(57)【要約】【課題】早期老化症、特にウェルナー症候群のモデル動物を提供すること。【解決手段】WRN RecQヘリカーゼ遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下したオナガザル上科動物である、早期老化症モデル動物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
WRN RecQヘリカーゼ遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下したオナガザル上科動物である、早期老化症モデル動物。
【請求項２】
前記早期老化症がウェルナー症候群である、請求項１に記載のモデル動物。
【請求項３】
前記オナガザル上科動物がオナガザル亜科動物である、請求項１又は２に記載のモデル動物。
【請求項４】
前記オナガザル亜科動物がマカク属動物である、請求項３に記載のモデル動物。
【請求項５】
前記マカク属動物がカニクイザルである、請求項４に記載のモデル動物。
【請求項６】
対応する野生型オナガザル上科動物に比べて、C-peptide、GIP、MCP-1、Insulin、PP、活性化Amylin、及びヒアルロン酸からなる群より選択される少なくとも1種の血中濃度が増加している、請求項１〜５のいずれかに記載のモデル動物。
【請求項７】
WRN RecQヘリカーゼ遺伝子のタンパク質コード領域に変異が導入されている、請求項１〜６のいずれかに記載のモデル動物。
【請求項８】
前記変異がアミノ酸の欠失、付加、及び挿入からなる群より選択される少なくとも1種を生じさせる変異である、請求項７に記載のモデル動物。
【請求項９】
前記変異がフレームシフトを生じさせる変異である、請求項７又は８に記載のモデル動物。
【請求項１０】
前記変異が第8〜13番エクソンにおける変異である、請求項７〜９のいずれかに記載のモデル動物。
【請求項１１】
野生型エキソヌクレアーゼドメインを含み、且つ野生型ヘリカーゼドメイン、野生型RQCドメイン、及び野生型HRDCドメインを含まない変異型WRN RecQヘリカーゼタンパク質を発現する、請求項７〜１０のいずれかに記載のモデル動物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載のモデル動物に発生する、受精卵。
【請求項１３】
オナガザル上科動物の細胞において、WRN RecQヘリカーゼ遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下する変異を導入することを含む、早期老化症モデル動物の作製方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載のモデル動物を用いた、早期老化症治療薬候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
（a）請求項１〜１２のいずれかに記載のモデル動物に被検物質を投与する工程、
（b）被検物質が投与された前記モデル動物の、早期老化症の表現型を評価する工程、及び
（c）早期老化症の表現型が治癒又は緩和していた場合に、前記被検物質を早期老化症の治療薬候補物質として選別する工程、
を含む、請求項１４に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、早期老化症モデル動物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウェルナー症候群は日本に多い早期老化症の1つで、RecQ型DNAヘリカーゼ（WRN RecQヘリカーゼ）の変異により白内障、動脈硬化、悪性腫瘍等が早期に発生する疾患である。この疾患の病態解析、予防法開発、治療法開発等においては、モデル動物の開発が重要である。
【０００３】
ところが、マウスにおいてWRN RecQヘリカーゼ遺伝子を変異させても、早期老化症状を示さないことが知られており（非特許文献１〜２）、ヒト以外のモデル動物の作製は困難であると考えられていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 95, pp. 13097-13102, October 1998.
【非特許文献２】Genetics 154: 357-362 (January 2000).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、早期老化症、特にウェルナー症候群のモデル動物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は鋭意研究を進めた結果、驚くべきことに、WRN RecQヘリカーゼ遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下したオナガザル上科動物が、早期老化症モデル動物として有用であることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【０００８】
項１．  WRN RecQヘリカーゼ遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下したオナガザル上科動物である、早期老化症モデル動物。
【０００９】
項２．  前記早期老化症がウェルナー症候群である、項１に記載のモデル動物。
【００１０】
項３．  前記オナガザル上科動物がオナガザル亜科動物である、項１又は２に記載のモデル動物。
【００１１】
項４．  前記オナガザル亜科動物がマカク属動物である、項３に記載のモデル動物。
【００１２】
項５．  前記マカク属動物がカニクイザルである、項４に記載のモデル動物。
【００１３】
項６．  対応する野生型オナガザル上科動物に比べて、C-peptide、GIP、MCP-1、Insulin、PP、活性化Amylin、及びヒアルロン酸からなる群より選択される少なくとも1種の血中濃度が増加している、項１〜５のいずれかに記載のモデル動物。
【００１４】
項７．  WRN RecQヘリカーゼ遺伝子のタンパク質コード領域に変異が導入されている、項１〜６のいずれかに記載のモデル動物。
【００１５】
項８．  前記変異がアミノ酸の欠失、付加、及び挿入からなる群より選択される少なくとも1種を生じさせる変異である、項７に記載のモデル動物。
【００１６】
項９．  前記変異がフレームシフトを生じさせる変異である、項７又は８に記載のモデル動物。
【００１７】
項１０．  前記変異が第8〜13番エクソンにおける変異である、項７〜９のいずれかに記載のモデル動物。
【００１８】
項１１．  野生型エキソヌクレアーゼドメインを含み、且つ野生型ヘリカーゼドメイン、野生型RQCドメイン、及び野生型HRDCドメインを含まない変異型WRN RecQヘリカーゼタンパク質を発現する、項７〜１０のいずれかに記載のモデル動物。
【００１９】
項１２．  項１〜１１のいずれかに記載のモデル動物に発生する、受精卵。
【００２０】
項１３．  オナガザル上科動物の細胞において、WRN RecQヘリカーゼ遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下する変異を導入することを含む、早期老化症モデル動物の作製方法。
【００２１】
項１４．  項１〜１２のいずれかに記載のモデル動物を用いた、早期老化症治療薬候補物質のスクリーニング方法。
【００２２】
項１５．  （a）項１〜１２のいずれかに記載のモデル動物に被検物質を投与する工程、
（b）被検物質が投与された前記モデル動物の、早期老化症の表現型を評価する工程、及び
（c）早期老化症の表現型が治癒又は緩和していた場合に、前記被検物質を早期老化症の治療薬候補物質として選別する工程、
を含む、項１４に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、早期老化症のモデル動物を提供することができる。このモデル動物を用いることにより、早期老化症の病態解析、予防法開発、治療法開発等が可能となる。一例として、このモデル動物を用いることにより、早期老化症治療薬候補物質のスクリーニングを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】WRN RecQヘリカーゼ遺伝子が変異したカニクイザル（WRN）、19〜25歳の野生型カニクイザル（Adult）、及び3歳の野生型カニクイザル（child）について、血中C-peptide濃度を測定した結果を示す。
【図２】WRN RecQヘリカーゼ遺伝子が変異したカニクイザル（WRN）、19〜25歳の野生型カニクイザル（Adult）、及び3歳の野生型カニクイザル（child）について、血中Insulin濃度を測定した結果を示す。
【図３】WRN RecQヘリカーゼ遺伝子が変異したカニクイザル（WRN）、19〜25歳の野生型カニクイザル（Adult）、及び3歳の野生型カニクイザル（child）について、血中GIP濃度を測定した結果を示す。
【図４】WRN RecQヘリカーゼ遺伝子が変異したカニクイザル（WRN）、19〜25歳の野生型カニクイザル（Adult）、及び3歳の野生型カニクイザル（child）について、血中PP濃度を測定した結果を示す。
【図５】WRN RecQヘリカーゼ遺伝子が変異したカニクイザル（WRN）、19〜25歳の野生型カニクイザル（Adult）、及び3歳の野生型カニクイザル（child）について、血中Leptin濃度を測定した結果を示す。
【図６】WRN RecQヘリカーゼ遺伝子が変異したカニクイザル（WRN）、19〜25歳の野生型カニクイザル（Adult）、及び3歳の野生型カニクイザル（child）について、血中活性化Amylin（＝Active Amylin）濃度を測定した結果を示す。
【図７】WRN RecQヘリカーゼ遺伝子が変異したカニクイザル（WRN）、19〜25歳の野生型カニクイザル（Adult）、及び3歳の野生型カニクイザル（child）について、血中MCP-1濃度を測定した結果を示す。
【図８】WRN RecQヘリカーゼ遺伝子が変異したカニクイザル（WRN）、19〜25歳の野生型カニクイザル（Adult）、及び3歳の野生型カニクイザル（child）について、血中ヒアルロン酸濃度を測定した結果を示す。
【図９】WRN RecQヘリカーゼ遺伝子が変異したカニクイザル（WRN）、19〜25歳の野生型カニクイザル（Adult）、及び3歳の野生型カニクイザル（child）について、血中Ghrelin濃度を測定した結果を示す。
【図１０】WRN RecQヘリカーゼ遺伝子が変異したカニクイザル（WRN）、19〜25歳の野生型カニクイザル（Adult）、及び3歳の野生型カニクイザル（child）について、血中GLP-1濃度を測定した結果を示す。
【図１１】WRN RecQヘリカーゼ遺伝子が変異したカニクイザル（WRN）、19〜25歳の野生型カニクイザル（Adult）、及び3歳の野生型カニクイザル（child）について、血中Glucagon濃度を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（1）定義
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００２６】
アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS，Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264−2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high−scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873−7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
【００２７】
本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
【００２８】
（2）モデル動物
本発明は、その一態様として、WRN RecQヘリカーゼ遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下したオナガザル上科動物である、早期老化症モデル動物（本明細書において、「本発明のモデル動物」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
【００２９】
オナガザル上科動物としては、特に制限されず、例えばオナガザル科動物が挙げられ、中でもオナガザル亜科動物が挙げられる。オナガザル亜科動物としては、特に制限されず、例えばヒヒ族（カニクイザル、アカゲザル、ベニガオザル、アッサムモンキー、タイワンザル、ニホンザル、ヘックモンキー、キタブタオザル、ムーアモンキー、アルナーチャルマカク、ミナミブタオザル、クロザル、ゴロンタロマカク、ブーツモンキー、パガイマカク、ボンネットモンキー、シベルトマカク、シシオザル、トクモンキー、バーバリーマカク、チベットモンキー、トンケアンモンキー等のマカク属動物；ドリル、マンドリル等のマンドリル属動物；アヌビスヒヒ、キイロヒヒ、マントヒヒ、キンダヒヒ、ギニアヒヒ、チャクマヒヒ等のヒヒ属動物；キプンジ等のキプンジ属動物；ゲラダヒヒ等のゲラダヒヒ属動物；アジルマンガベイ、スーティーマンガベイ、ゴールデンマンガベイ、タナマンガベイ、シロカンムリマンガベイ、サンジェマンガベイ、シロエリマンガベイ等のシロエリマンガベイ属；ホオジロマンガベイ、クロカンムリマンガベイ等のホオジロマンガベイ属等）、オナガザル族（アレンモンキー等のアレンモンキー属；ロエストモンキー、プロイスモンキー、サンテイルモンキー等のロエストモンキー属；オナガザル属；パタスモンキー等のパタスモンキー属；キタタラポアン、ミナミタラポアン等のタラポアン属等）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはヒヒ族動物が挙げられ、より好ましくはマカク属動物が挙げられ、さらに好ましくはカニクイザル、アカゲザル等が挙げられ、よりさらに好ましくはカニクイザルが挙げられる。
【００３０】
本発明が対象とするWRN RecQヘリカーゼ遺伝子は、ヒトにおけるウェルナー症候群原因遺伝子のオナガザル上科動物におけるホモログであり、その産物（WRN RecQヘリカーゼタンパク質）は、主に、N末端側から順に、エキソヌクレアーゼドメイン（第4〜7番エクソン）、ヘリカーゼドメイン（第14〜21番エクソン）、野生型RQCドメイン（第22〜25番エクソン）、及び野生型HRDCドメイン（第30〜31番エクソン）を含む。
【００３１】
オナガザル上科動物の各種において、WRN RecQヘリカーゼ遺伝子の塩基配列は公知である、或いはヒトWRN RecQヘリカーゼ遺伝子の塩基配列又はWRN RecQヘリカーゼタンパク質のアミノ酸配列に基づいて（例えば、これらとの同一性解析等により）容易に決定することができる。一例として、カニクイザルのWRN RecQヘリカーゼ遺伝子は、NCBIデータベースNC_022279.1、Genbank AB173945.1である。
【００３２】
本発明が対象とするWRN RecQヘリカーゼ遺伝子は、そのヘリカーゼ活性が著しく損なわれない限りにおいて、置換、欠失、付加、挿入等の塩基変異を有していてもよい。変異としては、該mRNAから翻訳されるタンパク質においてアミノ酸置換が生じない変異やアミノ酸の保存的置換が生じる変異が好ましい。また、該塩基変異は、ヘリカーゼ活性に影響を与え得る機能ドメイン（エキソヌクレアーゼドメイン、ヘリカーゼドメイン、野生型RQCドメイン、野生型HRDCドメイン等）コード領域以外の領域に存在することが好ましい。
【００３３】
本発明が対象とするWRN RecQヘリカーゼ遺伝子は、例えば、それによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列が、同種動物の野生型WRN RecQヘリカーゼ遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列と、例えば95％以上、好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の同一性を有する、遺伝子である。また、本発明が対象とするWRN RecQヘリカーゼ遺伝子は、例えば、それによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列が、同種動物の野生型WRN RecQヘリカーゼ遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列と同一であるか又は該アミノ酸配列に対して1もしくは複数個（例えば2〜10、好ましくは2〜5、より好ましくは2〜3個、さらに好ましくは2個）が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列である、遺伝子である。
【００３４】
本発明のモデル動物においては、上記した本発明が対象とするWRN RecQヘリカーゼ遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下している。すなわち、本発明のモデル動物においては、上記した本発明が対象とするWRN RecQヘリカーゼ遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下するように、該WRN RecQヘリカーゼ遺伝子に変異が導入されている。ここで、WRN RecQヘリカーゼ遺伝子の「機能」は、WRN RecQヘリカーゼタンパク質の本来の活性、ヘリカーゼ活性を示す。また、WRN RecQヘリカーゼ遺伝子の「発現」は、WRN RecQヘリカーゼmRNAの発現、及びWRN RecQヘリカーゼタンパク質の発現の両方を包含するが、好ましくはWRN RecQヘリカーゼタンパク質の発現である。「欠損」とは、本発明のモデル動物から得られたサンプルについて、WRN RecQヘリカーゼ遺伝子の活性及び／又は発現量が検出限界以下であることを示す。また、「低下」とは、本発明のモデル動物から得られたサンプルについて、WRN RecQヘリカーゼ遺伝子の活性及び／又は発現量が、変異導入前のWRN RecQヘリカーゼ遺伝子（本発明が対象とするWRN RecQヘリカーゼ遺伝子）の活性及び／又は発現量よりも低い（例えば1／2、1／5、1／10、1／20、1／50、1／100、1／200、1／500、1／1000、1／2000、1／5000、1／10000以下である）ことを示す。なお、WRN RecQヘリカーゼ遺伝子の活性及び／又は発現量は、公知の方法に従って測定することが可能である。
【００３５】
WRN RecQヘリカーゼ遺伝子に導入される変異としては、WRN RecQヘリカーゼ遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下する変異である限り特に制限されるものではない。ヒトウェルナー症候群患者については、WRN RecQヘリカーゼタンパク質の種々の領域における変異例が報告されており、変異部位及び変異の種類は特に制限されないと考えられる。当該変異としては、例えばタンパク質コード領域における変異、スプライシング調節領域における変異、発現制御領域（例えば、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー等）における変異等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはタンパク質コード領域における変異が挙げられる。また、当該変異は、好ましくはアミノ酸の欠失、付加、及び挿入からなる群より選択される少なくとも1種を生じさせる変異であり、より好ましくはフレームシフトを生じさせる変異である。当該変異のより具体的な部位としては、より効率的に本発明のモデル動物を得ることができるという観点から、第8〜13番エクソンであることが好ましく、第8〜10番エクソンであることがより好ましく、第9番エクソンであることがさらに好ましい。同様の観点から、本発明のモデル動物は、当該変異導入により、野生型エキソヌクレアーゼドメインを含み、且つ野生型ヘリカーゼドメイン、野生型RQCドメイン、及び野生型HRDCドメインを含まない変異型WRN RecQヘリカーゼタンパク質を発現することが好ましい。また、本発明のモデル動物においては、当該変異を、対の染色体の両方において有することが好ましい。
【００３６】
本発明のモデル動物は、早期老化症（好ましくはウェルナー症候群）の表現型の少なくとも1種を有する。該表現型としては、例えばC-peptide、GIP、MCP-1、Insulin、PP、活性化Amylin、ヒアルロン酸等の血中濃度の増加が挙げられる。この観点から、本発明のモデル動物は、好ましくは、対応する野生型オナガザル上科動物に比べて、C-peptide、GIP、MCP-1、Insulin、PP、活性化Amylin、及びヒアルロン酸からなる群より選択される少なくとも1種（好ましくは2種以上、より好ましくは3種以上、さらに好ましくは4種以上、よりさらに好ましくは5種以上、よりさらに好ましくは6種以上、特に好ましくは7種全て）の血中濃度が増加している。ここで、「対応する野生型オナガザル上科動物」とは、比較対象である本発明のモデル動物と同種の動物であることを示す。また、増加の程度は、特に制限されないが、例えば、1.2倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍である。
【００３７】
（3）モデル動物の作製方法
本発明のモデル動物の作製方法は、特に制限されず、公知の遺伝子変異動物作製技術を各種利用することができる。一例として、以下の方法が挙げられる。
【００３８】
本発明は、その一態様において、オナガザル上科動物の細胞において、WRN RecQヘリカーゼ遺伝子の機能及び／又は発現が欠損又は低下する変異を導入することを含む、早期老化症モデル動物の作製方法（本明細書において、「本発明の製造方法」と示すこともある。）に関する。
【００３９】
変異導入対象の細胞は、特に制限されないが、早期老化症モデル動物作製の効率の観点から、受精卵であることが好ましい。
【００４０】
変異の導入方法は、特に制限されないが、早期老化症モデル動物作製の効率の観点から、標的特異的ヌクレアーゼ、該ヌクレアーゼの発現カセット、及び該ヌクレアーゼのmRNAからなる群より選択される少なくとも1種を含む導入物を細胞に導入する方法が挙げられる。
【００４１】
標的特異的ヌクレアーゼは、ゲノムDNA上の特定部位を特異的に切断して、変異を誘導できるヌクレアーゼである限り特に制限されない。標的特異的ヌクレアーゼとしては、例えばCasタンパク質、TALENタンパク質、ZFNタンパク質などが挙げられる。
【００４２】
Casタンパク質を用いるCRISPR/Casシステムは、ヌクレアーゼ（RGN；RNA-guided nuclease）であるCasタンパク質とガイドRNAを使用する。該システムを細胞内に導入することにより、ガイドRNAが標的部位に結合し、該結合部位に呼び込まれたCasタンパク質によってDNAを切断することができる。
【００４３】
TALENタンパク質を用いるTALENシステムは、DNA切断ドメイン（例えばFokIドメイン）に加えて転写活性化因子様（TAL）エフェクターのDNA結合ドメインを含む人工ヌクレアーゼ（TALEN）を使用する。該システムを細胞内に導入することにより、TALENがDNA結合ドメインを介して標的部位に結合し、そこでDNAを切断する。標的部位に結合するDNA結合ドメインは、公知のスキーム（例えばZhang F et al. (2011) Nature Biotechnology 29 (2)；この論文は、本明細書に参考として援用される）に従って設計することができる。
【００４４】
ZFNタンパク質を用いるZFNシステムは、ジンクフィンガーアレイを含むDNA結合ドメインにコンジュゲートした核酸切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼ（ZFN）を使用する。該システムを細胞内に導入することにより、ZFNがDNA結合ドメインを介して標的部位に結合し、そこでDNAを切断する。標的部位に結合するDNA結合ドメインは、公知のスキームに従って設計することができる。
【００４５】
標的特異的ヌクレアーゼの中でも、切断部位をより自由に決定できるという観点から、Casタンパク質が好ましい。Casタンパク質としては好ましくはCas9タンパク質が挙げられる。
【００４６】
標的特異的ヌクレアーゼ発現カセットは、本発明の製造方法の対象物の細胞内で標的特異的ヌクレアーゼを発現可能なDNAである限り特に制限されない。標的特異的ヌクレアーゼ発現カセットの典型例としては、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置された標的特異的ヌクレアーゼコード配列を含むDNAが挙げられる。また、標的特異的ヌクレアーゼ発現カセットは、これのみで、或いは他の配列（例えば薬剤耐性遺伝子、複製起点等）と共にベクターを構成していてもよい。ベクターの種類は、特に制限されない。
【００４７】
標的特異的ヌクレアーゼがCasタンパク質である場合、本発明の製造方法における導入物は、さらに、ガイドRNA発現カセット及びガイドRNAからなる群より選択される少なくとも1種を含む。
【００４８】
ガイドRNAは、CRISPR/Casシステムにおいて用いられるものであれば特に制限されず、例えばゲノムDNAの標的部位に結合し、且つCasタンパク質と結合することにより、Casタンパク質をゲノムDNAの標的部位に誘導可能なものを各種使用することができる。
【００４９】
ガイドRNAとしては、効率的に変異を導入できるという観点から、好ましくはcrRNA配列中の標的配列に結合する配列として、配列番号12：AGATGTACTTGGAAATAAAG TGGで示される配列を含むガイドRNA（WRN RecQヘリカーゼ遺伝子の第9エクソンを標的とするガイドRNA）、配列番号13：ATGGCAAATTGGTAGAAGCT AGGで示される配列を含むガイドRNA（WRN RecQヘリカーゼ遺伝子の第30エクソンを標的とするガイドRNA）、これらの配列に対して1又は複数個（例えば2〜4個、好ましくは2〜3個、より好ましくは2個）の塩基が変異（例えば置換、欠失、挿入、削除等）してなる配列等が挙げられる。なお、ガイドRNAの標的部位への結合には、crRNA配列の内、標的配列に結合する配列の3’ 側の12塩基が重要であるといわれている。このため、crRNA配列の内、標的配列に結合する配列が、標的鎖と完全同一ではない場合、標的鎖と異なる塩基は、crRNA配列の内、標的配列に結合する配列の3’ 側の12塩基以外に存在することが好ましい。
【００５０】
導入物の細胞への導入方法は、特に制限されず、公知の方法、例えばマイクロインジェクション法、レンチウイルス法、レトロウィルス法等を採用することができる。
【００５１】
変異が導入された細胞は、必要に応じて胚へと発生させ、仮親に移植して、産仔を得ることにより、早期老化症モデル動物を得ることができる。
【００５２】
上記本発明の製造方法の過程で得られた受精卵は、本発明のモデル動物に発生し得る受精卵であり、このような受精卵も本発明の一態様である。また、本発明のモデル動物の精子及び／又は卵子を受精させて得られる受精卵も、本発明のモデル動物に発生し得る受精卵であり、このような受精卵も本発明の一態様である。これらの受精卵としては、凍結保存状態から生体に発生させることができる限り特に限定されず、受精直後の卵、前核期胚、初期胚、又は胚盤胞等が挙げられる。
【００５３】
上記説明以外の事項については、「（2）モデル動物」における説明と同様である。
【００５４】
（4）モデル動物の用途
本発明のモデル動物は、早期老化症（特にウェルナー症候群）の病態解析、予防法開発、治療法開発等に利用することができる。また、早期老化症（特にウェルナー症候群）の症状（例えば、動脈硬化、耐糖能低下、白内障、性腺機能低下、低身長、低体重、骨粗鬆症、骨変形、声帯萎縮、皮膚萎縮、皮膚硬化、皮膚潰瘍、白髪、禿げ、髄膜腫、線維肉腫、甲状腺腫瘍等）の病態解析、予防法開発、治療法開発等にも利用することができる。
【００５５】
本発明は、その一態様において、本発明のモデル動物を用いた、早期老化症治療薬候補物質のスクリーニング方法に関する。
【００５６】
スクリーニング方法は、本発明のモデル動物を用いている限り特に限定されないが、例えば工程（a）〜（c）：（a）本発明のモデル動物に被検物質を投与する工程、（b）被検物質が投与された前記モデル動物の、早期老化症の表現型を評価する工程、及び（c）早期老化症の表現型が治癒又は緩和していた場合に、前記被検物質を早期老化症の治療薬候補物質として選別する工程により行われる。
【００５７】
被検物質の種類は治療薬の候補になり得る限り特に限定されない。例えば、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物（ヌクレオチド、アミン、糖質、脂質等）、有機低分子化合物、無機低分子化合物、醗酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。
【００５８】
投与は、公知の方法に従って行うことができる。例えば経口投与、経管栄養、注腸投与等の経腸投与；  経静脈投与、経動脈投与、筋肉内投与、心臓内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与等の非経口投与等が挙げられる。
【００５９】
早期老化症の表現型の評価は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、C-peptide、GIP、MCP-1、Insulin、PP、活性化Amylin、ヒアルロン酸等の血中濃度を指標として評価することができる。より具体的には、これらの指標が、被検物質の投与により減少した場合、早期老化症の表現型が治癒又は緩和していると判定することができる。
【００６０】
選別された被検物質を治療候補物質として、さらなる解析を進めることにより、有用な治療薬を選別することができる。
【００６１】
上記説明以外の事項については、「（2）モデル動物」における説明と同様である。
【実施例】
【００６２】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００６３】
1．精液、卵細胞の採取
精液の採取は、以前に報告されている電気刺激法により行われた（Theriogenology 72, 33-38, 2011）。
【００６４】
卵細胞の採取は以前に報告されている方法により、以下のように行われた（Theriogenology 72, 33-38, 2011）。カニクイザルのメスの皮下にゴナドトロピン放出ホルモン拮抗剤（0.9 mg、Leuplin、武田薬品工業）を注射した。2週間後、ヒト卵胞刺激ホルモン（15 IU/kg、あすか製薬）を10日間持続投与するためのマイクロインフュージョンポンプ（iPRECIO SMP-200、Alzet Osmotic Pumps Co.）を皮下に埋め込む手術を行なった。10日後、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG、400 IU/kg、日本全薬工業）を筋肉内に注射した。hCG投与から40時間後に腹腔鏡（町田製作所）を用いて、カニクイザルの卵巣から卵胞液を吸引、回収した。採取した卵胞液を培養溶液（α-MEM（MP Biomedicals）、10%血清代替添加物（Irvine Scientific））の入ったシャーレ内に移し、1ないし2時間、38℃、5%炭酸ガスの条件で培養した。ヒアルロニダーゼ（0.5 mg/mL、Sigma Chemical）、m-TALP、Tyrode液、乳酸、ピルビン酸、ウシ血清アルブミン、HEPESを混合した溶液内で、ピペッティングにより卵細胞を分離した。分離した卵細胞はm-TALP溶液の入ったシャーレに移動させた。
【００６５】
2．細胞質内顕微授精
有糸分裂中期の卵細胞を顕微鏡下に選択し、HEPES添加m-TALP溶液内で培養した。ガラス針（Humagen Fertility Diagnostics）に採取した精子を吸引した。マイクロマニュピレーターを用いて、卵細胞の細胞質内に精子を注入した。受精卵は培養溶液（CMRL medium-1066（Invitrogen）、20%ウシ血清）中で、38℃、5%炭酸ガス、5%酸素の条件下で培養した。
【００６６】
3．CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集用ベクターの作製
カニクイザルWRN RecQ型DNAヘリカーゼ遺伝子（NCBIデータベースNC_022279.1、Genbank AB173945.1など）のエクソン9の塩基配列を元にオリゴDNA1（配列番号1：caccGAGATGTACTTGGAAATAAAG）とオリゴDNA2（配列番号2：aaacCTTTATTTCCAAGTACATCTC）、エクソン30の塩基配列を元にオリゴDNA3（配列番号3：caccGATGGCAAATTGGTAGAAGCT）とオリゴDNA4（配列番号4：aaacAGCTTCTACCAATTTGCCATC）の合成を株式会社ファスマックに依頼した。これらのオリゴDNA（25μM）5 μLずつ、10×annealing buffer 2 μL（100 mM Tris-HCl pH8.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 1 M NaCl）、精製蒸留水8 μLを混合した。混合液を95℃に4分間加熱ののち、室温に10分間静置し、オリゴアダプターを作製した。このオリゴアダプター2 μLとTE溶液198 μLを混合、希釈した。このオリゴアダプター希釈液9 μL、制限酵素Bbs Iを用いて切断処理を行ったpX330プラスミドベクター（Scientific Reports 3: 3355, 2013） 1 μL、Might Mix液（タカラバイオ）10μLを混合し、16℃に一晩静置した。この反応液を大腸菌DH5α（東洋紡）と混合し、通常の熱ショック法により形質転換を行った。アンピシリンを含むLB寒天培地に形質転換後のDH5αを塗布し、37℃で一晩培養した。通常の方法で、大腸菌コロニーを回収、2 mLのLB液体培地内で培養、プラスミドDNAを抽出後、プライマーA（配列番号5：tggactatcatatgcttaccg）を用いて挿入された塩基配列を確認した（ファスマック）。
【００６７】
4．受精卵注入用RNAの作製
Nature Protocols 9: 1956-1968, 2014において報告されている方法を参照し、受精卵に注入するためのRNAの作製を以下の5から9のように行った。
【００６８】
5．ガイドRNA作製用のPCR
RecQ型DNAヘリカーゼ遺伝子のエクソン9またはエクソン30の一部が挿入されたpX330プラスミドベクターを元に、エクソン9はプライマーB1（配列番号6：ttaatacgactcactataggAGATGTACTTGGAAATAAAG）とプライマーB2（配列番号7：AAAAGCACCGACTCGGTGCC）、エクソン30はプライマーC1（配列番号8：ttaatacgactcactataggGAGAGATGGCAAATTGGTAGAAGCT）とプライマーC2（配列番号9：AAAAGCACCGACTCGGTGCC）（Nature Protocols 9: 1956-1968, 2014）、KOD plus neo（東洋紡）1 μL、添付10×バッファー  5 μL、2 mM dNTP 5μL、25 mM MgSO4 3 μL、上記プライマー（10 mM） 1.5 μLずつ、エクソン9またはエクソン30の一部の配列をクローニングしたpX330プラスミド50 ng/1 μLを混合し、PCR反応を行った。94℃2分間の反応ののち、98℃10秒、68℃30秒を35サイクル、68℃7分間の反応を行った。RNaseを除去するために、上記PCR反応液39μL、10% SDS 2.5 μL、プロテイナーゼK（ナカライ）（10 mg/mL） 1 μL、蒸留水7.5 μLを混合し、50℃で30分静置した。その後、この反応液にTE液を50 μL加えた後、通常のフェノール・クロロホルム処理後、エタノール中で遠心沈殿させた。乾燥後、ヌクレアーゼフリー水を10 μL加え溶解した。
【００６９】
6．ガイドRNAの転写
MEGAshortscript T7 Transcription Kit（Life Technologies）を用いて、エクソン9とエクソン30 のガイドRNAを作製した。すなわち、T7 10×reaction buffer 2 μL、T7 ATP solution（75 mM） 2 μL、T7 CTP solution（75 mM） 2 μL、T7 GTP solution（75 mM） 2 μL、T7 UTP solution（75 mM） 2 μL、上記PCR精製物8 μL、T7 enzyme mix 2 μLを混合し、37℃で4時間静置した。TURBO DNase（Invitrogen）を1 μL添加し、37℃に15分静置した。
【００７０】
7．Cas9 mRNA作製用のPCR
蒸留水28 μL、10×buffer 5 μL、2 mM dNTP 5μL、25 mM MgSO4 3 μL、プライマー2種それぞれ 1.5 μL（プライマーD1（配列番号10：ttaatacgactcactatagGGAGAATGGACTATAAGGACCACGAC）及びプライマーD2（配列番号11：GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC））、pX330-WRN9またはpX330-WRN30 5 μL（50 ng）、KOD plus Neo 1 μLを混合し、PCR を行なった（94℃ 2分の後、98℃ 10秒、60℃ 30秒、68℃ 4分を35サイクル、68℃ 7分、15℃維持）。このPCR反応液 39 μLに10%SDS 2.5 μL、プロテイナーゼK（ナカライ）1 μLを混合し、50℃で30分間静置した。この反応液に蒸留水を50 μL加えた後、通常のフェノール・クロロホルム処理後、エタノール中で遠心沈殿させた。乾燥後、ヌクレアーゼフリー水を10 μL加え溶解した。
【００７１】
8．Cas9 mRNAの作製
mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA transcription kit（Life Technologies） を用いて、Cas9のmRNAを作製した。すなわち、T7 2×NTP/ARCA 10 μL、10×T7 reaction buffer 2 μL、T7 enzyme mix 2 μL、上記Cas9を増幅したPCR精製物 6 μLを混合した。37℃に2時間静置した。TURBO DNase（Invitrogen）を1 μL添加し、37℃に15分静置した。この反応液に蒸留水36 μL、5×E-PAP buffer 20 μL、25 mM MnCl2 10 μL、ATP solution 10 μL、E-PAP 4 μLを添加し、37℃に45分静置した。
【００７２】
9．ガイドRNAとCas9 mRNAの精製
MEGAclear transcription clean-up kit（Life Technologies）を用いて、上記ガイドRNA及びCas9 mRNA反応液よりRNAを精製した。濃度を測定し、500 ng/μLになる様にDEPC処理水で希釈し、5 μLずつマイクロチューブに分注した。-80℃冷凍庫にて保存した。
【００７３】
10．ガイドRNAとCas9 mRNAの顕微導入
最終濃度が、ガイドRNA 50 ng/μL とT7-Cas9 mRNA 200 ng/μLとなるように混合し、授精6時間後の卵細胞質内にガラス針を用いて注入した。
【００７４】
11．胚移植
仮親への発生胚の移植は以前に報告されている方法により、以下のように行われた（Scientific Reports 6: 24868, 2016）。カニクイザルの最終月経から10ないし14日後に、腹腔鏡を用いて、卵巣上の排卵を確認した。排卵の確認から1ないし6日後に腹腔鏡を用いて卵管を確認し、卵管内に発生胚を移植した。
【００７５】
12．出産結果
エクソン30に対するガイドRNAを使用した場合、胚移植14例の内、妊娠2例、出産1例であった。一方、エクソン9に対するガイドRNAを使用した場合、胚移植39例の内、妊娠13例、出産11例、出生後死亡1例であった。
【００７６】
このように、C末端側のエクソン（エクソン30）を変異させた場合は妊娠例及び出産例の割合が極端に低い（＝早期流産率が極端に高い）のに対して、N末端側のエクソン（エクソン9）を変異させた場合（野生型エキソヌクレアーゼドメイン（エクソン4〜7）を含み、且つ野生型ヘリカーゼドメイン（エクソン14〜21）、野生型RQCドメイン（エクソン22〜25）、及び野生型HRDCドメイン（エクソン30〜31）を含まない変異型WRN RecQヘリカーゼタンパク質を発現すると予想される。）は妊娠例及び出産例の割合が顕著に高い（＝早期流産率が顕著に低い）ことが分かった。
【００７７】
出産後、胎盤組織等を回収し、ゲノムDNAを増幅し、PCRにより標的部位周辺を増幅し、塩基配列を調べた。一部の例について、検出された変異を以下に示す。
【００７８】
＜エクソン30を標的とした場合＞
例1：8塩基欠失、1塩基挿入。
【００７９】
＜エクソン9を標的とした場合＞
例2：1塩基挿入、10塩基欠失、273塩基欠失＋24塩基挿入
例3：14塩基欠失、27塩基挿入＋5塩基欠失、11塩基欠失、10塩基欠失、9塩基挿入＋311塩基欠失
例4：4塩基欠失、3塩基欠失、3塩基欠失＋1塩基置換、5塩基欠失＋27塩基挿入、10塩基欠失、9塩基挿入＋311塩基欠失 
例5：10塩基欠失
例6：1塩基欠失、3塩基置換＋17塩基挿入、11塩基欠失、2塩基置換＋17塩基挿入
例7：2塩基置換＋2塩基挿入、10塩基欠失
例8：10塩基欠失、2塩基置換＋12塩基挿入、21塩基欠失＋1塩基挿入、1塩基欠失
例9：10塩基欠失
例10：10塩基欠失。
【００８０】
13．サイトカイン、ホルモン、及び血糖測定
出産例について、生後9ヶ月時点で、血液中のサイトカイン及びホルモン濃度をNon-human primate metabolic magnetic bead panel（NHPMHMAG-45K, Millipore Corporation）と測定装置Luminex200（Millipore社）を用いて測定した。また、血液中のヒアルロン酸を、Hyaluronan quantification kit（HA-96KIT、コスモ・バイオ株式会社）とプレートリーダー（TECAN社 sunrise F039300）を用いて測定した。コントロールとして、19〜25歳の野生型カニクイザル、及び3歳の野生型カニクイザルについても、同様の測定を行った。血糖値はAccu-Chek Active (Roche)を用いて測定した。
【００８１】
測定対象は以下の通りである。
C-peptide：プロインスリンとして合成されたタンパク質が分解され、C-peptideとインスリンになる。
Insulin：Werner症候群において、血中で上昇する。2型糖尿病の初期に上昇する。
GIP（Gastric inhibitory polypeptide）：肥満を促進する。
PP（pancreatic polypeptide）：食後、ブドウ糖負荷により上昇する。
Leptin：肥満を抑制するホルモン。
活性化Amylin：食欲抑制ホルモン。糖尿病では膵臓β細胞が減少すると低下する。Amylinとして生合成された後、部分分解されて本来の活性を持つに至ったAmylin（＝活性化Amylin）である。
MCP-1（Monocyte Chemoattractant Protein-1）：老化に伴い上昇するケモカイン。
ヒアルロン酸：Werner症候群において、尿中および血中で上昇する。
Ghrelin：食欲を増進させるホルモン。
GLP-1（Glucagon-like peptide-1）：インスリンの分泌を促進、グルカゴンの分泌を抑制する。食欲を抑制する。
Glucagon：血中ブドウ糖を増加させる。
【００８２】
結果を図１〜１１に示す。出産例は、野生型カニクイザルに比べて、C-peptide、GIP、MCP-1、Insulin、PP、活性化Amylin、及びヒアルロン酸の血中濃度が増加していた。また、その他にも各種傾向が読み取れた。
【００８３】
また、出産例の内の5頭の血糖値の平均は77.4 mg/dLであった。「医科学研究資源としてのカニクイザル」(Springer Japan)のｐ58によると1歳の正常サルの平均はメス47 mg/dL、オス50 mg/dLであるところ、上記平均値はこれらよりも高いものであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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