(57)【要約】【課題】ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体、又はそれに含まれるゲノムＤＮＡおよび／もしくはポリペプチドの単離又は解析。【解決手段】ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体にプローブを結合させること、及び該プローブと結合した該ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を回収することを含む、ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体の単離方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体の単離方法であって、
ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体にプローブを結合させること、及び
該プローブと結合した該ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を回収すること、
を含む、方法。
【請求項２】
ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に含まれるゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチドの単離方法であって、
ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体にプローブを結合させること、
該プローブと結合した該ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を回収すること、及び
回収された該ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体からゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチドを単離すること、
を含む、方法。
【請求項３】
前記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体が、クロマチン、ヌクレオソーム、ゲノムＤＮＡ−クロマチンリモデリング因子複合体、ゲノムＤＮＡ−転写因子複合体、及びゲノムＤＮＡ−ＤＮＡメチル化結合タンパク質複合体からなる群より選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記プローブが核酸、抗体、核酸結合タンパク質、及びタンパク質−核酸複合体からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記核酸が一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル−修飾核酸、ｓｉＲＮＡ、架橋型核酸、ペプチド核酸及びモルフォリノ・アンチセンス核酸からなる群より選択される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記プローブが、前記ゲノムＤＮＡの少なくとも一部とハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ、又は該ポリペプチドと結合する抗体である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記プローブがヒストン抗体である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記ヒストン抗体が修飾ヒストン抗体である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記プローブと結合したゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を、該プローブを介して担体に結合させることで回収する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記プローブが前記担体に親和性のある分子で修飾されている、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記担体に親和性のある分子がビオチンであり、前記担体がアビジン結合担体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記担体に親和性のある分子が磁性体であり、前記担体が磁性担体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記担体に親和性のある分子がビオチンであり、前記担体がアビジン結合磁性担体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記プローブが前記担体に固定化されている、請求項９記載の方法。
【請求項１５】
前記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体からのゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチドの単離において、前記プローブ又は担体と結合したゲノムＤＮＡが単離される、請求項２〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブを結合させる前の前記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体が断片化されている、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記プローブを結合させる前の前記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に対して、該ゲノムＤＮＡと該ポリペプチドとの相互作用を保持する処理を行う、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
前記プローブと結合させる前に、前記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体のゲノムＤＮＡを変性させる、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
前記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体の回収が、
前記プローブと結合した前記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に第２のプローブを結合させること、及び
該第２のプローブと結合した該ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を回収すること、
をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
前記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体がクロマチンである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記プローブが前記ゲノムＤＮＡの少なくとも一部とハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡであり、前記第２のプローブがヒストン抗体である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記プローブがヒストン抗体であり、前記第２のプローブが前記ゲノムＤＮＡの少なくとも一部とハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡである、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記ヒストン抗体が修飾ヒストン抗体である、請求項２１又は２２記載の方法。
【請求項２４】
ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に含まれるゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチドの解析方法であって、請求項２〜２３のいずれか１項記載の方法により単離されたゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に含まれるゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチドを、マイクロアレイ解析、定量ＰＣＲ、半定量ＰＣＲ、バイサルファイトシークエンス解析、メチル化ＤＮＡ特異的定量ＰＣＲ、メチル化ＤＮＡ特異的半定量ＰＣＲ、非メチル化ＤＮＡ特異的定量ＰＣＲ、非メチル化ＤＮＡ特異的半定量ＰＣＲ、ＣＯＢＲＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ、ＣＬＩＡ、ＣＥＬＩＡ、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット、クロマトグラフィー、質量分析、及びクロマトグラフィー−質量分析からなる群より選択される少なくとも１種により解析することを含む、方法。
【請求項２５】
前記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体がクロマチンである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記解析がエピジェネティクス解析である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記解析が遺伝子解析である、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に結合するプローブを含む、請求項１〜２７のいずれか１項記載の方法を行うためのキット。
【請求項２９】
前記プローブに結合したゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を固定化するための担体をさらに含む、請求項２８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体、ならびにそれに含まれるゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチドを単離又は解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エピジェネティクスは、ＤＮＡ配列の変化を伴わずに、細胞又は多細胞生物からその子孫へと遺伝子発現又は表現型の変化を継承する仕組みである。エピジェネティクスのメカニズムには、ＤＮＡメチル化等のＤＮＡの化学修飾、ヒストンの化学修飾、及びそれらによるヌクレオソームやクロマチンの構造もしくは安定性の変化などが関与していると考えられている。エピジェネティクスは、細胞が正常に発生分化又は機能するための制御に関わっていると考えられている。エピジェネティックな異常は、老化細胞、アポトーシス細胞又は異常細胞、特にがん細胞において見られることが多い。現在では、エピジェネティックな異常は、様々な疾病をもたらす原因として認識されている。エピジェネティクスに関わるタンパク質や核酸を検出又は解析する技術は、エピジェネティクス研究、及びエピジェネティクスを標的とした治療又は診断技術の開発にとって有用である。
【０００３】
クロマチンに会合したタンパク質の単離は、クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ法）を実施することによって達成されてきた。典型的なＣｈＩＰアッセイでは、クロマチン会合タンパク質は、ホルムアルデヒドを用いてＤＮＡへ架橋結合させられる。その後クロマチンは、小さなフラグメントにせん断され、精製される。精製されたクロマチンフラグメントは、標的クロマチン会合タンパク質に特異的な抗体を用いた免疫沈降を行うことで、単離される。沈降したクロマチンは、ＤＮＡを遊離させるように、架橋結合を解離させる処理に供される。得られたＤＮＡを精製、解析することで、特定のＤＮＡ領域に結合するクロマチン会合タンパク質を検出することが可能である。ＣｈＩＰ法を実施するためのプロトコールは、例えば、特許文献１、及び非特許文献１〜２に開示されている。
【０００４】
しかしながら、ＣｈＩＰ法に基づく技術を疾患等の診断に使用する場合、免疫沈降後に脱架橋、ＤＮＡ抽出、ＤＮＡ精製、及び、次世代シーケンサーやｑＰＣＲなどによる標的核酸配列の定量を行う必要があるため、ハイスループットな測定が困難である。また、含まれる夾雑物により、精製効率が十分でないこともある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１５−５００４７８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００６，１：１７９−１８５
【非特許文献２】Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９９９，３０４：５３３−４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体、それに含まれるゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチド、その他の核酸等の、標的核酸及び／又はこれと会合するポリペプチドを単離し、又はさらに解析する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の各発明を包含する。
〔１〕ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体の単離方法であって、
ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体にプローブを結合させること、及び
該プローブと結合した該ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を回収すること、
を含む、方法。
〔２〕ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に含まれるゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチドの単離方法であって、
ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体にプローブを結合させること、
該プローブと結合した該ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を回収すること、及び
回収された該ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体からゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチドを単離すること、
を含む、方法。
〔３〕前記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体が、クロマチン、ヌクレオソーム、ゲノムＤＮＡ−クロマチンリモデリング因子複合体、ゲノムＤＮＡ−転写因子複合体、及びゲノムＤＮＡ−ＤＮＡメチル化結合タンパク質複合体からなる群より選択される、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記プローブが核酸、抗体、核酸結合タンパク質、及びタンパク質−核酸複合体からなる群より選択される、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕前記核酸が一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル−修飾核酸、ｓｉＲＮＡ、架橋型核酸、ペプチド核酸及びモルフォリノ・アンチセンス核酸からなる群より選択される、〔４〕記載の方法。
〔６〕前記プローブが、前記ゲノムＤＮＡの少なくとも一部とハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ、又は該ポリペプチドと結合する抗体である、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔７〕前記プローブがヒストン抗体である、〔６〕記載の方法。
〔８〕前記ヒストン抗体が修飾ヒストン抗体である、〔７〕記載の方法。
〔９〕前記プローブと結合したゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を、該プローブを介して担体に結合させることで回収する、〔１〕〜〔８〕のいずれか１項記載の方法。
〔１０〕前記プローブが前記担体に親和性のある分子で修飾されている、〔９〕記載の方法。
〔１１〕前記担体に親和性のある分子がビオチンであり、前記担体がアビジン結合担体である、〔１０〕記載の方法。
〔１２〕前記担体に親和性のある分子が磁性体であり、前記担体が磁性担体である、〔１０〕記載の方法。
〔１３〕前記担体に親和性のある分子がビオチンであり、前記担体がアビジン結合磁性担体である、〔１０〕記載の方法。
〔１４〕前記プローブが前記担体に固定化されている、〔９〕記載の方法。
〔１５〕前記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体からのゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチドの単離において、前記プローブ又は担体と結合したゲノムＤＮＡが単離される、〔２〕〜〔１４〕のいずれか１項記載の方法。
〔１６〕前記プローブを結合させる前の前記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体が断片化されている、〔１〕〜〔１５〕のいずれか１項記載の方法。
〔１７〕前記プローブを結合させる前の前記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に対して、該ゲノムＤＮＡと該ポリペプチドとの相互作用を保持する処理を行う、〔１〕〜〔１６〕のいずれか１項記載の方法。
〔１８〕前記プローブと結合させる前に、前記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体のゲノムＤＮＡを変性させる、〔１〕〜〔１７〕のいずれか１項記載の方法。
〔１９〕前記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体の回収が、
前記プローブと結合した前記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に第２のプローブを結合させること、及び
該第２のプローブと結合した該ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を回収すること、
をさらに含む、〔１〕〜〔１８〕のいずれか１項記載の方法。
〔２０〕前記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体がクロマチンである、〔１９〕記載の方法。
〔２１〕前記プローブが前記ゲノムＤＮＡの少なくとも一部とハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡであり、前記第２のプローブがヒストン抗体である、〔２０〕記載の方法。
〔２２〕前記プローブがヒストン抗体であり、前記第２のプローブが前記ゲノムＤＮＡの少なくとも一部とハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡである、〔２０〕記載の方法。
〔２３〕前記ヒストン抗体が修飾ヒストン抗体である、〔２１〕又は〔２２〕記載の方法。
〔２４〕ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に含まれるゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチドの解析方法であって、〔２〕〜〔２３〕のいずれか１項記載の方法により単離されたゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に含まれるゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチドを、マイクロアレイ解析、定量ＰＣＲ、半定量ＰＣＲ、バイサルファイトシークエンス解析、メチル化ＤＮＡ特異的定量ＰＣＲ、メチル化ＤＮＡ特異的半定量ＰＣＲ、非メチル化ＤＮＡ特異的定量ＰＣＲ、非メチル化ＤＮＡ特異的半定量ＰＣＲ、ＣＯＢＲＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ、ＣＬＩＡ、ＣＥＬＩＡ、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット、クロマトグラフィー、質量分析、及びクロマトグラフィー−質量分析からなる群より選択される少なくとも１種により解析することを含む、方法。
〔２５〕前記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体がクロマチンである、〔２４〕記載の方法。
〔２６〕前記解析がエピジェネティクス解析である、〔２５〕記載の方法。
〔２７〕前記解析が遺伝子解析である、〔２５〕記載の方法。
〔２８〕ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に結合するプローブを含む、〔１〕〜〔２７〕のいずれか１項記載の方法を行うためのキット。
〔２９〕前記プローブに結合したゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を固定化するための担体をさらに含む、〔２８〕記載のキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、対象細胞のゲノム中の標的核酸、及び／又は該核酸と会合するポリペプチドを高い精製効率で精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】担体粒子を用いて回収されたクロマチン中のＣＥＮＰ−Ａの化学発光法による定量値。プローブありの場合の結果を１としたときの相対値。プローブあり:プローブＡ（α−サテライト配列認識プローブ）、コントロール：プローブなし。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（１．ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体の単離及び解析）
本発明は、対象細胞に存在するゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体、該複合体に含まれるゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチド、又は他の核酸を単離し、又はさらに解析する方法に関する。本発明による対象細胞は、固定保存された細胞であってもよいが、生細胞であることが好ましい。
【００１２】
（１−１．ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体、ならびにそれに含まれるゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチドの単離方法）
一態様において、本発明は、ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体の単離方法であって、
ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体にプローブを結合させること、及び
該プローブと結合した該ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を回収すること、
を含む方法を提供する。
【００１３】
別の一態様において、本発明は、ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に含まれるゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチドの単離方法であって、
ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体にプローブを結合させること、
該プローブと結合した該ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を回収すること、及び
回収された該ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体からゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチドを単離すること、
を含む方法を提供する。
【００１４】
本発明において、ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体の例としては、クロマチン、ヌクレオソーム、ゲノムＤＮＡ−クロマチンリモデリング因子複合体、ゲノムＤＮＡ−転写因子複合体、ゲノムＤＮＡ−ＤＮＡメチル化結合タンパク質複合体などからなる群より選択されるいずれか１種又は２種以上が挙げられる。本発明において、標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に含まれるゲノムＤＮＡは、特定タイプ又は領域のゲノムＤＮＡには限定されない。また本発明において、単離又は解析すべきポリペプチドの種類に応じて、標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に含まれるゲノムＤＮＡのタイプや配列の選択が可能である。
【００１５】
本発明において、ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に含まれるポリペプチドの例としては、ヒストン及び他のクロマチン会合タンパク質が挙げられる。これらのポリペプチドは、翻訳後修飾を受けていても、変異体（バリアント）であってもよい。ヒストンの例としては、ヒストンＨ１．０、Ｈ１．１、Ｈ１．２、Ｈ１．３、Ｈ１．４、Ｈ１．５、Ｈ２Ａ．１、Ｈ２Ａ．２、Ｈ２Ａ．３、Ｈ２Ｂ．ａ、Ｈ２Ｂ．ｂ、Ｈ２Ｂ．ｃ、Ｈ２Ａ．ｄ、Ｈ２Ａ．ｅ、Ｈ２Ａ．ｆ、Ｈ３．１、Ｈ３．２、Ｈ３．３、Ｈ４、及びそれらに関連した他種のホモログ等のヒストンアイソフォーム；Ｈ２Ａ−Ｘ、Ｈ２Ａ−Ｚ、マクロ−Ｈ２Ａ、Ｈ２Ａ−Ｂｂｄ、ＣＥＮＰ−Ａ、及びそれらに関連した他種のホモログ等のヒストンバリアント、などが挙げられる。したがって、本明細書における「ヒストン」とは、ヒストンアイソフォーム及びヒストンバリアントを包含する。ヒストンは修飾されていてもよい。当該修飾としては化学修飾が挙げられ、化学修飾としては、リン酸化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化等が挙げられる。他のクロマチン会合タンパク質の例としては、クロマチンリモデリング因子であるＳＷＩ／ＳＮＦ（switch/sucrose non-fermenting）ファミリータンパク質、ＩＳＷＩ（imitation switch）ファミリータンパク質、ＣＨＤ（chromatin helicase DNA binding protein ）ファミリータンパク質、ＩＮＯ８０（inositol 80 requiring ）ファミリータンパク質等；転写因子であるｃ−Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＦ−１、ステロイドホルモン受容体、ＧＡＴＡ因子、ＳＴＡＴ、ｐ５３等；メチル化ＤＮＡ結合タンパク質であるＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３等、などが挙げられる。
【００１６】
本発明の方法において、当該ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体は、後述する第１のプローブ（本明細書において、単にプローブということもある）と結合させる工程の前に、断片化されてもよい。断片化によって、単離すべき目的のゲノムＤＮＡを含み得る適当なサイズのゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体断片を生成させることができ、また標的の複合体と第１のプローブとの結合反応を促進することができる。
【００１７】
ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を断片化する手法としては、酵素処理、超音波処理、及びそれらの組み合わせが挙げられる。酵素処理に用いる酵素としては、制限酵素、ＤＮＡ分解酵素（エンドヌクレアーゼ）等を用いることができる。ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体がクロマチンの場合、ミクロコッカスヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）による酵素処理、超音波処理、又はそれらの組み合わせが好適に用いられ、クロマチンの断片（例えばヌクレオソーム）が生成される。断片化処理を効率よく行うため、断片化処理の前に、公知の方法を用いて対象細胞を溶解もしくは破砕するか、又は該細胞からゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体（例えば、クロマチン）分画を抽出しておくことが好ましい。
【００１８】
好ましくは、第１のプローブを結合させる前のゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に対して、該ゲノムＤＮＡとポリペプチドとの相互作用を保持する処理が行われる。相互作用を保持する処理としては、例えば架橋処理が挙げられる。該架橋処理に用いる好ましい架橋剤としては、例えばホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドが挙げられる。
【００１９】
好ましくは、第１のプローブと結合させる前のゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体のゲノムＤＮＡを変性させる。より詳細には、該複合体を加温し、その中のゲノムＤＮＡの二本鎖を解離させる。当該変性処理は、上記架橋処理をされた又はされていない複合体に対して行うことができるが、好ましくは、上記架橋処理された複合体に対して行われる。
【００２０】
本発明の方法においては、好ましくは、上述した断片化処理、相互作用を保持する処理、又は変性処理を経たゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体が、第１のプローブとの結合工程に適用される。したがって、第１のプローブとの結合工程に適用されるゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体は断片化されていても、されていなくともよい。以下の本明細書において、第１のプローブとの結合工程及びそれ以降の工程に適用される「ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体」は、断片化形態及び非断片化形態を包含し得る。
【００２１】
当該標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に結合させる第１のプローブは、該標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を内在する対象細胞に対して外来性の分子である。該第１のプローブの種類は、該標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に対して結合性を有するものであれば、特に限定されない。
【００２２】
一実施形態において、当該第１のプローブは、当該標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体中のゲノムＤＮＡ上の特定のＤＮＡ配列に結合する分子であり得る。そのような分子の例としては、ＤＮＡ結合タンパク質、核酸、タンパク質−核酸複合体などが挙げられる。標的となる該特定のＤＮＡ配列としては、特に限定されないが、例えば、遺伝子、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、テロメア、セントロメア、レトロウイルス由来配列、トランスポゾン、マイクロサテライト、及びその一部が挙げられる。一例として、クロマチンのセントロメア領域に存在するα−サテライト配列の一部を利用することができる。別の一実施形態において、当該第１のプローブは、当該標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体中の特定のポリペプチドと結合する分子であり得る。そのような分子の例としては、抗体が挙げられる。したがって、該第１のプローブは、好ましくは核酸、抗体、核酸結合タンパク質、及びタンパク質−核酸複合体からなる群より選択される。
【００２３】
当該第１のプローブのための核酸、核酸結合タンパク質、及びタンパク質−核酸複合体は、当該標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体中のゲノムＤＮＡの少なくとも一部と特異的に結合するものであればよい。当該核酸は、該ゲノムＤＮＡの配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするものであればよく、例えば、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル−修飾核酸（２’−ＭＯＥ−修飾核酸）、ｓｉＲＮＡ、架橋型核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及びモルフォリノ・アンチセンス核酸からなる群より選択され得る。
【００２４】
本明細書において、２つの核酸配列が「特異的にハイブリダイズする」とは、一方の配列の塩基の８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは１００％が、他方の配列の塩基と相補的に結合することをいう。
【００２５】
当該ＤＮＡ結合タンパク質の例としては、該ゲノムＤＮＡの配列の少なくとも一部に特異的に結合するように設計されたアミノ酸配列を有するものが挙げられ、例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬエフェクタータンパク質などが挙げられる。当該タンパク質−核酸複合体の例としては、該ゲノムＤＮＡの配列の少なくとも一部に特異的に結合するように設計された、不活性型Ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡとの複合体などが挙げられる。
【００２６】
当該第１のプローブに用いる核酸、ＤＮＡ結合タンパク質及びタンパク質−核酸複合体は、公知の手順に従って製造することができる。例えば、所定の配列を有する核酸は、化学合成法、ＰＣＲ法、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法、細胞に組み込んだ遺伝子からの転写等により製造することができる。また所定のアミノ酸配列を有するタンパク質は、例えば遺伝子組換え技術により組換えタンパク質として製造することができる。
【００２７】
当該第１のプローブのための抗体は、当該標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体中のポリペプチドと特異的に結合する抗体であればよい。該抗体の例としては、上述したヒストン、クロマチン会合タンパク質、ならびにそれらの修飾体又は変異体（バリアント）に対する抗体が挙げられる。該抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。当業者は、公知の手順に従って、目的のポリペプチドに対する抗体を製造することができる。
【００２８】
好ましくは、当該第１のプローブは、当該標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体中のゲノムＤＮＡの少なくとも一部と特異的にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ、又は該複合体中のポリペプチドと結合する抗体である。好ましくは、当該抗体は、ヒストン又は修飾ヒストン（例えば、アセチル化ヒストン又はメチル化ヒストン）に対する抗体である。
【００２９】
対象細胞として真核細胞を用いる場合、当該第１のプローブには、核移行シグナルを含めることができる。該プローブが核移行シグナルを有することにより、細胞内でプローブが核内に移行してゲノムＤＮＡと接触することが可能となる。核移行シグナルは、公知の核移行シグナルから適宜選択すればよい。具体的には、例えば、ＳＶ４０Ｔ抗原の核移行シグナル、ｃ−Ｍｙｃの核移行シグナル、ｐ５３の核移行シグナル、ＮＦ−κＢｐ５０の核移行シグナル、細胞内に取り込まれる性質を持つアミノ酸配列（タンパク質トランスダクションドメイン）などが挙げられる。
【００３０】
当該第１のプローブを標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に結合させる方法は、特に限定されない。例えば、標的複合体を含む細胞の溶解液又は抽出液と、該第１のプローブとを混合する方法、該第１のプローブを、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション等の公知の手段により対象細胞に導入して、細胞内で該標的複合体と接触させる方法、対象細胞を改変して該第１のプローブを細胞内で発現させ、細胞内に発現したプローブを該標的複合体と接触させる方法、該第１のプローブをコードする遺伝子が発現可能に導入されたトランスジェニック生物を用いる方法、などが挙げられる。
【００３１】
本発明の方法においては、当該第１のプローブと結合した標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を回収する。これにより、標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を単離することができる。好ましい実施形態において、該標的複合体は、該第１のプローブを介して担体に結合させることによって回収される。
【００３２】
当該担体は、タンパク質又は核酸の固定化に通常使用されるものであればよく、その種類は特に限定されない。該担体の素材の例としては、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、メタアクリレート、ラテックス、アガロース、セルロース、デキストラン、デンプン、デキストリン、シリカゲル、多孔性セラミックス、磁性体等の素材が挙げられる。また該担体の形状の例としては、ビーズ、カラム、ディスク、スティック、チューブ、プレート、チップ、マイクロアレイ等が挙げられる。
【００３３】
一実施形態において、当該第１のプローブは当該担体に固定化されている。プローブの担体への固定化には、物理的吸着、共有結合、架橋等の公知の方法を適宜用いることができる。該担体に固定化された第１のプローブをゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に結合させることによって、該プローブを介して該標的複合体が該担体に結合される。
【００３４】
別の一実施形態において、当該第１のプローブは、担体に親和性のある分子で修飾されており、該第１のプローブと結合した標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を担体に適用すれば、該プローブを介して該標的複合体が該担体に結合される。好ましい実施形態において、該担体に親和性のある分子はビオチン又はそのアナログであり、該担体は、表面にアビジン、ストレプトアビジン等が結合されたアビジン結合担体である。別の好ましい実施形態において、該担体に親和性のある分子は磁性体であり、該担体は磁性担体である。別の好ましい実施形態において、該担体に親和性のある分子はジゴキシゲニンであり、該担体は、表面にジゴキシゲニン抗体が結合された担体である。
【００３５】
さらなる一実施形態において、当該担体は、当該第１のプローブに親和性のある分子で修飾されており、該第１のプローブと結合した標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を担体に適用すれば、該プローブを介して該標的複合体が該担体に結合される。好ましい実施形態において、該第１のプローブは抗体であり、該担体は、抗体結合タンパク質（例えばプロテインＡ、プロテインＧ等）で修飾された担体（例えばアフィニティービーズ、アフィニティーカラム）である。
【００３６】
さらなる一実施形態において、当該担体は磁性粒子であり、さらに当該第１のプローブに親和性のある分子で修飾されている。該親和性のある分子を介した担体と第１のプローブとの結合により、該担体と標的複合体とが結合される。さらなる一実施形態において、該担体は磁性粒子であり、該担体と第１のプローブのそれぞれが、互いに親和性のある分子で修飾されている。それぞれの親和性のある分子の相互作用を介した担体と第１のプローブとの結合により、該担体と標的複合体とが結合される。好ましい実施形態において、該互いに親和性のある分子の一方はビオチン又はそのアナログであり、他方はアビジン又はストレプトアビジンである。磁性粒子担体に結合した標的複合体は、磁力を利用して回収される。
【００３７】
あるいは、本発明の方法においては、回収された第１のプローブと結合したゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に対して、さらに第２のプローブを結合させてもよい。該第２のプローブを用いることによって、第１のプローブに結合したゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体のさらなる選別や選択的単離、あるいは該ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体又はそこに含まれるゲノムＤＮＡもしくはポリペプチドの検出又は定量などが可能になる。
【００３８】
本発明で使用できる第２のプローブの例としては、上述した第１のプローブとして例示したものが挙げられる。基本的には、該第２のプローブは、該標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を内在する対象細胞に対して外来性の分子であり、かつ該第１のプローブとは異なる物質である。好ましい一実施形態において、該第１のプローブは、標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体中のゲノムＤＮＡの少なくとも一部と特異的にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡであり、該第２のプローブは、標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体中のポリペプチドと特異的に結合する抗体である。別の好ましい一実施形態において、該第１のプローブは、標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体中のポリペプチドと特異的に結合する抗体であり、該第２のプローブは、標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体中のゲノムＤＮＡの少なくとも一部と特異的にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡである。例えば、標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体がクロマチン又はその断片（例えばヌクレオソーム）である場合、該抗体は、好ましくはヒストン又は修飾ヒストン（例えば、アセチル化ヒストン又はメチル化ヒストン）に対する抗体である。
【００３９】
第２のプローブを用いる本発明の方法の一実施形態においては、回収された第１のプローブと結合したゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に、第２のプローブを結合させ、第２のプローブと結合したゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体を回収する。これにより、第１のプローブと結合したゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体をさらに選別し、選択的に単離することができる。
【００４０】
第２のプローブを用いる本発明の方法の別の一実施形態においては、回収された第１のプローブと結合したゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に、標識した第２のプローブを結合させ、次いで該標識を指標に、該回収された複合体、又はそこに含まれるゲノムＤＮＡもしくはポリペプチドを検出又は定量する。該標識の例としては、蛍光標識、発光標識、酵素標識、免疫標識、放射性標識などが挙げられ、より詳細な例としては、ビオチン又はそのアナログ、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ジニトロフェノール、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）、免疫タグ、同位体などが挙げられるが、これらに限定されない。第２のプローブが抗体の場合、サンドイッチ法を用いてもよい。すなわち、第２のプローブは、標的のポリペプチドに結合する抗体と、該抗体に結合する標識抗体との組み合わせであってもよい。
【００４１】
第２のプローブとゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体との結合、及び第２のプローブが結合した複合体の回収は、上述した第１のプローブの場合と同様の手順で行うことができる。標識を用いた物質の定量の手順は当該分野で周知であり、当業者は公知の手法の中から、標識の種類に応じた適切な手法を選択することができる。
【００４２】
回収したゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体からゲノムＤＮＡ又はポリペプチドを単離する場合、該複合体に対して、ゲノムＤＮＡとポリペプチドとの相互作用を解除する処理（例えば脱架橋処理）を行うことが好ましい。例えば、ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドによる架橋処理に対しては、高濃度塩溶液（５Ｍ  ＮａＣｌ溶液等）とのインキュベート（例えば約６５℃でオーバーナイト）により架橋を解除することができる。
【００４３】
回収したゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体からＤＮＡ又はポリペプチドを単離する方法としては、ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体のポリペプチドをタンパク質分解酵素により分解して、ＤＮＡとポリペプチドとを分離する方法、ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体のＤＮＡをＤＮＡ分解酵素により分解して、ＤＮＡとポリペプチドとを分離する方法などが挙げられる。
【００４４】
ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体からＤＮＡ又はポリペプチドを単離する場合、単離すべきＤＮＡ又はポリペプチドは、第１のプローブとの結合を解離されることなく単離されることが好ましく、より好ましくは、第１のプローブを介して担体と結合したまま単離される。例えば、該複合体からゲノムＤＮＡを単離する場合、該ゲノムＤＮＡは、好ましくは第１のプローブとの結合を維持したまま、より好ましくは該担体を含む画分から溶出されることなく、該複合体のポリペプチドから単離される。また例えば、該複合体からポリペプチドを単離する場合、該ポリペプチドは、好ましくは第１のプローブとの結合を維持したまま、より好ましくは該担体を含む画分から溶出されることなく、該複合体のゲノムＤＮＡから単離される。
【００４５】
（１−２．核酸の単離方法）
別の一態様において、本発明は、核酸の単離方法であって、
標的核酸にプローブを結合させること、及び
該プローブと結合した該標的核酸を回収すること、
を含む方法を提供する。
【００４６】
当該標的核酸の種類は、特に限定されず、任意の生物由来又は任意の種類の核酸であり得る。標的核酸の例としては、ゲノムＤＮＡ、非ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、リボザイム、ウイルスＲＮＡ、合成ＤＮＡ及びＲＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
標的核酸に結合させるプローブ（第１のプローブ）は、上記（１−１．）で例示した種類のプローブであって、該標的核酸の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするものであればよい。好ましくは、標的核酸に結合させる第１のプローブは、該標的核酸の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡである。該第１のプローブを標的核酸に結合させる方法、及び該第１のプローブと結合した標的核酸を回収する方法には、上記（１−１．）で例示した方法を用いることができる。好ましくは、該標的核酸は、該第１のプローブを介して担体に結合させることによって回収される。該第１のプローブと担体との結合のため、該第１のプローブは担体に親和性のある分子で修飾されていてもよく、また該担体は第１のプローブに親和性のある分子で修飾されていてもよい。あるいは、該第１のプローブ及び担体の両方が、互いに親和性のある分子で修飾されており、それらの分子の相互作用により、該第１のプローブと担体が結合されてもよい。
【００４８】
好ましい担体と第１のプローブとの組み合わせは、上記（１−１．）で例示したとおりである。好ましい実施形態において、該第１のプローブは担体に固定化されている。別の好ましい実施形態において、該第１のプローブはビオチン又はそのアナログで修飾されており、該担体は、表面にアビジン、ストレプトアビジン等が結合されたアビジン結合担体である。別の好ましい実施形態において、該第１のプローブは磁性体で修飾されており、該担体は磁性担体である。別の好ましい実施形態において、該第１のプローブはジゴキシゲニンで修飾されており、該担体は表面にジゴキシゲニン抗体が結合された担体である。別の好ましい実施形態において、該担体は磁性粒子であり、該担体と第１のプローブのそれぞれが、一方はビオチン又はそのアナログで、他方はアビジン又はストレプトアビジンで修飾されている。
【００４９】
回収した標的核酸は、該第１のプローブから解離させて単離してもよいが、第１のプローブとの結合を解離されることなく単離されることが好ましく、より好ましくは、第１のプローブを介して担体と結合したまま単離される。
【００５０】
（２．ゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチド、又は核酸の解析方法）
本発明のさらなる態様は、上述した手順で単離されたゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に含まれるゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチドの解析方法である。好ましくは、該解析方法においては、該ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体に含まれるゲノムＤＮＡ又はポリペプチドを、上述した本発明のゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体の単離方法で該複合体との結合に用いた第１のプローブ又は担体に結合させたまま解析する。解析の対象となり得るゲノムＤＮＡの例としては、遺伝子、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、テロメア、セントロメア、レトロウイルス由来配列、トランスポゾン、マイクロサテライトなどからなる群より選択される１種以上が挙げられる。解析の対象となり得るポリペプチドの例としては、ヒストン（修飾体を含む）、その他の核内クロマチン会合タンパク質（例えば、クロマチンリモデリング因子であるＳＷＩ／ＳＮＦ（switch/sucrose non-fermenting）ファミリータンパク質、ＩＳＷＩ（imitation switch）ファミリータンパク質、ＣＨＤ（chromatin helicase DNA binding protein ）ファミリータンパク質、ＩＮＯ８０（inositol 80 requiring ）ファミリータンパク質等；転写因子であるｃ−Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＦ−１、ステロイドホルモン受容体、ＧＡＴＡ因子、ＳＴＡＴ、ｐ５３等；メチル化ＤＮＡ結合タンパク質であるＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３等）などからなる群より選択される１種以上が挙げられる。
【００５１】
本発明のさらなる態様は、上述した手順で単離された核酸の解析方法である。好ましくは、該解析方法においては、該核酸を、上述した本発明の核酸の単離方法で該核酸との結合に用いた第１のプローブ又は担体に結合させたまま解析する。
【００５２】
ＤＮＡ、ポリペプチド及び核酸解析の手法としては、特に限定されず、公知のＤＮＡ、他の核酸又はポリペプチドの解析のための手法を、目的に応じて適宜使用すればよい。ＤＮＡの解析の例としては、塩基配列解析、マイクロアレイ解析、定量ＰＣＲ、半定量ＰＣＲ、バイサルファイトシークエンス解析、メチル化ＤＮＡ特異的定量ＰＣＲ、メチル化ＤＮＡ特異的半定量ＰＣＲ、非メチル化ＤＮＡ特異的定量ＰＣＲ、非メチル化ＤＮＡ特異的半定量ＰＣＲ、及びＣｏｍｂｉｎｅｄ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＯＢＲＡ）からなる群より選択される少なくとも１種による遺伝子解析（例えば、遺伝子同定、変異解析、多型解析、発現量解析、ＤＮＡメチル化解析など）が挙げられる。ＤＮＡ以外の他の核酸の解析の例としては、次世代シークエンサー解析、マイクロアレイ、逆転写産物を鋳型とした定量ＰＣＲもしくは半定量ＰＣＲによる発現量解析、及びノーザンブロットからなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。ポリペプチドの解析の例としては、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ：Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＥＬＩＡ：Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット、クロマトグラフィー、質量分析、クロマトグラフィー−質量分析からなる群より選択される少なくとも１種によるタンパク質の同定、定量などが挙げられる。好ましい実施形態において、本発明の解析方法においては、第１のプローブ又は担体に結合されたゲノムＤＮＡを解析対象として、定量ＰＣＲ、半定量ＰＣＲ、メチル化ＤＮＡ特異的定量ＰＣＲ、メチル化ＤＮＡ特異的半定量ＰＣＲ、非メチル化ＤＮＡ特異的定量ＰＣＲ、非メチル化ＤＮＡ特異的半定量ＰＣＲ、及びＣＯＢＲＡからなる群より選択される少なくとも１種による遺伝子解析が行われる。別の好ましい実施形態において、また本発明の解析方法においては、ポリペプチドを解析対象として、ＲＩＡ、ＦＩＡ、ＣＬＩＡ、ＣＥＬＩＡ、及びＥＩＡからなる群より選択される少なくとも１種が行われる。
【００５３】
本発明による上記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体由来ＤＮＡ及び／又はポリペプチドの解析方法、ならびに核酸の解析方法の応用例の１つは、エピジェネティクス解析である。エピジェネティックな遺伝子発現は、典型的には、ＤＮＡ又はクロマチン構造の化学修飾によって制御され得る。例えば、ＤＮＡのメチル化や、ＤＮＡと会合している又はＤＮＡに結合することのできるポリペプチドへの化学基の共有結合（例えば、ヒストンのメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化）は、エピジェネティックな遺伝子発現の活性化又は不活性化をもたらし得る。これらのエピジェネティック修飾は、細胞の発生分化における様々な時点で発生し、所定の遺伝子の不活性化もしくは活性化を生じさせ得る。エピジェネティック修飾の進行は、老化細胞、アポトーシス細胞又は異常細胞、特にがん細胞において多く見られる。エピジェネティック修飾が、がん、老化、肥満や糖尿病，脂質異常症等の生活習慣病、神経発達障害（例えばレット症候群）、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病）などの様々な疾病の発生因子であることが示唆されている。
【００５４】
一実施形態において、本発明によるエピジェネティクス解析では、クロマチンから単離したゲノムＤＮＡのメチル化を解析し得る。一実施形態において、本発明によるエピジェネティクス解析では、ヒストンの化学修飾（例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化）を解析し得る。
【００５５】
本発明によるエピジェネティクス解析は、上述したエピジェネティック修飾を発生因子とする疾病のリスク評価、発症診断、予後診断等を可能にする。代表的には、本発明によるエピジェネティクス解析は、がんのリスク評価、発症診断、又は予後診断に応用され得る。本発明によるがんの評価又は診断においては、例えば、ある種のがんの発症や進行に伴ってＤＮＡメチル化が亢進又は低下することが知られている遺伝子について、本発明の方法で該遺伝子のＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡについて公知の方法（例えば、バイサルファイト法）でメチル化解析を行う。解析の結果に基づいて、当該がんのリスク評価や診断を行う。あるいは、本発明によるエピジェネティクス解析は、特定の遺伝子やＤＮＡ領域のエピジェネティクス修飾と疾患との関連性を調べるためのツールとして有用である。
【００５６】
本発明による上記ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体由来ＤＮＡ及び／又はポリペプチドの解析方法、ならびに核酸の解析方法の他の応用例は、遺伝子解析である。遺伝子解析の一例は、疾患や体質に関連する遺伝子、遺伝子変異又は遺伝子多型（例えば、がん遺伝子）の保有者であるか否かの判定である。別の例は、培養細胞や培養組織の品質評価のための遺伝子検査であって、遺伝子変異の有無、分化状態の確認、菌やウイルス感染の有無などが調べられる。
【００５７】
（３．ゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチドの解析用キット）
本発明はまた、上述した本発明によるゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体、又はそれに含まれるゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチドの単離方法、核酸の解析方法、あるいは該単離したゲノムＤＮＡ及び／又はポリペプチドの解析方法を行うためのキットを提供する。当該キットは、標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体、又は標的核酸に結合する上述した第１のプローブを含み、該標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体、又は標的核酸の単離を可能にする。好ましくは、当該キットは、該第１のプローブに結合した標的ゲノムＤＮＡ−ポリペプチド複合体又は標的核酸を固定化するための担体をさらに含み、また必要に応じて、上記第２のプローブ、その標識、該複合体の断片化処理用の酵素、プローブと複合体又は担体との結合反応のための各種試薬などを含んでいてもよい。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。また、以下の記載は本発明の態様を概括的に示すものであり、特に理由なく、かかる記載により本発明は限定されるものではない。
【００５９】
（１）細胞
細胞は、ヒト結腸癌由来ＨＴ２９細胞を使用した。細胞の培養には、１０％ウシ胎児血清（ＧＥヘルスケア社）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、）、１００Ｕ/ｍＬペニシリン、及び１００μｇ/ｍＬストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を含有するマッコイ５Ａ改変培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用した。細胞は３７℃、５％ＣＯ2の環境下で、細胞培養用フラスコ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、製品番号：１５６３６７）を用いた接着培養を行うことで維持した。細胞を実験に使用する際には、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）によって対数増殖期の細胞を剥離した後、細胞をマッコイ５Ａ改変培地にて懸濁することで単細胞懸濁液を調製した。
【００６０】
（２）架橋処理
（１）で調製した細胞懸濁液５．３６ｍＬ（５．６×１０6Ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を、５０ｍＬチューブに添加し、室温、８００×ｇの条件下で４分間遠心分離した。上清を廃棄した後、４２ｍＬのＢｕｐＨ改変ダルベッコＰＢＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）（以下、ＰＢＳ）で一回洗浄し、１％グルタルアルデヒド（和光純薬工業製）を含有するＰＢＳを３２ｍＬ添加して、室温で１０分間静置した。静置後、グルタルアルデヒドによる架橋反応を停止させるために、１．２５Ｍのグリシン（和光純薬工業製）を含有するＰＢＳを加え、５分間室温で静置した。４℃、２０００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を廃棄し、４℃に冷却したＰＢＳを２０ｍＬ加えて沈降物を懸濁した。懸濁液を４℃、２０００×ｇで５分間遠心分離後、上清を廃棄し、１．６ｍＬの４℃に冷却したＰＢＳを加えた。懸濁液を２ｍＬチューブに移し、さらに、４℃、２０００×ｇで３分間遠心分離した後、上清を廃棄し、ペレットを得た。細胞ペレットは使用まで−８０℃で保存した。
【００６１】
（３）断片化
細胞溶解用の細胞溶解バッファとして、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（シグマアルドリッチ社製）ｐＨ８．０、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（和光純薬工業製）、１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（和光純薬工業製）を含有する水溶液を調製した。細胞溶解バッファに、最終濃度１ｍＭになるように１００ｍＭフッ化フェニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）（和光純薬工業製）イソプロパノール（株式会社トクヤマ製）溶液を添加するとともに、プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ製）を１倍になるように添加した。続いて、この細胞溶解バッファを、上記（２）で得た架橋処理済みの細胞ペレットと混合し、ペレットを懸濁した。この細胞溶解バッファの添加量は、ペレット重量の３０倍とした。ペレット懸濁液をソニファイアー（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）（登録商標）ＳＦＸ２５０（２０ｋＨｚ）（日本エマソン社製）にて、振幅：１５％、ＯＮ：３０秒、ＯＦＦ：４０秒のサイクルでトータル３時間超音波処理してＤＮＡを断片化した。その後、４℃、１６０００ｇの条件で遠心分離し、上清を全量回収した。得られた上清溶液中のＤＮＡの平均鎖長は、およそ４００〜５００ｂｐ程であった。ＤＮＡの鎖長は、アガロースゲル電気泳動によって確認した。得られた溶液を、使用まで−８０℃で保存した。
【００６２】
（４）クロマチンの回収
標的核酸配列として、セントロメア領域に存在するα−サテライト配列の一部を選択した。なお、α−サテライト配列が存在するセントロメアのクロマチンには、ヒストンＨ３バリアントであるＣＥＮＰ−Ａが存在していることが知られている（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９８７，１０４（４）：８０５−１５）。
【００６３】
プローブとして、上記α−サテライト配列の一部と相補的な配列を有し、かつ５’末端がＢｉｏｔｉｎ−Ｔｅｇ修飾されたプローブＡ（配列番号１；TCTCAGAAACTTCTTTGTGATGTGTGC、5'-Biotin-Teg修飾）を設計した。−８０℃で保存していた（３）のクロマチン溶液を氷上で融解し、１０μＬの２０ｍｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ（シグマアルドリッチ社製）を添加後、３７℃で３０分間インキュベーションした。続いて、このインキュベーション後の溶液と等量のホルムアミド（シグマアルドリッチ社製）を混合した。この混合液を６０μＬずつ、２本のチューブに分注し、各チューブに１００μＭプローブＡ水溶液を２．５μＬ添加した。ネガティブコントロールとして、プローブを添加しない混合液を調製した。これを３７℃で１時間インキュベーションすることで、プローブとクロマチンに含まれるＤＮＡとのアニーリングを促した。
【００６４】
得られた反応液に、担体としてＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標）ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＪＳＲライフサイエンス社製）のＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）懸濁液を１．５ｍｇ（粒子重量）添加し、３７℃で２０分間インキュベーションした。Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標）ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎは、表面にストレプトアビジンが固定化された磁性粒子であり、第１のプローブのビオチンとの相互作用を介して、クロマチンと結合することができる。反応液をＢｕｐＨトリス緩衝生理食塩水（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）（Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０３％（東京化成工業製）含有、以下、ＴＢＳＴという）１ｍＬで３回洗浄して、クロマチン結合磁性粒子を得た。
【００６５】
磁石が配設されているケース状の磁性デバイス（ＭＰＣ−Ｓ、Ｄｙｎａｌ社製）を用いて磁性粒子を集めて溶液と分離させ、上清を除去することでクロマチン結合粒子を回収した。
【００６６】
（５）標的クロマチン量の測定
上記（４）で回収したクロマチン中に標的とするα−サテライト配列を含むクロマチンが濃縮されているかどうかを、抗ＣＥＮＰ−ＡマウスＩｇＧ（株式会社医学生物学研究所製）による化学発光酵素免疫測定（ＣＬＥＩＡ）によって検出した。
具体的には、０．２５ｍｇの粒子を含む（４）で得られた生成物に、抗ＣＥＮＰ−ＡマウスＩｇＧをＴＢＳＴで２００倍希釈した混合液を９０μＬ添加し、３７℃で３０分間静置した。５００μＬのＴＢＳＴで４回洗浄した後、上清を除き、抗マウスＩｇＧ−アルカリフォスファターゼ標識抗体（プロメガ社製）をＴＢＳＴで５０００倍に希釈した混合液を９０μＬ添加し、３７℃で３０分間静置した。静置した液を５００μＬのＴＢＳＴで３回洗浄した後、２００μＬのＴＢＳＴで懸濁した。懸濁液から５０μＬとり、９６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に分注した。ＡＭＰＰＤ（アダマンチルメトキシフェニルホスホリルジオキシセタン）（富士レビオ社製）５０μＬと混和後、５分間静置し、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｎａｖｉｇａｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）により発光強度を測定した。
【００６７】
得られた結果を図１に示す。クロマチン結合粒子におけるＣＬＥＩＡの結果、α−サテライト配列認識プローブであるプローブＡを使用して回収したクロマチン中からは、プローブＡを加えなかったネガティブコントロールと比べて、強いＣＥＮＰ−Ａのシグナルが得られた。ＣＥＮＰ−Ａはセントロメア特異的なヒストンバリアントであることから、この結果は、セントロメア領域に存在する核酸に特異的なプローブにより、セントロメアのクロマチンを濃縮し、単離できたことを表す。
【図１】
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【配列表】
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