(57)【要約】      （修正有）【課題】野生型ゲノムのＤＮＡ配列並びに野生型に導入された全てのゲノム修飾、及び、それに基づいてさらに開発された株の提供。【解決手段】グラム陽性原核生物アクチノプラネス・ウタヘンシスのＳＣ３６８７−１８−４３株における変異の全て、アクチノプラネス・ウタヘンシスのＳＮ１２７５５−４８株における変異の全て、アクチノプラネス・ウタヘンシスのＣ４４５−Ｐ４７株における変異の全て、又は、アクチノプラネス・ウタヘンシスのＳＮ２２３−２９−４７株における変異の全てを含む、特定の配列を有するＤＮＡ、前記ＤＮＡを含む微生物、及び、前記微生物によるアカルボースの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表９に記載の少なくとも１個の変異を含むことを特徴とする、配列番号１６０５３また
はその断片を本質的に有するＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡを含む微生物。
【請求項３】
以下の工程：
ａ）請求項２に記載の微生物を培養し、
ｂ）微生物により生産されたアカルボースを回収する、
を含む、アカルボースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
グラム陽性原核生物アクチノプラネス・ウタヘンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｕｔ
ａｈｅｎｓｉｓ）は１９６３年に初めてＪｏｈｎ  Ｃｏｕｃｈにより説明された（Ｃｏｕ
ｃｈ，  Ｊ．  Ｎ．，  Ｅｌｉｓｈａ  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｓｃｉ．  Ｓｏｃ．，  １９
６３，  ７９：５３−７０）。その後、１９７７年に、アカルボース（ａｃａｒｂｏｓｅ
）とその同族体が最初にアクチノプラネス・ウタヘンシス培養物の上清に見出された（Ｓ
ｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ，  １９７７
，  ６４：５３５−５３６）。２年後に、ヒトの腸内でαグルコシダーゼ阻害剤としての
アカルボースの医療効果が発見され（Ｃａｓｐａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｓ．  Ｅｘ
ｐ．  Ｍｅｄ．，  １９７９，  １７５：１−６）、同じ年に、２型糖尿病治療の潜在的
用途が伝えられた（Ｆｒｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｐｌａｎｔ  Ｒ
ｅｓ．，  １９７９，  ３５：１９５−２１７）。
【０００２】
１９９０年から、α−グルコシダーゼ阻害剤アカルボースが２型糖尿病治療のために製
造され、市販される。Ａ．ｕｔａｈｅｎｓｉｓ野生型株から始まった製造は、発酵工程な
らびに株自身の最適化によってアカルボース収率を上昇させることに関して、継続的に改
良された。株の開発は、主としてアカルボース生産の上昇に関する、多数の変異誘発実験
によって推進された。
【０００３】
変異実験で引き起こされる、生物における遺伝子組換えは、今までのところ、表現型の
特徴（例えば、アカルボース収率の増加）のみから認識可能であった。より正確に、製造
収率の増大の遺伝的基礎は、現在まで完全に未知であった。しかしながら、この知識は製
造における上昇につながる、メカニズムの理解のための根本的な関心である。さらに、そ
れは、Ａ．ｕｔａｈｅｎｓｉｓからさらにより拡張されて最適化された、生物の標的化さ
れた遺伝子組換えの工程についての最も重要な前提条件を形成する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は野生型ゲノム、ならびに野生型、およびそれを基にさらに開発された株に導入
されたすべての遺伝子組換え型のＤＮＡ配列を記載する。その結果、本発明の主要な部分
を占める、最新の製造株を含む開発された株の最初の遺伝子型の解析が実行された。さら
に、決定されたＤＮＡ配列に基づいて、本発明の他の部分として、潜在的遺伝子が同定さ
れ、それらの機能注解と結合されて説明される。特に、潜在的に製造収率の増加に寄与す
る、株開発工程を通しての変異修飾により影響される遺伝子−およびＤＮＡ−配列、なら
びにそれらに由来するタンパク質配列が、本発明に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、本明細書で記載された高スループット配列決定の実施により修正された、アカルボースクラスターの以前の誤った配列を示す。
【０００６】
【図２】図２はゲノム足場の構築に使用されるフォスミドクローン（灰色）の円形マッピングについて表す。ペアエンド（Ｐａｉｒｅｄ  Ｅｎｄ）情報に基づいた、１１の足場が黒で示される。
【０００７】
【図３】図３はアクチノプラネス・ウタヘンシス  ＳＥ５０−１００野生型染色体の円形のゲノムプロットを示す。最外円では、順方向の遺伝子が表現される。２番目の円は逆のストランド上の宿主遺伝子である。Ｇ＋Ｃ含量とＧ＋Ｃ非対称は、それぞれ３番目および４番目の円に示される。
【０００８】
【図４】図４は野生型と最新の製造株の間のＳＮＰ変異の変遷頻度を示す。
【０００９】
【図５】図５は変異事象を起こした１８９６の遺伝子だけを可視化する。最外円では、順方向の遺伝子が記載される。２番目の円では、逆方向の遺伝子が表現される。３番目と４番目の円は、それぞれとＧ＋Ｃ含量とＧ＋Ｃ非対称を表す。
【００１０】
【図６】図６は、示された以前の製造株の開発の間にそこに導入された変異に関連したアカルボースクラスターを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
材料と方法
上で簡潔に説明されるように、一連の変異誘発実験が、最初に土の試料から単離された
、アクチノプラネス・ウタヘンシス野生型株ＳＥ５０−１００で行われた。これらの実験
は、高成長速度、栄養成分要求および消費の最適化ならびに面倒な副産物の低い形成など
の発酵による工業的生産に関連する他のパラメーターと同様に、アカルボースの改良され
た生産をもつ変異体の同定を目的とした。まず野生型株に基づいて、更なる変異誘発実験
が以前の実験で選択された変異株について継続的に実施された。株開発の進行の間、優れ
た特質をもついくつかの変異体が新たな製造株として選択され、大規模生産に移された。
これらから、最新の製造株および野生型株を含む７種の株が選択され、Ｂｉｅｌｅｆｅｌ
ｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ’ｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  
（ＣｅＢｉＴｅｃ）  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｓｓｔｒａｓｓｅ  ２７，  ３３６１５  
Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ，  Ｇｅｒｍａｎｙにより配列決定された。表１はこのプロジェクト
の間に使用されているすべての７種の株をそれらの開発の年代順に記載する。
【００１２】
【表１】
2019030317.tif 000002
【００１３】
株培養
それらのアカルボース生産性をチェックするための株の培養が以前に記載されたとおり
に行われた（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅ
ｎ，  １９７７，  ６４：５３５−５３６）。ＤＮＡを単離するために、アクチノプラネ
ス株は二段階振とうフラスコ系で培養された。無機塩類の他に、培地は炭素源としてので
んぷん加水分解物および窒素源としての酵母エキスを含んだ。予備培養（ｐｅｒｃｕｒｔ
ｕｒｅ）および本培養（ｍａｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）はそれぞれ３日間および４日間、回
転式振とう培養機上で２８℃にて実行された。その後、バイオマスは遠心分離によって集
められた。
【００１４】
株変異誘発
アカルボース生産株の開発は、より高い産生株の段階的な選別方法により実施された。
この方法は化学的または物理的な手段によるランダム変異の工程を使用する。変異を誘導
するために使用される化学物質は、アルキル化剤またはフレームシフト型変異原物質とし
て機能する染料のいずれかであった。細胞に変位を誘導するための物理学的処理は、３６
５ｎｍのＵＶ光で行われた。菌糸体の断片は適切な緩衝系における変異誘発処理に使用さ
れた。処理の後に、生体物質は誘導された改変の形質発現を許容するために短期間液体培
地で生育させられ、その後、寒天プレート上に播種された。変異誘発処理で生存したクロ
ーンのランダム選択は、小規模振とうフラスコ実験において、それらのアカルボース生産
能についてチェックされた。この種の変異サイクルの間で得られた最良の変異体クローン
は次の変異段階に選択された。変異および選択のそのようないくつかの段階は、生産性の
漸増をもたらした。
【００１５】
ゲノムＤＮＡの調製
Ａ．ｕｔａｈｅｎｓｉｓ株ＳＥ５０−１１０のゲノムＤＮＡの調製は、一般的に開示さ
れた手順（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ
Ｊ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａ
ｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８２）を改変
して実施された。５０ｍＬの新たに成長した培養物の菌糸体は、Ｃｈｒｉｓｔ遠心分離機
での遠心分離（１０分、４．０００ｒｐｍ、４℃）によって回収された。ペレットは同条
件下で、１５％のスクロース（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒ
ｍａｎｙ，  ｃａｔ．  ７６５１）、２５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．２（Ｍｅｒｃ
ｋ  ＫＧａＡ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  ｃａｔ．  １．０８３８２
．１０００）、および２５ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，  Ｄａｒｍｓｔａｄ
ｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  ｃａｔ．  ８４１８）を含むバッファーで４回洗浄された。最
終的に、ペレットは４．５ｍＬの同バッファーに再懸濁され、リゾチーム（Ｍｅｒｃｋ  
ＫＧａＡ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  ｃａｔ．  １．０５２８１．０
０１０）およびＲＮＡｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  ｃａ
ｔ．  １９１０１）がそれぞれ５ｍｇ／ｍＬおよび５０μｇ／ｍＬの最終濃度で加えられ
、混合物は４５分間３７℃で培養された。ＳＤＳ（Ｓｅｒｖａ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ
，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  ｃａｔ．  ２０７６７）およびタンパク質加水分解酵素Ｋ（Ｑｉ
ａｇｅｎ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  ｃａｔ．  １９１３３）の、それぞれ
０．５％および２μｇ／ｍＬの最終濃度での添加の後に、培養は５０℃にて５分間続けら
れた。ＮａＣｌ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  
ｃａｔ．１．０６４０４．１０００）が最終濃度３００ｍＭで添加され、容量がＷＦＩで
８ｍＬに調整された。溶解物（ｌｙｓａｔｅ）は３つの連続したフェノール／ＳＥＶＡＧ
抽出（ＳＥＶＡＧは２４部のクロロホルム［Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，  Ｄａｒｍｓｔａｄ
ｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  ｃａｔ．  １．０２４４５．１０００］および１部のイソアミ
ルアルコール［Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  ｃ
ａｔ．  １．９７９．１０００］の混合物である）に供され、フェノールが、１０ｍＬ  
ＳＥＶＡＧでのＤＮＡ溶液の洗浄により除去された。ＤＮＡは０．１容量の３Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ４．８）（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎ
ｙ，  ｃａｔ．  ６２６８）および１容量の冷イソプロパノール（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ
，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  ｃａｔ．  １．０９６３４．１０１１）
の添加で沈殿した。ＤＮＡは遠心によりペレット化され（２５分、４．０００ｒｐｍ、４
℃；Ｃｈｒｉｓｔ遠心分離機）、ＤＮＡペレットは、７０％のエタノール（Ｍｅｒｃｋ  
ＫＧａＡ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  ｃａｔ．  １．００９８３．１
０１１）で十分に（５ｘ）洗浄され（１０分、４．０００ｒｐｍ、４℃；Ｃｈｒｉｓｔ遠
心分離機）、空気乾燥された。最終的に、２００μＬのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５に４℃にて
一晩再懸濁され、ＤＮＡ濃度が２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの光学密度を測定することに
より決定された。調製されたＤＮＡのサイズは、ＤＮＡ溶液のアリコート（１０μＬ）を
品質チェックとしての１％アガロースゲルを通した電気泳動に供することにより分析され
た。
【００１６】
フォスミドライブラリー構築
フォスミドは、より小さい挿入サイズが望まるとき、ゲノムライブラリーを調製するた
めに一般的に使用される。挿入は、４０ｋｂの平均のサイズを有し、他のライブラリーの
型よりもより均一な範囲をもたらす、無作為の切断により生産される。フォスミドはそれ
らの均一な範囲のため、においてギャップを閉じるための優れた候補である。アクチノプ
ラネス・ウタヘンシス野生型のためのフォスミドライブラリー構築がＩＩＴ  Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ  ＧｍｂＨ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｓｓｔｒ．  ２５，  ３３６１５  Ｂｉｅｌ
ｅｆｅｌｄ，  Ｇｅｒｍａｎｙにより、ゲノムＤＮＡ上で行われた。大腸菌ＥＰＩ３００
細胞における構築のため、ＣｏｐｙＣｏｎｔｒｏｌ登録商標クローニングシステム（ＥＰ
ＩＣＥＮＴＲＥ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ７２６  Ｐｏｓｔ  Ｒｏａｄ，  
Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ  ５３７１３，  ＵＳＡ）が用いられた。キットは、Ｂｉｏｚｙ
ｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＧｍｂＨ，  Ｓｔｅｉｎｂｒｉｎｋｓｗｅｇ  ２７，  ３１
８４０  Ｈｅｓｓｉｓｃｈ  Ｏｌｄｅｎｄｏｒｆ，  Ｇｅｒｍａｎｙから入手した。
【００１７】
フォスミドライブラリー配列決定
アクチノプラネス・ウタヘンシス野生型のためのフォスミドライブラリー配列決定が、
３７３０ｘｌＤＮＡ分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ８５０  Ｌｉｎ
ｃｏｌｎ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ  ９４４０４
，  ＵＳＡ）の上にＩＩＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｓｓｔ
ｒ）上で、ＩＩＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｓｓｔｒ．  
２５，  ３３６１５  Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ，  Ｇｅｒｍａｎｙによって行われた。装置は
９６本のキャピラリーで並行サンガー配列決定法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．
Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９７５，  ９４  （３）：４４１−４４８）を実行する。
得られるフローグラムファイルは、ＦＡＳＴＡ形式で呼ばれる塩基であり、ＦＡＳＴＡ形
式で格納された。両方のファイルは後にギャップ閉鎖と品質評価に使用された。
【００１８】
高性能ゲノム配列解読装置
ゲノムシーケンサーＦＬＸ
ゲノムシーケンサーＦＬＸ（ＧＳ  ＦＬＸ）システム（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ，  １５  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｓｔｒｅｅｔ，  Ｂｒａｎｆｏｒｄ，  ＣＴ  
０６４０５，  ＵＳＡ）は、アクチノプラネス・ウタヘンシス野生型株ＳＥ５０−１００
ならびに最新の生産株ＳＮ１９９１０−３７−２１のピロ配列決定（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ）のために使用された。２個の異なるプロトコルおよび試薬系がＧＳ  ＦＬＸ
プラットホームで使用された:
【００１９】
１．長ペアエンド（ｌｏｎｇ  ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ）（ＰＥ）プロトコルでの標準系
。ＰＥライブラリー構築のためのゲノムＤＮＡ断片サイズは２．５〜３．０ｋｂであった
。プロトコルは、２×１００塩基の平均読み取り長および約１００Ｍｂの配列決定された
塩基の総数をもたらす。
【００２０】
２．  全ゲノムショットガン（ＷＧＳ）プロトコルでのチタン系。ＷＧＳライブラリー
構築のためのゲノムＤＮＡ断片サイズは５００〜８００ｂｐであった。プロトコルは、４
００〜５００塩基の読み取り長および４００〜６００Ｍｂの範囲の配列決定された塩基の
総数をもたらす。
【００２１】
プロトコルに関する詳細は製造者の説明書、すなわちＧＳ  ＦＬＸ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００７），  ＧＳ  ＦＬＸ
Ｐａｉｒｅｄ  Ｅｎｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈ
ｏｄ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００７），  ＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉ
ｕｍ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００
８）  およびＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒ
ｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００８）で提
供される。
【００２２】
ゲノムアナライザーＩＩｘ
クラスターステーション（Ｃｌｕｓｔｅｒ−Ｓｔａｔｉｏｎ）およびペアエンドモジュ
ールを含むゲノムアナライザーＩＩｘ（ＧＡ  ＩＩｘ）システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  
Ｉｎｃ．，  ９８８５  Ｔｏｗｎｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ
，  ＣＡ  ９２１２１，  ＵＳＡ）は、５個の以前の生産株、ＳＮ２２３−２９−４７、
Ｃ４４５−Ｐ４７、ＳＮ１２７５５−４８、ＳＣ３６８７−１８−４３およびＳＣ７１７
７−４０−１７の合成時解読（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）のた
めに使用された。５個の株全てのために、約３３０ｂｐのゲノムＤＮＡ断片サイズおよび
２×３６塩基の読み取り長をもつペアエンドプロトコルが使用された。ライブラリー調製
、クラスター生成および配列決定は、製造者の説明書、Ｐａｉｒｅｄ−Ｅｎｄ  ｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ  （Ｐａｒｔ  ＃  
１００５０６３  Ｒｅｖ．  Ｂ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００９），  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈ
ｅ  Ｐａｉｒｅｄ−Ｅｎｄ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２  ｏ
ｎ  ｔｈｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｉｒｅｄ−Ｅｎｄ  Ｍｏｄ
ｕｌｅ  （Ｐａｒｔ  ＃  １００５６２９  Ｒｅｖ．  Ｃ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００９
）およびＵｓｉｎｇ  ＳＢＳ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｖ３  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｇ
ｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ｐａｒｔ  ＃  １００５６３７  Ｒｅｖ．  Ａ  Ｎｏ
ｖｅｍｂｅｒ  ２００８）に従って実施された。
【００２３】
野生型ゲノムアセンブリ概要
ＧＳ  ＦＬＸプラットホームによって生成されたすべてのアクチノプラネス・ウタヘン
シス野生型読み取りの自動化されたアセンブリは、Ｎｅｗｂｌｅｒアセンブラソフトウェ
ア（ｇｓＡｓｓｅｍｂｌｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．００．２２，  ４５４  Ｌｉｆ
ｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で実施された。 アセンブリアルゴリズムの詳細な情報に関しては
、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｍａ
ｎｕａｌ  Ｐａｒｔ  Ｃ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．３  （Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００９）を
参照のこと。
【００２４】
野生型ゲノム仕上げ
Ｎｅｗｂｌｅｒプログラムにより自動化されたｄｅ  ｎｏｖｏアセンブリの後でも存在
する連続する配列（コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ））の間に残るギャップを閉じるために、
視覚アセンブリソフトウェアパッケージＣｏｎｓｅｄ（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  
Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９８，  ８：１９５−２０２）が利用された。
グラフィカルユーザーインターフェース内で、連続するコンティグの末端のプライマー対
が選択された。これらのプライマー対は、その後、連続するコンティグの間のギャップを
埋めるために、以前に構築されたフォスミドライブラリーを発祥とするクローンからの所
望の配列を増幅するために使用された。
【００２５】
これらのフォスミド読み取りのＤＮＡ配列が決定された後に、すべての適切な読み取り
の手動のアセンブリは異なるプログラム機能の補助により実施された。詳細には、フォス
ミド読み取りは、まずコンティグの５’末端に並べられ、その５’残余により伸長される
。その後、コンティグに隣接する３’末端がその伸長に並べられ、以前に存在するギャッ
プを埋め、２個のコンティグが接合される。
【００２６】
１個のフォスミド読み取りの長さまたは質がギャップを埋めるために十分でない場合、
プライマー選択、配列決定および手動のアセンブリの複数の繰り返しが行われた。
【００２７】
野生型ゲノム注釈
コード配列（ＣＤＳ）の同定
野生型ゲノム上の潜在的遺伝子と部分的な遺伝子配列（付録（ａｐｐｅｎｄｉｘ）を参
照）はコンピュータ分析のシリーズによって同定された。すべての利用されたプログラム
は、ＧｅｎＤＢの注釈パイプライン（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａ
ｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００３，  ３１（８）：２１８７−９５）の一部であ
る。ＣＤＳの同定のため、内因性の（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）、外因性の（ｅｘｔｒｉｎｓ
ｉｃ）、および組み合わせられた方法は、最良の結果を達成するために適用された。
【００２８】
ＣＤＳの内因性予測に関与するプログラムはＧｌｉｍｍｅｒ（Ｄｅｌｃｈｅｒ  ｅｔ  
ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９９，  ２７：４６３
６−４１）である。それは、まず分析されるゲノムから取られる最適の特徴でのＣＤＳか
らのトレーニングセットを構成する。このセットに基づいて、ゲノム配列のすべてのＣＤ
Ｓを同定するために実行される実際の検索で使用される、補間マルコフモデル（ｉｎｔｅ
ｒｐｏｌａｔｅｄ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌ）が計算される。Ｇｌｉｍｍｅｒは、実際
にそこにあるよりも多くのＣＤＳについて計算する傾向がある。
【００２９】
外因性ＣＤＥ予測がＣＲＩＴＩＣＡ（Ｂａｄｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉ
ｏｌ．  Ｅｖｏｌ．，  １９９９，  １６：５１２−２４）により実施された。ＣＲＩＴ
ＩＣＡはまず、公共のＤＮＡデータベースからの配列と少なくともわずかな類似性を示す
ゲノム配列のリストを決定するためにＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅ
ｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９０，  ２１５（３）：４０３−１
０）を利用する。翻訳されたアミノ酸配列が、ＤＮＡ類似性を基にして期待されるものよ
りも高い類似性を所有するならば、それは保存されたコード配列であることの証拠として
解釈される。ＣＲＩＴＩＣＡは、従前は未知であった配列の予測を改良するために、ヘキ
サヌクレオチドの分布に基づく内因性分析とこれらの結果を結合する。これにもかかわら
ず、ＣＲＩＴＩＣＡは、公共データベースでホモログ配列が全くないとして既に蓄積され
ている場合でも、まだ少数のＣＤＳを予測する傾向がある。
【００３０】
Ｒｅｇａｎｏｒソフトウェア（ＭｃＨａｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ
ａｔｉｃｓ，  ２００４，  ２０（１０）：１６２２−３１）は、Ｇｌｉｍｍｅｒおよび
ＣＲＩＴＩＣＡによって計算された結果を最適化するために使用された。それは、両方の
プログラムの結果を結合し、その結果、それぞれの短所を最小にする。さらに、ＣＲＩＴ
ＩＣＡによって予測されたＣＤＳは、Ｇｌｉｍｍｅｒによって計算された内因性予測で補
足された、結合した結果の基礎を形成する。
【００３１】
注釈および機能予測
同定されたオープン・リーディング・フレームは、それらの潜在的な機能に関するそれ
らのＲＮＡおよび／またはアミノ酸配列から結論を得るために、さまざまな異なったソフ
トウェアパッケージを通して分析された。それらの機能の予測の他にも、さらなる特徴お
よび構造上の特性についても計算されている。
【００３２】
相同性を基にした検索は、公共の、および／または独自のヌクレオチドおよびタンパク
質データベースとの比較の手段によって、保存配列を同定するために適用された。有意な
配列類似性が遺伝子の主要なセクション中で見つけられたなら、遺伝子がＡ．ｕｔａｈｅ
ｎｓｉｓにおいて同様の機能を有するはずであると結論づけられた。アクチノプラネス・
ウタヘンシスの遺伝子リストを注釈するために使用された、相同性を基にした方法は、Ｂ
ＬＡＳＴＸと呼ばれる（Ｃｏｕｌｓｏｎ，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，  １９９４，  １２：７６−８０）。ＢＬＡＳＴＸは、特定のヌクレオチド配列
を３個のフォワードおよび３個のリバースの相補的リーディングフレームへと、それらを
タンパク質データベース（例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の
公共の、非冗長タンパク質データベース（ｎｒ−ａａ））に対して比較する前に、翻訳す
る。
【００３３】
酵素の分類は酵素委員会（ＥＣ）番号（Ｗｅｂｂ，  Ｅｄｗｉｎ  Ｃ．，  Ｓａｎ  Ｄ
ｉｅｇｏ：  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎ
ｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ  ｂｙ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９２，  ＩＳＢＮ  ０−１２−２２７
１６４−５）に基づいて実行された。更なる機能的遺伝子予測のために、タンパク質のオ
ルソロググループのクラスター（ＣＯＧ）分類システムが適用される、（Ｔａｔｕｓｏｖ
ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９７，  ２７８（５３３８）：６３１−７  
ａｎｄ  Ｔａｔｕｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２
００１，  ２９（１）：２２−８）。
【００３４】
潜在的な膜貫通タンパク質を同定するために、ソフトウェアＴＭＨＭＭ（Ｋｒｏｇｈ  
ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２００１，  ３０５（３）：５６７−
８０  ａｎｄ  Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｉｎｔ．  Ｃｏｎ
ｆ．  Ｉｎｔｅｌｌ．  Ｓｙｓｔ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９８，  ６：１７５
−８２）が利用される。膜貫通タンパク質の膜貫通ヘリックスおよび他の特徴を予測する
ために隠れマルコフモデルが利用される。それらから得られた情報により、膜に関連する
機能的な予測が、有意により強い結論を得る。
【００３５】
ソフトウェアＳｉｇｎａｌＰ（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  
Ｂｉｏｌ．，  ２００４，  ３４０：７８３−９５  ａｎｄ  Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａ
ｌ．，  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ２９９７，  １０：１−６）は、
同定されたＣＤＳの分泌能力を予測するために使用された。これは、アミノ酸配列内の潜
在的なシグナルペプチド切断部位の出現および位置を探索する、隠れマルコフモデルおよ
びニューラル・ネットワークによって行われる。得られたスコアは、翻訳されたタンパク
質の分泌のための確率測度として解釈できる。ＳｉｇｎａｌＰは古典的なシグナルペプチ
ド結合メカニズムによって分泌されるそれらのタンパク質だけを取り出す。
【００３６】
古典的経路を経て分泌されないアクチノプラネス・ウタヘンシスからのさらなるタンパ
ク質を同定するために、ソフトウェアＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰが適用された（Ｂｅｎｄｔｓ
ｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２００５，  ５：５８）
。潜在的な神経回路網は、エキソプロテオームにおけるその発生にもかかわらず、シグナ
ルペプチドを欠くことが知られている、分泌タンパク質で訓練された。翻訳された遺伝子
の最終的な分泌能力は、ＳｉｇｎａｌＰおよびＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ予測の結果の組み合
わせにより得られる。
【００３７】
多シストロン性転写単位を明らかにするために、共同転写遺伝子を、その方向および隣
接遺伝子への接近により予測する独自のソフトウェアが開発された（Ｓａｌｇａｄｏ  ｅ
ｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ２０００，
９７（１２）：６６５２−７から持ち込まれた）。これらの予測の観点から、オペロン
構造が決定でき、さらにそれらに基づいて、含まれたプロモーターとオペレータ要素の高
い確率で、さらなる配列領域を引き出すことができる。
【００３８】
一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ分子それぞれの二次構造はＲＮＡｓｈａｐｅｓソフトウェア（Ｓ
ｔｅｆｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  ２００６，  ２２（
４）：５００−５０３）によって計算された。結果は、オペロンおよび遺伝子末端をそれ
ぞれ示す、転写終結の内因性予測に使用された。
【００３９】
生産株参照アセンブリ
すべての６個の生産株として得られる読み取りのアセンブリは、野生型参照ゲノムにそ
れらをマッピングすることにより達成された。この作業のため、ゲノムシーケンサーＦＬ
Ｘ（読み取り長４００〜５００塩基  ＷＧＳ）およびゲノムアナライザーＩＩｘ（読み取
り長２×３６塩基  ＰＥ）システムそれぞれを基とする２個の読み取り型を考慮して、２
個の異なるソフトウェアプログラムが利用された。
【００４０】
ｇｓＭａｐｐｅｒソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．３，  ４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）は、野生型参照ゲノムに対するゲノムシーケンサーＦＬＸプラットホームか
らの読み取りを整列（ａｌｉｇｎ）するために使用された。プログラムは、参照配列内で
読まれた各々のために最良の整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）位置を発見するために発見的問
題解決法を実装する。すべての読み取りが整列された後に、参照に隣接して整列する読み
取りのための多重整列は、コンティグを形成するために実施される。コンティグの多重整
列から、コンセンサスベースコール配列は、各々の塩基への品質および信頼値をもたらす
、多重整列における読み取りに関する伝達信号を使用することで作成される。マッピング
アルゴリズムの詳細な情報に関してはＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  Ｓｙ
ｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｍａｎｕａｌ  Ｐａｒｔ  Ｃ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．３
（Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００９）を参照のこと。
【００４１】
ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＣＬＣ  ｂｉｏ，  Ｆｉｎｌａｎｄ
ｓｇａｄｅ  １０−１２，  Ｋａｔｒｉｎｅｂｊｅｒｇ，  ８２００  Ａａｒｈｕｓ  Ｎ
，  Ｄｅｎｍａｒｋ）の一部として、ＰＥ情報をもつ短い読み取りアセンブリアルゴリズ
ムが、参照ゲノムに対するゲノムアナライザーＩＩｘプラットホームからの読み取りを整
列するために使用された。マッピングアルゴリズムの詳細な情報に関しては、ＣＬＣ  Ｇ
ｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ  ３．７．１を参照のこ
と。
【００４２】
生産株における変異の同定
野生型株ＳＥ５０−１００と最新の生産株ＳＮ１９９１０−３７−２の間の遺伝的変異
はｇｓＡｓｓｅｍｂｌｅｒソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．３，  ４５４  Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ）の手段により、参照アセンブリ工程の間に、自動的に決定される。単
一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）ならびに構造的な変化を決定するためのアルゴリズムの詳
細は、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  
Ｍａｎｕａｌ  Ｐａｒｔ  Ｃ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．３  （Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００９
）に見つけられる。
【００４３】
野生型株および５個の以前の製造株の間の変異は、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒ
ｋｂｅｎｃｈ（ＣＬＣ  ｂｉｏ，  Ｆｉｎｌａｎｄｓｇａｄｅ  １０−１２  Ｋａｔｒｉ
ｎｅｂｊｅｒｇ，  ８２００  Ａａｒｈｕｓ  Ｎ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用することで
決定された。ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ
３．７．１に詳細に記載された、ＳＮＰおよび欠失／挿入多型（ＤＩＰ）の高性能データ
分析に特有化されたアルゴリズムが使用された。
【００４４】
アクチノプラネス・ウタヘンシス野生型株の配列決定、アセンブリ、および注釈
アクチノプラネス・ウタヘンシス野生型株ＳＥ５０−１００のゲノム配列概要は、３種
の高性能処理の実行からの配列情報の組み合わせにより決定された。これらは、２個のペ
アエンド（ＰＥ）および１個の全ゲノムショットガン（ＷＧＳ）アプローチを使用して、
ゲノムシーケンサーＦＬＸシステム上で実施された。配列決定は、合計で約４億７００万
の配列決定された塩基を占める約２００万の読み取りの成功したヌクレオチド配列決定を
もたらした（それぞれの実行の結果の詳細な情報に関しては表２を参照のこと）。
【００４５】
【表２】
2019030317.tif 000003
【００４６】
配列決定された読み取りは、その後長さで５００塩基を超える、４７６個の連続した配
列（コンティグ）へと成功裏に（９９．６５％）組み立てられた（ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）
。得られた９，１２２，６３２塩基のゲノムサイズの概要を考慮すると、４３．８８倍の
ゲノム範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）が達成された。４８０，０３０（９１．４８％）の成功
裏にマッピングされたペアエンド読み取りのため、これらのコンティグは既に順序付けさ
れ、１１のの足場に方向付けされた（その順序および方向付けペアエンド情報から知られ
ている複数のコンティグ）。表３はアクチノプラネス・ウタヘンシス野生型株ＳＥ５０−
１００の予備的なゲノム配列の概要に至るアセンブリ工程の成功およびエラー率のさらな
る内面（ｉｎｓｉｄｅ）を与える。
【００４７】
【表３】
2019030317.tif 000004
【００４８】
興味深いことに、以前に公表されたアカルボースクラスターのゲノム配列（Ｗｅｈｍｅ
ｉｅｒ，  Ｂｉｏｃａｔ．  Ｂｉｏｔｒａｎｓ．，  ２００３，  ２１：２７９−２８５
ａｎｄ  Ｗｅｈｍｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｐｉｅｐｅｒｓｂｅｒｇ，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００４，  ６３：６１３−６２５）は、
上述した配列決定の結果と同一ではなかった。合計で、３７の単一ヌクレオチド多型（Ｓ
ＮＰ）および２４の欠失／挿入多型（ＤＩＰ）が以前の配列決定の試みによる野生型配列
に人工的に導入されたことがわかった（図１を参照のこと）。これらの不備のある配列決
定の修正は、ａｃｂＣ遺伝子の小さな伸長（４２塩基）ならびにａｃｂＥ遺伝子内のいく
つかの一時的なフレームシフトの修正をもたらした。これは、しかしながら、遺伝子の注
釈全体および全アカルボースクラスターに関する結果を全く有していなかった
【００４９】
フォスミドライブラリー配列決定によるゲノム配列概要の仕上げ
野生型株ＳＥ５０−１００の全ゲノム足場を得るために、９９９の不作為に選択された
フォスミドクローンの末端挿入配列（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｉｎｓｅｒｔ  ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ）が決定された（図２）。配列決定実行の品質ならびにアセンブリ工程の正確さを裏付
けるように、１１のペアエンドを基にした足場と、フォスミドライブラリーを基にした全
ゲノム足場の間に矛盾は全く見つけられなかった。合計で６００のサンガー読み取りは、
ゲノム概要の残余のギャップの大部分をカバーする選択されたクローンに由来した。これ
らの読み取りの手動のアセンブリにより、コンティグ間の４１１のギャップはそれぞれ埋
められ、閉じることができた。残っている６４のコンティグは、単一、円形の足場を形成
して、フォスミドライブラリー内の長い反復性ＤＮＡ配列および／またはカバーされてい
ない領域のためにこの方法では埋めることができなかった。結果として改良されたＡ．ｕ
ｔａｈｅｎｓｉｓ野生型株ＳＥ５０−１００のゲノム配列が、この文書の付録に蓄積され
る。
【００５０】
改良されたゲノム系列に基づいて、アクチノプラネス属と密接に関連する放線菌類に典
型的な、７１．２９％のグアニン−シトシン（Ｇ＋Ｃ）含量が計算された（Ｖｅｎｔｕｒ
ａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．，  ２０
０７，  ７１（３）：  ４９５−５４８）。
【００５１】
アクチノプラネス・ウタヘンシス野生型株ゲノムの注釈
改良されたゲノム配列を基礎として、完全なゲノム注釈は実行され、９８５ヌクレオチ
ドの平均遺伝子長をもつ８，０２７の推定のコード配列（ＣＤＳ）の同定をもたらした。
これに基づいて、アクチノプラネス・ウタヘンシスは、ＤＮＡコード領域（７１．６８％
）および非コード領域（６８．７０％）間で約３％の目立ったＧ＋Ｃ含量の差異をもつ、
８６．３５％のコーディング密度を示した。構造遺伝子の構成を調べることにより、オペ
ロンあたり３．３４遺伝子の平均数で５，９８０の遺伝子（７４．５０％）を保有する（
ｈｏｓｔｉｎｇ）、１，７９３の推定の多シストロン性転写単位が予測された。全てのヌ
クレオチド配列ならびにそれらのアミノ酸翻訳が、この文書の付録に蓄積される。表４は
真核生物の遺伝子予測工程の結果を要約する。
【００５２】
【表４】
2019030317.tif 000005
【００５３】
さまざまな異なるプログラムが、同定されたオープン・リーディング・フレームの機能
注釈を実行するために使用された。外因性タンパク質データベース比較に起因して、酵素
委員会（ＥＣ）番号で、２，８３９のＣＤＳ（３５．６７％）を酵素的に特徴付けること
ができた。さらに、典型的な膜貫通領域を保有する、７０１ＣＤＳ（８．７３％）が膜関
連タンパク質として同定および分類された。６００のタンパク質の総数について、これに
より細胞外培地中に分泌される可能性が高い、シグナルペプチド、が予測された。追加の
６５７のタンパク質に関して、他の分泌機構が提案された。しかしながら、これらの予測
は異常に高い数の分泌タンパク質をもたらすであろう。その上、タンパク質のオルソログ
グループのクラスター（ＣＯＧ）分類システムが適用され、単一またＣＯＧカテゴリーへ
の３，９８３（４９．６２％）ＣＤＳの割当（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）を明らかにした。
付録の表９はＣＯＧ−カテゴリーおよびその細分の、より包括的な概説を提供し、一方で
、一般的な注釈の結果は表５に要約される。完全な注釈の後でも、２，６８４の遺伝子（
３３．４４％）には、関連する機能をいまだ全く有さなかった。しかしながら、他の配列
への遠い（ｄｉｓｔａｎｔ）類似性は公開データベースで見つけられた。４３４（５．４
１％）の孤児遺伝子（ｏｒｐｈａｎ  ｇｅｎｅ）に関しては、遠い関連配列でさえデータ
ベースで見つけられなかった。
【００５４】
【表５】
2019030317.tif 000006
【００５５】
注釈された野生型ゲノムは図３の円形プロットとして示される。順鎖（ｆｏｒｗａｒｄ
ｓｔｒａｎｄ）（最外円）および逆鎖（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）（２番目の円
）で描かれる遺伝子に加えて、Ｇ＋Ｃ含量（３番目の円）ならびにＧ＋Ｃ非対称（ｓｋｅ
ｗ）がそこに描かれる。さらに、複製起点、以前に記載されたトレハロース（Ｌｅｅ  ｅ
ｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００
８，  ８０：７６７−７７８）およびアカルボースクラスター、約２５の連続したリボソ
ームタンパク質からなる興味深いタンパク質クラスターならびに組込および接合要素（ｉ
ｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＩＣＥ）
を含む、いくつかの重要性の高い部位が示される。表６はアクチノプラネス・ウタヘンシ
ス野生型ゲノムの一般的特性を記載する。
【００５６】
【表６】
2019030317.tif 000007
【００５７】
更なる外因性データベース検索により、最も相同的な遺伝子およびそれを基にする有機
体は、各々のオープン・リーディング・フレームに割り当てられた。上記の詳細の注釈と
共に、この情報は付録表１０に各ＣＤＳのために記載される。
【００５８】
多くの遺伝子について、さらに詳細な手作業での注釈が、上記の（半）自動化された情
報に加えられる。これらの遺伝子は、これらの全ての要素に限定されるわけではないが、
アカルボースクラスター（Ｗｅｈｍｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｐｉｐｅｒｓｂｅｒｇ，  Ａｐｐ
ｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００４，  ６３：  ６１３
−６２５）、トレハロースクラスター（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００８，  ８０：７６７−７７８）ならび
に、でんぷん分解および合成酵素などのあるクラスのタンパク質、糖エピメラーゼ、マル
トースの取り込み、輸送および代謝に関与する遺伝子、分泌タンパク質、セルラーゼおよ
び窒素代謝に関与する遺伝子および胞子形成関連遺伝子およびそれらのタンパク質翻訳を
含む。
【００５９】
Ａ．ｕｔａｈｅｎｓｉｓ野生型株の代謝能
注釈されたＥＣ番号の使用を通して、アクチノプラネス・ウタヘンシスの代謝能力を分
析することが可能であった。京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）の標準経路へのＥＣ
番号のマッピングは、解凍、ＴＣＡサイクル、ペントースリン酸経路などの中央代謝に関
するすべての主要経路への有用性を明らかにした。しかしながら、Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕ
ｄｏｒｏｆｆ経路の利用について、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸の２−デヒドロ−３−デ
オキシ−Ｄ−グルコネート−６リン酸への触媒作用のための鍵酵素ホスホグルコン酸デヒ
ドラターゼが消失している。
【００６０】
Ａ．ｕｔａｈｅｎｓｉｓ生産株のゲノム配列決定
野生型株ＳＥ５０−１００に加えて、最新の生産株ＳＮ１９９１０−３７−２１ならび
に５種の以前の株が、これらの株において、遺伝的な差が増加したアカルボース生産の原
因となることを明らかにするために、配列決定された。最新の株はゲノムシーケンサーＦ
ＬＸ（ＧＳ  ＦＬＸ）システム上で配列決定され、一方で以前の株は、ペアエンドデータ
に基づくゲノムアナライザーＩＩｘ（ＧＡ  ＩＩｘ）プラットホームのみを使用すること
で配列決定された。結果は表７に要約される。合計で、５６億個の塩基が配列決定された
。
【００６１】
【表７】
2019030317.tif 000008
【００６２】
変異株と野生型の間の遺伝的変異の同定
以前に終了した野生型ゲノムに対する結果の参照マッピングは、６種の生産株全てのア
センブリに通じる。加えて、生産株と野生型株の間のすべての遺伝的変異が決定できた。
興味深いことに、野生型ゲノムが、生産株に由来する読み取りにより完全にカバーされて
いるように、主要な欠失変異は全く起こっていなかった。しかしながら、１，８２６の単
一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）および１２８の欠失／挿入多型（ＤＩＰ）は野生型ゲノム
と最新の生産株の間で発見された。表８に記載されているように、各々のゲノムに導入さ
れたＳＮＰの数は、株開発の年代順で上昇する。全ての変異およびそれらの正確な変遷は
、生産株と共に、初生産を示す、付録の表１１に記載される。
【００６３】
【表８】
2019030317.tif 000009
【００６４】
ＳＮＰを基にしたヌクレオチド転移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）は、ガウス分布ではなか
ったが、２種の転移（Ｇ→Ａ）および（Ｃ→Ｔ）について１００倍よりも高い優先傾向を
示した。図４はこれらの調査結果について表す。
【００６５】
ＳＮＰおよびＤＩＰが導入された位置に対する注釈された遺伝子座の比較により、１，
８９６の遺伝子（２３．６２％）が、図５で見ることができるように、ヌクレオチドレベ
ルでのこれらの変異に影響を受けたことがわかった。これらのうち、３７６の遺伝子が、
サイレント変異のみを保持して、同じタンパク質配列をまだコードしていた。他方で、８
１６の遺伝子のタンパク質配列は、大部分のアミノ酸配列は不変のまま残しながら、その
個々の位置が異なっていた。しかしながら、残りの７０４の遺伝子はそれらの長さおよび
／またはリーディングフレームを変える変異を受けた。詳細には、４２９の遺伝子は野生
型と比較して増加した長さを有することが、一方で２７５の遺伝子が短くなったと予測さ
れた。
【００６６】
中央代謝の修飾
変異誘発事象により影響を受けた酵素をコードする遺伝子は、アカルボース形成をコー
ドするもののように、全体的な代謝ならびに特有の経路に影響を与える可能性がある。こ
の理由で、これらの遺伝子は、変異誘発実験で導入された機能の損失を特定するために、
それらのＥＣ番号に従って、ＫＥＧＧデータベースの標準経路にマッピングされた。中央
代謝のいくつかの酵素がＳＮＰで影響を受けた一方で、機能の損失の可能性をもたらす変
異によりヒットしたのはほんのわずかな遺伝子だけであった。加えて、これらの大幅に変
更された遺伝子の各々のため、同じＥＣ番号で注釈された少なくとも１の他の遺伝子が、
おそらくノックアウト型のための補助を受けて、まだ利用可能であった。
【００６７】
アカルボースクラスターの修飾と以前の生産株の使用
以前の生産株の配列決定により、それらが最初に導入された株まで時間を遡って変異を
追跡することは可能であった。この分析は、図６に表されるように、アカルボースクラス
ターの配列上で特に教示されていた。クラスターに起こる１３のＳＮＰが、変異実験を実
行した際に、連続して導入された。２のＳＮＰが遺伝子ａｃｂＷおよびａｃｂＶの間の遺
伝子内領域に導入された。さらに、２のＳＮＰがａｃｂＤ遺伝子に導入された。ａｃｂＤ
コードタンパク質、アカルビオシルトランスフェラーゼは、アカルボース・インポーター
複合体を通した再輸入の前に、細胞外空間にマルトデキストリンと共にアカルボースを導
入すると信じられている。他の変異は、アカルボース・インポーター複合体の対象結合タ
ンパク質であるａｃｂＨ遺伝子に位置する。
【００６８】
【表９−１】
2019030317.tif 000010
【表９−２】
2019030317.tif 000011
【表９−３】
2019030317.tif 000012
【表９−４】
2019030317.tif 000013
【表９−５】
2019030317.tif 000014
【表９−６】
2019030317.tif 000015
【表９−７】
2019030317.tif 000016
【表９−８】
2019030317.tif 000017
【表９−９】
2019030317.tif 000018
【００６９】
【表９−１０】
2019030317.tif 000019
【表９−１１】
2019030317.tif 000020
【表９−１２】
2019030317.tif 000021
【表９−１３】
2019030317.tif 000022
【表９−１４】
2019030317.tif 000023
【表９−１５】
2019030317.tif 000024
【表９−１６】
2019030317.tif 000025
【表９−１７】
2019030317.tif 000026
【表９−１８】
2019030317.tif 000027
【表９−１９】
2019030317.tif 000028
【００７０】
【表９−２０】
2019030317.tif 000029
【表９−２１】
2019030317.tif 000030
【表９−２２】
2019030317.tif 000031
【表９−２３】
2019030317.tif 000032
【表９−２４】
2019030317.tif 000033
【表９−２５】
2019030317.tif 000034
【表９−２６】
2019030317.tif 000035
【表９−２７】
2019030317.tif 000036
【表９−２８】
2019030317.tif 000037
【表９−２９】
2019030317.tif 000038
【００７１】
【表９−３０】
2019030317.tif 000039
【表９−３１】
2019030317.tif 000040
【表９−３２】
2019030317.tif 000041
【表９−３３】
2019030317.tif 000042
【表９−３４】
2019030317.tif 000043
【表９−３５】
2019030317.tif 000044
【表９−３６】
2019030317.tif 000045
【表９−３７】
2019030317.tif 000046
【表９−３８】
2019030317.tif 000047
【表９−３９】
2019030317.tif 000048
【００７２】
【表９−４０】
2019030317.tif 000049
【表９−４１】
2019030317.tif 000050
【表９−４２】
2019030317.tif 000051
【表９−４３】
2019030317.tif 000052
【表９−４４】
2019030317.tif 000053
【表９−４５】
2019030317.tif 000054
【表９−４６】
2019030317.tif 000055
【表９−４７】
2019030317.tif 000056
【表９−４８】
2019030317.tif 000057
【表９−４９】
2019030317.tif 000058
【００７３】
【表９−５０】
2019030317.tif 000059
【表９−５１】
2019030317.tif 000060
【表９−５２】
2019030317.tif 000061
【表９−５３】
2019030317.tif 000062
【表９−５４】
2019030317.tif 000063
【表９−５５】
2019030317.tif 000064
【表９−５６】
2019030317.tif 000065
【表９−５７】
2019030317.tif 000066
【表９−５８】
2019030317.tif 000067
【００７４】
【表１０】
2019030317.tif 000068
【００７５】
【表１１−１】
2019030317.tif 000069
【表１１−２】
2019030317.tif 000070
【表１１−３】
2019030317.tif 000071
【表１１−４】
2019030317.tif 000072
【表１１−５】
2019030317.tif 000073
【表１１−６】
2019030317.tif 000074
【表１１−７】
2019030317.tif 000075
【表１１−８】
2019030317.tif 000076
【表１１−９】
2019030317.tif 000077
【００７６】
【表１１−１０】
2019030317.tif 000078
【表１１−１１】
2019030317.tif 000079
【表１１−１２】
2019030317.tif 000080
【表１１−１３】
2019030317.tif 000081
【表１１−１４】
2019030317.tif 000082
【表１１−１５】
2019030317.tif 000083
【表１１−１６】
2019030317.tif 000084
【表１１−１７】
2019030317.tif 000085
【表１１−１８】
2019030317.tif 000086
【表１１−１９】
2019030317.tif 000087
【００７７】
【表１１−２０】
2019030317.tif 000088
【表１１−２１】
2019030317.tif 000089
【表１１−２２】
2019030317.tif 000090
【表１１−２３】
2019030317.tif 000091
【表１１−２４】
2019030317.tif 000092
【表１１−２５】
2019030317.tif 000093
【表１１−２６】
2019030317.tif 000094
【表１１−２７】
2019030317.tif 000095
【表１１−２８】
2019030317.tif 000096
【表１１−２９】
2019030317.tif 000097
【００７８】
【表１１−３０】
2019030317.tif 000098
【表１１−３１】
2019030317.tif 000099
【表１１−３２】
2019030317.tif 000100
【表１１−３３】
2019030317.tif 000101
【表１１−３４】
2019030317.tif 000102
【表１１−３５】
2019030317.tif 000103
【表１１−３６】
2019030317.tif 000104
【表１１−３７】
2019030317.tif 000105
【表１１−３８】
2019030317.tif 000106
【表１１−３９】
2019030317.tif 000107
【００７９】
【表１１−４０】
2019030317.tif 000108
【表１１−４１】
2019030317.tif 000109
【表１１−４２】
2019030317.tif 000110
【表１１−４３】
2019030317.tif 000111
【表１１−４４】
2019030317.tif 000112
【表１１−４５】
2019030317.tif 000113
【表１１−４６】
2019030317.tif 000114
【表１１−４７】
2019030317.tif 000115
【表１１−４８】
2019030317.tif 000116
【表１１−４９】
2019030317.tif 000117
【００８０】
【表１１−５０】
2019030317.tif 000118
【表１１−５１】
2019030317.tif 000119
【表１１−５２】
2019030317.tif 000120
【表１１−５３】
2019030317.tif 000121
【表１１−５４】
2019030317.tif 000122
【表１１−５５】
2019030317.tif 000123
【表１１−５６】
2019030317.tif 000124
【表１１−５７】
2019030317.tif 000125
【表１１−５８】
2019030317.tif 000126
【表１１−５９】
2019030317.tif 000127
【００８１】
【表１１−６０】
2019030317.tif 000128
【表１１−６１】
2019030317.tif 000129
【表１１−６２】
2019030317.tif 000130
【表１１−６３】
2019030317.tif 000131
【表１１−６４】
2019030317.tif 000132
【表１１−６５】
2019030317.tif 000133
【表１１−６６】
2019030317.tif 000134
【表１１−６７】
2019030317.tif 000135
【表１１−６８】
2019030317.tif 000136
【表１１−６９】
2019030317.tif 000137
【００８２】
【表１１−７０】
2019030317.tif 000138
【表１１−７１】
2019030317.tif 000139
【表１１−７２】
2019030317.tif 000140
【表１１−７３】
2019030317.tif 000141
【表１１−７４】
2019030317.tif 000142
【表１１−７５】
2019030317.tif 000143
【表１１−７６】
2019030317.tif 000144
【表１１−７７】
2019030317.tif 000145
【表１１−７８】
2019030317.tif 000146
【表１１−７９】
2019030317.tif 000147
【００８３】
【表１１−８０】
2019030317.tif 000148
【表１１−８１】
2019030317.tif 000149
【表１１−８２】
2019030317.tif 000150
【表１１−８３】
2019030317.tif 000151
【表１１−８４】
2019030317.tif 000152
【表１１−８５】
2019030317.tif 000153
【表１１−８６】
2019030317.tif 000154
【表１１−８７】
2019030317.tif 000155
【表１１−８８】
2019030317.tif 000156
【表１１−８９】
2019030317.tif 000157
【００８４】
【表１１−９０】
2019030317.tif 000158
【表１１−９１】
2019030317.tif 000159
【表１１−９２】
2019030317.tif 000160
【表１１−９３】
2019030317.tif 000161
【表１１−９４】
2019030317.tif 000162
【表１１−９５】
2019030317.tif 000163
【表１１−９６】
2019030317.tif 000164
【表１１−９７】
2019030317.tif 000165
【表１１−９８】
2019030317.tif 000166
【表１１−９９】
2019030317.tif 000167
【００８５】
【表１１−１００】
2019030317.tif 000168
【表１１−１０１】
2019030317.tif 000169
【表１１−１０２】
2019030317.tif 000170
【表１１−１０３】
2019030317.tif 000171
【表１１−１０４】
2019030317.tif 000172
【表１１−１０５】
2019030317.tif 000173
【表１１−１０６】
2019030317.tif 000174
【表１１−１０７】
2019030317.tif 000175
【表１１−１０８】
2019030317.tif 000176
【表１１−１０９】
2019030317.tif 000177
【００８６】
【表１１−１１０】
2019030317.tif 000178
【表１１−１１１】
2019030317.tif 000179
【表１１−１１２】
2019030317.tif 000180
【表１１−１１３】
2019030317.tif 000181
【表１１−１１４】
2019030317.tif 000182
【表１１−１１５】
2019030317.tif 000183
【表１１−１１６】
2019030317.tif 000184
【表１１−１１７】
2019030317.tif 000185
【表１１−１１８】
2019030317.tif 000186
【表１１−１１９】
2019030317.tif 000187
【００８７】
【表１１−１２０】
2019030317.tif 000188
【表１１−１２１】
2019030317.tif 000189
【表１１−１２２】
2019030317.tif 000190
【表１１−１２３】
2019030317.tif 000191
【表１１−１２４】
2019030317.tif 000192
【表１１−１２５】
2019030317.tif 000193
【表１１−１２６】
2019030317.tif 000194
【表１１−１２７】
2019030317.tif 000195
【表１１−１２８】
2019030317.tif 000196
【表１１−１２９】
2019030317.tif 000197
【００８８】
【表１１−１３０】
2019030317.tif 000198
【表１１−１３１】
2019030317.tif 000199
【表１１−１３２】
2019030317.tif 000200
【表１１−１３３】
2019030317.tif 000201
【表１１−１３４】
2019030317.tif 000202
【表１１−１３５】
2019030317.tif 000203
【表１１−１３６】
2019030317.tif 000204
【表１１−１３７】
2019030317.tif 000205
【表１１−１３８】
2019030317.tif 000206
【表１１−１３９】
2019030317.tif 000207
【００８９】
【表１１−１４０】
2019030317.tif 000208
【表１１−１４１】
2019030317.tif 000209
【表１１−１４２】
2019030317.tif 000210
【表１１−１４３】
2019030317.tif 000211
【表１１−１４４】
2019030317.tif 000212
【表１１−１４５】
2019030317.tif 000213
【表１１−１４６】
2019030317.tif 000214
【表１１−１４７】
2019030317.tif 000215
【表１１−１４８】
2019030317.tif 000216
【表１１−１４９】
2019030317.tif 000217
【００９０】
【表１１−１５０】
2019030317.tif 000218
【表１１−１５１】
2019030317.tif 000219
【表１１−１５２】
2019030317.tif 000220
【表１１−１５３】
2019030317.tif 000221
【表１１−１５４】
2019030317.tif 000222
【表１１−１５５】
2019030317.tif 000223
【表１１−１５６】
2019030317.tif 000224
【表１１−１５７】
2019030317.tif 000225
【表１１−１５８】
2019030317.tif 000226
【表１１−１５９】
2019030317.tif 000227
【表１１−１６０】
2019030317.tif 000228
【００９１】
【表１１−１６１】
2019030317.tif 000229
【表１１−１６２】
2019030317.tif 000230
【表１１−１６３】
2019030317.tif 000231
【表１１−１６４】
2019030317.tif 000232
【表１１−１６５】
2019030317.tif 000233
【表１１−１６６】
2019030317.tif 000234
【表１１−１６７】
2019030317.tif 000235
【表１１−１６８】
2019030317.tif 000236
【表１１−１６９】
2019030317.tif 000237
【００９２】
【表１１−１７０】
2019030317.tif 000238
【表１１−１７１】
2019030317.tif 000239
【表１１−１７２】
2019030317.tif 000240
【表１１−１７３】
2019030317.tif 000241
【表１１−１７４】
2019030317.tif 000242
【図１】
2019030317.tif 000243
【図２】
2019030317.tif 000244
【図３】
2019030317.tif 000245
【図４】
2019030317.tif 000246
【図５】
2019030317.tif 000247
【図６】
2019030317.tif 000248
【配列表】
2019030317000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月17日(2018.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表９に記載の、ＳＣ３６８７−１８−４３の変異の全て、ＳＮ１２７５５−４８の変異の全て、Ｃ４４５−Ｐ４７の変異の全て、または、ＳＮ２２３−２９−４７の変異の全てを含むことを特徴とする、配列番号１６０５３の配列を有するＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡを含む微生物。
【請求項３】
以下の工程：
ａ）請求項２に記載の微生物を培養し、
ｂ）微生物により生産されたアカルボースを回収する、
を含む、アカルボースの製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
【表９−１】
2019030317.tif 000249
【表９−２】
2019030317.tif 000250
【表９−３】
2019030317.tif 000251
【表９−４】
2019030317.tif 000252
【表９−５】
2019030317.tif 000253
【表９−６】
2019030317.tif 000254
【表９−７】
2019030317.tif 000255
【表９−８】
2019030317.tif 000256
【表９−９】
2019030317.tif 000257
【外国語明細書】
2019030317000001.pdf