(57)【要約】      （修正有）【課題】乳房腫瘍の発生と転移を抑制する方法の提供。【解決手段】有効量の糖質コルチコイド受容体促進剤であって、主な活性組成物とされる牛樟芝成分のアントシンAと、担体や賦形剤とが含まれる医学組成物が、投与され、該組成物と乳癌細胞とが反応し、糖質コルチコイド受容体αの転写活性化によりマイクロRNA-708を活性化し、上記乳癌細胞の増殖を抑制しながら、細胞の周期停滞を誘発させ、上記医学組成物活性化のシグナル伝達によって、miR-708の表現が誘発されてから、NF-κBの活性が抑制され、そして、その下位標的遺伝子COX-2とcMYCの表現を下向き調節する。【選択図】図１
2019151613.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の、糖質コルチコイド受容体（glucocorticoid receptor, GR）促進剤であって、主な活性組成物とされる牛樟芝成分のアントシンA（antcin A, ATA）と、医学上、納得できる担体や賦形剤とが含まれる医学組成物が、投与され、上記医学組成物と乳癌細胞とが反応し、糖質コルチコイド受容体α（GRα）の転写活性化により、マイクロRNA-708（microRNA-708, miR-708）を活性化し、上記乳癌細胞の増殖を抑制しながら、細胞の周期停滞を誘発させ、上記医学組成物活性化のシグナル伝達によって、miR-708の表現が誘発されてから、NF-κBの活性が抑制され、そして、その下位標的遺伝子COX-2とcMYCの表現を下向き調節する、ことを特徴とする乳房腫瘍の発生と転移を抑制できる方法。
【請求項２】
上記医学組成物は、1〜20μMの濃度によって投与される、ことを特徴とする請求項１に記載される乳房腫瘍の発生と転移を抑制できる方法。
【請求項３】
上記ATAは、牛樟芝子実体から分離される、ことを特徴とする請求項１に記載される乳房腫瘍の発生と転移を抑制できる方法。
【請求項４】
上記ATAは、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）と質量分析器（1H-NMR）によって分析されると、その純度が99%より高い、ことを特徴とする請求項１に記載される乳房腫瘍の発生と転移を抑制できる方法。
【請求項５】
上記の医学上、納得できる担体や賦形剤は、投与タイプによって選択され、また、一部に制限された担体や賦形剤と、静脈注射や皮内注射、経口投薬或いは皮下注射の担体や賦形剤とが、含まれる、ことを特徴とする請求項１に記載される乳房腫瘍の発生と転移を抑制できる方法。
【請求項６】
上記乳癌細胞は、非惡性乳癌細胞株（MCF-7）と、高度惡性乳癌細胞株（MDA-MB-231）とが、含まれる、ことを特徴とする請求項１に記載される乳房腫瘍の発生と転移を抑制できる方法。
【請求項７】
上記医学組成物は、合成されたものや天然のGR促進剤である、ことを特徴とする請求項１に記載される乳房腫瘍の発生と転移を抑制できる方法。
【請求項８】
上記医学組成物は、更に、腫瘍幹細胞の表現と癌細胞の転移を抑制できる、ことを特徴とする請求項１に記載される乳房腫瘍の発生と転移を抑制できる方法。
【請求項９】
上記医学組成物は、更に、NF-κBの下位標的遺伝子cyclin D1やMMP-2、MMP-9、CD24及びCD44の表現を抑制できる、ことを特徴とする請求項１に記載される乳房腫瘍の発生と転移を抑制できる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳房腫瘍の発生と転移を抑制できる方法に関し、特に、合成や天然の糖質コルチコイド受容体（glucocorticoid receptor, GR）促進剤であっても、マイクロRNA-708（microRNA-708, miR-708）の表現を誘発でき、乳房腫瘍の発生と転移を抑制でき、特に、糖質コルチコイド受容体α（GRα）の転写活性化により、miR-708を活性化し、乳癌細胞の増殖を低減させながら、細胞の周期停滞を誘発させ、主として、転写により、NF-κBとその標的遺伝子COX-2とcMYCの作用を抑制できるものに関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、世界の女性において、よく発生する悪性腫瘍であって、また、がんによって死亡の主原因であり、毎年、約130万の新乳癌症例が診断されて、50万人が乳癌[1]で死亡すると推定され、国際がん研究機関（International Agency for Research on Cancer, IARC）の報告によれば、乳癌は、すべてのがんの11.88%になり、地球において、二番目の悪性腫瘍[2]であり、統計結果から分かるように、乳癌の検出や診断及び治療は、至急に改善しなければならない重要な課題である。
【０００３】
糖質コルチコイド（Glucocorticoids, GCs）は、コルチコステロイドの一種類であり、主な機能が、代謝や生存、増殖及び細胞分化に関し、その作用経路が、殆ど、糖質コルチコイド受容体（glucocorticoid receptor, GR）を介し、糖質コルチコイド受容体が、一種類の転写因子で、核内受容体スーパーファミリー[3]に属し、糖質コルチコイドが、糖質コルチコイド受容体と結合するコルチコステロイドであり、大部分の脊椎動物の細胞[4]に存在し、例えば、デキサメサゾン（Dexamethasone, DEX）やベタメタゾン（betamethasone）、プレドニゾン（prednisone）とメチルプレドニゾロン（methylprednisolone）である合成糖質コルチコイドが、幅広く、抗炎症剤として利用される。事実上、多いがん治療において、デキサメサゾンは、よく、化学療法前の予防薬として利用されて、過敏反応[5]を防止する。多くなった体外と体内の研究によれば、デキサメサゾンは、前立腺癌[6]や黒色腫[6]及び一部の悪性リンパ腫の成長を抑制でき、また、がん細胞のアポトーシス作用[7]を誘発できる。最近の研究によれば、糖質コルチコイド受容体拮抗薬のミフェプリストン（mifepristone）は、三種陰性乳癌（triple negative breast cancer, TNBC）の細胞がパクリタキセルに対する感作を増大させることができるが、ミフェプリストンだけで、三種陰性乳癌を処置すれば、癌細胞生存率に対して、顕著な影響[8]を得ず、そして、異目間移植腫瘍動物実験によれば、デキサメサゾンで、予めに、動物を治療すると、顕著的に、パクリタキセルの腫瘍に対する抑制効果[9]が強化される。いままで、糖質コルチコイド促進剤が、乳房腫瘍の成長やがん幹細胞の分化と転移に対する影響を検討する、将来性のある研究は、他にない。そのため、乳癌治療において、糖質コルチコイドの確実の作用と応用を検討しなければならない。
【０００４】
糖質コルチコイド促進剤によって誘発される細胞のアポトーシスと、腫瘍の成長とは、多数の信号伝達経路の複雑な過程に係わるようであり、NF-κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB）の転写抑制メカニズムや転写活性化で細胞アポトーシスを誘発する関連遺伝子が含まれ、Bim1を始め、生存や増殖の低下調節と細胞周期調整の関連遺伝子は、例えば、COX-2やcMYC及びcyclin D1 [7]である。NF-κBは、Relファミリーの転写因子であり、生存や増殖、分化、炎症及び免疫の分野において、極めて重要な機能を有する。多い乳房腫瘍において、持続的にNF-κBを活性化させれば、NF-κBの活性化が失調になって、p50やp52、p65、cRel及びRelB等のタンパク質が、持続的に細胞核内に位置づけ、更に、抗アポトーシス遺伝子を上に調整させることによって、細胞増殖と死亡とのバランス[10]が破壊される。がん幹細胞（Cancer stem cells, CSCs）や腫瘍始原幹細胞（tumor initiating stem-like cells, TICs）は、腫瘍始原細胞の僅かの一部であり、セルフリフレッシュできるだけでなく、各種類の化学療法の薬剤を対抗できる。がん幹細胞は、例えば、脳がんや乳癌、卵巣がん、前立腺癌、膵がん及び大腸癌等の多種類のがんにおいて、発見される[11]。乳癌幹細胞のセルフリフレッシュ行為は、Wnt/β-cateninグロブリンやNotch、Hedgehog及びNF-κB等の複数のシグナル伝達経路に係わり[12]、その中、NF-κBは、多数の乳房腫瘍において、よく発見されるため、特に注目され、NF-κBの転写活性は、乳癌幹細胞のセルフリフレッシュにおいて、重要な作用を発揮する[13]。しかし、いままでは、GR促進剤によって誘発されて、NF-κBと乳癌の幹細胞分子の抑制メカニズムを解明できる研究はない。
【０００５】
マイクロRNA（MicroRNAs, miRNA）は、植物や動物及びウイルス遺伝子群に発見されて、一種類の内因性且つ非コードの小さいRNA分子で、長さが、約22個のヌクレオチドであり、主な機能は、RNAと遺伝子転写後の調整作用を抑制する。miRNAは、直接、転写元の3'非転写域（3'UTR）と結合でき、癌細胞の増殖や転移、がん幹細胞の分化と他の生物機能の各種類の生物過程において[14]、転写作用を抑制でき、及び/或いは、mRNAの分解を誘発できる[15]。miRNAの発見により、がん研究に、新しい見解が登場した。2005年、Iorioらは、先に、miRNAが乳癌に対する調整を発表し[16]、彼らは、29種のmiRNAが、乳房腫瘍組織と正常乳腺組織での表現差異を発見した。miR-708は、新しく発見されたmiRNAであり、腎細胞がんや肝臓がん、卵巣がん、前立腺癌、乳癌、多形性膠芽腫及びユーイング肉腫等の多種類のがんを抑制できる。しかし、miRNAは、特に、膀胱癌や大腸直腸癌及び一部の肺癌の少数がんタイプに対して、発ガン性を有する[17]。最近のある研究によれば、慢性リンパ性白血病において、miR-708の後成的抑制が、直接に、IKKβに作用することにより、NF-κBの信号伝達が強化された[18]。その後、2015年に、Maらの研究によれば、三種陰性乳癌において、強いて伝達miR-708を作製すると、LSD1（lysine-specific histone demethylase）に作用することにより、三種陰性乳癌の増殖と侵襲能力を抑制できることが発見された[19]。しかし、少数だけの研究は、miR-708が、乳癌に対する機能を注目するが、関連する大部分の分子相互作用のメカニズムが、検討されていない。
【０００６】
合成的なGR促進剤は、幅広く、化療期間の補助治療として、適用されるが、天然なGR促進剤や植物ステロールは、殆ど研究されていない。植物ステロールは、炎症と免疫系において、潜在性を有するコンディショニング剤[20]であり、本発明者は、この前、薬用真菌牛樟芝から分離されたアントシンA（Antcin A, ATA）のステロール植物化学物が、GR促進剤の作用に擬態して肺細胞の炎症反応を抑制でき、それが、合成のGR促進剤（例えば、コーチゾン（cortisone）やデキサメタゾン）と類似する効能を有することを発見した[21]。その他、乳癌に対して、GR促進剤で、信号伝達経路を媒介してmiRNAを調節することは、殆ど分かっていない。そのため、一般の従来のものは、実用的とは言えない。
【０００７】
本発明者は、上記欠点を解消するため、慎重に研究し、また、学理を活用して、有効に上記欠点を解消でき、設計が合理である本発明を提案する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】[1]  1.  Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 2011;61:69-90.[2] 2.  Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer 2015;136:E359-E86.[3]  3.    Schoneveld OJLM, Gaemers IC, Lamers WH. Mechanisms of glucocorticoid signalling. Biochim Biophys Acta 2004;1680:114-28.[4]  4.    Becker DE. Basic and Clinical Pharmacology of Glucocorticosteroids. Anesth Prog 2013;60:25-32[5]  5.    Chen FC, Wang LH, Zheng XY, Zhang XM, Zhang J, Li LJ. Meta-analysis of the effects of oral and intravenous dexamethasone premedication in the prevention of paclitaxel-induced allergic reactions. Oncotarget 2017;8:19236-43.[6]  6.    Moon EY, Ryu YK, Lee GH. Dexamethasone inhibits in vivo tumor growth by the alteration of bone marrow CD11b(+) myeloid cells. Int Immunopharmacol 2014;21:494-500.[7]    7.    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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の主な目的は、従来の諸問題を解消でき、合成或いは天然のGR促進剤であっても、miR-708の表現を誘発でき、乳房腫瘍の発生と転移を抑制し、糖質コルチコイド受容体α（GRα）を転写活性化して、miR-708を活性化させ、乳癌細胞の増殖を低下させながら、細胞の周期停滞を誘発させ、主に、NF-κBとその標的遺伝子COX-2及びcMYCの作用を転写抑制して、乳房腫瘍の発生と転移を調節する方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、GR促進剤で、miR-708の表現を誘発して、有効的に、乳癌細胞の増殖や細胞周期プロセス、腫瘍幹細胞の表現及び癌細胞の転移を抑制できて、乳房腫瘍の発生と転移を調節できる方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の更に他の目的は、糖質コルチコイド受容体促進剤やmiR-708を遺伝子移入して細胞を処置して、顕著的に、IKKβの表現を抑制でき、また、NF-κBの活性と、例えば、COX-2やcMYC、cyclin D1、MMP-2、MMP-9、CD24及びCD44の下位標的遺伝子の表現を抑制でき、且つ、癌細胞の増殖や細胞の周期プロセス、転移及び腫瘍幹細胞標識タンパク質p21CIP1とp27KIP1の表現量を向上できる、乳房腫瘍発生と転移を調節する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の更に他の目的は、GR促進剤で、動物を治療し、顕著的に腫瘍の成長や腫瘍の重量と体積を抑制でき、乳癌治療に適用できる新規の治療方式で、乳房腫瘍の発生と転移を調節できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上記の目的を達成するため、有効量の、糖質コルチコイド受容体（glucocorticoid receptor, GR）促進剤であって、主な活性組成物とされる牛樟芝成分のアントシンA（antcin A, ATA）と、医学上、納得できる担体や賦形剤とが含まれる医学組成物が、投与され、上記医学組成物と乳癌細胞とが反応し、転写活性化糖質コルチコイド受容体α（GRα）により、マイクロRNA-708（microRNA-708, miR-708）を活性化し、上記乳癌細胞の増殖を抑制しながら、細胞の周期停滞を誘発させ、上記医学組成物活性化のシグナル伝達によって、miR-708の表現が誘発されてから、NF-κBの活性が抑制され、そして、その下位標的遺伝子COX-2とcMYCの表現を下向き調節する、ことを特徴とする乳房腫瘍の発生と転移を抑制できる方法である。
【００１４】
本発明の実施例によれば、上記医学組成物は、1〜20 μMの濃度で投与される。
【００１５】
本発明の実施例によれば、上記ATAは、牛樟芝子実体から分離される。
【００１６】
本発明の実施例によれば、上記ATAは、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）と質量分析器（1H-NMR）によって分析されると、その純度が、99%より高い。
【００１７】
本発明の実施例によれば、上記の医学上、納得できる担体や賦形剤は、投与タイプによって選択され、また、一部に制限された担体や賦形剤と、静脈注射や皮内注射、経口投薬或いは皮下注射の担体や賦形剤とが、含まれる。
【００１８】
本発明の実施例によれば、上記乳癌細胞は、非悪性乳癌細胞株（MCF-7）と高度悪性乳癌細胞株（MDA-MB-231）が、含まれる。
【００１９】
本発明の実施例によれば、上記医学組成物は、合成されたものや天然のGR促進剤である。
【００２０】
本発明の実施例によれば、上記医学組成物は、更に、腫瘍幹細胞の表現と癌細胞の転移を抑制できる。
【００２１】
本発明の実施例によれば、上記医学組成物は、更に、NF-κBの下位標的遺伝子cyclin D1やMMP-2、MMP-9、CD24及びCD44の表現を抑制できる。
【００２２】
以下、図面を参照しながら、本発明の特徴や技術内容について、詳しく説明するが、それらの図面等は、参考や説明のためであり、本発明は、それによって制限されることが無い。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明に係るATAを投与して乳房腫瘍の発生と転移を調節する方法の流れ概念図である。
【図２】本発明に係るGR促進剤が、GRα信号で乳癌細胞のmiR-708を活性化する概念図である。
【図３】本発明に係るDEXやATAを投与して、乳癌細胞生存率に対する影響の概念図である。
【図４】本発明に係るフローサイトメーターでAnnexin V/PI染色乳癌細胞アポトーシスを分析する概念図である。
【図５】本発明に係るmiRNA-708/GRα信号経路で乳癌細胞の増殖を抑制する概念図である。
【図６】本発明に係るトリパンブルー色素排除試験法で、細胞増殖を評価する概念図である。
【図７】本発明に係るmiRNA-708/GRαシグナル伝達経路で体外と体内腫瘍の成長を調整する概念図である。
【図８】本発明に係るGR促進剤が、体外試験において、乳癌細胞の転移を抑制できることの概念図である。
【図９】本発明に係るmiRNA-708/GRα信号経路が、乳癌細胞のIKKβ表現を集中的に調整できる作用の概念図である。
【図１０】本発明に係るmiRNA-708で、乳癌細胞中NF-κBの活性を抑制する概念図である。
【図１１】本発明に係るGR促進剤が、miR-708を活性化してNF-κB下位標的遺伝子を抑制する概念図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、乳房腫瘍の発生と転移を調節する方法であり、乳癌に対して、具有抗腫瘍と抗転移の作用を発揮できる。本発明は、アントシンA（antcin A, ATA）が、乳線癌腫瘍の発生と転移を抑制する作用を有し、また、上記作用の分子メカニズムを解明した。
【００２５】
図１は、本発明のATAを投与して乳房腫瘍の発生と転移を調節する方法の流れ概念図である。図のように、ATAを、医学組成物として、投与して、乳房腫瘍の発生と転移を抑制する方法である。上記方法において、第一ステップs111は、牛樟芝の原料からATAを分離する。一部の実施例によれば、ATAが、牛樟芝子実体から分離される。一部の実施例によれば、ATAの純度が99%である。
【００２６】
第二ステップs112において、ATAと、医学上、納得できる担体や賦形剤とを、混合して、医学組成物が作製される。医学上、納得できる担体や賦形剤は、投与タイプに基づいて選択することができ、また、一部に制限された担体や賦形剤と、静脈注射や皮内注射、経口投薬或いは皮下注射の担体や賦形剤とが、含まれる。
【００２７】
第三ステップs113は、乳癌細胞に対して、有効量の医学組成物を投与して、乳癌細胞の増殖と転移を抑制する。少なくとも一つの実施例において、上記医学組成物は、非悪性乳癌細胞株（MCF-7）や高度悪性乳癌細胞株（MDA-MB-231）と、一緒に、如何なる方式によって処置されることができる。一部の実施例によれば、医学組成物が、腹腔に注射されて乳癌細胞を処置し、また、医学上、納得できる担体や賦形剤は、容易に投与されるジメチルスルホキシド（Dimethyl sulfoxide, DMSO）や他の物質を許す。
【００２８】
その他の実施例によれば、上記有効量は、約1 μMから約20 μMまでの濃度であるが、2 μMや3 μM、4 μM、5 μM、6 μM、7 μM、8 μM、9 μM、10 μM、11 μM、12 μM、13 μM、14 μM、15 μM、16 μM、17 μM、18 μM及び19 μMによって制限されていない。その他の実施例によれば、上記有効量は、約10 μMから約20 μMまでである。
【００２９】
本発明について、下記の実施例を挙げて説明するが、これらの実施例は、説明用のためであり、本発明の実施は、それによって制限されることない。
【００３０】
整備例：材料と方法
一、化学薬剤：
前述のように、ATAは、牛樟芝子実体から分離され、その方法は、例えば、発表された研究[21]の様である。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）と質量分析器（1H-NMR）で分析すると、ATAの純度が、99%より高いと実証された。ダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium）は、Invitrogen （Carlsbad，CA）から購入される。ロズウェルパーク記念研究所培地（Roswell Park Memorial Institute）や最小必須培地（minimum essential medium）、ウシ胎仔血清（fetal bovine serum, FBS）、ピルビン酸ナトリウム（sodium pyruvate）、ペニシリン（penicillin）、ストレプトマイシン（streptomycin）、デキサメサゾン（Dexamethasone, DEX）、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物（3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT）、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）及びシクロヘキシミド（cycloheximide）は、ともにSigma-Aldrich（St.Louis，CA）から購入される。本発明に使用される抗体は、表１のようである。その他の全ての化学品は、ともに、試剤級やHPLC級であり、Merck（Darmstadt, Germany）やSigma-Aldrichから購入される。
【００３１】
【表１】
2019151613.tif 000003
【００３２】
二、方法：
細胞培養や試料調製及び遺伝子移入
人類の正常乳腺上皮細胞株（MCF-10A）と乳癌細胞株MCF-7及びMDA-MB-231は、ともに、台湾新竹生物資源収集と研究中心（BCRC）から購入される。DMEM/Ham's-F12とMEM及びロズウェルパーク記念研究所培地で、それぞれ、MCF-10AとMCF-7及びMDA-MB-231の三種類の細胞を培養し、細胞培養培地は、10% FBSと1.5g/L炭酸水素ナトリウム、100 U/Lペニシリン及びストレプトマイシンが含有され、37°Cで、5%二酸化炭素（CO2）のインキュベータにおいて、細胞を培養する。DEX（1 μM）かATA（10 μM）で、24〜72時間に、細胞を処置する。もう一方、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を利用して、細胞に、低分子干渉RNA（small interfering RNA, siRNA）やマイクロRNA（microRNA, miRNA）擬態物を遺伝子移入する。毎回遺伝子移入に、20 nM pre-miRNAやsiRNAを使用する。20 ng/mLの腫瘍壊死因子α（Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α）で、細胞を刺激する。対照群は、0.1% DMSOを含有する培地である。
【００３３】
細胞増殖と細胞周期分析
市販の細胞増殖検知試剤（CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay，Promega）で、細胞増殖試験を行う。細胞周期試験において、フローサイトメーター（Beckman Coulter FC500）で分析する。簡単に言えば、細胞を、1x105個の細胞/孔の細胞数で、6孔細胞培養ディッシュに培養し、pre-miR-708かDEXとATAとを、細胞培養ディッシュに添加して、72時間を処置する。そして、細胞を収集して、3分間、1500×gで遠心させ、95%氷酢酸で、細胞を固定し、-20°Cで、一夜反応させる。PBSで、細胞を洗浄してから、3分間、1500×gで遠心させ、その後、1 mL PI/Triton X-100（20μg/mL PI、0.1% Triton X-100と2.5μg/mL RNAse）を含有する染料を添加して、氷上において、30分間、反応させる。フローサイトメーターで、細胞のDNA含有量を分析し、少なくとも、10,000個の細胞数データを分析する。細胞周期の分析について、CXPソフト（Beckman Coulter）で分析する。
【００３４】
本発明は、更に、トリパンブルー色素排除試験法（Trypan blue exclusion assay）で、細胞の増殖を評価し、細胞を、5x104個の細胞/孔で、6孔細胞細胞培養ディッシュに接種し、一夜培養した後、細胞にpre-miR-708を遺伝子移入するか、DEXかATAで、24〜72時間、処置して、0.2%トリパン青で、細胞染色を行い、更に、細胞計数器で、染色細胞を計数する。生細胞の割合は、各孔において、生細胞が総細胞に対する比率によって算出される。細胞増殖比率は、対照群の生細胞量に対して、相対的に試料調製群の生細胞数である。
【００３５】
細胞アポトーシス検出
製造業者の説明書（BD Biosciences，San Jose，CA）に従って、Annexin V-FITC/PIアポトーシス検出試剤で、Annexin V-FITC/PIの染色を検知する。言い換えれば、5×105個の細胞/細胞培養ディッシュを、10cm細胞培養ディッシュに接種し、一夜培養した後、細胞を、DEXかATAに、24時間、露出させ、そして、PBSで、二回洗浄して、エチレンジアミン四酢酸（Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）を含まない0.25%トリプシンで、細胞を処置し、5分間、1500xgで遠心させた後、細胞を収集する。その後、細胞を、500 μLの1 μL Annexin V-FITCと5 μL PIを含有する結合緩衝液に浮遊させ、暗やみにおいて、5分間、反応させた後、フローサイトメーターで、直接、染色の細胞を分析する。CXPソフト（Beckman Coulter）で、データーを採集して分析する。
【００３６】
がん小球細胞形成試験
乳癌細胞の腫瘍小球細胞形成検知は、まず、6孔細胞培養ディッシュに、200 μLの基底膜マトリックス（Matrigel, BD Biosciences，San Jose，CA）を添加して、37°Cにおいて、15分間、凝集させる。また、MCF-7とMDA-MB-231（5×104個の細胞/孔）の細胞を、それぞれ、1 mLのMEMやDMEM（10%基底膜マトリックスと10% FBSを含有する）の培地に遺伝子移入する。細胞培養ディッシュを、37°Cにおいて、反応させて、細胞が完全に沈降した後、元の培地の代わりに、5% Matrigelを有する細胞培養培地を添加する。そして、二層の細胞に、DEXかATA或いは賦形剤（0.1% DMSO）を添加して、15日間、培養させ、三日毎に、基底膜マトリックスを有する新鮮な培地を交換する。15日目、細胞を撮影して分析する。
【００３７】
体外癌細胞移動と侵入試験
MCF-7やMDA-MB-231の細胞を、1×105個の細胞/孔で、12孔細胞培養ディッシュに接種して、細胞のない硅素板隙間（ibidi GmbH，Martinsried，ドイツ）を挿入する。単層細胞が形成された後、挿入板を取り出して、PBSで細胞を洗浄した後、DEXやATAを添加して細胞を24時間処置する。MCF-7細胞の移動を誘発するため、形質転換増殖因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）を細胞培養培地（MCF-7TGF-β）に添加する。0と24時間において、移動の細胞を撮影（100倍拡大）し、細胞が隙間領域に向かう移動を監視して、隙間領域の接近程度を計算する。腫瘍細胞の侵襲作用を検知するため、24孔透過性（transwell）細胞培養ディッシュを利用して、細胞侵襲試験を行い、基底膜マトリックス（10μL，0.5mg/mL；BD Bioscience，Los Angeles，CA）を、8-μmポリカーボネートフィルムフィルターに覆って、1x105個の細胞をフィルムフィルターに接種し、200 μLのDEXやATAを有する無血清培地を添加し、各群に、それぞれ、三回繰り返す。培養装置の下室において、750 μLの完全増殖培地（complete growth medium）を添加し、細胞培養が、37°Cにおいて、24時間反応させ、細胞の移動現象を観察する。培養装置の下室にある侵入細胞を、氷メタノールで15分間固定させ、更に、PBSで三回洗浄し、そして、ギームザ染色液（Giemsa stain）で細胞染色を行い、その後、PBSで洗浄し、最後に、光学顕微鏡（200X拡大率）で細胞を撮影して、手動で、侵入細胞を計数する。遺伝子サイレンシング作用について、実験の前に、スクランブル（scrambled）のsiRNAやsiGRαを細胞に遺伝子移入する。
【００３８】
免疫蛍光染色
免疫蛍光染色法は、前記の発表された研究のようである[22]。言い換えれば、MCF-7とMDA-MB-231細胞（1x104細胞/孔）を8孔Nunc Lab-Tekガラスチャンバースライド（ThermoFisher Scientific）に接種し、DEXとATA或いはマイクロRNA-708（microRNA-708, miR-708）擬態物を添加して72時間反応させ、そして、培地を除去した後、4%パラフォルムアルデヒドを利用して、15分間で細胞を固定し、そして、0.1% Triton X-100を使用して、10分間に透過処理を行い、その後、10% FBSを勧誘するPBSで洗浄して、阻隔作用を行い、更に、1.5% FBSに調合された特異一級抗体を添加して一夜反応させ、その後、細胞と、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）を有する二級抗体（6%ウシ血清アルブミン(Bovine serum albumin, BSA)に調合される）と、1時間反応させる。その後、1μg/mL 4'，6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI，Cell Signaling Technology）で、5分間染色した後、PBSで洗浄し、最後に、蛍光顕微鏡（Motic Electric Group）を利用して、40×倍率で観察する。
【００３９】
タンパク質抽出と免疫ブロット法は、製造業者の取扱説明書の指示に従って、それぞれ、放射性免疫沈降分析（Radioimmunoprecipitation assay, RIPA）を利用して、緩衝液を開裂するか、細胞核と細胞質抽出試剤（Thermo Fisher Scientific）或いは、膜貫通タンパク抽出試剤（Fivephoton Biochemicals，San Diego，CA）で、細胞タンパク抽出を行い、また、Bio-Radタンパク質検知試剤（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）で、タンパク質含有量を検知する。そして、7〜12%のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（sodium dodecyl sulfate-poly acrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）で、タンパク質サンプル（60μg）を分離した後、塩化ビニリデン樹脂（polyvinylidene chloride, PVDC）の上に移転し、更に、特異一級抗体を添加して一夜反応させ、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（horseradish peroxidase-conjugated）を有する抗ウサギヤギ・ポリクローナル抗体や抗小ねずみ抗体を添加して、2時間反応させ、最後に、高感度ケミルミネッセンス（enhanced chemiluminescence, ECL）ウエスタンブロット試剤（Millipore，Billerica，MA）を添加して、VL Chemi-Smart 3000（Viogene Biotek，Sunnyvale，CA）で、冷光信号を検出する。
【００４０】
定量的リアルタイムPCR（Quantitative real-time PCR, qRT-PCR）
まず、Trizol試剤（Thermo Fisher Scientific）で、細胞総RNAを抽出する。NanoVue Plus分光計（GE Health Care Life Sciences，Chicago，IL）で、RNA濃度の定量を行う。定量的リアルタイムPCR検出システムとソフト（Applied Biosystems，Foster City，CA）を利用して、リアルタイムPCRを行わせる。まず、SuperScript III逆転写酵素試剤（Invitrogen）で、RNAを逆転写して第一鎖cDNAが生成され、そして、正方向と逆方向プライマー（primer, 10μM）と蛍光試剤SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）を、cDNAに添加して均等に混合し、更に、リアルタイムPCRで、標的遺伝子の表現量を定量し、mRNA定量分析は、GAPDH遺伝子表現量によって、標準化され、miRNA定量分析は、U6遺伝子表現量によって標準化される。各遺伝子のプライマーシーケンスは、表２のようである。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
冷光試験
ルシフェラーゼ報告遺伝子検知試剤（GAL4 reporter kit, BPS Biosciences, San Diego, CA and Cignal NF-κB pathway reporter assay kit, Quiagen, Chatsworth, CA）を利用して、糖質コルチコイド受容体α（GRα）とNF-κBの転写活性を検知する。3'非翻訳領域（3'UTR）報告遺伝子試験において、pre-miR-708を一緒に遺伝子移入するか否かについて、pGL3-IKKβ3'UTRとRenilla蛍光を、乳癌細胞に遺伝子移入すると、それぞれ、DEXとATAを処置するか処置しない状態になり、最後に、二重のルシフェラーゼ報告遺伝子試験システム（Promega）で検知する。プライマーシーケンスが、表３のようである。
【００４３】
【表３】
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【００４４】
動物と腫瘍細胞接種
異目間の動物腫瘍移植模式は、四周齢の雌性ヌードマウス（BALB/c-nu，台湾台北ラスコ(BioLASCO)会社から購入する）を使用し、特定病原体除去の動物室に飼われ、グリレス大目飼料（Oriental Yeast, Tokyo, Japan）を給食し、任意に水を飲ませ、また、12時間の光照と12時間の暗やみの光照周期を取り、全ての動物実験は、「実験動物の管理と使用の指南」と台湾の動物保護の関連法律に基づいて行い、また、実験動物倫理委員會の許可を得てから行う。継代数が15より小さい細胞を使用して、腫瘍細胞接種試験を行い、MCF-7とMDA-MB-231細胞（200 μLのゲル基質に1×106個の細胞が含まれる）を、皮下注射により、ヌードマウスの右後腹に接種する。小ねずみを、6群に分けて、各群に5匹の小ねずみがあり、平均な腫瘍体積が、50mm3（細胞接種後約3週間）に達すると、薬剤投与を開始し、DEXとATAを、PBS緩衝液に調合して、MCF-7_DEXとMCF-7_ATA、MDA-MB-231_DEX及びMDA-MB-231_ATAの四つの投与群があり、DEX（1mg/kg）やATA（10mg/kg）を腹腔内注射し、毎週、二回投与を行い、対照群に、MCF-7_PBSとMDA-MB-231_PBSが含まれ、PBS緩衝液だけを投与する。実験期が、10週間であり、その中、投与期が、7週間になる。10週間後、小ねずみから腫瘍を取り出し、腫瘍組織を撮影して、重さを量り、その後、4%パラフォルムアルデヒドに浸入して固定させる。カリパスで、腫瘍体積を測定し、三日おきに、一回測定し、腫瘍体積の計算式は、（長さ×広さ2×高度×1/2）。薬剤毒性を監視するため、三日おきに動物体重を測定する。
【００４５】
組織切片と免疫組織染色分析
腫瘍組織を、石蝋に埋め込んで、3 mmの厚さの切片に切り、ヘマトキシリン・エオジン染色（H&E stain）後、光学顕微鏡で観察し、生存の腫瘍細胞と壊死及び細胞アポトーシスを検出して分析する。がんマーカーの表現を検定し、組織切片に対して、COX-2とNF-κB特異抗体で、免疫組織染色を行い、また、室温で、2時間反応させ、最後に、二級検出抗体とREAL EnVision検出試剤（Dako Cytomation A / S，デンマーク）を添加して反応させる。
【００４６】
統計分析
実験データーは、ともに、平均値±標準差によって表示される。全ての実験データーに対して、ともに、統計分析ソフトGraphpad Prism版6.0（GraphPad Software，La Jolla，CA）で、分析し、一元配置分散分析（one-way ANOVA）を利用して統計分析を行い、その後、Dunnett検定で、多重比較を行い、P値が0.05より小さいことは、顕著な統計差異を示す。
【００４７】
結果
糖質コルチコイド受容体（glucocorticoid receptor, GR）促進剤が、GRα信号を介して、乳癌細胞のmiR-708を活性化
図２は、本発明のGR促進剤が、GRα信号を介して、乳癌細胞のmiR-708を活性化する概念図である。図のように、miR-708が、正常人類乳腺と乳癌細胞において、その表現差異を解明するため、本発明は、正常乳腺上皮細胞株（MCF-10A）や非悪性乳癌細胞株（MCF-7）及び高度悪性乳癌細胞株（MDA-MB-231）を利用して、試験を行い、図２（A）は、定量RT-PCRによって、miR-708が、正常や非悪性及び悪性乳癌細胞においての遺伝子表現を分析し、（B）は、pre-miR-708が、遺伝子移入された72時間後、乳癌細胞において、miR-708の表現であり、（C）は、乳癌細胞に対して、DEX（1 μM）とATA（10 μM）を処置してから、72時間後、miR-708の表現であり、（D）は、miR-708が、乳癌細胞にスクランブルなsiRNA（sc siRNA）かGRα特異siRNA（siGRα）を遺伝子移入した後、DEXかATAで、72時間処置した後の表現であり、（E）は、乳癌細胞に対して、ミフェプリストン（mifepristone）で2時間予処置した後、更に、DEXかATAで72時間処置してから、測定したmiR-708の表現であり、（F）は、シクロヘキシミド（cycloheximide, CHX，10 μM）で、乳癌細胞を、12時間予処置した後、更に、DEXかATAで72時間処置してから、検知したmiR-708の表現で、U6遺伝子で計算した標準化miR-708の含有量であり、（G）は、DEXかATAで、乳癌細胞を48時間処置した後、GRαのルシフェラーゼ活性（RLU，相対ルシフェラーゼ単位）であり、（H）は、DEXかATAで、48時間処置した後、免疫蛍光によって測定された乳癌細胞のGRαの細胞定位で、DAPIが、細胞核染色に利用され、及び、（I）は、DEXかATAで、48時間処置した後、細胞質と細胞核のGRαのタンパク質表現で、β-actinとLamin B1グロブリンが、それぞれ、細胞質と細胞核群の内部対照である。データーは、三回独自実験の平均値±標準差によって示される。*P<0.05と**P<0.01及び***P<0.001によって、対照群とpre-miR-708遺伝子移入或いはDEXとATA処置群と比較すると、顕著な差異が示される。
【００４８】
図２（A）のRT-PCR分析結果によれば、MCF-10A（11.11倍）と比較すると、MCF-7（2.43倍）とMDA-MB-231（0.43倍）のmiR-708表現が、正常人類乳腺細胞より顕著的に低い。また、更に、非転移性MCF-7細胞と高度転移性MDA-MB-231細胞とを比較すると、MDA-MB-231細胞において、miR-708の表現を観察できない。更に、図２（B）のRT-PCR結果によれば、一時的に、miR-708先駆体を遺伝子移入すると、MCF-7とMDA-MB-231細胞が、過度的にmiR-708を表現する。Maらの前の研究[19]によれば、一時的にmiR-708先駆体を遺伝子移入することにより、MDA-MB-231細胞が、過度的にmiR-708を表現させて、乳癌細胞の増殖と侵襲を抑制できるが、miR-708の表現を抑制すると、MDA-MB-231細胞の成長と転移が増加される。また、最近のある研究によれば、卵巣がん転移過程において、miR-708を上向き調整させることが、糖質コルチコイド受容体の活性化反応に関連することが分かる[23]。そのため、本発明は、GRαによって媒介されたシグナル伝達経路が、乳癌のmiR-708表現を調整することに関与すると仮定する。上記の仮定を確証するため、乳癌細胞を、それぞれ、DEXやATAと72時間反応させ、図２（C）のRT-PCRにおいて、細胞のmiR-708のmRNA表現を検知することから分かるように、本発明の予期通りで、DEXとATAが、顕著的に、miR-708の表現量を増加した。しかし、図２（D）のように、GRαサイレンシングの乳癌細胞において、殆ど、DEXとATAによって誘発されたmiR-708表現の増加を観察できないが、GRα薬剤抑制剤であるミフェプリストンによって処置された乳癌細胞に、類似結果が観察され、図２（E）に示された結果によれば、GRαが、miR-708表現を誘発することに、極めて重要な機能を有する。更にデノボ合成（de novo synthesis）を検査するため、タンパク質合成抑制剤（CHX）で乳癌細胞を処置した後、DEXとATAで72時間処置し、図２（F）のRT-PCR分析結果によれば、CHX予処置の乳癌細胞において、DEXとATAが、細胞miR-708の表現量を増加することができる。上記の結果によれば、DEXとATAによって誘発される、GRα媒介のmiR-708転写は、デノボタンパク質合成を必要しない。
【００４９】
前の研究によれば、糖質コルチコイド（glucocorticoids, GC）によって刺激された後、miR-708の四つの潛在プロモータ領域の中の、CpG島を有するプロモータ領域-3（哺乳動物において、高度的に相似する）は、卵巣がん細胞において、40倍超えのプロモータ活性を有する[23]。そのため、本発明は、プロモータ領域-3が、乳癌細胞において、miR-708のプロモータ領域とされる可能性を仮定する。本発明は、行動プロモータ領域-3の報告プラスミドを構築し、また、ルシフェラーゼアッセイでGRαの転写活性を分析する。図２（G）のように、DEXとATAは、それぞれ、MCF-7細胞のルシフェラーゼ活性を、顕著的に、8.2倍と6.5倍に増加させて、MDA-MB-231細胞のルシフェラーゼ活性を、顕著的に、4.9倍と4.8倍に増加させ、GRαの転写活性が、GC刺激下のmiR-708転写作用を調整ることに役目がある。そして、本発明は、GC媒介のGRα核内移行作用を検査し、まず、DEXとATAで、乳癌細胞を48時間処置した後、免疫蛍光分析で、GRαの細胞間定位を検出する。結果は、図２（H）のように、対照群の細胞において、GRαの基本表現が、主に、細胞質に存在し、細胞核において、殆ど観察できず、DEXとATAで処置した後、顕著的に、乳癌細胞核のGRαの表現量が向上される。ウエスタンブロット法（western blot）で分析すると、更に、類似の結果が証明され、図２（I）のように、DEXとATAで処置した細胞は、その細胞核のGRαグロブリン表現が顕著的に増加するが、細胞質のGRαグロブリン表現が低下し、また、両者が比例し、そのため、GC誘発のGRα転写活性化は、核内移行後の一連反応によるものである。
【００５０】
miRNA-708/GRα経路が、乳癌細胞の増殖を抑制できる
図３は、本発明に係るDEXかATAを投与することにより乳癌細胞生存率に対する影響の概念図である。図のように、GR促進剤が乳癌細胞においての機能を評価するため、本発明は、DEXとATAで幹細胞を処置してその増殖状況を分析する。また、GR促進剤が乳癌細胞に対する作用を検討するため、MCF-7とMDA-MB-231細胞を、それぞれ、異なる薬量のDEX（0.1や1、2.5、5及び10 μM）とATA（1や5、10及び20 μM）と、24や48及び72時間反応させ、対照群は、0.1%のDMSOであり、その後、MTTとMTS試験で、細胞の成長と増殖を分析し、図３（A）は、MCF-7細胞を、ATA（1〜20 μM）やDEXと、24〜72時間反応させるものであり、（B）は、MDA-MB-231細胞を、逓増濃度のATA（1〜20 μM）やDEX（0.1〜10 μM）と、24〜72時間反応させる。MTT比色で、細胞生存率を検知して評価し、データーは、三回独自実験の平均値±標準差によって示される。MTT結果によれば、対照群と比較すると、細胞がDEXとATAによって処置された後、その成長曲線が、薬量と時間に関連して、急に低下する。また、DEXとATAで72時間処置することにより、低い薬量のDEXとATA（1 μM）下でも、細胞数も、顕著的に低下する。
【００５１】
図４は、本発明に係るフローサイトメーターでAnnexin V/PI染色乳癌細胞アポトーシスを分析する概念図である。図のように、Annexin-V/PI染色で、細胞数の低下が、細胞アポトーシスに関連するか否かを検知し、データーは、三回独自実験の平均値±標準差によって示される。フローサイトメーター分析結果によれば、対照群と比較すると、DEXやATA処置群のアポトーシス細胞は、顕著的に増加することがない。そのため、本発明は、GR促進剤が、乳癌細胞の成長停滞や老衰を誘発して、更に、細胞数を低減する可能性を仮定する。
そして、図５と図６は、それぞれ、本発明に係るmiRNA-708/GRα信号経路が乳癌細胞の増殖を抑制する概念図と、本発明に係るトリパンブルー色素排除試験法で細胞増殖を評価する概念図である。図のように、本発明は、MTSの細胞増殖試験により、上記の仮定を証明する。その中、図５（A）は、DEXやATAを投与して乳癌細胞を72時間処置した後、市販の細胞増殖試剤で、乳癌細胞増殖作用を検知することであり、（B）は、pre-miR-708で乳癌細胞を72時間遺伝子移入した後、乳癌細胞増殖の様子であり、（C）は、DEXやATAで乳癌細胞を72時間処置してから、PI染色後、フローサイトメーターで細胞周期分布を測定することであり、（D）は、pre-miR-708が乳癌細胞に 72時間遺伝子移入された様子であり、（E）は、DEXやATAで、乳癌細胞を72時間処置した後、ウエスタンブロットで、細胞周期調整グロブリンの表現を分析することであり、（F）は、免疫ブロット法で、CDK抑制剤のタンパク質表現を分析し、β-actinグロブリンを、内部統制とする。データーは、三回独自実験の平均値±標準差によって示される。**P<0.01は、対照群と、pre-miR-708遺伝子移入やDEXとATA処置群と比較すると、顕著な差異を示す。図６（A、B）は、pre-miR-708で乳癌細胞に一時的に遺伝子移入して、24や48及び72時間後、細胞増殖を測定する様子であり、（C、D）は、DEXやATAで、乳癌細胞を24〜72時間処置した後、トリパン青排除分析で、生細胞の数を検知する。データーは、三回独自実験の平均値±標準差によって示される。*P<0.05や**P<0.01及び***P<0.001は、対照群と、pre-miR-708遺伝子移入或いはDEX とATA処置群と比較すると、顕著な差異を示す。
【００５２】
図５（A）のMTS検知結果によれば、DEXとATAにより、顕著的に、細胞数が低減され、GR促進剤が、乳癌細胞増殖の抑制作用を有することを示す。更に、GR促進剤の細胞増殖抑制が、miR-708の作用を介すること確認するため、乳癌細胞をpre-miR-708先駆体に遺伝子移入して、過度的にmiR-708を表現させた後、細胞増殖を検知し、図５（B）のように、細胞が過度的にmiR-708を表現すると、顕著的に生存細胞の比率を低減でき、それは、GR促進剤の乳癌細胞増殖抑制が、miR-708の作用によるものと示される。また、図６の平行（parallel）トリパン青排除分析において、類似の結果が観察される。
【００５３】
本発明は、更に、フローサイトメーターで、細胞周期プロセスを分析し、GR促進剤が、細胞の周期停滞を誘発して細胞増殖を抑制することを確認する。図５（C）の結果によれば、DEXにより、MCF-7とMDA-MB-231である細胞周期G2の細胞群が増加し、細胞が、G2-M過渡期に停滞することを示す。比較すると、ATA処置後の細胞は、G0/G1期の細胞群の比例が、顕著的に増加し、ATAが、細胞をG1-S変換期に停滞させることを示す。また、図５（D）のように、乳癌細胞をpre-miR-708に遺伝子移入しても、その結果が確証されて、DEXの結果と一致し、pre-miR-708の遺伝子移入により、MCF-7とMDA-MB-231の細胞が、G2-M変換期に停滞される。更に、これらの結果を証明するため、免疫ブロット法で、細胞周期調整グロブリンの表現を検出し、例えば、サイクリン（cyclins）やサイクリン依存性キナーゼ（cyclin-dependent kinases, CDKs）及びCDKインヒビター（CDK inhibitors, CKIs）である。図５（E）の実験結果によると、上記の観点が支持され、DEXとATAは、顕著的にG1-S過度調節タンパク質を下向き調節でき、特に、cyclin D1やCDK4及びCDK6であり、また、ATAが、顕著的に、cyclin BとCDK1を抑制できる。しかし、cyclin Aとcyclin Eのグロブリン表現は、DEXやATAによって影響されない。図５（F）において、DEXやATA処置により、顕著的に、MCF-7とMDA-MB-231細胞のp21Cip1とp27Kip1のグロブリン表現が上に調整され、p21Cip1とp27Kip1は、成長停滞と細胞老衰に関連するタンパク質である。
【００５４】
miRNA-708/GRα経路が乳癌細胞のがん幹細胞表現を抑制できる
そして、図７は、本発明に係るmiRNA-708/GRαシグナル伝達経路により体外と体内腫瘍の成長が調整られる概念図である。図のように、GR促進剤が腫瘍球形細胞の形成を抑制できるか否かを検査し、それは、がん幹細胞の一つの特徴である。その中、図７（A）は、乳癌細胞を6孔培養ディッシュ上に接種し、各孔に200個の細胞が含有され、細胞沈降後、DEXやATAで14日処置する。腫瘍形成を観察して、計数し、ヒストグラムに、各孔の腫瘍数が表示され、（B）は、pre-miR-708を細胞に14日遺伝子移入した後、検知した腫瘍数であり、（C）は、sc siRNAやsiGRαを乳癌細胞に遺伝子移入した後、DEXやATAで14日処置してから、腫瘍形成を検出する様子であり、（D、E）は、膜グロブリン抽出試剤で、細胞膜グロブリンを抽出し、そして、免疫ブロット法でCD44とCD24のタンパク質表現を分析し、α-Tubulinを内部統制とし、（F）は、DEXやATAで人類乳房腫瘍を、小ねずみに異目間移植して7週間処置するときの様子であり、（G）は、治療終了後（10週間）、腫瘍体積を測定する様子であり、（H）は、治療終了後、腫瘍重量を測定する様子であり、（I）は、腫瘍組織学に基づいて、腫瘍細胞壊死の状況を検査する様子であり、（J）は、腫瘍組織学に基づいて腫瘍細胞のアポトーシス（H&E染色；拡大率100×）を検査する様子である。データーは、三回独自実験の平均値±標準差によって示される。*P<0.05と**P<0.01及び*** P<0.001によって、対照群とpre-miR-708遺伝子移入或いはDEXとATA処置群と比較すると、顕著な差異が示される。
【００５５】
まず、乳癌細胞を、DEXとATA処置するか処置しない状況で、3次元微小環境において、14日培養した後、3次元培養条件下で、形成された腫瘍球形細胞数を計数し、図７（A）のように、MCF-7とMDA-MB-231細胞は、それぞれ、7日と5日後、腫瘍球形細胞が形成される。薬剤で処置していない状況で、MCF-7細胞は、各孔に、5〜7個の腫瘍球形細胞が形成され、DEXとATA処置の状況で、腫瘍球形細胞の形成を発見できない。もう一方、薬剤で処置していない状況で、MDA-MB-231細胞は、各孔に、15〜22個の腫瘍球形細胞が形成され、DEXとATA細胞は、それぞれ、顕著的に低い5〜7個の腫瘍球と3〜7個の腫瘍球が形成される。これらの結果によれば、GR促進剤が、有効的に、乳癌細胞の腫瘍球形成を抑制できる。更に、miR-708が、GR促進剤の抑制作用においての役目を解明するため、pre-miR-708を細胞に遺伝子移入した後、腫瘍球の形成を検知し、図７（B）のように、処置されていない対照群と比較すると、miR-708過度表現は、明白的に、MCF-7とMDA-MB-231細胞の腫瘍球数を低減させる。本発明は、図７（C）から、GRαサイレンシング細胞において、DEXやATAが、腫瘍球体形成を抑制できないことを発見し、この結果から、GR促進剤の体外抗腫瘍作用は、miR-708/GRα信号を介して、直列に反応することが分かる。また、図７（D）のウエスタンブロット法の結果によれば、DEXとATAは、顕著的に、MCF-7とMDA-MB-231細胞のCD44とCD24グロブリン表現を下向き調節できる。同様に、図７（E）によれば、pre-miR-708の遺伝子移入は、顕著的に、乳癌細胞のCD44とCD24グロブリンの表現を下向き調節でき、DEXとATA或いはpre-miR-708が腫瘍球体形成を抑制することと、CD44とCD24の表面グロブリンマークを下向き調節することとは、強烈な関連性を有する。
【００５６】
GR促進剤が、異目間移植動物模型において、乳房腫瘍成長を抑制できる
上記体外発ガン性検査の結果によれば、GR促進剤は、抗腫瘍試剤とする潜在性がある。体内で、これらの効果を確証するため、MCF-7とMDA-MB-231細胞を、雌性ヌードマウスの右側皮下に接種し、乳癌異目間移植模式を構築し、腫瘍の大きさが、50 mm3に達した後、毎週間二回に、腹腔内注射でDEXとATAを投与する。図７（F、G）のように、MCF-7腫瘍対照群の小ねずみは、五週目の腫瘍大きさが、40 mm3から450 mm3までに増加し、MDA-MB-231腫瘍の対照群の小ねずみは、60 mm3から2700 mm3までに増加する。しかし、DEXとATA投与の小ねずみは、顕著的に、腫瘍の成長が低下され、MCF-7腫瘍体積は、それぞれ、170±37 mm3と110±28 mm3に低下され、MDA-MB-231腫瘍は、それぞれ、330±117 mm3と437±136 mm3に低下される。また、図７（H）のように、MCF-7対照群の腫瘍重量が、2.1±0.5gで、MDA-MB-231対照群の腫瘍重量が3.7±1.3gであるが、DEXとATAは、顕著的に、MCF-7腫瘍重量を、0.6±0.2gと0.15±0.02g低下させ、MDA-MB-231の腫瘍重量は、それぞれ、1.5±0.5と1.1±0.5gである。また、ATA処置の小ねずみ体重は、僅かに低下し（体重が10%弱低減する）、顕著的な副作用影響がない。図７（I）の組織切片結果によれば、対照群腫瘍組織は、僅かの壊死現象があるが、DEXとATA処置群は、ともに、MCF-7とMDA-MB-231の腫瘍組織に、大量に壊死領域が発見される。図７（J）の組織化学染色によっても、対照群の腫瘍組織には、顕著な的細胞核濃縮とアポトーシス小体の発生を発見できないが、MCF-7とMDA-MB-231両者の腫瘍組織には、DEXとATAによって、細胞核濃縮とアポトーシス小体の発生が増加され、このような結果は、上記細胞アポトーシス試験結果と衝突し、DEXとATAは、体外で、乳癌細胞のアポトーシスを誘発できない。
【００５７】
GR促進剤が乳癌細胞の転移を抑制できる
図８は、本発明に係るGR促進剤が、体外試験において、乳癌細胞の転移を抑制できる概念図である。図のように、更に、GR促進剤が癌細胞転移の活性を抑制できることを検査するため、DEXとATAで乳癌細胞を処置して、癌細胞移動と侵入試験を行って分析する。MCF-7細胞の転移能力が悪いため、培地に、TGF-β1を添加して、MCF-7細胞（MCF-7TGF-β）を誘発して転移させる。その中、図８（A）は、TGF-βが存在するか存在しない状況で、DEXやATAで、乳癌細胞を、24時間処置した後、傷口癒合試験で、細胞移動を分析し、ヒストグラムにおいて、腫瘍細胞の移動が、倍数に増加する様子であり、（B）は、TGF-βが存在するか存在しない状況で、DEXやATAで、乳癌細胞を、24時間処置した後、transwell試験法で、腫瘍細胞の侵襲作用を検知し、また、0時間と24時間に、倒立顕微鏡で撮影した写真（増幅倍率が10倍である）であり、（C）は、特異抗体を利用して、ウエスタンブロット法で、MMP-2とMMP-9のタンパク質表現を分析する様子であり、（D）は、定量Q-PCRで、MMP-2とMMP-9のmRNA表現を検知する様子であり、（E）は、乳癌細胞をsc siRNAやsiGRαに遺伝子移入した後、DEXやATAと、24時間反応させて、乳癌細胞移動を検知し、ヒストグラムには、腫瘍細胞移動の割合が示される。データーは、三回独自実験の平均値±標準差によって示される。＃P<0.001は、対照群とTGF-β1処置群とを比較して、顕著な差異があることを示す。**P<0.01と***P<0.001は、TGF-β1だけの処置群とDEXやATA処置群とを比較して、顕著な差異があることを示す。△P<0.001は、siGRαだけの遺伝子移入とDEXやATA処置群と比較して、顕著な差異があることを示す。
【００５８】
図８（A）は、薬剤で処置されていない対照群の細胞と比較すると、TGF-β1処置の細胞において、細胞移動の程度が、顕著的に増加し、DEXやATAで処置した細胞は、その細胞隙間の接近比例が、明白に低く、顕著的に、TGF-β1誘発の細胞移動が低減される。同様に、GR促進剤のDEXとATAは、顕著的に、乳癌細胞の移動能力を低減できる。そして、トランスウエル侵襲試験（trans-well invasion assay）で、GR促進剤が、TGF-β1がMCF-7細胞の侵襲を誘発できるか否かを検査し、図８（B）は、TGF-β1群の侵襲細胞数が、顕著的に対照群より高いが、DEXやATA処置により、細胞に侵入したMCF-7の数が低下される。また、GR促進剤も、顕著的に、MDA-MB-231細胞の侵襲作用を低下させる。そして、GR促進剤によって抑制された癌細胞移動と侵襲作用が、MMPsの下向き調節と関連することを証明するため、MMP-2とMMP-9の遺伝子表現を検出する。本発明の予期通りで、図８（C）には、MCF-7TGF-βとMDA-MB-231細胞において、DEXとATAにより、MMP-2とMMP-9のmRNA表現が明白的に低減されることを示し、また、図８（D）には、DEXとATAにより、顕著的にMMP-2とMMP-9のタンパク質表現が抑制される。更に、GRαの乳癌細胞においての調整転移作用を確証するため、MCF-7TGF-βとMDA-MB-231細胞を、GRα特異siRNAに遺伝子移入して、GRαをサイレンシングさせ、そして、移動試験で、DEXとATAの抗転移作用を検知し、図８（E）のように、DEX或ATAにより、sc siRNAを細胞に遺伝子移入した腫瘍細胞移動が、明白的に、低減されるが、GRαサイレンシングの細胞においては、DEXが、MCF-7TGF-βとMDA-MB-231細胞の移動を抑制できず、それから、ATAが、一部のGRαサイレンシング細胞の腫瘍細胞移動を抑制でき、それは、ATAが、他の信号経路を調節することにより、腫瘍細胞の転移を抑制できることを示す。
【００５９】
miRNA-708/GRα経路が集中的に乳癌細胞のIKKβ表現を調整する作用を有する
図９は、本発明に係るmiRNA-708/GRα信号経路が集中的に乳癌細胞のIKKβ表現を調整する作用を有する概念図である。図のように、調節乳癌増殖のmiR-708の標的遺伝子を鑑定するため、三種類のターゲット予測計算法（miRandaやTargetScan及びmiRTarBase）でmiR-708と相互作用のmRNAをサーチし、三種類の予測計算法は、ともに、miR-708が、NF-κBに作用して、キナーゼβ（IKKβ）遺伝子を活性化できることを示し、また、IKK-NF-κB経路は、乳癌発生の重要因素として認められ、また、治療乳癌の潛在ターゲットである[24]。その中、図９（A）は、miR-708の標的位置が、IKBKB（IKKβ）3'UTRの位置にあり、（B）は、pre-miR-708を細胞に48時間遺伝子移入した後（RLU、相対ルシフェラーゼ単位）、乳癌細胞のIKKβのプロモータ活性であり、（C）は、pre-miR-708を細胞に48時間遺伝子移入した後、乳癌細胞のIKKサブユニット（subunits）のmRNA表現であり、（D）は、DEXやATAで細胞を48時間処置した後、乳癌細胞のIKKサブユニットのmRNA表現であり、（E）は、ウエスタンブロット法でIKKαとIKKβのグロブリン表現を分析し、（F）は、細胞にsc siRNAやsiGRαを遺伝子移入した後、DEXやATAと48時間反応させて、IKKβ mRNAの表現を分析し、（G）は、細胞がDEXやATAと48時間反応した後、IKKαとIKKβのグロブリン表現である。データーは、三回独自実験の平均値±標準差によって示される。*P<0.05と**P<0.01は、対照群とpre-miR-708遺伝子移入やDEXとATA処置群と比較すると、顕著な差異を示す。△P<0.001は、siGRα遺伝子移入群とDEXやATA処置群だけを利用すると、顕著な差異を示す。
【００６０】
図９（A）には、IKBKB（inhibitor of nuclear factor kappa B kinase subunit beta）抑制剤とmiR-708の予測結合サイトを示し、miR-708とIKKβの直接作用を評価し、図９（B）には、IKKβの3'UTR領域を、ホタルルシフェラーゼ下流の報告プラスミドにクローニングして、miR-708にMCF-7とMDA-MB-231を遺伝子移入した後、ルシフェラーゼ活性が、それぞれ、対照群の38.7%と40.1%に低下し、これらの結果は、明白的に、IKKβがmiR-708の直接ターゲットであることを示す。そして、本発明は、乳癌細胞のIKKαやIKKβ及びIKKγ等のIKKサブユニットのmRNA表現を分析し、図９（C）には、MCF-7とMDA-MB-231細胞が、過度的に、miR-708を表現すると、細胞のIKKβ mRNA表現が、顕著的に低下するが、IKKαとIKKγのmRNA表現は、pre-miR-708の遺伝子移入によって影響されない。同様に、図９（D）には、GR促進剤のDEXやATAが、顕著的に、IKKβ mRNAの表現を下向き調節でるが、IKKαとIKKγは、影響されない。これらの結果は、GR促進剤によるIKKβの低減は、miR-708の作用によるものを示す。図９（E）の免疫ブロット結果によっても、DEXとATAが、IKKβのグロブリン表現を低下させるだけでなく、そのリン酸化反応を抑制するが、DEXやATAは、IKKαグロブリン表現とそのリン酸化反応に影響を与えない。更に、GRαが、IKKβ調整との係わりを検出するため、図９（F、G）には、GRα siRNAを一時的に乳癌細胞に遺伝子移入した後、IKKβグロブリンとmRNAの表現を検知し、GRα抑制（knockdown）の細胞において、DEXとATAは、ともに、IKKβ mRNAとタンパク質の表現を下向きに調節することができないが、ATAが、GRαサイレンシングのMDA-MB-231細胞においても、顕著的に、IKKβリン酸化反応を抑制でき、それは、ATAがIKKβリン酸化反応を抑制することにおいて、一部GRαが、依存しないものである。以上の結果によれば、GR促進剤が、miR-708を活性化でき、IKKβが、miR-708の直接に作用する標的である。
【００６１】
miRNA-708が乳癌細胞のNF-κB活性を抑制する
今までに、NF-κB信号が、多い癌細胞において、多い遺伝子の転写表現を調節することを発見し、これらの遺伝子は、一般、細胞生存と増殖の促進や細胞アポトーシスの抑制及びがん幹細胞分化と腫瘍細胞転移の誘発に関わりがある[13,25]。最近のある研究[18]によって、miR-708の後成学サイレンシングが、慢性リンパ性白血病（CLL）のNF-κB信号を強化することを証明した。図１０は、本発明に係るmiRNA-708が乳癌細胞のNF-κBの活性を抑制することの概念図である。図のように、miR-708が、細胞増殖や腫瘍の発生と転移の機能を有することに対して、本発明は、miR-708が、NF-κBで癌細胞を調整するか否かを検査した。その中、図１０（A）pre-miR-708で細胞に48時間遺伝子移入した後（RLU、相対ルシフェラーゼ単位）の乳癌細胞にあるNF-κBのルシフェラーゼ活性であり、（B）は、DEXやATAで48時間処置した後の乳癌細胞にあるNF-κBのルシフェラーゼ活性であり、（C）は、pre-miR-708で細胞に48時間遺伝子移入した後の細胞質と細胞核にあるNF-κBのグロブリン表現であり、（D）は、DEXやATAで細胞を48時間処置した後の細胞質と細胞核にあるNF-κBのグロブリン表現であり、GAPDHとLamin B1は、それぞれ、細胞質と細胞核の内部対照とされ、（E）は、sc siRNAやsiGRαで細胞に遺伝子移入した後、DEXやATAと48時間反応させ、NF-κBのルシフェラーゼ活性であり、（F）は、細胞にsiRNAやsiGRαが遺伝子移入された後、DEXやATAと48時間反応させ、細胞質と細胞核にあるNF-κBのグロブリン表現であり、（G）は、動物対照群やDEX或いはATA処置群の腫瘍異目間移植物のNF-κBの免疫組織化学染色であり、（H）は、細胞にpre-miR-708を48時間遺伝子移入した後、乳癌細胞のI-κBαのタンパク質表現とそのリン酸化反応グロブリン表現であり、（I）は、DEXやATAで細胞を48時間処置した後、乳癌細胞のI-κBαのタンパク質とそのリン酸化反応グロブリン表現である。MCF-7細胞のNF-κB信号伝達を誘発するため、TNF-α（10 ng/mL）で細胞を予処置し、また、TNF-α刺激のMCF-7細胞を、MCF-7TNFとして表示される。データーは、三回独自実験の平均値±標準差によって示される。**P<0.01は、対照群とpre-miR-708遺伝子移入或いはDEXとATA処置群が、顕著な差異を有することを示す。
【００６２】
図１０（A）ルシフェラーゼ報告遺伝子活性試験結果によれば、乳癌細胞のmiR-708の表現が、NF-κB転写活性を、顕著的に低下させることが分かる。また、図１０（B）によれば、GR促進剤のDEXやATAが、顕著的に、乳癌細胞のNF-κBの転写活性化を抑制することを示す。そして、本発明は、pre-miR-708によって処置されたNF-κBの核外移行作用を検査した。図１０（C）のウエスタンブロット法結果によれば、対照群細胞においては、NF-κBの主な表現が、細胞核にあり、pre-miR-708遺伝子移入の細胞においては、細胞質のNF-κB表現が増加することを発見した。同様に、図１０（D）には、DEXとATAが、明白的に、NF-κB核内移行を抑制し、その細胞核のNF-κB表現がやや低いことを示す。前の研究によれば、糖質コルチコイド受容体の表現を誘発すれば、HeLa細胞のNF-κB活性を抑制できる[26]。そのため、本発明は、GR促進剤がIKKβ表現を下向き調節することが、乳癌細胞において、NF-κB活性を抑制することに、重要の機能を発揮すると推定し、図１０（E）のように、DEXとATAが、顕著的にsc siRNA遺伝子移入の細胞のNF-κB活性を抑制できるが、DEXとATAが、GRαサイレンシングの細胞のNF-κB活性を抑制できない。図１０（F）の免疫ブロット法結果によれば、GRαサイレンシングの細胞に、DEXとATAが、NF-κBの核内移行を抑制することを、殆ど観察できない。更に、GR促進剤が、NF-κBに対する調節作用を検討するため、異目間移植皮下腫瘍組織に対して免疫組織化学染色を行い、図１０（G）のように、対照群の腫瘍組織に対して、NF-κB陽性の免疫染色細胞を観察できるが、DEXとATA群のNF-κB陽性免疫染色細胞の数が、顕著的に低下する。
【００６３】
IKK phosphorylates NF-κB-bound IκBs（inhibitor-κBs）は、IκB N-末端調節ドメイン内の二つの保守セリンにおいて、リン酸化し、IκB蛋白質分解は、リン酸化とユビキチン化（ubiquitination）経路依存作用によって行われ、また、NF-κB活性化の関与ステップである。IκBリン酸化は、主として、IKK複合体のIKKβ触媒サブユニットに依存する[10]。そのため、NF-κBの上流グロブリンI-κBαの表現を測定しても、図１０（H）のように、対照群において、殆ど、I-κBの表現を観察できないが、pre-miR-708遺伝子移入の細胞には、I-κB表現の増加が観察され、しかし、対照群やpre-miR-708遺伝子移入細胞には、ともに、I-κBのリン酸化表現を観察できない。図１０（I）に示されるように、DEXとATA処置後の細胞I-κBグロブリン表現が、処置前のそれと、顕著な差異がない。
【００６４】
GR促進剤がmiR-708の活性化でNF-κB下位標的遺伝子を抑制する
最近の研究によれば、乳癌細胞が、特異に、COX-2とcMYCグロブリンを表現し、また、乳癌患者のCOX-2とcMYC表現が向上され、予後価値を有する[27,28]。図１１は、本発明に係るGR促進剤がmiR-708の活性化でNF-κBの下位標的遺伝子を抑制する時の概念図である。図のように、miR-708がNF-κB信号経路下流遺伝子の転写活性に影響を与えるか否かを検知するため、細胞にTNF-αを処置してNF-κB下流遺伝子COX-2とCmycの表現を誘発した後、検査し、その中、図１１（A）は、pre-miR-708を細胞に48時間遺伝子移入した後、乳癌細胞のCOX-2とcMYCのmRNA表現であり、（B）は、細胞にDEXやATAが48時間処置された後、ウエスタンブロット法でCOX-2とcMYCグロブリン表現を分析し、（C）は、乳癌細胞をpre-miR-708によって、細胞に48時間遺伝子移入された後、細胞のCOX-2とcMYC mRNAの表現であり、（D）は、人類乳房腫瘍異目間移植動物対照群やDEX或いはATA処置群のCOX-2免疫組織化学染色であり、（E）は、細胞にsc siRNAやsiGRαが遺伝子移入されて、DEXやATAと48時間反応した後のCOX-2 mRNAの表現である。データーは、三回独自実験の平均値±標準差によって示される。**P<0.01は、対照群と、pre-miR-708遺伝子移入或いはDEXとATA処置群とが、顕著な差異を有することを示す。#P<0.05は、sc siRNA群とsiGRα群とが、顕著な差異を有することを示す。△P<0.001は、siGRαだけ遺伝子移入群とDEXやATA処置群とが、顕著な差異を有することを示す。
【００６５】
図１１（A、C）の結果から分かるように、miR-708の過度表現により、COX-2とcMYC遺伝子（図A）とタンパク質（図C）の表現が抑制される。図１１（B）は、GR促進剤のDEXとATA処置の細胞にも、類似の結果が観察されることを示す。また、図１１（D）の動物実験において、薬剤を処置していない対照群と比較すると、DEXとATA群の腫瘍組織のCOX-2陽性細胞の数が、明白的に低減した。GRα活性化がCOX-2表現に対する影響を評価するため、GRαサイレンシング細胞に対してDEXとATAを処置した後、RT-PCRとウエスタンブロット法で分析する。図１１（E）のRT-PCR分析結果によれば、対照群と比較すると、GRαサイレンシングの細胞のCOX-2遺伝子表現が、顕著的に増加することが分かるが、DEXとATAの一部が、GRαサイレンシング細胞のCOX-2表現を抑制する。
【００６６】
討論
miR-708は、腎細胞がんや前立腺癌、グリオーマ、肝臓がん、卵巣がん及び乳癌等の多いがんにおいて、最も下向き調節できるmiRNAの一つである[17,29]。比較すれば、miR-708は、非小細胞肺癌や児童によく見られるＢ前駆細胞急性リンパ性白血病及び膀胱癌において、高度表現される[17,29]。前の研究によれば、多数の転移性腫瘍細胞に、miR-708表現が観察されるが、今まで、腫瘍の発生においての作用を検討する研究は、少ない。Ryuらの[30]研究によれば、polycombで、miR-708を抑制すれば、乳癌のカルシウム誘発の細胞移動が発生し、そして、がん転移を促進し、また、Maらの研究[19]によれば、強制表現miR-708は、LSD1表現を抑制して、更に乳癌細胞の増殖と侵襲を抑制できることが証明される。miR-708は、種属間において、高度相似性を有し、また、特定組織に、異なる表現があり、そのため、本発明は、一群の非腫瘍形成性や腫瘍形成性（非転移性）及び腫瘍形成性（転移性）の乳癌細胞のmiR-708表現差異を検査し、結果によれば、miR-708が、非腫瘍形成性のMCF-10A細胞において、表現量がやや高く、miR-708が、転移性癌細胞においての表現は、顕著的に、非転移性癌細胞においての表現よりも低い。また、本発明は、発見透過miR-708先駆体の遺伝子移入により、細胞において、miR-708を強制表現させると、顕著的に乳癌細胞の増殖と体外発ガン性を抑制でき、この結果は、他の研究に観察された乳癌細胞[19]或いは他の癌細胞[31,33]の結果に類似する。実験結果によれば、miR-708類似物によって、細胞の周期停滞が発生して細胞増殖を抑制するが、転移と非転移癌細胞の細胞の周期停滞が、異なる段階に発生し、MCF-7細胞において、miR-708類似物が、細胞を、G1-S変換期に停滞させ、MDA-MB-231細胞において、G2-M変換期に停滞させる。更に、細胞周期調節タンパク質を分析すると、miR-708類似物が、二種類の細胞系において、ともに、p21CIP1とp27KIP1の表現を誘発さることが発見される。全体から言うと、本発明の研究結果によれば、miR-708が、乳癌に対して、抗腫瘍の作用を発揮することを証明した。
【００６７】
より多い証拠によれば、miRNAは、各種類の真核生物の胚幹細胞と組織幹細胞を調整する特性がある。最近の研究によれば、miRNAは、がん幹細胞のメカニズムを調整する新方向を提供する。Shimonoら[34]は、乳癌幹細胞において、八つのmiRNAが、選択的に下向き調節されて、miR-200c-141やmiR-200b-200a-429及びmiR-183-96-182の三つのmiRNAクラスターに位置づけ、その中、二つがmiR-200クラスター（miR-200c-141とmiR-200b-200a-429）であることを発見した。BMI1は、一種類の幹細胞セルフリフレッシュを調節する調整因子であり、その表現が、miR-200cによって調整され、これは、miR-200ファミリーを抑制することが、幹細胞機能を維持することに、極めて重要であることを示す[35]。また、let-7ファミリーmiRNAs標的遺伝子H-RASとHMGA2を活性化調整することにより、乳癌幹細胞のセルフリフレッシュと分化を抑制できる[36]。この証拠によれば、乳癌幹細胞特異miRNAは、セルフリフレッシュ能力の調整や発ガン性及び転移において、極めて重要の機能を有する。本発明において、高侵襲性の乳癌細胞株MDA-MB-231を選択して、GR促進剤やmiR-708ががん幹細胞に対する潛在作用を検査する。MDA-MB-231は、ER-/PR-/HER-1-三種陰性乳癌（triple negative breast cancer, TNBC）に属して、また、高比例CD44+/CD24-細胞群を表現する。MDA-MB-231細胞は、高CD44+細胞群を有するため、乳癌幹細胞の良い模型とすることができる。GR促進剤とmiR-708過度表現が、乳癌幹細胞に対する影響を研究するため、本発明は、腫瘍球形成試験で、がん幹細胞の表現を分析すると、結果として、GR促進剤や遺伝子移入miR-708類似物は、ともに、顕著的に、腫瘍球形成とCD44+表現の低減を発見し、それは、GR促進剤が、活性化miR-708により乳癌細胞のがん幹細胞の表現を抑制できることを示す。
【００６８】
前の研究によれば、GR促進剤で、がんを治療するには、分岐の結果が現れる。合成のGR促進剤-デキサメタゾン（DEX）は、キセノエストロゲンスルホ基転移酵素の増加と腫瘍組織のエストラジオールの低減により、小細胞肺癌と乳房腫瘍の成長を抑制する[37]。しかし、他の研究によれば、糖質コルチコイド受容体拮抗薬-ミフェプリストンに合わせて、化療を使用することにより、有効的に三種陰性乳癌の発ガン性を抑制でき、また、細胞のアポトーシスを誘発できることを発見するが、単独的にミフェプリストン治療を利用すれば、三種陰性乳癌に効果がない[38]。Linらの最近の一つの研究によれば、GR促進剤DEXが、Rap1Bに作用することにより、miR-708を活性化して卵巣がんの転移を抑制できることを発見した[23]。そのため、本発明は、GR促進剤がmiR-708を活性化調整する作用を有することと、乳癌細胞の発ガン性を抑制する潜在性とを仮定する。本発明は、合成のGR促進剤DEX或いは天然GR促進剤-アントシンA（ATA）が、ともに、miR-708表現を誘発することにより、乳癌細胞の増殖や癌細胞群落形成の抑制及び細胞周期停滞を誘発できることを発見した。また、本発明においては、合成的や天然的GR促進剤が、ともに、乳癌細胞アポトーシスを誘発できないことを観察し、この結果は、前の急性リンパ性白血病に観察した現象と、矛盾し[39]、また、DEXやATAは、顕著的にヌードマウス皮下MCF-7とMDA-MB-231乳房腫瘍の成長及び腫瘍体重と体積を低減した。以上の結果によれば、GR促進剤は、乳癌を治療する潜在性を有する。
【００６９】
乳癌において、NF-κB経路は、多動性であり、また、一種類の生存に有利の機能を提供する。NF-κB 信号経路は、多い、様々の因子の刺激によって、活性化され、例えば、サイトカインや成長因子信号伝達、病原体産物の識別或いはDNA損傷とがんストレス等である[40]。今までの研究によれば、藥理学抑制剤が、乳癌細胞アポトーシスの増加と体内腫瘍成長の抑制の作用を有することが発見された[41,42]。NF-κB信号経路の活性化は、その上流キナーゼIKKαとIKKβが活性化された後、プロテアソームがI-κBα/βを分解することを促進し、NF-κBが、細胞核に入ってその下流遺伝子を転写活性化する[40]。多い活性化NF-κBの信号因子が、IKKβの上に集中し、例えば、成長因子や炎症サイトカイン、内毒素及びウイルス感染等があり、活性化のNF-κBは、免疫と炎症反応に関与するだけでなく、細胞接着や血管生成、自己貪食、エネルギー代謝、老衰及び細胞増殖の誘発と生存の調整にも関与する[43]、そのため、実験模式やがん患者には、ともに、NF-κBががんの発生と発展に関与することを発見することが、特に意外ではない。この研究において、本発明は、miR-708が、NF-κBの上流キナーゼIKKβに作用することと予測し、ルシフェラーゼ報告遺伝子試験の結果によれば、miR-708が直接に、IKKβの3'UTR領域に結合し、また、過度表現miR-708やGR促進剤の処置は、ともに、顕著的に、IKKβグロブリン表現とNF-κB転写活性を低減でき、また、GR促進剤は、顕著的に、乳癌異目間移植小ねずみの腫瘍組織のNF-κB表現を低減できる。他の研究によれば、miR-708が、慢性リンパ性白血病に対して、NF-κBを抑制する機能を発見し[18]、また、最近の研究によれば、乳腺上皮細胞NF-κBが、乳癌幹細胞のセルフリフレッシュを調整し[13]、NF-κBの藥理学抑制剤が、有効的にがん幹細胞セルフリフレッシュ作用を低減でき、異目間移植腫瘍成長を抑制できる[44]。そのため、本発明は、GR促進剤やmiR-708類似物ががん幹細胞を抑制することとCD44+細胞群の作用は、NF-κBシグナル伝達抑制に関与し、これらの結果により、miR-708とNF-κBは、綿密に相互作用で、乳癌細胞成長とがん幹細胞表現を調整することが証明される。
【００７０】
COX-2の高度活性化は、人類上皮性腫瘍の共同特徴であり、例えば、大腸直腸癌や乳癌及び前立腺癌である[45]。乳癌において、COX-2の表現が、腫瘍の成長や侵襲及転移を調整でき、また、乳癌予後予測のバイオマーカーとすることができる[28]。今までに、腫瘍癌細胞増殖を抑制でき、細胞アポトーシスを誘発できる、数種類のCOX-2抑制剤が、発見された[46]。また、流行病学研究によれば、長期に非ステロイド抗炎症薬（NSAID）に露出することにより、COX-2誘発による前列腺素の発生を抑制でき、また、多種類のがん発生率を低減でき、例えば、乳癌である[47]、そのため、臨床上、COX-2抑制剤と抗癌薬剤とを、一緒に使用する[48]。もう一方、cMYCは、大多数のがんにも、高度表現の発がん遺伝子であり、例えば、リンパ腫や黒色腫、骨髓性白血病、胃腸癌、前立腺癌及び乳癌である[49]。前の研究によれば、遺伝子導入マウスの乳腺上皮細胞において、誘発システムによってc-Myc過度表現が誘発されて、侵襲性乳癌が形成されるが、cMYCの活性を抑制すれば、腫瘍が持続に退化されることを発見した[50]。COX-2とcMYCのがん予防の作用と抗癌薬剤の組合を検討するため、本発明は、実験でGR促進剤が乳癌細胞のCOX-2とcMYC表現に対する影響を、評価し、RT-PCRと免疫ブロット分析の結果によれば、GR促進剤やmiR-708類似物は、顕著的に、MCF-7とMDA-MB-231細胞のCOX-2とcMYC遺伝子とタンパク質表現を下向き調節でき、また、動物実験において、GR促進剤は、顕著的に、MCF-7やMDA-MB-231細胞異目間移植腫瘍のCOX-2表現を抑制できる。
【００７１】
本発明によって、合成や天然のGR促進剤が、GRαを介してmiR-708を活性化し、乳癌細胞の増殖を抑制して、また、細胞周期停滞を誘発できることを、始めに証明される。GR促進剤によって活性化されたシグナル伝達で、miR-708の表現を誘発した後、NF-κB活性が抑制され、また、その下位標的遺伝子COX-2とcMYCの表現が下向き調節される。本発明の実験結果によれば、GR促進剤やその下流miRNA-708は、乳房腫瘍の発生の抑制に応用される潜在性があると、推定できる。
【００７２】
糖質コルチコイドは、よく、化療に合わせて、乳癌治療の緩和治療に使用される。最近の研究によれば、糖質コルチコイド治療が、卵巣がん細胞のmiR-708の表現を誘発して、腫瘍細胞の転移を抑制し、乳癌細胞において、miR-708を強制表現すれば、腫瘍細胞の増殖と転移を抑制できることが発見される。また、慢性リンパ性白血病において、NF-κBの上流キナーゼIKKβが、miR-708によって調整されるが、乳癌細胞の糖質コルチコイドによって誘発されるmiR-708の系図とその下流NF-κBの標的は、また、確認待ちである。本発明において、合成の糖質コルチコイドDEXや天然の糖質コルチコイド類似物ATAで、乳癌細胞MCF-7とMDA-MB-231を処置した後、GRαの活性化により、顕著的に、miR-708表現を増加することが発見される。GR促進剤によって誘発されたmiR-708表現は、有効的に乳癌細胞増殖や細胞周期プロセス、腫瘍幹細胞表現と癌細胞転移を抑制できる。また、GR促進剤やmiR-708遺伝子移入で細胞を処置すると、ともに、顕著的に、IKKβの表現を抑制でき、また、NF-κB活性とその下位標的遺伝子を抑制でき、例えば、COX-2やcMYC、cyclin D1、MMP-2、MMP-9、CD24及びCD44の表現であり、また、癌細胞増殖や細胞周期プロセス、転移及び腫瘍幹細胞標識タンパク質p21CIP1とp27KIP1の表現量の関与性が増加される。乳癌細胞異目間移植模式試験によれば、GR促進剤で、動物を治療すれば、顕著的に腫瘍成長と腫瘍重量及び体積を抑制できることが発見された。全体的にいえば、本実験の結果によれば、GR促進剤でmiR-708表現を誘発して、NF-κB下流信号伝達を抑制するため、新規な治療方式として、乳癌治療に応用できることを強く推定できる。
【００７３】
以上のように、本発明は、乳房腫瘍の発生と転移を抑制する方法であり、有効的に、従来の諸欠点を解消でき、合成や天然の糖質コルチコイド受容体（GR）促進剤であっても、miR-708表現を誘発して、乳房腫瘍の発生と転移を抑制し、糖質コルチコイド受容体α（GRα）の転写活性化により、miR-708を活性化し、乳癌細胞の増殖を低下させながら、細胞の周期停滞を誘発させ、主として、NF-κBとその標的遺伝子COX-2とcMYCを転写抑制する作用を利用し、そのため、本発明は、より進歩的かつより実用的で、法に従って特許請求を出願する。
【００７４】
以上は、ただ、本発明のより良い実施例であり、本発明は、それによって制限されることが無く、本発明に係わる特許請求の範囲や明細書の内容に基づいて行った等価の変更や修正は、全てが、本発明の特許請求の範囲内に含まれる。
【符号の説明】
【００７５】
s111〜s113    ステップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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