(57)【要約】【課題】アレルギーを診断するための方法を提供すること。【解決手段】方法は、以下の工程：ａ）患者の全血サンプルに由来する好塩基球を、水性溶液中の全血の体積含有量が少なくとも２０体積％である、全血の存在下での該水性溶液中のアレルゲンと、該アレルゲンによる該好塩基球の活性化を可能にする条件下で接触させる工程、ｂ）工程ａ）からの該好塩基球を富化する工程およびｃ）活性化好塩基球を検出する工程を包含し、ここで工程ｃ）の検出は、好塩基球について好塩基球の表面に位置するマーカーが、化学発光によって検出されるという点で行われ、工程ｂ）において、好塩基球は、該好塩基球が活性化好塩基球に特徴的なマーカーであるポリペプチドに特異的に結合するリガンドに結合するという点で富化され、そして／または工程ｃ）における検出は、活性化好塩基球に特徴的なマーカーが化学発光によって検出されるという点で行われる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレルギーの指標として活性化好塩基球を使用するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）患者の全血サンプルに由来する好塩基球を、水性溶液中の全血の体積含有量が少なくとも２０体積％である、全血の存在下での該水性溶液中のアレルゲンと、、該アレルゲンによる該好塩基球の活性化を可能にする条件下で接触させる工程、
ｂ）工程ａ）からの該好塩基球を富化する工程、および
ｃ）活性化好塩基球を検出する工程
を包含し、
ここで工程ｃ）における該検出は、好塩基球に関する好塩基球の表面に位置するマーカーが化学発光によって検出されるという点で行われ、
ここで工程ｂ）において、好塩基球は、該好塩基球が、活性化好塩基球に特徴的なマーカーであるポリペプチドに特異的に結合するリガンドに結合するという点で富化され、
そして／または工程ｃ）における該検出は、活性化好塩基球に特徴的なマーカーが化学発光によって検出されるという点で行われる、
方法。
【請求項２】
前記全血は、非処理全血である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）は、水性溶液中で、少なくとも３０体積％、好ましくは３５体積％、より好ましくは４０体積％、より好ましくは４５体積％の全血含有量で行われる、請求項１および２のうちの１項に記載の方法。
【請求項４】
好ましくは工程ｂ）の前に、前記好塩基球の活性化を停止する工程を包含する、請求項１〜３のうちの１項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ）において、前記好塩基球は、該好塩基球が、好ましくは該好塩基球の活性化状態とは独立して好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドに特異的に結合するリガンドに結合するという点で富化される、請求項１〜４のうちの１項に記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドは、前記ポリペプチドに対するモノクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）において、前記好塩基球は、固定化される、請求項１〜６のうちの１項に記載の方法。
【請求項８】
前記好塩基球は、ビーズ、好ましくは磁性ビーズ上に固定化される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記好塩基球は、固定化後に洗浄される、請求項７〜８のうちの１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｂ）において、赤血球は、溶解および除去される、請求項１〜９のうちの１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記赤血球は、前記好塩基球の固定化の前に遠心分離によって除去される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出は、工程ｃ）において、好塩基球の表面に位置する前記マーカー、好ましくは活性化好塩基球に特徴的なマーカーに対して化学発光が可能な標識とともに提供されるリガンドを使用して行われる、請求項１〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
化学発光が可能な標識とともに提供される前記リガンドは、それ自体が、化学発光が可能な標識を含むか、または化学発光が可能な標識を有する二次抗体に結合するモノクローナル抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程ａ）、工程ｂ）および工程ｃ）は、マイクロタイタープレートのウェル中で行われる、請求項１〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程ａ）は、工程ｂ）および工程ｃ）の前に行われる、請求項１〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
キットであって、
好塩基球をアレルゲンに接触させるための容器であって、ここで該容器は、好ましくはマイクロタイタープレートである、容器、
任意選択で、アレルゲン、ならびに
好塩基球を富化するための好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドに対するリガンド、および好塩基球の細胞表面に位置する検出のためのマーカーに対するリガンドであって、
ここで好塩基球の表面に位置する検出のための該マーカーに対する該リガンドは、化学発光が可能な標識を含み、
ここで化学発光が可能な該標識は、化学発光反応を触媒する酵素または適切な条件下で化学発光シグナルを自身で生成する分子であり得、ここで前者の場合の該酵素は、化学発光が可能な基質溶液と組み合わせて該キット中に含まれ、
そしてここで好塩基球の細胞表面に位置する該ポリペプチドおよび／または好塩基球の細胞表面に位置する該マーカーは、活性化好塩基球に特徴的である、
リガンド、
任意選択で、該好塩基球の活性化を停止するための作用物質、ならびに
任意選択で、赤血球を溶解および／または除去するための作用物質、
を含む、キット。
【請求項１７】
アレルギーを診断するための、アレルギーを診断するキットを生成するための、またはアレルゲンに対するアレルギーの処置のための候補活性成分をスクリーニングするための、
好塩基球を富化するための好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドに対するリガンドを、好塩基球の細胞表面に位置する検出のためのマーカーに対するリガンドと一緒に含む組み合わせ物であって、
ここで好塩基球の細胞表面に位置する検出のための該マーカーに対する該リガンドは、化学発光が可能な標識を含み、
ここで化学発光が可能な該標識は、化学発光反応を触媒する酵素または適切な条件下で化学発光シグナルを自身で生成する分子であり得、ここで前者の場合の該酵素は、化学発光が可能な基質溶液と組み合わせて使用され、
そしてここで好塩基球の細胞表面に位置する該ポリペプチドおよび／または好塩基球の細胞表面に位置する該マーカーは、活性化好塩基球に特徴的である、
組み合わせ物。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００１】
本発明は、アレルギーを診断するための方法であって、患者の全血サンプルに由来する好塩基球を、水性溶液中の全血の体積含有量が少なくとも２０体積％である、全血の存在下での上記水性溶液中のアレルゲンと、上記アレルゲンによる上記好塩基球の活性化を可能にする条件下で接触させる工程、上記工程ａ）からの好塩基球を富化する工程および活性化好塩基球を検出する工程を包含し、ここで上記検出は、活性化好塩基球に特徴的なマーカーが化学発光によって検出されるという点で行われる、方法；ならびに、以下：好塩基球をアレルゲンと接触させるための、好ましくはマイクロタイタープレートである容器、任意選択で、アレルゲン、好ましくは、化学発光が可能な標識とともに提供されるマーカーに対するリガンド（該リガンドは、より好ましくはモノクローナル抗体である）である、化学発光によって活性化好塩基球に特徴的なマーカーを検出するための作用物質（agent）、任意選択で、好塩基球の活性化を停止するための作用物質、任意選択で、好塩基球の活性化状態とは独立して好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドに結合する固定化可能なリガンド（ここで該リガンドは、好ましくは該ポリペプチドに対するモノクローナル抗体である）、および任意選択で、赤血球を溶解および／または除去するための作用物質、を含むキットに関する。
【０００２】
ＩｇＥ媒介性免疫応答に基づく即時性アレルギー（Ｉ型アレルギーともいわれる）の診断において、使用される主な方法は、詳細な患者病歴を入手し、次いで、皮膚プリックテストまたはチャレンジ試験などの皮膚試験を行うことであり、これは、アレルギー診断におけるゴールドスタンダードである。補助として、インビトロ試験が、１種または１種より多くの特定のアレルゲンに対する特異的ＩｇＥ抗体の存在が検出される手段によって使用される。
【０００３】
このような検出を行うために、アレルゲンは、スポンジ、膜またはビーズなどのマトリクスに結合され、患者血清と接触される。この後、結合したＩｇＥの量が、標識された抗ヒトＩｇＥ抗体を使用して決定される。
【０００４】
インビトロでの特異的ＩｇＥ決定の利点は、行うのが容易であり、標準化可能であり、そして大規模に実現可能であるという事実にある。しかし多くの場合には、この方法は、臨床上関連のあるアレルギーと単純な感作との間を区別できない。
【０００５】
さらなる欠点は、多くの抗原の利用可能性に乏しいこと、およびアレルゲンにおける、マトリクスへのその連結が原因である、考えられるコンホメーション変化であり、これは、検出されるべきＩｇＥ抗体に対する親和性を変化させ得る。多くの場合において、アレルゲン抽出物は、困難を伴ってのみ標準化され得るか、または全く標準化され得ない。さらに、より小さなアレルゲンは、血清アルブミンなどのキャリア分子に結合されなければならない。さらに、好塩基球およびマスト細胞などのエフェクター細胞に対する血清中のＩｇＥ抗体および膜結合したＩｇＥ抗体のアレルゲン特異性は、溶解し結合したＩｇＥのゆっくりとした交換のみが起こるので、必ずしも同じではない。最後に、特異的ＩｇＥ抗体を検出するためのインビトロ試験において反映され得ない他の因子は、細胞性アレルギー反応が実際に誘発されるかどうか、血中の全ＩｇＥ  対  特異的ＩｇＥの全体的な比または抗体の親和性を決定する。
【０００６】
特に、ＩｇＥおよび皮膚試験が不明瞭な結果を生じる場合には、それ故に、補助として、好塩基球脱顆粒試験または好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）などの細胞試験システムを使用することは、賢明である。通常は、用語「ＢＡＴ」は、フローサイトメトリー試験を参照して使用される。
【０００７】
特異的ＩｇＥ抗体決定（これは、血清中に溶解した生物学的に不活性なＩｇＥ含有量のみを決定する）を超える細胞試験の特定の利点は、それら試験が、好塩基球の細胞表面上のレセプターに結合したＩｇＥ抗体へのアレルゲンの結合およびその架橋によって誘発される実際の細胞生物学的反応を検出することである。細胞試験はまた、脱顆粒能力の閾値を決定することを可能にする。それらは、患者において治療の成功をモニターするために、特に免疫療法後に必要とされる。
【０００８】
概して、細胞試験は、まず、患者血液をアレルゲンと接触させることによって行われる。その患者が既に感作されている場合、これは、好塩基球の細胞表面に位置するレセプターに結合したアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体へのアレルゲンの結合を生じる。これは、ＩｇＥレセプターの架橋をもたらし、これは翻って、好塩基性顆粒球の脱顆粒を、従って、細胞内顆粒からのメディエーターの放出を誘発する。これらのメディエーター（例えば、ヒスタミン、ロイコトリエンおよびトリプターゼ）は、酵素イムノアッセイによって上清中で定量され得る。メディエーターの分泌は、ＣＤ６３またはＣＤ２０３ｃなどのマーカー（これらは、細胞内顆粒の膜に以前は位置しており、従って、細胞反応も示す）の上昇した細胞表面濃度を相伴う。従って、メディエーターの分泌は、アレルゲンに対する細胞反応を示す。
【０００９】
この上昇した表面濃度は、発蛍光団に結合される、活性化特異的細胞表面マーカーに対する抗体を使用するフローサイトメトリーによって今日まで慣用的な診断において検出されてきた。この場合、調べられるべき細胞は、薄い測定チャンバを通って液体流の中で個々に流れ、異なる波長の複数のレーザー光を通過し、ここで各細胞タイプに特徴的な散乱光が生成され、同時に、それぞれの波長に応じて、その抗体に連結した発蛍光団が刺激される（ただし活性化した細胞が存在することを条件とする）。励起した発蛍光団によって発せられた光および散乱光は、検出器によって捕らえられる。
【００１０】
この試験システムの欠点は、フローサイトメーターの取得費用が高額であること、試験結果が複雑であること（これは、訓練された技術職員によって解釈され得るに過ぎない）、および標準化の困難さである。さらに、全ての場合で、１つのデバイスで一度に１サンプルを測定することが可能であるのみである。
【００１１】
本発明に従うさらなる課題は、活性化可能な好塩基球を含むサンプルの品質に関する。そのサンプルの品質および従って、それらの診断法の適切性は、それらが専門的な標準に従って得られ、輸送され、そして貯蔵されるかどうかに依存する。例えば、細胞は、熱または不適切な緩衝液に曝される場合に死滅し得る。
【００１２】
その品質が不十分である場合、これは、偽陰性の結果を引き起こし得る。これは、陰性の結果が、患者がアレルギー性でないということを示さないが、単純に患者のサンプルが不十分な品質のものであるか、またはより正確には、活性化可能な好塩基球が含まれないかもしくは少なすぎることを意味する。
【００１３】
それは、サンプルの欠陥のある品質がフローサイトメトリーなどの複雑な方法を行うことによってのみ検出される場合、特に非効率的である。
【００１４】
従って、サンプルの品質を効率的な方法で、すなわち、ハイスループットに適したプロセスを使用して決定するために適した方法（単数または複数））が必要である。このような方法は、アレルゲンを使用して行われず、従って、診断上有用な結果を提供しないが、サンプル品質が別個のバッチで行われる診断法に適しているかどうかに関して予測を行うことを可能にする。この方法は、診断法の前に、診断法の後に、または診断法と並行して行われ得る。この方法またはそこで使用される試薬は、細胞調製物、好ましくはサンプル中の活性化可能な好塩基球の数または含有量を決定するのに働き得る。
【００１５】
ＤＥ  １０２３５３１０は、好塩基球の活性化が蛍光カルシウム染料を使用して検出される試験を開示する。密度勾配遠心分離によって分画された血液が使用される。
【００１６】
ＷＯ  ２０１２／０４４７５６、ＵＳ  ２００９／０２４６８０５、ＷＯ  ９８／３２０１４およびＥＰ  ２０３７２６９は、好塩基球の活性化を検出するためのフローサイトメトリー試験を開示する。
【００１７】
この背景に対して、本発明の目的は、先行技術に記載される方法の上述の欠点が克服され得る手段、特に、フローサイトメーター以外のシステムで行われ得る好塩基球活性化試験による方法および上記方法に適した試薬を提供することである。
【００１８】
特に、目的は、ハイスループット法において複数のサンプルの同時処理を可能にするシステムを提供することである。さらに、再現性および標準化可能性（standardizability）が担保されることである。
【００１９】
この目的およびさらなる目的は、本発明の主題によって、特に、添付の独立請求項の主題によって達成され、ここで好ましい実施形態は、従属請求項に示される。
【００２０】
第１の局面において、本発明の課題は、アレルギーを診断するための方法、好ましくはハイスループットに適した方法によって解決され、上記方法は、以下の工程：
ａ）患者の全血サンプルに由来する好塩基球を、水性溶液中の全血の体積含有量が少なくとも２０体積％である、全血の存在下での上記水性溶液中のアレルゲンと、上記アレルゲンによる好塩基球の活性化を可能にする条件下で接触させる工程、
ｂ）  工程ａ）からの好塩基球を富化する工程、および
ｃ）活性化好塩基球を検出する工程、
を包含し、
ここで工程ｃ）における検出は、活性化好塩基球に特徴的なマーカーが化学発光によって検出されるという点で行われる。
【００２１】
あるいは、上記課題は、アレルギーを診断するための方法によって第１の局面において解決され、上記方法は、以下の工程：
ａ）患者の全血サンプルに由来する好塩基球を、水性溶液中の全血の体積含有量が少なくとも２０体積％である、全血の存在下での上記水性溶液中のアレルゲンと、上記アレルゲンによる好塩基球の活性化を可能にする条件下で接触させる工程、
ｂ）工程ａ）からの好塩基球を富化する工程、および
ｃ）活性化好塩基球を検出する工程、
を包含し、
ここで工程ｃ）における検出は、好塩基球の表面に位置するマーカーが化学発光によって検出されるという点で行われ、
ここで工程ｂ）において、好塩基球は、上記好塩基球が、活性化好塩基球に特徴的なマーカーであるポリペプチドに特異的に結合するリガンドに結合するという点で富化され、
そして／または工程ｃ）における検出は、活性化好塩基球に特徴的なマーカーが化学発光によって検出されるという点で行われる。
【００２２】
好ましい実施形態において、上記全血は、非処理全血である。
【００２３】
さらに好ましい実施形態において、工程ａ）は、少なくとも３０体積％、好ましくは３５体積％、より好ましくは４０体積％、より好ましくは４５体積％の全血含有量を含む、水性溶液中で行われる。
【００２４】
さらなる実施形態において、上記方法は、好塩基球の活性化を、好ましくは工程ｂ）の前に停止する工程を包含する。
【００２５】
さらなる実施形態において、工程ｂ）の好塩基球は、上記好塩基球が、好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドに特異的に結合するリガンドに結合するという点で富化される。このポリペプチドは、上記好塩基球の活性化状態および／または活性化好塩基球に特徴的なマーカー、好ましくは活性化好塩基球に特徴的なさらなるマーカー（これは、化学発光によって本発明に従って検出されるマーカーとは異なる）とは独立して、好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドであり得る。特に好ましい実施形態において、それは、上記好塩基球の活性化状態とは独立して好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドである。
【００２６】
さらなる実施形態において、好塩基球の活性化状態とは独立して好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドに特異的に結合するリガンドは、上記ポリペプチドに対するモノクローナル抗体である。
【００２７】
好ましい実施形態において、上記好塩基球は、工程ｂ）において固定化される。
【００２８】
好ましい実施形態において、上記好塩基球は、工程ｂ）において、ビーズ、好ましくは磁性ビーズ上で固定化される。
【００２９】
好ましい実施形態において、上記好塩基球は、固定化後に洗浄される。
【００３０】
好ましい実施形態において、上記赤血球は、工程ｂ）において溶解および除去される。
【００３１】
好ましい実施形態において、上記赤血球は、上記好塩基球の固定化前に遠心分離によって除去される。
【００３２】
好ましい実施形態において、工程ｃ）における検出は、好塩基球の表面に位置するマーカー、好ましくは活性化好塩基球に特徴的なマーカーに対する、化学発光が可能な標識とともに提供されるリガンドを使用して行われる。
【００３３】
好ましい実施形態において、化学発光が可能な標識とともに提供されるリガンドは、モノクローナル抗体であって、それ自身化学発光が可能な標識を含むか、または化学発光が可能な標識を有する二次抗体に結合するモノクローナル抗体である。
【００３４】
好ましい実施形態において、工程ａ）、工程ｂ）および工程ｃ）は、マイクロタイタープレート中で行われる。
【００３５】
好ましい実施形態において、工程ａ）は、工程ｂ）および工程ｃ）の前に行われる。
【００３６】
さらなる局面において、本発明の目的は、キットであって、以下：好ましくはマイクロタイタープレートである、好塩基球をアレルゲンと接触させるための容器、任意選択で、アレルゲン、好ましくは化学発光が可能な標識とともに提供されるマーカーに対するリガンド（該リガンドは、より好ましくは、モノクローナル抗体である）である、化学発光によって活性化好塩基球に特徴的なマーカーを検出するための作用物質、任意選択で、好塩基球の活性化を停止するための作用物質、任意選択で、好塩基球の活性化状態とは独立して好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドに結合する固定化されたリガンド（ここで該リガンドは、好ましくは該ポリペプチドに対するモノクローナル抗体である）、ならびに任意選択で、赤血球を溶解および／または除去するための作用物質を含む、キットによって達成される。
【００３７】
あるいは、上記課題は、さらなる局面において、キットであって、以下：好ましくはマイクロタイタープレートである、好塩基球を上記アレルゲンと接触させるための容器、任意選択で、アレルゲン、好塩基球の富化のための好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドに対するリガンド、および好塩基球の細胞表面に位置する検出のためのマーカーに対するリガンド（化学発光が可能な標識を含む）、を含むキットによって解決され、ここで上記化学発光が可能な標識は化学発光反応を触媒する酵素または適切な条件下で化学発光シグナルを自身で生成する分子であり得、ここで前者の場合の酵素は、化学発光が可能な基質溶液と組み合わせて該キットの中に含まれ、そしてここで好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドおよび／または好塩基球の細胞表面に位置するマーカーは、活性化好塩基球に特徴的である。任意選択で、上記キットは、好塩基球の活性化を停止するための作用物質を含む。任意選択で、上記キットは、赤血球を溶解および／または除去するための作用物質を含む。
【００３８】
本発明に従うキットの中に含まれる試薬はまた、アレルギーを診断するためのキットを提供するために、好塩基球をアレルゲンと接触させるための容器ありまたはなしで使用され得る。
【００３９】
さらなる局面において、上記課題は、アレルギーを診断するために、アレルギーを診断するためのキットを生成するために、またはアレルゲンに対するアレルギーの処置のための候補活性成分をスクリーニングするために、好塩基球の細胞表面上に位置する検出のためのマーカーに対するリガンドと一緒に、好塩基球を富化するための好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドに対するリガンドの使用によって解決され、ここで好塩基球の細胞表面に位置する検出のためのマーカーに対するリガンドは、化学発光が可能な標識を含み、ここで上記化学発光が可能な標識は、化学発光反応を触媒する酵素または適切な条件下で化学発光シグナルを自身で生成する分子であり得、ここで前者の場合の酵素は、化学発光が可能な基質溶液と組み合わせて使用され、そしてここで好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドおよび／または好塩基球の細胞表面に位置するマーカーは、活性化好塩基球に特徴的である。
【００４０】
さらなる局面において、上記課題は、アレルギーを診断するために、アレルギーを診断するためのキットを提供するために、またはアレルゲンに対するアレルギーの処置のための候補活性成分をスクリーニングするために、活性化好塩基球に特徴的なリガンドに対するリガンドの使用によって解決され、ここで上記リガンドは、化学発光が可能な標識を有する。
【００４１】
好ましい実施形態において、上記使用は、好ましくはハイスループット法において感度を増加させるためのものである。
【００４２】
本発明は、まず、患者の全血サンプルに由来する好塩基球を、水性溶液中のアレルゲンと接触させる工程ａ）を含む、アレルギーを診断するための方法に関する。上記全血サンプルは、好ましくは抗凝固剤作用を有する物質を有する全血である。上記全血は、好塩基球が、水性溶液中のその最終体積含有量が少なくとも２０体積％、より好ましくは２５体積％、３０体積％、３５体積％、４０体積％、４５体積％、５０体積％、５５体積％、６０体積％、６５体積％、７０体積％、７５体積％または８０体積％であるような量で、アレルゲンと実際に接触させられる前に水性溶液に添加される。全血の存在は、好塩基球とアレルゲンとの接触を、実質的に生理学的な条件下で起こさせる。
【００４３】
上記方法は、好ましくは、ハイスループットに適切な方法である。これは、好ましい実施形態において、複数のサンプル、例えば、少なくとも２個、４個、８個、１６個または３２個のサンプルの並行処理を可能にする方法をいうことが理解される。ここで上記方法の工程（これは、個々のサンプルに必要とされる処理時間のうちの少なくとも５０％、より好ましくは６０％、７０％、８０％または９０％を占める）は、本質的に、上記サンプルの処理と同時に行い得る。これは、実際の測定プロセスがサンプルの全てに関して連続的に測定デバイスを使用して行われる方法を含むが、サンプルに関する個々の非並行処理時間は、５分間、より好ましくは４分間、３分間、２分間、１分間または３０秒間を超えない。例えば、ハイスループットに適した方法は、この目的に適したマイクロタイタープレート中での化学発光測定を含む。対照的に、例えば、フローサイトメトリーは、ハイスループットに適した方法ではない。
【００４４】
全血は、好ましくは非処理全血である。好ましい実施形態において、用語「非処理全血（ｕｎｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ）」は、本明細書で使用される場合、血液が希釈され得るかまたは保存のための化学物質（好ましくは抗凝固薬作用を有する物質（例えば、ヘパリン））が血液に添加され得るが、例えば、密度勾配遠心分離などの遠心分離法によって分画されないことを意味すると理解される。
【００４５】
工程ａ）はまた、異なる並行処理バッチにおいて、１種より多くのアレルゲンおよび／または１種より多くの濃度のアレルゲンを用いて行われ得る。特に、上記抗原は、相当する数の並行バッチにおいて、２種またはこれより多くの、好ましくは３種またはこれより多くの異なる濃度で使用され得る。好ましくは、陽性コントロールおよび陰性コントロールが、さらに行われる。好ましい実施形態において、上記アレルゲンは、分類学上の動物界、節足動物門のダニ培養物およびダニの糞便；分類学上の動物界、脊索動物門に由来する鱗片、毛、唾液、糞便もしくは他の分泌物；分類学上の菌界、子嚢菌門に由来する芽胞もしくは粒子；分類学上の球果植物綱に由来する花粉、分類学上の植物界、双子葉植物綱に由来する花粉、分類学上の植物界、単子葉植物綱に由来する花粉；分類学上の動物界、節足動物門に由来する毒素もしくは分泌物；または分類学上の植物界、双子葉植物綱の樹木に由来するゴムもしくはゴムを含む生成物を含む群から選択される物質である。
【００４６】
好ましい実施形態において、上記アレルゲンは、以下を含む群から選択される薬物である：抗生物質、より好ましくはβ−ラクタム、より好ましくはペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ＰＰＬ、ＭＤＭ、アモキシシリンおよびアンピシリンを含む群からのもの；セファロスポリン、より好ましくはセファゾリン、セファマンドール、セファクロル、セフォナキシム（ｃｅｆｏｎａｘｉｍｅ）、セフタジジム、セフォタキシム、セフタジジム、セフェピムを含む群からのもの；カルバペネム、モノバクタム、β−ラクタマーゼインヒビター、より好ましくはクラブラン酸；マクロライド、アミノグリコシド、リファマイシン、糖タンパク質、ポリペプチド、テトラサイクリン、イミダゾール、キノロン、ピラゾロン、より好ましくはスルファメトキサゾール；ストレプトグラミン、ニトロフラン、イソニアジド、ペンタミジン；防腐剤、より好ましくはクロルヘキシジン、殺真菌薬、抗ウイルス剤、抗マラリア薬、鎮痛薬、ＣＯＸ−２インヒビターおよび非ステロイド系抗炎症剤、好ましくはアスピリン、リジン−アスピリン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ジクロフェナク、ナプロキセン、パラセタモール、ジピロン、インドメタシン、メフェナム酸、フェニルブタゾンおよびプロピフェナゾンを含む群からのもの；神経筋遮断薬、好ましくはスキサメトニウム、アトラクリウム、シスアトラクリウム、ミバクリウム、パンクロニウム、ロクロニウム、ベクロニウムおよびスクシニルコリンを含む群からのもの；催眠薬および局所麻酔薬、好ましくはミダゾラム、プロポフォール、チオペンタール、フェンタニルおよびリドカインを含む群からのもの；精神安定薬；オピオイド；放射線造影剤、好ましくはイオン性ヨード造影剤（ｉｏｎｉｃ  ｉｏｄｉｎａｔｅｄ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔ）、非イオン性ヨード造影剤、イソスルファンブルー、パテントブルーおよびメチレンブルーを含む群からのもの；プロトンポンプインヒビター、抗けいれん薬および神経弛緩薬、好ましくはカルバマゼピン、フェニトインおよびバルプロ酸を含む群からのもの；抗精神病薬；抗鬱薬；ドパミン；抗ヒスタミン薬；コルチコステロイドおよびグルココルチコイド；化学療法剤および免疫抑制薬；利尿薬；抗凝固薬；血管収縮薬および血管拡張薬；心臓薬、好ましくはスタチン、ＡＣＥインヒビター、αレセプター遮断薬、βレセプター遮断薬、カルシウムアンタゴニストおよび降圧剤を含む群からのもの；（抗）腫瘍薬；（抗）甲状腺薬；エストロゲン；ヘパリンおよび誘導体；インスリン；ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼ。
【００４７】
好ましい実施形態において、上記アレルゲンは、コロイドエキスパンダー（ｃｏｌｌｏｉｄ  ｅｘｐａｎｄｅｒ）、血漿エキスパンダーまたは補助剤であり、好ましくはアルブミン、デキストラン、ゼラチン、ヘタスターチ、ペンタスターチ、シニストリン（ｓｉｎｉｓｔｒｉｎ）、ポリドカノール６００（エトキシスクレロール）、ラクトース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、プロタミンおよびアプロチニンを含む群から選択される。
【００４８】
好ましい実施形態において、上記アレルゲンは、食品添加剤であり、好ましくは食品保存剤、食用色素、食品仕上げ剤（ｆｏｏｄ  ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、抗酸化剤および乳化剤を含む群から選択される。
【００４９】
好ましい実施形態において、上記アレルゲンは、環境汚染物質または有害物質であり、好ましくはイソシアネート、イソチアゾリノン、ホルムアルデヒド、エチレンオキシド、フタル酸無水物、クロラミン−Ｔ、ＤＭＳＯ、ラテックスならびに膨張剤（ｂａｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、食品加工、および洗浄産業（ｗａｓｈｉｎｇ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ）において使用される酵素を含む群から選択される。
【００５０】
好ましい実施形態において、上記アレルゲンは、Ａｃａｒｕｓ、Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ、Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｕｓ、Ｔｒｙｏｐｈａｇｕｓ、Ｂｌｏｍｉａ、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ、Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ、ＢｌａｔｅｌｌａおよびＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａから選択される属のダニから構成される群より選択されるダニ培養物および／または糞便；Ｃａｎｉｓ、ＦｅｌｉｓまたはＥｑｕｕｓから選択される属の動物の鱗片、毛、唾液または糞便；Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、ＡｌｔｅｒｎａｒｉａおよびＣａｎｄｉｄａから構成される群から選択される属の酵母、糸状菌、または真菌；Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ、Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｈｏｌｃｕｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｏｒｙｚａ、Ｐａｓｐａｌｕｍ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｚｅａ、Ａｍｂｒｏｓｉａ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ、Ａｌｎｕｓ、Ｂｅｔｕｌａ、Ｃｏｒｙｌｕｓ、Ｆｒａｘｉｎｕｓ、ＯｌｅａおよびＰｌａｔａｎｕｓから構成される群から選択される属の花粉；Ａｐｉｓ  Ｂｏｍｂｕｓ、Ｄｏｌｉｃｈｏｖｅｓｐｕｌａ、Ｐｏｌｉｓｔｅｓ、Ｐｏｌｙｂｉａ、ＶｅｓｐａおよびＶｅｓｐｕｌａから構成される群から選択される属の昆虫に由来する毒液；ならびにＨｅｖｅａ属に由来するゴムまたはゴムを含む生成物、を含む群より選択される物質である。
【００５１】
好ましい実施形態において、上記アレルゲンは、分類学上の動物界、節足動物門のエビまたはエビ含有食品；分類学上の動物界、節足動物門のロブスターまたはロブスター含有食品；分類学上の植物界、単子葉植物綱に由来する果実、豆果、穀物、もしくは豆、またはこのような果実、豆果、穀物、および／もしくは豆を含む食品；分類学上の植物界、双子葉植物綱に由来する果実、豆果、穀物、もしくは豆、このような果実、豆果、穀物、および／もしくは豆を含む食品；ならびに分類学上の植物界、双子葉植物綱の堅果もしくは堅果含有食品を含む群から選択される物質である。
【００５２】
好ましい実施形態において、上記アレルゲンは、牛乳、牛乳含有食品、鶏肉タンパク質、鶏肉含有食品、魚肉または魚肉含有食品を含む群から選択される物質である。
【００５３】
好ましい実施形態において、上記アレルゲンは、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｏｒｙｚａ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｚｅａ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｃｏｒｙｌｉｓ、Ｊｕｇｌａｎｓ、Ｐｒｕｎｕｓ、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ、ＰｉｓｔａｃｉａおよびＧｌｙｃｉｎｅを含む群から選択される物質である。
【００５４】
好ましい実施形態において、上記アレルゲンは、以下を含む群からの抗原またはその改変体を含むポリペプチドである：Ａｃａ  ｓ  １３、Ｇｌｙ  ｄ  ２、Ｌｅｐ  ｄ  ２、Ｌｅｐ  ｄ  ５、Ｌｅｐ  ｄ  ７、Ｌｅｐ  ｄ  １０、Ｌｅｐ  ｄ  １３、Ｔｙｒ  ｐ  ２、Ｔｙｒ  ｐ  ３、Ｔｙｒ  ｐ  １０、Ｔｙｒ  ｐ  １３、Ｔｙｒ  ｐ  ２４、Ｂｌｏ  ｔ  １、Ｂｌｏ  ｔ  ２、Ｂｌｏ  ｔ  ３、Ｂｌｏ  ｔ  ４、Ｂｌｏ  ｔ  ５、Ｂｌｏ  ｔ  ６、Ｂｌｏ  ｔ  １０、Ｂｌｏ  ｔ  １１、Ｂｌｏ  ｔ  １２、Ｂｌｏ  ｔ  １３、Ｂｌｏ  ｔ  １９、Ｂｌｏ  ｔ  ２１、Ｄｅｒ  ｆ  １、Ｄｅｒ  ｆ  ２、Ｄｅｒ  ｆ  ３、Ｄｅｒ  ｆ  ６、Ｄｅｒ  ｆ  ７、Ｄｅｒ  ｆ  １０、Ｄｅｒ  ｆ  １１、Ｄｅｒ  ｆ  １３、Ｄｅｒ  ｆ  １４、Ｄｅｒ  ｆ  １５、Ｄｅｒ  ｆ  １６、Ｄｅｒ  ｆ  １７、Ｄｅｒ  ｆ  １８、Ｄｅｒ  ｆ  ２２、Ｄｅｒ  ｍ  １、Ｄｅｒ  ｐ  １、Ｄｅｒ  ｐ  ２、Ｄｅｒ  ｐ  ３、Ｄｅｒ  ｐ  ４、Ｄｅｒ  ｐ  ５、Ｄｅｒ  ｐ  ６、Ｄｅｒ  ｐ  ７、Ｄｅｒ  ｐ  ８、Ｄｅｒ  ｐ  ９、Ｄｅｒ  ｐ  １０、Ｄｅｒ  ｐ  １１、Ｄｅｒ  ｐ  １４、Ｄｅｒ  ｐ  ２０、Ｄｅｒ  ｐ  ２１、Ｄｅｒ  ｐ  ２３、Ｅｕｒ  ｍ  １、Ｅｕｒ  ｍ  ２、Ｅｕｒ  ｍ  ３、Ｅｕｒ  ｍ  ４、Ｅｕｒ  ｍ  １４、Ｂｌａ  ｇ  １、Ｂｌａ  ｇ  ２、Ｂｌａ  ｇ  ４、Ｂｌａ  ｇ  ５、Ｂｌａ  ｇ  ６、Ｂｌａ  ｇ  ７、Ｂｌａ  ｇ  ８、Ｐｅｒ  ａ  １、Ｐｅｒ  ａ  ３、Ｐｅｒ  ａ  ６、Ｐｅｒ  ａ  ７、Ｐｅｒ  ａ  ９、Ｐｅｒ  ａ  １０、Ｃａｎ  ｆ  １、Ｃａｎ  ｆ  ２、Ｃａｎ  ｆ  ３、Ｃａｎ  ｆ  ４、Ｃａｎ  ｆ  ５、Ｃａｎ  ｆ  ６、Ｆｅｌ  ｄ  １、Ｆｅｌ  ｄ  ２、Ｆｅｌ  ｄ  ３、Ｆｅｌ  ｄ  ４、Ｆｅｌ  ｄ  ５ｗ、Ｆｅｌ  ｄ  ６ｗ、Ｆｅｌ  ｄ  ７、Ｆｅｌ  ｄ  ８、Ｅｑｕ  ｃ  １、Ｅｑｕ  ｃ  ２、Ｅｑｕ  ｃ  ３、Ｅｑｕ  ｃ  ４  ａｎｄ  Ｅｑｕ  ｃ  ５、Ｃｌａ  ｃ  ９ｍ、Ｃｌａ  ｃ  １４、Ｃｌａ  ｈ  ２、Ｃｌａ  ｈ  ５、Ｃｌａ  ｈ  ６、Ｃｌａ  ｈ  ７、Ｃｌａ  ｈ  ８、Ｃｌａ  ｈ  ９、Ｃｌａ  ｈ  １０、Ｃｌａ  ｈ  １２、Ａｓｐ  ｆｌ  １３、Ａｓｐ  ｆ  １、Ａｓｐ  ｆ  ２、Ａｓｐ  ｆ  ３、Ａｓｐ  ｆ  ４、Ａｓｐ  ｆ  ５、Ａｓｐ  ｆ  ６、Ａｓｐ  ｆ  ７、Ａｓｐ  ｆ  ８、Ａｓｐ  ｆ  ９、Ａｓｐ  ｆ  １０、Ａｓｐ  ｆ  １１、Ａｓｐ  ｆ  １２、Ａｓｐ  ｆ  １３、Ａｓｐ  ｆ  １５、Ａｓｐ  ｆ  １６、Ａｓｐ  ｆ  １７、Ａｓｐ  ｆ  １８、Ａｓｐ  ｆ  ２２、Ａｓｐ  ｆ  ２３、Ａｓｐ  ｆ  ２７、Ａ５ｐ  ｆ  ２８、Ａ５ｐ  ｆ  ２９、Ａｓｐ  ｆ  ３４、Ａｓｐ  ｎ  １４、Ａｓｐ  ｎ  １８、Ａｓｐ  ｎ  ２５、Ａｓｐ  ｏ  １３、Ａｓｐ  ｏ  ２１、Ｐｅｎ  ｂ  １３、Ｐｅｎ  ｂ  ２６、Ｐｅｎ  ｃｈ  １３、Ｐｅｎ  ｃｈ  １８、Ｐｅｎ  ｃｈ  ２０、Ｐｅｎ  ｃｈ  ３１、Ｐｅｎ  ｃｈ  ３３、Ｐｅｎ  ｃｈ  ３５、Ｐｅｎ  ｃ  ３、Ｐｅｎ  ｃ  １３、Ｐｅｎ  ｃ  １９、Ｐｅｎ  ｃ  ２２、Ｐｅｎ  ｃ  ２４、Ｐｅｎ  Ｃ  ３０、Ｐｅｎ  ｃ  ３２、Ｐｅｎ  ｏ  １８、Ｆｕｓ  ｃ  １、Ｆｕｓ  ｃ  ２、Ａｌｔ  ａ  １、Ａｌｔ  ａ  ３、Ａｌｔ  ａ  ４、Ａｌｔ  ａ  ５、Ａｌｔ  ａ  ６、Ａｌｔ  ａ  ７、Ａｌｔ  ａ  ８、Ａｌｔ  ａ  １０、Ａｌｔ  ａ  １２、Ａｌｔ  ａ  １３、Ｃａｎｄ  ａ  １、Ｃａｎｄ  ａ  ３  ａｎｄ  Ｃａｎｄ  ｂ  ２、Ｃｈａ  ｏ  １、Ｃｈａ  ｏ  ２、Ｃｕｐ  ａ  １、Ｃｕｐ  ｓ  １、Ｃｕｐ  ｓ  ３、Ｊｕｎ  ���  １、Ｊｕｎ  ａ  ２、Ｊｕｎ  ａ  ３、Ｊｕｎ  ｏ  ４、Ｊｕｎ  ｓ  １、Ｊｕｎ  ｖ  １  ａｎｄ  Ｊｕｎ  ｖ  ３、Ａｎｔ  ｏ  １、Ｃｙｎ  ｄ  １、Ｃｙｎ  ｄ  ７、Ｃｙｎ  ｄ  １２、Ｃｙｎ  ｄ  １５、Ｃｙｎ  ｄ  ２２ｗ、Ｃｙｎ  ｄ  ２３、Ｃｙｎ  ｄ  ２４、Ｄａｃ  ｇ  １、Ｄａｃ  ｇ  ２、Ｄａｃ  ｇ  ３、Ｄａｃ  ｇ  ４、Ｄａｃ  ｇ  ５、Ｆｅｓ  ｐ  ４、Ｈｏｌ  ｌ  １、Ｈｏｌ  ｌ  ５、Ｈｏｒ  ｖ  １、Ｈｏｒ  ｖ  ５、Ｌｏｌ  ｐ  １、Ｌｏｌ  ｐ  ２、Ｌｏｌ  ｐ  ３、Ｌｏｌ  ｐ  ４、Ｌｏｌ  ｐ  ５、Ｌｏｌ  ｐ  １１、Ｐａｓ  ｎ  １、Ｐｈａ  ａ  １、Ｐｈａ  ａ  ５、Ｐｈｌ  ｐ  １、Ｐｈｌ  ｐ  ２、Ｐｈｌ  ｐ  ４、Ｐｈｌ  ｐ  ５、Ｐｈｌ  ｐ  ６、Ｐｈｌ  ｐ  ７、Ｐｈｌ  ｐ  １１、Ｐｈｌ  ｐ  １２、Ｐｈｌ  ｐ  １３、Ｐｏａ  ｐ  １、Ｐｏａ  ｐ  ５、Ｓｅｃ  ｃ  １、Ｓｅｃ  Ｃ  ５、Ｓｅｃ  ｃ  ２０、Ｓｏｒ  ｈ  １、Ｔｒｉ  ａ  １５、Ｔｒｉ  ａ  ２１、Ｔｒｉ  ａ  ２７、Ｔｒｉ  ａ  ２８、Ｔｒｉ  ａ  ２９、Ｔｒｉ  ａ  ３０、Ｔｒｉ  ａ  ３１、Ｔｒｉ  ａ  ３２、Ｔｒｉ  ａ  ３３、Ｔｒｉ  ａ  ３４、Ｔｒｉ  ａ  ３５、Ｚｅａ  ｍ  １、Ｚｅａ  ｍ  １２、Ａｍｂ  ａ  １、Ａｍｂ  ａ  ２、Ａｍｂ  ａ  ３、Ａｍｂ  ａ  ４、Ａｍｂ  ａ  ５、Ａｍｂ  ａ  ６、Ａｍｂ  ａ  ７、Ａｍｂ  ａ  ８、Ａｍｂ  ａ  ９  ａｎｄ  Ａｍｂ  ａ  １０、Ａｍｂ  ｐ  ５、Ａｍｂ  ｔ  ５、Ａｒｔ  ｖ  １、Ａｒｔ  ｖ  ２、Ａｒｔ  ｖ  ３、Ａｒｔ  ｖ  ４、Ａｒｔ  ｖ  ５、Ａｒｔ  ｖ  ６、Ａｌｎ  ｇ  １、Ａｌｎ  ｇ  ４、Ｂｅｔ  ｖ  １、Ｂｅｔ  ｖ  ２、Ｂｅｔ  ｖ  ３、Ｂｅｔ  ｖ  ４、Ｂｅｔ  ｖ  ６、Ｂｅｔ  ｖ  ７、Ｃｏｒ  ａ  １０、Ｆｒａ  ｅ  １、Ｏｌｅ  ｅ  １、Ｏｌｅ  ｅ  ２、Ｏｌｅ  ｅ  ３、Ｏｌｅ  ｅ  ４、Ｏｌｅ  ｅ  ５、Ｏｌｅ  ｅ  ６、ＯＩｅ  ｅ  ７、Ｏｌｅ  ｅ  ８、Ｏｌｅ  ｅ  ９、Ｏｌｅ  ｅ  １０、Ｏｌｅ  ｅ  １１、Ｐｌａ  ａ  １、Ｐｌａ  ａ  ２、Ｐｌａ  ａ  ３、Ｐｌａ  ｏｒ  １、Ｐｌａ  ｏｒ  ２  ａｎｄ  Ｐｌａ  ｏｒ  ３、Ａｐｉ  ｃ  １、Ａｐｉ  ｄ  １、Ａｐｉ  ｍ  １、Ａｐｉ  ｍ  ２、Ａｐｉ  ｍ  ３、Ａｐｉ  ｍ  ４、Ａｐｉ  ｍ  ５、Ａｐｉ  ｍ  ６、Ａｐｉ  ｍ  ７、Ａｐｉ  ｍ  ８、Ａｐｉ  ｍ  ９、Ａｐｉ  ｍ  １０、Ａｐｉ  ｍ  １１、Ｂｏｍ  ｐ  １、Ｂｏｍ  ｐ  ４、Ｂｏｍ  ｔ  １、Ｂｏｍ  ｔ  ４、Ｄｏｌ  ａ  ５、Ｄｏｌ  ｍ  １、Ｄｏｌ  ｍ  ２、Ｄｏｌ  ｍ  ５、Ｐｏｌ  ａ  １、Ｐｏｌ  ａ  ２  ａｎｄ  Ｐｏｌ  ａ  ５、Ｐｏｌ  ｄ  １、Ｐｏｌ  ｄ  ４、Ｐｏｌ  ｄ  ５、Ｐｏｌ  ｅ  １、Ｐｏｌ  ｅ  ４  ａｎｄ  Ｐｏｌ  ｅ  ５、ＰｏＩ  ｆ  ５、Ｐｏｌ  ｇ  １、Ｐｏｌ  ｇ  ５、Ｐｏｌｙ  ｐ  １、Ｐｏｌｙ  ｓ  ５、Ｖｅｓｐ  ｃ  １、Ｖｅｓｐ  ｃ  ５、Ｖｅｓｐ  ｍａ  ２、Ｖｅｓｐ  ｍａ  ５、Ｖｅｓｐ  ｍ  １、Ｖｅｓｐ  ｍ  ５、Ｖｅｓ  ｇ  ５、Ｖｅｓ  ｍ  １、Ｖｅｓ  ｍ  ２、Ｖｅｓ  ｍ  ５、Ｖｅｓ  ｐ  ５、Ｖｅｓ  ｓ  １、Ｖｅｓ  ｓ  ５、Ｖｅｓ  ｖｉ  ５、Ｖｅｓ  ｖ  １、Ｖｅｓ  ｖ  ２、Ｖｅｓ  ｖ  ３、Ｖｅｓ  ｖ  ５、Ｈｅｖ  ｂ  １、Ｈｅｖ  ｂ  ２、Ｈｅｖ  ｂ  ３、Ｈｅｖ  ｂ  ４、Ｈｅｖ  ｂ、５  Ｈｅｖ  ｂ  ６、Ｈｅｖ  ｂ  ７、Ｈｅｖ  ｂ  ８、Ｈｅｖ  ｂ  ９、Ｈｅｖ  ｂ  １０、Ｈｅｖ  ｂ  １１、Ｈｅｖ  ｂ  １２、Ｈｅｖ  ｂ  １３  ａｎｄ  Ｈｅｖ  ｂ  １４、Ｈｏｒ  ｖ  １２、Ｈｏｒ  ｖ  １５、Ｈｏｒ  ｖ  １６、Ｈｏｒ  ｖ  １７、Ｈｏｒ  ｖ  ２１、Ｏｒｙ  ｓ  １２、Ｓｅｃ  ｃ  ２０、Ｔｒｉ  ａ  １２、Ｔｒｉ  ａ  １４、Ｔｎ  ａ  １８、Ｔｒｉ  ａ  １９、Ｔｒｉ  ａ  ２１、Ｔｒｉ  ａ  ２５、Ｔｒｉ  ａ  ２６、Ｔｒｉ  ａ  ３６、Ｚｅａ  ｍ  １４、Ｚｅａ  ｍ  ２５、Ａｒａ  ｈ  １、Ａｒａ  ｈ  ２、Ａｒａ  ｈ  ３、Ａｒａ  ｈ  ４、Ａｒａ  ｈ  ５、Ａｒａ  ｈ  ６、Ａｒａ  ｈ  ７、Ａｒａ  ｈ  ８、Ａｒａ  ｈ  ９、Ａｒａ  ｈ  １０、Ａｒａ  ｈ  １１、Ｃｏｒ  ａ  １、Ｃｏｒ  ａ  ２、Ｃｏｒ  ａ  ８、Ｃｏｒ  ａ  ９、Ｃｏｒ  ａ  １１、Ｃｏｒ  ａ  １２、Ｃｏｒ  ａ  １３、Ｃｏｒ  ａ  １４、Ｊｕｇ  ｎ  １、Ｊｕｇ  ｎ  ２、Ｊｕｇ  ｒ  １、Ｊｕｇ  ｒ  ２、Ｊｕｇ  ｒ  ３、Ｊｕｇ  ｒ  ４、Ｐｒｕ  ｄｕ  ３、Ｐｒｕ  ｄｕ  ４、Ｐｒｕ  ｄｕ  ５、Ｐｒｕ  ｄｕ  ６、Ａｎａ  ｏ  １、Ａｎａ  ｏ  ２、Ａｎａ  ｏ  ３、Ｐｉｓ  ｖ  １、Ｐｉｓ  ｖ  ２、Ｐｉｓ  ｖ  ３、Ｐｉｓ  ｖ  ４、Ｐｉｓ  ｖ  ５、Ｇｌｙ  ｍ  １、Ｇｌｙ  ｍ  ２、Ｇｌｙ  ｍ  ３、Ｇｌｙ  ｍ  ４、Ｇｌｙ  ｍ  ５およびＧｌｙ  ｍ  ６。
【００５５】
工程ａ）は、好塩基球をアレルゲンと接触させるための容器の中で行われ得る。好ましい実施形態において、上記容器は、マイクロタイタープレートである。さらに好ましい実施形態において、上記アレルゲン（単数または複数）は、凍結乾燥形態で容器中に先ず入れられ、水性溶液および全血サンプルの添加に際して液相へと変換される。
【００５６】
好ましい実施形態において、上記抗原は、Ａｒａ  ｈ  ７アイソタイプ７．０２０１（ＥＰ  １７０００２４５）である。さらに好ましい実施形態において、上記抗原は、ＥＰ  １６０００１６５．７に記載されるマカダミアナッツ抗原である。改変ポリペプチドはまた、抗原、例えば、ＥＰ  １５００１２７７．１に開示されるオレオシン構築物として使用され得る。
【００５７】
好ましい実施形態において、上記方法は、好塩基球の活性化を、好ましくは工程ｂ）の前に停止する工程を包含する。当業者は、その活性化反応を停止する種々の手段、例えば、ＥＤＴＡなどのカルシウム結合剤の添加、アジド（好ましくは、アジ化ナトリウム）の添加、またはサンプルの冷却（好ましくは高くても４℃の温度への）に精通している。
【００５８】
好ましくは，工程ａ）の後に、上記好塩基球は、工程ｂ）において富化される。好ましい実施形態において、用語「富化する」は、本明細書で使用される場合、全細胞の総数または白血球の数に対する、好ましくは全血サンプル中の白血球の数に対する好塩基球の数が、好ましくは少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍または１０００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍だけ増加することを意味すると理解される。これは、好ましくは、好塩基球が、それらの活性化状態に依存してまたは独立して、好ましくは独立して、好塩基球において発現され、それらの細胞表面に位置する一方で、他の細胞では、少なくとも他の細胞のうちの大部分では、僅かな程度でのみ存在するかまたは好ましくは全く存在しないポリペプチドへと第１の結合部位を介して特異的に結合するリガンドを結合するという点で起こる。このポリペプチドは、従って、血液サンプル中の細胞の総数に対して好塩基球を富化するための選択剤として適切でなければならない。この場合、その富化が完全に成功裡というわけでないが、少数の他の細胞がサンプル中に残っている場合（例えば、樹状細胞）、それは受容可能である。好ましくは、上記ポリペプチドは、好塩基球の活性化状態とは独立して好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドの群（これは、ＣＤ１２３（データベースコード  ＮＭ＿００２１８３）、ＣＤ１９３（ＮＰ＿００１８２８）、ＦｃεＲＩ（ＮＭ＿００２００１）、ＩｇＥ，  ＣＤ２０３ｃ（ＮＭ＿００５０２１）およびＣＲＴＨ２  （ＮＭ＿００４７７８）を含み、好ましくはＣＤ１２３またはＩｇＥであり、より好ましくはＣＤ１２３である）から選択される。本願において使用されるデータベースコードの全ては、番号によって特定されるデータベースにおいて優先日を生じる最先の出願の出願日にオンラインで利用可能になった配列に言及する。上記リガンドは、好ましくは、上記ポリペプチドに対するモノクローナル抗体、好ましくはＣＤ１２３またはＩｇＥに対する、より好ましくはＣＤ１２３に対するモノクローナル抗体である（Ａｇｉｓ，  Ｈ．，  Ｆｕｅｒｅｄｅｒ，  Ｗ．，  Ｂａｎｋｌ，  Ｈ．  Ｃ．，  Ｋｕｎｄｉ，  Ｍ．，  Ｓｐｅｒｒ，  Ｗ．  Ｒ．，  Ｗｉｌｌｈｅｉｍ，  Ｍ．，  ．．．  ＆  Ｖａｌｅｎｔ，  Ｐ．  （１９９６）．  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ，  ｂｌｏｏｄ  ｂａｓｏｐｈｉｌｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ８７（４），  ５３５−５４３．；  Ｓａｉｎｔｅ−Ｌａｕｄｙ，  Ｊ．  Ｓａｂｂａ，  Ａ．，  Ｖａｌｌｏｎ  Ｃ，  Ｇｕｅｒｉｎ  ＪＣ  （１９９８）．  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＩｇＥ  ａｎｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｂａｓｏｐｈｉｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ．  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｒｅｓ．  ４７（１０），  ４０１−８．）。なおより好ましい実施形態において、単離されたモノクローナル抗体が使用される。さらに好ましい実施形態において、上記好塩基球は、１種より多くのリ��ンド（上記リガンドは、好塩基球の活性化状態に依存してまたは独立して好塩基球において発現されかつそれらの細胞表面に位置するポリペプチドに第１の結合部位を介して特異的に結合し、ここで上記ポリペプチドは、好ましくは好塩基球の活性化状態とは独立して好塩基球の細胞表面において発現されるペプチドの群（これは、ＣＤ１２３（データベースコードＮＭ＿００２１８３）、ＣＤ１９３（ＮＰ＿００１８２８）、ＦｃεＲＩ（ＮＭ＿００２００１）、ＩｇＥ、ＣＤ２０３ｃ（ＮＭ＿００５０２１）およびＣＲＴＨ２（ＮＭ＿００４７７８）を含む）から選択される）、より好ましくは２種または３種のリガンド（ここでより好ましくは上記リガンドのうちの１つは、ＣＤ１２３である）に結合する。好塩基球の活性化状態に依存して好塩基球において発現され、かつそれらの細胞表面に位置するポリペプチドは、好ましくは、バソグラヌリン（ｂａｓｏｇｒａｎｕｌｉｎ）（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  Ａ，  ＭｃＥｕｅｎ  ＡＲ，  Ｂｕｃｋｌｅｙ  ＭＧ，  Ｗａｌｌｓ  ＡＦ．  Ｔｈｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｂａｓｏｇｒａｎｕｌｉｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＩｇＥ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ＩｇＥ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｔｉｍｕｌｉ：  ｖａｌｉｄｉｔｙ  ｏｆ  ｂａｓｏｇｒａｎｕｌｉｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｏｆ  ｂａｓｏｐｈｉｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００３  Ｊｕｌ；  １１２（１）：  １０２−８．）、２Ｄ７抗原（ＣＬ  Ｋｅｐｌｅｙ，  ＳＳ  Ｃｒａｉｇ  ａｎｄ  ＬＢ  Ｓｃｈｗａｒｔｚ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｂａｓｏｐｈｉｌｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｊｕｎｅ  １５，  １９９５，  １５４  （１２）  ６５４８−６５５５；）、アビジン結合メディエーター（Ｊｏｕｌｉａ  Ｒ，  Ｖａｌｉｔｕｔｔｉ  Ｓ，  Ｄｉｄｉｅｒ  Ａ，  Ｅｓｐｉｎｏｓａ  Ｅ．  Ｄｉｒｅｃｔ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｓｏｐｈｉｌ  ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａｖｉｄｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｂｅｓ．  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１７）、ＣＤ１３（ＮＭ＿００１１５０）、ＣＤ４５  （ＮＭ＿００１１５０）、ＣＤ６３（ＮＰ＿００１２４４３１８．１）、ＣＤ１０７ａ（ＮＭ＿００５５６）、ＣＤ１１ｂ（ＮＭ＿０００６３２）、ＣＤ６２Ｌ（ＮＭ＿０００６５５）、ＣＤ１１ｃ（ＸＭ＿０１１５４５８５２）、ＣＤ１６４（ＮＭ＿００１１４２４０１）、ＣＤ４５（ＮＭ＿００１２６７７９８）およびＣＤ２０３ｃ（ＮＭ＿００５０２１）を含む群から選択され、そして好ましくはＣＤ６３（Ｋｎｏｌ，  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍｕｌ，  Ｆ．  Ｐ．，  Ｊａｎｓｅｎ，  Ｈ．，  Ｃａｌａｆａｔ，  Ｊ．，  ＆  Ｒｏｏｓ，  Ｄ．  （１９９１）．  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｂａｓｏｐｈｉｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ＣＤ６３  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ４３５．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ８８（３），  ３２８−３３８��）である。
【００５９】
好ましくは、上記リガンドは、これを固体キャリア上に固定化するために、好ましくは具体的には、上記キャリアが相補的結合能力、より具体的には、上記リガンドに特異的に結合する能力を示す場合に、使用され得る第２の結合部位を含む。好ましくは、上記リガンドは、それ自体、ビオチン、ストレプトアビジン、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴ、アビジン、ニュートラアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、ＳタグおよびＭＢＰを含む群から選択される結合能力を有する分子を含む。上記固体キャリアは、好ましくはビーズ、好ましくは磁性ビーズ、マイクロタイタープレート、プラスチックから構成される反応容器およびガラスから構成される反応容器を含む群からのキャリアである。特に好ましい実施形態において、上記キャリアは、ビーズ、好ましくは磁性ビーズであり、そして上記ビーズを含む水性溶液は、マイクロタイタープレートのウェル中に置かれる。好ましい実施形態において、上記水性溶液は、工程ａ）および／または工程ｂ）において、例えば、撹拌または振盪によって連続して混合される。
【００６０】
上記方法の好ましい実施形態において、赤血球の溶解およびその後の除去は、好ましくは、工程ｂ）において行われる。赤血球を溶解するための方法は、当業者に、例えば、ＵＳ  ４９０２６１３、ＵＳ  ６１４３５６７またはＷＯ  ８５／０５６４０に記載されるように公知である。例えば、低張性溶解は、水単独で、またはジエチレングリコール、ホルムアルデヒドおよびクエン酸（ＵＳ  ４９０２６１３）の存在下で行われ得る。
【００６１】
赤血球の除去は、好ましくは遠心分離によって行われる。
【００６２】
好塩基球の活性化は、活性化に特徴的なマーカーの表面濃度が化学発光によって検出されるという点で、本発明に従って検出される。好ましくは、マーカーは、バソグラヌリン（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  Ａ，  ＭｃＥｕｅｎ  ＡＲ，  Ｂｕｃｋｌｅｙ  ＭＧ，  Ｗａｌｌｓ  ＡＦ．  Ｔｈｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｂａｓｏｇｒａｎｕｌｉｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＩｇＥ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ＩｇＥ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｔｉｍｕｌｉ：  ｖａｌｉｄｉｔｙ  ｏｆ  ｂａｓｏｇｒａｎｕｌｉｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｏｆ  ｂａｓｏｐｈｉｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００３  Ｊｕｌ；  １１２（１）：  １０２−８）、２Ｄ７抗原（ＣＬ  Ｋｅｐｌｅｙ，  ＳＳ  Ｃｒａｉｇ  ａｎｄ  ＬＢ  Ｓｃｈｗａｒｔｚ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｂａｓｏｐｈｉｌｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｊｕｎｅ  １５，  １９９５，  １５４  （１２）：  ６５４８−６５５５）、アビジン結合メディエーター（Ｊｏｕｌｉａ  Ｒ，  Ｖａｌｉｔｕｔｔｉ  Ｓ，  Ｄｉｄｉｅｒ  Ａ，  Ｅｓｐｉｎｏｓａ  Ｅ．  Ｄｉｒｅｃｔ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｓｏｐｈｉｌ  ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａｖｉｄｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｂｅｓ．  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１７）、ＣＤ１３（ＮＭ＿００１１５０）、ＣＤ４５（ＮＭ＿００１１５０）、ＣＤ６３（ＮＰ＿００１２４４３１８．１）、ＣＤ１０７ａ（ＮＭ＿００５５６）、ＣＤ１１ｂ（ＮＭ＿０００６３２）、ＣＤ６２Ｌ（ＮＭ＿０００６５５）、ＣＤ１１ｃ（ＸＭ＿０１１５４５８５２）、ＣＤ１６４（ＮＭ＿００１１４２４０１）、ＣＤ４５（ＮＭ＿００１２６７７９８）およびＣＤ２０３ｃ（ＮＭ＿００５０２１）を含む群から選択され、そして好ましくはＣＤ６３（Ｋｎｏｌ，  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍｕｌ，  Ｆ．  Ｐ．，  Ｊａｎｓｅｎ，  Ｈ．，  Ｃａｌａｆａｔ，  Ｊ．，  ＆  Ｒｏｏｓ，  Ｄ．  （１９９１）．  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｂａｓｏｐｈｉｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ＣＤ６３  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ４３５．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ８８（３），  ３２８−３３８）である。これらマーカーのうちの１種より多くを検出することは、可能である。この目的のために、活性化好塩基球に特徴的なマーカーに対するリガンド、好ましくはモノクローナル抗体が、好ましくは、化学発光が可能な標識とともに提供される。なおより好ましい実施形態において、単離されたモノクローナル抗体が使用される。
【００６３】
上記化学発光が可能な標識は、化学発光反応を触媒する酵素または適切な条件下で化学発光シグナルを自身で生成する分子、好ましくは後者の分子、より好ましくはアクリジニウムエステルまたはアクリジニウムスルホンアミドであり得る。工程ａ）の前に行われる工程において、活性化好塩基球に特徴的なマーカーに対するリガンドは、化学発光が可能な標識に連結され得る。例えば、上記モノクローナル抗体は、アクリジニウムエステル（ＡＥ）と混合され得る。ＡＥ化合物は、臨床診断のための自動化アッセイにおいて既に使用されている高特異的活性標識である（Ｉ  Ｗｅｅｋｓ，  Ｉ  Ｂｅｈｅｓｈｔｉ，  Ｆ  ＭｃＣａｐｒａ，  ＡＫ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  ＪＳ  Ｗｏｏｄｈｅａｄ．  Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒｓ  ａｓ  ｈｉｇｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｌａｂｅｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２９：  １４７４−１４７９  （１９８３））。抗体へのＡＥ化合物の連結は、十分に確立されており、通常は、フェノール環においてＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）などの官能基を介して達成される。この目的のために、精製抗体が、ＡＥ（例えば、Ｈｅｌｉｏｓｅｎｓｅという会社のＮＳＰ−ＳＡ−ＮＨＳ、ＮＳＰ−ＤＭＡＥまたはＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳ）と特定の期間にわたって室温で反応される。この後に、その標識された抗体は、カラムまたは他の精製法（例えば、ＨＰＬＣ）を使用して未反応の遊離ＡＥから分離される。
【００６４】
好ましい実施形態において、上記アクリジニウムエステルは、以下の式：
【化１】
2019032317.tif 000002
を有し、ここでＲ１は、アルキル、置換されたアルキル、アリール、または置換されたアリール基であり、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立して、水素またはアルキル、置換されたアルキル、ハロゲン、シアニド、ヒドロキシ、アルコキシ、チオール、またはアルキルメルカプト基を含む群から選択され、Ｙは、脱離基（好ましくはｐＫａ＜１２を有する）であり、好ましくはアリールオキシ、置換されたアリールオキシ、置換されたアルコキシ、メルカプト、置換されたメルカプト、スルホンアミジル、置換されたスルホンアミジル、Ｎ−ヒドロキシルアミド、または置換されたＮ−ヒドロキシルアミド基を含む群からのものであり、上記アクリジニウムエステルは、ポリペプチド（好ましくは抗体）に連結され得るかまたは連結される基、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）基を含む。適切な化合物および方法は、ＷＯ  ２０１２／０２８１６７に記載される。
【００６５】
化学発光検出キット（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｎという会社から）はまた、検出のために使用され得る。未結合抗体を洗浄した後に、２種のトリガーを連続して（各々１００μｌ；トリガー１：過酸化水素を含む；トリガー２：水酸化ナトリウムを含む）、ルミノメーターに自動的に添加する。この場合、アクリジニウムエステル化合物は、アルカリ性条件下で酸化され、それは、発光するアクリドンを生成する。このシグナルは、代表的には１〜５秒間持続する閃光の形態で発せられる（フラッシュルミネッセンス）。発光の短い持続時間は、開始および測定が検出器の中で直接行われることを必要とする。適切なルミノメーターは、マイクロタイタープレートにおける自動的なトリガー添加およびシグナルの検出を可能にする。より高い強度を達成するために、通常はシグナル全体が、測定間隔にわたって積分される。
【００６６】
代替手段は、酵素（好ましくはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼを含む群から選択される）への抗体の連結であり、上記酵素は、化学発光が可能な基質と反応し得る（Ｋｒｉｃｋａ  ＬＪ．  （２００３）．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａ  ｃｈｉｍｉｃａ  ａｃｔａ，  ５００（１）：  ２７９−２８６）。この場合、酵素に依存して、環式ジアシルヒドラジドの群からの基質（好ましくはルミノールまたはイソルミノール、アクリジン、ジオキセタンおよびその誘導体）が使用される。この目的に最も一般に使用される酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であり、これは、過酸化水素の存在下でルミノールの酸化を触媒する。このようにして発せられた光は、４２５ｎｍの波長で検出され得る。考えられるアプローチは、Ｎｅｕｐｅｒｔ，  Ｗ．，  Ｏｅｌｋｅｒｓ，  Ｒ．，  Ｂｒｕｎｅ，  Ｋ．，  Ｇｅｉｓｓｌｉｎｇｅｒ，  Ｇ．  Ａ  ｎｅｗ  ｒｅｌｉａｂｌｅ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  （ＣＬＩＡ）  ｆｏｒ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２  ｕｓｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌｕｍｉｎｏｌ  ａｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ．  １９９６  Ｎｏｖ；  ５２（５）：  ３８５−４０１に記載される。
【００６７】
さらなる代替手段は、電気化学発光の使用である。トリス（２，２−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）は、いくつかのイムノアッセイにおいて既に使用されている（Ｘｉａｏｍｉｎｇ  Ｚｈｏｕ，  Ｄｅｂｉｎ  Ｚｈｕ，  Ｙｕｈｕｉ  Ｌｉａｏ，  Ｗｅｉｐｅｎｇ  Ｌｉｕ，  Ｈｏｎｇｘｉｎｇ  Ｌｉｕ，  Ｚｈａｏｋｕｉ  Ｍａ  ＆  Ｄａ  Ｘｉｎｇ  （２０１４）．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  ｔｒｉｓ（２，２−ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）−ｂａｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｂｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ９，  ｐｐ．  １１４６−１１５９）。電流が印加された後、６２０ｎｍの最大発光を有する化学発光が、ルテニウム錯体とトリプロピルアミン（ＴＰＡ）との反応において、周りの媒体から生成される。好ましくは、化学発光が可能な標識は、化学発光が可能な金属錯体（好ましくは、ルテニウムを含む）である。
【００６８】
好ましい実施形態において、化学発光が可能な標識は、別の基による発光を触媒するか、またはその標識自体が、４００ｎｍもしくはこれより大きい、好ましくは４００ｎｍ〜６５０ｎｍ、より好ましくは４００ｎｍ〜５５０ｎｍ、より好ましくは４０５ｎｍ〜５００ｎｍ、より好ましくは４０５ｎｍ〜４９０ｎｍ、より好ましくは４１０〜４９０ｎｍ、より好ましくは４１０〜４５０ｎｍ、および最も好ましくは４１５〜４４５ｎｍの波長でルミネッセンスを発光する。適切な化合物および方法は、Ｎａｔｒａｊａｎら（２０１０）  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｌｉｇｈｔ  ｏｕｔｐｕｔ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７  Ｊｕｌｙ  ２０１０に記載される。
【００６９】
好ましくは、複数の反応は、マイクロタイタープレートの異なるウェルにおいて並行して行われ、その化学発光シグナルは、市販のプレートルミノメーター（例えば、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を使用して検出される。ここで、好塩基球活性化の程度は、未刺激コントロールに対して化学発光シグナルの強度または増加と相関する。陽性評価に関しては、当業者が慣用的に決定し得る試験基質に依存する閾値を、超えていなければならない。
【００７０】
好ましくは、上記方法は、先ず工程ａ）、続いて工程ｂ）、および最後に工程ｃ）の順序で行われる。しかし、まず工程ｂ）、続いて工程ａ）、およびその後工程ｃ）を行うことも可能である。あるいは、工程ｂ）および工程ｃ）は、同時にまたは重複する方法で行われ得る。
【００７１】
特に好ましい実施形態において、工程ａ）の後、好塩基球の活性化状態とは独立して好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドに特異的に結合するリガンドおよび化学発光が可能な標識とともに提供される活性化好塩基球に特徴的なマーカーに対するリガンドの両方が、好塩基球ともに水性溶液に添加される。より好ましくは、これは、キャリアの存在下で行われ、ここで上記好塩基球の活性化状態とは独立して好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドに特異的に結合するリガンドは、より好ましくは、ビーズなどの固体キャリア上に既に固定化されているかまたはその固定化に供される。この後に、その水性溶液は交換され得、その固定化された好塩基球が洗浄され得、ここで過剰なリガンドおよび未結合細胞が除去される。存在するとすれば、残っているものは、好塩基球の活性化状態とは独立して好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドに特異的に結合するリガンドを介して、キャリア上に固定される好塩基球である。これらの固定化好塩基球の中で、アレルゲンとの接触によって実際に活性化されるものは、活性化好塩基球に特徴的なマーカーに対するリガンドがそれらに結合されるという点で特徴づけられる。後者のリガンドがそれ自体、化学発光が可能な標識とともに提供されない場合、必要な場合、任意選択で、過剰なリガンドを除去するための洗浄工程の後に、そして次の工程において、後者のリガンドに結合する化学発光が可能な標識を有する二次抗体が添加され得、ここでこの抗体は、活性化好塩基球にのみ結合されたままであり、非活性化好塩基球には結合されない。過剰な二次抗体は、さらなる洗浄工程において除去され得る。
【００７２】
この後に、化学発光が測定される。この方法によって、特に、赤血球の除去と組み合わせにおいて、活性化の検出における感度のレベルは、好塩基球の低含有量に関わらず達成され得、そのレベルはフローサイトメトリーを使用する方法のレベルに匹敵する。
【００７３】
本発明に従う方法および／もしくは本発明に従うキット、または本発明に従うキットの中に含まれ得るものなどの１種もしくは１種より多くの試薬はまた、候補活性成分の選択から治療上有効な活性成分を同定するために、候補活性成分をスクリーニングするために使用され得る。この場合、工程ａ）は、好塩基球を候補活性成分と接触させる工程の後に行われる。治療上有効な候補活性成分の場合には、候補活性成分を含まないか、または有効でない候補活性成分を含むバッチと比べてより低いレベルの活性化が認められる。
【００７４】
好ましい実施形態において、用語「候補活性成分」とは、本明細書で使用される場合、患者において治療効果を有すると想定されるか、または好ましくはアレルギー反応を軽減もしくは防止するという意味においてかかる治療効果を有するかどうかを決定するために調べられるべき化合物に言及することが理解される。好ましい実施形態において、１種または１種より多くの既に既知の活性成分が、任意選択で、アレルギーに罹患している患者の下位群においてのみ有効であり、特定の患者において有効であるかどうかを決定するために調べられる。
【００７５】
本発明は、アレルギーを診断するために、またはアレルギーを診断するためのキットを生成するために、活性化好塩基球に特徴的なリガンドに対する化学発光が可能な標識を含むリガンドの使用に関する。本発明に従うキットはまた、アレルギーを診断するために使用され得る。生成は、リガンドへの化学発光が可能な標識の連結を含み得る。上記リガンドは、キット、組成物、または好塩基球の活性化状態とは独立して好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドに特異的に結合するリガンドとの別の組み合わせにおいて使用され得る。
【００７６】
本発明に従うキットは、アレルゲンの存在とは独立して好塩基球を活性化する試薬を含み得る。このような試薬は、先行技術において記載され、ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ）、イオノマイシン、１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）、ｆＭＬＰおよびＡ２３１８７、抗ヒトＩｇＧ、抗ＩｇＥレセプター抗体Ｃ４０／８０ならびにシノメニンを含むが、これらに限定されない。上記試薬は、好ましくは、ｆＭＬＰおよび／または抗Ｆｃイプシロン−ＲＩ、より好ましくはｆＭＬＰである。
【００７７】
本発明はさらに、サンプルの品質を効率的に、すなわち、ハイスループットに適している方法によって、決定するために使用される方法およびこの方法に適している試薬に関する。このような方法は、アレルゲンを使用して行われないので、診断上有用な結果を提供しないが、そのサンプル品質が別個のバッチにおいて行われる診断法に適しているかどうかに関して行われるべき推定を可能にする。
【００７８】
本発明に従う方法は、この目的のために行われ、ここで上記アレルゲンは、アレルゲンの存在とは独立して活性化可能な好塩基球を活性化することが公知の試薬によって置き換えられる。
【００７９】
さらなるまたは代替の陽性コントロールとして、患者サンプルの代わりに、好塩基球調製物がアレルゲンまたはアレルゲンの存在とは独立して活性化可能な好塩基球を活性化することが公知の試薬と組み合わせて添加され得る。ここで上記好塩基球調製物は、十分に反応性であることが公知である、すなわち、アレルゲンによって活性化可能である。それは、本発明に従うキット単独で、またはアレルゲンもしくはアレルゲンの存在とは独立して活性可能な好塩基球を活性化することが公知の試薬と組み合わせて使用され得る。
【００８０】
この方法は、診断方法の前に、その後に、またはそれと並行して、またはそれとは独立して、行われ得る。
【００８１】
本発明はさらに、好塩基球活性化を検出するか、または好塩基球を含むサンプルの品質、好ましくはサンプル中に含まれる好塩基球の活性化可能性を決定するための方法の信頼性を検証または確認するための非診断法に関し、上記方法は、以下の工程を包含する：
【００８２】
ａ）患者の全血サンプルに由来する好塩基球を、アレルゲンの存在とは独立して好塩基球を活性化する試薬と、上記アレルゲンによる好塩基球の活性化を可能にする条件下で接触させる工程、
ｂ）上記工程ａ）からの好塩基球を富化する工程、および
ｃ）活性化好塩基球を検出する工程、
ここで工程ｃ）における検出は、活性化好塩基球に特徴的なマーカーが化学発光によって検出されるという点で行われる。
【００８３】
アレルゲンの存在とは独立して好塩基球を活性化する試薬は、ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ；例えば、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）製）および／または抗ＩｇＥレセプター抗体であり得る。
【００８４】
以下において、本発明は、例示によって図面を参照しながら説明される。記載される実施形態は、あらゆる点において、限定ではない例証としてのみ理解されるべきであり、列挙される特徴の種々の組み合わせは、本発明の範囲内に含まれる。
【００８５】
本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
アレルギーを診断するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）患者の全血サンプルに由来する好塩基球を、水性溶液中の全血の体積含有量が少なくとも２０体積％である、全血の存在下での該水性溶液中のアレルゲンと、、該アレルゲンによる該好塩基球の活性化を可能にする条件下で接触させる工程、
ｂ）工程ａ）からの該好塩基球を富化する工程、および
ｃ）活性化好塩基球を検出する工程
を包含し、
ここで工程ｃ）における該検出は、好塩基球に関する好塩基球の表面に位置するマーカーが化学発光によって検出されるという点で行われ、
ここで工程ｂ）において、好塩基球は、該好塩基球が、活性化好塩基球に特徴的なマーカーであるポリペプチドに特異的に結合するリガンドに結合するという点で富化され、
そして／または工程ｃ）における該検出は、活性化好塩基球に特徴的なマーカーが化学発光によって検出されるという点で行われる、
方法。
（項目１Ａ）
アレルギーの指標として活性化好塩基球を使用するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）患者の全血サンプルに由来する好塩基球を、水性溶液中の全血の体積含有量が少なくとも２０体積％である、全血の存在下での該水性溶液中のアレルゲンと、、該アレルゲンによる該好塩基球の活性化を可能にする条件下で接触させる工程、
ｂ）工程ａ）からの該好塩基球を富化する工程、および
ｃ）活性化好塩基球を検出する工程
を包含し、
ここで工程ｃ）における該検出は、好塩基球に関する好塩基球の表面に位置するマーカーが化学発光によって検出されるという点で行われ、
ここで工程ｂ）において、好塩基球は、該好塩基球が、活性化好塩基球に特徴的なマーカーであるポリペプチドに特異的に結合するリガンドに結合するという点で富化され、
そして／または工程ｃ）における該検出は、活性化好塩基球に特徴的なマーカーが化学発光によって検出されるという点で行われる、
方法。
（項目２）
前記全血は、非処理全血である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３）
工程ａ）は、水性溶液中で、少なくとも３０体積％、好ましくは３５体積％、より好ましくは４０体積％、より好ましくは４５体積％の全血含有量で行われる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
好ましくは工程ｂ）の前に、前記好塩基球の活性化を停止する工程を包含する、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
工程ｂ）において、前記好塩基球は、該好塩基球が、好ましくは該好塩基球の活性化状態とは独立して好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドに特異的に結合するリガンドに結合するという点で富化される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記リガンドは、前記ポリペプチドに対するモノクローナル抗体である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
工程ｂ）において、前記好塩基球は、固定化される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記好塩基球は、ビーズ、好ましくは磁性ビーズ上に固定化される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記好塩基球は、固定化後に洗浄される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
工程ｂ）において、赤血球は、溶解および除去される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記赤血球は、前記好塩基球の固定化の前に遠心分離によって除去される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記検出は、工程ｃ）において、好塩基球の表面に位置する前記マーカー、好ましくは活性化好塩基球に特徴的なマーカーに対して化学発光が可能な標識とともに提供されるリガンドを使用して行われる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
化学発光が可能な標識とともに提供される前記リガンドは、それ自体が、化学発光が可能な標識を含むか、または化学発光が可能な標識を有する二次抗体に結合するモノクローナル抗体である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
工程ａ）、工程ｂ）および工程ｃ）は、マイクロタイタープレートのウェル中で行われる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
工程ａ）は、工程ｂ）および工程ｃ）の前に行われる、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
キットであって、
好塩基球をアレルゲンに接触させるための容器であって、ここで該容器は、好ましくはマイクロタイタープレートである、容器、
任意選択で、アレルゲン、ならびに
好塩基球を富化するための好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドに対するリガンド、および好塩基球の細胞表面に位置する検出のためのマーカーに対するリガンドであって、
ここで好塩基球の表面に位置する検出のための該マーカーに対する該リガンドは、化学発光が可能な標識を含み、
ここで化学発光が可能な該標識は、化学発光反応を触媒する酵素または適切な条件下で化学発光シグナルを自身で生成する分子であり得、ここで前者の場合の該酵素は、化学発光が可能な基質溶液と組み合わせて該キット中に含まれ、
そしてここで好塩基球の細胞表面に位置する該ポリペプチドおよび／または好塩基球の細胞表面に位置する該マーカーは、活性化好塩基球に特徴的である、
リガンド、
任意選択で、該好塩基球の活性化を停止するための作用物質、ならびに
任意選択で、赤血球を溶解および／または除去するための作用物質、
を含む、キット。
（項目１７）
アレルギーを診断するための、アレルギーを診断するキットを生成するための、またはアレルゲンに対するアレルギーの処置のための候補活性成分をスクリーニングするための、
細胞表面に位置する検出のためのマーカーに対するリガンドと組み合わせた、好塩基球を富化するための好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドに対するリガンドの使用であって、
ここで好塩基球の細胞表面に位置する検出のための該マーカーに対する該リガンドは、化学発光が可能な標識を含み、
ここで化学発光が可能な該標識は、化学発光反応を触媒する酵素または適切な条件下で化学発光シグナルを自身で生成する分子であり得、ここで前者の場合の該酵素は、化学発光が可能な基質溶液と組み合わせて使用され、
そしてここで好塩基球の細胞表面に位置する該ポリペプチドおよび／または好塩基球の細胞表面に位置する該マーカーは、活性化好塩基球に特徴的である、
使用。
（項目１７Ａ）
アレルギーを診断するための、アレルギーを診断するキットを生成するための、またはアレルゲンに対するアレルギーの処置のための候補活性成分をスクリーニングするための、
好塩基球を富化するための好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドに対するリガンドを、好塩基球の細胞表面に位置する検出のためのマーカーに対するリガンドと一緒に含む組み合わせ物であって、
ここで好塩基球の細胞表面に位置する検出のための該マーカーに対する該リガンドは、化学発光が可能な標識を含み、
ここで化学発光が可能な該標識は、化学発光反応を触媒する酵素または適切な条件下で化学発光シグナルを自身で生成する分子であり得、ここで前者の場合の該酵素は、化学発光が可能な基質溶液と組み合わせて使用され、
そしてここで好塩基球の細胞表面に位置する該ポリペプチドおよび／または好塩基球の細胞表面に位置する該マーカーは、活性化好塩基球に特徴的である、
組み合わせ物。
【００８６】
開示の摘要
本発明は、以下に関する：アレルギーを診断するための方法であって、上記方法は、患者の全血サンプルに由来する好塩基球を、水性溶液中の全血の体積含有量が少なくとも２０体積％である、全血の存在下での上記水性溶液中のアレルゲンと、アレルゲンによる好塩基球の活性化を可能にする条件下で接触させる工程、工程ａ）からの好塩基球を富化する工程および活性化好塩基球を検出する工程を包含し、ここで上記検出は、活性化好塩基球に特徴的なマーカーの発現が化学発光によって検出されるという点で行われる方法；ならびに、キットであって、以下：好ましくはマイクロタイタープレートである、好塩基球をアレルゲンと接触させるための容器、任意選択で、アレルゲン、好ましくは化学発光が可能な標識とともに提供されるマーカーに対するリガンド（ここで該リガンドは、より好ましくはモノクローナル抗体である）である、化学発光によって活性化好塩基球に特徴的なマーカーを検出するための作用物質、、任意選択で、好塩基球の活性化を停止するための作用物質、任意選択で、好塩基球の活性化状態とは独立して好塩基球の細胞表面に位置するポリペプチドに結合する固定化可能なリガンド（ここで上記リガンドは、好ましくは上記ポリペプチドに対するモノクローナル抗体である）、および任意選択で、赤血球を溶解および／または除去するための作用物質、を含むキット。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１−１】図１は、フラッシュ化学発光相対発光量（relative  light  unit）（ＲＬＵ；図１ａ〜ｄ）において測定される本発明に従う方法の結果を示す。各場合において、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｔ２：ニワトコ花粉抽出物；ｔ３：カバノキ花粉抽出物；ｔ４：ハシバミ花粉抽出物）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化を化学発光試験によって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、絶対ＲＬＵ測定値を示す。その測定値はまた、棒の上に示される。図１ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）ならびに抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。図１ｂは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のニワトコ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図１ｃは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のカバノキ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図１ｄは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のハシバミ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。決定を三連で行った。平均値および標準偏差を計算した。図１ｅ〜ｈは、図１ａ〜ｄに示されるサンプルに関して、（活性化サンプルのＲＬＵの平均値）／（陰性コントロールのＲＬＵの平均値）として計算した刺激指数（ＳＩ）を示す。
【図１−２】図１は、フラッシュ化学発光相対発光量（relative  light  unit）（ＲＬＵ；図１ａ〜ｄ）において測定される本発明に従う方法の結果を示す。各場合において、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｔ２：ニワトコ花粉抽出物；ｔ３：カバノキ花粉抽出物；ｔ４：ハシバミ花粉抽出物）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化を化学発光試験によって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、絶対ＲＬＵ測定値を示す。その測定値はまた、棒の上に示される。図１ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）ならびに抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。図１ｂは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のニワトコ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図１ｃは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のカバノキ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図１ｄは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のハシバミ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。決定を三連で行った。平均値および標準偏差を計算した。図１ｅ〜ｈは、図１ａ〜ｄに示されるサンプルに関して、（活性化サンプルのＲＬＵの平均値）／（陰性コントロールのＲＬＵの平均値）として計算した刺激指数（ＳＩ）を示す。
【００８８】
【図２−１】図２は、％（図２ａ〜ｄ）でまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ；図２ｅ〜ｈ）として、好塩基球活性化試験と活性化好塩基球のフローサイトメトリーでの決定とを示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１ｎｇ）の図１の試験におけるものと同じアレルゲン抽出物（ｔ２：ニワトコ花粉抽出物；  ｔ３：カバノキ花粉抽出物；  ｔ４：ハシバミ花粉抽出物）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化をフローサイトメトリーによって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、活性化好塩基球の含有量を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図２ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）ならびに抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。好塩基球のうちのおよそ３０％は、両方の陽性コントロールにおいて活性化した。１０％より高い刺激において、反応を陽性と評価した。図２ｂは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のニワトコ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図２ｃは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のカバノキ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図２ｄは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のハシバミ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。ＣＤ１２３＋／ＨＬＡ−ＤＲ−表現型を有する細胞を、好塩基球として同定し、活性化を抗ＣＤ６３−ＶｉｏＢｌｕｅで検出した。
【図２−２】図２は、％（図２ａ〜ｄ）でまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ；図２ｅ〜ｈ）として、好塩基球活性化試験と活性化好塩基球のフローサイトメトリーでの決定とを示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１ｎｇ）の図１の試験におけるものと同じアレルゲン抽出物（ｔ２：ニワトコ花粉抽出物；  ｔ３：カバノキ花粉抽出物；  ｔ４：ハシバミ花粉抽出物）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化をフローサイトメトリーによって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、活性化好塩基球の含有量を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図２ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）ならびに抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。好塩基球のうちのおよそ３０％は、両方の陽性コントロールにおいて活性化した。１０％より高い刺激において、反応を陽性と評価した。図２ｂは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のニワトコ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図２ｃは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のカバノキ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図２ｄは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のハシバミ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。ＣＤ１２３＋／ＨＬＡ−ＤＲ−表現型を有する細胞を、好塩基球として同定し、活性化を抗ＣＤ６３−ＶｉｏＢｌｕｅで検出した。
【００８９】
好塩基球の最大反応性は、それぞれの使用される最高濃度での花粉抽出物に応じて、８０〜８８％であり、アレルゲン抽出物の希釈率が増加するとともに、一定に低下した。
【００９０】
【図３−１】図３は、フラッシュ化学発光相対発光量（ＲＬＵ；図３ａ〜ｄ）で測定した本発明に従う方法の結果を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｆ４９：リンゴ抽出物；  ｇ６：オオアワガエリ花粉抽出物；  ｔ３：カバノキ花粉抽出物）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化を化学発光試験によって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、絶対ＲＬＵ測定値を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図３ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）および抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。図３ｂは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のリンゴ抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図３ｃは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のオオアワガエリ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図３ｄは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のカバノキ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。決定を三連で行った。平均値および標準偏差を計算した。図３ｅ〜ｈは、図３ａ〜ｄにおいて示されるサンプルに関して、（活性化サンプルのＲＬＵの平均値）／（陰性コントロールのＲＬＵの平均値）として計算した刺激指数（ＳＩ）を示す。
【図３−２】図３は、フラッシュ化学発光相対発光量（ＲＬＵ；図３ａ〜ｄ）で測定した本発明に従う方法の結果を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｆ４９：リンゴ抽出物；  ｇ６：オオアワガエリ花粉抽出物；  ｔ３：カバノキ花粉抽出物）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化を化学発光試験によって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、絶対ＲＬＵ測定値を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図３ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）および抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。図３ｂは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のリンゴ抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図３ｃは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のオオアワガエリ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図３ｄは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のカバノキ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。決定を三連で行った。平均値および標準偏差を計算した。図３ｅ〜ｈは、図３ａ〜ｄにおいて示されるサンプルに関して、（活性化サンプルのＲＬＵの平均値）／（陰性コントロールのＲＬＵの平均値）として計算した刺激指数（ＳＩ）を示す。
【００９１】
【図４−１】図４は、％（図４ａ〜ｄ）でまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ；図４ｅ〜ｈ）として、好塩基球活性化試験と活性化好塩基球のフローサイトメトリーによる決定を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｆ４９：リンゴ抽出物；  ｇ６：オオアワガエリ花粉抽出物；  ｔ３：カバノキ花粉抽出物）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化をフローサイトメトリーによって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、活性化好塩基球の含有量を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図４ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）および抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。好塩基球のうちのおよそ３０％は、両方の陽性コントロールにおいて活性化した。１０％より高い刺激において、反応を陽性と評価した。図４ｂは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のリンゴ抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図４ｃは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のオオアワガエリ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図４ｄは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のカバノキ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。ＣＤ１２３＋／ＨＬＡ−ＤＲ−表現型を有する細胞を好塩基球と同定し、活性化を抗ＣＤ６３−ＶｉｏＢｌｕｅで検出した。
【図４−２】図４は、％（図４ａ〜ｄ）でまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ；図４ｅ〜ｈ）として、好塩基球活性化試験と活性化好塩基球のフローサイトメトリーによる決定を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｆ４９：リンゴ抽出物；  ｇ６：オオアワガエリ花粉抽出物；  ｔ３：カバノキ花粉抽出物）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化をフローサイトメトリーによって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、活性化好塩基球の含有量を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図４ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）および抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。好塩基球のうちのおよそ３０％は、両方の陽性コントロールにおいて活性化した。１０％より高い刺激において、反応を陽性と評価した。図４ｂは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のリンゴ抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図４ｃは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のオオアワガエリ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図４ｄは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のカバノキ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。ＣＤ１２３＋／ＨＬＡ−ＤＲ−表現型を有する細胞を好塩基球と同定し、活性化を抗ＣＤ６３−ＶｉｏＢｌｕｅで検出した。
【００９２】
抽出物に応じて、好塩基球の最大反応性は、それぞれの使用される最高濃度で９６〜６５％であり、アレルゲン抽出物の希釈率が増加するとともに一定に低下した。
【００９３】
【図５−１】図５は、フラッシュ化学発光相対発光量（ＲＬＵ；図５ａ〜ｄ）で測定した本発明に従う方法の結果を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｅ９４：ｒＦｅｌｄ  ｄ  １；  ｔ３：カバノキ花粉抽出物；  ｗ６：ヨモギ花粉抽出物）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化を化学発光試験によって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、絶対ＲＬＵ測定値を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図５ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）および抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。図５ｂは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のｒＦｅｌ  ｄ  １で刺激したサンプルの反応を示す。図５ｃは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のカバノキ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図５ｄは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のヨモギ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。決定を三連で行った。平均値および標準偏差を計算した。図５ｅ〜ｈは、図５ａ〜ｄに示されるサンプルに関して、（活性化サンプルのＲＬＵの平均値）／（陰性コントロールのＲＬＵの平均値）として計算した刺激指数（ＳＩ）を示す。
【図５−２】図５は、フラッシュ化学発光相対発光量（ＲＬＵ；図５ａ〜ｄ）で測定した本発明に従う方法の結果を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｅ９４：ｒＦｅｌｄ  ｄ  １；  ｔ３：カバノキ花粉抽出物；  ｗ６：ヨモギ花粉抽出物）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化を化学発光試験によって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、絶対ＲＬＵ測定値を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図５ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）および抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。図５ｂは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のｒＦｅｌ  ｄ  １で刺激したサンプルの反応を示す。図５ｃは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のカバノキ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図５ｄは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のヨモギ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。決定を三連で行った。平均値および標準偏差を計算した。図５ｅ〜ｈは、図５ａ〜ｄに示されるサンプルに関して、（活性化サンプルのＲＬＵの平均値）／（陰性コントロールのＲＬＵの平均値）として計算した刺激指数（ＳＩ）を示す。
【００９４】
【図６−１】図６は、％（図６ａ〜ｄ）でまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ；図６ｅ〜ｈ）として、好塩基球活性化試験と活性化好塩基球のフローサイトメトリーによる決定を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｅ９４：ｒＦｅｌｄ  ｄ  １；  ｔ３：カバノキ花粉抽出物；  ｗ６：ヨモギ花粉抽出物）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化をフローサイトメトリーによって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、活性化好塩基球の含有量を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図６ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）および抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。好塩基球のうちのおよそ４０％は、両方の陽性コントロールにおいて活性化した。１０％より高い刺激において、反応を陽性と評価した。図６ｂは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のｒＦｅｌ  ｄ  １で刺激したサンプルの反応を示す。図６ｃは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のカバノキ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図６ｄは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のヨモギ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。ＣＤ１２３＋／ＨＬＡ−ＤＲ−表現型を有する細胞を好塩基球として同定し、活性化を抗ＣＤ６３−ＶｉｏＢｌｕｅで検出した。
【図６−２】図６は、％（図６ａ〜ｄ）でまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ；図６ｅ〜ｈ）として、好塩基球活性化試験と活性化好塩基球のフローサイトメトリーによる決定を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｅ９４：ｒＦｅｌｄ  ｄ  １；  ｔ３：カバノキ花粉抽出物；  ｗ６：ヨモギ花粉抽出物）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化をフローサイトメトリーによって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、活性化好塩基球の含有量を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図６ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）および抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。好塩基球のうちのおよそ４０％は、両方の陽性コントロールにおいて活性化した。１０％より高い刺激において、反応を陽性と評価した。図６ｂは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のｒＦｅｌ  ｄ  １で刺激したサンプルの反応を示す。図６ｃは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のカバノキ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図６ｄは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のヨモギ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。ＣＤ１２３＋／ＨＬＡ−ＤＲ−表現型を有する細胞を好塩基球として同定し、活性化を抗ＣＤ６３−ＶｉｏＢｌｕｅで検出した。
【００９５】
抽出物に応じて、好塩基球の最大反応性は、７３〜１２％であった。
【００９６】
【図７−１】図７は、フラッシュ化学発光相対発光量（ＲＬＵ；図７ａ〜ｄ）で測定した本発明に従う方法の結果を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｅ２：イヌの毛抽出物；  ｉ３：スズメバチ（ｗａｓｐ）毒液抽出物；  ｉ２０９：  ｒＶｅｓ  ｖ  ５）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化を化学発光試験によって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、絶対ＲＬＵ測定値を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図７ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）および抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。図７ｂは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のイヌの毛抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図７ｃは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のスズメバチ毒液抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図７ｄは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のｒＶｅｓ  ｖ  ５で刺激したサンプルの反応を示す。決定を三連で行った。平均値および標準偏差を計算した。図７ｅ〜ｈは、図７ａ〜ｄにおいて示されるサンプルに関して、（活性化サンプルのＲＬＵの平均値）／（陰性コントロールのＲＬＵの平均値）として計算した刺激指数（ＳＩ）を示す。
【図７−２】図７は、フラッシュ化学発光相対発光量（ＲＬＵ；図７ａ〜ｄ）で測定した本発明に従う方法の結果を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｅ２：イヌの毛抽出物；  ｉ３：スズメバチ（ｗａｓｐ）毒液抽出物；  ｉ２０９：  ｒＶｅｓ  ｖ  ５）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化を化学発光試験によって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、絶対ＲＬＵ測定値を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図７ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）および抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。図７ｂは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のイヌの毛抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図７ｃは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のスズメバチ毒液抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図７ｄは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のｒＶｅｓ  ｖ  ５で刺激したサンプルの反応を示す。決定を三連で行った。平均値および標準偏差を計算した。図７ｅ〜ｈは、図７ａ〜ｄにおいて示されるサンプルに関して、（活性化サンプルのＲＬＵの平均値）／（陰性コントロールのＲＬＵの平均値）として計算した刺激指数（ＳＩ）を示す。
【００９７】
【図８−１】図８は、％（図８ａ〜ｄ）でまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ；図８ｅ〜ｈ）として、好塩基球活性化試験と活性化好塩基球のフローサイトメトリーによる決定を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｅ２：イヌの毛抽出物；  ｉ３：スズメバチ毒液抽出物；  ｉ２０９：ｒＶｅｓ  ｖ  ５）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化をフローサイトメトリーによって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、活性化好塩基球の含有量を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図８ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）および抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。好塩基球のうちのおよそ３０％は、両方の陽性コントロールにおいて活性化した。１０％より高い刺激において、反応を陽性と評価した。図８ｂは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のイヌの毛抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図８ｃは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のスズメバチ毒液抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図８ｄは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のｒＶｅｓ  ｖ  ５で刺激したサンプルの反応を示す。ＣＤ１２３＋／ＨＬＡ−ＤＲ−表現型を有する細胞を好塩基球と同定し、活性化を抗ＣＤ６３−ＶｉｏＢｌｕｅで検出した。
【図８−２】図８は、％（図８ａ〜ｄ）でまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ；図８ｅ〜ｈ）として、好塩基球活性化試験と活性化好塩基球のフローサイトメトリーによる決定を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｅ２：イヌの毛抽出物；  ｉ３：スズメバチ毒液抽出物；  ｉ２０９：ｒＶｅｓ  ｖ  ５）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化をフローサイトメトリーによって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、活性化好塩基球の含有量を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図８ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）および抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。好塩基球のうちのおよそ３０％は、両方の陽性コントロールにおいて活性化した。１０％より高い刺激において、反応を陽性と評価した。図８ｂは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のイヌの毛抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図８ｃは、種々の濃度（１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）のスズメバチ毒液抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図８ｄは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ）のｒＶｅｓ  ｖ  ５で刺激したサンプルの反応を示す。ＣＤ１２３＋／ＨＬＡ−ＤＲ−表現型を有する細胞を好塩基球と同定し、活性化を抗ＣＤ６３−ＶｉｏＢｌｕｅで検出した。
【００９８】
抽出物に応じて、好塩基球の最大反応性は、２５〜８％であった。
【００９９】
【図９−１】図９は、フラッシュ化学発光相対発光量（ＲＬＵ；図９ａ〜ｄ）で測定した本発明に従う方法の結果を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１００ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｗ８：タンポポ花粉抽出物；  ｆ１７：ヘーゼルナッツ抽出物；  ｆ４９：リンゴ抽出物；  ｅ９４  ｒＦｅｌ  ｄ  １）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化を化学発光試験によって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、絶対ＲＬＵ測定値を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図９ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）および抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。図９ｂは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のタンポポ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図９ｃは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のヘーゼルナッツ抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図９ｄは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のリンゴ抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図９ｅは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のｒＦｅｌ  ｄ  １で刺激したサンプルの反応を示す。決定を三連で行った。平均値および標準偏差を計算した。図９ｆ〜ｊは、図９ａ〜ｅに示されるサンプルに関して、（活性化サンプルのＲＬＵの平均値）／（陰性コントロールのＲＬＵの平均値）として計算した刺激指数（ＳＩ）を示す。
【図９−２】図９は、フラッシュ化学発光相対発光量（ＲＬＵ；図９ａ〜ｄ）で測定した本発明に従う方法の結果を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１００ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｗ８：タンポポ花粉抽出物；  ｆ１７：ヘーゼルナッツ抽出物；  ｆ４９：リンゴ抽出物；  ｅ９４  ｒＦｅｌ  ｄ  １）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化を化学発光試験によって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、絶対ＲＬＵ測定値を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図９ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）および抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。図９ｂは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のタンポポ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図９ｃは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のヘーゼルナッツ抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図９ｄは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のリンゴ抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図９ｅは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のｒＦｅｌ  ｄ  １で刺激したサンプルの反応を示す。決定を三連で行った。平均値および標準偏差を計算した。図９ｆ〜ｊは、図９ａ〜ｅに示されるサンプルに関して、（活性化サンプルのＲＬＵの平均値）／（陰性コントロールのＲＬＵの平均値）として計算した刺激指数（ＳＩ）を示す。
【図９−３】図９は、フラッシュ化学発光相対発光量（ＲＬＵ；図９ａ〜ｄ）で測定した本発明に従う方法の結果を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１００ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｗ８：タンポポ花粉抽出物；  ｆ１７：ヘーゼルナッツ抽出物；  ｆ４９：リンゴ抽出物；  ｅ９４  ｒＦｅｌ  ｄ  １）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化を化学発光試験によって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、絶対ＲＬＵ測定値を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図９ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）および抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。図９ｂは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のタンポポ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図９ｃは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のヘーゼルナッツ抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図９ｄは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のリンゴ抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図９ｅは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のｒＦｅｌ  ｄ  １で刺激したサンプルの反応を示す。決定を三連で行った。平均値および標準偏差を計算した。図９ｆ〜ｊは、図９ａ〜ｅに示されるサンプルに関して、（活性化サンプルのＲＬＵの平均値）／（陰性コントロールのＲＬＵの平均値）として計算した刺激指数（ＳＩ）を示す。
【０１００】
【図１０−１】図１０は、％（図１０ａ〜ｅ）でまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ；図１０ｆ〜ｊ）として、好塩基球活性化試験と活性化好塩基球のフローサイトメトリーでの決定を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１００ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｗ８：タンポポ花粉抽出物；  ｆ１７：ヘーゼルナッツ抽出物；  ｆ４９：リンゴ抽出物；  ｅ９４  ｒＦｅｌ  ｄ  １）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化をフローサイトメトリーによって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、活性化好塩基球の含有量を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図１０ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）および抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。好塩基球のうちのおよそ３０％は、両方の陽性コントロールにおいて活性化した。１０％より高い刺激において、反応を陽性と評価した。図１０ｂは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のタンポポ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図１０ｃは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のヘーゼルナッツ抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図１０ｄは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のリンゴ抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図１０ｅは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のｒＦｅｌ  ｄ  １で刺激したサンプルの反応を示す。ＣＤ１２３＋／ＨＬＡ−ＤＲ−表現型を有する細胞を好塩基球として同定し、活性化を抗ＣＤ６３−ＶｉｏＢｌｕｅで検出した。
【図１０−２】図１０は、％（図１０ａ〜ｅ）でまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ；図１０ｆ〜ｊ）として、好塩基球活性化試験と活性化好塩基球のフローサイトメトリーでの決定を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１００ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｗ８：タンポポ花粉抽出物；  ｆ１７：ヘーゼルナッツ抽出物；  ｆ４９：リンゴ抽出物；  ｅ９４  ｒＦｅｌ  ｄ  １）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化をフローサイトメトリーによって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、活性化好塩基球の含有量を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図１０ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）および抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。好塩基球のうちのおよそ３０％は、両方の陽性コントロールにおいて活性化した。１０％より高い刺激において、反応を陽性と評価した。図１０ｂは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のタンポポ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図１０ｃは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のヘーゼルナッツ抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図１０ｄは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のリンゴ抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図１０ｅは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のｒＦｅｌ  ｄ  １で刺激したサンプルの反応を示す。ＣＤ１２３＋／ＨＬＡ−ＤＲ−表現型を有する細胞を好塩基球として同定し、活性化を抗ＣＤ６３−ＶｉｏＢｌｕｅで検出した。
【図１０−３】図１０は、％（図１０ａ〜ｅ）でまたは平均蛍光強度（ＭＦＩ；図１０ｆ〜ｊ）として、好塩基球活性化試験と活性化好塩基球のフローサイトメトリーでの決定を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、種々の濃度（１０μｇ〜１００ｎｇ）のアレルゲン抽出物（ｗ８：タンポポ花粉抽出物；  ｆ１７：ヘーゼルナッツ抽出物；  ｆ４９：リンゴ抽出物；  ｅ９４  ｒＦｅｌ  ｄ  １）またはコントロール（抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰ）で刺激し、好塩基球活性化をフローサイトメトリーによって決定した。それぞれの棒グラフは、アレルゲン濃度またはコントロールに応じて、活性化好塩基球の含有量を示す。測定値はまた、棒の上に示される。図１０ａは、未刺激コントロール（陰性コントロール）および抗ＦｃεＲＩおよびｆＭＬＰでのコントロール刺激の反応を示す。好塩基球のうちのおよそ３０％は、両方の陽性コントロールにおいて活性化した。１０％より高い刺激において、反応を陽性と評価した。図１０ｂは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のタンポポ花粉抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図１０ｃは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のヘーゼルナッツ抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図１０ｄは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のリンゴ抽出物で刺激したサンプルの反応を示す。図１０ｅは、種々の濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のｒＦｅｌ  ｄ  １で刺激したサンプルの反応を示す。ＣＤ１２３＋／ＨＬＡ−ＤＲ−表現型を有する細胞を好塩基球として同定し、活性化を抗ＣＤ６３−ＶｉｏＢｌｕｅで検出した。
【０１０１】
抽出物に応じて、好塩基球の最大反応性は、８９〜３７％であった。
【０１０２】
【図１１】図１１は、異なる検出システムでの未刺激コントロール（陰性コントロール）のｆＭＬＰでの刺激後の患者サンプルの結果を示す。図１１ａは、フラッシュ化学発光相対発光量（ＲＬＵ）で測定した本発明に従う方法の結果を示す。図１１ｂは、蛍光強度（ＦＩ）として測定した蛍光標識抗体（抗ＣＤ６３−ＦＩＴＣ；２μｇ／ｍｌ）での検出後の本発明の方法に従って行われる好塩基球の活性化の結果を示す。図１１ｃは、好塩基球活性化試験と活性化好塩基球のフローサイトメトリーでの決定を示す。各場合に、花粉に対してアレルギーのある個人に由来する全血５０μｌを、ｆＭＬＰで刺激したかまたは未刺激のままにしておいた（陰性コントロール）。次いで、好塩基球活性化を、上記の方法によって決定した。それぞれの棒グラフは、ＲＬＵ（図１１ａ）もしくはＦＩ（図１１ｂ）での絶対測定値または％（図１１ｃ）での好塩基球活性化を示す。
【０１０３】
【図１２−１】図１２は、好塩基球の富化および検出のための種々の抗体組み合わせを使用する、ｆＭＬＰでの刺激後の患者サンプルまたは未刺激コントロール（陰性コントロール）の結果を示す。アレルゲンは使用しなかった。図１２ａは、フラッシュ化学発光相対発光量（ＲＬＵ）で測定した本発明に従う方法の結果を示す。図１２ｂは、図１２ａに示されるサンプルに関して、（活性化サンプルのＲＬＵの平均値）／（陰性コントロールのＲＬＵの平均値）として計算した刺激指数（ＳＩ）を示す。図１２ｃは、好塩基球活性化試験と活性化好塩基球のフローサイトメトリーでの決定を示す。図１２ｄは、抗ＣＤ６３ビオチンを介する活性化依存性マーカーＣＤ６３での好塩基球の富化および抗ＩｇＥ−ＮＳＰ−ＳＡでの検出の結果を示す。抗ＣＤ６３ビオチン抗体を０．２〜１μｇ／ｍｌの濃度で使用した一方で、検出抗体抗ＩｇＥ−ＮＳＰ−ＳＡを０．５μｇ／ｍｌの固定濃度で使用した。図１２ｅは、図１２ｄにおいて示されるサンプルに関して、（活性化サンプルのＲＬＵの平均値）／（陰性コントロールのＲＬＵの平均値）として計算した刺激指数（ＳＩ）を示す。
【図１２−２】図１２は、好塩基球の富化および検出のための種々の抗体組み合わせを使用する、ｆＭＬＰでの刺激後の患者サンプルまたは未刺激コントロール（陰性コントロール）の結果を示す。アレルゲンは使用しなかった。図１２ａは、フラッシュ化学発光相対発光量（ＲＬＵ）で測定した本発明に従う方法の結果を示す。図１２ｂは、図１２ａに示されるサンプルに関して、（活性化サンプルのＲＬＵの平均値）／（陰性コントロールのＲＬＵの平均値）として計算した刺激指数（ＳＩ）を示す。図１２ｃは、好塩基球活性化試験と活性化好塩基球のフローサイトメトリーでの決定を示す。図１２ｄは、抗ＣＤ６３ビオチンを介する活性化依存性マーカーＣＤ６３での好塩基球の富化および抗ＩｇＥ−ＮＳＰ−ＳＡでの検出の結果を示す。抗ＣＤ６３ビオチン抗体を０．２〜１μｇ／ｍｌの濃度で使用した一方で、検出抗体抗ＩｇＥ−ＮＳＰ−ＳＡを０．５μｇ／ｍｌの固定濃度で使用した。図１２ｅは、図１２ｄにおいて示されるサンプルに関して、（活性化サンプルのＲＬＵの平均値）／（陰性コントロールのＲＬＵの平均値）として計算した刺激指数（ＳＩ）を示す。
【図１２−３】図１２は、好塩基球の富化および検出のための種々の抗体組み合わせを使用する、ｆＭＬＰでの刺激後の患者サンプルまたは未刺激コントロール（陰性コントロール）の結果を示す。アレルゲンは使用しなかった。図１２ａは、フラッシュ化学発光相対発光量（ＲＬＵ）で測定した本発明に従う方法の結果を示す。図１２ｂは、図１２ａに示されるサンプルに関して、（活性化サンプルのＲＬＵの平均値）／（陰性コントロールのＲＬＵの平均値）として計算した刺激指数（ＳＩ）を示す。図１２ｃは、好塩基球活性化試験と活性化好塩基球のフローサイトメトリーでの決定を示す。図１２ｄは、抗ＣＤ６３ビオチンを介する活性化依存性マーカーＣＤ６３での好塩基球の富化および抗ＩｇＥ−ＮＳＰ−ＳＡでの検出の結果を示す。抗ＣＤ６３ビオチン抗体を０．２〜１μｇ／ｍｌの濃度で使用した一方で、検出抗体抗ＩｇＥ−ＮＳＰ−ＳＡを０．５μｇ／ｍｌの固定濃度で使用した。図１２ｅは、図１２ｄにおいて示されるサンプルに関して、（活性化サンプルのＲＬＵの平均値）／（陰性コントロールのＲＬＵの平均値）として計算した刺激指数（ＳＩ）を示す。
【実施例】
【０１０４】
１ａ．アレルゲン希釈物の調製：
好塩基球活性化を検出するために、抗ＣＤ６３抗体（Ｋｌｏｎ  ７Ｇ３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃３５３０１４）を、製造業者の指示に従って、ＮＳＰ−ＳＡ−ＮＨＳアクリジニウムエステル（Ｈｅｌｉｏｓｅｎｓｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＃１９９２９３−８３−９）に共有結合的に連結した。この後に、その抗体を、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ＃３８３４２０）を使用して精製した。Ｂｉｏｍｏｌ  ＧｍｂＨのＩｇＥを、同じ方法でＮＳＰ−ＳＡ−ＮＨＳで標識した。
【０１０５】
１ｂ．アレルゲン希釈物の調製：
Ｔ２ニワトコ花粉抽出物（Ｓｑｕａｒｉｘ，  ＃Ｔ−４４０２）、ｔ３カバノキ花粉抽出物（Ｓｑｕａｒｉｘ，  ＃Ｔ−４４００）およびｔ４ハシバミ花粉抽出物（Ｓｑｕａｒｉｘ，  ＃Ｔ−４４０４）を、希釈緩衝液（１×ハンクス平衡塩類溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃１４０６５０５６）、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中で、１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、および１ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈した。希釈緩衝液を、陰性コントロールとして使用した。１０−６Ｍの濃度のｆＭＬＰ（Ｓｉｇｍａ，  ＃Ｆ３５０６−５ＭＧ）および１００ｎｇ／ｍｌの濃度の抗ＦｃεＲＩ抗体（Ｋｌｏｎ  ＡＥＲ−３７，  ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ＃１４−５８９９−８２）を、陽性コントロールとして使用した。さらに、リンゴ抽出物（Ｓｑｕａｒｉｘ  ＃Ｆ−２３２７）、オオアワガエリ花粉抽出物（Ｓｑｕａｒｉｘ，  ＃Ｇ−５５０１）、ｅ９４（Ｒｏｇｅｒｓら（１９９３），  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｆｅｌ  ｄ．Ｉ：  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ＩｇＥ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃａｔ−ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ３０  Ａｐｒｉｌ  ２０１０  （６），  ５５９−５６８に従って精製）、ヨモギ花粉抽出物（Ｓｑｕａｒｉｘ  ＃Ｗ−３４００）、イヌの毛抽出物（Ｓｑｕａｒｉｘ  ＃Ｅ−６６１７）、スズメバチ毒液抽出物（Ｓｑｕａｒｉｘ  ＃Ｉ−７８０４）、ｉ２０９（Ｓｅｉｓｍａｎｎら，  ２０１０，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ，  ８：７に従って精製）、タンポポ花粉抽出物（Ｓｑｕａｒｉｘ  ＃Ｗ−３４０４）およびヘーゼルナッツ抽出物（Ｓｑｕａｒｉｘ，  ＃Ｔ−４４０４）を、抗原として使用した。
【０１０６】
１ｃ．刺激：
末梢全血（ヘパリン処理）の各５０μｌを、マイクロタイタープレート中で、各５０μｌのアレルゲンまたはコントロール希釈物と混合し、２０分間、３７℃においてインキュベーター中でインキュベートした。反応を、１０μｌの濃縮ＥＤＴＡ溶液（ＰＢＳ中１００ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加することによって停止させた。
【０１０７】
２ａ１．抗体インキュベーション：
この後に、２種の抗体をサンプルに添加した：
１）最終濃度０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ１２３ビオチン（Ｋｌｏｎ  Ｈ５Ｃ６，  Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃３５３０１４）
２）最終濃度２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ６３−ＮＳＰ−ＳＡ（Ｋｌｏｎ  ７Ｇ３，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃３５３０１４）
【０１０８】
サンプルを混合し、１０分間室温でインキュベートした。
【０１０９】
あるいは、抗ＣＤ６３ビオチン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ３５３０１７）および抗ＣＤ６３−ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  １３０−１００−１６０）を使用した。
【０１１０】
２ａ２．赤血球溶解：
赤血球を、１００μｌのサポニン含有溶解緩衝液（ＰＢＳ中０．１４％  サポニン）を添加し、１０分間室温でインキュベーションを行うことによって溶解した。この後に、マイクロタイタープレートを、５分間５００ｇにおいて遠心分離し、その上清を除去した。
【０１１１】
２ａ３．ビーズインキュベーション：
それぞれのサンプルを、１０μｇのストレプトアビジン被覆磁性ビーズ（Ｓｅｒａ−Ｍａｇ  ＳｐｅｅｄＢｅａｄｓ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｌｏｃｋｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，  ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ＃２１１５２１０４０１０３５０）と混合し、１０分間室温でインキュベートした。
【０１１２】
２ａ４．洗浄：
上記ビーズに結合した細胞を、プレート洗浄機（例えば、ＭＢＳ９６磁石を備えたＴｅｃａｎ  ＨｙｄｒｏＦｌｅｘ）において３００μｌの洗浄緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３）で５回洗浄した。
【０１１３】
２ａ５．検出：
その後の検出において、ＣＤ６３抗体上のＮＳＰ−ＳＡアクリジニウムエステルを、２種の溶液（Ｈ２Ｏ２；  ０．１Ｍ  ＨＮＯ３および０．２５Ｍ  ＮａＯＨ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｎ  Ｌｔｄ．，  ＃ＩＶ１−００１））を使用して誘発した。生成された化学発光シグナル（フラッシュルミネッセンス）を、波長４２５ｎｍにおいてプレートルミノメーターで（例えば、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｃｅｎｔｒｏ  ＬＢ  ９６０）検出した。
【０１１４】
２ａ６．評価：
好塩基球活性化の強度を、未刺激コントロールと比較した化学発光シグナルの増加に基づいて計算した。刺激指数（ＳＩ）は、活性化サンプルの相対発光量（ＲＬＵ）／未刺激サンプルのＲＬＵに基づいて計算され得る。ここで、超えられるべき閾値は、試験物質に依存する。
【０１１５】
２ｂ．フローサイトメトリー測定：
フローサイトメトリーでの決定のために、抗ＣＤ１２３−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  ＃１３０−０９８−８９４）、抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＰｅｒＣＰＶｉｏ７００（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  ＃１３０−１０３−８７３）および抗ＣＤ６３−ＶｉｏＢｌｕｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  ＃１３０−１００−１５４）抗体での活性化後に、サンプルを、製造業者の指示に従って、１５分間４℃での遮光下でインキュベートした。
【０１１６】
１ｍｌの１×ＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ＃３４９２０２）の添加および１０分間室温でのインキュベーションの後に、サンプルを５００ｇで５分間遠心分離し、その上清を除去し、そのサンプルを再び、各５００μｌの洗浄緩衝液（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なしのＰＢＳ、０．５％  ＢＳＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  ＮａＮ３）で洗浄した。測定を、フローサイトメーター（例えば、ＭＡＣＳ  Ｑｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ））で２時間以内に行った。ＣＤ１２３＋／ＨＬＡ−ＤＲ−表現型を有する細胞を好塩基球と同定した。好塩基球は、ＣＤ６３シグナルが選択された閾値を超えた場合に活性化された。≧１０％の全活性化を、陽性と評価した。
【０１１７】
２ｃ．蛍光測定
抗ＣＤ６３−ＦＩＴＣの蛍光を、ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  ＦＬＵＯｓｔａｒ（４８５ｎｍ／５２０ｎｍ）ユニットで測定した。
【０１１８】
結果：
化学発光試験（図１）を刺激サンプルのシグナルがコントロールに対して２倍になった（ＳＩ≧２）場合に、陽性と評価した。フローサイトメトリーでの決定（図２）の評価において、≧１０％の活性化を示す全サンプルを、陽性と評価した。化学発光試験とフローサイトメトリー試験との比較は、この２種の試験システムの結果の間の良好な相関および非常に良好な再現性とを示す。ここで化学発光シグナルの測定ダイナミックレンジは、蛍光シグナルのものより有意に広い。
【０１１９】
フローサイトメトリーでの評価において、分析ウインドウは、各患者について個々に適合されかつそれぞれの評価当事者によって主観的に設定されなければならない活性化細胞集団および非活性化細胞集団（ゲーティング）を規定するために設定する必要がある。種々の評価のこの可能性（this  possibility  of  varying  evaluation）は、化学発光試験には存在しない。なぜなら化学発光試験では、構成されるコントロールに対する刺激サンプルの関係性が存在するに過ぎないからである。これは、標準化された評価を可能にする。標準化された評価は、フローサイトメトリー試験においてこのように行うことはできない。さらに、有意により高いサンプルスループットは、マイクロタイタープレート形式におけるサンプル調製、迅速な測定および単純な評価によって可能になる。
【０１２０】
この試験はまた、検出システムとしての化学発光の使用が、決定的な利点を提供することを示した：好塩基球およびさらなる細胞は、ごく僅かな自家化学発光を示すに過ぎない。測定における標的細胞の絶対純度は、従って、必要とされない。
【０１２１】
対照的に、死細胞および顆粒球は、特に、高度な自家化学発光を有し、これは、フローサイトメトリーにおいて望ましいシグナルの重なり合いを引き起こすので、相当するゲーティングを要する。好塩基球を精製するためにＣＤ１２３ビオチン抗体を使用するにあたって、サンプルは、表面にＣＤ１２３も発現する特に樹状細胞の低含有量を有する。しかし、これらの細胞は、ＣＤ６３を発現しないので、その検出される抗ＣＤ６３化学発光シグナルは、専ら好塩基球に帰すことができる。その測定自体は、他の非標識細胞の存在によって損なわれない。
【０１２２】
検出法としての化学発光と非分画全血の存在との組み合わせは、従って、複数のサンプルが最大の再現性および標準化可能性をもって並行して処理され得る高感度の検出法を提供する。
【０１２３】
図３〜１０は、広く種々の抗原およびサンプルドナーを用いて、本発明に従う方法が広く適用可能であることを示す。各場合に、第１の図（例えば、図３）は、化学発光での同じ実験および比較可能性を示すためにフローサイトメトリーでの次の図（図４）を示す。上記結果は、この比較可能性が驚くべきことに高いことである。本発明に従う方法は、従って、フローサイトメトリーに取って代わることができる。
【０１２４】
図１１は、３種の検出法、化学発光、蛍光およびフローサイトメトリーの直接比較を示す。化学発光は、感度においてフローサイトメトリーにおおよそ相当し、蛍光より有意に適していることは明らかに認められ得るので、本発明に従う方法は、フローサイトメトリーに取って代わり得ることが確認される。
【０１２５】
最後に、図１２に示される実験は、活性化依存性リガンドが富化のために使用されかつ活性化非依存性リガンドが検出のために使用される場合に（その逆ではなく）、他の実験の場合と同様に、本発明に従う方法がまた適切に機能することを示す。この場合、化学発光におけるバックグラウンドがシグナルより高いが、そのシグナルは、そのバックグラウンドから明らかに区別され得る。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【外国語明細書】
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