(57)【要約】【課題】細菌から放出されるメンブレンヴェシクル(membrane vesicle)の産生量を増大させる方法を提供する。【解決手段】細菌の培養時にグリシンを添加することにより、細菌から放出されるメンブレンヴェシクル(membrane vesicle)の産生量を増大させる。グリシンは、細菌の培養液における濃度が1.0〜1.2 wt％である。細菌は、大腸菌、カンピロバクター・ジェジュニ、ラクトバチルス種、ナイセリア・ゴノレア、レジュネラ・ニューモフィラ、サルモネラ種、シゲラ種等である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の培養時にグリシンを添加することにより、前記細菌から放出されるメンブレンヴェシクル(membrane vesicle)の産生量を増大させることを特徴とする、メンブレンヴェシクルの産生増大方法。
【請求項２】
前記グリシンは、細菌の培養液における濃度が1.0〜1.2 wt％であることを特徴とする請求項１に記載のメンブレンヴェシクルの産生増大方法。
【請求項３】
前記細菌は、大腸菌、カンピロバクター・ジェジュニ、ラクトバチルス種、ナイセリア・ゴノレア、レジュネラ・ニューモフィラ、サルモネラ種、シゲラ種、及び、シュードモナス・エルギノーサからなる群から選択される、請求項１又は２に記載のメンブレンヴェシクルの産生増大方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌から放出されるメンブレンヴェシクル(membrane vesicle)の産生量を増大させる、メンブレンヴェシクルの産生増大方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌は、細胞外へメンブレンヴェシクル(以下、MV:membrane vesicleと称することがある。)と呼ばれるナノサイズの小胞を放出する。歴史的には、グラム陰性で偏性嫌気性非芽胞形成桿菌として主要な腸内細菌であるバクテロイデスで類似する構造が電顕写真で1963年に報告された(非特許文献１)が、近年はグラム陰性のみならずグラム陽性菌、すなわち全ての細菌がメンブレンヴェシクルを産生することが明らかとなっている(非特許文献２)。また、モデル生物である大腸菌でも1966年にはリジン要求性変異株をリジン制限下で培養したときの異常形態として報告されている(非特許文献３)。
【０００３】
メンブレンヴェシクルは細胞膜由来のリン脂質や膜タンパク質、LPS等で構成されるほか、核酸や酵素等の様々な物質を含有するため、多面的な機能を有し、新規ワクチン抗原のような応用展開も期待されている。例えば、ターゲットタンパク質を抗原として載せた大腸菌のOMVを用いた簡便なワクチン製造として利用されている(非特許文献４)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】H.A.Bladen & J.F.Waters:J.Bacteriol., 86,1339(1963).
【非特許文献２】Jain S, Pillai J. Int J Nanomedicin. 1529541664367_0 12:6329-6341 (2017)
【非特許文献３】K.W.Knox,M.Vesk & E. Work:J.Bacteriol.,92,1206(1966).
【非特許文献４】D.J.Chen,N.Osterrieder,S.M.Metzger,E.Buckles,A.M. Doody,M.P.DeLisa & D.Putnam:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,107,3099(2010).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、細菌から放出されるメンブレンヴェシクル(membrane vesicle)の産生量を増大させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明にかかるメンブレンヴェシクルの産生増大方法は、細菌の培養時にグリシンを添加することにより、前記細菌から放出されるメンブレンヴェシクル(membrane vesicle)の産生量を増大させることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、簡易な手法により、細菌から放出されるメンブレンヴェシクル(membrane vesicle)の産生量を増大させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】TEMによるメンブレンヴェシクルの観察結果の写真図であり、そのうち(A)は既存の大腸菌培養の場合であり、(B)は本実施例のメンブレンヴェシクルの産生増大方法を適用した大腸菌培養の場合である。
【図２】各グリシン添加濃度の場合における超遠心分離した大腸菌のメンブレンヴェシクルのペレットの写真図である。
【図３】各グリシン添加濃度の場合における超遠心分離した大腸菌のメンブレンヴェシクルのBradford法によるタンパク質定量の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１０】
本発明にかかるメンブレンヴェシクルの産生増大方法は、細菌の培養時にグリシンを添加することにより、細菌から放出されるメンブレンヴェシクル(membrane vesicle)の産生量を増大させる。
【００１１】
本発明において、メンブレンヴェシクルは、細菌の表層構造が、酵母に見られる出芽のような形式で外側に隆起して、袋状の塊となって細胞外に放出される小胞、または菌体の破裂と同時に形成される小胞を意味する。
【００１２】
細菌が産生するメンブレンヴェシクルの形状は、例外として扁平あるいは棒状の形状が報告されているが、原則として球状である。
【００１３】
細菌が産生するメンブレンヴェシクルのサイズは、通常では直径数十〜数百ナノメートルといわれるが、後述する実施例に示されているように本発明にかかるメンブレンヴェシクルの産生増大方法を適用することによってもほぼ同様のサイズのものが得られる。
【００１４】
細菌の培養液に添加されるグリシンの量は、メンブレンヴェシクルの産生増大の観点から適宜設定され、特に限定されるものではないが、例えば細菌の培養液における濃度が1.0〜1.2 wt％とすることが好ましい。グリシンの量が1.0 wt％よりも少ないと細菌に作用する物理量が不足する場合があり、一方で、グリシンの量が1.2 wt％よりも多いとペプチドグリカンに含まれるアラニンと競合し、グリシンが代わりに組込まれることに起因するグリシンの生育抑制作用が生じうるからである。
【００１５】
細菌は、特に限定されるものではないが、例えばグラム陰性細菌であり、具体的には、大腸菌、カンピロバクター・ジェジュニ、ラクトバチルス種、ナイセリア・ゴノレア、レジュネラ・ニューモフィラ、サルモネラ種、シゲラ種、及び、シュードモナス・エルギノーサからなる群から選択され、好ましくは大腸菌である。
【実施例】
【００１６】
1.大腸菌の培養
1-1.本実施例のメンブレンヴェシクルの産生増大方法を適用した大腸菌培養
白金耳の先端を大腸菌Nissle 1917 ΔflhD株の溶液につけ、プレート培地の表面に線を描くように塗り、その後プレートの蓋をしめて37℃で一晩培養することにより画線培養を行い、大腸菌コロニーを形成させた。なお、遺伝子改変大腸菌としたのは、ヴェシクル画分には鞭毛が多量に混在するため、鞭毛を形成する遺伝子カスケードの上流にあるflhDを欠損させることで鞭毛非発現株を作製し、より純度の高いヴェシクル調製を可能にするためである。
【００１７】
15 mL遠心チューブに2.5 mLの液体LB培地を無菌的に分注した。滅菌した白金耳の先端を、画線培養したプレート上の一つの大腸菌コロニーに接触させた。15 mL遠心チューブに分注した液体LB培地に、大腸菌コロニーに接触させた白金耳の先端を軽く浸した。更に培養液1.0wt％のグリシンを添加した。これをウォーターバスを用いて37℃で130rpmにて振とうさせながら一晩インキュベーションした。
【００１８】
1-2.既存の大腸菌培養
上記の1-1において、1.0wt％のグリシンを添加しない以外は同様にして大腸菌培養を行った。
【００１９】
2.メンブレンヴェシクルの調製及び分析
本実施例のメンブレンヴェシクルの産生増大方法を適用した大腸菌培養と、既存の大腸菌培養とにおいて、培養上清をフィルトレーション後、大腸菌のメンブレンヴェシクルを超遠心分離することにより調製した。調製したメンブレンヴェシクルについてTEM(透過型電子顕微鏡)による観察を行った。大腸菌の遺伝子破壊はDatsenko and Wannerの方法(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000)に従った。図１は、TEMによるメンブレンヴェシクルの観察結果の写真図であり、そのうち(A)は既存の大腸菌培養の場合であり、(B)は本実施例のメンブレンヴェシクルの産生増大方法を適用した大腸菌培養の場合である。
【００２０】
図１に示されているように、本実施例のメンブレンヴェシクルの産生増大方法を適用した大腸菌培養の場合、超遠心後に得られたメンブレンヴェシクル画分のペレットが顕著に大きくなったことが目視でも判別できた。またグリシン添加によりえられたメンブレンヴェシクルは通常得られるメンブレンヴェシクルとぼぼ同様のサイズ(直径、数十から数百nm)と形態(球形)を維持しており、明瞭な細胞のデブリスも認められなかった。
【００２１】
また、調製したメンブレンヴェシクルについてタンパク質反応性の色素を使用して595 nmで吸光度を測定する方法すなわち、Bradford法によるタンパク質定量を行った。本実施例のメンブレンヴェシクルの産生増大方法を適用した大腸菌培養の場合、グリシン添加区のメンブレンヴェシクルのタンパク質量は、既存の大腸菌培養の未添加区のメンブレンヴェシクルのタンパク質量と比較して、相対的に40〜70倍増大していた。
【００２２】
3.グリシン添加量の検討
上記の1-1において、1.0wt％のグリシンを添加することなく、0wt％のグリシン添加、0.5wt％のグリシンを添加、1.2wt％のグリシンを添加、1.5wt％のグリシン添加、又は、2.0wt％のグリシン添加を行った。
【００２３】
そして、上記の1-1において、1.0wt％のグリシンを添加することなく、0wt％のグリシン添加、0.5wt％のグリシンを添加、1.2wt％のグリシンを添加、1.5wt％のグリシン添加、又は、2.0wt％のグリシン添加を行った場合と、上記の1-1に示した1.0wt％のグリシンを添加した場合とにおいて、それぞれ、培養上清をフィルトレーション後、大腸菌のメンブレンヴェシクルを超遠心分離することにより調製した。図２は、各グリシン添加濃度の場合における超遠心分離した大腸菌のメンブレンヴェシクルのペレットの写真図である。図２に示されるように、グリシンを細菌の培養液へ1.0〜1.2 wt％添加した場合に、メンブレンヴェシクルの産生量が特に増大することが示された。
【００２４】
図３は、各グリシン添加濃度の場合における超遠心分離した大腸菌のメンブレンヴェシクルのBradford法によるタンパク質量を示す図である。図３に示されるように、グリシンを細菌の培養液へ1.0〜1.2 wt％添加した場合に、メンブレンヴェシクルのタンパク質量が特に増大することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
ワクチン、がん治療、免疫療法に用いられる医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品の製造等に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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