(57)【要約】      （修正有）【課題】高い分離能を有する電気泳動用ゲルを作製するために用いられるゲル分離能向上剤を提供する。【解決手段】下記の（１）および（２）のいずれか一つ以上の精製工程を含む：（１）ガラクトマンナン水溶液から上清を得る固液分離工程と、アルコール沈殿工程とを含む精製工程；（２）上記ガラクトマンナン水溶液に活性炭を加え、不純物を除去する工程を含む精製工程。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）および（２）のいずれか一つ以上の精製工程を含む、ゲル分離能向上剤の製造方法：
（１）ガラクトマンナン水溶液から上清を得る固液分離工程と、
上記上清をアルコール沈殿に供し、沈殿物を得るアルコール沈殿工程とを含む精製工程；
（２）上記ガラクトマンナン水溶液に活性炭を加え、不純物を除去する工程を含む精製工程。
【請求項２】
上記アルコール沈殿工程において、上記上清が酸性であることを特徴とする、請求項１に記載のゲル分離能向上剤の製造方法。
【請求項３】
上記アルコール沈殿工程において、エタノールを用いることを特徴とする、請求項１または２に記載のゲル分離能向上剤の製造方法。
【請求項４】
上記ガラクトマンナン水溶液の濃度が、０．３％〜２．０％であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のゲル分離能向上剤の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のゲル分離能向上剤の製造方法により得られる、ゲル分離能向上剤。
【請求項６】
請求項５に記載のゲル分離能向上剤とアガーとを含むことを特徴とする、電気泳動用ゲル。
【請求項７】
請求項６に記載の電気泳動用ゲルを用いることを特徴とする、電気泳動方法。
【請求項８】
請求項５に記載のゲル分離能向上剤とアガロースとを含むことを特徴とする、電気泳動用ゲル。
【請求項９】
請求項８に記載の電気泳動用ゲルと、ＧｅｌＲＥＤＴＭを含む電気泳動試料とを用いることを特徴とする、電気泳動方法。
【請求項１０】
請求項５に記載のゲル分離能向上剤を備える電気泳動用ゲル製造キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲル分離能向上剤の製造方法およびゲル分離能向上剤の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸またはタンパク質をそれらのサイズ（すなわち分子量）に応じて分離する場合には、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル等のゲルを用いた電気泳動方法が主に行われる。ゲルの作製の際には、ゲルの分離能に応じて好適なゲル濃度に調整する必要があり、操作が非常に煩雑である。このため、高い分離能を有する電気泳動用ゲルを簡便に得る方法が求められ、種々検討がなされている。
【０００３】
例えば、非特許文献１には、アガロースに特定の多糖類を組み合わせてゲルを作製する技術が開示されている。また、特許文献１には、ガンマ線を照射したガラクトマンナンをアガロースと組み合わせる技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第９２／１２７８９号（１９９２年８月６日公開）
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Perlman, D. et. al.，Anal. Biochem. 163，p.247-254，1987
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上述のような従来技術は、高い分離能を有する電気泳動用ゲルを簡便に得るという観点からは改善の余地があった。また、電気泳動用ゲルの作製の際には、分離したい電気泳動試料のサイズに応じて好適なゲル濃度に調整する必要があり、操作が非常に煩雑である。
【０００７】
本発明の一態様は、高い分離能を有する電気泳動用ゲルが得られるゲル分離能向上剤を簡易に製造する方法を実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を解決するために、本発明者が鋭意研究を行った結果、特定の工程を含む製造方法によって、高い分離能を有する電気泳動用ゲルが作製できるゲル分離能向上剤を提供できることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は以下の態様を含む。
〔１〕下記の（１）および（２）のいずれか一つ以上の精製工程を含む、ゲル分離能向上剤の製造方法：
（１）ガラクトマンナン水溶液から上清を得る固液分離工程と、
上記上清をアルコール沈殿に供し、沈殿物を得るアルコール沈殿工程とを含む精製工程；
（２）上記ガラクトマンナン水溶液に活性炭を加え、不純物を除去する工程を含む精製工程。
〔２〕上記アルコール沈殿工程において、上記上清が酸性であることを特徴とする、〔１〕に記載のゲル分離能向上剤の製造方法。
〔３〕上記アルコール沈殿工程において、エタノールを用いることを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載のゲル分離能向上剤の製造方法。
〔４〕上記ガラクトマンナン水溶液の濃度が、０．３％〜２．０％であることを特徴とする、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のゲル分離能向上剤の製造方法。
〔５〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のゲル分離能向上剤の製造方法により得られる、ゲル分離能向上剤。
〔６〕〔５〕に記載のゲル分離能向上剤とアガーとを含むことを特徴とする、電気泳動用ゲル。
〔７〕〔６〕に記載の電気泳動用ゲルを用いることを特徴とする、電気泳動方法。
〔８〕〔５〕に記載のゲル分離能向上剤とアガロースとを含むことを特徴とする、電気泳動用ゲル。
〔９〕〔８〕に記載の電気泳動用ゲルと、ＧｅｌＲＥＤＴＭを含む電気泳動試料とを用いることを特徴とする、電気泳動方法。
〔１０〕〔５〕に記載のゲル分離能向上剤を備える電気泳動用ゲル製造キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の一態様によれば、高い分離能を有する電気泳動用ゲルを作製するために用いられるゲル分離能向上剤が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１および比較例１の電気泳動の結果を示す図である。
【図２】実施例２および比較例２の電気泳動の結果を示す図である。
【図３】参考例１〜参考例３の電気泳動の結果を示す図である。
【図４】実施例３、実施例４、比較例３および参考例４の電気泳動の結果を示す図である。
【図５】実施例５および実施例６の電気泳動の結果を示す図である。
【図６】実施例７〜１１の電気泳動の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態の一例について詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されない。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【００１２】
本明細書において、電気泳動用ゲルを単に「ゲル」と称する場合もある。ゲル中にてサイズの異なる核酸のバンド間の距離が離れているほど、分離能が高いと言える。
【００１３】
〔１．ゲル分離能向上剤の製造方法〕
本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤の製造方法（本明細書中、「製造方法」とも称する）は、下記の（１）および（２）のいずれか一つ以上の精製工程を含む：
（１）ガラクトマンナン水溶液から上清を得る固液分離工程と、
上記上清をアルコール沈殿に供し、沈殿物を得るアルコール沈殿工程とを含む精製工程；
（２）上記ガラクトマンナン水溶液に活性炭を加え、不純物を除去する工程を含む精製工程。
【００１４】
本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤の製造方法は、上記の（１）および（２）のうち、（１）のみを含んでいてもよく、（２）のみを含んでいてもよく、（１）および（２）の両方を含んでいてもよい。なお、以下では上記の（１）の精製工程を「精製工程（１）」、上記の（２）の精製工程を「精製工程（２）」とも称する。
【００１５】
例えば、粗製ガラクトマンナンを用いてＤＮＡ電気泳動を行うと、ＤＮＡバンドは分離せず、ＤＮＡバンドのスメア（smearing of DNA bands）が観察される場合がある。この原因は、（ｉ）電気泳動試料中に、ＤＮＡの陽極への移動と競合する物質が混在すること、（ｉｉ）ＤＮＡと強い親和性のある物質が混在することにより、ＤＮＡの移動が妨げられること、および（ｉｉｉ）ガラクトマンナンと電気泳動用ゲルの原料（アガロース等）とで形成される分子ふるいが予想以上に細かく、陽極へのＤＮＡの移動が極めて困難になっていること等であると、発明者は考える。
【００１６】
本発明の一実施形態に係る製造方法により、核酸の陽極への移動と競合する物質およびＤＮＡと強い親和性のある物質を除去することができる。そのため、本発明の一実施形態に係る製造方法により得られるゲル分離能向上剤を用いることにより、高い分離能を有するゲルが作製できると、発明者は考える。
【００１７】
［１−１．精製工程］
本発明の一実施形態に係る製造方法は、下記の（１）および（２）のいずれか一つ以上の精製工程を含む：
（１）ガラクトマンナン水溶液から上清を得る固液分離工程と、
上記上清をアルコール沈殿に供し、沈殿物を得るアルコール沈殿工程とを含む精製工程；
（２）上記ガラクトマンナン水溶液に活性炭を加え、不純物を除去する工程を含む精製工程。
【００１８】
ガラクトマンナンは、Ｄ−マンノースがβ１→４結合して形成された直線状主鎖に、Ｄ−ガラクトースがα１→６結合した構造を有する多糖類である。ガラクトマンナンは、構成するマンノースとガラクトースの組成比（Ｍ／Ｇ）の違いにより３つに分類することができる。例えば、ローカストビーンガム由来のガラクトマンナンは、Ｍ／Ｇ＝４であり、タラガム由来のガラクトマンナンは、Ｍ／Ｇ＝３であり、グァーガム由来のガラクトマンナンは、Ｍ／Ｇ＝２であることが知られている。本発明の実施形態において、ガラクトマンナンは上述の３種類のガラクトマンナンのいずれであってもよい。
【００１９】
ガラクトマンナンは、精製された市販品を用いてもよい。ローカストビーンガム由来のガラクトマンナンの市販品としては、Locust bean gum from Ceratonia siliqua seeds（Sigma-Aldrich社製、平均分子量：３１０ｋＤａ）等が挙げられる。タラガム由来のガラクトマンナンの市販品としては、SP175（ユニテックフーズ製）等が挙げられる。グァーガム由来のガラクトマンナンの市販品としては、VIDOCREAM（ユニテックフーズ製）等が挙げられる。
【００２０】
ガラクトマンナン水溶液１００重量％におけるガラクトマンナンの濃度（すなわち、ガラクトマンナン水溶液の濃度）は、特に限定されないが、０．３〜２．０重量％が好ましく、１．０〜１．５重量％がより好ましい。ガラクトマンナン水溶液の濃度が上記範囲内であれば、ガラクトマンナン水溶液の粘度を上げ過ぎることなく、ガラクトマンナンを好適に溶解させることができる。
【００２１】
＜精製工程（１）＞
本発明の一実施形態に係る製造方法において、精製工程（１）は、ガラクトマンナン水溶液から上清を得る固液分離工程と、当該上清をアルコール沈殿に供し、沈殿物を得るアルコール沈殿工程とを含む。
【００２２】
（固液分離工程）
固液分離工程は、遠心分離、ろ過、等の公知の固液分離方法を用いて行うことができる。例えば、遠心分離により固液分離方法を実施する場合、遠心分離の条件（時間、温度、遠心力（×ｇ）等）は、上清の量および上清に含まれるガラクトマンナン水溶液の濃度等に応じて適宜決定すればよい。
【００２３】
遠心分離の時間は、例えば１００００×ｇの条件で遠心分離を行う場合、５分間〜３０分間であることが好ましい。また、遠心分離の温度は、０℃〜３０℃であることが好ましく、５℃〜２０℃であることがより好ましい。遠心分離の時間および温度が上記範囲内であれば、可溶物を含む上清と不溶物を含む沈殿物とを分離することができる。
【００２４】
また、例えば、ガラクトマンナン水溶液の濃度が、０．３〜２．０重量％の場合は、ナイロンメッシュシート(例えば、製品名；ナイロンメッシュシート230、TAITEC)を用いたろ過により固液分離方法を実施することもできる。
【００２５】
（アルコール沈殿工程）
本発明の一実施形態に係る製造方法は、上記固液分離工程により得られる上清をアルコール沈殿に供し、沈殿物を得る工程を含む。本明細書において、この工程は、「アルコール沈殿工程」とも称される。
【００２６】
アルコール沈殿工程は、常法により実施してもよい。アルコール沈殿工程は、例えば、以下の工程（ｉ）〜（ｉｖ）を含む。
（ｉ）上記上清に酢酸水溶液を加えることにより酸性溶液を得る工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）により得られる酸性溶液にアルコールを加える工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）により得られる溶液に遠心分離を行い、得られる沈殿物を回収する工程、および、
（ｉｖ）工程（ｉｖ）により得られる沈殿物を乾燥させ、ゲル分離能向上剤を得る工程。
【００２７】
工程（ｉ）では、上清を酸性にすることができればよい。そのため、上記酢酸水溶液の量は、上清の量および上清に含まれるガラクトマンナンの濃度等に応じて適宜決定すればよい。上記酸性溶液のｐＨは、ｐＨ２〜４が好ましい。酸性溶液に可溶な不純物がＤＮＡの陽極への移動と競合すると考えられるため、これらを除去する目的である。
【００２８】
工程（ｉｉ）において、上記アルコールは、例えば、エタノールおよびイソプロピルアルコール等であり、エタノールが好ましい。上記アルコールは、溶液の温度が５〜１５℃の冷却されたアルコールであってもよく、常温のアルコールであってもよい。上記アルコールの量は、上清の量、ガラクトマンナン水溶液の濃度、緩衝液の量およびアルコールの種類等に応じて適宜決定すればよい。例えば、工程（ｉ）において、ガラクトマンナン水溶液に酢酸水溶液を加えて酸性溶液を得て、さらにエタノールを加えてアルコール沈殿を行ってもよい。この場合、当該酸性溶液とエタノールの重量比（＝酸性溶液の重量：エタノールの重量）は、例えば、０．２５：１〜４：１であり、例えば、０．６：１である。
【００２９】
工程（ｉｉｉ）において、遠心分離の時間、遠心分離の速度および遠心分離の温度等の遠心分離条件は、上清の量および上清に含まれるガラクトマンナンの濃度等に応じて適宜決定すればよい。例えば、遠心分離の時間は、５〜２０分間であり、遠心分離の遠心力は、６０００×ｇ〜１００００×ｇであり、遠心分離の温度は、５℃〜２５℃である。
【００３０】
工程（ｉｉ）および工程（ｉｉｉ）を繰り返す回数は、特に限定されないが、例えば、１〜２回である。
【００３１】
工程（ｉｖ）は、得られる沈殿物を乾燥させる工程である。乾燥方法は、特に限定されず、自然乾燥、送風乾燥および加熱乾燥等が挙げられる。乾燥温度および乾燥時間は、得られた沈殿物の量等に応じて適宜決定すればよい。加熱乾燥の場合、例えば乾燥温度は、５０℃〜６０℃である。
【００３２】
＜精製工程（２）＞
本発明の一実施形態に係る製造方法において、精製工程（２）は、ガラクトマンナン水溶液に活性炭を加え、不純物を除去する工程を含む。精製工程（２）は、例えば、以下の工程（Ｉ）〜（ＩＶ）を含む。
（Ｉ）ガラクトマンナン水溶液に活性炭を加える工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ）により得られる溶液を放置する工程、
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）により得られる溶液を遠心分離する工程、および、
（ＩＶ）工程（ＩＩＩ）により得られる溶液から上清を回収する工程。
【００３３】
工程（Ｉ）において、活性炭の原料は、特に限定されず、例えば、マツ、竹および椰子殻等の植物、石炭ならびに石油等である。また、活性炭の形態は、特に限定されず、例えば、繊維状、ハニカム状、円柱状、破砕状、粒状、粉末状等である。不純物を効率よく除去するという観点からは、粉末状が好ましい。活性炭の添加量は、ガラクトマンナン水溶液の濃度および量等に応じて適宜決定すればよい。ガラクトマンナン水溶液に活性炭を加えることにより、粗製ガラクトマンナンに含まれると考えられる微量のタンパク質および核酸の分離に影響を与える微量物質を除去することができると考えられる。
【００３４】
工程（ＩＩ）において、工程（Ｉ）により得られる溶液を放置する時間は、例えば、１０〜３０分間である。
【００３５】
また、工程（ＩＩ）において、撹拌しながら放置することが好ましい。撹拌を行うことで、活性炭への不純物の吸着およびガラクトマンナンの水への可溶化を効率的に行うことができると考えられる。
【００３６】
工程（ＩＩＩ）および工程（ＩＶ）は複数回繰り返してもよい。工程（ＩＩＩ）および工程（ＩＶ）を繰り返す回数は、活性炭を除去できる限りにおいて、特に限定されないが、例えば、２〜３回である。また、必要に応じ、ナイロンメッシュ等で上清を濾過してもよい。
【００３７】
工程（ＩＶ）により得られる上清は、そのままゲル分離能向上剤として用いてもよく、当該上清をさらに凍結乾燥または乾燥させてゲル分離能向上剤として用いてもよい。すなわち、本発明の一実施形態に係る製造方法において、精製工程（２）は、工程（ＩＶ）により得られる上清を凍結乾燥する凍結乾燥工程および工程（ＩＶ）により得られる上清を乾燥する乾燥工程等を含んでいてもよい。
【００３８】
［１−２．溶解工程］
本発明の一実施形態に係る製造方法は、ガラクトマンナン水溶液を得る工程が含まれていてもよい。本明細書において、この工程は、「溶解工程」とも称される。
【００３９】
上記溶解工程では、ガラクトマンナンを水に溶解することにより、ガラクトマンナン水溶液を得ることができる。ガラクトマンナンを溶解する際、加熱溶解してもよい。
【００４０】
加熱温度としては、ガラクトマンナン水溶液の濃度に応じて適宜決定すればよく、８０℃〜１１０℃が好ましい。上記溶解工程における加熱温度がこの温度範囲内であれば、ガラクトマンナンを好適に溶解させることができる。
【００４１】
加熱は、マイクロウェーブオーブンおよびオートクレーブ等を用いて行うことができる。
【００４２】
上記溶解工程における加熱時間としては、ガラクトマンナンの濃度に応じて適宜決定すればよく、例えば、マイクロウェーブオーブンを用いる場合は１〜２分間、オートクレーブを用いる場合は１０〜２１分間である。上記溶解工程における加熱時間がこの範囲内であれば、ガラクトマンナン水溶液の粘度を上げ過ぎることなく、ガラクトマンナンを好適に溶解させることができる。
【００４３】
ガラクトマンナン水溶液は撹拌しながら作製してもよい。手動で撹拌してもよく、撹拌機構を備えた装置によって撹拌してもよい。撹拌機構を備えた装置としては、マグネチックスターラー等が挙げられる。
【００４４】
ガラクトマンナンが水に溶解しているか否かは目視で確認できる。本明細書においては、ガラクトマンナン水溶液において、溶解せずに残っているガラクトマンナンの塊が存在しなければ、均一に溶解していると判断する。
【００４５】
上記溶解工程と上記精製工程とは、同時に行われてもよい。すなわち、ガラクトマンナン水溶液を得る溶解工程において、精製工程を行ってもよい。
【００４６】
［１−３．冷却工程］
本発明の一実施形態に係る製造方法は、溶解工程の後に、当該溶解工程により得られるガラクトマンナン水溶液を冷却する工程を含んでいてもよい。本明細書において、この工程は、「冷却工程」とも称される。
【００４７】
ガラクトマンナン水溶液の冷却時間および冷却温度は、ガラクトマンナン水溶液の量および濃度等に応じて適宜決定すればよい。ガラクトマンナン水溶液は、例えば、一晩冷却させることが好ましい。ガラクトマンナン水溶液の冷却温度は、例えば、３〜１０℃である。
【００４８】
上記冷却工程は、ガラクトマンナン水溶液を放置することによって一定温度まで冷却させる前冷却工程を含むことが好ましい。当該一定温度は、２０℃〜６０℃であることが好ましく、室温であることがより好ましい。
【００４９】
［１−４．粉砕工程］
本発明の一実施形態に係る製造方法は、ゲル分離能向上剤を粉砕する粉砕工程を含んでいてもよい。ゲル分離能向上剤が固相である場合、ゲル分離能向上剤を粉砕することにより、ゲル分離能向上剤が溶液に溶解しやすくなる。
【００５０】
〔２．ゲル分離能向上剤〕
本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤は、本発明の一実施形態に係る製造方法により製造される。なお、本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤は、一般的に化学的分析および同定が容易ではないガラクトマンナンを原料としているため、構造の特定が困難である。
【００５１】
本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤の形態は、特に限定されず、粉末状等の固相であってもよく、液相であってもよい。
【００５２】
本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤は、特性を損なわない範囲で、任意の量の溶媒に溶解または混合させてもよく、任意の量の他の成分を含んでいてもよい。溶媒としては、後述の緩衝液（トリス−酢酸−エチレンジアミン四酢酸緩衝液およびトリス−ホウ酸−エチレンジアミン四酢酸緩衝液）、トリスリン酸緩衝液等が挙げられる。また、他の成分としては、エチヂウムブロマイド、ＧｅｌＲＥＤＴＭ、ＳＹＢＲＲ  ＧｒｅｅｎおよびＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）等が挙げられる。
【００５３】
〔３．電気泳動用ゲル〕
本発明の一実施形態に係る電気泳動用ゲルは、本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤を含む。本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤を用いることにより、高い分離能を有する電気泳動用ゲルを簡易に作製することができる。
【００５４】
電気泳動用ゲルの原料は、アガー、アガロースおよびポリアクリルアミド等の電気泳動用ゲルの原料として一般的に知られている原料を用いればよい。これらの電気泳動用ゲルの原料は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。アガー、アガロースおよびポリアクリルアミド等は、市販品を用いればよい。市販のアガーとしては、精製寒天末（ナカライテスク株式会社製）等が挙げられる。市販のアガロースとしては、Agarose H（ニッポンジーン社製）およびAgarose S（ニッポンジーン社製）等が挙げられる。市販のポリアクリルアミドとしては、SuperSep Ace (和光純薬社製)等が挙げられる。
【００５５】
本発明の一実施形態に係る電気泳動用ゲルは、本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤とアガーとを含む。また、本発明の他の実施形態に係る電気泳動用ゲルは、本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤とアガロースとを含む。また、本発明の他の実施形態に係る電気泳動用ゲルは、本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤および、アガーとアガロースとを用いてもよい。アガロースの重量比とアガーの重量比とは特に限定されないが、例えば、２：１〜２．５：１である。
【００５６】
本発明の一実施形態に係る電気泳動用ゲルの作製は、例えば、Molecular Cloning: A LABORATORY MANUAL, T. Maniatis, EF Fritsch, J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982を参考にして常法により実施してもよい。上記電気泳動用ゲルの作製は、例えば、以下の工程（α）および（β）を含む方法で実施される。
（α）電気泳動用ゲルの原料とゲル分離能向上剤とを緩衝液に混合してゲル化用溶液を得る工程、および、
（β）上記ゲル化用溶液をゲル化させて電気泳動用ゲルを得る工程。
【００５７】
工程（α）において、緩衝液は、トリス−酢酸−エチレンジアミン四酢酸緩衝液またはトリス−ホウ酸−エチレンジアミン四酢酸緩衝液であることが好ましい。
【００５８】
トリス−酢酸−エチレンジアミン四酢酸緩衝液はＴＡＥ緩衝液とも称される。ＴＡＥ緩衝液は、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、酢酸およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を水に溶解させることによって調製され得る。トリスヒドロキシメチルアミノメタンは、単にトリス（Ｔｒｉｓ）とも称される。トリスは塩の形態（例えば、トリス塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ））で用いられてよい。また、酢酸は酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）の形態で用いられてもよい。ＤＮＡ回収および遺伝子工学的手法に提供するという観点からは、ＴＡＥ緩衝液が好ましい。
【００５９】
トリス−ホウ酸−エチレンジアミン四酢酸緩衝液は、ＴＢＥ緩衝液とも称される。ＴＢＥ緩衝液は、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ホウ酸およびＥＤＴＡを水に溶解させることによって調製され得る。１ｋｂｐ以下のＤＮＡを分離するという観点からは、ＴＢＥ緩衝液が好ましい。
【００６０】
ゲル化用溶液１００重量％における電気泳動用ゲルの原料およびゲル分離能向上剤の合計の濃度は、０．４〜２．０重量％であることが好ましく、０．５〜１．５重量％であることがより好ましい。上記濃度が０．４重量％以上であれば、ゲルの分離能および強度を十分向上させることができる。上記濃度が２．０重量％以下であれば、均一なゲル化用溶液を容易に得ることができる。
【００６１】
ゲル化用溶液１００重量％における電気泳動用ゲルの原料の濃度（すなわち、電気泳動用ゲルにおける電気泳動用ゲルの原料の濃度）は、０．３〜１．５重量％であることが好ましい。電気泳動用ゲルの原料の濃度が０．３重量％以上であれば、十分な強度のゲルを得ることができる。電気泳動用ゲルの原料の濃度が１．５重量％以下であれば、均一なゲル化用溶液を容易に得ることができる。
【００６２】
ゲル化用溶液１００重量％におけるゲル分離能向上剤の濃度は、電気泳動用ゲルの原料の濃度によって適宜決定すればよい。例えば、電気泳動用ゲルが、アガロースを１．０重量％含む場合は、０．１重量％以上０．４重量％未満であることが好ましい。ゲル分離能向上剤の濃度が０．１重量％以上であれば、ゲルの分離能および強度を十分向上させることができる。ゲル分離能向上剤の濃度が０．４重量％未満であれば、均一なゲル化用溶液を容易に得ることができる。
【００６３】
本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤および電気泳動用ゲルの原料を、緩衝液中に投入した後、撹拌することが好ましい。手動で撹拌してもよく、撹拌機構を備えた装置によって撹拌してもよい。撹拌機構を備えた装置としては、マグネチックスターラー等が挙げられる。
【００６４】
工程（α）においては、加熱しながら、電気泳動用ゲルの原料とゲル分離能向上剤とを緩衝液に溶解させることが好ましい。これにより、電気泳動用ゲルの原料とゲル分離能向上剤とを緩衝液に容易に溶解させることができる。溶解工程における加熱温度は８０〜１００℃であることが好ましい。加熱温度が上記範囲であれば、電気泳動用ゲルの原料とゲル分離能向上剤とを十分に溶解させることができる。加熱は、電気泳動用ゲルの作製で通常用いられている、マイクロウェーブオーブン等を用いて行うことができる。
【００６５】
本発明の一実施形態に係る電気泳動用ゲルの作製において粉末状のゲル分離能向上剤を用いる場合、工程（α）の前に電気泳動用ゲルの原料とゲル分離能向上剤とを混合して混合粉末を得る工程を含んでいてもよい。例えば、電気泳動用ゲルの原料としてアガロースを用いる場合、上記混合粉末におけるアガロースの粉末に対する上記ゲル分離能向上剤の粉末の重量比（ゲル分離能向上剤の粉末の重量／アガロースの粉末の重量）は、０．３〜２であることが好ましい。上記重量比が０．３以上であれば、得られるゲルの分離能および強度をより高めることができる。また、上記重量比が２以下であれば、電気泳動用ゲルの原料とゲル分離能向上剤とが緩衝液に溶解しやすい。
【００６６】
上記電気泳動用ゲルの作製にゲル分離能向上剤の粉末を用いる場合、上記重量比は、例えば、０．８〜２であってもよく、１〜２であってもよい。このようにゲル分離能向上剤の濃度が比較的高い場合であっても、上記混合粉末は緩衝液に十分に溶解する。従って、十分な強度のゲルを得ることができる。これは、アガロースとゲル分離能向上剤とが粉末の状態で混合されるためである。また、上記重量比は、０．３〜０．６であってもよく、０．３〜０．５であってもよい。このようにゲル分離能向上剤の濃度が比較的低い場合であっても、ゲルの分離能を十分に高めることができる。
【００６７】
アガロースの粉末とゲル分離能向上剤の粉末とを混合する方法は、特に限定されない。これらの粉末は、手動で混合されてもよく、撹拌機構を備えた装置等によって混合されてもよい。いずれにせよ、アガロースの粉末とゲル分離能向上剤の粉末とが均一に混合されるように、これらの粉末を十分に撹拌することが好ましい。
【００６８】
工程（β）においては、ゲル化用溶液を放置することによってゲル化させることが好ましい。放置する温度は、２０〜６０℃であることが好ましく、室温であることがより好ましい。ここで、ゲル化用溶液を型に流し込んだ後に放置することによって、所望の形状のゲルを得ることができる。また、ゲル化する前のゲル化用溶液にコームを差し込んでおくことによって、サンプルを導入するためのウェルを形成することもできる。
【００６９】
なお、本明細書において、「ゲル化」とは、ゲル化用溶液を固化させることによって、流動性を示さないゲルを得ることを意図している。上記ゲルは、上述のゲル分離能向上剤を溶解させた溶液をゲル化させたものである。それゆえ、上記ゲルは、十分な強度および高い分離能を有している。
【００７０】
〔４．電気泳動方法〕
本発明の一実施形態に係る電気泳動方法は、本発明の一実施形態に係る電気泳動用ゲルを用いて行われる。当該電気泳動用ゲルは、本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤を含むため、当該電気泳動用ゲルを用いて電気泳動を行うことで、核酸（特に、低分子量のＤＮＡ）を好適に分離することができる。
【００７１】
上記電気泳動方法は、例えば、Molecular Cloning: A LABORATORY MANUAL, T. Maniatis, EF Fritsch, J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982を参考にして常法により実施してもよい。
【００７２】
電気泳動試料の染色方法は、特に限定されないが、電気泳動用ゲルに染色試薬を添加することにより染色してもよく、電気泳動を行った後の電気泳動用ゲルを染色試薬中で震盪することにより染色してもよい。上記染色試薬としては、一般公知の核酸染色試薬を用いればよく、例えば、エチジウムブロマイド、ＧｅｌＲＥＤＴＭ（Gene One社製）およびＧｅｌＧｒｅｅｎＴＭ（Gene One社製）等が挙げられる。
【００７３】
また、本発明の他の実施形態に係る電気泳動方法は、本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤とアガロースとを含む電気泳動用ゲルおよびＧｅｌＲＥＤＴＭを含む電気泳動試料を用いて行われる。
【００７４】
上述の染色試薬は、紫外線を当てると蛍光を発する物質が多いため、核酸染色用途に使用される。また、上記染色試薬は、ＤＮＡにインターカレートすることにより、ＤＮＡバンドが明りょうとなる。そのため、上記染色試薬をＤＮＡインターカレート試薬として電気泳動試料に添加することで、ＤＮＡバンドを観察しやすくしてもよい。当該ＤＮＡインターカレート試薬として、電気泳動用ゲルの染色に用いる染色試薬と異なる染色試薬を用いることが好ましい。例えば、ＧｅｌＲＥＤＴＭを添加した電気泳動試料を電気泳動に供した後、電気泳動用ゲルをエチジウムブロマイドで染色してもよい。
【００７５】
なお、アガーを含む電気泳動用ゲル（すなわち、電気泳動用ゲルの原料としてアガーのみを含む電気泳動用ゲル、電気泳動用ゲルの原料としてアガーとアガロースとを含む電気泳動用ゲル）を用いて電気泳動を行う場合は、電気泳動試料にＧｅｌＲＥＤＴＭを加えてもよく、電気泳動試料にＧｅｌＲＥＤＴＭを加えなくてもよい。
【００７６】
電気泳動試料１００重量％におけるＧｅｌＲＥＤＴＭの濃度（または、電気泳動試料に添加するＧｅｌＲＥＤＴＭの希釈倍率）は、電気泳動試料の組成等によって適宜決定すればよい。例えば、ローディング液（製品名：６×Loading Buffer Orange G、ニッポンジーン社製）２μＬに対して、ＧｅｌＲＥＤＴＭを１μＬ加える場合は、ＧｅｌＲＥＤＴＭは１０００倍希釈されていることが好ましい。ＧｅｌＲＥＤＴＭの希釈は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）溶液等を用いて行うことができる。
【００７７】
〔５．電気泳動用ゲル製造キット〕
本発明の一実施形態に係る電気泳動用ゲル製造キットは、本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤を備える。それゆえ、上述のように、高い分離能を有するゲルを簡便に作製することができる。以下では、電気泳動用ゲル製造キットを単に「キット」とも称する。また、〔３．電気泳動用ゲル〕で既に説明した事項については、以下では説明を省略し、適宜、上述の記載を援用する。
【００７８】
上記キットは、緩衝液として、ＴＡＥ緩衝液またはＴＢＥ緩衝液をさらに備えていてもよい。本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤を当該緩衝液に溶解させてゲル化用溶液を得ることができる。当該ゲル化用溶液をゲル化させることにより、ゲルを作製することができる。
【００７９】
上記緩衝液は、使用される際の濃度に比べて高い濃度にて調製されたストック溶液であってもよい。例えば、ストック溶液は、使用される際の濃度に比べて５倍、１０倍、または５０倍の濃度であってもよい。当該ストック溶液を希釈して、ゲルの作製に使用することができる。
【００８０】
また、上記キットは、トリス−酢酸−エチレンジアミン四酢酸の粉末またはトリス−ホウ酸−エチレンジアミン四酢酸の粉末を備えていてもよい。これらの粉末を水に溶解させることによって、ＴＡＥ緩衝液またはＴＢＥ緩衝液を得ることができる。
【００８１】
上記キットは、本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤、電気泳動用ゲルの原料および緩衝液以外に、ゲルを作製するための部材を備えていてもよい。例えば、上記キットは、ゲル化用溶液が流し込まれるトレーを備えていてもよい。また、上記キットは、形成されたゲルを支持するためのプレートを備えていてもよい。さらに、上記キットは、ゲルにウェルを形成するためのコームを備えていてもよい。
【００８２】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８４】
〔１．アガーゲルでのゲル分離能向上剤Ａ１の効果の観察〕
＜実施例１＞
（１）ゲル分離能向上剤Ａ１の作製
下記の〔ａ〕〜〔ｈ〕により得たゲル分離能向上剤Ａ１を電気泳動に用いた。
〔ａ〕ローカストビーンガム由来のガラクトマンナン１ｇ（Locust bean gum from Ceratonia siliqua seeds、Sigma-Aldrich社製）を１００ｍＬの精製水に加え、マイクロウェーブオーブンにて１００℃で２分間加熱し、ガラクトマンナンを溶解させた。これを室温まで冷却した後、５℃にて一晩放置した。
〔ｂ〕〔ａ〕により得られた溶液を遠心管に分取し、室温で８０００×ｇ、１０分間遠心した。
〔ｃ〕〔ｂ〕により得られた溶液から上清を遠心管に分取し、沈殿物を除去した。このとき、除去された沈殿物は約０．４ｇであった。
〔ｄ〕〔ｃ〕により沈殿物が除去された上清に酢酸２０ｍＬ（特級試薬、和光純薬製）を加えることにより酸性溶液とした。酸性溶液：エタノール＝１：１となるように１００％エタノールを当該酸性溶液にさらに加え、遠心管の蓋をし、上下に２〜３回程度、素早く振盪した。混合すると速やかに、白い繊維状の物質が出現した。
〔ｅ〕上記遠心管を室温で８０００×ｇ、１０分間遠心させ、得られた沈殿物を回収した。
〔ｆ〕当該沈殿物にエタノールを１０ｍＬ加え、よく振盪し、残存している酢酸を除去した。その後、再度、室温で８０００×ｇ、１０分間遠心させた。
〔ｇ〕得られた沈殿物を回収し、６０℃で１時間放置し、完全に乾燥させた。
〔ｈ〕乾燥させた上記得られた沈殿物を乳鉢に移し、乳棒で粉砕した。
【００８５】
（２）アガーの溶解
アガー（精製寒天末、ナカライテスク株式会社製）１．０ｇおよび０．３ｇのゲル分離能向上剤Ａ１をそれぞれ秤量した。薬さじを用いて、これらをよく撹拌混合し、混合粉末を作製した。
【００８６】
蓋付きの２００ｍＬガラス瓶に、１００ｍＬのＴＡＥ緩衝液（ｐＨ８．０；４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ）およびスターラーバーを入れた。当該ガラス瓶に、上記混合粉末を投入し、蓋をして上下に２〜３回程度、素早く振盪した。マイクロウェーブオーブンを用いて、上記ガラス瓶を１００℃で２分程度加熱し、アガーを溶解させた。その後、ガラス瓶をスターラーに乗せ、撹拌した。これにより、ゲル化用溶液を得た。当該ゲル化用溶液においては、アガーおよびゲル分離能向上剤Ａ１が完全に溶解されていることを確認した。実施例１において、ゲル化用溶液１００重量％におけるアガーおよびゲル分離能向上剤Ａ１の濃度はそれぞれ、１．０重量％および０．３重量％である。
【００８７】
（３）ゲルの作製
上述の電気泳動装置に付属しているサンプルコーム（８ウェル用）およびゲルプレート（幅５４ｍｍ、長さ６０ｍｍ、高さ１０ｍｍ）をゲル作製用トレーにそれぞれセットした。当該ゲル作製用トレーにゲル化用溶液１３ｍＬを流し込んだ。ゲル化用溶液を室温で１時間放置し、ゲル化させた。
【００８８】
固化したゲルの上にＴＡＥ緩衝液を少量入れ、サンプルコームを注意深く抜き取った。このようにしてゲルを作製した。
【００８９】
（４）電気泳動
電気泳動装置（Ｍｕｐｉｄミニゲル泳動槽、ミューピッド社（旧アドバンス社）製）にゲルをセットした。所望の希釈倍率のＧｅｌＲＥＤＴＭ（ＤＭＳＯ溶液により希釈）を１μＬ、ローディング液（製品名：６×Loading Buffer Orange G、ニッポンジーン社製）２μＬ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−０．１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）６．５μＬを加え混合することにより、電気泳動試料を調製した。各レーンの電気泳動試料を表１に示す。なお、上記ＤＮＡサイズマーカー（表１中、「マーカー」と記載）としては、下記の（ａ）または（ｂ）を用いた。
（ａ）０．１〜２０ｋｂｐのＤＮＡ（Gene Ladder wide 2,ニッポンジーン社製）
（ｂ）０．１〜２ｋｂｐのＤＮＡ（Gene Ladder 100, ニッポンジーン社製）
【００９０】
【表１】
2019100775.tif 000003
【００９１】
ゲルに形成されたウェルに、電気泳動試料を１０μＬ加えた。１００Ｖで３０分間、室温にて電気泳動を行った。泳動バッファーとしては、ＴＡＥ緩衝液（ｐＨ８．０；４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いた。なお、電気泳動は、Molecular Cloning: A LABORATORY MANUAL, T. Maniatis, EF Fritsch, J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982を参考にして常法により実施した。
【００９２】
（５）ゲルの染色
エチジウムブロマイド（０．５μｇ／ｍＬ）を溶かしたＴＡＥ緩衝液に、電気泳動後のゲルを１５分間浸漬した。さらに、当該ゲルを蒸留水に５分間、静置浸漬した。
【００９３】
（６）ゲルの撮影
アガロースゲル撮影装置（ＵＶイルミネーター；Model BioDoc-It（登録商標） Imaging system, ＵＶＰ社製）を用いてゲルを撮影した。
【００９４】
＜比較例１＞
ゲルの作製において、ゲル分離能向上剤Ａ１を入れなかったこと以外は実施例１と同様に、ゲルを作製し、当該ゲルを用いて、電気泳動を行った。参考例１において、ゲル化用溶液１００重量％におけるアガーの濃度は１．０重量％である。
【００９５】
＜結果＞
図１に、実施例１および比較例１の電気泳動の結果を示す。なお、図１において「＊」は、レーン６に基づく２ｋｂｐのＤＮＡバンドを示す。また、図１に示したＤＮＡのサイズを表す目盛は、実施例１のレーン１のバンドに基づく。実施例１の結果と比較例１の結果との比較により、アガーゲルにおいて、精製方法（１）により得られたゲル分離能向上剤Ａ１を添加すると、特に１００〜３ｋｂｐにおいて格段に高い分離能を示すことがわかる。また、実施例１のレーン１および２の結果より、１％アガーゲルを用いる電気泳動では、ゲル分離能向上剤Ａ１を加えると、ＧｅｌＲＥＤＴＭを電気泳動試料に加えなくても、ゲル分離能が向上することがわかる。
【００９６】
精製寒天はアガロースよりも安価に入手可能である。そのため、本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤を用いることにより、より安価に電気泳動を行うことができることが示唆される。
【００９７】
〔２．アガロースゲルでのゲル分離能向上剤Ａ１の効果の観察〕
＜実施例２＞
アガー１．０ｇの代わりにアガロース（Agarose S, ニッポンジーン社製）１．０ｇを用いた以外は実施例１と同様に、ゲルを作製し、当該ゲルを用いて、電気泳動を行った。実施例２において、ゲル化用溶液１００重量％におけるアガロースおよびゲル分離能向上剤Ａ１の濃度はそれぞれ、１．０重量％および０．３重量％である。
【００９８】
＜比較例２＞
ゲル分離能向上剤Ａ１を入れなかったこと以外は実施例２と同様に、ゲルを作製し、当該ゲルを用いて、電気泳動を行った。比較例２において、ゲル化用溶液１００重量％におけるアガロースの濃度は０．３重量％である。
【００９９】
＜参考例１＞
電気泳動試料への添加試薬の考察のため、レーン１〜６において、表２に示す電気泳動試料を流した以外は実施例１と同様に、電気泳動を行った。所望の希釈倍率の添加試薬（ＧｅｌＲＥＤＴＭはＤＭＳＯ溶液により希釈）を１μＬ、ローディング液（製品名：６×Loading Buffer Orange G、ニッポンジーン社製）２μＬ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−０．１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）６．５μＬを加えて混合することによって、電気泳動試料を調製した。参考例１において、ゲル化用溶液１００重量％におけるアガロースおよびゲル分離能向上剤Ａ１の濃度はそれぞれ、１．０重量％および０．３重量％である。
【０１００】
【表２】
2019100775.tif 000004
【０１０１】
＜参考例２＞
ゲルの作製において、ゲル分離能向上剤Ａ１の代わりに、ローカストビーン由来のガラクトマンナンを０．３ｇ入れたこと以外は実施例１と同様に、ゲルを作製した。その後、当該ゲルを用いて、以下の電気泳動試料について電気泳動を行った。所望の希釈倍率の添加試薬（ＧｅｌＲＥＤＴＭはＤＭＳＯ溶液により希釈）を１μＬ、ローディング液（製品名：６×Loading Buffer Orange G、ニッポンジーン社製）２μＬ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−０．１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）６．５μＬを加えて混合することによって、電気泳動試料を調製した。添加試薬として、レーン３用の電気泳動試料には、ＳＹＢＲＲ  Ｇｒｅｅｎ（Thermo Fisher社製）、Ｍｉｄｏｒｉ  Ｇｒｅｅｎ  Ｄｉｒｅｃｔ（ニッポンジーン社製）を用いた。ＤＮＡサイズマーカーは、実施例１と同じマーカーを用いた。各レーンの電気泳動試料を表３に示す。参考例２において、ゲル化用溶液１００重量％におけるアガロースおよびローカストビーン由来のガラクトマンナンの濃度はそれぞれ、１．０重量％および０．３重量％である。
【０１０２】
【表３】
2019100775.tif 000005
【０１０３】
＜参考例３＞
ローカストビーン由来のガラクトマンナンの代わりに、ゲル分離能向上剤Ａ１を入れたこと以外は参考例２と同様に、ゲルを作製し、当該ゲルを用いて、電気泳動を行った。参考例３において、ゲル化用溶液１００重量％におけるアガロースおよびゲル分離能向上剤Ａ１の濃度はそれぞれ、１．０重量％および０．３重量％である。
【０１０４】
＜結果＞
図２に、実施例２および比較例２の電気泳動の結果を、図３に、参考例１〜参考例３の電気泳動の結果を示す。なお、図２および３において「＊」は、レーン６に基づく２ｋｂｐのＤＮＡバンドを示す。
【０１０５】
実施例２および比較例２の結果の比較により、ゲル分離能向上剤Ａ１を添加したアガロースゲルでは、特に１００ｂｐ〜２ｋｂｐにおいて格段に高い分離能を示すことがわかる。１００ｂｐ〜２ｋｂｐの領域は、ＰＣＲ反応の結果解析に多用される領域である。ゆえに、本発明の一実施形態に係るゲル分離能向上剤は、ＤＮＡの電気泳動において将来的に汎用され得ることが示唆される。
【０１０６】
ゲル分離能向上剤Ａ１をアガロースに添加した電気泳動では、ＤＮＡバンドが出現せず、ＤＮＡバンドのスメア（smearing of DNA bands）が観察された（実施例２のレーン１および２を参照のこと）。しかし、実施例２のレーン３〜５の結果より、ＧｅｌＲＥＤＴＭを電気泳動試料にあらかじめ加えることにより、ＧｅｌＲＥＤＴＭの容量に依存してＤＮＡバンドが分離されることがわかった。また、実施例２のレーン５で用いたＧｅｌＲＥＤＴＭの濃度が最も効果的にＤＮＡを分離することができることがわかった。なお、実施例２のレーン５で用いたＧｅｌＲＥＤＴＭの濃度は、通常、ゲル内ＤＮＡ染色に供される量（一万倍希釈）に対して１０倍高い濃度である。
【０１０７】
また、参考例１の結果より、ＧｅｌＲＥＤＴＭの代わりにエチジウムブロマイドを電気泳動試料にあらかじめ加えても、エチジウムブロマイドを添加しない場合と比べてＤＮＡの分離能は向上しないことが分かった。
【０１０８】
さらに、参考例２および参考例３の結果より、ＧｅｌＲＥＤＴＭの代わりにＳＹＢＲＲ  ＧｒｅｅｎやＭｉｄｏｒｉ  Ｇｒｅｅｎ  Ｄｉｒｅｃｔを電気泳動試料にあらかじめ加えても、これらを添加しない場合と比べて、ＤＮＡの分離能は向上しないことが分かった。また、参考例２の結果より、ゲル分離能向上剤Ａ１の原料であるローカストビーンガム由来のガラクトマンナンをアガロースゲルに添加しても、ゲル分離能は向上しないことがわかった。なお、実施例、比較例および参考例において、レーン１の結果とレーン２の結果とを比較しても有意差が見られないことから、溶剤であるＤＭＳＯは、ＤＮＡ分離能に影響しないことがわかった。
【０１０９】
〔３．アガロース／アガーゲルでのゲル分離能向上剤Ａ１の効果の観察〕
＜実施例３＞
アガー１．０ｇの代わりに、アガロース０．７ｇおよびアガー０．３ｇを用いた以外は実施例１と同様に、ゲルを作製した。その後、当該ゲルを用いて、以下の電気泳動試料について電気泳動を行った。各レーンの電気泳動試料を表４に示す。なお、ＧｅｌＲＥＤＴＭの希釈は、精製水を用いて行った。実施例３において、ゲル化用溶液１００重量％におけるアガロース、アガーおよびゲル分離能向上剤Ａ１の濃度はそれぞれ、０．７重量％、０．３重量％および０．３重量％である。
【０１１０】
【表４】
2019100775.tif 000006
【０１１１】
＜実施例４＞
ＴＡＥ緩衝液の代わりに、ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭトリス、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸、ｐＨ８．０）を用いた以外は実施例３と同様に、ゲルを作製し、当該ゲルを用いて、電気泳動を行った。各レーンの電気泳動試料を表５に示す。実施例４において、ゲル化用溶液１００重量％におけるアガロース、アガーおよびゲル分離能向上剤Ａ１の濃度はそれぞれ、０．７重量％、０．３重量％および０．３重量％である。
【０１１２】
【表５】
2019100775.tif 000007
【０１１３】
＜比較例３＞
アガー１．０ｇの代わりに、アガロース０．６ｇおよびアガー０．３ｇを用いたことおよびゲル分離能向上剤Ａ１の代わりに、ローカストビーンガム由来のガラクトマンナンを０．３ｇ加えたこと以外は実施例１と同様に、ゲルを作製した。当該ゲルを用いて、電気泳動を行った。各レーンの電気泳動試料は実施例４と同様である。比較例３において、ゲル化用溶液１００重量％におけるアガロース、アガーおよびガラクトマンナンの濃度はそれぞれ、０．６重量％、０．３重量％および０．３重量％である。
【０１１４】
＜参考例４＞
ゲル分離能向上剤を用いなかった以外は実施例３と同様に、ゲルを作製し、当該ゲルを用いて、電気泳動を行った。各レーンの電気泳動試料は実施例４と同様である。参考例４において、ゲル化用溶液１００重量％におけるアガロースおよびアガーの濃度はそれぞれ、０．７重量％および０．３重量％である。
【０１１５】
＜結果＞
図４に実施例３、実施例４、比較例３および参考例４の電気泳動の結果を示す。実施例３の結果および実施例４の結果により、ゲル分離能向上剤を添加したアガロース／アガーゲルにおいても、ゲル分離能向上剤を添加したアガーゲルと同様に、特に１００〜２ｋｂｐにおいて格段に高い分離能を示すことがわかる。また、実施例３および実施例４のレーン１および２の結果より、アガーゲルと同様に、アガロース／アガーゲル用いる電気泳動でも、ゲル分離能向上剤を加えると、ＧｅｌＲＥＤＴＭを電気泳動試料にあらかじめ加えなくても、ゲル分離能が向上することがわかる。さらに、実施例５の結果より、ＴＡＥ緩衝液の代わりにＴＢＥ緩衝液を用いた場合も特に１００〜２ｋｂｐにおいて格段に高い分離能を示すことがわかる。
【０１１６】
一方、比較例３の結果より、ゲル分離能向上剤Ａ１の原料であるローカストビーンガム由来のガラクトマンナンをアガロース／アガーゲルに添加しても、ゲル分離能は向上しないことがわかった。
【０１１７】
また、参考例４の結果より、電気泳動試料にＧｅｌＲＥＤＴＭを電気泳動試料にあらかじめ加えることによりゲル分離能が向上することがわかった。
【０１１８】
〔４．ゲル分離能向上剤Ａ２およびＡ３の効果の観察〕
＜実施例５＞
ローカストビーンガム由来のガラクトマンナンの代わりに、グァーガム由来のガラクトマンナン（VIDOCREAM、ユニテックフーズ社製）を用いた以外は実施例３と同様にゲル分離能向上剤Ａ２を作製した。ゲル分離能向上剤Ａ１の代わりに当該ゲル分離能向上剤Ａ２を用いた以外は実施例３と同様にゲルを作製し、当該ゲルを用いて、電気泳動を行った。各レーンの電気泳動試料を表６に示す。実施例５において、ゲル化用溶液１００重量％におけるアガロース、アガーおよびゲル分離能向上剤Ａ２の濃度はそれぞれ、０．７重量％、０．３重量％および０．３重量％である。
【０１１９】
【表６】
2019100775.tif 000008
【０１２０】
＜実施例６＞
グァーガム由来由来のガラクトマンナンの代わりに、タラガム由来のガラクトマンナン（SP175、ユニテックフーズ社製）を用いた以外は実施例５と同様にゲル分離能向上剤Ａ３を作製した。ゲル分離能向上剤Ａ２の代わりに当該ゲル分離能向上剤Ａ３を用いた以外は実施例５と同様にゲルを作製し、当該ゲルを用いて、電気泳動を行った。各レーンの電気泳動試料は実施例５と同様である。実施例６において、ゲル化用溶液１００重量％におけるアガロース、アガーおよびゲル分離能向上剤Ａ３の濃度はそれぞれ、０．７重量％、０．３重量％および０．３重量％である。
【０１２１】
＜結果＞
図５に実施例５および６の電気泳動の結果を示す。実施例５の結果より、グァーガム由来のガラクトマンナンを用いて作製したゲル分離能向上剤Ａ２を電気泳動用ゲルに添加した場合も特に１００〜２ｋｂｐにおいて格段に高い分離能を示すことがわかる。また、実施例６の結果より、タラガム由来のガラクトマンナンを用いて作製したゲル分離能向上剤Ａ３を電気泳動用ゲルに添加した場合も、特に１００〜２ｋｂｐにおいて格段に高い分離能を示すことがわかる。
【０１２２】
〔５．ゲル分離能向上剤Ｂ１の効果の観察〕
＜実施例７＞
下記の〔Ａ〕〜〔Ｈ〕により、ゲル分離能向上剤Ｂ１および当該ゲル分離能向上剤Ｂ１を用いたゲルを作製し、電気泳動を行った。
〔Ａ〕ローカストビーンガム由来のガラクトマンナン（VIDOGUM L175HQ、ユニテックフーズ株式会社製）１ｇを、さらに５ｍＬのエタノールに懸濁した後に、撹拌子を回転させながら９５ｍＬの水に少量ずつ加え分散させた。１０分撹拌させた後ガラクトマンナン分散液を遠心管、２本に分注した。
〔Ｂ〕〔Ａ〕により得られた溶液を５０ｍＬの遠心管２本に分取した。各遠心管に０．２ｇの活性炭（和光純薬、クロマトグラム用）を加え、室温で１５ｒｐｍでｒｏｔａｔｅｒを用いて回転させながら３０分間放置させた。
〔Ｃ〕上記の遠心管を室温で１０，０００×ｇ、１５分間遠心した。
〔Ｄ〕〔Ｃ〕により得られた溶液から上清を回収した。
〔Ｅ〕１０，０００×ｇ、５分間遠心した。
〔Ｆ〕上記の１％ガラクトマンナン溶液２５ｍＬ、１ｍＬの５０×ＴＡＥ、精製水２４ｍＬを混合し、アガロース（agarose S，ニッポンジーン社製）０．３５ｇ、アガー０．１５ｇを加え、マイクロウェーブオーブンにより１００℃で２分間、加熱溶解させた。実施例８において、ゲル化用溶液１００重量％におけるアガロース、アガーおよびゲル分離能向上剤Ｂ１の濃度はそれぞれ、０．７重量％、０．３重量％および０．５重量％である。
〔Ｇ〕ゲル化用溶液をゲル作製プレートに注ぎ、室温で５０分、５度で１０分放置し、ゲル化させることにより、ゲルを作製した。
〔Ｈ〕ゲルに形成されたウェルに、電気泳動試料を１０μＬ加えた。１００Ｖで３５分間、室温にて電気泳動を行った。なお、実施例７における各レーンの電気泳動試料を表７に示す。
【０１２３】
それ以降は、＜実施例１＞の「（５）ゲルの染色」「（６）ゲルの撮影」と同様にした。
【０１２４】
【表７】
2019100775.tif 000009
【０１２５】
＜実施例８＞
１％ガラクトマンナン溶液２５ｍＬの代わりに、１％ガラクトマンナン溶液１５ｍＬを用いた以外は、実施例７と同様にゲルを作製し、当該ゲルを用いて、電気泳動を行った。各レーンの電気泳動試料を表８に示す。実施例８において、ゲル化用溶液１００重量％におけるアガロース、アガーおよびゲル分離能向上剤Ｂ１の濃度はそれぞれ、０．７重量％、０．３重量％および０．３重量％である。
【０１２６】
【表８】
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【０１２７】
＜実施例９＞
ローカストビーンガム由来のガラクトマンナンの代わりに、グァーガム由来のガラクトマンナン（VIDOCREAM、ユニテックフーズ社製）を用いた以外は実施例７と同様にして、ゲル分離能向上剤Ｂ２を作製した。ゲル分離能向上剤Ｂ１の代わりに当該ゲル分離能向上剤Ｂ２を用いた以外は実施例７と同様にゲルを作製した。当該ゲルを用いて、電気泳動を行った。各レーンの電気泳動試料を表９に示す。なお、グァーガム由来のガラクトマンナンのＧＭ分散液の作製は、熱水にグァーガム由来のガラクトマンナンを溶解することにより行った。実施例９において、ゲル化用溶液１００重量％におけるアガロース、アガーおよびゲル分離能向上剤Ｂ２の濃度はそれぞれ、０．７重量％、０．３重量％および０．５重量％である。
【０１２８】
【表９】
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【０１２９】
＜実施例１０および実施例１１＞
ローカストビーンガム由来のガラクトマンナンの代わりに、タラガム由来のガラクトマンナン（SP175、ユニテックフーズ社製）を用いた以外は実施例７と同様にして、ゲル分離能向上剤Ｂ３を作製した。ゲル分離能向上剤Ｂ１の代わりに当該ゲル分離能向上剤Ｂ３を用いた以外は実施例７と同様にゲルを作製し、当該ゲルを用いて、電気泳動を行った。なお、実施例１０では、電気泳動を３５分間行い、実施例１１では、電気泳動を７０分間行った。また、実施例１０および実施例１１における各レーンの電気泳動試料を表１０に示す。なお、表中マーカー（ｃ）は、Lambda phage/Sty I digest (λ/Sty I )(ニッポンジーン社製)である。実施例１０および実施例１１においてゲル化用溶液１００重量％におけるアガロース、アガーおよびゲル分離能向上剤Ｂ３の濃度はそれぞれ、０．７重量％、０．３重量％および０．５重量％である。
【０１３０】
【表１０】
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【０１３１】
＜結果＞
図６に実施例７〜１１の電気泳動の結果を示す。なお、図６の実施例７において「＊」は、レーン２に基づく２ｋｂｐのＤＮＡバンドを示す。また、図６の実施例１０および１１において「＊」は、レーン３に基づく２ｋｂｐのＤＮＡバンドを示す。実施例７および実施例８の結果より、精製方法（２）により得られたゲル分離能向上剤Ｂ１を電気泳動用ゲルに添加すると、特に１００〜２ｋｂｐにおいて格段に高い分離能を示すことがわかる。また、実施例９の結果より、グァーガム由来のガラクトマンナンを用いて作製したゲル分離能向上剤Ｂ２を電気泳動用ゲルに添加した場合も特に１００〜２ｋｂｐにおいて格段に高い分離能を示すことがわかる。さらに、実施例１０および実施例１１の結果より、タラガム由来のガラクトマンナンを用いて作製したゲル分離能向上剤Ｂ３を電気泳動用ゲルに添加した場合も特に１００〜２ｋｂｐにおいて格段に高い分離能を示すことがわかる。また、実施例１１の結果より、ゲル分離能向上剤Ｂ３を添加した電気泳動用ゲルを用いて電気泳動を７０分間行った場合、１０００ｂｐから２０ｋｂｐまでのより長い鎖長のＤＮＡにおいて高い分離能を示すことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明は、電気泳動を伴う解析が行われる様々な分野に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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