(57)【要約】【課題】酸化還元色素と微生物との反応時間による影響を受けにくい、オフラインでも測定可能な微生物量の評価方法および評価装置を提供する。【解決手段】検体水中の微生物量を評価する方法であって、ａ）検体水のｐＨが９以上になるようにｐＨ調整剤を添加するｐＨ調整剤添加工程と、ｂ）ｐＨを調整したｐＨ調整水に、微生物と反応して蛍光ピーク波長が変化する酸化還元色素を添加する色素添加工程と、ｃ）酸化還元色素を添加した色素添加水における、酸化型の酸化還元色素と還元型の前記酸化還元色素の蛍光ピークの強度をそれぞれ測定する測定工程と、ｄ）測定した酸化型の酸化還元色素と還元型の酸化還元色素の蛍光ピークの強度の比率から、あらかじめ求めた検量線を用いて微生物量を演算する演算工程と、を含む、微生物量の評価方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体水中の微生物量を評価する方法であって、
ａ）前記検体水のｐＨが９以上になるようにｐＨ調整剤を添加するｐＨ調整剤添加工程と、
ｂ）前記ｐＨを調整したｐＨ調整水に、微生物と反応して蛍光ピーク波長が変化する酸化還元色素を添加する色素添加工程と、
ｃ）前記酸化還元色素を添加した色素添加水における、酸化型の前記酸化還元色素と還元型の前記酸化還元色素の蛍光ピークの強度をそれぞれ測定する測定工程と、
ｄ）前記測定した酸化型の酸化還元色素と還元型の酸化還元色素の蛍光ピークの強度の比率から、あらかじめ求めた検量線を用いて微生物量を演算する演算工程と、
を含むことを特徴する、微生物量の評価方法。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物量の評価方法であって、
前記酸化還元色素は、レサズリンであることを特徴する、微生物量の評価方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の微生物量の評価方法であって、
前記検量線の一般式は、以下の式で表されることを特徴する、微生物量の評価方法。
微生物数［ＣＦＵ／ｍＬ］＝ａ×１０ｂ×蛍光強度比ｃ
（ここで、ａ，ｂ，ｃは係数である。）
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物量の評価方法であって、
前記酸化還元色素と前記微生物との反応時間は、１．５分〜１５分であることを特徴する、微生物量の評価方法。
【請求項５】
検体水中の微生物量を評価する装置であって、
Ａ）前記検体水のｐＨが９以上になるようにｐＨ調整剤を添加するｐＨ調整剤添加手段と、
Ｂ）前記ｐＨを調整したｐＨ調整水に、微生物と反応して蛍光ピーク波長が変化する酸化還元色素を添加する色素添加手段と、
Ｃ）前記酸化還元色素を添加した色素添加水における、酸化型の前記酸化還元色素と還元型の前記酸化還元色素の蛍光ピークの強度をそれぞれ測定する測定手段と、
Ｄ）前記測定した酸化型の酸化還元色素と還元型の酸化還元色素の蛍光ピークの強度の比率から、あらかじめ求めた検量線を用いて微生物量を演算する演算手段と、
を備えることを特徴する、微生物量の評価装置。
【請求項６】
請求項５に記載の微生物量の評価装置であって、
前記酸化還元色素は、レサズリンであることを特徴する、微生物量の評価装置。
【請求項７】
請求項５または６に記載の微生物量の評価装置であって、
前記検量線の一般式は、以下の式で表されることを特徴する、微生物量の評価装置。
微生物数［ＣＦＵ／ｍＬ］＝ａ×１０ｂ×蛍光強度比ｃ
（ここで、ａ，ｂ，ｃは係数である。）
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物量の評価装置であって、
前記酸化還元色素と前記微生物との反応時間は、１．５分〜１５分であることを特徴する、微生物量の評価装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体水中の微生物量の評価方法および評価装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
産業用水システムでは、しばしば微生物の増加等によって水処理や水加工の工程で支障をきたすことがあり、例えば冷却水システムでの微生物の成長は配管等の金属部を覆うように微生物のコロニーが成長することで、微生物コロニーに接する金属部が腐食を起こしたり、熱交換器表面に微生物のコロニーが付着することで、冷却水システムの熱交換効率を低下させたりするため、システムの運転において重要な懸念事項となっている。また、微生物汚染の高い冷却水システムのうち、特に開放冷却塔では微生物が空気中に飛散する場合がある。
【０００３】
そのため、多くの産業用水システムではシステムを微生物汚染から保護するため、定期的にシステム中の微生物の量を測定し、微生物による汚染度によっては殺菌剤等の使用によってシステム内の汚染度を低下させる管理を行っている。
【０００４】
産業用水システムにおける微生物の量を測定する種々の評価方法が提案されており、従来から最も採用されている方法として、産業用水システムから用水の一部を採取し、培養を行うことでシステム内の付着性微生物および浮遊性微生物の量を評価する方法が挙げられる。しかし、この手法は微生物の量の測定結果が得られるまでに４８時間以上を要するため、測定結果を把握するまでに時間差が生じてしまう。この方法を改善した手法として産業用水システム中の微生物が分泌するＡＴＰ（アデノシン３リン酸）を測定することで微生物量を評価する方法が考案されたが、測定に必要な試薬を冷却しておく必要性等があり、実際の産業用水システムで評価を行うには適さない。
【０００５】
これに対して、例えば特許文献１には、微生物やその分泌物と反応することにより還元されて蛍光波長が変化する、レサズリン、リン酸４−メチルウンベリフェリル、リン酸ピラニン等の酸化還元色素を測定対象に加え、この酸化還元色素の酸化型と還元型の蛍光の比率から微生物の量を測定する方法が記載されている。
【０００６】
酸化還元色素を用いた微生物量の測定は主に産業用水システム中にオンラインで用いられており、評価結果に基づいて殺菌剤の投入量等を自動制御する機能等が付随しているため、大型の装置となっている。このオンライン装置はコンビナート等の大規模な産業用水システムを設置している場合には有効的だが、一般規模の工場では中小規模の産業用水システムを複数台設置していることが多く、また、その各産業用水システムはそれぞれが独立した水系となっていることが一般的である。そのため、一般規模の工場の産業用水システムに対しては、大型のオンライン装置を複数台設置することはコスト的に現実的ではない。こういった条件下ではオンラインでの微生物量の測定よりもオフラインでの微生物量の測定が適切と言え、オフラインで微生物量を測定可能な評価装置が求められている。
【０００７】
酸化還元色素を用いたオンライン装置では特に流量等の変化がない限り、酸化還元色素の添加位置から検出部までに要する時間、すなわち酸化還元色素と微生物との反応時間は概ね一定となるが、オフラインでの測定を行う場合は測定者の事情や測定のときの周囲環境の制限等によって反応時間を適切に管理することが難しい場合がしばしば想定される。例えば、特許文献１にも、「つかみ取り法の技術を使用する場合、蛍光光度計から受信したデータが産業用水システムの現状を正確に反映するように、妥当な時間内に、つかみ取り法によるサンプルを蛍光光度計へ搬送する手段を設けるべきである。」（段落００３１）と記載されている。そのため、酸化還元色素と微生物との反応時間による影響を受けにくい、微生物量の評価方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００３−５１９３９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、酸化還元色素と微生物との反応時間による影響を受けにくい、オフラインでも測定可能な微生物量の評価方法および評価装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、検体水中の微生物量を評価する方法であって、ａ）前記検体水のｐＨが９以上になるようにｐＨ調整剤を添加するｐＨ調整剤添加工程と、ｂ）前記ｐＨを調整したｐＨ調整水に、微生物と反応して蛍光ピーク波長が変化する酸化還元色素を添加する色素添加工程と、ｃ）前記酸化還元色素を添加した色素添加水における、酸化型の前記酸化還元色素と還元型の前記酸化還元色素の蛍光ピークの強度をそれぞれ測定する測定工程と、ｄ）前記測定した酸化型の酸化還元色素と還元型の酸化還元色素の蛍光ピークの強度の比率から、あらかじめ求めた検量線を用いて微生物量を演算する演算工程と、を含む、微生物量の評価方法である。
【００１１】
前記微生物量の評価方法において、前記酸化還元色素は、レサズリンであることが好ましい。
【００１２】
前記微生物量の評価方法において、前記検量線の一般式は、例えば、以下の式で表される。
微生物数［ＣＦＵ／ｍＬ］＝ａ×１０ｂ×蛍光強度比ｃ
（ここで、ａ，ｂ，ｃは係数である。）
【００１３】
前記微生物量の評価方法において、前記酸化還元色素と前記微生物との反応時間は、１．５分〜１５分であることが好ましい。
【００１４】
また、本発明は、検体水中の微生物量を評価する装置であって、Ａ）前記検体水のｐＨが９以上になるようにｐＨ調整剤を添加するｐＨ調整剤添加手段と、Ｂ）前記ｐＨを調整したｐＨ調整水に、微生物と反応して蛍光ピーク波長が変化する酸化還元色素を添加する色素添加手段と、Ｃ）前記酸化還元色素を添加した色素添加水における、酸化型の前記酸化還元色素と還元型の前記酸化還元色素の蛍光ピークの強度をそれぞれ測定する測定手段と、Ｄ）前記測定した酸化型の酸化還元色素と還元型の酸化還元色素の蛍光ピークの強度の比率から、あらかじめ求めた検量線を用いて微生物量を演算する演算手段と、を備える、微生物量の評価装置である。
【００１５】
前記微生物量の評価装置において、前記酸化還元色素は、レサズリンであることが好ましい。
【００１６】
前記微生物量の評価装置において、前記検量線の一般式は、例えば、以下の式で表される。
微生物数［ＣＦＵ／ｍＬ］＝ａ×１０ｂ×蛍光強度比ｃ
（ここで、ａ，ｂ，ｃは係数である。）
【００１７】
前記微生物量の評価装置において、前記酸化還元色素と前記微生物との反応時間は、１．５分〜１５分であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、酸化還元色素と微生物との反応時間による影響を受けにくい、オフラインでも測定可能な微生物量の評価方法および評価装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施形態に係る微生物量の評価装置の一例を示す概略構成図である。
【図２】実施例および比較例における、ｐＨに対する蛍光強度比を示すグラフである。
【図３】実施例および比較例で用いた検量線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００２１】
本発明の実施形態に係る微生物量の評価装置の一例の概略を図１に示し、その構成について説明する。評価装置１は、
Ａ）検体水のｐＨが９以上になるようにｐＨ調整剤を添加するｐＨ調整剤添加手段として、ｐＨ調整剤添加配管１８と、
Ｂ）ｐＨを調整したｐＨ調整水に、微生物と反応して蛍光ピーク波長が変化する酸化還元色素を添加する色素添加手段として、色素添加配管２０と、
Ｃ）酸化還元色素を添加した色素添加水における、酸化型の酸化還元色素と還元型の前記酸化還元色素の蛍光ピークの強度をそれぞれ測定する測定手段として測定部１２と、
Ｄ）測定した酸化型の酸化還元色素と還元型の酸化還元色素の蛍光ピークの強度の比率から、あらかじめ求めた検量線を用いて微生物量を演算する演算手段として演算部１４と、
を備える。評価装置１は、酸化還元色素と前記微生物とを反応させる反応手段として、反応部１０を備えてもよい。
【００２２】
図１の評価装置１において、反応部１０の出口と測定部１２の入口とは、配管１６により接続されている。反応部１０には、ｐＨ調整剤添加配管１８と、色素添加配管２０とが接続されている。測定部１２と演算部１４とは、電気的接続等によって通信可能なように接続されていてもよい。
【００２３】
本実施形態に係る微生物量の評価方法および評価装置１の動作について説明する。
【００２４】
反応部１０において、測定対象の産業用水システム等から採取された検体水にｐＨ調整剤添加配管１８を通してｐＨ調整剤が添加され、検体水のｐＨが９以上になるようにｐＨが調整される（ｐＨ調整剤添加工程）。
【００２５】
次に、反応部１０において、ｐＨが調整されたｐＨ調整水に、微生物と反応して蛍光ピーク波長が変化する酸化還元色素が色素添加配管２０を通して添加され（酸化還元色素添加工程）、酸化還元色素と微生物とを反応させる（反応工程）。酸化還元色素と微生物は反応して酸化型の酸化還元色素の一部が還元型の酸化還元色素に逐次的に変化すると考えられる。反応工程において、酸化還元色素が添加されたｐＨ調整水は、所定の時間および温度で、図示しない撹拌手段により撹拌されてもよい。
【００２６】
酸化還元色素が添加された色素添加水は、配管１６を通して測定部１２に送液される。測定部１２において、酸化型の酸化還元色素と還元型の前記酸化還元色素の蛍光ピークの強度がそれぞれ測定される（測定工程）。
【００２７】
演算部１４により、測定された酸化型の酸化還元色素と還元型の酸化還元色素の蛍光ピークの強度の比率から、あらかじめ求めた検量線を用いて微生物量が演算される（演算工程）。この評価結果に基づいて測定対象の産業用水システム等において殺菌剤の投入量等が制御されてもよい。
【００２８】
本発明者らは、例えばオフラインで酸化還元色素を用いた微生物量の測定を行う際に、ｐＨの条件によっては酸化還元色素と微生物の反応時間によって得られる数値に乖離が生じることを発見した。そして、検体水のｐＨが９以上になるように調整することにより、酸化還元色素と微生物との反応時間による影響を受けにくくなり、オフラインでも検体水の微生物の量が測定可能となることを見出した。
【００２９】
酸化還元色素は、微生物が有機物質を資化するときに還元されるため、そのときの酸化型色素（生物資化前）および還元型色素（生物資化後）の双方の吸光度または蛍光強度を測定して、その比率を求めることで間接的に微生物量を求めることができる。
【００３０】
微生物またはその分泌物と反応して蛍光ピーク波長が変化する酸化還元色素の特性を利用し、酸化型の酸化還元色素と還元型の酸化還元色素の蛍光ピークの強度を比較することで微生物の存在量を評価する方法および装置において、酸化還元色素と微生物との反応のときのｐＨを９以上に調整することで、反応時間による測定値のばらつきが抑制される。
【００３１】
検体水としては、特に制限はないが、例えば、冷却塔（開放、密閉、半密閉）、ボイラー水、産業排水処理、下水処理、化学プロセス、紙パルプおよび製紙工程における水処理、水性化学プロセス、景観水、その他非飲用水システムを含む産業用水システムにおける水等が挙げられる。
【００３２】
本実施形態に係る評価方法および評価装置は、景観水や河川水等、産業用水システム以外の水系であっても不特定な理由で微生物汚染から水系を保護する必要があるものに適用することもできる。
【００３３】
評価対象の微生物としては、付着性微生物であっても浮遊性微生物であってもよく、付着性微生物と浮遊性微生物とが含まれていてもよい。微生物としては、特に制限はないが、例えば、ズーグレア、スフェロティルス、ニトロバクテリア等が挙げられる。
【００３４】
酸化還元色素を検体水に添加すると微生物やその分泌物と酸化還元色素とが反応するが、ｐＨが９未満であった場合、時間経過とともに反応が進行してしまい、試験操作ごとに値がぶれてしまうことがわかった。検体水のｐＨは、ｐＨ９以上になるように調整すればよいが、ｐＨ９を超えるように調整することが好ましく、ｐＨ１０以上になるように調整することがより好ましく、ｐＨ１０以上１４以下になるように調整することがさらに好ましい。
【００３５】
検体水中に添加することで検体水のｐＨを９以上に調整するｐＨ調整剤としては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、アルカリ金属塩、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等のアルカリ土類金属水酸化物、酸化カルシウム等のアルカリ土類金属酸化物、ホウ酸塩、水酸化鉄、水酸化銅等の金属水酸化物、アンミン錯体の水酸化物、炭酸アンモニウム、アンモニア、アンモニア水、水酸化アンモニウム、リン酸水素アンモニウム等の塩基性アンモニア化合物、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム等のリン酸水素アルカリ金属塩、リン酸三ナトリウム等のアルカリ剤のうち１種類以上を含むものが挙げられる。
【００３６】
ｐＨ調整剤としては、上記アルカリ剤の他にも、測定対象の検体水のｐＨを９以上に調整できるものであればよく、特に制限はない。また、ｐＨ調整剤としては、必要に応じて、塩酸、硫酸等の酸を用いてもよい。
【００３７】
アルカリ剤等のｐＨ調整剤としては、固形状、粉末状、液体状のものが挙げられ、操作性や携帯性等の観点から、固形状または粉末状のものが好ましい。
【００３８】
蛍光ピークの強度の比較を行うため、好ましい酸化還元色素の条件としては、酸化型の蛍光ピーク波長と還元型の蛍光ピーク波長とが重ならないこと、好ましくは酸化型の蛍光ピーク波長と還元型の蛍光ピーク波長との差が２０ｎｍ以上であることが挙げられる。
【００３９】
酸化還元色素としては、３，６，８−トリスルホン酸ピレン酢酸エステル、二酢酸カルボキシルフルオレセイン、３−カルボキシウンベリフェリル、２，６ジクロロフェノールインドフェノール、ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）カリウム、レゾルフィン、レサズリン、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート、メルドラブルー、メチレンブルー、ニコチンアデニンジヌクレオチド、リン酸４−メチルウンベリフェリル、リン酸ピラニン等が挙げられ、好ましい酸化還元色素は、微生物との反応前後の酸化型と還元型の蛍光ピーク波長が重ならない等の点から、レサズリン、４−メチルウンベリフェリル、リン酸ピラニンであり、より好ましい酸化還元色素は、微生物との反応性等の観点から、レサズリンである。またレサズリンに関しては、レサズリンナトリウム等、そのアルカリ金属塩等の塩類も含まれる。
【００４０】
酸化型のレサズリンは生物による資化によって還元されて還元型のレゾルフィンへと変化する。蛍光波長５５０ｎｍで励起した際にレサズリンは６３０ｎｍ付近（６３０±５ｎｍ）、レゾルフィンは５８０ｎｍ付近（５８０±５ｎｍ）にそれぞれピークを示すため、蛍光光度計等を用いて測定した際に蛍光ピークが互いに阻害にくく、各値からの演算を必要とする本実施形態に係る評価方法および評価装置に対して有効的である。
【００４１】
酸化還元色素の添加量は、検量線を作成する際の添加量と同じにすればよく、特に制限はないが、例えば、検体水に対して０．１ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌとすればよく、１ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌであることが好ましい。添加量が０．１ｍｇ／Ｌ未満であると、濃度制御が困難になる場合や全量が速やかに反応してしまうことで検量線の傾きが大きくなり、演算精度が悪くなる可能性があり、２０ｍｇ／Ｌを超えると、未反応分の割合が増えることで検量線の傾きが小さくなり、演算精度が悪くなる可能性がある。
【００４２】
反応工程における酸化還元色素と微生物との反応時間は、検量線を作成する際の反応時間と同じにすればよく、特に制限はないが、例えば、１．５分〜１５分であることが好ましく、１．５分〜３分であることがより好ましい。反応時間が１．５分未満であると、水温等の環境条件によっては反応が進行していない場合があり、１５分を超えると、同じく環境条件によって反応が促進しきってしまう場合がある。
【００４３】
反応工程における温度は、検量線を作成する際の温度と同じにすればよく、特に制限はないが、例えば、１５℃〜５０℃であることが好ましく、２０℃〜３０℃であることがより好ましい。反応温度が１５℃未満であると、生物が不活発になり、反応が遅れる場合があり、５０℃を超えると、生物種によっては不活性化してしまうため菌数を測定することが困難となる場合がある。水温よりも毎回の測定時における反応温度が統一されることが好ましい。
【００４４】
各蛍光ピーク強度の測定は、例えば、採取した検体水に対してｐＨ調整剤を添加した後、酸化還元色素を添加して十分に撹拌した検体水（色素添加水）を用いればよい。その後、その色素添加水中の酸化型の酸化還元色素と還元型の酸化還元色素の蛍光ピーク強度をそれぞれ蛍光強度計で測定すればよい。なお、酸化還元色素を用いた従来の評価方法では、検体水の採取後、時間をおかずに測定することが好ましいとされているが、本実施形態に係る評価方法および評価装置を適用した場合はその限りではない。
【００４５】
酸化還元色素の蛍光ピーク強度を測定する装置としては、特定波長で励起した際に酸化型の酸化還元色素と還元型の酸化還元色素の蛍光ピーク強度を測定できる装置であれば特に制限はなく、市販の蛍光光度計の適用も可能である。蛍光ピーク強度の測定方法としては公知の手順で測定すればよい。
【００４６】
酸化還元色素と微生物との反応前後の物質（酸化型の酸化還元色素と還元型の酸化還元色素）の蛍光ピーク強度から蛍光強度の比率（蛍光強度比）を計算する。蛍光強度比は、
蛍光強度比＝（還元型の酸化還元色素の蛍光ピーク強度）／（酸化型の酸化還元色素の蛍光ピーク強度）
である。例えば、酸化還元色素がレゾルフィンの場合は、蛍光強度比は、
蛍光強度比＝（レゾルフィン（還元型）の蛍光ピーク強度）／（レサズリン（酸化型）の蛍光ピーク強度）
である。蛍光強度比は、計算機、コンピュータプログラム等を用いて計算可能であるが、手動で計算してもよい。
【００４７】
このように計算した蛍光強度比を用いて、あらかじめ決められた検量線から微生物量を演算する。この演算は、計算機、コンピュータプログラム等を用いて計算可能であるが、手動で計算してもよい。
【００４８】
検量線は、蛍光強度比と実際に測定した微生物数の値とから作成すればよい。検量線は水系ごとに設定されることが好ましいが、１つの汎用的な検量線を様々な水系に適用することも可能である。
【００４９】
検量線の一般式は、例えば、以下の式で表される。
微生物数［ＣＦＵ／ｍＬ］＝ａ×１０ｂ×蛍光強度比ｃ
（ここで、ａ，ｂ，ｃは係数である。）
ただし、検体水によっては、例えば以下の式のような１次式等になることもあり、この限りではない。
微生物数［ＣＦＵ／ｍＬ］＝ｄ×蛍光強度比＋ｅ
（ここで、ｄ，ｅは係数である。）
【００５０】
評価装置１は、ＣＰＵ等の制御素子を含んで構成され、評価装置１を統合的に制御する機能を有する制御部を備えてもよい。
【００５１】
評価装置１は、半導体メモリ、ハードディスク等を含んで構成され、制御部で処理されるプログラムや各種データ等の電子情報を格納および保持する記憶部を備えてもよく、記憶部に、水系ごとに設定された検量線のデータや、汎用的な検量線のデータを格納および保持してもよい。
【００５２】
オンラインシステムでは特に流量等の変化がない限り、酸化還元色素の添加位置から検出部までに要する時間は概ね一定となるが、オフラインでの測定を行う場合は測定者の事情や測定のときの周囲環境の制限等によって反応時間を適切に管理することが難しい場合がしばしば想定される。特に産業用水システムで微生物を測定するものは専門家に限らず、現場作業員やその委託を受けた者が行うことも多いため、誰が測定を行っても同じような結果となるような測定方法が求められる。
【００５３】
本実施形態に係る評価方法および評価装置では、酸化還元色素を検体水に添加する前に検体水のｐＨを９以上、好ましくは９超、より好ましくは１０以上に調整することで、蛍光物質と微生物やその分泌物との反応を遅延させられるため、酸化還元色素と微生物との反応時間による影響を受けにくく、オフラインでも測定可能となる。したがって、本実施形態に係る評価方法および評価装置を適用することで、実際に産業用水システムを用いている現場でも、反応時間の制御を行わなくてもよく、なおかつ測定者の経験や手際等にほとんど影響されずにオフラインで測定することが可能となる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００５５】
＜実施例および比較例＞
ここでは酸化還元色素としてレサズリンナトリウムを用いた実施例を説明する。
【００５６】
検体水としては、オルガノ株式会社開発センター（神奈川県相模原市）の敷地内より採取した地下水に対して次亜塩素酸ナトリウムを添加して殺菌処理を施した水に対し、活性炭を用いて酸化剤成分を取り除いた上でブイヨンを加えて３７℃で２日間培養することによって、十分な数の微生物を保有させた水を用いた。なお、この検体水中の菌数は、１０４ＣＦＵ／ｍＬ程度であった。菌数は、微生物検出用シート状培地シートチェックＲ２Ａ（ニプロ株式会社製）を用い、採取した菌を３０℃で７日間培養した後のコロニー数から評価した。ここでは微生物数として一般細菌数を表す。
【００５７】
この検体水を５００ｍＬ採取した後、ｐＨを５〜１１にそれぞれ調整し、その後、レサズリンナトリウム（和光純薬工業製）を濃度１０ｍｇ／Ｌになるように添加して、室温（２０℃±５℃）で撹拌した。レサズリンナトリウムの添加後、微生物によるレサズリンの資化が行われ、レサズリンの一部がレゾルフィンへと反応する。酸化還元色素を添加してから１０秒以内を反応前とし、添加０．５分を経過し、また撹拌を行ったものを反応後とした。レサズリンナトリウムの添加から１．５分撹拌後と１０分撹拌後のレサズリンの蛍光ピーク（６３０ｎｍ）の強度およびレゾルフィンの蛍光ピーク（５８０ｎｍ）の強度を、分光蛍光光度計（島津製作所製）で測定した。また、各検体水について、実際の菌数の測定も行った。
【００５８】
ｐＨ調整には硫酸（和光純薬工業製）および水酸化カリウム（和光純薬工業製）を用いた。また、蛍光ピークの強度の測定は以下の条件で行った。
［蛍光ピーク強度の測定条件］
レサズリン（反応前）
励起バンド幅：５．０ｎｍ
励起波長：５５０ｎｍ
発光バンド幅：５．０ｎｍ
発光波長：６３０ｎｍ
レゾルフィン（反応後）
励起バンド幅：５．０ｎｍ
励起波長：５５０ｎｍ
発光バンド幅：５．０ｎｍ
発光波長：５８０ｎｍ
【００５９】
［評価条件］
試験水：地下水（神奈川県相模原市）、ｐＨ：６．９、電気伝導率：１７１μＳ／ｃm、菌数：１０４ＣＦＵ／ｍＬ（ｐＨ調整後もおおよその生菌数は同等であった。）
酸化還元色素：レサズリンナトリウム塩（和光純薬工業）
ｐＨ調整：水酸化カリウム（和光純薬工業）および硫酸（和光純薬工業）
測定装置：分光蛍光光度計（島津製作所製、ＲＦ−５３００）
【００６０】
分光蛍光光度計を用いて酸化還元色素とその反応後の物質の蛍光ピークの強度を測定した後、酸化還元色素（反応前）に対する酸化還元色素（反応後）の割合を蛍光強度比（レゾルフィン（５８０ｎｍ）の蛍光ピーク強度／レサズリン（６３０ｎｍ）の蛍光ピーク強度）として算出した。ｐＨに対する蛍光強度比を図２に示す。算出した蛍光強度比をあらかじめ作成した検量線と対比して微生物数を演算し、各ｐＨにおける所定時間後の微生物量を評価した。結果を表１に示す。
【００６１】
【表１】
2019203711.tif 000002
【００６２】
今回の実施例および比較例では、演算値は算出した蛍光強度比を用いて図３に示すあらかじめ作成した検量線から以下の式で求めた。なお、検量線は、ｐＨ９、水温２０±５℃、レサズリンナトリウムの添加量１０ｍｇ／Ｌの条件で作成した。
微生物数［ＣＦＵ／ｍＬ］＝６．０×１０７×蛍光強度比１６．３１４
【００６３】
実施例および比較例の試験結果より、検体水採取後にｐＨを９以上に調整した検体水（実施例）では、酸化還元色素を添加して１．５分後と１０分後とで蛍光強度比がほとんど変わらず、ｐＨを９未満に調整した検体水（比較例）では時間の経過とともに蛍光強度比が上昇する傾向にあった。この結果は、ｐＨを９以上に調整しなかった場合、時間の経過とともに蛍光強度比が上昇し、検量線を用いて演算した際に実際よりも多くの微生物が存在することを示す演算結果になってしまうことを表す。
【００６４】
このように、実施例の方法は、酸化還元色素と微生物との反応時間による影響を受けにくい、オフラインでも測定可能な方法であることがわかった。
【符号の説明】
【００６５】
１  評価装置、１０  反応部、１２  測定部、１４  演算部、１６  配管、１８  ｐＨ調整剤添加配管、２０  色素添加配管。
【図１】
2019203711.tif 000003
【図２】
2019203711.tif 000004
【図３】
2019203711.tif 000005