(57)【要約】      （修正有）【課題】パーキンソン病における脳内のリン酸化αシヌクレイン凝集体の蓄積および伝搬、緩徐進行性の黒質ドパミン神経細胞の変性、およびこれに伴う運動障害を全て再現するパーキンソン病モデル非ヒト動物の提供。【解決手段】グリシンがアスパラギン酸に置換された特定のアミノ酸配列からなる変異型ヒトαシヌクレインの組換えタンパク質を作製する工程と、得られた組換えタンパク質から変異型ヒトαシヌクレインフィブリルを作製する工程と、得られた変異型ヒトαシヌクレインフィブリルを０．３〜２．０ｍｇ／ｋｇの用量で非ヒト動物の黒質内に投与する工程と、運動障害が出現するまで飼育する工程と、を含む、パーキンソン病における脳内のリン酸化αシヌクレイン凝集体の蓄積および伝搬、緩徐進行性の黒質ドパミン神経細胞の変性、およびこれに伴う運動障害を全て再現するパーキンソン病モデル非ヒト動物の作製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸化αシヌクレイン凝集体の脳内蓄積および伝搬、黒質ドパミン神経細胞の変性、ならびに運動障害を表現することを特徴とするパーキンソン病モデル非ヒト動物。
【請求項２】
黒質ドパミン神経細胞の変性が緩徐進行性である請求項１に記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物。
【請求項３】
非ヒト動物が、遺伝子改変を伴わない非ヒト動物である請求項１または２に記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物。
【請求項４】
非ヒト動物が、げっ歯類または霊長類である請求項１〜３のいずれかに記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物。
【請求項５】
パーキンソン病モデル非ヒト動物を作製する方法であって、
配列番号１に示されるアミノ酸配列において第５１番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ヒトαシヌクレインの組換えタンパク質を作製する工程と、得られた組換えタンパク質から変異型ヒトαシヌクレインフィブリルを作製する工程と、得られた変異型ヒトαシヌクレインフィブリルを０．３〜２．０ｍｇ／ｋｇの用量で非ヒト動物の黒質内に投与する工程と、運動障害が出現するまで飼育する工程と、を含むことを特徴とする作製方法。
【請求項６】
非ヒト動物が、遺伝子改変を伴わない動物である請求項５に記載の作製方法。
【請求項７】
非ヒト動物が、げっ歯類または霊長類である請求項５または６に記載の作製方法。
【請求項８】
パーキンソン病治療薬候補物質のスクリーニング方法であって、
請求項１〜４のいずれかに記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、行動解析を行う工程と、被験物質を投与していないパーキンソン病モデル非ヒト動物と比較して運動障害の改善が観察された被験物質を選択する工程と、を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項９】
パーキンソン病治療薬候補物質のスクリーニング方法であって、
請求項１〜４のいずれかに記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、脳の組織学的解析を行う工程と、被験物質を投与していないパーキンソン病モデル非ヒト動物と比較してリン酸化αシヌクレイン凝集体の脳内蓄積および／または黒質ドパミン神経細胞の変性の改善が観察された被験物質を選択する工程と、を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パーキンソン病モデル非ヒト動物およびその作製方法、ならびに当該パーキンソン病モデル非ヒト動物を用いたパーキンソン病治療薬候補物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病は病理学的にはαシヌクレイン凝集体を主体とするＬＥＷＹ小体の形成と中脳黒質のドパミン神経細胞の変性、細胞死を主体とする進行性の神経変性疾患で、臨床的には筋強剛、振戦、寡動、歩行障害等の運動障害を主体とする疾患である。パーキンソン病は、神経変性疾患の中でアルツハイマー病に次いで多く、有病率は１０万人に１２０〜１３０人といわれ、日本では約１４万人の患者がいると推定されている。加齢が最大の危険因子であり、超高齢化社会を迎える日本では、今後もパーキンソン病患者の増加が予想される。現状ではパーキンソン病に対する根治療法は存在しておらず、その進行に伴いＡＤＬ（Activities of Daily Living、日常生活動作）が低下していき、いわゆる「寝たきり状態」を強いられることも多い。そのサポートには多くの医療資源、介護資源を必要とし、社会的負担は非常に大きく早急な解決が望まれている。
【０００３】
これまでに多くの研究がなされてきたが、未だにパーキンソン病の原因究明やその根本的治療法の開発などは進んでおらず、臨床現場ではＬ−ＤＯＰＡの補充による対症療法が主体であり、根治療法はおろか進行を遅らせる治療法も確立されていない状況である。また、その対症療法に要する経済的負担も莫大なものとなっている。この様な状況からも根治療法もしくは進行抑制を可能にするｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙの開発が社会的急務と考えられる。これまでに多くの研究がなされてきたが、その病態解明には至らず現状では対症療法しか存在しない。その原因の一つとしてパーキンソン病の病態を反映した適切な動物モデルが存在しないことが挙げられる。
【０００４】
近年、パーキンソン病の病態機序としてパーキンソン病をはじめとする神経変性疾患では神経細胞内で異常折りたたみタンパク質が凝集しその異常タンパク質凝集体が神経細胞を伝播し拡散するという「ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ仮説」が議論されている。パーキンソン病の場合はαシヌクレインが何らかの契機にβシート構造を多く含む立体構造に変化し、それを鋳型として他のαシヌクレインも構造変化が起こり凝集体を形成する（図１参照）。この凝集体が神経細胞間を伝播し神経変性を誘発することでパーキンソン病の病態が進展すると多くの研究結果から示されている（非特許文献１）。
【０００５】
従来パーキンソン病の治療薬開発には、げっ歯類にＭＰＴＰ、６−ＯＨＤＡ等の神経毒を投与するモデルが用いられていた。これらの薬剤は黒質ドパミン神経細胞に対して選択性があり、取り込まれた後にミトコンドリア障害を起し神経細胞死に導く。この薬剤モデルは黒質ドパミン神経細胞の脱落、黒質線条体系のドパミン欠乏は再現できるが、急性に作用し細胞死を引き起こすため、緩徐進行性の細胞死が表現されない（非特許文献２、３）。また、作用機序がミトコンドリア障害や酸化ストレスであり、シヌクレインの蓄積も再現されない。
【０００６】
また上記「ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ仮説」に基づき、人為的に作製したαシヌクレインフィブリルをマウス脳に直接打ち込む方法が考案され多くの研究報告が出された（非特許文献４）。しかし、凝集体形成は再現できるが緩徐進行性の黒質ドパミン神経の変性の両方を再現することは困難であった。さらに、ヒトの変異型αシヌクレインフィブリルをマウスに投与する方法も報告されている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Luk KC et al., Intracerebral inoculation of pathological α-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative α-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 2012 May 7;209(5):975-86.
【非特許文献２】Furuya T et al., Caspase-11 mediates inflammatory dopaminergic cell death in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease. J Neurosci. 2004 Feb 25;24(8):1865-72.
【非特許文献３】Bove J, Perier C. Neurotoxin-based models of Parkinson's disease. Neuroscience. 2012 Jun 1;211:51-76.
【非特許文献４】Masuda-Suzukake M et al., Prion-like spreading of pathological α-synuclein in brain. Brain. 2013 Apr;136(Pt 4):1128-38. doi: 10.1093/brain/awt037.
【非特許文献５】Rutherford NJ et al., Comparison of the in vivo induction and transmission of α-synuclein pathology by mutant α-synuclein fibril seeds in transgenic mice. Hum Mol Genet. 2017 Dec 15;26(24):4906-4915.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
パーキンソン病における脳内のリン酸化αシヌクレイン凝集体の蓄積および伝搬、緩徐進行性の黒質ドパミン神経細胞の変性、およびこれに伴う運動障害を全て再現するパーキンソン病モデル非ヒト動物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記の課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］リン酸化αシヌクレイン凝集体の脳内蓄積および伝搬、黒質ドパミン神経細胞の変性、ならびに運動障害を表現することを特徴とするパーキンソン病モデル非ヒト動物。
［２］黒質ドパミン神経細胞の変性が緩徐進行性である前記［１］に記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物。
［３］非ヒト動物が、遺伝子改変を伴わない非ヒト動物である前記［１］または［２］に記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物。
［４］非ヒト動物が、げっ歯類または霊長類である前記［１］〜［３］のいずれかに記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物。
［５］パーキンソン病モデル非ヒト動物を作製する方法であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列において第５１番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ヒトαシヌクレインの組換えタンパク質を作製する工程と、得られた組換えタンパク質から変異型ヒトαシヌクレインフィブリルを作製する工程と、得られた変異型ヒトαシヌクレインフィブリルを０．３〜２．０ｍｇ／ｋｇの用量で非ヒト動物の黒質内に投与する工程と、運動障害が出現するまで飼育する工程と、を含むことを特徴とする作製方法。
［６］非ヒト動物が、遺伝子改変を伴わない動物である前記［５］に記載の作製方法。
［７］非ヒト動物が、げっ歯類または霊長類である前記［５］または［６］に記載の作製方法。
［８］パーキンソン病治療薬候補物質のスクリーニング方法であって、前記［１］〜［４］のいずれかに記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、行動解析を行う工程と、被験物質を投与していないパーキンソン病モデル非ヒト動物と比較して運動障害の改善が観察された被験物質を選択する工程と、を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
［９］パーキンソン病治療薬候補物質のスクリーニング方法であって、前記［１］〜［４］のいずれかに記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、脳の組織学的解析を行う工程と、被験物質を投与していないパーキンソン病モデル非ヒト動物と比較してリン酸化αシヌクレイン凝集体の脳内蓄積および／または黒質ドパミン神経細胞の変性の改善が観察された被験物質を選択する工程と、を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、パーキンソン病における脳内のリン酸化αシヌクレイン凝集体の蓄積および伝搬、緩徐進行性の黒質ドパミン神経細胞の変性、およびこれに伴う運動障害を全て再現することができる。また、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、遺伝子改変動物を用いる必要がないので、げっ歯類および霊長類のパーキンソン病モデルを安価に作製することができ、その科学的効果および経済的効果は非常に大きいといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】リン酸化シヌクレイン陽性病変の観察を行った脳の部位を示す図であり、（Ａ）はブレグマから鼻側に０．０２ｍｍの位置の切片を示し、（Ｂ）はブレグマから背側に１．４６ｍｍの位置の切片を示し、（Ｃ）はブレグマから背側に２．９２ｍｍの位置の切片を示す。
【図２】野生型ヒトαシヌクレインフィブリルを投与したマウスから投与１２週後および２４週後に脳を採取して切片を作製し、抗リン酸化シヌクレイン抗体で染色してリン酸化シヌクレイン陽性病変を観察した結果を示す図である。
【図３】Ｇ５１Ｄヒトαシヌクレインフィブリルを投与したマウスから投与１２週後および２４週後に脳を採取して切片を作製し、抗リン酸化シヌクレイン抗体で染色してリン酸化シヌクレイン陽性病変を観察した結果を示す図である。
【図４】図２および図３で観察した各標本における、リン酸化シヌクレイン陽性病変の広がりを示す図である。
【図５】野生型ヒトαシヌクレインフィブリルおよびＧ５１Ｄヒトαシヌクレインフィブリルをそれぞれ投与したマウスから、２４週後に採取した脳の切片を抗ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ抗体で染色した結果を示す図である。
【図６】野生型ヒトαシヌクレインフィブリルおよびＧ５１Ｄヒトαシヌクレインフィブリルをそれぞれ投与したマウスから、１２週後および２４週後に採取した脳の切片を抗ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＴＨ）抗体で染色し、ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ陽性細胞（黒質ドパミン神経細胞）数をカウントした結果を示す図であり、（Ａ）は野生型ヒトαシヌクレインフィブリル投与マウスの結果、（Ｂ）はＧ５１Ｄヒトαシヌクレインフィブリル投与マウスの結果である。
【図７】野生型ヒトαシヌクレインフィブリルおよびＧ５１Ｄヒトαシヌクレインフィブリルをそれぞれ投与したマウスを用いて、投与２４週後に回旋試験を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
〔パーキンソン病モデル非ヒト動物およびその作製方法〕
本発明は、リン酸化αシヌクレイン凝集体の脳内蓄積および伝搬、黒質ドパミン神経細胞の変性、ならびに運動障害を表現するパーキンソン病モデル非ヒト動物を提供する。非ヒト動物は、哺乳動物であることが好ましく、げっ歯類または霊長類であることがより好ましい。げっ歯類動物としては、マウス、ラットなどが挙げられ、霊長類としては、マーモセット、マカクザルなどが挙げられる。
【００１３】
本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、遺伝子改変を伴わない非ヒト動物を用いて作製することができる。それゆえ、遺伝子改変動物を作製することが困難な霊長類を用いることができる点で非常に有用である。遺伝子改変を伴わない動物は、一般に野生型動物と称される。ただし、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、遺伝子改変を伴う非ヒト動物を用いて作製してもよい。本発明に使用することができる遺伝子改変を伴う非ヒト動物としては、例えば、ヒトαシヌクレインを発現するトランスジェニックマウス、ヒトαシヌクレインを発現するトランスジェニックマーモセットなどが挙げられる。
【００１４】
本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、以下の工程１〜４を含む方法で作製することができる。
工程１：配列番号１に示されるアミノ酸配列において第５１番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ヒトαシヌクレインの組換えタンパク質を作製する工程、
工程２：得られた組換えタンパク質から変異型ヒトαシヌクレインフィブリルを作製する工程、
工程３：得られた変異型ヒトαシヌクレインフィブリルを０．３〜２．０ｍｇ／ｋｇの用量で非ヒト動物の黒質内に投与する工程、および
工程４：運動障害が出現するまで飼育する工程。
【００１５】
工程１では、配列番号１に示されるアミノ酸配列において第５１番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ヒトαシヌクレインの組換えタンパク質を作製する。配列番号１に示されるアミノ酸配列はヒトαシヌクレインのアミノ酸配列であり、ＮＣＢＩのアクセッション番号はＣＡＧ４６４５４である。配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトαシヌクレインをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号２に示されており、ＮＣＢＩのアクセッション番号はＣＲ５４１６５３である。配列番号１に示されるアミノ酸配列において第５１番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ヒトαシヌクレイン（以下Ｇ５１Ｄヒトαシヌクレインと記す）は、２０１３年にイギリスで最初に報告され、２０１４年に日本でも報告された変異型ヒトαシヌクレインであり（Acta Neuropathol. 2013 May;125(5):753-769、Parkinsonism Relat Disord. 2014 Feb;20(2):262-264）、この変異を有するパーキンソン病患者は若年発症であり、孤発性のパーキンソン病では認められない精神症状や錐体路症状を呈する特徴がある。
【００１６】
Ｇ５１Ｄヒトαシヌクレインの組換えタンパク質は、公知の遺伝子組換え技術を用いる方法で作製することができる。具体的には、公知の部位特異的突然変異誘発法を用いて、配列番号２に示されるヒトαシヌクレイン塩基配列の１５２番目のグアニンをアデニンに置換することによりＧ５１ＤヒトαシヌクレインをコードするＤＮＡを作製し、公知の発現ベクターに挿入してＧ５１Ｄヒトαシヌクレイン発現ベクターを構築する。このＧ５１Ｄヒトαシヌクレイン発現ベクターを適切な宿主細胞に導入して発現させることによりＧ５１Ｄヒトαシヌクレインの組換えタンパク質を作製することができる。発現系は特に限定されず、大腸菌等の細菌を用いる系、酵母を用いる系、哺乳動物細胞を用いる系など、公知の発現系から適宜選択することができる。
【００１７】
工程２では、Ｇ５１Ｄヒトαシヌクレインフィブリルを作製する。フィブリルの作製方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、工程１で作製されたＧ５１Ｄヒトαシヌクレインを適切な方法で精製してＧ５１Ｄヒトαシヌクレイン溶液を調製し、これを約３７℃で３〜１０日間振とうすることによりＧ５１Ｄヒトαシヌクレインフィブリルを作製することができる。また、例えば、Ｓｏらの文献（J Mol Biol. 2011 Sep 30;412(4):568-577）に記載されている方法でＧ５１Ｄヒトαシヌクレインフィブリルを作製することができる。
【００１８】
工程３では、工程２で作製したＧ５１Ｄヒトαシヌクレインフィブリルを０．３〜２．０ｍｇ／ｋｇの用量で非ヒト動物の黒質内に投与する。Ｇ５１Ｄヒトαシヌクレインフィブリルを、生理食塩水、ＰＢＳなどの適当な溶媒を用いて、１０〜３０ｍｇ／ｍＬに調製し、これをろ過滅菌して投与用Ｇ５１Ｄヒトαシヌクレインフィブリル溶液とすることができる。用量は０．５〜２．０ｍｇ／ｋｇであってもよく、０．７〜２．０ｍｇ／ｋｇであってもよく、０．８〜１．５ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【００１９】
投与手段は、投与対象動物の黒質内に投与可能な手段であれば特に限定されないが、通常、投与対象動物に適した脳定位固定装置が用いられる。脳定位固定装置は市販品を好適に用いることができる。例えば、８〜１０週齢の雄マウスの左側黒質に投与する場合は、麻酔下でマウスを脳定位固定装置に固定し、皮膚切開の後に矢状縫合と冠状縫合の交点（ブレグマ）を基準点として、そこから後方へ２．８ｍｍ、正中線から左へ１．３ｍｍの位置で刺入し脳表面から４．３ｍｍの深さにシリンジの針先を固定すれば、左側黒質に投与することができる。マウスの場合、オートインジェクターを用いて流速約２．５μｌ／分で投与することが好ましい。針先の固定位置、投与ボリューム、投与時の流速等の条件は、動物の種類、大きさ等に応じて、適宜変更することが好ましい。
【００２０】
工程４では、運動障害が出現するまで飼育する。本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、黒質ドパミン神経細胞の変性が緩徐進行性であるので、運動障害が出現するまで時間を要するためである。この期間の飼育は、通常の飼育を行えばよく、特別なことを行う必要はない。運動障害が出現したか否かは、行動解析を行い、Ｇ５１Ｄヒトαシヌクレインフィブリル非投与動物と比較することにより確認することができる。本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物の行動解析に用いることができる試験としては、例えば、アポモルフィン投与による回旋試験、ロータロッドテスト、ビームテストなどが挙げられる。マウスの場合、通常、Ｇ５１Ｄヒトαシヌクレインフィブリル投与後約２０週経過後に運動障害が出現することが、発明者らにより確認されている。したがって、非ヒト動物がマウスの場合、運動障害が出現を確認するための行動解析は、Ｇ５１Ｄヒトαシヌクレインフィブリル投与から２０週以上経過後に行うことが好ましい。
【００２１】
本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物が、リン酸化αシヌクレイン凝集体の脳内蓄積および伝搬を表現していることは、運動障害が出現した後に脳の組織学的解析を行うことによって確認することができる。例えば、定法に従って脳の切片を作製し、抗リン酸化シヌクレイン抗体を用いて免疫染色を行い、これを顕微鏡で観察する方法を用いることができる。本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物では、黒質を含む切片の標本において、Ｇ５１Ｄヒトαシヌクレインフィブリル投与側にリン酸化αシヌクレイン凝集体の蓄積が観察され、非投与側にリン酸化αシヌクレイン凝集体の形成、伝搬を観察することができる。
【００２２】
本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物が、黒質ドパミン神経細胞の変性を表現することは、運動障害が出現した後に脳の組織学的解析を行うことによって確認することができる。例えば、定法に従って脳の切片を作製し、抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体を用いて免疫染色を行い、これを顕微鏡で観察する方法を用いることができる。チロシンヒドロキシラーゼはドパミン作動性神経細胞で発現するので、線条体および黒質におけるチロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞は、黒質ドパミン神経細胞とみなすことができる。本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物では、Ｇ５１Ｄヒトαシヌクレインフィブリル投与側のチロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞が、非投与側と比較して減少していることを観察することができる。
【００２３】
本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物の黒質ドパミン神経細胞の変性が緩徐進行性であることは、運動障害の発現に相当の時間を要することから明らかである。運動障害は黒質ドパミン神経細胞の変性による細胞数の減少により発現するからである。あるいは、運動障害が発現する前と後に組織学的解析を行い、線条体および黒質におけるチロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞の経時的変化を観察することによっても確認することができる。
【００２４】
〔パーキンソン病治療薬候補物質のスクリーニング方法〕
本発明は、上記本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物を用いてパーキンソン病治療薬候補物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、以下の工程を含むものであればよい。
工程Ｉ：上記本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物に被験物質を投与する工程、
工程ＩＩ：行動解析を行う工程、および
工程ＩＩＩ：被験物質を投与していないパーキンソン病モデル非ヒト動物と比較して運動障害の改善が観察された被験物質を選択する工程。
【００２５】
また、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程を含むものであってもよい。
工程ｉ：上記本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物に被験物質を投与する工程、
工程ｉｉ：脳の組織学的解析を行う工程、および
工程ｉｉｉ：被験物質を投与していないパーキンソン病モデル非ヒト動物と比較してリン酸化αシヌクレイン凝集体の脳内蓄積および／または黒質ドパミン神経細胞の変性の改善が観察された被験物質を選択する工程。
【００２６】
工程Ｉまたは工程ｉで使用する被験物質は特に限定されず、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等を好ましく用いることができる。ただし、これらに限定されない。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。これら被験物質は塩を形成していてもよい。被験物質の塩としては、生理学的に許容される酸や塩基との塩が好適に用いられる。
【００２７】
被験物質の投与量、投与経路、投与回数、投与間隔等は特に限定されず、動物の種類および被験物質の種類に応じて適宜設定すればよい。好ましくは、予備検討を行って、投与量、投与経路、投与回数、投与間隔等を決定することである。
【００２８】
工程ＩＩでは行動解析を行う。行動解析に用いる試験としては、例えば、アポモルフィン投与による回旋試験、ロータロッドテスト、ビームテストなどを用いることができる。非ヒト動物がマウスの場合、行動解析は、Ｇ５１Ｄヒトαシヌクレインフィブリル投与から２０週以上経過後に行うことが好ましい。これ以前であれば、Ｇ５１Ｄヒトαシヌクレインフィブリル投与かつ被験物質非投与のマウスに運動障害が出現していない可能性があるからである。
【００２９】
工程ＩＩＩでは、被験物質を投与していないパーキンソン病モデル非ヒト動物と比較して運動障害の改善が観察された被験物質を選択する。具体的には、被験物質を投与していない動物に運動障害が発現した時点で、被験物質を投与した動物に運動障害が発現していなければ運動障害の改善が観察された被験物質と判断することができる。被験物質を投与していない動物に運動障害が発現した後、１週間以上、２週間以上、３週間以上、４週間以上、運動障害が発現しない場合に運動障害の改善が観察された被験物質と判断することが好ましい。
【００３０】
工程ｉｉでは、脳の組織学的解析を行う。脳の組織学的解析には、例えば、定法に従って脳の切片を作製し、抗リン酸化シヌクレイン抗体または抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体を用いて免疫染色を行い、これを顕微鏡で観察する方法を用いることができる。抗リン酸化シヌクレイン抗体を用いた場合はリン酸化αシヌクレイン凝集体を検出することができ、抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体を用いた場合は黒質ドパミン神経細胞（チロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞）を検出することができる。
【００３１】
工程ｉｉｉでは、被験物質を投与していないパーキンソン病モデル非ヒト動物と比較してリン酸化αシヌクレイン凝集体の脳内蓄積および／または黒質ドパミン神経細胞の変性の改善が観察された被験物質を選択する。具体的には、被験物質を投与していない動物と、被験物質を投与した動物の両方から、脳を採取して上記のように免疫染色を行い、両者のリン酸化αシヌクレイン凝集体数および／または黒質ドパミン神経細胞数をカウントする。その結果、リン酸化αシヌクレイン凝集体数が有意に減少している、および／または、黒質ドパミン神経細胞数が有意に減少していない場合に、投与した被験物質をパーキンソン病治療薬候補物質として選択することができる。
【００３２】
工程ｉ〜ｉｉｉを含むスクリーニング方法は、被験物質を投与した動物に運動障害が発現する前に行うことができる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
〔実施例１：パーキンソン病モデルマウスの作製〕
１−１  作製手順
（１）シヌクレインフィブリルの作製
野生型ヒトαシヌクレインをコードするＤＮＡ（配列番号２）をｐｃＤＮＡ３．１（Thermo Fisher Scientific）に挿入し、野生型ヒトαシヌクレイン（ＷＴｓｙｎ）発現ベクターを作製した。また、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、配列番号２の第１５２番目のグアニン（ｇ）がアデニン（ａ）に変異したＧ５１Ｄヒトαシヌクレイン（Ｇ５１Ｄｓｙｎ）をコードするＤＮＡを作製し、これをｐｃＤＮＡ３．１に挿入してＧ５１Ｄｓｙｎ発現ベクターを作製した。ＷＴｓｙｎ発現ベクターおよびＧ５１Ｄｓｙｎ発現ベクターを、それぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen）に導入した後大腸菌を培養し、ＷＴｓｙｎおよびＧ５１Ｄｓｙｎをそれぞれ発現させた。
【００３５】
Ａｒａｋｉら（Araki K, et al., Scientific reports 6:30473 2016, DOI: 10.1038/srep30473）の記載に従い、ＷＴｓｙｎおよびＧ５１Ｄｓｙｎをそれぞれ発現させた大腸菌の破砕物からイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて精製を行った。５ｍｇ／ｍｌ（150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.4）の野生型シヌクレイン溶液およびＧ５１Ｄシヌクレイン溶液をそれぞれ調製した。続いて３７℃で７日間振とう（200 rpm）を続け、シヌクレインフィブリルを作製した。ウェスタンブロッティング法で大腸菌からの精製標品が単一のタンパク質であることを確認すると共に、質量分析にて、ＷＴｓｙｎおよびＧ５１Ｄｓｙｎの分子量の差から、Ｇ５１Ｄｓｙｎであることを確認した。
【００３６】
（２）使用動物およびフィブリルの投与
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、８〜１０週齢、日本チャールズリバー）を使用した。各群５匹のマウスにＷＴｓｙｎフィブリルおよびＧ５１Ｄｓｙｎフィブリルをそれぞれ投与した。具体的には、麻酔をしたマウスを脳定位固定装置（マウス用SR-5M、NARISHIGE）に固定し、皮膚切開の後に矢状縫合と冠状縫合の交点（ブレグマ）を基準点として、そこから後方へ２．８ｍｍ、正中線から左へ１．３ｍｍの位置で刺入し脳表面から４．３ｍｍの深さにシリンジの針先を固定した。この位置が左側黒質の直上の位置である。シリンジには１０μlハミルトンシリンジ（701N, HAMILTON）を用い、電動マイクロインジェクター（IMS-10, NARISHIGE）にて投与スピード１μｌ／９０秒で合計４μl（２０μg）投与した。投与後４分間その状態を維持した後に抜去し閉創した。
【００３７】
１−２  免疫組織学的解析
（１）サンプル採取
投与１２週後および２４週後に、マウスに三種混合麻酔薬（0.3 mg/kgのmedetomidine、4.0 mg/kgのmidazolam、および5.0 mg/kgのbutorphanol）を腹腔内投与して深麻酔させ、開胸して右心耳を切開し、心尖部からＰＢＳ２０ｍｌを約１０分間かけて還流した。その後、４％パラホルムアルデヒド（PFA）２０ｍｌを約１０分間かけて還流した。還流後脳を取り出し、４％ＰＦＡに浸して冷蔵庫で４８時間浸漬し固定を行った。その後０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳに置き換えて冷蔵庫で保存した。免疫組織学的解析を行う前に０．０１％アジ化ナトリウム含有３０％スクロース／ＰＢＳ溶液に置き換えて２〜３日かけて置換した。
【００３８】
（２）免疫染色標本作製
０．０１％アジ化ナトリウム含有３０％スクロース／ＰＢＳ溶液に置換したマウス脳から、クライオスタット（Leica社）を用いて厚さ２０μｍの切片を作製した。シヌクレイン凝集体の評価に関しては、マウス脳切片（全領域）に対して１次抗体として抗リン酸化シヌクレイン抗体（Wako, 015-25191）、２次抗体としてビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（Vectastain, BA-2000）を用いた。発色基質としてジアミノベンジン（DAB, SIGMA-ALDRICH, 11718096001）を用いて、リン酸化シヌクレイン陽性の病変を検出し、その病態の拡がりを評価した。また、線条体および黒質について、１次抗体として抗ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＴＨ）抗体（calbiochem : 657012-100UL）、２次抗体としてビオチン化抗ラビットＩｇＧ抗体（Vectastain BA-1000）を用いて免疫染色を行い、同様にＤＡＢを用いて発色を行った。線条体および黒質に存在するＴＨ陽性神経細胞を黒質ドパミン神経細胞としてその数をカウントした。
【００３９】
（３）リン酸化シヌクレイン陽性病変の観察結果
図１に、観察した脳の部位を示した。（Ａ）はブレグマから鼻側に０．０２ｍｍの位置の切片を示し、（Ｂ）はブレグマから背側に１．４６ｍｍの位置の切片を示し、（Ｃ）はブレグマから背側に２．９２ｍｍの位置の切片を示す。ａ〜ｉは投与側を示し、ａ’〜ｉ’は非投与側を示す。ａとａ’はＳｅｎｓｏｒｙ ｃｔｘであり、ｂとｂ’はＧｌｏｂｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓであり、ｃとｃ’はＣａｕｄａｔｅ ｐｕｔａｍｅｎであり、ｄとｄ’はＡｍｙｇｄａｌａであり、ｅとｅ’はｄｏｒｓｏｍｅｄｉａｌ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｎｕｃｌｅｕｓ（DMH）であり、ｆとｆ’はＣＡ３であり、ｇとｇ’はＥｃｔｏｒｈｉｎａｌ ｃｔｘであり、ｈとｈ’はＳｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａであり、ｉとｉ’はｐｅｒｉａｑｕｅｄｕｃｔａｌ ｇｒａｙ ｍａｔｔｅである。
【００４０】
図２に、ＷＴｓｙｎフィブリル投与から１２週後および２４週後のリン酸化シヌクレイン陽性病変の観察結果を示した。図中矢印は、代表的なレビーニューライト（Lewy neurites）様の病変を示す。投与側のａ〜ｉで示した全ての部位でレビーニューライト様の病変が観察された。１２週後より２４週後の病変数が増加していた。
【００４１】
図３に、Ｇ５１Ｄｓｙｎフィブリル投与から１２週後および２４週後のリン酸化シヌクレイン陽性病変の観察結果を示した。図中矢印は、代表的なレビーニューライト様の病変を示す。投与側のａ〜ｉで示した全ての部位でレビーニューライト様の病変とレビー小体様の病変が観察された。１２週後より２４週後の病変数が増加していた。２４週後では、非投与側にも病変が観察された。図２（ＷＴｓｙｎフィブリル投与マウス）と比較して、Ｇ５１Ｄｓｙｎフィブリル投与マウスのほうが病変数は顕著が増加していた。
【００４２】
図４に、上記図２および図３で観察した各標本におけるリン酸化シヌクレイン陽性病変の広がりを示した。ＷＴｓｙｎフィブリル投与マウスと比較して、Ｇ５１Ｄｓｙｎフィブリル投与マウスでは、明らかにリン酸化シヌクレイン陽性病変の伝搬が強いことが示された。また、フィブリル投与１２週後より２４週後のほうが病変の広範な広がりが認められたことから、本発明のパーキンソン病モデルマウスは緩徐進行性の病態を再現できることが示唆された。
【００４３】
図５に、ＷＴｓｙｎフィブリル投与およびＧ５１Ｄｓｙｎフィブリル投与から２４週後にそれぞれ採取した脳の切片を抗ＴＨ抗体で染色した結果を示した。左側および中央の画像中の矢印は黒質を示し、右側の画像中の矢印は線条体を示す。Ｇ５１Ｄｓｙｎフィブリル投与マウスの投与側は、ＴＨ陽性領域が少ないことがわかる。
【００４４】
図６に、上記図５で観察した標本、および投与１２週後に採取した脳の切片を抗ＴＨ抗体で染色した標本におけるＴＨ陽性細胞（黒質ドパミン神経細胞）数をカウントした結果を示した。（Ａ）はＷＴｓｙｎフィブリル投与マウスの結果、（Ｂ）はＧ５１Ｄｓｙｎフィブリル投与マウスの結果である。同一週のバーは左が投与側、右が非投与側である。（Ｂ）のコントロールはｓｙｎフィブリル非投与マウスである。ＷＴｓｙｎフィブリル投与マウスでは、１２週、２４週とも黒質ドパミン神経細胞の減少は認められなかった。一方、Ｇ５１Ｄｓｙｎフィブリル投与マウスでは、１２週では黒質ドパミン神経細胞の減少は認められなかったが、２４種では投与側の黒質ドパミン神経細胞が非投与側と比較して有意に減少していた（p<0.05 Mann-Whitney's U test）。この結果から、Ｇ５１Ｄｓｙｎフィブリルを黒質内に投与することにより、投与側の黒質ドパミン神経細胞の変性は、緩徐進行性であることが示された。
【００４５】
１−３  行動解析
ＷＴｓｙｎフィブリル投与から２４週後のマウス（ＷＴｆｉｂｒｌ群）およびＧ５１Ｄｓｙｎフィブリル投与から２４週後のマウス（Ｇ５１Ｄｆｉｂｒｌ群）の回旋試験を行った。陰性対照として非投与群を、陽性対照として６−ＯＨＤＡ投与群を設けた。６−ＯＨＤＡ投与群のマウスには、回旋試験を行う１４日前に、６−ＯＨＤＡを５μｇ／匹の用量で左側黒質内に投与した。１群の匹数は４〜６匹とした。アポモルフィン（SIGMA）０．１ｍｇ／ｍｌおよびアスコルビン酸（wako）１ｍｇ／ｍｌを含む溶液を調製し、アポモルフィンを１ｍｇ/ｋｇで腹腔内投与した。５分後に直径１７ｃｍのボウル内にマウスを置き、５分間の回旋運動を測定した。
【００４６】
図７に、回旋試験の結果を示した。Ｇ５１Ｄｓｙｎフィブリル投与群は、コントロール群（ｓｙｎフィブリル非投与）およびＷＴｓｙｎフィブリル投与群と比較して有意に回旋運動が増加した（p<0.05 Wilcoxon test）。なお、データを示していないが、Ｇ５１Ｄｓｙｎフィブリル投与後１２週では、回旋運動の有意増加は認められなかったことから、本発明のパーキンソン病モデルは、黒質ドパミン神経細胞の変性が緩徐進行性であることが裏付けられた。
【００４７】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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