(57)【要約】      （修正有）【課題】ラクトバチルス・カルバタスＣＰ２９９８株を検出できる新規な技術を提供することを目的とする。【解決手段】ラクトバチルス・カルバタスＣＰ２９９８株（受託番号：ＮＩＴＥ ｐ−０２０３３）である乳酸菌株を検出するためのプライマー対であって、ある特定の塩基配列からなるフォワードプライマーと別のある特定の塩基配列からなるリバースプライマーとにより構成されるプライマー対。該プライマー対を用いて、検体のＤＮＡの特定領域を増幅し、前記ＤＮＡの特定領域を増幅して得られた増幅産物をＮｌａ ＩＶで処理し、前記Ｎｌａ ＩＶで処理された前記増幅産物の塩基配列の長さに基づき、前記乳酸菌株を検出する、乳酸菌株の検出方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・カルバタス ＣＰ２９９８株（受託番号：ＮＩＴＥ  ｐ−０２０３３）である乳酸菌株を検出するためのプライマー対であって、
配列表の配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列表の配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとにより構成されるプライマー対。
【請求項２】
ラクトバチルス・カルバタス ＣＰ２９９８株（受託番号：ＮＩＴＥ  ｐ−０２０３３）である乳酸菌株の検出方法であって、
配列表の配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列表の配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとにより構成されるプライマー対を用いて、検体のＤＮＡの特定領域を増幅し、
前記ＤＮＡの特定領域を増幅して得られた増幅産物をＮｌａ ＩＶで処理し、
前記Ｎｌａ ＩＶで処理された前記増幅産物の塩基配列の長さに基づき、前記乳酸菌株を検出する、
乳酸菌株の検出方法。
【請求項３】
前記Ｎｌａ ＩＶで処理された前記増幅産物の塩基配列の長さを、前記ＤＮＡの前記特定領域を増幅して得られた前記増幅産物の塩基配列の長さと比較して、前記乳酸菌株を検出する請求項２に記載の乳酸菌株の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトバチルス・カルバタス ＣＰ２９９８株を検出するためのプライマー対及びそのプライマー対を用いたラクトバチルス・カルバタス ＣＰ２９９８株の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、乳酸菌を含む様々な食品が開発されており、それらの食品の中には、食品に含まれる乳酸菌の作用により、体調を整える機能が発揮される食品（以下、「機能性食品」ともいう）がある。このような機能性食品を提供するには、機能性食品に含まれる乳酸菌の株を同定・検出するための手法を確立することが必要となる。
【０００３】
通常、菌（菌株や菌種）の同定・検出には、非特許文献１に記載される手法に従い、被検菌の鏡検による形態観察および生理・生化学的試験、すなわち表現形質による同定が行われる。しかしながら、表現形質を基にした同定法は非常に煩雑で判定に熟練の技能を要し、多大な時間と労力を要する。加えて、食品中の乳酸菌は、調理や殺菌の過程で加熱されて死滅することもあるが、表現形質による同定には、加熱死菌を適用することが困難である。
【０００４】
そこで、塩基配列情報を解析して、菌（菌株や菌種）を同定・検出する様々な手法が開発されてきた。このような手法としては、例えば、（ａ）１６Ｓ ｒＲＮＡ配列解析法や、（ｂ）ＲＡＰＤ法（Ｒａｎｄｏｍｌｙ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ法）や、（ｃ）ＰＦＧＥ法（Ｐｕｌｓｅｄ−Ｆｉｅｌｄ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ法）や、（ｄ）ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法（ＰＣＲ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ法）等が挙げられる。
【０００５】
（ａ）１６Ｓ ｒＲＮＡ配列解析法は、例えば、特許文献１に記載されており、リボソームの小サブユニットを構成する１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を用いて同定・検出する手法である。（ｂ）ＲＡＰＤ法は、例えば、非特許文献２に記載されており、任意に合成した複数のプライマーを用いて、ＤＮＡ中の異なる複数の特定領域をＰＣＲで増幅し、増幅産物の塩基配列の長さ（バンドパターン）から同定・検出する手法である。（ｃ）ＰＦＧＥ法は、ゲノムＤＮＡを制限酵素で処理し、ＤＮＡ断片の塩基配列の長さ（バンドパターン）から同定・検出する手法である。（ｄ）ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、ＰＣＲで増幅したＤＮＡの特定領域を制限酵素で処理し、ＤＮＡ断片の塩基配列の長さ（バンドパターン）から同定・検出する手法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平０３−２３６７９９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】バージーズ  マニュアル  デターミネイティブ  バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｖｏｌ．２、（１９８６年）
【非特許文献２】インターナショナル  ジャーナル  オブ  システマティック  バクテリオロジー  （ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），ミクロバクテリオロジー  ソサエティ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ），４９巻, （１９９９年）, Ｐ９９７〜１００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
１６Ｓ ｒＲＮＡ配列解析法は微生物の系統分類には多用されるが、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列は同一菌種内で保存性が高く、同一菌種内において菌株の異同を区別することは難しいという問題がある。また、ＰＦＧＥ法は、菌株の識別能力に長けているが、分析には一定以上のＤＮＡを必要とし、乳酸菌を少量しか含まない食品分析では適用しにくいという問題がある。
【０００９】
本発明は、ラクトバチルス・カルバタス ＣＰ２９９８株を検出できる新規な技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の要旨は以下のとおりである。
【００１１】
［１］ラクトバチルス・カルバタス ＣＰ２９９８株（受託番号：ＮＩＴＥ  ｐ−０２０３３）である乳酸菌株を検出するためのプライマー対であって、配列表の配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列表の配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとにより構成されるプライマー対。
【００１２】
［２］ラクトバチルス・カルバタス ＣＰ２９９８株（受託番号：ＮＩＴＥ  ｐ−０２０３３）である乳酸菌株の検出方法であって、配列表の配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列表の配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとにより構成されるプライマー対を用いて、検体のＤＮＡの特定領域を増幅し、前記ＤＮＡの特定領域を増幅して得られた増幅産物をＮｌａ ＩＶで処理し、前記Ｎｌａ ＩＶで処理された前記増幅産物の塩基配列の長さに基づき、前記乳酸菌株を検出する、乳酸菌株の検出方法。
【００１３】
［３］前記Ｎｌａ ＩＶで処理された前記増幅産物の塩基配列の長さを、前記ＤＮＡの前記特定領域を増幅して得られた前記増幅産物の塩基配列の長さと比較して、前記乳酸菌株を検出する［２］に記載の乳酸菌株の検出方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ラクトバチルス・カルバタス ＣＰ２９９８株を検出できる新規な技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】参考例１の電気泳動の分析結果を示す図である。
【図２】参考例２の電気泳動写真である。
【図３】実施例１の電気泳動の分析結果を示す図である。
【図４】実施例２の電気泳動写真である。
【図５】実施例２の電気泳動の分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
まず、本発明を完成するに至った経緯を説明する。
【００１７】
乳酸菌であるラクトバチルス・カルバタス ＣＰ２９９８株（以下、単に「ＣＰ２９９８株」ともいう）は、特開２０１６−２１６４０８号公報に記載されるように、筋肉の分解を抑制することが知られており、ＣＰ２９９８株を食品に含有することが検討されている。このため、食品に含まれるＣＰ２９９８株の検出方法を確立することが必要であった。
【００１８】
そこで、本発明者らは、まず、後述する実施例に示す通り、ＲＡＰＤ法（ｒａｎｄｏｍｌｙ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ法）によりＣＰ２９９８株が検出できないか否かを検討した。ここで、ＲＡＰＤ法は、任意に合成した複数のプライマーを用いて、ＤＮＡ中の異なる複数の特定領域をＰＣＲで増幅し、増幅産物の塩基配列の長さ（バンドパターン）から同定・検出する手法である。
【００１９】
しかしながら、加熱死菌となったＣＰ２９９８株は、ＲＡＰＤ法によっては検出することができなかった。この結果について検討したところ、ＲＡＰＤ法によってＣＰ２９９８株が検出できなかったのは、加熱死菌のＣＰ２９９８株では、ＤＮＡが加熱によって分解（切断）されていることを原因としていることを突き止めた。
【００２０】
食品を製造する過程（例えば、調理過程や、成形過程や、殺菌過程）では、通常、食品に熱が加えられるため、ＣＰ２９９８株は加熱死菌となる。このため、本発明者等は、食品に含まれるＣＰ２９９８株を検出するには、ＤＮＡが分解されるか否かにかかわらず検出できることが必要だと考えた。
【００２１】
そこで、本発明者等は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法（ＰＣＲ − Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ法）に着目した。そして、ＣＰ２９９８株のＤＮＡのうち、ＣＰ２９９８株以外の他の乳酸菌株（以下、単に「他の乳酸菌株」ともいう）とは塩基配列が異なる特定領域（以下、「多型領域」ともいう）を利用し、食品に含まれるＣＰ２９９８株を検出できないかを検討した。ここで、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、ＰＣＲで増幅したＤＮＡの特定領域を制限酵素で処理し、ＤＮＡ断片の塩基配列の長さから同定・検出する手法である。
【００２２】
その結果、複数ある多型領域の中に、食品の製造過程などでＤＮＡが分解されたとしても保存されやすい（つまり、切断されにくい）多型領域であって、乳酸菌株のうちＣＰ２９９８株については制限酵素で切断できない多型領域があることを見出した。この多型領域に着目してさらに検討を進め、本発明者等は、本発明を完成させた。
【００２３】
以下、本発明の一実施形態について説明する。
【００２４】
まず、本実施形態のプライマー対について説明する。
【００２５】
本実施形態のプライマー対は、ＣＰ２９９８株を検出するためのプライマー対であり、本実施形態のプライマー対によれば、食品に含まれるＣＰ２９９８株を検出することができる。
【００２６】
なお、本実施形態において、検出とは、検体がＣＰ２９９８株であるか否かを同定すること指す。言い換えれば、検出とは、検体がＣＰ２９９８株であると同定すること、及び／又は検体がＣＰ２９９８株でないと同定することを指す。また、ＣＰ２９９８株は、乳酸菌であり、ラクトバチルス・カルバタス菌種の中の１種の菌株である。ＣＰ２９９８株は、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ-０２０３３として２０１５年４月１５日に特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００２７】
本実施形態のプライマー対は、配列表の配列番号１（以下、単に「配列番号１」ともいう）で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列表の配列番号２（以下、単に「配列番号２」ともいう）で表される塩基配列からなるリバースプライマーとにより構成される一対のプライマーである。
【００２８】
配列番号１の塩基配列は、以下の通りである。
５’- ＧＣＧＡＴＧＣＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＴＧＣ -３’ 
【００２９】
配列番号２の塩基配列は、以下の通りである。
５’- ＣＧＣＡＡＴＡＴＣＡＣＣＣＡＴＴＴＴＴＡＧＧ-３’
【００３０】
配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーは、配列番号１で表される塩基配列のフォワードプライマーそのものだけでなく、配列番号１の塩基配列と実質的に相同な塩基配列のフォワードプライマーを含む。同様に、配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーは、配列番号２で表される塩基配列のリバースプライマーそのものだけでなく、配列番号２の塩基配列と実質的に相同な塩基配列のリバースプライマーを含む。
【００３１】
本実施形態において、実質的に相同とは、後述するＤＮＡの特定領域（後述するＦＴＬ遺伝子の特定領域）を増幅できるプライマーとして機能し得る程度の相同性を意味する。つまり、本実施形態のプライマー対は、必ずしも、配列番号１で表される塩基配列のフォワードプライマー（そのもの）と、配列番号２で表される塩基配列のリバースプライマー（そのもの）により構成される必要はなく、各プライマーは、１個もしくは数個（５個以下）の塩基が置換、付加もしくは欠失したものであってもよい。なお、フォワードプライマーの３’末端側は、後述する制限酵素の認識能に影響することがあるため、該酵素の認識配列であるＧＧＮＮＣ（Ｎは任意の塩基を指す）に相当するＧＧＴＧＣについては、置換、付加もしくは欠失していないことが好ましい。
【００３２】
本実施形態のプライマー対を構成する各プライマーは、例えば、公知の核酸合成法により化学的に合成することができ、また、例えば、ＤＮＡ合成装置で合成することもできる。
【００３３】
本実施形態のプライマー対は、検体のＤＮＡを鋳型とした核酸増幅に用いられる。本実施形態のプライマー対を用いて、検体のＤＮＡを鋳型とした核酸増幅を行うことで、各プライマーの配列に相当する塩基配列に挟まれた特定領域が増幅される。本実施形態のプライマー対により増幅される特定領域は、具体的には、Ｆｏｒｍａｔｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｌｉｇａｓｅ（ギ酸テトラヒドロ葉酸リガーゼ）遺伝子の塩基配列のうちの一部の領域（以下、「ＦＴＬ遺伝子の特定領域」ともいう）である。
【００３４】
本実施形態のプライマー対は、ＣＰ２９９８株のＦＴＬ遺伝子の特定領域だけでなく、ＦＴＬ遺伝子を有する他の乳酸菌株のＦＴＬ遺伝子の特定領域を増幅することもできる。しかしながら、ＣＰ２９９８株のＦＴＬ遺伝子の特定領域は、他の乳酸菌株のＦＴＬ遺伝子の特定領域とは１塩基異なっており、後述するＦＴＬ制限酵素で切断することができない。一方で、他の乳酸菌株のＦＴＬ遺伝子の特定領域については、たとえＣＰ２９９８株と同じ菌種であるラクトバチルス・カルバタスであっても、ＦＴＬ制限酵素により認識されて切断される。このため、本実施形態のプライマー対を用いて、検体のＦＴＬ遺伝子の特定領域を増幅し、その増幅産物をＦＴＬ制限酵素で処理することにより、検体がＣＰ２９９８株であるか否かを同定することができる（つまり、ＣＰ２９９８株を検出することができる。）。
【００３５】
また、本実施形態のプライマー対で増幅されるＦＴＬ遺伝子の特定領域は、熱や衝撃などによりＤＮＡが分解されたとしても、保存されやすい領域である。このため、本実施形態のプライマー対によれば、食品の製造過程などによりＤＮＡが分解されてしまったとしてもＣＰ２９９８株を検出することができる。
【００３６】
次に、本実施形態のプライマー対を用いて、ＣＰ２９９８株を検出する方法を説明する。
【００３７】
本実施形態の検出方法は、（１）増幅工程と、（２）酵素処理工程と、（３）検出工程を含む。
【００３８】
（１）増幅工程では、本実施形態のプライマー対を用いて検体のＤＮＡの特定領域を増幅する。増幅工程で増幅されるＤＮＡの特定領域は、上述したＦＴＬ遺伝子の特定領域である。
【００３９】
ここで、検体とは、ＤＮＡを遺伝情報として保有している生物を指し、具体的には、乳酸菌を指す。つまり、本実施形態の検出方法では、ＣＰ２９９８株の他、他の乳酸菌株を検体として用いてもよい。なお、検体は、生菌であってもよく、死菌であってもよい。
【００４０】
増幅工程で用いられる検体のＤＮＡは、少なくとも、ＦＴＬ遺伝子の特定領域を含むものであればよく、熱や衝撃により分解されたＤＮＡ（つまり、ＤＮＡ断片）であってもよい。増幅工程で用いられる検体のＤＮＡは、例えば、検体から抽出（単離）したＤＮＡを用いることができる。
【００４１】
ＤＮＡの抽出は、公知の方法で行うことができ、特に限定されるものではない。例えば、Ｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等の試薬キットを使用することで、検体からＤＮＡを抽出しやすくなる。
【００４２】
増幅工程で用いられる検体が生菌である場合、検体を培養したうえで、ＤＮＡの抽出（単離）を行ってもよい。培養は、特に限定されるものではないが、例えば、ＭＲＳ（ｄｅ Ｍａｎ, Ｒｏｇｏｓａ ａｎｄ Ｓｈａｒｐｅ）などの寒天培地を用いて行うことができる。培養の温度は、特に限定されるものではないが、例えば、２５〜３７℃とすることができ、至適増殖温度の観点から３０℃であることが好ましい。培養の期間は、１〜２日間とすることができ、増殖速度の観点から１日間であることが好ましい。ＤＮＡの抽出には、培養物を遠心分離して集めた検体を用いて行うことができる。
【００４３】
ここで、検体が食品に含まれている場合、ＤＮＡの抽出には、食品から分離した検体を用いることができる。検体の分離は、食品の組成に応じて常法を用いることができる。
【００４４】
増幅工程において、ＦＴＬ遺伝子の特定領域の増幅には、核酸増幅反応、つまり、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いることができる。ＰＣＲでは、ＤＮＡの変性、変性したＤＮＡへの各プライマーのアニーリング、及び特定領域の伸長反応を行い、これらの反応を複数サイクル繰り返す。
【００４５】
ＰＣＲは、公知の方法で行うことができるが、例えば、Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社製）等のＰＣＲ試薬キットを使用することによって、より簡便に行うことができる。
【００４６】
このようなキットを用いる場合、使用キットの推奨条件にてＰＣＲを行うことができる。推奨条件にてＰＣＲを行う場合、アニーリング温度については、最適な条件を検討することが好ましい。また、伸長時間（伸長反応の時間）は、増幅産物の塩基配列の長さを考慮して決定することができ、上述したＰＣＲ試薬キット（Ｅｘ Ｔａｑ）においては、予想される増幅産物長１ｋｂに対して６０秒間を推奨している。
【００４７】
また、上述したＰＣＲ試薬キット（Ｅｘ Ｔａｑ）を用いてＰＣＲを行う場合、例えば、ＰＣＲに用いる溶液の総量を５０μＬとすると、キット付属の反応緩衝液５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、プライマー各１μＭ、鋳型ＤＮＡ（検体のＤＮＡ） ５００ｎｇ、及びＥｘ Ｔａｑ  ２．５Ｕを含む反応液を、サーマルサイクラーにより９４℃で３分間予備加熱し、その後、ＤＮＡの変性を９４℃で３０秒間、アニーリングを５５℃で３０秒間、伸長反応を７２℃で１５秒間行い、これらの処理を３５サイクル繰り返し行うことができる。なお、検体のＤＮＡは、緩衝液（例えば、ＴＥ緩衝液等）で溶解されていてもよく、この場合、例えば、ＤＮＡの濃度を約１００ｎｇ/μＬとすることができる。
【００４８】
（２）酵素処理工程では、増幅工程で増幅された特定領域（ＦＴＬ遺伝子の特定領域）の増幅産物を制限酵素で処理する。
【００４９】
酵素処理工程において、増幅産物を制限酵素で処理するとは、制限酵素と増幅産物を緩衝液の存在下で共存させることを指し、必ずしも、増幅産物を制限酵素で切断する処理を指すものでない。なお、緩衝液としては使用する制限酵素に適したものを選択すればよく、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒシリーズ（タカラバイオ社製）やＲＥ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒシリーズ（ニッポンジーン社製）の中から選択することができる。例えば、後述する制限酵素であるＮｌａ ＩＶには、ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ社製）を用いることができる。
【００５０】
制限酵素には、ＦＴＬ遺伝子の特定領域を認識する制限酵素であって、変異が生じているＦＴＬ遺伝子の特定領域を認識しない制限酵素（以下、「ＦＴＬ制限酵素」ともいう）が用いられる。ＦＴＬ制限酵素は、具体的には、Ｎｌａ ＩＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ社製）である。
【００５１】
増幅産物のＦＴＬ制限酵素による処理は、公知の方法で行うことができる。例えば、Ｎｌａ ＩＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ社製）を用いる場合、増幅産物のＦＴＬ制限酵素による処理は、反応液の総量を５０μＬとすると、Ｎｌａ ＩＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ社製）に付属されるＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ５μＬ、増幅産物１５μＬ、ＮｌａＩＶ ０．５Ｕを含む反応液を、サーマルサイクラーにより３７℃で６０分間処理し、６５℃で２０分間の不活性化を行えばよい。
【００５２】
ＣＰ２９９８株では、ＦＴＬ遺伝子の特定領域が、他の乳酸菌株と１塩基異なっているため、上述したＦＴＬ制限酵素により認識されない。このため、処理工程では、ＣＰ２９９８株の増幅産物はＦＴＬ制限酵素で切断されない。一方、他の乳酸菌株では、ＦＴＬ制限酵素がＦＴＬ遺伝子の特定領域を認識する。このため、処理工程では、他の乳酸菌の増幅産物は制限酵素で切断されて、増幅産物の断片となる。
【００５３】
（３）検出工程では、制限酵素（ＦＴＬ制限酵素）で処理された増幅産物の塩基配列の長さに基づきＣＰ２９９８株を検出する。
【００５４】
ここで、ＦＴＬ制限酵素で処理された増幅産物とは、上述した処理工程の処理が施された増幅産物を指す。具体的には、検体が他の乳酸菌株である場合には上述した処理工程の処理により増幅産物が切断されるため、制限酵素で処理された増幅産物は、増幅産物の断片を指す。また、検体がＣＰ２９９８株である場合には上述した処理工程の処理により増幅産物が切断されないため、制限酵素で処理された増幅産物は、増幅産物そのものを指す。
【００５５】
検出工程では、制限酵素で処理された増幅産物の塩基配列の長さを用いてＣＰ２９９８株を検出すればよく、特に限定されるものではない。例えば、制限酵素で処理された増幅産物（以下、「増幅産物（酵素処理後）」ともいう）の塩基配列の長さを、制限酵素で処理される前の増幅産物（以下、「増幅産物（酵素処理前）」ともいう）の塩基配列の長さと比較することで、ＣＰ２９９８株を検出することができる。
【００５６】
この方法では、増幅産物（酵素処理後）の塩基配列の長さが、増幅産物（酵素処理前）の塩基配列の長さと同じである場合、検体がＣＰ２９９８株であると同定することができる。一方、増幅産物（酵素処理後）の塩基配列の長さが、増幅産物（酵素処理前）の長さよりも短い場合、検体がＣＰ２９９８株以外の乳酸菌株であると同定することができる。
【００５７】
上述した方法において、増幅産物（酵素処理後）の塩基配列の長さと、増幅産物（酵素処理前）の長さの比較は、公知の方法で行うことができる。例えば、泳動用ゲルを用いて電気泳動を行い、次いで、泳動用ゲル中のＤＮＡを可視化することで、塩基配列の長さを比較することができる。なお、増幅産物（酵素処理後）の塩基配列の長さと、増幅産物（酵素処理前）の長さの比較には、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）等を用いたマイクロチップ型電気泳動法により行ってもよい。なお、マイクロチップ型電気泳動法とは、微細な流路が組み込まれたマイクロチップを利用して電気泳動を自動化した方法である。
【００５８】
電気泳動に用いられる泳動用ゲルは、特に制限されず、公知のゲルを使用することができ、例えば、アガロースゲルを用いることができる。アガロースの濃度は、例えば、ゲル１００質量％に対して、３．０〜５．０質量％とすることができ、ＦＴＬ遺伝子の特定領域の長さは約１５０ｂｐであるため断片長の観点から４．０％とすることが好ましい。
【００５９】
泳動用ゲル中のＤＮＡを可視化する方法は、特に限定されず、例えば、ＤＮＡを染色する染色試薬を用いることができる。例えば、染色試薬としてＧｅｌＲｅｄ（登録商標）（Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）を用いた場合には、紫外線を照射することで蛍光を発する。
【００６０】
電気泳動を用いる場合、ＤＮＡの移動距離の違いから、塩基配列の長さの違いを判断することができる。具体的には、泳動用ゲルを移動した距離が長いＤＮＡは、泳動用ゲルを移動した距離が短いＤＮＡよりも塩基配列が長いと判断できる。ＤＮＡの位置は、可視化されたＤＮＡのバンドを目視で確認して行ってもよく、画像化して行ってもよい。
【００６１】
電気泳動を用いる具体的な方法としては、例えば、増幅産物と染色試薬を混合した混合液を用いて、アガロースゲルによる電気泳動を行い、ＵＶランプ下で可視化されたＤＮＡのバンドを観察する方法が挙げられる。電気泳動の電圧は、例えば、５０〜１００Ｖとすることができ、試験の簡便性の観点から１００Ｖとすることが好ましい。電気泳動を行う時間は、目的のＤＮＡのバンドが比較観察できる程度に分離される時間であればよく、例えば、６０〜１２０分とすることができ、ＤＮＡのバンドの比較の観点から、９０分とすることが好ましい。
【００６２】
ここで、増幅産物（酵素処理後）の塩基配列の長さと、増幅産物（酵素処理前）の塩基配列の長さの比較は、上述したように、ＤＮＡの移動距離を比較することで行ってもよいが、増幅産物（酵素処理後）や増幅産物（酵素処理前）の塩基配列の長さそのものを比較してもよい。塩基配列の長さは、測定対象のＤＮＡの移動距離を、塩基配列の長さに変換することで得ることができる。
【００６３】
なお、上述した検出工程では、増幅産物（酵素処理後）と増幅産物（酵素処理前）の塩基配列の長さを比較し、ＣＰ２９９８株の検出を行っているが、この方法に限定されるものではない。例えば、他の乳酸菌株の増幅産物（酵素処理後）の塩基配列の長さを予め取得しておき、この塩基配列の長さと、検体の増幅産物（酵素処理後）の塩基配列の長さを比較してもよい。この方法では、検体の増幅産物（酵素処理後）の塩基配列の長さが、予め取得しておいた他の乳酸菌株の増幅産物（酵素処理後）の塩基配列の長さよりも長い場合、検体がＣＰ２９９８株であると同定することができる。一方、検体の増幅産物（酵素処理後）の塩基配列の長さが、予め取得しておいた他の乳酸菌株の増幅産物（酵素処理後）の塩基配列の長さよりも長くない場合、検体が他の乳酸菌株であると同定することができる。
【００６４】
以上説明した本実施形態の検出方法によれば、ＣＰ２９９８株を検出することができる。また、本実施形態の検出方法によれば、食品の製造過程などにおいてＤＮＡが分解されてしまったとしても、ＣＰ２９９８株を検出することができる。
【実施例】
【００６５】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００６６】
まず、複数の乳酸菌株の死菌及び生菌を用いて、ＲＡＰＤ法によりＣＰ２９９８株を検出できるか否かを確認した。
【００６７】
（参考例１）
【００６８】
生菌の被検菌（検体）をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ培地(Ｄｉｆｃｏ社製)で３０℃で２４時間培養した。培養した被菌体について、Ｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、メーカー推奨プロトコールに従いＤＮＡを抽出した。なお、ＤＮＡの抽出には、培養液をそのまま用いた。
【００６９】
また、加熱死菌の被検菌（検体）を用意した。用意した被菌体について、Ｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、メーカー推奨プロトコールに従いＤＮＡを抽出した。
【００７０】
なお、ＤＮＡの抽出に用いた被検菌は、いずれも菌種がラクトバチルス・カルバタス菌種であるが、異なる複数の菌株を用いた。具体的には、ラクトバチルス・カルバタスＣＰ２９９８株、ラクトバチルス・カルバタス１０９６Ｔ株、ラクトバチルス・カルバタスＡ１４株及びラクトバチルス・カルバタスＡ２０株を用いた。
【００７１】
抽出した被菌体（生菌及び死菌）の各ＤＮＡを鋳型として、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＲＡＰＤ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、メーカー推奨プロトコールに従って行った。
【００７２】
ＰＣＲにより得られた各増幅産物を用いて、マイクロチップ型電気泳動法によるＤＮＡ分析を行った。マイクロチップ型電気泳動法によるＤＮＡ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡ１０００キット(Ａｇｉｌｅｎｔ社製)を用いて行った。なお、ＤＮＡを染色する試薬には、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）（Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）を用い、泳動用ゲルには、Ａｇａｒｏｓｅ Ｓ (ニッポンジーン社製)を用いた。
【００７３】
分析結果を図１に示す。
【００７４】
図１から理解できるように、生菌と加熱死菌との間ではバンドパターンが異なるため、ＣＰ２９９８株を検出することはできなかった。
【００７５】
（参考例２）
参考例１の結果から、ＲＡＰＤ法によってＣＰ２９９８株が検出できなかった理由は、加熱死菌のＣＰ２９９８株では、加熱によりＤＮＡが分解（切断）されていることが原因であると考えられた。
【００７６】
そこで、加熱死菌に含まれるＤＮＡの状態を確認するため、参考例１と同様の方法で抽出した被菌体の各ＤＮＡを電気泳動した。なお、電気泳動は、１質量％アガロースゲルを用い、１００Ｖで４０分間行った。
【００７７】
電気泳動写真を図２に示す。
【００７８】
図２から理解できるように、加熱死菌ではＤＮＡが分解されていることが確認された。
【００７９】
（実施例１）
次に、本実施形態のプライマー対を用いて、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によりＣＰ２９９８株を検出できるか否かを確認した。
【００８０】
参考例１と同様の方法で、被検菌（生菌及び死菌）のＤＮＡを抽出した。抽出した各ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ用のサンプルを調製した。サンプルの組成を表１に示す。
【００８１】
［表１］
2019216707.tif 000003
【００８２】
表１に示すＦ−ｐｒｉｍｅｒには、公知の核酸合成法により化学的に合成した、配列番号１で表される塩基配列のフォワードプライマー（そのもの）を用いた。表１に示すＲ−ｐｒｉｍｅｒには、公知の核酸合成法により化学的に合成した、配列番号２で表される塩基配列のリバースプライマー（そのもの）を用いた。なお、表１に示すＴｅｍｐｌａｔｅは、抽出したＤＮＡを示す。
【００８３】
上述した各サンプルを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件を表２に示す。
【００８４】
［表２］
2019216707.tif 000004
【００８５】
得られた各増幅産物を、制限酵素（ＮｌａＩＶ）により処理した。制限酵素による処理に用いた溶液の組成を表３に示す。また、制限酵素による処理の条件を表４に示す。
【００８６】
［表３］
2019216707.tif 000005
【００８７】
［表４］
2019216707.tif 000006
【００８８】
増幅産物（酵素処理後）及び増幅産物（酵素処理前）について、Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡ１０００キット(Ａｇｉｌｅｎｔ社製)を用い、マイクロチップ型電気泳動法によるＤＮＡ分析を行った。なお、ＤＮＡの染色には、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）（Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）を用い、泳動用ゲルには、Ａｇａｒｏｓｅ Ｓ (ニッポンジーン社製)を用いた。
【００８９】
分析結果を図３に示す。なお、図３において、「株名−ｃｕｔ」は、増幅産物（酵素処理後）を指し、「株名」は、増幅産物（酵素処理前）を示す。
【００９０】
図３から理解できるように、ＣＰ２９９８株では、生菌であっても加熱死菌であっても、制限酵素による処理により増幅産物の長さに変化がなく、ともに１５３ｂｐであった。一方、ＣＰ２９９８株以外のラクトバチルス・カルバタスの乳酸菌株では、生菌であっても加熱死菌であっても、制限酵素による処理により増幅産物の長さが短くなっており、増幅産物（酵素処理後）の長さは、１３５ｂｐであった。
【００９１】
この結果から、本実施形態のプライマー対によれば、ＣＰ２９９８株を検出することができることが理解できた。また、本実施形態の検出方法によれば、熱によりＤＮＡが分解されてしまったとしても、ＣＰ２９９８株を検出することができることが理解できた。
【００９２】
（実施例２）
ＣＰ２９９８株（加熱死菌）をセルロース（結合剤）、麦芽糖（賦形剤）、ステアリン酸カルシウム（滑沢剤）、二酸化ケイ素（固結防止剤）と混合し、得られた混合物を打錠（圧縮成形）して錠剤を取得した。得られた錠剤を１５ｍＬチューブに入れ、滅菌水１０ｍＬを加えた。この溶液中の錠剤を超音波洗浄機で溶解し、菌数が２×１０９個になるよう１．５ｍＬチューブに分取した。得られたＣＰ２９９８株から、参考例１と同様の方法で、ＤＮＡを抽出した。
【００９３】
また、錠剤の原料としたＣＰ２９９８株（打錠前のＣＰ２９９８株）と、ラクトバチルス・カルバタス１０９６Ｔ株（加熱死菌）から、参考例１と同様の方法で、ＤＮＡを抽出した。
【００９４】
抽出した各ＤＮＡを用いて、実施例１と同様の方法で、ＰＣＲを行うとともに、制限酵素（ＮｌａＩＶ）による処理を行った。増幅産物（酵素処理後）及び増幅産物（酵素処理前）を、電気泳動した。なお、電気泳動は、４質量％アガロースゲルを用い、１００Ｖで９０分間行った。
【００９５】
電気泳動写真を図４に、バイオアナライザーによる分析結果を図５に示す。
【００９６】
図４及び図５に示すように、ＣＰ２９９８株では、打錠されるか否かにかかわらず、制限酵素による処理により増幅産物の長さに変化がなく、ともに１５３ｂｐであった。この結果から、本実施形態のプライマー対によれば、ＣＰ２９９８株に衝撃を加えたとしても、ＣＰ２９９８株を検出することができることが理解できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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