(57)【要約】      （修正有）【課題】種子の発芽率を維持しながら、種子の生存率を維持させることができる種子の生存率維持剤及び生存率維持方法を提供する。【解決手段】プライミング処理において、特定の化合物を含む液に、所定の工程により種子を浸漬させることにより生存率を維持できるようにする。アブラナ科、ナス科、ウリ科又はマメ科の植物の種子の生存率維持剤として、種子に細胞周期阻害剤を含める。生存率維持方法として、種子に細胞周期阻害剤を含めたプライミング液を種子に吸収させる工程と吸水後の種子を乾燥する工程により行う。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞周期阻害剤を含む、種子の生存率維持剤。
【請求項２】
前記種子がアブラナ科、ナス科、ウリ科又はマメ科の植物の種子である、請求項１に記載の種子の生存率維持剤。
【請求項３】
細胞周期阻害剤を含むプライミング液を種子に吸収させる工程と、
吸水後の種子を乾燥する工程とを含む、種子の生存率維持方法。
【請求項４】
前記種子がアブラナ科、ナス科、ウリ科又はマメ科の植物の種子である、請求項３に記載の種子の生存率維持方法。
【請求項５】
細胞周期阻害剤を吸収した種子。
【請求項６】
前記種子がアブラナ科、ナス科、ウリ科又はマメ科の植物の種子である、請求項５に記載の種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライミング後の種子の生存率を維持することができる化合物及び該化合物を用いた種子の生存率維持方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、種子の保存は乾燥条件下で行われるが、採種後の時間が経過するに伴い種子の発芽率は低下する。また、採種後の種子は、それぞれ休眠性が異なるため、同時に播種しても発芽時期が揃わない。
そこで、播種前の種子にプライミング処理（一定条件下での吸水及び乾燥処理）を施し、種子の発芽率を向上させ、発芽時期を揃える方法がとられている（非特許文献１、２）。
【０００３】
しかしながら、プライミング処理を施すことにより、一時的な吸水を経た種子の発芽率は向上するものの、種子を保存した際の種子寿命（種子が発芽できる期間）が短くなる欠点があった（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Varierl, A., Vari, A. K., & Dadlani, M.，“The subcellular basis of seed priming”，Current Science，2010年， Vol. 99，No. 4，p. 450-456
【非特許文献２】Paparella S, Araujo SS, Rossi G, Wijayasinghe M, Carbonera D, Balestrazzi A，“Seed priming: state of the art and new perspectives”， Plant Cell Reports， 2015年，Vol. 34， p. 1281-93
【非特許文献３】Liu, Y., Bino, R. J., van der Burgz, W. J., Groot, S. P. C., & Hilhorst, H. W. M.， “Effects of osmotic priming on dormancy and storability of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) seeds”， Seed Science Research, 1996年，Vol. 6， p. 49-55
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の目的は、プライミングを経ても、種子の生存率を維持させることができる種子の生存率維持剤及び生存率維持方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、プライミング処理において、特定の化合物を含む液に種子を浸漬させることにより、上述した課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、次の発明を提供するものである。
【０００８】
〈１〉
細胞周期阻害剤を含む、種子の生存率維持剤。
【０００９】
〈２〉
前記種子がアブラナ科、ナス科、ウリ科又はマメ科の植物の種子である、〈１〉記載の種子の生存率維持剤。
【００１０】
〈３〉
細胞周期阻害剤を含むプライミング液を種子に吸収させる工程と、
吸水後の種子を乾燥する工程とを含む、種子の生存率維持方法。
【００１１】
〈４〉
前記種子がアブラナ科、ナス科、ウリ科又はマメ科の植物の種子である、〈３〉に記載の種子の生存率維持方法。
【００１２】
〈５〉
細胞周期阻害剤を吸収した種子。
【００１３】
〈６〉
前記種子がアブラナ科、ナス科、ウリ科又はマメ科の植物の種子である、〈５〉に記載の種子。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、プライミング処理により、種子の発芽率を向上させ、発芽時期を揃えることができ、さらにプライミングを経ても、種子の生存率を維持させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ミモシン存在下でプライミング処理を行った場合のシロイヌナズナ種子の生存率を表すグラフである。
【図２】アフィジコリン存在下でプライミング処理を行った場合のシロイヌナズナ種子の生存率を表すグラフである。
【図３】オリザリン存在下でプライミング処理を行った場合のシロイヌナズナ種子の生存率を表すグラフである。
【図４】ヒドロキシウレア存在下でプライミング処理を行った場合のシロイヌナズナ種子の生存率を表すグラフである。
【図５】ミモシン存在下でプライミング処理を行った場合のシロイヌナズナ種子の発芽率を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
《種子の生存率維持剤》
〈細胞周期阻害剤〉
１つの細胞が細胞分裂によって２以上の娘細胞に分かれ、再び細胞分裂を行なう細胞となって新しい娘細胞を生み出す一連のサイクルは細胞周期と呼ばれている。細胞周期は、分裂期（Ｍ期）、第一間期（Ｇ１期）、ＤＮＡ合成期（Ｓ期）、第二間期（Ｇ２期）に分けることができ、各段階を順番に経て細胞は分裂し、増殖する。本発明において、上記の細胞周期のいずれかの段階にある細胞が細胞周期の次の段階へ進行することを停止又は遅延することができる化合物を「細胞周期阻害剤」いう。
本発明の種子の生存率維持剤は細胞周期阻害剤を含む。本発明の種子の生存率維持剤に含まれる細胞周期阻害剤としては、特に限定されず、細胞周期のＭ期、Ｇ１期、Ｓ期及びＧ２期のいずれの段階に作用する化合物であってもよい。本発明の種子の生存率維持剤に含まれる細胞周期阻害剤の具体例としては、ミモシン、アフィジコリン、ヒドロキシウレア、オリザリン、プロピザミド等が挙げられる。
【００１７】
ミモシン(L-mimosine)
ミモシンは植物由来のアミノ酸（チロシン類似体）である。ミモシンは、細胞周期のＧ１後期にある細胞に取り込まれ、ＤＮＡ複製の開始を阻害する作用を有し、細胞周期をＧ１後期で停止させる。
【００１８】
アフィジコリン(aphidicolin)
アフィジコリンは四環式ジテルペン系抗生物質である。アフィジコリンはDNAポリメラーゼα、δ、εを阻害する作用を有し、細胞周期をＳ期初期で停止させる。
【００１９】
ヒドロキシウレア(hydroxyurea)
ヒドロキシウレアは尿素誘導体の代謝拮抗剤である。ヒドロキシウレアは細胞周期のＳ期に働き、リボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに変換する酵素であるリボヌクレオチド還元酵素を阻害する作用を有し、細胞周期をＳ期初期で停止させる。
【００２０】
オリザリン(orizalin)
オリザリンはジニトロアニリン系化合物である。オリザリンは微小管を構成する球状タンパク質であるチューブリンに作用し、細胞周期をＭ期で停止させる。
【００２１】
プロピザミド(Propyzamide)
プロピザミドは酸アミド系の化合物である。プロピザミドは微小管を構成する球状タンパク質であるチューブリンに作用し、細胞周期をＭ期で停止させる。
【００２２】
本発明の種子の生存率維持剤は、本発明の効果を損なわない範囲で、公知のプライミング液に含まれる成分、例えば、塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム及び硫酸マグネシウム等の無機塩；ポリエチレングリコール等を含んでいてもよい。
【００２３】
本発明の種子の生存率維持剤は使用時に水と混合し、水溶液として種子に用いることが好ましい。水と混合する前に、種子の生存率維持剤を予め少量のジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶解し、水で希釈して水溶液としてもよい。該水溶液中、種子の生存率維持剤は、細胞周期阻害剤が細胞周期を阻害するのに十分な量、いわゆる有効量含まれることが好ましい。この有効量は細胞周期阻害剤の種類によって異なるため、用いる細胞周期阻害剤に応じて該水溶液中の細胞周期阻害剤濃度が適宜決定される。例えば、ミモシンの場合、該水溶液のミモシン濃度は1〜1000μＭであることが好ましく、20〜500μＭであることがより好ましく、100〜200μＭであることがさらに好ましい。また、アフィジコリンの場合、該水溶液のアフィジコリン濃度は1〜1000μＭであることが好ましく、10〜200μＭであることがより好ましく、20〜50μＭであることがさらに好ましい。また、オリザリンの場合、該水溶液のオリザリン濃度は、1〜1000μＭであることが好ましく、10〜200μＭであることがより好ましく、20〜100μＭであることがさらに好ましい。また、ヒドロキシウレアの場合、該水溶液のヒドロキシウレア濃度は、1〜1000ｍＭであることが好ましく、10〜500ｍＭであることがより好ましく、50〜200ｍＭであることがさらに好ましい。
【００２４】
〈種子〉
本発明に用いられる種子は特に限定されないが、アブラナ科、ナス科、ウリ科又はマメ科の植物の種子が好ましい。
アブラナ科の植物としては、シロイヌナズナ、ナズナ、カラシナ、タカナ、ターサイ、ケール、カリフラワー、キャベツ、メキャベツ、コールラビ、ブロッコリー、アブラナ、ミズナ、カブ、ノザワナ、コマツナ、ハクサイ、チンゲンサイ、ハボタン、ルッコラ、ダイコン、ワサビ等が挙げられる。ナス科の植物としては、ジャガイモ、トマト、ナス、ピーマン、トウガラシ、シシトウ等が挙げられる。ウリ科の植物としては、スイカ、メロン、カボチャ、キュウリ、ニガウリ等が挙げられる。マメ科の植物としては、ダイズ、インゲンマメ、ソラマメ、エンドウ、ラッカセイ等が挙げられる。
【００２５】
《種子の生存率維持方法》
本発明の種子の生存率維持方法では、採種後の種子に対して、本発明の種子の生存率維持剤を含む水溶液を用いて、プライミング処理を行う。プライミング液を本発明の種子の生存率維持剤を含む水溶液とすることで、プライミング後の生存率を維持することができる。
【００２６】
〈プライミング液の調製〉
プライミング液として、細胞周期阻害剤を含む水溶液を調製する。細胞周期阻害剤としては、上述したものが使用できる。細胞周期阻害剤が水溶性の化合物であれば、細胞周期阻害剤を水に直接溶解して水溶液とする。一方、細胞周期阻害剤が脂溶性の化合物であれば、予め少量のジメチルスルホキシド等の有機溶媒に溶解し、水で希釈して水溶液とする。
プライミング液の細胞周期阻害剤の濃度は、細胞周期阻害剤が細胞周期を阻害するのに十分な量、いわゆる有効量含まれる濃度であればよく、細胞周期阻害剤の種類に応じて適宜決定される。
例えば、ミモシンの場合、プライミング液のミモシン濃度は1〜1000μＭであることが好ましく、20〜500μＭであることがより好ましく、100〜200μＭであることがさらに好ましい。また、アフィジコリンの場合、プライミング液のアフィジコリン濃度は1〜1000μＭであることが好ましく、10〜200μＭであることがより好ましく、20〜50μＭであることがさらに好ましい。また、オリザリンの場合、プライミング液のオリザリン濃度は、1〜1000μＭであることが好ましく、10〜200μＭであることがより好ましく、20〜100μＭであることがさらに好ましい。また、ヒドロキシウレアの場合、プライミング液のヒドロキシウレア濃度は、1〜1000ｍＭであることが好ましく、10〜500ｍＭであることがより好ましく、50〜200ｍＭであることがさらに好ましい。
【００２７】
〈プライミング処理〉
このようにして調製したプライミング液を用いて採種後の種子にプライミング処理を行う。プライミング処理の条件は、種子の種類に応じた常法で行なえばよい。また、本発明の種子の生存率維持方法において、プライミング処理を行う前に、採種後の種子に常法の消毒処理をおこなってもよい。
【００２８】
例えば、シロイヌナズナの種子を用いた場合、プライミング処理の条件は次の通りである。
（１）暗条件での吸水
シロイヌナズナの種子およそ２００粒（約１０μＬ）に、プライミング液１００〜２００μＬ、好ましくは１５０μＬを加える。シロイヌナズナの種子およそ２００粒に対して、プライミング液の容積が５０μＬより少ないと十分に吸水できないおそれがある。
種子とプライミング液との接触方法としては、容器に種子とプライミング液を入れて容器内で種子をプライミング液に浸漬させる方法が挙げられる。また、プライミング液を吸収させた紙、布、樹脂等の吸水体を介して種子を吸水させる方法でもよい。
そして、０〜４℃、好ましくは４℃の暗所で３日間静置する。
【００２９】
（２）明条件での吸水
次に、（１）の処理後の種子を２０〜２８℃、好ましくは２２℃の明所に移し、１２時間静置する。
【００３０】
（３）乾燥
次に、（２）の処理後の種子を乾燥する。乾燥方法としては、ろ紙等の上に（２）の種子を移し、風通しのよいところ、例えばクリーンベンチ内で、室温で１２時間程通風させればよい。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例を示し、本願発明を更に詳細に説明するが、本願発明は下記の例に制限されるものではない。
【００３２】
〈種子〉
以下の実施例で使用したシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の野生型（Ｃｏｌ−０）の種子は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓ ｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから入手した。
なお、シロイヌナズナの野生型（Ｃｏｌ−０）の種子は、種子消毒液［５％（ ｖ／ｖ）次亜塩素酸及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含む脱イオン水］に５分間、２２℃で浸したのち、脱イオン水で種子表面を洗浄した後に、以下の実施例に記載の通りの処理を行った。
【００３３】
〈処理〉
本実施例で行った各処理は、以下の通りである。
・種子のプライミング処理
種子およそ２００粒を１．５ｍＬ容チューブに入れた。以下に記載のいずれかのプライミング液１５０μＬを該チューブに加え、４℃の暗所で３日間種子に吸水させた。その後、該チューブを２２℃の明所に移し、１２時間処理液を吸収させた。その後、種子をろ紙を敷いた３５ｍｍシャーレに移し、蓋を開けた状態でクリーンベンチ内で１２時間通風させ、種子の乾燥を行った。
【００３４】
・種子の劣化処理（ＣＤＴ；ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｄｅｔ ｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）
乾燥した種子２００粒程度を１．５ ｍＬチューブに入れ、蓋を開けた状態で、タイトボックスに入れた。さらに、飽和塩化カリウム水溶液が入ったシャーレを、蓋を開けた状態で、種子と同じタイトボックス内に置き、タイトボックスを密閉した。密閉したタイトボックスを３７℃に移すと、タイトボックス内の相対湿度がおよそ８０%となるため、この状態で種子を３日間保存し、劣化させた。
なお、シロイヌナズナの種子を自然劣化させた場合の種子寿命（発芽できる期間）は２年程であるため、劣化処理は、種子の寿命を迅速に評価し、予測するために通常用いられる手法である。
【００３５】
〈生存率の算出方法〉
本実施例で行った種子の生存率の算出方法は、以下の通りである。
・種子の生存率の算出
種子を、０．８％の寒天を含む１／２濃度のムラシゲスクーグ培地（ＭＳ培地）に、５０粒ずつ３反復で播種し、播種後の種子を、２２℃の明所に静置した。
播種後７日目の時点で、健全な子葉の緑化及び展開を確認できた個体数の割合から、種子の生存率を算出した。
【００３６】
〈プライミング液の調製〉
プライミング液０として、脱イオン水を用いた。
脱イオン水に、ミモシンを２０μＭ（Ｍはモル／Ｌを意味する）、１００μＭ、及び５００μＭでそれぞれ溶解して、プライミング液１−１〜１−３をそれぞれ調製した。
脱イオン水に、アフィジコリンを２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ及び１５０μＭでそれぞれ溶解して、プライミング液２−１〜２−４をそれぞれ調製した。
脱イオン水に、オリザリンを２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ及び１５０μＭでそれぞれ溶解して、プライミング液３−１〜３−４をそれぞれ調製した。
脱イオン水に、ヒドロキシウレアを５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ及び５００ｍＭでそれぞれ溶解して、プライミング液４−１〜４−４をそれぞれ調製した。
【００３７】
〈実施例１〉
種子およそ２００粒を、４つの１．５ｍＬ容チューブにそれぞれ入れた。プライミング液０、及び１−１〜１−３のそれぞれ１５０μＬを該チューブに加え、４℃の暗所で３日間種子に吸水させた。その後、該チューブを２２℃の明所に移し、１２時間吸水させた。吸水後の種子をろ紙を敷いた３５ｍｍシャーレ４つにそれぞれ移し、蓋を開けた状態でクリーンベンチ内で１２時間通風させ、種子の乾燥を行った。
【００３８】
上記それぞれのプライミング液でプライミング処理した後の乾燥した種子２００粒程度の種子がそれぞれ入った４つの１．５ｍＬチューブそれぞれに対して、上記劣化処理を実施し、上記方法にて、それぞれ生存率を算出した。別途、各プライミング処理後、上記劣化処理を施さなかった種子についても、上記方法にて生存率をそれぞれ算出した。結果を図１に示す。
なお、参照として、プライミング処理を行わなかった以外は同様にして劣化処理した種子の生存率も図１中に併せて示した。また、図１中、「CDT 0d」は劣化処理を施していない種子の生存率を示し、「CDT ３d」は劣化処理を施した種子の生存率を示す。
【００３９】
〈実施例２〉
プライミング液１−１〜１−３を、プライミング液２−１〜２−４にそれぞれ替えた以外は、実施例１と同様にして、種子の生存率を算出した。結果を図２に示す。
【００４０】
〈実施例３〉
プライミング液１−１〜１−３を、プライミング液３−１〜３−４にそれぞれ替えた以外は、実施例１と同様にして、種子の生存率を算出した。結果を図３に示す。
【００４１】
〈実施例４〉
プライミング液１−１〜１−３を、プライミング液４−１〜４−４にそれぞれ替えた以外は、実施例１と同様にして、種子の生存率を算出した。結果を図４に示す。
【００４２】
図１〜図４に示した結果により、本発明の生存率維持剤を含むプライミング処理液を用いることにより、プライミング処理によって種子の生存率が低下するのを抑制でき、すなわち生存率維持効果が得られることが実証された。
【００４３】
なお、プライミング処理は、種々の目的で行われるが、その一つの目的として発芽促進効果がある。本発明の生存率維持剤は、プライミング処理による効果を阻害することなく、生存率の低下を抑制する効果がある。一例として、発芽促進を目的として通常行われる脱イオン水を用いたプライミング処理後の種子の発芽率（図５中、０μＭが付された折れ線で示される）、ミモシンを所定の濃度で含む各プライミング液を用いたプライミング処理後の種子の発芽率（図５中、２０μＭ及び１００μＭが付された折れ線で示される）、及びプライミング処理をしていない種子の発芽率（図５中、Non-primedが付された折れ線で示される）をそれぞれ７日間追跡した結果を示す。
なお、発芽率は、種子を、０．８％の寒天を含む１／２濃度のムラシゲスクーグ培地（ＭＳ培地）に、５０粒ずつ３反復で播種し、２２℃の明所に静置した状態で、０〜７日間観察し、種皮からの幼根の突出及び緑化した子葉が展開した個体数の割合から算出した。
【００４４】
図５に示す結果から、本発明の生存率維持剤を含むプライミング処理液は、３日後の発芽率が、プライミング処理を実施していない種子と比較して顕著に高く、通常の発芽促進目的のプライミング処理と同等の発芽促進を達成できることが理解できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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