(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞を用いた評価試験を一つの容器で効率的に行うことができる細胞含有容器を提供する。【解決手段】細胞含有容器１は、少なくとも２つの凹部３を有し、凹部が細胞を含み、細胞の種類が容器２に対して少なくとも２種であり、最も近くで隣接する２つの凹部の中心間の最短距離が、９．０ｍｍ以下である。凹部が液体を含み、凹部に対する液体の総液量が１０．０μＬ以下である態様が好ましく、凹部に含まれる細胞の数の充填精度が、３０％以下である態様がより好ましい。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの凹部を有し、前記凹部が細胞を含み、
前記細胞の種類が容器に対して少なくとも２種であり、
最も近くで隣接する２つの前記凹部の中心間の最短距離が、９．０ｍｍ以下であることを特徴とする細胞含有容器。
【請求項２】
前記凹部が液体を含み、前記凹部に対する前記液体の総液量が１０．０μＬ以下である請求項１に記載の細胞含有容器。
【請求項３】
前記凹部に含まれる前記細胞の数の充填精度が、３０％以下である請求項１から２のいずれかに記載の細胞含有容器。
【請求項４】
前記凹部に含まれる前記細胞の数の充填精度が、１５％以下である請求項１から２のいずれかに記載の細胞含有容器。
【請求項５】
前記細胞が、ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ（ｉＰＳ）細胞、ｉＰＳ細胞由来の分化細胞、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ（ＥＳ）細胞、ＥＳ細胞由来の分化細胞、及び人体から取得した幹細胞の少なくともいずれかである請求項１から４のいずれかに記載の細胞含有容器。
【請求項６】
前記２つの凹部の中心間の最短距離が、４．５ｍｍ以下である請求項１から５のいずれかに記載の細胞含有容器。
【請求項７】
前記２つの凹部の中心間の最短距離が、２．２５ｍｍ以下である請求項１から６のいずれかに記載の細胞含有容器。
【請求項８】
前記凹部が、細胞培養液をさらに含む請求項１から７のいずれかに記載の細胞含有容器。
【請求項９】
前記細胞含有容器を識別する識別手段と、
前記細胞含有容器の情報及び前記凹部に含まれている前記細胞に関する情報の少なくともいずれかを記憶する記憶手段と、をさらに有する請求項１から８のいずれかに記載の細胞含有容器。
【請求項１０】
前記細胞の情報が、細胞の種類、細胞の分化履歴、前記凹部内の細胞数、及び前記凹部内の細胞の生存率の少なくともいずれかである請求項９に記載の細胞含有容器。
【請求項１１】
前記記憶手段が、前記容器とは分離している請求項９から１０のいずれかに記載の細胞含有容器。
【請求項１２】
前記識別手段が、前記容器上に設けられている請求項９から１１のいずれかに記載の細胞含有容器。
【請求項１３】
前記識別手段が、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、Ｒａｄｉｏ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＲＦＩＤ）、文字、記号、図形、及び色の少なくともいずれかである請求項９から１２のいずれかに記載の細胞含有容器。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載の細胞含有容器の製造方法であって、少なくとも２つの凹部への、細胞を含む細胞懸濁液の分注において、インクジェット法で行う工程を含むことを特徴とする細胞含有容器の製造方法。
【請求項１５】
前記インクジェット法におけるインクジェットヘッドが、
前記細胞懸濁液を保持する液体保持部と、前記細胞懸濁液に振動を付与して液滴を吐出する膜状部材と、前記液体保持部を大気に開放する大気開放部とを少なくとも有する請求項１４に記載の細胞含有容器の製造方法。
【請求項１６】
前記インクジェットヘッドを少なくとも２つ有し、同時又は交互に使用する請求項１４に記載の細胞含有容器の製造方法。
【請求項１７】
前記細胞懸濁液を分注した少なくとも一の凹部内の細胞数を計測する工程を更に含む請求項１４から１７のいずれかに記載の細胞含有容器の製造方法。
【請求項１８】
計測した前記細胞数と、所定の細胞数との差分を算出する工程と、
算出した前記差分の細胞数を前記一の凹部内へインクジェット方式で分注する工程と、をさらに含む請求項１７に記載の細胞含有容器の製造方法。
【請求項１９】
前記細胞懸濁液の細胞の濃度を調整する工程をさらに含む請求項１４から１８のいずれかに記載の細胞含有容器の製造方法。
【請求項２０】
前記少なくとも２つの凹部への、前記細胞を含む前記細胞懸濁液の分注において、ディスペンサによる分注を行った後に、インクジェット法による分注を行うことを含む請求項１４から１９のいずれかに記載の細胞含有容器の製造方法。
【請求項２１】
細胞が収容された少なくとも２つの凹部を有する細胞チップであって、
前記凹部は第一の細胞種を含む第１の凹部と第二の細胞種を含む第２の凹部とを少なくとも有し、
前記凹部間の最小中心間距離が５．０ｍｍ以下であることを特徴とする細胞チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞含有容器及び細胞含有容器の製造方法、並びに、細胞チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞を用いた毒性又は薬効評価試験を行う器具の需要が高まっている。
【０００３】
その理由の１つとして、動物実験の３Ｒｓ（「代替（Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」、「削除（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、及び「改善（Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）」）の促進により実験動物数の削除、さらに実験動物を用いる方法の代替法が求められていることなどが挙げられる。
【０００４】
また、上記の実験動物の３Ｒｓの促進以外の理由には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生細胞を用いた実験は、実験動物にかかる経費の削減や試験時間の短縮など多くの利点を有していることなどが挙げられる。
【０００５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生細胞を用いた実験を行うために、例えば、細胞同士の相互作用を生体外で再現するために、細胞を収容するためのマイクロウェルを均一に配置した細胞培養容器が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
また、プレートにおけるウェルにおいて、必要な液量を確保しつつ、粒状物をウェル毎に１つだけ収容するために粒状物を収容するウェルの形状を被収容物の大きさに併せて設計したプレート状容器が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、細胞を用いた評価試験を一つの容器で効率的に行うことができる細胞含有容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための手段としての本発明の細胞含有容器は、少なくとも２つの凹部を有し、前記凹部が細胞を含み、前記細胞の種類が容器に対して少なくとも２種であり、最も近くで隣接する２つの前記凹部の中心間の最短距離が、９．０ｍｍ以下であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、細胞を用いた評価試験を一つの容器で効率的に行うことができる細胞含有容器を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、細胞数の平均値ｘと変動係数ＣＶとの関係を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の細胞含有容器の一例を示す斜視図である。
【図３】図３は、本発明の検査デバイスの他の一例を示す斜視図である。
【図４】図４は、図３の側面図である。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明の細胞含有容器の製造方法の一例を示すフローチャートである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本発明の細胞含有容器の製造方法の他の一例を示すフローチャートである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、本発明の細胞含有容器の製造方法の他の一例を示すフローチャートである。
【図６Ａ】図６Ａは、電磁バルブ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、図６Ｂにおけるピエゾ方式の吐出ヘッドの変形例の模式図である。
【図７Ａ】図７Ａは、圧電素子に印加する電圧の一例を示す模式図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、圧電素子に印加する電圧の他の一例を示す模式図である。
【図８Ａ】図８Ａは、液滴の状態の一例を示す模式図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、液滴の状態の一例を示す模式図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、液滴の状態の一例を示す模式図である。
【図９】図９は、凹部内に順次液滴を着弾させるための分注装置の一例を示す概略図である。
【図１０】図１０は、液滴形成装置の一例を示す模式図である。
【図１１】図１１は、図１０の液滴形成装置の制御手段のハードウェアブロックを例示する図である。
【図１２】図１２は、図１１の液滴形成装置の制御手段の機能ブロックを例示する図である。
【図１３】図１３は、液滴形成装置の動作の一例を示すフローチャートである。
【図１４】図１４は、液滴形成装置の変形例を示す模式図である。
【図１５】図１５は、液滴形成装置の他の変形例を示す模式図である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、飛翔する液滴に２個の蛍光粒子が含まれる場合を例示する図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、飛翔する液滴に２個の蛍光粒子が含まれる場合を例示する図である。
【図１７】図１７は、粒子同士の重なりが生じない場合の輝度値Ｌｉと、実測される輝度値Ｌｅとの関係を例示する図である。
【図１８】図１８は、液滴形成装置の他の変形例を示す模式図である。
【図１９】図１９は、液滴形成装置の他の一例を示す模式図である。
【図２０】図２０は、マイクロ流路中を通過してきた細胞をカウントする方法の一例を示す模式図である。
【図２１】図２１は、吐出ヘッドのノズル部近傍の画像を取得する方法の一例を示す模式図である。
【図２２】図２２は、確率Ｐ（＞２）と平均細胞数の関係を表すグラフである。
【図２３】図２３は、実施例１における細胞生存率を示すグラフである。
【図２４】図２４は、実施例１における細胞膜損傷率を示すグラフである。
【図２５】図２５は、実施例１における炎症物質の分泌量を示すグラフである。
【図２６Ａ】図２６Ａは、ディスペンサによる分注の一例を示す図である。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、ディスペンサによる分注の一例を示す図である。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、ディスペンサによる分注の一例を示す図である。
【図２６Ｄ】図２６Ｄは、ディスペンサによる分注の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（細胞含有容器）
本発明の細胞含有容器は、少なくとも２つの凹部を有し、前記凹部が細胞を含み、前記細胞の種類が容器に対して少なくとも２種であり、最も近くで隣接する２つの前記凹部の中心間の最短距離が、９．０ｍｍ以下であり、更に必要に応じてその他の部材を有する。
【００１１】
本発明者らは、細胞を用いた評価試験を一つの容器で効率的に行うことができる細胞含有容器について検討したところ、以下の知見を得た。
例えば、従来の細胞培養容器及びプレート状容器では、使用者が試験を行う際に容器に細胞を充填する必要があり、その際に所定のウェルに所望の数及び種類の細胞を充填することが難しいという問題がある。
本発明者らは、少なくとも２つの凹部を有する容器に対して、細胞の種類を少なくとも２種有し、最も近くで隣接する２つの凹部の中心間の最短距離が９．０ｍｍ以下である容器、即ち、面積当たりの収容細胞数及び種類が多い容器とすることにより、細胞を用いた評価試験を一つの容器で効率的に行うことができることを見出した。
【００１２】
＜凹部＞
凹部は、容器に設けられた区画であり、後述する細胞を含み、その他の部材を配するための部位である。
凹部の数としては、少なくとも２つであり、５以上が好ましく、５０以上がより好ましい。
【００１３】
本発明の細胞含有容器においては、最も近くで隣接する２つの凹部の中心間の最短距離が、９．０ｍｍ以下であり、５．０ｍｍ以下が好ましく、４．５ｍｍ以下がより好ましく、２．２５ｍｍ以下が更に好ましい。なお、本明細書においては、最も近くで隣接する２つの凹部の中心間の最短距離を、最短凹部間ピッチ、又は最短ピッチと称することがある。
ここで、最も近くで隣接するとは、一の凹部に対して隣接する他の凹部との中心間の距離を比較したときに、一の凹部との中心間の距離が最も短いときを意味する。また、ここでの中心とは、凹部の開口部の形状の重心を意味する。
また、最短距離とは、２点間を結ぶ線のうち最も短いもの、即ち、２点を結ぶ線分の長さを意味する。
【００１４】
凹部の数が少なくとも２つであり、最も近くで隣接する２つの凹部の中心間の最短距離が、５．０ｍｍ以下であるものとしては、例えば、マルチウェルプレート、マイクロウェルスライド（以下、チップと称することもある）などが挙げられる。
マルチウェルプレートとしては、例えば、９６ウェル、３８４ウェル、又は１,５３６ウェルのウェルプレートが挙げられる。
マイクロウェルスライドとしては、例えば、１９２ウェル、７６８ウェル、又は３，４５６ウェルのマイクロウェルスライドが挙げられる。マイクロウェルスライドとしては、光透過率が高く、自家蛍光が少ない基材にジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）に孔を設けたシートを貼り付けて製造することもできる。
凹部の数としては、少なくとも２つであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１９２個以上３，４５６個以下が好ましい。凹部の数が、１９２個以上３，４５６個以下であると、一つの細胞含有容器を用いて扱うことができるサンプルの数を増加させることができるため、細胞を用いた評価試験を一つの容器で効率的に行うことができる。
【００１５】
凹部は、その形状、容積、材質、色などについては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
凹部は、後述する細胞を配することができればその形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平底、丸底、Ｕ底、Ｖ底等の凹部、基板上の区画などが挙げられる。また、検査装置の仕様により使用する凹部の形状は異なっており、ＰＣＲでは丸底、顕微鏡等の光学観察による検査では平底が一般的である。
凹部の容積としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、一般的な評価方法に用いられる試薬の使用量を考慮すると、０．１μＬ以上１,０００μＬ以下が好ましく、更に希少な試薬での評価においては液量を微小にすることが望ましいので、０．１μＬ以上１０μＬ以下がより好ましい。
凹部の色としては、例えば、透明、半透明、着色、完全遮光などが挙げられる。また、光学系の検査の場合、隣接した凹部同士の干渉が起きるのは好ましくないので、底面部は透明で、側面部に着色をした容器がより好ましい。
【００１６】
凹部の材質としては、後述する細胞との親和性が低い、即ち、細胞非接着性を有していれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞非接着性材料などが挙げられる。細胞非接着性材料としては、例えば、下記に記載の有機材料や無機材料などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞接着性材料を吸着しやすいものが好ましい。容器の材質が細胞接着性材料を吸着しやすいと、凹部の底面である容器に細胞接着性材料を吐出させた場合には、細胞接着性材料を安定した状態で付着させることができる。
【００１７】
−細胞非接着性材料−
細胞非接着性とは、少なくとも、使用する細胞接着性材料よりも目的の細胞に対し、接着性が低いことを意味する。
細胞非接着性の計測方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、容器上に培養された細胞に対して、針状のＡＦＭ探針を挿入し引き上げて、細胞を容器より剥離することにより、探針にかかる負荷をＡＦＭで測定し、容器に対する細胞の接着性を測定・評価する方法などが挙げられる。他の方法としては、例えば、簡易的には容器上で培養した細胞に対し、純水等を流して、その前後での細胞の容器上への接着剥離率で評価する方法などが挙げられる。
【００１８】
細胞非接着性材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、撥水性材料が好ましい。細胞非接着性材料が撥水性材料であると、細胞がより接着しにくくなる点で有利である。
また、細胞非接着性材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ケイ素含有材料が好ましい。
ケイ素含有材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、生体適合性の点からポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が好ましい。
【００１９】
有機材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、ウレタンアクリレート等のアクリル系材料、セルロース、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのシリコーン系材料などが挙げられる。
無機材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス、セラミックスなどが挙げられる。
【００２０】
−細胞接着性材料−
凹部の底面に容器よりも細胞接着性の高い細胞接着性材料をさらに有する。
細胞接着性材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞外基質から選ばれる蛋白質などが挙げられる。
細胞外基質から選ばれる蛋白質としては、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、ビトロネクチン、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列含有ペプチド、ＹＩＧＳＲ（チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）配列含有ペプチド、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチンなどが挙げられる。加えて、細胞外基質から選ばれる蛋白質としては、例えば、上記蛋白質の混合物、マトリゲル、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ、フィブリンなどが挙げられる。これらの中でも、コラーゲン、または幹細胞培養等で利用されているラミニンの一部構造を模倣したｉＭａｔｒｉｘ５１１(株式会社ニッピ製)が好ましい。さらに、細胞外基質から選ばれる蛋白質としては、例えば、ポリリジン等の塩基性高分子、アミノプロピルトリエトキシシラン等の塩基性化合物なども挙げられる。
細胞接着性材料を凹部に設ける方法には、細胞接着性材料を含有する溶液を凹部に付与する方法が挙げられる。この場合、溶液には生体親和性粒子が含有されていてもよい。
【００２１】
生体親和性粒子としては、細胞等の生体と親和性を有すれば特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、ゼラチン粒子、コラーゲン粒子などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
生体親和性粒子がゼラチン粒子である場合、ゼラチン粒子の原料であるゼラチンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、商品名：ＡＰＨ−２５０（新田ゼラチン株式会社製）などが挙げられる。
粒子状であるゼラチン粒子は、容器への細胞の接着性を向上することができ、非粒子状であるゼラチンと比較すると、長期間、細胞に分解されることなく所望の位置に配置することができる。そのため、ゼラチン粒子には、細胞の接着性を向上させ、さらに、長期にわたって、細胞の栄養源として利用されるという利点がある。
【００２２】
また、生体親和性粒子としては、その構造中において架橋剤により架橋されていることが好ましい。
【００２３】
架橋剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド等のアルデヒド；エチレンプロピレンジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジルエーテル；ヘキサメチレンジイソシアネート、α−トリジンイソシアネート、トリレンジイソシアネート、ナフチレン−１，５−ジイソシアネート、４，４−ジフェニルメタンジイソシアネート、トリフェニルメタン−４，４，４−トリイソシアネート等のイソシアネート；グルコン酸カルシウム、（１Ｓ，２Ｒ，６Ｓ）−２−ヒドロキシ−９−（ヒドロキシメチル）−３−オキサビシクロ［４．３．０］ノナ−４，８−ジエン−５−カルボン酸メチル（ゲニピン）、ポリフェノールと西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酸化剤との組合せ、スクシンイミド基を有する化合物などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、アルデヒドが好ましく、グルタルアルデヒドがより好ましい。
【００２４】
架橋剤の含有量としては、生体親和性粒子の原料全量に対して、１質量％以上２０質量％以下が好ましく、２質量％以上１０質量％以下がより好ましい。
生体親和性粒子の含有量としては、細胞接着性材料を含有する溶液全量に対して、０．５質量％以上１０質量％以下が好ましく、１質量％以上５質量％以下がより好ましい。
【００２５】
−細胞接着性材料を含有するサンプル液の調製例−
純水製造装置（商品名：ＧＳＨ−２０００、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて得られた純水に、生体親和性粒子を濃度０．５質量％で分散させる。測定用の液量は５ｍＬ、分散はスターラーを用いて２０ｍｍ回転子を２００ｒｐｍ、約一日撹拌することでサンプル液を調製することができる。
【００２６】
−測定条件−
・溶媒：水（屈折率：１．３３１４、２５℃における粘度：０．８８４ｍＰａ・ｓ（ｃＰ）、ＮＤフィルターにより最適光量調整は適宜設定）
・測定プローブ：濃厚用プローブ
・測定ルーチン：測定：２５℃で１８０秒間→測定：２５℃で６００秒間（本体側を３５℃に変更すると次第に液温が２５℃から３５℃になる。その間の粒子径変化をモニタ）→測定：３５℃で１８０秒間
【００２７】
凹部は、さらに液体を含むことが好ましい。
【００２８】
−液体−
液体としては、後述する本発明の細胞含有容器の製造に用いる際に、細胞を分散させる分散媒として使用可能なものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リン酸緩衝生理食塩水などが挙げられる。
さらに、液体とは別に、細胞培養用の培地（細胞培養液と称することもある）、湿潤剤、分散剤、ｐＨ調整剤などを添加してもよい。
【００２９】
液体の体積としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞含有容器を構成する凹部に対する液体の総液量が１０．０μＬ以下であることが好ましい。細胞含有容器を構成する凹部に対する液体の総液量が１０．０μＬ以下であると、一回の試験に使用する試薬（細胞及び薬剤など）の量を少なくすることができる。
【００３０】
液体の体積の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液体の付与前後におけるマイクロ天秤による重量測定、液体付与後の液面の超音波走査による液面検知（例えば、装置名：ＬＡＢＣＹＴＥ（登録商標）、キコーテック株式会社製）などが挙げられる。
【００３１】
−細胞−
細胞は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３２】
本発明の細胞含有容器においては、細胞含有容器を構成する容器に対する細胞の種類が少なくとも２種である。換言すると、細胞含有容器に配される細胞の種類は、容器、即ち、細胞含有容器に含まれる細胞の種類が少なくとも２種であることを意味する。
例えば、２種類の細胞（細胞Ａ及び細胞Ｂ）を凹部が９６箇所ある容器に配する場合、４８箇所を細胞Ａ、残りの４８箇所を細胞Ｂのように配してもよし、細胞Ａ及び細胞Ｂを９６箇所の全ての凹部に配してもよい。このように細胞を容器の凹部にどのように配するかは適宜選択することができる。
ここで、細胞の種類としては、例えば、神経細胞と筋細胞のような異なる種類の細胞を意味するだけでなく、例えば、一のマウスＡから得られた神経細胞ａと他のマウスＢから得られた神経細胞ｂのように、細胞としては同じ種類であるが異なる由来から得られた細胞についても、異なる細胞の種類とみなす。また、多能性幹細胞を用い分化させた細胞を利用する場合においても、多能性幹細胞を取得したドナーが異なる場合には、異なる細胞の種類とみなす。
【００３３】
細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、すべての細胞について使用することができる。なお、細胞としては、生細胞が好ましい。
【００３４】
真核細胞としては、特に制限はなく、目的応じて適宜選択することができ、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌、藻類、原生動物などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞、真菌が好ましい。
【００３５】
接着性細胞としては、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、組織や器官から直接採取した初代細胞を何代か継代させたものでもよく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化した細胞、未分化の細胞などが挙げられる。
【００３６】
分化した細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞；星細胞；クッパー細胞；血管内皮細胞；類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞；骨芽細胞；砕骨細胞；歯根膜由来細胞；表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞；消化管上皮細胞；子宮頸部上皮細胞；角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞；ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞；腎細胞；膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞；骨細胞、ｉＰＳ細胞由来の分化細胞、ＥＳ細胞由来の分化細胞などが挙げられる。
【００３７】
未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞、ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ（ｉＰＳ）細胞、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ（ＥＳ）細胞、人体から取得した幹細胞などが挙げられる。
【００３８】
真菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カビ、酵母菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞周期を調節することができ、１倍体を使用することができる点から、酵母菌が好ましい。
細胞周期とは、細胞が増えるとき、細胞分裂が生じ、細胞分裂で生じた細胞（娘細胞）が再び細胞分裂を行う細胞（母細胞）となって新しい娘細胞を生み出す過程を意味する。
【００３９】
酵母菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、Ｇ０／Ｇ１期に同調して同調培養され、Ｇ１期で固定されているものが好ましい。
また、酵母菌としては、例えば、細胞周期をＧ１期に制御するフェロモン（性ホルモン）の感受性が増加したＢａｒ−１欠損酵母が好ましい。酵母菌がＢａｒ−１欠損酵母であると、細胞周期が制御できていない酵母菌の存在比率を低くすることができ、配置する細胞数を制御しやすくできる。
【００４０】
原核細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真正細菌、古細菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４１】
細胞としては、光を受光したときに発光可能な細胞であってもよい。光を受光したときに発光可能な細胞であると、細胞の数を高精度に制御して凹部内に着弾させることができる。
受光とは、光を受けることを意味する。
光学センサとは、人間の目で見ることができる可視光線と、それより波長の長い近赤外線や短波長赤外線、熱赤外線領域までの光のいずれかの光をレンズで集め、対象物である細胞の形状などを画像データとして取得する受動型センサを意味する。
【００４２】
−−光を受光したときに発光可能な細胞−−
光を受光したときに発光可能な細胞としては、光を受光したときに発光可能であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、蛍光色素によって染色された細胞、蛍光タンパク質を発現した細胞、蛍光標識抗体により標識された細胞などが挙げられる。
細胞における蛍光色素による染色部位、蛍光タンパク質の発現部位、又は蛍光標識抗体による標識部位としては、特に制限はなく、細胞全体、細胞核、細胞膜などが挙げられる。
【００４３】
−−−蛍光色素−−−
蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類が好ましく、エオシン、エバンスブルー、トリパンブルー、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミン１２３がより好ましい。
【００４４】
蛍光色素としては、市販品を用いることができ、市販品としては、例えば、商品名：ＥｏｓｉｎＹ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：エバンスブルー（和光純薬工業株式会社製）、商品名：トリパンブルー（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミン６Ｇ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミンＢ（和光純薬工業株式会社製）、商品名：ローダミン１２３（和光純薬工業株式会社製）などが挙げられる。
【００４５】
−−−蛍光タンパク質−−−
蛍光タンパク質としては、例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ、ＣＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＰＳ−ＣＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｋａｅｄｅ、ＥｏｓＦＰ、ＫｉｋｕｍｅＧＲなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００４６】
−−蛍光標識抗体−−
蛍光標識抗体としては、蛍光標識されていれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００４７】
細胞の体積平均粒径としては、遊離状態において、３０μｍ以下が好ましく、１５μｍ以下がより好ましく、１０μｍ以下が特に好ましい。体積平均粒径が、３０μｍ以下であれば、インクジェット方式やセルソーターなどの液滴吐出手段に好適に用いることができる。
【００４８】
細胞の体積平均粒径としては、例えば、下記の測定方法で測定することができる。
作製した染色済み酵母分散液から１０μＬ取り出してＰＭＭＡ製プラスチックスライドに載せ、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いることにより体積平均粒径を測定することができる。なお、細胞数も同様の測定方法により求めることができる。
【００４９】
ここで、各凹部に含まれる細胞の数は、細胞を凹部に充填する際に生じるばらつき、即ち、充填精度を有している。
【００５０】
［充填精度］
本発明において、充填精度とは、細胞を凹部に充填する際に生じる各凹部に充填される細胞数のばらつきの相対値（百分率、％）を意味する。即ち、充填精度とは、凹部に充填した細胞の数の変動係数を百分率（％）で表した値を意味する。変動係数とは、標準偏差σを平均値ｘで除した値であり、下記式１の関係式になる。
【００５１】
【数１】
2019216708.tif 000003
【００５２】
変動係数は、集団の規模を考慮したばらつきの大きさを相対的に表すことができるため、平均値が異なる２つの集団のばらつきを比較することができる。
【００５３】
式１より、平均値ｘごとの変動係数（ＣＶ値）を求めると、表１及び図１に示すとおりである。なお、図１に示すグラフに基づき、平均値ｘから変動係数（吐出細胞数精度：凹部内に配された、インクジェットヘッドから吐出された液滴内に含まれた細胞数の合計）を求めることができる。
【００５４】
【表１】
2019216708.tif 000004
【００５５】
細胞吐出精度（変動係数）の算出方法としては、例えば、細胞含有容器の各凹部に含まれる細胞の数を計数し、平均値ｘ及び標準偏差ｓを算出し、得られた標準偏差ｓを平均値ｘで除することにより算出する方法などが挙げられる。
また、細胞吐出精度（変動係数）の算出方法としては、測定に用いる機器、操作などに起因する測定結果のばらつきを表す「不確かさ」に基づき推定することもできる。
【００５６】
「不確かさ」とは、「測定の結果に付随した、合理的に測定量に結びつけられ得る値のばらつきを特徴づけるパラメータ」とＩＳＯ／ＩＥＣ  Ｇｕｉｄｅ９９：２００７［国際計量計測用語−基本及び一般概念並びに関連用語（ＶＩＭ）］に定義されている。
ここで、「合理的に測定量に結びつけられ得る値」とは、測定量の真の値の候補を意味する。即ち、不確かさとは、測定対象の製造に係る操作、機器などに起因する測定結果のばらつきの情報を意味する。不確かさが大きいほど、測定結果として予想されるばらつきが大きくなる。
不確かさとしては、例えば、製造に係る操作及び機器におけるばらつきを算出するための測定を行った結果から得られる標準偏差であってもよく、真の値が所定の確率以上で含まれている値の幅として表す信頼水準の半分の値としてもよい。
不確かさを算出する方法としては、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ  ｉｎ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ（ＧＵＭ：ＩＳＯ／ＩＥＣ  Ｇｕｉｄｅ９８−３）、及びＪａｐａｎ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  Ｂｏａｒｄ  Ｎｏｔｅ  １０  試験における測定の不確かさに関するガイドラインなどに基づき算出することができる。
不確かさを算出する方法としては、例えば、測定値などの統計を用いたタイプＡ評価法と、校正証明書、製造者の仕様書、公表されている情報などから得られる不確かさの情報を用いたタイプＢ評価法の２つの方法を適用することができる。
不確かさは、操作及び測定などの要因から得られる不確かさを全て標準不確かさに変換することにより、同じ信頼水準で表現することができる。標準不確かさとは、測定値から得られた平均値のばらつきを示す。
【００５７】
不確かさを算出する方法の一例としては、例えば、不確かさを引き起こす要因を抽出し、それぞれの要因の不確かさ（標準偏差）を算出する。さらに、算出したそれぞれの要因の不確かさを平方和法により合成し、合成標準不確かさを算出する。合成標準不確かさの算出において、平方和法を用いるため、不確かさを引き起こす要因の中で不確かさが十分に小さい要因については無視することができる。不確かさは合成標準不確かさを期待値で除した変動係数（ＣＶ値）を用いてもよい。
【００５８】
不確かさを引き起こす要因としては、例えば、細胞を含有する細胞懸濁液中の細胞数を計数及び分注して作成する場合、各凹部内の細胞数の不確かさの要因としては、細胞を凹部に配置する手段によるもの、配置された細胞が凹部の適切な位置に配置された頻度などが挙げられる。
細胞を凹部に配置する手段によるものとしては、例えば、後述するインクジェット方式の場合には、細胞懸濁液をインクジェット方式により吐出し液滴を形成する際の液滴中に含まれる細胞数、細胞懸濁液の分散性などが挙げられる。
【００５９】
一定の吐出精度によって凹部に配された細胞は、凹部の底部に接着し、さらに細胞同士が相互作用をおこしながら、形態を変化させていく。通常、検査工程にかかるまでに一定の時間、体内に近い環境にて静置することで、細胞本来の機能が発現することが知られており、24時間か、更に長い期間の培養工程が必要になる。特に、分化途中の多能性幹細胞を吐出した場合は、分化が完了したのちに検査工程に入るのが望ましく、３日から1か月程度の培養期間を要することがある。
つまり、検査工程時に凹部に存在する細胞の数のばらつきである充填精度は、各細胞の接着機能のばらつき、細胞間の距離のばらつき、基材との相互作用のばらつき、培養中の環境要因によるばらつき、等の影響を受けることで、吐出精度より大きな値を取ることは明らかである。
【００６０】
本発明の細胞含有容器の凹部に含まれる細胞の数の充填精度としては、３０％以下が好ましく、１５％以下がより好ましい。充填精度が３０％以下であると、細胞含有容器に含まれる細胞数が結果に与える影響下少ない試験から、細胞含有容器に含まれる細胞数が厳密であることが要求される試験にまで幅広い試験に適用することができる。
【００６１】
＜その他の部材＞
その他の部材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、識別手段、記憶手段、複数の凹部を覆蓋する蓋部材、被覆シートなどが挙げられる。
【００６２】
＜＜識別手段＞＞
識別手段は、本発明の細胞含有容器に設けられ、細胞含有容器を識別するための手段である。
識別手段としては、識別部及び識別表示の少なくともいずれかであることが好ましい。
識別部としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メモリ、ＩＣチップ、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、Ｒａｄｉｏ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＲＦＩＤ）、色分け、印刷などが挙げられる。これらの中でも、細胞含有容器を大量生産する場合には、無線通信で対応付けが行えるＲＦＩＤが好ましい。また、細胞含有容器を分析装置に挿入した場合にも、無線通信で対応付けが行える点から、ＲＦＩＤが好ましい。
【００６３】
識別表示としては、文字、記号、図形、及び色の少なくともいずれかであることが好ましい。これらの中でも、数字が特に好ましい。識別表示は、識別部に比べて、作成コストが低く、識別部の情報を読取る読み取り装置が必要なく、目視で識別することができる点が好ましい。
【００６４】
識別手段を設ける位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、容器上の凹部の内側以外の部分及び凹部の外周縁部以外の部分に設けられていることが好ましい。
識別手段の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６５】
識別部に識別情報を書き込む方法としては、例えば、手入力、書き込み装置による方法などが挙げられる。
識別表示を容器に書き込む方法としては、例えば、識別表示を容器に直接印字する方法、識別表示を印字したシールを容器に貼り付ける方法などが挙げられる。
【００６６】
識別部の識別情報の読み取りは、容器を分析装置に装着した際に、分析装置に内蔵している読み取り機構により行うことができる。また、分析装置の外部にある読み取り装置を用いることもできる。
識別表示の読み取りは、目視、容器を分析装置に装着した際に、装置に内蔵している読み取り機構により行うことができる。また、分析装置の外部にある読み取り装置を用いることもできる。
【００６７】
＜＜記憶手段＞＞
記憶手段は、本発明の細胞含有容器の測定領域以外の部位に、細胞含有容器の情報及び凹部に含まれている細胞に関する情報を記憶する手段である。なお、容器の測定領域とは、測定対象物を保持可能な凹部（ウェル）部分（複数の凹部を容器が有する場合はそれら凹部間も含む）である。
【００６８】
細胞含有容器の情報とは、細胞含有容器を構成する部材に関する情報を意味し、例えば、容器の種類、凹部に付与された液体の種類、細胞接着性材料の種類、測定日時、測定者などが挙げられる。
【００６９】
凹部に含まれている細胞に関する情報としては、例えば、細胞の種類、細胞の分化履歴、細胞の由来、製造会社、製造ロット番号、分析結果（活性値、発光強度等）、凹部に細胞を充填する際に生じる液滴中の細胞数の計数結果、凹部内の細胞数（計数された既知数）、凹部内の細胞の生存率、複数の凹部のうち細胞が含まれている凹部の位置の情報、細胞含有容器における細胞の充填精度、細胞の数（既知数）の確からしさ（または不確かさ）の情報などが挙げられる。
凹部に細胞を充填する際に生じる液滴中の細胞数の計数結果、及び細胞の数（計数された既知数）については、例えば、配置された直後に凹部の底部から観察したり、後述する液滴吐出計数装置により測定することができる。
【００７０】
記憶手段としては、例えば、メモリ、ハードディスクドライブ、ソリッドステートドライブ、ＩＣチップなどが挙げられる。これらは、サーバに備えられたものであってもよく、パーソナルコンピュータに備えられたものでもよい。
【００７１】
容器の測定領域以外の部位としては、測定する領域以外の部位であれば、容器の内部であっても容器の外部であってもよい。
記憶手段は、容器から着脱可能に設けられていることが好ましい。記憶手段の着脱方法としては、容器と記憶手段の境界部にミシン目を設けておくことにより、必要に応じてミシン目に沿って記憶手段を切り離すことができる。これにより、容器を分析装置に挿入する際には、記憶手段を容器から切り離して、切り離した記憶手段を読み取り装置に入れて、両者を対応付けすることができる。
記憶手段は、結合部材により容器に取り付けられていることが好ましい。これにより、記憶手段の紛失を防止することができる。結合部材としては、例えば、紐、磁石などが挙げられる。
【００７２】
記憶手段に、細胞含有容器の情報及び凹部に収容されている細胞に関する情報を書き込む方法としては、手入力、細胞の個数を計数する液滴吐出計数装置から直接データを書き込む方法、サーバに保存されているデータの転送、クラウドに保存されているデータの転送などが挙げられる。これらの中でも、液滴吐出計数装置から直接データを書き込む方法が好ましい。
液滴吐出計数装置としては、例えば、特願２０１６−１２２６０号明細書、特願２０１６−１３２０２１号明細書などを参照することができる。液滴吐出計数装置は、細胞が液体に懸濁した細胞懸濁液を液滴として吐出し、吐出した液滴が凹部に着滴する前の飛翔中に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数する細胞数計数手段を有する。さらに、液滴吐出計数装置は、凹部に着滴した細胞数をセンサによって計数する細胞数計数手段を併せて有している。
【００７３】
液滴吐出計数装置における液滴吐出手段の動作方式としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、圧電素子を用いた圧電加圧方式、ヒータを用いたサーマル方式、静電引力によって液を引っ張る静電方式等によるインクジェットヘッドなどが挙げられる。
【００７４】
記憶手段に記憶されている情報の読み取りは、外部の情報読み取り装置を用いて行うことができ、容器を分析装置に装着した際に、装置に内蔵している読み取り機構により行うことができる。
【００７５】
識別手段と記憶手段との対応付け方法は、識別手段が識別表示である場合には、記憶手段にも識別手段と同じ識別表示を記憶させることで行われる。記憶手段における識別表示の記憶は、識別表示を直接印字する方法、識別表示を記載したシールを貼り付ける方法などが挙げられる。
一方、識別手段が識別部である場合には、識別部の識別情報を記憶手段が記憶することで行われる。記憶手段における識別部の情報の記憶は、手入力、書き込み装置による書き込みなどが挙げられる。
【００７６】
なお、容器を分析装置に装着した際に読み込んだ識別手段としての識別部の識別情報と、記憶手段に記憶されている容器の情報とを照合させることもできる。これにより、識別手段と記憶手段との対応付けが正確にできているか否かを確認することができる。
【００７７】
本発明の細胞含有容器は、少なくとも２つの凹部を有し、前記凹部が細胞を含み、前記細胞の種類が容器に対して少なくとも２種であり、最も近くで隣接する２つの前記凹部の中心間の最短距離が、５．０ｍｍ以下であることにより、小さい領域に複数の種類の細胞を含有しているため、細胞を用いた評価試験を一つの容器で効率的に行うことができる。さらに、細胞を用いた評価試験に使用する試薬の量を少なくすることができる。
本発明の細胞含有容器は上記の特徴を有しているため、細胞を用いた薬効又は毒性評価の試験に好適に用いることができる。
【００７８】
薬効の評価を行う試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、オキサゾロン、ベンゾキノン、２，４−ジニトロコロベンジン、４−フェニレンジアミン、グルタルアルデヒド、ベンゾイルペルオキシド、４−メチルアミノフェノール硫酸塩、ホルムアルデヒド、シンナムアルデヒド、エチレンジアミン、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、イソオイゲノール、硫酸ニッケル（ＩＩ）、ベンジリデンアセトン、２−ノニン酸メチル、サルチル酸ベンジル、ジエチレントリアミン、チオグリセロール、２−メルカプトベンゾチアゾール、フェニルアセトアルデヒド、ヘキシルシンナムアルデヒド、ジヒドロオイゲノール、ベンゾイソチアゾリオーネ、シトラール、レゾルシノール、安息香酸フェニル、オイゲノール、アビエチン酸、アミノ安息香酸エチル、ベンジルシンナメート、シンナミルアルコール、ヒドロキシシトロネラール、イミダゾリジニル尿素、ブチルグリシジルエーテル、エチレングリコールジメタクリラート、グリオキサール、４−ニトロベンジルブロミドなどが挙げられる。
毒性の評価を行う試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化亜鉛、１−ブタノール、安息香酸、エチルバニリン、４−ヒドロキシ安息香酸、スルファニル酸、酒石酸、サリチル酸メチル、サリチル酸、ラウリル硫酸ナトリウム、乳酸、ベンジルアルコール、デキストラン、ジエチルフタレート、グリセロール、プロピルパラベン、Ｔｗｅｅｎ８０、ジメチルイソフタレート、フェノール、クロロベンゼン、スルファニルアミド、オクタン酸などが挙げられる。
【００７９】
本発明の細胞含有容器は、バイオ関連産業、ライフサイエンス産業、及び医療産業等において幅広く使用することができる。
【００８０】
ここで、本発明の細胞含有容器について図面を参照して詳細に説明する。なお、各図面において、同一構成部分には同一符号を付し、重複した説明を省略する場合がある。また、下記構成部材の数、位置、形状等は本実施の形態に限定されず、本発明を実施する上で好ましい数、位置、形状などにすることができる。
図２は、本発明の細胞含有容器の一例を示す斜視図である。細胞含有容器１は、容器２に複数の凹部３が設けられており、凹部３に細胞４が所望の数充填されている。なお、図３及び図４中５は、密閉部材である。
【００８１】
ここで、例えば、図３及び図４に示すように、各凹部３に充填する細胞４と細胞の数に係る不確かさ（確からしさ）の情報、もしくはこれらの情報と関連付けられた情報を記憶するＩＣチップ又はバーコード（識別手段６）が、密閉部材５と容器２との間で且つ凹部の開口部以外の位置に配置されている。これは、識別手段６の意図しない改変等を防止するのに好適である。
また、細胞含有容器が識別手段を有することで、識別手段を有しない一般のウェルプレートとの区別可能である。このため、取り違えを防止することが可能である。
【００８２】
（細胞含有容器の製造方法）
本発明の細胞含有容器の製造方法は、少なくとも２つの凹部への、細胞を含む細胞懸濁液の分注において、インクジェット法で行う工程を含む。
本発明の細胞含有容器の製造方法を用いることにより、所望の細胞数を所定の位置の凹部へ充填すること、細胞を充填するのに必要な液体の体積を抑えることができるため、細胞含有容器に含まれる試薬が使用者の実験系に与える影響を小さくすることができる。
【００８３】
本発明の細胞含有容器の製造方法においては、例えば、前記細胞懸濁液の分注を、インクジェット法による分注のみで行ってもよいし、ディスペンサによる分注を行った後にインクジェット法による分注を行ってもよい。
まず、前記細胞懸濁液の分注をインクジェット法による分注のみで行う場合について、以下に説明を行う。
【００８４】
以下に、本発明の細胞含有容器の製造方法の一例を示すフローチャートを図５Ａ及び図５Ｃに示すと共に、各工程（ステップ）について以下に説明する。
【００８５】
図５Ａは、本発明の細胞含有容器の製造方法の一例を示すフローチャートである。
なお、ステップＳ１０３において「ＮＯ」の場合にステップＳ１０１に戻る処理と、ステップＳ１０５において「ＮＯ」の場合にステップＳ１０１に戻る処理とは、分注する対象となる凹部内に所定値の細胞数に達していない場合に当該凹部内における前記細胞数を前記所定値にするための「補正処理」と位置づけられる。
また、前記凹部が複数ある場合、ステップＳ１０５において「ＮＯ」の場合にステップＳ１０１に戻る、前記「補正処理」は、個々の前記凹部に対し、ステップＳ１０１からステップＳ１０４までが行われた後で、まとめて行ってもよい。
ステップＳ１０６は、前記凹部が複数ある場合において、少なくとも一の凹部に対して所定値の細胞数となるような分注を行うときに、前記一の凹部について行われる処理である。
【００８６】
ステップＳ１０１では、細胞懸濁液を液滴として吐出する。
【００８７】
ステップＳ１０２では、吐出した液滴中の細胞数を計数する。
【００８８】
ステップＳ１０３では、計数した液滴中の細胞数と液滴数に基づき算出した少なくとも一の凹部内の細胞数が所定値に達しているか否か判定する。
液滴中の細胞数の計数の方法としては、後述する光学的に検出する方法、電気的・磁気滴に検出する方法などが挙げられる。
ステップＳ１０３では、液滴中の細胞数を計数し、少なくとも一の凹部内へ吐出した液滴の数に基づいて、少なくとも一の凹部に所定値（設定した数）の細胞が分注されたか否かを判定する。即ち、前記一の凹部へ吐出した液滴に含まれる細胞数と、前記一の凹部に吐出した液滴の数とに基づき、前記一の凹部内へ分注した細胞数を計数（推定）する。ステップＳ１０３では、少なくとも一の凹部に所定の数の細胞が分注されたと判定すると、処理をＳ１０４へ移行させ、少なくとも一の凹部に所定の数の細胞が分注されていないと判定すると、処理をＳ１０１へ移行する。
【００８９】
ステップＳ１０４では、少なくとも一の凹部内へ着弾した細胞数を計数する。
少なくとも一の凹部内へ着弾した細胞数の計数の方法としては、後述する光学的に検出する方法、電気的・磁気滴に検出する方法などが挙げられる。
【００９０】
ステップＳ１０５では、少なくとも一の凹部内へ着弾した細胞数が所定値に達しているか否か判定する。
ステップＳ１０５では、ステップＳ１０４で計数した少なくとも一の凹部内へ着弾した（凹部内に実際に存在する）細胞数が所定値（設定した数）に達していると判定すると、処理をステップＳ１０６へ移行し、ステップＳ１０４で計数した少なくとも一の凹部内へ着弾した（凹部内に実際に存在する）細胞数が所定値（設定した数）に達していないと判定すると、処理をＳ１０１へ移行する。処理をＳ１０１に移行させる場合、細胞懸濁液はインクジェット方式により吐出され、凹部内の細胞数を補正する動作が行われる。
【００９１】
ステップＳ１０６では、所定の凹部に対して分注が終了したか否かを判定する。所定の凹部とは、少なくとも一つの凹部を有する容器の任意に選択した凹部を意味する。
ステップＳ１０６では、所定の凹部に分注が終了していない場合には、処理をＳ１０１に移行し、残りの所定の凹部への液滴の吐出を行い、所定の凹部に分注が終了している場合には、処理を終了する。
【００９２】
ディスペンサのみによる分注を行った場合においては、吸引動作時に凹部内へ気泡を混入させないようにするために、余剰の細胞懸濁液を必要とするためにデッドボリュームが生じてしまう傾向にある。また、ディスペンサのみによる分注を行った場合においては、分注する液量が大きくなる傾向がある。
前記細胞懸濁液の分注を、インクジェット法による分注のみで行うことにより、分注する液量を小さくすること、及びデッドボリュームを小さくすることができ、使用する細胞懸濁液を過剰に用意する必要がなくなる。
【００９３】
また、図５Ｂに示すように、本発明の細胞含有容器の製造方法は、Ｂ：液滴吐出工程、Ｃ：細胞数計数工程、及びＤ：液滴着弾工程を含み、更に必要に応じて、Ａ：細胞懸濁液生成工程、Ｅ：Ａ〜Ｄ工程における推定する細胞の数の確からしさを算出する工程、Ｇ：出力工程、Ｈ：記録工程を含む。また、必要に応じて、Ａ：細胞懸濁液生成工程において、Ａ２：細胞懸濁液に含まれる核酸の数を推定してもよく、Ｃ：細胞数計数工程において、Ｃ１：吐出前に細胞を観察する処理、及びＣ３：着弾後の細胞をカウントする処理を含んでもよい。
【００９４】
＜細胞懸濁液生成工程＞
前記細胞懸濁液生成工程は、細胞、液体を含む細胞懸濁液を生成する工程である。
液体とは、細胞を分散させるために用いる液体を意味する。
細胞懸濁液における懸濁とは、細胞が液体中に分散して存在する状態を意味する。
生成とは、作り出すことを意味する。
【００９５】
−−細胞−−
細胞は、本発明の細胞含有容器に用いることができるものと同様であるため、説明を省略する。
【００９６】
細胞懸濁液における細胞の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下が好ましく、５×１０５個／ｍＬ以上５×１０７個／ｍＬ以下がより好ましい。細胞数が、５×１０５個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下であると、吐出した液滴中に細胞を確実に含むことができる。細胞数としては、体積平均粒径の測定方法と同様にして、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定することができる。
【００９７】
−−液体−−
液体としては、細胞が生存できる環境を維持できれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、培養液、分離液、希釈液、緩衝液、有機物溶解液、有機溶剤、高分子ゲル溶液、コロイド分散液、電解質水溶液、無機塩水溶液、金属水溶液、及びこれらの混合液体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、培地、緩衝液、または前記液体と高分子ゲル溶液の併用が好ましく、培地、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）、併用する高分子ゲル材料としてはコラーゲン、ｉＭａｔｒｉｘ５１１、等がより好ましい。
【００９８】
−−添加剤−−
添加剤としては、細胞が生存できる環境を維持できれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、界面活性剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００９９】
−−−界面活性剤−−−
界面活性剤は、細胞同士の凝集を防止し、連続吐出安定性を向上することができる。
【０１００】
界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、添加量にもよるが、タンパク質を変性及び失活させない点から、非イオン性界面活性剤が好ましい。
【０１０１】
イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、脂肪酸ナトリウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）がより好ましい。
【０１０２】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルグリコシド、アルキルポリオキシエチレンエーテル（Ｂｒｉｊシリーズ等）、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘシリーズ、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡシリーズ、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐシリーズ、Ｎｉｋｋｏｌ  ＯＰシリーズ等）、ポリソルベート類（Ｔｗｅｅｎ２０等のＴｗｅｅｎシリーズなど）、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルキルマルトシド、ショ糖脂肪酸エステル、グリコシド脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリドなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、ポリソルベート類が好ましい。
【０１０３】
界面活性剤の含有量としては、細胞が生存できる環境を維持できれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、細胞懸濁液全量に対して、０．００１質量％以上３０質量％以下が好ましい。含有量が、０．００１質量％以上であると、界面活性剤の添加による効果を得ることができ、３０質量％以下であると、細胞の凝集を抑制することができる。
【０１０４】
−−その他の材料−−
その他の材料としては、細胞が生存できる環境を維持できれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、架橋剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、分散剤などが挙げられる。
【０１０５】
［細胞を分散する方法］
細胞を分散する方法としては、細胞が生存できる環境を維持できれば特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピペッティングによる拡散、ビーズミル等のメディア方式、超音波ホモジナイザー等の超音波方式、フレンチプレス等の圧力差を利用する方式などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞へのダメージが少ないことからピペッティングがより好ましい。超音波やメディア方式では、解砕能力が強く、細胞膜や細胞壁を破壊する可能性やメディアがコンタミとして混入することがある。
【０１０６】
［細胞のスクリーニング方法］
細胞のスクリーニング方法としては、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、湿式分級、セルソーター、フィルタによるスクリーニングなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞へのダメージが少ないことから、セルソーター、フィルタによるスクリーニングが好ましい。
【０１０７】
＜液滴吐出工程＞
液滴吐出工程は、少なくとも２つの凹部を有する容器に対して、液滴吐出手段により細胞懸濁液を液滴として吐出する工程である。
液滴とは、表面張力によりまとまった液体のかたまりを意味する。
吐出とは、細胞懸濁液を液滴として飛翔させることを意味する。
【０１０８】
液滴吐出手段としては、細胞懸濁液を液滴として吐出する手段（以下、「吐出ヘッド」、「インクジェットヘッド」とも称することがある）、自動分注装置を好適に用いることができる。自動分注装置としては、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＢｒａｖｏ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  Ｐｌａｔｆｏｒｍなどが挙げられる。
【０１０９】
吐出ヘッド（インクジェットヘッド）は、細胞懸濁液を保持する液体保持部と、細胞懸濁液に振動を付与して液滴を吐出する膜状部材と、液体保持部を大気に開放する大気開放部とを少なくとも有する。
また、液滴吐出手段としては、インクジェットヘッドを少なくとも２つ有し、同時又は交互に使用することが好ましい。
【０１１０】
細胞懸濁液を液滴として吐出する方式としては、例えば、オンデマンド方式、コンティニュアス方式などが挙げられる。これらの中でもコンティニュアス方式の場合、安定的な吐出状態に至るまでの空吐出、液滴量の調整、凹部間を移動する際にも連続的に液滴形成を行い続ける等の理由から、用いる細胞懸濁液のデッドボリュームが多くなる傾向にある。本発明では細胞数を調整する観点からデッドボリュームによる影響を低減させることが好ましく、そのため上記２つの方式では、オンデマンド方式の方がより好適である。
【０１１１】
オンデマンド方式としては、例えば、液体に圧力を加えることによって液体を吐出する圧力印加方式、加熱による膜沸騰によって液体を吐出するサーマル方式、静電引力によって液滴を引っ張ることによって液滴を形成する静電方式等の既知の複数の方式などが挙げられる。これらの中でも、以下の理由から、圧力印加方式が好ましい。
【０１１２】
静電方式は、細胞懸濁液を保持して液滴を形成する吐出部に対向して電極を設置する必要がある。本発明の細胞含有容器の製造方法では、液滴を受けるための細胞含有容器が対向して配置されており、細胞含有容器の構成の自由度を上げるため電極の配置は無いほうが好ましい。
サーマル方式は、局所的な加熱が発生するため生体材料である細胞への影響や、ヒーター部への焦げ付き（コゲーション）が懸念される。熱による影響は、含有物や細胞含有容器の用途に依存するため、一概に除外する必要はないが、圧力印加方式は、サーマル方式よりヒーター部への焦げ付きの懸念がないという点から好ましい。
【０１１３】
圧力印加方式としては、ピエゾ素子のような膜状部材を用いて液体に圧力を加える方式、電磁バルブ等のバルブによって圧力を加える方式などが挙げられる。細胞懸濁液の液滴吐出に使用可能な液滴生成デバイスの構成例を図６Ａ〜図６Ｃに示す。
図６Ａは、電磁バルブ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。電磁バルブ方式の吐出ヘッドは、電動機１３ａ、電磁弁１１２、液体保持部１１ａ、細胞懸濁液３００ａ、及びノズル１１１ａを有する。
電磁バルブ方式の吐出ヘッドとしては、例えば、ＴｅｃｈＥｌａｎ社のディスペンサなどを好適に用いることができる。
また、図６Ｂは、ピエゾ方式の吐出ヘッドの一例を示す模式図である。ピエゾ方式の吐出ヘッドは、圧電素子１３ｂ、液体保持部１１ｂ、細胞懸濁液３００ｂ、及びノズル１１１ｂを有する。
ピエゾ方式の吐出ヘッドとしては、Ｃｙｔｅｎａ社のシングルセルプリンターなどを好適に用いることができる。
これらの吐出ヘッドのいずれも用いることが可能であるが、電磁バルブによる圧力印加方式では高速に繰り返し液滴を形成することができないため、細胞含有容器の製造のスループットを上げるためにはピエゾ方式を用いることが好ましい。また、一般的な圧電素子１３ｂを用いたピエゾ方式の吐出ヘッドでは、沈降によって細胞濃度のムラが発生することや、ノズル詰まりが生じることが問題として生じることがある。
このため、より好ましい構成として図６Ｃに示した構成などが挙げられる。図６Ｃは、図６Ｂにおける圧電素子を用いたピエゾ方式の吐出ヘッドの変形例の模式図である。図６Ｃの吐出ヘッドは、圧電素子１３ｃ、液体保持部１１ｃ、細胞懸濁液３００ｃ、及びノズル１１１ｃを有する。
図６Ｃの吐出ヘッドでは、図示していない制御装置からの圧電素子１３ｃに対して電圧印加することにより、紙面横方向に圧縮応力が加わりメンブレンを紙面上下方向に変形させることができる。これにより、液体保持部１１ｃ内の細胞懸濁液３００ｃを撹拌しつつ、液滴を形成するため、ノズル詰まりを抑制し、かつ高速に繰り返し液滴を形成することができる。
【０１１４】
オンデマンド方式以外の方式としては、例えば、連続的に液滴を形成させるコンティニュアス方式などが挙げられる。コンティニュアス方式では、液滴を加圧してノズルから押し出す際に圧電素子やヒーターによって定期的なゆらぎを与え、それによって微小な液滴を連続的に作り出すことができる。さらに、飛翔中の液滴の吐出方向を、電圧を印加することによって制御することにより、凹部に着弾させるか、回収部に回収するかを選ぶことも可能である。このような方式は、セルソーター、又はフローサイトメーターで用いられており、例えば、ソニー株式会社製の装置名：セルソーターＳＨ８００を用いることができる。
【０１１５】
図７Ａは、圧電素子に印加する電圧の一例を示す模式図である。また、図７Ｂは、圧電素子に印加する電圧の他の一例を示す模式図である。図７Ａは、液滴を形成するための駆動電圧を示す。電圧（ＶＡ、ＶＢ、ＶＣ）の強弱により、液滴を形成することができる。図７Ｂは、液滴の吐出を行わずに細胞懸濁液を撹拌するための電圧を示している。
【０１１６】
液滴を吐出しない期間中に、液滴を吐出するほどには強くない複数のパルスを入力することによって、液質内の細胞懸濁液を撹拌することが可能であり、細胞沈降による濃度分布の発生を抑制することができる。
【０１１７】
本発明において使用することができる吐出ヘッドの液滴形成動作に関して、以下に説明する。
吐出ヘッドは、圧電素子に形成された上下電極に、パルス状の電圧を印加することにより液滴を吐出することができる。図８Ａ〜図８Ｃは、液滴吐出工程における液滴の形成状態を示す模式図である。図８Ａは、まず、圧電素子１３ｃに電圧を印加することにより、メンブレン１２ｃが急激に変形することによって、液体保持部１１ｃ内に保持された細胞懸濁液とメンブレン１２ｃとの間に高い圧力が発生し、この圧力によってノズル部から液滴が外に押し出される。次に、図８Ｂに示すように、圧力が上方に緩和するまでの時間、ノズル部からの液押し出しが続き液滴が成長する。最後に、図８Ｃに示すように、メンブレン１２ｃが元の状態に戻る際に細胞懸濁液とメンブレン１２ｃとの界面近傍の液圧力が低下し、液滴３１０’が形成される。
【０１１８】
容器としては、バイオ分野において一般的に用いられる部材であれば特に制限はなく、例えば、穴、凹部、及び凸部の少なくともいずれかの区画が形成されたプレート、区画が形成されていないプレート、チューブなどの容器などが挙げられる。より具体的には、区画が形成されたプレートとしては、例えば、２４穴、９６穴、３８４穴、１，５３６穴プレート等が挙げられ、区画が形成されていないプレートとしては、例えば、スライドガラスなどが挙げられ、チューブとしては、８連ＰＣＲチューブ、単独で使用するＰＣＲチューブなどが挙げられる。
凹部としては、細胞を保持可能である特定の領域があれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞含有容器に設けられた区画、細胞含有容器に設けられた区画以外の領域などが挙げられる。より具体的には、例えば、２４穴、９６穴、３８４穴、１，５３６穴プレートなどにおけるウェルなどが挙げられる。
容器における凹部の数は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、単数であってもよく、複数であってもよい。ここで、凹部の数とは、区画が形成されているプレートにおいては、区画の数そのものを意味し、区画が形成されていないプレートにおいては、細胞を保持可能である特定の領域の数を意味し、チューブにおいては、そのチューブの個数を意味する。
凹部数が複数である容器としては、凹部の数が２４個、９６個、３８４個、１，５３６個など業界において一般的な個数及び寸法で穴が形成されたものを用いることが好ましい。
なお、本発明において、容器をプレートと称することもある。本発明において、容器をプレートと称するときには、凹凸を有しているもの、及び凹凸を有していない容器の少なくともいずれかの容器を意味する。
【０１１９】
容器の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、後の処理のために、細胞や核酸の壁面への付着が抑制されているものを用いることが好ましい。
【０１２０】
容器としては、個々に認識することが可能な認識手段が設けられたものを利用することが好ましい。認識手段としては、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、Ｒａｄｉｏ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（以下、「ＲＦＩＤ」とも称することがある）などを用いることが可能である。細胞含有容器を大量生産する場合には、無線でも使用可能なＲＦＩＤが好ましい。
【０１２１】
容器としては、１穴マイクロチューブ、８連チューブ、９６穴、３８４穴、１，５３６穴のウェルプレートなどを用いることが好ましいが、凹部が複数である場合には、これらの容器における凹部には同じ個数の細胞を分注することも可能であるし、異なる水準の個数を入れることも可能である。また、細胞が含まれない凹部が存在していてもよい。
【０１２２】
＜細胞数計数工程＞
細胞数計数工程は、液滴の凹部への飛翔中に、液滴に含まれる細胞数を複数のセンサによって２以上の方向から計数する工程である。
センサとは、自然現象や人工物の機械的・電磁気的、熱的、音響的、又は化学的性質、或いはそれらにより示される空間情報・時間情報を、何らかの科学的原理を応用して、人間や機械が扱い易い別媒体の信号に置き換える装置を意味する。
計数とは、数を数えることを意味する。
【０１２３】
細胞数計数工程としては、液滴の凹部への飛翔中に、液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数すれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、吐出前に細胞を観測する処理、着弾後の細胞をカウントする処理を含んでもよい。
【０１２４】
液滴の凹部への飛翔中に、液滴に含まれる細胞数を計数する方法としては、例えば、液滴が容器の凹部に確実に入ることが予測される所望の凹部の直上の位置にあるタイミングにて液滴中の細胞を計数することが好ましい。なお、凹部が開口部を有する場合には、所望の凹部の開口部の直上にあるタイミングを意味する。
【０１２５】
液滴中の細胞数を計数する方法としては、例えば、光学的に検出する方法、電気的・磁気的に検出する方法などが挙げられる。
【０１２６】
−光学的に検出する方法−
図１０、図１４、及び図１５を用いて、光学的に検出する方法に関して以下に述べる。
図１０は、液滴形成装置の一例を示す模式図である。図１４、及び図１５は、液滴形成装置の他の一例を示す模式図である。図１０に示すように、液滴形成装置１は、吐出ヘッド（液滴吐出手段）１０と、駆動手段２０と、光源３０と、受光素子６０と、制御手段７０とを有する。
【０１２７】
図１０では、細胞懸濁液として細胞を特定の色素によって蛍光染色した後に所定の溶液に分散した液を用いており、吐出ヘッドから形成した液滴に光源から発せられる特定の波長を有する光を照射し細胞から発せられる蛍光を受光素子によって検出することによって計数を行う。このとき、蛍光色素によって細胞を染色する方法に加え、細胞中に元々含まれる分子が発する自家蛍光を利用してもよいし、細胞に蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ））を生産するための遺伝子を予め導入しておき細胞が蛍光を発するようにしておいてもよい。
光を照射とは、光をあてることを意味する。
【０１２８】
吐出ヘッド１０は、液体保持部１１と、メンブレン１２と、駆動素子１３とを有しており、蛍光染色細胞３５０を懸濁した細胞懸濁液３００を液滴として吐出することができる。
【０１２９】
液体保持部１１は、蛍光染色細胞３５０を懸濁した細胞懸濁液３００を保持する液体保持部であり、下面側には貫通孔であるノズル１１１が形成されている。液体保持部１１は、例えば、金属やシリコン、セラミック等から形成することができる。蛍光染色細胞３５０としては、蛍光色素によって染色された無機微粒子や有機ポリマー粒子などが挙げられる。
【０１３０】
メンブレン１２は、液体保持部１１の上端部に固定された膜状部材である。メンブレン１２の平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
【０１３１】
駆動素子１３は、メンブレン１２の上面側に設けられている。駆動素子１３の形状は、メンブレン１２の形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン１２の平面形状が円形である場合には、円形の駆動素子１３を設けることが好ましい。
【０１３２】
駆動素子１３に駆動手段２０から駆動信号を供給することにより、メンブレン１２を振動させることができる。メンブレン１２の振動により、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０を、ノズル１１１から吐出させることができる。
【０１３３】
駆動素子１３として圧電素子を用いる場合には、例えば、圧電材料の上面及び下面に電圧を印加するための電極を設けた構造とすることができる。この場合、駆動手段２０から圧電素子の上下電極間に電圧を印加することによって紙面横方向に圧縮応力が加わり、メンブレン１２を紙面上下方向に振動させることができる。圧電材料としては、例えば、ジルコン酸チタン酸鉛（ＰＺＴ）を用いることができる。この他にも、ビスマス鉄酸化物、ニオブ酸金属物、チタン酸バリウム、或いはこれらの材料に金属や異なる酸化物を加えたもの等、様々な圧電材料を用いることができる。
【０１３４】
光源３０は、飛翔中の液滴３１０に光Ｌを照射する。なお、飛翔中とは、液滴３１０が液滴吐出手段１０から吐出されてから、着弾対象物に着弾するまでの状態を意味する。飛翔中の液滴３１０は、光Ｌが照射される位置では略球状となっている。又、光Ｌのビーム形状は略円形状である。
【０１３５】
ここで、液滴３１０の直径に対し、光Ｌのビーム直径が１０倍〜１００倍程度であることが好ましい。これは、液滴３１０の位置ばらつきが存在する場合においても、光源３０からの光Ｌを確実に液滴３１０に照射するためである。
【０１３６】
ただし、液滴３１０の直径に対し、光Ｌのビーム直径が１００倍を大きく超えることは好ましくない。これは、液滴３１０に照射される光のエネルギー密度が下がるため、光Ｌを励起光として発する蛍光Ｌｆの光量が低下し、受光素子６０で検出し難くなるからである。
【０１３７】
光源３０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましく、例えば、固体レーザー、半導体レーザー、色素レーザー等が好適に用いられる。光Ｌがパルス光である場合のパルス幅は１０μｓ以下が好ましく、１μｓ以下がより好ましい。単位パルス当たりのエネルギーとしては、集光の有無等、光学系に大きく依存するが、概ね０．１μＪ以上が好ましく、１μＪ以上がより好ましい。
【０１３８】
受光素子６０は、飛翔中の液滴３１０に蛍光染色細胞３５０が含有されていた場合に、蛍光染色細胞３５０が光Ｌを励起光として吸収して発する蛍光Ｌｆを受光する。蛍光Ｌｆは、蛍光染色細胞３５０から四方八方に発せられるため、受光素子６０は蛍光Ｌｆを受光可能な任意の位置に配置することができる。この際、コントラストを向上するため、光源３０から出射される光Ｌが直接入射しない位置に受光素子６０を配置することが好ましい。
【０１３９】
受光素子６０は、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆを受光できる素子であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、液滴に特定の波長を有する光を照射して液滴内の細胞からの蛍光を受光する光学センサが好ましい。受光素子６０としては、例えば、フォトダイオード、フォトセンサ等の１次元素子が挙げられるが、高感度な測定が必要な場合には、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオードを用いることが好ましい。受光素子６０として、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、ゲートＣＣＤ等の２次元素子を用いてもよい。
【０１４０】
なお、光源３０が発する光Ｌと比較して蛍光染色細胞３５０の発する蛍光Ｌｆが弱いため、受光素子６０の前段（受光面側）に光Ｌの波長域を減衰させるフィルタを設置してもよい。これにより、受光素子６０において、非常にコントラストの高い蛍光染色細胞３５０の画像を得ることができる。フィルタとしては、例えば、光Ｌの波長を含む特定波長域を減衰させるノッチフィルタ等を用いることができる。
【０１４１】
また、前述のように、光源３０から発せられる光Ｌはパルス光であることが好ましいが、光源３０から発せられる光Ｌを連続発振の光としてもよい。この場合には、連続発振の光が飛翔中の液滴３１０に照射されるタイミングで受光素子６０が光を取り込み可能となるように制御し、受光素子６０に蛍光Ｌｆを受光させることが好ましい。
【０１４２】
制御手段７０は、駆動手段２０及び光源３０を制御する機能を有している。また、制御手段７０は、受光素子６０が受光した光量に基づく情報を入手し、液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数（ゼロである場合も含む）を計数する機能を有している。以下、図１１〜図１３を参照し、制御手段７０の動作を含む液滴形成装置１の動作について説明する。
【０１４３】
図１１は、図１０の制御手段のハードウェアブロックを例示する図である。図１２は、図１０の制御手段の機能ブロックを例示する図である。図１３は、液滴形成装置の動作の一例を示すフローチャートである。
【０１４４】
図１１に示すように、制御手段７０は、ＣＰＵ７１と、ＲＯＭ７２と、ＲＡＭ７３と、Ｉ／Ｆ７４と、バスライン７５とを有している。ＣＰＵ７１、ＲＯＭ７２、ＲＡＭ７３、及びＩ／Ｆ７４は、バスライン７５を介して相互に接続されている。
【０１４５】
ＣＰＵ７１は、制御手段７０の各機能を制御する。記憶手段であるＲＯＭ７２は、ＣＰＵ７１が制御手段７０の各機能を制御するために実行するプログラムや、各種情報を記憶している。記憶手段であるＲＡＭ７３は、ＣＰＵ７１のワークエリア等として使用される。また、ＲＡＭ７３は、所定の情報を一時的に記憶することができる。Ｉ／Ｆ７４は、液滴形成装置１を他の機器等と接続するためのインターフェイスである。液滴形成装置１は、Ｉ／Ｆ７４を介して、外部ネットワーク等と接続されてもよい。
【０１４６】
図１２に示すように、制御手段７０は、機能ブロックとして、吐出制御手段７０１と、光源制御手段７０２と、細胞数計数手段（細胞数検知手段）７０３とを有している。
【０１４７】
図１２及び図１３を参照しながら、液滴形成装置１の粒子数計数について説明する。まず、ステップＳ１１において、制御手段７０の吐出制御手段７０１は、駆動手段２０に吐出の指令を出す。吐出制御手段７０１から吐出の指令を受けた駆動手段２０は、駆動素子１３に駆動信号を供給してメンブレン１２を振動させる。メンブレン１２の振動により、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０が、ノズル１１１から吐出される。
【０１４８】
次に、ステップＳ１２において、制御手段７０の光源制御手段７０２は、液滴３１０の吐出に同期して（駆動手段２０から液滴吐出手段１０に供給される駆動信号に同期して）光源３０に点灯の指令を出す。これにより、光源３０が点灯し、飛翔中の液滴３１０に光Ｌを照射する。
【０１４９】
なお、ここで、同期するとは、液滴吐出手段１０による液滴３１０の吐出と同時に（駆動手段２０が液滴吐出手段１０に駆動信号を供給するのと同時に）発光することではなく、液滴３１０が飛翔して所定位置に達したときに液滴３１０に光Ｌが照射されるタイミングで、光源３０が発光することを意味する。つまり、光源制御手段７０２は、液滴吐出手段１０による液滴３１０の吐出（駆動手段２０から液滴吐出手段１０に供給される駆動信号）に対して、所定時間だけ遅延して発光するように光源３０を制御する。
【０１５０】
例えば、液滴吐出手段１０に駆動信号を供給した際に吐出する液滴３１０の速度ｖを予め測定しておく。そして、測定した速度ｖに基づいて液滴３１０が吐出されてから所定位置まで到達する時間ｔを算出し、液滴吐出手段１０に駆動信号を供給するタイミングに対して、光源３０が光を照射するタイミングをｔだけ遅延させる。これにより、良好な発光制御が可能となり、光源３０からの光を確実に液滴３１０に照射することができる。
【０１５１】
次に、ステップＳ１３において、制御手段７０の細胞数計数手段７０３は、受光素子６０からの情報に基づいて、液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数（ゼロである場合も含む）を計数する。ここで、受光素子６０からの情報とは、蛍光染色細胞３５０の輝度値（光量）や面積値である。
【０１５２】
細胞数計数手段７０３は、例えば、受光素子６０が受光した光量と予め設定された閾値とを比較して、蛍光染色細胞３５０の個数を計数することができる。この場合には、受光素子６０として１次元素子を用いても２次元素子を用いても構わない。
【０１５３】
受光素子６０として２次元素子を用いる場合は、細胞数計数手段７０３は、受光素子６０から得られた２次元画像に基づいて、蛍光染色細胞３５０の輝度値或いは面積を算出するための画像処理を行う手法を用いてもよい。この場合、細胞数計数手段７０３は、画像処理により蛍光染色細胞３５０の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、蛍光染色細胞３５０の個数を計数することができる。
【０１５４】
なお、蛍光染色細胞３５０は、細胞や染色細胞であってもよい。染色細胞とは、蛍光色素によって染色された細胞、又は、蛍光タンパク質を発現可能な細胞を意味する。
【０１５５】
染色細胞において、蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類、アゾ類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、エオシン、エバンスブルー、トリパンブルー、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミン１２３がより好ましい。
蛍光タンパク質としては、例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ、ＣＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＰＳ−ＣＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｋａｅｄｅ、ＥｏｓＦＰ、ＫｉｋｕｍｅＧＲなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０１５６】
このように、液滴形成装置１では、蛍光染色細胞３５０を縣濁した細胞懸濁液３００を保持する液滴吐出手段１０に、駆動手段２０から駆動信号を供給して、蛍光染色細胞３５０を含有する液滴３１０を吐出させ、飛翔中の液滴３１０に光源３０から光Ｌを照射する。そして、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０が光Ｌを励起光として蛍光Ｌｆを発し、蛍光Ｌｆを受光素子６０が受光する。更に、受光素子６０からの情報に基づいて、細胞数計数手段７０３が、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を計数（カウント）する。
【０１５７】
つまり、液滴形成装置１では、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を実際にその場で観察するため、蛍光染色細胞３５０の個数の計数精度を従来よりも向上することが可能となる。又、飛翔する液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０に光Ｌを照射して蛍光Ｌｆを発光させて蛍光Ｌｆを受光素子６０で受光するため、高いコントラストで蛍光染色細胞３５０の画像を得ることが可能となり、蛍光染色細胞３５０の個数の誤計数の発生頻度を低減できる。
【０１５８】
図１４は、図１０の液滴形成装置の変形例を示す模式図である。図１４に示すように、液滴形成装置１Ａは、受光素子６０の前段にミラー４０を配置した点が、液滴形成装置１（図１０参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【０１５９】
このように、液滴形成装置１Ａでは、受光素子６０の前段にミラー４０を配置したことにより、受光素子６０のレイアウトの自由度を向上することができる。
【０１６０】
例えば、ノズル１１１と着弾対象物を近づけた際に、図１０のレイアウトでは着弾対象物（図１０では省略しているが、例えば、図９の細胞含有容器７００に相当）と液滴形成装置１の光学系（特に受光素子６０）との干渉が発生するおそれがあるが、図１１のレイアウトにすることで、干渉の発生を回避することができる。
【０１６１】
すなわち、図１４のように受光素子６０を、液滴吐出手段の吐出面から、液滴の吐出方向と反対方向の領域に設置することにより、液滴３１０が着弾する着弾対象物とノズル１１１との距離（ギャップ）を縮めることが可能となり、着弾位置のばらつきを抑制することができる。その結果、分注の精度を向上することが可能となる。
【０１６２】
図１５は、図１０の液滴形成装置の他の変形例を示す模式図である。図１５に示すように、液滴形成装置１Ｂは、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆ１を受光する受光素子６０に加え、蛍光染色細胞３５０から発せられる蛍光Ｌｆ２を受光する受光素子６１を設けた点が、液滴形成装置１（図１０参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【０１６３】
ここで、蛍光Ｌｆ１及びＬｆ２は、蛍光染色細胞３５０から四方八方に発せられる蛍光の一部を示している。受光素子６０及び６１は、蛍光染色細胞３５０から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる任意の位置に配置することができる。なお、蛍光染色細胞３５０から異なる方向に発せられる蛍光を受光できる位置に３つ以上の受光素子を配置してもよい。又、各受光素子は同一仕様としてもよいし、異なる仕様としてもよい。
【０１６４】
受光素子が１つであると、飛翔する液滴３１０に複数個の蛍光染色細胞３５０が含まれる場合に、蛍光染色細胞３５０同士が重なることに起因して、細胞数計数手段７０３が液滴３１０に含有された蛍光染色細胞３５０の個数を誤計数する（カウントエラーが発生する）おそれがある。
【０１６５】
図１６は、飛翔する液滴に２個の蛍光染色細胞が含まれる場合を例示する図である。例えば、図１６Ａに示すように、蛍光染色細胞３５０１と３５０２とに重なりが発生する場合や、図１６Ｂに示すように、蛍光染色細胞３５０１と３５０２とに重なりが発生しない場合があり得る。受光素子を２つ以上設けることで、蛍光染色細胞が重なる影響を低減することが可能である。
【０１６６】
前述のように、細胞数計数手段７０３は、画像処理により蛍光粒子の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、蛍光粒子の個数を計数することができる。
【０１６７】
受光素子を２つ以上設置する場合，それぞれの受光素子から得られる輝度値或いは面積値のうち、最大値を示すデータを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能である。これに関して、図１７を参照して、より詳しく説明する。
【０１６８】
図１７は、粒子同士の重なりが生じない場合の輝度値Ｌｉと、実測される輝度値Ｌｅとの関係を例示する図である。図１７に示すように、液滴内の粒子同士の重なりがない場合には、Ｌｅ＝Ｌｉとなる。例えば、細胞１個の輝度値をＬｕとすると、細胞数／滴=１個の場合はＬｅ＝Ｌｕであり、粒子数／滴＝ｎ個の場合はＬｅ＝ｎＬｕである（ｎ：自然数）。
【０１６９】
しかし、実際には、ｎが２以上の場合には粒子同士の重なりが発生し得るため、実測される輝度値はＬｕ≦Ｌｅ≦ｎＬｕ（図１４の網掛部分）となる。そこで、細胞数／滴＝ｎ個の場合、例えば閾値を（ｎＬｕ−Ｌｕ／２）≦閾値＜（ｎＬｕ＋Ｌｕ／２）と設定することができる。そして、複数の受光素子を設置する場合、それぞれの受光素子から得られたデータのうち最大値を示すものを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能となる。なお、輝度値に代えて面積値を用いてもよい。
【０１７０】
また、受光素子を複数設置する場合、得られる複数の形状データを基に、細胞数を推定するアルゴリズムにより粒子数を決定づけてもよい。
このように、液滴形成装置１Ｂでは、蛍光染色細胞３５０が異なる方向に発した蛍光を受光する複数の受光素子を有しているため、蛍光染色細胞３５０の個数の誤計数の発生頻度を更に低減できる。
【０１７１】
図１８は、図１０の液滴形成装置の他の変形例を示す模式図である。図１８に示すように、液滴形成装置１Ｃは、液滴吐出手段１０が液滴吐出手段１０Ｃに置換された点が、液滴形成装置１（図１０参照）と相違する。なお、既に説明した実施の形態と同一構成部についての説明は省略する場合がある。
【０１７２】
液滴吐出手段１０Ｃは、液体保持部１１Ｃと、メンブレン１２Ｃと、駆動素子１３Ｃとを有している。液体保持部１１Ｃは、液体保持部１１Ｃ内を大気に開放する大気開放部１１５を上部に有しており、細胞懸濁液３００中に混入した気泡を大気開放部１１５から排出可能に構成されている。
【０１７３】
メンブレン１２Ｃは、液体保持部１１Ｃの下端部に固定された膜状部材である。メンブレン１２Ｃの略中心には貫通孔であるノズル１２１が形成されており、液体保持部１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００はメンブレン１２Ｃの振動によりノズル１２１から液滴３１０として吐出される。メンブレン１２Ｃの振動の慣性により液滴３１０を形成するため、高表面張力（高粘度）の細胞懸濁液３００でも吐出が可能である。メンブレン１２Ｃの平面形状は、例えば、円形とすることができるが、楕円状や四角形等としてもよい。
【０１７４】
メンブレン１２Ｃの材質としては特に限定はないが、柔らか過ぎるとメンブレン１２Ｃが簡単に振動し、吐出しないときに直ちに振動を抑えることが困難であるため、ある程度の硬さがある材質を用いることが好ましい。メンブレン１２Ｃの材質としては、例えば、金属材料やセラミック材料、ある程度硬さのある高分子材料等を用いることができる。
【０１７５】
特に、蛍光染色細胞３５０として細胞を用いる際には、細胞やタンパク質に対する付着性の低い材料であることが好ましい。細胞の付着性は一般的に材質の水との接触角に依存性があると言われており、材質の親水性が高い又は疎水性が高いときには細胞の付着性が低い。親水性の高い材料としては各種金属材料やセラミック（金属酸化物）を用いることが可能であり、疎水性が高い材料としてはフッ素樹脂等を用いることが可能である。
【０１７６】
このような材料の他の例としては、ステンレス鋼やニッケル、アルミニウム等や、二酸化ケイ素、アルミナ、ジルコニア等を挙げることができる。これ以外にも、材料表面をコーティングすることで細胞接着性を低下させることも考えられる。例えば、材料表面を前述の金属又は金属酸化物材料でコーティングすることや、細胞膜を模した合成リン脂質ポリマー（例えば日油株式会社製、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ）によってコーティングすることが可能である。
【０１７７】
ノズル１２１は、メンブレン１２Ｃの略中心に実質的に真円状の貫通孔として形成されていることが好ましい。この場合、ノズル１２１の径としては特に限定はないが、蛍光染色細胞３５０がノズル１２１に詰まることを避けるため、蛍光染色細胞３５０の大きさの２倍以上とすることが好ましい。蛍光染色細胞３５０が例えば動物細胞、特にヒトの細胞である場合、ヒトの細胞の大きさは一般的に５μｍ〜５０μｍ程度であるため、ノズル１２１の径を、使用する細胞に合わせて１０μｍ以上が好ましく、１００μｍ以上がより好ましい。
【０１７８】
一方で、液滴が大きくなり過ぎると微小液滴を形成するという目的の達成が困難となるため、ノズル１２１の径は２００μｍ以下であることが好ましい。つまり、液滴吐出手段１０Ｃにおいては、ノズル１２１の径は、典型的には１０μｍ〜２００μｍの範囲となる。
【０１７９】
駆動素子１３Ｃは、メンブレン１２Ｃの下面側に形成されている。駆動素子１３Ｃの形状は、メンブレン１２Ｃの形状に合わせて設計することができる。例えば、メンブレン１２Ｃの平面形状が円形である場合には、ノズル１２１の周囲に平面形状が円環状（リング状）の駆動素子１３Ｃを形成することが好ましい。駆動素子１３Ｃの駆動方式は、駆動素子１３と同様とすることができる。
【０１８０】
駆動手段２０は、メンブレン１２Ｃを振動させて液滴３１０を形成する吐出波形と、液滴３１０を形成しない範囲でメンブレン１２Ｃを振動させる撹拌波形とを駆動素子１３Ｃに選択的に（例えば、交互に）付与することができる。
【０１８１】
例えば、吐出波形及び撹拌波形を何れも矩形波とし、吐出波形の駆動電圧よりも撹拌波形の駆動電圧を低くすることで、撹拌波形の印加により液滴３１０が形成されないようにすることができる。つまり、駆動電圧の高低により、メンブレン１２Ｃの振動状態（振動の程度）を制御することができる。
【０１８２】
液滴吐出手段１０Ｃでは、駆動素子１３Ｃがメンブレン１２Ｃの下面側に形成されているため、駆動素子１３Ｃによりメンブレン１２が振動すると、液体保持部１１Ｃの下部方向から上部方向への流れを生じさせることが可能である。
【０１８３】
この時、蛍光染色細胞３５０の動きは下から上への運動となり、液体保持部１１Ｃ内で対流が発生して蛍光染色細胞３５０を含有する細胞懸濁液３００の撹拌が起きる。液体保持部１１Ｃの下部方向から上部方向への流れにより、沈降、凝集した蛍光染色細胞３５０が液体保持部１１Ｃの内部に均一に分散する。
【０１８４】
つまり、駆動手段２０は、吐出波形を駆動素子１３Ｃに加え、メンブレン１２Ｃの振動状態を制御することにより、液体保持部１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００をノズル１２１から液滴３１０として吐出させることができる。又、駆動手段２０は、撹拌波形を駆動素子１３Ｃに加え、メンブレン１２Ｃの振動状態を制御することにより、液体保持部１１Ｃに保持された細胞懸濁液３００を撹拌することができる。なお、撹拌時には、ノズル１２１から液滴３１０は吐出されない。
【０１８５】
このように、液滴３１０を形成していない間に細胞懸濁液３００を撹拌することにより、蛍光染色細胞３５０がメンブレン１２Ｃ上に沈降、凝集することを防ぐと共に、蛍光染色細胞３５０を細胞懸濁液３００中にムラなく分散させることができる。これにより、ノズル１２１の詰まり、及び吐出する液滴３１０中の蛍光染色細胞３５０の個数のばらつきを抑えることが可能となる。その結果、蛍光染色細胞３５０を含有する細胞懸濁液３００を、長時間連続して安定的に液滴３１０として吐出することができる。
【０１８６】
また、液滴形成装置１Ｃにおいて、液体保持部１１Ｃ内の細胞懸濁液３００中に気泡が混入する場合がある。この場合でも、液滴形成装置１Ｃでは、液体保持部１１Ｃの上部に大気開放部１１５が設けられているため、細胞懸濁液３００中に混入した気泡を、大気開放部１１５を通じて外気に排出できる。これによって、気泡排出のために大量の液を捨てることなく、連続して安定的に液滴３１０を形成することが可能となる。
【０１８７】
すなわち、ノズル１２１の近傍に気泡が混入した場合や、メンブレン１２Ｃ上に多数の気泡が混入した場合には吐出状態に影響を及ぼすため、長い時間安定的に液滴の形成を行うためには、混入した気泡を排出する必要がある。通常、メンブレン１２Ｃ上に混入した気泡は、自然に若しくはメンブレン１２Ｃの振動によって上方に移動するが、液体保持部１１Ｃには大気開放部１１５が設けられているため、混入した気泡を大気開放部１１５から排出可能となる。そのため、液体保持部１１Ｃに気泡が混入しても不吐出が発生することを防止可能となり、連続して安定的に液滴３１０を形成することができる。
【０１８８】
なお、液滴を形成しないタイミングで、液滴を形成しない範囲でメンブレン１２Ｃを振動させ、積極的に気泡を液体保持部１１Ｃの上方に移動させてもよい。
【０１８９】
−電気的又は磁気的な検出方法−
電気的又は磁気的な検出方法としては、図１９に示すように、液体保持部１１’から細胞懸濁液を液滴３１０’として細胞含有容器７００’に吐出する吐出ヘッドの直下に、細胞数計数のためのコイル２００がセンサとして設置されている。細胞は特定のタンパク質によって修飾され細胞に接着することが可能な磁気ビーズによって覆うことにより、磁気ビーズが付着した細胞がコイル中を通過する際に発生する誘導電流によって、飛翔液滴中の細胞の有無を検出することが可能である。一般的に、細胞はその表面に細胞特有のタンパク質を有しており、このタンパク質に接着することが可能な抗体を磁気ビーズに修飾することによって、細胞に磁気ビーズを付着させることが可能である。このような磁気ビーズとしては既製品を用いることが可能であり、例えば、株式会社ベリタス製のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）が利用可能である。
【０１９０】
センサの位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液滴吐出手段と細胞含有容器との間、もしくは細胞含有容器と液滴吐出手段との間以外の領域で、特に、液滴吐出手段の吐出面から液滴の吐出方向と反対方向の領域などが挙げられる。
液滴吐出手段の吐出面から液滴の吐出方向と反対方向の領域とは、液滴吐出を吐出する面の液滴吐出手段側の空間を意味している。
【０１９１】
＜＜吐出前に細胞を観測する処理＞＞
吐出前に細胞を観測する処理としては、図２０に示すマイクロ流路２５０中を通過してきた細胞３５０’をカウントする方法や、図２１に示す吐出ヘッドのノズル部近傍の画像を取得する方法などが挙げられる。図２０はセルソーター装置において用いられている方法であり、例えば、ソニー株式会社製のセルソーターＳＨ８００を用いることができる。図２０では、マイクロ流路２５０中に光源２６０からレーザー光を照射して散乱光や蛍光を、集光レンズ２６５を用いて検出器２５５により検出することによって細胞の有無や、細胞の種類を識別しながら液滴を形成することが可能である。本方法を用いることによって、マイクロ流路２５０中に通過した細胞の数から所定の凹部中に着弾した細胞の数を推測することが可能である。また、図２１に示す吐出ヘッド１０’としては、Ｃｙｔｅｎａ社のシングルセルプリンターを用いることが可能である。図２１では、吐出前において、ノズル部近傍をレンズ２６５’を介して、画像取得部２５５’において画像取得した結果からノズル部近傍の細胞３５０”が吐出されたと推定することや、吐出前後の画像から差分により吐出されたと考えられる細胞の数を推定することによって、所定の凹部中に着弾した細胞の数を推測することができる。図２０に示すマイクロ流路中を通過してきた細胞をカウントする方法では、液滴が連続的に生成されるのに対して、図２１は、オンデマンドで液滴形成が可能であるため、より好ましい。
【０１９２】
＜＜着弾後の細胞をカウントする処理＞＞
着弾後の細胞をカウントする処理としては、細胞懸濁液を分注した少なくとも一の凹部内の細胞数を計測する工程などが挙げられる。具体的には、細胞含有容器における凹部を蛍光顕微鏡などにより観測することにより、蛍光染色した細胞を検出する方法を取ることが可能である。この方法は、例えば、Ｓａｎｇｊｕｎ  ｅｔ  ａｌ．,  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ６（３），  ｅ１７４５５などに記載されている。
【０１９３】
液滴の吐出前及び着弾後に、細胞を観測する方法では、以下に述べる問題があるが、製造する細胞含有容器の種類によっては吐出中の液滴内の細胞を観測することがもっとも好ましい。吐出前に細胞を観測する手法においては、流路中を通過した細胞数や吐出前（および吐出後）の画像観測から、着弾したと思われる細胞数を計数するため、実際にその細胞が吐出されたのかどうかの確認は行われておらず、思いがけないエラーが発生することがある。例えば、ノズル部が汚れていることにより液滴が正しく吐出せず、ノズルプレートに付着し、それに伴い液滴中の細胞も着弾しない、といったケースが発生する。他にも、ノズル部の狭い領域に細胞が残留することや、細胞が吐出動作によって想定以上に移動し観測範囲外に出てしまうといった問題の発生も起こりうる。また、着弾後の細胞含有容器上の細胞を検出する手法においても問題がある。まず、容器として顕微鏡観察が可能であるものを準備する必要がある。観測可能な細胞含有容器として、一般的に底面が透明かつ平坦な容器、特に底面がガラス製となっている容器が用いられるが、特殊な細胞含有容器となってしまうため、一般的な凹部（例えば、ウェル）を使用することができなくなる問題がある。また、細胞数が数十個など多いときには、細胞の重なりが発生するため正確な計数ができなくなる問題もある。そのため、液滴の吐出後、かつ液滴の凹部への着弾前に、液滴に含まれる細胞数をセンサ及び粒子数（細胞数）計数手段によって計数することに加えて、吐出前に細胞を観測する処理、着弾後の細胞をカウントする処理を行うことが好ましい。
【０１９４】
細胞懸濁液を分注した少なくとも一の凹部内の細胞数を計測する工程としては、例えば、各凹部に対して底面側から画像を撮影し、２値化などの画像処理を行い細胞数を計測し、データファイルとして出力/保存する。
【０１９５】
また、細胞懸濁液を分注した少なくとも一の凹部内の細胞数を計測する工程に加えて、計測した前記細胞数と所定の細胞数との差分を算出する工程、算出した前記差分の細胞数を前記一の凹部内へインクジェット方式で分注する工程、をさらに含むことが好ましい。
計測した前記細胞数と所定の細胞数との差分を算出する工程は、計測されたデータから狙いの細胞数との差分を算出する。算出した差分データは、凹部の位置情報と紐付けておくことが好ましい。
算出した前記差分の細胞数を前記一の凹部内へインクジェット方式で分注する工程は、算出した差分の値に基づいて、各凹部にインクジェット方式で分注する。これにより、実際に凹部に分注された細胞数と狙い（所望）の細胞数とが異なってしまっている場合においても、インクジェット方式によって正確に狙いの細胞数になるように凹部へ細胞を吐出することができる。
計測した前記細胞数と所定の細胞数との差分を算出する工程、及び算出した前記差分の細胞数を前記一の凹部内へインクジェット方式で分注する工程は、少なくとも一の凹部内の細胞数を補正する目的で行う。
【０１９６】
また、着弾後の細胞のカウント結果を用いて、液体保持部に保持する細胞懸濁液の細胞濃度を調整する工程を更に含むことが好ましい。細胞懸濁液の細胞濃度を調整する工程を含むことによって、細胞を含まない液滴の吐出動作を抑制することができる。そのため、細胞懸濁液を構成する溶媒の無駄を少なくすることができ、動作時間を短縮することができる。
【０１９７】
また、受光素子としては１又は少数の受光部を有する受光素子、例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管を用いることが可能であるし、その他に２次元アレイ状に受光素子が設けられたＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｐｕｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、ゲートＣＣＤなど二次元センサを用いることも可能である。
１又は少数の受光部を有する受光素子を用いる際には、蛍光強度から細胞が何個入っているかを予め用意された検量線を用いて決定することも考えられるが、主として飛翔液滴中の細胞有無を二値的に検出することが行われる。細胞懸濁液の細胞濃度が十分に低く、液滴中に細胞が１個または０個しかほぼ入らない状態で吐出を行う際には、前記の二値的な検出で十分精度よく計数を行うことが可能である。細胞懸濁液中で細胞はランダムに配置していることを前提とすれば、飛翔液滴中の細胞数はポアソン分布に従うと考えられ、液滴中に細胞数が２個以上入る確率Ｐ（＞２）は下記式（１）で表される。図２２は、確率Ｐ（＞２）と平均細胞数の関係を表すグラフである。ここで、λは液滴中の平均細胞数であり、細胞懸濁液中の細胞濃度に吐出液滴の体積を乗じたものになる。
Ｐ（＞２）＝１−（１＋λ）×ｅ−λ  ・・・  式（１）
【０１９８】
二値的な検出で細胞数計数を行う場合には、確率Ｐ（＞２）が十分小さい値であることが精度を確保する上では好ましく、確率Ｐ（＞２）が１％以下となるλ＜０．１５であることが好ましい。光源としては、細胞の蛍光を励起できるものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、水銀ランプやハロゲンランプなどの一般的なランプに特定の波長を照射するようにフィルタをかけたものや、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）、レーザーなどを用いることが可能である。ただし、特に１ｎＬ以下の微小な液滴を形成するときには、狭い領域に高い光強度を照射する必要があるため、レーザーを用いるのが好ましい。レーザー光源としては、固体レーザーやガスレーザー、半導体レーザーなど一般的に知られている多種のレーザーを用いることが可能である。また、励起光源としては、液滴が通過する領域を連続的に照射したものであってもよいし、液滴の吐出に同期して液滴吐出動作に対して所定時間遅延を付けたタイミングでパルス的に照射するものであってもよい。
【０１９９】
＜液滴着弾工程＞
液滴着弾工程は、少なくとも１つの凹部に所定数の細胞が配置されるように液滴を着弾させる工程である。
所定数とは、任意に設定した数を意味する。ここでは、各凹部に配置する細胞数を任意に設定することを意味する。
所定数としては、例えば、細胞含有容器の全ての凹部に配置する細胞数を同じ数としてもよく、各凹部において同じ細胞数のグループ（水準とも称することがある）を複数設けるようにしてもよい。
配置とは、所定の位置に所定のものが配されることを意味する。
着弾とは、液滴を凹部に到達させることを意味する。
【０２００】
液滴を着弾させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、一の凹部に設定された所定数に達するまで液滴を配置した後に、他の凹部に設定された所定数に達するまで液滴を着弾させるようにすることを繰り返す方法、各凹部に設定された所定数に達するまで順次液滴を配置する方法などが挙げられる。
順次とは、次々に順序どおりにすることを意味する。
【０２０１】
図９では、本発明の細胞含有容器の製造方法において、凹部（凹部）が形成された細胞含有容器を移動可能なステージ上に固定し、ステージの駆動と吐出ヘッドとからの液滴形成を組み合わせることにより、凹部（凹部）に順次液滴を着弾させる。ここで、ステージの移動として細胞含有容器を移動させる方法を示したが、当然のことながら吐出ヘッドを移動させてもよい。
【０２０２】
図９は、細胞含有容器の凹部内に順次液滴を着弾させるための装置の一例を示す概略図である。
図９に示すように、液滴を着弾させるための装置（分注装置）２は、液滴形成手段１と、ステージ８００と、制御装置９００とを有している。
【０２０３】
細胞含有容器７００は、移動可能に構成されたステージ８００上に配置されている。細胞含有容器７００には液滴形成手段１の吐出ヘッドから吐出された液滴３１０が着弾する複数の凹部７１０（凹部）が形成されている。制御装置９００は、ステージ８００を移動させ、液滴形成手段１の吐出ヘッドとそれぞれの凹部７１０との相対的な位置関係を制御する。これにより、液滴形成手段１の吐出ヘッドからそれぞれの凹部７１０中に順次、蛍光染色細胞３５０を含む液滴３１０を吐出することができる。
【０２０４】
制御装置９００は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、メインメモリ等を含む構成とすることができる。この場合、制御装置９００の各種機能は、ＲＯＭ等に記録されたプログラムがメインメモリに読み出されてＣＰＵにより実行されることによって実現できる。ただし、制御装置９００の一部又は全部は、ハードウェアのみにより実現されてもよい。又、制御装置９００は、物理的に複数の装置等により構成されてもよい。
【０２０５】
吐出する液滴としては、凹部内に細胞懸濁液を着弾させる際に、複数の水準を得るように液滴を凹部内に着弾させることが好ましい。
複数の水準とは、標準となる複数の基準を意味する。
複数の水準としては、例えば、凹部ごとに特定の塩基配列を有する核酸を有する複数の細胞を異なる数で配置することで、細胞保持部材が所定の濃度勾配を有することを意味する。濃度勾配を有することにより、検量線用試薬として好適に使用することができる。複数の水準は、前記センサによって計数される値を用いて制御することができる。
【０２０６】
＜細胞懸濁液生成工程、及び液滴着弾工程における推定する細胞の数の確からしさを算出する工程＞
細胞懸濁液生成工程、及び液滴着弾工程における推定する細胞の数の確からしさを算出する工程は、細胞懸濁液生成工程、及び液滴着弾工程それぞれの工程における確からしさを算出する工程である。
当該推定する細胞の数の確からしさの算出は、細胞懸濁液生成工程における確からしさと同様に算出することができる。
なお、確からしさの算出タイミングは、図１のように細胞数計数工程の次工程で、纏めて算出してもよいし、細胞懸濁液生成工程、及び液滴着弾工程の各工程の最後に算出し、細胞数計数工程の次工程で各不確かさを合成して算出してもよい。言い換えれば、上記各工程での確からしさは、合成算出までに適宜算出しておけばよい。
【０２０７】
＜出力工程＞
出力工程は、凹部内に着弾した細胞懸濁液に含まれる細胞数を、センサにより測定された検出結果に基づいて粒子数計数手段にて計数された値を出力する工程である。
計数された値とは、センサにより測定された検出結果から、粒子数計数手段にて算出した当該凹部に含まれる合計の細胞数を意味する。
粒子数計数手段は、センサにより測定された細胞数を計数して合計値を算出する手段である。
出力とは、原動機、通信機、計算機などの装置が入力を受けて計数された値を外部の計数結果記憶手段としてのサーバに電子情報として送信することや、計数された値を印刷物として印刷することを意味する。
【０２０８】
出力工程は、細胞含有容器の製造時に、細胞含有容器における各凹部の細胞数を観察又は推測し、観測値又は推測値、外部の記憶部に出力する。
出力は、細胞数計数工程と同時に行ってもよく、細胞数計数工程の後に行ってもよい。
【０２０９】
＜記録工程＞
記録工程は、出力工程において、出力された観測値又は推測値を記録する工程である。
記録工程は、記録部において好適に実施することができる。
記録は、出力工程と同時に行ってもよく、出力工程の後に行ってもよい。
記録とは、記録媒体に情報を付与することだけでなく、記録部に情報を保存することも含む意味である。
【０２１０】
次に、前記細胞懸濁液の分注をディスペンサによる分注を行った後にインクジェット法による分注を行う場合について、本発明の細胞含有容器の製造方法の一例を示すフローチャートを図５Ｃに示すと共に、各工程（ステップ）について以下に説明する。
図５Ｃは、本発明の細胞含有容器の製造方法の一例を示すフローチャートである。図５Ｃは、前記ディスペンサによる分注を行った後にインクジェット法による分注を行う場合について説明する図であり、図５Ａに示すＳ１０１の前にディスペンサによる細胞懸濁液の分注の工程を入れる以外は、前記インクジェット法のみで分注を行う場合における分注を行う場合と同様である。
【０２１１】
ステップＳ２０１では、少なくとも一の凹部内へ細胞懸濁液をディスペンサで分注する。
ステップＳ１０１におけるディスペンサによる分注は、図２６Ａから図２６Ｄに示すような動作で行う。
図２６Ａに示すように、ディスペンサによる分注では、ピペットチップ１００２を装着したディスペンサヘッド１００１と、予め所定の濃度に調整した細胞懸濁液（分注液）１００３を貯留するリザーバー１００４とを用いる。
まず、図２６Ｂに示すように、ディスペンサヘッド１００１を下降させてリザーバー１００４に貯留している細胞懸濁液１００３を各ピペットチップ１００２に吸引する。このとき、図２６Ｃに示すように、必要な分注量に対して余剰の細胞懸濁液１００３をリザーバー１００４に入れておくことにより、ピペットチップ１００２への吸引量のばらつきや、ピペット容積のばらつきによる気泡の巻き込みなどを防止することができる。気泡を巻き込んでしまうと、細胞懸濁液１００３を凹部へ分注した際に、凹部内の観察、撮影、及び細胞数の計数に支障がでる可能性がある。また、吸引動作においては、凹部へ分注するのに必要な細胞懸濁液の量よりも、余剰にピペットチップ１００２内に細胞懸濁液１００３を吸引することが好ましい。余剰の量の細胞懸濁液をピペットチップ１００２内に吸引することにより、ピペットチップ１００２内の細胞懸濁液１００３を全て排出するときに、凹部内に気泡を混入させることを防止することができる。
次に、図２６Ｄに示すように、吸引動作後のディスペンサヘッド１００１を対象の凹部上へ移動させ、各凹部に吸引した細胞懸濁液１００３を所望の量分注する。
【０２１２】
ステップＳ２０２では、少なくとも一の凹部内へ分注した細胞数を計数する。凹部内の細胞数の計数の方法としては、上述した方法と同様の方法を用いることができる。
【０２１３】
ステップＳ２０３では、少なくとも一の凹部内の細胞数が所定値に達しているか否か判定する。即ち、ステップＳ２０３では、ステップＳ２０２で計数した少なくとも一の凹部内へ分注した（凹部内に実際に存在する）細胞数が所定値（設定した数）に達していないと判定すると、処理をＳ１０１へ移行させ、少なくとも一の凹部内に分注した細胞数が所定値に達していると判定すると、処理を終了する。
ステップＳ１０１以降の処理は、前記細胞懸濁液の分注をインクジェット法による分注のみで行う場合と同様であるため、説明を省略する。
【０２１４】
前記細胞懸濁液の分注を、ディスペンサによる分注を行った後にインクジェット法による分注を行うことにより、生産性を向上させつつ、デッドボリュームを小さくすることができる。
【０２１５】
本発明の細胞含有容器の製造方法により製造される細胞含有容器は、バイオ関連産業、ライフサイエンス産業、及び医療産業等において幅広く使用され、例えば、細胞を用いた評価試験などの用途等に好適に用いることができる。
【０２１６】
（細胞チップ）
本発明の細胞チップは、細胞が収容された少なくとも２つの凹部を有する細胞チップであって、前記凹部は第一の細胞種を含む第１の凹部と第二の細胞種を含む第２の凹部とを少なくとも有し、前記凹部間の最小中心間距離が５．０ｍｍ以下である。
【０２１７】
本発明の細胞チップにおける細胞としては、第一の細胞種と第二の細胞種の少なくとも２種の細胞であれば特に制限はなく、本発明の細胞含有容器に用いられる細胞と同様のものを用いることができるため記載を省略する。
また、本発明の細胞チップにおける凹部としては、第一の細胞種を含む第１の凹部と、第二の細胞種を含む第２の凹部とを少なくとも有していれば特に制限はなく、本発明の細胞含有容器の凹部と同様のものを用いることができるため記載を省略する。
さらに、本発明の細胞チップにおける凹部間の最小中心間距離としては、本発明の細胞含有容器における最も近くで隣接する２つの凹部の中心間の最短距離と同様の意味であるため、詳細な説明については記載を省略する。
【実施例】
【０２１８】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【０２１９】
（製造例１）
＜細胞含有容器１の作製＞
−細胞分散液Ａの調製例−
ヒトから作成したｉＰＳ細胞Ａを１０ｃｍディッシュに播き、Ｓｔｅｍｆｉｔ  ＡＫ０２Ｎ（味の素株式会社製）で７日間、３７℃で培養後、ｉＰＳ細胞Ａを剥離し、２４ウェルプレートに再度播種する際に、培地をＥｌｉｘｉｒｇｅｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＱｕｉｃｋ−Ｎｅｕｒｏｎ  Ｍｉｘｅｄ  ＳｅＶ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｋｉｔ内のＭｅｄｉｕｍ  Ｎ９に変更し、最終濃度が０．１％になるようにＥｌｉｘｉｒｇｅｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＱｕｉｃｋ−Ｎｅｕｒｏｎ  Ｍｉｘｅｄ  ＳｅＶ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｋｉｔ内のＤ１溶液を添加し、２日間、３３℃、５％ＣＯ２濃度で培養することにより、神経細胞に分化誘導を開始した。培養３日目にディッシュから細胞を剥離し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液に分散させ細胞分散液Ａを調製した。なお、ｉＰＳ細胞Ａは、神経細胞Ａへの分化に際して、遊離のＧＦＰタンパク質を発現するように遺伝子改変が行われている。
【０２２０】
−細胞分散液Ｂの調製例−
細胞分散液Ａの調製例において、異なるヒトから作成したｉＰＳ細胞Ｂを用いた以外は、細胞分散液Ａの調製例と同様にして、細胞分散液Ｂを調製した。なお、ｉＰＳ細胞Ｂは、神経細胞Ｂへの分化に際して、遊離のＧＦＰタンパク質を発現するように遺伝子改変が行われている。
【０２２１】
−細胞の凹部への配置、充填−
各凹部にＥｌｉｘｉｒｇｅｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＱｕｉｃｋ−Ｎｅｕｒｏｎ  Ｍｉｘｅｄ  ＳｅＶ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｋｉｔ内のＭｅｄｉｕｍ  Ｎ９を２００μＬ分注した３８４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、最短ピッチ：４．５ｍｍ）を、自動分注装置（Ａｇｉｌｅｎｔ社のＢｒａｖｏ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ製、ディスペンサ方式）のステージ上に設置する。ウェルプレートを装置に設置前に、ＵＶランプを１５分間ほど照射して装置内を滅菌する。
自動分注装置により３８４ウェルプレートの中心部の９６ウェル分の凹部に対して、細胞分散液Ａ（細胞濃度５×１０５個／ｍＬ）及び細胞分散液Ｂ（細胞濃度５×１０５個／ｍＬ）をそれぞれ、１６箇所ずつに細胞数が５００個、１，０００個、１，５００個となるように分注し（図５Ｃ中のＳ２０１）、充填を行った。このとき、続けて充填を行った凹部内の細胞数を計数し（図５Ｃ中のＳ２０２）、所定数に達しているか判定させた（図５Ｃ中のＳ２０３）。
自動分注装置によって凹部内へ分注された細胞数が所定の数に達していない場合には、インクジェット装置による細胞分散液Ａ及び細胞分散液Ｂの分注処理を行った（図５Ｃ中のＳ１０１）。
インクジェット装置（開発装置名：ＩＪ−ＭＩＮＩ、株式会社リコー）に、調製した細胞分散液Ａ及び細胞分散液Ｂをそれぞれ充填した吐出ヘッドを設置し、凹部中心への着滴位置合わせ、吐出安定のための調整を行い、インクジェット装置の調整を行った。
インクジェット装置の調整後、３８４ウェルプレートの中心部の９６ウェル分の凹部に対して、細胞分散液Ａ及び細胞分散液Ｂをそれぞれ、上述で充填を行った９６ウェル分の凹部に対して、それぞれの凹部内の細胞数の計数結果を参照しながら、所定値との差分をインクジェット方式で吐出し、細胞を充填した。なお、細胞分散液Ａ及び細胞分散液Ｂの吐出においては、吐出後かつ飛翔中の液滴中の細胞数をレーザ光で計数し（図５Ｃ中のＳ１０２）、さらに、着弾後の凹部内における細胞数を顕微鏡で計数し（図５Ｃ中のＳ１０４）、「吐出後の液滴中の細胞数」及び「着弾後の凹部内における細胞数」が所定の細胞数に達していない場合には、図５ＣのステップＳ１０３及びＳ１０５に示すような補正処理を行いながら、充填を行った（図５Ｃ中のＳ１０６）。充填終了後に、ウェルプレートを５％ＣＯ２インキュベータ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ社製）で３０分間培養し、ウェルプレートへの接着を促した。３０分間培養後にウェルプレートの細胞を充填した凹部と、細胞を充填した凹部の周囲の凹部にも２００μＬずつＥｌｉｘｉｒｇｅｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＱｕｉｃｋ−Ｎｅｕｒｏｎ  Ｍｉｘｅｄ  ＳｅＶ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｋｉｔ内のＭｅｄｉｕｍ  Ｎ９培地を分注して、４日間、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養し、細胞含有容器１を製造した。
【０２２２】
−細胞数計数−
４日間培養後のウェルプレートを蛍光顕微鏡（カールツァイス株式会社製、Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｄ１）にて、各凹部に対して４８８ｎｍの励起光を照射することにより蛍光顕微鏡観察を行った。蛍光顕微鏡観察により得られた画像を画像処理ソフトウェアであるＩｍａｇｅ  Ｊを用いて２値化画像を作成して細胞数を計数した。得られた結果から平均値ｘ、標準偏差ｓ、及び充填精度ＣＶ値を算出した。結果を表２に示す。
【０２２３】
【表２】
2019216708.tif 000005
【０２２４】
（製造例２）
＜細胞含有容器２の作製＞
−細胞分散液Ｃの調製例−
ヒトから作成したｉＰＳ細胞Ｃを１０ｃｍディッシュに播き、Ｓｔｅｍｆｉｔ  ＡＫ０２Ｎ（味の素株式会社）で７日間、３７℃で培養後、ｉＰＳ細胞Ｃを剥離し、２４ウェルプレートに再度播種する際に、培地をＥｌｉｘｉｒｇｅｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＱｕｉｃｋ−Ｎｅｕｒｏｎ  Ｍｉｘｅｄ  ＳｅＶ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｋｉｔ内のＭｅｄｉｕｍ  Ｎ９に変更し、最終濃度が０．１％になるようにＥｌｉｘｉｒｇｅｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＱｕｉｃｋ−Ｎｅｕｒｏｎ  Ｍｉｘｅｄ  ＳｅＶ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｋｉｔ内のＤ１溶液を添加し、２日間、３３℃、５％ＣＯ２濃度で培養することにより、神経細胞Ｃに分化誘導を開始した。培養３日目にディッシュから細胞を剥離し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液に分散させ細胞分散液Ｃを調製した。
【０２２５】
−細胞分散液Ｄの調製例−
細胞分散液Ｃの調製例において、異なるヒトから作成したｉＰＳ細胞Ｄを用いた以外は、細胞分散液Ｃの調製例と同様にして、細胞分散液Ｄを調製した。
【０２２６】
−容器の準備−
最短ピッチが２．２５ｍｍとなるように、直径１．５ｍｍの孔を１９２個空いたジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）のシート（商品名：Ｓｙｌｇａｒｄ（登録商標）  １８４、東レ・ダウコーニング社製、２５ｍｍ×７５ｍｍ×ｈ０．７５ｍｍになるように成型加工と１００℃４０分の加熱硬化で作製）を、ポリスチレン製のプラスチックスライド（パーノマックス社製）とを、１００％エタノールに５分間浸漬させて滅菌処理する。滅菌したＰＤＭＳシートとプラスチックスライドを濡れている状態で貼り合わせ、常温で乾燥させる。以下、貼り合わせたものを容器と称する。
【０２２７】
ＰＢＳにｉＭａｔｒｉｘ５１１（株式会社ニッピ社製）を最終濃度１．５μＬ／１００μＬになるように希釈し細胞接着性材料を調製し、よく混合撹拌した後、１．０μＬ／凹部の細胞接着製材料を滴下し、４℃、８時間〜１２時間静置（又は３７℃のインキュベータで２時間静置）する。
容器を所定の時間静置後、凹部内の乾燥に注意しつつ液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄操作を行った後、Ｎ９培地を２００μＬずつ滴下する。
【０２２８】
−細胞の凹部への充填−
製造した容器を、インクジェット装置（開発装置名：ＩＪ−ＭＩＮＩ、株式会社リコー）のステージに設置し、ＵＶランプを１５分間ほど照射して装置内を滅菌する。
インクジェット装置に、調製した細胞分散液Ｃ及び細胞分散液Ｄをそれぞれ充填した吐出ヘッドを設置し、凹部中心への着滴位置合わせ、吐出安定のための調整を行い、インクジェット装置の調整を行った。
インクジェット装置の調整後、容器の中心部の９６ウェル分の凹部に対して、細胞分散液Ｃ及び細胞分散液Ｄをそれぞれ、１６箇所ずつに５００滴、１，０００滴、１，５００滴吐出し、充填を行った。充填終了後に、容器を５％ＣＯ２インキュベータ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ社製）で３０分間培養し、容器への接着を促した。３０分間培養後に容器の細胞を充填した凹部と、細胞を充填した凹部の周囲の凹部にも２００μＬずつＮ９培地（ＥＬＩＸＩＲＧＥＮ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を分注して、４日間、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養し、細胞含有容器２を製造した。
【０２２９】
−細胞数計数−
４日間培養後の細胞含有容器の各凹部の培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、細胞含有容器のＰＤＭＳシートを剥がし取る。細胞培養を行った９６か所の凹部の全体を囲むようにパップペン（商品名：スーパーパップペン  リキッドブロッカー、コスモ・バイオ株式会社製）で枠を作製し、枠内に４％パラホルムアルデヒド５００μＬ滴下し、１０分間、４℃で固定後、４％パラホルムアルデヒドを抜き取り、ＰＢＳを２００μＬにより洗浄を行う。
【０２３０】
次に、最終濃度が１０％となるようにＮｏｒｍａｌ  Ｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と、最終濃度が１％となるようにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（富士フィルム和光純薬株式会社製）をＰＢＳに添加したブロッキング溶液を５００μＬスライドに滴下し、遮光、保湿しながら１時間静置してブロッキングを行った。次に、１次抗体としてａｎｔｉ−ｂｅｔａ−ＩＩＩ  Ｔｕｂｌｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（製品名：Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉ−Ｔｕｂｕｌｉｎ  Ｂｅｔａ  ３（ＴＵＢＢ３）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を、ＰＢＳで５，０００倍希釈し１次抗体希釈液を調製した。スライドをＰＢＳで洗浄した後、１次抗体希釈液を２００μＬ滴下し、４℃、一晩静置する。
次に、最終濃度が３％となるようにＮｏｒｍａｌ  Ｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍと、最終濃度が０．２％となるようにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加した溶液で、２次抗体としてＡｌｅｘａ  ５５５  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ−ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ社製）を５００倍希釈し、２次抗体希釈液を調製した。スライドをＰＢＳで洗浄した後、２次抗体希釈液を２００μＬ滴下し、遮光した状態で４℃、１時間静置する。
次に、ＰＢＳで洗浄を行った後に、１００％エタノールで滅菌したカバースリップにＤＡＰＩ入の封入液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を塗り、スライドの上に載せ、４℃、１時間静置する。
【０２３１】
作製したスライドに、蛍光顕微鏡を用いて、３６４ｎｍ、５５５ｎｍの励起光を照射し、核とチューブリンが染色されていることを確認し、スライドの蛍光顕微鏡画像を取得した。
得られた画像を画像処理ソフトウェアであるＩｍａｇｅ  Ｊを用いて、各凹部内の細胞数を計数した。得られた結果から平均値ｘ、標準偏差ｓ、及び充填精度ＣＶ値を算出した。結果を表３に示す。
【０２３２】
【表３】
2019216708.tif 000006
【０２３３】
（製造例３）
製造例２において、細胞の凹部への充填を手技（マルチチャンネルピペット、商品名：Ｐ８Ｘ１０Ｌ、ギルソン社製）を用いて所定の細胞数を各凹部に充填した以外は、製造例２と同様にして、細胞含有容器３を製造した。結果を表４に示す。
【０２３４】
【表４】
2019216708.tif 000007
【０２３５】
（実施例１）
＜薬効スクリーニング＞
製造例２において、細胞を凹部へ充填した後の培養３日目において、Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（富士フィルム和光純薬株式会社製）をＤＭＳＯに溶解して２，０００μＭの薬剤溶液を調製し、最終濃度が０．１μＭ、０．３μＭ、１．０μＭ、３μＭ、又は１０μＭになるように、各凹部へ１０μＬチップを用いたピペット（商品名：ピペットマン、エッペンドルフ社製）を用いて添加した。このとき使用した薬剤溶液は５０ｐＬ〜５０００ｐＬであった。
【０２３６】
薬剤溶液を添加した翌日に、細胞含有容器の各凹部の培地を除去し、室温のＨａｎｋ’ｓ平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）２００μＬで各凹部を洗浄する。洗浄後、ＨＢＳＳでＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ、コスモ・バイオ株式会社製）、Ｃａｌｓｅｉｎ  ＡＭ（タカラバイオ株式会社製）をそれぞれ１，０００倍希釈した染色液混合液を調製し、調製した染色液混合液を２００μＬずつ添加する。５％ＣＯ２インキュベータにて２０分間静置する。
【０２３７】
染色終了後の細胞含有容器を、蛍光顕微鏡を用いて蛍光顕微鏡画像を取得した。得られた蛍光顕微鏡画像を画像処理ソフトウェアであるＩｍａｇｅ  Ｊを用いて処理し、細胞数及び死細胞数を計数した。結果を下記表５に示す。
【０２３８】
【表５】
2019216708.tif 000008
【０２３９】
本発明の細胞含有容器を用いて薬効スクリーニングを行う場合、細胞及び死細胞の数の比率として薬剤有効率を定量化することができるため、凹部間の細胞数にばらつきが生じていても（実施例１では、ＣＶ値２０％以程度の細胞含有容器）定量評価を行うことができる。また、本発明の細胞含有容器は、凹部当たりの体積が小さいため、一回の試験に使用する試薬（細胞及び薬剤など）の量を少なくすることができる。即ち、サンプルを大量に使用することなく、定量解析を行うために必要な実験データを一つの容器で効率よく得ることができる。
【０２４０】
（実施例２）
＜細胞毒性評価＞
−細胞生存率−
製造例２の評価用容器に、被験物質として、０μＭ、１００μＭ、１６０μＭ、及び２２０μＭの４つの濃度条件の塩化亜鉛をそれぞれ添加したＮ９培地（ＥＬＩＸＩＲＧＥＮ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）をマイクロピペットで１００μＬ加え、一晩（２０時間）、３７℃のＣＯ２インキュベータ内に静置した。
次に、塩化亜鉛による細胞生存率への影響を評価するため、ＷＳＴ−１試薬（商品名：Ｐｒｅｍｉｘ  ＷＳＴ−１  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、タカラバイオ株式会社製）を１ウェル（凹部）あたり１０μＬ添加し、１時間、３７℃のＣＯ２インキュベータに静置して反応させた。その後、プレートリーダー（装置名：Ｃｙｔａｔｉｏｎ５、ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いて、４５０ｎｍ、リファレンスの値として５７０ｎｍの吸光度を測定して、「細胞生存率」を評価した。結果を図２３に示す。
【０２４１】
（細胞膜損傷率）
細胞生存率の評価と同様にして、塩化亜鉛を添加した前述のＮ９培地を添加して、一晩（２０時間）、３７℃のＣＯ２インキュベータ内に静置した。
塩化亜鉛による細胞膜損傷への影響を評価するため、マイクロピペットを用いて、培地のみ回収し、９６ウェルの細胞含有容器に入れ、さらに、ＬＤＨ測定試薬（商品名：Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ社製）をそれぞれ添加し、室温（２３℃）にて５分間反応させた。その後、プレートリーダーを用いて４９２ｎｍ、リファレンスの値として６２０ｎｍの吸光度を測定して、「細胞膜損傷率」を評価した。結果を図２４に示す。
【０２４２】
（炎症物質の分泌量）
細胞生存率の評価と同様にして、塩化亜鉛を添加したＮ９培地（ＥＬＩＸＩＲＧＥＮ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加して、一晩（２０時間）、３７℃のＣＯ２インキュベータ内に静置した。
塩化亜鉛による炎症物質の分泌量への影響を評価するため、マイクロピペットを用いて、培地のみ回収した。タンパク質測定キット（商品名：Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−８  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！（登録商標）、ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて、ＥＬＩＳＡ法にてＩＬ−８の分泌量を、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍ、リファレンスの値として５７０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図２５に示す。
【０２４３】
図２３から図２５の結果からも分かるように、製造例２における細胞含有容器２における神経細胞Ｃ及び神経細胞Ｄとでは、塩化亜鉛に対する細胞生存率、細胞膜損傷率、及び炎症物質の分泌量がほぼ同様の毒性反応の傾向を示した。これらの結果より、本発明の細胞含有容器は、毒性反応を効率よく評価するために有効であることが分かる。
【０２４４】
本発明の態様は、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  少なくとも２つの凹部を有し、前記凹部が細胞を含み、
前記細胞の種類が容器に対して少なくとも２種であり、
最も近くで隣接する２つの前記凹部の中心間の最短距離が、９．０ｍｍ以下であることを特徴とする細胞含有容器である。
＜２＞  前記凹部が液体を含み、前記容器に対する前記液体の総液量が１０．０μＬ以下である前記＜１＞に記載の細胞含有容器である。
＜３＞  前記凹部に含まれる前記細胞の数の充填精度が、３０％以下である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の細胞含有容器である。
＜４＞  前記凹部に含まれる前記細胞の数の充填精度が、１５％以下である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の細胞含有容器である。
＜５＞  前記細胞が、ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ（ｉＰＳ）細胞、ｉＰＳ細胞由来の分化細胞、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ（ＥＳ）細胞、ＥＳ細胞由来の分化細胞、及び人体から取得した幹細胞の少なくともいずれかである前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の細胞含有容器である。
＜６＞  前記２つの凹部の中心間の最短距離が、４．５ｍｍ以下である前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の細胞含有容器である。
＜７＞  前記２つの凹部の中心間の最短距離が、２．２５ｍｍ以下である前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の細胞含有容器である。
＜８＞  前記凹部が、細胞培養液をさらに含む前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の細胞含有容器である。
＜９＞  前記細胞含有容器を識別する識別手段と、
前記細胞含有容器の情報及び前記凹部に含まれている前記細胞に関する情報の少なくともいずれかを記憶する記憶手段と、をさらに有する前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の細胞含有容器である。
＜１０＞  前記細胞の情報が、細胞の種類、細胞の分化履歴、前記凹部内の細胞数、及び前記凹部内の細胞の生存率の少なくともいずれかである前記＜９＞に記載の細胞含有容器である。
＜１１＞  前記記憶手段が、前記容器とは分離している前記＜９＞から＜１０＞のいずれかに記載の細胞含有容器である。
＜１２＞  前記識別手段が、前記容器上に設けられている前記＜９＞から＜１１＞のいずれかに記載の細胞含有容器である。
＜１３＞  前記識別手段が、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、Ｒａｄｉｏ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＲＦＩＤ）、文字、記号、図形、及び色の少なくともいずれかである前記＜９＞から＜１２＞のいずれかに記載の細胞含有容器である。
＜１４＞  前記凹部毎に、前記細胞を１種ずつ有する前記＜１＞から＜１３＞のいずれかに記載の細胞含有容器である。
＜１５＞  前記＜１＞から＜１４＞のいずれかに記載の細胞含有容器の製造方法であって、少なくとも２つの凹部への、細胞を含む細胞懸濁液の分注において、インクジェット法で行う工程を含むことを特徴とする細胞含有容器の製造方法である。
＜１６＞  前記インクジェット法におけるインクジェットヘッドが、
前記細胞懸濁液を保持する液体保持部と、前記細胞懸濁液に振動を付与して液滴を吐出する膜状部材と、前記液体保持部を大気に開放する大気開放部とを少なくとも有する前記＜１５＞に記載の細胞含有容器の製造方法である。
＜１６＞  前記インクジェットヘッドを少なくとも２つ有し、同時又は交互に使用する前記＜１６＞に記載の細胞含有容器の製造方法である。
＜１７＞  前記細胞懸濁液を分注した少なくとも一の凹部内の細胞数を計測する工程を更に含む前記＜１５＞から＜１６＞のいずれかに記載の細胞含有容器の製造方法である。
＜１８＞  計測した前記細胞数と、所定の細胞数との差分を算出する工程と、
算出した前記差分の細胞数を前記一の凹部内へインクジェット方式で分注する工程と、をさらに含む前記＜１５＞から＜１７＞のいずれかに記載の細胞含有容器の製造方法である。
＜２０＞  前記細胞懸濁液の細胞の濃度を調整する工程をさらに含む前記＜１５＞から＜１７＞のいずれかに記載の細胞含有容器の製造方法である。
＜２１＞  前記少なくとも２つの凹部への、前記細胞を含む前記細胞懸濁液の分注において、ディスペンサによる分注を行った後に、インクジェット法による分注を行うことを含む前記＜１５＞から＜２０＞のいずれかに記載の細胞含有容器の製造方法である。
＜２２＞  細胞が収容された少なくとも２つの凹部を有する細胞チップであって、
前記凹部は第一の細胞種を含む第１の凹部と第二の細胞種を含む第２の凹部とを少なくとも有し、
前記凹部間の最小中心間距離が５．０ｍｍ以下であることを特徴とする細胞チップである。
【０２４５】
前記＜１＞から＜１４＞のいずれかに記載の細胞含有容器、前記＜１５＞から＜２１＞に記載の細胞含有容器の製造方法、及び前記＜２２＞に記載の細胞チップによると、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。
【符号の説明】
【０２４６】
１      細胞含有容器
２      容器（基材）
３      凹部
４      細胞
６      識別手段
【先行技術文献】
【特許文献】
【０２４７】
【特許文献１】特開２０１５−４７０７７号公報
【特許文献２】特開２０１０−１１２８３９号公報
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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