(57)【要約】【課題】左室駆出率が保たれた心不全（ＨＦＰＥＦ）、拡張期心不全（ＤＨＦ）又は拡張機能障害（ＤＦ）に罹患した人を治療するための医薬組成物を提供する。【解決手段】左室駆出率が保たれた心不全（ＨＦＰＥＦ）、拡張期心不全（ＤＨＦ）又は拡張機能障害（ＤＦ）に罹患した人を治療するための医薬組成物であって、心筋内の線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、心内膜細胞、及び心筋細胞上に存在するリラキシン受容体（ＲＸＦＰ１）に特異的に結合してより低い拡張末期圧において心臓の一回拍出量を増加させることができる化合物を治療有効量含む、医薬組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性的な左室駆出率が保持されている心不全（ＨＦＰＥＦ）であって、心筋の硬化も有する心不全に罹患しており、心臓特異的なタイチンの潜在的なリン酸化障害に罹患していると診断されている人を治療するための医薬組成物であって、心筋内の線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、心内膜細胞、及び心筋細胞上に存在するリラキシン受容体（ＲＸＦＰ１）に特異的に結合して心臓コンプライアンス及び一回拍出量を増加させ、左心室の拡張末期圧を低下させることができるリラキシンを治療有効量含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記慢性的な心不全が心臓特異的なタイチンのリン酸化障害により生じたものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記慢性的な心不全が心臓特異的なタイチンＮ２Ｂの低リン酸化により生じたものである、請求項１又は請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
皮下投与、静脈注射又は経口投与に適した薬学的に許容されるアジュバント、キャリア、希釈剤又は賦形剤と混合したヒトリラキシン−２分子を含む、請求項１〜請求項３のうちいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ヒトリラキシン−１、ヒトリラキシン−２、及びヒトリラキシン−３を含む群から選択されるヒトリラキシン分子を含む、請求項１〜請求項３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
口腔粘膜又は胃腸管粘膜に送達するためのエマルジョン（水中油型又は油中水型）として製剤化されている、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記リラキシンがミセル、逆ミセル、リポソーム、キュボソーム及びそれらの混合物から選択される送達ビヒクルに含まれる、請求項１〜請求項６のうちいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
粘膜付着性タンパク質が化学的又は物理的結合を介して前記送達ビヒクルと結びついており、前記リラキシンの全身送達を達成するために前記医薬組成物が粘膜に吸着するか又は粘膜表面に保持される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬組成物が、ヒトリラキシン−２を投与する皮下輸注（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）用であるか、又は皮下輸注（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）で達成されるものと同等の血漿濃度を生じる経口投与用である、請求項１〜請求項３のうちいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記慢性的な心不全に罹患している人が、さらに腎障害を有する、請求項１〜請求項９のうちいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記人の、ＭＤＲＤ式に従って推定されるクレアチニンクリアランスが３０〜７５ｍＬ／分／１．７３ｍ２の範囲である、請求項１〜請求項１０のうちいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記慢性的な心不全に罹患している人が、高血圧であり、及び／又は糖尿病及び／又は酸化ストレス及び／又は炎症を患っている、請求項１〜請求項１１のうちいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記リラキシンが心臓流入血量を増加させ、心臓の拡張末期圧を低下させ、心臓の拍出量を増加させる、請求項１〜請求項１２のうちいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心不全に罹患したヒトの対象を治療するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
心不全は、一般に、心臓のどの機能が最も影響されているか、又は心臓のどちらの側が最も影響されているか、に基づいて分類される。「左心不全」は、肺からの酸素に富む血液を、左心房を通して左心室に移動させ、その後に体の残りの部分に移動させる、左心ポンピング作用の不全のことを表す。「右心不全」という用語は、静脈を通って心臓に戻ってくる血液を、右心房を通して右心室に送り込み、次に肺に戻して血液に酸素を補充する右心ポンピング作用の不全に対して使われる。心不全の症状は、急速に生じたか（急性心不全）又は時間をかけて徐々に生じたか（慢性心不全）によりさらに区別される。うっ血性心不全（ＣＨＦ）は、心臓が身体の必要を満たすのに十分な血液を送り込むことができない状態一般を表す。心臓からの血流が遅くなると、静脈を通って心臓に戻る血液が滞り、組織にうっ血を引き起こす。その典型的な徴候は、脚又は足首のむくみ、疲労、呼吸困難、肺水腫、呼吸窮迫である。ＣＨＦは、冠動脈疾患、先天性及び原発性心疾患、心筋の感染（心筋症、心内膜炎及び／又は心筋炎）、心筋梗塞、高血圧、心臓弁膜症によって生じうる。ＣＨＦはまた、腎臓の機能に影響を及ぼす。ＣＨＦの治療に使用される薬物は、血管を拡張して抵抗を低下させるアンジオテンシン阻害剤及び血管拡張剤、左心室の機能を改善するためのβ遮断薬、心臓のポンピング作用を高めるジギタリス、及び過剰の塩と水を除くための利尿剤である。
【０００３】
本開示は、駆出率が正常な心不全又は単に拡張期心不全（ＤＨＦ）とも呼ばれる、左室駆出率が保たれた心不全（ＨＦＰＥＦ）に関する。より具体的には、心筋タンパク質の変化した化学的機械的特性を含むＨＦＰＥＦサブグループに関する。拡張期とは、心臓が血液を身体、脳、肺に押し出すための収縮（ｓｙｓｔｏｌｅ）をしておらず、代わりに弛緩しており、下大静脈（ＩＶＣ）及び上大静脈（ＳＶＣ）を通って体から戻ってくる血液で満たされている、心周期における段階である。したがって、心不全のＨＦＰＥＦサブグループは、心臓の左心室の拡張期性能の低下に関連する。心筋が硬化して弛緩能力を失った場合、左心室を収縮後に血液で満たすのは容易でなく、心拍出量が減少するか、あるいは本質的に正常な拡張末期容積（ＥＤＶ）であるにも関わらず補うために上昇した心室拡張期圧が観察される。左室駆出率が保たれた心不全は、心筋細胞の肥大、間質性コラーゲン沈着の増加及び心筋内のカルシウム沈着によって組織学的に特徴づけられることが多く、これらは合わさって、低下した伸展性及びコンプライアンスにつながると考えられる。心筋タンパク質及び心筋細胞の化学的機械的特徴と、不全心臓の生物物理学的特性とは、未だ臨床的関連性を達成していない。
【０００４】
左室駆出率が保たれた心不全に対する利用可能な具体的治療法はない。慢性状態が患者によって許容される場合、治療は高血圧及び糖尿病などの悪化因子に対するものとしてもよい。利尿剤がしばしば投与される。カルシウムチャネル遮断薬及び／又はアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬の投与は、場合により、心室の硬化を減少させるのに有益であり得るが、死亡率に対する良好な効果はない。主な合併症は、肺水腫であり、利尿剤によるその治療はしばしば困難である。患者の硬くなった心臓及び血管が塩分及び水分排出後の降圧事象に対して非常に感受性であるためである。したがって、左室駆出率が保たれた心不全（ＨＦＰＥＦ）の患者を治療するための手段及びツールはない。したがって、従来技術は問題を表している。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、心筋の線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、心内膜細胞、及び心筋細胞に存在するリラキシン受容体（ＲＸＦＰ１）に特異的に結合して、心臓のコンプライアンス及び一回拍出量を増加させ、左心室の拡張末期圧を低下させることが可能な治療有効量の化合物を含む、心筋の硬化を伴い、慢性的な、左室駆出率が保たれた心不全（ＨＦＰＥＦ）に罹患した人を治療するための医薬組成物を提供する。提供される医薬組成物は、特に、心臓特異的なタイチンの不十分なリン酸化の影響、特に心臓特異的なタイチンＮ２Ｂの低リン酸化の影響、を処置するために、使用及び投与することができる。前記組成物は、皮下若しくは静脈内注射又は経口投与に適した医薬的に許容されるアジュバント、キャリア、希釈剤又は賦形剤と混合した、ヒトリラキシン分子又は薬学的に許容されるその誘導体若しくは前駆体を含んでもよい。
【０００６】
前記医薬組成物は、口腔粘膜又は胃腸管粘膜に送達するためのエマルジョン（水中油型又は油中水型）として製剤化してもよい。リラキシンは、ミセル、逆ミセル、リポソーム、キュボソーム及びそれらの混合物から選択される送達ビヒクル中に含まれてもよい。好ましい実施形態は、組成物が粘膜に吸着するか又は粘膜表面に保持されてリラキシンの全身送達を達成するために、粘膜付着性タンパク質が化学的又は物理的結合を介して前記送達ビヒクルと結びついている組成物に関する。
【０００７】
本開示の別の実施形態は、１０ｐｇ／ｋｇ／日〜１０００ｐｇ／ｋｇ／日の範囲の速度でヒトリラキシンを皮下に輸注（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）するための組成物、又は皮下輸注（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）で達成されるのと同等の血漿濃度を生じる経口投与用の組成物に関する。リラキシンは、好ましくは、３０ｐｇ／ｋｇ／日〜１００ｐｇ／ｋｇ／日の範囲の輸注（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）速度で投与される。
【０００８】
本開示はさらに、慢性拡張期心不全に罹患しており、心臓特異的なタイチンのリン酸化障害と診断された対象の治療のための医薬組成物を提供する。前記対象は、ＭＤＲＤの式に従って見積もられたクレアチニンクリアランスが３０〜７５ｍＬ／分／１．７３ｍ２の範囲である腎障害を有していてもよい。慢性拡張期心不全に罹患した前記対象は、さらに高血圧であってもよく、及び／又は糖尿病及び／又は酸化ストレス及び／又は炎症を患っていてもよい；これらはつまり、心臓特異的なタイチンのリン酸化障害に至る典型的な合併症及び慢性状態である。本開示の別の態様は、病理学的に減少した心臓流入血量を示す患者に、心筋におけるリラキシン受容体に特異的に結合し、心臓の拡張末期圧を低下させ、心臓の一回拍出量を増加させることのできる治療有効量の化合物を投与することによって心臓流入血量を増加させる方法に関する。
【０００９】
心筋タンパク質（特に、タイチン）の変化した化学的機械的特徴によって（より細かくは、タイチンの低リン酸化によって）引き起こされる、左室駆出率が保たれた慢性拡張期心不全（ＨＦＰＥＦ）に罹患した人の治療のための医薬組成物であって、前記組成物は、心筋の線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、及び心筋細胞上に存在するリラキシン受容体（ＲＸＦＰ１）に特異的に結合することができ、それにより低い圧力で心臓の一回拍出量を増加させることができる治療有効量の化合物を含む。
【００１０】
本開示は、非経口投与に適した薬学的に許容されるアジュバント、キャリア、希釈剤又は賦形剤と混合された、ヒトリラキシンの受容体結合コア構造（最小活性構造）又は薬学的に許容されるその誘導体若しくは前駆体を、活性リラキシン薬剤又は成分として提供する。さらなる実施形態では、医薬組成物は、ヒトリラキシン−１、ヒトリラキシン−２、ヒトリラキシン−３及びそれらの類似体又は誘導体を含む群から選択される少なくとも１つを活性成分又は薬剤として含んでいてもよい。最も好ましい実施形態は、ヒトリラキシン−２と生物学的に等価である合成リラキシン分子を含む。合成ヒトリラキシン−２は、化学的に合成されてもよい。
【００１１】
述べたように、前記医薬組成物は、注射用であってもよく、好ましくは筋肉内注射、皮下注射、又は最も好ましくは静脈内注射用であってもよく、ヒトリラキシン−２の用量は、１ｐｇ／ｋｇ／日〜１０００ｐｇ／ｋｇ／日の範囲であってもよい。リラキシンペプチド、好ましくはヒトリラキシン−２、の徐放性を得るためには、皮下注射が好ましい。静脈内点滴を介して静脈に直接送達する投与は、好ましくはリラキシン−２が５ｐｇ／ｋｇ／日から１００ｐｇ／ｋｇ／日の範囲であってもよい。
【００１２】
インスリンの経口又は経鼻送達及び投与にも用いられる製剤に含ませてリラキシン剤を投与することもさらに考えられる。このようなガレヌス製剤は、機能的に活性な量の粘膜付着性タンパク質、前記リラキシン化合物、及び所望によって含まれてもよい送達のための追加の薬剤；並びにこれらの剤の送達ビヒクルを含んでいてもよい。前記組成物は、エマルジョン（水中油型又は油中水型）として、また、口腔又は消化管粘膜への送達のために製剤化されてもよい。粘膜付着性タンパク質は、免疫グロブリン、アルブミン、ムチンタンパク質及びトランスフェリンから選択されてもよい。組成物が粘膜に吸着するか又は粘膜表面上に保持されて薬剤の全身送達を達成するために、粘膜付着性タンパク質は化学的又は物理的結合を介して送達ビヒクルと結びついていてもよい。送達ビヒクルは、ミセル、逆ミセル、リポソーム、キュビソーム及びこれらの混合物から選択されてもよい。その種の標的化されたエマルジョン及び製剤は、例えば、ＥＰ１７６８６４７Ｂ１、ＵＳ８，４１４，９１４に詳細に記載されている。リラキシンの経口投与のための例示的な製剤が記載されている。Ｗ０２００３／０４７４９４Ａ２、ＵＳ５，４４４，０４１及びＷＯ０２／０９４２２１Ａ１は、エマルジョン／マイクロエマルジョン組成物に関連しており、ＷＯ９６／３７２１５Ａ１は、油中水型ペプチドエマルジョンに関連しており、ＵＳ２００６／０２１０６２２Ａ１は、表面改質粒子組成物に関連しており、ＷＯ０３／０３０８６５Ａ１、ＵＳ５，２０６，２１９Ａ及びＵＳ２００４／０９７４１０Ａ１は、例えば、界面活性剤及び／又は脂質成分を含むペプチド組成物に関連しており、ＵＳ２００６／０１８２７７１Ａ１は、自己乳化組成物に関連しており、そしてＷＯ２００８／１４５７３０Ａ１、ＷＯ２００８／１４５７２８Ａ１及びＭａ  Ｅｒ−Ｌｉら、Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ、Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００６、Ｖｏｌ．２７（１０）：１３８２−１３８８は、マイクロエマルジョン又はエマルジョン前濃縮物に関連する。ＳＭＥＤＤＳ組成物は、シクロスポリン、インスリン及びリラキシンなどのポリペプチドの溶解性及び経口生体利用効率を改善することが知られている。しかし、ＳＭＥＤＤＳ及びＳＮＥＤＤＳにおけるヒトのインスリン又はリラキシンなどの親水性の水溶性ポリペプチドの溶解性及び生体利用効率が常に最適であるとは限らない。
【００１３】
前記医薬組成物は、好ましくは、左室駆出率が保たれた心不全（ＨＦＰＥＦ）に罹患し、タイチンドメインのリン酸化に差次的変化を引き起こす少なくとも１つの症状を有すると診断された対象に投与される。リラキシンによって誘発されるタイチンドメインのリン酸化の変化は、心臓の拡張機能が回復できるように受動的な心筋硬さ（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）をうまく調整する。
【００１４】
タイチンドメインのリン酸化に影響を与える症状は、糖尿病、高血圧、虚血、動脈硬化性血管疾患を含む非限定的疾患群のうちの少なくとも１つ、又は酸化ストレス及び／又は心臓への酸素及び栄養素の供給不足を引き起こす疾患群のいずれか１つ（例えば、喫煙）であってもよく、それらは不全心筋におけるタイチンドメインのリン酸化の変化をもたらす。不全心筋におけるタイチンのリン酸化の変化（タイチンＮ２Ｂアイソフォームの低リン酸化）は、例えば、タイチンＮ２Ｂを血清から単離、例えば、不全心筋から放出されたタイチンのエクソン４９フラグメントを単離し、そのリン酸化を質量分析により測定することによって検出することができる。
【００１５】
ここに開示する医薬組成物は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症及び／又は高血圧を含む群のうちの少なくとも１つを有し、心筋の変化した化学的機械的特徴により左室駆出率が保たれた心不全（ＨＦＰＥＦ）を発症する危険性の高い患者に投与してもよい。最も好ましい実施形態では、前記医薬組成物は、腎障害も有する、拡張期心不全又は左室駆出率が保たれた心不全に罹患している対象に投与してもよい。これは、例えば、対象が３０〜７５ｍＬ／分／１．７３ｍ２の範囲のクレアチニンクリアランスを有する場合に当てはまる。拡張機能障害、拡張期心不全又は左室駆出率が保たれた心不全に罹患した対象がさらに高血圧である場合、ここに開示した有効成分は、記載にしたがって投与してよいが、好ましくは抗高血圧剤をさらに含む医薬組成物に含ませて投与してもよい。抗高血圧剤は、血管拡張薬、アドレナリン遮断薬、中枢作用性α−作動薬、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬及び利尿剤を含む抗高血圧剤の群から選択されてもよい。
【００１６】
別の態様は、病理学的に減少した心臓流入血量を示す患者に、患者がタイチンＮ２Ｂの非典型的な発現、例えば、タイチンアイソフォームのＮ２Ｂ及びＮ２Ａの発現のシフト、又は心臓タンパク質タイチンＮ２Ｂのリン酸化障害若しくは低リン酸化、又はその両方、をさらに示す場合に、心筋内のリラキシン受容体に特異的に結合して心臓の一回拍出量を増加させることができる化合物を治療上有効量投与し、心臓流入血量を増加させる方法に関する。しかしながら、本発明は、タイチンの特定の誤ったリン酸化に限定されるものではなく、タイチンの翻訳後修飾一般に関するものである。なお、左室駆出率が保たれた心不全の治療におけるリラキシンの主要な生理学的効果は、リラキシンに関連する比較的非特異的な血管拡張効果のどれかというわけではなく、リラキシンによって誘導される心筋の化学的機械的特性の変化と、タイチンドメインの増加したリン酸化であり、これによって心臓コンプライアンス及び伸展性も増加する。したがって、本発明のこの態様に係る方法は、心筋の化学的機械的不全の結果である拡張機能障害、ＤＨＲ又は左室駆出率が保たれた心不全に罹患している対象に、いずれかの請求項に記載の医薬組成物を投与する方法を含む。
本発明は、好ましい実施形態を例示する役割を果たす添付の図面と併せて読むと最もよく理解される。しかし、本発明は図面に開示された特定の実施形態に限定されるものではないことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】収縮機能障害（左）及び拡張機能障害（右）の場合の圧力−容積関係（ＥＳＰＶＲ−収縮末期圧・容積関係、ＥＤＰＶＲ−拡張末期圧・容積関係）及び一回拍出量（ＳＶ）を示す代表的な図である。
【図２】Ｐａｕｌｕｓ  ＷＪらの、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００７）２８（２０）：２５３９−２５５０「Ｈｏｗ  ｔｏ  ｄｉａｇｎｏｓｅ  ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ：ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ  ａｎｄ  Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ（拡張期心不全の診断方法：欧州心臓学会の心不全及び心エコー検査協会の合意文書）」による診断フローチャートである。
【図３Ａ】ＲＸＦＰ１受容体で安定的にトランスフェクトされたヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ）−２９３Ｔを用いたユーロピウム標識ヒトリラキシン−２の生物学的同等性を示すｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ結合実験のプロットである（Ｓｈａｂａｎｐｏｏｒ  Ｆら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１２）４２０（２）：２５３−６を参照のこと）。
【図３Ｂ】ＲＸＦＰ１受容体で安定的にトランスフェクトされた細胞におけるｃＡＭＰ活性（ｃＡＭＰレポーター遺伝子アッセイ）と合成ヒトリラキシン−２との関係を示すプロットである（Ｙａｎ  Ｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８，４７（２６）：６９５３−６９６８を参照のこと）。
【図４】拡張期心不全に罹患した患者及び対照における内因性静脈リラキシン−２の濃度を示す棒グラフである（対照に対してＰ＜０．０５、順位に関するマン・ホイットニーのＵ検定）。
【図５】拡張期心不全に罹患した患者及び対照における内因性リラキシン−２の冠動脈濃度勾配を示す棒グラフである（２要因分散分析で分析（要因：群、反復測定；Ｐ＞０．０５、有意差なし）。
【図６】心エコーマーカーＥ／Ｅ’によって決定された患者における拡張機能障害に対する内因性リラキシン−２の冠動脈濃度勾配を示すプロットであり、ここで、Ｅは組織ドップラーにより測定された早期僧帽弁血流速度を示し、Ｅ’は早期心筋弛緩速度を示す。
【図７】２つの独立した拡張期心不全動物モデル（ＳＨ及びＺＤＦラット−ＳＨ：高血圧自然発症；ＺＤＦ：Ｚｕｃｋｅｒの肥満型糖尿病（Ｚｕｃｋｅｒ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｆａｔｔｙ）と適切な対照（Ｌｅａｎ（痩せ型）；Ｚｕｃｋｅｒ  ｌｅａｎ）及び対照における左心室拡張末期圧ＬＶＥＤＰ（ｍｍＨｇ）と酸化ストレスの血中マーカーである血漿ニトロチロシン（ｎｍｏｌ／Ｌ）との相関及び線形回帰を示すプロットである。
【図８】図７の動物モデルにおいて合成リラキシン−２（５ｎｍｏｌ／Ｌ）の３０分間投与による左心室拡張末期圧の低下を示す棒グラフである（Ｐｌａｃ：プラセボ；Ｒｌｘ：リラキシン−２；ＳＨＲ：高血圧自然発症ラット；ＺＤＦ：Ｚｕｃｋｅｒの肥満型糖尿病ラット；Ｌｅａｎ：Ｚｕｃｋｅｒ  ｌｅａｎ（痩せ型）ラット；Ｃｏｎｔｒｏｌ：ＳＨＲに対する対照ラット）。
【図９】図７の動物モデルにおける合成リラキシン−２（５ｎｍｏｌ／Ｌ）３０分間によるＮ２ＢからＮ２ＢＡアイソフォームへのタイチンリン酸化におけるシフト（リン酸化されたタイチンＰ−Ｎ２ＢＡ／Ｐ−Ｎ２Ｂアイソフォーム比として表される）を示す棒グラフである（Ｐｌａｃ：プラセボ；Ｒｌｘ：リラキシン−２；ＳＨＲ：高血圧自然発症ラット；ＺＤＦ：Ｚｕｃｋｅｒの肥満型糖尿病ラット；Ｌｅａｎ：Ｚｕｃｋｅｒ  ｌｅａｎ（痩せ型）ラット；Ｃｏｎｔｒｏｌ：ＳＨＲに対する対照ラット）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本開示は、左室駆出率が保たれた心不全（ＨＦＰＥＦ）及び拡張期心不全（ＤＨＦ）に罹患した患者の治療に関する。より正確には、これらの患者の関連するサブグループは、コネクチンとしても知られる心筋タンパク質タイチンのリン酸化障害を患っており、このリン酸化障害は左室駆出率が保たれた心不全（ＨＦＰＥＦ）につながる。タイチンは、大きな構造タンパク質−知られている中で最も大きいものの１つ−であり、ヒトにおいてはＴＴＮ遺伝子によってコードされている（Ｌａｂｅｉｔ  Ｓら、Ａ  ｒｅｇｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  １００−ｒｅｓｉｄｕｅ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｉｔｉｎ（タイチン配列における２つのタイプの１００残基モチーフの規則的なパターン）、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４５：２７３−６。ｄｏｉ：１０．１０３８／３４５２７３ａ０．ＰＭＩＤ２１２９５４５）。タイチンは、約２７，０００〜３３，０００個のアミノ酸長（スプライスアイソフォームに依存する）を有し、概ね２００〜２５０個の個別にフォールディングしたタンパク質ドメインを含み、これらのドメインは、この巨大タンパク質が伸長したときにはアンフォールディングし、張力が取り除かれたときには再びフォールディングする。異なるタイプの筋肉（例えば、心筋又は骨格筋）の間でのタイチン配列のバリエーションは、これらの筋肉の機械的特性の差異と関係づけられた。このことは、本発明を、例えばＶｉｔｏｖｅｃ  Ｊら、Ｋａｒｄｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２０１３；１５（２）：１１３−１１７に記載されているような高血圧治療及び血管拡張を目的としたリラキシン又はセレラキシン（ＲＬＸ０３０）の使用から区別するものである。これらの治療的適用は、本明細書中の本発明の背景技術の項で記載したような様々なタイプの急性心不全の治療のために設計されてきた。
【００１９】
心臓の横紋筋に関しては、タイチンは分子スプリングのように働くと考えられ、これは横紋筋組織の収縮において重要であるばかりでなく、筋肉の受動的弾性の原因ともなると考えられる。心臓特異的なタイチンのアイソフォームが存在する。より正確には、筋繊維の硬さ（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）は、心臓のタイチンのアイソフォームであるＮ２Ｂ及びＮ２ＢＡの発現レベルに依存し、弾性を有するタイチンドメインであるＮ２−Ｂのユニーク配列（Ｎ２−Ｂｕｓ）及びＰＥＶＫのリン酸化による。ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）又はｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＧ）によるＮ２−Ｂｕｓのリン酸化は、タイチンの硬さ（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）を減少させるが、ＰＫＣによるＰＥＶＫドメインのリン酸化はタイチンの硬さを増加させる。したがって、Ｎ２−Ｂｕｓの低リン酸化及びＰＥＶＫドメインの高リン酸化は、相補的に作用してヒトの不全心臓における受動的緊張を高める（Ｍｕ（ウムラウト）ｌｌｅｒ  ＥＡ  らのＣａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ（２０１３）、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｃｖｒ／ｃｖｔ１４４；２０１３年６月１３日にオンラインで刊行）。
【００２０】
上記は、心筋細胞（筋細胞）が筋原繊維の束を含有し、さらに筋原繊維はミオシン及びアクチンを含む筋フィラメントからなるという一般的な技術的文脈に属する。筋原線維は、筋細胞の基本的な収縮単位を表すサルコメアと呼ばれる微小解剖学的単位から構成される。サルコメアは、筋フィラメント構造における２つのＺ線の間の領域として定義される。Ｚ線とＺ線の間の距離（すなわち、サルコメアの長さ）はヒトの心臓においては約１．６ｐｍ〜２．２ｐｍの範囲にあるが、筋細胞は直径が約２５ｐｍ、長さが約１００ｐｍである。アクチンとミオシンとの間の化学的及び物理的相互作用により、サルコメアの長さが短くなり、筋細胞を収縮させる。したがって、一方では、収縮する摺動フィラメントが筋肉収縮を生じ、他方では、受動的な力の発生及びストレスの伝達のためにタイチンフィラメントが必要とされる。しかし、タイチンの硬さ（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）は、心臓のサルコメアにおける２つの主要なタイチンアイソフォームであるＮ２ＢＡ（柔軟）及びＮ２Ｂ（より硬い）の発現比のシフトによって、心臓の発育及び疾患の過程で変化する。より硬いＮ２Ｂタイチンアイソフォームは、とりわけ、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ経路を活性化する甲状腺ホルモンによって引き起こされる。逆に、低甲状腺ホルモン（Ｔ３）は、柔軟なＮ２ＢＡ−タイチンを促進する。さらに、心臓特異的な１バンドのタイチンセグメントであるＮ２−Ｂドメインのプロテインキナーゼ（ＰＫ）Ａ媒介性又はＰＫＧ媒介性のリン酸化により、タイチンの硬さ（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）を急激に低下させることができる。したがって、β−アドレナリン作動性アゴニスト、一酸化窒素、又はナトリウム利尿ペプチドは、タイチン分子スプリングの硬さ（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）を減少させる。したがって、ヒトの心臓の受動的硬さ（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）の上昇は、心筋の機械的不全並びに左室駆出率が保たれた心不全及び拡張期心不全などの症候群に伴って起こり得るタイチンＮ２Ｂのリン酸化障害によって引き起こされる可能性がある（総説に関しては、Ｋｒｕ（ウムラウト）ｇｅｒら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．（２００９）４６（４）：４９０−８；Ｋｅｌｌｅｒｍａｙｅｒら、Ｊ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｒｅｓ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ（２００２）２３（５−６）：４９９−５１１を参照のこと）。
【００２１】
本発明者らは、リラキシンの投与によって、タイチン−Ｎ２Ｂｕｓドメインのリン酸化障害が相殺され得ることを見出した。いかなる理論にも縛られるものではないが、リラキシンは心筋細胞（線維芽細胞、筋線維芽細胞、心筋細胞、心内膜細胞、内皮細胞）におけるＮＯ−ｃＧＭＰプロテインキナーゼＧ及び／又はｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ経路を活性化するＲＬＸＦＰ１受容体に結合すると考えられる。増加したリン酸化活性は、次に、横紋筋の受動的コンプライアンスを増加させ、そして左心室拡張末期圧の低下をもたらす。リラキシンタンパク質スーパーファミリーは、インスリン、インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ、並びにインスリン様因子３、４、５及び６を含む。３つの異なる形態のリラキシンがヒトにおいて同定されており、そのうちリラキシン−２（Ｈ２）が主要な貯蔵形態であり、循環系に分泌されることが知られている唯一の形態である。リラキシンは、Ａ鎖及びＢ鎖がジスルフィド架橋を介して連結された約６ｋＤａのヘテロ二量体ペプチドホルモンである。ヒトリラキシン−１（Ｈ１）の生物学的役割は今日まで明らかではなく、リラキシン−３（Ｈ３）は脳においてのみ見られ、神経ペプチドとして作用する（Ｂａｔｈｇａｔｅら、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０１３）。
【００２２】
リラキシン受容体を同定する努力は、リラキシン−２に対する対応受容体（ｃｏｇｎａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）としてのＧタンパク質共役受容体ＬＧＲ−７（現在ＲＸＦＰ１として分類されている）及び生理学的リラキシン−３受容体としてのＧＰＣＲ−１３５（現在ＲＸＦＰ３として分類されている）の発見につながった。ヒトリラキシン−２は、また、ヒトグルココルチコイド受容体（ＧＲ）にも結合して活性化する（Ｄｓｃｈｉｅｔｚｉｇ  Ｔら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２００４；１８：１５３６ｅ８）。ヒトリラキシン−１及びリラキシン−２は、さらに、受容体ＬＧＲ８（現在ＲＸＦＰ２として分類されている）及びＧＰＣＲ１４２（現在ＲＸＦＰ４として分類されている）に結合する。しかしながら、ＲＸＦＰ１は、ヒトリラキシン（Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）のそれぞれと高親和性で結合する唯一の広く発現した受容体である。したがって、全てのヒトリラキシンは、ＲＸＦＰ１受容体を発現する細胞においてｃＡＭＰ活性及び他のＲＸＦＰ１関連経路を刺激する能力に関して類似の生物学的活性を示すと推定することができる（総説については、Ｂａｔｈｇａｔｅ  ＲＡら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ  ２０１３を参照のこと）。
【００２３】
ヒトにおけるリラキシンの内在的生理学的機能は、依然として不明である。リラキシンは元々、その妊娠ホルモンとしての活性によって同定された（Ｈｉｓａｗ  ＦＬら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９２６；２３：６６１−６６３を参照のこと）。それ以来、リラキシンは、腎臓、盲腸間膜、肺及び末梢血管系における血管の拡張（血管拡張）を引き起こす内分泌及びパラクリン因子として作用すること、そしてこれらの組織における血流及び灌流を増加させることが示されている（Ｄｓｃｈｉｅｔｚｉｇ  ＆  Ｓｔａｎｇｌ、ＣＭＬＳ  ２００２；５９：１−１３（総説）；Ｄｓｃｈｉｅｔｚｉｇ  Ｔら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００３；９２：３２−４０）。これとは関係しない多くの活性の原因ともされており、そのような活性は、例えば、血管緊張、血漿浸透圧、血管新生、コラーゲン代謝回転、腎臓及び心筋機能、及び中枢神経プロセスの調節因子などである（Ｄｓｃｈｉｅｔｚｉｇ  Ｔら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００３；６０：６８８−７００；Ｄｓｃｈｉｅｔｚｉｇ  Ｔら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００６；１１２：３８ｅ５６、Ｎｉｓｔｒｉ  Ｓら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００７；５：１０１ｅ８を参照のこと）。異常なリラキシン活性及び／又は発現は、高血圧、飲酒、記憶関連機能、及び脳及び脳室周囲器官の受容体に結合することによる中毒性行為、並びに心血管疾患、腎臓疾患、線維性障害（心筋線維化及び気道リモデリングに関連する線維症を含む）、神経障害、免疫疾患、子宮内膜障害及び生殖障害などの多様な障害及び疾患に関与している。
したがって、リラキシン並びにリラキシンアゴニスト及びアンタゴニストを使用する多数の臨床応用が提案されてきており、特に、血管収縮（ＥＰ０７００８８４０）に関連する疾患の治療のため、インスリン補因子又は代替（ＥＰ１９０９８０９）として、動脈コンプライアンスを増加させるため（ＥＰ０５７３１４４３）、腫瘍抑制のため（ＥＰ０７７１９５３１）、幹細胞の分化におけるアジュバント（ＥＰ０４８０６８６８）として、受精率を増加させるため（ＥＰ０３００５４８８）又は胎児の成長の管理のため（ＥＰ５７８００４９、ＥＰ９８９３２７９９）、アポトーシスを調節するため、神経変性障害を治療するため、血管新生を促進するため、また、さらには髪の成長を促進するため及び皮膚の老化を抑制するため、提案されている（ＥＰ０７９３５０５）。
【００２４】
しかしながら、硬くなった心筋の治療は、血管緊張又は他の腎臓及び心筋機能の調節とは明らかに独立した医学的効能である。本発明の薬学的組成物は、心筋（すなわち、異なる細胞型から構成される心筋全体）中の線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、心内膜細胞及び心筋細胞の上に存在するＲＸＦＰ１受容体に結合するリラキシン分子、より好ましくはヒトリラキシン−２、を含む。以下の実験は、タイチンＮ２Ｂリン酸化障害及び硬くなった心筋を患う患者が、それによって、より低圧で心臓の一回拍出量を増加させることができることを示している。今日まで、心臓拡張という望ましくない状況無しに、心筋の伸展性及びコンプライアンスの増加につながる、拡張期の硬くなった心筋の治療法は存在していない。
【００２５】
より細かくいえば、拡張期心不全（ＨＦＰＥＦ）における心筋は、収縮期心不全（ＨＦＲＥＦ、低下した駆出率を伴う心不全）における心筋と区別されなければならない。ＨＦＲＥＦの拡張した心臓は、拡張期圧の量に対し相対的に増加した容積を有している。これとは対照的に、拡張期心不全（ＨＦＰＥＦ）の心臓は、既に、正常あるいは僅かに減少した容積においてすら、増加した充満圧を示す（収縮期心不全［左］及び拡張期心不全［右］を示す図１のダイアグラムも参照のこと）。臨床的に、心不全の異なる疾患単位であるＨＦＰＥＦ及びＨＦＲＥＦは、類似の症状（浮腫、呼吸困難、うっ血、疲労）を呈しうる。収縮期心不全（ＨＦＲＥＦ）に罹患している患者の中には、拡張機能障害も検出される者もいるという事実は、基本的な相違を弱めるものではない：収縮期心不全（ＨＦＲＥＦ）では、拡張機能障害が起こることがあり、これは先んずる収縮期障害により引き起こされ、また収縮期障害に関連するものである。拡張期心不全（ＨＦＰＥＦ）では、一般に硬くなった血管床と組み合わさった拡張機能障害が飛び抜けて多い。これらの病態生理学的考察は、臨床的及び治療的状況に対応する：現代医学は、収縮期の心不全の死亡率を低下させる実に様々な薬物（アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬、β遮断薬、アルドステロンアンタゴニスト、イバブラジン）を利用可能であるが、左室駆出率が保たれた心不全に対しては、全く引けを取らず成長さえしている疫学的関連性にもかかわらず、そのような薬物は１つも存在しない（Ｙａｎｃｙら、ＪＡＣＣ  ２００６；Ａｕｒｉｇｅｍｍａ  ＧＰら、ＮＥＪＭ（２００４）３５１：１０９７−１１０５）。ＨＦＲＥＦに有益な多くの薬剤は、拡張期心不全の大規模な臨床試験で既に失敗している：アンジオテンシン変換酵素阻害剤及びアンジオテンシン受容体遮断薬は、ＰＥＰ−ＣＨＦ試験（ペリンドプリルを使用）、ＣＨＡＲＭ−Ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ試験（カンデサルタン）及びＩ−ＰＲＥＳＥＲＶＥ試験（イルベサルタン）において不合格となっており、そしてβ遮断薬はＥＬＡＮＤＤ試験（ネビボロール）で不合格となっている。アルドステロンアンタゴニストを用いた試験（エプレレノンを試験するＲＡＡＭ−ＰＥＦ、スピロノラクトンを評価するＡＬＤＯ−ＤＨＦ）は、最近の第ＩＩ相試験において入り交じった結果をもたらし、死亡率に関する何らかの利点を示すにはほど遠いものである。
【００２６】
左室駆出率が保たれた心不全（ＨＦＰＥＦ）はまれな疾患ではない。心不全の臨床徴候を示す全患者の半分までが拡張期心不全に苦しみ、この特定の疾患単位は、駆出率が正常である（収縮機能が保持されている）が、左心室充満圧が増加しており且つ心不全の臨床徴候有することを特徴とする（Ｙａｎｃｙ  ＣＷら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．（２００６）４７（１）：７６−８４）。心不全のこの疾患単位における死亡率は、収縮期心不全における死亡率に匹敵し（Ｏｗａｎら、ＮＥＪＭ  ２００６，３５５：２５１−２５９）、このためリラキシン組成物を用いる治療処置は罹患率及び死亡率に良好な影響を与えるであろう。注目すべきことに、高齢患者（＞７０歳）及び高血圧又は糖尿病の患者は、タイチンのリン酸化障害及び硬くなった拡張期の心臓を患っている可能性があり、リラキシンの投与を含む治療処置の恩恵を受けるであろう。したがって、リラキシン治療の必要性は、私たちの社会において予想される人口の変化に伴って上昇している（Ｓｍｉｔｈ  ＧＬら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ（２００３）４１：１５１０−８）。
【００２７】
ここに開示される組成物は、好ましくは生理学的に活性な量のヒトリラキシン分子、最も好ましくは生理学的に活性な量のヒトのリラキシン−２（Ｈ２）又はＲＸＦＰ１受容体に結合するヒトリラキシンの活性コアを有する融合タンパク質を含む。ＵＳ４，７５８，５１６及びＵＳ４，８７１，６７０（Ｈｕｄｓｏｎら）は、ヒトリラキシンＨ１及びＨ２の遺伝子配列及びタンパク質配列を開示している。リラキシンを合成する方法は、ＵＳ４，８３５，２５１（Ｂｕｒｎｉｅｒら）、ＷＯ２０１０／１４００６０（Ｂａｒｌｏｓ）及びＷＯ２０１３／１７６７９（Ｄｓｃｈｉｅｔｚｉｇ  Ｔら）に記載されている。合成リラキシンＨ２及びその類似体を用いたバイオアッセイは、生物学的活性を有するリラキシンコア構造を明らかにした（Ｄｓｃｈｉｅｔｚｉｇら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００６；１１２：３８−５６）。したがって、好ましい実施形態は、ＲＸＦＰ１受容体に結合するリラキシンコアを有する化合物を活性成分として含む医薬組成物に関する。
【００２８】
組換えＨ２は、急性心血管治療において、そして神経変性疾患を治療するために既に試験されている（ＵＳ５，１６６，１９１（Ｃｒｏｎｉｎら）及びＤｓｃｈｉｅｔｚｉｇ  Ｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｆａｉｌｕｒｅ（２００９）１５：１８２−１９０；Ｔｅｅｒｌｉｎｋら、Ｌａｎｃｅｔ  ２０１２、ｐｉｉ：ＳＯ１４０−６７３６（１２）６１８５５−８；ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１４０−６７３６（１２）６１８５５−８を参照のこと）。リラキシン−２の心臓血管活性は、動物モデル（Ｐｅｒｎａ  ＡＭら（２００５）、ＦＡＳＥ  Ｊ、１９：１５２５−１５２７；Ｂａｎｉ、Ｄ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９８）１５２：１３６７−１３７６；Ｚｈａｎｇ  Ｊ．ら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（２００５）２６：１６３２−１６３９）でさらに評価された。これらの研究は、心筋症、糖尿病性心筋症、心筋梗塞又はイソプレナリン誘発心臓毒性などの心機能障害を検討しており、これらに対しては、確立された治療、例えばアンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、利尿剤、血管拡張剤、及びβ遮断薬の投与、が利用可能である。硬化した拡張期の心筋の治療は、これらの治療には属しない。また、左室駆出率が保たれた心不全の治療に関して成功した臨床データは存在せず、心臓線維症、弁膜機能障害（心臓弁の異常な肥厚）、及び／又は線維性心筋は付随し得るが、ただし関係は無い医学的徴候である。後者は、正常にではなく過度にコラーゲンを分泌し、心筋の柔軟性及び伸展性の喪失をもたらす、過剰に活性化された線維芽細胞及び筋線維芽細胞によって引き起こされる。しかし、構造的支持の低下は、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン）受容体に結合する薬物についても観察されるように、「拡張」又は「リモデリング」された心臓につながる可能性がある。リラキシン−２の投与は過剰なコラーゲンの分泌及び蓄積を減少させるが、線維芽細胞及び筋線維芽細胞上のＲＸＦＰ１受容体の活性化は健康な組織の基底コラーゲン含量に影響しないので、ヒトリラキシン−２などのＲＸＦＰ１アゴニストの投与は心臓拡張をもたらさず、ヒトにおける治療的使用に対して安全である。
【００２９】
ヒトリラキシン−２はまた、糸球体濾過速度及び腎血流を増加させるため、及びエンドセリンＢ型受容体媒介性血管拡張及びエンドセリン−１クリアランスを増大させるための、末梢血管及び腎臓血管の拡張剤として試験されているが、ヒトリラキシン−２はまた心房性ナトリウム利尿ペプチドの放出も刺激する。他の研究者らは、ブタリラキシンの投与は、無傷ラットにおいて良好な血行力学的変化を誘発し、動脈圧の有意な低下なしに後負荷を減少させ、心係数を上昇させることを示した。さらに、リラキシンは、強皮症患者及び慢性収縮期心不全を有する患者のための治療上の選択肢として、ヒト臨床試験において試験されている（Ｓｅｉｂｏｌｄら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０００，１３２：８７１−８７９；Ｄｓｃｈｉｅｔｚｉｇら、Ｊ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｆａｉｌｕｒｅ  ２００９，１５：１８２−１９０）。リラキシンの血管拡張効果が急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）及び慢性収縮期心不全（ＣＨＦ）を有する患者の研究においてさらに調べられている。これらは、他の治療法が利用可能な別の医学的適応症であり、酸化ストレス又は老化後の心筋におけるタンパク質（タイチン）の変化した化学的機械的特徴のために、慢性的なＨＦＰＥＦという医学的サブグループには関連しない。
【００３０】
本開示は、保持された左室駆出率を有し、リラキシンの血管拡張活性を必要としない、心不全（ＨＦＰＥＦ）に罹患した患者を治療するためのリラキシン−２の使用に関する。これにより、本発明は、リラキシンの血管拡張効果に基づく開示（ＷＯ２０１３／０１７６７９）と区別される。後者の活性は、例えば、大血管（大動脈）及び小動脈、細動脈、静脈の中膜層に、並びにリンパ管、膀胱、子宮（子宮平滑筋と呼ばれる）、男性及び女性の生殖管、胃腸管、気道、及び腎臓の糸球体の周囲などに存在する内皮細胞及び血管平滑筋の細胞（これらの特化した平滑筋様細胞はメサンギウム細胞と呼ばれる）に対する血管活性に由来する。
【００３１】
平滑筋細胞は異なる器官において基本的に同じ構造及び機能を有するが、心筋は一種の横紋筋であり、骨格筋や他の平滑筋とは異なる。したがって、本開示は、心筋内の線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、心内膜細胞、及び心筋細胞上に存在するリラキシン受容体（ＲＸＦＰ１）によって媒介されるヒトリラキシン−２の活性に関する。このような活性は、これまで示唆も記述もされていない。このことと合致するように、本開示におけるヒトリラキシン−２の治療標的であるタイチンＮ２Ｂアイソフォームは、絶対的に心臓特異的であり、他のいかなるタイプの筋肉にも見られない（総説については、Ａｒｏｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｒｕｍ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒａｐ  ２０１２を参照のこと）。
【００３２】
さらに、Ｃｈａｇａｓ心臓疾患は、収縮機能が損なわれない拡張期心不全のモデルを表すと言われている（Ｍａｒｉｎ−Ｎｅｔｏら、Ｅｖｉｄｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｙｕｓｕｆ  Ｓ、Ｃａｉｒｎｓ  Ｊ、Ｃａｍｍ  Ｊら（編集者）、２０１０、８２３頁以下）。したがって、心筋の伸展性を保持し、拡張した心臓の形成に対抗するために、本明細書に記載されるリラキシンベースの組成物をＣｈａｇａｓ心筋炎、例えば、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉに対して血清反応陽性である患者、の治療に使用することが考えられる。いかなる理論にも束縛されるものではないが、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ寄生虫はリン酸化障害を引き起こし、そしてタイチンアイソフォームの構造特性を妨害すると考えられる。
【００３３】
拡張期心不全の診断（２０１３  ＩＣＤ−１０−ＣＭ  １５０．３＋４）
患者が心不全の徴候及び症状を有するが、測定された左心室駆出率が正常に近いか又は６０％超の場合、その患者は拡張機能障害（ＨＦＰＥＦ）を有すると主に診断される。別の診断ツールは、正常な駆出率と組み合わせたＢＮＰレベルの上昇である。心エコー検査法を用いて拡張機能障害を診断してもよいが、どの心エコーパラメーターも単独では、それぞれの診断を確認することはできない。僧帽弁流入速度パターン、肺静脈流パターン、Ｅ：Ａの逆転、組織ドップラー測定（すなわち、Ｅ／Ｅ’比）、及びＭ−モードエコー測定（すなわち、左心房サイズの）を含む複数の心エコーパラメーターが、感度が高く特異的であるとして提案されている。複数の心エコーパラメーターを組み合わせるアルゴリズムがさらに開発されている。
【００３４】
拡張機能障害には４つの基本的な心エコーパターンがあり、それらはＩ〜ＩＶに等級分けされる：最も軽度の形態は「弛緩異常パターン」又はグレードＩの拡張機能障害と呼ばれる。僧帽弁流入ドップラー心エコー図では、正常なＥ／Ａ比の逆転がある。このパターンは、患者によって通常は年齢と共に発現する可能性があり、多くのグレード１の患者は心不全の臨床的徴候又は症状を有しない。グレードＩＩの拡張機能障害は、「偽正常充満動態」と呼ばれる。これは中等度の拡張機能障害と考えられ、左心房充満圧の上昇に関連する。これらの患者は、より一般的には心不全の症状を有し、多くは左心臓の高い圧力のために左心房の拡大を有する。グレードＩＩＩ及びＩＶの拡張機能障害は「拘束型充満動態」と呼ばれる。これらはいずれも重度の拡張機能障害の形態であり、患者は進行した心不全の症状を呈する傾向がある。クラスＩＩＩの拡張機能障害患者は、バルサルバ手技を行うときに、心エコー図において患者の有する拡張期異常の逆転を示す。これは、「可逆的拘束型拡張機能障害」と呼ばれる。クラスＩＶの拡張機能障害患者は、彼らの心エコー図の異常の可逆性を示さないので、「固定拘束型拡張機能障害」に罹患していると言われる。クラスＩＩＩ又はＩＶの拡張機能障害のいずれかの存在は、著しく不良な予後と関連する。これらの患者は、左心房の拡大を有することとなる。収縮期の心臓性能の、具現化された（ｉｍａｇｅｄ）容積測定的定義は、一般に駆出率として受け入れられている。収縮期における心臓の容積測定的定義は、最初にＡｄｏｌｐｈ  Ｆｉｃｋによって心拍出量として記載された。Ｆｉｃｋを心臓への拍入血量及びインジェクション率へと容易にかつ安価に反転でき、拡張機能障害を数学的に記述できる。Ｅ／Ａ比の減少及びＥ／Ｅ’比の増加と対をなしたインジェクション率の減少は、拡張期心不全の数学的定義を支持する上でより強力な論拠であるように思われる。任意の収縮機能障害及び重症度に関わらず、心筋のコンプライアンス及び伸展性の低下が、関係するタイチンアイソフォームのリン酸化障害によって引き起こされる場合、拡張機能障害はリラキシンベースの組成物を用いて有益に治療することができる。
【００３５】
タイチンの変化したリン酸化パターン（タイチンＮ２Ｂアイソフォーム）の診断
タイチンのエクソン４９アイソフォーム（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＪ２７７８９２−Ｆｒｅｉｂｕｒｇ  Ａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８６、１１１４−１１２１）は、損傷した心臓の場合には、例えば、循環血液中に放出される。他の骨格筋又は平滑筋ではこのようなアイソフォームは生じないので、タイチンのエクソン４９のアミノ酸配列は心臓特異的である。心臓特異的なタイチンのエクソン４９配列は、９２８個のアミノ酸（エクソン４９）を含み、血清中で検出され、そこから単離され得る。血清タイチンＮ２Ｂタンパク質の検出限界は、約１０ｐｇ／ｍＬであり、血清からのタイチンＮ２Ｂの免疫学的精製のための捕捉抗体として使用できる、利用可能なモノクローナル抗体が存在する（ＤＥ  １０  ２０１２  ０１７  ５６６．３−Ｌａｂｅｉｔ  Ｄら）。次いで、精製されたタイチンＮ２Ｂを、電気泳動（Ｂｏｒｂｅｌｙ  Ａら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ  ２００９，１０４（６）：７８０−６）又は好ましくは質量分析法（Ｋｏ（ウムラウト）ｔｔｅｒ  Ｓら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２０１３、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｃｖｒ／ｃｖｔ／４４）を用いてそのリン酸化を調べてもよい。
【００３６】
タイチンリン酸化障害に対する他の間接的なマーカーは、血漿又は血清のニトロチロシン及びインターロイキン−６（両方とも酸化ストレスに対するマーカー）のレベルの上昇であってもよい。拡張期心不全の患者は、コントロールの対象と比較して、腫瘍壊死因子α並びにインターロイキン６及び８の血漿レベルも有意に上昇している。ニトロソ化／酸化ストレスの指標であるニトロチロシンの発現は、特に、心筋プロテインキナーゼＧ活性（ＰＫＧ）及び下流の心筋細胞におけるタイチンリン酸化活性に相関する。心筋プロテインキナーゼＧ活性の修正が特定のＨＦＰＥＦ治療の標的となり得ることが既に推測されていたが、この効果に指向した医薬組成物は提案されていない。この文脈において、ヒトリラキシン−２は、一酸化窒素を増加させることによってｃＧＭＰ−ＰＫＧ経路を直接的に刺激する一方で、その抗酸化作用及び抗炎症作用により一酸化窒素の生体利用効率及び可溶性グアニル酸シクラーゼ（すなわち、一酸化窒素による刺激でｃＧＭＰを産生する酵素）の機能的完全性を間接的に保護するので、独特である（Ｄｓｃｈｉｅｔｚｉｇ  Ｔら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２０１２）。
【実施例】
【００３７】
実施例１−合成ヒトリラキシン−２及び生物学的同等性（従来技術）
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ＲＢ、固相合成（ノーベル賞受賞講演）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．１９８５；２４：７９９−８１０）の改変を用いて、ＷＯ２０１３／１７６７９（Ｄｓｃｈｉｅｔｚｉｇ  Ｔら）に開示されているようにヒトリラキシン−２を調製した。本質的に、ヒトリラキシン−２を調製するためのプロセスには、以下のアミノ酸配列の固相合成が含まれていた：
配列番号：１−Ａ鎖
ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ
配列番号：２−Ｂ鎖：
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−ｌｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ
【００３８】
Ａ鎖の内部鎖間（Ｃｙｓ−１０とＣｙｓ−１５）及びＡ鎖とＢ鎖との組み合わせ（Ａ鎖のＣｙｓ−１１とＢ鎖のＣｙｓ−１１、及びＡ鎖のＣｙｓ−２４とＢ鎖のＣｙｓ−２３）の結合に関して、Ａ鎖及びＢ鎖は、トリチル基で保護されたシステイン（Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）を用いて最初に合成された。個々のＡ鎖及びＢ鎖は、固相合成の後、クロマトグラフィーにより精製し、ｐＨ７．９〜８．４の炭酸水素アンモニウム緩衝液中で個々のＡ鎖及びＢ鎖のフォールディング及び組み合わせを同時に行い、その後形成されたリラキシン−２の精製を行った。
【００３９】
調製されたペプチドホルモンは、ヒトリラキシン−２及び組換えヒトリラキシン−２と構造的に同一で生物学的に同等であった。実験は、基礎的な受容体薬理学の確立された細胞株である、ＲＸＦＰ１受容体を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及び内在性ＲＸＦＰ１発現を有するヒトマクロファージ細胞株であるＴＨＰ−１細胞で行った。ポリ−Ｌ−リジンでプレコートされた白い壁と透明な底部を有する９６穴ＩｓｏＰｌａｔｅ（商標）のマイクロプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に播種したそれぞれの細胞を用いて、結合特性を測定した。比較結合は、ユーロピウムで標識されたヒトリラキシン−２をトレーサーとして、そして漸増濃度のヒト合成リラキシン−２（２つの異なるロット）を用いて測定した。非特異的結合は、過剰（５００ｎＭ）の非標識ヒトリラキシン−２の存在下で測定した。各濃度点を三連で測定した。少なくとも３つの独立したアッセイでペプチドを試験して活性を確認した。曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）のワンサイト結合モデルを用いて適合させた。ペプチド活性の尺度としての阻害定数（ＫＩ）を、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式を用いてＩＣ５０値から決定した。
【００４０】
合成ヒトリラキシン−２（ｓｈＲｌｘ）の有するＲＸＦＰ１関連シグナル伝達を活性化する能力を決定するために、ＲＸＦＰ１を安定的に発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞及びｐＣＲＥ−β−ガラクトシダーゼレポータープラスミドをさらに使用した（Ｈａｌｌｓ  ＭＬら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．２００９；１１６０：１０８−１１）。ＲＸＦＰ１受容体の刺激は、アデニル酸シクラーゼの活性化をもたらし、したがってｃＡＭＰの増加をもたらす。２つの異なるロットの合成ヒトリラキシン−２及び記された他の供給源からのリラキシンの濃度を高めながら、細胞を６時間インキュベートした。各濃度点は三連で行い、ペプチドは少なくとも三つの独立した実験で試験した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてデータを分析し、非線形回帰シグモイド用量応答（可変勾配）モデルを用いて曲線をプロットし、ｐＥＣ５０値を算出した。
【００４１】
合成ヒトリラキシン−２ペプチドは、組換えヒトリラキシン−２と同様に、ヒトリラキシン受容体ＲＸＦＰ１（リラキシンファミリーペプチド受容体１）に結合した；表１と図３Ａを参照のこと。ヒトリラキシン−２について開発されたｃＡＭＰアッセイによって示されるように、シグナル伝達もまた同様であった；図３Ｂを参照のこと。ヒトＴＨＰ−１細胞では、合成及び組換えのヒトリラキシン−２は同等の生物活性を示した；詳細は下記表１を参照のこと。
【表１】
2019203022.tif 000002
【００４２】
さらに、心筋肥大の確立された細胞モデル（Ｄｓｃｈｉｅｔｚｉｇ  Ｔら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００６；１１２：３８−５６）において、合成ヒトリラキシン−２は、組換えヒトリラキシン−２と同じくらい強力であることが判明した。本発明者らのモデルでは、合成ヒトリラキシン−２は、心臓の線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化及びこれらの細胞による成長因子の分泌を阻害した。合成ヒトリラキシン−２は、優れた安定性を有していた。Ｂ鎖のＮ末端アスパラギン酸を含まない生物学的に完全に活性な副産物が、３７℃で８０日後に観察された。
【００４３】
実施例２−安全性及び用量応答（最初の医療適応症−従来技術）
ヒトリラキシンは、生理学的にアップレギュレートされ、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチドのようにヒト心不全において代償的役割を果たす。安定した心不全患者のヒトリラキシン（組換え産生ヒトリラキシン−２（ｒｈＲＬＸ））に対する安全性及び用量応答を測定するために、１６人の患者を３つの連続した用量コホートで静脈内投与したヒトリラキシン−２で処置し、２４時間輸注（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）の間、及び輸注（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）後の期間、血行力学的にモニターした。
【００４４】
グループＡ（１０ｐｇ、３０ｐｇ及び１００ｐｇのヒトリラキシン−２／ｋｇ／日に相当する用量でそれぞれ８時間の処置）で示された安全性は、Ｂ群（２４０ｐｇ／ｋｇ／日、４８０ｐｇ／ｋｇ／日及び９６０ｐｇ／ｋｇ／日）への増量を可能にし、最大の安全用量９６０ｐｇ／ｋｇ／日をＣ群の２４時間投与に選択した。
【００４５】
ヒトリラキシン−２は、関連する副作用を示さず、全身の血管拡張に合致する血行力学的効果、すなわち心指数の上昇傾向及び肺楔状圧の減少傾向を、低血圧を引き起こすことなく生み出した。したがって、ヒトリラキシン−２のこの示された血行力学的効果は、ヒトの心不全、特にうっ血性心不全、において静脈内投与されたヒトリラキシン−２の最初の治療的使用を表している（Ｄｓｃｈｉｅｔｚｉｇら、ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００１，１５：２１８７−２１９５；ドイツ連邦医薬品・医療機器庁（ＢｆＡｒＭ）承認試験「Ａ  Ｐｉｌｏｔ  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｄｏｓｅ−Ｆｉｎｄｉｎｇ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｌａｘｉｎ（ｒｈＲｌｘ）ｉｎ  Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｄ  Ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ（代償性うっ血性心不全における静脈内投与の組換えヒトリラキシン（ｒｈＲｌｘ）の安全性に関するパイロット試験及び用量設定試験）」、欧州連合臨床試験データベース（ＥｕｄｒａｃｔＣＴ）２００５−００１６７４−２７、プロトコル番号ＲＬＸ−ＣＨＦ．００１）。ヒトリラキシン−２の静脈内投与は、急性心不全の場合のその血行力学的効果に関して第ＩＩＩ相臨床試験においても良好に試験されている（Ｔｅｅｒｌｉｎｋら、Ｒｅｌａｘｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ（急性心不全患者の治療のためのリラキシン）（Ｐｒｅ−ＲＥＬＡＸ−ＡＨＦ）：ａ  ｍｕｌｔｉ−ｃｅｎｔｒｅ，ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｐａｒａｌｌｅｌ−ｇｒｏｕｐ，ｄｏｓｅ−ｆｉｎｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ  ＩＩｂ  ｓｔｕｄｙ（多施設、無作為化、ランダム化、プラセボ対照、並行群間、用量設定第ＩＩｂ相臨床試験）Ｌａｎｃｅｔ  ２００９，３７３：１４２９−１４３９；（６）Ｐｏｎｉｋｏｗｓｋｉら，Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｌａｘｉｎ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｓｔｕｄｙ（急性心不全研究におけるリラキシンの設計）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１２，１６３：１４９−１５５）。したがって、ヒトリラキシン−２が心不全の治療のために安全に投与され得るという十分なデータがある。
【００４６】
実施例３−リラキシンの皮下輸注（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）による拡張機能障害の治療
リラキシンは、線維芽細胞の筋線維芽細胞への形質転換、組織線維症の発生の初期段階、及び筋線維芽細胞によるマトリックスタンパク質の刺激された分泌を調節及び減弱する役割を果たすことが知られている（Ｓａｍｕｅｌら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２００４，１４５：４１２５−４１３３）。したがって、リラキシンはまた、心筋肥大を緩和するために使用されてもよい（Ｄｓｃｈｉｅｔｚｉｇら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＹ  Ａｃａｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５、１０４１：４４１−３；Ｍｏｏｒｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００７、１４８：１５８２−１５８９；Ｓａｍｕｅｌら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２００８，１４９：３２８６−３２９３；Ｌｅｋｇａｂｅら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２００５，４６：４１２−４１８；Ｘｉｏａ−Ｊｕｎ  Ｄｕら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓ  ２００３，５７：３９５−４０４）。しかし、これらの開示は、筋肉タンパク質の化学的機械的硬化とは無関係に、心筋の線維性硬化又は肥大性硬化によるプロセスに関連する。
【００４７】
したがって、本発明者らは、拡張期心不全、及び弛緩及び伸展性が不十分な硬くなった心筋の治療を試験するための動物モデルを使用した。以下の表は、対照と比較した拡張期心不全のタイプのマウスで得られたデータをまとめたものである。マウスに１２週間にわたり、単離したブタリラキシンを皮下輸注（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）（ブタリラキシン５０ｐｇ／ｋｇ／日）すると、拡張末期圧が低下し、結果的に、Ｅ／Ａ比が改善された。Ｅ／Ａ比は、心室充満の質を表す機能的パラメーターである。リラキシンの皮下輸注（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）は、連続的にブタリラキシンを放出する膜カプセルをマウスの首部分に移植することによって得られた。結果を以下の表２にまとめた。
【表２】
2019203022.tif 000003
【００４８】
データは、ブタリラキシンの皮下輸注（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）が、拡張期マウスについてのみ心機能に有益な効果を有したが、対照においては薬学的効果は認められなかったことを示す。したがって、リラキシンは、心臓の性能が硬化作用により既に危険にさらされている場合に有効であることが証明された。対照において、測定されたＥ／Ａ比はいかなる影響も受けなかった（Ｅ／Ａ＝２．５又は２．６±０．２）。しかし、拡張機能障害の場合、Ｅ／Ａ比の低下は、正常範囲に劇的にシフトし、リラキシンの投与がマウス心臓の拡張期機能を大きく改善したことを示した。したがって、データは、治療された心臓では伸展性及び弛緩性が向上したことを支持している。それにもかかわらず、リラキシンの効果及びこの観察結果の根底にあるメカニズムを理解する必要があった。
【００４９】
実施例４−心筋による内因性のヒトリラキシン−２産生
心房細動のアブレーションのために選択的なカテーテル法を受けている患者のうち、収縮期又は拡張期の心不全のない対照患者２０名（閉経後女性５名、男性１５名）及びＰａｕｌｕｓらによる診断アルゴリズム（図２を参照）を用いて診断された拡張期心不全（ＤＨＦ）を患う３０名の患者（閉経後女性１０名、男性２０名）を採用した。
【００５０】
ＥＬＩＳＡによるリラキシン−２の測定のための血液は、肘正中静脈、大動脈／左心室、及び冠状静脈洞から、アブレーション処置の直前に採血された。大動脈／左心室と冠状静脈洞との濃度差を冠状動脈勾配と称することとした。正の勾配（冠状動脈洞レベル＞大動脈／左心室レベル）は、心筋によるリラキシン産生の尺度と考えられ、負の勾配は、血中リラキシンの心筋による消費を示すものであった。
【００５１】
血中（静脈）リラキシン−２は、対照と比較して拡張期心不全（ＤＨＦ）を有する患者において有意に増加した；図４を参照のこと（対照に対してＰ＜０．０５；順位についてのマン・ホイットニーのＵ検定）。リラキシン−２の冠状動脈勾配に関して、対照と拡張期心不全患者との間に何らの有意差も認められなかった。図５を参照のこと（２要因分散分析（要因：群、反復測定）で分析；Ｐ＞０．０５、有意差なし）。しかし、拡張期心不全患者について冠動脈リラキシン−２勾配と拡張機能障害の心エコー指標（Ｅ／Ｅ’、下記を参照のこと）との関係を分析したところ、非常に有意な非線形逆相関が見られた。言い換えれば、高いリラキシン勾配（心筋による高い産生を反映する）を有する拡張期心不全患者の心臓は、低い又はさらに負の勾配を有する拡張期心不全患者の心臓よりも、拡張期において良好に機能する。この分析の結果を図６に示す：Ｅ／Ｅ’により評価された拡張期機能の関数である拡張期心不全患者におけるリラキシン−２の個人毎の冠状動脈勾配。Ｅ／Ｅ’は、拡張期心不全を分類及び診断するために使用される拡張機能障害の最も確立された心エコーマーカーである（Ｐａｕｌｕｓら、Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  ２００７；図２を参照のこと）。Ｅは早期僧帽弁血流速度を示し、Ｅ’は組織ドップラー法によって測定された早期心筋弛緩速度を示し、Ｅ／Ｅ’はその無次元の比である。９５％信頼区間を有する３次関数回帰；ピアソン相関係数ｒ＝０．９５。対照では、そのような相関は見られなかった。
【００５２】
これらの知見は、各個人での心筋リラキシン−２アップレギュレーションの欠如が、各個人の拡張機能障害の程度を悪化させるという結論を与える。逆に治療のためのリラキシン投与は、拡張期心不全を有意に改善すると予想される。最も重要なこととして、ヒトリラキシン−２は心臓の線維芽細胞及び筋線維芽細胞に影響を及ぼし、これらの有益な効果は血行力学的起源を有するものではなく、例えば、ヒトリラキシン−２の血管拡張効果に由来するものではないことに注目すべきである。
【００５３】
実施例５−炎症／酸化ストレスと左心室拡張末期圧との間の相関関係及びリラキシン−２の投与により変化したタイチンＮ２Ｂの低リン酸化
雄の５ヶ月齢の対照及び高血圧自然発症（ＳＨＲ）ラットの心臓並びに１２週齢のＺｕｃｋｅｒの痩せ型ラット（Ｌｅａｎ）及びＺｕｃｋｅｒの肥満型糖尿病ラット（ＺＤＦ）の心臓を切除し、Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ心臓標本とした（それぞれｎ＝１６）。同様に、ヘテロ接合体（Ｃ５７Ｂｌｋ６ＪｘＳＪＬ）の親から生成した野生型（ＷＴ）及びヘテロ接合型β２−アドレナリン受容体トランスジェニック（ＴＧ）マウス（それぞれｎ＝１０）からも心臓を採取した。β２−アドレナリン受容体トランスジェニック（ＴＧ）マウスは、主に線維化関連の拡張機能障害を有するモデルである。
【００５４】
動物の事前の放血の過程で、血漿ニトロチロシン及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）の測定のために血液が採取された。最大左室収縮期圧発生時（活性ＬＶＰ）の左心室拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）を測定した。その後、全ての心臓を５ｎｍｏｌ／Ｌの合成ヒトリラキシン−２又はプラセボで３０分間処置した（各サブグループについてｎ＝８）。最後に、遊離した左心室壁のホモジネート中で、総和の及びリン酸化されたＮ２ＢＡ及びＮ２Ｂタイチンアイソフォームを検出及び定量した。
【００５５】
ベースライン：最大活性ＬＶＰにおいて、高血圧自然発症ラットの心臓は、対照の心臓と比較して有意に上昇した左心室拡張末期圧を示した：高血圧自然発症ラットでは１４±２ｍｍＨｇ；対照では５±１ｍｍＨｇ。同様に、ＺＤＦの心臓は、Ｌｅａｎの心臓よりも高い左心室拡張末期圧を有した：ＺＤＦでは１２±２ｍｍＨｇ；Ｌｅａｎでは６±１ｍｍＨｇ。Ｐ＜０．０１；及び前記トランスジェニック（ＴＧ）マウスは野生型マウスより有意に高い左心室拡張末期圧を有した：前記トランスジェニック（ＴＧ）では１２．３±２ｍｍＨｇ；野生型では４．９±１．１ｍｍＨｇ（順位についてのクラスカル・ウォリスの分散分析、次いでマン・ホイットニーのＵ−検定）。
【００５６】
対照としての高血圧自然発症ラット及びラットのＬｅａｎ−ＺＤＦコホートのどちらにおいても、ニトロチロシン及びＩＬ−６の血漿レベルは、ベースライン左心室拡張末期圧と相関していた。図７は、ラット群におけるニトロチロシンと左心室拡張末期圧とのこの相関を示す；ピアソンの相関係数は全てのラット群においてｒ＝０．８９であった（Ｐ＜０．０１）。同様に、血漿ＩＬ−６と左心室拡張末期圧との間に正の相関が見られ、全てのラット群でｒ＝０．９１であった（Ｐ＜０．０１）。そのような相関は野生型及び前記トランスジェニック（ＴＧ）マウスで見られなかった。
【００５７】
左心室拡張末期圧に関するリラキシン−２の効果（治療）
プラセボと比較すると、５ｎｍｏｌ／Ｌの合成ヒトリラキシン−２の３０分間の投与は、高血圧自然発症ラット及びＺＤＦの心臓において左心室拡張末期圧を著しく減少させたが、対照及びＬｅａｎの心臓においてはより小さな変化が見られた。野生型及び前記トランスジェニック（ＴＧ）マウスでは、合成ヒトリラキシン−２は、小さいとはいえ有意な左心室拡張末期圧の減少を誘発した。この左心室拡張末期圧の減少は、２つのラットモデルで得られたデータとは対照的に、対照（野生型）及び罹患動物（ＴＧ）の間で差異がなかった。図８の棒グラフは、異なる群における左心室拡張末期圧の平均減少の点で心臓に生じる生理学的効果をまとめたものである（＊は対プラセボでＰ＜０．０５であることを示し、＊＊は、順位についてのクラスカル・ウォリスの分散分析、次いでマン・ホイットニーのＵ検定によってＰ＜０．０１であることを示す）。リラキシン−２の投与は、酸化ストレス及び変化した心筋の機械的特性を患ったＺＤＦ及びＳＨラットの心臓に対して明らかに実質的で有益な効果を有していた。
【００５８】
タイチンリン酸化に対するリラキシンの効果
プラセボとは対照的に、５ｎｍｏｌ／Ｌの合成ヒトリラキシン−２の３０分間の投与は、高血圧自然発症ラットの心臓及びＺＤＦの心臓において見られる硬い（ｓｔｉｆｆ）タイチンＮ２Ｂアイソフォームの相対的な低リン酸化（本明細書では比率Ｐ−Ｎ２ＢＡ／Ｐ−Ｎ２Ｂとして表される）を大きく逆転させた。対照的に、Ｎ２Ｂタイチンの相対的リン酸化状態は、野生型マウスと比較して前記トランスジェニック（ＴＧ）では変化せず（野生型及び前記トランスジェニック（ＴＧ）のプラセボ群同士の比較）、リラキシン効果は対照（野生型）及び疾患動物（ＴＧ）の間で差異が無かった。図９は、異なる群における平均のＰ−Ｎ２ＢＡ／Ｐ−Ｎ２Ｂ比をまとめたものである（＊は対プラセボでＰ＜０．０５であることを示し；＊＊は順位についてのクラスカル・ウォリスの分散分析、次いでマン・ホイットニーのＵ検定によってＰ＜０．０１であることを示す）。
【００５９】
検討したラット群の全てにおいて、全ての群のプラセボ処置心臓のＰ−Ｎ２ＢＡ／Ｐ−Ｎ２Ｂ比とベースライン左心室拡張末期圧との間に有意な相関が見られた（全群に対するピアソンのｒ＝０．７５［Ｐ＜０．０１］）が、マウスでは発見はされなかった。したがって、拡張期心不全を有する心臓において見られる増加したベースライン左心室拡張末期圧は、相対的なＮ２Ｂリン酸化障害（Ｐ−Ｎ２ＢＡ／Ｐ−Ｎ２Ｂ比）と相関し、そして、Ｎ２Ｂのリン酸化を増加させることによってＰ−Ｎ２ＢＡ／Ｐ−Ｎ２Ｂ比を減少させるリラキシン−２の投与によって、ベースライン左心室拡張末期圧は低下させることができる。
【００６０】
結果の考察
巨大タンパク質のタイチンは、心筋拡張期の硬さの主要な決定要因となる（Ｂｏｒｂｅｌｙら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ２００９；１０４：７８０−７８６；Ｐａｕｌｕｓ  ａｎｄ  Ｔｓｃｈｏｅｐｅ、ＪＡＣＣ  ２０１３；６２：２６３−２７１）。左心室充満圧（ＬＶＥＤＰ）が付随して増加している心筋拡張期の硬さの増大は、ＨＦＰＥＦ（拡張期心不全、拡張機能障害）の存在の最も明白な診断的徴候であり、該ＨＦＰＥＦ（左室駆出率が保たれた心不全、ＨＦＰＥＦ）は、硬い（ｓｔｉｆｆ）Ｎ２Ｂタイチンアイソフォームの低リン酸化に関連し得るのみならず、該障害されたタイチンリン酸化は、一酸化窒素の生体利用効率を減少させる酸化ストレスの増加に起因すると考えられる。後者は、ｃＧＭＰ−プロテインキナーゼＧシグナル伝達及びＮ２Ｂリン酸化を減少させることが以前に示されている（Ｈｅｅｒｅｂｅｅｋら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２０１２；１２６：８３０−８３９）。本発明者らは、合成ヒトリラキシン−２がＲＸＦＰ１細胞におけるｃＡＭＰ活性を増加させることができ、これによりタイチンアイソフォームのリン酸化障害を相殺することができ、このことはまた、拡張機能障害の独立した２つの動物モデルである高血圧自然発症ラット及びＺＤＦにおける病理学的に上昇した左心室拡張末期圧を改善（低下）させる、という証拠をさらに提示した。さらに、リラキシンが有する左心室拡張末期圧を減少させる効果が、上昇したＮ２Ｂリン酸化を伴うことが初めて示された。本発明者らのモデルでは、酸化ストレス及び／又は炎症の血中マーカーであるニトロチロシン及びインターロイキン−６は、拡張機能障害の程度（左心室拡張末期圧の増加）及び相対的なＮ２Ｂ低リン酸化の程度と相関していた。一方、主に線維症に関係する拡張機能障害のモデルであるβ２−アドレナリン受容体トランスジェニックマウスにおいては、リラキシンの投与によって治療することができたＮ２Ｂタイチンのリン酸化障害は存在しない。したがって、合成リラキシン−２の効果は、対照動物と罹患動物との間で差異はなかった。したがって、合成ヒトリラキシン−２は、Ｎ２Ｂ低リン酸化のタイチンによる拡張期の心筋の増加した硬さを示す、酸化／炎症マーカーの高い血漿レベルを示す拡張期心不全に罹患している患者を治療する候補薬剤である。
【００６１】
実施例７−合成ヒトリラキシン−２を用いた拡張期心不全患者（臨床試験第ＩＩ相）の試験。
臨床第ＩＩ相の当局の承認は、Ｐａｕｌｕｓらの記載（図２のダイアグラムを参照）に従って拡張期心不全と診断された患者について得られている。拡張期心不全試験に含める患者の基準は、次のとおりである：ａ）過去６ヶ月間以内の呼吸困難での入院；ｂ）治療前の少なくとも４週間、安定した薬物療法；ｃ）左心室駆出率（ＬＶＥＦ）−少なくとも５０％の保持された左心室駆出率；ｄ）Ｐａｕｌｕｓらによる左室駆出率が保たれた心不全の確立した診断（図２の診断フローチャートのダイアグラムを参照のこと）。この試験から除外されたのは、何らかの関連する収縮機能障害を有する患者、又は過去４週間以内に急性冠動脈症候群を有した患者、又は過去６ヶ月以内に心臓手術を受けた若しくは急性心筋梗塞を有した患者、又は低血圧（収縮期血圧が１００Ｈｇ未満）の患者、又は試験前過去６ヶ月以内において致命的な頻脈又は徐脈を有した患者、又は試験前に２ｍｇ／ｄｌを超える血清クレアチニンを有する患者；肺疾患又は非心臓起源の呼吸困難を有する患者；又は何らかの悪性腫瘍を有する患者である。
【００６２】
１２人の患者からなる３つの群に対しては、ａ）プラセボ、ｂ）１０ｐｇ／ｋｇ／日の低用量のヒトリラキシン−２、又はｃ）１００ｐｇ／ｋｇ／日の高用量のリラキシンが、４週間のフォローアップモニタリングを含めて３ヶ月間投与される。この試験は、１つの病院で、二重盲検、前向き、無作為化で行われる。
【００６３】
以下の追加の評価が現在行われているか、又は検討されている：
・リラキシン投与後の拡張機能の心エコー検査（Ｅ／Ｅ’、ＬＡＶＩ）
・運動能力及び関連する拘束因子を評価するためのスパイロエルゴメトリー
・「コンパニオンマーカー」としての血清ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの測定
・炎症マーカー及びコンパニオンマーカーとしての血中ＩＬ−６、ＩＬ−８、ニトロチロシンの測定
・コラーゲン代謝回転（ＰＩＮＰ、ＰＩＩＩＮＰ、ＭＭＰ−２、ＴＩＭＰ−４、ＰＩＩＩＮＰ、ＭＭ  Ｐ−８）の測定
・生活の質（ＱＯＬ）と呼吸困難のアンケート
・リラキシン投与の異なるモード（皮下投与又は静脈投与）の評価（乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）−ガレヌス製剤）
・「安全性／有効性」のモニタリング：７日目、３０日目、６０日目、９０日目及び１２０日目
（付記）
＜１＞  慢性的な、左室駆出率が保持されている心不全（ＨＦＰＥＦ）であって、心筋の硬化も有する心不全に罹患した人を治療するための医薬組成物であって、心筋内の線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、心内膜細胞、及び心筋細胞上に存在するリラキシン受容体（ＲＸＦＰ１）に特異的に結合して心臓コンプライアンス及び一回拍出量を増加させ、左心室の拡張末期圧を低下させることができる化合物を治療有効量含む、医薬組成物。
＜２＞  心臓特異的なタイチンのリン酸化障害の影響を治療するための、＜１＞に記載の医薬組成物。
＜３＞  心臓特異的なタイチンＩＭ２Ｂの低リン酸化の影響を治療するための、＜１＞又は＜２＞に記載の医薬組成物。
＜４＞  皮下注射若しくは静脈注射又は経口投与に適した薬学的に許容されるアジュバント、キャリア、希釈剤又は賦形剤と混合したヒトリラキシン分子又はその薬学的に許容される誘導体若しくは前駆体を含む、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜５＞  ヒトリラキシン−１、ヒトリラキシン−２、ヒトリラキシン−３及びそれらの類似体又は誘導体を含む群から選択されるヒトリラキシン分子を含む、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜６＞  口腔粘膜又は胃腸管粘膜に送達するためのエマルジョン（水中油型又は油中水型）として製剤化されている、＜５＞に記載の医薬組成物。
＜７＞  前記リラキシンが、ミセル、逆ミセル、リポソーム、キュボソーム及びそれらの混合物から選択される送達ビヒクル中に含まれる、＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜８＞  粘膜付着性タンパク質が、化学又はを介して前記送達ビヒクルと結びついている、＜７＞に記載の医薬組成物。
＜９＞  物理的結合を介して、前記リラキシンの全身送達を達成するために、前記組成物が粘膜に吸着するか又は粘膜表面に保持される。
＜１０＞  前記組成物が、１０ｐｇ／ｋｇ／日〜１０００ｐｇ／ｋｇ／日の範囲の速度でヒトリラキシン−２を投与する皮下輸注（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）用であるか、又は皮下輸注（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）で達成されるものと同等の血漿濃度を生じる経口投与用である、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜１１＞  Ｈ２リラキシンが、３０ｐｇ／ｋｇ／日〜１００ｐｇ／ｋｇ／日の範囲の輸注（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）速度で投与される、＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜１２＞  慢性拡張期心不全に罹患している対象が、心臓特異的なタイチンの潜在的なリン酸化障害に罹患していると診断されている、＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜１３＞  拡張機能障害及び拡張期心不全に罹患している前記対象がさらに腎障害を有する、＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜１４＞  前記対象の、ＭＤＲＤ式に従って推定されるクレアチニンクリアランスが３０〜７５ｍＬ／分／１．７３ｍ２の範囲である、＜１＞〜＜１３＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜１５＞  拡張機能障害及び拡張期心不全に罹患している前記対象が、高血圧であり、及び／又は糖尿病及び／又は酸化ストレス及び／又は炎症を患っている、＜１＞〜＜１４＞のいずれかに記載の医薬組成物。
＜１６＞  病理学的に減少した心臓流入血量を示す患者に、心筋内のリラキシン受容体と特異的に結合して前記心臓の拡張末期圧を低下させ、前記心臓の拍出量を増加させることのできる化合物を治療有効量投与することにより、心臓流入血量を増加させる方法。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年9月26日(2019.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心臓流入血量の増加を必要とする人を治療するための医薬組成物であって、
心筋におけるリラキシン受容体（ＲＸＦＰ１）に特異的に結合して、心臓の拡張末期圧を低下させ、心臓の一回拍出量を増加させることが可能な化合物を治療有効量含む、医薬組成物。
【請求項２】
リラキシン受容体（ＲＸＦＰ１）に特異的に結合可能な前記化合物が、配列番号１及び配列番号２のペプチド配列の少なくともいずれか１つを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
リラキシン受容体（ＲＸＦＰ１）に特異的に結合可能な前記化合物が、薬学的に許容されるアジュバント、キャリア、希釈剤、又は賦形剤と混合されたヒトリラキシン−２を含む医薬組成物中に含まれる、請求項１又は請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
リラキシン受容体（ＲＸＦＰ１）に特異的に結合可能な前記化合物が、ヒトリラキシン−１、ヒトリラキシン−２、ヒトリラキシン−３及び生物学的活性を有するそれらの類似体又は誘導体を含むヒトリラキシン群から選択される、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
リラキシン受容体（ＲＸＦＰ１）に特異的に結合可能な前記化合物が、口腔粘膜又は胃腸管粘膜に送達するためのエマルジョン（水中油型又は油中水型）として製剤化された医薬組成物中に含まれる、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
リラキシン受容体（ＲＸＦＰ１）に特異的に結合可能な前記化合物が、前記医薬組成物が粘膜に吸着するか又は粘膜表面に保持されてリラキシンの全身送達を達成するために、粘膜付着性タンパク質が化学的又は物理的結合を介して送達ビヒクルと結びついている医薬組成物中に含まれる、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
リラキシン受容体（ＲＸＦＰ１）に特異的に結合可能な前記化合物が、皮下輸注（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ）用の医薬組成物中に含まれる、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記人が、心房細動に罹患している、及び／又は潜在的な心臓特異的タイチンのリン酸化障害を有すると診断された人である、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記人が、さらに腎障害を有する、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記人の、ＭＤＲＤ式に従って推定されるクレアチニンクリアランスが３０〜７５ｍＬ／分／１．７３ｍ２の範囲である、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記人が、高血圧であり、及び／又は糖尿病及び／又は酸化ストレス及び／又は炎症を患っている、請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。