(57)【要約】【課題】新規な発酵物の製造方法及び該製造方法により得られる発酵物を含有する組成物を提供すること。【解決手段】オタネニンジン（高麗人参；Ｋｏｒｅａｎ  ｇｉｎｓｅｎｇ：Ｐａｎａｘ  Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）、三七ニンジン（Ｐａｎａｘ  ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ  Ｂｕｒｋ．）、アメリカニンジン（Ｐａｎａｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ  Ｌ．）、竹節ニンジン（Ｐａｎａｘ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）、ヒマラヤニンジン（Ｐａｎａｘ  Ｐｓｅｕｄｏ−ｇｉｎｓｅｎｇ  Ｑａｌｌ．Ｓｕｂｓｐ．Ｈｉｍａｌａｉｃｕｓ  Ｈａｒａ）及びベトナムニンジン（Ｐａｎａｘ  Ｖｕｅｔｎａｍｅｎｓｉｓ  Ｈａ  ｅｔ  Ｇｒｕｓｈｖ．）からなる群より選択される少なくとも１種のウコギ科薬用ニンジンを、ラクトバチルス属に属する乳酸菌を２種以上組み合わせて発酵させることを特徴とする、発酵物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オタネニンジン（高麗人参；Ｋｏｒｅａｎ  ｇｉｎｓｅｎｇ：Ｐａｎａｘ  Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）、三七ニンジン（Ｐａｎａｘ  ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ  Ｂｕｒｋ．）、アメリカニンジン（Ｐａｎａｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ  Ｌ．）、竹節ニンジン（Ｐａｎａｘ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）、ヒマラヤニンジン（Ｐａｎａｘ  Ｐｓｅｕｄｏ−ｇｉｎｓｅｎｇ  Ｑａｌｌ．Ｓｕｂｓｐ．Ｈｉｍａｌａｉｃｕｓ  Ｈａｒａ）及びベトナムニンジン（Ｐａｎａｘ  Ｖｕｅｔｎａｍｅｎｓｉｓ  Ｈａ  ｅｔ  Ｇｒｕｓｈｖ．）からなる群より選択される少なくとも１種のウコギ科薬用ニンジンを、ラクトバチルス属に属する乳酸菌を２種以上組み合わせて発酵させることを特徴とする、発酵物の製造方法。
【請求項２】
乳酸菌が、ラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・ブレビスから選ばれる、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
乳酸菌が、ラクトバチルス・カゼイの２種以上を含むか、又はラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・ブレビスを含む、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
乳酸菌が、ラクトバチルス・カゼイ  ハセガワ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
乳酸菌が、ラクトバチルス・カゼイ  ハセガワ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）と、ハセガワ菌株でないラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・ブレビスから選択される少なくとも１種とを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
乳酸菌が、ラクトバチルス・カゼイ  ハセガワ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）及びラクトバチルス・カゼイ  ＮＢＲＣ１５８８３株を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
乳酸菌が、ラクトバチルス・ブレビス  ＤＮＢＬ１８７１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６１）を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
乳酸菌が、ラクトバチルス・カゼイ  ハセガワ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）と、ラクトバチルス・ブレビス  ＤＮＢＬ１８７１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６１）を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
得られる発酵物が２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール  ２０−Ｏ−β−ｄ−グルコピラノサイド（Ｍ１）を含有してなる、請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法により得られる発酵物を含有してなる、組成物。
【請求項１１】
ストレス、がん及び糖尿病から選ばれる少なくとも１種の疾患又は症状の予防、改善及び／又は治療用である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
ラクトバチルス・ブレビス  ＤＮＢＬ１８７１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６１）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵物の製造方法に関する。より詳しくは、本発明は、発酵物の製造方法及び該製造方法により得られる発酵物を含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
オタネニンジン（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  Ｃ．Ａ．  Ｍｅｙｅｒ）をはじめとする薬用人参は、中国、朝鮮半島、日本を中心に古来より生薬として利用されてきた。その有用成分は、ジンセノシドと呼ばれるダラマン骨格を有したサポニン類（ニンジンサポニン）と言われ、抗酸化、抗糖尿病、抗肥満、抗高血圧、抗がん等の様々な生理作用が研究により見出されている（非特許文献１）。
【０００３】
ニンジンサポニンには種々のジンセノシドが存在することが知られている。なかでも、ジンセノシドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄのようなプロトパナキサジオールが、腸内細菌によって２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール  ２０−Ｏ−β−ｄ−グルコピラノシド（Ｍ１、ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｋ）に代謝変換された後に、腸管壁を通過して血中へ移行し、上記に示したような生理作用を発揮すると考えられている。本発明者らは、このＭ１について、乳酸菌でオタネニンジンを発酵することにより得られた発酵オタネニンジンが、マウスやヒトでの試験にて、発酵前よりもストレスが低減されること（特許文献１）、睡眠改善効果が増加することを報告している（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５２０４７７１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Journal of Ginseng Research 37, 261-268(2013)
【非特許文献２】SLEEP 32, 413-421(2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発酵オタネニンジンは、オタネニンジンを微生物により発酵させて得られるが、特許文献１には、当該微生物としては、β−グルコシダーゼ、α−アラビノシダーゼ及びα−ラムノシダーゼからなる群より選択される少なくとも１種の酵素を生産する微生物であって、好ましくは食品に添加することができる微生物であればよいとされており、具体的には、ラクトバチルス  カゼイ  ハセガワ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）を用いる製造方法が開示されている。しかしながら、Ｍ１をより効率良く製造しうる方法については、未だ検討の余地が残されていた。
【０００７】
本発明は、新規な発酵物の製造方法及び該製造方法により得られる発酵物を含有する組成物等に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、Ｍ１を効率良く製造する方法を鋭意検討した結果、ラクトバチルス属に属する乳酸菌を２種以上組み合わせてオタネニンジンを発酵することにより、Ｍ１を予想外に高含有する発酵物を製造することができること等を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、下記〔１〕〜〔１２〕に関する。
〔１〕  オタネニンジン（高麗人参；Ｋｏｒｅａｎ  ｇｉｎｓｅｎｇ：Ｐａｎａｘ  Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）、三七ニンジン（Ｐａｎａｘ  ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ  Ｂｕｒｋ．）、アメリカニンジン（Ｐａｎａｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ  Ｌ．）、竹節ニンジン（Ｐａｎａｘ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）、ヒマラヤニンジン（Ｐａｎａｘ  Ｐｓｅｕｄｏ−ｇｉｎｓｅｎｇ  Ｑａｌｌ．Ｓｕｂｓｐ．Ｈｉｍａｌａｉｃｕｓ  Ｈａｒａ）及びベトナムニンジン（Ｐａｎａｘ  Ｖｕｅｔｎａｍｅｎｓｉｓ  Ｈａ  ｅｔ  Ｇｒｕｓｈｖ．）からなる群より選択される少なくとも１種のウコギ科薬用ニンジンを、ラクトバチルス属に属する乳酸菌を２種以上組み合わせて発酵させることを特徴とする、発酵物の製造方法。
〔２〕  乳酸菌が、ラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・ブレビスから選ばれる、前記〔１〕記載の製造方法。
〔３〕  乳酸菌が、ラクトバチルス・カゼイの２種以上を含むか、又はラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・ブレビスを含む、前記〔１〕又は〔２〕記載の製造方法。
〔４〕  乳酸菌が、ラクトバチルス・カゼイ  ハセガワ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）を含む、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の製造方法。
〔５〕  乳酸菌が、ラクトバチルス・カゼイ  ハセガワ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）と、ハセガワ菌株でないラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・ブレビスから選択される少なくとも１種とを含む、前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔６〕  乳酸菌が、ラクトバチルス・カゼイ  ハセガワ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）及びラクトバチルス・カゼイ  ＮＢＲＣ１５８８３株を含む、前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の製造方法。
〔７〕  乳酸菌が、ラクトバチルス・ブレビス  ＤＮＢＬ１８７１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６１）を含む、前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の製造方法。
〔８〕  乳酸菌が、ラクトバチルス・カゼイ  ハセガワ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）と、ラクトバチルス・ブレビス  ＤＮＢＬ１８７１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６１）を含む、前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の製造方法。
〔９〕  得られる発酵物が２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール  ２０−Ｏ−β−ｄ−グルコピラノサイド（Ｍ１）を含有してなる、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１０〕  前記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の製造方法により得られる発酵物を含有してなる、組成物。
〔１１〕  ストレス、がん及び糖尿病から選ばれる少なくとも１種の疾患又は症状の予防、改善及び／又は治療用である、前記〔１０〕記載の組成物。
〔１２〕  ラクトバチルス・ブレビス  ＤＮＢＬ１８７１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６１）。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、新規な発酵物の製造方法が提供される。このような本発明の製造方法によれば、Ｍ１を効率良く製造しうる。特に、本発明によれば、Ｍ１を高含有する発酵物を製造することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ラクトバチルス属乳酸菌を２種組み合わせて共培養した時の薄層クロマトグラフィーによる発酵培地の分析結果を示す図である。
【図２】図２は、ＮＢＲＣ１５８８３株単独で培養した時の薄層クロマトグラフィーによる発酵培地の分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の発酵物の製造方法は、ウコギ科薬用ニンジンを、ラクトバチルス属に属する乳酸菌を２種以上組み合わせて発酵させることを特徴とする。
【００１３】
ウコギ科薬用ニンジンは、発酵によりＭ１を生成可能なニンジンであってもよい。
ウコギ科薬用ニンジンとしては、例えば、オタネニンジン（高麗人参；Ｋｏｒｅａｎ  ｇｉｎｓｅｎｇ：Ｐａｎａｘ  Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）、三七ニンジン（Ｐａｎａｘ  ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ  Ｂｕｒｋ．）、アメリカニンジン（Ｐａｎａｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ  Ｌ．）、竹節ニンジン（Ｐａｎａｘ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）、ヒマラヤニンジン（Ｐａｎａｘ  Ｐｓｅｕｄｏ−ｇｉｎｓｅｎｇ  Ｑａｌｌ．Ｓｕｂｓｐ．Ｈｉｍａｌａｉｃｕｓ  Ｈａｒａ）及びベトナムニンジン（Ｐａｎａｘ  Ｖｕｅｔｎａｍｅｎｓｉｓ  Ｈａ  ｅｔ  Ｇｒｕｓｈｖ．）からなる群より選択される少なくとも１種などが挙げられる。本発明の効果が損なわれない範囲内であれば、その他の薬用ニンジンが含まれていてもよい。
【００１４】
上記薬用ニンジンとしては、天然品もその加工品も使用することができる。加工品としては、例えば、薬用ニンジンの乾燥物、裁断物、粉砕物、抽出物、ペースト等が挙げられる。前記乾燥方法、裁断方法、粉砕方法、抽出方法、ペースト状化方法は、従来公知の方法を使用することができる。その大きさは、特に限定されないが、例えば、平均長径が０．２ｍｍ以下に裁断、粉砕、抽出、ペースト状化されることが好ましい。薬用ニンジンとしては、前記した処理を行って調製したものであっても、市販品であってもよい。
【００１５】
本発明において使用される薬用ニンジンの部位は、特に限定されず、どの部位でも使用することができる。例えば、根、茎、葉、花蕾、果実、全草等が挙げられる。これらは１種又は２種以上を使用することができる。好ましくは根等であり、より好ましくは、側根、主根等である。
【００１６】
薬用ニンジンの発酵物は、前記ニンジンを、微生物を用いて発酵させることにより得られる生産物である。発酵方法は、従来十分に確立されており（例えば、特許３６７８３６２号公報に記載の方法）、本発明もそれに従ってよい。前記発酵は、例えば、薬用ニンジンを含有する培地を常法により減菌処理した後、該培地に微生物を接種し、発酵する方法が好ましく挙げられる。
【００１７】
本発明において使用される培地は、特に限定されないが、例えば、微生物の培養に通常使用される炭素源、窒素源、ミネラル源等を含むもの等を使用することができ、天然培地又は合成培地等を用いることができる。好ましくは、液体培地を用いる。
【００１８】
培地に添加する窒素源としては、特に限定されないが、無機態窒素源としては、例えば、アンモニア、アンモニウム塩等が挙げられ、有機態窒素源としては、例えば、ペプトン、ポリペプトン、尿素、アミノ酸、タンパク質、大豆ペプチド等のペプチド類等が挙げられる。窒素源は、好ましくは、ペプトン、ポリペプトン、ペプチド等である。また、ミネラル源としては、特に限定されないが、酵母エキスや肉エキスの他、Ｋ、Ｐ、Ｍｇ、Ｓ等を含む、例えば、リン酸一水素カリウム、硫酸マグネシウム等が挙げられる。これらの窒素源、ミネラル源は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。培地中の窒素源の濃度は、微生物が生育できる通常の濃度であればよく、特に限定されない。培養開始時の窒素源の濃度は、通常は、約０．０５〜１０重量％が好ましく、約０．１〜５重量％がより好ましい。
【００１９】
前記培地は、前記の窒素源、ミネラル源に加えて、さらに、炭素源、無機質、ｐＨ緩衝剤等を添加しても良い。無機質としては、特に限定されないが、例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデン、各種ビタミン類等が挙げられ、これらは１種単独で又は２種以上を組合せて使用することができる。ｐＨ緩衝剤としては、特に限定されないが、例えば、炭酸カルシウム等が好ましく挙げられる。
【００２０】
薬用ニンジンの使用量は、特に限定されず、その種類、形状、乾燥状態、及び培養条件等に応じて適宜選択され得る。薬用ニンジンと培地全量の重量比（薬用ニンジン／培地全量）としては、好ましくは１／１００〜５０／１００であり、より好ましくは５／１００〜２０／１００であり、更に好ましくは１０／１００〜１５／１００である。本発明において、薬用ニンジンの重量は、内温約１００〜１８０℃で約１〜６時間乾燥させた薬用人参に換算したものであることが好ましい。前記培地は、上述した薬用ニンジン以外の成分や添加剤を含んでも良い。
【００２１】
前記培地のｐＨは、例えば約３〜７とすることが好ましく、約５〜６．５とすることがより好ましい。ｐＨを制御してもよく、酸又はアルカリを用いてｐＨの調整を行うことができる。
【００２２】
前記培地に前記薬用ニンジンを添加することにより薬用ニンジン含有培地が得られる。該培地を常法により滅菌した後、該培地に微生物を接種して発酵することにより、薬用ニンジンの発酵物が得られる。滅菌方法としては、例えば、加熱滅菌、高圧蒸気滅菌、ろ過滅菌等が挙げられ、これらに限定されることなく従来公知の方法を使用することができる。
【００２３】
本発明で用いられる微生物は、ラクトバチルス属に属する乳酸菌である。
【００２４】
ラクトバチルス属に属する乳酸菌としては、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・マリ（Ｌ．ｍａｌｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ガリナラム（Ｌ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ラクトバチルス・アミロボラス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ラムノーザス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ケフィア（Ｌ．ｋｅｆｉｒ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）などが挙げられ、本発明ではラクトバチルス属菌を２種以上組み合わせて用いる。
【００２５】
２種以上のラクトバチルス属菌を組み合わせる方法としては、同一の種から組み合わせても異なる種から組み合わせてもよい。なかでも、ラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・ブレビスから選ばれるラクトバチルス属菌を２種以上組み合わせて用いることが好ましい。代表的には、ラクトバチルス・カゼイの２種以上を含むか、又はラクトバチルス・カゼイ（の１種以上）とラクトバチルス・ブレビス（の１種以上）とを組み合わせてもよい。
【００２６】
ラクトバチルス・カゼイとしては、ラクトバチルス  カゼイ  ハセガワ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）、ラクトバチルス・カゼイ  ＡＴＣＣ３９３株、ラクトバチルス・カゼイ  ＮＢＲＣ１５８８３株等を用いることができる。
ラクトバチルス・ブレビスとしては、ラクトバチルス・ブレビス  ＡＴＣＣ１４８６９株、ラクトバチルス・ブレビス  ＪＣＭ１５５９株、ラクトバチルス・ブレビス  ＮＢＲＣ１２００５株、ラクトバチルス・ブレビス  ＤＮＢＬ１８６７株、ラクトバチルス・ブレビス  ＤＮＢＬ１８６８株、ラクトバチルス・ブレビス  ＤＮＢＬ１８６９株、ラクトバチルス・ブレビス  ＤＮＢＬ１８７０株、ラクトバチルス・ブレビス  ＤＮＢＬ１８７１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６１）等を用いることができる。
これらのラクトバチルス属菌は、どのように組み合わせて用いてもよく、例えば、ラクトバチルス  カゼイ  ハセガワ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）を少なくとも含む組み合わせであってもよい。
このような組み合わせとしては、例えば、ラクトバチルス  カゼイ  ハセガワ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）と、ハセガワ菌株でないラクトバチルス・カゼイ（特に、ラクトバチルス・カゼイ  ＮＢＲＣ１５８８３株を含むラクトバチルス・カゼイ）及びラクトバチルス・ブレビスから選択された少なくとも１種との組み合わせなどが挙げられる。
また、組み合わせの一例としては、ラクトバチルス  カゼイ  ハセガワ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）とラクトバチルス・ブレビス  ＤＮＢＬ１８７１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６１）との組み合わせを挙げることができる。
なお、上記ラクトバチルス  カゼイ  ハセガワ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：郵便番号３０５−８５６６  日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、平成１５年（２００３年）８月１１日（受託日）に、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３として寄託されており、ラクトバチルス・ブレビス  ＤＮＢＬ１８７１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６１）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：郵便番号２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、平成３０年（２０１８年）３月６日（受託日）に、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６１として寄託されている。
【００２７】
ラクトバチルス属菌の使用量は、２種以上用いて発酵させるのであれば特に限定はなく、当業者によって適宜設定され得る。また、ラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・ブレビスを用いる場合、その使用量比（ラクトバチルス・カゼイ／ラクトバチルス・ブレビス、細胞量比）としては、例えば、１０００／１〜１／１０００、１００／１〜１／１０００、１０／１〜１／１０００などが例示される。
【００２８】
かかるラクトバチルス属菌を２種以上用いて薬用ニンジンを発酵させる。
【００２９】
具体的には、例えば、前記した薬用ニンジン含有培地に、２種以上のラクトバチルス属菌を別々の培地に単独で又は同一の培地に組み合わせて添加し、好ましくは２５〜３７℃、より好ましくは２８〜３３℃で発酵させる。発酵時間は、仕込み液の組成、植菌量、発酵温度などに応じて適切に設定することが可能であり、例えば、２〜２１日、７〜１４日などが例示される。
【００３０】
以上のようにして得られた発酵物には、通常、２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール  ２０−Ｏ−β−ｄ−グルコピラノシド（Ｍ１、ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｋ）が含まれる。このような発酵物では、２種以上のラクトバチルス属菌の使用により効率良くＭ１が生成されている場合が多く、例えば、ラクトバチルス属菌を１種単独で使用した場合〔例えば、ラクトバチルス  カゼイ  ハセガワ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）を単独で使用した場合〕と比べて、好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、更に好ましくは１．３倍以上、更に好ましくは１．５倍以上多いものである。
【００３１】
また、本発明においては、前記した２種以上のラクトバチルス属菌を組み合わせることによって、ジンセノシドＦ２からＭ１への代謝が促進されることから、得られる発酵物にはＭ１の含有量が多くなる。よって、得られる発酵物中、ジンセノシドＦ２とＭ１の含有量比（Ｆ２／Ｍ１）は、好ましくは５０／５０以下、より好ましくは４０／６０以下、更に好ましくは３０／７０以下、更に好ましくは２０／８０以下、更に好ましくは１０／９０以下である。また、実質的にジンセノシドＦ２が含有されない程度に代謝が促進されていてもよい。なお、本明細書において、「実質的に含有されない」とは、例えば、後述の実施例に示す測定方法において検出限界以下となる量であればよい。
【００３２】
得られた発酵物に対しては、所望により、ろ過、遠心分離、濃縮、限外ろ過、凍結乾燥、粉末化、分画等の処理を公知の方法に従って行ってもよく、目的物（例えば、Ｍ１を含む画分）そのものを単離して又は培地を含むものをそのまま製剤化したり、飲食品（健康食品）等の原材料に用いることが可能な形態に調製したりしてもよい。よって、本発明の発酵物の一態様として前記処理物が含まれる。
【００３３】
本発明はまた、前記製造方法により得られる発酵物、及び当該発酵物を含有してなる、組成物を提供する。かかる発酵物又は組成物は、例えば、ストレス、がん及び糖尿病から選ばれる少なくとも１種の疾患又は症状の予防、改善及び／又は治療するために使用することができる。
【００３４】
本発明の発酵物又は組成物は、Ｍ１やジンセノシドＦ２以外に、ジンセノシドＲｂ１、ジンセノシドＲｂ２、ジンセノシドＲｃ、ジンセノシドＲｄ、ジンセノシドＲｅ、ジンセノシドＲｇ１、ジぺノシドＸＶＩＩなどを含有してもよい。それらの含有量は、本発明の効果を損なわない範囲内であれば、特に限定されない。
【００３５】
本発明の発酵物又は組成物は、本発明の発酵物を体内に摂取できるのであれば、その形態は限定されない。例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、乳剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等の経口製剤又は非経口製剤として製剤化することができる。
【００３６】
本発明の発酵物又は組成物の投与条件は、その形態や投与目的、当該組成物の投与対象の種類、年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。例えば、Ｍ１の有効ヒト投与量として、一日当たり、好ましくは０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ程度、より好ましくは１〜５０ｍｇ／ｋｇ程度となるよう設定することができる。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で又は数回に分けて行ってもよい。投与期間も任意である。
【００３７】
本発明の発酵物又は組成物の投与対象としては、好ましくはストレス、がん及び糖尿病から選ばれる少なくとも１種の疾患又は症状の治療を必要とするヒトであるが、ウシ、ウマ、ヤギ等の家畜動物、イヌ、ネコ、ウサギ等のペット動物、又は、マウス、ラット、モルモット、サル等の実験動物であってもよい。
【００３８】
上記形態を有する本発明の組成物は、本発明の発酵物を含有するものであれば、常法に従って、製剤分野等において通常使用される担体、基剤、及び／又は添加剤等を本発明の目的を達成する範囲内で適宜配合して調製することができる。具体的には、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、及び必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調製剤、防腐剤、抗酸化剤等を使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を、本発明の効果を損なわない範囲内で適量配合して常法により製剤化される。本発明の発酵物の含有量は、剤型、投与方法、担体等により異なるが、本発明の組成物中、通常０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜９５重量％である。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４０】
試験例１
（１）  ラクトバチルス  カゼイ  ハセガワ菌株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３、Ａ２２１株）とＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ＮＢＲＣ１５８８３（別名：ＪＣＭ１１３４Ｔ、以下、ＮＢＲＣ１５８８３株）をそれぞれ一般乳酸菌接種用培地（日水製薬社製）５ｍＬに接種し、３０℃で一晩、前培養した。
（２）  発酵培地として、蒸留水１００ｍＬに対してオタネニンジン末５ｇ、酵母エキス１ｇ、大豆ペプトン０．５ｇ、酢酸ナトリウム・三水和物１ｇ、硫酸マグネシウム・七水和物２０ｍｇ、硫酸マンガン・四水和物１ｍｇ、硫酸鉄・七水和物１ｍｇ、塩化ナトリウム１ｍｇを添加して混合し、１２１℃で１５分間加熱滅菌した。
（３）  発酵培地に乳酸菌前培養液をそれぞれ別々に、あるいは同時に０．１ｍＬずつ添加し、２８℃で静置培養させた。
（４）  ２週間後、発酵培地を各５ｍＬ採取し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分間）して上清を得た。この上清をＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）に添加して吸着させ、蒸留水及び４０％メタノール水溶液で洗浄した後、メタノールによる溶出を行った。
（５）  溶出したメタノール溶液を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供してＭ１の生成を確認した。ＴＬＣにはＳｉｌｉｃａｇｅｌ６０  Ｆ２５４アルミニウムシート（Ｍｅｒｃｋ社製）を使用し、クロロホルム：メタノール：蒸留水＝６５：３５：１０（ｖ／ｖ／ｖ、下層）の溶媒にて展開した。バニリン３ｇをエタノール３０ｍＬに溶解したものに３ｍｏｌ／Ｌの硫酸を１００ｍＬ添加したものを発色液として噴霧した。
（６）  精製Ｍ１との比較で発酵培地中のＭ１を示すバンドを特定し、バンド強度を画像解析（Ｉｍａｇｅ  Ｊ）に供してＡ２２１株のＭ１生成量に対する相対値を数値化し、画像解析結果を表１に示す判定基準にて判定した。
【００４１】
【表１】
2019170246.tif 000002
【００４２】
図１に示すように、Ａ２２１株のみよりもＡ２２１株＋ＮＢＲＣ１５８８３株でオタネニンジンを発酵した方がＭ１の生成量が飛躍的に増加した。画像解析でＭ１に相当するバンド強度を算出すると、Ａ２２１株のみと比較してＡ２２１株＋ＮＢＲＣ１５８８３株では１．８倍以上増加していた（表２）。一方、図２に示すようにＮＢＲＣ１５８８３株単独ではＭ１生成能は認められなかった。したがって、ＮＢＲＣ１５８８３株にはＭ１生成能がないものの、Ａ２２１株と共培養することによってＡ２２１株によるＭ１生成を補助する相乗的な効果を示した。
【００４３】
【表２】
2019170246.tif 000003
【００４４】
試験例２
（１）  オタネニンジン末５０ｇに蒸留水５００ｍＬを添加して混合し、９０℃の水浴で４時間加熱して抽出した後、Ｎｏ．２ろ紙（アドバンテック社）にてろ過したろ液をオタネニンジン抽出物とした。
（２）  オタネニンジン抽出物５０％、大豆ペプトン０．５％、酵母エキス１％、硫酸マグネシウム・七水和物０．０４％となるように蒸留水と混合し、１２１℃で１５分間加熱滅菌を行ったものを発酵培地とした。
（３）  発酵培地０．５ｍＬに、表３に示す市販の乳酸菌株及びキムチより単離した乳酸菌株をそれぞれ接種し、さらにＡ２２１株を追加接種した。なお、ＤＮＢＬ１８７１株は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６１で寄託されたものを用いた。
（４）  ３０℃で７日間培養した後、エタノールを培地と等量の０．５ｍＬ添加し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５分間）した上清を分析用サンプルとした。
（５）  分析用サンプルはＴＬＣに供してＭ１の生成量を確認した。ＴＬＣの方法として展開溶媒に酢酸エチル：メタノール：水＝１４：５：４（ｖ／ｖ／ｖ）を使用したこと以外は、試験例１と同様の方法で行った。また、Ｍ１生成促進能の判定方法は試験例１と同様に行った。
【００４５】
表３に示したように、ラクトバチルス属乳酸菌は、それ自体にはＭ１生成能がないものの、Ａ２２１株と共に培養することでＭ１生成量を高める効果を現した。
【００４６】
【表３】
2019170246.tif 000004
【００４７】
試験例３
培養日数を６日間に変更して表４に示す乳酸菌を使用する以外は、試験例２と同様に行った。
【００４８】
表４に示したように、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属の乳酸菌をＡ２２１株と共に培養してもＭ１生成量はＡ２２１株単独での発酵時よりも増加せず、Ｍ１生成促進能の判定はすべて「−」であった。
【００４９】
【表４】
2019170246.tif 000005
【００５０】
試験例４
試験例２で高いＭ１生成促進能を発揮したＤＮＢＬ１８７１株について、発酵開始時のＡ２２１株との接種割合比での違いを試験した。
【００５１】
（１）  一般乳酸菌接種用培地にＡ２２１株及びＤＮＢＬ１８７１株をそれぞれ接種し、３日間３０℃で培養した。
（２）  遠心分離により乳酸菌体を回収し、ＰＢＳ（−）で２回菌体を洗浄した。
（３）  ＰＢＳ（−）に乳酸菌体を懸濁し、Ｏ．Ｄ．値（６００ｎｍ）を分光光度計で測定した。
（４）  さらに遠心分離して集菌後、菌体を発酵培地（試験例２と同様）に再懸濁した。
（５）  最終菌体濃度がＯ．Ｄ．値が０．００１〜１となるように各乳酸菌株を発酵培地に添加した。菌体濃度（初期値Ｏ．Ｄ．）は表５に示した通りである。
（６）  ３０℃で７日間培養後、発酵培地と等量のエタノールを添加し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１５分間）した上清を分析用サンプルとした。
（７）  分析用サンプルはＴＬＣに供してＭ１の生成量を確認した。ＴＬＣの方法とＭ１生成促進能の判定方法は試験例１や試験例２を参照にして行った。
【００５２】
表５に示したようにＡ２２１株の単独培養のＮｏ．１と比較して、Ａ２２１株とＤＮＢＬ１８７１株を共培養させたＮｏ．２〜Ｎｏ．８でＭ１生成促進が確認された。その中でも初期値Ｏ．Ｄ．がＡ２２１株よりＤＮＢＬ１８７１株の方が等しい又は大きいＮｏ．５〜Ｎｏ．８でさらに良好なＭ１生成が見られた。特にＤＮＢＬ１８７１株の初期値Ｏ．Ｄ．がＡ２２１株より１００倍及び１０００倍の時に飛躍的なＭ１生成促進が確認された。
【００５３】
【表５】
2019170246.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の製造方法により、２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール  ２０−Ｏ−β−ｄ−グルコピラノシド（Ｍ１、ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｋ）を含む発酵物を得ることができる。このような発酵物や当該発酵物を含む組成物は、例えば、ストレス、がん及び糖尿病から選ばれる少なくとも１種の疾患又は症状の予防、改善及び／又は治療に好適に用いることができる。
【図１】
2019170246.tif 000007
【図２】
2019170246.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月16日(2018.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オタネニンジン（高麗人参；Ｋｏｒｅａｎ  ｇｉｎｓｅｎｇ：Ｐａｎａｘ  Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）、三七ニンジン（Ｐａｎａｘ  ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ  Ｂｕｒｋ．）、アメリカニンジン（Ｐａｎａｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ  Ｌ．）、竹節ニンジン（Ｐａｎａｘ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）、ヒマラヤニンジン（Ｐａｎａｘ  Ｐｓｅｕｄｏ−ｇｉｎｓｅｎｇ  Ｑａｌｌ．Ｓｕｂｓｐ．Ｈｉｍａｌａｉｃｕｓ  Ｈａｒａ）及びベトナムニンジン（Ｐａｎａｘ  Ｖｕｅｔｎａｍｅｎｓｉｓ  Ｈａ  ｅｔ  Ｇｒｕｓｈｖ．）からなる群より選択される少なくとも１種のウコギ科薬用ニンジンを、ラクトバチルス・カゼイ  ハセガワ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）及びラクトバチルス・カゼイ  ＮＢＲＣ１５８８３株を含む乳酸菌により発酵させることを特徴とする、発酵物の製造方法。
【請求項２】
オタネニンジン（高麗人参；Ｋｏｒｅａｎ  ｇｉｎｓｅｎｇ：Ｐａｎａｘ  Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）、三七ニンジン（Ｐａｎａｘ  ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ  Ｂｕｒｋ．）、アメリカニンジン（Ｐａｎａｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ  Ｌ．）、竹節ニンジン（Ｐａｎａｘ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）、ヒマラヤニンジン（Ｐａｎａｘ  Ｐｓｅｕｄｏ−ｇｉｎｓｅｎｇ  Ｑａｌｌ．Ｓｕｂｓｐ．Ｈｉｍａｌａｉｃｕｓ  Ｈａｒａ）及びベトナムニンジン（Ｐａｎａｘ  Ｖｕｅｔｎａｍｅｎｓｉｓ  Ｈａ  ｅｔ  Ｇｒｕｓｈｖ．）からなる群より選択される少なくとも１種のウコギ科薬用ニンジンを、ラクトバチルス・カゼイ  ハセガワ菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２３）と、ラクトバチルス・ブレビス  ＤＮＢＬ１８７１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６１）を含む乳酸菌により発酵させることを特徴とする、発酵物の製造方法。
【請求項３】
得られる発酵物が２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール  ２０−Ｏ−β−ｄ−グルコピラノサイド（Ｍ１）を含有してなる、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
ラクトバチルス・ブレビス  ＤＮＢＬ１８７１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６１）。