(57)【要約】【課題】コラーゲン結合材、その製造方法などを提供する。【解決手段】触媒ドメインとリンカーとプレペプチダーゼＣ末端ドメインとをこの順に含む細菌性Ｍ９Ａコラゲナーゼのアミノ酸配列の一部であって、少なくともリンカーの一部と前記リンカーに連続して配列されるプレペプチダーゼＣ末端ドメインとを含むアミノ酸配列（Ｉ）、または該配列（Ｉ）において１〜２０個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列（ＩＩ）で示されるペプチドを含む。カルシウムフリー環境や加熱後でもコラーゲン結合性を維持し、ドラッグデリバリーシステムその他に使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端からＣ末端に向かって、触媒ドメインとリンカーとプレペプチダーゼＣ末端ドメインとをこの順に含む細菌性Ｍ９Ａコラゲナーゼのアミノ酸配列の一部であって、
少なくとも前記リンカーの一部と前記リンカーに連続して配列されるプレペプチダーゼＣ末端ドメインとを含むアミノ酸配列（Ｉ）、または前記配列（Ｉ）において１〜２０個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列（ＩＩ）で示されるペプチドを含む、コラーゲン結合材。
【請求項２】
前記アミノ酸配列（Ｉ）および／または前記アミノ酸配列（ＩＩ）が、２以上のシステインを含むことを特徴とする、請求項１記載のコラーゲン結合材。
【請求項３】
前記細菌性Ｍ９Ａコラゲナーゼが、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼである、請求項１または２記載のコラーゲン結合材。
【請求項４】
（ａ）カルシウムが存在しない環境下でコラーゲンと結合する、
（ｂ）Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲンおよびＶ型コラーゲンと結合する、および
（ｃ）温度２５〜９５℃に加熱した後もコラーゲン結合性を維持している、請求項１または２記載の、コラーゲン結合材。
【請求項５】
請求項１記載のコラーゲン結合材を構成するペプチドをコードするＤＮＡ配列、または前記配列において１〜４５個のＤＮＡ残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有する、核酸を含んでなる組換えＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５記載の組換えＤＮＡにより形質転換されてなる形質転換体。
【請求項７】
請求項６記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１のコラーゲン結合材の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲン結合材を使用するドラッグデリバリーシステム。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲン結合材を担持した担持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン結合材、前記コラーゲン結合材の製造方法、前記コラーゲン結合材を使用するドラッグデリバリーシステム、および前記コラーゲン結合材を担持した担持体に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、ペプチド、抗体断片などの特異的活性分子に、特定の組織に親和性を有するペプチドを結合すると、目的組織に当該活性分子を供給するドラッグデリバリーシステムとして使用することができる。例えば、グリカンにコラーゲン結合性ペプチドとヒアルロン酸結合性ペプチドとを共有結合した細胞外マトリックス結合性合成ペプチドグリカンがある（特許文献１）。この合成ペプチドグリカンは、コラーゲンやヒアルロン酸と結合しやすいため、軟骨、髄核、および眼の硝子体液などのコラーゲンとヒアルロン酸の両方を有する組織を補強し、および／または保護するのに有用である、という。特許文献１では、コラーゲン結合性ペプチドとして、ヴォン・ヴィレブランド因子または血小板コラーゲン受容体のコラーゲン結合性ドメインを使用している。
【０００３】
また、成長因子受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子を、コラーゲン線維が露出してなる骨移植基材に結合させた、成長因子アンカーリング型骨移植材料もある（特許文献２）。コラーゲン結合性ペプチド部は、骨移植基材に成長因子受容体アゴニストペプチド部を結合させるための結合部として機能する。成長因子は骨形成作用を示すが、静脈注射などによって全身投与すると局所残存率が低く、持続的な骨形成作用を期待することができないため、コラーゲン線維が露出してなる骨移植基材と、成長因子受容体アゴニストペプチド部（ＧＦ部）とコラーゲン結合性ペプチド部（ＣＢ部）とを含むＣＢ−ＧＦを混合し、成長因子受容体アゴニストを骨移植基材に結合させたものである。特許文献２では、ＣＢ部として、クロストリジウム・ヒストリカム（Clostridium histolyticum）由来コラゲナーゼＨ（ＣｏｌＨ）のコラーゲン結合ドメインを使用している。
【０００４】
また、ラミニン、またはヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントのα鎖のＮ末端、β鎖のＮ末端およびγ鎖のＮ末端の少なくとも１か所にコラーゲン結合性分子を結合させた改変ラミニンもある（特許文献３）。使用できるコラーゲン結合性分子として、フィブロネクチン、コラゲナーゼ、インテグリンα１鎖、インテグリンα２鎖、インテグリンα１０鎖、インテグリンα１１鎖、血小板グリコプロテインＶＩ、ディスコイディンドメイン受容体１、ディスコイディンドメイン受容体２、マンノース受容体、ホスホリパーゼＡ２受容体、ＤＥＣ２０５、Ｅｎｄｏ１８０、ヴォン・ヴィレブランド因子、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、白血球関連免疫グロブリン様受容体１、白血球関連免疫グロブリン様受容体２のコラーゲン結合部位を例示している。
【０００５】
また、治療剤での治療を必要とする被験者に、治療剤に結合した細菌性コラーゲン結合ポリペプチドセグメントを含む組成物を投与する治療剤を送達する方法もある（特許文献４）。部分的にねじれていないか又はねじれが不十分なコラーゲン部位をターゲットとする細菌性コラーゲン結合ポリペプチドセグメントを使用する点に特徴がある。特許文献４では、このようなコラーゲン結合ポリペプチドセグメントとして、ＣｏｌＧのコラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）や、ＣｏｌＨのＣＢＤ、コラーゲン結合タンパク質の多発性嚢胞腎様（ＰＫＤ）ドメインを例示している。
【０００６】
従来から、ＣｏｌＨやＣｏｌＧなどのクロストリジウム・ヒストリチカム由来コラゲナーゼは、複数のドメイン構造を持つマルチドメインタンパク質であること、その活性はドメインの組み合わせと相対的な配置に関連することは公知である（非特許文献１）。非特許文献１によれば、クロストリジウム属由来コラゲナーゼは、共通して、触媒ドメイン（catalytic domain: ＣＤ）、多発性嚢胞腎様ドメイン（Polycystic kidney disease-like domain：ＰＫＤ）、コラーゲン結合ドメイン（collagen-binding domain: ＣＢＤ）の３種を含み、ＣｏｌＨのドメイン構造は、１つのＣＤ、２つのＰＫＤ、１つのＣＢＤからなる、ＣＤ−ＰＫＤ−ＰＫＤ−ＣＢＤであり、ＣｏｌＧのドメイン構造は、１つのＣＤ、１つのＰＫＤ、２つのＣＢＤからなる、ＣＤ−ＰＫＤ−ＣＢＤ−ＣＢＤである。非特許文献１は、ＣＢＤのＮ末端側にはカルシウムが結合すること、カルシウムが外れることでドメインのＮ末端部が構造変化すること、カルシウムはコラーゲンの結合に重要であること、およびカルシウムがＣｏｌＨの安定化に寄与していることなどを開示している。
【０００７】
一方、比活性が高い微生物由来コラゲナーゼとして、グリモンティア・ホリセー（Grimontia hollisae）由来コラゲナーゼがある（非特許文献２）。プレプロ領域、触媒ドメイン（以下、ＣＤとも称する。）、リンカー、およびプレペプチダーゼＣ末端ドメイン（以下、ＰＰＣとも称する。）を含む、分子量８４ｋＤａのコラゲナーゼである。ＢＬＡＳＴ検索の結果、ＣｏｌＨやＣｏｌＧとの相同性が低いことがわかっている。また、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼは安価な取得が困難であるという問題に鑑みて、遺伝子工学的手法を用いた当該コラゲナーゼ生産のための技術も提案されている（特許文献５）。特許文献５には、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの全コーディング領域の遺伝子を含むバクミドｐＣＣ１ＢＡＣ−２を作製する方法、バクミドｐＣＣ１ＢＡＣ−２を用いてブレビバチルス・チョウシネンシス組み換え体を作製し、これによりグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼを製造する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０１６−５１６０６５号公報
【特許文献２】国際公開２０１２／１５７３３９号
【特許文献３】国際公開２０１４／１０３５３４号
【特許文献４】特表２０１５−５１３３１２号公報
【特許文献５】特開２０１０−２６３８８０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】大林尚美、村山和隆、”マルチドメインタンパク質コラゲナーゼの分子内コンホメーション変化の解析、生化学、第８５巻、第８号、ｐｐ６９２−６９９、２０１３年
【非特許文献２】Teramura Naoko etc, Cloning of a Novel Collagenase Gene from the Gram-Negative Bacterium Grimontia (Vibrio) hollisae 1706B and Its Efficient Expression in Brevibacillus choshinensis, Journal of Bacteriology, June 2011 vol.193 no.12 p.3049-3056.
【非特許文献３】Matsushita Osamu etc, "A Study of the Collagen-binding Domain of a 116-kDa Clostridium histolyticum Collagenase", Journal of Biological Chemistry, February 1998 vol.273 no.6 p.3643-3648.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＣｏｌＨなどのクロストリジウム・ヒストリチカム由来コラゲナーゼから切り出したＣＢＤは、その名の示す通りコラーゲン結合性を有する。このＣＢＤを所定の薬剤と共役結合させてコラーゲン組織と混合すると、前記薬剤をコラーゲン組織に結合させることができる。しかしながら非特許文献１に記載するように、このＣＢＤはカルシウム依存性があり、コラーゲンとの結合にカルシウムを必要とする場合がある。一方、カルシウムフリーの環境でもコラーゲン結合性を有するポリペプチドからなるコラーゲン結合材であれば、用途を拡大することができる。したがって、カルシウムが存在しない環境下でもコラーゲン結合性を有するコラーゲン結合材の開発が望まれる。
【００１１】
コラーゲンには生体内の存在場所や機能が異なる２０種以上の型がある。Ｉ型コラーゲンは線維性コラーゲンであって、皮膚の真皮や骨、腱などの主タンパク質であるが、ＩＩ型コラーゲンは硝子軟骨のコラーゲン線維の主成分であり、ＩＶ型コラーゲンは基底膜を構成する主成分である。ＣｏｌＨやＣｏｌＧなどのクロストリジウム・ヒストリチカム由来コラゲナーゼのＣＢＤは、Ｉ型コラーゲンに対する結合性を有するが、これまで他の型のコラーゲンに対する結合性は知られていない。例えば、ＩＩ型コラーゲンに対する結合性に優れるコラーゲン結合材が存在すれば、硝子軟骨へのドラッグデリバリーシステムに好適に使用することができる。したがって、Ｉ型以外のコラーゲンにも結合性を有するコラーゲン結合材の開発が望まれる。
【００１２】
更に、特許文献１〜特許文献４に記載されるコラーゲン結合ペプチドは、生体内に投与され、または細胞培養に使用されるため、細胞培養温度の範囲でコラーゲン結合性を発揮するものである。しかしながら、加熱後にコラーゲン結合性を維持できれば、細胞系以外の結合にも使用でき、更に用途を拡大することができる。また、予め加熱殺菌も可能となる。したがって、耐熱性に優れるコラーゲン結合材の開発が望まれる。
【００１３】
このような状況下、本発明は、耐熱性に優れ、Ｉ型以外のコラーゲンと結合できる、新規コラーゲン結合材を提供することを目的とする。
【００１４】
また、カルシウムフリーでコラーゲン結合性を発揮する新規コラーゲン結合材を提供することを目的とする。
【００１５】
更に本発明は、新規コラーゲン結合材の製造方法を提供することを目的とする。
【００１６】
本発明は、上記コラーゲン結合材を用いたドラッグデリバリーシステムや担持体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者等は、グリモンティア・ホリセーを含む細菌性Ｍ９ＡコラゲナーゼのＰＰＣがコラーゲン結合性を有すること、加熱後でもコラーゲン結合性を維持していること、Ｉ型以外のコラーゲンにも結合することを見出し、本発明を完成させた。
【００１８】
すなわち本発明は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤとリンカーとＰＰＣとをこの順に含む細菌性Ｍ９Ａコラゲナーゼのアミノ酸配列の一部であって、
少なくとも前記リンカーの一部と前記リンカーに連続して配列されるＰＰＣとを含むアミノ酸配列（Ｉ）、または前記配列（Ｉ）において１〜２０個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列（ＩＩ）で示されるペプチドを含む、コラーゲン結合材を提供するものである。
【００１９】
また本発明は、前記アミノ酸配列（Ｉ）および／またはアミノ酸配列（ＩＩ）が、２以上のシステインを含むことを特徴とする、前記コラーゲン結合材を提供するものである。
【００２０】
また本発明は、前記細菌性Ｍ９Ａコラゲナーゼが、グリモンティア・ホリセー  コラゲナーゼである、前記コラーゲン結合材を提供するものである。
【００２１】
また本発明は、（ａ）カルシウムが存在しない環境下でコラーゲンと結合する、
（ｂ）Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲンおよびＶ型コラーゲンと結合する、および
（ｃ）温度２５〜９５℃に加熱した後もコラーゲン結合性を維持している、前記コラーゲン結合材を提供するものである。
【００２２】
また本発明は、前記コラーゲン結合材を構成するペプチドをコードするＤＮＡ配列、または前記配列において１〜４５個のＤＮＡ残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有する、核酸を含んでなる組換えＤＮＡを提供するものである。
【００２３】
また本発明は、前記組換えＤＮＡにより形質転換されてなる形質転換体を提供するものである。
【００２４】
また本発明は、前記形質転換体を培養する工程を含む、前記コラーゲン結合材の製造方法を提供するものである。
【００２５】
また本発明は、前記コラーゲン結合材を使用するドラッグデリバリーシステム、または前記コラーゲン結合材を担持した担持体を提供するものである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、細菌性Ｍ９ＡコラゲナーゼのＰＰＣのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、新規コラーゲン結合材が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Ａは、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼのドメイン構造を、Ｂは、リンカー領域のアミノ酸配列、および前記コラゲナーゼによるリンカーの自己分解位置等を説明する図である。
【図２】実施例１の結果を示す図であり、ペプチドの電気泳動図を示す図である。Ｍはマーカーを示す。
【図３】実施例1で得たペプチドの円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルおよび、クロストリジウム・コラゲナーゼのＣＢＤのＣＤスペクトルを示す図である。
【図４】実施例１で得たペプチドのコラーゲン結合能（図４（Ａ））と、ゼラチン結合能（図４（Ｂ））の結果を示す図である。
【図５】実施例１で得たペプチドが、コラーゲン線維に結合することを免疫染色法で確認した図である。
【図６】実施例１で得たペプチドのスキャッチャードプロットの図である。
【図７】実施例１で得たペプチド（図７（Ａ））、ＣｏｌＧｓ３ｂ、およびＣｏｌＧｓ３ａ３ｂ（図７（Ｂ））のコラーゲン結合性が、カルシウムの存在下、およびＥＧＴＡ存在下で変化するかを確認した結果を示す図である。
【図８】実施例１で得たペプチドのコラーゲン結合性が、加熱処理およびカルシウムの存在によって変化するかを確認した結果を示す図である。
【図９】実施例１で得たペプチドと、Ｉ型〜Ｖ型コラーゲンに結合することを示す図である。
【図１０】実施例１で得たペプチドのコラーゲン結合性が、還元処理によって変化するかを確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の第一は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤとリンカーとＰＰＣとをこの順に含む細菌性Ｍ９Ａコラゲナーゼのアミノ酸配列の一部であって、少なくとも前記リンカーの一部と前記リンカーに連続して配列されるＰＰＣとを含むアミノ酸配列（Ｉ）、または前記配列（Ｉ）において１〜２０個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列（ＩＩ）で示されるペプチドを含む、コラーゲン結合材である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００２９】
（１）細菌性Ｍ９Ａコラゲナーゼ
細菌性プロテアーゼの中で、コラゲナーゼは主としてＭ９に分類され、Ｍ９は更に、Ｍ９Ａのビブリオ（Vibrio）種由来コラゲナーゼと、Ｍ９Ｂのバチルス種及びクロストリジウム種由来コラゲナーゼとに大別される。特許文献２や特許文献４で使用されるＣｏｌＨやＣｏｌＧはいずれもＭ９Ｂコラゲナーゼであり、いずれもＣＤ、ＰＫＤ、ＣＢＤの３種のドメインを含む。一方、Ｍ９Ａコラゲナーゼは、ビブリオ種由来コラゲナーゼであり、非特許文献２や特許文献５に記載されるグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼが含まれる。グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼのドメイン構造は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、プレプロ領域−ＣＤ−リンカー−ＰＰＣでありＣＢＤを有しない。しかしながら、本発明者等は、グリモンティア・ホリセーなどのＭ９ＡコラゲナーゼのＰＰＣがコラーゲン結合性を有すること、ペプチドでありながら耐熱性に優れることなどを見出した。
【００３０】
細菌性Ｍ９Ａコラゲナーゼとしては、非特許文献２に記載されるように、グリモンティア・ホリセー、ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）、ビブリオ・アルギノリチカス（Vibrio alginolyticus）などがある。なお、グリモンティア・ホリセーは、例えばＡＴＣＣ  Ｎｏ．３３５６４やＡＴＣＣ  Ｎｏ．３３５６５として入手することができる。
【００３１】
（２）細菌性Ｍ９Ａコラゲナーゼのドメイン構造
細菌性Ｍ９Ａコラゲナーゼとしてグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼがある。グリモンティア・ホリセー１７０６Ｂ株由来コラゲナーゼのアミノ酸配列を配列番号１に、全コーディング領域のＤＮＡ配列を配列番号２に示し、アミノ酸配列のドメイン構造を図１Ａに示す。このコラゲナーゼは、７６７個のアミノ酸で構成され、分子量は８４ｋＤａである。Ｎ末端からＣ末端に向かって、アミノ酸番号第１〜第８７のプレプロ領域、アミノ酸番号第８８〜第６１５の触媒ドメイン領域（ＣＤ）、アミノ酸番号第６１６〜第６８７のリンカー、アミノ酸番号第６８８〜第７４９のＰＰＣを含む。また、ビブリオ・パラヘモリティカス（ＮＰ＿７９７７１９）由来コラゲナーゼや、ビブリオ・アルギノリチカス（ＣＡＡ４４５０１）由来コラゲナーゼは、非特許文献２に示すように、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤ、リンカー、ＰＫＤ、リンカー、ＰＰＣを含む。
【００３２】
（３）コラーゲン結合材
本発明のコラーゲン結合材は、細菌性Ｍ９Ａコラゲナーゼのアミノ酸配列の一部であって、少なくともリンカーの一部と前記リンカーと結合しているプレペプチダーゼＣ末端ドメインとを含むアミノ酸配列（Ｉ）、または該配列（Ｉ）において１〜２０個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列（ＩＩ）で示されるペプチドを含む。以下、便宜のため、グリモンティア・ホリセー１７０６Ｂ株コラゲナーゼで説明する。
【００３３】
本発明のコラーゲン結合材を構成するペプチドのアミノ酸配列（Ｉ）としては、図１Ａの（ｉ）に示すように、コラゲナーゼの全アミノ酸配列において、Ｎ末端からＣ末端に向かって、少なくともリンカーの一部とＰＰＣとからなるアミノ酸配列でもよく、（ｉｉ）に示すように、Ｎ末端からＣ末端に向かって、リンカーの一部以降のアミノ酸配列でもよい。更に、（ｉｉｉ）に示すように、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤの一部以降のアミノ酸配列であってもよい。
【００３４】
図１Ａに示すドメイン構造におけるリンカーのアミノ酸配列の一部を図１Ｂに示す。本発明では、調製が容易な点で（ｉｉ）に示す、リンカーの少なくとも一部を含む態様が好ましい。グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼは自己分解能を有し、リンカーを切断してＣＤとＰＰＣとを分離する特性を有する。図１Ｂのリンカーのアミノ酸配列で説明すると、コラゲナーゼのＮ末端のアミノ酸を第１とした場合に、第６４６アミノ酸と第６４７アミノ酸との間で自己分解して６２ｋＤａコラゲナーゼとなり、第６２４と第６２５との間で自己分解して６０ｋＤａコラゲナーゼとなる。したがって、８４ｋＤａコラゲナーゼを自己分解させ、同時に生成する第６２５〜第７６７アミノ酸からなるペプチドや、第６４７〜第７６７アミノ酸からなるペプチドを回収および精製し、得られたペプチドを本発明のコラーゲン結合材として使用することができる。なお、「リンカーの一部以降のアミノ酸配列」とは、第６１６〜第６８７に示すリンカーのアミノ酸配列の、いずれかのアミノ酸からＣ末端の第７６７番までのアミノ酸配列を意味し、リンカーの全領域を含むものであってもよい。本発明で使用するペプチドは、第６８７以降のアミノ酸を含めばよいが、好ましくは第６１６〜第６５０のいずれかのアミノ酸をＮ末端とし、当該Ｎ末端からコラゲナーゼのＣ末端の第７６７アミノ酸までのアミノ酸配列を有するペプチドである。第６１６〜第７６７のアミノ酸配列は、１５２アミノ酸からなるペプチドであり、第６５０〜第７６７のアミノ酸配列は、１１８アミノ酸からなるペプチドである。
【００３５】
なお、細菌性Ｍ９Ａコラゲナーゼであるビブリオ・パラヘモリティカスやビブリオ・アルギノリチカスは、ＣＤとＰＰＣとの間にＰＫＤを有する点でグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼと相違する。しかしながら、Ｎ末端からＣ末端に向かって、リンカーと連続するＰＰＣを有する点でグリモンティア・ホリセーと共通する。本発明ではグリモンティア・ホリセーと同様に、ビブリオ・パラヘモリティカスやビブリオ・アルギノリチカス由来のコラゲナーゼの全アミノ酸配列において、Ｎ末端からＣ末端に向かって、少なくともリンカーの一部と当該リンカーに連続するＰＰＣとからなるアミノ酸配列や、Ｎ末端からＣ末端に向かって、当該リンカーの一部以降のアミノ酸配列を含むペプチドを、コラーゲン結合材として使用することができる。
【００３６】
配列番号１に示すように、グリモンティア・ホリセー１７０６Ｂ株由来コラゲナーゼは、Ｎ末端からＣ末端側に向かって、リンカー以降のアミノ酸配列に４つのシステインを含み、２対のジスルフィド結合を構成する可能性がある。通常、このジスルフィド結合によってペプチドの立体構造が決定される。本発明では、アミノ酸配列（Ｉ）、アミノ酸配列（ＩＩ）において、２以上のシステインを含むことが好ましく、より好ましくは３以上、より好ましくは４以上のシステインを含む。分子内ジスルフィド結合の有無は耐熱性等に影響を与える可能性がある。非特許文献２、図３に示すように、細菌性Ｍ９Ａコラゲナーゼであるビブリオ・パラヘモリティカスやビブリオ・アルギノリチカスも、グリモンティア・ホリセー１７０６Ｂ株由来コラゲナーゼのリンカー以降のアミノ酸配列と対応する位置にシステインが含まれている。
【００３７】
本発明のコラーゲン結合材は、アミノ酸配列（Ｉ）において１〜２０個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列（ＩＩ）で示されるペプチドであってもよい。なお、アミノ酸配列（Ｉ）において１〜２０個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列（ＩＩ）で示されるペプチドとしては、コラーゲン結合能を有することを条件に、例えば、本発明のコラーゲン結合材を構成するペプチドの一例である配列番号３のアミノ酸配列に５０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列、好ましくは７０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列、特に好ましくは９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列が例示される。例えば、グリモンティア・ホリセー１７０６Ｂ株由来コラゲナーゼの第６４７番〜第７６７番のアミノ酸配列とビブリオ・アルギノリチカスの対応するアミノ酸配列のホモロジーは５６．４１％であり、ビブリオ・パラヘモリティカスのホモロジーは５７．２６％である。
【００３８】
更に、本発明のコラーゲン結合材を構成するペプチドは、コラーゲン結合活性に影響を及ぼさないことを条件に、翻訳の効率を向上させるためのペプチドや、前記ポリペプチドの精製を容易とするためのペプチド（例えばヒスチジン−タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等）、シャペロンなど発現効率を向上させるアミノ酸配列を、更に付加するものであってよい。
【００３９】
（４）コラーゲン結合材の特性
本発明のコラーゲン結合材を構成するペプチドは、グリモンティア・ホリセーなどの細菌性Ｍ９Ａコラゲナーゼのアミノ酸配列の一部に由来する。特許文献４に記載されるように、ＣｏｌＨやＣｏｌＧなどの細菌性Ｍ９ＢコラゲナーゼのＣＢＤが、部分的にねじれていないか又はねじれが不十分なコラーゲン部位をターゲットとして結合することは公知である。また、コラゲナーゼのＣＤが、触媒活性の発現に際しコラーゲンに結合することも公知である。しかしながら、細菌性Ｍ９ＡコラゲナーゼのＰＰＣがコラーゲン結合性を有することは全く知られていなかった。前記したＰＰＣを含むアミノ酸配列（Ｉ）について詳細に検討したところ、そのコラーゲン結合能は極めて特異的であることが判明した。すなわち、本発明のコラーゲン結合材を構成するペプチドのコラーゲン結合能は、コラーゲン三重螺旋に依存することが判明した。このため、コラーゲン線維に結合するが、コラーゲン分解物であるゼラチンには結合することができない。この点、部分的にねじれているコラーゲンをターゲットとするＣｏｌＨやＣｏｌＧと相違する。また、コラーゲンであれば、Ｉ型に限定されず、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型にも結合する。コラーゲンはいずれの型も、コラーゲン分子からコラーゲン細線維で構成されるが、最終形態は線維状に限定されず細網板状なども存在する。本発明のコラーゲン結合材は、コラーゲンの三重螺旋構造を認識して結合するため、Ｉ型に限定されず、他の型のコラーゲンにも結合することができる。実施例では、Ｉ型からＶ型までの結合実験をおこなっているが、コラーゲン三重螺旋構造を有すればいずれのコラーゲンにも結合することができる。すなわち、コラーゲン三重螺旋構造を有すれば線維状に限定されず細網板状その他でも結合能を発揮する。
【００４０】
本発明のコラーゲン結合材のコラーゲン結合能は、カルシウムフリーの環境下でもコラーゲン結合能が消失しない。しかも、後記する実施例に示すように、本発明のコラーゲン結合材を構成するペプチドを、室温から９０℃に加熱しても、その後のコラーゲン結合能が維持されていた。本発明のコラーゲン結合材は、温度２５〜９５℃、好ましくは５０〜９５℃、特に好ましくは７０〜９５℃に加熱した後もコラーゲン結合性を維持することができる。耐熱性が何に起因するかは明確ではない。しかしながら、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル分析によれば、ＣｏｌＧなどのＭ９Ａ細菌性コラゲナーゼのＣＢＤはβ−シート構造を有するが、本発明のコラーゲン結合材を構成するペプチドは、ＣｏｌＧと全く異なるスペクトルを示し、ランダムコイルを有すると推定された。また、アミノ酸配列中に複数のシステインを含むため、２以上のジスルフィド結合を有する可能性がある。このようなジスルフィド結合の存在や立体構造によって、耐熱性が確保された可能性が推察される。
【００４１】
（５）コラーゲン結合材の製造方法
本発明のコラーゲン結合材を構成するペプチドは、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼを自己分解させ、ＣＤとＰＰＣとを切り離すことで調製することができる。自己分解は、図１Ｂに示すように、第６２４と第６２５との間や第６４６アミノ酸と第６４７アミノ酸との間を切り離す。この方法によれば、第６２５〜第７６７で示すアミノ酸配列のペプチドや第６４７〜第７６７で示すアミノ酸配列を製造することができる。
【００４２】
一方、本発明のコラーゲン結合材を構成するペプチドは、遺伝子工学の技術を使用して製造することができる。このような遺伝子組換えに使用するＤＮＡ配列としては、前記アミノ酸配列（Ｉ）やアミノ酸配列（ＩＩ）をコードするＤＮＡ配列を使用することができる。例えば、配列番号２に示す配列において、図１Ａの（ｉ）〜（ｉｉｉ）に対応するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を使用することができる。このようにして調製されたペプチドのアミノ酸配列の一例を配列番号３に示す。
【００４３】
本発明のコラーゲン結合材を構成するペプチドを調製するには、例えば配列番号３に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを調製し、前記組み換えベクターで形質転換して、コラーゲン結合能を有する宿主細胞を調製し、前記宿主細胞を培養してコラーゲン結合能を有する遺伝子産物を産生させればよい。例えば、グリモンティア・ホリセーのゲノムライブラリーからグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼ遺伝子を含むクローンを選択し、そのクローンを鋳型として前記配列番号３をコードするＤＮＡ断片の５’側にＮｃｏ  Ｉサイトを、３’側にＨｉｎｄ  ＩＩＩサイトを付加し、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）により増幅し、増幅された断片をＮｃｏ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで処理して回収した当該ＤＮＡ断片を、プラスミドベクターなどに挿入して組換プラスミドを調製し、これを用いて例えばブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３株などを形質転換し、ブレビバチルス・チョウシネンシス組換え体を作製する。あるいは、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼ遺伝子を含むクローンを鋳型として前記配列番号３で示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の両端に、挿入する直鎖状発現ベクターの両末端と相同な１５塩基対の配列を付加したＤＮＡ断片を調製および増幅し、当該増幅されたＤＮＡ断片と直鎖状発現ベクターとを混合後、新Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法にてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３株などのブレビバチルス属に導入して組換プラスミドおよび組換え体を作製してもよい。このようにして得たブレビバチルス・チョウシネンシス組換え体を培養すれば、培養上清中にペプチドを産生させることができる。
【００４４】
培養物中から目的物質であるペプチドを採取及び精製する方法は、一般の酵素の採取及び精製手段に準じて行うことができる。例えば、培養物を遠心、又は濾過などによって菌体を分離し、その培養濾液から通常の分離手段、例えば、有機溶媒沈澱法、塩析、限外濾過膜による濃縮等を用い、カラムクロマトグラフィー等により精製する方法が挙げられる。これにより、本発明のコラーゲン結合材を構成するペプチドを製造することができる。
【００４５】
（６）コラーゲン結合材の用途
本発明のコラーゲン結合材は、コラーゲン結合性を有し、融合タンパク質や、生物活性剤、医薬剤の一部に組み込むことができる。コラーゲン結合材は、そのまま使用することもでき、他のペプチドや化合物に共有結合によって結合してもよく、また水素結合などによって結合させることもできる。
【００４６】
例えば、特許文献１記載のヴォン・ヴィレブランド因子や血小板コラーゲン受容体のコラーゲン結合性ドメインなどのコラーゲン結合性ペプチドに代えて本発明のコラーゲン結合材を使用し、ドラッグデリバリーシステムを構築することができる。また、精製用カラムに使用する担体に本発明のコラーゲン結合材を担持させ、担持体とすることができる。本発明のコラーゲン結合材はゼラチンと結合しないため、コラーゲン結合材を担持した担体を充填したカラムでコラーゲン溶液を精製すると、保存工程で生成したゼラチンを除去することができる。
【００４７】
本発明のコラーゲン結合材は、ＥＤＴＡやＥＧＴＡ等のキレート剤の存在下でもコラーゲンと結合するため、予めコラーゲン結合材固定化カラムを調製し、ＥＤＴＡ含有細胞溶解液やＥＤＴＡ含有組織抽出液から三重螺旋構造を有する各種コラーゲンを精製あるいは吸着除去するために使用することができる。例えば、ＥＤＴＡを含む細胞溶解液から、ＸＩＩＩ型、ＸＶＩＩ型、ＸＸＩＩＩ型、ＸＸＶ型などの三重螺旋構造を有する膜貫通型コラーゲンをコラーゲン結合材固定化カラムに吸着させ、その精製の用途に使用することができる。コラーゲン結合材に結合したコラーゲンは、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤や尿素などの変性剤を添加することでコラーゲン結合材から遊離させることができる。
【００４８】
本発明のコラーゲン結合材は、加熱後にもコラーゲン結合性を維持するため、発酵に応じて発熱する革屑や生ゴミの堆肥化において、本発明のコラーゲン結合材を耐熱性分解酵素と結合させてコンポストに仕込むと、酵素が革屑やコラーゲン含有生ごみに結合するため少量の酵素で効率的に分解することができる。
【００４９】
本発明のコラーゲン結合材は、Ｉ型以外のコラーゲンにも結合性を有するため、軟骨や硝子体（ＩＩ型コラーゲン）、血管（ＩＩＩ型コラーゲン）、腎糸球体、レンズ包や各種臓器の基底膜（ＩＶ型コラーゲン）、角膜や胎盤（Ｖ型コラーゲン）等ほぼすべての臓器や組織へのドラッグデリバリーの用途に使用することができる。
【実施例】
【００５０】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【００５１】
（実施例１）
以下の方法で、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼのリンカー以降のアミノ酸配列の１５．４ｋＤａのペプチド（８４ｋＤａコラゲナーゼの第６１６〜第７６７アミノ酸からなるペプチド）を製造した。得られたペプチドのアミノ酸配列を配列番号３に示す。
（１）グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの全コーティング領域の遺伝子を含むバクミドｐＣＣ１ＢＡＣ−２（受託番号；ＮＩＴＥ  ＢＰ−００７３９：原寄託２００９年４月２８）を鋳型として、配列番号３のペプチド配列から誘導された当該コラゲナーゼ遺伝子の部分配列（長さ４５６ｂｐ）を、下記プライマーセットを使用してＰＣＲ反応を使って単離した。プライマーの配列のうち、直鎖状プラスミドベクターｐＢＩＣ２の両端の配列と相同な配列を下線で示す。
プライマー：
Fwd: GATGACGATGACAAAaccgaggcgctggcgaag（配列番号４） 
Rvs: CATCCTGTTAAGCTTttactgacgacactggtt（配列番号５）
【００５２】
（３）得られた、４５６ｂｐのＤＮＡ断片と、直鎖状発現ベクターｐＢＩＣ２とをモル比２：１で混合後、新Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法にてコンピテントセルに導入するとともにブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３株を形質転換し、プラスミドｐＢＩＣ２−ＰＰＣおよび組換え体を作製した。
【００５３】
（４）前記ブレビバチルス・チョウシネンシス組換え体を１００ｍｌのＴＭＮ培地（１０ｇ／Ｌ  グルコース、１０ｇ／Ｌ  ファイトンペプトン、５ｇ／Ｌ  エルリッヒ  カツオエキス、２ｇ／Ｌ  酵母エキスＢ２、１０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、１ｍｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０μｇ／ｍＬ  ネオマイシン、ｐＨ７．０）中で、３０℃、４８時間培養し、Ｎ末端にＨｉｓタグが結合した配列番号３で示すペプチドを含む培養液を得た。
【００５４】
（５）得られた培養液を遠心し、上清を０．２μｍフィルターで濾過滅菌し、次いで上清４０ｍｌをニッケルカラムにて精製・分画した。培養上清をカラムに供してＨｉｓタグ付きペプチドを吸着させた後、２５０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）を流し、前記Ｈｉｓタグ付きペプチドを分離溶出させた。溶出液を限外濾過により濃縮し、２５℃で一晩エンテロキナーゼ処理を行い、Ｈｉｓタグを切断した。処理液を再びニッケルカラムに供して配列番号３で示すペプチドと切断されたＨｉｓタグとを分離した。配列番号３で示すペプチドはフロースルー画分に溶出された。溶出液を限外濾過により濃縮し、０．２ＭのＮａＣｌと５ｍＭのＣａＣｌ２を含む４℃の５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液で透析し、２．８ｍｇの配列番号３で示すペプチドを得た。
【００５５】
（６）上記（５）で得たペプチドを用い、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加しないサンプル（非還元サンプル）と、ＤＴＴを添加してジスルフィド結合を切断したサンプル（還元サンプル）とを調製し、これらを同時に電気泳動にて分析した。結果を図２に示す。図２に示すように、非還元サンプル、還元サンプルともに一本の目的のタンパク質のバンドのみが検出された。一方、還元サンプルと非還元サンプルとは移動度に差があり、還元サンプルの移動度が遅い。この移動度の差は立体構造によるものと推定され、配列番号３で示すアミノ酸配列を有するペプチドは、分子内ジスルフィド結合を有すると推定された。
【００５６】
また、得られたペプチドの質量とＮ末端アミノ酸配列を調べた。ＬＣ−ＴＯＦ／ＭＳを用いて分子量を調べると、１５，４４５．００であった。アミノ酸配列より推定される分子量は１５，４４８．７２であるが、ペプチドに含まれる４つのシステイン残基が２つのジスルフィド結合を形成しているため、水素４個分の質量を除くと推定分子量は１５，４４４．７２となり、実施値との差は０．２８であった。また、ペプチドシークエンサーを用いてＮ末端配列を解析したところ、ＴＥＡＬＡＫＧＤＳＧ−（配列番号６）の配列を有することが同定された。質量分析計およびＮ末端アミノ酸配列の分析結果から、得られたペプチドのアミノ酸配列は配列番号３で示すペプチドと同一であり、かつ２か所のジスルフィド結合を有するペプチドであることが確認された。
【００５７】
（実施例２）
実施例１で得たペプチドの円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを測定した。
実施例１で得たペプチドを、濃度０．１ｍｇ／ｍｌ、２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．５に溶解して測定用サンプルを調製した。この溶液について、波長１９０〜２６０ｎｍのＣＤスペクトルを測定した。また、実施例１のペプチドに代えて、岡山大学大学院医歯薬学総合研究科病原細菌学分野  松下治教授から供与されたＣｏｌＧのＣＢＤ（ｓ３ｂ）、及びＣｏｌＧのＣＢＤ（ｓ３ａ３ｂ）を使用して同様に操作し、ＣＤスペクトルを測定した。これらの結果を図３に示す。
【００５８】
α−へリックスは、１９６ｎｍ付近に大きな正の極大と、２０７ｎｍおよび２２２ｎｍ付近に二つの負の極大とを形成する特徴があり、β−シート構造は、１９７ｎｍ付近に正の極大と２１６ｎｍ付近に負の極大を形成し、ランダムコイルは１９６ｎｍ付近に大きな負の極大を形成する、という特徴がある。ＣｏｌＧｓ３ｂおよびＣｏｌＧｓ３ａ３ｂは、典型的なβ−シート構造のスペクトルを呈したが、実施例１で得たペプチドは、ＣｏｌＧｓ３ｂおよびＣｏｌＧｓ３ａ３ｂと大きく異なり、ランダムコイルを有すると推定された。実施例１で得たペプチドの二次構造は、クロストリジウム・ヒストリチカム由来コラゲナーゼのＣＢＤの二次構造と大きく異なることが確認された。
【００５９】
（実施例３）
以下の方法で、コラーゲン線維に対する結合実験を行った。
ウシのアキレス腱をホモジナイズして乾燥した不溶性Ｉ型コラーゲン線維５ｍｇをスピンカラムに入れ、４００μＬの結合バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）を加え、室温で３０分放置した。遠心（１０，０００ｘｇ、２分）により結合バッファーを除き、これを繰り返し、計３回コラーゲン線維を洗浄した。洗浄したコラーゲン線維にタンパク質混合液５０μＬ（実施例１で得たペプチド：０．２ｍｇ／ｍｌ、ＢＳＡ：０．２ｍｇ／ｍｌ）を加え、室温で３０分放置して実施例１で得たペプチドをコラーゲン線維に結合させた。この溶液を遠心（１０，０００ｘｇ、１０分）し、上清を回収した。上清にはコラーゲン線維に結合しなかったペプチドが含まれている。さらに５０μＬの結合バッファーを沈殿物に添加して洗浄および遠心し、計１００μＬの上清を回収した。この上清と、コラーゲン線維との結合処理を行っていない上記タンパク質混合液とを共に電気泳動で分析した。結果を図４（Ａ）に示す。同図において、Collagenの文字の下部の「＋」は上記上清であり、Collagenの文字の下部の「−」は結合処理を行っていないタンパク質混合液を使用したことを意味する。
【００６０】
コラーゲン（＋）では、コラーゲン（−）と比べて実施例１で得たペプチドのバンドが薄い。実施例１で得たペプチドがコラーゲン線維と結合したことを示す。なお、ＢＳＡのバンドの濃さはコラーゲン（＋）とコラーゲン（−）との間で変化がなく、コラーゲン線維には結合していなかった。
【００６１】
（実施例４）
以下の方法で、ゼラチンに対する結合実験を行った。
実施例３で使用した不溶性Ｉ型コラーゲン線維５ｍｇの代わりに、ゼラチンセファロース５０μＬを用いて同様に操作した。結果を図４（Ｂ）に示す。同図において、Gelatinの文字の下部の「＋」は結合処理を行った上清であり、Gelatinの文字の下部の「−」は結合処理を行っていないタンパク質混合液を使用したことを意味する。
【００６２】
ゼラチン（＋）とゼラチン（−）との間には、実施例１で得たペプチドのバンドの濃さに変化がなく、ＢＳＡのバンドの濃さにも変化がない。この結果から、実施例１で得たペプチドとＢＳＡとは、ゼラチンに結合しないことが示された。
【００６３】
実施例３の結果および実施例４の結果から、実施例１で得たペプチドは、コラーゲンの三重螺旋構造に結合すると推定された。
【００６４】
（実施例５）
コラーゲン線維と実施例１で得たペプチドとの結合を、免疫染色にて確認した。
スライドグラスへのペプチドの吸着を防ぐために、あらかじめスライドグラスを１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）にてブロッキングした。洗浄後、ＰＢＳ（−）に溶解した０．２ｍｇ／ｍｌの酸抽出コラーゲンを滴下し、３７℃で１時間保温してゲルを作製した。乾燥後、結合バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で洗浄した。これに、実施例１の（４）で調製したＮ末端にＨｉｓタグが結合した配列番号３で示すペプチド（ペプチド０．２μｇ／ｍｌ）溶液を５０μＬ滴下してコラーゲン再生線維に結合させた。次いで、蛍光標識された抗Ｈｉｓタグ抗体を添加し、免疫染色を行った。免疫染色の結果を図５に示す。図５左図は位相差顕微鏡像であり、図５右図は免疫染色像である。免疫染色像には、コラーゲン線維に淡色の点で示される蛍光発色が観察され、実施例１で得たペプチドがコラーゲン線維に結合することが免疫染色にて確認された。
【００６５】
（実施例６）
実施例１で得たペプチドの量を変えて結合実験を行い、不溶性Ｉ型コラーゲン線維に対する最大結合量（Ｂｍａｘ）および解離定数（Ｋｄ）を算出した。
不溶性Ｉ型コラーゲン線維２．５ｍｇをスピンカラムに入れ、４００μＬの結合バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）を加え、室温で３０分放置した。遠心（１０，０００ｘｇ、２分）して上清を除去し、これを繰り返し計３回行ってコラーゲン線維を洗浄した。洗浄したコラーゲン線維にタンパク質混合液５０μＬ（実施例１で得たペプチド：５、１０、２５、５０、７５、１００μｇ、ＢＳＡ：２．５μｇ）を加え、室温で３０分放置して実施例１で得たペプチドをコラーゲン線維に結合させた。遠心（１０，０００ｘｇ、１０分）し、上清５０μＬを回収した。この上清を用いて電気泳動を行い、バンドの濃さより結合しなかった実施例１で得たペプチドの量を定量した。用いた実施例１で得たペプチド量から結合しなかった実施例１で得たペプチド量を減じることで、結合量を算出した。スキャッチャードプロットによりＫｄ及びＢｍａｘを算出した。スキャッチャードプロットの結果を図６に示す。実施例１で得たペプチドは、Ｋｄ＝２．７×１０−５Ｍ、Ｂｍａｘ＝１．９４ｎｍｏｌ／ｍｇコラーゲンであった。
【００６６】
なお、非特許文献３には、ＣｏｌＨｓ３の測定値が記載されている。ＣｏｌＨｓ３のＫｄ＝１．５９×１０−５Ｍ、Ｂｍａｘ＝１．０１ｎｍｏｌ／ｍｇコラーゲンである。この結果を参照し、実施例１で得たペプチドのコラーゲン結合能は、クロストリジウム・ヒストリチカム由来コラゲナーゼのＣＢＤのコラーゲン結合能と略同等の結合能を有することが確認された。
【００６７】
（実施例７）
実施例１のペプチドのコラーゲン線維結合に対するカルシウム依存性を調べた。
不溶性Ｉ型コラーゲン線維２．５ｍｇをスピンカラムに入れ、４００μＬの結合バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）を加え、室温で３０分放置した。遠心（１０，０００ｘｇ、２分）により結合バッファーを除き、これを繰り返し、計３回コラーゲン線維を洗浄した。次いで、タンパク質混合液５０μＬ（実施例１で得たペプチド：０．１ｍｇ／ｍｌ、ＢＳＡ：０．１ｍｇ／ｍｌ）を、前記洗浄したコラーゲン線維に加え、室温で３０分放置して実施例１で得たペプチドをコラーゲン線維に結合させた。この混合液を遠心（１０，０００ｘｇ、１０分）し、上清を回収した。
また、前記タンパク質混合液５０μＬ（実施例１で得たペプチド：０．１ｍｇ／ｍｌ、ＢＳＡ：０．１ｍｇ／ｍｌ）にＥＧＴＡ１０ｍＭを加えて、室温で３０分間プレインキュベートした。前記洗浄したコラーゲン線維にこのタンパク質混合液５０μＬを加え、室温で３０分放置して実施例１で得たペプチドをコラーゲン線維に結合させた。この混合液を遠心（１０，０００ｘｇ、１０分）し、上清を回収した。
また、コラーゲン線維との結合処理を行っていない前記タンパク質混合液とを共に電気泳動で分析した。結果を図７（Ａ）に示す。
【００６８】
カルシウム存在下でコラーゲン線維と結合させた実施例１で得たペプチドのバンド、およびカルシウムとＥＧＴＡ存在下でコラーゲン線維と結合させた実施例１で得たペプチドのバンドは、いずれもコラーゲン線維と結合させなかった実施例１で得たペプチドのバンドより薄い。実施例１で得たペプチドは、カルシウムの有無にかかわらずコラーゲン線維に結合することが確認された。
【００６９】
また、実施例１で得たペプチドに代えて、クロストリジウム（ＣｏｌＧ）のＣＢＤ（ｓ３ｂ及びｓ３ａ３ｂ）を使用して同様に操作した。結果を図７（Ｂ）に示す。ＥＧＴＡ存在下でのＣｏｌＧｓ３ｂ及びＣｏｌＧｓ３ａ３ｂのバンドはカルシウム存在下でのバンドより濃く、コラーゲン線維との結合にカルシウム依存性を有することが確認された。
【００７０】
（実施例８）
実施例１のペプチドの、加熱への影響を調べた。
タンパク質混合液５０μＬ（実施例１で得たペプチド：０．１ｍｇ／ｍｌ、ＢＳＡ：０．１ｍｇ／ｍｌ）をあらかじめ室温、５０℃、７０℃、９０℃で３０分間インキュベートし、その後、室温で３０分間放置した。実施例７と同様に処理して得た洗浄したコラーゲン線維に、前記タンパク質混合液５０μＬを加え、室温で３０分放置して実施例１で得たペプチドをコラーゲン線維に結合させた。この混合液を遠心（１０，０００ｘｇ、１０分）し、上清を回収した。また、コラーゲン線維との結合処理を行っていない前記タンパク質混合液とを共に電気泳動で分析した。結果を図８に示す。同図において、コラーゲン（＋）はコラーゲン結合処理をおこなったもの、コラーゲン（−）は結合処理を行っていない試料を意味する。
【００７１】
また、前記タンパク質混合液５０μＬ（実施例１で得たペプチド：０．１ｍｇ／ｍｌ、ＢＳＡ：０．１ｍｇ／ｍｌ）、または前記タンパク質混合液５０μＬにＥＧＴＡ１０ｍＭを加えた混合液を、それぞれ９０℃で３０分間プレインキュベートした。これらに、それぞれ前記洗浄したコラーゲン線維を加え、室温で３０分放置して実施例１で得たペプチドをコラーゲン線維に結合させた。次いで、これら混合液を遠心（１０，０００ｘｇ、１０分）し、上清を回収した。コラーゲン線維との結合処理を行っていない前記タンパク質混合液と共に、電気泳動で分析した。結果を図８に示す。
【００７２】
室温、５０℃、７０℃、９０℃に加熱処理した後にコラーゲンに結合させた実施例１で得たペプチドのバンドは、コラーゲン結合処理を行っていないペプチドのバンドよりもいずれも薄く、実施例１で得たペプチドは、加熱後にもコラーゲン線維への結合能を維持していることが確認された。また、実施例１で得たペプチドは、カルシウムの存在下、およびカルシウムとキレート剤ＥＧＴＡの存在下に加熱処理しても、その後のコラーゲン結合能を維持することが確認された。
【００７３】
（実施例９）
Ｉ型以外の代表的なコラーゲンにも結合するか調べるため、各種ペプシン可溶化コラーゲン（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ型）をセファロースビーズに固定化し、結合実験を行った。
（１）２００μＬのＮＨＳ活性化セファロースビーズを１ｍＬの１ｍＭ  ＨＣｌで３回洗浄した。０．５Ｍ  ＮａＣｌ、４％  ｓｕｃｒｏｓｅを含む０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３に溶解した上記各種コラーゲンの溶液（濃度１．５ｍｇ／ｍｌ）５００μＬを洗浄したビーズに添加し、４℃で４０時間、撹拌しながら反応させた。反応後、遠心して未反応のコラーゲンを除去し、５００μＬのバッファー（Ｉ）（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）、更に５００μＬのバッファー（ＩＩ）（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）で洗浄した。上記バッファー（Ｉ）および（ＩＩ）での洗浄をそれぞれ３回繰り返し、コラーゲン固定化ビーズを得た。各コラーゲンのビーズへの固定化率は、Ｉ型：２０．７％、ＩＩ型：１９．４％、ＩＩＩ型：２０．７％、ＩＶ型：２９．９％、Ｖ型：３０．１％であった。
（２）実施例３で使用した不溶性コラーゲン線維に代えて上記（１）のコラーゲン固定化ビーズ１００μＬを用いて同様の結合実験を行った。結果を図９に示す。
（３）比較例のため、上記（１）のコラーゲン固定化ビーズに代えてトリスバッファー処理セファロースビーズを使用して同様に操作した。結果を図９に併記する。
【００７４】
何れのコラーゲンに関しても、コラーゲン結合処理を行った実施例１で得たペプチドのバンドは、コラーゲン結合処理を行っていない実施例１で得たペプチドのバンドよりもバンドが薄かった。実施例１で得たペプチドは、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ型コラーゲンの何れにも結合するものであり、実施例１で得たペプチドが各種コラーゲンに結合することが確認された。図９に、デンシトメトリーによりバンドの濃さを定量して算出した結合率を示す。また、実施例１で得たペプチドのトリスバッファー処理セファロースビーズ（比較例）への結合実験ではバンドの濃さに変化が少なく、結合率は１２．３％に過ぎなかった。
【００７５】
（実施例１０）
実施例１で得たペプチドを還元処理した後のコラーゲン結合性を評価した。
予め、実施例１で得たペプチド５μｇに還元剤ジチオスレイトール１ｍＭを添加して、ペプチドの分子内ジスルフィド結合を切断した。
このサンプルを使用し、非還元サンプルと共に実施例３と同様に操作して結合実験を行った。結果を図１０に示す。実施例１で得たペプチドは、ジチオスレイトールによる還元処理の有無にかかわらず、コラーゲン線維に結合した。よって、実施例１で得たペプチドの分子内ジスルフィド結合が、コラーゲン結合性に関与する可能性は低いと考えられた。
【００７６】
なお、結合バッファーのｐＨを６、７、８、９に代えた以外は実施例３と同様に操作したところ、ｐＨ６〜９の間でいずれもコラーゲン結合能が維持され（図示せず）、コラーゲン結合性に対するｐＨの影響は少ないと考えられた。
【００７７】
さらに、結合バッファーのＮａＣｌ濃度を、０Ｍ、０．１Ｍ、０．５Ｍ、１．０Ｍに代えた以外は実施例３と同様に操作したところ、ＮａＣｌ濃度０〜１．０Ｍの間でいずれもコラーゲン結合能が維持され（図示せず）、コラーゲン結合性に対するＮａＣｌ濃度の影響は少ないと考えられた。
【受託番号】
【００７８】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−００７３９
【図１】
2019083741.tif 000002
【図２】
2019083741.tif 000003
【図３】
2019083741.tif 000004
【図４】
2019083741.tif 000005
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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