(57)【要約】      （修正有）【課題】長鎖脂肪酸の生産に関与するタンパク質、長鎖脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体、並びに、長鎖脂肪酸若しくはこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させた脂質の製造方法、の提供。【解決手段】下記（Ａ）〜（Ｃ）の群から選ばれるいずれかのタンパク質、下記（Ａ）〜（Ｃ）の群より選ばれるいずれか１種のタンパク質をコードする遺伝子を含む形質転換体、並びに、下記（Ａ）〜（Ｃ）の群より選ばれるいずれか１種のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を産生させる脂質の製造方法；（Ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、Δ５エロンガーゼ活性を有するタンパク質、（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列を有し、かつ、Δ５エロンガーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか１種のタンパク質。
（Ａ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ５エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつΔ５エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
下記ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれるいずれか１つからなる遺伝子。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ５エロンガーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有し、かつΔ５エロンガーゼ活性を有するＤＮＡ。
【請求項４】
下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか１種のタンパク質をコードする遺伝子、又は下記ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれるいずれか１つからなる遺伝子を含んでなる、形質転換体。
（Ａ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ５エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつΔ５エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ５エロンガーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有し、かつΔ５エロンガーゼ活性を有するＤＮＡ。
【請求項５】
前記形質転換体がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類の形質転換体である、請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
前記形質転換体の宿主が、本来炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸の産生能を有さない微生物である、請求項４又は５に記載の形質転換体。
【請求項７】
下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか１種のタンパク質をコードする遺伝子、又は下記ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれるいずれか１つの塩基配列からなる遺伝子を導入した形質転換体を培養し、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を産生させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ５エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつΔ５エロンガーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ５エロンガーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有し、かつΔ５エロンガーゼ活性を有するＤＮＡ。
【請求項８】
前記形質転換体がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類の形質転換体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記長鎖脂肪酸が、炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸である、請求項７又は８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質の製造方法、並びにこれに用いるΔ５エロンガーゼタンパク質及び形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素原子数が１８以上の長鎖脂肪酸は炭素原子数や不飽和度によって化学的性質が異なり、様々な用途に用いられている。例えば、エイコサペンタエン酸（eicosapentaenoic acid、以下「ＥＰＡ」ともいう）やドコサペンタエン酸（docosapentaenoic acid、以下「ＤＰＡ」ともいう）、ドコサヘキサエン酸（docosahexaenoic acid、以下、「ＤＨＡ」ともいう）といった長鎖多価不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid、以下、「ＰＵＦＡ」ともいう）の多くは、動物の生体内では合成できない必須脂肪酸であることが知られている。よってＰＵＦＡは栄養学的用途に特に有用であり、機能性食品などに用いられている。
【０００３】
一般に植物の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在する。葉緑体ではアセチル−アシルキャリアプロテイン（acyl carrier protein、以下「ACP」ともいう）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素原子数が１８程度のアシル-ACP（脂肪酸残基であるアシル基とACPとからなる複合体）が合成される。合成されたアシル-ACPは、アシル-ACPチオエステラーゼによって遊離脂肪酸となり、小胞体に運ばれる。そして小胞体上で、遊離脂肪酸、アシル−ＣｏＡ、又は脂肪酸とグリセロールとのエステル化合物を基質とし、多数のデサチュラーゼ（Desaturase）やエロンガーゼ（Elongase）が作用する多段階反応によって、ＰＵＦＡが合成される。
【０００４】
近年、持続可能な社会の実現に向けて再生可能エネルギーに関する研究、開発が推し進められている。特に光合成微生物は、二酸化炭素の削減効果に加えて、穀物と競合しないバイオ燃料生物として期待されている。
この中で、とりわけ、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産能力や脂質蓄積能力を有するとの報告もある。
【０００５】
前述のように、脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたる。そのため、植物や細菌等の宿主において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素原子数（鎖長）や不飽和結合数（不飽和度）に依存するため、脂肪酸の炭素原子数や不飽和結合数を制御する試みも行われている。
一般的にＰＵＦＡの生産性向上には、エロンガーゼの強化が有効であると考えられており、エロンガーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換体を用いて様々なＰＵＦＡを製造する方法が提案されている。例えば、オストレオコッカス・タウリ（Ostreococcus tauri）由来のΔ５−エロンガーゼ（配列番号２９）をコードする遺伝子（配列番号３）を油糧酵母に導入して作製した形質転換体や、ピラミモナス・コーダタ（Pyramimonas cordata）由来のΔ５−エロンガーゼ（配列番号３０）をコードする遺伝子（配列番号４）を植物細胞に導入して作製した形質転換体を用いて、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡなどのＰＵＦＡを製造することが知られている（特許文献１及び２参照）。また、トラウストキトリウム・エスピー（Thraustochytrium sp.）由来のΔ５−エロンガーゼ（配列番号３１）やこれをコードする遺伝子（配列番号５）も知られている（特許文献３参照）。
【０００６】
一方、次世代の油脂生産源として注目を集めている微細藻類の一種であるナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類由来のデサチュラーゼが、ＥＰＡなどのＰＵＦＡの合成に使用できることが知られている（特許文献４、非特許文献１及び２参照）。しかし、ナンノクロロプシス属に属する藻類では炭素原子数が２０までのＰＵＦＡしか製造することができず、炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸の生産能を有する形質転換体について未だ報告はされていない。
【０００７】
このように、藻類の脂質合成や蓄積のメカニズム、並びに藻類の脂質生産能力や脂質蓄積能力を応用した脂質生産技術について研究が始まっており、藻類において所望の炭素原子数を有するＰＵＦＡに富む脂質を効率的に産生させる方法に対しては、当技術分野における需要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０５７２４６号
【特許文献２】国際公開第２００６／０５２８７０号
【特許文献３】国際公開第２０１０／１０１２２０号
【特許文献４】国際公開第２０１２／１４９４５７号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Yuval Kaye，et  al.，Algal Research，2015，Vol．11，p．387-398
【非特許文献２】MA Xiaolei，et  al.，Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2011，Vol．29(2)，p．290-296
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、長鎖脂肪酸の生産に関与するタンパク質を提供することを課題とする。
また本発明は、長鎖脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体を提供することを課題とする。
さらに本発明は、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させた、脂質の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。
ナンノクロロプシス属に属する藻類はＥＰＡなどのＰＵＦＡの生産性に優れる。しかし、ナンノクロロプシス属に属する藻類では、炭素原子数が２０までの脂肪酸の産生能しか有しておらず、炭素原子数が２０を超える長鎖の脂肪酸は産生することができない。
そこで本発明者らは、ナンノクロロプシス属などの不等毛植物に属する藻類において、炭素原子数が２０を超えるＰＵＦＡ及びこれを構成成分とする脂質の製造を可能とするタンパク質（酵素）の探索を行った。その結果、サルシノクリシス・マリナ（Sarcinochrysis marina）のゲノム配列を解析し、脂肪酸の鎖長伸長を促進する酵素の１種としてΔ５エロンガーゼ（以下、「Δ5-ELO」ともいう）の候補物質を複数特定した。そして、これらの候補物質の中から、ナンノクロロプシス属に属する藻類において炭素原子数が２０を超えるＰＵＦＡの製造を可能とするΔ5-ELO及びこれをコードする遺伝子（以下、「Δ5-ELO遺伝子」ともいう）を見出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
【００１２】
本発明は、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか１種のタンパク質に関する。
（Ａ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ５エロンガーゼ活性（以下、「Δ5-ELO活性」ともいう）を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質。
【００１３】
また本発明は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子を含んでなる、形質転換体に関する。
さらに本発明は、前記形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を産生させる、脂質の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のタンパク質は、炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸の生産に関与できる。
よって、本発明によれば、炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体を提供できる。さらに、本発明の脂質の製造方法によれば、炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】藻類や植物でのＰＵＦＡの一般的な合成経路を示す図である。
【図２】図２（Ａ）は野生型ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）NIES-2145株の培養細胞から抽出した総脂質のガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データを示すグラフである。図２（Ｂ）はナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株に本発明のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体の培養細胞から抽出した総脂質のガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データを示すグラフである。図２（Ｃ）はナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株に本発明のタンパク質をコードしない遺伝子を導入して得られた形質転換体の培養細胞から抽出した総脂質のガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データを示すグラフである。図２（Ｄ）は標品（Ｃ２２：５）のガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書における「脂質」は、中性脂質（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸（遊離脂肪酸）、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
一般に誘導脂質に分類される脂肪酸は、脂肪酸そのものを指し、「遊離脂肪酸」を意味する。本発明では単純脂質及び複合脂質分子中の脂肪酸部分を「脂肪酸残基」と表記する。そして、特に断りのない限り、「脂肪酸」は「遊離脂肪酸」と「脂肪酸残基」の総称として用いる。
また本明細書において、「脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質」は、「遊離脂肪酸」と「当該脂肪酸残基を有する脂質」を総称して用いる。更に本明細書において、「脂肪酸組成」とは、前記遊離脂肪酸と脂肪酸残基とを合計した全脂肪酸（総脂肪酸）の分子数に対する各脂肪酸の分子数の割合を意味する。脂肪酸の重量（生産量）や脂肪酸組成は、実施例で用いた方法により測定できる。
さらに本明細書において、脂肪酸や、脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Cx:y」とあるのは、炭素原子数xで二重結合の数がyであることを表す。「Cx」は炭素原子数xの脂肪酸やアシル基を表す。
【００１７】
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、Unit  size  to  compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W．Russell.，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
さらに明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
【００１８】
植物や藻類におけるＰＵＦＡの合成経路を、図１に示す。ナンノクロロプシス属に属する藻類は、図１に記載の長鎖脂肪酸のうち、炭素原子数が２０までの脂肪酸（アラキドン酸、ＥＰＡなど）の生産能しか有しない。
宿主が、本来炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸の産生能を有しない生物種であっても、Δ5-ELOやω3-DES、Δ4-FADをコードする特定の遺伝子を導入することで、炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸の生産能を獲得させることができることを見出した。
【００１９】
本発明では、Δ5-ELOとして前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）を用いる。
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）は、炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸の合成に関与するタンパク質の１種であり、炭素原子数が２０のアラキドン酸やＥＰＡなどの脂肪酸から、炭素原子数が２２のドコサテトラエン酸やＤＰＡといった脂肪酸への伸長反応を触媒する脂肪酸伸長酵素である。
配列番号２７のアミノ酸配列からなる前記タンパク質（Ａ）は、サルシノクリシス（Sarcinochrysis）属に属する藻類であるサルシノクリシス・マリナLB1720株由来のΔ5-ELOである。本発明の配列番号２７のアミノ酸配列からなるタンパク質（前記タンパク質（Ａ））がΔ5-ELO活性を示すことは、後述の実施例で説明する。
なお、配列番号２７で表されるアミノ酸配列は、既知のΔ5-ELOであるオストレオコッカス・タウリ由来のΔ5-ELO（配列番号２９）、ピラミモナス・コーダタ由来のΔ5-ELO（配列番号３０）、及びトラウストキトリウム・エスピー由来のΔ5-ELO（配列番号３１）のアミノ酸配列に対して、それぞれ35.57%、27.16%、及び30.32%の同一性を示す。
【００２０】
一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このようにΔ5-ELO活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したタンパク質を用いることができる。
【００２１】
前記タンパク質（Ｂ）において、Δ5-ELO活性の点から、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９１％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記タンパク質（Ｂ）として、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１００個以下、好ましくは１個以上８７個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上５０個以下、より好ましくは１個以上３７個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上１２個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個又は２個）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
【００２２】
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing  overlap  extension（SOE）PCR（Horton  et  al.，Gene  77，61−68，1989）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh  et  al.，Gene，152，271-276，1995））、Kunkel法（Kunkel，T.  A.，Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA，1985，82，488）等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clontech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
【００２３】
前記タンパク質（Ｃ）は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列にタンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチド、又はタンパク質の安定性を高める既知のアミノ酸配列等が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
【００２４】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、サルシノクリシス・マリナ等、ゲノム上にΔ5-ELO遺伝子を有する藻類から単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号２７で表されるアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）を作製してもよい。
また本発明で用いるΔ5-ELOは、１種でもよいし、２種以上のΔ5-ELOを組合せて用いてもよい。
サルシノクリシス・マリナ等の藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。例えば、サルシノクリシス・マリナLB1720株は、テキサス大学（米国）の藻類カルチャーコレクション（https://utex.org/）から入手することができる。
【００２５】
本明細書において「Δ5-ELO活性」とは、炭素原子数２０の脂肪酸から、炭素原子数２２の脂肪酸への伸長反応を触媒する活性を意味する。本発明のタンパク質がΔ5-ELO活性を有することは、例えば、大腸菌やナンノクロロプシス属に属する藻類等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にΔ5-ELO遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞に導入し、導入したΔ5-ELO遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
また、大腸菌やナンノクロロプシス属に属する藻類等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にΔ5-ELO遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入したΔ5-ELO遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92(23), p. 10639-10643）によって調製した各種アシル-ACPを基質とした反応を行うことにより、Δ5-ELO活性を測定することができる。
【００２６】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子（以下、「Δ5-ELO遺伝子」ともいう）の具体例として、下記ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有し、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２７】
配列番号１で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡ（ａ）は、配列番号２７のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（以下、「Δ5-ELO-1遺伝子」ともいう）であり、サルシノクリシス・マリナLB1720株由来のΔ5-ELO遺伝子である。
なお、配列番号１で表される塩基配列は、既知のΔ5-ELO遺伝子であるオストレオコッカス・タウリ由来のΔ5-ELO遺伝子（配列番号３）、ピラミモナス・コーダタ由来のΔ5-ELO遺伝子（配列番号４）、及びトラウストキトリウム・エスピー由来のΔ5-ELO遺伝子（配列番号５）と、それぞれ50.39%、49.51%、及び54.79%の同一性を示す。
【００２８】
前記ＤＮＡ（ｂ）において、Δ5-ELO活性の点から、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９１％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｂ）として、配列番号１で表される塩基配列において、１又は複数個（例えば１個以上３０１個以下、好ましくは１個以上２６３個以下、より好ましくは１個以上２２５個以下、より好ましくは１個以上１８８個以下、より好ましくは１個以上１５０個以下、より好ましくは１個以上１１２個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上６７個以下、より好ましくは１個以上５２個以下、より好ましくは１個以上３７個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上７個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
【００２９】
変異としては、塩基の欠失、置換、付加、又は挿入が挙げられる。塩基配列に変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、SOE-PCRを利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed  Mutagenesis  System  Mutan-SuperExpress  Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer  TM  Site-Directed  Mutagenesisキット（Clontech社）、KOD-Plus-Mutagenesis  Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
【００３０】
前記ＤＮＡ（ｃ）は、前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列にタンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチド、又はタンパク質の安定性を高める既知のアミノ酸配列等をコードするＤＮＡが付加された塩基配列からなる遺伝子であってもよい。
【００３１】
前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号２７で表されるアミノ酸配列又は配列番号１で表される塩基配列に基づいて、Δ5-ELO遺伝子を人工的に合成できる。Δ5-ELO遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸を含有する藻類のゲノムからクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。また、使用する宿主の種類に応じて、配列番号１で表される塩基配列の一部を最適化してもよい。例えば、Thermo Fisher Scientific社のGeneArt人工遺伝子合成サービスを利用することができる。
また本発明で用いるΔ5-ELO遺伝子は、１種でもよいし、２種以上のΔ5-ELO遺伝子を組合せて用いてもよい。
【００３２】
本発明の形質転換体は、前記Δ5-ELO遺伝子を常法により前記宿主に導入することで得ることができる。具体的には、前記遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる組換えベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。本発明の形質転換体において、当該遺伝子の発現が促進されていることが好ましい。
【００３３】
また、本発明の形質転換体は、前記Δ5-ELO遺伝子をゲノム上に有する宿主において、常法により当該遺伝子の発現調節領域を改変して、当該遺伝子の発現を促進させることで得ることができる。具体的には、当該宿主のゲノム上に存在するΔ5-ELO遺伝子の上流に位置するプロモーター配列を、より高いプロモーター活性を示すものに置換すること等で作製できる。
なお本明細書において、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させたものを「形質転換体」ともいい、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。
【００３４】
本発明で用いる形質転換体は、宿主自体に比べ、炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上する。またその結果、当該形質転換体では、脂質中の脂肪酸組成が改変される。そのため、当該形質転換体を用いた本発明は、特定の炭素原子数の脂質、特に長鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質、好ましくは炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質、より好ましくはＣ２２：４、Ｃ２２：５若しくはＣ２２：６の脂肪酸並びにこれを構成成分とする脂質、より好ましくはＣ２２：４若しくはＣ２２：５の脂肪酸並びにこれを構成成分とする脂質、の生産に好適に用いることができる。
さらに、炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸の産生能を有さない宿主に前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子を導入することで、宿主に炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸の産生能を付与することができる。
なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産性については、実施例で用いた方法により測定することができる。
【００３５】
本発明の形質転換体の作製方法について説明する。しかし本発明は、これに制限するものではない。
【００３６】
形質転換体の宿主としては通常用いられるものより適宜選択することができる。本発明で用いることができる宿主としては、微生物（藻類や微細藻類を含む）、植物体、及び動物体が挙げられる。
【００３７】
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属の微生物やバシラス（Bacillus）属の微生物、シネコシスティス（Synechocystis）属の微生物、シネココッカス（Synechococcus）属のシアノバクテリア等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂肪酸の生産性の観点から、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、又はモルチエレラ・エスピー（Mortierella sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
藻類や微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類、クロレラ（Chlorella）属の藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属の藻類、又はナンノクロロプシス属の藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属の藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・オキュラータ(Nannochloropsis oculata)、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス・アトムス（Nannochloropsis atomus）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Nannochloropsis maculata）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis sp．）等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オセアニカ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オセアニカがより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、西洋アブラナ（Brassica napus）、アブラナ（Brassica rapa）、ココヤシ（Cocos nucifera）、パーム（Elaeis guineensis）、クフェア、ダイズ（Glycine max）、トウモロコシ（Zea mays）、イネ（Oryza sativa）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、クスノキ（Cinnamomum camphora）、又はヤトロファ（Jatropha curcas）が好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
なお、ナンノクロロプシス・オセアニカ等の藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株は、国立環境研究所（NIES）から入手することができる。
【００３８】
本発明の形質転換体が、前記Δ5-ELO遺伝子などを常法により前記宿主に導入することで得られる場合、本発明の形質転換体の宿主は、本来炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸の産生能を有しない生物、換言すると炭素原子数が２１以上の長鎖脂肪酸を生産しない生物であることが好ましい。炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸の産生能を有しない生物としては、例えばナンノクロロプシス属に属する藻類、クロレラ属に属する藻類、タラシオシラ（Thalassiosira）属に属する珪藻、サッカロマイセス（Saccharomyces）属に属する酵母、藍藻類等が挙げられる。宿主が炭素原子数２０を超える長鎖脂肪酸の産生能を有しないことは、宿主細胞における脂肪酸組成を、実施例に記載の方法により測定すること等で確認できる。
【００３９】
遺伝子発現用プラスミド又は遺伝子発現カセットの母体となるベクター（プラスミド）としては、目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で目的の遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、使用する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
本発明で好ましく用いることができる発現用ベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS) II SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（1986, Plasmid 15(2), p. 93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、及びpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript II SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
【００４０】
藻類又は微細藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC18（タカラバイオ社製）、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas Center）、P-322（Chlamydomonas Center）、pPha-T1（Journal of Basic Microbiology, 2011, vol. 51, p. 666-672参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pUC18、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)の記載の方法を参考にして、目的の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。
植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、及びIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナなどの植物細胞の場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
【００４１】
また、前記発現ベクターに組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaA及びpsaB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、c-phycocyanin  βサブユニット（cpcB）、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、西洋アブラナ又はアブラナ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)）、及びナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクLDSP（lipid droplet surface protein）遺伝子のプロモーター（PLOS Genetics, 2012; 8(11): e1003064. doi: 10. 1371）が挙げられる。本発明で宿主としてシロイヌナズナなどの植物細胞を用いる場合、西洋アブラナ又はアブラナ由来Napin遺伝子プロモーターを好ましく用いることができる。
また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
【００４２】
目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
また、形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。
【００４３】
目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
【００４４】
前記Δ5-ELO遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域を改変して、当該遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
「発現調節領域」とは、プロモーター、ターミネーター、及び非翻訳領域を示し、これらの配列は一般に隣接する遺伝子の発現量（転写量、翻訳量）の調節に関与している。ゲノム上に前記Δ5-ELO遺伝子を有する宿主においては、当該遺伝子の発現調節領域を改変して当該遺伝子の発現を促進させることで、炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸の生産性を向上させることができる。
【００４５】
発現調節領域の改変方法としては、例えばプロモーターの入れ替えが挙げられる。ゲノム上に前記Δ5-ELO遺伝子などを有する宿主において、当該遺伝子のプロモーターを、より転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、当該遺伝子の発現を促進させることができる。
前記宿主としては、前述した生物種のうち、ゲノム上にΔ5-ELO遺伝子などを有するものを好適に用いることができる。
【００４６】
プロモーターの入れ替えに用いるプロモーターとしては特に限定されず、Δ5-ELO遺伝子のプロモーターよりも転写活性が高く、長鎖脂肪酸の生産に適したものから適宜選択することができる。
宿主としてナンノクロロプシスを用いる場合には、チューブリンプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）、及びナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ遺伝子のプロモーターを好ましく用いることができる。長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性向上の観点から、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター及びＬＤＳＰ遺伝子のプロモーターがより好ましい。
【００４７】
前述のプロモーターの改変は、相同組換えなどの常法に従い行うことができる。具体的には、標的とするプロモーターの上流、下流領域を含み、標的プロモーターに代えて別のプロモーターを含む直鎖状のＤＮＡ断片を構築し、これを宿主細胞に取り込ませ、宿主ゲノムの標的プロモーターの上流側と下流側とで２回交差の相同組換えを起こす。その結果、ゲノム上の標的プロモーターが別のプロモーター断片と置換され、プロモーターを改変することができる。
このような相同組換えによる標的プロモーターの改変方法は、例えば、Methods in molecular biology,1995, vol. 47, p. 291-302等の文献を参考に行うことができる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)等の文献を参考にして、相同組換え法によりゲノム中の特定の領域を改変することができる。
【００４８】
本発明の形質転換体は、炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸の生産性が、前記Δ5-ELO遺伝子などの発現が促進されていない宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養又は栽培し、次いで得られた培養物又は生育物から炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸を回収すれば、炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸を効率よく製造することができる。
ここで「培養物」とは培養した後の培養液及び形質転換体をいい、「生育物」とは生育した後の形質転換体をいう。
【００４９】
本発明の形質転換体の培養条件は、形質転換体の宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。また脂肪酸の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はマロン酸等を添加してもよい。
大腸菌を宿主として用いる場合、形質転換体の培養は、例えば、ＬＢ培地又はOvernight Express Instant TB Medium（Novagen社）で、３０〜３７℃、０．５〜１日間培養することができる。
また、シロイヌナズナを宿主として用いる場合、形質転換体の培養は、例えば、土壌で温度条件２０〜２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１〜２か月間栽培することができる。
【００５０】
宿主として藻類を用いる場合、培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する形質転換体の量は適宜選択することができ、生育性の点から培地当り１〜５０％（vol/vol）が好ましく、１〜１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは１５〜３０℃である。
また藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、好ましくは１００〜５０，０００ルクスの範囲、より好ましくは３００〜１０，０００ルクスの範囲、さらに好ましくは１，０００〜６，０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８〜２４時間、より好ましくは１０〜１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）〜１０％が好ましく、より好ましくは０．０５〜５％、さらに好ましくは０．１〜３％、よりさらに好ましくは０．３〜１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１〜５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５〜２質量％、さらに好ましくは０．１〜１質量％である。
培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３〜９０日間、より好ましくは３〜３０日間、さらに好ましくは７〜３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、振とう培養が好ましい。
【００５１】
培養物又は生育物から脂肪酸を採取する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物、生育物又は形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂肪酸を単離、回収することができる。より大規模な培養を行った場合は、培養物、生育物又は形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂肪酸を得ることができる。
また、同様の方法で脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
【００５２】
本発明の製造方法により得られる脂肪酸は、食用として用いる他、可塑剤、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
【００５３】
本発明は、Δ5-ELO遺伝子などを含有する組換えベクターを含んでなる、形質転換体の作製用キットも提供する。なお本発明のキットは、前記組換えベクターの他、宿主、前記ベクターで宿主を形質転換するために通常用いられる試薬、形質転換用緩衝液、形質転換体を選抜するための指標となる試薬等、形質転換体の作製の検出に必要な他の要素を含んでいてもよい。
【００５４】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下のタンパク質、遺伝子、形質転換体、方法を開示する。
【００５５】
＜１＞下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか１種のタンパク質。
（Ａ）配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上のアミノ酸配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質。
【００５６】
＜２＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１００個以下、より好ましくは１個以上８７個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上５０個以下、より好ましくは１個以上３７個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上１２個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個又は２個、のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質である、前記＜１＞項に記載のタンパク質。
＜３＞前記タンパク質（Ｃ）が、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列に、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチド、又はタンパク質の安定性を高める既知のアミノ酸配列等が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である、前記＜１＞又は＜２＞項に記載のタンパク質。
＜４＞前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
＜５＞下記ＤＮＡ（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれるいずれか１つからなる遺伝子。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有し、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜６＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上３０１個以下、より好ましくは１個以上２６３個以下、より好ましくは１個以上２２５個以下、より好ましくは１個以上１８８個以下、より好ましくは１個以上１５０個以下、より好ましくは１個以上１１２個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上６７個以下、より好ましくは１個以上５２個以下、より好ましくは１個以上３７個以下、より好ましくは１個以上２２個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上７個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ5-ELO活性を有するタンパク質コードするＤＮＡである、前記＜５＞項に記載の遺伝子。
＜７＞前記ＤＮＡ（ｃ）が、前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列に、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチド、又はタンパク質の安定性を高める既知のアミノ酸配列等をコードする遺伝子が付加された塩基配列からなるＤＮＡである、前記＜５＞又は＜６＞項に記載の遺伝子。
【００５７】
＜８＞前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子、又は前記＜４＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の遺伝子を含有する、組換えベクター又は遺伝子発現カセット。
＜９＞前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子、又は前記＜４＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の遺伝子の発現が促進されている、形質転換体。
＜１０＞前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子、又は前記＜４＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の遺伝子を含んでなる、形質転換体。
＜１１＞前記＜８＞項に記載の組換えベクター又は遺伝子発現カセットを宿主に導入する、形質転換体の作製方法。
＜１２＞前記＜８＞項に記載の組換えベクター又は遺伝子発現カセットを宿主に導入し、形質転換体に炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の産生能を付与する方法。
＜１３＞前記形質転換体が、微生物の形質転換体である、前記＜１０＞〜＜１２＞のいずれか１項に記載の形質転換体又は方法。
＜１４＞前記微生物が、大腸菌又はナンノクロロプシス属の藻類である、前記＜１３＞に記載の形質転換体又は方法。
＜１５＞前記形質転換体の宿主が、ゲノム上にΔ5-ELO遺伝子を有しない微生物である、前記＜９＞〜＜１４＞のいずれか１項に記載の形質転換体又は方法。
＜１６＞前記形質転換体の宿主が、本来炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸、好ましくはＣ２２：４、Ｃ２２：５若しくはＣ２２：６の脂肪酸、より好ましくはＣ２２：４及びＣ２２：５の脂肪酸、の産生能を有さない微生物である、前記＜９＞〜＜１５＞のいずれか１項に記載の形質転換体又は方法。
【００５８】
＜１７＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか１種のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を産生させる、脂質の製造方法。
＜１８＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか１種のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を産生させる、脂質の製造方法。
＜１９＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか１種のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養して、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂肪酸産生の向上方法。
＜２０＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか１種のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養して、長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂肪酸産生の向上方法。
＜２１＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか１種のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養して、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂肪酸の組成の改変方法。
＜２２＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか１種のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養して、形質転換体の細胞内で生産される長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂肪酸の組成の改変方法。
【００５９】
＜２３＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるいずれか１種のタンパク質をコードする遺伝子が、前記＜４＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の遺伝子である、前記＜１７＞〜＜２２＞のいずれか１項に記載の方法。
＜２４＞前記形質転換体が微生物の形質転換体である、前記＜１７＞〜＜２３＞のいずれか１項に記載の方法。
＜２５＞前記微生物が大腸菌又はナンノクロロプシス属に属する藻類である、前記＜２４＞に記載の方法。
＜２６＞前記長鎖脂肪酸が、炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸である、好ましくはＣ２２：４、Ｃ２２：５若しくはＣ２２：６の脂肪酸、より好ましくはＣ２２：４及びＣ２２：５の脂肪酸である、前記＜１７＞〜＜２５＞のいずれか１項に記載の方法。
【００６０】
＜２７＞前記＜８＞項に記載の組換えベクター又は遺伝子発現カセットを含んでなる、形質転換体の作製用キット。
＜２８＞長鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を製造するための、前記＜１＞〜＜２７＞のいずれか１項記載のタンパク質、遺伝子、ベクター、形質転換体、形質転換体の作製方法、又は形質転換体の作製用キットにより得られた形質転換体の使用。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いたプライマーの塩基配列を表１に示す。
【００６２】
【表１】
2019216643.tif 000002
【００６３】
実施例１  サルシノクリシス・マリナ由来Δ5-ELO遺伝子発現プラスミドの作製、ナンノクロロプシスへの形質転換、及び形質転換体による脂質の製造
（１）ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
ゼオシン耐性遺伝子（配列番号７）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示すプライマー番号１４及びプライマー番号１５のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子を増幅した。また、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号１６及びプライマー番号１７のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＶＣＰ２プロモーター配列（配列番号６）を増幅した。さらに、プラスミドベクターpUC18（タカラバイオ社製）を鋳型として、表に示すプライマー番号１８及びプライマー番号１９のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、プラスミドベクターpUC18を増幅した。
これら３つの増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）にて処理し、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した。その後、得られた３つの断片をIn-Fusion  HD  Cloning  Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドは、ＶＣＰ２プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子の順に連結したインサート配列とpUC18ベクター配列からなる。
【００６４】
（２）サルシノクリシス・マリナ由来Δ5-ELO遺伝子の取得、及びΔ5-ELO遺伝子発現用プラスミドの構築
ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号２０とプライマー番号２１のプライマー対、及びプライマー番号２２とプライマー番号２３のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ＶＣＰ１プロモーター断片（配列番号８）及びＶＣＰ１ターミネーター断片（配列番号９）を取得した。さらに、前記ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号１８及びプライマー番号２４のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（ＶＣＰ２プロモーター配列、並びにゼオシン耐性遺伝子）及びpUC18配列からなる断片を増幅した。
ＶＣＰ１プロモーター断片、ＶＣＰ１ターミネーター断片、並びにゼオシン耐性遺伝子発現カセット及びpUC18配列からなる断片、を前述と同様の方法にて融合し、Δ5-ELO遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドは、ＶＣＰ２プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ＶＣＰ１プロモーター配列、及びＶＣＰ１ターミネーター断片の順に連結したインサート配列とpUC18ベクター配列からなる。
【００６５】
次に、サルシノクリシス・マリナLB1720株の全ＲＮＡを抽出し、SuperScript（商標）  III  First-Strand  Synthesis  SuperMix  for  qRT-PCR（invitrogen社製）を用いて逆転写を行ってｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを鋳型として、表１に示すプライマー番号３２とプライマー番号３３のプライマー対、及びプライマー番号３４とプライマー番号３５のプライマー対をそれぞれ用いたＰＣＲにより、配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子（Δ5-ELO-1遺伝子）断片、及び配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子（以下、「Δ5-ELO-2遺伝子」ともいう）断片をそれぞれ取得した。
なお、Δ5-ELO-1遺伝子及びΔ5-ELO-2遺伝子はともに、サルシノクリシス・マリナLB1720株のゲノム情報に対して、既知の脂肪酸エロンガーゼとして報告、登録されているアミノ酸配列との類似性比較解析から推定することで、同定された遺伝子である。
ここで、配列番号１で表される塩基配列に対する配列番号２で表される塩基配列の同一性は、５４．６３％である。また、配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２７）に対する、配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２８）の同一性は、３０．６２％である。また、配列番号２８で表されるアミノ酸配列は、既知のΔ5-ELOであるオストレオコッカス・タウリ由来のΔ5-ELO（配列番号２９）、ピラミモナス・コーダタ由来のΔ5-ELO（配列番号３０）、及びトラウストキトリウム・エスピー由来のΔ5-ELO（配列番号３１）のアミノ酸配列に対して、それぞれ30.73%、26.91%、及び36.09%の同一性を示す。
【００６６】
Δ5-ELO-1遺伝子PCR断片を鋳型として、表１に示すプライマー番号１０とプライマー番号１１のプライマー対を、また、Δ5-ELO-2遺伝子PCR断片を鋳型として、表１に示すプライマー番号１２とプライマー番号１３のプライマー対をそれぞれ用いたＰＣＲにより、各エロンガーゼ遺伝子PCR断片の両末端にΔ5-ELO遺伝子発現用プラスミドに相同な15塩基からなる塩基配列を付加した目的遺伝子のPCR断片を得た。得られたPCR断片と、制限酵素NotIで切断したΔ5-ELO遺伝子発現用プラスミド断片を前述と同様の方法にて融合し、Δ5-ELO-1遺伝子発現用プラスミド、及びΔ5-ELO-2遺伝子発現用プラスミドをそれぞれ構築した。なお、本発現プラスミドはＶＣＰ２プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ＶＣＰ１プロモーター配列、各エロンガーゼ遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター断片とpUC18ベクター配列からなる。
【００６７】
（３）エロンガーゼ遺伝子発現カセットのナンノクロロプシスへの導入、形質転換体の培養
前記Δ5-ELO-1遺伝子発現用プラスミド及びΔ5-ELO-2遺伝子発現用プラスミドをそれぞれ鋳型として、表１に示すプライマー番号２５及びプライマー番号２６のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、各エロンガーゼ遺伝子発現カセット（Δ5-ELO-1遺伝子発現カセット及びΔ5-ELO-2遺伝子発現カセット：ＶＣＰ２プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ＶＣＰ１プロモーター配列、各エロンガーゼ遺伝子、ＶＣＰ１ターミネーター断片からなるＤＮＡ断片）をそれぞれ増幅した。増幅した両断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
【００６８】
約１０９細胞のナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株を、３８４ｍＭのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅した各エロンガーゼ遺伝子発現カセット約５００ｎｇをそれぞれ宿主細胞に混和し、５０μＦ、５００Ω、２，２００ｖ／２ｍｍの条件でエレクトロポレーションを行った。ｆ／２液体培地（ＮａＮＯ３  ７５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ６ｍｇ、ビタミンＢ１２  ０．５μｇ、ビオチン  ０．５μｇ、チアミン  １００μｇ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ、Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ  ４．４ｍｇ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  ３．１６ｍｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  １２μｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２１μｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  １８０μｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ７μｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ７μｇ／人工海水１Ｌ）にて２４時間回復培養を行った後に、２μｇ／ｍＬのゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、２５℃、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーの中から、Δ5-ELO-1遺伝子発現用カセットを導入したナンノクロロプシス形質転換株（以下、「Δ5-ELO-1株」ともいう）及びΔ5-ELO-2遺伝子発現用カセットを導入したナンノクロロプシス形質転換株（以下、「Δ5-ELO-2株」ともいう）をＰＣＲ法によりそれぞれ選抜した。
【００６９】
選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を２倍に増強した培地（以下Ｆ２Ｎ培地）２０ｍＬに播種し、２５℃、２４ｈ明暗条件にて１週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液から、初期藻体濃度2.0×107cells/mLになるようにＦ２Ｎ培地２００ｍＬに植菌し、２５℃、２４ｈ明暗条件にて３日間週間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株であるNIES-2145株についても同様に実験を行った。それぞれの株についてＮ＝３で培養を行った。
【００７０】
（４）ナンノクロロプシス培養液中の脂肪酸の抽出及び構成脂肪酸の分析
培養液２５ｍＬを遠心回収し、藻体を沈殿させた後、０．５ｍＬのクロロホルム及び１ｍＬのメタノールを培養液に添加して激しく攪拌後１０分間放置した。その後、反応液を３，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、沈殿を除いた。得られた上清に０．５ｍＬのクロロホルム及び０．９ｍＬの１％ＫＣｌを添加して攪拌後、３，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離することで２層に分離させ、クロロホルム層（下層）を回収した。得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固した。クロロホルム／メタノール溶液（クロロホルム：メタノール=１：２）を５０μＬ添加し、沈殿を溶解した後、１００μＬの１ｍＭ Ｃ１５：０と０．５ｍＬの塩酸メタノールを添加し、８５℃にて１時間恒温した。その後、ヘキサン０．５ｍＬを添加し激しく撹拌し、３，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離することで２層に分離させ、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。
【００７１】
得られた脂肪酸エステルに窒素ガスを吹き付け６０μＬまで濃縮した後、ガスクロマトグラフィー解析に供した。測定条件を以下に示す。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
分析装置：GC-2014（SHIMADZU社製）
キャピラリーカラム：ULBON-HR-SS-10（25m、内径0.25mm、膜厚0.25μm、信和化工株式会社製）
移動相：高純度ヘリウム
オーブン温度：180℃  保持21分→220℃（20℃/min昇温）→220℃  保持７分
注入口温度：250℃
注入方法：スプリット注入（スプリット比：68.8：1）
注入量：3μＬ
洗浄バイアル：ヘキサン
検出方法：ＦＩＤ
検出器温度：250℃
【００７２】
また、脂肪酸エステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析に供することにより行った。野生株と各形質転換体における各脂肪酸メチルエステルについて、ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データを、標品（Ｃ２２：５）データと併せて図２に示す。
また、図２の波形データのピーク面積より、内部標準として用いたＣ１５：０の値を指標に各脂肪酸のメチルエステル量比を算出した。その結果を表２に示す。なお、下記表２において、「脂肪酸組成（％ＴＦＡ）」は総脂肪酸の面積値に対する各脂肪酸メチルエステルの面積値の比を示す。また、「Ｃｘ：ｙ」は、炭素原子数ｘで二重結合数がｙの脂肪酸を表す。また、「ｎ」とは不飽和脂肪酸のオメガ末端からn番目の炭素に一つ目の不飽和結合が存在することを示し、「ｃ」は幾何異性体のシス体であることを示す。
【００７３】
【表２】
2019216643.tif 000003
【００７４】
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データの解析の結果、野生株及びΔ5-ELO-2株では、標品（Ｃ２２：５）由来のピークが出現する位置に脂肪酸エステル由来のピークは検出されなかった（図２（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｄ）参照）。
これに対してΔ5-ELO-1株では、標品（Ｃ２２：５）由来のピークが出現する位置に脂肪酸エステル由来の波形（ピーク）が検出された（図２（Ｂ）参照）。このことから、Δ5-ELO-1遺伝子発現用カセットを導入することで、Δ5-ELO-1株はＣ２２：５の産生能を獲得していることが明らかとなった。
【００７５】
さらに脂肪酸組成について検討した結果、表２から明らかなように、Δ5-ELO-1株では、野生株と比べ、Ｃ２２：４、及びＣ２２：５の割合が大幅に向上した。また、それに対応してΔ5-ELO-1株では野生株と比べ、Ｃ２２：４、及びＣ２２：５の合成の基質となる脂肪酸である、Ｃ２０：４、及びＣ２０：５の割合が減少した。
【００７６】
以上のことから、元来炭素原子数が２０を超える長鎖脂肪酸の産生能を有さない宿主であっても、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することで、長鎖脂肪酸の生産能が向上した形質転換体を得ることができる。
【図１】
2019216643.tif 000004
【図２】
2019216643.tif 000005
【配列表】
2019216643000001.app