(57)【要約】      （修正有）【課題】酵素的コンジュゲート化による大腸菌での組み換えワクチンの製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】in vivoでの糖コンジュゲート（glycoconjugate）生成能が高い原核生物細胞、ならびにこれらの細胞を作製する方法および糖コンジュゲートを生成するためにこれらの細胞を使用する方法を提供する。言及される糖コンジュゲートの組成物ならびにそれらの種々の用途もまた含まれる。【選択図】図１
2019030309.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖の生成のための、遺伝子操作されたグラム陰性細菌であって、グラム陽性細菌の莢膜多糖遺伝子クラスターの調節遺伝子を含む、上記グラム陰性細菌。
【請求項２】
前記莢膜多糖遺伝子クラスターのオープンリーディングフレームのうち、少なくとも25％、50％、75％、85％、90％、または少なくとも95％を含む、請求項1に記載のグラム陰性細菌。
【請求項３】
完全な前記莢膜多糖遺伝子クラスターを含む、請求項1に記載のグラム陰性細菌。
【請求項４】
前記多糖が、前記莢膜多糖のエピトープを含む、請求項1に記載のグラム陰性細菌。
【請求項５】
エシェリキア属の種、大腸菌、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、サルモネラ属の種、イェルシニア属の種、ナイセリア属の種、ビブリオ属の種およびシュードモナス属の種からなる群より選択される、請求項1に記載のグラム陰性細菌。
【請求項６】
大腸菌である、請求項5に記載のグラム陰性細菌。
【請求項７】
前記調節遺伝子が肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）調節遺伝子である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項８】
前記肺炎連鎖球菌調節遺伝子が、肺炎連鎖球菌1型に由来する、請求項7に記載のグラム陰性細菌。
【請求項９】
前記肺炎連鎖球菌調節遺伝子が、肺炎連鎖球菌4型に由来する、請求項7に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１０】
前記調節遺伝子が、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）調節遺伝子である、請求項1〜9のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１１】
前記調節遺伝子が、B群溶血性連鎖球菌（Staphylococcus agalactiae）調節遺伝子である、請求項1〜10のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１２】
前記調節遺伝子が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）調節遺伝子である、請求項1〜11のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１３】
オリゴサッカリルトランスフェラーゼをさらに含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１４】
前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、前記グラム陰性細菌にとって異種である、請求項13に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１５】
少なくとも1種の異種グリコシルトランスフェラーゼをさらに含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１６】
前記異種グリコシルトランスフェラーゼが原核生物グリコシルトランスフェラーゼである、請求項15に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１７】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、前記調節遺伝子と同じグラム陽性細菌から取得される、請求項16に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１８】
前記グラム陰性細菌にとってネイティブの1種以上の遺伝子が欠失されているか、または不活性化されている、請求項1〜17のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１９】
前記1種以上の欠失された遺伝子が、waaL遺伝子を含む、請求項18に記載のグラム陰性細菌。
【請求項２０】
前記1種以上の欠失された遺伝子が、前記グラム陰性細菌でのO抗原生合成に関連するすべての遺伝子を含む、請求項18に記載のグラム陰性細菌。
【請求項２１】
前記調節遺伝子が、wzg、wzh、wzd、wze、capA、capB、またはcapCである、請求項1〜20のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項２２】
グリコシル化のためのコンセンサス配列を含む担体タンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項２３】
前記担体タンパク質をコードする核酸が、前記グラム陰性細菌にとって異種である、請求項22に記載のグラム陰性細菌。
【請求項２４】
前記担体タンパク質が、緑膿菌（P. aeruginosa）由来の無毒化型外毒素A、CRM197、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の無毒化型溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化型変異体、コレラ毒素Bサブユニット（CTB）、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化型変異体、大腸菌satタンパク質、大腸菌satタンパク質のパッセンジャードメイン（passenger domain）、C.ジェジュニ（C. jejuni）AcrA、C.ジェジュニ天然糖タンパク質、肺炎連鎖球菌ニューモリシン、肺炎連鎖球菌NOX、肺炎連鎖球菌PspA、肺炎連鎖球菌PcpA、肺炎連鎖球菌PhtD、肺炎連鎖球菌PhtE、肺炎連鎖球菌Ply、または肺炎連鎖球菌LytBである、請求項22に記載のグラム陰性細菌。
【請求項２５】
前記担体タンパク質が肺炎連鎖球菌タンパク質である、請求項22に記載のグラム陰性細菌。
【請求項２６】
前記担体タンパク質が、オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより多糖にコンジュゲートされる、請求項22または24に記載のグラム陰性細菌。
【請求項２７】
前記莢膜多糖が、肺炎連鎖球菌CPS1、CPS2、CPS3、CP4、CPS5、CPS6（AおよびB）、CPS7（A、B、C）、CPS8、CPS9（A、L、N、V）、CPS10（A、B、C、F）、CPS11（A、B、C、D、F）、CPS12（A、B、F）、CPS13、CPS14、CPS15（A、B、C、F）、CPS16（A、F）、CPS17（A、F）、CPS18（A、B、C、F）、CPS19（A、B、C、F）、CPS20、CPS21、CPS22（A、F）、CPS23（A、B、F）、CPS24（A、B、F）、CPS25（A、F）、CPS26、CPS27、CPS28（A、F）、CPS29、CPS31、CPS32（A、F）、CPS33（A、B、C、D、F）、CPS34、CPS35（A、B、C、D、F）、CPS36、CPS37、CPS38、CPS39、CPS40、CPS41（A、F）、CPS42、CPS43、CPS44、CPS45、CPS46、CPS47（A、F）、もしくはCPS48；または黄色ブドウ球菌CPS5、もしくはCPS8；B群溶血性連鎖球菌（B群、GBS）CPSIa、CPSIb、CPSII、CPSIII、CPSIV、CPSV、CPSVI、CPSVII、もしくはCPSVIII；またはエンテロコッカス・フェカリスCPSA、CPSB、CPSC、もしくはCPSDである、請求項1〜26のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項２８】
グラム陰性細菌で複製可能なベクターであって、グラム陽性細菌での莢膜多糖生合成と関連する調節遺伝子を含む、上記ベクター。
【請求項２９】
UDP-グルコース：ウンデカプレニルリン酸グルコース-リン酸トランスフェラーゼ活性の発現および活性が増大している、請求項1〜27のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項３０】
腸内一般細菌（例えば、大腸菌W3110）のコラン酸wcaオペロンによりコードされるWcaJを発現する、請求項1〜27のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項３１】
多糖の生成のための、遺伝子操作されたグラム陰性細菌であって、該グラム陰性細菌のGtr酵素をコードする遺伝子が機能的に不活性化されている、上記グラム陰性細菌。
【請求項３２】
Gtr酵素をコードする遺伝子の機能的不活性化が、Und-P連結型グルコースの除去をもたらす、請求項31に記載のグラム陰性細菌。
【請求項３３】
前記グラム陰性細菌のGtr酵素をコードする遺伝子が欠失されている、請求項31に記載のグラム陰性細菌。
【請求項３４】
GtrA、GtrBおよび/またはGtrSをコードする遺伝子が機能的に不活性化されている、請求項31または33に記載のグラム陰性細菌。
【請求項３５】
GtrA、GtrBおよび/またはGtrSをコードする遺伝子が欠失されている、請求項34に記載のグラム陰性細菌。
【請求項３６】
前記グラム陰性細菌のGtr酵素をコードする遺伝子が機能的に不活性化されている、請求項1〜27のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項３７】
前記グラム陰性細菌のGtr酵素をコードする遺伝子が欠失されている、請求項36に記載のグラム陰性細菌。
【請求項３８】
GtrA、GtrBおよび/またはGtrSをコードする遺伝子が機能的に不活性化されている、請求項36または37に記載のグラム陰性細菌。
【請求項３９】
GtrA、GtrBおよび/またはGtrSをコードする遺伝子が欠失されている、請求項38に記載のグラム陰性細菌。
【請求項４０】
エシェリキア属の種、大腸菌、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、サルモネラ属の種、イェルシニア属の種、およびシュードモナス属の種からなる群より選択される、請求項31に記載のグラム陰性細菌。
【請求項４１】
オリゴサッカリルトランスフェラーゼをさらに含む、請求項31〜40のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項４２】
前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、前記グラム陰性細菌にとって異種である、請求項41に記載のグラム陰性細菌。
【請求項４３】
前記グラム陰性細菌にとって異種である少なくとも1種のグリコシルトランスフェラーゼをさらに含む、請求項31〜40のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項４４】
前記グリコシルトランスフェラーゼが原核生物グリコシルトランスフェラーゼである、請求項43に記載のグラム陰性細菌。
【請求項４５】
グリコシル化のためのコンセンサス配列を含む担体タンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項31〜40のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項４６】
前記担体タンパク質をコードする核酸が、前記グラム陰性細菌にとって異種である、請求項45に記載のグラム陰性細菌。
【請求項４７】
前記担体タンパク質が、緑膿菌（P. auruginosa）由来の無毒化型外毒素A、CRM197、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の無毒化型溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化型変異体、コレラ毒素Bサブユニット（CTB）、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化型変異体、大腸菌satタンパク質、大腸菌satタンパク質のパッセンジャードメイン、C.ジェジュニAcrA、およびC.ジェジュニ天然糖タンパク質である、請求項45に記載のグラム陰性細菌。
【請求項４８】
前記担体タンパク質が、オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより多糖にコンジュゲートされる、請求項45に記載のグラム陰性細菌。
【請求項４９】
前記多糖が肺炎連鎖球菌の莢膜多糖である、請求項31に記載のグラム陰性細菌。
【請求項５０】
前記多糖が、大腸菌O抗原（O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186、O187）、サルモネラ属の種（S.エンテリカ亜種エンテリカ（S. enterica subsp. Enterica）、S.エンテリカ亜種サラマエ（S. enterica subsp. Salamae）、S.エンテリカ亜種アリゾナエ（S. enterica subsp. arizonae）、S.エンテリカ亜種ジアリゾナエ（S. enterica subsp. Diarizonae）、S.エンテリカ亜種ホウテナエ（S. enterica subsp. Houtenae）、S.ボンゴリ（S. bongori）、およびS.エンテリカ亜種インディカ（S. enterica subsp. Indica）、およびO 1〜67型、シュードモナス属の種（緑膿菌O血清型1〜20）、クレブシエラ属の種（特に、K.ニューモニエ（K. pneumonia）血清型O1、O2（および下位血清型）、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12）、アシネトバクター属O抗原（特に、A.バウマンニイ（A. baumannii）O抗原）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）O抗原（血清型A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L1、L2、L3）、コレラ菌（Vibrio cholera）O抗原O1〜155、リステリア属の種、特にL.モノサイトゲネス（L. monocytogenes）1型、2型、3型、4型およびそれらの下位血清型、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）血清型1〜15 O抗原、ボルデテラ・パラペルツッシス（Bordetella parapertussis）O抗原、ブルクホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）およびシュードマレイ（pseudomallei）O抗原、野兎病菌（Francisella tularensis）、カンピロバクター属の種（C.ジェジュニ）；クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）（血清型A、G、H、K、S1、S4、D、Cd-5、およびウェルシュ菌（C. perfringens）血清型A、B、C、DおよびE）の莢膜多糖、黄色ブドウ球菌5型および8型、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyrogenes）（B群連鎖球菌莢膜血清型多糖）、大腸菌、B群溶血性連鎖球菌（Streptococcus agalacticae）（A群連鎖球菌莢膜多糖）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）（血清型A、B、C、W、Y、X）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、エンテロコッカス・フェカリス莢膜多糖I〜V型；ならびに他の表面多糖構造、例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）糖脂質）、髄膜炎菌ピリン（pilin）Oグリカンおよびリポオリゴ糖（lipooligosaccharide）（LOS）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）LOS、リューシュマニア属主要リポホスホグリカン（Leishmania major lipophosphoglycan）、腫瘍関連炭水化物抗原、マラリアグリコシルホスファチジルイノシトール（malaria glycosyl phosphatidylinositol）、またはヒト��結核菌（mycobacterium tuberculosis）アラビノマンナンである、請求項31〜48のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項５１】
請求項1〜27および29〜50のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌により生成される組み換え糖タンパク質。
【請求項５２】
タンパク質の産生に好適な条件下で請求項1〜27および29〜50のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌を培養するステップを含む、組み換え糖タンパク質の生成方法。
【請求項５３】
前記組み換え糖タンパク質を精製するステップをさらに含む、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
プレシオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）O抗原遺伝子クラスターを含む遺伝子操作された大腸菌細胞であって、該O抗原遺伝子クラスターのwbgW遺伝子が不活性化されており、該大腸菌細胞がUnd-PP-D-FucNAc4Nを生成する、上記大腸菌細胞。
【請求項５５】
ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）またはプレシオモナス・シゲロイデスO17 O抗原遺伝子クラスターを含む遺伝子操作された大腸菌細胞であって、該O抗原遺伝子クラスターのwbgW遺伝子が不活性化されており、該大腸菌細胞がUnd-PP-D-FucNAc4Nを生成する、上記大腸菌細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1-導入
in vivoでの糖コンジュゲート（glycoconjugate）生成能が高い原核生物細胞、ならびにこれらの細胞を作製する方法および糖コンジュゲートを生成するためにこれらの細胞を使用する方法が、本明細書中に提供される。言及される糖コンジュゲートの組成物ならびにそれらの種々の用途もまた含まれる。
【背景技術】
【０００２】
2-背景
グリコシル化は、それによって炭水化物分子または糖（単糖、二糖、オリゴ糖もしくは多糖）がタンパク質またはポリペプチド中の様々なアミノ酸残基の側鎖に連結されて、糖タンパク質が生成されるプロセスである。
【０００３】
糖タンパク質は、細胞相互作用および細胞シグナル伝達などのいくつかのプロセスに関与し；それらはタンパク質フォールディング、オリゴマー化、安定性、品質管理、ソーティングならびに分泌タンパク質および膜タンパク質の輸送に参加する。タンパク質グリコシル化は、タンパク質の抗原性、安定性および半減期に対して非常に有益な影響を有する。
【０００４】
炭水化物分子とタンパク質担体中のアミノ酸残基との間の結合のタイプに応じて、糖タンパク質の異なる分類（sort）がある。
【０００５】
N結合型タンパク質グリコシル化（標的タンパク質のポリペプチド鎖中のアスパラギン残基への炭水化物分子の付加）は、真核生物の小胞体で生じる翻訳後修飾のうちの最も一般的なタイプである。このプロセスは、小胞体中で保存された配列Asn-X-Ser/Thr（Xはプロリンを除くいずれかのアミノ酸）内での新生タンパク質のアスパラギン残基への、脂質担体（ドリコールリン酸）からの予め組み立てられたオリゴ糖の転移を担う、酵素的オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（oligosaccharyltransferase）複合体（OST）により遂行される。次に、糖鎖がゴルジ装置での他の修飾に供される。N結合型グリコシル化プロセスは、真核生物で、および古細菌で幅広く起こるが、細菌では非常に稀にしか起こらない（以下を参照されたい）。
【０００６】
O結合型グリコシル化は、真核生物、古細菌および細菌で起こるグリコシル化の一形態である。これは、タンパク質標的のアミノ酸残基中の酸素原子への糖分子の連結である。
【０００７】
一種の細菌である食品由来病原菌カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）は、該細菌がそれ自体のグリコシル化機構を有するという事実により、そのタンパク質をN-グリコシル化することもできることが示されている（Wacker et al., Science. 2002; 298(5599):1790-3）。この反応に関与する機構は、pgl（protein glycosylation）と称されるクラスターによりコードされる。
【０００８】
C.ジェジュニのグリコシル化機構を大腸菌に移動させて、大腸菌細胞により発現される組み換えタンパク質のグリコシル化を可能にすることができる。以前の研究により、N-グリコシル化を行なうことができる大腸菌株をどのようにして作製するかが実証されている（例えば、Wacker et al., Science. 2002; 298 (5599):1790-3；Nita-Lazar et al., Glycobiology. 2005; 15(4):361-7；Feldman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102(8):3016-21；Kowarik et al., EMBO J. 2006; 25(9):1957-66；Wacker et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103(18):7088-93；国際公開第2003/074687号、同第2006/119987号、同第2009/104074号、および同第2011/06261号、ならびに同第2011/138361号を参照されたい）。
【０００９】
細菌は、莢膜多糖により囲まれていることが多い一重鞘細胞膜または二重鞘細胞膜のいずれを有するかに応じて、グラム陽性とグラム陰性の2つの群に分けられる。そのような細菌の例としては、ストレプトコッカス属の種、シュードモナス属の種、ナイセリア属の種、サルモネラ属の種、エシェリキア属の種、スタフィロコッカス属の種、カンピロバクター属の種などが挙げられる。医学的および商業的に最も重要な感染性因子の1つは、グラム陽性病原菌である肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）である。
【００１０】
肺炎連鎖球菌は、世界中で軽症および重症の両方の感染症の主要な原因である。肺炎球菌感染（pneumococcal infection）に関連する主な臨床症状は、肺炎、髄膜炎、血流感染および急性中耳炎であり、肺炎が有病率および死亡率に関してそれらのうちで最も重要である。肺炎連鎖球菌により引き起こされる感染は、幼齢者および高齢者で特に相当な疾病負担の原因である（Isaacman DJ, M. E., Reinert RR. 2010.  Burden of invasive pneumococcal disease and serotype distribution among Streptococcus pneumoniae isolates in young children in Europe: impact of the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine and considerations for future conjugate vaccines. Int J Infect Dis. 14:197-209）。
【００１１】
肺炎球菌（pneumococci）は、その化学的および血清学的に異なる莢膜多糖に基づいて、いくつかの血清型（約93種）にグループ分けされる。一部の血清型は他のものよりも豊富であり、臨床的に明らかな感染に関連し、重篤な侵襲性感染を引き起こし、1種以上のクラスの抗生物質に対する耐性を獲得する（Rueda, A. M. M., MSc; Serpa, Jose A. MD; Matloobi, Mahsa MD; Mushtaq, Mahwish MD; Musher, Daniel M. MD. 2010.  The spectrum of invasive pneumococcal disease at an adult tertiary care hospital in the early 21st century. Medicine (Baltimore) 89:331-336）。多糖類莢膜での構造的差異に基づいて、肺炎連鎖球菌の特徴的な血清型が特定されている。以前の解析によれば、約10種または11種の血清型が、世界の全領域での侵襲的な小児科感染症の70％超を占める（Hausdorff WP, Bryant J, Paradiso PR, Siber GR: Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America 2000, 30(1):100-121）。疾患を引き起こす血清型の分布は、年齢、疾患症候群、疾患重症度、地理的地域により、および時間の経過により変化する。ペニシリン、エリスロマイシン、コトリモキサゾールまたは多剤に対して耐性である肺炎球菌が、多くの領域で一般的である（Evolving trends in Streptococcus pneumoniae resistance: implications for therapy of community-acquired bacterial pneumonia. Jones RN, Jacobs MR, Sader HS. Int J Antimicrob Agents. 2010 Sep;36(3):197-204）。
【００１２】
肺炎球菌莢膜は、主要な細菌毒性因子のうちの1つであり、種々のワクチンで抗原として成功裏に用いられてきている。莢膜多糖に対する抗体は、肺炎球菌感染に対して保護的であることが示されている（Musher DM PH, Watson DA, Baughn RE: Antibody to capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae at the time of hospital admission for Pneumococcal pneumonia. J Infect Dis 2000, 182(1):158-167；Isaacman DJ ME, Reinert RR: Burden of invasive pneumococcal disease and serotype distribution among Streptococcus pneumoniae isolates in young children in Europe: impact of the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine and considerations for future conjugate vaccines. Int J Infect Dis 2010, 14(3):197-209）。
【００１３】
肺炎球菌莢膜多糖（CPS）合成経路は、血清型（約93種）に応じて異なる。シンターゼ経路により合成される3型および37型を除いて（Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA et al: Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes. PLoS genetics 2006, 2(3):e31）、肺炎球菌CPSは一般的に、O-抗原-フリッパーゼ（Wzx）/ポリメラーゼ（Wzy）依存的経路により合成される（図1）。
【００１４】
CPSは、段階的アプローチにより、担体脂質上で共通前駆体（例えば、ヌクレオチド活性化型単糖）から組み立てられる。まず、種々のグリコシルトランスフェラーゼにより膜の細胞質側で担体上に反復単位が組み立てられる。脂質連結型オリゴ糖が、次に、膜の外側へとフリップ（flip）されて、ここで反復単位が重合（ポリマー化）される。完全なCPSは担体脂質から放出され、表面へと運び出される。
【００１５】
細菌多糖は、それらがT細胞エピトープを含むタンパク質担体にカップリングされている場合には、ヒトで長期的免疫応答を惹起することができる。この構想は、ほとんど100年前に練られ（Avery, O.  T., and W.  F.  Goebel, 1929.  Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.  Immunological specificity of synthetic sugar-proteins.  J. Exp. Med.  50:521-533）、タンパク質担体であるジフテリア毒素にカップリングされたB型インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）（HIB）の多糖に関して後に証明された（Anderson, P. 1983.  Antibody responses to Haemophilus influenzae type b and diphtheria toxin induced by conjugates of oligosaccharides of the type b capsule with the nontoxic protein CRM197. Infect Immun 39:233-8；Schneerson, R., O. Barrera, A. Sutton, and J. B. Robbins. 1980.  Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates. J Exp Med 152:361-76）。この糖コンジュゲートはまた、1987年に米国で認可された最初のコンジュゲートワクチンでもあり、その後すぐに米国幼児予防接種スケジュールに導入された。HIBに加えて、莢膜性ヒト病原菌である髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）および肺炎連鎖球菌に対してコンジュゲートワクチンが成功裏に開発されている。これらのワクチンの常用は、鼻咽頭での定着（nasopharyngeal colonization）ならびに感染を減少させている。現在、世界的ワクチン市場の約25％がコンジュゲートワクチンを含む。
【００１６】
コンジュゲートワクチンは、細菌感染症を防ぐために、成功裏に用いられている。タンパク質担体への抗原性多糖のコンジュゲートは、多糖がT細胞非依存性抗原であるので、保護的記憶応答に対して必要とされる。多糖は、多糖中ならびにタンパク質担体中の活性化反応性基を用いて、様々な化学的方法によりタンパク質担体へとコンジュゲート化されている（Pawlowski, A., G. Kallenius, and S. B. Svenson. 2000.  Preparation of pneumococcal capsular polysaccharide-protein conjugates vaccines utilizing new fragmentation and conjugation technologies. Vaccine 18:1873-1885；Robbins, J. B., J. Kubler-Kielb, E. Vinogradov, C. Mocca, V. Pozsgay, J. Shiloach, and R. Schneerson. 2009.  Synthesis, characterization, and immunogenicity in mice of Shigella sonnei O-specific oligosaccharide-core-protein conjugates. Proc Natl Acad Sci U S A 106:7974-7978）。
【００１７】
コンジュゲートワクチンは、細菌感染から小児を保護するために小児に投与することができ、成人に長期的免疫応答をもたらすことができる。本発明の構築物は、動物でIgG応答を生じることが見出されている。多糖（すなわち、糖残基）が、糖特異的な短期的免疫応答を引き起こすと考えられる。実際に、ヒト免疫系は、O-抗原および莢膜多糖などの細菌の特異的多糖表面構造に対して強い応答を生じる。しかしながら、多糖に対する免疫応答がIgM依存性である場合、免疫系は記憶を発生させない。しかしながら、多糖を担持するタンパク質担体は、T細胞依存性であり、免疫系が記憶を発生させるので、長期的保護をもたらすIgG応答を引き起こす。この理由のために、タンパク質担体-多糖コンジュゲートとしてワクチンを開発するのが有利である。
【００１８】
純粋な肺炎球菌多糖ワクチンが低年齢小児で重要な血清型に対して保護的免疫応答を誘導できないために、幼児予防接種（免疫化）に関するそれらの検討が排除されている。
【００１９】
今日まで、肺炎球菌疾患に対するワクチンは、よく確立された化学的コンジュゲート技術によりin vitroで合成されている。抗原性莢膜多糖が、病原性生物から抽出され、精製され、化学的に活性化され、かつ好適なタンパク質担体にコンジュゲートされる。現在、糖コンジュゲートを生成するために用いられる様々なタンパク質担体がある（例えば、CRM197（ジフテリアトキソイド）、破傷風トキソイド、およびインフルエンザ菌プロテインD）。
【００２０】
7価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（PCV7）は、数年前に認可され、WHOの戦略諮問委員会（Strategic Advisory Group of Experts；SAGE）により、高い疾病負担を有する発展途上国での使用に関して推奨されてきた（Vaccine 2012 Jul 6;30(32):4717-8. Epub 2012 May 20.  Pneumococcal vaccines WHO position paper - 2012 - recommendations. WHO Publication）。10価（PCV10）および13価（PCV13）コンジュゲートワクチンが、同様に様々な国で認可されている。追加のコンジュゲートワクチンが、様々な開発段階にある（Jiang SM, Wang L and Reeves PR: Molecular characterization of Streptococcus pneumoniae type 4, 6B, 8, and 18C capsular polysaccharide gene clusters. Infect Immun 2001, 69(3):1244-1255）。
【００２１】
化学的コンジュゲートワクチンの製造に関して、いくつかの問題が明らかになっている。コンジュゲートのための多糖の化学的処理が、多糖の天然のコンホメーションを害することが示されており、このことは、抗原の品質に影響を及ぼし、結果として、最終生成物の抗原性および免疫原性に影響する（Impact of the conjugation method on the immunogenicity of Streptococcus pneumoniae serotype 19F polysaccharide in conjugate vaccines, Poolman J, Frasch C, Nurkka A, Kayhty H, Biemans R, Schuerman L.Clin Vaccine Immunol. 2011 Feb;18(2):327-36. Epub 2010 Dec 1）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】国際公開第2003/074687号
【特許文献２】国際公開第2006/119987号
【特許文献３】国際公開第2009/104074号
【特許文献４】国際公開第2011/06261号
【特許文献５】国際公開第2011/138361号
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Wacker et al., Science. 2002; 298(5599):1790-3
【非特許文献２】Nita-Lazar et al., Glycobiology. 2005; 15(4):361-7
【非特許文献３】Feldman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102(8):3016-21
【非特許文献４】Kowarik et al., EMBO J. 2006; 25(9):1957-66
【非特許文献５】Wacker et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103(18):7088-93
【非特許文献６】Isaacman DJ, M. E., Reinert RR. 2010.  Burden of invasive pneumococcal disease and serotype distribution among Streptococcus pneumoniae isolates in young children in Europe: impact of the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine and considerations for future conjugate vaccines. Int J Infect Dis. 14:197-209
【非特許文献７】(Rueda, A. M. M., MSc; Serpa, Jose A. MD; Matloobi, Mahsa MD; Mushtaq, Mahwish MD; Musher, Daniel M. MD. 2010.  The spectrum of invasive pneumococcal disease at an adult tertiary care hospital in the early 21st century. Medicine (Baltimore) 89:331-336
【非特許文献８】Hausdorff WP, Bryant J, Paradiso PR, Siber GR: Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America 2000, 30(1):100-121
【非特許文献９】Evolving trends in Streptococcus pneumoniae resistance: implications for therapy of community-acquired bacterial pneumonia. Jones RN, Jacobs MR, Sader HS. Int J Antimicrob Agents. 2010 Sep;36(3):197-204
【非特許文献１０】Musher DM PH, Watson DA, Baughn RE: Antibody to capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae at the time of hospital admission for Pneumococcal pneumonia. J Infect Dis 2000, 182(1):158-167
【非特許文献１１】Isaacman DJ ME, Reinert RR: Burden of invasive pneumococcal disease and serotype distribution among Streptococcus pneumoniae isolates in young children in Europe: impact of the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine and considerations for future conjugate vaccines. Int J Infect Dis 2010, 14(3):197-209
【非特許文献１２】Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA et al: Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes. PLoS genetics 2006, 2(3):e31
【非特許文献１３】Avery, O.  T., and W.  F.  Goebel, 1929.  Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.  Immunological specificity of synthetic sugar-proteins.  J. Exp. Med.  50:521-533
【非特許文献１４】Anderson, P. 1983.  Antibody responses to Haemophilus influenzae type b and diphtheria toxin induced by conjugates of oligosaccharides of the type b capsule with the nontoxic protein CRM197. Infect Immun 39:233-8
【非特許文献１５】Schneerson, R., O. Barrera, A. Sutton, and J. B. Robbins. 1980.  Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates. J Exp Med 152:361-76
【非特許文献１６】Pawlowski, A., G. Kallenius, and S. B. Svenson. 2000.  Preparation of pneumococcal capsular polysaccharide-protein conjugates vaccines utilizing new fragmentation and conjugation technologies. Vaccine 18:1873-1885
【非特許文献１７】Robbins, J. B., J. Kubler-Kielb, E. Vinogradov, C. Mocca, V. Pozsgay, J. Shiloach, and R. Schneerson. 2009.  Synthesis, characterization, and immunogenicity in mice of Shigella sonnei O-specific oligosaccharide-core-protein conjugates. Proc Natl Acad Sci U S A 106:7974-7978
【非特許文献１８】Vaccine 2012 Jul 6;30(32):4717-8. Epub 2012 May 20.  Pneumococcal vaccines WHO position paper - 2012 - recommendations. WHO Publication
【非特許文献１９】Jiang SM, Wang L and Reeves PR: Molecular characterization of Streptococcus pneumoniae type 4, 6B, 8, and 18C capsular polysaccharide gene clusters. Infect Immun 2001, 69(3):1244-1255
【非特許文献２０】Poolman J, Frasch C, Nurkka A, Kayhty H, Biemans R, Schuerman L.Clin Vaccine Immunol. 2011 Feb;18(2):327-36. Epub 2010 Dec 1
【発明の概要】
【００２４】
3-発明の概要
本発明は、肺炎球菌細胞由来の多糖を含有する糖コンジュゲートワクチンを生成する新規な方法を記載する。この革新的な肺炎球菌ワクチンは、グラム陽性細菌のオリゴ糖または多糖生合成に関与する調節遺伝子を、グラム陰性宿主菌株でオリゴ糖または多糖を効率的に合成するために用いることができること、およびこのようにして生成されたオリゴ糖または多糖は、グラム陰性宿主細胞で糖コンジュゲートワクチンを製造するために用いることができるという発見に基づく。本発明のさらなる新規かつ予期しない特徴は、非限定的に、下記で説明される実施形態を含む。
【００２５】
本発明は、肺炎球菌多糖に基づくコンジュゲートワクチンの生成のための独自の手順を記載する。手順は、様々なステップに基づく：
(i)多糖の生成効率を増強する調節遺伝子を用いる、大腸菌でのウンデカプレニルピロリン酸（Und-PP）連結型O抗原様多糖としての肺炎球菌多糖の組み換え生成；
(ii)多糖生成をより効率的にするために当初の菌株の特定の機能を欠失させることによる、好適な産生菌株の開発；
(iii)大腸菌での肺炎球菌多糖の効率的な組み換え合成を可能にする好適なDNA構築物の設計；
(iv)オリゴサッカリルトランスフェラーゼによるアクセプタータンパク質への多糖のin vivoでの効率的コンジュゲートのための方法。
4-図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】肺炎連鎖球菌の莢膜多糖生合成経路の遺伝子構成を示す図である。in vivoコンジュゲートのために使用される肺炎連鎖球菌株の莢膜多糖生合成経路の一般的遺伝子構成の模式図である。
【図２】CPS1生合成に関連する遺伝子構成を示す図である。CPS1遺伝子構成であるwzg〜rmlDは、莢膜多糖生合成に関与する遺伝子である。
【図３】CPS1サブユニットを示す図である。CPS1サブユニットの模式図である。
【図４】ソンネ赤痢菌（S. sonnei）およびP.シゲロイデス（P. shigelloides）由来のO抗原サブユニットを示す図である。ソンネ赤痢菌およびP.シゲロイデス反復単位の模式図である。
【図５】P.シゲロイデスO17抗原クラスターを示す図である。プレシオモナス・シゲロイデスO17 O抗原クラスターである。
【図６】大腸菌での肺炎連鎖球菌CPS1多糖の生成を示す図である。大腸菌での肺炎連鎖球菌CPS1多糖の生成。完全CPS1生合成遺伝子、wzg〜ugdを含むプラスミドpGVX767を用いて形質転換された種々の大腸菌株由来の、プロテイナーゼK処理全細胞抽出物のウエスタンブロット分析。レーン1：タンパク質マーカー；レーン2：大腸菌GVX2174（W3110 ΔwaaL ΔwecAwzzECA ΔrfbO16::rfbP.シゲロイデスO17-clmR）；レーン3：pGVX767を用いて形質転換された大腸菌GVX2174（プロモーターをコードするpLAFR、RBS、および1型CPSのwzg〜ugd）；レーン4および5：pGVX767を用いて形質転換された大腸菌GVX3329（＝GVX2174 wbgW::clmR＝W3110 ΔwaaL ΔwecAwzzECA ΔrfbO16::( rfbP.シゲロイデスO17 ΔwbgW::clmR)）。サンプルは、MESを用いて12％Bis-Trisゲル（invitrogen社）にて35分間、200Vで泳動し、続いてiBlotでブロットし、一次抗体としての抗CP1抗体（1：250）により発色させた。clmRはクロラムフェニコール（clm）耐性を付与するDNAセグメント（すなわち、clm耐性カセット）を示す。
【図７】大腸菌で生成されたCPS1多糖に関する酸処理に対する感受性を示す図である。プラスミドpGVX767（完全CPS1生合成遺伝子、wzg〜ugdを含む）を用いて形質転換された大腸菌GVX3329のウエスタンブロット分析。レーン1、3：2つの異なるコロニーの全細胞抽出物のプロテイナーゼK処理物；レーン2および4：対応する抽出物のTFA処理物；レーン5：タンパク質マーカー。サンプルは、MESバッファーを用いて12％Bis-Tris PAGEゲルにて35分間、200Vで泳動し、続いて、電気ブロットし、一次抗体としての抗CP1抗体（1：250）により発色させた。
【図８】肺炎連鎖球菌CPS1でのトランスポーター遺伝子の欠失の影響を示す図である。大腸菌での肺炎連鎖球菌CPS1多糖の生合成に対する、莢膜多糖トランスポーター遺伝子であるwzg、wzh、wzd、およびwzeの欠失の影響。プラスミドpGVX808（＝pGVX767 Δwzg-wze::clmR）（レーン2〜5）およびpGVX767（完全CPS1クラスター）（レーン6）を用いて形質転換された大腸菌GVX3329の4種類の異なるコロニーの全細胞抽出物（プロテイナーゼK消化）のウエスタンブロット分析。サンプルは、MESを用いて12％Bis-Trisゲル（invitrogen社）にて35分間、200Vで泳動し、続いてiBlotでブロットし、一次抗体としての抗CP1抗体（1：250）により発色させた。
【図９】遺伝子操作された大腸菌由来の肺炎連鎖球菌CPS 1型を含むN-グリコシル化EPAのHis-Trap精製ステップを示す図である。遺伝子操作された大腸菌由来の肺炎連鎖球菌莢膜多糖1型群を含むN-グリコシル化EPAのHisTrap精製ステップ。パネルAおよびBは、抗Hisおよび抗CP1によりそれぞれ発色させたEPA-CP1コンジュゲートの精製ステップからのタンパク質サンプルのウエスタンブロットを示す。タンパク質サンプルを分離する（resolve）ために、4〜12％Bis-Tris PAGEゲルを用いた。pGVX767、pGVX114、およびpGVX150を用いて形質転換された大腸菌株GVX3329（＝GVX2174 wbgW::clmR＝W3110 ΔwaaL ΔwecAwzzECA ΔrfbO16::( rfbP.シゲロイデスO17 ΔwbgW::clmR)）を用いた。
【図１０】CPS4サブユニットの模式図である。
【図１１】CPS4の遺伝子構成を示す図である。CPS4遺伝子構成、wzg〜fnlCは、莢膜多糖の生合成に関与する遺伝子である。
【図１２】大腸菌での肺炎連鎖球菌CPS4多糖の生成を示す図である。種々の大腸菌株由来のプロテイナーゼK処理全細胞抽出物のウエスタンブロット分析。レーン1：タンパク質マーカー；レーン2〜4：pGVX803（CPS4クラスター全体を発現する）およびpGVX238（Z3206、エピメラーゼ）を用いて形質転換された大腸菌W3110 ΔwaaL；レーン5〜7：pGVX803およびpGVX207（galE、エピメラーゼ）を用いて形質転換された大腸菌W3110 ΔwaaL；レーン8〜10：pGVX753（部分的CPS4クラスター、wcij〜fnlc、調節遺伝子およびwciIを除く）およびpGVX238を用いて形質転換された大腸菌W3110 ΔwaaL大腸菌。誘導のために0.1％アラビノースが用いられた。0.1 OD当量の培養バイオマスを、MESを用いて12％Bis-Trisゲルにて35分間、200Vで泳動し、続いてiBlotでブロットし、一次抗体としての抗CPS4抗体（1：100）により発色させた。
【図１３Ａ】大腸菌SCM6で生成された肺炎連鎖球菌CPS4の分析からの結果を示す。大腸菌で生成された肺炎連鎖球菌CPS4の分析。LLOを大腸菌SCM6から抽出し（Schwarz F, Huang W, Li C, Schulz BL, Lizak C, Palumbo A, Numao S, Neri D, Aebi M, Wang LX: A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol 2010）、以前に記載された通りに2ABを用いて標識した（米国特許出願公開第2011/0274720 A1号）。パネルA：pGVX803（pLAFR由来のCPS4クラスター全体を発現する） およびgalEエピメラーゼ（pGVX207、pMLBAD骨格）を用いて形質転換された大腸菌SCM6から抽出された2AB標識LLO（破線）を、空ベクターpLAFRおよびpMLBADを用いて形質転換されたバックグラウンド大腸菌株（実線）と比較するクロマトグラム。
【図１３Ｂ】大腸菌SCM6で生成された肺炎連鎖球菌CPS4の分析からの結果を示す。大腸菌で生成された肺炎連鎖球菌CPS4の分析。LLOを大腸菌SCM6から抽出し（Schwarz F, Huang W, Li C, Schulz BL, Lizak C, Palumbo A, Numao S, Neri D, Aebi M, Wang LX: A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol 2010）、以前に記載された通りに2ABを用いて標識した（米国特許出願公開第2011/0274720 A1号）。パネルB：53.9分で溶出されたCPS4ピークの単一反復単位のMS/MS分析（パネルA）。
【図１４】大腸菌SCM3で生成された肺炎連鎖球菌CPS4の分析の結果を示す図である（Faridmoayer A, Fentabil MA, Mills DC, Klassen JS, Feldman MF: Functional characterization of bacterial oligosaccharyltransferases involved in O-linked protein glycosylation. JOURNAL OF BACTERIOLOGY 2007, 189(22):8088-8098）。大腸菌で生成された肺炎連鎖球菌CPS4の分析。LLOを、大腸菌SCM3（Sφ874、ΔwaaL）から抽出し、記載された通りに2ABを用いて標識した（米国特許出願公開第2011/0274720 A1号）。pGVX771（調節遺伝子を除いて、CPS14クラスターのプロモーター、RBS、Z3206遺伝子、およびwciJ〜fnlcを含むpLAFR）を用いて形質転換された大腸菌SCM3から抽出された2AB標識LLO（実線）を、空ベクターpGVX725（プロモーターおよびRBSのみを含むpLAFR）を用いて形質転換されたバックグラウンド大腸菌SCM3株（破線）と比較するHPLCクロマトグラム。ピルベート（Pyr）を含むかまたは含まない、単一CPS4反復単位に合致する50.8分、53.6分および56.2分で溶出されたピークのMS分析。
【図１５Ａ】CPS4-LLOを用いたin vitro N-グリコシル化の分析からの結果を示す図である。CPS4脂質連結型オリゴ糖を用いたin vitro N-グリコシル化。LLOを、pGVX771（前図に記載）およびpGVX725（空ベクター）を用いて形質転換された大腸菌SCM3（Sφ874 ΔwaaL）から抽出した。in vitro反応は、反応バッファー中で精製C.ジェジュニPglB、蛍光標識ペプチドアクセプター（Tamra-DANYTK）およびLLO抽出物を一晩混合することにより完了させた。ペプチドは、有機相分離により反応混合物から分離され、UPLCおよびそれに続くMS分析に供された。パネルAおよびB：pGVX725（陰性対照）を含むSCM3およびpGVX771を含むSCM3から抽出されたLLOを用いるグリコシル化後のペプチドのUPLCクロマトグラム。
【図１５Ｂ】CPS4-LLOを用いたin vitro N-グリコシル化の分析からの結果を示す図である。CPS4脂質連結型オリゴ糖を用いたin vitro N-グリコシル化。LLOを、pGVX771（前図に記載）およびpGVX725（空ベクター）を用いて形質転換された大腸菌SCM3（Sφ874 ΔwaaL）から抽出した。in vitro反応は、反応バッファー中で精製C.ジェジュニPglB、蛍光標識ペプチドアクセプター（Tamra-DANYTK）およびLLO抽出物を一晩混合することにより完了させた。ペプチドは、有機相分離により反応混合物から分離され、UPLCおよびそれに続くMS分析に供された。パネルAおよびB：pGVX725（陰性対照）を含むSCM3およびpGVX771を含むSCM3から抽出されたLLOを用いるグリコシル化後のペプチドのUPLCクロマトグラム。
【図１５Ｃ】CPS4-LLOを用いたin vitro N-グリコシル化の分析からの結果を示す図である。CPS4脂質連結型オリゴ糖を用いたin vitro N-グリコシル化。LLOを、pGVX771（前図に記載）およびpGVX725（空ベクター）を用いて形質転換された大腸菌SCM3（Sφ874 ΔwaaL）から抽出した。in vitro反応は、反応バッファー中で精製C.ジェジュニPglB、蛍光標識ペプチドアクセプター（Tamra-DANYTK）およびLLO抽出物を一晩混合することにより完了させた。ペプチドは、有機相分離により反応混合物から分離され、UPLCおよびそれに続くMS分析に供された。パネルCおよびD：ペプチド上に組み立てられたCPS4の1つまたは2つの完全サブユニットに対応する15.43分および17.62分で溶出された糖ペプチドのMS/MS分析。
【図１５Ｄ】CPS4-LLOを用いたin vitro N-グリコシル化の分析からの結果を示す図である。CPS4脂質連結型オリゴ糖を用いたin vitro N-グリコシル化。LLOを、pGVX771（前図に記載）およびpGVX725（空ベクター）を用いて形質転換された大腸菌SCM3（Sφ874 ΔwaaL）から抽出した。in vitro反応は、反応バッファー中で精製C.ジェジュニPglB、蛍光標識ペプチドアクセプター（Tamra-DANYTK）およびLLO抽出物を一晩混合することにより完了させた。ペプチドは、有機相分離により反応混合物から分離され、UPLCおよびそれに続くMS分析に供された。パネルCおよびD：ペプチド上に組み立てられたCPS4の1つまたは2つの完全サブユニットに対応する15.43分および17.62分で溶出された糖ペプチドのMS/MS分析。
【図１６】肺炎連鎖球菌CPS4を含むN-グリコシル化EPAのHisTrap精製ステップを示す図である。遺伝子操作された大腸菌由来の肺炎連鎖球菌CPS4を含むN-グリコシル化EPAのHisTrap精製ステップ。大腸菌W3110ΔwaaLを、pGVX539、pGVX114、pGVX207およびpGVX803を用いて形質転換し、TB培地中で増殖させた。パネルA、BおよびCは、抗Hisおよび抗CP4によりそれぞれ発色させたEPA-CPS4コンジュゲートの精製ステップからのタンパク質サンプルのクーマシー染色およびウエスタンブロットを示す。タンパク質サンプルを分離するために、4〜12％Bis-Tris SDSゲルを用いた。pGVX539は、EPA担体タンパク質発現のための発現プラスミドであり、この場合、EPAは無毒化されており、2つのN-グリコシル化コンセンサス配列を含む。
【図１７】CPS4-EPA糖コンジュゲートのHPLC RP分析によるPMP誘導体化分析を示す図である。大腸菌で生成されたCPS4-EPA糖コンジュゲートのHPLC RP分析によるPMP誘導体化分析。実線：糖コンジュゲートの加水分解および分析から得られたトレース、破線：CP4莢膜多糖から同じく作成されたトレース。
【図１８】CPS4-EPAコンジュゲートを用いて免疫化されたウサギ由来血清のドットブロット分析を示す図である。CPS4-EPAコンジュゲートを用いて免疫化されたウサギ由来血清のドットブロット分析。肺炎連鎖球菌4型群から単離されたCPS4莢膜多糖50ngを、各スポットにブロットした。2回目の注入後に得られた血清を、1〜100倍希釈で分析のために用いた。レーン1：本研究で用いたウサギの未免疫血清のプール；レーン2〜7：EPA-CPS4を注入された異なるウサギ由来の血清；レーン8〜9：水酸化アルミニウムおよびフロイント完全アジュバント（Freund’s complete adjuvans）をそれぞれ含有するバッファーを注入された対照ウサギの血清；レーン10〜11：プレベナー13（Prevenar-13）を注入された陽性対照ウサギの血清；レーン12〜13：Statens serum institute社製の一次抗体としての肺炎球菌（Pneumococoal）抗血清4型を、1：100希釈および1：200希釈でそれぞれ用いた。
【図１９】CPSの生合成に関与する遺伝子のCPS14遺伝子構成を説明する図である。CPS14遺伝子構成、wzg〜wciYは、莢膜多糖の生合成に関与する遺伝子である。
【図２０】CPS14サブユニットの模式図である。
【図２１Ａ】大腸菌でのCPS14 LLOの発現を示す図である。CPS14由来のwchA遺伝子〜wciY遺伝子を、O16 O抗原クラスター（rfbO16）プロモーターを含む遺伝子置換ベクターpDOC-C（pGVX615）へとクローニングし、大腸菌GVX1128（W3110ΔwaaL）に形質転換した。パネルA：pGVX615wzymut（単一サブユニットを生成するCPS14ポリメラーゼ突然変異体）を用いて形質転換した大腸菌GVX1128由来の2AB標識LLO（実線）を、バックグラウンド菌株から抽出したLLO（破線）と比較するクロマトグラム；挿入図は、一次抗体としての抗CPS14抗体によりプローブされた、pGVX615を用いて形質転換されたプロテイナーゼK消化大腸菌GVX1128のウエスタンブロットである。
【図２１Ｂ】大腸菌でのCPS14 LLOの発現を示す図である。CPS14由来のwchA遺伝子〜wciY遺伝子を、O16 O抗原クラスター（rfbO16）プロモーターを含む遺伝子置換ベクターpDOC-C（pGVX615）へとクローニングし、大腸菌GVX1128（W3110ΔwaaL）に形質転換した。パネルB：57分で溶出されたCPS14の単一サブユニット（パネルAで矢印で示される）のMS/MS分析。
【図２２】コラン酸（colanic acid）（CA）がCPS14クラスターで置き換えられた大腸菌株でのCPS14多糖の発現を示す図である。抗CPS14によりプローブされた異なる組み込み型（integrated）大腸菌株由来のプロテイナーゼK消化細胞のウエスタンブロットが描かれる。組み込み株のすべて：GVX6126（GVX1052 CA::CPS14；レーン1および2）、GVX6129（GVX1128 CA::CPS14；レーン3および4）、およびGVX6300（GVX1716；レーン5および6）が、RcsAを発現するpGVX688を用いて形質転換された場合に、CPS14ポリメラーゼ（CPS14 polymere）の産生に対応するラダー様パターンを示した。
【図２３】大腸菌株GVX6126（大腸菌W3110 CA::CPS14）での肺炎連鎖球菌CPS14多糖の生成に対するCPS14トランスポーター遺伝子の影響を示す図である。異なる大腸菌細胞由来のプロテイナーゼK処理全細胞抽出物のウエスタンブロット分析を示す。レーン1：タンパク質マーカー；レーン2：pGVX688（rcsA）およびpGVX72（空ベクター）を用いて形質転換された大腸菌GVX6126；レーン3：pGVX688（rcsA）およびpGVX1497（pGVX72へとクローニングされたCPS14 wzg〜wze）を用いて形質転換された大腸菌GVX6126。0.4 OD当量の培養バイオマスを、MESを用いて12％Bis-Trisゲル（Invitrogen社）にて35分間、200Vで泳動し、続いてiBlotでブロットし、一次抗体としての抗CPS4抗体（1：100）により発色させた。
【図２４】pGVXN688（RcsAを発現する）を用いて形質転換された大腸菌GVX6129 (W3110ΔwaaL CA::CPS14)から抽出された2AB標識LLOのクロマトグラムを示す図であり、糖脂質は、段落0079および0080に記載される通りに2-AB標識およびMS/MS分析により分析された。MS/MS分析により、それぞれ95.9分および115.3分で溶出される2個および3個のCPS14サブユニットが明らかになった（矢印により示される）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
5-発明の詳細な説明
肺炎球菌莢膜多糖は、肺炎連鎖球菌細胞のCPSクラスター中に典型的にコードされる酵素のセットの協働により、担体脂質上に合成される（Whitfield C, Roberts IS: Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli. Mol Microbiol 1999, 31(5):1307-1319）。wzy依存性CPSの合成は、膜の細胞質側でウンデカプレニルリン酸（Und-P）への単糖-リン酸の付加から開始される。短いオリゴ糖が、異なるグリコシルトランスフェラーゼによる活性化型糖ヌクレオチドからの単糖の連続的付加により伸長され、脂質連結型多糖はフリッパーゼにより膜を介してフリップ（flip）される。抗原-反復単位（RU）は、タンパク質wzyにより行なわれる酵素反応により重合（ポリマー化）される。続いて、多糖が、最終的なアクセプター構造へと転移される。ポリマー化および細胞表面への輸送は、CPSクラスターの5’末端に位置する3〜4種類の酵素により制御されると考えられている。
【００２８】
グリコシルトランスフェラーゼ、ポリメラーゼwzy、フリッパーゼwzx、および単糖-リン酸トランスフェラーゼは、ほとんどの場合に、dexB〜aliAクラスター内にコードされるが、ヌクレオチド活性化型単糖生合成経路は、一般的なハウスキーピング活性の場合にゲノム中のどこかで、および単糖がCPSに特異的である場合には特異的にCPSクラスター内にコードされる（Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA et al: Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes. PLoS genetics 2006, 2(3):e31）。
【００２９】
CPS生合成での長さの制御は、調節のためのリン酸化イベントのサークル（circle）を含むと考えられている（Morona JK, Miller DC, Morona R, Paton JC. The effect that mutations in the conserved capsular polysaccharide biosynthesis genes have on virulence of Streptococcus pneumoniae. J Infect Dis. 2004 May 15;189(10):1905-13.Epub 2004 Apr 27. PubMed PMID: 15122528）。CPSを生成する大部分の生合成経路は、ヌクレオチド二リン酸（NDP）活性化型単糖を基質として用い、すなわち、これはUDP-GlcおよびUDP-GlcNAcである。これらのNDP糖は、ハウスキーピング遺伝子によりグラム陰性宿主およびグラム陽性宿主で与えられ、つまり、特定の糖の合成のための出発材料として利用可能である。特定のNDP糖の合成または他の修飾のための生合成遺伝子は、ほとんどいつもCPSクラスター中にコードされる。
【００３０】
O抗原合成とCPS合成とは、生合成の最後のステップが異なる。O抗原は、リガーゼWaaLによりリピドAコアへと付加され、外膜へとさらに輸送される一方で、CPSは細胞上に莢膜構造として存在する。平均では、最終的なO抗原糖の長さはCPSよりもかなり短い。
【００３１】
肺炎連鎖球菌CPSは、その合成につながる特異的な生化学的経路により、I群CPSとして分類される。グラム陰性細菌もまたI群CPS経路を含み、これは、外膜輸送を担う追加の膜トランスポータータンパク質遺伝子の存在により、肺炎球菌I群クラスターとは異なる。例えば、これらはコラン酸（colanic acid）（CA）生合成機構遺伝子クラスターwca（Stevenson G, Andrianopoulos K, Hobbs M, Reeves PR: Organization of the Escherichia coli K-12 gene cluster responsible for production of the extracellular polysaccharide colanic acid. J Bacteriol 1996, 178(16):4885-4893）、およびK30 CPSクラスター（Whitfield C: Biosynthesis and assembly of capsular polysaccharides in Escherichia coli. Annu Rev Biochem 2006, 75:39-68）である。
【００３２】
しかしながら、一部のグラム陰性および陽性莢膜多糖クラスターは機能的エレメントでは類似しているという事実にもかかわらず、大腸菌で機能的に発現される完全な肺炎球菌CPSクラスターはまったくなかった。異なる細胞エンベロープ構造が、外膜を通過しなければならない場合には別の、多糖生成のための特定の機構を必要とすることは、一般的に受け入れられている。つまり、 (i)グラム陰性生物でのLPSおよび莢膜多糖経路の側面および(ii)グラム陽性莢膜生合成調節および輸送経路の側面を、グラム陰性宿主細胞内で組み合わせて用いる、肺炎球菌莢膜多糖の改良された生成方法が、本明細書中に記載される。そのような多糖は、グラム陰性宿主でLPS経路機構により生成され、そのような多糖の構造はLPS多糖と同じである。したがって、本発明のグラム陰性系で生成されるそのような多糖は、本出願の目的のために、「改変型莢膜多糖」または「LPS莢膜」として特徴付けることができる。さらに、この新規に合成される発現系および生合成経路（LPS経路と莢膜生合成経路とを組み合わせる）は、本出願の目的のために、「改変型LPS生合成経路」であるとして特徴付けることができる。
【００３３】
したがって、追加の実施形態は、改変型莢膜多糖またはLPS莢膜の生成を含む改変型LPS経路を用いるグリコシル化系により作製される肺炎連鎖球菌ワクチンを含む。
【００３４】
本発明の別の特定の実施形態は、肺炎球菌CPSの最適化された発現のための、グラム陰性大腸菌宿主細胞ゲノムの最適化を含む。大腸菌W3110は、gtrと称されるプロファージ遺伝子クラスターをコードする。Gtr酵素であるGtrA、BおよびSは、ペリプラズム腔（periplasmic space）にて成長中のO抗原鎖へと分岐グルコース残基を付加することによりO抗原を修飾する機構をコードする（Lehane AM, Korres H, Verma NK: Bacteriophage-encoded glucosyltransferase GtrII of Shigella flexneri: membrane topology and identification of critical residues. The Biochemical journal 2005, 389(Pt 1):137-143）。該経路は、細胞膜の細胞質表面でのウンデカプレニルリン酸（Und-Pであり、Und-PPではない）連結型グルコースの生成、ペリプラズムへのフリップ、および成長中のO抗原多糖へのUnd-P連結型グルコースの連続的転移を含む。
【００３５】
一部の実施形態では、gtrABS遺伝子は、部分的もしくは完全に機能的に不活性化されているか、またはグラム陰性宿主細胞から欠失され、例えば、gtrABSは大腸菌宿主細胞で欠失される。理論に拘泥するものではないが、そのような欠失は、すべてのCPS生合成活性をグリコシル化可能なUnd-PP経路へと切り替え、それにより、糖タンパク質生成を増強させる。多くの肺炎球菌多糖は、開始単糖としてグルコースを用いて反復単位（RU）ポリマーとして合成される。つまり、そのような反復単位は、それらがUnd-P上に組み立てられる場合に、タンパク質のグリコシル化を妨げ得る。
【００３６】
別の具体的実施形態は、UDP-グルコース：ウンデカプレニルリン酸グルコース-リン酸トランスフェラーゼ活性の発現および活性を増大させることによる、Und-PP連結型CPS生成の増強であり、これは、細胞中のUnd-PP-Glc量を増大させ、したがってCPS反復単位（RU）および多糖の増強された生成効率をもたらす。そのようなUDP-グルコース：ウンデカプレニルリン酸グルコース-リン酸トランスフェラーゼに対する例は、肺炎連鎖球菌のWchA（すなわち、開始因子機能を提供する天然酵素）または大腸菌W3110コラン酸wcaオペロン中にコードされるWcaJである。本発明の具体的実施形態は、糖脂質生成能力を最適化するための、wcaJ遺伝子にコードされる大腸菌機能による、天然の肺炎連鎖球菌wchA遺伝子機能の置換である。
【００３７】
本発明の別の実施形態は、安定かつ高収率な糖脂質生成のための、および増強されたグリコシル化活性のための、大腸菌W3110 wcaオペロンの代わりとしての組み換えCPSクラスターのゲノム組み込みである。
【００３８】
調節遺伝子
グラム陽性細菌の莢膜多糖遺伝子クラスターの様々な調節遺伝子を、本発明の方法および宿主細胞と共に用いることができる。具体的な実施形態では、調節遺伝子は、肺炎連鎖球菌の莢膜多糖遺伝子クラスターのwzg、wzh、wzd、もしくはwze、または黄色ブドウ球菌（S. aureus）の莢膜多糖遺伝子クラスターのcapA、capB、もしくはcapC、またはB群溶血性連鎖球菌（Streptococcus agalactiae；group B Streptococcus、またはGBS）の莢膜多糖遺伝子クラスターのCpsA、CpsB、CpsC、もしくはCpsDである。一部の実施形態では、調節遺伝子は、下記の「莢膜多糖」の節に列挙される莢膜多糖遺伝子クラスターの調節遺伝子である。
【００３９】
莢膜多糖
一部の実施形態では、本発明の方法および宿主細胞を、肺炎連鎖球菌の莢膜多糖を生成するために用いる。これらの莢膜多糖としては、肺炎連鎖球菌CPS1、CPS2、CPS3、CP4、CPS5、CPS6（AおよびB）、CPS7（A、B、C）、CPS8、CPS9（A、L、N、V）、CPS10（A、B、C、F）、CPS11（A、B、C、D、F）、CPS12（A、B、F）、CPS13、CPS14、CPS15（A、B、C、F）、CPS16（A、F）、CPS17（A、F）、CPS18（A、B、C、F）、CPS19（A、B、C、F）、CPS20、CPS21、CPS22（A、F）、CPS23（A、B、F）、CPS24（A、B、F）、CPS25（A、F）、CPS26、CPS27、CPS28（A、F）、CPS29、CPS31、CPS32（A、F）、CPS33（A、B、C、D、F）、CPS34、CPS35（A、B、C、D、F）、CPS36、CPS37、CPS38、CPS39、CPS40、CPS41（A、F）、CPS42、CPS43、CPS44、CPS45、CPS46、CPS47（A、F）、CPS48および（Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA et al: Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes. PLoS genetics 2006、2(3):e31）で言及されている通りのすべての追加の莢膜が挙げられる。具体的には、これらの莢膜多糖としては、肺炎連鎖球菌CPS1、CPS4、およびCPS14が挙げられる。
【００４０】
他の実施形態では、他のグラム陽性細菌の莢膜多糖を、本発明の方法および宿主細胞を用いて生成することができる。他のグラム陽性細菌としては、黄色ブドウ球菌およびB群溶血性連鎖球菌（GBS）が挙げられる。そのような莢膜多糖の例としては、黄色ブドウ球菌CPS5、CPS8、B群溶血性連鎖球菌（B群、GBS）CPSIa、CPSIb、CPSII、CPSIII、CPSIV、CPSV、CPSVI、CPSVII、CPSVIII、エンテロコッカス・フェカリスCPSA、CPSB、CPSC、CPSDが挙げられる。
【００４１】
一部の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼが、本明細書中で提供される宿主細胞へと導入され、該宿主細胞内で所望の莢膜多糖が合成されるようにする。例えば、国際公開第2011/138361号を参照されたい（該文献は、その全体で参照により本明細書中に組み入れられる）。
【００４２】
バイオコンジュゲート（bioconjugate）
本発明の一部の実施形態では、宿主細胞は、バイオコンジュゲート（すなわち、宿主細胞中で生成される莢膜タンパク質を用いてグリコシル化される担体タンパク質）を生成するために、さらに改変される。担体タンパク質上への莢膜多糖の転移は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより触媒される。一部の実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、宿主細胞中で組み換え的に発現される。一部の実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、原核生物宿主へと導入される。オリゴサッカリルトランスフェラーゼはいずれの供給源由来でもあり得、異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、すなわち、原核生物宿主細胞とは異なる生物由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、異なる細菌種由来のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ）を含み得る。具体的な実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、カンピロバクター属の種（例えば、C.ジェジュニ）由来である。
【００４３】
担体タンパク質は、組み換えタンパク質であり得る。一部の実施形態では、担体タンパク質は、天然に1種以上のN-グリコシル化コンセンサス配列を含むタンパク質である。他の実施形態では、1種以上のN-グリコシル化コンセンサス配列は、担体タンパク質へと組み換え的に導入されている。コンジュゲートワクチンの作製での使用に好適ないずれかの担体タンパク質を、本明細書中で用いることができる。例示的な担体タンパク質としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：緑膿菌の外毒素A（EPA）、CRM197、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の無毒化型溶血素A、黄色ブドウ球菌のクランピング因子A（clumping factor A）、黄色ブドウ球菌のクランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化型変異体、コレラ毒素Bサブユニット（CTB）、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化型変異体、大腸菌Satタンパク質、大腸菌Satタンパク質のパッセンジャードメイン（passenger domain）、C.ジェジュニAcrA、およびC.ジェジュニ天然糖タンパク質、肺炎連鎖球菌ニューモリシン（S. pneumoniae pneumolysin）および追加の肺炎連鎖球菌タンパク質抗原（例えば、肺炎連鎖球菌NOX、肺炎連鎖球菌PspA、肺炎連鎖球菌PcpA、肺炎連鎖球菌PhtD、肺炎連鎖球菌PhtE、肺炎連鎖球菌Ply、および肺炎連鎖球菌LytB）。
【００４４】
一部の実施形態では、本明細書中に記載されるコンジュゲートの生成で用いられる担体タンパク質は改変され、例えば、該タンパク質が、より毒性でなく、かつ/またはグリコシル化に対してより感受性となるなどの様式で改変される。具体的な実施形態では、本明細書中に記載されるコンジュゲートワクチンの生成で用いられる担体タンパク質は、そのバイオコンジュゲート形態で、例えば免疫原性組成物中で投与されるタンパク質の濃度低下を可能にする様式で、担体タンパク質中のグリコシル化部位の数が最大化されるように、改変される。したがって、一部の実施形態では、本明細書中に記載される担体タンパク質は、該担体タンパク質に通常伴うであろう数よりも（例えば、そのネイティブ/天然状態（例えば、「野生型」状態）での該担体タンパク質に伴うグリコシル化部位の数と比較して）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10箇所以上のグリコシル化部位を含むように改変される。具体的な実施形態では、グリコシル化部位の導入は、タンパク質の一次構造中のどこかへのそのようなグリコシル化コンセンサス配列の挿入により遂行される。そのようなグリコシル化部位の導入は、例えば、タンパク質の一次構造への新規アミノ酸の付加により（すなわち、グリコシル化部位が、全体で、または部分的に付加される）、またはグリコシル化部位をつくり出すためにタンパク質中に存在するアミノ酸を突然変異させる（すなわち、アミノ酸はタンパク質に付加されないが、タンパク質の選択されたアミノ酸が、グリコシル化部位を形成するように突然変異される）ことにより、遂行することができる。当業者は、当技術分野で公知のアプローチ（例えば、タンパク質をコードする核酸配列の改変を含む組み換え的アプローチ）を用いて、タンパク質のアミノ酸配列を容易に改変することができることを認識するであろう。具体的な実施形態では、グリコシル化コンセンサス配列が、担体タンパク質の特異的領域（例えば、タンパク質の表面構造、タンパク質のNもしくはC末端、および/またはタンパク質の基部でジスルフィド架橋により安定化されているループ）へと導入される。一部の実施形態では、古典的な5種類のアミノ酸グリコシル化コンセンサス配列を、より効率的なグリコシル化のためにリシン残基により伸長することができ、つまり、挿入されたコンセンサス配列は、挿入されるはずであるかまたはアクセプタータンパク質アミノ酸を置き換える、5個、6個または7個のアミノ酸をコードし得る。
【００４５】
一部の実施形態では、本明細書中に記載されるコンジュゲートワクチンの生成で用いられる担体タンパク質は、「タグ」、すなわち、該担体タンパク質の単離および/または特定を可能にするアミノ酸の配列を含む。例えば、本明細書中に記載される担体タンパク質へとタグを付加することは、該タンパク質の精製、したがってタグ付けされた担体タンパク質を含むコンジュゲートワクチンの精製で有用であり得る。本明細書中で用いることができる例示的タグとしては、限定するものではないが、ヒスチジン（HIS）タグ（例えば、ヘキサヒスチジンタグ、または6×Hisタグ）、FLAG-TAG、およびHAタグが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書中で用いられるタグは、それらがもう必要でなくなった後は（例えば、タンパク質が精製された後）、除去可能（例えば、化学的薬剤により、または酵素的手段による除去）である。
【００４６】
一部の実施形態では、本明細書中に記載される細菌宿主細胞および本明細書中に記載されるそのような細菌宿主細胞により生成されるコンジュゲートは、有利な特性を有する。例えば、一部の実施形態では、グラム陽性細菌由来の調節遺伝子（該調節遺伝子はオリゴ糖または多糖生合成に関与する）を含む、本明細書中に記載される細菌宿主細胞は、該調節遺伝子の存在の結果として増加した長さの糖抗原（例えば、オリゴ糖および/または多糖）を生成することが可能である。さらに、本明細書中に記載される細菌宿主細胞は、グラム陽性細菌由来の調節遺伝子を有しないグラム陰性細菌宿主細胞と比較して、増大した量の糖抗原（例えば、オリゴ糖および/または多糖）を生成することが可能である。細菌細胞により生成されるコンジュゲートがより高い糖抗原-タンパク質比を有する点で、および細菌細胞がより多数のコンジュゲートを生成するので、これらの特徴のそれぞれが有利である。
【００４７】
一部の実施形態では、本明細書中に記載される細菌宿主細胞は、同じ特性を有するがオリゴ糖または多糖生合成に関与するグラム陽性細菌由来の調節遺伝子を有しない細菌宿主細胞よりも、約5％、10％、15％、20％、約25％、約30％、約40％、約50％、または50％超、多くのコンジュゲートを生成する。一部の実施形態では、本明細書中に記載される細菌宿主細胞は、同じ特性を有するがオリゴ糖または多糖生合成に関与するグラム陽性細菌由来の調節遺伝子を有しない細菌宿主細胞よりも、5％〜10％、10％〜20％、20％〜30％、30％〜40％、または40％〜50％、多くのコンジュゲートを生成する。
【００４８】
一部の実施形態では、本明細書中に記載される細菌宿主細胞は、同じ特性を有するがオリゴ糖または多糖生合成に関与するグラム陽性細菌由来の調節遺伝子を有しない細菌宿主細胞よりも、約5％、10％、15％、20％、約25％、約30％、約40％、約50％、または50％超、多くの糖抗原（例えば、オリゴ糖および/または多糖）を生成する。一部の実施形態では、本明細書中に記載される細菌宿主細胞は、同じ特性を有するがオリゴ糖または多糖生合成に関与するグラム陽性細菌由来の調節遺伝子を有しない細菌宿主細胞よりも、5％〜10％、10％〜20％、20％〜30％、30％〜40％、または40％〜50％、多くの糖抗原（例えば、オリゴ糖および/または多糖）を生成する。
【００４９】
一部の実施形態では、本明細書中に記載される細菌宿主細胞は、同じ特性を有するがオリゴ糖または多糖生合成に関与するグラム陽性細菌由来の調節遺伝子を有しない細菌宿主細胞により生成される糖抗原（例えば、オリゴ糖および/または多糖）よりも、約5％、10％、15％、20％、約25％、約30％、約40％、約50％、または50％超、長い糖抗原（例えば、オリゴ糖および/または多糖）を生成する。一部の実施形態では、本明細書中に記載される細菌宿主細胞は、同じ特性を有するがオリゴ糖または多糖生合成に関与するグラム陽性細菌由来の調節遺伝子を有しない細菌宿主細胞により生成される糖抗原（例えば、オリゴ糖および/または多糖）よりも、5％〜10％、10％〜20％、20％〜30％、30％〜40％、または40％〜50％、長い糖抗原（例えば、オリゴ糖および/または多糖）を生成する。
【００５０】
本明細書中に記載されるコンジュゲートを特性決定するために、例えば、担体タンパク質、結合された糖抗原（例えば、オリゴ糖および/または多糖）、またはその両者を特性決定するために、例えば、高速サイズ排除クロマトグラフィー、等電点電気泳動、SDS-PAGEおよびウエスタンブロット、MSによる分子量測定、N末端配列決定、アミノ酸分析、逆相液体クロマトグラフィー、エレクトロスプレー質量分析、タンデム質量分析（MS/MS）、およびトリプシン消化後質量分析によるペプチドマッピングをはじめとする、様々なアッセイを用いることができる。
【００５１】
実施形態
一実施形態では、多糖の生成のための遺伝子操作されたグラム陰性細菌が本明細書中に提供され、該グラム陰性細菌は、グラム陽性細菌の莢膜多糖遺伝子クラスターの調節遺伝子を含む。一部の実施形態では、グラム陰性細菌は、莢膜多糖遺伝子クラスターのオープンリーディングフレームの少なくとも25％、50％、75％、85％、90％、または少なくとも95％を含む。一部の実施形態では、グラム陰性細菌は、完全な莢膜多糖遺伝子クラスターを含む。一部の実施形態では、多糖は莢膜多糖のエピトープを含む。
【００５２】
一部の実施形態では、先行する段落のグラム陰性細菌は、エシェリキア属の種、大腸菌、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、サルモネラ属の種、イェルシニア属の種、ナイセリア属の種、ビブリオ属の種およびシュードモナス属の種からなる群より選択される。具体的な実施形態では、グラム陰性細菌は大腸菌である。
【００５３】
一部の実施形態では、先行する段落のいずれか1つのグラム陰性細菌へと遺伝子操作されるグラム陽性細菌の莢膜多糖遺伝子クラスターの調節遺伝子は、肺炎連鎖球菌の調節遺伝子である。具体的な実施形態では、肺炎連鎖球菌調節遺伝子は肺炎連鎖球菌1型由来である。具体的な実施形態では、肺炎連鎖球菌調節遺伝子は肺炎連鎖球菌4型由来である。
【００５４】
一部の実施形態では、先行する段落のいずれか1つのグラム陰性細菌へと遺伝子操作されるグラム陽性細菌の莢膜多糖遺伝子クラスターの調節遺伝子は、黄色ブドウ球菌の調節遺伝子である。具体的な実施形態では、調節遺伝子はB群溶血性連鎖球菌の調節遺伝子である。
【００５５】
一部の実施形態では、先行する段落のいずれか1つのグラム陰性細菌へと遺伝子操作されるグラム陽性細菌の莢膜多糖遺伝子クラスターの調節遺伝子は、エンテロコッカス・フェカリスの調節遺伝子である。
【００５６】
一部の実施形態では、先行する段落のいずれかのグラム陰性細菌は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼを含む。具体的な実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、該グラム陰性細菌にとって異種である。
【００５７】
一部の実施形態では、先行する段落のいずれかのグラム陰性細菌は、少なくとも1種の異種グリコシルトランスフェラーゼを含む。具体的な実施形態では、異種グリコシルトランスフェラーゼは、原核生物グリコシルトランスフェラーゼである。具体的な実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、調節遺伝子と同じグラム陽性細菌から得られる。
【００５８】
一部の実施形態では、先行する段落のいずれかのグラム陰性細菌は、該グラム陰性細菌にとってネイティブである1種以上の遺伝子の欠失または不活性化を含む。具体的な実施形態では、1種以上の欠失される遺伝子は、waaL遺伝子を含む。具体的な実施形態では、1種以上の欠失される遺伝子は、該グラム陰性細菌でのO抗原生合成に関連するすべての遺伝子を含む。
【００５９】
一部の実施形態では、先行する段落のいずれかのグラム陰性細菌へと遺伝子操作される調節遺伝子は、wzg、wzh、wzd、wze、capA、capB、またはcapCである。
【００６０】
一部の実施形態では、先行する段落のいずれかのグラム陰性細菌は、グリコシル化のためのコンセンサス配列を含む担体タンパク質をコードする核酸を含む。具体的な実施形態では、担体タンパク質をコードする核酸は、該グラム陰性細菌にとって異種である。具体的な実施形態では、担体タンパク質は、緑膿菌（P. auruginosa）由来の無毒化型外毒素A、CRM197、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の無毒化型溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化型変異体、コレラ毒素Bサブユニット（CTB）、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化型変異体、大腸菌satタンパク質、大腸菌satタンパク質のパッセンジャードメイン、C.ジェジュニAcrA、C.ジェジュニ天然糖タンパク質、および肺炎連鎖球菌ニューモリシン（S. pneumoniae pneumolysin）である。具体的な実施形態では、担体タンパク質は肺炎連鎖球菌タンパク質であり、例えば、肺炎連鎖球菌ニューモリシン（S. pneumoniae pneumolysin）、肺炎連鎖球菌NOX、肺炎連鎖球菌PspA、肺炎連鎖球菌PcpA、肺炎連鎖球菌PhtD、肺炎連鎖球菌PhtE、肺炎連鎖球菌Ply、または肺炎連鎖球菌LytBである。具体的な実施形態では、担体タンパク質は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより多糖にコンジュゲートされる。
【００６１】
一部の実施形態では、先行する段落のいずれかの陰性細菌（-negative bacterium）へと遺伝子操作される調節遺伝子は、以下の莢膜多糖遺伝子クラスターの1つに対応する調節遺伝子である：肺炎連鎖球菌CPS1、CPS2、CPS3、CP4、CPS5、CPS6（AおよびB）、CPS7（A、B、C）、CPS8、CPS9（A、L、N、V）、CPS10（A、B、C、F）、CPS11（A、B、C、D、F）、CPS12（A、B、F）、CPS13、CPS14、CPS15（A、B、C、F）、CPS16（A、F）、CPS17（A、F）、CPS18（A、B、C、F）、CPS19（A、B、C、F）、CPS20、CPS21、CPS22（A、F）、CPS23（A、B、F）、CPS24（A、B、F）、CPS25（A、F）、CPS26、CPS27、CPS28（A、F）、CPS29、CPS31、CPS32（A、F）、CPS33（A、B、C、D、F）、CPS34、CPS35（A、B、C、D、F）、CPS36、CPS37、CPS38、CPS39、CPS40、CPS41（A、F）、CPS42、CPS43、CPS44、CPS45、CPS46、CPS47（A、F）、もしくはCPS48；または黄色ブドウ球菌CPS5、もしくはCPS8；B群溶血性連鎖球菌（B群、GBS） CPSIa、CPSIb、CPSII、CPSIII、CPSIV、CPSV、CPSVI、CPSVII、もしくはCPSVIII；またはエンテロコッカス・フェカリスCPSA、CPSB、CPSC、もしくはCPSD。
【００６２】
一実施形態では、グラム陰性細菌で複製可能なベクターが本明細書中に提供され、該ベクターは、グラム陽性細菌での莢膜多糖生合成に関連する調節遺伝子を含む。
【００６３】
一部の実施形態では、UDP-グルコース:ウンデカプレニルリン酸グルコース-リン酸トランスフェラーゼ活性の発現および活性が、先行する段落のいずれかのグラム陰性細菌で増大する。
【００６４】
一部の実施形態では、先行する段落のいずれかのグラム陰性細菌は、腸内一般細菌（enterocommonbacteriae）（例えば、大腸菌W3110）のコラン酸wcaオペロンによりコードされるWcaJを発現する。
【００６５】
一部の実施形態では、先行する段落のいずれかのグラム陰性細菌をはじめとする、多糖の生成のための遺伝子操作されたグラム陰性細菌が本明細書中に提供され、該グラム陰性細菌のGtr酵素をコードする遺伝子は、機能的に不活性化される。具体的な実施形態では、Gtr酵素をコードする遺伝子の機能的不活性化は、Und-P連結型グルコースの除去をもたらす。具体的な実施形態では、グラム陰性細菌のGtr酵素をコードする遺伝子が欠失される。具体的な実施形態では、GtrA、GtrB、および/またはGtrSをコードする遺伝子が機能的に不活性化される。具体的な実施形態では、GtrA、GtrB、および/またはGtrSをコードする遺伝子が欠失される。具体的な実施形態では、グラム陰性細菌は、エシェリキア属の種、大腸菌、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、サルモネラ属の種、イェルシニア属の種、およびシュードモナス属の種からなる群より選択される。
【００６６】
具体的な実施形態では、先行する段落のグラム陰性細菌は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼを含む。具体的な実施形態では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、該グラム陰性細菌にとって異種である。
【００６７】
具体的な実施形態では、先行する段落のグラム陰性細菌は、該グラム陰性細菌にとって異種である少なくとも1種のグリコシルトランスフェラーゼを含む。具体的な実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、原核生物グリコシルトランスフェラーゼである。
【００６８】
具体的な実施形態では、先行する段落のグラム陰性細菌は、グリコシル化のためのコンセンサス配列を含む担体タンパク質をコードする核酸を含む。具体的な実施形態では、担体タンパク質をコードする核酸は、該グラム陰性細菌にとって異種である。具体的な実施形態では、担体タンパク質は、緑膿菌（P. auruginosa）由来の無毒化型外毒素A、CRM197、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の無毒化型溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化型変異体、コレラ毒素Bサブユニット（CTB）、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化型変異体、大腸菌satタンパク質、大腸菌satタンパク質のパッセンジャードメイン、C.ジェジュニAcrA、およびC.ジェジュニ天然糖タンパク質である。具体的な実施形態では、担体タンパク質は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより多糖にコンジュゲートされる。
【００６９】
具体的な実施形態では、先行する段落のグラム陰性細菌の多糖は、肺炎連鎖球菌の莢膜多糖である。
【００７０】
具体的な実施形態では、先行する段落のグラム陰性細菌の多糖は、以下のものである：大腸菌O抗原（O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186、O187）、サルモネラ属の種（S.エンテリカ亜種エンテリカ（S. enterica subsp. Enterica）、S.エンテリカ亜種サラマエ（S. enterica subsp. Salamae）、S.エンテリカ亜種アリゾナエ（S. enterica subsp. arizonae）、S.エンテリカ亜種ジアリゾナエ（S. enterica subsp. Diarizonae）、S.エンテリカ亜種ホウテナエ（S. enterica subsp. Houtenae）、S.ボンゴリ（S. bongori）、およびS.エンテリカ亜種インディカ（S. enterica subsp. Indica）、およびO 1〜67型、シュードモナス属の種（緑膿菌O血清型1〜20）、クレブシエラ属の種（特に、K.ニューモニエ（K. pneumonia）血清型O1、O2（および下位血清型）、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12）、アシネトバクター属O抗原（特に、A.バウマンニイ（A. baumannii）O抗原）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）O抗原（血清型A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L1、L2、L3）、コレラ菌（Vibrio cholera）O抗原O1〜155、リステリア属の種、特にL.モノサイトゲネス（L. monocytogenes）1型、2型、3型、4型およびそれらの下位血清型、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）血清型1〜15 O抗原、ボルデテラ・パラペルツッシス（Bordetella parapertussis）O抗原、ブルクホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）およびシュードマレイ（pseudomallei）O抗原、野兎病菌（Francisella tularensis）、カンピロバクター属の種（C.ジェジュニ）；クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）（血清型A、G、H、K、S1、S4、D、Cd-5、およびウェルシュ菌（C. perfringens）血清型A、B、C、DおよびE）の莢膜多糖、黄色ブドウ球菌5型および8型、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyrogenes）（B群連鎖球菌莢膜血清型多糖）、大腸菌、B群溶血性連鎖球菌（Streptococcus agalacticae）（A群連鎖球菌莢膜多糖）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）（血清型A、B、C、W、Y、X）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、エンテロコッカス・フェカリス莢膜多糖I〜V型；ならびに他の表面多糖構造、例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）糖脂質）、髄膜炎菌ピリン（pilin）Oグリカンおよびリポオリゴ糖（lipooligosaccharide）（LOS）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）LOS、リューシュマニア属主要リポホスホグリカン（Leishmania major lipophosphoglycan）、腫瘍関連炭水化物抗原、マラリアグリコシルホスファチジルイノシトール（malaria glycosyl phosphatidylinositol）、またはヒト型結核菌（mycobacterium tuberculosis）アラビノマンナン。
【００７１】
具体的な実施形態では、先行する段落のいずれか1つのグラム陰性細菌により生成される組み換え糖タンパク質が、本明細書中に提供される。
【００７２】
具体的な実施形態では、タンパク質の産生に好適な条件下で、先行する段落のいずれか1つのグラム陰性細菌を培養するステップを含む、組み換え糖タンパク質を生成する方法が、本明細書中に提供される。具体的な実施形態では、該方法は、組み換え糖タンパク質を精製するステップをさらに含む。
【００７３】
具体的な実施形態では、プレシオモナス・シゲロイデスO抗原遺伝子クラスターを含む遺伝子操作された大腸菌細胞が本明細書中に提供され、該O抗原遺伝子クラスターのwbgW遺伝子が不活性化され、大腸菌細胞はUnd-PP-D-FucNAc4Nを生成する。
【００７４】
具体的な実施形態では、ソンネ赤痢菌またはプレシオモナス・シゲロイデスO17 O抗原遺伝子クラスターを含む遺伝子操作された大腸菌細胞が本明細書中に提供され、該O抗原遺伝子クラスターのwbgW遺伝子が不活性化され、大腸菌細胞はUnd-PP-D-FucNAc4Nを生成する。
【実施例】
【００７５】
6-実施例
実施例1：大腸菌でのCPS1コンジュゲートの合成
本発明の一実施形態の目標は、大腸菌でCPS 1型抗原性多糖を生成させることである。上記で論じた通り、本発明者らは、新規な様式で、肺炎連鎖球菌CPSクラスターの生合成機構を発現する大腸菌の能力を利用した。
【００７６】
CPSクラスターDNA（dexBとaliAとの間のDNA配列により定義される）を図2に示し、肺炎連鎖球菌1型の反復単位構造を図3に示す。反復単位は、D-FucNAc4Nから始まり、それにα1-3グリコシド結合で連結された2つのD-GalA残基が続く（-4-a-D-GalA-1,3-a-D-GalA-1,3-a-D-FucNAc4N-）。さらに、RUは非化学量論的にO-アセチル化される（Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, Collins M, Donohoe K, Harris D, Murphy L, Quail MA et al: Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes. PLoS genetics 2006, 2(3):e31）。DNA配列は、以下のものに対するタンパク質をコードする推定遺伝子を含む：
【００７７】
(i)輸送/調節（Wzg、Wzh、Wzd、Wze）、
(ii)相同性探索から結論付けた場合に、2つのGalA残基の転移を担っていることが最も確からしい2種類のグリコシルトランスフェラーゼ（WchBD）、
(iii)推定アセチルトランスフェラーゼWchC、
(iv)細胞質膜の外葉上での反復単位の重合（ポリマー化）のための、ポリメラーゼwzy、
(v)細胞質膜の内葉から外葉へと単一反復単位をフリップさせるための、フリッパーゼwzx、
(vi)ヌクレオチド活性化型D-GalAの合成を担う2種類のタンパク質（すなわち、GlaおよびUgd）。ハウスキーピングUDP-GlcからのGlaおよびUgdによるUDP-D-GalA合成が示された（Munoz R, Lopez R, de Frutos M, Garcia E: First molecular characterization of a uridine diphosphate galacturonate 4-epimerase: an enzyme required for capsular biosynthesis in Streptococcus pneumoniae type 1. Mol Microbiol 1999, 31(2):703-713）、
(vii) TDP-L-ラムノースを生成することが知られている4種類のタンパク質RmlACBD。これらの遺伝子は不可解（cryptic）であり、おそらくCPS生成に対して必要ではない。
【００７８】
考え合わせると、これは、1型CPSの生成のためのすべての必須遺伝子が、以下のものを除いて、このクラスター中にコードされていることを意味する：
(a)開始因子糖UDP-D-FucNAc4Nの合成のためのタンパク質をコードする生合成遺伝子；
(b)脂質担体Und-Pへとホスホ-D-FucNAc4Nを付加するためのホスホル糖トランスフェラーゼ（phosphorsugar transferase）をコードする遺伝子。改変されたLPS生合成経路によってCPS 1型を合成するために、CPS 1型クラスターの付加により、肺炎球菌LPS莢膜を合成することができる様式で、大腸菌宿主菌株中に(a)および(b)を提供することが必要である。大腸菌株は、一般的に、そのような酵素をコードしていない。注目すべきことに、FucNAc4Nを合成し、これを多糖に組み込む公知の微生物は、わずかしかない：肺炎連鎖球菌CP1株、ソンネ赤痢菌、プレシオモナス・シゲロイデスO17、およびバクテロイデス・フラジリス（Bacterioides fragilis）。
【００７９】
つまり、本発明者らは、前記機能性（functionalites）を提供する遺伝子クラスターを見出すことが必要であると推論した。本発明者らは、ソンネ赤痢菌またはシュードモナス・シゲロイデス（Pseudomonas shigelloides）O17 O抗原の合成のための生合成機構の遺伝子エレメントを用いることにより、これを実現した。これらの生物の両方が、同一の構造を有するO抗原を合成する。このO抗原は、二糖反復単位-4-a-L-AltNAcA-1,3-a-D-FucNAc4N-1-から構成される直鎖ポリマーにより構成される真性のグラム陰性O抗原である（図4）（Batta G, Liptak A, Schneerson R, Pozsgay V: Conformational stabilization of the altruronic acid residue in the O-specific polysaccharide of Shigella sonnei/Plesiomonas shigelloides. Carbohydr Res 1997, 305(1):93-99）。開始糖は、D-FucNAc4Nであることが示された （Kubler-Kielb J, Vinogradov E, Ben-Menachem G, Pozsgay V, Robbins JB, Schneerson R: Saccharide/protein conjugate vaccines for Bordetella species: preparation of saccharide, development of new conjugation procedures, and physico-chemical and immunological characterization of the conjugates. Vaccine 2008, 26(29-30):3587-3593）。生合成に必要とされる遺伝子クラスター（図5）は、P.シゲロイデスのゲノム中、およびソンネ赤痢菌の病原性プラスミド上にコードされる（Kopecko DJ, Washington O, Formal SB: Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infection and immunity 1980, 29(1):207-214）。遺伝子機能は、相同性解析により推定的に公知である（Xu DQ, Cisar JO, Ambulos Jr N, Jr., Burr DH, Kopecko DJ: Molecular cloning and characterization of genes for Shigella sonnei form I O polysaccharide: proposed biosynthetic pathway and stable expression in a live salmonella vaccine vector. Infect Immun 2002, 70(8):4414-4423）。
【００８０】
つまり、大腸菌でのCPS 1型生成のための生合成機構を組み立てる戦略は、以下の通りであった：
第1に、本発明者らは、Und-PP-D-FucNAc4N生成経路を再構築することを目指した。これを達成するために、本発明者らは、大腸菌でP.シゲロイデスO抗原クラスターを組み換え的に発現させた。
第2に、本発明者らは、P.シゲロイデスO17クラスターからL-AltNAcAグリコシルトランスフェラーゼを欠失させ、これはUnd-PP-D-FucNAc4N切断型脂質前駆体を生じさせる。
第3に、本発明者らは、プラスミド上にCPS 1型クラスターを付加した。このプラスミド中にコードされる酵素は、P.シゲロイデス系により生成されるUnd-PP-D-FucNAc4N前駆体を伸長させて、CPS 1型RUを完成させ、かつRUを重合（ポリマー化）して、改変型LPSを生成すると考えられた。
【００８１】
技術的には、これは以下のように行なわれた：
第1ステップでは、本発明者らは、P.シゲロイデスO抗原遺伝子クラスター（rfbP.シゲロイデスO17）を、ドナープラスミドpDOC-Cへとクローニングした（Lee DJ, Bingle LE, Heurlier K, Pallen MJ, Penn CW, Busby SJ, Hobman JL: Gene doctoring: a method for recombineering in laboratory and pathogenic Escherichia coli strains. BMC Microbiol 2009, 9:252）。このドナープラスミドと、リコンビナーゼおよびエンドヌクレアーゼをコードするヘルパープラスミド（Kuhlman TE, Cox EC: Site-specific chromosomal integration of large synthetic constructs. Nucleic acids research 2010, 38(6):e92）を用いることにより、本発明者らは、W3110 ΔwecAwzzECA ΔwaaL大腸菌株のrfbクラスターを、相同組み換えにより該プラスミドから、P.シゲロイデスクラスター（wzz〜wbgZ、図5）に交換した。例えば、国際出願第PCT/EP2013/071328号を参照されたい（この文献は、その全体で参照により本明細書中に組み入れられる）。結果として得られる染色体組み込み型菌株は、ウエスタンブロットにて、抗ソンネ赤痢菌タイピング血清に対して反応性である組み換えO抗原を生成する。
【００８２】
この組み込まれたP.シゲロイデスクラスター内にコードされるwbgW遺伝子を、DatsenkoおよびWannerの方法に従って、相同組み換えにより染色体から欠失させた（Datsenko KA, Wanner BL: One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97(12):6640-6645）。得られた菌株は、いずれの抗ソンネ赤痢菌特異的脂質連結型多糖ももはや生成せず、このことは、最もあり得ることとしては、該菌株が、完全な二糖反復単位を生成できないことに起因した。
【００８３】
次に、wzgからugd（図2）までのCPS 1クラスターを、人工プロモーター（J23103、http://partsregistry.org/Part:BBa_J23103）および大腸菌で活性な最適リボソーム結合部位の後ろにクローニングした。
【００８４】
脂質連結型オリゴ糖生合成の分析のための振盪フラスコ培養での記載された遺伝子系の発現は、抗CPS 1型特異的抗血清を用いたウエスタンブロットで、ラダー様バンドパターンを生じた（図6）。このことは、改変型LPS生合成経路が、肺炎連鎖球菌の1型CPSの組み換え発現で協働したことを示す。
【００８５】
生成された反応性のプロテアーゼ抵抗性物質が実際にウンデカプレニルピロリン酸に連結されたCPS 1型であることの証拠をさらに提供するために、酸感受性試験を図6からのサンプルに適用した。TFAによる弱酸処理は、抗CPS 1型シグナルを無効にし、これは、多糖とウンデカペニル（undecapenyl）とを連結するピロリン酸結合の存在を示した（図7）。本発明者らは、トランスポーター遺伝子wzg〜wzdの存在下で改変型O抗原を生成することは可能であることを見出した。これらの遺伝子が直接的な影響を有したかを調べるために、本発明者らは、相同組み換えによりCPS 1型プラスミドから4つのトランスポーター遺伝子を欠失させた（Bloor AE, Cranenburgh RM: An efficient method of selectable marker gene excision by Xer recombination for gene replacement in bacterial chromosomes. Applied and environmental microbiology 2006, 72(4):2520-2525）。改変型プラスミドの共発現は、驚くべきことに、抗CPS 1型シグナルの欠損を生じさせる（図8）。このことは、改変型O抗原の効率的な生成に、トランスポーター遺伝子が必要であることを示す。
【００８６】
組み換えCPS 1型を、タンパク質のグリコシル化のために、つまりタンパク質-炭水化物コンジュゲートの形成のために用いることができることを示すために、本発明者らは、好適な組み換え大腸菌株でのコンジュゲート生成の能力に関して、細菌タンパク質グリコシル化機構（Wacker M, Linton D, Hitchen PG, Nita-Lazar M, Haslam SM, North SJ, Panico M, Morris HR, Dell A, Wren BW et al: N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science 2002, 298(5599):1790-1793）を試験した。
【００８７】
実験は、以下の文献に文書化されたN-グリコシル化システムを用いて行なった（Feldman MF, Wacker M, Hernandez M, Hitchen PG, Marolda CL, Kowarik M, Morris HR, Dell A, Valvano MA, Aebi M: Engineering N-linked protein glycosylation with diverse O antigen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 2005, 102(8):3016-3021；Kowarik M, Young NM, Numao S, Schulz BL, Hug I, Callewaert N, Mills DC, Watson DC, Hernandez M, Kelly JF et al: Definition of the bacterial N-glycosylation site consensus sequence. The EMBO journal 2006, 25(9):1957-1966；Wacker M, Linton D, Hitchen PG, Nita-Lazar M, Haslam SM, North SJ, Panico M, Morris HR, Dell A, Wren BW et al: N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science 2002, 298(5599):1790-1793；Ihssen J, Kowarik M, Dilettoso S, Tanner C, Wacker M, Thony-Meyer L: Production of glycoprotein vaccines in Escherichia coli. Microbial cell factories 2010, 9:61）。CPS 1型脂質連結型オリゴ糖を発現する組み換え大腸菌を、2つの誘導性プラスミドを用いて形質転換した。一方のプラスミドは、PglB酵素をコードし、これは一般的にアクセプタータンパク質をN-グリコシル化することが繰り返し示されている（-D/E-x-N-x-S/T-型（xはプロリンではあり得ない）のコンセンサスアミノ酸配列をコードする）。第2のプラスミド上には、担体タンパク質EPAがコードされ、これは2つの挿入されたN-グリコシル化コンセンサス配列およびNiアフィニティークロマトグラフィー精製のためのHisタグを含む。グリコシル化実験の後、EPAタンパク質を精製し、抗Hisタグ抗血清（図9、パネルA）および抗CPS 1型抗血清（図9、パネルB）を用いてプローブし、溶出画分ではっきりと検出した。このことは、組み換えCPS 1型発現系と組み合わせたPglB系が、抗肺炎球菌ワクチン候補として用いることができるタンパク質コンジュゲートの効率的生成を可能にすることを証明する。
【００８８】
実施例2：大腸菌でのCPS4コンジュゲートの合成
活性なコンジュゲートワクチンを生成するためにタンパク質グリコシル化を用いることができることをさらに示すために、本発明者らは、CPS1と同様に、トランスポーター遺伝子の存在下でCPS 4型コンジュゲートを生成させることを目指した。
【００８９】
CPS4は、還元末端でGalNAcを含む反復単位構造を有する（図10）。完全な構造は：
-1,4-(2,3 S pyr)-a-D-Gal-1,3-a-D-ManNAc-1,3-a-L-FucNAc-1,3-a-D-GalNAc
である。
【００９０】
CPS1の遺伝子クラスターとは異なり、肺炎連鎖球菌由来のCPS 4型をコードするクラスターは、CPS4を合成するためのすべての必須酵素をコードする（図11）。UDP-D-FucNAcおよびUDP-D-ManNAcは、タンパク質MnaA、FnlA、B、およびCにより生成される。様々なグリコシルトランスフェラーゼの機能が、公知の特異性を有する他のグリコシルトランスフェラーゼに対するそれらの相同性に基づいて予測されている。WciIは、予測上のグリコシル-リン酸トランスフェラーゼであり、つまり、Und-PP-D-GalNAc合成を担い、WciJ、K、およびLはD-ManNAc、L-FucNAc、およびD-Galトランスフェラーゼであり、WciMはピルビン酸トランスフェラーゼのホモログである（Jiang SM, Wang L, Reeves PR: Molecular characterization of Streptococcus pneumoniae type 4, 6B, 8, and 18C capsular polysaccharide gene clusters. Infect Immun 2001, 69(3):1244-1255）。
【００９１】
大腸菌でCPS4改変型経路を再構築するために、本発明者らはまず、CPS4遺伝子クラスター（aliAとdexBとの間の遺伝子）を、大腸菌での発現のためのプラスミドへとクローニングし、これによりpGVXN803を生じた。第2のセットアップでは、本発明者らは、wzg、wzh、wzd、およびwzeの影響、ならびにwciI欠失の影響を明確に分析するために、トランスポーター遺伝子の下流の遺伝子（すなわち、wciJ〜fnlC）のみを含めた（pGVXN753を生じた）。WciIは、バイオインフォマティクス解析に従えば、ホスホル-糖トランスフェラーゼ（phosphor-sugar transferase）ホモログである。類似の活性が大腸菌で存在し、具体的には腸内細菌一般抗原（ECA）クラスター中にコードされるwecA遺伝子である。pGVXN753には、本発明者らは、挿入された遺伝子の転写を確実にするために、マルチクローニング部位の上流に人工プロモーター配列を含めた。
【００９２】
大腸菌での発現に対する上述のプラスミドの影響を分析するために、本発明者らは、W3110 ΔwaaL細胞を、pGVXN753およびpGVXN803を用いて形質転換した。W3110 ΔwaaLはWecAタンパク質をコードし、このタンパク質はUnd-PP-D-GlcNAcの合成を担うが、Und-PP-D-GalNAcを生成することができない。後者の脂質連結型単糖は、CPS4 RUを完成させるはずであるCPS4クラスターの酵素に対する予測上の基質である。つまり、本発明者らは、CPS4クラスタープラスミドに加えて、2種類の異なるD-GlcNAc→D-GalNAcエピメラーゼであるZ3206（Rush JS, Alaimo C, Robbiani R, Wacker M, Waechter CJ: A novel epimerase that converts GlcNAc-P-P-undecaprenyl to GalNAc-P-P-undecaprenyl in Escherichia coli O157. J Biol Chem 2010, 285(3):1671-1680）およびGalE（Linton D, Dorrell N, Hitchen PG, Amber S, Karlyshev AV, Morris HR, Dell A, Valvano MA, Aebi M, Wren BW: Functional analysis of the Campylobacter jejuni N-linked protein glycosylation pathway. Mol Microbiol 2005, 55(6):1695-1703）を提供した。両方の遺伝子が、in vivoでD-GalNAc合成を可能にするタンパク質をコードし、前者は脂質連結型D-GlcNAcのエピマー化により（Und-PP-D-GlcNAc←→Und-PP-D-GalNAc）、後者は基質としてのヌクレオチド活性化型糖を用いることによる（UDP-D-GlcNAc←→UDP-D-GalNAc）。
【００９３】
図12は、分析の結果を示す。細胞を増殖させ、エピメラーゼ発現を誘導し、プロテアーゼ抵抗性バイオマスをSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース膜への糖脂質の転写後に免疫検出により分析した。結果は、細胞中にpGVXN803が存在する場合はいつでも、抗CPS4抗血清によりラダー様シグナルが検出されたことを示す。pGVXN753もまたシグナルを生じさせたが、トランスポーター遺伝子およびwciIを含む構築物よりもかなり弱かった。エピメラーゼの誘導および性質は、シグナル強度にわずかに影響した。最も強い反応性は、pGVXN803およびヌクレオチド活性化型糖に特異的なエピメラーゼを用いて得られ、このことから、WciIがD-GalNAc-リン酸トランスフェラーゼであることが示唆された。したがって、驚くべきことに、CPS1と同様に、トランスポーター遺伝子が大腸菌でのCPS4改変型LPSの効率的な生成のために重要である。トランスポーター遺伝子とwciIとの影響を詳細に分析するために、pGVX753の存在下でのwciIの共発現を用いることができる。最もあり得そうなこととしては、wciI単独では、トランスポーター遺伝子の存在下で（すなわち、pGVX803を含むW3110 ΔwaaL中で）得られるレベルまではCPS4発現を増強させることができない。
【００９４】
大腸菌で生成されるCPS4をさらに特性決定するために、本発明者らは、大腸菌SCM6でpGVXN803を発現させ（Schwarz F, Huang W, Li C, Schulz BL, Lizak C, Palumbo A, Numao S, Neri D, Aebi M, Wang LX: A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol 2010；SCM6がwecA、ECA、waaLを欠失している）、2-AB標識化およびMS/MS分析により糖脂質を分析した。2-AB標識化は、多糖およびオリゴ糖を単離し、加水分解し、修飾し、かつそれらをHPLCおよびMS/MSにより分析するために開発された方法である。細胞を一晩増殖させ、確立された手順に従って調製および処理した（米国特許出願公開第2011/0274720号）。
【００９５】
簡潔には、糖脂質を有機溶媒によりバイオマスから抽出し（クロロホルム：メタノール：水 10：10：3）、C18カートリッジに対して精製し；溶出液を、ピロリン酸結合を加水分解してUnd-PP-グリカンからグリカン部分を放出させるために、水/イソプロパノール中でTFAを用いて処理した。得られた溶液を、脂質を除去するために別のC18カートリッジに通した。フロースルーを乾燥させ、グリカンを、還元末端で2-アミノベンズアミドを用いて標識した。得られた標識済みグリカンを、gylcosepN順相カラムを用いてHPLCにより分離し、蛍光により検出した（米国特許出願公開第2011/0274720 A1号）。
【００９６】
得られたクロマトグラムを図13に示す（パネルA）。pGVXN803を含むかまたは欠損しているSCM6細胞から取得したクロマトグラムの比較は、前者には存在するが後者には存在しない数箇所のピークを示す。これらの一部を、グリカンが何であるかおよび配列の特定のために、MS/MSにより分析した。数箇所のピークに関して、予想されるCPS4 RUおよびポリマー構造と一致するMS/MSパターンを特定することが可能であった（矢印により示される）。図13のパネルBは、53.8分で溶出されるピークからのMALDI-MS/MSスペクトルを示す。一連の断片化イオン（Fragmentation ion series）は、非還元性ヘキソースでピルベートにより修飾されたCPS4 RUと一致する。
【００９７】
本発明者らは、ピルベートの非化学量論的存在による不均一性を観察し、このことは、ピルベートによるCPS4反復単位の非定量的修飾またはサンプル調製の間の加水分解のいずれかを示唆した。本発明者らは、データから、本発明者らがUnd-PP上にCPS4グリカンを生成する改変型LPS生合成経路を作製できたことを結論付けた。
【００９８】
CSP4糖脂質をさらに分析するために、本発明者らは、CSP4を発現する大腸菌SCM3株（Faridmoayer A, Fentabil MA, Mills DC, Klassen JS, Feldman MF: Functional characterization of bacterial oligosaccharyltransferases involved in O-linked protein glycosylation. JOURNAL OF BACTERIOLOGY 2007, 189(22):8088-8098）から糖脂質を抽出し、それらを上記の通りに分析するか（図14）、またはin vitroグリコシル化のために糖脂質を直接用いた。この実験では、糖脂質、Nグリコシル化コンセンサス配列を含むアクセプターペプチド、およびオリゴサッカリルトランスフェラーゼPglBの精製調製物を混合する（Jervis AJ, Butler JA, Lawson AJ, Langdon R, Wren BW, Linton D: Characterization of the structurally diverse N-linked glycans of Campylobacter species. JOURNAL OF BACTERIOLOGY 2012, 194(9):2355-2362）。グリカンの配列決定のために、HILICクロマトグラフィー（図15、パネルAおよびB）およびそれに続くESI-MS/MSにより分析することができる糖ペプチドが形成される。そのような実験からの生成物が分析された場合、ペプチドに連結された、排他的にピルビン酸化された（exclusively pyruvylated）グリカンが特定された（図15、パネルCおよびD）。つまり、図13および図14で観察される非化学量論的ピルビン酸化（pyruvylation）は、最もあり得そうなことには、CPS4 RUの非定量的修飾ではなく、サンプル調製中のグリカンからのピルベートの加水分解に起因した。つまり、本発明者らは、改変型LPS生合成経路により、活性かつ化学的コンジュゲートと比較しておそらく良好であるコンジュゲートの合成を可能にする、ネイティブ条件下でのCPSの生成が可能であることを主張する。
【００９９】
この仮説を試すために、本発明者らは、前臨床アッセイで糖コンジュゲートを試験することを目指した。第1ステップでは、本発明者らは、一般的担体タンパク質である遺伝学的に無毒化された緑膿菌の外毒素A（EPA、米国特許出願公開第2011/0274720 A1号）へとコンジュゲートされたCPS4を生成するために、微生物発酵を用いた。大腸菌W3110 ΔwaaLを、pGVXN539（2つのNグリコシル化コンセンサス配列をコードするEPA担体タンパク質を発現し（米国特許出願公開第2011/0274720 A1号およびdyx）、pACT3にクローニングされており（GenBank：U51556.1）、ここで、clmRカセットはカナマイシン耐性カセット（kanR）に置き換えられた）；pGVXN114（PglBの誘導可能な発現、米国特許出願公開第2011/0274720 A1号）、pGVXN207（GalEの誘導可能な発現、（Rush JS, Alaimo C, Robbiani R, Wacker M, Waechter CJ: A novel epimerase that converts GlcNAc-P-P-undecaprenyl to GalNAc-P-P-undecaprenyl in Escherichia coli O157. J Biol Chem 2010, 285(3):1671-1680））およびpGVXN803（CPS4クラスターをコードする）を用いて形質転換した。細胞をTB培地中で増殖させ、好適なODで誘導し、産生を一晩行なった。Hisタグ付けEPAを、リゾチームおよびそれに続くIMACを用いたペリプラズム抽出により調製されたペリプラズム抽出物から精製した。溶出画分の分析的アッセイを、図16に示す。SDS-PAGEおよびクーマシー染色は、70kDaおよび70kDa超で非グリコシル化EPAおよびグリコシル化EPAを示し、後者はラダー様パターンで存在し、これはRUにより構成される（改変型）O抗原グリカンを示す（図16、パネルA）。同じ画分のニトロセルロース膜への電気的トランスファー後の抗His（図16、パネルB）および抗CPS4（図16、パネルC）による免疫検出により、物質中のCPS4およびEPAの存在が確認された。
【０１００】
非グリコシル化EPAおよびグリコシル化EPAの分離のために、アニオン交換クロマトグラフィーにより糖コンジュゲートをさらに精製し；続いて糖タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。得られた糖タンパク質調製物を、1-フェニル-3-メチル-5-ピラゾロン（PMP、Lv L, Yang X, Zhao Y, Ruan Y, Yang Y, Wang Z: Separation and quantification of component monosaccharides of the tea polysaccharides from Gynostemma pentaphyllum by HPLC with indirect UV detection. Food Chemistry 2009, 112:742-746）による誘導体化を用いて単糖組成について分析し、これにより、組み換え糖コンジュゲートのグリカン組成が肺炎連鎖球菌から単離されたCPS4と同一であることが実証された（図17）。
【０１０１】
糖コンジュゲートのワクチン活性を試験するために、免疫化研究およびオプソニン化貪食作用アッセイ（OPA）を行なった。OPAは、肺炎連鎖球菌細胞を排除するための抗体の機能性を扱うための一般的に認識されたアッセイであり、保護に対する代用である。本発明者らは、様々な用量のEPA-CPS4コンジュゲートを用いてウサギを免疫した。対照として、本発明者らはプレベナー13（小児肺炎球菌疾患の予防のために広く用いられる、認可済み市販製品）を用いた。得られた抗血清を、標準化されたプロトコールに従って、免疫原性に関するドットブロット（図18）および機能性に関するOPAによる分析に供した（Romero-Steiner S, Frasch CE, Carlone G, Fleck RA, Goldblatt D, Nahm MH: Use of opsonophagocytosis for serological evaluation of pneumococcal vaccines. Clin Vaccine Immunol 2006, 13(2):165-169）。
【０１０２】
表1は、得られた関連するオプソニン力価を示す。結果は、大腸菌で組み換え的に生成された糖コンジュゲートが、オプソニン化貪食作用アッセイで活性な抗血清を生起する能力に関して、認可ワクチン比較物と同等に良好であり、一部の場合には優れてさえいることを示す。
【０１０３】
実施例3：大腸菌でのCPS14コンジュゲートの合成
CPSコンジュゲートの生成のために大腸菌を用いることができることをさらに示すために、本発明者らは、CPS14コンジュゲートを生成させることを目指した。CPS14多糖は、CPS1およびCPS4と類似の構造で、CPS14クラスター（図19）によりコードされる。CPS14は、以下の構造を有する重合（ポリマー化）されたRUからなる（図20）：-1,6-(b-D-Gal-1,4)-b-D-GlcNAc-1,3-b-D-Gal-1,4-b-D-Glc-。
【０１０４】
CPS14の生合成は、WchAの活性によるウンデカプレニルリン酸（Und-P）へのホスホ-D-Glcの付加から開始される。WchAは、コラン酸クラスター中の遺伝子によりコードされる大腸菌WcaJタンパク質と同じ活性を有するホスホ-グルコーストランスフェラーゼであることが生化学的に示された。D-Glcのさらなる伸長は、クラスター中に存在する他のグリコシルトランスフェラーゼの酵素作用により達成される（Kolkman MA, van der Zeijst BA, Nuijten PJ: Functional analysis of glycosyltransferases encoded by the capsular polysaccharide biosynthesis locus of Streptococcus pneumoniae serotype 14. J Biol Chem 1997, 272(31):19502-19508）。CPS14クラスター中の様々なORFの詳細な機能は、wzg、wzh、wzd、wze（調節因子、および3種類の輸送関連遺伝子）、WchJK（D-Galトランスフェラーゼ）、WchL（D-GlcNAcトランスフェラーゼ）、WchM（D-Galトランスフェラーゼ）、Wzy（ポリメラーゼ）、Wzx（フリッパーゼ）について予測されている。WciYは、CPS14形成にとって必要ではないが、wchN欠失はCPS14収量に負の影響を与える（Kolkman MA, Wakarchuk W, Nuijten PJ, van der Zeijst BA: Capsular polysaccharide synthesis in Streptococcus pneumoniae serotype 14: molecular analysis of the complete cps locus and identification of genes encoding glycosyltransferases required for the biosynthesis of the tetrasaccharide subunit. Mol Microbiol 1997, 26(1):197-208）。CPS14クラスターは、CPS14生合成に最小限必要な機能よりも多くの機能がコードされているという意味で、特殊である。最も確からしいことには、指定されていない機能を有するタンパク質の一部は、莢膜の生合成を補助する補助酵素である。
【０１０５】
大腸菌でのCPS14多糖の生成を試験するために、wchAからwciYまでのひと続きの部分（ストレッチ）からなるCPS14遺伝子クラスターを、pDOCドナープラスミド（Lee DJ, Bingle LE, Heurlier K, Pallen MJ, Penn CW, Busby SJ, Hobman JL: Gene doctoring: a method for recombineering in laboratory and pathogenic Escherichia coli strains. BMC Microbiol 2009, 9:252）へとクローニングし、これはO16抗原クラスターへのCPS14の組み込みのために指定されており（pGVXN615）、大腸菌株GVXN1128（W3110ΔwaaL）へと形質転換した。pGVXN615を保有する、プロテイナーゼK消化された大腸菌細胞の免疫ブロット分析は、ラダー様パターンを示し、これは臨床的CPS14分離株の莢膜血清型決定のために用いられるCPS14抗血清を用いて検出された（図21、パネルAの挿入図）。さらに、単一反復単位を集めるために、CPS14クラスターのポリメラーゼであるwzyを、トランスポゾン突然変異誘発によりpGVXN615中で欠失させ、pGVXN643を生じさせた。pGVXN643を用いて形質転換した大腸菌細胞から糖脂質を抽出し、上記の通りの加水分解および蛍光標識後のNP-HPLCにより分析した。特異的ピークは、glycosepNカラムから、57.4分で溶出した（図21、パネルA）。このピークのMSおよびMS/MS分析は、CPS14の単一反復単位の予測される質量および断片化パターンと合致した（図21、パネルB）。このことにより、O抗原プロモーターの制御下での部分的CPS14遺伝子クラスターの発現が、一般的な大腸菌宿主細胞での組み換えLPS生合成CPS14オリゴ糖生成をもたらし得ることが確認される。
【０１０６】
大腸菌でのCPS14多糖の生合成を改善および安定化するために、wchAからwciYまでのひと続きの部分（ストレッチ）を含むCPS14クラスターの一部分をpDOC-C置換プラスミドへとクローニングし（Lee DJ, Bingle LE, Heurlier K, Pallen MJ, Penn CW, Busby SJ, Hobman JL: Gene doctoring: a method for recombineering in laboratory and pathogenic Escherichia coli strains. BMC Microbiol 2009, 9:252）、これは大腸菌コラン酸クラスターへのCPS14の組み込みのために指定された（pGVXN710）。CPS14の組み込みは、上記の通り、GVXN1052（W3110）、GVXN1128（W3110 ΔwaaL）およびGVXN1716（W3110 ΔwaaLΔwecA-wzzE）を含む数種類の大腸菌株中で達成された。コラン酸遺伝子は正常条件下では大腸菌で発現されず、それらの発現は調節因子の複雑なネットワークにより制御されていることが示されている。コラン酸の転写には、RcsAという正の調節因子が必要とされることが特定された（Ebel W, Trempy JE. J Bacteriol. 1999;181(2):577-84）。RcsAの発現のためのプラスミド（pGVX688）を保有し、コラン酸クラスターがCPS14クラスターにより置き換えられた、プロテイナーゼK消化大腸菌株の免疫ブロット分析は、臨床的CPS14分離株の血清型決定のために用いられるCPS14抗血清により検出されるラダー様パターンを示し；このパターンは、RcsAの非存在下では検出できなかった（図22を参照されたい）。この結果は、コラン酸が、多糖生合成経路を組み込むために好適な標的位置であること、および異種多糖の発現が大腸菌RcsAタンパク質により厳重に制御されることを実証する。
【０１０７】
大腸菌により生成されるCPS14をさらに特性決定するために、GVX6129（W3110ΔwaaL CA::CPS14）を、pGVXN688（rcsA）と共に大腸菌に形質転換した。糖脂質を、上記の通りに2-AB標識化およびMS/MS分析により分析した。MS/MS分析は、それぞれ95.9分および115.3分で溶出されるCPS14の2個および3個のサブユニットを特定した（図24を参照されたい）。
【０１０８】
大腸菌でのCPS14多糖の生成に対するトランスポーター遺伝子の発現の影響を試験するために、トランスポーター遺伝子を含む肺炎連鎖球菌CPS14クラスターのwzg〜wzeを、IPTG誘導性プロモーターを有する低コピー数プラスミド（pGVX72）へとクローニングして、pGVX1497を形成させた。プラスミドを大腸菌株GVX6126（大腸菌W3110 CA::CPS14）へと形質転換し、該プラスミドからCPS14クラスターのwchA〜wciY部分がコラン酸大腸菌へと組み込まれた。GVX6126を、pGVX72またはpGVX1497を用いて形質転換し、0.01mM IPTGを用いるトランスポーター遺伝子発現の誘導を伴って培養した。一晩のインキュベーションの後、大腸菌細胞を回収し、プロテイナーゼKを用いて消化し、プロテアーゼ抵抗性バイオマスをSDS-PAGEにより分離して、ニトロセルロース膜への糖脂質のトランスファー後に免疫検出により分析した。結果は、pGVXN1497（wzg-wzh-wzd-wzeを発現する）の存在下で、高分子量ラダー様シグナルが抗CPS14抗血清により検出されたこと（図23を参照されたい。レーン3）、およびpGVXN1497が空ベクター（pGVX72）で置き換えられた場合には、ラダーサイズは著しく低下したこと（図23を参照されたい。レーン2）を示す。このことは、CPSの生成に対するトランスポーター遺伝子の支持要件（supporting requirement）を実証する。
【０１０９】
gtrABSオペロンは、CPS14（wchAにより合成される）にとってネイティブな開始ステップであるUnd-PPと非常に似通った細胞性化合物であるUnd-P上でのグルコースの合成に関与する。gtrABSオペロンは、細胞質中でのUnd-P上でのグルコースの組み立て、ペリプラズムへの糖脂質のフリップに関与する酵素、およびUnd-P-グルコースをドナーとして用いてグルコース残基を大腸菌W3110中のO16サブユニットの還元末端GlcNAcへと転移させるグルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む。
【０１１０】
D-Glcを含む2種類の脂質前駆体の生成を回避するために、かつUnd-PP-CPS14のみを生成させてUnd-P-CPS14を生成させないために、Und-PP-グルコースのみを開始因子グルコースとしてつくり出す酵素を用いることができる。さらに、Und-P-グルコース生成経路を欠失させることができる。このように、すべてのCPSがピロリン酸結合によりUndへと連結され、したがってグリコシル化のために利用可能である。
【０１１１】
大腸菌でのCPS14の生合成経路をさらに解明しかつ最適化するために、CPS14経路の開始因子グルコシルトランスフェラーゼ活性を強化することができる。これは、wchAおよびwcaJの欠失、および同じ遺伝子を用いるプラスミド媒介過剰発現戦略によりそれらを補完すること、および糖脂質生成に対する影響を分析することにより、調査された。
【０１１２】
wcaJ遺伝子を含むプラスミドを、CPS14を含むがWchAおよびWcaJを有しない大腸菌株（例えば、W3110 ΔwaaL ΔrfbO16::CPS14-clmR ΔwchA ΔgtrABS）へとうまく形質転換することができる。確立された方法を用いて、これらの菌株で糖生成を分析することができる。これらの結果に基づいて、Und-PPに連結されたCPS14の最大量の生成のための遺伝子の最適な組み合わせを決定し、これを用いて大腸菌を形質転換して最適生成菌株を作製することができるであろう。確かに、優れた糖生成を伴うこの新規大腸菌株は、Nグリコシル化およびOグリコシル化の両方のグリコシル化タンパク質の生成を富化するために理想的であり得るであろう。さらに、この新規に遺伝子操作された菌株を、追加的である場合には異なる糖コンジュゲートを生成するために用いることができ；還元末端でGlcを含むいずれかの糖コンジュゲートの産生株には、多様なタンパク質担体が含められる。
【表１】
2019030309.tif 000003
【０１１３】
表1：「ニュージーランドホワイト」種ウサギを、皮下経路を介して、示した糖コンジュゲートワクチン（注：記載の量（μg）は、多糖の量/注入を指す）を用いて、0日目、21日目および42日目に免疫化した。糖コンジュゲートワクチンを、3回すべての免疫化に対して0.12％Al3+を用いるか、またはプライミング免疫化（d0）に対してはフロイントの完全アジュバント（FCA）を用いて、2回のブースト免疫化（d21およびd42）に対してはフロイントの不完全アジュバント（FIA）を用いるかのいずれかでアジュバント添加した。プレベナー13（Prevnar-13）は、製造業者の取扱説明書に従って用い、ヒト1回用量（2.2μg CPS4多糖に相当する）を1回の免疫化ごとに注入した。56日目に動物を屠殺し、得られた血清をオプソニン化貪食殺作用アッセイ（OPK）で中和活性について分析した。「オプソニン指数」は、細菌のうちの50％を死滅させる血清の希釈率として定義される（肺炎球菌血清型4）。
【０１１４】
等価物：
本明細書中に開示された方法、宿主細胞、および組成物は、本明細書中に記載された具体的な実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際には、記載のものに加えて、方法、宿主細胞、および組成物の様々な改変が、上記の説明および添付の図面から当業者には明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
本発明は以下の実施形態を包含する：
１．多糖の生成のための、遺伝子操作されたグラム陰性細菌であって、グラム陽性細菌の莢膜多糖遺伝子クラスターの調節遺伝子を含む、上記グラム陰性細菌。
２．前記莢膜多糖遺伝子クラスターのオープンリーディングフレームのうち、少なくとも25％、50％、75％、85％、90％、または少なくとも95％を含む、実施形態1に記載のグラム陰性細菌。
３．完全な前記莢膜多糖遺伝子クラスターを含む、実施形態1に記載のグラム陰性細菌。４．前記多糖が、前記莢膜多糖のエピトープを含む、実施形態1に記載のグラム陰性細菌。
５．エシェリキア属の種、大腸菌、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、サルモネラ属の種、イェルシニア属の種、ナイセリア属の種、ビブリオ属の種およびシュードモナス属の種からなる群より選択される、実施形態1に記載のグラム陰性細菌。
６．大腸菌である、実施形態5に記載のグラム陰性細菌。
７．前記調節遺伝子が肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）調節遺伝子である、実施形態1〜6のいずれかに記載のグラム陰性細菌。
８．前記肺炎連鎖球菌調節遺伝子が、肺炎連鎖球菌1型に由来する、実施形態7に記載のグラム陰性細菌。
９．前記肺炎連鎖球菌調節遺伝子が、肺炎連鎖球菌4型に由来する、実施形態7に記載のグラム陰性細菌。
１０．前記調節遺伝子が、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）調節遺伝子である、実施形態1〜9のいずれかに記載のグラム陰性細菌。
１１．前記調節遺伝子が、B群溶血性連鎖球菌（Staphylococcus agalactiae）調節遺伝子である、実施形態1〜10のいずれかに記載のグラム陰性細菌。
１２．前記調節遺伝子が、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）調節遺伝子である、実施形態1〜11のいずれかに記載のグラム陰性細菌。
１３．オリゴサッカリルトランスフェラーゼをさらに含む、実施形態1〜12のいずれかに記載のグラム陰性細菌。
１４．前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、前記グラム陰性細菌にとって異種である、実施形態13に記載のグラム陰性細菌。
１５．少なくとも1種の異種グリコシルトランスフェラーゼをさらに含む、実施形態1〜14のいずれかに記載のグラム陰性細菌。
１６．前記異種グリコシルトランスフェラーゼが原核生物グリコシルトランスフェラーゼである、実施形態15に記載のグラム陰性細菌。
１７．前記グリコシルトランスフェラーゼが、前記調節遺伝子と同じグラム陽性細菌から取得される、実施形態16に記載のグラム陰性細菌。
１８．前記グラム陰性細菌にとってネイティブの1種以上の遺伝子が欠失されているか、または不活性化されている、実施形態1〜17のいずれかに記載のグラム陰性細菌。
１９．前記1種以上の欠失された遺伝子が、waaL遺伝子を含む、実施形態18に記載のグラム陰性細菌。
２０．前記1種以上の欠失された遺伝子が、前記グラム陰性細菌でのO抗原生合成に関連するすべての遺伝子を含む、実施形態18に記載のグラム陰性細菌。
２１．前記調節遺伝子が、wzg、wzh、wzd、wze、capA、capB、またはcapCである、実施形態1〜20のいずれかに記載のグラム陰性細菌。
２２．グリコシル化のためのコンセンサス配列を含む担体タンパク質をコードする核酸をさらに含む、実施形態1〜21のいずれかに記載のグラム陰性細菌。
２３．前記担体タンパク質をコードする核酸が、前記グラム陰性細菌にとって異種である、実施形態22に記載のグラム陰性細菌。
２４．前記担体タンパク質が、緑膿菌（P. aeruginosa）由来の無毒化型外毒素A、CRM197、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の無毒化型溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化型変異体、コレラ毒素Bサブユニット（CTB）、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化型変異体、大腸菌satタンパク質、大腸菌satタンパク質のパッセンジャードメイン（passenger domain）、C.ジェジュニ（C. jejuni）AcrA、C.ジェジュニ天然糖タンパク質、肺炎連鎖球菌ニューモリシン、肺炎連鎖球菌NOX、肺炎連鎖球菌PspA、肺炎連鎖球菌PcpA、肺炎連鎖球菌PhtD、肺炎連鎖球菌PhtE、肺炎連鎖球菌Ply、または肺炎連鎖球菌LytBである、実施形態22に記載のグラム陰性細菌。
２５．前記担体タンパク質が肺炎連鎖球菌タンパク質である、実施形態22に記載のグラム陰性細菌。
２６．前記担体タンパク質が、オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより多糖にコンジュゲートされる、実施形態22または24に記載のグラム陰性細菌。
２７．前記莢膜多糖が、肺炎連鎖球菌CPS1、CPS2、CPS3、CP4、CPS5、CPS6（AおよびB）、CPS7（A、B、C）、CPS8、CPS9（A、L、N、V）、CPS10（A、B、C、F）、CPS11（A、B、C、D、F）、CPS12（A、B、F）、CPS13、CPS14、CPS15（A、B、C、F）、CPS16（A、F）、CPS17（A、F）、CPS18（A、B、C、F）、CPS19（A、B、C、F）、CPS20、CPS21、CPS22（A、F）、CPS23（A、B、F）、CPS24（A、B、F）、CPS25（A、F）、CPS26、CPS27、CPS28（A、F）、CPS29、CPS31、CPS32（A、F）、CPS33（A、B、C、D、F）、CPS34、CPS35（A、B、C、D、F）、CPS36、CPS37、CPS38、CPS39、CPS40、CPS41（A、F）、CPS42、CPS43、CPS44、CPS45、CPS46、CPS47（A、F）、もしくはCPS48；または黄色ブドウ球菌CPS5、もしくはCPS8；B群溶血性連鎖球菌（B群、GBS）CPSIa、CPSIb、CPSII、CPSIII、CPSIV、CPSV、CPSVI、CPSVII、もしくはCPSVIII；またはエンテロコッカス・フェカリスCPSA、CPSB、CPSC、もしくはCPSDである、実施形態1〜26のいずれかに記載のグラム陰性細菌。
２８．グラム陰性細菌で複製可能なベクターであって、グラム陽性細菌での莢膜多糖生合成と関連する調節遺伝子を含む、上記ベクター。
２９．UDP-グルコース：ウンデカプレニルリン酸グルコース-リン酸トランスフェラーゼ活性の発現および活性が増大している、実施形態1〜27のいずれかに記載のグラム陰性細菌。
３０．腸内一般細菌（例えば、大腸菌W3110）のコラン酸wcaオペロンによりコードされるWcaJを発現する、実施形態1〜27のいずれかに記載のグラム陰性細菌。
３１．多糖の生成のための、遺伝子操作されたグラム陰性細菌であって、該グラム陰性細菌のGtr酵素をコードする遺伝子が機能的に不活性化されている、上記グラム陰性細菌。３２．Gtr酵素をコードする遺伝子の機能的不活性化が、Und-P連結型グルコースの除去をもたらす、実施形態31に記載のグラム陰性細菌。
３３．前記グラム陰性細菌のGtr酵素をコードする遺伝子が欠失されている、実施形態31に記載のグラム陰性細菌。
３４．GtrA、GtrBおよび/またはGtrSをコードする遺伝子が機能的に不活性化されている、実施形態31または33に記載のグラム陰性細菌。
３５．GtrA、GtrBおよび/またはGtrSをコードする遺伝子が欠失されている、実施形態34に記載のグラム陰性細菌。
３６．前記グラム陰性細菌のGtr酵素をコードする遺伝子が機能的に不活性化されている、実施形態1〜27のいずれかに記載のグラム陰性細菌。
３７．前記グラム陰性細菌のGtr酵素をコードする遺伝子が欠失されている、実施形態36に記載のグラム陰性細菌。
３８．GtrA、GtrBおよび/またはGtrSをコードする遺伝子が機能的に不活性化されている、実施形態36または37に記載のグラム陰性細菌。
３９．GtrA、GtrBおよび/またはGtrSをコードする遺伝子が欠失されている、実施形態38に記載のグラム陰性細菌。
４０．エシェリキア属の種、大腸菌、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、サルモネラ属の種、イェルシニア属の種、およびシュードモナス属の種からなる群より選択される、実施形態31に記載のグラム陰性細菌。
４１．オリゴサッカリルトランスフェラーゼをさらに含む、実施形態31〜40のいずれかに記載のグラム陰性細菌。
４２．前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、前記グラム陰性細菌にとって異種である、実施形態41に記載のグラム陰性細菌。
４３．前記グラム陰性細菌にとって異種である少なくとも1種のグリコシルトランスフェラーゼをさらに含む、実施形態31〜40のいずれかに記載のグラム陰性細菌。
４４．前記グリコシルトランスフェラーゼが原核生物グリコシルトランスフェラーゼである、実施形態43に記載のグラム陰性細菌。
４５．グリコシル化のためのコンセンサス配列を含む担体タンパク質をコードする核酸をさらに含む、実施形態31〜40のいずれかに記載のグラム陰性細菌。
４６．前記担体タンパク質をコードする核酸が、前記グラム陰性細菌にとって異種である、実施形態45に記載のグラム陰性細菌。
４７．前記担体タンパク質が、緑膿菌（P. auruginosa）由来の無毒化型外毒素A、CRM197、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の無毒化型溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化型変異体、コレラ毒素Bサブユニット（CTB）、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化型変異体、大腸菌satタンパク質、大腸菌satタンパク質のパッセンジャードメイン、C.ジェジュニAcrA、およびC.ジェジュニ天然糖タンパク質である、実施形態45に記載のグラム陰性細菌。
４８．前記担体タンパク質が、オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより多糖にコンジュゲートされる、実施形態45に記載のグラム陰性細菌。
４９．前記多糖が肺炎連鎖球菌の莢膜多糖である、実施形態31に記載のグラム陰性細菌。５０．前記多糖が、大腸菌O抗原（O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186、O187）、サルモネラ属の種（S.エンテリカ亜種エンテリカ（S. enterica subsp. Enterica）、S.エンテリカ亜種サラマエ（S. enterica subsp. Salamae）、S.エンテリカ亜種アリゾナエ（S. enterica subsp. arizonae）、S.エンテリカ亜種ジアリゾナエ（S. enterica subsp. Diarizonae）、S.エンテリカ亜種ホウテナエ（S. enterica subsp. Houtenae）、S.ボンゴリ（S. bongori）、およびS.エンテリカ亜種インディカ（S. enterica subsp. Indica）、およびO 1〜67型、シュードモナス属の種（緑膿菌O血清型1〜20）、クレブシエラ属の種（特に、K.ニューモニエ（K. pneumonia）血清型O1、O2（および下位血清型）、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12）、アシネトバクター属O抗原（特に、A.バウマンニイ（A. baumannii）O抗原）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）O抗原（血清型A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L1、L2、L3）、コレラ菌（Vibrio cholera）O抗原O1〜155、リステリア属の種、特にL.モノサイトゲネス（L. monocytogenes）1型、2型、3型、4型およびそれらの下位血清型、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）血清型1〜15 O抗原、ボルデテラ・パラペルツッシス（Bordetella parapertussis）O抗原、ブルクホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）およびシュードマレイ（pseudomallei）O抗原、野兎病菌（Francisella tularensis）、カンピロバクター属の種（C.ジェジュニ）；クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）（血清型A、G、H、K、S1、S4、D、Cd-5、およびウェルシュ菌（C. perfringens）血清型A、B、C、DおよびE）の莢膜多糖、黄色ブドウ球菌5型および8型、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyrogenes）（B群連鎖球菌莢膜血清型多糖）、大腸菌、B群溶血性連鎖球菌（Streptococcus agalacticae）（A群連鎖球菌莢膜多糖）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）（血清型A、B、C、W、Y、X）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、エンテロコッカス・フェカリス莢膜多糖I〜V型；ならびに他の表面多糖構造、例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）糖脂質）、髄膜炎菌ピリン（pilin）Oグリカンおよびリポオリゴ糖（lipooligosaccharide）（LOS）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）LOS、リューシュマニア属主要リポホスホグリカン（Leishmania major lipophosphoglycan）、腫瘍関連炭水化物抗原、���ラリアグリコシルホスファチジルイノシトール（malaria glycosyl phosphatidylinositol）、またはヒト型結核菌（mycobacterium tuberculosis）アラビノマンナンである、実施形態31〜48のいずれかに記載のグラム陰性細菌。
５１．実施形態1〜27および29〜50のいずれかに記載のグラム陰性細菌により生成される組み換え糖タンパク質。
５２．タンパク質の産生に好適な条件下で実施形態1〜27および29〜50のいずれかに記載のグラム陰性細菌を培養するステップを含む、組み換え糖タンパク質の生成方法。
５３．前記組み換え糖タンパク質を精製するステップをさらに含む、実施形態52に記載の方法。
５４．プレシオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）O抗原遺伝子クラスターを含む遺伝子操作された大腸菌細胞であって、該O抗原遺伝子クラスターのwbgW遺伝子が不活性化されており、該大腸菌細胞がUnd-PP-D-FucNAc4Nを生成する、上記大腸菌細胞。
５５．ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）またはプレシオモナス・シゲロイデスO17 O抗原遺伝子クラスターを含む遺伝子操作された大腸菌細胞であって、該O抗原遺伝子クラスターのwbgW遺伝子が不活性化されており、該大腸菌細胞がUnd-PP-D-FucNAc4Nを生成する、上記大腸菌細胞。
【０１１５】
種々の刊行物、特許および特許出願が本明細書中に引用され、これらの開示はその全体で参照により組み入れられる。
【図１】
2019030309.tif 000004
【図２】
2019030309.tif 000005
【図３】
2019030309.tif 000006
【図４】
2019030309.tif 000007
【図５】
2019030309.tif 000008
【図６】
2019030309.tif 000009
【図７】
2019030309.tif 000010
【図８】
2019030309.tif 000011
【図９】
2019030309.tif 000012
【図１０】
2019030309.tif 000013
【図１１】
2019030309.tif 000014
【図１２】
2019030309.tif 000015
【図１３Ａ】
2019030309.tif 000016
【図１３Ｂ】
2019030309.tif 000017
【図１４】
2019030309.tif 000018
【図１５Ａ】
2019030309.tif 000019
【図１５Ｂ】
2019030309.tif 000020
【図１５Ｃ】
2019030309.tif 000021
【図１５Ｄ】
2019030309.tif 000022
【図１６】
2019030309.tif 000023
【図１７】
2019030309.tif 000024
【図１８】
2019030309.tif 000025
【図１９】
2019030309.tif 000026
【図２０】
2019030309.tif 000027
【図２１Ａ】
2019030309.tif 000028
【図２１Ｂ】
2019030309.tif 000029
【図２２】
2019030309.tif 000030
【図２３】
2019030309.tif 000031
【図２４】
2019030309.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月1日(2018.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖の生成のための、遺伝子操作されたグラム陰性細菌であって、該グラム陰性細菌のGtr酵素をコードする遺伝子が機能的に不活性化されている、上記グラム陰性細菌。
【請求項２】
Gtr酵素をコードする遺伝子の機能的不活性化が、Und-P連結型グルコースの除去をもたらす、請求項1に記載のグラム陰性細菌。
【請求項３】
前記グラム陰性細菌のGtr酵素をコードする遺伝子が欠失されている、請求項1に記載のグラム陰性細菌。
【請求項４】
GtrA、GtrBおよび/またはGtrSをコードする遺伝子が機能的に不活性化されている、請求項1または3に記載のグラム陰性細菌。
【請求項５】
GtrA、GtrBおよび/またはGtrSをコードする遺伝子が欠失されている、請求項4に記載のグラム陰性細菌。
【請求項６】
前記グラム陰性細菌のGtr酵素をコードする遺伝子が機能的に不活性化されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項７】
前記グラム陰性細菌のGtr酵素をコードする遺伝子が欠失されている、請求項6に記載のグラム陰性細菌。
【請求項８】
GtrA、GtrBおよび/またはGtrSをコードする遺伝子が機能的に不活性化されている、請求項6または7に記載のグラム陰性細菌。
【請求項９】
GtrA、GtrBおよび/またはGtrSをコードする遺伝子が欠失されている、請求項8に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１０】
エシェリキア属の種、大腸菌、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、サルモネラ属の種、イェルシニア属の種、およびシュードモナス属の種からなる群より選択される、請求項1〜9のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１１】
オリゴサッカリルトランスフェラーゼをさらに含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１２】
前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、前記グラム陰性細菌にとって異種である、請求項11に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１３】
前記グラム陰性細菌にとって異種である少なくとも1種のグリコシルトランスフェラーゼをさらに含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１４】
前記グリコシルトランスフェラーゼが原核生物グリコシルトランスフェラーゼである、請求項13に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１５】
グリコシル化のためのコンセンサス配列を含む担体タンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１６】
前記担体タンパク質をコードする核酸が、前記グラム陰性細菌にとって異種である、請求項15に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１７】
前記担体タンパク質が、緑膿菌（P. auruginosa）由来の無毒化型外毒素A、CRM197、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の無毒化型溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌FimH、大腸菌FimHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの無毒化型変異体、コレラ毒素Bサブユニット（CTB）、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化型変異体、大腸菌satタンパク質、大腸菌satタンパク質のパッセンジャードメイン、C.ジェジュニAcrA、およびC.ジェジュニ天然糖タンパク質である、請求項15に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１８】
前記担体タンパク質が、オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより多糖にコンジュゲートされる、請求項15に記載のグラム陰性細菌。
【請求項１９】
前記多糖が肺炎連鎖球菌の莢膜多糖である、請求項1〜18のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項２０】
前記多糖が、大腸菌O抗原（O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186、O187）、サルモネラ属の種（S.エンテリカ亜種エンテリカ（S. enterica subsp. Enterica）、S.エンテリカ亜種サラマエ（S. enterica subsp. Salamae）、S.エンテリカ亜種アリゾナエ（S. enterica subsp. arizonae）、S.エンテリカ亜種ジアリゾナエ（S. enterica subsp. Diarizonae）、S.エンテリカ亜種ホウテナエ（S. enterica subsp. Houtenae）、S.ボンゴリ（S. bongori）、およびS.エンテリカ亜種インディカ（S. enterica subsp. Indica）、およびO 1〜67型、シュードモナス属の種（緑膿菌O血清型1〜20）、クレブシエラ属の種（特に、K.ニューモニエ（K. pneumonia）血清型O1、O2（および下位血清型）、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12）、アシネトバクター属O抗原（特に、A.バウマンニイ（A. baumannii）O抗原）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）O抗原（血清型A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L1、L2、L3）、コレラ菌（Vibrio cholera）O抗原O1〜155、リステリア属の種、特にL.モノサイトゲネス（L. monocytogenes）1型、2型、3型、4型およびそれらの下位血清型、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）血清型1〜15 O抗原、ボルデテラ・パラペルツッシス（Bordetella parapertussis）O抗原、ブルクホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）およびシュードマレイ（pseudomallei）O抗原、野兎病菌（Francisella tularensis）、カンピロバクター属の種（C.ジェジュニ）；クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）（血清型A、G、H、K、S1、S4、D、Cd-5、およびウェルシュ菌（C. perfringens）血清型A、B、C、DおよびE）の莢膜多糖、黄色ブドウ球菌5型および8型、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyrogenes）（B群連鎖球菌莢膜血清型多糖）、大腸菌、B群溶血性連鎖球菌（Streptococcus agalacticae）（A群連鎖球菌莢膜多糖）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）（血清型A、B、C、W、Y、X）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、エンテロコッカス・フェカリス莢膜多糖I〜V型；ならびに他の表面多糖構造、例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）糖脂質）、髄膜炎菌ピリン（pilin）Oグリカンおよびリポオリゴ糖（lipooligosaccharide）（LOS）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）LOS、リューシュマニア属主要リポホスホグリカン（Leishmania major lipophosphoglycan）、腫瘍関連炭水化物抗原、マラリアグリコシルホスファチジルイノシトール（malaria glycosyl phosphatidylinositol）、またはヒト��結核菌（mycobacterium tuberculosis）アラビノマンナンである、請求項1〜18のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌。
【請求項２１】
請求項1〜20のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌により生成される組み換え糖タンパク質。
【請求項２２】
タンパク質の産生に好適な条件下で請求項1〜20のいずれか1項に記載のグラム陰性細菌を培養するステップを含む、組み換え糖タンパク質の生成方法。
【請求項２３】
前記組み換え糖タンパク質を精製するステップをさらに含む、請求項22に記載の方法。