(57)【要約】【課題】細胞をより効率的かつ高品質に大量生産すること。【解決手段】本発明の一実施形態に係る細胞生産方法は、アモルファスカーボンの被膜を有する培養基材を用意する第１の工程と、第１の工程で用意された培養基材において細胞を培養する第２の工程と、第２の工程において培養された培養基材内の細胞に音響放射圧を付与することにより、培養された細胞を剥離する第３の工程と、を含む。【選択図】図３
2019030260.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アモルファスカーボンの被膜を有する培養基材を用意する第１の工程と、
前記第１の工程で用意された前記培養基材において細胞を培養する第２の工程と、
前記第２の工程において培養された前記培養基材内の細胞に音響放射圧を付与することにより、培養された細胞を剥離する第３の工程と、
を含むことを特徴とする細胞生産方法。
【請求項２】
前記第３の工程では、前記音響放射圧を発生するための加振振動数がスイープされることを特徴とする請求項１に記載の細胞生産方法。
【請求項３】
前記第３の工程の後、剥離された細胞を別の前記培養基材で再び培養する第４の工程と、
前記第４の工程において培養された前記培養基材内の細胞に音響放射圧を付与することにより、培養された細胞を剥離する第５の工程と、
をさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞生産方法。
【請求項４】
前記第３の工程の後、前記培養基材に残存した細胞を再び培養する第６の工程と、
前記第６の工程において培養された前記培養基材内の細胞に音響放射圧を付与することにより、培養された細胞を剥離する第７の工程と、
をさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞生産方法。
【請求項５】
前記第１の工程では、所定の培養基材表面にアモルファスカーボンの被膜を形成することにより、前記培養基材が用意されることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞生産方法。
【請求項６】
アモルファスカーボンの被膜を有し、細胞が培養された培養基材に超音波振動を伝達する伝達媒体と、
前記伝達媒体に付与される超音波振動を発生する音響放射圧発生手段と、
を備え、
前記伝達媒体から前記培養基材に前記超音波振動が伝達されることにより、前記培養基材において培養されている細胞を音響放射圧によって剥離することを特徴とする細胞生産装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞生産方法及び細胞生産装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ｉＰＳ細胞をはじめとして、再生医療を治療に応用することへの期待が高まっている。再生医療を応用した治療においては、大量の細胞が必要であることから、大量の細胞を効率的かつ安定的に供給することが望まれている。また、細胞は浮遊性細胞と接着性細胞に大別できるが、生体組織の大部分は接着性細胞によって構成されていることから、とりわけ大量の接着性細胞が必要とされる。
従来の細胞培養においては、ディッシュでの細胞の培養、ディッシュからの細胞の剥離、細胞の回収及び洗浄の各工程を経て、目的とする細胞が取得される。
このような細胞培養の手法において、細胞を大量生産する上では、細胞の生産に要する時間を短縮すること、細胞の生産工程を簡素化すること、及び、生産される細胞の品質を確保することが求められる。
なお、細胞の品質低下を抑制可能な細胞の生産方法として、特許文献１に記載された技術が知られている。
特許文献１に記載された技術においては、温度刺激による細胞の剥離方法を実現しており、トリプシンを用いることなく細胞を剥離するものとしている。そのため、特許文献１に記載された技術によれば、トリプシンによるタンパク質の溶解に起因して、細胞の増殖性や活性が低下することを抑制できると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１５−２１６８６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、温度刺激による細胞の剥離方法においては、細胞の剥離に際して、細胞周辺の温度を低下させる必要があり、温度の低下により細胞の増殖性に影響が生じる可能性がある。また、トリプシンを用いずに細胞を剥離する方法は、トリプシンを用いる方法に比べ、コストや技術的な難易度が高くなる傾向にある。
したがって、従来の技術においては、細胞を効率的かつ高品質に大量生産することが困難であった。
【０００５】
本発明は、細胞をより効率的かつ高品質に大量生産することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明の一態様の細胞生産方法は、
アモルファスカーボンの被膜を有する培養基材を用意する第１の工程と、
前記第１の工程で用意された前記培養基材において細胞を培養する第２の工程と、
前記第２の工程において培養された前記培養基材内の細胞に音響放射圧を付与することにより、培養された細胞を剥離する第３の工程と、
を含む。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、細胞をより効率的かつ高品質に大量生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本実施形態で用いられるＤＬＣコーティングディッシュ１００の構成を示す模式図である。
【図２Ａ】本発明の第１実施形態に係る細胞生産装置１の全体構成を示す模式図である。
【図２Ｂ】本発明の第１実施形態に係る細胞生産装置１の使用形態例を示す模式図である。
【図３】細胞生産装置１の動作時におけるＤＬＣコーティングディッシュ１００内の状態遷移を模式的に示す図である。
【図４】既存の細胞生産方法の手順と本発明における細胞生産方法の手順とを比較して示す模式図である。
【図５】本発明に係る細胞生産方法とトリプシンを用いた場合とにおいて細胞の回収実験を行った結果を示す模式図である。
【図６】本発明に係る細胞生産方法とトリプシンを用いた場合とにおいて細胞の定着実験を行った結果を示す模式図である。
【図７】本発明に係る細胞生産方法とトリプシンを用いた場合とにおいて細胞の表面を撮影した顕微鏡写真である。
【図８】ランジュバン型超音波振動子からなる振動部材１３の構成例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の実施形態について、図面を用いて説明する。
［本発明の基本的概念］
本発明に係る細胞生産方法では、培養ディッシュ表面に所定のアモルファスカーボン膜を成膜し、この培養ディッシュに細胞の培地を形成して、接着性細胞を培養する。ここで成膜される所定のアモルファスカーボン膜には、ＤＬＣ（Ｄｉａｍｏｎｄ−Ｌｉｋｅ  Ｃａｒｂｏｎ）あるいはＰＬＣ（Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｌｉｋｅ  Ｃａｒｂｏｎ）の被膜が含まれるが、本実施形態においては、アモルファスカーボン膜の一例として、ＤＬＣ被膜を培養ディッシュ表面に形成するものとする。以下、この構造を有する培養ディッシュを適宜「ＤＬＣコーティングディッシュ」と称する。そして、ＤＬＣコーティングディッシュの外底面（裏面）から振動子によって超音波振動を入力し、培養された細胞を音響放射圧によって剥離する。
このとき音響放射圧（超音波振動）を発生させる装置は、例えば、圧電素子を用いた超音波振動子等からなる振動発生装置を用いることができる。
本実施形態で用いられるＤＬＣコーティングディッシュは、細胞の定着性が培養に適した表面特性であると共に、音響放射圧を付与した場合の細胞の剥離性がＤＬＣの非成膜時に対して一定以上の表面特性となっている。
そのため、細胞の生産において、超音波振動をＤＬＣコーティングディッシュに入力することで、音響放射圧によって細胞がＤＬＣの被膜から容易に分離し、トリプシン等の酵素を用いることなく、培養された細胞を剥離・回収することができる。
したがって、本発明によれば、細胞の剥離工程及び回収工程において、トリプシン等の酵素による浸漬や洗浄が不要となるため、工程の簡素化、生産時間の短縮、生産される細胞の高活性化・高品質化等の効果を実現することができる。
即ち、本発明によれば、細胞をより効率的かつ高品質に大量生産することが可能となる。
なお、以下、培養の対象とする細胞がＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）である場合を想定して説明するが、ｉＰＳ細胞等の各種接着性細胞を培養の対象とすることができる。また、本発明において、細胞の培養に用いられる培地としては、無血清の培地及び血清が添加された培地のいずれも採用可能である。
【００１０】
［第１実施形態］
［培養ディッシュの構成］
本実施形態において用いられる培養ディッシュ（ＤＬＣコーティングディッシュ）は、ディッシュ表面に所定のＤＬＣ被膜が形成された構造を有している。
図１は、本実施形態で用いられるＤＬＣコーティングディッシュ１００の構成を示す模式図である。
図１においては、ＤＬＣコーティングディッシュ１００の鉛直断面図が示されており、内周面及び内底面にＤＬＣの被膜が形成された状態が模式的に示されている。なお、図１におけるＤＬＣ被膜の膜厚等は、説明の便宜上、実際の膜厚よりも誇張して示されている。
【００１１】
図１において、ＤＬＣコーティングディッシュ１００は、例えば、ガラス材料の培養ディッシュを用意し、ＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｖａｐｏｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）等のコーティング手法によってＤＬＣの被膜を一様に形成することで取得される。なお、ＤＬＣコーティングが可能であれば、ガラス材料以外の培養ディッシュを用いることも可能である。
【００１２】
本実施形態におけるＤＬＣコーティングディッシュ１００は、超音波振動が入力された場合に、ＤＬＣ被膜を有していない培養ディッシュよりも、培養された細胞の音響放射圧による剥離が容易となる膜の形態（膜厚及び膜種等）であることが必要である。
一方、細胞の培養作業の便宜上、ＤＬＣコーティングディッシュ１００における細胞の培養状態を外部から視認可能であることが望ましく、例えば、ＤＬＣコーティングディッシュ１００の蓋にはＤＬＣ被膜を形成しない（またはＤＬＣコーティングディッシュ１００よりも膜厚を薄く形成する）ことや、ＤＬＣコーティングディッシュ１００に形成する膜の形態（膜厚及び膜種等）を、外部から細胞の培養状態を視認可能なものとすることが好適である。
【００１３】
このように培養ディッシュ表面にＤＬＣ被膜を形成することにより、ＤＬＣ被膜を形成する前の培養ディッシュの表面から特性が変化し、細胞の培養に適切な定着性を有すると共に、音響放射圧を付与した場合の剥離性がより高いＤＬＣコーティングディッシュ１００を構成することができる。
【００１４】
本実施形態においては、このＤＬＣコーティングディッシュ１００を用いて、ＣＨＯ細胞を培養した後、音響放射圧による剥離を行い、剥離された細胞を回収する。そして、回収した細胞を別のＤＬＣコーティングディッシュ１００に再播種して再培養する。このように細胞の剥離を行うことで、トリプシン等の酵素を用いる必要がないことから、剥離された細胞の活性が高いものとなり、培養を複数回繰り返す場合の接着等に要する時間が短縮され、細胞をより効率的かつ高品質に大量生産することができる。
また、本実施形態においては、１つのＤＬＣコーティングディッシュ１００を用いて、ＣＨＯ細胞の培養及び音響放射圧による剥離を１回または複数回行い、剥離された細胞を回収することで、大量の培養細胞をトリプシン等の酵素を用いることなく生産することも可能である。この場合、ＣＨＯ細胞の培養後、音響放射圧によって剥離された細胞をＤＬＣコーティングディッシュ１００から回収し、このＤＬＣコーティングディッシュ１００に残存した細胞をさらに培養することで、一旦、培養環境が整えられたＤＬＣコーティングディッシュ１００を再利用し、複数回の培養を行うことが可能である。
【００１５】
［細胞生産装置の構成］
次に、本実施形態で用いられる細胞生産装置１の構成について説明する。
図２Ａは、本発明の第１実施形態に係る細胞生産装置１の全体構成を示す模式図である。また、図２Ｂは、本発明の第１実施形態に係る細胞生産装置１の使用形態例を示す模式図である。
図２Ａ及び図２Ｂに示すように、細胞生産装置１は、加振ユニット１０と、発信器２０と、アンプ３０と、コントローラ４０とを備えている。
【００１６】
加振ユニット１０は、下側アクリル板１１と、フェルト部材１２と、振動部材１３と、ガラス板１４と、上側シリコーンラバー部材１５と、上側アクリル板１６と、ボルト１７及びナット１８とを備えている。なお、図２Ａにおいて、加振ユニット１０は、説明の便宜のため、分解図として示されている。
【００１７】
下側アクリル板１１は、方形のアクリル樹脂によって構成され、細胞生産装置１の各部材が設置されるベース部材となる。なお、下側アクリル板１１に代えて、ポリカーボネート製の板状部材等を用いることとしてもよい。
フェルト部材１２は、円環形状に構成され、下側アクリル板１１の上に設置される。また、フェルト部材１２は、その上に設置される振動部材１３を下側から支持する。
振動部材１３は、圧電素子からなる超音波振動子等を備えて構成され、本実施形態においては、円環形状の部材として構成されている。また、振動部材１３は、下面をフェルト部材１２に支持されている。なお、後述するように、本実施形態においては、振動部材１３が有する固有振動数の範囲をカバーするように、振動部材１３における加振振動数がスイープされる。これにより、ＤＬＣコーティングディッシュ１００の個体差等、条件の相違がある場合であっても、これらの条件を吸収して、振動部材１３に固有振動（超音波振動）を確実に発生させることができる。
【００１８】
ガラス板１４は、振動部材１３の上に設置され、ＤＬＣコーティングディッシュ１００を載置するためのステージとなる円形の部材によって構成される。また、ガラス板１４は、ＤＬＣコーティングディッシュ１００の素材と近い超音波振動の伝達率を有する部材によって構成されている。ガラス板１４をＤＬＣコーティングディッシュ１００の素材と近い超音波振動の伝達率を有する部材で構成する理由は、超音波振動の伝達率が大きく異なると、その境界において、音波が大きく反射し、ＤＬＣコーティングディッシュ１００に対して効率的に超音波振動を伝達することができないためである。
【００１９】
ここで、ガラス板１４とＤＬＣコーティングディッシュ１００との間に、水等の液体やグリセロール等のゲル状物質を介在させることとしてもよい。これら液体あるいはゲル状物質の層が形成されることにより、ガラス板１４とＤＬＣコーティングディッシュ１００の外底面（裏面）との間に空気層が生じることを防ぐことができる。なお、これら液体あるいはゲル状物質は、超音波振動の伝達率がＤＬＣコーティングディッシュ１００の素材と近いものであるため、音波の反射を抑制できる。
【００２０】
上側シリコーンラバー部材１５は、方形のシリコーン樹脂によって構成され、ガラス板１４の上に設置される。また、上側シリコーンラバー部材１５は、中央にＤＬＣコーティングディッシュ１００を収容する貫通穴を有すると共に、ガラス板１４の周縁を上側から支持する。
上側アクリル板１６は、方形のアクリル樹脂によって構成され、上側シリコーンラバー部材１５の上に設置される。また、上側アクリル板１６は、上側シリコーンラバー部材１５と同様に、中央にＤＬＣコーティングディッシュ１００を収容する貫通穴を有すると共に、上側シリコーンラバー部材１５を上側から支持する。なお、上側アクリル板１６に代えて、ポリカーボネート製の板状部材等を用いることとしてもよい。
【００２１】
このように、加振ユニット１０においては、下側アクリル板１１、フェルト部材１２、振動部材１３、ガラス板１４、上側シリコーンラバー部材１５及び上側アクリル板１６が積層して配置されると共に、方形の下側アクリル板１１、フェルト部材１２、上側シリコーンラバー部材１５及び上側アクリル板１６の四隅には、ボルト１７を挿通する貫通穴が形成されている。そして、これらの貫通穴を加振ユニット１０の上側からボルト１７が挿通し、最下部に位置する下側アクリル板１１の下側からナット１８で締め付けることにより、下側アクリル板１１と上側アクリル板１６との間において、各部材が挟み込んで支持される。
さらに、このように構成された加振ユニット１０において、図２Ｂに示すように、上側シリコーンラバー部材１５及び上側アクリル板１６に形成された貫通穴内にＤＬＣコーティングディッシュ１００が配置され、ガラス板１４上にＤＬＣコーティングディッシュ１００が載置されると共に、重りＷがＤＬＣコーティングディッシュ１００の蓋に載せられた状態で、超音波振動が入力される。
【００２２】
発信器２０は、コントローラ４０からの指示信号によって指示される周波数で交流電圧の信号（交流信号）を発生させ、発生した交流信号を振動部材１３の圧電素子に印加する。
アンプ３０は、発信器２０によって発生された交流信号を目的とするレベルに増幅する。アンプ３０の出力は、振動部材１３における圧電素子の駆動電圧として印加される。
コントローラ４０は、ＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）あるいはＰＬＣ（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｌｏｇｉｃ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）等の制御装置によって構成される。コントローラ４０には、振動部材１３に対して印加する加振振動数の範囲が設定されている。この加振振動数の範囲は、振動部材１３が有する固有振動数の範囲をカバーするように設定されている。そして、コントローラ４０は、発信器２０に対して指示信号を出力し、設定された加振振動数の範囲を所定時間でスイープさせる。
【００２３】
［動作］
次に、細胞生産装置１の動作を説明する。
図３は、細胞生産装置１の動作時におけるＤＬＣコーティングディッシュ１００内の状態遷移を模式的に示す図である。
以下、図３を適宜参照しつつ、細胞生産装置１の動作について説明する。
［装置の基本動作］
細胞生産装置１の駆動に先立ち、培養工程として、ＤＬＣコーティングディッシュ１００の内底面に培地を形成し、この培地に細胞を培養する（図３における状態（ａ））。
そして、剥離工程として、細胞生産装置１によって、培養されたＤＬＣコーティングディッシュ１００内の細胞に音響放射圧を付与し、接着性細胞を剥離させる。
具体的には、剥離工程として、細胞生産装置１による以下のような処理が実行される。
細胞が培養されたＤＬＣコーティングディッシュ１００を細胞生産装置１のステージ（ガラス板１４）上に載置する。
この状態において、細胞生産装置１の発信器２０が、設定された周波数で交流信号を発生させ、アンプ３０が、発生された交流信号を増幅して振動部材１３の圧電素子に印加する。このとき、コントローラ４０に設定された加振振動数の範囲をスイープさせて、発信器２０から交流信号を発生させる。
すると、発信器２０によって発生された交流信号がアンプ３０によって増幅されて、振動部材１３の圧電素子に印加される。
【００２４】
本実施形態においては、振動部材１３は、交流信号が入力されることにより、厚さ方向に超音波振動を発生させる。
この結果、ＤＬＣコーティングディッシュ１００の外底面において、超音波振動が入力され、ＤＬＣコーティングディッシュ１００内の細胞に音響放射圧が付与される（図３における状態（ｂ））。
このとき、コントローラ４０に設定された加振振動数の範囲がスイープされることから、細胞生産装置１に設置された振動部材１３に確実に固有振動が発生し、音響放射圧によって接着性細胞が剥離される状態となる（図３における状態（ｃ））。
【００２５】
このように、細胞生産装置１によれば、トリプシン等の酵素を用いることなく、接着性細胞をＤＬＣコーティングディッシュ１００から剥離することができる。また、振動部材１３に印加される加振振動数がスイープされることから、ＤＬＣコーティングディッシュ１００の個体差等、条件に相違がある場合であっても、加振振動数をスイープすることで、これらの条件を吸収して、振動部材１３に固有振動を確実に発生させることができる。
即ち、細胞生産装置１によれば、細胞をより効率的かつ高品質に大量生産することができる。
【００２６】
［細胞生産方法の具体例］
次に、細胞生産装置１を用いた細胞生産方法の具体例について説明する。
なお、以下の各工程は、滅菌環境を維持した状態で実行される。
【００２７】
初めに、培養工程として、ＤＬＣコーティングディッシュ１００の内底面に培地を形成し、この培地に細胞を培養する（工程１）。
具体的には、工程１においては、以下の手順（１）〜（４）が含まれる。
（１）細胞を培地に懸濁してＤＬＣコーティングディッシュ１００に播種する。
（２）インキュベータ（３７℃、ＣＯ２５％、湿度１００％）内で数日間培養する。
（３）細胞を観察し、ＤＬＣコーティングディッシュ１００内底面のおよそ８〜９割に細胞が接着していることを確認し、培地を除去する。
（４）生理食塩水（ＰＢＳ）でＤＬＣコーティングディッシュ１００の表面を１〜３回洗浄し、培地を完全に除去する。
そして、剥離工程として、細胞生産装置１によって、ＤＬＣコーティングディッシュ１００内の細胞に音響放射圧を付与し、接着性細胞を剥離させる（工程２）。
具体的には、工程２においては、以下の手順（５）、（６）が含まれる。
（５）ＰＢＳを添加し、インキュベータ（３７℃、ＣＯ２５％、湿度１００％）内に５分間静置する。
（６）音響放射圧（２９〜３１ｋＨｚ、２００Ｖ）をＤＬＣコーティングディッシュ１００の外底面から照射（即ち、超音波振動を入力）する。
さらに、回収工程として、工程２によって剥離した細胞をＤＬＣコーティングディッシュ１００から回収する（工程３）。
具体的には、工程３においては、以下の手順（７）が含まれる。
（７）細胞懸濁液をＤＬＣコーティングディッシュ１００から遠沈管に回収し、培地で懸濁する。
【００２８】
そして、工程３で取得した細胞を新たなＤＬＣコーティングディッシュ１００に再播種して培養を行う（工程１への再帰）。
このとき、工程３で取得したサンプルの一部を培地で満たした新たなＤＬＣコーティングディッシュ１００に再播種し、再度培養が行われる。
このような細胞生産方法を実施することにより、トリプシン等の酵素を用いることなく剥離・回収された細胞が再び培養されるため、培養される細胞の活性が高いものとなり、培養を複数回繰り返す場合の接着等に要する時間が短縮され、細胞をより効率的かつ高品質に大量生産することができる。
【００２９】
なお、工程１に再帰する工程では、工程３の後にＤＬＣコーティングディッシュ１００に残存している細胞を引き続き培養することも可能である。
この場合、ＤＬＣコーティングディッシュ１００内の培地は新しい培地に交換されるが、ＤＬＣコーティングディッシュ１００の内底面には、細胞が生成したタンパク質（細胞外マトリクス）が残存している。そのため、新たなＤＬＣコーティングディッシュ１００に新たに培地を形成して細胞を培養する場合よりも、細胞が増殖し易く、培養された細胞の活性化も高いものとなるため、大量に細胞を培養する上で有利である。
このような細胞生産方法を実施することにより、同一のＤＬＣコーティングディッシュ１００において、トリプシン等の酵素を用いることなく、複数回の細胞の培養、剥離及び回収を行うことができるため、細胞生産工程の自動化率を高め、細胞の生産効率を向上させることが可能となる。
以下、工程１から工程３を目的とする回数だけ繰り返す。
【００３０】
ちなみに、既存の細胞生産方法においては、上記工程２の手順（５）、（６）及び工程３の手順（７）が、本発明における細胞生産方法と大きく異なっている。
図４は、既存の細胞生産方法の手順と本発明における細胞生産方法の手順とを比較して示す模式図である。
図４に示すように、既存の細胞生産方法では、以下の手順（５）〜（９）を経て細胞の生産が行われる。
（５）トリプシン−ＥＤＴＡを添加し、インキュベータ（３７℃、ＣＯ２５％、湿度１００％）内に３〜１０分間静置する。
（６）ピペッティングや振とうにより細胞を剥離する。
（７）培地を添加し、トリプシンの効果を阻害する。
（８）遠沈管に回収して、２〜５分間遠心分離器にかけて、細胞と溶液を分離する。
（９）上積み液を回収し，培地で再度懸濁する。
なお、既存の細胞生産方法の場合、手順（９）の後、手順（９）で取得した細胞を、培地で満たした新たな培養ディッシュに再播種して、再度培養が行われる。
【００３１】
［効果］
次に、本発明に係る細胞生産方法を適用した場合の効果を説明する。
［細胞の剥離性］
図５は、本発明に係る細胞生産方法とトリプシンを用いた場合とにおいて細胞の回収実験を行った結果を示す模式図である。
図５に示す細胞の回収実験では、以下の手順で細胞を回収した。なお、以下の説明において、ＰＢＳ（−／−）の表記は、ＰＢＳの成分として、カルシウム及びマグネシウムが含まれていないことを示している。
（１）ＣＨＯ細胞をφ３５ディッシュ（ＤＬＣ，Ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｄｉｓｈ）に播種する（４．０×１０５ｃｅｌｌｓ）。
（２）２４時間後、ＰＢＳ（−／−）で洗浄して、ＰＢＳ（−／−）に浸漬して５分間スイープ振動励振（２９−３１ｋＨｚ，１０ｍｓ，２００Ｖ）して細胞を回収した。
なお、Ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＰＢＳ（−／−）に５分間浸漬した後にトリプシンに５分間浸漬したシリーズを準備した。
（２）の後、血球計算盤で細胞数を測定した。
その結果、図５に示すように、本発明に係る細胞生産方法とトリプシンを用いた場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とでは、有意差が見られず、同等の数の細胞が回収されていることがわかった。
即ち、本発明に係る細胞生産方法とトリプシンを用いた場合とにおいて、細胞の剥離性は同等であることがわかる。
【００３２】
［細胞の定着性］
図６は、本発明に係る細胞生産方法とトリプシンを用いた場合とにおいて細胞の定着実験を行った結果を示す模式図である。
図６に示す細胞の定着実験では、以下の手順で細胞を回収した。
（１）ＣＨＯ細胞をφ３５ディッシュ（ＤＬＣ，Ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｄｉｓｈ）に播種する（４．０×１０５ｃｅｌｌｓ）。
（２）２４時間後、ＰＢＳ（−／−）で洗浄して、ＰＢＳ（−／−）に浸漬して５分間スイープ振動励振（２９−３１ｋＨｚ，１０ｍｓ，２００Ｖ）して細胞を回収した。
なお、Ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＰＢＳ（−／−）に５分間浸漬した後にトリプシンに５分間浸漬したシリーズを準備した。
（３）回収した細胞を培養ディッシュに再播種し（２．０×１０５ｃｅｌｌｓ）、１０分後に、トリプシンに５分間浸漬して細胞を回収した。なお、このとき、上澄みは洗浄し、浮遊細胞は予め除去した。
その結果、図６に示すように、本発明に係る細胞生産方法とトリプシンを用いた場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とでは、回収された細胞の数に有意差が見られ、本発明に係る細胞生産方法では、定着した細胞の数が多いことがわかった。
即ち、本発明に係る細胞生産方法の方が、トリプシンを用いた場合よりも、細胞の定着性が高いことがわかる。
【００３３】
［細胞表面の観察結果］
図７は、本発明に係る細胞生産方法とトリプシンを用いた場合とにおいて細胞の表面を撮影した顕微鏡写真である。
図７に示す細胞の表面観察では、以下の手順で細胞を観察した。
（１）ＣＨＯ細胞をφ３５ディッシュ（ＤＬＣ，Ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｄｉｓｈ）に播種する（４．０×１０５ｃｅｌｌｓ）。
（２）２４時間後、ＰＢＳ（−／−）で洗浄して、ＰＢＳ（−／−）に浸漬して５分間スイープ振動励振（２９−３１ｋＨｚ，１０ｍｓ，２００Ｖ）して細胞を回収した。
なお、Ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＰＢＳ（−／−）に５分間浸漬した後にトリプシンに５分間浸漬したシリーズを準備した。
（３）回収した細胞を培養ディッシュに再播種し（２．０×１０５ｃｅｌｌｓ）、１０分間培養した後、グルタルアルデヒドで固定し、ＳＥＭ（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で観察した。
その結果、図７の細胞全体写真に示すように、本発明に係る細胞生産方法では、細胞から仮足が延び、定着が進んでいる状態であるのに対し、トリプシンを用いた場合では、細胞表面が分解されて細胞全体が球状となっており、定着が進んでいないことがわかる。また、図７の細胞表面の拡大写真に示すように、本発明に係る細胞生産方法では、細胞表面に細胞外マトリクスが残っており、定着し易い状態であるのに対し、トリプシンを用いた場合では、細胞表面の細胞外マトリクスが分解により減少していることがわかる。
即ち、本発明に係る細胞生産方法の方が、トリプシンを用いた場合よりも、細胞表面の構造が定着性の高いものであることがわかる。
【００３４】
［変形例１］
上述の実施形態において、振動部材１３は圧電素子からなる超音波振動子を備えるものとして説明したが、振動部材１３をランジュバン型超音波振動子によって構成することができる。
図８は、ランジュバン型超音波振動子からなる振動部材１３の構成例を示す模式図である。
図８に示すように、ランジュバン型超音波振動子によって振動部材１３が構成される場合、電極Ｅを挟んで配置された２つの圧電素子Ｐ１，Ｐ２をさらに２つの金属ブロックＭ１，Ｍ２で挟み込み、軸方向にボルト締結されたボルト締結型ランジュバン型超音波振動子として構成することができる。
ランジュバン型超音波振動子とした場合、振動部材１３は、金属ブロックの端面が軸方向に一様に振動するため、ＤＬＣコーティングディッシュ１００内の細胞に対して一様な音響放射圧を付与することが可能となる。
【００３５】
（１）以上のように、本実施形態に係る細胞生産方法は、アモルファスカーボンの被膜を有する培養基材を用意する第１の工程と、第１の工程で用意された培養基材において細胞を培養する第２の工程と、第２の工程において培養された培養基材内の細胞に音響放射圧を付与することにより、培養された細胞を剥離する第３の工程と、を含む。
これにより、細胞の生産において、音響放射圧をアモルファスカーボンの被膜を有する培養基材（例えば、ＤＬＣコーティングディッシュ１００）内の細胞に付与することで、細胞がＤＬＣの被膜から容易に分離し、トリプシン等の酵素を用いることなく、培養された細胞を剥離・回収することができる。
したがって、細胞の剥離工程及び回収工程において、トリプシン等の酵素による浸漬や洗浄が不要となるため、工程の簡素化、生産時間の短縮、生産される細胞の高活性化・高品質化等の効果を実現することができる。
即ち、細胞をより効率的かつ高品質に大量生産することが可能となる。
【００３６】
（２）第３の工程では、音響放射圧を発生するための加振振動数がスイープされる。
これにより、アモルファスカーボンの被膜を有する培養基材の個体差等、条件の相違がある場合であっても、これらの条件を吸収して、音響放射圧の発生源である振動部材に固有振動を確実に発生させることができる。
【００３７】
（３）また、本実施形態における細胞生産方法は、剥離された細胞を別の培養基材で再び培養する第４の工程と、第４の工程において培養された培養基材内の細胞に音響放射圧を付与することにより、培養された細胞を剥離する第５の工程と、をさらに含む。
これにより、トリプシン等の酵素を用いることなく剥離・回収された細胞が再び培養されるため、培養される細胞の活性が高いものとなり、培養を複数回繰り返す場合の接着等に要する時間が短縮され、細胞をより効率的かつ高品質に大量生産することができる。
【００３８】
（４）また、本実施形態における細胞生産方法は、第３の工程の後、培養基材に残存した細胞を再び培養する第６の工程と、第６の工程において培養された培養基材内の細胞に音響放射圧を付与することにより、培養された細胞を剥離する第７の工程と、をさらに含む。
これにより、同一の培養基材において、トリプシン等の酵素を用いることなく、複数回の細胞の培養、剥離及び回収を行うことができるため、細胞生産工程の自動化率を高め、細胞の生産効率を向上させることが可能となる。
【００３９】
（５）第１の工程では、所定の培養基材表面にアモルファスカーボンの被膜を形成することにより、培養基材が用意される。
これにより、細胞生産方法に適した表面特性の培養基材を用いて、細胞の生産をより適切に行うことができる。
【００４０】
（６）また、本実施形態における細胞生産装置１は、ガラス板１４と、振動部材１３とを備える。
ガラス板１４は、アモルファスカーボンの被膜を有し、細胞が培養された培養基材（例えば、ＤＬＣコーティングディッシュ１００）に超音波振動を伝達する。
振動部材１３は、ガラス板１４に付与される超音波振動を発生する。
ガラス板１４から培養基材に超音波振動が伝達されることにより、培養基材において培養されている細胞が音響放射圧によって剥離される。
これにより、細胞の生産において、超音波振動をアモルファスカーボンの被膜を有する培養基材（例えば、ＤＬＣコーティングディッシュ１００）に入力することで、音響放射圧によって、細胞がアモルファスカーボンの被膜から容易に分離し、トリプシン等の酵素を用いることなく、培養された細胞を剥離・回収することができる。
したがって、細胞の剥離工程及び回収工程において、トリプシン等の酵素による浸漬や洗浄が不要となるため、工程の簡素化、生産時間の短縮、生産される細胞の高活性化・高品質化等の効果を実現することができる。
即ち、細胞をより効率的かつ高品質に大量生産することが可能となる。
【００４１】
なお、本発明は、本発明の効果を奏する範囲で変形、改良等を適宜行うことができ、上述の実施形態に限定されない。
例えば、上述の実施形態において、ＤＬＣ被膜を形成する対象を培養ディッシュであるものとして説明したが、これに限られない。例えば、細胞生産装置１に内蔵された細胞の培養基材等、培養ディッシュ以外の基材にＤＬＣ被膜を形成して、細胞を培養・剥離等することが可能である。
【００４２】
また、上述の実施形態に記載された例を適宜組み合わせて、本発明を実施することが可能である。
上述の実施形態における制御のための処理は、ハードウェア及びソフトウェアのいずれにより実行させることも可能である。
即ち、上述の処理を実行できる機能が細胞生産装置１に備えられていればよく、この機能を実現するためにどのような機能構成及びハードウェア構成とするかは上述の例に限定されない。
【００４３】
なお、上記実施形態は、本発明を適用した一例を示しており、本発明の技術的範囲を限定するものではない。即ち、本発明は、本発明の要旨を逸脱しない範囲で、省略や置換等種々の変更を行うことができ、上記実施形態以外の各種実施形態を取ることが可能である。本発明が取ることができる各種実施形態及びその変形は、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
【符号の説明】
【００４４】
１  細胞生産装置、１０  加振ユニット、１１  下側アクリル板、１２  フェルト部材、１３  振動部材、１４  ガラス板、１４ａ  貫通部、１５  上側シリコーンラバー部材、１６  上側アクリル板、１６ａ  カバー、１７  ボルト、１８  ナット、２０  発信器、３０  アンプ、４０  コントローラ、１００  ＤＬＣコーティングディッシュ、Ｗ  重り、Ｅ  電極、Ｐ１，Ｐ２  圧電素子、Ｍ１，Ｍ２  金属ブロック
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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