(57)【要約】      （修正有）【課題】より優れた細胞剥離性を有する温度応答性細胞培養基材を提供する。【解決手段】（Ａ）温度応答層；及び（Ｂ）基材層を含有する温度応答性細胞培養基材であって、前記温度応答層（Ａ）は、窒素原子を有する温度応答性ポリマーであるブロック及び水不溶性ポリマーであるブロックを含むブロックポリマーを含有し、前記温度応答層（Ａ）は、前記基材層（Ｂ）の少なくとも一方の面に配置されており、前記基材層（Ｂ）は、窒素原子を有さず、かつ前記温度応答層（Ａ）側の表面は、放出角４５°におけるＸ線光電子分光法で測定される、窒素元素濃度Ｎ１ｓ及び炭素元素濃度Ｃ１ｓが、以下の数式（１）：（１）１００×（Ｎ１ｓ／Ｃ１ｓ）／（Ｎ／Ｃ）≧８０（（Ｎ／Ｃ）は、夫々前記温度応答性ポリマーにおける各元素比の理論値を表わす）を満たす、温度応答性細胞培養基材。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）温度応答層；及び
（Ｂ）基材層
を含有する温度応答性細胞培養基材であって、
前記温度応答層（Ａ）は、窒素原子を有する温度応答性ポリマーであるブロック及び水不溶性ポリマーであるブロックを含むブロックポリマーを含有し、
前記温度応答層（Ａ）は、前記基材層（Ｂ）の少なくとも一方の面に配置されており、
前記基材層（Ｂ）は、窒素原子を有さず、かつ
前記温度応答層（Ａ）側の表面は、放出角４５°におけるＸ線光電子分光法で測定される、窒素元素濃度Ｎ１ｓ及び炭素元素濃度Ｃ１ｓが、以下の数式（１）：
（１）１００×（Ｎ1ｓ／Ｃ1ｓ）／（Ｎ／Ｃ）≧８０
（数式中、（Ｎ／Ｃ）は、それぞれ前記温度応答性ポリマーにおける各元素比の理論値を表わす）
を満たす、温度応答性細胞培養基材。
【請求項２】
前記温度応答層（Ａ）側の表面は、アルゴンガスクラスターイオンビームにより表面側からエッチングしながら、Ｘ線光電子分光法により測定されるＮ１ｓとＣ１ｓとが、以下の条件（Ａ）を満たす、請求項１に記載の温度応答性細胞培養基材：
（Ａ）前記窒素原子のそれぞれ一種について、エッチング深さ２ｎｍにおける測定値が、以下の数式（２）を満たす：
（２）１００×（Ｎ１ｓ／Ｃ１ｓ）／（Ｎ／Ｃ）≧５０
（数式中、Ｎ／Ｃは、前記と同じ意味を表わす）。
【請求項３】
前記温度応答層（Ａ）側の表面に、前記温度応答性ポリマーが、１〜１０μｇ／ｃｍ２固定化されている、請求項１又は２に記載の温度応答性細胞培養基材。
【請求項４】
前記温度応答性ポリマーの少なくとも一種が、
（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）置換（メタ）アクリルアミド及びビニルエーテルからなる群より選択される少なくとも一種を少なくとも含むモノマー組成物を重合することにより得られうる温度応答性ポリマー、又は
ポリビニルアルコール部分酢化物
である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の温度応答性細胞培養基材。
【請求項５】
前記Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）置換（メタ）アクリルアミドが、ポリ−Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド、及びポリ−Ｎ、Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミドからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項４に記載の温度応答性細胞培養基材。
【請求項６】
前記基材層（Ｂ）がポリスチレンを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材。
【請求項７】
リユース用である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材。
【請求項８】
（Ａ）窒素原子を有する温度応答性ポリマーであるブロック、及び水不溶性ポリマーであるブロックを含むブロックポリマーが溶解してなる、ポリスチレンの良溶媒と貧溶媒とを含む溶液を、ポリスチレン基材表面に滴下し、展開させる工程；
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた表面を、２時間以上、前記溶媒の蒸気下に置く工程；及び
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた表面を、乾燥させる工程
を含む、温度応答性細胞培養基材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温度応答性細胞培養基材及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養基材として、温度応答性の表面を有する基材が用いられている。これらの基材は、主に、接着性細胞の培養のために用いられる。接着性細胞は、担体の表面に接着することにより増殖する。接着性細胞は、一般に、適度な疎水性表面に接着しやすく、親水性表面に接着しない性質を持っているとされる（非特許文献１）。このため、温度応答によって適度な疎水性から親水性へ、あるいはその逆方向に変化する表面を有する基材を用いることにより、接着細胞の表面への接着を温度変化により制御することが可能となる。
【０００３】
このような細胞培養基材のことを、「温度応答性細胞培養基材」という。これまで、培養した細胞は、蛋白分解酵素（ペプシン、トリプシン、ペプチダーゼなど）、EDTA（エチレンジアミン四酢酸＝金属キレート剤）などを用いて、基材−細胞間のタンパク質を「化学的に破壊」させる方法、あるいは、ピペッティング（ピペットで培養液を噴射）、ラバーポリスマン、セルスクレイパーなど用いて、同タンパク質を「物理的に破壊」させる方法で、基材表面から剥離するしかなかった。温度応答性細胞培養基材を用いれば、こうした操作が全て不要となり、温度を変えるだけで培養した細胞を剥がせるようになる。本基材から回収した細胞（シートに限定されない）は、化学的、物理的に損傷を受けていない特徴がある。また、温度応答性細胞培養基材から回収した細胞シートは、細胞自身が分泌した接着性タンパク質をそのまま保持しており、生体組織にも速やかに付着することができる。また、細胞シート同士を積層化すれば組織化することもでき、今後の再生医療技術の展開のためのプラットホーム技術と位置付けられる。
【０００４】
温度応答性細胞培養基材として、種々のものが開発されている。例えば、下限臨界溶液温度［Ｌｏｗｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＬＣＳＴ）］が３２℃であるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）を表面に固定化した培養基材が開発されている（特許文献１）。３２℃以上の温度の水に触れた基材表面のポリマー鎖は凝縮し、基材表面の性質としてはＰＩＰＡＡｍポリマー鎖そのものの性質が強く現れ、比較的疎水性を示す。一方、基材表面が３２℃以下の温度の水に接すると温度応答が起こり、表面のポリマー鎖は水分子と水和する。これにより、基材表面の性質としては、温度応答前に比べ親水性を示すことになり、接着していた細胞を剥離することができる。その他にも、特許文献２や特許文献３において、種々の温度応答性細胞培養基材が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平２−２１１８６５号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４／１３３１６８号
【特許文献３】特許第５８４６５８４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｙ．  Ｔａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌら他１名、Ｐｏｌｙｍｅｒ、１９９３年、３４、ｐｐ．２２０８−２２１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、従来の温度応答性細胞培養基材においては、温度応答時の細胞剥離性において改善すべき点があることを見出した。本発明は、より優れた細胞剥離性を有し、また、再利用安定性にも優れた温度応答性細胞培養基材を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討を重ね、蒸気中で乾燥させることを特徴とする塗布工程で作製した、温度応答性ポリマーであるブロックと水不溶性ポリマーであるブロックとを含むブロックポリマーで基材表面が覆われた温度応答性細胞培養基材において、温度応答性ポリマーによる表面被覆率を従来よりもさらに向上させることにより、上記課題を解決できることを見出した。さらに本発明者らは、温度応答性ポリマーの表面被覆率を、Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）法で測定される元素濃度に基づいて評価する手法を開発し、かかる評価指標に基づいて、上記課題を解決することのできる表面特性を定義した。本発明は、かかる知見に基づきさらなる試行錯誤を重ねることにより完成したものであり、以下の態様を含む。
【０００９】
項１．
（Ａ）温度応答層；及び
（Ｂ）基材層
を含有する温度応答性細胞培養基材であって、
前記温度応答層（Ａ）は、窒素原子を有する温度応答性ポリマーであるブロック及び水不溶性ポリマーであるブロックを含むブロックポリマーを含有し、
前記温度応答層（Ａ）は、前記基材層（Ｂ）の少なくとも一方の面に配置されており、
前記基材層（Ｂ）は、窒素原子を有さず、かつ
前記温度応答層（Ａ）側の表面は、放出角４５°におけるＸ線光電子分光法で測定される、窒素元素濃度Ｎ１ｓ及び炭素元素濃度Ｃ１ｓが、以下の数式（１）：
（１）１００×（Ｎ1ｓ／Ｃ1ｓ）／（Ｎ／Ｃ）≧８０
（数式中、（Ｎ／Ｃ）は、それぞれ前記温度応答性ポリマーにおける各元素比の理論値を表わす）
を満たす、温度応答性細胞培養基材。
項２．
前記温度応答層（Ａ）側の表面は、アルゴンガスクラスターイオンビームにより表面側からエッチングしながら、Ｘ線光電子分光法により測定されるＮ１ｓとＣ１ｓとが、以下の条件（Ａ）を満たす、項１に記載の温度応答性細胞培養基材：
（Ａ）前記窒素原子のそれぞれ一種について、エッチング深さ２ｎｍにおける測定値が、以下の数式（２）を満たす：
（２）１００×（Ｎ１ｓ／Ｃ１ｓ）／（Ｎ／Ｃ）≧５０
（数式中、Ｎ／Ｃは、前記と同じ意味を表わす）。
項３．
前記温度応答層（Ａ）側の表面に、前記温度応答性ポリマーが、１〜１０μｇ／ｃｍ２固定化されている、項１又は２に記載の温度応答性細胞培養基材。
項４．
前記温度応答性ポリマーの少なくとも一種が、
（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）置換（メタ）アクリルアミド及びビニルエーテルからなる群より選択される少なくとも一種を少なくとも含むモノマー組成物を重合することにより得られうる温度応答性ポリマー、又は
ポリビニルアルコール部分酢化物
である、項１〜３のいずれかに記載の温度応答性細胞培養基材。
項５．
前記Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）置換（メタ）アクリルアミドが、ポリ−Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド、及びポリ−Ｎ、Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミドからなる群より選択される少なくとも一種である、項４に記載の温度応答性細胞培養基材。
項６．
前記基材層（Ｂ）がポリスチレンを含む、項１〜５のいずれかに記載の温度応答性細胞培養基材。
項７．
リユース用である、項１〜６のいずれかに記載の温度応答性細胞培養基材。
項８．
（Ａ）窒素原子を有する温度応答性ポリマーであるブロック、及び水不溶性ポリマーであるブロックを含むブロックポリマーが溶解してなる、ポリスチレンの良溶媒と貧溶媒とを含む溶液を、ポリスチレン基材表面に滴下し、展開させる工程；
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた表面を、２時間以上、前記溶媒の蒸気下に置く工程；及び
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた表面を、乾燥させる工程
を含む、温度応答性細胞培養基材の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、優れた細胞剥離性を有し、また、再利用安定性にも優れた温度応答性細胞培養基材を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の温度応答性細胞培養基材であって、温度応答層（Ａ）の表面のうち、中心点と、中心点からそれぞれ均等に離間した特定の４点との計５点における温度応答性ポリマー固定化量の各測定値の間に大きなばらつきのないことを特徴とする、本発明の一態様における、それら測定点５点の取り方の例を示した図面である。
【図２】本発明の別の一態様における、前記測定点５点の取り方を示した図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において用語「（メタ）アクリレート」は、アクリレート及びメタアクリレートを含む総称として用いられる。
１．  温度応答層（Ａ）
１．１  温度応答性ポリマーの分布に関するパラメーター
本発明の温度応答性細胞培養基材は、
（Ａ）温度応答層；及び
（Ｂ）基材層
を含有する温度応答性細胞培養基材であって、
前記温度応答層（Ａ）は、窒素原子を有する温度応答性ポリマーであるブロック及び水不溶性ポリマーであるブロックを含むブロックポリマーを含有し、
前記温度応答層（Ａ）は、前記基材層（Ｂ）の少なくとも一方の面に配置されており、
前記基材層（Ｂ）は、窒素原子を有さず、かつ
前記温度応答層（Ａ）側の表面は、放出角４５°におけるＸ線光電子分光法で測定される、窒素元素濃度Ｎ１ｓ及び炭素元素濃度Ｃ１ｓが、以下の数式（１）：
（１）１００×（Ｎ1ｓ/Ｃ1ｓ）/（Ｎ/Ｃ）≧８０
（数式中、（Ｎ/Ｃ）は、それぞれ前記温度応答性ポリマーにおける各元素比の理論値を表わす）
を満たす、温度応答性細胞培養基材である。
【００１３】
温度応答層（Ａ）は、少なくとも温度応答性ポリマーであるブロック（温度応答性ポリマーセグメント）及び水不溶性ポリマーであるブロック（水不溶性ポリマーセグメント）を含むブロックポリマーを含み、表面が温度応答性を示す。本発明の温度応答性細胞培養基材は、この温度応答性を示す表面を、細胞培養を行う面として使用する。
【００１４】
温度応答層（Ａ）は、温度応答性ポリマーであるブロック、及び水不溶性ポリマーであるブロックを含む、ブロックポリマーを含有する。水不溶性ポリマーセグメントが温度応答層（Ａ）の基材層（Ｂ）側の面近傍に局在化し、温度応答性ポリマーセグメントが温度応答層（Ａ）の基材層（Ｂ）とは反対側の面近傍に局在化していことが好ましい。かかる構成をとることにより、温度応答性ポリマーセグメントを表面側に局在化させつつ、ブロックポリマーを、基材層（Ｂ）の面に安定的に固定化することができる。
【００１５】
本発明の温度応答性細胞培養基材は、温度応答層（Ａ）側の表面が上記の特性を有していることにより、温度応答時の細胞剥離性がより優れたものとなる。
【００１６】
具体的には、温度応答層（Ａ）側の表面は、温度応答性ポリマーの被覆量が、従来の温度応答性細胞培養基材におけるものよりも高いという特徴を有している。数式（１）は、ＸＰＳ法で温度応答層（Ａ）側の表面を測定することにより得られる、温度応答性ポリマーの被覆量の指標の一つである。表面が完全に温度応答性ポリマーで被覆されている場合には、Ｎ１ｓ／Ｃ１ｓがＮ／Ｃと等しくなるため、数式（１）の左辺の値は１００（％）となる。ここで、Ｎ１ｓはＸＰＳ法で測定される窒素原子濃度を表わし、Ｎ／Ｃは、前記温度応答性ポリマーに含まれる炭素原子量（Ｃ）に対する、窒素原子（Ｎ）の比率の理論値を表わす。温度応答性ポリマーがポリイソプロピルアクリルアミドの場合、その繰返単位のイソプロピルアクリルアミドは窒素原子１個、炭素原子６から構成されるため、Ｎ／Ｃの理論値は、１／６＝０．１６７である。
【００１７】
一方、表面が温度応答性ポリマーで全く被覆されていない場合には、基材層（Ｂ）が、温度応答性ポリマーの有する窒素原子を有さないためＮ１ｓが検出されない。したがって、数式（１）の左辺の値は０（％）となる。
【００１８】
数式（１）の左辺の値が８０以上であると、温度応答性ポリマーの表面被覆量が十分に高く、温度応答時の細胞剥離性がより優れたものとなる。この効果の点で、数式（１）の左辺は、８５以上であれば好ましく、９０以上であればより好ましく、９５以上であればさらに好ましい。
【００１９】
ＸＰＳは、具体的には以下のようにして測定する。
アルバック・ファイ社製  表面分析装置  ＰＨＩ５０００  ＶｅｒｓａＰｒｏｂｅ  ＩＩを用いて、単色化されたＸ線  ＡｌＫαを照射し、放出角４５°で測定する。
【００２０】
本発明の温度応答性細胞培養基材は、好ましくは、前記温度応答層（Ａ）側の表面が、アルゴンガスクラスターイオンビームにより表面側からエッチングしながら、ＸＰＳにより測定されるＮ１ｓとＣ１ｓとが、以下の条件（Ａ）及び／又は（Ｂ）を満たす：
（Ａ）エッチング深さ２ｎｍにおける測定値が、以下の数式（２）を満たす：
（２）１００×（Ｎ１ｓ／Ｃ１ｓ）／（Ｎ／Ｃ）≧５０
（数式中、Ｎ／Ｃは、前記と同じ意味を表わす）
（Ｂ）以下の数式（３）が満たされるエッチング深さが５ｎｍ以上である：
（３）１００×（Ｎ１ｓ／Ｃ１ｓ）／（Ｎ／Ｃ）≦５
（数式中、Ｎ／Ｃは、前記と同じ意味を表わす）。
【００２１】
数式（２）は、アルゴンガスクラスターイオンビームにより温度応答性細胞培養基材の表面側からエッチングしながらＸＰＳ法で測定することにより得られる、表面からの深さ２ｎｍの位置における、温度応答性ポリマーの存在量の指標である。この位置が完全に温度応答性ポリマーで占められている場合には、温度応答性ポリマーに含まれるヘテロ原子のそれぞれに関して、Ｎ１ｓ／Ｃ１ｓがＮ／Ｃと等しくなるため、数式（２）の左辺の値は１００（％）となる。
【００２２】
数式（２）の左辺の値が５０（％）以上であると、表面からの深さ２ｎｍの位置における温度応答性ポリマーの存在量が十分に多く、温度応答時の細胞剥離性がより優れたものとなる。この効果の点で、数式（２）の左辺は、６０（％）以上であれば好ましく、７０（％）以上であればより好ましく、８０（％）以上であればさらに好ましい。
【００２３】
数式（３）は、アルゴンガスクラスターイオンビームにより温度応答性細胞培養基材の表面側からエッチングしながらＸ線光電子分光法で測定することにより得られる、温度応答性ポリマーの存在量が十分に少なくなる深さ位置の指標である。つまり、数式（３）が満たされる地点では、温度応答性ポリマーの存在量が十分に少なくなっている。数式（３）が満たされる深さ位置が５ｎｍ以上であると、温度応答性ポリマーが表面側からより深い位置にまで十分量存在していると言え、このとき、温度応答時の細胞剥離性がより優れたものとなる。この効果の点で、数式（３）の左辺が満たされるエッチング深さは４ｎｍ以上であれば好ましく、５ｎｍ以上であればより好ましく、６ｎｍ以上であればさらに好ましい。
【００２４】
アルゴンガスクラスターイオンビームによるエッチングを行いながらＸＰＳを測定する方法は、具体的には以下のようにして行う。
アルバック・ファイ社製  表面分析装置  ＰＨＩ５０００ ＶｅｒｓａＰｒｏｂｅ  ＩＩを用いて、２．５ｋＶ、１０ｎＡ（Ａｒｅａ  ２ｍｍ□）の条件で、アルゴンガスクラスターイオンでエッチングしながら深さ方向の元素を測定する。エッチングレートは、膜厚６１ｎｍのＰＮＩＰＡＭ薄膜（基板：シリコンウエハ）に、Ｓｉが検出されるまでアルゴンガスクラスターイオンでエッチングすることにより、２．０ｎｍ／ｍｉｎを算出する。
【００２５】
本発明の温度応答性細胞培養基材は、温度応答性ポリマーの表面被覆量が、表面においてより均一に被覆されていると好ましい。この点で、
前記温度応答層（Ａ）側の表面の中心点、及び
該中心点から各端点までの距離の合計が最大となるように設定された、該中心点を交点とする十字線における、各端点と中心点とを結ぶ線の中心点
からなる５点における、前記温度応答性ポリマー固定化量の各測定値から算出された変動係数［（標準偏差／平均値）×１００］が、以下の数式（４）：
（４）変動係数≦１０
を満たすことが好ましい。
【００２６】
数式（４）は、表面のうち、中心点と、中心点からそれぞれ均等に離間した特定の４点との計５点における温度応答性ポリマー固定化量の各測定値の間に大きなばらつきのないことを保証したものである。ばらつきが全くない場合、標準偏差は０となるため、数式（４）の左辺は０となる。よりばらつきの少ない表面であるという点において、数式（４）の左辺は１０以下であれば好ましく、６以下であればより好ましく、５以下であればさらに好ましい。
【００２７】
特定の５点の取り方の例を図１及び図２に示す。図１は表面が円形の場合の例を示しており、図２は表面が略正方形の場合の例を示している。図１及び図２の両方において、点Ａは中心点を、点Ｂは、十字線（破線で示す）における、各端点と中心点とを結ぶ線の中心点をそれぞれ示している。測定に用いられる基材の面積は、例えば、９．６〜７８．５ｃｍ２である。
【００２８】
本発明において、基材表面への温度応答性ポリマーの固定化量は、基材表面に適用した温度応答性ポリマーの量から計算できる。ただし、必要に応じて、温度応答性ポリマーの固定化量を常法に従って測定することもできる。そのような測定方法としては、例えばフーリエ変換赤外分光全反射減衰法（ＦＴ-ＩＲ-ＡＴＲ法）、元素分析法及びＸＰＳ法等が挙げられる。測定結果にバラつきが生じない限り、いずれの測定法を選択してもよいが、バラつきが生じる場合は、本発明においてはＦＴ-ＩＲ-ＡＴＲ法による測定結果を採用する。
【００２９】
ＦＴ-ＩＲ-ＡＴＲ法での測定は、具体的には以下のようにして行う。
【００３０】
ポリスチレン製セルカルチャーディッシュを基材とし、温度応答性ポリマーとしてＰＮＩＰＡＭを固定化させた、温度応答性細胞培養基材を用意する。同基材をＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲ測定すると、次式（５）にて表される、ポリスチレンに由来するベンゼン環伸縮（１６００ｃｍ−１）の吸収強度に対する、ＰＮＩＰＡＭに由来するアミド伸縮（１６５０ｃｍ−１）の吸収強度の比率を得る事ができる。
（５）  吸収強度比率＝Ｉ１６５０／Ｉ１６００
【００３１】
既知量のＰＮＩＰＡＭ（１〜１０μｇ/ｃｍ２）をポリスチレン基材に塗布し、式（５）により得られる吸収強度比率から検量線を予め作成しておくことにより、ポリスチレン基材上に固定化された未知のＰＮＩＰＡＭの量を求める事ができる。なお、ポリスチレン基材上のポリマー固定化層は、試料に対する赤外光（エバネッセント波）のしみこみ深さ（１μｍオーダー）に対し十分に薄いと仮定する（参考文献：Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００４，２０，５５０６−５５１１）。
【００３２】
本発明の温度応答性細胞培養基材は、温度応答性ポリマーが、表面に０．５μｇ／ｃｍ２以上固定化されていることが好ましい。本発明の温度応答性細胞培養基材は、温度応答性ポリマーが他の構造との複合体として表面に固定化されている場合、当該複合体が温度応答性ポリマー換算で０．５μｇ／ｃｍ２以上、好ましくは１．０μｇ／ｃｍ２以上、より好ましくは１．５μｇ／ｃｍ２以上基材表面に固定化されていることが好ましい。本発明の温度応答性細胞培養基材は、温度応答性ポリマーの固定化量が上記以上であると、温度を変えても当該ポリマー上の培養細胞が剥離し難くなるということがない。い。
【００３３】
本発明の温度応答性細胞培養基材は、温度応答性ポリマーが、あるいは温度応答性ポリマーが他の構造との複合体として表面に固定化されている場合は、当該複合体が温度応答性ポリマー換算で、１０μｇ／ｃｍ２以下、好ましくは５μｇ／ｃｍ２以下、より好ましくは４μｇ／ｃｍ２以下、基材表面に固定化されていれば、温度応答前の状態で細胞が表面に付着し易く、細胞を十分に付着させることが容易となる。
【００３４】
総合すると、本発明の温度応答性細胞培養基材は、温度応答性ポリマーが、あるいは温度応答性ポリマーが他の構造との複合体として表面に固定化されている場合は、当該複合体が温度応答性ポリマー換算で、０．５〜１０μｇ／ｃｍ２、表面に固定化されていることが好ましく、１〜５μｇ／ｃｍ２、表面に固定化されていることがより好ましく、１．５〜４μｇ／ｃｍ２、表面に固定化されていることがさらに好ましい。
【００３５】
１．２  温度応答性ポリマー
温度応答性ポリマーは、窒素原子及び酸素原子からなる群より選択される少なくとも一種の窒素原子を有する温度応答性ポリマーであれば特に限定されず、幅広く選択することができる。温度応答性ポリマーは、具体的には、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を有するポリマー、又は上限臨界溶解温度［Ｕｐｐｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＵＣＳＴ）］を有するポリマーが挙げられ、特定構造のブロックポリマーを用いることが好ましい。ブロックポリマーは、一種の温度応答性ポリマーをブロックとして含んでいてもよいし、複数種の温度応答性ポリマーをブロックとして含んでいてもよい。
【００３６】
温度応答性ポリマーとしては、例えば、特公平０６−１０４０６１号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの少なくとも一種に基づく構成単位を有するポリマーが挙げられる。モノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体及びビニルエーテル誘導体等が挙げられる。
【００３７】
温度応答性ポリマーとしては、ポリビニルアルコール部分酢化物及び含窒素環状ポリマー等も例示できる。
【００３８】
温度応答性ポリマーとしては、アルキル置換セルロース誘導体、ポリアルキレンオキサイドブロック共重合体及びポリアルキレンオキサイドブロック共重合体等も例示できる。
【００３９】
培養細胞の剥離は、通常、５℃〜５０℃の範囲で行うことが好ましいため、ＬＣＳＴ又はＵＣＳＴがこの範囲内である温度応答性ポリマーが好ましい。そのような温度応答性を有する、ポリ（Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体を重合して得られるポリマー（ポリ（Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド））の具体例としては、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ（Ｎ−エチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド）及びポリ（Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド）等が挙げられる。
【００４０】
上記と同様の範囲のＬＣＳＴ又はＵＣＳＴを有する具体的なポリマーとしては、他にも、以下のものを例示できる。ポリビニルエーテルとして、例えば、ポリメチルビニルエーテル等が挙げられる。含窒素環状ポリマーとして、例えば、ポリ（Ｎ−アクリロイルピロリジン）及びポリ（Ｎ−アクリロイルピペリジン）等が挙げられる。アルキル置換セルロース誘導体として、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。ポリアルキレンオキサイドブロック共重合体としては、例えば、ポリポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体等が挙げられる。
【００４１】
温度応答性ポリマーとしては、ホモポリマーが温度応答性を示す上記モノマーの少なくとも一種と、上記モノマー以外の少なくとも一種のモノマーとの共重合体を用いることもできる。そのような他のモノマーとして、例えば、荷電を有するモノマー及び／又は疎水性モノマーを使用できる。
【００４２】
荷電を有するモノマーとして、例えばアミノ基を有するモノマー、アンモニウム塩を有するモノマー、カルボキシル基を有するモノマー、及びスルホン酸基を有するモノマー等が挙げられる。
【００４３】
アミノ基を有するモノマーとしては、例えば、ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド、ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレート、アミノアルキル（メタ）アクリレート、アミノスチレン、アミノアルキルスチレン、アミノアルキル（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
【００４４】
アンモニウム塩を有するモノマーとしては、例えば、［2-(2-メチルアクリロイルオキシ)エチル]トリメチルアンモニウム塩、（メタ）アクリルアミドアルキルトリメチルアンモニウム塩である３−アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロライド等が挙げられる。
【００４５】
カルボキシル基を有するモノマーとしては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸等が挙げられる。
【００４６】
また、スルホン酸を有するモノマーとしては、（メタ）アクリルアミドアルキルスルホン酸等が挙げられる。
【００４７】
疎水性モノマーとしては、アルキルアクリレート、アルキルメタアクリレート等が挙げられる。アルキルアクリレートとしては、例えば、ｎ−ブチルアクリレート、ｔ−ブチルアクリレート等が挙げられる。アルキルメタアクリレートとしては、例えば、ｎ−ブチルメタクリレート、ｔ−ブチルメタクリレート、メチルメタクリレート等が挙げられる。あるいは、特開２０１５−２１１６６５号公報の段落［００４７］〜［００６０］に記載されているフルオロアルキル基含有アクリル酸エステル又はフルオロアルキル基含有アクリルアミドが挙げられる。
【００４８】
温度応答性ポリマーとしては、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）置換（メタ）アクリルアミド及びビニルエーテルからなる群より選択される少なくとも一種を少なくとも含むモノマー組成物を重合することにより得られる温度応答性ポリマー、又はポリビニルアルコール部分酢化物が好ましい。
【００４９】
また、前記した温度応答性ポリマーをセグメントとして有するブロックポリマーを用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で温度応答性ポリマー同士を架橋したものを用いてもよい。その際利用される架橋性モノマーとしては特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、N,N’-メチレンビス（メタ）アクリルアミドが挙げられる。
【００５０】
温度応答性ポリマーは、ブロックポリマー中の含量として３０〜９９質量％であるのが好ましく、４０〜９８質量％であることがより好ましく、５０〜９５質量％であることがさらに好ましい。温度応答性ポリマーがブロックポリマー中に３０質量％以上含まれることにより、温度変化に応答して培養細胞が剥離しやすくなる。また、温度応答性ポリマーのブロックポリマー中の含量が９９質量％以下であることにより、細胞培養器材へのブロックポリマーの十分な接着性を確保することができる。
【００５１】
１．３  水不溶性ポリマー
水不溶性ポリマーは、特に限定されず、幅広く用いることができる。水不溶性ポリマーは、１３０℃で２時間乾燥させた後、２０℃の水１００ｇに添加し、６０分間撹拌した後の溶解量が、０．１ｇ以下であるポリマーであれば好ましい。
【００５２】
水不溶性のポリマー構造としても、公知の構造を広く選択することが可能であり、特に限定はない。中でもデンドリティック以外の（デンドリティックではない）ポリマー構造を有する水不溶性ポリマーを採用することが好ましく、ポリマーの合成プロセスを簡略化できるメリットが得られる。かかるデンドリティック以外のポリマー構造として、具体的には、線状、分岐状、星状などの各種の構造を採用することが可能である。線状又は分岐状の水不溶性ポリマーとして具体的には、ポリスチレン、ポリアルキル（メタ）アクリレート、疎水性ポリアルキレングリコール等が挙げられる。ここで、基材との親和性を考慮し、例えば、ポリスチレンを基材に用いる場合には、水不溶性ポリマーとしてポリスチレンを使用することが好ましい。
【００５３】
ポリ（メタ）アクリレートとしては、エステル部が置換されていてもよい炭化水素基であるアクリレートに基づく構成単位を有するものが挙げられる。上記において、アクリレートとしては、エステル部が、直鎖状、分岐状又は環状の炭化水素基であるものを使用できる。エステル部が直鎖状炭化水素基である場合、炭素数が１〜２２の炭化水素基であれば好ましい。
【００５４】
ポリ（メタ）アクリレートとしては、ポリアルキル（メタ）アクリレート、ポリシクロヘキシル（メタ）アクリレート、ポリベンジル（メタ）アクリレート、ポリイソボルニル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００５５】
ポリアルキル（メタ）アクリレートとしては、ポリ−ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、ポリ−ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、ポリ−メチル（メタ）アクリレート、ポリ−ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００５６】
例えば、水不溶性ポリマーとして線状のポリマーを使用する場合、上記に例示される水不溶性ポリマーの中から、その細胞培養基材の目的・用途に応じて適宜選択すればよい。その際の分子量としては、水不溶性の観点から、５，０００〜１００，０００が好ましく、１０，０００〜５０，０００がより好ましい。尚、本明細書においてポリマーの分子量とは、全て重量平均分子量を意味するものとする。
【００５７】
水不溶性ポリマーとして、デンドリティックポリマーを採用するのも、好ましい実施態様である。これにより、上記の好ましい温度応答性ポリマーの分布に関するパラメーターを達成しやすくなる。
【００５８】
この場合、デンドリティックポリマーが、スチレン骨格又はシロキサン骨格のデンドリティックポリマーであることが好ましい。本発明者らの検討によれば、このような骨格を有していることにより、デンドリティックポリマー部分が、基材表面に規則的に配置されやすくなり、これにより安定的に基材表面に固定化される結果、細胞培養のときだけでなく、温度応答により細胞を剥離させるときにおいても溶出しにくいという効果が得られる。
【００５９】
デンドリティックポリマーとしては、末端数１５以上のデンドリティックポリマーが好ましい。末端数が１５以上であることにより、末端に結合する温度応答性ポリマーの単位体積当たり密度を好ましい範囲とすることができ、このことが、温度応答時の細胞剥離性の向上に寄与する。この点において、スチレン骨格のデンドリティックポリマーの末端数は、１５以上であれば好ましく、２０以上であればより好ましい。
【００６０】
また、このデンドリティックポリマーの末端数は、温度応答性ポリマーを付加させる反応の時間を短縮できるという点において、１００以下であることが好ましく、５０以下であることがより好ましい。
【００６１】
以上を総合すると、デンドリティックポリマーの末端数の好ましい範囲としては、１５〜５０が挙げられ、その中においても２０〜５０が好ましく、３０〜５０がより好ましい。
【００６２】
デンドリティックポリマーの分子量は特に限定されず、幅広い範囲から選択することができる。特に、デンドリティックポリマーの分子量が２，０００以上であれば、ポリスチレン基材に、デンドリティックポリマーと温度応答性ポリマーとが結合したブロックポリマーが固定化されやすくなり、培地等に溶出する可能性が低減される。この点で、デンドリティックポリマーの分子量は、３，０００以上が好ましく、４，０００以上がより好ましく、５，０００以上が最も好ましい。
【００６３】
また、デンドリティックポリマーの分子量が１，０００，０００以下であれば、温度応答性ポリマー導入率を好ましい範囲内に保つことができる。この点で、デンドリティックポリマーの分子量は、５００，０００以下が好ましく、３００，０００以下がより好ましく、１００，０００以下が最も好ましい。
【００６４】
上記したスチレン骨格のデンドリティックポリマー（以下、スチレン骨格デンドリティックポリマーという。）の構造は、幅広く選択することができる。スチレン骨格デンドリティックポリマーの構造は、例えば、以下の一般式（１）により表わすことができる。
【００６５】
【化１】
2019083761.tif 000002
【００６６】
上記式中、Ｒ１は、共有結合により温度応答性ポリマーが導入されうる基である。
【００６７】
Ｒ１としては、特に限定されず、幅広く選択することができる。特に、可逆的付加−開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）剤として作用しうる基であれば、ＲＡＦＴ重合により温度応答性ポリマーを導入できるため好ましい。このようなＲＡＦＴ剤として作用しうる基としては、特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、チオカルボニルチオ基等が挙げられる。チオカルボニルチオ基としては、ジチオエステル基、ジチオカルバメート基、トリチオカーボネート基、キサンタート基及びジチオベンゾエート基等が挙げられる。
【００６８】
Ｒ１は、末端に、炭素数３〜１２の、置換されていてもよい炭化水素基を有していてもよい。この炭化水素基は、分岐状炭化水素基であれば好ましい。このことにより、温度応答性ポリマーと結合したブロックポリマー中の温度応答性部位に適度な立体障害を持たせる事ができ、より効果的に基材表面を被覆する事ができるという効果が得られる。このときのＲの具体例として、以下のようなトリチオカーボネート基が挙げられる。
【００６９】
【化２】
2019083761.tif 000003
【００７０】
上記式中、Ｒ２は、炭素数３〜１２の、置換されていてもよい炭化水素基を指す。Ｒ２は、分岐状炭化水素基であれば好ましい。具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、分岐プロピル基、ブチル基、分岐ブチル基、ヘキシル基、分岐ヘキシル基、ペンチル基、分岐ペンチル基、ヘプチル基、分岐ヘプチル基、オクチル基、分岐オクチル基、２−エチルヘキシル基、ノニル基、分岐ノニル基、デシル基、分岐デシル基、ドデシル基、分岐ドデシル基があり、好ましくはイソプロピル基、エチルヘキシル基及びブチルオクチル基等が挙げられる。
【００７１】
スチレン骨格デンドリティックポリマーの製造方法は、特に限定されず、幅広く選択することができる。例えば、常法として行われているクロロベンゼン中、塩化銅存在下で原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）法によって得ることができる。あるいは、乾燥トルエン中、加熱下、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）存在下にてラジカル重合させることによっても得ることができる。
【００７２】
より詳細には、上記Ｒ１の導入の目的のために、官能基を有するスチレン誘導体を少なくともモノマーとして用いて重合することが好ましい。このようなスチレン誘導体としては、ハロゲン化メチルスチレン等が挙げられる。ハロゲン化メチルスチレンとしては、クロルメチルスチレン、ブロムメチルスチレン等が用いられる。スチレン誘導体は一種を単独で用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。
【００７３】
上記の通り重合反応によりスチレン骨格デンドリティックポリマーを製造する際、使用する総モノマー全体に対する、官能基を有するスチレン誘導体の割合は、５％以上であることが好ましい。官能基を有するスチレン誘導体の上記割合が５％以上であると、温度応答性ポリマー鎖を導入する効率が良好となり、本発明で目標とする温度応答性ポリマー導入率を達成しやすくなる。この点で、官能基を有するスチレン誘導体の上記割合は、１０％以上であればより好ましく、１５％以上であればさらに好ましく、２０％以上であれば最も好ましい。
【００７４】
官能基を有するスチレン誘導体の上記割合が９０％以下であると、温度応答性ポリマー鎖を導入する効率を良好な範囲に保ちつつ、得られるブロックポリマーが水に溶けにくくなり、ブロックポリマーが培地等に溶出する可能性が低減される。この点で、官能基を有するスチレン誘導体の上記割合は、８０％以下であればより好ましく、７０％以下であればさらに好ましく、６０％以下であれば最も好ましい。
【００７５】
総合すると、官能基を有するスチレン誘導体の上記割合としては、５％〜９０％が好ましく、１０％〜８０％がより好ましく、１５％〜７０％がさらに好ましく、２０％〜６０％が最も好ましい。
【００７６】
シロキサン骨格デンドリティックポリマーは、幅広く選択することができる。シロキサン骨格デンドリティックポリマーは、例えば、ビス（ジメチルビニルシロキサン）メチルシラン、トリス（ジメチルビニルシロキサン）シラン、ビス（ジメチルアリルシロキサン）メチルシラン及びトリス（ジメチルアリルシロキサン）シランからなる群より選択される少なくとも一種のモノマーを重合することにより得られうるもの等が挙げられる。また、ビス（ジメチルシロキシ）メチルビニルシラン、トリス（ジメチルシロキシ）ビニルシラン、ビス（ジメチルシロキシ）メチルアリルシラン及びトリス（ジメチルシロキシ）アリルシランからなる群より選択される少なくとも一種のモノマーを重合することにより得られうるもの等も挙げられる。このようなシロキサン骨格デンドリティックポリマーは、例えばＷＯ２００４／０７４１７７号パンフレット等に記載の方法により得ることができる。
【００７７】
１．４  ブロックポリマー
本発明においては、温度応答層（Ａ）が、上記した温度応答性ポリマーであるブロック、及びデンドリティックではない水不溶性ポリマーであるブロックを少なくとも有するブロックポリマーを含有する。かかる構成を採用することにより、上述の好ましい温度応答性ポリマーの分布に関するパラメーターを達成しやすくなる。
【００７８】
ブロックポリマーとしては、少なくとも、上記項目１．２に記載される温度応答性ポリマーセグメントであるブロックと、同じく上記項目１．３に記載される水不溶性ポリマーセグメントであるブロックとを有するブロックポリマーであればよい。必要に応じてこれら以外の種類のポリマーセグメントをさらに有していて含んでもよい。また、安定的にブロックポリマーを基材表面に固定化し、細胞培養のときだけでなく、温度応答により細胞を剥離させるときにおいてもブロックポリマーが溶出され難くするという観点から、少なくとも水不溶性ポリマーセグメントが基材層（Ｂ）の表面に接着していることが好ましい。
【００７９】
ブロックポリマーとは、２種以上の組成的に別個のセグメントを有するポリマーを意味し、当業者に理解されているように、例えば、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、ランダムブロックコポリマー、星状枝分れブロックコポリマー、デンドリティックブロックコポリマーを挙げることができる。また、温度応答性ポリマーセグメントであるブロックをＸ、水不溶性ポリマーセグメントであるブロックをＹとしたときに、上記２つのブロックを有するＸ−Ｙ構造であってよい。また、３つのブロックを有するＸ−Ｙ−Ｘ構造、Ｙ−Ｘ−Ｙ構造であってもよいが、上述の如く、少なくとも水不溶性ポリマーセグメントが基材層（Ｂ）の表面に接着していることが好ましいことに鑑みれば、Ｙ−Ｘ−Ｙ構造の方が好ましい。
【００８０】
ブロックポリマーの好ましい実施態様としては、Thermoresponsive Poly(N-isopropylacrylamide)-Based Block Copolymer Coating for Optimizing Cell Sheet Fabrication, Macromol Biosci. 2012 Jun;12(6):751-60 に記載されているＰＢＭＡ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭに代表されるＰＮＩＰＡＭジブロック共重合体や、Novel poly(N-isopropylacrylamide)-poly[(R)-3-hydroxybutyrate]-poly(N-isopropylacrylamide) triblock copolymer surface as a culture substrate for human mesenchymal stem cells, Soft Matter, 5, 2937-2946(2009) に記載されているＰＮＩＰＡＭ−ＰＨＢ−ＰＮＩＰＡＭトリブロック共重合体に代表されるＰＮＩＰＡＭトリブロック共重合体を挙げることができる。
【００８１】
本発明のブロックコポリマーの分子量は、ＧＰＣにより以下の条件で測定する。
装置：特に限定されない。
検出器：示差屈折率検出器ＲＩ
カラム ：ＴＳＫｇｅｌ−Ｍ（１本）、ＴＳＫｇｅｌ−３０００（１本）（東ソー）
溶媒 ：ジメチルホルムアミド（５０ｍＭ  ＬｉＢｒ  添加）
流速 ：０．８ ｍＬ/ｍｉｎ
カラム温度 ：２３℃
試料調製 ：試料１０ｍｇにＤＭＦ溶媒５ ｍＬを加え、室温で緩やかに攪拌して溶解させた後、０．４５μｍフィルターを用いてろ過する。
注入量：０．２ｍＬ
標準試料：東ソー製単分散ポリスチレン
【００８２】
本発明のブロックコポリマーの分子量（重量基準）は、１０，０００〜５００，０００であれば好ましい。測定された分子量が１０，０００未満の場合、基材から培地にブロックコポリマーが溶出した際に細胞の品質に悪影響を与える可能性がある。
【００８３】
水不溶性ポリマーの末端に温度応答性ポリマーを結合させる方法は、特に限定されず、可逆的付加開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）法、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）法、アニオン重合法、リビングラジカル重合法などの公知の方法を幅広く選択できる。
【００８４】
但し、上記した方法の中でも、ＲＡＦＴ重合法を用いることが好ましい。ＲＡＦＴ重合法を用いてブロックコポリマーを製造した場合、ＲＡＦＴ剤の構造の一部であるジチオエステル系官能基が、生成したブロックコポリマーの末端に残存することになる。これはＲＡＦＴ重合法に特徴的な現象であり、重合反応が終了した後、さらにその末端から重合反応を開始させることが可能となる。その際、温度応答性ポリマーの末端に存在するジチオエステル系官能基は、２−エタノールアミンなどを添加することにより、容易にチオール基に置換される。この反応は特別な条件下で行われる必要はなく、簡便でありまた短時間で進行する。その結果、反応性の高いチオール基を有するポリマー鎖を得ることができるため、マレイミド基、チオール基などの官能基を有する機能性分子を選択的かつ効率的にポリマー鎖末端に修飾できる。従って、本発明の細胞培養用温度応答性基材表面に新たな機能性を付与することが可能となる。なお、官能基の種類については特に限定されるものではないが、例えば、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、カルボニル基、アルデヒド基、スルホン酸基等が挙げられる。また、上記で製造されたポリマー鎖末端には細胞接着を促進させるようなペプチドや蛋白質が固定化されていてもよい。これに関連して、例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が末端官能基の親水性・疎水性に依存して変化することから、本発明のようなポリマー鎖末端への官能基導入は、基材表面の温度応答性を別の観点から制御する新たな手法としても期待される。
【００８５】
結合方法としては、水不溶性ポリマーの末端にＲＡＦＴ剤を導入し、それを起点に各種モノマーを成長させる等の方法が挙げられる。
【００８６】
ＲＡＦＴ重合の開始剤は特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、２，２‘−アゾビス（イソブチロニトリル）、２，２’−アゾビス（４−メトキシ‐２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−７０）及び２，２‘−アゾビス[（２−カルボキシエチル）−２−（メチルプロピオンアミジン）（Ｖ−０５７）等が挙げられる。
【００８７】
ＲＡＦＴ重合時に使用する溶媒については特に限定されず幅広く選択できる。例えば、ベンゼン、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン及びジメチルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）等が好ましく、重合反応に使用するモノマー、ＲＡＦＴ剤及び重合開始剤の種類によって、適宜選択できる。重合時の開始剤濃度、ＲＡＦＴ剤量、反応温度及び反応時間等は特に限定されず、目的に応じて適宜設定できる。重合時、反応液は静置させても攪拌してもよい。
【００８８】
１．５．  基材層（Ｂ）表面への温度応答層（Ａ）の配置方法
【００８９】
本発明の温度応答性細胞培養基材は、基材層（Ｂ）の少なくとも一方の面に温度応答層（Ａ）を配置することにより得られうる。具体的には、例えば、温度応答性ポリマーを、基材層（Ｂ）の面に直接的又は間接的に固定することにより、温度応答層（Ａ）を基材層（Ｂ）の面に配置できる。
【００９０】
温度応答層（Ａ）は、互いに異なるＵＣＳＴ又はＬＣＳＴを有する二以上の領域を有し、それらの領域が二次元パターンを形成するように配列していてもよい。
【００９１】
温度応答層（Ａ）は、基材層（Ｂ）の少なくとも一方の面の一部に配置されており、その領域と、温度応答しない領域とが、二次元パターンを形成するように配列していてもよい。
【００９２】
温度応答性ポリマーの基材層（Ｂ）の面への固定方法は、特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、温度応答性ポリマーを溶媒に溶解又は分散させてから、基材表面が均一に被覆されるように塗布することにより直接的に固定することができる。
【００９３】
また、温度応答性ポリマーを含む複合体を溶媒に溶解させてから、基材層（Ｂ）の面に塗布することにより、温度応答性ポリマーを間接的に固定することもできる。
【００９４】
この場合に使用する溶媒としては、窒素原子を有する温度応答性ポリマーであるブロック、及び水不溶性ポリマーであるブロックを含むブロックポリマーが溶解してなる、ポリスチレンの良溶媒と貧溶媒とを含む混合溶媒を使用する。このような混合溶媒を使用すると、特に基材層（Ｂ）の材質がポリスチレンであり、水不溶性ポリマーとしてもポリスチレン、ポリブチルメタクリレートなどを採用する場合、基材層（Ｂ）の面のポリスチレンを膨潤させつつ、水不溶性ポリマーを固定化させることができ、結果的に水不溶性ポリマーが基材層（Ｂ）の面に埋め込まれるような形となるため好ましい。また、かかる混合溶媒を使用することにより、上述の好ましい温度応答性ポリマーの分布に関するパラメーターを達成しやすくなる。
【００９５】
良溶媒としては、テトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、キシレン、酢酸ブチル、シクロヘキサン、ヘキサン、ジオキサンなどが例示される。貧溶媒としては、メタノール、エタノール、シクロヘキサノール、ノルマルプロパノール、ノルマルブタノールなどのアルコール、水が例示される。いずれの良溶媒と貧溶媒の組み合わせにおいても、混合溶媒中の良溶媒含量が１０〜３５体積％であればより好ましい。
【００９６】
組み合わせる溶媒の蒸気圧は可能な限り近いことが好ましい。例えば、良溶媒の蒸気圧に対する貧溶媒の蒸気圧は、５０〜２００％の範囲が好ましい。テトラヒドロフラン［蒸気圧：１９．３ｋＰａ（２０℃）］とメタノール［蒸気圧：１２．３ｋＰａ（２０℃）］の組み合わせは６４％であり、上記数値範囲に入るので、特に好ましい。
【００９７】
温度応答性ポリマー又はそれを含む複合体の基材層（Ｂ）の面への固定化に際しては、温度応答性ポリマー又はそれを含む複合体を含む溶液を基材層（Ｂ）の面へ均一に塗布することが好ましい。その方法は特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、ディスペンサーを利用する方法、基材層（Ｂ）を水平な台の上に静置させる方法等が挙げられる。
【００９８】
温度応答性ポリマー又はそれを含む複合体を含む溶液を基材層（Ｂ）の面へ塗布した後、溶媒を除去することにより、本発明の温度応答性細胞培養基材が得られる。溶媒の除去方法は特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、室温にて、かつ大気中で時間をかけてゆっくり蒸発させる方法、室温にて、かつ溶媒飽和環境下で時間をかけてゆっくり蒸発させる方法、加熱下で蒸発させる方法、減圧下で蒸発させる方法等が挙げられる。特に、均一な温度応答層（Ａ）の面が得られるという点で、室温にて、かつ溶媒飽和環境下で時間をかけてゆっくり蒸発させる方法が好ましい。具体的には、２時間以上、前記溶媒の蒸気下に置くことが好ましい。２時間以上、溶媒の蒸気下に置くことにより、上述の好ましい温度応答性ポリマーの分布に関するパラメーターを達成しやすくなる。
【００９９】
均一な温度応答層（Ａ）の面が得られるという点で、溶媒飽和環境下で時間をかけてゆっくり溶媒を蒸発させた後、いったん表面を水洗してから乾燥させることが好ましい。
【０１００】
２．  基材層（Ｂ）
基材層（Ｂ）の材質は、窒素原子を有さないものであればよく、特に限定されない。通常、細胞培養に用いられるものであればよく特に制限されない。例えば、ガラス、改質ガラス、各種樹脂等が挙げられる。また、これらの他にもさらに、一般に形態付与が可能とされる材質からなるものであってもよい。そのような材質は、特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、グラフトポリマー、セラミックス及び金属類等が挙げられる。
【０１０１】
樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、シクロオレフィン、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリサルフォン及びポリフェニレンスルファイド等が挙げられる。
【０１０２】
これらの中でも、特に、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等が好ましく用いられる。
【０１０３】
基材層（Ｂ）の、温度応答層（Ａ）が配置される側の面は、必要に応じて表面処理がなされていてもよい。表面処理としては、例えば、プラズマ処理及びコロナ処理等が挙げられる。
【０１０４】
また、基材層（Ｂ）の、温度応答層（Ａ）が配置される側の面は、平滑であってもよいし、穴状、突起状又は壁状等の三次元構造が形成されていてもよい。そのような三次元構造を表面に有する基材層（Ｂ）としては、例えば、市販されている三次元構造細胞培養基材である、ＳＣＩＶＡＸ製ＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ、日立ハイテクノロジーズ製  ナノピラープレート、３Ｄ  Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ製Ｐｅｒｆｅｃｔａ３Ｄ又はクラレ製ＥＬＰＬＡＳＩＡ等を使用できる。
【０１０５】
温度応答層（Ａ）は、基材層（Ｂ）の面に、少なくとも一種のその他の層を介して配置されていてもよい。その他の層としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、シクロオレフィン、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリサルフォン及びポリフェニレンスルファイド等が挙げられる。
【０１０６】
３．  温度応答性細胞培養基材のその他の構成、特性及び用途等
【０１０７】
本発明の温度応答性細胞培養基材は、必要に応じて、温度応答層（Ａ）及び基材層（Ｂ）に加えてさらにその他の層を有していてもよい。その他の層としては、例えば、形状保持の目的で使用される支持層が挙げられる。
【０１０８】
本発明の温度応答性細胞培養基材の形状は、特に限定されない。ペトリ皿等の細胞培養皿であってもよいし、プレート、ファイバー又は粒子等であってもよい。粒子は多孔質であってもよい。また、一般に細胞培養等に用いられる別の容器形状であってもよい。そのような容器形状としては、例えば、フラスコ、バッグ等が挙げられる。
【０１０９】
本発明の温度応答性細胞培養基材は、細胞全般に対して使用できる。例えば、動物、昆虫、植物等の細胞、細菌類が挙げられる。動物細胞の由来の例として、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、ヌードマウス、マウス、モルモット、ブタ、ヒツジ、チャイニーズハムスター、ウシ、マーモセット及びアフリカミドリザル等が挙げられる。
【０１１０】
本発明の温度応答性細胞培養基材は、接着性細胞に対して好ましく使用できる。接着性細胞としては、幅広く選択することができ、例えば、内皮細胞、表皮細胞、上皮細胞、筋細胞、神経細胞、骨細胞及び脂肪細胞等のほか、樹状細胞及びマクロファージ等も挙げられる。内皮細胞としては、例えば、肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞及び角膜内皮細胞等が挙げられる。表皮細胞としては、例えば、繊維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞及び表皮角化細胞等が挙げられる。上皮細胞としては、例えば、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞及び角膜上皮細胞等が挙げられる。筋細胞としては、例えば、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞及び心筋細胞等が挙げられる。神経細胞としては、例えば、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞及び視神経細胞等が挙げられる。骨細胞としては、例えば、破骨細胞、軟骨細胞等が挙げられる。
【０１１１】
接着性細胞としては、各種幹細胞も使用できる。接着性の幹細胞としては、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ：ＥＧ細胞）、生殖細胞系列幹細胞（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ＧＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞；ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）等の多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞等の複能性幹細胞、心筋前駆細胞、血管内皮前駆細胞、神経前駆細胞、脂肪前駆細胞、皮膚線維芽細胞、骨格筋筋芽細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞等の単能性幹細胞（前駆細胞）等の幹細胞が挙げられる。
【０１１２】
本発明の温度応答性細胞培養基材においては、対象となる細胞を培養するために通常用いられる培地をそのまま使用できる。
【０１１３】
本発明の細胞培養用温度応答性基材においては、全面もしくは一部の培養基材の温度を温度応答性ポリマーのＵＣＳＴ以上若しくはＬＣＳＴ以下にすることによって、培養細胞を酵素処理することなく剥離させることができる。この温度変化による剥離は、培養液中において行ってもよいし、その他の等張液中等において行ってもよい。また、細胞をより早く、より高効率に剥離及び回収する目的で、基材を軽くたたいたり、ゆらしたりすることができる。さらに必要に応じて、ピペット等を用いて培地を撹拌する等してもよい。基材の一部のみの温度を変化させることのメリットとしては、例えば、ｉＰＳ細胞の分化誘導において、分化した細胞コロニーのみを選択的に剥離することが可能となること等が挙げられる。
【０１１４】
本発明の細胞培養用温度応答性基材は、温度応答性ポリマーが表面に強固に固定されていることが好ましく、この場合、リユース用として用いることができる。
【０１１５】
リユース用として用いる場合、液体培地を添加して細胞培養を行い、温度応答により細胞を剥離し、基材表面をリン酸緩衝生理食塩水等の適当な洗浄液で洗浄する、という一連の工程を一サイクルとして、同一の細胞培養用温度応答性基材を二以上のサイクルにおいて使用する、すなわち、２回以上のリユースのために用いられる。本発明の細胞培養用温度応答性基材は、好ましくは３回以上のリユースのために用いられる。
【実施例】
【０１１６】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
【０１１７】
＜製造例１、２＞
＜ＰＳ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ（製造例１）＞
スチレン（75.0 mmol）、連鎖移動剤としてジチオ安息香酸２‐シアノプロピル（0.9 mmol）、重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル（AIBN）（0.2 mmol）を５０ｍLのベンゼンに溶解させた。その溶液を減圧下で、三回凍結融解することで脱気し、６５℃、１５時間加熱して重合した。重合後、ポリマーを過剰のメタノール中で２回沈殿して精製し、室温、減圧下で乾燥した。
PBMA-b-PNIPAMは、上述のマクロ連鎖移動剤としてのPBMAを用いて合成した。NIPAM（12.0 mmol）、PBMA（0.05 mmol）、AIBN（0.01 mmol） を５ｍLの１，４ージオキサンに溶解した。その溶液を減圧下で、三回凍結融解することで脱気し、７０℃、２０時間加熱して重合した。重合後、ポリマーを過剰のヘキサン中で２回沈殿し、室温、減圧下で乾燥した。
得られたポリマーの分子量は下記条件に基づき、ＧＰＣによりキャラクタリゼーションした。
検出器：示差屈折率検出器ＲＩ
カラム ：ＴＳＫｇｅｌ−Ｍ（１本）、ＴＳＫｇｅｌ−３０００（１本）（東ソー）
溶媒 ：ジメチルホルムアミド（５０ｍＭ  ＬｉＢｒ  添加）
流速 ：０．８ ｍＬ/ｍｉｎ
カラム温度 ：２３ ℃
試料調製 ：試料１０ ｍｇにＤＭＦ溶媒５ ｍＬを加え、室温で緩やかに攪拌して溶解させた後、０．４５ μｍフィルターを用いてろ過する。
注入量：０．２ｍＬ
標準試料：東ソー製単分散ポリスチレン
＜ＰＢＭＡ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ（製造例２）＞
製造例１のスチレンをｎ−ブチルメタクリレートに置き換える以外は同じ方法で合成した。
【０１１８】
＜比較製造例１＞
［ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ）の合成］
窒素置換下の５０ｍｌ三ツ口フラスコ中へ、ＮＩＰＡＭ（５ｇ，０．０４４ｍｏｌ）、２−プロパノール（２５ｍｌ）を添加し、撹拌して溶解させた。さらにそこへ、ＡＩＢＮ（０．０７２６ｇ，４．４×１０−４ｍｏｌ）を添加し、８０℃にて６時間撹拌した。反応後、溶媒を減圧留去し、白色固体を４．９５ｇ得た。
【０１１９】
＜実施例１＞
［コーティング溶液の調製］
製造例１にて合成したブロックコポリマー１０ｍｇを、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ＝＝２／５（ｖ／ｖ）の混合溶媒（４ｍｌ）へ溶解させた。これを、母液と称する。この母液を、培養面積９．６ｃｍ２（３．５ｃｍφ）のセルカルチャーディッシュに５０μｌ塗布した時の、ＰＮＩＰＡＭ換算での塗布量が３．５μｇ／ｃｍ２となるよう、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ＝１／４（ｖ／ｖ）の混合溶媒でさらに希釈した。
【０１２０】
［ポリスチレン製基材に対するポリマーの固定化、水洗なし］
上記方法で得られたコーティング溶液（５０μｌ）を、ポリスチレン製セルカルチャーディッシュ（コーニング製Ｆａｌｃｏｎ３００１、培養面積９．６ｃｍ２）に塗布し、蓋をした。そのまま２．５時間静置させた後に乾燥させ、温度応答性細胞培養基材を得た。
【０１２１】
［ポリスチレン製基材に対するポリマーの固定化、水洗あり］
コーティング溶液（５０μｌ）を、ポリスチレン製セルカルチャーディッシュ（コーニング製Ｆａｌｃｏｎ３００１、培養面積９．６ｃｍ２）に塗布し、蓋をした。そのまま４時間静置させた後に乾燥させた。乾燥後、純水にて１時間洗浄した。洗浄後は、水切り後一晩自然乾燥させ、温度応答性細胞培養基材を得た。
【０１２２】
＜実施例２＞
［コーティング溶液の調製］
ＰＳ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭを、製造例２で合成したＰＢＭＡ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭに置き換えた以外は、実施例１と同じ方法で調製した。
【０１２３】
［その他の操作］
ポリスチレン製基材に対するポリマーの固定化、並びに細胞評価の方法については、実施例１と同様に実施した。
【０１２４】
＜比較例１＞
コーニング製Ｆａｌｃｏｎ３００１（培養面積９．６ｃｍ２）を比較例１として用いた。
【０１２５】
＜比較例２，３＞
［コーティング溶液の調製］
ＰＳ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭを比較製造例１で合成したＰＮＩＰＡＭに置き換える以外は、 実施例１と同じ方法で調製した。
【０１２６】
［その他の操作］
ポリスチレン製基材に対するポリマーの固定化、並びに細胞評価の方法については、実施例１と同様に実施した。ポリマー塗布後、水洗なしの場合を比較例２，水洗ありの場合を比較例３とした。
【０１２７】
＜比較例４＞
電子線照射によりポリスチレン基材表面にＰＮＩＰＡＭをグラフト重合により化学的に付与した、市販品温度応答性細胞培養基材Ａ（セルシード製UpCell、培養面積９．６ｃｍ２）を比較例４として用いた。
【０１２８】
［ＸＰＳによる測定］
アルバック・ファイ社製  表面分析装置  ＰＨＩ５０００  ＶｅｒｓａＰｒｏｂｅ  ＩＩ又はその同等品を用いて、単色化されたＸ線  ＡｌＫαを照射し、放出角４５°で測定した。２．５ｋＶ、１０ｎＡ（Ａｒｅａ  ２ｍｍ□）の条件で、アルゴンガスクラスターイオンでエッチングしながら深さ方向の元素を測定した。エッチングレートは、膜厚６１ｎｍのＰＮＩＰＡＭ薄膜（基板：シリコンウエハ）に、Ｓｉが検出されるまでアルゴンガスクラスターイオンでエッチングすることにより、２．０ｎｍ／ｍｉｎを算出した。
【０１２９】
［温度応答性ポリマーによる被覆率］
表面、又は特定のエッチング深さにおける温度応答性ポリマーによる被覆率は、以下のようにして評価した。
放出角４５°におけるＸＰＳ法で測定される窒素元素濃度Ｎ１ｓ及び炭素元素濃度Ｃ１ｓに関する、以下の数式（１）の値（％）を、被覆率とした。
（１）１００×（Ｎ１ｓ／Ｃ１ｓ）／（Ｎ／Ｃ）（％）
（数式中、（Ｎ／Ｃ）は、温度応答性ポリマーにおける各元素比の理論値を表わす）
【０１３０】
［ＦＴ-ＩＲ-ＡＴＲ法］
ポリスチレン製セルカルチャーディッシュを基材とし、温度応答性ポリマーとして比較製造例１のＰＮＩＰＡＭを固定化させた、温度応答性細胞培養基材を用意した。同基材をＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲ測定することにより、次式（５）にて表される、ポリスチレンに由来するベンゼン環伸縮（１６００ｃｍ−１）の吸収強度に対する、ＰＮＩＰＡＭに由来するアミド伸縮（１６５０ｃｍ−１）の吸収強度の比率を得た。
（５）  吸収強度比率＝Ｉ１６５０／Ｉ１６００
既知量のＰＮＩＰＡＭ（１〜１０μｇ/ｃｍ２）をポリスチレン基材に固定化させ、式（５）により得られる吸収強度比率から検量線を予め作成しておくことにより、ポリスチレン基材上に固定化された未知のＰＮＩＰＡＭの量を求めた。なお、ポリスチレン基材上のポリマー固定化層は、試料に対するＩＲ光の侵入深さに対し十分に薄いと仮定した（参考文献：Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００４，２０，５５０６−５５１１）。
【０１３１】
［培養後における温度応答性細胞培養基材の細胞評価方法］
３．５ｃｍφ温度応答性細胞培養ディッシュへ培地［ダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０％仔ウシ血清、１％抗生物質含］１ｍｌを加え、さらに３Ｔ３マウス線維芽細胞が１×１０５個分散した培地１ｍｌを加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で４日間培養を行った。
【０１３２】
培養終了後、培養細胞の付着状態、並びに培養細胞がディッシュへ内で満杯（コンフルエント）になるまで増殖しているかどうかを、倒立顕微鏡を用いて観察した。その後、培養細胞が入った温度応答性ディッシュを低温ＣＯ２インキュベーター（２０℃、５％ＣＯ２）内で静置し、１５分間冷却した。冷却後、培養細胞の剥離状態、培養細胞がシート状で剥離しているかどうかを倒立顕微鏡で観察し、以下の基準に従って細胞シートの剥離性を評価した。
１．剥離しない
２．一部剥離
３．培養細胞全体が剥がれるが、剥離に１５分程度かかる
４．１５分以内に良好に剥離する
５．さらに短い時間で極めて良好に剥離する
【０１３３】
実施例、比較例の結果を表１にまとめた。
【０１３４】
［実施例１（水洗なし）の評価、及び比較例４との比較］
結果を表１に示す。実施例１（水洗なし）の基材は、エッチング深さ０ｎｍにおける最表面のＰＮＩＰＡＭ被覆率が９０％以上であった。一方、比較例４（市販品Ａ）で得た基材は、最表面のＰＮＩＰＡＭ被覆率が８０％に満たないことから、基材が露出している事が示唆された。さらに、エッチング深さに対するＰＮＩＰＡＭ被覆率を測定したところ、比較例４で得た基材と比べ、実施例１で得た基材の方が２倍以上深くＰＮＩＰＡＭが存在している事が示唆された。以上より、本発明品は、基材に対し効果的にポリマーを埋め込む事ができており、且つ基材表面をＰＮＩＰＡＭによりほぼ被覆できている事が確認された。
【０１３５】
［実施例１（水洗あり）の評価、及び比較例４との比較］
実施例１（水洗なし）の基材では、基材に固定化しきれなかったポリマーが、細胞シート剥離性を阻害する可能性があった。そこで、実施例１において得られた温度応答性細胞培養基材を水洗し、水洗前後において、ＰＮＩＰＡＭ被覆率が５％以下となるエッチング深さ（＝ＰＮＩＰＡＭ存在深さ）を比較したところ、水洗後はＰＮＩＰＡＭ存在深さが約２ｎｍ浅い事が確認された。ＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲ測定においては、水洗によりＰＮＩＰＭＡ被覆量が約半分にまで減少している事、さらに、変動係数が５％以下に軽減している事が確認された。従って、余分なポリマーを除去する事によって、非常に均一なＰＮＩＰＡＭ層を得られる事が確認された。比較例４と同じく、基材表面の露出が懸念されたが、エッチング深さ０ｎｍにおけるＰＮＩＰＡＭ被覆率を確認したところ、表面は水洗前と同様に被覆されていることが判った。
【０１３６】
実施例１の水洗なし基材、実施例１の水洗あり基材、比較例４の基材について、マウス線維芽細胞を用いて細胞シート剥離性評価を実施した。その結果、比較例４＜実施例１（水洗なし）＜実施例１（水洗あり）の順に良好な剥離性を示した。これは、ポリスチレンデンドリティックポリマー部位を基材に埋め込む事により、表面を効果的にＰＮＩＰＡＭで被覆し、さらに、水洗により余分なポリマーを除去したことによる効果であると考えられる。一方、比較例４はＰＮＩＰＡＭの被覆量、被覆率ともに不足していたため、実施例１と比べ剥離時間が長くなったものと考えられる。
【０１３７】
［実施例２の評価］
ブロックコポリマー（製造例１）をブロックコポリマー（製造例２）に置き換える以外は実施例１と同じ方法で評価した。製造例１と製造例２の違いは、水不溶性ポリマーであるポリスチレン（ＰＳ）をポリｎーブチルメタクリレート（ＰＢＭＡ）置き換えたことであるが、ほぼ同じ結果が得られた。
【０１３８】
［比較例１の評価］
比較例１の基材においては、温度応答性ポリマーで表面を被覆していないため、上述したような細胞剥離性は発現しなかった。
【０１３９】
［比較例２、３の評価］
比較例２では、比較製造例１にて得られたＰＮＩＰＡＭを塗布した基材について評価したが、細胞剥離性は発現しなかった。このＰＮＩＰＡＭは、基材に対する結合手段を有していないことから、培地（水）を添加した際に溶解し、除去されたためと考えられる。比較例３は、比較例２の基材を水洗した場合である。ＰＮＩＰＡＭが基材と結合していないため、水洗後に塗布したすべてのＰＮＩＰＡＭが除去され、細胞剥離性が発現しなかった。
【０１４０】
【表１】
2019083761.tif 000004
【図１】
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【図２】
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