(57)【要約】【課題】４，４−二置換シクロヘキシル架橋ヘプタメチンシアニン色素およびその使用を提供すること。【解決手段】本発明は、蛍光性シアニン色素を含む化合物のファミリーに関する。上記化合物は、ポリメチン発色団の一部として４，４−二置換シクロヘキシル環を有する近赤外吸収性のヘプタメチンシアニン色素である。化合物は、一般に親水性であり、タンパク質、核酸および治療用小分子などの生体分子に化学的に連結され得る。上記化合物は、様々な医学的、生物学的および診断的用途でのイメージングのために使用され得る。一実施形態では、上記化合物は、約５００ｎｍ〜約１１００ｎｍの範囲、好ましくは約６００ｎｍ〜約９００ｎｍの範囲の吸収および発光波長を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９８，５６２号の利益および優先権を主張する。この米国仮特許出願の全内容が、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、４，４−二置換シクロヘキシル架橋部分を含むポリメチン架橋となる新しい蛍光性色素のための組成物および方法を提供する。新しい組成物は、一般に、色素に高い親水性を付与する複数のスルホン酸またはスルホネート基を含有しており、様々な医学的、診断的および生物学的用途において使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
背景
光学イメージング方法には、他のイメージング方法を上回るいくつかの利点がある。このようなイメージングでは、典型的に、赤色および近赤外（ＮＩＲ）範囲（６００〜１２００ｎｍ）の光を使用して、組織透過性を最大限にし、天然の生物学的吸収剤、例えばヘモグロビンおよび水による吸収を最小限に抑える。光学イメージングにより、高い感受性を提供することができ、試験対象または実験技師を電離放射線に曝露する必要がなくなり、複数の識別可能なプローブ（分子イメージングにおいて重要となり得る）を同時に使用され得、機能的イメージングおよびｉｎ  ｖｉｖｏ顕微鏡においてそれぞれ重要な、高い時間および空間分解能が提供される。
【０００４】
蛍光イメージングでは、規定帯域幅を有するフィルタ光またはレーザーが、励起光源として使用される。励起光は、身体組織中を移動し、レポーター分子（例えば、コントラスト剤またはイメージングプローブ）に遭遇すると、その光は吸収される。次に、レポーター分子は、励起光とは検出可能に異なる特性を有する光を放出する。次に、放出されて生じた光を使用して、画像を構築することができる。ほとんどの光学イメージング技術は、レポーター分子として有機および無機蛍光性色素を使用することに依存している。
【０００５】
蛍光性色素は、一般に公知であり、蛍光顕微鏡法、蛍光免疫アッセイおよびフローサイトメトリーなどの手順によって、様々な生物学的および非生物学的材料の蛍光標識および検出に使用される。このような材料を蛍光性色素で標識するための典型的な方法は、色素分子上の適切な基と、標識される材料上の適合性のある基との結合を用いて蛍光性複合体を作り出すことである。このように、例えば細胞、組織、アミノ酸、タンパク質、抗体、薬物、ホルモン、ヌクレオチド、核酸、脂質および多糖等の材料は、化学的に標識され、検出もしくは定量化されてよいか、または標的材料に特異的に結合することができ、かつ蛍光検出方法によって検出され得る蛍光プローブとして使用されてよい。明るい蛍光性色素によって、高い感度を有する結合材料の検出または局在化が可能になる。
【０００６】
生物学的および生物医学的研究のための検出可能な標識が必要である。ｉｎ  ｖｉｖｏで使用されるクエンチされたプローブのために十分に働く色素は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの利用において常に有効であるわけではない。ある場合には、タンパク質または生体分子上にこれらのフルオロフォアの二つ以上が存在することによって、検出を妨害する著しいクエンチが生じる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で使用することができ、分子を過剰にクエンチしない色素が必要である。高い可溶性の親水性蛍光性色素は、目的
の標識細胞、タンパク質および他の生体分子の移動および機能を追跡することもできる。ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで過剰にクエンチしない新しいクラスの色素により、生物学的研究に利用可能なツールを増やすことができる。
【０００７】
それにも関わらず、様々な医学的、診断的および生物学的用途で使用できる新しい色素が、現在も必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、４，４−二置換シクロヘキシル架橋部分を含むポリメチン架橋を有する新しい蛍光性色素を生成可能であるという発見に、部分的に基づく。これらの色素は、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏイメージング用途で使用され得る。
【０００９】
ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、式（ＩＩ）
Ｚ１−（ＰＭＢ）−Ｚ２（ＩＩ）
およびその塩によって表され得る
［Ｚ１およびＺ２は、それぞれ独立に、置換または非置換インドリニウムまたはベンゾインドリウム（ｂｅｎｚｉｎｄｏｌｉｎｉｕｍ）環から選択することができ、ＰＭＢは、４，４−二置換シクロヘキシル架橋部分を含むポリメチン架橋を表す］。他の実施形態では、化合物は、約５００ｎｍ〜約１１００ｎｍの範囲、好ましくは約６００ｎｍ〜約９００ｎｍの範囲の吸収および発光波長を有する。ある特定の実施形態では、色素は、約６００ｎｍ〜約８５０ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約９００ｎｍ、または約６５０ｎｍ〜約８５０ｎｍの範囲の波長を有する光を吸収および／または放出する。
【００１０】
一態様では、本発明は、一般に式Ｉによって表され得る蛍光色素化合物のファミリーを提供する。
【化１】
2019151665.tif 000002
【００１１】
ある特定の実施形態では、本発明は、式ＩＩＩ：［ＢＭ］ｎ−Ｆｍによって表される生体適合性のある蛍光性分子であり、ＢＭは、生体分子であり、Ｆは、既に記載したフルオロフォアである。他の実施形態では、本発明は、以下の構造式ＩＶａ〜ＩＶｄのいずれか一つによって表される、生体適合性のある蛍光性生体分子であり、ＢＭは、生体分子である。
【化２】
2019151665.tif 000003
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏ光学イメージング方法を提供する。該方法は、（ａ）対象、例えば動物またはヒトに、本発明の蛍光色素化合物を投与するステップと、（ｂ）蛍光色素化合物を、対象内に分布させるか、または生物学的標的と接触させ、もしくは相互作用させるステップと、（ｃ）対象を、電磁放射線、例えば蛍光色素化合物によって吸収可能な波長の光に曝露するステップと、（ｄ）蛍光色素化合物によって放出された光学シグナルを、例えば内視鏡、カテーテル、断層撮影システム、平面もしくは反射システム、手持ち式の光学イメージングシステム、または術中システムおよび顕微鏡を用いて検出するステップとを含む。化合物によって放出されたシグナルは、画像化される領域または構造の画像、例えば断層画像を構築するために使用され得る。蛍光色素化合物は、生体分子に化学的に連結されている蛍光色素を含み得ると理解される。
【００１３】
先のステップは、所定の間隔で反復され、それによって対象における蛍光性化合物の放出されたシグナルを経時的に評価することができる。ある特定の実施形態では、シグナル特性が識別可能な２種類またはそれより多くの種類の化合物を対象に投与することができ、それらの化合物の発光特性は、対象における二つまたはそれより多くの特色を画像化するために使用され得る。
【００１４】
開示の方法は、疾患、例えば骨疾患、がん、心血管疾患、皮膚疾患、環境疾患、免疫疾患、感染性疾患、炎症、遺伝性疾患、代謝性疾患、神経変性疾患、眼疾患、および呼吸器疾患を検出および／またはモニタするために使用され得る。
【００１５】
ある特定の実施形態では、細胞は、本明細書に記載の蛍光色素化合物で標識され、得られた標識細胞は、対象に投与される。蛍光色素化合物によって放出されたシグナルは、細胞の輸送および局在をモニタするか、または細胞治療の有効性を評価するために使用され得る。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ光学イメージング方法を提供する。該方法は、（ａ）試料、例えば生物学的試料を、本発明の蛍光色素化合物と接触させるステップと、（ｂ）蛍光色素化合物を、生物学的標的によって活性化するか、または生物学的標的に結合させるステップと、（ｃ）任意選択により、結合していない蛍光色素化合物を除去するステップと、（ｄ）試料を、電磁放射線、例えば蛍光色素化合物によって吸収可能な波長の光に曝露するステップと、（ｅ）蛍光色素化合物から放出されたシグナルを検
出し、それによって蛍光色素化合物が生物学的標的によって活性化されたか、または生物学的標的に結合したかを決定するステップとを含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
式Ｉ−Ａによって表される蛍光性化合物
【化５７】
2019151665.tif 000004
またはその塩であって、式中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＣ（Ｃ１〜４アルキル）２であり、
Ｗ１およびＷ２は、ベンゾ、ナフトまたはピリジル環であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、水素であるか、またはハロゲン、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−および−ＯＨからなる群から独立に選択される一つまたは二つの置換基で任意選択により置換されている−Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、Ｈまたは−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、Ｈ、−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１２）−アルキレン−Ｘ３、ハロゲンまたは−ＮＯ２であり、
Ｘ３は、出現するごとに独立に、Ｈ、ハロゲン、−ＣＨ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−、−ＮＣＳ、−ＮＣＯ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、−ＯＨ、−ＳＨ、マレイミド、フタルイミド、−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−（ハロゲン）、−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＣＮ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＯＮ（Ｈ）Ｒ１２、アルキニル、−Ｎ３、ポリエチルグリコール、任意選択により置換されているアリール、または任意選択により置換されているヘテロシクリルを表し、
Ｒ９およびＲ１０は、水素、ハロゲンもしくはアルキルであるか、またはＲ１およびＲ９もしくはＲ２およびＲ１０は、それらの相互接続原子と一緒になって、５員、６員または７員環を形成し、
Ｒ１２は、出現するごとに独立に、水素またはアルキルを表し、
ｍは、出現するごとに独立に、０、１、２、３または４を表し、
ｎは、出現するごとに独立に、１〜１０を表す、
蛍光性化合物またはその塩。
（項目２）
Ｒ５およびＲ６が、それぞれ独立に、−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３である、項目１に記載の化合物。
（項目３）
Ｒ５およびＲ６が、それぞれ独立に、−Ｃ２〜Ｃ８アルキレン−Ｘ３である、項目１に記載の化合物。
（項目４）
Ｒ５およびＲ６が、それぞれ独立に、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−または−ＣＯＯＨによって置換されている−Ｃ２〜Ｃ８アルキレンである、項目１に記載の化合物。
（項目５）
Ｒ７およびＲ８が水素である、項目１から４のいずれか一項に記載の化合物。
（項目６）
式Ｉ−Ｂによって表される蛍光性化合物
【化５８】
2019151665.tif 000005
またはその塩であって、式中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＣ（Ｃ１〜４アルキル）２であり、
Ｗ１およびＷ２は、ベンゾ、ナフトまたはピリジル環であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、水素であるか、またはハロゲン、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−および−ＯＨからなる群から独立に選択される一つまたは二つの置換基で任意選択により置換されている−Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、
Ｒ５およびＲ７は、それぞれ独立に、水素または−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、水素、−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１２）−アルキレン−Ｘ３、ハロゲンまたは−ＮＯ２であり、
Ｘ３は、出現するごとに独立に、Ｈ、ハロゲン、−ＣＨ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−、−ＮＣＳ、−ＮＣＯ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、−ＯＨ、−ＳＨ、マレイミド、フタルイミド、−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−（ハロゲン）、−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＣＮ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＯＮ（Ｈ）Ｒ１２、アルキニル、−Ｎ３、ポリエチルグリコール、任意選択により置換されているアリール、または任意選択により置換されているヘテロシクリルを表し、
Ｒ９およびＲ１０は、Ｈ、ハロゲンもしくはアルキルであるか、またはＲ１およびＲ９もしくはＲ２およびＲ１０は、それらの相互接続原子と一緒になって、５員、６員または７員環を形成し、
Ｒ１１は、−ＣＯＯＨ、−ＣＮ、ハロゲン、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）−ハロアルキル、ハロアルキル、−ＣＯＯＲ１５、−ＣＯＮ（Ｈ）Ｒ１５、または−ＣＯ（ＣＨ２）ｎＲ１５であり、
Ｒ１２は、出現するごとに独立に、水素またはアルキルを表し、
Ｒ１５は、Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ２、−ＳＨ、アルキル、またはＸ３で任意選択により置換されているアリール、および／またはポリエチレングリコールであり、ｍは、出現するごとに独立に、０、１、２、３または４を表し、
ｎは、出現するごとに独立に、１〜１０を表す、
蛍光性化合物またはその塩。
（項目７）
Ｒ５が、−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３であり、Ｒ７が水素である、項目６に記載の化合物。
（項目８）
Ｒ５が、−Ｃ２〜Ｃ８アルキレン−Ｘ３であり、Ｒ７が水素である、項目６に記載の化合物。
（項目９）
Ｒ５が、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−または−ＣＯＯＨによって置換されている−Ｃ２〜Ｃ８アルキレンであり、Ｒ７が水素である、項目６に記載の化合物。
（項目１０）
式Ｉ−Ｃによって表される蛍光性化合物
【化５９】
2019151665.tif 000006
またはその塩であって、式中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＣ（Ｃ１〜４アルキル）２であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、水素であるか、またはハロゲン、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−および−ＯＨからなる群から独立に選択される一つまたは二つの置換基で任意選択により置換されている−Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、水素、−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１２）−アルキレン−Ｘ３、ハロゲンまたは−ＮＯ２であり、
Ｘ３は、出現するごとに独立に、Ｈ、ハロゲン、−ＣＨ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−、−ＮＣＳ、−ＮＣＯ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、−ＯＨ、−ＳＨ、マレイミド、フタルイミド、−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−（ハロゲン）、−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＣＮ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＯＮ（Ｈ）Ｒ１２、アルキニル、−Ｎ３、ポリエチルグリコール、任意選択により置換されているアリール、または任意選択により置換されているヘテロシクリルを表し、
Ｘ４は、出現するごとに独立に、水素、ハロゲン、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、または−ＣＯ２−を表し、
Ｒ９およびＲ１０は、Ｈ、ハロゲンもしくはアルキルであるか、またはＲ１およびＲ９もしくはＲ２およびＲ１０は、それらの相互接続原子と一緒になって、５員、６員または７員環を形成し、
Ｒ１２は、出現するごとに独立に、水素またはアルキルを表し、
ｍは、出現するごとに独立に、０、１、２、３または４を表し、
ｎは、出現するごとに独立に、１〜１０を表す、
蛍光性化合物またはその塩。
（項目１１）
式Ｉ−Ｄによって表される蛍光性化合物
【化６０】
2019151665.tif 000007
またはその塩であって、式中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＣ（Ｃ１〜４アルキル）２であり、
Ｗ１およびＷ２は、ベンゾ、ナフトまたはピリジル環であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、水素であるか、またはハロゲン、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−および−ＯＨからなる群から独立に選択される一つまたは二つの置換基で任意選択により置換されている−Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、Ｈ、−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１２）−アルキレン−Ｘ３、ハロゲンまたは−ＮＯ２であり、
Ｘ３は、出現するごとに独立に、Ｈ、ハロゲン、−ＣＨ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−、−ＮＣＳ、−ＮＣＯ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、−ＯＨ、−ＳＨ、マレイミド、フタルイミド、−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−（ハロゲン）、−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＣＮ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＯＮ（Ｈ）Ｒ１３、アルキニル、−Ｎ３、ポリエチルグリコール、任意選択により置換されているアリール、または任意選択により置換されているヘテロシクリルを表し、
Ｒ９およびＲ１０は、水素、ハロゲンもしくはアルキルであるか、またはＲ１およびＲ９もしくはＲ２およびＲ１０は、それらの相互接続原子と一緒になって、５員、６員または７員環を形成し、
Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立に、アルキル、ハロアルキル、アリール、アラルキル、シアノ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）−ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）−アリール、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１５、−ＣＯＮ（Ｈ）Ｒ１５、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ１５、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ１５、−ＣＯ（ＣＨ２）ｎＲ１５、−（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｈ、または−（ＣＨ２）ｎＳＯ３−であり、
Ｒ１３は、出現するごとに独立に、水素またはアルキルを表し、
Ｒ１５は、出現するごとに独立に、Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ２、−ＳＨ、アルキル、ポリエチレングリコール、またはＸ３で任意選択により置換されていてもよいアリール、および／またはポリエチレングリコールを表し、
ｍは、出現するごとに独立に、０、１、２、３または４を表し、
ｎは、出現するごとに独立に、１〜１０を表す、
蛍光性化合物またはその塩。
（項目１２）
Ｘ１およびＸ２が、Ｃ（ＣＨ３）２である、項目１から１１のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１３）
Ｗ１およびＷ２が、ベンゾ環である、項目１から１２のいずれか一項に記載の化合物。（項目１４）
Ｗ１およびＷ２が、ナフト環である、項目１から１２のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１５）
Ｒ１およびＲ２が、独立に、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ３−で任意選択により置換されている−Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである、項目１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１６）
Ｒ１およびＲ２が、独立にＣ１〜Ｃ６アルキルである、項目１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１７）
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３およびＲ１４が、それぞれ独立に、Ｈ、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ３である、項目１から１６のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１８）
Ｒ７が、水素である、項目１から１７のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１９）
Ｒ９およびＲ１０が、水素である、項目１から１８のいずれか一項に記載の化合物。
（項目２０）
式ＩＩによって表される蛍光性化合物
【化６１】
2019151665.tif 000008
またはその塩であって、式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、水素であるか、またはハロゲン、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−および−ＯＨからなる群から独立に選択される一つまたは二つの置換基で任意選択により置換されている−Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、Ｈまたは−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、Ｈ、−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１２）−アルキレン−Ｘ３、ハロゲンまたは−ＮＯ２であり、
Ｘ３は、出現するごとに独立に、Ｈ、ハロゲン、−ＣＨ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−、−ＮＣＳ、−ＮＣＯ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、−ＯＨ、−ＳＨ、マレイミド、フタルイミド、−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−（ハロゲン）、−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＣＮ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＯＮ（Ｈ）Ｒ１２、アルキニル、−Ｎ３、ポリエチルグリコール、任意選択により置換されているアリール、または任意選択により置換されているヘテロシクリルを表し、
Ｒ９およびＲ１０は、水素、ハロゲンもしくはアルキルであるか、またはＲ１およびＲ９もしくはＲ２およびＲ１０は、それらの相互接続原子と一緒になって、５員、６員または７員環を形成し、
Ｒ１２は、出現するごとに独立に、水素またはアルキルを表し、
ｍは、出現するごとに独立に、０、１、２、３または４を表し、
ｎは、出現するごとに独立に、１〜１０を表す、蛍光性化合物またはその塩。
（項目２１）
Ｒ１およびＲ２が、独立に、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ３−で任意選択により置換されている−Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである、項目２０に記載の化合物。
（項目２２）
Ｒ１およびＲ２が、独立に、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ３で任意選択により置換されている−Ｃ２〜Ｃ６アルキルである、項目２０に記載の化合物。
（項目２３）
Ｒ１およびＲ２が、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである、項目２０に記載の化合物。
（項目２４）
Ｒ５およびＲ６が、それぞれ独立に、−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３である、項目２０から２３のいずれか一項に記載の化合物。
（項目２５）
Ｒ５およびＲ６が、それぞれ独立に、−Ｃ２〜Ｃ８アルキレン−Ｘ３である、項目２０から２３のいずれか一項に記載の化合物。
（項目２６）
Ｒ５およびＲ６が、それぞれ独立に、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−または−ＣＯＯＨにより置換されている−Ｃ２〜Ｃ８アルキレンである、項目２０から２３のいずれか一項に記載の化合物。
（項目２７）
Ｒ７およびＲ８が、水素である、項目２０から２６のいずれか一項に記載の化合物。
（項目２８）
Ｒ９およびＲ１０が、水素である、項目２０から２７のいずれか一項に記載の化合物。（項目２９）
生物学的分子と、項目１から２８のいずれか一項に記載の化合物の反応によって形成された、コンジュゲート化合物。
（項目３０）
−Ｌ−ＢＭによって定義される１、２または３個の基でさらに置換されている、項目１から２８のいずれか一項に記載の化合物である、コンジュゲート化合物であって、Ｌは結合またはリンカーであり、−ＢＭは生物学的分子のラジカルである、コンジュゲート化合物。
（項目３１）
項目１から３０のいずれか一項に記載の化合物、および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
（項目３２）
以下の構造式すなわち式Ｉによって表される蛍光性化合物であって、
【化６２】
2019151665.tif 000009
式中、以下に示す通り、Ｘ＝Ｒ＝ＣＯ−ＮＲ５Ｒ７（式Ｉａ）である場合、Ｘ＝ＣＯ−ＮＲ５Ｒ７かつＲ＝Ｒ１１（式Ｉｂ）である場合、Ｘ＝Ｒ＝ＣＯ−Ｐｈ−Ｘ３（式Ｉｃ）である場合に、
【化６３】
2019151665.tif 000010
式中、Ｘ１およびＸ２は、独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｃ（ＣＨ２Ｒ３ＣＨ２Ｒ４）から選択され、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、Ｈ、（ＣＨ２）ｎＸ３（ｎ＝１〜２０）から選択され、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、Ｈ、（ＣＨ２）ｎＸ３（ｎ＝０〜２０）から選択され、
Ｘ３は、独立に、Ｈ、ハロゲン、ＣＨ３、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ３−、ＣＯＯＨ、ＮＣＳ（イソチオシアネート）、ＮＣＯ（イソシアネート）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル（ＮＨＳＳ）エステル、ヒドロキシ（ＯＨ）、チオール（ＳＨ）、マレイミド、フタルイミド、ヨードアセトアミド、ＣＯＮＨＮＨ２（ヒドラジド）、ＣＮ、ＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、アルキン、アジド（Ｎ３）、ＳＯ２ＮＸ３Ｒ７、Ｘ３で任意選択によりさらに置換されているアリールから選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、Ｈまたはハロゲンまたはアルキル基であり、
Ｒ１およびＲ９またはＲ２およびＲ１０は、任意選択により、一緒になって５員または６員または７員の環を形成し、
Ｗ１およびＷ２は、ベンゾまたはナフトまたはピリジルを含むアリール環を形成するのに必要な原子であり、Ｒ１１は、独立に、ＣＯＯＨ、ＣＮ、Ｆ、ＮＯ２、ＣＯＣＦ３、ＣＦ３、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯ（ＣＨ２）ｎＲから選択され、Ｒは、ＨまたはＣＯＯＨまたはＳＯ３ＨまたはＮＨ２またはＳＨまたはアルキル、またはＸ３で任意選択によりさらに置換されているアリール、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）単位
【化６４】
2019151665.tif 000011
である、
蛍光性化合物。
（項目３３）
前記分子が、約５００ｎｍ〜約１１００ｎｍの範囲の吸収および発光波長を有する、項目３２に記載の化合物。
（項目３４）
前記分子が、約６００ｎｍ〜約９００ｎｍの範囲の吸収および発光波長を有する、項目３２に記載の化合物。
（項目３５）
ＸおよびＲが、カルボン酸基（ＣＯＯＨ）である、項目３２に記載の化合物。
（項目３６）
ＸまたはＲのいずれかが、カルボン酸基（ＣＯＯＨ）である、項目３２に記載の化合物。
（項目３７）
Ｘ３が、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、カルボキシル、−ＣＯＣｌ、−（ＣＯ）Ｏ（ＣＯ）Ｒａ、−ＣＯＮＨＮＨ２、置換および非置換Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、置換および非置換Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、ニトロ−またはフルオロ−フェノールエステル、アジド、−ＮＣＳ、−ＣＨＯ、アジド、−ＣＯＣＨ２Ｉ、ホスホルアミダイト、フタルアミド、ならびにマレイミドからなる群から選択され、Ｒａが、Ｈ、アルキルおよびアリールからなる群から選択される、項目３２に記載の化合物。
（項目３８）
Ｗ１およびＷ２が、同じである、項目３２に記載の化合物。
（項目３９）
Ｗ１およびＷ２が、
【化６５】
2019151665.tif 000012
からなる群から選択される、項目３２に記載の化合物。
（項目４０）
Ｘ１およびＸ２が、Ｃ（ＣＨ３）２である、項目３２に記載の化合物。
（項目４１）
前記剤が、遠赤または近赤外において蛍光性である、項目３２から４０に記載の化合物。
（項目４２）
以下のうちの一つから選択される化合物
【化６６−１】
2019151665.tif 000013
【化６６−２】
2019151665.tif 000014
【化６６−３】
2019151665.tif 000015
［Ｒ１１およびＲ１２は、独立に、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨＲ、ＣＮ、Ｏ＝Ｃ−フェニル、ＣＯＣＨ２Ｒであり、ここで、Ｒ＝Ｈ、または
【化６６−４】
2019151665.tif 000016
（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’または（ＣＨ２）ｎＣＨ３または（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｈまたは（ＣＨ２）ｎＳＯ３−であり、ここで、Ｒ’＝アルキルまたはアリールである］
【化６７−１】
2019151665.tif 000017
【化６７−２】
2019151665.tif 000018
【化６７−３】
2019151665.tif 000019
またはその塩。
（項目４３）
式ＩＩＩによって表される、生体適合性のある蛍光性分子であって、
［ＢＭ］ｎ−Ｆｍ    式ＩＩＩ
式中、ＢＭは、生体分子であり、Ｆは、式Ｉａ、ＩｂまたはＩｃによって表されるフルオロフォアであり、ｎ＝１〜４であり、ｍ＝１〜１００であり、
【化６８】
2019151665.tif 000020
式中、Ｘ１およびＸ２は、独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｃ（ＣＨ２Ｒ３ＣＨ２Ｒ４）から選択され、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、Ｈ、（ＣＨ２）ｎＸ３（ｎ＝１〜２０）から選択され、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、Ｈ、（ＣＨ２）ｎＸ３（ｎ＝０〜２０）から選択され、
Ｘ３は、独立に、Ｈ、ハロゲン、ＣＨ３、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ３−、ＣＯＯＨ、ＮＣＳ（イソチオシアネート）、ＮＣＯ（イソシアネート）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル（ＮＨＳＳ）エステル、ヒドロキシ（ＯＨ）、チオール（ＳＨ）、マレイミド、フタルイミド、ヨードアセトアミド、ＣＮ、ＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、アルキン、アジド（Ｎ３）、ＳＯ２ＮＸ３Ｒ７、Ｘ３で任意選択によりさらに置換されているアリールから選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、Ｈまたはハロゲンまたはアルキル基であり、
Ｒ１およびＲ９またはＲ２およびＲ１０は、任意選択により、一緒になって５員または６員または７員の環を形成し、
Ｗ１およびＷ２は、ベンゾまたはナフトまたはピリジルを含むアリール環を形成するのに必要な原子であり、Ｒ１１は、独立に、ＣＯＯＨ、ＣＮ、Ｆ、ＮＯ２、ＣＯＣＦ３、ＣＦ
３、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯ（ＣＨ２）ｎＲから選択され、Ｒは、ＨまたはＣＯＯＨまたはＳＯ３ＨまたはＮＨ２またはＳＨまたはアルキル、またはＸ３で任意選択によりさらに置換されているアリール、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）単位
【化６９】
2019151665.tif 000021
である、
生体適合性のある蛍光性分子。
（項目４４）
以下の構造式ＩＶａ〜ＩＶｄのうち任意の一つによって表される、生体適合性のある蛍光性生体分子であって、
【化７０】
2019151665.tif 000022
式中、ＢＭは生体分子である、
生体適合性のある蛍光性生体分子。
（項目４５）
ＢＭが、タンパク質、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、酵素、抗体、細胞、脂質、脂肪酸、炭水化物、糖、グルコース、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸から構成される、項目４４に記載の生体適合性のある蛍光性生体分子。
（項目４６）
先行する項目のいずれか一項に記載の剤、および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
（項目４７）
以下の式Ｖによって表される化合物であって、
【化７１】
2019151665.tif 000023
式中、Ｒ１１およびＲ１２は、独立に、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨＲ、ＣＦ３、ハロゲン、ＣＮ、Ｏ＝Ｃ−フェニル、ＣＯＣＨ２Ｒであり、Ｒ＝Ｈ、または
【化７２】
2019151665.tif 000024
（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’または（ＣＨ２）ｎＣＨ３または（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｈまたは（ＣＨ２）ｎＳＯ３−であり、Ｒ’＝アルキルまたはアリールであり、Ｐｈは、フェニル基であり、前記フェニル基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＭｅ、ＮＭｅ２、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、アルキルのうちの一つで任意選択により置換されている、化合物。
（項目４８）
Ｒ１１がＣＯＯＨであり、Ｒ１２がＣＯＯＨである、項目４７に記載の化合物。
（項目４９）
Ｒ１１がＣＯＯＨである場合、Ｒ１２はＣＯＯＲ’であり、Ｒ１２がＣＯＯＨである場合、Ｒ１１はＣＯＯＲ’であり、ここで、Ｒ’はアルキルまたはアリールである、項目４７に記載の化合物。
（項目５０）
ａ．対象に、先行する項目のいずれか一項に記載の剤を投与するステップと、
ｂ．前記剤を、前記対象内に分布させるステップと、
ｃ．前記タンパク質標識化剤によって放出されたシグナルを検出するステップと
を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング方法。
（項目５１）
ｄ．対象に、蛍光色素を含む、先行する項目のいずれか一項に記載の剤を投与するステップと、
ｅ．前記剤を、前記対象内に分布させるステップと、
ｆ．前記対象を、前記蛍光色素によって吸収可能な波長の光に曝露するステップと、
ｇ．前記剤によって放出されたシグナルを検出するステップと
を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏ光学イメージング方法。
（項目５２）
前記剤によって放出された前記シグナルが、画像を構築するために使用される、項目５０または５１に記載の方法。
（項目５３）
前記画像が、断層画像である、項目５０または５１に記載の方法。
（項目５４）
ステップ（ａ）〜（ｃ）が、所定の時間間隔で反復され、それによって前記対象において前記タンパク質標識化剤の前記放出されたシグナルの経時的評価を可能にする、項目５０に記載の方法。
（項目５５）
ステップ（ａ）〜（ｄ）が、所定の時間間隔で反復され、それによって前記対象において前記タンパク質標識化剤の前記放出されたシグナルの経時的評価を可能にする、項目５１に記載の方法。
（項目５６）
前記対象が、動物またはヒトである、項目５０または５１に記載の方法。
（項目５７）
ステップ（ａ）において、シグナル特性が互いに識別可能な２種類またはそれより多くの種類のイメージングプローブが、対象に投与され、前記イメージングプローブの少なくとも一つが、タンパク質標識化剤である、項目５０または５１に記載の方法。
（項目５８）
前記照射および検出ステップが、内視鏡、カテーテル、断層撮影システム、手持ち式の光学イメージングシステム、または術中顕微鏡を使用して実施される、項目５１に記載の方法。
（項目５９）
放出されたシグナルの存在、非存在またはレベルが、病状を示す、項目５０または５１に記載の方法。
（項目６０）
疾患を検出および／またはモニタするために使用される、項目５０または５１に記載の方法。
（項目６１）
前記疾患が、骨疾患、がん、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、心虚血、心筋再かん流傷害、環境疾患、皮膚疾患、免疫疾患、遺伝性疾患、感染性疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、神経変性疾患、眼疾患、および呼吸器疾患からなる群から選択される、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
ステップ（ａ）において、前記蛍光性化合物で標識された細胞が、前記対象に投与される、項目５０または５１に記載の方法。
（項目６３）
前記剤によって放出された前記シグナルが、前記細胞の輸送および局在をモニタするために使用される、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
疾患のエリアに局在し、実効線量の放射線を送達する放射標識を含む、項目１から４９のいずれか一項に記載の剤を、対象に全身的または局所的に投与するステップを含む、対象の疾患を処置する方法。
（項目６５）
ｈ．試料を、項目１から４９のいずれか一項に記載の剤と接触させるステップと、
ｉ．前記剤を、生物学的標的に結合させるステップと、
ｊ．任意選択により、結合していない剤を除去するステップと、
ｋ．前記剤から放出されたシグナルを検出し、それによって前記剤が前記生物学的標的によって活性化されたか、または前記生物学的標的に結合したかを決定するステップと
を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏイメージング方法。
（項目６６）
前記試料が、生物学的試料である、項目６５に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１は、本発明のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とコンジュゲートした色素の蛍光および吸光度スペクトルを示す図である。図１Ａは、化合物１ｂのＢＳＡ−コンジュゲートによって放出された蛍光のグラフである。
【図１Ｂ】図１は、本発明のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とコンジュゲートした色素の蛍光および吸光度スペクトルを示す図である。図１Ｂは、ＢＳＡとコンジュゲートした化合物１ｂのＢＳＡ−コンジュゲートの蛍光吸光度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、約５００ｎｍ〜約１１００ｎｍの範囲、より好ましくは約６００ｎｍ〜約９００ｎｍの範囲の波長を有する光を吸収および／または放出する蛍光色素化合物（色素）のファミリーを提供する。ある特定の実施形態では、色素は、約６００ｎｍ〜約８５０ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約９００ｎｍ、または約６５０ｎｍ〜約８５０ｎｍの範囲の波長を有する光を吸収および／または放出する。蛍光色素化合物は、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏイメージング用途において特に有用である。
【００１９】
ある特定の実施形態では、本発明の蛍光色素化合物は、式Ｚ１−ＰＭＢ−Ｚ２およびその塩によって表すことができ、Ｚ１およびＺ２は、それぞれ独立に、複素環式部分を含有する同じまたは異なる多環式基を表し、ＰＭＢは、４，４−二置換シクロヘキシル架橋部分を含むポリメチン架橋を表す。蛍光色素化合物を、本明細書で以下により詳細に論じる。しかし、本発明をさらに説明する前に、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で用いられる特定の用語を、以下のセクションにまとめて示す。
【００２０】
Ｉ．定義
本明細書に列挙した定義は、本開示の残りの部分に照らして読まれ、当業者によるように理解されるべきである。別段定義されない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【００２１】
「化学的に連結されている」は、組み合わされた凝集体が一単位として機能し得るほど十分に強力な原子間の引力によって、接続されていることを意味する。これには、化学結合、例えば共有結合、非共有結合、例えばイオン結合、金属結合、および架橋結合、疎水性相互作用、水素結合、およびファンデルワールス相互作用が含まれるが、これらに限定されない。これには、架橋またはケージング（ｃａｇｉｎｇ）も含まれる。
【００２２】
用語「アルキル」は、当技術分野で認識されており、これには、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む飽和脂肪族基が含まれる。ある特定の実施形態では、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格内に約３０個またはそれ未満の炭素原子を有しており（例えば、直鎖ではＣ１〜Ｃ３０、分岐鎖ではＣ３〜Ｃ３０）、あるいは約２０個またはそれ未満の炭素原子を有している。同様に、シクロアルキルは、それらの環構造内に約３〜約１０個の炭素原子を有しており、あるいは環構造内に約５、６または７個の炭素を有している。用語「アルキル」には、ハロ置換アルキルも含まれる。
【００２３】
さらに、用語「アルキル」には、「置換アルキル」が含まれ、これは、炭化水素骨格の一つまたは複数の炭素上の水素と置き換わっている置換基を有するアルキル部分を指す。
このような置換基には、例えば、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミルまたはアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテートまたはチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくは複素芳香族部分が含まれ得る。適切な場合、炭化水素鎖上の置換部分は、それら自体置換されていてもよいことが、当業者には理解される。例えば、置換アルキルの置換基には、アミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホネートおよびホスフィネートを含む）、スルホニル（サルフェート、スルホンアミド、スルファモイルおよびスルホネートを含む）、およびシリル基、ならびにエーテル、アルキルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシレートおよびエステルを含む）、−ＣＮ等の置換および非置換形態が含まれ得る。例示的な置換アルキルを以下に記載する。シクロアルキルは、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニル置換アルキル、−ＣＮ等でさらに置換されていてもよい。ある特定の実施形態では、アルキルは非置換である。ある特定の実施形態では、アルキルは、非置換の直鎖または分岐鎖アルキル基である。
【００２４】
用語「ハロアルキル」は、一つまたは複数の水素原子がハロゲンで置き換えられていることを除き、先に定義されているアルキル基を指す。
【００２５】
用語「アルキレン」は、非置換の直鎖または分岐鎖アルキル基のジラジカルを指す。
【００２６】
用語「アラルキル」および「アルキルアリール」は、当技術分野で認識されており、アリール基（例えば、芳香族または複素芳香族基）で置換されているアルキル基を指す。
【００２７】
用語「アルケニル」および「アルキニル」は、当技術分野で認識されており、前述のアルキルに対して長さおよび可能な置換が類似している不飽和脂肪族基を指すが、それぞれ少なくとも１個の二重結合または三重結合を含有している。
【００２８】
用語「ヘテロ原子」は、当技術分野で認識されており、炭素または水素以外の任意の元素の原子を指す。例示的なヘテロ原子として、ホウ素、窒素、酸素、リン、硫黄およびセレンが挙げられる。
【００２９】
用語「アリール」は、当技術分野で認識されており、０〜４個のヘテロ原子を含み得る５員、６員および７員の単環芳香族基、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジン等を指す。環構造内にヘテロ原子を有するアリール基は、「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」と呼ぶこともできる。芳香環は、前述のような置換基、例えばハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族または複素芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮ等で、一つまたは複数の環の位置において置換されていてもよい。用語「アリール」には、２個またはそれより多くの炭素が二つの隣接する環（この環は「縮合環」である）に共通しており、環の少なくとも一つが芳香族であり、例えば他の環式環が、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよび／またはヘテロシクリルであり得る、二つまたはそれより多くの環式環を有する多環式環系も含まれる。
【００３０】
用語「ヘテロシクリル」、「複素環式基」または「複素環式部分」は、当技術分野で認
識されており、その環構造には１〜４個のヘテロ原子が含まれる、３員〜約１０員の環構造あるいは３員〜約７員環を指す。複素環は、多環（ｐｏｌｙｃｙｃｌｅ）であってもよい。ヘテロシクリル基には、例えばチオフェン、チアントレン、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサンテン（ｐｈｅｎｏｘａｎｔｈｅｎｅ）、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、ピリミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェナルサジン、フェノチアジン、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、ラクタム、例えばアゼチジノンおよびピロリジノン、スルタム、スルトン等が含まれる。複素環式環は、前述のような置換基、例えばハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族または複素芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮ等で、一つまたは複数の位置において置換されていてもよい。
【００３１】
用語「ポリシクリル（ｐｏｌｙｃｙｃｌｙｌ）」、「多環式基」または「ポリシクロ（ｐｏｌｙｃｙｃｌｏ）部分」は、当技術分野で認識されており、２個またはそれより多くの炭素が二つの隣接する環に共通しており、例えばその環が「縮合環」である、二つまたはそれより多くの環（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよび／またはヘテロシクリル）を指す。隣り合っていない原子を介して結合されている環は、「架橋」環と呼ばれる。多環の環のそれぞれは、前述のような置換基、例えばハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族または複素芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮ等で置換されていてもよい。
【００３２】
用語「ニトロ」は、当技術分野で認識されており、−ＮＯ２を指す。用語「ハロゲン」は、当技術分野で認識されており、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉを指す。用語「スルフヒドリル」は、当技術分野で認識されており、−ＳＨを指す。用語「ヒドロキシル」は、−ＯＨを意味する。用語「スルホニル」は、当技術分野で認識されており、−ＳＯ２−を指す。「ハロゲン化物」は、ハロゲンの対応するアニオンを指し、「擬ハロゲン化物」は、ＣｏｔｔｏｎおよびＷｉｌｋｉｎｓｏｎによる「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」に記載の定義を有する。
【００３３】
用語「アミン」および「アミノ」は、当技術分野で認識されており、非置換および置換アミンの両方を指し、例えば、以下の一般式によって表され得る部分を指す。
【化３】
2019151665.tif 000025
式中、Ｒ５０、Ｒ５１、Ｒ５２およびＲ５３は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１を表すか、またはＲ５０およびＲ５１は、それらが結合
しているＮ原子と一緒になって、環構造内に４〜８個の原子を有する複素環を完成し、Ｒ６１は、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環または多環を表し、ｍは、０または１〜８の範囲の整数である。ある特定の実施形態では、Ｒ５０またはＲ５１の一方のみがカルボニルであってもよく、例えばＲ５０、Ｒ５１および窒素は、一緒になってイミドを形成しない。他の実施形態では、Ｒ５０およびＲ５１（および任意選択によりＲ５２）は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルケニル、または−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１を表す。したがって、用語「アルキルアミン」には、置換または非置換アルキルが結合している、先に定義したアミン基が含まれ、すなわち、Ｒ５０およびＲ５１の少なくとも一つは、アルキル基である。
【００３４】
用語「アシルアミノ」は、当技術分野で認識されており、以下の一般式によって表され得る部分を指す。
【化４】
2019151665.tif 000026
式中、Ｒ５０は、先に定義した通りであり、Ｒ５４は、水素、アルキル、アルケニルまたは−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１を表し、ｍおよびＲ６１は、先に定義した通りである。
【００３５】
用語「アミド」は、当技術分野ではアミノ置換カルボニルと認識されており、これには、以下の一般式によって表され得る部分が含まれる。
【化５】
2019151665.tif 000027
式中、Ｒ５０およびＲ５１は、先に定義した通りである。本発明では、アミドのある特定の実施形態は、不安定であり得るイミドは含まない。
【００３６】
用語「アルキルチオ」は、硫黄ラジカルが結合している、先に定義したアルキル基を指す。ある特定の実施形態では、「アルキルチオ」部分は、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アルケニル、−Ｓ−アルキニル、および−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１のうちの一つによって表され、ｍおよびＲ６１は、先に定義されている。代表的なアルキルチオ基には、メチルチオ、エチルチオ等が含まれる。
【００３７】
用語「カルボニル」は、当技術分野で認識されており、これには、以下の一般式によって表され得るような部分が含まれる。
【化６】
2019151665.tif 000028
式中、Ｘ５０は、結合であるかまたは酸素もしくは硫黄を表し、Ｒ５５およびＲ５６は、水素、アルキル、アルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１または薬学的に許容される塩を表し、Ｒ５６は、水素、アルキル、アルケニルまたは−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１を表し、ｍおよびＲ６１は、先に定義されている。Ｘ５０が酸素であり、Ｒ５５またはＲ５６が水素ではない場合、式は、「エステル」を表す。Ｘ５０が酸素であり、Ｒ５５が、先に定義した通りである場合、部分は、本明細書ではカルボキシル基と呼ばれ、特にＲ５５が水素である場合、式は、「カルボン酸」を表す。Ｘ５０が酸素であり、Ｒ５６が水素である場合、式は、「ホルメート」を表す。一般に、先の式の酸素原子が硫黄に置き換えられた場合、式は、「チオールカルボニル」基を表す。Ｘ５０が硫黄であり、Ｒ５５またはＲ５６が水素ではない場合、式は、「チオールエステル」を表す。Ｘ５０が硫黄であり、Ｒ５５が水素である場合、式は、「チオールカルボン酸」を表す。Ｘ５０が硫黄であり、Ｒ５６が水素である場合、式は、「チオールホルメート」を表す。他方では、Ｘ５０が結合であり、Ｒ５５が水素ではない場合、先の式は、「ケトン」基を表す。Ｘ５０が結合であり、Ｒ５５が水素である場合、先の式は、「アルデヒド」基を表す。
【００３８】
用語「アルコキシル」または「アルコキシ」は、当技術分野で認識されており、酸素が結合している、先に定義したアルキル基を指す。代表的なアルコキシル基には、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ等が含まれる。「エーテル」は、酸素によって、共有結合で連結されている二つの炭化水素である。したがって、アルキルをエーテルにするアルキルの置換基は、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１（ｍおよびＲ６１は、前述の通りである）のうちの一つによって表され得るものなどのアルコキシルであるか、またはアルコキシルに似ている。
【００３９】
用語「スルホネート」は、当技術分野で認識されており、以下の一般式によって表され得る部分を指す。
【化７】
2019151665.tif 000029
式中、Ｒ５７は、電子対、水素、アルキル、シクロアルキルまたはアリールである。
【００４０】
用語「サルフェート」は、当技術分野で認識されており、これには、以下の一般式によって表され得る部分が含まれる。
【化８】
2019151665.tif 000030
式中、Ｒ５７は、先に定義した通りである。
【００４１】
用語「スルホンアミド」は、当技術分野で認識されており、これには、以下の一般式によって表され得る部分が含まれる。
【化９】
2019151665.tif 000031
式中、Ｒ５０およびＲ５６は、先に定義した通りである。
【００４２】
用語「スルファモイル」は、当技術分野で認識されており、以下の一般式によって表され得る部分を指す。
【化１０】
2019151665.tif 000032
式中、Ｒ５０およびＲ５１は、先に定義した通りである。
【００４３】
用語「スルホニル」は、当技術分野で認識されており、以下の一般式によって表され得る部分を指す。
【化１１】
2019151665.tif 000033
式中、Ｒ５８は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリールのうちの一つである。
【００４４】
用語「スルホキシド（ｓｕｌｆｏｘｉｄｏ）」は、当技術分野で認識されており、以下の一般式によって表され得る部分を指す。
【化１２】
2019151665.tif 000034
式中、Ｒ５８は、先に定義されている。
【００４５】
用語「ホスホリル」は、当技術分野で認識されており、一般に以下の式によって表され得る。
【化１３】
2019151665.tif 000035
式中、Ｑ５０は、ＳまたはＯを表し、Ｒ５９は、水素、低級アルキルまたはアリールを表す。例えばアルキルを置換するために使用される場合、ホスホリルアルキルのホスホリル基は、以下の一般式によって表され得る。
【化１４】
2019151665.tif 000036
式中、Ｑ５０およびＲ５９は、それぞれ独立に、先に定義されており、Ｑ５１は、Ｏ、ＳまたはＮを表す。Ｑ５０がＳである場合、ホスホリル部分は、「ホスホロチオエート」である。
【００４６】
用語「ホスホルアミダイト」は、当技術分野で認識されており、以下の一般式によって表され得る。
【化１５】
2019151665.tif 000037
式中、Ｑ５１、Ｒ５０、Ｒ５１およびＲ５９は、先に定義した通りである。
【００４７】
用語「ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｍｉｄｉｔｅ）」は、当技術分野で認識されており、以下の一般式によって表され得る。
【化１６】
2019151665.tif 000038
式中、Ｑ５１、Ｒ５０、Ｒ５１およびＲ５９は、先に定義した通りであり、Ｒ６０は、低級アルキルまたはアリールを表す。
【００４８】
アルケニルおよびアルキニル基に対して類似の置換を行って、例えば、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、イミノアルケニル、イミノアルキニル、チオアルケニル、チオアルキニル、カルボニル置換アルケニルまたはアルキニルを生成することができる。
【００４９】
各表現、例えばアルキル、ｍ、ｎ等の定義は、任意の構造において一回より多くの回数生じる場合、同構造の他所におけるその定義とは独立であるものとする。
【００５０】
「置換」または「で置換されている」は、このような置換が、置換された原子および置換基の許容される原子価に従い、置換によって、例えば転移、環化、脱離または他の反応などによる変換を自然発生的に受けない安定な化合物が得られるという暗黙の条件を含むことが理解される。
【００５１】
また用語「置換」は、有機化合物のあらゆる許容可能な置換基を含むことが企図される。例示的な置換基として、例えばハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族または複素芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮ等が挙げられる。広範な一態様では、許容可能な置換基には、有機化合物の非環式および環式、分枝鎖および非分枝鎖、炭素環式および複素環式、芳香族および非芳香族置換基が含まれる。例示的な置換基として、例えば、本明細書に先に記載したものが挙げられる。許容可能な置換基は、適切な有機化合物に対して一つであっても複数であってもよく、そして同じであっても異なっていてもよい。本発明の目的では、窒素などのヘテロ原子は、ヘテロ原子の価数を満たす、本明細書に記載の有機化合物の水素置換基および／または任意の許容可能な置換基を有することができる。本発明は、有機化合物の許容可能な置換基によって、いかなる方式でも制限されないものとする。
【００５２】
用語「ポリメチン架橋」は、奇数の炭素を含む、コンジュゲートした二重結合メチレン鎖を指す。このような架橋は、コンジュゲートした二重結合メチレン鎖の一部として、環構造を含み得る。
【００５３】
用語「生理的に許容される担体」は、本発明の化合物の一つまたは複数が、分散、溶解、懸濁、混合し、かつ生理的に容認される、すなわち過度の不快感も、刺激感も、毒性もなしに、対象の身体に、体内に、または身体上に投与され得る担体を指す。
【００５４】
本説明を通して、組成物が特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と説明される場合、その組成物はまた、列挙した成分から本質的になるかまたは列挙した成分からなることが企図される。同様に、プロセスが特定のプロセスステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と説明される場合、そのプロセスはまた、列挙したプロセスステップから本質的になるかまたは列挙したプロセスステップからなる。さらに、ステップの順序または特定の動作を実施する順序は、本発明が操作可能である限り、重要ではないことを理解すべきである。さらに、二つまたはそれより多くのステップまたは動作は、同時に実施することができる。
【００５５】
ＩＩ．本発明の蛍光色素化合物
本発明の一態様は、式Ｉ−Ａによって表される蛍光性化合物
【化１７】
2019151665.tif 000039
またはその塩を提供し、式中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＣ（Ｃ１〜４アルキル）２であり、
Ｗ１およびＷ２は、ベンゾ、ナフト（ｎａｐｈｔｈａ）またはピリジル環であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、水素であるか、またはハロゲン、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−および−ＯＨからなる群から独立に選択される一つまたは二つの置換基で任意選択により置換されている−Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、Ｈまたは−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、Ｈ、−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１２）−アルキレン−Ｘ３、ハロゲンまたは−ＮＯ２であり、
Ｘ３は、出現するごとに独立に、Ｈ、ハロゲン、−ＣＨ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−、−ＮＣＳ、−ＮＣＯ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、−ＯＨ、−ＳＨ、マレイミド、フタルイミド、−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−（ハロゲン）、−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＣＮ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＯＮ（Ｈ）Ｒ１２、アルキニル、−Ｎ３、ポリエチルグリコール、任意選択により置換されているアリール、または任意選択により置換されているヘテロシクリルを表し、
Ｒ９およびＲ１０は、水素、ハロゲンもしくはアルキルであるか、またはＲ１およびＲ９もしくはＲ２およびＲ１０は、それらの相互接続原子と一緒になって、５員、６員または７員環を形成し、
Ｒ１２は、出現するごとに独立に、水素またはアルキルを表し、
ｍは、出現するごとに独立に、０、１、２、３または４を表し、
ｎは、出現するごとに独立に、１〜１０を表す。
【００５６】
ある特定の実施形態では、Ｘ１およびＸ２は、Ｃ（ＣＨ３）２である。ある特定の実施形態では、Ｗ１およびＷ２は、ベンゾ環である。ある特定の実施形態では、Ｗ１およびＷ２は、ナフト（ｎａｐｔｈａ）環である。ある特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、独立に、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ３−で任意選択により置換されている−Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、独立にＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、Ｈ、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ７は、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ９およびＲ１０は、水素である。
【００５７】
ある特定の実施形態では、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、−Ｃ２〜Ｃ８アルキレン−Ｘ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ５およびＲ６は、それぞ
れ独立に、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−または−ＣＯＯＨで置換されている−Ｃ２〜Ｃ８アルキレンである。ある特定の実施形態では、Ｒ７およびＲ８は、水素である。
【００５８】
本発明の別の態様は、式Ｉ−Ｂによって表される蛍光性化合物
【化１８】
2019151665.tif 000040
またはその塩を提供し、式中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＣ（Ｃ１〜４アルキル）２であり、
Ｗ１およびＷ２は、ベンゾ、ナフトまたはピリジル環であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、水素であるか、またはハロゲン、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−および−ＯＨからなる群から独立に選択される一つまたは二つの置換基で任意選択により置換されている−Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、
Ｒ５およびＲ７は、それぞれ独立に、水素または−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、水素、−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１２）−アルキレン−Ｘ３、ハロゲンまたは−ＮＯ２であり、
Ｘ３は、出現するごとに独立に、Ｈ、ハロゲン、−ＣＨ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−、−ＮＣＳ、−ＮＣＯ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、−ＯＨ、−ＳＨ、マレイミド、フタルイミド、−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−（ハロゲン）、−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＣＮ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＯＮ（Ｈ）Ｒ１２、アルキニル、−Ｎ３、ポリエチルグリコール、任意選択により置換されているアリール、または任意選択により置換されているヘテロシクリルを表し、
Ｒ９およびＲ１０は、Ｈ、ハロゲンもしくはアルキルであるか、またはＲ１およびＲ９もしくはＲ２およびＲ１０は、それらの相互接続原子と一緒になって、５員、６員または７員環を形成し、
Ｒ１１は、−ＣＯＯＨ、−ＣＮ、ハロゲン、−ＮＯ２、−Ｃ（Ｏ）−ハロアルキル、ハロアルキル、−ＣＯＯＲ１５、−ＣＯＮ（Ｈ）Ｒ１５、または−ＣＯ（ＣＨ２）ｎＲ１５であり、
Ｒ１２は、出現するごとに独立に、水素またはアルキルを表し、
Ｒ１５は、Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ２、−ＳＨ、アルキル、またはＸ３で任意選択により置換されているアリール、および／またはポリエチレングリコールであり、ｍは、出現するごとに独立に、０、１、２、３または４を表し、
ｎは、出現するごとに独立に、１〜１０を表す。
【００５９】
ある特定の実施形態では、Ｘ１およびＸ２は、Ｃ（ＣＨ３）２である。ある特定の実施形態では、Ｗ１およびＷ２は、ベンゾ環である。ある特定の実施形態では、Ｗ１およびＷ２は、ナフト環である。ある特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、独立に、−ＳＯ３
Ｈまたは−ＳＯ３−で任意選択により置換されている−Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、独立にＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、Ｈ、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ７は、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ９およびＲ１０は、水素である。
【００６０】
ある特定の実施形態では、Ｒ５は、−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３であり、Ｒ７は水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ５は、−Ｃ２〜Ｃ８アルキレン−Ｘ３であり、Ｒ７は水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ５は、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−または−ＣＯＯＨによって置換されている−Ｃ２〜Ｃ８アルキレンであり、Ｒ７は水素である。
【００６１】
本発明の別の態様は、式Ｉ−Ｃによって表される蛍光性化合物
【化１９】
2019151665.tif 000041
またはその塩を提供し、式中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＣ（Ｃ１〜４アルキル）２であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、水素であるか、またはハロゲン、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−および−ＯＨからなる群から独立に選択される一つまたは二つの置換基で任意選択により置換されている−Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、水素、−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１２）−アルキレン−Ｘ３、ハロゲンまたは−ＮＯ２であり、
Ｘ３は、出現するごとに独立に、Ｈ、ハロゲン、−ＣＨ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−、−ＮＣＳ、−ＮＣＯ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、−ＯＨ、−ＳＨ、マレイミド、フタルイミド、−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−（ハロゲン）、−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＣＮ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＯＮ（Ｈ）Ｒ１２、アルキニル、−Ｎ３、ポリエチルグリコール、任意選択により置換されているアリール、または任意選択により置換されているヘテロシクリルを表し、
Ｘ４は、出現するごとに独立に、水素、ハロゲン、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、または−ＣＯ２−を表し、
Ｒ９およびＲ１０は、Ｈ、ハロゲンもしくはアルキルであるか、またはＲ１およびＲ９もしくはＲ２およびＲ１０は、それらの相互接続原子と一緒になって、５員、６員または７員環を形成し、
Ｒ１２は、出現するごとに独立に、水素またはアルキルを表し、
ｍは、出現するごとに独立に、０、１、２、３または４を表し、
ｎは、出現するごとに独立に、１〜１０を表す。
【００６２】
ある特定の実施形態では、Ｘ１およびＸ２は、Ｃ（ＣＨ３）２である。ある特定の実施形態では、Ｗ１およびＷ２は、ベンゾ環である。ある特定の実施形態では、Ｗ１およびＷ２は、ナフト環である。ある特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、独立に、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ３−で任意選択により置換されている−Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、独立にＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、Ｈ、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ７は、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ９およびＲ１０は、水素である。
【００６３】
本発明の別の態様は、式Ｉ−Ｄによって表される蛍光性化合物
【化２０】
2019151665.tif 000042
またはその塩を提供し、式中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＣ（Ｃ１〜４アルキル）２であり、
Ｗ１およびＷ２は、ベンゾ、ナフトまたはピリジル環であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、水素であるか、またはハロゲン、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−および−ＯＨからなる群から独立に選択される一つまたは二つの置換基で任意選択により置換されている−Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、Ｈ、−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１２）−アルキレン−Ｘ３、ハロゲンまたは−ＮＯ２であり、
Ｘ３は、出現するごとに独立に、Ｈ、ハロゲン、−ＣＨ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−、−ＮＣＳ、−ＮＣＯ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、−ＯＨ、−ＳＨ、マレイミド、フタルイミド、−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−（ハロゲン）、−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＣＮ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＯＮ（Ｈ）Ｒ１３、アルキニル、−Ｎ３、ポリエチルグリコール、任意選択により置換されているアリール、または任意選択により置換されているヘテロシクリルを表し、
Ｒ９およびＲ１０は、水素、ハロゲンもしくはアルキルであるか、またはＲ１およびＲ９もしくはＲ２およびＲ１０は、それらの相互接続原子と一緒になって、５員、６員または７員環を形成し、
Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立に、アルキル、ハロアルキル、アリール、アラルキル、シアノ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）−ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）−アリール、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１５、−ＣＯＮ（Ｈ）Ｒ１５、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ１５、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ１５、−ＣＯ（ＣＨ２）ｎＲ１５、−（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｈ、または−（ＣＨ２）ｎＳＯ３−であり、
Ｒ１３は、出現するごとに独立に、水素またはアルキルを表し、
Ｒ１５は、出現するごとに独立に、Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ２、−ＳＨ、アルキル、ポリエチレングリコール、またはＸ３で任意選択により置換されていてもよいアリール、および／またはポリエチレングリコールを表し、
ｍは、出現するごとに独立に、０、１、２、３または４を表し、
ｎは、出現するごとに独立に、１〜１０を表す。
【００６４】
ある特定の実施形態では、Ｘ１およびＸ２は、Ｃ（ＣＨ３）２である。ある特定の実施形態では、Ｗ１およびＷ２は、ベンゾ環である。ある特定の実施形態では、Ｗ１およびＷ２は、ナフト環である。ある特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、独立に、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ３−で任意選択により置換されている−Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、独立にＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、Ｈ、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ７は、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ９およびＲ１０は、水素である。
【００６５】
本発明の別の態様は、式ＩＩによって表される蛍光性化合物
【化２１】
2019151665.tif 000043
またはその塩を提供し、式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、水素であるか、またはハロゲン、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−および−ＯＨからなる群から独立に選択される一つまたは二つの置換基で任意選択により置換されている−Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、Ｈまたは−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３であり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、Ｈ、−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１２）−アルキレン−Ｘ３、ハロゲンまたは−ＮＯ２であり、
Ｘ３は、出現するごとに独立に、Ｈ、ハロゲン、−ＣＨ３、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ２−、−ＮＣＳ、−ＮＣＯ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、−ＯＨ、−ＳＨ、マレイミド、フタルイミド、−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−（ハロゲン）、−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＣＮ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＯＮ（Ｈ）Ｒ１２、アルキニル、−Ｎ３、ポリエチルグリコール、任意選択により置換されているアリール、または任意選択により置換されているヘテロシクリルを表し、
Ｒ９およびＲ１０は、水素、ハロゲンもしくはアルキルであるか、またはＲ１およびＲ９もしくはＲ２およびＲ１０は、それらの相互接続原子と一緒になって、５員、６員または７員環を形成し、
Ｒ１２は、出現するごとに独立に、水素またはアルキルを表し、
ｍは、出現するごとに独立に、０、１、２、３または４を表し、
ｎは、出現するごとに独立に、１〜１０を表す。
【００６６】
ある特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、独立に、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ３−で任意選択により置換されている−Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、独立に、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ３で任意選択により置換されてい
る−Ｃ２〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、−Ｃ１〜Ｃ２２アルキレン−Ｘ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、−Ｃ２〜Ｃ８アルキレン−Ｘ３である。ある特定の実施形態では、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３−または−ＣＯＯＨで置換されている−Ｃ２〜Ｃ８アルキレンである。ある特定の実施形態では、Ｒ７およびＲ８は、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ９およびＲ１０は、水素である。
【００６７】
本発明の別の態様は、式（ＩＩ）によって表される化合物
Ｚ１−（ＰＭＢ）−Ｚ２（ＩＩ）
およびその塩を提供する。
【００６８】
Ｚ１およびＺ２は、それぞれ独立に、複素環式部分を含む多環式基を表す。例えば、Ｚ１およびＺ２は、それぞれ独立に、置換または非置換インドリニウムまたはベンゾインドリウム環から選択することができる。ＰＭＢは、４，４−二置換シクロヘキシ架橋部分を含むポリメチン架橋を表す。化合物は、約５００ｎｍ〜約１１００ｎｍの範囲、好ましくは約６００ｎｍ〜約９００ｎｍの範囲の吸収および発光波長を有する。ある特定の実施形態では、色素は、約６００ｎｍ〜約８５０ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約９００ｎｍ、または約６５０ｎｍ〜約８５０ｎｍの範囲の波長を有する光を吸収および／または放出する。
【００６９】
Ｚ１、Ｚ２、および／またはＰＭＢは、任意選択により、生体分子と共有結合および／または化学的連結を形成することができるリンカー部分を含み得る。このようなリンカー部分は、異なる化合物上の官能基と化学的に反応して、共有結合性連結を形成することができる反応基、または異なる化合物上の反応基と化学的に反応して、共有結合性連結を形成することができる官能基を含み得る。このような反応基には、例えば、それぞれ求核試薬または求電子試薬である対応する官能基への曝露によって共有結合性連結を形成することができる求電子試薬または求核試薬が含まれ得る。あるいは、反応基は、光で活性化可能な基であり、適切な波長の光を照射した後のみ化学的に反応性になる。本発明の化合物と連結される生体分子との反応の結果、コンジュゲート物質に本発明の化合物を結合させる新しい連結に、反応基の一つまたは複数の原子が組み込まれ得る。
【００７０】
本明細書で企図される生体分子として、タンパク質（例えば、酵素、ホルモン、抗体およびその抗原結合フラグメント、ならびに単鎖抗体）、ペプチド、アミノ酸、糖タンパク質、細胞受容体のリガンド、ポリサッカライド、炭水化物、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、ヌクレオシド、ヌクレオチド、アプタマー、ペプチジル核酸、細胞受容体、酵素基質、酵素補因子、ビオチン、ホルモン、神経伝達物質、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、レクチン、セレクチン、脂質、脂質集合体（例えば、ミセルまたは小胞）、および毒素が挙げられるが、これらに限定されない。限定されるものではないが、アシアロ糖タンパク質受容体、ソマトスタチン、神経成長因子、オキシトシン、ボンベシン、カルシトニン、アルギニンバソプレシン、アンギオテンシンＩＩ、心房性ナトリウム利尿ペプチド、インスリン、グルカゴン、プロラクチン、ゴナドトロピン、様々なオピオイドおよびウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン活性化因子を含む、トランスフェリン、ビタミン、炭水化物および内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ）受容体を標的化するリガンドの標的化および送達、例えば葉酸媒介性標的化（Ｌｅａｍｏｎ  ＆  Ｌｏｗ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ、６巻：４４〜５１頁、２００１年）に関与するものなどの他の生体分子を使用することができる。また、限定されるものではないが、ウイルスおよび細菌を含むいくつかの供給源に由来し得る膜、膜透過および核移行シグナル配列も企図される。生体分子には、有機分子、ポリマー、デンドリマー、細胞（例えば、哺乳動物細胞、非哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、胚細胞）、細菌、バクテリオファージ、ウイルス、生物、粒子、微粒子、またはナノ粒子も含まれ得る。生体分子には、限定
されるものではないが、光線療法または放射線療法分子を含む治療用薬物分子も含まれ得る。
【００７１】
本発明の蛍光色素化合物は、以下のタイプの造影剤またはプローブ：分子プローブ、活性化可能なプローブ、酵素活性化可能なプローブ、量子ドットベースのイメージングプローブ、ナノ粒子ベースのイメージングプローブ、生体分子を標的化したプローブ、波長偏移ビーコン、多色プローブ、標的に高い結合親和性を有するプローブ、非特異的イメージングプローブ、細胞ベースのプローブ、二重様式（ｄｕａｌ  ｍｏｄａｌｉｔｙ）剤、光学／ＣＴ二重様式剤（例えば、ＣＴ剤に物理的または化学的に結合した光学的剤）、光学／ＭＲ二重様式剤（例えば、ＭＲ剤に物理的または化学的に結合した光学的剤）、光学／核二重様式剤（例えば、放射性原子にまたは放射性原子と物理的または化学的に結合した光学的剤）、および／またはそれらの任意の組合せ、の一つまたは複数を作り出すために使用され得る。
【００７２】
化学的に連結された生体分子を含む本発明の化合物は、生体分子に化学的に連結されていない化合物と比較して、増強された蛍光を有することができる。ある特定の実施形態では、蛍光は、連結されていない化合物と比較して、約１０％、約２５％または約５０％増強されている。本発明の化合物に化学的に連結されている生体分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分子の蓄積、体内分布、排除、標的化、結合および／または認識を変えてもよく、増強させてもよい。
【００７３】
一つまたは複数の生体分子は、いくつかの反応性官能基を含有する多価の連結またはリンカーを介してＺ１、ＰＭＢ、および／またはＺ２に化学的に連結されて、構造（Ｚ１−（ＰＭＢ）−Ｚ２）−（（Ｌ）ｖ（ＢＭ）ｒ）ｔ［Ｌは、リンカーもしくはスペーサ、または多価のスペーサもしくはリンカーであり、ＢＭは、生体分子であり、Ｚ１、Ｚ２、およびＰＭＢは、既に定義されている通りであり、ｔ＝１〜６、ｖ＝１〜５００およびｒ＝１〜５００であり、（Ｌ）ｖは、ｖが１を超える場合、同じリンカーのコピーまたは異なるリンカーの組合せを表す］の生体適合性である蛍光性分子を形成することができる。
【００７４】
本発明の化合物に適したリンカー部分の例は、既に文献（米国特許出願第２００２／００６４７９４号（２００２年）、米国特許第６，０８６，７３７号、米国特許第６，０４８，９８２号、米国特許第６，７４７，１５９号、および米国特許第６，４４８，００８号参照）に記載されている。
【００７５】
本発明の１種超の蛍光色素化合物は、単一の生体分子に化学的に連結され得ると理解される。このような構造の一例は、［Ｚ１−（ＰＭＢ）−Ｚ２］ｕ−ＢＭ（ｕ＝１〜５００であり、Ｚ１、Ｚ２、ＰＭＢ、およびＢＭは、先に定義した通りである）と表され得る。
【００７６】
開示の化合物の塩も企図され、それには、塩基付加塩および酸付加塩の両方が含まれる。本発明の化合物は、適切な有機または無機塩基と反応して塩基付加塩を形成することができる、一つまたは複数の十分に酸性のプロトンを有することができる。塩基付加塩には、無機塩基、例えばアンモニウム、またはアルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等、ならびに有機塩基、例えばアルコキシド、アルキルアミド、アルキルおよびアリールアミン等に由来する塩が含まれる。したがって、本発明の塩を調製するのに有用なこのような塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム等が含まれる。
【００７７】
十分に塩基性の基、例えばアミンを有する本発明の化合物は、有機または無機酸と反応して、酸付加塩を形成することができる。塩基性の基を有する化合物から酸付加塩を形成するために一般に用いられる酸は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫
酸、リン酸等、および有機酸、例えばｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニル−スルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等である。このような塩の例として、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−二酸塩、ヘキシン−１，６−二酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ガンマ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、マンデル酸塩等が挙げられる。
【００７８】
例えば、式Ｉの化合物は、式Ｉａ、ＩｂおよびＩｃ
【化２２】
2019151665.tif 000044
またはその塩によって表され得、式中、
Ｘ１およびＸ２は、独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｃ（ＣＨ２Ｒ３ＣＨ２Ｒ４）から選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、Ｈ、（ＣＨ２）ｎＸ３（ｎ＝１〜２０）から選択され、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、Ｈ、（ＣＨ２）ｎＸ３（ｎ＝０〜２０）から選択され、Ｘ３は、独立に、Ｈ、ハロゲン、ＣＨ３、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ３−、ＣＯＯＨ、ＮＣＳ（イソチオシアネート）、ＮＣＯ（イソシアネート（ｉｓｃｏｃｙａｎａｔｅ））、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル（ＮＨＳＳ）エステル、ヒドロキシ（ＯＨ）、チオール（ＳＨ）、マレイミド、フタルイミド、ヨードアセトアミド、ＣＮ、ＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、アルキン、アジド（Ｎ３）、ＳＯ２ＮＸ３Ｒ７、Ｘ３で任意選択によりさらに置換されているアリールから選択され、
Ｒ９およびＲ１０は、Ｈまたはハロゲンまたはアルキル基であり、Ｒ１およびＲ９またはＲ２およびＲ１０は、任意選択により、一緒になって５員または６員または７員の環を形成し、Ｗ１およびＷ２は、ベンゾまたはナフトまたはピリジルを含むアリール環を形成するのに必要な原子であり、Ｒ１１は、独立に、ＣＯＯＨ、ＣＮ、Ｆ、ＮＯ２、ＣＯＣＦ３、ＣＦ３、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯ（ＣＨ２）ｎＲから選択され、Ｒは、ＨまたはＣＯＯＨまたはＳＯ３ＨまたはＮＨ２またはＳＨまたはアルキル、またはＸ３で任意選択によりさらに置換されているアリール、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）単位
【化２３】
2019151665.tif 000045
である。
【００７９】
ある特定の実施形態では、Ｘ３は、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ３Ｈ、カルボキシル、−ＣＯＣｌ、−（ＣＯ）Ｏ（ＣＯ）Ｒ１６、−ＣＯＮＨＮＨ２、置換および非置換Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）エステル、置換および非置換Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、ニトロ−またはフルオロ−フェノールエステル、アジド、−ＮＣＳ、−ＣＨＯ、アジド、−ＣＯＣＨ２Ｉ、ホスホルアミダイト、フタルアミド、ならびにマレイミドからなる群から選択され、Ｒ１６は、Ｈ、アルキルおよびアリールからなる群から選択される。
【００８０】
他の実施形態では、Ｘ１およびＸ２は、−Ｃ（ＣＨ３）２である。
【００８１】
Ｗ１およびＷ２は、同じであっても異なっていてもよいと理解される。例えば、Ｗ１およびＷ２は、
【化２４】
2019151665.tif 000046
からなる群から選択され得る。縮合環上に一つまたは複数の非水素置換基を組み込むことを使用して、得られる色素の吸収および発光スペクトルを調整することができる。
【００８２】
ある特定の実施形態では、化合物は、以下のうちの一つまたはその塩である。
【化２５−１】
2019151665.tif 000047
【化２５−２】
2019151665.tif 000048
【化２５−３】
2019151665.tif 000049
［Ｒ１１およびＲ１２は、独立に、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨＲ、ＣＮ、Ｏ＝Ｃ−フェニル、ＣＯＣＨ２Ｒであり、Ｒ＝Ｈまたは
【化２５−４】
2019151665.tif 000050
（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’または（ＣＨ２）ｎＣＨ３または（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｈまたは（ＣＨ２）ｎＳＯ３−であり、Ｒ’＝アルキルまたはアリールである。］
【化２６−１】
2019151665.tif 000051
【化２６−２】
2019151665.tif 000052
【化２６−３】
2019151665.tif 000053
【００８３】
本発明の化合物が、環およびポリメチン架橋における二重結合の位置を示す構造によって本明細書に図示される場合、その構造は、例えば以下の図に示されている通り、任意の共鳴構造を包含することも理解されたい。
【化２７】
2019151665.tif 000054
式中、先の構造のそれぞれにおいて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｗ１、Ｗ２、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、本明細書で定義の通りである。
【００８４】
一般に、本明細書に開示の化合物は、以下の通り合成することができる。まず、四級化複素環であるＺ１を調製する。次に、複素環式塩基を、求電子試薬であるポリメチン架橋（ＰＭＢ）、例えばＰｈＮＨ−ＰＭＢ−ＣＨ＝ＮＨＰｈ．ＨＣｌ、またはＲＯ−ＰＭＢ−ＣＨ（ＯＲ）２（ＰＭＢは、コンジュゲートした二重結合鎖（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−からなり、このような鎖は、その一部として４，４−二置換シクロヘキシル架橋部分を含み、Ｐｈはフェニル環であり、Ｒは、メチルまたはエチル基である）と反応させると、ヘミシアニン、例えばＺ１−ＰＭＢ−ＣＨ＝ＮＨＰｈまたはＺ１−ＰＭＢ−ＣＨ＝ＮＡｃＰｈ（Ａｃはアセチルラジカルである）またはＺ１−（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＯＲが得られる。次に、これらの中間体を、異なる第四級複素環であるＺ２と反応させる。官能化されたサイドアームは、第１（Ｚ１）または第２（Ｚ２）の四級化複素環のいずれかに結合している。最終的に、非対称性ポリメチン標識試薬、Ｚ１−ＰＭＢ−Ｚ２が得られる。ヘミシアニン中間体の例は、Ｆ．  Ｍ．  Ｈａｍｅｒ、「Ｓｏｍｅ  Ｕｎｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ  Ｐｅｎｔａｍｅｔｈｉｎｃｙａｎｉｎｅ  Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｉｎ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ」、Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、３２巻（１９４９年）、ならびにＲ．  Ｂ．  Ｍｕｊｕｍｄａｒ、Ｌ．  Ａ．  Ｅｒｎｓｔ、Ｓｗａｔｉ  Ｒ．  Ｍｕｊｕｍｄａｒ、Ｃ．  Ｊ．  ＬｅｗｉｓおよびＡ．  Ｓ．  Ｗａｇｇｏｎｅｒ、「Ｃｙａｎｉｎｅ  Ｄｙｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ：  Ｓｕｌｆｏｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｅｓｔｅｒｓ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４巻、１０５頁（１９９３年）に記載されている。
【００８５】
別の態様では、本発明は、一般構造式Ｖの化合物を提供する。
【化２８−１】
2019151665.tif 000055
式中、Ｒ１１およびＲ１２は、独立に、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨＲ、ＣＦ３、ハロゲン、ＣＮ、Ｏ＝Ｃ−フェニル、ＣＯＣＨ２Ｒであり、Ｒ＝Ｈまたは
【化２８−２】
2019151665.tif 000056
（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’または（ＣＨ２）ｎＣＨ３または（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｈまたは（ＣＨ２）ｎＳＯ３−であり、Ｒ’＝アルキルまたはアリールであり、Ｐｈはフェニル基であり、これは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＭｅ、ＮＭｅ２、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＦ３、アルキルのうちの一つで任意選択により置換されている。
【００８６】
ある特定の他の実施形態では、式４５ａおよび４５ｂによって表される以下の構造が企図され、式中、Ｒ’は、アルキルまたはアリールである。
【化２９】
2019151665.tif 000057
【００８７】
ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、式ＩＩＩ−［ＢＭ］ｎ−Ｆｍ（ＢＭは、生体分子であり、Ｆは、式１ａ、１ｂまたは１ｃ（前述の通り）によって表されるフルオロフォアであり、ｎ＝１〜４であり、ｍ＝１〜１００である）によって表される通り、生物学的分子または生体分子（ＢＭ）に化学的に連結され得る。得られた化合物−生体分子のコンジュゲートは、例えば生物学的分子と標的の相互作用に起因して、例えば受容体−リガンドの相互作用、酵素−基質の相互作用、抗体−抗原の相互作用等を介して、標的に高い結合親和性を有することができる。他の実施形態では、一般形態［Ｚ１−（ＰＭＢ）−Ｚ２］−ＢＭの、化学的に連結されているこのような化合物は、例えば以下の通りに表され得る。
【化３０】
2019151665.tif 000058
式中、先の構造のそれぞれにおいて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｗ１、Ｗ２、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、本明細書で定義の通りであり、Ｙ−は、対イオンであり、ＢＭは、生体分子である。先の構造は例示的であり、生体分子（ＢＭ）は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｗ１、Ｗ２、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３と同定される基の任意の一つまたは複数を介して、このような化合物に化学的に連結され得ると理解される。
【００８８】
本発明の別の態様は、生物学的分子と、式Ｉ−Ａ、Ｉ−Ｂ、Ｉ−Ｃ、Ｉ−ＤまたはＩＩの化合物などの本明細書に記載の化合物との反応によって形成されたコンジュゲート化合物を提供する。
【００８９】
本発明の別の態様は、−Ｌ−ＢＭによって定義される１、２または３個の基でさらに置換されている、本明細書に記載の化合物（例えば、式Ｉ−Ａ、Ｉ−Ｂ、Ｉ−Ｃ、Ｉ−ＤまたはＩＩの化合物）であるコンジュゲート化合物を提供し、ここで、Ｌは結合またはリンカーであり、−ＢＭは生物学的分子のラジカルである。
【００９０】
化合物は、以下の通り生体分子または細胞で標識され得る。本発明の化合物（蛍光色素）は、様々な濃度において約５分間〜２４時間またはそれより長く、約４℃〜約３７℃の温度で一つまたは複数の生体分子と共にインキュベートされる。インキュベーション後、遊離蛍光色素、または生体分子に化学的に連結されなかった蛍光色素は、例えばクロマトグラフィーまたは限外濾過法などの当業者に公知の方法を使用して除去され得る。
【００９１】
細胞を、インキュベーション後に遠心分離して、上清が除去されている細胞ペレットを作り出すことができる。細胞を、培養培地または生理食塩水に再度懸濁させて、残留蛍光色素、結合していない蛍光色素、または遊離蛍光色素を洗い流すことができる。これを数回反復してもよい。この方式では、内部もしくは外部の細胞分子への直接的なコンジュゲートによって、または限定されるものではないがサイトゾル、エンドソーム、核、ゴルジ装置、および他の細胞内小器官を含む様々な細胞内区画への非特異的な細胞取込みによって、細胞を標識することができる。
【００９２】
開示の化合物および／または組成物を、キットとしてパッケージングすることができ、このキットは任意選択により、化合物を使用するための指示を含むことができる。非限定
的な例として、例えば粉末または凍結乾燥形態の組成物、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの利用のための再構成、投与量情報および保存情報を含む使用のための指示を含有するキットが挙げられる。キットは、任意選択により、使える状態のまたは投与のために溶液とさらに混合する必要がある液体形態の組成物の容器、例えば粉末形態を再構成するためのバイアル、注射のためのシリンジ、特製のＩＶ送達システム、吸入器等を含有することができる。このような容器は、対象への単一または複数用量を含有することができる。さらにキットは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける組成物の検出に役立つ構成要素、例えば特殊内視鏡、光フィルタを含有することができる。
【００９３】
生体分子に化学的に連結されている化合物を含む、本明細書に開示の化合物は、対象、例えば動物またはヒト対象に投与するのに適した医薬組成物に製剤化することができる。したがって製剤は、化合物を、投与の所望の形態および／または用量に適した生理的に許容される担体と一緒に含む。生理的に許容される担体として、水、食塩水を挙げることができ、これには、緩衝剤などの剤、および医薬製剤における使用に適合する保存剤などの他の剤がさらに含まれ得る。好ましい担体は、流体、好ましくは液体、より好ましくは水溶液であるが、固体製剤、局所製剤、吸入製剤、眼科用製剤、および経皮製剤のための担体も、本発明の範囲に含まれることが企図される。
【００９４】
さらに医薬組成物は、生理的に許容される担体に一つまたは複数の安定剤を含むことができる。このような組成物における使用に適した安定剤の例として、例えば、低分子量炭水化物、例えば直鎖多価アルコール、例えばソルビトールおよびグリセロールが挙げられる。イノシトールなどの他の低分子量炭水化物を使用することもできる。
【００９５】
本発明の化合物は、経口または非経口投与され得ることが企図される。非経口投与では、化合物は、静脈内、筋肉内、皮膚、経皮、皮下、直腸内、経鼻、膣内、および眼に投与され得る。したがって組成物は、例えば、固体錠剤、カプセル、丸剤、凍結乾燥散剤を含む散剤、コロイド懸濁液、ミクロスフェア、リポソーム顆粒、懸濁液、エマルション、溶液、ヒドロゲルを含むゲル、ペースト、軟膏、クリーム、ギプス、灌注溶液、水薬、浸透圧送達デバイス、坐剤、浣腸、注射剤、移植片、スプレー、またはエアロゾルの形態であってよい。医薬組成物は、従来の薬務に従って製剤化され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、２０００年、Ａ．Ｒ．  Ｇｅｒｍａｒｏ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、およびＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．  ＳｗａｒｂｒｉｃｋおよびＪ．  Ｃ．  Ｂｏｙｌａｎ編、１９８８〜１９９９年、Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。
【００９６】
ＩＩＩ．本発明の蛍光色素化合物の利用
本発明の化合物は、様々なｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの用途において使用され得る。これらの用途を、以下の部分に論じる。
（ａ）ｉｎ  ｖｉｖｏでの用途
【００９７】
本発明は、様々なイメージング用途、例えば光学イメージング用途で使用することができる新規蛍光性化合物を提供する。光学イメージング技術の総説については、例えば、Ａｌｆａｎｏら、Ａｎｎ．  ＮＹ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８２０巻：２４８〜２７０頁、１９９７年；Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９巻、３１６〜３１７頁（２００１年）；Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓら、Ｅｕｒ．  Ｒａｄｉｏｌ．  １３巻：１９５〜２０８頁（２００３年）；Ｇｒａｖｅｓら、Ｃｕｒｒ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ４巻：４１９〜４３０頁（２００４年）；Ｃｉｔｒｉｎら、Ｅｘｐ
ｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ４巻：８５７〜８６４頁（２００４年）；Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  ８巻：１〜３３頁（２００６年）；Ｋｏｏら、Ｃｅｌｌ  Ｏｎｃｏｌ．  ２８巻：１２７〜１３９頁（２００６年）；およびＲａｏら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８巻：１７〜２５頁（２００７年）参照。
【００９８】
本発明の実施に有用なイメージングシステムは、典型的に、三つの基本的な構成要素、（１）本発明の蛍光色素化合物を励起するのに適切な光源、（２）蛍光色素の励起を誘発するために使用した光による発光を分離または識別するためのシステム、および（３）検出システムを含む。この検出システムは、手持ち式であってもよく、他の有用なイメージングデバイス、例えば内視鏡、カテーテル、術中顕微鏡および／もしくはビューアーに組み込むことができる。
【００９９】
好ましくは、光源は、単色（または実質的に単色）光を提供する。光源は、適切にフィルタをかけた白色光、すなわち広帯域供給源からのバンドパス光であり得る。例えば、１５０ワットのハロゲンランプからの光を、Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ（バーモント州Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ）から市販されている適切なバンドパスフィルタに通過させることができる。システムに応じて、光源はレーザーであってもよい。例えば、Ｂｏａｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１巻：４８８７〜４８９１頁、１９９４年；Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７巻：２７６７〜２７７２頁、２０００年；およびＡｌｅｘａｎｄｅｒ、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｓｅｒ  Ｍｅｄ．  Ｓｕｒｇ．  ９巻：４１６〜４１８頁、１９９１年参照。イメージングのためのレーザーに関する情報は、例えばＩｍａｇｉｎｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（フロリダ州Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）および様々な他の供給源に見出され得る。高域または高バンドパスフィルタを使用して、励起光から光学発光を分離することができる。適切な高域または高バンドパスフィルタは、Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ（バーモント州Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）から市販されている。
【０１００】
一般に、光検出システムは、集光／画像形成構成要素および光検出／画像記録構成要素を含むとみなすことができる。光検出システムは、両方の構成要素を組み込む単一の集積デバイスであってもよいが、集光／画像形成構成要素および光検出／画像記録構成要素を、別個に論じる。
【０１０１】
特に有用な集光／画像形成構成要素は、内視鏡である。腹膜（Ｇａｈｌｅｎら、Ｊ．  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．  Ｂ  ５２巻：１３１〜１３５頁、１９９９年）、卵巣がん（Ｍａｊｏｒら、Ｇｙｎｅｃｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ．  ６６巻：１２２〜１３２頁、１９９７年）、結腸および直腸（Ｍｙｃｅｋら、Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．
Ｅｎｄｏｓｃ．  ４８巻：３９０〜３９４頁、１９９８年；およびＳｔｅｐｐら、Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ  ３０巻：３７９〜３８６頁、１９９８年）、胆管（Ｉｚｕｉｓｈｉら、Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ４６巻：８０４〜８０７頁、１９９９年）、胃（Ａｂｅら、Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ  ３２巻：２８１〜２８６頁、２０００年）、膀胱（Ｋｒｉｅｇｍａｉｒら、Ｕｒｏｌ．  Ｉｎｔ．  ６３巻：２７〜３１頁、１９９９年；およびＲｉｅｄｌら、Ｊ．Ｅｎｄｏｕｒｏｌ．  １３巻：７５５〜７５９頁、１９９９年）、肺（Ｈｉｒｓｃｈら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７巻：５〜２２０頁、２００１年）、脳（Ｗａｒｄ，  Ｊ．  Ｌａｓｅｒ  Ａｐｐｌ．  １０巻：２２４〜２２８頁、１９９８年）、食道、および頭頸部領域を含む数々の組織および臓器のｉｎ  ｖｉｖｏ光学イメージングに使用されている内視鏡デバイスおよび技術を、本発明の実施において用いることができる。
【０１０２】
他のタイプの集光構成要素は、光ファイバーデバイスを含むカテーテルベースのデバイスである。このようなデバイスは、血管内イメージングに特に適している。例えば、Ｔｅａｒｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６巻：２０３７〜２０３９頁、１９９７年；およびＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９４巻：３０１３頁、１９９６年参照。
【０１０３】
フェーズドアレイ技術（Ｂｏａｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．
ＵＳＡ  ９１巻：４８８７〜４８９１頁、１９９４年；Ｃｈａｎｃｅ、Ａｎｎ．  ＮＹ
Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８３８巻：２９〜４５頁、１９９８年）、光学断層撮影法（Ｃｈｅｎｇら、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３巻：１１８〜１２３頁、１９９８年；およびＳｉｅｇｅｌら、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ４巻：２８７〜２９８頁、１９９９年）、生体内顕微鏡法（Ｄｅｌｌｉａｎら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８２巻：１５１３〜１５１８頁、２０００年；Ｍｏｎｓｋｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５９巻：４１２９〜４１３５頁、１９９９年；およびＦｕｋｕｍｕｒａら、Ｃｅｌｌ  ９４巻：７１５〜７２５頁、１９９８年）、共焦点イメージング（Ｋｏｒｌａｃｈら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６巻：８４６１〜８４６６頁、１９９９年；Ｒａｊａｄｈｙａｋｓｈａら、Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １０４巻：９４６〜９５２頁、１９９５年；およびＧｏｎｚａｌｅｚら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３０巻：３３７〜３５６頁、１９９９年）ならびに蛍光分子断層撮影法（ＦＭＴ）（Ｎｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８巻：７５７〜７６０頁、２００２年；米国特許第６，６１５，０６３号、ＰＣＴ出願第ＷＯ０３／１０２５５８号、およびＰＣＴ  ＵＳ／０３／０７５７９）を含むさらに他のイメージング技術を、本発明の蛍光色素化合物と共に使用することができる。同様に、蛍光色素化合物は、様々なイメージングシステム、例えば、［１］ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングシステム：１００シリーズ、２００シリーズ（Ｘｅｎｏｇｅｎ、カルフォルニア州Ａｌａｍｅｄａ）、［２］ＳＰＥＣＴＲＵＭおよびＬＵＭＩＮＡ（Ｘｅｎｏｇｅｎ、カルフォルニア州Ａｌａｍｅｄａ）、［３］ＳｏｆｔＳｃａｎ（登録商標）またはｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）、［４］Ｍａｅｓｔｒｏ（商標）およびＮｕａｎｃｅ（商標）−２  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＣＲｉ、マサチューセッツ州Ｗｏｂｕｒｎ）、［５］Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ（ニューヨーク州Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）製のＩｍａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｉｎ−Ｖｉｖｏ  ＦＸ（かつてのＫｏｄａｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、［６］ＯＶ１００、ＩＶ１００（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、日本）、［７］Ｃｅｌｌｖｉｚｉｏ  Ｍａｕｎａ  Ｋｅａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フランス）［８］ＮａｎｏＳＰＥＣＴ／ＣＴまたはＨｉＳＰＥＣＴ（Ｂｉｏｓｃａｎ、ワシントンＤＣ）、［９］ＣＴＬＭ（登録商標）またはＬＩＬＡＴＭ（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、フロリダ州Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、［１０］ＤＹＮＯＴＴＭ（ＮＩＲｘ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州Ｇｌｅｎ  Ｈｅａｄ）、ならびに［１１］Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ドイツ）によるＮｉｇｈｔＯＷＬイメージングシステムにおいて使用され得る。
【０１０４】
このようなシステムでは、様々な光検出／画像記録構成要素、例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）システムまたは写真フィルムを使用することができる。光検出／画像記録の選択は、使用される集光／画像形成構成要素のタイプを含む因子に応じて決まる。しかし、適切な構成要素の選択、光学イメージングシステムへの構成要素の組入れ、およびシステムの操作は、当技術分野の通常の技術の範囲内であると理解される。
【０１０５】
光学イメージングおよび測定技術として、蛍光イメージング、ルミネッセンスイメージング、内視鏡検査、蛍光内視鏡検査、光干渉断層計、透過イメージング、時間分解透過イメージング、共焦点イメージング、非線形顕微鏡法、光音響イメージング、音響光学型イメージング、分光法、反射分光法、生体内イメージング、二光子イメージング、干渉法、
コヒーレンス干渉法、拡散光学断層撮影法、および蛍光分子断層撮影法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
注射の蛍光色素化合物は、固体支持体、例えば粒子にカップリングされるか、またはそれらの内部に組み込まれ得ることが企図される。したがって、蛍光色素化合物は、蛍光性でもある粒子を生成するために、磁気特性を有する金属酸化物ナノ粒子にカップリングされ得ると理解される。したがって、得られた粒子は、当技術分野で公知の技術を使用して、ＭＲＩイメージングで使用されてもよい。ＭＲＩ技術の総説については、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＭＲＩ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２版、１９９９年、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ参照。例えば、蛍光性分子断層撮影法および磁気共鳴イメージングによって得られた画像が、互いに位置合わせされるか（ｃｏ−ｒｅｇｉｓｔｅｒ）または融合されて、画像化される項目に関する追加の情報を提供し得ることは可能である。さらに、多重様式のイメージングシステム（すなわち、光学的およびＭＲイメージングシステムを組み合わせたもの）を使用して、組み合わされた光学的ＭＲ画像を作り出すことができる。
【０１０７】
さらに、本発明の組成物および方法は、他のイメージング組成物および方法と組み合わせて使用され得る。例えば、本発明の蛍光色素化合物は、単独で、または他の従来のイメージング様式、例えばＸ線、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ＭＲイメージング、超音波、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、および単光子コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）と組み合わせて、光学イメージングプロトコールを介して目的の領域を画像化するために使用され得る。例えば、本発明の組成物および方法を、ＣＴまたはＭＲイメージングと組み合わせて使用して、例えば別のイメージング様式によって生成された画像を位置合わせすることによって、解剖学的および分子的情報の両方を同時に得ることができる。本発明の組成物および方法は、Ｘ線、ＣＴ、ＰＥＴ、超音波、ＳＰＥＣＴ、ＭＲおよび他の光学コントラスト剤と組み合わせて使用されてもよいか、または代わりに本発明の蛍光色素化合物は、光学イメージングと組み合わせてＣＴ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴおよびＭＲイメージング様式を使用して検出することができる、ヨウ素、ガドリニウム原子および放射性同位元素などの造影剤を含有することもできる。
【０１０８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ光学イメージングの例示的な方法は、（ａ）対象、例えばヒトまたは動物に、本発明の蛍光性化合物を投与するステップと、（ｂ）蛍光色素化合物が対象内に分布するか、または生物学的標的と接触もしくは相互作用するのに十分な時間を設けるステップと、（ｃ）対象を、電磁放射線、例えば蛍光色素化合物によって吸収可能な波長の光に曝露するステップと、（ｄ）蛍光色素化合物によって放出された光学シグナルを検出するステップとを含む。
【０１０９】
対象は、脊椎動物、例えばヒトを含む哺乳動物であり得ると理解される。また動物は、非脊椎動物（例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａまたは他のモデル研究生物等）であってもよい。生物学的標的として、細胞、細胞培養物、組織、組織切片、臓器、臓器切片、サイトスピン試料、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１１０】
例えばステップ（ａ）〜（ｄ）を含む上述のステップは、所定の時間間隔で反復され得、それによって対象において放出された蛍光色素化合物のシグナルの経時的な評価を可能にし得る。照射および検出ステップ（それぞれステップ（ｃ）および（ｄ））は、平面イメージングシステム、内視鏡、カテーテル、断層撮影システム、手持ち式の光学イメージングシステム、ゴーグル、または術中顕微鏡を使用して実施され得る。蛍光色素化合物によって放出されたシグナルは、画像、例えば断層画像を構築するために使用され得る。
【０１１１】
これらのステップの前または最中に、検出システムは、対象から放出された光学的および／または他のシグナル（例えばＭＲ、核、Ｘ線）を検出するために、対象（例えば動物またはヒト）の周りまたはその近傍に位置することができる。放出された光学的および／または他のシグナルは、画像、例えば断層画像または平面画像を構築するために処理され得る。さらに、処理されたシグナルは、単独で、または融合（組み合わされた）画像のいずれかの画像として表示され得る。
【０１１２】
さらに、一つまたは複数の造影剤を選択的に検出し、同時に画像化するｉｎ  ｖｉｖｏイメージング方法を実施することが可能である。このような手法では、例えば前述のステップ（ａ）において、シグナル特性が互いに識別可能な２種類またはそれより多くの種類の造影剤が、同時または連続的に対象に投与され、造影剤の少なくとも一つは、本発明の蛍光色素化合物を含有する。複数の剤を使用すると、複数の生物学的プロセス、機能または標的の記録が可能になる。
【０１１３】
本発明はまた、標識された細胞が対象に投与されるｉｎ  ｖｉｖｏイメージング方法を特色とする。細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏで蛍光色素化合物により標識することができる。細胞は、対象に直接由来してもよく、別の供給源（例えば、別の対象、細胞培養物等）に由来してもよい。蛍光色素化合物は、細胞と混合されて、細胞を有効に標識することができ、得られた標識細胞はステップ（ａ）で対象に投与されて生じる標識細胞を有効に標識することができる。次に、ステップ（ｂ）〜（ｄ）を下記の通りに行う。この方法は、Ｔ細胞、腫瘍細胞、免疫細胞および幹細胞を含む特定の細胞型、ならびに他の細胞型の輸送および局在をモニタするために使用され得る。特に、この方法は、細胞ベースの治療をモニタするために使用され得る。
【０１１４】
蛍光色素化合物の製剤化、投与方法の選択、対象に投与される蛍光色素化合物の投薬量、および蛍光色素化合物の投与と光（および、その環境下で適切な場合、他の形態の電磁放射線も）へのそれらの曝露との間のタイミングは、当技術分野の技術レベルの範囲内であると理解される。
【０１１５】
本発明の方法は、対象における蛍光色素化合物の局在を経時的に追跡するか、または対象における蛍光色素化合物の代謝および／もしくは排泄の変化もしくは変質を経時的に評価することを含み、いくつかの兆候を決定するために使用され得る。上記方法はまた、限定されるものではないが、有効性、最適なタイミング、最適な投与レベル（個々の患者または試験対象に合わせることを含む）、および治療の組合せの相乗効果を決定することを含めて、このような治療によってモジュレートされた分子的事象および生物学的経路を画像化することによって、このような疾患の治療の次に来るように使用されてもよい。
【０１１６】
本発明の方法および組成物はまた、医師または外科医が、疾患領域、例えば関節炎、がん、特に結腸ポリープ、または脆弱もしくは不安定なプラークを同定し、特徴付けて、疾患状態の組織と通常の組織を識別する（例えば、通常の手術用顕微鏡を使用して検出することが困難な腫瘍境界を検出すること）のを助ける、例えば、脳外科手術において、例えば病変ががん性であり除去されるべきかもしくは非がん性であり静置されるべきかを決定することによる、または疾患の外科的ステージ分類（例えば、術中のリンパ節のステージ分類、センチネルリンパ節マッピング、もしくは術中出血の評価）における治療的もしくは外科的介入の決定を助けるためか、または腫瘍境界を描くために使用され得る。
【０１１７】
本発明の方法および組成物はまた、疾患、特に初期疾患の局在、疾患もしくは疾患関連状態の重症度、疾患のステージ分類の検出、特徴付けおよび／もしくは決定、ならびに／または疾患のモニタリングに使用され得る。放出されたシグナルの存在、非存在またはレベルは、病状を示し得る。本発明の方法および組成物はまた、様々な治療介入、例えば外
科手順をモニタおよび／または案内し、細胞ベースの治療を含む薬物治療をモニタするために使用され得る。本発明の方法はまた、疾患または疾患状態の予後において使用され得る。
【０１１８】
前述のそれぞれに関して、（治療の前、最中または後に）検出またはモニタされ得るこのような疾患または疾患状態の例として、例えば、炎症（例えば、関節炎によって引き起こされた炎症、例えば関節リウマチ）、がん（例えば、結腸直腸、卵巣、肺、乳房、前立腺、子宮頸部、精巣、皮膚、脳、胃腸管、膵臓、肝臓、腎臓、膀胱、胃、白血病、口、食道、骨）、心血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症および血管の炎症状態、虚血、脳卒中、血栓症、播種性血管内凝固）、皮膚疾患（例えば、カポジ肉腫、乾癬、アレルギー性皮膚炎）、眼疾患（例えば、黄斑変性症、糖尿病性網膜症）、感染性疾患（例えば、後天性免疫不全症候群、マラリア、シャーガス病、住血吸虫症を含む、細菌、ウイルス、真菌および寄生虫の感染症）、免疫疾患（例えば、自己免疫性障害、リンパ腫、多発性硬化症、関節リウマチ、真性糖尿病、紅斑性狼瘡（ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）、重症筋無力症、グレーブス病）、中枢神経系疾患（例えば神経変性疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病）、遺伝性疾患、代謝性疾患、環境疾患（例えば、鉛、水銀および放射能の中毒症、皮膚がん）、骨に関係する疾患（例えば、骨粗鬆症、原発性および転移性骨腫瘍、変形性関節症）、神経変性疾患、および外科手術に関係する合併症（例えば、移植片拒絶、臓器拒絶反応、創傷治癒の変質、線維症、または外科的移植に関係する他の合併症）が挙げられる。
【０１１９】
したがって、本発明の方法および組成物は、例えば、腫瘍細胞の存在および／または局在、例えばアテローム性動脈硬化症または関節炎における活性化マクロファージの存在を含む、炎症の存在および／または局在、冠動脈および末梢動脈において急性閉塞の危険性がある領域（すなわち、脆弱なプラーク）、拡大動脈瘤の領域、頸動脈の不安定なプラークおよび虚血領域を含む、血管疾患の存在および局在を決定するために使用され得る。本発明の開示の方法は、例えばアポトーシス、壊死、低酸素症および血管新生の同定および評価において使用され得る。あるいは、開示の方法はまた、例えば治療用化合物または治療で処置する前、および処置した後の対象を画像化し、対応する画像を比較することによって、特定の分子標的に対する治療用化合物または治療の効果を評価するために使用され得る。
【０１２０】
（ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの用途
さらに、蛍光色素化合物は、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば結合実験およびｉｎ  ｖｉｔｒｏイメージング実験でもまた使用され得ると理解される。先のセクションで論じたイメージング技術は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏイメージング実験にも利用できると理解される。
【０１２１】
例示的なｉｎ  ｖｉｔｒｏイメージング方法は、（ａ）試料を、本発明の蛍光色素化合物を含むプローブと接触させるステップと、（ｂ）蛍光色素化合物を、（ｉ）生物学的標的によって活性化し、かつ／または（ｉｉ）生物学的標的に結合させるステップと、（ｃ）任意選択により、活性化していないかまたは結合していない蛍光色素化合物を除去するステップと、（ｄ）試料を、蛍光色素化合物によって吸収可能な波長の電磁放射線、例えば光に曝露するステップと、（ｅ）蛍光色素化合物から放出されたシグナルを検出し、それによってプローブが生物学的標的によって活性化されたか、または結合されたかを決定するステップとを含む。
【０１２２】
試料は、例えば初代細胞、細胞培養物または組織を含有する液体または固体試料であり得る。生物学的標的は、例えば細胞、細胞凝集体、組織もしくは組織試料、構造（マクロセルレベル（例えば、骨または組織）または細胞内レベル（例えば、ミトコンドリアまた
は核）の両方）、および細胞成分、例えばタンパク質（例えば、酵素または構造的タンパク質）、脂質、核酸または多糖であり得る。
【０１２３】
蛍光色素化合物は、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏリガンド結合アッセイで使用され得、したがって磁気粒子に組み込まれると、磁気検出ベースのアッセイにおいて使用され得る（米国特許第６，０４６，５８５号および同第６，２７５，０３１号、米国特許第５，４４５，９７０号、米国特許第４，２１９，３３５号、Ｃｈｅｍｌａら（２０００年）Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７巻、１４２６８〜７２頁参照）。また蛍光色素化合物は、米国特許第５，１６４，２９７号およびＰｅｒｅｚらＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００２年、２０巻（８号）：８１６〜２０頁に記載のものなどの磁気共鳴ベースのリガンド結合アッセイにおいて使用され得る。蛍光色素化合物は、細胞選別および計数用途で使用されてもよい。
【０１２４】
蛍光色素化合物はまた、核酸ベースのアッセイにおいてレポーター基として使用され得る。例えば、蛍光色素化合物は、ハイブリダイゼーションアッセイ、例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定反応、増幅反応、例えばリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応増幅反応において使用するために、核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ、修飾核酸、ＰＮＡ、分子ビーコン、または他の核酸結合分子（例えば、低分子干渉ＲＮＡすなわちｓｉＲＮＡ）とカップリングさせられ得る。例えば、核酸ハイブリダイゼーション原則によって、試料中の一本鎖核酸（すなわち、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは変性二本鎖ＤＮＡ）を検出するために、本発明の蛍光色素化合物を、一本鎖核酸（プローブ）に化学的に連結させ、一つまたは複数の一本鎖核酸（標的核酸）を含有すると疑われる試料と接触させ、任意選択により固体支持体上に固定する。プローブは、プローブが試料中の標的核酸にハイブリダイズして二本鎖を形成することを可能にする条件下で、試料と共にインキュベートされる。非結合プローブは、洗浄によって除去され得、結合したプローブは検出され得、プローブ中の蛍光色素化合物によって放出された蛍光の存在またはレベルは、試料中の標的核酸の存在または量を示す。
【０１２５】
（ｃ）ｅｘ  ｖｉｖｏでの用途
さらに、蛍光色素化合物は、様々なｅｘ  ｖｉｖｏアッセイ、例えば結合実験、およびｅｘ  ｖｉｖｏイメージング実験で使用され得ると理解される。先のセクションで論じたイメージング技術は、ｅｘ  ｖｉｖｏイメージング実験にも利用できると理解される。
【０１２６】
例示的なｅｘ  ｖｉｖｏイメージング方法は、（ａ）試料を、本発明の蛍光色素化合物を含むプローブと接触させるステップと、（ｂ）蛍光色素化合物を、（ｉ）生物学的標的によって活性化し、かつ／または（ｉｉ）生物学的標的に結合させるステップと、（ｃ）任意選択により、活性化していないかまたは結合していない蛍光色素化合物を除去するステップと、（ｄ）試料を、蛍光色素化合物によって吸収可能な波長の電磁放射線、例えば光に曝露するステップと、（ｅ）蛍光色素化合物から放出されたシグナルを検出し、それによってプローブが生物学的標的によって活性化されたか、または結合されたかを決定するステップとを含む。
【０１２７】
試料は、例えば初代細胞、細胞培養物または組織を含有する液体試料または固体試料であり得る。生物学的標的は、例えば細胞、細胞凝集体、組織もしくは組織試料、構造物（マクロセルレベル（例えば、骨  臓器または組織）または細胞内レベル（例えば、ミトコンドリアまたは核））の両方、および細胞成分、例えばタンパク質（例えば、酵素または構造的タンパク質）、脂質、核酸または多糖であり得る。
【０１２８】
ここで本発明を、単に例示する目的で示され、本発明の範囲を制限するものではない以下の実施例を用いて例示する。
【実施例】
【０１２９】
本発明の化合物の調製に使用できる代表的な材料および方法を、以下にさらに記載する。あらゆる市販の化学薬品および溶媒（試薬グレード）は、一般に、さらなる精製なしに供給されたまま使用される。分析および分取ＨＰＬＣ法は、以下を含む。
Ａ    カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ８０Å、Ｅｘｔｅｎｄ  Ｃ１８、４．６×２５０ｍｍ（５μｍ）。
移動相：アセトニトリル、２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム。
Ｂ    カラム：Ｖａｒｉａｎ  Ｄｙｎａｍａｘ、１００Å、Ｃ１８、４１．４×２５０ｍｍ。
移動相：アセトニトリル、２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム。
Ｃ    カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ、３００Å、Ｃ１８
移動相：アセトニトリル、２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム。
【０１３０】
（実施例１）化合物１ｇの合成
式１の反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳＥ）としての化合物１ｇの合成を、以下のスキーム３Ａに図示した複数ステップの合成手順によって達成した。
【化３１】
2019151665.tif 000059
【０１３１】
ＱＳ１Ａの調製：５−スルホ−２，３，３−トリメチルインドレニン（ｉｎｄｏｌｉｎｉｎｅ）を、カリウム塩（１）として、Ｓｙｎｔｈａｒｏ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ドイツから得た。１１０℃のオーブンで最短３時間乾燥させたインドレニン（化合物１）１０ｇを、１００ｍＬの丸底フラスコ中で、常に磁気により撹拌しながら１２０℃の油浴で８時間加熱することによって、Ｎ−メチルピロリジノン（Ａｌｄｒｉｃｈ）１０ｍ
Ｌ中１．５当量の１，３−プロパンスルトン（ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ）と反応させた。黄色反応混合物が濃い紫色に変わり、生成物が溶液から沈殿した。室温に冷却した後、酢酸エチルを反応混合物（ＲＭ）に添加し、５分間超音波処理した。沈殿物を濾過し、酢酸エチル（ＥＡ）−メタノールの９０％〜１０％混合物約１００ｍＬで３回洗浄し、次に真空下で４時間乾燥させた。収率９０％で得られた第四級塩ＱＳ１Ａを、ＬＣＭＳによって特徴付けた（ｍ／ｅ算出値：３６１（遊離スルホン酸として）；実測値：３６１（Ｍ＋１））。
【０１３２】
ビスアニル（ｂｉｓａｎｉｌ）９の調製：化合物９を、米国特許第５８７６９１５号（１９９９年３月２日付け）に記載のＤｅｒｏｏｖｅｒらの手順に従って、以下のスキームに示されている通り、三つのステップで調製した。中間体ＡおよびＢを、蒸留によって単離して、それぞれ１３ｇおよび１０ｇを得た。化合物Ｂを、ビルスマイヤー反応によって化合物９に変換し、生成物を、濾過し、真空下で終夜乾燥させることによって、暗赤色固体として単離した。
【化３２】
2019151665.tif 000060
【０１３３】
化合物１ａの調製：化合物９（１００ｍｇ、０．２１４ｍｍｏｌ）および化合物ＱＳ１Ａ（１７１ｍｇ、０．４１８ｍｍｏｌ）を、酢酸２．５ｍＬおよび無水酢酸７．５ｍＬ中で混合した。２分間超音波処理した後、酢酸ナトリウム３５ｍｇを添加し、混合物を１２０℃で撹拌しながら４時間加熱した。酢酸エチル（２５ｍＬ）を添加し、固体を遠心分離し、それを追加のＥＡ５ｍＬで洗浄し、遠心分離し、固体をｓｐｅｅｄ  ｖａｃで３０分間乾燥させた。粗製色素を、ＨＰＬＣによって、逆相（ＲＰ）Ｃ１８カラムにより、１０〜５０％重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）−アセトニトリル（ＡＣＮ）系を使用して精製した。精製した生成物を、ＬＣＭＳによって特徴付けた。質量算出値：９６８．２（遊離スルホン酸として）；質量実測値：９６９．２（Ｍ＋１）；収率：５０％。
【０１３４】
１ｂの調製：蒸留水０．８ｍＬに溶解させた５０ｍｇの精製化合物１ａに、１Ｍ水酸化ナトリウム０．８ｍＬを添加し、反応混合物を暗室内で室温において回転させた。９０分後、５０％酢酸水溶液１ｍＬを添加した。薄黄色反応混合物は、酸性化すると緑青色に変わった。それを、ＲＰＣ１８カラムにより、１０〜５０％ＴＥＡＢ−ＡＣＮ系を使用して精製した。純粋な生成物は、ＬＣＭＳによって一酸エステルであることが同定された。質量算出値：９４０．２（遊離スルホン酸として）；質量実測値：９４１．１（Ｍ＋１）；吸収７４９ｎｍ；発光７７１ｎｍ；ε２４０，０００（１×ＰＢＳ）；収率８０％。
【０１３５】
１ｃの調製：４０ｍｇの乾燥させた化合物１ｂを、２ｍＬのポリプロピレン遠心分離管中、乾燥ＤＭＦ０．５ｍＬに溶解させた。ＨＡＴＵ２５ｍｇ、２−アミノエタンスルホン酸（タウリン）２５ｍｇおよびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ｄｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）（ＤＩＰＥＡ）２５μＬを添加し、３７℃で１時間反応させた。反応の完了は、ＬＣＭＳによって示された。粗製反応混合物を２５％酢酸水溶液２ｍＬで希釈し、ＲＰＣ１８カラムにより、１０〜４０％酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡｃ、ｐＨ６．６）−ＡＣＮ系を使用して精製した。質量算出値：１０４７．２（遊離スルホン酸として）；質量実測値：１０４８．１（Ｍ＋１）。吸収極大：水中７４９ｎｍ。収率：７０％。
【０１３６】
１ｄの調製：３０ｍｇの化合物１ｃを、２５０ｍＭ水酸化リチウム溶液で室温において処理した。けん化は、２時間で完了した。得られた酸生成物を、ＲＰＣ１８カラムによって、５〜２５％ＴＥＡＡｃ−ＡＣＮ系を使用して精製した。吸収極大：７５１ｎｍ；発光極大：７７１ｎｍ（水／１×ＰＢＳ中）。質量算出値：１０１９．２（遊離スルホン酸として）；質量実測値：１０２０．１（Ｍ＋１）；収率：７０％
【０１３７】
１ｅの調製：２０ｍｇの乾燥させた化合物１ｄを、ＨＡＴＵ（２０ｍｇ）、エチル−６−アミノヘキサノエート塩酸塩（２５ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（１５μＬ）のＤＭＦ（５００μＬ）中混合物と、３７℃で４５分間反応させた。２５％酢酸水溶液１ｍＬで希釈した後、それをＨＰＬＣによって、ＲＰＣ１８カラムにより１０〜４０％ＴＥＡＡｃ−ＡＣＮ系を使用して精製した。質量算出値：１１６０．３（遊離スルホン酸として）；質量実測値：１１６１．２（Ｍ＋１）。吸収極大：７５１ｎｍ；発光極大：７７１ｎｍ（水／１×ＰＢＳ中）。収率：７５％。
【０１３８】
１ｆの調製：化合物１ｅを、２５０ｍＭ水酸化リチウム溶液で室温において処理した。けん化は、１時間で完了した。得られた酸生成物を、ＨＰＬＣによって、ＲＰＣ１８カラムにより５〜３０％ＴＥＡＡｃ−ＡＣＮ系を使用して精製した。吸収極大：７５１ｎｍ；発光極大：７７１ｎｍ（水／１×ＰＢＳ中）。質量算出値：１１３２．２（遊離スルホン酸として）；質量実測値：１１３３．３（Ｍ＋１）。収率：８５％。
【０１３９】
１ｇの調製：５ｍｇの乾燥させた化合物１ｆに、ジスクシンイミジルジカーボネート（１０ｍｇ）を添加し、乾燥ＤＭＦ２５０μＬを添加し、その後Ｎ−メチルモルホリン５μＬを添加した。ＮＨＳＥエステルの形成は、ブチルアミンとの試験反応によって、およびＨＰＬＣ−ＬＣＭＳにより分析することによって明らかになる通り、約２時間で完了した。ＮＨＳＥを、酢酸エチル中で沈殿させることによって単離し、ｓｐｅｅｄ  ｖａｃにより６０分間乾燥させた。
【０１４０】
化合物１ａ〜１ｇに関して先に記載した手順を、スキーム３Ｂ〜３Ｓで合成される化合物に対して使用する。
【０１４１】
第四級塩を調製するための一般手順
インドール、ベンゾインドール（ｂｅｎｚｉｎｄｏｌｅ）、ベンゾオキサゾールおよびベンゾチアゾール（ｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｅ）（化合物２〜５および１０）のＮ−（プロパン−３−スルホネート）第四級塩を、スキームに示されている通り、１，２−ジクロロベンゼンまたはＮ−メチルピロリジノン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｏｎｅ）中、複素環（５ｍｍｏｌ）を１，３−プロパンスルトン（７．５ｍｍｏｌ）と反応させることによって調製し、１２０℃で撹拌しながら８時間加熱した。生成物は、常に固体として形成され、それを濾過によって単離し、適切な有機溶媒混合物（ヘキサンの後に酢酸エチル、または酢酸エチル）で洗浄した。それらをＬＣＭＳによって特徴付けた。
【０１４２】
同様に、化合物１〜５および１０のＮ−エチル第四級塩を、スキームに示されている通り、１，２−ジクロロベンゼンまたはＮ−メチルピロリジノン中、複素環（５ｍｍｏｌ）をヨウ化エチル（１５ｍｍｏｌ）と反応させることによって調製し、１２０℃で圧力管中、撹拌しながら８時間加熱した。生成物は、常に固体として形成され、それを濾過によって単離し、適切な有機溶媒混合物で洗浄した。１，２−ジクロロベンゼンを伴う反応については、ヘキサンの後に酢酸エチルを使用し、Ｎ−メチルピロリジノンを伴う反応については、酢酸エチルだけを使用した。生成物を、すべてＬＣＭＳによって特徴付けた。
【０１４３】
化合物１ａ〜１ｇについて先に記載した手順を、合成スキーム３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ
、３Ｆ、３Ｇ、３Ｈ、３Ｉおよび３Ｊに図示した化合物の合成に対して行う。
【０１４４】
（実施例２）非対称性色素の合成
ＱＳ１Ｃの調製
【化３３】
2019151665.tif 000061
【０１４５】
１０ｍｍｏｌの化合物１（酸として）を、ＰＯＣｌ３１０ｍＬと共に加熱して、２時間還流させた。冷却した反応混合物に、ｎ−ヘキサン２５ｍＬを添加し、有機上清を安全に廃棄した。ガム状の固体を、ｒｏｔｏｖａｐにより真空下で数時間乾燥させて、残留オキシ塩化リンを除去した。スルホニルクロリド（ｓｕｌｆｏｎｌｙｃｈｌｏｒｉｄｅ）を、次のステップでそのまま使用した。収率：９９％。
【０１４６】
５０ｍｍｏｌの４−（Ｎ−メチル）−アミノ酪酸塩酸塩を、無水エタノール１００ｍＬに溶解させ、塩化チオニル（５５ｍｍｏｌ）を室温で激しく撹拌しながら注意深く添加することによって、エチルエステルに変換した。反応を室温で１２時間かけて進行させた。窒素を反応フラスコにフラッシュし、溶液中に１０分間吹き込んだ。溶媒をｒｏｔｏｖａｐによって除去し、得られた白色固体を、高真空下で１２時間乾燥させた。
【０１４７】
前述の通り得られたエチル（４−（Ｎ−メチル））−アミノブチレート塩酸塩を、乾燥アセトニトリル１００ｍＬに溶解させ、５℃に冷却した。１０倍過剰のトリエチルアミンを添加し、激しく撹拌した。塩化スルホニルをアセトニトリル３０ｍＬに溶解させ、それを撹拌溶液に１０分かけてゆっくり添加すると、その間に溶液が黄色に変わった。反応は３０分間で完了し、それを室温まで温めた。白色トリエチルアミン塩酸塩を濾別し、冷却したアセトニトリルで洗浄した。濾液を濃縮し、残渣を、溶出のために３％ＡＣＮ−９４％ＣＨ２Ｃｌ２−３％ＴＥＡ混合物を使用して、シリカゲルによるクロマトグラフで処理した。生成物１Ｃは、使用した溶出剤が５％ＡＣＮ−９２％ＣＨ２Ｃｌ２−３％ＴＥＡだったとき溶出した。それをＬＣＭＳによって特徴付けた。収率：７５％。
【０１４８】
化合物１Ｃを、第四級塩の合成について記載した一般手順に従って、１，２−ジクロロベンゼンを溶媒として使用して、第四級塩ＱＳ１Ｃに変換した。収率：７５％
【０１４９】
非対称性色素の合成のための一般手順：二つの異なる複素環から導出された二つの異なる第四級塩を使用する、非対称性色素の合成を伴うスキームでは、ビスアニル（化合物９）、二つの第四級塩を、それぞれ等モル量で使用したことを除き、化合物１ａについて記載の手順に従った。その他はすべて本質的に同じであった。
【０１５０】
（実施例３）ＢＳＡとの化合物１ｂのコンジュゲーション
ＢＳＡ（４４．４ｎｍｏｌ）３ｍｇを、０．４ＭのＭＥＳ緩衝液１．５ｍＬ、ｐＨ５．３に溶解させ、４５０ｎｍｏｌの化合物１ｂ水溶液（１０ｍＭおいて４５μＬ）を添加し、その後ＥＤＣ２５ｍｇを添加した。混合物を、３７℃で終夜（１８時間）静置した。反
応混合物を水５ｍＬで希釈し、２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによって、３０ｋＤカットオフのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４、ＰＬＴＫ  Ｕｌｔａｃｅｌ−ＰＬ膜フィルタを介して濾過した。濾液が無色になるまで、生成物を１×ＰＢＳ緩衝液で数回洗浄した。濃縮された生成物を定量化し、色素／タンパク質の比を、次式によって決定した。
【数１】
2019151665.tif 000062
式中、Ａｄｙｅは、７５０ｎｍにおける色素の吸収であり、εｐは、タンパク質（ＢＳＡ、４３８２４）の消衰係数であり、Ａ２７８は、２７８ｎｍにおけるタンパク質の吸収であり、ｃ％Ａｄｙｅは、λｍａｘ、７５０ｎｍ（４％）における色素の吸収に関する２７８ｎｍにおける吸収％であり、εｄｙｅは、色素（１×ＰＢＳ中２４０，０００）の消衰係数である。また、生成物を、ＭＡＬＤＩ（Ｔｕｆｔ’ｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、ボストン）によって特徴付け、色素の数を決定すると、ＢＳＡ一つ当たり８．７であった。ＢＳＡにコンジュゲートした化合物１ｂの蛍光および吸光度の決定の結果を、図１に示す。
スキーム
【０１５１】
第四級塩の合成のためのスキーム１、シッフ塩基としての４，４−二置換シクロヘキシルビスアルデヒドの合成のためのスキーム２および２Ａ、ならびに様々な式の色素の合成のための３Ｂ〜３Ｔを、以下の頁に示す。
【化３４−１】
2019151665.tif 000063
【化３４−２】
2019151665.tif 000064
【化３５】
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【化３６−１】
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【化３６−２】
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【化３７】
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【化３８】
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【化３９】
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【化４０】
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【化４１】
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【化４２】
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【化４３】
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【化４４】
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【化４５】
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【化４６】
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【化４７】
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【化４８】
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【化４９】
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【化５０】
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【化５１】
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【化５２】
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【化５３】
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【化５４】
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【０１５２】
（実施例４）化合物４ｍの合成（スキーム３Ｈ）
Ａ．化合物ＱＳ４Ｂの調製
２，３，３−トリメチルベンゾインドール−５，７−ジスルホネート（化合物４、３．１ｇ、７ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＦ２５ｍＬに溶解させて、透明なオレンジ色の溶液を得た。ヨウ化エチル３ｍＬ（５．８５ｇ、３７．５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、溶液を封止管中１３０℃に１６時間加熱した。濃い紫色に変わった反応混合物を冷却し、
エチルエーテル１５０ｍＬに注いだ。混合物を遠心分離し、溶媒をデカントで除去した。固体生成物を、管中、３部の２５ｍＬの２−プロパノールでさらに洗浄した後、エーテル２５ｍＬで洗浄し、真空中で乾燥させた。濃い紫色の固体（８５％）２．６ｇを得、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって確認した。Ｃ１７Ｈ１９ＮＯ６Ｓ２＋のｍ／ｅ算出値３９７．１［Ｍ］＋、実測値３９７．６。
【化５５】
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Ｂ．化合物４ｍの調製
【０１５３】
化合物４ｍを、化合物ＱＳ４Ｂおよび９を使用して、４ｈ〜４ｌによって、化合物１ｆの合成について記載した手順と同じ手順に従って合成した。全収率は約１５％であった。吸収極大：７７５ｎｍ（水）、７８０ｎｍ（ＭｅＯＨ）；発光極大：７９５ｎｍ（水）、８０５３ｎｍ（ＭｅＯＨ）。
【化５６】
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【０１５４】
（実施例５）細胞の標識化
マウス脾細胞を、単一細胞懸濁液として調製し、脾細胞調製物中のＴ細胞亜集団を、Ｂ細胞およびマクロファージを除去するカラム（Ｒ＆Ｄキット、マウスＴ細胞濃縮カラム、ＭＴＣＣ５００）により、継代によって濃縮する。次に、Ｔ細胞を遠心分離して、細胞１０７個の細胞ペレットを作製する。上清を細胞ペレットから除去し、１０ｍｇ／ｍＬの１ｇ（化合物１ｆのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）溶液１００μＬを添加する。細胞を室温で５分間インキュベートし、その後２回遠心分離し、生理的緩衝液に再懸濁させて、結合していない化合物１ｆを洗い流す。細胞を蛍光顕微鏡法によって評価する。
【０１５５】
（実施例６）細胞標識化およびｉｎ  ｖｉｖｏイメージング
マウス４Ｔ１の乳腺癌細胞を遠心分離して、細胞１０７個の細胞ペレットを作製する。上清を細胞ペレットから除去し、１０ｍｇ／ｍＬの化合物１ｆのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル溶液１００μＬを添加する。細胞を、室温で５分間インキュベートし、その後、２回遠心分離し、生理的緩衝液に再懸濁させて、結合していない化合物１ｆを洗い流す。細胞を、蛍光顕微鏡法によって評価する。
【０１５６】
細胞を、マウス１匹あたり細胞５×１０５個でマウスに静脈内注射し、生存マウスを、注射直後および注射の２４時間後に蛍光性分子断層撮影法によって画像化する。４Ｔ１細胞は、主に肺に転移するので、肺の蛍光を定量化することができる。
【０１５７】
（実施例７）化合物１ｆ−ペプチドコンジュゲートによるＦＭＴイメージング
化合物１ｆのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル溶液を、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含有するペプチドに塩基条件下で化学的に連結させて、ｉｎ  ｖｉｖｏ光学イメージングのために生体適合性のある蛍光性分子を得る。
【０１５８】
腫瘍細胞株ＨＴ−２９（ヒト結腸癌／ＨＴＢ−３８）を、ＡＴＣＣ（バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から得る。ＨＴ−２９細胞を、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気において、１０％ＦＢＳを補充したＭｃＣｏｙ中、３７℃で増殖させる。指数関数的に増殖する細胞をトリプシン処理し、ハンクス平衡塩類溶液に３×１０７個の細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させる。雌性ＮＵ／ＮＵマウス６〜８週齢（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、マサチューセッツ州Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）において、第１の乳房脂肪体の両側に３×１０６個のＨＴ−２９細胞を皮下注射する。１週間後、腫瘍はおよそ３０ｍｍ３になり、マウスに、蛍光性分子（１×ＰＢＳ１５０μＬ中）を静脈内注射し、２４時間後に蛍光反射システム（ＦＲＩ、Ｋｏｄａｋ  ２０００ＭＭ）システムおよびＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）製の蛍光断層撮影法システム（ＦＭＴ２５００）で画像化する。
【０１５９】
（実施例８）化合物１ｆによる骨成長のｉｎ  ｖｉｖｏイメージング
化合物１ｆのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル溶液を、生体分子を含有するビスホスホネートに塩基条件下で化学的に連結させて、ｉｎ  ｖｉｖｏ光学イメージングのための生体適合性のある蛍光性分子を得る。
【０１６０】
５日齢のＢＡＬＢ／ｃ×ＣＦ−１Ｆ１マウスに、蛍光性分子（１×ＰＢＳ１５μＬ中）を皮下注射し、２４時間後に蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）システム（Ｋｏｄａｋ  ２０００ＭＭ）を使用して画像化する。骨成長のエリアを画像化する。
【０１６１】
（実施例９）ナノ粒子の標識化
化合物１ｆのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル溶液を、酸化鉄ナノ粒子のポリマー表面上に配置されたアミン基に化学的に連結させて、ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングのための生体適合性のある蛍光性プラットフォームを得る。その後、ポリエチレングリコールをこれらのナノ粒子にカップリングさせると、蛍光イメージングおよび生体内顕微鏡に適した、生体適合性のある造影剤が得られる。
【０１６２】
参考としての援用
本明細書に引用したあらゆる刊行物、特許文書および特許出願文書は、それぞれがそうして個々に示されている場合と同程度に、それら全体が参考として、かつ、あらゆる目的で本明細書に明確に援用される。
【０１６３】
均等物
本発明は、本発明の趣旨または必須の特徴から逸脱することなく、他の特定の形態に具体化され得る。したがって、上述の実施形態は、本明細書に記載の本発明を制限するものではなく、例示的なあらゆる観点で考慮されるべきである。したがって、本発明の範囲は、上述の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価物の意味および範囲に含まれるあらゆる変化が、本発明に包含されるものとする。
【図１Ａ】
2019151665.tif 000088
【図１Ｂ】
2019151665.tif 000089
【外国語明細書】
2019151665000001.pdf