(57)【要約】【課題】従来のB型肝炎治療剤とは異なるメカニズムで治療効果を有する薬剤の提供。【解決手段】本発明は、B型肝炎ウイルス（HBV）の増殖を阻害する候補物質のスクリーニングのためのアッセイ方法を提供する。本発明の方法は、HBVの弛緩型環状DNA（rcDNA）のr配列を含む基質を、フラップエンドヌクレアーゼ１（FEN1）と共にインキュベートするステップ、及びr配列の切断を検出するステップを含み、上記のインキュベートするステップを該候補物質の存在下又は不存在下で実施する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
B型肝炎ウイルス（HBV）の増殖を阻害する候補物質のスクリーニングのためのアッセイ方法であって、
HBVの弛緩型環状DNA（rcDNA）のr配列を含む基質を、フラップエンドヌクレアーゼ１（FEN1）と共にインキュベートするステップ、及び
r配列の切断を検出するステップ
を含み、上記のインキュベートするステップを該候補物質の存在下又は不存在下で実施する、上記方法。
【請求項２】
上記基質がrcDNAを含むサンプルである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記r配列の切断の検出が、共有結合閉環DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）の形成を検出するものである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
上記cccDNAの形成を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、サザンブロッティング、又は蛍光標識した基質からの蛍光によって検出する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ポリメラーゼ連鎖反応が、HBVの全DNAを検出する定量的PCR、cccDNA特異的PCR、及び／又はローリングサークル増幅（rolling circle amplification, RCA）である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
上記r配列の切断の検出が、cccDNAの形成を介したHBV DNAの形成を検出するものである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
上記基質がr配列の切断によって蛍光を生じる人工基質である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
上記FEN1が、細胞溶解物中に含まれる、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
上記FEN1が、細胞から単離されたFEN1又は組換えタンパク質である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
上記基質がrcDNAを含むサンプルであり、上記FEN1が、細胞から単離されたFEN1又は組換えタンパク質であって、更にDNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼを用いてrcDNAからcccDNAを形成させるステップを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
上記候補物質がHBVのcccDNA形成阻害剤である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、B型肝炎ウイルス（HBV）増殖阻害剤のスクリーニング方法に関する。より具体的には、本発明は、HBVの共有結合閉環DNA形成阻害剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
B型肝炎ウイルス（hepatitis B virus, HBV）は、ヘパドナウイルス科に属し、B型肝炎の原因となるDNAウイルスである。B型肝炎は、ウイルスの活動が持続すると慢性肝炎から肝硬変、肝臓癌に到る場合がある。
【０００３】
HBVに感染した宿主細胞中でのウイルス複製の鋳型となる共有結合閉環DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）は、ヌクレオカプシド内に存在し、一部に一本鎖領域を有する二本鎖DNAである弛緩型環状DNA（relaxed circular DNA, rcDNA）から形成されることが知られている。また、HBVの生活環の中で、cccDNAからプレゲノムRNAが合成された後、逆転写反応によってDNAが合成されてrcDNAが形成されることも知られている。尚、ウイルス粒子内のHBV DNAは、ヌクレオカプシドDNA（NC-DNA）と呼ばれることがある。
【０００４】
ヒトの生体内機能にとって逆転写反応は必要ではないことから、B型肝炎の治療において、逆転写酵素阻害作用を有する核酸アナログ製剤、例えばラミブジンが用いられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
B型肝炎の治療剤としては、上記のような逆転写酵素阻害剤やインターフェロンが使用されている。しかしながら、逆転写酵素阻害剤は感染した細胞からcccDNAを除去することはできないため、治療中止後に、いわゆるウイルスのリバウンド（再燃）が生じる場合があることが報告されており、逆転写酵素阻害剤やインターフェロンとは異なるメカニズムによる効果的な治療剤が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、宿主細胞内でのcccDNA形成に関わる因子の特定を目的として種々検討を行った結果、DNA修復等に関わることが知られている5'-フラップ構造特異的なエンドヌクレアーゼであるFEN1が関与していることを見出し、これが無細胞実験系でのcccDNA形成においても必須であることを確認した。この知見に基づけば、従来知られているB型肝炎治療剤とは異なるメカニズムで治療効果を有する薬剤を簡便な無細胞スクリーニング法で見出すことが可能であることに着目し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．B型肝炎ウイルス（HBV）の増殖を阻害する候補物質のスクリーニングのためのアッセイ方法であって、
HBVの弛緩型環状DNA（rcDNA）のr配列を含む基質を、フラップエンドヌクレアーゼ１（FEN1）と共にインキュベートするステップ、及び
r配列の切断を検出するステップ
を含み、上記のインキュベートするステップを該候補物質の存在下又は不存在下で実施する、上記方法。
２．上記基質がrcDNAを含むサンプルである、上記１記載の方法。
３．上記r配列の切断の検出が、共有結合閉環DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）の形成を検出するものである、上記１又は２記載の方法。
４．上記cccDNAの形成を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、サザンブロッティング、又は蛍光標識した基質からの蛍光によって検出する、上記３記載の方法。
５．ポリメラーゼ連鎖反応が、HBVの全DNAを検出する定量的PCR、cccDNA選択的qPCR、及び／又はローリングサークル増幅（rolling circle amplification, RCA）である、上記４記載の方法。
６．上記r配列の切断の検出が、cccDNAの形成を介したHBV DNAの形成を検出するものである、上記１又は２記載の方法。
７．上記基質がr配列の切断によって蛍光を生じる人工基質である、上記１記載の方法。
８．上記FEN1が、細胞溶解物中に含まれる、上記１〜７のいずれか記載の方法。
９．上記FEN1が、細胞から単離されたFEN1又は組換えタンパク質である、上記１〜７のいずれか記載の方法。
１０．上記基質がrcDNAを含むサンプルであり、上記FEN1が、細胞から単離されたFEN1又は組換えタンパク質であって、更にDNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼを用いてrcDNAからcccDNAを形成させるステップを含む、上記１記載の方法。
１１．上記候補物質がHBVのcccDNA形成阻害剤である、上記１〜１０のいずれか記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、HBVの複製・増殖において必須の段階であるcccDNAの形成を阻害し、従ってB型肝炎の新たな治療薬となり得る薬剤をin vitroで簡便にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】rcDNAからのcccDNAの形成を模式的に示す。FEN1によってr配列が切断された後、ライゲーションによって環状化される。
【図２】Ａ：in vitro cccDNA形成アッセイの模式図を示す。Ｂ：in vitro cccDNA形成アッセイのcccDNA選択的qPCRによる検出結果を示す。Ｃ：in vitro cccDNA形成アッセイのサザンブロット解析による検出結果を示す。Ｄ：in vitro cccDNA形成アッセイのRCAによる検出結果を示す。矢印は複製欠損対照として使用したHBVプラスミドの5.4kbの断片を示す。Ｅ：in vitro cccDNA形成アッセイにおいてcccDNA形成を介して複製が生じて培養上清中に分泌されたHBV DNA（virion）量を示す。Ｆ：in vitro cccDNA形成アッセイにおいてcccDNA形成を介して複製が生じて細胞内に存在するNC-DNAの量を示す。
【図３】細胞溶解物を用いたアッセイ方法を模式的に示す。細胞溶解物内に含まれる因子により、r配列の切断及びライゲーションが生じてcccDNAが形成する。
【図４】HepG2細胞の細胞溶解物を用いたアッセイの結果を示す。Ａ：HBV DNAの総量を示す。Ｂ：使用したNC-DNAに対するcccDNA形成量を示す。Ｃ：HBV DNAの総量に対するcccDNAの割合を示す。
【図５】HepG2細胞溶解物を用いてRCAアッセイを行った結果を示す。溶解物の量が多くなるほどcccDNAに相当する3.2kbpに濃いバンドが得られた。
【図６】HepG2細胞溶解物5.0μl又は2.5μlを用いたアッセイにおいて、EDTA（10mM）を添加した場合には形成されるcccDNA量が顕著に少なくなり、また反応中にdNTP又はNAD+を添加しない場合にもcccDNAの形成量が少なくなることが示された。
【図７】FEN1アッセイのための人工基質の例を模式的に示す。
【図８】野生型又は変異型FEN1を強制発現させた293FT細胞からの免疫沈降物を用いた人工基質の切断を示す。Mock：陰性対照、wt：野生型FEN1、D181A：活性部位欠損変異型、ΔC：DNA結合部位欠損変異型。
【図９】免疫沈降物のウェスタンブロッティングの結果を示す。野生型及び変異型のいずれも抗-Myc抗体と結合して沈降している。
【図１０】野生型FEN1を含む免疫沈降物を用いたアッセイでのPTPDの阻害効果を示す。
【図１１】Hep38.7-Tet細胞及びHepG2細胞の細胞溶解物を用いたFEN1アッセイ（Ａ：30分間、Ｂ：60分間）における人工基質からの蛍光検出結果を示す。いずれも、細胞溶解物の量に依存して蛍光強度が高く、基質が切断されていることが示され、またこれらの切断がPTPD及びEDTAによって抑制されていることが示される。
【図１２】LMH細胞の細胞溶解物を用いたFEN1アッセイにおける人工基質からの蛍光検出結果を示す。細胞溶解物の量及びインキュベーション時間に依存して蛍光強度が高く、基質が切断されていることが示される。また、切断は、PTPDの添加によって抑制された。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、B型肝炎ウイルス（HBV）の増殖を阻害する候補物質のスクリーニングのためのアッセイ方法を提供する。
本発明の方法は、以下のステップ：
HBVの弛緩型環状DNA（rcDNA）のr配列を含む基質を、フラップエンドヌクレアーゼ１（FEN1）と共にインキュベートするステップ、及び
r配列の切断を検出するステップ
を含み、上記のインキュベートするステップを該候補物質の存在下又は不存在下で実施するものである。
【００１１】
HBVのrcDNAは、図１に示すように一部に一本鎖構造を有する環状二本鎖DNAである。プラス鎖の5'-末端には小さなRNAオリゴマーが結合しており、マイナス鎖の5'-末端には末端重複（terminal redundancy）配列として知られる約10ヌクレオチドの配列が結合し、これに更にポリメラーゼタンパク質が結合している。本明細書において、この重複配列を「r配列」と記載する。
【００１２】
本発明の方法における基質は、r配列としてHBV rcDNAに含まれる配列を含むものであれば良く、特に限定するものではない。例えば、配列番号３に示す配列中の6〜31番目の塩基からなる配列はHBV rcDNA由来の配列であり、そのうち6〜15番目の塩基（配列番号４）がr配列に相当する。尚、この配列はマイナス鎖中に存在するため、天然のHBVのプラス鎖にはその相補配列が含まれる（JOURNAL OF VIROLOGY, 2007, Vol.81, No.12 ,p.6164-6174; JOURNAL OF VIROLOGY, 2007, Vol.81, No.22, p.12472-12484等）。また、r配列はHBVの種類（サブタイプ）によって変動し、必ずしも上記配列とはならないことは理解されるべきである。
【００１３】
HBVのゲノムの複製のためには、rcDNAから上記のRNAオリゴマー及びr配列が切断される必要がある。本発明者等は、宿主細胞内でr配列の切断に関与する因子として、フラップエンドヌクレアーゼ１（flap endonuclease 1、FEN1）を特定した。すなわち、FEN1の存在下においてr配列の切断が生じ、FEN1の不存在下ではr配列は切断されない。
【００１４】
FEN1は、フラップ構造に特異的なエンドヌクレアーゼであり、DNAの複製、及びロングパッチ塩基除去修復（long-patch base excision repair、LP-BER）の際に生じる5'-フラップ構造を除去する作用を有することが報告されている（Trends Biochem Sci 37, 162-172, 2012）。
【００１５】
ヒトFEN1は380個のアミノ酸からなり、そのアミノ酸配列及びこれをコードする塩基配列の情報は、例えばNCBI等のデータベースから取得することができる（NCBI Reference Sequence NP_004102.1；GENE ID 2237, NC_000011.1）。
【００１６】
本発明の方法は、このFEN1の存在下におけるr配列の切断の阻害を指標として、HBVの増殖を阻害する候補物質のスクリーニングを行うことができるものである。すなわち、候補物質の存在下又は不存在下でアッセイを行った場合に、r配列の切断が阻害されれば、その候補物質はrcDNAからのcccDNAの形成を阻害する活性を有することが示され、このcccDNA形成阻害によって、HBVの増殖を抑制することができる。
【００１７】
本発明において使用するFEN1は、例えば細胞溶解物に含まれた状態で利用することができる。あるいはまた、FEN1は、上記のアミノ酸構造に基づき、合成することができ、また、市販のものを利用することもできる。例えば熱安定性を有するFEN1（M0645、New England Biolabs）が入手可能である。
【００１８】
FEN1の介在する反応を阻害することが知られている公知のFEN1阻害剤として、例えば3-ヒドロキシ-5-メチル-1-フェニルチエノ[2,3-d]ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン（PTPD, CAS: 1422057-40-6, Cat No: GLXC-01904としてGlixx Laboratoriesより入手可能）が知られている。
【００１９】
本発明の方法の第一の態様において、基質として、rcDNAを含むサンプルを使用することができる。rcDNAは、例えばHBV感染細胞からHBV DNAを抽出し、HBV DNAのみを増幅することができるプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅して取得することができる。
【００２０】
この場合、r配列の切断の検出は、共有結合閉環DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）の形成を検出するものであり得る。cccDNAの形成は、例えばPCR、サザンブロッティング、又は蛍光標識した基質からの蛍光によって検出することができる。
【００２１】
PCRとしては、例えば上記のようなHBVの全DNAを検出する定量的PCR、cccDNA選択的PCR、及び／又はローリングサークル増幅（rolling circle amplification, RCA）を使用することができる。
【００２２】
HBV DNAを増幅するPCRは、rcDNA及びcccDNAの双方を検出及び定量するためのPCRであり、HBVのDNAの総量を決定することができる。
【００２３】
rcDNAはr配列及びRNAオリゴマーの存在のために閉環状にならず、ギャップが存在する。PCRではこの部分が増幅しにくいため、cccDNA選択的qPCRは、例えばrcDNAのギャップ領域にまたがるようにプライマーを設計してPCR反応を行うことで実施できる。このようなプライマーセットに加えて、TaqManプローブを組み合わせても良い。TaqManプローブもギャップが存在すると結合しにくいため、上記の構成により、閉環状となっているcccDNAが選択的に増幅され得る。
【００２４】
RCAは、環状二本鎖DNAを効率的に増幅できる手法であり、低レベルの感染においてもcccDNAを検出することができる（Antimicrob Agents Chemother 52, 3068-3073, 2008）。具体的には、限定するものではないが、ポリメラーゼとしてphi29ポリメラーゼ（NEB M0269S）を用い、プライマーとして複数のオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００２５】
PCRでは、増幅反応中のプライマーの安定性の向上のために、プライマーであるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合であっても良い。当業者であれば、目的の増幅産物に応じてプライマーを設計することができ、また場合によってはホスホロチオエート結合を含むプライマーの合成を業者に依頼することができる。
【００２６】
r配列の切断はまた、cccDNAの形成を介したHBV DNAの形成を検出するものであっても良い。これは、HBVの複製がcccDNAの形成を介して生じることを利用して行うことができる。
【００２７】
本発明の方法の第二の態様において、基質として、r配列の切断によって蛍光を生じる人工基質を用いることができる。本発明の方法において使用できる人工基質としては、例えば3種のDNA：T鎖（テンプレート、20〜32個のオリゴヌクレオチド）、Q鎖（クエンチャー、23〜35個のオリゴヌクレオチド）及びF鎖（フラップ、24〜36個のオリゴヌクレオチド）が図７のようにアニールする構成のものであり得る。FEN1によるr配列の切断を蛍光的に検出するために、Q鎖は3'末端をクエンチャーで標識し、F鎖は5'末端を蛍光色素で標識し、r配列が切断されていない状態では蛍光色素とクエンチャーが近接して蛍光が検出されず、r配列の切断により蛍光色素からの蛍光が検出されるように構成することができる。蛍光を利用したこのような検出方法については当分野で知られており、適切な蛍光色素とクエンチャーとの組合せを選択することができる。
【００２８】
本発明の方法において好適に使用できる人工基質として、例えば以下のような組合せを挙げることができる。
【００２９】
F鎖はr配列を含み、r配列を挟んで5'側にQ鎖と相補対を形成する短い塩基配列、3'側にT鎖と相補対を形成する塩基配列を含む。r配列は例えば配列番号４に示す配列からなるものを好適に使用できるが、天然のHBVに含まれるr配列、あるいはヒトFEN1によって切断され得るr配列であれば同様に使用することができる。Q鎖と相補対を形成する塩基配列は5個のヌクレオチドであれば良く、これはr配列が切断されていない状態ではF鎖とQ鎖との相補対が形成され、r配列が切断された状態では塩基対形成が外れるように設計される。T鎖と相補対を形成する塩基配列は、本発明の方法の実施の間、安定に塩基対を形成することができるように設計されたものであれば良い。
【００３０】
Q鎖は、上記のF鎖のr配列ともT鎖とも相補対を形成しない塩基配列を含み、この配列を挟んで5'側にT鎖と相補対を形成する塩基配列、3'側にF鎖と相補対を形成する短い塩基配列を含む。
【００３１】
T鎖は、HBV DNA中に含まれる配列からなるオリゴヌクレオチドであっても、異なるオリゴヌクレオチド配列であっても良いが、5'側から3'側に向けて、F鎖と相補対を形成する塩基配列、スペーサーとなる短い塩基配列、及びQ鎖と相補対を形成する塩基配列を含む。
【００３２】
従って、より具体的には、後の実施例で使用するように、例えば32個のオリゴヌクレオチドからなるT鎖（例えば配列番号１）、29個のオリゴヌクレオチドからなるQ鎖（例えば配列番号２）、及び31個のオリゴヌクレオチドからなるF鎖（例えば配列番号３）を用いる場合、以下の要件を満たすものを好適に使用することができる。
T：GCGCACCAGCACCATGGTACCTCTGCCTAATC（配列番号１）
Q：GATTAGGCAGAGGTGTTGAAAAAGACATC（配列番号２）
F：GATGTGAAAAAGTTGCATGGTGCTGGTGCGC（配列番号３）
r配列：GAAAAAGTTG（配列番号４）
【００３３】
・F鎖の5'末端から5個のヌクレオチドとQ鎖の3'末端の5個のヌクレオチドが相補的な配列を有する；
・F鎖の5'末端から6〜15番目のヌクレオチド（例えば配列番号４）とQ鎖の3'末端から6〜15番目のヌクレオチドは相補対にならない；
・T鎖は「F鎖の5'末端から16〜31番目のヌクレオチドと相補対になる配列」＋「スペーサーの2個のヌクレオチド」＋「Q鎖の5'末端から14番目までのヌクレオチドと相補対になる配列」からなる。
【００３４】
しかしながら、人工基質は、本発明の方法においてFEN1によるr配列の切断を検出できるものであればこれらに限定されるものではない。
【００３５】
一方、本発明の方法によってr配列の切断反応を触媒する酵素であるFEN1は、上記の通り、細胞溶解物中に含まれた状態で用いることができる。FEN1はまた、細胞から単離されたFEN1又は組換えタンパク質であっても良い。
【００３６】
基質としてr配列の切断によって蛍光を生じるものである場合、アッセイは、その切断に対する阻害の有無で候補物質の作用を確認することができる。一方で、上記基質がrcDNAを含むサンプルである場合、阻害活性の検出は、r配列の切断ではなく、cccDNAの形成に対する阻害の有無で確認し得る。
【００３７】
FEN1として細胞溶解物を用いる場合には、溶解物中に他の宿主由来の因子、例えば酵素が含まれるため、基質としてrcDNAを用いたアッセイ中に細胞溶解物を加えることでcccDNAが形成され得る。しかしながら、FEN1として細胞から単離されたFEN1又は組換えタンパク質を用いる場合、反応はr配列の切断で停止し、その後のライゲーション反応は生じない。従って、このような基質とFEN1との組合せを選択する場合には、ライゲーション反応が生じるように、FEN1に加えて、更にDNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼを添加することが好ましい。DNAポリメラーゼとしては、例えばBst DNAポリメラーゼ（M0328S、New England Biolabs）等を好適に使用することができ、DNAリガーゼとしては、例えばTaq DNAリガーゼ（0208S、New England Biolabs）、T4 DNA ligase（2011A, Takara）等を好適に使用することができる。
【００３８】
従って、本発明の方法は、基質がrcDNAを含むサンプルであり、FEN1が細胞から単離されたFEN1又は組換えタンパク質である場合に、更にDNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼを用いてrcDNAからcccDNAを形成させるステップを含む方法であり得る。
【００３９】
本発明の方法は、in vitroにより、例えばディッシュやマルチウェルプレート等で数μl〜数mlの反応体積で実施することができる。反応は、FEN1によるr配列の切断のための至適条件を考慮すれば、例えば37℃で30〜120分間インキュベートすることで実施することができるが、特に限定するものではない。
【００４０】
本発明の方法によって効果が確認される物質は、HBVのcccDNA形成阻害剤である。cccDNA結合阻害剤は、cccDNAがHBVの転写において必須の段階であることから、HBVの増殖阻害剤となり得る。従って、本発明の方法によって効果が確認される物質は、B型肝炎の治療剤となり得る。
【００４１】
候補物質としては、天然に存在するか、化学合成等の人工的手段によって取得される任意の物質が含まれ、特に限定するものではないが、例えばFEN1阻害剤として知られているPTPDを親化合物として、様々な類似化合物を合成して本発明によってスクリーニングし、in vitro及びin vivoで有効なcccDNA形成阻害剤を得ることができる。
【実施例】
【００４２】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４３】
［参考例１  NC-DNAの調製］
Hep38.7-Tet細胞（国立感染症研究所 ウイルス第二部 渡士幸一博士より供与、元の細胞は下記1997年論文に記載されたHepAD38でDr. C. Seegerより許諾）は、HBVの複製が可能な培養細胞株であり、テトラサイクリン不在下での培養中は複製せず、培地からテトラサイクリンを除くことで複製及びcccDNAの蓄積が誘導される（Antimicrob Agents Chemother 41, 1715-1720 (1997); Biochem Biophys Re Commun 452, 315-321 (2014)）。
【００４４】
Hep38.7-Tet細胞（3 x 106 cells/10-cm dish）をテトラサイクリン不在下で6日間培養した後、トリプシン-EDTAを添加して回収し、750μl PBS中に再懸濁した。これに37.5μlの10％ NP-40を添加し、氷上で20分間インキュベートした。インキュベーション後、4℃で10分間、150,000rpmで遠心分離して上清を回収し、4.5μlの1M MgCl2及び1μlのDNase I（10104159001, Roche）を添加し、37℃で1時間インキュベートした。これに15.7μlの0.5 M EDTA（最終濃度10 mM）、80μlの10％ SDS（最終濃度1％）、15.7μlの5M NaCl（最終濃度100 mM）、及びProK（166-14003  Wako、最終濃度500μg/ml）を添加し、55℃で4時間インキュベートした。
【００４５】
インキュベーション後、DNAを抽出・精製し、HBV DNAの増幅のためにフォワードプライマー：GAATTGATGACTCTAGCTACCTG（配列番号５）及びリバースプライマー：GAAACCACAATAGTTGCCTGATC（配列番号６）を用いてqPCR（SYBR Green法）を行い、コピー数を決定した。
【００４６】
［実施例１  cccDNA選択的qPCRによるcccDNA形成アッセイ］
rcDNAを用い、FEN1によるcccDNA形成を確認した。図１に本実施例での反応を模式的に示す。また図２Ａに本実施例から実施例４で行ったアッセイのステップを模式的に示す。
【００４７】
参考例１で調製したrcDNA 1μl（108コピー数）に、10倍濃度のTermoPol Buffer（New England Biolabs）5μl、水27.5μl、及びFEN1（M0645S、New England Biolabs）2μlを加えて65℃で10分間インキュベートした。
【００４８】
次いで、1×NAD+ 0.5μl、100μM dNTPs 2μl、Bst DNAポリメラーゼ（M0328S、New England Biolabs）及びTaq DNAリガーゼ（0208S、New England Biolabs）を添加して37℃で20分間インキュベートした。
反応後、DNAを抽出し、cccDNAの形成をqPCRによって確認した。
【００４９】
cccDNA選択的qPCRのためには、rcDNAのギャップ領域にまたがるようにプライマーを設計してPCR反応を行うことができる。このようなプライマーセットとして、フォワードプライマー：CGTCTGTGCCTTCTCATCTGC（配列番号８）及びリバースプライマー：GCACAGCTTGGAGGCTTGAA（配列番号９）を用い、これに加えて、3'側にマイナーグルーブバインダー（MGB）修飾を有するTaqManプローブ：CTGTAGGCATAAATTGGT（配列番号７）を組み合わせて使用した。
【００５０】
その結果、図２Ｂに示すように、FEN1、DNAポリメラーゼ及びリガーゼが存在する場合に顕著に多量のcccDNAが形成した。FEN1がない場合、酵素を添加しない対照サンプルと差が見られなかった。
【００５１】
［実施例２  サザンブロッティングによるcccDNA形成アッセイ］
実施例１における反応によるcccDNAの形成をサザンブロッティングによって確認した。
反応後のHBV DNAをT5 エキソヌクレアーゼ（M0363S、New England Biolabs）で消化し（37℃、30分間）、次いでEcoRI（1040A、Takara）で消化した（37℃、30分間）。
【００５２】
消化後のサンプルを電気泳動にかけた後、ナイロンメンブレンにトランスファーし、AlkPhos direct labelling system (RPN3690 Amersham)で標識したプローブをハイブリダイズした。HBV DNA（rcDNA及びcccDNA）のシグナルはLAS1000 imager system (Fuji Film)で検出した。その結果、図２Ｃに示すように、FEN1、DNAポリメラーゼ及びリガーゼが存在する場合には約3.3kbにバンドが検出され、cccDNAの形成が確認されたが、FEN1を添加しない場合には検出されなかった。
【００５３】
［実施例３  RCAによるcccDNA形成アッセイ］
実施例１における反応によるcccDNAの形成をRCAによって確認した。
本実施例で使用した8種のプライマーの配列を以下に示す。配列中「＊」はホスホロチオエート結合を示す。
【００５４】
【表１】
2019030242.tif 000002
【００５５】
DNAサンプル 5.0μl、上記のプライマーセット 1.0μl、反応バッファー（phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer（New England Biolabs））1.0μlを混合し、95℃で3分間、50℃で15秒間、30℃で15秒間、20℃で10分間の反応を行った後、氷上に載せた。対照として、トランスフェクション後のHBVの複製ができないHBVプラスミド（HBVゲノムを含むプラスミドpPB（H.Y. Kim（韓国Ajou University School of Medicine）より供与）をPstI（1073A、Takara）で消化（37℃、30分間）したDNA断片5.4kbを同様に処理したもの）を用いて同様に反応させた。
【００５６】
次いで、更にプライマーセット 1.0μl、反応バッファー 1.0μl、10mg/ml BSA 0.4μl、0.1M DTT 0.4μl、10mM dNTP 2.5μl、phi29ポリメラーゼ（M0269、New England Biolabs）1.0μl、及び蒸留水 6.7μlを添加して30℃で18時間以上、65℃で10分間反応させた後、EcoRI（1040A、Takara）で消化した（37℃、30分間）。
【００５７】
消化後のサンプルを電気泳動にかけた後、エチジウムブロマイド染色で検出した。その結果、図２Ｄに示すように、FEN1、DNAポリメラーゼ及びリガーゼが存在する場合には約3.3kbにバンドが検出され、cccDNAの形成が確認されたが、FEN1を添加しない場合には検出されなかった。
【００５８】
［実施例４  トランスフェクションによるcccDNA形成アッセイ］
実施例３において得られるRCA産物を分子内ライゲーションによって環状化させ（RCA産物（concatamer）をEcoRIで消化（monomer）後、DNA精製し（Wizard(登録商標) SV Gel and PCR Clean-Up System, Promega）、得られたDNA 50 ngを2×Ligation Mix（319-05961、ニッポンジーン）でセルフライゲーション）、HepG2細胞（Japanese Collection of Research Bioresources（JCRB））にトランスフェクトした。3日後、参考例１と同様に、配列番号５及び６に示すプライマーを用いてqPCRを実施し、培養上清中のHBV DNA及びNC-DNAの量を測定した。
その結果、図２Ｅ及び２Ｆに示すように、複製欠損型の対照プラスミドと比較して、顕著に多量のHBV DNAが細胞培養上清中及び細胞内に検出された。
【００５９】
［実施例５  細胞溶解物を用いたcccDNA形成アッセイ］
細胞溶解物を用いてrcDNAからのcccDNA形成を確認した。図３に本実施例での反応を模式的に示す。
HepG2細胞を培養後、PBSで洗浄し、溶解バッファー（50mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM MgCl2、1 mM DTT、0.01％ Tween20）に溶解し、超音波処理にかけた後、15,000rpmで10分間遠心分離し、上清を回収して細胞溶解物とした。
【００６０】
反応は、上記の細胞溶解物（5μl、10μl、又は20μl）に10倍濃度のTermoPol Buffer（New England Biolabs）5μl、rcDNA 1μl（108コピー数）50mM NAD+ 0.5μl、100μM dNTPs 2μlを加え、更に水を加えて総量50μlとし、37℃で1時間インキュベートした。精製したHBV DNAを、参考例１に記載したqPCR及び実施例１に記載したcccDNA選択的qPCRにより、cccDNA量及び総DNA量として定量した。
その結果、図４に示すように、HepG2細胞の溶解物の量に依存してcccDNAが形成していることが示された。
【００６１】
［実施例６  RCAによるcccDNA形成アッセイ］
実施例５における反応によるcccDNAの形成を実施例３と同様にしてRCAによって確認した。
その結果、図５に示すように、約3.2kbpのバンドから、HepG2細胞の溶解物の量に依存してcccDNAが形成されていることが示された。
【００６２】
［実施例７  EDTAによるcccDNA形成反応阻害］
HepG2細胞溶解物を用いたアッセイにおいて、反応液中にEDTA（最終濃度10mM）を添加して実施例５の反応を行った。
その結果、図６に示すように、EDTAの添加によってcccDNAの形成は顕著に阻害された。また、dNTPを添加しない場合、NAD+を添加しない場合にも、形成するcccDNA量が約半分に減少した。
【００６３】
［実施例８  人工基質の合成］
rcDNAの代わりに、FEN1で切断される構造を含む人工基質を合成した。図７に人工基質を用いた検出方法を模式的に示す。
人工基質として、以下の3種のDNA：T鎖（テンプレート）、Q鎖（クエンチャー）及びF鎖（フラップ）を使用し、以下のようにアニールした。
T：GCGCACCAGCACCATGGTACCTCTGCCTAATC（配列番号１）
Q：GATTAGGCAGAGGTGTTGAAAAAGACATC（配列番号２）
F：GATGTGAAAAAGTTGCATGGTGCTGGTGCGC（配列番号３）
（下線はr配列を示し、r配列の3'末端のグアニンと隣接するシトシンの結合がFEN1によって切断される。例えばSeeger C. et al., Virology, 2015, 479-480: 672-686; Nassal M., Gut. 2015, 64(12): 1972-1984. doi: 10.1136/gutjnl-2015-309809を参照されたい。）
【００６４】
FEN1による切断を蛍光的に検出するために、Q鎖は3'末端をBHQ（ブラックホールクエンチャー、Merck、図７に「Q」で示す）で標識し、F鎖は5'末端をTAMRA（カルボキシテトラメチルローダミン、図７に「F」で示す）で標識した。
T鎖、Q鎖及びF鎖をそれぞれ10μMずつ混合して95℃で5分間インキュベートした後に室温で静置し、相補的配列のハイブリダイゼーションを行った。
【００６５】
Q鎖の5'側配列とF鎖の3'側配列がT鎖と相補的な配列となっており、図７に示すように、ハイブリダイズによって蛍光色素（TAMRA）及びクエンチャー（BHQ）が近接した状態では蛍光が検出されず、FEN1によってF鎖のr配列が切断されて蛍光色素を有する配列がT鎖及びQ鎖から離れると、蛍光を発するようになる。
【００６６】
［実施例９  人工基質と免疫沈降FEN1との反応］
実施例８で合成した人工基質に対して反応させる酵素として、免疫沈降したFEN1を調製した。
FEN1の機能を確認することを意図して、293FT細胞（Thermo Fisher Scientific）に、野生型、活性欠損変異型、及びDNA結合部位欠損変異型のヒトFEN1をコードするポリヌクレオチドを含む以下のプラスミドベクターをトランスフェクションし、myc-Hisタグを有する外因性FEN1を強制発現させた。
pcDNA4/TO hFEN-wt：myc-Hisタグ付き野生型FEN1発現ベクター
pcDNA4/TO hFEN-N（D181A）：D181A変異を有し、ヌクレアーゼ活性を持たないmyc-Hisタグ付きFEN1発現ベクター
pcDNA4/TO hFEN-ΔC：C末端の21アミノ酸を欠失したmyc-Hisタグ付きFEN1発現ベクター
pcDNA4/TO mock：空ベクター（Invitrogenより入手）
【００６７】
尚、pcDNA4/TO hFEN-wt、及びpcDNA4/TO hFEN-Nは長崎大学 頭頸部放射線学分野、中村卓博士からご供与頂き（Shibata Y & Nakamura T (2002) Defective flap endonuclease 1 activity in mammalian cells is associated with impaired DNA repair and prolonged S phase delay. J Biol Chem 277(1):746-754）、pcDNA4/TO hFEN-ΔCは、合成オリゴヌクレオチド#1643: GTGACCGGCTCACTCTCTTCAGCTAAGCGCAAGGAGCCAGAActcgagT（配列番号１８）及び#1644: CTAGActcgagTTCTGGCTCCTTGCGCTTAGCTGAAGAGAGTGAGCCG（配列番号１９）をハイブリダイズさせて二本鎖DNAリンカーを作製し、pcDNA4/TO hFEN-wt中のEcoO65I/XbaI部位を利用して、このDNAリンカーをFEN1 ORFのC末端領域をコードするDNAと置き換えることで、FEN1 ORFのC末端から21個のアミノ酸を欠失するFEN1変異体を発現させるベクターとして作製した。
【００６８】
上記のプラスミドがそれぞれ導入された293FT細胞（6 x 106 cells/dish）を培養後、PBSで洗浄し、溶解バッファー（150mM NaCl、1％ Nonidet P-40、0.5％ デオキシコール酸ナトリウム、0.1％(w/v) ドデシル硫酸ナトリウム、50mM Tris-Cl(pH 8.0)、5mM EDTA、プロテアーゼインヒビター）に溶解した後、超音波処理にかけ、15,000rpmで10分間遠心分離し、上清を回収して細胞溶解物とした。
【００６９】
上清を回収し、抗-c-Myc抗体（9E10、sc-40、Santa Cruz Biotechnology）及びプロテインGセファロース（ベッド体積25μl、GE Healthcare）を添加して、4℃で一晩撹拌混合した。反応後、上記溶解バッファーで2回、洗浄バッファー（50mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.01％ Tween20）で2回洗浄し、FEN1と抗体との複合体を沈降させた。
【００７０】
得られた免疫沈降物に、実施例８で合成した人工基質（10μM）を加え、反応バッファー（50mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM MgCl2、1mM DTT及び0.01％ Tween20）中で37℃でインキュベートし、Power Scan（DS Pharma Biomedical）で切断されたF鎖からの蛍光を検出した。
【００７１】
その結果、図８に示すように、野生型FEN1を発現する細胞由来の免疫沈降物では、経時的に蛍光強度が増大し、r配列の切断が示された。これに対してDNA結合部位欠損変異型及び活性欠損変異型（D181A）のFEN1を発現する細胞由来の免疫沈降物では、r配列の切断はほとんど又は全く見られなかった。尚、本実施例ではc-Myc抗体による免疫沈降物を用いているため、反応は導入遺伝子由来のFEN1によるものであり、293FT細胞内在性FEN1は関与していない。
【００７２】
尚、図９に示すように、抗-c-Myc抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、反応に使用した細胞及び免疫沈降物中には、トランスフェクトしたプラスミドから発現したFEN1が存在することが確認された。
【００７３】
［実施例１０  FEN1阻害剤による切断反応の阻害］
実施例８で合成した人工基質、及び実施例９で調製した野生型FEN1を含む免疫沈降物を用いたアッセイにおいて、反応液中にPTPDを添加して37℃で120分間インキュベーションした。
その結果、図１０に示すように、0.1μMのPTPDを添加した場合、添加しない場合と比較して顕著な蛍光の減少が見られ、1μMのPTPDを添加した場合は蛍光がほとんど検出されなかった。
【００７４】
［実施例１１  人工基質と細胞溶解物との反応１］
Hep38.7-Tet細胞及びHepG2細胞をそれぞれ培養後、PBSで洗浄し、バッファー（50mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM MgCl2、1 mM DTT、0.01％ Tween20）に懸濁し、1×104個/μlの細胞濃度とした。
これを氷の上で15秒間超音波処理し、15秒間停止する操作を3回行った後、15,000rpmで15分間遠心分離し、上清を回収して細胞溶解物とした。
【００７５】
得られた溶解液2.5〜10μlに実施例８で合成した人工基質10μMを5.0μl加え、上記のバッファーを加えて全量20μlとして、37℃でインキュベートした後、蛍光を検出した。
その結果、図１１Ａ及びＢに示すように、細胞溶解物の量が多くなるにつれて人工基質からの蛍光強度が増大し、r配列が切断されていることが示された。また、この反応が、PTPD（5μM）又はEDTA（10mM）の添加により阻害されることも示された。
【００７６】
［実施例１２  人工基質と細胞溶解物との反応２］
LMH細胞（金沢大学黒木和之博士より供与）を用いて実施例１１と同様に細胞溶解物を調製し、実施例８で合成した人工基質の切断を確認した。
その結果、図１２に示すように、細胞溶解物の量及びインキュベーション時間に依存して人工基質からの蛍光強度が増大し、r配列が切断されていることが示された。また、この反応が、PTPD（5μM）の添加により阻害されることも示された。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
HBVのcccDNA形成を阻害する薬剤は、従来B型肝炎の治療剤として使用されているインターフェロン及び逆転写酵素阻害剤とは異なるメカニズムでHBVの増殖を阻害する作用を有するため、単独で使用可能であると共に、従来の薬剤と組み合わせてより治療効果を高めることができる。本発明の方法は、そのような新規薬剤を簡便にスクリーニングすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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