(57)【要約】【課題】運動性低下ユーグレナ及び運動性低下ユーグレナを用いるパラミロンの製造方法を提供する。【解決手段】運動性低下ユーグレナは、ユーグレナ（Euglena）属に属し、運動性が野生型のユーグレナの運動性よりも低く、前記野生型のユーグレナの重イオンビーム誘発突然変異株であり、野生株よりも高いパラミロン貯蔵量を示すため、パラミロンの製造方法において運動性低下ユーグレナを用いると好適である。【選択図】図５Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーグレナ（Euglena）属に属し、
運動性が野生型のユーグレナの運動性よりも低く、
前記野生型のユーグレナの重イオンビーム誘発突然変異株であることを特徴とする運動性低下ユーグレナ。
【請求項２】
運動性が野生株の運動性の１０００分の１以下であることを特徴とする請求項１に記載の運動性低下ユーグレナ。
【請求項３】
培養液にて撹拌培養後、２０ｃｍの水深において、撹拌を停止してから３．５時間後に沈降する細胞の量が、前記野生型のユーグレナの１０倍以上である性質を有することを特徴とする請求項１又は２記載の運動性低下ユーグレナ。
【請求項４】
独立栄養条件で培養したときの藻体内の炭水化物含有量が、前記野生型のユーグレナを独立栄養条件で培養したときの該野生型のユーグレナ藻体内の炭水化物含有量の１．６倍以上であることを特徴とする請求項１乃至３いずれか一項に記載の運動性低下ユーグレナ。
【請求項５】
従属栄養条件及び独立栄養条件の両方の条件において、前記野生型のユーグレナと同程度の増殖速度を示すことを特徴とする請求項１乃至４いずれか一項に記載の運動性低下ユーグレナ。
【請求項６】
前記野生型のユーグレナは、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）であることを特徴とする請求項１乃至５いずれか一項に記載の運動性低下ユーグレナ。
【請求項７】
ユーグレナ・グラシリスM-3ZFeL株（受託番号：FERM P-22341）であることを特徴とする請求項１に記載の運動性低下ユーグレナ。
【請求項８】
請求項１乃至７いずれか一項に記載の運動性低下ユーグレナを用いるパラミロンの製造方法。
【請求項９】
重イオンビームを用いて、ユーグレナ生細胞の突然変異を誘発する突然変異誘発工程と、
該突然変異誘発工程を経た前記細胞から運動性の低下している前記細胞を分取して、前記突然変異で運動性が低い変異体を選抜する変異体選抜工程と、
前記変異体を培養する変異体培養工程と、を行うことを特徴とする運動性低下ユーグレナの製造方法。
【請求項１０】
前記変異体選抜工程では、走光性を示さない個体を選択することを特徴とする請求項９に記載の運動性低下ユーグレナの製造方法。
【請求項１１】
ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）種に属するM-3ZFeL株（受託番号：FERM P-22341）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、運動性が低下した運動性低下ユーグレナに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の移動は、食糧の獲得、快適な環境の発見、捕食者からの逃避など、生存競争に直結している。環境要因に反応した移動は、化学物質に向かう移動である化学走性、重力に向かう移動である重力走性、光に向かう移動である走光性を含む「走性」として定義される。そのような走性は、生物が自然環境で生存するために不可欠であり、複雑なメカニズムによって統制されることが示されている。
【０００３】
移動の方法は、生物の大きさに依存し、進化を通じて最適化されている。例えば、水圏の運動性単細胞微生物の多くは、鞭毛を用いて遊泳する。光合成鞭毛虫であるユーグレナは、単一の鞭毛を用いて遊泳し、また、運動性行動の起源を含む基礎研究のためのモデル生物としても用いられている。ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）は、光合成、細胞代謝、重力走性や走光性などの運動挙動のメカニズムを研究するためのモデル生物として広く用いられている。
【０００４】
ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）は、微細藻類の一種であり、食糧源として大量培養されている。ユーグレナ・グラシリスの産業上の応用は、その迅速な増殖と栄養源を豊富に含むという特徴に基づいている。ユーグレナ・グラシリスは貯蔵糖として、様々な食品機能を備え、結晶性の構造を有するβ−１,３−グルカンであるパラミロンを貯蔵する。従って、ユーグレナ・グラシリス細胞は機能性食品及びサプリメントの成分として特に適している。さらに、貯蔵されたパラミロンは低酸素条件下でバイオ燃料源に適したワックスエステルに代謝される（非特許文献１）。
【０００５】
本発明者らは、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）の運動性低下株を樹立することができた場合、運動性低下株は、遊泳する野生株と比較して相当な量のエネルギーを節約するため、野生株よりも高いパラミロン生産量を有するとの仮説を立てた。また、運動性低下変異株の獲得は、移動挙動のメカニズムを理解するだけでなく、長期的な顕微観察や単一細胞操作など、ユーグレナ・グラシリスを用いた基礎研究にも貢献することが期待される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】嵐田亮、「微細藻類ユーグレナの特徴と食品・環境分野への応用」、光合成研究、vol.22, no.1, pp.33-38 (2012).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、ユーグレナ・グラシリスの変異株を得ることには、未だ多くの困難が残っており、従って、運動性を欠いた変異株の特定や特徴の評価はほとんどなされていない。
【０００８】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、運動性低下ユーグレナ、運動性低下ユーグレナを用いるパラミロンの製造方法および運動性低下ユーグレナの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、変異源としてＦｅ−イオンビームを用いると、鞭毛を有しているが実質的な移動を示さない、運動性が低下したE. gracilisの変異株を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
前記課題は、本発明の運動性低下ユーグレナによれば、ユーグレナ（Euglena）属に属し、運動性が野生型のユーグレナの運動性よりも低く、前記野生型のユーグレナの重イオンビーム誘発突然変異株であること、により解決される。
【００１１】
また、運動性が野生株の運動性の１０００分の１以下であるとよい。
【００１２】
培養液にて撹拌培養後、２０ｃｍの水深において、撹拌を停止してから３．５時間後に沈降する細胞の量が、前記野生型のユーグレナの１０倍以上である性質を有するとよい。
独立栄養条件で培養したときの藻体内の炭水化物含有量が、前記野生型のユーグレナを独立栄養条件で培養したときの該野生型のユーグレナ藻体内の炭水化物含有量の１．６倍以上であるとよい。
このように構成されているため、従来のユーグレナよりも速い沈降速度を示し、炭水化物含量が高められた新規なユーグレナを得ることができるため、パラミロンなど有用成分の製造に利用することで、藻体を分離する際の時間及びコストを抑えることが可能となる。
【００１３】
従属栄養条件及び独立栄養条件の両方の条件において、前記野生型のユーグレナと同程度の増殖速度を示すとよい。
前記野生型のユーグレナは、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）であるとよい。
ユーグレナ・グラシリスM-3ZFeL株（受託番号：FERM P-22341）であるとよい。
【００１４】
また、前記課題は、本発明のパラミロンの製造方法によれば、運動性低下ユーグレナを用いるパラミロンの製造方法により解決される。
【００１５】
また、前記課題は、本発明の運動性低下ユーグレナの製造方法によれば、重イオンビームを用いて、ユーグレナ生細胞の突然変異を誘発する突然変異誘発工程と、該突然変異誘発工程を経た前記細胞から運動性の低下している前記細胞を分取して、前記突然変異で運動性が低い変異体を選抜する変異体選抜工程と、前記変異体を培養する変異体培養工程と、を行うことにより解決される。
このとき、前記変異体選抜工程では、走光性を示さない個体を選択するとよい。
【００１６】
前記課題は、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）種に属するM-3ZFeL株（受託番号：FERM P-22341）により解決される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、同一培養条件で従来のユーグレナよりも低下した運動性を示し、沈降速度が速く、野生株に匹敵する増殖速度を示し、細胞内パラミロン含量が高められた新規な運動性低下ユーグレナを得ることができるため、食品成分および化学物質の工業的生産において好適に利用することができる。
また、運動性低下ユーグレナは速い沈降速度を示すため、パラミロンなど有用成分の製造に利用することで、藻体を分離する際の時間及びコストを抑えることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本実施形態の運動性低下ユーグレナを製造する方法を示すフロー図である。
【図２】本実施形態の運動性低下ユーグレナを製造するために用いられるフローサイトメーター及びセルソーターの機構の概略説明図である。
【図３Ａ】静置培養における野生株（WT株）のKH培地における成長の様子を示す写真である。
【図３Ｂ】静置培養におけるM-3ZFeL株のKH培地における成長の様子を示す写真である。
【図４Ａ】従属栄養条件におけるWT株（○）とM-3ZFeL株（●）の成長曲線を表すグラフである。
【図４Ｂ】独立栄養条件におけるWT株（○）とM-3ZFeL株（●）の成長曲線を表すグラフである。
【図５Ａ】WT株（左）とM-3ZFeL株（右）の細胞分布および約８秒間の遊泳軌跡を示す図である。四角で囲った内側の領域を拡大した図を、左下に示している（円の直径は約２．５ｍｍである）。
【図５Ｂ】トレースモーメント（ＴＭ）値を用いて評価を行ったWT株（○）およびM-3ZFeL株（●）の運動性。ＴＭ値は１．６秒ごとに取得し、１０分間の平均をとった。
【図６Ａ】従属栄養培地で培養したWT株とM-3ZFeL株のパラミロン貯蔵量を示すグラフである。パラミロン貯蔵量の測定は、対数増殖期に行った（Ｎ＝３）。
【図６Ｂ】独立栄養培地で培養したWT株とM-3ZFeL株のパラミロン貯蔵量を示すグラフである。パラミロン貯蔵量の測定は、対数増殖期に行った（Ｎ＝３，＊＊ｐ＜０．０５，スチューデントのｔ−検定）。
【図７Ａ】従属栄養培地で培養した場合のWT株（□）とM-3ZFeL株（■）の沈降速度を比較したグラフである。
【図７Ｂ】独立栄養培地で培養した場合のWT株（□）とM-3ZFeL株（■）の沈降速度を比較したグラフである
【図８】沈降した細胞を示す写真である。WT株（左の容器）とM-3ZFeL株（右の容器）を２Ｌの容積のタンク中に撹拌せずに投入し、独立栄養条件で３．５時間置いて観察を行い、沈降速度を比較した。株の名称の下部の数字は、矢印で示す容器の底に沈んだバイオマスの乾燥重量（ｇ／Ｌ）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、運動性低下ユーグレナに関する。本発明の一実施形態に係る運動性低下ユーグレナについて、以下、詳細に説明する。
本発明の運動性低下ユーグレナは、ユーグレナ（Euglena）属に属し、運動性が野生型のユーグレナの運動性よりも低く、野生型のユーグレナの重イオンビーム誘発突然変異株である。
【００２０】
本発明の運動性低下ユーグレナの一実施形態は、原料である野生株のユーグレナに重イオンビーム照射により変異導入し新奇形質を獲得した、ユーグレナの重イオンビーム誘発突然変異株である。
【００２１】
実施例において、製造された運動性低下ユーグレナである、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）M-3ZFeL株は、２０１７年７月１９日に独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター  特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）に寄託された（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２２３４１）。
【００２２】
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同様の意味を有する。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。
【００２３】
＜ユーグレナ＞
実施形態において、「ユーグレナ」とは、分類学上、ユーグレナ属（Euglena）に分類される微生物、その変種、その変異種及びユーグレナ科（Euglenaceae）の近縁種を含む。
ここで、ユーグレナ属（Euglena）とは、真核生物のうち、エクスカバータ、ユーグレノゾア門、ユーグレナ藻綱、ユーグレナ目、ユーグレナ科に属する生物の一群である。
【００２４】
ユーグレナ属に含まれる種として、具体的には、Euglena chadefaudii、Euglena deses、Euglena gracilis、Euglena granulata、Euglena mutabilis、Euglena proxima、Euglena spirogyra、Euglena viridisなどが挙げられる。
ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis），特に、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株を用いることができるが、そのほか、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株の変異株ＳＭ−ＺＫ株（葉緑体欠損株）や変種のE. gracilis var. bacillaris、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株、Astaia longa等のその他のユーグレナ類であってもよい。
【００２５】
ユーグレナ属は、池や沼などの淡水中に広く分布しており、これらから分離して使用しても良く、また、既に単離されている任意のユーグレナ属を使用してもよい。
ユーグレナ属は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組換え、形質導入、形質転換等により得られたものも含有される。
【００２６】
＜運動性低下ユーグレナの製造方法＞
本実施形態の運動性低下ユーグレナは、図１のフローに従い、次の工程を順次実施することにより製造される。
【００２７】
（突然変異誘発工程）
まず、変異原を用いて、ユーグレナ細胞に対して突然変異誘発処理を行う突然変異誘発工程を行う（ステップＳ１）。
【００２８】
変異原とは、自然突然変異よりも高い割合で突然変異を誘発する物理的，化学的，生物的因子の総称である。本実施形態において、変異原としては、Ｘ線，γ線，中性子線，粒子線，重イオンビーム等を含むエネルギー線等の物理的変異原，アルキル化剤や核酸塩基アナログ等を含む化学変異原，ウイルス等の生物的変異原のいずれを用いてもよいが、物理的変異原，特に、重イオンビームを用いると好適である。
エネルギー線の中でもエネルギー付与率が高く、大きな影響を生体に与える重イオンビームを用いると、短時間での効率的な変異原処理が可能となり、効率よく運動性低下ユーグレナを得ることができる。
この突然変異誘発工程を経ることにより、ユーグレナ個々の細胞にランダムに変異が導入された変異体からなる集団が形成される。
【００２９】
（変異体選抜工程）
変異体選抜工程では、メチルセルロースなどのゲル化剤を含む培地を用いて、動かない細胞を選択する（ステップＳ２）。このとき、容器の一端を遮光して細胞を播種し、容器の他端を光照射することで、走光性を示さない個体を選抜すると好適である。
この選抜を実施する容器は、十分に大きいことが好ましく、例えば１０ｃｍ以上の長さがあるとよい。また、ゲル化剤を含む培地としては、遮光した状態でも細胞が増殖可能な従属培地が好ましく、例えばKH培地にゲル化剤を添加した培地を用いることができる。走光性を示す個体と、走光性を示さない個体の分離は、容器を十分な期間静置することにより実施し、好ましくは１週間から２週間の期間、静置培養するとよい。
十分な期間経過後、播種地点に残り増殖している集団を回収する。この変異体選択工程の実施は１回でも良いが、好ましくは回収した集団に対して複数回同様の操作を実施し、集団中の動かない細胞の割合を増やすと良い。
【００３０】
（変異体単離工程）
次いで、ユーグレナ変異体集団を、単離する変異体単離工程を行う（ステップＳ３）。単離操作は、古典的なキャピラリーピペットを用いてもよいが、好ましくはFACS(登録商標)（Fluorescence activated cell sorting)を用いた分取を行うとよい。FACSを利用した細胞の単離は細胞浮遊液をフローセル内で高流速のシース流の中心に流し、この細胞浮遊液／シース流をフローセル下端の円錐状のノズルから流路に連続的に流し、流路のフローにレーザー光を照射して、個々の細胞が発する蛍光、もしくは散乱光を測定することによって細胞を認識し、単一の細胞を含む液滴を静電力により分取する手法である。
【００３１】
細胞分取は、フロー中のレーザーで励起されたそれぞれの細胞からの蛍光を検出することにより、細胞を１個ずつ高感度，高分解能，高速に測定する。FACSを利用した細胞分取は、１００００セル／秒より大きいハイスループットが得られる。
【００３２】
流体力学的絞り込みを用いたFACSの機構の概念図を、図２に示す。
図２の装置１は、細胞浮遊液チューブ２及びシース液チューブ３の排出口が上端に連結され、下端に先端が絞り込まれたノズル５を備えたフローセル４を備えている。フローセル４は、上方から流入するシース流の中心に細胞浮遊液を流して、先端のノズル５から細胞／シース流が層流のまま飛び出して下方へ落下するように構成されている。
【００３３】
細胞分取においては、ノズル５からシース液に包まれた細胞浮遊液をジェット噴出させ、その直後に光源６からレーザーを照射し、データをデータ処理系８で取り込む。このとき、不図示のピエゾ素子でノズル５を振動させ、細胞を含んでいるジェット流を液滴化し、データのソーティング領域に基づき、目的細胞の入った液滴が形成される直前にチャージをかける。目的細胞が入り帯電した(＋もしくは−)液滴は，水平方向の電場９内を落下するにつれ、電荷に応じて左右に偏向し、試験管１０に分取される。
【００３４】
本実施形態では、ノズル５として、ノズル径が７０μｍより大きく、１５０μｍ以下のもの、好ましくは、１００μｍ以上であり、１３０μｍ以下のもの，より好ましくは１１５μｍのものを用いる。ノズル径が７０μｍより大きいと、分取後のユーグレナ細胞の十分な生存率が確保できる。ノズル径が１００μｍ以上になると、分取により発生する死細胞の比率が数％となり、分取によるユーグレナ細胞の歩留まりが、１００％に近い値となる。ノズル径が１３０μｍより大きくなると、液適の形成が困難となると共にスループットも低下する。また、試薬の取扱いが難しくなって、例えば、自動補正機能が機能しにくくなることもある。従って、正確な細胞分取の実行が難しくなる。
【００３５】
なお、細胞分取の方式としては、細胞浮遊液を高流速のシース流の中心に流し、円錐状のノズルから流路に連続的に流し、流路のフローに、集光されたレーザービームを照射して、レーザーで励起されたそれぞれの細胞からの蛍光を検出する流体力学的絞り込みを用いた図２の方式のほか、マイクロキャピラリーを用いることによってシース液を用いないフローセルや、超音波を照射することによって流れの中心に粒子を集積させる音響絞り込み（acoustic focusing）と呼ばれる方式を用いてもよい。
【００３６】
本変異体単離工程では、マルチウェルプレートに単離するとよく、好ましくは９６ウェル以上を持つマルチウェルプレートに単離するとよい。マルチウェルプレートの各ウェルには適量の培地を加えておくが、細胞の増殖が速くなるように従属培地を用いるとよく、例えばKH培地を用いることができる。キャピラリーピペットを用いた古典的手法を用いる場合、動かない個体を単離するとよい。一方で、FACSを行うことにより、ユーグレナ変異体の単離を行う場合には、単離する前に個々の細胞が運動性をもつか判断できないため、多数の個体を無作為に単離することにより、集団中の目的の形質を持つ個体が単離される確率をあげる。
【００３７】
（変異体培養工程）
次いで、分取した細胞を培養する変異体培養工程を行う（ステップＳ４）。
この工程では、後述するCM培地又はKH培地等の公知の培地で、５日〜１０日間，好ましくは１週間培養する。単離した後に植え継ぐ必要はなく、マルチウェルプレートに単離した状態で培養すればよい。後述の運動性評価の指標とするために、マルチウェルプレートは振動を与えずに静置して培養することが好ましい。
【００３８】
単離後はマルチウェルプレートを静置し培養し、一定期間後に観察し、運動性を失ったことにより培養液の底で密集した集団（コロニー）を形成する株を候補株として選択する。一見運動性がないように見える集団であっても、動きが悪い、もしくは観察した時間帯にたまたま運動していない時期である可能性があるが、そこで密集した集団を形成している場合には複数回の細胞分裂を経た後であっても同じ位置にとどまっていたことを示し、強く運動性を失っている株であることが期待される。
【００３９】
（運動性評価工程）
その後、選択工程で選択された株の運動性を定量化して評価する運動性評価工程を行い、運動性低下ユーグレナの製造方法を完了する（ステップＳ５）。
【００４０】
＜運動性低下ユーグレナ＞
上記製造方法で製造された本実施形態の運動性低下ユーグレナは、以下のような特性を有する。また、以下のような特性を有するため、本実施形態の運動性低下ユーグレナをパラミロンの製造に用いること好適である。
【００４１】
（運動性）
上記製造方法で製造された本実施形態の運動性低下ユーグレナは、運動性が野生株の運動性の１０００分の１以下であり、沈降速度が野生型のユーグレナ（ユーグレナ・グラシリス  Ｚ株）の１０倍以上である。
運動性の評価は、例えば、閉鎖された環状のマイクロチャンバーに、細胞懸濁液を添加して細胞を閉鎖空間に封じ込め、ビデオ画像を順次、分化し、閾値化し、重ね合わせることによって細胞の動きを視覚化して（トレース画像）、トレース画像におけるトレースピクセルの空間的合計をカウントすることによって評価することが可能であるがこれに限定されるものではない。
【００４２】
運動性評価の指標として、トレースピクセルの数である、トレースモーメント（ＴＭ）を用いることが可能である（Ozasa K, Lee J, Song S, Hara M, Maeda M. Gas/liquid sensing via chemotaxis of Euglena cells confined in an isolated micro-aquarium. Lab Chip 2013; 13:4033、Ozasa K, Lee J, Song S, Maeda M. Transient freezing behavior in photophobic responses of Euglena gracilis investigated in a microfluidic device. Plant Cell Physiol 2014; 55:1704-1712）。
【００４３】
（沈降速度）
本実施形態の運動性低下ユーグレナは、培養液にて撹拌培養後、２０ｃｍの水深において、撹拌を停止して３．５から９時間後に沈降する細胞の量が、野生型のユーグレナ（ユーグレナ・グラシリス  Ｚ株）の１０倍以上である性質を有する。
【００４４】
沈降速度を比較するに際し、沈降速度を公知の手法に従い算出して比較を行うことも可能である（中村貴彦ら、「微粒子の沈降速度測定法の開発およびそれを適用したアオコの単一細胞の沈降速度の決定」、農業土木学会論文集、No.187, pp.31〜36 (1997)）。なお、沈降速度の算出方法は、特に限定されるものではない。
【００４５】
（炭水化物含有量）
本実施形態の運動性低下ユーグレナは、独立栄養条件で培養したときの藻体内の炭水化物含有量（パラミロン含有量）が、藻体の重量を１００重量％としたときに５〜７重量％であり、野生型のユーグレナ（ユーグレナ・グラシリス  Ｚ株）に対し、藻体内の炭水化物含有量（パラミロン含有量）が１．６倍以上高いものである。
【００４６】
（増殖速度）
本実施形態の運動性低下ユーグレナは、従属栄養条件及び独立栄養条件の両方の条件において、突然変異誘発工程前の原料ユーグレナと同程度の増殖速度を示す。
このとき、原料ユーグレナとして、野生型のユーグレナ（ユーグレナ・グラシリス  Ｚ株）を用いた場合、本実施形態の運動性低下ユーグレナは、従属栄養条件及び独立栄養条件の両方の条件において、野生型のユーグレナと同程度の増殖速度を示す。
【００４７】
（細胞の形態と鞭毛について）
本実施形態の運動性低下ユーグレナは、形態学的に自然な形状および野生株細胞（ユーグレナ・グラシリス  Ｚ株）と類似の単一の鞭毛を有するが、その鞭毛は拍動を示さない。
【実施例】
【００４８】
以下、具体的実施例により、本発明の運動性低下ユーグレナの特性及び運動性低下ユーグレナの調製方法についてより詳細に説明する。但し、本発明は、実施例の記載により限定されるものではない。
【００４９】
本実施例では、Ｆｅ−イオンビーム照射及び変異株のスクリーニングを行って得られたユーグレナ・グラシリスの運動性低下変異株の単離及び特性の評価について検討を行った。
具体的には、マイクロ水槽装置と追跡システムを用いて変異株（M-3ZFeL株）の遊泳挙動を定量化し、増殖速度、パラミロン貯蔵量、および沈降速度を測定して、工業的規模の生産に対する変異株の適合性を検討した。
【００５０】
＜１．試験方法＞
（株、培養条件、培地）
ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）の野生株であるＺ株（以下、「WT株」という。）及びその変異株であるM-3ZFeL株を用いた。両方の株を、CM培地（表１）を用いた独立栄養条件、及びKH培地（表２）を用いた従属栄養条件でそれぞれ培養した。CM培地及びKH培地のｐＨが３．５となるように培地を調製した。
【００５１】
【表１】
2019083740.tif 000003
【００５２】
【表２】
2019083740.tif 000004
【００５３】
（変異誘発及び変異株のスクリーニング）
変異株は、Ｆｅ−イオンビーム照射によって得た。
２ｍＬのE. gracilis細胞（４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を５×７ｃｍのハイブリダイゼーションバッグに密閉した。ハイブリダイゼーションバッグを理化学研究所のＲＩビームファクトリー（日本国埼玉県和光市）において、１００ＧｙでＦｅイオン(ＬＥＴ（線エネルギー付与）：６５０ｋｅＶ／μｍ)照射した。KH培地を用いた１週間のリカバリー培養の後、０．５％メチルセルロースを含有するKH培地に細胞をおき、光に向かって移動しなかった細胞を回収した。
【００５４】
２ラウンドの選別の後、蛍光活性化セルソーター（FACS：fluorescence activated cell sorting，MoFlo XDP，Beckman Coulter）を用いてKH培地を含む９６穴マイクロプレート中で回収した各候補細胞を単離した。細胞運動性のない集団を選択し、顕微鏡観察を用いて運動性欠損株として樹立した。
【００５５】
（生育試験）
生育試験は、５０ｍＬの培地を含む試験管で行った。細胞をフラスコ内で振盪することによりKH培地中で前培養した。培養した細胞を２０００ｇで遠心分離して回収し、KHまたはCM培地で２回洗浄した。次に、細胞懸濁液をＯＤ６８０＝０．１となるように新しい培養管に播種し、KH培養物およびCM培養物について、２６℃、１００μｍｏｌ／ｍ２の定常光照明および１×体積／体積の空気および５％ＣＯ２で通気して培養した。分光光度計（UV Mini-1240，Shimadzu）を用いて、６８０ｎｍの波長における光学密度の値により培養物の増殖速度を毎日測定した。
【００５６】
（動きの定量分析）
細胞の動きを定量的に分析するために、ビデオ画像キャプチャを用いた顕微鏡観察をお行った。観察および画像処理技術は既報の方法に従って行った（Ozasa K, Lee J, Song S, Hara M, Maeda M. Two-dimensional optical feedback control of Euglena confined in closed-type microfluidic channels. Lab Chip 2011; 11:1933-1940）。閉鎖された、環状のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）マイクロチャンバー（直径２．４９ｍｍ、深さ１４０μｍ）中の懸濁液（０．７μＬ、３００〜５００細胞を含有）に細胞を封じ込め、５倍の対物レンズを用い、赤色明視野透過画像を観察した。細胞の動きは、ビデオ画像を順次、分化し、閾値化し、重ね合わせることによって視覚化して（トレース画像）、トレース画像におけるトレースピクセルの空間的合計をカウントすることによって評価した（Ozasa K, Lee J, Song S, Hara M, Maeda M. Gas/liquid sensing via chemotaxis of Euglena cells confined in an isolated micro-aquarium. Lab Chip 2013; 13:4033、Ozasa K, Lee J, Song S, Maeda M. Transient freezing behavior in photophobic responses of Euglena gracilis investigated in a microfluidic device. Plant Cell Physiol 2014; 55:1704-1712）。トレースピクセルの数をトレースモーメント（ＴＭ）と命名した。ＴＭ値の測定速度は０．６７Ｈｚ（１．６秒あたり１フレーム）であった。ＴＭ値は、チャンバー内で観察された全ての動きの活性の良い尺度であった。典型的な遊泳痕跡を細胞分布画像に別々に重ね合わせ、細胞の遊泳活性を視覚的に示すために二値画像として用意した（Ozasa K, Won J, Song S, Maeda M. Autonomous oscillation/separation of cell density artificially induced by optical interlink feedback as designed interaction between two isolated microalgae chips. Sci Rep 2016; 6:24602）。
【００５７】
（沈降試験）
１ｍＬのKH培地中の細胞の沈降を１．５ｍＬのマイクロチューブ中で分析して、沈降速度を測定した。各マイクロチューブにおける細胞懸濁液の画像を１〜５分間隔で撮影した。Image Jソフトウェアを用い、画像を処理した。２０ｃｍの深さにおける沈降速度を評価するために、WT株およびM-3ZFeL変異株を、２９℃および１３００μｍｏｌ／ｍ２の上方からの光照射（明、暗：１２時間、１２時間）条件でCM培地を用いて直方体ビーカー中で培養した。沈降を３．５時間観察した。
【００５８】
（炭水化物の定量）
収穫した藻体細胞を凍結乾燥器（FDV-1200、EYELA）を用いて凍結乾燥し、脱タンパクされた炭水化物成分を既報の方法に従って抽出した（Inui H, Miyatake K, Nakano Y, Kitaoka S. Wax ester fermentation in Euglena gracilis. FEBS Lett 1982; 150:89-93、Suzuki K, Mitra S, Iwata O, Ishikawa T, Kato S, Yamada K. Selection and characterization of Euglena anabaena var . minor as a new candidate Euglena species for industrial application. Biosci Biotechnol Biochem 2015; 79:1730-1736）。具体的には、細胞をアセトンで９０秒間２回超音波処理した（UD-201、TOMY）。次いで、炭水化物を遠心分離によって残渣として分離し、１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液中で３０分間煮沸した。そして、１０ｍＬの０．１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液、１０ｍＬの水の順で２回洗浄した。抽出したパラミロンを含む炭水化物を、フェノール硫酸法を用いて定量した（Montgomery R. Determination of glycogen. Arch Biochem Biophys 1957; 67:378-386）。
【００５９】
＜２．試験の結果＞
（E. gracilisの運動性欠損変異体のスクリーニング）
運動性のない変異株を生み出すために、５０ＧｙのＦｅ−イオンビーム照射に続いて２ラウンドの変異株濃縮を行った。変異を誘発した細胞を、０．５％メチルセルロースを含む液体KH培地で満たした培養皿の一端に置き、他端から照射した。培養１週間後に、開始地点に留まった細胞を推定上の運動性低下株細胞として回収した。次に、細胞を、０．５％メチルセルロースを含む液体KH培地で満たした１５ｍＬコニカルチューブの開口端に置き、閉鎖端部を除いてアルミニウム箔で遮光した。チューブを水平に静置して２週間培養した後、開始位置から移動しなかった細胞を回収し、さらに２週間培養した。増殖した細胞を蛍光活性化セルソーター（MoFlo  XDP、Beckman Coulter）を用いて単離し、クローン細胞系統を樹立した。候補となる変位株の中で、M-3ZFeL株は、安定した行動の表現型を示したことから、命名法に従って、運動性の表現型「M」に、Ｆｅ−イオン照射である変異原記号「Fe」を付加して命名した。
【００６０】
（M-3ZFeL株のキャラクタリゼーション）
変異株の運動性は、静的な培養物の出現によって評価した。野生株および変異株の単一細胞を９６ウェルプレートのウェルに接種した。M-3ZFeL表現型は、液体KH培地中においてコロニー形成を示したが、野生株細胞は、同じKH培地において、分散した（図３Ａ，３Ｂ）。
９６穴マイクロプレートの中において、WT株はコロニーを形成せず（図３Ａ上図）、M-3ZFeL株はコロニーを形成した（図３Ａ上図）。図３Ａの下図はWT株の顕微鏡写真であり、図３Ｂの下図はM-3ZFeL株の顕微鏡写真である。
【００６１】
CM培地およびKH培地を用いて、それぞれの株の独立栄養条件および従属栄養条件における成長速度を評価した（図４Ａ，４Ｂ）。
培養は１５日間行い、細胞は２６℃で、従属栄養条件（KH培地）、独立栄養条件（CM培地）でそれぞれ培養した。初期細胞濃度がＯＤ６８０＝０．１となるように細胞を接種した。生育試験は、３つの独立した試験管で行った。エラーバーは３本の試験管の値から計算された標準誤差を示している。
変異株の増殖は、両方の培養条件において野生株と同等であった。このことは、変異株が光合成系を含む代謝経路の機能と同様に正常に増殖する能力を維持することを示した。
【００６２】
ＴＭ値によって、変異株および野生株の運動性を定量した。両方の株を従属栄養培地で成長させ、対数増殖期に測定を行った。液体KH培地で培養した細胞をよく撹拌し、ＴＭ測定を行った。約３００〜５００個の細胞をマイクロチャンバー内で測定した。
【００６３】
図５Ａは、約８秒にわたる細胞分布および遊泳痕跡を示す。変異株の遊泳痕跡がほぼ完全に欠如していることから、変異株細胞は鞭毛を使用して動くことができないことが明らかになった。図５Ｂに示すように、野生株の全ＴＭ値は１１１６１であり、３６８細胞の標準偏差は２６９であったが、変異株のＴＭは９であり、４６７細胞の標準源差は６であった。変異株のＴＭ値は測定ノイズ領域にあった。CM培地中で独立栄養的に増殖した細胞も同様の結果を示し、M-3ZFeL株は独立栄養培養および従属栄養培養条件の両方において運動性を欠いていることがわかった。
【００６４】
変異株細胞に強力な青色光が照射されたとき、細胞のまわりのフリンジ（ｆｒｉｎｇｅｓ）としてわずかな動きの痕跡が観察された。変異株細胞は光を嫌う反応としてユーグレナ運動を示したが、それ自体遊泳を示さなかった。さらに、各変異株細胞は、形態学的に自然な形状および野生株細胞と類似の単一の鞭毛を有していた。しかし、変異株細胞の鞭毛は、水中を細胞が推進するのに必要である拍動を示さなかった。
【００６５】
次に、E. gracilisのバイオ燃料への応用に不可欠である、M-3ZFeL株の低酸素条件下でのパラミロン貯蔵およびその後の脂質への変換を測定した。図６Ａおよび図６Ｂに示すように、変異株細胞は独立栄養条件（図６Ｂ）において、野生株よりも多くのパラミロンを産生したが（１．６倍、ｐ＜０．０５）、従属栄養条件（図６Ａ）では野生株と同量のパラミロンを産生した。M-3ZFeL株と野生株は、独立栄養条件及び従属栄養条件において同じ脂質含量を示した。M-3ZFeL株が代謝経路を損なわずに有しており、エネルギーを節約することにより、独立栄養条件において野生株よりも多くのパラミロンを貯蔵することがわかった。
【００６６】
（M-3ZFeL株は沈降の速い表現型である）
運動性を失うことに加え、M-3ZFeL変異株は、速い沈降を示した。電力を必要とする遠心分離またはろ過プロセスを単純化することが可能となるため、急速に沈降する細胞はバイオマスの収穫に必要なコストを抑制する。沈降速度を定量化し、変異株が収穫に有利であるか否かを検討した。細胞懸濁液を十分に撹拌し、放置した後、１．５ｍＬ試験管中の沈降速度を経時的に画像を撮影することによって沈降速度を測定した。細胞懸濁液の写真を測定点ごとに撮影し、それぞれの試験管における透明な上澄領域の面積を測定した。透明な上澄領域の面積を沈降速度の評価と比較した。エラーバーは、３回の測定の標準誤差を示している。
【００６７】
図７Ａに示すように、従属栄養条件で培養した場合、変異株細胞の沈降速度は、野生株細胞の沈降速度よりも速かった。また、図７Ｂに示すように、独立栄養条件で培養した場合も、変異株細胞は、野生株よりも速い沈降速度を有していた。これらの知見は、不動型表現型がより速い沈降を有することを示唆している。
【００６８】
大規模培養における沈降を分析することにより、M-3ZFeLは産業収穫に有利であることが判明した。具体的には、２０ｃｍのビーカーを用い、野生株および変異株の培養物の沈降速度を経時的に観察した。まず、両方の２つのビーカーを同濃度の培養液で満たした。変異株細胞は野生株細胞よりも、明らかに速い沈降速度を示した（図８）。変異株のビーカー底部の細胞数は、野生株のビーカー底部の細胞数の１０倍以上であった。これらの結果から、変異株細胞はより大きな培養スケールにおいても速い沈降速度を示し、産業的収穫における変異株の利点が示唆された。
【００６９】
＜３．試験の考察＞
単離したM-3ZFeL変異株は、運動性を示さず、速い沈降を示したが、これらの表現型は重力走性に強く相関している。E. gracilisの野生株は、環境および細胞の状態に応じて、陽性および陰性の重力走性を示した。最近の研究では、E. gracilisは浮力制御ではなく、メカノセンシングタンパク質と鞭毛拍動を利用して、好ましい水深に留まることが示されている（Schwartzbach SD, Shigeoka S (eds.). Euglena: Biochemistry,Cell and Molecular Biology. Springer; 2017）。M-3ZFeL変異株細胞は、鞭毛を拍動するができず、沈降を防ぐために重力走性を用いることができないため、M-3ZFeL変異株細胞は、迅速かつ単調な沈降速度を示したことが示唆された。
【００７０】
鞭毛運動は、鞭毛のダイニン（ｄｙｎｅｉｎ）における二連微小管の推進力に由来する。ダイニン、軸索タンパク質、または関連成分の欠損は、鞭毛運動の欠如をもたらすことが知られている（Wang H, Gau B, Slade WO, Juergens M, Li P, Hicks LM. The Global Phosphoproteome of Chlamydomonas reinhardtii Reveals Complex Organellar Phosphorylation in the Flagella and Thylakoid Membrane. Mol Cell Proteomics 2014; 13:2337-2353、Turner RM. Moving to the beat: A review of mammalian sperm motility regulation. Reprod Fertil Dev 2006; 18:25-38）。M-3ZFeL変異株のどの成分、より具体的にはどの遺伝子が、不動性の原因であるかは、まだ特定されていない。運動性の欠如は、細胞におけるエネルギー消費の抑制に起因する可能性がある。細胞におけるエネルギー消費の抑制は、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）において報告されているように、デンプン蓄積の増加をもたらす（Tuncay H, Findinier J, Duchene T, Cogez V, Cousin C, Peltier G, Ball SG, Dauvillee D. A Forward Genetic Approach in Chlamydomonas reinhardtii as a Strategy for Exploring Starch Catabolism. PLoS One 2013; 8、Hamilton BS, Nakamura K, Roncari DAK. Accumulation of starch in Chlamydomonas reinhardtii flagellar mutants. Biochem Cell Biol 1992; 70:255-258）。従って、M-3ZFeL変異株細胞において観察されたより高いパラミロン貯蔵も、細胞におけるエネルギー消費の抑制に起因すると考えられる。
【００７１】
M-3ZFeL変異株は、細胞形状、細胞小器官、細胞成長および光合成における欠損を示さなかった。このことは、変異株において、代謝および再生には重要ではない鞭毛の運動に関与する成分に欠陥があることを示唆した。増殖することが可能な運動性欠損変異株の獲得に成功したことは、遺伝子中に少数の大きな欠失を引き起こすことが知られているＦｅ−イオン照射による変異誘発によるものである可能性がある（Kazama Y, Hirano T, Saito H, Liu Y, Ohbu S, Hayashi Y, Abe T. Characterization of highly efficient heavy-ion mutagenesis in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol 2011; 11:161）。
【００７２】
本実施形態に係るM-3ZFeL変異株は、速い沈降速度、高いパラミロン貯蔵量および野生株に匹敵する増殖速度を示すため、食品成分および化学物質の工業的生産において非常に有望である。変異株の速い沈降速度は、E. gracilisを用いたグリーンケミストリーの収穫プロセスにおいて、時間とエネルギーを節約することを可能とする。また、運動性欠損細胞は、顕微鏡下の限られた領域で取り扱うことが容易である。したがって、遺伝子やタンパク質などのエフェクタント（ｅｆｆｅｃｔａｎｔ）を細胞に送達するために、単一細胞エレクトロポレーションを用いた単細胞のさらなる研究およびマイクロマニピュレーションに役立つといえる。さらに、M-3ZFeL変異株における遺伝子変異を同定することにより、ユーグレナ運動の根底にある分子機構を明らかにすることが可能である。
【符号の説明】
【００７３】
１  装置
２  細胞浮遊液チューブ
３  シース液チューブ
４  フローセル
５  ノズル
６  光源
７  検出器
８  データ処理系
９  電場
１０  試験管
【図１】
2019083740.tif 000005
【図２】
2019083740.tif 000006
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2019083740.tif 000013
【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月18日(2018.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーグレナ（Euglena）属に属し、
運動性が野生型のユーグレナの運動性よりも低く、
前記野生型のユーグレナの重イオンビーム誘発突然変異株であり、
前記運動性が、鞭毛運動に基づく重力走性であることを特徴とする運動性低下ユーグレナ。
【請求項２】
前記運動性が野生型のユーグレナの運動性よりも低いのは、鞭毛拍動が欠如に起因し、
運動性が野生株の運動性の１０００分の１以下であることを特徴とする請求項１に記載の運動性低下ユーグレナ。
【請求項３】
培養液にて撹拌培養後、２０ｃｍの水深において、撹拌を停止してから３．５時間後に沈降する細胞の量が、前記野生型のユーグレナの１０倍以上である性質を有することを特徴とする請求項１又は２記載の運動性低下ユーグレナ。
【請求項４】
独立栄養条件で培養したときの藻体内の炭水化物含有量が、前記野生型のユーグレナを独立栄養条件で培養したときの該野生型のユーグレナ藻体内の炭水化物含有量の１．６倍以上であることを特徴とする請求項１乃至３いずれか一項に記載の運動性低下ユーグレナ。
【請求項５】
従属栄養条件及び独立栄養条件の両方の条件において、前記野生型のユーグレナと同程度の増殖速度を示すことを特徴とする請求項１乃至４いずれか一項に記載の運動性低下ユーグレナ。
【請求項６】
前記野生型のユーグレナは、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）であることを特徴とする請求項１乃至５いずれか一項に記載の運動性低下ユーグレナ。
【請求項７】
ユーグレナ・グラシリスM-3ZFeL株（受託番号：FERM P-22341）であることを特徴とする請求項１に記載の運動性低下ユーグレナ。
【請求項８】
請求項１乃至７いずれか一項に記載の運動性低下ユーグレナを用いるパラミロンの製造方法。
【請求項９】
重イオンビームを用いて、ユーグレナ生細胞の突然変異を誘発する突然変異誘発工程と、
該突然変異誘発工程を経た前記細胞から運動性の低下している前記細胞を分取して、前記突然変異で運動性が低い変異体を選抜する変異体選抜工程と、
前記変異体を培養する変異体培養工程と、を行い、
前記運動性が、鞭毛運動に基づく重力走性であることを特徴とする運動性低下ユーグレナの製造方法。
【請求項１０】
前記変異体選抜工程では、走光性を示さない個体を選択することを特徴とする請求項９に記載の運動性低下ユーグレナの製造方法。
【請求項１１】
ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）種に属するM-3ZFeL株（受託番号：FERM P-22341）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
前記課題は、本発明の運動性低下ユーグレナによれば、ユーグレナ（Euglena）属に属し、運動性が野生型のユーグレナの運動性よりも低く、前記野生型のユーグレナの重イオンビーム誘発突然変異株であり、前記運動性が、鞭毛運動に基づく重力走性であること、により解決される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
また、前記運動性が野生型のユーグレナの運動性よりも低いのは、鞭毛拍動が欠如に起因し、運動性が野生株の運動性の１０００分の１以下であるとよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
また、前記課題は、本発明の運動性低下ユーグレナの製造方法によれば、重イオンビームを用いて、ユーグレナ生細胞の突然変異を誘発する突然変異誘発工程と、該突然変異誘発工程を経た前記細胞から運動性の低下している前記細胞を分取して、前記突然変異で運動性が低い変異体を選抜する変異体選抜工程と、前記変異体を培養する変異体培養工程と、を行い、前記運動性が、鞭毛運動に基づく重力走性であることにより解決される。
このとき、前記変異体選抜工程では、走光性を示さない個体を選択するとよい。