(57)【要約】【課題】根本的な治療法がなかった房室ブロックや心室内伝導障害を修正するための心筋細胞を得る。【解決手段】ＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性である細胞がプルキンジェ（Ｐｕｒｋｉｎｊｅ）繊維細胞様細胞およびその製造方法、該細胞を含む移植片およびその製造方法、ならびに該細胞を用いる刺激伝導系に影響を及ぼす薬剤の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性であるプルキンジェ（Ｐｕｒｋｉｎｊｅ）繊維細胞様細胞。
【請求項２】
幹細胞由来である請求項１記載の細胞。
【請求項３】
ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞由来である請求項２記載の細胞。
【請求項４】
下記工程：
（ａ）ＨＣＮ４遺伝子を導入した幹細胞を心筋細胞に分化させ、
（ｂ）工程（ａ）で得られた分化細胞のなかからＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性細胞を採取する
を含む、プルキンジェ繊維細胞様細胞の製造方法。
【請求項５】
幹細胞がｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞である請求項４記載の方法。
【請求項６】
幹細胞が、１の標識遺伝子が作動可能に連結されたＨＣＮ４遺伝子および別の標識遺伝子が作動可能に連結されたＭｌｃ２ｖ遺伝子を含むものである、請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
ＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性細胞の採取がフローサイトメトリーにより行われる、請求項４〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
１の標識遺伝子が作動可能に連結されたＨＣＮ４遺伝子および別の標識遺伝子が作動可能に連結されたＭｌｃ２ｖ遺伝子を含む幹細胞。
【請求項９】
ＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性であるプルキンジェ繊維細胞様細胞を含む、房室ブロックおよび／または心室内伝導障害を治療するための移植片。
【請求項１０】
ＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性であるプルキンジェ繊維細胞様細胞を移植に適した形状に成型することを含む、房室ブロックおよび／または心室内伝導障害を治療するための移植片の製造方法。
【請求項１１】
ＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性であるプルキンジェ繊維細胞様細胞に試験薬剤を添加し、試験薬剤添加後の細胞の特性を調べることを含む、刺激伝導系に影響を及ぼす薬剤の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な新規刺激伝導系細胞様細胞に関する。詳細には、本発明は、ＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性であるプルキンジェ（Ｐｕｒｋｉｎｊｅ）繊維細胞様細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
徐脈性不整脈は加齢とともに増加し、心不全やＴｏｒｓｏ  ｄｅ  Ｐｏｉｎｔｅｓ型の不整脈から失神や突然死に繋がる。徐脈性不整脈の中でも房室ブロックや脚ブロックは刺激伝導系に途絶により生じるが、徐脈のみならず右室と左室の収縮の非同期に伴い心機能の低下を来たす。これらの治療に対しては機械式ペースメーカ移植が適応となるが（非特許文献１等参照）、特に右室と左室の収縮の非同期に対してはｄｕａｌ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｐａｃｉｎｇによる心再同期療法が用いられる。しかし、心再同期療法の効果は刺激伝導系の障害の程度に依存するために、脚ブロックや心室内伝導障害を修正する新たな治療が必要となる。また、抗癌剤（パクリタキセル等）は刺激伝導系を障害し心不全を起こすため、事前に刺激伝導系に対する心毒性評価が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】奥村謙，他：不整脈の非薬物治療ガイドライン（２０１１年改訂版）．循環器病の診断と治療に関するガイドライン（２０１０  年度合同研究班報告）．日本循環器学会，他編．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本出願は未だ根本的な治療法の無い房室ブロックや心室内伝導障害を修正できる新たな刺激伝導系細胞が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、幹細胞由来のＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性である細胞がプルキンジェ繊維細胞様細胞であることを見出し、本発明を完成させるに至った。ＨＣＮ４は洞結節細胞のマーカーであり、Ｍｌｃ２ｖは心室筋マーカーであるために、これら二つのマーカーを持つ細胞は、洞結節と心室筋の両方の性質を有する細胞ということとなる。理論上は作業心筋とペースメーカ細胞の中間体細胞が存在するとは考えられず、本発明での知見は意外なものであった。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のものを提供する：
（１）ＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性である、プルキンジェ繊維細胞様細胞。
（２）幹細胞由来である（１）記載の細胞。
（３）ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞由来である（２）記載の細胞。
（４）下記工程：
（ａ）ＨＣＮ４遺伝子を導入した幹細胞を心筋細胞に分化させ、
（ｂ）工程（ａ）で得られた分化細胞のなかからＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性細胞を採取する
を含む、プルキンジェ繊維細胞様細胞の製造方法。
（５）幹細胞がｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞である（４）記載の方法。
（６）幹細胞が、１の標識遺伝子が作動可能に連結されたＨＣＮ４遺伝子および別の標識遺伝子が作動可能に連結されたＭｌｃ２ｖ遺伝子を含むものである、（５）または（６）記載の方法。
（７）ＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性細胞の採取がフローサイトメトリーにより行われる、（４）〜（６）のいずれか記載の方法。
（８）１の標識遺伝子が作動可能に連結されたＨＣＮ４遺伝子および別の標識遺伝子が作動可能に連結されたＭｌｃ２ｖ遺伝子を含む幹細胞。
（９）ＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性であるプルキンジェ繊維細胞様細胞を含む、房室ブロックおよび／または心室内伝導障害を治療するための移植片。
（１０）ＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性であるプルキンジェ繊維細胞様細胞を移植に適した形状に成型することを含む、房室ブロックおよび／または心室内伝導障害を治療するための移植片の製造方法。
（１１）ＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性であるプルキンジェ繊維細胞様細胞に試験薬剤を添加し、試験薬剤添加後の細胞の特性を調べることを含む、刺激伝導系に影響を及ぼす薬剤の検出方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性であるプルキンジェ繊維細胞様細胞（以下、「本発明のプルキンジェ繊維細胞様細胞」または「本発明の細胞」と略称することがある）を移植することにより、根本的な治療法がなかった房室ブロックや心室内伝導障害を修正することができる。さらに、本発明の細胞を用いて、刺激伝導系を障害する心毒性を評価することができるので、本発明の細胞は創薬や安全性試験にも利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ＨＣＮ４−ＢＡＣベクターの改変および幹細胞への導入を模式的に示す。
【図２】図２は、幹細胞のＭｌｃ２ｖ遺伝子座へのｍｃｈｅｒｒｙの導入を模式的に示す。
【図３】図３は、ｐＣＡＧ−ＣｒｅによるｐＰＧＫ−ｎｅｏ−ｐｏｌｙＡカセットの除去を模式的に示す。
【図４】図４は、ヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化誘導法を模式的に示す。
【図５】図５は、ＣＦＰ（ＨＣＮ４）とｍＣｈｅｒｒｙ（ＭＬＣ２ｖ）の心筋分化過程における経時的発現を示す。
【図６】図６は、フローサイトメトリーを用いた本発明の細胞の選択的分取の結果を示す。フラクション１はＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖともに陰性の群、フラクション２はＨＣＮ４単一陽性の群、フラクション３はＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖともに陽性の群、フラクション４はＭｌｃ２ｖ単一陽性の群を示す。
【図７】図７は、ＨＣＮ４単一陽性細胞（上）と本発明の細胞（下）の活動電位持続時間を調べた結果を示すグラフである。グラフの横軸は時間（１目盛りは２０ｍｓｅｃ）を、縦軸は膜電位（１目盛りは３．２５ｍＶ）を示す。
【図８】図８は、ｉＣｅｌｌ  ＣＭ（ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞）（●）、ヒトｉＰＳ細胞由来のＨＣＮ４単一陽性細胞（洞結節細胞）（▲）およびｉＰＳ細胞由来の本発明の細胞（■）のＮａ電流特性を示すグラフである。
【図９】図９は、ｉＣｅｌｌ  ＣＭ（ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞）（●）、ヒトｉＰＳ細胞由来のＨＣＮ４単一陽性細胞（洞結節細胞）（▲）およびｉＰＳ細胞由来の本発明の細胞（■）のＣａ電流特性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ｉＣｅｌｌ  ＣＭ（ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞）（●）、ヒトｉＰＳ細胞由来のＨＣＮ４単一陽性細胞（洞結節細胞）（▲）およびｉＰＳ細胞由来の本発明の細胞（■）のｈＥＲＧ電流特性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、１の態様において、洞結節細胞のマーカーおよび心室筋細胞のマーカーを一緒に発現するプルキンジェ繊維細胞様細胞を提供する。この態様の一具体例において、本発明は、ＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性であるプルキンジェ繊維細胞様細胞を提供する。
【００１０】
ＨＣＮ４は洞結節細胞のマーカーであり、Ｍｌｃ２ｖは心室筋細胞のマーカーである。本発明者らは、幹細胞からこれら２つのマーカーを一緒に発現するプルキンジェ繊維細胞様細胞の製造に初めて成功した。
【００１１】
刺激伝導系は、洞結節に生じた電気的興奮を心房から心室に伝える筋線維束である。刺激伝導系は、洞房結節、房室結節、ヒス束およびプルキンジェ線維を含む。刺激伝導系細胞は刺激伝導系を構成する細胞である。刺激伝導系細胞様細胞は刺激伝導系細胞に類似した性質を有する細胞をいう。
【００１２】
プルキンジェ繊維は左脚と右脚の先にある分枝した繊維状の部位である。プルキンジェ繊維細胞はプルキンジェ繊維を構成する細胞であり、その伝導速度は約２〜約４ｍ／秒と極めて早い。本明細書において、プルキンジェ繊維細胞様細胞はプルキンジェ繊維細胞に類似した性質を有する細胞をいう。本発明のプルキンジェ繊維細胞様細胞は、伝導速度が約２〜約４ｍ／秒であることによって特徴づけられてもよい。また、プルキンジェ繊維細胞様細胞は、ナトリウムチャンネル密度が高いこと、あるいは活動電位持続時間が長いことによって特徴づけられてもよい。本発明のプルキンジェ繊維細胞様細胞は、活動電位持続時間が心筋型細胞のそれよりも長く、約４００ｍｓｅｃまたはそれ以上であると定義してもよい。
【００１３】
本発明のプルキンジェ繊維細胞様細胞は幹細胞由来であってもよい。幹細胞は自己複製能と多分化能を持つ細胞と定義される。幹細胞は公知であり、様々な種類のものがある。本発明にて用いる好ましい幹細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、あるいは始原生殖細胞由来万能細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
本発明は、さらなる態様において下記方法を提供する。
下記工程：
（ａ）幹細胞を心筋細胞に分化させ、
（ｂ）工程（ａ）で得られた分化細胞のなかから洞結節細胞のマーカーおよび心室筋細胞のマーカーに関して二重陽性である細胞を採取する
を含む、プルキンジェ繊維細胞様細胞の製造方法。
この態様の一具体例において、本発明は、下記工程：
（ａ）幹細胞を心筋細胞に分化させ、
（ｂ）工程（ａ）で得られた分化細胞のなかからＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性細胞を採取する
を含む、プルキンジェ繊維細胞様細胞の製造方法。
【００１５】
上記方法において、幹細胞としてＨＣＮ４遺伝子を外部から導入したものを用いることが好ましい。したがって、本発明は下記方法を提供する。
下記工程：
（ａ）ＨＣＮ４遺伝子を導入した幹細胞を心筋細胞に分化させ、
（ｂ）工程（ａ）で得られた分化細胞のなかからＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性細胞を採取する
を含む、プルキンジェ繊維細胞様細胞の製造方法。
【００１６】
本発明の方法の工程（ａ）において、ＨＣＮ４遺伝子を導入した幹細胞を心筋細胞に分化させる。この工程で用いる幹細胞は、いずれの方法でＨＣＮ４遺伝子が導入されたものであってもよい。ＨＣＮ４遺伝子を幹細胞に導入する方法は当業者によく知られており、ＣａＣｌ２法、リポフェクタミン法、ヌクレオフェクター法、電気せん孔法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、レトロウイルスベクターを用いる方法、アデノウイルスベクターを用いる方法、ＨＡＣベクターを用いる方法などが例示されるが、これらの方法に限定されない。
【００１７】
選別可能な標識をコードする遺伝子（標識遺伝子）がＨＣＮ４遺伝子に作動可能に連結されていることが好ましい。ＨＣＮ４遺伝子への標識遺伝子の連結方法は公知である。標識を付すことによって、ＨＣＮ４遺伝子を発現している細胞を容易に選別・取得することができる。標識は様々なものが公知であり、外部から検出あるいは結合が可能なものが好ましく、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｍｃｈｅｒｒｙなどの蛍光タンパク質、抗体の結合部位、薬剤耐性などが例示されるが、これらに限定されない。作動可能に連結とは、目的遺伝子の発現に伴って標識遺伝子も発現するように、これらの遺伝子が連結されていることをいう。これらの遺伝子は直接連結されていてもよく、１個以上の塩基を含む配列を介して連結されていてもよい。
【００１８】
幹細胞を心筋細胞へと分化誘導させるための手段・方法は当業者が適宜選択して採用することができ、そのための培地成分、培養条件も公知のものを採用、あるいは適宜改変することができる。  ｉＰＳ細胞を心筋細胞に分化させる方法としては、例えばMiki K. et al., Cell Stem Cell. 2015 Jun 4;16(6):699-711に記載の方法、Yamauchi et al, Genes Cells. 2010 Dec; 15(12): 1216-27に記載の方法が挙げられるが、これらに限定されない。幹細胞を心筋細胞に分化させるための市販キットを用いてもよい。
【００１９】
本発明の方法の工程（ｂ）において、工程（ａ）で得られた分化細胞のなかからＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性細胞を採取する。目的細胞の採取を効率良く行うために、工程（ａ）において、１の標識遺伝子が作動可能に連結されたＨＣＮ４遺伝子および別の標識遺伝子（すなわちＨＣＮ４遺伝子に連結されているのとは異なる標識遺伝子）が作動可能に連結されたＭｌｃ２ｖ遺伝子を含む幹細胞を心筋細胞に分化させることが好ましい。Ｍｌｃ２ｖ遺伝子への標識遺伝子の連結方法は公知である。例えば、ゲノム編集を用いて幹細胞中のＭｌｃ２ｖ遺伝子座に標識遺伝子を導入することにより連結を行ってもよい。
【００２０】
ＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性細胞は、公知の様々な方法を用いて採取することができる。好ましくは、セルソーターを用いるフローサイトメトリーによって細胞を採取する。フローサイトメトリーを行う際に、ＨＣＮ４遺伝子およびＭｌｃ２ｖ遺伝子に付した標識を利用することができる。
【００２１】
本発明の上記方法によりＨＣＮ４およびＭｌｃ２ｖ二重陽性細胞を採取した後、必要数の細胞を得るために細胞を培養してもよい。
【００２２】
本発明は、もう１つの態様において、１の標識遺伝子が作動可能に連結されたＨＣＮ４遺伝子および別の標識遺伝子が作動可能に連結されたＭｌｃ２ｖ遺伝子を含む幹細胞を提供する。このような幹細胞を心筋細胞に分化させた場合、本発明の細胞を効率良く採取することができる。幹細胞としてはｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞が好ましい。このような幹細胞は、（１）１の標識遺伝子が作動可能に連結されたＨＣＮ４遺伝子を幹細胞に導入すること、および（２）幹細胞中のＭｌｃ２ｖ遺伝子座に別の標識遺伝子を導入することによって得てもよい。なお、工程（１）、（２）のどちらを先に行ってもよい。
【００２３】
本発明は、さらにもう１つの態様において、本発明の細胞を含む、房室ブロックおよび／または心室内伝導障害を治療するための移植片を提供する。本発明の移植片を用いて、根本的な治療法がなかった房室ブロックや心室内伝導障害を修正することができる。
【００２４】
本発明は、さらにもう１つの態様において、本発明の細胞を移植に適した形状に成型することを含む、房室ブロックおよび／または心室内伝導障害を治療するための移植片の製造方法を提供する。移植に適した形状は、移植部位の形や疾患の種類によって異なるが、一般的にはシート状または細胞塊であり、好ましくはシート状である。心筋細胞シートの作製方法も公知である。例えばＵｐＣｅｌｌ（登録商標）を用いて心筋細胞を培養することにより心筋シートを得てもよい。
【００２５】
本発明は、さらにもう１つの態様において、本発明の細胞に試験薬剤を添加し、試験薬剤添加後の細胞の特性を調べることを含む、刺激伝導系に影響を及ぼす薬剤の検出方法を提供する。調べる細胞の特性は、電気的特性、生物学的特性、科学的特性、形態などが挙げられるが、これらに限らない。伝導速度、活動電位持続時間、Ｎａチャンネル密度などの電気的特性を調べることが好ましい。通常は、試験薬剤添加後の細胞の特性を、試験薬剤を添加しない細胞の特性と比較する。本発明の方法を用いて、創薬や安全性試験における刺激伝導系を障害する心毒性を評価してもよい。
【００２６】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２７】
（１）細胞株の作製
ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ１株、ＫｈＥＳ３株）あるいはヒトｉＰＳ細胞（４０９Ｂ２株）を用いて、ＨＣＮ４イオンチャネルとＭｌｃ２ｖミオシン軽鎖（ＭＹＬ２）の発現をそれぞれ別々の蛍光タンパク質で可視化できる細胞株の樹立を行った。
【００２８】
（ｉ）ＨＣＮ４の可視化：ＨＣＮ４遺伝子を含むＢＡＣ（Bacterial Artificial Chromosome）ベクター（ＲＰ−１１０５Ａ６）を用いて、ＢＡＣベクター上のＨＣＮ４遺伝子のエクソン１の一部分をＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent protein）緑色蛍光タンパク質あるいはＥＣＦＰ（Enhanced Cyan Fluorescent protein）青色蛍光タンパク質で置き換えた改変ＢＡＣベクター（ＨＣＮ４−ＥＧＦＰ−ＢＡＣ、ＨＣＮ４−ＥＣＦＰ−ＢＡＣ）を作製した（図１）。作製したこれら改変ＢＡＣベクターをヒトＥＳ細胞あるいはヒトｉＰＳ細胞にエレクトロポーレーション法によって、ヒトＥＳ細胞の場合には、ＨＣＮ４−ＥＣＦＰ−ＢＡＣベクターを、ヒトｉＰＳ細胞の場合にはＨＣＮ４−ＥＧＦＰ−ＢＡＣベクターを遺伝子導入した。複数得られた導入細胞株をすべて心筋へと分化誘導し、拍動する心筋でのみＥＧＦＰあるいはＥＣＦＰが強く発現する細胞株を選択することによって、ＨＣＮ４の発現をＥＧＦＰで可視化できるヒトｉＰＳ  細胞株とＥＣＦＰでＨＣＮ４の発現を可視化できるヒトＥＳ細胞株を樹立した。なお、ゲノム上の内在ＨＣＮ４遺伝子への標識遺伝子（例えば蛍光タンパク質をコードする遺伝子）の導入によってもＨＣＮ４の発現を可視化できる。
【００２９】
（ｉｉ）Ｍｌｃ２ｖの可視化：上記のＨＣＮ４を可視化できるヒトＥＳ細胞株あるいはヒトｉＰＳ  細胞株に対して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集法によって、内在のＭＬＣ２ｖ遺伝子のエクソン１に、ｍＣｈｅｒｒｙ赤色蛍光タンパク質をノックインした２重改変ヒトＥＳ細胞株あるいは２重改変ヒトｉＰＳ  細胞株を樹立した。図２に示したノックインベクターを用いた。
【００３０】
（ｉｉｉ）薬剤選択カセットの除去：改変ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞株の作製のために、遺伝子導入株の選択のためのネオマイシン耐性遺伝子カセットが組み込まれたベクターを用いている。これらは、蛍光タンパク質がノックインされた近傍の遺伝子（ＨＣＮ４、Ｍｌｃ２ｖ）の発現に影響与える可能性がある。そこで、ＣＲＩＰＲ／Ｃａｓ９法によってＭｌｃ２ｖ遺伝子座にｍＣｈｅｒｒｙをノックインした後、Ｃｒｅ組換え酵素によって（図３−ａ）、ＨＣＮ４−ＥＧ（Ｃ）ＦＰ−ＢＡＣベクターを導入した後、Ｆｌｐｅ組換え酵素処理によって（図３−ｂ）、ゲノムあるいはＢＡＣベクター上からネオマイシン体制遺伝子カッセトを除去した。最終的に作製した二重改変細胞株は、ネオマイシン耐性カセットを含んではいない。
【００３１】
（２）心筋への分化誘導
改変ヒトＥＳ細胞株あるいはヒトｉＰＳ細胞株からの心筋への分化誘導は、Ｙａｍａｕｃｈｉらの方法を最適化し行った（図４：Yamauchi et al, Genes Cells. 2010 Dec; 15(12): 1216-27改変）。この方法は、単層培養とＳｐｈｅｒｅ（細胞凝集塊）形成の２ステップから成り立っている。改変ヒトＥＳ細胞株に由来する刺激伝導系細胞作製のため、ステップ１において、二つのパラメーターを最適化した。単層培養の日数を５日から４日へ、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度を６ｍＭから  ３ｍＭへと変更した。
【００３２】
ヒトＥＳ細胞の場合には、分化誘導後約１ケ月で、ＥＣＦＰとｍＣｈｅｒｒｙの二重陽性細胞株が生じてきた（図５）。これらの二重陽性細胞をセルソーターで選択的に分取すると、それらの細胞はＨＣＮ４とＭｌｃ２ｖが発現しており、刺激伝導系細胞と同等の電気生理学的特性を示した。また、二重陽性細胞は、その後数か月にわたって検出することができ、刺激伝導系細胞と同等の細胞を選択的に分取することができた。ヒトｉＰＳ細胞株の場合には、二重陽性細胞が出現する日時が少し遅れ、約４５日目前後から検出することができた。
【００３３】
（３）セルソーターによる刺激伝導系細胞の分取
前述の改変ヒトｉＰＳ細胞を心筋分化誘導後２か月の時点で、細胞を酵素処理により単一細胞に分離し、セルソーターを用いて、ＨＣＮ４の遺伝子発現をＧＦＰの蛍光で、Ｍｌｃ２ｖの遺伝子発現をｍｃｈｅｒｒｙの蛍光で識別し、ＨＣＮ４−ＧＦＰ／Ｍｌｃ２ｖ−ｍｃｈｅｒｒｙ二重陽性細胞（本発明の細胞）を選別採取した。
【００３４】
図１に示すように、心筋分化誘導後２か月の時点で、本発明の細胞塊は緑色のＨＣＮ４−ＧＦＰシグナルと赤色のＭｌｃ２ｖ−ｍｃｈｅｒｒｙシグナルを発現していた。細胞塊を酵素処理により単一細胞に分離し、セルソーターを用いて、ＨＣＮ４の遺伝子発現をＧＦＰの蛍光で、Ｍｌｃ２ｖの遺伝子発現をｍｃｈｅｒｒｙの蛍光で識別し、本発明の細胞（図１のフローサイトメーター上の３の領域）を選別採取した。
【００３５】
（４）電気生理学的解析
本発明の細胞をセルソーターで分取後に円形のカバーグラス上で１日培養し、カバーグラス上に接着させた。既報のパッチクランプ法により活動電位とイオンチャネル活性を測定した。細胞内液として、１３０ｍＭグルタミン酸カリウム、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＮａＯＨ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および５ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ（ＫＯＨにてｐＨ  ７．３に合わせた）の組成の液を使用した。細胞外液として、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．３３ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および５ｍＭグルコース（ＮａＯＨにてｐＨ  ７．４ｍに合わせた）の組成を使用した。
【００３６】
（ｉ）本発明の細胞の活動電位特性
各細胞の自動能性活動電位波形を図２示す。ＨＣＮ４−ＧＦＰ単独陽性細胞の自動能活動電位は洞結節様であったが（上段）、本発明の細胞は活動電位持続時間が長く、プルキンジェ線維様の活動電位を示した（下段）。
【００３７】
（ｉｉ）本発明の細胞のＮａ電流特性
各細胞のＮａ電流特性を示す電流−電圧関係を図３に示す。ＨＣＮ４−ＧＦＰ単独陽性細胞（ｉＰＳ細胞由来の洞結節細胞）やｉＣｅｌｌ  ＣＭ（ｉＰＳ細胞由来の心室筋細胞）と比較して、本発明の細胞のＮａチャネル密度が高いことが示され、この特性は刺激伝導系細胞であるプルキンジェ線維細胞の特性に類似していた。
【００３８】
（ｉｉｉ）本発明の細胞のＣａ電流ならびにｈＥＲＧ電流特性
各細胞のＣａ電流特性を示す電流−電圧関係を図４に、各細胞のｈＥＲＧ電流特性を示す電流−電圧関係を図５に示す。ＨＣＮ４−ＧＦＰ単独陽性細胞（ｉＰＳ細胞由来の洞結節細胞）やｉＣｅｌｌ  ＣＭ（ｉＰＳ細胞由来の心室筋細胞）の特性と、本発明の細胞の特性に大きな差はなかった。以上の結果も、本発明の細胞の特性が刺激伝導系細胞であるプルキンジェ線維細胞の特性に類似していることを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の細胞は、心疾患の治療のための移植用細胞および移植片の製造において有用である。さらに本発明の細胞は、創薬や安全性試験などにおいても有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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