(57)【要約】【課題】大型の検出装置を用いることなく、容易に、標的物質の有無を高感度に検出することができるセンシング用チップ、センシング用キット及びそれを用いたセンシング方法を提供する。【解決手段】センシング用チップ１００は、基板１０２と、基板の上に配列された複数の球体１０４と、複数の球体の上に形成された金属層１０６と、金属層の上に形成された接着層１０８と、接着層に固定された標的物質を捕捉するための捕捉体１１０とを有する。センシング用チップ上に、標的物質と、当該標的物質に特異吸着する認識体で表面修飾された金属ナノ微粒子とが投入された状態で、光が照射されることにより局在型プラズモン共鳴が発生し、金属ナノ微粒子の局在型プラズモン共鳴のピーク波長と金属層の局在型表面プラズモン共鳴のピーク波長との差は１００ｎｍ以下である。これにより、標的物質を高感度に検出することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質を検出するためのセンシング用チップであって、
測定部が形成された基板を備え、
前記測定部は、
前記基板上に配列された複数の凸部と、
前記複数の凸部の上に形成された金属層と、
前記標的物質を捕捉するための捕捉体とを有し、
前記捕捉体は、前記金属層の上、前記金属層の上に形成された保護層の上、又は、前記金属層若しくは前記保護層の上に形成された接着層の上に配置され、
前記複数の凸部の各々は、同じ直径の半球部を有し、
前記直径は、０．１μｍ以上２μｍ以下であり、
前記測定部の前記捕捉体の上に、前記標的物質と、当該標的物質に特異吸着する認識体で表面修飾された金属ナノ微粒子とが投入された状態で、光が照射されることにより局在型プラズモン共鳴が発生し、
前記金属ナノ微粒子の局在型プラズモン共鳴のピーク波長と前記金属層の局在型表面プラズモン共鳴のピーク波長との差は１００ｎｍ以下であることを特徴とするセンシング用チップ。
【請求項２】
前記複数の凸部のそれぞれは、誘電物質で形成された球体であることを特徴とする、請求項１に記載のセンシング用チップ。
【請求項３】
前記測定部は、前記金属層の上に前記保護層を有し、
前記金属層は、銀で形成され、
前記保護層は、金で形成され、
前記捕捉体は、前記保護層の上、又は、前記保護層の上に形成された前記接着層の上に配置されることを特徴とする請求項１又は２に記載のセンシング用チップ。
【請求項４】
前記測定部は、前記接着層を有し、
前記捕捉体は、前記接着層の上にのみ配置されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のセンシング用チップ。
【請求項５】
前記基板は、複数の前記測定部を有し、
複数の前記測定部の各々の前記金属層は、面積１ｃｍ２以上に形成されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のセンシング用チップ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のセンシング用チップと、
標的物質に特異吸着する認識体で表面修飾された金属ナノ微粒子とを含むセンシング用キット。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のセンシング用チップを用いたセンシング方法であって、
前記測定部の前記捕捉体の上に、標的物質と、当該標的物質に特異吸着する認識体で表面修飾された金属ナノ微粒子とを投入する第１ステップと、
前記第１ステップが実行された前記センシング用チップに光が照射され、局在型プラズモン共鳴が発生した状態で、前記測定部を撮像する第２ステップと、
前記第２ステップにより得られた画像の色相角を算出し、当該色相角と基準角との差を算出し、当該差により前記標的物質の有無を判定する第３ステップとを含み、
前記金属ナノ微粒子の局在型プラズモン共鳴のピーク波長と前記センシング用チップの前記金属層の局在型表面プラズモン共鳴のピーク波長との差は１００ｎｍ以下であることを特徴とする、センシング方法。
【請求項８】
前記基準角は、前記第１ステップの前に、前記センシング用チップに光が照射され、局在型プラズモン共鳴が発生した状態で、前記測定部を撮像して得られた画像から算出された色相角であることを特徴とする、請求項７に記載のセンシング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、局在型プラズモン共鳴の相互作用を利用して、標的物質を検出するセンシング用チップ、センシング用キット及びそれを用いたセンシング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、局在型表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ：Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いて種々の光学特性に関する研究が行なわれている。例えば、非特許文献１には、基板上に金薄膜、シリカ微粒子膜（φ＝１００ｎｍ）、及び金薄膜の３層構造の構造を作製し、その構造による吸光度変化から、基板表面に吸着したＤＮＡを検出するＤＮＡバイオセンサが開示されている。そのＤＮＡバイオセンサでは、測定スポットがアレイ状に配置されている。
【０００３】
非特許文献２には、基板上に金ナノロッドアレイ構造を作製し、全反射イメージングによって、基板表面に吸着したＤＮＡを検出するＤＮＡバイオセンサが開示されている。このＤＮＡバイオセンサの検出限界は約１００ｐＭである。
【０００４】
非特許文献３には、銀ナノ微粒子（粒径５ｎｍ程度）の多層膜による呈色膜を作製し、多層膜への標的分子であるストレプトアビジンの吸着を、ビオチン修飾した金ナノ微粒子を用いて、吸収ピーク波長のシフトとして検出することが開示されている。
【０００５】
非特許文献４には、近赤外波長領域に局在型表面プラズモン共鳴を起こす金ナノリングアレイを作製し、金ナノ微粒子を用いてＤＮＡハイブリダイゼーションを検出するバイオセンサが開示されている。ＤＮＡハイブリダイゼーションは、フーリエ変換型赤外吸収分光光度計を用い、吸収ピーク波長のシフトとして検出している。このバイオセンサの検出限界は約５０ｐＭである。
【０００６】
非特許文献５には、近赤外波長の光を用いたＳＰＲイメージャーで、金ナノ微粒子を用いてＤＮＡハイブリダイゼーションを検出するバイオセンサが開示されている。このバイオセンサでは、ＤＮＡを基板に固定するためにポリドーパミン薄膜を使用している。このバイオセンサの検出限界は１０ｐＭ程度である。
【０００７】
非特許文献６には、近赤外波長の光を用いたＳＰＲ顕微鏡で、金ナノ微粒子を用いてＤＮＡハイブリダイゼーションを検出することが開示されている。特殊な光学系を用いて、画像処理を行なうことにより、１００ｆＭ程度の検出限界を達成している。
【０００８】
非特許文献７には、アルミニウムのナノ構造体の反射スペクトルから色相角度を算出し、媒体の屈折率変化を検出する屈折率センサが開示されている。
【０００９】
また、下記特許文献１には、局在型表面プラズモン共鳴によるバイオセンシングにおいて、光第２高調波発生（ＳＨＧ：Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）による増強により検出感度を向上することが開示されている。具体的には、基板上に形成された金属層の上に、固定部材（自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ））を介して、リガンドで修飾された金ナノ微粒子を固定してセンサを形成し、これに、波長約７００〜９００ｎｍの基本波を入射し、波長約３５０〜４５０ｎｍの第２高調波を観測する。その後、センサ上にアナライトを投入してリガンドと結合させた状態で、同様に波長約７００〜９００ｎｍの基本波を入射し、波長約３５０〜４５０ｎｍの第２高調波を観測し、アナライトの投入前後での第２高調波の変化を観測する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−２５５９４７号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】So Young Yoo, et al. ”Detection of the Most Common Corneal DystrophiesCaused by BIGH3 Gene Point Mutations Using a Multispot Gold-Capped NanoparticleArray Chip”, Anal. Chem. 2010, 82, 1349-1357
【非特許文献２】Marek Piliarik, et al. ”High-resolution biosensor based on localizedsurface plasmons”, Optics Express 2012, 20, 672-680
【非特許文献３】Shuhei Shinohara, et al. ”Colorimetric plasmon sensors withmultilayered metallic nanoparticle sheets”, Phys. Chem. Chem. Phys., 2015, 17,18606
【非特許文献４】Mana Toma, et al. ”Gold Nanoring Arrays for Near Infrared PlasmonicBiosensing” Plasmonics (2014) 9:765-772
【非特許文献５】Jennifer B. Wood, et al. ”Fabrication of DNA Microarrays onPolydopamine-Modified Gold Thin Films for SPR Imaging Measurements”, Langmuir 2013, 29, 10868-73
【非特許文献６】Aaron R. Halpern, et al. ”Single-Nanoparticle Near-Infrared SurfacePlasmon Resonance Microscopy for Real-Time Measurements of DNA HybridizationAdsorption” Acs Nano 2014, 8, 1022-33
【非特許文献７】Nicholas S. King, et al. ”Fano Resonant Aluminum Nanoclusters forPlasmonic Colorimetric Sensing” Acs Nano 2015, 9, 10628-10636
【非特許文献８】A. R. Smith, “Color gamut transform pairs” SIGGRAPH '78 Proceedings of the 5thannual conference on Computer graphics and interactive techniques, 1978
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従来の局在型プラズモン共鳴を利用したセンシングにおいては、波長分解能が高い分光光度計によって吸収波長及び光吸光度のごくわずかな変化を正確に測定し、センシングの前後におけるスペクトルシフトを解析することが求められていた。そのためには、テーブルトップサイズの大型の分光光度計を用いた測定が必要であり、ベッドサイド、臨床現場、空港・港湾、又は社会インフラの整備されていない地域での応用には制限があった。場所に依存せず、正確に、且つ簡単に測定できるセンシングチップ及びセンシング方法が望まれている。また、局在型プラズモン共鳴を利用したセンシング自体の検出感度を向上することも望まれている。
【００１３】
したがって、本発明は、大型の検出装置を用いることなく、容易に、標的物質の有無を高感度に検出することができるセンシング用チップ、センシング用キット及びそれを用いたセンシング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本願発明者は、上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、従来、表面プラズモン共鳴を用いたバイオセンサでは、感度が悪く、金ナノ微粒子の光吸収・散乱によってスペクトル形状が変化するために使用されない、金ナノ微粒子の共鳴波長（例えば５２５ｎｍ）付近の波長の光を利用することにより、高感度のセンシング用チップを実現できることを見出した。
【００１５】
本発明の第１の局面に係るセンシング用チップは、標的物質を検出するためのセンシング用チップであって、測定部が形成された基板を備える。測定部は、基板上に配列された複数の凸部と、複数の凸部の上に形成された金属層と、標的物質を捕捉するための捕捉体とを有する。捕捉体は、金属層の上、金属層の上に形成された保護層の上、又は、金属層若しくは保護層の上に形成された接着層の上に配置され、複数の凸部の各々は、同じ直径の半球部を有し、直径は０．１μｍ以上２μｍ以下である。測定部の捕捉体の上に、標的物質と、当該標的物質に特異吸着する認識体で表面修飾された金属ナノ微粒子とが投入された状態で、光が照射されることにより局在型プラズモン共鳴が発生する。その際、金属ナノ微粒子の局在型プラズモン共鳴のピーク波長と金属層の局在型表面プラズモン共鳴のピーク波長との差は１００ｎｍ以下である。
【００１６】
これにより、標的物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、マーカー、蛋白質、ウイルス、病原性細菌、毒素等）を容易且つ高感度に検出することができる。
【００１７】
好ましくは、複数の凸部のそれぞれは、誘電物質で形成された球体である。
【００１８】
より好ましくは、測定部は、金属層の上に保護層を有し、金属層は、銀で形成され、保護層は、金で形成され、捕捉体は、保護層の上、又は、保護層の上に形成された接着層の上に配置される。
【００１９】
さらに好ましくは、測定部は、接着層を有し、捕捉体は、接着層の上にのみ配置される。これにより、捕捉体を安定して金属層の近傍に配置することができ、捕捉体と標的物質との結合及び標的物質と認識体との結合により、金属層の近傍に位置する金属ナノ微粒子を安定して金属層の近傍に位置させることができる。
る。
【００２０】
好ましくは、基板は、複数の測定部を有し、複数の測定部の各々の金属層は、面積１ｃｍ２以上に形成される。これにより、標的物質の検出効率を向上し、検出作業のスループットを向上することができる。
【００２１】
本発明の第２の局面に係るセンシング用キットは、上記のセンシング用チップと、標的物質に特異吸着する認識体で表面修飾された金属ナノ微粒子とを含む。これにより、標的物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、マーカー、蛋白質、ウイルス、病原性細菌、毒素等）を容易且つ高感度に検出することができる。
【００２２】
本発明の第３の局面に係るセンシング方法は、上記のセンシング用チップを用いたセンシング方法であって、測定部の捕捉体の上に、標的物質と、当該標的物質に特異吸着する認識体で表面修飾された金属ナノ微粒子とを投入する第１ステップと、第１ステップが実行されたセンシング用チップに光が照射され、局在型プラズモン共鳴が発生した状態で、測定部を撮像する第２ステップと、第２ステップにより得られた画像の色相角を算出し、当該色相角と基準角との差を算出し、当該差により標的物質の有無を判定する第３ステップとを含み、金属ナノ微粒子の局在型プラズモン共鳴のピーク波長とセンシング用チップの金属層の局在型表面プラズモン共鳴のピーク波長との差は１００ｎｍ以下である。これにより、標的物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、マーカー、蛋白質、ウイルス、病原性細菌、毒素等）を容易且つ高感度に検出することができる。
【００２３】
好ましくは、基準角は、第１ステップの前に、センシング用チップに光が照射され、局在型プラズモン共鳴が発生した状態で、測定部を撮像して得られた画像から算出された色相角である。これにより、精度よく標的物質の検出を行なうことができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、標的物質を容易且つ高感度に検出することができる。
【００２５】
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサの設計に重要となるのが、標的物質及び金ナノ微粒子等の信号増強物質が吸着する領域（センシングを行う局所領域）での屈折率感度である。この局所領域での屈折率感度は表面プラズモン共鳴によって引き起こされる金属表面近傍での電場増強度に大きく依存し、バルクの屈折率感度と相関があることはよく知られている。そのため、予備的にバルクの屈折率感度を評価し、最も感度の良かった構造をバイオセンシングに用いることが一般的に行なわれている。表面プラズモン共鳴を用いたバイオセンサの場合、金ナノ微粒子の共鳴波長（例えば５２５ｎｍ）付近では感度が悪く、金ナノ微粒子の光吸収・散乱によってスペクトル形状が変化するため、この波長は使われない。また、局所領域でのバルクの屈折率感度は局在型表面プラズモン共鳴波長を長波長（近赤外領域）に設定した方が改善することが知られている。このように、従来、金ナノ微粒子の共鳴波長（例えば５２５ｎｍ）に近付く短波長側（５５０ｎｍ前後）に共鳴波長を設定することは好ましくないと考えられていた。
【００２６】
これに対して、本発明では、金属層の局在型表面プラズモン共鳴波長を、金属ナノ微粒子の局在型プラズモン共鳴波長に近付けて、両波長を所定範囲内の値に設定することにより、標的物質の検出感度を従来よりも向上することができる。
【００２７】
複数の凸部及び金属層により構成される、センシング用チップの基本構造である金属ナノ構造体（金属ナノドームアレイ）を、金属薄膜で被覆した誘電物質の球体の層（例えば、ポリスチレン粒子層）で構成する場合、スピンコート法による粒子層の作製と金属薄膜の製膜との２ステップで簡便に作製できる。したがって、電子線リソグラフィー等のトップダウンプロセスと比較して、低コストであり、必要な設備も少なくてよい。また、比較的大きな面積（数センチメートル四方）の金属ナノ構造体を容易に作製できるため、同一基板上に多数の測定スポットを配置でき、測定の高スループット化を実現できる。
【００２８】
また、ポリスチレン粒子を使用することで、比較的低温で加熱（１００℃で数分間）することで基板との接着性及び構造の耐久性を改善できるため、プラスチック基板等、ガラス基板以外の基板材料上でも構造を作製できる。
【００２９】
また、白色光源の下で、センシング用チップ表面をスマートフォン又は一般のデジタルカメラ等により撮像して、色相の変化を検出することにより、簡単に且つ安価に標的物質の高感度検出が可能である。したがって、感染症対策として、空港、港湾での迅速診断、被災地での簡便診断等に適用することができる。また、環境科学の分野では、水質や土壌の検査等に応用することもできる。スマートフォンが使用可能な環境であれば屋内外を問わず、撮像した画像をサーバに送信して色相差を算出することにより、又は、スマートフォンに搭載されているアプリケーションプログラムにより色相差を算出することにより、リアルタイムでのモニタリングが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の実施の形態に係るセンシング用チップの構造を模式的に示す断面図である。
【図２】図１のセンシング用チップの製造方法を示す断面図である。
【図３】図１のセンシング用チップの製造方法に関し、図２に続く工程を示す断面図である。
【図４】図１のセンシング用チップの製造方法に関し、図３に続く工程を示す断面図である。
【図５】図１のセンシング用チップの製造方法に関し、図４に続く工程を示す断面図である。
【図６】ポリスチレンビーズが密に配置された状態を示すＡＦＭ（Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）像である。
【図７】図１のセンシング用チップを用いた検出方法を示す模式図である。
【図８】測定装置の概略構成を示すブロック図である。
【図９】図１のセンシング用チップに標的物質及び表面修飾された金属ナノ微粒子を投入した状態を示す模式図である。
【図１０】標的物質及び表面修飾された金属ナノ微粒子を投入した後のセンシング用チップを用いた検出方法を示す模式図である。
【図１１】色相環の例を示す図である。
【図１２】図２と異なる構成を示す断面図である。
【図１３】反射光強度の測定結果を示すグラフである。
【図１４】Ｒｃ３０の割合を変えて共鳴波長の時間変化を測定した結果を示すグラフである。
【図１５】図１４の測定結果から得られた検量線を示すグラフである。
【図１６】複数の測定スポットの形成方法を示す斜視図である。
【図１７】複数の測定スポットが形成されたチップを示す平面図である。
【図１８】作製した複数の測定スポットを有するチップを示す写真である。
【図１９】図１８のチップを用いた測定方法を示す斜視図である。
【図２０】図１８のチップを用いた測定結果（シフト量Δλ）を示すグラフである。
【図２１】図１８のチップを用いた測定結果（色相角の変化ΔＨｕｅ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下の実施の形態では、同一の部品には同一の参照番号を付してある。それらの名称及び機能も同一である。したがって、それらについての詳細な説明は繰返さない。
【００３２】
［センシング用チップの構造］
図１を参照して、本発明の実施の形態に係るセンシング用チップ１００は、ベース基板１０２と、ベース基板１０２の上に配置された複数の球体１０４と、複数の球体１０４の上に形成された金属層１０６と、金属層１０６の上に形成された接着層１０８と、接着層１０８の上に配置された複数の捕捉体１１０とを備えて構成されている。ベース基板１０２は、ガラス、プラスチック等で形成された平板である。ベース基板１０２は、高分子フィルム等で形成されていてもよい。
【００３３】
球体１０４は、直径が約０．２μｍ〜２．０μｍの粒子であり、例えば、ポリスチレンで形成されたビーズ（以下、ＰＳビーズともいう）である。複数の球体１０４は、略同じ粒径の粒子であって、間隔を空けずに最密構造に配置されることが好ましい。但し、一部の領域で最密構造が形成されていなくてもよい。図１では、複数の球体１０４がベース基板１０２の上に１層に配置された状態を示しているが、これに限定されない。複数の球体１０４が複数層に形成されていてもよい。また、一部の球体１０４が、層上に突出して配置されていてもよい。
【００３４】
金属層１０６は、例えば金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）又はアルミニウム（Ａｌ）等のＳＰＲを生じる金属で、膜厚が約５０ｎｍ〜１００ｎｍに形成されている。合計の膜厚が約５０〜１００ｎｍであれば、複数の金属を組み合わせてもよい。後述するように、センシング用チップ１００の上には、ＤＮＡ等の検出対象（以下、標的物質という）を含む溶液が投入される。したがって、金属層１０６に銀を使用すると、水中で非常に不安定な銀が酸化し、金属層１０６が損傷を受けて剥離してしまう。これを防止するために、金属層１０６に銀を使用する場合には、金属層１０６の上に保護層を形成することが好ましい。保護層は、水中で化学的に安定でありかつＳＰＲを生じる金属が好ましく、例えば金で、膜厚が約３ｎｍ〜１０ｎｍに形成される。保護層を金属以外の部材で形成することも考えられるが、局在型表面プラズモンの双極子相互作用によるセンサでは、金属ナノドーム構造の金属層の表面と、金ナノ微粒子の金表面の距離がセンサ感度に大きく影響すると考えられるので、保護層にはプラズモン特性を持つ金属を使うことが好ましい。球体１０４及び金属層１０６により形成された構造（保護層が形成される場合には保護層をも含む）を、金属ナノドームアレイともいう。
【００３５】
接着層１０８は、捕捉体１１０を接着（吸着）して、金属層１０６の近傍に捕捉体１１０を安定して位置させるための部材である。接着層１０８は、例えばドーパミン（Ｃ８Ｈ１１ＮＯ２）が重合したポリドーパミンである。接着層１０８には、アルキル鎖末端に機能性部位を有するアルカンチオールの自己組織化単分子膜も利用可能である。ただし、捕捉体１１０が直接的に金属層１０６に接着する場合もあるので、接着層は不可欠なものではない。
【００３６】
捕捉体１１０は、標的物質を捕捉するための部材である。捕捉体１１０は、例えば標的物質に特異吸着する部分を有する分子である。
【００３７】
［センシング用チップの製造方法］
センシング用チップ１００の製造方法に関して説明する。ここでは、複数の球体１０４に同一粒径のＰＳビーズを使用するとする。
【００３８】
・ステップ１：球体１０４の層を公知のスピンコート法により形成する。即ち、ＰＳビーズ水溶液にエタノールを投入し攪拌した後、その混合溶液を、ベース基板１０２表面の回転の中心位置に滴下する。溶液滴下後にベース基板１０２を回転させると、遠心力により、図２に示すように、ベース基板１０２の表面に球体１０４の最密構造の層が形成される。
【００３９】
・ステップ２：ベース基板１０２の上に形成された球体１０４の層の上に、金、銀又はアルミニウム等のターゲットを用いて、公知のＲＦスパッタ法により金属層１０６を形成する。ＲＦスパッタ法は、例えば数ＭＨｚ以上の高周波を使用することで、絶縁物の表面にも金属膜を形成することができる。図３に示すように、球体１０４の上側表面（図２の半球部１１８の球面）に金属層１０６が形成される。なお、上記したように、球体１０４を銀で形成する場合には、ＲＦスパッタ法により銀の膜を形成した後、さらに、銀の膜の上に、保護層として金の膜を形成する。このとき、金の膜は、ＲＦスパッタ法により形成しても、銀の膜が導電性であるので、通常のスパッタ法により形成してもよい。
【００４０】
・ステップ３：ベース基板１０２の上に球体１０４及び金属層１０６が形成された構造体（金属ナノドームアレイ）を加熱して、ベース基板１０２と球体１０４との接着性を改善する。加熱には、例えばホットプレートを用い、約１００℃の比較的低温で、数分間加熱する。なお、加熱処理は、接着性を高めるために必要であるが、ベース基板１０２表面に球体１０４の接着層を導入した場合には、不可欠ではない。
【００４１】
・ステップ４：ステップ３に続いて、金属層１０６の上に接着層を形成する。即ち、加熱処理が終わった金属ナノドームアレイの金属層１０６を、ドーパミンを含む溶液に浸漬する。ドーパミンを含む溶液には、例えば緩衝液であるＴｒｉｓバッファー（トリスヒドロキシメチルアミノメタン、Ｃ４Ｈ１１ＮＯ３、１０ｍＭ、ｐＨ８．５）にドーパミンを投入したもの（ドーパミン濃度２ｍｇ／ｍＬ）を使用し、これに約１０分間浸漬する。これにより、ドーパミンが酸化及び重合してポリドーパミンが形成され、図４に示すように、金属層１０６の表面がポリドーパミンによりコーティングされ、接着層１０８が形成される。
【００４２】
・ステップ５：ステップ４に続いて、金属ナノドームアレイの上に形成された接着層１０８の上に捕捉体１１０を配置する。例えば、標的物質に特異吸着する分子を所定量、燐酸緩衝液（以下、ＰＢＳともいう）に投入して生成した溶液に、金属ナノドームアレイの接着層１０８を浸漬する。これにより、図５に示すように、接着層１０８の上に捕捉体１１０が配置され、センシング用チップ１００が作製される。金ナノ微粒子の非特異吸着を予防するために、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等でブロッキングを行なっても良い。
【００４３】
ＰＳビーズを用いて、上記したようにスピンコート法により球体１０４の層を形成した結果を図６に示す。図６の（ａ）〜（ｃ）はそれぞれ、粒径が０．２μｍ、０．３５μｍ及び０．５μｍのＰＳビーズを用いて形成した構造の原子間力顕微鏡による画像（ＡＦＭ像）である。図６から、ＰＳビーズがほぼ最密構造に配列されていることが分かる。
【００４４】
［センシング用チップを用いた第１の検出方法］
図１に示したセンシング用チップ１００を用いて、標的物質を検出する方法を説明する。検出には、上記したセンシング用チップ１００に加えて、標的物質（例えば、ＤＮＡ）に特異吸着する認識体（例えば、ＤＮＡ）で表面が修飾された金属ナノ微粒子を用いる。金属ナノ微粒子は、例えば、粒径約１５ｎｍの金の粒子である。金属ナノ微粒子はこれに限定されず、局在型プラズモン共鳴を生じる金属で、共鳴波長が約５００ｎｍ〜５５０ｎｍであるナノオーダの粒子（例えば、粒径約１０ｎｍ〜１００ｎｍ）であればよい。球形の粒子でなくてもよい。表面が認識体で修飾された金属ナノ微粒子を生成する方法には、例えばクエン酸等で保護された金属ナノ微粒子のキャッピング剤の置換反応等がある。機能性部位を有するアルカンチオールで金属ナノ微粒子を被覆した後に、標的物質を認識する認識体（抗体）等を結合させる方法が用いられる。チオール基末端の一本鎖ＤＮＡを置換反応によって直接、金ナノ微粒子に結合させることも可能である。
【００４５】
・ステップ１：図７に示すようにセンシング用チップ１００に光Ｌinを照射してその反射光Ｌrefの強度を測定する。図８を参照して、測定装置は、光源２００と、コンデンサ２０２及び２１４と、光ファイバケーブル２０４及び２１６と、コリメータ２０６と、アパーチャ２０８と、ビームスプリッタ２１０と、集光レンズ２１２と、分光光度計２１８とを含む。
【００４６】
光源２００は、白色光源であり、例えばタングステンハロゲンランプである。光源２００はこれに限定されない。光源２００の放射スペクトルに、センシング用チップ１００に照射した場合に、局在型プラズモン共鳴が発生する波長が含まれていればよい。光源２００は、４００ｎｍ〜７００ｎｍの波長成分を含んでいることが好ましい。光源２００にＬＥＤ光源を使用することもできる。
【００４７】
光源２００から出力された光はコンデンサ２０２に入力され、コンデンサ２０２により集光されて、光ファイバケーブル２０４に入力する。光ファイバケーブル２０４に入力された光は、コリメータ２０６まで伝搬され、コリメータ２０６により平行光として出力される。コリメータ２０６から出力された平行光は、アパーチャ２０８により絞られ、所定の広がり範囲の光束がビームスプリッタ２１０に入射する。ビームスプリッタ２１０は、入射される光の経路を分離する装置であり、一部の光を透過させ、残りの光を反射する。ビームスプリッタ２１０は、例えばハーフミラーである。ビームスプリッタ２１０を透過した光は、集光レンズ２１２により集束されて、図７のＬinで示すように、センシング用チップ１００に照射される。センシング用チップ１００に入射した光の一部は反射される。反射された光は集光レンズ２１２を介してビームスプリッタ２１０に入射され、コンデンサ２１４の方向に反射される。コンデンサ２１４に入力した光は集光され、光ファイバケーブル２１６により伝搬され、分光光度計２１８に入力される。分光光度計２１８は、入力される光を測定し、例えばスペクトルを生成する。図７に示したセンシング用チップ１００に入射された光Ｌinは、特定の波長においてセンシング用チップ１００の金属層１０６により局在型表面プラズモン共鳴が発生し、反射光Ｌrefの強度が低下する。したがって、後述するように、分光光度計２１８により測定される反射スペクトルは、特定の波長（局在型表面プラズモン共鳴波長）で反射強度が極小となる。
【００４８】
・ステップ２：標的物質１１６を例えばＰＢＳに投入し、その溶液をセンシング用チップ１００の上に投入（滴下）する。標的物質を一定時間（例えば、１０〜６０分程度）かけて捕捉体１１０に結合させた後に、センシング用チップをＰＢＳで洗浄する。続いて、認識体１１４で表面が修飾された金属ナノ微粒子１１２を、例えばＰＢＳに投入し、その溶液をセンシング用チップ１００の上に投入（滴下）する。図９に、標的物質１１６に特異吸着する認識体１１４で表面が修飾された金属ナノ微粒子１１２が、センシング用チップ１００の上に投入された状態を模式的に示す。図９には、標的物質１１６及び認識体１１４が結合した状態（図９の左側の１点鎖線参照）、及び、標的物質１１６が、認識体１１４とセンシング用チップ１００の捕捉体１１０とに結合した状態（図９の中央の１点鎖線参照）を示す。図９に示した状態のセンシング用チップ１００をＰＢＳでリンス（洗浄）し、捕捉体１１０に結合していない、認識体１１４で修飾された金属ナノ微粒子１１２を除去する。リンス後、認識体１１４及び標的物質１１６を介して捕捉体１１０に結合している金属ナノ微粒子１１２は、センシング用チップ１００の上に残る。即ち、標的物質１１６の量（濃度）に応じた量の金属ナノ微粒子１１２が、金属層１０６の近傍に位置することになる。
【００４９】
・ステップ３：ステップ１と同様に、図８に示した測定装置を用いて、図１０に示すように、金属ナノ微粒子１１２が残存するセンシング用チップ１００の上に光Ｌinを照射してその反射光Ｌrefの強度を測定する。図７に示したセンシング用チップ１００と同様に、図１０に示したセンシング用チップ１００においても、局在型表面プラズモン共鳴が発生し、反射光Ｌrefの強度が低下する。したがって、分光光度計２１８により測定される反射スペクトルは、特定の波長で反射強度が極小となる。しかし、反射光Ｌrefの強度が極小となる波長（局在型表面プラズモン共鳴波長）は、図７に示したセンシング用チップ１００の場合と異なる。即ち、実施例として後述するように、反射光Ｌrefの強度が極小となる波長がシフトする。これは、局在型プラズモン共鳴の波長は、局在型プラズモン共鳴の発生源となる金属、その構造（形状及び大きさ）、及び周囲の電気的特性（誘電率等）により異なるからである。また、図１０に示したセンシング用チップ１００では、金属層１０６により発生する局在型表面プラズモン共鳴に加えて、センシング用チップ１００の上に残存している金属ナノ微粒子１１２によっても局在型プラズモン共鳴が発生し、金属層１０６により発生する局在型表面プラズモン共鳴との相互作用が生じると考えられる。したがって、ステップ１及び３で測定された反射光Ｌrefの強度が極小となる波長の差（波長のシフト量）を求める。これにより、標的物質を検出することができる。
【００５０】
後述する実験結果から、金属ナノ微粒子の局在型プラズモン共鳴波長が、金属ナノ構造体（金属層１０６の構造）の局在型表面プラズモン共鳴波長に近似することが好ましい。即ち、センサ基板上の金属ナノ構造体（金属層１０６の構造）の局在型表面プラズモン共鳴の共鳴曲線のピーク（共鳴波長に対応）の半値幅の範囲に、金属ナノ微粒子の共鳴波長が存在していることが好ましく、両者の差は、１００ｎｍ以下であることが好ましい。両者が同じ値であることが最も好ましい。
【００５１】
［センシング用チップを用いた第２の検出方法］
また、センシング用チップ１００の上に金属ナノ微粒子１１２が存在するか否か、またどの程度の量存在するかにより、反射光Ｌrefの色（色相）も変化するので、色相の変化を観測することによって、標的物質を検出することができる。即ち、第２の検出方法では、第１の検出方法と同様に、図１に示したセンシング用チップ１００と、標的物資に特異吸着する認識体で表面が修飾された金属ナノ微粒子を用いて、第１の検出方法のステップ１及び３の代わりに、それぞれ次のステップ１’及び３’を実行する。ステップ１’及び３’の間には、上記のステップ２を実行する。
・ステップ１’：図７に示したように、センシング用チップ１００に白色光Ｌinを照射した状態でセンシング用チップ１００の表面を撮影し、その色相を求める。
・ステップ３’：図１０示したように、上記のステップ２を実行した後のセンシング用チップ１００に白色光Ｌinを照射した状態でセンシング用チップ１００の表面を撮影し、その色相を求め、それらの色相に有意な差があるか否かを判定する。有意な差があれば、標的物質を検出できたことになる。
【００５２】
具体的には、図７及び図１０に示したそれぞれの状態で、センシング用チップ１００の表面をデジタルカメラ、スマートフォンのカメラ等により撮影し、撮影された画像データのＲＧＢ値を求め、ＲＧＢ値から色相角Ｈｕｅを求める。
【００５３】
図１１に色相環の例を示す。図１１に示した色相環では、赤（（Ｒ，Ｇ，Ｂ）＝（２５５，０，０））が色相角Ｈｕｅの基準（Ｈｕｅ＝０）であり、Ｈｕｅ＝２π／３に緑（（Ｒ，Ｇ，Ｂ）＝（０，２５５，０））が位置し、Ｈｕｅ＝４π／３に青（（Ｒ，Ｇ，Ｂ）＝（０，０，２５５））が位置している。０＜Ｈｕｅ＜π／３  の間では、Ｈｕｅが増大するにつれてＧ値が単調に増大し、Ｈｕｅ＝π／３で（Ｒ，Ｇ，Ｂ）＝（２５５，２５５，０）となる。π／３＜Ｈｕｅ＜２π／３  の間では、Ｈｕｅが増大するにつれてＲ値が単調に減少し、Ｈｕｅ＝２π／３で、上記したように（Ｒ，Ｇ，Ｂ）＝（０，２５５，０）（緑）となる。２π／３＜Ｈｕｅ＜π  の間では、Ｈｕｅが増大するにつれてＢ値が単調に増大し、Ｈｕｅ＝πで（Ｒ，Ｇ，Ｂ）＝（０，２５５，２５５）となる。π＜Ｈｕｅ＜４π／３  の間では、Ｈｕｅが増大するにつれてＧ値が単調に減少し、Ｈｕｅ＝４π／３で、上記したように（Ｒ，Ｇ，Ｂ）＝（０，０，２５５）（青）となる。４π／３＜Ｈｕｅ＜５π／３  の間では、Ｈｕｅが増大するにつれてＲ値が単調に増大し、Ｈｕｅ＝５π／３で（Ｒ，Ｇ，Ｂ）＝（２５５，０，２５５）となる。５π／３＜Ｈｕｅ＜２π  の間では、Ｈｕｅが増大するにつれてＢ値が単調に減少し、Ｈｕｅ＝２π（即ちＨｕｅ＝０）で、上記したように（Ｒ，Ｇ，Ｂ）＝（２５５，０，０）（赤）となる。
【００５４】
画像データから求めたＲＧＢ値から、図１１に示した色相環における色相角Ｈｕｅは、以下のアルゴリズム（ステップ１〜６）により求めることができる。
ステップ１：Ｖ＝ｍａｘ（Ｒ，Ｇ，Ｂ）と定義する。ｍａｘは最大値を意味する。
ステップ２：Ｘ＝ｍｉｎ（Ｒ，Ｇ，Ｂ）と定義する。ｍｉｎは最小値を意味する
ステップ３：Ｓ＝（Ｖ−Ｘ）／Ｖを求め、Ｓ＝０の場合、色相角度なし（Ｒ＝Ｇ＝Ｂとなり、色はモノトーン）とする。
ステップ４：ｒ＝（Ｖ−Ｒ）／（Ｖ−Ｘ）、ｇ＝（Ｖ−Ｇ）／（Ｖ−Ｘ）、ｂ＝（Ｖ−Ｂ）／（Ｖ−Ｘ）と定義する。
ステップ５：もしＲ＝Ｖ（Ｒ値が最大値）となる場合、Ｇ＝Ｘ（Ｇ値が最小値）であれば、Ｈ＝(５＋ｂ)とし、それ以外であれば、Ｈ＝（１−ｇ）とする。もしＧ＝Ｖ（Ｇ値が最大値）となる場合、Ｂ＝Ｘ（Ｂ値が最小値）であれば、Ｈ＝（１＋ｒ）とし、それ以外であれば、Ｈ＝（３−ｂ）とする。その他の場合、Ｒ＝Ｘ（Ｒ値が最小値）であれば、Ｈ＝（３＋ｇ）とし、それ以外であれば、Ｈ＝（５−ｒ）とする。
ステップ６：Ｈｕｅ＝６０＊Ｈとする。
上記の色相角度の求め方は、上記の非特許文献８を参照した。なお、色相角度Ｈｕｅの算出方法は、上記の方法に限定されず、公知の算出法を使用することができる。
したがって、図８に示した状態で、センシング用チップ１００の表面を撮影して得られた画像上の複数の点で色相角Ｈｕｅを求め、同様に、図９に示した状態で、センシング用チップ１００の表面を撮影して得られた画像上の複数の点で色相角Ｈｕｅを求め、得られた色相角Ｈｕｅの２つのグループに、統計的に有意差があるか否かを判定することにより、標的物質が検出されたか否かを判定することができる。色相角Ｈｕｅを測定に用いる場合は、金属ナノ微粒子と基板側の金属ナノドームアレイの色相角度の差は６０度以下が好ましい。これは、金属構造体（金属ナノドームアレイ）と金属ナノ微粒子の共鳴ピーク波長の差に関する上記の限定（１００ｎｍ以下）に対応する。
【００５５】
また、標的物質の有無の検出に加えて、標的物質の濃度を検出することも可能である。後述するように、センシング用チップ１００の捕捉体１１０が標的物質１１６に結合し、標的物質１１６が認識体１１４に結合することにより、金属ナノ微粒子１１２がセンシング用チップ１００の金属層１０６近傍に位置することになる。そして、金属層１０６の近傍に位置する金属ナノ微粒子１１２の量（個数）に応じて、シフト量Δλは変化し、色相の差（色相角Ｈｕｅの差ΔＨｕｅ）も変化する。即ち、金属層１０６の近傍に位置する金属ナノ微粒子１１２の量が多いほど、シフト量Δλは増大し、色相角Ｈｕｅの差ΔＨｕｅは大きくなる。したがって、Δλ又はΔＨｕｅを測定することにより、金属層１０６の付近に位置する金属ナノ微粒子１１２の量、即ち標的物質の量を求めることができる。
【００５６】
また、後述するように、１つのチップに、図１に示した構造の測定部を複数形成すれば、同じサンプル又は異なるサンプルを同時に測定することができる。各測定部に固定する捕捉体の種類、及びその割合は任意である。複数の測定部に、同じ種類の捕捉体を固定しても、測定部毎に、異なる種類の捕捉体を固定してもよい。
【００５７】
例えば、複数の測定部に、同じ種類の捕捉体を同程度の割合で固定する場合、異なるサンプルに関して、特定の標的物質の検出を同時に行なうことができ、効率的であり、高いスループットを実現できる。また、同じサンプルに関して、特定の標的物質の検出をより高精度に行なうことができる。測定部毎に、異なる種類の捕捉体を同じ割合で固定する場合、同じサンプルに関して、異なる標的物質の検出を同時に行なうことができ、効率的である。
【００５８】
球体１０４は、ポリスチレンに限定されない。誘電物質で形成されていればよい。
【００５９】
上記では、スピンコート法により、ベース基板１０２の上に球体１０４を配置する場合を説明したが、これに限定されない。例えば、スプレー法により、ベース基板１０２に、球体１０４を含む溶液を吹付けて、ベース基板１０２の上に球体１０４を配置してもよい。
【００６０】
上記では、ベース基板１０２の上に球体１０４を最密構造に配置する場合を説明したが、これに限定されない。図１２に示すように、所定の大きさの凸部１２２が形成されていればよく、スタンパー（型）を用いたプレス成型法又は射出成型法、モールド（型）を用いた熱ナノインプリント法、モールドを用いた光硬化樹脂による光ナノインプリント法等、公知の方法によって形成することもできる。
【００６１】
測定装置の構成は、図１０に限定されない。局在型プラズモン共鳴波長を含む光を放射することができる光源と、センシング用チップからの反射光を測定することができる装置（撮像装置を含む）とを含んでいればよい。
【００６２】
標的物質は、ＤＮＡに限定されない。ＲＮＡ、マーカー、蛋白質、ウイルス、病原性細菌、毒素等を標的物質とすることができる。捕捉体１１０と、金属ナノ微粒子１１２を修飾する認識体１１４との組合せは、それぞれが標的物質の異なる部位に結合する適切なものを使用すればよい。
【実施例１】
【００６３】
以下に実験結果を示し、本発明の有効性を示す。図１に示した構造のセンシング用チップを、上記した製造方法で作製した。粒径φが０．２μｍのＰＳビーズを、スピンコート法によりガラスのベース基板上に配置し、その上にＲＦスパッタ法により、膜厚５０ｎｍの銀の金属層を形成し、さらにその上に保護層として膜厚８ｎｍの金の層を形成した。続いて、ドーパミンをＴｒｉｓに投入して生成した溶液（ドーパミン濃度２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ８．５）に、金の保護層を約１０分間浸漬し、金の保護層の上をポリドーパミンでコーティングし、接着層とした。さらに、１本鎖ＤＮＡであるＲｃ３０をＰＢＳに投入して生成した溶液（Ｒｃ３０の濃度１００μＭ）に、接着層（ポリドーパミン）を一晩浸漬して、接着層の上にＲｃ３０を固定した。
【００６４】
金属ナノ微粒子には、粒径が約１５ｎｍの金を用い、その表面を１本鎖ＤＮＡであるＡｃ３０で修飾した。具体的には、金ナノ微粒子の濃度１０ｎＭの溶液１ｍＬ（ＰＢＳ）に、Ａｃ３０の濃度１ｍＭの溶液１０μＬ（ＰＢＳ）を投入し、３７℃の環境で４８時間静置し、その後、遠心分離により精製して、Ａｃ３０で修飾された金ナノ微粒子の濃度を約３ｎＭに調整した。
【００６５】
Ｒｃ３０及びＡｃ３０は、それぞれ次の塩基配列で表される相補的なＤＮＡであり、ハイブリダイズ（以下、結合ともいう）する。
Ｒｃ３０：  5’-NH2-(CH2)12-CGAAATCCAGACACATAAGCACGAACCGAA-3’
Ａｃ３０：  5’-SH-(CH2)6-TTCGGTTCGTGCTTATGTGTCTGGATTTCG-3’
【００６６】
作製したセンシング用チップに対して、図８に示した構成の測定装置で、図７に示したように白色光を照射し、その反射光強度のスペクトルを分光光度計で測定した。また、作製したセンシング用チップに、Ａｃ３０で修飾された金属ナノ微粒子を投入して、Ｒｃ３０とＡｃ３０とを結合させ、ＰＢＳで洗浄した後、図１０に示したように白色光を照射し、その反射光強度のスペクトルを分光光度計で測定した。なお、ここでは、接着層の上に固定したＲｃ３０自体が、標的物質である。このようなサンドイッチアッセイでは、標的となるＤＮＡ（ＤＮＡ−Ｓという）の約半分とＤＮＡハイブリダイゼーションを起こすＤＮＡ（ＤＮＡ−Ａという）を基板に固定化する。そこにＤＮＡ−Ｓ（標的物質）を含む試料を接触させ、ＤＮＡ−Ｓが基板表面のＤＮＡ−Ａとハイブリダイゼーションにより結合する。その後、ＤＮＡ−Ｓの残り半分に相補的なＤＮＡ（ＤＮＡ−Ｂという）で修飾された金属ナノ微粒子を導入し、信号検出を行なう。即ち、Ｒｃ３０は、ＤＮＡ−ＡにＤＮＡ−Ｓ（標的物質）が結合した複合体を模している。
【００６７】
測定結果を図１３に示す。ＰＢＳ中の、Ａｃ３０で修飾された金ナノ微粒子の濃度は３ｎＭであった。図１３において、横軸（Wavelength）は反射光の波長であり、縦軸（Reflectivity）は、各波長における反射光強度（入射光の強度に対する比率）である。Ｒｃ３０と付した破線のグラフは、作製したセンシング用チップのみを用いて測定して得られた反射スペクトルである。Ｒｃ３０−ＡｕＮＰｓと付した実線のグラフは、Ａｃ３０で修飾された金属ナノ微粒子を投入したセンシング用チップを用いて測定して得られた反射スペクトルである。これから分かるように、反射スペクトルの極小値の位置（波長の値）が大きくシフトしている。シフト量Δλは、約４２ｎｍであった。局在型表面プラズモン共鳴の強度の観点からは、反射スペクトルが極小値となる波長は、局在型表面プラズモン共鳴曲線のピーク波長（共鳴波長）と言える。図１３の値（Reflectivity）から、１−Reflectivityで得られるグラフ（共鳴曲線）を作成すると、実線のグラフから作成した共鳴曲線における金属ナノ微粒子の局在型プラズモン共鳴波長は、破線のグラフから作成した金属層の局在型表面プラズモン共鳴曲線の半値幅の範囲に収まっている。即ち、金属ナノ微粒子の局在型プラズモン共鳴のピーク波長と、金属層の局在型表面プラズモン共鳴のピーク波長との差は１００ｎｍ以下である。
【００６８】
なお、基板の金属ナノ構造体（金属層）と金属ナノ微粒子の局在プラズモンの相互作用を起こさせるためには、共鳴のピーク波長の差そのものよりも、双方の共鳴曲線にどれだけの重ね合わせがあるかも重要であると考えられる。半値幅の小さいシャープな共鳴曲線をもつ構造では、共鳴ピーク波長の差が小さくても、局在プラズモンの相互作用が起こりにくいことが想定される。したがって、上記したように共鳴曲線の形状（半値幅）に関する条件を満たすこと、即ち、金属ナノ微粒子の局在型プラズモン共鳴のピーク波長は、金属層の局在型表面プラズモン共鳴の共鳴曲線のピークの半値幅の範囲に収まっていることが、より好ましい。
【００６９】
また、色相の変化も大きかった。作製したセンシング用チップのみに白色光を照射して、デジタルカメラで撮像した画像から求めた色相角（約７度）と、Ａｃ３０で修飾された金属ナノ微粒子を投入したセンシング用チップに、同じ光源の白色光を照射して、同じデジタルカメラで撮像した画像から求めた色相角（約２０７度）との差は、約１６０度（反時計回り）であった。
【実施例２】
【００７０】
実施例１と異なる粒径のＰＳビーズを用いて、実施例１と同様に、センシング用チップ、及び、認識体（Ａｃ３０）で修飾した金属ナノ微粒子（金）を作製し、同様の反射スペクトルを測定した。使用したＰＳビーズの粒径は、０．３５μｍ及び０．５μｍである。また、金属層に金を用いて、実施例１と同様に、粒径が０．２μｍのＰＳビーズを用いたセンシング用チップ、及び、認識体（Ａｃ３０）で修飾した金属ナノ微粒子を作製し、同様に反射スペクトルを測定した。金属層（金）の膜厚は約５０ｎｍである。金属層を金で形成したので、実施例１とは異なり、保護層（膜厚８ｎｍの金）は形成していない。
【００７１】
検出結果を表１に示す。なお、最上位の行は、実施例１の値を示す。金属層の膜厚はいずれも５０ｎｍである。λは、センシング用チップのみで測定して得られた反射スペクトルにおける極小値の波長（局在型表面プラズモン共鳴波長）である。Δλは、Ａｃ３０で修飾された金属ナノ微粒子を投入したセンシング用チップを用いて測定して得られた反射スペクトルにおける極小値の波長とλとの差である。それぞれのＰＳビーズ直径に関して複数回の測定を行なった。測定結果のバラツキを標準偏差で示している。
【００７２】
【表１】
2019203818.tif 000003
【００７３】
表１から分かるように、金属層に銀を使用した場合、ＰＳビーズ径が小さいほど、波長λ（局在型表面プラズモン共鳴波長）が小さく、波長λが金属ナノ微粒子の局在型プラズモン共鳴波長（粒径約１５ｎｍの金の場合５２５ｎｍ）に近付くほど、シフト量Δλは大きい。シフト量Δλを観測するには、波長λは、局在型表面プラズモン共鳴の測定で従来使用される近赤外領域よりも短波長であることが好ましい。また、金属層として銀を使用した場合と、金を使用した場合とを比較すると、銀を使用した場合の方が、波長λが小さく、シフト量Δλは大きい。
【実施例３】
【００７４】
検出限界を見積るために、Ｒｃ３０の割合を変えて、上記と同様の実験を行なった。即ち、実施例１と同様のセンシング用チップを作製したが、接着層の上には２種類の１本鎖ＤＮＡ（Ｒｃ３０及びＴ３０）を種々の混合比で固定した。実施例１と同様に、金属ナノ微粒子には、粒径が約１５ｎｍの金を用い、その表面を１本鎖ＤＮＡであるＡｃ３０で修飾した。
【００７５】
Ｔ３０は次の塩基配列で表され、Ｒｃ３０及びＡｃ３０のいずれともハイブリダイズしない。
Ｔ３０：  5’-NH2-(CH2)12-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’
金のナノ微粒子を修飾しているＡｃ３０は、センシング用チップの接着層の上に固定されたＲｃ３０及びＴ３０のうち、Ｒｃ３０とのみ結合する。したがって、Ｒｃ３０及びＴ３０の混合比（モル比）を変化させて、Ｒｃ３０が基板表面の接着層に結合する割合である被覆率を変化させることにより、センシング用チップに固定される金のナノ微粒子の量を変化させることができる。後述するように、被覆率を濃度に換算することができるので、Ｒｃ３０及びＴ３０の混合比（モル比）を変化させることは、モデルの標的物質であるＲｃ３０の濃度を変化させることに相当する。
【００７６】
Ｒｃ３０の割合を変えて行なった測定結果を図１４に示す。縦軸は、反射強度が極小となる波長λのシフト量Δλ（ｎｍ）を表し、横軸は時間（分）を表す。ＤＮＡ−ＡｕＮＰｓを付した矢印で示した時刻に、Ｒｃ３０及びＴ３０を固定したセンシング用チップに、Ａｃ３０で修飾した金属ナノ微粒子を投入した。４本のグラフは、上から順に、Ｒｃ３０の割合が０．１％、０．０１％、０．００２５％及び０％（Ｔ３０の割合が９９．９％、９９．９９％、９９．９９７５％及び１００％）である場合の測定結果である。
【００７７】
また、図１５は、図１４に示した測定結果から求めたＲｃ３０の割合（％）とΔλ（ｎｍ）との関係を表す検量線を示す。算出には、Ｒｃ３０及びＴ３０の混合溶液に、Ａｃ３０で修飾した金属ナノ微粒子を投入してから約４０分経過後の値（Δλ）を使用した。各濃度で複数回行なった測定結果のバラツキ（標準偏差）をエラーバーで示している。
【００７８】
図１４及び図１５から分かるように、Ａｃ３０で修飾した金属ナノ微粒子を投入してからの経過時間が同じであれば、Ｒｃ３０の割合（％）が高いほど、Δλは大きい。また、Ｒｃ３０の割合が０．００２５％と低くても、有意にΔλを検出できた。
【００７９】
接着層の上に固定されるＲｃ３０の割合（被覆率）から、Ｒｃ３０によるＡｃ３０の検出限界濃度を見積った。検出限界のＡｃ３０の溶液中の濃度Ｃは、ＤＮＡハイブリダイゼーションの結合係数Ｋadsを用いて被覆率θから、換算式  Ｃ＝θ／Ｋads  により見積ることができることが知られている。ここで、Ｋads＝１×１０８Ｍ−１である。したがって、Ｒｃ３０の割合０．００２５％（θ＝２．５×１０−５）に対応する濃度Ｃは２５０ｆＭになる。この値は、後述するように、非特許文献４に開示されている近赤外の波長を用いて測定した標的ＤＮＡの検出可能濃度である５０ｐＭの１／２００であり、従来の検出方法と比較して非常に高感度であることが分かる。なお、図１５に示した検量線を用いれば、測定により得られたΔλから被覆率（Ｒｃ３０の割合）が得られ、その被覆率を用いて上記の換算式により標的物質の濃度を算出することができる。
【実施例４】
【００８０】
ベース基板上に配置したＰＳビーズ上への金属薄膜の成膜時に、マスクを用いて複数の測定部（以下、測定スポットともいう）を形成して、上記と同様の実験を行なった。具体的には、図１６を参照して、ベース基板１０２にスピンコート法により球体１０４を配置した後、その上から、５つの円形の開口部３０２が形成されたマスク３００を配置して、スパッタ法により金属層を形成し、その後、マスク３００を取り除いた。これにより、球体１０４の層の上に５つの円形の金属層領域が形成された。さらに、実施例３と同様に、各円形の金属層領域の上に、Ｒｃ３０及びＴ３０を種々の混合比で固定した。図１７に示す測定スポット（１本鎖ＤＮＡが固定された金属層）Ａ〜ＧにおけるＲｃ３０及びＴ３０の混合比（モル比）を表２に示す。
【００８１】
【表２】
2019203818.tif 000004
【００８２】
作製した複数の測定スポットを有するチップ（以下、マルチチップともいう）の写真を図１８に示す。各測定スポットの大きさは、直径約２ｍｍである。このマルチチップと、実施例１と同様に作製した、表面がＡｃ３０で修飾された金のナノ微粒子とを用いて、上記と同様に、分光光度計により反射スペクトルを測定した。また、各測定スポットにおける色相の変化を観測するために、図１９に示すように、マルチチップ３１０を撮影した。具体的には、白色光源からの光Ｌinでマルチチップ３１０を照射し、デジタルカメラ３１２で撮影して、画像データを取得した。
【００８３】
測定した反射スペクトルから求めたシフト量Δλ（ｎｍ）を、Ｒｃ３０の割合（％）に対してプロットした結果を図２０に示す。測定では、金ナノ微粒子の導入前に全ての測定スポットで反射率を測定し、金ナノ微粒子を導入し、４０分経過してリンスをした後に、再度全ての測定スポットで反射率測定を行なった。図２０から分かるように、Ｒｃ３０の割合が大きくなるにつれて、シフト量Δλは大きくなる。図２０に示した曲線は、シフト量Δλ及びＲｃ３０の割合から求めた検量線である。これから、シフト量Δλによる検出限界値として約０．０１％が得られた。図２０に示した検量線を用いれば、測定により得られたΔλから被覆率（Ｒｃ３０の割合）が得られ、その被覆率を用いて上記の換算式により標的物質の濃度を算出することができる。
【００８４】
表面がＡｃ３０で修飾された金のナノ微粒子をマルチチップに投入する前後で、マルチチップの表面を撮影して得られた画像データを、公知の画像解析ソフトＩｍａｇｅＪを用いて処理した。各測定スポットに関して、ＲＧＢ値を求め、そのＲＧＢ値から色相角Ｈｕｅを求めた。その後、表面がＡｃ３０で修飾された金のナノ微粒子をマルチチップに投入して、同様に撮影して得られた画像データから、ＲＧＢ値及び色相角Ｈｕｅを求めた。そして、Ａｃ３０で修飾された金のナノ微粒子をマルチチップに投入する前後での色相角の差ΔＨｕｅを求めた。
【００８５】
例えば、測定スポットＢに関しては、Ａｃ３０で修飾された金のナノ微粒子をマルチチップに投入する前にはＲＧＢ値は（１３０，７４，６９）、色相角Ｈｕｅは５（度）であり、投入後にはＲＧＢ値は（８６，９４，１０２）、色相角Ｈｕｅは２１１（度）であった。したがって、色相角の差ΔＨｕｅは（反時計回りに）１５４（度）であった。測定スポットＦに関しては、投入前にはＲＧＢ値は（９０，６９，７８）、色相角Ｈｕｅは３３５（度）であり、投入後にはＲＧＢ値は（１００，８８，１０４）、色相角Ｈｕｅは２８５（度）であり、色相角の差ΔＨｕｅは５０（度）であった。
【００８６】
得られた色相角の差ΔＨｕｅを、Ｒｃ３０の割合に対してプロットした結果を図２１に示す。図２１から分かるように、Ｒｃ３０の割合が大きくなるにつれて、色相角の差ΔＨｕｅは大きくなる。図２１に示した曲線は、ΔＨｕｅ及びＲｃ３０の割合から求めた検量線である。これから、色相角の差ΔＨｕｅによる検出限界値として、上記のシフト量Δλによる検出限界値と同程度の約０．０１％が得られた。上記の換算式により、Ｒｃ３０の割合０．０１％を濃度Ｃに換算すると１ｐＭになる。図２１に示した検量線を用いれば、測定により得られたΔＨｕｅから被覆率（Ｒｃ３０の割合）が得られ、その被覆率を用いて上記の換算式により標的物質の濃度を算出することができる。
【００８７】
表３に、上記の実施例１〜４での測定と、従来の検出方法とを対比して示す。表３において、Ｎｏ．１〜３にはそれぞれ、非特許文献５、４及び６に開示されている値を示す。Ｎｏ．４及び５はそれぞれ、上記の実施例３及び４の結果を示す。
【００８８】
【表３】
2019203818.tif 000005
【００８９】
Ｎｏ．１（非特許文献５）は、従来一般的に用いられているＳＰＲを用いた測定法であると言える。Ｎｏ．２（非特許文献４）は、金属構造体アレイの局在型表面プラズモンの吸収波長を測定したものであり、近赤外領域の波長が使用されている。Ｎｏ．３（非特許文献６）は、特殊な顕微鏡装置及び画像解析処理により測定されたものであり、高感度を実現している。これらと、Ｎｏ．４（実施例３）及びＮｏ．５（実施例４）の結果を比較すると、Ｎｏ．４に示した検出可能濃度は、従来一般的に用いられているＳＰＲを用いた測定法（Ｎｏ．１）による検出可能濃度の約１／４０であり、検出感度は約４０倍になっている。また、Ｎｏ．４に示した検出可能濃度は、ＬＳＰＲを用いたバイオセンサで高感度と考えられる近赤外領域の波長を用いた方法（Ｎｏ．２）による検出可能濃度の約１／２００であり、検出感度は約２００倍になっている。即ち、Ｎｏ．４（実施例３）に示した測定方法は、簡便な測定方法でありながら、特殊な光学装置を用いたＮｏ．３（非特許文献６）の感度に匹敵する高感度である。
【００９０】
また、Ｎｏ．５（実施例４）に示した測定方法は、より簡便な測定方法でありながら、従来一般的に用いられているＳＰＲを用いた測定法（Ｎｏ．１）の約１０倍、ＬＳＰＲを用いたバイオセンサで高感度と考えられる近赤外領域の波長を用いた方法（Ｎｏ．２）の約５０倍の高感度である。
【００９１】
Ｎｏ．４及び５に関して、金属層による局在型プラズモン共鳴波長は、金ナノ微粒子の局在型プラズモン共鳴波長（５２５ｎｍ）と近い値であり、局在型プラズモン共鳴同士のカップリングによる効果により、高感度を実現できたと考えられる。また、可視光領域でのスペクトル変化を検出することが、バイオセンサの感度を向上するために重要であることが分かる。
【００９２】
以上、実施の形態を説明することにより本発明を説明したが、上記した実施の形態は例示であって、本発明は上記した実施の形態のみに制限されるわけではない。本発明の範囲は、発明の詳細な説明の記載を参酌した上で、特許請求の範囲の各請求項によって示され、そこに記載された文言と均等の意味及び範囲内での全ての変更を含む。
【符号の説明】
【００９３】
１００    センシング用チップ
１０２    ベース基板
１０４    球体
１０６    金属層
１０８    接着層
１１０    捕捉体
１１２    金属ナノ微粒子
１１４    認識体
１１６    標的物質
１１８    半球部
１２２    凸部
２００    光源
２０２、２１４    コンデンサ
２０４、２１６    光ファイバケーブル
２０６    コリメータ
２０８    アパーチャ
２１０    ビームスプリッタ
２１２    集光レンズ
２１８    分光光度計
３００    マスク
３０２    開口部
３１０    マルチチップ
３１２    デジタルカメラ
【図１】
2019203818.tif 000006
【図２】
2019203818.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2019203818.tif 000019
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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