(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質を検出および定量するためにＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを使用する方法を提供する。【解決手段】ホルマリン固定腫瘍組織の生体試料から調製したタンパク質消化物において、細胞分裂、細胞分化、細胞成長阻害、細胞代謝、細胞シグナル伝達、および腫瘍免疫応答／調節を含むあらゆる細胞プロセスに関与するタンパク質を検出および定量するためにＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを使用する方法が提供される。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、発現の細胞起源に関わらず、全組織微小環境の腫瘍組織プロファイルを提供することができ、これにより最適な癌治療を提供することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者から得られるホルマリン固定腫瘍組織の生体試料中のタンパク質発現プロファイルを作成する方法であって、
質量分析を用い、前記ホルマリン固定腫瘍組織の生体試料から調製したタンパク質消化物中の１以上の断片ペプチドのレベルを検出および定量化すること、ならびに
前記ホルマリン固定腫瘍組織の生体試料中の、対応する１または複数のタンパク質のレベルを計算すること
を含んでなり、前記１以上の対応するタンパク質が、 
ＡＢＣＧ２、ＡＩＭＰ３、ＡＬＤＨ１Ｂ１、α−カテニン、ＡＲＧ２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、Ｂａｘ、ＢＣＬ２、ブラキウリ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＥ、ＣＡＤ、Ｃａｖ−１、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ９９、ＣＤ２２６、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫ１０、ＣＤＸ２、ＣＨＦＲ、ＣＨＫ１、ｃ−ＪＵＮ、ＣＬＫ４、ＣＯＸ４１、ＣＯＸ５Ｂ、ＣＯＸ６Ｃ、ＤＣＴＤ、ＤＤＲ１、ＤＧＫＡ、ディアブロ、ＤＩＣＥＲ１、ＤＵＳＰ１、ＥＩＦ３Ａ、ＥＭＳＹ、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＣＣ２、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＣ２、ＦＯＸＦ２、γ−カテニン、ＧＤＡ、ＧＪＡ１、ＧＬＳ、ＧＬＵＴ１、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＭ３、ＧＳＴＰ１、ＧＳＴＴ１、ＨＡＩ２、ｈＣＮＴ３、ＨＤＡＣ６、ＨＫ２、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＲ２３Ｂ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ−１５、ＩＬ−８、ＩＲＳ２、ＬＡＧ３、ＬＧＲ５、ＬＩＧ４、ＭＣＴ１、ＭＥＮＡ、ＭＥＮＡＩＮＶ、ＭＦＦ、ＭＩＧ６、ＭＬＨ１、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＲＥ１１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＣ４、ＮＤ１、ＮＥＤＤ８、ニブリン、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ８０、ＮＮＭＴ、ＮＴ５Ｃ、ＮＴ５Ｃ２、ＮＴ５Ｃ３Ａ、Ｐ２１、Ｐ２７、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ１６、ＰＡＲＰ４、パキシリン、ＰＤＫ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＦＫＦＢ３、ＰＩ３ＫＣＡ、ＰＩＭ１、ＰＩＭ２、ＰＫＭ、ＰＭＳ２、ＰＳＭＡ、ＰＲＫＤＣ、ＱＰＲＴ、ＲＡＤ５０、ＳＡＭＨＤ１、ＳＩＡＨ２、ＳＩＲＴ１、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＣ３４Ａ２、ＳＬＣ４６Ａ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＯ、ＳＯＤ１、ＳＯＤ２、ＳＯＸ９、ＳＰＲＹ２、ＴＢＸ２１、ＴＪＰ１、ＴＭＳＢ１５Ａ、ＴＰＸ２、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＫＡ、ＷＴ−１、ＸＰＯ１、ＸＲＣＣ４、ＸＲＣＣ５、ＸＲＣＣ６、ＡＭＤ１、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＰＭＬ、ＩＬ１２ＲＢ２、ＳＰＡＧ５、ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＭＬＨ３、ＣＥＡＣＡＭ６、ＬＧＡＬＳ９、ＲＰＡ２、ＲＰＡ１、ＦＥＮ１、ＬＩＧ３、ＢＬＭ、Ｂ２Ｍ、ＲＮＰＥＰ、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＹＥＳ１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、およびＲＢ１
からなる群から選択される、方法。
【請求項２】
１以上の断片ペプチドの量の検出および定量化の前に前記タンパク質消化物を分画する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分画工程が液体クロマトグラフィー、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーまたは逆相高速液体クロマトグラフィーを含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記質量分析がタンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、ハイブリッドイオントラップ／四重極質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、および／または飛行時間型質量分析を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
使用する質量分析のモードが選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、インテリジェント選択反応モニタリング（ｉＳＲＭ）、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）、および／または多重選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１以上の断片ペプチドが配列番号１〜２９１に対応するペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ホルマリン固定腫瘍組織がパラフィン包埋組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組織が腫瘍から得られる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍が原発腫瘍である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍が二次腫瘍である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記１以上の断片ペプチドの定量化が、生体試料中の１以上の断片ペプチドの量を異なる別の生体試料中の同一の１以上の断片ペプチドの量と比較することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記１以上の断片ペプチドの定量化が、生体試料中の１以上の断片ペプチドの量を、前記１以上の断片ペプチドと同一のアミノ酸配列を有する、添加した既知量の内部標準ペプチドと比較することによって決定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記内部標準ペプチドが同位体標識プチドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記同位体標識内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈおよびそれらの組合せからなる群から選択される１以上の重安定同位体を含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質消化物中の１以上の断片ペプチドの量の検出および定量化が、対応するタンパク質の存在および被験体における癌との関連を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記１以上の断片ペプチドの量、または対応するタンパク質のレベルの検出および定量化の結果を、癌患者の免疫系の活性化状態と相関させることをさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記１以上の断片ペプチドの量または対応するタンパク質のレベルの検出および定量化の結果を癌患者の免疫系の活性化状態と相関させることが、他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドの発現の量の検出および定量化と組み合わされて、癌患者の腫瘍細胞の分子状態についてさらなる情報を提供する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体試料が得られた患者または被験体に治療上有効な量の癌治療薬を投与することをさらに含んでなり、
前記癌治療薬および／または癌治療薬の投与量は、配列番号１〜２９１から選択される１以上の断片ペプチドの検出および／または量に基づき、
前記癌治療薬は、配列番号１〜２９１から選択される１以上の断片ペプチドに対応する１以上のタンパク質と相互作用する標的薬剤である、
請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌治療薬および／または癌治療薬の投与量が配列番号１〜２９１から選択される２以上の断片ペプチドの多重検出および／または量に基づく、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体試料が得られた患者または被験体に治療上有効な量の癌治療薬を投与することをさらに含んでなり、
前記癌治療薬および／または癌治療薬の投与量は、配列番号１〜２９１から選択される１以上の断片ペプチドの検出および／または量に基づき、
前記癌治療薬は免疫調節癌治療薬であり、その機能は癌患者の免疫応答を惹起、増強、操作、および／またはそうでなければ調節し、前記患者の腫瘍細胞を攻撃し死滅させることである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌治療薬および／または癌治療薬の投与量が、配列番号１〜２９１から選択される２以上の断片ペプチドの多重検出および／または量に基づく、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
配列番号１〜２９１に対応する２以上の断片ペプチドを多重検出および定量することを、患者の腫瘍細胞の成長を促す他の癌タンパク質の分析と組み合わせることをさらに含んでなり、癌タンパク質の機能を阻害または調節し患者の腫瘍細胞の成長を阻害する標的癌治療薬が、癌患者の免疫応答を惹起、増強、操作、および／またはそうでなければ調節するように１以上のタンパク質と相互作用し患者の腫瘍細胞を攻撃し死滅させる免疫調節癌治療薬と組み合わせて患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照出願
本願は、２０１８年３月９日に出願された米国仮出願第６２／６４０，６３２号の利益を主張するものであり、その全内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００２】
分野
個別化患者腫瘍プロファイルのための、癌患者から得られる腫瘍組織の質量分析に基づく定量的プロテオーム解析の方法が提供される。患者の腫瘍組織に対して実施されたこれらのタンパク質アッセイは、１）免疫に基づく癌治療に対する陽性または陰性応答に関連するタンパク質、この場合、これらのアッセイは免疫に基づく癌治療に対する陽性または陰性応答を効果的に予測することができる、２）分子標的癌治療に対する陽性または陰性応答に関連するタンパク質、この場合、これらのアッセイは分子標的癌治療に対する陽性または陰性応答を予測することができる、３）患者自身の腫瘍細胞を攻撃するように患者自身の免疫系を惹起、阻害、維持、促進、および／またはそうでなければ調節(modulate)する、タンパク質のレベルを検出および定量することができる。これらの方法により提供される癌患者の腫瘍組織プロテオームプロファイルは、腫瘍細胞を特異的に攻撃し死滅させるため、または腫瘍細胞を死滅させるように患者の腫瘍免疫応答を操作するために設計された癌治療薬を使用する改良された癌治療法の一部として使用される。
【背景技術】
【０００３】
背景
腫瘍細胞において異常に発現する、また、腫瘍細胞の成長および生存を促すタンパク質（癌バイオマーカー）の小分子の生物学的阻害剤は、様々な癌に対する治療薬として使用される。異常に発現される、また、腫瘍細胞の成長および生存を促す癌バイオマーカータンパク質の例としては、Ｍｅｔ、ＩＧＦ−１Ｒ、およびＨｅｒ２が挙げられる。癌治療薬はこれらのタンパク質と直接的に相互作用させるために開発され、従って、患者の腫瘍組織における直接的なこれらのタンパク質の発現の検出および定量化は、これらのタンパク質の機能を阻害する、腫瘍細胞の成長を妨げる、および患者の全生存期間を延長する治療薬、または薬剤の組合せを選択および投与するための治療計画の一部として使用することができる。腫瘍組織、特に、そのような組織に存在する腫瘍細胞におけるタンパク質の正確な検出および定量は、組織の顕微解剖により患者の腫瘍組織から抽出された腫瘍細胞で発現されたタンパク質に由来する特定のプロテアーゼ消化ペプチドの質量分析−ＳＲＭ／ＭＲＭ分析によって効果的に実施することができる。単一のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイで一度にこのようなタンパク質群を定量化することは、腫瘍細胞を標的とする癌治療薬を特徴付けるためのタンパク質発現ランドスケープ(landscape)の「プロファイル(profile)」または「シグネチャー(signature)」を提供する。標的治療薬とともに治療計画の一部として使用可能な定量的アッセイの例としては、ＩＧＦ−１Ｒタンパク質（米国特許第８，７２８，７５３号参照）およびｃＭｅｔタンパク質（米国特許第９，３７２，１９５号参照）が挙げられる。
【０００４】
癌のプロセスを促すタンパク質の機能を特異的に阻害する、従って、腫瘍細胞の成長を妨げるように設計された癌治療薬のさらなる例は、トラスツズマブである。とりわけ、商品名ハーセプチン（商標）として販売されているトラスツズマブは、腫瘍組織内の腫瘍細胞においてＨｅｒ２受容体タンパク質を発現する、主として乳癌であるが他の癌の治療にも使用されるモノクローナル抗体である。トラスツズマブは、Ｈｅｒ２受容体タンパク質の細胞外セグメントのドメインＩＶに結合する。トラスツズマブで処置された腫瘍細胞は細胞周期のＧ１期で休止を受け、従って、増殖の低下が見られる。トラスツズマブはＨｅｒ−２の遺伝子発現は変化させないが、ＡＫＴの活性化を下方調節することが示唆されている。加えて、トラスツズマブは、抗血管新生因子の誘導と血管新生促進因子の抑制の両方によって血管新生を抑制する。癌に見られる制御を欠いた成長への寄与は、細胞外ドメインの放出をもたらすＨｅｒ２タンパク質のタンパク質分解性の切断のためであり得ると思われる。トラスツズマブはまた、乳癌細胞においてＨｅｒ２エクトドメインの切断を阻害することも知られており、それもまた腫瘍細胞の成長の阻害を助ける。
【０００５】
癌患者の腫瘍免疫応答を特徴付けるタンパク質が製薬業界によって研究されている。これらのタンパク質は、腫瘍細胞、固形組織の良性細胞、および様々な系譜の血液由来リンパ球を含む多くの異なる細胞種で通常に、また、異常に発現される。これらのタンパク質は、患者自身の腫瘍細胞に対する患者自身の免疫応答を惹起、増強、調節、または阻害する働きをする。これらのタンパク質のそれぞれは異なる機能を有するが、免疫系へのそれらの影響はどの細胞がそのタンパク質を発現しているかに依存し得る。正常な状況では、免疫系は、リンパ球依存性の腫瘍細胞死滅によって媒介される自己と非自己の認識の複雑な分子シグナル伝達プロセスを介して腫瘍細胞を根絶する働きをする。しかしながら、この複雑なプロセスは、免疫監視を逃れようとする腫瘍細胞によって乱されることがある。腫瘍細胞を攻撃し死滅させるように免疫系を操作するために、これらのタンパク質と相互作用する小分子の生物学的治療薬が開発されている。標的免疫調節治療薬の投与が成功すれば、その組織内でどの標的タンパク質が発現されるかを決定するために、患者の免疫系ランドスケープのタンパク質発現「プロファイル」または「シグネチャー」から大きな利益が得られるであろう。次に、この免疫プロファイルは、どの治療薬、または薬剤の組合せが、最適な患者の転帰のために腫瘍細胞に対して患者免疫系を武装させる、調節する、操作する、および／または補助する最大の機会を提供する可能性が最も高いのかという情報をもたらし得る。
【０００６】
患者の免疫系を操作するように設計された癌治療薬のタイプの例は、免疫チェックポイントタンパク質として知られるタンパク質の集合体と相互作用する免疫チェックポイント阻害剤として知られる化合物の集合体である。ＰＤ−１タンパク質は、Ｔ細胞と呼ばれるリンパ球上に通常存在し、Ｔ細胞が体内の他の細胞を攻撃しないように保つ助けをする「スイッチオフ」のタイプとして機能する免疫チェックポイントタンパク質である。免疫チェックポイントタンパク質は、一部の正常（および癌）細胞の表面に存在するタンパク質であるＰＤ−Ｌ１にそれが結合した場合にこれを行う。ＰＤ−１がＰＤ−Ｌ１に結合すると、ＰＤ−１は、Ｔ細胞にＰＤ−Ｌ１を発現する細胞を攻撃しないようにシグナルを送る。癌細胞には多量のＰＤ−Ｌ１を持つものがあり、このＰＤ−Ｌ１は免疫系に対して癌細胞をマスクし、癌細胞を免疫監視から逃れさせ、Ｔ細胞からの攻撃を避けることを可能とする。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかを標的とするモノクローナル抗体は、癌細胞のマスクを外し、癌細胞に対する免疫応答を増強することができる。この癌治療戦略はある種の癌の治療に多大な見込みを示し、ＰＤ−１阻害剤の例としては、ペンブロリズマブ（キートルーダ(Keytruda)（商標））およびニボルマブ（オプジーボ(Opdivo)（商標））が挙げられる。これらの薬物は、黒色腫、非小細胞肺癌、腎臓癌、頭頸部癌、およびホジキンリンパ腫を含む数種の癌の治療に有用であることが示された。これらの薬物はまた、多くの他のタイプの癌に対する使用についても研究されている。ＰＤ−Ｌ１阻害剤の例は、膀胱癌の治療に現在使用されており、他のタイプの癌に対する使用についても研究されているアテゾリズマブ（テセントリク(Tecentriq) （商標））である。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかを標的とする他の多くの薬物もまた、現在、臨床試験において、単剤および他の薬物との併用の両方で試験されている。これらの例は、腫瘍細胞および免疫系細胞の両方の分子状態のどのような知識が有効な標的免疫癌治療戦略の一部として使用できるのかを示す。
【０００７】
組織学的に特定された細胞集団の分子プロファイリングのために、患者の腫瘍組織切片に直接由来する細胞の均質な集団を獲得できることは極めて有利であり、それにより、例えば、正常な上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および免疫細胞を含む他のタイプの細胞内に存在し得る腫瘍細胞が研究できる。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(Laser Capture Microdissection)（ＬＣＭ）技術（米国特許第６，８６７，０３８号参照）は、正確に定義された細胞集団に腫瘍組織の分子分析を区画化するために使用することができる。ＬＣＭ、ならびにＤＩＲＥＣＴＯＲ（商標）技術（米国特許第７，３８１，４４０号参照）を含む他の市販の組織顕微解剖技術は、組織サンプルに由来する細胞の分子プロファイリングを病理学的に関連のある文脈の中でとらえることを可能とすることによって、組織サンプルの分析を改善した。
【発明の概要】
【０００８】
概要
よって、本明細書では、患者の免疫系ランドスケープのタンパク質発現「プロファイル」または「シグネチャー」を作出するために使用可能な新規なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイが提供される。具体的には、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、癌患者の腫瘍組織から直接調製したプロテオーム溶解液中の特定のタンパク質のレベルを検出および定量するために使用することができる。これらのタンパク質は、癌治療薬の選択に関する情報を提供するために、治療計画の一部として使用することができる。分析されるタンパク質は、腫瘍細胞の誘導および成長を提供し、これらのタンパク質は細胞内で局在し、限定されるものではないが、増殖因子、増殖因子受容体、細胞シグナル受容体、細胞間コミュニケーションタンパク質、細胞構造タンパク質、転写因子、核酸プロセシングタンパク質、ＤＮＡ合成タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、細胞分裂タンパク質、シグナル経路タンパク質、代謝経路タンパク質、分泌タンパク質、細胞膜タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質、膜結合タンパク質、およびタンパク質翻訳タンパク質が含まれる。これらのタンパク質は、治療薬の標的、特定の治療薬に対する患者転帰の予測因子、および／または癌患者の免疫系のモジュレーター(modulator)であり得る。
【０００９】
今回記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、患者の腫瘍組織において直接、腫瘍細胞の個別化分子プロファイルを作成する(developing)ために有用である。これらのタンパク質の発現状態が決定されれば、特定の治療薬を患者に投与することができ、それにより、このような薬剤は今回記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによって検出および測定されるタンパク質と相互作用し、それらのタンパク質の機能を阻害または増強して腫瘍細胞を死滅させることができる。加えて、この治療計画の一部として癌患者自身の免疫系を誘導して患者自身の腫瘍細胞を死滅させる治療薬を、癌患者に投与することができる。腫瘍関連タンパク質を特異的に標的とする治療薬および免疫系指向治療薬(immune system-directed therapeutic agents)は両方とも、今回記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによって決定した場合に癌患者分子プロファイルに直接的に適合し、標的化および免疫の両方に基づく癌治療の個別化戦略を提供する可能性がある。
【００１０】
詳細な説明
患者の腫瘍組織から直接調製されたプロテオーム溶解液において、多様な機能および細胞内局在を有するタンパク質の集合体に由来する特定のプロテアーゼ消化ペプチドを正確に定量することによって癌患者の分子プロファイルを作成するために有用な特異的質量分析−ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うための方法が提供される。これらの方法およびアッセイは、患者の腫瘍の分子ランドスケープを理解するため、ならびに腫瘍細胞を直接死滅させるか、または患者自身の腫瘍細胞に対する活発かつ良好な免疫応答を誘導、惹起、支持、および／もしくはそうでなければ操作する最適な癌治療薬の選択に指針を与えて患者の生存の改善をもたらすために使用することができる。例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織などの癌患者の生体試料(biological sample)由来の細胞は、例えば、組織顕微解剖法を用いて回収することができる。質量分析用の溶解液は、回収細胞から、例えば、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）試薬およびプロトコール（米国特許第７，４７３，５３２号参照）を用いて調製することができる。溶解液は、以下により詳細に記載されるように、特定のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを用いて分析することができ、ここで、これらのアッセイは、患者／被験体の分子プロファイルを作成するために、これらのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイからのタンパク質検出／定量データを用いて、個々にまたは多重化して行われる。これらの方法および結果として得られるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイデータは、タンパク質機能を直接阻害する働きをし、腫瘍細胞を死滅させそれらの成長を阻害する治療薬を用いて患者にとって改善されたまたは最適な治療計画を決定するために使用することができる。加えて、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイデータは、今回記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによって検出および／または定量されるタンパク質のうち１以上と直接相互作用することによって腫瘍細胞を死滅させるように癌患者の免疫系を惹起する、調節する、影響を及ぼす、増強する、および／またはそうでなければ操作する働きをする治療薬を用いて患者にとって改善されたまたは最適な治療計画を決定するために使用することができる。
【００１１】
記載のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによる患者の分子プロファイルの決定は、限定されるものではないが、血液、尿、痰、胸水、腫瘍、正常組織、および／または腫瘍組織を取り巻く炎症液を含む様々な患者由来サンプルで行うことができる。特定の実施態様では、このサンプルは、ＦＦＰＥ組織、例えば、ＦＦＰＥ腫瘍組織である。
【００１２】
ＦＦＰＥ組織は、最も広くは、有利には、癌患者由来の、腫瘍組織を含む組織から得ることができる。外科的に摘出された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、世界的に癌組織サンプルを保存する極めて一般的な方法であり、標準的な病理学の実践において受け入れられた慣例である。ホルムアルデヒドの水溶液は、ホルマリンと呼ばれる。「１００％」ホルマリンは、水中のホルムアルデヒドの（飽和溶液約４０容量％または３７質量％）と酸化および重合度を制限するために少量の安定剤、通常はメタノールからなる。組織が保存される最も一般的な方法は、長時間（８時間〜４８時間）組織全体を、一般に１０％中性緩衝ホルマリンと呼ばれるホルムアルデヒド水溶液に浸漬した後、固定された組織全体を室温での長期保存のためにパラフィンワックスに包理することである。ホルマリン固定癌組織を分析することができる分子分析方法は、癌患者の組織の分析のための最も受け入れられ、頻用されている方法である。
【００１３】
癌患者の組織、特に、ＦＦＰＥ組織でタンパク質発現を分析するために現在適用される、最も広く使用されている方法論は、免疫組織化学（ＩＨＣ）である。ＩＨＣ法では、対象タンパク質を検出するために抗体を使用する。ＩＨＣ試験の結果は、ほとんどの場合、病理学者または組織検査技師によって解釈される。この解釈は主観的であり、特定のタンパク質を標的とする治療薬に対する感受性を予測し得る定量的データを提供しない。加えて、Ｈｅｒ２  ＩＨＣ試験などのＩＨＣアッセイを含む研究は、このような試験から得られた結果が不良であるかまたは紛らわしい場合がある。これはおそらく、研究室(laboratories)が異なれば陽性および陰性ＩＨＣ状態を分類するために使用する規則も異なるためである。検査を行う各病理学者もまた、結果が陽性であるかまたは陰性であるかを決定するために異なる判定基準を用いることがある。ほとんどの場合、これは検査結果がボーダーラインである場合、すなわち、結果が強い陽性でも強い陰性でもない場合に起こる。他の場合で、癌組織切片の一領域に存在する細胞は陽性と判定することができるが、癌組織切片の異なる領域の細胞は陰性と判定することができる。不正確なＩＨＣ検査結果は、癌を有すると診断された患者が最善の治療を受けないことを意味し得る。腫瘍組織の総てのまたは特定の領域／細胞が特定のタンパク質に関して真に陽性であるが、検査結果がそれを陰性と分類すれば、医師はその患者に適切な治療薬を投与する見込みがない。腫瘍組織は特定されたタンパク質の発現に関して真に陰性であるが、検査結果がそれを陽性と分類すれば、医師は、患者が利益を受ける見込みがないだけでなく、薬剤の二次的リスクに曝露されることになるにもかかわらず、特定の治療薬を使用する可能性がある。よって、不要な毒性および他の副作用を軽減しつつ、患者が良好な免疫調節治療計画を受ける最大の機会を得られるように、腫瘍組織において特定の免疫に基づくタンパク質を正確に検出し、その定量的レベルを適切に評価できることに大きな臨床価値がある。
【００１４】
腫瘍組織における特定のタンパク質の定量的レベルの正確な検出および適切な評価は、ＳＲＭ／ＭＲＭ法によって質量分析計で効果的に決定することができる。この方法は、癌バイオマーカーおよび免疫に基づくタンパク質を含む特定のタンパク質に由来するユニークな断片ペプチドを検出および定量するものであり、この場合、各ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積は、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解液中に存在する複雑なペプチド混合物内で決定される（米国特許第７，４７３，５３２号参照）。ホルマリン固定組織から直接、複雑な生体分子サンプルを調製する一つの方法は、米国特許第７，４７３，５３２号に記載されており、その内容は全体が引用することにより本明細書の一部とされる。米国特許第７，４７３，５３２号に記載の方法は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（ロックヴィル，Ｍｄ．）から入手可能なＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）試薬およびプロトコールを用いて好都合に行うことができる。例えば、ホルマリン固定腫瘍サンプルおよび反応バッファーを含んでなる組成物を８０℃〜１００℃の温度で１０分〜４時間の期間、加熱することができる。加えて、得られた組成物は、トリプシン、キモトリプシン、およびエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃからなる群から選択される有効量のタンパク質分解酵素を用いて３７℃〜６５℃の温度で３０分〜２４時間の期間、処理することができる。特定の実施態様では、タンパク質分解酵素はトリプシンである。次に、タンパク質の定量的レベルは、それにより生体試料中の各タンパク質に由来する個々の特定されたペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積が、個々の断片ペプチドのそれぞれに関する既知量の「スパイクの(spiked)」内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積と比較されるＳＲＭ／ＭＲＭ法によって決定することができる。
【００１５】
一つの実施態様では、「スパイクの」内部標準は、同じ正確なタンパク質由来断片ペプチドの合成型であり、ここで、この合成ペプチドは、２Ｈ、１８Ｏ、１７Ｏ、１５Ｎ、１３Ｃ、またはそれらの組合せなどの１以上の重い同位体で標識された１以上のアミノ酸残基を含有する。このような同位体標識内部標準は、質量分析が、天然の断片ペプチドクロマトグラフィーシグネチャーピークとは違った、独特で、比較ピークとして使用可能な予測可能で一貫したＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピークを生成するように合成される。よって、内部標準は、生体試料由来のタンパク質またはペプチド調製物に既知量で「スパイクされ」、質量分析によって分析される場合に、天然ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積が内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積と比較され、この数値の比較が、生体試料由来の元のプロテオーム調製物中に存在する天然ペプチドの絶対モル濃度および／または絶対重量を示す。断片ペプチドの定量的データは、サンプルごとに分析されるプロテオーム溶解液の量に従って示される。
【００１６】
所与のタンパク質に関して断片ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発(develop)および実施するために、単なるペプチド配列を超えるさらなる情報が質量分析計によって使用できる。このさらなる情報は、特定の断片ペプチドの適切かつ集中的分析を行うために質量分析計（例えば、三連四重極質量分析計）を指示および教示するために使用することができる。標的ペプチドに関するさらなる情報は一般に、ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆体の荷電状態、前駆体ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、および各遷移イオンのイオンタイプのうち１以上を含み得る。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、三連四重極質量分析計またはイオントラップ／四重極ハイブリッド装置で効果的に実施可能である。これらのタイプの質量分析計は、細胞内に含まれる全タンパク質に由来する何十万から何百万という個々のペプチドを含有する極めて複雑なタンパク質溶解液内で単一の単離された標的ペプチドを分析することができる。このさらなる情報は、極めて複雑なタンパク質溶解液内での単一の単離された標的ペプチドの分析を可能とする適切な指示(directives)を伴った質量分析計を提供する。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイはまた、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、イオントラップ／四重極ハイブリッド、または三連四重極装置を含む他のタイプの質量分析計で開発および実施することもできる。
【００１７】
生体試料において特定のタンパク質を検出および定量するための単一ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの基礎は、より長い全長型のタンパク質に由来する１以上の断片ペプチドの同定および分析である。これは、質量分析計が、単一の断片ペプチドなどの極めて小さな分子を分析する際に極めて有効で、熟達し、かつ、再現性のある装置ではあるものの、質量分析計は全長の完全なタンパク質を有効に、熟達度をもって、または再現性よく検出および定量することができないからである。
【００１８】
個々のタンパク質のための単一ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するための候補ペプチドは、理論上は、完全な全長タンパク質の完全なプロテアーゼ消化、例えば、トリプシンによる消化から得られるいずれの個々のペプチドであってもよい。しかしながら、驚くことに、多くのペプチドは所与のタンパク質の信頼性のある検出および定量に好適でなく、実際に、いくつかのタンパク質については、好適なペプチドがまだ発見されていない。よって、所与のタンパク質に関して、どれがＳＲＭ／ＭＲＭによるアッセイに最も有利なペプチドであるかを予測することは不可能であり、従って、各ペプチドに関して具体的に定義されるアッセイの特徴は、実験により発見および決定しなければならない。これは、ＦＦＰＥ組織由来のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解液などのタンパク質溶解液において、分析に最良のＳＲＭ／ＭＲＭペプチドを同定する場合に特にそうである。今回記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、各タンパク質に関して１以上のプロテアーゼ消化ペプチド（例えば、トリプシン消化ペプチド）を表し、それにより、各ペプチドが、ホルマリン固定患者組織から調製されたＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解液におけるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに有利なペプチドであることが見出された。
【００１９】
今回記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、患者の腫瘍組織微小環境の分子プロファイルを作成するために使用可能なタンパク質を検出および定量する。これらのタンパク質は多様な機能を提供し、細胞内の多様な場所に見られる。これらのタンパク質には、限定されるものではないが、増殖因子、増殖因子受容体、細胞外基質タンパク質、核転写因子、上皮細胞分化因子、細胞シグナル伝達タンパク質、免疫細胞分化因子、細胞／細胞認識因子、自己対腫瘍認識因子、免疫細胞活性化因子、免疫細胞阻害因子、および免疫チェックポイントタンパク質が含まれる。このタンパク質集合体内のこれら個々のタンパク質のそれぞれは、限定されるものではないが、上皮腫瘍細胞、正常上皮細胞、正常線維芽細胞、腫瘍関連線維芽細胞、正常内皮細胞、腫瘍関連内皮細胞、正常間葉細胞、および腫瘍関連間葉細胞などのあらゆる種類の固形組織細胞を含む、癌患者内の多様な細胞によって発現され得る、また発現される。これらのタンパク質のそれぞれは、限定されるものではないが、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状突起、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、好酸球、好中球、および好塩基球などのあらゆる種類のリンパ球を含む多様な血液由来の白血球によって発現され得る。多くの場合、これらの個々のタンパク質のそれぞれは固形組織細胞および血液由来組織細胞によって発現され得ることが周知されている。
【００２０】
これらのタンパク質のそれぞれの細胞発現パターンは、その個体の健康状態によって大きく異なり得る。正常および通常の健康状態では、これらのタンパク質は、細胞の健康および健康な免疫系を維持する。健康な免疫系の維持については、主として主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を介して自己の細胞認識が非自己の認識とバランスがとれている。ＭＨＣは、脊椎動物において外来分子を認識するために免疫系に不可欠な細胞表面タンパク質のセットであり、そしてこれが組織適合性を決定する。ＭＨＣ分子の主要な機能は、病原体に由来するペプチド断片に結合し、適当なＴ細胞による認識のためにそれらを細胞表面に提示することであり、従って、その病原体に対して免疫応答が惹起され得る。ＭＨＣ分子は、免疫細胞である白血球とそれ以外の白血球細胞または固形組織である体細胞との相互作用を媒介する。ＭＨＣは、臓器移植のドナーの適合性、ならびに交差反応免疫誘導を介して自己免疫疾患に対する個体の感受性を決定する。ヒトでは、ＭＨＣはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ともよばれる。細胞では、宿主自身の表現型の、または他の生物学的実体(biologic entites)のタンパク質分子が絶えず合成されては分解される。細胞表面上の各ＭＨＣ分子は、エピトープとよばれるタンパク質の分子画分を提示している。提示される抗原は自己または非自己のいずれかであり得る。抗原が自己として認識されれば、生物体の免疫系は、その自身の細胞を免疫系の死滅応答で標的化しないようにする。
【００２１】
ＭＨＣは、身体を病原体から保護するだけでなく、自然の癌細胞制御にも主要な役割を果たす。癌細胞は、免疫系に警報を発するためにＭＨＣ分子によって提示され得る、多くの突然変異タンパク質および異常な発現のタンパク質を含んでいる。腫瘍細胞はまた、正常タンパク質を、異常な場所で、異常な様式で、および／または異常な量で発現して、免疫応答を動員または阻害するようにシグナルを与えることがある。正常細胞は、正常な細胞タンパク質のターンオーバー(turnover)からそのクラスＩ  ＭＨＣ上にペプチドを提示し、免疫系細胞（白血球）は、白血球の表面に通常発現される特定のタンパク質によって媒介される中枢および末梢性免疫寛容機構のために、それらに応答して活性化されない。ウイルス感染後または癌細胞による異常なタンパク質発現の場合などに、細胞が外来タンパク質を発現する場合、クラスＩ  ＭＨＣの一部が細胞表面にこれらのペプチドを提示する。結果として、そのＭＨＣ：ペプチド複合体に特異的な白血球が、異常なペプチドを提示する癌細胞を含むそれらの細胞を認識して死滅させる。あるいは、クラスＩ  ＭＨＣそれ自体が、ウイルス感染細胞および癌細胞を死滅させるナチュラルキラー細胞（ＮＫ）とよばれる白血球の集団に対して阻害リガンドとして働くこともできる。表面クラスＩ  ＭＨＣの正常なレベルの低下（免疫回避中にまたはある種の腫瘍でいくつかのウイルスにより使用される機構）は、ＮＫにより媒介される細胞死滅を不活化することによって、腫瘍細胞が免疫介在性死滅を回避するよう助けることができる。
【００２２】
免疫監視を回避するためになお別の戦略を使用している癌細胞のさらなる例は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）チェックポイントタンパク質を異常発現する癌細胞の場合である。ＰＤ−Ｌ１は、妊娠、組織同種移植、自己免疫疾患、および他の病態、例えば癌などの特定の事象の際に免疫系の抑制に主要な役割を果たす膜貫通タンパク質である。通常、免疫系は、リンパ節または脾臓にいくらかの蓄積がある場合に、ＰＤ−１を発現する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘発する外来抗原と反応する。ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合は、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を低減し、それにより、癌細胞を無視するように免疫系にシグナル伝達を行う阻害シグナルを伝達する。
【００２３】
癌細胞により上方調節されたＰＤ−Ｌ１の異常な発現は、癌細胞が宿主免疫系を回避することを可能とする。腎細胞癌を有する患者からの１９６の腫瘍検体の分析によれば、ＰＤ−Ｌ１の高い腫瘍発現は腫瘍の悪性度および死亡リスクの４．５倍の上昇に関連付けられることが見出された。ＰＤ−Ｌ１発現がより高い卵巣癌患者は、発現がより低い患者よりも有意に不良な予後を示す。また、ＰＤ−Ｌ１発現は上皮内ＣＤ８＋Ｔリンパ球数と逆相関があることも知られ、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１が抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制し得ることが示唆される。ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、現在、慣例の癌治療で使用され、免疫に基づく癌治療薬として開発中である。これらの薬剤は、多くの患者で良好な奏効率(response rates)を示す。
【００２４】
免疫に基づく癌治療戦略は、患者自身の免疫系を患者自身の癌細胞と闘い、死滅させるように惹起、調節、強化または操作するように設計されている。多くの形態の免疫療法が癌の治療のために使用されている。本明細書に記載の方法は、腫瘍により活性化される免疫応答を惹起および／またはそのバランスを調節するために免疫に基づく癌治療薬を用いる、可能性のある治療戦略の一部として使用可能な、患者の腫瘍細胞中のＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１免疫チェックポイントタンパク質などのタンパク質に関する定量的タンパク質発現データを提供し、それが本明細書の焦点である。ＰＤ−Ｌ１タンパク質の免疫チェックポイントタンパク質に関する単一ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの例は、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１０３８６に記載されている。
【００２５】
今回記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、多くの異なる機能を示し、細胞内の多くの異なる場所に存在する多くの異なる細胞種によって発現されるユニークなタンパク質の発現を検出および定量する。これらのアッセイのそれぞれは、単一のタンパク質の信頼性および再現性のある検出および測定に有用であることが判明した少なくとも１つの最適ペプチドを記載し、ここで、各アッセイは個々に、または他のタンパク質に関する他のペプチドと多重で行うことができる。タンパク質およびペプチドの一覧を表１に示す。これらのアッセイが開発されたタンパク質を１以上の一般名および／または別名により表１に挙げる：ＡＢＣＧ２（ＣＤｗ３３８、分化抗原群(cluster of differentiation)ｗ３３８）、ＡＩＭＰ３（ＡＲＳ相互作用多機能タンパク質３(ARS-interacting multi-functional  proteins 3)、ｐ１８）、ＡＬＤＨ１Ｂ１（ＡＬＤＨ５、ＡＬＤＨＸ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＢ１）、α−カテニン、ＡＲＧ２（アルギナーゼ、タイプＩＩ）、ＡＲＩＤ１Ａ（ＡＴリッチ相互作用ドメイン含有タンパク質(AT-rich interactive domain-containing protein)１Ａ、Ｂ１２０、ＢＡＦ２５０、ＢＡＦ２５０ａ、ＢＭ０２９、Ｃ１ｏｒｆ４、ＥＬＤ、ＭＲＤ１４、ＯＳＡ１、Ｐ２７０、ＳＭＡＲＣＦ１、ｈＥＬＤ、ｈＯＳＡ１、ＣＳＳ２）、ＡＲＩＤ２（ＢＡＦ２００、ｐ２００、ＡＴリッチ相互作用ドメイン(AT-rich interaction domain)２）、ＡＴＭ（ＡＴＭセリン／トレオニンキナーゼ、ＡＴ１、ＡＴＡ、ＡＴＣ、ＡＴＤ、ＡＴＤＣ、ＡＴＥ、ＴＥＬ１、ＴＥＬＯ１、毛細血管拡張性運動失調症変異(ataxia-telangiectasia mutated)）、ＡＴＲ（ＡＴＲセリン／トレオニンキナーゼ、ＦＣＴＣＳ、ＦＲＰ１、ＭＥＣ１、ＳＣＫＬ、ＳＣＫＬ１）、Ｂａｘ（ＢＣＬ２Ｌ４、ＢＣＬ２関連Ｘタンパク質、ＢＣＬ２関連Ｘ、アポトーシスレギュレーター）、ＢＣＬ２（Ｂｃｌ−２、ＰＰＰ１Ｒ５０、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２、アポトーシスレギュレーター）、ブラキウリ（Ｔ、ＳＡＶＡ、ＴＦＴブラキウリ転写因子）、ＢＲＣＡ１（乳癌１、早期発症型、ＢＲＣＣ１、ＢＲＯＶＣＡ１、ＩＲＩＳ、ＰＮＣＡ４、ＰＰＰ１Ｒ５３、ＰＳＣＰ、ＲＮＦ５３、ＦＡＮＣＳ、乳癌１、ＤＮＡ修復関連）、ＢＲＥ（ＢＲＣＣ４、ＢＲＣＣ４５、脳および生殖器官発現［ＴＮＦＲＳＦ１Ａモジュレーター］）、ＣＡＤ（ＣＤＧ１Ｚ、カルバモイルリン酸シンセターゼ２、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼ、ＧＡＴＤ４、ＥＩＥＥ５０）、Ｃａｖ−１（ＢＳＣＬ３、ＣＧＬ３、ＬＣＣＮＳ、ＭＳＴＰ０８５、ＰＰＨ３、ＶＩＰ２１、カベオリン１）、ＣＤ８ｂ（ＣＤ８Ｂ１）、ＣＤ１６（分化抗原群１６）、ＣＤ２０（分化抗原群２０、ＭＳ４Ａ１、Ｂ１、Ｂｐ３５、ＣＤ２０、ＣＶＩＤ５、ＬＥＵ−１６、ＭＳ４Ａ２、Ｓ７、膜貫通４ドメインＡ１）、ＣＤ９９（分化抗原群９９、ＨＢＡ７１、ＭＩＣ２、ＭＩＣ２Ｘ、ＭＩＣ２Ｙ、ＭＳＫ５Ｘ）、ＣＤ２２６（分化抗原群２２６、ＤＮＡＭ−１、ＤＮＡＭ１、ＰＴＡ１、ＴＬｉＳＡ１）、ＣＤＫ４（ＣＭＭ３、ＰＳＫ−Ｊ３、サイクリン依存性キナーゼ４、サイクリン依存性キナーゼ４）、ＣＤＫ６（細胞分裂タンパク質キナーゼ６、ＭＣＰＨ１２、ＰＬＳＴＩＲＥＥ、サイクリン依存性���ナーゼ６）、ＣＤＫ１０（ＰＩＳＳＬＲＥ、サイクリン依存性キナーゼ１０、サイクリン依存性キナーゼ１０）、ＣＤＸ２（ＣＤＸ−３、ＣＤＸ２／ＡＳ、ＣＤＸ３、ｃａｕｄａｌタイプホメオボックス２、Ｃｄｘ２）、ＣＨＦＲ（ＲＮＦ１１６、ＲＮＦ１９６、ｆｏｒｋｈｅａｄおよびｒｉｎｇ  ｆｉｎｇｅｒドメインを有するチェックポイント(checkpoint with forkhead and ring finger domains)、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ、ｆｏｒｋｈｅａｄおよびｒｉｎｇ  ｆｉｎｇｅｒドメインを有するチェックポイント）、ＣＨＫ１（ＣＨＥＫ１、チェックポイントキナーゼ１）、ｃ−ＪＵＮ（ＪＵＮ、ＡＰ−１、ＡＰ１、ｃ−Ｊｕｎ、Ｊｕｎ癌原遺伝子、ＡＰ−１転写因子サブユニット）、ＣＬＫ４（ＣＤＣ様キナーゼ４、二重特異性タンパク質キナーゼＣＬＫ４）、ＣＯＸ４１（シトクロムｃオキシダーゼサブユニット４アイソフォーム１、ミトコンドリア、シトクロムｃオキシダーゼポリペプチドＩＶ、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＶアイソフォーム１、ＣＯＸ４、ＣＯＸ  ＩＶ−１）、ＣＯＸ５Ｂ（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶｂ、ＣＯＸＶＢ、シトクロムｃオキシダーゼサブユニット５Ｂ）、ＣＯＸ６Ｃ（シトクロムｃオキシダーゼサブユニット６Ｃ）、ＤＣＴＤ（デオキシシチジル酸デアミナーゼ、ｄＣＭＰデアミナーゼ）、ＤＤＲ１（ＣＡＫ、ＣＤ１６７、ＤＤＲ、ＥＨＧＫ２、ＭＣＫ１０、ＮＥＰ、ＮＴＲＫ４、ＰＴＫ３、ＰＴＫ３Ａ、ＲＴＫ６、ＴＲＫＥ、ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ１、ＣＤ１６７ａ、分化抗原群１６７ａ）、ＤＧＫＡ（ジアシルグリセロールキナーゼα、ＤＡＧＫ、ＤＡＧＫ１、ＤＧＫ−α）、ディアブロ（direct IAP binding protein with low pI、ＤＦＮＡ６４、ＳＭＡＣ、ディアブロ、ディアブロホモログ、ディアブロＩＡＰ結合ミトコンドリアタンパク質）、ＤＩＣＥＲ１（エンドリボヌクレアーゼＤｉｃｅｒ、ＲＮアーゼモチーフを有するヘリカーゼ(Helicase with RNase motif)、ヘリカーゼＭＯＩ、ＨＥＲＮＡ、ＫＩＡＡ０９２８）、ＤＵＳＰ１（二重特異性タンパク質ホスファターゼ１、ＣＬ１００、ＨＶＨ１、ＭＫＰ−１、ＭＫＰ１、ＰＴＰＮ１０、二重特異性ホスファターゼ１）、ＥＩＦ３Ａ（真核生物翻訳開始因子３サブユニット(Eukaryotic translation initiation factor)Ａ  ＥＩＦ３、ｅＩＦ３ａ、ＥＩＦ３Ｓ１０、Ｐ１６７、ＴＩＦ３２、ｅＩＦ３−ｐ１７０、ｅＩＦ３−θ、ｐ１８０、ｐ１８５）、ＥＭＳＹ（ＧＬ００２、Ｃ１１ｏｒｆ３０、ＢＲＣＡ２相互作用転写リプレッサー）、ＥＰＣＡＭ（上皮細胞接着分子、ＤＩＡＲ５、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ３１４、ＥＧＰ４０、ＥＳＡ、ＨＮＰＣＣ８、ＫＳ１／４、ＫＳＡ、Ｍ４Ｓ１、ＭＩＣ１８、ＭＫ−１、ＴＡＣＳＴＤ１、ＴＲＯＰ１）、ＥＲＣＣ２（除去修復交差相補群(excision repair cross-complementation group)２、ＸＰＤ、ＣＯＦＳ２、ＥＭ９、ＴＦＩＩＨ、ＴＴＤ、ＸＰＤ、ＴＴＤ１、ＥＲＣＣ除去修復２、ＴＦＩＩＨコア複合体ヘリカーゼサブユニット(TFIIH core complex helicase subunit)）、ＦＯＸＡ１（肝細胞核因子３−α、ＨＮＦ３Ａ、ＴＣＦ３Ａ、ｆｏｒｋｈｅａｄボックスＡ１）、ＦＯＸＣ１（ＦｏｒｋｈｅａｄボックスＣ１、ＡＲＡ、ＦＫＨＬ７、ＦＲＥＡＣ−３、ＦＲＥＡＣ３、ＩＧＤＡ、ＩＨＧ１、ＩＲＩＤ���、ＲＩＥＧ３、ＡＳＧＤ３）、ＦＯＸＣ２（Ｆｏｒｋｈｅａｄボックスタンパク質Ｃ２、ｆｏｒｋｈｅａｄ関連タンパク質、ＦＫＨＬ１４、転写因子  ＦＫＨ−１４、間充織ｆｏｒｋ  ｈｅａｄタンパク質１、ＭＦＨ１）、ＦＯＸＦ２（Ｆｏｒｋｈｅａｄボックスタンパク質Ｆ２、Ｆｏｒｋｈｅａｄ関連アクチベーター２、ＦＲＥＡＣ−２、Ｆｏｒｋｈｅａｄ関連タンパク質ＦＫＨＬ６、Ｆｏｒｋｈｅａｄ関連転写因子２）、γ−カテニン（プラコグロビン、ＪＵＰ、ＡＲＶＤ１２、ＣＴＮＮＧ、ＤＰ３、ＤＰＩＩＩ、ＰＤＧＢ、ＰＫＧＢ、ジャンクションプラコグロビン）、ＧＤＡ（グアニンデアミナーゼ、グアナーゼ、グアニンアミナーゼ、グアニンアミノヒドロラーセ、ＧＡＨ）、ＧＪＡ１（ギャップ結合α−１タンパク質、コネキシン４３、Ｃｘ４３、ＡＶＳＤ３、ＣＭＤＲ、ＣＸ４３、ＥＫＶＰ、ＧＪＡＬ、ＨＬＨＳ１、ＨＳＳ、ＯＤＤＤ、ＰＰＫＣＡ）、ＧＬＳ（グルタミナーゼ腎臓アイソフォーム−ミトコンドリア(glutaminase kidney isoform-mitochondrial)、Ｋ−グルタミナーゼ、Ｌ−グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＧＬＵＴ１（グルコース輸送体１、溶質輸送体ファミリー２促進グルコース輸送体メンバー１(solute carrier family 2 facilitated glucose transporter member 1)、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＳＥ、ＤＹＴ１７、ＤＹＴ１８、ＤＹＴ９、ＥＩＧ１２、ＧＬＵＴ、ＧＬＵＴ−１、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ１ＤＳ、ＨＴＬＶＲ、ＰＥＤ、ＳＤＣＨＣＮ、溶質輸送体ファミリー(solute carrier family)２メンバー１)）、ＧＳＴＭ１（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＭｕ  １、ＧＳＴ１、ＧＳＴＭ１−１、ＧＳＴＭ１ａ−１ａ、ＧＳＴＭ１ｂ−１ｂ、ＧＴＨ４、ＧＴＭ１、Ｈ−Ｂ、ＭＵ、ＭＵ−１）、ＧＳＴＭ３（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＭ３、ＧＳＴ５、ＧＳＴＢ、ＧＳＴＭ３−３、ＧＴＭ３）、ＧＳＴＰ１（グルタチオンｓ−トランスフェラーゼＰ、ＤＦＮ７、ＦＡＥＥＳ３、ＧＳＴ３、ＧＳＴＰ、ＨＥＬ−Ｓ−２２、ＰＩ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼｐｉ  １）、ＧＳＴＴ１（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼθ−１）、ＨＡＩ２（ＳＰＩＮＴ２、ＤＩＡＲ３、ＨＡＩ−２、Ｋｏｐ、ＰＢ、セリンペプチダーゼ阻害剤、Ｋｕｎｉｔｚタイプ、２、セリンペプチダーゼ阻害剤、Ｋｕｎｉｔｚタイプ２）、ｈＣＮＴ３（濃縮型Ｎａ（＋）−ヌクレオシド共輸送体(concentrative Na(+)-nucleoside cotransporter)、ＣＮＴ３、ＳＬＣ２８Ａ３）  ＨＤＡＣ６（ヒストンデアセチラーゼ６、ＣＰＢＨＭ、ＨＤ６、ＰＰＰ１Ｒ９０、ＪＭ２１）、ＨＫ２（セキソキナーゼ２、ＨＫＩＩ、ＨＸＫ２）、ＨＬＡ−Ａ（Ａｗ−３３、Ａｗ−７４、主要組織適合性遺伝子複合体、クラスＩ、Ａ、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１）  ＨＬＡ−Ｂ（ＡＳ、ＳＰＤＡ１、ＨＬＡ−Ｂ、Ｂｗ−４７、Ｂｗ−５０、主要組織適合性遺伝子複合体、クラスＩ、Ｂ、Ｂ−４９０１、Ｂ−５００１、ＨＥＬ−Ｓ−８３、ＨＬＡ−Ｂ＊４５ＺＪ、ＨＬＡ−Ｂ−３５０６、ＨＬＡ−Ｂ−３９０５、ＨＬＡ−Ｂ−５５０２、ＨＬＡ−Ｂ−５６０２、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ３９、ＨＬＡ−Ｂ４９、ＨＬＡ−Ｂ５０、ＨＬＡ−Ｂ５５、ＨＬＡ−Ｂ５９、ＨＬＡ−Ｂ６１、ＨＬＡ−Ｃｗ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１）、ＨＬＡ−ＤＭＡ（Ｄ６Ｓ２２２Ｅ、ＤＭＡ、ＨＬＡＤＭ、ＲＩＮＧ６、ＨＬＡ−ＤＭＡ、主要組織適合性遺伝子複合体、クラスＩＩ、ＤＭα）、ＨＬＡ−ＤＱＡ１（ＨＬＡクラスＩＩ主要適合性抗原、ＤＱα  １鎖、ＤＣ−１α鎖、ＤＣ−α、ＨＬＡ−ＤＣＡ、ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＱＡ１）、ＨＬＡ−ＤＲＡ（ＨＬＡ−ＤＲＡ１、ＭＬＲＷ、主要組織適合性遺伝子複合体、クラスＩＩ、ＤＲα）、ＨＰＶ１６Ｅ６（ヒト乳頭腫ウイルスタイプ１６  Ｅ６）、ＨＲ２３Ｂ（ＲＡＤ２３Ｂ、ＨＨＲ２３Ｂ、Ｐ５８、ＲＡＤ２３ホモログＢ、ヌクレオチド除去修復タンパク質）、ＩＤＨ１（ＨＥＬ−２１６、ＨＥＬ−Ｓ−２６、ＩＤＣＤ、ＩＤＨ、ＩＤＰ、ＩＤＰＣ、ＰＩＣＤ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ（＋））１、サイトゾル）、ＩＤＨ２  （Ｄ２ＨＧＡ２、ＩＣＤ−Ｍ、ＩＤＨ、ＩＤＨＭ、ＩＤＰ、ＩＤＰＭ、ｍＮＡＤＰ−ＩＤＨ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ（＋））２、ミトコンドリア）、ＩＧＦ２（Ｃ１１ｏｒｆ４３、ＧＲＤＦ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＰＰ９９７４、インスリン様増殖因子２）、ＩＧＦ２ＢＰ３（ＣＴ９８、ＩＭＰ−３、ＩＭＰ３、ＫＯＣ、ＫＯＣ１、ＶＩＣＫＺ３、インスリン様増殖因子２  ｍＲＮＡ結合タンパク質３）、ＩＫＺＦ１（ＤＮＡ結合タンパク質Ｉｋａｒｏｓ、Ｈｓ．５４４５２、ＩＫ１、ＩＫＡＲＯＳ、ＬＹＦ１、ＬｙＦ−１、ＰＰＰ１Ｒ９２、ＰＲＯ０７５８、ＺＮＦＮ１Ａ１、ＣＶＩＤ１３、ＩＫＡＲＯＳファミリージンクフィンガー１）、ＩＫＺＦ３（ＡＩＯ、ＡＩＯＬＯＳ、ＺＮＦＮ１Ａ３、ＩＫＡＲＯＳファミリージンクフィンガー３）、ＩＬ１３ＲＡ２（ＣＤ２１３Ａ２、ＣＴ１９、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ１３ＢＰ、インターロイキン１３受容体サブユニットα２）、ＩＬ−１５（ＩＬ１５、インターロイキン１５）、ＩＬ−８（ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド８、ＧＣＰ−１、ＧＣＰ１、ＬＥＣＴ、ＬＵＣＴ、ＬＹＮＡＰ、ＭＤＮＣＦ、ＭＯＮＡＰ、ＮＡＦ、ＮＡＰ−１、ＮＡＰ１、ＩＬ８、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド８、インターロイキン−８）、ＩＲＳ２（ＩＲＳ−２、インスリン受容体  基質２）、ＬＡＧ３（分化抗原群２２３、
ＣＤ２２３、リンパ球活性化３）、ＬＧＲ５（ＦＥＸ、ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７、ＧＲＰ４９、ＨＧ３８、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体(leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor)５、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体(leucine rich repeat containing G protein-coupled receptor)５）、ＬＩＧ４  ２０（ＬＩＧ４Ｓ、ＤＮＡリガーゼ４）、ＭＣＴ１（モノカルボン酸輸送体１、ＳＬＣ１６Ａ１、ＨＨＦ７、ＭＣＴ、ＭＣＴ１Ｄ、溶質輸送体ファミリー１６メンバー１）、ＭＥＮＡ（ＥＮＡＨ、ＥＮＡ、ＮＤＰＰ１、enabled homokog（ショウジョウバエ(Drosophila)）、アクチンレギュレーター）、ＭＥＮＡＩＮＶ、ＭＦＦ（ミトコンドリア核分裂因子、Ｃ２ｏｒｆ３３）、ＭＩＧ６（分裂促進因子誘導遺伝子６タンパク質、ＥＲＢＢ受容体ｆｅｅｄｂａｃｋ阻害剤１、ＥＲＲＦＩ１）、ＭＬＨ１（ＭｕｔＬホモログ１、結腸癌、非ポリープ症タイプ２、ｍｕｔＬホモログ１、ＣＯＣＡ２、ＦＣＣ２、ＨＮＰＣＣ、ＨＮＰＣＣ２、ｈＭＬＨ１）、ＭＭＰ７（マトリライシン、ＭＭＰ−７、ＭＰＳＬ１、ＰＵＭＰ−１、マトリックスメタロペプチダーゼ７）、ＭＭＰ９（ＣＬＧ４Ｂ、ゲルＢ、ＭＡＮＤＰ２、ＭＭＰ−９、９２ｋＤａタイプＩＶコラゲナーゼ、９２ｋＤａゼラチナーゼ、ゼラチナーゼＢ、マトリックスメタロペプチダーゼ９）、ＭＲＥ１１（ＡＴＬＤ、ＨＮＧＳ１、ＭＲＥ１１Ｂ、ＭＲＥ１１Ａ、ＭＲＥ１１ホモログ  Ａ、二本鎖切断修復ヌクレアーゼ、ＭＲＥ１１ホモログ、二本鎖切断修復ヌクレアーゼ）、ＭＳＨ２（ｍｕｔＳホモログ２、ＣＯＣＡ１、ＦＣＣ１、ＨＮＰＣＣ、ＨＮＰＣＣ１、ＬＣＦＳ２）、ＭＳＨ６（ｍｕｔＳホモログ６、ＧＴＢＰ、ＧＴＭＢＰ、ＨＮＰＣＣ５、ＨＳＡＰ、ｐ１６０）、ＭＵＣ４（ＡＳＧＰ、ＨＳＡ２７６３５９、ＭＵＣ−４、ムチン４、細胞表面関連）、ＮＤ１（ＭＴＭＴ−ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、サブユニット１［複合体Ｉ］）、ＮＥＤＤ８（ＮＥＤＤ−８、神経系前駆細胞発現(neural precursor cell expressed)、発生下方調節(developmentally downregulated)８）、ニブリン（ＮＢＮ、ＡＴ−Ｖ１、ＡＴ−Ｖ２、ＡＴＶ、ＮＢＳ、ＮＢＳ１、Ｐ９５、ニブリン）、ＮＫｐ３０（天然細胞傷害性誘発受容体(natural cytotoxicity triggering receptor)３、ＣＤ３３７、分化抗原群３３７、ＮＣＲ３、１Ｃ７、ＣＤ３３７、ＬＹ１１７、ＭＡＬＳ）、ＮＫｐ４４（天然細胞傷害性誘発受容体(natural cytotoxicity triggering receptor)２、ＣＤ３３６、分化抗原群３３６、ＮＣＲ２、ＣＤ３３６、ＬＹ９５、ＮＫ−ｐ４４、ＮＫＰ４４）、ＮＫｐ８０（キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＦメンバー１、レクチン様受容体Ｆ１、Ｃ型レクチンドメインファミリー５メンバーＣ、ＫＬＲＦ１）、ＮＮＭＴ（ニコチンアミドＮ−メチルトランスフェラーゼ）、ＮＴ５Ｃ（５’，３’−ヌクレオチダーゼ、サイトゾル、５’（３’）−デオキシリボヌクレオチダーゼ、サイトゾルタイプ、デオキシ−５’−ヌクレオチダーゼ１、ＤＮＴ、ＤＮＴ１、ＨＥＬ７４、Ｐ５Ｎ２、ＰＮ−Ｉ、ＰＮ−ＩＩ、ＵＭＰＨ２、ｃｄＮ、ｄＮＴ−１）、ＮＴ５Ｃ２（サイトゾルプリン５’−ヌクレオチダーゼ、サイトゾル５’−ヌクレオチダーゼＩＩ、サイトゾル５’−ヌクレオチダーゼ３Ａ、ピリミジン５’−ヌクレオチダーゼ）、ＮＴ５Ｃ３Ａ（サイトゾル５’−ヌクレオチダーゼ３、サイトゾル５’−ヌクレオチダーゼ３Ａ、ピリミジン５’−ヌクレオチダーゼ、ｐ５６、ＮＴ５Ｃ３、Ｐ５’Ｎ−１、Ｐ５Ｎ−１、ＰＮ−Ｉ、ＰＯＭＰ、ＰＳＮ１、ＵＭＰＨ、ＵＭＰＨ１、ｃＮ−ＩＩＩ、ｈＵＭＰ１、ｐ３６）、Ｐ２１（サイクリン依存性キナーゼ阻害剤  １またはＣＤＫ相互作用タンパク質１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＡＰ２０、ＣＤＫＮ１、ＣＩＰ１、ＭＤＡ−６、ＳＤＩ１、ＷＡＦ１、ｐ２１ＣＩＰ１、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ａ、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ａ）、Ｐ２７（サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ｂ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ４、ＫＩＰ１、ＭＥＮ１Ｂ、ＭＥＮ４、Ｐ２７ＫＩＰ１、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ｂ）、ＰＡＲＰ１（ポリ［ＡＤＰ−リボース］ポリメラーゼ１、ＮＡＤ＋  ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ１、ポリ［ＡＤＰ−リボース］シンターゼ１、ＡＤＰＲＴ、ＡＤＰＲＴ  １、ＡＤＰＲＴ１、ＡＲＴＤ１、ＰＡＲＰ、ＰＡＲＰ−１、ＰＰＯＬ、ｐＡＤＰＲＴ−１）、ＰＡＲＰ１６（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー１６、ＡＲＴＤ１５、Ｃ１５ｏｒｆ３０、ｐＡＲＴ１５）、ＰＡＲＰ４（ＡＤＰＲＴＬ１、ＡＲＴＤ４、ＰＡＲＰ−４、ＰＡＲＰＬ、ＰＨ５Ｐ、ＶＡＵＬＴ３、ＶＰＡＲＰ、ＶＷＡ５Ｃ、ｐ１９３、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー４）、パキシリン（ＰＸＮ）、ＰＤＫ１（ＰＤＰＫ１、ＰＤＰＫ２、ＰＲＯ０４６１、ＰＤＰＫ２Ｐ、ホスホイノシチド依存性キナーゼ−１、３−ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ１）、ＰＤ−Ｌ２（ＰＤ−１−リガンド２）、ＰＦＫＦＢ３（ＩＰＦＫ２、ＰＦＫ２、ｉＰＦＫ−２、６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２，６−ビホスファターゼ３）、ＰＩ３ＫＣＡ（ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸３−キナーゼ、触媒サブユニットα、ＣＬＯＶＥ、ＣＷＳ５、ＭＣＡＰ、ＭＣＭ、ＭＣＭＴＣ、ＰＩ３Ｋ、ｐ１１０−α、ＰＩ３Ｋ−α）、ＰＩＭ１（癌原遺伝子セリン／トレオニン−タンパク質キナーゼＰｉｍ−１、ＰＩＭ、Ｐｉｍ−１癌原遺伝子、セリン／トレオニンキナーゼ）、ＰＩＭ２（セリン／トレオニン−タンパク質キナーゼＰｉｍ−２、Ｐｉｍ−２癌原遺伝子、セリン／トレオニンキナーゼ）、ＰＫＭ（ピルビン酸キナーゼ筋アイソザイム［ＰＫＭ］、ピルビン酸キナーゼタイプＫ、サイトゾル甲状腺ホルモン結合タンパク質［ＣＴＨＢＰ］、甲状腺ホルモン結合タンパク質１［ＴＨＢＰ１］、ｏｐａ相互作用タンパク質３［ＯＩＰ３］、ＣＴＨＢＰ、ＨＥＬ−Ｓ３０、ＯＩＰ３、ＰＫ３、ＰＫＭ２、ＴＣＢ、ＴＨＢＰ１、ピルビン酸キナーゼ，筋肉(pyruvate kinase, muscle)としても知られる、ピルビン酸キナーゼアイソザイムＭ１／Ｍ２［ＰＫＭ１／Ｍ２］）、ＰＭＳ２  （ＨＮＰＣＣ４、ＰＭＳ２ＣＬ、ＰＭＳＬ２、ＭＬＨ４、ＰＭＳ１ホモログ２、ミスマッチ修復系成分）、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１、ＦＧＣＰ、ＦＯＬＨ、ＧＣＰ２、ＧＣＰＩＩ、ＮＡＡＬＡＤ１、ＮＡＡＬＡｄａｓｅ、ＰＳＭ、ｍＧＣＰ、葉酸ヒドロラーゼ［前立腺特異的膜抗原］１、葉酸ヒドロラーゼ１）、ＰＲＫＤＣ（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＤＮＡＰＫ、ＤＮＰＫ１、ＨＹＲＣ、ＨＹＲＣ１、ＸＲＣＣ７、ｐ３５０、ＩＭＤ２６、タンパク質キナーゼ、ＤＮＡ活性化、触媒ポリペプチド）、ＱＰＲＴ（ニコチン酸ヌクレオチドピロホスホリラーゼ［カルボキシル化］、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ［脱カルボキシル化］、ＱＡＰＲＴａｓｅ、ＱＰＲＴａｓｅ）、ＲＡＤ５０（ＮＢＳＬＤ、ＲＡＤ５０２、ｈＲａｄ５０、ＲＡＤ５０二本鎖切断修復タンパク質）、ＳＡＭＨＤ１（ＳＡＭドメインおよびＨＤドメイン含有タンパク質(SAM domain and HD domain-containing protein)１、ＣＨＢＬ２、ＤＣＩＰ、ＨＤＤＣ１、ＭＯＰ−５、ＳＢＢＩ８８、ＳＡＭおよびＨＤドメイン含有デオキシヌクレオシド三リン酸トリホスホヒドロラーゼ(SAM and HD domain containing deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase）１、ＳＩＡＨ２（ｈＳｉａｈ２、ｓｉａｈ  Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ）、ＳＩＲＴ１（ＳＩＲ２Ｌ１、ＳＩＲ２、ｈＳＩＲ２、ＳＩＲ２α、サーチュイン１、ＮＡＤ依存性デアセチラーゼサーチュイン−１）、ＳＬＡＭＦ６（ＣＤ３５２、ＫＡＬＩ、ＫＡＬＩｂ、Ｌｙ１０８、ＮＴＢ−Ａ、ＮＴＢＡ、ＳＦ２０００、ＳＬＡＭファミリーメンバー６）、ＳＬＣ３４Ａ２（ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２Ｂ［ＮａＰｉ２ｂ］、ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＡＰＩ−ＩＩｂ、ＮＰＴＩＩｂ、溶質輸送体ファミリー３４メンバー２）、ＳＬＣ４６Ａ１（プロトン共役葉酸１５輸送体［ＰＣＦＴ］、Ｇ２１、ＨＣＰ１、ＰＣＦＴ、溶質輸送体ファミリー４６メンバー１としても知られる溶質輸送体ファミリー４６［葉酸輸送体］、メンバー１［ＳＬＣ４６Ａ１］）、ＳＭＡＲＣＡ４（転写アクチベーターＢＲＧ１、ＡＴＰ依存性ヘリカーゼ  ＳＭＡＲＣＡ４、ＢＡＦ１９０、ＢＡＦ１９０Ａ、ＢＲＧ１、ＭＲＤ１６、ＲＴＰＳ２、ＳＮＦ２、ＳＮＦ２Ｌ４、ＳＮＦ２ＬＢ、ＳＷＩ２、ｈＳＮＦ２ｂ、ＣＳＳ４、ＳＷＩ／ＳＮＦ関連(SWI/SNF related)、マトリックス関連(matrix associated)、クロマチンのアクチン依存性レギュレーター(actin dependent regulator of chromatin)、サブファミリーａメンバー４）、ＳＭＯ（ＦＺＤ１１、Ｇｘ、ＳＭＯＨ、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ｆｒｉｚｚｌｅｄクラス受容体、ＣＲＪＳ）、ＳＯＤ１（ＡＬＳ、ＡＬＳ１、ＨＥＬ−Ｓ−４４、ＩＰＯＡ、ＳＯＤ、ｈＳｏｄ１、ホモ二量体、スーパーオキシドジスムターゼ１、可溶性、スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＳＯＤ２（ＩＰＯＢ、ＭＮＳＯＤ、ＭＶＣＤ６、ＩＰＯ−Ｂ、Ｍｎ−ＳＯＤ、スーパーオキシドジスムターゼ２、ミトコンドリア、スーパーオキシドジスムターゼ２）、ＳＯＸ９（転写因子ＳＯＸ−９、ＣＭＤ１、ＣＭＰＤ１、ＳＲＡ１、ＳＲＸＸ２、ＳＲＸＹ１０、ＳＲＹボックス９）、ＳＰＲＹ２（Ｓｐｒｏｕｔｙホモログ２、ｈＩＧＡＮ３、ｓｐｒｏｕｔｙ  ＲＴＫシグナル伝達アンタゴニスト２）、ＴＢＸ２１（Ｔボックス転写因子ＴＢＸ２１、Ｔ−ＰＥＴ、Ｔ−ｂｅｔ、ＴＢＥＴ、ＴＢＬＹＭ、Ｔボックス２１）、ＴＪＰ１（閉鎖帯(zonula occludens)−１  ＺＯ−１、密着結合タンパク質−１、ＺＯ−１、密着結合タンパク質１）、ＴＭＳＢ１５Ａ（チモシンβ−１５Ａ、ＴＭＳＢ１５、ＴＭＳＢ１５Ｂ、ＴＭＳＬ８、ＴＭＳＮＢ、Ｔｂ１５、ＴｂＮＢ、チモシンβ１５ａ）、ＴＰＸ２（Ｘｋｌｐ２の標的化タンパク質(Targeting protein for Xklp2)、Ｃ２０ｏｒｆ１、Ｃ２０ｏｒｆ２、ＤＩＬ−２、ＤＩＬ２、ＦＬＳ３５３、ＧＤ：Ｃ２０ｏｒｆ１、ＨＣＡ５１９、ＨＣＴＰ４、ＲＥＰＰ８６、ｐ１００、微小管核形成因子(microtubule nucleation factor)）、ＴＲＩＭ２４（三分節モチーフ含有(tripartite motifcontaining)２４、転写仲介因子(transcriptional intermediary factor)１α、ＰＴＣ６、ＲＮＦ８２、ＴＦ１Ａ、ＴＩＦ１、ＴＩＦ１Ａ、ＴＩＦ１Α、ｈＴＩＦ１、三分節  モチーフ含有２４）、ＴＲＫＡ（トロポミオシン受容体キナーゼＡ（ＴｒｋＡ）、高親和性神経成長因子受容体、神経栄養チロシンキナーゼ受容体タイプ１、ＴＲＫ１トランスフォーミングチロシンキナーゼタンパク質、ＭＴＣ、ＴＲＫ、ＴＲＫ１、Ｔｒｋ−Ａ、ｐ１４０−ＴｒｋＡ、神経栄養受容体チロシンキナーゼ１）、ＷＴ−１（ビルムス腫瘍タンパク質、ＡＥＷＳ−ＧＵＤ、ＮＰＨＳ４、ＷＡＧＲ、ＷＩＴ−２、ＷＴ３３、ビルムス腫瘍１）、ＸＰＯ１（エクスポーチン１、染色体維持(chromosomal maintenance)１、ＣＲＭ１、ｅｍｂ、ｅｘｐ１）、ＸＲＣＣ４（ＤＮＡ修復タンパク質ＸＲＣＣ４、Ｘ線修復交差補完タンパク質(X-ray repair cross-complementing protein)４、ＳＳＭＥＤ、チャイニーズハムスター細胞のＸ線修復補完不完全修復(X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells)４、Ｘ線修復交差補完(Xray repair cross complementing)４）、ＸＲＣＣ５（ＫＡＲＰ−１、ＫＡＲＰ１、ＫＵ８０、ＫＵＢ２、Ｋｕ８６、ＮＦＩＶ、Ｋｕ８０、チャイニーズハムスター細胞のＸ線修復補完不完全修復５、Ｘ線修復交差補完５）、ＸＲＣＣ６（チャイニーズハムスター細胞のＸ線修復補完不完全修復６、ＣＴＣ７５、ＣＴＣＢＦ、Ｇ２２Ｐ１、ＫＵ７０、ＭＬ８、ＴＬＡＡ、Ｘ線修復交差補完６）、ＡＭＤ１（Ａｄｅノシルメチオニンデカルボキシラーゼ１）、ＦＣＥＲ１Ｇ（ＩｇＥ受容体ＩｇのＦｃ断片(Fc fragment of IgE receptor Ig)）、ＲＡＤ５１Ｃ（ＢＲＯＶＣＡ３）、ＰＭＬ（ＴＲＩＭ１９、前骨髄球性白血病タンパク質）、ＩＬ１２ＲＢ２（インターロイキン１２受容体）、
ＳＰＡＧ５（Ｓｐｅｒｍ関連抗原５）、ＮＲＡＳ（神経芽腫ＲＡＳウイルス（Ｖ−Ｒａｓ）癌遺伝子ホモログ）、ＨＲＡＳ（Ｈａｒｖｅｙラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）、ＭＬＨ３（ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質Ｍｌｈ３）、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児性抗原関連細胞接着分子６）、ＬＧＡＬＳ９（ガレクチン９）、ＲＰＡ２（複製タンパク質Ａ２）、ＲＰＡ１（複製タンパク質Ａ１）、ＦＥＮ１（Ｆｌａｐ構造特異的エンドヌクレアーゼ１）、ＬＩＧ３（ＤＮＡリガーゼ３）、ＢＬＭ（ブルーム症候群ＲｅｃＱ様ヘリカーゼ）、Ｂ２Ｍ（β−２−ミクログロブリン）、ＲＮＰＥＰ（アルギニンアミノペプチダーゼ）、ＩＬ１２Ａ（インターロイキン１２Ａ）、ＩＬ１２Ｂ（インターロイキン１２Ｂ）、ＹＥＳ１（Ｖ−Ｙｅｓ−１山口肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ１）、ＮＴＲＫ１（ＮＴＲＫ１遺伝子神経栄養受容体チロシンキナーゼ１の別名）、ＮＴＲＫ２（ＮＴＲＫ１遺伝子神経栄養受容体チロシンキナーゼ２）、ＮＴＲＫ３（ＮＴＲＫ１遺伝子神経栄養受容体チロシンキナーゼ３の別名）、およびＲＢ１（網膜芽細胞腫１）。
【００２６】
驚くことに、表１に挙げられているタンパク質の切断に由来する多くの潜在的ペプチド配列は、すぐに明らかにならないという理由で、質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイで使用するには好適でないか、または有効でないことが判明した。ＭＲＭ／ＳＲＭアッセイに最も好適なペプチドを予測することが不可能であったので、指定の各タンパク質に対して信頼性があり、正確なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、実際のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解液中の修飾および非修飾ペプチドを実験的に同定する必要があった。いずれの理論にも縛られるものではないが、いくつかのペプチドは、例えば、十分にイオン化しないか、または他のタンパク質と明瞭に異なる断片を生成しないので、質量分析によって検出することが困難であり得ると考えられる。また、ペプチドはクロマトグラフィー分離で十分に分解できないことがあり、またはガラスもしくはプラスチック器具に付着することがある。
【００２７】
表１に見られるペプチドは、ヒトホルマリン固定癌組織から獲得された細胞から調製された複雑なＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解液内の総てのタンパク質のプロテアーゼ消化によるそれらの各指定タンパク質に由来した。そうではないことが記載されない限り、各場合において、プロテアーゼはトリプシンであった。次に、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解液を質量分析により分析して、質量分析により検出および分析される指定タンパク質に由来するペプチドを決定した。質量分析のためのペプチドの特定の好ましいサブセットの同定は、実験条件下で、タンパク質由来のどの１または複数のペプチドがＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解液の質量分析でイオン化するのかの発見に基づき、従って、そのペプチドが、そのプロトコールおよびその質量分析法によって分析されるＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解液の調製において使用される実験条件から生じる能力を示す。
【００２８】
このタンパク質の集合体を検出するのに好適な最適ペプチドは、次のようにして発見された。ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定組織から直接獲得された細胞からのタンパク質溶解液は、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）試薬、および組織顕微解剖によって細胞をサンプル管に採取すること、次いでそれらの細胞をＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）バッファー中で長時間加熱することを含むプロトコールを用いて調製した。ひと度、ホルマリンにより誘導される架橋が負の影響を受けたならば、次に、それらの組織／細胞を、例えば、プロテアーゼトリプシンなどのプロテアーゼを用い、予測可能な様式で完全に消化した。各タンパク質溶解液は、無傷のポリペプチドのプロテアーゼでの消化により、ペプチドの集合体となる。ペプチドの多重グローバルプロテオームサーベイを実施するために、各Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解液を分析し（例えば、イオントラップ質量分析による）、ここで、データは各タンパク質溶解液中に存在する総ての細胞タンパク質から質量分析によって同定され得るできる限り多くのペプチドの同定として提供された。単一の複雑なタンパク質／ペプチド溶解液からできる限り多くのペプチドを同定するために、グローバルプロファイリングの実施が可能なイオントラップ質量分析計または他の形式の質量分析計が一般に使用される。しかしながら、イオントラップ質量分析計は、ペプチドのグローバルプロファイリングを行うための最良のタイプの質量分析計であり得る。
【００２９】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、イオントラップ／四重極ハイブリッド、または三連四重極を含むいずれのタイプの質量分析計で開発および実施することもできるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに最も有利な機器プラットフォームは多くの場合、三連四重極機器プラットフォームであると考えられる。使用される条件下で単一の溶解液の単一のＭＳ分析においてできる限り多くのペプチドが同定されたところで、次に、ペプチドリストを照合し、その溶解液中で検出されたタンパク質を決定するために使用した。このプロセスを複数のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解液に対して繰り返し、極めて大きなペプチドリストが照合されて単一のデータセットを得た。このタイプのデータセットは、分析されたそのタイプの生体試料（プロテアーゼ消化後）において、具体的には、生体試料のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解液において質量分析によって検出され得るペプチドを表すと考えることができ、従って、指定タンパク質のそれぞれに関するペプチドを含む。
【００３０】
一つの実施態様では、指定タンパク質の絶対量または相対量の決定において有利として同定されたトリプシンペプチドを下表１に挙げる。これらのペプチドのそれぞれは、ＦＦＰＥ組織から調製されたＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解液における質量分析によって検出された。よって、各ペプチドは、直接的にはホルマリン固定患者組織を含むヒト生体試料中の指定タンパク質のための定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために使用することができる。
【００３１】
【表１】
2019203878.tif 000002
2019203878.tif 000003
2019203878.tif 000004
【００３２】
各指定タンパク質由来の特定の断片ペプチドについての特異的でユニークな特徴を、イオントラップおよび三連四重極質量分析計の両方で全断片ペプチドを分析することによって作成した。そのような情報は、ホルマリン固定サンプル／組織からのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解液において直接、各々および総ての候補ＳＲＭ／ＭＲＭペプチドに関して実験的に決定しなければならない；それは興味深いことに、本明細書に記載されるようなＳＲＭ／ＭＲＭを用いてこのような溶解液中で、いずれの指定タンパク質由来のペプチドも総てが検出できるわけではないためである。検出できない断片ペプチドは、ホルマリン固定サンプル／組織からのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解液において直接、ペプチド／タンパク質を定量する上で使用するためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するための候補ペプチドでない。
【００３３】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のＳＲＭアッセイで検出および／または定量された１以上の断片ペプチドは、上の表１の配列番号１〜２９１に対応する。
【００３４】
いくつかの実施態様では、２以上、３以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上など・・・の多重検出および／または定量は、配列番号１〜２９１から選択される断片ペプチドから実施される。
【００３５】
いくつかの実施態様では、特定の断片ペプチドに関するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、三連四重極質量分析計で実施される。特定のタンパク質ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによって分析される試験的サンプルは、例えば、ホルマリン固定およびパラフィン包埋された組織から調製されるＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）タンパク質溶解液である。このようなアッセイから得られるデータは、ホルマリン固定サンプル中のこの断片ペプチドに関するユニークなＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークの存在を示し得る。
【００３６】
所与のペプチドの特定の遷移イオン特性は、単に特定の断片ペプチドを検出するためではなく、ホルマリン固定された生体試料中の特定の断片ペプチドを定量的に測定するために使用される。これらのデータは、この断片ペプチドの絶対量を、被分析タンパク質溶解液１マイクログラム当たりのペプチドのモル量の関数として示す。ホルマリン固定された患者由来組織の分析に基づく、組織における対応するタンパク質(corresponding protein)レベルの評価は、各特定の患者についての診断、予後、および治療関連情報を提供することができる。一つの実施態様では、生体試料中の表１に挙げられたタンパク質のそれぞれのレベルを測定するための方法であって、前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中の１以上の断片ペプチドの量を、質量分析を用いて検出および／または定量化すること；ならびに前記サンプル中の修飾または非修飾タンパク質のレベルを計算することを含んでなる方法が提供され、ここで、前記レベルは相対レベルまたは絶対レベルである。１以上の修飾または非修飾断片ペプチドの定量化は、生体試料中の断片ペプチドのそれぞれの量を、添加した既知量の内部標準ペプチドとの比較により決定することによって達成することができ、ここで、生体試料中の断片ペプチドのそれぞれが、同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される。内部標準は、例えば、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはそれらの組合せなどの１以上の重い安定同位体を含有する、同位体で標識された内部標準ペプチドであり得る。１分子のペプチドが単一分子のタンパク質に由来するので、ペプチドのモル量を測定すれば、ペプチドが由来したタンパク質のモル量の直接的な測定値が得られる。
【００３７】
本明細書に記載の生体試料中の指定タンパク質（またはその代理(surrogates)としての断片ペプチド）のレベルを測定するための方法は、患者または被験体における癌の診断指標として使用することができる。指定タンパク質のレベルの測定から得られた結果は、組織に見られるタンパク質のレベルを正常組織および／または癌組織もしくは前癌組織に見られるタンパク質のレベルと相関させる（例えば、比較する）ことによって癌の診断ステージ／グレード／状態を決定するために使用することができる。指定タンパク質のレベルの測定から得られた結果はまた、どの癌治療薬で癌患者を処置するか、従って、最適な癌治療計画を決定するために使用することもできる。
【００３８】
組織タンパク質発現ランドスケープは極めて複雑であり、それによって、複数のタイプの固形組織細胞および局在性／非局在性の免疫細胞によって発現される複数のタンパク質は、複数の治療薬適応のために複数のアッセイを必要とする。タンパク質アッセイの複雑性のこのレベルは、今回記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによって分析することができる。これらのアッセイは、様々な分子機能を有する多くの異なるタンパク質を実質的に同時に（または実質的に同時点で、または実質的に一緒に）検出および定量するように設計され、ここで、これらのタンパク質としては、限定されるものではないが、可溶性タンパク質、膜結合タンパク質、核因子、分化因子、細胞間相互作用を調節するタンパク質、分泌タンパク質、免疫チェックポイントタンパク質、増殖因子、増殖因子受容体、細胞シグナル伝達タンパク質、免疫阻害タンパク質、サイトカイン、およびリンパ球活性化／阻害因子が含まれる。
【００３９】
組織顕微解剖は、患者の腫瘍細胞の状態を具体的に定義する分子プロファイルを決定するために、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを用いて、タンパク質発現分析向けに患者腫瘍組織から純粋な腫瘍細胞集団を獲得するために有利に使用することができる。腫瘍組織の組織顕微解剖は、ＤＩＲＥＣＴＯＲ（商標）技術を利用した細胞および細胞集団のレーザー誘起前方転送のプロセスを用いて実施することができる。
【００４０】
エネルギー移動層間コーティングの利用を介した、組織のレーザー誘起前方転送のためのＤＩＲＥＣＴＯＲ（商標）スライドを使用する方法が米国特許第７，３８１，４４０号に記載されており、その内容は引用することにより全体が本明細書の一部とされる。しかしながら、腫瘍細胞の顕微解剖純粋集団は、腫瘍細胞を死滅させると期待される細胞、すなわち、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のタンパク質発現シグネチャー／プロファイルを無視する可能性がある。この制限は、純粋な腫瘍細胞集団に加え、純粋なＴＩＬ集団を獲得するために組織顕微解剖を利用することによって克服することができ、それにより、大集団のＴＩＬを含む組織領域が採取でき、記載のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを用いるタンパク質発現分析向けに処理することができる。２つの明瞭に異なる細胞集団の回収および分析を介し、患者にとって最適な治療計画についての情報を得るために患者の免疫プロファイルを決定することができ、それにより、最適な免疫介在性腫瘍細胞死滅のための特定の免疫調節薬によって免疫系を調節させることができ、標的治療薬による死滅および／または免疫介在性腫瘍細胞死滅のために腫瘍細胞を標的とすることができる。
【００４１】
組織顕微解剖はＳＲＭ／ＭＲＭ分析用の患者組織から、特定された細胞集団の純粋な集団を作り出すが、大部分の腫瘍組織は、明瞭に異なるＴＩＬ集団の大領域が顕微解剖されることを好適に示すわけではない。ほとんどの場合、ＴＩＬは、不均質な複雑組織微小環境にまばらに散在するので、比較的純粋な腫瘍細胞集団は効果的に分析できるが、純粋なＴＩＬ集団の分析はいつも効果的であるわけではない。腫瘍組織由来ＴＩＬは、免疫系調節薬を用いて免疫応答の正の操作について情報を得るために重要な多くのタンパク質を発現するので、分析するべきである。この制限は、患者組織内に存在する腫瘍微小環境の全域から、記載のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ用の分析可能なタンパク質溶解液を調製することによって克服することができ、それにより、この溶解液は、限定されるものではないが、腫瘍細胞、良性の非腫瘍細胞、および免疫細胞を含む、多くの異なる細胞種の全体の複雑な環境のプロテオーム表現を含んでなる。このように、極めて複雑な患者特異的分子プロファイルは、患者の腫瘍環境の全分子ランドスケープをキャプチャーすること(capturing)によって決定することができる。加えて、同じ組織から連続切片の組織顕微解剖により回収されるような精製された腫瘍細胞集団の分析は、全域腫瘍微小環境ランドスケープと比較および対比することができる。このアプローチは、その組織サンプル中には存在しない局在性のＴＩＬおよび／または免疫細胞によって発現される可能性が最も高い免疫応答タンパク質およびそれらのタンパク質が腫瘍免疫ランドスケープに及ぼし得る影響を同定するために、免疫細胞プロファイルから腫瘍細胞プロファイルを機能的に分離している。
【００４２】
今回記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、固形腫瘍組織から調製された溶解液中の特定のタンパク質の発現を検出および定量するが、純粋な細胞集団が回収および分析されなければ、これらのアッセイは、どの細胞がどのタンパク質を発現するかについての詳細な情報を提供することができない。例えば、腫瘍細胞が、通常には正常細胞、正常リンパ球細胞、および／またはＴＩＬによってのみ発現される免疫阻害因子を発現する場合に、腫瘍微小環境では異常なタンパク質発現が一般的であるので、このことは重要である。よって、候補治療タンパク質標的の発現が記載のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによって検出および定量された場合には、欠落している細胞局在情報を提供するために追跡アッセイが必要とされることがある。細胞発現状況(cellular expression context)という目的を達成するための方法は、免疫組織化学である。どのタンパク質が腫瘍微小環境内で発現されるかおよびどの細胞がこれらのタンパク質を発現するかを理解することで、有利には、腫瘍細胞を探し出して死滅させるよう患者自身の免疫応答を調節するための最適な治療決定に関する情報が得られる。今回記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイおよび分析法は、患者の腫瘍組織において直接、免疫調節癌治療薬のタンパク質標的を検出および定量する能力を提供する。
【００４３】
腫瘍細胞の死滅化のための有利なアプローチは、免疫調節薬が最適な患者応答のために腫瘍細胞標的化薬と組み合わせて相乗的に使用される併用療法を使用することである。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、それに対して阻害治療薬が開発された癌タンパク質標的の、患者の腫瘍組織における、量的発現状態を決定するために使用することができる。癌タンパク質の量的状態を決定するためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの例は、例えば、Ｍｅｔタンパク質（米国特許第９，３７２，１９５号参照）およびＩＧＦ−１Ｒタンパク質（米国特許第８，７２８，７５３号参照）に関して記載されている。薬物クリゾチニブおよびカボザンチニブはＭｅｔタンパク質機能を阻害するが、フィギツムマブおよびシクスツムマブ(cixutumumab)はＩＧＦ−１Ｒタンパク質機能を阻害する。これらのアッセイからの情報は、腫瘍組織の免疫状態を理解するために、今回記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイからの情報と組み合わせることができる。両データセットは一緒に、標的化された免疫に基づく組合せ治療アプローチのための治療計画に関する情報を得るために使用することができる。例えば、患者の腫瘍細胞がＰＤ−Ｌ１タンパク質およびＭｅｔタンパク質の両方を過剰発現することがＳＲＭ／ＭＲＭ法により決定されれば、論理的組合せ治療計画は、ニボルマブ（ＰＤ−１阻害剤）またはアテゾリズマブ（ＰＤ−Ｌ１阻害剤）とクリゾチニブ（Ｍｅｔ阻害剤）の組合せを投与することを含み得る。このようなアプローチの結果は、患者の免疫系を武装して腫瘍細胞を攻撃し死滅させるとともに腫瘍細胞を特異的に標的とし死滅させる治療薬を最適に使用するということになろう。
【００４４】
よって、いくつかの実施態様では、配列番号１〜２９１に対応する２以上の断片ペプチドの多重検出および定量と患者の腫瘍細胞の成長を促す他の癌タンパク質の分析とを組み合わせることが有利であり得る。これは、癌タンパク質の機能を阻害または調節し患者の腫瘍細胞の成長を阻害する標的癌治療薬を、癌患者の免疫応答を惹起、増強、操作、および／またはそうでなければ調節するよう１以上のタンパク質と相互作用し患者の腫瘍細胞を攻撃し死滅させる免疫調節癌治療薬と組み合わせて患者に投与することを可能とし得る。(This can allow a targeted cancer therapeutic agent that inhibits or modulates the function of the oncoprotein to inhibit growth of the patient tumor cells to be administered to the patient in combination with an immunomodulatory cancer therapeutic agent that interacts with one or more of the proteins to initiate, enhance, manipulate, and/or otherwise modulate the cancer patient immune response to attack and kill the patient tumor cells.)
【００４５】
核酸およびタンパク質の両方が同じＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）生体分子調製物から分析できるので、今回記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイで分析された同じサンプルにおいて核酸からの薬物治療決定に関するさらなる情報を生み出すことが可能である。今回記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにより、特定のタンパク質がある特定の細胞によって高いレベルで発現されることを見出すことができるが、同時に、特定の遺伝子および／または核酸ならびにそれらがコードするタンパク質の突然変異状態についての情報（例えば、ｍＲＮＡ分子およびそれらの発現レベルまたはスプライスバリエーション）を得ることができる。それらの核酸は、例えば、シークエンシング法、ポリメラーゼ連鎖反応法、制限断片多形分析、欠失、挿入の同定、および／または限定されるものではないが、単一塩基対多形、トランジション、トランスバージョン、またはそれらの組合せを含む、突然変異の存在の決定のうち１以上、２以上、または３以上によって調べることができる。
【配列表】
2019203878000001.app
【外国語明細書】
2019203878000001.pdf