(57)【要約】【課題】本発明は、細菌検出用の細菌選択培地および細菌の選択的増殖方法を提供する。【解決手段】本発明は、夾雑細菌特異的溶菌酵素を含有する細菌選択培地、および夾雑細菌特異的溶菌酵素を細菌選択培地に添加し、夾雑細菌の増殖を抑制し、目的の細菌を選択的に培養する方法を課題の解決手段とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
夾雑細菌特異的溶菌酵素を含有する細菌選択培地。
【請求項２】
前記溶菌酵素が、エンドリシンおよび／またはオートリシンであることを特徴とする請求項１に記載の選択培地。
【請求項３】
前記夾雑細菌が腸球菌であることを特徴とする請求項１または２に記載の選択培地。
【請求項４】
前記腸球菌がEnterococcus faecalis（E. faecalis）であり、前記細菌がＢ群連鎖球菌（GBS）であることを特徴とする請求項３に記載の選択培地。
【請求項５】
前記エンドリシンが下記の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかに示されるタンパク質であることを特徴とする、請求項４に記載の培地。
（ａ）配列番号１、配列番号２または配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１、配列番号２または配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ペプチドグリカン分解活性を有するタンパク質、および
（ｃ）配列番号１、配列番号２または配列番号３で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ペプチドグリカン分解活性を有するタンパク質
【請求項６】
検体中に存在する細菌を検出する方法であって、請求項１ないし５のいずれかに記載の培地に検体を接種して培養する工程を含む、細菌検出方法。
【請求項７】
前記夾雑細菌が腸球菌であることを特徴とする請求項６に記載の細菌検出方法。
【請求項８】
前記腸球菌がE. faecalisであり、前記細菌がGBSであることを特徴とする請求項７に記載の細菌検出方法。
【請求項９】
少なくとも夾雑細菌特異的溶菌酵素を含むことを特徴とする、細菌検出キット。
【請求項１０】
前記夾雑細菌が腸球菌であることを特徴とする請求項９に記載の細菌検出キット。
【請求項１１】
前記腸球菌がE. faecalisであり、前記細菌がGBSであることを特徴とする請求項１０に記載の細菌検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌検出用の細菌選択培地および細菌の選択的増殖方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
病原性細菌による感染や汚染の有無は、感染症の重症化を未然に防ぐためにも可能な限り早急、かつ、確実に診断する必要がある。細菌検査は、生体への感染の有無を調べるだけでなく、食品などへの細菌汚染を確認し食中毒の発生を未然に防ぐ上でも重要である。
生体への感染の有無は、保健所やその他の医療機関において実施されているが、例えば、Ｂ群連鎖球菌（Group B Streptococcus; GBS）の検査もその１つである。GBSは、膣や腸管に常在し、妊婦における保菌率は10%〜30%と言われているが、出産時に垂直感染により新生児に感染し、髄膜炎、敗血症および肺炎などを引き起こす主たる起因菌である。新生児における発症率は1%〜2%と言われているが、重症化し死に至ることもあるため、妊婦の膣内保菌率を調べて、保菌者である場合には抗菌剤等であらかじめ治療を行っておくことが、新生児の生命を守るために極めて重要である。通常、GBS検査は、妊娠35〜37週の妊婦に対して実施される。
【０００３】
細菌検査において、問題となるのが検体中における夾雑細菌の存在である。前出のGBS検査では、検体をGBS選択培地に植菌して増菌培養し、GBSの検出感度を上げる方法が用いられている。ところが、近年、GBSの検査サンプル中には、夾雑細菌としてGBSと同様にβ溶血性を示す膣常在菌の腸球菌（特に、Enterococcus faecalis）が存在することが報告されており（非特許文献１）、汎用されている血液寒天培地では腸球菌との分離が難しいケースが生じている。また、従来の選択培地では、腸球菌の増殖を100 %阻害することが難しいため、腸球菌の混入によるGBSの検出精度の低下が問題となっている。
【０００４】
このように、GBS検査の例にあるように、細菌の検出を行うにあたり、検査サンプル中の夾雑細菌（すなわち、検出対象以外の細菌）の存在によって生じる検出精度の低下は、適切な細菌検査を行う上で改善すべき課題となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Saviniら, Diagn Microbiol Infect Dis. 82:32-33, 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記事情に鑑み、本発明者は、妊婦のGBS検査において、簡便、迅速にかつ高精度に検査を行う方法の提供を解決課題とし、より具体的には、夾雑細菌の増殖を抑え、検査対象の細菌を選択的に検出する方法、および、当該方法を実施するための細菌選択培地の提供を解決課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、腸球菌に対して特異的な溶菌酵素をGBS選択培地に含有させることにより、既存の選択培地では増殖を抑制できなかった腸球菌の増殖を効果的に抑制することに成功した。
GBS検査は、一般に、検査器具（例えば、綿棒など）で膣の入り口付近と肛門の周囲をこすって得た検体を培養し、GBSの増殖の有無を確認することによって行われている。しかし、検体の中には、膣や腸管の常在菌である腸球菌（特にEnterococcus faecalis）が含まれていることが多く、これが増殖することで、検査精度の低下が引き起こされる。発明者らは、腸球菌特異的に感染するバクテリオファージ由来の組換えエンドリシンを調製し、これをGBS検査用の選択培地に添加して検体の培養を行ったところ、腸球菌の増殖を特異的に抑制することを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１１）である。
（１）夾雑細菌特異的溶菌酵素を含有する細菌選択培地。
（２）前記溶菌酵素が、エンドリシンおよび／またはオートリシンであることを特徴とする上記（１）に記載の選択培地。
（３）前記夾雑細菌が腸球菌であることを特徴とする上記（１）または（２）に記載の選択培地。
（４）前記腸球菌がEnterococcus faecalis（E. faecalis）であり、前記細菌がＢ群連鎖球菌（GBS）であることを特徴とする上記（３）に記載の選択培地。
（５）前記エンドリシンが下記の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかに示されるタンパク質であることを特徴とする、上記（４）に記載の培地。
（ａ）配列番号１、配列番号２または配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１、配列番号２または配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ペプチドグリカン分解活性を有するタンパク質、および
（ｃ）配列番号１、配列番号２または配列番号３で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ペプチドグリカン分解活性を有するタンパク質
（６）検体中に存在する細菌を検出する方法であって、上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の培地に検体を接種して培養する工程を含む、細菌検出方法。
（７）前記夾雑細菌が腸球菌であることを特徴とする上記（６）に記載の細菌検出方法。
（８）前記腸球菌がE. faecalisであり、前記細菌がGBSであることを特徴とする上記（７）に記載の細菌検出方法。
（９）少なくとも夾雑細菌特異的溶菌酵素を含むことを特徴とする、細菌検出キット。
（１０）前記夾雑細菌が腸球菌であることを特徴とする上記（９）に記載の細菌検出キット。
（１１）前記腸球菌がE. faecalisであり、前記細菌がGBSであることを特徴とする上記（１０）に記載の細菌検出キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明で提供される培地を使用することにより、夾雑細菌の増殖を抑制し、検査対象細菌の検出精度を向上させることができる。具体的には、GBS検査を例にすると、腸球菌特異的に溶菌する酵素を含む培地で培養することで、腸球菌の増殖が抑制され、精度の高いGBS検査が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】E. faecalisのエンドリシンと推定されるタンパク質の発現確認。タンパク質を発現させた大腸菌培養物をSDS-PAGEにかけCBB（Coomassie Brilliant Blue）染色を行った結果（左図）と、SDS-PAGE後に抗Hisタグ抗体でウエスタンブロッティングを行った結果（右図）を示す。
【図２】E. faecalisのエンドリシンと推定されるタンパク質のペプチドグリカン分解活性。各濃度（図に示す）の発現タンパク質とE. faecalis29株のペプチドグリカンを混合後、0、5、15、30および60分間インキュベートした各時点のOD595値を示す。
【図３】φM1FE2-LYSの基質特異性の検討。φM1FE2-LYS と、E. faecalis（EF29株およびATCC29212株）、E. faecium（Efum4株）、E. avium（Eav1株）およびS. agalactiae（GBS3株）のペプチドグリカンを各々混合後、0、5、15、30および60分間インキュベートした各時点のOD595値を示す。
【図４】φM1FE2-LYSのE. faecalisに対する溶菌活性。各濃度のφM1FE2-LYSとE. faecalis29株の生菌を混合後、0、5、15、30および60分間インキュベートした各時点のOD595値を示す。
【図５】φM1FE2-LYSのE. faecalisに対する殺菌効果。各濃度のφM1FE2-LYSとE. faecalis29株の生菌を混合後、0、5、15、30および60分間インキュベートした各時点のE. faecalis29株の生菌数を示す。
【図６】φM1FE2-LYSの溶菌活性の菌特異性の検討。φM1FE2-LYS とE. faecalis（EF29株およびATCC29212株）、E. faecium（Efum4株）、E. avium（Eav1株）およびS. agalactiae（GBS3株）の生菌を混合後、0、5、15、30および60分間インキュベートした各時点のOD595値を示す。
【図７】GBS用培地中でのφM1FE2-LYSのE. faecalisに対する殺菌効果。φM1FE2-LYSまたはPBS（コントロール）を添加した培地でE. faecalis29株を培養し、培養後、2、3、4、5、6および7時間後の各生菌数を測定した。
【図８】GBSと共培養中のE. faecalisに対する溶菌効果。φM1FE2-LYS（A）またはPBS（B）を添加した培地でE. faecalis29株（EF）とS. agalactiae GBS2株（GBS）を培養し、培養後、3、6、9、12および24時間後の生菌数を測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の第１の実施形態は、夾雑細菌特異的溶菌酵素を含有する細菌選択培地である。
ここで「細菌」とは、真正細菌のことである。「夾雑細菌」とは、検出の目的以外の細菌、すなわち、第１の実施形態の「細菌選択培地」において、その増殖を抑制したい細菌のことである。より具体的には、例えば、本実施形態の「細菌選択培地」がGBSを選択するための培地であって、当該培地中でGBSを選択的に増殖させる場合、サンプル中に混入するEnterococcus faecalisなどの腸球菌は、検出の目的以外の細菌であって、その増殖を抑制したい「夾雑細菌」である。腸球菌としては、Enterococcus faecalis以外に、Enterococcus faecium、Enterococcus avium、Enterococcus casseliflavus、Enterococcus gallinarum、Enterococcus flavescensなどが知られているが、GBS検査で特に問題となるのは、Enterococcus faecalis（以下、E. faecalis）である。
【００１２】
本実施形態において、「溶菌酵素」とは、当該夾雑細菌を特異的に溶菌する（例えば、夾雑細菌の細胞壁を分解することにより溶菌する）酵素のことで、特に限定はしないが、例えば、バクテリオファージ（または細菌ウイルス）によってコードされるペプチドグリカン分解酵素であるエンドリシンの他、細菌由来のペプチドグリカン分解酵素で自己の細胞壁を分解するオートリシンなどを挙げることができる。
夾雑細菌が複数種存在する場合には、各夾雑細菌に特異的な複数の溶菌酵素を前記細菌培地に添加してもよい。
【００１３】
夾雑細菌が腸球菌の場合、腸球菌特異的に溶菌するバクテリオファージ由来のエンドリシンを溶菌酵素として使用することができる。腸球菌特異的なエンドリシンは、例えば、E. faecalisに特異的な溶菌活性を有する酵素として、Enterococcus phage φM1EF2由来のエンドリシン（配列番号１）、Enterococcus phage IME-EF1由来のエンドリシン（配列番号２）またはEnterococcus phage SAP6由来のエンドリシン（配列番号３）の他、他のEnterococcus faecalisファージ由来のエンドリシンであって腸球菌特異的に溶菌することができるエンドリシンなどを挙げることができ、本発明にかかる実施形態において好適に使用することができる。特に、上記配列番号１、配列番号２および配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるエンドリシンおよび当該エンドリシンと実質的に同一のエンドリシンは、膣スワブ由来のE. faecalisへの特異性が高く、妊婦へのGBS感染の有無を調べるためのGBS選択培地への使用には適している。
【００１４】
ここで、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるエンドリシンと実質的に同一のエンドリシンとしては、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ペプチドグリカン分解活性を有するタンパク質、ならびに、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ペプチドグリカン分解活性を有するタンパク質などを挙げることができる。
本発明の実施形態において、「１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列」と記す場合、置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸の数は、特に限定はしないが、たとえば、好ましくは1〜10個程度であり、より好ましくは1〜5個程度である。また、本明細書において、「80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列」は80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であれば、何％であってもよく、たとえば、80％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、好ましくは90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上である。
【００１５】
夾雑細菌を特異的に溶菌する酵素は、公知の酵素および新規の酵素いずれを使用してもよい。新規の溶菌酵素の遺伝子配列は、バイオインフォマティクス解析などの公知の技術に基づいて、容易に同定することができる。例えば、溶菌酵素を保持しているファージや細菌の遺伝子配列を決定した後、公知のデータベースに対し、NCBI BLASTプログラム（http://blast.ncbi.nle/nih.gov/Blast.egi）を使用し、公知の溶菌酵素との配列相同性に基づいて溶菌酵素と推定されるorfを同定することができる。同定された推定上の溶菌酵素は、ペプチドグリカン分解活性や細菌に対する溶菌活性の有無を指標にして、溶菌酵素として機能し得るかどうかを確認することができる。
【００１６】
例えば、夾雑細菌が腸球菌であって、目的の腸球菌を特異的に溶菌するエンドリシンを同定および／または調製する場合、まず、腸球菌特異的バクテリオファージを分離、同定する。腸球菌特異的バクテリオファージは、例えば、次のようにして分離、同定することができる。河川などから環境水を採取し、0.45 μm程度のフィルターで濾過滅菌後、２重寒天培地法で濾過環境水を宿主菌の腸球菌と培養する。一晩37℃で培養後、出現したプラークを分離する。プラークの分離は最低３回行う。分離したファージが腸球菌特異的バクテリオファージかどうかは、腸球菌種に感染することができ、かつ、他の菌に感染できないことを指標として確認することができる。詳細については、例えば、Wommack et al., Methods Mol Biol. 501:3-14 2009およびVan Twest and Kropinski, Methods Mol Biol. 501:15-21 2009などを参照のこと。
また、分離、同定した腸球菌特異的バクテリオファージの遺伝子解析は、当業者において容易に行うことができ、例えば、Uchiyama et al., Applied and Environmental Microbiology, 74:4149-4163, 2008に報告されている方法に準じて行うことができる。
腸球菌以外の細菌についても、当業者であれば、公知の方法に基づいて、特異的に感染するファージを取得し、エンドリシンなどの溶菌酵素を同定することができる。
【００１７】
第１の実施形態において、細菌選択培地は、選択する細菌の増殖に適する培地に溶菌酵素を適量加えることで調製することができる。選択する細菌の増殖に適する培地は、当該技術分野において公知のものを用いてもよく、当業者であれば容易に調製または入手することができる。例えば、選択対象の細菌がGBSの場合、培地の組成としては、特に限定はしないが、例えば、ペプトン、スターチ、グルコース、イーストエキストラクト、緩衝剤（例えば、Tricine、MOPSなど）、塩類（リン酸水素二ナトリウム、ピルピン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、）などを適宜組み合わせ、これに抗菌剤（ナリジクス酸（Nalidixic Acid）、コリスチン硫酸塩（Colistin Sulfate）、メトトレキサート（Methotrexate）、クリスタルバイオレット（Crystal violet）、メトロニダゾール（Metronidazole））を添加したものを使用することができる。より具体的には、LIM培地（Todd Hewitt Broth、Yeast Extractに抗菌剤であるNalidixic Acid、Colistin Sulfateを添加したもの）やGranada培地（Bacto? Proteose Peptone #3, (Difco) BD、Starch、Glucose、MOPS、Disodium hydrogen phosphate、Sodium pyruvate、Magnesium sulfateに抗菌剤であるMethotrexate、Crystal violet、Colistin sulfate、Metronidazoleを添加したもの）を挙げることができる。
GBSを選択的に増殖させる培地、培地の組成物および抗菌剤は市販されているものを使用することができる。
また、培地の形状は、液体培地、流動培地または固形培地など、いずれの形状であってもよい。好ましくは、液体培地や流動培地である。
培地中の溶菌酵素の濃度は、夾雑細菌および溶菌酵素の組み合わせによって異なり、当業者であれば、至適酵素の濃度を予備的な実験により決定することができる（例えば、実施例の「５．培地中での殺菌効果の検討」などを参照のこと）。
【００１８】
本発明の第２の実施形態は、検体中に存在する細菌を検出する方法であって、第１の実施形態にかかる細菌選択培地に検体を接種して培養する工程を含む、細菌の検出方法である。
GBS検査を例にとると、検体中に夾雑細菌であるE. faecalisが存在することが多く、E. faecalisの存在がGBSの検出精度の低下の原因の１つとなっている。そのため、E. faecalisの増殖を抑制または阻害し、GBSを選択的に増殖することができれば、GBSの検出精度を上げることが可能になる。
細菌の培養条件は、検査対象の細菌によって異なるが、当業者であれば適宜容易に選択することができる（GBS検査の場合、例えば、30〜40℃、好ましくは、35〜37℃前後で、数時間〜数十時間など）。
なお、第２の実施形態には、第１の実施形態にかかる細菌選択培地で増殖した細菌が、検出目的の細菌であることを確認するために、例えば、イムノクロマト法やPCR法などの公知の方法を実施する工程が、さらに含まれていてもよい。
【００１９】
本発明の第３の実施形態は、少なくとも夾雑細菌特異的溶菌酵素を含むことを特徴とする細菌検出キットである。本実施形態にかかるキットに含まれる溶菌酵素は、例えば、凍結または凍結乾燥など、酵素活性を維持する状態で供給することができる。本実施形態にかかるキットには、溶菌酵素の他、細菌培養のための培地または当該培地の構成成分、培養基材など、細菌検出に必要な如何なる物が含まれていてもよい。GBSを選択的に検出するための細菌検出キットの場合、溶菌酵素として、腸球菌特異的な溶菌酵素、例えば、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、Enterococcus faecalis特異的なエンドリシン）、またはこれらのタンパク質と実質的に同一のタンパク質であってペプチドグリカン分解活性を有するタンパク質の他、GBS培養のための培地または当該培地の構成成分、限定はしないが、例えば、ペプトン、スターチ、グルコース、イーストエキストラクト、緩衝剤（例えば、Tricine、MOPSなど）、塩類（リン酸水素二ナトリウム、ピルピン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム）、抗菌剤（ナリジクス酸（Nalidixic Acid）、コリスチン硫酸塩（Colistin Sulfate）、メトトレキサート（Methotrexate）、クリスタルバイオレット（Crystal violet）および／または、メトロニダゾール（Metronidazole））などが含まれていてもよい。
【００２０】
本明細書が英語に翻訳された場合、単数形の「a」、「an」、および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のも含むものとする。
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、本実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２１】
１．組換えタンパク質のクローニングおよび発現
膣由来E. faecalisを宿主菌とするバクテリオファージ（以下「φM1EF2」とする）を、公知の方法（Wommack et al., Methods Mol Biol. 501:3-14 2009およびVan Twest et and Kropinski, Methods Mol Biol. 501:15-21 2009）により下水流入水から分離した。
φM1EF2のゲノムDNAは、公知の方法（Uchiyama et al. FEMS
Microbiol. Lett. 278:200-206 2008：Uchiyama et al. Appl. Environ. Microbiol. 74:4149-4163 2008）を用いて取得した。得られたゲノムDNAの配列（56,583bp）は、常法に従い、次世代DNAシークエンサーRoche GS Junior（Roche）を使用して決定した。
エンドリシン遺伝子であると推定されるorf領域は、I-TASSER (http://zhang.bioinformatics..ku.edu/I-TASSER)を使用して予測した。予測したorf領域（推定上の分子量：26.4 kDa）を、ゲノムDNAを鋳型にし、下記のプライマーで増幅後、in-fusion（Takara Bio）を使用し、pUC19にクローニングを行った。
phiM1EF2LYS_F:
5’-CGGTACCCGGGGATCGGTACCATGGTTAAAGTAAACGATGTACTAAGCTATG-3’ （配列番号５）
phiM1EF2LYS_R2:
5’-CGACTCTAGAGGATCAAGCTTTTAATGATGATGATGATGATGTACTTTAACTTGTGGTAAAGCTGCTTCC-3’
（配列番号６）
【００２２】
クローニングしたorfの塩基配列を配列番号４に、そのアミノ酸配列を配列番号１に示す。クロ−ニングしたDNA断片をpColdIII（Takara Bio）へ挿入して発現ベクターを構築し、大腸菌NiCo21(DE3)（New England Biolabs）に導入した。得られた形質転換体をタンパク質発現用大腸菌として使用した。なお、発現タンパク質は、C末端にHisタグが融合して発現するようにデザインした。
得られた形質転換体を、IPTG（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）の存在下および非存在下で培養し、培養物を遠心してペレットとして回収した。各ペレットはサンプル処理バッファーに溶解し、5分間100℃で処理した後、遠心し、上清をSDS-PAGEにかけて、タンパク質の発現の有無を確認した。
その結果、IPTG存在下で培養した大腸菌由来のサンプルにのみ、分子量26.4 kDa付近にタンパク質のバンドが確認され、このバンドを目的の組換えタンパク質のバンドとして同定した。
【００２３】
２．組換えタンパク質の精製
上記１．で調製した発現ベクターを保持する大腸菌を培養した後、菌体をlysisバッファー（100 mM sodium phosphate、300 mM NaCl、pH 7.8）に懸濁し、氷上で超音波処理を行って細胞を破壊した。超音波処理したサンプルを遠心（10,000×g；4℃；20分間）した後、上清をTalon Metal Affinity Resin (Clontech Laboratories)に添加し、緩やかに懸濁した。懸濁したレシンをカラムに充填し、溶出バッファー（50 mM sodium phosphate、300 mM NaCl、pH 6.0）で溶出後、5 mM imidazoleを添加した溶出バッファーでさらに溶出を行った。次に、150 mM imidazoleを添加した溶出バッファーで溶出を行い、発現タンパク質の溶出分画として回収した。
回収したタンパク質分を、SDS-PAGEにかけ（図１左）、抗Hisタグ抗体によるウエスタンブロッティングで目的の発現タンパク質のバンドを確認した（図１右）。
【００２４】
３．発現タンパク質の酵素活性の検討
上記２．で調製した発現タンパク質が、E. faecalis（31株、ヒト膣分泌液から分離・同定した株（30株）およびATCCから入手した株（1株）を含む）、E. faecium（5株）、E. avium（5株）およびS. agalactiae（7株）（GBS）由来の各ペプチドグリカンの分解活性を有するかどうか検討した。
各細菌のペプチドグリカンは、一晩、細菌をTryptic Soy broth 10 mLで培養後、遠心（8,000×g、5 min、4℃）しペレットを回収した。5 mlの 4%SDSを加え、ペレットを溶解し、121℃、15 min加熱した。PBSで５回洗浄後、ペプチドグリカンとして使用した。
ペプチドグリカン分解活性は、濁度法で測定を行った。具体的には、発現タンパク質（50μl）とペプチドグリカン（100μL）の混合物を滅菌済みの96-wellタイタープレートのウェルに添加し、37℃で振盪しながらインキュベートした。インキュベート後、プレートリーダー（Multiskan JX spectrophotometer：Thermo Labsystems）で濁度（OD595）を測定した。各ウェルに添加したペプチドグリカンの量は、測定開始時のOD595が0.2〜0.3となるように調整した。
【００２５】
３−１．ペプチドグリカン分解活性
種々の濃度の発現タンパク質とE. faecalisEF29株のペプチドグリカンを混合し、37℃で、0分間、5分間、15分間、30分間および60分間インキュベートした。各インキュベート時におけるOD595を測定したところ、発現タンパク質の濃度依存的に濁度が減少しており（図２）、上記２で調製した発現タンパク質（以下「φM1FE2-LYS」とする）はE. faecalisのペプチドグリカン分解活性を有するエンドリシンであることが確認できた。
【００２６】
３−２．基質特異性の検討
Eav1株（E. avium）、Efum4株（E. faecium）、GBS3株（S. agalactiae）、EF29株（E. faecalis）およびATCC29212株（E. faecalis）由来の各ペプチドグリカンを基質として、φM1FE2-LYSによるペプチドグリカン分解活性を測定した。図３に示すように、EF29株およびATCC29212株のペプチドグリカンの濁度の減少は見られたが、他の細菌由来のペプチドグリカンの濁度は減少しなかった。図３に示す株以外についても同様の実験を行ったところ、E. faecalis（31株；EF29株とATCC29212株を含む）のペプチドグリカンのみ濁度が減少し、E. avium（5株；Eav1株を含む）、E. faecium（5株；Efum4株を含む）およびS. agalactiae（7株；GBS3株を含む）の各ペプチドグリカンの濁度は減少しなかった。
以上のことから、φM1FE2-LYSは、E. faecalisのペプチドグリカン特異的に分解することが分かった。
【００２７】
４．φM1FE2-LYSの溶菌活性の検討
E. faecalis（31株）、E. faecium（5株）、E. avium（5株）およびS. agalactiae（7株）（GBS）を用いて、φM1FE2-LYSの溶菌活性について検討した。
φM1FE2-LYS（50 μL）と生菌（100 μL）の混合物を滅菌済みの96-wellタイタープレートのウェルに添加し、37℃で振盪しながらインキュベートした。インキュベート後、プレートリーダーで濁度（OD595）を測定し、または生菌数を算出した。各ウェルに添加した生菌の量は、測定開始時のOD595が0.2〜0.3となるように調整した。
【００２８】
４−１．E. faecalisに対する溶菌活性
種々の濃度のφM1FE2-LYSとE. faecalisEF29株の生菌を混合し、37℃で、0分間、5分間、15分間、30分間および60分間インキュベートした。各インキュベート時におけるのOD595を測定したところ、φM1FE2-LYSの濃度依存的に濁度が減少しており（図４）、φM1FE2-LYSはE. faecalisを溶菌すると考えられた。そこで、各インキュベート時のサンプル中の生菌を寒天培地で培養し、生菌数を算出し、生菌濃度（cfu/mL）とφM1FE2-LYS濃度（mg/mL）との関係を調べた（図５）。図５から、約0.01mg/mL以上のφM1FE2-LYS存在下で菌濃度が減少し始めており、φM1FE2-LYSは濃度依存的にE. faecalisに対する溶菌効果を発揮することが確認できた。
【００２９】
４−２．溶菌活性の菌特異性の検討
次に、Eav1株（E. avium）、Efum4株（E. faecium）、GBS3株（S. agalactiae）、EF29株（E. faecalis）およびATCC29212株（E. faecalis）に対する溶菌活性を検討した。図６に示すように、EF29株およびATCC29212株の濁度は減少したが、他の細菌の濁度は減少しなかった。図６に示す株以外についても同様の実験を行ったところ、E. faecalis（31株；EF29株とATCC29212株を含む）の濁度のみが減少し、E. avium（5株；Eav1株を含む）、E. faecium（5株；Efum4株を含む）およびS. agalactiae（7株；GBS3株を含む）の各生菌の濁度は減少しなかった。
以上のことから、本発明のエンドリシンは、E. faecalis特異的に溶菌することが分かった。
【００３０】
５．培地中での殺菌効果の検討
φM1FE2-LYSがGBS用の培地中において、E. faecalisに対する殺菌効果を示すかどうか検討した。
GBS用の培地として、Granada培地（前述）を使用し、培養は全て37℃で行った。  9 mLのGranada培地に0.1 mLのE. faecalisEF29株（菌濃度：3.0×108 cfu/mL）と1 mLのφM1FE2-LYS（0.1 mg/mL）またはPBS（コントロール）を添加して培養を開始し、培養後、2、3、4、5、6および7時間後に寒天培地を使用して生菌数の測定を行った。その結果、培養後2〜6時間において、E. faecalisEF29株の増殖が抑制されることが確認できた（図７）。
【００３１】
６．GBSと共培養中のE. faecalisに対する溶菌効果
GBSと共培養されているE. faecalisに対するφM1FE2-LYSの溶菌効果を検討した。
E. faecalis EF29株またはS. agalactiae GBS2rif株をTryptic Soy broth中でOD 0.30〜0.35になるまで培養した。それぞれの菌液をPBSで希釈後、100 μLずつ9 mL 変法Granada培地に添加した。その後、すぐに、1 mLのφM1FE2-LYS（1 mg/mL）またはPBSを加え、37℃で培養を行った。経時的に、総菌数、E. faecalis数およびS.agalactiae数を測定した。細菌の定量には、総菌数計測にはTryptic Soy agar、E. faecalis数の測定にはEF基礎寒天培地（ニッスイ製薬）、S. agalactiae数の測定にはTryptic Soy agar（TSA）+20 μg/mL リファンピシンを使用した。
ここで使用したGBS株は、S. agalactiae GBS2株をTSA+20 μg/mL リファンピシンで培養し、耐性を獲得した変異株を分離したもので、GBS2rif株と名付けた。
また、変法Granada培地の組成は以下の通りである：
25.0 g/L proteose peptone No. 3、14.0 g/L soluble starch、2.5 g/L glucose、1.0 g/L pyruvic acid sodium salt、0.1 g/L cysteine hydrochroloide、0.3 g/L magnesium sulfate、11.0 g/L 3-(N-morpholino)propane sulphonic acid (MOPS)、10.7 g/L disodium hydrogen phosphate、 0.5 mg/L crystal violet、10 mg/L colistin sulfate、10 mg/L metronidazole、15 mg/L nalidixic acid pH 7.4
【００３２】
図８に結果を示す。PBSを加えて培養した場合にはGBSおよびE. faecalisいずれも増殖したのに対し（図８B）、φM1FE2-LYSを加えた培地中では、GBSの生育には影響を及ぼすことなく、E. faecalisの増殖を顕著に抑制した（図８A）。
【００３３】
以上のように、E. faecalisを特異的に溶菌するエンドリシンであるφM1FE2-LYSの存在下でE. faecalisの培養を行うと、E. faecalisの増殖が顕著に抑制されることが分かった。また、φM1FE2-LYSはGBSの増殖には影響を与えないことも確認された。従って、φM1FE2-LYSを添加した培地で検体を培養することにより、夾雑細菌であるE. faecalisの増殖が抑制され、GBSの選択的な増殖が可能になり、GBS検査の精度が向上すると考えられる。
【００３４】
以上の実施例から、夾雑細菌に特異的な溶菌酵素（エンドリシンやオートリシンなど）を添加した培地で、検出目的の細菌を培養すれば、目的細菌の検出精度を向上させることが可能といえる。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明により、細菌検査の精度を上げることができ、種々の細菌によって引き起こされる感染症の早期治療の開始が可能となり、予防医学の分野の発展に大いに貢献することが期待される。
【図１】
2019216609.tif 000002
【図２】
2019216609.tif 000003
【図３】
2019216609.tif 000004
【図４】
2019216609.tif 000005
【図５】
2019216609.tif 000006
【図６】
2019216609.tif 000007
【図７】
2019216609.tif 000008
【図８】
2019216609.tif 000009
【配列表】
2019216609000001.app