(57)【要約】      （修正有）【課題】バイオテクノロジー産業の分野において、組換えポリペプチドの産生を産業規模で可能にする、特に哺乳動物細胞の生存率、増殖および生産性に有益な効果を発揮する細胞培養培地、および該細胞培養培地を用いた組換えポリペプチドの産生方法の提供。【解決手段】全ナトリウムイオンの数を減らし、全カリウムイオンの数を増やした培地、すなわちナトリウムイオンとカリウムイオンのモル比が約１０対１と約１対１の間である、哺乳動物細胞を増殖するための細胞培養培地。該細胞培養培地を、哺乳動物細胞の培養、所望の組換えポリペプチドの産生に使用する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
約１０対１と約１対１の間のナトリウムイオンとカリウムイオンのモル比によって特徴
付けられる、哺乳動物細胞を増殖するための細胞培養培地。
【請求項２】
ナトリウムイオンとカリウムイオンのモル比が約８対１と約６対１の間である、請求項
１に記載の細胞培養培地。
【請求項３】
ナトリウムイオンの濃度が約５０ｍＭと約９０ｍＭの間である、請求項１または２に記
載の細胞培養培地。
【請求項４】
カリウムイオンの濃度が約８ｍＭと約１２ｍＭの間である、請求項１から３のいずれか
に記載の細胞培養培地。
【請求項５】
全アミノ酸濃度が約４０ｍＭと約１００ｍＭの間である、請求項１から４のいずれかに
記載の細胞培養培地。
【請求項６】
全アミノ酸濃度に対する全イオン濃度のモル比が約１．９と約４の間である、請求項１
から５のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項７】
組換えポリペプチドを産生するための方法であって、請求項１から６のいずれかに記載
の培地中で哺乳動物細胞を培養すること、および組換えポリペプチドを発現させることを
含む方法。
【請求項８】
培養条件が少なくとも１つの温度変動および／または少なくとも１つのｐＨ変動を含む
、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
培養をフェドバッチプロセスによって行う、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
産生されるポリペプチドがグリコシル化されたものである、請求項７から９のいずれか
に記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが抗体または抗体断片である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞およびＳＰ２／０細胞からなる群から選択され
る、請求項７から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
異なる成分を互いに混合する、請求項１に記載の細胞培養培地を作成するための方法。
【請求項１４】
約７ｍＭと約１５ｍＭの間の濃度で塩化ナトリウムが添加される、請求項１３に記載の
方法。
【請求項１５】
約８ｍＭと約１２ｍＭの間の濃度で塩化カリウムが添加される、請求項１３または１４
に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの一般的な分野、特に産業規模でポリペプチドを産生す
るための細胞の培養およびそれらの使用に関する。
【０００２】
本発明は、それらのナトリウムイオンとカリウムイオンのモル比によって特徴付けられ
る、高い細胞生存率での、細胞、好ましくはＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞の培養に適
した細胞培養培地を提供する。本発明による細胞培養培地は、ポリペプチド産生、特に哺
乳動物細胞培養系におけるポリペプチドの組換え発現による、特に産業規模におけるポリ
ペプチド産生に使用される場合、高いポリペプチド生産性の獲得を可能にする。
【背景技術】
【０００３】
組換え技術を使用したポリペプチドの調製は、この数十年の間に標準的手順に発展して
いる。各ポリペプチドをコードする遺伝子のクローニング、次に発現される遺伝子による
適切な発現宿主の二次形質転換、および最終産生、および得られた組換えポリペプチド産
物の精製による組換えポリペプチドへのアクセスは、全く新しいクラスの生物学的に設計
および産生される治療剤へのアクセスをもたらしている。
【０００４】
医薬品産業界では、組換えＤＮＡ技術を使用し、次に生物工学の分野で開発された産生
法を使用して調製される、医薬品活性がある化合物の数が増加し続けている。
【０００５】
このようなバイオ製品には、自己免疫疾患、炎症障害、免疫抑制、腫瘍学などを含めた
様々な医療分野において、重要な治療選択肢に発展しているモノクローナル抗体が含まれ
る。
【０００６】
生物源のこのような治療剤の開発には、それによって多量の組換えポリペプチドへのア
クセスをもたらす産業規模での生産が必要とされる。好ましい発現系は、昆虫細胞、酵母
などに基づく大部分の他の真核生物発現系、または一層伝統的な原核生物発現系より優れ
た、哺乳動物細胞培養系である。
【０００７】
しかしながら、哺乳動物細胞培養には、特に産業規模で多大な課題がある。哺乳動物細
胞培養のための生産施設は、多くの方法条件の完全な最適化を必要とする。
【０００８】
生産プロセス全体を制御するための最も重要な方法のパラメーターの１つは、細胞を増
殖させポリペプチド産生が起こる培地である。適切な細胞培養培地は全ての必要な栄養物
質を細胞培養にもたらすはずであり、血清またはタンパク質、例えば増殖因子のような動
物起源の成分を培地に加えない場合、これは特に難しい。
【０００９】
したがって、広く様々な異なる細胞培養培地が開発されている。いくつかの場合、一般
的な組成に焦点が当てられおり、広く様々な異なる物質を含む培地が提案されている（Ｕ
Ｓ５１２２４６９、ＥＰ０４８１７９１、ＥＰ０２８３９４２）。他の場合、個々の成分
が細胞培養を改善することが示唆されている。主な目標は依然として、細胞の増殖または
生存のいずれか、または組換え発現ポリペプチドの量および質を改善することである。
【００１０】
従来技術の文書において取り扱われる具体的態様は、特に追加的特徴（例えば、ＥＰ０
５０１４３５、ＵＳ５８３０７６１、ＵＳ７２９４４８４）と組み合わせた、個々の微量
イオン（例えば、ＷＯ０２／０６６６０３、ＥＰ０８７２４８７、ＥＰ１３６０３１４Ａ
２）、アスコルビン酸などのビタミン（例えば、ＵＳ６８３８２８４）、炭水化物（ＥＰ
１５４３１０６）、または具体的なアミノ酸の含有量の貢献である。
【００１１】
細胞培養培地中の主要イオンおよびそれらの濃度は大部分が一定に保たれ、考慮されず
不変のままである。例えばＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＢＭＥまたはＲＰＭＩ１６４０
などの、全ての古典型の培地は、一般に比較的狭い固定範囲の濃度のバルクイオン、およ
び詳細には一価カチオンＮａ＋およびＫ＋を使用する。これは、一般にバルクイオン、お
よび詳細には一価カチオンＮａ＋およびＫ＋のイオンバランスが、ほぼ全ての哺乳動物細
胞の相当な普遍的性質である事実と一致する。
【００１２】
より詳細には、細胞内に高濃度のカリウムイオン、細胞外に高濃度のナトリウムイオン
を伴う、ナトリウムイオンとカリウムイオンの膜を隔てた勾配（transmembrane gradient
）は、哺乳動物細胞の基本的性質である。ナトリウムカリウムポンプは、起電性でありそ
れぞれ膜を隔てたナトリウムイオンおよびカリウムイオン勾配の確立および維持に貢献す
る、細胞膜の主要イオンポンプの１つである（Kaplan,Membrane cation transport and t
he control of proliferation of mammalian cells. Annu Rev Physiol.;40:19-41 (1978
)）。このポンプは細胞エネルギーの約３０％を使用し、細胞の主なエネルギー消費プロ
セスの１つである。例えばＮａ＋／Ｃａ＋交換体または細胞へのアミノ酸輸送などの、多
くの基本的な生化学的プロセスは、ナトリウムイオンの電気化学的勾配と関係がある。し
たがって、細胞外のナトリウムイオンおよびカリウムイオンの濃度は、膜を隔てたこれら
のイオンの勾配および細胞の基本状態に影響を与える非常に重要なパラメーターである。
【００１３】
一般的な哺乳動物細胞内外のナトリウムイオンの典型的な濃度に従い（Alberts et al.
,Molecular Biology of the Cell(1994)）、大抵は、約５ｍＭのカリウムイオン濃度と一
緒に、約１４５ｍＭのナトリウム濃度が選択される。大部分の培地型に関して、これは約
２０〜３０の間の範囲内のナトリウムイオンとカリウムイオンの間の比をもたらす（以下
の表１、および例えばＵＳ５１３５８６６を参照）。
【００１４】
わずかな従来技術の文書のみが、哺乳動物細胞の培養または組換えタンパク質の産生に
適した細胞培養培地を記載し、ナトリウムイオンとカリウムイオンの具体的な比を言及す
る。これらの文書は、ＵＳ５２３２８４８中では約３０．７の高範囲、または約２５と３
５の間、したがってさらに高い値に到達する範囲で（ＥＰ０２８３９４２、ＥＰ０３８９
７８６）、特異的に高い比を有する培地組成を示唆する。ＨＡＭのＦ１２、またはＵＳ２
００８／０２６１２５９中で提案された定義済み動物細胞培養培地などの他の培地も、高
い値を具体的に示唆する（例えば、ＵＳ２００８／０２６１２５９中では２７．９〜５７
．５）。非常にわずかな文書のみが、１１．５〜３０などの２０未満のナトリウムイオン
とカリウムイオンの比（ＵＳ７２９４４８４）、または約１５（ＵＳ６１８０４０１）の
比を有する培地を開示する。これらの文書は１０を超える比を依然使用しており、さらに
特定の利点を割り当てて前述の値にこのパラメーターを変えることはない。
【００１５】
特定イオン間のイオンバランスに関する影響以外に、培地の全体モル浸透圧濃度に対す
る主要イオンの貢献も考慮されなければならない。例えばＤＭＥＭ、ＭＥＭα、またはＦ
ｉｓｃｈｅｒの培地などの、大部分の従来型培地は、多量の塩化ナトリウムによって特徴
付けられる。
【００１６】
ＷＯ０２／１０１０１９は、より高いモル浸透圧濃度の使用と組み合わせた、培地中の
高含有量のグルコースを取り扱う。約２〜４０ｇ／ｌの間の高いグルコース濃度は、塩化
ナトリウムなどの作用物質を低減またはさらに完全に排除し、それによって所与のレベル
にモル浸透圧濃度を維持することにより得られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
前述の課題および既存の欠点を考慮すると、バイオテクノロジー産業の分野において、
組換えポリペプチドの産生を産業規模で可能にする、改善された細胞培養培地が絶えず必
要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、低いＮａ＋／Ｋ＋比、すなわち、約１０の値未満のＮａ＋／Ｋ＋比を有する
細胞培養培地を提供する。これは、全ナトリウムイオンの数を減らし、全カリウムイオン
含有量を増やすことによって達成される。このような低い比は、特に哺乳動物細胞の改善
された生存率、増殖および生産性に、いくつかの有益な効果を発揮することが分かってい
る。
【００１９】
したがって本発明は、モル含有量として測定して、約１０対１と約１対１の間、あるい
は約８対１と約６対１の間のナトリウムイオンとカリウムイオンのモル比によって特徴付
けられる、哺乳動物細胞の増殖およびポリペプチド産生に最適な細胞培養培地を提供する
。この特徴の履行は、約５０ｍＭと約９０ｍＭの間のナトリウムイオン濃度および約８ｍ
Ｍと約１２ｍＭの間のカリウムイオン濃度を含むことができる。
【００２０】
別の態様では、細胞培養培地の最適化は、約４０ｍＭと約１００ｍＭの間、あるいは約
５０ｍＭと約１００ｍＭの間の、全アミノ酸含有量の選択を含む。この特徴は、全アミノ
酸濃度に対する全イオン濃度の特定の低いモル比（約１．９と約４の間のにあるモル比）
と組み合わせることができる。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、本発明による細胞培養培地を、哺乳動物細胞の培養、所
望の組換えポリペプチドの産生に使用する方法を提供する。この方法は、本発明による培
地中で哺乳動物細胞を培養すること、および組換えポリペプチドを発現させることを含む
。
【００２２】
いくつかの方法の履行は、培地の温度および／またはｐＨを培養中に少なくとも一回変
動させる培養条件を含む。さらなる選択肢として、フェドバッチプロセスにより供給を行
う。
【００２３】
所望のポリペプチド産物には、グリコシル化ポリペプチド、および特に抗体および抗体
断片がある。
【００２４】
本発明の方法中で使用する哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞およびＳＰ２／０
細胞からなる群から選択されることが好ましい。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、異なる成分を互いに混合する、本発明による細胞培養培
地を作成するための方法に関する。特に、培地組成に加える塩化ナトリウムの濃度は、約
７ｍＭと約１５ｍＭの間の範囲であってよい。培地組成に加えることができる塩化カリウ
ムの濃度は、約８ｍＭと約１２ｍＭの間の範囲であってよい。
【００２６】
本発明は、以下の実施例および図面を参照することによってさらによく理解される。し
かしながら実施例は、本発明の範囲を制限することを目的とするものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明によって記載する低いＮａ＋／Ｋ＋比を有する培地を使用し、振とうフラスコ培養における培養時間の関数として、ｍＡｂ１産生ＣＨＯ細胞クローンの生存細胞密度を示す図である（実施例１参照）。さらに、一定温度対温度変動の影響を示す。
【図２】低いＮａ＋／Ｋ＋比を有する培地を使用したｍＡｂ１産生ＣＨＯ細胞クローンの生存率、および第３日の一定温度対温度変動の影響を示す図である（実施例１参照）。
【図３】温度変動有りまたは無しで、ｍＡｂ１産生ＣＨＯ細胞クローンの振とうフラスコ培養に関する培養時間の関数として、産物力価を示す図である（実施例１参照）。本発明による低いＮａ＋／Ｋ＋比を有する培地中で細胞を培養した。
【図４】ｍＡｂ２産生クローンにおける培養時間中のラクテート濃度を示す図である（実施例２参照）。本発明による低いＮａ＋／Ｋ＋比を有する培地中で細胞を培養した。
【図５】ＣＨＯ細胞クローンを含む３００Ｌバイオリアクター中での培養時間の関数として、生存細胞密度を示す図である。培養条件は、温度ステップ（第５日）、および目標値および不動帯でのｐＨ制御による２つのｐＨ変動を含んでいた（これも実施例２参照）。本発明による低いＮａ＋／Ｋ＋比を有する培地中で細胞を培養した。
【図６】ＣＨＯ細胞クローンを含む３００Ｌバイオリアクター中での培養時間の関数として、産物力価を示す図である。方法は温度および２つのｐＨ変動と組み合わせた（図５および実施例２も参照）。本発明による低いＮａ＋／Ｋ＋比を有する培地中で細胞を培養した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明による細胞培養培地は、哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞およ
びＳＰ２／０細胞の増殖、およびこのような細胞を使用した組換えポリペプチドの産生に
使用する。ＣＨＯ細胞が特に好ましい。用語細胞培養培地は、長時間にわたり細胞を増殖
するのに使用することができる栄養素の水溶液を指す。典型的には、細胞培養培地は以下
の成分を含む。通常、炭水化物化合物、好ましくはグルコース、アミノ酸、好ましくは全
必須アミノ酸を含めたアミノ酸の基底集合、ビタミン、および／または低濃度で必要とさ
れる他の有機化合物、遊離脂肪酸、および微量元素、無機塩を含めた無機化合物、緩衝化
合物およびヌクレオシドおよび塩基であるエネルギー源。
【００２９】
本発明による細胞培養培地は、様々な細胞培養法において使用することができる。細胞
の培養は、接着培養、例えば単層培養、または好ましくは浮遊培養で実施することができ
る。
【００３０】
例えば治療活性がある組換えポリペプチドを産生するための、製薬産業の分野における
細胞培養培地の使用は、安全性および汚染の問題のため、生物起源の任意の物質の使用を
一般に可能にしない。したがって、本発明による細胞培養培地は、無血清および／または
無タンパク質培地であることが好ましい。用語「無血清および／または無タンパク質培地
」は、組織加水分解物のような動物源由来の添加剤、例えばウシ胎児血清などを含有しな
い、化学的に完全に定義された培地を表す。さらに、タンパク質、特にインスリン、トラ
ンスフェリンなどのような成長因子も、本発明による細胞培養に加えないことが好ましい
。さらに、本発明による細胞培養培地は、大豆、小麦または米ペプトンまたは酵母加水分
解物などのような、加水分解タンパク質源を補充しないことが好ましい。
【００３１】
培地のモル浸透圧濃度およびｐＨは、細胞の増殖を可能にする値、例えば約ｐＨ６．８
と約ｐＨ７．２の間の値に調節する。培養開始時の培地のモル浸透圧濃度は典型的には約
２８０ｍＯｓｍと約３６５ｍＯｓｍの間であるが、培養中および供給液の添加中に約６０
０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の値に段階的に増大する可能性もある。本発明による培地は、約２
８５ｍＯｓｍ／ｋｇと約３６５ｍＯｓｍ／ｋｇの間の開始モル浸透圧濃度を有することが
好ましい。
【００３２】
細胞培養の温度は、細胞に生命力があり増殖する範囲で選択する。細胞培養の典型的な
温度は、約３０℃と約３８℃の間の範囲内である。例えば、ＣＨＯ細胞に最適な約３６℃
〜約３７℃の温度で細胞を最初に増殖させる。しかしながら、正確な温度を細胞の必要性
に適合させることが可能であり、培養中に変化させてそれらの最適生存率、増殖または生
産性をもたらすことも可能である。
【００３３】
本発明の第一の態様は、細胞培養中のナトリウムイオンとカリウムイオンの間のイオン
バランスに関する。本発明は、約１０対１と約１対１の間にあるナトリウムイオンとカリ
ウムイオンのモル比を記載する。本発明のさらなる履行では、約９対１と約５対１の間の
比を選択する。あるいは、比は約８対１と約６対１の間にある。
【００３４】
ナトリウムイオンとカリウムイオンの濃度およびそれぞれの比は、ここではそれらのモ
ル含有量によって定義する。ナトリウムイオンとカリウムイオンの濃度は、それぞれの塩
を添加し培地溶液中に溶けた後に、増殖培地中のこれらのイオンの総数を計算することに
より決定する。
【００３５】
必要とされるナトリウム濃度に到達するため、通常は異なる塩を培地に加える。一般に
使用されるナトリウム塩は、例えばＮａＣｌ、一塩基性または二塩基性リン酸ナトリウム
塩、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、例えば亜セレン酸ナトリウムなどの微量イオ
ンであるが、これらの例だけには限られない。さらに、ｐＨ調節のために培地に加えるこ
とができる塩基水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）は、ナトリウムイオンの全含有量に貢献す
る。この点で、用語イオンは解離状態を指す。したがって、イオンのモル含有量を計算す
ることは、イオンの価数を考慮することを意味する。培地に加える１ｍＭの塩化ナトリウ
ム（ＮａＣｌ）は１ｍＭのナトリウムイオンに従って貢献し、一方１ｍＭの二塩基性リン
酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）は２ｍＭのナトリウムイオンに然るべく貢献し得る。本
発明によれば、培地中で使用するナトリウム濃度は約５０ｍＭと９０ｍＭの間である。あ
るいは、約６５ｍＭ〜約８５ｍＭであるようにナトリウムイオン濃度を選択する。
【００３６】
培地に使用されるカリウム塩は典型的にはＫＣｌであるが、例えばＫ２ＳＯ４またはリ
ン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）も含む。カリウム塩はこれらの個々の例に限られな
い。あるいは、培地中で使用するカリウム濃度は約８ｍＭと１２ｍＭ、または約１０．７
ｍＭの間である。
【００３７】
表１は、哺乳動物細胞の増殖に従来使用されている培地の例を示す。ＤＭＥＭ、ＤＭＥ
Ｍ／Ｆ１２、ＢＧＪおよびその他などの、これらの古典的培地は、Ｎａ／Ｋイオンの特に
高い比を有する。本発明による培地は、約１０対１未満の特に低いＮａ／Ｋ比によって特
徴付けられる（表２参照）。本発明による培地は、ＣＨＯおよび他の哺乳動物細胞を培養
するのに適しており、細胞の改善された増殖を示し、および／または改善されたポリペプ
チド産生を可能にする。このような培地の２つの例を、２例の培地の組成、およびどのよ
うにして低いＮａ／Ｋ比を得ることができるかを示す表３中に示す。ナトリウムイオンと
カリウムイオンの低い比と、他の培地の特徴の間の相乗効果には、細胞の増殖および組換
えタンパク質の産生に対して、さらに他の有利な効果がある。
【００３８】
ナトリウムイオンとカリウムイオンの個々の濃度およびそれらの具体的な比以外に、本
発明の培地は、培地成分の混合物に加える塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の特に低い濃度に
よっても特徴付けられる。約７ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度を使用することが好ましい。この
少量の塩化ナトリウムは普通ではない。本発明のいくつかの履行では、塩化ナトリウム濃
度（ｍＭ単位）は、加えるそれぞれのカリウム塩の濃度（ｍＭ単位）より一層低い。さら
に、本発明による培地は、塩化物イオンの低い全含有量を示すことが多い。表２の例によ
って示されるように、これは約３６ｍＭと４６ｍＭの間の初期塩化物濃度をもたらす。大
抵、ＮａＣｌまたはＣａＣｌ２などの無機塩はこの値に貢献するが、塩化コリン、または
例えばＬ−ヒスチジン塩酸塩もしくはＬ−リシン塩酸塩などのアミノ酸などの、培地成分
を全体濃度に加えることもできる。
【００３９】
本発明による培地組成のさらなる利点は、低いモルＮａ／Ｋ比と、約４０ｍＭ、あるい
は約５０ｍＭと約１００ｍＭの間の範囲にあるアミノ酸の開始濃度の組合せである。古典
的培地は、比較的低い濃度のアミノ酸および／または高いＮａ／Ｋ比を使用する。両方の
特徴の組合せは、細胞の増殖およびポリペプチドの産生に有利な追加的影響をもたらすこ
とができる。
【００４０】
表２は、本発明によるこれらのパラメーターの異なる履行を示す。それらの全アミノ酸
含有物以外に、細胞増殖に最適な本発明による適切な培地は、以下の範囲に従う初期アミ
ノ酸濃度を含有することが好ましい。
【００４１】
【表１】
2019216728.tif 000002
【００４２】
前の表中で定義したアミノ酸によってさらに指定される本発明の培地は、本発明による
改良型細胞培養法において使用可能であることが好ましい。
【００４３】
特に好ましい実施形態では、本発明による培地は産生用に最適化し、以下の範囲に従う
初期アミノ酸濃度を含有することが好ましい。
【００４４】
【表２】
2019216728.tif 000003
【００４５】
前の表中に定義したようにアミノ酸を含有する生産培地は、本発明による改良型細胞培
養法中で使用可能であることが好ましい。
【００４６】
本発明のさらなる態様では、ナトリウムイオンとカリウムイオンの間の具体的な比以外
に、（培地の全体イオン強度に貢献する）全体イオン濃度と培地中のアミノ酸の間の全体
的なバランスも重要である。栄養増殖培地中の全体イオン濃度とアミノ酸濃度の間の比は
、動物細胞用の多くの型の細胞培養培地の主成分である、例えば塩化ナトリウム、塩化カ
リウム、炭酸水素ナトリウム、およびその他などの、多量の無機塩によって主に影響を受
ける。微量イオン、アミノ酸またはビタミンの塩もこの値に貢献する（例えば、硫酸銅、
Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウ
ムおよびその他）。これらのイオンの濃度を調節することも細胞に有利である可能性があ
る。したがって本発明者らは、水溶液培地ならびに塩基性ＮａＯＨおよび酸性ＨＣｌにお
いてイオン化する、培地に加える主要な有機および無機塩の全ての合計として、イオンの
全体濃度をここで定義する。微量元素は含まれない。したがって、１ｍＭのＮａＣｌ、Ｎ
ａＯＨ、またはリシン−ＨＣｌもしくは塩化コリンなどの有機塩はそれぞれ２ｍＭのイオ
ンに貢献し得る。１ｍＭのＭｇＣｌ２は３ｍＭのイオンに然るべく加え、一方１ｍＭの有
機塩クエン酸三ナトリウムは４ｍＭに貢献する。
【００４７】
本発明によれば、イオンとアミノ酸の間のモル比は、約１．９と４の間にあるように選
択する。いくつかの履行では、約２．０と３．９の間の範囲の比を選択する。これらの特
定の低い比には、比較的高含有量のアミノ酸によってだけではなく、培地中のイオンの比
較的低いモル含有量によっても到達する。培地中のイオンの含有量は一般に２５０ｍＭ未
満である。例えば、約１５０ｍＭと２２０ｍＭの間、またはあるいは約１７０ｍＭと２０
０ｍＭの間である値を選択する。
【００４８】
要約すると、記載する特定の培地特徴は細胞の代謝および生理機能に対して重要な影響
があり、一方同時に、モル浸透圧濃度、または例えば栄養成分の利用能などの一般的パラ
メーターにも影響を与える。したがって異なる培地特徴のバランスは、細胞に関する予想
外の相乗効果につながる独自の性質をもたらす。
【００４９】
低いＮａ／Ｋ比を有する培地は、異なる哺乳動物細胞の増殖および大規模生産での組換
えポリペプチド／タンパク質の製造に一般に適している。本明細書で使用するポリペプチ
ドおよびタンパク質は、対象の産物をコードする１つまたは複数のＤＮＡ構築物による細
胞のトランスフェクション後に、それぞれの哺乳動物細胞によって発現される組換えポリ
ペプチドを指す。宿主細胞内で発現し得る任意のポリペプチドを、本発明によって産生す
ることができる。（１つまたは複数の）ポリペプチドが本発明の方法により産生された後
、使用する具体的な産物および細胞系に応じて、それは細胞外に分泌される、細胞と結合
する、または細胞内に留まるかのいずれかである。ポリペプチド産物は、培養上清から直
接、または標準手順による細胞の溶解後に回収することができる。さらなる単離および精
製も、当業者に知られている標準技法により行われる。本発明のポリペプチドは医薬組成
物中に含めることもできる。
【００５０】
本発明の別の態様は、組換えポリペプチドを産生するための方法であって、本発明によ
る培地中で哺乳動物細胞を培養することを含み、培養条件が少なくとも１つの温度変動お
よび／または少なくとも１つのｐＨ変動を含む方法に関する。
【００５１】
したがって、本発明の別の態様では、培養の行程中に温度を変えること、および特定時
間地点で開始する１つまたは複数の温度変動を含むことが有利である可能性がある。温度
の変化／変動は、温度の自然な変動は指さず、意図的である少なくとも１℃、または代替
的に少なくとも２℃の温度の変化を指し、この場合第二の温度は少なくとも１日間維持す
る。変化／変動は、培養の温度目標値を変えることにより履行することができる。タイミ
ングは、培養物の増殖状態、培養開始後の所定の日数、または細胞の代謝ニーズのいずれ
かに依存する。したがって温度は、培養開始後約１〜１０日の間に変動させることが可能
である。温度変動は細胞の増殖期中に、またはこの期の最後に向けて行うことが好ましい
。培養容器の体積に応じて、変化は迅速またはより緩慢に起こり、数時間続く可能性があ
る。一例では、このような温度変動は、密度が最大密度の約４０％と約９０％の間にある
培養の増殖期中に履行する。一例では、第一の温度は約３３℃と約３８℃の間にあり、一
方他の例では、第一の温度は約３６℃と約３８℃の間にある。第二の温度は約３０℃と約
３７℃の間にあり、またはあるいは約３２℃と約３４℃の間にある。
【００５２】
本発明の別の態様では、１つまたは複数のｐＨ変動を含めることによって、培養の行程
中にｐＨを変えることが有利である可能性がある。本発明のさらなる態様では、温度変動
を１つまたは複数のｐＨ変動と組み合わせることもできる。細胞の迅速な増殖に好ましい
第一のｐＨ（例えば７．０のｐＨ）を選択するが、特定細胞密度に達した後に、培養のｐ
Ｈを改変することは有利である。ｐＨのこの変化または変動は、バイオリアクター／培養
容器のｐＨ目標値を変えることによって、または不動帯と組み合わせてｐＨ目標値を定義
することによって実施する。ｐＨ変化はｐＨのわずかな変動は指さず、そうではなくて、
それは意図的な変化を指す。細胞死を減らし、適切な性質のポリペプチドの高い細胞特異
的産生率を与える、第二のｐＨ値（例えば６．８）を選択する。第二のｐＨは培養の最後
まで維持することができ、または追加的なｐＨ変動を導入することができる。一実施形態
では、ｐＨを少なくとも０．２変えることは有用であり得る。一実施形態では、ｐＨ６．
８とｐＨ７．５の間の範囲内にある第一のｐＨを選択する。別の実施形態では、ｐＨ６．
８とｐＨ７．２の間の範囲内にある第一のｐＨを選択する。ｐＨ変動後に到達する第二の
ｐＨ値はｐＨ６．０とｐＨ７．５の間の範囲内、またはあるいは６．５と６．８の間であ
ってよい。
【００５３】
本発明による細胞培養培地は、様々な細胞培養法において使用することができる。細胞
の培養は、接着培養、例えば単層培養、または好ましくは浮遊培養で実施することができ
る。
【００５４】
例えばバイオテクノロジー産業において確立した様々な発酵プロセスによって、細胞の
大規模培養を使用することができる。本発明による細胞培養培地を使用して、連続および
不連続な細胞培養プロセスを利用することができる。他の知られているリアクター技術、
例えば灌流技術なども利用することができる。バッチプロセスは好ましい一実施形態であ
る。
【００５５】
バッチ細胞培養は、フェドバッチ培養または単純バッチ培養を含む。用語「フェドバッ
チ細胞培養」は、哺乳動物細胞および細胞培養培地を最初に培養容器に供給し、他の培養
栄養素を、培養の停止前に定期的な細胞および／または産物採取有りまたは無しで培養プ
ロセス中に、培養物に連続的または不連続な増加で供給する、細胞培養を指す。用語「単
純バッチ培養」は、哺乳動物細胞および細胞培養培地を含めた細胞培養に関する全ての成
分を、培養プロセスの開始時に培養容器に供給する手順に関する。
【００５６】
本発明の好ましい一実施形態では、培養物の供給はフェドバッチプロセスで行う。培養
プロセス中に培地内で枯渇する培地成分および栄養素を交換するためのこのような供給は
、細胞に有益である。典型的には、供給液は、アミノ酸、エネルギー源として少なくとも
１つの炭水化物、微量元素、ビタミンまたは特定イオンを含む。供給液は細胞の必要性に
応じて加え、それらは特定の細胞系または細胞クローンおよび産物に関して決定された所
定のスケジュールに基づくか、または培養プロセス中に測定されるかのいずれかである。
濃縮供給液を使用して、多量体積増大および培地の希釈を回避することが特に有利である
。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる供給液を有することが有用である可
能性もある。これは細胞への２つ以上の異なる群の栄養素と成分の独立した投与、したが
って特定栄養素の最適な供給に関する供給条件のより良い調節を可能にする。
【００５７】
本発明のさらなる実施形態では、細胞培養培地に加える２つの供給液の１つは、ジペプ
チドシスチンおよびアミノ酸チロシンを含む供給物である。供給物は、１０を超える塩基
性ｐＨにおいて水溶液中に約６．５ｇ／ｌと約８．０ｇ／ｌの範囲内および約９ｇ／ｌと
約１１ｇ／ｌの範囲内の各濃度で、ジペプチドシスチンおよびアミノ酸チロシンを含有す
ることが好ましい。特定の実施形態では、濃縮供給物は、１０を超えるｐＨにおいて１０
．０６ｇ／ｌのＬ−チロシンおよび７．２５ｇ／ｌのシスチンの各濃度で、ジペプチドシ
スチンおよびアミノ酸チロシンを含む。
【００５８】
前に記載したようなシスチンおよびチロシンを含む供給培地は、測定した各アミノ酸の
消費に基づくか、または例えば、１日当たり初代細胞培養培地重量の約０．２重量％〜約
０．８重量％、好ましくは１日当たり初代細胞培養培地重量の約０．４重量％での固定ス
ケジュールに従うかのいずれかで、加えることができる。
【００５９】
いくつかの例では、他の供給液は、チロシンおよびシスチン以外の、塩基性培地中にも
存在する全ての他のアミノ酸を含有する。いくつかの例では、この追加的供給液は、例え
ばアミノ酸または炭水化物などの、特定の選択した成分からなってよい。本発明のさらな
る好ましい実施形態では、この濃縮供給培地は、以下の濃度範囲に従う選択したアミノ酸
を含有することが好ましい。
【００６０】
【表３】
2019216728.tif 000004
【００６１】
グルコースなどの炭水化物も、この濃縮供給培地に加えることが好ましく、好ましい濃
度は約１２００ｍｍｏｌ／ｌと約１４００ｍｍｏｌ／ｌの間、またはあるいは約１３００
ｍｍｏｌ／ｌと約１３９５ｍｍｏｌ／ｌの間である。
【００６２】
グルコースなどの炭水化物を含むことが好ましい、直前に記載した供給培地は、測定し
た各アミノ酸の消費に基づくか、または１日当たり初代細胞培養培地重量の例えば約１重
量％〜約４重量％、好ましくは、１日当たり初代細胞培養培地重量の約２重量％での固定
スケジュールに従うかのいずれかで、加えることができる。
【００６３】
本発明による細胞培養培地中で培養する細胞には、哺乳動物および非哺乳動物細胞があ
る。非哺乳動物細胞には、昆虫細胞などがある。しかしながら、哺乳動物細胞が好ましい
。用語細胞、細胞系および細胞培養物は、本明細書では同義的に使用することができる。
【００６４】
哺乳動物細胞の例には、ヒト網膜芽細胞、ヒト子宮頸癌細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞系
、ヒト肺細胞、ヒト肝臓細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（ヒト網膜芽細胞由来の細胞系）、ヒト
ヘパトーマ細胞系およびＡＧＥ１．ＨＮなどのヒト細胞系、ＳＶ４０によって形質転換し
たサル腎臓ＣＶ１系、サル腎臓細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズハムス
ター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスセルトリ細胞、マウス乳
腺腫瘍細胞、イヌ腎臓細胞、バッファローラット肝臓細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、
ＦＳ４細胞があり、ＣＨＯ細胞は本発明を実施するのに好ましい細胞系である。
【００６５】
本発明の好ましい一実施形態では、これらの細胞は、異なる系統のＣＨＯ細胞、野生型
ＣＨＯＫ１、ＣＨＯｄｈｆｒ−（Ｄｕｘ１）またはＣＨＯｄｈｆｒ−（ＤＧ４４）など、
さらにＨＥＫ細胞、Ｓｐ２／０細胞であってもよい。これらの細胞は、対象の（１つまた
は複数の）ポリペプチドをコードする１つまたは複数のＤＮＡ構築物で典型的にはトラン
スフェクトする。これらの宿主細胞中で発現され得る任意のポリペプチドは、本発明に従
い産生することができる。
【００６６】
本発明による細胞培養培地と共に使用することができる別のクラスの細胞には、モノク
ローナルまたはポリクローナル抗体の産生に一般に使用されるハイブリドーマ細胞がある
。
【００６７】
本発明による細胞培養および細胞培養培地から産生することができるポリペプチドは制
限されない。ポリペプチドは組換え型または非組換え型であってよい。本明細書で使用す
る用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合により接合した３つ以上のアミノ酸の鎖で構成
される分子、２本以上のこのような鎖を含有する分子、例えばグリコシル化によってさら
に修飾された１本または複数本のこのような鎖を含む分子を包含する。用語ポリペプチド
はタンパク質を包含するものとする。
【００６８】
本発明による細胞培養および細胞培養培地によって産生される好ましいクラスのポリペ
プチドは、組換え抗体である。
【００６９】
用語「抗体」は広義に使用し、（完全長モノクローナル抗体を含めた）モノクローナル
抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ナノボディ、
修飾抗体、抗体のサブユニット、抗体誘導体、人工抗体、抗体とタンパク質の組合せ、お
よび望ましい生物活性を示すほど十分長い抗体断片を具体的には含む。本明細書で使用す
るモノクローナル抗体はヒト抗体であってよい。
【００７０】
しかしながら、抗体以外のポリペプチド、例えば、膜貫通タンパク質、受容体、ホルモ
ン、増殖因子、プロテアーゼ、凝固および抗凝固タンパク質、阻害剤タンパク質、インタ
ーロイキン、輸送因子、融合タンパク質などのようなポリペプチドを、本発明による細胞
培養および細胞培養培地を使用して産生することもできる。
【００７１】
このような細胞培養プロセスから得られる産物は、医薬調製物の調製に使用することが
できる。用語「医薬調製物」は、哺乳動物、特にヒトへの投与に適切または適合状態の組
成物を示す。さらに、本発明による（１つまたは複数の）タンパク質は、薬学的に許容さ
れる界面活性剤、レシピエント、担体、希釈剤および賦形剤などの生物学的活性剤の他の
成分と一緒に投与することができる。
【００７２】
表１は市販の培地および従来技術からの他の細胞培養培地の組成を要約し、値は公開さ
れた値に基づき、したがってＮａＯＨなどの添加は値の中に含まれない。したがってナト
リウム濃度またはナトリウムとカリウムの比はむしろ過小評価されており、本発明の値か
らはさらに一層かけ離れている。
【００７３】
【表４】
2019216728.tif 000005
【００７４】
表２は、それらの特定の低いナトリウムイオンとカリウムイオンの比によって特徴付け
られる、本発明による細胞培養培地の配合を開示する。
【００７５】
【表５】
2019216728.tif 000006
【００７６】
表３は、本発明による化学的に定義された細胞培養培地に関する例の組成を開示する。
これらの細胞培養培地の個々の成分は、標準的な市販品から入手可能である。
【００７７】
【表６Ａ】
2019216728.tif 000007
【表６Ｂ】
2019216728.tif 000008
【実施例】
【００７８】
以下に記載する実施例中では、上記の表３中に詳述する組成を有する、化学的に定義さ
れた細胞培養培地１および２を使用する。これらの細胞培養培地の個々の成分は、標準的
な市販品から入手可能である。
【００７９】
以下の表４は、Ｌ−チロシンおよびシスチンを含有する濃縮供給培地の組成を示す。供
給培地は、測定した各アミノ酸の消費に基づくか、または１日当たり例えば０．４重量％
での固定スケジュールに従うかのいずれかで、加えることができる。
【００８０】
【表７】
2019216728.tif 000009
【００８１】
以下の表５は、例示的な濃縮供給培地の組成を示す。供給培地は、測定したアミノ酸の
消費に基づくか、または１日当たり例えば２重量％での固定スケジュールに従うかのいず
れかで、加えることができる。
【００８２】
【表８】
2019216728.tif 000010
【００８３】
実施例の実験用に、無血清、無タンパク質培地条件に適合させることによって、ｄｈｆ
ｒ（＋）ＣＨＯ−Ｋ１細胞系ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１に由来する親ＣＨＯ細胞系を使用す
る（Kao et.al., Genetics,1967,55,513-524; Kao et.al., PNAS,1968,60,1275-1281; Pu
ck et.al., J.Exp.Med.,1958,108,945-959）。この親細胞系の２アリコートをトランスフ
ェクトして、それぞれ２つの異なるモノクローナル抗体ｍＡＢ１、ｍＡＢ２を発現させる
。
【実施例１】
【００８４】
実施例１中では、培地１を含有する２つの振とうフラスコ培養物を、ｍＡｂ１産生ＣＨ
Ｏクローンと平行して接種する。振とうフラスコ培養物は、３７℃において二酸化炭素イ
ンキュベーター中でインキュベートする。第３日に、１つの振とうフラスコを３３℃に設
定した二酸化炭素インキュベーターに移す。両方の振とうフラスコに、２つの供給液を同
様に供給する。供給物には固定スケジュールに従い補充し、第５日に始めて１日当たり０
．４％の第一の供給液（表２）および２％の第二の供給液（表３）を加え、培養の最後ま
で続けた。
【００８５】
３３℃への温度変動によって、実験の全期間３７℃に維持した培養物と比較して、経時
的な培養物の生存細胞密度および生存率（図１および２）の長期の維持、および高い産物
力価の獲得（図３）が可能になる。この実施例は、ＣＨＯ細胞系ベースの細胞培養の生産
プロセス中に３３℃への温度変動を実施する利点を例示する。
【実施例２】
【００８６】
この実施例では、培地２を含有する３００ＬバイオリアクターにｍＡｂ２産生ＣＨＯク
ローンを接種する。第５日に、バイオリアクターの温度を３６．５℃から３３℃に変動さ
せる。ｐＨ目標値は６．９０であり不動帯は０．１０である。結果として、培養はｐＨ７
．００で始まり、ｐＨは第２日と第４日の間に６．８０まで移動し、細胞による乳酸消費
のため次いで７．００に次第に戻る（図４）。ｐＨ６．８０への変動によって、一定ｐＨ
７．００でのシナリオと比較して、塩基の添加を減らすことができる。ｐＨ７．００への
回復によって、第一の変動後ｐＨを６．８０に放置するシナリオと比較して、培地内のＣ
Ｏ２の濃度を低下させることが可能である。温度変動とｐＨ変動を組み合わせたこの方法
では、高い生存細胞密度に達し、経時的な生存細胞密度の低下は最小であり（図５）、第
１４日に適切な性質の産物の高力価に達することができる（図６）。供給は実施例１中と
同様に施す。
【図１】
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【図２】
2019216728.tif 000012
【図３】
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【図４】
2019216728.tif 000014
【図５】
2019216728.tif 000015
【図６】
2019216728.tif 000016
【外国語明細書】
2019216728000001.pdf