(57)【要約】【課題】自然発生型の正常眼圧緑内障の有用なモデルである緑内障モデル、及び臨床予見性に優れた、評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防及び治療効果の評価方法の提供。【解決手段】ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物からなる正常眼圧緑内障モデルである。本遺伝子が全身性に、またはアストロサイト／ミューラー細胞選択的に欠損した非ヒト動物からなるモデルである。また、前記正常眼圧緑内障モデルに対し、評価対象薬剤を投与する工程と、前記評価対象薬剤を投与した後の前記正常眼圧緑内障モデルについて、網膜神経節細胞の脱落に対する抑制作用が、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に正常眼圧緑内障の予防乃至治療効果があると評価する工程とを含む評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物であって、
前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物の眼圧は、前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損していない該非ヒト動物の眼圧に対し有意な差がなく、
前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物は、網膜神経節細胞の少なくとも一部が脱落しているまたは傷害されていることを特徴とする正常眼圧緑内障モデル。
【請求項２】
前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物は、アストロサイト及びミューラー細胞の前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損している請求項１に記載の正常眼圧緑内障モデル。
【請求項３】
前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物は、前記ＡＢＣＡ１遺伝子が全身性に欠損している請求項１に記載の正常眼圧緑内障モデル。
【請求項４】
前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物は、加齢に伴い網膜神経節細胞の少なくとも一部が脱落するまたは傷害される請求項１から３のいずれか一項に記載の正常眼圧緑内障モデル。
【請求項５】
前記非ヒト動物が、マウスである請求項１から４のいずれか一項に記載の正常眼圧緑内障モデル。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載された正常眼圧緑内障モデルに対し、評価対象薬剤を投与する工程と、
前記評価対象薬剤を投与した後の前記正常眼圧緑内障モデルについて、
（１）眼圧の低下、
（２）網膜神経節細胞の神経保護作用、
（３）網膜神経節細胞以外の網膜細胞の保護作用、
（４）アストロサイト／ミューラー細胞による網膜神経節細胞の神経軸索保護作用、
（５）視覚伝達系の上位リレー神経細胞の保護作用、及び
（６）大脳皮質視覚野神経細胞乃至周辺細胞の保護作用
の少なくともいずれかが、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に正常眼圧緑内障の予防乃至治療効果があると評価する工程とを含むことを特徴とする評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法。
【請求項７】
前記評価対象薬剤の投与が、眼局所投与、経口投与、及び静脈内投与のいずれかである請求項６に記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法。
【請求項８】
前記眼圧が、眼圧計により測定される請求項６から７のいずれかに記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法。
【請求項９】
前記網膜神経節細胞の神経保護作用が、前記網膜神経節細胞の細胞死の抑制である請求項６から８のいずれか一項に記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法。
【請求項１０】
前記網膜神経節細胞の細胞死が、光干渉断層計により測定される請求項９に記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法。
【請求項１１】
前記網膜神経節細胞の細胞死が、前記網膜神経節細胞の細胞数の減少により測定される請求項９から１０のいずれかに記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法。
【請求項１２】
前記網膜神経節細胞の細胞死が、前記網膜神経節細胞における特異的マーカーの網膜内発現量の減少により測定される請求項９から１１のいずれか一項に記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法。
【請求項１３】
前記評価対象薬剤が、副交感神経刺激薬、抗コリンエステラーゼ薬、プロスタグランジン製剤、α１遮断薬、α２刺激薬、炭酸脱水酵素阻害剤、β遮断薬、ＲＯＣＫ阻害薬、自律神経作動薬、カルシウムチャネル拮抗薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、及びフラボノイド類の少なくともいずれかである請求項６から１０のいずれかに記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正常眼圧緑内障モデル、及び評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑内障は、本邦における失明原因第一位の疾患であり、４０歳以上の約５．０％が罹患している（非特許文献１参照）。緑内障の有病率は年齢とともに増加するが、症状の進行が遅いため、緑内障であることを気づかない人も多い。一般に、緑内障とは、眼内の静水圧（眼圧）が高くなることで視神経が圧迫されて傷害を受ける。日本人の平均眼圧は約１４．５ｍｍＨｇで、標準偏差２．５ｍｍＨｇの２倍よりも高い場合に高眼圧と診断される。慢性的な高眼圧の負荷によって視神経が圧迫され続けると次第に視覚伝達機能が不全となり、視野が欠損する。症状が進行すると最終的に失明に至る（特許文献１参照）。
【０００３】
緑内障には、原発開放隅角緑内障、原発閉塞隅角緑内障、続発緑内障、発達緑内障などがあるが、日本人の場合は約８割が原発開放隅角緑内障（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｏｐｅｎ  Ａｎｇｌｅ  Ｇｌａｕｃｏｍａ，ＰＯＡＧ）である。ＰＯＡＧは、解剖学的な所見として、隅角が閉塞していないにも関わらず、緑内障に特徴的な形態的症状（視神経乳頭辺縁部の菲薄化、網膜神経線維層欠損など）や視野欠損が現れる。ＰＯＡＧには、その眼圧が正常値内（日本人の場合１０．０ｍｍＨｇ〜２１．０ｍｍＨｇ）であっても上記緑内障症状を呈する正常眼圧緑内障（Ｎｏｒｍａｌ  Ｔｅｎｓｉｏｎ  Ｇｌａｕｃｏｍａ，ＮＴＧ）が約９０％含まれる（非特許文献１参照）。その後の疫学調査から、ＰＯＡＧのうちＮＴＧに分類される患者の割合は、全世界的に見ても、非常に高い事が明らかとなっている。例えば、米国ラテンアメリカ系人種では８０〜８２％（非特許文献２〜３参照）、豪国白人で７４〜７６．２％（非特許文献４〜５参照）、タンザニア黒人で７５％（非特許文献６参照）、中国で９０％（非特許文献７参照）、韓国で７７％（非特許文献８参照）、インドで５２．３〜８２．２％（非特許文献９〜１０参照）などである。したがって、高眼圧以外の緑内障発症機構の解明が急務であるものの、研究は進んでいない。その理由として、正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）のメカニズムを解析するためのモデル動物が不足している事が挙げられる。
【０００４】
緑内障の自然発症型モデル動物として、現在最も汎用されているのはＤＢＡ／２Ｊマウスであり、前記ＤＢＡ／２Ｊマウスでは加齢に伴って眼圧上昇が生じる（非特許文献１１〜１２参照）。前記ＤＢＡ／２Ｊマウスでは、虹彩の色素細胞が炎症を伴う細胞死を起こし、その細胞破片などが線維柱帯につまることによって眼房水の排出抵抗が増大し、眼圧が上昇し、その機械的負荷によって網膜神経節細胞が傷害されると考えられている。したがって、前記ＤＢＡ／２Ｊマウスは、ヒトにおけるＮＴＧ（ヒトＮＴＧ）の症状を反映していない。
【０００５】
一方、原田らによって報告された自然発症型ＮＴＧモデルマウスとして、ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃａｒｒｉｅｒ  １  （ＥＡＡＣ１）またはｇｌｕｔａｍａｔｅ／ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  （ＧＬＡＳＴ）を欠損するマウスが報告されている（非特許文献１３参照）。ＥＡＡＣ１は網膜神経節細胞を含む網膜神経細胞に発現し、ＧＬＡＳＴはアストロサイト及びミューラー細胞に発現する。これら欠損マウスはいずれも眼圧の上昇は誘導しないが、網膜神経節細胞の脱落及び視覚機能異常を引き起こす。これらのマウスで見られる網膜神経節細胞の脱落はＮＭＤＡ受容体拮抗薬であるｍｅｍａｎｔｉｎｅで抑制される。これらの結果から、ＥＡＡＣ１やＧＬＡＳＴの欠損によって細胞外のグルタミン酸の取り込みが阻害される事で細胞外液中のグルタミン酸濃度が上昇し、このグルタミン酸が網膜神経節細胞に発現するＮＭＤＡ受容体を介して興奮毒性を惹起する事によって、網膜神経節細胞が傷害されると結論づけられた。したがって、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬が正常眼圧緑内障治療薬の有望な標的であると考えられたものの、ｍｅｍａｎｔｉｎｅは緑内障治療薬第三相治験において失敗に終わった（非特許文献１４参照）。つまり、これら欠損マウスの表現型はヒトＮＴＧを正確に反映しておらず、異なる遺伝子を標的としたＮＴＧモデルマウスが必要であった。
【０００６】
以上の点から、ヒトＮＴＧ患者における正常眼圧緑内障症状を反映した、自然発生型の正常眼圧緑内障モデル、及び臨床予見性に優れた、評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防及び治療効果の評価方法の研究開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１７−５１１８１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｉｗａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００４，１１１：１６４１−１６４８．
【非特許文献２】Ｑｕｉｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  ２００１，  １１９：１８１９−１８２６．
【非特許文献３】Ｖａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  ２００４，  １１１：  １１２１−１１３１．
【非特許文献４】Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  １９９６，  １０３：  １６６１−１６６９．
【非特許文献５】Ｗｅｉｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  ２００１，  １０８：  １９６６−１９７２．
【非特許文献６】Ｂｕｈｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＩＯＶＳ  ２０００，  ４１：  ４０−４８．
【非特許文献７】Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ＩＯＶＳ  ２０１１，  ５２：  ８２５０−８２５７．
【非特許文献８】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  ２０１１，  １１８：  １０２４−１０３０．
【非特許文献９】Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  ２００３，  １１０：  １４８４−１４９０．
【非特許文献１０】Ｖｉｊａｙａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  ２００８，  １１５：  ６４８−６５４．
【非特許文献１１】Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．ＩＯＶＳ  １９９８，３９，９５１−９６２
【非特許文献１２】Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｅｔ（２００１）２，１．
【非特許文献１３】Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００７，１１７：１７６３−１７７０．
【非特許文献１４】Ｉｋｏｎｏｍｉｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２００２，１：３８３−３８６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。すなわち、本発明は、自然発生型の正常眼圧緑内障の有用なモデルである緑内障モデル、及び臨床予見性に優れた評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記目的を達成するために、鋭意検討した結果、１）ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  １  （ＡＢＣＡ１）遺伝子を欠損させたマウスでは加齢に伴い網膜神経節細胞が脱落するまたは傷害される事、２）ＡＢＣＡ１の欠損は眼圧の変化を引き起こさないこと、３）ＡＢＣＡ１はアストロサイト及びミューラー細胞に高発現すること、４）アストロサイト及びミューラー細胞選択的にＡＢＣＡ１遺伝子を欠損させたマウスでも加齢に伴い網膜神経節細胞が脱落すること、５）この場合も眼圧の変化を引き起こさないことなど、全身性にまたはアストロサイト及びミューラー細胞選択的にＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物が自然発症型のＮＴＧモデルとして有用であることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１１】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。すなわち、
＜１＞  ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物であって、前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物の眼圧は、前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損していない該非ヒト動物の眼圧に対し有意な差がなく、前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物は、網膜神経節細胞の少なくとも一部が脱落しているまたは傷害されていることを特徴とする正常眼圧緑内障モデルである。
＜２＞  前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物は、アストロサイト及びミューラー細胞の前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損している前記＜１＞に記載の正常眼圧緑内障モデルである。
＜３＞  前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物は、全身性に前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損している前記＜１＞に記載の正常眼圧緑内障モデルである。
＜４＞  前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物は、加齢に伴い網膜神経節細胞の少なくとも一部が脱落するまたは傷害される前記＜１＞から＜３＞のいずれか一項に記載の正常眼圧緑内障モデルである。
＜５＞  前記非ヒト動物が、マウスである前記＜１＞から＜４＞のいずれか一項に記載の正常眼圧緑内障モデルである。
＜６＞  前記＜１＞から＜５＞のいずれか一項に記載された正常眼圧緑内障モデルに対し、評価対象薬剤を投与する工程と、
前記評価対象薬剤を投与した後の前記正常眼圧緑内障モデルについて、
（１）眼圧の低下、
（２）網膜神経節細胞の神経保護作用、
（３）網膜神経節細胞以外の網膜細胞の保護作用、
（４）アストロサイト及びミューラー細胞による網膜神経節細胞の神経軸索保護作用、
（５）視覚伝達系の上位リレー神経細胞の保護作用、及び
（６）大脳皮質視覚野神経細胞乃至周辺細胞の保護作用
の少なくともいずれかが、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に正常眼圧緑内障の予防乃至治療効果があると評価する工程とを含むことを特徴とする評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜７＞  前記評価対象薬剤の投与が、眼局所投与、経口投与、及び静脈内投与のいずれかである前記＜６＞に記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜８＞  前記眼圧が、眼圧計により測定される前記＜６＞から＜７＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜９＞  前記網膜神経節細胞の神経保護作用が、前記網膜神経節細胞の細胞死の抑制である前記＜６＞から＜８＞のいずれか一項に記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１０＞  前記網膜神経節細胞の細胞死が、光干渉断層計により測定される前記＜９＞に記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１１＞  前記網膜神経節細胞の細胞死が、前記網膜神経節細胞の細胞数の減少により測定される前記＜９＞から＜１０＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１２＞  前記網膜神経節細胞の細胞死が、前記網膜神経節細胞における特異的マーカーの網膜内発現量の減少により測定される前記＜９＞から＜１１＞のいずれか一項に記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１３＞  網膜神経節細胞の細胞死が、網膜神経節細胞が蛍光蛋白質で標識された前記正常眼圧緑内障モデル動物において、蛍光シグナルの減少による測定される前記＜９＞から＜１２＞のいずれか一項に記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１４＞  網膜神経節細胞の細胞死が、傷害された網膜神経節細胞の核酸が蛍光分子で標識された前記正常眼圧緑内障モデルにおいて、蛍光シグナルの増加によって測定される前記＜９＞から＜１３＞のいずれか一項に記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１５＞  網膜神経節細胞の神経保護作用が、前記網膜神経節細胞の軸索流の低下抑制である前記＜６＞から＜１４＞のいずれか一項に記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１６＞  網膜神経節細胞の軸索流が、硝子体に注入した順行性軸索輸送マーカーの外側膝状体への輸送効率により測定される前記＜１５＞に記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１７＞  網膜神経節細胞の軸索流が、軸索内における蛍光物質で標識されたミトコンドリアの移動速度により測定される前記＜１５＞から＜１６＞のいずれかに記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１８＞  網膜神経節細胞の軸索流が、前記網膜神経節細胞の軸索における正常軸索マーカー及び障害軸索マーカーの少なくともいずれかの発現量により測定される前記＜１５＞から＜１７＞のいずれか一項に記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜１９＞  大脳皮質視覚野神経細胞乃至周辺細胞の保護作用が、網膜へ一定量の光を照射したときの、大脳皮質視覚野皮下に設置された電極から検出される電位変化により測定される前記＜６＞から＜１８＞のいずれか一項に記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜２０＞  大脳皮質視覚野神経細胞乃至周辺細胞の保護作用が、網膜へ一定量の光を照射したときの、大脳皮質視覚野の神経細胞の活動性により測定される前記＜６＞から＜１９＞のいずれか一項に記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜２１＞  大脳皮質視覚野の神経細胞の活動性が、前記神経細胞内のカルシウムイオン濃度の変化により測定される前記＜２０＞に記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
＜２２＞  評価対象薬剤が、副交感神経刺激薬、抗コリンエステラーゼ薬、プロスタグランジン製剤、α１遮断薬、α２刺激薬、炭酸脱水酵素阻害剤、β遮断薬、ＲＯＣＫ阻害薬、自律神経作動薬、カルシウムチャネル拮抗薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、及びフラボノイド類の少なくともいずれか前記＜６＞から＜２１＞のいずれか一項に記載の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、自然発生型の正常眼圧緑内障の有用なモデルである正常眼圧緑内障モデル、及び臨床予見性に優れた評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａは、実施例１の１２ヶ月齢の野生型マウス網膜ホールマウント標本のＢｒｎ３ａ陽性シグナル（網膜神経節細胞を示す）及びＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＵＴＰ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  （ＴＵＮＥＬ）陽性シグナル（アポトーシスを示す）の代表画像である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実施例１の１２ヶ月齢の全身性ＡＢＣＡ１欠損マウス網膜ホールマウント標本のＢｒｎ３ａ陽性シグナル及びＴＵＮＥＬ陽性シグナルの代表画像である。
【図２Ａ】図２Ａは、図１Ａ及び図１Ｂの１２ヶ月齢の野生型マウス及び全身性ＡＢＣＡ１欠損マウスの網膜ホールマウント標本のＢＲＮ３Ａ陽性細胞数を定量化した結果である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図１Ａ及び図１Ｂの１２ヶ月齢の野生型マウス及び全身性ＡＢＣＡ１欠損マウスの網膜ホールマウント標本のＴＵＮＥＬ陽性細胞数を定量化した結果である。
【図３】図３は、実施例２の３ヶ月齢及び１２ヶ月齢の野生型マウス及び全身性ＡＢＣＡ１欠損マウスの眼圧の計測結果を示す図である。
【図４】図４は、実施例３の磁気細胞分離法による網膜ミクログリア、アストロサイト／ミューラー細胞及びその他の細胞群に発現するＡＢＣＡ１遺伝子の相対発現量を定量的ＰＣＲ法により定量したグラフである。
【図５】図５は、実施例４のアストロサイト及びミューラー細胞選択的に緑色蛍光タンパク質を発現するマウス網膜の凍結切片に対する抗ＡＢＣＡ１抗体による免疫組織化学染色を行った結果を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、実施例５のアストロサイト選択的に緑色蛍光タンパク質を発現するマウスの視神経束の凍結切片に対する抗ＡＢＣＡ１抗体による免疫組織化学染色を行った結果を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図６Ａの部分拡大図である。
【図７Ａ】図７Ａは、実施例６のアストロサイト及びミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウス及び対照群マウスの１２ヶ月齢個体由来網膜のＢｒｎ３ａ陽性細胞を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａに示したＢｒｎ３ａ陽性細胞数を定量化してグラフで示したものである。
【図８Ａ】図８Ａは、実施例６の１２ヶ月齢のアストロサイト及びミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウス及び対照群マウスの網膜ホールマウントサンプルのＴＵＮＥＬ陽性シグナルを示す図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８Ａに示したＴＵＮＥＬ陽性細胞数を定量化してグラフで示したものである。
【図９】図９は、実施例７の対照群（１２ヶ月齢）マウスより調製した網膜切片のＢｒｎ３ａ陽性細胞及びＴＵＮＥＬ陽性の画像と、アストロサイト及びミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウス（１２ヶ月齢）マウスより調製した網膜切片のＢｒｎ３ａ陽性細胞及びＴＵＮＥＬ陽性の画像の図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、実施例８の１８ヶ月齢の対照群マウス及びアストロサイト及びミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスの網膜ホールマウントサンプルのＢｒｎ３ａ陽性細胞数を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図１０Ａに示したＢｒｎ３ａ陽性細胞数を定量化してグラフで示したものである。
【図１１】図１１は、実施例９の３ヶ月齢、６ヶ月齢及び１２ヶ月齢の対照群マウス及びアストロサイト及びミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスの眼圧の測定結果を示す図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、実施例１０の野生型（３ヶ月齢）マウス及び全身性ＡＢＣＡ１欠損マウス（３ヶ月齢）マウスより調製したホールマウント網膜のＢｒｎ３ａ陽性細胞の画像を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、図１２Ａに示したＢｒｎ３ａ陽性細胞数を定量化してグラフで示したものである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、実施例１１のアストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウス（３ヶ月齢）及び対照群（３ヶ月齢）マウスより調製したホールマウント網膜のＢｒｎ３ａ陽性細胞の画像を示す図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、図１３Ａに示したＢｒｎ３ａ陽性細胞数を定量化してグラフで示したものである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、実施例１２のアストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウス（１８ヶ月齢）及び対照群（１８ヶ月齢）マウスより調製したホールマウント網膜のＴＵＮＥＬ陽性細胞の画像を示す図である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、図１４Ａに示したＴＵＮＥＬ陽性細胞数を定量化してグラフで示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。なお、本明細書に記載したすべての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
【００１５】
（緑内障モデル）
本発明の正常眼圧緑内障モデルは、ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物からなることを特徴とする。
本発明のモデルは、ＡＢＣＡ１遺伝子が全身性に、またはアストロサイト及びミューラー細胞選択的に欠損した非ヒト動物からなる。
本発明は、ＡＢＣＡ１遺伝子が全身性に、またはアストロサイト及びミューラー細胞選択的に欠損した非ヒト動物において、ＡＢＣＡ１遺伝子を正常に発現する非ヒト動物と比較して、眼圧が正常であることを特徴とする。
本発明は、ＡＢＣＡ１が欠損した非ヒト動物が、野生型非ヒト動物と比較して正常な眼圧を示す事及び加齢に伴い網膜神経節細胞が脱落するという自然発症型の正常眼圧緑内障症状を呈するという未知の属性を見出し、この属性により、当該ＡＢＣＡ１が欠損した非ヒト動物が、自然発症型の正常眼圧緑内障モデルとしての新たな用途への使用に適することを見いだしたことに基づく発明である。
【００１６】
−ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物−
前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物としては、ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。なお、本明細書においてＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物は、ＡＢＣＡ１遺伝子が無効化された非ヒト動物も含む。
前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物の眼圧は、野生型マウスの眼圧に比べて、統計的に有意な差がなく、加齢に伴い網膜神経節細胞が脱落する、または傷害されるという表現型を示す。
【００１７】
前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物としては、個体そのものであってもよく、前記個体に由来する、器官、組織及び細胞のいずれかの試料であってもよい。
前記器官としては、眼球、脳が好ましい。前記組織としては、毛様体、網膜、視神経、視中枢リレーニューロン脳視覚領域が好ましい。前記細胞としては、毛様体上皮細胞、網膜神経節細胞、眼アストロサイト及びミューラー細胞、脳神経細胞、脳アストロサイトが好ましい。
前記視中枢リレーニューロン脳視覚領域としては、外側膝状体から大脳皮質視覚野をつなぐニューロンであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、外側膝状体、上丘、視床後外側核、大脳皮質視覚野などが挙げられる。
【００１８】
−−ＡＢＣＡ１遺伝子−−
前記ＡＢＣＡ１遺伝子は、ＡＢＣＡ１をコードする遺伝子である。
前記ＡＢＣＡ１は、細胞膜に存在し、細胞内アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）によって駆動する輸送体であるＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  （ＡＢＣ）  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙの１つである。ＡＢＣＡ１はリン脂質やコレステロールを基質とし、細胞膜から細胞外へ輸送する。細胞外へ放出された脂質はアポリポ蛋白であるＡｐｏ−Ａ１やＡｐｏ−Ｅなどと結合し、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）を形成する。
【００１９】
−−非ヒト動物−−
前記非ヒト動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゼブラフィッシュ等の魚類；マウス、ラット、モルモット等の齧歯類動物；ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、チンパンジー、マーモセットなどの、ヒトを除く哺乳類動物が挙げられる。これらの中でも、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、モルモットが好ましく、マウスがより好ましい。
【００２０】
前記全身性にＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物としては、ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損したマウスであることが好ましい。前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損したマウスとしては、遺伝子改変マウスであることが好ましい。前記遺伝子改変マウスは、前記ＡＢＣＡ１遺伝子のコーディングエキソン１７−２２の領域が欠損したマウスである。
【００２１】
前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物のうち、アストロサイト及びミューラー細胞選択的欠損の場合はＡＢＣＡ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスとＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスを交配したダブルトランスジェニックマウスである事が望ましい。
ＡＢＣＡ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスは遺伝子改変マウスであることが好ましい。前記遺伝子改変マウスは、前記ＡＢＣＡ１遺伝子のコーディングエキソン４４−４５及び４６−４７の間にｌｏｘＰ配列を挿入したトランスジェニックマウスである。
ＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスは遺伝子改変マウスであることが好ましい。前記遺伝子改変マウスは、ｈｕｍａｎ  ＧＦＡＰ  ｐｒｏｍｏｔｏｒの下流にＣｒｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを組み込んだトランスジェニックマウスである。
【００２２】
前記ＡＢＣＡ１遺伝子を全身性またはアストロサイト及びミューラー細胞選択的に欠損したマウスは、その眼圧が正常であるにもかかわらず、加齢に伴い網膜神経節細胞が脱落するまたは傷害されることは知られていなかった。
【００２３】
（評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法）
本発明の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法は、本発明の前記正常眼圧緑内障モデルを用いた評価方法であり、薬剤投与工程と、評価工程とを含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
本発明の評価対象薬剤の正常眼圧緑内障予防乃至治療効果の評価方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏの評価方法であってもよく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価方法であってもよい。
【００２４】
＜薬剤投与工程＞
前記薬剤投与工程は、前記正常眼圧緑内障モデルに対し、評価対象薬剤を投与する工程である。
【００２５】
−正常眼圧緑内障モデル−
前記正常眼圧緑内障モデルとしては、本発明の前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物からなる正常眼圧緑内障モデルを好適に用いることができる。
【００２６】
−評価対象薬剤−
前記評価対象薬剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の治療薬、被検薬、及び医薬品候補となる試験化合物のいずれであってもよく、天然化合物及び合成化合物のいずれであってもよい。また、遺伝子薬であってもよい。
また、前記治療薬としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の緑内障治療薬を適宜選択することができ、例えば、副交感神経刺激薬、抗コリンエステラーゼ薬、プロスタグランジン製剤、α１遮断薬、α２刺激薬、炭酸脱水酵素阻害薬、β遮断薬、ＲＯＣＫ阻害剤、自律神経作動薬、カルシウムチャネル拮抗薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、フラボノイド類などが挙げられる。
本発明の前記正常眼圧緑内障モデルは、前述のようにコレステロールやリン脂質の輸送やＨＤＬの生成異常が緑内障症状の原因となる可能性が高い。したがって、既存の緑内障治療薬とは異なる標的を持つ薬剤の評価にも利用できる。
既存の動物モデルであるＤＢＡ２／Ｊでは隅角を介した房水排出経路に異常があるものの、本モデルマウスは眼圧が正常である事から、房水産生及びシュレム管やぶどう膜を介した房水排出経路は正常な機能を保っていると推定される。したがって、房水産生経路と房水排出経路の両方を標的とした治療薬の評価に適している。
【００２７】
−−副交感神経刺激薬−−
前記副交感神経刺激薬としては、例えば、ピロカルピン塩酸塩などが挙げられる。
【００２８】
−−抗コリンエステラーゼ薬−−
前記抗コリンエステラーゼ薬としては、例えば、ジスチグミン臭化物などが挙げられる。
【００２９】
−−プロスタグランジン製剤−−
前記プロスタグランジン製剤としては、例えば、ラタノプロスト、タフルプロスト、ビマトプロスト、トラバプロストなどが挙げられる。
【００３０】
−−α１遮断薬−−
前記α１遮断薬としては、例えば、ブナゾシン塩酸塩などが挙げられる。
【００３１】
−−α２刺激薬−−
前記α２刺激薬としては、例えば、ブリモニジン酒石酸塩などが挙げられる。
【００３２】
−−炭酸脱水酵素阻害剤−−
前記炭酸脱水酵素阻害剤としては、例えば、ドルゾラミド塩酸塩、ブリンゾラミド塩酸塩などが挙げられる。
【００３３】
−−β遮断薬−−
前記β遮断薬としては、例えば、カルテオロール塩酸塩、チモロール塩酸塩、ニプラジロールなどが挙げられる。
【００３４】
−−ＲＯＣＫ阻害剤−−
前記ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、リバスジル塩酸塩などが挙げられる。
【００３５】
−−カルシウムチャネル拮抗薬−−
前記カルシウムチャネル拮抗薬としては、例えば、塩酸イガニジピン、ニルバジピン、ニカルジピン塩酸塩、アゼルニジピンなどが挙げられる。
【００３６】
−−ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬−−
前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬としては、例えば、ロバスタチン、セリバスタチン、アトルバスタチンカルシウム、ロバスタチン、フルバスタチン、エゼチミブなどが挙げられる。
【００３７】
−−フラボノイド類−−
前記フラボノイド類としては、例えば、アントシアニン、カテキン、クエルセチン、クロロゲン酸、コーヒー酸、ターメリック、クルクミンなどが挙げられる。
【００３８】
−−自律神経作動薬−−
前記自律神経作動薬としては、例えば、ジピベフリン塩酸塩などが挙げられる。
【００３９】
前記正常眼圧緑内障モデルに対し、前記評価対象薬剤を投与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて各薬剤に適した投与経路、投与タイミング、投与量、投与スケジュール等の投与条件を適宜選択することができる。
前記投与経路としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、眼局所投与、経口投与、静脈内投与が好ましい。
前記眼局所投与としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、角膜投与（例えば、点眼）、経強膜投与、経硝子体投与などが挙げられる。
前記投与タイミングとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記正常眼圧緑内障モデルは加齢に伴い緑内障症状が進行することから、正常眼圧緑内障症状の進行程度に応じたタイミングで投与することにより、所望の正常眼圧緑内障症状の進行程度における前記評価対象薬剤の評価を行うことができる。
【００４０】
前記投与条件としては、例えば、ラタノプロストを評価する場合は、０．０００５質量％〜０．０５質量％（例えば、０．００５質量％）の生理食塩水の溶液を０．５μＬ〜５０μＬ（例えば、５μＬ）点眼することが好ましい。
【００４１】
或いは、前記評価対象薬剤を投与する方法としては、評価しようとする投与経路、投与タイミング、投与量、投与スケジュール等の投与条件を適宜選択することができる。これにより、各々の薬剤について、適した投与条件を評価し選定することが可能となる。
【００４２】
本発明が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価方法の場合には、前記試料に前記評価対象薬剤を投与すればよい。
前記試料としては、前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物の個体に由来する、器官、組織及び細胞の少なくともいずれかの試料であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、眼球、脳等の器官；毛様体、網膜、視神経、視中枢リレーニューロン脳視覚領野等の組織；毛様体上皮細胞、網膜神経節細胞、網膜神経細胞、眼アストロサイト及びミューラー細胞、脳神経細胞、脳アストロサイト等の細胞などが挙げられる。これらの中でも、毛様体、網膜神経節細胞が好ましい。
本発明が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価方法の場合には、前記評価対象薬剤を投与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の各種条件を選択することができ、例えば、前記評価対象薬剤を含む培地を前記試料に投与すればよい。
【００４３】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価方法として、例えば、網膜神経節細胞の細胞死や軸索の形状などを指標とした評価を行うことができる。
【００４４】
＜評価工程＞
前記評価工程は、前記評価対象薬剤を投与した後の前記正常眼圧緑内障モデルについて、（１）眼圧の低下、（２）網膜神経節細胞の神経保護作用、（３）網膜神経節細胞以外の網膜細胞の保護作用、（４）アストロサイト及びミューラー細胞による網膜神経節細胞の神経軸索保護作用、（５）視覚伝達系の上位リレー神経細胞の保護作用、及び（６）大脳皮質視覚野神経細胞乃至周辺細胞の保護作用の少なくともいずれかが、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に正常眼圧緑内障の予防乃至治療効果があると評価する工程である。
ここで、「有意に観察される」とは、統計的解析により有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
前記統計的解析としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、一元配置分散分析、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅテストによる多重比較検定、マンホイットニーＵテスト、二要因反復分散分析、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔなどが挙げられる。
また、正常眼圧緑内障の予防乃至治療効果とは、正常眼圧緑内障の予防効果、及び正常眼圧緑内障の治療効果の少なくともいずれかを意味する。
【００４５】
前記対照とは、前記評価対象薬剤に代えて、薬剤に用いた溶媒のみを投与したこと以外は、前記正常眼圧緑内障モデルと同様に処理した対照マウスである。
前記溶媒としては、前記評価対象薬剤を溶解することができ、薬理学的に許容されるものであれば、特に制限はなく、使用する前記評価対象薬剤に応じて適宜選択することができ、例えば、生理食塩液などが挙げられる。
【００４６】
−（１）眼圧の低下−
正常眼圧緑内障においても、眼圧を更に低下させる事によって症状の進行を抑制する事ができる。従って、前記評価対象薬剤を投与した後の前記正常眼圧緑内障モデルについて、眼圧の低下が、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に正常眼圧緑内障の予防乃至治療効果があると評価することができる。
【００４７】
前記眼圧の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の測定方法を選択することができ、例えば、接触式眼圧計、非接触式眼圧計等の眼圧計を用いた測定方法；眼内圧を直接測定する方法などが挙げられる。
前記接触式眼圧計としては、例えば、リバウンド式トノメーター、ゴールドマン圧平式眼圧計、パーキンス眼圧計、トノペン眼圧計、眼内埋没型眼圧計、コンタクトレンズ型眼圧計などが挙げられる。前記非接触式眼圧計としては、例えば、空気眼圧計などが挙げられる。
眼内圧を直接測定する方法としては、前房にガラスキャピラリーを挿入し、キャピラリーに接続したｍｅｃｈａｎｏｔｒａｎｓｄｕｃｅｒにて眼圧を計測する方法（Ａｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．ＩＯＶＳ  ２００２）；眼内に埋没型の眼圧センサーを埋め込み、遠隔で眼圧を測定する方法などが挙げられる。
これらの中でも、侵襲性が低く、再現性、及び正確性が良好な点で、リバウンド式トノメーターが好ましい。
【００４８】
−（２）網膜神経節細胞の神経保護作用−
前記評価対象薬剤を投与した後の前記正常眼圧緑内障モデルについて、網膜神経節細胞の神経保護作用が、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に正常眼圧緑内障の予防乃至治療効果があると評価することができる。
【００４９】
前記網膜神経節細胞の神経保護作用としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の指標を選択することができ、例えば、前記網膜神経節細胞の細胞死の抑制、前記網膜神経節細胞の軸索流の低下抑制などが挙げられる。
【００５０】
−−網膜神経節細胞の細胞死−−
前記網膜神経節細胞の細胞死の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の方法を選択することができ、例えば、光干渉断層計により測定する方法、前記網膜神経節細胞の細胞数の減少を測定する方法、前記網膜神経節細胞における特異的マーカーの網膜内発現量の減少により測定する方法、網膜神経節細胞が蛍光蛋白質で標識された前記正常眼圧緑内障モデルにおいて、蛍光シグナルの減少による測定する方法などが挙げられる。
【００５１】
前記光干渉断層計とは、光コヒーレンストモグラフィ（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＯＣＴ）ともいい、赤外光を用いて生体内部の断層画像を高分解能で取得する技術であり、これにより、生体表皮から１ｍｍ〜２ｍｍの深さで、約１０μｍの高空間分解能を有する断層イメージが得られる。この技術を用いて、前記正常眼圧緑内障モデルにおける網膜の神経細胞の層構造を可視化し、神経節細胞層（ＧＣＬ）の面積及び内網状層（ＩＰＬ）の面積と、その他の網膜の神経細胞層（他の層）の面積との比（ＧＣＬ＋ＩＰＬ／他の層）を算出し、前記比の減少を指標として、前記網膜神経節細胞の細胞死を測定することができる。
【００５２】
前記網膜神経節細胞の細胞数は、前記網膜神経節細胞に特異的な細胞特異的マーカーを発現する細胞を指標として測定することができ、例えば、前記緑内障モデルから採取した網膜組織を用いた、免疫組織染色（蛋白質レベルでの検出）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｍＲＮＡレベルでの検出）等により測定する方法などが挙げられる。
前記細胞特異的マーカーとしては、前記網膜神経節細胞に特異的に発現するｍＲＮＡ及び蛋白質であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｂｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ／ＰＯＵ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３Ａ（Ｂｒｎ３ａ）、ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ（ＲＢＰＭＳ）、γ−シヌクレイン（γ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）などが挙げられる。
【００５３】
前記網膜神経節細胞における特異的マーカーの網膜内発現量を測定する方法としては、例えば、前記正常眼圧緑内障モデルから採取した網膜試料を用いた、ウエスタンブロッティング（蛋白質レベルでの検出）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡレベルでの検出；例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）等により測定する方法などが挙げられる。
【００５４】
前記網膜神経節細胞が蛍光蛋白質で標識された前記正常眼圧緑内障モデルにおいて、蛍光シグナルの減少による測定する方法としては、例えば、蛍光蛋白質で標識された前記網膜神経節細胞に特異的な細胞特異的マーカーをコードする遺伝子（例えば、ＧＦＰ−Ｂｒｎ３ａ、Ｔｈｙ１−ＧＦＰなど）が組み込まれた、前記正常眼圧緑内障モデルを用いて前記薬剤投与工程を行い、前記網膜神経節細胞における前記蛍光蛋白質の蛍光シグナルの減少を指標として前記網膜神経節細胞の細胞死を測定する方法などが挙げられる。
【００５５】
−−網膜神経節細胞の軸索流−−
前記網膜神経節細胞の軸索流の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の方法を選択することができ、例えば、硝子体に注入した軸索輸送マーカーの外側膝状体への輸送効率により測定する方法、中脳上丘に注入した軸索輸送マーカーの網膜の神経節細胞層への輸送効率により測定する方法、軸索内における蛍光物質で標識されたミトコンドリアの移動速度により測定する方法、前記網膜神経節細胞の軸索における正常軸索マーカー及び障害軸索マーカーの少なくともいずれかの発現量により測定する方法などが挙げられる。
【００５６】
前記硝子体に注入した軸索輸送マーカーの外側膝状体への輸送効率、又は中脳上丘に注入した軸索輸送マーカーの網膜の神経節細胞層への輸送効率により測定する方法によれば、前記軸索輸送マーカーが、前記網膜神経節細胞の軸索を経由して脳の入力部位である前記外側膝状体又は網膜の神経節細胞層へ輸送されるため、その輸送効率を指標として前記軸索流を測定することができる。
前記軸索輸送マーカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光物質で標識したコレラ毒素βサブユニット、カルボシアニン系蛍光色素（例えば、ＤｉＩ等）、フルオロゴールド、蛍光物質で標識したＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）などが挙げられる。
前記輸送効率としては、例えば、前記網膜神経節細胞の軸索を含む特定の領域における蛍光輝度、網膜組織を破砕した懸濁液における蛍光輝度、前記外側膝状体へ投影した前記網膜神経節細胞の軸索終末１つ当たりの蛍光輝度などにより測定することができる。
【００５７】
前記軸索内における蛍光物質で標識されたミトコンドリアの移動速度により測定する方法としては、例えば、Ｔａｋｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２０１５）等の文献に記載された方法などが挙げられる。
前記ミトコンドリアを標識する蛍光物質としては、例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ等の蛍光蛋白質などが挙げられる。前記ミトコンドリアを蛍光物質で標識する方法としては、例えば、シトクロムＣオキシダーゼＶＩＩＩと蛍光蛋白質との融合蛋白質を発現する発現ベクターを用いた強制発現などが挙げられる。前記ミトコンドリアの移動速度を測定する方法としては、例えば、二光子励起顕微鏡を用いた組織内ミトコンドリアのリアルタイムイメージングなどが挙げられる。
【００５８】
前記網膜神経節細胞の軸索における正常軸索マーカー及び障害軸索マーカーの少なくともいずれかの発現量により測定する方法としては、例えば、前記正常眼圧緑内障モデルから採取した網膜試料を用いた、ウエスタンブロッティング（蛋白質レベルでの検出）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡレベルでの検出；例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）等；前記正常眼圧緑内障モデルから採取した網膜組織を用いた、免疫組織染色（蛋白質レベルでの検出）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｍＲＮＡレベルでの検出）等；により測定する方法などが挙げられる。
前記正常軸索マーカーとしては、例えば、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ（ＮＦ２００）、Ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃβ−ＩＩＩ  Ｔｕｂｕｌｉｎ（Ｔｕｊ１）、Ｔａｕ１、ＳＭＩ３２などが挙げられる。
前記障害軸索マーカーとしては、例えば、ＳＭＩ３１、β−ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（β−ＡＰＰ）などが挙げられる。
【００５９】
−（３）網膜神経節細胞以外の網膜細胞の保護作用−
前記評価対象薬剤を投与した後の前記正常眼圧緑内障モデルについて、網膜神経節細胞以外の網膜細胞の保護作用が、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に正常眼圧緑内障の予防乃至治療効果があると評価することができる。
【００６０】
前記網膜神経節細胞以外の網膜細胞の保護作用としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の指標を選択することができ、例えば、細胞数の計測、マーカー蛋白質やｍＲＮＡの発現などが挙げられる。
前記網膜神経節細胞以外の網膜細胞としては、例えば、水平細胞、アマクリン細胞、双極細胞などが挙げられる。
【００６１】
−（４）アストロサイト及びミューラー細胞による網膜神経節細胞の神経軸索保護作用−
前記評価対象薬剤を投与した後の前記正常眼圧緑内障モデルについて、アストロサイト及びミューラー細胞による網膜神経節細胞の神経軸索保護作用が、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に正常眼圧緑内障の予防乃至治療効果があると評価することができる。
【００６２】
前記アストロサイト及びミューラー細胞による網膜神経節細胞の神経軸索保護作用としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の指標を選択することができ、例えば、正常軸索マーカー及び障害軸索マーカーの少なくともいずれかの発現量により測定する方法などが挙げられる。
【００６３】
−（５）視覚伝達系の上位リレー神経細胞の保護作用−
前記評価対象薬剤を投与した後の前記正常眼圧緑内障モデルについて、視覚伝達系の上位リレー神経細胞の保護作用が、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に正常眼圧緑内障の予防乃至治療効果があると評価することができる。
【００６４】
前記視覚伝達系の上位リレー神経細胞の保護作用としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の指標を選択することができ、例えば、細胞数、細胞マーカーの発現などが挙げられる。
前記視覚伝達系の上位リレー神経細胞としては、例えば、外側膝状体の神経細胞、上丘の神経細胞、視床後外側核のニューロンなどが挙げられる。
【００６５】
−（６）大脳皮質視覚野神経細胞乃至周辺細胞の保護作用−
前記評価対象薬剤を投与した後の前記正常眼圧緑内障モデルについて、大脳皮質視覚野神経細胞及び周辺細胞の少なくともいずれかの保護作用が、前記評価対象薬剤に代えて薬理学的に許容可能な溶媒を投与した対照と比較して有意に観察される場合に、前記評価対象薬剤に正常眼圧緑内障の予防乃至治療効果があると評価することができる。
【００６６】
前記大脳皮質視覚野神経細胞乃至周辺細胞の保護作用の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の指標を選択することができ、例えば、網膜へ一定量の光を照射したときの、大脳皮質視覚野皮下に設置された電極から検出される電位変化により測定する方法、網膜へ一定量の光を照射したときの、大脳皮質視覚野の神経細胞の活動性により測定する方法などが挙げられる。これらの方法は、例えば、Ａｄｒｉａｎ（Ａｄｒｉａｎ＆Ｍａｔｔｈｅｗｓ、Ｂｒａｉｎ  １９３４）；Ｏｈｋｉ（Ｏｈｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００５、２００６）等の文献に基づいて行うことができる。
【００６７】
網膜へ照射する前記光としては、一定量であれば、その強度、波長、照射時間などの条件について特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記強度としては、０．０１ｃｄ・ｓｅｃ／ｍ２〜１００ｃｄ・ｓｅｃ／ｍ２が好ましく、前記波長としては、３６０ｎｍ〜８５０ｎｍが好ましく、前記照射時間としては、０．１ｍｓｅｃ〜５００ｍｓｅｃが好ましい。
【００６８】
前記大脳皮質視覚野の神経細胞の活動性は、前記神経細胞における細胞内カルシウムイオンの濃度変化を指標として評価できる。前記細胞内カルシウムイオンの濃度変化を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プローブを用いて蛍光輝度変化により測定する方法などが挙げられる。
前記プローブとしては、例えば、カルシウムイオン指示薬、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ−ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｃａ２＋  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ（ＧＥＣＩ）などが挙げられる。
前記細胞内カルシウムイオンの濃度変化の評価方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記細胞内カルシウムイオンの濃度変化の、振幅の大きさ、起こる頻度、起こる細胞数などにより評価する方法などが挙げられる。
【００６９】
前記評価対象薬剤の薬理学的に許容可能な塩とは、前記評価対象薬剤と、無機酸、有機酸、無機塩基及び有機塩基の少なくともいずれかを化学反応させることにより形成される塩である。
前記無機酸又は有機酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、炭酸、リン酸、過塩素酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、乳酸、リンゴ酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、置換基含有ベンゼンスルホン酸（例えば、ｐ−トルエンスルホン酸）、イソニコチン酸、オレイン酸、タンニン酸、パントテン酸、アスコルビン酸、コハク酸、マレイン酸、ゲンチジン酸、フマル酸、グルコン酸、ウロン酸、サッカリン酸又はショ糖酸、蟻酸、安息香酸、グルタミン酸、ビスヒドロキシナフテン酸、ソルビン酸などが挙げられる。
前記無機塩基又は有機塩基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化第二鉄、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化アルミ二ウム、水酸化マグネシウム、水酸化亜鉛、アンモニア水、有機第四級アンモニウム水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸リチウム、炭酸カルシウム、炭酸バリウム、炭酸マグネシウム、有機第四級アンモニウム炭酸塩、重曹、炭酸水素カリウム、炭酸水素リチウム、炭酸水素カルシウム、炭酸水素バリウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸水素化有機第四級アンモニウムなどが挙げられる。
【００７０】
前記評価対象薬剤の薬理学的に許容可能な溶媒和物とは、前記評価対象薬剤が薬理学的に許容可能な溶媒と、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、錯体、インクルーションなどを形成して安定化したものである。前記溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、アセトン、アセトニトリル、エチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなどが挙げられる。
【００７１】
前記評価薬剤の薬理学的に許容可能なプロドラックとは、化学合成または物理的な方法により前記評価薬剤を他の化合物に変換させて、当該他の化合物を哺乳動物に投与してから、前記哺乳動物の体内で活性を有する前記評価薬剤に転換し戻すことが可能なものである。前記評価薬剤のプロドラックとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７２】
前記評価薬剤における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．３ｎｍｏｌ／Ｌ〜３ｍｍｏｌ／Ｌが望ましく、３０ｎｍｏｌ／Ｌ〜３００μｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
【００７３】
通常、緑内障の治療においては眼圧を低下させる薬剤が使用される。眼圧は、例えば、日本人の正常値は、１０ｍｍＨｇ〜２１ｍｍＨｇであり、マウスの正常値は、１０ｍｍＨｇ〜２１ｍｍＨｇである。正常眼圧緑内障においても、眼圧を更に低下させる事によって症状の進行を抑制する事ができる。
【００７４】
＜その他の成分＞
前記眼圧調整剤は、デキストリン、シクロデキストリンなどの薬理学的に許容可能な担体、助剤を用いて、常法に従い、液状、粉末状、顆粒状、錠剤状などの任意の剤形に製剤化して提供することができ、他の組成物（例えば、点眼薬、経口医薬品など）に配合して使用できる他、軟膏剤、外用液剤、貼付剤などとして使用することができる。
前記助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味剤、矯臭剤などを用いることができる。
【００７５】
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００７６】
前記眼圧調整剤を投与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて各薬剤に適した投与経路、投与タイミング、投与量、投与スケジュール等の投与条件を適宜選択することができる。
前記投与経路としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、眼局所投与（例えば点眼）、経口投与、静脈内投与が好ましい。
【００７７】
前記眼圧調整剤の投与量としては、特に制限はなく、処置を必要とする哺乳動物の疾患状態、体重等の要因に応じて適宜選択することができるが、一日当たり、０．００００６ｍｇ〜０．０２４ｍｇが好ましく、０．０００２ｍｇ〜０．００８ｍｇがより好ましい。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
【００７９】
（実施例１：１２ヶ月齢の全身性ＡＢＣＡ１欠損マウスの網膜神経節細胞の脱落または傷害の評価）
＜方法＞
＜網膜の摘出＞
網膜神経節細胞の脱落または傷害は、摘出した網膜を用いて評価した。雄性ＤＢＡ１／Ｊマウス（野生型、１２ヶ月齢）または雄性全身性ＡＢＣＡ１欠損マウス（１２ヶ月齢）に塩酸メデトミジン、ミダゾラム、酒石酸ブトルルファール（生理食塩水に溶解、アステラス製薬株式会社製、共立製薬株式会社製、Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａファルマ株式会社製）を腹腔内投与（それぞれ０．３，４．０及び５．０ｍｇ／Ｋｇ）し、正向反射が見られなくなった事を確認して心臓より脱血したのちに眼球を摘出した。眼球は４質量％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液（ＰＢＳ）溶液にて１２時間（４℃）処理した後に、氷冷ＰＢＳ中にて角膜を剥離し、網膜を摘出した。網膜神経節細胞の脱落または傷害は、Ｂｒｎ３ａの免疫組織化学染色ならびにＴＵＮＥＬ染色によって行った。
【００８０】
＜ホールマウント網膜の免疫組織染色＞
組織は、４質量％ＰＦＡにて固定（１２時間、４℃）し、ブロッキング溶液（２体積％ウシ血清アルブミン、及び２体積％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ）にて室温で１時間処理した。組織標本は、１次抗体として抗Ｂｒｎ３ａ抗体（１：５，０００、サンタクルズ社製）を含むブロッキング溶液と３日間（４℃）にて反応させ、ＰＢＳ／Ｔ（０．３体積％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。その後切片を２次抗体（ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ  ＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ｄｙｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、１：１，０００、ライフテクノロジーズ社製）を含むブロッキング溶液と１時間（室温）反応させた。切片はＰＢＳ／Ｔにて３回洗浄して観察を行った。
【００８１】
＜ホールマウント網膜のＴＵＮＥＬ染色＞
ＴＵＮＥＬ染色はＡｐｏＴａｇ  ｐｌｕｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｎ  Ｓｉｔｕ  ｋｉｔ（ミリポア社製）を用いて行った。
免疫組織化学染色の工程が終了した網膜組織を−２０℃に冷却したエチルアルコールと酢酸の混合溶媒（２：１）に２０分間浸漬した。組織はＰＢＳにて５回洗浄（各５分）して平衡バッファーに浸した後にＴｄＴ  ｅｎｚｙｍｅと３時間（３７℃）反応させた。Ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｓｔｏｐ／ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒにて反応を停止後、１０分間室温にて静置した。その後ＰＢＳで３回洗浄（各１分）後、フルオレセイン標識された抗Ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ抗体を加えて１２時間（４℃）反応させた。組織をＰＢＳにて４回洗浄（各２分）し、スライドガラスに貼り付け、カバーガラスで封入した。蛍光シグナルの観察はＦＶ１２００レーザー走査型顕微鏡（オリンパス社製）を用いて行った。
【００８２】
＜Ｂｒｎ３ａ陽性細胞・ＴＵＮＥＬ陽性細胞数の計測＞
Ｂｒｎ３ａ陽性細胞及びＴＵＮＥＬ陽性細胞数の計測はＩｍａｇｅ  Ｊ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｃ／ｉｊ／）のプラグイン「Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ」を用いて行った。それぞれの画像をＩｍａｇｅ  Ｊで開き、メニューからＰｌｕｇｉｎ−Ａｎａｌｙｓｉｓ−Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒを選択し、「ｉｎｉｔｉａｌｉｚｅ」を行った後、球状のＢｒｎ３ａ陽性またはＴＵＮＥＬ陽性シグナルをマウスでクリックして細胞数を計測した。
【００８３】
＜結果＞
雄性ＤＢＡ１／Ｊマウス（野生型、１２ヶ月齢）及び雄性ＡＢＣＡ１欠損（１２ヶ月齢）マウスより調製したホールマウント網膜のＢｒｎ３ａ陽性細胞またはＴＵＮＥＬ陽性細胞の画像を図１Ａ及び図１Ｂに示す。また、それぞれの定量結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。Ｂｒｎ３ａ陽性細胞数は野生型マウスに比べてＡＢＣＡ１欠損マウスにおいて顕著に減少していた。一方、ＴＵＮＥＬ陽性細胞数は野生型マウスに比べてＡＢＣＡ１欠損マウスにおいて顕著に増加していた。計数の結果、網膜神経節細胞の脱落率及び傷害率はそれぞれ１５〜２０％及び３０〜４０％であった。
なお、図２Ａ及び図２Ｂにおいて、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示し、＊＊は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−テストによる二群間比較検定による統計解析において有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
一般的にマウスの寿命は約３年（３６ヶ月と言われており、月齢１２ヶ月はヒトの年齢に換算すると３５歳〜４０歳に相当する。日本人の４０歳での正常眼圧緑内障の発生率が５％であり加齢に伴い発生率は上昇していく。また、後述する実施例１０〜１２に記載されているように、若齢マウスでは網膜神経節細胞が脱落または傷害されることはない。すなわち、月齢１２ヶ月の全身性ＡＢＣＡ１欠損マウスにおいて網膜神経節細胞が脱落するまたは傷害されるという結果は、自然発症型のＮＴＧモデルとして有用である事を示している。
【００８４】
（実施例２：  全身性ＡＢＣＡ１遺伝子欠損の眼圧に対する作用）
＜方法＞
眼圧の測定は全て麻酔下にて行った。雄性ＤＢＡ１／Ｊマウス（野生型、３ヶ月齢または１２ヶ月齢）または雄性の全身性ＡＢＣＡ１欠損マウス（３ヶ月齢または１２ヶ月齢）に塩酸メデトミジン、ミダゾラム、酒石酸ブトルルファール（生理食塩水に溶解、アステラス製薬株式会社製、共立製薬株式会社製、Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａファルマ株式会社製）を腹腔内投与（それぞれ０．３，４．０，及び５．０ｍｇ／Ｋｇ）し、正向反射が見られなくなったことを確認して計測を行った。眼圧の計測は、リバウンド式トノメーター（ＴｏｎｏＬａｂ、ｉＣａｒｅ社製）を用い、５回計測値の平均値を測定値として用いた。
＜結果＞
野生型マウスと全身性ＡＢＣＡ１欠損マウスについて、３ヶ月齢及び１２ヶ月齢で眼圧を計測した結果を図３に示す。３ヶ月齢及び１２ヶ月齢のどちらにおいても、野生型マウスと全身性ＡＢＣＡ１欠損マウスとの間に統計的に有意な眼圧の差は認められなかった。すなわち、全身性ＡＢＣＡ１欠損マウスは、眼圧が正常なので、自然発症型のＮＴＧモデルとして有用である。
【００８５】
（実施例３：磁気細胞分離法及び定量的ＰＣＲ法によるＡＢＣＡ１発現細胞の評価）
＜方法−磁気細胞分離法による網膜ミクログリア、アストロサイト／ミューラー細胞の単離＞
雄性Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（野生型、３ヶ月齢）に塩酸メデトミジン、ミダゾラム、酒石酸ブトルルファール（生理食塩水に溶解、アステラス製薬株式会社製、共立製薬株式会社製、ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａファルマ株式会社製）を腹腔内投与（それぞれ０．３，４．０，及び５．０ｍｇ／Ｋｇ）し、正向反射が見られなくなった事を確認して心臓より脱血したのちに眼球を摘出した。眼球は氷冷リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中にて角膜を剥離し、網膜を摘出した。
網膜細胞の分離はＡｄｕｌｔ  Ｂｒａｉｎ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｒａｔ（ミルテニー社製）を用いて手順の詳細は全てキットの説明書に基いて行った。摘出網膜をＭＡＣＳ  Ｃ  Ｔｕｂｅに入れ、ｂｕｆｆｅｒ  Ｙ及びｅｎｚｙｍｅ  Ａを加えて２０  ｒｐｍにて３０分間（３７℃）処理した。細胞懸濁液をセルストレイナー（１００μｍ）に通し、３００×ｇにて７分（４℃）遠心した。細胞懸濁液にＦｃＲブロッキング液を加えた後に、抗ＣＤ１１ｂ抗体が付加した磁気ビースを添加し、氷上にて５分間反応させた。細胞懸濁液を磁気スタンドに設置したＬＳカラムに添加し、磁気ビーズ及びＣＤ１１ｂ陽性細胞をカラム中に捕捉した。その後、ＬＳカラムを磁気スタンドからはずし、ＰＢＳにて洗浄する事によってＣＤ１１ｂ陽性網膜ミクログリアを得た
磁気スタンドに設置した状態で捕捉されなかった細胞懸濁液に対し、磁気ビーズが不可した抗ＡＣＳＡ１抗体を添加し、氷上にて５分間反応させた。細胞懸濁液を磁気スタンドに設置したＬＳカラムに添加し、磁気ビーズ及びＡＣＳＡ１陽性細胞をカラム中に捕捉した。その後、ＬＳカラムを磁気スタンドからはずし、ＰＢＳにて洗浄する事によってＡＣＳＡ１陽性アストロサイト／ミューラー細胞を得た。
抗ＣＤ１１ｂ抗体及び抗ＡＣＳＡ１抗体を付加した状態で磁気スタンドに設置しても補足されなかった細胞をミクログリア、アストロサイト／ミューラー細胞以外の細胞として回収した。
【００８６】
＜単離細胞からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ精製＞
磁気細胞分離法によって分離した網膜細胞からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ精製はＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて行った。手順の詳細は全てキットの説明書に基いて行った。細胞懸濁液にＱＩＡｚｏｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔを加えて細胞を破砕し、クロロホルムを加えた。１２０００×ｇにて１５分（４℃）遠心し、水層をエッペンドルフチューブに移し、同量の７０体積％エタノールを混和した。この混合液をＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎに加え、８０００×ｇにて１５秒（室温）遠心した。カラムにＲＷ１を加えてさらに８０００×ｇにて１５秒（室温）遠心した。カラムにＲＰＥを加えて８０００×ｇにて１５秒（室温）遠心した。カラムにヌクレアーゼフリーＨ２Ｏを加えて精製ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。
【００８７】
＜ｔｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡの生成＞
ＴＡＫＡＲＡ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡから逆転写によってｃＤＮＡを得た。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡと５ｘ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｂｕｆｆｅｒ，  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｅｎｘｙｍｅ  ｍｉｘ１，  Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒｓ，  Ｒａｎｄｏｍ  ６  ｍｅｒｓを混合し、サーマルサイクラーにて３７℃１５分及び８５℃５秒で反応させる事によってｃＤＮＡを生成した。
【００８８】
＜定量的ＰＣＲ法＞
定量的ＰＣＲ法は、ｃＤＮＡとＰｒｉｍｅｔｉｍｅ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＩＤＴ社製）及びＡＢＣＡ１遺伝子  ＰＣＲ  ｐｒｏｂｅ  （ＩＤＴ社製）を混合し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００（アプライドバイオシステムズ社製）にて９５℃３分の反応後に９５℃１５秒及び６０℃１分を３５回反応する事によってＡＢＣＡ１遺伝子の増幅曲線を得た。
【００８９】
＜結果＞
図４に示すように、網膜におけるＡＢＣＡ１遺伝子の発現は、アストロサイト／ミューラー細胞の画分に最も多く、ミクログリアやその他細胞の画分に比べて約３．５倍高い事が明らかになった。なお、図４において、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示し、＊は、一元配置分散分析及びＦｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅテストによる多重比較検定による統計解析において有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。
【００９０】
（実施例４：凍結網膜切片の免疫組織化学染色によるＡＢＣＡ１発現細胞の網膜における検討）
＜方法＞
実施例１と同様に摘出した網膜を２０質量％スクロース／ＰＢＳ液に入れて２日間（４℃）振盪しながら処理し、ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  （サクラファインテックジャパン社製）に包埋して凍結した。凍結ブロックをクライオスタット（ライカ製）を用いて薄切し、２０μｍ厚の網膜切片を得た。実施例１と同様の条件で抗ＡＢＣＡ１抗体と反応させた。アストロサイト／ミューラー細胞の同定にはＧＬＡＳＴプロモーター下に緑色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウス（雄性、３ヶ月齢）を用いた。
【００９１】
＜結果＞
ＡＢＣＡ１陽性シグナルは網膜断層全体に観察された。図５に矢印で示すように、神経節細胞層では網膜神経節細胞を取り囲むようなシグナルとして観察され、その多くがアストロサイト／ミューラー細胞に発現する緑色蛍光タンパク質のシグナルと共局在していた。内網状層でもアストロサイト／ミューラー細胞の微細突起に相当する部位と共局在が確認された。その他、内顆粒層、外網状層及び外顆粒層においてもアストロサイト／ミューラー細胞由来シグナルとの共局在が観察された。したがって、ＡＢＣＡ１はアストロサイト／ミューラー細胞に発現することが明らかとなった。
【００９２】
（実施例５：凍結視神経束切片の免疫組織化学染色によるＡＢＣＡ１発現細胞の視神経線維周囲における検討）
＜方法＞
実施例４と同様に摘出した視神経束を２０質量％スクロース／ＰＢＳ液に入れて２日間（４℃）振盪しながら処理し、ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  （サクラファインテックジャパン社製）に包埋して凍結した。凍結ブロックをクライオスタット（ライカ製）を用いて薄切し、２０μｍ厚の視神経束切片を得た。実施例１と同様の条件で抗ＡＢＣＡ１抗体と反応させた。視神経束周囲のアストロサイトの同定にはＧＬＡＳＴプロモーター下に緑色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウス（雄性、３ヶ月齢）を用いた。  
【００９３】
＜結果＞
ＡＢＣＡ１陽性シグナルは視神経束全体に観察された。図６Ａ及び図６Ｂ（図６Ｂは図６Ａの部分拡大図である）に示すように、ＡＢＣＡ１陽性シグナルは繊維状のシグナルとして観察され。視神経束ではミューラー細胞は存在せず、ＧＬＡＳＴを発現する細胞は主にアストロサイトである事、図６Ｂに示すようにＡＢＣＡ１陽性シグナルは緑色蛍光タンパク質のシグナルと共局在していたことから、ＡＢＣＡ１は視神経束では主にアストロサイトに発現することが明らかとなった。
【００９４】
（実施例６：アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスにおける網膜神経節細胞の傷害の評価）
＜方法＞
Ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉａｌｌｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＧＦＡＰ）プロモーターの下流にＣｒｅを発現するトランスジェニックマウス（ＧＦＡＰ−Ｃｒｅ）とＡＢＣＡ１遺伝子配列の両側にｆｌｏｘ配列を挿入したトランスジェニックマウス（ＡＢＣＡ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）を交配して作成したアストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウス（ＡＢＣＡ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ：：ＧＦＡＰ−Ｃｒｅ）及び雄性対照群マウス（ＡＢＣＡ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ：：Ｃｒｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）を作出した。全身性ＡＢＣＡ１欠損マウスの比較対象は「野生型」であるが、アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＣＢＣＡ１欠損マウスの比較対象は「対照群」とした。「野生型」は全く遺伝子を操作していないもの、「対照群」はＡＢＣＡ１遺伝子配列の両端にｆｌｏｘｅｄ配列を導入したトランスジェニックマウスである。
網膜の摘出、Ｂｒｎ３ａ免疫組織化学染色及びＴＵＮＥＬ染色並びに観察、それら陽性細胞数の計測は実施例１の方法に基いて行った。
【００９５】
＜結果＞
（アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスにおけるＢｒｎ３ａ陽性細胞数の変化）
雄性アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウス（１２ヶ月齢）及び雄性対照群（１２ヶ月齢）マウスより調製したホールマウント網膜のＢｒｎ３ａ陽性細胞の画像を図７Ａに示す。また、それぞれの定量結果を図７Ｂに示す。Ｂｒｎ３ａ陽性細胞数は対照群マウスに比べてアストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスにおいて顕著に減少していた。計数の結果、網膜神経節細胞の脱落率は１０％であった。なお、図７Ｂにおいて、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示し、＊＊は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−テストによる二群間比較検定による統計解析において有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【００９６】
（アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスにおけるＴＵＮＥＬ陽性細胞数の変化）
雄性アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウス（１２ヶ月齢）及び雄性対照群（１２ヶ月齢）マウスより調製したホールマウント網膜のＴＵＮＥＬ陽性細胞の画像を図８Ａに示す。また、それぞれの定量結果を図８Ｂに示す。ＴＵＮＥＬ陽性細胞数は対照群マウスに比べてアストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスにおいて顕著に増加していた。なお、図８Ｂにおいて、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示し、＊＊は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−テストによる二群間比較検定による統計解析において有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【００９７】
すなわち、後述する実施例１１〜１２の結果と合わせて、アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスは、加齢に伴い網膜神経節細胞の少なくとも一部が脱落するまたは傷害されることが明らかであり、自然発症型のＮＴＧモデルとして有用である。
【００９８】
（実施例７：アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスにおけるＴＵＮＥＬ陽性シグナルが観察される網膜の神経細胞層）
緑内障は主に網膜神経節細胞が選択的に傷害され、脱落する神経変性疾患である。実施例１及び６で示したＴＵＮＥＬ陽性シグナルは網膜ホールマウント標本の神経節細胞層を観察した結果であり、その他の神経細胞層（内顆粒層、内網状層）において神経傷害が生じているか否かは不明である。したがって、網膜断層を観察できるように切片を作成して、各神経細胞層におけるＴＵＮＥＬ陽性シグナルの評価を行った。
＜方法＞
実験動物については実施例６と同様に、アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウス及び対照群マウスの１２ヶ月齢の個体を用いた。網膜の摘出、Ｂｒｎ３ａ免疫組織化学染色及びＴＵＮＥＬ染色並びに観察、それら陽性細胞数の計測は実施例１の方法に基いて行った。網膜凍結切片の作成は実施例４の方法に基いて行った。
【００９９】
＜結果＞
（対照群マウス網膜切片及びアストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウス網膜切片におけるＢｒｎ３ａ陽性細胞及びＴＵＮＥＬ陽性細胞の局在）
雄性対照群（１２ヶ月齢）マウスより調製した網膜切片のＢｒｎ３ａ陽性細胞及びＴＵＮＥＬ陽性の画像と、アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウス（１２ヶ月齢）マウスより調製した網膜切片のＢｒｎ３ａ陽性細胞及びＴＵＮＥＬ陽性の画像を図９に示す。Ｂｒｎ３ａは網膜神経節細胞に選択的に発現するが、本結果でも対象群及びアストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスの両者において、Ｂｒｎ３ａ陽性シグナルが画面上部の神経節細胞層に局在していることが観察される。一方、ＴＵＮＥＬ陽性シグナルは、対象群においては顕著に強いものは観察されなかったが、アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスにおいては神経節細胞層に多く観察され、それらはＢｒｎ３ａ陽性シグナルと非常によく共局在していた。本結果ではＢｒｎ３ａ陽性細胞数がアストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスでも対照群と比較してあまり変化が無いように見えるが、これは網膜の切断面の場所による細胞の偏りのためだと考えられる。一部のＢｒｎ３ａ陽性シグナルは対象群と比べて顕著に小さく、アポトーシスの代表的な形態的特徴であるＰｙｋｎｏｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｉを示している事から、確かに脱落または傷害が起きていることを支持している。
【０１００】
（実施例８：１８ヶ月齢のアストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスにおけるＢｒｎ３ａ陽性細胞数）
＜方法＞
実験動物については実施例６と同様に、アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウス及び対照群マウスを作出し、１８ヶ月齢の個体を用いた。網膜の摘出、Ｂｒｎ３ａ免疫組織化学染色、及び観察を実施し、陽性細胞数の計測は実施例１の方法に基いて行った。
【０１０１】
＜結果＞
雄性アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウス（１８ヶ月齢）及び雄性対照群（１８ヶ月齢）マウスより調製したホールマウント網膜のＢｒｎ３ａ陽性細胞の画像を図１０Ａに示す。また、それぞれの定量結果を図１０Ｂに示す。Ｂｒｎ３ａ陽性細胞数は対照群マウスに比べてアストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスにおいて顕著に減少していた。計数の結果、網膜神経節細胞の脱落率は３０％であり、１２ヶ月齢よりもさらに脱落率が亢進していた。すなわち、加齢により、網膜神経節細胞がより脱落する、すなわち緑内障症状が加齢により進行することを示しているので、アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスは、自然発症型のＮＴＧモデルとして有用である。なお、図１０Ｂにおいて、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示し、＊＊は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−テストによる二群間比較検定による統計解析において有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【０１０２】
（実施例９：アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損による眼圧への影響）
＜方法＞
眼圧の測定は全て実施例２の条件に基いて行った。実験動物については実施例６と同様に、アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウス及び対照群マウスを作出し、３ヶ月齢、６ヶ月齢及び１２ヶ月齢の個体を用いた。
＜結果＞
眼圧を３ヶ月齢、６ヶ月齢及び１２ヶ月齢の対照群マウスとアストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスとで計測した結果を図１１に示す。各月齢において、対照群マウスとアストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスとの間に統計的に有意な眼圧の差は認められなかった。すなわち、アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスは、自然発症型のＮＴＧモデルとして有用である。
【０１０３】
（実施例１０：３ヶ月齢の全身性ＡＢＣＡ１欠損マウスの網膜神経節細胞の脱落の評価）＜方法＞
実験動物については実施例１と同様に、３ヶ月齢の野生型及びＡＢＣＡ１欠損マウスを用意し、これらの眼球から網膜ホールマウント標本を作成して、網膜神経節細胞の脱落をＢｒｎ３ａの免疫組織化学染色、及び観察を実施し、陽性細胞数の計測は実施例１の方法に基いて行った。
＜結果＞
野生型（３ヶ月齢）及び全身性ＡＢＣＡ１欠損マウス（３ヶ月齢）マウスより調製したホールマウント網膜のＢｒｎ３ａ陽性細胞の画像を図１２Ａに示す。また、それぞれの定量結果を図１２Ｂに示す。Ｂｒｎ３ａ陽性細胞数は野生型マウスとＡＢＣＡ１欠損マウスで顕著な差を示さなかった。この結果は若齢マウスにおいてはＡＢＣＡ１が全身性に欠損していても網膜神経節細胞の脱落は生じていない事を示している。実施例１の結果と実施例１０の結果より、全身性ＡＢＣＡ１欠損マウスは、加齢により網膜神経節細胞の脱落が生じることが明らかになり、自然発症型のＮＴＧモデルとして有用であるといえる。なお、図１２Ｂにおいて、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示し、＊＊は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−テストによる二群間比較検定による統計解析において有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【０１０４】
（実施例１１：３ヶ月齢のアストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスにおけるＢｒｎ３ａ陽性細胞数）
＜方法＞
実験動物については実施例６と同様に、アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウス及び対照群マウスを作出し、３ヶ月齢の個体を用いた。網膜の摘出、Ｂｒｎ３ａ免疫組織化学染色、及び観察を実施し、陽性細胞数の計測は実施例１の方法に基いて行った。
＜結果＞
アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウス（３ヶ月齢）及び対照群（１２ヶ月齢）マウスより調製したホールマウント網膜のＢｒｎ３ａ陽性細胞の画像を図１３Ａに示す。また、それぞれの定量結果を図１３Ｂに示す。Ｂｒｎ３ａ陽性細胞数は対照群マウスとアストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスとの間で統計的に有意な変化は示さなかった。この結果は若齢マウスにおいてはアストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスにおいて、網膜神経節細胞の脱落は生じていない事を示している。実施例６の結果と実施例１１の結果より、アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスは、加齢により網膜神経節細胞の脱落が生じることが明らかになり、自然発症型のＮＴＧモデルとして有用であるといえる。なお、図１３Ｂにおいて、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示し、＊＊は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−テストによる二群間比較検定による統計解析において有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【０１０５】
（実施例１２：３ヶ月齢のアストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスにおけるＴＵＮＥＬ陽性細胞数）
＜方法＞
実験動物については実施例６と同様に、アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウス及び対照群マウスを作出し、３ヶ月齢の個体を用いた。網膜の摘出、ＴＵＮＥＬ染色、及び観察を実施し、陽性細胞数の計測は実施例１の方法に基いて行った。
＜結果＞
アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウス（３ヶ月齢）及び対照群（３ヶ月齢）マウスより調製したホールマウント網膜のＴＵＮＥＬ陽性細胞の画像を図１４Ａに示す。また、それぞれの定量結果を図１４Ｂに示す。ＴＵＮＥＬ陽性細胞数は対照群マウスとアストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスとの間で顕著な変化は示さなかった。この結果は若齢マウスにおいてはアストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスにおいて、網膜神経節細胞は傷害されていない事を示している。実施例６の結果と実施例１２の結果より、アストロサイト／ミューラー細胞選択的ＡＢＣＡ１欠損マウスは、加齢により網膜神経節細胞の傷害が生じることが明らかになり、自然発症型のＮＴＧモデルとして有用であるといえる。なお、図１４Ｂにおいて、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示し、＊＊は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−テストによる二群間比較検定による統計解析において有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【０１０６】
これらの各実施例の結果から、ＡＢＣＡ１欠損マウス（全身性欠損またはアストロサイト／ミューラー選択的欠損）は、自然発症型のＮＴＧモデルとして有用であり、既存又は新規緑内障治療薬の有効な評価システムとして用いることができることが分かった。
【０１０７】
以上の実施例で示したように、ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物では、眼圧が正常値であるにも関わらず網膜神経節細胞が脱落するまたは傷害される表現型を示す。したがって、前記ＡＢＣＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物からなる本発明の緑内障モデルは、自然発症型の正常眼圧緑内障モデルと言える。また、本発明の正常眼圧緑内障モデルは、網膜神経節細胞の傷害の進行が比較的緩徐であることから、よりヒト正常眼圧緑内障の表現型に近いと考えられる。ＡＢＣＡ１の作用点は、現行の緑内障治療薬の作用点と異なることから、それらの評価に影響を与えず、より正確な評価系として使用できる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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