(57)【要約】【課題】皮膚細菌叢における黄色ブドウ球菌を解析することにより、アトピー性皮膚炎の発症リスクを、簡便に判定することのできる発症リスク判定方法を提供する。【解決手段】皮膚細菌叢における黄色ブドウ球菌のａｇｒＣ遺伝子座の変異解析、ＲＮＡＩＩＩ遺伝子の発現量検出のいずれか、または両方を行うアトピー性皮膚炎の発症リスク判定方法。【選択図】図６
2019030272.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚細菌叢における黄色ブドウ球菌のａｇｒＣ遺伝子座の変異を解析することを特徴とするアトピー性皮膚炎の発症リスク判定方法。
【請求項２】
皮膚細菌叢における黄色ブドウ球菌のＲＮＡＩＩＩ遺伝子の発現量を検出することを特徴とするアトピー性皮膚炎の発症リスク判定方法。
【請求項３】
皮膚細菌叢における黄色ブドウ球菌のａｇｒＣ遺伝子座の変異を解析し、
前記黄色ブドウ球菌のＲＮＡＩＩＩ遺伝子の発現量を検出することを特徴とするアトピー性皮膚炎の発症リスク判定方法。
【請求項４】
ＲＮＡＩＩＩ遺伝子からなるアトピー性皮膚炎の発症リスク判定用バイオマーカー。
【請求項５】
候補化合物を黄色ブドウ球菌の培養液またはモデル動物に投与した際の、黄色ブドウ球菌のａｇｒＣ変異依存性のＲＮＡＩＩＩ遺伝子発現量を指標とすることを特徴とするアトピー性皮膚炎の予防薬または治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アトピー性皮膚炎の発症リスク判定方法、アトピー性皮膚炎のバイオマーカー、アトピー性皮膚炎の予防薬または治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎（Ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ：以下ＡＤともいう）は、先進国で小児の罹患率が１５〜２０％、成人の罹患率が２〜５％にも達し、遺伝的素因に加え環境要因が大きな役割を果たしていると考えられている疾患である。ＡＤは、通常、幼少期に発症し、患者の約６０％が生後１２ヶ月までに発症する。
ＡＤの治療としては、保湿剤、ステロイド外用、および抗アレルギー剤、免疫抑制剤の内服などが行われている。しかし、これら既存の治療では、症状のコントロールに難渋することも少なくない上に、コントロール可能であったとしても予防や治癒に結びつく治療法は確立されていない。
【０００３】
近年、１６ｒＲＮＡ−ＤＮＡ解析法を用いた皮膚細菌叢解析により、ＡＤの病変部では健常者に比較し、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属）全体の分画の増大および、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：以下、Ｓ．ａｕｒｅｕｓともいう）分画の増大が起こっていることが報告された。一方、２歳以上のＡＤ非発症者では、黄色ブドウ球菌が皮膚から検出されることはまれである（非特許文献１）。ただし、ＡＤの病態にＳ．ａｕｒｅｕｓがどのような役割を果たしているのかは不明な点が多い。
【０００４】
本発明者らは、黄色ブドウ球菌産生毒素であるδ−ｔｏｘｉｎが、肥満細胞を刺激し、Ｔｈ２型の皮膚炎症反応を惹起することを報告し（非特許文献２）、このδ−ｔｏｘｉｎの産生をブロックする薬剤スクリーニング、δ−ｔｏｘｉｎ中和抗体開発を行い、皮膚の炎症を予防する方法を提案している（特許文献１)。ただし、現在、Ｓ．ａｕｒｅｕｓをターゲットにしたＡＤ予防法、治療法の臨床は行われていない。
【０００５】
国内外では現在、ＡＤに対するＢ細胞、ＩｇＥ、インターロイキン（ＩＬ）−４受容体、ＩＬ−３１受容体、ＩＬ−１２／２３  ｐ４０、ＩＬ−５、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）−αなどに対する抗体療法についても治療薬としての可能性が検討段階に入るなど模索されているが、抗体療法は高価であることや、先進国において小児の多くがＡＤに罹患し、かつ慢性疾患であるなどの観点から考えると、小児への生物学的製剤の使用は医学的、倫理的観点からその適応に制約があり、医療経済的に見ても大きな問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１５３２４１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈ．Ｈ．Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｓｈｉｆｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｆｌａｒｅｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２２，８５０−８５９  （２０１２）．
【非特許文献２】Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｌｔａ−ｔｏｘｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｓｋｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０３，３９７−４０１（２０１３）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、皮膚細菌叢における黄色ブドウ球菌を解析することにより、アトピー性皮膚炎の発症リスクを、簡便に判定することのできる発症リスク判定方法を提供することを課題とする。また、アトピー性皮膚炎のバイオマーカー、アトピー性皮膚炎の予防薬または治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の課題を解決するための手段は、以下のとおりである。
１．皮膚細菌叢における黄色ブドウ球菌のａｇｒＣ遺伝子座の変異を解析することを特徴とするアトピー性皮膚炎の発症リスク判定方法。
２．皮膚細菌叢における黄色ブドウ球菌のＲＮＡＩＩＩ遺伝子の発現量を検出することを特徴とするアトピー性皮膚炎の発症リスク判定方法。
３．皮膚細菌叢における黄色ブドウ球菌のａｇｒＣ遺伝子座の変異を解析し、
前記黄色ブドウ球菌のＲＮＡＩＩＩ遺伝子の発現量を検出することを特徴とするアトピー性皮膚炎の発症リスク判定方法。
４．ＲＮＡＩＩＩ遺伝子からなるアトピー性皮膚炎の発症リスク判定用バイオマーカー。
５．候補化合物を黄色ブドウ球菌の培養液またはモデル動物に投与した際の、黄色ブドウ球菌のａｇｒＣ変異依存性のＲＮＡＩＩＩ遺伝子発現量を指標とすることを特徴とするアトピー性皮膚炎の予防薬または治療薬のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、被験者の皮膚細菌叢における黄色ブドウ球菌を分析するだけで、アトピー性皮膚炎の発症リスクを判定することができる。皮膚細菌叢は、容易に採取することができるため、本発明の判定方法は被験者への負担が少ない。本発明の判定方法は、特に生後３月以上１年以下の乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクの判定に適している。
ＲＮＡＩＩＩ遺伝子からなるアトピー性皮膚炎の発症リスク判定用バイオマーカーは、被験者への負担が少なく測定することができる。また、アトピー性皮膚炎発症前や発症直後から測定することができるため、発症予防、早期発見、早期治療に有用である。
黄色ブドウ球菌のａｇｒＣ変異依存性のＲＮＡＩＩＩ遺伝子発現量は、皮膚生着性と関連しており、このＲＮＡＩＩＩ遺伝子発現量を指標として、容易にアトピー性皮膚炎の予防薬または治療薬をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】乳児から単離した全Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株を、ＭＬＳＴ（図１Ａ）、ａｇｒタイプ（図１Ｂ）に基づいて分類した結果を示す図。
【図２】ＡＤを発症しなかった乳児（Ｎｏｎ−ＡＤ：ｎ＝８６）とＡＤを発症した乳児（ＡＤ：ｎ＝１７）において、１ヶ月時と６ヶ月時に単離したＳ．ａｕｒｅｕｓ株における同一クローン、非クローンの割合を示す円グラフ（図２左）と、同一クローンのうちアミノ酸非同義置換（ノンシノニマス変異）とアミノ酸同義置換（シノニマス変異）の割合を示す円グラフ（図２右）。
【図３】ＡＤ非発症群のうちａｇｒ遺伝子座に変異を有する４つの同一クローンにおける変異を示す図。
【図４】ＡＤを発症しなかった乳児の１ヶ月時（１Ｍ  Ｎｏｎ−ＡＤ）、６ヶ月時（６Ｍ  Ｎｏｎ−ＡＤ）、ＡＤを発症した乳児の１ヶ月時（１Ｍ  ＡＤ）、６ヶ月時（６Ｍ  ＡＤ）のそれぞれで単離されたａｇｒＩタイプであるＳ．ａｕｒｅｕｓ株の各ポジションにおける、１塩基置換および塩基の挿入または欠損の変異の頻度解析結果を示す図。
【図５】ＡＤを発症しなかった乳児の１ヶ月時（１Ｍ  Ｎｏｎ−ＡＤ）、６ヶ月時（６Ｍ  Ｎｏｎ−ＡＤ）、ＡＤを発症した乳児の１ヶ月時（１Ｍ  ＡＤ）、６ヶ月時（６Ｍ  ＡＤ）のそれぞれで単離されたＳ．ａｕｒｅｕｓ株におけるａｇｒＣ遺伝子座のコアゲノム数を示す図。
【図６】ＡＤを発症しなかった乳児の１ヶ月時（１Ｍ  Ｎｏｎ−ＡＤ）、６ヶ月時（６Ｍ  Ｎｏｎ−ＡＤ）、ＡＤを発症した乳児の１ヶ月時（１Ｍ  ＡＤ）、６ヶ月時（６Ｍ  ＡＤ）のそれぞれで単離されたＳ．ａｕｒｅｕｓ株と、ＳＡ１１３（ネガティブコントロール）、ＬＡＣ（ポジティブコントロール）の、ＲＮＡＩＩＩ発現量を示す図。
【図７】ＡＤ非発症群のうちａｇｒ遺伝子座に変異を有する４つの同一クローンにおける１ヶ月時と６ヶ月時のＲＮＡＩＩＩ発現量の変化を示す図。
【図８】ＡＤを発症しなかった乳児（図８左：Ｎｏｎ−ＡＤ：ｎ＝８６）とＡＤを発症した乳児（図８右：ＡＤ：ｎ＝１７）において、生後１ヶ月と６ヶ月時に単離されたＳ．ａｕｒｅｕｓ株を培養した際のコロニー数を示す図。
【図９】マウスモデル試験におけるＬＡＣ株と欠損株（ＬＡＣ  Δａｇｒ）の生着７日後の皮膚写真（左）、ヘマトキシリンエオジン染色（中央左弱拡、中央右強拡）、蛍光顕微鏡画像（右）を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のアトピー性皮膚炎の発症リスク判定方法は、被験者の体質、遺伝型等ではなく、被験者の皮膚細菌叢における黄色ブドウ球菌を解析することを特徴とする。
以下、本発明の詳細について説明する。
【００１３】
「出生コホートデータ」
ヒトは、胎児期というおおよそ無菌と考えられる状態から、出生後より様々な細菌に曝露し、皮膚細菌叢を形成していく。その過程において、半数近くの乳児がＳ．ａｕｒｅｕｓを一時的に皮膚に保菌することが知られている。
日本人乳児２６８人について、生後１ヶ月時、および６ヶ月時に、頬から採取した皮膚細菌叢の解析を行い、細菌叢中の黄色ブドウ球菌の有無と、１歳時におけるＡＤ発症の有無との関連を調査して出生コホートデータを得た。この出生コホートデータをもとにした１ヶ月及び６ヶ月の乳児皮膚のＳ．ａｕｒｅｕｓ生着の頻度、および１歳時のＡＤ発症の有無について表１に示す。
【００１４】
【表１】
2019030272.tif 000003
【００１５】
１ヶ月時には３８．４％、６ヶ月時には４９．６％の乳児に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓが正着していた。１年後には４１人の乳児がＡＤを発症したが、１ヶ月時のＳ．ａｕｒｅｕｓの生着は、１歳時のＡＤ発生リスクと相関が認められなかった（オッズ比１．０５６、ｐ＝０．８８２）。一方、６ヶ月時の黄色ブドウ球菌の生着は、１歳時のＡＤ発症リスクを増加させた（オッズ比５．４３３、ｐ＜０．００１）。
【００１６】
「Ｓ．ａｕｒｅｕｓの解析」
１ヶ月時、６ヶ月時に、乳児の頬から単離したＳ．ａｕｒｅｕｓ全２４３株を系統解析した。結果を図１に示す。なお、図１中、１Ｍは１ヶ月時に単離された株、６Ｍは６ヶ月時に単離された株を表し、Ｎｏｎ−ＡＤは１歳時にＡＤを発症しなかった乳児から単離された株、ＡＤは１歳時にＡＤを発症した乳児から単離された株を意味する。
【００１７】
マルチシーケンス配列タイピング（ＭＬＳＴ）に基づいて分類したところ、乳児の皮膚細菌叢中のＳ．ａｕｒｅｕｓとして、多くのタイプが存在し、特にＳＴ８、ＳＴ１８８、ＳＴ１５が多く見られた。しかし、ＳＴタイプと１歳時のＡＤ発症の有無について相関は見られなかった（図１Ａ）。
また、Ｓ. ａｕｒｅｕｓは、ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ（ａｇｒ）系の対立遺伝子変異に基づいて、異なる自己誘導ペプチドを分泌する４つのクラスター（ａｇｒＩ〜ＩＶ）に分類することができるが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのａｇｒタイプについてもＡＤ発症の有無について相関は見られなかった（図１Ｂ）。
このことから、皮膚に生着する黄色ブドウ球菌の系統は、アトピー性皮膚炎を発症する乳児と発症しない乳児との間で差異がないことが確認できた。
【００１８】
「ゲノム解析」
単離したＳ．ａｕｒｅｕｓ全２４３株について全ゲノム解析を行い、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ株のゲノムを基準とした全てのゲノムワイドコア一塩基多型（ＳＮＰｓ）に基づいて、近隣結合法で系統樹を作成した。
この系統樹に基づき、５ヶ月間（１ヶ月時から６ヶ月時まで）の皮膚定着中における遺伝子変異を評価するために、同一乳児の１ヶ月時と６ヶ月時において同一株のクローンであると認められる菌株を同定した。なお、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの変異は、既報によると、概算で１サイトあたり１０−６／年以下であるため、５ヶ月間の皮膚定着中における変異数が１００以下である菌株を、同一株のクローンとして同定した。また、５ヶ月間の生着中のＳ．ａｕｒｅｕｓの進化を調べるために、同一クローンの６ヶ月での単離時のゲノムと、１ヶ月での単離時のゲノムとを比較して、ＳＮＰｓをさらに分析した。結果を図２に示す。
【００１９】
１ヶ月時に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓが定着していた乳児は１０３人であり、ＡＤを発症しなかった乳児８６人から２４株（以下、ＡＤ非発症群という）、ＡＤを発症した乳児は１７人から９株（以下、ＡＤ発症群という）が同一クローンとして同定でき、ＡＤを発症した乳児の皮膚上では、ＡＤを発症しなかった乳児の皮膚上よりも、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの遺伝子変異が起こりにくいことが確かめられた（（ｐ＜０．０５、χ二乗検定）（図２左）。
また、ＡＤ発症の有無に関わらず、５ヶ月間の生着中に、アミノ酸非同義置換（ノンシノニマス変異）がアミノ酸同義置換（シノニマス変異）よりも多く起こっており、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、皮膚に生着中に、いわゆるダーウィン進化における正の選択過程にあることが示唆された（図２右）。
【００２０】
ここで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのａｇｒシステムは、細胞密度依存性のシグナルトランスダクション経路により活性化されるａｇｒＡ、ａｇｒＢ、ａｇｒＣ、ａｇｒＤ、ｈｌｄ遺伝子を含み、ＲＮＡＩＩＩはそれ自体ノンコーディングＲＮＡとして働き、複数の病原性遺伝子の発現を制御している。
ＡＤ発症群では、全６３のＳＮＰｓのうち、ａｇｒ遺伝子座における変異はなかったが、ＡＤ非発症群では、全２５２のＳＮＰｓのうち４つの変異（ｓａｍｐｌｅ  ＩＤ：Ｋ０５１、Ｋ１５５、Ｃ０５６、Ｃ０５９）がａｇｒ遺伝子座で起こっていた。また、ＡＤ非発症群では、黄色ブドウ球菌の他の遺伝子座と比べて、ａｇｒ遺伝子座において高い頻度で変異が起きていることが確認できた（ｐ＜０．００１、χ二乗検定）（表２）。
【００２１】
【表２】
2019030272.tif 000004
【００２２】
図３に、ＡＤ非発症群で確認されたａｇｒ遺伝子座の４つの変異を示す。
Ｋ０５１、Ｋ１５５は、ａｇｒＣ遺伝子座における核酸挿入によるナンセンス変異、Ｃ０５６は、ＲＮＡＩＩＩにおける核酸置換、Ｃ０５９は、ａｇｒＢ遺伝子上流での核酸挿入であった。
【００２３】
次いで、乳児から単離した株のうちａｇｒ領域の核酸配列が一致している最大のグループであったａｇｒＩタイプであるＳ．ａｕｒｅｕｓについて、ａｇｒＩ遺伝子座内のＳＮＰｓ、塩基の挿入と欠損（ＩＮＤＥＬ：ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ、ｄｅｌｅｔｉｏｎ）の頻度を５塩基での移動平均で平滑化して分析した。なお、分析した菌株は、ＡＤ非発症乳児の１ヶ月時より単離された５４株（以下、１Ｍ  Ｎｏｎ−ＡＤ群）、ＡＤ発症乳児の１ヶ月時より単離された８株（以下、１Ｍ  ＡＤ群）、ＡＤ非発症乳児の６ヶ月時より単離された６８株（以下、６Ｍ  Ｎｏｎ−ＡＤ群）、ＡＤ発症乳児の６ヶ月時より単離された２０株（以下、６Ｍ  ＡＤ群）である。結果を図４に示す。
【００２４】
６Ｍ  Ｎｏｎ−ＡＤ群は、ａｇｒＣ遺伝子座におけるＳＮＰｓとＩＮＤＥＬの頻度が他の遺伝子座と比較して高く、ａｇｒＣ遺伝子座において変異が起こりやすいことが確かめられた（ｐ＜０．０１、χ二乗検定）。それに対し、その他の群は、ＳＮＰｓとＩＮＤＥＬの頻度が低く、また、特定の遺伝子座への偏りも認められなかった。
このことから、１歳時にＡＤを発症しない乳児は、６ヶ月時の皮膚に生着している黄色ブドウ球菌がａｇｒＣ遺伝子座において変異が起きている傾向が高いことが確認できた。
【００２５】
さらに、６Ｍ  Ｎｏｎ−ＡＤ群におけるａｇｒＣ遺伝子座における変異の特異性を評価するために、ａｇｒＩタイプ全株でのコアゲノムのヌクレオチド多様性を評価した。コアゲノムは、解析株のうち９９％以上が保有する遺伝子で、９５％以上の相同性を持つものとして定義した。
同定された１７８６個の遺伝子内で、コアゲノムは１８０９同定され、このうち６Ｍ  Ｎｏｎ−ＡＤ群に特徴的な多様性が高い遺伝子は２３９個同定され、ａｇｒＣも６Ｍ  Ｎｏｎ−ＡＤ群に特徴的な多様性が高まった遺伝子として同定された。すなわち、６Ｍ  Ｎｏｎ−ＡＤ群においてａｇｒＣ遺伝子座において多くの変異が起こっていることが確認できた（図５）。
【００２６】
「リアルタイムＰＣＲ」
乳児から単離したＳ．ａｕｒｅｕｓ全２４３株について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖期におけるｍＲＮＡ遺伝子の発現を、リアルタイムＰＣＲにより確認した。ａｇｒ領域の発現を反映する遺伝子として、ＲＮＡＩＩＩの発現量を、ハウスキーピング遺伝子であるｇｙｒＢとの相対発現量（ＲＮＡＩＩＩ／ｇｙｒＢ）として評価した。また、ＲＮＡＩＩＩ発現のネガティブコントロールとしてＳＡ１１３株、ポジティブコントロールとしてＬＡＣ株においても、同様にリアルタイムＰＣＲを行った。ＲＮＡＩＩＩ／ｇｙｒＢが１０以下を、ウエスタンブロット法でＲＮＡＩＩＩ領域から転写されるδ−ｔｏｘｉｎ蛋白が検出されないラインとして確認し、ａｇｒ欠損株として定義した。結果を図６に示す。なお、図６において、１Ｍ、６Ｍ、Ｎｏｎ−ＡＤ、ＡＤは図１と同様である。
【００２７】
１歳時にＡＤを発症しない乳児は、６ヶ月時に単離したＳ．ａｕｒｅｕｓ株のＲＮＡＩＩＩの発現量が低下していた。また、１歳時にＡＤを発症しない乳児は、１ヶ月時に比較して、６ヶ月時にａｇｒ欠損株の増加が認められた。１歳時にＡＤを発症した乳児では、ＲＮＡＩＩＩの発現量に変化は見られなかった。
【００２８】
さらに、上記ゲノム解析で同定したＡＤ非発症群のうち、ａｇｒ遺伝子座における変異が起きた４株の、生後１ヶ月で単離したクローンと生後６ヶ月で単離したクローンのＲＮＡＩＩＩの発現量を図７に示す。
生後１ヶ月時のクローンと生後６ヶ月時のクローンでは、ａｇｒ遺伝子座で変異が起きているが、変異後には、ＲＮＡＩＩＩの発現が大幅に低下していた。さらに、この４株のうち、変異によりａｇｒＣ遺伝子座に終止コドンが生じたＫ０５１とＫ１５５は、ＲＮＡＩＩＩの発現が認められないａｇｒ欠損株であった。
【００２９】
さらに、図６において、１歳時にＡＤを発症しない乳児の６ヶ月時に単離したＳ．ａｕｒｅｕｓ株のうち、ａｇｒ欠損株１３株（６Ｍ、ＮｏｎＡＤのドットラインより下方の株）について、ａｇｒＩ座における遺伝子配列を調べたところ、２株がａｇｒＡに、８株がａｇｒＣに突然変異を有し、大きなアミノ酸配列の欠損または一アミノ酸の置換を生じていた。その他の群においてａｇｒ欠損株９株について、ａｇｒＩ座における遺伝子配列を調べたところ、ａｇｒＡで変異が認められた株は２株であり、ａｇｒＣでは突然変異は認められなかった。
【００３０】
このことから、１歳時にＡＤを発症しない乳児は、６ヶ月時の皮膚に生着している黄色ブドウ球菌のＲＮＡＩＩＩ発現量が小さい傾向にあることが確認できた。６ヶ月時の皮膚に生着している黄色ブドウ球菌のＲＮＡＩＩＩ遺伝子の発現量が小さいほど、ＡＤが発症しにくいため、ＲＮＡＩＩＩ遺伝子の発現量を検出することによりアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定できることが確かめられた。また、黄色ブドウ球菌のＲＮＡＩＩＩ遺伝子は、アトピー性皮膚炎の発症リスク判定用バイオマーカーとして利用できることが確かめられた。さらに、ａｇｒＣ変異依存性のＲＮＡＩＩＩ遺伝子発現量は、アトピー性皮膚炎の予防薬または治療薬をスクリーニングする際の指標となることが確かめられた。
【００３１】
なお、本発明のマーカーを用いるに際し、コントロール値は、被験者のＲＮＡＩＩＩ遺伝子の発現量が、健常者の発現量よりも高いか否かを判断するための指標値であればよく、特に制限されない。例えば、コントロール値として、ＲＮＡＩＩＩを発現しない汎用される標準株であるＳＡ１１３株の値を１として用いて標準化した値を用いることができる。この場合、図６に示したように、ＲＮＡＩＩＩ／ｇｙｒＢが＜１０であれば、ＡＤ発症に関与しない株であると考えることができる。また、本発明と同様にして、生後３ヶ月〜１年の乳児から採取したＳ．ａｕｒｅｕｓ株を、採取した乳児の生後１年〜２年におけるＡＤ発症の有無に応じてＡＤグループと健常者グループとに分け、これらのＲＮＡＩＩＩ遺伝子の発現量を市販の統計解析ソフトウェアを用いてＲＯＣ曲線を求め、このＲＯＣ曲線から算出した閾値を用いることができる。
【００３２】
「培養試験」
乳児の頬部皮膚にＳ．ａｕｒｅｕｓ選択培地（Ｘ−ＳＡ寒天培地、日水製薬）を直接スタンプし、３７℃で４８時間培養して生後１ヶ月および６ヶ月時の菌の生着数を、コロニー数をカウントし確認した。結果を図８に示す。
【００３３】
ＡＤを発症しなかった乳児（Ｎｏｎ−ＡＤ）は、１ヶ月時に単離された菌株と比較して、６ヶ月時に単離された菌株の生着性が低下していた。一方、ＡＤを発症した乳児（ＡＤ）は、１ヶ月時に単離された菌株と６ヶ月時に単離された菌株との間に、生着性の有意差は確認できなかった。このことから、ａｇｒＣ遺伝子座に変異が生じることにより、皮膚への生着性が低下することが確認できた。
【００３４】
「マウスモデル試験」
ＲＮＡ表現型であるＬＡＣ株、ａｇｒ領域を欠損させたＬＡＣ株（以下、欠損株という）を、それぞれ３７℃のＴＳＢ培地で培養したところ、両者ともに増殖し、有意差は認められなかった。
【００３５】
Ｃ５７／ＢＬ６マウスの皮膚に、皮膚表面上のａｇｒ系の活性化を誘導するプロトコルを用いて、上記ＬＡＣ株、または欠損株を生着させた。
生着７日後の皮膚写真（左）と、ヘマトキシリンエオジン染色（中央左弱拡、中央右強拡）と、蛍光顕微鏡画像（右）を図９に示す。
【００３６】
生着７日後、ＬＡＣ株は、顕著な角化症、表皮肥厚、真皮炎症性細胞浸潤に関連する堅牢な炎症性疾患を引き起こした。一方、欠損株は、皮膚の炎症が起こらなかった（図９中央左右）。
また、免疫蛍光染色により、ＬＡＣ株は、皮膚への生着が認められたが、欠損株は、皮膚へほとんど生着していなかった（図９右）。
このことから、ａｇｒ遺伝子座における変異が、皮膚への生着性を低下させ、アトピー性皮膚炎の発症を抑制できることが確認できた。
【００３７】
「まとめ」
本発明のリスク判定方法により、早期にかつ精度よくアトピー性皮膚炎の発症リスクを予測することができる。そのため、本発明のリスク判定方法により「発症リスクあり」と判定された被験者に対し、発症予防、早期発見、早期治療を適切に行うことができる。特に、本発明のリスク判定方法は、その後のアトピー性皮膚炎の発症の有無に関わらず、皮膚に黄色ブドウ球菌が付着している可能性が高い生後３月以上１年以下の乳児に対して有用である。
本発明のバイオマーカーは、アトピー性皮膚炎の発症と密接に関連しており、アトピー性皮膚炎の発症リスク判定、病名確定に用いることができる。
本発明のスクリーニング方法は、アトピー性皮膚炎の予防薬または治療薬の開発に資するものである。
【図１】
2019030272.tif 000005
【図２】
2019030272.tif 000006
【図３】
2019030272.tif 000007
【図４】
2019030272.tif 000008
【図５】
2019030272.tif 000009
【図６】
2019030272.tif 000010
【図７】
2019030272.tif 000011
【図８】
2019030272.tif 000012
【図９】
2019030272.tif 000013