(57)【要約】      （修正有）【課題】ＬＡＭＰ検出方法における使用の為の新規核酸プローブの提供。【解決手段】標的核酸配列の領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ配列を含む等温核酸増幅の為のプローブであって、該オリゴヌクレオチドプローブ配列がただ１つの蛍光体標識を有し、且つ、該標識が内部シトシン塩基に結合されており、且つ、該オリゴヌクレオチドプローブ配列が３’末端ターミネーターを有さない前記プローブ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列の領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ配列を含む等温核酸増幅の為のプローブであって、該オリゴヌクレオチドプローブ配列がただ１つの蛍光体標識を有し、且つ、該標識が内部シトシン塩基に結合されており、且つ、該オリゴヌクレオチドプローブ配列が3’末端ターミネーターを有さない前記プローブ。
【請求項２】
該シトシン塩基が、オリゴヌクレオチドの長さ方向において、3’末端の1〜3位及び5’末端の1位以外で、実質的に中央に配置されている、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
該オリゴヌクレオチドプローブ配列がＤＮＡ配列であり、且つ、該標的核酸配列がＤＮＡ配列である、請求項１又は２に記載のプローブ。
【請求項４】
前記蛍光体がFAM、JOE、TET、HEX、TAMRA、ROX、ALEXA、及びATTOから選ばれる１またはそれより多くを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項５】
前記蛍光体がFAM、Joe、又はAlexa546である、請求項４に記載のプローブ。
【請求項６】
以下の配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプローブ、
5’ Xn C * Xm 3’ (配列ID NO. 1)
ここで、nは> 1、m>3、Xはヌクレオチド塩基であり、且つ*は蛍光体である。
【請求項７】
該ヌクレオチド塩基が、A、T、C、及びGから選ばれるものであり、nは1超〜20以下であり、より好ましくは1超〜10以下であり、mは3超〜20以下であり、好ましくは3超〜10以下である、請求項６に記載のプローブ。
【請求項８】
以下の配列の１又はそれより多くを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプローブ。
2019216722.tif 000014
【請求項９】
該標的核酸が、微生物、菌類、酵母又はウィルス由来のものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のループ媒介等温増幅プローブ。
【請求項１１】
試料中の標的核酸配列を検出する方法であって、
該試料中の標的核酸を増幅して、増幅された核酸を用意すること、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプローブで該増幅された核酸をプローブすること、及び、
該標的核酸の存在を検出すること
を含み、該プローブの蛍光の増加が該試料中の該標的核酸の存在を示す、前記方法。
【請求項１２】
該標的核酸が、微生物、菌類、酵母、又はウィルス由来のものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該標的核酸が、Chlamydia  trachomatis又はNeisseria  gonorrhoeae由来のものである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
患者におけるChlamydia及び／又はGonorrheaの感染を診断する方法であって、
該患者から得られた試料を用意すること、
該試料に請求項１〜１０の１またはそれより多くのプローブを添加すること、及び
Chlamydia  trachomatis及び／又はNeisseria  gonorrhoeaeから得られた核酸の存在を検出すること
を含み、ここで該プローブの蛍光の増加が、Chlamydia  trachomatis及び／又はNeisseria  gonorrhoeaeの感染の存在を示す、前記方法。
【請求項１５】
Chlamydia  trachomatis又はNeisseria  gonorrhoeae由来の核酸に特異的な１種類のプローブが該試料に添加される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも２つの異なるプローブが該試料に添加され、ここで第１のプローブが第１の蛍光標識により標識されており且つChlamydia  trachomatis核酸をプローブする為に特異的であり、且つ、第２のプローブが該第１のプローブと異なる蛍光標識により標識されており且つNeisseria  gonorrhoeae核酸をプローブする為に特異的である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
該プローブが、dNTPを1〜10mMの濃度で、１またはそれより多くの塩を各塩について2〜20mMの濃度で、Tris  pH8.8を10〜100mMの濃度で、トレハロースを10〜100mMの濃度で、BSTポリメラーゼを1U〜12Uの量で、及び0.01%〜1%の1,2プロパンジオールを含むバッファー系中に用意される、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記１またはそれより多くの塩が、KCl、(NH4)2SO4、及びMgSO4からなる群から選ばれるものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプローブ、ループ媒介等温増幅試薬バッファー、酵素、dNTP及び１またはそれより多くのループ媒介等温増幅プライマーを含む、標的核酸を検出する為のキット。
【請求項２０】
陽性対照及び陰性対照をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
該試薬バッファーが、dNTPを1〜10mMの濃度で、１またはそれより多くの塩を2〜20mMの濃度で、Tris  pH8.8を10〜100mMの濃度で、トレハロースを10〜100mMの濃度で、BSTポリメラーゼを1U〜12Uの量で、及び、0.01%〜1%の 1,2プロパンジオールを含む、請求項１９又は２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記１またはそれより多くの塩が、KCl、(NH4)2SO4及びMgSO4からなる群から選ばれる、請求項２１に記載のキット。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の検出の為のプローブに関し、該プローブを使用する方法及びパーツキット（kit of parts）に関する。好ましくは、本発明のプローブは、Chlamydia  trachomatis及び／又はNeisseria  gonorrhoeaeから得られた核酸の検出の為の方法において有用であり、及び、Chlamydia及び／又はGonorrhoeaの感染の診断において用いられうる。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅は、臨床医学などの適用志向性の分野を含むライフサイエンス分野において最も価値あるツールの一つであり、これにおいて感染症、遺伝子疾患及び遺伝形質の診断が特に利益を受ける。広く用いられるＰＣＲに基づく検出（Saiki  R.K.,  Scharf,S.,  Faloona,F.,  Mullis,K.B.,  Horn,G.T.,  Erlich,H.A.  and  Arnheim,N.  (1985)  Science,  230,  1350-1354）に加えて、いくつかの増幅方法が発明されてきた。例は、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、及びループ媒介等温増幅（loop-mediated  isothermal  amplification）を包含する。ＰＣＲは、二本鎖ＤＮＡ産物の熱変性を用いて、次の回のＤＮＡ合成を促進する。３ＳＲ及びＮＡＳＢＡは、転写反応及び逆転写反応のセットを用いて標的配列を増幅することにより熱変性を省く。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Saiki  R.K.,  Scharf,S.,  Faloona,F.,  Mullis,K.B.,  Horn,G.T.,  Erlich,H.A.  and  Arnheim,N.  (1985)  Science,  230,  1350-1354
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらの方法は、同様の程度で標的核酸を増幅することができ、全て１０コピー未満の検出限界を有し及び１時間以内程度である。それらは、標的配列選択の乏しい特異性の故に、増幅の為の精密な機器又は増幅産物の検出の為の複雑な方法を必要とする。その単純性及び得られる増幅程度にもかかわらず、ＰＣＲにおける高く精密なサーマルサイクラーについての要求が、この強力な方法が例えば民間の病院における通常の診断ツールなどとして広く使用されることを阻害する。対照的に、ＬＡＭＰは、数コピーのＤＮＡを１００超へと、１時間未満で、等温条件下で且つより大きな特異性とともに増幅することができる方法である。
【０００５】
上記で示された、分子プローブに基づく他の技術を用いたときと同様に、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）アッセイは、試料中の特定の微生物の存在を検出する為に用いられうる。しかしながら、その検出方法は、直接的な視覚的検出、濁度、又は非特異的なＤＮＡインターカレート染料を介することに基づく。直接的な視覚的測定は、エンドポイント測定であり及びリアルタイム分析を提供することができない。濁度及び非特異的インターカレート染料は、起こる増幅のリアルタイム分析を提供するが、これは非特異的であり、すなわち、全ての増幅が、これが真の陽性増幅であるか又は誤ったプライミング、クロス特異性に起因する偽の増幅であるかにかかわらず検出される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第一の局面に従い、標的核酸配列の領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ配列を含む、等温核酸増幅の為のプローブが提供され、ここで該オリゴヌクレオチドプローブ配列は、一つだけ蛍光体リガンドを有し且つ該リガンドが内部シトシン塩基に結合されており且つ該オリゴヌクレオチドプローブ配列は3’末端ターミネーターを有さない。
【０００７】
好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドプローブ配列はＤＮＡ配列であり且つ該標的核酸配列はＤＮＡ配列である。
【０００８】
好ましくは、蛍光が増加して、試料中の該標的核酸の存在を示す。
【発明の効果】
【０００９】
該シトシン塩基は好ましくは、該オリゴヌクレオチドの長さ方向において実質的に中央に配置される。プローブを内部にシトシン塩基において標識することに関連付けられる特定の利益がある。等温反応において増幅されたＤＮＡ産物の特異性は、融解曲線分析を用いて確認されうる。しかしながら、この反応において生成された多数の産物変異体及び融解曲線分析の低い解像度の故に、Ｖ１３のようなインターカレート染料を用いた場合、等温条件下で生成された特異的ＤＮＡ産物と非特異的ＤＮＡ産物とを区別することは非常に困難である。TaqMan（商標）プローブなどの一般に用いられるプローブは、BSTポリメラーゼの鎖置換活性（strand  displacement  activity）の故に、ＬＡＭＰ技術に適合しない。本発明のプローブは伸長され及び等温増幅の間にＤＮＡ産物内に組み込まれ、これが、生成産物に対して融解曲線分析を行うことを許す。本発明のプローブにおいて、該蛍光体は、アンチセンス鎖中のグアニンに相補的な内部シトシンに結合される。グアニンは、多くの蛍光体の励起状態に影響し、独特の融解曲線の特徴の形成を結果し、及び、等温条件下で生成された特異的産物及び非特異的産物とを区別することを許す。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明のＤＮＡプローブの模式図である。
【図２Ａ】Ｖ６．２１バッファー中でＣＴ  ＰＢ１プライマーを用いて生成された増幅プロットを示す図である。
【図２Ｂ】Ｖ６．２１バッファー中でＧＣ  ｇｌｎＡ７プライマーを用いて生成された増幅プロットを示す図である。
【図２Ｃ】Ｖ６．２１バッファー中でＧＣ  ｐｏｒＡ７プライマーを用いて生成された増幅プロットを示す図である。
【図２Ｄ】Ｖ６．２１ｐバッファー中でＣＴ  ＰＢ１プライマーを用いて生成された増幅プロットを示す図である。
【図２Ｅ】Ｖ６．２１ｐバッファー中でＧＣ  ｇｌｎＡ７プライマーを用いて生成された増幅プロットを示す図である。
【図２Ｆ】Ｖ６．２１ｐバッファー中でＧＣ  ｐｏｒＡ７プライマーを用いて生成された増幅プロットを示す図である。
【図３Ａ】FAMを結合したCT  PB1内部プローブの存在下においてCT  PB1により生成されたＬＡＭＰ産物の融解曲線分析を示す図である。
【図３Ｂ】FAMを結合したCT  PB1内部プローブの存在下においてCT  PB1により生成されたＬＡＭＰ産物の融解曲線分析を示す図である。
【図４Ａ】JOEを結合したGC  glnA7ループプローブの存在下においてGC  glnA7プライマーを用いて生成されたＬＡＭＰ産物の融解曲線分析を示す図である。
【図４Ｂ】JOEを結合したGC  glnA7ループプローブの存在下においてGC  glnA7プライマーを用いて生成されたＬＡＭＰ産物の融解曲線分析を示す図である。
【図５Ａ】ALEXA546を結合したGC  porA7ループプローブの存在下におけるGC  porA7プライマーを用いて生成されたＬＡＭＰ産物の融解曲線分析を示す図である。
【図５Ｂ】ALEXA546を結合したGC  porA7ループプローブの存在下におけるGC  porA7プライマーを用いて生成されたＬＡＭＰ産物の融解曲線分析を示す図である。
【図６Ａ】ループ媒介等温増幅において本発明のプローブによりＤＮＡ産物特異性を確認する為の試験の結果を示す図である。
【図６Ｂ】ループ媒介等温増幅において本発明のプローブによりＤＮＡ産物特異性を確認する為の試験の結果を示す図である。
【図６Ｃ】ループ媒介等温増幅において本発明のプローブによりＤＮＡ産物特異性を確認する為の試験の結果を示す図である。
【図６Ｄ】ループ媒介等温増幅において本発明のプローブによりＤＮＡ産物特異性を確認する為の試験の結果を示す図である。
【図７】CT  PB1プライマーにより、V13を含むV6.21バッファーにおいて又はV13染料を有さないV6.21pバッファーにおいて、FAMを結合した内部Ｃ及び3’ターミネーターを有するCT  PB1末端プローブ（ループ領域に相補的である）の存在下において生成された増幅プロットを示す図である。
【図８Ａ】CT  PB1プライマー及びFAM を結合した内部シトシンを有するCT  PB1末端プローブの存在下において、ROX含有V6.21pバッファーにおいて生成された増幅プロットを示す図である。
【図８Ｂ】ユニバーサルプライマー及びFAMを結合した内部シトシンを有する3’UPプローブの存在下において、ROX含有V6.21pバッファーにおいて生成された増幅プロットを示す図である。
【図９Ａ】CT  PB1プライマーを用いて、V13無しのV6.21pにおいて、FAM を結合した内部Ｃを有するCT  PB1内部プローブ及び参照染料(ROX)の存在下において生成された増幅プロットを示す図である。
【図９Ｂ】CT  PB1プライマーを用いて、V13無しのV6.21pにおいて、FAM を結合した内部Ｃを有するCT  PB1内部プローブ及び参照染料(ROX)の存在下において生成された増幅プロットを示す図である。
【図９Ｃ】CT  PB1プライマーを用いて、V13無しのV6.21pにおいて、FAM を結合した内部Ｃを有するCT  PB1内部プローブ及び参照染料(ROX)の存在下において生成された増幅プロットを示す図である。
【図１０Ａ】CT  PB1-FAMプローブ特異性の確認を示す図である。
【図１０Ｂ】CT  PB1-FAMプローブ特異性の確認を示す図である。
【図１０Ｃ】CT  PB1-FAMプローブ特異性の確認を示す図である。
【図１１Ａ】APTIMA  CTアッセイに対するCT  PB1-FAMプローブの確認を示す図である。
【図１１Ｂ】APTIMA  CTアッセイに対するCT  PB1-FAMプローブの確認を示す図である。
【図１２Ａ】CT/GCマルチプレックスにおいてCT  PB1-FAM + GC  porA7-Alexa546プローブを用いて生成された増幅プロットを示す図である。
【図１２Ｂ】CT/GCマルチプレックスにおいてCT  PB1-FAM + GC  porA7-Alexa546プローブを用いて生成された増幅プロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
該オリゴヌクレオチドは、3’末端にddNTPを含まず、これが標識されたオリゴヌクレオチドのアンプリコン内への組み込みを可能とする。すなわち、該プローブの3’末端が「ブロック」されない。
【００１２】
該蛍光体は、以下から選ばれるいずれか一つ又はそれより多くを含みうる：FAM, JOE, TET, HEX, TAMRA, ROX, ALEXA及びATTO。
【００１３】
該プローブは以下の配列を含みうる：
5’ Xn C* Xm 3’  (配列ID NO. 1)
ここでnは>1であり、mは>3であり、Xはヌクレオチド塩基であり;且つ*は蛍光体である。好ましくは該ヌクレオチド塩基は、A、T、C、及びGから選ばれる。好ましくは、nは1超〜20又はそれより少なく、より好ましくは1超〜10又はそれより少ない。好ましくは、mは3超〜20又はそれより少なく、より好ましくは3超〜10又はそれより少ない。先の範囲によってn又はmがとりうる可能なヌクレオチド数によりカバーされるプローブの長さの全ての組合せが開示されることが意図される。
【００１４】
好ましくは、該プローブは、以下の配列のいずれか一つから選択される配列を含みうる：
2019216722.tif 000002
【００１５】
該蛍光は好ましくは、該オリゴヌクレオチドが該標的核酸配列内に組み込まれたときに増加され、これが該アンプリコン−プローブ複合体の構成における変化を結果し、蛍光体励起状態の変化をもたらす。
【００１６】
該蛍光体リガンドに結合した該シトシンは、5’若しくは3’末端に配置されず又は5’若しくは3’末端に隣接しない。より好ましくは、該シトシンは、5’又は3’末端のいずれかから最初の３つの塩基内に配置されない。好ましくは、該蛍光体に結合した該シトシンは、該プローブの中央の塩基に配置される。
【００１７】
本発明のさらなる局面に従い、本明細書内上記に記載されたとおりの等温核酸増幅プローブが提供される。
【００１８】
本発明のさらなる局面に従い、本明細書内上記に記載されたとおりのループ媒介等温増幅プローブが提供される。
【００１９】
核酸の混合物中の少なくとも一つの標的核酸を決定する為の方法及び組成物は一般にプローブ、ハイブリダイズ試薬、及び、核酸鎖を形成するためのいずれかの必要なヌクレオチドトリホスフェートに関連した１又はそれより多くのリン酸結合形成性酵素を用いる。
【００２０】
これらの方法は通常は増幅を含み、例えばＲＮＡポリメラーゼとの併用におけるプロモーター、一つの鎖だけが開裂されそして次にＤＮＡポリメラーゼによる伸長によって置換される制限部位、又は、環状ハイブリダイズ試薬の使用を含み、連結した繰り返しが生成される。増幅された核酸の検出は、多くの形をとりうるが、好ましくは蛍光体による。
【００２１】
本発明のさらなる局面に従い、試料中の標的核酸を検出する方法が提供され、前記方法は、
a. 該試料中の標的核酸を増幅して、増幅された核酸を提供すること;
b. 本明細書内上記で記載されたとおりのプローブにより該増幅された核酸をプローブすること;及び
c. 一つ又は複数の標的核酸の存在を検出すること
を含む。
【００２２】
該標的核酸は、微生物、菌類、酵母、ウィルス、ヒト、動物、植物等に由来するものでありうる。ＬＡＭＰの為の該標的核酸はＬＡＭＰプライマー及び適切な特異的なプローブが合成されることを可能にすると知られている。すなわち、該微生物、菌類、酵母、ウィルス、ヒト、動物又は植物の試料中における存在又は不在が決定されることができる。好ましくは、該標的核酸は、Chlamydia  trachomatis又はNeisseria  gonorrhoeae由来のものである。
【００２３】
好ましくは、蛍光が増加して、試料中の該標的核酸の存在を示す。
【００２４】
該方法は等温的であり、且つ、一つの容器内での一段階又は逐次段階の増幅を許し、試薬の全てが適合的である。
【００２５】
さらなる局面において、本発明は、患者におけるChlamydia及び／又はGonorrheaを診断する方法であって、
該患者に由来する試料を用意すること；
本発明の１又はそれより多くのプローブを該試料に添加すること；及び
Chlamydia  trachomatis及び／又はNeisseria  gonorrhoeaeに由来する核酸の存在を検出すること、ここで該プローブの蛍光の増加がChlamydia  trachomatis及び／又はNeisseria  gonorrhoeaeの感染の存在を示す、
前記方法を提供する。
【００２６】
該試料は、該プローブが該試料中に存在する任意の標的ヌクレオチドに結合することを可能にするための通常の方法により処理されうる。そのような処理は、該試料を遠心すること及びに該試料を溶解して該感染性微生物から任意の標的核酸を放出させることを含みうる。
【００２７】
一つの実施態様において、Chlamydia  trachomatis又はNeisseria  gonorrhoeaeのいずれかからの核酸に特異的な一種類のプローブが、該方法において、Chlamydia  trachomatisだけ又はNeisseria  gonorrhoeaeだけが該試料において検出されるように用いられる。
【００２８】
好ましい実施態様において、少なくとも２つの異なるプローブが該試料に添加され、ここで第一のプローブは第一の蛍光ラベルにより標識されており且つChlamydia  trachomatis核酸をプローブするために特異的であり、且つ、第二のプローブは該第一のプローブと異なる蛍光ラベルにより標識されており且つNeisseria  gonorrhoeae核酸をプローブする為に特異的である。この実施態様において、患者に由来する一つの試料においてChlamydia 及びGonorrhea感染を同時に検出することが可能である。
【００２９】
本発明の方法の一つの局面において、該患者からの該試料は、血液試料、尿試料、血清試料、又は唾液試料でありうる。
【００３０】
本発明のさらなる局面に従い、本明細書内上記で記載されたとおりのプローブ、ポリメラーゼ酵素を含むＬＡＭＰ反応バッファー、dNTP、及び該標的についてのＬＡＭＰプライマーを含むキットが提供される。
【００３１】
一つの実施態様において、陽性及び陰性の対照が、該キットに含まれうる。該試薬は、湿った試薬として又は凍結乾燥された形で提供されうる。
【００３２】
本発明の方法又はキットにおいて用いられるバッファーは、dNTPを1〜10mMの濃度で、１又はそれより多くの塩を2〜20mMの濃度で、Tris  pH8.8を10〜100mMの濃度で、トレハロースを10〜100mMの濃度で、BSTポリメラーゼを1U〜12Uの量で、及び0.01%〜1%の1,2プロパンジオールを含む。
【００３３】
略語
CT - Chlamydia  trachomatis
GC - Neisseria  gonorrhoeae
GlnA7 - グルタミン合成酵素
PorA7 - ポリンタンパク質A7
LAMP -ループ媒介等温増幅
PCR - ポリメラーゼ連鎖反応
【００３４】
本発明が、以下の実施例及び図面を参照して、例示としてのみ説明される。
【００３５】
ＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰにより標的CT及びGT  ＤＮＡのV13に基づく検出が、本出願人により開発されたＬＡＭＰ  V6.21反応バッファーを用いて行われた。該標的ＤＮＡのプローブに基づく検出が、V6.21p (V13無し)において行われた。ＬＡＭＰプライマーの濃度は以下のとおりであった：CT PB1−0.8μMのFIP及びBIPプライマー、0.2μMのF3及びB3プライマー及び0.4μMのループプライマー、GC porA7及びGC glnA7−2μMのFIP及びBIP プライマー、0.25μMのF3及びB3並びに0.5μMのループプライマー。全てのプローブが、0.625μMの最終濃度で用いられた。ＬＡＭＰ反応は、６０分間、６３℃の一定温度でABI7500リアルタイムPCR装置を用いて行われた。蛍光シグナルの測定値は、SybrGreen/FAM, Joe又はCy3チャンネルにおいて適宜得られた。
【００３６】
プローブ配列
2019216722.tif 000003
【００３７】
標的配列
実施例において用いられた標的ＤＮＡ配列は以下である。
【００３８】
配列ID  No.8: Chlamydia  trachomatis  G/SotonG1  plasmid  pSotonG1  complete sequence (GenBank: HE603235.1)
2019216722.tif 000004
2019216722.tif 000005
2019216722.tif 000006
【００３９】
配列ID  No.9: Neisseria  gonorrhoeae  partial  porA  gene  for  class  1  outer  membrane  protein,  isolate  GC3 (GenBank: HE681886.1)
2019216722.tif 000007
【００４０】
配列ID  No.10: Neisseria  gonorrhoeae  glutamine  synthetase  (glnA)  gene,  glnA-14  allele,  partial  cds (GenBank: AF520262.1)
2019216722.tif 000008
【００４１】
ＬＡＭＰ反応において用いられたプライマーは以下の通りである。
【００４２】
ＣＴプラスミド
2019216722.tif 000009
【００４３】
ＧＣ  ｐｏｒＡ７
2019216722.tif 000010
【００４４】
ＧＣ  ｇｌｎＡ７
2019216722.tif 000011
2019216722.tif 000012
【００４５】
バッファー
本出願人は、本発明のプローブとの使用のためのバッファー系を開発し、以下の実施例においてV6.21 (又は存在するV13染料無しのV6.21p)と称される。該バッファー成分の濃度はバッファー再構成後である。
【００４６】
V6.21
4〜10mMのdNTP’、10mMの塩、30mMのTris  pH8.8、30mMのトレハロース、1〜8U のBstポリメラーゼ、染料及び0.05%プロパンジオール。
【００４７】
V6.21p
4〜10mMのdNTP’、10mMの塩、30mMのTris  pH8.8、30mMのトレハロース、1〜8UのBstポリメラーゼ、及び0.05%のプロパンジオール。
【００４８】
PCR
リアルタイムＰＣＲによる臨床試料のCT/GC検出が、APTIMA  CT/GCマルチプレックス(Gen-Probe)を用いて製造者の指示に従い行われた。
【００４９】
アガロースゲル電気泳動
ＤＮＡ電気泳動が、1%アガロースゲル1xTAEバッファーにおいて100Vで行われた。ＬＡＭＰ  ＤＮＡ産物が、GelRed (Invitrogen)を用いてトランスイルミネーターにより活性化された。
【００５０】
V6.21及びV6.21pバッファーが、本出願人により開発された。ＬＡＭＰプライマーが、Eurofinsから入手された。蛍光体により標識されたオリゴヌクレオチドが、Integrated  DNA  Technologies社から購入された。Trisバッファー、アガロースゲル及びPCRグレードの水が、Sigmaから購入された。CT及びGC  DNAの標準品が、ATCCから入手された。
【００５１】
図面
図１は、本発明のＤＮＡプローブの模式図である。該プローブは、既定の蛍光体を結合した内部シトシンを有するオリゴヌクレオチドからなる。該プローブは、Fip及びBipプライマーの横についたアンプリコンの内部領域に相補的であってよく、又は、蛍光体を内部に標識された、修飾されたループF又はループBプライマーでありうる。
【００５２】
実施例１
図２Ａ〜２Ｆは、V13を含有するV6.21バッファー中 (図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃ)又はV13染料無しのV6.21pバッファー中(図２Ｄ、２Ｅ及び２Ｆ)において、CT  PB1(図２Ａ及び図２Ｄ)、GC  glnA7 (図２Ｂ及び図２Ｅ)及びGC  porA7 (図２Ｃ及び図２Ｆ)プライマーを用いて生成された増幅プロットを示す。標的配列は、配列ID  NO８〜１０に示され、夫々FAM を結合したCT PB1内部プローブ、Joe を結合したGC  glnA7ループプローブ及びAlexa546を結合したGC  porA7ループプローブによる。全ての反応は、ABI7500装置を用いて60分間、63℃の一定温度で行われた。
【００５３】
実施例２
図３Ａ及び３Ｂは、FAMを結合したCT  PB1内部プローブの存在下におけるCT  PB1プライマーにより生成されたＬＡＭＰ産物の融解曲線分析である。反応当たり100pgのATTC  CT  DNA標準品が、陽性対照として用いられた。Ａ−ノーマライズ済みレポータープロット（normalized  reporter  plot）、Ｂ−微分レポータープロット（derivative  reporter  plot）。融解曲線プロットは、ABI7500装置によるFAMチャンネルにおける読み取り値に基づき生成された。
【００５４】
実施例３
図４Ａ及びＢは、JOEを結合したGC  glnA7ループプローブの存在下においてGC  glnA7プライマーを用いて生成されたＬＡＭＰ産物の融解曲線分析である。反応当たり100pgのATTC  GC  DNA標準が陽性対照として用いられた。図４Ａはノーマライズ済みレポータープロットを示し、及び、図４Ｂは微分レポータープロットを示す。融解曲線プロットは、ABI7500によるJOEチャンネルにおける読み取り値に基づき生成された。
【００５５】
実施例４
図５Ａ及び５Ｂは、ALEXA546を結合したGC  porA7ループプローブの存在下におけるGC  porA7プライマーを用いて生成されたＬＡＭＰ産物の融解曲線分析である。反応当たり100pgのATTC  GC  DNA標準品が陽性対照として用いられた。図５Ａはノーマライズ済みレポータープロットを示し、図５Ｂは微分レポータープロットを示す。融解曲線プロットは、ABI7500装置によるCy3チャンネルにおける読み取り値に基づき生成された。
【００５６】
実施例５
図６Ａ〜６Ｄは、ループ媒介等温増幅において本発明のプローブによるＤＮＡ産物特異性を確認する為の試験の結果を示す。偽陽性の後期増幅時間（ＬＡＭＰ反応において検出可能な標的ＤＮＡ最低濃度(100fg GC DNA）後３０分超）は、非特異的な増幅がプライマーダイマー形成の結果でありうることを示す。標準の融解曲線分析は、このＬＡＭＰ反応における特異的及び非特異的な産物の間で区別することを許さないが、非特異的産物は、本発明のプローブを用いて認識されうる。GC  DNAは、GC  porA7プライマーを用いて増幅され、V13染料又はGC porA7-ALEXA546プローブにより適宜可視化された。
【００５７】
実施例６
図７は、CT  PB1プライマーにより、V13を含むV6.21バッファーにおいて又はV13染料を有さないV6.21pバッファーにおいて、FAMを結合した内部Ｃ及び3’ターミネーターを有するCT  PB1末端プローブ（ループ領域に相補的である）の存在下において生成された増幅プロットを示す。対照反応におけるV13染料の励起により確認された標的ＤＮＡの成功裏の増幅にもかかわらず、3’ターミネーターを有するCT  PB1プローブは陽性シグナルを生成しなかった。
【００５８】
実施例７
図８Ａ及び８Ｂは、CT  PB1プライマー及びFAM を結合した内部シトシンを有するCT  PB1ターミナルプローブの存在下において (図８Ａ)、及び、ユニバーサルプライマー及びFAMを結合した３’末端シトシンを有する3’UPプローブの存在下において（図８Ｂ）、ROX含有V6.21pバッファーにおいて生成された増幅プロットを示す。第一の線は、ROXにより生成されたシグナルを表し、及び、第二の線は、FAMチャンネルにおいて生成されたシグナルに対応する。該標的ＤＮＡへの内部標識されたＣを有するプローブの結合は、FAM励起を結果する。標識された3’末端Cを有するプローブの該標的への結合は、FAM励起状態を変えない。
【００５９】
実施例８
図９Ａ〜９Ｃは、CT  PB1プライマーを用いて、V13無しのV6.21pにおいて、FAM を結合した内部Ｃを有するCT  PB1内部プローブ及び参照染料(ROX)の存在下において生成された増幅プロットを示す。図９Ａは生のデータを示し、FAMチャンネルからの読み取り値が第一の線にあり、及びROXチャネルからの読み取り値が第二の線にある。図９Bは、ROXに対してノーマライズ済みの増幅プロット（FAMチャンネルにおいて生成された）を示す。図９Ｃは、微分レポーター融解曲線プロットを示す。
【００６０】
実施例９
図１０Ａ〜１０Ｃは、CT  PB1-FAMプローブ特異性の確認を示す。図１０Ａは、CT  DNA及びCTプライマーの存在下において、CT  PB1-FAMプローブを用いて生成された増幅プロットを示す。対照として、２セットの反応が行われ、そこでは非特異的遺伝子、GC  glnA7 及びGC  porA7が、対応するＬＡＭＰプライマーを用いて、CT  PB1-FAMプローブの存在下において増幅された。V6.21pバッファーにおいて、FAMチャンネルにおけるCT  PB1プローブの存在下における増幅プロットが、CT  DNAが反応において存在する場合にだけ生成され、及び、非特異的遺伝子（GC  glnA7及びGC  porA7）が増幅された場合にシグナルは生成されなかった。CT  DNAがCTプライマーにより増幅されるところの反応において非特異的プローブが用いられた場合にもシグナルは生成されなかった。図１０Ｃは、類似の実験において得られたが、インターカレート染料V31を含むV6.21バッファー中において行われたデータを示す。図１０Ｃは、図１０Ａにおいて記載された実験において生成されたＤＮＡ産物を示す。
【００６１】
実施例１０
図１１Ａ及び１１Ｂは、APTIMA  CTアッセイに対するCT  PB1-FAMプローブの確認を示す。CTについて陽性(n=29)（図１１Ａ）又は陰性(n=21)（図１１Ｂ）と確認された５０の臨床試料が、V6.21pバッファー中において、CT  PB1-FAMプローブを用いて試験された。５０の試料のうち、ＣＴについてCT PB1-FAMプローブにより、２４が陰性と試験され（図１１Ａ）、及び、２６が陽性と試験された（図１１Ｂ）。Aptima試験及びCT  PB-FAM試験の間で86%の一致があった。
【００６２】
実施例１１
図１２Ａ及び１２Ｂは、CT/GCマルチプレックスにおいてCT  PB1-FAM + GC  porA7-Alexa546プローブを用いて生成された増幅プロットを示す。CT及びGCのDNAが、別々の反応において又は一緒に（in conjugation）、V6.21pバッファー中でCT  PB1-FAM及びGC  porA7-Alexa546プローブの存在下において増幅された。読み取り値は、Cy3 (図１２Ａ)及びFAM (図１２Ｂ)チャンネルにおいてとられた。実験は、FAM 及びAlexa546標識されたプローブを用いた同時の反応において、２つのＤＮＡ標的が増幅され及び検出されうること、及び、CT  PB1及びGC  porA7プライマー及びプローブの間での交差反応性が無いことを示した。
【００６３】
実施例１２
表１は、CT及びGCについてのV13 LAMP、CT/GC Aptima及びCT/GCマルチプレックス(CT  PB1-FAM + GC  porA7-Alexa546)の間の比較を示す。１３６の臨床試料から抽出されたＤＮＡが、CT/GC  Aptimaマルチプレックス、CT  PB1及びGC  porA7プライマーを用いて、 V13含有V6.21バッファーにおいて、又は、v6.21pにおけるマルチプレックス反応において、CT  PB1及びGC  porA7プライマー並びにCT  PB1-FAM及びGC  porA7-Alexa546プローブの存在下において試験された。対照実験において、試料はまた、GC  glnA7-joeプローブにより単一の反応において試験された。該表は試験間の一致スコアを示す。
【００６４】
【表１】
2019216722.tif 000013
【図１】
2019216722.tif 000015
【図２Ａ】
2019216722.tif 000016
【図２Ｂ】
2019216722.tif 000017
【図２Ｃ】
2019216722.tif 000018
【図２Ｄ】
2019216722.tif 000019
【図２Ｅ】
2019216722.tif 000020
【図２Ｆ】
2019216722.tif 000021
【図３Ａ】
2019216722.tif 000022
【図３Ｂ】
2019216722.tif 000023
【図４Ａ】
2019216722.tif 000024
【図４Ｂ】
2019216722.tif 000025
【図５Ａ】
2019216722.tif 000026
【図５Ｂ】
2019216722.tif 000027
【図６Ａ】
2019216722.tif 000028
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
2019216722.tif 000030
【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2019216722.tif 000034
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
2019216722.tif 000040
【図１１Ａ】
2019216722.tif 000041
【図１１Ｂ】
2019216722.tif 000042
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
2019216722.tif 000044
【配列表】
2019216722000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月31日(2019.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸配列を検出するための方法であって、
ループ媒介等温増幅によって試料中の標的核酸を増幅すること；
増幅された核酸を、標的核酸配列の領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ配列を含むプローブによってプローブすること、ここで該オリゴヌクレオチドプローブ配列がただ１つの蛍光体標識を有し、且つ、該標識が内部シトシン塩基に結合されており、且つ、該オリゴヌクレオチドプローブ配列が3’末端ターミネーターを有さず、且つ、該シトシン塩基が、オリゴヌクレオチドの長さ方向において、3’末端の1〜3位及び5’末端の1位以外で、実質的に中央に配置されている；及び
該標的核酸の存在を検出すること、ここで前記プローブの蛍光の増加が、前記試料中の前記標的核酸の存在を示す、
を含む前記方法。
【請求項２】
該オリゴヌクレオチドプローブ配列がＤＮＡ配列であり、且つ、該標的核酸配列がＤＮＡ配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光体がFAM、JOE、TET、HEX、TAMRA、ROX、ALEXA、及びATTOから選ばれる１またはそれより多くを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記蛍光体がFAM、Joe、又はAlexa546である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドプローブ配列が、以下の配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法、
5’ Xn C * Xm 3’ (配列ID NO. 1)
ここで、nは> 1、m>3、Xはヌクレオチド塩基であり、且つ*は蛍光体であり、且つ、
該ヌクレオチド塩基が、A、T、C、及びGから選ばれるものであり、nは1超〜20以下であり、mは3超〜20以下である。
【請求項６】
nは1超〜10以下であり、且つ、mは3超〜10以下である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドプローブ配列が、以下の配列の１つを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
2019216722.tif 000045
【請求項８】
該標的核酸が、微生物、菌類、酵母又はウィルス由来のものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
該標的核酸が、Chlamydia  trachomatis又はNeisseria  gonorrhoeae由来のものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
標的核酸配列の領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ配列を含む等温核酸増幅用プローブであって、該オリゴヌクレオチドプローブ配列がただ１つの蛍光体標識を有し、且つ、該標識が内部シトシン塩基に結合されており、且つ、該オリゴヌクレオチドプローブ配列が3’末端ターミネーターを有さず、且つ、該シトシン塩基が、オリゴヌクレオチドの長さ方向において、3’末端の1〜3位及び5’末端の1位以外で、実質的に中央に配置されており、前記プローブが以下の配列の１つを含む、前記プローブ。
2019216722.tif 000046
【請求項１１】
患者におけるChlamydia及び／又はGonorrheaの感染を診断する方法において使用するための請求項１０に記載のプローブであって、前記方法は
該患者から得られた試料を用意すること、
該試料に請求項１０の１またはそれより多くのプローブを添加すること、及び
Chlamydia  trachomatis及び／又はNeisseria  gonorrhoeaeに由来する核酸の存在を検出すること
を含み、ここで該プローブの蛍光の増加が、Chlamydia  trachomatis及び／又はNeisseria  gonorrhoeaeの感染の存在を示す、前記プローブ。
【請求項１２】
Chlamydia  trachomatis又はNeisseria  gonorrhoeae由来の核酸に特異的な１種類のプローブが該試料に添加される、請求項１１に記載の方法において使用するための請求項１０に記載のプローブ。
【請求項１３】
少なくとも２つの異なるプローブが該試料に添加され、ここで第１のプローブが第１の蛍光標識により標識されており且つChlamydia  trachomatis核酸をプローブする為に特異的であり、且つ、第２のプローブが該第１のプローブと異なる蛍光標識により標識されており且つNeisseria  gonorrhoeae核酸をプローブする為に特異的である、請求項１１に記載の方法において使用するための請求項１０に記載のプローブ。
【請求項１４】
該プローブが、dNTPを1〜10mMの濃度で、１またはそれより多くの塩を各塩について2〜20mMの濃度で、Tris  pH8.8を10〜100mMの濃度で、トレハロースを10〜100mMの濃度で、BSTポリメラーゼを1U〜12Uの量で、及び0.01%〜1%の1,2プロパンジオールを含むバッファー系中に用意される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法において使用するための請求項１０に記載のプローブ。
【請求項１５】
前記１またはそれより多くの塩が、KCl、(NH4)2SO4、及びMgSO4からなる群から選ばれるものである、請求項１４に記載の方法において使用するための請求項１０に記載のプローブ。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法に従い標的核酸を検出する為のキットであって、請求項１〜９のいずれか一つに記載された方法において特定されたとおりのプローブ、請求項１０に記載されたとおりのプローブ、又は請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法において使用するための請求項１０に記載のプローブ、ループ媒介等温増幅試薬バッファー、酵素、dNTP及び１またはそれより多くのループ媒介等温増幅プライマーを含む、前記キット。
【請求項１７】
陽性対照及び陰性対照をさらに含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
該試薬バッファーが、dNTPを1〜10mMの濃度で、１またはそれより多くの塩を2〜20mMの濃度で、Tris  pH8.8を10〜100mMの濃度で、トレハロースを10〜100mMの濃度で、BSTポリメラーゼを1U〜12Uの量で、及び、0.01%〜1%の1,2プロパンジオールを含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記１またはそれより多くの塩が、KCl、(NH4)2SO4及びMgSO4からなる群から選ばれる、請求項１８に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明の第一の局面に従い、標的核酸配列の領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ配列を含む、等温核酸増幅の為のプローブが提供され、ここで該オリゴヌクレオチドプローブ配列は、一つだけ蛍光体リガンドを有し且つ該リガンドが内部シトシン塩基に結合されており且つ該オリゴヌクレオチドプローブ配列は3’末端ターミネーターを有さない。
また、本発明は、試料中の標的核酸配列を検出するための方法であって、
ループ媒介等温増幅によって試料中の標的核酸を増幅すること；
増幅された核酸を、標的核酸配列の領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ配列を含むプローブによってプローブすること、ここで該オリゴヌクレオチドプローブ配列がただ１つの蛍光体標識を有し、且つ、該標識が内部シトシン塩基に結合されており、且つ、該オリゴヌクレオチドプローブ配列が3’末端ターミネーターを有さず、且つ、該シトシン塩基が、オリゴヌクレオチドの長さ方向において、3’末端の1〜3位及び5’末端の1位以外で、実質的に中央に配置されている；及び
該標的核酸の存在を検出すること、ここで前記プローブの蛍光の増加が、前記試料中の前記標的核酸の存在を示す、
を含む前記方法も提供する。
また、本発明は、標的核酸配列の領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ配列を含む等温核酸増幅用プローブであって、該オリゴヌクレオチドプローブ配列がただ１つの蛍光体標識を有し、且つ、該標識が内部シトシン塩基に結合されており、且つ、該オリゴヌクレオチドプローブ配列が3’末端ターミネーターを有さず、且つ、該シトシン塩基が、オリゴヌクレオチドの長さ方向において、3’末端の1〜3位及び5’末端の1位以外で、実質的に中央に配置されており、前記プローブが以下の配列の１つを含む、前記プローブも提供する。
2019216722.tif 000047
また、本発明は、前記方法に従い標的核酸を検出する為のキットであって、前記方法において特定されたとおりのプローブ又は前記プローブ、ループ媒介等温増幅試薬バッファー、酵素、dNTP及び１またはそれより多くのループ媒介等温増幅プライマーを含む、前記キットも提供する。