(57)【要約】      （修正有）【課題】セロトニン、トリプトファン、キヌレニン経路における代謝産物に対する抗体、及び、抗体を調製するための方法の提供。【解決手段】調製された抗体は、関連の代謝産物に対して低い交差反応性を有し、１つ、又は、複数の以下の代謝産物：セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、キヌレニン（Ｋ）、キヌレン酸（ＫＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸、及び、アントラニル酸に対して特異的で高感度の免疫アッセイのための有用な試薬である。【選択図】図１
2019151637.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物：
【化１】
2019151637.tif 000048
（式中、Ｒは、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミノアルキル、アミドアルキル、カルボキシアルキル、置換カルボキシアルキルからなる群から選択されるメンバーであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ及びＲ１１Ｂからなる群から独立に選択されるメンバーであり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に生じる接続部であり、
Ｂは、生体分子である）。
【請求項２】
Ｒが、アミノアルキル、カルボキシアルキル、及び置換カルボキシアルキルからなる群から選択されるメンバーである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒが、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、及びＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ２Ｈからなる群から選択されるメンバーである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７の群の少なくとも１つのメンバーがＲ１１Ｂである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｂが、タンパク質、免疫原性ペプチド、及びビオチンからなる群から選択されるメンバーである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
式ＩＩの化合物：
【化２】
2019151637.tif 000049
（式中、Ｒ１、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ、及びＲ１１Ｂからなる群から独立に選択されるメンバーであり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に生じる接続部であり、
Ｂは、生体分子である）。
【請求項７】
Ｒ１、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９の群の少なくとも１つのメンバーがＲ１１Ｂである、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｂが、タンパク質、免疫原性ペプチド、又はビオチンからなる群から選択されるメンバーである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
式：
【化３】
2019151637.tif 000050
を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
式ＩＩＩの化合物：
【化４】
2019151637.tif 000051
（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ、及びＲ１１Ｂからなる群から独立に選択されるメンバーであり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に生じる接続部であり、
Ｂは、生体分子である）。
【請求項１１】
Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の群の少なくとも１つのメンバーがＲ１１Ｂである、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｂが、タンパク質、免疫原性ペプチド、又はビオチンからなる群から選択されるメンバーである、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
式：
【化５】
2019151637.tif 000052
（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々水素である）
を有する、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
式ＩＶの化合物：
【化６】
2019151637.tif 000053
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ、及びＲ１１Ｂからなる群から独立に選択されるメンバーであり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に生じる接続部であり、
Ｂは、生体分子である）。
【請求項１５】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の群の少なくとも１つのメンバーがＲ１１Ｂである、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｂが、タンパク質、免疫原性ペプチド、又はビオチンからなる群から選択されるメンバーである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
式：
【化７】
2019151637.tif 000054
を有する、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
式Ｖの化合物：
【化８】
2019151637.tif 000055
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ、及びＲ１１Ｂからなる群から独立に選択されるメンバーであり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に生じる接続部であり、
Ｂは、生体分子である）。
【請求項１９】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の群の少なくとも１つのメンバーがＲ１１Ｂである、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｂが、タンパク質、免疫原性ペプチド、及びビオチンからなる群から選択されるメンバーである、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
式：
【化９】
2019151637.tif 000056
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々水素である）
を有する、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
式ＶＩの化合物：
【化１０】
2019151637.tif 000057
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ、及びＲ１１Ｂからなる群から独立に選択されるメンバーであり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に生じる接続部であり、
Ｂは、生体分子である）。
【請求項２３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の群の少なくとも１つのメンバーがＲ１１Ｂである、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｂが、タンパク質、免疫原性ペプチド、又はビオチンからなる群から選択されるメンバーである、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
式：
【化１１】
2019151637.tif 000058
（式中、Ｒ１及びＲ３は各々水素である）
を有する、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
式ＶＩＩの化合物：
【化１２】
2019151637.tif 000059
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ、及びＲ１１Ｂからなる群から独立に選択されるメンバーであり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に生じる接続部であり、
Ｂは、生体分子である）。
【請求項２７】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の群の少なくとも１つのメンバーがＲ１１Ｂである、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｂが、タンパク質、免疫原性ペプチド、又はビオチンからなる群から選択されるメンバーである、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
式：
【化１３】
2019151637.tif 000060
（式中、Ｒ１及びＲ３は各々水素である）
を有する、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３０】
式ＶＩＩＩの化合物：
【化１４】
2019151637.tif 000061
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ、及びＲ１１Ｂからなる群から独立に選択されるメンバーであり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に生じる接続部であり、
Ｂは、生体分子である）。
【請求項３１】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の群の少なくとも１つのメンバーがＲ１１Ｂである、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｂが、タンパク質、免疫原性ペプチド、又はビオチンからなる群から選択されるメンバーである、請求項３１に記載の化合物。
【請求項３３】
式：
【化１５】
2019151637.tif 000062
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は各々水素である）
を有する、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３４】
式Ｘの化合物：
【化１６】
2019151637.tif 000063
（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ、及びＲ１１Ｂからなる群から独立に選択されるメンバーであり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に生じる接続部であり、
Ｂは、生体分子である）。
【請求項３５】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の群の少なくとも１つのメンバーがＲ１１である、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｂが、タンパク質、免疫原性ペプチド、又はビオチンからなる群から選択されるメンバーである、請求項３５に記載の化合物。
【請求項３７】
式：
【化１７】
2019151637.tif 000064
を有する請求項３６に記載の化合物。
【請求項３８】
５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体が、トリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、及び５−ヒドロキシインドール酢酸からなる群から選択されるメンバーに対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項３９】
５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＯＨ）に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体が、トリプトファン、５−ヒドロキシトリプタミン、及び５−ヒドロキシインドール酢酸からなる群から選択される１つ又は複数のメンバーに対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４０】
５−トリプトファンに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体が、５−ヒドロキシトリプトファン、５−ヒドロキシトリプタミン、及び５−ヒドロキシインドール酢酸からなる群から選択される１つ又は複数のメンバーに対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４１】
５−ヒドロキシインドール酢酸に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体が、トリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、及び５−ヒドロキシトリプタミンからなる群から選択される１つ又は複数のメンバーに対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４２】
キヌレニンに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体が、キヌレン酸、３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシアントラニル酸、キノリン酸、アントラニル酸、Ｏ−硫酸セロトニン、及びＯ−リン酸セロトニンからなる群から選択される１つ又は複数のメンバーに対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４３】
キヌレン酸に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体が、キヌレニン、３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシアントラニル酸、キノリン酸、アントラニル酸、Ｏ−硫酸セロトニン、及びＯ−リン酸セロトニンからなる群から選択される１つ又は複数のメンバーに対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４４】
３−ヒドロキシキヌレニンに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体が、キヌレニン、キヌレン酸、３−ヒドロキシアントラニル酸、キノリン酸、アントラニル酸、Ｏ−硫酸セロトニン、及びＯ−リン酸セロトニンからなる群から選択される１つ又は複数のメンバーに対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４５】
３−ヒドロキシアントラニル酸に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体が、キヌレニン、キヌレン酸、３−ヒドロキシキヌレニン、キノリン酸、アントラニル酸、Ｏ−硫酸セロトニン、及びＯ−リン酸セロトニンからなる群から選択される１つ又は複数のメンバーに対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４６】
キノリン酸に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体が、キヌレニン、キヌレン酸、３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシアントラニル酸、アントラニル酸、Ｏ−硫酸セロトニン、及びＯ−リン酸セロトニンからなる群から選択される１つ又は複数のメンバーに対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４７】
アントラニル酸に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体が、キヌレニン、キヌレン酸、３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシアントラニル酸、キノリン酸、Ｏ−硫酸セロトニン、及びＯ−リン酸セロトニンからなる群から選択される１つ又は複数のメンバーに対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４８】
Ｏ−硫酸セロトニンに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体が、キヌレニン、キヌレン酸、３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシアントラニル酸、キノリン酸、アントラニル酸、及びＯ−リン酸セロトニンからなる群から選択される１つ又は複数のメンバーに対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項４９】
Ｏ−リン酸セロトニンに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体が、キヌレニン、キヌレン酸、３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシアントラニル酸、キノリン酸、アントラニル酸、及びＯ−硫酸セロトニンからなる群から選択される１つ又は複数のメンバーに対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項５０】
７−α−ヒドロキシ−４−コレステリン−３−オン誘導体に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体が、コレステロール及び７−α−コレステロールからなる群から選択されるメンバーに対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項５１】
プロピオン酸に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体が、酪酸に対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項５２】
酪酸に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体が、プロピオン酸に対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメント。
【請求項５３】
抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項３８〜５２のいずれか一項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項５４】
ポリクローナル抗体がウサギ抗体である、請求項５３に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項５５】
抗体がＦａｂ又はＦａｂ２フラグメントである、請求項３８〜５２のいずれか一項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項５６】
抗体が組換え抗体である、請求項３８〜５２のいずれか一項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項５７】
哺乳動物からの体液又は組織試料中の、セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、キヌレニン（Ｋ）、キヌレン酸（ＫＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸、アントラニル酸、及びこれらの組合せからなる群から選択される代謝産物をアッセイするための方法であって、方法が、
試料を、セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、キヌレニン（Ｋ）、キヌレン酸（ＫＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸、アントラニル酸、及びこれらの組合せからなる群から選択される代謝産物に特異的に結合する抗体と混合するステップと、
抗体が代謝産物に特異的に結合するか否かを決定するステップであり、特異的な抗体の結合が、代謝産物が試料中に存在することの指標である、ステップと
を含む方法。
【請求項５８】
哺乳動物からの体液又は組織試料中の７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンをアッセイするための方法であって、方法が、
試料を、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンに特異的に結合する抗体と混合するステップと、
抗体が７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンに特異的に結合するか否かを決定するステップであり、特異的な抗体の結合が、代謝産物が試料中に存在することの指標である、ステップと
を含む方法。
【請求項５９】
哺乳動物からの体液又は組織試料中のプロピオン酸及び酪酸及びこれらの組合せからなる群から選択される代謝産物をアッセイするための方法であって、方法が、
試料を、プロピオン酸及び酪酸及びこれらの組合せからなる群から選択される代謝産物に特異的に結合する抗体と混合するステップと、
抗体が代謝産物に特異的に結合するか否かを決定するステップであり、特異的な抗体の結合が、代謝産物が試料中に存在することの指標である、ステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、全ての目的でその教示の全文が参照により本明細書に組み込まれる２０１３年５月２４日に出願された米国特許出願第６１／８２７，５０６号の優先権を主張するものである。本出願は、本明細書と同日付に出願された代理人事件番号８８４７３−９０９０７３−０２６６１０ＰＣのＣＴ出願を参照により組み込むものである。
【０００２】
[0002]過敏性腸症候群（ＩＢＳ）は全ての消化管障害のなかでも最も一般的なものであり、一般集団の１０〜２０％が罹患しており、消化系の愁訴を有する全患者の５０％超を占める。しかし、研究によれば、ＩＢＳに罹ったものの約１０％〜５０％しか実際に治療を求めないことが示唆されている。ＩＢＳを有する患者は、例えば、主として排便に関連する腹痛、下痢、便秘又は交代性の下痢及び便秘、腹部膨満、ガス、並びに大便中の過剰な粘液などの種々の症状を表す。４０％を超えるＩＢＳ患者は非常に重い症状を有するため、仕事を休んだり、社会生活を控えたり、性交を避けたり、約束を取り消したり、旅行を中止したり、薬物を摂取したりしなければならず、さらには困惑を恐れて家に閉じこもることさえある。米国におけるＩＢＳの医療費は、推定で１年あたり８０億ドルである（Ｔａｌｌｅｙら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、１０９巻、１７３６〜１７４１頁（１９９５年））。
【０００３】
[0003]ＩＢＳ患者は、患者の主な腸の症状に従って３つの群：便秘優勢ＩＢＳ（ＩＢＳ−Ｃ）、下痢優勢ＩＢＳ（ＩＢＳ−Ｄ）、下痢と便秘の症状を交互に繰り返すＩＢＳ（ＩＢＳ−Ｍ）、及び分類不能型ＩＢＳ（ＩＢＳ−Ｕ）に分類される。現在の臨床診療では、ＩＢＳの診断はＲｏｍｅＩＩＩ診断基準に基づき、患者が表す症状に従う。この障害を同定するのに用いることができる生物学的、エックス線撮影的、内視鏡的、又は生理学的な特異的生物マーカーは存在しない。
【０００４】
[0004]過敏性腸症候群は、不均質な消化管（ＧＩ）機能障害である。その病原性における免疫系の関与を指摘する証拠がますます増えつつある。ＧＩ感染症は、ＩＢＳ症状の開始を引き起こす引き金因子であり得る。一方、ＩＢＳはしばしば「脳−腸管障害」と記述される。ＧＩの運動、及び５−ＨＴシグナル伝達経路の調節不全によって媒介される分泌における変化が、腸管の習性における不規則さの根底になり得る。結腸の神経に近接する肥満細胞の活性化が、ＩＢＳを有する患者が経験する腹痛に相関していた。肥満細胞は、活性化されると様々な炎症メディエータを生成及び放出することができることがよく知られている。しかし、これらの異なる経路がどのように相互に情報交換するのか、及びこれらの相互作用が健常対象と同様にＩＢＳ患者で振る舞うか否かは明らかではない。
【０００５】
[0005]ＩＢＳの正確な病態生理学は未だ解明されていない。腸管の運動障害及び内臓感覚の変化は、症状の病原性に対する重要な原因と考えられている一方で（Ｑｕｉｇｌｅｙ、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、３８巻（補完２３７）、１〜８頁（２００３年）；Ｍａｙｅｒら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、１２２巻、２０３２〜２０４８頁（２００２年））、この病状は、脳−腸管の情報交換の妨害、腸管感染症、腸の炎症、及び／又は微生物相の変更によって特徴付けられるストレス関連障害とみられている。近年、腸管感染症及び腸の炎症に対する役割も提唱されている。研究により細菌学的に確認された胃腸炎の後にＩＢＳが開始することが記述されている一方、他の研究によりＩＢＳにおける低グレードの粘膜炎症（Ｓｐｉｌｌｅｒら、Ｇｕｔ、４７巻、８０４〜８１１頁（２０００年）；Ｄｕｎｌｏｐら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、１２５巻、１６５１〜１６５９頁（２００３年）；Ｃｕｍｂｅｒｌａｎｄら、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．、１３０巻、４５３〜４６０頁（２００３年））及び免疫活性化（Ｇｗｅｅら、Ｇｕｔ、５２巻、５２３〜５２６頁（２００３年）；Ｐｉｍｅｎｔｅｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、９５巻、３５０３〜３５０６頁（２０００年））の証拠が提供されている。腸管フローラ（例えば、腸管の微生物叢）も関係しており、最近の研究により、免疫活性の変調による障害の処置におけるプロバイオティック生物体であるビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の有効性が実証された（Ｓｉｍｒｅｎら、Ｇｕｔ、６２巻、１５９〜１７６頁（２０１３年））。
【０００６】
[0006]抗菌抗体、ストレスホルモン、炎症性サイトカイン、及び肥満細胞マーカーの、様々な腸の疾患又は障害における役割を裏付ける証拠が相次いでいる。例えば、抗菌抗体であるＯｍｐＣ、ＣＢｉｒ１、ＦｌａＸ、及びＦｌａ２は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の貴重な生物マーカーであることが証明されている。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２タンパク質（例えば、Ｅｒａ、ＦｏｃＡ、ＦｒｖＸ、ＧａｂＴ、ＹｂａＮ、ＹｃｄＧ、ＹｈｇＮ、及びＹｉｄＸ）に対する抗体のサブセットを用いて、クローン病（ＣＤ）を有する個体と健常対照とを、さらにＣＤを有する個体と潰瘍性大腸炎を有する個体とを区別することができる（Ｃｈｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、８巻、１７６５〜１７７６頁（２００９年））。カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｊ））、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｃ）、サルモネラエンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓｅ））、シゲラフレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｆ））からの感染によってしばしば引き起こされる、ＩＢＳに付随する感染後小腸細菌異常増殖（ＳＩＢＯ）を有する個体は、感染性細菌のフラゲリンタンパク質に対する抗体を有することがある（Ｓｐｉｌｌｅｒ  Ｒ及びＧａｒｓｅｄ  Ｋ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１３６巻、１９７９〜１９８８頁（２００９年））。
【０００７】
[0007]遠位の腸管セグメントにおける肥満細胞の浸潤及び活性化の増大は、ＩＢＳの症状の開始及び重症度に関連する。肥満細胞は、ＩＢＳ患者における粘膜の刺激に対する内臓求心性神経の応答の上昇にも関係する。肥満細胞の過形成は、感染後ＩＢＳ及び非感染後ＩＢＳの両方とも、これらの細菌による感染の後に通常観察される。β−トリプターゼ、ヒスタミン、及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）などの肥満細胞マーカーの測定は、ＩＢＳの臨床診断において重要な意味がある。ＩＢＳの診断において助けとなる肥満細胞マーカーを用いる詳しい方法は、全ての目的でその開示の全文が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，１１４，６１６号及び米国特許出願公開第２０１２／２４４５５８号に記載されている。
【０００８】
[0008]ＩＢＳ患者は、脳−腸管軸及び腸管の微生物叢によって媒介される、腹部腸管運動及び内臓の過感受性を経験するのが典型的である。ＩＢＳを含めたストレス感受性の障害では、視床下部−下垂体−副腎皮質系（ＨＰＡ）のストレスホルモン、例えば、腸管ホルモン、セロトニン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、コルチゾール、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、及びカテコールアミンが放出され、よって、例えば、腸管の生理学的機能が制御される。代謝産物が駆動する経路を含めた脳−腸管軸の調節不全は、運動を低下させ、疼痛又は不快感を増大することにより、消化管機能に有害な影響を及ぼす可能性がある。セロトニン経路に対する治療薬は、ＩＢＳの処置について現在調査中である。腸の胆汁酸分泌及び吸収の調節不全もＩＢＳに関連する。いくつかの試験により、消化管機能は腸管の微生物叢による影響を受けることも示されている。例えば、食事、抗生物質、病原体、及び宿主の免疫応答が腸管の微生物叢の共同体を変化させることがあり、これがひいては腸の機能を変更する可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
[0009]前述を鑑みて、当技術分野において、脳−腸管−微生物叢軸をモニタリングすることにより、個体におけるＩＢＳを診断するための方法が必要とされている。様々な代謝経路及び異化経路が適切に機能しているか否かを評価するアッセイが必要とされている。本発明は、これら及びその他の必要性を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
[0010]本発明は、セロトニン、トリプトファン、及びキヌレニン経路における代謝産物に対する抗体、及び抗体を調製するための方法を提供する。調製された抗体は、関連の代謝産物に対して低い交差反応性を有し、１つ又は複数の以下の代謝産物：セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、キヌレニン（Ｋ）、キヌレン酸（ＫＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸、及びアントラニル酸に対して特異的で高感度の免疫アッセイのための有用な試薬である。
【００１１】
[0011]本発明は、セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、キヌレニン（Ｋ）、キヌレン酸（ＫＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸、及びアントラニル酸の安定な誘導体も提供する。誘導体は、担体タンパク質などの生体分子にコンジュゲートすることができ、免疫応答を刺激するためのアジュバントと組み合わせることができる。誘導体は、他の生体分子にコンジュゲートすることもできる。
【００１２】
[0012]他の態様において、本発明は、抗体を作成するための方法を提供する。方法は、
（ａ）担体タンパク質にコンジュゲートしている、セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、キヌレニン（Ｋ）、キヌレン酸（ＫＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸、及びアントラニル酸からなる群から選択される誘導体を含む免疫原を提供するステップと、
（ｂ）動物の免疫系が抗体を作成する条件下で、動物を免疫原で免疫化するステップと、
（ｃ）抗体を動物から除去するステップと
を含む。
【００１３】
[0013]ある種の他の態様において、本発明は、ヒトなどの哺乳動物からの体液又は組織試料中の、セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、キヌレニン（Ｋ）、キヌレン酸（ＫＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸、アントラニル酸、及びこれらの組合せからなる群から選択されるメンバーをアッセイするための方法を提供する。方法は、試料を、本明細書に記載する抗体と合わせ、次いで抗体が、試料からのセロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、キヌレニン（Ｋ）、キヌレン酸（ＫＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸、アントラニル酸、及びこれらの組合せからなる群から選択されるメンバーに特異的に結合するか否かを決定することを含む。例えば、これらの方法では、試料からのセロトニン（５−ＨＴ）に対する特異的な抗体の結合が、試料中にセロトニン（５−ＨＴ）が存在することの指標である。
【００１４】
[0014]本発明は、胆汁酸代謝産物に対する抗体、及び抗体を調製するための方法も提供する。調製された抗体は、関連の代謝産物に対して低い交差反応性を有し、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンに対する特異的で高感度の免疫アッセイに有用な試薬である。
【００１５】
[0015]本発明は、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンの安定な誘導体も提供する。誘導体は、担体タンパク質などの生体分子にコンジュゲートすることができ、免疫応答を刺激するためのアジュバントと組み合わせることができる。誘導体は、他の生体分子ともコンジュゲートすることができる。
【００１６】
[0016]他の態様において、本発明は、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンの抗体を作成するための方法を提供する。方法は、
（ａ）担体タンパク質にコンジュゲートしている、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンの誘導体を含む免疫原を提供するステップと、
（ｂ）動物の免疫系が抗体を作成する条件下で、動物を免疫原で免疫化するステップと、
（ｃ）抗体を動物から除去するステップと
を含む。
【００１７】
[0017]ある種の他の態様において、本発明は、ヒトなどの哺乳動物からの体液又は組織試料中の７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンをアッセイするための方法を提供する。方法は、試料を、本明細書に記載する抗体と合わせ、次いで、抗体が試料からの７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンに特異的に結合するか否かを決定することを含む。例えば、これらの方法では、試料からの７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンに対する特異的な抗体の結合が、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンが試料中に存在することの指標である。
【００１８】
[0018]加えて、本発明は、短鎖脂肪酸に対する抗体、及び抗体を作成する方法を提供する。調製された抗体は関連する代謝産物に対する低い交差反応性を有し、プロピオン酸及び酪酸に対する特異的で高感度の免疫アッセイに有用な試薬である。
【００１９】
[0019]本発明は、プロピオン酸及び酪酸などの短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の安定な誘導体も提供する。誘導体は、担体タンパク質などの生体分子にコンジュゲートすることができ、免疫応答を刺激するためのアジュバントと組み合わせることができる。誘導体は、他の生体分子にコンジュゲートすることもできる。
【００２０】
[0020]他の態様において、本発明は、短鎖脂肪酸の抗体を作成するための方法を提供する。方法は、
（ａ）担体タンパク質にコンジュゲートしている、短鎖脂肪酸の誘導体を含む免疫原を提供するステップと、
（ｂ）動物の免疫系が抗体を作成する条件下で、動物を免疫原で免疫化するステップと、
（ｃ）抗体を動物から除去するステップと
を含む。
【００２１】
[0021]ある種の他の態様において、本発明は、ヒトなどの哺乳動物からの体液又は組織試料中の短鎖脂肪酸をアッセイするための方法を提供する。方法は、試料を、本明細書に記載する抗体と合わせ、次いで、抗体が、試料からの短鎖脂肪酸に特異的に結合するか否かを決定することを含む。例えば、これらの方法では、試料からのプロピオン酸に対する特異的な抗体の結合が、試料中にプロピオン酸が存在することの指標である。
【００２２】
[0022]前述に加えて、本発明は、本明細書の代謝産物の存在又は濃度を用いて、対象における過敏性腸症候群（ＩＢＳ）の診断を決定するための方法を提供する。方法は、本明細書に記載するアッセイ方法により、患者の血液、血漿、又は血清中の１つ又は複数の代謝産物を測定することを含む。
【００２３】
[0023]本発明は、患者におけるＩＢＳに対する処置が効果的であるか否かを決定するための方法も提供する。方法は、本明細書に記載するアッセイ方法により、患者の血液、血漿、又は血清中の１つ又は複数の代謝産物を測定することを含む。
【００２４】
[0024]ある種の他の態様において、本発明は、ＩＢＳと以前に診断された患者を評価するための方法を提供する。方法は、本明細書に記載するアッセイ方法により、患者の血液、血漿、又は血清中の１つ又は複数の代謝産物を測定することを含む。
【００２５】
[0025]これら及び他の態様、利点、及び実施形態は、以下の詳細な説明及び図面を読めばより明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＩＢＳの複雑な病態生理学を図示し、セロトニン、トリプトファン、及びキヌレニン経路の代謝産物を強調した図である。
【図２】本発明の抗体生成の一方法の流れ図を示す図である。
【図３】ある種の代謝産物の不安定な性質を示す、ＴＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図４】本発明の安定化された誘導体に対する必要性を示す、セロトニンのシグナルの減少を示す図である。
【図５】本発明の誘導体化された代謝産物の安定な性質を示す、ＴＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図６】セロトニン及び本発明の誘導体のＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図７】５−ヒドロキシインドール酢酸及び本発明の誘導体のＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図８】患者の血清中の経路の代謝産物を検出するのに用いた競合的ＥＬＩＳＡの例示的な実施形態を示す図である。
【図９】採血１〜５（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、及びＢ５）におけるウサギＡ及びウサギＢからの抗血清中で検出されたベンゾオキサゾール誘導体に対する抗体のデータの棒グラフを示す図である。
【図１０】ウサギＡ及びＢにおいてＳｅｒ−Ｄに対して産生された抗体の親和性を評価するために行われた滴定実験からのデータを示す図である。
【図１１】図１１のＢに図示する直接アッセイを用いた抗血清の交差反応性の減少を示す図である。抗血清は５−ＨＧに特異的であり（図１１のＡ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＯＨ  Ｔｒｙｐ；図１１のＣ）及び５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ；図１１のＤ）などの構造的に類似な化合物に対して交差反応性を示さなかった。
【図１２】図１２のＢに図示する競合アッセイを用いて試験した、抗血清の交差反応性の欠如を示す図である。図１２のＡは、ヒト血清中にＳｅｒ−Ｄが存在すると、抗Ｓｅｒ−Ｄ抗体の、ビオチン化Ｓｅｒ−Ｄに対する結合が阻害されることを示す。遊離Ｓｅｒ−Ｄの量が増大すると、検出される抗体は少なくなった。図１２のＣ〜Ｅは、トリプトファン（図１２のＣ）、５−ヒドロキシトリプトファン（図１２のＤ）、及び５−ヒドロキシインドール酢酸（図１２のＥ）誘導体が存在した場合、ビオチン化Ｓｅｒ−Ｄに結合する抗体の量に変化はなかった、又はわずかな変化があったことを示す。
【図１３】ＩＢＳ−Ｄ患者におけるセロトニンの平均量は、健常対照における平均量に比べて有意差があったことを示す図である。図１３のＡは、ＥＬＩＳＡデータのグラフを示す。図１３のＢはデータの概要を表にしたものを示し、図１３のＣは四分位値分析を示す。
【図１４】複数日行ったセロトニンアッセイは安定であり、再現性があったことを示す図である。
【図１５】ＥＬＩＳＡを本発明の抗体と用いて測定したセロトニンレベルを示す図である。カルチノイド腫瘍、アルツハイマー病、又は自閉症を有する患者からの試料を試験した。健常対照に比べて、カルチノイド腫瘍を有する患者のセロトニンレベルはより高く、アルツハイマー病又は自閉症を有する患者のレベルはより低かった。
【図１６】図１６のＡは、胆汁酸がＦＧＦ１９シグナル伝達を活性化し、これがひいては胆汁酸代謝を制御することを示す図である。図１６のＢは、様々な徴候に対するＦＧＦ−１９データのグラフである。
【図１７】図１７のＡは、抗原（例えば、ＫＹＡ−Ｌ）からのデータは、５００ｎｇ／ｍｌ〜３１．３ｎｇ／ｍｌの範囲であることを示す図である。図１７のＢは、ＫＹＡ−Ｌは３１．３ｎｇ／ｍｌ〜０の範囲であることを示す図である。データは、抗体がキヌレン酸に特異的に結合することを示す。
【図１８】抗ＫＹＡ−Ｌ抗体の交差反応性の欠如を示す図である。図１８のＡは、ＫＹＡ−Ｌ抗原は、ビオチン化抗原と競合したことを示す。対照的に、増大量のＫｙ（図１８のＢ）、Ｈ−Ｋｙ（図１８のＣ）、及びＴｒｙｐｔ（図１８のＤ）が存在しても、アッセイで検出された抗ＫＹＡ−Ｌのレベルを変更しなかった。結果は、抗ＫＹＡ−Ｌ抗体は、キヌレニン代謝産物と交差反応せず、キヌレン酸に特異的であることを示す。
【図１９】プロピオン酸特異的抗体の存在に対して試験した免疫化ウサギからの抗血清の結果を示す図である。
【図２０】競合アッセイを用いて試験した抗ＰｒｏｐＬ抗体の交差反応性の欠如を示す図である。抗体はプロピオン酸に特異的であり（図２０のＡ）、酪酸（図２０のＢ）又はセロトニン（図２０のＣ）と交差反応性を示さなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
Ｉ．定義
[0046]本明細書で用いる「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、又は「その（ｔｈｅ）」の語は、１メンバーを有する態様を含むだけではなく、１つを超えるメンバーを有する態様も含む。例えば、「ポリアミン化合物及び賦形剤」を含む実施形態は、少なくとも第２のポリアミン化合物、少なくとも第２の賦形剤、又は両方を有するある態様を提示すると理解されたい。
【００２８】
[0047]「アッセイ」の語は、分析物の検出又は定量化を含む。典型的には、アッセイの実行は、用いられるペルオキシダーゼの量に対する光の出力の相関を必要とし、これによりペルオキシダーゼは直接決定される物質である。本発明は、いずれかの反応物（ルミノール、ペルオキシダーゼ、又は酸化剤）の存在又は量を決定するのに有用であるが、反応物は必ずしも、決定しようとする物質そのものではない。例えば、酸化剤（例えばＨ２Ｏ２）は、先立つ反応、又は一連の先立つ反応によって生成することができる。
【００２９】
[0048]抗体又は抗原結合性フラグメントは、対象の代謝産物に、他の代謝産物に対する１％未満の交差反応性で特異的に結合する。何らかの交差反応性が生じる場合、交差反応性は最小限であり、例えば、別の代謝産物に対する交差反応性の１％未満、又は約０．０３〜０．９％、又は０．０２〜０．８％、又は０．０５〜０．５％、又は０．０３〜０．９％などである。
【００３０】
[0049]本明細書で用いる「アシル」は、本明細書で規定する、アルカノイル、アロイル、ヘテロシクロイル、又はヘテロアロイル基を含む。代表的なアシル基には、アセチル、ベンゾイル、ニコチノイルなどが含まれる。
【００３１】
[0050]本明細書で用いる「アルカノイル」にはアルキル−Ｃ（Ｏ）−基が含まれ、アルキル基は本明細書で規定する通りである。代表的なアルカノイル基には、アセチル、エタノイルなどが含まれる。
【００３２】
[0051]本明細書で用いる「アルケニル」には、炭素−炭素二重結合又は三重結合を少なくとも１つ含む、炭素原子２個〜約１５個の、直鎖又は分岐鎖脂肪族炭化水素基が含まれる。好ましいアルケニル基は、炭素原子を２個〜約１２個含む。より好ましいアルケニル基は、炭素原子を２個〜約６個含む。一態様において、炭素−炭素二重結合を含む炭化水素基が好ましい。第２の態様において、炭素−炭素三重結合を含む炭化水素基が好ましい（すなわち、アルキニル）。本明細書で用いる「低級アルケニル」には、炭素原子２個〜約６個のアルケニルが含まれる。代表的なアルケニル基には、ビニル、アリル、ｎ−ブテニル、２−ブテニル、３−メチルブテニル、ｎ−ペンテニル、ヘプテニル、オクテニル、デセニル、プロピニル、２−ブチニル、３−メチルブチニル、ｎ−ペンチニル、へプチニルなどが含まれる。
【００３３】
[0052]アルケニル基は、非置換でも、又は任意選択により置換されていてもよい。任意選択により置換されている場合、アルケニル基の１つ又は複数（例えば、１〜４個、１〜２個、又は１個）の水素原子は、フルオロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオ、及びアルキルチオからなる群から独立に選択される部分で置き換えられていてもよい。
【００３４】
[0053]本明細書で用いる「アルケニレン」は、炭素−炭素二重結合又は三重結合を少なくとも１個含む、直鎖又は分岐鎖の二価炭化水素鎖を含む。好ましいアルケニレン基は鎖に炭素を２個〜約１２個含み、より好ましいアルケニレン基は鎖に炭素を２個〜６個含む。一態様において、炭素−炭素二重結合を含む炭化水素基が好ましい。第二の態様において、炭素−炭素三重結合を含む炭化水素基が好ましい。代表的なアルケニレン基には、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ−、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、エチニレン、プロピニレン、ｎ−ブチニレンなどが含まれる。
【００３５】
[0054]本明細書で用いる「アルコキシ」にはアルキル−Ｏ−基が含まれ、アルキル基は本明細書で規定される通りである。代表的なアルコキシ基には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ヘプトキシなどが含まれる。
【００３６】
[0055]アルコキシ基は非置換でも、又は任意選択により置換されていてもよい。任意選択により置換されている場合、アルコキシ基の１つ又は複数（例えば、１〜４個、１〜２個、又は１個）の水素原子は、フルオロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオ、及びアルキルチオからなる群から独立に選択される部分で置き換えられていてもよい。
【００３７】
[0056]本明細書で用いる「アルコキシアルキル」にはアルキル−Ｏ−アルキレン−基が含まれ、アルキル及びアルキレンは本明細書で規定される通りである。代表的なアルコキシアルキル基には、メトキシエチル、エトキシメチル、ｎ−ブトキシメチル、及びシクロペンチルメチルオキシエチルが含まれる。
【００３８】
[0057]本明細書で用いる「アルコキシカルボニル」にはエステル基、すなわちアルキル−Ｏ−ＣＯ−基が含まれ、アルキルは本明細書で規定される通りである。代表的なアルコキシカルボニル基には、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニルなどが含まれる。
【００３９】
[0058]本明細書で用いる「アルコキシカルボニルアルキル」にはアルキル−Ｏ−ＣＯ−アルキレン−基が含まれ、アルキル及びアルキレンは本明細書で規定される通りである。代表的なアルコキシカルボニルアルキルには、メトキシカルボニルメチル、エトキシカルボニルメチル、メトキシカルボニルエチルなどが含まれる。
【００４０】
[0059]本明細書で用いる「アルキル」には、鎖に炭素原子を約１個〜約２０個有する、直鎖でも、又は分岐鎖でもよい、脂肪族炭化水素基が含まれる。好ましいアルキル基は、鎖に炭素原子を１個〜約１２個有する。より好ましいアルキル基は、鎖に炭素原子を１個〜６個有する。本明細書で用いる「分岐鎖」には、メチル、エチル、又はプロピルなどの１つ又は複数の低級アルキル基が直鎖アルキル鎖に接続しているものが含まれる。本明細書で用いる「低級アルキル」は、直鎖でも、又は分岐鎖でもよい、鎖に炭素原子を１個〜約６個、好ましくは炭素原子を５個又は６個含む。代表的なアルキル基には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、及び３−ペンチルが含まれる。
【００４１】
[0060]アルキル基は、非置換でも、又は任意選択により置換されていてもよい。任意選択により置換されている場合、アルキル基の１つ又は複数（例えば、１〜４個、１〜２個、又は１個）の水素原子は、フルオロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオ、及びアルキルチオからなる群から独立に選択される部分で置き換えられていてもよい。
【００４２】
[0061]本明細書で用いる「アルキレン」には、炭素原子１個〜約６個の直鎖又は分岐鎖の二価炭化水素鎖が含まれる。好ましいアルキレン基は、炭素原子１個〜約４個を有する低級アルキレン基である。代表的なアルキレン基には、メチレン、エチレンなどが含まれる。
【００４３】
[0062]本明細書で用いる「アルキルチオ」にはアルキル−Ｓ−基が含まれ、アルキル基は本明細書で規定する通りである。好ましいアルキルチオ基は、アルキル基が低級アルキルであるものである。代表的なアルキルチオ基には、メチルチオ、エチルチオ、イソプロピルチオ、ヘプチルチオなどが含まれる。
【００４４】
[0063]本明細書で用いる「アルキルチオアルキル」にはアルキルチオ−アルキレン−基が含まれ、アルキルチオ及びアルキレンは本明細書で規定される通りである。代表的なアルキルチオアルキル基には、メチルチオメチル、エチルチオプロピル、イソプロピルチオエチルなどが含まれる。
【００４５】
[0064]本明細書で用いる「アミド」には式Ｙ１Ｙ２Ｎ−Ｃ（Ｏ）−の基が含まれ、Ｙ１及びＹ２は独立に、水素、アルキル、若しくはアルケニルであり、又はＹ１及びＹ２は、それらを介してＹ１及びＹ２が連結される窒素と一緒に、繋がれて４員〜７員アザヘテロシクリル基（例えば、ピペリジニル）を形成する。代表的なアミド基には、１級アミド（Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｏ）−）、メチルアミド、ジメチルアミド、ジエチルアミドなどが含まれる。「アミド」が−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’基であるのが好ましく、Ｒ及びＲ’は、Ｈ及びアルキルからなる群から独立に選択されるメンバーである。Ｒ及びＲ’の少なくとも１つがＨであるのがより好ましい。
【００４６】
[0065]本明細書で用いる「アミドアルキル」にはアミド−アルキレン−基が含まれ、アミド及びアルキレンは本明細書で規定される通りである。代表的なアミドアルキル基には、アミドメチル、アミドエチレン、ジメチルアミドメチルなどが含まれる。
【００４７】
[0066]本明細書で用いる「アミノ」には式Ｙ１Ｙ２Ｎ−の基が含まれ、Ｙ１及びＹ２は独立に、水素、アシル、若しくはアルキルであり、又はＹ１及びＹ２は、それを介してＹ１及びＹ２が連結される窒素と一緒に、繋がれて４員〜７員アザヘテロシクリル基（例えば、ピペリジニル）を形成する。任意選択によって、Ｙ１及びＹ２が独立に水素又はアルキルである場合、付加的な置換基を窒素に加え、四級アンモニウムイオンを作成してもよい。代表的なアミノ基には、一級アミノ（Ｈ２Ｎ−）、メチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノなどが含まれる。「アミノ」が−ＮＲＲ’基であるのが好ましく、Ｒ及びＲ’は、Ｈ及びアルキルからなる群から独立に選択されるメンバーである。Ｒ及びＲ’の少なくとも１つがＨであるのが好ましい。
【００４８】
[0067]本明細書で用いる「アミノアルキル」にはアミノ−アルキレン−基が含まれ、アミノ及びアルキレンは本明細書で規定される通りである。代表的なアミノアルキル基には、アミノメチル、アミノエチル、ジメチルアミノメチルなどが含まれる。
【００４９】
[0068]本明細書で用いる「アロイル」にはアリール−ＣＯ−基が含まれ、アリールは本明細書で規定される通りである。代表的なアロイルには、ベンゾイル、ナフタ−１−オイル、及びナフタ−２−オイルが含まれる。
【００５０】
[0069]本明細書で用いる「アリール」には、炭素原子６個〜約１４個、好ましくは炭素原子６個〜約１０個の芳香族単環又は多環環系が含まれる。代表的なアリール基には、フェニル及びナフチルが含まれる。
【００５１】
[0070]本明細書で用いる「芳香環」には、酸素、硫黄、セレン、及び窒素からなる群から選択されるヘテロ原子を０個〜４個含んでいてもよい、５〜１２員の芳香族単環又は縮合多環部分が含まれる。例示的な芳香環には、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン、ナフタレン、ベンゾチアゾリン（ｂｅｎｚａｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ）、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、インドール、ベンズインドール、キノリンなどが含まれる。芳香環基は、１つ又は複数のポジションが、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、ハロアルキル、シアノ、スルホネート、アミノスルホニル、アリール、スルホニル、アミノカルボニル、カルボキシ、アシルアミノ、アルキルスルホニル、アミノ、及び置換又は非置換の置換基で置換されていてもよい。
【００５２】
[0071]本明細書で用いる「生体分子」には、生物学的系で用いるための天然又は合成の分子が含まれる。好ましい生体分子には、タンパク質、ペプチド、酵素基質、ホルモン、抗体、抗原、ハプテン、アビジン、ストレプトアビジン、炭水化物、炭水化物誘導体、オリゴ糖、多糖、及び核酸が含まれる。より好ましい生体分子には、タンパク質、ペプチド、アビジン、ストレプトアビジン、又はビオチンが含まれる。
【００５３】
[0072]本明細書で用いる「カルボキシ」及び「カルボキシル」には、ＨＯＣ（Ｏ）−基（すなわち、カルボン酸）又はその塩が含まれる。
【００５４】
[0073]本明細書で用いる「カルボキシアルキル」にはＨＯＣ（Ｏ）−アルキレン−基が含まれ、アルキレンは本明細書に規定する。代表的なカルボキシアルキルには、カルボキシメチル（すなわち、ＨＯＣ（Ｏ）ＣＨ２−）及びカルボキシエチル（すなわち、ＨＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−）が含まれる。
【００５５】
[0074]本明細書で用いる「シクロアルキル」には、炭素原子約３個〜約１０個、好ましくは炭素原子約５個〜約１０個の非芳香族単環又は多環環系が含まれる。より好ましいシクロアルキル環は環原子を５個又は６個含む。シクロアルキル基は、ｓｐ２−混成炭素（例えば、環内又は環外オレフィンを組み入れる環）を少なくとも１個、任意選択により含む。代表的な単環シクロアルキル基には、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが含まれる。代表的な多環シクロアルキルには、１−デカリン、ノルボルニル、アダマンチルなどが含まれる。
【００５６】
[0075]本明細書で用いる「シクロアルキレン」には、炭素原子を約４個〜約８個有する二価シクロアルキルが含まれる。好ましいシクロアルキレニル基には、１，２−、１，３−、又は１，４−ｃｉｓ−又はｔｒａｎｓ−シクロへキシレンが含まれる。
【００５７】
[0076]本明細書で用いる「ハロ」又は「ハロゲン」には、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素が含まれる。
【００５８】
[0077]本明細書で用いる「ヘテロ原子」には、炭素又は水素以外の原子が含まれる。代表的なヘテロ原子には、Ｏ、Ｓ、及びＮが含まれる。ヘテロ原子の窒素又は硫黄原子は、任意選択によって、対応するＮ−オキシド、Ｓ−オキシド（スルホキシド）、又はＳ，Ｓ−ジオキシド（スルホン）に酸化される。好ましい一態様において、ヘテロ原子は、アルキレン炭素原子に対して少なくとも２つの結合を有する（例えば、−Ｃ１〜Ｃ９アルキレン−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ９アルキレン−）。いくつかの実施形態において、ヘテロ原子は、アシル、アルキル、アリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール基でさらに置換されている（例えば、−Ｎ（Ｍｅ）−、−Ｎ（Ａｃ）−）。
【００５９】
[0078]本明細書で用いる「ヒドロキシアルキル」には、１つ又は複数のヒドロキシ基で置換されている、本明細書に規定するアルキル基が含まれる。好ましいヒドロキシアルキルは低級アルキルを含む。代表的なヒドロキシアルキル基には、ヒドロキシメチル及び２−ヒドロキシエチルが含まれる。
【００６０】
[0079]「連結基」すなわちＬは、代謝産物の誘導体を、担体タンパク質、ビオチン、又はストレプトアビジンなどの生体分子と繋ぐ原子を含む。Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２年）も参照されたい。一実施形態において、Ｌはタンパク質と接続反応する前の連結基前駆物質を表し、Ｒ１１は、本発明の化合物とタンパク質又はビオチンとの間に生じる接続部を表す（すなわち、Ｒ１１は、生体分子に繋がれる連結基間に生じる接続部である）。好ましい反応性の官能基には、ホスホラミダイト基、活性化エステル（例えば、ＮＨＳエステル）、チオシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、及びヨードアセトアミドが含まれる。Ｌは、環に共有結合した、末端のアミノ、カルボン酸、又はスルフヒドリル基を含むことができる。場合によっては、末端のアミノ、カルボン酸、又はスルフヒドリル基が示され、−Ｌ−ＮＨ２、又は−Ｌ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ若しくは−Ｌ−ＳＨとして表される。
【００６１】
[0080]本明細書で用いる「オキソ」には、式＞Ｃ＝Ｏの基（すなわち、カルボニル基−Ｃ（Ｏ）−）が含まれる。
【００６２】
[0081]本明細書で用いる「スルホネート」には、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋などの陽イオンによってバランスがとられているのが好ましい、−ＳＯ３−基が含まれる。
【００６３】
[0082]本明細書で用いる「スルホネートアルキル」にはスルホネート−アルキレン−基が含まれ、スルホネート及びアルキレンは本明細書で規定される通りである。より好ましい実施形態には、炭素原子２〜６個を有するアルキレン基が含まれ、最も好ましい実施形態には炭素２、３、又は４個を有するアルキレン基が含まれる。代表的なスルホネートアルキルには、スルホネートメチル、３−スルホネートプロピル、４−スルホネートブチル、５−スルホネートペンチル、６−スルホネートヘキシルなどが含まれる。
ＩＩ．実施形態
【００６４】
[0083]セロトニン（５−ＨＴ）は、消化管の運動、分泌、及び感覚の制御において決定的な役割を果たす。腸管神経系内のセロトニン作動性シグナル伝達における５−ＨＴレベルの不均衡は、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、機能性消化不良、非心臓性の胸痛、自閉症、及び胃潰瘍形成を含めた様々な障害に関連している。特定の神経系領域において５−ＨＴレベルを同時進行で制御することが必要であり、５−ＨＴの異化作用はこの制御において重要な役割を果たす。５−ＨＴの他の化合物への異化的な変換は、５−ＨＴの全体的なレベルに影響を及ぼすため、これらの変換生成物の形成は、５−ＨＴ制御における根本的な因子であり得る。５−ＨＴに関与する３つの経路が、トリプトファン、セロトニン、及びキヌレニン経路である。これらの関係の模式図を図１に示す。
【００６５】
[0084]ある態様において、本発明は、トリプトファン、セロトニン、及びキヌレニン経路における代謝産物を測定するためのアッセイを提供する。例えば、図１を参照すると、キヌレニン経路内の、５−ＨＴ  １０１、５−ＨＩＡＡ（５−ヒドロキシインドール−３−酢酸）１１５、及び代謝産物を測定することにより、ＩＢＳ、並びにカルチノイド症候群、うつ病、高血圧、自閉症、アルツハイマー病、及び片頭痛などの他の病理学的現象の診断を助ける上で理解ができるようになる。
【００６６】
[0085]代謝産物を測定する先行技術の方法は、非存在、又は感度、特異度、及び再現性の欠如のいずれかである。その上、５−ＨＴ及び５−ＨＩＡＡなどの代謝産物は非常に不安定であり、そのためこれらを測定するのは非常に困難となっている。
【００６７】
Ａ．セロトニン経路の代謝産物に対するアッセイ
[0086]一態様において、本発明は、代謝産物の誘導体及びそのコンジュゲート、セロトニン代謝産物の抗体を生成するための方法及び抗体を提供する。ある態様において、５−ＨＴ及び５−ＨＩＡＡなどの代謝産物は酸素に対して感受性があり、よって不安定であるため、誘導体化が好ましい。血漿中のセロトニンのレベルは約０．６〜１７９ｎｍｏｌ／Ｌの範囲である。穏やかな条件下で５−ＨＴ及び５−ＨＩＡＡを化学的に誘導体化することにより化合物は安定化する。よって、一態様において、本発明は、セロトニン代謝産物の安定なベンゾオキサゾール誘導体を提供する。安定なベンゾオキサゾール誘導体は、その蛍光のため、高感度のＨＰＬＣによって検出することができる。
【００６８】
[0087]本発明は、セロトニン（５−ＨＴ）及び５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）の安定な誘導体を提供する。
【００６９】
[0088]一態様において、本発明は、式Ｉの化合物を提供し：
【化１】
2019151637.tif 000003
式中、Ｒは、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アミノアルキル、アミドアルキル、カルボキシアルキル、置換カルボキシアルキルからなる群から選択されるメンバーであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ、及びＲ１１Ｂからなる群から独立に選択されるメンバーであり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に生じる接続部であり、
Ｂは、生体分子である。
【００７０】
[0089]一態様において、Ｒは、アミノアルキル、カルボキシアルキル、及び置換カルボキシアルキルからなる群から選択されるメンバーである。別の一態様において、Ｒは、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、及びＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ２Ｈからなる群から選択されるメンバーである。
【００７１】
[0090]Ｌは、担体タンパク質又はビオチンなど、生体分子に対する接続のための連結基を表す。例えば、Ｌは、環に共有結合した、末端のアミノ、カルボン酸、又はスルフヒドリル基を含むことができる。場合によっては、末端のアミノ、カルボン酸、又はスルフヒドリル基が示され、−Ｌ−ＮＨ２、又は−Ｌ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ若しくは−Ｌ−ＳＨとして表される。
【００７２】
[0091]Ｒ１１は、本発明の化合物と、担体タンパク質、ペプチド、又はビオチンなどの生体分子との間に生じる接続部を表す（すなわち、Ｒ１１は、生体分子に繋がれる連結基を含む）。
【００７３】
[0092]Ｌは、直接連結、又は共有結合性の連結からなる群から選択されるメンバーであり、共有結合性の連結は、直鎖又は分岐鎖の、環状又は複素環の、飽和又は不飽和の、Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｏ、及びＳからなる群から選択される原子を１〜６０個有し、Ｌは原子価を満たすための付加的な水素原子を有することができ、連結は、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カーバメート、尿素、チオ尿素、オキシ、若しくはアミド結合のあらゆる組合せ、又は単、二重、三重、若しくは芳香族性の炭素−炭素結合であり、又はリン−酸素、リン−硫黄、窒素−窒素、窒素−酸素、若しくは窒素−白金結合であり、又は芳香族若しくは芳香族複素環（ｈｅｔｅｒｏａｒｏｍａｔｉｃ）結合を含む。ある態様において、Ｌは、末端のアミノ、カルボン酸、又はスルフヒドリル基を含む。
【００７４】
[0093]ある好ましい態様において、Ｌは式：
−Ｘ１−Ｙ１−Ｘ２−
のものであり、式中、Ｘ１は、二価の基、直接連結、酸素、任意選択により置換されている窒素及び硫黄の群から選択されるメンバーであり、Ｙ１は、直接連結、及び任意選択によりヘテロ原子によって割り込まれているＣ１〜Ｃ１０アルキレンの群から選択されるメンバーであり、Ｘ２は、二価の基、直接結合、酸素、任意選択により置換されている窒素及び硫黄の群から選択されるメンバーである。
【００７５】
[0094]Ｘ１及びＸ２の二価の基が、直接連結、任意選択により置換されているアルキレン、任意選択により置換されているアルキレンオキシカルボニル、任意選択により置換されているアルキレンカルバモイル、任意選択により置換されているアルキレンスルホニル、アリーレンスルホニル、任意選択により置換されているアリーレンオキシカルボニル、任意選択により置換されているアリーレンカルバモイル、任意選択により置換されているチオカルボニル、任意選択により置換されているスルホニル、及び任意選択により置換されているスルフィニルの群から各々独立に選択されるのが好ましい。
【００７６】
[0095]ある好ましい態様において、Ｌは−（ＣＨ２）ｎ−であり、ｒは１〜１０の整数であり、好ましくはｎは１〜５の整数、例えば１〜４、又は１、２、３、４、若しくは５である。
【００７７】
[0096]加えて、ベンゾオキサゾール誘導体を用いて免疫原性コンジュゲートを作成することができる。例えば、一態様において、本発明のコンジュゲートを用いて、対象の代謝産物に特異的である免疫原性の応答を産生させる。場合によっては、ベンゾオキサゾール誘導体及びリンカーアーム（ｎは約１〜４である）を用いて、ＢＳＡなどの担体タンパク質をアミノ（又はスルフヒドリル）末端に付け加えることができる。このように生成した抗体の親和性及び特異性を試験するために、ビオチン化されているハプテンを作成する。本発明は、セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）、及びセロトニン経路における他の代謝産物の安定な誘導体を提供する。誘導体は、担体タンパク質などの生体分子にコンジュゲートすることができ、アジュバントと組み合わせて免疫応答を刺激することができる。誘導体は、他の生体分子にコンジュゲートすることもできる。ある態様において、さらなるコンジュゲーションのための一セロトニン代謝産物の誘導体は以下の構造を有する：
【化２】
2019151637.tif 000004
【００７８】
[0097]式Ｉの化合物を、当技術分野においてよく知られているコンジュゲーションの化学反応を用いて、担体分子と反応させることができる。例えば、活性化エステル（ＮＨＳエステル）は、一級アミンと反応して安定なアミド結合を作成することができる。マレイミド及びチオールは一緒に反応し、チオエーテルを作成することができる。ハロゲン化アルキルは、アミン及びチオールと反応して、それぞれアルキルアミン及びチオエーテルを作成する。タンパク質にコンジュゲートすることができる反応性部分を提供するあらゆる誘導体を、本明細書において利用することができる。当技術分野で知られている通り、遊離のアミノ基、遊離のカルボン酸基、又は遊離のスルフヒドリル基を含む部分は、タンパク質のコンジュゲーションに有用な反応基を提供する。例えば、遊離のアミノ基はタンパク質に、タンパク質上の利用可能なカルボキシ部分に対する、グルタルアルデヒド架橋連結により、又はカルボジイミド架橋連結によりコンジュゲートすることができる。また、遊離のスルフヒドリル基を有するハプテンを、タンパク質のマレイミド活性化により、例えば、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を用いて、タンパク質にコンジュゲートさせ、次いでスルフヒドリル基に連結してもよい。
【００７９】
[0098]アミン含有代謝産物に対する接続のためのカルボン酸基を有する担体タンパク質を連結する場合、カルボン酸を、活性化試薬を用いて、より反応性の形態に最初に変換して、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル又は混合の無水物を形成させてもよい。アミン含有代謝産物を、得られた活性化された酸で処理してアミド連結を形成させる。当業者であれば、代替的に、ＮＨＳエステルは代謝産物上にあってもよく、アミンは担体タンパク質上にあってもよいことを認識されよう。
【００８０】
[0099]誘導体化により代謝産物を安定化させるプロセスにより、免疫原性のコンジュゲートに対する抗体の産生が可能になる。抗体があれば、抗体が対象の代謝産物に極めて特異的であるＥＬＩＳＡなどの免疫アッセイを用いることができる。他の場合には、誘導体は、以下に示すセロトニン−Ｏ−硫酸及びセロトニン−Ｏ−リン酸を含み：
【化３】
2019151637.tif 000005
式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ６、及びＲ７は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ、及びＲ１１Ｂからなる群から独立に選択されるメンバーである。
【００８１】
[0100]図１に示す通り、セロトニン経路における対象の代謝産物は、例えば、セロトニン１０１、５−ヒドロキシインドールアセトアルデヒド１０５、及び５−ヒドロキシインドール酢酸１１５である。よって、一態様において、本発明は、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）１０１に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原性結合フラグメントであって、抗体は、トリプトファン１２２、５−ヒドロキシトリプトファン１２５、及び５−ヒドロキシインドール酢酸１１５からなる群から選択されるメンバーなどの１つ又は複数の代謝産物に対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。別の一態様において、本発明は、５−ヒドロキシインドール酢酸１１５に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原性結合フラグメントであって、抗体は、トリプトファン１２２、５−ヒドロキシトリプトファン１２５、及び５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）１０１からなる群から選択される１つ又は複数の代謝産物に対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００８２】
[0101]次に図２を振り返ると、一態様において、本発明は、代謝産物コンジュゲートに対する抗体を提供する。ステップ２０１では、代謝産物又はその安定な誘導体を調製する。ステップ２２２では、ウシ血清アルブミンＢＳＡなどの担体タンパク質を誘導体にコンジュゲートする。ステップ２３１では、コンジュゲートを、ウサギ、マウス、ヒツジ、ニワトリ、ヤギなどの哺乳動物中に注射することによって抗体を作成する。その後、ビオチン化ハプテン２５１を用いて、このように生成した抗体を試験してもよい。
【００８３】
[0102]他の態様において、本発明は、抗体を作成するための方法を提供する。方法は：
（ａ）セロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）、及び５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）からなる群から選択される誘導体を含む免疫原を提供するステップであって、各誘導体は担体タンパク質にコンジュゲートしている、ステップと、
（ｂ）動物の免疫系が抗体を作成する条件下で、動物を免疫原で免疫化するステップと、
（ｃ）抗体を動物から除去するステップと
を含む。
【００８４】
[0103]一態様において、哺乳動物から産生された抗体を、本発明のコンジュゲートを用いて血清から除去することができる。例えば、一態様において、式Ｉａ、Ｉｂ、及びＩｃの化合物を用いて抗体を血清から除去することができ、このコンジュゲートは以下の構造を有する：
【化４】
2019151637.tif 000006
【００８５】
[0104]式Ｉａ、Ｉｂ、又はＩｃのビオチン化化合物を用いて、これらの対応する抗体を哺乳動物（例えば、ウサギ、マウス、又はヤギ）から除去することができる。その後、二次抗体を用いて抗体コンジュゲートを検出する。
【００８６】
[0105]別の一態様において、本明細書に記載する方法を用いてこのように生成した抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ又はＣＥＥＲなどの免疫アッセイを用いることにより、対象の経路における代謝産物の量又はレベルを定量化することができる。
【００８７】
[0106]一態様において、本発明は、抗体−抗原反応を行うアッセイ方法を提供する。例えば、抗原、又は５−ＨＴなどの代謝産物により、抗原−抗体複合体を形成するためのペルオキシダーゼ標識した抗体との反応が可能になる。このように形成した抗原−抗体複合体を、次いで固定した抗体と反応させ、これによりペルオキシダーゼの活性を、例えば、基質として働くルミノールとの反応によって産生される化学発光によって測定する。代謝産物の存在、濃度、及び／又はレベルをそれにより測定する。
【００８８】
[0107]場合によっては、本発明の抗体を、代謝産物の存在、レベル、及び濃度を検出するための酵素標識を利用する酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫アッセイにおいて用いる。一態様において、本発明の特異的な抗体をプレートに吸収させる。非特異的な部位を、特定のアッセイの特異的な免疫化学反応において活性な部分のないタンパク質溶液でブロックする。対象の代謝産物を、プレート上の抗体によって捕獲する。その後、コンジュゲートを、酵素標識を有する別の抗体によって検出することができる。酵素標識を、化学発光試薬と反応させ、検出する。
【００８９】
[0108]ＥＬＩＳＡの別の一実施形態において、代謝産物又は誘導体を固定化してもよい。本発明の抗体を用いて、固定化した代謝産物に結合させることができる。その後、コンジュゲートを、酵素標識を有する別の抗体によって検出することができる。次いで、酵素標識を、化学発光試薬と反応させ、検出する。
【００９０】
[0109]本明細書に記載するいずれかの代謝産物を検出するためのアッセイ方法は、当技術分野において知られているあらゆる免疫アッセイを含むことができる。いくつかの態様において、アッセイは液相中で行う。他の実施形態において、アッセイは固相上、例えば、ビーズ、又はマイクロプレート、例えば９６ウエルマイクロタイタープレートの上で行う。これらの方法に有用な免疫アッセイの非限定的な例として、ラジオイムノアッセイ、マイクロアレイアッセイ、蛍光偏光免疫アッセイ、ＦＲＥＴを含む免疫アッセイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、又はＣＥＥＲがある。
【００９１】
[0110]ハプテンの検出に有用であると当技術分野で知られているあらゆるＥＬＩＳＡを、本発明のアッセイに利用することができる。ハプテン用のＥＬＩＳＡは競合的なフォーマットを利用するのが一般的であり、すなわち、試料中のハプテン（代謝産物）は、標識化したハプテン（例えば、ビオチン−ハプテン又は酵素−ハプテンコンジュゲート）と抗ハプテン抗体結合部位を競合し、このため試料中に存在するハプテンが多いほど、標識化したハプテンの結合は少なくなる。よって、これらの競合アッセイでは、試料中に増大量のハプテンがあることで、固相に結合する酵素は少なくなり、結果として着色したシグナルは減少する。このような競合アッセイでは、試料を、標識化したハプテンとともに加えて抗体結合部位に対して直接競合させてもよく、又は、試料のハプテンが結合していないところに標識化したハプテンが単に結合するように試料及び標識化したハプテンを逐次的に加えてもよい。
【００９２】
[0111]いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡは、ハプテンがシグナル伝達酵素に直接結合する直接競合ＥＬＩＳＡ、又は酵素が例えば二次抗体などの別の分子若しくはストレプトアビジンに結合する間接競合ＥＬＩＳＡである。
【００９３】
[0112]一実施形態において、本明細書で生成する抗体は、固相に直接的又は間接的いずれかで結合し、後者では固相が抗−抗体でコーティングされ（例えば、ウサギＩｇＧ抗体に結合するヤギ抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ））、抗体は抗−抗体に結合する。抗−抗体は「二次抗体」としても知られている。これらのアッセイでは、試料及び標識化したハプテンを固相に加えて、コーティングされている固相上の抗体結合部位と競合させる。洗浄後、シグナルが産生され、それにより固相に結合している標識化したハプテンの量を測定する。
【００９４】
Ｂ．トリプトファン経路の代謝産物に対するアッセイ
[0113]別の一態様において、本発明は、トリプトファン経路における代謝産物の抗体を生成するための抗原を提供する。場合によっては、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）においてセロトニン機能が不規則であるのは、セロトニン前駆物質であるＬ−トリプトファン１２２の代謝が変化したことによる。トリプトファン１２２はセロトニンに対する前駆物質として働く必須アミノ酸であるが、キヌレニン経路内で代替的に代謝され、他の神経活性剤（ｎｅｕｒｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）の生成をまねき得る。
【００９５】
[0114]本発明は、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）に対する抗体、及び抗体を調製するための方法を提供する。
【００９６】
[0115]トリプトファン代謝産物のベンゾオキサゾールへの誘導体化（セロトニン代謝産物に類似する）は任意である。トリプトファン経路における対象の代謝産物は、例えば、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）１２５及びトリプトファン１２２である。一態様において、トリプトファン代謝産物の誘導体は式ＩＩの構造を有し：
【化５】
2019151637.tif 000007
Ｒ１、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ、及びＲ１１Ｂからなる群から独立に選択されるメンバーであり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に生じる接続部であり、
Ｂは、生体分子である。
【００９７】
[0116]別の一態様において、式ＩＩの化合物を用いて、抗体を作成するために、当技術分野ではよく知られているコンジュゲーションの化学反応を用いて、担体タンパク質にコンジュゲートすることができる。活性化エステル（ＮＨＳエステル）は、一級アミンと反応して安定なアミド結合を作成することができる。マレイミド及びチオールは一緒に反応し、チオエーテルを作成することができる。ハロゲン化アルキルは、アミン及びチオールと反応して、それぞれアルキルアミン及びチオエーテルを作成する。タンパク質にコンジュゲートすることができる反応性部分を提供するあらゆる誘導体を、本明細書において利用することができる。当技術分野で知られている通り、遊離のアミノ基、遊離のカルボン酸基、又は遊離のスルフヒドリル基を含む部分は、タンパク質のコンジュゲーションに有用な反応基を提供する。例えば、遊離のアミノ基はタンパク質に、タンパク質上の利用可能なカルボキシ部分に対する、グルタルアルデヒド架橋連結により、又はカルボジイミド架橋連結により、コンジュゲートすることができる。また、遊離のスルフヒドリル基を有するハプテンは、タンパク質のマレイミド活性化により、例えば、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を用いて、タンパク質にコンジュゲートし、次いでスルフヒドリル基に連結することができる。
【００９８】
[0117]一コンジュゲーションに対する例示的な模式図は以下の通りである：
【化６】
2019151637.tif 000008
【００９９】
[0118]哺乳動物から産生された抗体を、本発明のコンジュゲートを用いて血清から除去することができる。例えば、一態様において、式ＩＩの化合物は式ＩＩａの構造を有する：
【化７】
2019151637.tif 000009
【０１００】
[0119]本発明は、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）の安定な誘導体、及び抗体を作成するための方法も提供する。方法は、
（ａ）５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）の誘導体を含む、免疫原を提供するステップと、
（ｂ）動物の免疫系が抗体を作成する条件下で、動物を免疫原で免疫化するステップと、
（ｃ）抗体を動物から除去するステップと
を含む。
【０１０１】
[0120]別の一態様において、本発明は、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）１２５に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、抗体は、トリプトファン１２２、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）１０１、及び５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）１２５からなる群から選択される１つ又は複数のメンバーに対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。
【０１０２】
[0121]ある種の他の態様において、本発明は、ヒトなどの哺乳動物からの体液又は組織試料中の５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）に対してアッセイするための方法を提供する。方法は、試料を、本明細書に記載する抗体と合わせ、次いで抗体が試料からの５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）に特異的に結合するか否かを決定することを含む。例えば、これらの方法では、試料からの（５−ＨＴＰ）に対する特異的な抗体の結合が、セロトニン（５−ＨＴＰ）が試料中に存在することの指標である。
【０１０３】
[0122]場合によっては、本発明の抗体を、代謝産物のレベル及び濃度を検出するための酵素標識を利用することができる、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又はＣＥＥＲなどの免疫アッセイにおいて用いる。
【０１０４】
Ｃ．キヌレニン経路の代謝産物に対するアッセイ
[0123]場合によっては、キヌレニン経路の代謝産物は、内臓痛のメカニズムにおいて役割を果たし、ＩＢＳにおける低レベルの免疫活性化に関連している。食餌性のトリプトファンのわずか１％がセロトニンに変換され、９５％を超えてキヌレニンに代謝される。ＩＢＳでは、キヌレニンレベル及び「キヌレニン：トリプトファン比」の両方が、著しく増大する。キヌレニン経路には、神経変性プロセスに関係する、ＮＭＤＡ受容体の興奮毒である、キノリン酸の生成が含まれる。ＩＢＳ患者は、キヌレン酸（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト）の濃度の低減、並びにアントラニル酸及び３−ヒドロキシアントラニル酸（内因性ＮＭＤＡ受容体アゴニストの前駆物質）の増大を示すのが典型的である。キヌレニン経路に沿ったトリプトファン代謝は、ＩＢＳ−Ｄで阻害される。本発明は、トリプトファン及びキヌレニン経路の代謝産物のレベルを決定するための免疫アッセイを提供するものであり、これはＩＢＳ患者の状態を決定するのに診断上重要である。
【０１０５】
[0124]本発明は、キヌレニン（Ｋ）、キヌレン酸（ＫＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸、及びアントラニル酸の安定な誘導体も提供する。誘導体は、担体タンパク質などの生体分子にコンジュゲートすることができ、免疫応答を刺激するためのアジュバントと組み合わせることができる。誘導体は、他の生体分子にコンジュゲートすることもできる。
【０１０６】
[0125]他の態様において、本発明は、抗体を作成するための方法を提供する。方法は、
（ａ）キヌレニン（Ｋ）、キヌレン酸（ＫＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸、及びアントラニル酸からなる群から選択される誘導体を含む免疫原を提供するステップであって、各誘導体は担体タンパク質にコンジュゲートしている、ステップと、
（ｂ）動物の免疫系が抗体を作成する条件下で、動物を免疫原で免疫化するステップと、
（ｃ）抗体を動物から除去するステップと
を含む。
【０１０７】
[0126]ある種の他の態様において、本発明は、ヒトなどの哺乳動物からの体液又は組織試料中のキヌレニン（Ｋ）、キヌレン酸（ＫＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸、及びアントラニル酸からなる群から選択されるメンバーに対してアッセイするための方法を提供する。方法は、試料を、本明細書に記載する抗体と合わせ、次いで、抗体が、試料からのセロトニン（５−ＨＴ）、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）、キヌレニン（Ｋ）、キヌレン酸（ＫＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸、及びアントラニル酸に特異的に結合するか否かを決定することを含む。例えば、これらの方法では、試料からのキヌレニンに対する特異的な抗体の結合が、キヌレニンが試料中に存在することの指標である。
【０１０８】
[0127]ある態様において、本発明の免疫アッセイは、生体液中の代謝産物をモニタリングするための、信頼でき、容易な方法を提供する。本発明は、キヌレニン代謝産物を検出及び定量化するための高い特異度及び感度の信頼できる免疫アッセイを提供する。
【０１０９】
[0128]図１に示す通り、場合によっては、キヌレニン経路の代謝産物には、キヌレニン１３１、キヌレン酸１３５、３−ヒドロキシキヌレニン１４６、３−ヒドロキシアントラニル酸１４９、キノリン酸１６０、アントラニル酸１４０、及びキサンツレン酸１４８が含まれる。本発明は、これら代謝産物の各々に特異的な抗体を提供し、したがって高い特異度及び感度の免疫アッセイも提供する。
【０１１０】
[0129]表１は、本発明の、特に興味をひく代謝産物、対応する代謝産物の類似体、及びビオチン化類似体を示す。
【表１】
2019151637.tif 000010
【０１１１】
[0130]上記において、Ｌは、環に共有結合した、末端のアミノ、カルボン酸、又はスルフヒドリル基を含むことができる。場合によっては、末端のアミノ、カルボン酸、又はスルフヒドリル基が示され、−Ｌ−ＮＨ２、又は−Ｌ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ若しくは−Ｌ−ＳＨと表される。
【０１１２】
[0131]さらに別の一態様において、本発明は式ＩＩＩの化合物を提供し、
【化８】
2019151637.tif 000011
式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ、及びＲ１１Ｂからなる群から独立に選択されるメンバーであり、Ｌは、リンカーであり、Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に生じる接続部であり、Ｂは、生体分子である。式ＩＩＩの化合物は、キヌレニンに特異的な抗体を作成するのに有用である。
【０１１３】
[0132]一態様において、式ＩＩＩの化合物は式ＩＩＩａの構造を有し、式中、Ｌは末端のＳＨを含み：
【化９】
2019151637.tif 000012
場合によっては、チオール基を用いて担体タンパク質、ビオチン、又は他の生体分子を繋ぐことができる。
【０１１４】
[0133]別の一態様において、式ＩＩＩの化合物を用いて、抗体を作成するために、当技術分野ではよく知られているコンジュゲーションの化学反応を用いて、担体タンパク質にコンジュゲートすることができる。例えば、活性化エステル（ＮＨＳエステル）は、一級アミンと反応して安定なアミド結合を作成することができる。マレイミド及びチオールは一緒に反応して、チオエーテルを作成することができる。ハロゲン化アルキルは、アミン及びチオールと反応して、それぞれアルキルアミン及びチオエーテルを作成する。タンパク質にコンジュゲートすることができる反応性部分を提供するあらゆる誘導体を、本明細書において利用することができる。当技術分野で知られている通り、遊離のアミノ基、遊離のカルボン酸基、又は遊離のスルフヒドリル基を含む部分は、タンパク質のコンジュゲーションに有用な反応基を提供する。例えば、遊離のアミノ基はタンパク質に、タンパク質上の利用可能なカルボキシ部分に対して、グルタルアルデヒド架橋連結により、又はカルボジイミド架橋連結により、コンジュゲートすることができる。また、遊離のスルフヒドリル基を有するハプテンは、タンパク質のマレイミド活性化により、例えば、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を用いて、タンパク質にコンジュゲートし、次いでスルフヒドリル基に連結することができる。
【０１１５】
[0134]コンジュゲーションのための例示的な模式図は以下の通りであり、式中、Ｌは末端のＳＨを含む：
【化１０】
2019151637.tif 000013
【０１１６】
[0135]哺乳動物から産生された抗体は、本発明のコンジュゲートを用いて血清から除去することができる。例えば、一態様において、式ＩＩＩの化合物は式ＩＩＩａの構造を有し：
【化１１】
2019151637.tif 000014
式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々水素である。
【０１１７】
[0136]一態様において、本発明は、キヌレニンに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、抗体は、キヌレン酸１３５、３−ヒドロキシキヌレニン１４６、３−ヒドロキシアントラニル酸１４９、キノリン酸１６０、及びアントラニル酸１４０からなる群から選択される１つ又は複数のメンバーに１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。
【０１１８】
[0137]さらに別の一態様において、本発明は式ＩＶの化合物を提供し：
【化１２】
2019151637.tif 000015
式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ、及びＲ１１Ｂからなる群から独立に選択されるメンバーであり、Ｌは、リンカーであり、Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に生じる接続部であり、Ｂは、生体分子である。式ＩＶの化合物は、キヌレン酸１３５に特異的な抗体を作成するのに有用である。
【０１１９】
[0138]別の一態様において、式ＩＶの化合物を用いて、抗体を作成するために、当技術分野ではよく知られているコンジュゲーションの化学反応を用いて、担体タンパク質にコンジュゲートすることができる。例えば、活性化エステル（ＮＨＳエステル）は、一級アミンと反応して安定なアミド結合を作成することができる。マレイミド及びチオールは一緒に反応し、チオエーテルを作成することができる。ハロゲン化アルキルは、アミン及びチオールと反応して、それぞれアルキルアミン及びチオエーテルを作成する。タンパク質にコンジュゲートすることができる反応性部分を提供するあらゆる誘導体を、本明細書において利用することができる。当技術分野で知られている通り、遊離のアミノ基、遊離のカルボン酸基、又は遊離のスルフヒドリル基を含む部分は、タンパク質のコンジュゲーションに有用な反応基を提供する。例えば、遊離のアミノ基はタンパク質に、タンパク質上の利用可能なカルボキシ部分に対して、グルタルアルデヒド架橋連結により、又はカルボジイミド架橋連結によりコンジュゲートすることができる。また、遊離のスルフヒドリル基を有するハプテンは、タンパク質のマレイミド活性化により、例えば、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を用いて、タンパク質にコンジュゲートし、次いでスルフヒドリル基に連結することができる。
【０１２０】
[0139]コンジュゲーションのための例示的な模式図は以下の通りであり、式中、Ｌは末端のＳＨを含む：
【化１３】
2019151637.tif 000016
【０１２１】
[0140]哺乳動物から産生された抗体は、本発明のコンジュゲートを用いて血清から除去することができる。例えば、一態様において、式ＩＶの化合物は式ＩＶａの構造を有し：
【化１４】
2019151637.tif 000017
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は各々水素である。
【０１２２】
[0141]別の一態様において、本発明は、キヌレン酸に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、抗体は、キヌレニン１３１、３−ヒドロキシキヌレニン１４６、３−ヒドロキシアントラニル酸１４９、キノリン酸１６０、及びアントラニル酸１４０からなる群から選択される１つ又は複数のメンバーに１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。
【０１２３】
[0142]さらに別の一態様において、本発明は式Ｖの化合物を提供し：
【化１５】
2019151637.tif 000018
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ、及びＲ１１からなる群から独立に選択されるメンバーである。式Ｖの化合物は、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）１４６に対する抗体を作成するのに有用である。
【０１２４】
[0143]別の一態様において、式Ｖの化合物を用いて、抗体を作成するために、当技術分野ではよく知られているコンジュゲーションの化学反応を用いて、担体タンパク質にコンジュゲートすることができる。例えば、活性化エステル（ＮＨＳエステル）は、一級アミンと反応して安定なアミド結合を作成することができる。マレイミド及びチオールは一緒に反応し、チオエーテルを作成することができる。ハロゲン化アルキルは、アミン及びチオールと反応して、それぞれアルキルアミン及びチオエーテルを作成する。タンパク質にコンジュゲートすることができる反応性部分を提供するあらゆる誘導体を、本明細書において利用することができる。当技術分野で知られている通り、遊離のアミノ基、遊離のカルボン酸基、又は遊離のスルフヒドリル基を含む部分は、タンパク質のコンジュゲーションに有用な反応基を提供する。例えば、遊離のアミノ基はタンパク質に、タンパク質上の利用可能なカルボキシ部分に対して、グルタルアルデヒド架橋連結により、又はカルボジイミド架橋連結によりコンジュゲートすることができる。また、遊離のスルフヒドリル基を有するハプテンは、タンパク質のマレイミド活性化により、例えば、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を用いて、タンパク質にコンジュゲートし、次いでスルフヒドリル基に連結することができる。
【０１２５】
[0144]コンジュゲーションのための例示的な模式図は以下の通りであり、式中、Ｌは末端のＳＨを含む：
【化１６】
2019151637.tif 000019
【０１２６】
[0145]哺乳動物から産生された抗体は、本発明のコンジュゲートを用いて血清から除去することができる。例えば、一態様において、式Ｖの化合物は式Ｖａの構造を有し：
【化１７】
2019151637.tif 000020
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々水素である。
【０１２７】
[0146]なお別の一態様において、本発明は、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、抗体は、キヌレニン１３１、キヌレン酸１３５、３−ヒドロキシアントラニル酸１４９、キノリン酸１６０、及びアントラニル酸１４０からなる群から選択される１つ又は複数のメンバーに１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。
【０１２８】
[0147]さらに別の一態様において、本発明は式ＶＩの化合物を提供し、
【化１８】
2019151637.tif 000021
式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ、及びＲ１１からなる群から独立に選択されるメンバーであり、Ｌは、リンカーであり、Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に生じる接続部である。式ＶＩの化合物は、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）１４９に対する抗体を作成するのに有用である。
【０１２９】
[0148]別の一態様において、式ＶＩの化合物を用いて、抗体を作成するために、当技術分野ではよく知られているコンジュゲーションの化学反応を用いて、担体タンパク質にコンジュゲートすることができる。活性化エステル（ＮＨＳエステル）は、一級アミンと反応して安定なアミド結合を作成することができる。マレイミド及びチオールは一緒に反応し、チオエーテルを作成することができる。ハロゲン化アルキルは、アミン及びチオールと反応して、それぞれアルキルアミン及びチオエーテルを作成する。タンパク質にコンジュゲートすることができる反応性部分を提供するあらゆる誘導体を、本明細書において利用することができる。当技術分野で知られている通り、遊離のアミノ基、遊離のカルボン酸基、又は遊離のスルフヒドリル基を含む部分は、タンパク質のコンジュゲーションに有用な反応基を提供する。例えば、遊離のアミノ基はタンパク質に、タンパク質上の利用可能なカルボキシ部分に対して、グルタルアルデヒド架橋連結により、又はカルボジイミド架橋連結によりコンジュゲートすることができる。また、遊離のスルフヒドリル基を有するハプテンは、タンパク質のマレイミド活性化により、例えば、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を用いて、タンパク質にコンジュゲートし、次いでスルフヒドリル基に連結することができる。
【０１３０】
[0149]コンジュゲーションのための例示的な模式図は以下の通りであり、式中、Ｌは末端のＳＨを含む：
【化１９】
2019151637.tif 000022
【０１３１】
[0150]哺乳動物から産生された抗体は、本発明のコンジュゲートを用いて血清から除去することができる。例えば、一態様において、式ＶＩの化合物は式ＶＩａの構造を有し：
【化２０】
2019151637.tif 000023
式中、Ｒ１及びＲ３は各々水素である。
【０１３２】
[0151]さらに別の一態様において、本発明は、３−ヒドロキシアントラニル酸に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、抗体は、キヌレニン１３１、キヌレン酸１３５、３−ヒドロキシキヌレニン１４６、キノリン酸１６０、及びアントラニル酸１４０からなる群から選択される１つ又は複数のメンバーに１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。
【０１３３】
[0152]さらに別の一態様において、本発明は式ＶＩＩの化合物を提供し：
【化２１】
2019151637.tif 000024
式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ、及びＲ１１Ｂからなる群から独立に選択されるメンバーであり、Ｌは、リンカーであり、Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に生じる接続部であり、Ｂは生体分子である。化合物は、キノリン酸に対する抗体を作成するのに有用である。
【０１３４】
[0153]別の一態様において、式ＶＩＩの化合物を用いて、当技術分野ではよく知られているコンジュゲーションの化学反応を用いて、担体タンパク質にコンジュゲートすることができる。例えば、活性化エステル（ＮＨＳエステル）は、一級アミンと反応して安定なアミド結合を作成することができる。マレイミド及びチオールは一緒に反応し、チオエーテルを作成することができる。ハロゲン化アルキルは、アミン及びチオールと反応して、それぞれアルキルアミン及びチオエーテルを作成する。タンパク質にコンジュゲートすることができる反応性部分を提供するあらゆる誘導体を、本明細書において利用することができる。当技術分野で知られている通り、遊離のアミノ基、遊離のカルボン酸基、又は遊離のスルフヒドリル基を含む部分は、タンパク質のコンジュゲーションに有用な反応基を提供する。例えば、遊離のアミノ基はタンパク質に、タンパク質上の利用可能なカルボキシ部分に対して、グルタルアルデヒド架橋連結により、又はカルボジイミド架橋連結によりコンジュゲートすることができる。また、遊離のスルフヒドリル基を有するハプテンは、タンパク質のマレイミド活性化により、例えば、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を用いて、タンパク質にコンジュゲートし、次いでスルフヒドリル基に連結することができる。
【０１３５】
[0154]コンジュゲーションのための例示的な模式図は以下の通りであり、式中、Ｌは末端のＳＨを含む：
【化２２】
2019151637.tif 000025
【０１３６】
[0155]哺乳動物から産生された抗体は、本発明のコンジュゲートを用いて血清から除去することができる。例えば、一態様において、式ＶＩＩの化合物は式ＶＩＩａの構造を有し：
【化２３】
2019151637.tif 000026
式中、Ｒ１及びＲ３は各々水素である。
【０１３７】
[0156]一態様において、本発明は、キノリン酸に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、抗体は、キヌレニン、キヌレン酸、３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシアントラニル酸、及びアントラニル酸からなる群から選択される１つ又は複数のメンバーに１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。
【０１３８】
[0157]さらに別の一態様において、本発明は式ＶＩＩＩの化合物を提供し：
【化２４】
2019151637.tif 000027
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ、及びＲ１１Ｂからなる群から独立に選択されるメンバーであり、Ｌは、リンカーであり、Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に生じる接続部であり、Ｂは、生体分子である。式ＶＩＩＩの化合物は、アントラニル酸に対する抗体を作成及び生成するのに有用である。
【０１３９】
[0158]別の一態様において、式ＶＩＩＩの化合物を用いて、当技術分野ではよく知られているコンジュゲーションの化学反応を用いて、担体タンパク質にコンジュゲートすることができる。例えば、活性化エステル（ＮＨＳエステル）は、一級アミンと反応して安定なアミド結合を作成することができる。マレイミド及びチオールは反応し、チオエーテルを作成することができる。ハロゲン化アルキルは、アミン及びチオールと反応して、それぞれアルキルアミン及びチオエーテルを作成する。タンパク質にコンジュゲートすることができる反応性部分を提供するあらゆる誘導体を、本明細書において利用することができる。当技術分野で知られている通り、遊離のアミノ基、遊離のカルボン酸基、又は遊離のスルフヒドリル基を含む部分は、タンパク質のコンジュゲーションに有用な反応基を提供する。例えば、遊離のアミノ基はタンパク質に、タンパク質上の利用可能なカルボキシ部分に対して、グルタルアルデヒド架橋連結により、又はカルボジイミド架橋連結によりコンジュゲートすることができる。また、遊離のスルフヒドリル基を有するハプテンは、タンパク質のマレイミド活性化により、例えば、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を用いて、タンパク質にコンジュゲートし、次いでスルフヒドリル基に連結することができる。
【０１４０】
[0159]コンジュゲーションのための例示的な模式図は以下の通りであり、式中、Ｌは末端のＳＨを含む：
【化２５】
2019151637.tif 000028
【０１４１】
[0160]哺乳動物から産生された抗体は、本発明のコンジュゲートを用いて血清から除去することができる。例えば、一態様において、式ＶＩＩの化合物は式ＶＩＩＩａの構造を有し：
【化２６】
2019151637.tif 000029
式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は各々水素である。
【０１４２】
[0161]なお別の一態様において、本発明は、アントラニル酸に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、抗体は、キヌレニン、キヌレン酸、３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシアントラニル酸、及びキノリン酸からなる群から選択される１つ又は複数のメンバーに１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。
【０１４３】
[0162]別の一態様において、本発明は、あらゆる他の代謝産物に対して１％未満の交差反応性を有する、図１の各々の代謝産物に対する抗体を提供する。
【０１４４】
[0163]ある種の他の態様において、本発明は、ヒトなどの哺乳動物からの体液又は組織試料中のキヌレニン（Ｋ）、キヌレン酸（ＫＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キノリン酸、アントラニル酸、及びこれらの組合せからなる群から選択されるメンバーに対するアッセイの方法を提供する。
【０１４５】
[0164]方法は、試料を、本明細書に記載する抗体と合わせ、次いで、抗体が、試料からのキヌレニン（Ｋ）、キヌレン酸（ＫＡ）、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸、（３−ＨＡＡ）、キノリン酸、アントラニル酸、及びこれらの組合せからなる群から選択されるメンバーに特異的に結合するか否かを決定することを含む。例えば、これらの方法では、試料からの３−ＨＫに対する特異的な抗体の結合が、３−ＨＫが試料中に存在することの指標である。
【０１４６】
Ｄ．短鎖脂肪酸に対するアッセイ
[0165]ある態様において、本発明は、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）に対するアッセイを提供する。例えば、ＩＢＳ−Ｄを有する小児患者の糞便のＳＣＦＡプロファイルは、全ＳＣＦＡ、アセテート、及びプロピオネートの濃度が低く、ｎ−ブチレートの濃度及びパーセント値が高いことによって特徴付けられる。ＩＢＳ−Ｄを有する患者の結腸の細菌叢によるＳＣＦＡ生成における相違は、消化管症状の発症に関連し得る。ベイヨネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）及びラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）を組み合わせると酢酸及びプロピオン酸が生成されることが、研究により示されている。高レベルの酢酸及びプロピオン酸は、腹部症状及び生活の質の低下に関連し得る（Ｔｒｅｅｍ  ＷＲ、Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｒｏｌ  Ｎｕｔｒ．、１９９６年１０月、２３巻（３）、２８０〜６頁；Ｌｅ  Ｇａｌｌら、Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．、２０１１年９月２日、１０巻（９）、４２０８〜１頁；及びＴａｎａ  Ｃ．、Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｍｏｔｉｌ．、２０１０年５月、２２巻（５）、５１２〜９頁を参照されたい）。
【０１４７】
[0166]本発明は、ＩＢＳの素因を決定し、又はＩＢＳの診断における助けとなるために、ＳＣＦＡのレベル及び濃度を測定するためのＥＬＩＳＡ及びＣＥＥＲなどの免疫アッセイを提供する。
【０１４８】
[0167]本発明は、短鎖脂肪酸に対する抗体及び抗体を作成する方法を提供する。調製された抗体は、関連の代謝産物に対して低い交差反応性を有し、プロピオン酸及び酪酸に特異的で高感度の免疫アッセイに対する有用な試薬である。
【０１４９】
[0168]本発明は、プロピオン酸及び酪酸などの短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の安定な誘導体も提供する。誘導体は、担体タンパク質などの生体分子にコンジュゲートすることができ、免疫応答を刺激するためのアジュバントと組み合わせることができる。誘導体は、他の生体分子にコンジュゲートすることもできる。
【０１５０】
[0169]アセテート、プロピオネート、及びブチレートの分子サイズは小型であるため、リンカーを用いて、免疫原性のハプテンを作成するためにＳＣＦＡにコンジュゲートしてもよい。例えば、場合によっては、以下のリンカーを用いることができ：
【化２７】
2019151637.tif 000030
式中、Ｒ１は単鎖アルキル基（Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、又はＣ６）である。
【０１５１】
[0170]別の一例において、化合物は式ＩＸを有する：
【化２８】
2019151637.tif 000031
【０１５２】
[0171]Ｒ２はＬ又はＲ１１Ｂであり、Ｂは生体分子である。
【０１５３】
[0172]これらの化合物を用いて哺乳動物から産生された抗体を、本発明のコンジュゲートを用いて血清から除去することができる。例えば、一態様において、このようなコンジュゲートは以下の構造を有する：
【化２９】
2019151637.tif 000032
【０１５４】
[0173]他の態様において、本発明は、短鎖脂肪酸の抗体を作成するための方法を提供する。方法は、
（ａ）担体タンパク質にコンジュゲートしている、短鎖脂肪酸の誘導体を含む免疫原を提供するステップと、
（ｂ）動物の免疫系が抗体を作成する条件下で、動物を免疫原で免疫化するステップと、
（ｃ）抗体を動物から除去するステップと
を含む。
【０１５５】
[0174]一態様において、本発明は、プロピオン酸に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、抗体は酪酸に対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。
【０１５６】
[0175]別の一態様において、本出願は、酪酸に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、抗体はプロピオン酸に対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。
【０１５７】
[0176]ある種の他の態様において、本発明は、ヒトなどの哺乳動物からの体液又は組織試料中の短鎖脂肪酸に対するアッセイの方法を提供する。体液は、血液、尿、血漿、汗、唾液、吸引液、涙液などのあらゆる生体液であってよい。方法は、試料を、本明細書に記載する抗体と合わせ、次いで、抗体が、試料からの短鎖脂肪酸に特異的に結合するか否かを決定することを含む。例えば、これらの方法では、試料からのプロピオン酸に対する特異的な抗体の結合が、プロピオン酸が試料中に存在することの指標である。
【０１５８】
Ｅ．胆汁酸吸収不良を測定するためのアッセイ
[0177]胆汁酸吸収不良（ＢＡＭ）は、慢性下痢及びＩＢＳ−Ｄの発症に寄与し得る。血清７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンは、胆汁酸の（肝臓）合成を決定するための一試験であり、胆汁酸の（肝臓）合成は、コレステロールからの胆汁酸合成におけるコレステロール７−ヒドロキシラーゼ（律速酵素である）の活性に相関する。
【０１５９】
[0178]本発明は、胆汁酸代謝産物に対する抗体、及び抗体を調製するための方法も提供する。調製された抗体は、関連の代謝産物に対して低い交差反応性を有し、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンに対する特異的で高感度の免疫アッセイのための有用な試薬である。
【０１６０】
[0179]本発明は、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンの安定な誘導体も提供する。誘導体は、担体タンパク質などの生体分子にコンジュゲートすることができ、免疫応答を刺激するためのアジュバントと組み合わせることができる。誘導体は、他の生体分子にコンジュゲートすることもできる。
【０１６１】
[0180]本発明は、リンカーを有し、生物学的に重要な官能基を保持する７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンの合成を提供する。一態様において、本発明は、以下に示す通り、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン誘導体及びそのビオチン類似体の合成を提供する：
【化３０】
2019151637.tif 000033
【０１６２】
[0181]別の一態様において、式ＸＩの化合物を用いて、当技術分野ではよく知られているコンジュゲーションの化学反応を用いて、担体タンパク質にコンジュゲートすることができる。例えば、活性化エステル（ＮＨＳエステル）は、一級アミンと反応して安定なアミド結合を作成することができる。マレイミド及びチオールは一緒に反応し、チオエーテルを作成することができる。ハロゲン化アルキルは、アミン及びチオールと反応して、それぞれアルキルアミン及びチオエーテルを作成する。タンパク質にコンジュゲートすることができる反応性部分を提供するあらゆる誘導体を、本明細書において利用することができる。当技術分野で知られている通り、遊離のアミノ基、遊離のカルボン酸基、又は遊離のスルフヒドリル基を含む部分は、タンパク質のコンジュゲーションに有用な反応基を提供する。例えば、遊離のアミノ基はタンパク質に、タンパク質上の利用可能なカルボキシ部分に対して、グルタルアルデヒド架橋連結により、又はカルボジイミド架橋連結によりコンジュゲートすることができる。また、遊離のスルフヒドリル基を有するハプテンは、タンパク質のマレイミド活性化により、例えば、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を用いて、タンパク質にコンジュゲートし、次いでスルフヒドリル基に連結することができる。
【０１６３】
[0182]したがって、一態様において、本発明は、式Ｘの化合物を提供する：
【化３１】
2019151637.tif 000034
【０１６４】
[0183]式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は各々、水素、アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アロイル、アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、スルホネート、アルコキシアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、スルホネートアルキル、Ｌ、及びＲ１１Ｂからなる群から独立に選択されるメンバーであり、Ｌは、リンカーであり、Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に生じる接続部であり、Ｂは、生体分子である。
【０１６５】
[0184]他の態様において、本発明は、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンの抗体を作成するための方法を提供する。方法は：
（ａ）担体タンパク質にコンジュゲートしている、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンの誘導体を含む免疫原を提供するステップと、
（ｂ）動物の免疫系が抗体を作成する条件下で、動物を免疫原で免疫化するステップと、
（ｃ）抗体を動物から除去するステップと
を含む。
【０１６６】
[0185]ある種の他の態様において、本発明は、ヒトなどの哺乳動物からの体液又は組織試料中の７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンに対するアッセイの方法を提供する。方法は、試料を、本明細書に記載する抗体と合わせ、次いで、抗体が、試料からの７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンに特異的に結合するか否かを決定することを含む。例えば、これらの方法では、試料からの７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンに対する特異的な抗体の結合が、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンが試料中に存在することの指標である。
【０１６７】
[0186]哺乳動物から産生された抗体は、本発明のコンジュゲートを用いて血清から除去することができる。例えば、一態様において、式Ｘａの化合物は式Ｘａの構造を有し：
【化３２】
2019151637.tif 000035
式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は各々水素である。
【０１６８】
[0187]別の一態様において、本出願は、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン誘導体に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、抗体は、コレステロール及び７−α−コレステロールからなる群から選択されるメンバーに対して１％未満の交差反応性を有する、抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。
【０１６９】
Ｆ．抗体
[0188]一般に、小分子（ハプテン）に対する抗体を産生するには、ハプテンを担体タンパク質（ＣＰ）に架橋して、ハプテンを免疫原性にする。場合によっては、アミン含有神経伝達物質及び生体アミン（すなわち、アミノ化ハプテン）を、グルタルアルデヒドを介した１ステップの連結によって適切な担体タンパク質（ＣＰ）に連結し、非アミン含有ハプテン（例えば、５−ＨＩＡＡ、ＤＯＰＡＣ、メラトニンなど）を、マンニッヒ縮合反応によってＣＰにコンジュゲートする。場合によっては、ハプテンは、免疫系によって認識されるための主要な分子の特徴から遠位の部位で、スペーサー基に連結している所望のバックボーン分子構造から構成される。リンカーの他方の終端上の官能基は、抗原性の担体タンパク質に対する共有結合性の接続を容易に形成することができる。リンカーアームはまた、対象の化合物に対する親和性及び特異性を最大にするのに最適な距離での、ハプテンの担体タンパク質からの分離に寄与する。リンカーの両端に形成した化学結合及びこのスペーサーアームの長さ（炭素原子３〜９個）は、親和性及び特異性に関する質、並びに免疫応答の量（抗体の量）にとって重要である。（Ｍｅｙｅｒら、１９９１年、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３９巻、７４９〜７６０頁、Ｓｉｎｇｈ、Ｓｕｒｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１５巻、１号、２００４年；Ｉｖｙ  Ｃａｒｒｏｌｌら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０１１年、５４巻（１４）、５２２１〜５２２８頁）。
【０１７０】
ＩＩＩ．抗体の生成
[0189]抗体の産生及び選択はいくつかの方法によって達成することができる。対象の代謝産物に対応する合成及び精製した抗原を、例えば、マウス又はウサギ又は別の哺乳動物に注射して、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を産生する。当業者であれば、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ編集、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８年）に記載されているように、抗体の生成に多くの手順が利用できることを認識していると予想される。当業者であれば、抗体を擬する（例えば、抗体の機能的な結合領域を保持する）、結合性フラグメント又はＦａｂフラグメントも様々な手順によって遺伝情報から調製することができることも理解していると予想される。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編集、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９５年）；及びＨｕｓｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９巻、３９１４〜３９２０頁（１９９２年）を参照されたい。
【０１７１】
[0190]これらの方法により産生された抗体は、次いで、対象の精製された抗原（本明細書に記載するビオチン化抗原など）で親和性及び特異性に対して最初にスクリーニングすることによって選択することができ、必要であれば、抗体の親和性及び特異性に対する結果を、結合から除外するのが望ましい他の抗原と比較する。スクリーニングの手順は、精製された抗原をマイクロタイタープレートの別々のウエルに固定化することを伴い得る。プレートには、プレート上に固定化したストレプトアビジンを有することができ、次いで、潜在的な抗体又は抗体の群を含む溶液をそれぞれのマイクロタイターウエル中に配置し、約３０分〜２時間インキュベートする。次いでマイクロタイターウエルを洗浄し、標識化した二次抗体（例えば、産生させる抗体がマウス抗体であれば、アルカリホスファターゼにコンジュゲートしている抗マウス抗体）をウエルに加え、約３０分間インキュベートし、次いで洗浄する。基質をウエルに加えると、ビオチン化抗原などの固定化抗原に対する抗体が存在するところで呈色反応が出現する。
【０１７２】
[0191]このように同定した抗体を、次いで、親和性及び特異性に対してさらに分析してもよい。標的の代謝産物に対する免疫アッセイの開発では、精製した標的の代謝産物は、選択した抗体を用いて免疫アッセイの感度及び特異度を判断するための標準として作用する。様々な抗体の結合親和性は異なり得るため、例えば、ある種の抗体の組合せは立体的に相互に妨害し得るため、抗体のアッセイ性能は、その抗体の絶対的な親和性及び特異性よりも重要な尺度であり得る。
【０１７３】
[0192]当業者であれば、抗体又は結合性フラグメントを生成し、対象の様々な代謝産物に対する親和性及び特異性に対してスクリーニング及び選択をする上で多くのアプローチをとることができるが、これらのアプローチは本発明の範囲を変えるものではないことを認識されよう。
【０１７４】
Ａ．ポリクローナル抗体
[0193]ポリクローナル抗体は、本発明の抗原、及びアジュバントを、複数回皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射することによって動物に産生させるのが好ましい。二官能性又は誘導体化の薬剤を用いて、対象の抗原を、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、又はダイズトリプシン阻害剤など、免疫化しようとする種に免疫原性であるタンパク質の担体にコンジュゲートするのが有用であり得る。二官能性又は誘導体化の薬剤の非限定的な例には、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介したコンジュゲーション）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、及びＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲが含まれ、Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基である。
【０１７５】
[0194]例えば、抗原又はコンジュゲート１００μｇ（ウサギ）又は５μｇ（マウス）を３容積のフロイント完全アジュバントと合わせ、溶液を複数の部位に皮内注射することによって、動物を、本発明の抗原、又は免疫原性のコンジュゲート若しくはその誘導体に対して免疫化する。１か月後、動物に、複数の部位に皮内注射することによって、フロイント不完全アジュバント中コンジュゲートのオリジナルの量の約１／５〜１／１０で追加免疫する。７日〜１４日後、動物を出血させ、血清を抗体の力価に対してアッセイする。力価がプラトーになるまで動物に追加免疫するのが典型的である。動物に同じ抗原のコンジュゲートで追加免疫するのが好ましいが、異なる免疫原性の抗原に対するコンジュゲーション及び／又は異なる架橋連結の試薬を介したコンジュゲーションを用いてもよい。場合によっては、ミョウバンなどの凝集性の薬剤を用いて免疫応答を増強してもよい。
Ｂ．モノクローナル抗体
【０１７６】
[0195]モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得るのが一般的であり、すなわち、集団を含む個々の抗体は、微量存在し得る、可能な、天然に存在する変異以外は同一である。よって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の特性が、別個の抗体の混合物ではないことを示す。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５頁（１９７５年）によって記載されるハイブリドーマ法を用いて、又は当技術分野で知られているあらゆる組換えＤＮＡ法によって（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）作成することができる。
【０１７７】
[0196]ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物（例えば、ハムスター）を上記に記載した通り免疫化して、免疫化に用いる対象のポリペプチドに特異的に結合する抗体を生成し、又は抗体を生成することができるリンパ球を誘発する。或いは、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化する。免疫化したリンパ球を、次いで、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤（ｆｕｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を用いてミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、５９〜１０３頁（１９８６年）を参照されたい）。このように調製したハイブリドーマ細胞を、非融合の親のミエローマ細胞の増殖又は生存を阻害する１つ又は複数の物質を含むのが好ましい、適切な培養培地に接種し、増殖させる。例えば、親のミエローマ細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ細胞用の培養培地は、ＨＧＰＲＴ−欠損細胞の増殖を妨げる、ヒポキサンチン、アミノプレリン、及びチミジンを含む（ＨＡＴ培地）のが典型的である。
【０１７８】
[0197]好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定な高レベルの抗体の生成を支持し、及び／又はＨＡＴ培地などの培地に感受性のある細胞である。ヒトモノクローナル抗体を生成するのに好ましいこのようなミエローマ細胞株の例には、それだけには限定されないが、マウスミエローマ株、例えば、ＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能）、ＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手可能）、及びヒトミエローマ又はマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３巻、３００１頁（１９８４年）；及びＢｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、５１〜６３頁（１９８７年）を参照されたい）が含まれる。
【０１７９】
[0198]ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地を、対象のポリペプチドに対するモノクローナル抗体の生成に対してアッセイすることができる。ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ  ｖｉｔｒｏの結合アッセイにより決定するのが好ましい。モノクローナル抗体の結合親和性は、ＭｕｎｓｏｎらのＳｃａｔｃｈａｒｄ分析、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７巻、２２０頁（１９８０年）などを用いて決定することができる。
【０１８０】
[0199]ハイブリドーマ細胞が、所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を生成することを同定した後、クローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準法によって増殖させてもよい（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、５９〜１０３頁（１９８６年）を参照されたい）。この目的に適した培養培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。加えて、ハイブリドーマ細胞を、動物における腹水腫瘍としてｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させてもよい。サブクローニングによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロースヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は親和性クロマトグラフィーなどの従来の抗体精製法によって、培養培地、腹水、又は血清から分離することができる。
【０１８１】
[0200]モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を用いて容易に単離及び配列決定することができる（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として働く。単離後は、ＤＮＡを発現ベクター中に配置してもよく、次いで発現ベクターを、他のやり方では抗体を生成しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞などの宿主細胞中にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を誘発する。例えば、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５巻、２５６〜２６２（１９９３年）；及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．、１３０巻、１５１〜１８８頁（１９９２年）を参照されたい。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインに対するコード配列を、相同のマウス配列の代わりに置換することによって（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻、６８５１頁（１９８４年）を参照されたい）、又は免疫グロブリンコード配列を、非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード配列の全て又は一部に共有結合で繋ぐことによって、ＤＮＡを修飾してもよい。
【０１８２】
[0201]さらなる一実施形態において、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻、５５２〜５５４頁（１９９０年）；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻、６２４〜６２８頁（１９９１年）；及びＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２巻、５８１〜５９７頁（１９９１年）に記載されている技術を用いて産生される、抗体ファージライブラリから単離してもよい。チェインシャフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒトモノクローナル抗体の生成は、Ｍａｒｋｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻、７７９〜７８３頁（１９９２年）に記載されている。非常に大型のファージライブラリを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染及びｉｎ  ｖｉｖｏ組換えの使用は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１巻、２２６５〜２２６６頁（１９９３年）に記載されている。よって、これらの技術は、モノクローナル抗体を産生するための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な代替である。
Ｃ．抗体フラグメント
【０１８３】
[0202]抗体フラグメントを生成するために様々な技術が開発されている。伝統的に、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解性の消化に由来していた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．、２４巻、１０７〜１１７頁（１９９２年）；及びＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻、８１頁（１９８５年）を参照されたい）。しかし、これらのフラグメントは今では、組換え宿主細胞を用いて直接生成することができる。例えば、抗体フラグメントは、上記に論じた抗体ファージライブラリから単離することができる。或いは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを大腸菌細胞から直接回収し、化学的にカップリングさせてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻、１６３〜１６７頁（１９９２年）を参照されたい）。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞の培養物から直接単離することができる。抗体フラグメントを生成するための他の技術は、当業者であれば明らかである。他の実施形態では、選り抜きの抗体は、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。例えば、ＰＣＴ公開国際公開第９３／１６１８５号パンフレット、並びに米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号を参照されたい。抗体フラグメントは、米国特許第５，６４１，８７０号に記載される通り、直鎖抗体であってもよい。このような直鎖抗体フラグメントは単一特異性でも、又は二重特異性でもよい。
【０１８４】
Ｄ．二重特異性抗体
[0203]二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、同じ対象のポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合し得る。他の二重特異性抗体は、対象のポリペプチドに対する結合部位を、１つ又は複数の付加的な抗原に対する結合部位（複数可）と組み合わせてもよい。二重特異性抗体は、全長の抗体又は抗体フラグメントとして調製することができる（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）。
【０１８５】
[0204]二重特異性抗体を作成するための方法は当技術分野で知られている。全長の二重特異性抗体の伝統的な生成は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づくものであり、この場合２つの鎖は異なる特異性を有する（例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻、５３７〜５３９頁（１９８３年）を参照されたい）。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の取合せはランダムであるため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を生成し、その中で１つだけが正しい二重特異性の構造を有する。正しい分子の精製は通常、親和性クロマトグラフィーによって行う。同様の手順が、ＰＣＴ公開国際公開第９３／０８８２９号パンフレット及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０巻、３６５５〜３６５９頁（１９９１年）に開示されている。
【０１８６】
[0205]様々なアプローチに従って、所望の結合特異性（抗体−抗原組合せ部位）を有する抗体の可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。融合が、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとであるのが好ましい。少なくとも１つの融合物に存在する、軽鎖の結合に必要な部位を含む、第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有するのが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物をコードするＤＮＡ、及び所望により、免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクター中に挿入し、適切な宿主生物体中に同時トランスフェクトする。これにより、構築物で用いられる不均等な比率の３つのポリペプチド鎖が最適の収率をもたらす実施形態において、３つのポリペプチドフラグメントの相互の比率を調節する上ですぐれた柔軟性がもたらされる。しかし、等しい比率の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらす場合、又は比率が特に重要ではない場合は、２つ又は３つ全てのポリペプチド鎖に対するコード配列を１つの発現ベクター中に挿入することが可能である。
【０１８７】
[0206]このアプローチの好ましい一実施形態において、二重特異性抗体は、アームの一方における第一の結合特異性を有するハイブリッドの免疫グロブリン重鎖、及びアームの他方におけるハイブリッドの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）から構成される。二重特異性分子の半分だけに免疫グロブリン軽鎖が存在することにより容易な分離方法が提供されるため、この非対称性の構造により、不要な免疫グロブリン鎖の組合せから所望の二重特異性化合物の分離が促進される。例えば、ＰＣＴ公開国際公開第９４／０４６９０号パンフレット及びＳｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１２１巻、２１０頁（１９８６年）を参照されたい。
【０１８８】
[0207]米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている別のアプローチに従って、一対の抗体分子間の界面を、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセント値を最大にするように操作することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部分を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面からの１つ又は複数の小型アミノ酸の側鎖が、大型の側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えられている。大型のアミノ酸側鎖を小型のアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、大型の側鎖（複数可）に対する同一又は同様のサイズの代償性の「孔」が、第２の抗体分子の界面上に作り出される。これにより、ホモ二量体などの他の不要な最終産物を上回ってヘテロ二量体の収率を増大するためのメカニズムがもたらされる。
【０１８９】
[0208]二重特異性抗体には、架橋連結している、又は「ヘテロコンジュゲートの」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体の１つがアビジンにカップリングし、他方がビオチンにカップリングしていてよい。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる便利な架橋連結方法を用いて作成することができる。適切な架橋連結剤及び技術は当技術分野ではよく知られており、米国特許第４，６７６，９８０号などに記載されている。
【０１９０】
[0209]抗体フラグメントから二重特異性抗体を産生するのに適する技術も、当技術分野で知られている。例えば、二重特異性抗体は、化学連結を用いて調製することができる。場合によっては、二重特異性抗体は、インタクトな抗体をタンパク質分解性に切断してＦ（ａｂ’）２フラグメントを産生する手順により産生することができる（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻、８１頁（１９８５年）を参照されたい）。これらのフラグメントはジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、近接するジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防ぐ。産生されたＦａｂ’フラグメントを、次いで、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つを、メルカプトエチルアミンで還元することによりＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成させる。
【０１９１】
[0210]いくつかの実施形態において、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングして二重特異性抗体を形成することができる。例えば、完全にヒト化した二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子は、Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７５巻、２１７〜２２５頁（１９９２年）に記載されている方法により生成することができる。各Ｆａｂ’フラグメントは大腸菌から別々に分泌され、二重特異性抗体を形成するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏの定方向（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）化学的カップリングを受けるものであった。
【０１９２】
[0211]組換え細胞培養物から直接、二重特異性抗体フラグメントを作成及び単離するための様々な技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて生成されている。例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８巻、１５４７〜１５５３頁（１９９２年）を参照されたい。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって、２つの異なる抗体のＦａｂ’ポーションに連結した。抗体のホモ二量体をヒンジ領域で還元してモノマーを形成させ、次いで再び酸化して（ｒｅ−ｏｘｉｄｉｚｅ）抗体のヘテロ二量体を形成させた。抗体のホモダイマーを生成するのに、この方法を利用することもできる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、６４４４〜６４４８頁（１９９３年）により記載されている「ダイアボディ」技術により、二重特異性抗体のフラグメントを生成するための代替的なメカニズムが提供されている。フラグメントは、非常に短いため同じ鎖上の２つのドメイン間に対形成することができないリンカーによって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１フラグメントのＶＨ及びＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬ及びＶＨドメインとの対形成を強いられ、それにより２つの抗原結合性部位が形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを用いることにより二重特異性抗体フラグメントを作成するための別の戦略は、Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２巻、５３６８頁（１９９４年）に記載されている。
【０１９３】
[0212]原子価が２を超える抗体も企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。例えば、Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻、６０頁（１９９１年）を参照されたい。
【０１９４】
Ｅ．抗体の精製
[0213]組換え技術を用いる場合、抗体は、単離された宿主細胞内で、宿主細胞の細胞膜周辺腔において生成されても、又は宿主細胞から培地中に直接分泌されてもよい。抗体が細胞内で生成される場合、例えば、遠心分離又は限外濾過により、粒子状の残屑を最初に除去する。Ｃａｒｔｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈ．、１０巻、１６３〜１６７頁（１９９２年）は、大腸菌の細胞膜周辺腔中に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。簡潔に述べると、細胞のペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間、解凍する。細胞残屑は遠心分離によって除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合は、このような発現系からの上清を、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて濃縮するのが一般的である。タンパク質分解を阻害するためにＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤があらゆる前述のステップに含まれていてもよく、外来性の汚染菌の増殖を防ぐために抗生物質が含まれていてもよい。
【０１９５】
[0214]細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを用いて精製することができる。プロテインＡの親和性リガンドとしての適合性は、抗体に存在するあらゆる免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡを用いて、ヒトγ１、γ２、又はγ４の重鎖をベースにした抗体を精製することができる（例えば、Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、６２巻、１〜１３頁（１９８３年）を参照されたい）。プロテインＧは、マウスの全アイソタイプ及びヒトγ３に推奨される（例えば、Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、５巻、１５６７〜１５７５頁（１９８６年）を参照されたい）。親和性リガンドが接続するマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他のマトリクスが利用できる。細孔制御ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリクスにより、アガロースで実現することができるより速い流速及びより短い処理時間が可能になる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ；Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。イオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上のクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上のクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫安塩析など、タンパク質を精製するための他の技術も、回収しようとする抗体に応じて利用できる。
【０１９６】
[0215]あらゆる予備的な精製ステップ（複数可）後、対象の抗体及び汚染物質を含む混合物を、ｐＨ約２．５〜４．５の間の溶出バッファーを用いて、好ましくは低塩濃度（例えば、塩約０〜０．２５Ｍ）で行う、低ｐＨの疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけてもよい。
【０１９７】
[0216]当業者であれば、試料中の１つ又は複数の対象の分析物に特異的である、例えば結合分子又は結合パートナーなどの、抗体に類似の機能を有するあらゆる結合性分子を、本発明の方法及び組成物において用いることができることも理解していると予想される。適切な抗体様分子の例には、それだけには限定されないが、ドメイン抗体、ユニボディ（ｕｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、サメ抗原反応性タンパク質、アビマー、アドネクチン、アンチカルム（ａｎｔｉｃａｌｍ）、親和性リガンド、フィロマー（ｐｈｙｌｏｍｅｒ）、アプタマー、アフィボディ、トリネクチンなどが含まれる。
【０１９８】
ＩＶ．使用方法
[0217]本発明は、本明細書の代謝産物の存在又は濃度を用いて、対象における過敏性腸症候群（ＩＢＳ）の診断を決定するための方法を提供する。方法は、本明細書に記載するアッセイ方法によって、患者の血液、血漿、又は血清中の１つ又は複数の代謝産物を測定することを含む。
【０１９９】
[0218]本発明は、患者におけるＩＢＳのための処置が効果的であるか否かを決定するための方法も提供する。方法は、本明細書に記載するアッセイ方法によって、患者の血液、血漿、又は血清中の１つ又は複数の代謝産物を測定することを含む。
【０２００】
[0219]ある種の他の態様において、本発明は、ＩＢＳと以前に診断された患者を評価するための方法を提供する。方法は、本明細書に記載するアッセイ方法によって、患者の血液、血漿、又は血清中の１つ又は複数の代謝産物を測定することを含む。
【実施例】
【０２０１】
以下の実施例は説明のために提供するものであり、本発明を限定するためではない。
[0220]実施例１
Ａ．セロトニン（５−ＨＴ）及び５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）は酸素に感受性である
【０２０２】
[0221]５−ＨＴ及び５−ＨＩＡＡは酸素に感受性であり、非常に不安定である。これらの化合物の分解は、４℃で、解凍から約７時間で生じる。図３は、５−ＨＴ及び５−ＨＩＡＡの分解を示す薄層クロマトグラム（ＴＬＣ）である。５−ヒドロキシインドールの性質は不安定であるため、これらの濃度を測定するアッセイには信頼性がない。図４は５−ＨＴが１週間の期間の間不安定であることを示す。
【０２０３】
Ｂ．ベンゾオキサゾールを生成するためのセロトニンの誘導体化
【化３３】
2019151637.tif 000036
[0222]上記の反応物を、０．１Ｍ  ＣＡＰＳバッファー（ｐＨ１１．０）、０．１Ｍ  ｐ−（アミノメチル）ベンジル化合物、酸化剤（例えば、０．０５Ｍヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム又はＭｎＯ２）、及びメタノールを含む（１０／１１／２２／２３、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）、等体積の誘導体化混合物と混合した。誘導体化は、室温（ＲＴ）から約３７℃で約５〜約３０分間行うことができる。このように生成した蛍光のベンゾオキサゾール誘導体は安定であり、ＴＬＣプレート上ＵＶ下で可視化することができる。
【０２０４】
[0223]別の一態様において、以下の条件を用いてもよい：０．３Ｍ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１２）、０．１Ｍ  ｐ−（アミノメチル）ベンジル化合物、５０ｍＭ  ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム、及びメタノール（１／１／２／２  ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）。ある態様において、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ比は、１〜１０／１〜１１／２〜２２／２〜２３の範囲である。誘導体化は、室温（ＲＴ）から約３７℃で５分〜約３０分間行ってもよい。
【０２０５】
Ｃ．安定なベンゾオキサゾール誘導体は蛍光性であり、ＨＰＬＣによって検出することができる
[0224]ベンゾオキサゾール誘導体は、安定で、蛍光性であり、ＴＬＣプレート上ＵＶ下で可視化することができる（図５）。安定なベンゾオキサゾール誘導体は、ＨＰＬＣにより高感度で検出することができる。試料の調製：血清５０μｌを誘導体化混合物５０μｌと、約２０℃（室温）〜約３７℃の温度で５〜３０分間インキュベートする。アセトニトリル（ＡＣＮ）でタンパク質除去し（１：２ｖ／ｖの血清：ＡＣＮ）、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、０．２μｍでろ過し、５０μｌを注入する；ＨＰＬＣ方法：カラム：逆相、Ｃ１８カラム：図６は、５−ＨＴを分離するＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図７は、５−ＨＩＡＡのＨＰＬＣを示す。
【０２０６】
[0225]実施例２：５−ＨＴのベンゾオキサゾール誘導体及びそのビオチン化誘導体の合成
【０２０７】
[0226]以下のスキームは、Ｉ６、Ｉ７、及びＩ８の合成を説明するものである：
Ｉ６：４−（８−（２−アミノエチル）−６Ｈ−オキサゾロ［４，５−ｅ］インドール−２−イル）−Ｎ−（４−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ブチル）ベンズアミド、
Ｉ７：Ｎ，Ｎ’−（ジスルファンジイルビス（エタン−２，１−ジイル））ビス（４−（８−（２−アミノエチル）−６Ｈ−オキサゾロ［４，５−ｅ］インドール−２−イル）ベンズアミド）との４−（８−（２−アミノエチル）−６Ｈ−オキサゾロ［４，５−ｅ］インドール−２−イル）−Ｎ−（４−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ブチル）ベンズアミド化合物（１：１）、
Ｉ８：４−（８−（２−アミノエチル）−６Ｈ−オキサゾロ［４，５−ｅ］インドール−２−イル）−Ｎ−（４−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ブチル）ベンズアミド
【化３４】
2019151637.tif 000037
【０２０８】
[0227]ステップ１：０℃のＭｅＯＨ（３０ｍｌ）中の化合物Ｉ−１（２．３ｇ、１０．８ｍｍｏｌ）に、トリエチルアミン（３．３ｍｌ、２３．４ｍｍｏｌ）を加え、次いでＭｅＯＨ中Ｂｏｃ２Ｏ（３．４７ｍｌ、１６．２ｍｍｏｌ）を滴下添加した。混合物を室温に温め、さらに２時間撹拌し、次いで濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、所望のｂｏｃ生成物Ｉ−２（２．８８）を黄色の油状物として得た。
【０２０９】
[0228]ステップ２：化合物Ｉ−２（２，３６ｇ、８．５５ｍｍｏｌ）及び化合物Ｉ−３（２．８２ｇ、１７．１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３０ｍｌ）中のＭｎＯ２（５．９８ｇ、６８．４ｍｍｏｌ）と１日間撹拌した。混合物をろ過し、水と酢酸エチルとの間で分配した。有機層を分離し、精製して黄色固体のＩ−４（５１０ｍｇ）を得た。ＭＳ：４３６．０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２１０】
[0229]ステップ３：Ｉ−５（５１０ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１０ｍｌ）及び水（４ｍｌ）中のＬｉＯＨ．Ｈ２Ｏ（０．９８ｇ、２３．４ｍｍｏｌ）と１日間撹拌し、飽和ＮａＨＳＯ４によって酸性化し、酢酸エチルで抽出し、濃縮して黄色固体（０．５ｇ）を得た。
【０２１１】
[0230]ステップ４：無水ＤＭＦ（１．５ｍｌ）中の化合物１−５（７１ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）に、化合物３８（６２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．０４ｍｌ、０．２６ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（１０３ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を３時間撹拌し、次いで酢酸エチルと水との間で分配した。次いで、有機層を分離し、濃縮した。粗製物を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９０／１０）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して所望の生成物（３５ｍｇ）を得、これをＭｅＯＨ（２ｍｌ）中の６Ｎ  ＨＣｌで４時間処理し、次いで濃縮して所望の化合物Ｉ−６（３０ｍｇ）を得た。ＭＳ：６１８．０（Ｍ＋Ｈ）＋、４−（８−（２−アミノエチル）−６Ｈ−オキサゾロ［４，５−ｅ］インドール−２−イル）−Ｎ−（４−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ブチル）ベンズアミド。
【０２１２】
[0231]ステップ５：無水ＤＭＦ（２ｍｌ）中の化合物Ｉ−５（１００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）に、化合物３２（５３ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．１１ｍｌ、０．８ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（１８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を一夜撹拌し、次いで酢酸エチルと水との間で分配した。次いで、有機層を分離し、濃縮した。粗製物を、ＤＣＭ／酢酸エチル（１０／１）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して所望の生成物（３０ｍｇ）を得、これをジオキサン（２ｍｌ）中の４Ｎ  ＨＣｌで一夜処理し、次いで濃縮して所望の化合物Ｉ−７（１２．４ｍｇ）を得た。ＭＳ：８７２．２（Ｍ＋Ｈ）＋、Ｎ，Ｎ’−（ジスルファンジイルビス（エタン−２，１−ジイル））ビス（４−（８−（２−アミノエチル）−６Ｈ−オキサゾロ［４，５−ｅ］インドール−２−イル）ベンズアミド）（１：１）との４−（８−（２−アミノエチル）−６Ｈ−オキサゾロ［４，５−ｅ］インドール−２−イル）−Ｎ−（４−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ブチル）ベンズアミド化合物。
【０２１３】
[0232]ステップ６：Ｉ−５（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を、ジオキサン（２ｍｌ）及びＤＣＭ（２ｍｌ）中の４Ｎ  ＨＣｌと一夜撹拌し、次いで濃縮して所望の生成物Ｉ−８（２６ｍｇ）を得た。ＭＳ：３２２．０（Ｍ＋Ｈ）＋、４−（８−（２−アミノエチル）−６Ｈ−オキサゾロ［４，５−ｅ］インドール−２−イル）−Ｎ−（４−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ブチル）ベンズアミド。
【０２１４】
[0233]実施例３：リンカーを有するキヌレン酸の合成及びビオチン化
化合物２４：６−（６−アミノヘキサンアミド）−４−ヒドロキシキノリン−２−カルボン酸
【化３５】
2019151637.tif 000038
【０２１５】
[0234]ステップ１：ｂｏｃ−アミノ−ヘキサン酸（２１、２７７ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．２１ｍｌ、１．２ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（４５６ｍｇ、１．２ｍｍｍｏｌ）の混合物を、ＤＣＭ（５ｍｌ）及びアセトニトリル（５ｍｌ）中で３０分間撹拌した。
【０２１６】
[0235]ステップ２：水（５ｍｌ）及びアセトニトリル（５ｍｌ）の混合物中の化合物２２（２１８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）に、ＮａＨＣＯ３（８４０ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）を加え、続いて激しく撹拌しながら、ステップ１からの反応混合物をゆっくり加えた。その後混合物をさらに４時間撹拌し、次いで、飽和ＮａＨＳＯ４によって酸性化し、これにより沈澱が生じた。固体をろ過して中間物質２３を生じた。
【０２１７】
[0236]ステップ３：ステップ２からの固体２３を、６０℃で４時間、ＭｅＯＨ（１０ｍｌ）中のＬｉＯＨ．Ｈ２Ｏ（４１０ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）と撹拌し、次いでＮａＨＳＯ４飽和溶液によってｐＨ３に酸性化し、濃縮した。得られた固体をろ過し、水で洗浄し、乾燥させた。次いで、これをＤＣＭ（２ｍｌ）中に懸濁し、続いてＴＦＡ（２ｍｌ）を加えた。スラリーを室温で４時間撹拌し、次いで濃縮した。得られた固体を酢酸エチル（３０ｍｌ）と５分間撹拌し、不溶物をろ過し、酢酸エチルで洗浄し、乾燥させて、灰色固体の所望の生成物２４（１２０ｍｇ）を得た。ＭＳ：３１８．０（Ｍ＋Ｈ）＋６−（６−アミノヘキサンアミド）−４−ヒドロキシキノリン−２−カルボン酸。
化合物２７の合成：４−ヒドロキシ−６−（６−（６−（５−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）ヘキサンアミド）キノリン−２−カルボン酸。
【化３６】
2019151637.tif 000039
【０２１８】
[0237]化合物２５（３２７ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）及びＬｉＯＨ．Ｈ２Ｏ（４３０ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）の混合物を、ＭｅＯＨ（１０ｍｌ）中で一夜撹拌し、次いで、６Ｎ  ＨＣｌでｐＨ７に慎重に酸性化し、濃縮してＭｅＯＨを除去した。次いで、粗製物をアセトニトリル及び水（１０ｍｌ／１０ｍｌ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３（１．２６ｇ）を加え、引き続きビオチン−ＬＣ−ＬＣ−ＮＨＳ（８５２ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１日間激しく撹拌し、６Ｎ  ＨＣｌによって酸性化し、得られた固体をろ過し、ＭｅＯＨ、引き続き水で洗浄し、次いで、乾燥させて純粋な化合物２７（１４０ｍｇ）を得た。ＭＳ：６５７．２（Ｍ＋Ｈ）＋、４−ヒドロキシ−６−（６−（６−（５−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）ヘキサンアミド）キノリン−２−カルボン酸。
【０２１９】
[0238]実施例４：リンカーを有するキノリン酸の合成及びビオチン化
Ｐｙ−６：５−（１−（（２−アミノエチル）チオ）エチル）ピリジン−２，３−ジカルボン酸、及びＰｙ７：５−（１−（（２−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）エチル）チオ）エチル）ピリジン−２，３−ジカルボン酸の合成
【化３７】
2019151637.tif 000040
【０２２０】
[0239]ステップ１：ＭｅＯＨ（１００ｍｌ）中のｐｙ−１（５．０ｇ、２５．６ｍｍｏｌ）に、ＡｃＣｌ（２０ｍｌ、２３０ｍｍｏｌ）を３０分かけて注意深く加えた。次いで、混合物を一夜還流し、次いで濃縮し、ＭｅＯＨ（１００ｍｌ）中に再溶解し、ＡｃＣｌ（２０ｍｌ）を加えた。混合物を再び１日間還流し、濃縮し、水及び酢酸エチル中で分配した。有機層を、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、乾燥させ、濃縮して、ジメチルエステルｐｙ−２（３．１ｇ）を得た。
【０２２１】
[0240]ステップ２：ＣＣｌ４（５０ｍｌ）中のｐｙ−２（３ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）を、ＮＢＳ（２．４ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）と、ＡＩＢＮ（１００ｍｇ）の存在下で８時間還流した。固体をろ過し、溶液を濃縮して黄色がかった油状物（ｐｙ−３）を得た。ＭＳ：３０１．９（Ｍ＋Ｈ）＋。この材料を、さらなる精製をせずに、次のステップに用いた。
【０２２２】
[0241]ステップ３：ＤＣＭ（３０ｍｌ）中の上記油状物に、ＢｏｃＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＨ（２．７４ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加え、それとともにトリエチルアミン（２．１ｍｌ、１５ｍｍｏｌ）及びＤＢＵ（２．２８ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で一夜撹拌し、水と酢酸エチルとの間で分配した。有機層を単離し、ヘキサンと酢酸エチルとの混合溶媒でのカラムクロマトグラフィーにより単離し、精製して、所望の化合物ｐｙ−４（２．９ｇ）を得た。ＭＳ：３９９．０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２２３】
[0242]ステップ４：ｐｙ−４（２．１ｇ、５．３ｍｍｏｌ）の混合物を、ＭｅＯＨ（２０ｍｌ）中のＬｉＯＨ．Ｈ２Ｏ（２．２２ｇ、１０ｅｑ．）と１日間撹拌し、飽和ＮａＨＳＯ４によりｐＨ３に酸性化し、酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、濃縮して所望の生成物（ｐｙ−５、１．７ｇ）を得た。ＭＳ：３７１．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２２４】
[0243]ステップ５：ｐｙ−５（０．５ｇ、１．３５ｍｍｏｌ）を、ジオキサン（４Ｎ、１０ｍｌ）中のＨＣｌと２時間撹拌し、濃縮したところ、ｐｙ−６としての油状物（ＨＣｌ塩）が形成された。ＭＳ：２７１．０（Ｍ＋Ｈ）＋、５−（１−（（２−アミノエチル）チオ）エチル）ピリジン−２，３−ジカルボン酸。
【０２２５】
[0244]ステップ６：ＭｅＯＨ（３ｍｌ）中のＨＣｌ塩形態のｐｙ−６（２００ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）に、ＤＩＰＥＡ（１ｍｌ、５．５ｍｍｏｌ）を加え、引き続きビオチン−ＮＨＳ（３４１ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１２時間撹拌し、次いで濃縮し、ＨＰＬＣによって精製して所望の生成物ｐｙ−７（８５ｍｇ）を得た。ＭＳ：４９７．１（Ｍ＋Ｈ）＋、５−（１−（（２−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）エチル）チオ）エチル）ピリジン−２，３−ジカルボン酸。
【０２２６】
[0245]実施例５：リンカーを有するアントラニル酸及びビオチン化誘導体の合成
化合物３０：２−アミノ−４−（（４−アミノブチル）カルバモイル）安息香酸、及び
化合物３１：２−アミノ−４−（（４−（５−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ブチル）カルバモイル）安息香酸の合成
【化３８】
2019151637.tif 000041
【０２２７】
[0246]ステップ１：無水ＤＭＦ（１２ｍｌ）中の、Ｂｏｃ−４−アミノブチルアミン（５６４ｍｇ、３ｍｍｏｌ）、化合物２８（６７５ｍｇ、３ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．８ｍｌ、４．５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．５２ｇ、４ｍｍｏｌ）の混合物を室温で１２時間撹拌した。次いで、これを水と酢酸エチルとの間で分配した。有機層を単離し、飽和ＮａＨＳＯ４、及び６Ｎ  ＮａＯＨで洗浄し、次いで濃縮させて化合物２９を油状物として得た。
【０２２８】
[0247]ステップ２：この油状物を、ＴＨＦ（２０ｍｌ）及び水（０．５ｍｌ）の混合物中のＬｉＯＨ．Ｈ２Ｏ（１．４ｇ、３０ｍｍｏｌ）と２日間撹拌し、飽和ＮａＨＳＯ４によって酸性化し、酢酸エチルで抽出し、濃縮し、さらなる精製をせずに次のステップに用いた。
【０２２９】
[0248]ステップ３：ステップ２からの材料をエタノール（３０ｍｌ）中に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（２００ｍｇ）及びＮＨ４ＨＣＯ３（３．７８ｇ、６０ｍｍｏｌ）を加えた。スラリーを還流下で３時間撹拌し、次いでろ過し、濃縮して固体を得た。副生成物をＤＣＭ／ＭｅＯＨからさらに沈殿させ、ろ去し、母液を濃縮して黄色固体を得た。
【０２３０】
[0249]ステップ４：ステップ３からの黄色固体を、ＤＣＭ（１０ｍｌ）中の５０％ＴＦＡと２時間撹拌した。これを濃縮し、ＨＰＬＣによって精製して、黄色粉末の所望の生成物３０（５００ｍｇ）を得た。ＭＳ：２５２．０（Ｍ＋Ｈ）＋、２−アミノ−４−（（４−アミノブチル）カルバモイル）安息香酸。
【０２３１】
[0250]ステップ５：水中５０％アセトニトリル（４ｍｌ）中の化合物３０（２５０ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）に、ＮａＨＣＯ３（１７２ｍｇ、１．５ｅｑ）を加え、引き続きビオチン−ＮＨＳ（２３２ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で一夜撹拌し、次いで４Ｎ  ＨＣｌによって酸性化し、濃縮し、ＨＰＬＣによって精製して所望の生成物３１（１５８ｍｇ）、２−アミノ−４−（（４−（５−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ブチル）カルバモイル）安息香酸を得た。
【０２３２】
[0251]実施例６：キヌレニンのビオチン化誘導体の合成
Ｋ４：Ｎ−（４−（２−アミノ−４−（２−アミノフェニル）−４−オキソブタンアミド）ブチル）−５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミドの合成
【化３９】
2019151637.tif 000042
【０２３３】
[0252]ステップ１：アセトニトリル及び水（１０ｍｌ／２０ｍｌ）の混合物中のＤＬ−キヌレニン（ＤＬ−ｋｙｎｅｕｒｉｎｅ）（Ｋ−１、１．０ｇ、４．８ｍｍｏｌ）に、二炭酸ジ−ｔ−ブチル（２．１８ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加え、引き続き炭酸水素ナトリウム（１．２ｇ、２０ｍｍｏｌ）を加えた。スラリーを室温で１日間撹拌し、ＮａＨＳＯ４飽和溶液によってｐＨ３に酸性化した。粗製物を酢酸エチルにより抽出し、ヘキサン及び酢酸エチルを用いたクロマトグラフィーによって精製して所望の生成物（１．５ｇ）を得た。
【０２３４】
[0253]ステップ２：ＤＭＦ（２ｍｌ）中のＫ−１（３３０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）、化合物３２（２１９ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の混合物に、ＨＡＴＵ（７６０ｍｇ、２ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．２７８ｍｌ、２．０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２４時間撹拌し、ヘキサン及び酢酸エチルを用いたクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物２２０ｍｇを得た。
【０２３５】
[0254]ステップ３：ステップ２からの材料を、ジオキサン（１０ｍｌ）中の４Ｎ  ＨＣｌと２時間撹拌し、次いで濃縮し、ＨＰＬＣによって精製して所望の生成物Ｋ−３のＨＣｌ塩（１１８ｍｇ）を得た。ＭＳ：６４５．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２３６】
[0255]ステップ４：ＤＭＦ（５ｍｌ）中のＫ−１（６５０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）、化合物３８（５００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）の混合物に、ＨＡＴＵ（１．１４ｇ、３ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４１８ｍｌ、３．０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２４時間撹拌し、酢酸エチルで抽出し、次いで水で洗浄して、粗製生成物として７６０ｍｇの油状物を得た。
【０２３７】
[0256]ステップ５：ステップ４からの材料を、ＤＣＭ中５０％ＴＦＡ（１０ｍｌ）と８時間撹拌し、次いで濃縮し、ＨＰＬＣによって精製して、所望の生成物Ｋ−４のＴＦＡ塩（２００ｍｇ）を得た。ＭＳ：５０５．１（Ｍ＋Ｈ）＋、Ｎ−（４−（２−アミノ−４−（２−アミノフェニル）−４−オキソブタンアミド）ブチル）−５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド。
【０２３８】
[0257]実施例７：リンカーを有する３−ヒドロキシアントラニル酸の合成
Ｐ０２６：２−アミノ−５−（Ｎ−（４−アミノブチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−３−ヒドロキシ安息香酸、
化合物Ｐ０２７：２−アミノ−３−ヒドロキシ−５−（２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（４−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ブチル）アセトアミド）安息香酸の合成
【化４０】
2019151637.tif 000043
【０２３９】
[0258]ステップ１：無水ＤＭＦ（１６ｍｌ）中のＺ−１（１．４５ｇ、７．２ｍｍｏｌ）に、臭化ベンジル（１．９ｍｌ、１５．９ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（２．５１ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を６０℃で４時間撹拌した。次いで、粗製物を酢酸エチル及び水で希釈した。有機層を分離し、食塩水で洗浄し、濃縮し、ヘキサン／酢酸エチルで溶出するカラムクロマトグラフィーにより精製してＺ−２（２．２ｇ）を得た。
【０２４０】
[0259]ステップ２：Ｚ−２（１．５ｇ、４ｍｍｏｌ）及びＢｏｃＮＨ−（ＣＨ２）４ＮＨ２（０．９ｇ、４．８ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．３ｍｌ、９．６ｍｍｏｌ）の混合物を、アセトニトリル（２０ｍｌ）中１００℃で１日間加熱した。粗製物を濃縮し、ヘキサン／酢酸エチルで溶出するカラムクロマトグラフィーにより精製して置換生成物（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔ）１．０ｇを得た。ＭＳ：４５０．１（Ｍ−Ｂｏｃ＋Ｈ）＋。
【０２４１】
[0260]ステップ３：ＤＣＭ（１０ｍｌ）中の上記の生成物（１ｇ、１．８ｍｍｏｌ）に、トリエチルアミン（１．０ｍｌ、４ｅｑ）及び無水トリフルオロ酢酸（０．５ｍｌ、３．６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で３０分間撹拌した。粗製物を濃縮し、カラムクロマトグラフィーにより精製して所望の生成物Ｚ−３（１．２ｇ）を得た。
【０２４２】
[0261]ステップ４：エタノール（１０ｍｌ）中のＺ−３（１．１７ｇ、１．８ｍｍｏｌ）に、Ｐｄ／Ｃ（３８０ｍｇ）及びギ酸アンモニウム（０．７ｇ、１１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１時間還流し、次いでろ過して触媒を除去した。次いで、溶液を濃縮し、カラムクロマトグラフィーにより精製して所望の中間物質（４８０ｍｇ）を得た。ＭＳ：４３６．０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２４３】
[0262]ステップ５：上記の中間物質をジオキサン（３ｍｌ）中の４Ｎ  ＨＣｌ中で１時間撹拌し、形成した固体をろ過し、エーテルで洗浄し、乾燥させてＣＲＮ−Ｐ０２６（２６０ｍｇ）を得た。ＭＳ：３３６．０（Ｍ＋Ｈ）＋、２−アミノ−５−（Ｎ−（４−アミノブチル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−３−ヒドロキシ安息香酸。
【０２４４】
[0263]ステップ６：ＤＭＦ（５ｍｌ）中のＣＲＮ−Ｐ０２６（１３０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）に、トリエチルアミン（０．１９ｍｌ、１．４ｍｍｏｌ）及びビオチン−ＮＨＳ（１２０ｍｇ）を加えた。混合物を室温で１日間撹拌した。反応混合物を濃縮し、粗製物をＬＣによって精製してＣＲＮ−Ｐ０２７（１５０ｍｇ）を得た。ＭＳ：５６２．０（Ｍ＋Ｈ）＋、２−アミノ−３−ヒドロキシ−５−（２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（４−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ブチル）アセトアミド）安息香酸
【０２４５】
[0264]実施例８：リンカーを有する短鎖脂肪酸の合成
Ｐ００２：６，６’−ジスルファンジイルビス（ヘキサン−１−オール）の合成
【０２４６】
１）ジスルフィド類似体
【化４１】
2019151637.tif 000044
[0265]酢酸エチル（１００ｍｌ）中の化合物１（５ｇ、３７ｍｍｏｌ）に、Ｉ２を８粒子加え、引き続き、Ｉ２の赤色が持続するまで、過酸化水素（３１％）をゆっくり加えた。次いで、溶液を飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３で洗浄し、乾燥させ、濃縮して黄色の油状物を得、これを室温に放置して徐々に固化させた（４．４ｇ）。ＴＬＣにより、生成物は、出発材料より極性が低く、わずかにＵＶ陽性であることが示された。
【０２４７】
２）エステルの形成
【化４２】
2019151637.tif 000045
[0266]ＤＣＭ（５ｍｌ）中の化合物２（４７０ｍｇ、１，７７ｍｍｏｌ）に、塩化プロピオニル（０．３３７ｍｌ、２．４ｅｑ）を加え、引き続きトリエチルアミン（０．５１１ｍｌ、２．４ｅｑ）及びＤＭＡＰ１０ｍｇを加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、濃縮した。次いで、粗製物を酢酸エチル／ヘキサン（１／９）で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより直接精製して、所望の生成物３ａ（６２０ｍｇ）を得た。ＮＭＲは構造と一致する。
【０２４８】
[0267]ＤＣＭ（５ｍｌ）中の化合物２（２６６ｍｇ、１ｍｍｏｌ）にＤＭＡＰ１０ｍｇを加え、次いでトリエチルアミン（０．２７８ｍｌ、２ｍｍｏｌ）を加え、引き続き無水ｎ−酪酸（０．３２６ｍｌ、２ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、混合物を室温で１時間撹拌し、次いでさらなる酢酸エチルで希釈した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３、ＮａＨＳＯ４で洗浄し、乾燥させ、濃縮して所望の生成物３ｂ（３８０ｍｇ）を得た。ＮＭＲ：パス。
Ｐ００６：（Ｎ−（６−（４−（２−アセトアミドエチル）ピペラジン−１−イル）−６−オキソヘキシル）−６−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド、
Ｐ００７：Ｎ−（６−（４−（２−ホルムアミドエチル）ピペラジン−１−イル）−６−オキソヘキシル）−６−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミドの合成
【化４３】
2019151637.tif 000046
ＤＣＭ（３ｍｌ）中の化合物４（１８３ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）に、ＤＩＰＥＡ（０．２７８ｍｌ、２ｅｑ）、次いで、塩化プロピオニル（１３０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を加えた。反応を室温で１時間撹拌した。混合物を濃縮し、酢酸エチルと水との間で分配し、酢酸エチル層を分離し、乾燥させ、濃縮し、次いでジオキサン（４Ｎ、２ｍｌ）中のＨＣｌを加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、濃縮して粗製物５ａを得た。次いで、これを無水ＤＭＦ（５ｍｌ）で希釈し、加え、引き続きＤＩＰＥＡ（０．２７８ｍｌ、１．６ｍｍｏｌ）、次いで（ビオチン−ＬＣ−ＬＣ−ＮＨＳ（４５４ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１２時間撹拌した。混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機物を濃縮し、次いでＨＰＬＣによって精製して所望の生成物６ａ（３９０ｍｇ）を得た。ＮＭＲ：パス。
【０２４９】
[0268]無水ｎ−酪酸を用いた点以外は同じ手順を６ｂの調製に用いて、所望の生成物６ａ（３９０ｍｇ）を得た。ＮＭＲ：パス
【０２５０】
[0269]実施例９：７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン誘導体（Ｃｈｏ−Ｄ）の合成
Ｐ０２２：（Ｄ５）（４Ｒ）−４−（（７Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ）−７−ヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−３−オキソ−２，３，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）−Ｎ−（４−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ブチル）ペンタンアミドの合成
【化４４】
2019151637.tif 000047
【０２５１】
[0270]ステップ１：ＭｅＯＨ（９０ｍｌ）中の化合物Ｄ１（９．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）に、Ｈ２ＳＯ４（３．０ｍｌ）を加えた。得られた反応混合物を９５℃で４時間還流した。反応溶液を濃縮し、ＥｔＯＡｃ中に溶解し、ＮａＨＣＯ３飽和溶液で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮して所望のメチルエステル生成物（９．２ｇ）を得た。この材料（６．０ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を引き続き、トルエン（１８０ｍｌ）及びアセトン（７８ｍＬ）中のＡｌ（Ｏｔ−Ｂｕ）３（７．３ｇ、２９．７ｍｍｏｌ）と合わせた。得られた混合物を９５〜１００℃で１７時間還流した。反応混合物を２．０Ｍ  Ｈ２ＳＯ４（１００ｍＬ）で処理し、水及びＮａＨＣＯ３飽和溶液で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムにより精製して化合物Ｄ２（３．０ｇ）を得た。
【０２５２】
[0271]ステップ２：化合物Ｄ２（２．５ｇ、６．２ｍｍｏｌ）をＫＯＨ（５０ｍＬ  ＭｅＯＨ中５．６ｇ）と合わせ、得られた混合物を周囲温度で１７時間撹拌した。反応混合物をｐＨがおよそ３になるまで２．０  ＨＣｌで処理し、これをＥｔＯＡｃで引き続き抽出した。有機層を食塩水で洗浄し、乾燥させ、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムによって精製して黄色固体の所望の生成物Ｄ３を得た（２．１６ｇ）。
【０２５３】
[0272]ステップ３：ＨＩＯ３（３．５２ｇ）をＤＭＳＯ（２０ｍＬ）と合わせ、得られた混合物を、８０℃で１時間、暗所で加熱した。ＤＭＳＯ（５．６ｍＬ）及びシクロヘキサン（１．４４ｍＬ）中の化合物Ｄ３（２．１６ｇ、５．５６ｍｍｏｌ）の混合物に、予め調製したＨＩＯ３溶液を加え、得られた混合物を、４５℃で１７時間、暗所で加熱した。反応混合物を水５０ｍＬに吸収させ、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を乾燥させ、ろ過し、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムにより精製して、分離できない副生成物Ｄ４−１とともに、所望の生成物Ｄ４を得た（０．５８ｇ）。
【０２５４】
[0273]ステップ４：Ｄ４及びＤ４−１（０．６４ｍｍｏｌ、２５０ｍｇ）、ＨＡＴＵ（０．６４ｍｍｏｌ、２４３ｍｇ）、並びに化合物３８の混合物を、ＤＭＦ（５ｍＬ）と合わせた。トリエチルアミン（０．７１ｍｍｏｌ、０．０９７ｍＬ）を滴下添加した。得られた混合物を周囲温度で２時間撹拌した。反応混合物をＮａＨＣＯ３飽和溶液に吸収させ、ＥｔＯＡｃで抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。残渣を、シリカゲルカラムによって引き続き精製して、分離できない副生成物Ｄ５−１とともに、所望の生成物Ｄ５を得た（９５ｍｇ、１Ｈ  ＮＭＲによって決定した比率８２：１８）。ＭＳ：６８５．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２５５】
[0274]ステップ５：Ｄ４及びＤ４−１（０．７３ｍｍｏｌ、２８４ｍｇ）、ＨＡＴＵ（０．７３ｍｍｏｌ、２７７ｍｇ）、並びに化合物３２の混合物を、ＤＭＦ（５ｍＬ）と合わせた。トリエチルアミン（１．４６ｍｍｏｌ、０．２５ｍＬ）を滴下添加した。得られた混合物を周囲温度で１時間撹拌した。反応混合物を水に吸収させ、ＥｔＯＡｃで抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。残渣を、シリカゲルカラムによって引き続き精製して、分離できない副生成物Ｄ６−１とともに、所望の生成物Ｄ６を得た（１６５ｍｇ、１Ｈ  ＮＭＲによって決定した比率８０：２０）。ＭＳ：５０３．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２５６】
[0275]実施例１０：経路の代謝産物に対するＥＬＩＳＡアッセイ
【０２５７】
[0276]本実施例は、トリプトファン、セロトニン、キヌレニン、胆汁酸代謝、及び短鎖脂肪酸経路における代謝産物など、本明細書に提供する代謝産物に特異的に結合する抗体の産生を記載するものである。本実施例は、これらの抗体を、例えば、患者の血清などの試料中の代謝産物を検出するための免疫ベースのアッセイなどのアッセイにおいて用いることができることも示す。
【０２５８】
[0277]本明細書において、免疫原性のコンジュゲート（例えば、抗原）として働く、合成で作成した代謝産物の類似体（ハプテン）に対して産生された、新規な抗体をベースとした競合ＥＬＩＳＡを提供する。類似体を、小分子を突出させ、ハプテンに特異的な免疫応答を誘発するためのリンカーを用いて特異的にデザインした。図８は、患者の血清中の経路の代謝産物を検出するのに用いた、競合ＥＬＩＳＡの例示的な実施形態を提供する。ストレプトアビジンプレートを、対象のビオチン化ハプテン（例えば、ビオチン化Ｓｅｒ−Ｄ）でコーティングすることにより、アッセイプレートを作成した。セロトニン及びその誘導体などの代謝産物を安定化するために、患者の試料を誘導体化混合物で誘導体化した。誘導体化した患者の血清を、次いで、対象の代謝産物（ハプテン）に対する抗体（例えば、抗−Ｓｅｒ−Ｄ抗体）と混合し、次いでプレートに移した。プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを、洗浄バッファーで数回洗浄した。ヤギ抗ウサギ抗体−ＨＲＰコンジュゲートなどの二次抗体を加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを、洗浄バッファーで数回洗浄した。基質溶液を呈色反応用に加えた。停止溶液を加えて、基質反応を停止させた。次いで、プレートを、４０５ｎｍの分光光度計で読み取った。
【０２５９】
[0278]上記に記載した実施例に記載したハプテンをベースにして免疫原性コンジュゲートを作成した。簡潔に述べると、経路の代謝産物又はその誘導体を、リンカーアームとコンジュゲートさせた。リンカーアームのフリーの末端を、アミノ又はチオール活性化により担体タンパク質に連結した。得られたハプテンを、次いで、経路の代謝産物又はその誘導体に対する抗体を産生するための抗原として用いた。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編集、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８年）に記載される通り、当業者には知られている標準方法に従って、ポリクローナル抗体を産生させた。
【０２６０】
[0279]各々の経路の代謝産物又はその誘導体に対する、ビオチン化ハプテンも産生した。リンカーアームを担体タンパク質にコンジュゲートする代わりに、リンカーをビオチンにコンジュゲートした。例えば、セロトニンのビオチン化ベンゾオキサゾール誘導体を、誘導体のフェニル末端にリンカーアームを、及びリンカーの他端にビオチンを含むように化学合成した。
【０２６１】
[0280]産生した抗体の有効性及び特異性を試験するために、以下のアッセイを用いた。対象のビオチン化ハプテン（２μｇ／ｍｌ）をストレプトアビジンプレート上に、室温で１時間コーティングした。プレートを洗浄し、ブロッキングバッファー（例えば、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋバッファー）でブロックして、非特異的な結合を最小にした。ウサギ抗血清を段階希釈し（１：１００、１：１２５、１：２５０、１：５００、１：１０００）、プレートの個々のウエルに移した。プレートを、軌道を描くように振盪しながら、室温（ＲＴ）で約１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファー（例えば、ＰＢＳＴ）で数回洗浄した。ヤギ抗ウサギ抗体−セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートを希釈し（１：５０００）、各ウエルに加え、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファー（例えば、ＰＢＳＴ）中で数回洗浄して過剰のＨＲＰコンジュゲートを除去した。呈色基質を加え、プレートをＨＲＰ−触媒反応のためにＲＴでインキュベートして、検出できる色を産生させた（例えば、暗所で１５分）。発色後、停止溶液（例えば、４Ｎ  ＮａＯＨ）を加えて、基質反応を止めた。プレートを４０５ｎｍで読み取った。吸光度は、試料中の抗体の量に直接比例した。
【０２６２】
Ｉ．セロトニンのベンゾオキサゾール誘導体に対する抗体（Ｓｅｒ−Ｄ）
[0281]セロトニンのベンゾオキサゾール誘導体に対する抗体（例えば、実施例２に記載したＳｅｒ−Ｄ）を、誘導体で免疫化したウサギにおいて上首尾に産生させた。ベンゾオキサゾール誘導体に対する抗体が、採血１〜５（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、及びＢ５）におけるウサギＡ及びウサギＢからの抗血清中で検出された。図９を参照されたい。滴定実験を行って、ウサギＡ及びＢにおいてＳｅｒ−Ｄに対して産生させた抗体の親和性を評価した（図１０）。
【０２６３】
[0282]図１１のＢに図示する直接アッセイを用いて、抗血清の交差反応性を試験した。簡潔に述べると、ヒト血清中のセロトニン（５−ＨＴ）又はその経路の代謝産物（例えば、５−ＯＨ  Ｔｒｙｐ若しくは５−ＨＩＡＡ）を誘導体化し、マルチウエルプレート上に４℃で一夜、コーティングした。プレートを洗浄バッファーで数回洗浄した。Ｓｅｒ−Ｄ抗原に対して産生された抗血清を、プレート上、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで数回洗浄した。ヤギ抗ウサギ抗体−ＨＲＰコンジュゲート溶液をプレートに加え、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファー中で数回洗浄した。呈色基質を比色定量反応用に加え、停止溶液を加え、その後プレートを４０５ｎｍで読み取った。抗血清は５−ＨＴに特異的であり（図１１のＡ）、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＯＨ  Ｔｒｙｐ、図１１のＣ）及び５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ、図１１のＤ）などの構造的に類似な化合物に対して交差反応性を示さなかった。
【０２６４】
[0283]また、図１２のＢに図示する競合アッセイを用いて、抗血清の交差反応性を試験した。ビオチン化抗原（例えば、ビオチン化Ｓｅｒ−Ｄ）をストレプトアビジンプレート上にコーティングした。ヒト血清中のセロトニン（５−ＨＴ）又はその経路の代謝産物（例えば、Ｔｒｙｐ、５−ＯＨ  Ｔｒｙｐ、若しくは５−ＨＩＡＡ）を誘導体化し、抗血清に加えた。混合物をプレートに加え、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで数回洗浄した。ヤギ抗ウサギ抗体−ＨＲＰコンジュゲート溶液を加え、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファー中で数回洗浄した。呈色基質を、比色定量反応用に加え、停止溶液を加え、その後プレートを４０５ｎｍで読み取った。ヒト血清中にＳｅｒ−Ｄが存在することで、抗Ｓｅｒ−Ｄ抗体のビオチン化Ｓｅｒ−Ｄに対する結合が阻害された（図１２のＡ）。遊離Ｓｅｒ−Ｄの量が増大するほど、少ない抗体が検出された。対照的に、トリプトファン（図１２のＣ）、５−ヒドロキシトリプトファン（図１２のＤ）、及び５−ヒドロキシインドール酢酸（図１２のＥ）誘導体が存在する場合、ビオチン化Ｓｅｒ−Ｄに結合する抗体の量に変化はなく、又はわずかな変化があった。
ＩＩ．セロトニンＥＬＩＳＡ
【０２６５】
[0284]抗セロトニン抗体を、上記に記載した競合ＥＬＩＳＡにおいて用いて、血清中のセロトニンのレベルが、ＩＢＳ−Ｄを有する患者対健常対照において異なるか否かを決定した。試験したＩＢＳ−Ｄ患者におけるセロトニンの平均量は５０±２０ｎＭであり、それに対して健常対照では２３±１０ｎＭであった（図１３）。四分位値分析も、四分位値３及び４の患者は健常対照に比べて高レベルであったことを示し、よって、ＩＢＳ−Ｄ患者はセロトニン機能不全を表すことが指摘された。
【０２６６】
[0285]セロトニンアッセイを複数日に行った場合、方法は安定性及び再現性を示した。検量線の比較では、実験日をまたがった値における差は殆ど示されなかった。図１４は、４つの日にちに産生された様々な検量線を示す。この実験では、セロトニン検出の上限は約１ｍＭ又は０．２１３ｍｇ／ｍｌであり、検出の下限は約１ｅ−１０ｍＭ（２１．３ｎｇ／ｍｌ）であった。本明細書に提供するセロトニンＥＬＩＳＡの検出範囲は、ＨＰＬＣ（ＡＲＵＰ  Ｌａｂｓ）などの他の方法に比べて広く、ＨＰＬＣ法では５０〜２２０ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【０２６７】
[0286]セロトニンＥＬＩＳＡを用いて、他の疾患状態におけるセロトニンの機能不全を検出した。特に、カルチノイド腫瘍、アルツハイマー病、又は自閉症を有する患者からの試料を試験した。健常対照に比べて、カルチノイド腫瘍を有する患者のセロトニンのレベルは高かったが、アルツハイマー病又は自閉症を有する患者のレベルは低かった（図１５）。
【０２６８】
ＩＩ．ＦＧＦ１９  ＥＬＩＳＡ
[0287]胆汁酸の代謝は、慢性下痢及びＩＢＳ−Ｄの発症の一因となる。胆汁酸合成を評価するための方法には、律速酵素であるコレステロール７−ヒドロキシラーゼの活性に相関する、血清７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンの検出が含まれる。７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンはＨＰＬＣにより測定することができるが、ＨＰＬＣは高感度であるが高価であり、再現性が問題になりやすい。胆汁酸はＦＧＦ１９シグナル伝達を活性化し、ＦＧＦ１９シグナル伝達はひいては胆汁酸の代謝を調節する（図１６）。ＦＧＦ１９  ＥＬＩＳＡ法は、血清試料中のＦＧＦ１９のレベルを測定するために開発された。このアッセイを用いて、ＩＢＳ−Ｄ又はＩＢＳ−Ｃを有する患者は、健常対照及びＩＢＤを有する患者に比べてＦＧＦ１９のレベルが高いことが示された（図１６のＢ）。
【０２６９】
ＩＩＩ．キヌレン酸に対する抗体
[0288]リンカー類似体を有するキヌレン酸に対するポリクローナル抗体（例えば、実施例３に記載するＫＹＡ−Ｌ）を、類似体で免疫化したウサギにおいて産生した。滴定実験を行って、抗体の有効性を評価した。図１７のＡは、５００ｎｇ／ｍｌ〜３１．３ｎｇ／ｍｌの範囲の抗原（例えば、ＫＹＡ−Ｌ）からのデータを示す。図１７のＢは、３１．３ｎｇ／ｍｌ〜０の範囲のＫＹＡ−Ｌを示す。データは、抗体がキヌレン酸に特異的に結合することを示す。
【０２７０】
[0289]上記に記載した競合アッセイを用いて、抗ＫＹＡ−Ｌ抗体の交差反応性を試験した。簡潔に述べると、Ｌ−キヌレニン（Ｋｙ）、３−ヒドロキシ−ＤＬ−キヌレニン（Ｈ−Ｋｙ）、及びＬ−トリプトファン（Ｔｒｙｐ）などのキヌレン酸代謝産物を用いて、ビオチン化キヌレン酸と抗体結合に対して競合させた。図１８のＡは、ＫＹＡ−Ｌ抗原がビオチン化抗原と競合したことを示す。対照的に、増大量のＫｙ（図１８のＢ）、Ｈ−Ｋｙ（図１８のＣ）、及びＴｒｙｐｔ（図１８のＤ）が存在しても、アッセイにおいて検出される抗ＫＹＡ−Ｌのレベルを変更しなかった。結果より、抗ＫＹＡ−Ｌ抗体はキヌレニン代謝産物と交差反応せず、キヌレン酸に特異的であることが示される。
【０２７１】
ＩＩＩ．プロピオン酸に対する抗体
[0290]実施例８に記載するリンカー類似体を有するプロピオン酸（ＰｒｏｐＬ）を合成した。ＰｒｏｐＬに対する抗体を、ポリクローナル抗体を生成するための標準方法に従って産生した。免疫化したウサギからの抗血清を、プロピオン酸特異的抗体の存在に対して試験した（図１９）。抗ＰｒｏｐＬ抗体が採血１０〜１２において検出された。
【０２７２】
[0291]上記に記載した競合アッセイを用いて、抗ＰｒｏｐＬ抗体の交差反応性を試験した。抗体はプロピオン酸に特異的であり（図２０のＡ）、酪酸又はセロトニンと交差反応性を示さなかった。
【０２７３】
[0292]本明細書に記載する実施例及び実施形態は説明の目的にすぎず、これらに鑑みた様々な改変又は変更が、当業者に対して示唆され、本出願の趣旨及び権限内、並びに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきことが理解される。本明細書に列挙する出版物、特許、及び特許出願はいずれも、全ての目的でその全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2019151637.tif 000065
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019151637.tif 000071
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2019151637.tif 000077
【図１４】
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【図１５】
2019151637.tif 000079
【図１６】
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【図１７】
2019151637.tif 000081
【図１８】
2019151637.tif 000082
【図１９】
2019151637.tif 000083
【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月8日(2019.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の作成のための式Ｉの免疫化合物：
【化１】
2019151637.tif 000085
（式中、Ｒは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシＣ１−Ｃ６アルキル、アミノＣ１−Ｃ６アルキル、アミドＣ１−Ｃ６アルキル、カルボキシＣ１−Ｃ６アルキル、置換カルボキシＣ１−Ｃ６アルキルからなる群から選択されるメンバーであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は各々、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ハロ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、アミノ、Ｃ６−Ｃ１０アロイル、Ｃ１−Ｃ６アルカノイル、アミド、置換アミド、シアノ、カルボキシル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、スルホネート、Ｃ１−Ｃ６アルコキシＣ１−Ｃ６アルキル、カルボキシ、カルボキシＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニルＣ１−Ｃ６アルキル、スルホネートＣ１−Ｃ６アルキル、Ｌ及びＲ１１Ｂからなる群から独立に選択されるメンバーであり、ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の少なくとも１つはＲ１１Ｂであり、
Ｌは、リンカーであり、前記リンカーはＣ、Ｎ、Ｐ、Ｏ、及びＳからなる群から選択される原子を１〜６０個有する直鎖又は分岐鎖の、環状又は複素環の、飽和又は不飽和の連結からなる群から選択されるメンバーであり、Ｌは原子価を満たすための付加的な水素原子を有することができ、連結は、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カーバメート、尿素、チオ尿素、オキシ、若しくはアミド結合の任意の組合せ、又は単、二重、三重、若しくは芳香族性の炭素−炭素結合であり、又はリン−酸素、リン−硫黄、窒素−窒素、窒素−酸素、若しくは窒素−白金結合であり、又は芳香族若しくは芳香族複素環（ｈｅｔｅｒｏａｒｏｍａｔｉｃ）結合であり、
Ｒ１１は、化合物と生体分子との間に生じる接続部であり、Ｒ１１はリンカーＬを含み、
Ｂは、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、又はダイズトリプシン阻害剤からなる群から選択されるメンバーである免疫原性タンパク質である）。
【請求項２】
Ｒが、アミノＣ１−Ｃ６アルキル、カルボキシＣ１−Ｃ６アルキル、及び置換カルボキシＣ１−Ｃ６アルキルからなる群から選択されるメンバーである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒが、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、及びＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ２Ｈからなる群から選択されるメンバーである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ３がＲ１１Ｂである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
抗体を作成するための方法であって、
（ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫化合物を含む免疫原を提供するステップと、
（ｂ）動物の免疫系が抗体を作成する条件下で、動物を免疫原で免疫化するステップと、
（ｃ）抗体を動物から除去するステップと
を含み、前記動物がウサギ、マウス、ヒツジ、ニワトリ、及びヤギからなる群より選択される、抗体を作成するための方法。
【外国語明細書】
2019151637000001.pdf