(57)【要約】      （修正有）【課題】肝臓、肺または腎臓の線維症及びがん等の、ＧＲＥＭ１が関連する疾患または障害を治療する手段の提供。【解決手段】ヒトグレムリン−１（ＧＲＥＭ１）に特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント、前記ヒトモノクローナル抗体等および薬剤的に許容できる担体または希釈剤を含む医薬組成物、ならびに、前記ヒトモノクローナル抗体等または前記医薬組成物を患者に投与することを含む線維症を治療するための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトグレムリン−１（ＧＲＥＭ１）に特異的に結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
ＧＲＥＭ１が骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７またはヘパリンのうちの１つに結合することを妨げる、請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
ＧＲＥＭ１に特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、
（ａ）３７℃において、表面プラズモン共鳴で測定された約２７５ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫD）でＧＲＥＭ１と結合する；
（ｂ）３７℃において、表面プラズモン共鳴で測定された約３分間超の解離半減期（ｔ１／２）でＧＲＥＭ１に結合する；
（ｃ）２５℃において、表面プラズモン共鳴で測定された約２８０ｎＭ未満のＫDでＧＲ
ＥＭ１と結合する；
（ｄ）２５℃において、表面プラズモン共鳴で測定された約２分間超のｔ１／２でＧＲＥＭ１に結合する；
（ｅ）２５℃において競合的ＥＬＩＳＡアッセイで測定された約１．９ｎＭ未満のＩＣ50でＧＲＥＭ１がＢＭＰ４に結合することを妨げる；
（ｆ）ＢＭＰシグナル伝達のＧＲＥＭ１介在性阻害を妨げ、細胞分化を促進する；並びに（ｇ）ＧＲＥＭ１がヘパリンに結合することを妨げる、
から成る群から選択される１つ以上の特性を示す、前記単離されたヒト抗体またはその抗原結合性フラグメント
【請求項４】
抗体が重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体または抗原結合性フラグメントを有するＧＲＥＭ１への特異的結合を競合し、ＨＣＶＲが配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、４９８、５１４、５３０、５４６、５６２、及び５７８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
抗体が軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む抗体または抗原結合性フラグメントを有するＧＲＥＭ１への特異的結合を競合し、ＬＣＶＲが配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４、４９０、５０６、５２２、５３８、５５４、５７０、及び５８６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項６】
ＧＲＥＭ１に特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、抗体が配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、４９８、５１４、５３０、５４６、５６２、及び５７８から成る群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つの中に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）；並びに配列
番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４、４９０、５０６、５２２、５３８、５５４、５７０、及び５８６から成る群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つの中に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む、前記単離されたヒト抗体またはその抗原結合性フラグメント
【請求項７】
配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、４９８、５１４、５３０、５４６、５６２、及び５７８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、請求項６に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４、４９０、５０６、５２２、５３８、５５４、５７０、及び５８６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項６または７のいずれかに記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
（ａ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、４９８、５１４、５３０、５４６、５６２、及び５７８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ；並びに（ｂ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４、４９０、５０６、５２２、５３８、５５４、５７０、及び５８６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１０】
（ａ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４、３４０、３５６、３７２、３８８、４０４、４２０、４３６、４５２、４６８、４８４、５００、５１６、５３２、５４８、５６４、及び５８０から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６、３４２、３５８、３７４、３９０、４０６、４２２、４３８、４５４、４７０、４８６、５０２、５１８、５３４、５５０、５６６、及び５８２から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８、３４４、３６０、３７６、３９２、４０８、４２４、４４０、４５６、４７２、４８８、５０４、５２０、５３６、５５２、５６８、及び５８４から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６
、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２、３４８、３６４、３８０、３９６、４１２、４２８、４４４、４６０、４７６、４９２、５０８、５２４、５４０、５５６、５７２、及び５８８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３３４、３５０、３６６、３８２、３９８、４１４、４３０、４４６、４６２、４７８、４９４、５１０、５２６、５４２、５５８、５７４、及び５９０から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；並びに
（ｆ）配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６、３５２、３６８、３８４、４００、４１６、４３２、４４８、４６４、４８０、４９６、５１２、５２８、５４４、５６０、５７６、及び５９２から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン、
を含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１】
配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、３３８／３４６、３５４／３６２、３７０／３７８、３８６／３９４、４０２／４１０、４１８／４２６、４３４／４４２、４５０／４５８、４６６／４７４、４８２／４９０、４９８／５０６、５１４／５２２、５３０／５３８、５４６／５５４、５６２／５７０、及び５７８／５８６から成る群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１２】
単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、４９８、５１４、５３０、５４６、５６２、及び５７８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）；配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４、４９０、５０６、５２２、５３８、５５４、５７０、及び５８６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む抗体または抗原結合性フラグメントと同一のＧＲＥＭ１上のエピトープと結合する、前記単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＧＲＥＭ１に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合性フラグメント、及び薬剤的に許容できる担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
線維症を治療するための方法であって、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の有効量の抗体もしくはその抗原結合性フラグメント；または請求項１３に記載の医薬組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項１５】
抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または前記抗体もしくはその抗原結合性フ
ラグメントを含む医薬組成物が、第二の治療薬と組み合わされて患者に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第二の治療薬が、抗線維症剤、抗炎症剤、コルチコステロイド、栄養補給剤、降圧薬、抗生物質、ＧＲＥＭ１に対する別の抗体、ＩＬ−１、ＩＬ−６、またはＴＧＦ−β等のサイトカインに対する抗体、及びあらゆる他の緩和療法から成る群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
抗体またはその抗原結合性フラグメントが皮下、静脈内、皮内、経口、または筋肉内投与される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
抗体または抗原結合性フラグメントが約０．１ｍｇ／患者体重ｋｇ〜約１００ｍｇ／患者体重ｋｇの用量で投与される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
線維症が肝臓、肺または腎臓に存在する、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
線維症が肺線維症、肺高血圧症、特発性肺線維症、肝線維症、腎線維症、糖尿病性腎症、虚血性腎損傷、腎硬化症及び腎毒性を含む群から選択される、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
がんを治療するための方法であって、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の有効量の抗体もしくはその抗原結合性フラグメント；または請求項１３に記載の医薬組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項２２】
抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または前記抗体もしくはその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を第二の治療薬と組み合わせて患者に投与する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
第二の治療薬が、ＧＲＥＭ１に対する別の抗体、ＶＥＧＦアンタゴニスト、細胞傷害性薬物、化学療法剤、放射線、外科手術、抗炎症剤、コルチコステロイド、栄養補給剤、及びあらゆる他の緩和療法から成る群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体またはＶＥＧＦ阻害性融合タンパク質である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＶＥＧＦアンタゴニストがアフリベルセプトである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
血管新生を阻害するための方法であって、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の有効量の抗体もしくはその抗原結合性フラグメント；または請求項１３に記載の医薬組成物を治療を必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項２７】
抗体ががんを有する患者に投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗体が第二の治療薬と組み合わされて投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
第二の治療薬がＧＲＥＭ１に対する別の抗体またはＶＥＧＦアンタゴニストである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＢＭＰシグナル伝達及び細胞分化の促進に用いられる、請求項１〜１２のいずれか一項
に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項３１】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組成物であって、ヘパリン介在性血管新生の阻害に用いられる、前記組成物。
【請求項３２】
１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号６６、２１０、４１８及び４３４から成る群から選択されるＨＣＶＲ；並びに配列番号７４、２１８、４２６及び４４２から成る群から選択されるＬＣＶＲを含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
線維症またはがんを有する患者の治療に用いられる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項３４】
線維症またはがんを有する患者を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントの用途。
【請求項３５】
（ａ）配列番号５９４または配列番号５９５のアミノ酸配列を含むポリペプチドと（ｂ）ヘパリンとの相互作用を阻止する方法であって、（ａ）及び（ｂ）を含む混合物を、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体、または請求項３２に記載の組成物に暴露することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトグレムリン−１（ＧＲＥＭ１）に特異的に結合するヒト抗体及びヒト抗体の抗原結合性フラグメント、並びにこれらの抗体を用いた治療法及び診断法に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維症は、慢性的な臓器損傷に共通した特徴である瘢痕形成過程である。線維症は、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）の活性上昇と、その結果起こる細胞外マトリックス及び他の線維症関連タンパク質の沈着の増加及び変化を特徴とする。
【０００３】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する系統学的に保存されたシグナル伝達分子であり、種々の細胞型の成長、発生及び分化に関与している（非特許文献１）。ＢＭＰに対する生物学的反応は、ＢＭＰと直接結合し受容体結合を阻害することができるＢＭＰアンタゴニストによって負に調節される。システインノットスーパーファミリー（ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｋｎｏｔ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）のメンバーであるヒトグレムリン−１（ＧＲＥＭ１）は、ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストである（非特許文献２）。ＧＲＥＭ１はＢＭＰ２、ＢＭＰ４及びＢＭＰ７に結合する。ＧＲＥＭ１はＢＭＰシグナル伝達を遮断するが、これにより、ＢＭＰのその受容体への結合の阻止によって、多くの組織において線維症が抑制されると考えられている。
【０００４】
ＧＲＥＭ１の正常成人の腎臓、肝臓及び肺における発現は非常に低い。しかしながら、ＧＲＥＭ１発現は、線維症並びに糖尿病性腎症及び肺線維症等のヒト線維性疾患の両方のマウスモデルにおいて増加している（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。ＧＲＥＭ１の発現増加により、線維症を抑制するＢＭＰシグナル伝達が低減することとなる。ＧＲＥＭ１の発現増加はまた、これら疾患における血清クレアチニンのレベル増加及び尿細管間質性線維症のスコア増加とも相関している（非特許文献６）。肺線維症及び腎臓線維症等のいくつかの線維症モデルでは、ＧＲＥＭ１の発現は大きく増加しており、一方ＢＭＰシグナル伝達は減少している（非特許文献７）。ＢＭＰ７の投与によって、いくつかの腎疾患モデルで線維症を低減することができるが、ブレオマイシンによって誘導される肺線維症または皮膚線維症からは保護されない（非特許文献８）。
【０００５】
ＧＲＥＭ１ヘテロ接合マウスは、糖尿病性腎症の実験モデルにおいて線維症に対するいくらかの保護を示している（非特許文献９）。これらのマウスは、体重減少及び高血糖によって測られる糖尿病の発症、重症度及び進行に違いを示さない。ところが、これらのマウスでは、腎臓における線維構造変化が減弱され、腎機能における変化が低減されている。
【０００６】
これらのことから、ＧＲＥＭ１は、線維症を治療するための有望な治療標的となり得る。いかなる副作用も有さない線維症治療における特異的ＧＲＥＭ１阻害剤の開発が必要とされている。
【０００７】
さらに、ＧＲＥＭ１は、主要な血管新生促進受容体である血管内皮増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ−２）のアゴニストであり、特に子宮頚部癌、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、及び肉腫において腫瘍形成の役割を果たす場合がある（非特許文献１０；非特許文献１１）。抗凝固作用で知られるヘパラン硫酸（ＨＳ）及びヘパリン、グリコサミノグリカン類（ＧＡＧ）は、ＧＲＥＭ１に結合が示されている。ＧＲＥＭ１はヘパリンに結合し、ＢＭＰ非依存的にＶＥＧＦＲ−２を活性化する（非特許文献１２）。
【０００８】
抗ＧＲＥＭ１ポリクローナル抗体及び抗ＧＲＥＭ１モノクローナル抗体は市販されている（例えば、シグマ・アルドリッチ社、アブノバ社（Ａｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ノーバス・バイオロジカルズ社（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ジェンウェイ社（Ｇｅｎｗａｙ）から）。特許文献１には、ヒト、マウス、アフリカツメガエル及びニワトリ（ｃｈｉｃｋ）ＧＲＥＭ１並びにその欠失変異体のヌクレオチド配列及びタンパク質配列が記載されている特許文献２では、ＢＭＰ４阻害剤として用いられるＧＲＥＭ１ペプチド配列が開示されている。Ｋｉｍらは、非特許文献１３及び特許文献３において、ＢＭＰまたはＶＥＧＦＲ−２非依存的にＧＲＥＭ１を阻害するＧＲＥＭ１抗体を開示している。特許文献４では、ＧＲＥＭ１と結合する抗体であるＧＲＥＭ１アンタゴニストを投与することによる、緑内障を治療するための方法が開示されている。ＧＲＥＭ１アンタゴニスト（例えば抗体）を用いた緑内障またはがんに対する治療法及び製剤は、特許文献５、特許文献６、特許文献７、及び特許文献８に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＵＳ６４３２４１０
【特許文献２】ＵＳ２００９０２０３０４１
【特許文献３】ＷＯ２０１３１３７６８６
【特許文献４】ＵＳ７７４４８７３
【特許文献５】ＥＰ１４４０１５９Ｂ１
【特許文献６】ＥＰ１７７７５１９Ａ１
【特許文献７】ＥＰ２０５３１３５Ａ１
【特許文献８】ＵＳ２００９００４１７５７
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｙａｎａｇｉｔａ，  Ｍ．，  ２００９，  Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ  ＤＯＩ：  １０：１００２／ｂｉｏｆ．１５
【非特許文献２】Ｈｓｕ，  Ｄ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ  １９９８，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  １：  ６７３−６８３
【非特許文献３】Ｋｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １６９：  ６１−７１
【非特許文献４】Ｆａｒｋａｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４４：  ８７０−８７８
【非特許文献５】Ｌａｐｐｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  Ｄｉａｌ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  １７：  ６５−６７
【非特許文献６】Ｄｏｌａｎ，  Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ  ２００５，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．  ４５：  １０３４−９
【非特許文献７】Ｍｙｌｌａｒｎｉｅｍｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  １７７：  ３２１−３２９
【非特許文献８】Ｗｅｉｓｋｉｒｃｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  １４：  ４９９２−５０１２
【非特許文献９】Ｚｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  ＢＢＲＣ  ３８３：  １−３
【非特許文献１０】Ｎａｍｋｏｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２００６，  ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ６：  ７４  ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２４０７−６−７４
【非特許文献１１】Ｍｉｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０；  Ｂｌｏｏｄ  １１６：  ３６７７−３６８０
【非特許文献１２】Ｃｈｉｏｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１；  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．  ３１：  ｅ１１６−ｅ１２７
【非特許文献１３】ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７（４）：  ｅ３５１００．  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３５１００
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ヒトＧＲＥＭ１に特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びその抗原結合性フラグメントを提供する。このような抗体は、ＧＲＥＭ１の活性を中和する、またはＢＭＰ２、ＢＭＰ４もしくはＢＭＰ７等の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）へのＧＲＥＭ１の結合を阻止するのに有用であり得る。ある特定の他の実施形態では、これらの抗体は、前記活性を中和する、またはヘパリンもしくはヘパラン硫酸への結合を阻止するのに有用であり得る。これらの抗体は、線維症に関連する状態もしくは疾患の進行を停止するもしくはその重症度を軽減する、または疾患再発の回数、持続期間、もしくは重症度を減少させる、または線維症もしくはがんに付随する少なくとも１つの症状を寛解させる働きを有する。このような抗体は、単独で、または線維症もしくはがんの治療に有用な第二の作用剤と組み合わせて、用いられ得る。ある実施形態では、これらのＧＲＥＭ１特異的抗体は、線維症に関連する状態もしくはがんの重症度を軽減する、または疾患再発の回数、持続期間、もしくは重症度を減少させる、または線維症に関連する状態もしくはがんに付随する少なくとも１つの症状を寛解させるための第二の作用剤と組み合わせて、治療のために与えられ得る。ある実施形態では、これらの抗体は、線維症に関連する状態または疾患を発症するリスクを有する患者を保護するために、独立した治療法として予防的に用いられ得る。例えば、ある特定の患者集団は、線維症の状態または疾患を発症するリスクを有し得るが、例えば、高齢患者、または家族歴を有する患者、またはアルコール乱用もしくは薬物乱用の問題を有する患者、または線維症の素因となる、糖尿病、代謝障害、肝損傷、腎損傷もしくは肺損傷等の、慢性的及び／もしくは随伴性の、根源的な医学的状態を有する患者が含まれる。他の危険な状態にある患者集団としては、アスベストもしくは他の汚染物質等の化学物質に暴露された個人、または喫煙者が挙げられる。これらの患者集団はいずれも、単独でまたは第二の作用剤と組み合わされて与えられた場合に、本発明の抗体を用いた治療から恩恵を受け得る。
【００１２】
本発明の抗体は、患者の肺、肝臓、腎臓、皮膚、心臓、腸または筋肉における線維症を治療するために用いられ得る。他の実施形態では、本発明の抗体は、子宮頚部癌、肺癌、卵巣癌、腎癌、乳癌、結腸癌、または膵癌等のがんを治療するために用いられ得る。これらの抗体は、完全長（例えば、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体）であってもよく、あるいは抗原結合部位のみを含んでいてもよく（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントまたはｓｃＦｖフラグメント）、さらには、機能性に影響を与える、例え
ば、残存するエフェクター機能を除去する改変を受けていてもよい（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００），  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４：１９２５−１９３３）。
【００１３】
従って、第一の態様において、本発明は、ヒトＧＲＥＭ１に結合する単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００１４】
一実施形態では、前記ヒトモノクローナル抗体は配列番号５９４または配列番号５９５のＧＲＥＭ１に結合する。
【００１５】
一実施形態では、前記単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＧＲＥＭ１がＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７またはヘパリンに結合することを阻止する。
【００１６】
一実施形態では、前記単離ヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントは、表面プラズモン共鳴で測定された１０-7Ｍ以下のＫDで、ＧＲＥＭ１に結合する。
【００１７】
一実施形態では、前記単離抗体またはその抗原結合性フラグメントは、（ａ）３７℃に
おいて、表面プラズモン共鳴で測定された約２７５ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫD）
でＧＲＥＭ１と結合する；（ｂ）３７℃において、表面プラズモン共鳴で測定された約３分間超の解離半減期（ｔ１／２）でＧＲＥＭ１に結合する；（ｃ）２５℃において、表面プラズモン共鳴で測定された約２８０ｎＭ未満のＫDでＧＲＥＭ１と結合する；（ｄ）２
５℃において、表面プラズモン共鳴で測定された約２分間超のｔ１／２でＧＲＥＭ１に結合する；（ｅ）２５℃において競合的ＥＬＩＳＡアッセイで測定された約１．９ｎＭ未満のＩＣ50でＧＲＥＭ１がＢＭＰ４に結合することを妨げる；（ｆ）ＢＭＰシグナル伝達のＧＲＥＭ１介在性阻害を妨げ、細胞分化を促進する；並びに（ｇ）ＧＲＥＭ１がヘパリンに結合することを妨げる、から成る群から選択される１つ以上の特性を示す。
【００１８】
一実施形態では、ＧＲＥＭ１に結合する単離ヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントは、抗体が配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、４９８、５１４、５３０、５４６、５６２、及び５７８から成る群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つの中に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）；並びに配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４、４９０、５０６、５２２、５３８、５５４、５７０、及び５８６から成る群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つの中に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを特定するための方法及び技術は、当該技術分野において周知であり、本明細書で開示される特定の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列及び／または軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列内のＣＤＲを特定するために用いることができる。ＣＤＲの境界を特定するために用いることができる従来法の例として、例えば、カバット定義（Ｋａｂａｔ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）、コチア定義（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）、及びＡｂＭ定義（ＡｂＭ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）が挙げられる。大まかに言うと、カバット定義は配列多様性に基づいており、コチア定義は構造的ループ領域の位置に基づいており、ＡｂＭ定義はカバットアプローチとコチアアプローチの中間である。例えば、Ｋａｂａｔ，  “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９９１）；  Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ
ａｌ．，  （１９９７），  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７３：９２７−９４８；及びＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：９２６８−９２７２を参照されたい。また、抗体内のＣＤＲ配列の特定に公開データベースを利用することもできる。
【００１９】
一実施形態では、ＧＲＥＭ１に結合する単離ヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、４９８、５１４、５３０、５４６、５６２、及び５７８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。
【００２０】
一実施形態では、ＧＲＥＭ１に結合する単離ヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４
、４９０、５０６、５２２、５３８、５５４、５７０及び５８６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
【００２１】
一実施形態では、ＧＲＥＭ１に結合する単離ヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントは、（ａ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、４９８、５１４、５３０、５４６、５６２、及び５７８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ；並びに（ｂ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４、４９０、５０６、５２２、５３８、５５４、５７０及び５８６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
【００２２】
一実施形態では、ＧＲＥＭ１に結合する単離ヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントは以下を含む：
（ａ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４、３４０、３５６、３７２、３８８、４０４、４２０、４３６、４５２、４６８、４８４、５００、５１６、５３２、５４８、５６４、及び５８０から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６、３４２、３５８、３７４、３９０、４０６、４２２、４３８、４５４、４７０、４８６、５０２、５１８、５３４、５５０、５６６及び５８２から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８、３４４、３６０、３７６、３９２、４０８、４２４、４４０、４５６、４７２、４８８、５０４、５２０、５３６、５５２、５６８及び５８４から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２、３４８、３６４、３８０、３９６、４１２、４２８、４４４、４６０、４７６、４９２、５０８、５２４、５４０、５５６、５７２及び５８８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３３４、３５０、３６６、３８２、３９８、４１４、４３０、４４６、４６２、４７８、４９４、５１０、５２６、５４２、５５８、５７４、及び５９０から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；並びに
（ｆ）配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６、３５２、３６８、３８４、４００、４１６、４３２、４４８、４６４、４８０、４９６、５１２、５２８、５４４、５６０、５７６及び５９２から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン。
【００２３】
一実施形態では、ＧＲＥＭ１に結合する単離ヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０
、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、３３８／３４６、３５４／３６２、３７０／３７８、３８６／３９４、４０２／４１０、４１８／４２６、４３４／４４２、４５０／４５８、４６６／４７４、４８２／４９０、４９８／５０６、５１４／５２、５３０／５３８、５４６／５５４、５６２／５７０、及び５７８／５８６から成る群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【００２４】
一実施形態では、本発明は、ＧＲＥＭ１に結合する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供し、前記抗体またはそのフラグメントは、以下の特徴のうちの一つまたは複数を示す：（ｉ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、４９８、５１４、５３０、５４６、５６２、及び５７８から成る群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＨＣＶＲを含む；（ｉｉ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４、４９０、５０６、５２２、５３８、５５４、５７０、及び５８６から成る群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＬＣＶＲを含む；（ｉｉｉ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８、３４４、３６０、３７６、３９２、４０８、４２４、４４０、４５６、４７２、４８８、５０４、５２０、５３６、５５２、５６８、及び５８４から成る群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；並びに配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６、３５２、３６８、３８４、４００、４１６、４３２、４４８、４６４、４８０、４９６、５１２、５２８、５４４、５６０、５７６、及び５９２から成る群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含む；（ｉｖ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４、３４０、３５６、３７２、３８８、４０４、４２０、４３６、４５２、４６８、４８４、５００、５１６、５３２、５４８、５６４、及び５８０から成る群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６、３４２、３５８、３７４、３９０、４０６、４２２、４３８、４５４、４７０、４８６、５０２、５１８、５３４、５５０、５６６、及び５８２から成る群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２、３４８、３６４、３８０、３９６、４１２、４２８、４４４、４６０、
４７６、４９２、５０８、５２４、５４０、５５６、５７２、及び５８８から成る群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；並びに配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３３４、３５０、３６６、３８２、３９８、４１４、４３０、４４６、４６２、４７８、４９４、５１０、５２６、５４２、５５８、５７４、及び５９０から成る群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＬＣＤＲ２ドメインを含む；（ｖ）表面プラズモン共鳴で測定された１０-7Ｍ以下のＫDでＧＲＥＭ１に結合する。
【００２５】
第二の態様において、本発明は、ヒトＧＲＥＭ１への特異的結合において、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、４９８、５１４、５３０、５４６、５６２、及び５７８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）；並びに配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４、４９０、５０６、５２２、５３８、５５４、５７０、及び５８６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む抗体または抗原結合性フラグメントと競合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、４９８、５１４、５３０、５４６、５６２、及び５７８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）のＣＤＲ；並びに配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４、４９０、５０６、５２２、５３８、５５４、５７０、及び５８６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む抗体または抗原結合性フラグメントと同一のヒトＧＲＥＭ１上のエピトープと結合する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００２７】
一実施形態では、本発明は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７またはヘパリンのうちのいずれかへのヒトＧＲＥＭ１の結合を阻止する、単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供し、前記抗体は、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、４９８、５１４、５３０、５４６、５６２、及び５７８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）；並びに配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４、４９０、５０６、５２２、５３８、５５４、５７０、及び５８６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む。
【００２８】
一実施形態では、本発明は、ＧＲＥＭ１に結合する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供し、前記抗体またはそのフラグメントは、以下の特徴のうちの一つまたは複数を示す：（ｉ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、４９８、５１４、５３０、５４６、５６２、及び５７８から成る群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＨＣＶＲを含む；（ｉｉ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４、４９０、５０６、５２２、５３８、５５４、５７０、及び５８６から成る群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＬＣＶＲを含む；（ｉｉｉ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８、３４４、３６０、３７６、３９２、４０８、４２４、４４０、４５６、４７２、４８８、５０４、５２０、５３６、５５２、５６８、及び５８４から成る群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；並びに配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６、３５２、３６８、３８４、４００、４１６、４３２、４４８、４６４、４８０、４９６、５１２、５２８、５４４、５６０、５７６、及び５９２から成る群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含む；（ｉｖ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４、３４０、３５６、３７２、３８８、４０４、４２０、４３６、４５２、４６８、４８４、５００、５１６、５３２、５４８、５６４、及び５８０から成る群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６、３４２、３５８、３７４、３９０、４０６、４２２、４３８、４５４、４７０、４８６、５０２、５１８、５３４、５５０、５６６、及び５８２から成る群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２、３４８、３６４、３８０、３９６、４１２、４２８、４４４、４６０、４７６、４９２、５０８、５２４、５４０、５５６、５７２、及び５８８から成る群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；並びに配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３３４、３５０、３６６、３８２、３９８、４１４、４３０、４４６、４６２、４７８、４９４、５１０、５２６、５４２、５５８、５７４、及び５９０か
ら成る群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＬＣＤＲ２ドメインを含む；（ｖ）表面プラズモン共鳴で測定された１０-7Ｍ以下のＫDでＧＲＥＭ１に結合する；（ｖｉ）ＧＲＥＭ１がＢＭＰ２、ＢＭＰ４またはＢ
ＭＰ７のうちの１つに結合することを阻止する；（ｖｉｉ）ＢＭＰシグナル伝達のＧＲＥＭ１阻害を阻止し細胞分化を促進する；並びに（ｖｉｉｉ）ＧＲＥＭ１がヘパリンに結合することを阻止する。
【００２９】
第三の態様では、本発明は、抗ＧＲＥＭ１抗体またはそのフラグメントをコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸を有する組み換え発現ベクター、及びこのようなベクターが導入された宿主細胞もまた本発明に包含され、同様に、抗体の産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養し、産生された抗体を回収することによる、前記抗体を生産する方法も包含される。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、配列番号１、１７、３３、４９、６５、８１、９７、１１３、１２９、１４５、１６１、１７７、１９３、２０９、２２５、２４１、２５７、２７３、２８９、３０５、３２１、３３７、３５３、３６９、３８５、４０１、４１７、４３３、４４９、４６５、４８１、４９７、５１３、５２９、５４５、５６１、及び５７７から成る群から選択される核酸配列、またはその、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一な配列にコードされるＨＣＶＲを含む、抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００３１】
一実施形態では、前記抗体またはそのフラグメントは、配列番号９、２５、４１、５７、７３、８９、１０５、１２１、１３７、１５３、１６９、１８５、２０１、２１７、２３３、２４９、２６５、２８１、２９７、３１３、３２９、３４５、３６１、３７７、３９３、４０９、４２５、４４１、４５７、４７３、４８９、５０５、５２１、５３７、５５３、５６９、及び５８５から成る群から選択される核酸配列、またはその、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一な配列にコードされるＬＣＶＲをさらに含む。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、配列番号７、２３、３９、５５、７１、８７、１０３、１１９、１３５、１５１、１６７、１８３、１９９、２１５、２３１、２４７、２６３、２７９、２９５、３１１、３２７、３４３、３５９、３７５、３９１、４０７、４２３、４３９、４５５、４７１、４８７、５０３、５１９、５３５、５５１、５６７、及び５８３から成る群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列にコードされるＨＣＤＲ３ドメイン；並びに配列番号１５、３１、４７、６３、７９、９５、１１１、１２７、１４３、１５９、１７５、１９１、２０７、２２３、２３９、２５５、２７１、２８７、３０３、３１９、３３５、３５１、３６７、３８３、３９９、４１５、４３１、４４７、４６３、４７９、４９５、５１１、５２７、５４３、５５９、５７５、及び５９１から成る群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列にコードされるＬＣＤＲ３ドメインを含む、抗体または抗体の抗原結合性フラグメントを提供する。
【００３３】
一実施形態では、本発明は、配列番号３、１９、３５、５１、６７、８３、９９、１１５、１３１、１４７、１６３、１７９、１９５、２１１、２２７、２４３、２５９、２７５、２９１、３０７、３２３、３３９、３５５、３７１、３８７、４０３、４１９、４３５、４５１、４６７、４８３、４９９、５１５、５３１、５４７、５６３、及び５７９から成る群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％
、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列にコードされるＨＣＤＲ１ドメイン；配列番号５、２１、３７、５３、６９、８５、１０１、１１７、１３３、１４９、１６５、１８１、１９７、２１３、２２９、２４５、２６１、２７７、２９３、３０９、３２５、３４１、３５７、３７３、３８９、４０５、４２１、４３７、４５３、４６９、４８５、５０１、５１７、５３３、５４９、５６５、及び５８１から成る群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列にコードされるＨＣＤＲ２ドメイン；配列番号１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、１２３、１３９、１５５、１７１、１８７、２０３、２１９、２３５、２５１、２６７、２８３、２９９、３１５、３３１、３４７、３６３、３７９、３９５、４１１、４２７、４４３、４５９、４７５、４９１、５０７、５２３、５３９、５５５、５７１、及び５８７から成る群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列にコードされるＬＣＤＲ１ドメイン；並びに配列番号１３、２９、４５、６１、７７、９３、１０９、１２５、１４１、１５７、１７３、１８９、２０５、２２１、２３７、２５３、２６９、２８５、３０１、３１７、３３３、３４９、３６５、３８１、３９７、４１３、４２９、４４５、４６１、４７７、４９３、５０９、５２５、５４１、５５７、５７３、及び５８９から成る群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列にコードされるＬＣＤＲ２ドメインをさらに含む、抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒトＧＲＥＭ１に対する抗体またはその抗原結合性フラグメントは、放射性核種標識またはＭＲＩによって検出可能な標識等の検出可能な標識に連結されている場合がある。
【００３５】
第四の態様では、本発明は、ＧＲＥＭ１に結合する単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント及び薬剤的に許容できる担体または希釈剤を含む、医薬組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、分泌型ヒトＧＲＥＭ１に特異的に結合する単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント及び薬剤的に許容できる担体または希釈剤を含む、医薬組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、膜結合型ＧＲＥＭ１（成熟ＧＲＥＭ１タンパク質）に特異的に結合する単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント及び薬剤的に許容できる担体または希釈剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００３６】
一実施形態では、前記医薬組成物は、本明細書に記載の特徴のうちのいずれか一つまたは複数を有する、ＧＲＥＭ１に結合する完全ヒトモノクローナル抗体を含む。ＧＲＥＭ１に結合する抗体は、１０-7Ｍ以下のＫDで結合する。
【００３７】
一実施形態では、前記組成物は、ヒトＧＲＥＭ１に結合し、且つ、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、３３８／３４６、３５４／３６２、３７０／３７８、３８６／３９４、４０２／４１０、４１８／４２６、４３４／４４２、４５０／４５８、４６６／４７４、４８２／４９０、４９８／５０６、５１４／５２２、５３０／５３８、５４６／５５４、５６２／５７０、及び５７８／５８６から成る群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を有する、抗体を含む。
【００３８】
一実施形態では、本発明は、本発明の抗体または本発明の抗体の抗原結合性フラグメン
ト、及び第二の治療薬の組み合わせである組成物を特徴とする。
【００３９】
前記第二の治療薬は、小分子薬剤、タンパク質／ポリペプチド、抗体、核酸分子、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはｓｉＲＮＡであり得る。前記第二の治療薬は、合成されてもよいし天然由来であってもよい。
【００４０】
前記第二の治療薬は、本発明の抗体またはそのフラグメントと有利に組み合わされるいかなる作用剤であってもよく、例えば、ピルフェニドン等の抗線維化剤、抗生物質、抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、細胞傷害性薬物、化学療法剤、プレドニゾン等のコルチコステロイド、ボセンタン、マシテンタンもしくはアンブリセンタン等のエンドセリン受容体アンタゴニスト、栄養補給剤、降圧薬、抗酸化剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト［例えば、「ＶＥＧＦトラップ（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）」、例えば、アフリベルセプトもしくはＵＳ７，０８７，４１１に記載の他のＶＥＧＦ阻害性融合タンパク質、または抗ＶＥＧＦ抗体もしくはその抗原結合性フラグメント（例えば、ベバシズマブ、またはラニビズマブ）］、ＧＲＥＭ１に結合する別の抗体、またはＴＧＦ−β等のケモカインに対する抗体、またはＩＬ−１等のサイトカインに対する抗体、抗ＬＯＸＬ２抗体、抗ａｖｂ６インテグリン抗体、ガレクチン−３標的薬剤、イマチニブまたはあらゆる他のＰＤＧＦＲアンタゴニスト及び抗ＡＯＣ３薬剤が挙げられる。
【００４１】
ある実施形態では、前記第二の治療薬は、本発明の抗体または本発明の抗体の抗原結合性フラグメントに関連する起こり得るあらゆる副作用を、仮に起こったとしても、相殺または低減することを促す、作用剤であり得る。
【００４２】
また、本発明の抗体及び薬剤的に許容できる組成物を、併用療法に利用することができること、すなわち、前記抗体及び薬剤的に許容できる組成物を、１つ以上の他の所望の治療薬または医療処置と同時に、それの前に、またはそれの後に投与することができることも理解されよう。併用療法にて採用される治療法（治療薬または処置）の特定の組み合わせにおいては、所望の治療薬及び／または処置の適合性、並びに達成されるべき所望の治療効果が考慮される。また、採用された治療法が、同一の障害に対して所望の効果を達成してもよいこと（例えば、抗体は、同一の障害を治療するために用いられる別の作用剤と同時に投与されてもよい）、またはそれらが異なる作用を達成してもよいこと（例えば、あらゆる副作用の制御）も理解されよう。本明細書で使用される場合、特定の疾患または状態を治療または予防するために通常投与される追加の治療薬は、処置中である前記疾患または状態に適したものである。複数の治療薬が同時投与する際に、投与量を適宜調節してもよいことは、関連技術分野において理解されることである。
【００４３】
本発明の第五の態様は、線維症またはがん等のＧＲＥＭ１の発現増加と関連する疾患または障害を治療するための方法に関する。ある実施形態では、本発明は、がんを患う患者を治療するための、またはがんと関連する少なくとも１つの症状もしくは合併症を治療するための、またはがんの進行を停止させるための方法を提供し、前記方法は、がんに関連する状態または疾患が、予防される、もしくは重症度及び／もしくは持続期間が減少するように、または、前記状態もしくは疾患と関連する少なくとも１つの症状もしくは合併症が予防される、もしくは寛解するように、または、がんの頻度及び／もしくは持続期間、または重症度が減少するように、ヒトＧＲＥＭ１に結合する有効量の抗体もしくはその抗原結合性フラグメント；またはＧＲＥＭ１に結合する有効量の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を患者に投与することを含む。
【００４４】
ある実施形態では、本発明は、線維症を患う患者を治療するための、または線維症に関連する少なくとも１つの症状もしくは合併症を治療するための、または線維症の進行を停止させるための、または線維症を発症するリスクを有する患者を治療するための、方法を
提供し、前記方法は、線維症に関連する状態または疾患が、予防される、もしくは重症度及び／もしくは持続期間が減少するように、または、前記状態もしくは疾患と関連する少なくとも１つの症状もしくは合併症が予防される、もしくは寛解するように、または、線維症の頻度及び／もしくは持続期間、または重症度が減少するように、ＧＲＥＭ１に結合する有効量の抗体もしくはその抗原結合性フラグメント；またはＧＲＥＭ１に結合する有効量の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を患者に投与することを含む。一実施形態では、本抗体は、線維症に関連する状態もしくは疾患を患う患者、または前記状態もしくは疾患と関連する少なくとも１つの症状もしくは合併症を患う患者に、治療的に投与される（線維症が確立した後に投与され、前記状態の全期間にわたって与えられる）。一実施形態では、本抗体は、線維症に関連する状態もしくは疾患を発症するリスクを有する患者、または線維症に関連する少なくとも１つの症状もしくは合併症を発症するリスクを有する患者に、予防的に投与される（前記状態の発症に先立って投与される）。例えば、このような「線維症を発症するリスクを有する患者」には、高齢者、または家族歴を有する患者、または喫煙者、または糖尿病等の、線維症の素因となり得るいくつかの根源的な医学的状態を有する患者、またはアスベスト、木材、金属の粉塵、もしくは化学物質、ウイルス感染、ある種の薬物治療、もしくはタバコの煙に暴露された患者、またはウイルス性肝炎、寄生虫感染症、代謝疾患もしくは自己免疫疾患、先天性異常並びに薬物とアルコール中毒等の慢性肝障害を有する患者が含まれる。線維症を発症するリスクを有する他の患者には、慢性腎疾患、急性腎障害、慢性高血圧症、心不全、腎移植、強皮症、放射性造影剤への暴露、慢性アレルギー、慢性喘息または肺移植を有する患者が含まれる。
【００４５】
別の実施形態では、線維症に関連する状態または疾患と関連する少なくとも１つの症状または合併症は、息切れ、持続性乾性頻発空咳、疼痛、体重減少、吐き気、食欲不振、腹部の体液貯留、脚の腫脹、疲労、肺高血圧症、高血糖症、腎損傷、尿路感染症、肝障害、肝機能喪失、腎機能喪失、高血圧症、生活の質の低下、平均寿命の低下及び線維症に関連する状態または疾患の再発から成る群から選択される。いくつかの実施形態において、線維症に関連する疾患または状態は、肝臓、腎臓、肺、皮膚、腸または筋肉に存在し得る。別の実施形態では、線維症に関連する状態または疾患は、肺線維症、肺高血圧症、特発性肺線維症、腎線維症、肝線維症、虚血性腎損傷、尿細管間質性線維症、糖尿病性腎症、腎硬化症、及び腎毒性を含む群から選択される。
【００４６】
本発明の実施形態は、線維症を患う患者における、進行性組織傷害から保護する、または組織変性を阻止もしくは低減する方法に関し、前記方法は、前記患者内の組織が進行性傷害から保護される、または線維症を患う患者において組織変性が阻止もしくは低減されるように、ＧＲＥＭ１に結合する有効量の抗体もしくはその抗原結合性フラグメント；またはＧＲＥＭ１に結合する有効量の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を、患者に投与することを含む。本発明のいくつかの実施形態では、線維症によるダメージを受ける組織は肺であり、線維症は肺線維症、肺高血圧症または特発性肺線維症のうちの１つであり得る。一実施形態では、線維症によるダメージを受ける組織は肝臓であり得る。いくつかの実施形態では、線維症によるダメージを受ける組織は腎臓である場合があり、線維症は腎線維症、虚血性腎損傷、尿細管間質性線維症、糖尿病性腎症、腎硬化症、または腎毒性のうちの１つを含み得る。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本発明は、がんを治療する、または腫瘍成長、腫瘍細胞増殖もしくは腫瘍転移を阻害する方法を含み、前記方法は、ＧＲＥＭ１に結合する本発明の単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与することを含む。ある実施形態では、本発明は、血管新生を阻害するための方法を含み、前記方法は、ＧＲＥＭ１に結合する本発明の単離抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与することを含む。
【００４８】
一実施形態では、本発明の抗体を含む医薬組成物は、第二の治療薬と組み合わされて患者に投与される。
【００４９】
別の実施形態では、第二の治療薬は、ピルフェニドン等の抗線維症剤、抗炎症剤、ＮＳＡＩＤ、プレドニゾン等のコルチコステロイド、栄養補給剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト［例えば、「ＶＥＧＦトラップ」、例えば、アフリベルセプトもしくはＵＳ７，０８７，４１１に記載の他のＶＥＧＦ阻害性融合タンパク質、または抗ＶＥＧＦ抗体もしくはその抗原結合性フラグメント（例えば、ベバシズマブ、またはラニビズマブ）］、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＩＬ−１７、ＩＬ−２５、ＩＬ−３３またはＴＧＦ−β等のサイトカインに対する抗体、及び線維症に関連する状態またはがんに関連する少なくとも１つの症状を寛解させるのに有用なあらゆる他の緩和療法から成る群から選択される。いくつかの実施形態において、第二の治療薬は、線維症またはがんに関連する少なくとも１つの合併症を管理または治療するために投与され得る。
【００５０】
本発明の実施形態では、本抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは本抗体を含む医薬組成物は、皮下に、静脈内に、皮内に、経口的に、または筋肉内に投与される。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本抗体またはその抗原結合性フラグメントは、約０．１ｍｇ／体重ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重ｋｇ、より具体的には約２０ｍｇ／体重ｋｇ〜約５０ｍｇ／体重ｋｇの用量で投与される。
【００５２】
関連する実施形態では、本発明は、ＧＲＥＭ１活性に関連する、またはそれによって引き起こされる疾患または障害を治療するための薬剤の製造における、単離された抗ＧＲＥＭ１抗体または本発明の抗体の抗原結合部位の使用を含む。一実施形態では、本発明は、ＢＭＰシグナル伝達または細胞分化を促進する際に用いられる、単離された抗ＧＲＥＭ１抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。一実施形態では、本発明は、ヘパリン介在性血管新生を阻害する際に用いられる、単離された抗ＧＲＥＭ１抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。一実施形態では、本発明は、線維症を患う、またはそれを発症する危険性がある患者を治療するための薬剤の製造における、本発明の抗ＧＲＥＭ１抗体の使用を含む。一実施形態では、本発明は、がんを患う患者を治療するための薬剤の製造における、本発明の抗ＧＲＥＭ１抗体の使用を含む。
【００５３】
本発明の第六の態様では、肺線維症、特発性肺線維症、肺高血圧症、腎線維症、肝線維症及び糖尿病性腎症を含む群から選択される状態または疾患を患う患者における、線維症の予後を予測する方法が提供され、前記方法は、前記患者由来のＧＲＥＭ１タンパク質を本発明の抗体または抗原結合性フラグメントと反応させることを含み、ヒトＧＲＥＭ１との結合によって予後不良が予測される。
【００５４】
一実施形態では、本発明は、線維症を患う患者における低い生存率を予測する方法を特徴とし、前記方法は、前記患者由来のＧＲＥＭ１タンパク質を本明細書に記載の本発明の単離された抗体と反応させることを含み、ＧＲＥＭ１との結合によって低い生存率が示される。
【００５５】
一実施形態では、患者由来のＧＲＥＭ１タンパク質を含有する組織試料または細胞試料は、患者の血液、血清、血漿、または肝臓、肺もしくは腎臓等の組織の生検から得られる。
【００５６】
関連する実施形態では、本発明は、組織における線維症を診断する、または線維症に罹患していることが疑われる対象における線維症の活性をモニタリングする方法を特徴とし、前記方法は、放射性核種またはＭＲＩによって検出可能な標識等の検出可能な標識に連
結された本発明の抗体または抗原結合性フラグメントを投与し、このような投与の後に対象をイメージングすることを含み、ＧＲＥＭ１結合及び画像内での検出によって線維症が示される。
【００５７】
一実施形態では、線維症は特発性肺線維症である。いくつかの実施形態において、線維症は肺高血圧症、糖尿病性腎症、腎線維症、肝線維症、及び尿細管間質性線維症を含む群から選択される。いくつかの実施形態において、線維症の活性は、肺または腎臓または肝臓において検出される。
【００５８】
他の実施形態は、下記の発明を実施するための形態の概説から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、ＧＲＥＭ１タンパク質の構造的特徴を記載している（Ｗｏｒｄｉｎｇｅｒ，  Ｒ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ  ２００８，  Ｅｘｐ．  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．  ８７：  ７８−７９）。構造的特徴の予測位置が示される。シグナル配列（Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｅｑ．）（１〜２４位）；ＤＡＮ、システインリッチモチーフ（６９〜１８４位）；
【化１】
2019151654.tif 000002
糖鎖付加部位（４２位）；*、リン酸化部位（６、２９、４４、４７、５５、６６、７６
、７７、８８、１０２及び１５１位）；
【化２】
2019151654.tif 000003
ＰＫＣ特異的真核生物タンパク質リン酸化部位（１６５位）；ＮＬＳ、核局在化シグナル配列（１４５、１６６、１６３、１６４位）。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本方法を説明する前に、本発明は、特定の方法に限定されず、方法及び条件などの記載される実験条件は、変わり得ることを理解されるべきである。本発明の範囲が、添付の請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのみであり、限定されるものではないことも理解されるべきである。
【００６１】
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の通常の技術者により、一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または均等ないかなる方法及び物質も、本発明の実践または試験で使用され得るが、ここでは、好ましい方法及び物質を記載する。本明細書で述べた全ての出版物は、その全文を参照することにより、本明細書に組み入れられるものとする。
【００６２】
定義
「骨形成タンパク質」または「ＢＭＰ」という語は、身体の組織構造を組織化する、中心的形態形成シグナルとして機能する成長因子群を表す。それらは、本来、骨及び軟骨の形成を誘導するそれらの能力により、発見された。しかしながら、ＢＭＰは、胚発生の間に、様々な機能を有する。それらは、器官形成及び形態形成カスケードにも関する。ＢＭＰＳは、本質的に器官ホメオスタシスであることが発見された。さらに、ＢＭＰは、骨粗鬆症、関節炎、肺高血圧症及び腎疾患を含むいくつかの疾病の病態生理に、重要な役割を果たしている。ＢＭＰ及び疾病過程でのそれらの合併症は、Ｗｅｉｓｋｉｒｃｈｅｎ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ  ｉｎ  Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  ２００９，  １４：  ４９９２−５０１２により概説されている。２０種のＢＭＰが、今までに発見されており、そ
れらのうちのＢＭＰ２〜ＢＭＰ７は、トランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーに属する。
【００６３】
「ＧＲＥＭ１」という語は、システインノットスーパーファミリーのメンバーである、ヒトグレムリン−１（ｈｕｍａｎ  ｇｒｅｍｌｉｎ−１）を表す。ヒトＧＲＥＭ１のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿０３７５０４として、ジェンバンクで提供され、本明細書中では、配列番号５９４とも呼ばれる。ＧＲＥＭ１は、本明細書で、配列番号５９３として提供される核酸によりコードされ、受託番号ＮＭ＿０１３３７２として、ジェンバンクでも見られる。ＧＲＥＭ１は、染色体１５ｑ１３〜ｑ１５にマップされた、高度に保存された１８４ａａタンパク質である。該タンパク質は、シグナルペプチド（ａａ１〜２４）及び予測される糖鎖付加部位（ａａ４２において）を含有する。加えて、該タンパク質は、システインに富む領域、及びその構造が該トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーにより共有されるシステインノットモチーフ（ａａ９４〜１８４）を含有する。ＧＲＥＭ１は、分泌型及び細胞結合型（例えば、膜結合性）の両方で存在する。ＧＲＥＭ１は、グレムリン１（ｇｒｅｍｌｉｎ１）、システインノットスーパーファミリー１−ＢＭＰアンタゴニスト１（ＣＫＴＳＦ１Ｂ１）、ＤＡＮドメインファミリーメンバー２（ＤＡＮＤ２）、Ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  Ｍｏｓ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＤＲＭ）、グレムリン（ｇｒｅｍｌｉｎ）、ＧＲＥＭＬＩＮ、グレムリン−１（Ｇｒｅｍｌｉｎ−１）前駆体、Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ＩＨＧ−２）、ＭＧＣ１２６６６０、増殖誘導遺伝子２タンパク質（ＰＩＧ２）、またはグレムリン１様タンパク質としても知られている。ＧＲＥＭ１は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のアンタゴニストである。それは、ＢＭＰに結合して、それらが、それらの受容体に結合するのを阻害する。ＧＲＥＭ１及びＢＭＰ間の相互作用は、利用可能なＢＭＰレベルを微調整して、発症過程及び疾病過程に影響する。ＧＲＥＭ１は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７に結合して阻害し得る。ＧＲＥＭ１は、特に、腎臓、肺臓及び肝臓の線維症で、上方制御されることが発見された。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、「線維症」という語は、修復または反応過程で、器官または組織中の過剰な線維性結合組織の形成を表す。これは、器官または組織の正常な構成物として線維性組織の形成と対立するものである。瘢痕は、深部臓器または深部組織の構築を消すコンフルエントな線維症である。線維症は、身体の多くの器官を冒し得る。次表は、罹患器官に加えて、線維症のいくつかの例を示す：
【表１】
2019151654.tif 000004
【００６５】
「線維症」という語は、肺線維症、例えば、特発性肺線維症、肺高血圧症、糖尿病性腎症、虚血性腎損傷、腎線維症、肝線維症、尿細管間質性線維症、腎硬化症及び腎毒性などの複合疾患も含む。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、「抗体」という語は、それらの多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合性フラグメントだけでなく、ジスルフィド結合により相互接続した、４つのポリペプチド鎖、２つの重鎖（Ｈ鎖）及び２つの軽鎖（Ｌ鎖）から成る免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）を表す。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶH」）及び重鎖定常領域（ドメインＣH１、ＣH２及びＣH３から成る）から成る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」または「ＶL」）及び軽鎖定常領域（ＣL）から成る。ＶH及びＶL領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられた、より保存されている領域が組み入れられている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられた超可変性の領域に、さらに細分され得る。各ＶH及びＶLは、次の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で、アミノ末端からカルボキシ末端まで配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから成る。本発明の特定の実施形態では、抗体のＦＲ（またはその抗原結合性フラグメント）は、ヒト生殖系列配列に同一であり得、または自然にまたは人工的に修飾され得る。アミノ酸共通配列は、２つ以上のＣＤＲの並列解析に基づい
て、定義され得る。
【００６７】
１つ以上のＣＤＲ残基の置換または１つ以上のＣＤＲの省略も可能である。抗体は、科学文献に記載されており、結合のため、１つまたは２つのＣＤＲが、なしで済まされ得る。Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １９９５，  ９：１３３−１３９）は、発表されている結晶構造に基づいて、抗体及びそれらの抗原間の定常領域を解析し、ＣＤＲ残基の５分の１〜３分の１のみが、抗原と実際に接触すると結論した。Ｐａｄｌａｎは、１つまたは２つのＣＤＲが、抗原と接触するアミノ酸を有しない、多くの抗体も発見した（Ｖａｊｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２０：４１５−４２８も参照）。
【００６８】
抗原と接触していないＣＤＲ残基は、分子モデルにより、及び／または実験的に、コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）ＣＤＲの外側にあるカバット（Ｋａｂａｔ）ＣＤＲの領域から、前の研究に基づいて（例えば、ＣＤＲＨ２中の残基Ｈ６０〜Ｈ６５は、しばしば、必要とされない）、同定され得る。もし、ＣＤＲまたはその残基が、省略されるならば、それは、別のヒト抗体配列またはかかる配列の共通部中の相当する位置を占有するアミノ酸で、通常、置換される。ＣＤＲ内の置換位置及び置換するアミノ酸も、実験的に選択され得る。実験的置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
【００６９】
本明細書に開示の完全ヒト抗ＧＲＥＭ１モノクローナル抗体は、相当する生殖系列配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域及び／またはＣＤＲ領域中の１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を含み得る。かかる変異体は、本明細書に開示のアミノ酸配列を、例えば、公開抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することにより、容易に判明され得る。本発明は、本明細書に開示のアミノ酸配列のいずれかに由来の抗体、及びその抗原結合性フラグメントを含み、１つ以上のフレームワーク領域及び／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、該抗体が、それに由来する生殖系列配列の相当する残基、または別のヒト生殖系列配列の相当する残基、または相当する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に変異する（かかる配列変化を、本明細書中、まとめて、「生殖細胞系列変異」と呼ぶ）。本明細書に開示の重鎖及び軽鎖可変領域配列をはじめとして、当業者は、１つ以上の別々の生殖細胞系列変異体またはその組み合わせを含む多数の抗体及び抗原結合性フラグメントを、容易に製造し得る。特定の実施形態では、ＶH及び／またはＶLドメイン内の全てのフレームワーク及び／またはＣＤＲ残基は、該抗体が、それに由来する本来の生殖系列配列中で見られる残基に、変異して戻る。他の実施形態では、特定の残基のみが、該本来の生殖系列配列に、変異して戻り、例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸もしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内で見られる変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内で見られる変異残基のみ。他の実施形態では、１つ以上の該フレームワーク及び／またはＣＤＲ残基は、異なる生殖系列配列の相当する残基に変異する（すなわち、該抗体が、本来、それに由来する生殖系列配列と異なる生殖系列配列）。さらに、本発明の抗体は、フレームワーク及び／またはＣＤＲ領域内の２つ以上の生殖細胞系列変異体のいずれかの組み合わせを含み得、例えば、該本来の生殖系列配列と異なる特定の他の残基が、維持、または異なる生殖系列配列の相当する残基に変異する一方、特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の相当する残基に変異する。一旦、得られれば、１つ以上の生殖細胞系列変異体を含む抗体及び抗原結合性フラグメントは、結合特異性改良、結合親和性増加、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改良または増強（場合によっては）、免疫原性の減少、他などの１つ以上の所望の特性のため、容易に試験され得る。この一般的方法で得られた抗体及び抗原結合性フラグメントは、本発明内に包含される。
【００７０】
本発明は、１つ以上の保存的置換を有する、本明細書に開示のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む、完全ヒト抗ＧＲＥＭ１モノク
ローナル抗体も含む。例えば、本発明は、本明細書に開示の該ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと比較して、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下、その他の保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＧＲＥＭ１抗体を含む。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、「ヒト抗体」という語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来の可変及び定常領域を有する抗体を含むものとする。本発明のヒトｍＡｂｓは、例えば、ＣＤＲ中及び特定のＣＤＲ３中のヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、生体外ランダムもしくは部位特異的変異誘発または生体内体細胞変異により誘発される変異）を含み得る。しかしながら、本明細書で使用されるとき、「ヒト抗体」という語は、別の哺乳類種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトＦＲ配列上に移植されたｍＡｂｓを含まないものとする。
【００７２】
「特異的に結合する」、または「〜に特異的に結合する」等という語は、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、生理的条件下、比較的安定である抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも、約１ｘ１０-6Ｍ以下の平衡解離定数（例えば、より小さいＫDほど、より強力な結合を表す）により特徴付けられ得る。２つの分子
が特異的に結合するどうかを決定する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、平衡透析法、表面プラズモン共鳴法等が挙げられる。本明細書に記載の通り、ヒトＧＲＥＭ１に特異的に結合する抗体は、表面プラズモン共鳴法、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）により、同定された。さらに、ＧＲＥＭ１中の１つのドメイン及び１つ以上の追加の抗原に結合する、またはＧＲＥＭ１の２つの異なる領域に結合する二重特異的な多重特異的抗体は、それでもなお、本明細書で使用されるとき、「特異的に結合する」抗体として見なされる。
【００７３】
「高親和性」抗体という語は、表面プラズモン共鳴法、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）または溶液親和性（ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ａｆｆｉｎｉｔｙ）ＥＬＩＳＡにより測定したとき、少なくとも、１０-7Ｍ；好ましくは、１０-8Ｍ；より好ましくは、１０-9Ｍ；さらにより好ましくは、１０-10Ｍ；さらにより好ましくは、１０-11ＭのＫDとして表される
、ＧＲＥＭ１に対する結合親和性を有するこれらのｍＡｂｓを表す。
【００７４】
「スローオフ速度（ｓｌｏｗ  ｏｆｆ  ｒａｔｅ）」、「Ｋｏｆｆ」または「ｋｄ」という語は、表面プラズモン共鳴法、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）により測定したとき、１ｘ１０-3ｓ-1以下、好ましくは、１ｘ１０-4ｓ-1以下の速度定数で、ＧＲＥＭ１から解離する抗体を意味する。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、抗体の「抗原結合性部分」、抗体の「抗原結合性フラグメント」等という語は、抗原と特異的に結合して複合体を形成する、いかなる天然の、酵素的に入手可能な、合成的、または遺伝工学的ポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。本明細書で使用されるとき、抗体の「抗原結合性フラグメント」、または「抗体フラグメント」という語は、ＧＲＥＭ１に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを表す。
【００７６】
特定の実施形態では、本発明の抗体または抗体フラグメントは、抗生物質、第二抗ＧＲＥＭ１抗体、またはＩＬ−１、ＩＬ−６、もしくはＴＧＦ−βなどのサイトカインに対する抗体などの治療的部分（「免疫複合体」）、または肺線維症、腎線維症、肝線維症、虚血性腎損傷、尿細管間質性線維症、糖尿病性腎症、腎硬化症、または腎毒性を含む疾病または病態を治療するために有用な他のいかなる治療的部分と結合し得る。
【００７７】
本明細書で使用されるとき、「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する、実質
的に他の抗体（Ａｂｓ）が混ざっていない抗体を表す（例えば、ヒトＧＲＥＭ１と、特異的に結合する単離された抗体、またはそのフラグメントは、ＧＲＥＭ１以外の抗原と、特異的に結合するＡｂｓが実質的に混ざっていない）ものとする。
【００７８】
本明細書で使用されるとき、「阻止抗体」または「中和抗体」（または「ＧＲＥＭ１活性を中和する抗体」）は、ＧＲＥＭ１との結合が、ＧＲＥＭ１の少なくとも１つの生理活性の阻害をもたらす抗体を表すものとする。例えば、本発明の抗体は、線維症の拡大を阻害または予防に役立ち得る。あるいは、本発明の抗体は、線維症または、乾性咳嗽または息切れを含む、線維症が原因である少なくとも１つの症状を治療する能力を示し得る。ＧＲＥＭ１の生理活性のこの阻害は、いくつかの標準的な生体外アッセイ（本明細書に記載の中和アッセイなど）または当分野で公知の生体内アッセイ（例えば、本明細書に記載の１つ以上の該抗体の投与後、ＧＲＥＭ１活性からの保護を調査するための動物モデル）の１つ以上により、ＧＲＥＭ１生理活性の１つ以上の指標を測定することにより評価され得る。
【００７９】
本明細書で使用されるとき、「表面プラズモン共鳴法」という語は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システムを用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出により、リアルタイムの生体分子相互作用の解析を可能とする光学的現象を表す（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ
ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．）。
【００８０】
本明細書で使用されるとき、「ＫD」という語は、特定の抗体抗原相互作用の平衡解離
定数を表すものとする。
【００８１】
「エピトープ」という語は、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域中の特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を表す。１つの抗原は、２つ以上のエピトープを有し得る。従って、異なる抗体は、抗原上の異なる領域と結合し得る。「エピトープ」という語は、Ｂ及び／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位も表す。抗体と結合された抗原の領域も表す。エピトープは、構造的または機能的に定義され得る。機能的エピトープは、一般に、該構造的エピトープのサブセットであり、該相互作用の親和性に、直接的に、寄与するこれらの残基を有する。エピトープは、立体構造的でもあり、すなわち、非直鎖アミノ酸から成り得る。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面分類である決定基を含み得、特定の実施形態では、特異的３次元構造的特徴、及び／または特異的電荷特性を有し得る。
【００８２】
核酸またはそのフラグメントを表すとき、「実質的同一性」または「実質的に同一」という語は、別の核酸（またはその相補鎖）で、適切なヌクレオチド挿入または欠失で、最適に配列されるとき、後述されるＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧＡＰなどの配列同一性のいずれかの周知のアルゴリズムにより測定したとき、少なくとも、約９０％、より好ましくは、少なくとも、約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の該ヌクレオチド塩基で、ヌクレオチド配列同一性があることを示す。基準核酸分子と実質的に同一性を有する核酸分子は、場合によっては、該基準核酸分子によりコードされたポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
【００８３】
ポリペプチドに適用されるとき、「実質的類似性」または「実質的に類似の」という語は、デフォルトギャプウェイト（ｄｅｆａｕｌｔ  ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔｓ）を用いて、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどにより、最適に配列されるとき、２つのペプチド配列は、少なくとも、９０％、さらに好ましくは、少なくとも、９５％、９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、
保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、荷電または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により、置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換タンパク質の機能的特性が、実質的に変化しないだろう。２つ以上のアミノ酸配列が、保存的置換により、互いに異なる場合、類似性のパーセントまたは程度は、該置換の保存的性質のため、上向きに補正するよう調整され得る。この調整を行う手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ  （１９９４）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：  ３０７−３３１（参照することにより、本明細書に組み入れられるものとする）参照。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、及び７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：  １４４３  ４５（参照することにより、本明細書に組み入れられるものとする）に開示のＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで、正値を有するいずれかの変化である。「中程度に保存的」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで、負でない値を有するいずれかの変化である。
【００８４】
ポリペプチドでの配列類似性は、通常、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠失及び他の修飾に割り当てられた類似性の測度を用いて、類似の配列に一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物からの相同的ポリペプチドなどの密接に関係があるポリペプチド間、または野生型タンパク質及びその変異タンパク質間の配列相同性または配列同一性を決定するための初期パラメーターを用いて、使用され得るＧＡＰ及びＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１参照。ポリペプチド配列は、初期または推奨パラメーターを用いて、ＦＡＳＴＡを使用しても、比較され得る；ＧＣＧバージョン６．１．ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）のプログラムは、照会及び検索配列間の最適オーバーラップの領域の配列及び配列同一性パーセンテージを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ  （２０００）  ｓｕｐｒａ）。本発明の配列を、異なる生物からの多数の配列を含むデータベースと比較するとき、別の好ましいアルゴリズムは、初期パラメーターを用いた、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特に、ＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−４１０及び（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：  ３３８９−３４０２（各々は、参照することにより、本明細書に組み入れられるものとする）参照。
【００８５】
特定の実施形態では、本発明の方法で使用のための抗体または抗体フラグメントは、単一特異的、二重特異的、または多重特異的であり得る。多重特異的抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得、または２つ以上の標的ポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合性ドメインを含み得る。本発明との関連で、使用され得る実例となる二重特異性抗体のフォーマットは、１番目の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣH３ド
メイン及び２番目のＩｇＣH３ドメインの使用を含み、１番目及び２番目のＩｇＣH３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸で、互いに異なり、少なくとも１つのアミノ酸の差は、該アミノ酸の差がない二重特異性抗体と比較して、タンパク質Ａとの二重特異性抗体の結合を減少させる。１つの実施形態では、１番目のＩｇＣH３ドメインは、タンパク質Ａ
と結合し、２番目のＩｇＣH３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾などのタンパク質Ａ結合を減少
または無効にする変異体を含む（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）。２番目のＣH３は、Ｙ９６Ｆ修飾を、さらに含み得る（ＩＭＧＴ
による；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）。２番目のＣH３内で見られ得るさらなる修飾としては
：ＩｇＧ１ｍＡｂｓの場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２ｍＡｂｓの場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２Ｉ）；及びＩｇＧ４ｍＡｂｓの場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ）が挙げられる。上記二重特異性抗体のフォーマットのバリエーションは、本発明の範囲内と考えられる。
【００８６】
「治療有効量」という言い回しは、投与される所望の効果を提供する量を意味する。正確な量は、治療の目的に依存し、公知技術を用いて、当業者により確かめられるだろう（例えば、Ｌｌｏｙｄ  （１９９９）  Ｔｈｅ  Ａｒｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ参照）。
【００８７】
概要
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のアンタゴニストとして、ＧＲＥＭ１遺伝子は、器官形成、体パターン形成、及び組織分化を調節する役割を果たす。ＧＲＥＭ１は、肺分化で、重要な役割を果たすことが分かった。しかしながら、健康な成人の肺中のＧＲＥＭ１の発現は低い。ＧＲＥＭ１の上方制御レベルは、肺高血圧症及び肺線維症と相関していた（Ｃｏｓｔｅｌｌｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４２：  ５１７−５２３）。特に、突発性型の肺線維症は、予後不良及び治療効果なく、肺実質の進行性で瘢痕形成性及び障害を引き起こす疾病である。ＧＲＥＭ１発現増加は、特発性肺線維症の肺機能検査で、負に相関し、ＧＲＥＭ１が、進行期の線維症の重要なマーカーであり得ることを示唆している（Ｃｏｓｔｅｌｌｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４２：  ５１７−５２３）。
【００８８】
ＧＲＥＭ１発現は、腎臓器形成でも、重要である。しかしながら、健康な成人の腎臓内のＧＲＥＭ１発現は、ほとんど、検出されない。ＧＲＥＭ１レベル上昇は、高血糖症及び糖尿病性腎症を有する患者で見られる（Ｌａｐｐｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  Ｄｉａｌ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  １７：  ６５−６７）。ＧＲＥＭ１は、糖尿病性腎症を有する患者での尿細管間質性線維症の領域で上方制御されることが見られる。糖尿病性腎症は、硬化症及び尿細管間質性線維症の発症により特徴付けられる複合疾患である。それは、末期腎疾患の主要な原因であり、糖尿病を有する患者の２０〜４０％は、糖尿病性腎症を、最終的に、発症する。糖尿病性腎症の進行を、進行期へ戻すまたは抑制するための特異的療法は、利用可能でなく、現在の治療戦略は、血中グルコース値の管理及び高血圧症の抑制に限定される（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  ＢＢＲＣ  ３８３：  １−３））。
【００８９】
ＧＲＥＭ１は、肝線維症で、上方制御されることも分かった（Ｂｏｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８１：  １６２８９−１６２９５）。肝線維症は、ウイルス性肝炎、寄生虫感染症、代謝疾患または自己免疫疾患、先天性異常及び薬物とアルコール中毒のような、ほとんどの慢性肝障害に対する共通の応答である。線維症は、肝臓の進行性肝硬変の一因でもあり得る。肝疾患の発見は、しばしば、遅れ、効果的医療は、容易に利用可能でない。
【００９０】
本明細書に記載の抗体は、ヒトＧＲＥＭ１との特異的結合を示し、いくつかの実施形態では、線維症を患っている患者の治療に有用であり得る。かかる抗体の使用は、線維症を患っている患者の治療の効果的手段であり得、または乾性咳嗽の重症度または線維症に関連する呼吸困難を和らげるために使用され得る。それらは、単独または、これに限定されないが、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＩＡＤ）、プレドニゾンなどの副腎皮質ホルモン剤、もしくは他のいずれもの緩和療法などの他の治療成分または線維症治療の分野で公知の様式での補助療法として使用され得る。それらは、ＧＲＥＭ１に特異的な、またはＩＬ−１、ＩＬ−６またはＴＧＦ−βなどのサイトカインに対する、２番目または３番目の異なる抗体と併用して、使用され得る。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、（突発性）肺線維症、腎線維症、肝線維症、虚血性腎損傷、尿細管間質性線維症、糖尿病性腎症、腎硬化症、または腎毒性を含む線維症の疾病または病態を治療または管理するのに有用であり得る。
【００９２】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、肺、子宮頸部、結腸、乳房、及び膵臓の肉腫及び癌腫などのがんを治療または管理するため、有用であり得る。
【００９３】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、未変性の完全長ヒトＧＲＥＭ１（ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０３７５０４（配列番号５９４））などの一次免疫原またはＧＲＥＭ１（配列番号５９５）もしくはＧＲＥＭ１フラグメントの組み換え型で免疫化され、次いで、二次免疫原、またはＧＲＥＭ１の免疫的に活性なフラグメントで免疫化されたマウスから得られる。
【００９４】
該免疫原は、ヒトＧＲＥＭ１の免疫原フラグメントまたはその該フラグメントをコードするＤＮＡであり得る。該免疫原は、ヒスチジン及び／または抗体のＦｃ領域のフラグメントと結合したＧＲＥＭ１であり得る。
【００９５】
完全長ヒトＧＲＥＭ１のアミノ酸配列（ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０３７５０４でも公知）を、配列番号５９４として示す。組み換えＧＲＥＭ１の完全長アミノ酸配列（Ｆｃ領域及びヒスチジンタグと結合したａａ２５〜１８４ＧＲＥＭ１）を、配列番号５９５として示す。
【００９６】
ＧＲＥＭ１の完全長ＤＮＡ配列を、配列番号５９３として示す。
【００９７】
特定の実施形態では、ヒトＧＲＥＭ１と、特異的に結合する抗体は、上記領域のフラグメント、または本明細書に記載の領域のＮまたはＣ末端のいずれか、もしくは両方からの約５個〜約２０個のアミノ酸残基により、指定領域を超えて拡大するペプチドを用いて、製剤され得る。特定の実施形態では、上記領域またはそのフラグメントのいずれかの組み合わせは、ヒトＧＲＥＭ１特異的抗体の製剤で使用され得る。特定の実施形態では、ヒトＧＲＥＭ１の上記領域、またはそのフラグメントのいずれか１つ以上は、単一特異的、二重特異的、または多重特異的抗体を製剤するため、使用され得る。
【００９８】
抗体の抗原結合性フラグメント
特に、別途指定されない限り、本明細書で使用されるとき、「抗体」という語は、その抗原結合性フラグメントだけでなく、２つの免疫グロブリン重鎖及び２つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子（すなわち、「完全抗体分子」）を包含すると理解されるべきである。本明細書で使用されるとき、抗体の「抗原結合性部分」、抗体の「抗原結合性フラグメント」等という語は、抗原と特異的に結合して、複合体を形成する、いかなる天然の、酵素的に入手可能な、合成的、または遺伝工学的ポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。本明細書で使用されるとき、抗体の「抗原結合性フラグメント」、または「抗体フラグ
メント」という語は、ヒトＧＲＥＭ１と、特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを表す。抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フ
ラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、ＣＤＲを含むフラグメント、または単離ＣＤＲを含み得る。抗体の抗原結合性フラグメントは、例えば、タンパク質消化または、操作及び抗体可変及び（適宜に）定常ドメインをコードするＤＮＡの発現を含む組み換え遺伝子工学技術などのいかなる適切な標準的技術を用いて、完全抗体分子から誘導され得る。かかるＤＮＡは、公知であり、及び／または、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ−抗体ライブラリーを含む）から、容易に入手可能、または合成され得る。該ＤＮＡは、化学的に、または、分子生物学技術、例えば、１つ以上の可変及び／または定常ドメインを、適切な配置に配列する、またはコドンを導入、システイン残基を生成、アミノ酸を修飾、追加もしくは欠失するなどにより、配列及び操作され得る。
【００９９】
抗原結合性フラグメントの限定されない例としては：（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；及び（ｖｉｉ）抗体の高頻度可変性領域を模倣するアミノ酸残基から成る最小認識ユニット（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、または拘束性（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドが挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）（例えば、一価ナノ抗体、二価ナノ抗体、他）、小型モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変（ｓｈａｒｋ  ｖａｒｉａｂｌｅ）ＩｇＮＡＲドメインなどの、他の工学的分子は、本明細書で使用されるとき、「抗原結合性フラグメント」の表現内にも、包含される。
【０１００】
抗体の抗原結合性フラグメントは、通常、少なくとも１つの可変ドメインを含むだろう。該可変ドメインは、いずれかのサイズ、またはアミノ酸組成であり得、一般に、１つ以上のフレームワーク配列を有するフレームに隣接またはフレーム内にある、少なくとも１つのＣＤＲを含むだろう。ＶLドメインと関連するＶHドメインを有する抗原結合性フラグメントでは、ＶH及びＶLドメインは、いずれかの適切な配置内で、互いに関連して位置し得る。例えば、該可変領域は、二量体であり、ＶH−ＶH、ＶH−ＶLまたはＶL−ＶL二量体を含み得る。あるいは、該抗体の抗原結合性フラグメントは、単量体のＶHまたはＶLドメインを含み得る。
【０１０１】
特定の実施形態では、抗体の抗原結合性フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインと共有結合した、少なくとも１つの可変ドメインを含み得る。本発明の抗体の抗原結合性フラグメント内で見られ得る可変及び定常ドメインの限定されない実例となる配置としては：（ｉ）ＶH−ＣH１；（ｉｉ）ＶH−ＣH２；（ｉｉｉ）ＶH−ＣH３；（ｉｖ）ＶH−
ＣH１−ＣH２；（ｖ）ＶH−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｖｉ）ＶH−ＣH２−ＣH３；（ｖｉ
ｉ）ＶH−ＣL；（ｖｉｉｉ）ＶL−ＣH１；（ｉｘ）ＶL−ＣH２；（ｘ）ＶL−ＣH３；（ｘｉ）ＶL−ＣH１−ＣH２；（ｘｉｉ）ＶL−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｘｉｉｉ）ＶL−ＣH
２−ＣH３；及び（ｘｉｖ）ＶL−ＣLが挙げられる。上記に列挙した実例となる配置のい
ずれかを含む可変及び定常ドメインのいずれかの配置では、該可変及び定常ドメインは、直接、互いに結合しているか、あるいは完全もしくは部分的ヒンジもしくはリンカー領域により結合されているかのいずれかであり得る。ヒンジ領域は、１つのポリペプチド分子内の隣接する可変及び／または定常ドメイン間のフレキシブルまたは半フレキシブルな結合をもたらす、少なくとも２個（例えば、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個またはそれ以上）のアミノ酸から成り得る。さらに、本発明の抗体の抗原結合性フラグメントは、互いに、及び／または１つ以上の単量体ＶHもしくはＶLドメイン（例えば、ジ
スルフィド結合により）と非共有結合性会合で、上記列挙された該可変及び定常ドメイン配置のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
【０１０２】
完全抗体分子を有するとき、抗原結合性フラグメントは、単一特異的または多重特異的（例えば、二重特異的）であり得る。抗体の多重特異的抗原結合性フラグメントは、通常、各可変ドメインが、別の抗原または同じ抗原上の異なるエピトープと、特異的に結合可能である、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含むだろう。本明細書に開示の実例となる二重特異性抗体フォーマットを含む、いずれかの多重特異的抗体フォーマットは、当分野で有用な通例の技術を用いて、本発明の抗体の抗原結合性フラグメントと関連した使用に適用され得る。
【０１０３】
ヒト抗体の製剤
トランスジェニックマウス中にヒト抗体を産生する方法は、当分野で公知である。いかなるかかる公知の方法も、ヒトＧＲＥＭ１と、特異的に結合するヒト抗体を産生するため、本発明との関連で、使用され得る。
【０１０４】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術（例えば、米国特許第６，５９６，５４１号参照、リジェネロンファーマシューティカルズ社、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標））またはモノクローナル抗体を産生するいずれかの他の公知の方法を用いて、ヒトＧＲＥＭ１に対する高親和性キメラ抗体は、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有して、最初に単離される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術は、該マウスが、抗原刺激に応答して、ヒト可変領域及びマウス定常領域を含む抗体を産生するように、内在性マウス定常領域座位と、作動可能に結合されたヒト重鎖及び軽鎖可変領域を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスの生成を含む。該抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡは、単離され、該ヒト重鎖及び軽鎖定常領域をコードするＤＮＡと、作動可能に結合される。それから、該ＤＮＡは、該完全ヒト抗体の発現可能な細胞内で、発現される。
【０１０５】
一般に、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを、注目の抗原とチャレンジし、リンパ細胞（Ｂ細胞など）を、抗体を発現する該マウスから回収する。該リンパ細胞を、骨髄腫細胞株と融合し、不死ハイブリドーマ細胞株を作製し得、かかるハイブリドーマ細胞株を、スクリーニングし、選択して、注目の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を識別する。重鎖及び軽鎖の該可変領域をコードするＤＮＡを、単離して、重鎖及び軽鎖の所望のアイソタイプ定常領域と結合し得る。かかる抗体タンパク質を、ＣＨＯ細胞などの細胞内で、産生し得る。あるいは、該抗原特異的キメラ抗体または軽鎖及び重鎖の該可変ドメインをコードするＤＮＡを、抗原特異的リンパ球から直接、単離し得る。
【０１０６】
先ず、高親和性キメラ抗体を、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有して、単離する。下記実験のセクションでは、該抗体を、親和性、選択性、エピトープ、他を含む所望の特徴で、特徴付け、選択する。該マウス定常領域を、所望のヒト定常領域で置換して、本発明の完全ヒト抗体、例えば、野生型または修飾ＩｇＧ１またはＩｇＧ４を産生する。選択された該定常領域が、特定の使用により、異なり得るが、高親和性抗原結合性及び標的特異性特徴は、該可変領域中に存在する。
【０１０７】
一般に、本発明の抗体は、典型的に、固相に固定化された、または液相中のいずれかの抗原との結合により測定したとき、約１０-12〜約１０-7ＭのＫDを有する非常に高親和性を有する。該マウス定常領域を、所望のヒト定常領域で置換して、本発明の該完全ヒト抗体を産生する。選択された該定常領域が、特異的使用により異なり得るが、高親和性抗原結合性及び標的特異性特徴は、該可変領域中に存在する。
【０１０８】
生物学的均等物
本発明の抗ヒトＧＲＥＭ１抗体及び抗体フラグメントは、該記載の抗体と異なるが、ヒトＧＲＥＭ１と結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。かかる変異体抗体及び抗体フラグメントは、親配列と比較したとき、アミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、該記載の抗体のものと本質的に均等な生物活性を示す。同様に、本発明の該抗体をコードするＤＮＡは、開示の配列と比較したとき、ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗体または抗体フラグメントと本質的に、生物学的均等である配列を包含する。
【０１０９】
例えば、もし、それらが、その吸収速度及び程度が、同様な実験条件下、同モル用量を、単回投与あるいは反復投与で、投与されるとき、有意差を示さない医薬均等物または医薬代替物であるならば、２つの抗原結合性タンパク質、または抗体は、生物学的均等と見なされる。いくつかの抗体は、もし、それらが、その吸収の程度で均等であるが、その吸収速度で均等でないならば、均等物または医薬代替物と見なされるだろうし、さらに、かかる該吸収速度差が、意図的であり、標識に反映され、例えば、長期使用上、身体的依存性薬物有効濃度到達に本質的でないので、生物学的均等と見なされ得、試験された特定製剤にとって、医学的に重要でないと見なされる。
【０１１０】
１つの実施形態では、もし、その安全性、純度、及び効力で、臨床的に、意味ある差がないならば、２つの抗原結合性タンパク質は、生物学的均等である。
【０１１１】
１つの実施形態では、もし、患者が、かかる切り換えのない持続的治療と比較して、免疫原性での臨床的有意差、または有効性減少を含む、副作用のリスク増加が見込まれないで、基準製品及び生物由来製品の間で、１回以上切り換えされ得るならば、２つの抗原結合性タンパク質は、生物学的均等である。
【０１１２】
１つの実施形態では、もし、それらが、両方共、共通の機序または条件もしくは使用条件の作用機序により作用するならば、かかる機序が公知であるという限りでは、２つの抗原結合性タンパク質は、生物学的均等である。
【０１１３】
生物学的均等物は、生体内及び／または生体外的方法により示され得る。生物学的均等性測度としては、例えば、（ａ）抗体濃度もしくはその代謝物が、時間の関数として、血中、血漿中、血清中、または他の生体液中で測定される、ヒトまたは他哺乳類での生体内試験；（ｂ）ヒト生体内生物学的利用率データと相関があり、合理的に予測する生体外試験；（ｃ）該抗体（またはその標的）の適切な急性型薬理作用が、時間の関数として測定される、ヒトまたは他哺乳類での生体内試験；及び（ｄ）安全性、有効性、または抗体の生物学的利用率もしくは生物学的均等性を確立する、十分制御された臨床試験が挙げられる。
【０１１４】
本発明の抗体の生物学的均等な変異体は、例えば、残基もしくは配列の様々な置換、または生物活性に必要がない末端もしくは内部残基もしくは配列の欠失により、構築され得る。例えば、生物活性に必須でないシステイン残基は、再生時の不必要なまたは間違った分子内ジスルフィド架橋形成を防止するため、欠失または、他のアミノ酸で置換され得る。他の関連では、生物学的均等な抗体としては、該抗体のグリコシル化特性を修飾するアミノ酸変化を含む抗体変異体、例えば、グリコシル化を脱離または除去する変異体が挙げられる。
【０１１５】
Ｆｃ変異体を含む抗ＧＲＥＭ１抗体
本発明の特定の実施形態に従って、抗ＧＲＥＭ１抗体は、例えば、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおいて、ＦｃＲｎ受容体と結合する抗体を、増強または減少させる１つ以上
の変異体を含むＦｃドメインを含んで提供される。例えば、本発明は、変異体が、酸性環境（例えば、約５．５〜約６．０のｐＨ範囲のエンドソーム内）で、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる、ＦｃドメインのＣH２またはＣH３領域の該変異体を含む抗ＧＲＥＭ１抗体を含む。かかる変異体は、動物に投与されるとき、該抗体の血清の半減期の増加をもたらし得る。かかるＦｃ修飾の限定されない例としては、例えば、位置２５０の修飾（例えば、ＥまたはＱ）；２５０及び４２８（例えば、ＬまたはＦ）；２５２（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４（例えば、ＳまたはＴ）、及び２５６（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）；または位置４２８及び／または４３３（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）及び／または４３４（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、ＦまたはＹ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４ＦまたはＮ４３４Ｙ］）における修飾；または位置２５０及び／または４２８における修飾；または位置３０７または３０８（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及び４３４における修飾が挙げられる。１つの実施形態では、該修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾；２５２、２５４、及び２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）修飾；２５０Ｑ及び４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）；及び３０７及び／または３０８修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。さらに別の実施形態では、該修飾は、２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）及び／または２９７Ａ（例えば、Ｎ２９７Ａ）修飾を含む。
【０１１６】
例えば、本発明は：２５０Ｑ及び２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔ及び２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌ及び４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ）；２５７Ｉ及び３１１Ｉ（例えば、Ｐ２５７Ｉ及びＱ３１１Ｉ）；２５７Ｉ及び４３４Ｈ（例えば、Ｐ２５７Ｉ及びＮ４３４Ｈ）；３７６Ｖ及び４３４Ｈ（例えば、Ｄ３７６Ｖ及びＮ４３４Ｈ）；３０７Ａ、３８０Ａ及び４３４Ａ（例えば、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ及びＮ４３４Ａ）；並びに４３３Ｋ及び４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆ）から成る群から選択される変異体の１つ以上の対または群を含むＦｃドメインを含む抗ＧＲＥＭ１抗体を含む。前述のＦｃドメイン変異体の全ての可能な組み合わせ、及び本明細書に開示の抗体可変ドメイン内の他の変異体は、本発明の範囲内で考えられる。
【０１１７】
本発明は、キメラＣH領域が、２つ以上の免疫グロブリンアイソタイプのＣH領域由来のセグメントを含む、キメラ重鎖定常（ＣH）領域を含む抗ＧＲＥＭ１抗体も含む。例えば
、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４分子由来のＣH３ド
メインの部分または全てと結合した、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４分子由来のＣH２ドメインの部分または全てを含むキメラＣH領域を含み得る。特定の実施形態に従って、本発明の抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣH領域を含む。例えば
、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域由来の「下側ヒンジ」配列（ＥＵナンバリングに従って、位置２２８〜２３６のアミノ酸残基）と結合した、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域由来の「上側ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵナンバリングに従って、位置２１６〜２２７のアミノ酸残基）を含み得る。特定の実施形態に従って、該キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４上側ヒンジ由来のアミノ酸残基及びヒトＩｇＧ２下側ヒンジ由来のアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のキメラＣH領域を含む抗体は、該抗体の治
療的または薬物動態学的特性に悪影響を及ぼさない修飾したＦｃエフェクター機能を示し得る（例えば、２０１３年２月１日出願の米国特許仮出願第６１／７５９，５７８号（その全文を参照することにより、本明細書に組み入れられるものとする））。
【０１１８】
抗体の生物学的特性
一般に、本発明の抗体は、ヒトＧＲＥＭ１と結合することにより、機能し得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＧＲＥＭ１の触媒ドメイン、またはそのフラグメントと結合し得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＧＲＥＭ１の分泌型またはヒトＧＲＥＭ１の膜結合型と結合し得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、２つ以上のドメイン（交差反応性抗体）と結合し得る。
【０１１９】
本発明の特定の実施形態では、該抗体は、配列番号５９４または配列番号５９５のアミノ酸残基２５〜１８４の間の領域に位置するエピトープと結合し得る。
【０１２０】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５９３に示された核酸配列によりコードされる、そのアミノ酸配列が、配列番号５９４で示される完全長未変性タンパク質の他のいずれもの領域またはフラグメントと結合することにより、ＢＭＰシグナル伝達を遮断または阻害することにより機能し得る。１つの実施形態では、本発明の抗体は、完全長ＧＲＥＭ１またはそのフラグメントと結合することにより、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４またはＢＭＰ７の阻害を逆転させることにより機能し得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＢＭＰシグナル伝達を促進することにより機能し得、またはＧＲＥＭ１及び、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４またはＢＭＰ７を含む、ＢＭＰとの間の結合をブロックし得る。
【０１２１】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、ＧＲＥＭ１の、ヘパリンとの結合をブロックすることにより、及び／またはヘパリン介在のＶＥＧＦＲ２活性化を阻害することにより、機能し得る。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、二重特異性抗体であり得る。本発明の二重特異性抗体は、１つのドメイン中の１つのエピトープと結合し得、ヒトＧＲＥＭ１の２番目のドメイン中の１つのエピトープとも結合し得る。特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、同じドメイン中の２つの異なるエピトープと結合し得る。
【０１２３】
１つの実施形態では、本発明は、ヒトＧＲＥＭ１と結合する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントは、１つ以上の次の特性を示す：（ｉ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、４９８、５１４、５３０、５４６、５６２、及び５７８、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、その実質的に類似の配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含み；（ｉｉ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４、４９０、５０６、５２２、５３８、５５４、５７０、及び５８６、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、その実質的に類似の配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含み；（ｉｉｉ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８、３４４、３６０、３７６、３９２、４０８、４２４、４４０、４５６、４７２、４８８、５０４、５２０、５３６、５５２、５６８、及び５８４、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、その実質的に類似の配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；及び配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６、３５２、３６８、３８４
、４００、４１６、４３２、４４８、４６４、４８０、４９６、５１２、５２８、５４４、５６０、５７６、及び５９２、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、その実質的に類似の配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含み；（ｉｖ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４、３４０、３５６、３７２、３８８、４０４、４２０、４３６、４５２、４６８、４８４、５００、５１６、５３２、５４８、５６４、及び５８０、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、その実質的に類似の配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；及び配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６、３４２、３５８、３７４、３９０、４０６、４２２、４３８、４５４、４７０、４８６、５０２、５１８、５３４、５５０、５６６、及び５８２、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、その実質的に類似の配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２、３４８、３６４、３８０、３９６、４１２、４２８、４４４、４６０、４７６、４９２、５０８、５２４、５４０、５５６、５７２、及び５８８、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、その実質的に類似の配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；及び配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３３４、３５０、３６６、３８２、３９８、４１４、４３０、４４６、４６２、４７８、４９４、５１０、５２６、５４２、５５８、５７４、及び５９０、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、その実質的に類似の配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメインを含み；（ｖ）１０-7以下のＫDを有するＧＲＥＭ１と結合し；（
ｖｉ）ＧＲＥＭ１が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４またはＢＭＰ７の１つと結合するのをブロックし；（ｖｉｉ）ＧＲＥＭ１が、ＢＭＰシグナル伝達の阻害をブロックして、細胞分化を促進し；及び（ｖｉｉｉ）ＧＲＥＭ１が、ヘパリンと結合するのをブロックする。
【０１２４】
本発明の特定の抗ＧＲＥＭ１抗体は、生体外または生体内アッセイにより測定したとき、ＧＲＥＭ１の活性を、結合して中和することが可能である。本発明の抗体が、ＧＲＥＭ１の活性を結合して中和する能力は、本明細書に記載の結合アッセイ、または活性アッセイを含む、当業者に公知のいずれの標準的方法を用いても、測定され得る。
【０１２５】
結合活性を測定するための、限定されない、実例となる生体外アッセイは、本明細書中、実施例４で示される。実施例４では、ヒト抗ＧＲＥＭ１抗体の結合親和性及び速度定数を、表面プラズモン共鳴法により決定し、該測定を、Ｔ２００Ｂｉａｃｏｒｅ装置で実行した。実施例５では、抗ＧＲＥＭ１抗体が、生体外で、ＧＲＥＭ１のＢＭＰ４結合能をブロックする能力を決定するため、ブロッキングアッセイを使用した。実施例６及び７は、ＢＭＰ４シグナル伝達及び細胞分化を促進する、抗ＧＲＥＭ１抗体の活性を説明する。実施例６では、抗ＧＲＥＭ１抗体は、ＢＭＰ４シグナル伝達のＧＲＥＭ１阻害をブロックした。実施例７では、抗ＧＲＥＭ１抗体は、骨芽細胞前駆細胞のＢＭＰ４シグナル伝達及び細胞分化を促進した。実施例９は、ＧＲＥＭ１特異的抗体を用いて、ＧＲＥＭ１−ヘパリン結合相互作用の阻害を説明する。
【０１２６】
本発明は、次のタンパク質、またはペプチド：配列番号５９４（完全長未変性ヒトＧＲ
ＥＭ１）、または配列番号５９５（ヒトＧＲＥＭ１の組み換え型）のいずれかの少なくとも１つの生物活性フラグメントと結合する抗ＧＲＥＭ１抗体及びその抗原結合性フラグメントも含む。本明細書に記載のＧＲＥＭ１ペプチドのいずれも、またはそのフラグメントは、抗ＧＲＥＭ１抗体を産生するため、使用され得る。
【０１２７】
該ペプチドは、タギングまたはＫＬＨなどの担体分子と結合する目的のため、特定の残基の付加または置換を含むように修飾され得る。例えば、システインは、ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに、付加され得、またはリンカー配列は、例えば、免疫化のためのＫＬＨと結合するため、該ペプチドを製剤するため、付加され得る。
【０１２８】
ＧＲＥＭ１に特異的な該抗体は、追加の標識または部分を含むことがなく、それらは、Ｎ末端またはＣ末端標識もしくは部分を含み得る。１つの実施形態では、該標識または部分は、ビオチンである。結合アッセイでは、標識の位置は、（たとえあったにしても）該ペプチドが結合する表面に対して、該ペプチドの配向を決定し得る。例えば、もし、表面が、アビジンでコートされているならば、Ｎ末端ビオチンを含むペプチドは、該ペプチドのＣ末端部分が、該表面に対して遠位側になるように、配向されるだろう。１つの実施形態では、該標識は、放射性核種、蛍光色素またはＭＲＩ検出可能標識であり得る。特定の実施形態では、かかる標識化抗体は、イメージングアッセイを含む診断アッセイで使用され得る。
【０１２９】
エピトープマッピング及び関連技術
本発明は、ＧＲＥＭ１の１つ以上の領域内で見られる１つ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＧＲＥＭ１抗体を含む。該抗体が結合するエピトープは、該ＧＲＥＭ１分子の前述の領域（例えば、ドメイン中の直鎖エピトープ）のいずれか内に位置する３個以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上）のアミノ酸の単一隣接配列から成り得る。あるいは、該エピトープは、該ＧＲＥＭ１分子の前述の領域（例えば、立体構造エピトープ）のいずれかまたは両方内に位置する複数の非隣接アミノ酸（またはアミノ酸配列）から成り得る。
【０１３０】
当業者に公知の様々な技術は、抗体が、ポリペプチドまたはタンパク質内で、「１つ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定するために使用され得る。実例となる技術としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ）に記載されたものなどの、通常のクロスブロッキングアッセイが挙げられる。他の方法としては、アラニンスキャニング変異解析、ペプチドブロット解析（Ｒｅｉｎｅｋｅ  （２００４）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８：４４３−６３）、ペプチド切断解析結晶学的試験及びＮＭＲ分析が挙げられる。加えて、エピトープ切り出し及び抗原の化学修飾などの方法が、適用され得る（Ｔｏｍｅｒ  （２０００）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：  ４８７−４９６）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用され得る別の方法は、質量分析法により検出される水素／重水素交換である。一般に、水素／重水素交換法は、注目のタンパク質を重水素で標識化して、次いで、該抗体を、該重水素標識化タンパク質と結合させる。次に、該タンパク質／抗体複合体を、水に移動し、該抗体複合体により保護されるアミノ酸内の交換可能なプロトンが、界面の部分でないアミノ酸内の交換可能なプロトンより、遅い速度で重水素から水素へ逆交換する。結果として、タンパク質／抗体界面の部分を形成するアミノ酸は、重水素を保持し得、従って、該界面に含まれないアミノ酸と比較して、相対的により高質量を示す。該抗体の解離後、該標的タンパク質は、プロテアーゼ切断及び質量分析に付され、それにより、該抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識化残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ  （１９９９）  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７（２）：２５２−２５９；Ｅｎｇｅｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔ
ｈ  （２００１）  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７３：  ２５６Ａ−２６５Ａ参照。
【０１３１】
「エピトープ」という語は、Ｂ及び／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を表す。Ｂ細胞エピトープは、タンパク質の三次フォールディングにより並置された隣接アミノ酸または非隣接アミノ酸の両方から形成され得る。三次フォールディングにより形成されるエピトープが、通常、変性溶媒での処理で失われるのに対して、隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、変性溶媒に対する暴露で、通常、保持される。エピトープは、通常、唯一の空間立体構造内の少なくとも３個、より通常では、少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸で含む。
【０１３２】
抗原構造ベース抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても公知の修飾支援プロファイリング（ＭＡＰ）は、各抗体の、化学的または酵素的に修飾された抗原表面との結合プロファイルの類似性に従って、同じ抗原に対する大多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を分類する方法である（米国特許出願公開第２００４／０１０１９２０（その全文を参照することにより、本明細書に、特に、組み入れられるものとする）参照）。各分類は、別分類に示されたエピトープと明確に異なる、または部分的に重複しているかいずれかの唯一のエピトープに反映し得る。この技術は、特徴付けが、遺伝的に異なる抗体に焦点を当てられ得るように、遺伝的に同一な抗体を、即座に選別することを可能にする。ハイブリドーマスクリーニングに適用されるとき、ＭＡＰは、所望の特性を有するｍＡｂｓを産生するまれなハイブリドーマクローンの同定を促進し得る。ＭＡＰは、本発明の抗体を、異なるエピトープと結合する抗体の群に、分類するために使用され得る。
【０１３３】
特定の実施形態では、該抗ＧＲＥＭ１抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号５９４で例証のような不変性型で、あるいは配列番号５９５で例証の通り、もしくはそのフラグメントに組み換え製造された、ＧＲＥＭ１で例証されたいずれかの１つ以上の領域内のエピトープと結合する。特定の実施形態では、表１に示される本発明の抗体は、配列番号５９４の約位置１〜約位置２４の範囲のアミノ酸残基；または配列番号５９４の約位置２５〜約位置１８４の範囲のアミノ酸残基から成る群から選択される、少なくとも１つ以上のアミノ酸配列と相互作用する。これらの領域は、配列番号５９５に、さらに例証される。
【０１３４】
本発明は、表１中、本明細書に記載の特定の実例となる抗体、または表１に記載の実例となる抗体のいずれかのＣＤＲ配列を有する抗体のいずれかと同じエピトープ、または該エピトープの部分と結合する抗ヒトＧＲＥＭ１抗体を含む。同様に、本発明は、ＧＲＥＭ１またはＧＲＥＭ１フラグメントの、表１中、本明細書に記載の特定の実例となる抗体、または表１に記載の実例となる抗体のいずれかのＣＤＲ配列を有する抗体のいずれかとの結合で競合する抗ヒトＧＲＥＭ１抗体も含む。
【０１３５】
当分野で公知の通例の方法を用いて、抗体が、基準抗ＧＲＥＭ１抗体と同じエピトープと結合する、または結合で競合するかどうかを、容易に決定し得る。例えば、被検抗体が、本発明の基準抗ＧＲＥＭ１抗体と同じエピトープと結合するか否かを決定するため、該基準抗体は、飽和条件下、ＧＲＥＭ１タンパク質またはペプチドと結合することを可能とされる。次に、該ＧＲＥＭ１分子と結合する被検抗体の能力を、評価する。もし、被検抗体が、該基準抗ＧＲＥＭ１抗体と飽和結合後、ＧＲＥＭ１と結合可能であるならば、該被検抗体は、該基準抗ＧＲＥＭ１抗体と異なるエピトープと結合すると、結論され得る。一方、もし、被検抗体が、該基準抗ＧＲＥＭ１抗体と飽和結合後、ＧＲＥＭ１と結合可能でないならば、該被検抗体は、本発明の該基準抗ＧＲＥＭ１抗体と結合するエピトープと同じエピトープと結合し得る。
【０１３６】
抗体が、基準抗ＧＲＥＭ１抗体との結合で競合するか否かを決定するため、上記結合方
法は、２つの方向付けで実施される：１番目の方向では、該基準抗体を、飽和条件下、ＧＲＥＭ１タンパク質と結合させ、次いで、該ＧＲＥＭ１分子に対する該被検抗体の結合を評価する。２番目の方向では、該被検抗体を、飽和条件下、ＧＲＥＭ１タンパク質と結合させ、次いで、該ＧＲＥＭ１分子に対する該基準抗体の結合を評価する。もし、両方の方向で、１番目の（飽和）抗体のみが、該ＧＲＥＭ１分子と結合可能であるならば、該被検抗体及び該基準抗体は、ＧＲＥＭ１との結合で競合すると結論される。当業者には明らかなように、基準抗体との結合で競合する抗体は、該基準抗体と同一のエピトープと、必ずしも結合しなくてよく、しかし、重複するまたは隣接するエピトープとの結合により、該基準抗体の結合を、立体的にブロックし得る。
【０１３７】
もし、各々が、他方の該抗原との結合を、競合的に阻害（ブロック）するならば、２つの抗体は、同じまたは重複するエピトープと結合する。すなわち、競合結合アッセイ（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９０  ５０：１４９５−１５０２参照）で測定したとき、１つの抗体の１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍の過剰物が、少なくとも５０％、しかし好ましくは、７５％、９０％またはさらに９９％、他方の結合を阻害する。あるいは、もし、本質的に、１つの抗体の結合を減少または排除する該抗原中の全てのアミノ酸変異体が、他方の結合を減少または排除するならば、２つの抗体は、同じエピトープを有する。もし、１つの抗体の結合を減少または排除するいくつかのアミノ酸変異体が、他方の結合を減少または排除するならば、２つの抗体は、重複するエピトープを有する。
【０１３８】
それから、該被検抗体の観察の結合がないことが、事実上、該基準抗体と同じエピトープとの結合が原因であるかどうか、または立体的ブロッキング（または別の現象）が、観察の結合がないことの原因となるか否かを確認するため、追加の通例の実験方法（例えば、ペプチド変異及び結合分析）を実行する。この識別の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴法、フローサイトメトリー法、当分野で利用可能な他のいずれもの定量的または定性的抗体結合アッセイを用いて、実施され得る。
【０１３９】
免疫複合体
本発明は、線維症の重症度を減少可能である、または持続性乾性咳嗽及び／または呼吸困難、またはその重症度を含む、線維症と関連する少なくとも１つの症状を寛解するための薬剤などの、治療成分（「免疫複合体」）と結合したヒト抗ＧＲＥＭ１モノクローナル抗体を包含する。本明細書で使用されるとき、「免疫複合体」という語は、放射性医薬品、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター成分、酵素、毒素、または治療薬と、化学的または生物学的に結合している抗体を表す。該抗体は、その標的と結合可能である限り、分子に沿ったいずれかの位置で、放射性医薬品、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター成分、酵素、毒素、または治療薬と結合し得る。免疫複合体の例は、抗体薬物複合体である。いくつかの実施形態では、該薬剤は、ヒトＧＲＥＭ１、またはＩＬ−１、ＩＬ−６、もしくはＴＧＦ−βなどのケモカインなどのサイトカインに対する２番目の異なる抗体であり得る。治療成分の型は、抗ＧＲＥＭ１抗体と結合し得、治療される状態及び達成される所望の治療効果を考慮に入れるだろう。例えば、もし、所望の治療効果が、線維症関連の後遺症または症状、またはこれに限定されないが、炎症もしくは体重減少などの線維症から生じる他のいかなる状態を治療するためであるならば、該状態の後遺症もしくは症状を治療、または本発明の抗体のいかなる副作用も寛解するのに適切な薬剤を結合することは、有利であり得る。免疫複合体を形成するために適切な薬剤の例は、当分野で公知である；例えば、ＷＯ０５／１０３０８１参照。免疫複合体及び免疫毒素の製剤は、一般的に、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第４３４０５３５号参照）。免疫複合体は、例えば、米国特許第７２５０４９２号、米国特許第７４２００４０号及び米国特許第７４１１０４６号（各々は、その全文を参照することにより、本明細書に組み入れられるものとする）に、詳細に記載されている。
【０１４０】
多重特異的抗体
本発明の抗体は、単一特異的、または多重特異的であり得る。多重特異的抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であり得、または１つ以上の標的ポリペプチドに対して特異的な抗原結合性ドメインを含み得る。例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ
ａｌ．，  １９９１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：６０−６９；  Ｋｕｆｅｒ
ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２２：２３８−２４４参照。本発明の抗体は、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質と結合または同時発現され得る。例えば、抗体またはそのフラグメントは、２番目の結合特異性を有する二重特異的または多重特異的抗体を産生する別の抗体または抗体フラグメントなどの、１つ以上の他分子的実体と、機能的に結合（例えば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合または別様により）され得る。例えば、本発明は、免疫グロブリンの１つのアームが、ＧＲＥＭ１、またはそのフラグメントのＮ末端領域に対して特異的であり、該免疫グロブリンの他のアームが、ＧＲＥＭ１、または２番目の治療標的のＣ末端領域に対して特異的であり、または治療成分と結合している、二重特異性抗体を含む。本発明に関連して使用され得る実例となる二重特異性抗体フォーマットは、１番目及び２番目のＩｇＣH3ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸により、互いに異なり、少なくとも１つのアミノ酸差が、該アミノ酸差のない二重特異性抗体と比較したとき、タンパク質Ａとの該二重特異性抗体の結合を減少させる、１番目の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣH3ドメイン及び２番目のＩｇＣH3ドメインの使用を含む。１つの実施形態では、該１番目のＩｇＣH3ドメインは、タンパク質Ａと結合し、該２番目のＩｇＣH3ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）などのタンパク質Ａ結合を減少または無効にする変異を含む。該２番目のＣH3は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含み得る。該２番目のＣH3内で見られ得るさらなる修飾としては：ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２Ｉ）；及びＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ）が挙げられる。上記該二重特異性抗体フォーマットの変異体は、本発明の範囲内と考えられる。
【０１４１】
本発明との関連で、使用され得る他の実例となる二重特異性フォーマットとしては、例えば、ｓｃＦｖベースまたは二重特異性抗体二重特異性フォーマット、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、クアドローマ、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ、共通軽鎖（例えば、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ、他を有する共通軽鎖）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ｂｏｄｙ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ、及びＭａｂ2
二重特異性フォーマットが挙げられるが、これに限定されない（例えば、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２，  ｍＡｂｓ  ４：６，  １−１１、及び前述のフォーマットの概説のため、その中で引用された参考文献）。二重特異性抗体は、例えば、直交性化学反応を有する不自然なアミノ酸が、部位特異的抗体−オリゴヌクレオオチド複合体を産生し、それから、確定した組成、結合価及び配置を有する多量体複合体に自己集合するため使用される、ペプチド／核酸複合化を用いても、構築され得る（例えば、Ｋａｚａｎｅ  ｅｔ
ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ［Ｅｐｕｂ：  Ｄｅｃ．  ４，  ２０１２］参照）。
【０１４２】
治療薬投与及び処方物
本発明は、本発明の抗ＧＲＥＭ１抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む治療用
組成物を提供する。本発明に従った治療用組成物の投与は、適切な担体、賦形剤、及び、移動、送達、耐性等を改良するため、処方物中に混合される他の薬剤と一緒に、投与されるだろう。多数の処方物は、全ての薬剤師に公知の処方中に見られ得る：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ。これらの処方物としては、例えば、散剤、ペースト剤、軟膏剤、ゼリー剤、ワックス剤、油剤、脂質、小胞（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）を含む脂質（カチオン性またはアニオン性）、ＤＮＡ複合体、無水吸収ペースト剤、水中油型及び油中水型乳剤、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール類）、半固体ゲル剤、及びカーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”  ＰＤＡ  （１９９８）  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８−３１１も参照。
【０１４３】
抗体の用量は、投与される対象の年齢及び大きさ、標的の疾病、状態、投与経路等に依存して異なり得る。本発明の抗体が、成人患者の線維症治療のため、または肺高血圧症の治療のため、該疾病の重症度を和らげるため、使用されるとき、通常、約０．１〜約１００ｍｇ／体重ｋｇ、より好ましくは、約５〜約１００、約１０〜約９０、または約２０〜約７０ｍｇ／体重ｋｇの単一用量で、本発明の抗体を静脈内投与するのが有利である。病状の重症度に依存して、治療の頻度及び期間は、調節され得る。特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、少なくとも、約０．１ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、約５ｍｇ〜約３００ｍｇ、または約１０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１００ｍｇ、もしくは約５０ｍｇの初期用量として、投与され得る。特定の実施形態では、該初期用量に次いで、おおよそ、該初期用量と同じまたはより少なくあり得る量で、該抗体またはその抗原結合性フラグメントの２番目のまたは複数の引き続く用量を投与し、該引き続く用量は、少なくとも１日〜３日；少なくとも１週間、少なくとも２週間；少なくとも３週間；少なくとも４週間；少なくとも５週間；少なくとも６週間；少なくとも７週間；少なくとも８週間；少なくとも９週間；少なくとも１０週間；少なくとも１２週間；または少なくとも１４週間の間隔をおかれる。
【０１４４】
様々な送達系は、公知であり、本発明の医薬組成物を投与するため、使用され得、例えば、リポソーム中にカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現可能な組み換え細胞、受容体依存性エンドサイトーシスがある（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２：４４２９−４４３２参照）。導入方法としては、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外及び経口経路が挙げられるが、これに限定されない。該組成物は、いずれの従来の経路でも、例えば、点滴もしくはボーラス注入により、上皮層もしくは粘膜皮膚層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜、他）を経由した吸収により、投与され得、他の生物活性剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。該医薬組成物は、媒体で、特に、リポソームでも送達され得る（例えば、Ｌａｎｇｅｒ  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３参照）。
【０１４５】
本発明の抗体を送達するためのナノ粒子の使用は、本明細書でも、考えられる。抗体結合ナノ粒子は、治療用途及び診断用途の両方で使用され得る。抗体結合ナノ粒子及び製造方法及び使用は、Ａｒｒｕｅｂｏ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００９（Ｊ．  Ｎａｎｏｍａｔ．  Ｖｏｌｕｍｅ  ２００９中の「生物医学用途の抗体結合ナノ粒子」、記事ＩＤ４３９３８９、２４頁、ｄｏｉ：１０．１１５５／２００９／４３９３８９）に、詳細に説明されており、参照することにより、本明細書に組み入れられるものとする。薬剤送達用ナノ粒子は、例えば、米国特許第８２７７８１２号、米国特許第８２５８２５６号、米国特許第８２５７７４０号、米国特許第８２４６９９５号、米国特許第８２３６３３０号
（各々は、その全文を参照することにより、本明細書に組み入れられるものとする）にも、説明されている。
【０１４６】
特定の状況では、該医薬組成物は、放出制御系で送達され得る。１つの実施形態では、ポンプが使用され得る。別の実施形態では、ポリマー材料が、使用され得る。さらに別の実施形態では、放出制御系は、該組成物の標的に近接して配置され得、従って、全身用量の画分のみ必要とする。
【０１４７】
注射可能な製剤は、静脈内、皮下、皮内及び筋肉内注射、点滴、その他用の剤形を含み得る。これらの注射可能な製剤は、公知の方法により、製剤され得る。例えば、従来、注射用に使用される該注射可能な製剤は、例えば、無菌水性媒体または油性媒体中に、上記該抗体またはその塩を溶解、懸濁または乳化することにより、製剤され得る。注射用水性媒体として、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の補助剤、その他を含む等張液があり、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物）］、その他などの適切な溶解剤と組み合わせて使用され得る。該油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油、その他が使用され、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール、その他などの溶解剤と組み合わせて使用され得る。従って、製剤される該注射剤は、好ましくは、適切なアンプル中に充填される。
【０１４８】
本発明の医薬組成物は、標準的な針及び注射器を用いて、皮下または静脈内に送達され得る。加えて、皮下送達に関して、ペン型送達器具が、本発明の医薬組成物を送達するのに容易に適用される。かかるペン型送達器具は、再使用可能または使い捨てであり得る。再使用可能なペン型送達器具は、一般に、医薬組成物を含む交換可能なカートリッジを利用する。一旦、該カートリッジ内の全ての医薬組成物が投与され、該カートリッジが空になれば、該空のカートリッジは、容易に廃棄されて、該医薬組成物を含む新しいカートリッジと交換され得る。そうして、該ペン型送達器具は、再利用され得る。使い捨てのペン型送達器具では、交換可能なカートリッジはない。むしろ、該使い捨てペン型送達器具は、該器具内のレザーバー中に保持された該医薬組成物で、前以て充填される。一旦、該レザーバーは、該医薬組成物が空になれば、器具全体が、廃棄される。
【０１４９】
多数の再利用可能なペン型及び自動注入型送達器具は、本発明の医薬組成物の皮下送達で、適用される。例としては、用例は少なくなるが、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ
Ｍｕｍｆｏｒｄ，  Ｉｎｃ．，英国ウッドストック）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、スイス国ブルクドルフ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、インディアナ州インディアナポリス）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国コペンハーゲン）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国コペンハーゲン）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ、ドイツ国フランクフルト）が挙げられ、必ずしもこれに限定されない。本発明の医薬組成物の皮下送達に適用される使い捨てペン型送達器具の例としては、用例は少なくなるが、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ａｍｇｅｎ、カナダ国サザンオークス）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒドイツ国シュトゥットガルト）、ＥＰ
ＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，  Ｌ．Ｐ．）及びＨＵＭＩＲＡ（商標）Ｐｅｎ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ、イリノイ州アボットパーク）が挙げられ、必ずしも、これに限定されない。
【０１５０】
有利に、上記経口または非経口用該医薬組成物は、活性成分の用量に適合するため適切な単位用量での剤形に製剤される。単位用量でのかかる剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル剤）、坐剤、その他が挙げられる。含有される前述の抗体の量は、一般に、単位用量での剤形当たり、約５〜約５００ｍｇ；特に、注射剤の形態では、前述の抗体は、約５〜約１００ｍｇ、他の剤形では、約１０〜約２５０ｍｇで、含まれることが好ましい。
【０１５１】
抗体の治療使用
本発明の特定の実施形態では、本抗体は、線維症に関連する疾病または病態、または持続性咳嗽、息切れ、体重減少もしくは食欲不振などの少なくとも１つの症状を治療するため、または該疾病の重症度を和らげるために有用である。いくつかの実施形態では、該抗体は、該疾病の後期において、線維症の状態または症状を治療するため有用である。本発明の抗体は、線維症を発症するリスクのある患者の予防的使用のためも考えられる。これらの患者としては、高齢者、または家族が病歴を有する患者、または病気もしくは免疫抑制薬での治療が原因の免疫不全患者、または線維症に罹りやすくする糖尿病などの根底にある病状を有し得る患者、または喫煙またはアルコール中毒などの生活様式の選択肢が原因で、線維症に罹りやすくなり得る患者が挙げられる。本発明の抗体は、単独で、または線維症を治療、または線維症に関連したもしくは原因の腎機能もしくは肝機能の喪失などの、線維症に関連した少なくとも１つの症状もしくは合併症を緩和するため、２番目の薬剤または３番目の薬剤と併用して使用され得ると考えられる。該２番目または３番目の薬剤は、本発明の抗体と同時に送達され得、またはそれらは、本発明の抗体の前または後のいずれかで、別々に投与され得る。
【０１５２】
線維症障害の症状としては、乾式咳嗽、呼吸困難、食欲不振、体重減少、疲労、吐き気、腫脹及び体液貯留、肝障害、肝不全、高血圧症、及び腎機能喪失が挙げられるが、これに限定されない。他の徴候または症状としては、倦怠感、睡眠不足、または肺炎もしくは尿路感染症、高血糖症、及びタンパク尿症などの合併症が挙げられるが、これに限定されない。本発明の抗体は、上記列挙の１つ以上の症状または状態の重症度を、軽減または予防または減少するため、使用され得る。
【０１５３】
特定の実施形態では、本抗体は、これに限定されないが、肺、卵巣、腎臓、乳房、結腸、膵臓及び子宮頚部の肉腫または癌腫を含むがんと関連する状態または徴候を治療するのに有用である。
【０１５４】
特定の実施形態では、本発明の１つ以上の抗体は、単独または、ヘパリン及び／またはヘパリン介在血管新生と結合するＧＲＥＭ１のブロックと併用して使用され得る。
【０１５５】
本発明のさらなる実施形態では、本抗体は、線維症またはがん、または線維症もしくはがんと関連する症状に患っている患者を治療するため、医薬組成物の製剤のため使用される。本発明のさらに別の実施形態では、本抗体は、組織損傷の減少、または進行性変性症を予防、または線維症での腎機能もしくは肝機能の保護のための医薬組成物の製剤のため使用される。本発明の１つの実施形態では、本抗体は、鎮痛剤、ＮＳＡＩＤ、抗腫瘍薬、化学療法、放射線療法、グルココルチコイド、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト［例えば、アフリベルセプトなどの「ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ」または米国特許第７，０８７，４１１号に記載の他のＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または抗ＶＥＧＦ抗体もしくはその抗原結合性フラグメント（例えば、ベバシズマブ、またはラニビズマブ）］、ＧＲＥＭ１に対する第二抗体、ＧＲＥＭ２またはＩＬ−１、ＩＬ−６、もしくはＴＧＦ−βな
どの炎症性サイトカインに対する抗体、または当業者に公知の他のいずれもの対症療法を含む、線維症またはがんを治療するために有用な他のいずれもの薬剤を用いた、補助療法として使用される。
【０１５６】
併用療法
併用療法は、本発明の抗ＧＲＥＭ１抗体及び本発明の抗体と、または本発明の抗体の生理活性フラグメントと、有利に併用され得るいずれかの追加の治療薬を含み得る。
【０１５７】
例えば、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）または鎮痛剤などの２番目または３番目の治療薬は、乾式咳嗽または呼吸困難などの線維症の症状を軽減に役立つため、使用され得る。通常の鎮痛剤の例は、アセトアミノフェンである。実例となるＮＳＡＩＤとしては、アスピリン、イブプロフェン、及びナプロキセンが挙げられる。追加の治療薬は、尿路感染症などの合併症を治療するための抗生物質であり得る。本発明の抗体は、線維症の発症を遅らせるための降圧薬と併用され得る。例えば、糖尿病性腎症に患っている患者のため、該抗体は、血圧低下及び腎機能保護のため、アンジオテンシン変換酵素阻害剤などの治療と併用され得る。
【０１５８】
該抗体は、線維症治療で、コルチコステロイド剤または栄養補給剤など他の治療薬と併用して、使用され得る。ピルフェニドンなどの抗線維化剤は、持続する無症候性寛解を得て、線維症の進行を遅延または停止することの両方であることが分かった。これは、かかる損傷が、通常、不可逆であるとき、重要である。抗炎症薬及び鎮痛薬が、痛みを改善するが、組織損傷の予防も、該疾病進行の遅延もしない。いくつかの実施形態では、２番目または３番目の治療薬は、線維性組織損傷の予防だけでなく、吐き気及び腫脹などの臨床症状を最小化するために使用され得る。追加の治療薬は、コルチゾン療法、例えば、プレドニゾンまたはプレドニソロンの低用量は、線維症に対する長期治療プランで、本発明の１つ以上の抗体と併用して、使用され得る。線維症治療で、ＩＬ−１、ＩＬ−６、またはＴＧＦ−βなどのサイトカインを対象にする１つ以上の抗体の使用も、本発明の範囲内と認識される。本発明の抗体は、尿路感染症、高血糖症または血圧などの合併症を最小化または予防するため、追加の治療薬と併用され得る。
【０１５９】
本発明の抗体は、理学療法、生活様式変更（運動及び体重制御を含む）、肺リハビリテーション、酸素療法、及び食事変更を含む、線維症に対する他の治療法の選択肢と併用しても、投与され得る。肝臓、肺または腎臓の移植手術は、線維症の進行型では、必要となり得る。
【０１６０】
本発明の抗体は、１つ以上の抗がん剤またはがん治療のため使用される療法と一緒に、相乗的に併用され得る。抗がん剤及び使用され得る療法の例としては、細胞毒、化学療法剤、放射線照射及び手術が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の１つ以上の抗体は、抗炎症薬（例えば、コルチコステロイド剤、及び非ステロイド系抗炎症剤）、腫瘍特異的抗原に対する抗体（例えば、ＣＡ９、ＣＡ１２５、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、ビメンチン、腫瘍−Ｍ２−ＰＫ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＭＡＲＴ−１、及びＣＡ１９−９）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト［例えば、アフリベルセプトなどの「ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ」または米国特許第７，０８７，４１１号に記載の他のＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または抗ＶＥＧＦ抗体もしくはその抗原結合性フラグメント（例えば、ベバシズマブ、またはラニビズマブ）］、抗酸化剤などの栄養補助食品またはがん治療の対症療法と併用して使用され得る。
【０１６１】
追加の治療活性成分は、本発明の該抗ＧＲＥＭ１抗体の投与の前、同時に、または後に投与され得る。本開示の目的のため、かかる投与計画は、２番目の治療活性成分「と併用
した」抗ＧＲＥＭ１抗体の投与と見なされる。
【０１６２】
抗体の診断使用
本発明の抗ＧＲＥＭ１抗体は、例えば、診断目的のため、試料中のＧＲＥＭ１を検出及び／または測定するためにも、使用され得る。本発明のいずれか１つ以上の抗体は、線維症での組織損傷の重症度を検出するため使用され得ることが想定される。ＧＲＥＭ１に対する実例となる診断アッセイは、患者から得られる試料を、例えば、該抗ＧＲＥＭ１抗体が、検出可能な標識もしくはレポーター分子で標識化、または患者試料から、ＧＲＥＭ１を選択的に単離するため捕捉リガンドとして使用される、本発明の抗ＧＲＥＭ１抗体と接触させることを含み得る。あるいは、標識化していない抗ＧＲＥＭ１抗体は、それ自体検出可能に標識化されている二次抗体と組み合わせて、診断用途に使用され得る。該検出可能標識またはレポーター分子は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、または125Ｉなどの放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアネート、またはローダミンなどの蛍光もしくは化学発光部分；またはアルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。試料中のＧＲＥＭ１を検出または測定するため、使用され得る具体的実例となるアッセイとしては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫学的検定（ＲＩＡ）、及び蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０１６３】
本発明に従ったＧＲＥＭ１診断アッセイで使用され得る試料としては、正常または病的状態下、ＧＲＥＭ１タンパク質またはそのフラグメントのいずれかの検出可能な量を含む、患者から入手可能ないずれもの組織または液状試料が挙げられる。一般に、健康な患者（例えば、線維症を患っていない患者）から得られる特定の試料中のＧＲＥＭ１のレベルは、最初に、ベースライン、またはＧＲＥＭ１の標準レベルを確立するため、測定されるだろう。それから、ＧＲＥＭ１のこのベースラインレベルは、線維症関連状態、またはかかる状態と関連する症状を有する疑いのある個体から得られる試料中で測定されたＧＲＥＭ１のレベルに対して、比較され得る。
【０１６４】
ＧＲＥＭ１に対して特異的抗体は、追加の標識も部分も含まなくてもよく、またはそれらは、Ｎ末端またはＣ末端標識または部分を含み得る。１つの実施形態では、該標識または部分は、ビオチンである。結合アッセイでは、標識の位置は、（たとえあったにしても）該ペプチドが結合する表面に対して、該ペプチドの配向を決定し得る。例えば、もし、表面が、アビジンでコートされているならば、Ｎ末端ビオチンを含むペプチドは、該ペプチドのＣ末端部分が、該表面に対して遠位側になるように、配向されるだろう。いくつかの実施形態では、該標識は、放射性核種、蛍光色素またはＭＲＩ検出可能標識などの検出可能な標識であり得る。検出可能な標識は、かかる抗体が、イメージングアッセイで使用され得る、該抗体と結合され得る。イメージングアッセイを用いる方法は、線維症診断及び予後、または線維性活性のモニターに有用であり得る。
【０１６５】
本発明の態様は、患者の線維症の予後を予測するためのマーカーとして、開示の抗体の使用に関する。ＧＲＥＭ１は、例えば、肺または肝臓または腎臓の線維性組織で上方制御されることが分かった。ＧＲＥＭ１レベルの上昇は、糖尿病性腎症または肺高血圧症に相関があり、患者の予後の評価のため使用され得るはずである。本発明の抗体は、患者の線維症の予後を評価及び生存期間の予測するための診断アッセイで使用され得る。
【実施例】
【０１６６】
以下の実施例は、当業者に、本発明の方法及び組成物の作製法及び使用法の完全な開示及び説明を提供するために記載され、本発明者が発明と見なすものの範囲を限定することを意図したものではない。使用される数字（例えば、量、温度等）に関する正確さを確実にする努力はなされているが、いくらかの実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。特
に指示しない限り、部は重量部、分子量は平均分子量、温度は摂氏温度、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
【０１６７】
実施例１．  ヒトＧＲＥＭ１に対するヒト抗体の作製
ある実施形態では、免疫原はヒトＧＲＥＭ１のＮ末端またはＣ末端由来のペプチドであり得る。本発明の特定の実施形態では、免疫原は、配列番号５９４のおよそのアミノ酸残基２５〜１８４の範囲のヒトＧＲＥＭ１の成熟タンパク質である。一実施形態では、本発明の抗体は、完全長組換えヒトＧＲＥＭ１で免疫したマウスから得た。
【０１６８】
ある実施形態では、ヒトＧＲＥＭ１に特異的に結合する抗体は、上記領域のフラグメント、または本明細書に記載の領域のＮ末端もしくはＣ末端の一方もしくは両方から約５〜約２０アミノ酸残基だけ指定領域を超過するペプチドを用いて作製され得る。ある実施形態では、上記領域またはそのフラグメントのいかなる組み合わせも、ＧＲＥＭ１特異的抗体の作製に使用され得る。ある実施形態では、ｈＧＲＥＭ１の上記ドメインまたはそのフラグメントのうちのいずれか一つまたは複数が、単一特異性抗体、二重特異性抗体、または多重特異的抗体の作製に使用され得る（詳細については以下の実施例８を参照）。
【０１６９】
上記のように免疫原として使用した完全長タンパク質またはそのフラグメントは、ヒト免疫グロブリンの重鎖及びκ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに、免疫応答を刺激するためのアジュバントと共に、直接投与した。ＧＲＥＭ１特異的免疫学的検定によって抗体免疫応答をモニタリングした。所望の免疫応答が達成されたら、脾細胞を回収し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、それらの生存を保護し、ハイブリドーマ細胞株を形成させた。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニング及び選択して、ＧＲＥＭ１特異的抗体を産生する細胞株を特定した。この技法及び上記の種々の免疫原を用いて、いくつかの抗ＧＲＥＭ１抗体、並びに交差反応性キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメイン及びマウス定常ドメインを有する抗体）を作製し；このように作製した例示的な抗体を、Ｈ１Ｍ２９０７Ｎ、Ｈ２Ｍ２７８０Ｎ、Ｈ２Ｍ２７８２Ｎ、Ｈ２Ｍ２７８３Ｎ、Ｈ４Ｈ２７８３Ｎ２、Ｈ２Ｍ２７８４Ｎ、Ｈ２Ｍ２７８５Ｎ、Ｈ２Ｍ２７８６Ｎ、Ｈ２Ｍ２８８９Ｎ、Ｈ２Ｍ２８９０Ｎ、Ｈ２Ｍ２８９１Ｎ、Ｈ２Ｍ２８９２Ｎ、Ｈ２Ｍ２８９５Ｎ、Ｈ２Ｍ２８９７Ｎ、Ｈ２Ｍ２８９８Ｎ、Ｈ２Ｍ２８９９Ｎ、Ｈ２Ｍ２９０１Ｎ、Ｈ２Ｍ２９０６Ｎ、Ｈ２Ｍ２９２６Ｎ、Ｈ３Ｍ２７８８Ｎ、及びＨ３Ｍ２９２９Ｎと称した。
【０１７０】
また、Ｕ．Ｓ．２００７／０２８０９４５Ａ１（その全体が参照によって本明細書に具体的に組み込まれる）に記載されるように、抗ＧＲＥＭ１抗体を、骨髄腫細胞との融合無しで、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離した。この方法を用いて、いくつかの完全ヒト抗ＧＲＥＭ１抗体（すなわち、ヒト可変ドメイン及びヒト定常ドメインを有する抗体）を得て；このように作製した例示的な抗体を以下のように称した：Ｈ４Ｈ６２３２Ｐ、Ｈ４Ｈ６２３３Ｐ、Ｈ４Ｈ６２３６Ｐ、Ｈ４Ｈ６２３８Ｐ、Ｈ４Ｈ６２４０Ｐ、Ｈ４Ｈ６２４３Ｐ、Ｈ４Ｈ６２４５Ｐ、Ｈ４Ｈ６２４６Ｐ、Ｈ４Ｈ６２４８Ｐ、Ｈ４Ｈ６２５０Ｐ、Ｈ４Ｈ６２５１Ｐ、Ｈ４Ｈ６２５２Ｓ、Ｈ４Ｈ６２５６Ｐ、Ｈ４Ｈ６２６０Ｐ、Ｈ４Ｈ６２６９Ｐ、及びＨ４Ｈ６２７０Ｐ。
【０１７１】
本実施例の方法に従って作製した例示的な抗体の生物学的特性を、以下に記載する実施例において詳細に記載する。
【０１７２】
実施例２．  重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列
表１は、ヒトＧＲＥＭ１に特異的な選択された抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列対及びそれらに対応する抗体識別子を記載している。抗体は通常、本明細書において以下の命名法に従って称される：Ｆｃ接頭辞（例えば「Ｈ４Ｈ」、「Ｈ１Ｍ、「
Ｈ２Ｍ」）、続いて、数字による識別子（例えば表１に示すような「２９０７」）、続いて、「Ｐ」または「Ｎ」の接尾語。従って、この命名法によれば、ある抗体は例えば「Ｈ１Ｈ２９０７」と称され得る。本明細書で使用される抗体名の接頭辞Ｈ４Ｈ、Ｈ１Ｍ、及びＨ２Ｍは、その抗体の特定のＦｃ領域を表す。例えば、「Ｈ２Ｍ」抗体はマウスＩｇＧ２Ｆｃを有しており、一方、「Ｈ４Ｈ」抗体はヒトＩｇＧ４Ｆｃを有している。当業者には理解されることであるが、Ｈ１Ｍ抗体またはＨ２Ｍ抗体はＨ４Ｈ抗体に変換することができ、逆の場合も同じであるが、いずれにしても、表１に示される数字による識別子によって表される可変ドメイン（例えば、ＣＤＲ）は同じままである。同一の数字抗体名を有するが、Ｎ、ＢまたはＰという文字接尾語が異なる抗体は、同一のＣＤＲ配列を有するが、前記ＣＤＲ配列の範囲外である領域（すなわち、フレームワーク領域）内に配列多様性を有する重鎖及び軽鎖を有する抗体を指す。従って、特定の抗体のＮ、Ｂ及びＰ変異形は、それらの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域内に同一のＣＤＲ配列を有するが、それらのフレームワーク領域内で互いに異なっている。
【０１７３】
【表２】
2019151654.tif 000005
【０１７４】
実施例３．  バリアブル遺伝子利用解析
産生された抗体の構造を解析するために、抗体可変領域をコードする核酸をクローニングし配列決定した。抗体の核酸配列及び予測アミノ酸配列から、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）それぞれについての遺伝子使用を特定した。表２は、本発明に基づいて選択された抗体についての遺伝子使用を記載している。
【０１７５】
【表３】
2019151654.tif 000006
【０１７６】
実施例４．  表面プラズモン共鳴によって決定されるヒトＧＲＥＭ１への抗体結合
精製抗グレムリン１（ＧＲＥＭ１）抗体への抗原結合についての、結合の結合速度定数及び解離速度定数（それぞれｋa及びｋd）、並びに算出された平衡解離定数及び解離半減期（それぞれＫD及びｔ1/2）を、２５℃及び３７℃で、リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００）アッセイを用いて決定した。
【０１７７】
抗ＧＲＥＭ１抗体を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５センサーチップへの直接的アミン結合によって作製されたヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ＧＥヘルスケア社、＃ＢＲ−１００８−３８）表面またはマウス抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体（ＧＥヘルスケア社、＃ＢＲ−１００８−３９）表面のいずれかに捕捉した。ランニングバッファー及び試料用バッファーの両方としてＨＢＳ−ＥＰ＋ヘパリン［１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０、１０μｇ／ｍｌヘパリンナトリウム塩、ｐＨ７．４］を用いて、速度実験を行った。種々の濃度（１１〜１００ｎＭの範囲、３倍希釈）のヒトＧＲＥＭ１（ｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓ；配列番号５９５）を、捕捉された抗ＧＲＥＭ１抗体表面上に注入することにより、抗原抗体結合速度を測定した。抗原抗体結合を１５０秒間モニタリングし、一方、緩衝液中の解離を４２０秒間モニタリングした。Ｓｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア（バージョン２．０ａ）またはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価用ソフトウェア（ｖ１．０）を用いて速度解析を行い、ｋa
値及びｋd値を決定した。次に、ＫD及びｔ1/2を、ＫD＝ｋd／ｋaとして、及びｔ1/2＝ｌ
ｎ（２）／ｋdとして、実験的に決定したｋa値及びｋd値から算出した。
【０１７８】
表３に示されるように、３５種の抗ＧＲＥＭ１抗体が、Ｂｉａｃｏｒｅセンサー上に捕捉された際に、２５℃で前記表面上に注入されたｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓタンパク質に対する結合を示し、ＫD値は６２５ｐＭ〜２７０ｎＭの範囲であった。前記試験抗体のうち２
種（Ｈ２ａＭ２８９８Ｎ及びＨ２ｂＭ２７８５Ｎ）は、これらの実験条件下ではｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓと結合しなかった。前記３７種の抗ＧＲＥＭ１抗体の一部を３７℃において再度試験した。表４に示されるように、２４種の抗ＧＲＥＭ１抗体が、Ｂｉａｃｏｒｅセンサー上に捕捉された際に、３７℃で前記表面上に注入されたｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓタンパク質に対する結合を示し、ＫD値は１．２３ｎＭ〜２７５ｎＭの範囲であった。
【０１７９】
【表４】
2019151654.tif 000007
【０１８０】
【表５】
2019151654.tif 000008
【０１８１】
実施例５．  抗ｈＧＲＥＭ１抗体のＧＲＥＭ１阻害活性の決定
抗ヒトグレムリン１（ＧＲＥＭ１）抗体をさらに特徴付けるため、ＧＲＥＭ１がヒト骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）に結合することを阻止する前記抗体の能力をＥＬＩＳＡで調べた。プレートを組換えヒトＢＭＰ４（２ｕｇ／ｍＬ）（ｈＢＭＰ４；Ｒ＆Ｄ、＃３１４−ＢＰ／ＣＦ、受入番号Ｑ５３ＸＣ５の残基Ｓ２９３〜Ｒ４０８、ＮＳ０細胞で発現）で一晩コートし、次に、抗体の連続希釈物を一定量（１００ｐＭ）のビオチンタグ修飾組換えヒトＧＲＥＭ１タンパク質（ｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓ；配列番号５９５）と一緒に２５℃で１時間インキュベートした後、この複合体をコートされたプレートに加え、２５℃でさらに１時間インキュベートした。次に、プレートを洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ結合型ストレプトアビジン（ピアス社、＃Ｎ２００）を用いてプレートに結合したビオチン−ｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓを検出した。次に、プレートをＴＭＢ溶液（ＢＤバイオサイエンス社、＃５５５２１４）で発色させて比色反応を起こし、その反応を硫酸を用いた酸性化によりクエンチし、その後、パーキンエルマー社製ＶｉｃｔｏｒＸ５プレートリーダー上で４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェア内のＳ字形用量反応モデルを用いてデータを分析した。最大阻害の５０％を達成するのに必要な抗体
濃度と定義される、算出したＩＣ50値を、阻害能の指標として用いた。いくつかの試料のＩＣ50値が２．５Ｅ−１１Ｍという一定の下界値で報告されているが、これは、固定濃度のビオチン−ｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓがアッセイに使用されたことを考慮すると、このアッセイの理論上の下限である。阻害率は、ＧＲＥＭ１単独によるシグナルとバックグラウンド（ＨＲＰ結合型二次抗体単独からのシグナル）との間の差に対する、抗体存在下で観察されたシグナルの減少の比として算出した。一定濃度の１００ｐＭビオチン−ｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓ単独について測定された吸光度は０％阻害と定義され、ＧＲＥＭ１添加無しについて測定された吸光度は１００％阻害と定義される。各抗体について最高濃度を含有するウェルの吸光度値を用いて、最大阻害率を決定した。本アッセイで試験された２４種全ての抗ＧＲＥＭ１抗体は、ビオチン−ｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓを２５ｐＭ超〜１．９ｎＭの範囲のＩＣ50値で阻害した。２０ｎＭの抗体濃度において、前記２４種の抗体は、ビオチン−ｈＧＲＥＭ１−ＨｉｓのｈＢＭＰ４への結合を４２〜９６％阻害した。
【０１８２】
【表６】
2019151654.tif 000009
【０１８３】
実施例６．  ＢＭＰ４シグナル伝達に対するＧＲＥＭ１の影響
グレムリン１（ＧＲＥＭ１）は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の負の制御因子である（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）。ＢＭＰはＴＧＦ−βスーパーファミリーに属し、胚発生及び生後発達の間の増殖、分化、及び細胞運命決定を含む、多くの生理的過程の制御に関与している（Ｈｏｇａｎ，  １９９６）。ＢＭＰ受容体の活性化は、ＳＭＡＤタンパク質のリン酸化及びＢＭＰ応答性遺伝子の転写活性化をもたらす。ＧＲＥＭ１はＢＭＰ２、ＢＭＰ４、及びＢＭＰ７に結合し、それらの受容体への結合を阻害する。ＢＭＰ２応答性であることが以前に示された（Ｔｈｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２）哺乳類細胞株、Ｗ−２０−１７マウス骨髄間質細胞株における、ＧＲＥＭ１によるＢＭＰ４シグナル伝達の制御を検出するための、バイオアッセイを開発した。この細胞株を、Ｂ
ＭＰ応答性ルシフェラーゼレポーターを安定に発現するよう改変した。得られた安定細胞株（Ｗ−２０−１７／ＢＲＥ−ｌｕｃ細胞）を単離し、１０％ウシ胎児血清、ＤＭＥＭ、ＮＥＡＡ、ペニシリン／ストレプトマイシン、及び２００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８中に維持した。
【０１８４】
バイオアッセイにおいて、Ｗ−２０−１７／ＢＲＥ−ｌｕｃ細胞を９６ウェルアッセイプレート上に１０，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベ
ートした。次の日、組換えヒトＢＭＰ４（ｈＢＭＰ４；Ｒ＆Ｄ、＃３１４−ＢＰ／ＣＦ、受入番号Ｑ５３ＸＣ５の残基Ｓ２９３〜Ｒ４０８、ＮＳ０細胞で発現）を、用量反応のために１００ｎＭから始めて０．００２ｎＭまで（ｈＢＭＰ４無しの対照も含む）、１：３で段階希釈し細胞に添加した。ＧＲＥＭ１によるｈＢＭＰ４の阻害において、組換えヒトＧＲＥＭ１（ｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓ；Ｃ末端１０Ｈｉｓタグ付、Ｒ＆Ｄ、＃５１９０−ＧＲ、受入番号Ｏ６０５６５の残基Ｋ２５〜Ｄ１８４、ＮＳ０細胞で発現）を４００ｎＭから始めて０．４ｎＭまで（ｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓ無しの対照も含む）１：２で段階希釈し、２００ｐＭまたは１００ｐＭのｈＢＭＰ４と共に細胞に添加した。ｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓの阻害において、抗体を１００ｎＭから始めて０．００２ｎＭまで（抗体無しの対照も含む）１：３で段階希釈し、それぞれ２００ｐＭ及び２０ｎＭまたは１００ｐＭ及び１０ｎＭの最終濃度のｈＢＭＰ４及びｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓと共に細胞に添加した。３７℃、５％ＣＯ2でのインキュベーションの５．５時間後にルシフェラーゼ活性を検出した。
【０１８５】
Ｗ−２０−１７／ＢＲＥ−ｌｕｃバイオアッセイにおいて試験された３６種中３４種の抗ＧＲＥＭ１抗体が、１０ｎＭ  ｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓ及び１００ｐＭ  ｈＢＭＰ４または２０ｎＭ  ｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓ及び２００ｐＭ  ｈＢＭＰ４におけるｈＧＲＥＭ１−ＨｉｓによるｈＢＭＰシグナル伝達阻害を完全に阻害した。ある抗体Ｈ４Ｈ２７８０ＮはｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓの部分的な阻害を示し、別の抗体Ｈ４Ｈ６２６９ＰはｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓを阻害しなかった。アイソタイプ対照抗体（対照ｍＡｂ１及び対照ｍＡｂ２）も含まれた。ＩＣ50値を表６及び表７に示す。ｈＢＭＰ４は３９〜１１６ｐＭのＥＣ50値でＷ−２０−１７／ＢＲＥ−ｌｕｃ細胞を活性化した。ｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓは１０．３ｎＭのＩＣ50値で２００ｐＭ  ｈＢＭＰ４を阻害し、２．９〜６．０ｎＭのＩＣ50値で１００ｐＭ  ｈＢＭＰ４を阻害した。
【０１８６】
【表７】
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【０１８７】
【表８】
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【０１８８】
実施例７．  ＢＭＰシグナル伝達及び細胞分化に対する抗ＧＲＥＭ１の影響
抗ヒトグレムリン１（ＧＲＥＭ１）抗体の作用強度を決定するため、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）シグナル伝達のＧＲＥＭ１誘導性阻害を阻害するそれらの能力を調べた。Ｗ−２０−１７細胞は骨芽細胞の前駆細胞株であり、ＢＭＰ４シグナル伝達に応答して分化することができる。公知のＢＭＰ阻害剤であるＧＲＥＭ１はこの分化を阻害する。ＧＲＥＭ１の阻害は本アッセイではＢＭＰ４阻害の逆転をもたらす。分化は、基質を用いて骨芽細胞分化の初期マーカーであるアルカリホスファターゼの内因性発現を検出することによる比色測定で測定することができる。合計２４種の抗ＧＲＥＭ１抗体を試験した。
【０１８９】
Ｗ−２０−１７細胞を、ＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清／グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン（完全培地）中、３７℃５％ＣＯ2で、１００％の培養密度に増殖させ
た。細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理（ＥＤＴＡ含有トリプシン）し、透明なプラスチック製９６ウェルプレートに３０００細胞／ウェルで播種し、１００ｕＬ／ウェルの量の完全培地中で一晩増殖させた。次の日、組換えヒトＧＲＥＭ１タンパク質（ｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓ；Ｃ末端１０Ｈｉｓタグ付、Ｒ＆Ｄ、＃５１９０−ＧＲ、受入番号Ｏ６０５６５の残基Ｋ２５〜Ｄ１８４、ＮＳ０細胞で発現）を完全培地中で抗ＧＲＥＭ１抗体と混合し、室温で（ＲＴ）４０分間インキュベートした。また、完全培地中で希釈した組換えヒトＢＭＰ４（ｈＢＭＰ４；Ｒ＆Ｄ、＃３１４−ＢＰ／ＣＦ、受入番号Ｑ５３ＸＣ５の残基Ｓ２９３〜Ｒ４０８、ＮＳ０細胞で発現）を、ｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓ／ＧＲＥＭ１抗体混合物に加えた後、室温でさらに３０分間インキュベートした。インキュベーション後、５０ｕＬのこれらの混合物を、１００ｕＬの完全培地中に播種されたＷ−２０−１７細胞に添加した。各ウェルにおけるＷ−２０−１７細胞に対するｈＢＭＰ４及びｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓの最終濃度はそれぞれ１．５ｎＭ及び６ｎＭであり、抗体濃度は２倍希釈系列の１１点にわたって変化した（最高抗体濃度は２００ｎＭ）。３７℃５％ＣＯ2で３日
間増殖した後、培地を吸引し、５０ｕＬの水を各ウェルに加えた。９６ウェルプレートを−８０℃で２時間凍結した後、氷上で解凍した。説明書に従って調製したパラニトロフェニルリン酸基質（シグマ社、＃Ｎ２７７０−５０ＳＥＴ）を用いて、アルカリホスファターゼを測定した。５０ｕＬの基質を加えた７分後に、Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダー上で４０５ｎｍでの吸光度を測定した。Ｐｒｉｓｍにおいて、平均値＋／−ＳＥＭ（各条件につき４連）として、グラフをプロットした。
【０１９０】
試験された２４種中２２種の抗ＧＲＥＭ１抗体が、表８に示されるＩＣ50値で、本アッセイにおいてｈＢＭＰ４のｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓ阻害を阻害した。２種の抗体、Ｈ４Ｈ６２６９Ｐ及びＨ４Ｈ２７８０Ｎは、本アッセイにおいてｈＧＲＥＭ１−Ｈｉｓ活性のいかなる測定可能な阻害も示さなかった。
【０１９１】
【表９】
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【０１９２】
実施例８．  二重特異性抗体の作製
本発明の方法を実施するために種々の二重特異性抗体を作製した。例えば、ｈＧＲＥＭ１特異的抗体は、ｈＧＲＥＭ１の異なる領域に結合する可変領域同士を連結することで単一の結合分子内に二重ドメイン特異性を付与する二重特異性型（「二重特異性」）に作製される。適切に設計された二重特異性抗体は、特異性及び結合親和力の両方の増加により、全体的なＧＲＥＭ１阻害効果を増強し得る。ＧＲＥＭ１の個々の領域またはエピトープへの特異性を有する可変領域が、各領域が別々のエピトープに同時に結合することを可能にする構造足場上で対合されている。二重特異性抗体の一例では、ある領域に対する特異性を有する結合剤由来の重鎖可変領域（ＶH）が、第二の領域に対する特異性を有する一
連の結合剤由来の軽鎖可変領域（ＶL）と結合し直されることで、元のＶHと対合し得る非同源ＶLパートナーが、そのＶHに対する元の特異性を乱すことなく、特定される。このように、１つのＶLセグメント（例えば、ＶL１）を２つの異なるＶHドメイン（例えば、ＶH１及びＶH２）と結合することにより、２つの結合「腕」（ＶH１−ＶL１及びＶH２−ＶL
１）を含む二重特異性抗体を作製することができる。単一のＶLセグメントの使用は、前
記系の複雑さを低減し、それにより、二重特異性抗体の作製に用いられるクローニング、発現、及び精製プロセスを単純化し、それらの効率を増加させる（例えば、ＵＳＳＮ１３／０２２７５９及びＵＳ２０１０／０３３１５２７を参照）。
【０１９３】
あるいは、ＧＲＥＭ１及び、限定はされないが、例えば、第二の異なる抗ＧＲＥＭ１抗体または線維症に特異的な薬剤等の第二標的に結合する抗体が、本明細書に記載の技術または当業者に公知の他の技術を用いて二重特異性型に作製され得る。別々の触媒ドメイン領域に結合する抗体可変領域を、例えばシグナルペプチドドメイン上の関連部位に結合する可変領域と連結することで、単一の結合分子内に二重抗原特異性が付与され得る。このような適切に設計された二重特異性抗体は、二重の機能を果たす。例えば、前記ドメインの両方と結合する二重特異性抗体の場合、２つの別々の抗体を含有する組成物を投与する必要なく、前記ドメインの両方を同時により良好に中和することができ得る。触媒ドメインに対する特異性を有する可変領域が、シグナルペプチドドメインに対する特異性を有する可変領域と組み合わされ、各可変領域が別々の抗原に結合することを可能にする構造足場上で対合される。
【０１９４】
実施例９．  ＧＲＥＭ１特異的抗体を用いたＧＲＥＭ１−ヘパリン結合相互作用の阻害
本研究では、バイオレイヤー干渉法（Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）を用いて、ＧＲＥＭ１がヘパリンに結合することを示す以前の結果を確認し、ＧＲＥＭ１特異的モノクローナル抗体がこの結合相互作用に干渉する能力を評価した。ＧＲＥＭ１及び他の構造的に関連性があるシステインノット含有タンパク質（例えばＧＲＥＭ２及びケルベロス）も、ヘパリンに結合するそれらの能力について試験した。これらの知見を利用し、他のシステインノット含有ＤＡＮファミリータンパク質の配列及び公知のヘパリン結合特性を比較することにより、ヘパリンへのＧＲＥＭ１の結合に関与するアミノ酸残基を仮定した。ヘパリンへのＧＲＥＭ１の結合を、ヘパリン、ＨＳ、及びデルマタン硫酸（ＤＳ）を含む様々なＧＡＧで様々な程度に競合させて、相互作用の特異性を示した。最後に、個々の抗体を、ヘパリンへのＧＲＥＭ１の結合に干渉するそれらの能力について試験した。試験された２４種の抗体のうち４種が、この結合相互作用の側面に部分的に影響を与えることが示された。前記相互作用を完全に阻害する試みにおいて、単独で試験した場合にＧＲＥＭ１及びヘパリンの結合相互作用の部分的阻害を促進した前記４種の抗体を、組み合わせて試験した。前記抗体のうち３種を含むいくつかの組み合わせ、及び４種全ての抗体を含有する混合物は、ＧＲＥＭ１及びヘパリンの結合相互作用を完全に阻害することができた。これらの結果により、ＧＲＥＭ１及びヘパリンの結合機構に対するより多くの洞察が与えられ、治療的処置を目的とした、ＧＲＥＭ１とＨＳとの血管新生相互作用を阻害するために抗体の組み合わせを用いる、可能な方法が示される。
【０１９５】
試薬及び計装
Ｃ末端デカヒスチジンタグを有する無担体組換えヒトＧＲＥＭ１は、Ｒ＆Ｄシステムズ社（ミネソタ州ミネアポリス）から入手した。ブタ腸粘膜由来のヘパリン−ビオチンナトリウム塩及びブタ腸粘膜由来のヘパリンナトリウム塩は、ミリポア社（マサチューセッツ州ビルリカ）から入手した。ブタ腸粘膜由来のヘパラン硫酸（ＨＳ）ナトリウム塩及びブタ腸粘膜由来のデルマタン硫酸（ＤＳ）ナトリウム塩は、セルサス社（Ｃｅｌｓｕｓ）（オハイオ州シンシナティ）から入手した。
【０１９６】
結合測定はＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６無標識生体分子相互作用装置（フォルテバイオ社（
ＦｏｒｔｅＢｉｏ））を用いて行った。全ての実験は、１０００ｒｐｍでのプレート撹拌を用いて、２５℃で行った。溶液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．０５％Ｐ２０、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有しｐＨ７．４に調整された緩衝水溶液（ＨＢＳＴ緩衝液）中で作製した。
【０１９７】
捕捉されたヘパリンと相互作用するＧＲＥＭ１の結合速度
Ｓｕｐｅｒ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎバイオセンサーに１０μｇ／ｍＬヘパリン−ビオチン溶液を９０秒間添加した。１２０秒間洗浄した後、ヘパリンが捕捉されたバイオセンサーを１１．１ｎＭ、３３．３ｎＭ、１００ｎＭ、及び３００ｎＭ  ＧＲＥＭ１溶液を含有するウェルに浸して、２４０秒間結合を測定した。次に、バイオセンサーをＨＢＳＴ緩衝液に浸して、２４０秒間解離を測定した。測定された結合及び解離の速度定数（ｋon＝１．１７×１０6Ｍ-1ｓ-1及びｋoff＝３．２７×１０-3ｓ-1）は、ＧＲＥＭ１が高い親和性（ＫD＝ｋoff／ｋon＝２．８×１０-9Ｍ）でヘパリンに結合することを示している。
【０１９８】
グリコサミノグリカンによる捕捉されたヘパリンへのＧＲＥＭ１結合の阻害
Ｓｕｐｅｒ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎバイオセンサーに、１０μｇ／ｍＬヘパリン−ビオチン溶液を９０秒間添加した。１２０秒間洗浄した後、ヘパリンが補足されたバイオセンサーを、漸増濃度（０ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ、２μＭ）のヘパリン、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、またはデルマタン硫酸（ＤＳ）と予め混合された１００ｎＭ  ＧＲＥＭ１溶液を含有するウェルに浸して、２４０秒間結合を測定した。
【０１９９】
ＧＲＥＭ１は、結合の２４０秒後に観察される結合シグナル（表９）に示されるように、漸増濃度のヘパリン、ＨＳ、及びＤＳの存在下で捕捉されたヘパリン−ビオチンへの結合の減少を示した。外因的に加えられたヘパリンは、捕捉されたヘパリン−ビオチンへ結合する１００ｎＭ  ＧＲＥＭ１を阻害するのに最も効果的であり、１００ｎＭにおいて完全な阻害を示した。ＧＲＥＭ１が２μＭのＨＳ及びＤＳと混合された場合に、捕捉されたヘパリン−ビオチンへ結合するＧＲＥＭ１のほぼ完全な阻害が観察された。１００ｎＭの可溶性ヘパリンによる捕捉されたヘパリン−ビオチンへ結合する１００ｎＭ  ＧＲＥＭ１の完全阻害は、この結合の特異性を裏付けるものである。全て負に帯電している他のグリコサミノグリカンによる部分的阻害は、電磁気力がＧＲＥＭ１−ヘパリン結合相互作用において重要であり得ることを示唆している。
【０２００】
【表１０】
2019151654.tif 000013
【０２０１】
ヘパリンによるＧＲＥＭ１特異的モノクローナル抗体へ結合するＧＲＥＭ１の阻害
Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆｃ  Ｃａｐｔｕｒｅバイオセンサー（フォルテバイオ社）に、２４種の異なる抗ＧＲＥＭ１抗体溶液の５０μｇ／ｍＬ溶液を６０秒間別々に添加した。３０秒間洗浄した後、各抗体につき２連のバイオセンサーを１００ｎＭ  ＧＲＥＭ１溶液または５μＭのヘパリンを含有する１００ｎＭ  ＧＲＥＭ１溶液を含有するウェルに浸し、３００秒間結合を測定した。いくつかの抗体においてヘパリンの存在または不在は結合速度に影響を及ぼし、この効果は表１０に要約され、この表には３０秒及び３００秒の両方の時点において観察されたシグナルが記載される。ＧＲＥＭ１に対する抗体Ｈ４Ｈ２８９５Ｎ、Ｈ４Ｈ２７８０Ｎ、Ｈ４Ｈ６２６９Ｐ、及びＨ４Ｈ２８９２Ｎの結合は、ヘパリンの存在によって最小限にしか影響を受けなかった（３０秒の時点での結合シグナルの減少は０．０５ｎｍ以下であった）。８種の抗体（Ｈ４Ｈ２８９７Ｎ、Ｈ４Ｈ６２５２Ｐ、Ｈ４Ｈ６２４５Ｐ、Ｈ４Ｈ６２５１Ｐ、Ｈ４Ｈ６２３２Ｐ、Ｈ４Ｈ２７８３Ｎ２、Ｈ４Ｈ６２３６Ｐ、及びＨ４Ｈ６２４３Ｐ）の結合は、ヘパリン存在下で、ＧＲＥＭ１への結合において最も大きな減少を示した（結合シグナルは３０秒の時点で０．１９ｎｍ以上減少した）。試験されたその他の抗体は、ヘパリン存在下で、中間レベルのＧＲＥＭ１への結合阻害を示した。
【０２０２】
【表１１】
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【０２０３】
ＧＲＥＭ１抗体の組み合わせによるヘパリンに結合するＧＲＥＭ１の阻害
Ｓｕｐｅｒ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎバイオセンサーに１０μｇ／ｍＬのヘパリン−ビオチン溶液を６０秒間添加した。３０秒間洗浄した後、バイオセンサーを、単独で試験された場合にＧＲＥＭ１−ヘパリン結合の最も強い阻害を示した以前の実験における群から選択された４種の抗体（Ｈ４Ｈ２７８３Ｎ２、Ｈ４Ｈ２８９７Ｎ、Ｈ４Ｈ６２４３Ｐ、Ｈ４Ｈ６２４５Ｐ）の１５種全ての可能な組み合わせをそれぞれ含有する別々のＧＲＥＭ１溶液に浸した。前記混合物は単一の抗体及び２種、３種、または４種の抗体の組み合わせを含んでいた。各抗体は混合物中で６００ｎＭの濃度を有していた。また、ＧＲＥＭ１に結合しないことが知られている負のアイソタイプ対照抗体、ＧＲＥＭ１への結合がヘパリンの存在によって最小限にしか影響されない２種の抗体（Ｈ４Ｈ２８９２Ｎ及びＨ４Ｈ２７８０Ｎ）、及び参照条件であるＧＲＥＭ１単独も含まれた。表１１に示すように、個々の抗体は、この結合形式において、捕捉されたヘパリンへのＧＲＥＭ１の結合を部分的に減少させるのみであった。抗体の組み合わせは、捕捉されたヘパリンへのＧＲＥＭ１の結合をより効率的に減少させた。Ｈ４Ｈ２８９７Ｎ、Ｈ４Ｈ６２４３Ｐ、及びＨ４Ｈ６２
４５Ｐを含有する溶液並びに４種全ての抗体を含有する溶液は、ＧＲＥＭ１が捕捉されたヘパリンに結合することを完全に阻害した。
【０２０４】
ＧＲＥＭ１及びヘパリンの結合相互作用は、この結合相互作用への部分的な干渉において有効であることが各々特定された抗体の組み合わせを用いることにより、完全に阻害された。ヘパリンのより高度に負に帯電した性質を考慮すると、これらの結果は、ヘパリンがＧＲＥＭ１上の複数の正に帯電した表面残基においてＧＲＥＭ１に結合することを示唆している。この洞察により、血管新生を誘導するＨＳ及びＧＲＥＭ１の結合相互作用を完全に阻害するために、ＧＲＥＭ１構造内の複数のヘパリン結合部位と重複する多様なエピトープを有する複数の抗体が必要であることが提唱される。
【０２０５】
【表１２】
2019151654.tif 000015
【０２０６】
本発明は本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際には、本明細書に記載されるものの他に、本発明の様々な変更形態が、上記の説明及び添付の図面から当業者に明らかになる。そのような変更形態は添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
2019151654.tif 000016
【配列表】
2019151654000001.app
【外国語明細書】
2019151654000001.pdf