(57)【要約】 【課題】血糖値の上昇を抑制するための麹菌又は麹菌由来の酵素、麹菌又は麹菌由来の酵素を用いた血糖値上昇抑制剤、飲食品、医薬組成物、食品添加物、サプリメント及びこれらの製造方法、並びに麹菌又は麹菌由来の酵素を用いた血糖値上昇抑制方法及び細胞への糖取り込み促進方法の提供。【解決手段】血糖値の上昇を抑制するための、麹菌又は麹菌由来の酵素。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血糖値の上昇を抑制するための、麹菌。
【請求項２】
米麹に含まれる、請求項１に記載の麹菌。
【請求項３】
前記血糖値の上昇の抑制は細胞への糖の取り込みを促進することで行われる、請求項１又は請求項２に記載の麹菌。
【請求項４】
血糖値の上昇を抑制するための、麹菌由来の酵素。
【請求項５】
米麹から得られる、請求項４に記載の麹菌由来の酵素。
【請求項６】
前記血糖値の上昇の抑制は細胞への糖の取り込みを促進することで行われる、請求項４又は請求項５に記載の麹菌由来の酵素。
【請求項７】
麹菌又は麹菌由来の酵素を有効成分として含む、血糖値上昇抑制剤。
【請求項８】
麹菌又は麹菌由来の酵素を有効成分として含む、血糖値の上昇を抑制するための飲食品。
【請求項９】
麹菌又は麹菌由来の酵素を有効成分として含む、血糖値の上昇を抑制するための医薬組成物。
【請求項１０】
麹菌又は麹菌由来の酵素を有効成分として含む、血糖値の上昇を抑制するための食品添加物。
【請求項１１】
麹菌又は麹菌由来の酵素を有効成分として含む、血糖値の上昇を抑制するためのサプリメント。
【請求項１２】
麹から麹菌又は麹菌由来の酵素を含む抽出物を抽出する工程を含む、血糖値上昇抑制剤の製造方法。
【請求項１３】
麹菌又は麹菌由来の酵素を飲食品又は飲食品の原料に添加して混合する工程を含む、血糖値の上昇を抑制するための飲食品の製造方法。
【請求項１４】
麹菌又は麹菌由来の酵素と、添加剤又は薬学的に許容可能な担体とを混合する工程を含む、医薬組成物の製造方法。
【請求項１５】
麹菌又は麹菌由来の酵素と、食品用添加物用の他の成分とを混合する工程を含む、血糖値の上昇を抑制するための食品添加物の製造方法。
【請求項１６】
麹菌又は麹菌由来の酵素と、サプリメント用の他の成分とを混合する工程を含む、血糖値の上昇を抑制するためのサプリメントの製造方法。
【請求項１７】
麹菌又は麹菌由来の酵素を体内に摂取させることを含む、血糖値上昇抑制方法。
【請求項１８】
麹菌又は麹菌由来の酵素を体内に摂取させることを含む、細胞への糖取り込み促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麹菌、麹菌由来の酵素、血糖値上昇抑制剤、飲食品、医薬組成物、食品添加物、サプリメント及びこれらの製造方法、並びに血糖値上昇抑制方法及び糖取り込み促進方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、飲食品に含まれる機能性成分の研究とこれを利用した飲食品、栄養補助剤、医薬品等の開発が盛んに進められている。日本の伝統食品である味噌、醤油等の原料となる麹についてもその効能に関する研究成果は多数存在している。
【０００３】
例えば、特許文献１には豆類又は穀類からアスペルギウス属のかびを用いて得られた培養物の水抽出物がα−グルコシダーゼを阻害する活性を有し、これを用いることで血糖値の上昇の抑制等に有用であると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−１６６２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載された発明は、抽出物中の成分がα−グルコシダーゼ阻害活性を有することで血糖値の上昇が抑制されることを見出したものであるが、α−グルコシダーゼ阻害活性に限らず生体内において血糖値の上昇の抑制をもたらす作用機序及びそれに関わる成分を新たに見出すことは、血糖値の上昇を抑制する手段の選択肢を広げるうえで有益である。
【０００６】
本発明は上記事情に鑑み、血糖値の上昇を抑制するための麹菌由来の酵素、麹菌由来の酵素を用いた血糖値上昇抑制剤、飲食品、医薬組成物、食品添加物、サプリメント及びこれらの製造方法、並びに麹菌由来の酵素を用いた血糖値上昇抑制方法及び細胞への糖取り込み促進方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための手段は、以下の通りである。
＜１＞血糖値の上昇を抑制するための、麹菌。
＜２＞米麹に含まれる、＜１＞に記載の麹菌。
＜３＞前記血糖値の上昇の抑制は細胞への糖の取り込みを促進することで行われる、＜１＞又は＜２＞に記載の麹菌。
＜４＞血糖値の上昇を抑制するための、麹菌由来の酵素。
＜５＞米麹により得られる、＜４＞に記載の麹菌由来の酵素。
＜６＞前記血糖値の上昇の抑制は細胞への糖の取り込みを促進することで行われる、＜４＞又は＜５＞に記載の麹菌由来の酵素。
＜７＞麹菌又は麹菌由来の酵素を有効成分として含む、血糖値上昇抑制剤。
＜８＞麹菌又は麹菌由来の酵素を有効成分として含む、血糖値の上昇を抑制するための飲食品。
＜９＞麹菌又は麹菌由来の酵素を有効成分として含む、血糖値の上昇を抑制するための医薬組成物。
＜１０＞麹菌又は麹菌由来の酵素を有効成分として含む、血糖値の上昇を抑制するための食品添加物。
＜１１＞麹菌又は麹菌由来の酵素を有効成分として含む、血糖値の上昇を抑制するためのサプリメント。
＜１２＞麹から麹菌又は麹菌由来の酵素を含む抽出物を抽出する工程を含む、血糖値上昇抑制剤の製造方法。
＜１３＞麹菌又は麹菌由来の酵素を飲食品又は飲食品の原料に添加して混合する工程を含む、血糖値の上昇を抑制するための飲食品の製造方法。
＜１４＞麹菌又は麹菌由来の酵素と、添加剤又は薬学的に許容可能な担体とを混合する工程を含む、医薬組成物の製造方法。
＜１５＞麹菌又は麹菌由来の酵素と、食品用添加物用の他の成分とを混合する工程を含む、血糖値の上昇を抑制するための食品添加物の製造方法。
＜１６＞麹菌又は麹菌由来の酵素と、サプリメント用の他の成分とを混合する工程を含む、血糖値の上昇を抑制するためのサプリメントの製造方法。
＜１７＞麹菌又は麹菌由来の酵素を体内に摂取させることを含む、血糖値上昇抑制方法。
＜１８＞麹菌又は麹菌由来の酵素を体内に摂取させることを含む、細胞への糖取り込み促進方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、血糖値の上昇を抑制するための麹菌、麹菌由来の酵素、麹菌又は麹菌由来の酵素を用いた血糖値上昇抑制剤、飲食品、医薬組成物、食品添加物、サプリメント及びこれらの製造方法、並びに麹菌又は麹菌由来の酵素を用いた血糖値上昇抑制方法及び細胞への糖取り込み促進方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】麹抽出物のたんぱく質粗分画の２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２ＤＧ）取り込み活性の測定結果を示すグラフである。
【図２】麹中のたんぱく質のポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。
【図３】麹中のたんぱく質が麹菌由来の酵素であることを示すポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。
【図４】マウスに経口ブドウ糖負荷し、麹菌を摂取させ、試験後の血糖値の上昇抑制の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、以下の説明によって本発明の範囲が制限されるものではない。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
【００１１】
＜麹菌又は麹菌由来の酵素＞
本発明の麹菌又は麹菌由来の酵素は、血糖値の上昇を抑制する。麹菌又は麹菌由来の酵素は、麹菌又は麹菌由来の酵素単独の状態でも、麹等の中に含まれた状態であっても、麹等から抽出された状態であってもよい。
【００１２】
本発明者らの検討により、麹菌又は麹菌由来の酵素は血糖値の上昇を抑制する成分として機能することがわかった。
【００１３】
麹菌は、酵素を生成してデンプン、タンパク質等を分解する性質を有することから、種々の発酵食品の製造に用いられている。麹菌又は麹菌由来の酵素が血糖値の上昇を抑制する成分として機能する理由は必ずしも明らかとはなっていないが、麹菌由来の酵素が細胞への糖の取り込みを促進するように作用する結果、血中の糖の量が抑制されるためと推測される。一般的に酵素はデンプンを単糖類に分解し、血糖値を上昇させる方向に作用すると考えられるが、このような知見は、今まで報告されていないものである。
【００１４】
本発明において「麹菌」とは、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の不完全菌のうち、食用に利用されるものを意味する。麹菌としてはニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、タマリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔａｍａｒｉ）、カワチコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）、アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、サイトウコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ）等が挙げられ、これらのアルビノ等の変異種も麹菌に含まれる。麹菌の種類は特に制限されず、本発明の効果が達成される範囲内において選択することができる。本発明のある実施態様では、麹菌はニホンコウジカビのＷ−２０株（ＭＡ７２８株とも称する場合がある）である。Ｗ−２０株は、例えば、株式会社樋口松之介商店より入手可能である。
【００１５】
本発明において「麹菌由来の酵素」とは、麹菌により生成される酵素を意味する。具体的には、例えば、米、麦、大豆などの穀物に付着した麹菌が繁殖する際に産生する酵素を意味する。
【００１６】
本発明において麹とは、米、麦、大豆などの穀物に麹菌を付着させて繁殖させたものを意味する。麹の種類は特に制限されず、本発明の効果が達成される範囲内において選択することができる。本発明のある実施態様では、麹菌は米麹に含まれる。また、本発明のある実施態様では、麹菌由来の酵素は米麹より得られる。
【００１７】
麹菌又は麹菌由来の酵素は、種々の用途で使用できる。例えば、後述する血糖値上昇抑制剤、医薬組成物、飲食品、食品添加物、サプリメント等の成分として使用することができる。
【００１８】
＜血糖値上昇抑制剤＞
本発明の血糖値上昇抑制剤は、麹菌又は麹菌由来の酵素を有効成分として含む。本発明の血糖値上昇抑制剤を生体に投与すると、血糖値の上昇を抑制する効果が得られる。従って、日常的な血糖値の管理や、糖尿病その他の血糖値の上昇の抑制が有効である疾患の治療のために好適に用いることができる。麹菌由来の酵素の詳細は上述したとおりであり、以降の説明においても同様である。
【００１９】
ある実施態様では、血糖値上昇抑制剤は、有効成分として含まれる麹菌又は麹菌由来の酵素が細胞への糖取り込みを促進することにより血糖値上昇を抑制する。すなわち、血糖値上昇抑制剤は細胞への糖取り込み促進剤であってもよい。
【００２０】
血糖値上昇抑制剤の状態は特に制限されず、液体、粉末、ゲル、固形等から用途に応じて選択できる。
【００２１】
血糖値上昇抑制剤に含まれる麹菌又は麹菌由来の酵素の量は特に制限されないが、例えば、０．０１質量％〜９９質量％、好ましくは０．０１質量％〜８０質量％、より好ましくは０．０１質量％〜５０質量％とすることができる。
【００２２】
＜飲食品＞
本発明の飲食品は、麹菌又は麹菌由来の酵素を有効成分として含む。飲食品の種類は、特に制限されず、飲料類、麺類、菓子類、肉類又は畜産加工食品、乳製品、油脂加工品、調味料等が挙げられる。本発明の飲食品は、本発明の食品添加物を上記のような一般的な飲食品に添加することにより得ることができる。
【００２３】
粉末、ペースト、エキス、シロップ、ドリンク等が挙げられる。麹加工品は、充分な血糖値上昇の抑制効果を得る観点からは、酵素の分解等が抑制される条件で加工されたものであることが好ましい。例えば、加熱工程を経ないか、加熱される場合は６０℃以下の加熱工程を経たものであることが好ましい。
【００２４】
本発明の飲食品の摂取量は特に制限されない。例えば、成人１日当たりの麹菌の摂取量が１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１００ｍｇの範囲となるようにすることができる。菌体の測定は、例えば、F. Fujii et al  J. Bruw.Soc. Japan, Vol.87, No.10, p.757-759, 1992 を参考にして行うことができる。
【００２５】
＜医薬組成物＞
本発明の医薬組成物は、麹菌又は麹菌由来の酵素を有効成分として含む。本発明の医薬組成物を生体に投与すると、血糖値の上昇を抑制する効果が得られる。従って、日常的な血糖値の管理や、糖尿病その他の血糖値の上昇の抑制が有効である疾患の治療のために好適に用いることができる。
【００２６】
本発明の医薬組成物は、麹菌又は麹菌由来の酵素以外の添加物又は薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。このような添加物又は薬学的に許容可能な担体としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、界面活性剤、緩衝剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、溶剤、増粘剤、粘液溶解剤、湿潤剤、防腐剤などが挙げられる。
【００２７】
本発明の医薬組成物に含まれる麹菌又は麹菌由来の酵素の量は特に制限されないが、例えば、０．０１質量％〜９９質量％、好ましくは０．０１質量％〜８０質量％、より好ましくは０．０１質量％〜５０質量％とすることができる。      
【００２８】
本発明の医薬組成物の形態は特に制限されず、経口剤又は非経口剤のいずれであってもよい。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤等が挙げられる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、軟膏剤、点鼻剤、坐剤等が挙げられる。
【００２９】
本発明の医薬組成物の投与量は特に制限されない。例えば、成人１日当たりの麹菌の摂取量が１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１００ｍｇの範囲となるような投与量とすることができる。
【００３０】
＜食品添加物＞
本発明の食品添加物は、麹菌又は麹菌由来の酵素を有効成分として含む。本発明の食品添加物を飲食品に添加することにより、前記飲食品が摂取された際に、血糖値の上昇を抑制する効果を得ることができる。本発明の食品添加物は、必要に応じて食品用添加物用の他の成分を含んでもよい。他の成分としては、着色料、保存料、甘味料、増粘剤、安定剤、ゲル化剤、酸化防止剤、乳化剤、香料などが挙げられる。
【００３１】
食品添加物中における麹菌又は麹菌由来の酵素の量は、本発明の効果が達成される限りにおいて特に制限されないが、例えば、０．０１質量％〜９９質量％、好ましくは０．０１質量％〜８０質量％、より好ましくは０．０１質量％〜５０質量％とすることができる。  
【００３２】
＜サプリメント＞
本発明のサプリメント（栄養補助食品）は、麹菌又は麹菌由来の酵素を有効成分として含む。サプリメントの形態は特に制限されず、錠剤、顆粒剤、散剤、ドリンク剤等を挙げることができる。本発明のサプリメントは、麹菌又は麹菌由来の酵素と、サプリメント用の成分として使用可能な別の成分との組み合わせにより構成されていてもよい。そのような他の成分としては、多糖類、酸化防止剤、タンパク質、塩類などが挙げられる。
【００３３】
本発明のサプリメントにおける麹菌又は麹菌由来の酵素の量は、本発明の効果が達成される限りにおいて特に制限されないが、例えば、０．０１質量％〜９９質量％、好ましくは０．０１質量％〜８０質量％、より好ましくは０．０１質量％〜５０質量％とすることができる。
【００３４】
本発明のサプリメントの摂取量は特に制限されない。例えば、成人１日当たりの麹菌の摂取量が１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１００ｍｇの範囲となるような摂取量とすることができる。
【００３５】
＜血糖値上昇抑制剤の製造方法＞
本発明の血糖値上昇抑制剤の製造方法は、麹から麹菌又は麹菌由来の酵素を含む抽出物を抽出する工程を含む。前記方法は、必要に応じてその他の工程を含んでもよい。
【００３６】
麹から麹菌又は麹菌由来の酵素を含有する抽出物を得る際には、その抽出方法は特に制限されず、一般的な抽出方法を用いることができる。例えば、麹に溶媒を加えて抽出液を作製し、必要に応じて希釈、濃縮等を行う方法が挙げられる。溶媒は、麹菌又は麹菌由来の酵素の活性を維持する観点から、水が好ましい。
【００３７】
必要に応じ、麹菌又は麹菌由来の酵素を含有する抽出物をさらに精製してもよい。精製は、例えば、オープンカラム、ＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳなどにより行うことができる。
【００３８】
製造された血糖値上昇抑制剤の状態は特に制限されず、液体、粉末、ゲル、固形等から用途に応じて選択できる。
【００３９】
＜飲食品の製造方法＞
本発明の飲食品の製造方法は、麹菌又は麹菌由来の酵素を、飲食品又は飲食品の原料に添加して混合する工程を含む。前記方法は、必要に応じてその他の工程を含んでもよい。添加及び混合の方法は特に制限されず、公知の方法により行うことができる。
【００４０】
＜医薬組成物の製造方法＞
本発明の医薬組成物の製造方法は、麹菌又は麹菌由来の酵素と、添加剤又は薬学的に許容可能な担体とを混合する工程を含む。前記方法は、必要に応じてその他の工程を含んでもよい。混合の方法は特に制限されず、公知の方法により行うことができる。添加物又は薬学的に許容可能な担体としては、本発明の医薬組成物に関連して例示したものを挙げることができる。
【００４１】
＜食品添加物の製造方法＞
本発明の食品添加物の製造方法は、麹菌又は麹菌由来の酵素を、必要に応じて食品添加用の他の成分と混合する工程を含む。前記方法は、必要に応じてその他の工程を含んでもよい。混合の方法は特に制限されず、公知の方法により行うことができる。食品添加用成分の例としては、本発明の食品添加物に関連して例示したものを挙げることができる。
【００４２】
＜サプリメントの製造方法＞
本発明のサプリメントの製造方法は、麹菌又は麹菌由来の酵素を、必要に応じてサプリメント用の他の成分と混合する工程を含む。前記方法は、必要に応じてその他の工程を含んでもよい。混合の方法は特に制限されず、公知の方法により行うことができる。サプリメント用成分の例としては、本発明のサプリメントに関連して例示したものが挙げられる。
【００４３】
＜血糖値上昇抑制方法及び細胞への糖取り込み促進方法＞
本発明の血糖値上昇抑制方法及び細胞への糖取り込み促進方法は、麹菌又は麹菌由来の酵素を体内に摂取させることを含む。麹菌又は麹菌由来の酵素を体内に摂取させる方法は特に制限されない。例えば、上述した血糖値上昇抑制剤、医薬組成物、飲食品、食品添加物、サプリメント等として摂取することができる。麹菌又は麹菌由来の酵素を摂取させる対象は、ヒトであってもヒト以外の動物であってもよい。また、血糖値の作為的な制御が必要とされる疾患、体質、生活習慣等を有していても、有していなくてもよい。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、以下の実施例ではニホンコウジカビのＷ−２０株（ＭＡ７２８株とも称する場合がある、株式会社樋口松之介商店より入手）を用いて製造した麹又はその加工品を使用した。
【００４５】
＜糖取り込み活性促進成分の精製と同定＞
乾燥麹（米麹）１６ｇに純水を３０％（ｗ／ｖ）となるように添加し、４℃で一晩撹拌した。これを１２０００×ｇ、４℃で３０分の遠心分離を行い、上清を０．４５ｍｍディスクフィルターにて濾過して麹抽出物を得た。次いで、下記の手順で硫安分画を行い、活性画分の粗分画を行った。
【００４６】
（１）麹抽出物（約５０ｍＬ）を、一晩凍結乾燥した。
（２）凍結乾燥物の全量に、氷上にて１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液を５ｍＬ加え、懸濁した。
（３）１５ｍＬコニカルチューブに全量を移し、４℃、１５０００ｒｐｍで１５分の遠心分離を行った。その後、上清を別のコニカルチューブに移した。
（４）得られた上清に３１３ｇ／Ｌ（５０％飽和）となるよう硫酸アンモニウムを添加し、氷上で２０分間撹拌後、４℃、１４０００×ｇで１５分の遠心分離を行った。ここで生じた沈殿を回収し、５ｍＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液にて懸濁後、１７６ｇ／Ｌ（３０％飽和）となるよう硫酸アンモニウムを添加し、氷上で２０分間撹拌後、４℃、１４０００×ｇで１５分の遠心分離を行って得た上清を「フラクション１」とした。
（５）沈殿を回収した際の上清は別のコニカルチューブに移し、２１４ｇ／Ｌ（８０％飽和）の硫酸アンモニウムを添加し、氷上で２０分間撹拌後、４℃、１４０００×ｇで１５分の遠心分離を行った。ここで生じた沈殿を回収し、５ｍＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液にて懸濁後、３１３ｇ／Ｌ（５０％飽和）となるよう硫酸アンモニウムを添加し、氷上で２０分間撹拌後、４℃、１４０００×ｇで１５分の遠心分離を行って得た上清を「フラクション２」とした。また、沈殿を回収した際の上清を「フラクション３」とした。
【００４７】
得られたフラクション１〜３をゲルろ過スピンカラムで脱塩した後、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞を用いて２ＤＧ取り込み活性測定を行った。測定は、既報（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１２：９−１７（２０１１））に従い実施した。また、細胞への糖取り込みを促進する作用があることが知られているインスリンを添加したものをポジティブコントロールとして、何も添加しないものをネガティブコントロールとしてそれぞれ使用した。
【００４８】
測定には、下記の反応液Ａ〜Ｄを用いた。なお、上記論文では反応液Ｂ中のＧ６ＰＤＨ濃度が８６０Ｕ／ｍｌであったが、この濃度での使用により反応に不具合が生ずることが判明したため、２００Ｕ／ｍｌとした。
【００４９】
反応液Ａ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、１．８Ｕ／ｍｌ  グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）、２．１Ｕ／ｍｌ  グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）、２．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３１５μＭ  ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母工業株式会社）
反応液Ｂ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、２００μＭ  ＮＡＤＰ＋（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）、４０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００Ｕ／ｍｌ  Ｇ６ＰＤＨ
反応液Ｃ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、２０ｍＭ  グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）、４０μＭ  グルタチオン（酸化型）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、８０Ｕ／ｍｌ  Ｇ６ＰＤＨ、６Ｕ／ｍｌ  グルタチオンンレダクターゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）
反応液Ｄ：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、５ｍＭ  ５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）
【００５０】
測定に用いる細胞は、下記の手順で調製した。
マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞を一晩無血清のＤＭＥＭ培地で培養後、ＫＲＰＨ緩衝液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２、１１８ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で１回洗浄し、麹抽出液（０．１％又は１％）又はインスリン（最終濃度１００ｎＭ）を添加したＫＲＰＨ緩衝液中で３０分インキュベートした。次いで、２ＤＧ（０．２ｍＭ）を添加してさらに２０分インキュベートした。２０分後に氷冷ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）と０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を添加して細胞を溶解し、回収した。その後、９５℃で１５分熱処理し、１５０００×ｇで１５分間の遠心分離を行い、上清を回収した。
【００５１】
調製した上清を用いて、２ＤＧ取り込み活性の測定を下記の手順で実施した。
（１）調製した上清２０μＬを９６ウェル丸底プレートに添加し、ここに５５μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）を加えた。
（２）反応液Ｂを加え、３８℃で１時間インキュベートした。
（３）５μＬの１．５Ｍ  ＮａＯＨを加え、７０℃で１時間インキュベートした後、５μＬの１．５Ｍ  ＨＣｌと５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１）で中和した。
（４）２５μＬの反応液Ｃと２０μＬの反応液Ｄを加え、４０５ｎｍの吸光度を経時的に測定し、その傾きを評価した。
【００５２】
２ＤＧ取り込み活性の測定結果を、図１に示す。統計検定はＤｕｎｎｅｔｔ法により行い、有意水準は両側５％とした。データはｍｅａｎ±ＳＤで示す（ｎ＝３）。図１に示す結果より、フラクション１〜３のすべてに活性が見られたが、８０％飽和硫安の沈殿画分（フラクション２）を用いて疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製を実施した。
【００５３】
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、ＡＫＴＡ／Ｕｎｉｃｏｒｎ  Ｖｅｒ．４．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて下記の条件で実施した。  
緩衝液Ａ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、硫酸アンモニウム（５０％飽和）
緩衝液Ｂ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
溶離条件：サンプルアプリケーション５分間、緩衝液Ａでのカラム洗浄３分間、緩衝液Ａ１００％、２０分間→緩衝液Ａ０％、２０分間のグラジエント溶離、緩衝液Ｂでのカラム洗浄３分間
サンプリング：３０サンプル／分
カラム：ＨｉＴｒａｐ  ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰ、１ｍＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）
検出：ＵＶ２１５ｎｍ、２２０ｎｍ、２８０ｎｍ
【００５４】
２１５ｎｍと２２０ｎｍはペプチド結合に、２８０ｎｍは芳香族アミノ酸の側鎖に、それぞれ由来する吸収ピークを示す。なお、一般的には２８０ｎｍをタンパク質濃度の指標とする。
【００５５】
疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施したところ、保持時間１８分及び２４分付近の２８０ｎｍの吸収ピークに活性が認められた。その後の検討では、保持時間１８分付近の活性には再現が得られなかったため、保持時間２４分付近の画分からの活性成分の単離を試みた。
【００５６】
ＴＣＡ沈殿により、保持時間２４分付近の画分の濃縮を下記の手順で実施した。
（１）溶出液４５０ｕＬに５０ｕＬ（＝１０％ｖ／ｖ）のＴＣＡ／アセトン溶液を懸濁した。
（２）−２０℃で１時間インキュベートした後、１５０００×ｇで１５分間の遠心分離を行い、ペレットを回収した。
（３）冷却アセトン１ｍＬで３回洗浄した後、ペレットを乾燥してアセトンを完全に除去した。
（４）５％ＴＣＡ溶液で１回洗浄し、ｖｏｒｔｅｘにて撹拌後、１５０００×ｇで１５分間の遠心分離を行った。上清を除去後、同様にアセトン洗浄を行い、ペレットを回収した。
（５）得られたペレットに１ｘＳＤＳサンプルバッファーを５０ｕＬ添加し、９５℃で３分間煮沸した。
（６）１５０００×ｇで５分間の遠心分離を行い、得られた上清（５０ｕＬ）を泳動用サンプルとした。
【００５７】
得られた泳動用サンプルを用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を下記の手順で実施した。
（１）１０％及び１５％ポリアクリルアミドゲルを作製し（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｓｓａｙ−ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｃｏｍ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｂｉｏｌｏｇｙ／ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ／ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ−ｐａｇｅを参照）、泳動サンプル１０  ｕＬを分子量マーカーと共に定電流２３ｍＡで７５分泳動した。
（２）泳動終了後、ゲルをＥｚＳｔａｉｎ  Ａｑｕａ（アトー株式会社）１５ｍＬに浸し、電子レンジで１分間加熱後、シェーカー上で振盪させた。
（３）鮮明なバンドが見られた時点で振盪を止め、ＭＱ水１５ｍＬで３回ゲルを洗浄し、撮像を行った。結果を図２に示す。
【００５８】
図２の（Ａ）に示すように１０％のゲルに３本、図２の（Ｂ）に示すように１５％のゲルに３本の合計６本のバンドが確認された。この６本のバンドについて、ＧＥＮＯＭＩＮＥ社にＰＭＦ解析を依頼し、活性タンパク質の同定を行った。６本中２本（Ｂａｎｄ  ３及びＢａｎｄ  ６）については、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ解析において良好なピークは得られたものの、同定には至らなかったが、残り４本中３本（Ｂａｎｄ  １、２、４）については、ニホンコウジカビ由来の酵素（α−アミラーゼ）と同定された。解析可能であった４本のうち１本（Ｂａｎｄ  ５）はスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）と同定された。
【００５９】
上記の結果を踏まえ、３Ｔ３−Ｌ１細胞において、麹菌由来のα−アミラーゼの純品（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）１ｕｇ／ｍＬに相当する活性を示した保持時間２４分付近の画分（Ｂ５／Ｂ６）の濃度を１単位（Ｕ）／ｍＬとし、２Ｕ及び６Ｕ相当について上記と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。結果を図３に示す。
【００６０】
図３に示すように、Ｂ５／Ｂ６画分の泳動レーンにおいて、α−アミラーゼの純品で得られた２本のバンドの下方バンドとほぼ同位置にシングルバンドが認められ、活性ベースで考えるとほぼ１００％の活性がα−アミラーゼに起因することが示唆された。
【００６１】
＜麹菌又は麹菌由来の酵素による血糖値上昇抑制作用の確認＞
麹菌又は麹菌由来の酵素による血糖値上昇抑制作用を検証するため、マウスを用いて下記の手順により経口ブドウ糖負荷試験を実施した。試験では、血糖値の上昇を抑制する作用があることが知られているエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を投与する群をポジティブコントロールとし、何も投与しない群をネガティブコントロールとした。
【００６２】
（１）塩麹（国産米と麹菌から製造した米麹を加工）３ｇに蒸留水７ｍｌを添加し、一晩４℃で撹拌後、遠心分離を行った。得られた上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、既知量の精製麹菌由来α−アミラーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を対照として、画像解析により、塩麹中のα−アミラーゼの含有量を計算した。その結果、塩麹１ｇ中に６３０μｇのα−アミラーゼが存在していることがわかった。
【００６３】
（２）４週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスを購入後、１週間の予備飼育後に一群５頭として４群に分けた。各群のマウスの体重は以下の通りであり、群間に統計的な有意差はなかった。
投与なし群：２１．６±１．５ｇ
低用量群：２１．９±０．９ｇ
高用量群：２１．４±１．１ｇ
ＥＧＣＧ群：２１．５±０．８ｇ
【００６４】
（３）実験日前日の１８時に餌を取り除き、１６時間絶食させた。その際水は自由摂取させた。絶食終了後、投与なし群には生理食塩水を、低用量群と高用量群にはα−アミラーゼをそれぞれ１．７５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇの投与量となるように溶解した生理食塩水を、ＥＧＣＧ群にはＥＧＣＧを１０ｍＭとなるように溶解した生理食塩水を、それぞれ経口投与した。投与量は、各群とも１００μｌ／２０ｇとした。
【００６５】
（４）上記経口投与から１時間後に、ブドウ糖３ｇを２０ｍｌの生理食塩水に溶解したものを各群に経口投与した。投与量は、各群とも１００μｌ／２０ｇとした。
【００６６】
（５）ブドウ糖経口投与の直前、投与から１５分後、３０分後、１時間後、２時間後に尾静脈より血液を１滴採取し、簡易血糖値測定装置により血糖値を測定した。また、各時間における血糖値をグラフ化し、ＡＵＣ（血中濃度−時間曲線下面積、（ｍｇ／Ｌ）・ｈ）を算出した。結果を図４に示す。データはｍｅａｎ±ＳＤで示す（ｎ＝５）。
【００６７】
図４に示すように、α−アミラーゼを投与した群は、ＥＧＣＧを投与した群に次いで血糖値の上昇が抑制される傾向が認められた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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