(57)【要約】【課題】生理液中環境に置かれた生きた生物試料等にダメージを与えることなく、かつ、高速動作と高い空間分解能とを実現する表面計測方法等を提供する。【解決手段】表面計測方法は、第１の電解液中に試料を配置する試料準備工程と、プローブの貫通孔内に、第１の電解液よりもイオン濃度が高い第２の電解液を充填する充填工程と、第１の電解液に少なくとも一部が浸された第１の電極と第２の電解液に少なくとも一部が浸された第２の電極との間に第１の電解液と第２の電解液とを介して流れるイオン電流を計測する電流計測工程と、計測されたイオン電流に基づいてプローブの高さを調整する高さ調整工程と、貫通孔内に第２の電解液が充填されたプローブをプローブの高さ方向と直交する方向に走査し試料の表面状態を計測する走査工程と、を含む。【選択図】図３
2019049420.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン電流を利用して、長尺のプローブを走査しながら試料の表面形状および状態を計測する表面計測方法であって、
前記プローブは、前記プローブの長尺方向と同一の方向に長尺な形状を有しかつ前記長尺方向の両端を貫通する貫通孔を有し、
第１の電解液中に前記試料を配置する試料準備工程と、
前記貫通孔内に、前記第１の電解液よりもイオン濃度が高い第２の電解液を充填する充填工程と、
前記第１の電解液に少なくとも一部が浸された第１の電極と、前記第２の電解液に少なくとも一部が浸された第２の電極との間に、前記第１の電解液と前記第２の電解液とを介して流れるイオン電流を計測する電流計測工程と、
計測された前記イオン電流に基づいて、前記プローブの高さを調整する高さ調整工程と、
前記貫通孔内に前記第２の電解液が充填された前記プローブを、前記プローブの高さ方向と直交する方向に走査し、前記試料の表面形状および状態を計測する走査工程と、
を含む
表面計測方法。
【請求項２】
前記第２の電解液のイオン濃度は、４ｍｏｌ／ｌ以下である
請求項１に記載の表面計測方法。
【請求項３】
前記プローブの前記試料に近接する側の前記貫通孔の口径は、５０ｎｍ以下である
請求項２に記載の表面計測方法。
【請求項４】
イオン電流を利用して試料の表面形状および状態を計測するイオン伝導顕微鏡であって、
前記試料を第１の電解液に浸された状態で保持するステージと、
長尺な形状を有し、長尺方向の両端を貫通する貫通孔内に前記第１の電解液よりもイオン濃度が高い第２の電解液が充填されたプローブと、
前記第１の電解液に少なくとも一部が浸された第１の電極と、
前記第２の電解液に少なくとも一部が浸された第２の電極と、
前記第１の電極と前記第２の電極とに接続され、前記第１の電解液と前記第２の電解液とを介して前記第１の電極と前記第２の電極との間に流れるイオン電流を検出する検出部と、
前記プローブを、少なくとも前記プローブの高さ方向に移動させる駆動部と、
前記検出部で検出された前記イオン電流に基づいて前記駆動部を制御することにより、前記プローブの高さを調整する制御部とを備える
イオン伝導顕微鏡。
【請求項５】
長尺な形状を有し、長尺方向の両端を貫通する貫通孔を有するピペットと、
前記貫通孔内に充填された、前記ピペットの外側に配置される第１の電解液よりもイオン濃度が高い第２の電解液とを備える
プローブ。
【請求項６】
少なくとも前記貫通孔の内壁の表面は、被覆層で覆われている
請求項５に記載のプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面計測方法、イオン伝導顕微鏡およびプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
走査型のイオン伝導顕微鏡（ＳＩＣＭ：Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｉｏｎ Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）は、プローブを試料に対して走査し、イオン電流を計測することにより、凹凸などの試料表面の物理情報または試料の化学的性質を信号として取得する顕微鏡である（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
特許文献１に記載のイオン伝導顕微鏡は、内部を電解液で満たしたガラスピペットをプローブとして、ガラスピペット外部の電解液中に配置した外部電極とピペット内に配置された内部電極の間に生じたイオン電流を信号として用いる。このイオン電流は、ガラスピペットの先端が試料に近接して遮蔽されることで変化する。イオン伝導顕微鏡は、当該イオン電流の変化を計測しながらガラスピペットまたは試料を水平方向（ＸＹ方向）と垂直方向（Ｚ方向）に走査し、試料表面の立体形状を画像化するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００９−５４５７３６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
イオン伝導顕微鏡は、例えば柔らかい真核細胞などを電解液中で生きたまま立体観察するのに用いられる。したがって、イオン伝導顕微鏡は、真核細胞などの試料にダメージを与えることなく、高速かつ高い空間分解能で計測を行うことが求められる。
【０００６】
上記課題に鑑み、本発明は、生理液中環境に置かれた生きた生物試料等にダメージを与えることなく、かつ、高速動作と高い空間分解能とを実現する表面計測方法、イオン伝導顕微鏡およびプローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するため、本発明にかかる表面計測方法は、イオン電流を利用して、長尺のプローブを走査しながら試料の表面形状および状態を計測する表面計測方法であって、前記プローブは、前記プローブの長尺方向と同一の方向に長尺な形状を有しかつ前記長尺方向の両端を貫通する貫通孔を有し、第１の電解液中に前記試料を配置する試料準備工程と、前記貫通孔内に、前記第１の電解液よりもイオン濃度が高い第２の電解液を充填する充填工程と、前記第１の電解液に少なくとも一部が浸された第１の電極と、前記第２の電解液に少なくとも一部が浸された第２の電極との間に、前記第１の電解液と前記第２の電解液とを介して流れるイオン電流を計測する電流計測工程と、計測された前記イオン電流に基づいて、前記プローブの高さを調整する高さ調整工程と、前記貫通孔内に前記第２の電解液が充填された前記プローブを、前記プローブの高さ方向と直交する方向に走査し、前記試料の表面形状および状態を計測する走査工程と、を含む。
【０００８】
これにより、電解液のイオン濃度が高い領域は、プローブの貫通孔の開口近傍にのみ存在するので、観測対象の試料の大部分は高いイオン濃度の影響を受けること無く、信号となるイオン電流変化を大きくできる。このため、高感度でイオン電流を検出し、プローブを高速で走査することができる。また、信号雑音比を向上し、高分解能で試料の表面状態を計測することができる。
【０００９】
また、前記第２の電解液のイオン濃度は、４ｍｏｌ／ｌ以下であってもよい。
【００１０】
これにより、第２の電解液としてイオン濃度が高い電解液を用いるので、より高速かつ高分解能で試料の表面状態を計測することができる。
【００１１】
また、前記プローブの前記試料に近接する側の前記貫通孔の口径は、５０ｎｍ以下であってもよい。
【００１２】
これにより、貫通孔の口径を小さくすることにより、イオン濃度が高い領域をプローブの先端に集中させることができるので、試料が置かれた溶液の環境をほとんど変化させずに、より高分解で試料の表面状態を計測することができる。
【００１３】
また、上記の課題を解決するため、本発明にかかるイオン伝導顕微鏡は、イオン電流を利用して試料の表面形状および状態を計測するイオン伝導顕微鏡であって、前記試料を第１の電解液に浸された状態で保持するステージと、長尺な形状を有し、長尺方向の両端を貫通する貫通孔内に前記第１の電解液よりもイオン濃度が高い第２の電解液が充填されたプローブと、前記第１の電解液に少なくとも一部が浸された第１の電極と、前記第２の電解液に少なくとも一部が浸された第２の電極と、前記第１の電極と前記第２の電極とに接続され、前記第１の電解液と前記第２の電解液とを介して前記第１の電極と前記第２の電極との間に流れるイオン電流を検出する検出部と、前記プローブを、少なくとも前記プローブの高さ方向に移動させる駆動部と、前記検出部で検出された前記イオン電流に基づいて前記駆動部を制御することにより、前記プローブの高さを調整する制御部とを備える。
【００１４】
これにより、電解液のイオン濃度が高い領域は、プローブの貫通孔の開口近傍にのみ存在するので、高いイオン濃度の電解液により、試料が置かれた溶液の環境をほとんど変化させずに、イオン電流を大きくすることができる。また、高感度でイオン電流を検出し、プローブを高速で走査することができる。また、信号雑音比を向上し、高分解能で試料の表面状態を計測することができる。
【００１５】
また、上記の課題を解決するため、本発明にかかるプローブは、長尺な形状を有し、長尺方向の両端を貫通する貫通孔を有するピペットと、前記貫通孔内に充填された、前記ピペットの外側に配置される第１の電解液よりもイオン濃度が高い第２の電解液とを備える。
【００１６】
これにより、当該プローブを用いることにより、イオン伝導顕微鏡において、試料が置かれた溶液の環境をほとんど変化させずに、かつ、高速動作と高い空間分解能とを実現することができる。
【００１７】
また、少なくとも前記貫通孔の内壁の表面は、被覆層で覆われていてもよい。
【００１８】
これにより、貫通孔の口径をより小さくすることができるので、イオン伝導顕微鏡において、高いイオン濃度の電解液が貫通孔内から試料が置かれた領域に拡散するのを抑制しすることができる。よって、試料が置かれた環境が変化するのをより抑制することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、生きた生物試料等が置かれた溶液の環境をほとんど変化させずに、かつ、高速動作と高い空間分解能とを実現する表面計測方法、イオン伝導顕微鏡およびプローブを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施の形態にかかるイオン伝導顕微鏡の概略構成図
【図２】実施の形態にかかるプローブの先端と試料との距離に対するイオン電流を示す模式図
【図３】実施の形態にかかるイオン伝導顕微鏡における計測手順を示すフローチャート
【図４】実施の形態にかかるプローブ内外の電解液のイオン濃度分布を示す図
【図５】実施の形態にかかるプローブ内外の電解液のイオン濃度に対する正規化伝導度を示す図
【図６】実施の形態および比較例にかかるプローブの応答時間と感度とを示す図
【図７】実施の形態および比較例にかかるプローブの、試料からの高さに対するイオン電流との関係を示す図
【図８】実施の形態および比較例にかかるプローブの、電源電圧に対する信号雑音比を示す図
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、図面を用いて、本発明にかかる実施の形態について説明する。なお、図面において、同一の符号が付された構成要素は、同一または同種の構成要素を示す。
【００２２】
また、以下で説明する実施の形態は、本発明の好ましい一具体例を示す。以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置、接続形態、ステップおよびステップの順序等は、一例であり、本発明を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、本発明の最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、より望ましい形態を構成する任意の構成要素として説明される。
【００２３】
（実施の形態）
走査型のイオン伝導顕微鏡は、内部を電解液で満たしたガラスピペットをプローブとして、ガラスピペットの外部の電解液中に配置された電極とガラスピペットの内部に配置された電極との間に生じるイオン電流を計測する顕微鏡である。このイオン電流は、ガラスピペットの先端が試料に近接して遮蔽されることで変化する。イオン伝導顕微鏡は、この現象を利用しながらガラスピペットを走査して、試料表面の立体形状を画像化するものである。計測対象である試料は、柔らかい生きた真核細胞などである。イオン伝導顕微鏡は、電解液中の真核細胞などを生きたまま立体観察することができる。
【００２４】
［１．イオン伝導顕微鏡の構成］
はじめに、本実施の形態に係るイオン伝導顕微鏡１の構成について説明する。図１は、本実施の形態にかかるイオン伝導顕微鏡１の概略構成図である。
【００２５】
図１に示すように、本実施の形態にかかるイオン伝導顕微鏡１は、試料を保持するステージ１０と、プローブ１１と、駆動部１２と、検出部１３と、制御部１４と、表示部１５と、電源１６とを備えている。
【００２６】
ステージ１０は、底面と側面を有する箱状の形状を有している。ステージ１０の内部には、電解液２０が充填されている。本実施の形態において、電解液２０は第１の電解液である。電解液２０は、例えば、生理溶液成分である塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。電解液２０のイオン濃度は、例えば一般的な生理溶液の濃度である０．１５ｍｏｌ／ｌである。ステージ１０の内部の底面には、試料３０が電解液２０に浸された状態で保持されている。また、ステージ１０の内部には、電極１８が配置されている。本実施の形態において、電極１８は第１の電極である。電極１８は、少なくとも一部が電解液２０に浸された状態で配置されている。なお、電解液２０の種類および濃度は、上述したものに限らず変更してもよい。
【００２７】
プローブ１１は、ピペット１１ａと、ピペット１１ａの内部に充填された電解液２２とを有している。プローブ１１の少なくとも一部は、試料３０の計測の際に、ステージ１０に収容された電解液２０の中に浸される。すなわち、ピペット１１ａの外側の少なくとも一部には、電解液２０が配置されることになる。また、ピペット１１ａの内部には、電解液２２に少なくとも一部が浸された電極１１ｂが配置されている。本実施の形態において、電極１１ｂは第２の電極である。
【００２８】
ピペット１１ａは、例えば長尺な形状を有するガラスで構成され、長尺方向の両端を貫通する貫通孔を有している。ピペット１１ａにおいて、試料３０に近接する一端側の端面における貫通孔の口径は、他端側における貫通孔の口径よりも小さくなっている。試料３０に近接する一端側の端面における貫通孔の口径は、例えば２０ｎｍである。なお、当該一端側の端面における貫通孔の口径は、２０ｎｍに限らず、例えば５０ｎｍ以下であればよい。
【００２９】
なお、ピペット１１ａの貫通孔の内壁の表面は、被覆層（図示せず）で覆われていてもよい。これにより、貫通孔の口径をより小さくすることができる。したがって、イオン伝導顕微鏡において、高いイオン濃度の電解液が貫通孔内から試料が置かれた領域に拡散するのを抑制し、試料が置かれた環境が変化するのをより抑制することができる。被覆層は、例えば、絶縁体であるアルミナで構成されている。なお、被覆層は、アルミナに限らず、計測試料、電解液および貫通孔の口径に応じて、有機物、無機物、それらの複合材料で構成されていても良い。また、被覆層金属、絶縁体、半導体など、どんな電気的特性を有していても良い。
【００３０】
電解液２２は、上述した電解液２０と同様、例えば、生理溶液成分である塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。本実施の形態において、電解液２２は第２の電解液である。電解液２２のイオン濃度は、電解液２０よりも高い。電解液２２のイオン濃度は、例えば電解液２２の室温付近における飽和濃度程度である４ｍｏｌ／ｌである。なお、電解液２２の種類および濃度は、上述したものに限らず変更してもよい。
【００３１】
電極１１ｂは、例えば銀／塩化銀電極等で構成されている。電極１１ｂは、ピペット１１ａの内部において、少なくとも一部が電解液２２に浸されるように配置されている。電極１１ｂは、後述する検出部１３、電源１６および電極１８と電気的に接続されている。これにより、ピペット１１ａの外部の電解液２０中に配置された電極１８とピペット１１ａの内部に配置された電極１１ｂとの間には、イオン電流が生じる。このイオン電流は、ピペット１１ａの先端が試料３０に近接することで変化する。
【００３２】
プローブ１１をステージ１０に収容された電解液２０の中に配置した場合、プローブ１１の貫通孔の口径が小さければ、プローブ１１の先端では安定したイオン濃度勾配が形成され、時間に依存しない定常電流が得られる。そのため、ステージ１０に収容された電解液２０をマクロにみたときには、試料３０が配置された領域近傍の電解液２０のイオン濃度は変化していない。
【００３３】
ここで、プローブ１１の貫通孔の内部に充填された電解液２２のイオン濃度が高いほど、電極１１ｂと電極１８との間の抵抗は減少するため、電解液２２のイオン濃度が低い場合と比べて、電極１１ｂと電極１８にある一定電圧を印加した際に、電極１１ｂと電極１８との間に流れるイオン電流は増加する。例えば、生理溶液成分である塩化カリウムを電解液２０および２２として用いた場合では、プローブ１１の貫通孔内に充填される電解液２２のイオン濃度を電解液２０と同等とした場合と比較して、最大で８倍程度のイオン電流の増加が生じる。したがって、電解液２２のイオン濃度を電解液２０のイオン濃度よりも高くすることにより、電極１１ｂと電極１８にある一定電圧を印加した際に、イオン電流を高い信号雑音比で得ることができる。
【００３４】
図２は、本実施の形態にかかるプローブ１１の先端と試料３０との距離に対するイオン電流を示す模式図である。なお、プローブ１１の先端とは、プローブ１１の、試料３０に近接する一端のことをいう。
【００３５】
図２に示すように、プローブ１１では、試料３０に近接する一端側の端面（先端）と試料３０との間の距離を大きくするにつれてイオン電流が変化し、所定の距離を超えると、イオン電流はほとんど変化しなくなる。そこで、このほとんど変化しなくなるイオン電流値からの所定の変化の値Ｉ１であるに場合におけるプローブ１１の先端と試料３０との距離Ｄ１をセットポイントとする。そして、セットポイントにおけるイオン電流変化の値Ｉ１以上のイオン電流が流れる場合を非接触状態、セットポイントにおけるイオン電流変化の値Ｉ１より小さいイオン電流が流れる場合を接触状態としている。ここで、セットポイントにおけるイオン電流の値Ｉ１とは、例えば、図２に示すように、飽和したイオン電流との差分Δが、飽和したイオン電流の大きさの１％小さい（−１％）イオン電流の値としてもよい。なお、プローブ１１の特徴の詳細については、後述する。
【００３６】
駆動部１２は、プローブ１１をＸ方向、Ｙ方向およびＺ方向に移動させる走査機構である。駆動部１２は、例えばピエゾアクチュエータで構成されている。駆動部１２は、制御部１４から印加される電圧信号に基づいて、プローブ１１をＸ方向、Ｙ方向およびＺ方向に移動させる。なお、駆動部１２は、プローブ１１をＸ方向、Ｙ方向およびＺ方向にそれぞれ移動させる駆動部を別々に有していてもよい。また、駆動部１２は、プローブ１１のみに設けられた構成でなくてもよい。例えば、駆動部１２は、ステージ１０に設けられ、ステージ１０をＸ方向、Ｙ方向およびＺ方向に移動させる構成であってもよい。また、例えばステージ１０にＸ方向およびＹ方向に移動させる駆動部を設け、プローブ１１にＺ方向に移動させる駆動部を設けるなど、複数の駆動部を設ける構成であってもよい。すなわち、駆動部１２は、プローブ１１とステージ１０とを相対的に走査させる構成であればよい。
【００３７】
検出部１３は、例えば電流計である。検出部１３、電源１６、電極１１ｂおよび電極１８は電解液２０および２２を介して電気的に接続されているため、電源１６により電圧が印加されると、電極１１ｂと電極１８との間には電解液２０および２２を介してイオン電流が流れる。検出部１３は、このイオン電流を検出する。
【００３８】
制御部１４は、上述した駆動部１２に電圧信号を印加することにより、プローブ１１をステージ１０に対して相対的に走査させる。制御部１４は、検出部１３で計測されたイオン電流に基づいて、ステージ１０に保持された試料３０とプローブ１１との距離を調整する。具体的には、制御部１４は、駆動部１２を制御して、試料３０とプローブ１１とが所定の距離を維持するようにプローブ１１のＺ方向の高さを調整しながら、プローブ１１をＺ方向に直交するＸ方向およびＹ方向に移動させる。
【００３９】
これにより、例えば、プローブ１１はＸ方向に１ピクセル移動し、当該ピクセルにおいて１０μｓｅｃ静止してイオン電流を検出し、当該イオン電流に基づいてプローブ１１の高さが調整される。そして、順次この動作が繰り返され、一画面分の走査が行われる。このとき、プローブ１１のＸ方向およびＹ方向の位置も、ＸＹＺ座標として検出される。なお、一画面とは、５０×５０ピクセルの画面としてもよい。５０×５０ピクセルの一画面分の計測に要する時間は、例えば１ｓｅｃである。なお、一画面は５０×５０ピクセルに限らず、１００×１００ピクセルとしてもよい。
【００４０】
また、制御部１４は、ステージ１０に対するプローブ１１のＸＹＺ方向の相対的な移動距離を表示部１５に表示させる制御を行う。具体的には、制御部１４は、後述する表示部１５に、ステージ１０に対するプローブ１１のＸＹＺ方向の相対的な移動距離またはＸＹＺ座標を伝達し、各座標におけるイオン電流を二次元または三次元的に表示させてもよい。
【００４１】
表示部１５は、制御部１４から伝達されたＸＹＺ座標に基づいて、試料３０の表面状態、形状および動きなどを表示するモニターである。
【００４２】
以上の構成により、イオン伝導顕微鏡１において、試料３０を載置したステージ１０とプローブ１１とを相対的にＸＹＺ方向に走査することにより、試料３０の表面状態、形状および動作などの情報を得ることができる。このとき、検出したイオン電流に基づいてプローブ１１と試料３０との距離を制御することにより、イオン伝導顕微鏡１を安定して高速に走査することができるので、計測データを安定して高速に取得することができる。
【００４３】
ここで、イオン伝導顕微鏡１による試料の計測の手順について説明する。図３は、実施の形態にかかるイオン伝導顕微鏡１における計測手順を示すフローチャートである。
【００４４】
図３に示すように、はじめに、電解液２０が収容されたステージ１０の内部の底面に試料３０を配置する（試料準備工程）（ステップＳ１１）。試料３０は、電解液２０に浸された状態である。なお、電解液２０は、試料３０をステージ１０の内部の底面に配置した後にステージ１０の内部に収容されてもよいし、あらかじめステージ１０の内部に収容されていてもよい。
【００４５】
次に、プローブ１１の貫通孔の内部に、電解液２２を充填する（充填工程）（ステップＳ１２）。電解液２２は、例えば試料３０に近接する先端と反対側、すなわち、貫通孔の口径の大きい側から貫通孔の内部に充填してもよい。また、電解液２２を充填した後、プローブ１１の貫通孔の内部に、少なくとも一部が電解液２２に浸されるように電極１１ｂを配置する。
【００４６】
なお、試料３０をステージ１０に配置する試料準備工程と、プローブ１１の貫通孔内に電解液２２を充填する充填工程とは、いずれを先に行ってもよいし、同時に行ってもよい。
【００４７】
次に、電極１１ｂと電極１８との間に生じるイオン電流を検出部１３により検出する（電流計測工程）。そして、検出されたイオン電流の大きさに基づいて、試料３０に対するプローブ１１の高さを調整する（高さ調整工程）（ステップＳ１３）。さらに、試料３０とプローブ１１との距離を所定の距離に維持するように制御を行いながら、プローブ１１をＸ方向およびＹ方向に走査する（走査工程）。そして、ピクセルごと（または、所定時間ごと）のＸＹＺ座標を計測する（ステップＳ１４）。さらに、計測したＸＹＺ座標を表示部１５に表示させる（ステップＳ１５）。このときの表示は、プローブ１１の走査を行いながら順次行ってもよい。このようにして、イオン伝導顕微鏡１により、試料３０の表面状態を計測することができる。
【００４８】
［２．プローブの構成］
ここで、プローブの構成について詳細に説明する。図４は、実施の形態にかかるプローブ１１の内外の電解液２０および２２のイオン濃度分布を示す図である。図４において、（ａ）はプローブ１１の先端における貫通孔の開口からの正規化距離と、電解液２０および２２のイオン濃度およびイオン濃度の微分値を一次元的に示している。また、図４において、（ｂ）はプローブ１１の先端における貫通孔の開口の中心からの正規化距離と、電解液２０および２２のイオン濃度を二次元的に示している。図４の（ａ）は、図４の（ｂ）に示す、貫通孔の開口の中心をプローブ１１の長尺方向に通る矢印の位置における電解液２２のイオン濃度を示している。また、図４の（ａ）に示す破線はイオン濃度、実線はイオン濃度の微分値を示している。なお、正規化距離とは、プローブ１１の先端における貫通孔の口径を１としたときの距離である。
【００４９】
図４の（ａ）に破線で示すように、プローブ１１の外には電解液２０が配置されているため、電解液のイオン濃度は０．１５ｍｏｌ／ｌが示されている。一方、プローブ１１の貫通孔の内部には電解液２２が充填されているため、電解液のイオン濃度は貫通孔の開口から貫通孔の内部に行くにつれて４ｍｏｌ／ｌに近づくように高くなっている。また、図４の（ａ）に実線で示すように、イオン濃度の微分値を見ると、プローブ１１の外側では、貫通孔の開口に近づくにつれてイオン濃度の変化量が大きくなり、プローブ１１の貫通孔の内部では、貫通孔の開口から離れるにつれてイオン濃度の変化量は小さくなっている。つまり、プローブ１１の貫通孔の開口付近、特に、プローブ１１の外側において貫通孔の開口付近にイオン濃度の高い領域が存在していることがわかる。ここで、例えば、貫通孔の中心からプローブ１１の外側に正規化距離が５離れた位置（図４の（ａ）に示す正規化距離が−５の位置）では、電解液のイオン濃度は０．１５ｍｏｌ／ｌを示している。したがって、生細胞等の生物試料の計測において、貫通孔の開口の中心から少なくとも正規化距離が５離れた位置では、イオン濃度が高い電解液により試料３０がダメージを受けることを抑制することができる。
【００５０】
なお、図４の（ｂ）に示すように、イオン濃度が高い領域は、プローブ１１の高さ方向だけでなく、高さ方向と直交する方向にも、高さ方向と同様に分布していることがわかる。
【００５１】
また、図５は、実施の形態にかかるプローブ１１内外の電解液２０および２２のイオン濃度に対する正規化伝導度を示す図である。正規化伝導度とは、イオン濃度が０．１５ｍｏｌ／ｌのときの伝導度を１としたときの伝導度である。
【００５２】
図５に示すように、正規化伝導度は、電解液のイオン濃度が高くなるにつれて急激に増加する。つまり、電解液のイオン濃度が高くなるほどイオン電流が流れやすくなる。例えば、図５では、イオン濃度が４ｍｏｌ／ｌの場合の正規化伝導度は、実験による平均値が７．５、シミュレーションによる値が７程度という結果が得られている。
【００５３】
したがって、電解液のイオン濃度が高い領域は、プローブ１１の貫通孔の開口近傍にのみ存在するので、プローブ１１の貫通孔から離れた位置に配置された試料は、イオン濃度が高い電解液に接触することがなく、生物試料等の計測において、高いイオン濃度の電解液により試料がダメージを受けるのを抑制しつつ、イオン電流を大きくすることができる。これにより、試料にダメージを与えることなく、高感度でイオン電流を検出し、試料３０に対するプローブ１１の高さを素早く調整することができる。したがって、イオン伝導顕微鏡１において、プローブ１１を高速に走査することができる。
【００５４】
［３．プローブの特性］
以下、上述したプローブの特性を、比較例にかかるプローブの特性と比較しながら説明する。比較例に係るプローブとは、プローブの貫通孔の内部に０．１５ｍｏｌ／ｌの電解液を充填した場合である。
【００５５】
図６は、実施の形態および比較例にかかるプローブ１１の応答時間と感度とを示す図である。図６において、（ａ）はガラス基板４０からのプローブ１１の高さを示す模式図、（ｂ）はイオン電流、（ｃ）は駆動部１２の移動高さを示している。また、図６の（ｂ）では、本実施の形態に係るプローブ１１の結果を実施例として実線で示し、比較例に係るプローブ１１の結果を破線で示している。
【００５６】
図６の（ｂ）および（ｃ）では、プローブ１１がガラス基板４０に対して所定の高さで移動するときの、検出部１３で検出されたイオン電流と、駆動部１２によりプローブ１１を調整した高さとを示している。図６の（ｂ）および（ｃ）では、プローブ１１の高さを２０μｓｅｃで１０ｎｍ上昇させ、１５０μｓｅｃその高さを維持した後、２０μｓｅｃで１０ｎｍ下降させた場合を示している。
【００５７】
図６の（ａ）および（ｃ）に示すように、本実施の形態に係るプローブ１１を移動させるときに、駆動部１２によりプローブ１１の高さを１０ｎｍ上昇させると、それに伴い、図６の（ｂ）に示すように、イオン電流は１ｎＡ程度増加している。これに対し、比較例に係るプローブ１１では、プローブの高さを１０ｎｍ変化させても、図６の（ｂ）に示すように、イオン電流に変化は見られない。これは、比較例に係るプローブ１１の高さ変化に伴うイオン電流変化がイオン電流検出装置のノイズレベルよりも小さいことを意味している。
【００５８】
また、図６の（ｂ）と（ｃ）とを比較すると、本実施の形態に係るプローブ１１では、プローブ１１の高さを上昇させるとほぼ同時に、イオン電流も増加し、プローブ１１の高さを下降させるとほぼ同時に、イオン電流も減少している。したがって、本実施の形態に係るプローブ１１では、イオン電流に応じてプローブ１１の高さを高速にかつ精度よく調整することで、表面形状を高速に計測することが可能である。
【００５９】
なお、図７は、実施の形態および比較例にかかるプローブ１１の、試料３０からの高さに対する正規化イオン電流の関係を示す図である。ここでは、この曲線をアプローチカーブと称する。正規化イオン電流とは、試料３０とプローブ１１の先端とが十分に遠離れ、イオン電流がプローブと表面距離に依らない位置で得られるイオン電流を１としたときのイオン電流である。また、図７では、本実施の形態に係るプローブ１１の結果を実施例として実線で示し、比較例に係るプローブ１１の結果を破線で示している。図７において、実施例は比較例に対して、同様のバイアス電圧において、計測されるイオン電流の値が７倍程度大きい。
【００６０】
図７に示すように、同一形状のプローブ１１を用いて、正規化イオン電流値を計測することにより得られるアプローチカーブは、実施例と比較例において殆ど差が見られない。つまり、本実施の形態に係るプローブ１１では、プローブ１１が試料３０に近接しているか否かを判断するセットポイントの値は、正規化イオン電流値を用いれば、比較例に係るプローブ１１の場合とほぼ同等であることがわかる。したがって、本実施の形態に係るプローブ１１を用いても、プローブ１１の先端と試料３０との間の距離を適切に検出することができる。
【００６１】
また、図８は、実施の形態および比較例に係るプローブ１１の、電源１６により印加した電圧Ｖｂに対する信号雑音比を示す図である。図８では、本実施の形態に係るプローブ１１の結果を実施例として実線および黒四角で示し、比較例に係るプローブ１１の結果を破線および黒丸で示している。
【００６２】
図８に示すように、本実施の形態に係るプローブ１１では、比較例に係るプローブ１１と比べて、電源１６から電極１１ｂおよび１８を介して電解液２０および２２に印加される電圧Ｖｂを増加させたときの信号雑音比が大きく向上している。つまり、本実施の形態に係るプローブ１１では、電圧Ｖｂを増加させたときの信号の値が大きく増加している。したがって、本実施の形態に係るプローブ１１では、電源１６の電圧Ｖｂの大きさに応じてイオン電流の値を大きくし、プローブ１１の高さを精度よく調整することができる。したがって、イオン伝導顕微鏡１において、高速動作と高い空間分解能とを実現することができる。
【００６３】
［４．効果等］
以上、本実施の形態にかかるイオン伝導顕微鏡１および表面計測方法によると、電解液のイオン濃度が高い領域は、プローブ１１の貫通孔の開口近傍にのみ存在するので、プローブ１１の貫通孔から離れた位置に配置された試料は、イオン濃度が高い電解液に接触することがなく、高いイオン濃度の電解液により、生物試料等の計測において、試料がダメージを受けるのを抑制しつつ、イオン電流を大きくすることができる。これにより、試料にダメージを与えることなく、高感度でイオン電流を検出し、試料３０に対するプローブ１１の高さを素早く調整することができる。したがって、イオン伝導顕微鏡１において、プローブ１１を高速で走査することができる。
【００６４】
また、本実施の形態に係るプローブ１１では、電源１６から電極１１ｂおよび１８を介して電解液２０および２２に印加される電圧Ｖｂを増加させたときの信号雑音比が大きく向上するため、高分解能で試料３０の表面状態を計測することができる。
【００６５】
（その他の実施の形態）
以上、本発明にかかるイオン伝導顕微鏡について、実施の形態に基づいて説明したが、本発明は実施の形態に限定されるものではない。実施の形態に対して当業者が思いつく変形を施して得られる形態、および、複数の実施の形態における構成要素を任意に組み合わせて実現される別の形態も本発明に含まれる。
【００６６】
例えば、上述した実施の形態では、イオン伝導顕微鏡においてプローブをＸＹＺ方向に移動する構成を示したが、この構成に限らず、例えば、ステージをＸＹ方向、プローブをＺ方向に移動する構成としてもよい。また、ステージがＺ方向に移動する構成であってもよい。
【００６７】
また、プローブの試料に近接する一端側の端面における貫通孔の口径は、上述した２０ｎｍに限らず、適宜変更してもよい。
【００６８】
また、第１の電解液のイオン濃度は、上述した０．１５ｍｏｌ／ｌに限らず、試料に応じて適宜変更してもよい。また、第２の電解液のイオン濃度は、第１の電解液のイオン濃度よりも高い濃度であればよく、上述した４ｍｏｌ／ｌに限らず適宜変更してもよい。
【００６９】
また、試料をステージに配置する試料準備工程と、プローブの貫通孔内に第２の電解液を充填する充填工程とは、いずれを先に行ってもよいし、同時に行ってもよい。
【００７０】
また、駆動部は、上述したようにピエゾアクチュエータに限らず、モータ式の駆動部等他の駆動部であってもよい。
【００７１】
また、イオン伝導顕微鏡の構成は、上記したものに限らず、適宜変更してもよい。また、上述したプローブは、イオン伝導顕微鏡に限らず、他の顕微鏡のプローブとして用いられてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明にかかる表面計測方法は、プローブを試料に対して走査することにより、試料表面の物理情報または試料の化学的性質を信号として取得する走査型のイオン伝導顕微鏡等に有用である。
【符号の説明】
【００７３】
１  イオン伝導顕微鏡
１０  ステージ
１１  プローブ
１１ａ  ピペット
１１ｂ  電極（第２の電極）
１８  電極（第１の電極）
１２  駆動部
１３  検出部
１４  制御部
１５  表示部
１６  電源
２０  電解液（第１の電解液）
２２  電解液（第２の電解液）
３０  試料
４０  ガラス基板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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