(57)【要約】      （修正有）【課題】チロシンおよび／またはシステインの溶解性および／または安定性を改善した乾燥粉末細胞培養培地の提供。【解決手段】細胞培養培地中のチロシンの乏しい溶解性およびシステインの多くの場合不十分な安定性を、それらの無機エステル誘導体である、硫酸エステル誘導体またはリン酸エステル誘導体を用いて置換することにより克服した乾燥粉末細胞培養培地。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶媒を用いて溶解することによって、液体培地形状の細胞培養培地の調製に使用される、化学的に定義される乾燥粉末細胞培養培地であって、
該化学的に定義される乾燥粉末細胞培養培地は、（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニルプロパン酸および／またはその塩を含有しており、
該化学的に定義される乾燥粉末細胞培養培地を、溶媒を用いて溶解することによって、調製される、前記液体培地形状の細胞培養培地は、６．８〜８．４の間のｐＨを有し、そして、５〜４０ｍｍｏｌ／ｌの間の濃度で、（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニルプロパン酸を含んでいる
ことを特徴とする、化学的に定義される乾燥粉末細胞培養培地。
【請求項２】
（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニルプロパン酸の塩は、下記の式の（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニルプロパン酸ナトリウム塩、無水和物：
【化１】
2019030334.tif 000019
である、
ことを特徴とする、請求項１に記載の化学的に定義される乾燥粉末細胞培養培地。
【請求項３】
前記化学的に定義される乾燥粉末細胞培養培地を溶媒中に溶解して得られる、前記液体培地形状の細胞培養培地が、１０〜３０ｍｍｏｌ／ｌの間の濃度で、（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニルプロパン酸を含む、
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の化学的に定義される乾燥粉末細胞培養培地。
【請求項４】
前記化学的に定義される乾燥粉末細胞培養培地が、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸および／またはその塩をさらに含有する、
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化学的に定義される乾燥粉末細胞培養培地。
【請求項５】
前記化学的に定義される乾燥粉末細胞培養培地が、下記の式の（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸二ナトリウム塩、無水和物：
【化２】
2019030334.tif 000020
をさらに含有する、
ことを特徴とする、請求項４に記載の化学的に定義される乾燥粉末細胞培養培地。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の化学的に定義される乾燥粉末細胞培養培地を生成する方法であって、
該方法は、
ａ）（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニルプロパン酸および／またはその塩を、該化学的に定義される乾燥粉末細胞培養培地の他の成分と混合する工程；および
ｂ）工程ａ）で得られる混合物を、乾燥条件下、粉砕に供する工程
とを含む
ことを特徴とする、方法。
【請求項７】
工程ｂ）は、ピンミル、フィッツミルまたはジェットミル中で実施される
ことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）で得られる混合物は、粉砕に先立ち、０℃を下回る温度に冷却される
ことを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
バイオリアクター中における、動物細胞の培養のための、流加プロセスであって、
該流加プロセスは、下記の工程を含み、
（ｉ）バイオリアクター中に、動物細胞ならびに水性の化学的に定義される培地を添加する工程；
（ii）バイオリアクター中で、動物細胞をインキュベーションする工程；
（iii）バイオリアクター中の動物細胞のインキュベーションの全時間にわたり連続的に、または前記インキュベーション時間内の１回もしくは数回、液体培地形状のフィード培地を、バイオリアクターに供給する工程
前記液体培地形状のフィード培地は、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化学的に定義される乾燥粉末細胞培養培地を、溶媒により溶解することで調製される、液体培地形状のフィード培地である
ことを特徴とする、流加プロセス。
【請求項１０】
前記溶解により得られる、液体培地形状のフィード培地は、６．８〜８．４の間のｐＨを有し、そして、５〜４０ｍｍｏｌ／ｌの間の濃度で、（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニルプロパン酸を含んでいる
ことを特徴とする、請求項９に記載の流加プロセス。
【請求項１１】
前記溶解により得られる、液体培地形状のフィード培地は、１０〜３０ｍｍｏｌ／ｌの間の濃度で、（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニルプロパン酸を含んでいる
ことを特徴とする、請求項９または１０に記載の流加プロセス。
【請求項１２】
バイオリアクター中において培養される動物細胞は、ＣＨＯ細胞である
ことを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の流加プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシンおよび／またはシステインの無機エステル誘導体を含む細胞培養培地に関する。細胞培養培地中のチロシンの乏しい溶解性およびシステインの多くの場合不十分な安定性は、それらを無機エステル誘導体、例えばリン酸化誘導体で置換することにより克服される。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養培地は、人工的な環境において細胞の成長を支持および維持する。
【０００３】
細胞培養培地は、その成長が支持されるであろう生物の種類によって、複合成分混合物を含み、時には１００を超える異なる成分を含むこともある。
【０００４】
哺乳動物、昆虫または植物の細胞の増殖に必要とされる細胞培養培地は、典型的には、細菌および酵母の成長を支持するための培地よりもずっと複雑である。
【０００５】
開発された最初の細胞培養培地は、組成が不明確な成分、例えば血漿、血清、胚抽出物、または組成が不明確な他の生物学的抽出物もしくはペプトンからなっていた。従って、化学的に定義される培地の開発により、大きな進歩を遂げた。化学的に定義される培地は、しばしば、アミノ酸、ビタミン、金属塩、抗酸化剤、キレート剤、成長因子、緩衝液、ホルモン、および当業者に公知の多くのさらなる物質を含むが、これらだけには限定されない。
【０００６】
一部の細胞培養培地は、無菌の水性液体として提供される。液体細胞培養培地の欠点は、保存期間が短く、輸送および保存が困難であることである。結果として、多くの細胞培養培地は、現在、微粉砕された乾燥粉末混合物として提供される。それらは、水および／または水溶液中で溶解する目的で製造され、溶解した状態で、多くの場合は他の補充物質を用いて、細胞に、その細胞からのバイオ医薬品の成長および／または産生のための十分な栄養基剤を供給するように設計される。
【０００７】
大半のバイオ医薬品産生プラットフォームは、流加細胞培養プロトコールに基づいている。その目的は、典型的には、増加する市場需要を満たし、製造コストを低下させるための高力価の細胞培養プロセスを開発することである。高性能な組換え細胞株の使用の他に、細胞培養培地およびプロセスパラメータの改善が、最大限の産生潜在能力を実現するために必要とされる。
【０００８】
流加プロセス（fed-batch process）において、基礎培地は、初期成長および産生を支持し、フィード（供給）培地は、栄養分の枯渇を防止し、産生段階を持続させる。培地は、異なる産生段階の間での別個の代謝要求に適合するように選ばれる。フィード方略および制御パラメータを含めた、プロセスパラメータの設定によって、細胞成長およびタンパク質産生に適した化学的および物理的環境が決まる。
【０００９】
フィード培地の最適化は、流加プロセスの最適化における主要な側面である。
【００１０】
多くの場合、フィード培地を高度に濃縮してバイオリアクターの希釈を回避する。栄養分の制御された添加は、直接的に培養物の成長速度に影響する。
【００１１】
乾燥粉末からの細胞培養培地の調製についての限定因子は、一部の成分の乏しい溶解性または安定性、特にアミノ酸Ｌ−チロシンおよびＬ−システインの乏しい溶解性または安定性である。Ｌ−チロシンについては乏しい溶解性が主要な問題であり、Ｌ−システインについては安定性の問題が大きい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｒ．Ｈ．Ｐｌｉｍｍｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９４１），３５，４６１〜４６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
結果的に、Ｌ−チロシンおよびＬ−システインの溶解性および／または安定性を改善する方法を見出すことが好ましいであろう。
【００１４】
Ｌ−チロシンおよびＬ−システインの無機エステル誘導体は、改善された溶解性および／または安定性を有し、細胞培養培地中で、細胞成長に対して負の効果がなく、時には正の効果さえもなく、それぞれＬ−チロシンおよびＬ−システインの代わりに使用することができることが見出されている。
【００１５】
さらに、そのような無機エステル誘導体は、ｐＨ８．５を超えないｐＨを有し、細胞のための栄養分として適した形態である高濃度のチロシンおよびシステインを有するフィード溶液を調製するために特に適していることが見出されている。
【００１６】
従って、本発明は、チロシンおよび／またはシステインの少なくとも１つの無機エステル誘導体を含む細胞培養培地を対象とする。
【００１７】
好ましい実施形態において、無機エステル誘導体は、硫酸エステル誘導体またはリン酸エステル誘導体である。
【００１８】
好ましい実施形態において、細胞培養培地は、式Ｉおよび／またはＩＩの成分：
【００１９】
【化１】
2019030334.tif 000002
【００２０】
【化２】
2019030334.tif 000003
【００２１】
のうちの１つまたは複数を含む。
【００２２】
好ましい実施形態において、チロシンの無機エステル誘導体は、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸またはその塩である。
別の好ましい実施形態において、システインの誘導体は、（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニルプロパン酸またはその塩である。
好ましい実施形態において、チロシンのリン酸化された誘導体は、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸二ナトリウム塩である。
好ましい実施形態において、システインのスルホン化誘導体は、（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニルプロパン酸ナトリウム塩である。
【００２３】
好ましい実施形態において、細胞培養培地は、乾燥粉末培地である。
別の好ましい実施形態において、細胞培養培地はフィード（供給）培地である。
別の好ましい実施形態において、細胞培養培地は、８．５またはそれ以下のｐＨを有し、５〜４０ｍｍｏｌ／ｌの間、好ましくは１０〜３０ｍｍｏｌ／ｌの間の濃度のチロシンおよび／またはシステインの少なくとも１つの無機エステル誘導体を含む液体培地である。
好ましい実施形態において、液体培地のｐＨは、６．５〜８．５の間、最も好ましくは６．８〜７．８の間である。
【００２４】
一実施形態において、細胞培養培地は、少なくとも１つまたは複数の糖類成分、１つまたは複数のアミノ酸、１つまたは複数のビタミンまたはビタミン前駆体、１つまたは複数の塩、１つまたは複数の緩衝液成分、１つまたは複数の補因子、および１つまたは複数の核酸成分を含む。
【００２５】
本発明は、さらに、
ａ）Ｌ−チロシンおよび／またはＬ−システインの１つまたは複数の無機エステル誘導体を細胞培養培地の他の成分と混合すること、
ｂ）工程ａ）の混合物を粉砕に供すること
により、本発明による細胞培養培地を生成するための方法を対象とする。
【００２６】
好ましい実施形態において、工程ｂ）は、ピンミル、フィッツミルまたはジェットミル中で実施される。
【００２７】
別の好ましい実施形態において、工程ａ）からの混合物は、粉砕の前に０℃を下回る温度に冷却される。
【００２８】
本発明は、さらに、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸の二ナトリウム塩、二カリウム塩、一カリウム塩、２：１カルシウム塩、およびマグネシウム塩を対象とする。
【００２９】
本発明は、さらに、
ａ）バイオリアクターを準備すること、
ｂ）培養する細胞を、本発明による細胞培養培地と混合すること、
ｃ）工程ｂ）の混合物をインキュベートすること
により、細胞を培養するためのプロセスを対象とする。
【００３０】
本発明は、また、
−  バイオリアクターに細胞および水性細胞培養培地を充填すること、
−  バイオリアクター中で細胞をインキュベートすること、
−  バイオリアクター中の細胞のインキュベーションの全時間にわたり連続的に、または前記インキュベーション時間内の１回もしくは数回、バイオリアクターに細胞培養培地（この場合はフィード培地である）を添加すること
により、バイオリアクター中で細胞を培養するための流加プロセスであって、
フィード培地は、ｐＨ８．５未満のｐＨを有し、チロシンおよび／またはシステインの少なくとも１つの無機エステル誘導体を含む、流加プロセスを対象とする。
【００３１】
好ましくは、フィード培地は、１０〜５０ｍｍｏｌ／ｌの間、好ましくは１５〜３０ｍｍｏｌ／ｌの間の濃度のチロシンおよび／またはシステインの少なくとも１つの無機エステル誘導体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸を生成するための反応スキームを示す。さらなる詳細は、例１において見出すことができる。
【図２】（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−スルホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸を生成するための反応スキームを示す。さらなる詳細は、例２において見出すことができる。
【図３】本発明による細胞培養培地を使用したバッチ中での細胞成長実験を示す。さらなる詳細は、例５および６において見出すことができる。
【図４】本発明による細胞培養培地を使用したバッチ中での細胞成長実験を示す。さらなる詳細は、例５および６において見出すことができる。
【図５】（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−スルホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸塩を用いた本発明による最適化流加法を使用する流加細胞培養実験の結果を示す。詳細は、例７において見出すことができる。
【図６】（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−スルホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸塩を用いた本発明による最適化流加法を使用する流加細胞培養実験の結果を示す。詳細は、例７において見出すことができる。
【図７】（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−スルホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸塩および（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニル−プロピオン酸ナトリウム塩を用いた本発明による最適化流加法を使用する流加細胞培養実験の結果を示す。詳細は、例８において見出すことができる。
【図８】（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−スルホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸塩および（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニル−プロピオン酸ナトリウム塩を用いた本発明による最適化流加法を使用する流加細胞培養実験の結果を示す。詳細は、例８において見出すことができる。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明による無機エステル誘導体は、例えば、無機オキソ酸とチロシンまたはシステインとの縮合によって得られる生成物である。無機オキソ酸の例は、例えば、リン酸、硫酸、硝酸、およびホウ酸である。硫酸またはリン酸から誘導される無機エステル誘導体が好ましい。無機エステル誘導体は、このように、無機オキソ酸とシステインまたはチロシンとのエステル、およびその塩である。チロシンの適した無機エステル誘導体の例は、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸ならびに（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸の一ナトリウム塩、二ナトリウム塩、一カリウム塩、二カリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩である。
【００３４】
好ましい無機エステル誘導体は、また、以下の式ＩおよびＩＩにより示すことができる：
【００３５】
【化３】
2019030334.tif 000004
【００３６】
式中、Ｒは、
【００３７】
【化４】
2019030334.tif 000005
【００３８】
であり、
ＸおよびＹは、互いに独立に、Ｈ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、好ましくはＨ、Ｎａ、Ｋである。プロピオン酸という用語の代わりにプロパン酸という用語も使用することができる。
【００３９】
本発明による細胞培養培地は、細胞のインビトロでの成長を維持および／または支持する成分の任意の混合物である。細胞培養培地は、複合培地または化学組成が明確な培地でありうる。細胞培養培地は、細胞のインビトロ成長を維持および／または支持するために必要な成分を全て含んでもよく、あるいは一部の成分だけを含み、さらなる成分は別個に添加してもよい。本発明による細胞培養培地の例は、細胞のインビトロ成長を維持および／または支持するために必要な全ての成分ならびに培地補充物質またはフィードを含む完全培地である。好ましい実施形態において、細胞培養培地は、完全培地またはフィード培地である。基礎培地とも呼ばれる完全培地は、典型的には６．８〜７．８の間のｐＨを有する。フィード培地は、好ましくは８．５を下回るｐＨを有する。
【００４０】
典型的には、本発明による細胞培養培地は、バイオリアクター中で細胞の成長を維持および／または支持するために使用される。
【００４１】
フィードまたはフィード培地は、細胞培養における初期成長および産生を支持する基礎培地ではないが、栄養分の枯渇を防止するための後の段階で添加され、産生段階を持続する培地である、細胞培養培地である。フィード培地は、基礎培養培地と比較し、一部の成分をより高い濃度で有することができる。例えば、一部の成分、例えば、アミノ酸または炭水化物を含む栄養分は、基礎培地中での濃度の５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１２×、１４×、１６×、２０×、３０×、５０×、１００×、２００×、４００×、６００×、８００×、またはさらに約１０００×でフィード培地中に存在してもよい。
【００４２】
哺乳動物細胞培養培地は、哺乳動物細胞のインビトロ成長を維持および／または支持する成分の混合物である。哺乳動物細胞の例は、ヒト細胞または動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｉ  ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＡＫ−１細胞、ＳＰ２／０細胞、Ｌ５．１細胞、ハイブリドーマ細胞、またはヒト細胞である。
【００４３】
化学的に定義された細胞培養培地は、化学的に定義されない物質を含まない細胞培養培地である。これは、培地中で使用される全ての化学物質の化学組成が既知であることを意味する。化学組成が明確な培地は、酵母、動物または植物の組織を含まず、フィーダー細胞、血清、抽出物もしくは消化物、または化学組成が十分に明確ではないタンパク質を培地に付与しうる他の成分を含まない。化学的に定義されない、または十分に定義されていない化学成分は、その化学組成および構造が既知ではなく、様々な組成で存在し、または膨大な実験的な努力を払わないと明確にすることができず、それはアルブミンまたはカゼインなどタンパク質の化学組成および構造を評価することに匹敵するものである。
【００４４】
粉末細胞培養培地または乾燥粉末培地は、典型的には、粉砕プロセスまたは凍結乾燥プロセスから得られた細胞培養培地である。それは、粉末細胞培養培地が、粒状、微粒子培地であり、液体培地ではないことを意味する。用語「乾燥粉末」は、用語「粉末」と互換的に使用されうる。しかし、「乾燥粉末」は、本明細書中に使用する通り、粒状材料の肉眼的外観を単に指し、特に断らない限り、材料が複合化または凝集化溶媒を全く含まないことを意味することを意図するものではない。
【００４５】
本発明による培地を用いて培養される細胞は、細菌細胞などの原核細胞であっても、植物細胞もしくは動物細胞などの真核細胞であってもよい。細胞は、正常細胞、不死化細胞、疾患細胞、形質転換細胞、変異細胞、体細胞、生殖細胞、幹細胞、前駆細胞、または胚性細胞であってもよく、それらのいずれも、樹立もしくは形質転換された細胞株であっても、天然の供給源から得たものであってもよい。
【００４６】
粒子の大きさは、粒子の平均直径を意味する。粒径は、シリコーンオイル中でのレーザー光散乱により決定される。
【００４７】
不活性雰囲気は、それぞれの容器または装置に不活性ガスを充填することにより生成される。適した不活性ガスは、アルゴンなどの希ガスまたは好ましくは窒素である。これらの不活性ガスは、非反応性であり、望ましくない化学反応が起こることを防止する。本発明による工程において、不活性雰囲気を生成することは、例えば、液体窒素または窒素ガスを導入することにより、酸素の濃度が１０％（ｖ／ｖ）絶対値を下回り低下することを意味する。
【００４８】
様々な種類のミルが、当業者に公知であるピンミルは、遠心衝撃式ミルとも呼ばれ、固形物を粉砕し、それにより高速回転ディスク上の突出ピンが破壊エネルギーを供給する。ピンミルは、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ（米国）、Ｐｒｅｍｉｕｍ  Ｐｕｌｍａｎ（インド）、またはＳｔｕｒｔｅｖａｎｔ（ＵＳＡ）により販売されている。
ジェットミルは、圧縮ガスを使用して粒子を加速させることにより、粒子をプロセスチャンバー中で互いに衝突させる。ジェットミルは、例えば、Ｓｔｕｒｔｅｖａｎｔ（米国）またはＰＭＴ（オーストリア）により販売されている。
Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ（米国）により商品化されたフィッツミルは、粉砕用のブレードを備えたローターを使用している。
【００４９】
連続的に実行される工程は、バッチ式に実行されない工程である。粉砕プロセスが連続的に実行された場合、ある時間にわたりミル中に培地成分が絶えず安定的に供給されることを意味する。
【００５０】
本発明による細胞培養培地、特に完全培地は、典型的には、少なくとも１つまたは複数の糖類成分、１つまたは複数のアミノ酸、１つまたは複数のビタミンまたはビタミン前駆体、１つまたは複数の塩、１つまたは複数の緩衝液成分、１つまたは複数の補因子、および１つまたは複数の核酸成分を含む。
【００５１】
培地は、また、ピルビン酸ナトリウム、インスリン、植物タンパク質、脂肪酸および／または脂肪酸誘導体および／またはプルロニック酸および／または化学的に調製された非イオン性界面活性剤などの表面活性成分を含みうる。適した非イオン性界面活性剤の一例は、ポロキサマーとも呼ばれる一級ヒドロキシル基において終結する二官能性ブロックコポリマー界面活性剤（例えば、ＢＡＳＦ、ドイツから商標名ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の下で入手可能）である。
【００５２】
糖類成分は、グルコース、ガラクトース、リボース、もしくはフルクトース（単糖類の例）またはスクロース、ラクトース、もしくはマルトース（二糖類の例）などの全ての単糖類または二糖類である。
【００５３】
本発明によるアミノ酸の例は、チロシン、タンパク質を構成するアミノ酸（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）、特に必須アミノ酸である、ロイシン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファンおよびバリン、ならびにＤアミノ酸などのタンパク質を構成しないアミノ酸（ｎｏｎ−ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）である。
チロシンは、Ｌ−またはＤ−チロシン、好ましくはＬ−チロシンを意味する。
システインは、Ｌ−またはＤ−システイン、好ましくはＬ−システインを意味する。
【００５４】
ビタミンの例は、ビタミンＡ（レチノール、レチナール、種々のレチノイド、４つのカロテノイド）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン、ナイアシンアミド）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸、フォリン酸）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、メチルコバラミン）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール）、ビタミンＥ（トコフェロール、トコトリエノール）、およびビタミンＫ（フィロキノン、メナキノン）である。ビタミン前駆体も含まれる。
【００５５】
塩の例は、無機イオン、例えば、重炭酸、カルシウム、塩化物、マグネシウム、リン酸、カリウム、ナトリウムのイオン、または微量元素、例えば、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｎｉ、Ｂｉ、Ｖ、およびＺｎを含む成分である。例としては、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸鉄（ＩＩ）、リン酸ナトリウム一塩基性無水物（ＮａＨ２ＰＯ４）、硫酸マグネシウム無水物（ＭｇＳＯ４）、リン酸ナトリウム二塩基性無水物（Ｎａ２ＨＰＯ４）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛七水和物である。
【００５６】
緩衝液の例は、ＣＯ２／ＨＣＯ３（炭酸塩）、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、およびＴＲＩＳである。
【００５７】
補因子の例は、チアミン誘導体、ビオチン、ビタミンＣ、ＮＡＤ／ＮＡＤＰ、コバラミン、フラビンモノヌクレオチドおよびその誘導体、グルタチオン、ヘムヌクレオチドリン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅｓ）および誘導体である。
【００５８】
本発明による核酸成分は、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、またはウラシルなどの核酸塩基、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、およびチミジンなどのヌクレオシド、ならびにアデノシン一リン酸またはアデノシン二リン酸またはアデノシン三リン酸などのヌクレオチドである。
【００５９】
フィード培地は、完全培地と比較し様々な組成を有しうる。それらは、典型的には、アミノ酸、微量元素およびビタミンを含む。フィード培地は、糖類成分をも含みうるが、産生の理由のため、糖類成分が別のフィード中に添加されることもある。
【００６０】
適したフィード培地は、例えば、以下の化合物の１つまたは複数を含みうる：
Ｌ−アスパラギン一水和物
Ｌ−イソロイシン
Ｌ−フェニルアラニン
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム一水和物
Ｌ−ロイシン
Ｌ−スレオニン
Ｌ−リジン一塩酸塩
Ｌ−プロリン
Ｌ−セリン
Ｌ−アルギニン一塩酸塩
Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物
Ｌ−メチオニン
Ｌ−バリン
Ｌ−アスパラギン酸一ナトリウム一水和物
Ｌ−トリプトファン
塩化コリン
ミオイノシトール
ニコチンアミド
Ｄ（＋）パントテン酸カルシウム
ピリドキシン塩酸塩
チアミン塩化物塩酸塩
ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）微粉化
ビオチン
葉酸
リボフラビン
硫酸マグネシウム無水物
硫酸銅（ＩＩ）五水和物
硫酸亜鉛七水和物
１，４−ジアミノブタン二塩酸塩（ＤＩＨＹＤＲＣＨＬＯＲＩＤＥ）
ヘプタモリブデン酸アンモニウム四水和物
硫酸カドミウム水和物
塩化マンガン（ＩＩ）四水和物
塩化ニッケル（ＩＩ）六水和物
メタケイ酸ナトリウム
メタバナジン酸ナトリウム
塩化スズ（ＩＩ）二水和物
亜セレン酸ナトリウム（約４５％ＳＥ）
リン酸二水素ナトリウム一水和物
クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム（約１８％ＦＥ）。
【００６１】
本発明による凍結は、０℃を下回る温度まで冷却することを意味する。
【００６２】
本発明の主旨は、粉末と、粉末が溶解して液体細胞培養培地、例えば完全培地、培地補充物質、培地サブグループまたは所望の均質な濃度の培地成分を有するフィードを生成するような適した溶媒とを単に混合することにより、溶媒に容易に溶解することができる粉末細胞培養培地を提供することである。
【００６３】
粉末細胞培養培地の単純な溶解が、水性溶媒中での乏しい溶解性および／または安定性を有するチロシンまたはシステインなどの物質により複雑化されることが多い。例えばＬ−チロシンは、２５℃の温度で、水に対して０．４ｇ／ｌの溶解性を有する。これは、１リットルの水に約０．４ｇのＬ−チロシンが溶解することを意味する。しかし、細胞培養培地中でのチロシンの要求濃度は、より高いことが多い。システインは、好気的条件下で二量体を形成する傾向がある。この二量体は、シスチンと呼ばれる。また、システインは、細胞培養培地中に存在することが多い銅または鉄などの金属との毒性副産物を形成することが公知である。細胞培養培地中に存在するシステインまたはシスチンは、二量体または毒性副産物を形成しない、本発明による無機エステル誘導体により置換することができる。
【００６４】
チロシンおよび／またはシステインのリン酸化および／またはスルホン化誘導体は、一方では、典型的には、水溶液に対してより高い溶解性を有し、他方では、チロシンおよび／またはシステイン／シスチンの代替物として使用することができ、細胞培養培地の成分として天然アミノ酸であるチロシンおよびシステインと同等に適していることが見出されている。それは、例えば、Ｌ−チロシンがＬ−チロシンの１つまたは複数の無機エステル誘導体により置換された細胞培養培地が、細胞培養においてＬ−チロシンだけを含む培地と同等の性能を示すことを意味する。
【００６５】
チロシンおよびシステインの一部の無機エステル誘導体が、当技術分野において公知である。ペプチドおよびタンパク質中で、チロシンのリン酸化は、細胞プロセスの広い範囲で重要な役割を果たし、多くのタンパク質酵素をオンおよびオフにし、それにより、それらの機能および活性を変える。
【００６６】
（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸一ナトリウム塩は、ＣＡＳ番号１４６９００−４９−４を有する。Ｒ．Ｈ．Ｐｌｉｍｍｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９４１），３５，４６１〜４６９頁（非特許文献１）は、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸ならびにその１：１カルシウム塩の合成を開示している。
【００６７】
（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸の二ナトリウム塩、二カリウム塩、一カリウム塩、２：１カルシウム塩、およびマグネシウム塩などの、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸のさらなる新たな誘導体の合成および特徴が、本明細書中に開示される。
【００６８】
本発明によるチロシンの適したリン酸化誘導体は、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸またはその塩などの、フェノール性ＯＨ基でリン酸化されたものである。特に好ましい実施形態において、チロシンのリン酸化誘導体は、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸の塩である。
【００６９】
本発明によるチロシンの適したスルホン化誘導体は、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−スルホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸またはその塩などの、フェノール性ＯＨ基でスルホン化されたものである。特に好ましい実施形態において、チロシンのスルホン化誘導体は、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−スルホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸の塩である。
【００７０】
本発明によるシステインの適したリン酸化誘導体は、（Ｓ）−２−アミノ−３−ホスホノスルファニル−プロピオン酸またはその塩などの、システインのＳＨ基でリン酸化されたものである。
【００７１】
本発明によるシステインの適したスルホン化誘導体は、（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニル−プロピオン酸またはその塩などの、システインのＳＨ基でスルホン化されたものである。（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニル−プロパン酸とも呼ばれる２−アミノ−３−スルホスルファニル−プロピオン酸、Ｓ−スルホ−システインまたはシステイン−Ｓ−硫酸およびその塩の合成は、例えば、Ｉ．Ｈ．Ｓｅｇｅｌ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５，３３０〜３３７頁およびＪ．Ｓ．Ｃｈｕｒｃｈ，Ｄ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ，Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  Ｐａｒｔ  Ａ  ６９  （２００８）２５６〜２６２頁において開示されている。そのナトリウム塩は、さらに、Ｂａｃｈｅｍ（スイス）から市販されている。
【００７２】
適した塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩（例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩またはマグネシウム塩）であり、ナトリウム塩、カリウム塩および遊離酸が好ましく、ナトリウム塩が最も好ましい。
【００７３】
チロシンの無機エステル誘導体の場合において、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸−二ナトリウム塩が非常に良好な溶解性を示す。
【００７４】
チロシンおよびシステインの無機エステル誘導体は、任意の方法により、例えば、酵素的にまたは化学合成により生成することができる。好ましくは、チロシンのリン酸化誘導体は、五酸化リンの存在下でチロシンをリン酸と反応させることにより生成される。次いで、得られた（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸を適した塩基（水酸化ナトリウム、ナトリウムエチラート、水酸化カリウムなど）と反応させて、関連する塩を得ることができる。この合成の反応スキームを図１に示す。
【００７５】
（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸の溶解性は、チロシンの溶解性よりも高い（例３における表１を参照）。チロシンまたはシステイン誘導体の溶解性をさらに高めるために、上記の通り、誘導体を適した塩基と反応させることにより塩を形成することができる。例えば、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸のナトリウム塩は、より高い溶解性を有する（例３における表１を参照）。
【００７６】
本発明による細胞培養培地は、チロシンおよび／またはシステインの無機エステル誘導体の１つまたは複数、例えば、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸の一および二ナトリウム塩の混合物を含むことができる。
【００７７】
完全培地中でチロシンの無機エステル誘導体を使用する場合、培地組成に少量のチロシンを添加することが好ましいことが見出されている。これは、一部の細胞が、チロシンの無機エステル誘導体の取り込みを示さないことに起因しうる。チロシンの無機エステル誘導体は、細胞外で、ホスファターゼにより遊離チロシンに変換される必要がある。典型的には、十分な量のホスファターゼは、細胞培養の開始から２〜５日後に利用可能である。
【００７８】
新たに添加されるフィード培地中でチロシンの無機エステル誘導体を使用する場合、それは、細胞が既にチロシンを含む培地中で２〜５日間を超えて成長させた細胞培養物では、新たに添加されるフィード培地にチロシンを添加する必要性はないことを意味する。
【００７９】
結果的に、好ましい実施形態において、本発明による完全培地は、チロシンの少なくとも１つの無機エステル誘導体と、さらには５〜４０％（ｗ／ｗ）のチロシンとを含む。
【００８０】
この効果は、システインの無機エステル誘導体を使用する場合は見出されない。システインの無機エステル誘導体を使用する場合は、システインの添加は必要ではない。システインの無機エステル誘導体は、いかなる場合も、システインまたはシスチンの完全な代替物として使用することができる。
【００８１】
また、予想外に、システインの無機エステル誘導体は、細胞成長および生産性に正の効果を示した。典型的には、システインの無機エステル誘導体を含む培地およびフィードで成長させた細胞は、成長の増大を示す。システインの無機エステル誘導体を使用する場合、経時的な細胞の生存率は、システインを使用した細胞培養と比較して高い。
【００８２】
システインの無機エステル誘導体を使用した場合の組換えタンパク質の産生は、システインを使用した細胞培養物と比較してさらに増加する。
【００８３】
システインの無機エステル誘導体の正の効果は、細胞培養培地中で典型的に使用されるシステインおよび／またはシスチンの量と等しい量を使用することにより得ることができる。
【００８４】
本発明の粉末細胞培養培地は、好ましくは、全ての成分を混合し、それらを粉砕することにより生成される。成分の混合は、粉砕により乾燥粉末細胞培養培地を生成する当業者に公知である。好ましくは、全ての成分を十分に混合し、混合物の全ての部分がほとんど同じ組成を有するようにする。組成の均一性が高いほど、得られた培地の均質な細胞成長に関する品質が良好となる。
【００８５】
粉砕は、粉末細胞培養培地を生成するために適した任意の型のミルを用いて実施することができる。典型的な例は、ボールミル、ピンミル、フィッツミルまたはジェットミルである。ピンミル、フィッツミルまたはジェットミルが好ましく、ピンミルが非常に好ましい。当業者は、そのようなミルを実行する方法を知っている。
【００８６】
約４０ｃｍのディスク径の大規模機器ミルは、例えば、典型的には、ピンミルの場合は１分間当たり１〜６５００回転で実行し、１分間当たり１〜３０００回転が好ましい。
【００８７】
粉砕は、１０〜３００μｍの間、最も好ましくは２５〜１００μｍの間の粒子サイズの粉末が得られる標準粉砕条件下で行うことができる。
【００８８】
好ましくは、粉砕に供する混合物の全ての成分が乾燥している。これは、成分が水を含む場合、成分が結晶水だけを含むが、非結合または非配位水分子が１０重量％以下、好ましくは５重量％以下、最も好ましくは２重量％以下であることを意味する。
【００８９】
好ましい実施形態において、粉砕は不活性雰囲気中で実施する。好ましい不活性保護ガスは窒素である。
【００９０】
別の好ましい実施形態において、混合物の全ての成分が粉砕の前に凍結される。粉砕の前の成分の凍結は、０℃を下回る、最も好ましくは−２０℃を下回る温度への成分の冷却を確実にする任意の手段により行うことができる。好ましい実施形態において、凍結は液体窒素を用いて行われる。これは、例えば、成分がミルに導入する前に保存される容器中に液体窒素を注ぐことにより、成分を液体窒素で処理することを意味する。好ましい実施形態において、容器はフィーダーである。容器がフィーダーである場合、液体窒素は、好ましくは成分が導入されるフィーダーの側に、またはフィーダーの側に近接して導入される。
【００９１】
典型的には、成分は、２〜２０秒間にわたり液体窒素で処理する。
【００９２】
好ましくは、成分の冷却は、ミル中に入る全ての成分が０℃を下回る、最も好ましくは−２０℃を下回る温度となるように行われる。
【００９３】
好ましい実施形態において、全ての成分を、混合物がフィーダー中に、最も好ましくは計量スクリューフィーダー中に移された容器中に入れる。フィーダー中では、成分は、フィーダーの種類によってさらに混合されることがあり、追加的に冷却される。次に、凍結混合物はフィーダーからミルに移され、ミル中で粉砕される混合物が、好ましくは、依然として、０℃を下回る、より好ましくは−２０℃を下回る温度を有するようにする。
【００９４】
典型的には、混合時間は、フィーダー中の成分の混合物の滞留時間が、１分を超え、好ましくは１５〜６０分の間であることを意味する。
【００９５】
計量スクリューフィーダーは、投与量スネールとも呼ばれ、典型的には、１０〜２００回転／分の速度で実行され、好ましくは４０〜６０回転／分で実行される。
【００９６】
典型的にはミルの温度は−５０〜＋３０℃の間に保たれる。好ましい実施形態において、温度は１０℃前後に保たれる。
【００９７】
粉砕の間の酸素レベルは、好ましくは１０％（ｖ／ｖ）を下回る。
【００９８】
このプロセスは、例えば、バッチ式または連続的に実行することができる。好ましい実施形態において、本発明によるプロセスは、一定時間にわたり、成分の混合物をフィーダー中に絶えず充填して冷却し、冷却混合物をフィーダーからのミル中に絶えず充填することにより、連続的に行われる。
【００９９】
粉砕された粉末培地を使用する場合は、培地に溶媒、好ましくは、水（最も特に、蒸留水および／もしくは脱イオン水または精製水または注射用水）または水性緩衝液を添加し、培地が溶媒に完全に溶解するまで成分を混合する。
【０１００】
この溶媒は、また、生理食塩水、適したｐＨ範囲（典型的にはｐＨ１．０〜ｐＨ１０．０の間の範囲）を提供する可溶性の酸または塩基イオン、安定化剤、界面活性剤、保存剤およびアルコールまたは他の極性有機溶媒を含みうる。
【０１０１】
ｐＨの調整用の緩衝物質、ウシ胎仔血清、糖などのさらなる物質を細胞培養培地および溶媒の混合物に添加することも可能である。次いで、得られた液体細胞培養培地を成長または維持するための細胞と接触させる。
【０１０２】
より高い濃度のチロシン、例えば、１０ｇ／ｌのＬ−チロシンを、８．５を下回るｐＨで含む培地組成物は、溶媒と混合した場合、非溶解チロシンに起因する濁りを示しうるが、同濃度のチロシンの無機エステル誘導体を使用した本発明による細胞培養培地は、透明な溶液となる。
【０１０３】
本発明は、さらに、
ａ）バイオリアクターを準備すること、
ｂ）培養する細胞を、本発明による細胞培養培地と混合すること、
ｃ）工程ｂ）の混合物をインキュベートすること
により、細胞を培養する方法を対象とする。
【０１０４】
バイオリアクターは、細胞を培養することができる任意の容器またはタンクである。インキュベーションは、典型的には適した温度などの適した条件下で行われる。当業者は、細胞の成長／培養を支持または維持するための適したインキュベーション条件を認識している。
【０１０５】
本発明は、また、フィード培地の調製に非常に適していることが見出された。Ｌ−チロシンおよびＬ−システインの可溶性、特にフィード培地に必要な濃度の制約に起因し、これら２つの分子は、典型的には、塩基性ｐＨ１１．０〜１１．５でのストック溶液として調製される。このｐＨは、全体的なバイオ医薬品バイオ生産プロセスに負の影響を有する。大規模なバイオリアクターにおける混合時間および塩基性ｐＨ値は、要するに、細胞への栄養供給に負に影響し、極度の塩基性ｐＨ値への曝露により、細胞死をある程度まで加速する。
【０１０６】
これは、上清中への細胞内タンパク質の放出をもたらす。これらの放出されたタンパク質は、無傷細胞に付着し、それは、次に、互いに接着し、凝集体を形成する。これらの凝集体は、拡大された質量慣性により破壊され、全体的なバイオ生産プロセスがスキップを開始する。先端速度を低下させることは、選択肢ではない。なぜなら、これらのプロセスは、いずれにせよ、酸素供給の限度の近くで調節されているからである。
【０１０７】
結果的に、ここでは、全ての必要とされる成分を１つのフィード中に高濃度で含むフィード培地が必要とされている。また、フィードのｐＨは、細胞培養に、負に影響しないはずである。
【０１０８】
Ｌ−チロシンおよびＬ−システインの無機エステル誘導体は、改善された溶解性および／または安定性を有し、高度に濃縮されたフィード培地中で負の効果がなく、時には８．５を下回るｐＨでの細胞成長および／または生産性に対する正の効果でさえもなく、それぞれＬ−チロシンおよびＬ−システインの代わりに使用することができることが見出されている。
【０１０９】
本発明は、このように、粉末培地の形態の、または溶解後は液体培地の形態のフィード培地を対象とする。
【０１１０】
得られた液体培地は、５〜４０ｍｍｏｌ／ｌの間、好ましくは１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌの間の濃度のチロシンおよび／またはシステインの無機エステル誘導体を含み、好ましくは８．５またはそれ以下のｐＨを有する。
好ましい実施形態において、ｐＨは６．８〜８．４の間である。
【０１１１】
本発明は、また、
−  バイオリアクターに細胞および水性細胞培養培地を充填すること、
−  バイオリアクター中で細胞をインキュベートすること、
−  バイオリアクター中の細胞のインキュベーションの全時間にわたり連続的に、または
前記インキュベーション時間内の１回もしくは数回、バイオリアクターに細胞培養培地（
この場合はフィード培地である）を添加すること
により、バイオリアクター中で細胞を培養するための流加方法であって、
フィード培地は、好ましくは、ｐＨ８．５未満のｐＨを有し、チロシンおよび／またはシステインの少なくとも１つの無機エステル誘導体を含む、流加プロセスを対象とする。典型的には、フィード培地は、溶媒中に溶解される固形成分を１００〜１５０ｇ／ｌの間で含む。
【０１１２】
チロシンおよび／またはシステインの無機エステル誘導体を使用することにより、全ての必要な供給成分を高濃度で（１００〜１５０ｇ／ｌの間の全体的な濃度）含むフィード培地を得ることができることが見出されている。２つまたはそれ以上の異なるフィード培地をバイオリアクターに供給する必要がある公知の方法とは対照的に、本発明は、全ての成分を高濃度で含む１つのフィード培地の使用を可能にする培地および方法を提供する。また、本発明によるフィード培地のｐＨは、典型的には８．５を下回る。細胞培養培地およびフィード中のＬ−チロシンおよびＬ−システインの可用性の制約に起因し、これら２つの分子は、典型的には、現況技術に従って、塩基性ｐＨ１１．０〜１１．５でのストック溶液として調製される。このｐＨは、全体的なバイオ医薬品バイオ生産プロセスに対して負の影響を有する。大規模なバイオリアクターにおける混合時間および塩基性ｐＨ値は、要するに、細胞への栄養供給に負に影響し、極度の塩基性ｐＨ値への曝露により、細胞死をある程度まで加速する。本発明によるチロシンおよび／またはシステインの無機エステル誘導体を使用する場合、フィード培地のｐＨは、８．５を下回り保つことができ、それにもかかわらず、１０〜１３ｍＭの間で、チロシンおよび／またはシステインの無機エステル誘導体がフィード培地中に存在し、１００〜１５０ｇ／ｌの間の全体的な濃度である。
【０１１３】
結果的に、好ましい実施形態において、本発明のプロセスにおいて、バイオリアクターに前記時間内に連続的または１回もしくは数回、インキュベーションの間に添加されるフィード培地は、常に同じ組成を有する。
【０１１４】
本発明は、以下の図面および例によりさらに例示されるが、それらに制限されない。
【０１１５】
上記および下記に引用する全ての出願、特許、および刊行物、ならびに対応するＥＰ出願ＥＰ１２００７７１１．０（２０１２年１１月１４日に出願）の全開示が、参照により本明細書により組み入れられる。
【実施例】
【０１１６】
以下の例は、本発明の実際的な適用を表す。
例１  （Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸およびその塩の合成
文献（Ｐ．Ｆ．Ａｌｅｗｏｏｄ，Ｒ．Ｂ．Ｊｏｈｎｓ，Ｒ．Ｍ．Ｖａｌｅｒｉｏ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １９８３，３０．）に従い、Ｌ−チロシンから開始して（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸が合成され、続いてその塩に転換される。図１は、二ナトリウム塩の合成の反応スキームを示す。
【０１１７】
塩基の化学量論および／または陽イオンを変えることにより、１、２もしくは３倍荷電のチロシンホスホン酸塩または異なる塩をそれぞれ生成することが可能である。
【０１１８】
（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸
構造：
【０１１９】
【化５】
2019030334.tif 000006
【０１２０】
合成：１００ｇ（０．５５ｍｏｌ）のＬ−チロシンを４００ｇ（３．４８ｍｏｌ）のオルトリン酸に溶解し、続いて３０９ｇ（２．１３ｍｏｌ）の五酸化リンを冷却下で５回に分けて（ｐｒｏｔｉｏｎｓ）添加することによって、反応は実施される。粘性溶液を、８０℃で２０時間にわたり撹拌し、次に４０℃まで冷却し、４００ｍＬの水の添加により加水分解する。この溶液を８０℃でさらに１時間にわたり撹拌した後、６０℃で３．８Ｌのｎ−ブタノールをゆっくりと添加する。冷却は約３℃まで継続し、得られた懸濁液を濾過する。得られた無色結晶を、水、エタノール、およびメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで連続的に洗浄し、次に、真空中５０℃で乾燥させる。
【０１２１】
分析データ：
【０１２２】
【数１】
2019030334.tif 000007
【０１２３】
（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸一ナトリウム塩
構造：
【０１２４】
【化６】
2019030334.tif 000008
【０１２５】
分析データ：
【０１２６】
【数２】
2019030334.tif 000009
【０１２７】
（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸二ナトリウム塩
構造：
【０１２８】
【化７】
2019030334.tif 000010
【０１２９】
合成：５０ｇ（１９１ｍｍｏｌ）の（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸を、ＥｔＯＨ（２１重量％）中のＮａＯＥｔの溶液１４６ｍＬ（４０２ｍｍｏｌ）中に取った後、１２．５ｍＬの水を添加する。無色のスラリーを１時間にわたり還流し、０℃まで冷却し、濾過する。無色の生成物をエタノールで洗浄し、次に、真空中５０℃で乾燥させる。
【０１３０】
分析データ：
【０１３１】
【数３】
2019030334.tif 000011
【０１３２】
（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸一カリウム塩
構造：
【０１３３】
【化８】
2019030334.tif 000012
【０１３４】
分析データ：
【０１３５】
【数４】
2019030334.tif 000013
【０１３６】
（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸２：１カルシウム塩
構造：
【０１３７】
【化９】
2019030334.tif 000014
【０１３８】
分析データ：
【０１３９】
【数５】
2019030334.tif 000015
【０１４０】
（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸２：１マグネシウム塩
構造：
【０１４１】
【化１０】
2019030334.tif 000016
【０１４２】
分析データ：
【０１４３】
【数６】
2019030334.tif 000017
【０１４４】
荷電が等しいが溶媒分離のチロシンリン酸塩の間での１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおけるスペクトルの類似性に起因して、ＩＣＰ−ＯＥＳ分光分析を実施して、対応する陽イオンを明白に決定した。
【０１４５】
例２    （Ｓ）−２−アミノ−３−（４−スルホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸およびその塩の合成
文献（＊Ｓ．Ｆｕｔａｋｉ，Ｔ．Ｔａｉｋｅ，Ｔ．Ｙａｇａｍｉ，Ｔ．Ｏｇａｗａ，Ｔ．Ａｋｉｔａ，Ｋ．Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｊ：Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  Ｉ  １９９０，１７３９．）に従い、Ｌ−チロシンから開始して（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−スルホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸を合成し、続いてその塩への可能な転換を行うことができる。図２は、ナトリウム塩の合成の反応スキームを示す。
【０１４６】
塩基の化学量論および／または陽イオンを変えることにより、１もしくは２倍荷電のチロシンホスホン酸塩または異なる塩をそれぞれ生成することが可能である。
【０１４７】
例３    水に対する溶解性
水中でのＬ−チロシン（化合物Ｄ１）、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸（化合物Ｄ２）、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸ナトリウム塩（化合物Ｄ３）、および（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸二ナトリウム塩（化合物Ｄ４）の溶解性を、２０、２５、および３０℃で試験する。表１は結果を示す。
【０１４８】
【表１】
2019030334.tif 000018
【０１４９】
例４    複合細胞培養培地に対する溶解性
ダルベッコ改変イーグル培地は、ＤＭＥＭとしても公知であり、動物細胞を成長させるためにしばしば使用される培地である。ＤＭＥＭの成分はｍｇ／ｌで表す：
無機塩：
ＣａＣｌ２（無水）：２００．００
Ｆｅ（ＮＯ３）・９Ｈ２Ｏ：０．１０
ＫＣｌ：４００．００
ＭｇＳＯ４（無水）：９７．６７
ＮａＣｌ：６４００．００
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ：１２５．００
他の成分：
Ｄ−グルコース：４５００．００
ピルビン酸ナトリウム：１１０．００
プルロニック：１０００．００
Ｈｅｐｅｓ：１５ｍＭ
アミノ酸：
Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ：８４．００
Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ：６３．００
Ｌ−グルタミン：５８４．００
グリシン：３０．００
Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ・Ｈ２Ｏ：４２．００
Ｌ−イソロイシン：１０５．００
Ｌ−ロイシン：１０５．００
Ｌ−リシンＨＣｌ：１４６．００
Ｌ−メチオニン：３０．００
Ｌ−フェニルアラニン：６６．００
Ｌ−セリン：４２．００
Ｌ−スレオニン：９５．００
Ｌ−トリプトファン：１６．００
Ｌ−チロシン２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ：２４８．００
Ｌ−バリン：９４．００
ビタミン：
Ｄ−パントテン酸カルシウム：４．００
塩化コリン：４．００
葉酸：４．００
ｉ−イノシトール：７．２０
ナイアシンアミド：４．００
リボフラビン：０．４０
チアミン・ＨＣｌ：４．００。
【０１５０】
Ｌ−チロシン２Ｎａ・２Ｈ２Ｏが（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸二ナトリウム塩により等モル比で置換される以外は、同じ培地組成が作られる。
【０１５１】
両方の培地組成について、全ての成分を混合し、投与量スネールおよびピンミルを含む本発明の方法に従って粉砕する。
【０１５２】
得られた粉末細胞培養培地を、脱イオン水に２５℃で溶解する。（撹拌機を備えたフラスコ中での）１０分間の混合後に溶解性を測定する。リン酸化チロシン誘導体を有する培地組成物は透明な溶液であるが、Ｌ−チロシンを含む組成物は透明ではなく、濁りを示す。
【０１５３】
細胞培養実験
例５
この実験についてのデータを図３に示す。チロシンがＰＴｙｒ塩により置き換えられた化学組成が明確な培地中でのバッチ実験。ＰＴｙｒは、（Ｓ）−２−アミノ−３−（４−ホスホノオキシ−フェニル）−プロピオン酸塩を意味する。使用されるＰＴｙｒの濃度が、培地中のチロシンの濃度と同じであった場合、細胞は成長しなかった（示さず）。ＣＤＭに４．５ｍＭ（コントロール中での１ｍＭに対し）の濃度で溶解した場合、細胞は成長することができ、コントロールにおけるさらにより高い最大生存細胞密度および全体的に延長した成長（２日間）を示した。後の分析によって、初期成長が、ＰＴｙｒ誘導体合成（合成不純物５％（ｗ／ｗ））に由来する遊離チロシンを通じて可能であることが示された。延長した成長は、遊離チロシンおよびリン酸中でのその代謝的切断後のＰＴｙｒの直接的な効果に起因しうる。
【０１５４】
例６
この実験についてのデータを図４に示す。システインがＳ−スルホシステインナトリウム塩（等濃度）により置き換えられた化学組成が明確な培地中でのバッチ実験。基礎として使用したＣＤＭ粉末は、システインおよびシスチンが枯渇しており、コントロール条件（１．５および３ｍＭ）の場合はシステインが、または試験条件（１．５および３ｍＭ）の場合はＳ−スルホシステインナトリウム塩が復元の間に補充された。システインまたはＳ−スルホシステインナトリウム塩を含む、化学組成が明確な培地で培養した場合、細胞は、同程度の成長を示し、Ｓ−スルホシステインナトリウム塩をシステインの代わりとして使用することができることが示された。
【０１５５】
例７
図５および図６は、流加プロセスにおける経時的な生存細胞密度およびＩｇＧ濃度を示す。組換えＣＨＯ細胞を、化学組成が完全に明確な基礎培地中で成長させ、ｐＨ７．０でのリン酸化Ｔｙｒ塩を含むフィードを３；５、７、９日目に添加する（３％；６％、６％、６％の％ｖ／ｖの添加）。条件１はＰＴｙｒ二ナトリウム塩に対応し、条件２はＰＴｙｒカリウム塩に対応し、条件３はＰＴｙｒマグネシウム塩に対応し、中性ＰＨフィード中での３０ｍＭの濃度で可溶化される。これらの場合において、システインは、依然として、ｐＨ１１で別々のフィードとして添加される。
【０１５６】
このプロセスは、３７℃、５％ＣＯ２、撹拌３２０ｒｐｍでの３０ｍＬスピンチューブ中で実施される。コントロールについては、現況技術に従い、チロシン２Ｎａ＋およびシステインは、別々のフィード中のｐＨ１１で可溶化し、３；５；７；９日目に、０．３％、０．６％、０．６％、および０．６％の％（Ｖ／Ｖ）で添加する。結果的に、主なフィードは、システインおよびチロシンを含まず、上記のように添加する。
【０１５７】
グルコース濃度を毎日測定し、それに従い、＞２ｇ／Ｌの濃度を維持するように調節する。
【０１５８】
３つのホスホＴｙｒ塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム）を、成長または力価のいずれに対する負の影響を伴わず、流加プロセスにおける高度に濃縮された中性フィード中で使用し、このように、全体的なプロセスを単純化することができることがわかる。
【０１５９】
例８
図７および８は、流加プロセスにおける経時的な生存細胞密度およびＩｇＧ濃度を示す。組換えＣＨＯ細胞は、化学組成が完全に明確な基礎培地およびｐＨ７．０でＳ−スルホシステインおよびｐＴｙｒ２Ｎａ＋の両方を含むフィード中で成長させる。フィードは、３；５、７、９、１４日目に添加する（３％；６％、６％、６％、３％の％ｖ／ｖの添加）。この工程は、３７℃、ｐＨ７．０、５０％溶解酸素、撹拌１４０ｒｐｍでの１．２Ｌバイオリアクター中で実施する。コントロールについては、現況技術に従い、チロシン２Ｎａ＋およびシステインは、別々のフィード中のｐＨ１１で可溶化し、３；５；７；９、１４日目に、０．３％、０．６％、０．６％、０．６％、０．３％の％（Ｖ／Ｖ）で加える。グルコース濃度を毎日測定し、それに従い、＞２ｇ／Ｌの濃度を維持するように調節する。
【０１６０】
主なフィード中でのＳ−スルホシステインの使用（ここではｐＴｙｒ２Ｎａ＋と組み合わせる）が、コントロールと比較し、拡大成長を誘導し、力価の有意な増加を示すことがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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