(57)【要約】【課題】本発明は、目的のタンパク質を安定化することで、これまで構造解析が不可能または困難であった目的のタンパク質の効率的な構造解析を可能にする方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質に特異的に結合する抗ＢＲＩＬ抗体及びその抗原結合断片、該抗体及びその抗原結合断片をコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターを含む抗体生産細胞、該抗体の製造方法及び該抗体のタンパク質構造解析における使用方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片を用いて、目的タンパク質にＢＲＩＬを融合させたＢＲＩＬ融合タンパク質を安定化させる方法。
【請求項２】
ＢＲＩＬ融合タンパク質が、目的タンパク質の２つの隣接するヘリックス構造がＢＲＩＬによって融合されたタンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
目的タンパク質が、膜発現タンパク質である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
膜発現タンパク質が、Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＰＣＲ）、イオンチャネル及びトランスポーターから選ばれるいずれか１である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片をＢＲＩＬ融合タンパク質のＢＲＩＬに結合させることで、ＢＲＩＬ融合タンパク質を安定化させることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片が、以下の（１）〜（３）から選ばれるいずれか１である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（１）ＢＲＩＬの第３ヘリックス構造および第４ヘリックス構造の少なくともいずれか一方に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（２）ＢＲＩＬの第３へリックス構造から第４ヘリックス構造までの少なくとも一部に結合する抗体又はその抗原結合断片、および
（３）ＢＲＩＬのＮ末端から６７番目のＩｌｅ（Ｉ）、７１番目のＧｌｎ（Ｑ）、７４番目のＡｓｐ（Ｄ）、７７番目のＬｙｓ（Ｋ）、７８番目のＬｅｕ（Ｌ）、８３番目のＬｙｓ（Ｋ）、８５番目のＬｙｓ（Ｋ）、８６番目のＧｌｕ（Ｅ）、８８番目のＧｌｎ（Ｑ）、８９番目のＡｌａ（Ａ）、９０番目のＡｌａ（Ａ）、９２番目のＧｌｕ（Ｅ）、９３番目のＧｌｎ（Ｑ）、９６番目のＴｈｒ（Ｔ）、９７番目のＴｈｒ（Ｔ）、９９番目のＡｓｎ（Ｎ）及び１００番目のＡｌａ（Ａ）のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片が、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選ばれるいずれか１である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（ｉ）抗体のＨ鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＬ鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体と競合して結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｉｉ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体が結合するエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片、および
（ｉｉｉ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片が、抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
以下の（１）〜（３）から選ばれるいずれか１である抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片。
（１）ＢＲＩＬの第３ヘリックス構造および第４ヘリックス構造の少なくともいずれか一方に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（２）ＢＲＩＬの第３ヘリックス構造から第４ヘリックス構造までの少なくとも一部に結合する抗体又はその抗原結合断片および
（３）ＢＲＩＬのＮ末端から６７番目のＩｌｅ（Ｉ）、７１番目のＧｌｎ（Ｑ）、７４番目のＡｓｐ（Ｄ）、７７番目のＬｙｓ（Ｋ）、７８番目のＬｅｕ（Ｌ）、８３番目のＬｙｓ（Ｋ）、８５番目のＬｙｓ（Ｋ）、８６番目のＧｌｕ（Ｅ）、８８番目のＧｌｎ（Ｑ）、８９番目のＡｌａ（Ａ）、９０番目のＡｌａ（Ａ）、９２番目のＧｌｕ（Ｅ）、９３番目のＧｌｎ（Ｑ）、９６番目のＴｈｒ（Ｔ）、９７番目のＴｈｒ（Ｔ）、９９番目のＡｓｎ（Ｎ）及び１００番目のＡｌａ（Ａ）のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
以下の（１）〜（３）から選ばれるいずれか１である請求項９に記載の抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片。
（１）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体と競合して結合する抗体又はその抗原結合断片、
（２）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体が結合するエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片、および
（３）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む請求項９または１０記載の抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＢＲＩＬ抗体を用いてＢＲＩＬ融合タンパク質を安定化させる方法、抗ＢＲＩＬ抗体を用いたＢＲＩＬ融合タンパク質の結晶化方法、結晶製造方法および作製方法、抗ＢＲＩＬ抗体を用いてＢＲＩＬ融合タンパク質の結晶構造を解析する方法、抗ＢＲＩＬ抗体、該抗体をコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターが導入された形質転換細胞並びに抗ＢＲＩＬ抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命に必須の役割を担っているタンパク質は多くの疾患に関与しており、特にＧＰＣＲ（Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）はシグナル伝達の重要な機能を担っており、３０％を超える医薬品の標的タンパク質となっている。現在の創薬においては、標的タンパク質の立体構造を基盤とし、コンピュータシミュレーションにより候補化合物のスクリーニング、新たな化合物のデザインが行なわれているため、標的タンパク質の構造解析の重要性が高い。
【０００３】
ＧＰＣＲの構造解析としてはＸ線結晶構造解析が行われており、１９９０年代にバクテリオロドプシンのＸ線結晶構造が明らかになり（非特許文献１）、２０００年には哺乳類のＧＰＣＲとしては初めてウシのロドプシンが構造解析された（非特許文献２）。その後、２００７年にヒトのＧＰＣＲとして初めてβ２−アドレナリン受容体が構造解析された（非特許文献３）。
【０００４】
これまでに構造決定されたＧＰＣＲにおいて、野生型の状態で構造解析に成功しているものは、大量に調製可能なものであり、他のＧＰＣＲは精製できるレベルで組織に発現しておらず、培養細胞に強制発現させる場合としても安定性および発現量の観点から、野生型のまま結晶化できるレベルまで大量に調製しにくいという問題がある。
【０００５】
ＧＰＣＲは共通して７本の膜貫通へリックスと８番目の両親媒性へリックスで構成される。へリックスは６本のループでつながれ、Ｎ末端と３本のループが細胞外に、Ｃ末端と３本のループが細胞内に存在する。ＧＰＣＲの膜貫通部分は細胞外のアゴニスト結合を細胞内に伝える部分であるため、本質的にフレキシビリティーが高く、精製時にＧＰＣＲを不安定にさせる要因となる。また、ＧＰＣＲは細胞外ループ領域を中心としたリガンド結合部位の構造に大きな多様性を有するため、異なる受容体ファミリーにおいては、立体構造の予測が容易ではない。
【０００６】
ＧＰＣＲの構造解析に関して、安定性、発現量および結晶性等を改善するためにこれまでに様々な検討が行われ、約４０種類のヒトＧＰＣＲの構造解析がなされている。例えば、ＧＰＣＲとＧタンパク質との相互作用に関与するＧＰＣＲの細胞内第３ループをＴ４  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（以下、Ｔ４Ｌと称す）に置き換える手法（非特許文献３、特許文献１）やＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ５６２ＲＩＬに置き換える手法（非特許文献４、特許文献１）を用いて、構造解析に成功している報告例が存在する。
【０００７】
また、ＧＰＣＲのアミノ酸配列に変異を導入することでＧＰＣＲの構造を任意の３次元構造に安定化させる手法が報告されている（非特許文献５）。この手法は、変異の導入部位によってアゴニスト結合型やアンタゴニスト結合型に構造を固定できる点で効果的である。
【０００８】
ＧＰＣＲを特異的に認識する抗体とＧＰＣＲとの複合体を形成させる手法（非特許文献６）は、特定のＧＰＣＲに特異的な抗体フラグメントが特定のＧＰＣＲを安定化する手法である。また、結晶化の際には、抗体フラグメントがＧＰＣＲに結合することによって結晶格子中の分子間接触に寄与し得る膜外親水性表面が拡張されることで、結晶生成を促進するという効果がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／０２８８９１３号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Pebay-Peyroula E et al. Science, 1997; 277:1676-81
【非特許文献２】Palczewski K et al. Science, 2000; 289(5480):739-45
【非特許文献３】Rosenbaum et al. Science 2007; 318:1266-73
【非特許文献４】Chun et al. Structure 2012; 20: 967-976
【非特許文献５】Serrano et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008; 105: 877-882
【非特許文献６】Hino et al. Nature, 2012; 482: 237-240
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記したように、創薬における標的タンパク質の構造解析の重要性は高く、安定性等に課題のあるＧＰＣＲの構造解析に関してこれまでに様々な検討が行われている。しかしながら、非特許文献５に記載の手法は、アデノシンＡ２ａ受容体で効果的な変異導入部位を基に、その他のＧＰＣＲの変異導入部位を特定していくことから、汎用性が高いとは言い難い。さらに変異導入部位の組み合わせの探索や構造解析に大きな労力と時間を要する。また、非特許文献６に記載の手法は、それぞれのＧＰＣＲごとに特異的な抗体フラグメントを調製する必要がある。
【００１２】
本発明は上記実情に鑑み、目的タンパク質を安定化することで、これまで構造解析が不可能または困難であった目的タンパク質の効率的な構造解析を可能にする方法を提供することを目的とする。また、目的タンパク質の構造解析において、効率的かつ有効にタンパク質を安定化する汎用的な抗体又はその抗原結合断片を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明らは、目的の膜タンパク質を安定化する際に、ＢＲＩＬをタグタンパク質として該膜タンパク質と融合させたＢＲＩＬ融合タンパク質を調製し、ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片を用いて、該ＢＲＩＬ融合タンパク質を安定化できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
即ち本発明は以下の＜１＞〜＜２７＞に関する。
＜１＞ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片を用いて、目的タンパク質にＢＲＩＬを融合させたＢＲＩＬ融合タンパク質を安定化させる方法。
＜２＞ＢＲＩＬ融合タンパク質が、目的タンパク質の２つの隣接するヘリックス構造がＢＲＩＬによって融合されたタンパク質である＜１＞に記載の方法。
＜３＞目的タンパク質が、膜発現タンパク質である＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞膜発現タンパク質が、Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＰＣＲ）、イオンチャネル及びトランスポーターから選ばれるいずれか１である＜３＞に記載の方法。
＜５＞ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片をＢＲＩＬ融合タンパク質のＢＲＩＬに結合させることで、ＢＲＩＬ融合タンパク質を安定化させることを特徴とする＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載の方法。
＜６＞ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片が、以下の（１）〜（３）から選ばれるいずれか１である抗体又はその抗原結合断片である＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の方法。
（１）ＢＲＩＬの第３ヘリックス構造および第４ヘリックス構造の少なくともいずれか一方に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（２）ＢＲＩＬの第３ヘリックス構造から第４ヘリックス構造までの少なくとも一部に結合する抗体又はその抗原結合断片、および
（３）ＢＲＩＬのＮ末端から６７番目のＩｌｅ（Ｉ）、７１番目のＧｌｎ（Ｑ）、７４番目のＡｓｐ（Ｄ）、７７番目のＬｙｓ（Ｋ）、７８番目のＬｅｕ（Ｌ）、８３番目のＬｙｓ（Ｋ）、８５番目のＬｙｓ（Ｋ）、８６番目のＧｌｕ（Ｅ）、８８番目のＧｌｎ（Ｑ）、８９番目のＡｌａ（Ａ）、９０番目のＡｌａ（Ａ）、９２番目のＧｌｕ（Ｅ）、９３番目のＧｌｎ（Ｑ）、９６番目のＴｈｒ（Ｔ）、９７番目のＴｈｒ（Ｔ）、９９番目のＡｓｎ（Ｎ）及び１００番目のＡｌａ（Ａ）のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基に結合する抗体又はその抗原結合断片。
＜７＞ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片が、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選ばれるいずれか１である＜１＞〜＜６＞のいずれか１に記載の方法。
（ｉ）抗体のＨ鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＬ鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体と競合して結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｉｉ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体が結合するエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片、および
（ｉｉｉ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片。
＜８＞ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片が、抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む＜１＞〜＜７＞のいずれか１に記載の方法。
＜９＞以下の（１）〜（３）から選ばれるいずれか１である抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片。
（１）ＢＲＩＬの第３ヘリックス構造および第４ヘリックス構造の少なくともいずれか一方に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（２）ＢＲＩＬの第３ヘリックス構造から第４ヘリックス構造までの少なくとも一部に結合する抗体又はその抗原結合断片および
（３）ＢＲＩＬのＮ末端から６７番目のＩｌｅ（Ｉ）、７１番目のＧｌｎ（Ｑ）、７４番目のＡｓｐ（Ｄ）、７７番目のＬｙｓ（Ｋ）、７８番目のＬｅｕ（Ｌ）、８３番目のＬｙｓ（Ｋ）、８５番目のＬｙｓ（Ｋ）、８６番目のＧｌｕ（Ｅ）、８８番目のＧｌｎ（Ｑ）、８９番目のＡｌａ（Ａ）、９０番目のＡｌａ（Ａ）、９２番目のＧｌｕ（Ｅ）、９３番目のＧｌｎ（Ｑ）、９６番目のＴｈｒ（Ｔ）、９７番目のＴｈｒ（Ｔ）、９９番目のＡｓｎ（Ｎ）及び１００番目のＡｌａ（Ａ）のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基に結合する抗体又はその抗原結合断片。
＜１０＞以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選ばれるいずれか１である＜９＞に記載の抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片。
（ｉ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＬ鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体と競合して結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｉｉ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体が結合するエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片、および
（ｉｉｉ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片。
＜１１＞ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片が、抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む＜９＞または＜１０＞記載の抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片。
＜１２＞ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片を用いた、目的タンパク質にＢＲＩＬを融合させたＢＲＩＬ融合タンパク質の結晶促進方法又は結晶製造方法。
＜１３＞ＢＲＩＬ融合タンパク質が、目的タンパク質の２つの隣接するヘリックス構造がＢＲＩＬによって融合されたＢＲＩＬ融合タンパク質である＜１２＞に記載の結晶促進方法又は結晶製造方法。
＜１４＞目的タンパク質が、膜発現タンパク質である＜１２＞又は＜１３＞に記載の結晶促進方法又は結晶製造方法。
＜１５＞膜発現タンパク質が、ＧＰＣＲ、イオンチャネル及びトランスポーターから選ばれるいずれか１である＜１４＞に記載の結晶促進方法又は結晶製造方法。
＜１６＞ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片がＢＲＩＬ融合タンパク質のＢＲＩＬに結合することで、ＢＲＩＬ融合タンパク質を安定化させることを特徴とする＜１２＞〜＜１５＞のいずれか１に記載の結晶促進方法又は結晶製造方法。
＜１７＞ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片が、以下の（１）〜（３）から選ばれるいずれか１である＜１２＞〜＜１６＞のいずれか１に記載の結晶促進方法又は結晶製造方法。
（１）ＢＲＩＬの第３ヘリックス構造および第４ヘリックス構造の少なくともいずれか一方に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（２）ＢＲＩＬの第３ヘリックス構造から第４ヘリックス構造までの少なくとも一部に結合する抗体又はその抗原結合断片、および
（３）ＢＲＩＬのＮ末端から６７番目のＩｌｅ（Ｉ）、７１番目のＧｌｎ（Ｑ）、７４番目のＡｓｐ（Ｄ）、７７番目のＬｙｓ（Ｋ）、７８番目のＬｅｕ（Ｌ）、８３番目のＬｙｓ（Ｋ）、８５番目のＬｙｓ（Ｋ）、８６番目のＧｌｕ（Ｅ）、８８番目のＧｌｎ（Ｑ）、８９番目のＡｌａ（Ａ）、９０番目のＡｌａ（Ａ）、９２番目のＧｌｕ（Ｅ）、９３番目のＧｌｎ（Ｑ）、９６番目のＴｈｒ（Ｔ）、９７番目のＴｈｒ（Ｔ）、９９番目のＡｓｎ（Ｎ）、及び１００番目のＡｌａ（Ａ）のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基に結合する抗体又はその抗原結合断片。
＜１８＞ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片が、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選ばれるいずれか１である＜１２＞〜＜１７＞のいずれか１に記載の結晶促進方法又は結晶製造方法。
（ｉ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＬ鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体と競合して結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｉｉ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体が結合するエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片、および
（ｉｉｉ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片。
＜１９＞ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片が、抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む＜１２＞〜＜１８＞のいずれか１に記載の結晶促進方法又は結晶製造方法。
＜２０＞ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片を用いて、目的タンパク質にＢＲＩＬを融合させたＢＲＩＬ融合タンパク質の立体構造解析方法。
＜２１＞ＢＲＩＬ融合タンパク質が、目的タンパク質の２つの隣接するヘリックス構造がＢＲＩＬによって融合されたＢＲＩＬ融合タンパク質である＜２０＞に記載の立体構造解析方法。
＜２２＞目的タンパク質が、膜発現タンパク質である＜２０＞又は＜２１＞に記載の立体構造解析方法。
＜２３＞膜発現タンパク質が、ＧＰＣＲ、イオンチャネル及びトランスポーターから選ばれるいずれか１である＜２２＞に記載の立体構造解析方法。
＜２４＞ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片がＢＲＩＬ融合タンパク質のＢＲＩＬに結合することで、ＢＲＩＬ融合タンパク質を安定化させることを特徴とする＜２０＞〜＜２３＞のいずれか１に記載の立体構造解析方法。
＜２５＞ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片が、以下の（１）〜（３）から選ばれるいずれか１である＜２０＞〜＜２４＞のいずれか１に記載の立体構造解析方法。
（１）ＢＲＩＬの第３ヘリックス構造および第４ヘリックス構造の少なくともいずれか一方に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（２）ＢＲＩＬの第３ヘリックス構造から第４ヘリックス構造までの少なくとも一部に結合する抗体又はその抗原結合断片、および
（３）ＢＲＩＬのＮ末端から６７番目のＩｌｅ（Ｉ）、７１番目のＧｌｎ（Ｑ）、７４番目のＡｓｐ（Ｄ）、７７番目のＬｙｓ（Ｋ）、７８番目のＬｅｕ（Ｌ）、８３番目のＬｙｓ（Ｋ）、８５番目のＬｙｓ（Ｋ）、８６番目のＧｌｕ（Ｅ）、８８番目のＧｌｎ（Ｑ）、８９番目のＡｌａ（Ａ）、９０番目のＡｌａ（Ａ）、９２番目のＧｌｕ（Ｅ）、９３番目のＧｌｎ（Ｑ）、９６番目のＴｈｒ（Ｔ）、９７番目のＴｈｒ（Ｔ）、９９番目のＡｓｎ（Ｎ）、及び１００番目のＡｌａ（Ａ）のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基に結合する抗体又はその抗原結合断片。
＜２６＞ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片が、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選ばれるいずれか１である＜２０＞〜＜２５＞のいずれか１に記載の立体構造解析方法。
（ｉ）抗体のＨ鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３がそれぞれ配列番号１〜３を含み、かつ抗体のＬ鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体と競合して結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｉｉ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体が結合するエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片、および
（ｉｉｉ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片。
＜２７＞ＢＲＩＬに結合する抗体又はその抗原結合断片が、抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む＜２０＞〜＜２６＞のいずれか１に記載の立体構造解析方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、これまで構造解析が不可能または困難であった目的タンパク質の効率的な構造解析を可能にする方法を提供することができる。また目的タンパク質の構造解析において効率的かつ有効にタンパク質を安定化する方法を提供することができる。また本発明によれば、該タンパク質安定化に有用な抗体、該抗体をコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターを含む抗体生産細胞、該抗体の製造方法及び該抗体のタンパク質構造解析における使用方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１はｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ融合タンパク質のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＦＳＥＣ）によるヒストグラムの結果を示す図である。図１の横軸はタンパク質の溶出時間（分）を、縦軸は比蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。
【図２】図２は、ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ／ａｐｏ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂ複合体結晶のＸ線回折像を示す図である。
【図３】図３は、ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ／ａｐｏ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂ複合体の構造解析の結果を示す図である。
【図４】図４は、５ＨＴ１Ｂ−ＢＲＩＬ／Ｅｒｇｏｔａｍｉｎｅ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂ複合体の構造解析の結果を示す図である。
【図５】図５は、ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ／ａｐｏ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂの複合体を電子顕微鏡で撮影した図である。矢印（実線）で示した部分がＳＲＰ２０７０Ｆａｂ、矢印（破線）で示した部分がＧＰＣＲ部分である。
【図６】図６は、５ＨＴ１Ｂ−ＢＲＩＬ／Ｅｒｇｏｔａｍｉｎｅ／ＳＲＰ２０７０Ｆａ複合体を電子顕微鏡で撮影した図である。矢印（実線）で示した部分がＳＲＰ２０７０Ｆａｂ、矢印（破線）で示した部分がＧＰＣＲ部分である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ＢＲＩＬに結合する抗体（以下、抗ＢＲＩＬ抗体とも略す。）又はその抗原結合断片を用いてＢＲＩＬ融合タンパク質を安定化させる方法（以下、本発明の安定化方法とも略す。）に関する。本発明の安定化方法においては、目的タンパク質の構造解析を行うに当たり、目的タンパク質とＢＲＩＬとを融合させたＢＲＩＬ融合タンパク質を予め作製し、ＢＲＩＬ融合タンパク質のＢＲＩＬ部分に結合する抗体又はその抗原結合断片をＢＲＩＬ融合タンパク質と共存させ、結合させることで、ＢＲＩＬ融合タンパク質を安定化させることができる。
【００１８】
また、本発明は、ＢＲＩＬ融合タンパク質を安定に存在させることによる、ＢＲＩＬ融合タンパク質の精製方法、製造方法、結晶化方法、結晶化の促進方法、結晶製造方法及び立体構造解析方法なども含む。
【００１９】
本発明の安定化方法に用いられる抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片としては、後述する抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片のいずれのものも用いることができる。本発明のＢＲＩＬ融合タンパク質の精製方法としては、抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片をカラムやビーズに固相化してＢＲＩＬ融合タンパク質と結合させることにより、ＢＲＩＬ融合タンパク質を効率的かつ特異的に精製する方法が挙げられる。
【００２０】
本発明の安定化方法によれば、ＢＲＩＬ融合タンパク質を溶液内で安定に存在させることができることから、本発明の安定化方法は、目的タンパク質のネガティブ染色電子顕微鏡解析や、クライオ電子顕微鏡解析に用いることもできる。この際、抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片は、可溶性状態で目的のＢＲＩＬ融合タンパク質に方向性を与えるマーカーとして扱うこともできることから、目的タンパク質の電子顕微鏡解析像の解析に用いることができる。
【００２１】
即ち、溶液中において本発明の抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片をＢＲＩＬ融合タンパク質に結合させると、目的のＢＲＩＬ融合タンパク質のＢＲＩＬ部分に結合した抗体又はその抗原結合断片を、三次元構造におけるＢＲＩＬ部分、目的タンパク質部分を識別するマーカーとして認識できるため、目的タンパク質の構造解析に有用である。
【００２２】
また本発明の安定化方法によれば、結晶の生成過程において、ＢＲＩＬ融合タンパク質のＢＲＩＬ部分に抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片を結合させることで、ＢＲＩＬ融合タンパク質を規則正しく配列することができ、目的タンパク質の結晶化を効率的かつ促進することができる。本発明の安定化方法は、これまで結晶化が不可能または困難であった目的タンパク質の結晶化を効率的に促進する方法としても有用である。
【００２３】
本発明の結晶製造方法によれば、ＢＲＩＬ融合タンパク質と抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片を適当なモル比で混合したのち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、塩、有機溶媒及びバッファーと混合して、目的のＢＲＩＬ融合タンパク質と抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片との共結晶を製造することができる。
【００２４】
本発明の結晶製造方法としては、ＢＲＩＬ融合タンパク質を発現／精製する工程、ＢＲＩＬ融合タンパク質と抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片を反応させる工程、及びＢＲＩＬ融合タンパク質と抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片を共結晶化する工程を含む結晶の製造方法が挙げられる。
【００２５】
本発明の立体構造解析方法としては、ＢＲＩＬ融合タンパク質を発現／精製する工程、ＢＲＩＬ融合タンパク質と抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片を反応させる工程、ＢＲＩＬ融合タンパク質と抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片を共結晶化する工程、及びＸ線回折データを得る工程を含む結晶構造解析方法を含む立体構造解析方法、並びにＢＲＩＬ融合タンパク質を発現／精製する工程、ＢＲＩＬ融合タンパク質と抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片を反応させる工程、及び電子顕微鏡による構造解析を含む立体構造解析方法などが挙げられる。
【００２６】
また本発明は、ＢＲＩＬ融合タンパク質に結合する抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片に関する。本発明の抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片は、ＢＲＩＬ融合タンパク質のＢＲＩＬ部分に結合することでＢＲＩＬ融合タンパク質を安定化することができる。
【００２７】
本発明においてＢＲＩＬとは、ａｐｏｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ５６２のアミノ酸配列にＭ７Ｗ、Ｈ１０２Ｉ及びＲ１０６Ｌのアミノ酸残基置換が導入された熱耐性ａｐｏｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ５６２改変タンパク質のことをいう（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ５６２ＲＩＬともいう）［Chu et al, J. Mol. Biol. (2002) 323, 253-262］(Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ＩＤ：ＰＤＢ  １Ｍ６Ｔ）。
【００２８】
本発明において、アミノ酸残基置換は、元のアミノ酸残基、アミノ酸残基の位置、及び置換後のアミノ酸残基の順に示す。
【００２９】
また、本発明においてＢＲＩＬは、配列番号９のアミノ酸配列と、以下順に好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上の相同性を有するタンパク質、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ５６２のアミノ酸配列からなる立体構造を構成するタンパク質を包含する。
【００３０】
本発明においてＢＲＩＬ融合タンパク質とは、目的タンパク質にＢＲＩＬが融合されているタンパク質であれば、いずれのＢＲＩＬ融合タンパク質も含まれる。ＢＲＩＬ融合タンパク質は、ＢＲＩＬが目的タンパク質のヘリックス構造の少なくとも一部を構成するように目的タンパク質に融合されていることが好ましく、ＢＲＩＬが目的タンパク質の構造中のループ構造の少なくとも一部を構成するように目的タンパク質に融合されていることがより好ましい。
【００３１】
目的タンパク質に融合させるＢＲＩＬとしては、ＢＲＩＬ融合タンパク質におけるＢＲＩＬ部分に、抗ＢＲＩＬ抗体またはその抗原結合断片が結合することが可能であれば、その断片であってもよい。ＢＲＩＬ断片としては、目的タンパク質の種類等により、適宜調整することができる。
【００３２】
ＢＲＩＬ融合タンパク質として、具体的には例えば、目的タンパク質の細胞外ループ構造、細胞内ループ構造、小胞膜外ループ構造又は小胞内ループ構造の少なくとも一部を構成するように融合されているＢＲＩＬ融合タンパク質が挙げられる。
【００３３】
本発明においてＢＲＩＬ融合タンパク質としてより具体的には、例えば、目的タンパク質の構造中に存在する２つのへリックス構造の間に存在するループ構造の全部又は一部をＢＲＩＬタンパク質又は該断片で置換又は融合させたＢＲＩＬ融合タンパク質が挙げられる。
【００３４】
目的タンパク質の構造中に存在する前記２つのヘリックス構造は、タンパク質の１次配列上隣接していても、隣接していなくてもよいが、３次元立体構造上隣接していることが好ましく、目的タンパク質を構成する２つのヘリックス構造が１次配列上も隣接しかつ３次元立体構造上も隣接していることがより好ましい。
【００３５】
前記２つの隣接するヘリックス構造を構成する第１のヘリックス構造と第２のヘリックス構造のうち、第１のヘリックス構造のＣ末端側のアミノ酸残基と、第２のへリックス構造のＮ末端側又はＣ末端側のアミノ酸残基との距離が近いことが好ましく、該距離が以下順に１０〜１５Å、１１〜１５Å、１０〜１４Å、１１〜１４Å、１１〜１３Å、１２〜１４Åであることがより好ましい。
【００３６】
目的タンパク質の構造中のループ構造としては、例えば、各細胞膜、細胞小器官の小胞膜などの膜構造を貫通するへリックス構造の直下を形成する構造が挙げられる。該ループ構造の一部にＢＲＩＬタンパク質及び該断片を置換又は融合させてＢＲＩＬ融合タンパク質を発現、精製することができる。
【００３７】
具体的には、例えば、ＧＰＣＲの細胞内ループにＢＲＩＬを融合させる場合は、既報のＧＰＣＲ結晶構造解析結果より、ＧＰＣＲのＮ末端から５番目の膜貫通へリックスに保存されているプロリンから数えて１６〜２４番目のアミノ酸領域と、６番目の膜貫通へリックスに保存されたプロリンから−２４〜−２８番目のアミノ酸領域が重なる部分に、ＢＲＩＬを融合させることで、安定なＧＰＣＲ−ＢＲＩＬ融合タンパク質を作製することができる（Eugene Chun et al. Structure, 2012;20: 967-976）。
【００３８】
また、例えば、トランスポーターの細胞内ループにＢＲＩＬを融合させる場合は、トランスポータータンパク質の膜貫通ドメインを構成するヘリックス構造において、隣り合う２本のへリックス構造のそれぞれＣ末部分とＮ末部分との距離を計測し、１２〜１４Å程度の距離にある部分に、ＢＲＩＬ又は該断片を融合することでＢＲＩＬ融合タンパク質を作製することができる。
【００３９】
本発明において用いられる目的タンパク質としては、ＢＲＩＬ又は該断片と置換又は融合可能であればいずれのタンパク質でもよいが、好ましくは膜発現タンパク質（膜タンパク質ともいう）などが挙げられる。膜タンパク質としては、受容体、イオンチャネル、トランスポーター、酵素及び構造タンパク質などが挙げられるが、より好ましくは受容体、イオンチャネル及びトランスポーターが挙げられる。
【００４０】
受容体としては、例えば、ＧＰＣＲなどが挙げられる。
【００４１】
イオンチャネルとしては、例えば、ＣａｔＳｐｅｒ１、ＣａｔＳｐｅｒ２、ＣａｔＳｐｅｒ３、ＣａｔＳｐｅｒ４、ＴＰＣ１、ＴＰＣ２、ＣＮＧＡ１、ＣＮＧＡ２、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＡ４、ＣＮＧＢ１、ＣＮＧＢ３、ＨＣＮ１、ＨＣＮ２、ＨＣＮ３、ＨＣＮ４、ＫＣａ１．１、ＫＣａ２．１、ＫＣａ２．２、ＫＣａ２．３、ＫＣａ３．１、ＫＮａ１．１、ＫＮａ１．２、ＫＣａ５．１、Ｋｉｒ１．１、Ｋｉｒ２．１、Ｋｉｒ２．２、Ｋｉｒ２．３、Ｋｉｒ２．４、Ｋｉｒ３．１、Ｋｉｒ３．２、Ｋｉｒ３．３、Ｋｉｒ３．４、Ｋｉｒ４．１、Ｋｉｒ４．２、Ｋｉｒ５．１、Ｋｉｒ６．１、Ｋｉｒ６．２、Ｋｉｒ７．１、Ｋ２Ｐ１．１、Ｋ２Ｐ２．１、Ｋ２Ｐ３．１、Ｋ２Ｐ４．１、Ｋ２Ｐ５．１、Ｋ２Ｐ６．１、Ｋ２Ｐ７．１、Ｋ２Ｐ９．１、Ｋ２Ｐ１０．１、Ｋ２Ｐ１２．１、Ｋ２Ｐ１３．１、Ｋ２Ｐ１５．１、Ｋ２Ｐ１６．１、Ｋ２Ｐ１７．１、Ｋ２Ｐ１８．１、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．４、Ｋｖ１．５、Ｋｖ１．６、Ｋｖ１．７、Ｋｖ１．８、Ｋｖ２．１、Ｋｖ２．２、Ｋｖ３．１、Ｋｖ３．２、Ｋｖ３．４、Ｋｖ４．１、Ｋｖ４．２、Ｋｖ４．３、Ｋｖ５．１、Ｋｖ６．１、Ｋｖ６．２、Ｋｖ６．３、Ｋｖ６．４、Ｋｖ７．１、Ｋｖ７．２、Ｋｖ７．３、Ｋｖ７．４、Ｋｖ７．５、Ｋｖ８．１、Ｋｖ８．２、Ｋｖ９．１、Ｋｖ９．２、Ｋｖ９．３、Ｋｖ１０．１、Ｋｖ１０．２、Ｋｖ１１．１、Ｋｖ１１．２、Ｋｖ１１．３、Ｋｖ１２．１、Ｋｖ１２．２、Ｋｖ１２．３、ＲｙＲ１、ＲｙＲ２、ＲｙＲ３、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＣ１、ＴＲＰＣ２、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ４、ＴＲＰＣ５、ＴＲＰＣ６、ＴＲＰＣ７、ＴＲＰＭ１、ＴＲＰＭ２、ＴＲＰＭ３、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ５、ＴＲＰＭ６、ＴＲＰＭ７、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＭＬ１、ＴＲＰＭＬ２、ＴＲＰＭＬ３、ＴＲＰＰ１、ＴＲＰＰ２、ＴＲＰＰ３、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４、ＴＲＰＶ５、ＴＲＰＶ６、Ｃａｖ１．１、Ｃａｖ１．２、Ｃａｖ１．３、Ｃａｖ１．４、Ｃａｖ２．１、Ｃａｖ２．２、Ｃａｖ２．３、Ｃａｖ３．１、Ｃａｖ３．２、Ｃａｖ３．３、Ｈｖ１、Ｎａｖ１．１、Ｎａｖ１．２、Ｎａｖ１．３、Ｎａｖ１．４、Ｎａｖ１．５、Ｎａｖ１．５６、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、Ｎａｖ１．９、５−ＨＴ３ＡＢ、５−ＨＴ３Ａ、５−ＨＴ３Ｂ、５−ＨＴ３Ｃ、５−ＨＴ３Ｄ、５−ＨＴ３Ｅ、ＡＳＩＣ１、ＡＳＩＣ２、ＡＳＩＣ３、ＥＮａＣαβγ、ＥＮａＣ  α、ＥＮａＣ  β、ＥＮａＣ  δ、ＥＮａＣ  γ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α１  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α２  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α３  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α４  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α５  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α６  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  β１  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  β２  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  β３  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ１  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ２  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ３  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  δ  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ε  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  θ  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  π  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ρ１  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ρ２  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ρ３  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｇｌｙｃｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α１  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｇｌｙｃｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α２  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｇｌｙｃｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α３  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｇｌｙｃｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α４  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｇｌｙｃｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  β  ｓｕｂｕｎｉｔ、ＧｌｕＡ１、ＧｌｕＡ２、ＧｌｕＡ３、ＧｌｕＡ４、ＧｌｕＤ１、ＧｌｕＤ２、ＧｌｕＫ１、ＧｌｕＫ２、ＧｌｕＫ３、ＧｌｕＫ４、ＧｌｕＫ５、ＧｌｕＮ１、ＧｌｕＮ２Ａ、ＧｌｕＮ２Ｂ、ＧｌｕＮ２Ｃ、ＧｌｕＮ２Ｄ、ＧｌｕＮ３Ａ、ＧｌｕＮ３Ｂ、ＩＰ３Ｒ１、ＩＰ３Ｒ２、ＩＰ３Ｒ３、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α１  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α２  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α３  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α４  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α５  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α６  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α７  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α８  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α９  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α１０  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  β１  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  β２  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  β３  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  β４  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  δ  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ε  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ２、Ｐ２Ｘ３、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ５、Ｐ２Ｘ６、Ｐ２Ｘ７、ＺＡＣ、ＡＱＰ０、ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４、ＡＱＰ５、ＡＱＰ６、ＡＱＰ７、ＡＱＰ８、ＡＱＰ９、ＡＱＰ１０、ＣｌＣ−１、ＣｌＣ−２、ＣｌＣ−３、ＣｌＣ−４、ＣｌＣ−５、ＣｌＣ−６、ＣｌＣ−７、ＣｌＣ−Ｋａ、ＣｌＣ−Ｋｂ、ＣＦＴＲ、ＣａＣＣ、Ｍａｘｉ  Ｃｌ−、ＶＲＡＣ、Ｃｘ２３、Ｃｘ２５、Ｃｘ２６、Ｃｘ３０、Ｃｘ３０．２、Ｃｘ３０．３、Ｃｘ３１、Ｃｘ３１．１、Ｃｘ３１．９、Ｃｘ３２、���ｘ３６、Ｃｘ３７、Ｃｘ４０、Ｃｘ４０．１、Ｃｘ４３、Ｃｘ４５、Ｃｘ４６、Ｃｘ４７、Ｃｘ５０、Ｃｘ５９、Ｃｘ６２、Ｐｘ１、Ｐｘ２、Ｐｘ３、Ｎａｖｉ２．１などが挙げられる。
【００４２】
ＧＰＣＲとしては、例えば、５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｄ、５−ｈｔ１ｅ、５−ＨＴ１Ｆ、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｂ、５−ＨＴ２Ｃ、５−ＨＴ４、５−ＨＴ５ａ、５−ＨＴ６、５−ＨＴ７、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、Ａ３、α１Ａ−ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ、α１Ｂ−ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ、α１Ｄ−ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ、α２Ａ−ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ、α２Ｂ−ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ、α２Ｃ−ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ、β１−ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ、β２−ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ、β３−ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｃ５Ｌ２、ＡＴ１、ＡＴ２、ＡＰＪ、ＧＰＢＡ、ＢＢ１、ＢＢ２、ＢＢ３、Ｂ１、Ｂ２、ＣＢ１、ＣＢ２、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＸ３ＣＲ１、ＸＣＲ１、ＣＣＫ１、ＣＣＫ２、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、ＥＴＡ、ＥＴＢ、ＧＰＥＲ、ＦＰＲ１、ＦＰＲ２／ＡＬＸ、ＦＰＲ３、ＦＦＡ１、ＦＦＡ２、ＦＦＡ３、ＧＰＲ４２、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ３、グレリン、ＦＳＨ、ＬＨ、ＴＳＨ、ＧｎＲＨ、ＧｎＲＨ２、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、ＨＣＡ１、ＨＣＡ２、ＨＣＡ３、ｋｉｓｓｐｅｐｔｉｎ、ＢＬＴ１、ＢＬＴ２、ＣｙｓＬＴ１、ＣｙｓＬＴ２、ＯＸＥ、ＦＰＲ２／ＡＬＸ、ＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３、ＬＰＡ４、ＬＰＡ５、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４、Ｓ１Ｐ５、ＭＣＨ１、ＭＣＨ２、ＭＣ１、ＭＣ２、ＭＣ３、ＭＣ４、ＭＣ５、ＭＴ１、ＭＴ２、モチリン、ＮＭＵ１、ＮＭＵ２、ＮＰＦＦ１、ＮＰＦＦ２、ＮＰＳ、ＮＰＢＷ１、ＮＰＢＷ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５、ＮＴＳ１、ＮＴＳ２、δ、κ、μ、ＮＯＰ、ＯＸ１、ＯＸ２、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６、Ｐ２Ｙ１１、Ｐ２Ｙ１２、Ｐ２Ｙ１３、Ｐ２Ｙ１４、ＱＲＦＰ、ＰＡＦ、ＰＫＲ１、ＰＫＲ２、ＰＲＲＰ、ＤＰ１、ＤＰ２、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、ＥＰ４、ＦＰ、ＩＰ１、ＴＰ、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、ＰＡＲ４、ＲＸＦＰ１、ＲＸＦＰ２、ＲＸＦＰ３、ＲＸＦＰ４、ｓｓｔ１、ｓｓｔ２、ｓｓｔ３、ｓｓｔ４、ｓｓｔ５、ＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３、ＴＲＨ１、ＴＡ１、ＵＴ、Ｖ１Ａ、Ｖ１Ｂ、Ｖ２、ＯＴ、ＣＣＲＬ２、ＣＭＫＬＲ１、ＧＰＲ１、ＧＰＲ３、ＧＰＲ４、ＧＰＲ６、ＧＰＲ１２、ＧＰＲ１５、ＧＰＲ１７、ＧＰＲ１８、ＧＰＲ１９、ＧＰＲ２０、ＧＰＲ２１、ＧＰＲ２２、ＧＰＲ２５、ＧＰＲ２６、ＧＰＲ２７、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ３２、ＧＰＲ３３、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ３５、ＧＰＲ３７、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＧＰＲ３９、ＧＰＲ４２、ＧＰＲ４５、ＧＰＲ５０、ＧＰＲ５２、ＧＰＲ５５、ＧＰＲ６１、ＧＰＲ６２、ＧＰＲ６３、ＧＰＲ６５、ＧＰＲ６８、ＧＰＲ７５、ＧＰＲ７８、ＧＰＲ７９、ＧＰＲ８２、ＧＰＲ８３、ＧＰＲ８４、ＧＰＲ８５、ＧＰＲ８７、ＧＰＲ８８、ＧＰＲ１０１、ＧＰＲ１１９、ＧＰＲ１２０、ＧＰＲ１３２、ＧＰＲ１３５、ＧＰＲ１３９、ＧＰＲ１４１、ＧＰＲ１４２、ＧＰＲ１４６、ＧＰＲ１４８、ＧＰＲ１４９、ＧＰＲ１５０、ＧＰＲ１５１、ＧＰＲ１５２、ＧＰＲ１５３、ＧＰＲ１６０、ＧＰＲ１６１、ＧＰＲ１６２、ＧＰＲ１７１、ＧＰＲ１７３、ＧＰＲ１７４、ＧＰＲ１７６、ＧＰＲ１８２、ＧＰＲ１８３、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＬＰＡＲ６、ＭＡＳ１、ＭＡＳ１Ｌ、ＭＲＧＰＲＤ、ＭＲＧＰＲＥ、ＭＲＧＰＲＦ、ＭＲＧＰＲＧ、ＭＲＧＰＲＸ１、ＭＲＧＰＲＸ２、ＭＲＧＰＲＸ３、ＭＲＧＰＲＸ４、ＯＰＮ３、ＯＰＮ５、ＯＸＧＲ１、Ｐ２ＲＹ８、Ｐ２ＲＹ１０、ＳＵＣＮＲ１、ＴＡＡＲ２、ＴＡＡＲ３、ＴＡＡＲ４、ＴＡＡＲ５、ＴＡＡＲ６、ＴＡＡＲ８、ＴＡＡＲ９、ＣＣＰＢ２、ＣＣＲＬ１、ＦＹ、ＣＴ、カルシトニンレセプター様、ＣＲＦ１、ＣＲＦ２、ＧＨＲＨ、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、グルカゴン、セクレチン、ＰＴＨ１、ＰＴＨ２、ＰＡＣ１、ＶＰＡＣ１、ＶＰＡＣ２、ＢＡＩ１、ＢＡＩ２、ＢＡＩ３、ＣＤ９７、ＣＥＬＳＲ１、ＣＥＬＳＲ２、ＣＥＬＳＲ３、ＥＬＴＤ１、ＥＭＲ１、ＥＭＲ２、ＥＭＲ３、ＥＭＲ４Ｐ、ＧＰＲ５６、ＧＰＲ６４、ＧＰＲ９７、ＧＰＲ９８、ＧＰＲ１１０、ＧＰＲ１１１、ＧＰＲ１１２、ＧＰＲ１１３、ＧＰＲ１１４、ＧＰＲ１１５、ＧＰＲ１１６、ＧＰＲ１２３、ＧＰＲ１２４、ＧＰＲ１２５、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲ１２８、ＧＰＲ１３３、ＧＰＲ１４３、ＧＰＲ１４４、ＧＰＲ１５７、ＬＰＨＮ１、ＬＰＨＮ２、ＬＰＨＮ３、ＣａＳ、ＧＰＲＣ６、ＧＡＢＡＢ１、ＧＡＢＡＢ２、ｍＧｌｕ１、ｍＧｌｕ２、ｍＧｌｕ３、ｍＧｌｕ４、ｍＧｌｕ５、ｍＧｌｕ６、ｍＧｌｕ７、ｍＧｌｕ８、ＧＰＲ１５６、ＧＰＲ１５８、ＧＰＲ１７９、ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＧＰＲＣ５Ｃ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＳＭＯなどが挙げられる。
【００４３】
トランスポーターとしては、例えば、ＡＢＣ１、ＡＢＣ２、ＡＢＣ３、ＡＢＣＲ、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ７、ＡＢＣＡ８、ＡＢＣＡ９、ＡＢＣＡ１０、ＡＢＣＡ１２、ＡＢＣＡ１３、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＢ２、ＡＢＣＢ３、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ５、ＡＢＣＢ６、ＡＢＣＢ７、ＡＢＣＢ８、ＡＢＣＢ９、ＡＢＣＢ１０、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＣ５、ＡＢＣＣ６、ＡＢＣＣ７、ＡＢＣＣ８、ＡＢＣＣ９、ＡＢＣＣ１０、ＡＢＣＣ１１、ＡＢＣＣ１２  、ＡＢＣＤ１、ＡＢＣＤ２、ＡＢＣＤ３、ＡＢＣＧ１、ＡＢＣＧ２、ＡＢＣＧ４、ＡＢＣＧ５、ＡＢＣＧ８、Ｆ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  α  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｆ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  β  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｆ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  γ  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｆ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  δ  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｆ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  ε  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｆ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｆ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｂ  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｆ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｆ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｄ  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｆ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｆ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｆ２  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｆ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｆ６  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｆ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｇ２  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｆ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  ８  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ１  ｍｏｔｏｒ  Ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ１  ｍｏｔｏｒ  Ｂ１  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ１  ｍｏｔｏｒ  Ｂ２  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ１  ｍｏｔｏｒ  Ｃ１  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ１  ｍｏｔｏｒ  Ｄ  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ１  ｍｏｔｏｒ  Ｅ１  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ１  ｍｏｔｏｒ  Ｅ２  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ１  ｍｏｔｏｒ  Ｆ  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ１  ｍｏｔｏｒ  Ｇ１  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ１  ｍｏｔｏｒ  Ｇ２  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ１  ｍｏｔｏｒ  Ｇ３  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ１  ｍｏｔｏｒ  Ｈ  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ０  ｍｏｔｏｒ  ａ１  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ０  ｍｏｔｏｒ  ａ２  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ０  ｍｏｔｏｒ  ａ３  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ０  ｍｏｔｏｒ  ａ４  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ０  ｍｏｔｏｒ  ｂ  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ０  ｍｏｔｏｒ  ｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ０  ｍｏｔｏｒ  ｄ１  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ０  ｍｏｔｏｒ  ｄ２  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ０  ｍｏｔｏｒ  ｅ１  ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｖ−ｔｙｐｅ  ＡＴＰａｓｅ  Ｖ０  ｍｏｔｏｒ  ｅ２  ｓｕｂｕｎｉｔ、ｓｏｄｉｕｍ／ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ＡＴＰａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  α−１、ｓｏｄｉｕｍ／ｐｏ���ａｓｓｉｕｍ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ＡＴＰａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  α−２、ｓｏｄｉｕｍ／ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ＡＴＰａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  α−３、ｓｏｄｉｕｍ／ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ＡＴＰａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  α−４、ｓｏｄｉｕｍ／ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ＡＴＰａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  β−１、ｓｏｄｉｕｍ／ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ＡＴＰａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  β−２、ｓｏｄｉｕｍ／ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ＡＴＰａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  β−３、ｓｏｄｉｕｍ／ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  ＡＴＰａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  γ、ＳＥＲＣＡ１、ＳＥＲＣＡ２、ＳＥＲＣＡ３、ＰＭＣＡ１、ＰＭＣＡ２、ＰＭＣＡ３、ＰＭＣＡ４、ＳＰＣＡ１、ＳＰＣＡ２、ＡＴＰ４Ａ、ＡＴＰ１２Ａ、ＡＴＰ４Ｂ、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ８Ａ１、ＡＴＰ８Ａ２、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＴＰ８Ｂ２、ＡＴＰ８Ｂ３、ＡＴＰ８Ｂ４、ＡＴＰ９Ａ、ＡＴＰ９Ｂ、ＡＴＰ１０Ａ、ＡＴＰ１０Ｂ、ＡＴＰ１０Ｄ、ＡＴＰ１１Ａ、ＡＴＰ１１Ｂ、ＡＴＰ１１Ｃ、ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ２Ａ、ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ１２、ＥＡＡＴ３、ＥＡＡＴ４、ＥＡＡＴ５、ＡＳＣＴ１、ＡＳＣＴ２、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ４、ＧＬＵＴ５、ＧＬＵＴ６、ＧＬＵＴ７、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ９、ＧＬＵＴ１０、ＧＬＵＴ１１、ＧＬＵＴ１２、ＨＭＩＴ、ｒＢＡＴ、４Ｆ２ｈｃ、ＣＡＴ１、ＣＡＴ２、ＣＡＴ３、ＣＡＴ４、Ｐｒｏｂａｂｌｅ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、ＬＡＴ１、ＬＡＴ２、ｙ＋ＬＡＴ１、ｙ＋ＬＡＴ２、ｂ０、＋ＡＴ、Ａｓｃ−１、ｘＣＴ、ＡＧＴ１、ＡＥ１、ＡＥ２、ＡＥ３、ＡＥ４、ＮＢＣｅ１、ＮＢＣｅ２、ＮＢＣｎ１、ＮＢＣｎ２、ＮＤＣＢＥ、ＢＴＲ１、ＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ２、ＳＧＬＴ３、ＳＧＬＴ４、ＳＧＬＴ５、ＣＨＴ、ＮＩＳ、ＳＭＶＴ、ＳＭＣＴ１、ＳＭＣＴ２、ＳＭＩＴ１、ＳＭＩＴ２、ＮＥＴ、ＤＡＴ、ＧＡＴ１、ＧＡＴ２、ＧＡＴ３、ＢＧＴ１、ＴａｕＴ、ＣＴ１、ＧｌｙＴ１、ＧｌｙＴ２、ＡＴＢ０、ＰＲＯＴ、Ｂ０ＡＴ１、Ｂ０ＡＴ２、Ｂ０ＡＴ３、ＮＴＴ４、ＮＴＴ５、ＳＩＴ１、ＮＣＸ１、ＮＣＸ２、ＮＣＸ３、ＮＨＥ１、ＮＨＥ２、ＮＨＥ３、ＮＨＥ４、ＮＨＥ５、ＮＨＥ６、ＮＨＥ７、ＮＨＥ８、ＮＨＥ９、ＮＨＡ１、ＮＨＡ２、Ｓｐｅｒｍ−ＮＨＥ、ＮＨＥ１１、ＮＴＣＰ、ＡＳＢＴ、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、ＳＯＡＴ、Ｐ７、ＮＲＡＭＰ１、ＤＭＴ１、ＮＫＣＣ２、ＮＫＣＣ１、ＮＣＣ、ＫＣＣ１、ＫＣＣ２、ＫＣＣ３、ＫＣＣ４、ＣＣＣ９、ＣＣＣ６、ＮａＳ１、ＮａＳ２、ＮａＣ１、ＮａＣ２、ＮａＣ３、ＵＴ−Ａ、ＵＴ−Ｂ、ＰｅｐＴ１、ＰｅｐＴ２、ＰＨＴ１、ＰＨＴ２、ＭＣＴ１、Ｖ  ＭＣＴ２、ＭＣＴ３、ＭＣＴ４、ＭＣＴ５、ＭＣＴ６、ＭＣＴ７、ＭＣＴ８、ＭＣＴ９、ＭＣＴ１１、ＭＣＴ１２、ＭＣＴ１３、ＭＣＴ１４、ＴＡＴ１、ＮＰＴ１、ＮＰＴ３、ＮＰＴ４、Ｓｏｄｉｕｍ／ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｈｏｍｏｌｏｇ、ＡＳＴ、ＶＧＬＵＴ１、ＶＧＬＵＴ２、ＶＧＬＵＴ３、ＶＮＵＴ、ＶＭＡＴ１、ＶＭＡＴ２、ＶＡＣｈＴ、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  １８  ｍｅｍｂｅｒ  Ｂ１、ＦＯＬＴ、ＴｈＴｒ１、ＴｈＴｒ２、ＰｉＴ１、ＰｉＴ２、ＯＣＴ１、ＯＣＴ２、ＯＣＴ３、ＯＣＴＮ１、ＯＣＴＮ２、ＣＴ２、ＯＡＴ１、ＯＡＴ２、ＯＡＴ３、ＯＡＴ４、ＯＡＴ５、Ｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｉｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ４、ＵＲＡＴ１、ＯＲＣＴＬ３、ＯＲＣＴＬ４、ＦＬＩＰＴ１、ＢＯＩＴ、ＯＲＣＴＬ２、ＯＡＴ６、ＳＬＣ２２Ａ２３、ＳＬＣ２２Ａ２４、ＵＳＴ６、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ２２  ｍｅｍｂｅｒ  ３１が挙げられる。
【００４４】
また、トランスポーターとしては、例えば、ＳＶＣＴ１、ＳＶＣＴ２、ＳＶＣＴ３、ＳＮＢＴ１、ＮＫＣＸ１、ＮＫＣＸ２、ＮＫＣＸ３、ＮＫＣＸ４、ＮＫＣＸ５、ＮＫＣＸ６、ＣＩＣ、ＤＩＣ、ＯＧＣ、ＯＤＣ、ＳＬＣ２５Ａ３４、ＳＬＣ２５Ａ３５、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ２５  ｍｅｍｂｅｒ  ４７、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ２５  ｍｅｍｂｅｒ  ４８、ＡＧＣ１、ＡＧＣ２、ＧＣ１、ＧＣ２、ＯＲＣ１、ＯＲＣ２、ＣＡＣ、ＯＲＮＴ３、ＳＬＣ２５Ａ３８、ＣＧＩ−６９、ＭＣＦＰ、ＳＬＣ２５Ａ４４、ＳＬＣ２５Ａ４５、ＰＨＣ、ＡＮＴ１、ＡＮＴ２、ＡＮＴ３、ＡＮＴ４、ＧＤＣ、ＰＭＰ３４、ＤＮＣ、ＳＡＭＣ１、ＳＬＣ２５Ａ４２、ＡＰＣ１、ＡＰＣ２、ＡＰＣ３、ＭＦＴＣ、ＰＮＣ１、ＰＮＣ２、ＳＣａＭＣ−３Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ４３、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、ＵＣＰ３、ＵＣＰ４、ＵＣＰ５、ＫＭＣＰ１、ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  １、ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ２、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ２５  ｍｅｍｂｅｒ  ５１、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ２５  ｍｅｍｂｅｒ  ５２、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ２５  ｍｅｍｂｅｒ  ５３、Ｍｉｔｏｆｅｒｒｉｎ１、Ｍｉｔｏｆｅｒｒｉｎ２、ＳＬＣ２５Ａ４６、Ｓａｔ−１、ＤＴＤＳＴ、ＤＲＡ、Ｐｅｎｄｒｉｎ、ＰＡＴ−１、ＳＬＣ２６Ａ７、ＳＬＣ２６Ａ９、Ｐｒｅｓｔｉｎ、Ｔａｔ１、ＳＬＣ２６Ａ１０、ＫＢＡＴ、ＦＡＴＰ１、ＦＡＴＰ２、ＦＡＴＰ３、ＦＡＴＰ４、ＦＡＴＰ５、ＦＡＴＰ６、ＣＮＴ１、ＣＮＴ２、ＣＮＴ３、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２、ＥＮＴ３、ＰＭＡＴ、ＺｎＴ１、ＺｎＴ２、ＺｎＴ３、ＺｎＴ４、ＺｎＴ５、ＺｎＴ６、ＺｎＴ７、ＺｎＴ８、ＺｎＴ９、ＺｎＴ１０、ＣＴＲ１、ＣＴＲ２、ＶＩＡＡＴ、ＡＣＡＴＮ１、ＮａＰｉ−ＩＩａ、ＮａＰｉ−ＩＩｂ、ＮａＰｉ−ＩＩｃ、ＣＭＰ−ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、ＵＤＰ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、ＭＧＣ２５４１、ＦＬＪ１１１３０、ＵＧＴＲＥＬ１、ＰＡＰＳ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  １、ＰＡＰＳ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ２、ＹＥＡ、ＧＤＰ−Ｆｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、ＯＶＣＯＶ１、ＵＤＰ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ／ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ  ｄｕａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、ＨＦＲＣ１、ＦＲＣＬ１、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３５  ｍｅｍｂｅｒ  Ｅ１、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３５  ｍｅｍｂｅｒ  Ｅ２、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３５  ｍｅｍｂｅｒ  Ｅ２Ｂ、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３５  ｍｅｍｂｅｒ  Ｅ３、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３５  ｍｅｍｂｅｒ  Ｅ４、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３５  ｍｅｍｂｅｒ  Ｆ１、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３５  ｍｅｍｂｅｒ  Ｆ２、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３５  ｍｅｍｂｅｒ  Ｆ３、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３５  ｍ���ｍｂｅｒ  Ｆ４、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３５  ｍｅｍｂｅｒ  Ｆ５、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３５  ｍｅｍｂｅｒ  Ｆ６、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３５  ｍｅｍｂｅｒ  Ｇ１、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３５  ｍｅｍｂｅｒ  Ｇ２、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３５  ｍｅｍｂｅｒ  Ｇ３、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３５  ｍｅｍｂｅｒ  Ｇ４、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３５  ｍｅｍｂｅｒ  Ｇ５、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３５  ｍｅｍｂｅｒ  Ｇ６、ＰＡＴ１、ＰＡＴ２、ＰＡＴ３、ＰＡＴ４、ＳＰＸ１、ＳＰＸ２、ＳＰＸ３、ＳＰＸ４、ＳＮＡＴ１、ＳＮＡＴ２、ＳＮＡＴ３、ＳＮＡＴ４、ＳＮＡＴ５、ＳＮＡＴ６、ＳＮＡＴ７、Ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｓｏｄｉｕｍ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｎｅｕｔｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ８、Ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｓｏｄｉｕｍ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｎｅｕｔｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ９、ＰＰ１７４４、ＡＶＴ２、ＺＩＰ１、ＺＩＰ２、ＺＩＰ３、ＺＩＰ４、ＺＩＰ５、ＺＩＰ６、ＺＩＰ７、ＺＩＰ８、ＺＩＰ９、ＺＩＰ１０、ＺＩＰ１１、ＺＩＰ１２、ＺＩＰ１３、ＺＩＰ１４、ＩＲＥＧ１、ＭｇｔＥ、Ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ４１  ｍｅｍｂｅｒ  ２、Ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ４１  ｍｅｍｂｅｒ  ３、ＲｈＡＧ、ＲｈＢＧ、ＲｈＣＧ、ＬＡＴ３、ＬＡＴ４、ＥＥＧ１、ＣＴＬ１、ＣＴＬ２、ＣＴＬ３、ＣＴＬ４、ＣＴＬ５、Ｐｒｏｔｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｕｇａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ａ、Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ４５  ｍｅｍｂｅｒ  ３、Ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ４５  ｍｅｍｂｅｒ  ４、ＰＣＦＴ、ＴＳＣＯＴ、ＳＬＣ４６Ａ３、ＭＡＴＥ１、ＭＡＴＥ２−Ｋ、ＨＲＧ１、ＦＬＶＣＲ１、ＦＬＶＣＲ２、ＭＦＳＤ７、ＤＩＲＣ２、ＲＡＧ１ＡＰ１、ＯＳＴα、ＯＳＴβ、ＲＦＶＴ１、ＲＦＶＴ２、ＲＦＶＴ３、ＯＡＴＰ１Ａ２、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ＯＡＴＰ１Ｃ１、ＯＡＴＰ２Ａ１、ＯＡＴＰ２Ｂ１、ＯＡＴＰ３Ａ１、ＯＡＴＰ４Ａ１、ＯＡＴＰ４Ｃ１、ＯＡＴＰ５Ａ１、ＯＡＴＰ６Ａ１などが挙げられる。
【００４５】
ＢＲＩＬ融合タンパク質の作製に際し、目的タンパク質におけるＢＲＩＬの挿入位置、ＢＲＩＬ融合蛋白質のＮ末端とＣ末端のアミノ酸配列の長さ等は、ＢＲＩＬ融合タンパク質について実施例において後述するＦＳＥＣなどのスクリーニングを行うことにより、所望の単分散性および安定性等が得られるように適宜調整することができる。  
【００４６】
本発明の抗体又はその抗原結合断片としては、ＢＲＩＬに特異的に結合する抗体（抗ＢＲＩＬ抗体）又はその抗原結合断片が挙げられる。
【００４７】
抗体分子は重鎖（Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ、以下Ｈ鎖と記す）および軽鎖（Ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ、以下Ｌ鎖と記す）と呼ばれるポリペプチドより構成される。また、Ｈ鎖はＮ末端側よりＨ鎖可変領域（ＶＨとも表記される）、Ｈ鎖定常領域（ＣＨとも表記される）、Ｌ鎖はＮ末端側よりＬ鎖可変領域（ＶＬとも表記される）、Ｌ鎖定常領域（ＣＬとも表記される）の各領域により、それぞれ構成される。
【００４８】
ＣＨは各サブクラスごとに、α、δ、ε、γおよびμ鎖がそれぞれ知られている。ＣＨはさらに、Ｎ末端側よりＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインの各ドメインにより構成される。ドメインとは、抗体分子の各ポリペプチドを構成する機能的な構造単位をいう。また、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを併せてＦｃ領域または単にＦｃという。ＣＬは、Ｃλ鎖およびＣκ鎖が知られている。
【００４９】
本発明におけるＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＦｃ領域は、ＥＵインデックス［Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］により、Ｎ末端からのアミノ酸残基の番号で特定することができる。具体的には、ＣＨ１はＥＵインデックス１１８〜２１５番のアミノ酸配列、ヒンジはＥＵインデックス２１６〜２３０番のアミノ酸配列、ＣＨ２はＥＵインデックス２３１〜３４０番のアミノ酸配列、ＣＨ３はＥＵインデックス３４１〜４４７番のアミノ酸配列とそれぞれ特定される。
【００５０】
本発明の抗体としては、特に遺伝子工学的に作製された組換えマウス抗体、組換えラット抗体、組換えラビット抗体、マウス型キメラ抗体、ラット型キメラ抗体、ヒト型キメラ抗体（以下、単にキメラ抗体とも略記する）、ヒト化抗体［ヒト型相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）移植抗体ともいう］、及びヒト抗体などの遺伝子組換え抗体も含まれる。
【００５１】
キメラ抗体とは、例えば、ヒト以外の動物（非ヒト動物）の抗体のＶＨおよびＶＬと、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなる抗体を意味する。また、異種動物間のＶＨ／ＶＬとＣＨ／ＣＬとで組換えられたキメラ抗体も包含される。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【００５２】
ハイブリドーマとは、非ヒト動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウスなどに由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞をいう。したがって、ハイブリドーマが産生する抗体を構成する可変領域は、非ヒト動物抗体のアミノ酸配列からなる。
【００５３】
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産する非ヒト動物細胞由来のハイブリドーマより、該モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００５４】
ヒト化抗体とは、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの対応するＣＤＲに移植した抗体をいう。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ以外の領域はフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）と称される。
【００５５】
ヒト化抗体は、非ヒト動物抗体のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡと、非ヒト動物抗体のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００５６】
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。
【００５７】
ヒト抗体は、ヒトイムノグロブリン遺伝子を保持するマウス（Tomizuka K. et. al., Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 722-7, 2000）に所望の抗原を免疫することにより、取得することが出来る。また、ヒト由来のＢ細胞から抗体遺伝子を増幅したｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙライブラリーを用いることにより、所望の結合活性を有するヒト抗体を選択することで、免疫を行わずにヒト抗体を取得することができる（Winter G. et. al., Annu Rev Immunol.12:433-55. 1994）。さらに、ＥＢウイルスを用いてヒトＢ細胞を不死化することにより、所望の結合活性を有するヒト抗体を生産する細胞を作製し、ヒト抗体を取得することができる（Rosen A. et. al., Nature 267, 52-54.1977）。
【００５８】
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血から単離したリンパ球を、ＥＢウイルス等を感染させることによって不死化した後、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を得ることができ、該リンパ球を培養した培養物中より該抗体を精製することができる。
【００５９】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖ等の抗体断片を表面に発現させたファージのライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
【００６０】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が宿主動物の染色体内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
【００６１】
本発明の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列としては、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列、あるいは非ヒト動物抗体のＣＤＲを、任意のヒト抗体のフレームワークに移植したヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列のいずれでもよい。
【００６２】
本発明の抗体におけるＣＬのアミノ酸配列としては、ヒト抗体のアミノ酸配列または非ヒト動物抗体のアミノ酸配列のいずれでもよいが、ヒト抗体のアミノ酸配列のＣκあるいはＣλが好ましい。
【００６３】
本発明の抗体のＣＨとしては、イムノグロブリンに属すればいかなるものでもよいが、好ましくはＩｇＧクラスに属するサブクラス、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）のいずれも用いることができる。
【００６４】
本発明の抗体としては、Ｆｃと抗体断片とが結合したＦｃ融合タンパク質、Ｆｃと天然に存在するリガンドまたは受容体とが結合したＦｃ融合タンパク質（イムノアドヘシンともいう）、複数のＦｃ領域を融合させたＦｃ融合タンパク質等も本発明に包含される。また、抗体を安定化させるためおよび血中半減期を制御するために、アミノ酸残基を改変したＦｃ領域なども本発明の抗体に用いることができる。
【００６５】
本発明の抗体又はその抗原結合断片は、翻訳後修飾されたいかなるアミノ酸残基を含む抗体をも包含する。翻訳後修飾としては、例えば、Ｈ鎖のＣ末端におけるリジン残基の欠失［リジン・クリッピング（ｌｙｓｉｎｅ  ｃｌｉｐｐｉｎｇ）］、及びポリペプチドのＮ末端におけるグルタミン残基のピログルタミン（ｐｙｒｏＧｌｕ）への変換などが挙げられる［Beck et al, Analytical Chemistry, 85, 715-736（2013）］。
【００６６】
本発明において抗原結合断片（又は抗体断片ともいう）としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、複数のＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
【００６７】
Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）で結合した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗原結合断片である。
【００６８】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗原結合断片である。
【００６９】
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗原結合断片である。
【００７０】
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを４個のＧｌｙおよび１個のＳｅｒ残基からなるリンカー（Ｇ４Ｓ）を任意の個数つなげたリンカーペプチドなどの適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗原結合断片である。
【００７１】
Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗原結合断片で、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性または異なる抗原に対する特異的な抗原結合活性を有する抗原結合断片である。
【００７２】
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のＳ−Ｓ結合を介して結合させたものをいう。
【００７３】
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、ＣＤＲ同士を直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
【００７４】
本発明の改変抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法、またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。
【００７５】
本発明の抗ＢＲＩＬ抗体又はその抗原結合断片として具体的には、以下の（ａ）〜（о）から選ばれるいずれか１が挙げられる。
（ａ）ＢＲＩＬのヘリックス構造に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｂ）ＢＲＩＬの第１〜４ヘリックス構造のいずれか１に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｃ）ＢＲＩＬの第３ヘリックス構造および第４ヘリックス構造の少なくともいずれか一方に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｄ）ＢＲＩＬの第３ヘリックス構造から第４ヘリックス構造までの少なくとも一部に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｅ）ＢＲＩＬの第３ヘリックス構造及び第４ヘリックス構造に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｆ）ＢＲＩＬのＮ末端から６７番目のＩｌｅ（Ｉ）、７１番目のＧｌｎ（Ｑ）、７４番目のＡｓｐ（Ｄ）、７７番目のＬｙｓ（Ｋ）、７８番目のＬｅｕ（Ｌ）、８３番目のＬｙｓ（Ｋ）、８５番目のＬｙｓ（Ｋ）、８６番目のＧｌｕ（Ｅ）、８８番目のＧｌｎ（Ｑ）、８９番目のＡｌａ（Ａ）、９０番目のＡｌａ（Ａ）、９２番目のＧｌｕ（Ｅ）、９３番目のＧｌｎ（Ｑ）、９６番目のＴｈｒ（Ｔ）、９７番目のＴｈｒ（Ｔ）、９９番目のＡｓｎ（Ｎ）、及び１００番目のＡｌａ（Ａ）のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｇ）ＢＲＩＬのＮ末端から７４番目のＡｓｐ（Ｄ）、９２番目のＧｌｕ（Ｅ）、９６番目のＴｈｒ（Ｔ）、９７番目のＴｈｒ（Ｔ）、及び９９番目のＡｓｎ（Ｎ）のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｈ）ＢＲＩＬのＮ末端から７４番目のＡｓｐ（Ｄ）に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｉ）ＢＲＩＬのＮ末端から９２番目のＧｌｕ（Ｅ）、９６番目のＴｈｒ（Ｔ）、９７番目のＴｈｒ（Ｔ）、及び９９番目のＡｓｎ（Ｎ）のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｊ）ＢＲＩＬのＮ末端から９２番目のＧｌｕ（Ｅ）に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｋ）ＢＲＩＬのＮ末端から９６番目のＴｈｒ（Ｔ）に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｌ）ＢＲＩＬのＮ末端から９７番目のＴｈｒ（Ｔ）に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｍ）ＢＲＩＬのＮ末端から９９番目のＡｓｎ（Ｎ）に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｎ）ＢＲＩＬのＮ末端から９６番目のＴｈｒ（Ｔ）、９７番目のＴｈｒ（Ｔ）及び９９番目のＡｓｎ（Ｎ）のアミノ酸残基に結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｏ）ＢＲＩＬの９２番目のＧｌｕ（Ｅ）、９６番目のＴｈｒ（Ｔ）、９７番目のＴｈｒ（Ｔ）及び９９番目のＡｓｎ（Ｎ）のアミノ酸残基に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【００７６】
本発明においてＢＲＩＬのヘリックス構造を構成するアミノ酸配列としては、配列番号９で表されるアミノ酸配列のうち、第１ヘリックス構造を構成するアミノ酸配列としてＮ末端から４番目のＭから１９番目のＫまでのアミノ酸配列、第２ヘリックス構造を構成するアミノ酸配列としてＮ末端から２３番目のＡから４２番目のＫまでのアミノ酸配列、第３ヘリックス構造を構成するアミノ酸配列としてＮ末端から５９番目のＫから８１番目のＥまでのアミノ酸配列、及び第４ヘリックス構造を構成するアミノ酸配列としてＮ末端から８４番目のＶから１０５番目のＹまでのアミノ酸配列が挙げられる。
【００７７】
また、本発明の抗体又は該抗体断片としてより具体的には、以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）から選ばれるいずれか１が挙げられる。
（ｉ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体と競合して結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｉｉ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体が結合するエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｉｉｉ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片、
（ｉｖ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列と好ましくは以下順に９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列と好ましくは以下順に９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む抗体及びその抗原結合断片、
（ｖ）抗体のＶＨのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合断片、
（ｖｉ）抗体のＶＨが配列番号７で表されるアミノ酸配列と好ましくは以下順に９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬが配列番号８で表されるアミノ酸配列と好ましくは以下順に９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合断片、
（ｖｉｉ）抗体のＶＨが配列番号７で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬが配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合断片。
【００７８】
本発明の抗体には、本発明の抗体またはその抗原結合断片に蛍光物質、放射性同位元素など構造分析に必要な分子を融合させた誘導体も包含される。また本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＢＲＩＬ融合タンパク質の検出又は測定に用いることができる。例えば免疫学的検出又は測定として、標識を施した抗原または抗体もしくはその抗原結合断片を用いて、抗体もしくはその抗原結合断片量または抗原量を検出または測定する方法である。
【００７９】
免疫学的検出または測定方法としては、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット法または物理化学的手法などが挙げられる。
【００８０】
前記方法により、ＢＲＩＬ融合タンパク質の検出又は測定をすることができるだけでなく、ＢＲＩＬ融合タンパク質の電子顕微鏡による構造解析及びＸ線による結晶構造解析において、目的タンパク質に融合させたＢＲＩＬ部分を抗ＢＲＩＬ抗体で標識化したり、又は三次元下における分子の方向性を決定させることができる。
【００８１】
以下に、本発明の抗ＢＲＩＬ抗体の製造方法、及び抗ＢＲＩＬ抗体を用いたＢＲＩＬ融合タンパク質の安定化方法、ＢＲＩＬ融合タンパク質の結晶構造解析方法等を、具体的に説明する。
【００８２】
１．抗体の製造方法
（１）抗原の調製
抗原となるＢＲＩＬタンパク質又は目的タンパク質にＢＲＩＬを融合させたＢＲＩＬ融合タンパク質は、タンパク質の全長またはその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞などに導入することで得ることができる。
【００８３】
また、Ｆｍｏｃ法、またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によりＢＲＩＬの部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質は、Ｃ末端もしくはＮ末端にＦＬＡＧもしくはＨｉｓなどの公知のタグが付加されていてもよい。
【００８４】
本発明で用いられるＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)やCurrent Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)などに記載された方法などを用い、例えば、以下の方法により、該ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
【００８５】
まず、ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。得られた該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
【００８６】
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製または染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。
【００８７】
宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母、Ｓｆ９などの昆虫細胞、またはＣＨＯ細胞などの動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
【００８８】
大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質をコードする部分を含むＤＮＡ、および転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。該組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列ともいう）と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【００８９】
また、該ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質の生産率を向上させることができる。
【００９０】
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)］、ｐＬＳＡ１［Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)］、ｐＧＥＬ１［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、又はｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などが挙げられる。
【００９１】
宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９または大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。
【００９２】
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)、Gene, 17, 107 (1982)、Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)］が挙げられる。
【００９３】
動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３−２２９７９号公報；Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、pAS3-3（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、ｐＣＤＭ８［Nature, 329, 840 (1987)］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、Ｎ５ＫＧ１ｖａｌ（米国特許第６，００１，３５８号明細書）、ＩＮＰＥＰ４（Ｂｉｏｇｅｎ−ＩＤＥＣ社製）およびトランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）などが挙げられる。
【００９４】
宿主細胞としては、ヒト白血病細胞Ｎａｍａｌｗａ細胞、サル細胞ＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞［Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 , 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp. 883-900)］、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞）［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216（1980）］、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、Ｐｒｏ−３、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（またはＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫまたはＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３−０００２９９号公報）、などが挙げられる。
【００９５】
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、またはリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)］、などが挙げられる。
【００９６】
以上のようにして得られるＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、酵母、昆虫細胞または動物細胞などの由来の形質転換体を培地中で培養し、培養液中に該ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質を生成蓄積させ、該培養液から採取することにより、ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質を製造することができる。該形質転換体を培地中で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００９７】
ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質をコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産または融合タンパク質発現などの方法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)］を用いることができる。ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、または宿主細胞の外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
【００９８】
（２）動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
３〜２０週令のマウス、免疫不全マウス（ＭＲＬ／ＭｐＪＪｍｓ  ｓｌｃ−ｌｐｒ／ｌｐｒ）、ラットまたはハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。
【００９９】
免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチン、またはプロテオリポソームなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、またはＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリアタンパク質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
【０１００】
抗原の投与は、１回目の投与の後、１〜２週間おきに５〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Antibodies −A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を融合用抗体産生細胞の供給源とする。
【０１０１】
抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。
【０１０２】
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)］、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４１（ＮＳ−１）［European J. Immunology, 6, 511 (1976)］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Nature, 276, 269 (1978)］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［J. Immunology, 123, 1548 (1979)］、またはＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Nature, 256, 495 (1975)］などが用いられる。
【０１０３】
該骨髄腫細胞は、正常培地［グルタミン、２−メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、ＦＢＳ、および８−アザグアニンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地］で継代し、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
【０１０４】
（４）細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。
【０１０５】
沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）、ＭＥＭ培地およびジメチルスルホキシドの混液を３７℃にて、攪拌しながら加える。さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、融合用抗体産生細胞にＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジン、およびアミノプテリンを加えた正常培地］中にゆるやかに細胞を懸濁する。
【０１０６】
この懸濁液を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のバインディングアッセイなどのハイブリドーマの選択方法により、ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質含む抗原に反応し、ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質を含まない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを行い、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。
【０１０７】
（５）精製モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧあるいはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
【０１０８】
また、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ培地に懸濁し、３〜７日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡ−カラムまたはプロテインＧ−カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ培地には５％ダイゴＧＦ２１を添加することもできる。
【０１０９】
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。タンパク質量の定量は、ローリー法または２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
【０１１０】
（６）モノクローナル抗体の選択
モノクローナル抗体の選択は以下に示すように、ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＬＩＳＡ、リポソームＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーを用いて、ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質発現細胞への抗体の結合性を測定することなどにより行う。ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質発現細胞は、細胞表面上にＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質が発現していればいずれの細胞でもよく、例えばＳｆ９細胞、Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞、ヒト細胞株および（１）で得られるＢＲＩＬ融合タンパク質強制発現細胞株などが挙げられる。
【０１１１】
ＢＲＩＬ融合タンパク質、該リポソーム又はＢＲＩＬ融合タンパク質発現細胞を９６ウェルプレートなどのプレートに分注した後、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を分注し、反応させる。
【０１１２】
反応後の細胞を１〜１０％  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと記す）などで、よく洗浄した後、第２抗体として蛍光試薬などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＢＳＡ−ＰＢＳなどでよく洗浄した後、フローサイトメーターを用いて標識化抗体の蛍光量を測定することにより、ＢＲＩＬ融合タンパク質、ＢＲＩＬ融合タンパクリポソーム、又はＢＲＩＬ融合タンパク質発現細胞に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。
【０１１３】
また、本発明の抗体と競合してＢＲＩＬ融合タンパク質、ＢＲＩＬ融合タンパクリポソーム、又はＢＲＩＬ融合タンパク質発現細胞に結合する抗体は、上述のｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＬＩＳＡ、リポソームＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリーを用いた測定系に、被験抗体を添加して反応させることで取得できる。
【０１１４】
すなわち、被験抗体を加えた時に本発明の抗体と  ＢＲＩＬ融合タンパク質、ＢＲＩＬ融合タンパクリポソーム、又はＢＲＩＬ融合タンパク質発現細胞との結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質のアミノ酸配列、又は、ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質の立体構造への結合について、本発明の抗体と競合してＢＲＩＬへ結合しうるモノクローナル抗体を取得することができる。  
【０１１５】
また、本発明のＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質に結合するモノクローナル抗体が結合するエピトープを含むエピトープに結合する抗体は、上述のスクリーニング方法で取得された抗体のエピトープを公知の方法で同定し、同定したエピトープを含む合成ペプチド、またはエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで取得することができる。
【０１１６】
更に、本発明のＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質に結合するモノクローナル抗体が結合するエピトープと、同じエピトープに結合する抗体は、上述のスクリーニング方法で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの部分的な合成ペプチド、またはエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで、取得することができる。
【０１１７】
２．遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体の作製方法を示す。遺伝子組換えのマウス抗体、ラット抗体およびラビット抗体なども同様の方法で作製することができる。
【０１１８】
（１）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、マウス、ラット、又はヒトなど種々の抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターに所望の種の抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
【０１１９】
抗体のＣ領域は任意のマウス、ラット、ラビット、ヒトなどいずれの抗体のＣＨおよびＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。
【０１２０】
動物細胞用発現ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Cytotechnol., 3, 133 (1990)］、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochem., 101, 1307 (1987)］、ｐＨＳＧ２７４［Gene, 27, 223 (1984)］、ｐＫＣＲ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)］、ｐＳＧ１ｂｄ２−４［Cytotechnol., 4, 173 (1990)］、またはｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１−３［Cytotechnol., 13, 79 (1993)］などを用いる。
【０１２１】
動物細胞用発現ベクターのうちプロモーターとエンハンサーには、ＳＶ４０の初期プロモーター［J. Biochem., 101, 1307 (1987)］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987)］、または免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Cell, 41, 479 (1985)］とエンハンサー［Cell, 33, 717 (1983)］などを用いる。
【０１２２】
遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体H鎖およびL鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体H鎖およびL鎖が同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）の遺伝子組換え抗体発現用ベクター［J．Immunol． Methods， 167， 271（1994）］を用いるが、抗体H鎖およびL鎖が別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８［Hybridoma, 17, 559 (1998)］などを用いる。
【０１２３】
（２）ヒト又はヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
例えば、非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
【０１２４】
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージまたはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、例えばマウス抗体のＣ領域部分またはＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨあるいはＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージまたは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨあるいはＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨまたはＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
【０１２５】
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物には、マウス、ラット、ハムスター、またはラビットなどを用いるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
【０１２６】
選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)］などの反応を行った後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７００（ＰＥバイオシステムズ社製）またはＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などを用いる。
【０１２７】
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。
【０１２８】
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)］と比較することによって見出すことができる。
【０１２９】
（３）遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターの非ヒト又はヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト又はヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、マウス、ラット、ラビット又はヒト型キメラ抗体などの遺伝子組換え抗体発現ベクターを構築することができる。
【０１３０】
非ヒト又はヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、非ヒト又はヒト抗体のＣＨまたはＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを作製する。
【０１３１】
作製されたＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターの非ヒト又はヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、マウス、ラット、ラビット又はヒト型キメラ抗体などの遺伝子組換え抗体発現ベクターを構築する。
【０１３２】
構築された遺伝子組換え抗体発現ベクターは、上述の適当な宿主細胞に導入して発現させることで、遺伝子組換え抗体を作製することができる。
【０１３３】
３．ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質に結合する抗体の用途
本発明の抗体は、ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質に特異的に結合する性質を利用して、免疫学的手法、目的タンパク質の安定化方法、結晶製造方法、結晶構造解析方法、電子顕微鏡構造解析などの用途に使用される。免疫学的手法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。例えば、放射性物質標識免疫抗体法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウェスタンブロット法または物理化学的手法などが挙げられる。
【０１３４】
また、結晶製造方法、電子顕微鏡構造解析、結晶構造解析などの構造解析においては非標識抗体を用いてＢＲＩＬ融合タンパク質を安定化することで使用することができる。また、本構造解析においては、抗ＢＲＩＬ抗体自体が、ＢＲＩＬ又はＢＲＩＬ融合タンパク質に特異的に結合することで、複合体中の標識物として認識可能になるため、有用である。
【０１３５】
放射性物質標識免疫抗体法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体または該抗体断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する。
【０１３６】
酵素免疫測定法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、さらに酵素などで標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、基質を添加して反応液の吸光度を吸光光度計で測定する。酵素免疫測定法で用いる標識体としては、公知［酵素免疫測定法、医学書院（１９８７）］の酵素標識を用いることができる。標識酵素としてはアルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、またはビオチン標識などを用いる。
【０１３７】
蛍光免疫測定法は、文献［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などに記載された方法で測定する。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、公知［蛍光抗体法、ソフトサイエンス社（１９８３）］の蛍光標識を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣまたはＲＩＴＣなどを用いる。発光免疫測定法は文献［生物発光と化学発光  臨床検査４２、廣川書店（１９９８）］などに記載された方法で測定する。発光免疫測定法で用いる標識体としては、公知の発光体標識があげられ、アクリジニウムエステル、ロフィンなどを用いる。
【０１３８】
また、蛍光標識の抗体と細胞を反応させ、フロ−サイトメーターにて解析する蛍光抗体染色法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］により検出を行うことができる。また、蛍光抗体染色法のうち、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いた場合には、形成された抗体−抗原複合体と、抗体−抗原複合体の形成に関与していない遊離の抗体または抗原とを分離することなく、抗原量または抗体量を測定できる。
【０１３９】
本発明の抗ＢＲＩＬ抗体を用いたＢＲＩＬ融合タンパク質を安定化させる方法、結晶製造方法、結晶構造解析方法としては、例えばＢＲＩＬ特異的に結合する抗体又は該抗体断片を調整し、ＢＲＩＬ融合タンパク質と適当なモル比で反応させた後に、液体クロマトグラフィーを用いてＢＲＩＬ融合タンパク質及び抗ＢＲＩＬ抗体からなる複合体のピークを精製して結晶化することで、抗ＢＲＩＬ抗体がＢＲＩＬ融合タンパク質に結合することで安定化されたＢＲＩＬ融合タンパク質／抗ＢＲＩＬ抗体の共結晶を得ることができる。
【０１４０】
得られたＢＲＩＬ融合タンパク質は安定に結晶化され、Ｘ線結晶構造解析に用いることができる。
【０１４１】
また、本発明の抗ＢＲＩＬ抗体を用いてＢＲＩＬ融合タンパク質を溶液中で安定化させる方法としては、例えば、ネガティブ染色電子顕微鏡解析、またはクライオ電子顕微鏡解析等の構造解析において、試料となるＢＲＩＬ融合タンパク質に抗ＢＲＩＬ抗体を添加して電子顕微鏡解析を行うことで、溶液中のＢＲＩＬ融合タンパク質を安定化させかつ構造複合体のマーカーとして利用され、三次元における分子の方向性を付与することができる。抗ＢＲＩＬ抗体としては上述のラベル化されたものも、非ラベル化のものであってもいずれも用いることができる。ネガティブ染色電子顕微鏡解析およびクライオ電子顕微鏡解析は、ともに液相中における目的タンパク質の構造解析をする手法であり、ネガティブ染色電子顕微鏡を用いて構造解析できるサンプルは、同様にクライオ電子顕微鏡においても構造解析に用いることができる。
【０１４２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１４３】
［実施例１］ＢＲＩＬ融合ヒトＣｈｅｍＲ２３タンパク質の作製
既報のＧＰＣＲ結晶構造解析結果より、ＧＰＣＲの５番目の膜貫通へリックスに保存されているプロリンから数えて１６〜２４番目のアミノ酸領域と、６番目の膜貫通へリックスに保存されたプロリンから−２４〜−２８番目のアミノ酸領域が重なる部分に、ＢＲＩＬを融合させることで、ＧＰＣＲの構造安定性が向上し、結晶化確率が上がることが知られている（Eugene Chun et al. Structure, 2012;20: 967-976）。従って本実施例においてもヒトＣｈｅｍＲ２３（以下、ｈＣｈｅｍＲ２３とも略す。）の第５〜６膜貫通へリックス間のループ部分にＢＲＩＬを挿入してヒトＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ融合タンパク質を構築した。
【０１４４】
具体的には、ｈＣｈｅｍＲ２３のアミノ酸配列（配列番号１０）において、Ｎ末端から、２４７番目のロイシンと２４８番目のグルタミンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２４８番目のグルタミンと２４９番目のアルギニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２４９番目のアルギニンと２５０番目のアスパラギンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５０番目のアルギニンと２５１番目のアルギニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５１番目のアルギニンと２５２番目のロイシンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５２番目のロイシンと２５３番目のアラニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５３番目のアラニンと２５４番目のリジンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５４番目のリジンと２５５番目のスレオニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２４８番目のグルタミンから２５４番目のリジンまで削除し２４７番目のロイシンと２５５番目のスレオニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２４８番目のグルタミンから２５３番目のアラニンまで削除し２４７番目のロイシンと２５４番目のリジンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２４８番目のグルタミンから２５２番目のロイシンまで削除し２４７番目のロイシンと２５３番目のアラニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２４８番目のグルタミンから２５１番目のアルギニンまで削除し２４７番目のロイシンと２５２番目のロイシンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２４８番目のグルタミンから２５０番目のアスパラギンまで削除し２４７番目のロイシンと２５１番目のアルギニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２４８番目のグルタミンから２４９番目のアルギニンまで削除し２４７番目のロイシンと２５０番目のアスパラギンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２４８番目のグルタミンを削除し２４７番目のロイシンと２４９番目のアルギニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２４９番目のアルギニンから２５４番目のリジンまで削除し２４８番目のグルタミンと２５５番目のスレオニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２４９番目のアルギニンから２５３番目のアラニンまで削除し２４８番目のグルタミンと２５４番目のリジンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２４９番目のアルギニンから２５２番目のロイシンまで削除し２４８番目のグルタミンと２５３番目のアラニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２４９番目のアルギニンから２５１番目のアルギニンまで削除し２４８番目のグルタミンと２５２番目のロイシンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２４９番目のアルギニンから２５０番目のアスパラギンまで削除し２４８番目のグルタミンと２５１番目のアルギニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２４９番目のアルギニンを削除し２４８番目のグルタミンと２５０番目のアスパラギンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５０番目のアスパラギンから２５４番目のリジンまで削除し２４９番目のアルギニンと２５５番目のスレオニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５０番目のアスパラギンから２５３番目のアラニンまで削除し２４９番目のアルギニンと２５４番目のリジンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５０番目のアスパラギンから２５２番目のロイシンまで削除し２４９番目のアルギニンと２５３番目のアラニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５０番目のアスパラギンから２５１番目のアルギニンまで削除し２４９番目のアルギニンと２５２番目のロイシンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５０番目のアスパラギンを削除し２４９番目のアルギニンと２５１番目のアルギニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５１番目のアルギニンから２５４番目のリジンまで削除し２５０番目のアスパラギンと２５５番目のスレオニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５１番目のアルギニンから２５３番目のアラニンまで削除し２５０番目のアスパラギンと２５４番目のリジンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５１番目のアルギニンから２５２番目のロイシンまで削除し２５０番目のアスパラギンと２５３番目のアラニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５１番目のアルギニンを削除し２５０番目のアスパラギンと２５２番目のロイシンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５２番目のロイシンから２５４番目のリジンまで削除し２５１番目のアルギニンと２５５番目のスレオニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５２番目のロイシンから２５３番目のアラニンまで削除し２５１番目のアルギニンと２５４番目のリジンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５２番目のロイシンを削除し２５１番目のアルギニンと２５３番目のアラニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５３番目のアラニンから２５４番目のリジンまで削除し２５２番目のロイシンと２５５番目のスレオニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、２５３番目のアラニンを削除し２５２番目のロイシンと２５４番目のリジンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体、及び２５４番目のリジンを削除し２５３番目のアラニンと２５５番目のスレオニンの間にＢＲＩＬを挿入した変異体の計３２種類のＢＲＩＬ融合タンパク質を作製した。
【０１４５】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で断片化ベクター（ｐ４２６ＧＡＬ１にＴＥＶ  ｐｒｏｔｅａｓｅ認識配列、ＧＦＰ及びＨｉｓ８タグ配列が挿入されたベクター）と遺伝子断片を相同組換え反応で連結する系（Nat. Protoc. 2008; 784-98）を用いて、ヒトＣｈｅｍＲ２３のＣ末端にｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）及びＨｉｓ８タグ配列を融合させたＢＲＩＬ融合タンパク質を発現させた。
【０１４６】
発現させたｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ融合タンパク質を蛍光サイズ排除クロマトグラフィー（Fluorescent Size Exclusion Chromatography; FSEC）に供し、ＦＳＥＣスクリーニングを実施した。凝集体ピークに比べ所望のメインピークがより高く、単分散性が高いサンプルを、単一のＢＲＩＬ融合タンパク質として発現しているものと判断して、ＢＲＩＬが最適な挿入位置に挿入されたＢＲＩＬ融合タンパク質として選択した。
【０１４７】
更にＢＲＩＬ融合タンパク質のＮ末端とＣ末端のアミノ酸配列の長さを変えたｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ融合タンパク質を作製し、ＦＳＥＣスクリーニングによって最適なＮ末端とＣ末端のアミノ酸配列の長さを決定し、安定なｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ融合タンパク質を取得した。図１にｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ融合タンパク質のＦＳＥＣによるヒストグラムを示す。
【０１４８】
ＦＳＥＣスクリーニングの結果、ｈＣｈｅｍＲ２３の１〜３１番目のアミノ酸と３４３〜３７３番目のアミノ酸残基を欠損し、２５２番目のロイシンを削除した上でｈＣｈｅｍＲ２３の２５１番目のアルギニンと２５３番目のアラニンの間にＢＲＩＬを連結させたＢＲＩＬ融合タンパク質（配列番号１１）を選択した。
【０１４９】
［実施例２］ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ融合タンパク質の調製
選出した変異体に対し、以下の手順でバキュロウイルス発現系を構築した。まず、配列番号１０で表わされるｈＣｈｅｍＲ２３のアミノ酸配列のうち、３２番目から３４２番目のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列（２５２番目のロイシンを削除した上で、ＢＲＩＬを挿入）のＣ末端にヒスチジンタグを付加したアミノ酸配列をコードし、１９２番目のグルタミンをグルタミン酸に置換した配列からなるｃＤＮＡを改変型のｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組換え、Ｓｆ９細胞発現用ベクター（ｐＦａｓｔＢａｃ１−ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ）を構築した。
【０１５０】
Ｂａｃ  ｔｏ  Ｂａｃ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のマニュアルに従い、構築したｐＦａｓｔＢａｃ１−ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬベクターをＤＨ１０Ｂａｃコンピテントセルに形質転換し、ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ発現用のバクミドを取得した。該バクミドをＳｆ９細胞にトランスフェクションし、組換えバキュロウイルスを作製した。マニュアルに従い、作製したバキュロウイルスをＳｆ９細胞に感染させることで、ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬを細胞膜に発現したＳｆ９細胞を調製した。
【０１５１】
ＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬを細胞膜に発現したＳｆ９細胞から、細胞膜画分は以下の方法で調製した。Ｓｆ９細胞を凍結融解し、Ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ  ｂｕｆｆｅｒ［１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｔａｂｌｅｔ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）  ＥＤＴＡ  ｆｒｅｅ］で懸濁後、超遠心分離用チューブに移し、４℃にて４５，０００ｒｐｍ、３０分間超遠心分離を行った。
【０１５２】
沈澱をＨｉｇｈ  ｏｓｍｏｔｉｃ  ｂｕｆｆｅｒ［１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１０ｍｍｏｌ／ＬｍｇＣｌ２、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｔａｂｌｅｔ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）  ＥＤＴＡ  ｆｒｅｅ］で懸濁し、ダウンス型ホモジナイザー（日本ジェネティックス株式会社）で懸濁し、再度４５，０００ｒｐｍで３０分間超遠心分離を行った。沈澱をＨｉｇｈ  ｏｓｍｏｔｉｃ  ｂｕｆｆｅｒで懸濁し、ダウンス型ホモジナイザーで懸濁し、再度４５，０００ｒｐｍで３０分間超遠心分離を行った。
【０１５３】
沈澱を４０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌを含む  Ｈｉｇｈ  ｏｓｍｏｔｉｃ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、Ｓｆ９細胞膜画分として、−８０℃にて冷凍保存した。ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬを含むＳｆ９細胞膜を氷上で解凍後、膜画分を可溶化ｂｕｆｆｅｒ［５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２％  ｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ（登録商標）−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ（ＤＤＭ）、０．０３％  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ（ＣＨＳ）、ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｔａｂｌｅｔ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）  ＥＤＴＡ  ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）］で懸濁後、４℃にて２時間ほどｒｏｔａｔｏｒを用いて緩やかに混ぜることで、膜を可溶化した。
【０１５４】
可溶化後は、４５，０００ｒｐｍで４０分間超遠心分離を行い、上清を回収した。そこにＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２％  ＤＤＭ、０．０３％  ＣＨＳ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で平衡化したＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を１０ｍＬ加え、４℃にて２時間、バッチ法にて、タンパク質を吸着させた。
【０１５５】
レジンをエンプティカラムに詰め、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで５ＣＶ（Ｃｏｌｕｍｎ  Ｖｏｌｕｍｅ）洗浄後、塩濃度を８００ｍｍｏｌ／Ｌに上げたＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで５ＣＶ洗浄後、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２％  ＤＤＭ、０．０３％  ＣＨＳ、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で３ＣＶ溶出した。
【０１５６】
溶出したサンプルは、限外ろ過にて１０ｍＬまで濃縮し、ＰＤ−１０カラムを用いてＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  ｗ／ｏ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２％  ＤＤＭ、０．０３％  ＣＨＳ）に置換し、必要量のＴａｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＴＥＶ）プロテアーゼを加え、４℃にて１晩静置した。
【０１５７】
翌日、ＴＥＶプロテアーゼでの切断を確認後、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  ｗ／ｏ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅで平衡化したＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を６ｍＬ加え、４℃にて２時間、バッチ法にて、タンパク質を吸着させた。カラムにレジンを詰め、通過液を回収し、アミコンウルトラ（１００ｋＤａカットサイズ、メルクミリポア社製）を用いて１ｍＬ程度まで濃縮後、ＢＣＡアッセイ（Smith, P.K. et al. Anal. Biochem., 1985:150;76-85）とＵＶ２８０測定でタンパク質濃度を算出し、以降の濃縮はＵＶ２８０をモニターすることで、濃度を算出した。最終的に３０ｍｇ／ｍＬ程度まで濃縮し、精製ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬサンプルとした。
【０１５８】
［実施例３］免疫および抗体産生ハイブリドーマのサブクローニング
抗原として用いるため、精製ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬを以下の方法でリポソームに再構成したサンプルを調製した。
【０１５９】
Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＥｇｇＰＣ）溶液（１０ｍｇ／ｍＬ  ＥｇｇＰＣ、０．８ｗ／ｖ％  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｏｌａｔｅ、０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｌｉｐｉｄ  Ａ  ｉｎ  ＰＢＳ）に、精製したｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬを脂質１０ｍｇに対してタンパク質１ｍｇの割合で混合した。液量とほぼ等量のＢｉｏ−Ｂｅａｄｓ  ＳＭ−２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を加えて穏やかに転倒混和することで界面活性剤を除去した後、超音波ホモジナイズすることで免疫用ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬプロテオリポソームを調製した。  
【０１６０】
ＥＬＩＳＡ用のリポソーム抗原は、ＥｇｇＰＣを含むｂｉｏｔｉｎ−ＰＥ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ  ＥｇｇＰＣ、２５μｇ／ｍＬ  ｂｉｏｔｉｎｙｌ  ＰＥ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、０．８ｗ／ｖ％  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｏｌａｔｅ  ｉｎ  ＰＢＳ）にＥｇｇＰＣ  １０ｍｇに対してタンパク質１ｍｇの割合で混合し、免疫用リポソーム抗原の調製と同様の方法でＥＬＩＳＡ用ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬプロテオリポソームを調製した。
【０１６１】
免疫には５週齢の雌の免疫不全マウス（ＭＲＬ／ＭｐＪＪｍｓ  ｓｌｃ−ｌｐｒ／ｌｐｒ、日本エスエルシー株式会社）を用いた。初回免疫では、前述の免疫用ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬプロテオリポソームをＰＢＳバッファーで希釈したものを抗原液とし、腹腔注射によってマウスに免疫した。
【０１６２】
２回目以降の追加免疫では、ＰＢＳバッファーで希釈したリポソーム抗原と等量のＩｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を混合したものを抗原液とした。初回免疫（１００μｇ／ｍｏｕｓｅ）、初回免疫から７日後に１回目の追加免疫（５０μｇ／ｍｏｕｓｅ）、初回免疫から２１日後に２回目の追加免疫（５０μｇ／ｍｏｕｓｅ）を実施した。
【０１６３】
２回目の免疫後７日目にそれぞれ採取した血液を用いて遠心分離操作によって血清サンプルを調製し、リポソームＥＬＩＳＡ法によって抗体価の測定を行った。３回目の免疫後７日目に全採血、脾臓摘出を行った。採取した全血は遠心分離操作によって血清サンプルを調製した。摘出した脾臓から脾臓細胞を抽出し、ＰＥＧ法によってマウスミエローマ細胞（Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、独立行政法人  医薬基盤研究所ＪＣＲＢ細胞バンク）と融合した。
【０１６４】
５００ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（ナカライテスク社製）にＨＡＴ  Ｍｅｄｉａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０ｘ）Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を１瓶添加した培地でハイブリドーマを懸濁し、９６ウェルに３００μＬずつ分注し、３７℃、５％  ＣＯ２の条件で、１週間静置した。
【０１６５】
ＨＡＴ選抜後７日目に各ウェルの培養上清中の抗ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ抗体をリポソームＥＬＩＳＡ法による１次スクリーニングを行った。抗体の産生が認められたウェルを懸濁して２４ウェルに移して３７℃にて静置培養した。ここで使用したリポソームＥＬＩＳＡ法は、ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ包埋ビオチン化リポソームを、ストレプトアビジンを介して９６ウェルプレートに固定化して行う方法を用いた（日本国特願２００９−１１０９９４）。
【０１６６】
具体的には、ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ包埋ビオチン化リポソームをＰＢＳで１−１０μｇ／ｍＬとなるように希釈し、９６ウェルのストレプトアビジンプレートに分注した後、室温にて１．５時間静置することで、ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ包埋ビオチン化リポソームを固相化した。固相抗原溶液を除去し、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと記す）を１ウェル当たり２００μＬ加え、室温にて２時間静置した。
【０１６７】
ＢＳＡ−ＰＢＳを除去し、一次抗体としてハイブリドーマ培養上清を１ウェル当たり５０μＬ加え、室温にて２時間程度静置した。ハイブリドーマ培養上清を除去し、プレートウォッシャーで洗浄を実施した。二次抗体としてａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＨＲＰ
ｃｏｎｊｕｇａｔｅを０．５−１％のＢＳＡ−ＰＢＳで希釈し、１ウェル当たり５０ｍＬ加え、室温にて１．５時間程度静置した。二次抗体液を除去し、プレートウォッシャーで洗浄した。その後、ＨＲＰ反応基質トリメリルベンチジン（ＴＭＢ）の産物を４５０ｎｍの吸光度で検出した。
【０１６８】
２４ウェルに拡大培養後２日目に２次スクリーニングを行った。各ウェルの培養上清中の抗ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ抗体をリポソームＥＬＩＳＡ法によって検出した。ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ、ｈＣＣＲ１０−ＢＲＩＬ（１〜３９番目のアミノ酸と３１６〜３６２番目のアミノ酸を欠損し、２３６番目〜２４３番目のアミノ酸を削除した上でＢＲＩＬを連結させた変異体）（配列番号１２）、空リポソーム、及び変性ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬへの結合性を確認し、ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬへの結合が高く、その他のサンプルには結合性が低い抗体を産生する細胞を選出した。抗体の産生が認められたウェルを懸濁して２４ウェルに移して３７℃にて静置培養した。
【０１６９】
なお、ｈＣＣＲ１０−ＢＲＩＬは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの細胞膜に発現させ、培養後、菌体を凍結融解し、そこへＺｙｍｏｌｙａｓｅ（登録商標）１００Ｔ（ナカライテスク社製）を必要量添加し、３０℃にて１時間、１００ｒｐｍ程度の低速度で振とうすることで、細胞壁の消化反応を行った。その後、超音波破砕を行い、７，０００ｒｐｍで２０分間高速遠心分離し上清を回収した。
【０１７０】
回収した上清をさらに４５，０００ｒｐｍで４０分間超遠心分離を行い、沈澱をＨｉｇｈ  ｓａｌｔ  ｂｕｆ．（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１０ｍｍｏｌ／ＬｍｇＣｌ２、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ）で懸濁し、ダウンス型ホモジナイザーで懸濁し、再度４５，０００ｒｐｍで３０分間超遠心分離を行った。沈澱をＭｅｍｂｒａｎｅ  ｂｕｆ．（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、２０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で懸濁した後、適当なリガンドを１００ｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、これを膜画分とし、精製は、実施例２に記載の方法と同様に実施した。
【０１７１】
２次スクリーニングで選出した培養細胞上清中の抗ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ抗体を実施例１と同様のＦＳＥＣ法にて３次スクリーニングを実施した。ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬを発現させたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞膜と、ｈＣＣＲ１０−ＢＲＩＬを発現したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞膜をそれぞれ１％  ＤＤＭで可溶化し、超遠心分離して上清を用いた。
【０１７２】
ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬとｈＣＣＲ１０−ＢＲＩＬの両方に対して結合が見られるが、ｈＣＣＲ１０−ＢＲＩＬに比べ、明らかにｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬへの結合が強い抗体を産生するハイブリドーマを選出し、ハイブリドーマＳＲＰ２０７０とした。ハイブリドーマＳＲＰ２０７０が生産する抗ＢＲＩＬモマウスノクローナル抗体ＳＲＰ２０７０のサブクラスを確認したところマウスＩｇＧ２ａクラスであった。
【０１７３】
［実施例４］精製抗体の調製
取得した抗ＢＲＩＬ抗体産生ハイブリドーマＳＲＰ２０７０を１０ｃｍ  ｄｉｓｈで拡大培養を行いｄｉｓｈ  １枚当たりの細胞を１匹のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＳｌｃ−ｎｕ／ｎｕ、日本エスエルシー株式会社）へ腹腔内投与した。マウスはハイブリドーマの腹腔内投与の７日前に５００μＬのＦｒｅｕｎｄ’ｓ  Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＦＩＡ、ＤＩＦＣＯ社製）を腹腔内投与した。細胞接種後腹水を採取した。腹水は遠心分離により、細胞や残渣を除去した。その後、脱脂綿を詰めたシリンジでろ過し、さらに残渣をろ過した。
【０１７４】
３９０ｇの硫酸アンモニウムを１ＬのＰＢＳバッファーに溶解した飽和硫安溶液を調製し、腹水と飽和硫安溶液を体積比で１対２となるように混合し、４℃にて１時間以上撹拌した。その後、一晩かけてＰＢＳバッファーに透析置換した。
【０１７５】
モノクローナル抗体精製は、ＡＫＴＡ  ｐｕｒｅクロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を用いて、ＨｉＴｒａｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）で行った。溶出は、１ｍｏｌ／Ｌグリシン塩酸バッファーで行い、溶出用チューブに１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを溶出量の１０分の１添加しておくことで、溶出と同時に溶出液の中和を行った。
【０１７６】
取得した精製モノクローナル抗体は、ＰＢＳバッファーで置換後、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）にパパイン（ナカライテスク社製）を固定したレジンで処理することで、Ｆａｂ断片化した。その後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）に供し、通過液を回収することで、Ｆａｂフラグメントを調製した。得られたＦａｂフラグメントサンプルを構造解析用Ｆａｂ抗体ＳＲＰ２０７０Ｆａｂとした。
【０１７７】
［実施例５］抗ＢＲＩＬ抗体ＳＲＰ２０７０抗体の配列解析
樹立したＳＲＰ２０７０産生ハイブリドーマより抽出したｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子配列の解析を行った。
【０１７８】
その結果、ＳＲＰ２０７０抗体のＶＨ領域は配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなり、ＳＲＰ２０７０抗体のＶＨ領域のＣＤＲ１〜３は配列番号１〜３で表わされるアミノ酸配列からなることが明らかになった。配列番号７で表わされるアミノ酸配列をコードする遺伝子は配列番号１３で表わされることが明らかとなった。シグナル配列を含むアミノ酸配列は配列番号１５で表わされ、それをコードする遺伝子は配列番号１７で表わされることが明らかとなった。
【０１７９】
【化１】
2019203019.tif 000002
【０１８０】
また、ＳＲＰ２０７０抗体のＶＬ領域は、配列番号８で表わされるアミノ酸配列からなり、ＶＬ領域のＣＤＲ１〜３は配列番号４〜６で表わされるアミノ酸配列からなることが明らかになった。配列番号８で表わされるアミノ酸配列をコードする遺伝子は配列番号１４で表わされることが明らかとなった。シグナル配列を含むアミノ酸配列は配列番号１６で表わされ、それをコードする遺伝子は配列番号１８で表わされることが明らかとなった。
【０１８１】
【化２】
2019203019.tif 000003
【０１８２】
［実施例６］ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ／ａｐｏ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂ複合体の調製と構造解析
実施例２に記載の方法で調製したｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬサンプルに、モル比で約１．２倍量のＳＲＰ２０７０Ｆａｂを添加し、４℃にて１時間静置した。サンプルの精製は、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅクロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）とＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）の組み合わせで実施した。
【０１８３】
ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ／  ａｐｏ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂ複合体のピークを分取し、約５０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、結晶化用サンプルとした。
【０１８４】
得られた結晶化サンプルは、ＬＣＰ（Ｌｉｐｉｄｉｃ  ｃｕｂｉｃ  ｐｈａｓｅ）法［Martin Caffrey et al., NATURE PROTOCOLS 2009;4(5):706-31］により、共結晶化を実施した。具体的には、ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ／ａｐｏ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂ複合体結晶化用サンプル、１−ｏｌｅｏｙｌ−ｒａｃ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ、及びｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌを４０％、５４％、６％の比率でシリンジ内にて混合することで、ＬＣＰを作製した。
【０１８５】
結晶化はＬＣＰ結晶化用ガラスサンドイッチプレートを用いて、ＬＣＰ  ５０ｎＬに対し、結晶化溶液  ８００ｎＬを分注しガラスカバーで封入した。
【０１８６】
沈殿剤として２０−５０ｖ／ｖ％  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ３００、２０−５０ｖ／ｖ％  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ４００、２０−５０ｖ／ｖ％  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｏｎｏ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ  ５００、２０−５０ｖ／ｖ％  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ  ５５０、バッファーとして１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ６−６．５、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ  ｐＨ７−７．５、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８−８．５、有機溶媒の添加剤として０．５−２  ｖ／ｖ％  ｍｅｔｈｙｌ−２，４−ｐｅｎｔａｎｄｉｏｌ、０．５−２ｖ／ｖ％  ２，５−ｈｅｘａｎｅｄｉｏｌ、０．５−２ｖ／ｖ％  １，２，３−ｈｅｘａｎｅｄｉｏｌ、０．５−２ｖ／ｖ％  ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ、塩としては５０−４００ｍＭ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｏｎｏｂａｓｉｃ、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ  、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｆｏｒｍａｔｅ、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｉｂａｓｉｃ、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｂａｓｉｃ、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｎｉｔｒａｔｅ、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｔａｒｔｒａｔｅ  ｄｉｂａｓｉｃ、Ｃａｌｃｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｈｙｄｒａｔｅ、Ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｄｉｈｙｄｒａｔｅ、Ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ、Ｌｉｔｈｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｌｉｔｈｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｔｒｉｂａｓｉｃ  ｔｅｔｒａ  ｈｙｄｒａｔｅ、Ｌｉｔｈｉｕｍ  ｎｉｔｒａｔｅ、Ｌｉｔｈｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｔｅｔｒａ  ｈｙｄｒａｔｅ、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｈｙｄｒａｔｅ、Ｎｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｔｒｉｂａｓｉｃ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｏｎｏｂａｓｉｃ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｏｒｍａｔｅ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｂａｓｉｃ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｎｉｔｒａｔｅ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｔａｒｔｒａｔｅ  ｔｅｔｒａ  ｈｙｄｒａｔｅ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、Ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｔｒｉｈｙｄｒａｔｅ、Ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｔｒｉｂａｓｉｃ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ、Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｏｎｏｂａｓｉｃ、Ｓｏｄｉｕｍ  ｆｏｒｍａｔｅ、Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｂａｓｉｃ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ、Ｓｏｄｉｕｍ  ｍａｌｏｎａｔｅ  ｐＨ  ７．０、Ｓ���ｄｉｕｍ  ｎｉｔｒａｔｅ、Ｓｏｄｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｄｅｃａｈｙｄｒａｔｅ、Ｓｏｄｉｕｍ  ｔａｒｔｒａｔｅ  ｄｉｂａｓｉｃ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ、Ｓｏｄｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｐＨ  ７．０、Ｚｉｎｃ  ａｃｅｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ、Ｚｉｎｃ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｈｅｐｔａｈｙｄｒａｔｅの組み合わせで結晶化を実施した。
【０１８７】
上記条件のうち、沈殿剤として３６−４７ｖ／ｖ％  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ３００、３２−４３．５ｖ／ｖ％  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｏｎｏ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ  ５００、バッファーとして１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ６−６．５、有機溶媒の添加剤として０．５−２ｖ／ｖ％  ｍｅｔｈｙｌ−２，４−ｐｅｎｔａｎｄｉｏｌ、０．５−２ｖ／ｖ％  ２，５−ｈｅｘａｎｅｄｉｏｌ、塩として１２５−１９０ｍＭ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ、７５−１５０ｍＭ  ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅの組み合わせで、ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ／ａｐｏ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂの結晶が生成した。
【０１８８】
尚、抗体非存在下でｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ融合タンパク質の結晶化を行ったが、いずれの条件でも結晶を取得することはできず、ｈＣｈｅｍＲ２３の構造解析を実施することができなかった。一方、抗ＢＲＩＬ抗体存在下では、結晶を生成することができた（表１）。
【０１８９】
ＬＣＰ法で取得した結晶は、液体窒素で凍結し、高輝度光科学研究センターＳＰｒｉｎｇ−８  ビームラインＢＬ３２ＸＵにおいて、Ｘ線回折実験に供した。合計８１個の結晶からの部分データを結合し、回折能４．０の結晶が得られ、また分解能４．５オングストロームの完全データが得られ、ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ／ａｐｏ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂの複合体の構造解析を実施した結果、図３に示すタンパク質立体構造が得られた。図２にＸ線回折像の結果を、図３に構造解析の結果を示す。また、表１に抗ＢＲＩＬ抗体によるＢＲＩＬ融合タンパク質の結晶精製および構造解析の結果を示す。
【０１９０】
【表１】
2019203019.tif 000004
【０１９１】
以上の結果から、抗ＢＲＩＬ抗体非存在下では取得できなかったＢＲＩＬ融合タンパク質の結晶を、抗ＢＲＩＬ抗体存在下で初めて結晶化することができ、目的タンパク質を構造解析できたことがわかった。
【０１９２】
［実施例７］５ＨＴ１Ｂ−ＢＲＩＬとＳＲＰ２０７０Ｆａｂの複合体調製と構造解析
５ＨＴ１Ｂ−ＢＲＩＬは既報（Wang et al.,Science 2013;340: 610-614）と同一のコンストラクトを同一の方法で調製した。低分子リガンドのＥｒｇｏｔａｍｉｎｅは、５ＨＴ１Ｂ−ＢＲＩＬ融合タンパク質を発現させたＳｆ９細胞膜を可溶化する際に１００μＭで添加するとともに、以降の各精製段階のバッファーに１００μＭ添加して精製を行うことで、５ＨＴ１Ｂ−ＢＲＩＬ融合タンパク質を安定に精製した。実施例６と同様の方法で調製した５ＨＴ１Ｂ−ＢＲＩＬ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂを含むゲルろ過画分を、約３０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、実施例６記載の方法と同様にＬＣＰ法にて結晶化を行った。
【０１９３】
その結果、結晶化より１週間以内に、回折データ取得に利用できる結晶が生成した（表１）。実施例６と同様に高輝度光科学研究センターＳＰｒｉｎｇ−８  ビームラインＢＬ３２ＸＵにおいて、Ｘ線回折実験に供し、分解能３オングストロームの完全データが得られ、５ＨＴ１Ｂ−ＢＲＩＬ／Ｅｒｇｏｔａｍｉｎｅ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂの複合体の構造解析を実施した。結果を図４および表１に示す。
【０１９４】
以上の結果から、実施例６と同様に抗ＢＲＩＬ抗体存在下で良好な結晶を得ることができたことから、結晶化において抗ＢＲＩＬ抗体は、ＢＲＩＬ融合タンパク質の結晶化を阻害することは無く、むしろ抗ＢＲＩＬ抗体を共存させることで結晶化条件を簡便に見出すことができ、かつ結晶化を効率的に行うことができた。従って、本発明の抗ＢＲＩＬ抗体は、ＢＲＩＬを融合させた目的タンパク質を、安定に結晶化させることができ、ＢＲＩＬ融合タンパク質の構造解析において非常に有用なツールになることが明らかになった。
【０１９５】
［実施例８］ＢＲＩＬ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂの調製と結晶化
ＢＲＩＬタンパク質のアミノ酸配列のＮ末にＴＥＶ  ｐｒｏｔｅａｓｅ認識アミノ酸を付加させた変異体遺伝子を、制限酵素サイトＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入し、Ｈｉｓ−ｔａｇ融合体として発現させた。発現サンプルは、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）により精製し、その後、ＴＥＶ  ｐｒｏｔｅａｓｅでＨｉｓ−ｔａｇを切断した。
【０１９６】
再度、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗに供し、回収した通過液を陰イオン交換カラムで精製した。そのサンプルに対し、モル比で約１．２倍量のＳＲＰ２０７０Ｆａｂを添加し、４℃にて１時間静置した後、ゲルろ過に供し、ＢＲＩＬ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂ複合体のピークを分取し、約１５ｍｇ／ｍＬまで濃縮したサンプルを用いて、蒸気拡散法にて結晶化を実施した。
【０１９７】
具体的には、１００ｎＬのＢＲＩＬ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂ複合体タンパク質溶液と、１００ｎＬの結晶化溶液を混合して結晶化内液とし、５０μＬの結晶化溶液（結晶化外液）と共に密封して、４℃にて静置することにより、一週間以内に結晶を取得した。
【０１９８】
結晶化溶液としては、例えば、１８ｗ／ｖ％  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ８０００、１８０ｍｍｏｌ／Ｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣＨＥＳ  ｐＨ９．５より結晶が生成した。取得した結晶は、液体窒素で凍結し、Ｘ線回折実験を実施したところ、分解能２．０オングストロームの完全データが得られ、ＢＲＩＬ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂの複合体構造解析に成功した。
【０１９９】
ＢＲＩＬへのＳＲＰ２０７０Ｆａｂの結合様式は、実施例６のｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ融合タンパク質、及び実施例７の５ＨＴ１Ｂ−ＢＲＩＬ融合タンパク質における結合様式と同様であった。得られたＢＲＩＬとＳＲＰ２０７０Ｆａｂの複合体構造解析結果より、ＳＲＰ２０７０Ｆａｂのエピトープとパラトープを決定した。
【０２００】
ＢＲＩＬと抗ＢＲＩＬ抗体ＳＲＰ２０７０との複合体構造を確認したところ、抗ＢＲＩＬ抗体ＳＲＰ２０７０は、ＢＲＩＬの第３ヘリックス構造から第４へリックス構造までを認識して結合していることが明らかになった。
【０２０１】
また、詳細なエピトープを解析するため、抗ＢＲＩＬ抗体ＳＲＰ２０７０のＣＤＲと４Å以内で相互作用しているＢＲＩＬタンパク質内のアミノ酸残基を選択した結果、本発明の抗ＢＲＩＬ抗体ＳＲＰ２０７０は、ＢＲＩＬタンパク質の立体構造中の第３ヘリックス構造から第４ヘリックス構造までに存在するアミノ酸残基に結合しており、ＢＲＩＬアミノ酸配列のＮ末端から６７番目のＩｌｅ（Ｉ）、７１番目のＧｌｎ（Ｑ）、７４番目のＡｓｐ（Ｄ）、７７番目のＬｙｓ（Ｋ）、７８番目のＬｅｕ（Ｌ）、８３番目のＬｙｓ（Ｋ）、８５番目のＬｙｓ（Ｋ）、８６番目のＧｌｕ（Ｅ）、８８番目のＧｌｎ（Ｑ）、８９番目のＡｌａ（Ａ）、９０番目のＡｌａ（Ａ）、９２番目のＧｌｕ（Ｅ）、９３番目のＧｌｎ（Ｑ）、９６番目のＴｈｒ（Ｔ）、９７番目のＴｈｒ（Ｔ）、９９番目のＡｓｎ（Ｎ）、及び１００番目のＡｌａ（Ａ）のアミノ酸残基を認識することが明らかになった。
【０２０２】
更に前記エピトープの中でも７４番目のＡｓｐ（Ｄ）、９２番目のＧｌｕ（Ｅ）、９３番目のＧｌｎ（Ｑ）、９６番目のＴｈｒ（Ｔ）、９７番目のＴｈｒ（Ｔ）及び９９番目のＡｓｎ（Ｎ）は、抗体と水素結合していることから、抗ＢＲＩＬ抗体ＳＲＰ２０７０のエピトープを構成するアミノ酸残基のうち最も重要なアミノ酸残基であることが明らかになった。
【０２０３】
［実施例９］ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ／ａｐｏ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂのネガティブ染色電子顕微鏡解析
ｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ融合タンパク質を実施例１に記載の方法で調製した。その後、実施例６に記載の方法でｈＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ／ａｐｏ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂの複合体を調製し、ネガティブ染色電子顕微鏡のサンプルとして、約２ｍｇ／ｍＬの濃度に合わせた。このサンプルを１００倍に希釈し、４℃にて１５分間、１８０００回転で遠心分離した。２．５μＬの上清サンプルをサンプルグリッドの上に乗せ、室温にて１分間静置し、グリッドにサンプルを染み込ませた。
【０２０４】
その後、グリッドからサンプル液を取り除き、水で３回洗浄した。２．５μＬのネガティブ染色用の試薬ＮａｎｏＷ（Ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ  Ｔｕｎｇｓｔａｔｅ，ｆｒｏｍ  Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）をサンプルグリッドの上に乗せ、室温にて１分間静置し、タンパク質粒子を染色した。余剰の染色試薬を拭き取り、撮影前にサンプルグリッドを乾燥させた。ＴＦ２０電子顕微鏡を室温にて２００ｋＶで稼働し、１００，０００倍の倍率（ピクセルサイズ１．０６Å／ｐｉｘｅｌ）、焦点距離１．８〜２．５μｍの条件で電子顕微鏡写真を撮影した。
【０２０５】
２次元像の分類を実施し、５種類の代表的な平均像を取得した結果を図５に示す。図５に示すように、矢印（実線）で示した部分がＳＲＰ２０７０Ｆａｂ、矢印（破線）で示した部分がＧＰＣＲ部分であり、ＳＲＰ２０７０Ｆａｂの向きを識別することが可能であった。以上の結果から、ＢＲＩＬ融合タンパク質に対して本発明の抗ＢＲＩＬ抗体を用いることで、液相中で三次元構造におけるＧＰＣＲタンパク質部分、ＢＲＩＬ部分を識別することができ、その結果ＢＲＩＬ融合タンパク質分子の方向性を同定することができることが明らかになった。
【０２０６】
［実施例１０］５ＨＴ１Ｂ−ＢＲＩＬ／Ｅｒｇｏｔａｍｉｎｅ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂのネガティブ染色電子顕微鏡解析
５ＨＴ１Ｂ−ＢＲＩＬ／Ｅｒｇｏｔａｍｉｎｅ／ＳＲＰ２０７０Ｆａｂを実施例７に記載の方法で調製した。変更点として、最終的なバッファー組成中の界面活性剤ＤＤＭとＣＨＳの濃度を０．０２５％とした。ネガティブ染色電子顕微鏡用サンプルとして、約０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度に合わせた。このサンプルを５０倍に希釈し、４℃にて１５分間、１８，０００回転で遠心分離した。２．５μＬの上清サンプルをサンプルグリッドの上に乗せ、室温にて１０秒間静置し、グリッドにサンプルを染み込ませた。
【０２０７】
その後、グリッドからサンプル液を取り除き、水で３回洗浄した。２．５μＬのネガティブ染色用の試薬Ｎａｎｏ−Ｗ（Ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ  Ｔｕｎｇｓｔａｔｅ，ｆｒｏｍ  Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）をサンプルグリッドの上に乗せ、室温にて１分間静置し、タンパク質粒子を染色した。余剰の染色試薬を拭き取り、撮影前にサンプルグリッドを乾燥させた。ＴＦ２０電子顕微鏡を室温にて２００ｋＶで稼働し、８０，０００倍の倍率（ピクセルサイズ１．３２Å／ｐｉｘｅｌ）、焦点距離１．８〜２．５μｍの条件で電子顕微鏡写真を撮影した。
【０２０８】
２次元像の分類を実施し、１０種類の代表的な平均像を取得した結果を図６に示す。図６に示すように、矢印（実線）で示した部分がＳＲＰ２０７０Ｆａｂ、矢印（破線）で示した部分がＧＰＣＲ部分であり、ＳＲＰ２０７０Ｆａｂの向きを識別することが可能であった。以上の結果から、前実施例のＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ融合タンパク質だけでなく、他のＢＲＩＬ融合タンパク質でも同様に、本発明の抗ＢＲＩＬ抗体を用いることで、液相中で三次元構造におけるＧＰＣＲタンパク質部分、ＢＲＩＬ部分を識別することができ、その結果ＢＲＩＬ融合タンパク質分子の方向性を同定することができることが明らかになった。
【０２０９】
本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１７年７月１３日付けで出願された日本特許出願（特願２０１７−１３７２６９）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
【配列表フリーテキスト】
【０２１０】
配列番号９−人工配列の説明：ＢＲＩＬタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０−人工配列の説明：ヒトＣｈｅｍＲ２３のアミノ酸配列
配列番号１１−人工配列の説明：ヒトＣｈｅｍＲ２３−ＢＲＩＬ融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２−人工配列の説明：ヒトＣＣＲ１０−ＢＲＩＬ融合タンパク質のアミノ酸配列
【図１】
2019203019.tif 000005
【図２】
2019203019.tif 000006
【図３】
2019203019.tif 000007
【図４】
2019203019.tif 000008
【図５】
2019203019.tif 000009
【図６】
2019203019.tif 000010
【配列表】
2019203019000001.app