(57)【要約】      （修正有）【課題】眼の症状、障害または疾患を予防または治療するための医薬および方法の提供。【解決手段】本発明は、ｍＴＯＲインヒビターを含む、眼の症状、障害または疾患を予防または治療するための組成物。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防することができ、特に、角膜内皮の症状、障害または疾患は、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルおよび／または細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｍＴＯＲ（mechanistic  target  of  rapamycin  mammalian  target  of  rapamycinとも称された。）インヒビターを含む、眼の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬およびその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が、網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に伝達することで認識される。良好な視力を得るためには、角膜が透明であることが必要である。角膜の透明性は、角膜内皮細胞のポンプ機能とバリア機能により、含水率が一定に保たれることにより保持される。
【０００３】
ヒトの角膜内皮細胞は、出生時には１平方ミリメートル当たり約３０００個の密度で存在しているが、一度障害を受けると再生する能力は極めて限定的である。フックス角膜内皮ジストロフィは、角膜の内側の内皮細胞が異常を来し角膜内皮細胞の密度が著しく減少し、その結果、角膜の浮腫を生じたりする疾患であり、その原因は不明である。また、フックス角膜内皮ジストロフィでは、コラーゲン、フィブロネクチン等の細胞外マトリクスが角膜の後部にあるデスメ膜の後面の一部分に沈着しグッテー（Corneal  guttae）およびデスメ膜の肥厚を生じる。グッテー（Corneal  guttae）およびデスメ膜の肥厚はフックス角膜内皮ジストロフィ患者における羞明、霧視の原因であり患者のQOLを著しく損なう。このように、フィブロネクチンなどの細胞外マトリクスはまた、角膜内皮面の疣贅（グッタータ）や、デスメ膜の混濁グッテー等の視力低下の原因となる症状に関連しており、曇り、角膜混濁や白斑などの角膜の濁りに関連する角膜内皮障害の主な原因となりうる。フックス角膜内皮ジストロフィは角膜移植以外に有効な治療法はないとされるが、日本での角膜提供は不足しており、角膜移植の待機患者約２６００人に対し、年間に国内で行われている角膜移植件数は１７００件程度である。
【０００４】
フックス角膜内皮ジストロフィについては、フックス角膜患者由来の角膜内皮細胞の培養(非特許文献１および３)や不死化の報告(非特許文献２)があるが、細胞外マトリックスの過剰産生を伴うなどの疾患の特徴を維持した、治療薬、進行予防薬のスクリーニングに適切な細胞の報告はないため、その治療薬の開発には限界があり、現在のところ臨床で使用されている治療薬は存在せず角膜移植に頼らざるを得ない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Zaniolo  K,  et  al.  Exp  Eye  Res.;94(1)：22-31.  2012
【非特許文献２】Azizi  B,  et  al.  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci.  2；52(13)：9291-9297.  2011
【非特許文献３】Kelliher  C.  et  al.  Exp  Eye  Res  Vol.93(6),  880-888,  2011
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ｍＴＯＲを阻害することにより、眼、特に角膜内皮細胞の細胞死（アポトーシス）が抑制され、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に起因する角膜内皮障害（特に、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害）等の眼科疾患の治療または予防に使用することに応用することを見出した。また、本発明者らは、ｍＴＯＲを阻害することにより、予想外にフィブロネクチンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過剰発現を抑制することができることを見出した。これにより、本発明者らは、ｍＴＯＲインヒビターを、細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮障害（例えば、グッテー、デスメ層の肥厚、角膜混濁、白斑などの濁りの症状など）の改善、治療または予防にも応用可能であることを見出した。細胞死と細胞外マトリクスとは独立した事象であるため、両方を抑制することができることは好ましい。
【０００７】
したがって、本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ｍＴＯＲインヒビターを含む、眼の症状、障害または疾患を予防または治療するための組成物。
（項目２）
前記眼の症状、障害または疾患が、角膜内皮の症状、障害または疾患である、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記眼の症状、障害または疾患が、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患である、項目１または２に記載の組成物。
（項目４）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ（ＰＰＤ）、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ（ＣＨＥＤ）、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎からなる群より選択される、項目１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因するものである、項目１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視からなる群より選択される、項目５に記載の組成物。
（項目７）
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８）
前記ｍＴＯＲインヒビターが、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、ＰＩ−１０３、ＣＣ−２２３、ＩＮＫ１２８、ＡＺＤ８０５５、ＫＵ  ００６３７９４、ボクスタリシブ、リダフォロリムス、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＣＺ４１５、トルキニブ、トリン１、オミパリシブ、ＯＳＩ−０２７、ＰＦ−０４６９１５０２、アピトリシブ、ＷＹＥ−３５４、ビスツセルチブ、トリン２、タクロリムス、ＧＳＫ１０５９６１５、ゲダトリシブ、ＷＹＥ−１２５１３２、ＢＧＴ２２６、パロミド５２９、ＰＰ１２１、ＷＹＥ−６８７、ＣＨ５１３２７９９、ＷＡＹ−６００、ＥＴＰ−４６４６４、ＧＤＣ−０３４９、ＸＬ３８８、ゾタロリムス、およびクリソファン酸からなる群から選択される、項目１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
前記ｍＴＯＲインヒビターが、ｍＴＯＲ遺伝子の発現抑制物質である、項目１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）
前記ｍＴＯＲ遺伝子の発現抑制物質は、ｍＴＯＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸またはリボザイムである、項目９に記載の組成物。
（項目１１）
前記ｍＴＯＲ遺伝子の発現抑制物質は、ｍＴＯＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡであり、該ｓｉＲＮＡは、配列番号１に示される核酸配列、または１〜３塩基のヌクレオチドが欠失、置換、挿入および／または付加されている核酸配列からなるセンス鎖と、配列番号２に示される核酸配列、または１〜３塩基のヌクレオチドが欠失、置換、挿入および／または付加されている核酸配列からなるアンチセンス鎖とを含む、項目９または１０に記載の組成物。
（項目１２）
前記ｍＴＯＲインヒビターが、ラパマイシン、テムシロリムスおよびエベロリムスからなる群より選択される、項目１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３）
前記組成物が点眼剤である、項目１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４）
前記ｍＴＯＲインヒビターが、ラパマイシンであり、少なくとも約０．１ｎＭで前記組成物中に存在する、項目１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１５）
前記組成物が点眼剤であり、前記ｍＴＯＲインヒビターが、ラパマイシンであり、少なくとも約０．１ｍＭで該点眼剤中に存在する、項目１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１６）
前記ｍＴＯＲインヒビターが、テムシロリムスであり、少なくとも約０．０１ｎＭで前記組成物中に存在する、項目１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１７）
前記組成物が点眼剤であり、前記ｍＴＯＲインヒビターが、テムシロリムスであり、少なくとも約０．０１ｍＭで該点眼剤中に存在する、項目１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１８）
前記ｍＴＯＲインヒビターが、エベロリムスであり、少なくとも約０．１ｎＭで前記組成物中に存在する、項目１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１９）
前記組成物が点眼剤であり、前記ｍＴＯＲインヒビターが、エベロリムスであり、少なくとも約０．１ｍＭで該点眼剤中に存在する、項目１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１Ａ）
被験体中の眼の症状、障害または疾患を予防または治療するための方法であって、該方法は、ｍＴＯＲインヒビターの有効量を該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目２Ａ）
前記眼の症状、障害または疾患が、角膜内皮の症状、障害または疾患である、項目１Ａに記載の方法。
（項目３Ａ）
前記眼の症状、障害または疾患が、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患である、項目１Ａまたは２Ａに記載の方法。
（項目４Ａ）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ（ＰＰＤ）、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ（ＣＨＥＤ）、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎からなる群より選択される、項目１Ａ〜３Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目５Ａ）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因するものである、項目１Ａ〜４Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目６Ａ）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視からなる群より選択される、項目５Ａに記載の方法。
（項目７Ａ）
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む、項目１Ａ〜６Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目８Ａ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、ＰＩ−１０３、ＣＣ−２２３、ＩＮＫ１２８、ＡＺＤ８０５５、ＫＵ  ００６３７９４、ボクスタリシブ、リダフォロリムス、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＣＺ４１５、トルキニブ、トリン１、オミパリシブ、ＯＳＩ−０２７、ＰＦ−０４６９１５０２、アピトリシブ、ＷＹＥ−３５４、ビスツセルチブ、トリン２、タクロリムス、ＧＳＫ１０５９６１５、ゲダトリシブ、ＷＹＥ−１２５１３２、ＢＧＴ２２６、パロミド５２９、ＰＰ１２１、ＷＹＥ−６８７、ＣＨ５１３２７９９、ＷＡＹ−６００、ＥＴＰ−４６４６４、ＧＤＣ−０３４９、ＸＬ３８８、ゾタロリムス、およびクリソファン酸からなる群から選択される、項目１Ａ〜７Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目９Ａ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが、ｍＴＯＲ遺伝子の発現抑制物質である、項目１Ａ〜７Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０Ａ）
前記ｍＴＯＲ遺伝子の発現抑制物質は、ｍＴＯＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸またはリボザイムである、項目９Ａに記載の方法。
（項目１１Ａ）
前記ｍＴＯＲ遺伝子の発現抑制物質は、ｍＴＯＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡであり、該ｓｉＲＮＡは、配列番号１に示される核酸配列、または１〜３塩基のヌクレオチドが欠失、置換、挿入および／または付加されている核酸配列からなるセンス鎖と、配列番号２に示される核酸配列、または１〜３塩基のヌクレオチドが欠失、置換、挿入および／または付加されている核酸配列からなるアンチセンス鎖とを含む、項目９Ａまたは１０Ａに記載の方法。
（項目１２Ａ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが、ラパマイシン、テムシロリムスおよびエベロリムスからなる群より選択される、項目１Ａ〜８Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３Ａ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが点眼剤として投与される、項目１Ａ〜１２Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目１４Ａ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが、ラパマイシンであり、少なくとも約０．１ｎＭの濃度で投与される、項目１Ａ〜８Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目１５Ａ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが点眼剤として投与され、前記ｍＴＯＲインヒビターが、ラパマイシンであり、少なくとも約０．１ｍＭで前記点眼剤中に存在する、項目１Ａ〜８Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目１６Ａ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが、テムシロリムスであり、少なくとも約０．０１ｎＭの濃度で投与される、項目１Ａ〜８Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目１７Ａ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが点眼剤として投与され、前記ｍＴＯＲインヒビターが、テムシロリムスであり、少なくとも約０．０１ｍＭで前記点眼剤中に存在する、項目１Ａ〜８Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目１８Ａ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが、エベロリムスであり、少なくとも約０．１ｎＭの濃度で投与される、項目１Ａ〜８Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目１９Ａ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが点眼剤として投与され、前記ｍＴＯＲインヒビターが、エベロリムスであり、少なくとも約０．１ｍＭで前記点眼剤中に存在する、項目１Ａ〜８Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目２０Ａ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが局所投与される、項目１Ａ〜１９Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目２１Ａ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが眼に局所投与される、項目１Ａ〜２０Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目２２Ａ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが角膜に接触するように投与される、項目１Ａ〜２１Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目１Ｂ）
眼の症状、障害または疾患を予防または治療するための医薬の製造のためのｍＴＯＲインヒビターの使用。
（項目２Ｂ）
前記眼の症状、障害または疾患が、角膜内皮の症状、障害または疾患である、項目１Ｂに記載の使用。
（項目３Ｂ）
前記眼の症状、障害または疾患が、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患である、項目１Ｂまたは２Ｂに記載の使用。
（項目４Ｂ）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ（ＰＰＤ）、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ（ＣＨＥＤ）、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎からなる群より選択される、項目１Ｂ〜３Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目５Ｂ）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因するものである、項目１Ｂ〜４Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目６Ｂ）
前記角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視からなる群より選択される、項目５Ｂに記載の使用。
（項目７Ｂ）
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む、項目１Ｂ〜６Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目８Ｂ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、ＰＩ−１０３、ＣＣ−２２３、ＩＮＫ１２８、ＡＺＤ８０５５、ＫＵ  ００６３７９４、ボクスタリシブ、リダフォロリムス、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＣＺ４１５、トルキニブ、トリン１、オミパリシブ、ＯＳＩ−０２７、ＰＦ−０４６９１５０２、アピトリシブ、ＷＹＥ−３５４、ビスツセルチブ、トリン２、タクロリムス、ＧＳＫ１０５９６１５、ゲダトリシブ、ＷＹＥ−１２５１３２、ＢＧＴ２２６、パロミド５２９、ＰＰ１２１、ＷＹＥ−６８７、ＣＨ５１３２７９９、ＷＡＹ−６００、ＥＴＰ−４６４６４、ＧＤＣ−０３４９、ＸＬ３８８、ゾタロリムス、およびクリソファン酸からなる群から選択される、項目１Ｂ〜７Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目９Ｂ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが、ｍＴＯＲ遺伝子の発現抑制物質である、項目１Ｂ〜７Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目１０Ｂ）
前記ｍＴＯＲ遺伝子の発現抑制物質は、ｍＴＯＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸またはリボザイムである、項目９Ｂに記載の使用。
（項目１１Ｂ）
前記ｍＴＯＲ遺伝子の発現抑制物質は、ｍＴＯＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡであり、該ｓｉＲＮＡは、配列番号１に示される核酸配列、または１〜３塩基のヌクレオチドが欠失、置換、挿入および／または付加されている核酸配列からなるセンス鎖と、配列番号２に示される核酸配列、または１〜３塩基のヌクレオチドが欠失、置換、挿入および／または付加されている核酸配列からなるアンチセンス鎖とを含む、項目９Ｂまたは１０Ｂに記載の使用。
（項目１２Ｂ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが、ラパマイシン、テムシロリムスおよびエベロリムスからなる群より選択される、項目１Ｂ〜８Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目１３Ｂ）
前記医薬が点眼剤である、項目１Ｂ〜１２Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目１４Ｂ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが、ラパマイシンであり、少なくとも約０．１ｎＭで前記医薬中に存在する、項目１〜８のいずれか一項に記載の使用。
（項目１５Ｂ）
前記医薬が点眼剤であり、前記ｍＴＯＲインヒビターが、ラパマイシンであり、少なくとも約０．１ｍＭで該点眼剤中に存在する、項目１Ｂ〜８Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目１６Ｂ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが、テムシロリムスであり、少なくとも約０．０１ｎＭで前記医薬中に存在する、項目１Ｂ〜８Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目１７Ｂ）
前記医薬が点眼剤であり、前記ｍＴＯＲインヒビターが、テムシロリムスであり、少なくとも約０．０１ｍＭで該点眼剤中に存在する、項目１Ｂ〜８Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目１８Ｂ）
前記ｍＴＯＲインヒビターが、エベロリムスであり、少なくとも約０．１ｎＭで前記医薬中に存在する、項目１Ｂ〜８Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目１９Ｂ）
前記医薬が点眼剤であり、前記ｍＴＯＲインヒビターが、エベロリムスであり、少なくとも約０．１ｍＭで該点眼剤中に存在する、項目１Ｂ〜８Ｂのいずれか一項に記載の使用。
（項目１Ｃ）
眼の症状、障害または疾患の予防または治療に使用するための、ｍＴＯＲインヒビター。
（項目２Ｃ）
上記項目の１または複数の特徴を含む、項目１Ｃに記載のｍＴＯＲインヒビター。
（項目１Ｄ）
ｍＴＯＲインヒビターを含む角膜内皮細胞を保存するための組成物。
（項目２Ｄ）
上記項目の１または複数の特徴を含む、項目１Ｄに記載の組成物。
（項目１Ｅ）
ｍＴＯＲインヒビターの有効量を角膜内皮細胞に接触させる工程を包含する、角膜内皮細胞を保存するための方法。
（項目２Ｅ）
上記項目の１または複数の特徴を含む、項目１Ｅに記載の方法。
（項目１Ｆ）
ｍＴＯＲインヒビターの有効量を角膜内皮細胞に接触させる工程を包含する、角膜内皮細胞を増殖または角膜内皮細胞の増殖を促進するための方法。
（項目２Ｆ）
上記項目の１または複数の特徴を含む、項目１Ｅに記載の方法。
【０００８】
本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、ｍＴＯＲインヒビターが予想外に、フックス角膜内皮ジストロフィ等におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に起因する障害または疾患に起因する疾患を処置または予防しうることを見出し、そのような疾患を含む眼の症状、障害または疾患の処置または予防をなしうる医薬を提供し得る。また、グッテーまたはデスメ層の肥厚、角膜混濁、白斑などの濁りの症状）などの細胞外マトリクス（例えば、フィブロネクチン）の過剰産生に起因する角膜内皮細障害に起因する疾患を処置または予防しうる医薬も提供する。さらに、本発明は、ｍＴＯＲインヒビターを含む角膜内皮細胞の保存のための組成物または角膜内皮細胞の増殖を促進するための組成物、ならびに角膜内皮細胞を保存する、および／または増殖するもしくは増殖を促進する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ｉＦＥＣＤの顕微鏡画像を示す。左上がＴＧＦ−β２を添加していないコントロール群、右上がＴＧＦ−β２を添加した群、左下がＴＧＦ−β２およびラパマイシンを添加した群、右下がＴＧＦ−β２およびカスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＤ−ＦＭＫを添加した群を示す。
【図２】図２は、全長カスパーゼ３（ｔｏｔａｌ  ｃａｓｐａｓｅ  ３）、切断型カスパーゼ３（ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ  ３）、ＰＡＲＰ、およびＧＡＰＤＨのウェスタンブロットの結果を示す。左から、ＴＧＦ−β２を添加していないコントロール群、ＴＧＦ−β２を添加した群、ＴＧＦ−β２およびラパマイシンを添加した群、ＴＧＦ−β２およびカスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＤ−ＦＭＫを添加した群を示す。
【図３】図３は、Ａｋｔ、ｐ−Ａｋｔ、Ｓ６Ｋ、ｐ−Ｓ６Ｋ、およびＧＡＰＤＨのウェスタンブロットの結果を示す。左から、ＴＧＦ−β２を添加していないコントロール群、ＴＧＦ−β２を添加した群、ＴＧＦ−β２およびラパマイシンを添加した群、ＴＧＦ−β２およびカスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＤ−ＦＭＫを添加した群を示す。
【図４】図４は、Ｓｍａｄ２、ｐ−Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、ｐ−Ｓｍａｄ３、およびＧＡＰＤＨのウェスタンブロットの結果を示す。左から、ＴＧＦ−β２を添加していないコントロール群、ＴＧＦ−β２を添加した群、ＴＧＦ−β２およびラパマイシンを添加した群、ＴＧＦ−β２およびカスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＤ−ＦＭＫを添加した群を示す。
【図５】図５は、フィブロネクチンおよびＧＡＰＤＨのウェスタンブロットの結果を示す（ｎ＝３）。左から、ＴＧＦ−β２を添加していないコントロール群、ＴＧＦ−β２を添加した群、ＴＧＦ−β２およびラパマイシンを添加した群、ＴＧＦ−β２およびカスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＤ−ＦＭＫを添加した群を示す。
【図６】図６は、アガロースゲル電気泳動およびウェスタンブロットの結果を示す。上パネルが、ｍＴＯＲおよびＧＡＰＤＨのアガロースゲル電気泳動の結果を示し、下パネルが、ｍＴＯＲ、Ｓ６Ｋ、ｐ−Ｓ６Ｋ、およびＧＡＰＤＨのウェスタンブットの結果を示す。各パネルの左から、Ｒａｎｄｏｍ  ｓｉＲＮＡ添加群、ＴＧＦ−β２＋Ｒａｎｄｏｍ  ｓｉＲＮＡ添加群、ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡ添加群、ＴＧＦ−β２＋ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡ添加群を示す。
【図７】図７は、ｉＦＥＣＤの顕微鏡画像を示す。左上がＲａｎｄｏｍ  ｓｉＲＮＡ添加群、右上がｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡ添加群、左下がＴＧＦ−β２＋Ｒａｎｄｏｍ  ｓｉＲＮＡ添加群、右下がＴＧＦ−β２＋ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡ添加群を示す。
【図８】図８は、全長カスパーゼ３（ｔｏｔａｌ  ｃａｓｐａｓｅ  ３）、切断型カスパーゼ３（ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ  ３）、ＰＡＲＰ、およびＧＡＰＤＨのウェスタンブロットの結果を示す。左から、Ｒａｎｄｏｍ  ｓｉＲＮＡ添加群、ＴＧＦ−β２＋Ｒａｎｄｏｍ  ｓｉＲＮＡ添加群、ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡ添加群、ＴＧＦ−β２＋ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡ添加群を示す。
【図９】図９は、フィブロネクチンおよびＧＡＰＤＨのウェスタンブロットの結果を示す。左から、Ｒａｎｄｏｍ  ｓｉＲＮＡ添加群、ＴＧＦ−β２＋Ｒａｎｄｏｍ  ｓｉＲＮＡ添加群、ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡ添加群、ＴＧＦ−β２＋ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡ添加群を示す。
【図１０】図１０は、カスパーゼ３／７活性のグラフを示す。左から、ＴＧＦ−β２非添加群、コントロール群、ＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ラパマイシン（０．００００１ｎＭ、０．０００１ｎＭ、０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ）、ＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ（１０μＭ）を示す。統計学的有意は、Ｄｕｎｎｅｔｔ−ｔ検定により行った（＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。ｎ＝５）。
【図１１】図１１は、カスパーゼ３／７活性のグラフを示す。左から、ＴＧＦ−β２非添加群、コントロール群、ＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋エベロリムス（０．０００１μＭ、０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ）、ＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ（１０μＭ）を示す。統計学的有意は、Ｄｕｎｎｅｔｔ−ｔ検定により行った（＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。ｎ＝５）。
【図１２】図１２は、カスパーゼ３／７活性のグラフを示す。左から、ＴＧＦ−β２非添加群、コントロール群、ＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋テムシロリムス（０．０００００１μＭ、０．００００１μＭ、０．０００１μＭ、０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ）、ＴＧＦ−β２＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ（１０μＭ）を示す。統計学的有意は、Ｄｕｎｎｅｔｔ−ｔ検定により行った（＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。ｎ＝５）。
【図１３】図１３は、カスパーゼ３／７活性のグラフを示す。左から、ＴＧＦ−β２非添加群、コントロール群、ＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＰＩ−１０３（０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ）、ＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ（１０μＭ）を示す。統計学的有意は、Ｄｕｎｎｅｔｔ−ｔ検定により行った（＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。ｎ＝５）。
【図１４】図１４は、カスパーゼ３／７活性のグラフを示す。左から、ＴＧＦ−β２非添加群、コントロール群、ＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＣＣ−２２３（０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ）、ＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ（１０μＭ）を示す。統計学的有意は、Ｄｕｎｎｅｔｔ−ｔ検定により行った（＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。ｎ＝５）。
【図１５】図１５は、カスパーゼ３／７活性のグラフを示す。左から、ＴＧＦ−β２非添加群、コントロール群、ＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＮＫ１２８（０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ）、ＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ（１０μＭ）を示す。統計学的有意は、Ｄｕｎｎｅｔｔ−ｔ検定により行った（＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。ｎ＝５）。
【図１６】図１６は、カスパーゼ３／７活性のグラフを示す。左から、ＴＧＦ−β２非添加群、コントロール群、ＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＡＺＤ８０５５（０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ）、ＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ）２＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ（１０μＭ）を示す。統計学的有意は、Ｄｕｎｎｅｔｔ−ｔ検定により行った（＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。ｎ＝５）。
【図１７】図１７は、カスパーゼ３／７活性のグラフを示す。左から、ＴＧＦ−β２非添加群、コントロール群、ＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＫＵ  ００６３７９４（０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ）、ＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ（１０μＭ）を示す。統計学的有意は、Ｄｕｎｎｅｔｔ−ｔ検定により行った（＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。ｎ＝５）。
【図１８】図１８は、視力と角膜内皮細胞およびＥＣＭ沈着との関係の概略図を示す。角膜内皮細胞およびＥＣＭ沈着が増加するにつれて視力が低下することが示される。ＥＣＭ沈着によるグッテーまたはデスメ層の肥厚は、フックス角膜内皮ジストロフィ患者において一般的には３０代から４０代に生じ始め、生涯を通じて進行する。進行により霧視、ハロー、グレア、視力低下などの視力障害を生じる。また同時に角膜内皮細胞死が進行するが角膜内皮細胞密度が約１０００個／ｍｍ２を下回るまではポンプ機能を残された角膜内皮が代償することで角膜の透明性は維持される。一方で、約１０００個／ｍｍ２を下回ると角膜に前房水が進入することで角膜浮腫をきたし、重篤な視力障害を生じる。本技術はＥＣＭ沈着および角膜内皮細胞死の双方を抑制することで、視機能を維持することができるものである。
【図１９】図１９は、ｍＴＯＲインヒビター点眼剤（１ｍＭ）を、毎日朝夕の２回、左右の眼に２μｌずつ２ヶ月間点眼したＦＥＣＤモデルマウスにおける接触式角膜内皮スペキュラーにより観察される角膜内皮細胞像の代表例を示す。コントロールとして、生理的食塩水（基剤）を点眼したものを示す。
【図２０】図２０は、ｍＴＯＲインヒビター点眼剤を点眼されたＦＥＣＤモデルマウスにおける角膜内皮細胞密度（個／ｍｍ２）のグラフを示す。コントロールとして、生理的食塩水（基剤）を点眼したものを示す。統計学的有意は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定により行った（＊はｐ＜０．０５を示す。ｎ＝３）。
【図２１】図２１は、ｍＴＯＲインヒビター点眼剤を点眼されたＦＥＣＤモデルマウスにおけるグッテーの面積（％）のグラフを示す。コントロールとして、生理的食塩水（基剤）を点眼したものを示す。統計学的有意は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定により行った（＊＊はｐ＜０．０１を示す。ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１２】
（定義）
本明細書において、数値の前の「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。
【００１３】
本明細書において、「ｍＴＯＲインヒビター」とは、ｍＴＯＲのシグナル伝達を阻害する任意の薬剤をいう。ｍＴＯＲインヒビターは、水溶性のものが好ましい。水溶性でなければ、溶媒として身体に適合しにくいものを使用することが必要となりうるからである。水溶性かどうかについては薬局方の溶解度の定義に基づき分類されうる。すなわち、溶質1gまたは1mLを溶かすのに要する溶媒量として、極めて溶けやすい：1mL未満；溶けやすい：1mL以上10mL未満；やや溶けやすい：10mL以上30mL未満；やや溶けにくい：30mL以上100mL未満；溶けにくい：100mL以上1000mL未満；極めて溶けにくい：1000mL以上10000mL未満；ほとんど溶けない：10000mL以上と定義されており、本明細書においても同様に評価する。水溶性とは、水を溶媒としたときに、これらのうち有効量を溶解させるものであれば、任意の溶解性のものを利用することができることが理解される。このような水溶性の成分であれば、点眼剤としても有利に使用される。
【００１４】
mTOR（mammalian  target  of  rapamycin）はラパマイシンの標的分子として同定されたセリン・スレオニンキナーゼで、細胞の分裂や生存などの調節に中心的な役割を果たすと考えられており、SKS;  FRAP;  FRAP1;  FRAP2;  RAFT1;  RAPT1としても知られ、ＮＣＢＩのＧｅｎｅＩＤとして2475が付されており、この情報をもとに、当業者は、種々のｍＴＯＲインヒビターを設計し製造することができる。
【００１５】
本発明において使用され得るｍＴＯＲインヒビターは、ｍＴＯＲ阻害活性を有する化合物であれば、特に限定されず、例えば、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、ＰＩ−１０３、ＣＣ−２２３、ＩＮＫ１２８、ＡＺＤ８０５５、ＫＵ  ００６３７９４、ボクスタリシブ（Ｖｏｘｔａｌｉｓｉｂ（ＸＬ７６５、ＳＡＲ２４５４０９））、リダフォロリムス（Ｒｉｄａｆｏｒｏｌｉｍｕｓ（Ｄｅｆｏｒｏｌｉｍｕｓ、ＭＫ−８６６９））、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＣＺ４１５、Ｔｏｒｋｉｎｉｂ（ＰＰ２４２）、トリン１（Ｔｏｒｉｎ  １）、オミパリシブ（Ｏｍｉｐａｌｉｓｉｂ（ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＳＫ４５８））、ＯＳＩ−０２７、ＰＦ−０４６９１５０２、アピトリシブ（Ａｐｉｔｏｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２））、ＷＹＥ−３５４、ビスツセルチブ（Ｖｉｓｔｕｓｅｒｔｉｂ（ＡＺＤ２０１４））、トリン２（Ｔｏｒｉｎ  ２）、タクロリムス（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ（ＦＫ５０６））、ＧＳＫ１０５９６１５、ゲダトリシブ（Ｇｅｄａｔｏｌｉｓｉｂ（ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７））、ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）、ＢＧＴ２２６（ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６）、パロミド５２９（Ｐａｌｏｍｉｄ  ５２９（Ｐ５２９））、ＰＰ１２１、ＷＹＥ−６８７、ＣＨ５１３２７９９、ＷＡＹ−６００、ＥＴＰ−４６４６４、ＧＤＣ−０３４９、ＸＬ３８８、ゾタロリムス（Ｚｏｔａｒｏｌｉｍｕｓ（ＡＢＴ−５７８））、クリソファン酸（Ｃｈｒｙｓｏｐｈａｎｉｃ  Ａｃｉｄ）が挙げられる。
【００１６】
好ましいｍＴＯＲインヒビターとしては、ラパマイシン、テムシロリムスおよびエベロリムスが挙げられるが、これに限定されない。理論に束縛されることを望まないが、これらの医薬品はＦＤＡやＰＭＤＡなどで承認されており、安全性や毒性の面で問題が最小限化されているからである。さらに好ましいｍＴＯＲインヒビターはラパマイシンである。別の好ましいｍＴＯＲインヒビターはテムシロリムスである。別の好ましいｍＴＯＲインヒビターはエベロリムスであるこれらに限定されない。
【００１７】
このほかの、本発明で用いることができるｍＴＯＲインヒビターとしては、例えば、ｍＴＯＲに対する中和抗体、ｍＴＯＲの活性を阻害する化合物、ｍＴＯＲをコードする遺伝子の転写を阻害する化合物（例えば、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、リボザイム）、ペプチド、植物成分、漢方などの古典的医薬の成分等の化合物等が挙げられる。
【００１８】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により、ｍＴＯＲのシグナル伝達経路のメンバー等をコードする遺伝子（核酸）の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの実施形態としては、上述のｍＴＯＲをコードする遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、上述のｍＴＯＲ等をコードする遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物（細胞）が有するｍＴＯＲをコードする遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも１２塩基以上２５塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず、例えば、１１塩基以下、１００塩基以上、または５００塩基以上であってもよい。アンチセンス核酸は、ＤＮＡのみから構成されていてもよいが、ＤＮＡ以外の核酸、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでいてもよい。１つの実施形態としては、本発明で用いられるアンチセンス核酸は、５’末端にＬＮＡ、３’末端にＬＮＡを含むＬＮＡ含有アンチセンス核酸であってもよい。また、本発明において、アンチセンス核酸を用いる実施形態では、例えば平島および井上，新生化学実験講座２  核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現，日本生化学会編，東京化学同人，1993,319-347．に記載される方法を用いて、ｍＴＯＲの核酸配列に基づき、アンチセンス配列を設計することができる。
【００１９】
ｍＴＯＲの発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ  Ｐに含まれるＭ１  ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，２１９１．）。
【００２０】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Koizumi,  M.  et  al.,FEBS  Lett,  1988,  228,228.）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（Koizumi,  M.  et  al.,  FEBS  Lett,  1988,  239,  285.、小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素，1990,35,2191.、  Koizumi,M.  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  1989,17,
7059.）。
【００２１】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えば、タバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Buzayan,JM.,  Nature,  1986,  323,  349.）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi,Y.  &  Sasaki,N.,  Nucl.  Acids  Res,1991,  19,  6751.、菊池洋,化学と生物,  1992,  30,112.）。このように、リボザイムを用いてｍＴＯＲ等をコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
【００２２】
ｍＴＯＲの内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（RNA  interference、以下「ＲＮＡｉ」と略称する）によっても行うことができる。ＲＮＡｉは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が直接細胞内に取り込まれると、このｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑えられ現在注目を浴びている手法である。哺乳類細胞においては、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いることにより、ＲＮＡｉを誘導する事が可能で、ＲＮＡｉは、ノックアウトマウスと比較して、効果が安定、実験が容易、費用が安価であるなど、多くの利点を有している。ｓｉＲＮＡについては、本明細書において他の箇所において詳述される。
【００２３】
本明細書において、「ｓｉＲＮＡ」とは、１５〜４０塩基からなる二本鎖ＲＮＡ部分を有するＲＮＡ分子であり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と相補的な配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。詳細には、本発明におけるｓｉＲＮＡは、ｍＴＯＲのｍＲＮＡ中の連続したＲＮＡ配列と相同な配列からなるセンスＲＮＡ鎖と、該センスＲＮＡ配列に相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡ鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ部分を含むＲＮＡである。かかるｓｉＲＮＡおよび後述の変異体ｓｉＲＮＡの設計および製造は当業者の技量の範囲内である。ｍＴＯＲの配列の転写産物であるｍＲＮＡの任意の連続するＲＮＡ領域を選択し、この領域に対応する二本鎖ＲＮＡを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるｍＲＮＡ配列から、より強いＲＮＡｉ効果を有するｓｉＲＮＡ配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。ｓｉＲＮＡは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のＲＮＡの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。
【００２４】
二本鎖ＲＮＡ部分の長さは、塩基として、１５〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基、更に好ましくは１８〜２３塩基、最も好ましくは１９〜２１塩基である。これらの上限および下限は、これら特定のものに限定されず、これら列挙されているものの任意の組み合わせであってもよいことが理解される。ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の末端構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよく、３’端が突き出したタイプが好ましい。センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖の３’末端に数個の塩基、好ましくは１〜３個の塩基、さらに好ましくは２個の塩基からなるオーバーハングを有するｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制する効果が大きい場合が多く、好ましいものである。オーバーハングの塩基の種類は特に制限はなく、ＲＮＡを構成する塩基あるいはＤＮＡを構成する塩基のいずれであってもよい。好ましいオーバーハング配列としては、３’末端にｄＴｄＴ（デオキシＴを２ｂｐ）等を挙げることができる。例えば、好ましいｓｉＲＮＡとしては、全てのｓｉＲＮＡのセンス・アンチセンス鎖の、３’末端にｄＴｄＴ（デオキシＴを２ｂｐ）をつけているものが挙げられるがそれに限定されない。
【００２５】
さらに、上記ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の一方または両方において１〜数個までのヌクレオチドが欠失、置換、挿入および／または付加されているｓｉＲＮＡも用いることができる。ここで、１〜数塩基とは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜４塩基、さらに好ましくは１〜３塩基、最も好ましくは１〜２塩基である。かかる変異の具体例としては、３’オーバーハング部分の塩基数を０〜３個としたもの、３’−オーバーハング部分の塩基配列を他の塩基配列に変更したもの、あるいは塩基の挿入、付加または欠失により上記センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖の長さが１〜３塩基異なるもの、センス鎖および／またはアンチセンス鎖において塩基が別の塩基にて置換されているもの等が挙げられるが、これらに限定されない。ただし、これらの変異体ｓｉＲＮＡにおいてセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイゼーションしうること、ならびにこれらの変異体ｓｉＲＮＡが変異を有しないｓｉＲＮＡと同等の遺伝子発現抑制能を有することが必要である。
【００２６】
さらに、ｓｉＲＮＡは、一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するｓｉＲＮＡ（Short  Hairpin  RNA;shRNA）であってもよい。ｓｈＲＮＡは、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖ＲＮＡ、該センス鎖配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖ＲＮＡ、およびその両鎖を繋ぐリンカー配列を含むＲＮＡであり、センス鎖部分とアンチセンス鎖部分がハイブリダイズし、二本鎖ＲＮＡ部分を形成する。
【００２７】
ｓｉＲＮＡは、臨床使用の際には、いわゆるｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を示さないことが望ましい。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果とは、標的遺伝子以外に、使用したｓｉＲＮＡに部分的にホモロジーのある別の遺伝子の発現を抑制する作用をいう。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けるために、候補ｓｉＲＮＡについて、予めＤＮＡマイクロアレイなどを利用して交差反応がないことを確認することが可能である。また、ＮＣＢＩ（National  Center  for  Biotechnology  Information）などが提供する公知のデータベースを用いて、標的となる遺伝子以外に候補ｓｉＲＮＡの配列と相同性が高い部分を含む遺伝子が存在しないかを確認する事によって、ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けることが可能である。
【００２８】
本発明のｓｉＲＮＡを作製するには、化学合成による方法および遺伝子組換え技術を用いる方法等、公知の方法を適宜用いることができる。合成による方法では、配列情報に基づき、常法により二本鎖ＲＮＡを合成することができる。また、遺伝子組換え技術を用いる方法では、センス鎖配列やアンチセンス鎖配列をコードする発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入後、転写により生成されたセンス鎖ＲＮＡやアンチセンス鎖ＲＮＡをそれぞれ取得することによって作製することもできる。また、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖、該センス鎖配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖、およびその両鎖を繋ぐリンカー配列を含み、ヘアピン構造を形成するｓｈＲＮＡを発現させることにより、所望の二本鎖ＲＮＡを作製することもできる。
【００２９】
ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現抑制活性を有する限りにおいては、ｓｉＲＮＡを構成する核酸の全体またはその一部は、天然の核酸であってもよいし、修飾された核酸であってもよい。
【００３０】
本発明におけるｓｉＲＮＡは、必ずしも標的配列に対する一組の２本鎖ＲＮＡである必要はなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組（この「複数」とは特に制限されないが、好ましくは２〜５個程度の少数を指す。）の２本鎖ＲＮＡの混合物であってもよい。ここで標的配列に対応した核酸混合物としてのｓｉＲＮＡは、当業者においては市販の核酸合成機およびＤＩＣＥＲ酵素を用いて適宜作製することが可能であり、また、所望のＲＮＡの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。なお、本発明のｓｉＲＮＡには、所謂「カクテルｓｉＲＮＡ」が含まれる。また、本発明におけるｓｉＲＮＡは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド（ＲＮＡ）でなくともよい。即ち、本発明において、ｓｉＲＮＡを構成する１もしくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、グアニン、シトシン、チミン（ウラシル））であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことをいう。
【００３１】
さらに、本発明の上記ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）もまた、ｍＴＯＲ等の発現を抑制し得る核酸の好ましい実施形態に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）は、該二本鎖ＲＮＡの一方の鎖をコードするＤＮＡ、および該二本鎖ＲＮＡの他方の鎖をコードするＤＮＡが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するＤＮＡである。本発明の上記ＤＮＡは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、目的のＲＮＡをコードするＤＮＡを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
【００３２】
本発明において標的遺伝子の発現を抑制する核酸には、修飾された核酸を用いてもよい。修飾された核酸とは、ヌクレオシド（塩基部位、糖部位）および／またはヌクレオシド間結合部位に修飾が施されていて、天然の核酸と異なった構造を有するものを意味する。修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド」としては、例えば、無塩基（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオシド；アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシド；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基が結合したペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ核酸等が挙げられる。上記糖修飾を有するヌクレオシドには、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−デオキシ−２’−フルオロリボース、３’−Ｏ−メチルリボース等の置換五単糖；１’，２’−デオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース糖；六単糖およびアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。これらのヌクレオシドは塩基部位が修飾された修飾塩基であってもよい。このような修飾塩基には、例えば、５−ヒドロキシシトシン、５−フルオロウラシル、４−チオウラシル等のピリミジン；６−メチルアデニン、６−チオグアノシン等のプリン；および他の複素環塩基等が挙げられる。
【００３３】
修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド間結合」としては、例えば、アルキルリンカー、グリセリルリンカー、アミノリンカー、ポリ（エチレングリコール）結合、メチルホスホネートヌクレオシド間結合；メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、サルファメート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カルボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホルアミデートなどの非天然ヌクレオシド間結合が挙げられる。
【００３４】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡに含まれる核酸配列としては、ｍＴＯＲまたは他のｍＴＯＲのシグナル伝達のメンバーに対するｓｉＲＮＡなどを挙げることができる。
【００３５】
また、本発明の核酸または薬剤をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入することができる。そして、得られる細胞を例えば、静脈内、動脈内等に全身投与する。眼の必要な部位等に局所的に投与することもできる。ｓｉＲＮＡはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいては非常に優れた特異的転写後抑制効果を示すが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいては血清中のヌクレアーゼ活性により速やかに分解されてしまうため持続時間が限られるためより最適で効果的なデリバリーシステム開発が求められてきた。一つの例としては、Ochiya，T  et  al.，Nature  Med．，5:707-710，1999、Curr．Gene  Ther．，1  :31-52，2001より生体親和性材料であるアテロコラーゲンが核酸と混合し複合体を形成させると、生体中の分解酵素から核酸を保護する作用がありｓｉＲＮＡのキャリアーとして非常に適しているキャリアーであると報告されており、このような形態を利用することができるが、本発明の核酸、治療または予防薬の導入の方法はこれには限られない。このようにして、生体内においては血清中の核酸分解酵素の働きにより、速やかに分解されてしまうため長時間の効果の継続を達成することができる。例えば、Takeshita  F.  PNAS.(2003)  102(34)  12177-82、Minakuchi  Y  Nucleic  Acids  Reserch(2004)  32(13)  e109では、牛皮膚由来のアテロコラーゲンが核酸と複合体を形成し、生体内の分解酵素から核酸を保護する作用があり、ｓｉＲＮＡのキャリアーとして非常に適していると報告されており、このような技術を用いることができる。
【００３６】
本明細書において「ｉＦＥＣＤ」（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  Ｆｕｃｈｓ’  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）は、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞の略称である。ｉＦＥＣＤの製造法については、例えば、ＷＯ２０１５／０１５６５５に記載されている。
【００３７】
本明細書において「ＨＣＥＣ」（ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）とは、ヒト角膜内皮細胞の略称である。「ｉＨＣＥＣ」は、不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）ヒト角膜内皮細胞の略称である。
【００３８】
本明細書において、「プログラム細胞死」とは、あらかじめプログラムされているかのように決まった時期や環境で自発的に細胞が死ぬ現象を指す。プログラム細胞死は、例えば「アポトーシス」を含む意味で使用される。
【００３９】
本明細書において「トランスフォーミング増殖因子−β（トランスフォーミング成長因子−β；略称ＴＧＦ−βとも表示される）」とは、当該分野で用いられるものと同様の意味で用いられ、様々な硬化性疾患や、関節リウマチ、増殖性硝子体網膜症の病態形成を担い、脱毛に深く関与し、免疫担当細胞の働きを抑制する一方、プロテアーゼの過剰産生を抑制することによって肺組織が分解され肺気腫に陥るのを防ぎ、癌細胞の増殖を抑制するなど、多彩な生物活性を示す分子量２５ｋＤのホモダイマー多機能性サイトカインである。「ＴＧＦ−βシグナル」とは、ＴＧＦ−βによって媒介されるシグナルであって、ＴＧＦ−βによって惹起されるものをいう。ＴＧＦ−βシグナル例えば、ＴＧＦ−β２によって媒介されるシグナルが含まれ、このほか、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３等によって媒介されるシグナルも例示される。ＴＧＦ−βについて、ヒトでは、ＴＧＦ−β１〜β３までの相同性約７０％の３つのアイソフォームが存在し、その作用は類似している。ＴＧＦ−βはレセプターに結合できない分子量約３００ｋＤの不活性な潜在型として産生され、標的細胞表面やその周囲において活性化されてレセプターに結合できる活性型となり、その作用を発揮する。
【００４０】
理論に束縛されることを望まないが、標的細胞におけるＴＧＦ−βの作用はＳｍａｄという情報伝達を担う一連のタンパク質のリン酸化経路によって伝達されるとされている。まず、活性型ＴＧＦ−βが標的細胞表面に存在するＩＩ型ＴＧＦ−βレセプターに結合すると、ＩＩ型レセプター２分子とＩ型ＴＧＦ−βレセプター２分子からなるレセプター複合体が形成され、ＩＩ型レセプターがＩ型レセプターをリン酸化する。次に、リン酸化Ｉ型レセプターは、Ｓｍａｄ２またはＳｍａｄ３をリン酸化すると、リン酸化されたＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３はＳｍａｄ４と複合体を形成して核に移行し、標的遺伝子プロモーター領域に存在するＣＡＧＡ  ｂｏｘと呼ばれる標的配列に結合し、コアクチベーターとともに標的遺伝子の転写発現を誘導するとされている。
【００４１】
トランスフォーミング（形質転換）増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達経路は、その標的遺伝子の調節によって、細胞増殖および分化、増殖停止、プログラム細胞死、ならびに上皮間充織分化転換（ＥＭＴ；上皮間葉転換ともいう）といったような、多くの細胞活性を調節することができる。ＴＧＦ−β自体（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３）、アクチビンおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が含まれる、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、細胞増殖、分化、移動およびプログラム細胞死等の強力な調節剤である。
【００４２】
ＴＧＦ−βは、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球および活性化マクロファージを含め、多くの細胞により、および多くの他の細胞型により産生される、約２４Ｋｄのタンパク質である。免疫系に対するＴＧＦ−βの効果の中には、ＩＬ−２レセプター誘導、ＩＬ−１誘発性胸腺細胞増殖の阻害、およびＩＦＮ−γ誘発性マクロファージ活性化の遮断がある。ＴＧＦ−βは、様々な病的状態に関与すると考えられており（Ｂｏｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：１）、そして腫瘍抑制物質または腫瘍プロモーターのいずれかとして機能することが十分裏付けられている。
【００４３】
ＴＧＦ−βは、２つのセリン／スレオニンキナーゼ細胞表面レセプターであるＴＧＦ−βＲＩＩおよびＡＬＫ５によって、そのシグナル伝達を媒介する。ＴＧＦ−βシグナル伝達は、ＴＧＦ−βＲＩＩがＡＬＫ５レセプターをリン酸化するのを可能とする、リガンド誘発性レセプター二量体化で開始される。そのリン酸化は、ＡＬＫ５キナーゼ活性を活性化して、活性化ＡＬＫ５は次に、下流エフェクターＳｍａｄタンパク質（ＭＡＤの脊椎動物相同体、または「Ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＤＰＰ（デカペンタプレジック）」タンパク質）、Ｓｍａｄ２または３をリン酸化する。Ｓｍａｄ４とのｐ−Ｓｍａｄ２／３複合体は、核に入って、標的遺伝子の転写を活性化する。
【００４４】
Ｓｍａｄ３は、ＳｍａｄのＲ−Ｓｍａｄ（レセプター−活性化Ｓｍａｄ）サブグループのメンバーであって、ＴＧＦ−βレセプターによる転写活性化の直接メディエーターである。ＴＧＦ−β刺激は、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３のリン酸化および活性化をもたらし、これらは、Ｓｍａｄ４（脊椎動物における「共通（ｃｏｍｍｏｎ）Ｓｍａｄ」または「ｃｏ−Ｓｍａｄ」）と複合体を形成し、これが核と共に蓄積して、標的遺伝子の転写を調節する。Ｒ−Ｓｍａｄは、細胞質に局在し、そしてＴＧＦ−βレセプターによるリガンド誘発性リン酸化で、ｃｏ−Ｓｍａｄと複合体を形成して、核へと移動し、ここで、それらは、クロマチンおよび協同転写因子と関連のある遺伝子発現を調節する。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は阻害性Ｓｍａｄ（「Ｉ−Ｓｍａｄ」）であり、すなわち、ＴＧＦ−βにより転写的に誘発されて、ＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害剤として機能する（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１：６５９）。Ｓｍａｄ６／７は、Ｒ−Ｓｍａｄのレセプター媒介活性化を妨げることにより、それらの阻害効果を発揮する；それらは、Ｒ−Ｓｍａｄの動員およびリン酸化を競合的に妨げる、Ｉ型レセプターと関連する。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は、Ｓｍａｄ６／７相互作用タンパク質のユビキチン化および分解をもたらす、Ｅ３ユビキチンリガーゼを補充することが知られている。
【００４５】
ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、このほか、ＢＭＰ−７などによって伝達される経路も存在し、これは、ＡＬＫ−１／２／３／６を経由し、Ｓｍａｄ１／５／８を介して機能が発現されるとされている。ＴＧＦ−βシグナル伝達経路については、J.  Massagu’e,  Annu.  Rev.  Biochem.  1998.  67:  753-91;Vilar  JMG,  Jansen  R,  Sander  C  (2006)  PLoS  Comput  Biol  2(1):e3;  Leask,  A.,  Abraham,  D.  J.  FASEB  J.18,  816-827  (2004);  Coert  Margadant  &  Arnoud  Sonnenberg  EMBO  reports  (2010)11,  97-105;  Joel  Rosenbloom  et  al.,  Ann  Intern  Med.  2010;  152:  159-166等を参照のこと。
【００４６】
本明細書において、「眼の症状、障害または疾患」とは、眼における任意の症状、障害または疾患をいう。眼の症状、障害または疾患は、例えば、網膜、硝子体液、水晶体、角膜、強膜、または眼の他の部分の症状、障害または疾患である。本発明におけるｍＴＯＲインヒビターは、特に角膜内皮の症状、障害または疾患に有効であり得る。
【００４７】
本明細書において「トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患」とは、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βに誘導される任意の角膜内皮の症状、障害または疾患を指す。本発明では、角膜内皮細胞、例えば、フックス角膜内皮ジストロフィのモデル細胞（例えば、ｉＦＥＣＤ）を、ＴＧＦ−β２に曝露したところ、驚くべきことに種々の障害（例えば、プログラム細胞死）が生じた。このような現象は従来よく解明されていなかった現象である。そして、本発明者らは、このＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患をさらに分析したところ、予想外にも、ｍＴＯＲインヒビターによって、この障害を抑制することができることを見出した。ＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患はｍＴＯＲのシグナル伝達経路とは異なるものであり、ＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患としては、例えば、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術後の障害、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD：posterior  polymorphous  dystrophy)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED：congenital  hereditary  endothelial  dystrophy)、特発性角膜内皮障害およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎等において、ＴＧＦ−βの発現がみられるものを挙げることができるがそれらに限定されない。特にＴＧＦ−β２の発現が通常より亢進している角膜内皮細胞または角膜内皮組織では、本発明で見出された障害またはそれに関連する障害が発現または亢進していると考えられることから、そのような角膜内皮細胞または角膜内皮組織がみられる任意の角膜内皮の症状、障害または疾患は、特に本発明の対象として意図される。
【００４８】
本明細書において「角膜内皮細胞における細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過剰発現」とは、正常な角膜内皮細胞における細胞外マトリックスの発現レベルと比べて、異常なレベルで細胞外マトリックスを発現することをいう。「異常なレベルで細胞外マトリックスを発現する」とは、フィブロネクチン等の細胞外マトリクスタンパク質が、正常形態における細胞外マトリクスにおいて産生されている量よりも多く産生されていることをいう。産生状況は刺激なしのものに加え、必要に応じてトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βに対する応答により発現量が増加することも含む。たとえば、ヒト角膜内皮細胞についていえば、正常における細胞外マトリクスの量の約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２．０倍以上でありうる。正常に対する相違は統計学的に有意であることが好ましいが必ずしも有意でなくともよく、医学的に有意な相違であればよい。
【００４９】
本明細書において、「細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に起因する角膜内皮障害」またはその「症状」とは、主に細胞外マトリクスに起因する濁りや沈着、肥厚等に関連する障害またはその症状であり、角膜内皮面の疣贅（グッタータ）や、デスメ膜の混濁グッテー等の、デスメ膜の肥厚等が生じ、視力低下の原因となる症状に関連するものである。フックス角膜ジストロフィなどの角膜内皮障害においては、角膜内皮細胞の細胞死（特にアポトーシス）が原因による症状悪化とは異なり、この細胞外マトリクスの過剰産生は細胞数の減少が起こらなかったとしても視力、視感覚を悪化させるものであり、細胞死を抑制できたとしても取り組まなければならない点である。「細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰産生に起因する角膜内皮障害」またはその「症状」には以下：混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑などを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００５０】
好ましい実施形態では、本発明が対象とする症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィに関する障害である。フックス角膜内皮ジストロフィに関しては、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−β誘導が関与していることが示されており、ＦＥＣＤにおける細胞喪失に関与し得ることも示されている。したがって、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の阻害は、ＦＥＣＤの有効な治療になり得ることが当然予想される。しかしながら、本発明者らは、予想外にも、ｍＴＯＲインヒビターが、ＴＧＦ−βシグナルに起因する障害を抑制できることを見出した。
【００５１】
本発明の医薬は、フックス角膜内皮ジストロフィの中でもひとつの重要な異常または障害の原因となるＴＧＦ−β２に誘導される細胞障害等を処置しうることから、フックス角膜内皮ジストロフィの治療または予防に有用であることが理解される。特に、本発明では実施例において、フックス角膜内皮ジストロフィモデルにおいてＴＧＦ−β２に誘導される細胞障害あるいはプログラム細胞死を抑制することができたことから本発明は、フックス角膜内皮ジストロフィモデルにおけるＴＧＦ−β２に関連する重症患者の治療に使用することができると考えられる。また、本発明の医薬は、予想外にも細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過剰発現を抑制することが可能であり、ＥＣＭのデスメ層への沈着などの角膜内皮における障害等を処置または予防し得る。したがって、本発明は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害や、角膜内皮密度低下、グッテー（guttae）の形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、角膜上皮障害、混濁、瘢痕、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、ハロー、グレアおよび角膜実質の浮腫などを処置しまたは予防し得る。
【００５２】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook  J.et  al.(1989).Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual,Cold  Spring  Harborおよびその3rd  Ed.(2001);  Ausubel,F.M.(1987).Current  Protocols  in  Molecular  Biology,Greene  Pub.Associates  and  Wiley-Interscience;  Ausubel,F.M.(1989).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,Greene  Pub.Associates  and  Wiley-Interscience;  Innis,M.A.(1990).PCR  Protocols:A  Guide  to  Methods  and  Applications,Academic  Press;  Ausubel,F.M.(1992).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,Greene  Pub.Associates;  Ausubel,F.M.(1995).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,Greene  Pub.Associates;  Innis,M.A.et  al.(1995).PCR  Strategies,Academic  Press;  Ausubel,F.M.(1999).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,Wiley,and  annual  updates;  Sninsky,J.J.et  al.(1999).PCR  Applications:Protocols  for  Functional  Genomics,Academic  Press、Gait,M.J.(1985).Oligonucleotide  Synthesis:A  Practical  Approach,IRLPress;  Gait,M.J.(1990).Oligonucleotide  Synthesis:A  Practical  Approach,IRL  Press;  Eckstein,F.(1991).Oligonucleotides  and  Analogues:A  Practical  Approach,IRL  Press;  Adams,R.L.etal.(1992).The  Biochemistry  of  the  Nucleic  Acids,Chapman&Hall;  Shabarova,Z.et  al.(1994).Advanced  Organic  Chemistry  of  Nucleic  Acids,Weinheim;  Blackburn,G.M.et  al.(1996).Nucleic  Acids  in  Chemistry  and  Biology,Oxford  University  Press;  Hermanson,G.T.(I996).Bioconjugate  Techniques,  Academic  Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されている。角膜内皮細胞については、Nancy  Joyceらの報告｛Joyce,  2004  #161}  {Joyce,  2003  #7｝がよく知られているが、前述のごとく長期培養、継代培養により線維芽細胞様の形質転換を生じ、効率的な培養法の研究が現在も行われている。これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００５３】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
【００５４】
＜医薬＞
１つの局面において、本発明は、ｍＴＯＲインヒビターを含む、眼の症状、障害または疾患を予防または治療するための組成物を提供する。特に、ｍＴＯＲインヒビターは、角膜内皮における症状、障害または疾患に有効である。
【００５５】
ｍＴＯＲは、細胞内のシグナル伝達に関与し、細胞分裂、細胞の生存等の調節を担っているとされているが、角膜内皮におけるそのメカニズムは明らかになっていない。そのため、ｍＴＯＲインヒビターが、眼科、特に角膜内皮、疾患、障害または症状の治癒または予防に有効であることは予想できなかったことであり驚くべきことである。
【００５６】
１つの実施形態では、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術後の障害、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD：posterior  polymorphous  dystrophy)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED：congenital  hereditary  endothelial  dystrophy)、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎からなる群より選択される。
【００５７】
１つのさらなる好ましい実施形態では、本発明は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける細胞外マトリクスの過剰発現に起因する症状を治療または予防する作用効果を有し、このような症状の治療または予防のための医薬または治療法もしくは予防法を提供する。このような症状としては、角膜内皮面の疣贅（グッタータ）、デスメ膜の混濁グッテー、デスメ膜の肥厚、霧視、ハロー、グレア、視力低下、角膜混濁、白斑および視感覚の異常等を挙げることができる。細胞外マトリクスの過剰産生に起因する症状については、さらに以下に述べる。
【００５８】
さらに別の局面において、本発明は、ｍＴＯＲインヒビターを含む、角膜内皮細胞における細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬を提供する。上述のとおり、ｍＴＯＲインヒビターは、ＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮障害等を処置または予防し得るものであるが、ｍＴＯＲインヒビターがさらに角膜内皮細胞における細胞外マトリックスの過剰発現を抑制することが可能であることは驚くべきことであった。これは、ｍＴＯＲインヒビターが、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βシグナルおよび細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮障害を同時に処置し得ることを示唆する。特に、フックス角膜内皮ジストロフィは、ＴＧＦ−βシグナルに起因して角膜内皮細胞の密度が著しく減少し、さらに細胞外マトリクスがデスメ膜に沈着しグッテー（Corneal  guttae）およびデスメ膜の肥厚を生じる疾患であるため、細胞外マトリックスの過剰発現を抑制することは、フックス角膜内皮ジストロフィの治療および予防における著明な改善が可能であり、場合によっては完全な治癒が可能であることを意味している。また、フックス角膜内皮ジストロフィ等の角膜内皮障害における細胞外マトリクス過剰産生により発生し得るグッテー（Corneal  guttae）およ
びデスメ膜の肥厚やこのほか混濁や沈着に関連する症状（遷延化する角膜浮腫による不可逆的な角膜実質混濁など）を改善し、処置しまたは予防することができる。
【００５９】
１つの実施形態では、角膜内皮細胞における細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、角膜内皮細胞におけるフィブロネクチンの過剰発現に起因し得る。
【００６０】
１つの実施形態では、角膜内皮細胞における細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜実質混濁、角膜上皮浮腫、角膜上皮障害、羞明、および霧視からなる群より選択される。
【００６１】
別の局面において、本発明は、ｍＴＯＲインヒビターを含む、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βシグナルおよび細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬を提供する。ｍＴＯＲインヒビターは、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βシグナルおよび細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮障害を同時に処置または予防し得る。
【００６２】
１つの実施形態では、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βシグナルおよび細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、その他の角膜内皮ジストロフィ、ならびに薬物、手術、外傷、感染症、ぶどう膜炎などによる角膜内皮障害からなる群より選択される。
【００６３】
１つの実施形態では、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βシグナルおよび細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む。フックス角膜内皮ジストロフィは、ＴＧＦ−βシグナルに起因して角膜内皮細胞の密度が著しく減少し、さらに細胞外マトリクスがデスメ膜に沈着しグッテー（Corneal  guttae）およびデスメ膜の肥厚などの障害等を生じる疾患であるため、細胞外マトリックスの過剰発現を抑制することは、フックス角膜内皮ジストロフィの著明な改善が可能であり、場合によっては完全な治癒が可能であることを意味している。ｍＴＯＲインヒビターによる、フックス角膜内皮ジストロフィ等の疾患でのグッテー（Corneal  guttae）およびデスメ膜の肥厚などの障害等の改善は、眼科疾患における質的改善をもたらすものであり、座して死すしかなかったフックス角膜内皮ジストロフィ等の疾患において、従来にない治療効果を与えることになる。
【００６４】
１つの実施形態において、本発明の利用法としては、例えば点眼薬が挙げられるが、これに限定されず、前房内への注射、徐放剤への含浸、結膜下注射、全身投与（内服、静脈注射）などの投与方法も挙げることができる。
【００６５】
１つの実施形態において、本発明において用いられるｍＴＯＲインヒビターは、眼（例えば、角膜内皮）の症状、障害または疾患の治療または予防に有効である限りどのような種類のものを使用してもよい。具体的なｍＴＯＲインヒビターとしては、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、ＰＩ−１０３、ＣＣ−２２３、ＩＮＫ１２８、ＡＺＤ８０５５、ＫＵ  ００６３７９４、ボクスタリシブ（Ｖｏｘｔａｌｉｓｉｂ（ＸＬ７６５、ＳＡＲ２４５４０９））、リダフォロリムス（Ｒｉｄａｆｏｒｏｌｉｍｕｓ（Ｄｅｆｏｒｏｌｉｍｕｓ、ＭＫ−８６６９））、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＣＺ４１５、Ｔｏｒｋｉｎｉｂ（ＰＰ２４２）、トリン１（Ｔｏｒｉｎ  １）、オミパリシブ（Ｏｍｉｐａｌｉｓｉｂ（ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＳＫ４５８））、ＯＳＩ−０２７、ＰＦ−０４６９１５０２、アピトリシブ（Ａｐｉｔｏｌｉｓｉｂ（ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２））、ＷＹＥ−３５４、ビスツセルチブ（Ｖｉｓｔｕｓｅｒｔｉｂ（ＡＺＤ２０１４））、トリン２（Ｔｏｒｉｎ  ２）、タクロリムス（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ（ＦＫ５０６））、ＧＳＫ１０５９６１５、ゲダトリシブ（Ｇｅｄａｔｏｌｉｓｉｂ（ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７））、ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）、ＢＧＴ２２６（ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６）、パロミド５２９（Ｐａｌｏｍｉｄ  ５２９（Ｐ５２９））、ＰＰ１２１、ＷＹＥ−６８７、ＣＨ５１３２７９９、ＷＡＹ−６００、ＥＴＰ−４６４６４、ＧＤＣ−０３４９、ＸＬ３８８、ゾタロリムス（Ｚｏｔａｒｏｌｉｍｕｓ（ＡＢＴ−５７８））、クリソファン酸（Ｃｈｒｙｓｏｐｈａｎｉｃ  Ａｃｉｄ）からなる群より選択される少なくとも１つを含む。
【００６６】
本発明の医薬において、上記ｍＴＯＲインヒビターは、単独で使用されてもよく、組み合わせて使用されてもよい。本発明で使用されるｍＴＯＲインヒビターの濃度は、ｍＴＯＲインヒビターの種類に応じて適宜変更することができるが、例えば、少なくとも約０．０００１ｎＭ（ｎｍｏｌ／Ｌ）、少なくとも約０．００１ｎＭ、少なくとも約０．０１ｎＭ、少なくとも約０．１ｎＭ、少なくとも約１ｎＭ、少なくとも約１０ｎＭ、少なくとも約１００ｎＭ、または少なくとも約１０００ｎＭであり得るが、これらに限定されない。本発明で使用されるｍＴＯＲインヒビターの濃度の上限としては、約１００μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）、約１０μＭ、約１μＭ、または約０．５μＭが挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用されるｍＴＯＲインヒビターの濃度範囲としては、例えば、約０．０１ｎＭ〜約１００μＭ、約０．１ｎＭ〜約１００μＭ、約１ｎＭ〜約１００μＭ、約１０ｎＭ〜約１００μＭ、約１００ｎＭ〜約１００μＭ、約１μＭ〜約１００μＭ、約０．０１ｎＭ〜約１０μＭ、約０．１ｎＭ〜約１０μＭ、約１ｎＭ〜約１０μＭ、約１０ｎＭ〜約１０μＭ、約１００ｎＭ〜約１０μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、約０．０１ｎＭ〜約１μＭ、約０．１ｎＭ〜約１μＭ、約１ｎＭ〜約１μＭ、約１０ｎＭ〜約１μＭ、約１００ｎＭ〜約１μＭ、約０．０１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１０ｎＭ〜約１００ｎＭが挙げられるが、これらに限定されない。２種以上のｍＴＯＲインヒビターを組み合わせて使用する場合はそれぞれのｍＴＯＲインヒビターの濃度を適宜変更することができる。
【００６７】
好ましい実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターは、例えば、ラパマイシン、テムシロリムスおよびエベロリムスならびにそれらの塩からなる群より選択される。理論に束縛されることを望まないが、ラパマイシン、テムシロリムスおよびエベロリムスなどのｍＴＯＲインヒビターによる処置によって、他のｍＴＯＲインヒビターに比べても、顕著な治療成績が示され、特に、フックス内皮ジストロフィ等のトランスフォーミング増殖因子−β２（ＴＧＦ−β２）に関連する角膜内皮の疾患または障害、あるいは細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰発現に関連する角膜内皮の疾患または障害の治癒成績が顕著に改善することが見出されているからである。また、これらのｍＴＯＲインヒビターはＦＤＡ、ＰＭＤＡなどですでに承認されたものであり、安全性などの面を考慮しても医薬品として眼科用医薬としても投与可能であることが期待されているからである。
【００６８】
本発明の医薬において、上記化合物は、単独で使用されてもよく、組み合わせて使用されてもよい。本発明で使用される化合物の濃度は、約０．０１ｎＭ〜１００μＭ（μｍｏｌ／ｌ）、または約０．１ｎＭ〜１００μＭ、通常約１ｎＭ〜１００μＭ、約１０ｎＭ〜１００μＭ、好ましくは約０．１〜３０μＭ、より好ましくは約１〜１０μＭであり、これらの上限下限は適宜組み合わせて設定されることができ、２種以上の化合物を組み合わせて使用する場合は適宜変更することができ、他の濃度範囲としては、例えば、通常、約０．０１ｎＭ〜１００μＭ、約０．１ｎＭ〜１００μＭ、あるいは約０．００１〜１００μＭ、好ましくは、約０．０１〜７５μＭ、約０．０５〜５０μＭ、約１〜１０μＭ、約０．０１〜１０μＭ、約０．０５〜１０μＭ、約０．０７５〜１０μＭ、約０．１〜１０μＭ、約０．５〜１０μＭ、約０．７５〜１０μＭ、約１．０〜１０μＭ、約１．２５〜１０μＭ、約１．５〜１０μＭ、約１．７５〜１０μＭ、約２．０〜１０μＭ、約２．５〜１０μＭ、約３．０〜１０μＭ、約４．０〜１０μＭ、約５．０〜１０μＭ、約６．０〜１０μＭ、約７．０〜１０μＭ、約８．０〜１０μＭ、約９．０〜１０μＭ、約０．０１〜５０μＭ、約０．０５〜５．０μＭ、約０．０７５〜５．０μＭ、約０．１〜５．０μＭ、約０．５〜５．０μＭ、約０．７５〜５．０μＭ、約１．０〜５．０μＭ、約１．２５〜５．０μＭ、約１．５〜５．０μＭ、約１．７５〜５．０μＭ、約２．０〜５．０μＭ、約２．５〜５．０μＭ、約３．０〜５．０μＭ、約４．０〜５．０μＭ、約０．０１〜３．０μＭ、約０．０５〜３．０μＭ、約０．０７５〜３．０μＭ、約０．１〜３．０μＭ、約０．５〜３．０μＭ、約０．７５〜３．０μＭ、約１．０〜３．０μＭ、約１．２５〜３．０μＭ、約１．５〜３．０μＭ、約１．７５〜３．０μＭ、約２．０〜３．０μＭ、約０．０１〜１．０μＭ、約０．０５〜１．０μＭ、約０．０７５〜１．０μＭ、約０．１〜１．０μＭ、約０．５〜１．０μＭ、約０．７５〜１．０μＭ、約０．０９〜３５μＭ、約０．０９〜３．２μＭであり、より好ましくは、約０．０５〜１．０μＭ、約０．０７５〜１．０μＭ、約０．１〜１．０μＭ、約０．５〜１．０μＭ、約０．７５〜１．０μＭを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００６９】
点眼剤として用いられる場合は、涙液などでの希釈も考慮し、毒性にも気を付けながら、上記有効濃度の約１〜１００００倍、好ましくは約１００〜１００００倍、例えば、約１０００倍を基準として製剤濃度を決定することができ、これらを上回る濃度を設定することも可能である。例えば、約０．０１μＭ（μｍｏｌ／ｌ）〜１０００ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）、約０．１μＭ〜１００ｍＭ、約１μＭ〜１００ｍＭ、約１０μＭ〜１００ｍＭ、あるいは約０．１μＭ〜３０ｍＭ、約１μＭ〜３０ｍＭ、より好ましくは約１μＭ〜１０ｍＭ、約１０μＭ〜１０ｍＭ、約１００μＭ〜１０ｍＭ、約１０μＭ〜１００ｍＭ、約１００μＭ〜１００ｍＭであり、約￥ｍＭ〜１０ｍＭ、約１ｍＭ〜１００ｍＭであり得、これらの上限下限は適宜組み合わせて設定されることができ、２種以上の化合物を組み合わせて使用する場合は適宜変更することができる。
【００７０】
別の実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターはラパマイシンである。使用されるラパマイシンの濃度は、少なくとも約０．１ｎＭであり、少なくとも約１ｎＭであり、少なくとも約１０ｎＭであり、好ましくは、約１００ｎＭである。好ましい実施形態では、ラパマイシンは点眼剤として用いられ、その場合の使用されるラパマイシンの濃度は、少なくとも約０．１ｍＭであり、少なくとも約１ｍＭであり、少なくとも約１０ｍＭであり、好ましくは、少なくとも約１００ｍＭである。濃度の上限としては飽和量または１０００ｍＭが例示される。
【００７１】
別の実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターはテムシロリムスである。使用されるテムシロリムスの濃度は、少なくとも約０．０１ｎＭであり、少なくとも約０．１ｎＭであり、好ましくは、約１ｎＭ、好ましくは、約１０ｎＭ、より好ましくは、約１００ｎＭ、より好ましくは、約１μＭ、より好ましくは、約１０μＭ、である。テムシロリムスは点眼剤として用いられ、その場合の使用されるテムシロリムスの濃度は、少なくとも約０．０１ｍＭであり、少なくとも約０．１ｍＭであり、少なくとも約１ｍＭであり、好ましくは、少なくとも約１０ｍＭである。濃度の上限としては飽和量または１０００ｍＭが例示される。別の実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターはエベロリムスである。使用されるエベロリムスの濃度としては、少なくとも約０．１ｎＭであり、少なくとも約１ｎＭであり、少なくとも約１０ｎＭであり、好ましくは、約１００ｎＭである。エベロリムスは点眼剤として用いられ、その場合の使用されるエベロリムスの濃度は、少なくとも約０．１ｍＭであり、少なくとも約１ｍＭであり、少なくとも約１０ｍＭであり、好ましくは、少なくとも約１００ｍＭである。濃度の上限としては飽和量または１０００ｍＭが例示される。
【００７２】
１つの実施形態では、本発明の治療または予防するための医薬は、角膜内皮を有する任意の動物、例えば哺乳動物を対象とすることができ、好ましくは霊長類の角膜内皮の治療または予防を目的とする。好ましくは、この治療または予防の対象は、ヒトの角膜内皮である。
【００７３】
さらなる実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターは、ｍＴＯＲ遺伝子の発現抑制物質で合ってもよい。ｍＴＯＲ遺伝子の発現抑制物質としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸またはリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
特定の実施形態では、ｍＴＯＲインヒビターはｍＴＯＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡである。本発明において使用されるｓｉＲＮＡの代表的な例は、以下：
ＣＡＵＵＣＧＣＡＵＵＣＡＧＵＣＣＡＵＡｔｔ（配列番号１）
に示されるセンス鎖と
ＵＡＵＧＧＡＣＵＧＡＡＵＧＣＧＡＡＵＧａｔ（配列番号２）
に示されるアンチセンス鎖とを含むがこれに限定されず、ｍＴＯＲ遺伝子に対するアンチセンス効果あるいはＲＮＡｉ効果させあれば、どのような配列でもよい。これらのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、１〜３塩基のヌクレオチドが欠失、置換、挿入および／または付加されていてもよい。
【００７５】
別の局面では、本発明は、ｍＴＯＲインヒビターの有効量をそれを必要な被験体に投与する工程を含む、眼（例えば、角膜内皮）の症状、障害または疾患（角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βシグナルおよび／または細胞外マトリクスの過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患）の治療または予防のための方法を提供する。
【００７６】
本明細書において「被験体」とは、本発明の治療および予防するための医薬または方法の投与(移植)対象を指し、被験体としては、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等)があげられるが、霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。
【００７７】
特定の疾患、障害または状態の治療に有効な本発明の医薬の有効量は、障害または状態の性質によって変動しうるが、当業者は本明細書の記載に基づき標準的臨床技術によって決定可能である。さらに、必要に応じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物に使用しようとする正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重大性によっても変動しうるため、担当医の判断および各患者の状況に従って、決定すべきである。しかし、投与量は特に限定されないが、例えば、１回あたり０．００１、１、５、１０、１５、１００、または１０００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。投与間隔は特に限定されないが、例えば、１、７、１４、２１、または２８日あたりに１または２回投与してもよく、それらいずれか２つの値の範囲あたりに１または２回投与してもよい。投与量、投与回数、投与間隔、投与方法は、患者の年齢や体重、症状、投与形態、対象臓器等により、適宜選択してもよい。例えば、本発明は点眼剤として使用され得る。また、本発明の医薬を前房内に注入することもできる。また治療薬は、治療有効量、または所望の作用を発揮する有効量の有効成分を含むことが好ましい。治療マーカーが、投与後に有意に減少した場合に、治療効果があったと判断してもよい。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量−反応曲線から推定可能である。
【００７８】
＜角膜内皮細胞の保存および増殖＞
別の局面において、本発明は、ｍＴＯＲインヒビターを含む角膜内皮細胞を保存するための組成物を提供する。本発明はまた、ｍＴＯＲインヒビターの有効量を角膜内皮細胞に接触させる工程を包含する、角膜内皮細胞を保存するための方法を提供する。角膜内皮細胞の保存に使用されるｍＴＯＲインヒビター等の実施形態は、本明細書において＜医薬＞において記載される任意の実施形態が利用可能であることが理解される。角膜内皮細胞への接触、インビボであっても、エキソビボであってもインビトロであってもよく、細胞製剤の製造において使用されてもよい。
【００７９】
別の局面において、本発明は、ｍＴＯＲインヒビターを含む角膜内皮細胞を増殖する、または増殖を促進するための組成物を提供する。本発明はまた、ｍＴＯＲインヒビターの有効量を角膜内皮細胞に接触させる工程を包含する、角膜内皮細胞を増殖する、または増殖を促進するための方法を提供する。角膜内皮細胞の増殖または増殖の促進に使用されるｍＴＯＲインヒビター等の実施形態は、本明細書において＜医薬＞において記載される任意の実施形態が利用可能であることが理解される。角膜内皮細胞への接触、インビボであっても、エキソビボであってもインビトロであってもよく、細胞製剤の製造において使用されてもよい。
【００８０】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００８１】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００８２】
以下に、本発明の例を記載する。該当する場合生物試料等の取り扱いは、厚生労働省、文部科学省等において規定される基準を遵守し、該当する場合はヘルシンキ宣言またはその宣言に基づき作成された倫理規定に基づいて行った。研究のための眼の寄贈については、全ての故人ドナーの近親者から同意書を得た。本研究は、エルランゲン大学（ドイツ）、ＳｉｇｈｔＬｉｆｅＴＭ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）アイバンクの倫理委員会またはそれに準ずるものの承認を受けた。
【００８３】
（調製例：フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）モデルの作製）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞から不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）を作製した。
【００８４】
（培養方法）
シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地はＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ，  Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：３１９８５−０７０）に、８％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）、２００ｍｇ／ｍｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）、０．０８％  コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）、２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：１５７１０−０６４）および５ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を加えた３Ｔ３フィーダー細胞用の馴化させたものを基本培地として用いた。また、基本培地にＳＢ４３１５４２（１μｍｏｌ／ｌ）およびＳＢ２０３５８０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルホニルフェニル）−５（４−ピリジル）イミダゾール＜４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）（１μｍｏｌ／ｌ）を添加したもの（本明細書では「ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地」ともいう）で培養した。
【００８５】
（取得方法）
フックス角膜内皮ジストロフィの臨床診断により水疱性角膜症に至り、角膜内皮移植（デスメ膜内皮角膜移植＝ＤＭＥＫ）を実施されたヒト患者３名より文書による同意および倫理員会の承認のもと角膜内皮細胞を得た。ＤＭＥＫの際に機械的に病的な角膜内細胞と基底膜であるデスメ膜とともに剥離し、角膜保存液であるＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（ボシュロム社）に浸漬した。その後、コラゲナーゼ処理を行い酵素的に角膜内皮細胞を回収して、ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地により培養した。培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞はＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子をＰＣＲにより増幅して、レンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３＿Ｖ５−ＴＯＰＯ；  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）に導入した。その後、レンチウイルスベクターを３種類のヘルパープラスミド（ｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬＰ／ＶＳＶＧ；  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）とともにトランスフェクション試薬（Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ；  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を用いて２９３Ｔ  細胞  （ＲＣＢ２２０２；  Ｒｉｋｅｎ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｉｂａｒａｋｉ，  Ｊａｐａｎ）に感染させた。４８時間の感染後にウイルスを含む培養上清を回収して、５μｇ／ｍｌのポリブレンを用いて、培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞の培養液に添加して、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子を導入した。フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の位相差顕微鏡像を確認した。コントロールとしてシアトルアイバンクから輸入した研究用角膜より培養した角膜内皮細胞を同様の方法で不死化し、正常角膜内皮細胞の不死化細胞株を作製した（ｉＨＣＥＣ）。健常ドナー由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＨＣＥＣ）および不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の位相差顕微鏡像をみると、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはいずれも正常の角膜内皮細胞同様に一層の多角形の形態を有する。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）により維持培養を行った。
【００８６】
（実施例１：ＴＧＦ−β２により誘導される細胞障害に対するラパマイシンの抑制効果）
本実施例では、ｍＴＯＲインヒビターの代表例であるラパマイシンの、眼の細胞障害に対する効果を実証した。
【００８７】
（材料および方法）
ｉＦＥＣＤを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で３分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３２７７８−３４）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１%Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２−９４）を使用した。
【００８８】
１２ウェルプレートにｉＦＥＣＤを１ウェル当たり１×１０５個の割合で播種し、３７℃（５％  ＣＯ２）で２４時間培養した（培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した）。２４時間後、培地を除去し、ラパマイシンを添加し２４時間培養した（培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した）。２４時間後、培地を除去し、１０ｎｇ/ｍｌの組み換えヒトＴＧＦ−β２（Ｗａｋｏ、２００−１９９１１）およびラパマイシンを含有する培地を添加し、２４時間培養を行った（培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した）。２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。
【００８９】
（結果）
（ラパマイシンはＴＧＦ−β２により誘導される細胞障害を抑制する）
図１に結果を示す。ラパマイシン非存在下で、組み換えヒトＴＧＦ−β２によりｉＦＥＣＤを刺激した場合、顕著に細胞が障害されていることが認められる。他方で、ラパマイシンでプレトリートメントした場合、角膜内皮細胞の障害が抑制されていることが観察された。したがって、ラパマイシンは組み換えヒトＴＧＦ−β２により誘導される細胞障害を抑制することが認められた。
【００９０】
（実施例２：ＴＧＦ−β２により誘導されるカスパーゼ活性のラパマイシンによる抑制効果）
本実施例では、ｍＴＯＲインヒビターの代表例であるラパマイシンの、カスパーゼ活性に対する効果を実証した。
【００９１】
（材料および方法）
ｉＦＥＣＤを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で３分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３２７７８−３４）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１%Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２−９４）を使用した。
【００９２】
１２ウェルプレートにｉＦＥＣＤを１ウェル当たり１×１０５個の割合で播種し、３７℃（５％  ＣＯ２）で２４時間培養した（培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した）。２４時間後、培地を除去し、ラパマイシンを添加し２４時間培養した（培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した）。２４時間後、培地を除去し、１０ｎｇ/ｍｌの組み換えヒトＴＧＦ−β２（Ｗａｋｏ、２００−１９９１１）およびラパマイシンを含有する培地を添加し、２４時間培養を行った（培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した）。２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。
【００９３】
観察後、以下の手順でタンパク質のウェスタンブロットを行った。
【００９４】
１）タンパク質の回収
浮遊及び死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した溶液も回収し、４℃、８００ｇで１２分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＳＤＳ、０．５％  ＤＯＣ、１％ＮＰ−４０）を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊及び死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＳＨＯ  ＤＥＮＫＩ製）にて冷水中で３０秒、３回粉砕後に、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分遠心し、タンパク質の上清を回収した。
【００９５】
２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質８μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体は、ウサギ抗Ｃａｓｐａｓｅ  ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９６６２）、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５４２）、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１−３）を用いた。２次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＡ９３１Ｖ，ＮＡ９３４Ｖ）を用いた。１次抗体はウサギ抗Ｃａｓｐａｓｅ  ３抗体：１０００倍希釈、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体：２０００倍希釈、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体：５０００倍希釈し、２次抗体は５０００倍希釈した。検出にはＣｈｅｍｉ  Ｌｕｍｉ  ＯＮＥ  Ｕｌｔｒａ（ナカライテスク、１１６４４−４０）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）及びIｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により解析した。
【００９６】
（結果）
（ラパマイシンは、ＴＧＦ−β２により誘導されるカスパーゼ活性を抑制する）
図２にカスパーゼについてのウェスタンブロットの結果を示す。ラパマイシン非存在下で、組み換えヒトＴＧＦ−β２によりｉＦＥＣＤを刺激した場合、活性型である約１７ｋＤａの切断カスパーゼ３（約１７ｋＤａ）が認められた。他方で、ラパマイシン添加群においては、活性型の切断カスパーゼ３はほとんど確認されなかった。したがって、による解析よりラパマイシンは組み換えヒトＴＧＦ−β２により誘導されるカスパーゼの活性化を抑制することが認められた。ｍＴＯＲは、カスパーゼのシグナルとは無関係であり、また、ｍＴＯＲインヒビターがカスパーゼの活性化を抑制することも知られていないため、ラパマイシンが、カスパーゼの活性化を抑制できたことは驚くべきことであった。
【００９７】
（実施例３：組み換えヒトＴＧＦ−β２により誘導されるＳ６Ｋのリン酸化活性のラパマイシンによる抑制効果）
本実施例では、ｍＴＯＲインヒビターの代表例であるラパマイシンの、ＴＧＦ−β２により誘導されるＳ６Ｋのリン酸化活性に対する効果を実証した。
【００９８】
（材料および方法）
ｉＦＥＣＤを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で３分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３２７７８−３４）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１%Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２−９４）を使用した。
【００９９】
１２ウェルプレートにｉＦＥＣＤを１ウェル当たり７×１０４個の割合で播種し、３７℃（５％  ＣＯ２）で２４時間培養した（培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した）。２４時間後、培地を除去し、ラパマイシンを添加し２４時間培養した（培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した）。２４時間後、培地を除去し、１０ｎｇ/ｍｌの組み換えヒトＴＧＦ−β２（Ｗａｋｏ、２００−１９９１１）およびラパマイシンを含有する培地を添加し、２４時間培養を行った（培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した）。２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。
【０１００】
観察後、以下の手順でタンパク質のウェスタンブロットを行った。
【０１０１】
１）タンパク質の回収
浮遊及び死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した溶液も回収し、４℃、８００ｇで１２分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＳＤＳ、０．５％  ＤＯＣ、１％ＮＰ−４０）を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊及び死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＳＨＯ  ＤＥＮＫＩ製）にて冷水中で３０秒、３回粉砕後に、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分遠心し、タンパク質の上清を回収した。
【０１０２】
２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質５μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体は、ウサギ抗Ａｋｔ１抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２９３８）、マウス抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、４０５１）、ウサギ抗Ｓ６Ｋ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９２０２）、ウサギ抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ６Ｋ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９２０４）、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１−３）を用いた。２次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＡ９３１Ｖ，ＮＡ９３４Ｖ）を用いた。１次抗体はウサギ抗Ａｋｔ抗体：１０００倍希釈、マウス抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ抗体：１０００倍希釈、ウサギ抗Ｓ６Ｋ抗体：１０００倍希釈、ウサギ抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ６Ｋ抗体：１０００倍希釈、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体：５０００倍希釈し、２次抗体は５０００倍希釈した。検出にはＣｈｅｍｉ  Ｌｕｍｉ  ＯＮＥ  Ｕｌｔｒａ（ナカライテスク、１１６４４−４０）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）及びIｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社
）により解析した。
【０１０３】
（結果）
（ラパマイシンはＴＧＦ−β２により誘導されるＳ６Ｋのリン酸化活性を抑制する）
図３に結果を示す。ラパマイシン非存在下で、組み換えヒトＴＧＦ−β２によりｉＦＥＣＤを刺激した場合、Ａｋｔのリン酸化活性が認められた。他方で、ラパマイシン添加群においては、Ｓ６Ｋのリン酸化活性が抑制された。ウェスタンブロットによる解析よりラパマイシンはｍＴＯＲシグナル経路の阻害作用を有することを確認した。ＡｋｔはｍＴＯＲの上流、Ｓ６ＫはｍＴＯＲの下流に存在する。そのため、ｍＴＯＲインヒビターにより、上流のＡｋｔはリン酸化され、他方で下流のＳ６Ｋのリン酸化は抑制されたことから、ラパマイシンがｍＴＯＲ経路を阻害していることが確認された。
【０１０４】
（実施例４：ＴＧＦ−β２により誘導されるＳｍａｄ２／３のリン酸化活性のラパマイシンによる抑制効果）
本実施例では、ｍＴＯＲインヒビターの代表例であるラパマイシンの、ＴＧＦ−β２により誘導されるＳｍａｄ２／３のリン酸化活性に対する抑制効果を実証した。
【０１０５】
（材料および方法）
ｉＦＥＣＤを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で３分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３２７７８−３４）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１%Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２−９４）を使用した。
【０１０６】
１２ウェルプレートにｉＦＥＣＤを１ウェル当たり８×１０４個の割合で播種し、３７℃（５％  ＣＯ２）で２４時間培養した（培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した）。２４時間後、培地を除去し、ラパマイシンを添加し２４時間培養した（培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した）。２４時間後、培地を除去し、１０ｎｇ/ｍｌの組み換えヒトＴＧＦ−β２（Ｗａｋｏ、２００−１９９１１）およびラパマイシンを含有する培地を添加し、２４時間培養を行った（培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した）。２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。
【０１０７】
観察後、以下の手順でタンパク質のウェスタンブロットを行った。
【０１０８】
１）タンパク質の回収
浮遊及び死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した溶液も回収し、４℃、８００ｇで１２分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＳＤＳ、０．５％  ＤＯＣ、１％ＮＰ−４０）を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊及び死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＳＨＯ  ＤＥＮＫＩ製）にて冷水中で３０秒、３回粉砕後に、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分遠心し、タンパク質の上清を回収した。
【０１０９】
２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質８μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体は、ウサギ抗Ｓｍａｄ２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、５３３９）、マウス抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、３１０８）、ウサギ抗Ｓｍａｄ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５２３）、ウサギ抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５２０）、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１−３）を用いた。２次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＡ９３１Ｖ，ＮＡ９３４Ｖ）を用いた。１次抗体はウサギ抗Ｓｍａｄ２抗体：１０００倍希釈、マウス抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ２抗体：１０００倍希釈、ウサギ抗Ｓｍａｄ３抗体：１０００倍希釈、ウサギ抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ３抗体：１０００倍希釈、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体：５０００倍希釈し、２次抗体は５０００倍希釈した。検出にはＣｈｅｍｉ  Ｌｕｍｉ  ＯＮＥ  Ｕｌｔｒａ（ナカライテスク、１１６４４−４０）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）及びIｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により解析した。
【０１１０】
（結果）
（ラパマイシンはＴＧＦ−β２により誘導されるＳｍａｄ２／３のリン酸化活性を抑制しない）
図４に結果を示す。ラパマイシン存在下で、組み換えヒトＴＧＦ−β２により刺激した場合、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリン酸化活性が認められた。したがって、ウェスタンブロットによる解析よりラパマイシンは組み換えヒトＴＧＦ−β２により誘導されるＳｍａｄ２／３のリン酸化活性を抑制しないことが認められた。ＴＧＦ−βの作用は、Ｓｍａｄのリン酸化経路によって伝達されるとされているため、ラパマイシンの細胞障害抑制作用は、ＴＧＦ−βシグナルの阻害によるものでないことが明らかになった。これは、ラパマイシンが、ＴＧＦ−βシグナルを直接阻害することなくＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の障害等を抑制することを示唆しており、予想外の結果であった。
【０１１１】
（実施例５：ＴＧＦ−β２により誘導されるフィブロネクチンの産生に対するラパマイシンの抑制効果）
本実施例では、ｍＴＯＲインヒビターの代表例であるラパマイシンの、ＴＧＦ−β２により誘導されるフィブロネクチンの産生に対する抑制効果を実証した。
【０１１２】
(材料および方法）
ｉＦＥＣＤを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で３分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３２７７８−３４）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１%Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２−９４）を使用した。
【０１１３】
６ウェルプレートにｉＦＥＣＤを１ウェル当たり２×１０５個の割合で播種し、３７℃（５％  ＣＯ２）で２４時間培養した（培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した）。２４時間後、培地を除去し、ラパマイシンを添加し２４時間培養した（培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した）。２４時間後、培地を除去し、１０ｎｇ/ｍｌの組み換えヒトＴＧＦ−β２（Ｗａｋｏ、２００−１９９１１）およびラパマイシンを含有する培地を添加し、２４時間培養を行った（培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した）。２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。
【０１１４】
観察後、以下の手順でタンパク質のウェスタンブロットを行った。
【０１１５】
１）タンパク質の回収
浮遊及び死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した溶液も回収し、４℃、８００ｇで１２分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＳＤＳ、０．５％  ＤＯＣ、１％ＮＰ−４０）を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊及び死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＳＨＯ  ＤＥＮＫＩ製）にて冷水中で３０秒、３回粉砕後に、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分遠心し、タンパク質の上清を回収した。
【０１１６】
２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質５μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体は、マウス抗Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、６１００７７）、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１−３）を用いた。２次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＡ９３１Ｖ，ＮＡ９３４Ｖ）を用いた。１次抗体はマウス抗Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ抗体：１５０００倍希釈、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体：５０００倍希釈し、２次抗体は５０００倍希釈した。検出にはＣｈｅｍｉ  Ｌｕｍｉ  ＯＮＥ  Ｕｌｔｒａ（ナカライテスク、１１６４４−４０）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）及びIｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により解析した。
【０１１７】
（結果）
（ラパマイシンはＴＧＦ−β２により誘導されるフィブロネクチンの産生を抑制する）
図５に結果を示す。ラパマイシン非存在下で、組み換えヒトＴＧＦ−β２により刺激した場合、ｉＦＥＣＤにおいてフィブロネクチンの産生が認められた。他方で、ラパマシン添加群においては、フィブロネクチンの産生はほとんど確認されなかった。したがって、ウェスタンブロットによる解析よりラパマイシンは組み換えヒトＴＧＦ−β２により誘導されるフィブロネクチンの発現量を抑制することが認められた。ｍＴＯＲがフィブロネクチンなどの細胞外マトリックスの産生に関与していることは知られていなかったため、ｍＴＯＲインヒビターが、細胞外マトリックス産生を抑制することができることは予想外であった。
【０１１８】
フックス角膜内皮ジストロフィにおいてはフィブロネクチンなどの細胞外マトリックスの過剰産生およびデスメ膜への沈着による、デスメ膜肥厚、グッテー（ｇｕｔｔａｅ）の形成などの障害が生じる。これらの障害は、フックス角膜内皮ジストロフィ患者において一般的には３０代から４０代に生じ始め、生涯を通じて進行する。進行により霧視、ハロー、グレア、視力低下などの視力障害を生じる。さらに、フックス角膜内皮ジストロフィでは角膜内皮細胞が継続的に障害されるが、細胞密度が約１０００個／ｍｍ２を下回るまではポンプ機能を残された角膜内皮が代償することで角膜の透明性は維持される。一方で、約１０００個／ｍｍ２を下回ると角膜に前房水が進入することで、角膜浮腫が生じ視力障害を生じる（図１８）。このように、フックス角膜内皮ジストロフィ患者では、主に細胞外マトリックスの過剰産生と角膜内皮細胞死の２つの原因により視機能障害が生じる。本発明におけるカスパーゼ阻害剤の働きは、細胞外マトリックス産生の抑制および角膜内皮細胞死抑制の双方に働くことで、フックス角膜内皮ジストロフィ治療に特に有用であると言える。
【０１１９】
（実施例６：ｍＴＯＲの発現およびＳ６Ｋのリン酸化に対するｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡ抑制効果）
本実施例では、ｍＴＯＲインヒビターの別の代表例であるｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡの、ｍＴＯＲの発現およびＳ６Ｋのリン酸化に対する抑制効果を実証した。
【０１２０】
（材料および方法）
ｉＦＥＣＤを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で３分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３２７７８−３４）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１%Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２−９４）を使用した。
【０１２１】
１２ウェルプレートにｉＦＥＣＤを１ウェル当たり３×１０４個の割合で播種し、３７℃（５％  ＣＯ２）で２４時間培養した（培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ）。２４時間後、培地を除去し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、９２００８）及び３ｐｍｏｌのｍＴＯＲｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＳ０２６Ｍ０Ｌ）を添加し２４時間培養した（培地：ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５−０８８））。使用したｍＴＯＲｓｉＲＮＡは、配列番号１に示されるセンス鎖および配列番号２に示されるアンチセンス鎖を有する。２４時間後、培地を除去し、３７℃（５％  ＣＯ２）で７２時間培養した（培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ）。７２時間後、培地を除去し、１０ｎｇ/ｍｌの組み換えヒトＧＦ−β２（Ｗａｋｏ、２００−１９９１１）入りの培地を添加し、２４時間培養を行った（培地：ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ）。２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。
【０１２２】
観察後、以下の手順でＰＣＲ法によりｃＤＮＡの塩基配列の増幅を行った。
【０１２３】
１）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの回収
ｉＦＥＣＤを培養中の培養皿から培地を除去し、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｍ６１０Ａ）のＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを３５０μｌ添加し、細胞を溶出した。その後、３５０μｌの７０％ＥｔＯＨを添加し、ＲＮｅａｓ  ｍｉｎｉ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ）に移した後、１００００ｒｐｍで１５秒遠心し、Ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈを捨てた。さらに３０μｌのＲＮｅａｓｙ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）をＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎに添加した後、１００００ｒｐｍで１分遠心しｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。
【０１２４】
２）ｃＤＮＡ合成
抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ４５０ｎｇ、Ｒｅｖｅｒ  Ｔｒａ  Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ）、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（ＴＯＹＯＢＯ）、５×ＲＴ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ）、ランダムプライマー（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をそれぞれ添加し、Ｔ３０００  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ｂｉｏｍｅｔｒａ）を用いて補助的ＤＮＡを合成した。反応条件は３０℃で１０分のアニーリング反応、４２℃で６０分の逆転写反応、９９℃で５分の熱変性反応で行った。
【０１２５】
３）ＰＣＲ法
合成した補助的ＤＮＡ１μｌ、２×ＧＯ  Ｔａｑ  ＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を５μｌ、ｍＴＯＲのＦｏｒｗａｒｄカスタムプライマー（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１μｌ、Ｒｅｖｅｒｓｅカスタムプライマー（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１μｌ、Ｈ２Ｏを２μｌ混合し、Ｔ３０００  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ｂｉｏｍｅｔｒａ）を用いて、補助的ＤＮＡの塩基配列を増幅させた。反応条件は９４℃で２分の初期熱変性反応の後、９５℃で３０秒の熱変性反応、５３℃で２０秒のアニーリング反応、７２℃で２５秒伸長反応を２６サイクル行い、さらに７２℃で５分の伸長反応を行った。増幅の後、アガロースゲルを用いた電気泳動及びＡｍｅｒｓｈａｍＴＭ  Ｉｍａｇｅｒ  ６００（ＧＥヘルスケア・ジャパン）でＵＶ照射によって検出した。
【０１２６】
また、観察後、以下の手順でタンパク質のウェスタンブロットを行った。
【０１２７】
１）タンパク質の回収
浮遊及び死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した溶液も回収し、４℃、８００ｇ、１２分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＳＤＳ、０．５％  ＤＯＣ、１％  ＮＰ−４０）を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊及び死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＳＨＯ  ＤＥＮＫＩ製）にて冷水中で３０秒、３回粉砕後に、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分遠心し、タンパク質の上清を回収した。
【０１２８】
２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質５μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体は、ウサギ抗ｍＴＯＲ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２９７２）、ウサギ抗Ｓ６Ｋ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９２０２）、ウサギ抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ６Ｋ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９２０４）、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１−３）を用いた。２次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＡ９３１Ｖ，ＮＡ９３４Ｖ）を用いた。１次抗体はウサギ抗ｍＴＯＲ抗体：１０００倍希釈、ウサギ抗Ｓ６Ｋ抗体：１０００倍希釈、ウサギ抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ６Ｋ抗体：１０００倍希釈、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体：５０００倍希釈し、２次抗体は５０００倍希釈した。検出にはＣｈｅｍｉ  Ｌｕｍｉ  ＯＮＥ  Ｕｌｔｒａ（ナカライテスク、１１６４４−４０）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）及びIｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により解析した。
【０１２９】
（結果）
（ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡはｍＴＯＲの発現およびＳ６Ｋのリン酸化を抑制する）
図６に結果を示す。ｉＦＥＣＤにおいてｍＴＯＲに対してＲＮＡｉを行った場合、ＲＮＡレベル及びタンパクレベルのどちらにおいてもｍＴＯＲの発現抑制が認められた。また、ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡにより、タンパクレベルにおいてＳ６Ｋのリン酸化が抑制されたことが認められた。したがって、ＰＣＲ及びウェスタンブロットによる解析よりｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡはｍＴＯＲの発現およびＳ６Ｋのリン酸化を抑制したことが認められた。
【０１３０】
（実施例７：ＴＧＦ−β２により誘導される細胞障害に対するｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡの抑制効果）
ｉＦＥＣＤを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で３分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３２７７８−３４）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１%Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２−９４）を使用した。
【０１３１】
１２ウェルプレートにｉＦＥＣＤを１ウェル当たり３×１０４個の割合で播種し、３７℃（５％  ＣＯ２）で２４時間培養した（培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ）。２４時間後、培地を除去し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、９２００８）及び３ｐｍｏｌのｍＴＯＲｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＳ０２６Ｍ０Ｌ）を添加し２４時間培養した（培地：ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５−０８８））。使用したｍＴＯＲｓｉＲＮＡは、配列番号１に示されるセンス鎖および配列番号２に示されるアンチセンス鎖を有する。２４時間後、培地を除去し、３７℃（５％  ＣＯ２）で７２時間培養した（培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ）。７２時間後、培地を除去し、１０ｎｇ/ｍｌの組み換えヒトＧＦ−β２（Ｗａｋｏ、２００−１９９１１）入りの培地を添加し、２４時間培養を行った（培地：ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ）。２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。
【０１３２】
（結果）
（ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡはＴＧＦ−β２により誘導される細胞障害を抑制する）
図７に結果を示す。ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡを使用せず、組み換えヒトＴＧＦ−β２によりｉＦＥＣＤを刺激した場合、顕著に細胞が障害されていることが認められる。他方で、ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡを使用した場合、角膜内皮細胞の障害が抑制されていることが観察された。したがって、ｍＴＯＲの発現抑制がＴＧＦ−β２により誘導される細胞障害を抑制することが認められた。
【０１３３】
（実施例８：ＴＧＦ−β２により誘導されるカスパーゼの活性化に対するｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡの抑制効果）
本実施例では、ｍＴＯＲインヒビターの別の代表例であるｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡの、ＴＧＦ−β２により誘導されるカスパーゼの活性化に対する抑制効果を実証した。
【０１３４】
（材料および方法）
ｉＦＥＣＤを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で３分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３２７７８−３４）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１%Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２−９４）を使用した。
【０１３５】
１２ウェルプレートにｉＦＥＣＤを１ウェル当たり３×１０４個の割合で播種し、３７℃（５％  ＣＯ２）で２４時間培養した（培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ）。２４時間後、培地を除去し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、９２００８）及び３ｐｍｏｌのｍＴＯＲｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＳ０２６Ｍ０Ｌ）を添加し２４時間培養した（培地：ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５−０８８））。使用したｍＴＯＲｓｉＲＮＡは、配列番号１に示されるセンス鎖および配列番号２に示されるアンチセンス鎖を有する。２４時間後、培地を除去し、３７℃（５％  ＣＯ２）で７２時間培養した（培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ）。７２時間後、培地を除去し、１０ｎｇ/ｍｌの組み換えヒトＧＦ−β２（Ｗａｋｏ、２００−１９９１１）入りの培地を添加し、２４時間培養を行った（培地：ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ）。２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。
【０１３６】
観察後、以下の手順でタンパク質のウェスタンブロットを行った。
【０１３７】
１）タンパク質の回収
浮遊及び死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した溶液も回収し、４℃、８００ｇで１２分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＳＤＳ、０．５％  ＤＯＣ、１％  ＮＰ−４０）を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊及び死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＳＨＯ  ＤＥＮＫＩ製）にて冷水中で３０秒、３回粉砕後に、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分遠心し、タンパク質の上清を回収した。
【０１３８】
２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質６μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体は、ウサギ抗Ｃａｓｐａｓｅ  ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９６６２）、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５４２）、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１−３）を用いた。２次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＡ９３１Ｖ，ＮＡ９３４Ｖ）を用いた。１次抗体はウサギ抗Ｃａｓｐａｓｅ  ３抗体：１０００倍希釈、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体：２０００倍希釈、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体：５０００倍希釈し、２次抗体は５０００倍希釈した。検出にはＣｈｅｍｉ  Ｌｕｍｉ  ＯＮＥ  Ｕｌｔｒａ（ナカライテスク、１１６４４−４０）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）及びIｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により解析した。
【０１３９】
（結果）
（ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡはＴＧＦ−β２により誘導されるカスパーゼの活性化を抑制する）
図８に結果を示す。ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡを使用せず、組み換えヒトＴＧＦ−β２により刺激した場合、ｉＦＥＣＤにおいて活性型である約１７ｋＤａの切断カスパーゼ３が認められた。他方で、ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡ添加群においては、活性型の切断カスパーゼ３はほとんど確認されなかった。したがって、ウェスタンブロットによる解析より、ｍＴＯＲのシグナル抑制はＴＧＦ−β２により誘導されるカスパーゼの活性化を抑制することが示された。
【０１４０】
（実施例９：組み換えヒトＴＧＦ−β２により誘導されるフィブロネクチンの産生に対するｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡの抑制効果）
本実施例では、ｍＴＯＲインヒビターの別の代表例であるｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡの、ＴＧＦ−β２により誘導されるフィブロネクチンの産生に対する抑制効果を実証した。
【０１４１】
（材料および方法）
ｉＦＥＣＤを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で３分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３２７７８−３４）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１%Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２−９４）を使用した。
【０１４２】
１２ウェルプレートにｉＦＥＣＤを１ウェル当たり３×１０４個の割合で播種し、３７℃（５％  ＣＯ２）で２４時間培養した（培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ）。２４時間後、培地を除去し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、９２００８）及び３ｐｍｏｌのｍＴＯＲｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＳ０２６Ｍ０Ｌ）を添加し２４時間培養した（培地：ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５−０８８））。使用したｍＴＯＲｓｉＲＮＡは、配列番号１に示されるセンス鎖および配列番号２に示されるアンチセンス鎖を有する。２４時間後、培地を除去し、３７℃（５％  ＣＯ２）で４８時間培養した（培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ）。４８時間後、培地を除去し、１０ｎｇ/ｍｌの組み換えヒトＧＦ−β２（Ｗａｋｏ、２００−１９９１１）入りの培地を添加し、２４時間培養を行った（培地：ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ）。２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。
【０１４３】
観察後、以下の手順でタンパク質のウェスタンブロットを行った。
【０１４４】
１）タンパク質の回収
浮遊及び死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した溶液も回収し、４℃、８００ｇで１２分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＳＤＳ、０．５％  ＤＯＣ、１％  ＮＰ−４０）を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊及び死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＳＨＯ  ＤＥＮＫＩ製）にて冷水中で３０秒、３回粉砕後に、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分遠心し、タンパク質の上清を回収した。
【０１４５】
２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質７μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体は、マウス抗Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、６１００７７）、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１−３）を用いた。２次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＡ９３１Ｖ，ＮＡ９３４Ｖ）を用いた。１次抗体はウサギ抗Ｃａｓｐａｓｅ  ３抗体：１０００倍希釈、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体：２０００倍希釈、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体：５０００倍希釈し、２次抗体は５０００倍希釈した。検出にはＣｈｅｍｉ  Ｌｕｍｉ  ＯＮＥ  Ｕｌｔｒａ（ナカライテスク、１１６４４−４０）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）及びIｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により解析した。
【０１４６】
（結果）
（ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡは組み換えヒトＴＧＦ−β２により誘導されるフィブロネクチンの産生を抑制する）
図９に結果を示す。ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡを使用せず、組み換えヒトＴＧＦ−β２により刺激した場合、ｉＦＥＣＤにおいてフィブロネクチンの先生が認められた。他方で、ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡ添加群においては、フィブロネクチンの産生はほとんど確認されなかった。したがって、ウェスタンブロットによる解析よりｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡは組み換えヒトＴＧＦ−β２により誘導されるフィブロネクチンの発現を抑制することが認められた。
【０１４７】
（実施例１０：ＴＧＦ−β２により誘導されるカスパーゼ活性に対する各ｍＴＯＲインヒビターの抑制効果）
本実施例では、各種ｍＴＯＲインヒビターの、ＴＧＦ−β２により誘導されるカスパーゼ活性に対する抑制効果を実証した。
【０１４８】
（材料および方法）
ｉＦＥＣＤを培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で３分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３２７７８−３４）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分遠心することで細胞を回収した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１%Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２−９４）を使用した。
【０１４９】
９６ウェルプレートに不死化ＦＥＣＤ患者由来角膜内皮細胞（ロット：ｉＦＥＣＤ３−５）を１ウェル当たり４×１０３個の割合で播種し、３７℃（５％  ＣＯ２）で２４時間培養した（培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ）。２４時間後、培地を除去し、各ｍＴＯＲインヒビターを添加し２４時間培養した（培地：ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ）。２４時間後、培地を除去し、１０ｎｇ/ｍｌの組み換えヒトＴＧＦ−β２（Ｗａｋｏ、２００−１９９１１）および各ｍＴＯＲインヒビターを含有する培地を添加し、２４時間培養を行った（培地：ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ）。２４時間後、位相
差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。
【０１５０】
観察後、以下の手順で、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）  ３/７  Ａｓｓａｙによるカスパーゼ３／７活性の測定を行った。
【０１５１】
１ウェルあたり５０μｌになるように培地を捨て、Ｃａｓｐａｓｅ  Ｇｌｏ（登録商標）  ３／７  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）  ３／７  Ａｓｓａｙ  ＢｕｆｆｅｒとＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）  ３／７  Ａｓｓａｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅの混合液）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ８０９１）溶液を培地と１：１になるように５０μｌ／ｗｅｌｌ加えた。ここからの作業は遮光で行った。シェイカーを１２０分−１程度で２分よく混ぜ、室温で４０分静置させた。静置後、Ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９１２、Ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｅ  ９６ｗｅｌｌ、ｗｈｉｔｅ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）に８０μｌを移し、ＧｌｏＭａｘ-Ｍｕｌｔｉ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ７０５１）を用いて吸光度を測定した。
【０１５２】
本実施例で使用したｍＴＯＲインヒビターは、以下のとおりである。
・ラパマイシン（Ｗａｋｏ、＃５３１２３−８８−９）
・エベロリムス（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、＃１１５９７）
・テムシロリムス（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃５２６４）
・ＰＩ−１０３（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、＃１０００９２０９）
・ＣＣ−２２３（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、＃１９９１７）
・ＩＮＫ１２８（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、＃１１８１１）
・ＡＺＤ８０５５（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、＃１６９７８）
・ＫＵ  ００６３７９４（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃３７２５）
【０１５３】
（結果）
（ラパマイシン）
結果を図１０に示す。Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）  ３／７  Ａｓｓａｙは、アポトーシス誘導に伴うカスパーゼ３／７の活性を測定することができる。カスパーゼ３／７の活性が高いほど、細胞障害が誘導されていることを表す。図１０より、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１ｎＭのラパマイシンを添加した場合はコントロールと比較してカスパーゼ３／７の活性に有意な差は認められなかった。一方で０．１、１、１０、１００ｎＭのラパマイシンを添加すると、コントロール群と比較して有意にカスパーゼ３／７の活性が抑制したことを認めた。０．１ｎＭという極めて低い濃度でもラパマイシンはカスパーゼ３／７活性を有意に抑制することが明らかになった。
【０１５４】
（エベロリムス）
結果を図１１に示す。０．０００１、０．００１、０．０１、０．１μＭのエベロリムスを添加すると、コントロールと比較して有意にカスパーゼ３／７の活性が抑制したことを認めた。０．０００１μＭという極めて低い濃度でもエベロリムスはカスパーゼ３／７活性を有意に抑制することが明らかになった。
【０１５５】
（テムシロリムス）
結果を図１２に示す。０．０００００１μＭのテムシロリムスを添加した場合はコントロールと比較してカスパーゼ３／７の活性に有意な差は認められなかった。一方で０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、１０μＭのテムシロリムスを添加すると、コントロールと比較して有意にカスパーゼ３／７の活性が抑制されたことを認めた。０．００００１μＭという極めて低い濃度でもテムシロリムスはカスパーゼ３／７活性を有意に抑制することが明らかになった。
【０１５６】
（ＰＩ−１０３）
結果を図１３に示す。１μＭのＰＩ−１０３を添加した場合はコントロールと比較してカスパーゼ３／７の活性に有意な差は認められなかった。一方で０．００１、０．０１、０．１μＭのＰＩ−１０３を添加すると、コントロールと比較して有意にカスパーゼ３／７の活性が抑制したことを認めた。
【０１５７】
（ＣＣ−２２３）
結果を図１４に示す。０．００１、０．０１、０．１、１μＭのＣＣ−２２３を添加すると、コントロールと比較して有意にカスパーゼ３／７の活性が抑制したことを認めた。
【０１５８】
（ＩＮＫ１２８）
結果を図１５に示す。０．００１、０．０１、０．１、１μＭのＩＮＫ１２８を添加すると、コントロールと比較して有意にカスパーゼ３／７の活性が抑制したことを認めた。
【０１５９】
（ＡＺＤ８０５５）
結果を図１６に示す。０．０１、０．１、１μＭのＡＺＤ８０５５を添加すると、コントロールと比較して有意にカスパーゼ３／７の活性が抑制したことを認めた。
【０１６０】
（ＫＵ  ００６３７９４）
結果を図１７に示す。０．００１、０．０１μＭのＫＵ  ００６３７９４を添加した場合はコントロールと比較してカスパーゼ３／７の活性に有意な差は認められなかった。一方で０．１、１μＭのＫＵ  ００６３７９４を添加すると、コントロールと比較して有意にカスパーゼ３／７の活性が抑制したことを認めた。
【０１６１】
（実施例１１：マウスモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ評価）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィマウスモデル用いた評価系におけるｍＴＯＲインヒビターのｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を実証した。
詳細には、本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィのモデルマウスである８型コラーゲンの変異を有するマウス（Ｃｏｌ８ａ２  Ｑ４５５Ｋ／Ｑ４５５Ｋ）にｍＴＯＲインヒビターの点眼を行ってｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を確認した。
【０１６２】
（材料および方法）
フックス角膜内皮ジストロフィのモデルマウスであるＡｌｐｈａ２  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＶＩＩＩ  （Ｃｏｌ８ａ２）  Ｑ４５５Ｋ  ノックインマウス（Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．  ２０１２  Ｊａｎ  １５；２１（２）：３８４−９３．）を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでの評価が行った。このモデルマウスはヒトにおけるフックス角膜内皮ジストロフィに認められるのと同様にｇｕｔｔａｅと呼ばれる細胞外マトリックス（コラーゲンやフィブロネクチンなど）の角膜内皮基底膜（デスメ膜）への沈着および角膜内皮障害による細胞密度減少を認めるため、フックス角膜内皮ジストロフィの良いモデルであるとされる。
【０１６３】
このようなマウスに対して、ｍＴＯＲインヒビターを点眼投与、前房内投与、硝子体内投与、結膜下投与、全身投与を行う、あるいは遺伝子治療により角膜内皮のｍＴＯＲ経路を阻害することによって、フックス角膜内皮ジストロフィの治療または発症を予防もしくは病態の進行を遅らせることができるため、本実施例において効果確認のために用いた。
【０１６４】
（ｍＴＯＲインヒビター点眼剤の調製）
ｍＴＯＲインヒビターの点眼剤として、トーリセル（登録商標）点滴静注液２５ｍｇ（ファイザー株式会社）（テムシロリムス）を用いた。本製品と本製品に添付されている希釈用液を２：３の割合で混合し、９．７ｍＭ混合液９２．７８μｌを作製した。さらに大塚生食注（大塚製薬株式会社）（生理食塩液）８０７．２２μｌで希釈し、１ｍＭ混合液９００μｌを１．５ｍｌチューブに調製した。次に、作製した１ｍＭ混合液９μｌと大塚生食注８９１μｌを用いて１０μＭ混合液９００μｌを調製した。調製後、１．５ｍｌチューブをアルミホイルで覆い遮光状態にし、４℃冷蔵庫で保存した。
【０１６５】
（マウスへの点眼試験）
フックス角膜内皮ジストロフィ（ＦＥＣＤ）のモデルマウスである８型コラーゲンの変異を有するマウス（Ｃｏｌ８ａ２Ｑ４５５Ｋ／Ｑ４５５Ｋ）を用いた（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙより入手した。）。点眼試験前の角膜内皮像から、ＦＥＣＤの重症度のグレーディングを行い、同程度の症状を持つ生後２０〜２４週齢のＦＥＣＤモデルマウスを用いた。調製したｍＴＯＲインヒビター点眼剤（１ｍＭ、１０μＭ）を、マウス４５匹に対し毎日朝夕の２回、左右の眼２μｌずつ点眼した。コントロールには大塚生食注を用いた。点眼期間は３ヶ月とし、その間、実験担当者はｍＴＯＲインヒビター点眼剤およびコントロール点眼剤（大塚生食注）についてブラインドの状態で実験を行った。
【０１６６】
（点眼剤の有効性の評価）
点眼試験開始前に、接触式角膜内皮スペキュラー（ＫＳＳＰ  ｓｌｉｔ−ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｐｅｃｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｋｏｎａｎ  ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，Ｈｙｏｇｏ，Ｊａｐａｎ））で角膜内皮像を観察し、グレーディングを行った。点眼試験開始後、４週間おきに接触式角膜内皮スペキュラーを用いてマウスの角膜内皮像を観察し、ｍＴＯＲインヒビター点眼剤の有効性を評価した。
【０１６７】
（結果）
ｍＴＯＲインヒビター点眼剤（１ｍＭ）を、毎日朝夕の２回、左右の眼に２μｌずつ２ヶ月間点眼したＦＥＣＤモデルマウスにおける接触式角膜内皮スペキュラーにより観察される角膜内皮細胞像の代表例を図１９示す。コントロールとして、生理的食塩水を点眼したものを示す。コントロールと比べてｍＴＯＲインヒビター点眼剤の点眼を行った個体では角膜内皮細胞の大きさが小さく、細胞密度が高い。さらに、接触式角膜内皮スペキュラーにより黒く観察されるグッテー（ｇｕｔｔａｅ）と呼ばれる細胞外マトリックスの疣状の沈着像の発生が抑えられた（図１９）。
【０１６８】
コントロールの角膜内皮細胞密度が平均１５５８個／ｍｍ２であったのに対してｍＴＯＲインヒビター点眼群では平均１９５７個／ｍｍ２と有意に高く、ＦＥＣＤモデルマウスにおいて認められる角膜内皮細胞密度減少が抑制された（図２０）。このことはＦＥＣＤ患者において、ｍＴＯＲインヒビターの点眼投与により角膜内皮細胞減少を抑制することで、角膜内皮細胞密度が通常約１０００個／ｍｍ２以下になったときに認められることの多い、角膜実質浮腫、角膜上皮浮腫などの発生を予防できることを示唆する。
【０１６９】
また、グッテー（ｇｕｔｔａｅ）の範囲は、コントロールが平均３．０２％であったのに対して、ｍＴＯＲインヒビター点眼群では平均０．５８％と有意に低く、ＦＥＣＤモデルマウスにおいて認められるグッテーの発生が抑制された（図２１）。１５匹のマウスで同様の解析をしたところ、Ｇｕｔｔａｅの範囲について、統計学的有意差が見られた。グッテーは角膜実質浮腫、角膜上皮浮腫を有さない早期のＦＥＣＤ患者においてさえ光の乱反射などによる視機能の低下をきたすことが知られている。したがってこの結果は、ＦＥＣＤ患者においてｍＴＯＲインヒビターの点眼投与によりグッテーの発生を抑制することで、光の乱反射による視機能の低下を抑えることができることを示唆する。
【０１７０】
（実施例１２：診断および治療例）
フックス角膜内皮ジストロフィおよび類縁の角膜内皮疾患と診断された際に（具体例としては、1）細隙灯顕微鏡検査によるグッテー形成、デスメ膜肥厚、角膜上皮浮腫、角膜実質浮腫の観察、2）スペキュラマイクロスコープによるグッテー像、角膜内皮障害像の観察、3)ペンタカム、OCT、超音波角膜厚測定装置などによる角膜浮腫の観察、4）遺伝子診断により高リスクと判断された場合）使用する。本発明の組成物を、点眼薬、前房内注射、徐放剤を用いた投与、硝子体内注射、結膜下注射として用いて治療することができる。
【０１７１】
有効成分以外の各成分としては、例えば、日本薬局方またはその等価物に適合した、市販のものを利用することができる。
【０１７２】
（実施例１３：点眼剤の調製例）
本実施例では、製剤例として、ｍＴＯＲインヒビターを含有する点眼剤を以下のように製造する。
【０１７３】
各濃度の被験物質の組成を以下に示す。
【０１７４】
ラパマイシン                      有効量（例えば、終濃度０．１ｍＭ）
塩化ナトリウム                    ０．８５ｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物    ０．１ｇ
（任意に）ベンザルコニウム塩化物  ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム                  適量
精製水                            適量
全量１００ｍＬ（ｐＨ７．０）
濃度は、以下からなる基剤を用いて希釈してもよい。
【０１７５】
塩化ナトリウム                    ０．８５ｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物    ０．１ｇ
（任意に）ベンザルコニウム塩化物  ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム                  適量
精製水                            適量
全量１００ｍＬ（ｐＨ７．０）
【０１７６】
（実施例１４：マウスへの点眼試験）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィのモデルマウスである８型コラーゲンの変異を有するマウス（Ｃｏｌ８ａ２  Ｑ４５５Ｋ／Ｑ４５５Ｋ）にｍＴＯＲインヒビターの点眼を行った。このモデルマウスは、フックス角膜内皮ジストロフィに認められる細胞外マトリクス（コラーゲンやフィブロネクチンなど）の沈着を呈する。
（材料および方法）
【０１７７】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は日本国特許出願特願２０１７−１１８６１９号（２０１７年６月１６日出願）に対して優先権主張を行うものであり、それらの内容全体が本明細書において参照として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルおよび／または細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮障害の治療または予防のための医薬が提供され、特に、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害を治療または予防するための医薬が提供された。このような技術に基づく製剤等に関連する技術に関与する産業（製薬等）において利用可能な技術が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０１７９】
配列番号１：ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡのセンス鎖
配列番号２：ｍＴＯＲ  ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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