(57)【要約】【課題】多剤耐性菌に対して有効な抗生物質を提供する。【解決手段】式（１）で示される化合物又はその塩。【化１】2019151565.tif 000007【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で示される化合物又はその塩。
【化１】
2019151565.tif 000006
【請求項２】
請求項１に記載の化合物（１）を有効成分として含有する抗菌剤。
【請求項３】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５６０のストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）ＨＯＫ０２１株と、細胞壁にミコール酸を含有する微生物を混合して培養し、前記培養物から回収される二次代謝産物。
【請求項４】
前記細胞壁にミコール酸を含有する微生物がツカムレラ属に属する請求項３に記載の二次代謝産物。
【請求項５】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌及びバンコマイシン耐性腸球菌に対して抗菌作用を有する請求項３又は請求項４に記載の二次代謝産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、抗生物質として有効な新規化合物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
医療現場におけるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus；以下、「ＭＲＳＡ」と略称する）の蔓延は、感染防御能が低下した患者等に重篤な病態を引き起こす懸念があり、臨床的に重大な問題となっている。また、ＭＲＳＡに有効なバンコマイシンに対して耐性を獲得したバンコマイシン耐性腸球菌（Vancomycin-resistant Enterococcus ；以下、「ＶＲＥ」と略称する）も出現し、感染症の治療に用いられる抗菌薬の多くがＶＲＥに対して無効という現状がある。
【０００３】
このため、ＭＲＳＡ、ＶＲＥのような多剤耐性菌に対して有用な生理活性物質を産生する能力をもった微生物の探索が広く行われている。例えば、リソバクター(Lysobacter)属に属する微生物の培養液中から精製した抗生物質は、ＭＲＳＡとＶＲＥの双方に抗菌活性を示すことが報告されている（特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−５４８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
多剤耐性菌に対して有効な生理活性物質のスクリーニングには、単離された放線菌等の菌株の純粋培養株を使用するのが一般的である。
一方、本発明者は、放線菌とミコール酸含有菌を共培養（混合培養）することで、放線菌の二次代謝産物生産能力が活性化され、純粋培養では産生されない抗菌性を示す二次代謝産物を得ることができることを見出した。このような混合培養の手法を用いて、放線菌の潜在的な二次代謝を誘導することにより、従来の純粋培養では産生できない新規抗生物質を得ることが期待される。
【０００６】
本発明は、多剤耐性菌に対して有効な化合物を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、ミコール酸含有菌と被検菌を混合培養することで、純粋培養では得られない新規の生理活性物質が産生されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明は、以下の発明を包含する。
【化１】
2019151565.tif 000002
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、既知の抗生物質とは異なる化学構造を有し、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ等の多剤耐性菌に対して抗菌作用を示す新規な化合物が提供される。ここで、「抗菌作用」とは、細菌の生育もしくは増殖を阻害する作用、または細菌を死滅させる作用のことを言う。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】化合物（１）の化学構造である。
【図２】化合物（１）のＮＭＲデータである。
【図３】化合物（１）のＣＯＳＹ相関及びＲＯＥＳＹ相関を示す図である。
【図４】化合物（１）のＨＭＢＣ相関を示す図である。
【図５】化合物（１）の部分構造のＨＭＢＣ相関を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の化合物は、
【化２】
2019151565.tif 000003
で表される構造を有する。
【００１１】
化合物（１）は、ミコール酸含有菌と被検菌を複合（混合）して培養し、その培養液中から単離される二次代謝産物として得ることができる。以下、化合物（１）を、ＰＴＭ９０４と称する。
【００１２】
ミコール酸含有菌は、細胞壁にミコール酸を含有する微生物であって、被検菌の二次代謝産物生産を誘導する能力を有する。本発明で使用されるミコール酸含有菌は、例えば、ツカムレラ（Tsukamurella）属に属する微生物である。
【００１３】
被検菌は、例えば、国内（北海道富良野市）の土壌試料から分離され、本発明者がＨＯＫ０２１株と命名した放線菌である。ＨＯＫ０２１株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列は、ストレプトマイセス（Streptomyces）属のそれに対して高い相同性（相合率９９．６％）を示した。よって、ＨＯＫ０２１株は、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物である。
実施例１の被検菌として用いたStreptomyces hygroscopicus ＨＯＫ０２１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５６０として寄託されている（受託日：２０１７年１０月１７日）。
【００１４】
ミコール酸含有菌と被検菌の混合培養は、被検菌を単独で培養する場合に好適な培養条件下で行うことができ、通常、好気的条件下で行われる。培地の種類や培養条件（培地栄養源、培養時間、温度、ｐＨ等）は、一般の微生物による抗生物質の製造において通常使用される場合に準じ、また、ミコール酸含有菌や被検菌の性質を考慮して適宜決定される。ミコール酸含有菌と被検菌は、いずれも生菌の状態で混合培養される。
【００１５】
ＰＴＭ９０４は、ミコール酸含有菌と被検菌を混合培養した培養物から回収され、単離精製されて得られる。
単離精製方法としては、微生物からの二次代謝産物を取得するのに通常用いられる方法を採用することができる。例えば、培養物の培養後、濾過、遠心分離等の公知の手法によって菌体と上清とを分離し、上清を有機溶媒等で溶媒抽出した後、種々の分離方法で単離精製して、ＰＴＭ９０４を採取することができる。あるいは培養物を遠心操作あるいはフィルター濾過することにより、回収した菌体ペレットを適切な方法で破砕し、適切な溶媒等を用いて抽出し精製することでＰＴＭ９０４を回収することも可能である。分離方法としては、ＯＤＳカラム等の逆相カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーを用いたＨＰＬＣによる分取等を行うことができる。さらに、結晶化、減圧濃縮、凍結乾燥等の手段を単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。最終的に目的とするＰＴＭ９０４が得られる方法であれば、いかなる単離精製方法であるかを問わない。
【００１６】
被検菌のStreptomyces hygroscopicus ＨＯＫ０２１株とミコール酸含有菌とを混合培養し、その培養物から回収される二次代謝産物としては、抗菌性物質であるのが好ましく、ＰＴＭ９０４の他、既知化合物であるプラテンシマイシン（Platensimycin）、エンテロバクチン（Enterobactin）、ＥＮＴ４４７（N,N'-bis(2,3-dihydroxybenzoyl)-O-(α-aminoacryloyl)-O-serylserine）などが挙げられ、これらを単独で、または複数を組み合わせて用いることができる。
【００１７】
上述した二次代謝産物のうち、プラテンシマイシンは、南アフリカの土壌に存在する放線菌の一種であるストレプトマイセス・プラテンシス（Streptomyces platensis）から純粋培養で単離されたものである。
プラテンシマイシンは、細菌の脂肪酸合成を行う酵素（FabF）を阻害することで抗生作用を示し、耐性菌が出現しにくく、ＭＲＳＡ、ＶＲＥにも有効である。また、プラテンシマイシンは、ＭＲＳＡ、ＶＲＥを含むグラム陽性菌に対して広範な抗菌スペクトルを示すことが報告されている。プラテンシマイシンの抗生物質としての重要性に鑑み、後述する抗菌作用の評価試験においては、ＰＴＭ９０４とプラテンシマイシンのそれぞれのＭＩＣ（最少発育阻止濃度）を測定するものとする。
【００１８】
ＰＴＭ９０４は、公知の化学合成法を利用して合成されるものであってもよい。もっとも、微生物の培養によってＰＴＭ９０４を得る方法は、特別な金属触媒や試薬等を必要とせず、化学合成法に比べて有利な点が多い。ＰＴＭ９０４は、構造中に不斉炭素原子を有し、立体異性が生じるが、ここではいずれの立体異性体も含まれ、またラセミ体であってもよい。
【００１９】
ＰＴＭ９０４は、フリー体に限らず、塩として存在するものであってもよい。ＰＴＭ９０４の塩としては、薬理学的に許容される塩であれば特に限定されず、ＰＴＭ９０４は、無機酸や有機酸から誘導される塩として存在し得る。
【００２０】
本発明の抗菌剤は、ＰＴＭ９０４をそのまま用いてもよいが、使用し易い製剤に加工されるのが好ましい。例えば、経口投与のための製剤としては、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、口腔内崩壊錠、液剤、シロップ剤等が挙げられ、非経口投与のための製剤としては、注射剤、点滴剤、坐薬、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、点耳剤、軟膏、クリーム等が挙げられる。これらの製剤には、それぞれの製剤の種類に応じて、慣用の補助剤や担体成分を含ませることができる。また、これらの製剤は、その剤形に応じて、混和、混練、造粒、打錠、コーティング、滅菌処理、乳化等の慣用の方法で製造され得る。
また、医療用ガーゼなどに付着させて創部等の感染症を防ぐための被覆材として使用される場合も想定される。
【００２１】
＜実施例１＞
１．ＰＴＭ９０４の製造
［ＨＯＫ０２１の分離］
東京大学大学院農学生命科学研究科付属演習林（北海道演習林、北海道富良野市）において採取した土壌から希釈フェノール法及びＩＳＰ４培地（培地成分：1% Soluble starch, 0.1% K2HPO4, 0.1% MgSO4, 0.1% NaCl, 0.2% (NH4)2SO4, 0.2% CaCO3, 0.0001% FeSO4, 0.0001% MnCl2, 0.0001% ZnSO4, 2.0% agar.）を用いて放線菌を分離した。分離放線菌ＨＯＫ０２１株の部分１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅し、サンガー法により塩基配列を決定したところ、基準株であるStreptomyces hygroscopicus subsp. glebosus（遺伝子登録番号ＡＢ１８４４７９）と９９．６％（１４６３／１４６９）の相同性を示した。ＨＯＫ０２１株をStreptomyces hygroscopicus ＨＯＫ０２１株と命名した。
【００２２】
［ＨＯＫ０２１とＴＰ−Ｂ０５９６の培養］
Streptomyces hygroscopicus ＨＯＫ０２１株の胞子液グリセロールストック（−８０℃保存）をＩＳＰ２寒天培地（培地成分：0.4% Yeast extract, 1% Malt extract, 0.4% glucose, 2.0% agar.）に植菌し、３０℃で５日間静置培養を行った。ミコール酸含有菌であるTsukamurella pulmonis ＴＰ−Ｂ０５９６の菌体グリセロールストック（−８０℃保存）をＩＳＰ２寒天培地に植菌し、３０℃で３日間静置培養を行った。Ｋ−１型フラスコに１００ｍｌのＶ−２２培地（培地成分：1% Soluble starch, 0.5% Glucose, 0.3% NZ-case, 0.2% Yeast extract, 0.1% Tryptone, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4, 0.3% CaCO3（pH 7））を入れた培地に、寒天培地に生育したＨＯＫ０２１株菌体を植菌し、３日間（３０℃、２００ｒｐｍ）前培養を行った。Ｋ−１型フラスコに１００ｍｌのＶ−２２培地を入れた培地に、寒天培地に生育したＴＰ−Ｂ０５９６株菌体を植菌し、２日間（３０℃、２００ｒｐｍ）前培養を行った。ＨＯＫ０２１株の前培養液を３ｍｌ、ＴＰ−Ｂ０５９６株の前培養液１ｍｌを、Ｋ−１型フラスコに１００ｍｌのＡ−３Ｍ培地（培地成分：2% Soluble starch, 2% Glycerol, 1.5% Pharmamedia, 0.5% Glucose, 0.3% Yeast extract, 1% Diaion（登録商標）HP-20（pH 7））を入れた培地に同時に植菌し、その後８日間（３０℃、２００ｒｐｍ）本培養を行った。
【００２３】
［ＰＴＭ９０４の抽出］
本培養液（合計３．６Ｌ）を等量の酢酸エチル（３．６Ｌ、Ｗａｋｏ 特級試薬）を用いて一回目の撹拌抽出（約１時間）を行い、遠心分離によって酢酸エチル相と水相を分離し、酢酸エチル相を回収した。残った水相に対し、さらに等量の酢酸エチル（３．６Ｌ）を用いて二回目の撹拌抽出（約１時間）を行い、遠心分離によって酢酸エチル相と水相を分離し、酢酸エチル相を回収した。回収した一回目と二回目の酢酸エチル相を合わせ、エバポレーターによる減圧下、酢酸エチルを留去し、約２．９ｇのクルード抽出物を得た。
【００２４】
［ＰＴＭ９０４の精製（１）］
最初に、移動相にアセトニトリル（Ｗａｋｏ特級試薬）とｍｉｌｌｉ-Ｑ（登録商標）水を用いた中圧ＯＤＳカラムを使用し、クルード抽出物の粗精製を行った。クルード抽出物約０．６ｇをＤＭＳＯにより０．１ｇ／ｍｌ濃度に溶解し、２０％アセトニトリル溶媒に置換したＯＤＳカラム（４ｉ.ｄ.×２４ｃｍ、約３００ｍｌ）に添加した。２０％アセトニトリル溶媒、４０％アセトニトリル溶媒、６０％アセトニトリル溶媒、８０％アセトニトリル溶媒、１００％アセトニトリル溶媒、それぞれ３００ｍｌを用いて溶出した。分取した６０％アセトニトリル溶媒の後半１５０ｍｌに目的のＰＴＭ９０４を含む画分を得た。エバポレーターを用いてアセトニトリルを留去し、残った水相を−８０℃ディープフリーザー中で凍結させ、凍結乾燥により残った水相を留去し、４６．７ｍｇの粗精製物を得た。
【００２５】
［ＰＴＭ９０４の精製（２）］
次に、移動相にアセトニトリル（Ｗａｋｏ特級試薬）と１０ｍＭ 酢酸アンモニウム緩衝液を用いたフェニルエチル基カラムを使用し、ＨＰＬＣ精製を行った。粗精製物４６．７ｍｇをＤＭＳＯにより約２５ ｍｇ／ｍｌ 濃度に溶解し、３０％アセトニトリル溶媒に置換したＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標）５ＰＥ−ＭＳカラム（５μｍ、１０ｉ.ｄ．×２５０ｍｍ、ナカライ）に、一回に２０μＬずつ注入した。流速４．２ ｍｌ／ｍｉｎ、アイソクラティックで溶出し、保持時間８．５分に溶出したピークを分取し、目的のＰＴＭ９０４を含む画分を得た。エバポレーターを用いてアセトニトリルを留去し、残った緩衝液相を−８０℃ディープフリーザー中で凍結させ、凍結乾燥により残った水相を留去し、４．２ｍｇの精製物を得た。
【００２６】
［ＰＴＭ９０４の精製（３）］
次に、移動相にアセトニトリル（Ｗａｋｏ特級試薬）と０．１％ギ酸緩衝液を用いたＣ１８カラムを使用し、精製物からＰＴＭ９０４のＨＰＬＣ精製を行った。精製物４．２ｍｇをＤＭＳＯ約０．５ｍｌに溶解し、５５％アセトニトリル溶媒に置換したＣ１８−ＡＲ−IIカラム（５μｍ、１０ｉ.ｄ．×２５０ｍｍ、ナカライ）に、一回に２０μＬずつ注入した。流速３．０ｍｌ／ｍｉｎ、アイソクラティックで溶出し、保持時間７．６分に溶出したピークを分取し、目的のＰＴＭ９０４を含む画分を得た。エバポレーターを用いてアセトニトリル及び緩衝液相を留去し、３．４ｍｇの精製物を得た。
【００２７】
ＰＴＭ９０４を含むピークは、ＨＯＫ０２１とＴＰ−Ｂ０５９６のそれぞれの単独純粋培養では確認されなかった。つまり、ＰＴＭ９０４は、ＨＯＫ０２１とＴＰ−Ｂ０５９６の混合培養によって初めて確認されたものである。また、上記ＨＯＫ０２１とＴＰ−Ｂ０５９６の本培養液には、ＰＴＭ９０４以外の二次代謝産物として、プラテンシマイシン（Platensimycin）、エンテロバクチン（Enterobactin）、ＥＮＴ４４７（N,N'-bis(2,3-dihydroxybenzoyl)-O-(α-aminoacryloyl)-O-serylserine）が含まれていた。
【００２８】
２．ＰＴＭ９０４の構造解析
上述により単離されたＰＴＭ９０４の物理化学的特性を、以下に示す。
（Ａ）外観：淡黄色粉末
（Ｂ）分子量：903.9
（Ｃ）分子式 ：C44H45N3O16S
（Ｄ）HR QTOF ESI MS（ポジティブ）：実測値904.2616 [M+H]+
計算値904.2593 (for C44H46N3O16S+)
（Ｅ）HR QTOF ESI MS（ネガティブ）：実測値902.2512 [M-H]-

【００２９】
上述により単離されたＰＴＭ９０４のＮＭＲデータを、図２に示す。なお、図２中の「位置」欄の数字は、ＰＴＭ９０４を構成する炭素の位置番号を示す（図１を参照、ＩＵＰＡＣ命名法に従うものではない）。化学シフト（δＨ、δＣ）は、ｐｐｍで表現され、１Ｈ−ＮＭＲは５００ＭＨｚ、１３Ｃ−ＮＭＲは１２５ＭＨｚでそれぞれ分析され、重溶媒として、ピリジン−ｄ５を用いた。
【００３０】
質量分析データとＮＭＲデータにより、本化合物の分子式を、Ｃ４４Ｈ４５Ｎ３Ｏ１６Ｓと決定した。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルによって本化合物の４４個の炭素シグナルが確認された。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、芳香環、カルボキシル基、アミド結合、チオエステル結合等の存在を示唆した。
【００３１】
ＨＨ−ＣＯＳＹ（Proton-Proton Correlation Spectroscopy）により、図３の太線で示すプロトン間のつながりが認められた。ＨＭＢＣ（Heteronuclear Multiple Bond Coherence）により、図４の矢印で示すプロトン−カーボン間の相関が認められた。また、ＲＯＥＳＹ（Rotating Overhauser Enhancement and exchange Spectroscopy）により、図３の矢印で示す結合的に近いプロトン間の相関が認められた。ここで、Ｎ−Ｈ水素に近接するＣ−Ｈ水素との相関が認められた。
【００３２】
トリシクロ環の橋かけ環構造とエノン構造を有する図５に示す部分構造は、ＨＨ−ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ、ＲＯＥＳＹの各スペクトル解析により、その結合様式及び立体配置を決定した。
以上の解析結果により、ＰＴＭ９０４の構造を式（１）に示すごとく決定した。
【００３３】
３．ＰＴＭ９０４の抗菌作用
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、ＭＲＳＡと称する）、バンコマイシン耐性腸球菌（以下、ＶＲＥと称する）に対する抗菌作用の測定として、まず、ディスク拡散法による薬剤感受性試験（ハロー試験）を行った。
【００３４】
ＰＴＭ９０４をＤＭＳＯで溶解し、その検液２ｍｌを直径８ｍｍのペーパーディスクにしみ込ませた。こうしてＰＴＭ９０４をそれぞれ１０μｇ、１μｇ含ませたペーパーディスクを、菌液を塗布した培地上に置き、３０℃で１６〜２０時間培養した。その後、発育阻止円径（ペーパーディスクの中心を通る直径（ｍｍ））を測定した。結果を表１に示す。なお、表中の「−」は、発育阻止円なしを意味する。
【００３５】
2019151565.tif 000004
【００３６】
ＰＴＭ９０４は、ＭＲＳＡ、ＶＲＥのような多剤耐性グラム陽性菌に対して抗菌作用を示した。特に、ＰＴＭ９０４は、ＶＲＥに対して濃度依存的に顕著な生育阻害を示すことが明らかになった。
【００３７】
また、同様のディスク拡散法によって他の菌株に対するＰＴＭ９０４の抗菌作用を試験したところ、ＰＴＭ９０４は、Klebsiella pneumoniae DHA(+)およびAAC(6’)-Ib(+)、K. pneumoniae DHA(+)およびarmA(+)、Acinetobacter faecalis vanB(+). などのグラム陰性菌に対して発育阻止円形成を認めなかった。このため、ＰＴＭ９０４は、Staphylococcus属やEnterococcus属などの特定の多剤耐性菌の生育を選択的に抑制または阻止する作用を有していることが示唆された。したがって、ＰＴＭ９０４を有効成分として含む抗菌剤を感染症治療に用いることにより、腸内等の正常な細菌叢を乱すことなく治療効果を発揮させることが期待される。
【００３８】
次に、微量液体希釈法により、各種菌株に対するプラテンシマイシン（ＰＴＭ）及びＰＴＭ９０４のＭＩＣ（最少発育阻止濃度）を測定した。測定条件を以下に示す。
（Ａ）使用株：表２に記載
（Ｂ）薬剤：プラテンシマイシン（ＰＴＭ）及びＰＴＭ９０４
（Ｃ）培地：ＣＡＭＨＢ（注１）及びＩＤ−ＣＡＭＨＢ（注２）
（Ｄ）培養条件：３７℃、２０時間、暗所、好気条件下、静置
（Ｅ）培養開始時点の菌数：５（２〜８）×１０５ＣＦＵ／ｍｌ
（Ｆ）判定基準：目視で２ｍｍ以上の沈殿物の観察（ＣＬＳＩ基準）
【００３９】
（注１）ＣＡＭＨＢは、陽イオン調整ミュラーヒントン培地（Cation-adjusted Muller-Hinton broth）［Mueller II Broth Cation-Adjusted 500g BBL 212322］である。
（注２）ＩＤ−ＣＡＭＨＢは、鉄制限下の陽イオン調整ミュラーヒントン培地（Iron-depleted Cation-adjusted Mueller Hinton Broth）である。具体的には、ＩＤ−ＣＡＭＨＢは、上記ＣＡＭＨＢ１００ｍｌ当たりに樹脂（キレックス（登録商標）１００樹脂♯１４２２８４２）を５ｇ入れ、１時間撹拌後、樹脂をフィルタリングで除去し、滅菌した培地である。
ＭＩＣ測定結果を表２に示す。
【００４０】
2019151565.tif 000005
【００４１】
表２に示すとおり、ＰＴＭ９０４は、グラム陽性菌に対するＭＩＣがグラム陰性菌に対するＭＩＣより小さく、特にＭＲＳＡ、ＶＲＥに対して良好な抗菌作用を有することが明らかになった。
また、フリーな鉄が足りない体内に近い環境である鉄制限下の培地（ＩＤ−ＣＡＭＨＢ）では、ＰＴＭは４〜１６倍効きにくくなるのに比べ、ＰＴＭ９０４は効きにくくなる度合いが少なかった。さらに、ＭＲＳＡに関しては、ＰＴＭより効きが良くなることも確認できた。
例えば、ＰＴＭ９０４を含む薬剤をガーゼなどに吸収させ、創部やカテーテル刺入部位を被覆することにより、ＶＲＥやＭＲＳＡの増殖を抑制し、手術部位感染やカテーテル感染を防止することができると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の新規化合物は、新たな抗生物質を提供することができるという産業上の利用可能性を有している。
【受託番号】
【００４３】
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５６０
【図１】
2019151565.tif 000008
【図２】
2019151565.tif 000009
【図３】
2019151565.tif 000010
【図４】
2019151565.tif 000011
【図５】
2019151565.tif 000012