(57)【要約】      （修正有）【課題】デジタル測定を実施するための方法、デバイスおよびシステムの提供。【解決手段】デジタル測定を用いて試料中の被分析物分子のの濃度を決定する方法であって、第一の体積分布を有する第一の複数の液滴であって、前記第一の複数の液滴の少なくとも１つが試料からの被分析物分子及び検出可能な薬剤を含有する、第一の複数の液滴を生成すること；第一の体積分布と同一または異なる第二の体積分布を有する第二の複数の液滴を分析して、検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の個々の体積および第二の複数の液滴の数を決定すること；ならびに検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の個々の体積および第二の複数の液体の数を利用して試料中の被分析物分子の濃度を決定すること、を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デジタル測定を用いて試料の濃度を決定する方法であって、
第一の体積分布を有する第一の複数の液滴であって、前記第一の複数の液滴の少なくとも１つが試料からの内容物を含有する、第一の複数の液滴を生成すること；
第一の体積分布と同一または異なる第二の体積分布を有する第二の複数の液滴を分析して、検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の個々の体積および第二の複数の液滴の数を決定すること；ならびに
検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の個々の体積および第二の複数の液体の数を利用して試料の濃度を決定すること、
を含む、方法。
【請求項２】
第一および第二の体積分布が、連続体積分布である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第二の体積分布が、前記生成ステップの前に定義されていない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第一の複数の液滴が、不混和流体との組合せによりエマルジョン中に生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
不混和流体が水および油を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
エマルジョンが界面活性剤を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の液滴の第二の体積分布が、約１００ナノリットル（ｎＬ）〜約１フェムトリットル（ｆＬ）、約１０ｎＬ〜約１０ｆＬ、約１ｎＬ〜約１００ｆＬ、約１００ｎＬ〜約１ピコリットル（ｐＬ）、約１０ｎＬ〜約１０ｐＬ、約１ｎＬ〜約１ｐＬの範囲内の体積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
検出可能な薬剤が蛍光性である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
検出可能な薬剤が、核酸分子、ペプチド、蛋白質、またはそれらの組み合わせに会合している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ）、ループを介した増幅法（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、またはそれらの組み合わせを実施することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
検出可能な薬剤の濃度が、少なくとも３桁のダイナミックレンジを超えて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
検出可能な薬剤の濃度が、少なくとも６桁のダイナミックレンジを超えて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
第一の体積分布の体積が２倍を超えて変動する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
第一の体積分布の体積が１０倍を超えてまたは１００倍を超えて変動する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
デジタル測定を用いて試料の濃度を決定するシステムであって、
第一の体積分布を有する第一の複数の液滴を含有するサンプルホルダーと；  
第一の複数の液滴の少なくとも１つを含有する検出可能な薬剤を検出する検出器と；
その上に保存された実施可能な命令を有する記憶デバイスを含むコンピュータと、を含み、該命令がプロセッサにより実施されると、プロセッサに、
第一の体積分布と同一または異なる第二の体積分布を有する第二の複数の液滴を分析して、検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の個々の体積および第二の複数の液滴の数を決定すること；ならびに
検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の個々の体積および第二の複数の液体の数を利用して試料の濃度を決定させる、
システム。
【請求項１６】
第一および第二の体積分布が連続体積分布である、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
第二の体積分布が前記生成ステップの前に定義されていない、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
第一の複数の液滴が、不混和流体との組合せによりエマルジョン中に生成される、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１９】
不混和流体が水および油を含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
検出可能な薬剤が蛍光性である、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２１】
検出可能な薬剤が、核酸分子、ペプチド、蛋白質、またはそれらの組み合わせに会合している、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
第一の複数の液滴の少なくとも１つが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ）、ループを介した増幅法、またはそれらの組み合わせからの増幅産物から成る、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２３】
検出可能な薬剤の濃度が、少なくとも３桁のダイナミックレンジを超えて決定される、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２４】
検出可能な薬剤の濃度が、少なくとも６桁のダイナミックレンジを超えて決定される、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２５】
第一の体積分布の体積が、２倍を超えて変動する、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２６】
第一の体積分布の体積が、１０倍を超えてまたは１００倍を超えて変動する、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２７】
試料のデジタルでのループを介した増幅法を実施する方法であって、
試料の複数の液滴のうち少なくとも１つの液滴が核酸分子を含む、試料の該複数の液滴を、マイクロ流体デバイス上で生成すること；および
少なくとも１つの液滴中でループを介した増幅を実施して、核酸分子の増幅産物を生成すること、
を含む、方法。
【請求項２８】
増幅産物を検出することを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
増幅産物を含む複数の液滴中の液滴の数を決定すること；および
核酸分子を含有する複数の液滴の個々の体積および複数の液滴の数を用いて、試料中の前記核酸分子の濃度を計算すること、
を更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
マイクロ流体デバイスが、複数の液滴を形成するように構成された複数のチャンバーを含む、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、全ての目的で全体として本明細書に明示的に組み入れられた２０１１年１月２０日出願の米国特許仮出願第６１／４３４，６７０号の利益を主張するものである。
【０００２】
発明の背景
本発明は、デジタル測定を実施するための方法、デバイスおよびシステムに関する。より具体的には本発明は、様々な体積においてデジタル測定を実施するための方法、デバイスおよびシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
デジタル測定は、それが示すロバスト性、高感度および高精度ゆえに、生物学において益々重要になっている。加えて、実践標準で較正しなければならないことの多いアナログ測定とは異なり、二進法でのイエス／ノーの応答を計数することに基づくデジタル測定は、較正の必要が無く、つまりユーザーの時間を節約し、アッセイのロバスト性および容易性を高める。
【０００４】
デジタルアッセイの重要な適用例は、試料中に存在するＤＡＮまたはＲＮＡの精密な定量である。ここで、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するために最も広く用いられる方法は、試料を通常、６０℃および９５℃前後の２または３つの温度間をサイクルするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅させるためのＰＣＲの使用は、基礎生物学から臨床診断学および法医学の範囲で、広い範囲の専門分野を大きく発展させた。診断学および生体医学の研究で用いられることの多いＰＣＲの１つの特別な形態が、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）であり、それは試料中のＤＮＡまたはＲＮＡの存在を検出するだけでなく、その濃度の正確な測定も提供する。これは、それに続く決定および分析を行うための重要なデータポイントであり、例えば患者に与えられＨＩＶ治療薬の量は、検査試料中の検出されたウイルスＲＮＡ量により決定される。
【０００５】
これまでｑＰＣＲを実施するための最も一般的な形態が、リアルタイムｑＰＣＲであり、それは基礎生体医学研究および臨床診断をはじめとする多くの領域で広く用いられている。リアルタイムＰＣＲでは、試料の絶対濃度が、増幅工程の時間発展から推測され、増幅産物を特異的に認識する蛍光プローブ、例えば分子ビーコンまたはＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブを用いてモニタリングされる。リアルタイムＰＣＲは、プライマー分子が配列内の相補的伸張（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）のため互いに結合する不適切なプライマーダイマーを形成するなど、様々なエラーを受け易い。結果として、副生物が生成され、それが入手されるＰＣＲ試薬の標的要素と競合し、こうして標的配列の増幅を潜在的に阻害して、精密な定量を妨害する。標的の定量には、各サイクルの増幅効率の正確な知識も必要となり、成長が指数関数的であるため、増幅効率における些細な不確実性（例えば、閾値検出レベル未満の）が、標的コピー数の決定において非常に大きな誤差をもたらす。この誤差は、核酸の初期濃度が低い場合、または蛍光検出に十分な感受性が無い場合、非常に大きくなる可能性がある。複雑な試料から標的ＤＮＡを同定および定量する能力があるにもかかわらず、リアルタイムＰＣＲは、例えば病原検出または臨床診断に必要となる十分な正確さで、低濃度の試料を定量することができない。
【０００６】
低コピー数のＤＮＡを定量するリアルタイムＰＣＲの難点を克服するために、試料中の鋳型の絶対コピー数をより精密に定量することができるデジタルまたは限定希釈ＤＮＡ増幅が開発された。ｄＰＣＲでは、ポアソン統計に基づいてわずかな体積が１つ以上の標的分子を含有し、体積の大部分がＤＮＡを含有しないように、全試料を小体積のアレイに分割する。その後、ＤＮＡ増幅が、全ての体積で同時に実施され、標的分子を含有するわずかな体積で蛍光を増加させる。ＤＮＡコピー数は、蛍光体積（即ち、ＤＮＡのコピーを含有するもの）の数を計数することにより、容易にかつ精密に決定される。
【０００７】
ｄＰＣＲの概念は、魅力的であるが、（１）ｄＰＣＲに用いられる非常に少量の（ピコリットル〜ナノリットル）の大きなアレイを作成することが困難となり得るため、そして（２）実験のダイナミックレンジが分離したアレイのサイズおよび数により定義され、それが多くの場合非常に低いため、まだ広範囲で用いられない。試料中のＤＮＡまたは蛋白質の量を精密に定量するために、コンパートメントのほとんどが、典型的には最大で１つの標的分子を含有する。これにより、試料の初期濃度がアッセイのダイナミックレンジに適合されることが示唆される。言い換えれば、正しい試料濃度をデバイスに入力してｄＰＣＲを実践する前に、初期試料濃度が決定されていなければならない。これが、ｄＰＣＲ実践の不便さを促進し、一定体積でのデジタルアレイの可能性を限定する。
【０００８】
用いられる特定の反応にかかわらず、デジタルアッセイのダイナミックレンジの限定を克服することは重要である。直接的な方法は、同じサイズのデジタル化体積の数を増加させることにより、アッセイの範囲を拡大することである。このアプローチには問題があり、多量の体積を収容するために、デバイスは大きくなければならず、かなり複雑で高価な微細作製を含むことになる。つまり、デジタル測定を実施するための追加的方法およびシステムが必要となる。
【０００９】
ｄＰＣＲの上述の実践的問題の他に、該方法の広範な使用は、正確な温度制御および温度サイクルによっても妨害される可能性がある。一般にアニーリングおよびメルティングステップの温度は、±１℃以内に制御される。ＤＮＡおよびＲＮＡの絶対的定量が重要となる多くの適用例では、これらの因子は、特に資源の限られた設定およびポイント・オブ・ケアにおいては、適合が困難であるか、または実現に費用がかかる。これらの設定において、ＤＮＡおよびＲＮＡを増幅するためのより人間工学的方法を提供するために、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ）またはループを介した増幅法（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）をはじめとする複数の等温法が開発された。
【００１０】
ＬＡＭＰは、ＤＮＡまたはＲＮＡを非常に高い特異性により６０〜６５℃の一定温度で増幅するための等温法である。高い特異性により、増幅の間に一塩基差を識別することができる。結果として、ＬＡＭＰは、ＳＮＰ（一塩基多型）の分類に適用されてきた。ＬＡＭＰは、ＲＴ−ＰＣＲよりも約１０倍高い感度でウイルスＲＮＡを検出することも示された。他の等温法からＬＡＭＰを判別する別の特色は、溶液の濁度を上昇させるピロリン酸マグネシウムの生成と、ＤＮＡの増幅を直接相関させる能力である。つまりＬＡＭＰ溶液の進行は、簡単な濁度計で追跡することができる。それゆえ、不均一アッセイを、ＬＡＭＰから得られる増幅産物を検出するのに用いることができる。ピロリン酸マグネシウムの生成は、蛍光指示薬の形態で用いることもでき、それはデジタルアッセイの読出しに特に有用となる。反応の前に、少量のカルセインが、反応混合物に添加される。増幅の間に、ピロリン酸塩の生成が増加することにより、１つ以上の標的分子を含有するそれらの体積中のカルセイン蛍光色素が、急激に増加する。
【００１１】
これらの反応は、一定温度で進行し、機器の複雑性を低減してエネルギー消費を減少させるため、ポイント・オブ・ケア診断および家庭医学用デバイスにとってより適したものになる。これらの方法をデジタル形式に移行させるのは、ポイント・オブ・ケアでのより良好でより精密な病原検出に向けた重要なステップである。その上デジタルアッセイは、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）などの蛋白質増幅に基づくアッセイ、または増幅を必要とする場合もあれば、またはしない場合もある任意の一分子に基づくアッセイの精度も改善する。
【００１２】
先の観点から、デジタル測定を実施するための改善された方法およびシステムを提供する必要がある。加えて、デジタルＬＡＭＰなどのデジタル測定を用いた追加の技術を提供する必要もある。本明細書に開示された発明は、これらの必要物およびそれ以上を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
発明の簡単な概要
本発明は、デジタル測定を実施するための方法、デバイスおよびシステムを提供する。より具体的には本発明は、様々な体積においてデジタル測定を実施するための方法、デバイスおよびシステムに関する。幾つかの態様において、本発明は、非限定的にデジタルＰＣＲ、デジタル等温核酸増幅（例えば、デジタルＮＡＳＢＡおよびデジタルＬＡＭＰ）、デジタル蛋白質増幅（例えば、デジタルＥＬＩＳＡ）、デジタル一分子測定、および他の形態のデジタル測定をはじめとするデジタル測定のダイナミックレンジを増加させる方法および装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
一態様において、本発明は、
試料濃度勾配を生成すること；および／または
異なるサイズの試料体積を生成すること、
を含む、試料中のデジタル測定のダイナミックレンジを増加させる方法を提供する。
【００１５】
一実施形態において、ダイナミックレンジは、濃度勾配の形成のための方法および装置を用いてデジタル測定および読出しを統合することにより増加される。被分析分子の濃度勾配は、好ましくは対数的または指数関数的な形状であるが、非限定的に線形、多項式、誤差、ガウス、指数関数、対数数、およびそれらの任意の組み合わせをはじめとする多数の他の形状が可能である。
【００１６】
別の実施形態において、ダイナミックレンジは、様々なサイズのデジタル化体積を用いることにより増加される。例えばダイナミックレンジは、同じチップまたは基板上で、体積１００ｎＬであるデジタル体積のアレイの１セット、１０ｎＬであるアレイの第二のセット、１ｎＬであるアレイの第三のセット、１００ｐＬであるアレイの第四のセット、１０ｐＬであるアレイの第五のセット、１ｐＬであるアレイの第六のセット、１００ｆＬであるアレイの第七のセット、１０ｆＬであるアレイの第八のセット、および最後に１ｆＬであるアレイの第九のセット、を有することにより増加させてもよい。最終的な適用に応じて、同じチップ上のこれらのアレイセットの全てを有する必要がなくてもよい。幾つかの適用例では、１ｆＬ〜１ｎＬに及ぶアレイで、十分となり得、他の適用例では、１００ｎＬ〜１ｐＬに及ぶアレイが、より適切となり得る。更に別の適用例において、異なる体積の２つのセットを有する２つのアレイセットのみで、十分となり得る。異なる体積を含むアレイセットの数は、様々であり、各アレイのサイズに依存する。例えばアレイセットが、１００万のデジタル化体積を含む場合には、ｐＬ〜ｎＬの濃度範囲に及ぶ１ｎＬ、１００ｐＬ、１０ｐＬおよび１ｐＬのアレイを有する必要がなくてもよく、単に１００ｐＬおよび１ｐＬの２つのアレイセットで、十分となり得る。
【００１７】
別の態様において、濃度勾配およびデジタル化体積のサイズ変化の使用を組み合わせて、デジタル測定のダイナミックレンジを更に増加させることができる。別の態様において、本発明は、濃度勾配および異なるサイズの個別体積を利用して試料のデジタル一分子測定のダイナミックレンジを増加させる方法である。別の態様において、本発明は、疎水性および親水性パッチを用いてパターン化された表面を調製するプロセスであり、該パッチは、異なるサイズの試料体積の湿性液滴を形成させる。別の態様において、本発明は、本明細書に記載された方法のいずれかを実施する機械のためのコンピュータで実施可能な命令を保存する、非一時的コンピュータ読取り可能媒体である。別の態様において、本発明は、疎水性および親水性パッチを用いてパターン化された表面を含むアレイであり、該パッチは、異なるサイズの試料体積の湿性液滴を形成させる。別の態様において、本発明は、不均一アッセイにおいて試料のデジタル測定のダイナミックレンジを増加させるために用いられる。濃度勾配を形成させる方法および試料体積をデジタル化する方法が数多く存在することに留意することが重要である。本明細書に示された実施例は、限定と解釈すべきではない。
【００１８】
本発明は、以下のものを実施する方法および装置も記載する：（１）デジタルＮＡＳＢＡ、（２）デジタルＬＡＭＰ、（３）疎水性および親水性パッチでパターン化された表面を用いて形成された表面に付着された液滴を用いた、ＰＣＲまたは他の核酸増幅の実施、ならびに（４）不均一アッセイを用いたデジタル核酸増幅の読出し実施。
【００１９】
更に別の態様において、本発明は、デジタル測定を用いて試料の濃度を決定する方法を提供する。該方法は、第一の体積分布を有する第一の複数の液滴であって、該第一の複数の液滴の少なくとも１つが試料の内容物を含有する、第一の複数の液滴を生成すること；第一の体積分布と同一または異なる第二の体積分布を有する第二の複数の液滴を分析して、検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の個々の体積および第二の複数の液滴の数を決定すること；ならびに検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の個々の体積および第二の複数の液体の数を利用して試料の濃度を決定すること、を含み得る。
【００２０】
更に別の態様において、本発明は、試料のデジタル測定を実施するためのシステムを提供する。該システムは、第一の体積分布を有する第一の複数の液滴を含有するサンプルホルダーと；第一の複数の液滴の少なくとも１つを含有する検出可能な薬剤を検出する検出器と；保存された実施可能な命令を含む記憶デバイスを含むコンピュータと、を含み得て、該命令は、プロセッサにより実施されると、プロセッサに、第一の体積分布と同一または異なる第二の体積分布を有する第二の複数の液滴を分析させて、検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の個々の体積および第二の複数の液滴の数を決定させ；ならびに検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の個々の体積および第二の複数の液体の数を利用させて試料の濃度を決定させ得る。
【００２１】
更に別の態様において、本発明は、試料のデジタルでのループを介した増幅を実施する方法を提供する。該方法は、試料の複数の液滴のうち少なくとも１つの液滴が核酸分子を含む試料の該複数の液滴を、マイクロ流体デバイス上で生成すること；および少なくとも１つの液滴中でループを介した増幅を実施して核酸分子の増幅産物を生成すること、を含み得る。
【００２２】
本発明の性質および利点をより完全に理解するために、以下に続く詳細な説明を添付の図面と併せて参照しなければならない。図面は、本明細書の実施形態を例示として表す。本発明は、本発明を逸脱することなく様々な点で改良が可能である。したがって実施形態の図面／図および説明は、本質的に例示であり、限定ではない。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】勾配濃度の被分析物を含むデジタル化体積の生成を示す。視覚化の目的で、蛍光色素のフルオレセインを被分析物として用いた。ウェルのアレイに勾配を流す。ここで、最上部入口（最上列）からの２００μＬ／分の２００μＭフルオレセインおよび最下部入口（最下列）からの４００μＬ／分の水を用いて、勾配を生成させた。ウェルに濃度勾配が充填されたら、ライトミネラルオイル（水よりも低比重）をウェルに流して、ウェル内の個々のデジタル化体積を生成した。この実施例でのウェルは、同体積であるが、様々な体積のウェルを用いることができる。この実験では、ウェルは、径７５μｍおよび深さ１００μｍであり、高さ２ｍｍのフローチャンバーの下に静置した。
【図２】疎水性および親水性パターン化表面を用いて様々なサイズ（体積）のデジタル化体積を生成するための方法および装置を表す。ここで、円形状の親水性パッチが、疎水性表面の背景でパターン化される。この表面が、水（または任意の他の水性溶液、例えば試料溶液、ＰＣＲ試薬溶液、または緩衝液）および油に暴露されると、水性溶液は親水性パッチを浸し、油溶液は疎水性表面を浸すようになる。その結果、水性溶液の液滴（または半液滴）が、油を取り囲む親水性パッチ上に形成する。更に、親水性パッチの面積（例えば、円の面積）を変動させれば、異なるサイズの親水性パッチによって、親水性パッチにより保持された水溶液容量が制御される。親水性パッチにより保持された容量は、パッチが円形であったとしても異なる断面積形状を有することができる。厳密な形状は、用いられる正確な疎水性および親水性表面、ならびに油相および水相の性質に依存する。断面積形状は、半球形または半球形よりも丸まったもしくはパンケーキ状であってもよい。親水性パッチは、好ましくは円形であるが、正方形および長方形をはじめとする複数の他の形状であってもよい。
【図３】本発明の実施形態によるコンピュータシステムの例示を提供する。
【図４】本発明の例示的実施形態による、占有液滴の累積数に対する液滴数の関連性を表す。サイズのシミュレーションは、濃度（プロットの左から右に向かって）２．０×１０−３、２．０×１０−４、２．０×１０−５、２．０×１０−６、２．０×１０−７、および２．０×１０−８分子／ｆＬについてである。全てのシミュレーションは、径が４〜１９０ミクロンで広がる均一分布から出された１０，０００の液滴を含んだ。全ての液滴が、最小体積から最大体積まで分類され、液滴数ｉのための占有液滴の累積数は、液滴数がｉ以下である占有液滴の総数であった。
【図５】濃度２．０×１０−６での本発明の例示的実施例による占有液滴の累積数のシミュレーションを提供する。他の詳細は、図１と同様である。低領域では、液滴が占有されている確率は非常に小さく、そのためシミュレートされた曲線は、そこではゼロである。高領域では、液滴が占有されている確率は、１に非常に近似しており、曲線は  そこではほぼ単位勾配で上昇している。移行領域では、液滴が占有されている確率は、０近くからほぼ１まで上昇している。
【図６】本発明の例示的実施形態による均一な液滴分布（径４〜１９０ミクロン）のための推定された統計力を示す。破線は、サイズＥ１の測定誤差についてであり、実線は、サイズＥ２の測定誤差についてである。下の方の２本の線は、１．２倍の分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）についてであり、上の方の２本は、１．５倍の分解能についてである。点線は、０．９５に引かれている。
【図７】本発明の例示的実施形態による均一な液滴分布（径１０〜１００ミクロン）のための推定された統計力を示す。破線は、サイズＥ１の測定誤差についてであり、実線は、サイズＥ２の測定誤差についてである。下の方の２本の線は、１．２倍の分解能についてであり、上の方の２本は、１．５倍の分解能についてである。点線は、０．９５に引かれている。
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、本発明の例示的実施形態による顕微鏡を用いた乳化液滴のサイズの決定を表す。図８Ａは、シラン処理された顕微鏡スライド上の液滴の暗視野像を示す。個々の液滴のサイズは、液滴が十分に分離しているならば、暗視野像から決定することができる。コントラストが、水相と油との境界から散乱する光から生じ、液滴に円の輪郭を与え、そこから液滴径を測定することができる。スケールバーは、１００ミクロンを表す。図８Ｂは、乳化後に測定された５７７の液滴のサイズ分布を示す。分布は、メジアン径を２０μｍとして対称である。ほとんどの液滴径は、１０〜４０ミクロンの間の範囲内に収まる。
【図９】本明細書の表３内のシミュレーションに用いられた切り取り正規対数分布を示す。分布は、図８に示された実験的分布への理想的な近似である。
【図１０】図９に示された切り取り正規対数液滴分布の推定された統計力を示す。破線は、サイズＥ１の測定誤差についてであり、実線は、サイズＥ２の測定誤差についてである。下の方の２本の線は、１．２倍の分解能についてであり、上の方の２本は、１．５倍の分解能についてである。点線は、０．９５に引かれている。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄは、本発明の例示的実施形態による液滴のＰＣＲ増幅の検出を示す。図１１Ａおよび１１Ｂは、ＰＣＲ後の標的ＤＮＡを有さない液滴の映像を示す（陰性対照の実験）。暗視野像／ＲＯＸ（１１Ａ）および暗視野像／ＦＡＭ（１１Ｂ）の組み合わせを示す（ここでＲＯＸは、反応に添加された参照色素であり、ＦＡＭは、ＤＮＡ増幅を検出するためのＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ中で用いられる蛍光指示薬である）。暗視野が、液滴の環状外周を照らしており、蛍光源からのガウス形蛍光シグナルが重なっている。挿入図は、液滴の中心を通る淡灰色の線に沿って測定された強度を示す。液滴の中心領域のシグナルは、ほとんど蛍光によるものであり、ＤＮＡターゲットの非存在下では、中心領域は暗いままであり、ＲＯＸとＦＡＭとの蛍光比は、高い（ＲＯＸ：ＦＡＭ＝１２：２０＝６：１）。図１１Ｃおよび１１Ｄは、標的ＤＡＮを含む液滴のＰＣＲ後の映像である。暗視野像／ＲＯＸ（１１Ｃ）および暗視野像／ＦＡＭ（１１Ｄ）の組み合わせを、液滴を通る対応するラインスキャンと共に示す。ラインスキャンは、中心領域の蛍光シグナルの増加および含有しない液滴中で観察されなかったガウスプロファイルを示す。２つの蛍光シグナルの間の各比率は、含有しない液滴よりも有意に低い（ＲＯＸ：ＦＡＭ＝６０：３０＝２：１）。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、本発明の例示的実施形態による、デジタルＬＡＭＰ自己デジタル化チップの設計を表す。図１２Ａは、完全に組み立てられたチップの個々の構成要素を示す略図である。マイクロ流体アレイは、ＰＤＭＳの薄片中に埋め込むことができ、ＰＤＭＳは、最上部ではシーラントフィルムに、そして最下部ではＰＤＭＳコートされたカバーガラスに覆われていてもよい。空気圧を、取り外し可能なアダプターを介して送達することができ、該アダプターは、外部の圧力供給源に連結させることができる。図１２Ｂは、マイクロ流体ネットワークの例示的見取り図である。長方形のサイドチャンバーの高密度のアレイを、薄いメインチャネルに連結させた。アレイ全体が、別個の水貯蔵器に取り囲まれ、６５℃でのインキュベーションの間にＰＤＭＳを充満させる。スケールバーは、５ｍｍを表す。図１２Ｃは、サイドチャンバーアレイおよびメインチャネルの例示的配置を示す。寸法は全て、マイクロメートルである。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｅは、本発明の例示的実施形態による、ｄＬＡＭＰ  ＳＤチップ中の試料の自己デジタル化を示す。図１３Ａは、サイドチャンバーアレイへの水性溶液の最初の充填を示す連続映像を提供する。チップを油で下塗りした後、水性試料がメインチャネルに入り、水性試料自体をサイドコンパートメントに分配させて、油相をチャンバー内に配置させる。図１３Ｂは、サイドチャンバー内での水性試料の自己デジタル化を示す連続映像を提供する。水相全体がチップに入った後、メインチャネル内の尾を引いている油相により、サイドチャンバー内の個々のナノリットルサイズの液滴が分離された。図１３Ｃは、圧力を加えられたサイドチャンバー内の液滴サイズの分布の依存性を示す。最大平均相対体積分率（ＲＶＦ）を有する最も均一な分布が、外部圧７ｐｓｉについて得られた。より低い圧力および高い圧力で、より可変的体積および低いＲＶＦの液滴が形成した。図１３Ｄは、１６の個々のチップから５０００の自己デジタル化液滴のＲＶＦ値のサイズ分布を表す。外部圧は、全ての実験で７ｐｓｉに設定した。全ての液滴の平均ＲＶＦは、０．８９±０．１４であった。挿入図は、ＲＶＦ値の累積分布を示す。数字は、それぞれＲＶＦが５０％、７５％および９０％を超える液滴の分率に対応する。例えば全ての液滴の８５％が、チャンバーの７５％を超える量を満たしている。図１３Ｅは、試料の自己デジタル化の再現性を示す。それぞれが７ｐｓｉの外部圧で充填されている１５の個々のチップの平均ＲＶＦ値および標準偏差が示される。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、本発明の例示的実施形態による、高温でのチップ性能を表す。図１４Ａは、液滴体積に対するインキュベートの影響を示す。典型的な液滴のサイズ分布を、６５℃での７０分間インキュベートの前後で示す。試料は、テンプレート含まない陰性対照溶液からなり、つまり増幅が全く起こらないと予測された。液滴は、平均で約１０％収縮した。挿入図に認められる通り、アレイの周辺に位置する液滴は、嵩高のＰＤＭＳにより多く暴露されたため、わずかに収縮が増加した。アレイの中心の液滴は、収縮による影響をあまり受けなかった。図１４Ｂは、チップにおいて観察されたデジタルＬＡＭＰシグネイチャを示す。チャンバーアレイの区分を、インキュベートの前後で示す。強度プロファイルは、複数のチャンバーの中心を通る線に対応する。チャンバーの幾つかにおけるループを介したＤＮＡ増幅は、蛍光を急速に増加させた。隣接した非ＬＡＭＰ競合チャンバーは、蛍光の増加を全く示さず、隣り合うチャンバーの間の相互干渉が無視できる程度であることが実証された。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｆは、異なるＤＮＡテンプレート濃度ｃｉ：ｃｉ＝ｃ０／４（１５Ａ）、ｃｉ＝ｃ０／３０（１５Ｂ）、ｃｉ＝ｃ０／１５０（１５Ｃ)、ｃｉ＝ｃ０／４３０（１５Ｄ）およびｃｉ＝ｃ０／１３００（１５Ｅ）、でのデジタルＬＡＭＰの結果を示す。ｃ０は、テンプレート原液の濃度である。ＬＡＭＰ競合チャンバーの各分率は、図１６において分析される。最低の試料濃度（ｃ０／１３００）での実験では、５３５番チャンバーチップを用いて、陽性チャンバーの絶対数を増加させた。図１５Ｆは、テンプレートを添加していないＬＡＭＰ溶液の対照実験を示す。予測された通り、チャンバーはいずれも、バックグランドを超える蛍光増加を示さなかった。
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、本発明の例示的実施形態による、ＤＮＡ濃度の相対および絶対変動の定量を示す。図１６Ａは、ＬｏｏｐＡｍｐ（登録商標）キットに含まれた対照ＤＮＡ試料の希釈系列を示す（図１５参照）。各試料濃度では、少なくとも３つの異なるチップを分析した。実線は、原液１μｌあたり０．９９×１０４分子の鋳型濃度でのポアソン分布に基づく陽性事象の予測係数を表す。この濃度は、３つの最低の試料から決定された。５３５番ウェルのチップは、６５℃での７０分間インキュベーション前後に示される。λ相ＤＮＡは、１μｌあたり２０コピーの最終濃度に希釈されて、そこで約１２％陽性チャンバーを予測した。インキュベーション後に、５３５番ウェルアレイ内の９．８％ＬＡＭＰ競合液滴を検出した（最初に形成された液滴４７９のうち４７）。ｆａの予測値と測定値の間の差は、８倍希釈系列の間に蓄積されたピペッティング誤差により生じた可能性がある。
【図１７】Ｚ検定から推定された信頼水準とシミュレーションから推定された信頼水準との比較を含む表２を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、デジタル測定を実施するための方法およびシステムを提供する。より具体的には本発明は、様々な体積においてデジタル測定を実施するための方法およびシステムに関する。
【００２５】
Ｉ．概論
非限定的に、本発明は、可変的サイズの体積を生成させることによりデジタルアッセイのダイナミックレンジを増加させることに一部基づく。所与の試料濃度では、体積のサイズは、該当する１つ以上の分子（例えば、テンプレート分子）により占有される確率を定義することができる。増幅関連の技術の例において、体積サイズの変動を利用して、この占有の確率、つまり増幅を示すウェルまたは試料体積（例えば、液滴）の数を変化させることができる。とりわけ本発明は、単に一定サイズの体積の数を増加させることでダイナミックレンジを増加させる既存の技術よりも良好である。この利点は、本明細書に開示された方法およびシステムが、ダイナミックレンジを拡大するために必要となる体積を収容するのに大きな面積を要求せず、例えば幾つかのデジタル化体積が適切に形成しない、または他の欠点を有するチップ上の欠陥の見込みを高めるためである。加えて、体積の数を単に増加させると、デジタル化体積の全てを分析するのに必要となる時間も増加する。
【００２６】
更に本発明は、様々なサイズの体積が多量に生成される、ダイナミックレンジの増加わせるデジタルアッセイを実施する方法、システムおよびデバイスを提供する。上述の組立て式のプラットフォームとは異なり、本発明は、個別ではなくむしろ連続しているサイズ（例えば、体積）分布の使用を含み得る。幾つかの実施形態において、様々なサイズの液滴を、無秩序に、またはマイクロ流体の制御的適用により、様々な方法で生成することができる。例えば一定体積の液滴のマイクロ流体生成は、Ｔ字路の使用またはフローフォーカシングデバイスを用いることにより、当該技術分野で周知である。これらのシステムにおいて、液滴のサイズは、せん断速度およびチャネル寸法により制御することができる。所与のＴ字路配置で、せん断速度が連続的に変化する場合、これらの体積の液滴が生成され得る。これらの方法は、水相および油の担体液の相対的流速を調整する、例えばコンピュータ制御のシリンジポンプまたはモジュレートされた空気圧により、実現することがでる。
【００２７】
幾つかの実施形態において、様々なサイズの液滴が、サンプルホルダー（例えば、試験管）中での乳化により、無秩序に生成され得る。液滴の無秩序性は、例えば液滴のサイズを制御する労作を全く必要としないため、実験を単純化することができる。乳化の間に、異なる体積の液滴を、異なる界面活性剤の使用により安定化することができる。乳化アプローチは、複数の理由で特に有用であり：つまり（１）該方法は、各生体医療検査室において見出される基本的機器と適合性があり、（２）液滴の生成が単純で、流量制御のための複雑なチップ設計または洗練された設備を要求せず、（３）液滴が個々のウェルに閉じ込められず、多数の液滴を収容するのに要求されるスペースが最小限になり、および（４）試料容器が増幅の間の液滴生成および液滴貯蔵用に用いられ得るため、アッセイが単純である。試料の移行は、液滴生成から増幅反応までの間に全く必要とならない。
【００２８】
用語「ダイナミックレンジ」は、変動可能な量の可能な最大値と最小値との比率として定義される。
【００２９】
用語「デジタル化体積」は、最初の試料を得て、それをアッセイ用の調製において物理的に離れたより小さな体積に分離した後の生成された体積を指す。
【００３０】
用語「均一アッセイ」は、全てのアッセイ成分が検出時間に溶液相中に存在する場合に定義される。均一アッセイにおいて、アッセイ成分はいずれも、検出可能な光を散乱しない。
【００３１】
用語「不均一アッセイ」は、１つ以上のアッセイ成分が検出の時間に固相中に存在する場合に定義される。ＬＡＭＰまたはローリングサークル増幅法などにおける沈殿または粒子の形成が、不均一アッセイの一般的形態である。このタイプのアッセイでは、固相成分は、検出可能な光を散乱させ得る。
【００３２】
本明細書に示された用語「連続的体積分布」は、体積分布を通して予め定義された分離したステップではなくむしろ連続して変動する体積分布を説明するものとする。例えばチップに基づくプラットフォームは、予め定義された分離離したステップにより定義される体積分布で、チップの一部として組み立てられたウェルまたは液滴体積を含み得る。即ちチップは、１００ｎＬ、１０ｎＬ、および１ｎＬで存在する体積を有し、それらの分離したステップの間に他の体積が全く存在しないように作製することができる。これとは逆に、連続した体積分布は、予め定義されていない（即ち、体積分布は、液滴体積の生成または形成前は定義されない）。連続体積分布は、例えば本明細書に更に記載された通り乳化により生成することができる。乳化において、体積（例えば、液滴体積）は、分離した体積を有するが、分布における液滴体積は、液滴生成前は定義されておらず（即ち、組み立て技術により予め定義されることはなく）、体積は連続体積分布に沿って無秩序に分布されている。液滴体積の上限および下限は、エマルジョンに加えられた力により（例えば、ボルテックス処理の速度または振とうの強度により）改良することができる。しかしそのような技術により生成された液滴体積は、生成された体積分布に沿って連続して変化する。
【００３３】
幾つかの態様において、任意のセットの（または複数の）液滴体積について、ｆ（ｘ）ｄｘを、該セットにおける所与の液滴がｘ〜ｘ＋ｄｘの体積を有する確率とする場合に、その分布関数がｆ（ｘ）で示され得るように、連続体積分布を特徴づけることもできる。（ｄｘは、極わずかな数である。）特定の実施形態において、連続分布は、液滴セット中の液滴体積が（１）予め特定されておらず、（２）ある程度の範囲ｘｌｏｗｅｒ＜ｘ＜ｘｕｐｐｅｒでは、ｆ（ｘ）が、常にゼロよりも大きくなる（ｘｌｏｗｅｒは、ｘｕｐｐｅｒと同じになり得ず、ｆ（ｘ）について分かる要件は他にない）ものである。つまり本発明は、幾つかの実施形態において、連続分布から取り出された液滴セットを用いること、該セットにおける各液滴の体積を測定すること、および測定された液滴体積を分析において使用すること、を含み得る。
【００３４】
Ｉ．デジタル測定の方法
一実施形態において、本発明は、デジタル測定および読出しと統合された濃度勾配を生成する方法を提供する。例えば、マイクロ流体勾配の生成を試料のデジタル化チップと統合してもよい。図１は、マイクロチャネルの入口を用いて形成された濃度勾配の例を示す。ダイナミックレンジを増加させる場合、対数的または指数関数的濃度勾配が好ましいが、現在はパワー関数、指数関数、誤差関数、ガウス関数、および立方根関数などの非線形勾配を含む複数の方法を、チップ上の濃度勾配の様々なタイプおよび形状を形成させるのに利用できる。図１は、被分析物の勾配濃度を含むデジタル化体積の生成を表す。
【００３５】
図１に示されたマイクロ流体設計のタイプを用いて濃度勾配を形成するためには、わずか２つの入口貯蔵器またはチャネルが必要となるが、より多くが本発明の使用に適するであろう。１つの入口は試料用に用いられ、１つは緩衝液（またはデジタルＰＣＲの場合にはＰＣＲ試薬）用に用いられる。２つの溶液はネットワークを通して流れるため、試料溶液は緩衝（水またはＰＣＲ試薬）溶液により所定の方式で希釈されるようになり、その結果、出口チャネルのそれぞれで異なる濃度の試料が存在する。６桁にわたる線形、多項式および対数勾配は、全て、この設計の変動を利用して生成させた。
【００３６】
別の実施形態において、６桁に及ぶ濃度の対数または指数関数的勾配が、用いられる。試料およびＰＣＲ溶液が、２つの入口貯蔵器にピペット注入され、その後、ウェルのアレイを通過する。ウェルが濃度勾配で充填されると、ライトミネラルオイルまたは幾つかの他の非混和性液がウェルを流れて、ウェル内に個々のデジタル化体積が生成する。この実施例におけるウェルは、同じ体積である。本発明の別の実施形態において、図１に表されたスキームは、様々な体積のウェルが用いられる。
【００３７】
別の実施形態において、試料およびＰＣＲ溶液が、２つの入口貯蔵器にピペット注入され、その後、親水性および疎水性パッチのアレイを通過する。試料が親水性パッチを流れるため、それらは異なるサイズの試料体積の湿潤された液滴を形成させる。
【００３８】
あるいは試料は、図２に示されたパターン化された表面を用いて、図示された通りデジタル化することができる。
【００３９】
本発明の別の態様において、勾配は、バルブ、ウェル、または液滴を用いて生成されたデジタル化体積と協調的に用いられる。液滴を用いる実施形態において、液滴は、Ｔ−チャネル配置またはフローフォーカシング配置のいずれかの連続流動様式で形成することができ、その両者は当該技術分野で周知である。
【００４０】
希釈された試料をデジタル化するために、図１に記載されたデジタル化スキームを用いることができる。ここでは、異なる濃度の標的分子を含有する試料溶液が、凹凸パターン化された表面（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌｌｙ  ｐａｔｔｅｒｎｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ）を流れて、続くデジタル測定および読出しのためのデジタル化された分離した体積を形成する。あるいは、図２に示されたパターン化表面を用いて、示される通り試料をデジタル化することができる。
【００４１】
別の実施形態において、試料は、マイクロ流体チャネルおよび非混和性液相を用いてデジタル化することができる。この実施例において、試料の相がチャネルに導入され、その後、非混和性相に導入されて、サイドキャビティーの幾何学的寸法により画定される分離した試料体積を形成する（Ｄ．Ｅ．  Ｃｏｈｅｎ，  Ｔ．  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｍ．
Ｗａｎｇ，  Ｄ．Ｔ．  Ｃｈｉｕ  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ８２，  ５７０７−５７１７）。
【００４２】
本発明の別の態様は、本発明の方法を実施するためのデバイスを含む。そのようなデバイスは、デジタル測定および読出しと統合された濃度勾配を生成し得る。別の実施形態において、該デバイスは、試料濃度勾配を生成すること；および／または異なるサイズの試料体積を生成すること、を含む、試料のデジタル測定のダイナミックレンジを増加させる方法を実施する。
【００４３】
幾つかの実施形態において、本発明は、異なるサイズのデジタル化された分離した体積のアレイを生成することに基づく、デジタル測定のダイナミックレンジを増加させる方法を含む。この方法は、単にデジタル化体積の数を増加させてダイナミックレンジを増加させることよりも良好である。これは、デジタル化体積の数を単に増加させると、体積が占める面積を増加させるだけでなく、幾つかのデジタル化体積が適切に形成しない、または他の欠点を有する、チップ上に欠陥を有する見込みを高めることになるためである。単にデジタル化体積の数を増加させると、デジタル化体積の全てを分析するのに必要となる時間も増加する。ダイナミックレンジを増加させるためのより良好なアプローチは、デジタル化体積の数を単に増加させるよりもむしろ異なるサイズのデジタル化体積のアレイを生成することによる。異なるサイズのデジタル化体積のアレイは、無秩序なアレイであってもよく（例えば、１つの容器内に全て存在し、そこで無秩序に分布する異なる径の液滴）、または規則的なアレイであってもよい（例えば、図２に示すもの）。
【００４４】
図２は、パターン化された表面を用いて異なるサイズの堆積のアレイを生成する、異なるサイズのデジタル化体積のアレイを生成する一例を示す。この実施例において、７セットのアレイが生成され、各アレイは９００のデジタル化体積（３０×３０）を含む。アレイは、疎水性表面の背景内に親水性の円形パッチを生成することにより形成される。その結果、表面が水溶液および油に暴露されると、親水性パッチが、油に取り囲まれた水性の液滴に覆われることになる。水性液滴の側面図が、図の下側に示されている。この側面図は、半球形の液滴を表すが、その形状は、用いられる厳密な表面ならびに用いられる油および水性溶液に応じて変動し得る（よりパンケーキ状またはより丸まっている）。一実施形態において、重油が用いられ、油が液滴状を押圧するため、その液滴はよりパンケーキ状になるであろう。
【００４５】
９００の親水性パッチの各セットを画定する円形は、異なるサイズを有し、径が１μｍから５０μｍまで、１０μｍまで、５０μｍまで、１００μｍまで、５００μｍまで、最後に１ｍｍまでの範囲内である。液滴の体積は、概ね立方体として液滴の径に応じて増減するため、パッチの径が１０倍増加すると、体積は約１０００倍増加する。その結果、様々なサイズのデジタル化体積を用いれば、単に同じサイズのよりデジタル化された体積を用いるよりも、空間および読出しに関してより効率的になる。一実施形態において、アレイの各セットでは９００のデジタル化体積が用いられ、それはこの数が、統計的にロバストなデジタル読出しに到達するのに適しているためである。しかし、読出しの特定の適用およびに必要となるロバスト性に応じて、アレイの各セット内のよりデジタル化された体積、またはよりデジタル化されていない体積を、設計することができる。
【００４６】
この設計を利用すれば、異なるサイズの親水性パッチを表面パターン化することが容易になるため、様々なサイズのデジタル化体積の大きなアレイを生成するための特有のスキームになる。それゆえ、多くの場合広いダイナミックレンジが望ましいデジタルＰＣＲなどの適用例では、図２に記載されたパターン化表面を用いて生成された液滴中でＰＣＲを実施することが、非常に有利になる。
【００４７】
幾つかの実施形態において、本発明は、デジタル測定を用いて、試料の濃度を決定する方法を提供する。該方法は、第一の体積分布を有する第一の複数の液滴であって、第一の複数の液滴のうち少なくとも１つの液滴が試料の内容物を含有する、第一の複数の液滴を生成すること；第一の体積分布と同一または異なる第二の体積分布を有する第二の複数の液滴を分析して、検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の体積および第二の複数の液滴の数を決定すること；ならびに検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の体積および第二の複数の液体の数を利用して試料の濃度を決定すること、を含み得る。
【００４８】
幾つかの実施形態において、該体積は、バルブ、ウェル、または液滴を用いて生成することができる。液滴を含む実施形態が、特に有用となり得る。ここでは、非常に様々な方法を用いて、異なる体積（径）の液滴を生成することができる。一方法において、定義された体積の液滴は、マイクロ流体を用いて（例えば、当該技術分野で周知のＴ−チャネルまたはフローフォーカシングで）生成され；せん断速度またはチャネル寸法を変動させることにより、異なるサイズの液滴が容易に形成される。別の方法において、異なる体積の液滴が、異なる界面活性剤で補助された乳化により生成され、ここで異なる体積の液滴は安定化され、異なる界面活性剤の使用により制御される。いずれかの方法を用いれば、被分析物の増幅（例えば、デジタルＰＣＲ）を、異なる体積（サイズ）の液滴全てにおいて同時に実施することができ、その後、液滴をフローサイトメータ、または液滴サイズを決定し得る他の類似のデバイスにより単一ファイル形式で流すことができ、液滴の蛍光を調べることができる。この例のデバイスにおいて、各液滴内の増幅産物の存在は、蛍光に基づいて決定され、各液滴のサイズ（体積）は、液滴からの散乱シグナルに基づいて決定される。この方法において、各液滴のサイズおよび所与のサイズの各液滴における増幅の有無に注目することにより、異なるサイズの液滴の十分な数を調べた後に、試料中に存在する被分析物の本来の濃度を逆算することができる。液滴が異なるサイズであるため、所与のダイナミックレンジでは、これまで議論された理由で、分析が、液滴が全て類似サイズの場合のよりもかなり迅速になる。
【００４９】
本明細書に記載された通り、様々な体積分布を有する該体積を、生成することができ、それを様々な異なる方法を用いて分析することができる。幾つかの実施形態において、試料は、分析され得る該当する一分子または複数の分子を含有することができる。試料の分離した体積を、デジタル測定を介した分析用に生成させることができる。例えば本明細書に記載された方法は、１つの体積分布を有する複数の液滴を生成することを含み得る。幾つかの実施形態において、試料の複数の液滴が、本明細書に更に記載される通り、組み合わせた非混和性液を含むエマルジョン中に生成することができる。一実施例において、試料は、該当する分子（例えば、核酸分子）を含む水溶液を含み得る。試料を油と混合して、油中に懸濁された試料の液滴を形成させることができる。用いられる方法に応じて、エマルジョン中の複数の液滴の体積が、連続した体積分布に沿って無秩序に分布することができる。更に、体積の範囲は、エマルジョンを形成させるのに用いられる方法により制御することができる。例えば、ボルテックス処理、振とう、および／または音波処理の強度を制御して、所望の体積分布を生成することができる。
【００５０】
当業者には理解されるであろうが、体積分布の範囲およびその分布内の体積は、所与の分析の様々な因子に依存する。幾つかの実施形態において、複数の液滴の体積分布は、約１００ナノリットル（ｎＬ）〜約１フェムトリットル（ｆＬ）、約１０ｎＬ〜約１０ｆＬ、約１ｎＬ〜約１００ｆＬ、約１００ｎＬ〜約１ピコリットル（ｐＬ）、約１０ｎＬ〜約１０ｐＬ、約１ｎＬ〜約１ｐＬの体積範囲を含み得る。液滴を生成するために選択された因子に応じて、例えば試料および油を界面活性剤と混合する強度を変動させることにより、体積分布の上限および下限を定義することは日常的である。体積分布内に、体積の範囲を存在させることができる。例えば分布内の体積が、係数２よりも大きい範囲であってもよく、係数１０よりも大きい範囲であってもよく、係数１００よりも大きい範囲であってもよく、他の係数であってもよい。係数２の範囲にすることにより、体積分布の下限は、例えば上限が２０ｎＬであれば１０ｎＬであってもよい。同様に、係数１０の範囲にすることにより、体積分布の下限は、例えば上限が１００ｎＬであれば１０ｎＬであってもよい。
【００５１】
第一の体積分布を有する第一の複数の液滴を生成することに加えて、本発明は、第二の体積分布を有する第二の複数の液滴を分析することを更に含む。第二の複数の液滴を分析することは、例えば第二の複数の液滴の体積を決定することを含み得る。この体積決定は、様々な方法を用いて（例えば、散乱および／または顕微鏡検査を用いて）実施することができる。幾つかの実施形態において、複数の液滴全ての個々の体積が、決定されてもよい。幾つかの実施形態において、液滴の幾つかの個々の体積のみが、決定されてもよい。液滴を分析することは、本明細書に更に記載される検出可能な薬剤（即ち、１種以上の検出可能な薬剤）を含む液滴の数を決定することも含み得る。第二の複数の液滴が、第一の複数の液滴として生成された同じ液滴に基づくことに更に留意する。つまり第一の体積分布は、第二の体積分布と同一または異なっていても（例えば、より狭くても）よい。分布が同一である場合、第一の複数の各液滴は、第二の複数に含まれることになる。特定の実施形態において、第二の体積分布は、第一の体積分布よりも狭い。例えば液滴は、約１ｆＬ〜約１００ｎＬの範囲内の体積分布を有するエマルジョン中に生成することができる。例えば試料の濃度に応じて、デジタル測定の分析は、１ｆＬ〜１ｎＬの範囲内の体積分布で実施されてもよく、その場合の第二の体積分布は、第一の体積分布よりも狭い。
【００５２】
反応（例えば、増幅）を、体積の分析の前または分析の間に、異なるサイズの体積で実施して、どの体積が反応を受けたか（例えば、増幅産物を有するか）を決定することができる。特定の例において、体積（例えば、液滴）は、サイズ調整することができ、占有された液滴（例えば、検出可能な薬剤を含有する液滴）の数を計数することができる。液滴の全てまたはほんの一部を、分析してもよい。例えばフローサイトメータ、または類似のデバイスで単一ファイル中の液滴を流すことにより実現することができ、そこで液滴のサイズを決定することができ、増幅の存在を検出することができる。液滴のサイズは、例えば液滴からの散乱シグナルに基づいて決定することができ、増幅の存在は、液滴の蛍光シグナルにより指示することができる。あるいは液滴径を、顕微鏡検査により決定することができる。液滴は、サンプルホルダーから抽出して（反応、例えば増幅、の完了前、完了時、または完了後に）、ＣＣＤカメラで広視野で映像化することができる。液滴は、例えば表面に広げて、または２枚のスライドガラスの間に包埋して、広視野顕微鏡に配置させることができる。適当な励起および発光フィルターを用いることにより、液滴内の蛍光を定量して、増幅の有無を明らかにすることができる。液滴のサイズおよび各液滴内の増幅産物の有無の両方に注目することにより、異なるサイズの液滴の十分な数を調べた後に、試料中に存在する被分析物の本来の濃度を逆算することができる。液滴が異なるサイズであるため、所与のダイナミックレンジでは、分析が、液滴が全て類似サイズの場合のよりもかなり迅速になる。幾つかの実施形態において、本明細書における方法は、複数の液滴の数および複数の液滴の個々の体積を用いて、デジタル測定を実施することを更に含む。例えば、該当する分子の試料濃度を、複数の液滴の数、該当する分子を１個以上含む複数の液滴の数を用い、そして複数の液滴の一部または全ての体積を測定することにより、決定することができる。試料濃度を決定するための例示的方法は、実施例の節に見出すことができる。
【００５３】
本発明は、デジタル測定が試料についての有用な情報を提供する任意の技術に用いることができる。そのため本明細書において提供された方法、システムおよびデバイスは、検出可能な薬剤を含有する体積を含み得る。特定の実施形態において、該体積は、マイクロ流体チップ内のウェルもしくはチャンバーであってもよく、または検出可能な薬剤を含有する液滴（例えば、エマルジョン中またはチップの表面上に形成された水滴）であってもよい。検出可能な薬剤が、単一の検出可能な分子または複数の検出可能な分子を含み得ることは、一般に理解されよう。検出可能な薬剤の他のタイプ、例えばビーズ、量子ドット、ナノ粒子などを用いることができる。更に、検出可能な薬剤は、例えば分析される試料中の該当する分子であってもよい（例えば、血液、血清、唾液または他の溶液中の核酸分子）。あるいは検出可能な薬剤は、試料中の該当する分子（例えば、核酸分子）に会合した分子であってもよく、それにより該分子を検出することができる。幾つかの実施形態において、本発明の方法およびシステムは、デジタル測定を含む増幅関連技術（例えば、デジタルＰＣＲ）に用いることができる。増幅測定では、体積（例えば液滴）は、単一のＤＮＡ分子を含み得るが、例えば体積は、増幅および検出に用いられることが一般に周知の必須成分も含有する。幾つかの実施形態において、検出可能な薬剤は、蛍光であり、つまり当該技術分野で公知の蛍光に基づく検出法により検出することができる。しかし他の検出法（例えば、吸光度、化学発光、濁度、および／または散乱）を用いて、体積の内容物を分析することができる。本発明に適した様々な検出可能な薬剤が、当該技術分野で一般に周知であり、例えばＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第１１版（２０１０年）に見出すことができる。
【００５４】
特定の実施形態において、検出可能な薬剤は、検出のために該当する分子と会合していてもよい。例えば検出可能な薬剤は、試料中に存在する核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ペプチド、蛋白質、脂質または他の分子（例えば、生体分子）と会合していてもよい。本明細書に定義される、検出可能な薬剤に関連する「会合した」は、共有結合的、および／または非共有結合的相互作用を介した分子との相互作用を含む。例えば検出可能な薬剤は、該当する分子と共有結合的に付着していてもよい。あるいは検出可能な薬剤は、核酸分子（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子）を検出するために用いられ得るインターカレーション剤またはＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブであってもよい。該当する体積中の分子に会合し得ない参照色素など、他の検出可能な薬剤を用いることができる。
【００５５】
本発明の幾つかの実施形態は、非混和性液中で液滴を生成することを含む。当該技術分野で周知の通り、非常に様々な非混和性液を組み合わせて、様々な体積の液滴を生成することができる。本明細書に更に記載される通り、該液は、乳化など、様々な方法により組み合わせることができる。例えば水性溶液（例えば、水）を非水性液（例えば、油）と組み合わせて、サンプルホルダー中またはマイクロ流体チップ上に液滴を生成することができる。本発明における使用に適した水性溶液は、緩衝液、塩、およびＰＣＲなどの検出アッセイにおいて用いられることが一般に公知である他の成分を更に含み得る水ベースの溶液を含むことができる。つまり本明細書に記載された水性溶液は、例えばプライマー、ヌクレオチド、およびプローブを含むことができる。適切な非水性液は、非限定的に有機相液、例えば鉱物油（例えば、ライトミネラルオイル）、シリコーンオイル、フッ素化オイルまたは液（例えば、フッ素化アルコールまたはＦｌｕｏｒｉｎｅｒｔ）、他の市販の材料（例えば、Ｔｅｇｏｓｏｆｔ（登録商標））、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００５６】
水性溶液および非水性液に加えて、界面活性剤を含んで、例えば液滴の安定性を改善することおよび／または液滴の形成を容易にすることもできる。適切な界面活性剤は、非限定的に、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、シリコーン系界面活性剤、フッ素系界面活性剤、またはそれらの組み合わせを含み得る。非イオン系界面活性剤は、例えばモノステアリン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ  ６０）、オクチルフェノキシエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（Ｔｗｅｅｎ  ８０）およびソルビタンモノオレアート（Ｓｐａｎ  ８０）を含み得る。シリコーン系界面活性剤は、例えばＡＢＩＬ  ＷＥ  ０９界面活性剤を含み得る。当該技術分野で一般に周知の界面活性剤の他のタイプを、同様に用いることができる。幾つかの実施形態において、界面活性剤は、様々な濃度、または濃度範囲、例えばおよそ０．０１重量％、０．１重量％、０．２５重量％、０．５重量％、１重量％、５重量％、または１０重量％で存在することができる。
【００５７】
本発明は、試料の濃度を決定することを更に含む。例えば該方法およびシステムを用いて、（１）液滴の体積および（２）検出可能な薬剤を含有する液滴の数を決定することができ、それを用いて試料の濃度を決定することができる。この情報は、試料濃度を決定する様々な方法で用いることができる。例えば標的分子は、試料中に、分子の単位／体積中の濃度で存在する。試料は、分析され得る可変的体積の液滴中に分布させることができる。液滴（全てまたはほんの一部）の個々の体積を、本明細書に提供された方法により決定することができる。加えて、本明細書に記載された検出法を用いれば、液滴は、検出可能な薬剤を含有するか否かについて分析することができる。所与の試料濃度では、可変的体積の液滴の一部は、検出可能な薬剤を含有する可能性があり、一部は含有していない可能性がある。より高い試料濃度では、一般に複数の液滴のより多くが、検出可能な薬剤を含有し得て、その逆もあり得、低い試料濃度では、複数の液滴のより少量が、検出可能な薬剤に占有され得る。本明細書に更に記載される通り、特定の体積分布内での検出可能な薬剤による占有の確率は、広範囲の試料濃度で定義することができ、その後、実際のデータと比較して、未知試料の濃度を決定することができる。試料濃度を決定するための追加の開示は、以下の実施例１および２に見出すことができる。それらの実施例に示された方法は、試料濃度のための初期推定値を作成すること、およびその後、１種以上の検出可能な薬剤（占有された液滴）を含有すると予測される液滴数を計算すること、を含む。試料濃度の推定値は、その後、占有された液滴の予測数が所望の精度内で複数の占有液滴の実際の数と等しくなるまで、周知の数値法を用いて適合させる。
【００５８】
本明細書に更に記載される通り、本発明は、幾つかの既存の方法およびシステムにより実現し得ないデジタル測定のための様々な態様を提供する。例えば本発明は、広いダイナミックレンジにわたり試料濃度を測定する能力を提供することができる。幾つかの実施形態において、ダイナミックレンジは、少なくとも３桁、少なくとも４桁、少なくとも５桁、または少なくとも６桁であってもよい。幾つかの実施形態において、ダイナミックレンジは、約１０−１〜約１０−９分子／ｆＬ、約１０−２〜約１０−８分子／ｆＬ、約１０−３〜約１０−７分子／ｆＬ、または約１０−４〜約１０−６分子／ｆＬであってもよい。特定の実施形態において、ダイナミックレンジ内の試料濃度を決定することは、試料中の該当する分子と会合した検出可能な薬剤を検出することにより実施することができる。ダイナミックレンジは、様々な因子、例えばエマルジョン中に生成される体積の範囲ならびに／または分析および検出される体積の範囲に依存し得る。例えば第一の体積分布を有する第一の複数の液滴は、検出可能な濃度のダイナミックレンジを生成し得る。幾つかの例において、ダイナミックレンジは、第二の体積分布を有する第二の複数の液滴中で、より狭い体積分布を分析することにより減少させてもよい。特定の実施形態において、体積分布は、連続して変動する液滴体積を含む。
【００５９】
ｄＰＣＲをオンチップ勾配生成と統合することにより、または様々なサイズのデジタル化体積を用いることにより、またはこれらの方法の両方の組み合わせにより、本発明は、本発明のｄＰＣＲチップのダイナミックレンジを１〜６桁、効果的に増加させ、それはＲＴ−ＰＣＲにより提示されるダイナミックレンジに匹敵する。濃度勾配のより大きな範囲またはより大きなサイズ差を含むデジタル化体積のアレイを用いることにより、該ダイナミックレンジは、所望なら更に増加させることができる。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施するためのこの新しい方法は、複数の重要な利点を提示し：つまり（１）それは、以前に議論された通りより精密であり、（２）ＲＴ−ＰＣＲに必要となる較正試料のタイプを実践する必要性を未然に無くし、つまり時間を節約し、（３）通常のＰＣＲ機器に対するＲＴ−ＰＣＲの比較的高いコスト（約１０倍）の原因となるリアルタイム感受性蛍光検出の必要性を排除する。
【００６０】
本発明の別の態様は、本発明の方法を実施するためのデバイスを含む。そのようなデバイスは、異なるサイズのデジタル化された分離した体積のアレイを生成し得る。別の実施形態において、該デバイスは、試料濃度勾配を生成すること、および異なるサイズの試料体積を生成すること、を含む、試料のデジタル測定のダイナミックレンジを増加させる方法を実施する。
【００６１】
本発明の更に別の態様において、本明細書に記載された方法、システムおよびデバイスを、等温増幅技術、例えばデジタルＥＬＩＳＡ、ＮＡＳＢＡ、およびＬＡＭＰに適用することができる。ＥＬＩＳＡは、蛋白質に基づくもので、通常は蛋白質または小分子の定量に用いられる。ＮＡＳＢＡおよびＬＡＭＰは、ＰＣＲを補助するために開発された等温増幅スキームである。
【００６２】
等温増幅においては、伝統的なＰＣＲのような温度サイクリングが全く起こらない。複数のタイプの等温核酸増幅法、例えば転写を介した増幅、核酸配列に基づく増幅、ＲＮＡテクノロジーのシグナルを介した増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、ＤＮＡのループを介した等温増幅、等温多置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、単一プライマー等温増幅、および環状ヘリカーゼ依存性増幅などが存在する。
【００６３】
ＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）は、ＲＮＡを増幅する等温プロセス（約４０℃）であり、臨床試料中のウイルスおよび細菌のＲＮＡの両方を検出する際に有効に用いられてきた。ＮＡＳＢＡにより提示された利点は、（１）高い増幅効率および急速な増幅速度を有し、１０００倍を超える増幅を、１または２時間以内に実現することができること；（２）ＲＴ−ＰＣＲの場合と同様に、ゲノムｄｓＤＮＡにより誘発された偽陽性を与えないこと；（３）遺伝子発現試験が、イントロンフランキングプライマーを使用せずに実施し得ること；（４）ＰＣＲに必要な温度制御およびフィードバックを要求しないこと、である。結果として、ＮＡＳＢＡは、ウイルスおよび細菌ＲＮＡを検出するのに汎用されるようになった。ＮＡＳＢＡが等温法であるという事実により、温度制御オーブンの使用により複数の試料を同時に実施することが可能になり、それが、多くの実地調査において重要な実践利益となる。
【００６４】
ループを介した等温増幅を示すＬＡＭＰは、等温（約６０℃）条件下で高い特異性、効率、および迅速性でＤＮＡを増幅することができる。増幅反応の特徴により、ＬＡＭＰは、増幅の間に一塩基差を識別することができる。その結果、ＬＡＭＰは、ＳＮＰ（一塩基多形）タイピングに適用されてきた。ＬＡＭＰは、ウイルスの検出においてＲＴ−ＰＣＲよりも約１０倍高い感度を有することも示された。加えて、ＤＮＡのＬＡＭＰ増幅は、溶液の濁度を増加させるピロリン酸マグネシウムの生成に直接相関し得るため、ＬＡＭＰの進行は、簡単な濁度計を用いてモニタリングされてきた。それゆえ、不均一アッセイを、ＬＡＭＰから得られる増幅産物を検出するのに用いることができる。
【００６５】
一態様において、本発明は、試料のループを介した増幅を実施する方法を提供する。該方法は、少なくとも１つの液滴が核酸分子（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子）を含む試料の複数の液滴をマイクロ流体デバイス上で生成すること；および少なくとも１つの液滴内でループを介した増幅を実施して、核酸分子の増幅産物を生成すること、を含み得る。該方法は、増幅産物を検出することも含み得る。幾つかの実施形態において、該方法は、増幅産物を含む該複数の液滴の数を決定すること、および核酸分子を含有する該複数の液滴の個々の体積および該複数の液滴の数を用いて、試料中の核酸分子の濃度を計算すること、を含む。マイクロ流体デバイスは、複数の液滴を形成するように構成された複数のチャンバーを含み得る。本発明を用いてデジタルＬＡＭＰを実施する追加の態様は、実施例３に見出すことができる。
【００６６】
ＮＡＳＢＡおよびＬＡＭＰにより提示された利点の幾つかにもかかわらず、１つの重要な欠点は、ほとんどの状況において利益となる定量の実施に伴う難点である。定量は、同一条件下で増幅される標準を用いた、非常に注意深い較正および制御を必要とすることが多く、それは非常に退屈な場合もあり（特に、現地調査の場合）、多くの場合実践的でない。不均一アッセイ、例えばＬＡＭＰ中の沈殿の検出では、精密な構成が、特に困難でとなり得る。
【００６７】
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、等温核酸増幅法である。それは、複数の点で、ポリメラーゼ連鎖反応および他の核酸増幅スキームとは異なる。ＲＣＡの間に、短いＤＮＡプローブは、該当する標的ＤＮＡ、例えば病原生物体のＤＮＡまたは有害な突然変異を含むヒト遺伝子にアニーリングする。その後、プローブは、ローリングサークル増幅反応のためのプライマーとして作用する。プローブの遊離末端は、小さい環状ＤＮＡ鋳型にアニーリングする。ＤＮＡポリメラーゼが付加されて、プライマーを伸長させる。ＤＮＡポリメラーゼは、環状ＤＮＡ鋳型の周りに連続してプライマーを伸長して、環状物の多くの反復コピーからなる長いＤＮＡ産物を生成する。反応の終了時に、ポリメラーゼは、環状鋳型の何千ものコピーを生成し、そのコピー鎖は本来の標的ＤＮＡにつなげられる。これにより、標的の空間的解析およびシグナルの急速な増幅が可能になる。フォワードおよびリバースプライマーの使用により、上記の直線状増幅反応を、１時間以内で１０１２コピーまでを生成し得る指数関数モードに変換することができる。そのような定量測定に必要となる較正は、煩雑になり得る。
【００６８】
この欠点を克服するために、本発明は、デジタルＰＣＲに類似した、デジタル等温増幅、例えばＮＡＳＢＡおよびＬＡＭＰを提供し、ここでデジタル化体積のアレイの使用は、デジタルＮＡＳＢＡ、デジタルＬＡＭＰ、およびローリングサークル増幅を実施するために用いられる。更に、濃度勾配および／または異なるサイズのデジタル体積のアレイを用いることにより、これらのデジタル測定のダイナミックレンジを効果的に増加することができる。現在の方法は、これらの等温増幅スキームを理想的に補助して、それらをＲＮＡおよびＤＮＡの存在を測定する定量技術にする。本発明の別の実施形態において、該方法は、抗体に基づく増幅に適用される。別の実施形態において、該方法は、特異的分子認識に基づく増幅に適用される。
【００６９】
III．デジタル測定のためのシステム
更に別の態様において、本発明は、デジタル測定を用いて試料の濃度を決定するためのシステムを提供する。該システムは、第一の体積分布を有する第一の複数の液滴を含むサンプルホルダーと；第一の複数の液滴の少なくとも１つを含む検出可能な薬剤を検出する検出器と；保存された実施可能な命令を含む記憶デバイスを含むコンピュータと、を含み得て、該命令は、プロセッサにより実施されると、プロセッサに、第一の体積分布と同一または異なる第二の体積分布を有する第二の複数の液滴を分析させて、検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の個々の体積および第二の複数の液滴の数を決定させ；ならびに検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の個々の体積および第二の複数の液体の数を利用させて試料の濃度を決定させ得る。幾つかの実施形態において、試料中の検出可能な薬剤の濃度を用いて、試料濃度を計算する。
【００７０】
本明細書に更に記載される通り、デジタル測定に用いられる体積は、様々な方法で生成および分析することができる。本発明は、体積を保持するのに用いられ得るサンプルホルダーを含むため、体積は更に処理および／または分析される。本発明のサンプルホルダーは、試験管、エッペンドルフ管、マイクロアレイ上のウェルのアレイ、液滴を生成するように構成されたマイクロ流体チップ、および試料の分離した体積（例えば、液滴および／またはウェル）を保持し得る他の一般に公知のデバイスを含み得る。本発明のシステムは、体積を分析するように構成された検出システムを更に含む。該検出システムは、体積の内容物を分析して、液滴の体積、および／または該当する他の特徴を決定するための検出器を含み得る。本明細書に記載された方法は、一般に、体積（例えば、液滴および／またはウェル）を検出および分析することが可能な任意の公知システムと適合性がある。
【００７１】
更に別の態様において、該システムは、デジタル測定を実施するコンピュータで読出し可能な保存媒体を含み得る。コンピュータで読出し可能な保存媒体は、そこに保存された命令を有し、コンピュータのプロセッサにより実施されると、該命令がコンピュータに、第一の体積分布よりも狭い第二の体積分布を有し第一の複数の液滴に含まれる、第二の複数の液滴を分析させて、検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の数を決定させ；ならびに第二の複数の液滴の数、第二の複数の液滴の一部または全ての体積、および１種以上の検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の数を利用させて、試料中の検出可能な薬剤の濃度を決定させる。
【００７２】
更に別の態様において、体積を分析して分析された体積からの情報を検出および計算するシステムが、提供される。該システムは、１つ以上のプロセッサと、該１つ以上のプロセッサにより実施され得る命令を含む記憶デバイスと、を含む。該命令は、１つ以上のプロセッサにより実施されると、少なくとも該システムはユーザーの入力を受けて体積（例えば、複数の液滴）を分析する。該システムは、本発明の方法の態様、例えば体積（例えば、液滴）の数を計数すること、体積分布中の複数の液滴の体積を決定することを実施して、１種以上の検出可能な薬剤を含有する液滴の数を利用して試料中の検出可能な薬剤の濃度を決定するように構成され得る。該システムは、ユーザーにデータも提供する。ユーザーに提供されたデータは、試料中の検出可能な薬剤の濃度または試料濃度を含み得る。
【００７３】
図３は、本明細書に記載された方法、媒体およびシステムに用いられ得るコンピュータシステム１００の簡単なブロック図である。様々な実施形態において、コンピュータシステム１００を用いて、先に図示および記載されたシステムまたは方法のいずれかを実施してもよい。図３に示される通り、コンピュータシステム１００は、バスサブシステム１０４を介して複数の周辺サブシステムと通信するプロセッサ１０２を含む。これらの周辺サブシステムは、記憶サブシステム１０８およびファイル保存サブシステム１１０を含む保存サブシステム１０６と、ユーザーインターフェース入力デバイス１１２と、ユーザーインターフェース出力デバイス１１４と、ネットワークインターフェースサブシステム１１６と、を含んでいてもよい。
【００７４】
バスサブシステム１０４は、コンピュータシステム１００の様々な成分およびサブシステムに、意図に沿って互いに通信させるためのメカニズムを提供する。バスシステム１０４は、１つのバスとして概略的に示されているが、バスシステムの別の実施形態は、複数のバスを利用し得る。
【００７５】
ネットワークインターフェースサブシステム１１６は、他のコンピュータシステムおよびネットワークへのインターフェースを提供する。ネットワークインターフェースサブシステム１１６は、コンピュータシステム１００からのデータを受け取り、コンピュータシステム１００から他のシステムにデータを伝送するためのインターフェースとして働く。例えばネットワークインターフェースサブシステム１１６は、ユーザーのコンピュータをインターネットにつないで、インターネットを使用した通信を容易にすることができる。
【００７６】
ユーザーインターフェース入力デバイス１１２は、キーボード、ポインティングデバイス、例えばマウス、トラックボール、タッチパッド、またはグラフィックスタブレット、スキャナー、バーコードスキャナー、ディスプレイに組み込まれたタッチスクリーン、音声入力デバイス、例えば音声認識システム、マイク、および他のタイプの入力デバイスを含み得る。一般に用語「入力デバイス」の使用は、情報をコンピュータシステム１００に入力するためのデバイスおよびメカニズムの全ての可能なタイプを含むものとする。
【００７７】
ユーザーインターフェース出力デバイス１１４は、ディスプレイサブシステム、プリンター、ファックス機、または非視覚的ディスプレイ、例えば音声出力デバイスなどを含み得る。該ディスプレイサブシステムは、陰極線管（ＣＲＴ）、フラットパネルデバイス、例えば液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、または映写デバイスであってもよい。一般に用語「出力デバイス」の使用は、コンピュータシステム１００からの情報を出力するためのデバイスおよびメカニズムの全ての可能なタイプを含むものとする。広告が、１つ以上のユーザーインターフェース出力デバイス１１４を用いてコンピュータシステム１００により出力されてもよい。
【００７８】
貯蔵サブシステム１０６は、基本プログラミングおよびデータ構造を保存するためのコンピュータで読出し可能な保存媒体を提供する。プロセッサにより実施されると、本明細書に記載された方法およびシステムの機能性を提供するソフトウェア（プログアム、コードモジュール、命令）が、保存サブシステム１０６に保存され得る。これらのソフトウェアモジュールまたは命令は、プロセッサ（１つまたは複数）１０２により実施され得る。保存サブシステム１０６は、本発明により使用されるデータを保存するためのレポジトリも提供し得る。保存サブシステム１０６は、記憶サブシステム１０８およびファイル／ディスク保存サブシステム１１０を含み得る。
【００７９】
記憶サブシステム１０８は、プログラム実施の間の命令およびデータの保存のためのメインランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）１１８と、固定命令が保存されているリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）１２０とを含む複数のメモリーを含み得る。ファイル保存サブシステム１１０は、プログラムおよびデータファイルのための非一時的な永続的（不揮発性）保存を提供し、ハードディスクドライブ、関連の取り出し可能な媒体を伴うフロッピー（登録商標）ディスクドライブ、コンパクトディスクリードオンリーメモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）ドライブ、光学ドライブ、取り出し可能な媒体のカートリッジ、および他の類似の保存媒体を含み得る。
【００８０】
コンピュータシステム１００は、パーソナルコンピュータ、ポータブルコンピュータ、ワークステーション、ネットワークコンピュータ、メインフレーム、キオスク端末、サーバーまたは任意の他のデータ処理システムを含む様々なタイプであってもよい。コンピュータおよびネットワークの千変万化の性質により、図３に表されたコンピュータシステム１００の記載は、該コンピュータシステムの実施形態を例示する目的で具体的例を意図するに過ぎない。図３に表されたシステムよりも多いまたは少ない構成要素を有する多くの他の形態が、可能である。
【００８１】
本発明の装置、デバイス、システム、およびその構成要素のいずれかの具体的寸法は、本明細書内の開示を参照すれば当業者に明白となるため、意図した適用に応じて即座に変動させることができる。その上、本明細書に記載された実施例および実施形態が、例示のみを目的としており、それを考慮した様々な改良または変更が当業者に示唆され得、それが本願の主旨および範囲に含まれ、添付の特許請求の範囲に含まれることは理解されよう。本明細書に記載された実施形態の数多くの異なる組み合わせが可能であり、そのような組み合わせは本発明の一部とみなされる。加えて、本明細書の任意の一実施形態に関連して議論された全ての特色は、本明細書の他の実施形態における使用に即座に適合され得る。異なる実施形態の類似の特色への異なる用語または参照数字の使用は、必ずしも、明白に示されたものとの差を示唆するものではない。したがって本発明は、添付の特許請求の範囲を参照することによってのみ説明され、本明細書に開示された実施形態に限定されないものとする。
【実施例】
【００８２】
IV．実施例
実施例１
実施例の理論的枠組み
この実施例は、本明細書に記載された本発明の特定の態様を記載するために用いられ得る非限定的な理論的枠組みを記載する。この実施例に記載された方法が、本発明を用いて試料の濃度を決定するための多くの方法の１つであることは、理解されよう。この理論的枠組みの下では、標的分子が、分子／体積の単位あたり濃度Ｃｓで、試料中に存在するものと仮定する。試料は、可変的体積のデジタル体積に分布されており、液滴中の標的分子の分布は、ポアソン統計学に従う。デジタルアレイ中の各液滴について、および式１に示された通り、標的の平均数は、体積Ｖｉ、および初期試料濃度Ｃｓに依存する：
【数１】
2019030323.tif 000002
は、溶液中の標的分子の所与の濃度Ｃｓに対して、体積Ｖｉの液滴中にｎ個の分子を見出す確率である。増幅反応は、１つ以上の分子を含有する液滴を、例えば蛍光強度により、含有しない液滴と判別可能にする。この方法では、液滴が含有していないか、または占有されているか、のみが分かる。関連の確率を、式２に示す：
【数２】
2019030323.tif 000003
標的分子の濃度Ｃｓを決定するために、Ｐ（ｎ＞０、ＣｓＶｉ）は、各体積Ｖｉの十分に多数の液滴全体を合計する必要がある。
【００８３】
シミュレーション法
標的濃度Ｃｓが正確に決定され得ることを検証するために、デジタル増幅アッセイ、例えばデジタルＰＣＲ、デジタルＬＡＭＰまたはデジタルＥＬＩＳＡのシミュレーションを、連続する可変的体積と共に記載する。
【００８４】
各シミュレーションでは、液滴の固定数Ｎｄおよび被分析物分子のシミュレートされた濃度Ｃｓを、選択した。シミュレーションは、様々なＣｓ値について実施した。乱数発生器を用いて、所与の範囲および分布からＮｄ個の液滴の径を選択した。本発明の原理を例示するために、液滴径Ｄが最少径４ミクロン〜最大径１９０ミクロンの間で均一に分布するものと仮定して、シミュレーションを実施した。この結果、シミュレートされた体積は、３４〜３．６×１０６ｆｌの範囲内である。液滴径のより現実的な分布を、以下に議論する。
【００８５】
各シミュレーションでは、乱数発生器を用いて、初期標的濃度がＣｓである場合に、特定のシミュレートされた液滴が占有されているか、または含有しないか、を決定する。シミュレーションにおける占有された液体の総数Ｎｓを計数し、次に占有された液滴の予測数
【数３】
2019030323.tif 000004
（式中、ＮＥの最も可能性のある値を、Ｃ＝Ｃｓのために得た）と比較する。Ｎｄ個の液滴の体積を用いれば、式（３）をＮｓに適合させて、その濃度の最良適合値を得ることができる（Ｃは、唯一の調整可能なパラメータである）。本発明者らは、ニュートン・ラプソン・アルゴリズムを用いて、Ｎｓ−ＮＥのゼロを見出す。Ｃの初期値は、式（３）におけるＶｉ‘を分布のメジアン体積と置き換えて、Ｃを求めることにより得る。その後、アルゴリズムは、典型的にはＣの変更のために５〜１１の繰り返しを行い、１０５分の１未満になる。そのポイントでのＣの値は、Ｃの最良適合値となるように採用される。
【００８６】
シミュレーションでは、目的の一部は、（ｉ）Ｃｓを推定する際に、この手順がどれほど精密であるかを決定すること、および（ii）２つの異なる試料がＣの異なる最良適合値を与える場合に、試料が異なる濃度を有することの信頼度を計算する方法、である。
【００８７】
この方法は、各液滴の体積の測定を含み、それに関連する誤差が存在し、それが考慮される。これをシミュレートするために、ガウス分布の誤差をシミュレートされた径のそれぞれに加えて、シミュレートされた測定径を得る。その後、これらのシミュレートされた測定径を用いて、シミュレートされた測定体積
【数３−１】
2019030323.tif 000005
を計算し、それを式（３）に置き換えて、測定体積に基づく占有液滴の予測数を得る。
【数４】
2019030323.tif 000006
【００８８】
液滴径を決定する一方法は、顕微鏡検査による。この方法の精度は、用いられる物体の開口数（ＮＡ）および映像システムの他の詳細に依存し得る。表面上の静止した液滴の多数を映像化するために、ＮＡは、１未満になる可能性があり、本発明者らの実験では、径測定の誤差は、典型的には０．５〜１．０ミクロンであり、液滴サイズに非依存的である。本発明者らは、Ｅ１およびＥ２で示された２つの異なる規模の測定誤差をシミュレートした。Ｅ１では、液滴径に加えられるガウス分布の誤差の標準偏差は、１ミクロンより大きいか、またはその液滴径の８％である。シミュレーションが最大液滴の無視できない測定誤差を含むような、相対誤差が含まれる。Ｅ２では、液滴径に加えられるガウス分布の誤差の標準偏差は、２ミクロンよりも大きいか、またはその液滴径の１５％である。両方の例で、シミュレートされた測定径におかれた１つの限界がある。特定のガウス分散が０．５ミクロン未満の液滴径をもたらす場合、その分散を廃棄して、その液滴用に新しい分散を作成する。
【００８９】
実験の分析では、Ｃｓは、手順を決定しようと試みている実際の未知濃度であり、Ｃは、最良適合推定値であり、Ｖｉは、液滴の実際の体積であり、
【数４−１】
2019030323.tif 000007
は、実験者により測定された体積である。
【００９０】
シミュレーションの結果
典型的なシミュレーションセットの結果を、図４に示す。シミュレーションは、１０，０００個の液滴および６種の異なる濃度Ｃｓ（２．０×１０−３、２．０×１０−４、２．０×１０−５、２．０×１０−６、２．０×１０−７、および２．０×１０−８分子／ｆＬ）で実施した。液滴のサイズは、４．０〜１９０ミクロンの径の均一分布から取り出した。各シミュレーションでは、液滴を体積により分類し、最小体積の液滴をナンバー１とし、最大体積の液滴はナンバー１０，０００であった。図４には、占有された液滴の累積数をプロットしている。ｉ番目の液滴で占有された累積数は、ｉ以上の全ての液滴についての占有された液滴の合計である。
【００９１】
曲線の形状は、その濃度および液滴体積の分布形状の両方の関数である。液滴体積（液滴の径の代わりに）が均一な分布は、不均一な分布と同様に異なる形状の曲線を生成する。任意の所与のサイズ分布では、図４のタイプの曲線は、液滴数と共に単調に上昇し、異なる濃度の曲線は、決して交差しない。そのため液滴サイズの分布が測定されると、曲線の形状および占有された液滴の総数は、被分析物分子の濃度の身に依存する。十分に大きな濃度では、占有される確率が１．０に非常に近くなる液滴体積が存在する。その体積に対応する液滴数に達すると、曲線は、より大きな液滴数の全てでほぼ単位勾配で上昇する。十分に小さな濃度では、占有される確率が０．０と判別がつかなくなる液滴体積が存在する。その体積に対応する液滴数よりも小さな液滴数の全てで、曲線はゼロになる。
【００９２】
最良適合結果に対する液滴径の測定誤差の影響
本明細書に記載された通り、本発明は、液滴サイズを個々に測定することを含む。液滴の体積は液滴が占有される確率に入るため、体積が非常に精密に測定されることが重要であると思われる。このシミュレーションの液滴サイズの範囲では、最小の液滴（ほぼ４ミクロン径）は、光学顕微鏡により液滴径を測定する際の典型的誤差（ほぼ１ミクロン標準偏差）よりも実質的に大きくならない。液滴体積の得られた相対誤差は、有意である可能性があり、この方法の精度を低下させると予測し得る。意外にもこれは、事実ではないと思われる。表１で、一連のシミュレーションに、式（３）を適合させた結果と、式（４）に適合させた結果とを比較している。各濃度で、１００のシミュレーションを実施し、それぞれが２０００個の液滴を含んだ。式（３）では、シミュレートされた体積Ｖｉを用いた。式（４）では、シミュレートされた測定体積
【数４−２】
2019030323.tif 000008
を用いた。問題点は、式（３）を用いたシミュレート結果を適合させた結果が、液滴の体積が完璧な精度によって分かっている場合にえられる最良適合濃度を表し、式（４）に適合させた結果が、液滴体積の測定における誤差の影響を含む、ということである。式（３）および（４）を用いた最良適合濃度の平均および標準偏差を、Ｅ１およびＥ２の両方について表１に列挙する。
【表１】
2019030323.tif 000009
【００９３】
式（３）を用いた最良適合濃度と式（４）を用いた最良適合濃度との差は、最大濃度を除き、非常に小さい。誤差が±２ミクロンまたは１５％である場合であっても、誤差は最大濃度で２５％にしか達しない。その上、各濃度で、式（３）および（４）を用いた最良適合の結果の標準偏差は、最大濃度を除けばほとんど等しく、それらの間に任意の明らかな系統的差が存在しない。このことから、表１の濃度のほとんどで、最良適合濃度内の変動性の最大供給源が１つのシミュレーションから次のものまでの液滴占有数の変動であることが示唆される。液滴サイズ測定誤差による最良適合の結果の任意の変動性は、それが不偏であれば、濃度決定に対する小さな、または無視できる影響を有する。これの全ては、最小液滴では誤差の一標準偏差が２．０ミクロン誤差（Ｅ２）を有するシミュレーションでの径の半分に近い、という事実を無視している。このことは、この方法が液滴径の測定に非合理的に高い精度を必要としないということを意味するため、重要な結果である。以下に議論される通り、主として、任意の測定誤差が不偏であることが必要となる。この意外な結果は、図５の支援により説明することができる。
【００９４】
図５は、２．０×１０−６の濃度での、占有された液滴の累積数のシミュレーションの結果を示す。そのシミュレーションは、径が４〜１９０ミクロンで均一に分布する１０，０００個の液滴を含む。曲線を、３つの領域：低、移行、および高に分割している。低の領域では、液滴が占有されている確率は非常に小さく、そのためシミュレートされる曲線は、そこではゼロである。高の領域では、液滴が占有されている確率は、液滴が占有されている確率は、１に非常に近く、曲線は、そこではほぼ単位勾配で上昇している。移行領域では、液滴が占有されている確率は、ゼロ近く〜ほとんど１まで上昇している。低または高領域内の液滴についての測定誤差は、占有された液滴の総数に対する影響をほとんどまたはまったく有さない。式（４）から、本発明者らは、低領域内の液滴の測定誤差により、単に、ほとんどゼロである合計の期間を同じくほとんどゼロである異なる期間と置き換えており、それが占有された液滴の総数に無視できない変化をもたらすはずである、ということを理解している。類似の効果が、測定誤差によりほとんどゼロである式（４）の期間を同じくほとんどゼロである他の期間に置き換えた高領域で起こる。誤差が表１のシミュレーションと同様に不偏であれば、誤差の若干の打消しも存在する。低または高領域のいずれかにおいて液滴に対応する式（４）の期間の合計は、わずかに小さな期間により置き換えられるはずであるため、わずかに大きな期間により交換される可能性がある。それゆえ、最良適合濃度に対するそれらの誤差の影響を低減する液滴体積測定誤差の若干の打消しが存在する。誤差が不偏であれば、そして移行領域を定義する体積全体に分布した液滴が十分存在するならば、移行領域内の液滴の体積測定の若干の打消しが起こると思われる。事実、測定誤差が体積の分布関数の形状を有意に変更している場合のみ、そしてその後、その変更が移行領域内のそれらの液滴について起こる場合のみ、体積測定誤差が最良適合濃度における優位な誤差を誘発すると思われる。径の分布に対する表１で用いられたガウス分布測定誤差の影響は、分布の終了部分近くでわずかに顕著である。例えばこれらのシミュレーションにおいて発生した最小の液滴は、４ミクロンに近い径を有する。しかし、測定誤差が含まれる場合には、シミュレートされた測定径は、４ミクロン未満となり得る。即ち、シミュレートされた測定径の分布は、実際のシミュレートされた径よりも小さいサイズに拡張することになり、４ミクロン近くに分布関数のわずかな広がりになろう。これらの最小液滴では、占有されている確率は、シミュレートされたサイズを用いて計算されるが、データを適合させる場合には、占有されている確率は、より小さな測定サイズを用いて計算される。これがその適合を導いて、移行領域がこれらの最小液滴を含む場合に濃度を過大推定する可能性がある。これが、表１に認められているが、その影響はあまり大きくない。１９０ミクロン近くにある分布関数のわずかな広がりのため、最低濃度で同等の影響が存在するはずであるが、その影響は顕著ではない。
【００９５】
合理的サイズの液滴体積測定誤差が、占有された液滴の総数から濃度を推定する試みに対して顕著な影響を有すると予測され得るように、これらのシミュレーションに用いられた液滴径の範囲が選択される。しかしこれは、シミュレートされた濃度範囲（１０６）がシミュレートされた体積範囲（１０５）よりも大きい場合でも、このことは起こらなかったと思われる。より小さな範囲（１０および１０３）に均一分布した液滴径の他のシミュレーションは、合理的に精密な最良適合濃度がおよそ１０の係数により体積範囲よりも大きなシミュレート濃度範囲で得られ得る、という類似の結果を生じる。
【００９６】
この方法を用いて、２つの異なる試料の濃度が異なるかどうかを決定する場合には、異なる問題が生じる。そのため、この方法の信頼度および統計力が、考慮されなければならない。これを、次の節で実施する。
【００９７】
信頼度および統計力の推定
濃度の差を区別する方法の能力を、信頼度および統計力に関して記載することができる。（Ｌｉｅｂｅｒ，  Ｒ．  Ｌ．  （１９９０）  ”Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐｏｗｅｒ  ｉｎ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  Ｔｅｓｔｉｎｇ”，  Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８，
３０４−３０９）２つの異なる試料についての測定により、２つの異なる最良適合濃度（Ｃ１およびＣ２）が生じる場合、２つの試料の濃度が異なっていると主張することにおいて、およびそれらが異ならないと結論づけた場合に誤っている確率も、どれ程信頼できるかを知ることは有用となろう。偽陽性結果（Ｉ型誤差）のリスクは、その結果が必要な最小信頼度を有することを必要とすることにより制御され、偽陰性結果（II型誤差）のリスクは、その方法が必要な統計力を有することを必要とすることにより制御される。
【００９８】
２つの異なる試料からの２つの最良適合濃度を比較するために、帰無仮説は、２つの試料が同じ（未知の）濃度を有した、ということになろう。αが、同じ濃度の２つの試料が
【数４−３】
2019030323.tif 000010
より大きな規模で異なる最良適合濃度をもたらし得る確率である場合、（１−α）は、帰無仮説の拒絶に関連する信頼度である。（１−α）の許容される最小値は、偽陽性結果を抑制するように選択される。偽陰性結果に対して防御する統計力の使用を、以後に記載する。
【００９９】
信頼区間を推定するのに用いられる一方法が、Ｚ検定である。
【数５】
2019030323.tif 000011
９５％の信頼区間は、一般的選択であり、Ｚ＞１．９６を必要とする。Ｃｎは、式（４）の最良適合結果であり、
【数５−１】
2019030323.tif 000012
は、Ｃｎの測定に関連した分散である。
【数５−２】
2019030323.tif 000013
の扱いやすい解析方程式は、本発明者らの方法には存在しないと思われ、そのためシミュレーションにより
【数５−３】
2019030323.tif 000014
を推定する必要がある。その上、Ｚ検定の追加の一限定は、測定結果が正規分布すると仮定することである。これは必ずしも事実ではないため、信頼度を推定する第二のシミュレーション法を実施して、Ｚ検定結果と比較した。この後、２つの方法がＺ法およびペアまたはＰ法を示す。
【０１００】
信頼度のＺ法推定値では、Ｃｓの２つの異なる値を用いた（Ｃｓ１＝２．０×１０−５およびＣｓ２＝２．２×１０−５）。Ｃｓの各値では、５０００個の液滴のセットを、４〜１９０ミクロンに広がる液滴径の均一分布から無作為に選択し、式（２）を用いて占有された液滴の数をシミュレートした。測定誤差のＥ１サイズを用いて、シミュレートした測定体積を生成した。各セットの最良適合値を決定して、Ｃ１およびＣ２を得た（ここでＣｎは、シミュレートされた濃度でＣｓｎを用いたシミュレーションの最良適合結果である）。各Ｃｎについて、追加のＺ法シミュレーションを実施した。Ｃｎおよびシミュレートされた測定体積
【数５−４】
2019030323.tif 000015
を式（２）に用いて、
【数５−５】
2019030323.tif 000016
のセットの占有された液滴の、Ｎｚ＝１０００個の追加のシミュレートされた総数を得た。これらは、その後、式（２）を用いてＮｚの最良適合濃度
【数５−６】
2019030323.tif 000017
を得る適合となる。
【数５−７】
2019030323.tif 000018
の標準偏差を、式（５）の
【数５−８】
2019030323.tif 000019
に用いられる。これは、実験者が有する情報に対応する。信頼度の推定値を、最良適合濃度Ｃｎおよび
【数５−９】
2019030323.tif 000020
から計算することができる。信頼度のペア法推定では、帰無仮説は、２つの最良適合結果（Ｃ１およびＣ２）がそれぞれ、実際の濃度
【数５−１０】
2019030323.tif 000021
を２つの最良適合濃度の平均とする試料から得られた、ということであると仮定する。液滴径のＮｐ＝５００の追加のセットをシミュレートし、それぞれについて占有された液滴の数が濃度
【数５−１１】
2019030323.tif 000022
についてシミュレートされ、測定誤差のＥ１サイズを用いてシミュレートされた測定体積を生成した。最良適合濃度
【数５−１２】
2019030323.tif 000023
を、各セットについて得た。その後、値のＭｐ＝５００のペアを無作為に選択して、
【数５−１３】
2019030323.tif 000024
のセットから置き換えて、それらの差の絶対値
【数５−１４】
2019030323.tif 000025
をΔＣ＝Ｃ２−Ｃ１と比較した。ΔＣよりも大きな
【数５−１５】
2019030323.tif 000026
の割合は、濃度
【数５−１６】
2019030323.tif 000027
の試料から実施された２つの測定が互いにΔＣよりも大きく異なる確率αの推定値を提供する。αのＰ法推定値を用いて、（１−α）となる信頼度を計算する。
【０１０１】
信頼度の２つの推定値を得るための手順全体を、Ｃｓのペア１００回反復した。各反復では、シミュレートされた体積の新しいセットは、各Ｃｓについて生成させ、式（２）を用いて各Ｃｓの占有された液滴の数を生成させた。シミュレートされた測定体積を生成させて、式（４）に用い、結果を適合させて、最良適合濃度の新しいペア（Ｃ１およびＣ２）を得た。その後、Ｚ法およびＰ法を用いて、信頼度を推定した。
【０１０２】
Ｃｓの２つの選択された値の間の小さな差（１０％）が、ほぼ０〜ほぼ１の範囲内の信頼度をもたらす。これにより、一定範囲の値で信頼度を推定する２つの方法を比較することができ、全ての例において合理的な一致が得られた。図１７の表２に、１００の結果の幾つかを示した。特に表２は、信頼度の最小値をもたらした５セット、メジアンで信頼値をもたらした６セット、およびほぼ１．０の信頼値をもたらした５セットを示す。Ｚ法の結果を最初の５列に示し、Ｐ法の結果を最後の３列に示す。２つの異なる方法での信頼度の値（１−α）は、５列目および８列目であり、それらの間の合理的一致が、シミュレートされたセットの全てで見出される。Ｚ法において実施されるＺ検定は、十分に精密であると思われるため、解析方程式が存在しないことに問題はない。統計力の計算において引き続きＰ法を用いたが、実際にはＺ法が合理的代替法であり、コンピュータ処理としてはより安価である。その上、Ｐ法は、実際の分布への良好な近似である液滴サイズの分布を生成する数値的方法を必要とするが、Ｚ法はそうではない。この最後の要件は、シミュレーションにおいて問題とならず、実験結果を解析する際の難点となり得るため、Ｚ法は、その例ではより有用となろう。本発明者らは、ＮＺシミュレーションの全てについて同様の実験的に測定された液滴サイズを用いるＺ法が、Ｐ法のそれと合理的に一致する信頼度を生じて、Ｎｐシミュレーションのそれぞれについてのシミュレートされた液滴体積と関連する測定誤差との新しいセットを生成することに注目している。このことは、十分に多数の液滴では、液滴体積の特定試料分布の変動が、液滴が占有されていることのポアソン確率（式（２））よりも、占有された液滴の数における変動性への有意な寄与物質が少ないことを示唆している。
【０１０３】
信頼区間は、２つの試料が異なる濃度を有することを示す結果が、偽陽性となり得る可能性の推定値を提供する。統計力は、偽陰性である可能性の推定値を提供する。このため、シミュレーションのこれまでのセットの手順を用いた。参照および検査濃度の間の所与の％差については、互いに近接していて必要となる信頼区間を満たすことができない結果の割合が計算される。これは、特定の濃度差についての偽陰性および必要となる信頼水準（この場合９５％）を生じる結果の因子（β）であり、統計力は（１−β）となる。この検定の結果を、図６〜７に示す。その異なる図は、液滴径の２つの異なる分布について得られた統計力であり、Ｅ１およびＥ２の両方の測定誤差を含む。図６および７は、４〜１９０ミクロン（図６、体積範囲  およそ１０５）および１０〜１００ミクロン（図７、体積範囲  およそ１０３）の径範囲を有する均一分布の結果である。横座標の各濃度は、２０％および５０％大きな濃度（それぞれ１．２倍および１．５倍の分解能）に対して検定されている。それらの図の全ての結果は、５０００個の液滴のセットについてであり、他のパラメータは、信頼度を推定するためのペア法に用いられたものと同様である。
【０１０４】
濃度が２０％異なる試料間で判別する場合、この方法は、約１００の因子を示す濃度範囲では０．９５を超える統計力が可能である。その必要性が、１．２倍または１．５倍の分解能から緩和されれば、統計力が０．９５を超える濃度範囲は、広い均一分布では（図６、４〜１９０ミクロンの歯に内の液滴径）１０４を超える係数に及び、別のものでは（図７、１０〜１００ミクロンの範囲内の液滴径）ほとんど１０４に及ぶ。その範囲の位置は、液滴サイズ分布の形状に依存する。必要な分解能が緩和されると、または液滴数が増加すると、統計力が０．９５を超える範囲が増加する。
【０１０５】
４〜１９０ミクロン範囲の均一分布での５，０００の液滴試料における試料の総体積は、およそ５μＬである。８×１０−９のシミュレーション中の総コピー数は、およそ３５／５０００液滴、または約７８００コピー／ｍｌである。より大きなサイズの液滴またはより多数の液滴を含む液滴範囲を用いれば、より小さな濃度に達することができる。
【０１０６】
実施例２
可変的体積で液滴を生成する実験的方法およびそのサイズの決定
可変的サイズの液滴を、様々な方法で作製することができる。１つの方法において、マイクロ流体を用いて、Ｔ字路またはフローフォーカシングデバイスで様々なサイズの敵的を生成することができる。これは専用チップを用い、水性試料が液滴形成によりデジタル化されるようになる前に、２つの構成要素（油相および水性試料）が最初にそのチップに加えられる。この実施例では、より簡単で、よりユーザーに分かり易い方法を用いており、そこで様々なサイズの液滴が無秩序に、即ち試験管または他の適切な容器内での乳化により、生成される。第一の実施形態において、反応混合物を含有する水相を、適当な油−界面活性剤混合物を予め充填した０．２ｍＬ  ＰＣＲ試験管にピペット注入した。本明細書に示された通り、油相は、７３％Ｔｅｇｏｓｏｆｔ（登録商標）、２０％ライトミネラルオイルおよび７％ＡＢＩＬ  ＷＥ  ０９界面活性剤からなり、それらを新たに混合して、使用前の少なくとも３０分間に平衡にした。この混合物で形成されたエマルジョンは、標準のエマルジョンＰＣＲの間に優れた熱安定性を示す傾向がある。水相を油混合物にピペット注入した後、約３０００ｒｐｍで約１０秒間ボルテックス処理することにより、可変的サイズの液滴を形成させた。混合物に小さな撹拌棒を加えることにより、乳化を更に増進して、その間にボルテックス処理により水相のより小さな液滴への分解を促進することができる。油中の界面活性剤の存在が、エマルジョンを安定化させるため、個々の水性液滴が融合しない。別の実施形態において、水相と油の混合物を、小さなステンレス鋼ビーズを含有する小さなコレクションマイクロチューブに添加した。そのチューブを、次に１５〜１７Ｈｚで２０秒間振とうして、エマルジョンを生成させた。エマルジョンは、その後、ＰＣＲ反応を実施するために０．２ｍＬＰＣＲ試験管に移し替えた。
【０１０７】
液滴サイズの分布を測定するために、少量のエマルジョンをシラン処理されたスライドガラス上に広げ、過剰量の油−界面活性剤混合物で被覆した。その後、試料を格子や顕微鏡下に設置し、暗視野照明を底から照射した。このスキームでは、適切な寸法の不透明ディスクを、光源の光路内に置き、標本の前のほとんどの光を遮断した。結果として、粗油名の外輪からのわずかな光が、標本に到達する。標本から散乱されるほんの小さな部分が対物レンズに進入し得るように、不透明ディスクの位置を顕微鏡対象に適合させる。試料のコントラストが、試料から散乱される光により生じるため、得られる像は、図８Ａに示される通り個々の液滴の輪状周辺によって著しく目立つ。暗視野において得られた大きなコントラストにより、液滴が十分にまばらに分散されることを条件として、液滴径を映像内の各円形で容易に決定することができる。
【０１０８】
図８Ｂは、乳化後の５７７の液滴の分布を示す。分布は、メジアン径２０μｍとし非常に対称的である。この乳化は、およそ１０〜４０μｍのより小さな液滴を優先的に発生させ、最小液滴は約６〜８μｍの径を有し、見出された最大液滴径は、およそ７０〜８０μｍであった。液滴径のこの１０という係数は、概ね１０００という力学的体積範囲に変わる。
【０１０９】
図８に実証された通り、液滴の様々なサイズを生成させるのに用いられた任意の現実的プロセスは、均一分布というよりむしろピークを作る可能性が高い。液滴サイズの均一分布から得られた濃度が実験で得られたピープのある分布で妥当であることを検証するために、液滴でのデジタルＰＣＲ実験をシミュレートし、そのサイズ分布を図９に示す。その分布は、正規対数分布であり、８〜６４ミクロンの径のみを含む。これらの分布を、表１のために実施した同じタイプのシミュレーションに用い、結果を表３に列挙している。
【表３】
2019030323.tif 000028
【０１１０】
表３の結果から、あまり大きくないダイナミックレンジの対称分布でも、適度に実質的な濃度範囲にわたり被分析物分子濃度の合理的に精密な（±１０％）推定値が得られることが示唆される。このことは、ほとんど全ての検査室設定において実施され得る乳化のような簡単なプロセスが、４〜５ケタの標的ＤＮＡ濃度を精密に決定するのに十分大きな液滴分布を生じ得ることが示されるため、重要である。小さなリファインメントにより、このダイナミックレンジを更に改善することができる。
【０１１１】
更なる検定として、図１０に示される切り取り正規対数関数（体積範囲  およそ５００）の方法の統計力を推定した。図６および７の場合と同様に、シミュレーションの４つのセットを、８×１０−９〜８×１０−３分子／ｆＬの範囲内の濃度に及び実施した。データから、液滴の実験的分布を用いて実現され得る統計力が、類似の範囲の均一分布した液滴の例で推定されたものと同等であることが示された（図７）。解析のロバスト性能と組み合わせたエマルジョンでの液滴生成における簡単でユーザーが扱い易い手順が、ダイナミックレンジを増加させたデジタルアッセイを実践する新規な方法として本発明を魅力的にするはずである。
【０１１２】
ｄＰＣＲ後の増幅の分析
液滴内の増幅産物の存在を視覚化するために、アンプリコンの存在を特異的に認識する蛍光プローブを、反応混合物に添加する。ほとんどの例で、これは、分子ビーコン、即ち、増幅された標的ＤＮＡにハイブリダイズすると、蛍光が閉鎖立体配座で高度にクエンチされて、強度が上昇されるヘアピン構造、または標的ＤＮＡハイブリダイズして、次の増幅ステップの間にプローブＤＮＡから蛍光レポーターを切断させるＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブ、のいずれかである。
【０１１３】
これらのプローブは、無視できない程度のバックグランド蛍光を有し、増幅の間の蛍光強度の相対的上昇は、反応に添加されたプローブの量に応じ、むしろ小さくなり得る。更に励起強度は、検出プロセスの間に視野により変動し得る。データは通常、蛍光の変化が増幅産物の生成を示す程有意であるかを決定する閾値となるはずであるため、簡単な強度測定は時としてあいまいな結果をもたらす可能性がある。それゆえ本発明者らの実験全てにおいて、少量（１〜２μＭ）の赤色蛍光色素ローダミンを参照色素として反応混合物に添加すると、スペクトルシグネイチャを増幅時に報告する蛍光プローブと十分に分離することができる。その後、２つの強度、つまり参照色素から測定されたものとプローブから測定されたものとの比を構築する。同じ方法で両方の色素に影響を及ぼすため、強度比は、融合もしくは収縮による液滴体積の変動、または励起力の不適切な変動による影響を受けず、比は不変のままである。図１１は、２つのＰＣＲ反応の像、つまり（１）液滴が増幅の間に標的ＤＮＡを全く含有した像、および（２）反応混合物が標的ＤＮＡを含有した像、を示す。参照色素（ＲＯＸ）およびプローブ（ＦＡＭ）の存在を示す蛍光像は、落射蛍光で撮影し、液滴はそこの照明から暗視野で同時に映像化した。挿入図は、液滴の中心を通る線の測定強度を示す。標的ＤＮＡが存在しないものでは（Ａ、Ｂ）、ＦＡＭチャネルの強度は、液滴からの暗視野により著しく目立ち、シグナルにより中心部分がシグナルの増加を全く示さないが、ＲＯＸチャネルでは、暗視野シグナルは参照色素からのガウス形蛍光シグナル上に重ね合わさっている。ＲＯＸチャネルとＦＡＭチャネルとの、中心領域からの強度の比は、大きい（ＲＯＸ：ＦＡＭ＝１２０：２０＝６：１）。反応混合物中にＤＮＡが存在するものでは（Ｃ、Ｄ）、液滴中心におけるシグナル増加がＦＡＭチャネルでも観察され、増幅がその液滴で起こったことが示される。結論として、ＲＯＸとＦＡＭの蛍光の比は、有意に小さく、ＲＯＸ：ＦＡＭ＝６０：３０＝２：１である。
【０１１４】
本発明が実施され得る他の一方法は、異なる希釈で試料溶液を含有する液滴の異なる群を用いる。異なる希釈の試料を含有する液滴は、互いに分離を維持しなければならない。それが実施できたなら、実験の分析の唯一の変更は、ｄｉＶｉ（ここでｄｉは、ｉ番目の液滴の希釈係数である）による式において体積の因子を置き換えることである。例えば式（２）は、
【数６】
2019030323.tif 000029
となり、他の式と類似の変動を伴う。これにより、該方法を拡張して、他の方法で可能であった液滴サイズ分布よりも高濃度で精密に測定することができる。
【０１１５】
実施例３
デジタル等温ＤＮＡ増幅の実施例
この実施例は、ＰＣＲに基づくＤＮＡ増幅に適用されるだけでなく、当該技術分野で一般に知られるあらゆる種類のデジタルアッセイにも適する方法を記載する。該方法の簡便性およびロバスト性により、この実施例は、専用のベンチトップ設備の利用可能性が限定され得るポイント・オブ・ケアおよび資源が限られる設定では特に有用になる。
【０１１６】
再現性のある液滴形成での自動化された試料の自己デジタル化（ｓｅｌｆ−ｄｉｇｉｔｉａｔｉｏｎ）
デジタル化ＬＡＭＰチップを、一連の長方形キャビティとして設計して、液滴を保持し、試料送達に用いられるより小さな長方形チャネルに沿って配置させた（図１２）。チップの配列を設計して、液滴の安定性および付着、充填プロセスの自動化、ならびに高温での操作を改善した。メインチャネルとサイドキャビティーの高さ比を１／３まで低減すると、チャンバー間の相互干渉の機会が減少する。サイドチャンバーの深さは、液滴の付着が改善されることが見出された４００μｍにまで拡大した。空気圧で調整された流れを利用して、自動充填の再現性およびロバスト性を確実にした。より高温での水性液滴の蒸発は、様々な測定により最小化された：ａ）チャンバーを高密度のアレイに配列して、ＰＤＭＳの薄い最上と最下層の間だけに埋め込んだ。ｂ）追加の捨て水チャネルを、アレイの周囲に配置させる。ｃ）粘着フィルムをチップの最上部に蒸気バリアとして添加した。
【０１１７】
水相を加える前に、チップを連続相（０．０２５％ｗ／ｗ  ＳＰＡＮ−８０界面活性剤を含むライトミネラルオイル）でプライミングした。新たなＬＡＭＰ溶液を入口に導入し、サイドチャンバーの内側のナノリットルサイズの液滴に、自己デジタル化した。図１３Ａおよび１３Ｂは、チャンバー充填および液滴形成の間に撮影された映像を示す。水相がメインチャンバーに入り、サイドチャンバーからの油を緩やかに交換した。試料全体がチップに入ったら、尾を引いている油相が、サイドコンパートメントの開口部で液体を挟み切り、ナノリットルの液滴を単離した。
【０１１８】
アレイを横切る液滴サイズの均一性は、図１３Ｃに示す通り加えられた空気圧に依存した。保持された液滴の体積を、実験の節に記載された通り、チップインキュベーションの前に撮影された映像から推定した。この設定では、７〜８ｐｓｉの空気圧は、液滴サイズの最も均一な分布を与え、液滴の大部分は、単一体に近い相対体積分率（ＲＶＦ）により示されるほぼ完ぺきな体積保持を示した。わずかな割合のより小さなサイズが見出され、そのほとんどは、水相による初期サイドチャンバー充填が不完全であった出口近くであった。より高い圧力または低い圧力により、ＲＶＦ分布は広くなり、より多くの液滴がＲＶＦ値を有意に減少させた。
【０１１９】
図１３Ｄは、５０００の液滴の累積ヒストグラムを示す。液滴の９６％を超えるものが、チャンバー容積の少なくとも半分を占め、全ての液滴の５６％で、ＲＶＦが９０％を超えていた。平均では、０．８９±０．１４のＲＶＦ値が見出された。液滴の均一性は、初期液滴体積の差による定量の誤差を低減するため、それが望ましかった。後の節で、液滴サイズの分布がｄＬＡＭＰ分析の結果に有意な影響を及ぼさなかったことを示す。
【０１２０】
図１３Ｅは、７ｐｓｉ空気圧を用いた試料デジタル化の再現性を示す。１５の各チップでは、平均ＲＶＦおよび標準偏差を計算した。平均ＲＶＦは、１０％ウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ）内で変動し、それはチップ性能における十分な再現性を実証している。同じく液滴サイズの標準偏差は、幾らか大きなチップ間変動を有しながらも、全てのチップで同等であった。
【０１２１】
高温での得規定の安定性
充填後に、チップを６５℃で７０分間インキュベートして、等温ＤＮＡ増幅を実施した。より高温では、ナノリットルサイズのコンパートメントは、ＰＤＭＳによる水の蒸発および水の油相への分配を受け易い。これは、試薬濃度、例えばイオン強度の増加をもたらし、反応の阻害を誘発する場合がある。
【０１２２】
高温インキュベーションの間の試料蒸発量が、デジタル容積のほぼ１０％に限定されたことが見出された（図１４Ａ）。チップの周辺に位置するチャンバーは、より嵩のあるＰＤＭＳに暴露され、アレイの中心に位置するチャンバーに比較してわずかに高い収縮が示された（図１４の入口の像）。しかし、全体的影響は小さく、増幅反応に影響を及ぼすことは予測されなかった。周辺での蒸発が依然として懸念だとすれば、各チャンバーが見落とされる可能性があり、最も内側のチャンバーのみが、以下に議論される更なる分析を考慮され得る。
【０１２３】
６５℃でのインキュベーションの間に、等温ＤＮＡ増幅が１つ以上のＤＮＡ鋳型を含むそれらのコンパートメント内に進行すると予測された。ピロリン酸塩が増幅プロセスの間に放出された後、カルセイン蛍光色素が大きく増加することにより、陽性増幅が証明された。鋳型ＤＮＡを全く含まないそれらのコンパートメントは、バックグランド蛍光をわずかに示すはずである。次に、ＤＮＡの希釈試料の増幅により、デジタルシグネイチャを得ることができるかを、検査した（原液の４３０倍希釈）。図１４Ｂは、インキュベーションの前後のチップの区分を通る映像および強度のスキャンを示す。予測通り、一部のチャンバーで、蛍光の有意な増加が示されたが、隣接するチャンバーは依然として暗かった。つまりチャンバー間の相互干渉は、問題とは思われず、ＬＡＭＰ競合チャンバーは、わずかなバックグランドシグナルを示した隣接するチャンバーにより十分に分離された。
【０１２４】
液滴サイズの変動はｄＬＡＭＰ分析に影響を及ぼさない
より小さな液滴は、１つ以上の鋳型分子を含む確率がより低く、陽性事象がより小さな液滴で起こる可能性は低く、つまり分析においてより重視されるべきである。そのような手順がＬＡＭＰ活性コンパートメントの直接の計数により得られた結果と異なるかを検査するために、３つの異なる初期テンプレート濃度（ｃｉ＝ｃ０／１５０（Ａ）、ｃｉ＝ｃ０／４３０  （Ｂ）およびｃｉ＝ｃ０／１３００（Ｃ））の３つの代表的チップについて、これらの２つの分析スキームを比較した。表４にその結果を要約する。最初の例では、ＬＡＭＰ活性チャンバーの係数ｆ０を、最初の液滴サイズにかかわらず陽性液滴の試料係数から推測した。これを、最初の液滴体積に基づいて近似させた「効果的」係数ｆｅｆｆと比較した。ｆｅｆｆは、全ての陽性液滴の相対体積分率の逆数の合計として計算した。言い換えると、ＲＶＦ５０％を有した液滴は、フルサイドチャンバーを占有する液滴の２倍量を寄与した。その後、分析された３つのチップの間のｆ０とｆｅｆｆの比を解析した。本発明者らのシステムでは、両方の分析スキームで、全てのパラメータで類似の結果を与えることが見出された。ｆ０を超えるｆｅｆｆのおよそ１０％の上昇は、初期液滴サイズの１０〜１５％の変動を表す。この比較から、本発明者らの実験において初期液滴サイズの均一性が、直接の計数法を確証するのに十分良好であると結論づけられた。
【表４】
2019030323.tif 000030
【０１２５】
同じく、周辺液滴の優先的収縮が分析に影響を及ぼしたかどうかを確認した。ａ）全ての液滴が分析（ｆ０）で判断される場合、およびｂ）周辺液滴が分析（ｆｅｆｆ）から除外された場合、について、ＬＡＭＰ競合チャンバーの係数を比較した。収縮の増加が局所的溶質濃度を増加させる可能性があり、それが増幅プロセスに影響を及ぼし得るということを回想しなければならない。最も内側の液滴を分析した場合のみ、考慮される３つの濃度全てで、ＬＡＭＰ競合液滴の相対分率は６％未満の変動であった。異なる試料濃度での各比は、互いに１０％以内の一致であった。それゆえｄＬＡＭＰでは、分析においてすべての液滴を判断し、こうして周辺液滴の除外による不必要な試料廃棄を回避した。
【０１２６】
ｄＬＡＭＰで相対および絶対ＤＮＡ濃度を定量する
デジタルＤＮＡ増幅の重要な適用例は、試料中の絶対鋳型濃度の定量である。次に、試料中のＤＮＡ鋳型の系列希釈を用いてｄＬＡＭＰチップの性能を分析した。平均で１未満の鋳型を液滴内に閉じ込めれば、ＬＡＭＰ競合チャンバーの数がＤＮＡ濃度とほぼ直線的に拡大縮小すると予測される。ＤＮＡ対照試料からなる鋳型を、ＬｏｏｐＡｍｐ（登録商標）キットと共に提供した。最初に、ＤＮＡ原液中の鋳型濃度を推定するためのＵＶ吸収分光法を実施した。ＤＮＡの量が過度に少なく、２６０ｎｍで定量可能な吸収を提供することができなかった。それゆえ、インター化レーティング色素を用いて、ＤＮＡ定量を試行した。この実験では、標的鋳型をキチ濃度のλ相ＤＮＡの系列希釈と比較した。全ての試料を、インター化レーティング色素（Ｅｖａｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｂｉｏｔｉｕｍ、  Ｈａｙｗａｒｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）と共に３０分間インキュベートした。各試料の蛍光シグナルを、その後、Ｔｙｐｈｏｏｎ（商標）イメージャで定量した。λ相ＤＮＡの濃度および長さは公知であるため（４８５０２ｂｐ）、鋳型溶液中に存在するｂｐ数の少なくとも１つの精密な推定を得た。未知の試料からの強度は、１μｌあたりλ相１０５未満の溶液からの強度に匹敵した。この濃度領域では低コントラストであるため、その濃度を更に狭くすることはできなかった。プラスミドが全λ相ＤＮＡに匹敵するサイズであると仮定し、こうして１μｌあたり鋳型１０４〜１０５個の濃度を推定する。
【０１２７】
ｄＬＡＰ実験から濃度を決定するために、最初に、原液の１／４〜１／１３００の範囲内の鋳型濃度の系列希釈で、ｄＬＡＭＰを実施した。各実験は、少なくとも三重測定で実施した。図１５は、６５℃での７０分間インキュベートの後、複数のチップの代表的映像を示す。図１６は、ＬＡＭＰ競合チャンバーｆ０の各係数を示す。ｆ０を計算するために、最初に、インキュベーション前の初期チャンバーの数ｎｉを決定した。その後、増幅チャンバーの数ｎａを計数したが、それは、インキュベーション後に撮影された映像から定量された背景の少なくとも３倍の蛍光増加を有したチャンバーであった。その後ｆ０をｆ０＝ｎａ／ｎｉとして計算した。
【０１２８】
分析された３つの最低濃度のＤＮＡ濃度でのＬＡＭＰ競合チャンバーの数の直線変化が、観察された。ｄＬＡＭＰを介して標的ＤＮＡの濃度を推定するために、３つの最低試料濃度への直線化ポアソン適合を算出した。適合により１μｌあたり（０．９９±０．０３）×１０４コピーの濃度を得たが、それはＤＮＡインターカレーション実験からの推定と良好に一致した。この結果から、本発明者らのｄＬＡＭチップが道試料の系列希釈中のＤＮＡ濃度の相対変化を精密に再現できることが確認された。しかし元々のＤＮＡ濃度の決定に不正確さが与えられれば、データは絶対ＤＮＡ濃度をｄＬＡＭＰで決定する能力を、必ずしも実証しなかった。それゆえ、未知濃度の新規標的鋳型を用いた追加のｄＬＡＭＰ実験を実証した。
【０１２９】
対応するＬＡＭＰプライマーのセットを用いたインターカレーターアッセイに用いられる全λ相ＤＮＡ鋳型を選択した。原液中のＤＮＡ濃度をＵＶ分光光度法により４６５μｇ／ｍｌであると測定され、それは１μｌあたり８．９×１０９コピーに対応した。その後、試料を最終ＬＡＭＰ溶液で１μｌあたり２０コピーに希釈した。この濃度および６ナノリットルのサイドチャンバー容積に関して、全てのチャンバーの約１２％に増幅が起こるとの観察が予測された。ｄＬＡＭＰを７０分間実施し、図１６Ｂは、ＬＡＭＰ反応前後の５３５ウェルチップの映像を示す。オンチップの分離された液滴の初期数（４７９）およびインキュベーション後のＬＡＭＰ競合チャンバー数（４７）から、陽性事象の９．８％の相対分率を算出した。３５１のチャンバーアレイにおける第二の実験から、同じ鋳型濃度で１０．７％という同等の分率を得た。ｆａの予測値と測定値の間の小さな差は、おそらくピペッティング誤差に起因し、８倍希釈系列で蓄積した可能性がある。
【０１３０】
それゆえ、本発明者によるｄＬＡＭＰチップが、絶対ＤＮＡ濃度およびＤＮＡ濃度の相対変化を正しく決定することができると結論づけた。ＳＤチップ中のｄＬＡＭＰは、単純な操作と共に、最初試料消費で等温デジタルＤＮＡ定量を実施する簡便なプラットフォームを提供する。
【０１３１】
デジタル形式で有効なオンチップのループを介したＤＮＡ増幅を実証した。最小試料消費で使用が簡単な形式のデジタルＤＮＡ増幅を実施する既存のプラットフォームの限界に駆られて、自己デジタル化概念を精査して、６５℃での等温ＤＮＡ増幅を可能にした。その方法は、簡単でロバストであり：水相がチップ中にピペット注入されたら、簡単なポンプヘッドおよび一定空気圧の利用は、試料の離散化を誘発するのに十分であり、更なるチップ操作、例えば空気圧弁または機械作用を必要としない。ほとんどの（全てでなければ）他の報告されたデジタル化プラットフォームとは異なり、本発明者らのデザインは、完全で損失の少ない試料区画化を提示する。これは、ポイント・オブ・ケア適用例などの試料の利用性が限定される場合に重要となる。
【０１３２】
デジタルＬＡＭＰシグネイチャは、７０分間のインキュベーション期間内に十分な精密さで、絶対ＤＮＡ濃度および相対変化を再現した。高温での試料インキュベーションの間の液滴収縮は最小であり、増幅プロセスに影響を及ぼさなかった。同じくチップ充填の間の液滴サイズの変動の問題にも取り組み、およそ１０〜１５％変動する液滴体積で、十分なサイズ均一性が実証された。液滴体積の差は、潜在的に液滴あたりの平均鋳型数および得られたデジタルシグネイチャに影響を及ぼし得る。本発明者らの自主的チップ充填が、十分に均一な体積の液滴を生成し、それによりデータ解析でＬＡＭＰ競合チャンバーの計数が簡便化され、液滴体積の変動を考慮する必要がない。
【０１３３】
本発明者らの実験プロトコルは、加熱および映像化用の標準的検査機器を用いており、そのためほとんどの診断設定に適合性があり、追加の注文機器を全く必要としない。６５℃という中等度の反応温度ゆえ、チップインキュベーションは高温水浴で実施することもでき、それによりチップ操作が更に簡便化されよう。最後に、カルセイン蛍光色素の増加とは別に、ＬＡＭＰは、潜在的にピロリン酸塩の沈殿から視覚的シグナルを生成することに注目した。検出は、簡単な顕微鏡で実施することができ、最終的に蛍光設備の必要性が排除され、アッセイの複雑さが更に低減される。
【０１３４】
ｄＬＡＭＰでの実験区分
化学物質および試薬
ＬｏｏｐＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡ増幅キットおよびカルセイン蛍光指示薬キットを、ＳＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  （Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，  ＴＸ，  ＵＳＡ）から購入した。陽性対照ＤＮＡおよび対応するプライマーのセットが、キットに含まれていた。ライトミネラルオイル、モノオレイン酸ソルビタン（ＳＰＡＮ−８０）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、プロピレングリコールメチルエーテルアセタート（ＰＧＭＥＡ）およびイソプロピルアルコールを、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，
ＵＳＡ）から得た。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ、Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４キット）を、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｍｉｄｌａｎｄ，  ＭＩ，  ＵＳＡ）から購入した。
【０１３５】
全λ相ＤＮＡでのＬＡＭＰ実験では、以下の６プライマーのセットを用いた（フォワード内部プライマー（ＦＩＰ）:５’−ＣＡＧＣＡＴＣＣＣＴＴＴＣＧＧＣＡＴＡＣＣＡＧ
ＧＴＧＧＣＡＡＧＧＧＴＡＡＴＧＡＧＧ−３’（配列番号１）、バックワード内部プライマー（ＢＩＰ）:５’−ＧＧＡＧＧＴＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＧＧＣＡＧＴＣＧＡＴＧＧ
ＣＧＴＴＣＧＴＡＣＴＣ−３’（配列番号２）、フォワード外部プライマー（Ｆ３）：５’−ＧＡＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＣＧＡＧ−３’（配列番号３）、バックワード外部プライマー（Ｂ３）：５’−ＴＴＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＧＴＣＧ−３’（配列番号４）、ループフォワードプライマー（ＬＦ），５’−ＧＧＣＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＴＡＡＡＧＣＡ−３’（配列番号５）、およびループバックワードプライマー（ＬＢ）：５’−ＧＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＣＴＡ−３’（配列番号６））。全てのプライマーを、ＩＤＴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）から購入した。
【０１３６】
マイクロ流体チップの組立て
デジタルＬＡＭＰ用のマイクロ流体チップを、標準のソフトリソグラフィーを用いてポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）中で複製した。マイクロ流体チャネルのネットワークおよびサイドチャンバーを、ＡｕｔｏＣＡＤ（Ａｕｔｏｄｅｓｋ，  Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）で設計し、Ｍｙｌａｒ  ｐｈｏｔｏｍａｓｋ  （Ｆｉｎｅｌｉｎｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  ＣＯ，  ＵＳＡ）に印刷した。マスクを用いて、２層ＳＵ−８オン・シリコンマスターを組み立てた。各層について、以下のステップを実施した：ＳＵ−８フォトレジスト（ＳＵ−８  ２０５０，  ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ，  Ｎｅｗｔｏｎ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）を、新たに洗浄されたシリコンウェーハ上にスピンコートした。ソフトベークの後、ウェーハおよびフォトマスクを心合わせして、市販のマスクアライナー（Ｎｅｗｐｏｒｔ，  Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＡ，  ＵＳＡ）内でＵＶに暴露した。ＵＶ暴露により、フォトマスクの透明領域の下のＳＵ−８に架橋が誘導された。硬化の後、非暴露ＳＵ−８をＰＧＭＥＡに溶解し、イソプロピルアルコールで洗浄して、１５５℃で１０分間ハードベークした。マスターの陽性対象物の高さを自作の干渉計で測定すると、およそ７５μｍであった。複製の間にＰＤＭＳがウェーハ上に貼り付くのを避けるために、気相成膜により、ウェーハを（トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル）トリクロロシラン（Ｇｅｌｅｓｔ，  Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，  ＰＡ，  ＵＳＡ）でコーティングした。
【０１３７】
チップの複製では、ＰＤＭＳ基板および触媒を、製造業者の推奨どおり１０：１重量比で混合した。混合物を１５〜２０分間脱気して、ＳＵ−８オン・シリコンマスター上にスピンコートし、およそ３００μｍ厚の薄膜を形成させた。７０℃で３時間硬化した後、ＰＤＭＳをウェーハから剥離した。鋭利な１５ゲージパンチで、エラストマーにアクセスホールを穿孔した。酸素プラズマ処理により、硬化されたＰＤＭＳの薄層をコーティングした顕微鏡スライドに、ＰＤＭＳレプリカを結合させた。ＰＤＭＳチップを１１５℃で２日間貯蔵して、表面を疎水性に戻した。
【０１３８】
実験プロトコル
実験の前に、入口および出口の穴に適合する一組の小さなトラフを、ＰＤＭＳ内に複製して、両面テープでチップに付着させた。各トラフは、およそ５０μｌのリザーバを提供した。チップを真空下に２０〜３０分間静置して、嵩高のＰＤＭＳから過剰な空気を除去した。０．０２５％ｗ／ｗ  ＳＰＡＮ−８０を補充したライトミネラルオイル４０μｌを、メインチャネルの入口に入れて、チップに下塗りした。空気圧を加えて、空気をチップから追い出すまで油の流れを保持した。下塗りの後、チップを接着性ＰＣＲシーラントフィルム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）の小片で覆い、インキュベーションの間の水蒸発を低減した。
【０１３９】
ＬＡＭＰ溶液１３μｌを、製造業者のプロトコルに従って新たに調製した。混合物に、反応の間にポリメラーゼを安定化させる１．２ｇ／ｌ  ＢＳＡを、そしてカルセインを基にした蛍光検出キット０．６μｌを補充した。ＬＡＭＰ溶液１．８〜２μｌを入口にピペット注入し、過剰の油で覆われたトラフの底で水性プラグを形成させた。外部空気圧を加えて、前試料がデジタル化されたオンチップになるまで、チャネルネットワークを通して水性プラグを移動させた。デジタル化は、顕微鏡（ＡＺ  １００，  Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｍｅｌｖｉｌｌｅ  ＮＹ，  ＵＳＡ）で視覚的に確認した。出口への陰圧を用いて、捨て水チャネルに脱気水を手操作で充填した。全ての入口を少なくとも２０μｌの油で覆った後、チップをインサイチュのアダプターに取り付けたＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ，  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，  Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，  ＮＹ，  ＵＳＡ）上で６５℃で７０分間インキュベートした。
【０１４０】
チップの映像化および定量
加熱式インキュベーションの前後で、全てのチップを可変モードのイメージャ（Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ９０００，  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，
ＰＡ，  ＵＳA）でスキャンした。チャンバー内部のカルセイン蛍光色素を４７３ｎｍ
で励起し、ロングパスフィルター（５１０ＬＰ）を通して１０μｍピクセル解像度および光電子倍増管に加えられた電圧３５０Ｖで、映像を撮影した。次の映像解析を、ＩｍａｇｅＪ  （ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で実施して、離散化体積の数およびサイズ分布、ならびにＤＮＡ増幅を示したチャンバー数を定量した。更なるデータ解析は、ＩＧＯＲ
Ｐｒｏ  （ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ，  Ｌａｋｅ  Ｏｓｗｅｇｏ，  ＯＲ，  ＵＳＡ）を用いて実施した。最初は、カルセイン蛍光色素を高度にクエンチしたが、残留発光は、チャンバーの初期液滴サイズを決定するＴｙｐｈｏｏｎイメージャで依然としてモニタリングすることができた。初期液滴サイズの分布を、液滴面積とサイドチャンバー面積との比として推定された、保持された体積分率（ＲＶＦ）に関して定量した。液滴中のカルセイン蛍光色素の平均ピクセル強度の１／３と等しい閾値を利用して、バックグランドと識別した。少なくとも０．１５のＲＶＦを有する液滴のみが、更なる分析を考慮された。
【０１４１】
本明細書に提供された通り、連続サイズ分布からの液滴を用いたデジタル液滴アッセイの統計解析を、提示している。最良適合濃度は、個々の液滴体積の決定において、あまり大きくない不偏誤差に対しては適度に非感受性であり、そのためその決定に必要となる精度は、無理な負担にはならないはずである。異なる試料の結果と比較する際の信頼度を推定する簡単な方法を、提示している。それは、より計算集約的信頼度推定値と合理的に一致する信頼度推定値を生成する。シミュレーションから、該方法の統計力を、１．２および１．５倍分解能で、３つの異なる分布の液滴径について計算することができる。所望の分解能、液滴サイズ分布および液滴数を与えれば、これらの方法を用いて濃度範囲を決定することができ、それによりこの方法は利用可能な結果を生じるはずである。
【０１４２】
本発明は、特定の実施形態を強調して記載したが、本発明の範囲または趣旨を逸脱することなく、様々な改良および変更を本発明に施し得ることは、当業者に明白であろう。本明細書に開示された発明の詳細および実践を考慮すれば、本発明の他の実施形態が当業者に明白となろう。本明細書および実施例はレオ個としてのみ考慮され、本発明の新の範囲および主旨は以下の特許請求の範囲により定義されるものとする。
【図１】
2019030323.tif 000031
【図２】
2019030323.tif 000032
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019030323.tif 000040
【図１１】
2019030323.tif 000041
【図１２】
2019030323.tif 000042
【図１３】
2019030323.tif 000043
【図１４】
2019030323.tif 000044
【図１５】
2019030323.tif 000045
【図１６】
2019030323.tif 000046
【図１７】
2019030323.tif 000047
【配列表】
2019030323000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月25日(2018.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デジタル測定を用いて試料中の被分析物分子の濃度を決定する方法であって、
複数の液滴を生成する工程であって、前記複数の液滴のうちの少なくとも１つの液滴が試料からの被分析物分子及び検出可能な薬剤を含有する、工程；
少なくとも２０００個の液滴を含む前記複数の液滴の、少なくとも第一の部分の液滴を測定して、複数の液滴の第一の部分の液滴中の、液滴の個々の体積を決定する工程；
前記複数の液滴の、少なくとも第二の部分の液滴を解析して、複数の液滴の第二の部分の液滴中の、被分析物分子及び検出可能な薬剤を含有する液滴の数を決定する工程であって、前記複数の液滴の第一の部分における液滴の少なくとも一部と前記複数の液滴の第二の部分における液滴の少なくとも一部とが同じ液滴である、工程；
前記複数の液滴の第一の部分の液滴の個々の体積と、前記複数の液滴の第二の部分の被分析物分子及び検出可能な薬剤を含有する液滴の数とを用いて、試料中の被分析物分子の濃度を決定する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記複数の液滴が、不混和流体との組合せによりエマルジョン中に生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
不混和流体が水および油を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
エマルジョンが界面活性剤を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
被分析物分子が、核酸分子、ペプチド、蛋白質、またはそれらの組み合わせである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ポリメラーゼ連鎖反応、ローリングサークル増幅法、核酸配列に基づく増幅法、ループを介した増幅法、等温増幅法、またはそれらの組み合わせを実施することを更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
被分析物分子の濃度が、少なくとも３桁のダイナミックレンジ又は少なくとも６桁のダイナミックレンジにわたって決定される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の液滴の第二の部分が、前記複数の液滴の体積分布よりも狭い体積分布を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
被分析物分子が、検出可能な薬剤と会合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
被分析物分子が、共有結合的相互作用、非共有結合的相互作用、またはそれらの組み合わせを介して検出可能な薬剤と会合している、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の液滴からの少なくとも１つの液滴の体積が測定され、且つ前記少なくとも１つの液滴は前記複数の液滴の第一の部分中にはない、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の液滴からの少なくとも１つの液滴を解析して、被分析物分子及び検出可能な薬剤の有無を判定し、且つ前記少なくとも１つの液滴は前記複数の液滴の第二の部分中にはない、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の液滴の第一の部分中及び前記複数の液滴の第二の部分中の少なくとも２０００個の液滴が同じ液滴である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
デジタル測定を用いて試料中の被分析物分子の濃度を決定するシステムであって、
前記試料からの複数の液滴を含有するサンプルホルダーであって、前記複数の液滴の少なくとも１つの液滴が試料からの被分析物分子及び検出可能な薬剤を含有する、サンプルホルダーと；
検出可能な薬剤のシグナルを検出する検出器と；
その上に保存された実施可能な命令を有する記憶デバイスを含むコンピュータと、
を含み、
該命令がプロセッサにより実施されると、プロセッサに、
少なくとも２０００個の液滴を含む前記複数の液滴の、少なくとも第一の部分の液滴を測定して、複数の液滴の第一の部分の液滴中の、液滴の個々の体積を決定すること；
前記複数の液滴の、少なくとも第二の部分の液滴を解析して、前記検出可能な薬剤のシグナルに基づいて、複数の液滴の第二の部分の液滴中の、被分析物分子及び検出可能な薬剤を含有する液滴の数を決定することであって、ここで前記複数の液滴の第一の部分における液滴の少なくとも一部と前記複数の液滴の第二の部分における液滴の少なくとも一部とが同じ液滴である、こと；
前記複数の液滴の第一の部分の液滴の個々の体積と、前記複数の液滴の第二の部分の被分析物分子及び検出可能な薬剤を含有する液滴の数とを用いて、試料中の被分析物分子の濃度を決定すること、
をさせる、システム。
【請求項１５】
前記複数の液滴が、不混和流体との組合せによりエマルジョン中に生成される、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記複数の液滴の少なくとも１つが、ポリメラーゼ連鎖反応、ローリングサークル増幅法、核酸配列に基づく増幅法、ループを介した増幅法、等温増幅法、またはそれらの組み合わせからの増幅産物からなる、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
被分析物分子の濃度が、少なくとも３桁のダイナミックレンジ又は少なくとも６桁のダイナミックレンジにわたって決定される、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１８】
サンプルホルダーがウェルのアレイである、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１９】
サンプルホルダーがマイクロ流体チップである、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２０】
被分析物分子が、核酸分子、ペプチド、蛋白質、またはそれらの組み合わせである、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２１】
前記複数の液滴の第二の部分が、前記複数の液滴の体積分布よりも狭い体積分布を有する、請求項１４に記載のシステム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
本発明は、特定の実施形態を強調して記載したが、本発明の範囲または趣旨を逸脱することなく、様々な改良および変更を本発明に施し得ることは、当業者に明白であろう。本明細書に開示された発明の詳細および実践を考慮すれば、本発明の他の実施形態が当業者に明白となろう。本明細書および実施例は例示としてのみ考慮され、本発明の真の範囲および主旨は特許請求の範囲により定義されるものとする。
本願の出願当初の特許請求の範囲に係る発明の内容は、以下の通りである。
［１］  デジタル測定を用いて試料の濃度を決定する方法であって、
第一の体積分布を有する第一の複数の液滴であって、前記第一の複数の液滴の少なくとも１つが試料からの内容物を含有する、第一の複数の液滴を生成すること；
第一の体積分布と同一または異なる第二の体積分布を有する第二の複数の液滴を分析して、検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の個々の体積および第二の複数の液滴の数を決定すること；ならびに
検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の個々の体積および第二の複数の液体の数を利用して試料の濃度を決定すること、
を含む、方法。
［２］  第一および第二の体積分布が、連続体積分布である、［１］に記載の方法。
［３］  第二の体積分布が、前記生成ステップの前に定義されていない、［１］に記載の方法。
［４］  第一の複数の液滴が、不混和流体との組合せによりエマルジョン中に生成される、［１］に記載の方法。
［５］  不混和流体が水および油を含む、［４］に記載の方法。
［６］  エマルジョンが界面活性剤を含む、［４］に記載の方法。
［７］  前記複数の液滴の第二の体積分布が、約１００ナノリットル（ｎＬ）〜約１フェムトリットル（ｆＬ）、約１０ｎＬ〜約１０ｆＬ、約１ｎＬ〜約１００ｆＬ、約１００ｎＬ〜約１ピコリットル（ｐＬ）、約１０ｎＬ〜約１０ｐＬ、約１ｎＬ〜約１ｐＬの範囲内の体積を有する、［１］に記載の方法。
［８］  検出可能な薬剤が蛍光性である、［１］に記載の方法。
［９］  検出可能な薬剤が、核酸分子、ペプチド、蛋白質、またはそれらの組み合わせに会合している、［８］に記載の方法。
［１０］  ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ）、ループを介した増幅法（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、またはそれらの組み合わせを実施することを更に含む、［１］に記載の方法。
［１１］  検出可能な薬剤の濃度が、少なくとも３桁のダイナミックレンジを超えて決定される、［１］に記載の方法。
［１２］  検出可能な薬剤の濃度が、少なくとも６桁のダイナミックレンジを超えて決定される、［１］に記載の方法。
［１３］  第一の体積分布の体積が２倍を超えて変動する、［１］に記載の方法。
［１４］  第一の体積分布の体積が１０倍を超えてまたは１００倍を超えて変動する、［１］に記載の方法。
［１５］  デジタル測定を用いて試料の濃度を決定するシステムであって、
第一の体積分布を有する第一の複数の液滴を含有するサンプルホルダーと；  
第一の複数の液滴の少なくとも１つを含有する検出可能な薬剤を検出する検出器と；
その上に保存された実施可能な命令を有する記憶デバイスを含むコンピュータと、を含み、該命令がプロセッサにより実施されると、プロセッサに、
第一の体積分布と同一または異なる第二の体積分布を有する第二の複数の液滴を分析して、検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の個々の体積および第二の複数の液滴の数を決定すること；ならびに
検出可能な薬剤を含有する第二の複数の液滴の個々の体積および第二の複数の液体の数を利用して試料の濃度を決定させる、
システム。
［１６］  第一および第二の体積分布が連続体積分布である、［１５］に記載のシステム。
［１７］  第二の体積分布が前記生成ステップの前に定義されていない、［１５］に記載のシステム。
［１８］  第一の複数の液滴が、不混和流体との組合せによりエマルジョン中に生成される、［１５］に記載のシステム。
［１９］  不混和流体が水および油を含む、［１８］に記載のシステム。
［２０］  検出可能な薬剤が蛍光性である、［１５］に記載のシステム。
［２１］  検出可能な薬剤が、核酸分子、ペプチド、蛋白質、またはそれらの組み合わせに会合している、［２０］に記載のシステム。
［２２］  第一の複数の液滴の少なくとも１つが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ）、ループを介した増幅法、またはそれらの組み合わせからの増幅産物から成る、［１５］に記載のシステム。
［２３］  検出可能な薬剤の濃度が、少なくとも３桁のダイナミックレンジを超えて決定される、［１５］に記載のシステム。
［２４］  検出可能な薬剤の濃度が、少なくとも６桁のダイナミックレンジを超えて決定される、［１５］に記載のシステム。
［２５］  第一の体積分布の体積が、２倍を超えて変動する、［１５］に記載のシステム。
［２６］  第一の体積分布の体積が、１０倍を超えてまたは１００倍を超えて変動する、［１５］に記載のシステム。
［２７］  試料のデジタルでのループを介した増幅法を実施する方法であって、
試料の複数の液滴のうち少なくとも１つの液滴が核酸分子を含む、試料の該複数の液滴を、マイクロ流体デバイス上で生成すること；および
少なくとも１つの液滴中でループを介した増幅を実施して、核酸分子の増幅産物を生成すること、
を含む、方法。
［２８］  増幅産物を検出することを更に含む、［２７］に記載の方法。
［２９］  増幅産物を含む複数の液滴中の液滴の数を決定すること；および
核酸分子を含有する複数の液滴の個々の体積および複数の液滴の数を用いて、試料中の前記核酸分子の濃度を計算すること、
を更に含む、［２８］に記載の方法。
［３０］  マイクロ流体デバイスが、複数の液滴を形成するように構成された複数のチャンバーを含む、［２７］に記載の方法。
【外国語明細書】
2019030323000001.pdf