(57)【要約】      （修正有）【課題】厚みのある細胞培養標本をコントラスト良く、かつ、陰影が付いた立体的な画像を取得できる装置、方法を提供する。【解決手段】近赤外の波長を用いた変調コントラスト法により少なくとも底面がプラスティック製素材の容器Ｓ内に収容された生体試料を観察する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
近赤外の波長を用いた変調コントラスト法により少なくとも底面がプラスティック製素材の容器内に収容された生体試料を観察する方法。
【請求項２】
近赤外の波長が、９００ｎｍ以上である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも底面がプラスティック製素材の容器内に収容された生体試料を観察する方法であって、
近赤外波長の光を、中心部から離れた位置に矩形状開口を有する開口板およびコンデンサレンズを通して前記生体試料に照射するステップ、
前記生体試料からの光を前記プラスティック製素材、対物レンズ、変調器、および、結像レンズを介して撮像素子に結像するステップ、を含み、
前記変調器は段階的に透過率が異なる領域を備えた方法。
【請求項４】
近赤外の波長が、９００ｎｍ以上である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記生体試料が、非染色の立体構造を有する細胞集合体である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
生体試料を収容するための少なくとも底面がプラスティック製素材の容器と、
該容器を搭載するステージと、
前記生体試料を照明する近赤外照明部と、
中心部から離れた位置に矩形状開口を有する開口板と、
コンデンサレンズと、
対物レンズと、
段階的に透過率が異なる領域を備えた変調器と、
結像レンズと、
撮像素子と、を備えた倒立顕微鏡であって、
前記コンデンサ、前記開口板、および、前記近赤外照明部がが、
前記対物レンズ、前記変調器、前記結像レンズ、および、前記撮像素子と、
前記容器を挟んで対向する位置に配置され、
前記開口板および前記変調器が前記対物レンズの瞳位置または瞳位置と共役な位置に配置されたことを特徴とする倒立顕微鏡。
【請求項７】
近赤外の波長が、９００ｎｍ以上である請求項６に記載の倒立顕微鏡。
【請求項８】
前記生体試料が、非染色の立体構造を有する細胞集合体である請求項６または７のいずれかに記載の倒立顕微鏡。
【請求項９】
生体試料を収容するための少なくとも底面がプラスティック製素材の容器と、
該容器を搭載するステージと、
前記生体試料を照明する光源と、
中心部から離れた位置に矩形状開口を有する開口板と、
コンデンサレンズと、
対物レンズと、
段階的に透過率が異なる領域を備えた変調器と、
結像レンズと、
撮像素子と、
近赤外の波長を取り出すバンドパスフィルタと、を備えた倒立顕微鏡であって、
前記コンデンサ、前記開口板、および、前記光源が、
前記対物レンズ、前記変調器、前記結像レンズ、および、前記撮像素子と、
前記容器を挟んで対向する位置に配置され、
前記開口板および前記変調器が前記対物レンズの瞳位置または瞳位置と共役な位置に配置され、
前記バンドパスフィルタは、前記光源から前記撮像素子に至る光路の任意の位置に配置されたことを特徴とする倒立顕微鏡。
【請求項１０】
近赤外の波長が、９００ｎｍ以上である請求項９に記載の倒立顕微鏡。
【請求項１１】
前記生体試料が、非染色の立体構造を有する細胞集合体である請求項９または１０のいずれかに記載の倒立顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞観察装置、細胞観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、幹細胞研究や再生医療の進展に伴い、移植等の用途のために立体的な細胞が調製されるようになってきた。移植用の細胞は蛍光等で標識されていないものが好ましく、厚みのある立体的な培養細胞（例えば、スフェロイド、細胞シート等）を非標識で観察することが求められるようになってきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−１２６４８１
【特許文献２】特開２０１０−２７１３５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
３次元培養で細胞を増殖させる場合、プラスチック容器が適しているが、プラスチック容器は偏光特性がよくないので微分干渉（DIC）観察はできず位相差観察をすることになる。
しかし、位相差観察では陰影がついた立体的な画像は取得できない。
さらに、厚みのある細胞の場合、位相差用の可視の照明光が標本で散乱され位相差画像のコントラストも低下する。
【０００５】
本発明は、上述した事情を鑑みてなされたものであって、厚みのある細胞培養標本をコントラスト良く、かつ、陰影が付いた立体的な画像で取得できる装置、方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、近赤外の波長を用いた変調コントラスト法により少なくとも底面がプラスティック製素材の容器内に収容された生体試料を観察する方法を提供する。
【０００７】
本発明の別の態様は、
少なくとも底面がプラスティック製素材の容器内に収容された生体試料を観察する方法であって、
近赤外波長の光を、中心部から離れた位置に矩形状開口を有する開口板およびコンデンサレンズを通して前記生体試料に照射するステップ、
前記生体試料からの光を前記プラスティック製素材、対物レンズ、変調器、および、結像レンズを介して撮像素子に結像するステップ、を含み、
前記変調器は段階的に透過率が異なる領域を備えた方法を提供する。
【０００８】
本発明の別の態様は、
生体試料を収容するための少なくとも底面がプラスティック製素材の容器と、
該容器を搭載するステージと、
前記生体試料を照明する近赤外照明部と、
中心部から離れた位置に矩形状開口を有する開口板と、
コンデンサレンズと、
対物レンズと、
段階的に透過率が異なる領域を備えた変調器と、
結像レンズと、
撮像素子と、を備えた倒立顕微鏡であって、
前記コンデンサ、前記開口板、および、前記近赤外照明部が前記容器が、
前記対物レンズ、前記変調器、前記結像レンズ、および、前記撮像素子と、
前記容器を挟んで対向する位置に配置され、
前記開口板および前記変調器が前記対物レンズの瞳位置または瞳位置と共役な位置に配置されたことを特徴とする倒立顕微鏡を提供する。
【０００９】
本発明の別の態様は、
生体試料を収容するための少なくとも底面がプラスティック製素材の容器と、
該容器を搭載するステージと、
前記生体試料を照明する光源と、
中心部から離れた位置に矩形状開口を有する開口板と、
コンデンサレンズと、
対物レンズと、
段階的に透過率が異なる領域を備えた変調器と、
結像レンズと、
撮像素子と、
近赤外の波長を取り出すバンドパスフィルタと、を備えた倒立顕微鏡であって、
前記コンデンサ、前記開口板、および、前記光源が、
前記対物レンズ、前記変調器、前記結像レンズ、および、前記撮像素子と、
前記容器を挟んで対向する位置に配置され、
前記開口板および前記変調器が前記対物レンズの瞳位置または瞳位置と共役な位置に配置され、
前記バンドパスフィルタは、前記光源から前記撮像素子に至る光路の任意の位置に配置されたことを特徴とする倒立顕微鏡を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、厚みのある細胞培養標本に対して、コントラスト良く、かつ、陰影が付いた立体的な画像を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の第１実施形態にかかる装置を示す説明図である。
【図２】本発明の開口板の概略構成の例を示す説明図である。
【図３】本発明の変調コントラスト法の光路図を示す説明図である。
【図４】本発明の変調器および変調器に投影される矩形状開口の位置を示す説明図である。
【図５】本発明の（ａ）は標本の形状例、（ｂ）はこの標本に対応して現れる濃淡をそれぞれ示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の実施形態に係る細胞観察装置について、図面を参照して以下に説明する。
（第１実施形態）
本実施形態に係る細胞観察装置１００は、図１に示される構成の倒立顕微鏡である。
ステージ１５に搭載された少なくとも底面がプラスティック製素材の容器Ｓには、培地および細胞が収容されている。
細胞観察装置１００は、変調コントラスト法の光学系、および、観察光学系を備えている。
変調コントラスト法の光学系は、広帯域白色光源１、近赤外の波長（900〜950nm）を選択するバンドパスフィルタ（BP900-950）、コンデンサレンズ５、開口板６、対物レンズ７、変調器１４を備えている。
また、広帯域白色光源１及びバンドパスフィルタ（BP900-950）により近赤外照明部を構成している。
なお、バンドパスフィルタ（BP900-950）の位置は広帯域光源１の直後に限定されることはなく、光学性能的に悪影響を及ぼさない位置であればどこでも配置することができる。例えば、結像レンズと変調器の間の無限遠光路に配置することも可能である。
なお、前記バンドパスフィルタの選択波長域としては、750nm以上の波長が適応でき、望ましくは900nm以上の波長が観察する細胞による散乱が少なくて優れている。
開口板６は、図２に示すように、矩形開口６ａを備えている。
変調器１４は、段階的に透過率が異なる領域を備えており、例えば、図３、図４に示すように、透過率100％領域１４ａ、透過率15％領域１４ｂ、透過率0％領域１４ｃを備えている。
前記開口板および前記変調器は、前記対物レンズの瞳位置または瞳位置と共役な位置に配置されている。
観察光学系は、結像レンズ９、反射ミラー、撮像素子（CCDカメラなど）を備えている。
なお、撮像素子は近赤外の波長域（700〜1000nmくらい）の感度が高いものを用いている。
【００１３】
図１において、５はコンデンサレンズ、Sは標本容器（少なくとも底面がプラスティック製素材）で培養細胞（不図示）が収容されている。７は対物レンズである。また６は開口板で、図２に示すように、中心部から離れた位置に矩形状開口６ａを有している。また、１４は円盤状の変調器で、開口板６と略共役な位置に配置されている。この変調器１４には、図３、図４に示すように開口６aの像を含み得る透過率１００％の領域１４aと、例えば透過率１５％の領域１４bと、透過率０％の領域１４cとが順に隣接して配置形成されている。
この光学系では、矩形状開口６aが光軸から偏心した位置に配置されているので、コンデンサレンズ5に入射した光は標本Ｓ’を斜め方向から照明するように射出する。このとき、透明な標本Ｓ’が図３（a）に示すように扁平であると、標本Ｓ’を透過した光束は対物レンズ７により変調器１４の領域１４b内に結像し、図４（a）に示すように領域１４b内に開口像６a'が形成される。また、標本Ｓ’の表面が図３（b）に示すように右肩上がりの斜面となっていると、標本Sを透過するとき光束は右方へ屈折して変調器１４の領域１４c内に結像し、図４（b）に示すように領域１４c内に開口像６a'が形成される。また、標本Sの表面が図３（c）に示すように左肩上がりの斜面となっていると、標本Ｓ’を透過するとき光束は左方へ屈折して変調器１４の領域１４a内に結像し、図４（c）に示すように領域１４a内に開口像６a'が形成される。
この説明で明らかなように、標本Ｓ’が図５（a）に示すような平坦面と斜面とを有する無色透明体である場合、その観察像は図５（b）に示すように平坦面部分は灰色に、斜面部分は黒または白く見える。このように、変調コントラスト法では、変調器１４に設けた異なる透過率領域と偏斜照明の効果とにより、無色透明な標本（非染色標本、非標識標本）でも陰影を持つ立体感のある像として観察することが可能となる。
【００１４】
本実施形態の装置によれば、変調コントラスト法（ホフマンモジュレーションコントラスト法）なので微分干渉法と異なり、細胞培養に適したプラスティック製の標本容器が使用可能である。
また、ホフマンモジュレーションコントラスト法なので位相差観察と異なり、陰影が付いた立体的な画像を取得可能である。
さらに、光源の波長を近赤外（750nm以上、望ましくは900nm以上）としたので、厚みのある培養細胞でも散乱せずにコントラストの良い観察が可能である。
【００１５】
本実施形態においては、次のような変形例が考えられる。
・バンドパスフィルタと広帯域白色光源１からなる近赤外照明部を近赤外LED光源（例えばLED945）に置き換えてもよい。
【符号の説明】
【００１６】
１  広帯域白色光源
２  コレクタレンズ
３  照明レンズ
４  ミラー
５  コンデンサレンズ
６  開口板
７  対物レンズ
８  レボルバ
９  結像レンズ
１０、１１、１２  リレーレンズ
１３  接眼レンズ
１４  変調器
１５  ステージ
Ｓ  容器
Ｓ’標本
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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