(57)【要約】【課題】細胞等の物体に発生する応力の可視化および定量化が可能なフィルム状ソフトマテリアル及び蛍光フィルム基材、並びにそれらを用いる応力計測方法を提供する。【解決手段】高分子化合物からなる３次元網目構造を有し、該３次元網目構造の主骨格の側鎖に蛍光色素が導入されているフィルム状ソフトマテリアル１１。フィルム状ソフトマテリアル上に細胞等の物体を接触させる工程と、フィルム状ソフトマテリアルの少なくも一部に、パターン状にエネルギー線を照射して、高蛍光強度領域と、低蛍光強度領域との境目で蛍光強度に勾配または段差を生じさせる工程と、フィルム状ソフトマテリアルの蛍光強度分布の変位を評価する工程と、を備える応力計測方法。【選択図】図１
2019151747.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子化合物からなる３次元網目構造を有し、該３次元網目構造の主骨格の側鎖に蛍光色素が導入されているフィルム状ソフトマテリアル。
【請求項２】
前記高分子化合物が、ポリアクリルアミド系樹脂を含む、請求項１に記載のフィルム状ソフトマテリアル。
【請求項３】
高蛍光強度領域と、該高蛍光強度領域よりも蛍光強度の低い低蛍光強度領域とを有し、該高蛍光強度領域と該低蛍光強度領域との境目で蛍光強度に勾配または段差が生じている、請求項１又は２に記載のフィルム状ソフトマテリアル。
【請求項４】
基材上に、請求項１〜３のいずれかに記載のフィルム状ソフトマテリアルを備える蛍光フィルム基材。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のフィルム状ソフトマテリアルを製造する方法であって、
基板上で、重合性基を有する蛍光色素を含有し３次元網目構造を形成するモノマー液を重合させる工程を有する、フィルム状ソフトマテリアルの製造方法。
【請求項６】
請求項３に記載のフィルム状ソフトマテリアルを製造する方法であって、
基板上で、重合性基を有する蛍光色素を含有し３次元網目構造を形成するモノマー液を重合させてフィルム状ソフトマテリアル重合体を形成させる工程と
前記フィルム状ソフトマテリアル重合体の少なくも一部に、パターン状にエネルギー線を照射して、高蛍光強度領域と、低蛍光強度領域との境目で蛍光強度に勾配または段差を生じさせる工程と、を有する、フィルム状ソフトマテリアルの製造方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のフィルム状ソフトマテリアルを用いる応力計測方法であって、
前記フィルム状ソフトマテリアル上に細胞等の物体を接触させる工程と、
前記フィルム状ソフトマテリアルの少なくも一部に、パターン状にエネルギー線を照射して、高蛍光強度領域と、低蛍光強度領域との境目で蛍光強度に勾配または段差を生じさせる工程と、
前記フィルム状ソフトマテリアルの蛍光強度分布の変位を評価する工程と、を有する応力計測方法。
【請求項８】
請求項３に記載のフィルム状ソフトマテリアルを用いる応力計測方法であって、
前記フィルム状ソフトマテリアル上に細胞等の物体を接触させる工程と、
前記フィルム状ソフトマテリアルの蛍光強度分布の変位を評価する工程と、を有する応力計測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィルム状ソフトマテリアル、蛍光フィルム基材及びフィルム状ソフトマテリアルの製造方法、並びにフィルム状ソフトマテリアルを用いる応力計測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内で細胞は、周囲の細胞外マトリクス（以下、ＥＣＭという。）を構成するタンパク質と細胞膜上の膜タンパク質間で接着斑と呼ばれる接着点を形成している（非特許文献１）。接着斑は、細胞内の細胞骨格と結合しており、ＥＣＭと接着した細胞に発生する応力（以下、牽引力という。）が細胞内部に伝播することで細胞機能が制御される。ＥＣＭの組成および力学特性によって細胞に発生する牽引力が変化することが知られており、例えば、間葉系の幹細胞は、ＥＣＭの弾性率に応じて細胞の牽引力が変化し、その結果、分化後の細胞の性質が異なることが知られている。つまり、細胞牽引力が細胞機能と強い相関性があることがわかる。生体内のＥＣＭの性質は、外的損傷、疾病や加齢などによって変化する。このようなＥＣＭの性質変化が細胞機能に与える影響は長期に及ぶため、細胞牽引力の変化を長期間安定に計測し、ＥＣＭの性質変化に応じた細胞機能の変化を評価することが期待される。また、再生医療の観点からも、組織再生の際に細胞の足場となる基材が必要となり、長期間にわたる組織再生過程において、その基材の特性が細胞の牽引力に与える影響を解明することは、基材の材料設計に重要となる。
【０００３】
細胞に発生する牽引力を定量的に検出する手法が、これまでにいくつか提案されている。例えば、コストや実用性の観点から、広く利用されている方法として、Ｗａｎｇらの方法が挙げられる（非特許文献２）。この方法は、ポリアクリルアミド等からなるフィルム状ゲルの内部に化学架橋によって直径が１μｍ以下の蛍光ビーズを内包させ、このゲル表面に接着した細胞に発生する牽引力を蛍光ビーズの変位から検出するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Disher et al. 2009, Science, Vol.324, 2009, pp.1673-1677.
【非特許文献２】Dembo et al., Biophysical Journal. Vol.76, 1999, pp.2307-2316.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、非特許文献２で開示された方法では、表面に提示されるアクリレート基の密度を精密に制御することは困難なため、蛍光ビーズ周囲の架橋密度は各蛍光ビーズによってばらつきが生じてしまうこと、蛍光ビーズ周辺とその他の領域では弾性率に差異が生じる可能性がある、といった課題があった。また、蛍光ビーズの表面にアミノ基やＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの活性エステル基を提示し、アミド結合やエステル結合を介してアクリレート基を化学修飾するという煩雑な作業を行う必要がある。このような煩雑な操作を簡略化するために、蛍光ビーズをハイドロゲル内に化学架橋せずに埋包することも可能だが、その場合、蛍光ビーズがポリアクリルアミドゲル内で拡散運動することによる蛍光ビーズの揺らぎが、長期計測における牽引力計測の精度や再現性の低下の原因となっていた。
【０００６】
そこで、本発明では、細胞等の物体に発生する応力の可視化および定量化が可能なフィルム状ソフトマテリアル及び蛍光フィルム基材、並びにそれらを用いる応力計測方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の態様を包含するものである。
［１］  高分子化合物からなる３次元網目構造を有し、該３次元網目構造の主骨格の側鎖に蛍光色素が導入されているフィルム状ソフトマテリアル。
［２］  前記高分子化合物が、ポリアクリルアミド系樹脂を含む、［１］に記載のフィルム状ソフトマテリアル。
［３］  高蛍光強度領域と、該高蛍光強度領域よりも蛍光強度の低い低蛍光強度領域とを有し、該高蛍光強度領域と該低蛍光強度領域との境目で蛍光強度に勾配または段差が生じている、［１］又は［２］に記載のフィルム状ソフトマテリアル。
［４］  基材上に、［１］〜［３］のいずれかに記載のフィルム状ソフトマテリアルを備える蛍光フィルム基材。
【０００８】
［５］  ［１］〜［３］のいずれかに記載のフィルム状ソフトマテリアルを製造する方法であって、
基板上で、重合性基を有する蛍光色素を含有し３次元網目構造を形成するモノマー液を重合させる工程を有する、フィルム状ソフトマテリアルの製造方法。
［６］  ［３］に記載のフィルム状ソフトマテリアルを製造する方法であって、
基板上で、重合性基を有する蛍光色素を含有し３次元網目構造を形成するモノマー液を重合させてフィルム状ソフトマテリアル重合体を形成させる工程と、
前記フィルム状ソフトマテリアル重合体の少なくも一部に、パターン状にエネルギー線を照射して、高蛍光強度領域と、低蛍光強度領域との境目で蛍光強度に勾配または段差を生じさせる工程と、を有する、フィルム状ソフトマテリアルの製造方法。
［７］  ［１］又は［２］に記載のフィルム状ソフトマテリアルを用いる応力計測方法であって、
前記フィルム状ソフトマテリアル上に細胞等の物体を接触させる工程と、
前記フィルム状ソフトマテリアルの少なくも一部に、パターン状にエネルギー線を照射して、高蛍光強度領域と、低蛍光強度領域との境目で蛍光強度に勾配または段差を生じさせる工程と、
前記フィルム状ソフトマテリアルの蛍光強度分布の変位を評価する工程と、を備える応力計測方法。
［８］  ［３］に記載のフィルム状ソフトマテリアルを用いる応力計測方法であって、
前記フィルム状ソフトマテリアル上に細胞等の物体を接触させる工程と、
前記フィルム状ソフトマテリアルの蛍光強度分布の変位を評価する工程と、を有する応力計測方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細胞等の物体に発生する応力の可視化および定量化が可能なフィルム状ソフトマテリアル及び蛍光フィルム基材、並びにそれらを用いる応力計測方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施形態のフィルム状ソフトマテリアル１１、及び、フィルム状ソフトマテリアル１１を備える蛍光フィルム基材１を示す概略断面図である。
【図２】本発明の一実施形態のフィルム状ソフトマテリアル１１、及び、フィルム状ソフトマテリアル１１を備える蛍光フィルム基材２を示す概略断面図である。
【図３】本発明の一実施形態のフィルム状ソフトマテリアル１４、及び、フィルム状ソフトマテリアル１４を備える蛍光フィルム基材３を示す概略断面図である。
【図４】本発明の一実施形態の応力計測方法を示す概略図である。
【図５】本発明の一実施形態のフィルム状ソフトマテリアルの製造に用いることのできる基板の模式図である。
【図６】本発明の一実施形態のフィルム状ソフトマテリアル１１、及び蛍光フィルム基材２の製造手順を模式的に示す図である。
【図７】蛍光強度分布構造形成に用いるフォトマスクの例であって、（Ａ）はその平面概略図であり、（Ｂ）はその断面概略図である。
【図８】本発明の一実施形態のフィルム状ソフトマテリアル１４、及び蛍光フィルム基材３の製造手順を模式的に示す図である。
【図９】本発明の一実施形態のフィルム状ソフトマテリアルの蛍光強度分布の評価結果を表す。
【図１０】本発明の一実施形態のフィルム状ソフトマテリアルのデフォーカス光による退色を、蛍光顕微鏡によって観察した結果を表す。
【図１１】本発明の一実施形態のフィルム状ソフトマテリアルの、蛍光強度の変位分布の評価結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明のフィルム状ソフトマテリアル、蛍光フィルム基材及びフィルム状ソフトマテリアルの製造方法、並びにフィルム状ソフトマテリアルを用いる応力計測方法の実施形態を、図面に基づいて説明する。
なお、以下の説明で用いる図は、本発明の特徴を分かり易くするために、便宜上、要部となる部分を拡大して示している場合があり、各構成要素の寸法比率等が実際と同じであるとは限らない。
【００１２】
≪フィルム状ソフトマテリアル及び蛍光フィルム基材≫
図１は、本実施形態のフィルム状ソフトマテリアル１１、及び、フィルム状ソフトマテリアル１１を備える蛍光フィルム基材１を示す概略断面図である。本実施形態のフィルム状ソフトマテリアル１１は、高分子化合物からなる３次元網目構造を有し、該３次元網目構造の主骨格の側鎖に蛍光色素が導入されている。フィルム状ソフトマテリアル１１は、形状を保持するため、基材１２上に、フィルム状ソフトマテリアル１１を備える蛍光フィルム基材１として用いることができる。
【００１３】
本実施形態のフィルム状ソフトマテリアル１１には蛍光色素が導入されているので、後述する応力計測方法により、細胞等の物体に発生する応力の可視化および定量化が可能である。また、本実施形態のフィルム状ソフトマテリアル１１は、高分子化合物からなる３次元網目構造を有し、上述のように、蛍光色素が該３次元網目構造の主骨格の側鎖に、化学結合で修飾され導入されているため、従来の、フィルム状ソフトマテリアルの内部に化学架橋によって蛍光ビーズを内包させたものよりも、架橋密度変化の影響を少なくすることができ、架橋密度の局所的な違いによる弾性率のばらつきも小さくすることができる。さらに、本実施形態のフィルム状ソフトマテリアル１１において、主骨格に導入される蛍光色素は、分子サイズが小さいため、良溶媒へフィルム状ソフトマテリアルを膨潤させることで、未反応の蛍光色素はフィルム状ソフトマテリアルから除去可能である。そのため、未架橋の蛍光分子の拡散運動による、応力に依存しない揺らぎは生じないため、応力計測の精度や再現性が低下してしまう問題も解決でき、長期間安定な応力の計測が実現できる。
【００１４】
本実施形態のフィルム状ソフトマテリアル１１を構成する高分子化合物としては、３次元網目構造を有し、該３次元網目構造の主骨格の側鎖に蛍光色素を導入できるものであれば、種類は問わない。該高分子化合物として、例えば、ポリシリコーンなどのエラストマ、ポリアクリルアミドや多糖類などの水溶性高分子ゲル、親水性ゲルにシリコーンを配合したシリコーンハイドロゲル、コラーゲンなどのタンパク質から構成されるハイドロゲル、等が挙げられる。
【００１５】
フィルム状ソフトマテリアル１１を構成する高分子化合物は、生体適合性を有することが好ましい。エラストマの例としては、ポリシリコーン、ハイドロゲルの例としては、ポリアクリルアミドやポリヒドロキシエチルアクリレートなどの骨格がアクリル系高分子、デキストランやアルギン酸などの水溶性多糖類、コラーゲンやフィブロネクチン等、およびそれらの誘導体のタンパク質から構成されるハイドロゲル、等が挙げられる。また、これらの構成分子を複数種類混合しても良い。中でも高分子化合物が、ポリアクリルアミド系樹脂を含むことが好ましい。
【００１６】
フィルム状ソフトマテリアル１１の、基材１２とは反対側の表面には、図２に示されるように、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）等のタンパク質からなる細胞接着層１３が設けられていることが好ましい。フィルム状ソフトマテリアル１１の表面に設けられた細胞接着層１３により、任意の細胞および組織が接着可能となる。タンパク質からなる細胞接着層１３を設けるため、あらかじめフィルム状ソフトマテリアル１１に、ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ６-（４‘-ａｚｉｄｏ-２’-ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ（以下、ｓｕｌｆｏ−ＳＡＮＰＡＨ）の溶液を滴下して紫外線照射して、フィルム状ソフトマテリアル１１のタンパク質親和性を高めておくことが好ましい。フィルム状ソフトマテリアルの、弾性率は限定されないが、生体組織の弾性率である１００Ｐａ〜１ＭＰａとすることで、ＥＣＭ力学特性を模倣することができる。
【００１７】
フィルム状ソフトマテリアルは、図３に示すように、高蛍光強度領域３２と、該領域３２よりも蛍光強度の低い低蛍光強度領域３１とを有し、該領域３２と該領域３１との境目で蛍光強度に勾配または段差が生じていることが好ましい。すなわち、フィルム状ソフトマテリアルには、蛍光強度分布を有することが好ましい。
【００１８】
蛍光強度の勾配は、異なる蛍光強度を有する隣接した領域の境界で蛍光強度が連続的に変化していることをいい、蛍光強度の変化の傾きが大きいほど望ましく、蛍光顕微鏡で検出可能な蛍光強度分布の変化が生じていることが望ましい。
蛍光強度の段差は、隣接する蛍光強度が異なる高蛍光強度領域３２と低蛍光強度領域３１との間で、蛍光強度差が生じている境界をいい、その蛍光強度差が大きいことが望ましい。また、低蛍光強度領域３１の蛍光強度が０に近いほどよい。高蛍光強度領域３２と低蛍光強度領域３１との間隔は、応力を検出しようとする物体のサイズ、および応力の大きさに応じて適宜調整して最適化することができる。
【００１９】
≪フィルム状ソフトマテリアルの製造方法≫
本発明に係るフィルム状ソフトマテリアルの製造方法は、基板上で、重合性基を有する蛍光色素を含有し３次元網目構造を形成するモノマー液を重合させる工程を備える。本発明に係るフィルム状ソフトマテリアルの製造方法は、従来の、蛍光ビーズをハイドロゲルへ内包させる際の化学修飾過程の煩雑さがなく、簡便に調製することができ、架橋密度の不均一性、未反応の蛍光ビーズ由来の揺らぎから生じる問題も解決できる。重合させる工程で用いる基板を、そのまま、蛍光フィルム基材１の基材１２とすることもでき、重合させる工程を経て得られたフィルム状ソフトマテリアル１１を、別途準備した基材１２に転写して、蛍光フィルム基材１とすることもできる。
【００２０】
モノマー液は、重合性基を有する蛍光色素を含有し３次元網目構造を形成する。３次元網目構造を形成するために、モノマー液は、重合性基を有する蛍光色素及び二以上の重合性基を有する重合性化合物を含有することができる。
【００２１】
フィルム状ソフトマテリアルを構成する高分子化合物の、３次元網目構造の主骨格の側鎖に蛍光色素を導入できする方法は特に限定されないが、シリコーン系エラストマの場合、プラチナ触媒を用いたヒドロシリル化を用いる方法が挙げられる。ポリアクリルアミドゲルのようにモノマーの化学重合によって３次元網目構造を形成させる場合は、蛍光色素が化学修飾されたモノマーを用いる。
【００２２】
フィルム状ソフトマテリアルの蛍光強度は、３次元網目構造を有する高分子化合物の重合の際に、３次元網目構造を形成するモノマー液中の重合性基を有する蛍光色素の混合比によって、容易に制御可能である。未反応の蛍光色素モノマーに関しても、分子サイズが高分子化合物の網目構造よりも小さな分子構造とすることで、作製したフィルム状ソフトマテリアルを良溶媒中で再膨潤させることで、フィルム状ソフトマテリアルから除去することが可能である。コラーゲン等のタンパク質の自己集合やアルギン酸やヒアルロン酸などの多糖類の架橋による３次元網目構造からなるフィルム状ソフトマテリアルの場合、３次元網目構造を形成する前にアミド結合やエステル結合などの化学結合を介した蛍光色素の化学修飾を行う。３次元網目構造の主骨格の側鎖に蛍光色素を導入する方法は、上述のように、煩雑な化学修飾を行う必要がなく、簡易である。また、未反応の蛍光色素はフィルム形成前および形成後、どちらであっても透析によって除去可能である。
【００２３】
３次元網目構造の主骨格の側鎖に修飾する蛍光色素の導入率は限定されないが、主骨格のユニット単位に対し、０．０１〜１モル％となることが好ましい。フィルム主骨格の側鎖へ導入する蛍光色素の種類は限定されないが、水溶性を有し、色素間での分子会合が起こらないものが好ましい。
【００２４】
重合性基を有する蛍光色素として、好ましくは、シグマアルドリッチ社から販売されているフルオレセイン−Ｏ−アクリレート（式（１−Ａ）。以下、ＦＬアクリレート）などの蛍光修飾モノマーや、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社から販売されているＮｉｌｅ Ｂｌｕｅ Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（式（１−Ｆ））、Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ ｔｈｉｏｃａｒｂａｍｏｙｌ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ（式（１−Ｇ））などの蛍光修飾モノマーが挙げられる（式（１−Ａ）〜式（１−Ｇ））。
【００２５】
【化１】
2019151747.tif 000003
【００２６】
【化２】
2019151747.tif 000004
【００２７】
【化３】
2019151747.tif 000005
【００２８】
【化４】
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【００２９】
【化５】
2019151747.tif 000007
【００３０】
【化６】
2019151747.tif 000008
【００３１】
【化７】
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【００３２】
フィルム状ソフトマテリアルの調製方法は特に限定されないが、シリコーン系エラストマの場合、プラチナ触媒を用いたヒドロシリル化が挙げられる。アクリル系高分子の場合、アクリル基の重合反応による化学架橋が挙げられる。多糖類及びタンパク質の場合、自己集合によるゲル化を用いてもよく、また、上記のカルボジイミドを用いてアクリル基を主骨格に修飾することによる化学架橋を用いても良い。
【００３３】
重合反応の種類は特に限定されないが、例として、光重合開始剤を用いたラジカル重合が挙げられる。光照射により自らを構成する化学結合が生成される物質として、例えば光重合開始剤によって重合されるモノマー等の、高分子化合物の原材料が挙げられる。
光重合開始剤としては、水溶性の光重合開始剤が好ましく、下記式（２−Ａ）で表されるリチウムフェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィネート（ＬＡＰ）、下記式（２−Ｂ）で表される２−ヒドロキシ−４’−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン（Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９）、下記式（２−Ｃ）で表されるＥｏｓｉｎＹ、下記式（２−Ｄ）で表されるＮ−ビニルピロリドン（ＮＭＰ）、下記式（２−Ｅ）で表されるトリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）が例示できる。
【００３４】
【化８】
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【００３５】
【化９】
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【００３６】
【化１０】
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【００３７】
【化１１】
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【００３８】
【化１２】
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【００３９】
基板上で、重合性基を有する蛍光色素を含有し３次元網目構造を形成するモノマー液を重合させてフィルム状ソフトマテリアル重合体を形成させる工程の後に、前記フィルム状ソフトマテリアル重合体の少なくも一部に、パターン状にエネルギー線を照射して、高蛍光強度領域と、低蛍光強度領域との境目で蛍光強度に勾配または段差を生じさせる工程により、フィルム状ソフトマテリアルの蛍光強度に勾配または段差を形成することができる。
【００４０】
フィルム状ソフトマテリアルの蛍光強度に勾配または段差を生じさせる方法としては、例えば、フォトマスクや液晶フィルムをフォトマスクとして用いて、高強度のエネルギー線を照射して退色させる方法、デジタルミラーデバイス等を用いて局所的にエネルギー線を照射して退色させる方法、レーザー光のデフォーカスによる光の干渉によって退色させる方法が挙げられる。
【００４１】
≪応力計測方法≫
本発明に係る応力計測方法は、前記フィルム状ソフトマテリアル１４上に細胞等の物体１４を接触させる工程（図４（Ａ））と、前記フィルム状ソフトマテリアル１４の蛍光強度分布の変位を評価する工程（図４（Ｂ））と、を備える（図４）。
【００４２】
フィルム状ソフトマテリアルの蛍光強度に勾配または段差を生じさせるのは、細胞等の物体をフィルム状ソフトマテリアルに接触させる前後のどちらでもよい。本発明に係る応力計測方法は、前記フィルム状ソフトマテリアル上に細胞等の物体を接触させる工程と、前記フィルム状ソフトマテリアルの少なくも一部に、パターン状にエネルギー線を照射して、高蛍光強度領域と、低蛍光強度領域との境目で蛍光強度に勾配または段差を生じさせる工程と、前記フィルム状ソフトマテリアルの蛍光強度分布の変位を評価する工程と、を備えてもよい。
【００４３】
応力を長期間安定に計測方法として、蛍光フィルムに任意の蛍光強度分布をもたせ、物体が発生した応力による変位量を定量化することが挙げられる。均一な蛍光強度分布を有する蛍光フィルムでは、蛍光強度分布の変位量を定量的に計測することが難しくなる。蛍光色素が導入されているフィルム状ソフトマテリアルに、エネルギー線照射により局所的な蛍光強度分布の勾配または段差を形成させることができ、これにより、蛍光強度分布の変位量を定量的に計測することが可能となる。
【００４４】
蛍光強度分布の勾配または段差は、対象とする物体のサイズや発生する牽引力に応じて最適化することが好ましい。上述のように、蛍光色素が蛍光フィルムを構成するソフトマテリアルの主骨格の側鎖に化学結合で修飾されているため、架橋密度の局所的な違いによる弾性率のばらつきは無く、かつ、未反応の蛍光色素はフィルムから除去可能なため、蛍光分子の拡散運動による応力に依存しない揺らぎは生じないため、長期間安定な応力の計測が実現できる。
【００４５】
このような蛍光色素が導入されているフィルム状ソフトマテリアルを培養基材として用いることにより、細胞・組織がＥＣＭの力学特性を認識して、牽引力として応答するメカニズムを解明するためのin vitroモデルとすることができる。また、組織損傷時にはＥＣＭの力学特性が変化すること、疾病や加齢に伴うＥＣＭの力学特性が細胞・組織機能に影響を与えていることが示唆されており、本発明のフィルム状ソフトマテリアルを培養基板とし、組織再生に最適な足場材料の力学特性をスクリーニングするための外傷・疾病のin vitroモデルすることが可能である。
【実施例】
【００４６】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４７】
＜弾性率測定方法＞
実施例で得られた各ゲルの弾性率は、下記方法により求めた。
ヒトの体液とほぼ等張に調整したＰＢＳ水溶液で膨潤した状態のフィルム状ソフトマテリアルについて原子間力顕微鏡を用い、温度２５℃の測定条件で測定を行った。
【００４８】
［実施例１］
＜蛍光色素が導入されたフィルム状ゲル及び蛍光フィルム基材の作製＞
３−（トリメチルシリル）プロピルメタクリレートで表面修飾されたガラス基板１６（以下、シラン化ガラス基板）の両端に、図５で示すような、スペーサー１７としてサランラップ（登録商標）を配置した後、５質量％アクリルアミド、０．５質量％のビスアクリルアミド、０．０５質量％ＦＬアクリレート、光重合開始剤ＬＡＰを１ｍＭ含む水溶液（以下、モノマー液１８）をシラン化ガラス基板中央に滴下した（図６（Ａ））。このガラス基板１６に、酸素プラズマ処理したカバーガラス（以下、シール基板１９）を上面からのせ、モノマー液１８をシラン化ガラス基板とシール基板で挟み込み、余分なモノマー液１８をキムワイプで取り除いた。波長３６０ｎｍのバンドパスフィルターを用い、１０ｍＷ／ｃｍ２で１０分間、モノマー液１８へ光照射を行った（図６（Ｂ））。光照射終了後、得られたフィルム状ハイドロゲルを大過剰量のＰＢＳ溶液に浸漬し、未反応のモノマー液成分を除去した。カバーガラスを取り除き、蛍光色素が導入されたフィルム状ゲル表面の余分な溶液を取り除いた後、２ｍＭのｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ６-（４‘-ａｚｉｄｏ-２’-ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ（以下、ｓｕｌｆｏ−ＳＡＮＰＡＨ）を１００μｌ滴下して、波長３６０ｎｍバンドパスフィルターを介して１０分間光照射した（図６（Ｃ））。フィルム状ゲル表面のｓｕｌｆｏ−ＳＡＮＰＡＨ溶液を取り除いた後、０．１ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジン（以下、ＰＤＬ）溶液を１００μｌ滴下して、室温で２時間静置した（図６（Ｄ））。フィルム状ゲル表面のＰＤＬ溶液を取り除き、大過剰のＰＢＳ溶液で一晩以上浸透させることで、１８ｍｍ×１８ｍｍの、蛍光色素が導入されたフィルム状ゲルを備える蛍光フィルム基材２とした（図６（Ｅ））。フィルム状ソフトマテリアル１１としての、このフィルム状ゲルの弾性率は、約３．５ｋＰａであり、全体的におよそ均一であった。
【００４９】
［実施例２］
＜蛍光強度分布を有するフィルム状ゲル及び蛍光フィルム基材の作製１＞
実施例１の方法で蛍光色素が導入されたフィルム状ソフトマテリアルを備える蛍光フィルム基材２を作製後、金またはクロムのマスク２１が光透過基板２３上に設けられたフォトマスク２４（図７。以下、フォトマスク。）を、蛍光フィルム基材２の基板１６側に設置した。マスク２１の大きさは６２．５μｍ×６２．５μｍである。４２２ｎｍハイパスフィルターを介してキセノン光源による光照射を行い（図８（Ｇ））、蛍光フィルム基材３を得た（図８（Ｈ））。１０分間の光照射の後、蛍光顕微鏡による観察を行った（図９）。フィルム状ソフトマテリアル１４としての、フィルム状ゲルにマスクパターンに応じて、光照射された領域は蛍光色素が退色して低蛍光強度領域となり、マスクされた領域は高蛍光強度領域となって、約１２５μｍピッチの蛍光強度分布が形成され、隣接する領域間で蛍光強度に段差が生じることが示された。
【００５０】
［実施例３］
＜蛍光強度分布を有するフィルム状ゲル及び蛍光フィルム基材の作製２＞
実施例１の方法で蛍光色素が導入されたフィルム状ソフトマテリアルを備える蛍光フィルム基材２を作製後、顕微鏡の対物レンズを介して、４８８ｎｍのレーザー光をデフォーカス光として照射した。そのときの蛍光顕微鏡による観察結果を図１０に示す。デフォーカス光の照射によって、任意の領域で高蛍光強度領域３２と低蛍光強度領域３１が形成され、隣接する領域間で蛍光強度に段差が生じることが示された。
【００５１】
［実施例４］
＜フィルムの変位量の計測方法および応力分布の計測方法＞
応力分布の計測は、まず、粒子画像流速測定法（以下、ＰＩＶ）を用いて、ゲルの変位分布を解析する。細胞牽引力のモデル系として、ガラスニードルでゲルを１．６μｍ変位させた。変位前後のゲルの蛍光顕微鏡による観察結果およびＰＩＶ解析結果を図１１に示す。変位マッピングから、実際の変位方向および変位量と同等の解析結果を得た。次に、ゲルの変位分布から、線形弾性理論に基づく理論式を数値的に解析することにより、応力分布を計算することができる。取得画像のＰＩＶ解析および応力分布の解析は、ＩｍａｇｅＪのプラグインを用いた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明のフィルム状ソフトマテリアル及び蛍光フィルム基材を用いる応力計測方法により、物体として細胞を用いる場合、細胞外環境の力学特性変化に対する組織応答のメカニズム解明、および、組織の疾患・損傷モデル等とするために求められる、細胞が発生する応力を長期間安定に計測することが可能となる。また、本発明のフィルム状ソフトマテリアル及び蛍光フィルム基材は、細胞培養用のフィルム基材としても利用可能性がある。これまで明らかとなっていなかったＥＣＭ力学特性に対する細胞・組織の認識・応答メカニズムの解明が期待できる。再生医療の観点からは、損傷・疾病モデルとすることで、組織再生に最適な足場材料の力学特性をスクリーニングできる。
【符号の説明】
【００５３】
１、２、３・・・蛍光フィルム基材、１１、１４・・・フィルム状ソフトマテリアル，１２・・・基材、１３・・・細胞接着層、１３’・・・ＰＤＬ溶液、１３”・・・ｓｕｌｆｏ−ＳＡＮＰＡＨ溶液、１５・・・物体，１６・・・ガラス基板、１７・・・スペーサー、１８・・・モノマー液、１９・・・シール基板、２１・・・マスク、２２・・・光透過エリア、２３・・・光透過基板、３１・・・低蛍光強度領域、３２・・・高蛍光強度領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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