(57)【要約】【課題】短期間で老化し、機能が低下する気道粘膜上皮由来の初代培養細胞が有する問題点を解消する細胞を提供すること【解決手段】下記（１）及び（２）の遺伝子（１）ＣＤＫ４Ｒ２４Ｃ遺伝子又はＢＭＩ１遺伝子  （２）ＴＥＲＴ遺伝子をヒト気道上皮細胞に導入する工程を含む、不死化したヒト気道上皮細胞の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）及び（２）の遺伝子
（１）ＣＤＫ４Ｒ２４Ｃ遺伝子又はＢＭＩ１遺伝子  
（２）ＴＥＲＴ遺伝子
をヒト気道上皮細胞に導入する工程を含む、不死化したヒト気道上皮細胞の製造方法。
【請求項２】
前記（１）の遺伝子がＣＤＫ４Ｒ２４Ｃ遺伝子であり、さらに（３）ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子を導入する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法により得られる不死化ヒト気道上皮細胞。
【請求項４】
請求項３に記載の不死化ヒト気道上皮細胞を備える、ウイルス分離用キット。
【請求項５】
請求項３に記載の不死化ヒト気道上皮細胞を備える、ウイルス抑制剤スクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の不死化及び不死化細胞の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器ウイルス感染によるヒト気管上皮細胞やヒト鼻腔粘膜上皮細胞の機能変化や細胞におけるウイルス増殖能、抗ウイルス薬の活性を測定するために、病理解剖から提供される気管組織や手術で切除された鼻腔粘膜から採取した細胞を培養する初代培養細胞が使われていた。
【０００３】
初代培養細胞は呼吸器ウイルスの分離や気管支喘息・慢性閉塞性肺疾患などの増悪に関係する気道上皮細胞の機能変化の解析に有用であるが、短期間で老化し、機能が低下する欠点がある。ヒト気管は病理解剖から提供される手続き上、入手が非常に困難である。また、気管や鼻腔粘膜から繰り返して細胞を採取・培養する必要があり、多大な労力が必要であった。また、個体差間のウイルス増殖能が異なるため、抗ウイルス薬の評価判定に対しては、再現性のあるデータの取得が困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２５４５０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、短期間で老化し、機能が低下する気道上皮由来の初代培養細胞が有する問題点を解消する細胞を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる状況の下、本発明者らは鋭意研究した結果、ヒト気道上皮細胞に特定の遺伝子を導入して不死化し、これを用いることによりかかる課題を解決できることを見出した。従って、本発明は以下の項を提供する：
項１．下記（１）及び（２）の遺伝子
（１）ＣＤＫ４Ｒ２４Ｃ遺伝子又はＢＭＩ１遺伝子  
（２）ＴＥＲＴ遺伝子
をヒト気道上皮細胞に導入する工程を含む、不死化したヒト気道上皮細胞の製造方法。
【０００７】
項２．前記（１）の遺伝子がＣＤＫ４Ｒ２４Ｃ遺伝子であり、さらに（３）ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子を導入する、項１に記載の方法。
【０００８】
項３．項１又は２に記載の方法により得られる不死化ヒト気道上皮細胞。
【０００９】
項４．項３に記載の不死化ヒト気道上皮細胞を備える、ウイルス分離用キット。
【００１０】
項５．項３に記載の不死化ヒト気道上皮細胞を備える、ウイルス抑制剤スクリーニング用キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法により得られる細胞は継代による細胞の増殖能力の低下が抑制され、不死化されているため、細胞準備の手間を減らすことができる。また、当該細胞は呼吸器感染症をもたらすウイルス（インフルエンザウイルス、ライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど）の感染能力を有している。均一なロットのウイルス分離用宿主細胞を使うことができ、初代培養細胞の調整の手間や頻度を減らすことができるため、いつでもウイルス分離実験、抗ウイルス薬の抑制効果の評価等を行うことができる。また、当該細胞におけるウイルス感染に対する炎症性物質、活性酸素合成等の気道炎症の指標を測定し、ウイルス感染による気管支喘息や慢性閉塞性肺疾患の悪化等の病態に関係する、気道における機能変化を解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本願実施例中、「不死化ヒト気管上皮細胞におけるウイルス増殖」試験の結果を示す。
【図２】本願実施例中、「不死化ヒト気管上皮細胞におけるウイルス増殖」試験における顕微鏡写真を示す
【図３】本願実施例中、「不死化ヒト鼻腔粘膜上皮細胞におけるウイルス増殖」試験の結果を示す。
【図４】本願実施例中、「不死化ヒト鼻腔粘膜上皮細胞におけるウイルス増殖」試験の結果を示す。
【図５】本願実施例中、「不死化ヒト気管上皮細胞におけるウイルス増殖」試験における顕微鏡写真を示す（拡大率：x 100）。コラーゲン無処理のウエルにおいても処理したウエルと同様に不死化気管上皮細胞は増殖する。
【図６】本願実施例で使用したヒトＣＤＫ４Ｒ２４Ｃの核酸配列を示す。
【図７】本願実施例で使用したヒトＢＭＩ１の核酸配列を示す。
【図８】本願実施例で使用したヒトＴＥＲＴの核酸配列を示す。
【図９】本願実施例で使用したヒトＴＥＲＴの核酸配列を示す。
【図１０】本願実施例で使用したヒトｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１の核酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、核酸分子である遺伝子を細胞内に導入する方法に関する。本発明において、用語「遺伝子」には、特に言及しない限り、タンパク質、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等の一次構造を規定している構造遺伝子だけでなく、プロモーター、オペレーター等の特定の制御機能を有する核酸上の領域も包含される。従って、本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。また、「構造遺伝子」には、元のＤＮＡ配列にサイレント変異が施されたサイレントＤＮＡも包含される。また、本発明においては、遺伝子発現に干渉するｓｉＲＮＡ等の核酸分子も「遺伝子」に包含される。
【００１４】
本明細書中において、「核酸」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドと同義であって、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのいずれであってもよい。また、これらは２本鎖であっても１本鎖であってもよく、ある配列を有する核酸分子といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する核酸分子（またはヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド）も包括的に意味するものとする。また、これらの核酸分子は環状でも直鎖状であってもよく、また合成及び生物由来のいずれであってもよい。
【００１５】
不死化したヒト気道上皮細胞の製造方法及び当該方法により得られる不死化細胞
本発明は、下記（１）及び（２）の遺伝子
（１）ＣＤＫ４Ｒ２４Ｃ遺伝子又はＢＭＩ１遺伝子  
（２）ＴＥＲＴ遺伝子
をヒト気道上皮細胞に導入する工程を含む、不死化したヒト気道上皮細胞の製造方法を提供する。
【００１６】
本発明において、気道とは鼻腔、鼻咽腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支、肺を含む。本発明においては、気管、鼻腔の粘膜上皮細胞等が好ましい。
【００１７】
本発明の方法は、上記（１）及び（２）の遺伝子を導入することを特徴とする。ＣＤＫ４Ｒ２４Ｃは、変異型サイクリン依存的キナーゼ４である。典型的にはヒトＣＤＫ４Ｒ２４Ｃが挙げられる。ＣＤＫ４Ｒ２４Ｃの核酸配列としては、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００００７５（ＣＤＫ４）のｃｏｄｏｎ  ２４（ＣＧＴ＝Ａｒｇ）を（ＴＧＴ＝Ｃｙｓ）になるように変異導入（Ｃ  ｔｏ  Ｔ）したもの（配列番号１、図６）等が挙げられる。ＢＭＩ１は、ヒト赤白血病細胞株（Ｋ５６２）のｃＤＮＡライブラリーからクローニングされたポリコーム群タンパクの一種である。典型的にはヒトＢＭＩ１が挙げられる。ＢＭＩ１の核酸配列としては、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ１３６８９で示されるもの（配列番号２、図７）等が挙げられる。ＴＥＲＴ（テロメラーゼリバーストランスクリプターゼ）は、分子量約１００ｋＤのタンパク質で、Ｎ末端側にあるテロメラーゼ特異的ドメイン、中央部の逆転写酵素ドメイン、Ｃ端ドメインからなることが知られている。典型的にはヒトＴＥＲＴが挙げられる。ＴＥＲＴの核酸配列としては、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０８５６２８で示されるもの（配列番号３、図８、９）等が挙げられる。
【００１８】
本発明においては、前記（１）の遺伝子がＣＤＫ４Ｒ２４Ｃ遺伝子であり、さらに（３）ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子を導入すること、従って、ヒト気道上皮細胞に（１）ＣＤＫ４Ｒ２４Ｃ遺伝子（２）、ＴＥＲＴ遺伝子及び（３）ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子を導入することが好ましい。Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１は染色体転座の標的遺伝子として知られているタンパク質である。典型的にはヒトｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１が挙げられる。ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１の核酸配列としては、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ６４３４９で示されるもの（配列番号４、図１０）等が挙げられる。
【００１９】
遺伝子の導入方法は特に限定されず、例えば、物理的方法（エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃等）、化学的方法（リポフェクション等）、ウイルスベクターを使用した方法等が挙げられる。本発明においては、ウイルスベクターを使用した方法等が好ましい。ウイルスベクターとしては特に限定されないが、例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられる。遺伝子導入の具体的な方法は、標的細胞としてヒト気道上皮細胞を用いて、上記特定の遺伝子を導入すること以外、自体公知の方法に準じて行うことができる。例えばウイルスベクターを用いる方法としては、目的の遺伝子を含むウイルスベクターの存在下で、標的細胞を培養することにより、標的細胞をウイルス感染させる工程を含む方法が挙げられる。
【００２０】
培養工程に用いる培地は、上記細胞培養、ウイルス感染に適した培地であれば特に限定されるものではない。このような培地として、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ）等が挙げられる。培地は、必要に応じて通常の体細胞の培養の際に含める添加剤を含むものであってもよい。添加剤の具体例として、牛胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、アミノ酸（例えば、Ｌ−グルタミン等）、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等）などが挙げられる。必要な添加物を予め添加した、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ライフテクノロジーズ社製）などの市販品を用いることもできる。培養は、適切な容器中で行なうことができる。培養温度は特に限定されず、３０〜４０℃程度が挙げられる。培養を行う期間は、本発明の効果を損なわない範囲で、特に限定されるものではないが、例えば、１２時間から３日間程度とすることができる。
【００２１】
本発明の方法によりＣＤＫ４Ｒ２４Ｃ遺伝子又はＢＭＩ１遺伝子、及びＴＥＲＴ遺伝子を導入することによって得られる、これらの遺伝子を発現するヒト気道上皮細胞は、不死化、すなわち無限増殖能を獲得する。従って、好ましい実施形態において本発明は、上記方法により得られる不死化ヒト気道上皮細胞を提供する。本発明の好ましい実施形態において、気管上皮細胞、鼻腔粘膜上皮細胞等の本発明のヒト不死化気道上皮細胞は、コラーゲンなどのｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｏｒｔをウェルなどの培養容器に前処理するコーティングの工程が無くても増殖することができるため有用である。本発明は、下記（１）及び（２）の遺伝子
（１）ＣＤＫ４Ｒ２４Ｃ遺伝子又はＢＭＩ１遺伝子  
（２）ＴＥＲＴ遺伝子
をヒト気道粘膜の上皮細胞に導入する工程を含む、ヒト気道粘膜の上皮細胞の不死化方法も提供する。当該実施形態における各工程の詳細は、本発明の不死化ヒト気道粘膜上皮細胞の製造方法と同様である。
【００２２】
キット
本発明の不死化細胞は呼吸器感染症をもたらすウイルスの感染能力を有しているため、分離実験に有用である。従って、好ましい実施形態において本発明は、前述した不死化ヒト気道上皮細胞を備える、ウイルス分離用キットを提供する。
また、本発明のキットには、必要に応じて上記細胞以外の物品を含めることができる。他の物品としては、例えば、細胞培養、ウイルス感染等するためのチューブ、細胞培養プレート；培地又はその材料等が挙げられるが、これに限定されない。本発明のキットは、ウイルス分離方法を行うための手順を書き記した書面などを含むこともできる。
【００２３】
本発明にかかるウイルス分離用キットは、試料中の未知又は既知のウイルスを分離するために使用することができる。本発明のキットは、例えば、被験者由来の試料（痰、唾液、血液等）を本発明の不死化細胞に接触させ、培養して、被験者由来の試料に含まれるウイルスに感染させ、得られた細胞が感染したウイルスを検出することにより用いることができる。本発明のキットによれば、被験者が感染していることが疑われるウイルスを当該被験者由来の試料から分離、検出することができる。本発明の不死化ヒト気道上皮細胞は初代培養細胞よりも調整の手間、頻度が少なく、必要に応じてすぐに準備ができるため、本発明は、短時間での検査が求められるかかる用途において特に有用である。
【００２４】
本発明はまた、前述した不死化ヒト気道上皮細胞を備える、ウイルス抑制剤スクリーニング用キットも提供する。当該実施形態においても、本発明のキットには、必要に応じて上記細胞以外の物品を含めることができる。他の物品としては、例えば、細胞培養、ウイルス感染等するためのチューブ、細胞培養プレート；ウイルス抑制剤が対象とするウイルス試料；ウイルス検出に使用するための試薬；培地又はその材料等が挙げられるが、これに限定されない。本発明のキットは、ウイルス抑制剤スクリーニング方法を行うための手順を書き記した書面などを含むこともできる。本発明のキットは、例えば、本発明の不死化細胞を標的ウイルスに感染させ、当該細胞にウイルス抑制剤の候補薬物を接触させ、培養し、当該候補薬物によるウイルス抑制効果を測定、評価することにより行うことができる。本発明の不死化細胞はウイルス増殖能等の性質が同等のものを多数準備できるため、本発明は、再現性のあるデータをとることができ、有用である。
【実施例】
【００２５】
細胞樹立方法
１）不死化細胞の樹立に用いた初代培養細胞の作製法
１−１
１−１−１：ヒト気管上皮組織から細胞を採取する場合、病理解剖から提供されたヒト気管からコッヘルで粘膜上皮組織を剥離する。
１−１−２：ヒト鼻腔粘膜上皮組織は手術検体をそのまま用いる。
１−２：剥離した気管粘膜上皮組織及び鼻腔粘膜組織をリン酸緩衝液で洗浄し、粘液や喀痰を除去する。
１−３：リン酸緩衝液に溶かしたプロテアーゼ（0.5mg/mL）液に粘膜上皮組織を４℃で1晩静置する。
１−４：翌日、粘膜上皮組織とプロテアーゼ（0.5mg/mL）液が入ったプラスチックチューブを振とうし、細胞を単離する。
１−５：単離した細胞をフラスコあるいは24-ウエルプレート, 6-ウエルプレートで培養する。フラスコ底あるいはウエル底はヒト胎盤コラーゲンをコーティングして細胞の接着と増殖を促す。培養には2% ultroser Gを添加した培養液（Dulbecco’s MEM+Ham’s F12+2% ultroser G）を用いる。増殖した段階で初代培養細胞として不死化細胞の樹立に使用する。
【００２６】
２）不死化細胞の樹立方法
２−１：増殖したヒト気管上皮細胞およびヒト鼻腔粘膜上皮細胞の初代培養細胞にレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを用い、下記の組み合わせで遺伝子導入をして不死化細胞を樹立した。CDK4R24C、BMI1、TERT及びcyclin D1の核酸配列は図６〜１０に示す。非遺伝子導入細胞やGFP導入細胞などは下記培養条件で継代数５までに増殖を停止した。
1. CDK4R24C+cyclin D1+TERT
2. CDK4R24C+TERT
3. BMI1+TERT
4. CDK4R24C+cyclin D1
5. CDK4R24C
6. BMI1
7. TERT
8. GFP
0. mock
使用したレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター
CSII-CMV-TERT
CSII-CMV-CDK4R24C
CSII-CMV-cyclin D1
CSII(ins)-CMV-BMI1
CSII-CMV-EGFP
pCLXSH-TERT（これのみレトロウイルスベクター）
【００２７】
２−２：上記の組み合わせにより遺伝子導入後に増殖した細胞を不死化細胞として回収した。培養液には2% Ultroser Gのほか、細胞の増殖を促進するためにY-27632 (ROCK 阻害薬) (Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ阻害剤) (5-10 μM)およびA83-01（TGF-βRI阻害薬）(5 μM)を添加した。上記１〜８の遺伝子の組合せのうち、不死化細胞は、1（CDK4R24C+cyclin D1+TERT）、2（CDK4R24C+TERT）及び3.（BMI1+TERT）である。下記「細胞を使ったウイルス感染の操作方法」には、1（CDK4R24C+cyclin D1+TERT）の組合せを導入した細胞を使用した。
【００２８】
細胞を使ったウイルス感染方法
１）細胞培養の操作方法
細胞は24-ウエルプレート 底（インフルエンザウイルス）あるいはプラスチックチューブ側壁（ライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSウイルス））に培養する。フィルター表面にコラーゲンゲルを作成し、細胞を培養することもある（インフルエンザウイルス、ライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSウイルス））。フィルターは24-ウエルプレート内に静置する。細胞培養に使用した培地はDMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)とF-12（Nutrient Mixture F-12）を１：１に混合したものを用い、当該培養液には2% Ultroser G、Y-27632およびA83-01を添加する。
【００２９】
２）ウイルス感染の操作方法
２−１：ウエルあるいはプラスチックチューブ、フィルター表面に細胞が増殖した段階でウイルスを感染させる。
２−２：細胞上の培養液を除去し、ウイルスを含有した培養液をウエルあるいはプラスチックチューブ、フィルター表面に増殖した細胞に添加し、感染させる。感染の際、ウイルスを含有する培養液を、ウイルスを含有していない培養液で適宜希釈し、通常103 - 106 Median tissue culture infectious dose (TCID)50/mLのウイルス量を用いる。
２−３：、ウイルスを含有する培養液を細胞に添加した後、細胞を33-34℃（ライノウイルス、RSウイルス）、あるいは37℃（インフルエンザウイルス）で60分培養し、感染を成立させる。
２−４：その後、ウイルス含有の培養液を除去し、リン酸緩衝液を24-ウエルプレートあるいはプラスチックチューブ、フィルター容器に入れ、細胞を2回洗浄する。この操作により、細胞に吸着していないウイルスを除去する。
２−５：ウイルス感染・洗浄の後、プラスチックチューブに培養した細胞は33℃-34℃で回転培養する。24-ウエルプレートあるいはフィルターで培養した細胞は33℃-34℃（ライノウイルス、RSウイルス）、あるいは37℃（インフルエンザウイルス）で培養する。
２−６：感染後、適宜培養液あるいは細胞、RNAを回収してウイルスの複製あるいは放出を測定する。細胞培養に使用した培地はDMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)とF-12（Nutrient Mixture F-12）を１：１に混合したものを用い、当該培養液には2% ultroser G、Y-27632およびA83-01を添加する。
【００３０】
試験結果
１）不死化ヒト気管上皮細胞におけるウイルス増殖
１−１：  A型インフルエンザウイルス(A/H1N1 2009)103 TCID)50/mL感染の後、培養液中に放出されるインフルエンザウイルスの量は感染1日、３日と増加し、５日後も持続的に検出された。プロテアーゼ阻害薬のカモスタット(10 μg/mL)を添加した細胞ではウイルス量が減少した。
１−２：  14型ライノウイルス105 TCID50/mL感染の後、培養液中に放出されるインフルエンザウイルスの量は感染1日、３日と増加した（図１）。
１−３：  RSウイルス105 TCID50/mL感染の後、培養液中に放出されるインフルエンザウイルスの量は感染1日、３日と増加した。
【００３１】
２）不死化ヒト気管上皮細胞におけるイオン輸送
培養細胞表面にはナトリウムの吸収に伴って移動した水が形成するドームが観察された。本細胞が気道上皮細胞としてタイトジャンクションを形成し、イオン輸送と水吸収を行っていることが示された（図２矢印；x 100）。
【００３２】
３）不死化ヒト鼻腔粘膜上皮細胞におけるウイルス増殖
３−１：  A型インフルエンザウイルス(A/H1N1 2009)103 TCID)50/mL感染の後、培養液中に放出されるインフルエンザウイルスの量は感染1日、３日と増加し、持続的に検出された（図３）。プロテアーゼ阻害薬のカモスタット(10 μg/mL)を添加した細胞ではウイルス量が減少した。
３−２：  14型ライノウイルス105 TCID50/mL感染の後、培養液中に放出されるインフルエンザウイルスの量は感染1日、３日と増加し、持続的に検出された（図３右）。
３−３：  RSウイルス105 TCID50/mL感染の後、培養液中に放出されるインフルエンザウイルスの量は感染1日、３日と増加し、持続的に検出された（下図４）。
４）不死化細胞はコラーゲンなどのgrowth supportをウェルなどの培養容器に前処理するコーティングの工程が無くても増殖する（不死化気管上皮細胞および不死化鼻腔粘膜上皮細胞で確認済）（不死化気管上皮細胞の増殖は図５で表示）。これは、培養に際して高価なコラーゲンを使用する必要がなく、コーティングの手間が省けるため、培養する研究者にとっては経費・労力の削減となり、大きい利益となる。
【図１】
2019170213.tif 000002
【図２】
2019170213.tif 000003
【図３】
2019170213.tif 000004
【図４】
2019170213.tif 000005
【図５】
2019170213.tif 000006
【図６】
2019170213.tif 000007
【図７】
2019170213.tif 000008
【図８】
2019170213.tif 000009
【図９】
2019170213.tif 000010
【図１０】
2019170213.tif 000011
【配列表】
2019170213000001.app