(57)【要約】      （修正有）【課題】既存の層分離培養法を改善した効果的な細胞増殖率の増加をもたらす幹細胞の層分離培養および増殖方法の提供。【解決手段】1）個体から分離された骨髄を培養するステップ。2）前記1）の上層液だけを新たな容器に移動させて培養するステップ。3）前記2）の上層液だけを分離して培養した後上層液を新たな培養容器に移動させて繰り返し培養するステップを含むモノクローナル幹細胞の層分離培養および増殖方法。【選択図】図２５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）個体から分離された骨髄を培養するステップ；
２）前記１）ステップの上層液だけを新たな容器に移動させて培養するステップ；
３）前記２）ステップの上層液だけを分離して培養容器で３７℃で１時間〜３時間培養後、３７℃で１２〜３６時間培養を２〜３回繰り返し、次いで３７℃で２４〜７２時間で培養し、毎回上層液を新たな培養容器に移動させて繰り返し培養するステップ；
４）最終培養容器でモノクローナル幹細胞を得るステップ；および
５）モノクローナル幹細胞を５０〜１０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で培地に接種して培養するステップ；
を含む、幹細胞の層分離培養および増殖方法。
【請求項２】
前記５）ステップの培養が、１継代〜５継代培養であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記５）ステップの培養が、１０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で培地に接種して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記５）ステップの培地が、抗酸化剤が加えられた培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗酸化剤が１０〜３０μｇ／ｍｌ加えられた、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記５）ステップの培地が、ＤＭＥＭまたはα−ＭＥＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記５）ステップの培養が、１継代培養時に５０〜１０００細胞／ｃｍ２の細胞密度でモノクローナル幹細胞を培地に接種して培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記５）ステップの培養が、２継代〜５継代培養時に７００〜１０００細胞／ｃｍ２の細胞密度でモノクローナル幹細胞を培地に接種して培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記５）ステップの培地が、ゲンタマイシンが加えられた培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法を通して得られた幹細胞が、５〜１０継代の幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法を通して得られた幹細胞が、骨細胞分化能を有する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞の層分離培養およびそれを通して得られるモノクローナル幹細胞の増殖方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、我々の体の２１０個余りの全ての器官の組織に成長できる潜在的能力を有しており、無限に分裂でき、適切な操作を通して所望の臓器に分化できる。このような幹細胞の特性のため、幹細胞は新たな治療剤として脚光を浴びており、幹細胞を用いた難病の治療可能性は非常に高く、白血病、骨粗鬆症、肝炎、パーキンソン病、老人性認知症、やけど等、数多くの疾病治療が可能であるものと期待されている。
【０００３】
しかし、幹細胞の場合、それを大量に得ることが難しいという点で依然として多くの制約事項がある。幹細胞を得るための方法として、冷凍胚芽細胞から得る方法が効率的であるといえるが、倫理的な面で未だ多くの論争がある。このような問題点を解消するために、体細胞核移植方法や成体幹細胞を利用して幹細胞を得るための方法もまた多くの研究が進められている。胚芽幹細胞に関する研究より盛んに行われる分野は、成体幹細胞の研究である。成体幹細胞は、中枢神経系や骨髄等、各種の臓器に残って成長期の臓器発達と損傷時の再生に関与する細胞であって各種の臓器に存在するため、骨髄、脾臓、脂肪細胞等を含む様々な部位から得ることができるが、骨髄から得る方法が最もよく施行される。しかし、多くの様々な種類の骨髄細胞の中で中間葉幹細胞を分離、培養するにあたって常に均一な形態の細胞を得るには困難があり、このような問題点を補完するための研究が行われている。
【０００４】
分離初期に単核細胞だけをＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅという方法を用いて分離して細胞を培養容器に付着させる方法であるＦｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ等が用いた分離方法が未だ多く用いられているが、このような方法を用いる場合、細胞の特性が一定でなく、中間葉幹細胞とその他の単核細胞が共に存在し得、単一性細胞群を作ることが難しい。従って、より同一の細胞を得るための様々な方法が考案されているが、培養容器底面に付いて育つ全ての細胞を分離するLuria et al.の方法は、中間葉幹細胞でない他の幹細胞が混ざって分離されることがあるという短所があり（Luria et al., Transfusion, 11:345-349, 1971）、Simmons et al.の方法は、中間葉幹細胞の細胞表面抗原のうちＳｃａ−１、ＳＴＲＯ−１に対する特異抗体を使用した抗体を用いた方法であるため、多くのコストがかかり、汚染の問題が常に存在する（Simmons et al., Blood, 78:55-62, 2002）。Hung et al.の方法は、細胞の大きさの差を用いた中間葉幹細胞分離方法であり、これもまた中間葉幹細胞の純度が一定でなく、他の幹細胞が混ざることがあるという短所がある（Hung et al., Stem Cells, 20:249-258, 2002）。
【０００５】
上述のような問題点を解決するために、本発明者は、新たに層分離培養法と命名された幹細胞の分離方法を発明しており、大韓民国特許出願ＫＲ１０−２００６−００７５６７６号を通して特許出願し、その登録を受けた。前記層分離培養法は、他の方法に比べて少ないコストで行うことができるだけでなく、汚染の問題がなく、他の幹細胞が混ざる恐れなしにモノクローナル中間葉幹細胞（ＭＳＣ）を効果的に得ることができるという点において他の幹細胞取得方法に比べて卓越した優秀性を有している。
【０００６】
本発明者により考案された新規な層分離培養法（subfractionation culturing method、ＳＣＭ）は、単一細胞由来のモノクローナルＭＳＣｓをマウスおよびヒト細胞から得ることができるようにし、遠心分離または酵素分解が不要である。前記層分離培養法の原理は、細胞密度および培養プレート付着を基盤にＭＳＣｓを分離することにある。
【０００７】
しかし、前記方法の優秀性にもかかわらず、層分離培養法は、モノクローナルＭＳＣを大量生産して最終産物に使用するためには、ワーキングセルバンクを製造し、それを通して最終産物を得る工程を経てはじめて十分な量のモノクローナル中間葉幹細胞を得ることができ、約１０〜１２継代の培養が必要であるという点で速いモノクローナル中間葉幹細胞の集団的に得ることが難しい限界点があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記のような層分離培養法の改善を通してモノクローナル幹細胞の速い増殖を誘導するための研究をしていた中で、本発明者らは、モノクローナル幹細胞の培養細胞密度を低く調節し、抗酸化剤を添加して培養する場合、効果的な細胞増殖率の増加を誘導できることを確認し、本発明を完成した。
【０００９】
従って、本発明の目的は、既存の層分離培養法を改善した幹細胞の層分離培養および増殖方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、１）個体から分離された骨髄を培養するステップ；２）前記１）ステップの上層液だけを新たな容器に移動させて培養するステップ；３）前記２）ステップの上層液だけを分離して培養容器で３７℃で１時間〜３時間培養後、３７℃で１２〜３６時間培養を２〜３回繰り返し、次いで３７℃で２４〜７２時間で培養し、毎回上層液を新たな培養容器に移動させて繰り返し培養するステップ；４）最終培養容器でモノクローナル幹細胞を得るステップ；および、５）モノクローナル幹細胞を５０〜１０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で培地に接種して培養するステップ；を含む幹細胞の層分離培養および増殖方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の幹細胞の層分離培養および増殖方法によれば、モノクローナル幹細胞を速く汚染なしに得ることができる層分離培養法の長所に加えて、モノクローナル幹細胞の速い増殖を通して短時間で所望のモノクローナル幹細胞を大量に得ることが可能であるので、幹細胞治療剤の製造に有用に用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒト骨髄からの中間葉幹細胞を分離する層分離培養法を示した図である。
【図２】細胞培養密度および細胞培養継代による中間葉幹細胞の形態学的変化を、顕微鏡観察を通して確認した結果を示した図である。
【図３Ａ】細胞培養密度および細胞培養継代による中間葉幹細胞の細胞の大きさおよび粒度（granularity）の変化を、ＦＡＣＳ分析を通してＦＳＣの平均値で確認した結果を示した図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図３Ｂ】細胞培養密度および細胞培養継代による中間葉幹細胞の細胞の大きさおよび粒度（granularity）の変化を、ＦＡＣＳ分析を通してＳＳＣの平均値で確認した結果を示した図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図４】細胞培養密度および細胞培養継代を異にした中間葉幹細胞をβ−ｇａｌ−染色法を通して染色した後、細胞が老化したか否かを確認した結果を示した図である。
【図５】１５継代の中間葉幹細胞を、細胞培養密度を異にして培養した後、老化関連遺伝子であるＰ１５、Ｐ１６および増殖マーカーであるＰＣＮＡをＲＴ−ＰＣＲで確認した結果を示した図である。
【図６】細胞培養密度および細胞培養継代による中間葉幹細胞の増殖能をＰＤＴ（集団倍加時間）およびＰＤＬ（集団倍加数）を通して確認した結果を示した図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図７】細胞培養密度および細胞培養継代による中間葉幹細胞の分化能を確認した結果を示した図であって（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）、図７のＡは、細胞培養および細胞培養継代による中間葉幹細胞の脂肪細胞への分化能を、オイルレッドＯ組織学的染色を通して確認した図、図７のＢは、Ａの組織学的染色程度を定量化して示した図、図７のＣは、細胞培養および細胞培養継代による中間葉幹細胞の骨化細胞への分化能をアリザリンレッドＳ組織学的染色を通して確認した結果、図７のＤは、Ｃの組織学的染色程度を定量化して示した図である。
【図８Ａ】細胞培養密度および細胞培養継代によって中間葉幹細胞で生産される総ＲＯＳ生産を示した図である。
【図８Ｂ】細胞培養密度および細胞培養継代による総ＲＯＳ生産によるＤＮＡ損傷を、ｃｏｍｅｔアッセイを通して確認した結果を示した図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図９】細胞培養密度および細胞培養継代によって生産されるＲＯＳによるＤＮＡ損傷程度を確認するために８−ＯＨｄＧ（８−ヒドロキシ−デオキシグアノシン）の濃度を測定した結果を示した図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図１０】継代１１〜１５の中間葉幹細胞を高密度条件単独（ＨＤ）または高密度条件＋アスコルビン酸追加（ＨＤ＋ＡＡ）を通して培養した後、細胞増殖能の変化を確認した結果を示した図である。
【図１１】継代１５の中間葉幹細胞を高密度条件単独（ＨＤ）または高密度条件＋アスコルビン酸追加（ＨＤ＋ＡＡ）で培養した後、生産されるＲＯＳ水準を比較した結果を示した図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図１２】層分離培養法改良のための実験方法を模式化して示した図である。
【図１３】層分離培養法を通して得られたＳＣＭ０１モノクローナル中間葉幹細胞を１０００または４０００細胞／ｃｍ２の密度で接種し、抗酸化剤添加有無を異にしたＬＧ−ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ培養培地を利用して培養した細胞の増殖率を確認した結果を示した図であって、図のＡは、各実験群の１継代（Ｐ１）〜５継代（Ｐ５）による細胞数の変化を、図のＢは、各実験群のＰＤＴおよびＰＤＬ結果を示した図である。
【図１４】層分離培養法を通して得られたＳＣＭ０２モノクローナル中間葉幹細胞を１０００または４０００細胞／ｃｍ２の密度で接種し、抗酸化剤添加有無を異にしたＬＧ−ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ培養培地を利用して培養した細胞の増殖率を確認した結果を示した図であって、図のＡは、各実験群の１継代（Ｐ１）〜５継代（Ｐ５）による細胞数の変化を、図のＢは、各実験群のＰＤＴおよびＰＤＬ結果を示した図である。
【図１５】層分離培養法を通して得られたＳＣＭ０３モノクローナル中間葉幹細胞を１０００または４０００細胞／ｃｍ２の密度で接種し、抗酸化剤添加有無を異にしたＬＧ−ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ培養培地を利用して培養した細胞の増殖率を確認した結果を示した図であって、図のＡは、各実験群の１継代（Ｐ１）〜５継代（Ｐ５）による細胞数の変化を、図のＢは、各実験群のＰＤＴおよびＰＤＬ結果を示した図である。
【図１６】層分離培養法を通して得られたＳＣＭ０４モノクローナル中間葉幹細胞を１０００または４０００細胞／ｃｍ２の密度で接種し、抗酸化剤添加有無を異にしたＬＧ−ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ培養培地を利用して培養した細胞の増殖率を確認した結果を示した図であって、図のＡは、各実験群の１継代（Ｐ１）〜５継代（Ｐ５）による細胞数の変化を、図のＢは、各実験群のＰＤＴおよびＰＤＬ結果を示した図である。
【図１７】層分離培養法を通して得られたＳＣＭ０５モノクローナル中間葉幹細胞を１０００または４０００細胞／ｃｍ２の密度で接種し、抗酸化剤添加有無を異にしたＬＧ−ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ培養培地を利用して培養した細胞の増殖率を確認した結果を示した図であって、図のＡは、各実験群の１継代（Ｐ１）〜５継代（Ｐ５）による細胞数の変化を、図のＢは、各実験群のＰＤＴおよびＰＤＬ結果を示した図である。
【図１８】層分離培養法を通して得られたＳＣＭ０６モノクローナル中間葉幹細胞を１０００または４０００細胞／ｃｍ２の密度で接種し、抗酸化剤添加有無を異にしたＬＧ−ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ培養培地を利用して培養した細胞の増殖率を確認した結果を示した図であって、図のＡは、各実験群の１継代（Ｐ１）〜５継代（Ｐ５）による細胞数の変化を、図のＢは、各実験群のＰＤＴおよびＰＤＬ結果を示した図である。
【図１９】層分離培養法を通して得られたＳＣＭ０７モノクローナル中間葉幹細胞を１０００または４０００細胞／ｃｍ２の密度で接種し、抗酸化剤添加有無を異にしたＬＧ−ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ培養培地を利用して培養した細胞の増殖率を確認した結果を示した図であって、図のＡは、各実験群の１継代（Ｐ１）〜５継代（Ｐ５）による細胞数の変化を、図のＢは、各実験群のＰＤＴおよびＰＤＬ結果を示した図である。
【図２０】層分離培養法を通して得られたＳＣＭ０８モノクローナル中間葉幹細胞を１０００または４０００細胞／ｃｍ２の密度で接種し、抗酸化剤添加有無を異にしたＬＧ−ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ培養培地を利用して培養した細胞の増殖率を確認した結果を示した図であって、図のＡは、各実験群の１継代（Ｐ１）〜５継代（Ｐ５）による細胞数の変化を、図のＢは、各実験群のＰＤＴおよびＰＤＬ結果を示した図である。
【図２１】抗酸化剤が添加されていないＬＧ−ＤＭＥＭ培地を利用し、１０００または４０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞密度だけを異にした実験群での細胞増殖率を確認した結果を示した図である。
【図２２】抗酸化剤が添加されていないＬＧ−ＤＭＥＭ培地を利用し、１０００または４０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞密度だけを異にした実験群でのＰＤＴおよびＰＤＬを確認した結果を示した図である。
【図２３】抗酸化剤が添加されたα−ＭＥＭ培地を利用し、１０００または４０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞密度だけを異にした実験群での細胞増殖率を確認した結果を示した図である。
【図２４】抗酸化剤が添加されたα−ＭＥＭ培地を利用し、１０００または４０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞密度だけを異にした実験群でのＰＤＴおよびＰＤＬを確認した結果を示した図である。
【図２５】細胞密度を１０００細胞／ｃｍ２の密度に固定し、培養培地をＬＧ−ＤＭＥＭまたはα−ＭＥＭ培地で異にした実験群での細胞増殖率を確認した結果を示した図である。
【図２６】細胞密度を１０００細胞／ｃｍ２の密度に固定し、培養培地をＬＧ−ＤＭＥＭまたはα−ＭＥＭ培地で異にした実験群でのＰＤＴおよびＰＤＬを確認した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、中間葉幹細胞の層分離培養および増殖方法を提供する。
本発明の方法は、既存の層分離培養法を改良した方法であり、モノクローナル幹細胞、好ましくはモノクローナル中間葉幹細胞を速く汚染なしに得ることができる層分離培養法の長所に加えて、モノクローナル幹細胞、好ましくはモノクローナル中間葉幹細胞の速い増殖を通して短時間で所望のモノクローナル幹細胞を大量に得ることができる。
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、１）個体から分離された骨髄を培養するステップ；２）前記１）ステップの上層液だけを新たな容器に移動させて培養するステップ；３）前記２）ステップの上層液だけを分離して培養容器で３７℃で１時間〜３時間培養後、３７℃で１２〜３６時間培養を２〜３回繰り返し、次いで３７℃で２４〜７２時間で培養し、毎回上層液を新たな培養容器に移動させて繰り返し培養するステップ；４）最終培養容器でモノクローナル幹細胞を得るステップ；および、５）モノクローナル幹細胞を５０〜１０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で培地に接種して培養するステップ；を含む幹細胞の層分離培養および増殖方法を提供する。
【００１５】
前記１）〜３）ステップは、ＫＲ１０−２００６−００７５６７６号に記載の層分離培養方法と同一に行うこともでき、ＫＲ１０−２００６−００７５６７６号は、本発明に全体として参考になり得る。
【００１６】
本発明の「総分離培養」は、幹細胞を比重によって分離する方法を意味し、先ず、ヒト骨髄を抽出して細胞培養液に培養した後、上層液だけを得、それをコーティング剤が処理されたか、または処理されていない培養容器に移して培養した後、同一の過程を数回繰り返す工程をいう。このような層分離培養は、遠心分離過程なしに上層液を繰り返して得て培養する工程を繰り返すことを特徴とし、最終的に他の細胞の汚染なしにモノクローナル幹細胞、好ましくはモノクローナル中間葉幹細胞を得ることができる長所がある。
【００１７】
前記２）および３）ステップの培養は、３７℃で４時間以下、好ましくは１時間〜３時間、より好ましくは１時間３０分〜２時間３０分培養し、繰り返し培養は、３７℃で４時間以下培養後（好ましくは１時間〜３時間、より好ましくは１時間３０分〜２時間３０分）、３７℃で１２〜３６時間培養を２〜３回繰り返し（好ましくは１８時間〜３０時間）、次いで３７℃で２４〜７２時間で培養し（好ましくは３６時間〜６０時間）、毎回上層液を新たな培養容器に移動させて行うことができる。本発明の実施例において分離した方法を簡単に要約すれば、次のとおりである。
【００１８】
【化１】
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【００１９】
培養した細胞は、モノクローナル細胞群を形成するが、このモノクローナル細胞群を分離した後、継代培養を行うことができ、本発明は、層分離培養を通して得られたモノクローナル幹細胞を大量で迅速に得るために５）ステップの培養ステップを含むことを特徴とする。
【００２０】
前記５）ステップは、モノクローナル幹細胞を１０００細胞／ｃｍ２以下の細胞密度、好ましくは５０〜１０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で培地に接種して培養するステップである。
【００２１】
前記培養は、好ましくは１継代〜５継代の培養であることを特徴とし得る。本発明によれば、速いモノクローナル幹細胞の増殖を誘導することができるので、最終産物を速く得ることができ、１継代〜５継代の培養を通してＭＣＢ（Master Cell Bank）を製造することができる。
【００２２】
本発明のモノクローナル幹細胞は、１０００細胞／ｃｍ２を超えて既存の工程のように４０００細胞／ｃｍ２の高密度で培養される場合、細胞増殖能が顕著に減少し、中間葉幹細胞のマーカーが変化し、幹細胞の分化能が失われ得る。従って、層分離培養法を通して得られたモノクローナル幹細胞は、低密度乃至中間程度の密度、即ち、１０００細胞／ｃｍ２以下の細胞密度、好ましくは５０〜１０００細胞／ｃｍ２の細胞密度、さらに好ましくは１０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で培養され得る。
【００２３】
１０００細胞／ｃｍ２以下の細胞密度でモノクローナル中間葉幹細胞を培養する場合、細胞の増殖能は、４０００細胞／ｃｍ２のように高密度で培養された中間葉幹細胞と比較して長期間の培養期間中顕著に高く維持されるので、多くの継代を繰り返さなくても所望の量の大量モノクローナル細胞を速く得ることができる長所がある。また、前記細胞密度でモノクローナル中間葉幹細胞を培養する場合、該当細胞は、ＤＮＡ損傷が少なく、老化が抑制され、幹細胞の分化能を効果的に維持できる長所があって、早く迅速に優れた幹細胞特性を有するモノクローナル中間葉幹細胞を得ることができる。
【００２４】
本発明に使用される培地は、抗酸化剤を含まない培地、前記培地に抗酸化剤が加えられた培地、または抗酸化剤を含む培地をいずれも含むことができる。
【００２５】
抗酸化剤を含まない培地としては、これに制限されるものではないが、ＤＭＥＭ培地を使用することができ、必要に応じて前記培地に抗酸化剤をさらに加えて培養を行うことができる。また、必要に応じて抗酸化剤が含まれたα−ＭＥＭ培地を利用して培養を行うことができる。
【００２６】
本発明の抗酸化剤は、細胞培養に用いられ得る抗酸化剤を制限なく含むことができ、グルタチオン、システイン、システアミン、ユビキノール、β−メルカプトエタノールおよびアスコルビン酸からなる群から選択された１種以上であってよい。抗酸化剤が培地に加えられる場合、前記抗酸化剤は、１０〜５０、好ましくは１０〜３０、さらに好ましくは２５μｇ／ｍｌの濃度で加えられ得る。
【００２７】
本発明の一例においては、抗酸化剤を含まない培地として、ＤＭＥＭ、さらに好ましくはＬＧ−ＤＭＥＭ培地を使用し、抗酸化剤としてアスコルビン酸を含む培地として、α−ＭＥＭ培地を使用する。
【００２８】
一方、本発明の方法によれば、モノクローナル幹細胞を非常に効果的に増殖できるので、ＭＣＢを利用してＷＣＢ（Working Cell Bank）を製造する工程が省略され得る。これは、既存の層分離培養法がＭＣＢ製造後、ＷＣＢを製造する工程を伴うべきことと比較して工程を単純化したものである。
【００２９】
本発明の前記５）ステップの培養は、１継代〜５継代培養時、１０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下の細胞密度で培養することを特徴とし得、好ましくは、１継代培養時、５０〜１０００細胞／ｃｍ２の細胞密度でモノクローナル幹細胞を培地に接種して培養し、それを増殖させた後、２継代〜５継代培養時、１０００細胞／ｃｍ２以下の細胞、さらに好ましくは７００〜１０００細胞／ｃｍ２の細胞、さらにより好ましくは１０００細胞／ｃｍ２の細胞密度でモノクローナル幹細胞を培地に接種して培養することを特徴とし得る。
【００３０】
本発明の培養培地として抗酸化剤を含む培地を利用する場合、前記培養培地には、抗生剤としてゲンタマイシンが加えられ得る。
【００３１】
本発明の方法を通して得られた中間葉幹細胞は、最終的に５継代〜１０継代の中間葉幹細胞、好ましくは６継代〜８継代の中間葉幹細胞であってよい。これは、最小１０継代〜１２継代の中間葉幹細胞が最終産物として得られる既存の工程に対比してさらに低い継代数であり、細胞接種密度調節を通して低い継代で速く増殖された中間葉幹細胞を容易に大量に得られることを示す。
【００３２】
前記のように得られた中間葉幹細胞は、層分離培養法を通して得られたモノクローナル幹細胞であるだけでなく、幹細胞分化能が効果的に維持されている中間葉幹細胞であってよい。特に、１０００細胞／ｃｍ２以下の細胞密度で培養されるモノクローナル幹細胞は、１０００を超える高密度の細胞密度で培養されるモノクローナル幹細胞と比較して骨細胞分化能がさらに効果的に維持されていることを特徴とし得る。
【００３３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
下記実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の内容が下記実施例に限定されることはない。
【００３４】
＜実施例１＞細胞密度による中間葉幹細胞分析
大韓民国特許出願１０−２００６−００７５６７６号に記載の層分離培養法をより改良した中間葉幹細胞の層分離培養法および増殖方法を提供するために、培養条件のうち細胞密度および培養培地を変化させ、これによる中間葉幹細胞の特性を比較分析した。
【００３５】
以下の実験では、層分離培養法を通して得られたモノクローナル中間葉幹細胞（ＭＳＣ）の細胞培養密度をそれぞれ５０細胞／ｃｍ２（低密度）、１０００細胞／ｃｍ２（中間密度）、４，０００細胞／ｃｍ２（高密度）と異にして、それによる細胞の特性を分析した。
【００３６】
１．１  細胞密度によるＭＳＣの形態学的変化の確認
先ず、長期間の培養で細胞密度によるＭＳＣの形態学的変化を確認するための実験を行った。長期間の培養条件を与えるために、５継代（Ｐ５）、１０継代（Ｐ１０）、１５継代（Ｐ１５）のＭＳＣを利用し、それぞれ低密度、中間密度、高密度の条件でＤＭＥＭ培地に接種した。この後、細胞の形態学的変化を、顕微鏡を通して観察して幹細胞が老化したか否かを判断し、その結果を図２に示した。
【００３７】
図２に示したように、Ｐ５およびＰ１０では、細胞密度によって細胞の大きさと形態学的パターンで差を示し、特に、Ｐ１５の場合、高密度の培養条件で平らで大きくなった形態のＭＳＣが観察された。このような形態は、典型的なＭＳＣの老化を示すものであり、長期間の培養で細胞の密度調節がＭＳＣの老化を調節できることを確認した。
【００３８】
１．２  細胞密度によるＭＳＣ細胞の大きさおよび粒度の確認
細胞密度による幹細胞の変化をさらに確認するために、老化した細胞で増加すると知られている細胞の大きさおよび細胞の粒度（granularity）をＦＡＣＳ分析を通して定量分析し、その結果を図３に示した。
【００３９】
図３に示したように、細胞の大きさは、Ｐ５では有意的な差を示さなかったが、Ｐ１０およびＰ１５の場合、細胞密度によって有意的な差を示すことを確認した。特に、Ｐ１０およびＰ１５では、高い細胞密度の培養条件で細胞の大きさが有意的に増加し、細胞老化がさらに促進されることを確認することができた。これと同様に、細胞の粒度もまた全ての継代で細胞の密度が高くなるほど有意的に増加する結果を示した。従って、ＭＳＣの長期間の培養において、細胞の密度調節が細胞老化を調節する因子になり得ることを確認し、細胞培養密度を下げることで、後期継代で現れる形態学的変化を改善できることを確認した。
【００４０】
１．３  培養細胞密度によるＭＳＣの老化の確認
実施例１．１および１．２で確認された形態学的変化が実際にＭＳＣの年齢に依存する現象であるかを確認するために、老化細胞を選択的に染色できるβ−ｇａｌ−染色分析法を行い、老化関連遺伝子であるＰ１５、Ｐ１６および増殖マーカーであるＰＣＮＡ遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲを通して比較した。その結果をそれぞれ図４および図５に示した。
【００４１】
図４に示したように、Ｐ５およびＰ１０では、全ての細胞密度で老化した細胞の染色を確認することができなかったが、Ｐ１５では、細胞密度が高くなるほど老化した細胞の染色が明確に増加することを確認した。また、図５に示したように、Ｐ１５では、細胞の培養密度が増加するほど老化関連遺伝子であるＣＤＫ抑制剤Ｐ１５およびＰ１６の遺伝子発現が増加し、増殖マーカーであるＰＣＮＡは減少した。
【００４２】
このような結果は、ＭＳＣの形態学的変化がＭＳＣの老化と関連のあることを示す結果であり、細胞培養密度の調節がＭＳＣの老化を調節できることを示す結果である。
【００４３】
１．４  培養細胞密度によるＭＳＣの増殖能変化の確認
ＭＳＣの増殖能力は、継代が進み、細胞の老化が進むにつれて漸次に減少すると知られている。従って、増殖能は、ＭＳＣの老化を確認できる基準に使用され得、長期間の細胞培養時、細胞培養密度によるＭＳＣの増殖能の比較を行った。各細胞の増殖能は、初期接種細胞数と培養が終了した後に得られる細胞の数を通して各継代による増殖率を計算して確認し、その結果を表１および図６に示した。
【００４４】
【表１】
2019083805.tif 000004
【００４５】
表１に示したように、低密度で培養されたＭＳＣの場合、Ｐ５、１０、１５で倍増（fold increase）が８８．４、３４．３、１６．４であるのに対し、中間密度で培養されたＭＳＣは、８．５、４．９、３．１、高密度で培養されたＭＳＣは、３．０、１．９、１．１であることを確認した。また、図６に示したように、ＰＤＴとＰＤＬも倍増（fold increase）のようなパターンで現れることを確認した。このような結果は、長期間のＭＳＣ培養で細胞密度を下げることでＭＳＣの増殖能を維持させることができることを示す結果であり、同じ継代培養を行っても、ＭＳＣの老化を抑制させ、ＭＳＣの寿命を延ばすことができることを示す。
【００４６】
１．５  培養細胞密度によるＭＳＣの分化能変化の確認
細胞培養密度が幹細胞能に影響を与えるかを確認するために、Ｐ５〜Ｐ１５培養による分化能を比較した。幹細胞能で脂肪細胞分化能および骨細胞分化能を確認し、それぞれの継代および密度で定性、定量分析を行った。具体的に、脂肪細胞分化培養液は、Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｓｏｓｅ  ＤＭＥＭ培養液にＮＣＳ（Newborn Calf Serum）（Ｇｉｂｃｏ社製）、１０−７ｍｏｌデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）、０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０μｇ／ｍｌインスリン（Ｓｉｇｍａ社製）、１００μＭインドメタシン（Ｓｉｇｍａ社製）を添加した培地を作って実験し、７日分化後にオイルレッドＯ組織化学染色を通して確認した。また、オイルレッドＯ組織化学染色後、イソプロピルアルコールで溶出させ、５００ｎｍで測定後、定量分析して確認した。
【００４７】
骨細胞分化培養液は、α−ＭＥＭ培養液にＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製）、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸２−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ社製）、１０−８ｍｏｌデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｍＭ  β−グリセロホスフェート（Ｓｉｇｍａ社製）を添加した培地を使用し、２１日分化後にアリザリンレッドＳ組織化学染色を通して確認した。また、アリザリンレッドＳ組織化学染色後、１０％酢酸で溶出させ、４０５ｎｍで測定し、定量分析して確認した。前記のような方法で脂肪細胞分化能および骨細胞分化能を確認した結果を図７に示した。
【００４８】
図７に示したように、脂肪細胞分化能は、継代が進むにつれて全体的に潜在性（potential）が減少したが、密度による差が明確に現れていないのに対し、骨細胞分化能の場合、高密度条件のＰ１５培養群で有意に減少することを確認した。このような結果を通して、ＭＳＣの骨細胞分化能は、低い細胞密度で培養する場合、さらによく維持され得ることを確認した。
【００４９】
１．６  培養細胞密度によるＭＳＣの抗原プロファイルの分析
細胞培養密度が幹細胞の抗原発現にも影響を及ぼすか否かを確認するための実験を行い、各継代および培養密度による陽性および陰性抗原発現の変化をフローサイトメトリーで確認し、その結果を表２に示した。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
表２に示したように、陰性マーカー発現の変化は明確に確認されなかったが、一部の陽性マーカーの場合、同じ継代でも細胞培養密度によって発現量の変化が現れることを確認した。特に、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６の場合、細胞培養密度を増加させるにつれて発現量が明確に減少した。この他にＣＤ７３もまたＰ１０以上の継代では培養密度が増加するにつれて発現が顕著に減少する傾向を示した。特に、Ｐ１５では、高い密度で細胞を培養する場合、ほとんどの陽性マーカーの発現量が顕著に減少しただけでなく、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０５は陰性発現を示し、細胞密度を低く維持して細胞培養を行うことが常に重要な因子になり得ることを確認した。
【００５２】
１．７  培養細胞密度によるＲＯＳ生産およびＤＮＡ損傷の比較
中間葉幹細胞の機能の減少とＤＮＡ損傷は関連があると知られており、特に、活性酸素種であるＲＯＳにより誘導されるＤＮＡ損傷は、ＭＳＣの老化を促進すると知られている。従って、培養密度によって総ＲＯＳ生産およびこれによるＤＮＡ損傷が異なるように現れるか否かを確認するために、継代および細胞培養密度による総細胞性ＲＯＳ量を、蛍光強度分析を通して比較し、ｃｏｍｅｔ分析を通してＤＮＡ損傷程度を確認し、その結果を図８に示した。
【００５３】
図８に示したように、総ＲＯＳ生産は、全ての継代で細胞培養密度が増加するほど増加する傾向を確認し、特に、Ｐ１０、Ｐ１５では、有意的にＲＯＳ生産が増加することを確認した（Ａ）。ｃｏｍｅｔ分析では、ＤＮＡ損傷が最も弱いＣＣ１から損傷が最も激しいＣＣ５に分類してデータを分析し、損傷が最も激しいＣＣ５の場合、細胞培養密度が高くなるほど有意的に増加することを確認した。これに対し、ＣＣ１は、細胞密度が高くなるほど有意的に低くなる傾向を示した（Ｂ）。
【００５４】
さらに、ＤＮＡ損傷がＲＯＳにより誘発されたかを確認するために、ＲＯＳによるＤＮＡ損傷を確認する８−ＯＨｄＧの濃度を確認する実験を行った。８−ＯＨｄＧ分析方法は、次のとおりである。それぞれの細胞から得たＤＮＡ試料５０μｌを８−ＯＨｄＧコンジュゲートコーティングプレートに入れた後、常温で１０分間培養した。その後、抗８−ＯＨｄＧ抗体をさらに入れて常温で１時間培養し、３回洗浄後、二次抗体−酵素コンジュゲートを各ウェルに入れた後、さらに１時間の間常温で培養した。この後、さらに３回洗浄後、基質溶液を入れて常温で３０分間培養した。最後に、停止溶液（stop solution）を入れた後、４５０ｎｍで吸光度を測定して確認し、その結果を図９に示した。
【００５５】
図９に示したように、ＤＮＡ損傷が最も激しいものと現れたＰ１５群では、細胞培養密度が高くなるほど８−ＯＨｄＧの濃度が有意的に増加することを確認した。このような結果を通して、高密度培養条件で生産されるＲＯＳによりＤＮＡ損傷が増加するのであり、これによってＭＳＣの老化が促進されるということを示す。
【００５６】
このような結果は、細胞培養密度を低く調節することがＭＳＣのＲＯＳ生産増加によるＤＮＡ損傷からＭＳＣを保護する役割を果たすことができることを示す結果である。
【００５７】
１．８  抗酸化剤処理によるＭＳＣ増殖およびＲＯＳ生産能の確認
ＭＳＣの増殖が高密度培養条件で生産されるＲＯＳによって影響を受けるか否かを確認するために、ＲＯＳ消去実験を行った。Ｐ１１〜Ｐ１５で高密度培養条件および高密度培養条件に抗酸化剤であるアスコルビン酸２５μｇ／ｍｌを培地に添加して培養した後、両グループ間の増殖Ｆｏｌｄ増加を比較し、その結果を図１０に示した。
【００５８】
図１０に示したように、高密度培養条件で倍増（fold increase）がＰ１１〜Ｐ１５でそれぞれ２．６、１．９、１．６と、継代数が増加するほど増殖能が減少して老化が現れ始めたが、抗酸化剤を処理した場合、全ての継代で約５０％程度増殖能が高く維持されることを確認した。また、抗酸化剤処理群で増殖倍増（growth fold increase）はＰ１１〜Ｐ１５でそれぞれ３．８、２．９、２．５とＰ１５までも増殖能が高く維持された。
【００５９】
終点（Endpoint）であるＰ１５で高密度培養条件単独および高密度培養条件＋抗酸化剤処理の両グループ間のＲＯＳ水準を確認した結果を図１１に示した。
【００６０】
図１１に示したように、抗酸化剤であるアスコルビン酸を処理して増殖が増加した条件では、ＲＯＳの水準もまた減少していることを確認した。従って、ＭＳＣ培養は、高密度でない低い細胞密度で行うことが好ましく、高密度細胞培養で誘導されるＲＯＳ生産を抗酸化剤で消去する場合、ＭＳＣの増殖能を増加させることができることを確認した。即ち、高密度条件のＲＯＳによりＭＳＣの増殖能が抑制され、細胞密度が低くなるほどＲＯＳが減少してＭＳＣ増殖能が促進され得る。
【００６１】
このような結果をまとめると、層分離培養を通して得られたモノクローナル中間葉幹細胞の増殖、培養および幹細胞能を維持するためには、培養条件のうち細胞密度を１０００細胞／ｃｍ２以下の密度に調節することが重要であり、抗酸化剤を添加して培養する場合、細胞培養で誘発され得る酸化ストレスを抑制してＭＳＣ増殖を効果的に促進できることを確認した。
【００６２】
＜実施例２＞改良された層分離培養法の検証
前記実施例１を通して、層分離培養法で得られたＭＳＣ培養において、細胞密度の調節および抗酸化剤の添加が重要な因子になり得ることを確認したので、大韓民国特許出願１０−２００６−００７５６７６号に記載の層分離培養法の既存の工程で得られたモノクローナル中間葉幹細胞を細胞培養密度を異にし、抗酸化剤であるアスコルビン酸が添加された培地で培地を異にしてモノコロニーＭＳＣの増殖能およびこれによる細胞取得効果を比較した。以前の大韓民国特許出願１０−２００６−００７５６７６号では、単一性細胞群であるコロニーを１ウェル当たり１００〜６００の細胞数で移動し、それ以後の継代培養では、１ｃｍ２当たり４０００個の細胞で培養を進行した。
【００６３】
具体的に、本改良方法では、１継代（Ｐ１）の細胞数を１ｃｍ２当たり１０００に調節して培養する方法を通して細胞の効果的な増殖を誘導し、２継代（Ｐ２）以後の継代培養では、低い密度である１０００個以下の細胞を分注し、これを４０００個細胞培養の効果と比較した。また、細胞培養培地を抗酸化剤が含まれたα−ＭＥＭ培地と抗酸化剤が含まれていないＬＧ−ＤＭＥＭ培地で異にし、これによる細胞増殖効果を比較した。
【００６４】
改良された層分離培養法の効果を確認するための実験群を下記表３に、工程改良部分を図１２に模式化して示した。
【００６５】
【表３】
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【００６６】
細胞株は、層分離培養方法により分離された細胞株であり、ＳＣＭ０１〜ＳＣＭ０８とそれぞれ命名した。
【００６７】
２．１  細胞株密度および培地による増殖効果の確認
前記ＳＣＭ０１〜０８細胞株を利用して培養を行い、５継代（Ｐ５）までの継代培養による細胞増殖効果を、細胞数、ＰＤＴ（集団倍加時間）、ＰＤＬ（集団倍加数）でそれぞれ比較し、それを図１３〜図２０に示した。
【００６８】
図１３〜図２０から確認したように、１ｃｍ２当たり１０００個の細胞密度で接種して培養された全ての実験群において、１ｃｍ２当たり４０００個の細胞密度で接種して培養した実験群より優れた細胞増殖効果を示した。また、同じ１０００個の細胞密度群であっても、抗酸化剤であるアスコルビン酸が含まれたα−ＭＥＭ培地で培養された１０００α実験群でさらに顕著な細胞増殖効果を確認した。
【００６９】
２．２  細胞株密度による増殖効果の比較
培養細胞数による増殖率のより正確な比較のために、培養培地をそれぞれＬＧ  ＤＭＥＭまたはα−ＭＥＭ培地に固定し、１０００または４０００個の細胞接種密度による細胞増殖効果を比較し、その結果を図２１〜図２４に示した。
【００７０】
図２１に示したように、ＬＧ  ＤＭＥＭで培養されたＳＣＭ０１〜ＳＣＭ０８細胞株はいずれも１０００個の細胞数で接種して培養したとき、Ｐ５／Ｐ２増殖率が４０００個の細胞接種群より顕著に高いことを確認し、５継代（Ｐ５）で確認された４０００個の細胞接種に対比した１０００個の細胞接種群の増殖率は、最小３．０８〜最大４８．５０倍であることを確認した。また、図２２に示したように、ＰＤＴ値も全ての細胞で４０００個細胞接種より低いか、または類似した水準で現れ、ＰＤＬ値は、全ての細胞株で４０００個細胞接種に対比して高い値を確認した。
【００７１】
また、図２３に示したように、α−ＭＥＭで培養されたＳＣＭ０１〜ＳＣＭ０８細胞株はいずれも１０００個の細胞数で接種して培養したとき、ＤＭＥＭ実験群のような傾向を示し、５継代で確認された４０００個の細胞接種に対比した１０００個の細胞接種群の増殖率は、最小６．３２〜最大８５．６３倍であることを確認した。また、図２４に示したように、ＰＤＴ値も全ての細胞株で４０００個細胞接種より低いか、または類似した水準で現れ、ＰＤＬ値は、全ての細胞株で４０００個細胞接種に対比して高い値を確認した。
【００７２】
このような結果は、１ｃｍ２当たり４０００個の高密度細胞接種培養に対比して１０００個以下の細胞接種を通して速いモノクローナル中間葉幹細胞の増殖を誘導できることを示す結果である。
【００７３】
２．３  培養培地による増殖効果の比較
先に実施例２．２を通して１０００細胞／ｃｍ２培養が４０００細胞／ｃｍ２培養に対比して優れた増殖効果を奏することができることを確認したので、細胞数を１０００個に固定し、培地を変数で変化させながら細胞増殖効果を比較することで、培養培地条件による増殖効果をさらに検証し、その結果を図２５および図２６に示した。
【００７４】
図２５に示したように、培養培地をα−ＭＥＭおよびＤＭＥＭで異にして細胞増殖率を比較した結果、ＬＧ−ＤＭＥＭに対比してα−ＭＥＭ培地を用いた実験群で最小１．７７〜６．３９の高い細胞増殖率を確認した。また、図２６に示したように、ＰＤＴが全てのα−ＭＥＭ実験群で低く現れ、ＰＤＬは増加したことを確認した。
【００７５】
このような実験結果は、細胞接種密度を１ｃｍ２当たり１０００個以下の細胞に調節して２継代（Ｐ２）〜５継代（Ｐ５）で培養することに加えて抗酸化剤が添加された培地を利用して培養する場合、細胞増殖効率を極大化できることを示す。
【００７６】
＜実施例３＞改良工程の樹立
前記実施例を通して、ＭＳＣ培養において細胞密度の調節および抗酸化剤の添加が重要な因子になり得ることを確認したので、大韓民国特許出願１０−２００６−００７５６７６号に記載の層分離培養法の既存の工程に加えて、細胞培養密度および培地条件を異にして単一コロニーの中間葉幹細胞を効果的に得られる改善された工程を確立し、それをまとめて下記表４（ＤＭＥＭ培地を用いた培養条件）および表５（α−ＭＥＭ培地を用いた培養条件）に示した。
【００７７】
【表４】
2019083805.tif 000007
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【００７８】
【表５】
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【００７９】
より具体的には、本発明の骨髄由来中間葉幹細胞の層分離培養工程および増殖培養を下記のように行った。
【００８０】
骨髄提供者の臀部を局所麻酔剤で麻酔させた後、骨盤に注射針を刺して骨髄を採取した。１００ｍｍ培養容器に２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む１４ｍｌ  ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＭＤ、ＵＳＡ）、ヒト骨髄１ｍｌを入れて３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で２時間培養した。培養後、培養容器を一方に軽く傾けて底面に付いた細胞ができるだけ取れないように最大限に培養容器の上層培養液だけを新たな容器に移した。
【００８１】
同一の過程をもう一度繰り返した後、得られた培養液を底面にコラーゲンがコーティングされた培養容器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に移した後、３７℃で２時間培養した。培養液をまた新たなコラーゲンがコーティングされた容器に移し、２４時間後、また新たな容器に移し、２４時間後、また新たな容器に移した。最後に、４８時間後、新たな容器に移した後、残っている細胞が培養容器底面に付いて育つことを目視で確認した。先の数々の層分離ステップを経てこのステップにまで来ることができる細胞は、細胞の比重が他の細胞より飛び切り小さな細胞であることを推測できる。約１０〜１４日の時間が過ぎると細胞が単一コロニーを形成するが、この単クローン性細胞群をトリプシンを処理して分離した後、５０〜２００細胞／ｃｍ２の細胞数で６−ｗｅｌｌ培養容器に移した。３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で４〜５日培養した後、約８０％育ったとき、細胞を０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を処理して得た後、７５ｃｍ２培養容器に移して継代培養した。
【００８２】
このように、初期２継代〜５継代での細胞密度を１０００細胞／ｃｍ２の水準に下げて培養する場合、他の工程は全て同一に調節したにもかかわらず、ＭＳＣの増殖能および幹細胞特性が優れるように維持され、同じ継代でも増殖が効果的に誘導されることを確認した。特に、このように細胞密度を下げて培養する場合、既存の工程で必要としていた、ＭＳＣでＷＣＢ（Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ社製）を製造する過程を省略でき、細胞製造期間を効果的に短縮できる。特に、継代を少なくすれば、老化が比較的にあまり進んでいない細胞を多くの量で得ることができ、このような細胞を治療剤として利用する場合、治療効能に優れるものと期待することができる。
【００８３】
また、培養培地として抗酸化剤が添加されたα−ＭＥＭを利用する場合、高い密度の細胞培養で誘導されるＲＯＳストレスが抗酸化剤処理により効果的に改善され、ＭＳＣの細胞増殖能が回復でき、既存の工程に対比して細胞の継代を顕著に短縮し、ＭＳＣの特性を維持する老化が進んでいない新鮮な状態の単一コロニーＭＳＣを速く安定して得られるという特徴がある。
【００８４】
前記のような内容をまとめると、低密度細胞培養は、短時間で多くの細胞を得ることができ、製造工程を簡素化させるだけでなく、長期間の培養でも、ＭＳＣの特性を完全に維持する老化していない状態の細胞を得ることができるので、良質の幹細胞生産を可能にすることが分かる。従って、細胞治療剤の開発のための大規模製造の技術開発に活用度が高いものと期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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