(57)【要約】      （修正有）【課題】ＳＲＭ／ＭＲＭ法によってホルマリン中で固定された生体試料中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質を直接定量化するのに特に有利なタンパク質由来の特異的ペプチド、及びそれらのペプチドの派生イオン化特性を提供する。【解決手段】生体試料は、ホルマリン固定組織／細胞、ホルマリン固定／パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織／細胞、ＦＦＰＥ組織ブロック及びそれらのブロック由来の細胞、ならびにホルマリン固定及び／またはパラフィン包埋された組織培養細胞を含む、ホルムアルデヒド含有薬剤／固定剤で処理された組織及び細胞から選択される。タンパク質試料は、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）試薬及びプロトコルを使用して生体試料から調製され、タンパク質は、ＳＲＭ／ＭＲＭ質量分析法により、ペプチドの少なくとも１つ以上を定量化することによって定量化される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の少なくとも１つのＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のレベルを測定するための方法であって、質量分析を使用して前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中の１つ以上の修飾及び／または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量を検出及び／または定量化することと、前記試料中の修飾または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のレベルを計算することと、を含み、
前記量が、相対量または絶対量である、前記方法。
【請求項２】
１つ以上の修飾または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量を検出及び／または定量化する前に、前記タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３】
前記生体試料の前記タンパク質消化物が、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコルによって調製される、請求項１または２に記載の前記方法。
【請求項４】
前記タンパク質消化物が、プロテアーゼ消化物を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の前記方法。
【請求項５】
前記質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、及び／または飛行時間型質量分析を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の前記方法。
【請求項６】
前記ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６。配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９として示されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の前記方法。
【請求項７】
前記生体試料が、血液試料、尿試料、血清試料、腹水試料、喀痰試料、リンパ液、唾液試料、細胞、または固形組織である、請求項１〜５のいずれかに記載の前記方法。
【請求項８】
修飾及び／または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドを定量化することをさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の前記方法。
【請求項９】
前記ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドを定量化することが、１つの生体試料中の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６。配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９に示されるＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の約８〜約４５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む１つ以上のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量を、異なる別個の生体試料中の同一のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量と比較することを含む、請求項８に記載の前記方法。
【請求項１０】
１つ以上のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドを定量化することが、生体試料中の前記ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドのそれぞれの量を、既知量の添加内部標準ペプチドとの比較によって決定することを含み、前記生体試料中の前記ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドがそれぞれ、同一のアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される、請求項９に記載の前記方法。
【請求項１１】
前記内部標準ペプチドが、同位体標識ペプチドである、請求項１０に記載の前記方法。
【請求項１２】
前記タンパク質消化物中の１つ以上の修飾または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量を検出及び／または定量化することが、修飾または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の存在、及び患者または対象における、肺癌を含む癌との関連性を示す、請求項１〜５のいずれかに記載の前記方法。
【請求項１３】
１つ以上の修飾または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量、または前記ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の量の前記検出及び／または定量化の結果を、肺癌を含む前記癌の診断上の病期／グレード／状態と相関させることをさらに含む、請求項１２に記載の前記方法。
【請求項１４】
１つ以上の修飾または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／もしくはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量、または前記ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／もしくはＦＧＦＲ１タンパク質の量の前記検出及び／または定量化の結果を、前記癌の診断上の病期／グレード／状態と相関させることが、他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドの量を検出及び／または定量化することと多重形式で組み合わされて、肺癌を含む前記癌の診断上の病期／グレード／状態に関するさらなる情報を提供する、請求項１３に記載の前記方法。
【請求項１５】
前記生体試料が得られた患者または対象に、治療的有効量の治療剤を投与することをさらに含み、前記治療剤及び／または投与される前記治療剤の量が、１つ以上の修飾または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／もしくはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量、またはＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の量に基づく、請求項１３に記載の前記方法。
【請求項１６】
前記治療または前記治療剤が、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質を発現する癌細胞に指向される、請求項１５に記載の前記方法。
【請求項１７】
表１中のペプチド（配列番号１〜配列番号３９）のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０以上、及び／またはそれらに対する抗体を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
導入
肺癌は、最も蔓延している癌（米国内新規症例２００，０００超／年）であり、低い５年生存率（約１５％）を有する。肺癌のための療法は、放射線、葉酸代謝、白金系薬剤、及び／またはタキソール系薬剤からなる療法の限定的な選択肢の使用から、腫瘍、及び／または重要なバイオマーカーもしくは治療標的タンパク質の有無の組織学的特徴付けを必要とする、より標的化された治療へと移行している。全肺癌の８０％もが、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）型であり、この一般的な型は、組織学的分析に基づいて、腺癌、扁平上皮癌、細気管支肺胞上皮癌、及び大細胞未分化癌の４つの異なるサブタイプに分類することができる。残りの２０％の肺癌は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）として知られている。近年利用されている標的癌療法は、ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣ両方の患者の治療において劇的な成功を示している。癌療法に対する標的化されたアプローチは、癌の成長が特定の標的タンパク質（１つまたは複数）によって推進されるとき、かつ癌を推進している標的タンパク質（１つまたは複数）が標的タンパク質（１つまたは複数）を阻害するように設計及び製造された治療剤によって特異的に攻撃され、それ故に癌の成長を阻害する場合に、最も有利である。ペプチド及びペプチド配列が、どのタンパク質標的が肺癌患者由来の腫瘍組織内で直接発現または過剰発現されるかを定量的に決定するために使用することのできるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイでの使用のために提供される。これにより、標的肺癌療法のための改善された治療決定が可能になる。また、肺癌でない任意の他の癌のための標的治療決定を改善するために、どのタンパク質標的が、肺癌以外の癌を有する患者由来の腫瘍組織内で直接発現または過剰発現されるかを定量的に決定するために使用することのできるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイも提供される。
【発明の概要】
【０００２】
以下のタンパク質、すなわちＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及びＦＧＦＲ１のサブシーケンス由来の特異的ペプチドが提供される。ＡＬＫは、ＡＬＫチロシンキナーゼ受容体及びＣＤ２４６としても知られており、本明細書ではＡＬＫと称される。Ｒｏｓは、ｃ−Ｒｏｓ受容体チロシンキナーゼとしても知られており、本明細書ではＲｏｓと称される。Ｒｏｎは、マクロファージ刺激タンパク質受容体、ＣＤ１３６、及びｐ１８５−Ｒｏｎとしても知られており、本明細書ではＲｏｎと称される。Ｒｅｔは、プロトオンコジーンチロシン−タンパク質キナーゼ受容体Ｒｅｔ、及びプロトオンコジーンｃ−Ｒｅｔとしても知られており、本明細書ではＲｅｔと称される。ＴＳは、チミジル酸シンターゼとしても知られており、本明細書ではＴＳと称される。ＦＧＦＲ１は、線維芽細胞成長因子受容体１及びＣＤ３３１としても知られており、本明細書ではＦＧＦＲ１と称される。
【０００３】
タンパク質由来の各ペプチドに対するペプチド配列及び断片化／遷移イオンは、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイ（複数可）とも称することができ、以下、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ（複数可）と称される、質量分析ベースの選択反応モニタリング（ＳＲＭ）アッセイ（複数可）において有用である可能性がある。ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及びＦＧＦＲ１タンパク質、ならびにそれらのタンパク質のイソ型のＳＲＭ／ＭＲＭ分析用のペプチドの使用を記載する。
【０００４】
１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つもしくは６つのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ（複数可）を使用して、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来の特異的ペプチドの１つ以上の存在を検出し、かつその相対または絶対定量的レベルを測定することができ、それによって、質量分析によって生体試料から得られる所与のタンパク質調製物中のそれらのタンパク質のそれぞれの総量を測定する手段を提供することができる。それらのタンパク質由来の利用可能な全ペプチドのすべてまたは一部分は、単一のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイで同時に分析することができるか、個別のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの任意の組み合わせで分析することができる。これらのペプチドはそれぞれ、質量分析によって生体試料から得られる所与のタンパク質調製物中の対応するタンパク質のそれぞれの総量を測定する潜在的な手段を提供する。
【０００５】
本明細書に記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ（複数可）は、ホルマリン固定癌患者組織（例えば、生検）などの患者組織試料から得られた細胞から調製される複合タンパク質溶解試料中のこれらのペプチドを直接測定することができる。ホルマリン固定組織からのタンパク質試料調製方法は、米国特許第７，４７３，５３２号に記載されており、その内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。本特許に記載される方法は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手可能であるＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ試薬及びプロトコルを用いて好都合に行うことができる。
【０００６】
癌患者から外科的に切除された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、病理学的実践において認められた慣例である。結果として、ホルムアルデヒド／ホルマリン固定パラフィン包埋組織が、最も広範に入手できるこれらの患者由来の組織形態である。ホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、典型的に、ホルマリンと称されるホルムアルデヒドの水溶液を用いる。「１００％」のホルマリンは、ホルムアルデヒドの飽和水溶液（約４０容量％または３７質量％のホルムアルデヒド）から構成され、酸化を、及び重合の程度を制限するために、少量の安定剤、通常、メタノールを含む。組織を保存する最も一般的な方法は、１０％の中性緩衝ホルマリンと一般に呼ばれるホルムアルデヒド水溶液中に全組織を長時間（８時間〜４８時間）浸漬し、続いて、室温での長期貯蔵のために、固定した全組織をパラフィンワックス中に包埋することである。したがって、ホルマリン固定癌組織を分析するための分子分析方法が、癌患者組織の分析において、最も受け入れられ、頻繁に活用される方法であろう。
【０００７】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ（複数可）からの結果を、組織（生体試料）が収集及び保存された患者または対象の特定の組織試料（例えば、癌組織試料）中のこれらのタンパク質のいずれかまたはすべての正確かつ精密な定量的レベルを、これらのタンパク質の潜在的なイソ型の正確かつ精密な定量的レベルに加えて、相関させるために使用することができる。これは、癌に関する診断情報を提供するだけでなく、医師または他の医療従事者が、患者または対象のための適切な療法を決定することも可能にする。罹患組織中または別の患者／対象試料中のタンパク質発現のレベルに関する診断上及び治療上で重要な情報を提供するそのようなアッセイは、コンパニオン診断アッセイと呼ばれる。例えば、そのようなアッセイは、癌の病期、程度、または組織学を診断し、癌細胞の成長を止めるのに最も効果的な治療剤を決定し、患者または対象が応答する可能性が最も高い治療剤の決定を導くように設計することができる。
【０００８】
より具体的には、患者からの癌細胞中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上の検出及び／または定量化は、癌成長、とりわけ肺癌を示し、標的治療レジメンによって標的とされ得るタンパク質を識別する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書に記載されるアッセイは、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質を含むタンパク質由来の特定の非修飾ペプチドの相対もしくは絶対レベルを定量化または測定し、また、それらのタンパク質由来の特定の修飾ペプチドの相対または絶対レベルも測定することもできる。修飾の例としては、ペプチド上に存在するリン酸化アミノ酸残基及びグリコシル化アミノ酸残基が挙げられる。
【００１０】
タンパク質及び潜在的イソ型の相対定量的レベルは、ＳＲＭ／ＭＲＭ法により、例えば、ＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積（例えば、特徴的ピーク面積、または積分断片イオン強度）を比較することによって、決定することができる。個別のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１ペプチドの相対レベルは、異なる試料（例えば、対照試料、及び患者の組織または対象の組織から調製された試料）中で決定することができる。あるいは、各ペプチドがそれ自体の特定のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピークを有する場合、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１特徴的ペプチドのうちの１つ以上に対して複数のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を比較することが可能である。ピーク面積を比較することによって、１つの生体試料中、または１つ以上の追加または異なる生体試料中の相対ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質、ならびに潜在的タンパク質イソ型含有量を決定することが可能である。このように、それらのタンパク質由来の特定のペプチド（１つまたは複数）の相対量、したがって、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質、ならびにそれらの潜在的イソ型の相対量を、同じ実験条件下で複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超える）生体試料にわたって決定することができる。加えて、単一の試料中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来の所与のペプチド（１つまたは複数）の相対定量化を、ＳＲＭ／ＭＲＭ法により、そのペプチドの特徴的ピーク面積を、生体試料からの同じタンパク質調製物中の異なるタンパク質（１つまたは複数）由来の別の異なるペプチド（１つまたは複数）の特徴的ピーク面積と比較することによって決定することができる。
【００１１】
そのような方法を使用して、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来の特定のペプチドの量、したがって、対応するタンパク質のそれぞれ、及びそれらの潜在的イソ型の量を、同じ試料中または異なる試料中で互いに比較して決定され得る。個別のペプチド（１つまたは複数）の相対定量化は、試料中または試料間の別のペプチド（１つまたは複数）の量と比較して行われ得るため、生体試料中のタンパク質の容量に対する絶対重量、または重量に対する絶対重量にかかわらず、（例えば、互いに比較してピーク面積を決定することによって）存在するペプチドの相対量を決定することが可能である。故に、生体試料からのタンパク質調製物中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１ペプチドの量を使用して、様々な試料中及び試料間のそれらのタンパク質の量を決定することができる。異なる試料間の個別の特徴的ピーク面積に関する相対定量化データは、一般的に、試料ごとに分析されるタンパク質の量に正規化される（例えば、試料の総タンパク質濃度、及び分析される容量が試料の正規化に使用される）。相対定量化を、単一の試料中、及び／または多くの試料にわたって、複数のタンパク質、ならびにＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質（複数可）由来の多くのペプチドにわたって同時に実施して、相対タンパク質量、及び／または他のペプチド／タンパク質に対する１つのペプチド／タンパク質についてのさらなる洞察を得ることができる。
【００１２】
ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の絶対定量的レベルは、例えば、ＳＲＭ／ＭＲＭ法によって決定され、それによって、１つの生体試料中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来の個別のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積は、既知量の試料中で「スパイクされた」１つ以上の内部標準物の既知量のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較される（例えば、同位体標識標準物）。一実施形態において、内部標準物は、１つ以上の重同位体で標識された１つ以上のアミノ酸残基を含有する、全く同一のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１ペプチドの合成バージョンである。質量分析が、天然ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１ペプチド特徴的ピークとは異なり別個であり、かつコンパレータピークとして使用することのできる、予測可能かつ一貫したＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピークを生成するように、そのような同位体標識内部標準物が合成される。故に、内部標準物が、既知量の生体試料からのタンパク質またはペプチド調製物中に既知量でスパイクされ、質量分析によって分析されるとき、天然ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することができる。この数値比較が、対応するタンパク質の濃度もしくは重量が決定され得る生体試料からの最初のタンパク質調製物中に存在する天然ペプチドの絶対モル濃度及び／または絶対重量のいずれかの計算を可能にする。断片ペプチドに対する絶対定量化データは、典型的に、試料ごとに分析されるタンパク質の量に従って表示される。絶対定量化は、多くのペプチドにわたって実施することができ、それが、同時に単一の試料中及び／または複数の試料にわたる複数のタンパク質（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ等）の定量決定を可能にし、個別の生体試料及び／または個別の試料のコホート全体における絶対タンパク質量についての洞察を得ることができる。一実施形態において、タンパク質の定量化は、Ｇｙｇｉらよって米国特許第７，５０１，２８６号に記載されるペプチド標準物を使用して行ってもよい。
【００１３】
別途指定のない限り、本明細書で使用される場合、定量化する、定量化、測定する、測定という用語は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、標準物質（例えば、内部標準物）などの分析物の相対または絶対レベルを決定することを意味する。
【００１４】
本明細書に記載されるアッセイ法を、例えば、ホルマリン固定組織などの患者由来または対象由来の組織を用いる際に、癌の病期の決定を助けるものとして使用することができる。本明細書に記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイはまた、その患者または対象の治療に使用する際にどの治療剤が最も有利であるかの決定を助けるものとして使用することもできる。
【００１５】
本明細書に記載される肺癌に関連するタンパク質のレベルを試験するために、部分的または全体の腫瘍の外科的摘出、または疑わしい疾患の有無を決定するために行われる生検法のいずれかにより、患者もしくは対象から摘出された癌性組織、または癌性である疑いのある組織に対して分析を行うことができる。組織の試料を分析して、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質（複数可）のうちの１つ以上が患者の組織または対象の組織中に存在するかどうか、かつそれらのタンパク質のどの形態が存在するかを決定する。さらには、それらのタンパク質のうちの１つ以上の発現レベルを決定し、健常組織中に見出される「正常」または参照レベルと比較することができる。健常組織中に見出されるタンパク質の正常または参照レベルは、例えば、癌を有さない１つ以上の個体の関連組織に由来され得る。あるいは、正常または参照レベルは、癌に罹患していない関連組織（例えば、同じ器官の部分）の分析によって、癌を有する個体に対し得られ得る。
【００１６】
タンパク質またはペプチドのレベルもしくは量は、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにより決定されるタンパク質またはペプチドのモル、質量、もしくは重量で表される量として定義することができる。このレベルもしくは量は、分析される溶解物中のタンパク質または別の構成成分の総レベルもしくは量に正規化され得るか（例えば、タンパク質のマイクロモル／マイクログラム、またはタンパク質のマイクログラム／マイクログラムで表される）、または重量当たりでＤＮＡの量にさえ正規化され得る（例えば、ＤＮＡのマイクロモルもしくはマイクログラム／マイクログラム）。加えて、タンパク質またはペプチドのレベルもしくは量は、例えば、マイクロモルもしくはナノグラム／マイクロリットルで表される、容積基準で決定され得る。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによって決定されるタンパク質またはペプチドのレベルもしくは量を、分析される細胞の数に正規化することもできる。
【００１７】
ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質、ならびにこれらのタンパク質のイソ型に関する情報を使用して、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質、ならびにそれらのイソ型、または断片ペプチドのレベルを、正常組織中で観察されるレベルと相関させるか、または比較することにより、癌の組織学的病期またはグレードの決定を助けることができる。一旦癌の組織学的病期及び／もしくはグレード、ならびに／またはＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／もしくはＦＧＦＲ１タンパク質発現特性が決定されると、その情報は、例えば、アッセイされたタンパク質（複数可）（例えば、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１）の異常発現を特徴とする癌組織を特異的に治療するために開発された（化学的及び生物学的）治療剤の一覧と照合させることができる。特定の個体からのＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質アッセイからの情報をＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質（複数可）を発現している細胞／組織を特異的に標的とする治療剤の一覧と照合することは、肺癌を含む癌の治療に対するオーダーメイド医療手法を表す。本明細書に記載されるアッセイ方法は、診断及び治療法の決定のための源として患者または対象自身の組織由来のタンパク質の分析を用いることによりオーダーメイド医療手法の基盤を形成する。
【００１８】
ペプチド生成
原理的には、既知の特異性の任意のタンパク質分解プロセスによって調製される、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来の任意の予測されるペプチドが、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の存在量を決定するために、代理レポーターとして使用され得る。一実施形態において、試料は、既知の特異性のプロテアーゼ（１つまたは複数）（例えば、トリプシン及び／またはエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃのうちの１つ以上）で消化される。タンパク質分解処理から生じる１つ以上のペプチドを代理レポーターとして使用して、質量分析ベースのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイなどの好適なアッセイにおいて、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のうちの１つ以上の存在量を決定することができる。同様に、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質中で修飾されることが知られている部位にアミノ酸残基を含有する、任意の予測されるペプチド配列を使用して、試料中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の修飾の程度をアッセイしてもよい。
【００１９】
ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１断片ペプチドは、米国特許第７，４７３，５３２号に提供されるＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコルの使用を含む様々な方法によって生成され得る。Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコル及び試薬は、組織／生体試料中のタンパク質のタンパク分解性消化により、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から質量分光分析に適したペプチド試料を作製することができる。Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコルでは、組織／生体試料は、緩衝液中で、高温で長期間維持され（例えば、約８０℃〜約１００℃で、約１０分間〜約４時間）、タンパク質架橋を逆転または解放する。用いられる緩衝液は、中性緩衝液（例えば、トリスベース緩衝液、または洗剤含有緩衝液）であり、有利に、質量分光分析の妨げとならない緩衝液である。次に、組織／生体試料を、この生体試料の組織及び細胞構造を破壊し、この試料を液化するのに十分な時間（例えば、約３７℃〜約６５℃で約３０分〜約２４時間）、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、及びエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃを含むが、これらに限定されない１つ以上のプロテアーゼで処理する。加熱及びタンパク質分解の結果物は、液体で可溶性の希釈可能な液体生物分子溶解物である。一実施形態において、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、及びエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃから選択される２つ以上のプロテアーゼを、生体試料のタンパク質分解処理に用いる。
【００２０】
ペプチド分離及びアッセイ
一旦溶解物が調製されると、試料中のペプチドは、それらの分析及び測定（定量化）を促進する様々な技術に供され得る。分析を質量分析により行う場合、分析を促進するために、１つ以上のクロマトグラフ法を用いてもよい。
【００２１】
一実施形態において、ペプチドは、質量分析計器による分析の前に、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）によって分離される。例えば、ペプチドを、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｏ９０Å  Ｃ１２、４μｍ樹脂（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）で１２ｃｍのベッド長さに自己充填したＰｉｃｏＦｒｉｔ（１００μｍ  ＩＤ／１０μｍ先端ＩＤ、Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）カラムを用いて、ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）、またはＥＡＳＹ−ｎＬＣ  ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）上で分離することができる。
ペプチドを、８００ｎＬ／分の流量で、０．１％ギ酸を含有する１％〜５０％アセトニトリルの１２分のクロマトグラフィー勾配にわたって溶出することができる。液体クロマトグラフィーによって一旦分離されると、溶出されたペプチドは、分析のために質量分析計内に導かれる。一実施形態において、質量分析計は、ナノスプレー源を備える。
【００２２】
別の実施形態において、ペプチドは、親和性技術、例えば、免疫学ベースの精製（例えば、免疫親和性クロマトグラフィー）、イオン選択培地におけるクロマトグラフィー、またはペプチドが修飾されている場合は、炭水化物修飾ペプチドの分離のためのレクチンなどの適切な媒体を使用した分離などによって分離され得る。さらに別の実施形態において、質量分光分析前にペプチドの免疫学的分離を用いるＳＩＳＣＡＰＡ法が用いられる。ＳＩＳＣＡＰＡ技術は、例えば、米国特許第７，６３２，６８６号に記載されている。さらに他の実施形態において、レクチン親和性法（例えば、親和性精製及び／またはクロマトグラフィー）を使用して、質量分析による分析の前に溶解物からペプチドを分離し得る。
レクチンベースの方法を含む、ペプチド群の分離のための方法は、例えば、Ｇｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，７５２：２９３−３０６（２００１）に記載されている。免疫親和性クロマトグラフィー技術、レクチン親和性技術、ならびに親和性分離及び／またはクロマトグラフィーの他の形態（例えば、逆相、サイズベースの分離、イオン交換）は、質量分析によるペプチドの分析を促進するために任意の好適な組み合わせで用いることができる。
【００２３】
驚くべきことに、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来の多くの可能性のあるペプチド配列は、質量分析ベースのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイでの使用に不適切であるか、または効果がないことが明らかになったが、理由は明らかになっていない。特に、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来の多くのトリプシンペプチドが、ホルマリン固定パラフィン包埋組織由来のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で、効率的にまたは全く検出され得なかったことが明らかになった。ＭＲＭ／ＳＲＭアッセイに最も好適なペプチドを予測することができなかったため、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のための信頼でき、かつ正確なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、実際のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の修飾及び非修飾ペプチドを実験的に識別する必要があった。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、いくつかのペプチドは、うまくイオン化しないか、または他のタンパク質とははっきりと異なる断片を生成せず、また、分離（例えば、液体クロマトグラフィー）中にうまく分解できないか、またはガラスもしくはプラスチック製品に付着する可能性があるため、例えば、質量分析によって検出することが困難である可能性があると考えられている。したがって、ホルマリン固定組織試料から調製されたＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物（例えば、表１及び２中のペプチド）中に検出することのできる、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来のそれらのペプチドは、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイがＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにおいて用いられ得るペプチドである。一実施形態において、単一の試料中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の断片の同時調製に用いられるプロテアーゼは、トリプシンである。
【００２４】
本明細書に記載される様々な実施形態（例えば、表１及び／または２）に見出されるＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１ペプチドは、ホルマリン固定癌組織から得た細胞から調製された複合Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の全タンパク質のトリプシン消化により、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質に由来した。別段の指定がなければ、それぞれの例で、プロテアーゼはトリプシンであった。次いで、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物を質量分析によって分析し、質量分析によって検出及び分析されるＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来のそれらのペプチドを決定した。質量分光分析用に好ましい特異的サブセットのペプチドの特定は、次の項目に基づいている。１）タンパク質由来の１つ以上のどのペプチドがＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物の質量分析中にイオン化するかの実験的決定、及び２）Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物を調製するのに使用されるプロトコル及び実験条件におけるペプチドの生き残る能力。この後者の特性は、ペプチドのアミノ酸配列のみならず、ペプチド内の修飾アミノ酸残基の、試料調製の間で修飾された形態で生き残る能力までも及ぶものである。
【００２５】
ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定組織から直接得た細胞由来のタンパク質溶解物を、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）試薬及びプロトコルを用いて調製し、これは、組織の顕微解剖により試料チューブに細胞を収集し、続いて、細胞をＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）緩衝液中で長期間加熱することを伴う。一旦ホルマリン誘導架橋がマイナスの影響を受けると、組織／細胞は、トリプシンなどのプロテアーゼを使用して、予測可能な様式で完全に消化されるが、他のプロテアーゼを使用してもよい。それぞれのタンパク質溶解物は、プロテアーゼによる無傷のポリペプチドの消化により一群のペプチドへと変化する。それぞれのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物を分析し（例えば、イオントラップ質量分析により）、複数のペプチドの包括的プロテオミック調査を行った。
この場合、それぞれのタンパク質溶解物中に存在する全細胞性タンパク質から質量分析により特定され得る可能な限り多くのペプチドを特定するものとして、データを提示した。
単一の複合タンパク質／ペプチド溶解物からできる限り多くのペプチドを識別するためにイオントラップ質量分析計または包括的プロファイリングを実施することのできる質量分析計の別の形態が、典型的に分析に用いられる。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、または三連四重極を含む任意の種類の質量分析計において開発及び実行することができるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ用の最も都合のよい装置プラットフォームは、三連四重極装置プラットフォームであると考えられることが多い。
【００２６】
一旦採用された条件下で、単一の溶解物の単一ＭＳ分析により可能な限り多くのペプチドが特定されると、ペプチドの一覧が照合され、その溶解物中に検出されたタンパク質を判定するために使用された。そのプロセスは、複数のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物に対して繰り返され、ペプチドの非常に長い一覧を単一のデータセットに並べた。その種類のデータセットは、（プロテアーゼ消化後に）分析されたその種類の生体試料中で、具体的には生体試料のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で検出され得、故に、例えば、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質などの特定のタンパク質に対するペプチドを含むペプチドを表すと見なされ得る。
【００２７】
一実施形態において、ＡＬＫ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｑ９ＵＭ７３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５）、Ｒｏｓ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ０８９２２、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８、Ｒｏｎ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｑ０４９１２、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１。配列番号１２、及び配列番号１３）、Ｒｅｔ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ０７９４９、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６）、ＴＳ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ０４８１８、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５）、ならびに／またはＦＧＦＲ１（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ１１３６２、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９）の絶対もしくは相対量の決定に有用であると特定されるＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１トリプシンペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６。配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９のペプチドの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、もしくは１０以上、またはすべてを含み、これらのそれぞれは表１に記載される。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から調製されるＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物における質量分析によって検出された。故に、表１中のペプチドのそれぞれ、またはそれらのペプチドの任意の組み合わせ（例えば、表１に列挙されるこれらのペプチドの内の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０以上）は、ホルマリン固定患者または対象組織中直接を含む、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイでの使用の候補である。
【表１】
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【００２８】
表１に記載されるＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１ペプチドは、前立腺、結腸、及び乳房を含む異なるヒト器官の複数の異なるホルマリン固定組織の複数のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物から検出されたものを含む。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定組織中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに有用であると見なされる。これらの実験のさらなるデータ分析では、いずれの特定の器官部位に由来するいずれの特定のペプチドに対しても、選択性は観察されなかった。このため、これらのペプチドのそれぞれは、任意の生体試料または体内の任意の器官部位に由来する任意のホルマリン固定組織由来のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物におけるＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うのに好適であると考えられる。
【００２９】
別の実施形態において、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＴＳ及びＦＧＦＲ１のそれぞれに対して１つまたは２つのペプチドを用いる（例えば、表１中に列記されるペプチド）。別の実施形態において、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ及び／またはＲｅｔのそれぞれに対して１つまたは２つのペプチドを用いる（例えば、表１中に列記されるペプチド）。
【００３０】
他の実施形態において、ＡＬＫ及びＲｏｓタンパク質の一方または両方がアッセイされ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のうちの１つ、２つ、３つ、もしくは４つが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ（複数可）を使用してアッセイされる。そのような実施形態の一例において、Ｒｏｎ及びＲｅｔタンパク質の一方もしくは両方に対する少なくとも１つのペプチドまたは少なくとも２つのペプチドが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによってアッセイされ（例えば、表１中に列記されるＲｏｎ及びＲｅｔペプチド）、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、または４つに対する少なくとも１つのペプチドまたは少なくとも２つのペプチドが、アッセイされる（例えば、表１中に列記されるペプチド）。そのような実施形態の別の例において、ＡＬＫ及びＲｏｓタンパク質のうちの一方もしくは両方に対する少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによってアッセイされ（例えば、表１中に列記されるペプチド）、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１のうちのいずれかに対する少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドが、アッセイされる（例えば、表１中に列記されるペプチド）。同位体標識されているが、それ以外にこれらの実施形態のうちのいずれかに示されるペプチドのうちの１つ以上と同一であるペプチドを含む組成物が、本明細書において提供され、それらの調製及び使用、具体的には質量分析標準物質としての使用が下記に記載される。
【００３１】
一実施形態において、表１中の１つ以上のペプチド、またはこれらのペプチドの任意の組み合わせ（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１１すべて）が、免疫学的方法（例えば、ウエスタンブロット法またはＥＬＩＳＡ）を含むが、これに限定されない質量分析に依存しない方法によりアッセイされる。一実施形態では、これらのアッセイは、ホルマリン固定組織を用いて行われる。ペプチド（複数を含む）（絶対的または相対的）の量に対する情報がどのように得られるかに関わらず、この情報は、患者または対象の癌の存在を示す（診断する）こと、癌の病期／グレード／状態を決定すること、予後を示すこと、または患者または対象に対する治療剤または治療レジメンを決定すること等を含む、本明細書に記載されるいずれの方法にも用いることができる。
【００３２】
他の実施形態において、免疫学的方法（例えば、ウエスタンブロット法またはＥＬＩＳＡ）を含むが、これに限定されない質量分析に依存しない方法により、ＡＬＫ及びＲｏｓタンパク質の一方または両方がアッセイされ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及びＦＧＦＲ１タンパク質のうちの１つ、２つ、３つ、または４つがアッセイされる。そのような実施形態の一例において、ＡＬＫ及びＲｏｓタンパク質の一方または両方に対する少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドがアッセイされ（例えば、表１中に列記されるＡＬＫ及びＲＯＳペプチド）、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及びＦＧＦＲ１タンパク質のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、または４つに対する少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドがアッセイされる（例えば、表１中に列記されるペプチド）。そのような実施形態の別の例において、ＡＬＫ及びＲｏｎタンパク質の一方または両方に対する少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドが（例えば、表１中に列記されるＡＬＫ及びＲｏｎペプチド）、およびＲｏｓ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及びＦＧＦＲ１タンパク質のいずれかに対する少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドがアッセイされる（例えば、表１中に列記されるペプチド）。
【００３３】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行う上での重要な考慮すべきことは、ペプチドの分析に採用し得る装置の種類である。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、または三連四重極を含む任意の種類の質量分析計において開発及び実行することができるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ用の現在最も都合のよい装置プラットフォームは、三連四重極装置プラットフォームであると考えられることが多い。その種類の質量分析計が、細胞内に含まれる全タンパク質由来の何十万から何百万の個別のペプチドからなり得る極めて複雑化したタンパク質溶解物中の単一の単離標的ペプチドを分析するための最適の装置であると考えることができる。
【００３４】
ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来のそれぞれのペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを最も効率よく実施するためには、分析におけるペプチド配列に加えて情報を利用することが望ましい。そのさらなる情報は、アッセイを効率的に行うことが可能となるように、正しく、的を絞った特異的標的化ペプチドの分析を行うように、質量分析計（例えば、三連四重極質量分析計）を指示し、それに命令を与える際に用いることができる。
【００３５】
一般に、標的ペプチド、ならびに特定のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１ペプチドに関するさらなる情報は、各ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、及び各遷移イオンのイオン型のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上を含み得る。ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために使用され得るさらなるペプチド情報は、表１中の一覧の１２個のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１ペプチドについて表２中に示される。表２に示されるペプチドについて記載されるこのさらなる情報が、作成され、得られ、他のプロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせ（例えば、トリプシン及び／またはＬｙｓ  Ｃ）の作用によって産出されるものを含む、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来の任意の他のペプチドの分析に適用され得る。
【表２】
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【００３６】
いくつかの実施形態において、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のアッセイに好適なペプチド（例えば、表１に示され、配列番号１〜３９として示されるペプチド）は、切断されるとサブペプチドを産出するさらなるタンパク質分解部位をペプチド配列の内部に含有し得る。そのようなサブペプチドは、所望のプロテアーゼのタンパク質分解切断部位に対する識別されたペプチドの配列を分析することによって認識可能である。一実施形態において、トリプシンペプチドは、トリプシンによるさらなる切断時にサブペプチドをもたらすことができるさらなる内部トリプシン切断部位を含み得る。別の実施形態において、トリプシンペプチドは、トリプシン、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、及び／またはＬｙｓ  Ｃのうちのいずれか１つまたは２つ以上による切断時にサブペプチドの形成をもたらすことのできる、トリプシンＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、及び／またはＬｙｓ  Ｃを含むが、これらに限定されない、プロテアーゼのための内部部位を含有し得る。別の実施形態において、Ｌｙｓ  Ｃペプチドは、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、及び／またはトリプシンのうちのいずれか１つまたは２つ以上による切断時にサブペプチドの形成をもたらすことのできる、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、及び／またはトリプシンなどの他のプロテアーゼのための内部部位を含有し得る。そのようなサブペプチド、及び具体的には、配列番号１〜３９で示されるペプチドのうちのいずれか１つ以上のトリプシン、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、及び／またはＬｙｓ切断断片が示され、本開示の範囲内であることが理解される。
【００３７】
本明細書に示される実施形態は、表１及び２中のペプチドのうちの１つ以上を含む組成物を含み、同位体標識されているが、それ以外に表１及び２中に見出されるペプチドのうちの１つ以上と同一であるペプチドを任意に含み得る。いくつかの実施形態において、該組成物は、表１及び２中のペプチドのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または３９すべてを含む。そのような組成物は、アミノ酸配列が、同位体標識されているが、それ以外に表１及び２中に見出されるペプチドのうちの１つ以上と同一であるペプチドを含むペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を任意に含み得る。表１及び２中のペプチドのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ以上を含む、同位体標識された合成もしくは天然ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が用いられる場合、プロテアーゼ処理は、同位体標識されているが、それ以外に表１及び２中のペプチドと同一であるペプチドを解放する。そのような同位体標識された生物学的または生合成ペプチドは、同位体標識されたアミノ酸を使用して、例えば、プログラムされた細胞溶解物中、または組織培養物中で調製され得る。該同位体標識ペプチドのそれぞれは、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、またはそれらの組み合わせからなる群より独立して選択される１つ以上の同位体で標識され得る。ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来のペプチドを含む組成物は、同位体標識されていてもいなくても、そのタンパク質由来のペプチドのすべて（例えば、トリプシンペプチドの完全なセット）を含有する必要はない。いくつかの実施形態において、該組成物は、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質から組み合わせたすべてのペプチド、及び特に、表１及び表２中に示されているペプチドのすべてを含有するわけではない。ペプチドを含有する組成物は、乾燥もしくは凍結乾燥した材料、液状（例えば、水性）溶液もしくは懸濁液、アレイ、またはブロットの形態であり得る。
【００３８】
一実施形態において、特定のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１ペプチドに関するさらなる情報は、各ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、ならびにＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のＬｙｓ  Ｃタンパク質分解から生じるペプチドに対する各遷移イオンのイオン型のうちの１つ以上、２つ以上、または３つ以上を含む。
【００３９】
別の実施形態において、特定のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１ペプチドに関するさらなる情報は、各ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、ならびにＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のトリプシンタンパク質分解から生じるペプチドに対する各遷移イオンのイオン型のうちの１つ以上、２つ以上、または３つ以上を含む。
【００４０】
さらに別の実施形態において、特定のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１ペプチドに関するさらなる情報は、各ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、ならびにＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のトリプシン及び／またはＬｙｓ  Ｃタンパク質分解から生じるペプチドに対する各遷移イオンのイオン型のうちの１つ以上、２つ以上、または３つ以上を含む。一実施形態において、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のそれぞれに由来の単一のトリプシン及び／またはＬｙｓ  Ｃタンパク質分解ペプチドは、関連するさらなる情報とともに、診断決定に用いられる。したがって、例えば、配列番号４、７、９、１６、３１、及び／または３６のペプチド、ならびにそれらのペプチド（表３参照）に関するさらなる情報が、診断分析に用いられる。
【表３】
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【００４１】
特定の実施形態
本発明の特定の実施形態が以下に記載される。
【００４２】
１．生体試料中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のレベルを測定するための方法であって、質量分析を使用して該生体試料から調製されたタンパク質消化物中の１つ以上の修飾及び／または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量を検出及び／または定量化することと、該試料中の修飾または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のレベルを計算することと、を含み、
該量が相対量または絶対量である、方法。
【００４３】
２．１つ以上の修飾または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量を検出及び／または定量化する前に、該タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
【００４４】
３．該分画ステップが、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーからなる群より選択される、実施形態２に記載の方法。
【００４５】
４．該生体試料の該タンパク質消化物が、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコルによって調製される、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
【００４６】
５．該タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
【００４７】
６．該タンパク質消化物がトリプシン及び／またはｌｙｓ  Ｃ消化物を含む、実施形態５に記載の方法。
【００４８】
７．該質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、及び／または飛行時間型質量分析を含む、実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。
【００４９】
８．使用される質量分析のモードが、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、及び／もしくは複数選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）、またはそれらの任意の組み合わせである、実施形態７に記載の方法。
【００５０】
９．ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６。配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９として示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１〜８のいずれかに記載の方法。
【００５１】
１０．生体試料が、血液試料、尿試料、血清試料、腹水試料、喀痰試料、リンパ液、唾液試料、細胞、または固形組織である、実施形態１〜９のいずれかに記載の方法。
【００５２】
１１．生体試料がホルマリン固定組織である、実施形態１〜１０のいずれかに記載の方法。
【００５３】
１２．生体試料がパラフィン包埋組織である、実施形態１〜１１のいずれかに記載の方法。
【００５４】
１３．生体試料が腫瘍から得られる組織である、実施形態１〜１２のいずれかに記載の方法。
【００５５】
１４．腫瘍が原発腫瘍である、実施形態１３に記載の方法。
【００５６】
１５．腫瘍が二次腫瘍である、実施形態１３に記載の方法。
【００５７】
１６．修飾及び／または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドを定量化することをさらに含む、実施形態１〜１５のいずれかに記載の方法。
【００５８】
１７（ａ）．ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドを定量化することが、１つの生体試料中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の約８〜約４５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む１つ以上のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量を、異なる別個の試料または生体試料中の同一のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量と比較することを含む、実施形態１〜１６のいずれかに記載の方法。
【００５９】
１７（ｂ）．ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドを定量化することが、１つ以上の生体試料中の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６。配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９に示されるＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の約８〜約４５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む１つ以上のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量を、異なる別個の生体試料中の同一のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量と比較することを含む、実施形態１〜１６のいずれかに記載の方法。
【００６０】
１８．１つ以上のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドを定量化することが、生体試料中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドのそれぞれの量を、既知量の添加内部標準ペプチドとの比較によって決定することを含み、生体試料中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドがそれぞれ、同一のアミノ酸配列を有する添加内部標準ペプチドと比較される、実施形態１７（ａ）または１７（ｂ）に記載の方法。
【００６１】
１９．内部標準ペプチドが同位体標識ペプチドである、実施形態１８に記載の方法。
【００６２】
２０．同位体標識内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の重安定同位体を含む、実施形態１９に記載の方法。
【００６３】
２１．タンパク質消化物中の１つ以上の修飾または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量を検出及び／または定量化することが、修飾及び／または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の存在、ならびに患者または対象における癌との関連性を示す、実施形態１〜２０のいずれかに記載の方法。
【００６４】
２２．１つ以上の修飾及び／または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／もしくはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量、または該ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／もしくはＦＧＦＲ１タンパク質の量の該検出及び／または定量化の結果を、癌の診断上の病期／グレード／状態と相関させることをさらに含む、実施形態２１に記載の方法。
【００６５】
２３．１つ以上の修飾または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／もしくはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量、または該ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／もしくはＦＧＦＲ１タンパク質の量の該検出及び／または定量化の結果を、癌の診断上の病期／グレード／状態と相関させることが、他のタンパク質または他のタンパク質からのペプチドの量を検出及び／または定量化することと多重形式で組み合わされて、癌の診断上の病期／グレード／状態に関するさらなる情報を提供する、実施形態２２に記載の方法。
【００６６】
２４．生体試料が得られる患者または対象のために、１つ以上のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／もしくはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの有無もしくは量、またはＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／もしくはＦＧＦＲ１タンパク質の量に基づいて、治療を選択することをさらに含む、実施形態１〜２３のいずれかに記載の方法。
【００６７】
２５．該生体試料が得られた患者または対象に、治療的有効量の治療剤を投与することをさらに含み、治療剤及び／または投与される治療剤の量が、１つ以上の修飾または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／もしくはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量、またはＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／もしくはＦＧＦＲ１タンパク質の量に基づく、実施形態１〜２４のいずれかに記載の方法。
【００６８】
２６．治療または治療剤が、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質を発現する癌細胞に指向される、実施形態２４及び２５に記載の方法。
【００６９】
２７．生体試料が、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコル及び試薬を用いて１つ以上の修飾または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量を定量化するために処理されたホルマリン固定腫瘍組織である、実施形態１〜２７のいずれかに記載の方法。
【００７０】
２８．該１つ以上の修飾または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドが、表１中のペプチドのうちの１つ以上である、実施形態１〜２８のいずれかに記載の方法。
【００７１】
２９．表１中のペプチドのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、もしくは１０以上、及び／またはそれらに対する抗体を含む組成物。
【００７２】
３０．表２中のペプチドのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、もしくは１０以上、及び／またはそれらに対する抗体を含む、実施形態３０に記載の組成物。
【００７３】
例示的なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ法
１．以下に記載される方法は、１）ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の質量分析ベースのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイのために使用することのできるＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来の候補ペプチドを特定し、２）ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来の標的ペプチドのための個別のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ（１つまたは複数）を開発し、３）定量アッセイを癌診断及び／または最適治療の選択に適用するために使用された。ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のためのＳＲＭ／ＭＲＭ候補断片ペプチドの特定：
ａ．プロテアーゼ（１つまた複数）（トリプシンを含んでも含まなくてもよい）を使用して、ホルマリン固定生体試料からＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）タンパク質溶解物を調整して、タンパク質を消化させる。
ｂ．イオントラップタンデム質量分析計において、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の全タンパク質断片を分析し、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来の全断片ペプチドを特定し、この場合、個別の断片ペプチドは、リン酸化またはグリコシル化などのいかなるペプチド修飾も含有しない。
ｃ．イオントラップタンデム質量分析計において、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の全タンパク質断片を分析し、例えば、リン酸化またはグリコシル化残基などのペプチド修飾を有するＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来の全断片ペプチドを特定する。
ｄ．完全長ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質全体から特定の消化方法により生成された全ペプチドを測定することは潜在的に可能であるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの開発に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定生体試料から調製された複合Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）タンパク質溶解物中で直接質量分析により特定されるものである。
ｅ．患者または対象組織中で特異的に修飾され（リン酸化、グリコシル化等）、かつイオン化され、故に、ホルマリン固定生体試料からのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物を分析するとき、質量分析計中で検出することができるペプチドは、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のペプチド修飾をアッセイするための候補ペプチドとして特定される。
【００７４】
２．ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来の断片ペプチドのための質量分析アッセイ：
ａ．Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で特定された個別の断片ペプチドのための三連四重極質量分析計におけるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイが、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来のペプチドに適用される。
ｉ．ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない、最適クロマトグラフィー条件のための断片ペプチドに対する最適保持時間を決定する。
ｉｉ．それぞれのペプチドに対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、ペプチドのモノアイソトピック質量、それぞれのペプチドに対する前駆物質電荷状態、それぞれのペプチドに対する前駆物質ｍ／ｚ値、それぞれのペプチドに対するｍ／ｚ遷移イオン、及びそれぞれの断片ペプチドに対するそれぞれの遷移イオンのイオン型を決定する。
ｉｉｉ．次いで、（ｉ）及び（ｉｉ）からの情報を用いて、三連四重極質量分析計においてＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うことができ、この場合、それぞれのペプチドは、三連四重極質量分析計で行われる独特のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを明確に規定する特徴的かつ固有のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピークを有する。
ｂ．ＳＲＭ／ＭＲＭ質量分析の分析から固有のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積の関数として、検出されるＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の断片ペプチドの量が、特定のタンパク質溶解物中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の相対及び絶対量の両方を示すことができるように、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析を実施する。
ｉ．相対的定量化は、以下により得ることができる。
１．（ａ）１つのホルマリン固定生体試料からのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で検出された所与のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、（ｂ）少なくとも第２、第３、第４、またはそれを超えるホルマリン固定生体試料からの少なくとも第２、第３、第４、またはそれを超えるＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の同一のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１断片ペプチドの同一のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の存在の増加または減少を決定すること。
２．（ａ）１つのホルマリン固定生体試料からのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で検出された所与のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、（ｂ）異なる別個の生物学的起源由来の他の試料中の他のタンパク質由来の断片ペプチドから生成されたＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の存在の増加または減少を決定し、この場合、２つの試料間のペプチド断片に対するＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積の比較は、各試料中で分析されたタンパク質の量に正規化される。
３．ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の変化するレベルを、様々な細胞条件下でのそれらの発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルに正規化するために、（ａ）所与のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、（ｂ）ホルマリン固定生体試料からの同一のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の異なるタンパク質に由来する他の断片ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の存在の増加または減少を決定すること。
４．これらのアッセイを、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の非修飾断片ペプチド、ならびに修飾断片ペプチドの両方に適用することができ、この場合、修飾には、リン酸化及び／またはグリコシル化が含まれるが、これらに限定されず、修飾ペプチドの相対レベルは、非修飾ペプチドの相対量を決定するのと同一の様式で決定される。
ｉｉ．所与のペプチドの絶対定量化は、（ａ）個別の生体試料中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来の所与の断片ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、（ｂ）生体試料からのタンパク質溶解物中にスパイクされた内部断片ペプチド標準物のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、達成され得る。
１．内部標準物は、調べられているＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来の断片ペプチドの標識された合成バージョンである。この標準物は、既知量で試料中にスパイクされ、ＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積は、生体試料中の内部断片ペプチド標準物及び天然断片ペプチドの両方に対し、個別に決定され、その後、両方のピーク面積が比較され得る。
２．これは、非修飾断片ペプチド及び修飾断片ペプチドに適用可能であり、この場合、修飾には、リン酸化及び／またはグリコシル化が含まれるが、これに限定されず、また、修飾ペプチドの絶対レベルは、非修飾ペプチドの絶対的量を決定するのと同一の方法で決定され得る。
【００７５】
３．断片ペプチド定量化の癌診断及び治療への適用
ａ．ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の断片ペプチドレベルの相対及び／または絶対定量化を実施し、癌の分野で十分に理解されている、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質発現と患者及び対象の腫瘍組織における癌の病期／グレード／状態との以前に決定された関連性が確認されることを実証する。
ｂ．ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の断片ペプチドレベルの相対及び／または絶対定量化を実施し、異なる治療戦略からの臨床転帰との相関を実証し、この場合、この相関は、この分野ですでに実証されているか、または患者もしくは対象のコホート、及びそれらの患者もしくは対象からの組織にわたる相関研究により将来実証することができる。一旦以前に確立された相関関係、または将来得られる相関関係のいずれかがこのアッセイにより確認されると、本アッセイ方法を使用して、最適治療戦略を決定することができる。
【００７６】
ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来の断片ペプチドの質量分析アッセイ
ａ．タンパク質溶解物中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の相対及び／または絶対量を決定するために検出されるＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の断片ペプチドの量を決定するためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ。
ｉ．相対定量化は、下記により得ることができる。
１．（ａ）１つのホルマリン固定生体試料からのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で検出される所与のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、（ｂ）少なくとも第２、第３、第４、またはそれを超えるホルマリン固定生体試料からの少なくとも第２、第３、第４、またはそれを超えるＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の同一のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの同一のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の存在の増加または減少を決定すること。
２．（ａ）１つのホルマリン固定生体試料からのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で検出される所与のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、（ｂ）異なる別個の生物学的起源由来の他の試料中の他のタンパク質由来の断片ペプチドから生成したＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の存在の増加または減少を決定することであり、２つの試料間のペプチド断片に対するＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積比較は、各試料中で分析されたタンパク質の量に正規化される。
３．ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の変化するレベルを、様々な細胞条件下でのそれらの発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルに正規化するために、（ａ）所与のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、（ｂ）ホルマリン固定生体試料からの同一のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の異なるタンパク質に由来する他の断片ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の存在の増加または減少を決定すること。
４．これらのアッセイを、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の非修飾断片ペプチド、ならびに修飾断片ペプチドの両方に適用することができ、修飾には、リン酸化及び／またはグリコシル化が含まれるが、これらに限定されず、修飾ペプチドの相対レベルは、非修飾ペプチドの相対量を決定するのと同一の様式で決定される。
ｉｉ．所与のペプチドまたはそれが由来するタンパク質の絶対定量化は、（ａ）個別の生体試料中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来の所与の断片ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、（ｂ）生体試料からのタンパク質溶解物中にスパイクされた内部断片ペプチド標準物のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより達成され得る。
【００７７】
内部標準物は、調べられているＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質由来の断片ペプチドの標識された合成バージョン（または、タンパク質分解時に放出される断片ペプチドの標識された合成バージョンを含むタンパク質もしくはポリペプチド）である。この標準物は、既知量で試料中にスパイクされ、ＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積が、生体試料中の内部断片ペプチド標準物及び天然断片ペプチドの両方に対し、別々に決定され、その後、両ピーク面積が比較され得る。
【００７８】
これは、非修飾断片ペプチド及び修飾断片ペプチドに適用可能であり、この場合、修飾には、リン酸化及び／またはグリコシル化が含まれるが、これに限定されず、また、修飾ペプチドの絶対レベルは、非修飾ペプチドの絶対的量を決定するのと同一の方法で決定され得る。
【００７９】
ホルマリン固定患者由来または対象由来の組織の分析に基づいた組織中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質レベルの評価は、それぞれの特定の患者または対象に関する診断、予後、及び治療的関連情報を提供することができる。生体試料中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のレベルを測定するための方法が、本明細書に記載され、この方法は、質量分析を使用して、該生体試料から調製されたタンパク質消化物中の１つ以上の修飾または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量を検出及び／または定量化することと、該試料中の修飾または非修飾ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のレベルを計算することと、を含み、該レベルは、相対レベルまたは絶対レベルである。関連実施形態において、１つ以上のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドを定量化することは、既知量の添加内部標準ペプチドとの比較により、生体試料中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドのそれぞれの量を決定することを含み、生体試料中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドがそれぞれ、同一のアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される。いくつかの実施形態において、内部標準物は、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の重安定同位体を含む、同位体標識内部標準ペプチドである。
【００８０】
本明細書に記載される生体試料中のＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質（または、そのサロゲートとしての断片ペプチド）のレベルを測定するための方法は、患者または対象における癌の診断上の指標として使用され得る。
一実施形態において、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のレベルの測定からの結果を用いて、組織中に見出されるＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のレベルを、正常及び／または癌性もしくは前癌性組織中に見出されるＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質のレベルと相関させること（例えば、比較すること）により、診断上の癌の病期／グレード／状態を決定し得る。
【００８１】
ホルマリン固定患者組織中の特定のタンパク質のレベルを検出するために使用されている唯一の現行方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）である。この方法は、患者腫瘍組織試料からの単一の組織切片において一回につき１つのタンパク質のみを分析する。このため、複数のタンパク質を分析するためには、複数の組織切片を調べなければならず、それには多くの時間及び労力がかかる。ＩＨＣは、抗体を使用して標的タンパク質の存在を検出し、抗体のタンパク質への非特異的結合の可能性があるので、いかなるＩＨＣ実験においても信号バックグラウンドの生来の大きな可能性がある。加えて、ＩＨＣは、良くても半定量的でしかない。これらの問題に起因して、ＩＨＣは、複数のタンパク質の客観的な定量的分析を同時に提供することができない。本明細書に記載される方法は、患者組織試料の単一の切片を利用して、１００％アッセイ特異性で、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の客観的定量化を同時に提供することができ、多くの時間及び費用を節約しながら、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質の発現に関するより一層有益なデータを提供する。
【００８２】
この多重ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイはまた、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、及びｃＭｅｔなどの薬物標的タンパク質を含む、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質以外の他のさらなるタンパク質の同時分析を含むことができる。これは、さらなるタンパク質の分析が、さらなる薬物が特定の癌の治療に有用であり得ることも示すため、有益である。さらなる例となる薬物標的タンパク質の分析に基づいたさらなる薬物の例としては、ＥＧＦＲ受容体を標的とするアービタックス、ＩＧＦ−１Ｒを標的とするフィギツムマブ、及びｃ−Ｍｅｔ及び血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）を標的とするフォレチニブ（Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ）が挙げられる。
【００８３】
核酸及びタンパク質の両方を同一のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）生体分子の調製物から分析することができるので、タンパク質分析に使用される同一の試料中の核酸から、疾患の診断及び薬物治療決定に関するさらなる情報を生成することが可能である。例えば、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１タンパク質が、特定の細胞により増加したレベルで発現される場合、ＳＲＭによりアッセイされるとき、データは細胞の状態に関する情報を提供することができ、細胞の、制御されない成長、潜在的な薬物耐性、及び癌の発生の可能性を得ることができる。同時に、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＦＧＦＲ１遺伝子ならびに／またはそれらがコードする核酸及びタンパク質の状態に関する情報（例えば、ｍＲＮＡ分子及びそれらの発現レベルまたはスプライス変異体）を、同一の生体分子の調製物中に存在する核酸から得ることができる。一実施形態において、ＡＬＫ、Ｒｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／もしくはＦＧＦＲ１タンパク質、ならびに／または１つ、２つ、２つ、３つ、４つ以上のさらなるタンパク質に関する情報は、それらのタンパク質をコードする核酸を試験することによって分析され得る。これらの核酸を、例えば、シークエンシング法、ポリメラーゼ連鎖反応法、制限断片多型分析、欠失の識別、挿入、及び／または単一塩基対多型、遷移、塩基転換、もしくはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、突然変異体の存在の決定のうちの１つ以上、２つ以上、または３つ以上により、調査することができる。
【００８４】
上の説明ならびに方法及び組成物の例示的な実施形態は、本開示の範囲を例示説明するものである。しかしながら、当業者には明らかであろう変形のため、本開示は、上に記載される特定の実施形態に限定することを意図するものではない。
【配列表】
2019049557000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月24日(2018.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルマリン固定組織のヒト生体試料中のＦＧＦＲ１タンパク質の量を測定するための方法であって、質量分析を使用して前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中のＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量を検出及び定量化することと、前記試料中のＦＧＦＲ１タンパク質の量を計算することとを含んでなり、ここで、前記ＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドは、配列番号３９のアミノ酸配列を有するペプチドであり、前記量が、相対量または絶対量である、方法。
【請求項２】
前記ＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量を検出及び定量化する前に、前記タンパク質消化物を分画するステップをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト生体試料が腫瘍から取得されるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
１つ以上のＲｏｓ、Ｒｏｎ、Ｒｅｔ、ＴＳ、及び／またはＡＬＫタンパク質断片ペプチドを定量化することをさらに含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドを定量化することが、１つの生体試料中の前記ＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量を、異なる別個の生体試料中の同一のＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量と比較することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドを定量化することが、生体試料中の前記ＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量を、既知量の添加内部標準ペプチドとの比較によって決定することを含んでなり、前記生体試料中の前記ＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドが、同一のアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記内部標準ペプチドが同位体標識ペプチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質消化物中の前記ＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量を検出及び定量化することが、前記生体試料中の修飾または非修飾ＦＧＦＲ１タンパク質の存在、及び前記生体試料が得られた患者または対象における、肺癌を含む癌との関連性を示す、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量、または前記ＦＧＦＲ１タンパク質の量の前記検出及び定量化の結果を、肺癌を含む前記癌の診断上の病期／グレード／状態と相関させることをさらに含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量、または前記ＦＧＦＲ１タンパク質の量の前記検出及び定量化の結果を、前記癌の診断上の病期／グレード／状態と相関させることが、他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドの量を検出及び／または定量化することと多重形式で組み合わされて、肺癌を含む前記癌の診断上の病期／グレード／状態に関するさらなる情報を提供する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体試料が得られた患者または対象に治療的有効量の治療剤を投与するための治療レジメンを決定するための指標を、医師または他の医療従事者に提供することをさらに含んでなり、前記治療剤及び／または投与される前記治療剤の量が、前記ＦＧＦＲ１タンパク質断片ペプチドの量、またはＦＧＦＲ１タンパク質の量に基づいて決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記治療剤がＦＧＦＲ１タンパク質を発現する癌細胞に指向される、請求項１２に記載の方法。