(57)【要約】【課題】動物組織を用いた免疫染色において、抗原抗体反応量の数値化が可能であって、装置の開発に適した評価方法を提供すること。【解決手段】本発明の動物組織を用いた免疫染色の評価方法は、動物組織を薄片化した試料に、賦活化処理を施す工程と、ブロッキング処理を施す工程と、一次抗体反応を行わせる工程と、二次抗体反応用の試薬に加熱処理を施して、二次抗体反応用の試薬に含まれる発色反応に寄与するタンパク質の一部を凝集物として除去し、上清１ａを調製する工程と、上清１ａへ、発色反応に寄与しにくいタンパク質を含む溶液を加えて、希釈液２ａを調製する工程と、希釈液２ａを用いて、二次抗体反応用の試薬を希釈して、反応用試薬３ｂを調製する工程と、反応用試薬３ｂを用いて二次抗体反応を行わせる工程と、発色反応を行わせる工程と、吸光度測定を行う工程と、を備える。【選択図】図２
2019032254.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物組織を薄片化した試料に、
賦活化処理を施す工程と、
ブロッキング処理を施す工程と、
一次抗体反応を行わせる工程と、
二次抗体反応用の試薬に加熱処理を施して、前記二次抗体反応用の試薬に含まれる発色
反応に寄与するタンパク質の一部を凝集物として除去し、少なくとも発色反応に寄与しに
くいタンパク質を加えて希釈液を調製する工程と、
前記希釈液を用いて、前記二次抗体反応用の試薬を希釈して、反応用試薬を調製する工
程と、
前記反応用試薬を用いて二次抗体反応を行わせる工程と、
発色反応を行わせる工程と、
吸光度測定を行う工程と、を備えた免疫染色の評価方法。
【請求項２】
前記希釈液を調製する工程では、前記凝集物を除去した上清に、少なくとも前記発色反
応に寄与しにくいタンパク質を加え、
前記反応用試薬を調製する工程では、前記反応用試薬に含まれるタンパク質の種類と濃
度との調整を行う、請求項１に記載の免疫染色の評価方法。
【請求項３】
前記加熱処理は、１００℃以上、１２０℃以下の温度で、１０分間以上実施する請求項
１または請求項２に記載の免疫染色の評価方法。
【請求項４】
前記発色反応を行わせる工程の前に、前記試料を載置した基板における前記試料の周囲
へ、撥水剤を用いて撥水枠を形成する工程を備えた、請求項１から請求項３のいずれか１
項に記載の免疫染色の評価方法。
【請求項５】
対向して配置された第１電極および第２電極を備え、前記第１電極と前記第２電極との
間に電界を生じさせる電界撹拌機構により、
前記一次抗体反応を行わせる工程、前記二次抗体反応を行わせる工程のうち、少なくと
も１つの工程において撹拌操作を実施する請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の
免疫染色の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物組織を用いた免疫染色の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫染色は、癌などの病理診断の有効な手段として活用されている。このような病理診
断は、手術中に行われる場合もあることから、免疫染色をより迅速かつ正確に行うための
装置の開発が進められている。免疫染色では、組織中の抗原と抗体とを反応（抗原抗体反
応）させた後、抗原抗体反応を発色基質の発色によって可視化して、抗原抗体反応の反応
量の多少を発色強度の差として観察する。そのため、免疫染色に用いる装置の開発におい
ては、発色強度を詳細に評価して微小な発色強度の変化を効果として積み重ね、装置開発
に反映させる必要がある。
【０００３】
従来、発色強度の評価方法として、動物組織を用いて免疫染色を行い、発色の強弱を目
視などで観察する方法と、タンパク質などの検体を基板上に定着させ、ＥＬＩＳＡ（Enzy
me-Linked Immuno Sorbent Assay）法によって発色強度を吸光度として数値化する方法と
、の二つの方法が知られていた。
【０００４】
例えば、特許文献１には、特定の化合物を用いた酵素免疫染色法などにおいて、目視ま
たは分光光度計などを用いて、染色色素に関する情報を読み取る評価方法が紹介されてい
る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−２０２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載の免疫染色法では、動物組織の免疫染色に用いる装置
の開発には適さないという課題があった。詳しくは、抗体としてヒトＩｇＧ（免疫グロブ
リンＧ）を用いた酵素免疫染色法が例示されている。この方法では、抗体を単体で用いる
ことから、病理診断における免疫染色と工程が異なり、実際の人体組織に対して、抗原抗
体反応量の評価結果に微小なずれが生じる懸念があった。なぜなら、使用する試薬の粘度
や表面張力によって抗原抗体反応量が異なる場合があるためである。また、動物組織の免
疫染色では、細胞膜の膜電位の影響を受ける可能性がある。
【０００７】
また、特許文献１では、ヒト大腸癌のパラフィン切片を用いた免疫組織染色も例示され
ている。この方法では、人体組織の染色による色素像が適正に得られたか否かの判断は、
目視によるものである。このような染色法を手術中に用いる場合は、迅速かつ適正な判断
が求められる。したがって、動物組織の免疫染色に用いる装置の開発では、抗原抗体反応
量と発色強度との関係を目視の判断に頼るのではなく数値化することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上述の課題の少なくとも一部を解決するためになされたものであり、以下の
形態または適用例として実現することが可能である。
【０００９】
［適用例］本発明における免疫染色の評価方法は、動物組織を薄片化した試料に、賦活
化処理を施す工程と、ブロッキング処理を施す工程と、一次抗体反応を行わせる工程と、
二次抗体反応用の試薬に加熱処理を施して、二次抗体反応用の試薬に含まれる発色反応に
寄与するタンパク質の一部を凝集物として除去し、少なくとも発色反応に寄与しにくいタ
ンパク質を加えて希釈液を調製する工程と、希釈液を用いて、二次抗体反応用の試薬を希
釈して、反応用試薬を調製する工程と、反応用試薬を用いて二次抗体反応を行わせる工程
と、発色反応を行わせる工程と、吸光度測定を行う工程と、を備える。
【００１０】
本適用例によれば、動物組織を用いた免疫染色において、抗原抗体反応量の数値化が可
能な、従来よりも動物組織の免疫染色に用いる装置の開発に適した評価方法を提供するこ
とができる。
【００１１】
詳しくは、動物組織の免疫染色に用いる二次抗体反応用の試薬は、含まれる酵素標識抗
体（発色に寄与するタンパク質）の含有量が過多なものが多い。これは、病理診断におい
ては、発色強度（抗原抗体反応量）をコントロールすることよりも、抗原抗体反応を確実
に行わせ、動物組織を発色させることを優先するためである。酵素標識抗体が過剰に存在
すると、一次抗体と結合しない遊離分が組織上に多く残存して非特異的な発色反応が起こ
り、発色強度が過度に増大しやすくなる。
【００１２】
そこで、二次抗体反応用の試薬に加熱処理を施して、発色反応に寄与するタンパク質の
一部を凝集物として除去する。このとき、発色に寄与するタンパク質の一部が除去される
ことから、粘度などの物性が二次抗体反応用の試薬から変化する場合がある。そのため、
少なくとも発色反応に寄与しにくいタンパク質を加えて希釈液とする。これにより、希釈
液では、発色反応に寄与するタンパク質の含有量が低減されたまま、発色反応に寄与しに
くいタンパク質を添加することにから、含まれるタンパク質の含有量が増加して、希釈液
の物性を二次抗体反応用の試薬に近付けることができる。さらに希釈液を用いて二次抗体
反応用の試薬を希釈し、反応用試薬とする。希釈液と二次抗体反応用の試薬とは、比較的
に近しい物性であるため、二次抗体反応用の試薬を希釈液で希釈しても、二次抗体反応用
の試薬と反応用試薬との物性差が抑えられる。すなわち、反応用試薬では、二次抗体反応
用の試薬と比べて、物性の変化を抑えながら、発色反応に寄与するタンパク質の含有量が
低減される。これにより、一次抗体と結合しない、発色反応に寄与するタンパク質の遊離
分の残存が低減される。そのため、非特異的な発色反応の進行を抑制し、微小な抗原抗体
反応量の差を顕在化させることができる。したがって、顕在化された微小な抗原抗体反応
量の差を、吸光度として数値化することにより、免疫染色用の装置開発に反映させること
ができる。
【００１３】
反応用試薬では、二次抗体反応用の試薬に対して、粘度や表面張力などの物性の差が低
減される。そのため、動物組織（試料）への滴下や試料上での濡れ広がりなどの挙動を近
付けることができる。また、他の試薬を用いて二次抗体反応用の試薬を希釈するのではな
いため、物性を二次抗体反応用の試薬に対して容易に近付けることができる。
【００１４】
これらにより、従来よりも動物組織の免疫染色に用いる装置の開発に適した評価方法を
提供することができる。また、動物組織を用いた免疫染色において、従来と比べて、微小
な抗原抗体反応量の差を顕在化させることが可能であるため、装置開発のみならず、免疫
染色における工程または条件の改良、試薬類の開発などにも適用することができる。
【００１５】
上記適用例に記載の免疫染色の評価方法において、希釈液を調製する工程では、凝集物
を除去した上清に、少なくとも発色反応に寄与しにくいタンパク質を加え、反応用試薬を
調製する工程では、反応用試薬に含まれるタンパク質の種類と濃度との調整を行うことが
好ましい。
【００１６】
これによれば、遠心分離を用いて凝集物を容易に除去することができる。反応用試薬に
含まれるタンパク質の種類と濃度とを調整することから、反応用試薬における物性を、二
次抗体反応用の試薬に近付けることがさらに容易になる。
【００１７】
上記適用例に記載の免疫染色の評価方法において、加熱処理は、１００℃以上、１２０
℃以下の温度で、１０分間以上実施することが好ましい。
【００１８】
これによれば、二次抗体反応用の試薬に含まれる、発色反応に寄与するタンパク質の一
部を、熱変性によって凝集させ、容易に凝集物とすることができる。
【００１９】
上記適用例に記載の免疫染色の評価方法は、発色反応を行わせる工程の前に、試料を載
置した基板における試料の周囲へ、撥水剤を用いて撥水枠を形成する工程を備えることが
好ましい。
【００２０】
これによれば、撥水剤を用いて撥水枠を形成することで、貼付式の撥水枠に起因する非
特異的な反応の進行を抑制し、吸光度測定におけるノイズ要因を低減することができる。
詳しくは、貼付式の撥水枠を用いると、発色反応時に該撥水枠の周辺も発色することがあ
る。そのため、撥水剤による撥水枠を形成することによって、非特異的な反応の進行を抑
えて、撥水枠に起因する発色を低減することが可能となる。また、撥水剤を用いた撥水枠
は、貼付式と比べて撥水枠の高さが低くなるため、撥水枠の内側に試薬や洗浄液などが溜
まりにくく、試料の洗浄性を向上させることができる。
【００２１】
上記適用例に記載の免疫染色の評価方法において、対向して配置された第１電極および
第２電極を備え、第１電極と第２電極との間に電界を生じさせる電界撹拌機構により、一
次抗体反応を行わせる工程、二次抗体反応を行わせる工程のうち、少なくとも１つの工程
において撹拌操作を実施することが好ましい。
【００２２】
これによれば、電界撹拌機構による撹拌操作（電界撹拌）によって、一次抗体反応、二
次抗体反応における撹拌の効率が向上して、混合が促進される。そのため、一次抗体反応
を行わせる工程、二次抗体反応を行わせる工程の少なくとも１つの工程において反応時間
が短縮され、動物組織を用いた免疫染色の評価を迅速に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】動物組織が固定された組織標本を示す斜視図。
【図２】実施形態に係る動物組織を用いた免疫染色の工程を示すフローチャート。
【図３】電界撹拌機構の電気的および機械的な構成を示す概略図。
【図４】電界撹拌機構の電極構造を示す斜視図。
【図５】電界撹拌機構の電極構造を示す断面図。
【図６Ａ】電界撹拌機構による撹拌原理を示す模式図。
【図６Ｂ】電界撹拌機構による撹拌原理を示す模式図。
【図６Ｃ】電界撹拌機構による撹拌原理を示す模式図。
【図７】試薬中のタンパク質の濃度を示すグラフ。
【図８】実施例に係る動物組織を用いた免疫染色の評価方法の工程を示す表。
【図９】実施例１および比較例１に係る吸光度およびＳ／Ｎ比を示すグラフ。
【図１０】実施例２および実施例３に係る一次抗体反応時間と吸光度との関係を示すグラフ。
【図１１】実施例４に係る二次抗体反応時間と吸光度との関係を示すグラフ。
【図１２】実施例５および実施例６に係る吸光度およびＳ／Ｎ比を示すグラフ。
【図１３】動物組織を用いた免疫染色の従来の工程を示すフローチャート。
【図１４】ＥＬＩＳＡ法の工程を示すフローチャート。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。以下に説明する実施の形
態は、本発明の一例を説明するものである。本発明は、以下の実施の形態に限定されるも
のではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において実施される各種の変形例も、本発明
に含まれる。なお、以下の各図においては、各層や各部材を認識可能な程度の大きさにす
るため、各層や各部材の尺度を実際とは異ならせしめている。
【００２５】
＜従来の免疫染色の評価方法＞
まず、動物組織を用いた従来の免疫染色における、基本的な工程の一例について、図１
、図１３、図１４を参照して説明する。図１は動物組織が固定された組織標本を示す斜視
図であり、図１３は、動物組織を用いた免疫染色の従来の工程を示すフローチャートであ
り、図１４は、ＥＬＩＳＡ法の工程を示すフローチャートである。
【００２６】
［動物組織を用いる方法］
図１に示したように、動物組織を用いた組織標本Ｔｓは、基板９に固定される。基板９
としては、ＪＩＳ  Ｒ  ３７０３：１９９８にて規格化された、幅２６ｍｍ、長さ７６ｍ
ｍ、厚さ１．１ｍｍの無色透明な顕微鏡用スライドガラスが用いられる。基板９には、固
定された組織標本Ｔｓに対して供給される試薬などの液体を、所定の範囲内で保持するた
めに、例えば、シール状の撥水枠４が貼付されている。撥水枠４は、例えば、枠内の直径
が２０ｍｍの円形である。撥水枠４は、基板９に撥水剤をリング状に塗布して形成しても
よい。撥水枠４の形状は、円形であることに限定されず、四角形などの多角形や楕円形な
どであってもよい。
【００２７】
撥水枠４は、基板９に対して１つ形成されることに限定されず、例えば２つ形成しても
よい。一方の撥水枠４内にアクティブ組織標本を固定し、他方の撥水枠４内に比較用のネ
ガティブ組織標本を固定してもよい。
【００２８】
図１３に示したように、動物組織を用いた免疫染色の従来の工程の一例は、脱パラフィ
ン処理（工程Ｓ２１）、賦活化処理（工程Ｓ２２）、ブロッキング処理（工程Ｓ２３）、
一次抗体反応（工程Ｓ２４）、二次抗体反応（工程Ｓ２５）、発色反応（工程Ｓ２６）、
観察（工程Ｓ２７）を備えている。
【００２９】
まず、工程Ｓ２１の前処理として、動物組織から薄片状に切り出した組織標本Ｔｓを、
基板９に貼付して試料とする。具体的には、パラフィン包埋法を用いて、動物組織をパラ
フィンに包埋し、ミクロトームを用いて薄片状に切り出す処理を行う。切り出した動物組
織の薄片（組織標本Ｔｓ）は、上述した基板９の撥水枠４の内側に貼り付けて固定し、以
降の操作を行う。組織標本Ｔｓの厚さは、例えば３μｍから６μｍである。上記の処理に
は公知の方法が採用可能であり、本明細書では説明を省略する。なお、パラフィン包埋法
に代えて凍結切片法を用いて、動物組織を薄片状に切り出し、組織標本Ｔｓとしてもよい
。そして、工程Ｓ２１へ進む。
【００３０】
図１３の工程Ｓ２１（脱パラフィン処理）では、組織内部の水分がパラフィンで置換さ
れている組織標本Ｔｓから、パラフィンを取り除く。具体的には、まずキシレンなどのパ
ラフィンが可溶な非水溶性の有機溶剤に組織標本Ｔｓを浸漬し、パラフィンを非水溶性の
有機溶剤と置換して除去する。これにより、組織標本Ｔｓは、非水溶性の有機溶剤が組織
内部まで浸透した状態となる。次に、無水エタノールなどの水溶性の有機溶剤に組織標本
Ｔｓを浸漬し、非水溶性の有機溶剤を水溶性の有機溶剤と置換して除去する。次に、組織
標本Ｔｓを、ＰＢＳ−Ｔ（ブロッキング作用を有するノニオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２
０を含むＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline：リン酸緩衝生理食塩水））などの洗浄液
を用いて洗浄して、水溶性の有機溶剤を除去する。そして、工程Ｓ２２へ進む。
【００３１】
工程Ｓ２２（賦活化処理）では、組織標本Ｔｓの動物組織における抗原に賦活化処理を
施して、抗原のエピトープを再露出させる。賦活化処理の方法としては、タンパク質分解
酵素処理、加熱処理が挙げられる。タンパク質分解酵素処理では、緩衝液に、ペプシン、
プロテナーゼＫ、またはトリプシンなどのタンパク質分解酵素を溶解した処理液を用いる
。加熱処理では、組織標本Ｔｓを緩衝液と共に、例えば１００℃前後の温度まで加熱する
。加熱方法としては、電子レンジ、オートクレーブ、ウォーターバスなどが採用可能であ
る。緩衝液は、賦活化処理の方法や、後工程の工程Ｓ２４で用いる一次抗体に応じて選択
する。賦活化処理の後、ＰＢＳ−Ｔなどの洗浄液を用いて洗浄を行う。そして、工程Ｓ２
３へ進む。
【００３２】
工程Ｓ２３（ブロッキング処理）では、発色におけるバックグラウンドや偽陽性信号を
低減するために、ブロッキング処理を施す。ブロッキング処理の種別としては、組織標本
Ｔｓに対する抗体の非特異的な結合を防ぐためのブロッキング、内因性ビオチンのブロッ
キング、内因性ペルオキシダーゼのブロッキング、自家蛍光の抑制などが挙げられる。ブ
ロッキング処理の方法および用いる薬剤は、上記の種別に応じて選択され、公知の方法お
よび薬剤が採用可能である。ブロッキング処理を施した後、ＰＢＳ−Ｔなどの洗浄液を用
いて洗浄を行う。そして、工程Ｓ２４へ進む。
【００３３】
工程Ｓ２４（一次抗体反応）では、一次抗体（抗原に特異的に結合する抗体）を含む一
次抗体反応用の試薬を組織標本Ｔｓに接触させて、組織標本Ｔｓの動物組織中の抗原と一
次抗体とを反応（結合）させる。具体的には、マイクロピペットなどを用いて、例えば１
５０μＬの一次抗体反応用の試薬を、組織標本Ｔｓに対して滴下する。このとき、適当な
希釈液を用いて一次抗体反応用の試薬を希釈して用いてもよい。一次抗体反応は、静置な
どによって進行させる方法が採用される。一次抗体反応用の試薬は、検出対象とする抗原
、一次抗体を標識とするか否かなどに応じて、適宜選択される。一次抗体反応を行わせた
後、ＰＢＳ−Ｔなどの洗浄液を用いて洗浄を行う。そして、工程Ｓ２５へ進む。
【００３４】
工程Ｓ２５（二次抗体反応）では、二次抗体を含む二次抗体反応用の試薬を組織標本Ｔ
ｓに接触させて、一次抗体反応にて抗原と結合した一次抗体に対して、さらに二次抗体を
結合させる。具体的には、例えばマイクロピペットなどを用いて、１５０μＬの二次抗体
反応用の試薬を、組織標本Ｔｓに対して滴下する。二次抗体反応においても、一次抗体反
応と同様に、静置などの方法によって反応を進行させる。二次抗体反応用の試薬は、一次
抗体の種類などに応じて適宜選択される。なお、二次抗体反応を行わせずに、直接、一次
抗体を標識してもよい。二次抗体反応を行わせた後、ＰＢＳ−Ｔなどの洗浄液を用いて洗
浄を行う。そして、工程Ｓ２６へ進む。
【００３５】
工程Ｓ２６（発色反応）では、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）や３−アミノ
−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）などの発色基質を含む発色試薬を組織標本Ｔｓに接
触させる。これにより、一次抗体と結合した二次抗体（一次抗体を標識する場合には、一
次抗体）の作用によって、発色基質を酸化させて発色させる。具体的には、マイクロピペ
ットなどを用いて、例えば１５０μＬの発色試薬を、組織標本Ｔｓに対して滴下する。こ
れにより、組織標本Ｔｓにおいて、抗原抗体反応が行われた部位を発色させることができ
る。発色反応の後、水などを用いて洗浄し、発色反応を停止させると共に、余分な発色基
質を除去する。なお、発色基質とは異なる色調およびコントラストを付与させるように、
さらに対比染色を施してもよい。そして、工程Ｓ２７へ進む。
【００３６】
工程Ｓ２７（観察）では、光学顕微鏡などを用いて、組織標本Ｔｓを観察する。病理診
断においては、発色によって組織の形状を際立たせ、組織中の細胞配列の乱れなどを把握
して、病変の有無や程度を診断する。このように、従来の動物組織を用いた免疫染色は、
発色の強弱が明確であれば病理診断の目的に合致する。ところが、動物組織は同じ標本で
あっても観察者によって評価結果が異なる場合がある。したがって、動物組織の免疫染色
に用いる装置の開発においては、装置の改良に反映させるために、抗原抗体反応量を詳細
に数値化したいという要望があった。
【００３７】
［ＥＬＩＳＡ法］
次に、ＥＬＩＳＡ法について説明する。図１４に示したように、ＥＬＩＳＡ法の工程の
一例は、固相化（工程Ｓ３１）、ブロッキング処理（工程Ｓ３２）、一次抗体反応（工程
Ｓ３３）、発色反応（工程Ｓ３４）、反応停止（工程Ｓ３５）、吸光度測定（工程Ｓ３６
）を備えている。
【００３８】
工程Ｓ３１（固相化）では、上述した撥水枠４（図１参照）を形成した基板９を用いて
、撥水枠４の内側に、特定のタンパク質などの検体（抗原）を含む溶液を、例えば１５０
μＬ滴下する。これにより、撥水枠４の内側に、薄膜状の検体の層が形成される。次いで
、ＴＢＳ−Ｔ（ノニオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（Tris Buffered Sali
ne：トリス緩衝生理食塩水））などの洗浄液を用いて洗浄する。そして、工程Ｓ３２へ進
む。
【００３９】
工程Ｓ３２（ブロッキング処理）では、染色におけるバックグラウンドや偽陽性信号を
低減するために、ブロッキング処理を施す。ブロッキングの種別としては、検体に対する
抗体の非特異的な結合を防ぐためのブロッキング、内因性ビオチンのブロッキング、内因
性ペルオキシダーゼのブロッキング、自家蛍光の抑制などが挙げられる。ブロッキング処
理の方法および用いる薬剤は、上記の種別に応じて選択され、公知の方法およびブロッキ
ング剤が採用可能である。具体的には、例えば、検体に対する抗体の非特異的な結合を防
ぐためには、ウシアルブミン、スキムミルク、またはゼラチンなどのブロッキング剤を含
む溶液を検体に接触させる。具体的には、マイクロピペットなどを用いて、例えばブロッ
キング剤を含む溶液１５０μＬを、検体に対して滴下する。これにより、検体中に含まれ
る非特異的な結合を引き起こす因子や基板９の表面にブロッキング剤が結合して、ブロッ
キング処理が施される。この後、ＴＢＳ−Ｔなどの洗浄液を用いて洗浄を行う。そして、
工程Ｓ３３へ進む。
【００４０】
工程Ｓ３３（一次抗体反応）では、一次抗体（検体に特異的に結合する抗体）を含む一
次抗体反応用の試薬を、検体の層に接触させて、検体中の抗原と一次抗体とを反応（結合
）させる。具体的には、例えばマイクロピペットなどを用いて、１５０μＬの一次抗体反
応用の試薬を、検体に対して滴下する。一次抗体反応は、静置などによって進行させる方
法が採用される。抗原と一次抗体との反応を促進するために、電界撹拌を用いることが好
ましい。一次抗体反応用の試薬は、検出対象とする抗原、一次抗体を標識とするか否かな
どに応じて、適宜選択される。一次抗体反応を行わせた後、ＴＢＳ−Ｔなどの洗浄液を用
いて洗浄を行う。そして、工程Ｓ３４へ進む。
【００４１】
工程Ｓ３４（発色反応）では、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ
）などの発色基質を含む発色試薬を検体に接触させて、一次抗体に標識された酵素の作用
によって、発色基質を酸化させて発色させる。具体的には、マイクロピペットなどを用い
て、例えば１５０μＬの発色試薬を、検体に対して滴下する。これにより、検体における
抗原抗体反応量の多少（検体の抗原と結合した一次抗体の多少）に対応して、発色基質が
発色する。すなわち、抗原の量（抗原抗体反応量）と発色強度とは相関関係を有している
。なお、ＥＬＩＳＡ法においても、上述した動物組織を用いた従来の免疫染色のように、
さらに二次抗体反応用の試薬を用いて、一次抗体と二次抗体とを結合させてから、酵素で
標識された二次抗体で発色させてもよい。そして、工程Ｓ３５へ進む。
【００４２】
工程Ｓ３５（反応停止）では、発色基質を発色させた後に、例えば希硫酸などの反応停
止薬を検体に接触させて、発色反応を停止させる。具体的には、マイクロピペットなどを
用いて、例えば０．２Ｍ（２ｍｏｌ／Ｌ）の硫酸水溶液１５０μＬを、検体に対して滴下
する。そして、工程Ｓ３６へ進む。
【００４３】
工程Ｓ３６（吸光度測定）では、マイクロプレートリーダーなどを用いて、検体の吸光
度を測定する。吸光度を測定する光の波長は、用いた発色基質に応じて選択される。測定
された吸光度から抗原の濃度を求めることが可能である。このように、ＥＬＩＳＡ法は、
動物組織自体を試料として用いるのではなく、特定のタンパク質などの成分を検体とする
。そのため、吸光度をもって数値化が可能であるが、病理診断における免疫染色と工程が
異なっている。また、使用する試薬の粘度や表面張力によって抗原抗体反応量が異なる場
合があることから、実際の人体組織に対して、抗原抗体反応量の評価結果に微小なずれが
生じる懸念があった。
【００４４】
＜実施形態に係る評価方法＞
次に、本発明の実施形態に係る、動物組織を用いた免疫染色の評価方法について、図２
を参照して説明する。図２は、実施形態に係る動物組織を用いた免疫染色の工程を示すフ
ローチャートである。なお、図２に示した工程フローは一例であって、これに限定される
ものではない。
【００４５】
実施形態に係る免疫染色の評価方法は、動物組織を薄片化した試料（組織標本Ｔｓ）に
、賦活化処理を施す工程Ｓ２と、ブロッキング処理を施す工程Ｓ３と、一次抗体反応を行
わせる工程Ｓ４と、二次抗体反応用の試薬に加熱処理を施して、二次抗体反応用の試薬に
含まれる発色反応に寄与するタンパク質の一部を凝集物として遠心分離によって除去し、
少なくとも発色反応に寄与しにくいタンパク質を加えて希釈液を調製する工程Ｓ５−１と
、希釈液を用いて、二次抗体反応用の試薬を希釈して、反応用試薬を調製する工程Ｓ５−
２と、反応用試薬を用いて二次抗体反応を行わせる工程Ｓ６と、発色反応を行わせる工程
Ｓ７と、吸光度測定を行う工程Ｓ９と、を備える。
【００４６】
まず、図２に示した工程Ｓ１（脱パラフィン処理）の前工程として、上述した動物組織
を用いた従来の免疫染色（以降、単に「従来の免疫染色」ということもある。）の工程と
同様に、動物組織をパラフィン包埋して薄片状に切り出す。薄片の厚さは、例えば３μｍ
から６μｍとし、基板９（図１参照）の貼付式（シール状）の撥水枠４内に貼り付けて固
定し、組織標本Ｔｓ（パラフィン切片）とする。なお、パラフィン切片に代えて凍結切片
を用いてもよい。凍結切片法を用いる場合は、次の工程Ｓ１は省略する。
【００４７】
図２に示した工程Ｓ１から工程Ｓ３は、従来の免疫染色の工程Ｓ２１（脱パラフィン処
理）から工程Ｓ２３（ブロッキング処理）と同様にして行う。そして、工程Ｓ４へ進む。
【００４８】
工程Ｓ４（一次抗体反応）では、一次抗体を含む一次抗体反応用の試薬を組織標本Ｔｓ
に接触させて、動物組織中の抗原と一次抗体とを反応（結合）させる。具体的には、マイ
クロピペットなどを用いて、例えば１５０μＬの一次抗体反応用の試薬を、組織標本Ｔｓ
に対して滴下する。一次抗体反応用の試薬は、検出対象とする抗原、一次抗体を標識とす
るか否かなどに応じて、適宜選択される。一次抗体反応用の試薬は、市販の抗体希釈液に
て、例えば体積比で５０倍以上、１５０倍以下の範囲に希釈して用いる。そのため、一次
抗体反応用の試薬に含まれる一次抗体の濃度が低減される。このとき、一次抗体反応では
、静置などによって反応を進行させる方法、または後述する電界撹拌を用いて反応を進行
させる方法が採用される。抗原と一次抗体との混合を促進させるために、電界撹拌を用い
ることが好ましい。一次抗体反応を行わせた後、ＰＢＳ−Ｔなどの洗浄液を用いて洗浄を
行う。そして、工程Ｓ５−１へ進む。
【００４９】
工程Ｓ５−１（希釈液の調製）では、まず、二次抗体を含む試薬に加熱処理を施して、
二次抗体反応用の試薬に含まれる発色反応に寄与するタンパク質（二次抗体）の一部を、
熱変性によって凝集させて凝集物とする。二次抗体反応用の試薬は、一次抗体の種類など
に応じて適宜選択される。加熱処理は、１００℃以上、１２０℃以下の温度で、１０分間
以上実施する。このような加熱処理を施すことによって、発色反応に寄与するタンパク質
の一部を凝集物とし、減量することができる。加熱処理の方法としては、特に限定されな
いが、ホットスターラー（スターラーを備えたホットプレート）、ウォーターバス（湯煎
）、ブロックヒーターなどが採用可能である。また、凝集物の生成を促進するために、撹
拌しながら加熱処理を施すことが好ましい。次いで、生成した凝集物を、例えば、ろ過や
遠心分離などの手段を用いて除去する。ろ過に用いるフィルターの目詰まりなどの観点か
ら、遠心分離を用いることが好ましい。本実施形態では、遠心分離機を用いて凝集物を沈
殿させて除去し、上清とする。
【００５０】
次に、上清へ少なくとも発色反応に寄与しにくいタンパク質を加えて、凝集物として除
去した発色反応に寄与するタンパク質の分を補填する。これにより、希釈液における粘度
などの物性を、二次抗体反応用の試薬に近付けることができる。発色反応に寄与しにくい
タンパク質としては、ウシアルブミン、スキムミルク、ゼラチンなどが挙げられる。発色
反応に寄与しにくいタンパク質は、例えば、水などの媒体に、溶解または分散したものを
用いてもよい。上清に対する、発色反応に寄与しにくいタンパク質の添加量は、特に限定
されないが、例えば、上清１ｍＬに対して、１０ｍｇ以上、２０ｍｇ以下の範囲で添加す
る。このような添加量とすることによって、希釈液に含まれるタンパク質の種類と濃度と
を調整し、反応用試薬における物性の調整を容易に行うことができる。また、このような
希釈液を用いて、二次抗体反応用の試薬を次工程Ｓ５−２で希釈しても、希釈液の物性が
二次抗体反応用の試薬に比較的に近いことから、発色強度の調整などの目的のために、物
性を大きく変えずに希釈率を変更することができる。そして、工程Ｓ５−２へ進む。
【００５１】
工程Ｓ５−２（反応用試薬の調製）では、希釈液を用いて、二次抗体反応用の試薬を希
釈して反応用試薬を調製する。このとき、反応用試薬に含まれるタンパク質の種類と濃度
との調整を行う。これにより、反応用試薬の物性が調整される。調整される反応用試薬の
物性としては、粘度、表面張力、ｐＨなどが挙げられる。これらの物性を、希釈液による
二次抗体反応用の試薬の希釈率などにより、適宜調整する。希釈液による二次抗体反応用
の試薬の希釈率は、特に限定されないが、例えば、二次抗体反応用の試薬を、希釈液によ
って、体積比で２０倍以上、１００倍以下の希釈率の範囲で希釈する。このような倍率で
希釈することによって、反応用試薬に含まれるタンパク質の濃度と、反応用試薬の物性と
の調整を容易に行うことができる。以上により、次の工程Ｓ６において、一次抗体と結合
しない、発色反応に寄与するタンパク質の遊離分を低減すると共に、反応用試薬の物性を
二次抗体反応用の試薬に近付けることができる。そして、工程Ｓ６へ進む。
【００５２】
なお、例えば洗浄液として用いるＰＢＳ−Ｔなどを用いて、二次抗体反応用の試薬を希
釈し、発色反応に寄与するタンパク質の濃度を低減することは可能であるが、物性を二次
抗体反応用の試薬に近付けることは難しく、物性の調整に時間を要する場合がある。
【００５３】
工程Ｓ６（二次抗体反応）では、反応用試薬を組織標本Ｔｓに接触させて、一次抗体反
応にて抗原と結合した一次抗体に対して、さらに二次抗体を結合させる。具体的には、マ
イクロピペットなどを用いて、例えば１５０μＬの反応用試薬を、組織標本Ｔｓに対して
滴下する。二次抗体反応においても、一次抗体反応と同様に、静置または電界撹拌にて反
応を進行させる。一次抗体と二次抗体との混合を促進させるために、電界撹拌を用いるこ
とが好ましい。二次抗体反応を行わせた後、ＰＢＳ−Ｔなどの洗浄液を用いて洗浄を行う
。
【００５４】
ここで、工程Ｓ７（発色反応）の前に、基板９において、試料としての組織標本Ｔｓを
囲むように貼られたシール状の撥水枠４を剥がし取り、組織標本Ｔｓの周囲へ、免疫組織
化学染色用の撥水ペンなどの撥水剤を用いて、新たな撥水枠４を形成する工程を設ける。
これにより、貼付式の撥水枠４に起因する非特異的な反応の進行を抑制し、工程Ｓ９（吸
光度測定）におけるノイズ要因を低減することができる。詳しくは、貼付式の撥水枠４を
用いると、発色反応時に撥水枠４の周辺も発色することがある。そのため、撥水剤を用い
て撥水枠４を形成することによって、非特異的な反応の進行を抑えて、撥水枠４に起因す
る発色を低減することが可能となる。また、撥水剤を用いた撥水枠４は、貼付式と比べて
撥水枠４と基板９との段差が小さくなるため、撥水枠４の内側に試薬や洗浄液などが溜ま
りにくく、組織標本Ｔｓの洗浄性や乾燥性を向上させることができる。そして、工程Ｓ７
へ進む。
【００５５】
工程Ｓ７（発色反応）では、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）
などの、主にＥＬＩＳＡ法に用いられる発色基質を含む発色試薬を検体に接触させる。こ
れにより、二次抗体の作用によって発色反応が進行し、発色基質を酸化させて発色させる
。具体的には、マイクロピペットなどを用いて、例えば１５０μＬの発色試薬を、組織標
本Ｔｓに対して滴下する。発色反応により、組織標本Ｔｓにおける抗原抗体反応量の多少
に対応して、発色基質が発色する。すなわち、抗原の量（抗原抗体反応量）と発色強度と
は相関関係を有している。
【００５６】
なお、本実施形態では、試料として動物組織を用いているが、発色基質としては、ＥＬ
ＩＳＡ法用の発色基質を用いることが好ましい。上述したように、ＴＭＢはＥＬＩＳＡ法
に用いる発色基質である。そのため、従来の動物組織を用いた免疫染色とは異なり、撥水
枠４内側の略全面（撥水枠４に滴下した発色試薬の略全面）が発色する。そして、工程Ｓ
８へ進む。
【００５７】
工程Ｓ８（反応停止）では、発色基質を発色させた後に、例えば希硫酸などの反応停止
薬を組織標本Ｔｓに接触させて、発色反応を停止させる。具体的には、マイクロピペット
などを用いて、例えば０．２ｍｏｌ／Ｌ（０．２Ｍ）の硫酸水溶液１５０μＬを、組織標
本Ｔｓに対して滴下する。そして、工程Ｓ９へ進む。
【００５８】
工程Ｓ９（吸光度測定）では、撥水枠４内の発色した液体（発色した発色試薬）を９６
ウェルプレートなどに採取し、マイクロプレートリーダーなどを用いて、撥水枠４内の吸
光度を測定する。吸光度を測定する光の波長は、用いた発色基質に応じて選択される。例
えば、発色基質としてＴＭＢを用いると、発色により青色を呈し、希硫酸などで反応を停
止させると黄色を呈する。そのため、吸光度測定では、４５０ｎｍを測定波長とする。吸
光度をもって、抗体の量を数値化することができる。また、あらかじめ検出対象とする抗
原（特定のタンパク質など）を用いて、濃度に対する吸光度の検量線を作成しておき、組
織標本Ｔｓの吸光度と検量線とから、組織標本Ｔｓ中の抗原の濃度を定量し、数値化して
もよい。
【００５９】
ここで、上述したように、反応用試薬はタンパク質の種類と量とが調整されている。そ
のため、発色反応は急激に進行しにくく、かつ飽和しにくくなっている。これにより、二
次抗体反応の反応時間を調整すれば、発色強度の大小を調整することができる。また、上
述したように、一次抗体反応用の試薬は、従来よりも希釈率を大きくしている。そのため
、二次抗体反応と同様にして、一次抗体反応の反応時間を調整しても、発色強度の大小を
調整することができる。以上により、上述した工程のみならず、動物組織を用いた免疫染
色における様々な条件などを変更して、発色強度の大小を変動させることが可能になる。
そのような条件変更による発色強度の変化の知見をもって、動物組織の免疫染色に用いる
装置の開発や改良に反映させることができる。
【００６０】
＜電界撹拌機構＞
本実施形態に係る電界撹拌機構の概略構成について、図３を参照して説明する。図３は
、電界撹拌機構の電気的および機械的な構成を示す概略図である。
【００６１】
図３に示したように、本実施形態の電界撹拌機構１００は、ステージとして機能する第
１電極としての下側電極１０、第２電極としての上側電極２０、昇降機構１２０、移動機
構１３０、電界発生部１４０、制御部１５０、操作部１６０、電源部（図示せず）を備え
ている。電源部は、例えば交流電源装置であって、昇降機構１２０、移動機構１３０、電
界発生部１４０を駆動するための電力を外部交流電源から供給する。
【００６２】
電界撹拌機構１００においては、下側電極１０と上側電極２０とを上下方向に対向して
配置し、下側電極１０と上側電極２０との間に電界を生じさせることが可能である。これ
により、上述した本実施形態の免疫染色の工程（評価方法）では、対向して配置された下
側電極１０と上側電極２０との間に電界を生じさせ、一次抗体反応を行わせる工程Ｓ４、
二次抗体反応を行わせる工程Ｓ６のうち、少なくとも１つの工程において電界撹拌による
撹拌操作を実施する。
【００６３】
操作部１６０は、制御部１５０、と電気的に接続され、例えば、液晶表示パネルなどの
表示部と、表示部に重畳されたタッチパネル方式の入力部とを含んでいる。表示部には、
入力部としての各種操作ボタンが表示され、それらを押すことにより選択可能である。こ
れによって、操作部１６０は、制御部１５０を介して、電界撹拌機構１００の各部を駆動
制御し、上記各種操作ボタンに対応する各種操作を行わせる。
【００６４】
制御部１５０は、例えばＣＰＵ（Central Processing Unit）およびメモリーを有して
いる。制御部１５０は、昇降機構１２０、移動機構１３０、電界発生部１４０と電気的に
接続され、操作部１６０にて選択された各種操作に応じて、それらに電気信号を伝達して
各種操作を実行させる。
【００６５】
昇降機構１２０は、下側電極１０と機械的に接続され、制御部１５０と電気的に接続さ
れている。昇降機構１２０は、例えば、電気モーター駆動によるステージ移動装置であっ
て、制御部１５０の電気信号により、下側電極１０を上下方向に移動させることが可能で
ある。これにより、下側電極１０と上側電極２０との間の、上下方向の距離（電極間距離
）を調節することが可能である。
【００６６】
移動機構１３０は、上側電極２０と機械的に接続され、制御部１５０と電気的に接続さ
れている。移動機構１３０は、例えば、電気モーター駆動による電極移動機構であって、
制御部１５０の電気信号により、上側電極２０を上下方向と交差する方向、例えば前後方
向へ移動させることが可能である。これにより、下側電極１０に対する上側電極２０の位
置を変えて、下側電極１０への基板９の着脱を容易にすることが可能である。
【００６７】
ここで、上述した前後方向は、基板９を下側電極１０に載置した場合の、基板９の長手
方向と略一致する。また、上側電極２０と下側電極１０とが対向する上下方向、および該
前後方向と直交する方向を、左右方向とする。
【００６８】
下側電極１０および上側電極２０は、電界発生部１４０と接続されている。電界発生部
１４０は、例えば、矩形波発生回路である。電界発生部１４０は、例えば、０Ｖから４．
５ｋＶの電位差の範囲で、かつ１Ｈｚから１００Ｈｚの周波数範囲で、交流電圧としての
矩形波を発生させることが可能である。具体的には、上側電極２０に対して、下側電極１
０の極性を正極性（＋）とした矩形波や、下側電極１０の極性を負極性（−）とした矩形
波を発生させることができる。例えば、下側電極１０と上側電極２０との間の電位差を４
ｋＶとする場合には、下側電極１０の電位を−１ｋＶとし、上側電極２０の電位を＋３ｋ
Ｖとして、電位差４ｋＶを実現してもよい。これにより、電界発生部１４０は、制御部１
５０に制御されて、下側電極１０と上側電極２０とに電位を与えて交流電界を発生させる
。
【００６９】
上側電極２０に対向する下側電極１０の表面には、液滴Ｓが形成された基板９が載置さ
れる。液滴Ｓは、基板９の撥水枠４（図１参照）の内側に滴下された、一次抗体反応用の
試薬または反応用試薬である。液滴Ｓは、撥水枠４の撥水作用によって基板９の表面を濡
れ広がらずに、撥水枠４の内側で凸状に盛り上がった状態で保持される。液滴Ｓと基板９
の表面との間には、組織標本Ｔｓ（図示せず）が固定されている。
【００７０】
次に、電界撹拌機構１００における、上側電極２０および下側電極１０を含む電極構造
について、図４および図５を参照して説明する。図４は、電界撹拌機構の電極構造を示す
斜視図である。図５は、電界撹拌機構の電極構造を示す断面図である。
【００７１】
図４に示したように、上側電極２０と対向する下側電極１０の表面には、載置部１３が
設けられている。載置部１３によって基板９を前後方向に沿って配置して、基板９の位置
決めが可能である。具体的には、載置部１３は、前後方向に延在する一対のガイド部１１
と、前後方向の後端側に設けられ、左右方向に延在する度当たり部１２とを有している。
基板９の長手方向の一方の端が度当たり部１２に当接するように、一対のガイド部１１の
間に基板９を挿入すれば、基板９の長手方向の他方の端が前方に張り出した状態で、基板
９が下側電極１０上に配置される。ピンセットなどの把持ツールを用いて、基板９の前方
に張り出した部分を把持すれば、下側電極１０に対して基板９の着脱を容易に行うことが
できる。
【００７２】
上側電極２０における下側電極１０と対向する表面には、前後方向に延在する溝２１が
設けられている。溝２１の断面構造は四角形であり、上下方向に切り立った側面と平坦な
底面とを有している。
【００７３】
図５に示したように、下側電極１０に液滴Ｓが形成された基板９を載置して、下側電極
１０と上側電極２０とを対向して配置したときに、溝２１は、液滴Ｓの直上に位置するよ
うに設けられている。上述したように、基板９としては、ＪＩＳ  Ｒ  ３７０３：１９９
８にて規格化された顕微鏡用スライドグラス（幅２６ｍｍ、長さ７６ｍｍ、厚さ１．１ｍ
ｍの無色透明なガラス）を用いる。基板９に形成される撥水枠４の直径は、例えば２０ｍ
ｍである。溝２１の左右方向の幅ｄ３は例えば８ｍｍであり、溝２１の深さは例えば４ｍ
ｍである。
【００７４】
上側電極２０における下側電極１０と対向する表面のうち、溝２１内部の表面を底面２
０ｂとし、底面２０ｂ以外の表面を表面２０ａとする。基板９が載置される下側電極１０
の表面１０ａと、表面２０ａとの間の、上下方向における電極間距離ｄ１は、表面１０ａ
と底面２０ｂとの間の、上下方向における電極間距離ｄ２よりも小さくなる。なお、ガイ
ド部１１の表面１０ａにおける高さは、基板９の厚さよりも小さくなっている。
【００７５】
次に、電界撹拌機構１００を用いた電界撹拌の撹拌原理について、図６Ａから図６Ｃを
参照して説明する。図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃは、電界撹拌機構による撹拌原理を示す模式
図である。なお、図６Ａから図６Ｃでは、上述した上側電極２０の溝２１および一対のガ
イド部１１は、図示を省略している。
【００７６】
図６Ａに示したように、撥水枠４の撥水作用により、基板９上で液滴Ｓは凸状に盛り上
がって保持される。盛り上がった液滴Ｓの基板９上における高さｈは、主に、液滴Ｓにお
ける容量、粘度、表面張力、および液滴Ｓが接する基板９の表面の界面張力により決まる
。特に、液滴Ｓの粘度は、温度に依存するため、電界撹拌機構１００を用いる場合の温度
管理は重要になる。液滴Ｓ（一次抗体反応用の試薬または反応用試薬）は、基板９への滴
下量の調整のし易さや、撹拌の容易さなどの理由から、例えば５ｃｐｓ以下とすることが
好ましい。また、一般に液体の粘度は温度に依存するため、電界撹拌機構１００には、液
滴Ｓを加温することによって液滴Ｓの粘度を低減する機構を設けてもよい。液滴Ｓを加温
して、抗原抗体反応を促進させてもよい。
【００７７】
基板９の１つの撥水枠４に形成される液滴Ｓの容量は、動物組織の大きさや試薬の種類
および濃度によって適宜選択される。具体的には、例えば５０μＬ以上、６００μＬ以下
である。
【００７８】
次に、電界発生部１４０によって、上側電極２０と下側電極１０との間に交流電界が発
生すると、図６Ｂに示したように、交流電界によって液滴Ｓの頂部が引き上げられる方向
にクーロン力が働き、液滴Ｓは変形して高さｈが△ｈ分大きくなる。また、交流電界によ
って、液滴Ｓの頂部が引き上げられる方向のクーロン力が働かなくなる（液滴Ｓに重力が
作用する）と、あるいは液滴Ｓの頂部が引き下げられる方向のクーロン力が働くと、図６
Ｃに示したように、液滴Ｓの頂部が陥没した状態に変形して、液滴Ｓの高さｈは小さくな
る。
【００７９】
電界撹拌とは、このような変形（振動）を連続的に発生させて、少量の液体を非接触で
撹拌する方法である。電界撹拌を用いて液滴Ｓを撹拌することにより、基板９に固定され
た組織標本Ｔｓの抗原または抗体と、液滴Ｓとの接触の機会を増大させ、静置を用いた場
合と比べて撹拌効率を高めることができる。すなわち、静置による発色強度と同程度の発
色強度を得るには、反応時間を短縮することができる。
【００８０】
以上に述べたように、上記実施形態に係る動物組織を用いた免疫染色の評価方法によれ
ば、以下の効果を得ることができる。
【００８１】
二次抗体反応用の試薬に加熱処理を施して、発色反応に寄与するタンパク質の一部を凝
集物として除去し、上清とする。上清は、発色に寄与するタンパク質の一部が除去されて
いることから、粘度などの物性が二次抗体反応用の試薬から変化している場合がある。そ
のため、上清に、発色反応に寄与しにくいタンパク質を加えて希釈液とする。これにより
、希釈液では、発色反応に寄与するタンパク質の含有量が低減されたまま、発色反応に寄
与しにくいタンパク質を添加することによって、希釈液に含まれるタンパク質の含有量を
増加させ、物性を二次抗体反応用の試薬に近付けることができる。さらに希釈液を用いて
二次抗体反応用の試薬を希釈し、反応用試薬とする。希釈液と二次抗体反応用の試薬とは
、比較的に近しい物性であるため、二次抗体反応用の試薬を希釈液で希釈しても、二次抗
体反応用の試薬と反応用試薬との物性差が抑えられる。すなわち、反応用試薬では、二次
抗体反応用の試薬と比べて、物性の変化を抑えながら、発色反応に寄与するタンパク質の
含有量が低減される。これにより、一次抗体と結合しない、発色反応に寄与するタンパク
質の遊離分の残存が低減される。そのため、非特異的な発色反応の進行を抑制し、微小な
抗原抗体反応量の差を顕在化させることができる。したがって、顕在化された微小な抗原
抗体反応量の差を、吸光度として数値化することができる。抗原抗体反応量を数値化する
ことにより、発色強度を目視だけでなく客観的に判断が可能となって、免疫染色用の装置
開発に反映させることができる。
【００８２】
反応用試薬では、二次抗体反応用の試薬に対して、粘度や表面張力などの物性の差が低
減される。そのため、組織標本Ｔｓへの滴下や組織標本Ｔｓ上での濡れ広がりなどの挙動
を近付けることができる。また、他の試薬を用いて二次抗体反応用の試薬を希釈するので
はないため、物性を二次抗体反応用の試薬に対して容易に近付けることができる。
【００８３】
工程Ｓ５−１（希釈液の試薬の調製）において、遠心分離を用いて凝集物を容易に除去
することができる。反応用試薬に含まれるタンパク質の種類と濃度とを調整することから
、反応用試薬の物性を二次抗体反応用の試薬に近付けることがさらに容易になる。
【００８４】
加熱処理を、１００℃以上、１２０℃以下の温度で、１０分間以上実施することから、
二次抗体反応用の試薬に含まれる、発色反応に寄与するタンパク質の一部を、熱変性によ
って凝集させ、容易に凝集物とすることができる。
【００８５】
工程Ｓ７（発色反応）の前に撥水剤を用いて撥水枠４を形成することで、貼付式の撥水
枠４に起因する非特異的な反応の進行を抑制し、吸光度測定におけるノイズ要因を低減す
ることができる。また、撥水剤を用いた撥水枠４は、貼付式と比べて撥水枠４の高さが低
くなるため、撥水枠４の内側に試薬や洗浄液などが溜まりにくく、試料の洗浄性や乾燥性
を向上させることができる。
【００８６】
電界撹拌機構１００による撹拌操作（電界撹拌）によって、液滴Ｓを効率的に撹拌する
ことができる。そのため、電界撹拌を工程Ｓ４（一次抗体反応）、工程Ｓ６（二次抗体反
応）の少なくとも１つの工程において用いれば、反応時間が短縮され、免疫染色の評価を
迅速に行うことができる。
【００８７】
以上により、従来よりも動物組織の免疫染色に用いる装置の開発に適した評価方法を提
供することができる。また、動物組織を用いた免疫染色において、従来と比べて、抗原抗
体反応量の違いを数値化することが可能であるため、装置開発のみならず、免疫染色にお
ける工程または条件の改良、試薬類の開発などにも適用することができる。
【００８８】
次に、上記実施形態の動物組織を用いた免疫染色の評価方法について、実施例と比較例
とを示し、上記実施形態の効果をより具体的に説明する。
【００８９】
＜タンパク質濃度＞
二次抗体反応用の試薬、上清、および希釈液におけるタンパク質の濃度を調査した。二
次抗体反応用の試薬としては、Ｄａｋｏ（登録商標）  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）＋
Ｄｕａｌ  Ｌｉｎｋ  Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ（商品名、Ａｇｉｌｅｎｔ社）（以降、単に
「ＥｎＶｉｓｉｏｎ試薬」と略記する。）を用いた。まず、工程Ｓ５−１として、ＥｎＶ
ｉｓｉｏｎ試薬を耐熱ガラス製の試験管に入れ、時折振とうさせながら１１５℃で１０分
間の加熱処理を施した。これにより、ＥｎＶｉｓｉｏｎ試薬に含まれている発色反応に寄
与するタンパク質を熱変性させ、凝集物とした。次いで、室温（約２０℃）程度まで放冷
してから遠沈管に移し、小型超遠心機ＣＳ１５０ＮＸ（日立工機社）を用いて、回転速度
１５０００ｒｐｍ（revolution per minute）で１０分間の遠心分離を行った。これによ
り、凝集物を除去した上清１ａを得た。
【００９０】
次に、工程Ｓ５−２として、ウシアルブミンのアルブミンウシ血清由来Ａ７９０６（製
品名、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加した。添加量は、ウシアルブミンの質量で
、上清１ａの１ｍＬ当たり１３ｍｇとした。次いで、撹拌、混合して希釈液２ａとした。
【００９１】
次に、ＥｎＶｉｓｉｏｎ試薬、上清１ａ、および希釈液２ａについて、Ｌｏｗｒｙ法を
用いて、それぞれが含有するタンパク質の濃度を測定した。その結果を図７に示した。図
７は、試薬中のタンパク質の濃度を示すグラフである。
【００９２】
図７に示したように、ＥｎＶｉｓｉｏｎ試薬のタンパク質の濃度は、１５．６ｍｇ／ｍ
Ｌであった。これに対して、上清１ａでは、工程Ｓ５−１においてタンパク質の一部を熱
変性させて除去したことにより、タンパク質の濃度が２．０ｍｇ／ｍＬまで低減されてい
た。希釈液２ａでは、工程Ｓ５−１において上清１ａにウシアルブミンを添加したことに
より、タンパク質の濃度が１１．１ｍｇ／ｍＬに増加した。これにより、希釈液２ａを用
いてＥｎＶｉｓｉｏｎ試薬を希釈すれば、ＰＢＳ−Ｔなどの洗浄液を用いた場合と比べて
、タンパク質の濃度を大きく変えずに希釈することができる。すなわち、反応用試薬の粘
度などの物性を、ＥｎＶｉｓｉｏｎ試薬に近付けることができる。
【００９３】
＜吸光度およびＳ／Ｎ比＞
［実施例１］
実施例１の動物組織を用いた免疫染色の評価方法について、図８を参照して説明する。
図８は、実施例に係る動物組織を用いた免疫染色の評価方法の工程を示す表である。
【００９４】
動物組織として、ブタ肝臓組織を用いた。動物組織の採取から、パラフィン包埋法を用
いて薄片状に切り出し、基板９（ＪＩＳ  Ｒ  ３７０３：１９９８に準拠した顕微鏡用ス
ライドガラス）に貼り付けて固定するまでの工程については、公知の方法が採用可能であ
り、説明は省略する。動物組織は、ミクロトームにて厚さ４μｍの薄片状に切り出して、
基板９に貼り付けた。以降、試料（組織標本Ｔｓ）とは基板９に貼付した状態の動物組織
をいう。なお、以下に説明する各工程は、特に断わりがない限り、室温（約２０℃）環境
下で行った。
【００９５】
図８に示したように、工程Ｓ１では、試料に脱パラフィン処理を施した。具体的には、
キシレンを満たした容器を３槽用意し、試料を順次、該容器のキシレンに浸漬した。浸漬
時間は、１槽につき３分間とした。次に、無水エタノールを満たした容器を４槽用意し、
試料を順次、該容器の無水エタノールに浸漬した。浸漬時間は、１槽につき１分間とした
。その後、洗浄として、ＰＢＳ−Ｔを満たした容器を３槽用意し、試料を順次、該容器の
ＰＢＳ−Ｔに浸漬した。浸漬時間は、１槽につき１０秒間とした。そして、工程Ｓ２へ進
む。
【００９６】
工程Ｓ２では、試料に賦活化処理を施した。具体的には、市販の賦活化処理液Ｅｐｉｔ
ｏｐｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐＨ９（商品名、Ｌａｉｃａ社）を用
いた。試料を浸漬した該賦活化処理液を、湯煎にて９８℃で４５分間加熱した。次いで、
室温（約２０℃）で２０分間自然冷却（放冷）した。その後、洗浄として、ＰＢＳ−Ｔを
満たした容器を３槽用意し、試料を順次、該容器のＰＢＳ−Ｔに浸漬した。浸漬時間は、
１槽につき１０秒間とした。次に、試料を囲むように貼付式の撥水枠４（直径２０ｍｍ）
を基板９に貼り付けた。そして、工程Ｓ３へ進む。
【００９７】
工程Ｓ３では、ブロッキング処理を施した。具体的には、３質量％濃度の過酸化水素水
へ試料を５分間浸漬した。その後、洗浄として、ＰＢＳ−Ｔを満たした容器を３槽用意し
、試料を順次、該容器のＰＢＳ−Ｔに浸漬した。浸漬時間は、１槽につき１０秒間とした
。そして、工程Ｓ４へ進む。
【００９８】
工程Ｓ４では、一次抗体反応用の試薬を用いて、一次抗体反応を行わせた。具体的には
、一次抗体反応用の試薬として、Ｄａｋｏ（登録商標）  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐ
ａｔｏｃｙｔｅ  Ｃｌｏｎｅ  ＯＣＨ１Ｅ５（商品名、Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用い、希釈
液Ｄａｋｏ（登録商標）ＲＥＡＬ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（商品名、Ａｇｉ
ｌｅｎｔ社）にて体積比で５０倍に希釈して希釈試薬を調製した。次に、マイクロピペッ
トを用いて、該希釈試薬を試料に１５０μＬ滴下した。試料が該希釈試薬の液滴に包まれ
た状態で静置して、一次抗体反応を行わせた。静置時間は１０分間とした。この静置時間
が一次抗体反応時間である。その後、洗浄として、ＰＢＳ−Ｔを満たした容器を３槽用意
し、試料を順次、該容器のＰＢＳ−Ｔに浸漬した。浸漬時間は、１槽につき１０秒間とし
た。そして、工程Ｓ５−１へ進む。
【００９９】
ここで、ブランク試料は、工程Ｓ４において、試料に滴下した希釈試薬に代えて、希釈
液Ｄａｋｏ（登録商標）ＲＥＡＬ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（商品名、Ａｇｉ
ｌｅｎｔ社）を試料に１５０μＬ滴下した。この他は、以降の工程も同様に行ってブラン
ク試料とした。すなわち、上記の希釈液には一次抗体が含まれないため、ブランク試料で
は、一次抗体反応が起こらない。
【０１００】
工程Ｓ５−１では、上清１ａを調製した。上清１ａは、上述したタンパク質濃度の調査
と同様にして調製した。
【０１０１】
次に、上清１ａとウシアルブミンとを用いて希釈液２ａを調製した。希釈液２ａは、上
述したタンパク質濃度の調査と同様にして調製した。そして、工程Ｓ５−２へ進む。
【０１０２】
工程Ｓ５−２では、反応用試薬３ａを調製した。具体的には、希釈液２ａを希釈液とし
て用い、ＥｎＶｉｓｉｏｎ試薬を体積比で２５倍に希釈し、反応用試薬３ａとした。そし
て、工程Ｓ６へ進む。
【０１０３】
工程Ｓ６では、反応用試薬３ａを用いて、二次抗体反応を行わせた。具体的には、マイ
クロピペットを用いて、反応用試薬３ａを試料に１５０μＬ滴下した。試料が反応用試薬
３ａの液滴に包まれた状態で１０分間静置して、二次抗体反応を行わせた。この静置時間
が二次抗体反応時間である。その後、洗浄として、ＰＢＳ−Ｔを満たした容器を３槽用意
し、試料を順次、該容器のＰＢＳ−Ｔに浸漬した。浸漬時間は、１槽につき１０秒間とし
た。次に、基板９から貼付式の撥水枠４を剥がし取り、市販の撥水ペンとしてスーパー・
パップペン  リキッドブロッカー（商品名、大道産業社）を用いて、試料およびブランク
試料のそれぞれの周囲に直径２０ｍｍの撥水枠４を形成した。そして、工程Ｓ７へ進む。
【０１０４】
工程Ｓ７では、発色試薬を用いて発色反応を行わせた。具体的には、発色基質のＴＭＢ
を含む市販の発色試薬ＴＭＢ  Ｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＨＲＰ（商品名、ベチルラ
ボラトリーズ社）を用い、マイクロピペットにて該発色試薬を試料に１５０μＬ滴下した
。試料が発色試薬の液滴に包まれた状態で５分間静置して、発色反応を行わせた。発色反
応の進行により、試料のみならず、撥水枠４内側の略全面にＴＭＢによる発色が発現した
。そして、工程Ｓ８へ進む。
【０１０５】
工程Ｓ８では、発色反応を停止させた。具体的には、マイクロピペットを用いて、０．
２ｍｏｌ／Ｌの硫酸水溶液を試料に１５０μＬ滴下した。試料が該硫酸水溶液の液滴に包
まれた状態で１５分間静置して、発色反応を停止させた。そして、工程Ｓ９へ進む。
【０１０６】
工程Ｓ９では、マイクロプレートリーダーを用いて、試料の吸光度を測定した。具体的
には、撥水枠４の内側の液体（発色した発色試薬）を９６ウェルプレートに採取して、マ
イクロプレートリーダーとして、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ（登録商標）  ＧＯ吸光マイクロプ
レートリーダー５１１１９２５０（商品名、サーモフィッシャーサイエンティフィックラ
ボプロダクツ社）を用いて、採取した液体における波長４５０ｎｍの光の吸光度を測定し
た。また、ブランク試料についても同様にして吸光度を測定し、試料の吸光度をブランク
試料の吸光度で除して、実施例１の吸光度のＳ／Ｎ比（Signal-to-Noise ratio）を求め
た。実施例１の試料の吸光度およびＳ／Ｎ比を図９に示した。
【０１０７】
［比較例１］
比較例１では、実施例１の動物組織を用いた免疫染色の評価方法において、工程Ｓ５−
１から工程Ｓ５−３を行わず、工程Ｓ６にて反応用試薬３ａを用いずに、ＥｎＶｉｓｉｏ
ｎ試薬（二次抗体反応用の試薬）を原液のまま用いた他は、実施例１と同様に行った。得
られた比較例１の試料の吸光度およびＳ／Ｎ比を図９に示した。
【０１０８】
実施例１および比較例１の試料の吸光度およびＳ／Ｎ比について、図９を参照して説明
する。図９は、実施例１および比較例１に係る吸光度およびＳ／Ｎ比を示すグラフである
。図９において、横軸は実施例１および比較例１の水準を表し、左の縦軸は試料の吸光度
（棒グラフ）を表し、右の縦軸は吸光度のＳ／Ｎ比（点グラフ）を表している。
【０１０９】
図９に示したように、実施例１では比較例１と比べて、試料の吸光度が約１／３に減少
すると共に、ブランク試料の吸光度も減少してＳ／Ｎ比が大きくなった。したがって、二
次抗体反応に反応用試薬３ａを用いることにより、非特異的な発色反応の進行が抑制され
て、ノイズが低減されることが示された。
【０１１０】
＜一次抗体反応用の試薬の希釈率＞
［実施例２および実施例３］
次に、工程Ｓ４における一次抗体反応用の試薬の希釈率を変更し、一次抗体反応時間を
５分間から６０分間まで振った場合の吸光度を調査した。
【０１１１】
まず、実施例２として、実施例１の評価方法において、工程Ｓ４の一次抗体反応時間を
、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０分間と振った他は実施例１と同様に行って、
実施例２のそれぞれの試料の吸光度を測定した。その結果を図１０に示した。
【０１１２】
次に、実施例３では、実施例１の工程Ｓ４における一次抗体反応用の試薬（Ｄａｋｏ（
登録商標）  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｃｌｏｎｅ  ＯＣＨ１Ｅ５
（商品名、Ａｇｉｌｅｎｔ社））に対する、希釈液（Ｄａｋｏ（登録商標）ＲＥＡＬ  Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（商品名、Ａｇｉｌｅｎｔ社））の添加量（希釈率）を
変更した。具体的には、一次抗体反応用の試薬を希釈液にて体積比で１００倍に希釈して
希釈試薬を調製し、一次抗体反応に用いた。この他は実施例２と同様にして、一次抗体反
応時間を振り、実施例３のそれぞれの試料の吸光度を測定した。その結果を図１０に示し
た。
【０１１３】
実施例２および実施例３の試料の吸光度について、図１０を参照して説明する。図１０
は、実施例２および実施例３に係る一次抗体反応時間と吸光度との関係を示すグラフであ
る。図１０において、横軸は一次抗体反応時間を表し、縦軸は試料の吸光度を表している
。
【０１１４】
図１０に示したように、実施例２では、一次抗体反応時間を５分間から６０分間の間で
振っても、吸光度の変化が小さいことが分かった。これは、一次抗体反応に用いた希釈試
薬に含まれる一次抗体の濃度が高く、５分間の一次抗体反応で反応の進行が略飽和するた
めである。実施例３では、実施例２と比べて、一次抗体反応時間によって吸光度が大きく
変化することが分かった。これは、実施例３では、実施例２と比べて、希釈試薬中の一次
抗体が少量であるため、一次抗体反応の進行が６０分間では飽和しないことを示している
。
【０１１５】
＜二次抗体反応用の試薬の希釈率＞
［実施例４］
次に、工程Ｓ５−２におけるＥｎＶｉｓｉｏｎ試薬の希釈率を変更し、二次抗体反応時
間を５分間から６０分間まで振った場合の吸光度を調査した。具体的には、実施例１の希
釈液２ａを希釈液として用い、ＥｎＶｉｓｉｏｎ試薬を体積比で５０倍に希釈し、反応用
試薬３ｂとした。実施例４では、一次抗体反応に実施例３と同一の希釈試薬（体積比で１
００倍に希釈）を用い、二次抗体反応に反応用試薬３ｂを用い、工程Ｓ６の二次抗体反応
時間を５、１０、２０、３０、４０、５０、６０分間と振った。これ以外の工程は、実施
例１と同様にして行い、実施例４のそれぞれの試料の吸光度を測定した。その結果を図１
１に示した。
【０１１６】
実施例４の試料の吸光度について、図１１を参照して説明する。図１１は、実施例４に
係る二次抗体反応時間と吸光度との関係を示すグラフである。図１１において、横軸は二
次抗体反応時間を表し、縦軸は試料の吸光度を表している。
【０１１７】
図１１に示したように、実施例４では、実施例３と比べて吸光度の変化がより急峻にな
り、かつ吸光度の数値も大きくなった。これは、反応用試薬３ｂにおける二次抗体の濃度
がより適切になったため、反応条件（二次抗体反応時間）に対して、より鋭敏に吸光度の
変化を捉えることができたことを示している。
【０１１８】
＜二次抗体反応用の試薬の希釈率＞
［実施例５および実施例６］
次に、一次抗体反応および二次抗体反応における電界撹拌機構の適用による効果につい
て調査した。一次抗体反応および二次抗体反応（抗原抗体反応）において、従来の静置に
よって該反応を行わせた実施例５と、静置に代えて電界撹拌機構による電界撹拌を施して
該反応を行わせた実施例６とについて、試料の吸光度およびＳ／Ｎ比を求めて双方を比較
した。
【０１１９】
実施例５では、実施例３と同様な一次反応用の希釈液（希釈率が体積比で１００倍）を
一次抗体反応に用い、実施例４と同様な反応用試薬３ｂを二次抗体反応に用いた他は、実
施例１の評価方法と同様にして試料の吸光度およびＳ／Ｎ比を求めて、その結果を図１２
に示した。なお、実施例５では、実施例１と同様に、一次抗体反応および二次抗体反応は
、共に静置にて１０分間とした。
【０１２０】
実施例６では、一次抗体反応および二次抗体反応共に、静置に代えて電界撹拌を施した
他は、実施例５と同様にして試料の吸光度およびＳ／Ｎ比を求めて、その結果を図１２に
示した。具体的には、電界撹拌染色装置（電界撹拌機構）として、ヒスト・テック（登録
商標）  Ｒ−ＩＨＣ  Ｔｙｐｅ  Ａ２（商品名、サクラファインテックジャパン社）を用
いた。電界撹拌条件は、一次抗体反応では、電圧を４．０ｋＶ、周波数を５Ｈｚ、電極間
距離ｄ１を４．１ｍｍとし、二次抗体反応では、電圧を４．０ｋＶ、周波数を４Ｈｚ、電
極間距離ｄ１を４．１ｍｍとし、一次抗体反応時間および二次抗体反応時間共に１０分間
とした。
【０１２１】
実施例５および実施例６の試料の吸光度およびＳ／Ｎ比について、図１２を参照して説
明する。図１２は、実施例５および実施例６に係る吸光度およびＳ／Ｎ比を示すグラフで
ある。図１２において、横軸は実施例５および実施例６の水準を表し、左の縦軸は試料の
吸光度（棒グラフ）を表し、右の縦軸は吸光度のＳ／Ｎ比（点グラフ）を表している。
【０１２２】
図１２に示したように、実施例５および実施例６の吸光度は、実施例１（図９参照）の
吸光度０．７５と比べて、実施例５が０．３０４、実施例６が０．３７８と小さな値とな
った。実施例５および実施例６のＳ／Ｎ比は、実施例１のＳ／Ｎ比５．７と比べて、実施
例５が８．０、実施例６が１１．５と大きくなることが分かった。特に、実施例６は電界
撹拌を用いたことにより、実施例５よりもさらにＳ／Ｎ比が向上し、電界撹拌による効果
が示された。
【０１２３】
以上に述べた実施例および比較例の結果から、本実施例においては、一次抗体反応に用
いる試薬は希釈することが好ましく、その希釈率は、体積比で１００倍であることがより
好ましく、反応用試薬は、二次抗体反応に寄与するタンパク質の含有量を減らし、その分
を二次抗体反応に寄与しにくいタンパク質で補うように調整することが好ましく、希釈液
による二次抗体反応用の試薬の希釈率は、体積比で５０倍であることがより好ましく、抗
原抗体反応には電界撹拌機構による電界撹拌を用いることがより好ましいことが示された
。
【符号の説明】
【０１２４】
１ａ…上清、２ａ…希釈液、３ａ、３ｂ…反応用試薬、４…撥水枠、９…基板、１０…
第１電極としての下側電極、２０…第２の電極としての上側電極、１００…電界撹拌機構
、Ｔｓ…組織標本。
【図１】
2019032254.tif 000003
【図２】
2019032254.tif 000004
【図３】
2019032254.tif 000005
【図４】
2019032254.tif 000006
【図５】
2019032254.tif 000007
【図６Ａ】
2019032254.tif 000008
【図６Ｂ】
2019032254.tif 000009
【図６Ｃ】
2019032254.tif 000010
【図７】
2019032254.tif 000011
【図８】
2019032254.tif 000012
【図９】
2019032254.tif 000013
【図１０】
2019032254.tif 000014
【図１１】
2019032254.tif 000015
【図１２】
2019032254.tif 000016
【図１３】
2019032254.tif 000017
【図１４】
2019032254.tif 000018