(57)【要約】【課題】インビトロ精子形成誘導を向上する方法およびその手段。【解決手段】本願はカプリル酸低含有アルブミンを含有する培地を使用することを特徴とするインビトロ精子形成誘導、その培地、およびその培地に使用するための剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロ精子形成誘導に使用される培地に使用するための、カプリル酸低含有アルブミンを含有する剤。
【請求項２】
該インビトロ精子形成誘導が精巣器官培養を含む、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
インビトロ精子形成誘導に使用される培地に使用するための、カプリル酸低含有アルブミンを含有する剤；および
該剤をインビトロ精子形成誘導に使用される培地に使用することの説明；
を含む、インビトロ精子形成誘導における培地用キット。
【請求項４】
インビトロ精子形成誘導に使用するための、カプリル酸低含有アルブミンを含有する培地。
【請求項５】
該インビトロ精子形成誘導が精巣器官培養を含む、請求項４に記載の培地。
【請求項６】
インビトロ精子形成誘導に使用するための、カプリル酸低含有アルブミンを含有する培地；および
該培地をインビトロ精子形成誘導に使用することの説明；
を含む、インビトロ精子形成誘導における培地用キット。
【請求項７】
カプリル酸低含有アルブミンを含有する培地を使用することを特徴とする、インビトロ精子形成誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、精子形成誘導用培地およびそれを用いた精子形成誘導方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
佐藤ら（非特許文献１）は、アガロースゲル上で新生仔マウス精巣を培養する精巣器官培養法において、血清代替物であるKnockOut（商標） Serum Replacement（KSR）（Gibco（商標））もしくは牛血清由来アルブミン製剤であるAlbuMAX（商標）（Gibco（商標））を用いることで精原幹細胞から完全な精子までの分化に成功したことを報告している。しかしながら、これら製品の製法および成分は全てが明らかにされている訳ではないため、化学組成の明らかな合成培地（CDM: Chemically-defined medium）での研究が続けられている。三條ら（非特許文献２）はCDMを用いてのin vitro精子形成において、4.5日齢以降のマウス精巣組織を用いて円形精子細胞まで分化させることに成功した。その過程で、CDMにおける精巣器官培養法にはアルブミンが重要な成分の１つであることを見出した。しかしながら、CDMでは完全な精子までの分化は得られておらず、更なる研究が継続されている。
アルブミンは血漿等を精製して得られるが、得られたアルブミンは重合体を形成し易く不安定であり、その安定化には脂肪酸の添加が有効であることが知られている（非特許文献３など）。脂肪酸のなかでもカプリル酸がアルブミンの安定剤として通常使用されている（非特許文献４など）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes, T. Sato, Nature 471, 504-507, 2011
【非特許文献２】In vitro mouse spermatogenesis with an organ culture method in chemically defined medium, H. Sanjo, PLoS One. 2018 Feb 12;13(2):e0192884. doi: 10.1371/journal.pone.0192884.
【非特許文献３】Biochim. Biophys. Acta (2004) 1702(1): 9-17.
【非特許文献４】米国薬局方  Albumin Humanの項
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本願の課題は、インビトロにおける精子形成誘導を向上する方法およびその手段の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、カプリル酸が精子形成誘導を阻害するため、カプリル酸低含有アルブミンを精巣器官培養に使用することで精子形成誘導は向上されることを見出し、本願発明に至った。
本願は下記を提供する。
【０００６】
［１］  インビトロ精子形成誘導に使用される培地に使用するための、カプリル酸低含有アルブミンを含有する剤。
［２］  該インビトロ精子形成誘導が精巣器官培養を含む、［１］に記載の剤。
［３］  該カプリル酸低含有アルブミンが、アルブミン１ｇあたりカプリル酸を遊離形態として７０μｍｏｌ以下含む、［１］または［２］に記載の剤。
［４］  インビトロ精子形成誘導に使用される培地に使用するための、カプリル酸低含有アルブミンを含有する剤；および
該剤をインビトロ精子形成誘導に使用される培地に使用することの説明；
を含む、インビトロ精子形成誘導における培地用キット。
［５］  インビトロ精子形成誘導に使用するための、カプリル酸低含有アルブミンを含有する培地。
［６］  該インビトロ精子形成誘導が精巣器官培養を含む、［５］に記載の培地。
［７］  該カプリル酸低含有アルブミンが、アルブミン１ｇあたりカプリル酸を遊離形態として７０μｍｏｌ以下含む、［５］または［６］に記載の剤。
［８］  インビトロ精子形成誘導に使用するための、カプリル酸低含有アルブミンを含有する培地；および
該培地をインビトロ精子形成誘導に使用することの説明；
を含む、インビトロ精子形成誘導における培地用キット。
［９］  カプリル酸低含有アルブミンを含有する培地を使用することを特徴とする、インビトロ精子形成誘導方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、カプリル酸低含有アルブミンを含有する培地を使用することで、インビトロ精子形成誘導は向上する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】培養後の精巣組織の形態（上段）及び蛍光画像（下段）。  「処理前」は試験例2の浄化処理前のアルブミンを含有するCDMを意味する。  「処理後」は試験例2の浄化処理後のアルブミンを含有するCDMを意味する。  「処理後+1000」は試験例2の浄化処理後のアルブミンと1000μmol/L カプリル酸を含有するCDMを意味する。  「処理後+3000」は試験例2の浄化処理後のアルブミンと3000μmol/L カプリル酸を含有するCDMを意味する。  「処理後+5000」は試験例2の浄化処理後のアルブミンと5000μmol/L カプリル酸を含有するCDMを意味する。
【図２】培養後の精巣組織の精子形成誘導能。平均値＋S.E.
【図３】カプリル酸濃度と精子形成誘導能との関連性。平均値＋S.E.
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１つの態様において、本願は、インビトロ精子形成誘導に使用される培地に使用するための、カプリル酸低含有アルブミンを含有する剤を提供する。本願の剤は、例えば培地製造の原料として、あるいは、インビトロ精子形成誘導の基礎培地等に適宜添加して使用されるサプリメントとして使用されうる。
【００１０】
別の態様において本願は、インビトロ精子形成誘導に使用するための、カプリル酸低含有アルブミンを含有する培地を提供する。
【００１１】
さらに別の態様として本願は、カプリル酸低含有アルブミンを含有する培地を使用することを特徴とする、インビトロ精子形成誘導方法を提供する。
【００１２】
本願において「培地」とは、精子形成誘導において細胞等に適用されうるものであれば、その使用目的は特に限定されない。例えば、本願における培地は、細胞等を培養するために、細胞を洗浄するために、細胞等を懸濁するために、および細胞等を保存するために使用されうる。
【００１３】
本願において精子形成誘導とは、幹細胞（例えば精子幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）から精子が形成される過程に見られる一連のステップを完全にまたは部分的に誘導することを意味する。
【００１４】
本願においてインビトロ精子形成誘導とは、インビトロでなされる精子形成誘導を意味する。インビトロ精子形成誘導は、インビボでの精子形成誘導と組み合わせて行われても良い。インビトロ精子形成誘導の例として、精巣器官培養が挙げられる。
【００１５】
精巣組織には通常、精子幹細胞、精原細胞、精母細胞、精細胞等の精子の前駆細胞が存在する。精巣器官培養とは精子形成を誘導するために精巣組織片をインビトロで培養する方法である。精巣器官培養の方法は特に限定されず、当該技術分野における通常の方法により行うことができる。例えば精巣組織片を培養液（例えばアルブミン（好ましくはウシ血清アルブミン）を添加した、αＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地）に半分浸したゲル（例えばアガロースゲル）に載せて培養することにより行うことができる。
【００１６】
本願において、精子形成が誘導されたかどうかは、当該技術分野における通常の基準に照らして、例えば、組織学的観察等により決定される。インビトロ精子形成誘導が実験動物において行われる場合には精子形成の過程でGFPが発現するように設計されたトランジェニック動物を用いて観察されてもよい。
【００１７】
本願において、インビトロ精子形成誘導の対象は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（ヒトおよびヒト以外の哺乳類（例えばウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、サル））であり、さらに好ましくはヒトである。
【００１８】
本願において、カプリル酸低含有アルブミンは、カプリル酸を精子形成誘導に悪影響を及ぼす程度には含有しないアルブミンを意味する。
【００１９】
カプリル酸低含有アルブミンに含まれうるカプリル酸の量は精子形成誘導に悪影響を及ぼさない限り特に限定されないが、例えば、アルブミン１ｇに含まれるカプリル酸の量は遊離形態として、７０μｍｏｌ以下、好ましくは５０μｍｏｌ以下、より好ましくは４０μｍｏｌ以下、さらに好ましくは３６μｍｏｌ以下、またさらに好ましくは３０μｍｏｌ以下、またさらにより好ましくは２８μｍｏｌ以下、さらに好ましくは２６μｍｏｌ以下である。さらに、カプリル酸低含有アルブミンの量の例として、アルブミン１ｇに対してカプリル酸（遊離形態として）を０．０１〜７０μｍｏｌ、好ましくは０．１〜５０μｍｏｌ、さらに好ましくは０．５〜４０μｍｏｌ、さらにより好ましくは１〜３６μｍｏｌ、またさらにより好ましくは２〜３０５μｍｏｌ、さらに好ましくは３〜２８μｍｏｌ、より好ましくは５〜２６μｍｏｌ含むアルブミンが挙げられる。あるいはアルブミン１ｇに含まれるカプリル酸（遊離形態として）の好ましい範囲は、０．０１μｍｏｌ、０．１μｍｏｌ、０．５μｍｏｌ、１μｍｏｌ、２μｍｏｌ、３μｍｏｌ、４μｍｏｌ、および５μｍｏｌから選択される下限値；および７０μｍｏｌ、６０μｍｏｌ、５０μｍｏｌ、４０μｍｏｌ、３６μｍｏｌ、３０μｍｏｌ、２８μｍｏｌ、２６μｍｏｌ、２４μｍｏｌ、２２μｍｏｌ、および２０μｍｏｌから選択される上限値；の組合せにより示されうる。
【００２０】
アルブミンの量の測定方法は特に限定されず、当該技術分野で通常用いられる方法により測定することができる。例えばアルブミンの量は蛋白質量として、例えばブラッドフォード法により測定されることができる。
【００２１】
カプリル酸（遊離形態として）を測定する方法は特に限定されず、当該技術分野で通常用いられる方法により測定することができる。例えば、アルブミン含有液を抽出し（例えばBligh-Dyer抽出により）、得られた脂質分画を（好ましくはトリメチルシリル化後に）ガスクロマトグラフィー質量分析計に供して測定することができる。
【００２２】
アルブミンに含まれるカプリル酸（遊離形態として）を測定する好ましい方法を以下に例示する。
（１）アルブミンに、溶媒（例えば水）を加える（例えば、蛋白質濃度（例えばブラッドフォード法による）として４ｗ／ｖ％となるように）。
（２）得られたアルブミン含有液を抽出（例えばBligh-Dyer抽出）し、得られた脂質分画を（例えばトリメチルシリル化後に）ガスクロマトグラフィー質量分析計に供して遊離カプリル酸量を測定する。
【００２３】
本願のカプリル酸低含有アルブミンは、天然由来（例えば卵白アルブミン、ブタ由来アルブミン、ウシ由来アルブミン、ヒト由来アルブミン）のアルブミンであっても、ウシ型、ブタ型、またはヒト型等の遺伝子組換え体のアルブミンであってもよく、好ましくはウシ由来アルブミン（例えばウシ血清アルブミン）である。
【００２４】
本願においてアルブミンの製造方法は特に限定されず、常法により製造することができる。例えば、アルブミンは血漿から精製されて、または遺伝子組換え技術を使って酵母等で産生させ精製することによって製造される。当該精製方法としては、例えば、低温エタノール分画法、熱処理法、およびクロマトグラフィー精製法が挙げられる。
【００２５】
精製後（特に低温エタノール分画法および熱処理法による精製後）のアルブミンは重合化しやすく不安定であるため、カプリル酸（遊離形態または塩形態）が添加され得る。カプリル酸が精子形成誘導に悪影響を及ぼす程度添加されている場合には、カプリル酸を除去することで、本願のカプリル酸低含有アルブミンを得ることができる。
【００２６】
１つの実施態様において、本願に用いられるカプリル酸低含有アルブミンとしては、低温エタノール分画法（例えばコ−ンのFraction V）または熱処理法、好ましくは低温エタノール分画法で精製され、かつカプリル酸（遊離形態または塩形態）が添加されたアルブミンから、適宜カプリル酸が除去されたアルブミンが使用されうる。
【００２７】
商業的に入手可能なアルブミンの例には下記のものが挙げられ、適宜カプリル酸を除去して、本願のカプリル酸低含有アルブミンとして用いることができる。
ウシ血清アルブミン： Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, BioReagent, suitable for cell culture, 96% (SIGMA-ALDRICH)、アルブミン, 牛血清由来（和光純薬工業）、Bovine Albumin Fraction V（ThermoFisher Scientific）
組換えヒトアルブミン：CellPrime rAlbumin AF-s（Merck）
ヒト血漿由来アルブミン：Human Serum Albumin Solution (Irvine Scientific)、HUMAN SERUM ALBUMIN (InVitroCare)
【００２８】
カプリル酸を除去する方法は特に限定されず、脂肪酸の除去に通常用いられる方法（例えば活性炭を用いる方法）を使用することができる。酸性下で活性炭処理後、さらに脱イオン処理することで脂質や金属イオンを除去する方法（Ｉｓｃｏｖｅ処理）を用いてもよい。
【００２９】
あるいは、イオン交換処理を用いるカプリル酸除去方法を用いて、人為的に添加されたカプリル酸を除去することで本願のカプリル酸低含有アルブミンを得ることができる。イオン交換処理の方法は特に限定されないが、陽イオン交換処理および陰イオン交換処理の両方が行われることが好ましい。
【００３０】
陽イオン交換処理は、弱酸性陽イオン交換処理（例えばカルボン酸基を交換基として用いる）であっても、強酸性陽イオン交換処理（例えばスルホン酸基を交換基として用いる）であってもよいが、強酸性陽イオン交換処理（例えばスルホン酸基を交換基として用いる）であることが好ましい。交換基のイオン形態は特に限定されず、たとえば、水素、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられ、好ましくは水素が用いられる。陽イオン交換処理は例えば陽イオン交換樹脂（例えば弱酸性陽イオン交換樹脂、強酸性陽イオン交換樹脂）を用いて、通常の方法に従って行うことができる。
【００３１】
陰イオン交換処理は、弱塩基性陰イオン交換処理（例えば一〜三級アミノ基を交換基として用いる）であっても、強塩基性陰イオン交換処理（例えば四級アンモニウムを交換基として用いる）であってもよいが、強塩基性陰イオン交換処理であることが好ましい。四級アンモニウムの例としては、トリメチルアンモニウム基およびジメチルエタノールアンモニウム基が挙げられ、好ましくはトリメチルアンモニウム基が用いられる。交換基のイオン形態は特に限定されず、例えば、塩化物、水酸化物、酢酸塩、ギ酸塩が挙げられ、好ましくは水酸化物が使用される。陰イオン交換処理は例えば陰イオン交換樹脂（例えば弱塩基性陰イオン交換樹脂、強塩基性陰イオン交換樹脂）を用いて、通常の方法に従って行うことができる。
【００３２】
イオン交換樹脂の母体は特に限定されず、通常イオン交換樹脂の母体として使用されるもの（例えばスチレンジビニルベンゼン）を用いることができる。
【００３３】
好ましいイオン交換樹脂としては、作業性の観点から、陽イオン交換樹脂と陰イオン交換樹脂を両方含む混床樹脂（例えば、ＡＧ  ５０１−Ｘ８  （Ｄ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ）、およびＡＧ  ５０１−Ｘ８（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いることが好ましい。
【００３４】
当該イオン交換処理を用いるカプリル酸除去方法は、例えば、イオン交換樹脂とカプリル酸を含有しうるアルブミンを適当な溶媒（例えば水）下で混合（好ましくは、低温（例えば１〜１０℃、好ましくは２〜６℃）・遮光下、例えば１〜４８時間、好ましくは３〜３６時間、さらに好ましくは５〜３０時間）することにより行うことができる。
【００３５】
得られたアルブミン含有液はそのままで、あるいはｐＨの調整、安定剤（例えばカプリル酸以外の脂肪酸）の添加等、当該技術分野で知られるアルブミンの安定化技術を適宜行って、カプリル酸低含有アルブミン含有剤として使用することができる。
【００３６】
あるいは、得られたアルブミン含有液は凍結乾燥や限外濾過などにより濃縮されてもよい。またろ過によってウィルス・細菌等の除去を行ってもよい。この場合にも当該技術分野で知られるアルブミンの他の安定化技術（例えばカプリル酸以外の脂肪酸の添加）が適宜施されてもよい。
【００３７】
本願のカプリル酸低含有アルブミンは、人為的にカプリル酸が添加されていないアルブミンであっても良い。例えば、カプリル酸低含有アルブミンは低温エタノール分画法（例えばコ−ンのFraction V）または熱処理法、好ましくは低温エタノール分画法で精製されたアルブミンであって、カプリル酸が人為的に添加されていないアルブミンが挙げられる。これらの精製法で精製されたアルブミンは不安定でありうるため、適宜安定化技術（例えばカプリル酸以外の脂肪酸の添加）を施して使用することが好ましい。
【００３８】
アルブミンは、種々の物質と結合する能力の高いタンパク質であり、例えば血清由来のアルブミンは血清中に含まれる種々の物質と結合している。そのため人為的にカプリル酸が添加されていなくてもアルブミンは生体由来のカプリル酸を担持することがあるが、精子形成誘導に悪影響を及ぼさない量であれば含まれていてもよい。精子形成誘導に悪影響を及ぼしうる量が含まれている場合には、イオン交換処理を用いるカプリル酸除去方法または活性炭を用いる方法等の従来方法によりカプリル酸を除去し、適宜安定化技術（例えばカプリル酸以外の脂肪酸の添加）を施して使用することができる。
【００３９】
本願において、培地に含まれるカプリル酸低含有アルブミンの量は、特に限定されず、インビトロ精子形成誘導におけるその培地の使用目的に応じて、通常使用される範囲において適宜選択され得る。例えば、培地に含まれるカプリル酸低含有アルブミンの濃度は０．１〜１０ｗ／ｖ％、好ましくは１〜８ｗ／ｖ％、よりこのましくは２〜６ｗ／ｖ％、さらにより好ましくは３〜５ｗ／ｖ％、またさらに好ましくは４ｗ／ｖ％であり得る。あるいは、培地に含まれるカプリル酸低含有アルブミンの量の好ましい範囲は、０．１ｗ／ｖ％、１ｗ／ｖ％、２ｗ／ｖ％、３ｗ／ｖ％、および４ｗ／ｖ％から選択される下限値；および１０ｗ／ｖ％、８ｗ／ｖ％、６ｗ／ｖ％、５ｗ／ｖ％、および４ｗ／ｖ％から選択される上限値；の組合せにより示されうる。
【００４０】
本願において、カプリル酸低含有アルブミンの安定化（例えば重合体の形成防止）のために使用されうる脂肪酸は、カプリル酸以外の脂肪酸が好ましく、例えば炭素数１０〜２０の飽和または不飽和脂肪酸またはその塩（例えばラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、それらの塩（例えばアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、およびその混合）、およびそれらの混合）が挙げられる。その量は特に限定されないが、例えばアルブミン１ｇに対して当該脂肪酸またはその塩が、遊離形態として１０〜１００μｍｏｌ、好ましくは２０〜８０μｍｏｌ、さらに好ましくは３０〜５０μｍｏｌ含まれる。
【００４１】
本願のインビトロ精子形成誘導に使用される培地に使用するためのカプリル酸低含有アルブミンを含有する剤の形状は特に限定されず、例えば適当な溶媒（例えば、水、緩衝液）等と混合された液体（適宜好ましいｐH（例えばｐH７〜８）に調製される）、凍結乾燥等された固体であることができる。本願の剤には、精子形成誘導に悪影響を及ぼさない限り、培地構成成分として公知の添加物を含んでいてもよい。例えば、これらに限定されないが、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、コレステロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、レチノイン酸、レチノール、テストステロン、トリヨードチロニン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、NaHCO3、抗菌剤、抗真菌剤等が挙げられる。また、従来からインビトロ精子形成誘導における培養等に用いられてきた他の添加物も適宜含むことができる。添加物は、インビトロ精子形成誘導や製品の安定性に悪影響を及ぼさない限りにおいて、それぞれ公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。
【００４２】
本願のインビトロ精子形成誘導に使用するためのカプリル酸低含有アルブミンを含有する培地の形状は特に限定されず、固体培地（寒天培地など）、液体培地等、粉末培地（例えば水に溶かして液体培地として使用される）等、インビトロ精子形成誘導における培地の使用目的に応じて適宜選択され、常法を用いて製造することができる。本願培地は、上記の本願の剤と同様に、精子形成誘導に悪影響を及ぼさない限り、培地構成成分として公知の添加物を公知の濃度範囲で含んでいてもよい。例えば、本願のインビトロ精子形成誘導に使用するためのカプリル酸低含有アルブミンを含有する培地はインビトロ精子形成誘導用として知られる既知の培地（例えば、αＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地（適宜、必須脂肪酸（例えば、リノール酸、リノレン酸）、レチノール、レチノイン酸、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、テストステロン、トリヨードチロニン等を添加、さらにパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸が適宜添加されてもよい））にカプリル酸低含有アルブミンを添加することによって製造することができる。
【００４３】
本願のインビトロ精子形成誘導に使用するためのカプリル酸低含有アルブミンを含有する培地に添加されうる成分の例には、これらに限定されないが、カプリル酸以外の脂肪酸（例えば培地中濃度が６００〜６０００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０００〜４０００μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１５００〜２５００μｍｏｌ／Ｌ：例えば、パルミチン酸（例えば培地中濃度が２００〜１８００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは３００〜１０００μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは５００〜７００μｍｏｌ／Ｌ）、ステアリン酸（例えば培地中濃度が２００〜１８００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは３００〜１０００μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは５００〜７００μｍｏｌ／Ｌ）、オレイン酸（例えば培地中濃度が２００〜１８００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは３００〜１０００μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは５００〜７００μｍｏｌ／Ｌ）、リノール酸（例えば培地中濃度が３０〜３００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは５０〜１５０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは８０〜１２０μｍｏｌ／Ｌ）、およびリノレン酸（例えば培地中濃度が１０〜１５０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２０〜８０μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは３０〜７０μｍｏｌ／Ｌ）からなる群から選択される脂肪酸の任意の組合せ）、コレステロール（例えば培地中濃度が１〜１０μｇ／ｍＬ、好ましくは２〜５μｇ／ｍＬ、より好ましくは２．５〜４μｇ／ｍＬ）、スフィンゴミエリン（例えば培地中濃度が１〜１０μｇ／ｍＬ、好ましくは２〜５μｇ／ｍＬ、より好ましくは２．５〜４．５μｇ／ｍＬ）、ホスファチジルコリン（例えば培地中濃度が５〜６０μｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜４０μｇ／ｍＬ、より好ましくは１５〜２５μｇ／ｍＬ）、レチノイン酸（例えば培地中濃度が０．３〜３μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５〜２μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７〜１．５μｍｏｌ／Ｌ）、レチノール（例えば培地中濃度が０．３〜３μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５〜２μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７〜１．５μｍｏｌ／Ｌ）、テストステロン（例えば培地中濃度が０．３〜３μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５〜２μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．７〜１．５μｍｏｌ／Ｌ）、トリヨードチロニン（例えば培地中濃度が０．５〜６ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１〜４ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１．５〜２．５ｎｇ／ｍＬ）、黄体形成ホルモン（例えば培地中濃度が０．３〜３μｇ／ｍＬ、好ましくは０．５〜２μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．７〜１．５μｇ／ｍＬ）、卵胞刺激ホルモン（例えば培地中濃度が０．３〜３μｇ／ｍＬ、好ましくは０．５〜２μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．７〜１．５μｇ／ｍＬ）、NaHCO3（例えば培地中濃度が０．５〜５ｇ／Ｌ、好ましくは１〜４ｇ／Ｌ、より好ましくは１．２〜２．５ｇ／Ｌ）、抗菌剤、抗真菌剤等が挙げられる。該カプリル酸以外の脂肪酸は、その全てまたは一部が、アルブミンの安定化剤として予めアルブミンと混合された状態で、培地中に添加されてもよい。
【００４４】
本願のインビトロ精子形成誘導に使用するためのカプリル酸低含有アルブミンを含有する培地にはカプリル酸低含有アルブミン以外にはカプリル酸を供給しうる成分は含有されないことが好ましい。当該培地中に含まれうるカプリル酸の量は精子形成誘導に悪影響を及ぼさない限り特に限定されないが、例えば、培地１０００ｇあたりに含まれるカプリル酸の量は遊離形態として、２８００μｍｏｌ以下、好ましくは２５００μｍｏｌ以下、より好ましくは２０００μｍｏｌ以下、さらに好ましくは１８００μｍｏｌ以下、またさらに好ましくは１５００μｍｏｌ以下、またさらにより好ましくは１４００μｍｏｌ以下、さらに好ましくは１３００μｍｏｌ以下である。さらに、培地１０００ｇに含まれるカプリル酸（遊離形態として）量の例として、０．０１〜２８００μｍｏｌ、好ましくは０．１〜２５００μｍｏｌ、さらに好ましくは０．５〜２０００μｍｏｌ、さらにより好ましくは１〜１８００μｍｏｌ、またさらにより好ましくは２〜１５００μｍｏｌ、さらに好ましくは３〜１４００μｍｏｌ、より好ましくは５〜１３００μｍｏｌが挙げられる。あるいは培地１０００ｇに含まれるカプリル酸（遊離形態として）の量の好ましい範囲は、０．０１μｍｏｌ、０．１μｍｏｌ、０．５μｍｏｌ、１μｍｏｌ、２μｍｏｌ、３μｍｏｌ、４μｍｏｌ、および５μｍｏｌから選択される下限値；および２８００μｍｏｌ、２５００μｍｏｌ、２０００μｍｏｌ、１８００μｍｏｌ、１５００μｍｏｌ、１４００μｍｏｌ、１３００μｍｏｌ、１２００μｍｏｌ、１１００μｍｏｌ、および１０００μｍｏｌから選択される上限値；の組合せにより示されうる。
【００４５】
本願の別の態様において、本願の剤または培地、およびこれらがインビトロ精子形成誘導において使用されることの説明を含む、キットが提供される。該説明は、その形態はとくに限定されず、使用説明書であっても、当該説明の内容をインターネット上で閲覧するためのアクセス情報（URL、QRコード等）が記載されていてもよい。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例および試験例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４７】
試験例1  実験動物の準備
RIKEN BRCから入手したAcr-Gfp transgenic mice (C57BL/6 strain)を交配させ、生後4.5〜5.5日齢のArc-Gfp (+/+)もしくは(+/-)のマウスを培養試験に用いた。Acr-Gfpマウスの精細胞はmid-pachytene期からGFPを発現し、精子細胞の先体に集積する。全ての動物実験は横浜市立大学動物実験委員会の承認のもと、動物実験指針に従い実施した。
【００４８】
試験例2  アルブミンの浄化処理
2.1  活性炭及びイオン交換処理
ウシ血清アルブミン（BSA）はSigma社の製品番号A9418のうち、Lot. SLBF5061V、SLBF1402V、SLBJ3866Vを用いた。Dextran（D299100, TRC Canada）を200mLの蒸留水に溶解し、2gの活性炭（Wako）を加え室温で30分間穏やかに撹拌しながらインキュベートした。そこに10gのBSAを加え、HClでpH 3.0に調整した。得られた溶液は、撹拌しながら60℃で60分間インキュベートし、2700gで遠心し上清を回収した。得られた溶液に、1M NaOHを加えてpHを5.5に調整し、0.22μmのフィルター（Millipore Express（商標） PLUS）を通した。ろ液にイオン交換樹脂（Bio-Rex（商標） MSZ 501(D) Resin）を加え4℃で一晩インキュベート後、限外ろ過膜（VIVASPIN TURBO 15, Sartorius）で濃縮し、Bradford法で蛋白質濃度を測定した。得られた溶液をろ過滅菌し、使用まで4℃で保存した。
2.2  遊離脂肪酸測定
処理前後のウシ血清アルブミンを蛋白質濃度で4w/v％に超純水で調製し、Bligh-Dyer抽出し、得られた脂質分画をトリメチルシリル化後ガスクロマトグラフィー質量分析計（7890A GC & 5975C GC/MSD, Agilent）に供して遊離脂肪酸濃度を測定した。得られた結果を表1に示す。
表1. 活性炭及びイオン交換処理前後のBSAの脂肪酸濃度（4w/v%BSAあたりのμmol/L）
【表１】
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【００４９】
同一製品であってもロット毎に含有される脂肪酸の量はばらつきがあった。活性炭及びイオン交換処理により殆どの脂肪酸が除去できた。
【００５０】
試験例3  精巣組織の培養法
遊離脂肪酸（パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸）、コレステロール、スフィンゴミエリン、フォスファチジルコリンをエタノールに溶解し、終濃度が表２の通りになるようガラスビーカーに加えた後、エタノールを蒸発させた。カプリル酸（159-02382, Wako）を添加する場合、6.31mmol/Lのストック液を作製後、それぞれ終濃度が1000μmol/L、3000μmol/L、5000μmol/Lとなるようガラスビーカーに加えた。そこに蒸留水で8w/v％に調製した試験例２の処理前後のBSAおよびAlbuMAX(商標)（Gibco（商標））をそれぞれ加え、室温で4時間撹拌した。この溶液に2倍濃縮した等量のαMEMを加え、レチノイン酸、レチノール、テストステロン、トリヨードサイロニン、LH、FSH、NaHCO3、抗菌剤-抗真菌剤を終濃度が表２の通りになるよう添加しCDMを作製して精巣組織の培養に用いた。
【００５１】
表2. CDMの組成(4w/v％ BSA含有)
【表２】
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【００５２】
組織培養のためのアガロースゲルは、アガロースを蒸留水に加えて1.5w/v％とした後、オートクレーブし、固まる前に10cmディッシュに33mL注ぎ入れて5mm厚のゲルを作製した。得られたゲルは、約10mm2の大きさにカットした。培養開始の6時間以上前から12wellマイクロプレート内にゲルを入れ、0.5mLの培地を加えてゲルの下側半分が浸かる状態にして34℃、5％CO2条件下で平衡化した。それぞれのゲルには2〜4個の精巣組織をのせ、週1回培地交換しながら培養を継続した。
【００５３】
試験例4  カプリル酸の毒性評価
培養開始から10日目に蛍光実体顕微鏡（Leica M205 FA, Leica）で精巣組織を観察した。精細管にそったGFPの発現を精子形成誘導のサインとし、GFP発現率をスコア化した。ただし、組織の中心部は栄養素が行き届かず多くの場合GFP発現しないので評価対象外とした。得られた結果を図１および図２に示す。
【００５４】
図1および図2のとおり、高濃度のカプリル酸存在下では精子形成誘導が阻害された。
【００５５】
試験例5：
試験例2で使用した処理前のウシ血清アルブミン（Lot. SLBJ3866V）を用いて、カプリル酸無添加群（0μmol/L）、および1000μmol/L、2000μmol/L、4000μmol/Lとなるようカプリル酸を添加した群をそれぞれ試験例3と同様の方法で精巣組織を培養した。また同時に、AlbuMAX(商標)（Gibco（商標））を用いて試験例3と同様の方法で精巣組織を培養した。培養開始から8日目、16日目、22日目、25日目にGFP発現領域を計測した。
【００５６】
図３に示すとおり、カプリル酸濃度依存的に精子形成誘導能は低下した。
【００５７】
試験例6.  イオン交換処理によるカプリル酸除去
【００５８】
6.1  カプリル酸除去処理
あらかじめ超純水で洗浄したイオン交換樹脂(AG 501-X8 (D), BIO-RAD)と10％遺伝子組換えヒトアルブミン（rHA, Merck）もしくはヒト血清アルブミン（HSA, Irvine Scientific）を混合後、ローテーター（RT50, TAITEC）を用いて4℃遮光下で24時間穏やかに撹拌した。処理後のアルブミン溶液を回収し、ブラッドフォード法により蛋白質濃度を定量し、5w/v％（pH7.4）となるよう超純水と2mol/L NaOHで調製した。
【００５９】
6.2  遊離脂肪酸測定
処理前のrHA（比較例1）とHSA（比較例2）、処理後のrHA（実施例1）とHSA（実施例2）をそれぞれBligh-Dyer抽出し、得られた脂質分画をトリメチルシリル化後ガスクロマトグラフィー質量分析計（7890A GC & 5975C GC/MSD, Agilent）に供し遊離脂肪酸濃度を測定した。得られた結果を表３に示す。
【００６０】
表3. イオン交換処理前後の5w/v％アルブミン溶液中の遊離脂肪酸濃度（μmol/L）
【表３】
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【００６１】
表３に示すように、イオン交換処理をおこなうことで、アルブミン溶液に含まれている遊離脂肪酸のち、カプリル酸を特異的に除去することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本願の剤または培地を用いれば精子形成誘導を向上することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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