(57)【要約】      （修正有）【課題】多様な生殖補助医療の実施に用いる目的で、老化卵母細胞の質を保存すると共に、卵原幹細胞（ＯＳＣ）をさらに増加する方法、又は細胞質若しくは単離されたミトコンドリアを改善する方法の提供。【解決手段】卵母細胞、卵原幹細胞（ＯＳＣ）又は前記ＯＳＣの子孫からなる群から選択される単離された細胞と、生体エネルギー物質とを含み、前記生体エネルギー物質が、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン及びＣＤ３８阻害剤、並びにこれらの機能性誘導体からなる群から選択される組成物。【選択図】図１−３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵母細胞、卵原幹細胞（ＯＳＣ）又はＯＳＣの子孫からなる群から選択される単離された細胞と、生体エネルギー物質とを含む組成物。
【請求項２】
前記生体エネルギー物質が、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン及びＣＤ３８阻害剤、並びにこれらの機能性誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記生体エネルギー物質が、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
細胞培地、卵母細胞回収液、卵母細胞洗浄液、卵母細胞体外成熟培地、卵胞体外成熟培地、卵母細胞体外受精培地、ガラス化液及び低温保存液からなる群から選択される溶液をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＯＳＣが、単離された非胚性幹細胞であり、これは、有糸分裂能があり、且つＶａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、及び任意選択でステージ特異的胎児抗原を発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＯＳＣが、卵巣組織から得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＯＳＣが、非卵巣組織から得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記非卵巣組織が、血液である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記非卵巣組織が、骨髄である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、卵巣組織、卵胞、骨髄、臍帯血又は末梢血を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
対照と比較して、増強されたミトコンドリア機能を有する単離された細胞であって、前記細胞が、卵母細胞、卵巣幹細胞（ＯＳＣ）又はＯＳＣの子孫からなる群から選択され、ここで、前記細胞は、生体エネルギー物質と接触している、細胞。
【請求項１２】
前記生体エネルギー物質が、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン及びＣＤ３８阻害剤、並びにこれらの機能性誘導体からなる群から選択される、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記生体エネルギー物質が、式Ｉ〜ＸＶの化合物からなる群から選択される、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１４】
前記細胞が、増加したミトコンドリアＤＮＡコピー数及び／又は増大したＡＴＰ生産能力を有する、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１５】
前記ミトコンドリアの数が、対照細胞と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又は約６０％増加している、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１６】
前記増強されたミトコンドリア機能が、ｍｔＤＮＡ含量、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ、ミトコンドリア質量、膜電位、並びに既知ミトコンドリア質量調節因子の遺伝子発現、及び電子伝達系成分をアッセイすることにより検出される、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１７】
前記細胞が、細胞培地、卵母細胞回収液、卵母細胞洗浄液、卵母細胞体外成熟培地、卵胞体外成熟培地、卵母細胞体外受精培地、ガラス化液及び低温保存液からなる群から選択される溶液中に存在する、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１８】
前記ＯＳＣが、単離された非胚性幹細胞であり、これは、有糸分裂能があり、且つＶａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、及び任意選択でステージ特異的胎児抗原を発現する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＯＳＣが、卵巣組織から得られる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＯＳＣが、非卵巣組織から得られる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記非卵巣組織が、血液である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記非卵巣組織が、骨髄である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記細胞が、卵巣組織、卵胞、骨髄、臍帯血又は末梢血との混合物中に存在する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２４】
ＯＳＣミトコンドリア又は卵母細胞ミトコンドリアと、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、並びにこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質とを含有する、組成物。
【請求項２５】
ＯＳＣミトコンドリアを含有する前記組成物が、核を含まないＯＳＣ細胞質である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
卵母細胞ミトコンドリアを含有する前記組成物が、核を含まない卵母細胞細胞質である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
ＯＳＣミトコンドリアを含有する前記組成物が、前記ＯＳＣから得られるミトコンドリアの精製調製物である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
卵母細胞ミトコンドリアを含有する前記組成物が、前記卵母細胞から得られるミトコンドリアの精製調製物である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ＯＳＣが、単離された非胚性幹細胞であり、これは、有糸分裂能があり、且つＶａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、及び任意選択でステージ特異的胎児抗原を発現する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ＯＳＣが、卵巣組織から得られる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ＯＳＣが、非卵巣組織から得られる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３２】
前記非卵巣組織が、血液である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記非卵巣組織が、骨髄である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記細胞が、卵巣幹細胞であり、前記細胞が、生体エネルギー物質と接触している、請求項１７に記載の細胞。
【請求項３５】
単離されたミトコンドリアであって、式Ｉ〜ＸＩの化合物からなる群から選択される生体エネルギー物質と接触している、ミトコンドリア。
【請求項３６】
単離されたミトコンドリアであって、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン及びＣＤ３８阻害剤、並びにこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質と接触している、ミトコンドリア。
【請求項３７】
前記ミトコンドリアが、対照と比較して、増加したミトコンドリアＤＮＡコピー数及び／又は増大したＡＴＰ生産能力を有する、請求項３５又は３６に記載のミトコンドリア。
【請求項３８】
前記ミトコンドリアの数が、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又は約６０％増加している、請求項３５又は３６に記載のミトコンドリア。
【請求項３９】
前記増強されたミトコンドリア機能が、ｍｔＤＮＡ含量、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ、ミトコンドリア質量、膜電位、並びに既知ミトコンドリア質量調節因子の遺伝子発現、及び電子伝達系成分をアッセイすることにより検出される、請求項３５又は３６に記載のミトコンドリア。
【請求項４０】
前記ミトコンドリアが、卵母細胞、卵巣幹細胞（ＯＳＣ）又はＯＳＣの子孫からなる群から選択される細胞、及び生体エネルギー物質中に存在する、請求項３５又は３６に記載のミトコンドリア。
【請求項４１】
前記細胞が、細胞培地、卵母細胞回収液、卵母細胞洗浄液、卵母細胞体外成熟培地、卵胞体外成熟培地、卵母細胞体外受精培地、ガラス化液及び低温保存液からなる群から選択される溶液中に存在する、請求項４０に記載のミトコンドリア。
【請求項４２】
前記ＯＳＣが、単離された非胚性幹細胞であり、これは、有糸分裂能があり、且つＶａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、及び任意選択でステージ特異的胎児抗原を発現する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ＯＳＣが、卵巣組織から得られる、請求項４０に記載のミトコンドリア。
【請求項４４】
前記ＯＳＣが、非卵巣組織から得られる、請求項４０に記載のミトコンドリア。
【請求項４５】
前記非卵巣組織が、血液である、請求項４４に記載のミトコンドリア。
【請求項４６】
前記非卵巣組織が、骨髄である、請求項４４に記載のミトコンドリア。
【請求項４７】
前記細胞が、卵巣組織、卵胞、骨髄、臍帯血若しくは末梢血との混合物中に存在する、請求項４０に記載のミトコンドリア。
【請求項４８】
ＯＳＣミトコンドリア又は卵母細胞ミトコンドリアと、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、及びこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質とを含む、単離細胞非含有組成物。
【請求項４９】
前記ＯＳＣが、単離された非胚性幹細胞であり、これは、有糸分裂能があり、且つＶａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、及び任意選択でステージ特異的胎児抗原を発現する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ＯＳＣが、卵巣組織から得られる、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ＯＳＣが、非卵巣組織から得られる、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５２】
前記非卵巣組織が、血液である、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記非卵巣組織が、骨髄である、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５４】
体外授精（ＩＶＦ）用の卵母細胞を調製する方法であって、ＯＳＣミトコンドリアと、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、及びこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質とを含有する組成物を、オートロガス卵母細胞に移入するステップを含み、これによって体外受精用の前記卵母細胞を調製する方法。
【請求項５５】
前記ＯＳＣが、単離された非胚性幹細胞であり、これは、有糸分裂能があり、且つＶａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、及び任意選択でステージ特異的胎児抗原を発現する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＯＳＣが、卵巣組織から得られる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＯＳＣが、非卵巣組織から得られる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記非卵巣組織が、血液である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記非卵巣組織が、骨髄である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
ＯＳＣミトコンドリアを含有する前記組成物が、核を含まないＯＳＣ細胞質である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
ＯＳＣミトコンドリアを含有する前記組成物が、ＯＳＣから得られるミトコンドリアの精製調製物である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
卵母細胞を体外受精して受精卵を形成し、前記受精卵から得た着床前胚を雌性被検者の子宮に移入するステップをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６３】
前記受精卵及び着床前胚を、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、及びこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質と一緒にインキュベートする、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
請求項５４に記載の方法に従い調製される卵母細胞。
【請求項６５】
ａ）雌性被検者からのＯＳＣを、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、及びこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質と一緒にインキュベートするステップ；
ｂ）前記ＯＳＣ由来のＯＳＣミトコンドリアを含有する組成物を取得するステップ；
ｃ）前記組成物を、単離されたオートロガス卵母細胞に移入するステップ；並びに
ｄ）前記オートロガス卵母細胞を体外受精させて、受精卵を形成するステップを含む、体外受精の方法。
【請求項６６】
前記受精卵から得た着床前胚を雌性被検者の子宮に移入するステップをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ステップａ）が任意選択であり、ステップｂ及び又はステップｃ）が、ＯＳＣミトコンドリアを含有する前記組成物を、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン及びＣＤ３８阻害剤、並びにこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質と一緒にインキュベートすることをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
体外授精用の卵母細胞を調製する方法であって、卵母細胞ミトコンドリアと、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、及びこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質とを含有する組成物を、オートロガス卵母細胞に移入するステップを含み、これによって体外受精用の前記卵母細胞を調製する方法。
【請求項６９】
卵母細胞ミトコンドリアを含有する組成物が、核を含まない卵母細胞細胞質である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
卵母細胞ミトコンドリアを含有する前記組成物が、卵母細胞から得られるミトコンドリアの精製調製物である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
請求項６８に記載の方法に従い調製される卵母細胞。
【請求項７２】
体外受精の方法であって、以下：
ａ）雌性被検者からの卵母細胞を、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、及びこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質と一緒にインキュベートするステップ；
ｂ）前記卵母細胞由来の卵母細胞ミトコンドリアを含有する組成物を取得するステップ；
ｃ）前記組成物を、単離されたオートロガス卵母細胞に移入するステップ；並びに
ｄ）前記オートロガス卵母細胞を体外受精させて、受精卵を形成するステップ
を含む方法。
【請求項７３】
前記受精卵から得た着床前胚を雌性被検者の子宮に移入するステップをさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ステップａ）が任意選択であり、ステップｂ）が、卵母細胞ミトコンドリアを含有する前記組成物を、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、及びこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質と一緒にインキュベートすることをさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
体外受精の方法であって、以下：
ａ）雌性被検者からの卵母細胞を、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、及びこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質と一緒にインキュベートするステップ；並びに
ｂ）前記卵母細胞を体外受精させて、受精卵を形成するステップ
を含む方法。
【請求項７６】
細胞培地、卵母細胞回収液、卵母細胞洗浄液、卵母細胞体外成熟培地、卵胞体外成熟培地、卵母細胞体外受精培地、胚培地、卵割培地、ガラス化液、低温保存液及び胚解凍培地からなる群から選択される溶液と、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、及びこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質とを含有する組成物。
【請求項７７】
雌性被検者の受精能を改善する方法であって、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、及びこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質を、卵母細胞及び／若しくはＯＳＣの質、デノボ生産並びに／又は排卵卵母細胞の回収率を改善するのに有効な量で、前記被検者に投与するステップを含み、これによって、前記雌性被検者の受精能を改善する方法。
【請求項７８】
前記生体エネルギー物質を前記雌性被検者に全身投与する、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記生体エネルギー物質を前記雌性被検者の卵巣に局所投与する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記雌性被検者の妊娠結果が、対照標準と比較して、改善される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
体外受精の方法であって、以下：
ａ）トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、及びこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質を、卵母細胞及び／若しくはＯＳＣのデノボ生産、質並びに／又は排卵卵母細胞の回収率を改善するのに有効な量で、雌性被検者に投与するステップ；
ｂ）前記被検者から卵母細胞を取得するステップ；並びに
ｃ）前記卵母細胞を体外受精させて、受精卵を形成するステップを含む方法。
【請求項８２】
前記生体エネルギー物質を前記雌性被検者に全身投与する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記生体エネルギー物質を前記雌性被検者の卵巣に局所投与する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
ステップａ）を、ステップｂ）及びステップｃ）の前、及び／又はステップｂ）及びステップｃ）の後に実施する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
前記受精卵から得た着床前胚を前記雌性被検者の子宮に移入して、前記生体エネルギー物質を前記雌性被検者に投与し続けるステップｄ）をさらに含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８６】
ステップｂ）及び／又はステップｃ）が、前記卵母細胞を、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、及びこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質と一緒にインキュベートすることをさらに含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８７】
前記雌性被検者の妊娠結果が、対照標準と比較して、改善される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８８】
胚発育の持続を必要とする妊娠雌性被検者における胚発育を持続させる方法であって、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、及びこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質を、治療に有効な量で、前記被検者に投与するステップを含み、これによって、妊娠雌性被検者における胚発育を持続させる方法。
【請求項８９】
前記生体エネルギー物質を前記雌性被検者に全身投与する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記生体エネルギー物質を前記雌性被検者の卵巣に局所投与する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
卵巣機能の回復を必要とする雌性被検者の卵巣機能を回復する方法であって、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、及びこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質を、治療に有効な量で投与するステップを含み、これによって、前記雌性被検者の卵巣機能を回復する方法。
【請求項９２】
前記生体エネルギー物質を前記雌性被検者に全身投与する、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記生体エネルギー物質を前記雌性被検者の卵巣に局所投与する、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記雌性被検者が、早発卵巣不全、化学療法による不妊、又は加齢に伴い低下した受精能を有する、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
採取対象の雌性被検者由来の組織又はその細胞を調製する方法であって、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、及びこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質を、有効な量で、前記雌性被検者に投与するステップを含み、これによって、採取対象の前記雌性被検者由来の前記組織又はその細胞を調製する方法。
【請求項９６】
前記組織が、卵巣、卵胞、骨髄、臍帯血及び末梢血である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記細胞が、卵母細胞、ＯＳＣ、及びＯＳＣの子孫からなる群から選択される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
卵母細胞を生産する方法であって、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、及びこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質の存在下で、ＯＳＣ、胚性幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）からなる群から選択される幹細胞を、前記幹細胞を卵母細胞に分化させるのに十分な条件下で培養するステップを含む方法。
【請求項９９】
前記受精卵から得た着床前胚を雌性被検者の前記子宮に移入するステップをさらに含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項１００】
前記着床前胚を、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、ＣＤ３８阻害剤、及びこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質と一緒にインキュベートする、請求項６６、７２及び９８に記載の方法。
【請求項１０１】
卵母細胞、卵原幹細胞（ＯＳＣ）又はＯＳＣの子孫からなる群から選択される単離された細胞と、体外受精用の生体エネルギー物質とを含む組成物。
【請求項１０２】
対照と比較して、増強されたミトコンドリア機能を有する単離された細胞であって、前記細胞が、卵母細胞、卵原幹細胞（ＯＳＣ）又はＯＳＣの子孫からなる群から選択され、前記細胞が、体外受精用の前記生体エネルギー物質と接触している、細胞。
【請求項１０３】
雌性の受精能の改善、妊娠雌性における胚発育の持続、雌性における卵巣機能の回復又は増加、採取対象の雌性からの組織又はその細胞の調製並びに卵母細胞の調製からなる群の１つ以上における使用を目的とする、以下：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、及びこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に従い、２０１１年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／５０２，８４０号及び２０１２年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／６００，５２９号の利益を請求する。尚、これらの文献の全開示内容は、参照として本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
連邦政府による支援の下で達成された本発明に対する権利についての声明
この研究は、国立衛生研究所助成金（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｒａｎｔ）第ＮＩＨＲ３７−ＡＧ０１２２７９号によって一部資金援助を受けた。政府は、本発明に所定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
１９５０年代の初めから、老化又は傷害に起因する不妊症などの卵巣不全及び卵巣機能不全に関連する問題の臨床管理は、誕生時に呈示される卵母細胞のプールに、置換又は再生を施すことができないという考えによって制限されてきた（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ  Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ  １９５１  ６：６３−１０８）。言い換えれば、所望の臨床結果をもたらすためには、いかなる治療的介入も卵母細胞を含有する卵胞の既存の予備能の操作に従うしかなかった。しかし、２００４年、マウスによる研究では、誕生時に賦与されている卵母細胞の一定卵巣予備能の認識について検証した（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００４  ４２８：１４５−１５０）。複数の実験アプローチから得られた結果に基づき、成体雌性哺乳動物の卵巣は、成体精巣において精子生産の生殖幹細胞支持と類似した様式で日常的に新しい卵母細胞を生産する生殖細胞系又は卵原幹細胞（ＯＳＣ）を稀にしか保持しないという結論に至った（Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００４  ４２８：１３３−１３４）。それから数年後、新生マウス及び成体マウスの卵巣からＯＳＣを単離することに成功した（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６；Ｐａｃｈｉａｒｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２０１０  ７９：１５９−１７０）。他のマウス研究からの複数の報告（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ２００５  １２２：３０３−３１５；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ２０１０  ９：３３９−３４９；Ｎｉｉｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｉｎｇ  ２０１０  ２：９９９−１００３）と共に、前述の研究結果を考え合わせ、移植のための物質、並びに卵巣機能及び雌性不妊を調節するための新規療法の標的としての、ＯＳＣの使用が概念的に確認された（Ｔｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００９  ８０：２−１２；Ｔｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００９；１５：３９３−３９８）。さらに、老齢マウスの卵巣萎縮における休眠ＯＳＣ（これは、若年成体卵巣環境に曝露すると、自発的に卵母細胞形成を回復する）の発見は、卵巣老化が可逆的でありうることを示している（Ｎｉｉｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｉｎｇ  ２００９  １：９７１−９７８；Ｍａｓｓａｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｉｎｇ  ２０１０；２：１−２）。ＯＳＣの臨床上の有用性について、卵母細胞生産幹細胞の同等の集団が、健康な出産可能年齢の女性の卵巣に存在し、卵巣から精製が可能であるという本明細書に示すエビデンスによってさらに確認する。
【０００４】
これらの研究は、成体卵巣中の卵母細胞の数が、ＯＳＣに基づく技術を用いた治療による増殖を受けられることを示しているが、卵巣老化及び卵巣不全は、卵巣に存在する卵母細胞数の減少と卵母細胞の質の低下の両者によって決定される。従って、特に母体年齢の高い女性の場合、卵母細胞の質を改善する方法をみいだす必要がある。この数十年の間に、文化及び社会的変化により、先進諸国の女性は、出産時期がかなり遅くなっている。例えば、米国における３５〜４４歳の女性の初産率は、この４０年間で８倍超増加した（Ｖｅｎｔｕｒａ  Ｖｉｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔａｔ  ２００９  ４７：１−２７；Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ＮＣＨＳ  Ｄａｔａ  Ｂｒｉｅｆ  ２００９  ２１：１−８）。年齢が３５歳以上の女性の妊娠率は、自然妊娠及び生殖補助医療による妊娠のいずれも、有意に低いことは周知である。出産率の低下は、ゴナドトロピンホルモン（卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ））による卵巣刺激法に対する応答の低下、卵母細胞及び胚の質及び妊娠率の低下、並びに流産及び胎児異数性の発生率増加をもたらす。実際、卵子における加齢に関連する染色体及び減数分裂紡錘体異常が、高出産年齢の女性における不妊、胎児喪失（流産）並びに先天異常（最も顕著には、２１トリソミー又はダウン症候群）につながる受胎の発生増加の主な原因であると考えられる（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９６８  ２１８：２２−２８，Ｈａｓｓｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １９８５  ７０：１１−１７；Ｂａｔｔａｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９９６  １１：２２１７−２２２２；Ｈｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  ２００８  ２４：８６−９３）。ヒト及び動物モデルの卵母細胞において加齢に関連する異数性の発生及び結果については広範に研究されている（Ｔａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００１  ６５：１４１−１５０；Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２００８  ３１６：３９７−４０７；Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００９  ８１：７６８−７７６）が、加齢と共に、減数細胞分裂中に染色体分離の忠実性を維持するアプローチは依然としてわかりにくいままである。現在のところ、高齢の女性患者の妊娠結果を改善するための公知の介入はない。動物の研究では、幼若期間中及び成体生殖期全体にわたる、薬理学的用量の抗酸化剤の長期投与が、老齢雌マウスでの卵母細胞の質を改善することが報告されている（Ｔａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ  ２００２  ６１：３８５−３９７）。しかし、この手法は、卵巣及び子宮の機能に有意な長期のマイナスの作用をもたらし、処置した動物において、胎児死亡及び吸収の増加、並びに同腹子の頻度及び大きさの低下を招く（Ｔａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ２００２  ５７：１５３９−１５５０）。従って、高齢女性において卵母細胞の質を維持又は改善する目的での全生殖期にわたる長期抗酸化剤治療の臨床解釈（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）は実際的ではない。
【０００５】
ミトコンドリアの機能障害は、生殖老化に大きな役割を有しており、従って、高齢女性の生殖機能は、ミトコンドリア栄養素の使用によって改善されうる（Ｂｅｎｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  ２０１０  ９３：２７２−２７５）。老化及び加齢に関連する疾病は、多くの場合、ミトコンドリア数（生合成及びマイトファジー）の減少、ミトコンドリアの凝集の増大、ミトコンドリア活性（細胞の主要エネルギー源である、ＡＴＰの生産）及びミトコンドリア膜電位の低減、並びに／又はミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）突然変異及び欠失の蓄積による、ミトコンドリア機能の喪失と関連している。卵母細胞が老化し、卵母細胞のミトコンドリアエネルギー生産が減少するにつれて、コンピテント卵子を産生するのに必要な、卵母細胞成熟の重要なプロセス（特に、核紡錘体活性及び染色体分離）の多くが、損なわれることになる（Ｂａｒｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｓｓｉｓｔ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｇｅｎｅｔ  ２００４  ２１：７９−８３，Ｗｉｌｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｚｙｇｏｔｅ  ２００５  １３：３１７−２３）。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）は、シグナル伝達経路、細胞−細胞連絡、及びエピジェネティックな変化を含む多くの他のプロセスの小分子調節物質である。非常に安定していたかと思うと、ＮＡＤ＋のレベルは、減食及び運動に応答して上昇する。ＮＡＤ＋レベルの上昇は、カロリー制限（ＣＲ）として知られる食事にも関連しており、これは、不妊を含む老化及び疾患の多くの形態を遅延させることがわかっている（Ｓｉｎｃｌａｉｒ  Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ  ２００５  ２６：９８７；Ｓｅｌｅｓｎｉｅｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  ７：６２２−６２９，２００８）。
【０００６】
ＮＡＤ＋レベルは、ミトコンドリアの適正な機能及びそれらを含む細胞のために重要である。ミトコンドリアＮＡＤ＋が低い細胞は、細胞機能障害及び細胞死に到りやすい（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００８）。肥満及び老化はいずれも、ミトコンドリアＮＡＤ＋レベルが低下し、その結果、ミトコンドリアの機能が低下し、細胞死が増加して、加齢に関連する疾患が加速する（Ｈａｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｇｉｎｇ  ２０１０  ２：１〜１０）。卵母細胞が老化し、卵母細胞のミトコンドリアエネルギー生産が減少するにつれて、卵母細胞成熟のプロセス（特に、減数分裂紡錘体活性及び染色体分離）の多くが、損なわれることになる（Ｂａｒｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｓｓｉｓｔ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｇｅｎｅｔ  ２００４  ２１：７９−８３，Ｗｉｌｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｚｙｇｏｔｅ  ２００５  １３：３１７−２３）。ＮＡＤ＋レベルの上昇は、細胞、器官、組織の生合成及び生存能、及び胚発生を増大するための実行可能な選択肢である。下流メディエータとしては、サーチュイン脱アセチル化酵素（ＳＩＲＴ１−７）及びポリ−ＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）がある。当業者には、ＮＡＤ＋レベルの上昇及びミトコンドリア機能の促進によって、カロリー制限の健康上の効用を模倣することができることは公知である（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ  ２００６  ４１：７１８−７２６）。
【０００７】
高出産年齢の雌性における卵母細胞の質を維持するための長期抗酸化剤療法との関係は確立されており（Ｔａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９９５  １０：１５６３−１５６５）、加齢に関連する不妊の問題に関する駆動力としての、卵子のミトコンドリアの機能障害の重要な役割を支持するデータが入手可能である。例えば、単離したマウス卵母細胞において、実験により誘導した酸化ストレスは、ＡＴＰレベルを低下させ、これによって、染色体のミスアラインメントを招く減数分裂紡錘体異常が増加する（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２００６  １６：８４１−８５０）。さらに、ヒト卵母細胞の減数分裂成熟は、様々なＡＴＰ濃度で進行することができるが、ＡＴＰ含量がより高い卵母細胞は、胚形成、着床及び発生の成功について、はるかに高い能力を示す（Ｖａｎ  Ｂｌｅｒｋｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９９５  １０：４１５−４２４）。
【０００８】
これらの同じ系列と共に、若いドナー卵母細胞（異なる女性から取得したもの）由来の細胞質抽出物の、生殖障害の病歴を持つ高齢女性の卵母細胞への異種移入は、卵細胞質移植又は卵細胞質移入として知られる方法であるが、この方法によって、胎児胚形成及び生存子孫の分娩の改善が明らかにされた。しかし、残念なことに、この方法に従って生まれた子供は、ミトコンドリアヘテロプラスミー又は２つの異なる由来のミトコンドリアの存在を呈示する（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９９８  ４：２６９−２８０，Ｂａｒｒｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００１  １６：５１３−５１６，Ｍｕｇｇｌｅｔｏｎ−Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８２  ２９９：４６０−４６２，Ｈａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２００７  ７７：２２９−２４９。このことは、精子からの父親由来のミトコンドリアが受精から間もなく破壊されるため、卵子に存在する母親由来のミトコンドリアが、胚にミトコンドリアを「接種」するのに用いられる事実と一致している（Ｓｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２０００  ６３：５８２０５９０）。上記の方法は、ドナー卵子からの精製ミトコンドリアの移入ではなく、細胞質の移入を含むものであるが、移入された細胞質におけるドナーミトコンドリアの存在は、子孫への「外来」ミトコンドリアの継代によって確認されており、これが、異種卵細胞質移入が受胎能利益をもたらす理由であると広く考えられている（Ｈａｒｖｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２００７  ７７：２２９−２４９）。それにもかかわらず、これらの子供における誘導ミトコンドリアヘテロプラスミーの健康への影響はまだ未知である；しかし、ミトコンドリアヘテロプラスミーのマウスモデルは、代謝症候群と一致する表現型を生成することが明らかにされている（Ａｃｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００７  ７７：５６９−５７６）。おそらく、異種卵細胞質移入に関する最も重要な課題は、ミトコンドリアも、生物学的母親及び生物学的父親が寄与する核遺伝子とは異なる遺伝子材料を含む事実と関連している。
従って、この方法に従って受胎された子供には、３人の遺伝上の親（生物学的母親、生物学的父親、卵子ドナー）がいることから、胚の形成のためのヒト生殖細胞系の遺伝子操作の例を代表するものとなる。従って、ミトコンドリアヘテロプラスミーを招く卵細胞質移植方法は、現在、規制され、ＦＤＡによって広範に禁止されている。詳細については、ＣＢＥＲ  ２００２  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ議事録（２００２年５月９日）（ＦＤＡから一般に閲覧可能）、並びに“Ｌｅｔｔｅｒ  ｔｏ  Ｓｐｏｎｓｏｒｓ／Ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ  −  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｂｙ  Ｍｅａｎｓ  Ｏｔｈｅｒ  Ｔｈａｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｇａｍｅｔｅ  Ｎｕｃｌｅｉ”（やはりＦＤＡから一般に閲覧可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ＢｉｏｌｏｇｉｃｓＢｌｏｏｄＶａｃｃｉｎｅｓ／ＳａｆｅｔｙＡｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ／ｕｃｍ１０５８５２．ｈｔｍ）を参照されたい。体細胞からのオートロガスミトコンドリアの使用は、ミトコンドリアヘテロプラスミーを回避しうるが、体細胞のミトコンドリアも、遺伝性突然変異を招くミトコンドリアＤＮＡ損傷及び欠失を被りやすいため、やはり不適切である。卵細胞質移植方法における、雌性生殖細胞のオートロガス供給源、すなわちＯＳＣ及びそれから得られる組成物（例えば、ＯＳＣ細胞質又は単離されたミトコンドリア）は、ミトコンドリアヘテロプラスミーを回避しうるため、この方法に関連する倫理及び安全上の課題が改善される。重要なことは、加齢に関連する障害を被りやすい卵母細胞が、このような方法に高い信頼性で用いるのに十分な量又は質ではないことである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、多様な生殖補助医療の実施に用いる目的で、老化卵母細胞の質を保存すると共に、ＯＳＣをさらに増加する、又はそれらの誘導体（例えば、細胞質若しくは単離されたミトコンドリア）を改善することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、体外受精方法の実施前及び／又は実施後、あるいは卵巣、卵母細胞、ＯＳＣ及び／若しくは着床前胚のｉｎ  ｖｉｖｏでの曝露後の卵母細胞、生後雌性生殖幹細胞（本明細書ではＯＳＣとも呼ぶ）及び／若しくは着床前胚におけるミトコンドリア数、ミトコンドリア活性、細胞エネルギーレベル若しくは細胞エネルギー生産能力（集合的に「生体エネルギー状態」と呼ぶ）を増大するための物質の使用を提供する。特定の実施形態では、このような使用のための物質としては、ＮＡＤ＋の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、Ｓｉｒｔ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体が挙げられる。これらの物質は、本明細書では集合的に「生体エネルギー物質」と呼ぶ。
【００１１】
一態様では、本発明は、卵母細胞、卵原幹細胞（ＯＳＣ）若しくはＯＳＣの子孫の１つ以上と、生体エネルギー物質（例えば、ＮＡＤ＋の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体の１つ以上）を含有する組成物を提供する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、増強されたミトコンドリア機能を有する単離細胞を提供し、ここで、細胞は、卵母細胞、卵原幹細胞（ＯＳＣ）若しくはＯＳＣの子孫の１つ以上であり、細胞は、生体エネルギー物質（ＮＡＤ＋の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体の１つ以上）と接触している。
【００１３】
また別の態様では、本発明は、ＯＳＣミトコンドリア又は卵母細胞ミトコンドリアと、ＮＡＤ＋の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体の１つ以上である生体エネルギー物質を含有する組成物を提供する。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、単離されたミトコンドリアを提供し、ここで、ミトコンドリアは、ＮＡＤ＋の１種以上の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体のいずれか１つ以上である生体エネルギー物質と接触している。
【００１５】
別の態様では、本発明は、単離細胞を含まない組成物を提供し、この組成物は、ＯＳＣミトコンドリア又は卵母細胞ミトコンドリアと、ＮＡＤ＋の１種以上の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体のいずれか１つ以上である生体エネルギー物質を含有する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、体外受精（ＩＶＦ）用の卵母細胞を調製する方法を提供し、この方法は、ＯＳＣミトコンドリアと、ＮＡＤ＋の１種以上の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体のいずれか１つ以上の１つ以上である生体エネルギー物質を含有する組成物をオートロガス卵母細胞に移入し、これによって体外受精用の卵母細胞を調製することを含む。一実施形態では、ＯＳＣミトコンドリアを含有する組成物は、ＯＳＣから得られるミトコンドリアの精製調製物である。
【００１７】
また別の態様では、本発明は、前述の態様、又は本明細書に記載するいずれか他の態様の方法に従って調製した卵母細胞を提供する。
【００１８】
さらにまた別の態様では、本発明は、体外受精の方法を提供し、この方法は、（ａ）雌性被検者由来のＯＳＣを、ＮＡＤ＋の１種以上の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体のいずれか１つ以上である生体エネルギー物質と一緒にインキュベートするステップ；（ｂ）ＯＳＣ由来のＯＳＣミトコンドリアを含有する組成物を取得するステップ；（ｃ）組成物を、単離したオートロガス卵母細胞に移入するステップ；及び（ｄ）オートロガス卵母細胞を体外受精させることにより、受精卵を形成するステップを含む。一実施形態では、本方法はさらに、受精卵由来の着床前胚を雌性被検者の子宮に移入するステップを含む。一実施形態では、ステップａ）は、任意選択であり、またステップｂ）は、ＯＳＣミトコンドリアを含有する組成物を、ＮＡＤ＋の１種以上の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体のいずれか１つ以上である生体エネルギー物質と一緒にインキュベートするステップさらに含む。
【００１９】
さらに別の態様では、本発明は、体外受精用の卵母細胞を調製する方法を提供し、この方法は、卵母細胞ミトコンドリアと、ＮＡＤ＋の１種以上の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体のいずれか１つ以上である生体エネルギー物質を含有する組成物をオートロガス卵母細胞に移入するステップを含み、これによって体外受精用の卵母細胞を調製する。一実施形態では、卵母細胞ミトコンドリアを含有する組成物は、核を含まない卵母細胞細胞質である。別の実施形態では、卵母細胞ミトコンドリアを含む組成物は、卵母細胞から得られるミトコンドリアの精製調製物である。一実施形態では、本方法は、卵母細胞を体外受精して受精卵を形成し、前記受精卵から得た着床前胚を雌性被検者の子宮に移入するステップをさらに含む。別の実施形態では、受精卵及び着床前胚を、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＳＩＲＴ１活性化物質、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、並びにこれらの機能性誘導体からなる群から選択される生体エネルギー物質と一緒に、インキュベートする。
【００２０】
さらにまた別の態様では、本発明は、前述の態様、又は本明細書に記載の本発明のいずれか他の態様の方法に従い調製した卵母細胞を提供する。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、体外受精の方法を提供し、この方法は、（ａ）雌性被検者由来の卵母細胞を、ＮＡＤ＋の１種以上の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体のいずれか１つ以上である生体エネルギー物質と一緒にインキュベートするステップ；（ｂ）卵母細胞由来の卵母細胞ミトコンドリアを含有する組成物を取得するステップ；（ｃ）組成物を、単離したオートロガス卵母細胞に移入するステップ；及び（ｄ）オートロガス卵母細胞を体外受精させることにより、受精卵を形成するステップを含む。一実施形態では、本方法は、受精卵に由来する着床前段階の胚を雌性被検者の子宮に移入することをさらに含む。別の実施形態では、ステップａ）は、任意選択であり、また、ステップｂ）は、卵母細胞ミトコンドリアを含有する組成物を、ＮＡＤ＋の１種以上の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体のいずれか１つ以上である生体エネルギー物質と一緒にインキュベートすることをさらに含む。
【００２２】
さらに別の態様では、本発明は、体外受精の方法を提供し、本方法は、雌性被検者由来の卵母細胞を、ＮＡＤ＋の１種以上の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体のいずれか１つ以上である生体エネルギー物質と一緒にインキュベートするステップ；及び卵母細胞を体外受精させることにより、受精卵を形成するステップを含む。
【００２３】
さらに別の態様では、本発明は、細胞培地、卵母細胞回収液、卵母細胞洗浄液、卵母細胞体外成熟培地、卵胞体外成熟培地、卵母細胞体外受精培地、胚培地、卵割培地、ガラス化液、低温保存液及び胚解凍培地からなる群から選択される溶液と、ＮＡＤ＋の１種以上の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体のいずれか１つ以上である生体エネルギー物質を含有する組成物を提供する。
【００２４】
また別の態様では、本発明は、雌性被検者の受精能を改善する方法を提供し、この方法は、ＮＡＤ＋の１種以上の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体のいずれか１つ以上である生体エネルギー物質を、卵母細胞及び／又はＯＳＣの質、デノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）生産及び／又は排卵される卵母細胞の回収率を改善するのに有効な量で、雌性被検者に投与するステップを含み、これによって、雌性被検者の受精能を改善する。一実施形態では、生体エネルギー物質は、雌性被検者に全身投与する。別の実施形態では、生体エネルギー物質は、雌性被検者の卵巣に局所投与する。また別の実施形態では、雌性被検者の妊娠結果は、対照標準と比較して、改善される。
【００２５】
さらにまた別の態様では、本発明は、体外受精の方法を提供し、本方法は、以下：
（ａ）ＮＡＤ＋の１種以上の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、若しくはこれらの機能性誘導体のいずれか１つ以上である生体エネルギー物質を、卵母細胞及び／又はＯＳＣデノボ生産、排卵される卵母細胞の質及び／又は回収率を改善するのに有効な量で、雌性被検者に投与するステップ：
（ｂ）雌性被検者から卵母細胞を取得するステップ；
（ｃ）卵母細胞を体外受精させることにより、受精卵を形成するステップ
を含む。一実施形態では、生体エネルギー物質は、雌性被検者に全身投与する。別の実施形態では、生体エネルギー物質は、雌性被検者の卵巣に局所投与する。別の実施形態では、ステップａ）は、ステップｂ）及びｃ）の前並びに／又はステップｂ）及びｃ）の後に実施する。別の実施形態では、本方法は、受精卵由来の着床前胚を雌性被検者の子宮に移入して、雌性被検者への生体エネルギー物質の投与を続けるステップｄ）をさらに含む。別の実施形態では、ステップｂ）及び／又はｃ）は、ＮＡＤ＋の１種以上の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、若しくはこれらの機能性誘導体のいずれか１つ以上である生体エネルギー物質と一緒に、卵母細胞をインキュベートすることをさらに含む。
【００２６】
別の実施形態では、雌性被検者の妊娠結果は、対照標準と比較して、改善される。
【００２７】
また別の態様では、本発明は、胚発育の持続を必要とする妊娠雌性被検者における胚発育を持続させる方法を提供し、本方法は、ＮＡＤ＋の１種以上の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体のいずれか１つ以上である生体エネルギー物質を、治療に有効な量で、被検者に投与するステップを含み、これによって、妊娠雌性被検者における胚発育を持続させる。一実施形態では、生体エネルギー物質は、雌性被検者に全身投与する。別の実施形態では、生体エネルギー物質は、雌性被検者の卵巣に局所投与する。
【００２８】
また別の態様では、本発明は、卵巣機能の回復を必要とする雌性被検者の卵巣機能を回復する方法を提供し、本方法は、ＮＡＤ＋の１種以上の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体のいずれか１つ以上である生体エネルギー物質を、治療に有効な量で投与するステップを含み、これによって、雌性被検者の卵巣機能を回復する。
【００２９】
一実施形態では、生体エネルギー物質は、雌性被検者に全身投与する。別の実施形態では、生体エネルギー物質は、雌性被検者の卵巣に局所投与する。別の実施形態では、雌性被検者は、早発卵巣不全を有する。
【００３０】
また別の態様では、本発明は、採取対象の雌性被検者由来の組織又はその細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ＮＡＤ＋の１種以上の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体のいずれか１つ以上である生体エネルギー物質を、有効な量で、雌性被検者に投与するステップを含み、これによって、採取対象の雌性被検者由来の組織又はその細胞を調製する。一実施形態では、組織は、卵巣、卵胞、骨髄又は末梢血液である。
【００３１】
さらにまた別の態様では、本発明は、卵母細胞を生産する方法を提供し、本方法は、幹細胞を卵母細胞に分化させるのに十分な条件下において、ＮＡＤ＋の１種以上の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体のいずれか１つ以上である生体エネルギー物質の存在下で、ＯＳＣ、胚性幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である幹細胞を培養するステップを含む。
【００３２】
別の態様では、本発明は、卵母細胞、卵原幹細胞（ＯＳＣ）又はＯＳＣの子孫である単離細胞と、体外受精に用いるための生体エネルギー物質とを含有する組成物を特徴とする。
【００３３】
別の態様では、本発明は、対照と比較して、ミトコンドリア機能が増強した単離細胞を特徴とし、ここで、細胞は、卵母細胞、卵原幹細胞（ＯＳＣ）又はＯＳＣの子孫であり、この細胞は、体外受精に用いるための生体エネルギー物質と接触させている。
【００３４】
別の態様では、本発明は、雌性の不妊の改善、妊娠雌性における胚発生の支持、雌性の卵巣機能の回復若しくは増加、採取対象の雌性被検者由来の組織若しくはその細胞の調製又は卵母細胞の調製の１つ以上に用いるために、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、又はこれらの機能性誘導体である生体エネルギー物質を特徴とする。
【００３５】
前述の態様のいずれか、又は本明細書に記載の本発明のいずれかの態様の様々な実施形態では、生体エネルギー物質は、ＮＡＤ＋の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、レスベラトロール、ＤＯＩ、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、ＳＲＴ−１７２０、ＳＩＲＴ１活性化物質、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、若しくはこれらの機能性誘導体の１つ以上である。前述の態様のいずれか、又は本明細書に記載の本発明のいずれかの態様の様々な実施形態では、生体エネルギー物質は、図２９に記載の化合物である。
【００３６】
前述の態様のいずれか、又は本明細書に記載の本発明のいずれかの態様の様々な実施形態では、本発明の組成物は、細胞培地、卵母細胞回収液、卵母細胞洗浄液、卵母細胞体外成熟培地、卵胞体外成熟培地、卵母細胞体外受精培地、ガラス化液及び低温保存液の１つ以上から選択される溶液をさらに含有する。様々な実施形態では、本組成物は、卵巣組織、卵胞、骨髄、臍帯血若しくは末梢血を含有する。他の実施形態では、ＯＳＣは、単離された非胚性幹細胞であり、これは、有糸分裂能があり、且つＶａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、及び任意選択でステージ特異的胎児抗原の１つ以上を発現する。他の実施形態では、ＯＳＣは、卵巣組織から得る。様々な実施形態において、ＯＳＣは、非卵巣組織から得る。特定の実施形態では、非卵巣組織は、血液又は骨髄である。様々な実施形態において、細胞は、卵巣幹細胞であり、ここで、細胞は、生体エネルギー物質と接触している。別の実施形態では、接触させた細胞は、増加したミトコンドリアＤＮＡコピー数及び／又は増加したＡＴＰ生産能力を有する。さらに別の実施形態では、ミトコンドリアの数は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％若しくは６０％増加する。前述の態様のいずれか、又は本明細書に記載の本発明のいずれかの態様の様々な実施形態において、ミトコンドリア機能の増大は、ｍｔＤＮＡ含量、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ、ミトコンドリア質量、膜電位、並びに既知ミトコンドリア量調節因子の遺伝子発現、及び電子伝達系成分をアッセイすることにより検出する。
【００３７】
前述の態様のいずれか、又は本明細書に記載のいずれかの態様の様々な実施形態において、細胞は、細胞培地、卵母細胞回収液、卵母細胞洗浄液、卵母細胞体外成熟培地、卵胞体外成熟培地、卵母細胞体外受精培地、ガラス化液及び低温保存液のいずれか１つ以上である溶液中に存在する。他の実施形態では、ミトコンドリアは、卵母細胞、卵原幹細胞（ＯＳＣ）又はＯＳＣの子孫の１つ以上である細胞内に存在する。特定の実施形態では、細胞は、卵巣組織、卵胞、骨髄、臍帯血若しくは末梢血との混合物中に存在する。
【００３８】
前述の態様のいずれか、又は本明細書に記載のいずれかの態様の様々な実施形態において、ＯＳＣミトコンドリアを含有する組成物は、核のないＯＳＣ細胞質である。様々な実施形態において、卵母細胞ミトコンドリアを含有する組成物は、核のない卵母細胞細胞質である。様々な実施形態において、ＯＳＣミトコンドリアを含有する組成物は、ＯＳＣから得られたミトコンドリアの精製された調製物である。別の実施形態では、卵母細胞ミトコンドリアを含有する組成物は、卵母細胞から得られたミトコンドリアの精製された調製物である。
【００３９】
前述の態様のいずれか、又は本明細書に記載のいずれかの態様の他の実施形態において、ミトコンドリアは、卵母細胞、卵原幹細胞（ＯＳＣ）又はＯＳＣの子孫の１つ以上である細胞、及び生体エネルギー物質中に存在する。前述の態様のいずれか、又は本明細書に記載のいずれかの態様の様々な実施形態において、細胞は、卵巣組織、卵胞、骨髄、臍帯血若しくは末梢血との混合物中に存在する。また別の実施形態では、雌性被検者の妊娠結果は、対照標準と比較して、改善される。さらにまた別の実施形態では、生体エネルギー物質は、雌性被検者に全身投与するか、又は雌性被検者の卵巣に局所投与する。
【００４０】
本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明、及び特許請求の範囲から明らかになるだろう。従って、本発明の他の態様を以下の開示内容に記載するが、これらは本発明の範囲に含まれる。
【００４１】
以下の詳細な説明は、例として記載するが、記載される特定の実施形態に本発明を限定する意図はなく、参照として本明細書に組み込む添付の図面と一緒に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ＯＳＣ単離のための蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づくプロトコルの実証を示す。図１ａには、ＶＡＳＡ発現（緑色と青色のＤＡＰＩ対比染色）の免疫蛍光分析を、ＶＡＳＡのＮＨ２又はＣＯＯＨ末端に対する抗体を用いた成体マウス卵巣において示す（スケールバー、５０μｍ）。図１ｂには、分散マウス卵巣又は単離卵母細胞の免疫磁気分離を、ＶＡＳＡのＮＨ２又はＣＯＯＨ末端に対する抗体を用いて示す。画分１は、分離前の細胞とビーズを含み、画分２は、洗浄若しくは通過画分（非免疫反応性）であり、また、画分３は、ビーズ画分（ＶＡＳＡ陽性細胞、白い矢印で示す）である。図１ｃには、ＶＡＳＡのＮＨ２又はＣＯＯＨ末端に対する抗体を用いた分散マウス卵巣からの生存細胞若しくは透過処理細胞のＦＡＣＳ分析を示す。生存ＶＡＳＡ陽性細胞は、ＣＯＯＨ抗体でしか検出されない（赤い点線の四角）が、透過処理によって、ＮＨ２抗体を用いたＶＡＳＡ陽性細胞の単離が可能になる（青い点線の四角）。図１ｄでは、ＣＯＯＨ抗体で得られた生存ＶＡＳＡ陽性細胞の透過処理（赤い点線の四角）によって、ＮＨ２抗体を用いたＦＡＣＳによる同じ細胞の再単離が可能になる（青い点線の四角）。図１ｅには、生存ＯＳＣの単離のためにＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ抗体を用いたＦＡＣＳプロトコルの概略図を示す。図１ｆは、ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ抗体を用いたＯＳＣのＦＡＣＳによる単離用の細胞を得るための卵巣分散工程中に調製された各細胞画分における、生殖細胞系マーカＢｌｉｍｐ１（ＺＮＦドメインと共に１を含むＰＲドメイン、若しくはＰｒｄｍ１とも呼ばれる）、Ｓｔｅｌｌａ、Ｆｒａｇｉｌｉｓ（インターフェロン誘導貫膜タンパク質３若しくはＩｆｉｔｍ３とも呼ばれる）、Ｔｅｒｔ（テロメラーゼ逆転写酵素）、Ｖａｓａ、Ｄａｚｌ（無精子症などで欠失する）及び卵母細胞マーカＮｏｂｏｘ（卵胞特異的ホメオボックス）、Ｚｐ３（透明帯糖タンパク質３）、Ｇｄｆ９（増殖分化因子９）の遺伝子発現分析を表す（＋ｖｅ、ＦＡＣＳ後のＶＡＳＡ陽性生存細胞画分；−ｖｅ、ＦＡＣＳ後のＶＡＳＡ陰性生存細胞画分；ＲＴなし、すなわち、逆転写なしのＲＮＡサンプルのＰＣＲ；βアクチン、サンプルをロードした対照）。
【図２】混入卵母細胞を含む免疫磁気ビーズ分離による成体マウス卵巣から単離したＯＳＣ画分を表す。遺伝子発現分析の生殖細胞系マーカ（Ｂｌｉｍｐ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｔｅｒｔ、Ｖａｓａ、Ｄａｚｌ）及び卵母細胞特異的マーカ（Ｎｏｂｏｘ、Ｚｐ３、Ｇｄｆ９）が、若い成体マウス卵巣（陽性対照）又は分散した若い成体マウス卵巣のＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ抗体に基づく免疫磁気ビーズ分離によって得られた最終細胞画分においてみとめられる（ＲＴなし、すなわち、逆転写なしの選別細胞ＲＮＡサンプルのＰＣＲ；βアクチン、サンプルをロードした対照）。
【図３】ＦＡＣＳを用いた、成体マウス及びヒト卵巣からのＶＡＳＡ陽性細胞の単離を表す。図３ａ及びｂには、ヒト（ａ）及びマウス（ｂ）ＯＳＣ単離のために用いた成体卵巣組織の典型的組織学的出現を示す。スケールバー、１００μｍ。図３ｃ及びｄには、ＶＡＳＡの細胞表面発現に基づくＦＡＣＳによって単離した生存細胞の形態を示す。スケールバー、１０μｍ。図３ｅは、出発卵巣材料及び新しく単離したＯＳＣの遺伝子発現プロフィールを提供し、ヒト組織分析のための例として３人の患者の評価を示す（ＲＴなし：逆転写なしのＲＮＡサンプルのＰＣＲ；βアクチン、サンプルをロードした対照）。図３ｆ〜図３ｋには、マウス胚性幹細胞（ＥＣＳ）の注射から３週間後のマウスにおける腫瘍の発生と比較した、マウスＯＳＣの注射から２４週間後のマウスにおける腫瘍の非存在（３ｆ）を呈示する、奇形腫形成アッセイを、実験結果のまとめ（３ｋ）と一緒に示す（図３ｇ〜図３ｊ；パネル３ｈ〜３ｊは、３つ全ての胚葉由来の細胞の例を示し、パネル３ｈに神経前駆細胞を強調表示する（挿入））。
【図４】卵巣内移植後のマウスＯＳＣから得られた機能性卵を表す。図４ａ及びｂでは、５〜６ヵ月早くＧＦＰ発現ＯＳＣを注射した野生型マウスの卵巣において、ＧＦＰ陰性及びＧＦＰ陽性（茶色対青色のヘマトキシリン対比染色）卵母細胞を含む成長卵胞の例を示す。図４ｃには、５〜６ヵ月早くＧＦＰ発現ＯＳＣの卵巣内移植を受けた野生型雌マウスの誘導排卵後に、排卵したＧＦＰ陰性卵（卵丘−卵母細胞複合体中の）、並びにその結果、ＩＶＦによって発生した胚（例として２細胞、４細胞、充桑実胚（ＣＭ）及び初期胚盤胞（ＥＢ）期を示す）の例を示す。図４ｄ及び４ｅには、５〜６ヵ月早くＧＦＰ発現ＯＳＣの卵巣内移植を受けた野生型雌マウスの誘導排卵後に、卵管から得られたＧＦＰ陽性卵（卵丘−卵母細胞複合体中の）を示す。これらの卵を、野生型精子を用いて、体外受精させると、着床前発生によって進行した２細胞胚が得られ（ＧＦＰ陽性胚の例として２細胞、４細胞、８細胞、充桑実胚（ＣＭ）、拡張桑実胚（ＥＭ）、胚盤胞（Ｂ）及び孵化胚盤胞（ＨＢ）期を示す）、受精から５〜６日後に孵化中胚盤胞を形成した。
【図５】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマウス及びヒトＯＳＣによる生殖細胞コロニー形成を表す。ＶＡＳＡ発現の免疫蛍光に基づく分析を図５ｂ及び５ｄに；（緑色と青色のＤＡＰＩ対比染色）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上に樹立後のマウス（５ａ、５ｂ）及びヒト（５ｃ、５ｄ）ＯＳＣによって形成された典型的生殖細胞コロニーにおいて示す（典型的コロニーを白い点線で強調表示する）。
【図６】規定培地におけるマウス及びヒト卵巣由来のＶＡＳＡ陽性細胞の評価を表す。図６ａ〜６ｄは、ＭＥＦ非含有培地中に維持したマウス（６ａ、６ｂ）及びヒト（６ｃ、６ｄ）ＯＳＣにおけるＶＡＳＡ発現（緑色）及びＢｒｄＵ組込み（赤色）の二重検出によるＯＳＣ増殖の評価を示す。図６ｅは、継代、並びに２４ウェル培養プレートにおけるウェル当たり２．５×１０４細胞の接種後のマウスＯＳＣのＭＥＦ非含有培養についての典型的増殖曲線を示す。図６ｆは、数か月後の増殖後（図示する例では、継代４５）のマウスＯＳＣにおけるＶＡＳＡの細胞表面発現を検出するために、ＣＯＯＨ抗体を用いたＦＡＣＳ分析を示す。図６ｇは、出発卵巣材料、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏでの４か月以上の増殖後の培養マウス及びヒトＯＳＣの遺伝子発現プロフィールを示す（ＲＴなし、すなわち、逆転写なしのＲＮＡサンプルのＰＣＲ；βアクチン、サンプルをロードした対照）。２人の患者から樹立した２つの異なるヒトＯＳＣ系（ＯＳＣ１及びＯＳＣ２）を例として示す。図６ｈ及び６ｉは、ＭＥＦ非含有培地中のマウス（ｈ）及びヒト（ｉ）ＯＳＣにおけるＢＬＩＭＰ１、ＳＴＥＬＬＡ及びＦＲＡＧＩＬＩＳ発現（緑色）の典型的免疫蛍光分析を示す。細胞は、核ＤＮＡ及び細胞質Ｆ−アクチンをそれぞれ視覚化するために、ＤＡＰＩ（青色）及びローダミン−ファロイジン（赤色）で対比染色した。
【図７】培養したマウス及びヒトＯＳＣからの自然卵形成を表す。図７ａ〜７ｃは、培養中のマウスＯＳＣによって形成された未成熟卵母細胞の例を提供する図であり、形態学的評価（７ａ）、卵母細胞マーカタンパク質ＶＡＳＡ及びＫＩＴ（７ｂ；ＶＡＳＡの細胞質局在化に注意）、並びに卵母細胞マーカ遺伝子Ｖａｓａ、Ｋｉｔ、Ｍｓｙ２（Ｙボックスタンパク質２若しくはＹｂｘ２とも呼ばれる）、Ｎｏｂｏｘ、Ｌｈｘ８、Ｇｄｆ９、Ｚｐ１、Ｚｐ２及びＺｐ３をコードするｍＲＮＡの存在（７ｃ；ＲＴなし、すなわち、逆転写なしのＲＮＡサンプルのＰＣＲ；βアクチン、サンプルをロードした対照）を示す。スケールバー、２５μｍ。図７ｄは、継代、並びに２４ウェル培養プレートにおけるウェル当たり２．５×１０４細胞の接種から２４、４８及び７２時間後のマウスＯＳＣによって形成された未成熟卵母細胞の数を示す（決定のために各時点で、培養上澄みを回収した。従って、これらの値は、各々２４時間のブロックにわたって産生された数を表し、卵丘の数ではない；平均±ＳＥＭ、ｎ＝３つの独立した培養物）。図７ｅ〜７ｇは、ヒトＯＳＣからのｉｎ  ｖｉｔｒｏ卵形成を示し、培養中のヒトＯＳＣによって形成された未成熟卵母細胞の例（７ｆ、形態学；７ｇ、卵母細胞マーカタンパク質ＶＡＳＡ、ＫＩＴ、ＭＳＹ２及びＬＨＸ８の発現）並びに継代、及び２４ウェル培養プレートにおけるウェル当たり２．５×１０４細胞の接種後に形成された数（７ｅ；平均±ＳＥＭ、ｎ＝３つの独立した培養物）を示す。マウスＯＳＣ由来の卵母細胞についての結果と共に、ヒトＯＳＣ由来の卵母細胞における卵母細胞マーカ遺伝子（Ｖａｓａ、Ｋｉｔ、Ｍｓｙ２、Ｎｏｂｏｘ、Ｌｈｘ８、Ｇｄｆ９、Ｚｐ１、Ｚｐ２及びＺｐ３）をコードするｍＲＮＡの存在をパネルｃに示す。スケールバー、２５μｍ。図７ｈには、免疫蛍光検出の減数分裂組換えマーカ、ＤＭＣ１（ｍｃｋ１相同体の用量サプレッサー）及びＳＹＣＰ３（シナプトネマ構造タンパク質３）（赤色対青色のＤＡＰＩ対比染色）を、培養したヒトＯＳＣの核において示す：ヒト卵巣間質細胞を負の対照として用いた。図７ｉには、継代から７２時間後の培養ヒトＯＳＣのＦＡＣＳによる倍数性分析を示す。培養ヒト線維芽細胞（負の対照）及び培養マウスＯＳＣの倍数性分析の結果を図９に示す。
【図８】成人卵巣における卵母細胞特異的マーカの検出を表す。成人卵巣皮質細胞における卵母細胞でのＶＡＳＡ（８ａ、赤色）、ＫＩＴ（８ｂ、緑色）、ＭＳＹ２（８ｃ、赤色）及びＬＨＸ８（８ｄ、緑色）発現の免疫蛍光分析を示す（図１０ｈも参照）。核の視覚化のために、切片をＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。スケールバー、２５μｍ。
【図９】培養中のヒト線維芽細胞及びマウスＯＳＣの倍数性分析を表す。図９ａ及び９ｂは、活発に分裂するヒト胎児腎線維芽細胞の培養物（９ａ）及び継代から４８時間後に回収したマウスＯＳＣ（９ｂ）における倍数性状態の典型的なＦＡＣＳ評価を示す。半数体（１ｎ）細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持したヒトＯＳＣの分析の結果（図７ｉ）と一致して、生殖細胞系培養物中にしか検出されなかったが、全ての培養物が、細胞の二倍体（２ｎ）及び四倍体集団（４ｎ）を含んでいた。
【図１０】ヒト卵巣組織におけるヒトＯＳＣからの卵母細胞の産生を表す。分散、ＧＦＰ−ｈＯＳＣとの再凝集（１０ａ）及び２４〜７２時間にわたるｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養（１０ｂ、１０ｃ）後のヒト卵巣皮質組織の直接（生存細胞）ＧＦＰ蛍光分析を示す。卵胞に類似する緊密な構造で、より小さなＧＦＰ陰性細胞に取り囲まれる大きなＧＦＰ陽性単細胞の形成に注意されたい（図１０ｂ及び１０ｃ；スケールバー、５０μｍ）。ＧＦＰ−ｈＯＳＣを注射して、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ雌マウスに異種移植した成人卵巣皮質組織におけるＧＦＰ陽性卵母細胞（茶色、黒い矢印で示す；青色のヘマトキシリン対比染色に対して）を含む未成熟卵胞の例を示す（図１０ｄ、移植から１週間後；図１０ｆ、移植から２週間後）。同じ移植片におけるＧＦＰ陰性卵母細胞を含む同等の卵胞に注意されたい。負の対照として、ＧＦＰ−ｈＯＳＣ注射及び異種移植の前のヒト卵巣皮質組織（１０ｅ）又は異種移植の前にビヒクル注射（ＧＦＰ−ｈＯＳＣなし）を受けたもの（１０ｇ）における未成熟卵胞は、全て、上に示したサンプルと並行して行ったＧＦＰ検出のための処理の後、ＧＦＰ陰性卵母細胞を含んでいた。図１０ｈは、ＧＦＰ発現（緑色）の二重免疫蛍光分析、並びにＧＦＰ−ｈＯＳＣ注射を受けた異種移植片における複糸期卵母細胞特異的マーカＭＳＹ２（赤色）又は卵母細胞転写因子ＬＨＸ８（赤色）のいずれかを示す。ＧＦＰは、ＧＦＰ−ｈＯＳＣ注射前の移植片に検出されなかったが、ＭＳＹ２及びＬＨＸ８が、全ての卵母細胞に検出されたことに注意されたい。核の視覚化のために、切片をＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。スケールバー、２５μｍ。
【図１１】ＧＦＰ−ｈＯＳＣ移植後のヒト卵巣異種移植片における卵母細胞形成の形態計測に基づく評価を表す。３つのランダムに選択したヒト卵巣皮質組織サンプル（標識１、２及び３）における原始及び一次卵胞の総数を示すが、これらは、ＧＦＰ−ｈＯＳＣの注射及びＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの異種移植から７日後であり、ＧＦＰ陰性（宿主由来）又はＧＦＰ陽性（ＯＳＣ由来）卵母細胞を含む（例えば、図１０ｄ〜１０ｇを参照）。
【図１２】ヒト卵巣皮質組織及び新しく単離したヒトＯＳＣの低温保存及び解凍を表す。図１２ａ及び１２ｂは、ガラス化前及び後の成人卵巣皮質組織の組織学的外観を示し、組織統合性の維持と、凍結−解凍処置に耐えて生存する多数の卵母細胞（黒の矢印）を強調表示する。図１２ｃでは、新しく単離したヒトＯＳＣの凍結−解凍後の細胞喪失のパーセントを示す（２人の患者から得られた結果）。
【図１３】オートロガス生殖細胞系ミトコンドリアエネルギー移動方法の概要を表す図である。尚、この方法は、「オートロガス生殖細胞系ミトコンドリアエネルギー移動のための組成物及び方法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）」という名称で、２０１１年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／４７５，５６１号明細書に記載されている。エネルギー移動のためのミトコンドリアの供給源として用いられるＯＳＣ、並びにこのミトコンドリアを受ける、受精させようとする卵は、同じ被検者から得られることに注意されたい。
【図１４】細胞を単離するためにＶａｓａの細胞表面発現を用いた、雌性生殖周期の発情期中の成体雌マウスの骨髄調製物からの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による生殖細胞精製を表す。
【図１５】細胞を単離するためにＶａｓａの細胞表面発現を用いた、雌性生殖周期の発情期中の成体雌マウスの末梢血調製物からの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による生殖細胞精製を表す。
【図１６】制限カロリー摂取（「ＣＲ」）の結果として、排卵した卵母細胞数の加齢に伴う減少の予防を表す。（Ａ）３月齢（３Ｍ）自由（ＡＬ）飼料（ＡＬ）給餌（ｎ＝６）、１２月齢（１２Ｍ）ＡＬ給餌（ｎ＝１２）、及び１２Ｍ  ＣＲ−ＡＬ給餌（ｎ＝６）マウスの誘発排卵後に得られた卵母細胞の回収率及び形態（平均±ＳＥＭ；＊、３Ｍ  ＡＬ給餌雌マウスに対してＰ＜０．０５）。（Ｂ）雌１匹につき誘発排卵周期毎に胞胚まで発育した体外受精第二分裂中期（ＭＩＩ）卵母細胞の数（ｎ＝１１〜１６匹のグループ；平均±ＳＥＭ；＊、３Ｍ  ＡＬ給餌雌マウスに対してＰ＜０．０５）。（Ｃ）３Ｍ  ＡＬ給餌、１２Ｍ  ＡＬ給餌及び１２Ｍ  ＡＬ−ＣＲ給餌雌マウスにおける卵巣当たりの非閉鎖未成熟卵胞の数（平均±ＳＥＭ、グループ当たりｎ＝９〜１４匹；＊、３Ｍ  ＡＬ給餌雌マウスに対してＰ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０５）。
【図１７】ＩＶＦの後、着床前胚発生に対してＣＲの作用がないことを表す。（Ａ及びＢ）体外受精後に、２細胞胚期（２ＣＥ）まで発育した、３Ｍ  ＡＬ給餌、１２Ｍ  ＡＬ給餌及び１２Ｍ  ＣＲ−ＡＬ給餌雌マウスから収集した卵丘細胞剥離ＭＩＩ卵母細胞のパーセント（Ａ）又は卵丘細胞に囲まれた卵丘細胞（Ｂ）のパーセント、並びに胞胚期（Ｂ）胚まで発育した２ＣＥ又は完全受精卵（ＴＩＯ）［それぞれ、Ｂ（２ＣＥ）及びＢ（ＴＩＯ）］のパーセント。データは、以下の平均±ＳＥＭである：（Ａ）グループ当たり合計６〜９匹を用いた、３つの独立した実験から得たｎ＝５５〜１４０裸化ＭＩＩ卵母細胞；（Ｂ）グループ当たり合計５〜７匹を用いた、３つの独立した実験から得たｎ＝３８〜１４４の卵丘−卵母細胞複合体。
【図１８】卵母細胞と体重の関係を表す。（Ａ及びＢ）３Ｍ  ＡＬ給餌（Ａ）、１２Ｍ  ＡＬ給餌（Ｂ）及び１２Ｍ  ＣＲ−ＡＬ給餌（Ｃ）雌マウスにおける過排卵卵母細胞回収率に対するマウス毎の体重の評価。
【図１９】ＣＲによるＭＩＩ卵母細胞における加齢に伴う異数性の防止を表す。（Ａ）２１染色体を含む高数体ＭＩＩ卵母細胞の例（青色で示すＤＮＡのＤＡＰＩ染色）。（Ｂ）３Ｍ  ＡＬ給餌、１２Ｍ  ＡＬ給餌及び１２Ｍ  ＣＲ−ＡＬ給餌雌マウスのＭＩＩ卵母細胞における高数性、低数性及び未成熟姉妹染色分体分離（並びに全３つのエンドポイントの複合による全染色体欠陥）の発生率（平均±ＳＥＭ、グループ当たり合計２０〜３４匹を用いて、４回反復した各実験において、グループ毎に分析したｎ＝１８〜２３の成熟卵母細胞；＊、３Ｍ  ＡＬ給餌雌マウスに対してＰ＜０．０５；ｎｄ、未検出）。
【図２０】ＣＲによる老齢雌マウスの卵母細胞における紡錘体及び染色体アラインメント欠損の防止を表す。（Ａ及びＢ）３Ｍ  ＡＬ給餌、１２Ｍ  ＡＬ給餌及び１２Ｍ  ＣＲ−ＡＬ給餌雌マウスのＭＩＩ卵母細胞における紡錘体異常の発生率（Ａ）及び中期プレートでの染色体ミスアラインメントの発生率（Ｂ）（平均±ＳＥＭ、グループ当たり合計４〜８匹を用いて、４〜７回反復した各実験において、グループ毎に分析したｎ＝３〜２０の成熟卵母細胞；＊、３Ｍ  ＡＬ給餌雌マウスに対してＰ＜０．０５）。（Ｃ）αチューブリン抗体（緑色）での標識及びＰＩ（赤色）でのＤＮＡの対比染色後に、表示のマウスから得たＭＩＩ卵母細胞（グループ毎に分析したｎ＝２２〜７２の成熟卵母細胞）における減数分裂紡錘体の典型例。
【図２１】ＣＲによる老齢雌マウスの卵母細胞における正常なミトコンドリア動態の維持を表す。（Ａ）３Ｍ  ＡＬ給餌、１２Ｍ  ＡＬ給餌及び１２Ｍ  ＣＲ−ＡＬ給餌雌マウス由来のＭＩＩ卵母細胞における典型的ミトコンドリア動態（赤色で示すＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色）。（Ｂ）３Ｍ  ＡＬ給餌、１２Ｍ  ＡＬ給餌及び１２Ｍ  ＣＲ−ＡＬ給餌雌マウス由来のＭＩＩ卵母細胞における異常ミトコンドリア凝集の発生率（平均±ＳＥＭ、グループ当たり４〜１１匹を用いた、３回の独立した実験から、グループ毎に分析したｎ＝２３〜４６の卵母細胞；＊、３Ｍ  ＡＬ給餌雌マウスに対してＰ＜０．０５）。（Ｃ）３Ｍ  ＡＬ給餌、１２Ｍ  ＡＬ給餌及び１２Ｍ  ＣＲ−ＡＬ給餌雌マウス由来の個々のＭＩＩ卵母細胞における細胞質ＡＴＰレベル（平均±ＳＥＭ、グループ当たり合計５〜２１匹を用いた、５〜７回の独立した実験から、グループ毎に分析したｎ＝３８〜１４５の全卵母細胞；＊、３Ｍ  ＡＬ給餌雌マウスに対してＰ＜０．０５）。
【図２２】ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ共役因子−１α（ＰＧＣ−１α）の喪失に起因する老齢雌性における卵母細胞の回収率及び質の改善を表す。（Ａ）３Ｍ  ＡＬ給餌野生型（ｗｔ）マウス、１２Ｍ  ＡＬ給餌若しくはＣＲ−ＡＬ給餌ｗｔマウス、又は１２Ｍ  ＡＬ給餌若しくはＣＲ−ＡＬ給餌Ｐｇｃ−１αヌルマウスの単離ＭＩＩ卵母細胞におけるＰｇｃ−１α及びＰｇｃ−１βｍＲＮＡレベルのＰＣＲ分析（アクチン、サンプルローディングのための対照遺伝子；サイズ、分子サイズマーカ；Ｏｖ、正の対照として用いる成体卵巣ＲＮＡ；−ＲＴ、負の対照としての逆転写酵素なしの卵巣ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析）。（Ｂ〜Ｅ）過排卵後の卵母細胞回収率（Ｂ）、減数分裂紡錘体形成（Ｃ）、中期プレートでの染色体アラインメント（Ｄ）、及びミトコンドリア分布（Ｅ）に対する、ＡＬ給餌及びＣＲ−ＡＬ給餌雌マウスのＰＧＣ−１α欠失の影響を示す。（Ｄ）及び（Ｅ）についての凡例は、（Ｃ）と同じである。データは、平均±ＳＥＭである（グループ当たり合計３〜１４匹を用いた、３回の独立した実験から、各エンドポイントについてグループ毎に分析したｎ＝２０〜１１７の卵母細胞；＊、他の全グループに対してＰ＜０．０５）。
【図２３】卵母細胞でのＰＧＣ−１の発現を表す。若い成体マウス卵巣におけるＰＧＣ−１の免疫組織化学的検出（青色のヘマトキシリン対比染色に対する茶色の反応産物）。挿入図は、典型的な陽性卵母細胞の各大画像を示す。
【図２４】ＰＧＣ−１α欠失マウスにおいて加齢と共に減少する卵巣予備能を表す。３Ｍ  ＡＬ給餌、１２Ｍ  ＡＬ給餌若しくは１２Ｍ  ＣＲ−ＡＬ給餌野生型（ｗｔ）又はＰＧＣ−１α欠失（ヌル）雌マウスにおける卵巣毎の非閉鎖静止（原始）及び初期成長（一次、前胞状）未成熟卵胞の数。データは、平均±ＳＥＭである（グループ当たりｎ＝４〜１２；＊、いずれかの遺伝子型の３Ｍ  ＡＬ給餌雌マウスに対してＰ＜０．０５）。
【図２５】幼若及び老齢雌マウスの卵巣における同等レベルのＰＧＣ−１を表す。（Ａ）幼若（３Ｍ）ＡＬ給餌、老齢（１２Ｍ）ＡＬ給餌、及び老齢（１２Ｍ）ＣＲ−ＡＬ給餌雌マウス卵巣における内生ＰＧＣ−１タンパク質レベルのウェスタンブロット分析（３匹のマウスから調製したサンプルを各グループについて示す）。パン−アクチン（ＡＣＴＩＮ）をローディングの対照として用いた。（Ｂ）ＰＧＣ−１ウェスタンブロット（Ａ）用のサンプルを得るのに用いた同じ雌の卵巣におけるＰＧＣ−１の免疫組織化学的検出の例（青色のヘマトキシリン対比染色に対する茶色の反応産物）。
【図２６】体重に対する給餌操作の影響を表す。ＣＲ給餌の開始前（３Ｍ）、ＣＲ計画の終了時（１１Ｍ）、及びＡＬ給餌の開始から１ヵ月後（１２Ｍ）の雌マウスの体重を示す。示すデータは、グループ当たり５〜２３匹の分析からの平均±ＳＥＭである（＊、各グループにおいて３Ｍ  ＡＬ給餌雌マウスに対しＰ＜０．０５）。ＪＡＸ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＣ５７ＢＬ／６マウス；ＮＩＡ、ＮＩＡからのＣ５７ＢＬ／６マウス；Ｐｇｃ−１α、Ｂ．Ｍ．Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎから得た突然変異系（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２００４  １１９；１２１−１３５）。
【図２７】ＣＲによる雌性生殖周期の加齢に関連する崩壊の防止を表す。典型的な４〜５日の発情周期又は５日超持続する不規則な発情周期を示した老齢（１２Ｍ）ＡＬ給餌、及びＣＲ−ＡＬ給餌雌マウスの割合。データは、３０日にわたって、毎日の膣内容塗布により並行して分析したグループ当たり１０〜１５匹の分析から得たものである。
【図２８】ミトコンドリアＤＮＡコピー数（核ゲノムに対する）を表す。培地に維持したマウスＯＳＣ（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６）を表示の試験化合物に２４時間曝露した後、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）含量について評価した。
【図２９】ミトコンドリア膜電位を表す。培地に維持したマウスＯＳＣ（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６）を表示の試験化合物に２４時間曝露した後、ミトコンドリア電位（ＭＭＰ）について評価した。
【図３０】ミトコンドリアＤＮＡコピー数（核ゲノムに対する）を表す。培地に維持したマウスＯＳＣ（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６）を表示の試験化合物に２４時間曝露した後、ミトコンドリアＤＮＡコピー数について評価した。
【図３１】ミトコンドリア活性の測度としてのＡＴＰレベルを表す。培地に維持したマウスＯＳＣ（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６）を表示の試験化合物に２４時間曝露した後、ミトコンドリア活性について評価した。
【図３２】色素ＮＡＯによって測定されるミトコンドリア密度のパーセンテージ増加を表す。培地に維持したマウスＯＳＣ（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６）を表示の試験化合物に２４時間曝露した後、ミトコンドリア密度について評価した。
【図３３】ミトコンドリア生合成を駆動することがわかっている遺伝子のｍＲＮＡレベルを表す。培地に維持したマウスＯＳＣ（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６）を表示の試験化合物に２４時間曝露した後、ミトコンドリア生合成を駆動することがわかっている遺伝子の発現レベルについて評価した。
【図３４】ミトコンドリア電子伝達系成分をコードする遺伝子のｍＲＮＡレベルを表す。培地に維持したマウスＯＳＣ（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６）を表示の試験化合物に２４時間曝露した後、ミトコンドリア電子伝達系成分をコードする遺伝子の発現レベルについて評価した。
【図３５】ミトコンドリアエンハンサーで処理したＯＳＣ中のＮＡＤ＋（Ａ）及びＮＡＤ＋（Ｂ）のレベルを表す。培地に維持したマウスＯＳＣ（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６）を表示の試験化合物に２４時間曝露した後、ＮＡＤ＋及びＮＡＤＨレベルについて評価した。
【図３６】ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒＭ７５１４による染色及び細胞溶解後のミトコンドリアを表す。ヒトＯＳＣをＭ７５１４と一緒にインキュベートした後、溶解することにより、浸透圧衝撃を用いて、染色したミトコンドリアを放出させた。集団全体（溶解細胞及び残る非溶解染色細胞からのミトコンドリア）をＦＡＣＳによって分析した。左のパネルは、溶解細胞からのミトコンドリアを示すが、これらは、大きさに基づいて、残りの非溶解細胞に含まれるミトコンドリアから容易に識別することができる（前方散乱、ＦＳＣ−Ａ）。蛍光強度（ＦＩＴＣ−Ａ）によって、溶解細胞由来のミトコンドリアの２つの異なる集団が明らかにされ、１つは高い強度（Ｍｉｔｏ  Ｍｔ高）を、もう１つは低い強度（Ｍｉｔｏ  Ｍｔ低）を有していた。機能性ミトコンドリアは、より高い取込み及び色素の保持を有することがわかっており、従って、より高い強度で蛍光を放出する（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｓｔａｆｆ）。
【図３７】哺乳動物細胞におけるＮＡＤ＋の合成及び分解の経路を示す概略図である（Ｈａｓｓａ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００６  ｖｏｌ．７０  ｎｏ．３  ７８９−８２９）。
【図３８】ＮＡＤ＋の可溶性前駆物質例の構造を示す。これらの物質を用いて、ＮＡＤ＋レベルを高め、損傷及び／若しくは老化細胞における細胞エネルギーを増加することができる。
【図３９】図３９Ａ〜３９Ｃは、ニコチンアミドモノヌクレオチドが、マウス卵原幹細胞（ＯＳＣ）中の細胞ＮＡＤ＋及びＮＡＤ＋／ＮＡＤＨを増加することを示すグラフである。ＦＡＣＳによる選別プロトコルを用いて、摘出した卵巣から卵原幹細胞を単離して、混入卵母細胞のないＯＳＣを精製した（実施例１を参照）。細胞を以下から構成される培地中に維持した：最少必須培地α（ＭＥＭα）、１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍｌ−１ＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１ＸＮ−２ＭＡＸ  Ｍｅｄｉａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒ＆Ｄ）、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（上皮増殖因子、ヒト組換え；Ｇｉｂｃｏ）、４０ｎｇ／ｍｌのヒトＧＤＮＦ（グリア細胞系由来神経栄養因子；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、１ｎｇ／ｍｌのヒトｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子；Ｇｉｂｃｏ）。
【図４０】ニコチンアミドモノヌクレオチドが、マウスＯＳＣ中のミトコンドリアＤＮＡ含量を増加することを示すグラフである。ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従い、表示した時点で細胞から全細胞ＤＮＡを単離した。Ｒｏｃｈｅ  ４８０ＰＣＲ装置を用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により、ミトコンドリアＤＮＡコピー数を定量した。
【図４１】ニコチンアミドモノヌクレオチドが、培養したマウス卵原幹細胞中の自発的卵母細胞形成を増加することを示すグラフである。自発的卵母細胞形成のアッセイのために、２４ウェルプレートの各ウェルに２５，０００個のＯＳＣを接種し、接種から２日目と、ＮＭＮ処理後の指定時点で、形成されて培地中に放出された卵母細胞の数をウェル毎に評価した。
【図４２】ＮＡＤ＋前駆物質ＮＭＮが、幼若及び老齢マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでＮＡＤ＋レベルを高めることを示すグラフである。心臓［ＮＡＤ＋］は、加齢と共に低下するが、これはＮＭＮ処理によって逆転する（ｎ＝３；１週間にわたり、２００ｍｇ．ｋｇ．ｄ．Ｉ．Ｐ．）。
【図４３】図４３Ａ〜Ｄは、ｉｎ  ｖｉｖｏでミトコンドリア機能に対するＮＡＤ＋前駆物質（ＮＭＮ）の回復作用を示すグラフである。２４月齢マウスの骨格筋におけるミトコンドリア機能の低下は、治療からわずか１週間後に、ＮＭＮ（ニコチンアミドモノヌクレオチド）によって完全に逆転した（図４３Ａ、Ｂ）。ＮＭＮを腹腔内（ＩＰ）注射によって送達すると、脳、心臓及び骨格筋中のＮＡＤ＋レベルが約３０〜１００％上昇した。ＮＭＮは、ＳＩＲＴ１依存的にＣ２Ｃ１２細胞中のミトコンドリア機能を高める（図４３Ｃ、Ｄ）。ｓｈ  Ｃｔ１＝スクランブルｓｈＲＮＡ、ＳｈＳＩＲＴ１＝ＳＩＲＴ１に対するｓｈＲＮＡ。
【図４４】老齢雌マウス由来の卵母細胞に対するアピゲニン、ルテオニン及びＳＲＴ−１７２０の作用を示す棒グラフである。
【図４５】老齢雌マウスと比較して、過排卵後に回収した成熟第二分裂中期卵母細胞のパーセンテージに対するアピゲニン、ルテオニン及びＳＲＴ−１７２０の作用を示す棒グラフである。
【図４６】アピゲニン、ルテオニン及びＳＲＴ−１７２０が、老齢雌マウスと比較して、老齢マウスの卵母細胞の質を改善することを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
定義
別途定義されていない限り、本明細書で用いる技術及び科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。不一致が生じる場合には、定義を含む本願が優先されるものとする。
【００４４】
「投与」又は「投与する（こと）」という用語は、化合物の意図する機能を実施させるように、化合物を被検者に導入する経路を包含する。用いることができる投与の経路例として、注射（皮下、静脈内、非経口、腹腔内、胞膜内）、眼、及び経皮がある。言うまでもなく、医薬製剤は、各投与経路に適した形態で提供される。例えば、これらの製剤は、錠剤若しくはカプセル形態、注射、又は吸入により投与される。経口投与が好ましい。注射は、ボーラスであっても、連続的注入であってもよい。投与経路に応じて、選択した材料で化合物をコーティング又は処理することにより、その意図する機能を実施する能力に有害に作用しうる天然の状態から化合物を保護することができる。
【００４５】
薬剤は、単独で投与してもよいし、あるいは、前述のような別の薬剤（例えば、別の生体エネルギー物質）若しくは薬学的に許容される担体のいずれか、又はその両方と一緒に投与することができる。化合物は、他の薬剤の投与前、それと同時、又は投与後に投与することができる。さらに、化合物は、その活性代謝物、又はｉｎ  ｖｉｖｏでより活性の代謝物に変換されるプロフォームとして投与してもよい。
【００４６】
本明細書において、ヒトに関して用いる場合、「母体年齢が高い」という用語は、３４歳以上の女性を指す。本明細書において、ヒトに関して用いる場合、「卵母細胞に関連する不妊（症）」とは、解剖学的異常（例えば、卵管閉塞）又は病的状態（例えば、子宮筋腫、重篤な子宮内膜症、ＩＩ型糖尿病、多嚢胞性卵巣疾患）に起因するものではなく、避妊なしで１年間の性交後受胎することができないことを指す。
【００４７】
用語「アルキル」は、飽和脂肪族基、例えば、直鎖状アルキル基、分枝状アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、及びシクロアルキル置換アルキル基に関する。用語「アルキル」は、さらに、アルキル基を包含し、これは、炭化水素骨格の１個以上の炭素を置換する酸素、窒素、イオウ若しくはリン原子、例えば、酸素、窒素、イオウ若しくはリン原子をさらに含んでよい。好ましい実施形態では、直鎖又は分枝状アルキルは、その骨格に３０個以下の炭素原子（例えば、直鎖の場合、Ｃ１〜Ｃ３０、分枝鎖の場合、Ｃ３〜Ｃ３０）、好ましくは２６個以下、より好ましくは２０個以下の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、その環構造中に３〜１０個の炭素原子、より好ましくは環構造中に３、４、５、６若しくは７個の炭素原子を有する。
【００４８】
さらに、本明細書及び特許請求の範囲全体を通じて用いる用語「アルキル」は、「非置換アルキル」及び「置換アルキル」の両方を包含するものとし、後者は、炭化水素骨格の１個以上の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルキル部分を指す。このような置換基としては、例えば、以下のものが挙げられる：ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、リン酸塩、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、硫酸塩、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、又は芳香族若しくはヘテロ芳香族部分。当業者には、炭化水素鎖上で置換された部分は、必要に応じて、それ自体で置換することができることは理解されよう。シクロアルキルは、例えば、前述の置換基でさらに置換することができる。「アルキルアリール」部分は、アリール（例えば、フェニルメチル（ベンジル））で置換したアルキルである。用語「アルキル」は、長さが類似する不飽和脂肪族基、及び前述したアルキルに対する可能な置換も含むが、これらは、それぞれ少なくとも１つの二重若しくは三重結合を含んでいる。
【００４９】
炭素数が記載されていない限り、本明細書で用いる「低級アルキル」は、上に定義したアルキル基であるが、その骨格構造に、１〜１０個の炭素、好ましくは１〜６個、最も好ましくは１〜４個の炭素原子を有するアルキル基を意味し、直鎖又は分枝鎖のいずれであってもよい。低級アルキルの例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヘキシル、へプチル、オクチルなどがある。好ましい実施形態では、用語「低級アルキル」は、その骨格構造に、４個以下の炭素原子を有する直鎖、例えば、Ｃ１〜Ｃ４アルキルを含む。
【００５０】
本明細書で用いる用語「アルコキシ」は、酸素原子を介して別の部分に結合するアルキル基又はシクロアルキル基を指す。アルコキシ基は、任意選択で、１つ以上の置換基で置換することができる。
【００５１】
用語「アルコキシアルキル」、「ポリアミノアルキル」及び「チオアルコキシアルキル」は、前述したアルキル基を指し、これらは、炭化水素骨格の１個以上の炭素を置換する酸素、窒素若しくはイオウ原子、例えば、酸素、窒素若しくはイオウ原子をさらに含んでよい。
【００５２】
用語「アルケニル」及び「アルキニル」は、長さが類似する不飽和脂肪族基、及び前述したアルキルに対する可能な置換を指すが、これらは、それぞれ少なくとも１つの二重若しくは三重結合を含んでいる。例えば、本発明は、シアノ及びプロパルギル基を考慮する。
【００５３】
用語「アリール」は、５員及び６員の単環芳香族基などのアリール基のラジカルを指し、これは、０〜４個のヘテロ原子、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ベンゾキサゾール、ベンゾチアゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン及びピリミジンなどを含んでもよい。アリール基はまた、ナフチル、キノリル、インドリルなどの多環融合芳香族基も含む。環構造にヘテロ原子を有するこうしたアリール基は、「アリール複素環」、「ヘテロアリール」又は「複素芳香環」と呼ばれることもある。芳香環は、１つ以上の環位置で、前述したような置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、リン酸塩、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、硫酸塩、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、又は芳香族若しくはヘテロ芳香族部分で置換することができる。アリール基はまた、芳香族ではない脂環若しくは複素環と融合又は架橋することにより、多環（例えば、テトラリン）を形成することもできる。
【００５４】
用語「ハロゲン」又は「ハロ」は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉを意味する。
【００５５】
用語「ハロアルキル」は、ハロゲンで、単一、二重若しくは三重置換された前述のアルキル基、例えば、フルオロメチル及びトリフルオロメチルを包含するものとする。
【００５６】
用語「ヒドロキシル」は、−ＯＨを意味する。
【００５７】
本明細書で用いる用語「ヘテロ原子」は、いずれかの元素の炭素又は水素以外の１原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、イオウ及びリンである。
【００５８】
用語「ヘテロアリール」は、芳香族５〜８員単環式、８〜１２員二環式、又は１１〜１４員三環式系を指し、これは、単環式の場合、１〜４個の環ヘテロ原子を、二環式の場合、１〜６個のヘテロ原子を、三環式の場合、１〜９個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、若しくはＳから選択され、残りの環原子は、炭素である。ヘテロアリール基は、任意選択で、１個以上の置換基で置換してもよい。ヘテロアリール基の例として、限定するものではないが、以下を挙げることができる：ピリジル、フラニル、ベンゾジオキソリル、チエニル、ピロリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリルチアゾリル、イソキサゾリル、キノリニル、ピラゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、トリアゾリル、チアジアゾリル、イソキノリニル、インダゾリル、ベンゾキサゾリル、ベンゾフリル、インドリジニル、イミダゾピリジル、テトラゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチジアゾリル、ベンゾキサジアゾリル、及びインドリル。
【００５９】
本明細書で用いる用語「複素環式」は、環構造内に少なくとも１個以上の原子（例えば、Ｓ、Ｏ、Ｎ）を含有する有機化合物を指す。これらの有機化合物の環構造は、芳香族又は非芳香族のいずれであってもよい。複素環式部分のいくつかの例として、限定するものではないが、ピリジン、ピリミジン、ピロリジン、フラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、及びジオキサンが挙げられる。本明細書で用いる「生体エネルギー物質」は、体外受精方法の実施前並びに／又は卵巣、卵母細胞、ＯＳＣ及び／若しくは着床前胚のｉｎ  ｖｉｖｏでの曝露後の卵母細胞、ＯＳＣ及び／若しくは着床前胚におけるミトコンドリア数、ミトコンドリア活性、細胞エネルギーレベル若しくは細胞エネルギー生産能力（生体エネルギー状態）を増大する物質である。特に、ミトコンドリアの数又は活性を増大することにより、本発明の生体エネルギー物質は、例えば、卵母細胞異数性、中期プレートでの染色体のミスアラインメント、減数分裂紡錘体異常、及び／又はミトコンドリア機能障害（凝集、ＡＴＰ生産障害）の加齢に伴う増加を防止又は軽減することによって、卵母細胞又はＯＳＣ生産及び質を改善する。生体エネルギー物質としては、Ｓｉｒｔ１活性化物質がある。Ｓｉｒｔ１活性化物質の例を表１（以下）に挙げる。
【００６０】
【表１−１】
2019030326.tif 000003
【００６１】
【表１−２】
2019030326.tif 000004
【００６２】
【表１−３】
2019030326.tif 000005
【００６３】
ＣＤ３８阻害剤も生体エネルギー物質である。ＣＤ３８阻害剤の例を表２Ａ及び２Ｂ（以下）に挙げる。
【００６４】
【表２Ａ】
2019030326.tif 000006
【００６５】
別のＣＤ３８阻害剤を表２Ｂに挙げる。
【００６６】
【表２Ｂ】
2019030326.tif 000007
【００６７】
このような使用のために好ましい生体エネルギー物質として、限定するものではないが、ＮＡＤ＋の可溶性前駆物質（例えば、トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、及びニコチン酸）、フィセチン、ケルセチン、ヒドロキシチロソール（４−（２−ヒドロキシエチル）−１，２−ベンゼンジオール）、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＣＤ３８阻害剤、及びＳＲＴ−１７２０、式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物、並びにこれらの機能性誘導体がある。
【００６８】
ＤＯＩ（２，５−ジメトキシ−４−ヨード−フェニルイソプロピルアミン）は、５−ＨＴ２選択性アゴニストとして特性決定されているフェニルアルキルアミンである。
【００６９】
フィセチン（２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３，７−ジヒドロキシクロメン−４−オン）は、例えば、以下の文献に記載されている：Ｈｅｒｚｉｇ，Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ  ｆｕｅｒ  Ｃｈｅｍｉｅ  １８９１  １２：１７７−９０；Ｇａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，．Ｎａｔｕｒｅ  １９６６  ２１２（５０６７）：１２７３；及びＭａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２０１１  ６（６）：ｅ２１２２６（これらの各々は、参照として本明細書に組み込むものとする）。ケルセチンは、例えば、Ｂｅｎｔｚ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｙｏｕｎｇ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ：  Ａｐｐａｌａｃｈｉａｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．［Ｏｎｌｉｎｅ］  Ａｐｒｉｌ  １，２００９に記載されている（この文献は、参照として本明細書に組み込むものとする）。
【００７０】
レスベラトロール（３，５，４’−トリヒドロキシ−トランス−スチルベン）は、例えば、以下の文献に記載されている：Ｔａｋａｏｋａ，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｋａｇａｋｕ  Ｋａｉｓｈｉ  １９３９  ６０：１０９０−１１００；Ｈａｔｈｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９５９  ７２：３６９−３７４；及びＮｏｎｏｍｕｒａｅｔ  ａｌ．，Ｙａｋｕｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ  １９６３  ８３：９８８−９９０（これらの各々は、参照として本明細書に組み込むものとする）。
【００７１】
ピロロキノリンキノン（４，５−ジヒドロ−４，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｆ］キノリン−２，７，９−トリカルボン酸）は、例えば、以下の文献に記載されている：Ｈａｕｇｅ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９６４  ２３９：３６３０−９；Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９６７  １０４：９６０−９；Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９７９  ２８０：８４３−４；Ｗｅｓｔｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９７９  ８７：７１９−２４；Ａｍｅｙａｍａ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９８１  １３０：１７９−８３（これらの各々は、参照として本明細書に組み込むものとする）。
【００７２】
メトホルミン（Ｎ，Ｎ−ジメチルイミドジカルボンイミド酸ジアミド）は、例えば、以下の文献に記載されている：Ｗｅｒｎｅｒ．Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  １９２１  １２１：１７９０−５；Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１９５９  ８１：２２２０−５；仏国特許第２３２２８６０号明細書（１９７５年、仏国）；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（Ｓｉｔｔｉｇ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ）．３ｒｄ  ｅｄ．Ｖｏｌ．３．Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＮＹ：Ｗｉｌｌｉａｍ  Ａｎｄｒｅｗ；２００７（これらの各々は、参照として本明細書に組み込むものとする）。
【００７３】
アピゲニン（５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）は、例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，１１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，７６３（この文献は、参照として本明細書に組み込むものとする）に記載されている。
【００７４】
ルテオリン（２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−４−クロメノン）は、例えば、Ｍａｎｎ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  １９９２（２ｎｄ  ｅｄ．）．Ｏｘｆｏｒｄ  ＵＫ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．ｐｐ．２７９−２８０；及びＬｏｐｅｚ−Ｌａｚａｒｏ  Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００９  ９：３１−５９に記載されている。
【００７５】
トリホスチン８（２−［（４−ヒドロキシフェニル）メチリデン］プロパンジニトリル）は、例えば、Ｍａｒｔｉｎ；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９８  ５６：４８３；Ｗｏｌｂｒｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４  ２６９：２２４７０；Ｓｔａｎｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０  １４５：２１８９、及びＧａｚｉｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８９  ３２：２３４４に記載されている。
【００７６】
ベルベリン（９，１０−ジメトキシ−５，６−ジヒドロ［１，３］ジオキソロ［４，５−ｇ］イソキノ［３，２−ａ］イソキノリン−７−イウム）は、例えば、Ｄｅｗｉｃｋ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ａ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（３ｒｄ  ｅｄ．）．Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ，Ｅｎｇｌａｎｄ：Ｗｉｌｅｙ．２００９  ｐ．３５７−３５８に記載されている。
【００７７】
ＳＲＴ−１７２０（Ｎ−［２−［３−（ピペラジン−１−イルメチル）イミダゾ［２，１−ｂ］［１，３］チアゾール−６−イル］フェニル］キノキサリン−２−カルボキサミド）は、例えば、Ｍｉｌｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００７  ４５０：７１２−６に記載されている。
【００７８】
「卵原幹細胞」（ＯＳＣ）は、雌性生殖系幹細胞としても知られ、生後の供給源から得られるものであり、Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、及び任意選択でＳＳＥＡなどのマーカを発現する。ＯＳＣは、有糸分裂能があり（すなわち、有糸分裂することができる）、且つ、増殖／分化因子９（「ＧＤＦ−９」）などの卵母細胞マーカ、及び透明帯糖タンパク質（例えば、透明帯糖タンパク質３、「ＺＰ３」）、又はシナプトネマ構造タンパク質３（「ＳＹＣＰ３」若しくは「ＳＣＰ３」）などの減数分裂組換えのマーカを発現しない。ＯＳＣは、生後の卵巣から得ることができる。ＯＳＣは当分野では公知であり、代理人整理番号第５１５８８−６２０５４号として２００５年５月１７日に提出され、米国特許出願公開第２００６００１０５０８号明細書として公開された米国特許出願第１１／１３１，１１４号明細書に記載されており、この文献の内容は、参照として本明細書に組み込むものとする。さらに、ＯＳＣは、Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６及びＰａｃｃｈｉａｒｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２０１０  ７９：１５９−１７０にも記載されており、これらの文献の内容は、参照として本明細書に組み込むものとする。好ましくは、本発明のＯＳＣは、ヒトＯＳＣである。
【００７９】
本明細書で用いる場合、「ＯＳＣの子孫」は、本発明のＯＳＣに由来する全ての娘細胞、例えば、始原細胞及び分化細胞などを指し、これらは、卵形成能力（すなわち、卵母細胞を形成する能力）を維持する。好ましくは、本発明のＯＳＣ子孫は、ヒトＯＳＣ子孫である。
【００８０】
ＯＳＣは、また、骨髄、末梢血又は臍帯血からも得ることができる。本発明の骨髄由来ＯＳＣは、身体全体に循環させてもよく、最も好ましくは、骨髄、末梢血及び卵巣に局在化させることができる。骨髄由来のＯＳＣは、Ｏｃｔ４、Ｖａｓａ、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、Ｆｒａｇｉｌｉｓ、及び任意選択でＮｏｂｏｘ、Ｋｉｔ及びＳｃａ−１などのマーカを発現する。骨髄由来ＯＳＣは、有糸分裂能があり（すなわち、有糸分裂することができる）、且つＧＤＦ−９、透明帯糖タンパク質（例えば、ＺＰ３）又はＳＣＰ３を発現しない。骨髄由来ＯＳＣについて、さらに詳しくは、代理人整理番号第５１５８８−６２０６０号として２００５年５月１７日に提出され、米国特許出願公開第２００６００１０５０９号明細書として公開された米国特許出願第１１／１３１，１５３号明細書を参照されたい。尚、この文献の全内容は、骨髄におけるＯＳＣの説明について、参照として本明細書に組み込むものとする。末梢血及び臍帯血由来のＯＳＣについて、さらに詳しくは、代理人整理番号第５１５８８−６２０６５号として２００５年５月１７日に提出され、米国特許出願公開第２００６００１５９６１号明細書として公開された米国特許出願第１１／１３１，１５２号明細書を参照されたい。尚、この文献の全内容は、末梢血におけるＯＳＣの説明について、参照として本明細書に組み込むものとする。
【００８１】
Ｏｃｔ−４は、ＰＯＵドメインクラス５転写因子１若しくはＰｏｕ５ｆ１とも呼ばれ、雌性生殖系幹細胞及びその始原細胞に発現する遺伝子である。Ｏｃｔ−４遺伝子は、哺乳動物生殖細胞系の樹立に関与する転写因子をコードし、初期生殖細胞分化決定に有意な役割を果たす（Ｓｃｈｏｌｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１９９１  ７（１０）：３２３−３２９を参照）。発生中の哺乳動物胚において、Ｏｃｔ−４は、胚盤葉上層の分化中に下方制御され、その結果、生殖細胞系に閉じ込められることになる。生殖細胞系では、Ｏｃｔ−４発現は、胚盤葉上層発現とは別に調節される。Ｏｃｔ−４の発現は、全能性の表現型マーカである（Ｙｅｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９６  １２２：８８１−８８８）。
【００８２】
Ｓｔｅｌｌａは、一般に、発生多分化能関連３若しくはＤｐｐａ３とも呼ばれ、雌性生殖系幹細胞及びそれらの始原細胞に発現する遺伝子である。Ｓｔｅｌｌａは、始原生殖細胞及びその子孫（卵母細胞など）に特異的に発現する新しい遺伝子である（Ｂｏｒｔｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００４  ４（２）：１−５）。Ｓｔｅｌｌａは、ＳＡＰ様ドメイン及びスプライシング因子モチーフ様構造を有するタンパク質をコードする。Ｓｔｅｌｌａ発現が欠損した胚は、着床前発生が損なわれ、稀にしか芽細胞期に到達しない。従って、Ｓｔｅｌｌａは、初期胚発生に関与する母性因子である。
【００８３】
Ｄａｚｌは、雌性生殖系幹細胞及びその始原細胞に発現する遺伝子である。常染色体遺伝子Ｄａｚｌは、共通ＲＮＡ結合ドメインを含む遺伝子のファミリーのメンバーであり、生殖細胞に発現する。マウスにおいてインタクトなＤａｚｌタンパク質の発現の欠失は、生殖細胞が減数分裂前期を完了できないことに関連する。特に、Ｄａｚｌが欠損した雌マウスでは、減数分裂前期を通した生殖細胞の進行と同時期の胎児期の間に生殖細胞の喪失が起こる。Ｄａｚｌが欠損した雄マウスでは、生殖細胞は、減数分裂前期Ｉのレプトテン期を越えて進行することができない。従って、Ｄａｚｌの非存在下では、有糸分裂前期を通した進行が中断する（Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ２００３  １２６：５８９−５９７）。
【００８４】
Ｖａｓａは、ＤＥＡＤボックスポリペプチド４（配列番号１として開示される「ＤＥＡＤ」）又はＤｄｘ４とも呼ばれ、雌性生殖系幹細胞及びその始原細胞に発現する遺伝子である。Ｖａｓａは、ＤＥＡＤファミリー（配列番号１として開示される「ＤＥＡＤ」）ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼをコードする生殖質の成分である（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９４  １２０：１２０１−１２１１；Ｌａｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８  ３３５；６１１−１６７）。Ｖａｓａの分子機能は、生殖細胞樹立（例えば、Ｏｓｋａｒ及びＮａｎｏｓ）、卵形成、（例えば、Ｇｒｕｋｅｎ）、及び翻訳開始（Ｇｒａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９６  １１０：５２１−５２８）に関与する標的ｍＲＮＡに結合することに向けられる。Ｖａｓａは、極細胞形成に必要であり、発生全体を通して専ら生殖細胞系に制限される。従って、Ｖａｓａは、ほとんどの動物種における生殖細胞系の分子マーカである（Ｔｏｓｈｉａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ２００１  ２６：１３１−１３６）。
【００８５】
ステージ特異的胎児抗原は、任意選択で雌の生殖細胞系幹細胞に発現させ、また、本発明の雌の生殖細胞系幹細胞に発現させる。ステージ特異的胎児抗原−１（ＳＳＥＡ−１）は、細胞表面胎児抗原であり、その機能は、細胞接着、遊走及び分化に関連している。胚盤葉下層形成中に、ＳＳＥＡ−１陽性細胞は、胞胚腔及び胚盤葉下層に、また後に生殖三日月環にみいだすことができる。ＳＳＥＡ−１は、初期生殖細胞及び神経細胞発生において機能する（Ｄ’Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９９  ４３（４）：３４９−３５６；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００２  ２０：３２９−３３７）。特定の実施形態では、雌性生殖系幹細胞におけるＳＳＥＡの発現は、細胞が分化するにつれて起こりうる。本発明で有用なＳＳＥＡとして、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−２、ＳＳＥＡ−３、及びＳＳＥＡ−４がある。
【００８６】
本明細書で用いる場合、「オートロガス」という用語は、同じ被検者から得られる生物学的組成物を指す。一実施形態では、生物学的組成物は、ＯＳＣ、ＯＳＣ由来の組成物及び卵母細胞を含む。従って、本発明の方法を実施する上で、移入に用いる雌性生殖細胞の細胞質又はミトコンドリア、並びに前述の組成物を移入するレシピエント卵母細胞は、同じ被検者から得られる。
【００８７】
本明細書で用いる場合、「増加する」という用語は、一般に、この用語が本明細書で定義されているように、また、統計学的有意性（ｐ＜０．０５）を達成する方法によって決定されるように、基準レベルと比較して、少なくとも５％の増加、例えば、少なくとも約１０％の増加、又は少なくとも約２０％の増加、又は少なくとも約３０％の増加、又は少なくとも約４０％の増加、又は少なくとも約５０％の増加、又は少なくとも約６０％の増加、又は少なくとも約７０％の増加、又は少なくとも約８０％の増加、又は少なくとも約９０％の増加、又は１００％以下の増加（すなわち、検出レベルを実質的に超える）、あるいは、５〜１００％の範囲のいずれかの増加を意味する。
【００８８】
本明細書で用いる場合、「単離された」という用語は、その天然の生物学的環境から物理的に分離された、又は取り出された、ＯＳＣ、ＯＳＣ由来のミトコンドリア又は組成物（例えば、細胞質、ミトコンドリア調製物）を指す。単離されたＯＳＣ、ミトコンドリア又は組成物を精製する必要はない。生物学的サンプルとしては、例えば、骨髄、末梢血、臍帯血、卵巣若しくは膵臓、又は骨髄、末梢血、臍帯血、卵巣若しくは膵臓から得られる細胞を挙げることができる。好ましくは、本組成物は、他の細胞型又は細胞小器官に対して、少なくとも５０％、７５％、８５％、９０％、９５％又は１００％の目的の細胞型又は細胞小器官を含む。
【００８９】
本明細書で用いる用語「低い卵巣予備能」は、ヒトに関する場合、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ，１９８９  ５１：６５１−４に記載されているように、「Ｄａｙ３ＦＳＨ試験」で、１５ｍｉｕ／ｍｌを超える循環卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、又は０．６ｎｇ／ｍｌ未満の循環抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）レベル、又は７未満の胞状卵胞数（超音波によって測定される）を示す女性を指す。
【００９０】
本明細書で用いる用語「外性」は、１つの細胞から取り出されて、別の細胞に移入される、移入細胞材料（例えば、ミトコンドリア）を指す。好ましくは、細胞及び移入材料は、オートロガスである。例えば、卵母細胞に移入されたＯＳＣ由来のミトコンドリアは、たとえ両者が同じ被検者に由来する場合でも、外性である。
【００９１】
用語「プロドラッグ」は、生体内で代謝することができる部分を含む化合物を包含する。一般に、プロドラッグは、エステラーゼにより、又は他の作用機構により、生体内で活性薬物に代謝される。プロドラッグの例及びそれらの使用については、当分野では公知である（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照）。プロドラッグは、化合物の最終単離及び精製時にｉｎ  ｓｉｔｕで、又はその遊離酸形態の精製化合物又はヒドロキシルを好適なエステル化剤と個別に反応させることによって調製することができる。ヒドロキシル基は、カルボン酸を用いた処理により、エステルに変換することができる。プロドラッグ部分の例として、以下が挙げられる：置換及び非置換、分枝若しくは非分枝状低級アルキルエステル部分（例えば、プロピオン酸エステル）、低級アルケニルエステル、ジ−低級アルキル−アミノ低級−アルキルエステル（例えば、ジメチルアミノエチルエステル）、アシルアミノ低級アルキルエステル（例えば、アセチルオキシメチルエステル）、アシルオキシ低級アルキルエステル（例えば、ピバロイルオキシメチルエステル）、アリールエステル（フェニルエステル）、アリール−低級アルキルエステル（例えば、ベンジルエステル）、置換（例えば、メチル、ハロ、若しくはメトキシ置換基で）アリール及びアリール−低級アルキルエステル、アミド、低級アルキルアミド、ジ−低級アルキルアミド、及びヒドロキシルアミド。好ましいプロドラッグ部分は、プロピオン酸エステル及びアシルエステルである。また、生体内の他の作用機構によって活性形態に変換されるプロドラッグも含まれる。
【００９２】
サーチュイン、例えば、ＳＩＲＴ１の活性を高める化合物は、「ＳＩＲＴ１活性化物質」と呼ばれる。化合物の例を表１、２Ａ及び２Ｂに挙げるが、これらは、例えば、以下：国際公開第０５／００２６７２号パンフレット、国際公開第０５／００２５５５号パンフレット、米国特許第２００５０１３６５３７号明細書、米国特許出願公開第２００６００２５３３７号明細書、国際公開第２００５／０６５６６７号パンフレット、及び国際公開第２００７／０８４１６２号パンフレットに記載されており、ポリフェノール、例えば、植物ポリフェノールが含まれる。
【００９３】
本明細書で用いる「低下（低減）した」又は「低下（低減）する」又は「減少する」という用語は、一般に、この用語が本明細書において定義されているように、また、統計学的有意性（ｐ＜０．０５）を達成する方法によって決定されるように、基準レベルと比較して、少なくとも５％の減少、例えば、少なくとも約１０％の減少、又は少なくとも約２０％の減少、又は少なくとも約３０％の減少、又は少なくとも約４０％の減少、又は少なくとも約５０％の減少、又は少なくとも約６０％の減少、又は少なくとも約７０％の減少、又は少なくとも約８０％の減少、又は少なくとも約９０％の減少、又は約１００％の減少（すなわち、実質的に存在しないか、若しくは検出レベルに満たない）まで、あるいは、５〜１００％の範囲のいずれかの減少を意味する。
【００９４】
「被検者」は、哺乳類のあらゆるメンバーを含む脊椎動物であり、ヒト、家畜及び酪農動物、動物園、競技用若しくはペット用動物、例えば、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、家畜及び高等霊長類が挙げられる。
【００９５】
本明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法で定義される意味を有し、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味すると考えてよく；同様に、「〜からほぼ構成される」又は「ほぼ構成する」は、米国特許法で定義される意味を有し、この用語には制限がなく、記載されるものより多い存在によって記載されるものの基本的若しくは新規の特徴が変化しない限り、記載されるものより多い存在を許容するが、従来技術の実施形態は除外する。
【００９６】
本明細書で用いる「低下（低減）した」又は「低下（低減）する」又は「減少する」という用語は、一般に、統計学的に有意な量の減少を意味する。しかし、誤解を避けるために、「低下（低減）した」は、この用語が本明細書で定義されるように、基準レベルと比較して、少なくとも５％の減少、例えば、少なくとも約１０％の減少、又は少なくとも約２０％の減少、又は少なくとも約３０％の減少、又は少なくとも約４０％の減少、又は少なくとも約５０％の減少、又は少なくとも約６０％の減少、又は少なくとも約７０％の減少、又は少なくとも約８０％の減少、又は少なくとも約９０％の減少、又は約１００％の減少（すなわち、実質的に存在しないか、若しくは検出レベルに満たない）まで、あるいは、基準レベルと比較して、５〜１００％の範囲のいずれかの減少を意味する。
【００９７】
本明細書で用いる「増加する」という用語は、一般に、統計学的に有意な量の増加を意味する。しかし、誤解を避けるために、「増加する」は、この用語が本明細書で定義されるように、基準レベルと比較して、少なくとも５％の増加、例えば、少なくとも約１０％の増加、又は少なくとも約２０％の増加、又は少なくとも約３０％の増加、又は少なくとも約４０％の増加、又は少なくとも約５０％の増加、又は少なくとも約６０％の増加、又は少なくとも約７０％の増加、又は少なくとも約８０％の増加、又は少なくとも約９０％の増加、又は約１００％の増加（すなわち、検出レベルを実質的に超える）まで、あるいは、基準レベルと比較して、１０〜１００％の範囲のいずれかの増加を意味する。
【００９８】
本明細書で用いる場合、「標準」又は「基準（参照）」という用語は、測定された生物学的パラメータを指し、限定するものではないが、別のサンプルと比較する既知のサンプルにおける、異数性、突然変異、染色体のミスアラインメント、減数分裂紡錘体異常、及び／又はミトコンドリア機能不全（凝集、ＡＴＰ生産の障害）などの欠陥、又は、このような欠陥の低減若しくは排除を含み；あるいは、標準は、単純に、比較のためのベースラインを画定する、測定された生物学的パラメータの量を表す基準数である場合もある。基準数は、個体から採取したサンプル、又は個体の集団若しくはそこから得られた細胞（例えば、卵母細胞、ＯＳＣ）のいずれからも得ることができる。すなわち、「標準」は、試験するサンプルである必要はなく、許容される基準数又は値であってもよい。個体の状態（例えば、年齢、性別、体重、身長、民族的背景など）を考慮に入れた一連の標準を作成することができる。標準レベルは、例えば、異なる個体（例えば、試験しようとする個体以外の）由来の既知サンプルから得ることができる。既知サンプルは、平均化集団に対する標準を得るために、複数の個体（又はそこから得られた細胞）由来のサンプルをプールすることにより取得することもできる。さらに、標準は、一連の標準を用いて、個体のサンプルにおける生物学的パラメータを定量するように、標準を合成することもできる。試験しようとする個体由来のサンプルは、早期の時点（おそらく治療の開始前）で取得することができ、治療の開始後に同じ個体から採取したサンプルと比較される標準若しくは基準として役立つ。こうした例では、標準は、治療の効果の測度を提供することができる。
【００９９】
本明細書に記載する範囲は、その範囲に含まれる値の全てを意味すると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０からなる群からの、あらゆる数、数の組合せ、又は小範囲を含むと理解される。
【０１００】
その他の定義は、本明細書全体を通して本文に記載される。
【０１０１】
本発明の組成物及び方法
本発明で用いる生体エネルギー物質
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、式Ｉの化合物又は式ＩＩの化合物である：
【化１】
2019030326.tif 000008
（式中、
【化２】
2019030326.tif 000009
は、アリール複素環ジラジカルであり；
【化３】
2019030326.tif 000010
は、ヘテロアリールであり；
Ｘは、ハロであり；
Ｒ１は、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｒ２は、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノである）。
【０１０２】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、
【化４】
2019030326.tif 000011
は、アザインドール、ベンゾ（ｂ）チエン、ベンゾイミダゾール、ベンゾフラン、ベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾチアジアゾール、ベンゾトリアゾール、ベンゾオキサジアゾール、フラン、イミダゾール、イミダゾピリジン、インドール、インドリン、インダゾール、イソインドリン、イソキサゾール、イソチアゾール、イソキノリン、オキサジアゾール、オキサゾール、プリン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、ピロール、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、キノリン、キナゾリン、トリアゾール、チオベンゼン、テトラヒドロインドール、テトラゾール、チアジアゾール、チオフェン、チオモルホリン、又はトリアゾールのジラジカルである。
【０１０３】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、
【化５】
2019030326.tif 000012
は、フラン、イミダゾール、イソチアゾール、オキサゾール、ピロール、トリアゾール、チアゾール、テトラゾール、チアジアゾール、チオフェン、又はトリアゾールのジラジカルである。
【０１０４】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、
【化６】
2019030326.tif 000013
は、イミダゾールのジラジカルである。
【０１０５】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、
【化７】
2019030326.tif 000014
は、アザインドリル、ベンゾ（ｂ）チエニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、フラニル、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、インドリル、インドリニル、インダゾリル、イソインドリニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、イソキノリニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジニル、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジニル、キノリニル、キナゾリニル、トリアゾリル、チアゾリル、チオフェニル、テトラヒドロインドリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、チエニル、チオモルホリニル、又はトリアゾリルである。
【０１０６】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、
【化８】
2019030326.tif 000015
は、フラニル、イミダゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピロリル、トリアゾリル、チアゾリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、チエニル、又はトリアゾリルである。
【０１０７】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、
【化９】
2019030326.tif 000016
は、イミダゾリルである。
【０１０８】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、ｘは、ブロモである。
【０１０９】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ１は、ヒドロキシである。
【０１１０】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ２は、アルコキシである。
【０１１１】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ２は、メトキシである。
【０１１２】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、式ＩＩＩの化合物である：
【化１０】
2019030326.tif 000017
（式中、各々の存在について独立に、
【化１１】
2019030326.tif 000018
は、ヘテロアリールであり；
Ｘは、ハロであり；
Ｒ２は、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｙは、−Ｏ−又は−ＮＨ−である）。
【０１１３】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、
【化１２】
2019030326.tif 000019
は、アザインドリル、ベンゾ（ｂ）チエニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、フラニル、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、インドリル、インドリニル、インダゾリル、イソインドリニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、イソキノリニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジニル、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジニル、キノリニル、キナゾリニル、トリアゾリル、チアゾリル、チオフェニル、テトラヒドロインドリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、チエニル、チオモルホリニル、又はトリアゾリルである。
【０１１４】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、
【化１３】
2019030326.tif 000020
は、フラニル、イミダゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピロリル、トリアゾリル、チアゾリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、チエニル、又はトリアゾリルである。
【０１１５】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、
【化１４】
2019030326.tif 000021
は、イミダゾリルである。
【０１１６】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｘは、ブロモである。
【０１１７】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ２は、アルコキシである。
【０１１８】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ２は、メトキシである。
【０１１９】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｙは、−Ｏ−である。
【０１２０】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、式ＩＶの化合物である：
【化１５】
2019030326.tif 000022
（式中、各々の存在について独立に、
Ｒは、−Ｈ、ハロ、アリール、ニトロ、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｒ１は、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｙは、−Ｓ−、−Ｏ−又は−ＮＨ−である）。
【０１２１】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒの１例は、ヒドロキシである。特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、卵母細胞、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒの１例が、ヒドロキシであり、Ｒの残りの例が、−Ｈである。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ１は、ヒドロキシである。
【０１２３】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｙ１は、−Ｏ−である。
【０１２４】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、式Ｖの化合物である：
【化１６】
2019030326.tif 000023
（式中、各々の存在について独立に、
Ｒは、−Ｈ、ハロ、アリール、ニトロ、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｒ１は、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノである）。
【０１２５】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒは、−Ｈである。
【０１２６】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ１は、ヒドロキシである。
【０１２７】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、式ＶＩの化合物である：
【化１７】
2019030326.tif 000024
（式中、各々の存在について独立に、
Ｒは、−Ｈ、ハロ、アリール、ニトロ、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｒ１は、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｒ３は、−Ｈ、シアノ、−ＣＯ２Ｒ４、又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ４）２であり；
Ｒ４は、−Ｈ又はアルキルである）。
【０１２８】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒは、−Ｈである。
【０１２９】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ３の少なくとも１つの例は、シアノである。特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ３の少なくとも２つの例は、シアノである。
【０１３０】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、式ＶＩＩの化合物である：
【化１８】
2019030326.tif 000025
（式中、各々の存在について独立に、
Ｒは、−Ｈ、ハロ、アリール、ニトロ、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｒ１は、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノである）。
【０１３１】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒは、−Ｈである。
【０１３２】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ１は、ヒドロキシである。
【０１３３】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、式ＶＩＩＩの化合物である：
【化１９】
2019030326.tif 000026
（式中、各々の存在について独立に、
Ｒは、−Ｈ、ハロ、アリール、ニトロ、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｘは、ハロであり；
Ｙ１は、−Ｏ−、−Ｓ−、又は−ＮＨ−であり；
Ｙ２は、＝Ｎ−、又は＝ＣＲ−である）。
【０１３４】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒは、−Ｈである。
【０１３５】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｘは、クロロである。
【０１３６】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｙ１は、−ＮＨ−である。
【０１３７】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｙ２は、＝Ｎ−である。
【０１３８】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、式ＩＸの化合物である：
【化２０】
2019030326.tif 000027
（式中、各々の存在について独立に、
【化２１】
2019030326.tif 000028
は、５員の不飽和複素環ジラジカルであり；
【化２２】
2019030326.tif 000029
は、ヘテロアリールであり；
Ｒは、−Ｈ、ハロ、アリール、ニトロ、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｒ１は、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｙ２は、＝Ｎ−、又は＝ＣＲ−である）。
【０１３９】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、
【化２３】
2019030326.tif 000030
は、アザインドリル、ベンゾ（ｂ）チエニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、フラニル、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、インドリル、インドリニル、インダゾリル、イソインドリニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、イソキノリニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジニル、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジニル、キノリニル、キナゾリニル、トリアゾリル、チアゾリル、チオフェニル、テトラヒドロインドリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、チエニル、チオモルホリニル、又はトリアゾリルである。
【０１４０】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒは、−Ｈである。
【０１４１】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ１は、ヒドロキシである。
【０１４２】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｙ２の１例は、＝Ｎ−である。
【０１４３】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、式Ｘの化合物である：
【化２４】
2019030326.tif 000031
（式中、各々の存在について独立に、
【化２５】
2019030326.tif 000032
は、ヘテロアリールであり；
Ｒは、−Ｈ、ハロ、アリール、ニトロ、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｙ１は、−Ｓ−、−Ｏ−又は−ＮＨ−である）。
【０１４４】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、
【化２６】
2019030326.tif 000033
は、アザインドリル、ベンゾ（ｂ）チエニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、フラニル、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、インドリル、インドリニル、インダゾリル、イソインドリニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、イソキノリニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジニル、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジニル、キノリニル、キナゾリニル、トリアゾリル、チアゾリル、チオフェニル、テトラヒドロインドリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、チエニル、チオモルホリニル、又はトリアゾリルである。
【０１４５】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒは、−Ｈである。
【０１４６】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｙ１は、−ＮＨ−である。
【０１４７】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、式ＸＩの化合物である：
【化２７】
2019030326.tif 000034
（式中、各々の存在について独立に、
【化２８】
2019030326.tif 000035
は、アリール複素環ジラジカルであり；
【化２９】
2019030326.tif 000036
は、ヘテロアリールであり；
Ｒは、−Ｈ、ハロ、アリール、ニトロ、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｒ１は、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｙ２は、＝Ｎ−又は＝ＣＲ−である）。
【０１４８】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、
【化３０】
2019030326.tif 000037
は、アザインドリル、ベンゾ（ｂ）チエニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、フラニル、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、インドリル、インドリニル、インダゾリル、イソインドリニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、イソキノリニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジニル、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジニル、キノリニル、キナゾリニル、トリアゾリル、チアゾリル、チオフェニル、テトラヒドロインドリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、チエニル、チオモルホリニル、又はトリアゾリルである。
【０１４９】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒは、−Ｈである。
【０１５０】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ１は、ヒドロキシである。
【０１５１】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｙ２の１例は、＝Ｎ−である。
【０１５２】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、式ＸＩＩの化合物である：
【化３１】
2019030326.tif 000038
（式中、各々の存在について独立に、
Ｒは、−Ｈ、ハロ、アリール、ニトロ、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｙ１は、−Ｓ−、−Ｏ−又は−ＮＨ−である）。
【０１５３】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒの少なくとも１つの例は、−Ｈである。
【０１５４】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｙ１の少なくとも１つの例は、−Ｓ−である。
【０１５５】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、式ＸＩＩＩの化合物である：
【化３２】
2019030326.tif 000039
（式中、各々の存在について独立に、
【化３３】
2019030326.tif 000040
は、アリール又はヘテロアリールであり；
Ｒは、−Ｈ、ハロ、アリール、ニトロ、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｒ１は、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｒ２は、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｒ３は、−Ｈ、シアノ、−ＣＯ２Ｒ４、又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ４）２であり；
Ｘは、ハロであり；
Ｙ３は、１結合、−Ｃ（Ｏ）−ｄ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ｄ、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ｄ、又は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ｄであり；
ｄは、
【化３４】
2019030326.tif 000041
との結合である）。
【０１５６】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒは、−Ｈである。
【０１５７】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ１は、ヒドロキシである。
【０１５８】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ２は、アルコキシである。特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、卵母細胞、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ２は、メトキシである。
【０１５９】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ３の１例は、シアノである。
【０１６０】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ３は、−Ｈである。
【０１６１】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｘは、ブロモである。
【０１６２】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｙ３は、１結合である。特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｙ３は、−Ｃ（Ｏ）−ｄである。特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｙ３は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ｄである。特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｙ３は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ｄである。特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｙ３は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ｄである。
【０１６３】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、式ＸＩＶの化合物である：
【化３５】
2019030326.tif 000042
（式中、各々の存在について独立に、
【化３６】
2019030326.tif 000043
は、５員の複素環ラジカルであり；
Ｒは、−Ｈ、ハロ、アリール、ニトロ、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｒ１は、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｒ２は、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｘは、ハロである）。
【０１６４】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒは、−Ｈである。
【０１６５】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ１は、ヒドロキシである。
【０１６６】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ２は、アルコキシである。特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、卵母細胞、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ２は、メトキシである。
【０１６７】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｘは、ブロモである。
【０１６８】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、式ＸＶの化合物である：
【化３７】
2019030326.tif 000044
（式中、各々の存在について独立に、
【化３８】
2019030326.tif 000045
は、アリール又はヘテロアリールであり；
Ｒは、−Ｈ、ハロ、アリール、ニトロ、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｒ１は、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｒ２は、ヒドロキシ、アルコキシ、又はアミノであり；
Ｒ３は、−Ｈ、シアノ、−ＣＯ２Ｒ４、又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ４）２であり；
Ｘは、ハロであり；
Ｙ３は、１結合、−Ｃ（Ｏ）−ｄ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ｄ、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ｄ、又は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ｄであり；
ｄは、
【化３９】
2019030326.tif 000046
との結合である）。
【０１６９】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒは、−Ｈである。
【０１７０】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ１は、ヒドロキシである。
【０１７１】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、卵母細胞、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ２は、アルコキシである。特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ２は、メトキシである。
【０１７２】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ３は、シアノである。
【０１７３】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｒ３は、−Ｈである。
【０１７４】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｘは、ブロモである。
【０１７５】
特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｙ３は、１結合である。特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、卵母細胞、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｙ３は、−Ｃ（Ｏ）−ｄである。特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｙ３は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ｄである。特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｙ３は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ｄである。特定の実施形態では、本発明は、前述の組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、Ｙ３は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ｄである。
【０１７６】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、以下：
【化４０】
2019030326.tif 000047
である。
【０１７７】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、以下：
【化４１】
2019030326.tif 000048
からなる群から選択される。
【０１７８】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、以下：
【化４２】
2019030326.tif 000049
からなる群から選択される。
【０１７９】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、以下：
【化４３】
2019030326.tif 000050
からなる群から選択される。
【０１８０】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、以下：
【化４４】
2019030326.tif 000051
からなる群から選択される。
【０１８１】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する組成物、組織、細胞（例えば、ＯＳＣ、卵母細胞）、又は方法のいずれか１つに関し、ここで、生体エネルギー物質は、αリノール酸、リノール酸、ステアリン酸、エライジン酸、アラキドン酸、オレイン酸、及びパルミトレイン酸からなる群から選択される。
【０１８２】
別の実施形態では、以下の生体エネルギー物質の１つ以上が、本発明の方法から特に排除される：トリプトファン、キノリン酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸、フィセチン、ケルセチン、ヒドロキシチロソール、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、メトホルミン、アピゲニン、ルテオリン、トリホスチン８、ベルベリン、ＳＲＴ−１７２０、並びに
【化４５】
2019030326.tif 000052
【０１８３】
また、本明細書に記載する生体エネルギー物質の薬学的に許容される塩及びプロドラッグを用いてもよい。
【０１８４】
卵母細胞及びＯＳＣの単離
超音波誘導経膣採卵などの方法を用いて、ヒト被検者から卵母細胞を単離する標準的方法は、当分野では公知である。Ｆａｂｂｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００１  １６：４１１−４１６を参照。
【０１８５】
ＯＳＣの単離の前に、小さな（例えば、３×３×１ｍｍ）卵巣生検を採取するための、当分野では公知の小規模な腹腔鏡手術を用いて、成体卵巣皮質組織を得ることができ、その後、これをＯＳＣ単離のために処理する。Ｇｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００４  ２０：７２−７８を参照。成体卵巣皮質組織からのヒトＯＳＣの単離は、実施例１、図１に記載されているように、又は既に記載されているように、実施することができる。例えば、２００５年５月１７日に米国特許出願第１１／１３１，１１４号として提出された、米国特許出願公開第２００６００１０５０８号明細書の段落０１１６、及びＺｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６を参照されたい。ＯＳＣはまた、骨髄又は末梢血などの非卵巣供給源から得ることもできる。骨髄又は末梢血由来のＯＳＣは、例えば、骨髄又は血液から幹細胞を分離するための当分野では公知の標準的手段（例えば、細胞選別）によって単離することができる。任意選択で、単離プロトコルは、造血細胞を除去したｋｉｔ＋／ｌｉｎ−画分の作製を含む。遺伝子発現（例えば、Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ、Ｆｒａｇｉｌｉｓ）の固有のプロフィールに基づく別の選択手段を用いて、細胞の集団のさらなる精製を、これらを取得した生体サンプル（例えば、骨髄、末梢血、臍帯血）を実質的に含有しない程度まで、実施することができる。例えば、実施例１、図１に記載する方法は、非卵巣供給源から、精製ＯＳＣを取得するために、血液細胞及び骨髄細胞の単核画分に適用されている。手短には、ウサギ抗ＶＡＳＡ抗体（ＣＯＯＨ−抗体５７７−７１６）と一緒に細胞を２０分間インキュベートして（ａｂ１３８４０；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、洗浄し、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）に結合させたヤギ抗−ウサギＩｇＧと一緒に２０分間インキュベートした後、再度洗浄した。負の（非染色で、一次抗体なし）対照に対してゲーティングした、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩサイトメーター（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、溶出液中の標識細胞を単離した。ヨウ化プロピジウムを細胞懸濁液に添加した直後に、死滅細胞を排除するための選別を行った。非卵巣供給源からＯＳＣを単離するために、Ｖａｓａの細胞表面発現を用いて得られた結果を図１４及び１５に示すが、これらの図面には、雌性生殖周期の発情期中の成体雌マウスに由来する骨髄及び末梢血調製物のＦＡＣＳによる生殖細胞精製を示す。単離方法に用いられる他の抗体としては、米国特許第７，８８４，１９３号明細書、第７，２２６，９９４号明細書及び第６，８７５，８５４号明細書に記載のものが挙げられるが、これら文献の内容は、参照として本明細書に組み込むものとする。
【０１８６】
卵母細胞及びＯＳＣ由来の組成物の調製及び移入方法
精製ミトコンドリアの調製及び移入方法は、当分野では公知であり、既述されているように、実施することができる。例えば、Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  ２００７  １４：５２４−５３３及びＰｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０３：５００−１（これらの各内容は、参照として本明細書に明確に組み込む）を参照されたい。手短には、前述のように、ＯＳＣ及び／又は卵母細胞を単離した後、培養することができる。任意選択で、ＯＳＣ及び／又は卵母細胞を単離した後、ミトコンドリア抽出又は調製の前に、１種以上の生体エネルギー物質の存在下で培養することができる。ＯＳＣ、ＯＳＣ子孫及び／又は卵母細胞からミトコンドリアを取得するためには、２ｍｌのミトコンドリア溶解バッファー（０．３Ｍショ糖、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＭＯＰＳ、５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ＢＳＡ）を各プレートに添加し、必要に応じ、セルスクレーパーを用いて、細胞を回収する。細胞懸濁液を小ガラス製組織バウンサーに移して、滑らかになるまで均質化（約１０往復行程）した後、溶解物を４℃にて３０分間６００ｇで遠心分離する。上澄みを回収し、４℃にて１２分間１０，０００ｇでスピンした後、得られた粗ミトコンドリアペレットを０．２ｍｌの０．２５Ｍショ糖中に再懸濁させる。次に、このサンプルを０．２５Ｍショ糖で希釈した２５〜６０％パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）密度勾配で積層する。界面バンドを勾配から抽出して、２容量の０．２５Ｍショ糖で洗浄した後、４℃にて１０分間１４，０００ｇでの最終遠心分離にかけることにより、ミトコンドリアペレットを得る。
【０１８７】
ミトコンドリアペレットはまた、Ｆｒｅｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２００７  ２：２８７−２９５（この内容は、参照として本明細書に組み込む）に記載されているように、調製することもできる。本発明の特定の実施形態では、ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）に非依存的様式で、ミトコンドリアに特異的に結合する蛍光プローブを含むＦＡＣＳによる方法を用いて、組織、細胞、溶解細胞、又はその画分中の全ＯＳＣ由来ミトコンドリア集団を単離、特性決定及び／又は列挙することができる。ＭＭＰ非依存的様式で、ミトコンドリアに特異的に結合する蛍光プローブとしては、限定するものではないが、蓄積依存性プローブ（例えば、ＪＣ−１（赤色スペクトル；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔ３１６８）、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ  ＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍ２２４２６）及びＪＣ−１（緑色スペクトル；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔ３１６８）が挙げられる。機能性（例えば、呼吸）ミトコンドリアは、限定するものではないが、非酸化依存性プローブ（例えば、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍ７５１４）など、ミトコンドリア塊を示すミトコンドリア追跡用プローブを用いて、大きさ及び蛍光強度に基づいて、選別及び収集することができ、好ましくは、残留する非溶解細胞及び非機能性ミトコンドリアは排除する。非酸化依存性プローブを用いて、ＦＡＣＳを実施するプロトコル例の詳細については、以下の実施例１０に記載する。任意選択で、ＦＡＣＳによる方法は、ＭＭＰ依存的様式でミトコンドリアに特異的に結合するミトコンドリア膜蛍光プローブを用いて、機能性（例えば、呼吸）ミトコンドリアの純粋な集団を選択的に得るために使用することもできる。ＭＭＰ依存的様式でミトコンドリアに特異的に結合する蛍光プローブとしては、限定するものではないが、低酸化状態ミトトラッカー（ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）プローブ（例えば、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭ−Ｈ２ＸＲｏｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍ７５１３）及びＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ＣＭ−Ｈ２ＴＭＲｏｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍ７５１１）がある。さらに、ＭＭＰ依存性及びＭＭＰ非依存性プローブを用いた二重標識を実施して、組織、細胞、溶解細胞又はこれらに由来する画分中の全ミトコンドリアに対する機能性ミトコンドリアの比率を定量することができる。ＭＭＰに基づく示差スクリーニングのためのプローブを用いる場合、スペクトルの色が、機能性ミトコンドリアを示す主要な決定因子であり、残留する非溶解細胞に依然として含まれるものから、溶解細胞から放出される蛍光ミトコンドリアを識別するのに、前方散乱を用いることができる。
【０１８８】
ミトコンドリアペレットはまた、Ｔａｙｌｏｒらにより、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３  Ｍａｒ；２１（３）：２３９−４０；Ｈａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．  ２００１  Ｍａｒ；２２（５）：９５０−９；及びＨａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１  Ｍａｙ１１；２７６（１９）：１６２９６−３０１に記載されているように、調製することができる。本発明の特定の実施形態では、実施例１１に記載するような示差遠心分離方法を用いて、又は本明細書の実施例１２に記載するようなショ糖密度勾配分離方法を用いて、組織、細胞、溶解細胞又はこれらの画分中の全ＯＳＣ由来ミトコンドリア集団を単離、特性決定及び／又は列挙することができる。
【０１８９】
単離後、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）統合性（例えば、突然変異及び欠失）の評価を当分野では公知の方法に従って実施することができる（Ｄｕｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ２０１１  ９６（２）：３８４−３８８；Ａｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１０  ３３：１−４；Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ２００５  １１（１２）：８４３−８４６；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０１１  １２：８）。機能性パラメータ（例えば、ＭＭＰ依存性／活性若しくはＭＭＰ非依存性／活性及び非活性）に従って選別したミトコンドリア又はあまり好ましくないＯＳＣ供給源（大きさが限定されたサンプルなど）からのミトコンドリアの集団を本発明の方法に従って取得することができる。
【０１９０】
任意選択で、細胞からのミトコンドリア抽出、細胞抽出物からのミトコンドリア単離又はミトコンドリア注射の前に、ミトコンドリア調製物に、１種以上の生体エネルギー物質を添加することができる。マイクロインジェクション用針及びホールディングピペットは、Ｓｕｔｔｅｒ  ｐｕｌｌｅｒ（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＤｅ  Ｆｏｎｂｒｕｎｅ  Ｍｉｃｒｏｆｏｒｇｅ（ＥＢ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅａｓｔ  Ｇｒａｎｂｙ，ＣＴ，ＵＳＡ）を用いて、達成することができる。マイクロインジェクション用針は、内径が５μｍで、先端が丸い。注射しようとする物質は、吸引圧によって針に吸引される。約１×１０３〜約５×１０４個のＯＳＣ又はその子孫由来のミトコンドリアを注射することができる（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８〜９×１０３；約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９〜約５×１０４個のミトコンドリア）。ピエゾ（Ｐｉｅｚｏ）マイクロマニピュレータを用いて、ショ糖中の材料（例えば、ミトコンドリア懸濁液）（例えば、約１×１０３〜約５×１０４個のＯＳＣ又はその子孫由来のミトコンドリアを含む５〜７ｐｌ）を卵母細胞に注射することができる。マイクロインジェクション施術に耐えて生存する卵母細胞を、培養のために移し、次に、任意選択で、評価若しくは低温保存した後、体外受精若しくは子宮内人工授精に付す。任意選択で、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）と呼ばれる方法で、体外受精中に、ミトコンドリア懸濁液を単一の精子と一緒に同時注射することができる。任意選択で、低温保存、体外受精又は子宮内人工授精の前に、１種以上の生体エネルギー物質の存在下で卵母細胞を培養することができる。卵母細胞の低温保存の方法は、当分野では公知である。詳細については、例えば、Ｐｏｒｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２０００  １６９：３３−３７；Ｍａｎｄｅｌｂａｕｍ，Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２０００  １５：４３−４７；及びＦａｂｂｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２０００  １６９：３９−４２（これらの内容は、参照として本明細書に組み込む）を参照されたい。
【０１９１】
無核細胞質画分の調製及び移入方法は、当分野では公知であり、既述されているように実施することができる。例えば、Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９９８  ４：２６９−２８０（これらの内容は、参照として本明細書に組み込む）を参照されたい。手短には、採卵から約４時間後に、レシピエント卵を０．１％ヒアルロニダーゼに曝露し、注射用の成熟卵を選択する。放線冠細胞を微細ピペットで全て除去する。卵細胞質の移入は、ＯＳＣ卵細胞質とインタクトなＭＩＩ卵母細胞の電気細胞融合によって実施することができる。０．１％ヒアルロニダーゼに曝露後、マイクロスピア（ｍｉｃｒｏｓｐｅａｒ）を用いて、帯層を機械的に切開する。ＯＳＣ及び／又は卵母細胞を、サイトカロシンＢ（ＣＣＢ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）含有のｈＨＴＦ培地に３７℃で１０分間曝露する。ヒトＭＩＩ卵母細胞の分割には、その感受性に応じた様々なサイトカラシンＢ濃度（約２．５ｍｇ／ｍｌ）を必要とする。原形質膜に囲まれた卵細胞質の一部を取り出すことによって、様々な大きさの卵細胞質体をＯＳＣ及び／又は卵母細胞から分離する。任意選択で、卵細胞質体を生体エネルギー物質と混合してもよい。極体を除去したレシピエント卵の囲卵腔中に上記の卵細胞質体を挿入した後、マンニトール溶液中でのアラインメント及び電気細胞融合を実施する。これは、直径が約３０〜４０μｍの大孔径研磨マイクロツールを用いて実施することができる。卵細胞質体をマイクロツールに吸引し、囲卵腔の深部にツールを導入した後、放出する。電気細胞融合工程に耐えて生存する卵母細胞を培養のために移し、次に任意選択で、評価若しくは低温保存した後、体外受精又は子宮内人工授精に付す。任意選択で、１種以上の生体エネルギー物質の存在下で、卵母細胞を培養した後、低温保存、体外受精若しくは子宮内人工授精に付してもよい。
【０１９２】
あるいは、無核細胞質画分又は単離ミトコンドリアの移入に関して、生体エネルギー物質と一緒に、又はこの物質なしで、従来の卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）法を用いることもできる。例えば、Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９９８  ４：２６９−２８０（これらの内容は、参照として本明細書に組み込む）を参照されたい。一例として、マイクロスピアを用いて、レシピエント卵の帯層を極体に沿って機械的に切開する。閉じたマイクロスピアを用いて帯層を解剖することができるように、卵母細胞をホールディングピペット上に移した後、極体を除去する。同じ位置を用いて、極体が入っていた領域の約９０°左側に卵細胞質体を挿入する。同じツールを用いて、帯層を閉じる。電気融合した細胞を洗浄し、ＨＴＦ中に４０〜９０分間インキュベートした後、ＩＣＳＩを実施する。ＩＣＳＩのために１０％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）中に精子を固定化する。この手順は、ＨＴＦ中で実施するが、その間、アパーチャの短辺は約３時に位置する。標準的ＩＣＳＩの間に、帯層の孔形成時に卵細胞質が押し出されるのを回避するために、ＩＣＳＩツールを人工の隙間から動かす。受精卵は、子宮移入の前に、１種以上の生体エネルギー物質の存在下で培養することができる。
【０１９３】
体外受精の基準方法は、当分野では公知である。カップル（夫婦）は、一般に、まず、その具体的不妊の問題を診断するために、評価される。これらは、両パートナーの不明な不妊症から、女性（例えば、生理不順又は多嚢胞性卵巣疾患を伴う非開存性卵管を引き起こす子宮内膜症）又は男性（例えば、形態異常を伴う低精子数、又は通常、脊髄病変を伴う射精不能、逆行性射精、又は精管切断術の逆転）の深刻な問題まで、多岐にわたりうる。これらの評価の結果によっても、各カップルについて実施すべき具体的方法を決定する。
【０１９４】
施術は、多くの場合、視床下部／下垂体系を下方制御する薬剤（ゴナドトロピン放出ホルモン又はＧｎＲＨアゴニスト）の投与で開始する。この方法は、ゴナドトロピンの血清濃度を低下させ、発生する卵胞が退化するため、発生の初期に一群の新しい卵胞がもたらされる。これにより、視床下部下垂体軸による影響の非存在下で、外性ゴナドトロピンの投与によるこれら新しい卵胞の成熟をより正確に制御することが可能になる。超音波を用いた毎日の観察及び血清エストラジオールの決定により、成熟の進行及び増殖する卵胞（通常、卵巣当たり４〜１０個を刺激する）の数をモニターする。卵胞が排卵前期の大きさ（１８〜２１ｍｍ）に達し、エストラジオール濃度が線形に増加し続ける場合、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の外性投与により、排卵応答を開始させる。
【０１９５】
移植処置の前に、個々の卵母細胞を形態学的に評価した後、培地及び熱不活性化血清を含むペトリ皿に移すことができ、任意選択で、１種以上の生体エネルギー物質の存在下で、卵母細胞を培養することができる。精液サンプルが男性パートナーから提供されると、これを「スイムアップ」法を用いて処理し、これによって、最も活性の運動精子を授精のために取得する。女性の卵管が存在すれば、この時点で、ＧＩＦＴ（配偶子卵管内移植）と呼ばれる方法を実施することができる。この手法によって、精子が取り囲む卵母細胞−卵丘複合体を、生体エネルギー物質と一緒に、又はこれなしで、腹腔鏡検査法によって卵管に直接導入する。この方法は、通常の一連のイベントを最もよく刺激し、卵管内で受精が起こるようにすることができる。当然のことながら、ＧＩＦＴは、１９９０年に採卵を受けた３，７５０人の患者のうち、２２％が出産するという最も高い成功率を有する。別の方法であるＺＩＦＴ（受精卵卵管内移植）では、採卵の翌日に、生体エネルギー物質と一緒に、又はこれなしで、卵管に移植しようとする体外受精卵由来の着床前胚の選択が可能である。余剰の受精卵及び／又は着床前胚は、将来の移入のために、又は雌性配偶子のないカップルへの供与のために、この時点で低温保存することができる。しかし、さらに重症の不妊障害を有するほとんどの患者は、子宮への移入のために、初期卵割状態の着床前胚を選択することができるように、さらに１〜２日の培地中でのインキュベーションを必要とする。このＩＶＦ−ＵＴ（体外受精子宮移植）法は、複数、すなわち２〜６個の細胞（第２日）又は８〜１６（第３日）個の着床前胚の子宮底への頸管経由移植を必要とする（４〜５個の着床前胚が、最適な成功をもたらす）。
【０１９６】
体外受精の方法は、以下：米国特許第６，６１０，５４３号明細書、同第６，５８５，９８２号明細書、同第６，５４４，１６６号明細書、同第６，３５２，９９７号明細書、同第６，２８１，０１３号明細書、同第６，１９６，９６５号明細書、同第６，１３０，０８６号明細書、同第６，１１０，７４１号明細書、同第６，０４０，３４０号明細書、同第６，０１１，０１５号明細書、同第６，０１０，４４８号明細書、同第５，９６１，４４４号明細書、同第５，８８２，９２８号明細書、同第５，８２７，１７４号明細書、同第５，７６０，０２４号明細書、同第５，７４４，３６６号明細書、同第５，６３５，３６６号明細書、同第５，６９１，１９４号明細書、同第５，６２７，０６６号明細書、同第５，５６３，０５９号明細書、同第５，５４１，０８１号明細書、同第５，５３８，９４８号明細書、同第５，５３２，１５５号明細書、同第５，５１２，４７６号明細書、同第５，３６０，３８９号明細書、同第５，２９６，３７５号明細書、同第５，１６０，３１２号明細書、同第５，１４７，３１５号明細書、同第５，０８４，００４号明細書、同第４，９０２，２８６号明細書、同第４，８６５，５８９号明細書、同第４，８４６，７８５号明細書、同第４，８４５，０７７号明細書、同第４，８３２，６８１号明細書、同第４，７９０，８１４号明細書、同第４，７２５，５７９号明細書、同第４，７０１，１６１号明細書、同第４，６５４，０２５号明細書、同第４，６４２，０９４号明細書、同第４，５８９，４０２号明細書、同第４，３３９，４３４号明細書、同第４，３２６，５０５号明細書、同第４，１９３，３９２号明細書、同第４，０６２，９４２号明細書、及び同第３，８５４，４７０号明細書（これらの内容は、上記の方法の説明のために、参照として本明細書に明示的に組み込む）にも記載されている。
【０１９７】
あるいは、患者は、外性の、オートロガスＯＳＣミトコンドリアを任意選択で含む卵母細胞を、子宮内人工授精（ＩＵＩ）を用いて、再移植及び体外受精させるように選択することもできる。ＩＵＩは、高度に濃縮された量の活性運動精子を調製し、これを頸管から子宮に直接送達することを含む、公知の方法である。ＩＵＩのための精子を調製するのに利用可能な複数の方法がある。第１に、精子を精液から分離する。精子分離の一方法は、「密度勾配分離」として公知である。この方法では、粘性溶液を用いて、運動精子を死滅精子及び他の細胞から分離する。調製後、薄く、柔軟なカテーテルを用いて、精子濃縮物を頸管から子宮に導入すると、再移植した卵母細胞の受精が起こる。
【０１９８】
培地
本発明の方法（例えば、ＩＶＦ、低温保存、配偶子調製、細胞及び／若しくは胚の洗浄又は培養）を実施するために、有効量の生体エネルギー物質若しくはその機能性誘導体を用いて、又はこれを添加して、生理学的に適合性の溶液を調製することができる。例えば、細胞用培地、胚用培地及び低温保存液は、当分野では公知であり、生理溶液の調製のための当分野では公知の標準的方法を用い、必要に応じて、配合又は添加することができる。体外受精用の配偶子の調製及び処理のために市販されている培地として、Ｇ−ＩＶＦ（商標）ＰＬＵＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｌｉｆｅから市販されている）があり、これは、ヒト血清アルブミンと、抗菌薬としてのゲンタマイシンを含有する重炭酸塩緩衝培地である。卵母細胞用のＳＡＧＥ  Ｍｅｄｉａ（商標）成熟培地は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッド、ゲンタマイシン、非必須及び必須アミノ酸、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、塩化カルシウム、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化クロリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキシン、ＨＣＬ、リボフラビン、及びチアミンを含有し、最終濃度７５ｍｌＵ／ｍｌのＦＳＨ及び７５ｍｌＵ／ｍｌのＬＨを添加した最終濃度７５ｍｌＵ／ｍｌのＦＳＨ及び７５ｍｌＵ／ｍｌのＬＨを補充している。ヒト胞胚の凍結及び閉じ込めのための培地製品としては、ＳＡＧＥＩｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．から市販されているＳＡＧＥ  Ｍｅｄｉａ（商標）平衡溶液及びガラス化液がある。また、卵胞成熟培地も当分野では公知であり、例えば、Ｔｅｌｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００８  ２３：１１５１−１１５８（その内容は、参照として本明細書に明示的に組み込む）に記載されている。ＳＡＧＥ  Ｍｅｄｉａ（商標）平衡溶液は、非必須及び必須アミノ酸、硫酸ゲンタマイシン（０．０１ｇ／Ｌ）、各々７．５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ及びエチレングリコール、並びに１２ｍｇ／ｍＬのヒトアルブミンを含有するモディファイドＨＴＦのＭＯＰＳ緩衝液である。ガラス化液は、非必須及び必須アミノ酸、硫酸ゲンタマイシン（０．０１ｇ／Ｌ）、各々１５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ及びエチレンを含有するモディファイドヒト卵管液（ＨＴＦ）のＭＯＰＳ緩衝液である。ＳＡＧＥ胞胚用培地は、発生３日目のコンパクション期から、胞胚期までのヒト胚の培養を含む体外受精に用いるために調製されるものであり、以下から構成される：塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、乳酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、タウリン、グルタチオン、アラニル−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化クロリン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ゲンタマイシン、及びフェノールレッ��。ＳＡＧＥ卵割用培地は、卵割期ヒト胚の培養を含む体外受精方法で用いるために調製されるもので、以下から構成される：塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、乳酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、アラニル−グルタミン、タウリン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、クエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ゲンタマイシン及びフェノールレッド。ＳＡＧＥ受精用培地は、ヒト卵母細胞の受精を含む体外受精方法で用いるために調製されるもので、以下から構成される：塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、乳酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、アラニル−グルタミン、タウリン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、クエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ゲンタマイシン及びフェノールレッド。ＬｉｆｅＧｌｏｂａｌから数種の製品が市販されており、以下のものが含まれる：胚の洗浄及び処理用溶液（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、重炭酸ナトリウム、グルコース、乳酸ナトリウム塩、ピルビン酸ナトリウム、アミノ酸、ｅｄｔａ、ゲンタマイシン、フェノールレッド、及びＨＥＰＥＳから構成される）；１日目から胞胚期までの胚の培養（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、重炭酸ナトリウム、グルコース、乳酸ナトリウム塩、ピルビン酸ナトリウム、アミノ酸、ｅｄｔａ、ゲンタマイシン及びフェノールレッドから構成される）；生検処置中の胚の維持（塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、重炭酸ナトリウム、グルコース、乳酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、アミノ酸、ｅｄｔａ、フェノールレッド、硫酸ゲンタマイシン、ＨＥＰＥＳ、ショ糖及びヒト血清アルブミンから構成される）；胚の凍結（塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム、及びヒト血清アルブミンから構成される）；並びに胚の解凍（塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム、ヒト血清アルブミン、及び任意選択で１，２−プロパンジオール及びショ糖から構成される）。Ｅａｒｌｙ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｍｅｄｉａ（商標）（ＥＣＭ（登録商標））は、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されており、体外受精（ＩＶＦ）の際のヒト配偶子の培養、及び発生３日目からの胚の生育に用いることを目的とする。この溶液は、グルコースナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、乳酸塩（ｄ／ｌ）、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、重炭酸ナトリウム、アラニル−グルタミン、タウリン、クエン酸ナトリウム、ｅｄｔａ、二ナトリウム、脱水物、フェノールレッド、ゲンタマイシン、及び硫酸塩から構成される。体外受精の際のヒト配偶子及び胚の培養、並びに発生５／６日目までの胚の生育のための培地もＩｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されており、以下から構成される：塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、重炭酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、グルコース、乳酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ジペプチド、アラニル−グルタミン、フェノールレッド、ゲンタマイシン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、アルギニン、シスチン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン。
【０１９９】
従って、補助生殖技術（例えば、ＩＶＦ）の実施に用いるための培地の適切な選択又は調製は、医師及び臨床検査室により日常的に行われている。当分野では公知の補助生殖技術に関連して行われるプロトコルの前、プロトコル中若しくは後に、生体エネルギー物質又はその機能性誘導体のいずれか１種以上を有効量で、目的の培地に添加することができる。用いる濃度、時間及びその他の条件は、生体エネルギー物質又はその機能性誘導体を、限定するものではないが、卵巣組織、卵母細胞、ＯＳＣ若しくはその誘導体（例：細胞質若しくは単離されたミトコンドリア）又は着床前胚などの、目的とする所望の組織又は細胞に対する最大限の曝露を達成するように最適化する。目的の組成物及び／又は細胞は、当分野では公知の補助生殖技術に関連して行われるプロトコルの前若しくはプロトコル中に、生体エネルギー物質又はその機能性誘導体を含む培地を用いて、ｅｘ  ｖｉｖｏで処理することができ、こうした補助生殖技術として、限定するものではないが、卵母細胞若しくはＯＳＣ成熟及び収集、卵胞成熟、卵巣組織若しくは卵巣細胞の移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）、卵巣組織若しくは卵巣細胞の移植、低温保存、体外受精、並びにヒト卵母細胞、受精卵及び着床前胚の培養が挙げられる。
【０２００】
本発明は、卵母細胞を生産する方法も提供し、本方法は、生体エネルギー物質若しくはその機能性誘導体の存在下で、幹細胞を卵母細胞に分化させるのに十分な条件下で、幹細胞、例えば、限定するものではないが、ＯＳＣ、胚性幹細胞、皮膚幹細胞、膵幹細胞、及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を培養するステップを含む。
【０２０１】
幹細胞は、自己再生性細胞分裂を経ることにより、表現型及び遺伝子型が同じ娘細胞を無期限に生産することができ、最終的に、少なくとも１つの最終細胞型に分化することができる。幹細胞は、複数の細胞系統に分化する広範な、そして恐らく無限の増殖能を有し、移植時に組織に再配置することができる細胞として定義される。典型的な幹細胞は、無制限の自己再生能及び多能性分化能を有することから、胚性幹（ＥＳ）細胞である。これらの細胞は、胞胚の内部細胞塊から、又は着床後胚由来の始原生殖細胞（胚性生殖細胞若しくはＥＧ細胞）から得ることができる。ＥＳ及びＥＧ細胞は、マウス、ヒト以外の霊長類及びヒトから得られている。マウスの胞胚、又は別の動物の胞胚に導入すると、ＥＳ細胞は、マウス（動物）のすべての組織に寄与することができる。生後の動物に移植すると、ＥＳ及びＥＧ細胞は、奇形腫を形成するが、これもまた多能性であることがわかっている。
【０２０２】
体幹細胞は、ほとんどの臓器の組織にみいだされている。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に記載する卵母細胞分化及び／又は成熟培養方法に有用な幹細胞として、限定するものではないが、ＯＳＣ、間葉系幹細胞、骨髄由来幹細胞、造血幹細胞、軟骨前駆細胞、皮膚幹細胞（例えば、表皮幹細胞）、胃腸幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、膵前駆細胞及び／又は幹細胞、毛胞幹細胞、内皮前駆細胞及び平滑筋前駆細胞が挙げられる。
【０２０３】
「人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞」は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）と類似した特性、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの無制限の自己再生、通常の核型、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）及び幹細胞特異的抗原３及び４（ＳＳＥＡ３／４）のような幹細胞マーカ遺伝子を含む特有の遺伝子発現パターン、並びに特殊化細胞型に分化する能力を呈示する細胞である（Ｈａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７  ３１８：１９２０−１９２３；Ｍｅｉｓｓｎｅｒ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００７  ２５（１０）：１１７７−８１，Ｏｋｉｔａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００７  ４４８（７１５１）：３１３−７，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２００７  １３１（５）：８６１−７２，Ｗｅｒｎｉｇ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００７  ４４８（７１５１）：３１８−２４，Ｙｕ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７  ３１８（５８５８）：１９１７−２０，及びＰａｒｋ，Ｉ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００８  ４５１（７１７５）：１４１−６。線維芽細胞培養物からのｉＰＳ細胞の作製及び最新技術については、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｏｋｉｔａ，Ｎａｋａｇａｗａ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００７）２（１２）に記載されている。
【０２０４】
幹細胞、前駆細胞及び再プログラム化細胞などの細胞の卵母細胞への分化及び／又は成熟のための条件は、当分野では公知であり、例えば、以下の文献に記載されている：Ｄａｎｎｅｒ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ．２００７  Ｊａｎ；１３（１）：１１−２０，Ｄｙｃｅ  Ｐ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１；６（５），Ｄｙｃｅ  Ｐ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２０１１  Ｍａｙ；２０（５）：８０９−１９，Ｌｉｎｈｅｒ  Ｋ．ｅｔ  Ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２００９  Ｄｅｃ  １４；４（１２），Ｄｙｃｅ  Ｐ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００６  Ａｐｒ；８（４）：３８４−９０，  Ｐａｎｕｌａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２０１１  Ｆｅｂ  １５；２０（４）：７５２−６２，Ｐａｒｋ  Ｔ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００９  Ａｐｒ；２７（４）：７８３−９５，Ｈｕａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２００８  Ｊｕｎ；１７（３）：３９９−４１１，Ａｆｌａｔｏｏｎｉａｎ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ２００６  Ｎｏｖ；１３２（５）：６９９−７０７，Ｋｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｍｉｎ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｍｅｄ．２００６  Ｎｏｖ；２４（５）：３２２−９，Ｋｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．２０１０  Ｊａｎ  １；１５：４６−５６，Ｐｓａｔｈａｋｉ  Ｏ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２０１１  Ｍａｒ  ８．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］及びＨｕｅｂｎｅｒ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３  Ｍａｙ  ２３；３００（５６２３）：１２５１−６（これらの内容は、参照として本明細書に明示的に組み込む）。特に、アクチビンの存在下で、始原卵胞からのヒト卵母細胞の発育を支持する２段階無血清培養系について説明するＴｅｌｆｅｒ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ．２００８；２３（５）：１１５１−８によって記載されている方法を生体エネルギー物質又はその機能性誘導体と一緒に用いることができる。生体エネルギー物質又はその機能性誘導体のいずれか１種以上を有効量で、当分野では公知の卵母細胞分化及び／又は成熟プロトコルの前、プロトコル中若しくは後のいずれかに、目的の培地に添加することができる。用いる濃度、時間及び他の条件は、生体エネルギー物質又はその機能性誘導体を、幹細胞及びその卵母細胞誘導体との最大限の曝露を達成するように最適化する。
【０２０５】
受精能の改善及び／又は生殖機能の回復方法
生体エネルギー物質及びその機能性誘導体は、雌性被検者における不妊、生殖障害又は生殖老化の症状の治療のための様々な治療用途に用いることができる。いくつかのケースでは、閉経雌性被検者は、閉経周辺期若しくは閉経後いずれかの段階にあってよく、ここで、閉経は、正常（例えば、加齢）又は病理的（例えば、手術、疾患、卵巣損傷）プロセスのいずれかに起因するものである。生殖（例えば、卵巣）機能の回復は、閉経に関連する有害な症状及び合併症（限定するものではないが、骨粗鬆症、心臓血管病、身体的性的機能障害、顔面潮紅、膣乾燥、睡眠障害、抑うつ、過敏性、性無欲症、ホルモン平衡異常などの身体疾患、並びに記憶喪失；情動障害、抑うつなどの認知障害）を軽減しうる。
【０２０６】
従って、本発明は、雌性被検者の不妊を改善する方法を提供し、本方法は、生体エネルギー物質又はその機能性誘導体を、卵母細胞及び／又はＯＳＣデノボ生産、その質及び／又は排卵卵母細胞収率を改善するのに有効な量で、雌性被検者に投与するステップを含む。
【０２０７】
本発明はまた、以下：
ａ）生体エネルギー物質又はその機能性誘導体を、卵母細胞及び／又はＯＳＣデノボ生産、その質及び／又は排卵される卵母細胞収率を改善するのに有効な量で、雌性被検者に投与するステップ；
ｂ）雌性被検者から卵母細胞を取得する（雌性被検者のＯＳＣ若しくは組織から卵母細胞、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られる若しくは成熟した卵母細胞を取得することを含む）ステップ；及び
ｃ）卵母細胞を体外受精させることによって、受精卵を形成するステップ
を含む体外受精の方法も提供する。
ステップｂ）及び／又はステップｃ）は、さらに、卵母細胞若しくはその供給源を生体エネルギー物質又はその機能性誘導体と一緒にインキュベートすることも含んでよい。生体エネルギー物質の投与は、卵母細胞、ＯＳＣ若しくは卵巣組織採取の前に行ってよく、受精卵、又は着床前胚を雌性被検者（若しくは代理雌性被検者）の子宮に移入後、並びに、妊娠雌性被検者への生体エネルギー物質の投与の継続又は開始後を含む、全工程を通じて継続することができる。
【０２０８】
本発明は、本方法を必要とする雌性被検者の卵巣機能を回復する方法も提供し、本方法は、生体エネルギー物質又はその機能性誘導体を治療に有効な量で投与することを含み、これによって、雌性被検者の卵巣機能を回復する。一般に、卵巣機能の回復は、限定するものではないが、正常なホルモン生産、月経周期並びに適切な卵母細胞及びＯＳＣ予備能などの生殖に関する健康利益の回復をもたらす。卵巣機能の回復を必要とする雌性被検者は、例えば、未熟な卵巣不全を有する可能性がある。
【０２０９】
本発明は、本方法を必要とする妊娠雌性被検者において、胚発生を支持、維持及び／又は延長するための方法も提供し、本方法は、生体エネルギー物質又はその機能性誘導体を治療に有効な量で投与することを含む。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、妊娠結果に有益な作用をもたらすが、これは、限定するものではないが、対照標準と比較して、生存能力のある胚の移入数の増加、授精及び妊娠率の増加（例えば、これに相応して、移植胚の数の減少）、多胎出産率の減少、移植、妊娠及び胚形成の改善（集合的に「妊娠成功」と呼ぶ）を含む。標準を用いて、当業者は、１つ以上のパラメータ（例えば、生存能力のある胚の移入、受精及び妊娠率、移植胚の数、多胎出産、移植、並びに妊娠及び胚形成の期間）の相対的増加及び減少を評価することによって、妊娠成功の量を決定することができる。標準は、比較のための基準レベルとして役立ち、これにより、妊娠成功の存在、非存在若しくは程度を推定するために、結果を適切な標準に規格化することができる。一実施形態では、標準は、より早期の時点で（すなわち、生体エネルギー物質又はその機能性誘導体による治療の開始前）、試験した同じ個体から取得する。従って、１患者からの妊娠成功に寄与する１つ以上のパラメータを同じパラメータに関する以前の記録（基準として作用する）と比較する。このタイプの標準は、ほとんどの因子が、１個体において、時間が経過しても比較的類似したままであることから、一般に、診断、予後及び効果モニタリングについて最も正確である。標準は、理想的には、治療の開始前に取得すべきである。しかし、治療後であっても、治療の改善又は退行についての情報を提供することができるため、治療後の個体から標準を得ることもできる。また、別の個体又は複数の個体から標準を取得してもよく、この場合、標準は、治療を受けた、又は受けていない個体の集団における妊娠成功の平均レベルを表す。従って、このようにして得られる標準における妊娠成功のレベルは、生殖年齢の雌性の一般集団などの、所与の集団における平均レベルを表すものである。
【０２１１】
本発明はまた、採取（例えば、身体からの摘出）のための雌性被検者由来の組織若しくはその細胞を調製する方法も提供し、本方法は、生体エネルギー物質又はその機能性誘導体を治療に有効な量で雌性被検者に投与するステップを含み、これによって、採取対象の雌性被検者由来の組織若しくはその細胞を調製する。この組織は、例えば、卵巣、卵胞、骨髄及び末梢血であってよく、細胞は、例えば、卵母細胞又はＯＳＣであってよい。採取した目的の組織及び／又は細胞は、任意選択で、当分野では公知の補助生殖技術に関連する方法の前若しくはその間に、生体エネルギー物質又はその機能性誘導体を含む培地を用いて、ｅｘ  ｖｉｖｏで処理することができ、こうした補助生殖技術の方法として、限定するものではないが、卵母細胞若しくはＯＳＣ成熟及び収集、卵胞成熟、移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）、移植、低温保存、体外受精、並びにヒト胚及び受精卵の培養が挙げられる。
【０２１２】
「有効量」又は「治療に有効な量」とは、治療を受けていない患者と比較して、障害（例えば、不妊症、加齢に関連する生殖機能低下）の症状を改善するのに必要な生体エネルギー物質若しくはその機能性誘導体、又はこの物質を含む組成物の量を意味する。治療的処置のために本発明を実施するのに用いられる物質の有効量は、投与方法、被検者の年齢、体重、及び全般的健康状態に応じて変動する。最終的に、担当医が適切な量及び投与方法を決定する。このような量は、「有効量」又は「治療に有効な量」と呼ばれる。
【０２１３】
一般に、本発明の化合物の用量は、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇから１日当たり約２０００ｍｇ／ｋｇまでの範囲である。一実施形態では、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、３、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１５００、１７００、１８００、１９００、２０００ｍｇの生体エネルギー物質（例えば、Ｓｉｒｔ１活性化物質、ＣＤ３８阻害剤）を被検者に投与する。有効量は、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇから１日当たり約２０００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり、この範囲の最下層は、０．０１〜１９９９のあらゆる整数であり、この範囲の最上層は、０．０２〜１０００のあらゆる整数である。約５〜約２０００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量が好適であると考えられるが、用いる具体的生体エネルギー物質に応じて異なる。静脈内投与及び医薬品などの特定の投与形態の場合には、より低い用量となる。最初に用いた用量で、被検者の応答が低い場合には、より高い用量（又は、別の、より局在化した送達経路によって実質的により高い用量）を患者が耐容できる程度まで使用してもよい。本発明の組成物の適切な全身レベルを達成するために、１日につき複数用量が考慮される。
【０２１４】
本発明は、生体エネルギー物質又はその機能性誘導体を含む医薬組成物及び製剤を投与する方法を提供する。別の実施形態では、本発明の組成物を薬学的に許容される担体と一緒に製剤化する。別の実施形態では、本発明の医薬組成物及び製剤は、非経口、局所、経口経路で、又はエアロゾル若しくは経皮などの局部投与によって投与することができる。医薬組成物は、あらゆる方法で製剤化することができ、各患者の病状若しくは疾患（例えば、生殖障害の種類）及び疾病の程度、全般的健康状態、並びに結果として好ましい投与方法などに応じ、様々な単位投与形態で投与することができる。医薬品の製剤化及び投与技術については、その詳細が科学及び特許文献に十分に記載されており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ  （“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ”）の最新版を参照されたい。
【０２１５】
生体エネルギー物質又はその機能性誘導体は、単独で、又は医薬製剤（組成物）の１成分として投与することができる。これらの化合物は、ヒト又は獣医学での使用に好適な任意の方法で、投与のために製剤化してよい。また、湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色料、剥離剤、コーティング剤、甘味料、香味料及び香料、防腐剤及び抗酸化剤を組成物に含有させてもよい。
【０２１６】
本発明の組成物の製剤は、皮内、吸入、経口／鼻内、局所、非経口、直腸、及び／又は膣内投与に適したものを含む。製剤は、好適には、単位投与形態で提供することができ、製薬の分野で公知のあらゆる方法で調製してよい。単一投与形態を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分（例えば、生体エネルギー物質又はその機能性誘導体）の量は、治療しようとする宿主、具体的投与方法（例えば、皮内若しくは吸入など）に応じて変動する。単一投与形態を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果、例えば、卵母細胞若しくはＯＳＣ生産及びその質の改善並びに／又は排卵される卵母細胞の回収率増加をもたらす化合物の量である。
【０２１７】
本発明の医薬組成物は、医薬品製造のための当分野では公知のあらゆる方法に従い調製することができる。このような薬剤は、甘味料、香味料、着色料及び防腐剤を含有してもよい。製剤は、製造に好適な無毒かつ薬学的に許容される賦形剤と混合することができる。製剤は、１種以上の希釈剤、乳濁剤、防腐剤、バッファー、賦形剤などを含有してもよく、また、液体、粉末、エマルション、凍結乾燥粉末、スプレー、クリーム、ローション、徐放剤、錠剤、丸薬、ゲル、パッチ、インプラントなどの形態で提供してもよい。
【０２１８】
経口投与のための医薬組成物は、適切かつ好適な投与形態で、当分野では公知の薬学的に許容される担体を用いて、製剤化することができる。このような担体によって、医薬品を、患者による摂取に好適な、錠剤、丸薬、粉末、糖剤、カプセル、液体、ロゼンジ、ジェル、シロップ、スラリー、懸濁液などの単位投与形態に製剤化することができる。経口用の医薬調製剤は、固体賦形剤として製剤化することができ、任意選択で、必要に応じて、好適な追加化合物を添加した後、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理することによって、錠剤若しくは糖剤のコアを取得する。好適な固体賦形剤は、炭水化物又はタンパク質充填材であり、例えば、乳糖、ショ糖、マンニトール、若しくはソルビトールなどの糖；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、若しくは他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、又はナトリウムカルボキシ−メチルセルロースなどのセルロース；並びにアラビアゴム及びトラガカントなどのゴム；並びに、例えば、ゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質が挙げられる。崩壊剤若しくは可溶化剤を添加してもよく、このようなものとして、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギニン酸、又はアルギニン酸ナトリウムなどのその塩がある。プッシュフィットカプセルには、乳糖若しくはデンプンなどの充填材又は結合剤、タルク若しくはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、及び任意選択で、安定剤と混合した活性薬剤を含有させることができる。ソフトカプセルの場合、脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に、安定剤と一緒に、又は安定剤なしで、活性薬剤を溶解若しくは懸濁させることができる。
【０２１９】
水性懸濁液は、水性懸濁液（例えば、水性内皮注射用）の製造に好適な賦形剤と混合した活性薬剤（例えば、生体エネルギー物質、又はその機能性誘導体）を含有してもよい。このような賦形剤としては、以下のものが挙げられる：懸濁液、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギニン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴム、並びに分散若しくは湿潤剤、例えば、天然に存在するホスファチド（例：レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸の縮合物（例：ステアリン酸ポリオキシエチレン）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合物（例：ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステルとの縮合物（例：ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、又はエチレンオキシドと、脂肪酸及び無水ヘキシトール由来の部分エステルとの縮合物（例：ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）。水性懸濁液は、さらに、エチル若しくはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートなどの１種以上の防腐剤、１種以上の着色料、１種以上の香味料、並びにショ糖、アスパルターム若しくはサッカリンなどの１種以上の甘味料を含んでもよい。製剤は、重量オスモル濃度について調節することができる。
【０２２０】
一実施形態では、本発明の核酸配列の投与に油性医薬品を用いる。油性懸濁液は、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油などの植物油、又は液体パラフィンなどの鉱油；あるいはこれらの混合物に活性薬剤を懸濁させることにより、製剤化することができる。例えば、経口投与される疎水性医薬化合物の生物学的利用能を高めると共に、個体間及び個体内変動性を低減するための精油又は精油成分の使用について記載する米国特許第５，７１６，９２８号明細書を参照されたい（また、米国特許第５，８５８，４０１号明細書も参照のこと）。油性懸濁液は、蜜蝋、固形パラフィン若しくはセチルアルコールなどの増粘剤を含有してよい。嗜好性経口調製剤を提供するために、グリセロール、ソルビトール若しくはショ糖などの甘味料を添加してもよい。これらの製剤は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加により、保存することができる。注射用油性ビヒクルの１例として、例えば、Ｍｉｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９９７  ２８１：９３−１０２を参照されたい。
【０２２１】
また、本発明の医薬組成物は、水中油形エマルションの形態であってもよい。油相は、前述した植物油若しくは鉱油、又はこれらの混合物であってよい。好適な乳濁剤として、アカシアゴム及びトラガカントゴムなどの天然ゴム、ダイズレシチンなどの天然ホスファチド、脂肪酸と無水ヘキシトールのエステル又は部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレエート、並びにこれらの部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートがある。エマルションは、シロップ及びエレキシルの製剤と同様に、甘味料及び香味料を含有してもよい。このような製剤は、さらに粘滑剤、防腐剤、又は着色料を含有してもよい。別の実施形態では、本発明の注射用水中油形エマルションは、パラフィン油、ソルビタンモノオレエート、エトキシル化ソルビタンモノオレエート及び／又はエトキシル化ソルビタントリオレエートを含む。
【０２２２】
本発明の実施に際し、医薬化合物は、座薬、通気法、粉末及びエアロゾル製剤（例えば、ステロイド吸入剤、例えば、Ｒｏｈａｔａｇｉ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９５  ３５：１１８７−１１９３；Ｔｊｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５  ７５：１０７−１１１を参照）などの鼻内、眼内及び膣内経路によって投与することもできる。座薬製剤は、常温で固体であるが、体温では液体の好適な非刺激性賦形剤と薬剤を混合することにより調製することができ、これにより、製剤は、体内で融解して、薬剤を放出する。このような材料は、カカオ脂及びポリエチレングリコールである。
【０２２３】
本発明の実施に際し、医薬化合物は、局所経路によって経皮送達することができ、塗薬スティック、溶液、懸濁液、エマルション、ジェル、クリーム、軟膏、ペースト、ゼリー、塗薬、粉末、及びエアロゾルとして製剤化することができる。
【０２２４】
本発明の実施に際し、医薬化合物は、体内での徐放のためのミクロスフィアとして送達することもできる。例えば、ミクロスフィアは、皮下で徐放する薬剤の皮内注射によって（Ｒａｏ  Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｅｄ．１９９５  ７：６２３−６４５を参照）；生分解性及び注射用ジェル製剤として（例えば、Ｇａｏ  Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９５  １２：８５７−８６３を参照）；又は経口投与用のミクロスフィアとして（例えば、Ｅｙｌｅｓ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９７  ４９：６６９−６７４）投与することができる。
【０２２５】
本発明の実施に際し、医薬化合物は、静脈内（ＩＶ）投与又は体腔への投与若しくは卵巣への直接投与などにより、非経口投与することができる。これらの製剤は、薬学的に許容される担体に溶解させた活性薬剤の溶液を含むことができる。用いることができる許容されるビヒクル及び溶媒は、水及びリンガー液、等張性塩化ナトリウムである。さらに、溶媒又は懸濁媒として、無菌不揮発性油を用いることができる。この目的のために、あらゆる無刺激の不揮発性油を用いることができ、例えば、合成モノジグリセリド又はジグリセリドがある。また、同様に、オレイン酸などの脂肪酸も注射液の調製に用いることができる。これらの溶液は無菌であり、概して不要な物質は含まれていない。これらの製剤は、従来の公知の滅菌方法で滅菌することができる。製剤は、生理的条件に近似させる上で必要となるような薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節及び緩衝剤、毒性調節剤を含有してもよく、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどがある。これらの製剤中の活性薬剤の濃度は、広範に変動しうるが、選択した具体的投与方法及び患者の必要性に従い、主として液量、粘度、体重などに基づいて選択される。ＩＶ投与の場合、製剤は、無菌の注射用水性又は油性懸濁液などの無菌注射調製剤であってよい。この懸濁液は、好適な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、製剤化することができる。無菌注射調製剤は、１，３−ブタンジオールの溶液など、無毒かつ非経口的に許容される希釈剤若しくは溶媒中の懸濁液であってもよい。投与は、ボーラス又は連続注入（例えば、規定の期間にわたる血管への実質的に中断なしの導入）によって実施することができる。
【０２２６】
本発明の医薬化合物及び製剤は、凍結乾燥することができる。本発明は、本発明の組成物を含む安定した凍結乾燥製剤を提供し、この製剤は、本発明の薬剤と、充填材（例えば、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、及びショ糖、又はこれらの混合物）を含む溶液を凍結乾燥することによって製造することができる。
【０２２７】
本発明の組成物及び製剤は、リポソームを用いて送達することができる。リポソームを用いることにより、特にリポソーム表面が、標的細胞に特異的なリガンドを担持するか、又は特定の器官に選択的に向けられる場合、活性薬剤の送達をｉｎ  ｖｉｖｏで標的細胞に集中させることができる。例えば、米国特許第６，０６３，４００号明細書；第６，００７，８３９号明細書；Ａｌ−Ｍｕｈａｍｍｅｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１９９６  １３：２９３−３０６；Ｃｈｏｎｎ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９５  ６：６９８−７０８；Ｏｓｔｒｏ  Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．１９８９  ４６：１５７６−１５８７を参照されたい。
【０２２８】
本発明の製剤は、予防及び／又は治療的処置のために投与することができる。別の実施形態では、治療用途の場合、卵母細胞若しくはＯＳＣの生産及び質の改善及び／又は排卵される卵母細胞の回収率増加を必要とする被検者に、生殖障害若しくはその合併症の臨床症状（例えば、不妊症、閉経、未成熟卵巣不全）を治癒、改善又は部分的に停止するのに十分な量（これを治療に有効な量と呼ぶことができる）で、組成物を投与する。
【０２２９】
これを達成するのに適した医薬組成物の量が、治療に有効な用量である。この使用のために有効な投薬スケジュール及び量、すなわち投与計画は、様々な要因、例えば、疾患又は病状の段階、疾患又は病状の重症度、患者の全般的健康状態、患者の全身状態、年齢などに応じて異なる。１患者について投与計画を計算する際、投与方法も考慮に入れる。
【０２３０】
投与計画は、当業者には公知の薬物動態学パラメータ、すなわち、活性薬剤の吸収速度、生物学的利用能、代謝、クリアランスなども考慮に入れる（例えば、Ｈｉｄａｌｇｏ−Ａｒａｇｏｎｅｓ  Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９６  ５８：６１１−６１７；Ｇｒｏｎｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｚｉｅ  １９９６５１：３３７−３４１；Ｆｏｔｈｅｒｂｙ  Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ  １９９６  ５４：５９−６９；Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９９５  ８４：１１４４−１１４６；Ｒｏｈａｔａｇｉ  Ｐｈａｒｍａｚｉｅ  １９９５  ５０：６１０−６１３；Ｂｒｏｐｈｙ  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９８３  ２４：１０３−１０８；最新版Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ（前掲）を参照。最新技術によって、臨床医は、個別の患者、活性薬剤、及び治療しようとする疾患若しくは病状の各々について、投与計画を決定することができる。薬剤として用いられる類似組成物について提供されるガイドラインを指針として用いることによって、投与計画、すなわち、本発明を実施するために行われる投薬スケジュール及び投与レベルが正確かつ適切であることを決定することができる。
【０２３１】
例えば、必要に応じた用量及び頻度、並びに患者の耐容性、それぞれの投与後に形成されるコレステロール恒常性の量などによって、単一又は複数回の製剤投与を実施することができる。製剤は、病状、疾患若しくは症状を有効に治療、予防若しくは改善する、例えば、卵母細胞若しくはＯＳＣの生産及び質を改善する、及び／又は排卵される卵母細胞の回収率を増加するのに十分な量の活性薬剤を提供すべきである。
【０２３２】
別の実施形態では経口投与用の医薬製剤は、１日当たり体重１キログラムにつき約１〜１００ｍｇ以上の１日量である。経口投与とは対照的に、血流、体腔又は器官の管腔には、より低い用量を用いることができる。これより実質的に高い用量を局所若しくは経口投与、又は粉末、スプレー若しくは吸入による投与に用いることができる。非経口又は経口投与が可能な製剤を調製するための実際の方法は、当業者には公知又は明らかであり、Ｒｅｍｉｎｔｏｎ’ｓ（前掲）のような刊行物に、さらに詳しく記載されている。
【０２３３】
本発明及びその多くの利点のさらに明瞭な理解を促す以下の例示的、非制限的実施例によって、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０２３４】
実施例１〜６では、承認されたプロトコルを用いて、ＯＳＣを健康な若い女性の組織から確実に単離して、後の臨床処置に用いるためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖することができることを証明する。実施例７では、成体期のＣＲが、高い母体齢が原因で生殖不全になりかけている雌マウスの卵母細胞の質及び回収率を改善することを証明する。実施例８では、ＣＲと同様に、生体エネルギー物質が、ＯＳＣにおけるミトコンドリアパラメータを増加することを証明する。以下の実施例は、あくまで例示を目的として記載するものであり、本発明者らがその発明と考えるものの範囲を限定することを意図するわけではない。
【０２３５】
実施例１：ＯＳＣ単離のためのＦＡＣＳによるプロトコル
免疫磁気分離によってマウスＯＳＣを単離するために、Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６によって用いられるＶＡＳＡ抗体は、ヒトＶＡＳＡのＣＯＯＨ−末端の最後の２５アミノ酸に対するウサギポリクローナルである（ＤＤＸ４）（ａｂ１３８４０；Ａｂｃａｍ）。この領域は、マウスＶＡＳＡ（ＭＶＨ）の対応領域と９６％の全体相同性を共有する。比較研究のために、ヒトＶＡＳＡのＮＨ２−末端の最初の１４５アミノ酸に対するヤギポリクローナル抗体（ＡＦ２０３０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたが、これは、マウスＶＡＳＡの対応領域と９１％の全体相同性を共有する。
【０２３６】
いずれの抗体を用いた若い成体（生後２ヶ月）マウス卵巣の免疫蛍光分析も、予想通り、卵母細胞に制限されたＶＡＳＡ発現の同じパターンを示した（図１ａ）。次いで、分散した若い成体マウス卵巣組織の免疫磁気分離のために、各抗体を用いた（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６）。細胞の各調製のために、４匹のマウスからの卵巣をプールして、細かく刻んだ後、８００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼ［ＩＶ型；カルシウム及びマグネシウムを除いたハンクス平衡塩類溶液中で調製される（ＨＢＳＳ）］と一緒に１５分のインキュベーション、続いて、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡと一緒に１０分のインキュベーションを含む２ステップ酵素消化により解離させた。消化は、細胞調製物における粘着性を最小限にするために、１μｇ／ｍｌＤＮａｓｅ−Ｉ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で実施し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）の添加により、トリプシンを中和した。卵巣分散質を、７０μｍナイロンメッシュを介して濾過した後、ＨＢＳＳ中に、１％正常ヤギ血清（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ；ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨに対するａｂ１３８４０を用いた後の反応のために）又は１％正常ロバ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；ＶＡＳＡ−ＮＨ２に対するＡＦ２０３０を用いた後の反応のために）のいずれかを含む１％脂肪酸遊離ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から構成される溶液中で、氷上で２０分間ブロックした。次に、ＣＯＯＨ末端（ａｂ１３８４０）又はＮＨ２末端（ＡＦ２０３０）のいずれかを認識するＶＡＳＡ抗体の１：１０希釈物と細胞を氷上で２０分間反応させた。その後、細胞をＨＢＳＳで２回洗浄した後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ結合マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；ａｂ１３８４０検出）又はビオチン結合ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ＡＦ２０３０検出）のいずれかの１：１０希釈物と一緒に氷上で２０分間インキュベートし、続いて、ストレプトアビジン結合マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と一緒にインキュベーションを行った。ＨＢＳＳ中でもう１回洗浄した後、製造業者の指定事項（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に従って、細胞調製物をＭＡＣＳカラムにロードし、分離した。個々の卵母細胞と起こりうる抗体−ビーズ相互作用を視覚化する実験のために、妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ、１０ＩＵ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の注射、それから４６〜４８時間後のヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ、１０ＩＵ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の注射により、成体雌マウスを過排卵させた。ｈＣＧ注射から１５〜１６時間後、卵管から卵母細胞を採取し、ヒアルロニダーゼ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、卵丘細胞を除去してから、ＢＳＡを添加したヒト卵管液（ＨＴＦ；Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で洗浄した。前述したように、分散した卵巣細胞又は単離した卵母細胞をブロックし、ＶＡＳＡに対して一次抗体と一緒にインキュベートした。ＨＢＳＳで洗浄した後、２．５μｍＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合した、種適性二次抗体と反応させた。Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ（登録商標）−Ｓ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒを用いた分離のために、懸濁液を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに導入した。
【０２３７】
ＶＡＳＡ−ＮＨ２抗体を用いた場合には、ビーズ画分中に細胞は全く得られなかった；しかし、ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ抗体を用いた場合、磁気ビーズに結合した５〜８μｍの細胞が観察された（図１ｂ）。これらの細胞の分析から、免疫磁気分離を用いて、Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６により以前単離されたＯＳＣについて報告されたものと一致する生殖系遺伝子発現が明らかになった（図２）。ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ抗体を用いて同時に評価した単離卵母細胞は、非免疫反応性洗浄液画分に常に検出された（図１ｂ）が、免疫磁気分離によって得られたＶＡＳＡ陽性細胞画分の別のマーカ分析から、Ｎｏｂｏｘ、Ｚｐ３及びＧｄｆ９などの複数の卵母細胞特異的ｍＲＮＡが明らかになった（図２）。これらの知見から、卵母細胞は、個別の実体として分析すると、ＶＡＳＡの細胞表面発現を呈示しない（図１ｂ）が、卵母細胞は、分散卵巣組織からＯＳＣを免疫磁気分離すると、やはり混入細胞型であることがわかる。この結果は、恐らく、ビーズの遠心分離ステップ中の卵母細胞の非特異的な物理的キャリーオーバー（ｃａｒｒｙ−ｏｖｅｒ）、又は原形質膜損傷（破損）卵母細胞中の細胞質ＶＡＳＡとＣＯＯＨ抗体の反応性のいずれかを表していると考えられる。いずれの場合も、ＦＡＣＳの使用により緩和される。
【０２３８】
次に、各抗体と分散マウス卵巣細胞の反応性をＦＡＣＳによって評価した。各実験のために、前述したように、卵巣組織（マウス：４つの卵巣をプール；ヒト：１０×１０×１ｍｍ厚さ、皮質のみ）を解離し、ブロックした後、一次抗体（ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨに対するａｂ１３８４０、又はＶＡＳＡ−ＮＨ２に対するＡＦ２０３０）と反応させた。ＨＢＳＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ａｂ１３８４０検出）に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＡＦ２０３０）に結合したロバ抗ヤギＩｇＧの１：５００希釈物と一緒に、細胞を氷上で２０分間インキュベートした後、ＨＢＳＳで洗浄した。次に、標識細胞を再度濾過（３５μｍ孔径）し、負の（非染色で、一次抗体なし）対照に対してゲーティングした、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩサイトメーター（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて、ＦＡＣＳによって単離した。死滅細胞排除のための選別の直前に、ヨウ化プロピジウムを細胞懸濁液に添加した。新しく単離したＶＡＳＡ陽性生存細胞を、遺伝子発現プロファイリング、奇形腫形成能の評価又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のために収集した。実験によっては、２％中性緩衝パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に細胞を固定し、０．１％トリトン−Ｘ１００で透過処理した後、ＶＡＳＡ（ＡＦ２０３０）のＮＨ２末端に対する一次抗体と反応させ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に結合したロバ抗ヤギＩｇＧとの反応後にＦＡＣＳによる検出を行った。再選別実験の場合には、生存細胞をＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ抗体（ａｂ１３８４０）と反応させ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧとの反応後、ＦＡＣＳによって選別した。得られたＡＰＣ陽性（ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ陽性）生存細胞をインタクトのままにしておくか、又は、固定及び透過処理した後、ＶＡＳＡ−ＮＨ２抗体（ＡＦ２０３０）とのインキュベーション、続いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に結合したロバ抗ヤギＩｇＧとのインキュベーションを行ってから、ＦＡＣＳ分析を実施した。
【０２３９】
磁気ビーズ分離結果と一致して、生存ＶＡＳＡ陽性細胞は、ＣＯＯＨ抗体を用いた場合にしか得られなかった（図１ｃ）。しかし、ＦＡＣＳの前に卵巣細胞を透過処理すると、ＮＨ２抗体を用いても、ＶＡＳＡ陽性細胞集団が得られた（図１ｃ）。さらに、ＣＯＯＨ抗体を用いたＦＡＣＳによって単離した生存ＶＡＳＡ陽性細胞を透過処理し、再選別した場合には、同じ細胞集団が、ＶＡＳＡ−ＮＨ２抗体によって認識された（図１ｄ）。このＯＳＣ単離方法の妥当性を確認する最後の手段として、プロトコルの各ステップでの細胞の画分を、生殖細胞についてのマーカ（Ｂｌｉｍｐ１／Ｐｒｄｍ１、Ｓｔｅｌｌａ／Ｄｐｐａ３、Ｆｒａｇｉｌｉｓ／Ｉｆｉｔｍ３、Ｔｅｒｔ、Ｖａｓａ、Ｄａｚｌ）及び卵母細胞についてのマーカ（Ｎｏｂｏｘ、Ｚｐ３、Ｇｄｆ９）の組合せを用いた遺伝子発現分析によって評価した。ＦＡＣＳのための細胞を取得するために、卵巣組織を細かく刻み、コラゲナーゼ及びトリプシンで酵素的に消化し、７０μｍフィルターで濾過することにより、大きな組織凝集塊を除去した後、３５μｍフィルターで濾過することにより、細胞の最終画分を取得した。ＦＡＣＳによって得られたＶＡＳＡ陽性生存細胞画分を除いて、プロトコルの各ステップから得られた細胞の全ての画分が、全ての生殖細胞系及び卵母細胞マーカを発現した（図１ｆ）。ＦＡＣＳで選別したＶＡＳＡ陽性細胞画分は、全ての生殖細胞系マーカを発現したが、卵母細胞マーカは一切検出されなかった（図１ｆ）。従って、ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ抗体を用いた免疫磁気分離によってＯＳＣを単離したときに観察された卵母細胞混入（図２参照）とは異なり、ＦＡＣＳでこの同じ抗体を使用すれば、卵母細胞を含まない成体卵巣由来ＯＳＣ画分を取得する優れた方法が提供される。
【０２４０】
実施例２：ヒト卵巣からのＯＳＣの単離
書面でのインフォームドコンセントと共に、埼玉医療センター（Ｓａｉｔａｍａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）で、性同一性障害を持つ年齢２２〜３３（２８．５±４．０）歳の６人の女性患者から卵巣を外科手術で摘出した。外側の皮質層を注意深く取り出し、ガラス化した後、低温保存した（Ｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｍｅｄ．２００９  Ｏｎｌｉｎｅ  １８：５６８−５７７；図１２）。手短には、厚さ１ｍｍの皮質断片を１００ｍｍ２（１０×１０ｍｍ）の切片に切断し、７．５％エチレングリコール（ＥＧ）及び７．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む平衡溶液中、２６℃で２５分間インキュベートし、２０％ＥＧ、２０％ＤＭＳＯ及び０．５Ｍショ糖を含むガラス化溶液中で、２６℃で１５分間インキュベートした後、液体窒素に浸漬した。実験分析のために、低温保存した卵巣組織を、Ｃｒｙｏｔｉｓｓｕｅ  Ｔｈａｗｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｋｉｔａｚａｔｏ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）を用いて解凍してから、組織学、異種移植又はＯＳＣ単離のために直ちに処理した。ＣＯＯＨ抗体を用いて、年齢が２２〜３３歳の全患者のヒト卵巣皮質組織生検から、直径５〜８μｍの生存ＶＡＳＡ陽性細胞もＦＡＣＳにより一貫して単離したが、その収率（％）（選別した全生存細胞に対して１．７％±０．６％ＶＡＳＡ陽性；平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）は、並行して処理した若い成体マウス卵巣からのＯＳＣの収率（選別した全生存細胞に対して１．５％±０．２％ＶＡＳＡ陽性；平均±ＳＥＭ、ｎ＝１５）と同等であった。この収率（％）は、ＦＡＣＳによって選別した生存単細胞の最終プール中のこれら細胞の出現率であり、これは、処理前の卵巣中に存在する細胞の総数の小部分を表している。卵巣当たりのＯＳＣの出現率を推定するために、生後１．５〜２ヶ月のマウスの卵巣当たりのゲノムＤＮＡ量を決定し（１，７７４４．４４±４２６．１５μｇ；平均±ＳＥＭ、ｎ＝１０）、卵巣毎に選別した生存細胞の画分当たりのゲノムＤＮＡ量に分割した（１６．４１±４．０１μｇ；平均±ＳＥＭ、ｎ＝１０）。細胞当たりのゲノムＤＮＡ量が同等であると想定して、全卵巣細胞プールのどれくらいが、処理後に得られた全生存選別細胞画分によって表されるかを決定した。この相関係数を用いて、卵巣当たりのＯＳＣの出現率を０．０１４％±０．００２％［０．００９２６Ｘ（１．５％±０．２％）］であると推定した。ＯＳＣ収率に関して、この数は、複製によって変動したが、４つの卵巣のプールから最初に調製した分散質のＦＡＣＳ後に、成体卵巣当たり２５０〜わずかに１，０００を超える生存ＶＡＳＡ陽性細胞が、一貫して得られた。
【０２４１】
マウス及びヒト卵巣からの新たに単離したＶＡＳＡ陽性細胞の分析（図３ａ、３ｂ）により、類似した大きさ及び形態（図３ｃ、３ｄ）、並びに初期生殖細胞のマーカが豊富なマッチした遺伝子発現プロフィールが明らかになった（Ｓａｉｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００２  ４１８：２９３−３００；Ｏｈｉｎａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００５  ４３６：２０７−２１３；Ｄｏｌｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．２００２  １１５：１６４３−１６４９）（Ｂｌｉｍｐ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｆｒａｇｉｌｉｓ及びＴｅｒｔ；図３ｅ）。これらの結果は、科学文献（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６；Ｐａｃｃｈｉａｒｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２０１０  ７９：１５９−１７０）に報告されているマウスＯＳＣの形態学及び遺伝子プロフィールと一致している。
【０２４２】
成体卵巣から得られたＶＡＳＡ陽性細胞に特有の特徴をさらに決定するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ奇形腫形成アッセイを用いて、マウスＯＳＣを試験した。これは、近年の研究で、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の奇形腫形成能を有する成体マウスからのＯｃｔ３／４−陽性幹細胞の単離が報告されている（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．２０１０  ９３：２５９４−２６０１）ことから、重要である。前述のように、合計１００匹の若い成体雌マウスから卵巣を採取し、解離させた後、ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ陽性生存細胞の単離のためにＦＡＣＳに付した。新しく単離したマウスＯＳＣを、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ雌マウスの後ろ臀部付近に皮下注射した（マウス当たり１×１０５細胞を注射）。対照として、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣｖ６．５）を並行して対応齢の雌マウスに注射した（レシピエントマウス当たり１×１０５細胞を注射）。腫瘍形成について、６ヵ月までの間マウスをモニターした。
【０２４３】
予想通り、正の対照として用いたマウスＥＳＣを移植したマウスの１００％が、３週間以内に奇形腫を形成した；しかし、成体マウス卵巣から単離したＶＡＳＡ陽性細胞を並行して移植したマウスには、移植から２４週間後であっても奇形腫は観察されなかった（図３ｆ〜ｋ）。従って、ＯＳＣは、多数の幹細胞及び原始胚細胞マーカを発現する（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６；Ｐａｃｃｈｉａｒｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２０１０  ７９：１５９−１７０；また、図１ｆ及び図３ｅも参照のこと）が、これらの細胞は、これまで記載されている他のタイプの多能性幹細胞とは明らかに異なる。
【０２４４】
実施例３：ＦＡＣＳ精製マウスＯＳＣからの卵母細胞の産生
レトロウイルス形質導入によりＧＦＰを発現するように操作されたＦＡＣＳ精製マウスＯＳＣ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活発に分裂する生殖細胞だけの培養物として樹立後）が、成体雌マウスの卵巣への移植後に卵母細胞を産生する能力を評価した。得られる結果が、卵巣への移植細胞の安定な組込みを表すものであり、また、移植前に誘導された生殖腺への損傷によって複雑化しないことを確実にするために、１×１０４ＧＦＰ発現マウスＯＳＣを、月齢２ヶ月の非化学療法条件付け野生型レシピエントの卵巣に注射し、分析まで５〜６ヵ月間マウスを維持した。月齢７〜８ヶ月の、移植マウスを、外性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ（１０ＩＵ）の単回腹腔内注射、その４６〜４８時間後ｈＣＧ（１０ＩＵ））で排卵を誘導した後、それらの卵巣と、卵管に放出された全ての卵母細胞を採取した。排卵された卵丘−卵母細胞複合体を、０．４％ＢＳＡ添加ＨＴＦに移して、ＧＦＰ発現について直接蛍光顕微鏡検査によって評価した。最初にＦＡＣＳにより精製したＧＦＰ発現マウスＯＳＣを受けた雌の卵巣において、ＧＦＰ陰性卵母細胞を含む卵胞と一緒に、ＧＦＰ陽性卵母細胞を含む発生中の卵胞が容易に検出可能であった（図４ａ）。
【０２４５】
卵管のフラッシング後、の中央に位置する卵母細胞を取り囲む拡張した卵丘細胞を含む複合体が観察され、これらは、ＧＦＰ欠失及びＧＦＰ発現の両方を含んだ。これらの複合体と野生型雄由来の精子を混合すると、受精が起こり、着床前胚が発生した。体外受精（ＩＶＦ）のために、精巣上体尾及び精管を成体野生型Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスから摘出し、ＢＳＡ添加ＨＴＦ培地に導入した。ピンセットで組織を穏やかに絞ることによって精子を取得し、３７℃で１時間にわたり受精能を獲得させた後、卵丘−卵母細胞複合体（ＢＳＡ添加ＨＴＦ培地中１〜２×１０６精子／ｍｌ）と４〜５時間にわたって混合した。次に、授精した卵母細胞を洗浄して精子を洗い流してから、新鮮な培地に移した。授精から４〜５時間後、卵母細胞（受精及び非受精）を５０μｌ液滴のＫＳＯＭ−ＡＡ培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移し、液滴を鉱油で被覆することにより、着床前胚発生をさらに支持した。合計１４４時間にわたり、２４時間毎に光学及び蛍光顕微鏡検査を実施して、孵化胚盤胞期まで胚発生をモニターした（Ｓｅｌｅｓｎｉｅｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２０１１  １０８：１２３１９〜１２３２４）。卵管からの排卵した卵母細胞の回収時に採取した卵巣組織を固定し、既に詳述されている（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００７  ２５：３１９８−３２０４）ように、ＭＯＭ（商標）キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に、ＧＦＰに対するマウスモノクローナル抗体（ｓｃ９９９６；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、ＧＦＰ発現の免疫組織化学的検出のために、処理した。非移植野生型雌マウス及びＴｇＯＧ２トランスジーン雌マウスからの卵巣を、それぞれ、ＧＦＰ検出のための負及び正の対照として用いた。
【０２４６】
受精ＧＦＰ陽性卵から得られた着床前胚は、孵化胚盤胞期までＧＦＰ発現を保持した（図４ｂ〜ｄ）。５〜６ヵ月早くＧＦＰ発現ＯＳＣを移植した５匹の成体野生型雌マウスから、合計３１個の卵丘−卵母細胞複合体を卵管から採取したが、そのうちの２３個は、受精に成功し、胚を発生した。各卵母細胞の周りに卵丘細胞が存在するために、排卵したＧＦＰ陽性卵母細胞に対するＧＦＰ陰性細胞の数を正確に決定することができなかった。しかし、体外受精（ＩＶＦ）後に発生した２３の胚の評価により、８つがＧＦＰ陽性であり、試験した５匹の全てが、受精して、ＧＦＰ陽性胚を発生する少なくとも１つの卵を放出したことがわかった。これらの知見から、ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ抗体に基づくＦＡＣＳによって精製されたＯＳＣが、既に報告されている免疫電磁分離によって単離されたそれらの対応物（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６）と同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏで機能性卵母細胞を産生することがわかる。しかし、本発明者らのデータは、以前報告されている（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６）ように、ＯＳＣが成体卵巣組織に移植されて、機能性卵母細胞を産生するのに、移植前の化学療法条件付けは必要ないことも示している。
【０２４７】
実施例４：候補ヒトＯＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特性決定
マウスＯＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖のために以前記載された（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６）パラメータを用いて、支持細胞として有糸分裂不活性マウス胎児性線維芽細胞（ＭＥＦ）を含む規定培地に、成体マウス及びヒト卵巣由来ＶＡＳＡ陽性細胞を導入した。手短には、以下：１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ非必須アミノ酸、１Ｘ濃縮ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍ  Ｍβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１Ｘ濃縮Ｎ−２補充物（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ；１０３単位／ｍｌ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト上皮増殖因子（ｒｈＥＧＦ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び４０ｎｇ／ｍｌ神経膠細胞由来の神経栄養因子  （ＧＤＮＦ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加したＭＥＭα（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において細胞を培養した。培養物は、隔日４０〜８０μｌの新しい培地を添加することにより新しくし、２週間毎に細胞を新鮮なＭＥＦＳに移しかえた。増殖を評価するために、ＭＥＦを含まないＯＳＣ培養物を１０μＭ  ＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で４８時間処理した後、記載されている（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９  １１：６３１−６３６）ように、ＢｒｄＵ組込み（有糸分裂活性細胞）及びＶＡＳＡ発現（生殖細胞）の二重免疫蛍光による検出のために、２％ＰＦＡ中に固定した。一次抗体が省かれるか、又は正常ウサギ血清の同等希釈物で置換された場合、シグナルは全く検出されなかった（示していない）。
【０２４８】
新しく単離したＯＳＣをクローン系として樹立することができ、ＭＥＦに接種していないヒトＯＳＣのコロニー形成効率は、０．１８％〜０．４０％の範囲であった。コロニー形成効率の正確な評価は、初期支持細胞としてＭＥＦを用いて実施することはできなかったが、これは、マウス及びヒトＯＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの樹立を非常に容易にする。１０〜１２週（マウス）又は４〜８週（ヒト）の培養後、活発に分裂する生殖細胞コロニーが容易に明らかになった（図５）。いったん樹立して、増殖すると、細胞は、増殖能力を喪失することなく、ＭＥＦの非存在下で生殖細胞だけの培養物として再樹立させることができた。ＭＥＦ非含有培地でのＶＡＳＡ発現及びブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）組込みの二重分析によって、多数の二重陽性細胞が明らかになり（図６ａ〜ｄ）、成体マウス及びヒト卵巣由来のＶＡＳＡ陽性細胞が活発に分裂していることを証明している。この段階で、マウス細胞は、培養物分割比１：６〜１：８で、４〜５日毎に、培養飽和密度での継代を必要とした（推定倍加時間１４時間；図６ｅ）。マウスＯＳＣ増殖の速度は、並行して維持したヒト生殖細胞の速度より約２〜３倍高く、ヒト細胞の場合、培養物分割比１：３〜１：４で、７日毎に、培養飽和密度での継代を必要とした。ＶＡＳＡの細胞表面発現は、数ヵ月の増殖後も、９５％を超える細胞の表面で検出可能であった（図６ｆ）。ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ抗体を用いたＦＡＣＳによって検出されなかった残りの細胞は、マウス及びヒトＯＳＣによって自然に産生された大きな（直径３５〜５０μｍ）球形の細胞であり、これらは、ＶＡＳＡの細胞質発現を呈示しており、実施例５に詳しく説明する。
【０２４９】
培養した細胞の遺伝子発現分析により、初期生殖細胞系マーカの維持が証明された（図６ｇ）。複数の卵母細胞特異的マーカもこれらの培養物中に検出された。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ（商標）ｃＤＮＡ合成キット  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより、ｍＲＮＡのレベルを評価した。同一性を確認するために、全ての産物を配列決定した。対応する遺伝子のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号と共に、フォワード及びリバースプライマーの配列を表３（マウス）及び表４（ヒト）に記載する。
【０２５０】
【表３】
2019030326.tif 000053
【０２５１】
【表４】
2019030326.tif 000054
【０２５２】
Ｂｌｉｍｐ１、Ｓｔｅｌｌａ及びＦｒａｇｉｌｉｓのｍＲＮＡ分析を拡張するために、これら３つの伝統的原始生殖細胞系マーカの免疫蛍光分析を実施した（Ｓａｉｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００２  ４１８：２９３−３００；Ｏｈｉｎａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００５  ４３６：２０７−２１３）。培養したＯＳＣの分析のために、細胞を１Ｘ濃縮リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２０℃にて４５分間２％ＰＦＡ中で固定し、ＰＢＳ−Ｔ（０．０１％トリトン−Ｘ１００を含むＰＢＳ）で３回洗浄した後、ブロッキングバッファー（２％正常ヤギ血清及び２％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で、２０℃にて１時間インキュベートした。次に、細胞を以下の一次抗体のうち１つの１：１００希釈物と一緒に２０℃で１時間インキュベートした：ＢＬＩＭＰ１に対するビオチン化マウスモノクローナル（ａｂ８１９６１、Ａｂｃａｍ）、ＳＴＥＬＬＡに対するウサギポリクローナル（ａｂ１９８７８、Ａｂｃａｍ）又はＦＲＡＧＩＬＳに対するウサギポリクローナル（マウス：ａｂ１５５９２、ヒト：ａｂ７４６９９、Ａｂｃａｍ）。細胞を洗浄して、ローダミン−ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で、ストレプトアビジン結合Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＢＬＩＭＰ１検出）、又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＳＴＥＬＬＡ  ａｎｄ  ＦＲＡＧＩＬＩＳ検出）に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧの１：５００希釈物と一緒に２０℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄して、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と一緒にインキュベートし、さらに３回洗浄した後、画像化した。一次抗体を省くか、又は代わりに正常血清を用いた場合、シグナルは全く検出されなかった（図示していない）。
【０２５３】
マウス及びヒトＯＳＣによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生される卵母細胞の評価のために、個々の卵母細胞を培養物上澄みから収集して、洗浄し、３７℃にて０．５％ＢＳＡ含有の２％ＰＦＡで４５分間固定し、洗浄した後、０．５％ＢＳＡと、５％正常ヤギ血清（ＶＡＳＡ若しくはＬＨＸ８検出）又は１％正常ロバ血清（ｃ−ＫＩＴ検出）のいずれかを含むＰＢＳ中で、２０℃にて１時間ブロックした。ブロック後、卵母細胞を以下の一次抗体のうち１つの１：１００希釈物（０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中）と一緒に２０℃で２時間インキュベートした：ｃ−ＫＩＴに対するヤギポリクローナル（ｓｃ１４９４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＶＡＳＡに対するラビットポリクローナル（ａｂ１３８４０、Ａｂｃａｍ）又はＬＨＸ８に対するウサギポリクローナル（ａｂ４１５１９、Ａｂｃａｍ）。次に、細胞を洗浄して、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＶＡＳＡ検出）若しくはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＬＨＸ８検出）に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧの１：２５０希釈物、又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に結合したロバ抗ヤギＩｇＧの１：２５０希釈物（ｃ−ＫＩＴ検出）と一緒にインキュベートした。細胞を洗浄して、ＤＡＰＩと一緒にインキュベートし、さらに３回洗浄した後、画像化した。一次抗体を省くか、又は代わりに正常の血清を用いた場合、シグナルは全く検出されなかった。
【０２５４】
これら後出の実験では、ＶＡＳＡ、ｃ−ＫＩＴの卵母細胞特異的発現、また、ヒト卵巣については、卵巣組織切片中におけるＬＨＸ８の発現の検出を正の対照として用いた。マウス及びヒト卵巣組織を４％ＰＦＡ中に固定し、パラフィン包埋して、スライス（６μｍ）した後、０．０１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）を用いて、高温抗原賦活化処理を実施した。冷却後、切片を洗浄して、１％正常ヤギ血清（ＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ若しくはＬＨＸ８検出）又は１％正常ロバ血清（ＶＡＳＡ−ＮＨ２若しくはｃ−ＫＩＴ検出）のいずれかを含むＴＮＫバッファー（リン酸緩衝食塩水中の０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、０．５５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１  ｍＭ  ＫＣＬ、０．５％ＢＳＡ、及び０．１％トリトン−Ｘ１００）を用いて、２０℃で１時間ブロックした。次いで、切片を一次抗体の１：１００希釈物（１％正常血清含有のＴＮＫバッファー）と一緒に４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（ヒト卵巣におけるＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ検出）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（マウス卵巣におけるＶＡＳＡ−ＣＯＯＨ若しくはＬＨＸ８の検出）又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に結合したロバ抗ヤギＩｇＧ（ｃ−ＫＩＴ又はＶＡＳＡ−ＮＨ２検出）の１：５００希釈物と一緒に、２０℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を用いて、切片をカバーガラスで覆った。一次抗体を省くか、又は代わりに正常の血清を用いた場合、シグナルは全く検出されなかった。
【０２５５】
３つのタンパク質は全て、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持するマウス（図６ｈ）及びヒト（図６ｉ）ＯＳＣにおいて容易に、かつ均質に検出された。特に、これらの細胞でのＦＲＡＧＩＬＩＳの検出は、このタンパク質を用いて、免疫磁気ビーズ分離によりマウス卵巣からＯＳＣを単離することもできると報告する近年の研究と一致している（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．  ２０１１  ｄｏｉ：１０．１０８９／ｓｃｄ．２０１１．００９１）。
【０２５６】
実施例５：候補ヒトＯＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの卵形成能
他者（Ｐａｃｃｈｉａｒｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２０１０  ７９：１５９−１７０）の結果と一致して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養したマウスＯＳＣは、大きな（直径３５〜５０μｍ）球形の細胞を自然に産生したが、これは、形態学（図７ａ）及び遺伝子発現分析（図７ｂ、ｃ）によって、卵母細胞に類似していた。マウスＯＳＣからのｉｎ  ｖｉｔｒｏ卵形成のピークレベルは、各継代から２４〜４８時間以内に観察され（図７ｄ）、その後、次第に減少して、ＯＳＣが培養飽和密度に達する毎に、ほぼ検出不能レベルまで降下する。成体ヒト卵巣から単離して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持したＶＡＳＡ陽性細胞の並行分析から、これらの細胞は、マウスＯＳＣと同様に、形態学（図７ｆ）及び遺伝子発現（図７ｃ、ｇ）分析の両方から推定されるように、卵母細胞を自然に産生したことが明らかになった。ヒトＯＳＣからのｉｎ  ｖｉｔｒｏ卵形成の動態は、卵母細胞形成のピークレベルが各継代から７２時間後に観察された点で、マウスＯＳＣとはやや異なっていた（図７ｅ）。広く認められている多数の卵母細胞マーカ（Ｖａｓａ、ｃ−Ｋｉｔ、Ｎｏｂｏｘ、Ｌｈｘ８、Ｇｄｆ９、Ｚｐ１、Ｚｐ２、Ｚｐ３；（Ｓｕｚｕｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．２００２  １１１：１３７−１４１；Ｒａｊｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４  ３０５：１１５７−１１５９；Ｐａｎｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００６  １０３：８０９０−８０９５；Ｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９９９  １３：１０３５−１０４８；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｍｅｄ．２００７  ２５：２４３−２５１）の検出に加えて、マウス及びヒトＯＳＣ由来の卵母細胞は、複糸期特異的マーカＭｓｙ２も発現した（図７ｃ）。ＭＳＹ２は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ＦＲＧＹ２の哺乳動物相同体であり、これは、両性において減数分裂進行及び配偶子形成に必須の生殖細胞特異的核酸結合Ｙボックスタンパク質である（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．１９９８  ５９：１２６６−１２７４；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００５  １０２：５７５５−５７６０）。正の対照として成体ヒト卵巣皮質組織を用いた、市販の抗体の実証試験から、成体ヒト卵巣に存在する未熟の卵母細胞と特異的に反応する卵母細胞マーカ（ＶＡＳＡ、ｃ−ＫＩＴ、ＭＳＹ２、ＬＨＸ８；図８）に対する４つの抗体をみいだしたが；これらのタンパク質の４つ全ても、ヒトＯＳＣによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生される卵母細胞に検出された（図７ｇ）。
【０２５７】
ヒトＯＳＣからｉｎ  ｖｉｔｒｏで新しく形成された卵母細胞における、減数分裂マーカＭＳＹ２をコードするｍＲＮＡの存在によって、本発明者らは、これらの培養物における減数分裂開始の見込みについて探ることにした。継代から７２時間後の結合（非卵母細胞生殖系）細胞の免疫蛍光分析によって、減数分裂特異的ＤＮＡリコンビナーゼの点状核局在を含む細胞、ＤＭＣ１と、減数分裂組換えタンパク質である、シナプトネマ構造タンパク質３（ＳＹＣＰ３）をみいだした（図７ｈ）。いずれのタンパク質も、生殖細胞に特異的であり、減数分裂組換えのために必要である（Ｐａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２００４  ２０：５２５−５５８；Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２  ２９６：１１１５−１１１８；Ｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｊ．２０１０  ２７７：５９０−５９８）。
【０２５８】
継代から７２時間後のヒトＯＳＣ培養物の染色体ＤＮＡ量解析を決定した。培養したマウス（継代から４８時間後）又はヒト（継代から７２時間後）ＯＳＣをトリプシン処理によって収集して、洗浄し、氷冷ＰＢＳ中に再懸濁させてから、血球計で計数した。氷冷の７０％エタノール中で１時間の固定後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄して、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ−Ａと一緒に３７℃で１時間インキュベートした。次に、ヨウ化プロピジウムを添加（１０μｇ／ｍｌ最終）し、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩサイトメーターを用いて、倍数性状態を決定した。対照体細胞系として、ヒト胎児腎線維芽細胞（ＫＥＫ２９３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、上記の実験を繰り返した。この分析によって、予想した二倍体（２ｎ）細胞集団の存在が明らかになった；しかし、細胞の４ｎ及び１ｎ集団に一致するピークが検出され、後者は、半数体状態に達した生殖細胞を示している（Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．  ２０１１  ２０：１０７９−１０８８）（図７ｉ）。対照として同時に分析した胎児腎線維芽細胞の活発に分裂する培養物では、細胞の２ｎ及び４ｎ集団（図９ａ）しか検出されなかった。マウスＯＳＣ培養物のＦＡＣＳによる染色体分析でも、同等の結果が観察された（図９ｂ）。
【０２５９】
実施例６：ヒトＯＳＣは、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト卵巣皮質組織に卵母細胞を産生する
候補ヒトＯＳＣからの推定卵形成のｉｎ  ｖｉｔｒｏ観察を確認し、拡張するために、２つの最終実験において、成体ヒト卵巣から単離したＶＡＳＡ陽性細胞に、ＧＦＰ発現ベクター（ＧＦＰ−ｈＯＳＣ）で安定に形質導入することにより、細胞追跡を容易にした。細胞追跡実験のために、レトロウイルスを用いて、ヒトＯＳＣに形質導入して、ＧＦＰ（ＧＦＰ−ｈＯＳＣ）の安定な発現を有する細胞を取得した。手短には、１μｇのｐＢａｂｅ−ＧｆｐベクターＤＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミドリポジトリ＃１０６６８）を、製造業者のプロトコル（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ａレトロウイルスパッケージング細胞系（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後にウイルス上澄みを回収した。ヒトＯＳＣの形質導入は、新鮮なウイルス上澄みを用いて実施したが、これは、ポリブレン（５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在によって促進した。４８時間後、ウイルスを除去し、新鮮なＯＳＣ培地と交換した。最初の１週間の増殖後、ＧＦＰの発現を有するヒトＯＳＣを精製し、精製した細胞をさらに２週間増殖させた後、２回目のＦＡＣＳ精製を行うことにより、ヒト卵巣組織再凝集又は異種移植実験のためのＧＦＰ−ｈＯＳＣを取得した。
【０２６０】
最初の実験では、次に、分散させた成体ヒト卵巣皮質組織と一緒に、約１×１０５ＧＦＰ−ｈＯＳＣを再凝集させた。前述のように、ヒト卵巣皮質を解離して、洗浄した後、３５μｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；Ｓｉｇｍａ）及び１×１０５ＧＦＰ−ｈＯＳＣと一緒に３７℃で１０分間インキュベートした。細胞混合物を遠心分離（９，３００ｘｇ、２０℃で１分間）によりペレット化して、組織凝集体を形成し、これを、１ｍｌのＯＳＣ培地を含む６ウェル培養皿内のＭｉｌｌｉｃｅｌｌ  ０．４μｍ培養プレートインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に塗布した。３７℃の５％ＣＯ２−９５％空気中で凝集体をインキュベートし、２４、４８及び７２時間後、生存細胞ＧＦＰ画像化を実施した。
【０２６１】
予想通り、再凝集した組織全体に、多数のＧＦＰ陽性細胞が観察された（図１０ａ）。次に、凝集体を培養物に導入し、直接（生存細胞）ＧＦＰ蛍光によって２４〜７２時間後に評価した。２４時間以内に、複数の非常に大きな（≧５０μｍ）単細胞が凝集体中に観察され、それらの多くは、卵胞に似た緊密な構造で、より小さなＧＦＰ陰性細胞によって囲まれており；これらの構造は、７２時間を通じて検出可能であった（図１０ｂ、ｃ）。これらの知見から、ＧＦＰを発現するヒトＯＳＣは、卵母細胞を自然に産生し、これらは、成体ヒト卵巣分散質中に存在する体細胞（前顆粒膜／顆粒膜）によって取り囲まれることがわかった。
【０２６２】
次に、ＧＦＰ−ｈＯＳＣを成体ヒト卵巣皮質組織生検に注射した後、これをＮＯＤ／ＳＣＩＤ雌マウスに異種移植した（ｎ＝合計４０移植片）。３５ゲージ斜端針を備える１０μｌ  ＮａｎｏＦｉｌ注射器（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、卵巣皮質組織切片（２×２×１ｍｍ）に個別に約１．３×１０３個のＧＦＰ−ｈＯＳＣを注射した。レシピエントＮＯＤ／ＳＣＩＤ雌マウスを麻酔し、ほぼ記載されている（Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．１９９９  ６０：１４６２−１４６７；Ｍａｔｉｋａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２００１  ２８：３５５−３６０）通りに、ヒト卵巣皮質組織の皮下挿入のために背側脇腹に沿って小さな切開を施した。移植から７又は１４日後に異種移植片を取り出し、４％ＰＦＡ中に固定し、パラフィン包埋した後、ＧＦＰに対するマウスモノクローナル抗体（ｓｃ９９９６；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた免疫組織化学的分析のために、順次切断した（６μｍ）（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００７  ２５：３１９８−３２０４）。手短には、０．０１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）を用いて、高温抗原賦活化処理を実施した。冷却後、メタノール中の３％過酸化水素と一緒に切片を１０分間インキュベートすることにより、内生ペルオキシダーゼ活性をブロックし、洗浄した後、製造業者のプロトコル（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に従い、ストレプトアビジン−ビオチンプレブロック溶液中でインキュベートした。次に、１％正常ヤギ血清を含むＴＮＫバッファーを用いて、切片を２０℃で１時間ブロックした後、１％正常ヤギ血清含有のＴＮＫバッファー中に調製したＧＦＰ抗体の１：１００希釈物と一緒に４℃で一晩インキュベートした。次に、切片を洗浄し、ヤギ抗マウスビオチン化二次抗体の１：５００希釈物と一緒に２０℃で３０分間インキュベートした後、洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ試薬（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）と２０℃で３０分間反応させた後、ジアミノベンジジン（ＤＡＫＯ）を用いたＧＦＰ陽性細胞の検出を行った。細胞及び組織構造を視覚化するために、切片をヘマトキシリンで軽く対比染色した。負の対照（ビヒクル注射を受けた異種移植組織に対する完全免疫組織化学的染色）も並行して常に実施したが、陽性シグナルは示さなかった。これらの観察結果を確認及び拡張するために、免疫分析の説明で既に詳述したように、ＤＡＰＩ対比染色を用いて、異種移植したヒト卵巣組織におけるＧＦＰと、ＭＳＹ２（複糸期卵母細胞特異的マーカ）又はＬＨＸ８（初期卵母細胞転写因子）のいずれかの二重免疫蛍光による検出を実施した。
【０２６３】
ＧＦＰ発現の評価のために、７又は１４日後に移植片を収集した。ヒト卵巣移植片は全て、容易に認められる始原及び一次卵胞を含んでおり、その中心にＧＦＰ陽性卵母細胞が位置していた。恐らく、ＧＦＰ−ｈＯＳＣ注射の前に組織中に存在していたこれらの卵胞の間、及び往々にしてこれらに隣接して、ＧＦＰ陽性卵母細胞を含む他の未成熟卵胞が散在していた（図１０ｄ、ｆ）。ＧＦＰ−ｈＯＳＣを注射した３つのランダムに選択したヒト卵巣組織生検の連続した切片組織形態計測的分析から、マウスへの異種移植から７日後に、移植片当たり１５〜２１個のＧＦＰ陽性卵母細胞の存在が明らかになった（図１１）。対照として、ＧＦＰ−ｈＯＳＣ注射前のヒト卵巣皮質組織（図１０ｅ）又はＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの移植前に模擬注射（ＧＦＰ−ｈＯＳＣを含まないビヒクル）を受けた異種移植片（図１０ｇ）には、ＧＦＰ陽性卵母細胞は全く検出されなかった。複糸期卵母細胞特異的マーカＭＳＹ２（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．  １９９８  ５９：１２６６−１２７４；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００５  １０２：５７５５−５７６０）又は初期卵母細胞転写因子ＬＨＸ８（Ｐａｎｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００６  １０３：８０９０−８０９５）のいずれかを用いた二重免疫蛍光に基づくＧＦＰの検出によって、ＧＦＰ−ｈＯＳＣを注射した異種移植片全体に散在する多数の二重陽性細胞が認められた（図１０ｈ）。予想したように、ＧＦＰ−ｈＯＳＣ注射前の卵巣組織又はＧＦＰ−ｈＯＳＣ注射を受けなかった異種移植片には、ＧＦＰ陽性卵母細胞は全く検出されなかった（図示していない；図１０ｅ、ｇ参照）；しかし、これらの卵母細胞は、ＬＨＸ８及びＭＳＹ２に対しては一貫して陽性であった（図１０ｈ；図８）。
【０２６４】
実施例７：オートロガス生殖細胞系ミトコンドリアエネルギー移動（「ＡＵＧＭＥＮＴ」へのＯＳＣの使用
図１３は、体外受精（ＩＶＦ）前又は体外受精中の同じ被検者から得た卵母細胞または卵細胞に移入することができる卵形成細胞質又はミトコンドリア画分の誘導化のための雌性生殖細胞のオートロガス供給源としてのＯＳＣの使用の概観を表す。その結果起こったＡＵＧＭＥＮＴ後の卵細胞におけるミトコンドリアＤＮＡコピー数及びＡＴＰ生産能力の増大によって、卵細胞が、受精及び胚発生の成功に必要なエネルギー駆動イベントのためのＡＴＰの十分な蓄積を有することが確実になる。ＡＵＧＭＥＮＴにより卵細胞に供給される追加のミトコンドリアは、卵細胞を産生するために身体によって用いられる天然の前駆細胞に由来する。さらに、追加ミトコンドリアは、胚発生に必要なミトコンドリアの最小閾値数がほぼ４倍増大した場合でも、健全な胚形成が進行することを示すデータ（Ｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ２０１０  ８３：５２−６２、図６参照）によれば、卵母細胞に有害な影響をもたらすことはない。異種卵細胞質移入の有益な作用については、Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９９８  ４：２６９−８０（その方法は、胚／子孫に、生殖細胞系遺伝子操作及びミトコンドリアのヘテロプラスミーをもたらすために、ヒトへの使用は制限される）によって早期に報告されており、このことは、卵細胞が、追加のミトコンドリアによって利益を被ることを示している。
【０２６５】
ＡＵＧＭＥＮＴのための臨床プロトコルの一例は以下の通りである。標準的ＩＶＦの開始前に、月経周期の１〜７日の間に、被検者に腹腔鏡検査を実施して、１卵巣から卵巣上皮（卵巣皮質生検）の３つ以下の切片（各々約３×３×１ｍｍ）を採取する。この施術の間に、腹部内に２〜３つの切開を施し、装置を挿入して、滅菌手法を用いて、卵巣から組織を採取する。採取した組織を滅菌溶液に導入して、ＧＴＰ準拠試験施設に氷上で輸送し、そこで、ＡＵＧＭＥＮＴ／ＩＣＳＩの実施時まで低温保存した。組織は、酵素的解離の実施時まで凍結状態に維持した。これは、ミトコンドリアを精製するオートロガスＯＳＣの供給源として用いられる。
【０２６６】
次に、ＯＳＣを単離して、ＯＳＣからミトコンドリアを回収する。卵巣皮質生検組織を解凍した後、組織を細かく刻んで、組換えコラゲナーゼ及び組換えＤＮａｓｅ１を含む溶液に導入した後、単細胞懸濁液に均質化する。懸濁液をセルストレイナーに通過させて、単細胞の溶液を調製する。単細胞懸濁液を抗ＶＩＳＡ抗体と一緒にインキュベートする。次に、標識細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって単離する。ＯＳＣのアリコートを凍結するために標準的徐冷低温保存法を用いる。
【０２６７】
被検者に、ベースライン評価、ＧｎＲＨアンタゴニスト下方制御及びゴナドトロピン刺激などの標準的ＩＶＦプロトコルを実施する。ｈＣＧ投与から３４〜３８時間以内に卵母細胞を回収し、卵母細胞を質及び成熟状態について評価する。成熟卵母細胞をＩＣＳＩによって授精させる。
【０２６８】
卵細胞の採取日に、当該被検者の凍結ＯＳＣバイアルを標準的方法で解凍する。ＯＳＣを処理して、ミトコンドリアペレットを取得する（Ｆｒｅｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２００７  ２：２８７−２９５  ｏｒ  Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２００７  ３：５２４−３３．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｏｃｔ  １３）か、又は以下の実施例９（ここでは、ＦＡＣＳによる方法を用いて、組織中の全ミトコンドリア集団を単離する）に記載のように、また任意選択で、活発に呼吸するミトコンドリア集団をさらに単離する、あるいは、組織中の全ミトコンドリアに対する活性ミトコンドリアの比率を定量する。ミトコンドリア調製物の評価及び活性を評価し、記録する。ミトコンドリアペレットを、卵母細胞の質を改善するミトコンドリア活性の標準化濃度まで、媒質中に再懸濁させる。ミトコンドリアを含むこの媒質を、送達しようとする精子を含むマイクロインジェクション針に吸引する。ミトコンドリアと精子の両方を一緒に、ＩＣＳＩによって卵母細胞に送達する。
【０２６９】
受精及び胚培養後に、典型的には、最大３つのグレード１又はグレード２（ＳＡＲＴ格付けシステム（５０））胚を、胚発生の評価に基づき、３又は５日後、超音波誘導下で移入してもよい。βｈＣＧ試験によって妊娠が確認されたら、被検者は、後に約６及び２０週の妊娠期間で検査を受ける。
【０２７０】
実施例８：ＣＲ誘導によるミトコンドリア刺激が、高齢雌性における卵母細胞の質及び回収率を改善する
多くの種において、栄養不良のないカロリー摂取制限により、寿命が延び、老化に関連する健康上の合併症の重症度が軽減される（Ｍａｓｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ  ２００５  １２６：９１３−９２２；Ｍａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００８  ７７：７２７−７５４；Ｆｏｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１０  ３２８：３２１−３２６）。ＣＲ応答の一般的特徴は、ミトコンドリア力学、並びに加齢に伴い器官に蓄積される酸化ストレスに影響する代謝制御因子の改変であるようだ（Ｓｏｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ  １９９４  ７４：１２１−１３３，Ｂａｒｊａ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ  １：３９７−４１１，Ｂａｒｊａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  Ｃａｍｂ  Ｐｈｉｌｏｓ  Ｓｏｃ  ２００４  ７９：２３５−２５１）。例えば、成長ホルモン／インスリン／インスリン様成長因子−１軸（ａｘｉｓ）、哺乳類ラパマイシン標的、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ及びサーチュインは全て、ＣＲの媒介物質として関与している（Ｆｏｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１０  ３２８：３２１−３２６，Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ  ２００５  １２６：９８７−１００２，Ｒｏｄｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２００８  ５８２：４６−５３，Ｆｉｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ２００９  ８：１７３−１８８）。これらの経路のいくつかは、報告によれば、栄養因子（ｃｕｅｓ）に高度に応答性の転写制御因子であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ共役因子−１α（ＰＧＣ−１α）に集中する。その作用の中でも、ＰＧＣ−１αは、ミトコンドリア呼吸に関与する遺伝子の発現を調節することによってエネルギー欠乏に対する適応を促進する（Ｆｏｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１０  ３２８：３２１−３２６，Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ  ２００５  １２６：９８７−１００２，Ｒｏｄｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．２００８  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５８２：４６−５３，Ｆｉｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ２００９  ８：１７３−１８８，Ｒｏｄｇｅｒｓ  ＪＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００５  ４３４：１１３−１１８，Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００５  １：３６１−３７０）。驚くことに、マウスにおけるＰＧＣ−１αの欠失は、微細な表現型しか生じないが、急激な絶食のような攻撃時には、複数の代謝異常がはるかに強固に発現する（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２００４  １１９：１２１−１３５，Ａｒａｎｙ  Ｚ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００５  １：２５９−２７１，Ｌｅｏｎｅ  ＴＣ，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ２００５  ３：６７２−６８７）。しかし、Ｐｇｃ−１αヌルマウスを低カロリー食餌に付すことによって、任意の老化組織でのＰＧＣ−１αとＣＲ間の機能的関係について調べた研究はなかった。従って、ＰＧＣ−１αを操作していない、又は操作した成体期中のＣＲが、高い母体齢のために生殖不全になりかけている雌マウスにおける卵母細胞の質に影響を及ぼすか���かを明らかにするために、４年にわたる研究を実施した。
【０２７１】
３．５月齢から段階的に開始した７．５ヵ月の食餌療法ＣＲ（ＣＲ−ＡＬ給餌）の後、１ヵ月間自由（ＡＬ）給餌に戻した１２月齢（老化）雌マウスから得た卵母細胞の回収率、成熟状態及び受精後発生能を最初に評価した。このプロトコルは、成体期の間にＣＲを維持した雌マウスが繁殖を続け、ＡＬ給餌に戻した後、高齢になってからも子孫を生むことを証明する以前の研究に基づくものであった（Ｓｅｌｅｓｎｉｅｍｉ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  ７：６２２−６２９）。マウスは、妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ、１０ＩＵ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の注射、その４６〜４８時間後のヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ、１０ＩＵ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の注射によって、過排卵させた。ｈＣＧ注射から１５〜１６時間後、卵管から卵母細胞を収集し、ヒアルロニダーゼ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）を用いて卵丘細胞を剥離し、ＢＳＡ（画分Ｖ、脂肪酸を含まない；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したヒト卵管液（ＨＴＦ；Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で洗浄した後、ＭＩＩ（卵黄周囲空間中の最初の極体）として分類し、成熟を停止させる（極体を押し出さない卵核胞崩壊、又はインタクトな卵核胞）か、又は変性させた。
【０２７２】
全実験期間中、ＡＬ給餌を行った対照雌マウスでは、雌１匹につき排卵した卵母細胞の総数及び完全成熟卵母細胞（減数第二分裂中期；ＭＩＩと呼ぶ）の数は、３〜１２月齢で有意に減少した（図１６Ａ）。しかし、卵母細胞の総回収率及び成熟卵母細胞の回収率の加齢による減少は、ＣＲを維持した１２月齢雌マウスにおいて解消された（図１６Ａ）。
【０２７３】
次に、体外受精（ＩＶＦ）及び着床前胚発生率を評価した。雄マウスの精巣上体尾部からの精子を、ＢＳＡを添加したＨＴＦ中に収集した後、受精能を獲得させた。ＢＳＡを添加したＨＴＦ中の１〜２ｘ１０６精子／ｍｌと、裸化ＭＩＩ卵母細胞又はインタクトな卵丘−卵母細胞複合体を６〜９時間かけて混合し、洗浄した後、新鮮な培地に移した。２細胞胚の数を用いて、ＩＶＦ成功率を測定し、これらの胚からの胞胚発生率を記録した。２８４個（３月齢ＡＬ給餌）、９３個（１２月齢ＡＬ給餌）及び１９８個（１２月齢ＣＲ−ＡＬ給餌）卵母細胞の分析後、体外受精（ＩＶＦ）又は着床前胚発生率に関して、差はみとめられなかった（図１７）。しかし、ＣＲによって、１２月齢での誘発排卵周期後に雌１匹当たりのＭＩＩ卵母細胞の回収率は改善されたため、各老齢ＣＲ−ＡＬ給餌マウスから得た卵母細胞のＩＶＦ後に得られた胞胚の数は、幼若マウスを用いて得られたものと同様であり、老齢ＡＬ給餌マウスを用いたものより有意に高かった（図１６Ｂ）。
【０２７４】
老齢雌マウスからの卵母細胞回収率の維持に対するＣＲの有益な効果が、体重の差と関係するのかどうかを決定するために、幼若ＡＬ給餌、老齢ＡＬ給餌、及び老齢ＣＲ−ＡＬ給餌雌マウスの過排卵率をマウス毎に評価した。マウス毎の卵母細胞回収率の差は、老齢ＡＬ給餌グループで最も大きかったが、３つのマウスグループ間では体重の差と無関係であった（図１９）。また、１２月齢ＡＬ給餌及びＣＲ−ＡＬ給餌雌マウス両方の卵巣における卵母細胞含有卵胞の予備能が、３月齢マウスと比較して著しく減少していることも注目すべきである（図１６Ｃ）。従って、老齢雌マウスからのＭＩＩ卵母細胞の高い回収率を維持するＣＲの能力は、体重差、又はサイズが幼若マウスと同等の卵胞予備能の維持の変化と関連していないようである。
【０２７５】
次に、老齢ＡＬ給餌及びＣＲ−ＡＬ給餌雌マウスから収集したＭＩＩ卵母細胞の質を調べた。老化に関連する卵母細胞の欠損は、この成熟期で明らかであり、また、ＭＩＩ卵母細胞は、受精能卵のプールを呈示することから、完全成熟（ＭＩＩ）卵母細胞を分析のために選択した。このために、染色体動態、紡錘体統合性及びミトコンドリア動態を評価したが、これらは、卵の発生能を確実にするのに関与する重要なイベントである。Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ法（Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９６６  ５：３９４−４００，Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００９  ８０：１０６６−１０７１）を用いて、染色体動態分析のために、３月齢ＡＬ給餌（ｎ＝２０匹）、１２月齢ＡＬ給餌（ｎ＝３４匹）及び１２月齢ＣＲ−ＡＬ給餌（ｎ＝２０匹）雌マウスを個別に固定した。調製物を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロライド（ＤＡＰＩ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した後、蛍光顕微鏡下で、異数性の割合についてスコアを付けた。連続的ＡＬ給餌雌マウスから収集したＭＩＩ卵母細胞では、高数体（細胞当たり＞２０染色体；図１０Ａ）の発生率が、３月齢で検出限界以下であったのが、１２月齢でほぼ５％まで有意に増加した。対照的に、ＣＲを維持した１２月齢マウスからのＭＩＩ卵母細胞には、高数体は検出されなかった（図１０Ｂ）。低数体（細胞当たり＜２０染色体）の発生率もまた、３月齢ＡＬ給餌雌マウスに対し、１２月齢ＡＬ給餌雌マウスからのＭＩＩ卵母細胞において有意に高かったが、これは、ＣＲによって完全に防止された（図１０Ｂ）。未成熟な姉妹染色分体分離（ＰＳＣＳ）の発生率において類似のパターンが、３つのマウスグループの間で成熟卵母細胞にみとめられたが、これらの相違は統計的に有意ではなかった（図１０Ｂ）。
【０２７６】
αチューブリン及びＤＮＡ分布の共焦点分析を調べた。過排卵した卵母細胞から卵丘細胞を剥離し、酸性タイロード液（Ａｃｉｄｉｆｉｅｄ  Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で短時間インキュベートして、透明帯を軟化した後、マウス抗α−チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、次に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８と結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、免疫染色した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを用いて、卵母細胞を固定し、共焦点顕微鏡検査により分析した。αチューブリン及びＤＮＡ分布の共焦点分析から、３月齢ＡＬ給餌又は１２月齢ＣＲ−ＡＬ給餌雌マウスのいずれかから得られたＭＩＩ卵母細胞の９０％超の減数分裂紡錘体は、明確な微小管形態をしており、形状及び大きさ共に正常であった；しかし、１２月齢ＡＬ給餌マウスから採取したＭＩＩ卵母細胞の場合、正常な減数分裂紡錘体を呈示したのは、３９％に満たなかった（図２０Ａ及びＣ）。さらに、１２月齢ＡＬ給餌マウスからのＭＩＩ卵母細胞の６４％が、中期プレート上の染色体の不完全又は異常なアラインメントを呈示したのに対し、３月齢ＡＬ給餌又は１２月齢ＣＲ−ＡＬ給餌雌マウスのいずれかから回収したＭＩＩ卵母細胞では、染色体ミスアラインメントを呈示したのは２５％以下であった（図２０Ｂ及びＣ）。
【０２７７】
加齢に伴う卵母細胞の質の低下と関連していた（Ｔａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００１  ６５：１４１−１５０）ミトコンドリア凝集が、カロリー摂取によって影響を受けるか否かを評価した。卵母細胞から卵丘細胞を剥離し、Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＲｏｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にインキュベートし、顕微鏡分析のために処理した。市販の生物発光アッセイキットを用いて、製造者の指示（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に従い、個々のＭＩＩ卵母細胞中のＡＴＰレベルを決定した。Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒで染色したＭＩＩ卵母細胞の共焦点分析から、３月齢ＡＬ給餌雌マウスから収集したＭＩＩ卵母細胞の９０％超が、均一に散在するミトコンドリアの細胞質分布を示すことが明らかにされた（図２１Ａ及びＢ）。これに対し、１２月齢ＡＬ給餌雌マウスから得られたＭＩＩ卵母細胞の５０％近くが、広範囲にわたるミトコンドリア凝集を示した。しかし、１２月齢ＣＲ−ＡＬ給餌雌マウスから収集した成熟卵母細胞の９０％超が、均一に散在するミトコンドリアの細胞質分布を呈示し、幼若雌マウスから回収したＭＩＩ卵母細胞で観察したものと類似していた（図２１Ａ及びＢ）。このようなミトコンドリアの変化に相応して、老齢ＡＬ給餌雌マウスの卵母細胞中のＡＰＴ含量の加齢による低下も、成体期で開始するＣＲによって同様に予防された（図２１Ｃ）。
【０２７８】
最後に、遺伝子突然変異マウスを用いて、他の細胞型におけるＣＲの作用と関連しており（Ｆｉｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ  ８：１７３−１８８，Ｃｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ  Ａ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  ２００５  ６０Ａ：１４９４−１５０９，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００９  １７９０：１０５９−１０６６，Ｌｏｐｅｚ−Ｌｌｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２００６  １０３：１７６８−１７７３）、また、卵母細胞において発現される（図２１Ａ及び図２３）ＰＧＣ−１αの欠失が、老齢の卵母細胞の質を維持するＣＲの能力に影響を及ぼすかどうかを調べた。ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）若しくはＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、５個のＭＩＩ卵母細胞又は１つの卵巣からの全ＲＮＡをそれぞれ単離し、ランダムプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で逆転写した（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲによって、ｃＤＮＡを増幅した：
【０２７９】
【表５】
2019030326.tif 000055
【０２８０】
過去の研究（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２００４  １１９：１２１−１３５）と一致して、ＰＧＣ−１αが存在しないと、突然変異子孫の死亡率が増加した（ヘテロ接合体を育種することによって生まれた合計６９６匹のうち９０匹の子は、２１日目にノックアウトとして遺伝子型決定された）。１２ヵ月まで生存したヌル雌マウス（合計４７匹のうち３６匹）の評価から、ＡＬ給餌雌におけるＰＧＣ−１αの欠失によって、排卵卵母細胞回収率（図２２Ｂ）、減数分裂紡錘体形成（図２２Ｃ）、染色体アラインメント（図２２Ｄ）及び細胞質内のミトコンドリア分布（図２２Ｅ）に対してＣＲの有益な作用が再現されることがわかった。１２ヵ月では、ＰＧＣ−１αが欠失したＡＬ給餌雌マウスは、野生型の対照よりやや大きい卵胞予備能を示すが、いずれの遺伝子型の若い成体マウスと比較して卵胞数は著しく減少したままであった（図２４）。ＰＧＣ−１αが欠失したマウスをＣＲに付した場合、卵巣当たりの卵母細胞数（図２４）、又は卵母細胞回収率若しくは質（図２２Ｂ〜Ｄ）にそれ以上の変化はみとめられなかった。
【０２８１】
記載されている（Ｍａｔｉｋａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２００１  ２８：３５５−３６０）ように、ウサギ抗ＰＧＣ−１抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて、パラホルムアルデヒド固定パラフィン包埋組織切片に、ＰＧＣ−１タンパク質を局在化した。タンパク質サンプル（１０μｇ）を、ＰＧＣ−１に対する抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）及びローディング・コントロールとしてパン−アクチン（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を用いて、イムノブロッティングにより評価した。老齢ＡＬ若しくはＣＲ−ＡＬ給餌マウスの卵巣において、ＰＧＣ−１タンパク質のレベルは、ほとんど不変のままであったことから、ＣＲがこの器官におけるＰＧＣ−１遺伝子発現を直接改変するわけではないとみられる。しかし、ＣＲ及びＰＧＣ−１αが独立に、排卵卵母細胞において同じ結果をもたらしたという知見は、２つのモデルにおいて活性化されたシグナル伝達経路が、卵の質を保証する上で重要な共通の下流地点に集中することを示している。
【０２８２】
要約すると、この研究は、通常であれば、乏しい生殖パラメータを伴う月齢の雌マウスの成熟卵母細胞における染色体、紡錘体及びミトコンドリア動態に対する成体期開始ＣＲの際立って有益な作用を明らかにした。本研究は、ＣＲが、卵母細胞染色体動態の有意な改善によって、老齢雌マウスの受精能を持続させることを証明するだけではなく、卵母細胞の質の調節因子としてのＰＧＣ−１αも確認するものである。従って、生体エネルギー物質（例えば、ＣＲ模倣物を含む）の投与による卵母細胞異数性及び紡錘体欠損の防止は、母体年齢の高い女性における受精及び妊娠結果を改善する手段を提供する。
【０２８３】
ＣＲ分析のための実験手順に関する追加情報：
米国立老化研究所により、その老化バイオマーカ研究（Ｔｕｒｔｕｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ  Ａ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  １９９９  ５４Ａ：Ｂ４９２−Ｂ５０１）において開発された成体期開始ＣＲプロトコルを用いたが、このプロトコルでは、ＣＲを３．５月齢で２週間かけて段階的に開始し、４月齢で４０％制限に到達するようにする。各雌マウスを従来の（換気なし）ケージに個別に収容し、一定配給量のげっ歯類用強化飼料（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ）を１日１回給餌した。げっ歯類強化用飼料に、ビタミン及びミネラル類を添加するが、その際、これら微量養分の１日摂取量が、非強化（標準）のげっ歯類用飼料を自由（ＡＬ）に摂取できる対照マウスの１日摂取量と同等になるように添加する。それ以外の飼料組成は同じである。ＣＲプロトコルは、１１月齢まで継続し、この時点で、それまでＣＲを維持したマウスには、１ヵ月間標準的げっ歯類用飼料を自由に摂取させた。ＣＲプロトコルが予想通りに機能していることを確認するために、ＣＲプロトコルの開始直前（３月齢）、ＣＲプロトコルの終了時（１１月齢）及びＣＲマウスのＡＬ給餌に戻してから１ヵ月後（１２月齢）に、それぞれ各マウスの体重を計測した（図２６）。さらに、雌マウスにおいてＣＲを達成するように絶食日と給餌日を交互に実施した以前の研究では、発情周期性の加齢に関連する崩壊が、食事制限によって遅延したことが報告されている（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９８５  ３２：５１５−５２２）。これらのデータは、成体期開始ＣＲが、自然交配実験で検証された雌マウスにおける生殖不全の時期を遅延させるという最新の観察結果（Ｓｅｌｅｓｎｉｅｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  ２００８  ７：６２２−６２９）と共に、このアプローチが、正常な４５日発情周期に必要な生殖ホルモンの周期的生産を維持することを支持するものである。ＣＲを達成するためにここで用いた給餌プロトコルの下で、このことをさらに確認するために、記載されている（Ｆｅｌｉｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９８６  ３４：８４９−８５８）ように、毎日の膣細胞塗抹を評価することにより、３０日の期間にわたって老齢のＡＬ給餌マウス及びＣＲ−ＡＬ給餌マウスにおいて、発情周期性を比較した（図２７）。雌の生殖系老化が、４５日の典型的発情周期から５日超持続する延長周期への移行に関連することは、マウスにおいて十分に証明されている（Ｇｏｓｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９８３  ２８：２５５−２６０）。例えば、４５日持続対５日超延長の周期を示す若い成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスの比率は、それぞれ約８０％〜２０％である：しかし、１２月齢までには、雌マウスのほぼ２／３が、延長した発情周期を呈示し、これは未決定の卵巣不全を示すものである（Ｆｅｌｉｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９８６  ３４：８４９−８５８，Ｇｏｓｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９８３  ２８：２５５−２６０；また、図２７も参照）。全ての実験は、独立に少なくとも３回繰り返した。実験反復から得られた定量データを総合し、平均±ＳＥＭとして表す。ＡＮＯ��Ａ及びスチューデントｔ検定を用いて、数値同士の統計的比較を実施した。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
【０２８４】
実施例９：生体エネルギー因子は、ＯＳＣ中のミトコンドリアパラメータを増加させる
化学療法、老化及び未成熟卵巣不全（ＰＯＦ）による雌性不妊は、一部には、卵母細胞及びＯＳＣのミトコンドリア機能の低下に起因する。従って、マウスからのＯＳＣを用いて、雌性生殖細胞におけるミトコンドリア機能（「生体エネルギー状態」）を増強する小化合物をスクリーニングした。ミトコンドリア機能を増強するためのアッセイは、ｍＤＮＡ含量、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ、ミトコンドリア質量、ミトコンドリア膜電位、並びに既知ミトコンドリア質量調節因子及び電子伝達系成分の遺伝子発現を含んだ。
【０２８５】
化合物はすべて、ＤＭＳＯ中に溶解させた。スクリーニングの目的で、ビヒクル（０．００１％ＤＭＳＯ）又は各々２５若しくは５０μＭの化合物（使用濃度が５μＭ及び２５μＭであったベルベリンを除く）で２４時間にわたり細胞を処理した。上位６ヒットの確認のために、ビヒクル（０．００１％ＤＭＳＯ）又は各々５若しくは２５μＭのいずれかの化合物で２４時間にわたり細胞を処理した。遺伝子発現プロフィールのために、前の確認アッセイでよりよく作用すると考えられる濃度で、細胞を処理した。
【０２８６】
以前記載されている（Ｒｏｌｏ  Ａ．Ｐ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２００３  １６３７：１２７−１３２）ように、蛍光プローブ、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ミトコンドリア膜電位を測定した。手短には、暗所において、３７℃でＨＢＳＳバッファー中６．６μＭのＴＭＲＭを細胞に１５分かけてロードした。次に、上澄みを吸引した後、ＫＨＨで細胞を元の量に戻した。ＴＭＲＭは、ミトコンドリア膜電位に比例してミトコンドリア中に電気泳動的に蓄積する膜透過性陽イオン性フルオロフォアである（Ｅｈｒｅｎｂｅｒｇ  Ｂ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９８８  ５３：７８５−７９４）。細胞懸濁液（１０５細胞を含む２００μｌ）を９６ウェルプレートにロードした後、それぞれ４８５及び５９０ｎｍの励起及び発光波長を用いて、蛍光を測定した。カルボニルシアニドｐ−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）によって起こった完全脱分極を計算に入れて、ミトコンドリア膜電位を推定した。
【０２８７】
ｍｔＤＮＡ分析のために、ＤＮｅａｓｙ血液及び組織キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、全ＤＮＡを抽出した。ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼサブユニット２（ＣＯＸ２）遺伝子に特異的なプライマーを用いて、ｍｔＤＮＡを増幅した後、リボソームタンパク質ｓ１８（ｒｐｓ１８）核遺伝子の増幅によってゲノムＤＮＡに正規化した。プライマーは、ＩＤＴソフトウエア（ＩＤＴ）を用いて、設計した。
【０２８８】
市販のキットを用いたルシフェラーゼアッセイにより、製造者の指示（Ｒｏｃｈｅ）に従い、ＡＴＰ含量を測定し、各サンプル中のタンパク質含量に正規化した。
【０２８９】
蛍光プローブＮ−ノニルアクリジンオレンジ（ＮＡＯ）を用いてミトコンドリア質量を評価した。手短には、暗所にて、３７℃で、１０ｎＭのＮＡＯを含む培地中で３０分間細胞をインキュベートした。次に、細胞をトリプシン処理し、ＮＡＯを含まない培地中で再懸濁させた。その後、４８８ｎｍレーザを用いて、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのフローサイトメトリーにより、ＮＡＯ蛍光強度を決定した。
【０２９０】
遺伝子発現分析のために、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、骨格筋組織及びＣ２Ｃ１２細胞からのＲＮＡを、指示に従い抽出し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。２００ｎｇのＲＮＡを用いて、ｉＳＣＲＩＰ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｒａｄ）でｃＤＮＡを合成した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０検出装置（Ｒｏｃｈｅ）において１μＭのプライマーとＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、定量ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。内部標準としてアクチンを用いて、比較方法（２−△△ＣＴ）により計算を実施した。プライマーは、ＩＤＴソフトウエア（ＩＤＴ）を用いて、設計した。
【０２９１】
ＣＤ３８を阻害することがわかっている数種の生体エネルギー物質が、ベースライン（ＤＭＳＯのみ）を超える活性を生成し、プラスの結果として評点されたが、このようなものとして、アピゲニン、ルテオリン、チルホスチン８、ベベリン及びＳＲＴ−１７２０が挙げられる。従って、これらの生体エネルギー物質は、ミトコンドリアパラメータを有益な様式で増加することがわかった。
【０２９２】
アピゲニン、ルテオリン、ベルベリン、及びチルホスチン８などの生体エネルギー物質は、ＮＡＤ＋レベルを高めると共に、ミトコンドリアパラメータを有益な様式で増加することが証明された。一実施形態では、このような物質は、化学療法、老化及び未成熟卵巣不全に関連する雌性不妊の治療のための雌性生殖細胞を増強する上で有用である。
【０２９３】
実施例１０：ミトコンドリアのＦＡＣＳによる単離
本実施例に記載するように、ＦＡＣＳによる方法は、組織内の全ミトコンドリア集団を単離するのに用いることができる。さらに、ミトコンドリア単離のためのＦＡＣＳによる方法は、機能性（例えば、活発に呼吸する）ミトコンドリア集団だけを単離するために、又は組織、細胞、溶解細胞若しくはそれらから得た画分における全ミトコンドリアに対する機能性ミトコンドリアの比率を定量するために、２つの異なる蛍光色素（ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）依存性及びＭＭＰ非依存性）を用いて、二重標識を用いることもできる。
【０２９４】
ミトコンドリア塊を示す非酸化依存性Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｍ７５１４）ミトコンドリア追跡用プローブを、以下に記載するように作製し、使用した。Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ原液（無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた１〜５ｍｇ／ｍｌ）を２５〜５００ｎＭの使用濃度に達するまで、無血清増殖培地に希釈した。新しく単離又は解凍したＯＳＣを５分間の３００ｘｇの遠心分離によりペレット化した。上澄みを吸引して、細胞ペレットを２００μｌの希釈Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ原液中に再懸濁させた。
【０２９５】
細胞を３７℃で４５分インキュベートし、予熱（３７℃）した無血清増殖培地で洗浄した後、５分間の３００ｘｇの遠心分離によりペレット化した（あるいは、目的のプローブとのインキュベーション前に、細胞を溶解させてもよい）。上澄みを吸引して、細胞ペレットを１００μｌのミトコンドリア溶解バッファー中に再懸濁させた後、急速な浸透圧刺激を用いた機械的透過処理による溶解のために、ＦＡＣＳソートチューブに移した。溶解後に、細胞を氷上で１５〜３０分平衡させ、２００μｌの（最小量）氷冷ＰＢＳ中でインキュベートした後、ボルテクスした。図３６に示すように、３つの異なる集団：残留Ｍ７５１４陽性細胞（細胞ＭＴ＋）、高蛍光ミトコンドリア（機能性、Ｍｉｔｏ  ＭＴ高）、及び低発現ミトコンドリア（非機能性、Ｍｉｔｏ  ＭＴ低）が観察された。溶解後の機能性ミトコンドリアと非機能性ミトコンドリアの比は、約１：１であった（１５５２ミトコンドリア；７４３は、機能性としてゲーティングし、７１６は、非機能性としてゲーティングした；蓄積。図３６では、集団の周辺にゲートが描かれている）。従って、機能性ミトコンドリアを選別及び収集し、残る非溶解細胞及び非機能性ミトコンドリアを大きさ及び蛍光強度に基づいて排除することができる。複数のプローブ又はＪＣ−１プローブ（赤色スペクトル；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔ３１６８）を用いた二重標識は、非機能性ミトコンドリアから機能性ミトコンドリアをさらに識別するのに役立てることができる。二重標識に用いるためのプローブとしては、限定するものではないが、低酸化状態ミトトラッカー（ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）プローブ（例えば、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭ−Ｈ２ＸＲｏｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍ７５１３）、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ＣＭ−Ｈ２ＴＭＲｏｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍ７５１１）、並びに蓄積依存性プローブ：ＪＣ−１プローブ（赤色スペクトル；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔ３１６８）、Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ  ＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍ２２４２６）及びＪＣ−１（緑色スペクトル；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔ３１６８）が挙げられる。
【０２９６】
実施例１１：分画遠心分離法を用いたミトコンドリアの単離
本実施例に記載するように、組織中に存在するミトコンドリアを単離及び／又は分画するために、分画遠心分離法を用いることができる。任意の組織又は細胞からミトコンドリアを単離する場合の基本的ステップは、以下の通りである：（ｉ）機械及び／又は化学的手段により細胞を破砕するステップ、（ｉｉ）低速で分画遠心分離を実施することにより、残屑及び極めて大きな細胞小器官（ＳＰＩＮ１）を除去するステップ、並びに（ｉｉｉ）より高速で分画遠心分離を実施することにより、ミトコンドリア（ＳＰＩＮ２）を単離して、回収するステップ。
【０２９７】
組織を計量し、１．５ｍｌの市販の洗浄バッファー（Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ）（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄する。組織を細かく刻み、予冷したダウンス型（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーに導入する。２．０ｍｌまでの市販の単離バッファー（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を添加する。ダウンス型（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーを用いて細胞を破砕し（２０〜４０行程）、ホモジネートをエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブに移す。各チューブを単離バッファーで２．０ｍｌまで充填する。４℃で、ホモジネートを１，０００ｇで１０分間遠心分離する。上澄みを保存し、新しいチューブに移し、これらチューブを各々、単離バッファーで２．０ｍｌまで充填する。４℃で、チューブを１２，０００ｇで１５分間遠心分離する。ペレットを保存する。所望であれば、質について上澄みを分析する。１０μｌの市販のプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した１．０ｍｌの単離バッファーに再懸濁させることにより、ペレットを２回洗浄する。４℃で、チューブを１２，０００ｇで１５分間遠心分離する。洗浄後、ペレットを合わせて、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した５００μｌの単離バッファーに再懸濁させる。所望であれば、使用までアリコートを−８０℃で保存する。
【０２９８】
一手法では、市販の抗体、例えば、ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓのＭＳＡ０６、ＭＳＡ０３、及びＭＳＡ０４を用いて、上澄み画分中のものに対する単離ミトコンドリア中のシトクロムｃ、ポリン、若しくはシクロフィリンＤをウェスタンブロットスクリーニングすることにより、ミトコンドリアの統合性を試験する。別の手法では、例えば、市販のＯＸＰＨＯＳ複合体検出（Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）カクテル（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ミトコンドリアのサンプルをウェスタンブロットによりプロービングして、ミトコンドリア複合体の成分を検出する。
【０２９９】
実施例１２：ショ糖密度勾配分離法を用いたミトコンドリアの単離
このプロトコルは、市販されている以下の試薬：ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ラウリルマルトシド；ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＭＳ９１０）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ショ糖溶液１５、２０、２５、２７．５、３０及び３５％、再蒸留水、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、及び１３×５１ｍｍポリアロマー遠心分離管（Ｂｅｃｋｍａｎ  ３２６８１９）を使用する。
【０３００】
ショ糖密度勾配分離法は、ミトコンドリアのために最適化されたタンパク質細分画方法である。この方法は、サンプルを少なくとも１０の画分に分離する。可溶化した全細胞をはるかに複雑性の低い画分に分離することができるが、すでに単離したミトコンドリアを分析する場合には、これらの画分はさらに単純化される。ショ糖密度勾配分離法は、５ｍｇ／ｍｌタンパク質で０．５ｍｌまでの初期サンプル量のために設計されている。従って、２．５ｍｇ以下の全タンパク質を用いる必要がある。これより大きい量の場合には、複数の勾配を調製するか、又はより大きなスケールの勾配を作ることができる。
【０３０１】
サンプルを非イオン性界面活性剤中で可溶化させる。このタンパク質濃度で、ミトコンドリアは、２０ｍＭ  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（１％ｗ／ｖラウリルマルトシド）により完全に可溶化することがわかっている。この可溶化の工程で重要なのは、事前に膜包埋したマルチサブユニットＯＸＰＨＯＳ複合体をインタクトに維持しながら、膜を破砕することであり、これは、本明細書に記載するショ糖密度勾配分離法に必要なステップである。１つの重要な例外は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＰＤＨ）である。５ｍｇ／ｍｌミトコンドリアのタンパク質濃度で、ＰＤＨを単離するために、必要な界面活性剤の濃度は、わずか１０ｍＭ（０．５％）ラウリルマルトシドである。また、ＰＤＨ酵素もまた、より低い速度で遠心分離すべきであり、ＰＤＨ複合体には、１６，０００ｇの遠心力が最大である。
【０３０２】
ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌタンパク質のミトコンドリア膜懸濁液に、ラウリルマルトシドを１％の最終濃度まで添加する。これを十分に混合し、３０分氷上でインキュベートする。次に、混合物を７２，０００ｇで３０分間遠心分離する。小サンプル量には、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｏｐｔｉｍａベンチトップ超遠心機が推奨される。しかし、最低でも、最大速度（例えば、約１６，０００ｇ）のベンチトップ微量高速遠心機で十分なはずである。遠心分離後、上澄みを回収し、ペレットを廃棄する。プロテアーゼ阻害剤カクテルをサンプルに添加して、これを遠心分離の実施まで氷上に維持する。ミトコンドリアが非常に豊富なサンプルでは、複合体ＩＩＩ及びＩＶ中のシトクロムが、上澄みに褐色の色を与えうるが、これは、後の分離の有効性を確認する際に有用である。
【０３０３】
順次密度を下げてショ糖溶液を次々と重ねることにより、不連続ショ糖密度勾配を調製する。１５〜３５％のショ糖溶液を含む不連続勾配の調製及び遠心分離を以下に説明する。この勾配は、ミトコンドリアＯＸＰＨＯＳ複合体（密度２００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ）の良好な分離をもたらす。しかし、この設定は、特定の複合体の分離又はより大きな量の材料の分離のために変更することができる。
【０３０４】
次第に密度を下げてショ糖溶液を次々と重ねることにより、勾配を調製する；そのために、適用する第１の溶液は、３５％ショ糖溶液である。溶液の安定した適用によって、最も再現性の高い勾配が得られる。この適用を補助するために、Ｂｅｃｋｍａｎポリアロマー管をチューブスタンドにまっすぐに立てる。次に、２００μｌピぺットの先端を、１０００μｌピぺットの先端に配置する。ぴったりと合わせた両先端をクランプスタンドで固定し、黄色い先端の末端を管の内壁と接触させる。次に、ショ糖溶液を青い先端の内部に導入し、ゆっくりと且つ着実に管内に供給するが、その際、３５％溶液（０．２５ｍｌ）から開始する。
【０３０５】
３５％溶液を管内に排出したら、３０％溶液（０．５ｍｌ）を管内の３５％溶液の上にロードする。この手順を２７．５％（０．７５ｍｌ）、２５％（１．０ｍｌ）、２０％（１．０ｍｌ）及び１５％（１．０ｍｌ）でそれぞれ続ける。管の上部に、０．５ｍｌの可溶化ミトコンドリアのサンプルを添加する十分なスペースを残しておく。
【０３０６】
ショ糖密度勾配が注ぎ込まれたら、それぞれのショ糖層を肉眼で見ることができる。勾配の上部にサンプルを導入した後、非常に注意深く管をロータに装着し、遠心分離を開始する。全ての遠心分離工程で、均衡のとれたロータが要求され、従って、厳密に同じ質量を含むもう１つの管が得られる。実際には、これは、２つの勾配を調製しなければならないことを意味するが、第２の勾配は、実験サンプルを含む必要はなく、０．５ｍｌのタンパク質サンプルの代わりに、０．５ｍｌの水を含んでよい。
【０３０７】
ポリアロマー管は、スイングバケットＳＷ５０．１型ロータ（Ｂｅｃｋｍａｎ）において３７，５００ｒｐｍ（相対遠心力平均１３２，０００ｘｇ）で、加速プロフィール７及び減速プロフィール７を用いて、４℃で１６時間３０分にわたり遠心分離する必要がある。実施直後に、ショ糖層を乱さないように細心の注意を払いながら、管をロータから取り外さなければならない。ミトコンドリアを豊富に含むサンプルを分離すると、異なる色のタンパク質層が観察される。最も一般的には、これらは、管の底部から約１０ｍｍ地点の複合体ＩＩＩ（５００ｋＤａ：褐色）と、管の底部から２５ｍｍ地点の複合体ＩＶ（２００ｋＤａ：緑色）である。また、それ以外のバンドが観察される場合もある。これらは、別のＯＸＰＨＯＳ複合体である。
【０３０８】
画分の回収のために、クランプスタンドを用いて、管を一定かつまっすぐに維持する。細い針を用いて、管の最も底部に小さな孔をあける。この孔は、ショ糖溶液を毎秒約１滴を滴下させるのにちょうどの大きさである。あけた孔から、等量の画分をエッペンドルフチューブ中に回収する。合計１０×０．５ｍｌの画分が適切であるが、これより多い画分（従って、量はこれより小さい）も可能である（例えば、２０×０．２５ｍｌの画分）。画分は、分析まで−８０℃で保存する。本明細書に記載した方法（例えば、実施例９、１０）又は当分野で公知の方法のいずれかを用いて、ミトコンドリアの統合性を決定するために、回収した画分を分析する。
【０３０９】
実施例１３：ＮＡＤ＋レベルを高める物質が卵母細胞生産を増大する
図３７に示すように、ＮＡＤ＋は、以下の３つの主要な経路により合成される：（ｉ）ＮＡＤサルベージ経路（ＮＡＭＰＴ及びＮＭＮＡＴ１−３を介してニコチンアミド、ＮＡＭからＮＭＮへ、ＮＭＮからＮＡＤ＋へ）；（ｉｉ）トリプトファンから、デノボ経路を介し、キノリン酸を介して（図３８）；及び（ｉｉｉ）乳汁及びその他の食品に存在する分子である、ニコチンアミドリボシドから（図３８）。近年まで、ＮＡＤ＋は、単純に、電子を１つの反応から別の反応へと運搬する補酵素としてみなされていた。現在、ＮＡＤ＋は、低カロリー摂取の主要なシグナルであり、主に、サーチュインの活性を刺激することにより、主要な代謝経路の活性を調整することが発見された。２つの重要な下流媒介物質が、ＳＩＲＴ１（核サーチュイン）及びＳＩＲＴ３（ミトコンドリアサーチュイン）であり、これらは、相乗的に作用して、空腹及び運動に応答して、心臓及び骨格筋において呼吸及び脂肪酸酸化を増加する。卵原幹細胞では、ＳＩＲＴ１は、卵原幹細胞の卵母細胞への分化を調節する重要な転写因子の発現を制御する。
【０３１０】
しかし、老化と共に、核及びミトコンドリア中のＮＡＤ＋レベルは低下するため、これら２つのサーチュインの活性が低減し、ミトコンドリア機能を著しく損なう。ＮＡＤ＋レベルは、ＮＭＮなどのＮＡＤ前駆物質と一緒に細胞をインキュベートすることにより（例えば、図３９）、ＮＡＤ前駆物質をｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に注射若しくは送達することにより（図４２）、ＮＡＤ＋を合成する遺伝子、例えば、ＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１−３の発現を増大することにより；又はＰＡＲＰ若しくはＣＤ３８阻害を介して、ＮＡＤ分解を阻害することにより、実施することができる。（図３７参照）。ＣＤ３８阻害剤としては、限定するわけではないが、上の表２Ａ及び２Ｂに記載したものがあり、また、Ｄｏｎｇ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１１（９）：３２４６−３２５７及びＫｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２０１１  ２１（１３）：３９３９−４２（これらの文献の内容は、参照として本明細書に組み込む）に記載されている。細胞中のＮＡＤ＋の増加は、他の方法、例えば、ＴＣＡ回路のための基質（例えば、ピルビン酸塩、脂肪酸）の適用などにより達成することができる。ＮＡＤ＋レベルを高め、及び／又はサーチュインを活性化する遺伝子及び小分子が、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで、雌性受精能に対する老化及び細胞ストレス／損傷の作用を遅延若しくは逆転させるかどうかを決定するために、以下の実験を実施した。
【０３１１】
ＦＡＣＳによる選別プロトコルを用いて、摘出した卵巣から卵原幹細胞を単離して、混入卵母細胞のないＯＳＣを精製した（詳しくは、実施例１を参照）。細胞を以下から構成される培地中に維持した：最少必須培地α（ＭＥＭα）、１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−ｌ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍｌ−１ＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１ＸＮ−２ＭＡＸ  Ｍｅｄｉａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒ＆Ｄ）、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（上皮増殖因子、ヒト組換え；Ｇｉｂｃｏ）、４０ｎｇ／ｍｌのヒトＧＤＮＦ（グリア細胞系由来神経栄養因子；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、１ｎｇ／ｍｌのヒトｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子；Ｇｉｂｃｏ）。
【０３１２】
全実験のために、２５，０００個の細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに配置した。細胞を２４時間かけて結合させた後、ＮＭＮ（β−ニコチンアミドモノヌクレオチド；Ｓｉｇｍａ）で処理した。別途記載のない限り、ＮＭＮは、細胞に２回添加した。すなわち、まず１２時間の時点で添加し、次に、分析の６時間前に再度添加した（１２＋６時間）。以下のように、ミトコンドリアＤＮＡコピー数を分析した。ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従い、表示した時点で細胞から全細胞ＤＮＡを単離した。Ｒｏｃｈｅ  ４８０ＰＣＲ装置で、以下のプライマーを使用し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ミトコンドリアＤＮＡコピー数を定量した。
ＭＴ−ＮＤ２：
Ｆ：ＡＡＧＧＧＡＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＣＡＴＡ
Ｒ：ＡＧＴＣＣＴＣＣＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＡＴ
ＲＰＳ１８核
Ｆ：ＣＣＡＧＡＧＧＴＴＧＣＡＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧ
Ｒ：ＴＡＡＧＧＣＣＧＡＴＡＡＧＧＣＡＡＡＣＧＡＡ
ＮＭＮでの処理後、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を用いて、製造者の指示に従い、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨレベルを測定した。細胞中及びｉｎ  ｖｉｖｏでＮＡＤ＋レベルが上昇すると、ミトコンドリア機能及びミトコンドリア含量が劇的に増加したが、これは、一般に、雌性受精能、代謝健全性、脳機能、心臓血管の健全性及びグルコース代謝／ＩＩ型糖尿病の主な決定因子として認識されている。ＮＡＤ前駆物質（例えば、ニコチンアミドリボシド、すなわち「ＮＭＮ」、図３８を参照）で処理したＯＳＣ及び卵母細胞は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤ＋：ＮＡＤＨ、及びミトコンドリアＤＮＡ含量が増加した（図４０）。
【０３１３】
ＮＡＤ＋レベルの増加が、卵母細胞生産に影響をもたらしたかどうかを決定するために、自発的卵母細胞形成をアッセイした。２４ウェルプレートの各ウェルに２５，０００個のＯＳＣを接種した。接種後２日目と、ＮＭＮ処理からの表示時点で、ウェル毎に、形成されて培地中に放出された卵母細胞の数を評価した。ＮＭＮ処理によって、卵形成（ＥＦＡ）率が増加した（図３７、３８及び４１）。これらの結果に基づき、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＡＤ＋を増加させる化合物及び遺伝子は、雌性被検者のミトコンドリア損傷、エネルギー欠乏、及び卵巣の老化に関連する不妊を軽減若しくは逆転すると予想される。ＮＭＮ処理はまた、ＯＣＳＯＣＳ、卵母細胞、顆粒膜細胞、及び卵巣の血管の機能を増強することも予想される。
【０３１４】
ＮＡＤ＋レベルを増加させるＮＭＮ又はその他の化合物は、雌性被検者における受精能を増大するか、あるいは、不妊を軽減若しくは逆転させる上で有用である。一実施形態では、被検者が受胎し、健康な子孫を出産する確率を高めるために、このような化合物を、経口、腹腔内注射（ＩＰ），又は皮下経路により被検者に送達する。ＮＡＤ＋前駆物質であるＮＭＮの全身投与によって、幼若及び老齢マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでＮＡＤ＋レベルが上昇した。心臓［ＮＡＤ＋］は加齢と共に低下する。このＮＡＤ＋低下は、ＮＭＮ処理によって逆転した（ｎ＝３；１週間にわたり、２００ｍｇ．ｋｇ．ｄ．Ｉ．Ｐ．）（図４２）。ＮＭＮ処理は、ミトコンドリア機能の回復作用も有していた（図４３）。別の実施形態では、ＮＡＤ＋レベルを増加するＮＭＮ及びその他の化合物をＯＳＣ、卵母細胞、胞胚、精子、若しくは単離したミトコンドリアにｉｎ  ｖｉｔｒｏで送達する。例えば、このような化合物をＩＶＦの前、その過程で、又はその後、生殖細胞に送達する。別の実施形態では、本発明の化合物を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＯＳＣ、卵母細胞、胞胚、精子、若しくは単離したミトコンドリアからのミトコンドリアの回収率若しくは保存を高める。
【０３１５】
実施例１４：アピゲネニン、ルテオリン、及びＳＲＴ１７２０の経口接種は、老齢雌性における卵母細胞の質を改善する
雌マウス（８月齢、Ｃ５７ＢＬ／６系列）を１２：１２明暗周期で維持し、水及び餌を自由に摂取させた。室内の条件は、５０％±２０％相対湿度で、２１℃±１℃に維持した。マウスは、８．５月齢で実験飼料に付し、３ヵ月間その飼料を維持した。飼料は全て注文品であり、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓから注文した：ＯｐｅｎＳｔａｎｄａｒｄ  Ｄｉｅｔ（２０ｋカロリー％タンパク質、１５ｋカロリー％脂肪及び６５ｋカロリー％炭水化物）。また、実験グループは、通常のＯｐｅｎＳｔａｎｄａｒｄ  Ｄｉｅｔ、ＯｐｅｎＳｔａｎｄａｒｄ  Ｄｉｅｔ＋アピゲニン（体重１ｋｇ当たり０．５ｇ）、ＯｐｅｎＳｔａｎｄａｒｄ  Ｄｉｅｔ＋ルテオリン（体重１ｋｇ当たり０．５ｇ）、及びＯｐｅｎＳｔａｎｄａｒｄ  Ｄｉｅｔ＋ＳＲＴ−１７２０（体重１ｋｇ当たり２ｇ）から構成された。餌の摂取は、毎週測定し、平均増量を２週間毎に評価した。各実験グループは、１２匹のランダムに割り当てたマウスから構成された。マウスを安楽死させた場合には、別のグループの３月齢Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを正の対照として用いた。全てのグループにおいて、過排卵のためのホルモン刺激後に、卵母細胞を評価した。
【０３１６】
この実験で、１１．５月齢対照マウスは、あったとしても極めてわずかな卵母細胞しか排卵せず、アピゲニン、ルテオリン、及びＳＲＴ−１７２０は全て、卵母細胞回収率を高めることがみとめられた（図４４）。ＯｐｅｎＳｔａｎｄａｒｄ  Ｄｉｅｔを給餌した１２Ｍ対照グループは、後の分析のために十分な数の卵母細胞を排卵できなかった（約１．３卵母細胞／マウス、ｎ＝１２マウス）。老齢対照マウスからの卵母細胞の回収率が極めて低いため、１２月齢Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスからの卵母細胞の記録データ（「Ｈｉｓｔ  １２Ｍ」と呼ぶ；Ｓｅｌｅｓｎｉｅｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１１  Ｊｕｌｙ  ２６；１０８（３０）：１２３１９−１２３２４から）を老齢対照グループについての別の基準点として用いてもよい。
【０３１７】
アピゲニン、ルテオリン、及びＳＲＴ−１７２０は、年齢相応の対照（Ｈｉｓｔ  １２Ｍ）と比較して、過排卵後に採取した成熟した第二分裂中期卵細胞の割合に影響を及ぼさないこともわかった。図４５Ａでは、第二分裂中期に評価した卵母細胞の割合を示す。図４５Ｂには、卵核胞（未成熟）期で停止した卵母細胞の割合を示す。図４５Ｃには、閉鎖（死滅）卵母細胞の割合を示す。
【０３１８】
また、アピゲニン、ルテオリン、及びＳＲＴ−１７２０は、年齢相応の対照（Ｈｉｓｔ  １２Ｍ）と比較して、老齢マウスにおける卵母細胞の質を改善することも確認された。図４６Ａでは、異常ミトコンドリアクラスター形成を呈示する卵母細胞の割合が、アピゲニン、ルテオリン、又はＳＲＴ−１７２０給餌マウスにおいて減少したことが明らかである（方法は、Ｓｅｌｅｓｎｉｅｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１１  Ｊｕｌｙ  ２６；１０８（３０）：１２３１９−１２３２４に記載されている）。図４６Ｂ及び４６Ｃでは、それぞれ、アピゲニン、ルテオリン、又はＳＲＴ−１７２０給餌マウスが、ＭＩＩ卵母細胞において紡錘体異常の割合の低下及び染色体のミスアラインメントの減少を示すことがわかる。紡錘体異常及び染色体のミスアラインメントを決定する方法は、上の実施例８に記載されている。異常なミトコンドリア分布は、３Ｍマウス由来の卵母細胞の１６．１３％、Ｈｉｓｔ  １２Ｍマウス由来の卵母細胞の４６％、アピゲニン添加後の卵母細胞の７．７％、ルテオリン添加後の卵母細胞の１２％、ＳＲＴ−１７２０添加後の卵母細胞の６．９％に、存在することがわかった。紡錘体異常は、３Ｍマウスの卵母細胞の１８．３％、Ｈｉｓｔ  １２Ｍマウスの卵母細胞の６０％、アピゲニン添加後の卵母細胞の３２％、ルテオリン添加後の卵母細胞の３２％、ＳＲＴ−１７２０添加後の卵母細胞の３２．８％に、存在することがわかった。染色体ミスアラインメントは、３Ｍマウスの卵母細胞の１８．３％、Ｈｉｓｔ  １２Ｍマウスの卵母細胞の６２％、アピゲニン添加後の卵母細胞の４４％、ルテオリン添加後の卵母細胞の４０％、ＳＲＴ−１７２０添加後の卵母細胞の４０．９％に、存在することがわかった。
【０３１９】
他の実施形態
以上の説明から、本発明を様々な用途及び条件に合わせるために、本明細書に記載した本発明に、改変及び変更を実施しうることは明らかであろう。このような実施形態も、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【０３２０】
ある変数のいずれかの定義における要素を列挙した記載は、いずれか単一の要素として、又は列挙された要素のあらゆる組合せ（若しくは部分的組合せ）としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の記載は、いずれかの単一実施形態として、又はいずれか他の実施形態又はその一部との組合せとしてのその実施形態を含む。
【０３２１】
本出願は、２０１１年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／４７５，５６１号明細書及び２０１２年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／６００，５０５号明細書及び２０１１年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／５０２，５８８号明細書、並びに２０１２年４月１３日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／３３６４３号明細書に関連すると思われる主題を含む。尚、これらの文献は、その全開示内容を参照として本明細書に組み込むものとする。本明細書に記載するあらゆる特許及び刊行物は、あたかも各々の独立した特許及び刊行物が、参照として本明細書に組み込まれることを明示的かつ個別に示されているのと同じ程度まで、参照として本明細書に組み込むものとする。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月21日(2018.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又はそれ以上の生体エネルギー物質を雌性の哺乳動物である対象の卵母細胞又は卵原幹細胞（ＯＳＣ）の生体エネルギー状態を増強するのに有効な量で含有し、雌性の哺乳動物である対象の受精能を改善する方法、雌性の哺乳動物である対象について体外受精する方法、胚発育の持続を必要とする妊娠中の雌性哺乳動物である対象において胚発育を持続させる方法、卵巣機能の回復又は増加を必要とする雌性の哺乳動物である対象において卵巣機能を回復又は増加させる方法、及び雌性の哺乳動物である対象から採取してその組織又はその細胞を調製する方法からなる群より選択される方法に用いるための医薬組成物。
【請求項２】
受精能の改善を必要とする雌性の哺乳動物である対象の受精能を改善する方法に用いるための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
体外受精を必要とする雌性の哺乳動物である対象について体外受精する方法に用いるための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
胚発育の持続を必要とする妊娠中の雌性哺乳動物である対象において胚発育を持続させる方法に用いるための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
卵巣機能の回復又は増加を必要とする雌性の哺乳動物である対象において卵巣機能を回復又は増加させる方法に用いるための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
雌性の哺乳動物である対象から採取してその組織又はその細胞を調製する方法に用いるための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＯＳＣが、非胚性幹細胞であり、有糸分裂能があり、且つＶａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、Ｓｔｅｌｌａ及び任意選択でステージ特異的胎児抗原を発現する、請求項１〜６の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
医薬組成物が、雌性の哺乳動物である対象に全身投与又は局所投与されることを特徴とする、請求項１〜７の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
医薬組成物が、さらに薬学的に許容される担体を含有してなる、請求項１〜８の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
生体エネルギー物質が、ＣＤ３８阻害剤、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）前駆物質、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜９の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
生体エネルギー物質が、ＣＤ３８阻害剤及びＮＡＤ前駆物質を含有してなる、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ＣＤ３８阻害剤が、１−［（２−アセトキシエトキシ）メチル］−３−（アミノカルボニル）−塩化ピリジニウム、１−［（２−ベンジルオキシエトキシ）メチル］−３−（アミノカルボニル）−塩化ピリジニウム、１−｛［２−（４−メトキシ−フェノキシ）エトキシ］メチル｝−３−（アミノカルボニル）−塩化ピリジニウム、１−｛［２−（４−フェノキシ−フェノキシ）エトキシ］メチル｝−３−（アミノカルボニル）−塩化ピリジニウム、１−｛［２−（４−ニトロ−フェノキシ）エトキシ］メチル｝−３−（アミノカルボニル）−塩化ピリジニウム、１−｛［２−（３−トリフルオロメチル−フェノキシ）エトキシ］メチル｝−３−（アミノカルボニル）−塩化ピリジニウム、１−｛［２−（８’−キノリルオキシ）エトキシ］メチル｝−３−（アミノカルボニル）−塩化ピリジニウム、１，２−ジメトキシ−エチレン−ビス−Ｎ，Ｎ’−３−（アミノカルボニル）−二塩化ピリジニウム、１，４−ジメトキシ−ブチレン−ビス−Ｎ，Ｎ’−３−（アミノカルボニル）−二塩化ピリジニウム、１，４−ジメトキシ−ブチン−ビス−Ｎ，Ｎ’−３−（アミノカルボニル）−二塩化ピリジニウム、１，４−ジメトキシ−ヘキサメチレン−ビス−Ｎ，Ｎ’−３−（アミノカルボニル）−二塩化ピリジニウム、（Ｅ）−１−｛［４−（８’−キノリルオキシ）ブト−２−エニルオキシ］メチル｝−３−（アミノカルボニル）−塩化ピリジニウム、１−｛［２−（４−フェノキシ−フェノキシ）エトキシ］メチル｝−６−（アミノカルボニル）−塩化キノリニウム、１−｛［２−（４−フェノキシ−フェノキシ）エトキシ］メチル｝−３−（アミノカルボニル）−４−アミノ−塩化ピリジニウム、ルテオリニジン、クロマニン、ルテオリン、デルフィニジン、ペラルゴニジン、マルビジン、ケルセタゲチニジン、ペオニジン、ミリセチン、シアニジン、ジオスメチニジン、ケルセチン、ロビネチン、ペツニジン、フィセチン、フィセチニジン、ケルセタゲチン、ｒａｃ−タキシフォリン、ｒａｃ−カテキン、ピセアタンノール、レスベラトロール、アピゲニン、チルホスチン−８、ベルベリン及びＳＲＴ−１７２０からなる群より選択される化合物である、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＮＡＤ前駆物質が、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド及びニコチン酸からなる群より選択される化合物である、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ＣＤ３８阻害剤が、アピゲニン、ルテオリン、チルホスチン−８、ベルベリン及びＳＲＴ−１７２０からなる群より選択される化合物であり、ＮＡＤ前駆物質が、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド及びニコチン酸からなる群より選択される化合物である、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
雌性の哺乳動物である対象が、母体年齢が高い女性、卵母細胞に関連する不妊症に罹っている女性、低い卵巣予備能を有する女性、未成熟卵巣不全に罹っている女性、及び化学療法による不妊に罹っている女性からなる群より選択されるヒトの女性である、請求項１〜１４の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
１又はそれ以上の生体エネルギー物質が、雌性の哺乳動物である対象の卵母細胞又はＯＳＣに含まれる機能性ミトコンドリアの数を増加させるのに有効な量で含まれる、請求項１〜１５の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
１又はそれ以上の生体エネルギー物質が、雌性の哺乳動物である対象の卵母細胞又はＯＳＣのミトコンドリアエネルギーを増大させるのに有効な量で含まれる、請求項１〜１６の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
１又はそれ以上の生体エネルギー物質が、雌性の哺乳動物である対象の卵母細胞又はＯＳＣの細胞エネルギーを増大させるのに有効な量で含まれる、請求項１〜１７の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
１又はそれ以上の生体エネルギー物質が、卵母細胞の質、ＯＳＣの質、デノボ生産又は排卵される卵母細胞の回収率を改善するのに有効な量で含まれる、請求項１〜１８の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ＣＤ３８阻害剤が、濃度≧２５μＭで含まれる、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ＮＡＤ前駆物質が、濃度≧１００μＭで含まれる、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５０】
【表３】
2019030326.tif 000124
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５１】
【表４】
2019030326.tif 000125
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７９】
【表５】
2019030326.tif 000126
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９１】
ＣＤ３８を阻害することがわかっている数種の生体エネルギー物質が、ベースライン（ＤＭＳＯのみ）を超える活性を生成し、プラスの結果として評点されたが、このようなものとして、アピゲニン、ルテオリン、チルホスチン８、ベルベリン及びＳＲＴ−１７２０が挙げられる。従って、これらの生体エネルギー物質は、ミトコンドリアパラメータを有益な様式で増加することがわかった。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１２】
全実験のために、２５，０００個の細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに配置した。細胞を２４時間かけて結合させた後、ＮＭＮ（β−ニコチンアミドモノヌクレオチド；Ｓｉｇｍａ）で処理した。別途記載のない限り、ＮＭＮは、細胞に２回添加した。すなわち、まず１２時間の時点で添加し、次に、分析の６時間前に再度添加した（１２＋６時間）。以下のように、ミトコンドリアＤＮＡコピー数を分析した。ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従い、表示した時点で細胞から全細胞ＤＮＡを単離した。Ｒｏｃｈｅ  ４８０ＰＣＲ装置で、以下のプライマーを使用し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ミトコンドリアＤＮＡコピー数を定量した。
ＭＴ−ＮＤ２：
Ｆ：ＡＡＧＧＧＡＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＣＡＴＡ（配列番号７０）
Ｒ：ＡＧＴＣＣＴＣＣＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＡＴ（配列番号７１）
ＲＰＳ１８核
Ｆ：ＣＣＡＧＡＧＧＴＴＧＣＡＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧ（配列番号７２）
Ｒ：ＴＡＡＧＧＣＣＧＡＴＡＡＧＧＣＡＡＡＣＧＡＡ（配列番号７３）
ＮＭＮでの処理後、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を用いて、製造者の指示に従い、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨレベルを測定した。細胞中及びｉｎ  ｖｉｖｏでＮＡＤ＋レベルが上昇すると、ミトコンドリア機能及びミトコンドリア含量が劇的に増加したが、これは、一般に、雌性受精能、代謝健全性、脳機能、心臓血管の健全性及びグルコース代謝／ＩＩ型糖尿病の主な決定因子として認識されている。ＮＡＤ前駆物質（例えば、ニコチンアミドリボシド、すなわち「ＮＭＮ」、図３８を参照）で処理したＯＳＣ及び卵母細胞は、ＮＡＤ＋、ＮＡＤ＋：ＮＡＤＨ、及びミトコンドリアＤＮＡ含量が増加した（図４０）。
【外国語明細書】
2019030326000001.pdf