(57)【要約】【課題】操作された細胞（例えば、操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞））を同定、効率的に単離／ソート、選択的に増殖、インビボで追跡および制御もしくは除去するための組成物および方法を提供する。【解決手段】本開示は、疎水性部分によって接続された細胞外成分および細胞内成分を含む単鎖融合タンパク質であって、ここで上記細胞外成分は、標的を特異的に結合する結合ドメイン、タグカセット、およびヒンジを含むコネクター領域を含み、上記細胞内成分は、エフェクタードメインを含むものに関する。いくつかの局面において、本開示は、（ａ）細胞外結合ドメインのアミノ末端に位置するか、（ｂ）細胞外結合ドメイン内に埋め込まれるか、または（ｃ）細胞外結合ドメインとエフェクタードメインを含む細胞内成分との間に配置されてかつこれらを接続している、１個以上の細胞外タグカセットを有する融合タンパク質を含むキメラ抗原レセプター分子に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１３年１２月２０日に出願された米国仮出願第６１／９１９，２０１号（この出願は、その全体が参考として本明細書に援用される）に対する利益を主張する。
【０００２】
（政府の権利に関する陳述）
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金／契約番号ＣＡ１３６５５１の下で、政府支援によって行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
（配列表に関する陳述）
本願に関する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参考として援用される。この配列表を含むテキストファイルの名称は、３６００５６＿４２６ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。このテキストファイルは、３２．３ＫＢであり、２０１４年１２月２２日に作成されたものであり、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通じて電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
（技術分野）
本開示は、タグカセットを含む融合タンパク質、ならびにより具体的には、タグ化キメラエフェクター分子（Ｋｅｙ−ＣｈＥＭ）およびタグ化キメラ抗原レセプター分子（Ｔ−ＣｈＡＲＭ）、ならびにこのような融合タンパク質を生成する組換え宿主細胞であって、ここで上記組換え宿主細胞は、同定され得、単離され得、ソートされ得、増殖するように誘発され得、追跡され得、除去され得、および／または治療剤（例えば、養子免疫療法において）として使用され得るものに関する。
【０００５】
（関連分野の説明）
Ｔ細胞ベースの免疫療法は、腫瘍反応性Ｔ細胞が腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団の中で見出されたときに開発され始めた（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２９：７０５，  １９６９）。１つのストラテジー（養子Ｔ細胞移入として公知）は、腫瘍反応性に関して予備選択される腫瘍浸潤リンパ球の単離、ＩＬ−２の存在下で抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体によって誘発される上記腫瘍反応性Ｔ細胞のクローン性増殖、および上記増殖させた細胞集団を上記腫瘍を有する患者に最終的に注入し戻すこと（化学療法およびＩＬ−２の反復投与とともに）を包含する（Ｄｕｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：８５０，  ２００２）。腫瘍浸潤リンパ球での養子Ｔ細胞療法のこの形態は、技術的に扱いづらく、黒色腫を有する患者のうちのごく僅かな割合においてのみ完全な寛解をもたらし、他の癌において有効なのは希である（Ｂｅｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １６：２６４６，  ２０１０）。
【０００６】
腫瘍反応性Ｔ細胞クローンの単離は、別の免疫療法的アプローチ、すなわち、特定の抗原に対して特異的な組換えＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）の生成（これは、Ｔ細胞へとベクター送達系を使用して導入されて、腫瘍細胞上で発現されるＭＨＣ分子によって呈示される腫瘍関連ペプチドに対して特異性を付与する）の開発をもたらした。類似のアプローチは、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）といわれる合成レセプターを導入し、これは、例えば、抗腫瘍治療の状況において、エフェクタードメイン（例えば、ＴＣＲおよび／もしくは共刺激シグナル伝達ドメイン）を含む１以上の細胞内成分に連結された、腫瘍特異的抗原もしくは腫瘍関連抗原に結合し得る抗原結合ドメインを含む。ＴＩＬとは異なり、ＴＣＲもしくはＣＡＲ  Ｔ細胞免疫療法の基本的な手順は、ヒトＴ細胞を、腫瘍標的化部分をコードする導入遺伝子で遺伝的に改変すること、上記組換えＴ細胞のエキソビボでの増殖、および上記増殖させた組換えＴ細胞を患者に輸注し戻すことである。ＣＡＲ  Ｔ細胞での養子療法の場合には、上記合成ＣＡＲ構造の組成、ならびに上記遺伝的に操作したＴ細胞の質および純度は、インビボでの腫瘍に対する治療効力を決定する。しかし、上記組換え細胞集団を増殖および選択すること、ならびに重篤な自己免疫副作用を回避するためにインビボで十分に上記細胞が有効でありかつ特異的であることを確実にすることには、困難がある。
【０００７】
現在では、操作された細胞（例えば、操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞））を同定、効率的に単離／ソート、選択的に増殖、インビボで追跡、および制御もしくは除去するための組成物および方法が、免疫療法分野で必要なままである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｌａｒｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９６９）２９：７０５
【非特許文献２】Ｄｕｄｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９８：８５０
【非特許文献３】Ｂｅｓｓｅｒら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２０１０）１６：２６４６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（要旨）
ある種の局面において、本開示は、疎水性部分によって接続された細胞外成分および細胞内成分を含む単鎖融合タンパク質であって、ここで上記細胞外成分は、標的を特異的に結合する結合ドメイン、タグカセット、およびヒンジを含むコネクター領域を含み、上記細胞内成分は、エフェクタードメインを含むものに関する。
【００１０】
いくつかの局面において、本開示は、（ａ）細胞外結合ドメインのアミノ末端に位置するか、（ｂ）細胞外結合ドメイン内に埋め込まれるか、または（ｃ）細胞外結合ドメインとエフェクタードメインを含む細胞内成分との間に配置されてかつこれらを接続している、１個以上の細胞外タグカセットを有する融合タンパク質を含むキメラ抗原レセプター分子に関する。
【００１１】
さらなる局面において、本開示は、細胞外成分と細胞内成分との間に配置されてかつこれらを接続している疎水性部分を含む単鎖融合タンパク質であって、ここで上記細胞外成分は、タグカセットとヒンジを含むコネクター領域とを含み、上記細胞内成分は、エフェクタードメインを含むものに関する。
【００１２】
なおさらなる局面において、本開示は、細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、非天然のＴ細胞））を活性化するための方法に関し、上記方法は、細胞と、タグカセットに対して特異的な結合ドメインとを接触させる工程を包含し、ここで上記細胞は、本開示に従う融合タンパク質をコードする核酸分子を含み、上記タグカセットに対して特異的な結合ドメインは、固体表面に結合される。
【００１３】
なおさらなる局面において、本開示は、細胞増殖（例えば、Ｔ細胞増殖）を促進するための方法に関し、上記方法は、細胞（例えば、非天然のＴ細胞）と、タグカセットに対して特異的な結合ドメインおよび増殖因子サイトカインとを、細胞増殖を可能にするために十分な時間にわたって接触させる工程であって、ここで上記細胞は、本開示に従う融合タンパク質をコードする核酸分子を含み、上記タグカセットに対して特異的な結合ドメインは、固体表面に結合される工程を含む。
【００１４】
ある種の他の局面において、本開示は、細胞（例えば、Ｔ細胞）を同定するための方法に関し、上記方法は、細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、非天然のＴ細胞））を含むサンプルと、タグカセットに対して特異的な結合ドメインとを接触させる工程であって、ここで上記細胞は、本開示に従う融合タンパク質をコードする核酸分子を含み、上記タグカセットに対して特異的な結合ドメインは、検出可能な部分を含む、工程、ならびに上記サンプルにおいて融合タンパク質を発現する細胞の存在を検出する工程を包含する。
【００１５】
ある種のさらなる局面において、本開示は、Ｔ細胞をソートするために方法に関し、上記細胞は、非天然のＴ細胞を含むサンプルと、タグカセットに対して特異的な結合ドメインとを接触させる工程であって、ここで上記非天然のＴ細胞は、本開示に従う融合タンパク質をコードする核酸分子を含み、上記タグカセットに対して特異的な結合ドメインは、検出可能な部分を含む工程、ならびに上記サンプルにおいて、融合タンパク質を発現する上記非天然のＴ細胞を、融合タンパク質を発現しない他の細胞からソートする工程を包含する。
【００１６】
ある種の局面において、本開示は、Ｔ細胞を富化もしくは単離するための方法に関し、上記方法は、非天然のＴ細胞を含むサンプルと、タグカセットに対して特異的な結合ドメインとを接触させる工程であって、ここで上記非天然のＴ細胞は、本開示に従う融合タンパク質をコードする核酸分子を含み、上記タグカセットに対して特異的な結合ドメインは、検出可能な部分を含む、工程、ならびに上記サンプルにおいて、融合タンパク質を発現する上記非天然のＴ細胞を、融合タンパク質を発現しない他の細胞から富化もしくは単離する工程を包含する。
【００１７】
さらなる局面において、本開示は、ある種のＴ細胞を枯渇させるための方法に関し、上記方法は、非天然のＴ細胞と、タグカセットに対して特異的な結合ドメインとを接触させる工程であって、ここで上記非天然のＴ細胞は、本開示に従う融合タンパク質をコードする核酸分子を含み、上記タグカセットに対して特異的な結合ドメインの結合は、融合タンパク質を発現する上記Ｔ細胞の細胞死をもたらす工程を包含する。
【００１８】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば明らかになる。本明細書で開示される全ての参考文献は、各々が個々に援用されるかのように、それらの全体において参考として援用される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
疎水性部分によって接続された細胞外成分および細胞内成分を含む単鎖融合タンパク質であって、ここで前記細胞外成分は、標的を特異的に結合する結合ドメイン、タグカセット、およびヒンジを含むコネクター領域を含み、そして前記細胞内成分は、エフェクタードメインを含む、単鎖融合タンパク質。
（項目２）
前記結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ｓｃＴＣＲ、レセプターエクトドメイン、もしくはリガンドである、項目１に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目３）
前記標的は、ＣＤ３、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ−アセチルＧＤ２、Ｏ−アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＦＬＴ４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１５１、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ−Ａ、メソセリン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＴＷＥＡＫ−Ｒ、ＨＬＡ、ＨＬＡに結合される腫瘍もしくは病原体関連ペプチド、ＨＬＡに結合されるｈＴＥＲＴペプチド、ＨＬＡに結合されるチロシナーゼペプチド、ＨＬＡに結合されるＷＴ−１ペプチド、ＬＴβＲ、ＬＩＦＲβ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＯＳＭＲβ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、Ｂ７Ｈ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ−１、Ｒｏｂｏ１、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、またはＣＤ７９ｂを含む、項目１または２に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目４）
前記コネクター領域は、リンカーモジュールをさらに含む、項目１〜３のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目５）
前記リンカーモジュールは、（ＧｌｙｘＳｅｒｙ）ｎであり、ここでｎは、１〜１０の整数であり、ｘおよびｙは、独立して０〜１０の整数であるが、ただしｘおよびｙは、両方が０ではない、項目４に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目６）
前記リンカーモジュールは、ＣＨ２ＣＨ３もしくはＣＨ３である、項目４に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目７）
前記コネクター領域は、前記タグカセットのうちの１以上を含む、項目１〜６のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目８）
前記コネクター領域は、１〜５個のタグカセットを含む、項目１〜６のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目９）
前記コネクター領域は、１〜５個のタグカセットを含み、ここで各タグカセットは、（ＧｌｙｘＳｅｒｙ）ｎを含む１もしくは２個のリンカーモジュールに接続され、ここでｎは、１〜１０の整数であり、ｘおよびｙは、独立して、０〜１０の整数であるが、ただしｘおよびｙは、両方が０ではない、項目７または８に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目１０）
前記リンカーモジュールは、アミノ酸配列  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１０）、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２（配列番号１１）、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１２）、もしくはこれらの任意の組み合わせを有する、項目９に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目１１）
前記結合ドメインは、１個以上のタグカセットを含む、項目１〜１０のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目１２）
前記タグカセットは、前記結合ドメインに対してアミノ末端側に、前記結合ドメインに対してカルボキシ末端側に、もしくは両方に位置する、項目１〜１０のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目１３）
前記結合ドメインは、可変領域リンカーを含む、ｓｃＦｖもしくはｓｃＴＣＲであり、ここで前記可変領域リンカーは、１個以上のタグカセットを含む、項目１１に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目１４）
前記タグカセットは、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタメートタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、Ｘタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆタグ、Ｖ５タグ、ＣＢＰ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＧＦＰ、チオレドキシンタグ、もしくはこれらの任意の組み合わせであるかまたはこれらを含む、項目１〜１３のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目１５）
前記タグカセットは、アミノ酸配列  Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（配列番号１）もしくはＴｒｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２）を有するＳｔｒｅｐタグであるかまたはこれを含む、項目１４に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目１６）
前記コネクター領域は、１個以上のタグカセットに隣接するリンカーモジュールをさらに含み、ここで前記リンカーモジュールおよび隣接するタグカセットはまとめて、アミノ酸配列
【化２】
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を有する、項目１〜１５のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目１７）
前記疎水性部分は、膜貫通ドメインである、項目１〜１６のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目１８）
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８もしくはＣＤ２７膜貫通ドメインである、項目１７に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目１９）
前記エフェクタードメインもしくはそのエフェクター部分は、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、Ｌｃｋ、ＬＡＧ３、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、ＳＬＡＭＦ１、Ｓｌｐ７６、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｚａｐ７０、ＰＴＣＨ２、もしくはこれらの任意の組み合わせである、項目１〜１８のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目２０）
前記エフェクタードメインもしくはそのエフェクター部分は、ＣＤ３ζならびに４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）のうちの１以上を含む、項目１〜１９のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目２１）
前記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：細胞外結合ドメイン、タグカセット、ヒンジを含むコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む、項目１〜２０のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目２２）
前記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：細胞外結合ドメイン、第１のコネクター領域、タグカセット、ヒンジを含む第２のコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む、項目１〜２０のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目２３）
前記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：細胞外結合ドメイン、第１のタグカセット、第１のコネクター領域、第２のタグカセット、ヒンジを含む第２のコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む、項目１〜２０のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目２４）
前記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：細胞外結合ドメイン、第１のタグカセット、第１のコネクター領域、第２のタグカセット、第２のコネクター領域、第３のタグカセット、ヒンジを含む第３のコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む、項目１〜２０のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目２５）
前記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：タグカセット、細胞外結合ドメイン、ヒンジを含むコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む、項目１〜２０のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目２６）
前記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：細胞外結合ドメイン、２〜５個のタグカセット、ヒンジを含むコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む、項目１〜２０のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目２７）
前記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：前記可変領域の間に配置されかつタグカセットを含む可変領域リンカーを含む細胞外ｓｃＦｖもしくはｓｃＴＣＲ結合ドメイン、ヒンジを含むコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む、項目１〜２０のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目２８）
前記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：細胞外ｓｃＦｖもしくはｓｃＴＣＲ結合ドメイン、タグカセット、ＩｇＧヒンジを含むコネクター領域、膜貫通ドメイン、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含み、ここで前記エフェクタードメインは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ、ＣＤ２７およびＣＤ３ζ、ＣＤ２８およびＣＤ３ζ、ＯＸ４０およびＣＤ３ζ、ＣＤ２８、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ、ＯＸ４０、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ、またはＣＤ２８、ＯＸ４０およびＣＤ３ζを含む、項目１〜２０のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目２９）
前記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：レセプターエクトドメインを含む細胞外結合ドメイン、タグカセット、ヒンジを含むコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含み、ここで前記エフェクタードメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、もしくはＯＸ４０を含む、項目１〜２０のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目３０）
抗原に対して特異的に結合する細胞外結合ドメインとエフェクタードメインを含む細胞内成分との間に配置されかつこれらを接続する１個以上の細胞外タグカセットを有する融合タンパク質を含む、キメラ抗原レセプター分子。
（項目３１）
前記１個以上のタグカセットは、１個のタグカセットを含む、項目３０に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目３２）
前記１個以上のタグカセットは、２〜５個のタグカセットを含む、項目３０に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目３３）
前記キメラ抗原レセプター分子は、（ＧｌｙｘＳｅｒｙ）ｎを含む１個以上のリンカーモジュールをさらに含み、ここでｎは、１〜１０の整数であり、ｘおよびｙは、独立して０〜１０の整数であるが、ただしｘおよびｙは、両方が０ではない、項目３０〜３２のいずれか１項に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目３４）
前記融合タンパク質は、前記結合ドメインと前記１個以上のタグカセットとの間に配置された（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎリンカーモジュールをさらに含み、ここでｘは、２〜４の整数であり、ｎは、１〜３の整数である、項目３０〜３２のいずれか１項に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目３５）
前記融合タンパク質は、前記１個以上のタグカセットとエフェクタードメインを含む前記細胞内成分との間に配置された細胞外（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎリンカーモジュールをさらに含み、ここでｘは、２〜４の整数であり、ｎは、１〜３の整数である、項目３０〜３２のいずれか１項に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目３６）
前記融合タンパク質は、２個の細胞外（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎリンカーモジュールをさらに含み、ここでｘは、２〜４の整数であり、ｎは、１〜３の整数であり、第１の前記リンカーモジュールは、前記１個以上のタグカセットのうちの少なくとも１個に対してアミノ末端側にあり、第２の前記リンカーモジュールは、前記１個以上のタグカセットのうちの少なくとも１個に対してカルボキシ末端側にある、項目３０〜３２のいずれか１項に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目３７）
前記１個以上のタグカセットは、２個のタグカセットを含み、前記分子は、２個の細胞外（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎリンカーモジュールをさらに含み、ここでｘは、２〜４の整数であり、ｎは、１〜３の整数であり、ここで第１のタグカセットは、前記結合ドメインと第１の前記リンカーモジュールとの間に配置され、第２のタグカセットは、第１の前記リンカーモジュールと第２の前記リンカーモジュールとの間に配置され、第２の前記リンカーモジュールは、前記第２のタグカセットと前記エフェクタードメインとの間に配置される、項目３０に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目３８）
前記融合タンパク質は、第３のタグカセットおよび第３の細胞外（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎリンカーモジュールをさらに含み、ここで前記第３のタグカセットは、第２の前記リンカーモジュールと第３の前記リンカーモジュールとの間に配置され、第３の前記リンカーモジュールは、前記第３のタグカセットと前記エフェクタードメインとの間に配置される、項目３７に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目３９）
前記融合タンパク質は、細胞外ヒンジおよび細胞外ＣＨ２ＣＨ３リンカーモジュールをさらに含み、ここで前記ヒンジは、前記結合ドメインに隣接し、前記ＣＨ２ＣＨ３リンカーモジュールは、エフェクタードメインを含む前記細胞内成分に隣接し、前記１個以上のタグカセットのうちの少なくとも１個は、前記ヒンジと前記ＣＨ２ＣＨ３リンカーモジュールとの間に配置される、項目３０〜３８のいずれか１項に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目４０）
前記融合タンパク質は、細胞外ヒンジおよび細胞外ＣＨ３リンカーモジュールをさらに含み、ここで前記ヒンジは、前記結合ドメインに隣接し、前記ＣＨ３リンカーモジュールは、エフェクタードメインを含む前記細胞内成分に隣接し、前記１個以上のタグカセットのうちの少なくとも１個および／もしくは各々は、前記ヒンジと前記ＣＨ３リンカーモジュールとの間に配置される、項目３０〜３８のいずれか１項に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目４１）
前記１個以上のタグカセットのうちの少なくとも１個は、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇ（登録商標）タグ、Ｘｐｒｅｓｓ（登録商標）タグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタメートタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、Ｘタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ、Ｖ５タグ、ＣＢＰ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＧＦＰ、チオレドキシンタグ、もしくはこれらの任意の組み合わせであるかまたはこれらを含む、項目３０〜４０のいずれか１項に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目４２）
前記１個以上のタグカセットのうちの少なくとも１個は、アミノ酸配列  Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（配列番号１）もしくはＴｒｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２）を有するＳｔｒｅｐタグであるかまたはこれを含む、項目４１に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目４３）
前記結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ｓｃＴＣＲ、レセプターエクトドメイン、もしくはリガンドである、項目３０〜４０のいずれか１項に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目４４）
前記抗原は、ＣＤ３、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ−アセチルＧＤ２、Ｏ−アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＦＬＴ４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１５１、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ−Ａ、メソセリン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＴＷＥＡＫ−Ｒ、ＨＬＡ、ＨＬＡに結合される腫瘍もしくは病原体関連ペプチド、ＨＬＡに結合されるｈＴＥＲＴペプチド、ＨＬＡに結合されるチロシナーゼペプチド、ＨＬＡに結合されるＷＴ−１ペプチド、ＬＴβＲ、ＬＩＦＲβ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＯＳＭＲβ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、Ｂ７Ｈ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ−１、Ｒｏｂｏ１、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、もしくはＣＤ７９ｂであるかまたはこれを含む、項目３０〜４３のいずれか１項に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目４５）
前記エフェクタードメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、Ｌｃｋ、ＬＡＧ３、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＳＬＡＭＦ１、Ｓｌｐ７６、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｚａｐ７０、ＰＴＣＨ２、もしくはこれらの任意の組み合わせである、項目３０〜４４のいずれか１項に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目４６）
前記エフェクタードメインは、ＣＤ３ζならびに４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、およびＯＸ４０のうちの１種以上を含む、項目３０〜４５のいずれか１項に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目４７）
前記エフェクタードメインは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ、ＣＤ２７およびＣＤ３ζ、ＣＤ２８およびＣＤ３ζ、またはＣＤ２８、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζを含む、項目３０〜４５のいずれか１項に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目４８）
前記結合ドメインは、レセプターエクトドメインを含み、前記エフェクタードメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、もしくはＯＸ４０を含む、項目３０〜４５のいずれか１項に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目４９）
前記タグカセットは、前記レセプターエクトドメインに対してカルボキシ末端側に位置する、項目４８に記載のキメラ抗原レセプター分子。
（項目５０）
細胞外成分と細胞内成分との間に配置された疎水性部分を含む単鎖融合タンパク質であって、ここで前記細胞外成分は、タグカセットとヒンジを含むコネクター領域とを含み、前記細胞内成分は、エフェクタードメインを含む、単鎖融合タンパク質。
（項目５１）
前記コネクター領域は、リンカーモジュールをさらに含む、項目５０に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目５２）
前記リンカーモジュールは、（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎであり、ここでｘは、１〜５の整数であり、ｎは、１〜１０の整数である、項目５１に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目５３）
前記リンカーモジュールは、ＣＨ２ＣＨ３もしくはＣＨ３である、項目５１に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目５４）
１個以上のタグカセットは、前記コネクター領域に対してアミノ末端側にある、項目５０〜５３のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目５５）
前記融合タンパク質は、１〜５個のタグカセットを含む、項目５０〜５４のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目５６）
各タグカセットは、（ＧｌｙｘＳｅｒｙ）ｎを含む１もしくは２個のリンカーモジュールに接続され、ここでｎは、１〜１０の整数であり、ｘおよびｙは、独立して０〜１０の整数であるが、ただしｘおよびｙは、両方が０ではない、項目５５に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目５７）
前記リンカーモジュールは、アミノ酸配列  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１０）、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２（配列番号１１）、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１２）、もしくはこれらの任意の組み合わせを有する、項目５６に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目５８）
１個以上のタグカセットは、リンカーモジュールによって前記コネクター領域に連結される、項目５０〜５７のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目５９）
前記リンカーモジュールは、（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎであるかまたはこれを含み、ここでｘは、１〜５の整数であり、ｎは、１〜１０の整数である、項目５８に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目６０）
前記リンカーモジュールは、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２（配列番号１１）であるかまたはこれを含む、項目５８に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目６１）
１個以上のタグカセットは、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇ（登録商標）タグ、Ｘｐｒｅｓｓ（登録商標）タグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタメートタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、Ｘタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ、Ｖ５タグ、ＣＢＰ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＧＦＰ、チオレドキシンタグ、もしくはこれらの任意の組み合わせであるかまたはこれらを含む、項目５０〜６０のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目６２）
１個以上のタグカセットは、アミノ酸配列  Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（配列番号１）もしくはＴｒｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２）を有するＳｔｒｅｐタグであるかまたはこれを含む、項目６１に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目６３）
前記融合タンパク質は、１個以上のタグカセットに隣接するリンカーモジュールをさらに含み、ここで前記リンカーモジュールおよび隣接する前記タグカセットは、アミノ酸配列
【化３】
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を有する、項目５０〜６２のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目６４）
前記疎水性部分は、膜貫通ドメインである、項目５０〜６３のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目６５）
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８もしくはＣＤ２７膜貫通ドメインである、項目６４に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目６６）
前記エフェクタードメインは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＡＲＤ１１、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、Ｌｃｋ、ＬＡＧ３、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、ＳＬＡＭＦ１、Ｓｌｐ７６、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｚａｐ７０、ＰＴＣＨ２、もしくはこれらの任意の組み合わせである、項目１〜１８のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目６７）
前記エフェクタードメインは、ＣＤ３ζならびに４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）のうちの１種以上を含む、項目５０〜６６のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目６８）
前記エフェクタードメインは、ＬＲＰ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＲＯＲ２、もしくはＲｙｋを含む、項目５０〜６６のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目６９）
前記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：タグカセット、ヒンジを含むコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む、項目５０〜６８のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目７０）
前記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：第１のコネクター領域、タグカセット、ヒンジを含む第２のコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む、項目５０〜６８のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目７１）
前記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：第１のタグカセット、第１のコネクター領域、第２のタグカセット、ヒンジを含む第２のコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む、項目５０〜６８のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目７２）
前記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：第１のタグカセット、第１のコネクター領域、第２のタグカセット、第２のコネクター領域、第３のタグカセット、ヒンジを含む第３のコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む、項目５０〜６８のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目７３）
前記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：２〜５個のタグカセット、ヒンジを含むコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む、項目５０〜６８のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目７４）
前記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：タグカセット、ＩｇＧヒンジを含むコネクター領域、膜貫通ドメイン、ならびに４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ、ＣＤ２７およびＣＤ３ζ、ＣＤ２８およびＣＤ３ζ、またはＣＤ２８、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζを含むエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む、項目５０〜６８のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目７５）
前記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：タグカセット、ヒンジを含むコネクター領域、疎水性部分、およびＬＲＰ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＲＯＲ２、もしくはＲｙｋを含むエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む、項目５０〜６８のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目７６）
前記融合タンパク質は、非共有結合的に会合した結合ドメインをさらに含む、項目５０〜７５のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目７７）
前記非共有結合的に会合した結合ドメインは、タグカセットと会合する、項目７６に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目７８）
前記非共有結合的に会合した結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ｓｃＴＣＲ、レセプターエクトドメイン、もしくはリガンドである、項目７６または７７に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目７９）
前記非共有結合的に会合した結合ドメインは、二重特異的であり、ここでその第１の結合末端は、前記タグカセットに対して特異的であり、その第２の結合末端は、前記タグカセット以外の標的に対して特異的である、項目７６〜７８のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目８０）
前記非共有結合的に会合した結合ドメインは、ＣＤ３、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ−アセチルＧＤ２、Ｏ−アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＦＬＴ４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１５１、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ−Ａ、メソセリン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＴＷＥＡＫ−Ｒ、ＨＬＡ、ＨＬＡに結合される腫瘍もしくは病原体関連ペプチド、ＨＬＡに結合されるｈＴＥＲＴペプチド、ＨＬＡに結合されるチロシナーゼペプチド、ＨＬＡに結合されるＷＴ−１ペプチド、ＬＴβＲ、ＬＩＦＲβ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＯＳＭＲβ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、Ｂ７Ｈ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ−１、Ｒｏｂｏ１、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、もしくはＣＤ７９ｂに対して特異的である、項目７９に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目８１）
前記結合ドメインは、二重特異的であり、ここでその第１の結合末端および第２の結合末端は、前記タグカセットに対して特異的である、項目７６〜７８のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目８２）
前記結合ドメインは、多重特異的であり、ここで第１の末端は、前記タグカセットに結合し、第２の末端は、前記タグカセット以外の１個以上の標的に対して特異的である、項目７６〜７８のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目８３）
少なくとも１個の結合ドメインは、ＣＤ３、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ−アセチルＧＤ２、Ｏ−アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＦＬＴ４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１５１、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ−Ａ、メソセリン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＴＷＥＡＫ−Ｒ、ＨＬＡ、ＨＬＡに結合される腫瘍もしくは病原体関連ペプチド、ＨＬＡに結合されるｈＴＥＲＴペプチド、ＨＬＡに結合されるチロシナーゼペプチド、ＨＬＡに結合されるＷＴ−１ペプチド、ＬＴβＲ、ＬＩＦＲβ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＯＳＭＲβ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、Ｂ７Ｈ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＷＴ−１、Ｒｏｂｏ１、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０、もしくはＣＤ７９ｂに対して特異的である、項目８２に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目８４）
前記結合ドメインは、抗体である、項目７６に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目８５）
前記タグカセットは、アミノ酸配列  Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（配列番号１）もしくはＴｒｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２）を有するＳｔｒｅｐタグであり、前記会合した結合ドメインは、ビオチン結合タンパク質である、項目７６に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目８６）
前記結合ドメインは、細胞傷害性薬剤、放射性同位体、放射性金属、もしくは検出可能な因子をさらに含む、項目７６〜８５のいずれか１項に記載の単鎖融合タンパク質。
（項目８７）
前記融合タンパク質は、細胞傷害性薬剤、放射性同位体、放射性金属、もしくは検出可能な因子をさらに含む、項目１〜８５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目８８）
項目１〜８５または５０〜８７のいずれか１項に記載の融合タンパク質あるいは項目３０〜４９のいずれか１項に記載のキメラ抗原レセプターをコードする核酸分子。
（項目８９）
項目８８に記載の核酸分子を含むベクター。
（項目９０）
前記ベクターは、ウイルスベクターである、項目８９に記載のベクター。
（項目９１）
前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターである、項目９０に記載のベクター。
（項目９２）
項目１〜８５のいずれか１項に記載の融合タンパク質もしくはキメラ抗原レセプターをコードする核酸分子を含む宿主細胞。
（項目９３）
前記宿主細胞は、Ｔ細胞である、項目９２に記載の宿主細胞。
（項目９４）
細胞を活性化するための方法であって、前記方法は、項目１〜８５のいずれか１項に記載の融合タンパク質もしくはキメラ抗原レセプターおよび／または項目８８に記載の核酸分子を含む細胞と、タグカセットに対して特異的な結合ドメインとを接触させる工程を包含する、方法。
（項目９５）
前記タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインは、固体表面に結合され、そして／または前記タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインは、同系レセプター、抗タグ抗体、および／もしくは抗タグｓｃＦｖである、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
前記タグカセットは、アミノ酸配列  Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（配列番号１）もしくはＴｒｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２）を有するＳｔｒｅｐタグである、項目９４または９５に記載の方法。
（項目９７）
前記タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインは、ビオチン結合タンパク質もしくは抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体である、項目９４〜９６のいずれか１項に記載の方法。
（項目９８）
前記結合ドメインは、平らな表面、アガロース、樹脂、３Ｄファブリックマトリクス、もしくはビーズに結合される、項目９４〜９７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９９）
前記結合ドメインは、マイクロビーズもしくはナノビーズに結合される、項目９４〜９８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１００）
前記活性化は、インビボもしくはエキソビボで行われる、項目９４〜９９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０１）
前記細胞は、Ｔ細胞であり、そして／またはヒトＴ細胞である、項目９４〜１００のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０２）
細胞増殖を促進するための方法であって、前記方法は、項目１〜８５のいずれか１項に記載の融合タンパク質もしくはキメラ抗原レセプターおよび／または項目８８に記載の核酸分子を含む非天然の細胞と、タグカセットに対して特異的な結合ドメインおよび増殖因子サイトカインとを、細胞増殖を可能にするために十分な時間にわたって接触させる工程を包含する、方法。
（項目１０３）
前記タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインは、固体表面に結合され、そして／または前記タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインは、同系レセプター、抗タグ抗体、もしくは抗タグｓｃＦｖである、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
前記タグカセットは、アミノ酸配列  Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（配列番号１）もしくはＴｒｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２）を有するＳｔｒｅｐタグである、項目１０２または１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインは、ビオチン結合タンパク質もしくは抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体である、項目１０２〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０６）
前記結合ドメインは、平らな表面、アガロース、樹脂、３Ｄファブリックマトリクス、もしくはビーズに結合される、項目１０２〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０７）
前記結合ドメインは、マイクロビーズもしくはナノビーズに結合される、項目１０２〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０８）
前記増殖因子サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ１５、もしくは両方である、項目１０２〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０９）
前記方法は、前記細胞を、抗ＣＤ２７結合ドメイン、抗ＣＤ２８結合ドメイン、抗ＣＤ１３７結合ドメイン、抗ＯＸ４０結合ドメインもしくはこれらの任意の組み合わせとともにインキュベートする工程をさらに包含し、ここで前記結合ドメインは、固体表面に結合されている、項目１０２〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１０）
前記抗ＣＤ２７結合ドメイン、前記抗ＣＤ２８結合ドメイン、前記抗ＣＤ１３７結合ドメイン、前記抗ＯＸ４０結合ドメインもしくはこれらの任意の組み合わせは、平らな表面、アガロース、樹脂、３Ｄファブリックマトリクス、もしくはビーズに結合されている、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
前記増殖は、インビボもしくはエキソビボで誘発される、項目１０２〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１２）
前記細胞は、Ｔ細胞であり、そして／または前記細胞は、ヒトＴ細胞である、項目１０２〜１１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１３）
前記Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞である、項目１１２に記載の方法。
（項目１１４）
前記機能的Ｔ細胞は、ウイルス特異的Ｔ細胞、腫瘍抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーステムＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、もしくはＣＤ４＋  ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞である、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記増殖は、項目１〜８５のいずれか１項に記載の融合タンパク質もしくはキメラ抗原レセプターの結合ドメインが標的細胞リガンドを結合する場合にインビボで誘発される、項目１０２〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１６）
前記標的細胞リガンドは、Ｔ細胞サプレッサー細胞リガンドである、項目１１５に記載の方法。
（項目１１７）
前記Ｔ細胞サプレッサー細胞リガンドは、ＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２である、項目１１６に記載の方法。
（項目１１８）
細胞を同定するための方法であって、前記方法は、
項目１〜８５のいずれか１項に記載の融合タンパク質もしくはキメラ抗原レセプターおよび／または項目８８に記載の核酸分子を含む細胞を含むサンプルと、タグカセットに対して特異的な結合ドメインとを接触させる工程であって、ここで前記タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインは、検出可能な部分を含む、工程、ならびに
前記サンプル中の細胞の存在を検出する工程、
を包含する、方法。
（項目１１９）
細胞もしくは細胞集団をソートもしくは選択するための方法であって、前記方法は、
項目１〜８５のいずれか１項に記載の融合タンパク質もしくはキメラ抗原レセプターおよび／または項目８８に記載の核酸分子を含むＴ細胞を含むサンプルと、タグカセットに対して特異的な結合ドメインとを接触させる工程、ならびに
前記結合ドメインによって特異的に結合される細胞を、他の細胞から選択もしくはソートし、それによって、前記細胞もしくは前記細胞集団を他の細胞から選択もしくはソートする工程、
を包含する、方法。
（項目１２０）
前記結合ドメインは、検出可能な部分を含み、前記部分は、蛍光マーカーである、項目１１８または１１９に記載の方法。
（項目１２１）
前記結合ドメインは、検出可能な部分を含み、前記部分は、ＡＰＣもしくはＦＩＴＣである、項目１１８〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２２）
前記サンプルは血液である、項目１１８〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２３）
前記細胞は、フローサイトメトリーを使用して検出もしくはソートされる、項目１１８〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２４）
前記細胞は、非天然の細胞であるか、Ｔ細胞であるか、そして／またはヒトＴ細胞である、項目１１８〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２５）
細胞もしくはその集団を富化するかもしくは単離するための方法であって、前記方法は、
項目８８に記載の核酸分子および／または項目１〜８５のいずれか１項に記載のタンパク質もしくはレセプターを含む前記細胞を含むサンプルと、タグカセットに対して特異的な結合ドメインとを接触させる工程、ならびに
前記サンプルにおいて、前記細胞を、前記融合タンパク質もしくは前記レセプターを発現しない他の細胞から富化もしくは単離する工程、
を包含する、方法。
（項目１２６）
前記タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインは、同系レセプター、抗タグ抗体、もしくは抗タグｓｃＦｖである、項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
前記タグカセットは、アミノ酸配列  Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（配列番号１）もしくはＴｒｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２）を有するＳｔｒｅｐタグである、項目１２５または１２６に記載の方法。
（項目１２８）
前記タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインは、ビオチン結合タンパク質もしくは抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体である、項目１２５〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２９）
前記結合ドメインは、平らな表面、アガロース、樹脂、３Ｄファブリックマトリクス、もしくはビーズに結合される、項目１２５〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３０）
前記結合ドメインは、マイクロビーズもしくはナノビーズに結合される、項目１２５〜１２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３１）
活性化は、エキソビボで行われる、項目１２５〜１３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３２）
富化もしくは単離の前に、項目１０２〜１１７のいずれか１項に記載のサンプルにおいて前記細胞集団を増殖させる工程をさらに包含する、項目１２５〜１３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３３）
前記細胞は、非天然の細胞であり、Ｔ細胞であり、そして／またはヒトＴ細胞である、項目１２５〜１３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３４）
前記細胞は、前記サンプルの他の成分から、磁性カラムクロマトグラフィーによって富化もしくは単離される、項目１２５〜１３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３５）
富化もしくは単離された前記細胞もしくは前記細胞集団を同定する工程をさらに包含し、ここで前記同定する工程は、前記細胞と、前記タグカセットに対して特異的であり、かつ検出可能な部分を有する結合ドメインとを接触させることを包含する、項目１２５〜１３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３６）
前記検出可能な部分は、蛍光マーカーである、項目１３５に記載の方法。
（項目１３７）
前記検出可能な部分は、ＡＰＣ、ＰＥ、パシフィックブルー、Ａｌｅｘ  ｆｌｕｏｒ、もしくはＦＩＴＣである、項目１３５または１３６に記載の方法。
（項目１３８）
細胞もしくは集団は、フローサイトメトリーを使用して検出される、項目１３５〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３９）
前記サンプルは、血液もしくは血液由来サンプルである、項目１２５〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４０）
細胞を枯渇させるための方法であって、前記方法は、
項目８８に記載の核酸分子または項目１〜８５のいずれか１項に記載のタンパク質もしくはレセプターを含む細胞と、タグカセットに対して特異的な結合ドメインとを接触させる工程であって、ここで前記タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインの結合は、前記融合タンパク質もしくは前記キメラレセプターを発現する前記細胞の細胞死をもたらす、工程、
を包含する、方法。
（項目１４１）
前記タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインは、同系レセプター、抗タグ抗体、抗タグｓｃＦｖ、または抗タグ結合ドメインをその細胞表面に有する細胞である、項目１４０に記載の方法。
（項目１４２）
前記タグカセットは、アミノ酸配列  Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（配列番号１）もしくはＴｒｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２）を有するＳｔｒｅｐタグである、項目１４０または１４１に記載の方法。
（項目１４３）
前記タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインは、ビオチン結合タンパク質、抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体、または抗Ｓｔｒｅｐタグ結合ドメインをその細胞表面に発現する細胞である、項目１４０〜１４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４４）
前記タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインは、二重特異的結合ドメインであり、ここで第１の結合ドメインは、前記タグカセットに対して特異的であり、その第２の結合ドメインは、ＣＤ３に対して特異的である。項目１４０〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４５）
前記タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインは、細胞傷害性薬剤、放射性同位体、放射性金属、もしくは検出可能な因子をさらに含む、項目１４０〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４６）
非天然のＴ細胞をインビボで追跡する工程をさらに包含し、ここで前記タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインは、検出可能な因子を含む、項目１４５に記載の方法。
（項目１４７）
タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインは、被験体に投与される、項目１４０〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４８）
前記被験体はヒトである、項目１４７に記載の方法。
（項目１４９）
前記方法は、前記タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインを投与した後に、前記被験体におけるサイトカインレベルをモニターする工程をさらに包含する、項目１４７または１４８に記載の方法。
（項目１５０）
前記方法は、前記被験体において前記細胞を追跡する工程をさらに包含する、項目１４７〜１４９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５１）
前記インビボで追跡する工程は、磁性粒子、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、フルオロデオキシグルコース（１８Ｆ）、蛍光化合物、またはこれらの任意の組み合わせに結合体化した前記タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインの使用を含む、項目１５０に記載の方法。
（項目１５２）
前記インビボで追跡する工程は、ＭＲＩ、ＰＥＴ、もしくは近赤外線画像化の使用を含む、項目１５０または１５１に記載の方法。
（項目１５３）
望ましい細胞集団を生成するための方法であって、前記方法は、非天然の前駆細胞を含むサンプルと、タグカセットに対して特異的な結合ドメインおよび増殖因子とを、細胞増殖および分化を可能にするために十分な時間にわたって接触させる工程であって、ここで前記非天然の前駆細胞は、項目５０〜８５のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含み、前記タグカセットに対して特異的な前記結合ドメインは、固体表面に結合される、工程を包含する、方法。
（項目１５４）
前記前駆細胞は、幹細胞である、項目１５３に記載の方法。
（項目１５５）
増殖させた前記前駆細胞集団は、項目１２５〜１３９のいずれか１項に記載の方法を使用してさらに単離もしくは富化される、項目１５３に記載の方法。
（項目１５６）
被験体における疾患を処置する方法であって、前記方法は、項目９２または９３に記載の宿主細胞を被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目１５７）
前記疾患は、ウイルス疾患、細菌疾患、癌、炎症性疾患、免疫疾患、もしくは加齢関連疾患である、項目１５６に記載の方法。
（項目１５８）
前記被験体はヒトである、項目１５６または１５７に記載の方法。
（項目１５９）
前記宿主細胞は、Ｔ細胞もしくは自己由来Ｔ細胞である、項目１５６〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６０）
前記Ｔ細胞は、調節性Ｔ細胞である、項目１５９に記載の方法。
（項目１６１）
前記Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞もしくはＣＤ４＋  Ｔ細胞である、項目１５９に記載の方法。
（項目１６２）
前記宿主細胞は、幹細胞である、項目１５６〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６３）
免疫細胞の局所活性化のためのインビボでの方法であって、前記方法は、被験体に、タグカセットに対する結合ドメインおよび共刺激分子に対する結合ドメインを含むマトリクス組成物を投与する工程、ならびに項目９２に記載の宿主細胞を投与する工程を包含し、ここで前記マトリクス組成物中の前記結合ドメインと、前記宿主細胞との会合は、前記宿主細胞を活性化する、方法。
（項目１６４）
局所活性化のためのインビボでの方法であって、ここでマトリクス組成物は、アルギネート、基底膜マトリクス、もしくはバイオポリマーを含む、方法。
（項目１６５）
局所活性化のためのインビボでの方法であって、ここで免疫細胞はＴ細胞である、方法。
（項目１６６）
免疫細胞の局所活性化のためのインビボでの方法であって、前記方法は、被験体に、タグカセットに対する結合ドメインおよび共刺激分子に対する結合ドメインを含むデバイスを投与する工程、ならびに項目９２に記載の宿主細胞を投与する工程を包含し、ここでマトリクス組成物中の前記結合ドメインと、前記宿主細胞との会合は、前記宿主細胞を活性化する、方法。
（項目１６７）
局所活性化のためのインビボでの方法であって、ここでデバイスは、平らな表面、アガロースビーズ、樹脂、３Ｄファブリックマトリクス、もしくはビーズを含む、方法。
（項目１６８）
局所活性化のためのインビボでの方法であって、ここで免疫細胞は、Ｔ細胞である、方法。
（項目１６９）
細胞を追跡する方法であって、前記方法は、被験体に、検出可能な部分を含む結合分子を投与する工程であって、ここで前記被験体は、項目９２もしくは９３に記載の細胞を投与されたか、または前記方法は、項目９２もしくは９３に記載の細胞の投与をさらに包含し、前記結合分子は、融合タンパク質もしくはキメラレセプター内に含まれるタグカセットに特異的に結合する、工程、ならびに前記投与の後に、前記被験体においてインビボで、または前記被験体から得られたサンプル中で、前記分子の存在を検出し、それによって前記被験体またはその組織もしくは体液中で前記細胞を検出する工程を包含する、方法。
（項目１７０）
前記方法は、前記細胞の前記投与をさらに含み、ここで前記細胞および前記結合分子は、同時に投与される、項目１６９に記載の方法。
（項目１７１）
前記結合分子および前記細胞は、複合体として投与される、項目１７０に記載の方法。
（項目１７２）
前記結合分子は、磁性粒子、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、フルオロデオキシグルコース（１８Ｆ）、蛍光化合物、もしくはこれらの任意の組み合わせに結合体化される、項目１５０に記載の方法。
（項目１７３）
前記追跡する工程は、インビボで実行され、ＭＲＩ、ＰＥＴ、もしくは近赤外線画像化の使用を含む、項目１５０または１５１に記載の方法。
（項目１７４）
タグカセットに対する結合ドメインおよび免疫細胞共刺激分子に対する結合ドメインを含む、マトリクス組成物。
（項目１７５）
アルギネート、基底膜マトリクス、もしくはバイオポリマーをさらに含む、項目１７４に記載のマトリクス組成物。
（項目１７６）
タグカセットに対する結合ドメインおよび免疫細胞共刺激分子に対する結合ドメインを含む、デバイス。
（項目１７７）
前記結合ドメインのうちの一方もしくは両方は、表面、アガロースビーズ、樹脂、３Ｄファブリックマトリクス、もしくはビーズに配置される、項目１７６に記載のデバイス。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａ〜１Ｈは、１個以上のアフィニティータグカセット（Ａ〜Ｄ、本明細書ではＫｅｙ−ＣｈＥＭといわれる）を含み、そして１個以上の特異的結合ドメイン（Ｅ〜Ｇ、本明細書ではＴ−ＣｈＡＲＭといわれる）を必要に応じて含む、種々の単鎖キメラエフェクター分子の実例を示す。上記単鎖ＣｈＥＭおよびＣｈＡＲＭは、細胞内ドメインを含む。上記タグカセットは、アフィニティータグ（例えば、Ｓｔｒｅｐタグ（登録商標）ＩＩ（配列番号１）、Ｍｙｃタグ（配列番号７）、Ｖ５タグ（配列番号８）、Ｆｌａｇ（登録商標）タグ（配列番号３）、Ｈｉｓタグ、または非内因性同系（ｃｏｇｎａｔｅ）結合パートナー（例えば、レセプター、タンパク質、抗体）によって認識される他のペプチドもしくは分子のいずれかのタイプであり得る。示されるように、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭは、（Ａ，Ｂ）１個のタグカセット、（Ｃ）２個のタグカセット（Ｋｅｙ−ＣｈＥＭ２）、（Ｄ）３個のタグカセット（Ｋｅｙ−ＣｈＥＭ３）、またはより多くを含み得る。さらに、上記キメラ分子は、複数のエフェクタードメインを有し得（例えば、ＡおよびＣ〜Ｇの分子は、２個のエフェクタードメインを有する一方で、Ｂに示される分子は、３個のエフェクタードメインを有する）、上記タグカセットは、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭ分子の種々の異なる領域に配置され得る。これら具体例において、Ｔ−ＣｈＡＲＭは、上記特異的結合ドメインと上記エフェクタードメインとの間に（Ｅ）、上記特異的結合ドメインの遠位末端（例えば、アミノ末端）に（Ｆ）、上記特異的結合ドメイン内に組み込まれて（Ｇ）（例えば、ｓｃＦｖのＶＨ鎖とＶＬ鎖との間の可撓性リンカー内に位置する）配置された１個のタグカセット、および２個の異なるタグ（一方は、結合ドメインのＣ末端、一方は結合ドメインのＮ末端）を有する（Ｈ）を有する。上記Ｔ−ＣｈＡＲＭはまた、上記Ｋｅｙ−ＣｈＥＭについて示されるように、２個、３個もしくはより多くのタグカセットを有し得る。これら実例において明らかであるように、タグカセットは、別のＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭ成分または別のタグへと、リンカーモジュール（例えば、可撓性（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎリンカーモジュール）を介して接続され得る。上記リンカーの長さは、特異的結合ドメインと、標的リガンドもしくは抗原との最良の相互作用を達成するように、および上記ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現する細胞と、標的細胞との間の最良の相互作用を達成するように、より長くもしくはより短く調整され得る。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、ＣＤ１９もしくはＲＯＲ１（コントロール）を発現するようにトランスフェクトしたＫ５６２白血病細胞、ＣＤ１９＋／ＲＯＲ１＋  Ｒａｊｉリンパ腫細胞、および膜結合した抗ＣＤ３  ｍＡｂ単鎖抗体（ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ）を発現して、全てのエフェクターＴ細胞を活性化するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞に対する、種々の種の抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭおよび従来の抗Ｃ１９  ＣＡＲ（タグカセットを欠いており、かつ短スペーサー、中間スペーサー、および長スペーサードメインを有する）を発現するヒトエフェクターＴ細胞の細胞溶解活性を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｆは、種々の抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ（Ａ〜Ｃ）および従来の抗Ｃ１９  ＣＡＲ（Ｄ〜Ｆ）を発現するＴ細胞を、ＣＤ１９（ＡおよびＤ）もしくはＲＯＲ１（陰性コントロール；ＢおよびＥ）のいずれかを発現するＫ５６２細胞とともに、およびＰＭＡ／イオノマイシン（陽性コントロール；ＣおよびＦ）とともに共培養して２４時間後に得られた上清の多重サイトカインアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標））の結果を示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、種々の抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ（Ａ）およびＣＤ１９  ＣＡＲ（Ｂ）を発現するＴ細胞をＣＤ１９＋  Ｒａｊｉ細胞と共培養して２４時間後に得られた上清の多重サイトカインアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標））の結果を示す。
【図５−１】図５は、Ｔ細胞増殖アッセイの結果を示し、ここでカルボキシフルオレセイン色素希釈物は、Ｔ−ＣｈＡＲＭ（１個、２個もしくは３個のタグカセットを含む）もしくは従来のＣＡＲ（ＣＤ１９（長））を発現する抗ＣＤ１９  ＣＤ８＋  Ｔ細胞がＣＤ１９を発現する腫瘍細胞（青色）に応じて増殖していたが、ＲＯＲ１を発現する腫瘍細胞（赤色）の存在下では増殖していなかったことを示す。
【図５−２】図５は、Ｔ細胞増殖アッセイの結果を示し、ここでカルボキシフルオレセイン色素希釈物は、Ｔ−ＣｈＡＲＭ（１個、２個もしくは３個のタグカセットを含む）もしくは従来のＣＡＲ（ＣＤ１９（長））を発現する抗ＣＤ１９  ＣＤ８＋  Ｔ細胞がＣＤ１９を発現する腫瘍細胞（青色）に応じて増殖していたが、ＲＯＲ１を発現する腫瘍細胞（赤色）の存在下では増殖していなかったことを示す。
【図５−３】図５は、Ｔ細胞増殖アッセイの結果を示し、ここでカルボキシフルオレセイン色素希釈物は、Ｔ−ＣｈＡＲＭ（１個、２個もしくは３個のタグカセットを含む）もしくは従来のＣＡＲ（ＣＤ１９（長））を発現する抗ＣＤ１９  ＣＤ８＋  Ｔ細胞がＣＤ１９を発現する腫瘍細胞（青色）に応じて増殖していたが、ＲＯＲ１を発現する腫瘍細胞（赤色）の存在下では増殖していなかったことを示す。
【図５−４】図５は、Ｔ細胞増殖アッセイの結果を示し、ここでカルボキシフルオレセイン色素希釈物は、Ｔ−ＣｈＡＲＭ（１個、２個もしくは３個のタグカセットを含む）もしくは従来のＣＡＲ（ＣＤ１９（長））を発現する抗ＣＤ１９  ＣＤ８＋  Ｔ細胞がＣＤ１９を発現する腫瘍細胞（青色）に応じて増殖していたが、ＲＯＲ１を発現する腫瘍細胞（赤色）の存在下では増殖していなかったことを示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｅは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ（１個、２個もしくは３個のタグカセットを含む）もしくは従来のＣＡＲ（短もしくは中間コネクター領域を含む）のいずれかを発現する抗ＣＤ１９ヒトＴ細胞が、ＮＳＧマウスにおいて確立されたＲａｊｉ腫瘍を根絶し得ることを示す。これら実験において、上記Ｒａｊｉ細胞は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するようにトランスフェクトされ、腫瘍増殖は、上記マウスへのルシフェリンの注射およびバイオルミネッセンス画像化によって測定される。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｅは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ（１個、２個もしくは３個のタグカセットを含む）もしくは従来のＣＡＲ（短もしくは中間コネクター領域を含む）のいずれかを発現する抗ＣＤ１９ヒトＴ細胞が、ＮＳＧマウスにおいて確立されたＲａｊｉ腫瘍を根絶し得ることを示す。これら実験において、上記Ｒａｊｉ細胞は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するようにトランスフェクトされ、腫瘍増殖は、上記マウスへのルシフェリンの注射およびバイオルミネッセンス画像化によって測定される。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｅは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ（１個、２個もしくは３個のタグカセットを含む）もしくは従来のＣＡＲ（短もしくは中間コネクター領域を含む）のいずれかを発現する抗ＣＤ１９ヒトＴ細胞が、ＮＳＧマウスにおいて確立されたＲａｊｉ腫瘍を根絶し得ることを示す。これら実験において、上記Ｒａｊｉ細胞は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するようにトランスフェクトされ、腫瘍増殖は、上記マウスへのルシフェリンの注射およびバイオルミネッセンス画像化によって測定される。
【図６Ｄ】図６Ａ〜６Ｅは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ（１個、２個もしくは３個のタグカセットを含む）もしくは従来のＣＡＲ（短もしくは中間コネクター領域を含む）のいずれかを発現する抗ＣＤ１９ヒトＴ細胞が、ＮＳＧマウスにおいて確立されたＲａｊｉ腫瘍を根絶し得ることを示す。これら実験において、上記Ｒａｊｉ細胞は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するようにトランスフェクトされ、腫瘍増殖は、上記マウスへのルシフェリンの注射およびバイオルミネッセンス画像化によって測定される。
【図６Ｅ】図６Ａ〜６Ｅは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ（１個、２個もしくは３個のタグカセットを含む）もしくは従来のＣＡＲ（短もしくは中間コネクター領域を含む）のいずれかを発現する抗ＣＤ１９ヒトＴ細胞が、ＮＳＧマウスにおいて確立されたＲａｊｉ腫瘍を根絶し得ることを示す。これら実験において、上記Ｒａｊｉ細胞は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するようにトランスフェクトされ、腫瘍増殖は、上記マウスへのルシフェリンの注射およびバイオルミネッセンス画像化によって測定される。
【図７−１】図７は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＴ−ＣｈＡＲＭを発現するヒトＴ細胞が、Ｒａｊｉリンパ腫を接種したＮＳＧマウスへの養子移入後に血液中で存続し得ることを示す。ヒトＴ細胞は、ヒトＣＤ８およびＣＤ４５細胞表面分子に対して特異的なモノクローナル抗体で染色することによって区別される。
【図７−２】図７は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＴ−ＣｈＡＲＭを発現するヒトＴ細胞が、Ｒａｊｉリンパ腫を接種したＮＳＧマウスへの養子移入後に血液中で存続し得ることを示す。ヒトＴ細胞は、ヒトＣＤ８およびＣＤ４５細胞表面分子に対して特異的なモノクローナル抗体で染色することによって区別される。
【図７−３】図７は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＴ−ＣｈＡＲＭを発現するヒトＴ細胞が、Ｒａｊｉリンパ腫を接種したＮＳＧマウスへの養子移入後に血液中で存続し得ることを示す。ヒトＴ細胞は、ヒトＣＤ８およびＣＤ４５細胞表面分子に対して特異的なモノクローナル抗体で染色することによって区別される。
【図７−４】図７は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＴ−ＣｈＡＲＭを発現するヒトＴ細胞が、Ｒａｊｉリンパ腫を接種したＮＳＧマウスへの養子移入後に血液中で存続し得ることを示す。ヒトＴ細胞は、ヒトＣＤ８およびＣＤ４５細胞表面分子に対して特異的なモノクローナル抗体で染色することによって区別される。
【図７−５】図７は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＴ−ＣｈＡＲＭを発現するヒトＴ細胞が、Ｒａｊｉリンパ腫を接種したＮＳＧマウスへの養子移入後に血液中で存続し得ることを示す。ヒトＴ細胞は、ヒトＣＤ８およびＣＤ４５細胞表面分子に対して特異的なモノクローナル抗体で染色することによって区別される。
【図７−６】図７は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＴ−ＣｈＡＲＭを発現するヒトＴ細胞が、Ｒａｊｉリンパ腫を接種したＮＳＧマウスへの養子移入後に血液中で存続し得ることを示す。ヒトＴ細胞は、ヒトＣＤ８およびＣＤ４５細胞表面分子に対して特異的なモノクローナル抗体で染色することによって区別される。
【図７−７】図７は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＴ−ＣｈＡＲＭを発現するヒトＴ細胞が、Ｒａｊｉリンパ腫を接種したＮＳＧマウスへの養子移入後に血液中で存続し得ることを示す。ヒトＴ細胞は、ヒトＣＤ８およびＣＤ４５細胞表面分子に対して特異的なモノクローナル抗体で染色することによって区別される。
【図７−８】図７は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＴ−ＣｈＡＲＭを発現するヒトＴ細胞が、Ｒａｊｉリンパ腫を接種したＮＳＧマウスへの養子移入後に血液中で存続し得ることを示す。ヒトＴ細胞は、ヒトＣＤ８およびＣＤ４５細胞表面分子に対して特異的なモノクローナル抗体で染色することによって区別される。
【図７−９】図７は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＴ−ＣｈＡＲＭを発現するヒトＴ細胞が、Ｒａｊｉリンパ腫を接種したＮＳＧマウスへの養子移入後に血液中で存続し得ることを示す。ヒトＴ細胞は、ヒトＣＤ８およびＣＤ４５細胞表面分子に対して特異的なモノクローナル抗体で染色することによって区別される。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、タグ特異的結合剤を使用するフローサイトメトリーによって同定され得ることを示す。上記例において、精製Ｔ−ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞は、発現マーカーｔＥＧＦＲ（Ａ）によって検出されるか、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳＴＩＩ）（Ｂ）によって検出されるか、またはＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  ＡＰＣ（Ｃ，Ｄ）で検出される。
【図８−２】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、タグ特異的結合剤を使用するフローサイトメトリーによって同定され得ることを示す。上記例において、精製Ｔ−ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞は、発現マーカーｔＥＧＦＲ（Ａ）によって検出されるか、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳＴＩＩ）（Ｂ）によって検出されるか、またはＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  ＡＰＣ（Ｃ，Ｄ）で検出される。
【図８−３】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、タグ特異的結合剤を使用するフローサイトメトリーによって同定され得ることを示す。上記例において、精製Ｔ−ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞は、発現マーカーｔＥＧＦＲ（Ａ）によって検出されるか、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳＴＩＩ）（Ｂ）によって検出されるか、またはＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  ＡＰＣ（Ｃ，Ｄ）で検出される。
【図８−４】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、タグ特異的結合剤を使用するフローサイトメトリーによって同定され得ることを示す。上記例において、精製Ｔ−ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞は、発現マーカーｔＥＧＦＲ（Ａ）によって検出されるか、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳＴＩＩ）（Ｂ）によって検出されるか、またはＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  ＡＰＣ（Ｃ，Ｄ）で検出される。
【図８−５】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、タグ特異的結合剤を使用するフローサイトメトリーによって同定され得ることを示す。上記例において、精製Ｔ−ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞は、発現マーカーｔＥＧＦＲ（Ａ）によって検出されるか、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳＴＩＩ）（Ｂ）によって検出されるか、またはＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  ＡＰＣ（Ｃ，Ｄ）で検出される。
【図８−６】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、タグ特異的結合剤を使用するフローサイトメトリーによって同定され得ることを示す。上記例において、精製Ｔ−ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞は、発現マーカーｔＥＧＦＲ（Ａ）によって検出されるか、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳＴＩＩ）（Ｂ）によって検出されるか、またはＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  ＡＰＣ（Ｃ，Ｄ）で検出される。
【図８−７】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、タグ特異的結合剤を使用するフローサイトメトリーによって同定され得ることを示す。上記例において、精製Ｔ−ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞は、発現マーカーｔＥＧＦＲ（Ａ）によって検出されるか、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳＴＩＩ）（Ｂ）によって検出されるか、またはＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  ＡＰＣ（Ｃ，Ｄ）で検出される。
【図８−８】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、タグ特異的結合剤を使用するフローサイトメトリーによって同定され得ることを示す。上記例において、精製Ｔ−ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞は、発現マーカーｔＥＧＦＲ（Ａ）によって検出されるか、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳＴＩＩ）（Ｂ）によって検出されるか、またはＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  ＡＰＣ（Ｃ，Ｄ）で検出される。
【図８−９】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、タグ特異的結合剤を使用するフローサイトメトリーによって同定され得ることを示す。上記例において、精製Ｔ−ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞は、発現マーカーｔＥＧＦＲ（Ａ）によって検出されるか、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳＴＩＩ）（Ｂ）によって検出されるか、またはＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  ＡＰＣ（Ｃ，Ｄ）で検出される。
【図８−１０】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、タグ特異的結合剤を使用するフローサイトメトリーによって同定され得ることを示す。上記例において、精製Ｔ−ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞は、発現マーカーｔＥＧＦＲ（Ａ）によって検出されるか、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳＴＩＩ）（Ｂ）によって検出されるか、またはＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  ＡＰＣ（Ｃ，Ｄ）で検出される。
【図８−１１】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、タグ特異的結合剤を使用するフローサイトメトリーによって同定され得ることを示す。上記例において、精製Ｔ−ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞は、発現マーカーｔＥＧＦＲ（Ａ）によって検出されるか、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳＴＩＩ）（Ｂ）によって検出されるか、またはＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  ＡＰＣ（Ｃ，Ｄ）で検出される。
【図８−１２】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、タグ特異的結合剤を使用するフローサイトメトリーによって同定され得ることを示す。上記例において、精製Ｔ−ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞は、発現マーカーｔＥＧＦＲ（Ａ）によって検出されるか、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳＴＩＩ）（Ｂ）によって検出されるか、またはＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  ＡＰＣ（Ｃ，Ｄ）で検出される。
【図８−１３】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、タグ特異的結合剤を使用するフローサイトメトリーによって同定され得ることを示す。上記例において、精製Ｔ−ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞は、発現マーカーｔＥＧＦＲ（Ａ）によって検出されるか、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳＴＩＩ）（Ｂ）によって検出されるか、またはＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  ＡＰＣ（Ｃ，Ｄ）で検出される。
【図８−１４】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、タグ特異的結合剤を使用するフローサイトメトリーによって同定され得ることを示す。上記例において、精製Ｔ−ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞は、発現マーカーｔＥＧＦＲ（Ａ）によって検出されるか、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳＴＩＩ）（Ｂ）によって検出されるか、またはＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  ＡＰＣ（Ｃ，Ｄ）で検出される。
【図８−１５】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、タグ特異的結合剤を使用するフローサイトメトリーによって同定され得ることを示す。上記例において、精製Ｔ−ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞は、発現マーカーｔＥＧＦＲ（Ａ）によって検出されるか、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳＴＩＩ）（Ｂ）によって検出されるか、またはＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  ＡＰＣ（Ｃ，Ｄ）で検出される。
【図８−１６】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、タグ特異的結合剤を使用するフローサイトメトリーによって同定され得ることを示す。上記例において、精製Ｔ−ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞は、発現マーカーｔＥＧＦＲ（Ａ）によって検出されるか、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳＴＩＩ）（Ｂ）によって検出されるか、またはＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ  ＡＰＣ（Ｃ，Ｄ）で検出される。
【図９−１】図９は、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、蛍光色素に連結されたタグ特異的結合剤で低純度（例では１５％）から高純度（例では９９％）までフローサイトメトリーによってソートされ得ることを示す。例において、上記タグは、ＳｔｒｅｐタグＩＩであり、上記タグ特異的結合剤は、蛍光色素に連結された抗ＳＴＩＩ  ｍＡｂである。
【図９−２】図９は、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、蛍光色素に連結されたタグ特異的結合剤で低純度（例では１５％）から高純度（例では９９％）までフローサイトメトリーによってソートされ得ることを示す。例において、上記タグは、ＳｔｒｅｐタグＩＩであり、上記タグ特異的結合剤は、蛍光色素に連結された抗ＳＴＩＩ  ｍＡｂである。
【図９−３】図９は、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、蛍光色素に連結されたタグ特異的結合剤で低純度（例では１５％）から高純度（例では９９％）までフローサイトメトリーによってソートされ得ることを示す。例において、上記タグは、ＳｔｒｅｐタグＩＩであり、上記タグ特異的結合剤は、蛍光色素に連結された抗ＳＴＩＩ  ｍＡｂである。
【図９−４】図９は、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、蛍光色素に連結されたタグ特異的結合剤で低純度（例では１５％）から高純度（例では９９％）までフローサイトメトリーによってソートされ得ることを示す。例において、上記タグは、ＳｔｒｅｐタグＩＩであり、上記タグ特異的結合剤は、蛍光色素に連結された抗ＳＴＩＩ  ｍＡｂである。
【図１０−１】図１０は、種々のサイズのＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ビーズを使用することによる、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞（３個のＳｔｒｅｐタグ  タグカセットを含む）の直接富化を示す。左側のパネルは、富化画分の染色を示し、右側のパネルは、流出液（非富化画分）を示す。
【図１０−２】図１０は、種々のサイズのＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ビーズを使用することによる、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞（３個のＳｔｒｅｐタグ  タグカセットを含む）の直接富化を示す。左側のパネルは、富化画分の染色を示し、右側のパネルは、流出液（非富化画分）を示す。
【図１０−３】図１０は、種々のサイズのＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ビーズを使用することによる、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞（３個のＳｔｒｅｐタグ  タグカセットを含む）の直接富化を示す。左側のパネルは、富化画分の染色を示し、右側のパネルは、流出液（非富化画分）を示す。
【図１０−４】図１０は、種々のサイズのＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ビーズを使用することによる、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞（３個のＳｔｒｅｐタグ  タグカセットを含む）の直接富化を示す。左側のパネルは、富化画分の染色を示し、右側のパネルは、流出液（非富化画分）を示す。
【図１０−５】図１０は、種々のサイズのＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ビーズを使用することによる、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞（３個のＳｔｒｅｐタグ  タグカセットを含む）の直接富化を示す。左側のパネルは、富化画分の染色を示し、右側のパネルは、流出液（非富化画分）を示す。
【図１０−６】図１０は、種々のサイズのＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ビーズを使用することによる、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞（３個のＳｔｒｅｐタグ  タグカセットを含む）の直接富化を示す。左側のパネルは、富化画分の染色を示し、右側のパネルは、流出液（非富化画分）を示す。
【図１０−７】図１０は、種々のサイズのＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ビーズを使用することによる、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞（３個のＳｔｒｅｐタグ  タグカセットを含む）の直接富化を示す。左側のパネルは、富化画分の染色を示し、右側のパネルは、流出液（非富化画分）を示す。
【図１１】図１１は、タグ配列に対する結合リガンド（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標））に連結したビーズとともに共培養した、Ｔ−ＣｈＡＲＭ（１個、２個もしくは３個のタグカセットを含む）もしくは従来の抗ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するＴ細胞（ＣＤ１９  長）の光学顕微鏡写真を示す。この顕微鏡写真は、Ｔ−ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞の選択的クラスター化および増殖を実証する。
【図１２】図１２は、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）マイクロビーズとの１０日間の培養にわたるＴ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞（１個、２個もしくは３個のタグカセットを含む）の増殖曲線を示す。
【図１３−１】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  マイクロビーズ、ナノビーズもしくは抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ  ｍＡｂのみのいずれかによって、または抗ＣＤ２８  ｍＡｂとの組み合わせにおいて、上記タグカセットの結合後にＣＤ２５およびＣＤ６９のアップレギュレーションによって決定されるとおり、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の活性化を示す。刺激の（Ａ）２４時間後および（Ｂ）４８時間後のデータを示す。
【図１３−２】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  マイクロビーズ、ナノビーズもしくは抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ  ｍＡｂのみのいずれかによって、または抗ＣＤ２８  ｍＡｂとの組み合わせにおいて、上記タグカセットの結合後にＣＤ２５およびＣＤ６９のアップレギュレーションによって決定されるとおり、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の活性化を示す。刺激の（Ａ）２４時間後および（Ｂ）４８時間後のデータを示す。
【図１３−３】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  マイクロビーズ、ナノビーズもしくは抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ  ｍＡｂのみのいずれかによって、または抗ＣＤ２８  ｍＡｂとの組み合わせにおいて、上記タグカセットの結合後にＣＤ２５およびＣＤ６９のアップレギュレーションによって決定されるとおり、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の活性化を示す。刺激の（Ａ）２４時間後および（Ｂ）４８時間後のデータを示す。
【図１３−４】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  マイクロビーズ、ナノビーズもしくは抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ  ｍＡｂのみのいずれかによって、または抗ＣＤ２８  ｍＡｂとの組み合わせにおいて、上記タグカセットの結合後にＣＤ２５およびＣＤ６９のアップレギュレーションによって決定されるとおり、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の活性化を示す。刺激の（Ａ）２４時間後および（Ｂ）４８時間後のデータを示す。
【図１３−５】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  マイクロビーズ、ナノビーズもしくは抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ  ｍＡｂのみのいずれかによって、または抗ＣＤ２８  ｍＡｂとの組み合わせにおいて、上記タグカセットの結合後にＣＤ２５およびＣＤ６９のアップレギュレーションによって決定されるとおり、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の活性化を示す。刺激の（Ａ）２４時間後および（Ｂ）４８時間後のデータを示す。
【図１３−６】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  マイクロビーズ、ナノビーズもしくは抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ  ｍＡｂのみのいずれかによって、または抗ＣＤ２８  ｍＡｂとの組み合わせにおいて、上記タグカセットの結合後にＣＤ２５およびＣＤ６９のアップレギュレーションによって決定されるとおり、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の活性化を示す。刺激の（Ａ）２４時間後および（Ｂ）４８時間後のデータを示す。
【図１３−７】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  マイクロビーズ、ナノビーズもしくは抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ  ｍＡｂのみのいずれかによって、または抗ＣＤ２８  ｍＡｂとの組み合わせにおいて、上記タグカセットの結合後にＣＤ２５およびＣＤ６９のアップレギュレーションによって決定されるとおり、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の活性化を示す。刺激の（Ａ）２４時間後および（Ｂ）４８時間後のデータを示す。
【図１３−８】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  マイクロビーズ、ナノビーズもしくは抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ  ｍＡｂのみのいずれかによって、または抗ＣＤ２８  ｍＡｂとの組み合わせにおいて、上記タグカセットの結合後にＣＤ２５およびＣＤ６９のアップレギュレーションによって決定されるとおり、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の活性化を示す。刺激の（Ａ）２４時間後および（Ｂ）４８時間後のデータを示す。
【図１３−９】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  マイクロビーズ、ナノビーズもしくは抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ  ｍＡｂのみのいずれかによって、または抗ＣＤ２８  ｍＡｂとの組み合わせにおいて、上記タグカセットの結合後にＣＤ２５およびＣＤ６９のアップレギュレーションによって決定されるとおり、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の活性化を示す。刺激の（Ａ）２４時間後および（Ｂ）４８時間後のデータを示す。
【図１３−１０】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  マイクロビーズ、ナノビーズもしくは抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ  ｍＡｂのみのいずれかによって、または抗ＣＤ２８  ｍＡｂとの組み合わせにおいて、上記タグカセットの結合後にＣＤ２５およびＣＤ６９のアップレギュレーションによって決定されるとおり、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の活性化を示す。刺激の（Ａ）２４時間後および（Ｂ）４８時間後のデータを示す。
【図１３−１１】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  マイクロビーズ、ナノビーズもしくは抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ  ｍＡｂのみのいずれかによって、または抗ＣＤ２８  ｍＡｂとの組み合わせにおいて、上記タグカセットの結合後にＣＤ２５およびＣＤ６９のアップレギュレーションによって決定されるとおり、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の活性化を示す。刺激の（Ａ）２４時間後および（Ｂ）４８時間後のデータを示す。
【図１３−１２】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  マイクロビーズ、ナノビーズもしくは抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ  ｍＡｂのみのいずれかによって、または抗ＣＤ２８  ｍＡｂとの組み合わせにおいて、上記タグカセットの結合後にＣＤ２５およびＣＤ６９のアップレギュレーションによって決定されるとおり、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の活性化を示す。刺激の（Ａ）２４時間後および（Ｂ）４８時間後のデータを示す。
【図１３−１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  マイクロビーズ、ナノビーズもしくは抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ  ｍＡｂのみのいずれかによって、または抗ＣＤ２８  ｍＡｂとの組み合わせにおいて、上記タグカセットの結合後にＣＤ２５およびＣＤ６９のアップレギュレーションによって決定されるとおり、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の活性化を示す。刺激の（Ａ）２４時間後および（Ｂ）４８時間後のデータを示す。
【図１３−１４】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  マイクロビーズ、ナノビーズもしくは抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ  ｍＡｂのみのいずれかによって、または抗ＣＤ２８  ｍＡｂとの組み合わせにおいて、上記タグカセットの結合後にＣＤ２５およびＣＤ６９のアップレギュレーションによって決定されるとおり、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の活性化を示す。刺激の（Ａ）２４時間後および（Ｂ）４８時間後のデータを示す。
【図１４Ａ】図１４Ａおよび１４Ｂは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の選択的増殖を示す。ソートされていないＴ−ＣｈＡＲＭ１／４−１ＢＢおよびＴ−ＣｈＡＲＭ１／ＣＤ２８形質導入Ｔ細胞（ＣＤ８＋およびＣＤ４＋）を、抗Ｓｔｒｅｐタグ／抗ＣＤ２８−ＭＢとともに９日間培養した。Ｔ−ＣｈＡＲＭ細胞のパーセンテージを、（Ａ）培養前後のＴ細胞上のＳｔｒｅｐタグ発現をフロー検出によって評価した。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８−ＭＢのみで処理した培養細胞をコントロールとして使用した。（Ｂ）ＣＤ１９＋不死化Ｂ細胞株（ＴＭ−ＬＣＬ）増殖後のＦＡＣＳソートしたＥＧＦＲ＋抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞。それぞれ、抗ＥＧＦＲ抗体（上の行）および抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ抗体（下の行）で染色。
【図１４Ｂ】図１４Ａおよび１４Ｂは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の選択的増殖を示す。ソートされていないＴ−ＣｈＡＲＭ１／４−１ＢＢおよびＴ−ＣｈＡＲＭ１／ＣＤ２８形質導入Ｔ細胞（ＣＤ８＋およびＣＤ４＋）を、抗Ｓｔｒｅｐタグ／抗ＣＤ２８−ＭＢとともに９日間培養した。Ｔ−ＣｈＡＲＭ細胞のパーセンテージを、（Ａ）培養前後のＴ細胞上のＳｔｒｅｐタグ発現をフロー検出によって評価した。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８−ＭＢのみで処理した培養細胞をコントロールとして使用した。（Ｂ）ＣＤ１９＋不死化Ｂ細胞株（ＴＭ−ＬＣＬ）増殖後のＦＡＣＳソートしたＥＧＦＲ＋抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞。それぞれ、抗ＥＧＦＲ抗体（上の行）および抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ抗体（下の行）で染色。
【図１５−１】図１５は、種々の量のＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ビーズで刺激して７日後のＫｉ−６７タンパク質のレベルによって測定した場合の、抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞（１個、２個もしくは３個のタグカセットを含む）の増殖を示す。下パネルにおいて、ＣＤ１９＋  ＥＢＶ−ＬＣＬ（ＴＭ−ＬＣＬ）でのＴ−ＣｈＡＲＭの抗ＣＤ１９結合成分を介して刺激した後のＴ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞におけるＫｉ−６７の発現が示される。
【図１５−２】図１５は、種々の量のＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ビーズで刺激して７日後のＫｉ−６７タンパク質のレベルによって測定した場合の、抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞（１個、２個もしくは３個のタグカセットを含む）の増殖を示す。下パネルにおいて、ＣＤ１９＋  ＥＢＶ−ＬＣＬ（ＴＭ−ＬＣＬ）でのＴ−ＣｈＡＲＭの抗ＣＤ１９結合成分を介して刺激した後のＴ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞におけるＫｉ−６７の発現が示される。
【図１５−３】図１５は、種々の量のＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ビーズで刺激して７日後のＫｉ−６７タンパク質のレベルによって測定した場合の、抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞（１個、２個もしくは３個のタグカセットを含む）の増殖を示す。下パネルにおいて、ＣＤ１９＋  ＥＢＶ−ＬＣＬ（ＴＭ−ＬＣＬ）でのＴ−ＣｈＡＲＭの抗ＣＤ１９結合成分を介して刺激した後のＴ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞におけるＫｉ−６７の発現が示される。
【図１６】図１６は、種々の種のＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩもしくは抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８結合体化ビーズで培養したＴ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の増殖曲線を示す。
【図１７−１】図１７Ａおよび１７Ｂは、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎビーズ（Ａ）上での抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の選択的増殖を示す。抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞は、その後、ＣＤ１９＋  ＬＣＬ（Ｂ）での抗ＣＤ１９キメラレセプターを介した刺激によって増殖され得る。
【図１７−２】図１７Ａおよび１７Ｂは、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎビーズ（Ａ）上での抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の選択的増殖を示す。抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞は、その後、ＣＤ１９＋  ＬＣＬ（Ｂ）での抗ＣＤ１９キメラレセプターを介した刺激によって増殖され得る。
【図１８Ａ】図１８Ａ〜１８Ｄは、Ｔ細胞が、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズでの事前活性化なしにＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で培養した後に、２タイプのＴ−ＣｈＡＲＭ（４−１ＢＢ／ＣＤ３ζのエフェクタードメイン（ＡおよびＢ）もしくはＣＤ２８／ＣＤ３ζ（ＣおよびＤ））で形質導入され得ることを示す。形質導入したＴ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞は、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩビーズを培養物に添加する（ＢおよびＤ）ことによって（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ刺激の非存在下ですら）選択的に増殖および富化され得るが、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩビーズが培養物に添加されない（ＡおよびＣ）場合には増殖されない。
【図１８Ｂ】図１８Ａ〜１８Ｄは、Ｔ細胞が、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズでの事前活性化なしにＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で培養した後に、２タイプのＴ−ＣｈＡＲＭ（４−１ＢＢ／ＣＤ３ζのエフェクタードメイン（ＡおよびＢ）もしくはＣＤ２８／ＣＤ３ζ（ＣおよびＤ））で形質導入され得ることを示す。形質導入したＴ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞は、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩビーズを培養物に添加する（ＢおよびＤ）ことによって（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ刺激の非存在下ですら）選択的に増殖および富化され得るが、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩビーズが培養物に添加されない（ＡおよびＣ）場合には増殖されない。
【図１８Ｃ】図１８Ａ〜１８Ｄは、Ｔ細胞が、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズでの事前活性化なしにＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で培養した後に、２タイプのＴ−ＣｈＡＲＭ（４−１ＢＢ／ＣＤ３ζのエフェクタードメイン（ＡおよびＢ）もしくはＣＤ２８／ＣＤ３ζ（ＣおよびＤ））で形質導入され得ることを示す。形質導入したＴ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞は、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩビーズを培養物に添加する（ＢおよびＤ）ことによって（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ刺激の非存在下ですら）選択的に増殖および富化され得るが、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩビーズが培養物に添加されない（ＡおよびＣ）場合には増殖されない。
【図１８Ｄ】図１８Ａ〜１８Ｄは、Ｔ細胞が、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズでの事前活性化なしにＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で培養した後に、２タイプのＴ−ＣｈＡＲＭ（４−１ＢＢ／ＣＤ３ζのエフェクタードメイン（ＡおよびＢ）もしくはＣＤ２８／ＣＤ３ζ（ＣおよびＤ））で形質導入され得ることを示す。形質導入したＴ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞は、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩビーズを培養物に添加する（ＢおよびＤ）ことによって（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ刺激の非存在下ですら）選択的に増殖および富化され得るが、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩビーズが培養物に添加されない（ＡおよびＣ）場合には増殖されない。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｄは、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）マイクロビーズでの刺激によって増殖された抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ１  Ｔ細胞が、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（短）（ＣＤ１９−Ｓ）を発現するコントロールＴ細胞としてのＣＤ１９陽性腫瘍細胞（Ａ．  Ｋ５６２／ＣＤ１９；  Ｂ−  Ｒａｊｉ）での再刺激の際に、サイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロン−γ、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−α）を産生する匹敵するかもしくはより優れた能力を保持することを示す。Ｋ５６２細胞（Ｃ）およびＰＭＡ−イオノマイシン（Ｄ）を、それぞれ、陰性コントロールおよび陽性コントロールとして供した。
【図２０】図２０は、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、抗Ｓｔｒｅｐタグビーズのみで、または抗Ｓｔｒｅｐタグと抗ＣＤ２７抗体とを含むビーズもしくは抗Ｓｔｒｅｐタグと抗ＣＤ２８抗体とを含むビーズで、クラスターを形成し増殖するように誘発され得ることを示す。
【図２１】図２１は、ＣＤ１９＋不死化Ｂ細胞株（ＴＭ−ＬＣＬ）増殖後にＦＡＣＳソートしたＥＧＦＲ＋  抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析（ＭＦＩ）を示す。それぞれ、抗ＥＧＦＲ抗体（上の行）および抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ抗体（下の行）で染色。
【図２２】図２２は、ＣＤ１９で形質導入したＫ５６２細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）もしくはＲＯＲ１で形質導入したＫ５６２細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）、またはＣＤ１９＋  Ｒａｊｉ腫瘍細胞（標的）に対する、種々の抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ形質導入Ｔ細胞（エフェクター）の細胞溶解効果を調べるためのクロム放出アッセイの結果を示す。Ｅ／Ｔ＝エフェクター／標的比。
【図２３】図２３Ａおよび２３Ｂは、（Ａ）抗ＣＤ１９  短、Ｔ−ＣｈＡＲＭ１、Ｔ−ＣｈＡＲＭ２、Ｔ−ＣｈＡＲＭ３とＣＤ２８／ＣＤ３ζエフェクタードメインを発現する、ならびに（Ｂ）抗ＲＯＲ１  Ｒ１２  短およびＴ−ＣｈＡＲＭ１と４１ＢＢ／ＣＤ３ζエフェクタードメインとを有する、Ｔ細胞の細胞溶解活性を示す。上記細胞を、ＣＤ１９で形質導入したＫ５６２細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）もしくはＲＯＲ１で形質導入したＫ５６２細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）、またはＣＤ１９＋  Ｒａｊｉ腫瘍細胞（標的）に対する細胞溶解活性を試験した。Ｅ／Ｔ＝エフェクター／標的比。
【図２４】図２４は、ＣＤ１９で形質導入したＫ５６２細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）もしくはＲＯＲ１で形質導入したＫ５６２細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）、またはＣＤ１９＋  Ｒａｊｉ腫瘍細胞（標的）に対する種々の抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ形質導入Ｔ細胞（エフェクター）のＩＬ２／ＩＦＮ−γ産生を示す。
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｃは、ＣｈＡＲＭ形質導入Ｔ細胞とＣＤ１９＋  Ｒａｊｉ細胞（１：４比）との２４時間後の三連の共培養上清のｌｕｍｉｎｅｘ多重サイトカイン分析を示す。そのデータは、種々のドナーに由来するＴ細胞を使用する３回の独立した実験から得られ、全てのデータは、平均±ＳＤとして表される。スチューデントのｔ検定を行った。＊Ｐ＜０．０１。（Ａ）抗ＣＤ１９  ＣＡＲと長い（ＣＨ３−ＣＨ２−ヒンジ）、中間（ＣＨ３−ヒンジ）、および短い（ヒンジのみ）スペーサーを発現するＣＤ８＋  Ｔ細胞によるサイトカイン産生の比較。３回の独立した実験の多重サイトカインデータを正規化した（ＣＤ１９−ＣＡＲ  「長／４１ＢＢ」によるサイトカイン放出＝１）；（Ｂ）抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−短と４−１ＢＢ／ＣＤ３ζエフェクタードメインと比較した場合の、抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ１（１ＳＴ）、Ｔ−ＣｈＡＲＭ２（２ＳＴ）、Ｔ−ＣｈＡＲＭ３（３ＳＴ）と、４−１ＢＢ／ＣＤ３ζエフェクタードメインとを発現するＣＤ８＋  Ｔ細胞によるサイトカイン産生の比較。３回の独立した実験の多重サイトカインデータを正規化した（ＣＤ１９−ＣＡＲ−短：  Ｈｉ／４−１ＢＢによるサイトカイン放出＝１）；ならびに（Ｃ）抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−短とＣＤ２８／ＣＤ３ζエフェクタードメインと比較した場合の、抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ１（１ＳＴ）、Ｔ−ＣｈＡＲＭ２（２ＳＴ）、Ｔ−ＣｈＡＲＭ３（３ＳＴ）とＣＤ２８／ＣＤ３ζエフェクタードメインとを発現するＣＤ８＋  Ｔ細胞によるサイトカイン産生の比較。３回の独立した実験の多重サイトカインデータを正規化した（ＣＤ１９−ＣＡＲ−短：  Ｈｉ／ＣＤ２８によるサイトカイン放出＝１）。
【図２６】図２６は、外因性サイトカインの添加なしにＣＤ１９＋  Ｒａｊｉ腫瘍細胞（塗りつぶしのグレー）もしくは培地のみ（グレーの線）での刺激から５日後の、抗ＣＤ１９  ４−１ＢＢもしくはＣＤ２８  ＣｈＡＲＭを発現するＴ細胞の増殖を測定するために使用されるＣＦＳＥ色素希釈を示す。
【図２７−１】図２７Ａ〜２７Ｄは、ＦＡＣＳソートしたＥＧＦＲ＋  抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭを示す：（Ａ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＣＤ１９−Ｈｉ／４−１ＢＢ、ＳＴ−ＣＤ１９／４−１ＢＢ、ＣＤ１９（ＶＨ−ＳＴ−ＶＬ）／４−１ＢＢ；ＣＤ１９−１ＳＴ／４−１ＢＢ、ＣＤ１９−２ＳＴ／４−１ＢＢ、ＣＤ１９−３ＳＴ／４−１ＢＢ  ＣＡＲ）；（Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ１９−Ｈｉ／４−１ＢＢ、ＳＴ−ＣＤ１９／４−１ＢＢ、ＣＤ１９（ＶＨ−ＳＴ−ＶＬ）／４−１ＢＢ；ＣＤ１９−１ＳＴ／４−１ＢＢ、ＣＤ１９−２ＳＴ／４−１ＢＢ、ＣＤ１９−３ＳＴ／４−１ＢＢ  ＣＡＲ）；（Ｃ）抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＣＤ１９−Ｈｉ／ＣＤ２８、ＣＤ１９−１ＳＴ／ＣＤ２８、ＣＤ１９−２ＳＴ／ＣＤ２８、ＣＤ１９−３ＳＴ／ＣＤ２８  ＣＡＲ）；ならびに（Ｄ）抗ＲＯＲ１  Ｒ１２  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞（Ｒ１２−Ｈｉ／４−１ＢＢ、Ｒ１２−１ＳＴ／４−１ＢＢ）。これらを、ＩＬ２との培養において、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ被覆マイクロビーズ（ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ−ＭＢ）、抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体もしくは抗Ｓｔｒｅｐタグ／抗ＣＤ２８抗体被覆マイクロビーズ（αＳｔｒｅｐタグ−ＭＢおよびαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢ）で刺激した。刺激の４８時間後に、上記細胞を採取し、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５を、フローサイトメトリーによって評価した。非処理細胞（培地）をコントロールとして使用した。
【図２７−２】図２７Ａ〜２７Ｄは、ＦＡＣＳソートしたＥＧＦＲ＋  抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭを示す：（Ａ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＣＤ１９−Ｈｉ／４−１ＢＢ、ＳＴ−ＣＤ１９／４−１ＢＢ、ＣＤ１９（ＶＨ−ＳＴ−ＶＬ）／４−１ＢＢ；ＣＤ１９−１ＳＴ／４−１ＢＢ、ＣＤ１９−２ＳＴ／４−１ＢＢ、ＣＤ１９−３ＳＴ／４−１ＢＢ  ＣＡＲ）；（Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ１９−Ｈｉ／４−１ＢＢ、ＳＴ−ＣＤ１９／４−１ＢＢ、ＣＤ１９（ＶＨ−ＳＴ−ＶＬ）／４−１ＢＢ；ＣＤ１９−１ＳＴ／４−１ＢＢ、ＣＤ１９−２ＳＴ／４−１ＢＢ、ＣＤ１９−３ＳＴ／４−１ＢＢ  ＣＡＲ）；（Ｃ）抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＣＤ１９−Ｈｉ／ＣＤ２８、ＣＤ１９−１ＳＴ／ＣＤ２８、ＣＤ１９−２ＳＴ／ＣＤ２８、ＣＤ１９−３ＳＴ／ＣＤ２８  ＣＡＲ）；ならびに（Ｄ）抗ＲＯＲ１  Ｒ１２  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞（Ｒ１２−Ｈｉ／４−１ＢＢ、Ｒ１２−１ＳＴ／４−１ＢＢ）。これらを、ＩＬ２との培養において、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ被覆マイクロビーズ（ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ−ＭＢ）、抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体もしくは抗Ｓｔｒｅｐタグ／抗ＣＤ２８抗体被覆マイクロビーズ（αＳｔｒｅｐタグ−ＭＢおよびαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢ）で刺激した。刺激の４８時間後に、上記細胞を採取し、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５を、フローサイトメトリーによって評価した。非処理細胞（培地）をコントロールとして使用した。
【図２８】図２８は、ＩＬ２の存在下でＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ−ＭＢ、αＳｔｒｅｐタグ−ＭＢおよびαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢで刺激した、ＦＡＣＳソートしたＥＧＦＲ＋  抗ＣＤ１９  ４−１ＢＢ  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞（ＣＤ８＋）の代表的顕微鏡画像を示す。非処理細胞（培地）をコントロールとして使用した。顕微鏡画像は、刺激の４８時間後に撮った。
【図２９】図２９Ａおよび２９Ｂは、ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞の増殖曲線を示す。ＦＡＣＳソートしたＥＧＦＲ＋  抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ  （Ａ）  ＣＤ８＋および（Ｂ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＣＴＬ培地中で、ＩＬ２の存在下でＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ−ＭＢ、αＳｔｒｅｐタグ−ＭＢおよびαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢとともに培養した。
【図３０Ａ】図３０Ａ〜３０Ｆは、抗ＣＤ１９−１ＳＴ／４−１ＢＢもしくはＣＤ１９−１ＳＴ／ＣＤ２８  ＣＡＲで形質導入した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８  マイクロビーズ刺激ＣＤ８＋  Ｔ細胞を示す；ＥＧＦＲ染色およびソートの後、純粋なＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＴＭ−ＬＣＬまたはαＳｔｒｅｐタグ−ＭＢもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢとともに８日間増殖させた。インビトロ機能性試験を行って、増殖前（αＣＤ３／ＣＤ２８−ＭＢ）あるいは増殖後（ＴＭ−ＬＣＬまたはαＳｔｒｅｐタグ−ＭＢもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢ）に、ＣＡＲ  Ｔ細胞機能を評価した。（Ａ）クロム放出アッセイを行って、標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）に対するＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞の細胞溶解効果を試験した。Ｅ／Ｔ：エフェクター／標的比；（Ｂ）サイトカイン産生をＥＬＩＳＡによって測定して、５×１０４  抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞と、標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）との共培養の２４時間後に得られた上清中のＩＦＮ−γおよびＩＬ２を評価した。ＰＭＡ／イオノマイシン刺激Ｔ細胞を、陽性コントロールとして使用した（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）；（Ｃ）外因性サイトカインの添加なしに標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）（塗りつぶしのグレー）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）（グレーの線）での刺激の５日後の、ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞のＣＦＳＥ増殖アッセイ。分析のために、三連のウェルをプールし、生きている（ＰＩ−）ＥＧＦＲ陽性ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を分析した；（Ｄ）増殖前（αＣＤ３／ＣＤ２８−ＭＢ）もしくは増殖後（ＴＭ−ＬＣＬまたはαＳｔｒｅｐタグ−ＭＢもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢ）のＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞でのＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８およびＣＤ２７発現のフロー検出；（Ｅ）マウスのコホートに、１日目に尾静脈注射によってＲａｊｉ−ｆｆｌｕｃを接種し、次いで、ＣＤ１９＋  Ｂ  ＬＣＬもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢのいずれかに対して増殖させた５×１０６  ＣＤ８＋  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞（ＣＤ１９−Ｈｉ／４−１ＢＢおよびＣＤ１９−１ＳＴ／４−１ＢＢ）を、腫瘍移植の７日後に投与した。腫瘍の進行および分布を、ルシフェリン基質の注射後に連続バイオルミネッセンス画像化によって評価した；ならびに（Ｆ）ＮＳＧ／Ｒａｊｉマウスへの養子移入後の抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞の存続。Ｔ細胞注入後の種々の時点で種々のＣｈＡＲＭ形質導入Ｔ細胞で処置したマウスのコホートの末梢血（眼の出血（ｅｙｅ  ｂｌｅｅｄ））中のＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。ＣＤ８＋  ｔＥＧＦＲ＋およびＣｈＡＲＭ＋  Ｔ細胞の頻度を、生きている末梢血球のパーセンテージとして使用した。
【図３０Ｂ】図３０Ａ〜３０Ｆは、抗ＣＤ１９−１ＳＴ／４−１ＢＢもしくはＣＤ１９−１ＳＴ／ＣＤ２８  ＣＡＲで形質導入した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８  マイクロビーズ刺激ＣＤ８＋  Ｔ細胞を示す；ＥＧＦＲ染色およびソートの後、純粋なＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＴＭ−ＬＣＬまたはαＳｔｒｅｐタグ−ＭＢもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢとともに８日間増殖させた。インビトロ機能性試験を行って、増殖前（αＣＤ３／ＣＤ２８−ＭＢ）あるいは増殖後（ＴＭ−ＬＣＬまたはαＳｔｒｅｐタグ−ＭＢもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢ）に、ＣＡＲ  Ｔ細胞機能を評価した。（Ａ）クロム放出アッセイを行って、標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）に対するＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞の細胞溶解効果を試験した。Ｅ／Ｔ：エフェクター／標的比；（Ｂ）サイトカイン産生をＥＬＩＳＡによって測定して、５×１０４  抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞と、標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）との共培養の２４時間後に得られた上清中のＩＦＮ−γおよびＩＬ２を評価した。ＰＭＡ／イオノマイシン刺激Ｔ細胞を、陽性コントロールとして使用した（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）；（Ｃ）外因性サイトカインの添加なしに標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）（塗りつぶしのグレー）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）（グレーの線）での刺激の５日後の、ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞のＣＦＳＥ増殖アッセイ。分析のために、三連のウェルをプールし、生きている（ＰＩ−）ＥＧＦＲ陽性ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を分析した；（Ｄ）増殖前（αＣＤ３／ＣＤ２８−ＭＢ）もしくは増殖後（ＴＭ−ＬＣＬまたはαＳｔｒｅｐタグ−ＭＢもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢ）のＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞でのＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８およびＣＤ２７発現のフロー検出；（Ｅ）マウスのコホートに、１日目に尾静脈注射によってＲａｊｉ−ｆｆｌｕｃを接種し、次いで、ＣＤ１９＋  Ｂ  ＬＣＬもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢのいずれかに対して増殖させた５×１０６  ＣＤ８＋  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞（ＣＤ１９−Ｈｉ／４−１ＢＢおよびＣＤ１９−１ＳＴ／４−１ＢＢ）を、腫瘍移植の７日後に投与した。腫瘍の進行および分布を、ルシフェリン基質の注射後に連続バイオルミネッセンス画像化によって評価した；ならびに（Ｆ）ＮＳＧ／Ｒａｊｉマウスへの養子移入後の抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞の存続。Ｔ細胞注入後の種々の時点で種々のＣｈＡＲＭ形質導入Ｔ細胞で処置したマウスのコホートの末梢血（眼の出血（ｅｙｅ  ｂｌｅｅｄ））中のＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。ＣＤ８＋  ｔＥＧＦＲ＋およびＣｈＡＲＭ＋  Ｔ細胞の頻度を、生きている末梢血球のパーセンテージとして使用した。
【図３０Ｃ】図３０Ａ〜３０Ｆは、抗ＣＤ１９−１ＳＴ／４−１ＢＢもしくはＣＤ１９−１ＳＴ／ＣＤ２８  ＣＡＲで形質導入した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８  マイクロビーズ刺激ＣＤ８＋  Ｔ細胞を示す；ＥＧＦＲ染色およびソートの後、純粋なＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＴＭ−ＬＣＬまたはαＳｔｒｅｐタグ−ＭＢもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢとともに８日間増殖させた。インビトロ機能性試験を行って、増殖前（αＣＤ３／ＣＤ２８−ＭＢ）あるいは増殖後（ＴＭ−ＬＣＬまたはαＳｔｒｅｐタグ−ＭＢもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢ）に、ＣＡＲ  Ｔ細胞機能を評価した。（Ａ）クロム放出アッセイを行って、標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）に対するＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞の細胞溶解効果を試験した。Ｅ／Ｔ：エフェクター／標的比；（Ｂ）サイトカイン産生をＥＬＩＳＡによって測定して、５×１０４  抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞と、標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）との共培養の２４時間後に得られた上清中のＩＦＮ−γおよびＩＬ２を評価した。ＰＭＡ／イオノマイシン刺激Ｔ細胞を、陽性コントロールとして使用した（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）；（Ｃ）外因性サイトカインの添加なしに標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）（塗りつぶしのグレー）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）（グレーの線）での刺激の５日後の、ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞のＣＦＳＥ増殖アッセイ。分析のために、三連のウェルをプールし、生きている（ＰＩ−）ＥＧＦＲ陽性ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を分析した；（Ｄ）増殖前（αＣＤ３／ＣＤ２８−ＭＢ）もしくは増殖後（ＴＭ−ＬＣＬまたはαＳｔｒｅｐタグ−ＭＢもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢ）のＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞でのＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８およびＣＤ２７発現のフロー検出；（Ｅ）マウスのコホートに、１日目に尾静脈注射によってＲａｊｉ−ｆｆｌｕｃを接種し、次いで、ＣＤ１９＋  Ｂ  ＬＣＬもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢのいずれかに対して増殖させた５×１０６  ＣＤ８＋  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞（ＣＤ１９−Ｈｉ／４−１ＢＢおよびＣＤ１９−１ＳＴ／４−１ＢＢ）を、腫瘍移植の７日後に投与した。腫瘍の進行および分布を、ルシフェリン基質の注射後に連続バイオルミネッセンス画像化によって評価した；ならびに（Ｆ）ＮＳＧ／Ｒａｊｉマウスへの養子移入後の抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞の存続。Ｔ細胞注入後の種々の時点で種々のＣｈＡＲＭ形質導入Ｔ細胞で処置したマウスのコホートの末梢血（眼の出血（ｅｙｅ  ｂｌｅｅｄ））中のＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。ＣＤ８＋  ｔＥＧＦＲ＋およびＣｈＡＲＭ＋  Ｔ細胞の頻度を、生きている末梢血球のパーセンテージとして使用した。
【図３０Ｄ】図３０Ａ〜３０Ｆは、抗ＣＤ１９−１ＳＴ／４−１ＢＢもしくはＣＤ１９−１ＳＴ／ＣＤ２８  ＣＡＲで形質導入した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８  マイクロビーズ刺激ＣＤ８＋  Ｔ細胞を示す；ＥＧＦＲ染色およびソートの後、純粋なＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＴＭ−ＬＣＬまたはαＳｔｒｅｐタグ−ＭＢもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢとともに８日間増殖させた。インビトロ機能性試験を行って、増殖前（αＣＤ３／ＣＤ２８−ＭＢ）あるいは増殖後（ＴＭ−ＬＣＬまたはαＳｔｒｅｐタグ−ＭＢもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢ）に、ＣＡＲ  Ｔ細胞機能を評価した。（Ａ）クロム放出アッセイを行って、標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）に対するＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞の細胞溶解効果を試験した。Ｅ／Ｔ：エフェクター／標的比；（Ｂ）サイトカイン産生をＥＬＩＳＡによって測定して、５×１０４  抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞と、標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）との共培養の２４時間後に得られた上清中のＩＦＮ−γおよびＩＬ２を評価した。ＰＭＡ／イオノマイシン刺激Ｔ細胞を、陽性コントロールとして使用した（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）；（Ｃ）外因性サイトカインの添加なしに標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）（塗りつぶしのグレー）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）（グレーの線）での刺激の５日後の、ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞のＣＦＳＥ増殖アッセイ。分析のために、三連のウェルをプールし、生きている（ＰＩ−）ＥＧＦＲ陽性ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を分析した；（Ｄ）増殖前（αＣＤ３／ＣＤ２８−ＭＢ）もしくは増殖後（ＴＭ−ＬＣＬまたはαＳｔｒｅｐタグ−ＭＢもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢ）のＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞でのＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８およびＣＤ２７発現のフロー検出；（Ｅ）マウスのコホートに、１日目に尾静脈注射によってＲａｊｉ−ｆｆｌｕｃを接種し、次いで、ＣＤ１９＋  Ｂ  ＬＣＬもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢのいずれかに対して増殖させた５×１０６  ＣＤ８＋  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞（ＣＤ１９−Ｈｉ／４−１ＢＢおよびＣＤ１９−１ＳＴ／４−１ＢＢ）を、腫瘍移植の７日後に投与した。腫瘍の進行および分布を、ルシフェリン基質の注射後に連続バイオルミネッセンス画像化によって評価した；ならびに（Ｆ）ＮＳＧ／Ｒａｊｉマウスへの養子移入後の抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞の存続。Ｔ細胞注入後の種々の時点で種々のＣｈＡＲＭ形質導入Ｔ細胞で処置したマウスのコホートの末梢血（眼の出血（ｅｙｅ  ｂｌｅｅｄ））中のＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。ＣＤ８＋  ｔＥＧＦＲ＋およびＣｈＡＲＭ＋  Ｔ細胞の頻度を、生きている末梢血球のパーセンテージとして使用した。
【図３０Ｅ】図３０Ａ〜３０Ｆは、抗ＣＤ１９−１ＳＴ／４−１ＢＢもしくはＣＤ１９−１ＳＴ／ＣＤ２８  ＣＡＲで形質導入した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８  マイクロビーズ刺激ＣＤ８＋  Ｔ細胞を示す；ＥＧＦＲ染色およびソートの後、純粋なＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＴＭ−ＬＣＬまたはαＳｔｒｅｐタグ−ＭＢもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢとともに８日間増殖させた。インビトロ機能性試験を行って、増殖前（αＣＤ３／ＣＤ２８−ＭＢ）あるいは増殖後（ＴＭ−ＬＣＬまたはαＳｔｒｅｐタグ−ＭＢもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢ）に、ＣＡＲ  Ｔ細胞機能を評価した。（Ａ）クロム放出アッセイを行って、標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）に対するＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞の細胞溶解効果を試験した。Ｅ／Ｔ：エフェクター／標的比；（Ｂ）サイトカイン産生をＥＬＩＳＡによって測定して、５×１０４  抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞と、標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）との共培養の２４時間後に得られた上清中のＩＦＮ−γおよびＩＬ２を評価した。ＰＭＡ／イオノマイシン刺激Ｔ細胞を、陽性コントロールとして使用した（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）；（Ｃ）外因性サイトカインの添加なしに標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）（塗りつぶしのグレー）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）（グレーの線）での刺激の５日後の、ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞のＣＦＳＥ増殖アッセイ。分析のために、三連のウェルをプールし、生きている（ＰＩ−）ＥＧＦＲ陽性ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を分析した；（Ｄ）増殖前（αＣＤ３／ＣＤ２８−ＭＢ）もしくは増殖後（ＴＭ−ＬＣＬまたはαＳｔｒｅｐタグ−ＭＢもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢ）のＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞でのＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８およびＣＤ２７発現のフロー検出；（Ｅ）マウスのコホートに、１日目に尾静脈注射によってＲａｊｉ−ｆｆｌｕｃを接種し、次いで、ＣＤ１９＋  Ｂ  ＬＣＬもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢのいずれかに対して増殖させた５×１０６  ＣＤ８＋  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞（ＣＤ１９−Ｈｉ／４−１ＢＢおよびＣＤ１９−１ＳＴ／４−１ＢＢ）を、腫瘍移植の７日後に投与した。腫瘍の進行および分布を、ルシフェリン基質の注射後に連続バイオルミネッセンス画像化によって評価した；ならびに（Ｆ）ＮＳＧ／Ｒａｊｉマウスへの養子移入後の抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞の存続。Ｔ細胞注入後の種々の時点で種々のＣｈＡＲＭ形質導入Ｔ細胞で処置したマウスのコホートの末梢血（眼の出血（ｅｙｅ  ｂｌｅｅｄ））中のＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。ＣＤ８＋  ｔＥＧＦＲ＋およびＣｈＡＲＭ＋  Ｔ細胞の頻度を、生きている末梢血球のパーセンテージとして使用した。
【図３０Ｆ】図３０Ａ〜３０Ｆは、抗ＣＤ１９−１ＳＴ／４−１ＢＢもしくはＣＤ１９−１ＳＴ／ＣＤ２８  ＣＡＲで形質導入した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８  マイクロビーズ刺激ＣＤ８＋  Ｔ細胞を示す；ＥＧＦＲ染色およびソートの後、純粋なＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＴＭ−ＬＣＬまたはαＳｔｒｅｐタグ−ＭＢもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢとともに８日間増殖させた。インビトロ機能性試験を行って、増殖前（αＣＤ３／ＣＤ２８−ＭＢ）あるいは増殖後（ＴＭ−ＬＣＬまたはαＳｔｒｅｐタグ−ＭＢもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢ）に、ＣＡＲ  Ｔ細胞機能を評価した。（Ａ）クロム放出アッセイを行って、標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）に対するＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞の細胞溶解効果を試験した。Ｅ／Ｔ：エフェクター／標的比；（Ｂ）サイトカイン産生をＥＬＩＳＡによって測定して、５×１０４  抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞と、標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）との共培養の２４時間後に得られた上清中のＩＦＮ−γおよびＩＬ２を評価した。ＰＭＡ／イオノマイシン刺激Ｔ細胞を、陽性コントロールとして使用した（ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５）；（Ｃ）外因性サイトカインの添加なしに標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）（塗りつぶしのグレー）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）（グレーの線）での刺激の５日後の、ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞のＣＦＳＥ増殖アッセイ。分析のために、三連のウェルをプールし、生きている（ＰＩ−）ＥＧＦＲ陽性ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を分析した；（Ｄ）増殖前（αＣＤ３／ＣＤ２８−ＭＢ）もしくは増殖後（ＴＭ−ＬＣＬまたはαＳｔｒｅｐタグ−ＭＢもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢ）のＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞でのＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８およびＣＤ２７発現のフロー検出；（Ｅ）マウスのコホートに、１日目に尾静脈注射によってＲａｊｉ−ｆｆｌｕｃを接種し、次いで、ＣＤ１９＋  Ｂ  ＬＣＬもしくはαＳｔｒｅｐタグ／ＣＤ２８−ＭＢのいずれかに対して増殖させた５×１０６  ＣＤ８＋  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞（ＣＤ１９−Ｈｉ／４−１ＢＢおよびＣＤ１９−１ＳＴ／４−１ＢＢ）を、腫瘍移植の７日後に投与した。腫瘍の進行および分布を、ルシフェリン基質の注射後に連続バイオルミネッセンス画像化によって評価した；ならびに（Ｆ）ＮＳＧ／Ｒａｊｉマウスへの養子移入後の抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞の存続。Ｔ細胞注入後の種々の時点で種々のＣｈＡＲＭ形質導入Ｔ細胞で処置したマウスのコホートの末梢血（眼の出血（ｅｙｅ  ｂｌｅｅｄ））中のＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。ＣＤ８＋  ｔＥＧＦＲ＋およびＣｈＡＲＭ＋  Ｔ細胞の頻度を、生きている末梢血球のパーセンテージとして使用した。
【図３１】図３１は、外因性サイトカインの添加なしにＣＤ１９（Ｋ５６２／ＣＤ１９）、ＲＯＲ１（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）、培地のみ、もしくはＣＤ１９＋  Ｒａｊｉ腫瘍細胞で刺激して５日後の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−短、Ｔ−ＣｈＡＲＭ１、Ｔ−ＣｈＡＲＭ３、およびＭｙｃ−ＣｈＡＲＭ／４−１ＢＢ  Ｔ細胞の増殖を測定するために使用されるＣＦＳＥ色素希釈を示す。
【図３２】図３２は、標的細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９）もしくはコントロール細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１）に対する抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−短、Ｔ−ＣｈＡＲＭ１、Ｔ−ＣｈＡＲＭ３、およびＭｙｃ−ＣｈＡＲＭ／４−１ＢＢ  Ｔ細胞の細胞溶解効果を試験するために行ったクロム放出アッセイを示す。Ｅ／Ｔ：エフェクター／標的比。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（詳細な説明）
本開示は、１個以上のアフィニティータグカセットを含む種々の融合タンパク質（これは、「鍵」のように機能して、種々の生物学的経路のうちのいずれかにアクセスしこれを操作する（すなわち、スイッチを入れるもしくは切るまたは調節する）キメラエフェクター分子（ＣｈＥＭ）である）を生成するための組成物および方法を提供する。これらキメラエフェクター分子は、本明細書でＫｅｙ−ＣｈＥＭといわれる。このような融合タンパク質をコードする核酸分子は、特異的細胞応答（例えば、増殖もしくは死滅）が誘発されるか、制御されるかもしくはその両方である、改変された宿主細胞を生成するために使用され得る。例えば、あるタイプの前駆細胞は、被験体から得られ得、タグカセットを含む融合タンパク質を発現するように改変され得、増殖するように誘発され得、次いで、具体的治療効果（例えば、被験体の消耗した免疫系を再構成する）のために被験体へと注入し戻され得る。あるいは、タグを含むこのような融合タンパク質は、特定の標的（例えば、腫瘍抗原）に対して特異的な結合ドメインをさらに有し得る。このような例では、これら融合タンパク質は、特定の細胞へ導入され得、次いでその改変された細胞を同定、ソート、活性化、もしくは増殖するために使用され得るタグ化キメラ抗原レセプター分子（Ｔ−ＣｈＡＲＭ）である。ある種の実施形態において、このようなタグ化キメラ分子は、細胞（例えば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞））へと形質導入され、発現される。
【００２１】
ある種の局面において、本開示は、１個以上のタグカセットを有する融合タンパク質（Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭ）をコードする核酸分子を含む細胞（例えば、Ｔ細胞）を選択的に活性化する、増殖を促進する、同定する、ソートする、富化する、単離する、追跡するもしくは枯渇させるための方法をさらに提供する。さらに、本開示は、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭ、ならびに本開示のＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを種々の治療適用（被験体における疾患（例えば、癌、感染性疾患、炎症性疾患、免疫疾患、加齢関連疾患）の処置が挙げられる）において使用するための細胞、組成物および方法を提供する。
【００２２】
本開示をより詳細に示す前に、本明細書で使用される予定のある種の用語の定義を提供することは、その理解に役立ち得る。さらなる定義は、本開示全体を通じて示される。
【００２３】
この説明において、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比の範囲、もしくは整数範囲は、別段示されなければ、記載される範囲内にある任意の整数の値、および適切である場合には、その有理分数（例えば、ある整数の１／１０および１／１００）を含むと理解されるべきである。また、任意の物理的特徴（例えば、ポリマーサブユニット、サイズもしくは厚み）に関して本明細書で記載される任意の数値範囲は、別段示されなければ、その記載される範囲内の任意の整数を含むと理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「約」は、別段示されなければ、その示された範囲、値、もしくは体系（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の±２０％を意味する。用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書で使用される場合、挙げられる成分の「１以上」に言及することが理解されるべきである。選択肢（例えば、「または」）の使用は、上記選択肢のうちのいずれか一方、両方、もしくはその任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、類義語として使用され、これら用語およびその変形は、限定しないと解釈されるものとされる。
【００２４】
さらに、個々の化合物もしくは化合物群（本明細書で記載される構造および置換基の種々の組み合わせから得られる）が、あたかも各化合物もしくは化合物群が個々に示されるのと同程度まで本願によって開示されることは理解されるべきである。従って、特定の構造もしくは特定の置換基の選択は、本開示の範囲内である。
【００２５】
用語「から本質的になる」とは、特許請求の範囲を、特定された材料もしくは工程に、または特許請求された発明の基本的特徴に本質的に影響を及ぼさないものに限定する。例えば、タンパク質ドメイン、領域、モジュールもしくはカセット（例えば、結合ドメイン、ヒンジ領域、リンカーモジュール、タグカセット）またはタンパク質（これは、１個以上のドメイン、領域、モジュールもしくはカセットを有し得る）は、ドメイン、領域、モジュール、カセットもしくはタンパク質のアミノ酸配列が、伸長、欠失、変異、もしくはこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端もしくはカルボキシ末端にあるか、またはドメインの間にあるアミノ酸）を含む場合に、特定のアミノ酸配列「から本質的になる」。上記伸長、欠失、変異、もしくはこれらの組み合わせは、組み合わせにおいて、ドメイン、領域、モジュール、カセットもしくはタンパク質の長さのうちの最大で２０％（例えば、最大で１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％もしくは１％）に寄与しかつ上記ドメイン、領域、モジュール、カセットもしくはタンパク質の活性（例えば、結合タンパク質もしくはタグカセットの標的結合アフィニティー）に実質的に影響を及ぼさない（すなわち、上記活性を５０％を超えて低減しない（例えば、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、もしくは１％以下））。
【００２６】
「結合ドメイン」（「結合領域」もしくは「結合部分」ともいわれる）は、本明細書で使用される場合、標的分子（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＳＭＡ）と特異的にかつ非共有結合的に会合、合体、もしくは化合する能力を有する分子（例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質）をいう。結合ドメインは、目的の生物学的分子もしくは他の標的に対する任意の天然に存在する、合成の、半合成の、もしくは組換え生成される結合パートナーを含む。いくつかの実施形態において、上記結合ドメインは、抗原結合ドメイン（例えば、抗体もしくはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）または機能的結合ドメインもしくはその抗原結合フラグメント）である。例示的な結合ドメインとしては、単鎖抗体可変領域（例えば、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）、レセプターエクトドメイン（例えば、ＴＮＦ−α）、リガンド（例えば、サイトカイン、ケモカイン）、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の抗原結合領域（例えば、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ））、または生物学的分子に結合する特異的能力に対して選択される合成ポリペプチドが挙げられる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」とは、１０５Ｍ−１以上のアフィニティーもしくはＫａ（すなわち、単位１／Ｍでの特定の結合相互作用の平衡会合定数）での、一方でサンプル中の任意の他の分子もしくは成分と有意に会合も合体もしない、標的分子への結合ドメインもしくはその融合タンパク質の会合もしくは合体をいう。結合ドメイン（もしくはその融合タンパク質）は、「高アフィニティー」結合ドメイン（もしくはその融合タンパク質）または「低アフィニティー」結合ドメイン（もしくはその融合タンパク質）として分類され得る。「高アフィニティー」結合ドメインとは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、もしくは少なくとも１０１３Ｍ−１のＫａを有する結合ドメインをいう。「低アフィニティー」結合ドメインとは、最大で１０７Ｍ−１、最大で１０６Ｍ−１、最大で１０５Ｍ−１までのＫａを有する結合ドメインをいう。あるいは、アフィニティーは、Ｍの単位（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ）での特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義され得る。ある種の実施形態において、結合ドメインは、「増強されたアフィニティー」を有し得、これは、野生型（もしくは親）の結合ドメインより標的抗原へのより強い結合を有する選択もしくは操作された結合ドメインをいう。例えば、増強されたアフィニティーは、上記野生型結合ドメインのものより高い標的抗原に対するＫａ（平衡会合定数）に起因し得るか、または上記野生型結合ドメインのものより低い標的抗原に対するＫｄ（解離定数）に起因し得るか、または上記野生型結合ドメインのものより低い標的抗原に対するオフレート（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）（Ｋｏｆｆ）に起因し得る。種々のアッセイが、特定の標的を特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するために、ならびに結合ドメインもしくは融合タンパク質のアフィニティーを決定するために公知である（例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、およびＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１：６６０，  １９４９；および米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号もしくはその均等物もまた参照のこと））。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「異種の」もしくは「非内因性の」もしくは「外因性の」とは、宿主細胞もしくは被験体にとって生来のものではない任意の遺伝子、タンパク質、化合物、分子もしくは活性をいうか、または宿主もしくは宿主細胞にとって生来のものであるが、構造、活性もしくはその両方が天然の分子と変異させた分子との間で異なるような、変化させたもしくは変異させた任意の遺伝子、タンパク質、化合物、分子もしくは活性である。ある種の実施形態において、異種、非内因性、もしくは外因性の分子（例えば、レセプター、リガンド）は、宿主細胞もしくは被験体に対して内因性でなくてもよいが、代わりに、このような分子をコードする核酸は、結合体化、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどによって宿主細胞に付加されていてもよく、ここで上記付加された核酸分子は、宿主細胞ゲノムへと組みこまれ得るか、または染色体外遺伝物質として（例えば、プラスミドもしくは他の自己複製ベクターとして）存在し得る。用語「相同な」もしくは「ホモログ」とは、ある宿主細胞、種もしくは系統において見出されるかもしくはこれらから得られる分子もしくは活性をいう。例えば、異種もしくは外因性の分子または上記分子をコードする遺伝子は、それぞれ、天然の宿主もしくは宿主細胞分子もしくは上記分子をコードする遺伝子にとって相同であり得るが、変化した構造、配列、発現レベルもしくはその組み合わせを有し得る。非内因性の分子は、同じ種、異なる種もしくはその組み合わせに由来し得る。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「内因性」もしくは「天然の」とは、宿主もしくは宿主細胞に通常存在する遺伝子、タンパク質、化合物、分子もしくは活性をいう。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「タグカセット」とは、目的のタンパク質に固定されているか、融合されているかもしくはその一部である特有のペプチド配列であって、これに異種もしくは非内因性の同系結合分子（例えば、レセプター、リガンド、抗体、もしくは他の結合パートナー）が特異的に結合し得るものをいう。ここで、特にタグ化タンパク質がタンパク質もしくは他の物質の不均質な集団の一部である場合に、またはタグ化タンパク質を発現する細胞が細胞の不均質な集団（例えば、末梢血のような生物学的サンプル）の一部である場合に、結合特性は、タグ化タンパク質もしくはタグ化タンパク質を発現する細胞を検出、同定、単離もしくは精製、追跡、富化、または標的化するために使用され得る。ある種の実施形態において、タグ化タンパク質を発現する細胞は、異種もしくは非内因性の同系結合分子と接触させられて生物学的応答を誘発し得る（例えば、細胞活性化、細胞増殖もしくは細胞死を促進し得る）。上記提供される融合タンパク質において、上記タグカセットが上記同系結合分子によって特異的に結合される能力は、上記結合ドメインが上記標的分子に特異的に結合する能力とは別個であってもよいし、この能力に加えてあってもよい。上記タグカセットは一般に、抗原結合分子ではなく、例えば、抗体でもＴＣＲでもこれらの抗原結合部分でもない。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」もしくは「ヒンジ」とは、（ａ）免疫グロブリンヒンジ配列（例えば、アッパー領域およびコア領域から作られる）またはその機能的フラグメントもしくは改変体、（ｂ）タイプＩＩ  Ｃレクチンインタードメイン（ストーク（ｓｔａｌｋ））領域またはその機能的フラグメントもしくは改変体、あるいは（ｃ）分化抗原群（ＣＤ）分子ストーク領域もしくはその機能的改変体をいう。本明細書で使用される場合、「野生型免疫グロブリンヒンジ領域」とは、抗体の重鎖において見出される、ＣＨ１ドメインとＣＨ２との間に（ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤに関して）挿入されかつ接続するかまたはＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインとの間に（ＩｇＥおよびＩｇＭに関して）挿入されかつ接続する、天然に存在するアッパーおよびミドルヒンジアミノ酸配列をいう。ある種の実施形態において、ヒンジ領域は、ヒトのヒンジ領域であり、特定の実施形態では、ヒトのＩｇＧヒンジ領域を含む。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「コネクター領域」とは、融合タンパク質において２以上のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ドメイン、領域、モジュール、カセット、モチーフもしくはこれらの任意の組み合わせを繋ぐ、１以上のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ドメイン、領域、モジュール、カセット、モチーフもしくはこれらの任意の組み合わせをいう。例えば、コネクター領域は、２個の単鎖融合タンパク質の相互作用もしくは１個以上の結合ドメインの配置を促進するためにスペーサー機能を提供し得る。その結果、得られるポリペプチド構造は、標的分子に対する特異的結合アフィニティーを維持するかまたはシグナル伝達活性（例えば、エフェクタードメイン活性）を維持するかまたは両方を維持する。ある種の実施形態において、コネクター領域は、リンカーによって接続された２つの領域、ドメイン、モチーフ、カセットもしくはモジュールの間でのコンホメーション運動（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ）のための可撓性および余地を提供し得る、約２アミノ酸から最大で約５００アミノ酸までを有するアミノ酸配列である「リンカーモジュール」を含み得る。例示的リンカーモジュールとしては、１〜約１０反復のＧｌｙｘＳｅｒｙ（ここでｘおよびｙは、独立して０〜１０の整数であるが、ただしｘおよびｙは両方が０ではない（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号６７）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２（配列番号６８）、Ｇｌｙ２Ｓｅｒ、もしくはこれらの組み合わせ（例えば、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）（配列番号６９）））を有するものが挙げられる。ある種の他の実施形態において、コネクター領域は、１個以上の免疫グロブリン重鎖定常領域（例えば、ＣＨ３のみもしくはＣＨ２ＣＨ３）を含むリンカーモジュールを有し得る。さらなる実施形態において、コネクター領域は、ヒンジ領域もしくはタグカセットを含み得る。各このようなコネクター成分は、相互に排他的ではない。例えば、コネクター領域は、ヒンジおよび１個以上のリンカーモジュールを含んでいてもよいし、コネクター領域は、ヒンジ、１個以上のリンカーモジュール、および１個以上のタグカセットを含んでいてもよい。例示的コネクター領域は、長さにおいて、例えば、約５〜約５００アミノ酸、もしくは約１０〜約３５０アミノ酸、もしくは約１５〜約１００アミノ酸、もしくは約２０〜約７５アミノ酸、もしくは約２５〜約３５アミノ酸まで変動し得る。
【００３３】
「疎水性部分」とは、本明細書で使用される場合、細胞膜の中で熱力学的に安定であり、一般に、長さにおいて約１５アミノ酸〜約３０アミノ酸の範囲に及ぶ三次元構造を有する任意のアミノ酸配列を意味する。疎水性ドメインの構造は、αヘリックス、βバレル、βシート、βヘリックス、もしくはこれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「エフェクタードメイン」とは、適切なシグナルを受ける場合に細胞の中で生物学的もしくは生理学的応答を直接的もしくは間接的に促進し得る融合タンパク質もしくはレセプターの細胞内部分である。ある種の実施形態において、エフェクタードメインは、結合した場合にシグナルを受け取るタンパク質もしくはタンパク質複合体の一部であるか、またはこれは、標的分子（これは、上記エフェクタードメインからのシグナルの引き金となる）に直接結合する。エフェクタードメインは、これが１個以上のシグナル伝達ドメインもしくはモチーフ（例えば、イムノレセプターチロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ））を含む場合に、細胞応答を直接的に促進し得る。他の実施形態において、エフェクタードメインは、細胞応答を直接的に促進する１種以上の他のタンパク質と会合することによって、細胞応答を間接的に促進する。
【００３５】
「可変領域リンカー」とは、具体的には、重鎖免疫グロブリン可変領域を軽鎖免疫グロブリン可変領域に接続するか、またはＴ細胞レセプターＶα／β鎖およびＣα／β鎖を接続する（例えば、Ｖα−Ｃα、Ｖβ−Ｃβ、Ｖα−Ｖβ）か、または各Ｖα−Ｃα対、Ｖβ−Ｃβ対、Ｖα−Ｖβ対をヒンジドメインもしくは疎水性ドメイン（これは、上記２個のサブ結合ドメインの相互作用のために十分なスペーサー機能および可撓性を提供する）を接続し、その結果、得られた単鎖ポリペプチドが抗体もしくはＴ細胞レセプターと同じ標的分子に対して特異的結合アフィニティーを保持する、５〜約３５アミノ酸配列に言及する。ある種の実施形態において、可変領域リンカーは、約１０〜約３０アミノ酸もしくは約１５〜約２５アミノ酸を含む。特定の実施形態において、可変領域リンカーペプチドは、１〜１０回反復のＧｌｙｘＳｅｒｙ（ここでｘおよびｙは、独立して０〜１０の整数であるが、ただしｘおよびｙは両方が０ではなく（例えば、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１０）、Ｇｌｙ３Ｓｅｒ（配列番号７１）、Ｇｌｙ２Ｓｅｒ、もしくは（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１（配列番号７２）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）ｎ（配列番号７３）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号７２）、もしくは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１０）（ここでｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０の整数である））を含み、ここで連結された可変領域は、機能的な免疫グロブリン様結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＴＣＲ）を形成する。例示的可変領域リンカーとしては、配列番号４４、配列番号６５〜６９、および配列番号７１〜７３、ならびに（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１０）（ここでｎは、配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有するＴ−ＣｈＡＲＭで見出されるように、３である）に示されるアミノ酸配列が挙げられる。
【００３６】
「接合部アミノ酸」もしくは「接合部アミノ酸残基」とは、ポリペプチドの２個の隣接するモチーフ、領域もしくはドメインの間（例えば、結合ドメインと隣接するリンカー領域との間または疎水性ドメインと隣接するエフェクタードメインとの間または２個のモチーフ、領域もしくはドメインを繋ぐリンカー領域の一方の末端もしくは両方の末端に（例えば、リンカーと、隣接する結合ドメインとの間および／またはリンカーと、隣接するヒンジとの間）にある１個以上（例えば、約２〜２０個）のアミノ酸残基に言及する。接合部アミノ酸は、融合タンパク質の構築物設計から生じ得る（例えば、融合タンパク質をコードする核酸分子の構築の間に制限酵素部位を使用することから生じるアミノ酸残基）。例えば、単一の接合部アミノ酸、アスパラギンは、配列番号５８に示される核酸配列によってコードされるＴ−ＣｈＡＲＭにおいて、分泌シグナル配列をコードする核酸配列（配列番号６３）とタグカセットをコードする配列（配列番号３８）との間に見出されるＡＡＴコドンによってコードされる。同様に、アスパラギン（Ｎ）接合部アミノ酸は、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有するＴ−ＣｈＡＲＭで見出される、可撓性リンカーアミノ酸配列ＧＧＳＧＳＧ（配列番号６５）とアミノ酸タグ配列ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１）との間で見出される。
【００３７】
抗体技術の分野の人々によって理解される用語は、本明細書で異なって明確に定義されなければ、各々当該分野で獲得された意味を与えられる。用語「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む無傷の抗体、ならびに標的分子を結合する能力を有するかもしくは保持する無傷の抗体の抗原結合部分をいう。モノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分は、非ヒト、キメラ、ヒト化、もしくはヒト、好ましくは、ヒト化もしくはヒトのものであり得る。免疫グロブリン構造および機能は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １４  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９８８）において総説されている。
【００３８】
例えば、用語「ＶＬ」および「ＶＨ」とは、それぞれ、抗体軽鎖および重鎖の可変結合領域をいう。上記可変結合領域は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）および「フレームワーク領域」（ＦＲ）として公知の不連続の十分に定義された部分領域から構成される。用語「ＣＬ」とは、「免疫グロブリン軽鎖定常領域」もしくは「軽鎖定常領域」、すなわち、抗体軽鎖由来の定常領域をいう。用語「ＣＨ」とは、「免疫グロブリン重鎖定常領域」もしくは「重鎖定常領域」であって、これは、抗体アイソタイプに依存して、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ）またはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ、ＩｇＭ）へとさらに分けられ得るものをいう。「Ｆａｂ」（フラグメント抗原結合）は、抗原に結合しかつ鎖間ジスルフィド結合を介して、上記軽鎖に連結された上記重鎖の可変領域およびＣＨ１を含む、抗体の一部である。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域部分」とは、抗体に由来する上記Ｆｃフラグメントの重鎖定常領域セグメント（「フラグメント結晶化可能」領域もしくはＦｃ領域）であって、１個以上の定常ドメイン（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、もしくはこれらの任意の組み合わせ）を含み得るものをいう。ある種の実施形態において、Ｆｃ領域部分は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤ抗体のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、またはこれらの任意の組み合わせ、あるいはＩｇＭもしくはＩｇＥ抗体のＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメインならびにこれらの任意の組み合わせを含む。他の実施形態において、ＣＨ２ＣＨ３もしくはＣＨ３ＣＨ４の構造は、同じ抗体アイソタイプに由来する部分領域ドメインを有し、ヒト（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ）である（例えば、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ２ＣＨ３）。背景として、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンのエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）および補体結合、Ｆｃレセプター（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＦｃＲｎ）への結合、Ｆｃ領域を欠いているポリペプチドと比較してより長いインビボでの半減期、プロテインＡ結合、ならびにおそらくさらに胎盤通過（ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ））を担う（Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５，  １９８９を参照のこと）。ある種の実施形態において、本開示の融合タンパク質において見出されるＦｃ領域部分は、これらエフェクター機能のうちの１以上を媒介し得るか、または例えば、当該分野で公知の１以上の変異によってこれら活性のうちの１以上もしくは全てを欠いている。
【００４０】
さらに、抗体は、Ｆａｂ領域とＦｃ領域との間に代表的には位置するヒンジ配列を有する（しかし上記ヒンジの下側の部分は、上記Ｆｃ領域のアミノ末端部分を含み得る）。背景として、免疫グロブリンヒンジは、上記Ｆａｂ部分が空間の中で自由に動くことを可能にするように、可撓性スペーサーとして作用する。定常領域とは対照的に、ヒンジは、免疫グロブリンクラス間で、そしてさらにはサブクラス間でも配列および長さの両方において変動して、構造的に多様である。例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域は、自由に可撓性であり、これは、Ｆａｂフラグメントが対称的にそれらの軸の周りを回転しかつ２つの重鎖間ジスルフィド架橋の第１のものに中心がある球内で動くことを可能にする。比較によれば、ヒトＩｇＧ２ヒンジは比較的短く、４個の重鎖間ジスルフィド架橋によって安定化された剛性のポリプロリン二重らせんを含み、これは、可撓性を制限する。ヒトＩｇＧ３ヒンジは、その特有の伸長したヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍程度の長さ）によって他のサブクラスとは異なり、６２アミノ酸（２１プロリンおよび１１システインを含む）を含み、可撓性を欠くポリプロリン二重らせんを形成し、ＦａｂフラグメントがＦｃフラグメントからは比較的遠く離れているので、より大きな可撓性を提供する。ヒトＩｇＧ４ヒンジは、ＩｇＧ１より短いが、ＩｇＧ２と同じ長さを有し、その可撓性は、ＩｇＧ１とＩｇＧ２のものとの間の中間である。
「Ｔ細胞レセプター」（ＴＣＲ）とは、ＣＤ３と会合して、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識を概して担う、Ｔ細胞（もしくはＴリンパ球）の表面に見出される分子をいう。上記ＴＣＲは、大部分のＴ細胞において非常に可変性のα鎖およびβ鎖（それぞれ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても公知）のジスルフィド結合したヘテロダイマーを有する。Ｔ細胞の小さな部分セットにおいて、上記ＴＣＲは、可変性のγ鎖およびδ鎖（それぞれ、ＴＣＲγおよびＴＣＲδとしても公知）のヘテロダイマーから構成される。上記ＴＣＲの各鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、１個のＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１個の免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端に短い細胞質テールを有する（Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐ．  ４：３３，  １９９７を参照のこと）。ＴＣＲは、本開示で使用される場合、種々の動物種（ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヤギ、ウマ、もしくは他の哺乳動物が上げられる）に由来し得る。ＴＣＲは、細胞結合している（すなわち、膜貫通領域もしくはドメインを有する）か、または可溶性形態にあり得る。
【００４１】
「主要組織適合遺伝子複合体分子」（ＭＨＣ分子）とは、ペプチド抗原を細胞表面に送達する糖タンパク質をいう。ＭＨＣクラスＩ分子は、膜にまたがるα鎖（３個のαドメインを有する）および非共有結合的に会合したβ２ミクログロブリンからなるヘテロダイマーである。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、２個の膜貫通糖タンパク質であるαおよびβから構成され、これら両方が、膜にまたがる。各鎖は、２個のドメインを有する。ＭＨＣクラスＩ分子は、サイトゾルに端を発して細胞表面へとペプチドを送達する。ここでペプチド：ＭＨＣ複合体は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞によって認識される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、小胞系に端を発して細胞表面へとペプチドを送達する。ここでそれらは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞によって認識される。ＭＨＣ分子は、種々の動物種（ヒト、マウス、ラット、もしくは他の哺乳動物が挙げられる）に由来し得る。
【００４２】
「ベクター」とは、別の核酸を輸送し得る核酸分子である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、もしくはファージであり得る。「発現ベクター」とは、適切な環境の中で存在する場合に、上記ベクターが有する１個以上の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を指向し得るベクターである。
【００４３】
「レトロウイルス」とは、ＲＮＡゲノムを有するウイルスである。「ガンマレトロウイルス」とは、レトロウイルス科の属をいう。例示的なガンマレトロウイルスとしては、マウス幹細胞ウイルス、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、およびトリ細網内皮症ウイルスが挙げられる。
【００４４】
「レンチウイルス」とは、分裂中の細胞および分裂していない細胞に感染し得るレトロウイルスの属をいう。レンチウイルスのいくつかの例としては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶタイプ１、およびＨＩＶタイプ２が挙げられる）；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。
【００４５】
「造血前駆細胞」は、成熟細胞タイプ（例えば、Ｔ細胞系統の細胞）へのさらなる分化が可能な、造血幹細胞もしくは胎児組織に由来する細胞である。ある種の実施形態において、ＣＤ２４ｌｏ  Ｌｉｎ−  ＣＤ１１７＋  造血前駆細胞は有用である。本明細書で定義される場合、造血前駆細胞は、胚性幹細胞を含み得、これは、上記Ｔ細胞系統の細胞へとさらに分化し得る。造血前駆細胞は、種々の動物種（ヒト、マウス、ラット、もしくは他の哺乳動物が挙げられる）に由来し得る。「胸腺細胞前駆細胞」もしくは「胸腺細胞」は、胸腺に存在する造血前駆細胞である。
【００４６】
「造血幹細胞」とは、インビボで自己再生し得るか、インビトロで本質的に無制限に増殖し得、そしてＴ細胞系統の細胞を含む他の細胞タイプへと分化し得る未分化の造血細胞をいう。造血幹細胞は、胎児肝臓、骨髄、臍帯血から例えば単離され得るが、これらに限定されない。
【００４７】
「胚性幹細胞」もしくは「ＥＳ細胞」もしくは「ＥＳＣ」とは、発生中の胚の生殖細胞系へと組み込まれかつその一部になる能力を有する未分化の胚性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、造血前駆細胞、および任意の組織もしくは器官へと分化し得る。本明細書での使用に適している胚性幹細胞としては、Ｊ１  ＥＳ細胞株、１２９Ｊ  ＥＳ細胞株、マウス幹細胞株Ｄ３（アメリカンタイプカルチャーコレクション）、１２９／Ｓｖマウスに由来すＲ１もしくはＥ１４Ｋ細胞株、Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７Ｂｌ／６マウスに由来する細胞株、およびヒト胚性幹細胞（例えば、ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ＷＩ；もしくはＥＳ  ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａのもの）に由来する細胞が挙げられる。
【００４８】
「Ｔ細胞系統の細胞」とは、この細胞を他のリンパ系細胞ならびに赤血球系統および骨髄系統の細胞から区別するＴ細胞またはその前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）または前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）の少なくとも１つの表現型の特徴を示す細胞をいう。このような表現型の特徴は、Ｔ細胞に対して特異的な１種以上のタンパク質（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）、またはＴ細胞に対して特異的な生理学的、形態的、機能的もしくは免疫学的な特徴の発現を含み得る。例えば、上記Ｔ細胞系統の細胞は、Ｔ細胞系統に系統決定された前駆細胞または前駆体細胞；ＣＤ２５＋未成熟および不活性化Ｔ細胞；ＣＤ４もしくはＣＤ８系統決定を受けた細胞；ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性である胸腺細胞前駆細胞；単一陽性ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋；ＴＣＲαβもしくはＴＣＲγδ；または成熟および機能的もしくは活性化Ｔ細胞であり得る。
【００４９】
「核酸分子」、もしくはポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡの形態にあり得る。これらとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが挙げられる。核酸分子は、２本鎖もしくは１本鎖であり得、１本鎖の場合には、コード鎖もしくは非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。コード分子は、当該分野で公知のコード配列に同一なコード配列を有していてもよいし、遺伝コードの重複性もしくは縮重の結果として、またはスプライシングによって、同じポリペプチドをコードし得る異なるコード配列を有していてもよい。
【００５０】
「処置する」もしくは「処置」または「改善する」とは、被験体（例えば、ヒトもしくは非ヒト哺乳動物（例えば、霊長類、ウマ、イヌ、マウス、ラット））の疾患、障害もしくは状態の医学的管理をいう。一般に、本開示のＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現する宿主細胞、および必要に応じてアジュバントを含む適切な用量または処置レジメンは、治療利益もしくは予防利益を誘発するために十分な量で投与される。治療的もしくは予防的／防止的利益としては、臨床転帰の改善；疾患と関連した症状の低減もしくは緩和；症状の発生の低下；クオリティ・オブ・ライフの改善；より長期の疾患が無い状態；疾患の程度の低減、疾患状態の安定化；疾患進行の遅延；退縮；生存；生存の長期化；またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００５１】
本開示の融合タンパク質（例えば、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭ、Ｔ−ＣｈＡＲＭ）もしくは融合タンパク質を発現する細胞の「治療上有効な量」もしくは「有効量」とは、統計的に有意な様式で処置されている疾患の１以上の症状の改善を生じるために十分な、化合物もしくは細胞の量をいう。単独で投与される、個々の活性成分もしくは単一の活性成分を発現する細胞に言及する場合、治療上有効な用量とは、その成分もしくはその成分単独を発現する細胞の効果をいう。組み合わせに言及する場合、治療上有効な用量とは、逐次的に投与されようが同時に投与されようが、活性成分の組み合わされた量もしくは補助的活性成分と治療効果を生じる活性成分を発現する細胞との組み合わせに言及する。別の組み合わせは、２種の異なるＴ−ＣｈＡＲＭ、Ｔ−ＣｈＡＲＭおよびＴＣＲ、Ｔ−ＣｈＡＲＭおよびＣＡＲ、またはこれらの組み合わせのような１種より多くの活性成分を発現する細胞であり得る。
【００５２】
さらなる定義は、本開示全体を通じて提供される。
【００５３】
（Ｋｅｙ−ＣｈＥＭおよびＴ−ＣｈＡＲＭ）
ある種の局面において、本開示は、単鎖融合タンパク質（Ｋｅｙ−ＣｈＥＭといわれ、疎水性部分によって接続された細胞外成分および細胞内成分を含み、ここで上記細胞外成分は、タグカセットとヒンジを含むコネクター領域とを含み、上記細胞内成分は、エフェクタードメインを含む）を提供する。ある種の実施形態において、コネクター領域は、リンカーモジュールをさらに含むか、または１個以上のタグカセットは、上記コネクター領域内に位置する。ある種の他の実施形態において、１個以上のタグカセットは、リンカーモジュールによって上記コネクター領域に連結される。
【００５４】
さらなるＫｅｙ−ＣｈＥＭ実施形態において、上記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：タグカセット、ヒンジを含むコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む（例えば、図１Ａおよび１Ｂを参照のこと）。なおさらなるＫｅｙ−ＣｈＥＭ実施形態において、上記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：第１のコネクター領域、タグカセット、ヒンジを含む第２のコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む。まださらなるＫｅｙ−ＣｈＥＭ実施形態において、上記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：第１のタグカセット、第１のコネクター領域、第２のタグカセット、ヒンジを含む第２のコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む（例えば、図１Ｃを参照のこと）。いっそうなさらなるＫｅｙ−ＣｈＥＭ実施形態において、上記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：第１のタグカセット、第１のコネクター領域、第２のタグカセット、第２のコネクター領域、第３のタグカセット、ヒンジを含む第３のコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む（例えば、図１Ｄを参照のこと）。
【００５５】
ある種の他のＫｅｙ−ＣｈＥＭ実施形態において、上記融合タンパク質は、非共有結合的に会合した結合ドメイン（例えば、上記タグカセットと会合した結合ドメイン（すなわち、多重鎖Ｔ−ＣｈＡＲＭ））をさらに含む。さらに他のＫｅｙ−ＣｈＥＭ実施形態において、上記非共有結合的に会合した結合ドメインは、二重特異的であり、ここでその第１の結合末端は、上記タグカセットに対して特異的であり、その第２の結合末端は、上記タグカセット以外の標的に対して特異的であるか、またはその第１および第２の結合末端は、両方が上記タグカセットに対して特異的である。なお他のＫｅｙ−ＣｈＥＭ実施形態において、上記非共有結合的に会合した結合ドメインは、多重特異的であり、ここで第１の末端は、タグカセットに結合し、第２の末端は、上記タグカセット以外の１個以上の標的に対して特異的である。このような実施形態において、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭは、マルチマータンパク質を含む。いくつかの実施形態において、１個以上の非共有結合的に会合した結合ドメインを含むこのようなＫｅｙ−ＣｈＥＭは、ヘテロマルチマーを含む。
【００５６】
他の局面において、本開示は、単鎖融合タンパク質（Ｔ−ＣｈＡＲＭといわれ、疎水性部分によって接続された細胞外成分および細胞内成分を含み、ここで上記細胞外成分は、標的を特異的に結合する結合ドメイン、タグカセット、およびヒンジを含むコネクター領域を含み、上記細胞内成分は、エフェクタードメインを含む）を提供する。ある種の実施形態において、Ｔ−ＣｈＡＲＭ結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ｓｃＴＣＲ、レセプターエクトドメイン、もしくはリガンドである。
【００５７】
さらなるＴ−ＣｈＡＲＭ実施形態において、上記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：細胞外結合ドメイン、タグカセット、ヒンジを含むコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む（例えば、図１Ｅを参照のこと）。なおさらなるＴ−ＣｈＡＲＭ実施形態において、上記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：細胞外結合ドメイン、第１のコネクター領域、タグカセット、ヒンジを含む第２のコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む。まださらなるＴ−ＣｈＡＲＭ実施形態において、上記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：細胞外結合ドメイン、第１のタグカセット、第１のコネクター領域、第２のタグカセット、ヒンジを含む第２のコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む。いっそうさらなるＴ−ＣｈＡＲＭ実施形態において、上記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：細胞外結合ドメイン、第１のタグカセット、第１のコネクター領域、第２のタグカセット、第２のコネクター領域、第３のタグカセット、ヒンジを含む第３のコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む。
【００５８】
ある種の他のＴ−ＣｈＡＲＭ実施形態において、上記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：タグカセット、細胞外結合ドメイン、ヒンジを含むコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む（例えば、図１Ｆを参照のこと）。さらに他のＴ−ＣｈＡＲＭ実施形態において、上記融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端へと：可変領域間に配置された（例えば、可変領域リンカーのＮ末端にもしくはＮ末端近くに、可変領域リンカーＣ末端にもしくはＣ末端近くに、または可変領域リンカーの中央部付近に埋め込まれる）タグカセットを含む可変領域リンカーを含む細胞外ｓｃＦｖもしくはｓｃＴＣＲ結合ドメイン、ヒンジを含むコネクター領域、疎水性部分、およびエフェクタードメインを含む細胞内成分を含む。可変領域リンカーの中に埋め込まれる例示的なタグカセットは、ＧＧＳＧＳＧ（Ｘ）ｎＷＳＨＰＱＦＥＫＧＳＧＳＧ（配列番号４５）を含み、ここでＸは、任意選択のものであり、任意のアミノ酸であってよく、ｎは、０、１、２、３、４もしくは５である。配列番号５４において、埋め込まれたタグを有するこのような可変領域リンカーが存在し、ここでｎは１であり、Ｘはアスパラギン（Ｎ）である。
【００５９】
Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭは、細胞に結合されていてもよいし（例えば、細胞表面に発現される）または可溶性形態にあってもよい。ある種の実施形態において、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭ融合タンパク質をコードする核酸分子は、ある種の細胞タイプ（例えば、Ｔ細胞）において発現を増強もしくは最大化するようにコドン最適化され得る（Ｓｃｈｏｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１９：１３５，  ２００６）。
【００６０】
他の実施形態において、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭは、細胞傷害性成分（例えば、化学療法薬（例えば、抗有糸分裂薬（例えば、ビンデシン）、葉酸代謝拮抗薬（ａｎｔｉｆｏｌａｔｅ）、アルキル化剤（例えば、テモゾロミド）、細菌毒素、リシン、抗ウイルス薬、放射性同位体、放射性金属））をさらに含み得、これは、癌細胞、感染した細胞もしくは他の病的な細胞を特異的に死滅させるかまたは無力にするために有用である。さらなる実施形態において、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭは、検出可能な成分（例えば、ビオチン、蛍光部分、放射性核種）をさらに含み得、これは、癌細胞、感染した細胞もしくは他の組織（例えば、自己免疫攻撃を受けている組織）を追跡もしくは画像化するために有用である。なおさらなる実施形態において、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭは、機能的成分（例えば、免疫刺激部分、サイトカイン、免疫モジュレーター、免疫グロブリンタンパク質など）をさらに含み得る。
【００６１】
本開示の融合タンパク質の成分部分は、本明細書で詳細にさらに記載される。
【００６２】
（タグカセット）
本開示に従う単鎖融合タンパク質（例えば、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭ）に含まれるタグカセットは、高アフィニティーもしくはアビディティーで同系レセプターもしくは結合パートナー（例えば、抗体）に特異的に結合し得る細胞外成分であり、ここで上記同系レセプターもしくは結合パートナーは、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現する宿主もしくは細胞に対して異種もしくは非内因性である。単鎖融合タンパク質構造内では、タグカセットは、（ａ）コネクター領域に対してすぐアミノ末端側に、（ｂ）リンカーモジュール間に配置されかつリンカーモジュールを接続して、（ｃ）結合ドメインに対してすぐカルボキシ末端側に、（ｄ）結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とエフェクタードメインとの間に挿入されかつ結合ドメインをエフェクタードメインに接続して、（ｅ）結合ドメインのサブユニット間に挿入されかつ接続して、または（ｆ）本開示の単鎖融合タンパク質のアミノ末端に、位置し得る。ある種の実施形態において、１個以上の接合部アミノ酸が、タグカセットと疎水性部分との間に配置されてかつこれらを接続し得るか、またはタグカセットとコネクター領域との間に配置されてかつこれらを接続し得るか、またはタグカセットとリンカーモジュールとの間に配置されてかつこれらを接続し得るか、またはタグカセットと結合ドメインとの間に配置されてかつこれらを接続し得る。
【００６３】
例示的タグカセットとしては、Ｓｔｒｅｐタグ（これは、元のＳｔｒｅｐ（登録商標）タグ、Ｓｔｒｅｐ（登録商標）タグＩＩ、もしくはこれらの任意の改変体をいう；例えば、米国特許第７，９８１，６３２号を参照のこと（このＳｔｒｅｐタグは、本明細書に参考として援用される））、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ（配列番号３）、Ｘｐｒｅｓｓタグ（配列番号４）、Ａｖｉタグ（配列番号５）、カルモジュリンタグ（配列番号１９）、ポリグルタメートタグ、ＨＡタグ（配列番号６）、Ｍｙｃタグ（配列番号７）、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ  １（配列番号９）、Ｓｏｆｔａｇ  ３（配列番号３２）、Ｖ５タグ（配列番号８）、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、チオレドキシンタグ、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。ある種の実施形態において、タグカセットは、アミノ酸配列  Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（配列番号１）もしくはＴｒｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２）を有するＳｔｒｅｐタグである。他の実施形態において、タグカセットは、遺伝子操作されたアフィニティー部位（例えば、最小キレート化部位（例えば、ＨＧＧＨＨＧ、配列番号３３）であり得る。
【００６４】
タグカセットは、本開示の融合タンパク質の中に複数のコピーで存在し得る。例えば、本開示の融合タンパク質は、１個、２個、３個。４個もしくは５個のタグカセット（例えば、Ｓｔｒｅｐタグ）を有し得る。ある種の実施形態において、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭのコネクター領域は、１個のタグカセット、２個のタグカセット、３個のタグカセット、４個のタグカセット、もしくは５個のタグカセットを含む。上記複数のタグカセットの各々は、同じであっても異なっていてもよい。例示的な実施形態は、ＳｔｒｅｐタグおよびＳｔｒｅｐタグカセット、またはＨｉｓタグおよびＳｔｒｅｐタグカセット、またはＨＡタグおよびＳｔｒｅｐタグカセット、またはＭｙｃタグおよびＳｔｒｅｐタグカセットを有するＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを含む。あるいは、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭは、同じタイプもしくは同じアミノ酸配列の複数のタグカセット（例えば、２個、３個、４個もしくは５個のＳｔｒｅｐタグカセット（例えば、ＳｔｒｅｐタグＩＩ））を有する。
【００６５】
例えば、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭは、少なくとも２個の異なるタグカセットを有し得る。いくつかの実施形態において、第１のタグカセットは、刺激シグナルを提供し得、別個の第２のタグカセットは、検出試薬と会合させるために、または抗体−毒素結合体ともしくは抗体−画像化剤結合体と会合させるために使用され得る。さらなる実施形態において、上記２個以上の第１のタグカセットは、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭの異なる領域に位置し得る。ある種の実施形態において、第１のタグカセットは、コネクター領域中に位置し、第２のタグカセットは、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭのアミノ末端もしくはカルボキシ末端もしくはその両方に位置する（例えば、図１Ｈを参照のこと）。
【００６６】
ある種の実施形態において、タグカセットは、約５〜約５００アミノ酸、もしくは約６〜約１００アミノ酸、もしくは約７〜約５０アミノ酸、もしくは約８〜約２０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、タグカセットは、７〜１０アミノ酸を有する。好ましくは、タグカセットは、非免疫原性もしくは最小限に免疫原性である。本質的に、タグカセットは、ハンドルもしくはビーコンとして機能して、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現する細胞の同定、富化、単離、増殖の促進、活性化、追跡、もしくは除去を可能にし得る。
【００６７】
ある種の実施形態において、タグカセットは、本開示の融合タンパク質のコネクター領域内に位置する。例えば、コネクター領域は、タグカセットに隣接するリンカーモジュールをさらに含み得、ここで上記タグカセットを有する上記リンカーモジュールは、アミノ酸配列
【００６８】
【化１】
2019083821.tif 000004
【００６９】
を有する。
【００７０】
本明細書で記載されるとおりの１個以上のタグカセットを含む単鎖融合タンパク質は、同系結合パートナーと会合し得、ここで上記同系結合パートナーは、本明細書で記載されるとおりのタグカセットを含む融合タンパク質を発現する宿主もしくは細胞に対して異種である。ある種の実施形態において、本開示の単鎖Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭに存在するタグカセットは、Ｓｔｒｅｐタグであり、これは、同系結合パートナーとしてストレプトアビジン、ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎもしくはその両方を有するか、またはＳｔｒｅｐタグに対して特異的な抗体によって認識される。ある種の実施形態において、上記同系結合パートナー（例えば、レセプター、タンパク質、抗体）は、可溶性であってもよいし、マトリクス組成物の一部であってもよいし、固体表面（例えば、プレート、ビーズ）に結合体化されてもよい。例示的な固体表面は、ビーズおよび粒子（例えば、マイクロおよびナノ）（例えば、磁性ビーズおよび粒子）を含む。
【００７１】
単鎖Ｔ−ＣｈＡＲＭ融合タンパク質実施形態において、タンパク質複合体は、融合タンパク質と同系タグカセット結合パートナーとの間で形成し得、これは、上記タグカセットと上記結合パートナーとの間の結合の結果である。ある種の実施形態において、Ｔ−ＣｈＡＲＭは、ｓｃＦｖもしくはｓｃＴＣＲ結合ドメインを含み、ここで上記タグカセットは、上記可変領域リンカー内に（上記結合ドメインサブユニット間に）位置する。他の実施形態において、Ｔ−ＣｈＡＲＭは、上記結合ドメインのアミノ末端に位置したタグカセットを有する。このようなタンパク質複合体もしくは融合タンパク質構造において、Ｔ−ＣｈＡＲＭ結合ドメインは、その標的特異性もしくはその特異的標的結合アフィニティーを保持する。
【００７２】
（コネクター領域およびヒンジ）
本開示に従う単鎖融合タンパク質の中のヒンジを含むコネクター領域は、（ａ）疎水性部分に対して直ぐアミノ末端側に、（ｂ）タグカセット（例えば、Ｓｔｒｅｐタグ）とエフェクタードメインとの間に挿入されかつ接続して、（ｃ）結合ドメインに対して直ぐカルボキシ末端側に、または（ｄ）リンカーモジュールとエフェクタードメインとの間に挿入されかつ接続して、位置し得る。本明細書で記載されるとおりの、ヒンジを有するコネクター領域を含む単鎖融合タンパク質は、もう１つの単鎖融合タンパク質と会合して、ダイマー（例えば、ホモダイマーもしくはヘテロダイマー）を形成し得、ここでＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭダイマーは、同系結合パートナーを結合し得る１個以上のタグカセットを含み、Ｔ−ＣｈＡＲＭダイマーは、その標的特異性もしくはその特異的標的結合アフィニティーを保持する結合ドメインをさらに含む。
【００７３】
コネクター領域は、ヒンジのみ、リンカーモジュールのみ、ヒンジおよびリンカーモジュール、またはヒンジ、１個以上のリンカーモジュールおよび１個以上のタグカセットから構成され得る。ある種の実施形態において、リンカーモジュールは、可撓性構造を形成する約２〜約２０アミノ酸を含む。例示的リンカーモジュールとしては、免疫グロブリンＣＨ２ＣＨ３、免疫グロブリンＣＨ３、もしくは１個以上のＧｌｙｘＳｅｒｙ（ここでｘおよびｙは、独立して０〜１０の整数であるが、ただしｘおよびｙは、両方が０ではない（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号６７）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２（配列番号６８）、Ｇｌｙ２Ｓｅｒ、もしくはこれらの組み合わせ（例えば、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）（配列番号６９））））が挙げられる。さらなる実施形態において、コネクター領域は、タグカセットを含む。例えば、コネクター領域は、１〜５個のタグカセットを含み、ここで各タグカセットは、（ＧｌｙｘＳｅｒｙ）ｎ（ここでｎは、１〜１０の整数であり、ｘおよびｙは独立して０〜１０の整数であるが、ただしｘおよびｙは両方が０ではない）を含む１個もしくは２個のリンカーモジュールに接続される。例示的リンカーモジュールは、アミノ酸配列  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１０）、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２（配列番号１１）、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１２）を有し、これらは、コネクター領域内に任意の組み合わせで存在し得る。
【００７４】
ある種の実施形態において、本開示の単鎖Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭに存在するヒンジは、免疫グロブリンヒンジ領域（例えば、野生型免疫グロブリンヒンジ領域もしくはその変化した免疫グロブリンヒンジ領域）であり得る。ある種の実施形態において、ヒンジは、野生型ヒト免疫グロブリンヒンジ領域である。ある種の他の実施形態において、１個以上のアミノ酸残基は、融合タンパク質構築物設計の一部として野生型免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ末端もしくはカルボキシ末端に付加され得る。例えば、１個、２個もしくは３個のさらなる接合部アミノ酸残基は、ヒンジアミノ末端もしくはカルボキシ末端に存在し得るか、またはヒンジは、末端もしくは内部欠失を含み得、かつ１個、２個もしくは３個のさらなる接合部アミノ酸残基が付加し戻され得る。
【００７５】
ある種の実施形態において、ヒンジは、変化した免疫グロブリンヒンジであり、ここで野生型免疫グロブリンヒンジ領域の中の１個以上のシステイン残基は、１個以上の他のアミノ酸残基で置換されている。例示的な変化した免疫グロブリンヒンジとしては、野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４のヒンジの中に見出される１個、２個もしくは３個のシステイン残基が１個、２個もしくは３個の異なるアミノ酸残基（例えば、セリンもしくはアラニン）で置換されている免疫グロブリンヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４のヒンジ領域が挙げられる。ある種の実施形態において、ヒンジポリペプチドは、野生型免疫グロブリンヒンジ領域（例えば、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジ、もしくは野生型ヒトＩｇＧ４ヒンジ）と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはその配列である。
【００７６】
さらなる実施形態において、本開示の単鎖Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭに存在するヒンジは、免疫グロブリンヒンジに基づかないもしくはこれに由来しない（すなわち、野生型免疫グロブリンヒンジでも変化した免疫グロブリンヒンジでもない）ヒンジであり得る。このようなヒンジの例としては、タイプＩＩ  ＣレクチンもしくはＣＤ分子のストーク領域の約５〜約１５０アミノ酸のペプチド（約８〜約２５アミノ酸のペプチドもしくは約７〜約１８アミノ酸のペプチドもしくはこれらの改変体を含む）を含む。
【００７７】
タイプＩＩ  ＣレクチンもしくはＣＤ分子の「ストーク領域」とは、Ｃタイプレクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ；例えば、ナチュラルキラー細胞レセプターのＣＴＬＤに類似）と疎水性部分（膜貫通ドメイン）との間に位置するタイプＩＩ  ＣレクチンもしくはＣＤ分子の細胞外ドメインの一部をいう。例えば、ヒトＣＤ９４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ５０２９１．１）の細胞外ドメインは、アミノ酸残基３４〜１７９に相当するが、上記ＣＴＬＤは、アミノ酸残基６１〜１７６に相当し、その結果、上記ヒトＣＤ９４分子のストーク領域は、疎水性部分（膜貫通ドメイン）とＣＴＬＤとの間に位置するアミノ酸残基３４〜６０を含む（Ｂｏｙｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：７５，  １９９９を参照のこと；他のストーク領域の説明に関しては、Ｂｅａｖｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：７５３，  １９９２；およびＦｉｇｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２：７７，  ２００２もまた参照のこと）。これらタイプＩＩ  ＣレクチンもしくはＣＤ分子はまた、上記ストーク領域と上記膜貫通領域もしくは上記ＣＴＬＤとの間に接合部アミノ酸を有し得る。別の例では、２３３アミノ酸ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ２６７１５．１）は、アミノ酸７１〜９３の範囲に及ぶ疎水性部分（膜貫通ドメイン）およびアミノ酸９４〜２３３の範囲に及ぶ細胞外ドメインを有する。上記ＣＴＬＤは、アミノ酸１１９〜２３１を含み、上記ストーク領域は、アミノ酸９９〜１１６を含み、これらには、さらなる接合部アミノ酸が隣接し得る。他のタイプＩＩ  ＣレクチンもしくはＣＤ分子、ならびにそれらの細胞外リガンド−結合ドメイン、ストーク領域、およびＣＴＬＤは、当該分野で公知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１９９３．２；  ＡＡＨ０７０３７．１；  ＮＰ＿００１７７３．１；  ＡＡＬ６５２３４．１；  ＣＡＡ０４９２５．１を；それぞれ、ヒト  ＣＤ２３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｄの配列ならびにそれらの説明について参照のこと）。
【００７８】
タイプＩＩ  ＣレクチンもしくはＣＤ分子のストーク領域ヒンジ、もしくはこれらのフラグメントの「誘導体」は、約８〜約１５０アミノ酸配列を含み、ここで野生型タイプＩＩ  ＣレクチンもしくはＣＤ分子の上記ストーク領域の１個、２個もしくは３個のアミノ酸は、欠失、挿入、置換、もしくはこれらの任意の組み合わせを有する。例えば、誘導体は、１個以上のアミノ酸置換および／もしくはアミノ酸欠失を含み得る。ある種の実施形態において、ストーク領域の誘導体は、野生型ストーク領域配列（例えば、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２３、ＣＤ６４、ＣＤ７２、もしくはＣＤ９４の約８〜約２０アミノ酸に由来するもの）と比較してタンパク質分解切断に対してより抵抗性がある。
【００７９】
ある種の実施形態において、ストーク領域ヒンジは、約７〜約１８アミノ酸を含み得、αらせんコイルドコイル構造を形成し得る。ある種の実施形態において、ストーク領域ヒンジは、０個、１個、２個、３個、もしくは４個のシステインを含む。例示的なストーク領域ヒンジは、上記ストーク領域のフラグメント（例えば、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ９４、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｄのストーク領域に由来する約１０〜約１５０アミノ酸を含む部分）を含む。
【００８０】
本開示の単鎖Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭにおいて使用され得る代替のヒンジは、免疫グロブリンＶ様ドメインもしくは免疫グロブリンＣ様ドメインを接続する細胞表面レセプターの一部（ドメイン間領域）に由来する。上記細胞表面レセプターが複数のＩｇ  Ｖ様ドメインをタンデムに含むＩｇ  Ｖ様ドメインの間の領域、および上記細胞表面レセプターが複数のタンデムＩｇ  Ｃ様領域を含むＩｇ  Ｃ様ドメインの間の領域はまた、本開示の単鎖Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭにおいて有用なヒンジとして企図される。ある種の実施形態において、細胞表面レセプタードメイン間領域から構成されるヒンジ配列は、１個以上のジスルフィド結合を提供して、上記Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭダイマー形成を安定化するために、天然に存在するかもしくは付加されたモチーフ（例えば、ＩｇＧコアヒンジ配列）をさらに含み得る。ヒンジの例としては、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ６６、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５０、ＣＤ１６６、もしくはＣＤ２４４の上記Ｉｇ  Ｖ様領域とＩｇ  Ｃ様領域との間のドメイン間領域が挙げられる。
【００８１】
ある種の実施形態において、ヒンジ配列は、約５〜約１５０アミノ酸、約５〜約１０アミノ酸、約１０〜約２０アミノ酸、約２０〜約３０アミノ酸、約３０〜約４０アミノ酸、約４０〜約５０アミノ酸、約５０〜約６０アミノ酸、約５〜約６０アミノ酸、約５〜約４０アミノ酸、例えば、約８〜約２０アミノ酸もしくは約１０〜約１５アミノ酸を有する。上記ヒンジは、主に可撓性であり得るが、より剛性の特徴を提供してもよいし、最小限のβ−シート構造を有する主にα−ヘリックス構造を含んでいてもよい。
【００８２】
ある種の実施形態において、ヒンジ配列は、血漿および血清中で安定であり、タンパク質分解切断に抵抗性である。例えば、ＩｇＧ１アッパーヒンジ領域中の第１のリジンは、タンパク質分解切断を最小限にするために変異させられ得るかもしくは欠失させられ得、ヒンジは、接合部アミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態において、ヒンジ配列は、天然に存在するかもしくは付加されたモチーフ（例えば、１個以上のジスルフィド結合を形成して、ダイマー形成を安定化する能力を付与する免疫グロブリンヒンジコア構造ＣＰＰＣＰ（配列番号２６））を含み得る。
【００８３】
（疎水性部分）
本開示の単鎖融合タンパク質（例えば、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭ）に含まれる疎水性部分は、本開示の融合タンパク質が細胞膜と会合し、その結果、上記融合タンパク質の一部が細胞外に位置し（例えば、タグカセット、コネクタードメイン、結合ドメイン）、一部が細胞内に位置する（例えば、エフェクタードメイン）ことを可能にする。疎水性部分は一般に、細胞膜リン脂質二重層内に配置される。ある種の実施形態において、１個以上の接合部アミノ酸は、疎水性部分とエフェクタードメインとの間に配置されてかつこれらを接続し得るか、または疎水性部分とコネクター領域との間に配置されてかつこれらを接続し得るか、または疎水性部分とタグカセットとの間に配置されてかつこれらを接続し得る。
【００８４】
ある種の実施形態において、疎水性ドメインは、膜貫通ドメイン（例えば、内在性膜タンパク質（例えば、レセプター、分化抗原群（ＣＤ）分子、酵素、輸送体、細胞接着分子など）に由来するもの）である。特定の実施形態において、疎水性部分は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、もしくはＣＤ２８に由来する膜貫通ドメインである。ある種の実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号１６に示されるとおりのアミノ酸を有するＣＤ２８膜貫通ドメインである。
【００８５】
（エフェクタードメイン）
本開示の単鎖融合タンパク質（例えば、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭ）に含まれるエフェクタードメインは、細胞内成分であり、機能的シグナルを細胞に伝達し得る。ある種の実施形態において、単鎖Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭは、それぞれ、第２の単鎖Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭとダイマー化し、ここで上記ダイマー化は、エフェクタードメインを含む上記細胞内成分が近位に存在し、かつ適切なシグナルに曝される場合にシグナル伝達を促進することを可能にする。このようなダイマータンパク質複合体を形成することに加えて、上記エフェクタードメインは、他のシグナル伝達因子（例えば、共刺激因子）とさらに会合して、細胞内シグナルを生成する多重タンパク質複合体を形成し得る。ある種の実施形態において、エフェクタードメインは、細胞応答を直接的に促進する１個以上の他のタンパク質と会合することによって、細胞応答を間接的に促進する。エフェクタードメインは、１個、２個、３個もしくはより多くのレセプターシグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン、もしくはこれらの組み合わせを含み得る。種々のシグナル伝達分子（例えば、シグナル伝達レセプター）のうちのいずれかに由来するエフェクタードメイン、共刺激ドメインもしくはその両方を含む任意の細胞内成分は、本開示の融合タンパク質において使用され得る。
【００８６】
本開示の融合タンパク質において有用なエフェクタードメインは、以下のタンパク質に由来し得る：Ｗｎｔシグナル伝達経路（例えば、ＬＲＰ、Ｒｙｋ、ＲＯＲ２）、ＮＯＴＣＨシグナル伝達経路（例えば、ＮＯＴＣＨ１、ＮＴＯＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４）、Ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達経路（例えば、ＰＴＣＨ、ＳＭＯ）、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプターファミリー、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）レセプターファミリー、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）レセプターファミリー、インスリンレセプター（ＩＲ）ファミリー、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）レセプターファミリー、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプターファミリー、トロポミオシン（ｔｒｏｐｏｍｙｃｉｎ）レセプターキナーゼ（Ｔｒｋ）レセプターファミリー、エフリン（Ｅｐｈ）レセプターファミリー、ＡＸＬレセプターファミリー、白血球チロシンキナーゼ（ＬＴＫ）レセプターファミリー、免疫グロブリン様およびＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ１（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ａｎｄ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  １）（ＴＩＥ）レセプターファミリー、レセプターチロシンキナーゼ様オーファン（ＲＯＲ）レセプターファミリー、ジスコイジンドメイン（ＤＤＲ）レセプターファミリー、トランスフェクション中再配列（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）（ＲＥＴ）レセプターファミリー、チロシン−タンパク質キナーゼ様（ＰＴＫ７）レセプターファミリー、レセプターチロシンキナーゼ関連（ＲＹＫ）レセプターファミリー、筋特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）レセプターファミリー）；Ｇプロテイン共役レセプター、ＧＰＣＲ（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）；セリン／スレオニンキナーゼレセプター（ＢＭＰＲ、ＴＧＦＲ）；またはサイトカインレセプター（ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１５Ｒ）。
【００８７】
ある種の実施形態において、エフェクタードメインは、リンパ球レセプターシグナル伝達ドメインを含むか、または１以上のイムノレセプターチロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有するアミノ酸配列を含む。なおさらなる実施形態において、エフェクタードメインは、細胞質シグナル伝達タンパク質と会合する細胞質部分を含み、ここで上記細胞質シグナル伝達タンパク質は、リンパ球レセプターもしくはそのシグナル伝達ドメイン、複数のＩＴＡＭを含むタンパク質、共刺激因子、またはこれらの任意の組み合わせである。
【００８８】
例示的エフェクタードメインとしては、４−１ＢＢ（例えば、配列番号１７）、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ（例えば、配列番号１８）、ＣＤ２７、ＣＤ２８（例えば、配列番号３５）、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、Ｌｃｋ、ＬＡＧ３、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＯＴＣＨ１、Ｗｎｔ、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、ＳＬＡＭＦ１、Ｓｌｐ７６、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｚａｐ７０、ＰＴＣＨ２、またはこれらの任意の組み合わせに由来するものが挙げられる。
【００８９】
特定の実施形態において、本開示のＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭのエフェクタードメインは、ＣＤ３ζおよびＣＤ２８であるか、ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢであるか、またはＣＤ３ζ、ＣＤ２８および４−１ＢＢである。
【００９０】
（結合ドメイン）
本明細書で記載される場合、本開示のＴ−ＣｈＡＲＭ単鎖融合タンパク質は、標的を特異的に結合する結合ドメインを含む。上記結合ドメインによる標的の結合は、上記標的（例えば、レセプターもしくはリガンド）と別の分子との間の相互作用をブロックし得、例えば、上記標的のある種の機能（例えば、シグナル伝達）に干渉、低減もしくは除去し得るか、または標的の結合は、ある種の生物学的経路を誘発し得るか、または除去のための標的を同定し得る。
【００９１】
結合ドメインは、目的の標的を特異的に結合する任意のペプチドであり得る。結合ドメインの供給源としては、ヒト、齧歯類、トリ、もしくはヒツジを含む種々の種に由来する抗体可変領域（これは、抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖベースのグラバボディー（ｇｒａｂａｂｏｄｙ）、または可溶性ＶＨドメインもしくはドメイン抗体の形態にあり得る）が挙げられる。結合ドメインのさらなる供給源としては、他の種（例えば、ラクダ科の動物（ラクダ、ヒトコブラクダ、もしくはリャマに由来する；Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４１４：５２１，  １９９７；  Ｖｉｎｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８４：３２７３，  ２００９；  Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６，  １９９３  ａｎｄ  Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７５：４１３，  １９９８）、テンジクザメ（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  ９５：１１８０４，  １９９８）、スポッテッドラットフィッシュ（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ．  ５４：３９，  ２００２）、またはヤツメウナギ（Ｈｅｒｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ′ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  １０５：２０４０，  ２００８およびＡｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：３１９，  ２００８））に由来する抗体の可変領域が挙げられる。これら抗体は、重鎖可変領域のみを使用して抗原結合領域を形成し得る。すなわち、これら機能的抗体は、重鎖のみのホモダイマー（「重鎖抗体」といわれる）である（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２２：１１６１，  ２００４；  Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６４：２８５３，  ２００４；  Ｂａｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  １２：５８０，  ２００６；およびＢａｒｔｈｅｌｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８３：３６３９，  ２００８）。
【００９２】
本開示の結合ドメインの代替供給源としては、ランダムペプチドライブラリーをコードする配列または以下の代替の非抗体足場のループ領域における操作された多様性のアミノ酸をコードする配列が挙げられる：例えば、ｓｃＴＣＲ（例えば、Ｌａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：７４５，  １９９９；  Ｍａｙｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３０６：５１，  ２００５；  米国特許第８，３６１，７９４号を参照のこと）、フィブリノゲンドメイン（例えば、Ｗｅｉｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３８８，  １９８５を参照のこと）、Ｋｕｎｉｔｚドメイン（例えば、米国特許第６，４２３，４９８号を参照のこと）、設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）（Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３２：４８９，  ２００３およびＢｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２２：５７５，  ２００４）、フィブロネクチン結合ドメイン（アドネクチンもしくはモノボディー）（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３２６：１４７５，  ２００３；  Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌｅｃ．  １８：４３５，  ２００５およびＨａｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３８１：１２３８−１２５２）、システインノットミニタンパク質（Ｖｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  ９２：６４０４−６４０８；  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１：７１，  ２００２およびＨｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １３：７５５，  ２００５）、テトラトリコペプチド反復ドメイン（Ｍａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １１：４９７，  ２００３およびＣｏｒｔａｊａｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ３：１６１，  ２００８）、ロイシンリッチ反復ドメイン（Ｓｔｕｍｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３２：４７１，  ２００３）、リポカリンドメイン（例えば、ＷＯ  ２００６／０９５１６４、Ｂｅｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  ９６：１８９８，  １９９９およびＳｃｈｏｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  １０６：８１９８，  ２００９を参照のこと）、Ｖ様ドメイン（例えば、米国特許出願公開第２００７／００６５４３１号を参照のこと）、Ｃタイプレクチンドメイン（Ｚｅｌｅｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｇｒｅａｄｙ，  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７２：６１７９，  ２００５；  Ｂｅａｖｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ′ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  ８９：７５３，  １９９２およびＳａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ′ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  １００：７７７９，  ２００３）、ｍＡｂ２もしくはＦｃａｂＴＭ（例えば、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ  ２００７／０９８９３４；  ＷＯ  ２００６／０７２６２０を参照のこと）、アルマジロ反復タンパク質（例えば、Ｍａｄｈｕｒａｎｔａｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ２１：  １０１５，  ２０１２；  ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ  ２００９／０４０３３８を参照のこと）、アフィリン（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３７２：  １７２，  ２００７）、アフィボディー（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、ノッティン（ｋｎｏｔｔｉｎ）、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、アトリマー（ａｔｒｉｍｅｒ）、細胞傷害性Ｔ−リンパ球関連タンパク質−４（Ｗｅｉｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎ．  Ｐｒｏｔｅｏ．  １０：１５５，  ２０１３）など（Ｎｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ８：６０１，  １９９５；  Ｎｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １５：７７２，  １９９７；  Ｎｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒｏ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６８：４２６９，  ２００１；  Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：１２５７，  ２００５；  Ｂｏｅｒｓｍａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２２：８４９，  ２０１１）。
【００９３】
本開示の結合ドメインは、本明細書で記載されるとおりにもしくは当該分野で公知の種々の方法によって生成され得る（例えば、米国特許第６，２９１，１６１号および同第６，２９１，１５８号を参照のこと）。例えば、本開示の結合ドメインは、Ｆａｂファージライブラリーを、目的の標的に特異的に結合するＦａｂフラグメントに関してスクリーニングすることによって同定され得る（Ｈｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：３４４，  ２００５を参照のこと）。さらに、従来のシステム（例えば、マウス、ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）、ＴＣマウスＴＭ、ＫＭ−マウス（登録商標）、リャマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなど）において免疫原として目的の標的を使用するハイブリドーマ開発のための旧来のストラテジーは、本開示の結合ドメインを開発するために使用され得る。
【００９４】
いくつかの実施形態において、結合ドメインは、目的の標的に対して特異的なＶＨ領域およびＶＬ領域を含む単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ある種の実施形態において、上記ＶＨ領域およびＶＬ領域は、ヒトである。例示的なＶＨ領域およびＶＬ領域としては、抗ＣＤ１９特異的モノクローナル抗体ＦＭＣ６３のセグメントが挙げられる（例えば、それぞれ、配列番号５１および５２を参照のこと）。
【００９５】
ある種の実施形態において、結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（例えば、ＦＭＣ６３からは、配列番号５２；Ｒ１２からは、配列番号５６）または重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（例えば、ＦＭＣ６３からは、配列番号５１；Ｒ１２からは、配列番号５５）と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは１００％同一である配列、またはその両方を含むかまたはその配列であり、ここで各ＣＤＲは、目的の標的（例えば、ＣＤ１９、ＲＯＲ１）に特異的に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体から、ゼロ変化、もしくは最大で１、２、もしくは３つの変化を含む。
【００９６】
ある種の実施形態において、本開示の結合ドメインＶＨ領域は、既知のモノクローナル抗体のＶＨから得られ得るかもしくはこれに基づき得、既知のモノクローナル抗体のＶＨと比較した場合に、１以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の）挿入、１以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の）欠失、１以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の）アミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換）、または上記の変化の組み合わせを含む。挿入、欠失もしくは置換は、ＶＨ領域の中のどこかにあり得る（この領域のアミノ末端もしくはカルボキシ末端もしくはその両方を含むが、ただし各ＣＤＲは、ゼロ変化または最大で１、２もしくは３つの変化を含み、ただし上記改変されたＶＨ領域を含む結合ドメインは、その標的を、野生型結合ドメインに類似のアフィニティーでなお特異的に結合し得る）。
【００９７】
さらなる実施形態において、本開示の結合ドメインにおけるＶＬ領域は、既知のモノクローナル抗体のＶＬから得られ得るかもしくはこれに基づき得、既知のモノクローナル抗体のＶＬと比較した場合に、１以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の）挿入、１以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の）欠失、１以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の）アミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、または上記の変化の組み合わせを含む。挿入、欠失もしくは置換は、ＶＬ領域の中のどこかにあり得る（この領域のアミノ末端もしくはカルボキシ末端もしくはその両方を含むが、ただし各ＣＤＲは、ゼロ変化または最大で１、２もしくは３つの変化を含み、ただし上記改変されたＶＬ領域を含む結合ドメインは、その標的を、野生型結合ドメインに類似のアフィニティーでなお特異的に結合し得る）。
【００９８】
上記ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、いずれかの配向において（すなわち、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＶＨ−ＶＬもしくはＶＬ−ＶＨ）配置され得、スペーサー機能を提供し得るアミノ酸配列（例えば、長さ約５〜約３５アミノ酸を有する）によって繋がれ得、その結果、その２つのサブ結合ドメインは相互作用して、機能的結合ドメインを形成し得る。ある種の実施形態において、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを繋ぐ可変領域リンカーとしては、（ＧｌｙｎＳｅｒ）ファミリーに属するもの（例えば、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１（配列番号７２）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号７２）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号７２）、もしくは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１０））（ここでｎは、１〜５の整数である）が挙げられる。ある種の実施形態において、上記リンカーは、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３（配列番号１３）もしくはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）４（配列番号１４）である。ある種の実施形態において、これら（ＧｌｙｎＳｅｒ）ベースのリンカーは、結合ドメインの中で上記ＶＨドメインおよびＶＬドメインを連結するために使用され、これらリンカーはまた、上記結合ドメインをコネクター領域もしくはタグカセットへと連結するか、またはタグカセットをエフェクタードメインへと連結するために、使用され得る。ある種の他の実施形態において、タグカセットは、結合ドメインのＶＨドメインおよびＶＬドメインを連結するために使用される（ＧｌｙｎＳｅｒ）ベースのリンカーの一部であるかもしくはこのリンカー内に位置する。なおさらなる実施形態において、（ＧｌｙｎＳｅｒ）ベースのリンカーは、１個以上のタグカセットをＴ−ＣｈＡＲＭ結合ドメインのＮ末端に接続するために使用され得る。
【００９９】
いくつかの実施形態において、結合ドメインは、Ｖα／β鎖およびＣα／β鎖（例えば、Ｖα−Ｃα、Ｖβ−Ｃβ、Ｖα−Ｖβ）を含むかもしくは目的の標的（例えば、ペプチド−ＭＨＣ複合体）に特異的なＶα−Ｃα、Ｖβ−Ｃβ、Ｖα−Ｖβ対を含む単鎖Ｔ細胞レセプター（ｓｃＴＣＲ）である。
【０１００】
ある種の実施形態において、結合ドメインは、ＴＣＲ  Ｖα、Ｖβ、Ｃα、もしくはＣβのアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは１００％同一である配列を含むかまたはその配列であり、ここで各ＣＤＲは、目的の標的に特異的に結合するＴＣＲまたはそのフラグメントもしくは誘導体からゼロ変化または最大で１、２、もしくは３つの変化を含む。
【０１０１】
ある種の実施形態において、本開示の結合ドメインＶα、Ｖβ、Ｃα、もしくはＣβ領域は、既知のＴＣＲ（例えば、高アフィニティーＴＣＲ）のＶα、Ｖβ、Ｃα、もしくはＣβから得られ得るかもしくはこれに基づき得、既知のＴＣＲのＶα、Ｖβ、Ｃα、もしくはＣβと比較した場合に、１以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の）挿入、１以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の）欠失、１以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の）アミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換）、または上記の変化の組み合わせを含む。挿入、欠失もしくは置換は、Ｖα、Ｖβ、Ｃα、もしくはＣβ領域の中のどこかにあり得る（この領域のアミノ末端もしくはカルボキシ末端もしくはその両方を含むが、ただし各ＣＤＲは、ゼロ変化または最大で１、２もしくは３つの変化を含み、ただし改変されたＶα、Ｖβ、Ｃα、もしくはＣβ領域を含む結合ドメインは、その標的を、野生型結合ドメインに類似のアフィニティーでなお特異的に結合し得る）。
【０１０２】
標的分子（これは、本開示のＴ−ＣｈＡＲＭ単鎖融合タンパク質に含まれる結合ドメインによって特異的に結合される）は、目的の細胞（「標的細胞」）上にまたは関連して見出され得る。例示的な標的細胞としては、癌細胞、自己免疫疾患もしくは障害とまたは炎症性疾患もしくは障害と関連した細胞、および感染性生物もしくは細胞（例えば、細菌、ウイルス、ウイルス感染細胞）が挙げられる。感染性生物（例えば、哺乳動物の寄生生物）の細胞はまた、標的細胞として企図される。
【０１０３】
ある種の実施形態において、本開示のＴ−ＣｈＡＲＭ単鎖融合タンパク質の結合ドメインは、腫瘍抗原、Ｂ細胞標的、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーメンバー、Ｈｅｄｇｅｈｏｇファミリーメンバー、レセプターチロシンキナーゼ、プロテオグリカン関連分子、ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバー、Ｗｎｔ関連分子、Ｔ細胞標的、樹状細胞標的、ＮＫ細胞標的、単球／マクロファージ細胞標的、または血管形成標的から選択される標的を認識する。さらなる実施形態において、本開示のＴ−ＣｈＡＲＭ単鎖融合タンパク質の結合ドメインは、レセプタータンパク質（例えば、表在性膜レセプタータンパク質もしくは膜貫通レセプタータンパク質）を結合する。
【０１０４】
ある種の実施形態において、本開示のＴ−ＣｈＡＲＭ単鎖融合タンパク質は、標的、例えば、ＣＤ３、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＧＤ２、Ｏ−アセチルＧＤ２、Ｏ−アセチルＧＤ３、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＦＬＴ４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１５１、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＶＥＭ、ＭＡＧＥ−Ａ、メソセリン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫ、ＲＯＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＴＷＥＡＫ−Ｒ、ＨＬＡ、ＨＬＡに結合した腫瘍もしくは病原体由来ペプチド（例えば、ｈＴＥＲＴ、チロシナーゼ、もしくはＷＴ−１に由来する）、ＬＴβＲ、ＬＩＦＲβ、ＬＲＰ５、ＭＵＣ１、ＯＳＭＲβ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、Ｂ７Ｈ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ１、Ｒｏｂｏ１、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４ともいわれる）、またはＣＤ７９ｂを特異的に結合する。ある種の実施形態において、本開示のＴ−ＣｈＡＲＭ単鎖融合タンパク質は、感染細胞上で発現される病原体特異的分子、例えば、アデノウイルス、ブニヤウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、パポバウイルス、パピローマウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス、ＨＰＶ）、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病）、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザ）、ポックスウイルス（例えば、ワクシニア）、レオウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ）、フラビウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＣＶ；Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＢＶ）に由来する分子を特異的に結合する。
【０１０５】
（宿主細胞および核酸）
ある種の局面において、本開示は、本明細書で記載されるＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭのうちのいずれか１以上をコードする核酸分子を提供する。このような核酸分子は、目的の宿主細胞（例えば、造血前駆細胞、Ｔ細胞）の中に導入するために、適切なベクター（例えば、ウイルスベクターもしくは非ウイルスプラスミドベクター）へと挿入され得る。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、用語「組換え」もしくは「非天然の」とは、少なくとも１種の遺伝的変化を含むかまたは外因性核酸分子の導入によって改変された、生物、微生物、細胞、核酸分子、もしくはベクターであって、ここでこのような変化もしくは改変が、遺伝子操作によって導入されるものに言及する。遺伝的変化としては、例えば、タンパク質、融合タンパク質もしくは酵素をコードする発現可能な核酸分子を、または他の核酸分子の付加、欠失、置換もしくは細胞の遺伝物質の他の機能的破壊を導入する改変が挙げられる。さらなる改変は、例えば、上記改変が遺伝子もしくはオペロンの発現を変化させる非コード調節領域を含む。ある種の実施形態において、被験体から得られる細胞（例えば、Ｔ細胞）は、本明細書で記載されるとおりのＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭをコードする核酸を導入し、それによって上記細胞が細胞表面に位置したＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現することによって、非天然のもしくは組換えの細胞（例えば、非天然のもしくは組換えのＴ細胞）へと変換され得る。
【０１０７】
コアウイルスをコードするベクターは、本明細書では「ウイルスベクター」といわれる。ヒト遺伝子治療適用のために同定されたものを含め、本開示の組成物とともに使用するのに適した多数の利用可能なウイルスベクターがある（Ｐｆｅｉｆｅｒ  ａｎｄ  Ｖｅｒｍａ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２：１７７，  ２００１を参照のこと）。適切なウイルスベクターとしては、ＲＮＡウイルスベースのベクター（例えば、レトロウイルス由来ベクター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクター）が挙げられ、より複雑なレトロウイルス由来ベクター、例えば、レンチウイルス由来ベクターが挙げられる。ＨＩＶ−１由来ベクターは、このカテゴリーに属する。他の例としては、ＨＩＶ−２、ＦＩＶ、ウマ伝染性貧血ウイルス、ＳＩＶ、およびマエディービスナウイルス（ヒツジレンチウイルス）に由来するレンチウイルスベクターが挙げられる。レトロウイルスおよびレンチウイルスのウイルスベクター、ならびにキメラ抗原レセプター導入遺伝子を含むウイルス粒子で哺乳動物宿主細胞を形質導入するためのパッケージング細胞を使用するための方法は当該分野で公知であり、例えば、米国特許第８，１１９，７７２号；  Ｗａｌｃｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６：３２７９３０，  ２０１１；  Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７４：４４１５，  ２００５；  Ｅｎｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １４：１１５５，  ２００３；  Ｆｒｅｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １８：１７４８，  ２０１０；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５０６：９７，  ２００９において既に記載されている。レトロウイルスおよびレンチウイルスのベクター構築物および発現系もまた、市販されている。
【０１０８】
ある種の実施形態において、ウイルスベクターは、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭをコードする非内因性核酸配列もしくは標的に特異的なＴ−ＣｈＡＲＭをコードする非内因性核酸配列を導入するために使用される。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターはまた、形質導入のためのマーカーをコードする核酸配列を含み得る。ウイルスベクターのための形質導入マーカーは、当該分野で公知であり、薬物耐性を付与し得る選択マーカー、または検出可能なマーカー（例えば、蛍光マーカーもしくはフローサイトメトリーのような方法によって検出され得る細胞表面タンパク質）を含む。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、緑色蛍光タンパク質、ヒトＣＤ２の細胞外ドメインもしくは短縮型ヒトＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲｔ；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １１８：１２５５，  ２０１１を参照のこと）を含む形質導入のための遺伝子マーカーをさらに含む。ウイルスベクターゲノムが、別個の転写物として宿主細胞で発現される複数の核酸配列を含む場合、上記ウイルスベクターはまた、上記２つ（もしくはより多く）の転写物の間にさらなる配列を含み得、バイシストロン性もしくはマルチシストロン性の発現を可能にする。ウイルスベクターにおいて使用されるこのような配列の例としては、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、フーリン切断部位、ウイルス２Ａペプチド、もしくはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１０９】
他のベクターはまた、ＤＮＡウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベースのベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターが挙げられる）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のベクター（アンプリコンベクター、複製欠損ＨＳＶおよび弱毒化ＨＳＶが挙げられる（Ｋｒｉｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ５：  １５１７，  １９９８））を含め、ポリヌクレオチド送達のために使用され得る。
【０１１０】
遺伝子治療用途のために近年開発された他のベクターはまた、本開示の組成物および方法とともに使用され得る。このようなベクターとしては、バキュロウイルスおおびαウイルスに由来するもの（Ｊｏｌｌｙ，  Ｄ  Ｊ．  １９９９．    Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｖｔｏｒｓ．    ｐｐ  ２０９−４０  ｉｎ  Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ  Ｔ．  ｅｄ．    Ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．    Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ）、もしくはプラスミドベクター（例えば、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾンもしくは他のトランスポゾンベクター）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターもしくはプラスミドベクターは、形質導入のための遺伝子マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質、ｈｕＥＧＦＲｔ）をさらに含む。
【０１１１】
ある種の実施形態において、造血前駆細胞もしくは胚性幹細胞は、本開示のＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭをコードする非内因性核酸分子を含むように改変される。造血前駆細胞は、胸腺細胞前駆細胞もしくは人工多能性幹細胞を含み得、これらは、胎児肝組織、骨髄、臍帯血、もしくは末梢血に由来し得るかもしくはこれらから起こり得る。上記造血前駆細胞は、ヒト、マウス、ラット、もしくは他の哺乳動物に由来し得る。特定の実施形態において、ＣＤ２４ｌｏ  Ｌｉｎ−  ＣＤ１１７＋胸腺細胞前駆細胞が使用される。
【０１１２】
ある種の実施形態において、培養条件は、本開示の融合タンパク質を発現する造血前駆細胞を、増殖もしくは分化を誘発するために十分な時間にわたって培養する工程を要する。上記細胞は、概して約３〜約５日間、もしくは約４〜約１０日間、もしくは約５〜約２０日間にわたって培養物中で維持される。上記細胞が望ましい結果、すなわち、望ましい細胞組成物もしくは増殖レベルを達成するために必要な適切な時間量にわたって維持され得ることは理解される。例えば、主に未成熟かつ不活性なＴ細胞を含む細胞組成物を生成するために、細胞は、約５〜約２０日間にわたって培養物中で維持され得る。細胞は、主に成熟したＴ細胞を含む細胞組成物を生成するために、約２０〜約３０日間にわたって培養物中で維持され得る。非接着性の細胞はまた、種々の時点で（例えば、約数日から約２５日まで）培養物から集められ得る。ある種の実施形態において、造血幹細胞は、間質細胞株上で共培養される（米国特許第７，５７５，９２５号；  Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５：４１０，  ２００４；Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １７：７４９，  ２００２）。
【０１１３】
造血前駆細胞の拘束（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）もしくは分化を促進する１種以上のサイトカインは、上記培養物に添加され得る。上記サイトカインは、ヒトであってもよいし非ヒトであってもよい。使用され得るサイトカインの代表例としては、ＦＧＦファミリーの全てのメンバー（ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−２が挙げられる）；Ｆｌｔ−３−リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびＩＬ−７が挙げられる。サイトカインは、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸）と併用され得る。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、細胞表面に本開示の融合タンパク質を発現し得る細胞は、Ｔ細胞（ヒト、マウス、ラット、もしくは他の哺乳動物に由来する初代細胞もしくは細胞株が挙げられる）である。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、多くの供給源（血液、骨髄、リンパ節、胸腺、または他の組織もしくは流体が挙げられる）から得られ得る。Ｔ細胞は、富化もしくは精製され得る。Ｔ細胞系統は当該分野で周知であり、これらのうちのいくつかは、Ｓａｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２１：２３０，  ２０００に記載されている。ある種の実施形態において、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の内因性発現を欠いているＴ細胞が使用される。このようなＴ細胞は、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の内因性発現を天然に欠いていてもよいし、発現をブロックする（例えば、ＴＣＲα鎖およびβ鎖を発現しないトランスジェニックマウス由来のＴ細胞、またはＴＣＲα鎖およびβ鎖の発現を阻害するように操作された細胞）かもしくはＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、もしくは両方の遺伝子をノックアウトするように改変されていてもよい。ある種の実施形態において、細胞表面に本開示の融合タンパク質を発現し得る細胞は、Ｔ細胞でもＴ細胞系統の細胞でもないが、前駆細胞、幹細胞もしくは細胞表面抗ＣＤ３を発現するように改変された細胞である。
【０１１５】
ある種の実施形態において、本開示のＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現するようにトランスフェクトされた宿主Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞（例えば、ウイルス特異的Ｔ細胞、腫瘍抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーステムＴ細胞、セントラルもしくはエフェクターメモリーＴ細胞、またはＣＤ４＋  ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞）である。
【０１１６】
本開示のＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現するＴ細胞の増殖を促進する１種以上の増殖因子サイトカインは、培養物に添加され得る。上記サイトカインは、ヒトであっても非ヒトであってもよい。Ｔ細胞増殖を促進するために使用され得る例示的増殖因子サイトカインとしては、ＩＬ２、ＩＬ１５などが挙げられる。
【０１１７】
（使用）
本開示で記載されるとおりのＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現する細胞で処置され得る疾患としては、癌、感染性疾患（ウイルス、細菌、原生動物の感染）、免疫疾患（例えば、自己免疫）、または加齢関連疾患（例えば、老化）が挙げられる。養子免疫および遺伝子治療は、種々のタイプの癌（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４：１２６，  ２００６；  Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０：１２４０，  ２００９；  Ｊｕｎｅ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１７：１４６６，  ２００７）および感染性疾患（Ｋｉｔｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４：３８２０８，  ２００９；  Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２５：１４４４，  ２００７；  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．  ６：ｅ１００１０１８，  ２０１０；  Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ８９：９０３，  ２０１１）のための有望な処置である。
【０１１８】
広く種々の癌（固形腫瘍および白血病を含む）は、本明細書で開示される組成物および方法に適している。処置され得る癌の例示的タイプとしては、乳房、前立腺、および結腸の腺癌；肺の気管支原性癌の全形態；骨髄性白血病；黒色腫；肝癌；神経芽腫；乳頭腫；アプドーマ；分離腫；鰓腫；悪性カルチノイド症候群；カルチノイド心臓疾患；および癌腫（例えば、Ｗａｌｋｅｒ癌、基底細胞癌、基底有棘細胞癌、ブラウン・ピアース癌、腺管癌、エールリッヒ腫瘍、Ｋｒｅｂｓ  ２、メルケル細胞癌、粘液性癌腫、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭癌、硬性癌、細気管支癌、気管支原性癌、扁平細胞癌、および移行上皮癌）が挙げられる。処置され得る癌のさらなるタイプとしては、組織球性障害；悪性組織球症；白血病；ホジキン病；免疫増殖性小腸疾患（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ）；非ホジキンリンパ腫；形質細胞腫；細網内皮症；黒色腫；軟骨芽細胞腫；軟骨腫；軟骨肉腫；線維腫；線維肉腫；巨細胞腫；組織球腫；脂肪腫；脂肪肉腫；中皮腫；粘液腫；粘液肉腫；骨腫；骨肉腫；脊索腫；頭蓋咽頭腫；未分化胚細胞腫；過誤腫；間葉腫；中腎腫；筋肉腫；エナメル上皮腫；セメント質腫；歯牙腫；奇形腫；胸腺腫；絨毛性腫瘍が挙げられる。さらに、以下の癌のタイプもまた、処置に適していると企画される：腺腫；胆管腫；真珠腫；円柱腫（ｃｙｃｌｉｎｄｒｏｍａ）；嚢胞腺癌；嚢胞腺腫；顆粒膜細胞腫；半陰陽性卵巣腫瘍；肝癌；汗腺腫；膵島細胞腫瘍；ライディッヒ細胞腫瘍；乳頭腫；セルトリ細胞腫瘍；卵胞膜細胞腫；平滑筋腫；平滑筋肉腫；筋芽細胞腫；筋腫；筋肉腫；横紋筋腫；横紋筋肉腫；上衣腫；神経節細胞腫（ｇａｎｇｌｉｏｎｅｕｒｏｍａ）；神経膠腫；髄芽細胞腫；髄膜腫；神経鞘腫；神経芽腫；神経上皮腫；神経線維腫；神経腫；傍神経節腫；非クロム親和性傍神経節腫。処置され得る癌のタイプとしてはまた、以下が挙げられる：角化血管腫；好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症；硬化性血管腫；血管腫症；グロムス血管腫；血管内皮腫；血管腫；血管外皮細胞腫；血管肉腫；リンパ管腫；リンパ管筋腫；リンパ管肉腫；松果体腫；癌肉腫；軟骨肉腫；葉状嚢肉腫；線維肉腫；血管肉腫；平滑筋肉腫；白血肉腫（ｌｅｕｋｏｓａｒｃｏｍａ）；脂肪肉腫；リンパ管肉腫；筋肉腫；粘液肉腫；卵巣癌；横紋筋肉腫；肉腫；新生物；神経線維腫症；および子宮頚部異形成。
【０１１９】
Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭの治療に適した種々の過剰増殖性障害を例示すると、Ｂ細胞癌（Ｂ細胞リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）もしくは中枢神経系リンパ腫の種々の形態）、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄性白血病のＢ細胞幼若化（Ｂ  ｃｅｌｌ  ｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ））および骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）が挙げられる）がある。さらなるＢ細胞癌としては、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ形質細胞性リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｐｌａｓｍａｃｙｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、脾臓辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）の節外辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、縦隔性（胸腺性）大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ｍｅｄｉａｓｔｉｎａｌ  （ｔｈｙｍｉｃ）  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、血管内大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、悪性の可能性を持つＢ細胞増殖（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｕｎｃｅｒｔａｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、リンパ腫様肉芽腫症、および移植後リンパ増殖性疾患が挙げられる。
【０１２０】
炎症性疾患および自己免疫疾患としては、以下が挙げられる：関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、多発性軟骨炎、乾癬性関節炎、乾癬、皮膚炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、封入体筋炎、炎症性筋炎（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｙｏｓｉｔｉｓ）、中毒性表皮壊死症、全身性強皮症および全身性硬化症、クレスト症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、脳炎、ぶどう膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギー状態、湿疹、喘息、Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症応答が関わる状態、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、亜急性皮膚エリテマトーデス、円板状ループス、ループス脊髄炎、ループス脳炎、若年発症糖尿病、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、視神経脊髄炎、リウマチ熱、シデナム舞踏病、サイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される急性および遅延型過敏症と関連する免疫応答、結核、サルコイドーシス、ヴェーゲナー肉芽腫症およびチャーグストラウス病（Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）を含む肉芽腫症、顆粒球減少症、血管炎（過敏性血管炎／脈管炎、ＡＮＣＡおよびリウマチ性血管炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）を含む）、再生不良性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、自己免疫溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫溶血性貧血、悪性貧血、赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球遊出が関わる疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症障害、多臓器障害症候群（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｒｇａｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、重症筋無力症、抗原−抗体複合体媒介性疾患（ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）、抗糸球体基底膜抗体病（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群（Ｃａｓｔｌｅｍａｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、グッドパスチャー症候群、ランバート・イートン筋無力症症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、固形臓器移植拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、自己免疫性多内分泌腺症（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｐｏｌｙｅｎｄｏｃｒｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）、血清反応陰性脊椎関節症（ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｏｐａｔｈｉｅｓ）、ライター病、スティフ・マン症候群、巨細胞性動脈炎、免疫複合体腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性ニューロパチーもしくはＩｇＭ媒介性ニューロパチー、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性精巣炎および卵巣炎を含む精巣および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症；自己免疫性内分泌疾患（自己免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎（橋本病）、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病、グレーブス病、多腺性自己免疫症候群（もしくは多腺性内分泌腺障害症候群（ｐｏｌｙｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｐａｔｈｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ））、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）ともいわれるＩ型糖尿病およびシーハン症候群を含む）；自己免疫性肝炎、リンパ性間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植性）、非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）、ギラン・バレー症候群、大型血管炎（ｌａｒｇｅ  ｖｅｓｓｅｌ  ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）（リウマチ性多発筋痛および巨細胞性動脈炎（高安動脈炎）を含む）、中型血管炎（ｍｅｄｉｕｍ  ｖｅｓｓｅｌ  ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）（川崎病および結節性多発動脈炎を含む）、結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）強直性脊椎炎、バージャー病（ＩｇＡ腎症）、急速進行性糸球体腎炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアックスプルー（グルテン性腸症）、クリオグロブリン血症、肝炎と関連するクリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、冠動脈疾患、家族性地中海熱、顕微鏡的多発血管炎、コーガン症候群、ウィスコット・オルドリッチ症候群および閉塞性血栓血管炎。
【０１２１】
特定の実施形態において、本明細書で開示されるとおりのＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭで被験体を処置するための方法は、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、および慢性骨髄性白血病を含む。
【０１２２】
感染性疾患としては、感染性因子と関連するものが挙げられ、種々の細菌（例えば、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．など）、マイコバクテリア、および寄生生物（原生動物のうちの任意の公知の寄生生物メンバーが挙げられる）のうちのいずれかを含む。感染性ウイルスとしては、真核生物のウイルス（例えば、アデノウイルス、ブンヤウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、パピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ）、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病）、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザ）、ポックスウイルス（例えば、ワクシニア）、レオウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）、フラビウイルス（例えば、ＨＣＶ、ＨＢＶ）など）が挙げられる。ある種の実施形態において、抗原がプロセシングされかつＭＨＣクラスＩ分子とともに呈示されるサイトゾルの病原体による感染は、本開示のＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭで処置される。
【０１２３】
本開示のＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭは、細胞結合形態で被験体に投与され得る（例えば、標的細胞集団（成熟Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋  Ｔ細胞）またはＴ細胞系統の他の細胞））の遺伝子治療）。特定の実施形態において、被験体に投与されてＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現するＴ細胞系統の細胞は、同一遺伝子の、同種異系の、もしくは自己由来の細胞である。他の実施形態において、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭは、可溶性形態で被験体に投与され得る。可溶性ＴＣＲは、当該分野で公知である（例えば、Ｍｏｌｌｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５：４３８，  ２００５；米国特許第６，７５９，２４３号を参照のこと）。
【０１２４】
本開示のＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを含む薬学的組成物は、医療分野の当業者によって決定されるように処置（もしくは防止）される疾患もしくは状態に適切な様式で投与され得る。上記組成物の適切な用量、適切な継続時間、および投与頻度は、患者の状態、サイズ、疾患のタイプおよび重篤度、活性成分の特定の形態、ならびに投与方法のような要因によって決定される。本開示は、本明細書で開示されるとおりのＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現する細胞および薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤もしくは賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。適切な賦形剤としては、水、食塩水、デキストロース、グリセロールなどおよびこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１２５】
本開示の利点は、患者に投与されるＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現する細胞が、タグカセットに対する上記同系結合パートナーを使用して枯渇され得ることである。ある種の実施形態において、本開示は、上記タグカセットに対して特異的な抗体を使用するか、上記タグカセットに対して特異的な同系結合パートナーを使用するか、またはＣＡＲを発現しかつ上記タグカセットに対して特異性を有する第２のＴ細胞を使用することによって、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現するＴ細胞を枯渇させるための方法を提供する。ある種の実施形態において、タグカセットは、本開示のＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現するＴ細胞の免疫枯渇（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を可能にする。操作されたＴ細胞の除去は、タグカセットに特異的な枯渇剤を使用して達成され得る。例えば、Ｓｔｒｅｐタグが使用される場合、細胞傷害性試薬（例えば、毒素、放射性金属）に各々融合されるかもしくは結合体化された抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体、抗ＳｔｒｅｐタグｓｃＦｖ、もしくはＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎが使用されてもよいし、抗Ｓｔｒｅｐタグ／抗ＣＤ３二重特異的ｓｃＦｖ、もしくは抗ＳｔｒｅｐタグＣＡＲ  Ｔ細胞が使用されてもよい。
【０１２６】
ある種の他の実施形態において、本開示のＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現する細胞は、ビーズ、細胞培養プレート、アガロース、もしくは任意の他の固体表面マトリクスに結合体化されている、タグカセットに対して特異性を有する抗体（例えば、抗タグ抗体）への結合によって、またはタグカセットを特異的に結合する他のタンパク質（例えば、上記Ｓｔｒｅｐタグに結合するＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ）によって、同定、ソート、富化もしくは単離され得る。ある種の実施形態において、このような細胞は、アフィニティーカラムを使用することによってソート、富化もしくは単離される。
【０１２７】
ある種の実施形態において、本開示は、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現する非天然のもしくは組換えＴ細胞と、タグカセットに対して特異的でありかつ固体表面にもしくは生体適合性マトリクス（例えば、アルギネート、基底膜マトリクス（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））、バイオポリマー）の一部として結合された結合ドメインとを接触させることによって、Ｔ細胞を選択的に活性化させるための方法を提供する。上記組換えＴ細胞は、本開示のＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭ融合タンパク質をコードする外因性核酸分子を含む。例えば、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現するＴ細胞は、上記タグカセットに特異的な同系結合パートナー（例えば、抗体）で被覆されるかもしくは結合体化されたビーズで活性化され得る。例えば、上記タグカセットがＳｔｒｅｐタグである場合、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ被覆ビーズもしくは抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体結合体化ビーズが、Ｔ細胞活性化を誘発するために使用され得る。ある種の実施形態において、上記方法は、本開示のＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現し、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を必要に応じてさらに発現する組換えＴ細胞をエキソビボで活性化する工程を包含する。このような活性化されたＴ細胞は、本明細書で記載される疾患処置法において有用である。
【０１２８】
別の局面において、本開示は、本開示のＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現する組換えＴ細胞の増殖を選択的に促進するための方法を提供する。ある種の実施形態において、上記方法は、タグ結合パートナー（例えば、抗体）を使用して、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現するＴ細胞の選択的エキソビボ増殖を包含する。さらなる実施形態において、上記方法は、機能的Ｔ細胞（例えば、ウイルス特異的、ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）特異的ＣＴＬ、もしくは特異的Ｔ細胞部分セット（例えば、ナイーブＴ細胞、メモリーステムＴ細胞、セントラルもしくはエフェクターメモリーＴ細胞、ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞））を、タグ結合パートナー（例えば、抗体）で増殖させる工程を包含し、この工程は、必要に応じて、共刺激分子結合パートナー（例えば、抗ＣＤ２７もしくは抗ＣＤ２８抗体）の存在下で行われ得る。ある種の実施形態において、抗タグ結合パートナーは、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭ（例えば、ＷｎｔもしくはＮｏｔｃｈ  Ｋｅｙ−ＣｈＥＭ）形質導入された造血幹細胞、胚性幹細胞、もしくは組織幹細胞（例えば、神経幹細胞）を活性化して、自己再生させるか、増殖させるかもしくは治療用途に望ましい１以上の表現型へと分化させるために使用され得る。
【０１２９】
なおさらなる実施形態において、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭは、本開示のＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現する場合に、インビボでのＴ細胞増殖の選択的促進を可能にする。ある種の実施形態において、タグカセットを含むＣＡＲを発現するＴ細胞は、リガンド（例えば、Ｔ細胞サプレッサー細胞リガンドであるＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２が挙げられる）を発現する細胞を接触させる場合に、インビボで上記ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を可能にする。このような増殖させたＴ細胞は、本明細書で記載される疾患処置法において有用である。ある種の実施形態において、本明細書で開示されるとおりのＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現する細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）または増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）は、インビボで誘発され、これは、タグカセット結合パートナー（例えば、抗タグ抗体）および必要に応じて共刺激分子結合パートナー（例えば、抗ＣＤ２７もしくは抗ＣＤ２８抗体）で誘発され得る。
【０１３０】
ある種のさらなる実施形態において、本明細書で開示されるとおりのＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現する細胞は、インビボで（例えば、腫瘍の部位で）活性化される。例えば、タグカセット結合パートナー（例えば、抗タグ抗体）および共刺激分子結合パートナー（例えば、抗ＣＤ２７もしくは抗ＣＤ２８抗体）を含む組成物（例えば、アルギネート、基底膜マトリクス（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））、バイオポリマー、もしくは他のマトリクス）またはキャリア（例えば、マイクロビーズ、ナノ粒子、もしくは他の固体表面）は、腫瘍（例えば、固形腫瘍）の部位で、本明細書で開示されるとおりのＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現するＴ細胞を局所的に活性化するために使用され得る。
【０１３１】
ある種の実施形態において、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現する組換え細胞は、タグカセットへ特異性をもって結合する抗体（例えば、抗タグ抗体）を使用することによって、または上記タグカセット配列を特異的に結合する他の同系結合タンパク質（例えば、Ｓｔｒｅｐタグに結合するＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ）によって、インビボで検出もしくは追跡され得、そして上記タグカセットの結合パートナーは、Ｘ線、ＣＴスキャン、ＭＲＩスキャン、ＰＥＴスキャン、超音波、フローサイトメトリー、近赤外線画像化システム、もしくは他の画像化モダリティーによる検出のために、当該分野で公知の蛍光色素、放射性トレーサー、酸化鉄ナノ粒子もしくは他の画像化剤に結合体化される（例えば、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ  ２：３，  ２０１２を参照のこと）。
【０１３２】
さらなる実施形態において、本開示のＫｅｙ−ＣｈＥＭもしくはＴ−ＣｈＡＲＭを発現する細胞は、診断法もしくは画像化法（本明細書で同定される適応症もしくは状態に関連して使用される方法を含む）において使用され得る。
【実施例】
【０１３３】
実施例１：Ｋｅｙ−キメラエフェクター分子（Ｋｅｙ−ＣｈＥＭ）およびタグ化キメラ抗原レセプター分子（Ｔ−ＣｈＡＲＭ）、ならびにこれらの誘導体
１個以上のアフィニティータグカセットを含む例示的キメラ融合タンパク質は、図１に図示される。上記タグカセットは、概して小さく（すなわち、最小限に免疫原性もしくは非免疫原性）、宿主もしくは宿主細胞に対して内因性のいかなる分子とも会合も結合もしない。上記タグは、異種の同系レセプター（例えば、リガンド、抗体、もしくは他の結合パートナー）に特異的に結合し、その結合は、種々の細胞経路のうちのいずれかにアクセスしかつこれを操作する（すなわち、スイッチを入れるかもしくは切るかまたは調節する）ための「鍵」（本明細書ではＫｅｙ−ＣｈＥＭともいわれる）として、これらキメラエフェクター分子（ＣｈＥＭ）の状況において使用され得る。これらタグ化キメラ融合タンパク質は、特定の標的（例えば、腫瘍抗原）に特異的な結合ドメインをさらに含み得る。例えば、上記タグ化キメラ融合タンパク質は、キメラ抗原レセプター分子（本明細書ではＴ−ＣｈＡＲＭともいわれる）を含む。
【０１３４】
Ｋｅｙ−ＣｈＥＭ（図１Ａ）をコードする例示的核酸分子は、以下のエレメントを（５’→３’に）含む：Ｓｔｒｅｐタグ（登録商標）ＩＩ（配列番号１に示されるとおりのペプチドＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓをコードする配列番号３８）、リンカーモジュール（配列番号１１に示されるとおりのペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２をコードする配列番号４２）および改変されたＩｇＧ４ヒンジ（配列番号１５に示されるとおりのペプチドＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏをコードする配列番号２７）を含むコネクター部分、ＣＤ２８膜貫通ドメイン（配列番号１６に示されるとおりのペプチドをコードする配列番号２７）、ならびに４−１ＢＢ部分（配列番号１７に示されるとおりのペプチドをコードする配列番号２９）およびＣＤ３ζ部分（配列番号１８に示されるとおりのペプチドをコードする配列番号３０；  Ｋｏｗｏｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：１０９９５，  ２００６）を含むエフェクタードメインを含む細胞内成分。このＫｅｙ−ＣｈＥＭ（単一タグ）コード核酸分子を、Ｙａｍ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ５：４７９，  ２００２）およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｂｌｏｏｄ  １１８：１２５５，  ２０１１）によって記載されるとおりに、ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターへとクローニングした。
【０１３５】
上記ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターを、ｐＨＩＶ７のサイトメガロウイルスプロモーターをＥＦ−１プロモーターで置換することによって、ｐＨＩＶ７ベクターから得た（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；  Ｙａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。上記レンチウイルスベクターはまた、細胞外Ｎ末端リガンド結合ドメインおよび細胞内レセプターチロシンキナーゼ活性を欠いているが、天然のアミノ酸配列、Ｉ型膜貫通細胞表面局在化、および抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体セツキシマブ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）に対するコンホメーションとして無傷な結合エピトープを保持する、短縮型ヒトＥＧＦＲポリペプチド（ｈｕＥＧＦＲｔ）をコードする。上記レンチウイルスベクターは、自己切断Ｔ２Ａ配列（Ｓｚｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２２：５８９，  ２００４）によって分離されているＫｅｙ−ＣｈＥＭおよびｈｕＥＧＦＲｔ（ここで上記ｈｕＥＧＦＲｔは、抗ビオチン免疫磁性マイクロビーズとともにビオチン化セツキシマブを使用することによって、Ｋｅｙ−ＣｈＥＭ陽性細胞に対する代替の選択エピトープとして働く）を協調して発現する。
【０１３６】
Ｔ−ＣｈＡＲＭ（図１Ｅ）をコードする例示的核酸分子は、以下のエレメントを含む：ＣＤ１９特異的ＦＭＣ６３モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ遺伝子セグメントを含むｓｃＦｖ（配列番号３６；  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）、Ｓｔｒｅｐタグ（登録商標）ＩＩ（配列番号３８、配列番号１に示されるとおりのペプチドＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓをコードする）、リンカーモジュール（配列番号１１に示されるとおりのペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２をコードする配列番号３９、４０もしくは４１）およびＩｇＧ４ヒンジ（配列番号２７）を含むコネクター部分、ＣＤ２８膜貫通ドメイン（配列番号２８）、ならびに４−１ＢＢ部分（配列番号２９）およびＣＤ３ζ部分（配列番号３０）を含むエフェクタードメインを含む細胞内成分。２個のタグを含む例示的Ｔ−ＣｈＡＲＭ（Ｔ−ＣｈＡＲＭ２）は、第１と第２のＳｔｒｅｐタグとの間に第２のリンカーモジュール（配列番号１２に示されるとおりのペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒをコードする）を含むことによって、上記単一タグＴ−ＣｈＡＲＭ（Ｔ−ＣｈＡＲＭ１）とは異なる。３個のタグを含む例示的Ｔ−ＣｈＡＲＭ（Ｔ−ＣｈＡＲＭ３）は、第２と第３のＳｔｒｅｐタグとの間に第３のリンカーモジュール（配列番号１１に示されるとおりのペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２をコードする）を含むことによって、上記二重タグＴ−ＣｈＡＲＭとは異なる。ある種の実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号５７に示されるとおりのＲＯＲ１特異的Ｒ１２モノクローナル抗体（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ２１０１８，  ２０１１）のＶＨおよびＶＬ領域、ならびに配列番号１３に示されるとおりの可変ドメインリンカーを含む。さらに、抗ＣＤ１９および抗ＲＯＲ１  Ｔ−ＣｈＡＲＭは両方とも、４−１ＢＢ部分の代わりにＣＤ２８部分（配列番号３５）を含むエフェクタードメインを含む細胞内成分で代替的に構築した。
【０１３７】
ある種の実施形態において、本明細書で記載される融合タンパク質のうちのいずれも、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下を含む：細胞外ｓｃＦｖもしくはｓｃＴＣＲ  結合ドメイン、タグカセット、ＩｇＧヒンジを含むコネクター領域、膜貫通ドメイン、ならびにエフェクタードメインを含む細胞内成分。いくつかの実施形態において、エフェクタードメインは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ、ＣＤ２７およびＣＤ３ζ、ＣＤ２８およびＣＤ３ζ、ＯＸ４０およびＣＤ３ζ、ＣＤ２８、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ、ＯＸ４０、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ、またはＣＤ２８、ＯＸ４０およびＣＤ３ζという対合を含む。本明細書で定義される場合、これら分子のうちのいずれかに関するエフェクタードメインは、細胞内部分全体を含んでいてもよいし、選択された分子のエフェクター部分のみを含んでいてもよい。
【０１３８】
Ｎ末端タグを有するＴ−ＣｈＡＲＭ（Ｎ１ＣｈＡＲＭ；図１Ｆ；配列番号５８）をコードする例示的核酸分子は、以下のエレメントを含む：分泌シグナル配列（配列番号４７に示されるとおりのペプチドＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（これは、成熟タンパク質から切断される）をコードする配列番号６３）、アスパラギン接合部アミノ酸、Ｓｔｒｅｐタグ（登録商標）ＩＩ（配列番号１に示されるとおりのペプチドＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓをコードする配列番号３８）、リンカーモジュール（配列番号１１に示されるとおりのペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２をコードする配列番号４２）、ＣＤ１９特異的ＦＭＣ６３モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ遺伝子セグメントのｓｃＦｖ（配列番号３６；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）、ＩｇＧ４ヒンジ（配列番号２７）、ＣＤ２８膜貫通ドメイン（配列番号２８）、ならびに４−１ＢＢ部分（配列番号２９）およびＣＤ３ζ部分（配列番号３０）を含むエフェクタードメインを含む細胞内成分。
【０１３９】
可変領域リンカーに埋め込まれたタグを有するＴ−ＣｈＡＲＭ（Ｃｈ１ＡＲＭ；図１Ｇ；配列番号５９）をコードする例示的核酸分子は、以下のエレメントを含む：分泌シグナル配列（配列番号４７に示されるとおりのペプチドＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（これは、成熟タンパク質から切断される）をコードする配列番号６３）、ＣＤ１９特異的ＦＭＣ６３モノクローナル抗体のＶＨ遺伝子セグメント（配列番号５１に示されるとおりのアミノ酸配列をコードする）、第１のリンカーモジュール（配列番号６５に示される通りのペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙをコードする）、アスパラギン接合部アミノ酸、Ｓｔｒｅｐタグ（登録商標）ＩＩ（配列番号１に示されるとおりのペプチドＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓをコードする配列番号３８）、第２のリンカーモジュール（配列番号６６に示されるとおりのペプチドＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙをコードする）、ＣＤ１９特異的ＦＭＣ６３モノクローナル抗体のＶＬ遺伝子セグメント（配列番号５２に示されるとおりのアミノ酸配列をコードする）、ＩｇＧ４ヒンジ（配列番号２７）、ＣＤ２８膜貫通ドメイン（配列番号２８）、ならびに４−１ＢＢ部分（配列番号２９）およびＣＤ３ζ部分（配列番号３０）を含むエフェクタードメインを含む細胞内成分。
【０１４０】
これら例示的Ｔ−ＣｈＡＲＭ（例えば、単一、二重もしくは三重タグ化した、Ｎ末端タグ化した、埋め込まれたタグ、示されたｓｃＦｖ）の各々をコードする核酸分子を、Ｙａｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ５：４７９，  ２００２）によって記載されるようにｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターへと個々にクローニングし、本明細書中の実施例に記載されるようにＴ細胞を形質導入するために使用した。ある種の実施形態において、本開示のＫｅｙ−ＣｈＡＲＭをコードする核酸分子を、上記ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターへとクローニングする前にコドン最適化した。上記Ｔ−ＣｈＡＲＭコードレンチウイルス上清を、Ｃａｌｐｈｏｓトランスフェクション試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）を使用して、上記レンチウイルスベクタープラスミドの各々ならびにパッケージングベクターｐＣＨＧＰ−２、ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２およびｐＣＭＶ−Ｇで共トランスフェクトした２９３Ｔ細胞において生成した。培地をトランスフェクションの１６時間後に交換し、レンチウイルスを２４時間、４８時間および７２時間後に集めた。
【０１４１】
実施例２：組換えＴ細胞の生成およびＴ−ＣｈＡＲＭの発現
ＣＤ８＋およびＣＤ４＋を、ＣＤ８＋／ＣＤ４＋  Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して正常なドナーのＰＢＭＣから単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で製造業者の説明に従って活性化し、０．８μｇ／ｍＬ  ポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）を補充したレンチウイルス上清（各実施例に記載されるとおり）（ＭＯＩ＝３）で、２，１００ｒｐｍにおいて４５分間、３２℃での遠心分離による活性化後３日目に、形質導入した。Ｔ細胞を、組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ−２を終濃度５０Ｕ／ｍＬまで４８時間毎に補充した、ＲＰＭＩ、１０％  ヒト血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％  ペニシリン−ストレプトマイシン（ＣＴＬ培地）中で増殖させた。増殖後、各形質導入したＴ細胞系統のアリコートを、ビオチン結合体化抗ＥＧＦＲ抗体およびストレプトアビジン−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ）で染色した。上記ｔＥＧＦＲ＋  Ｔ細胞を、ＦＡＣＳ−Ａｒｉａ細胞ソーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でソートすることによって単離した。上記ｔＥＧＦＲ＋  Ｔ細胞部分セットを、その後、Ｔ細胞：ＬＣＬ比  １：７の照射した（８，０００ラド）  ＣＤ１９＋  Ｂ−ＬＣＬで刺激し、４８時間毎に５０  Ｕ／ｍＬ  ｒｈ  ＩＬ−２を追加しながら８日間にわたってＣＴＬ培地中で、またはＲ１２  Ｔ−ＣｈＡＲＭのための迅速増殖プロトコル（Ｒｉｄｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２８：１８９，  １９９０）を使用して増殖させた。
【０１４２】
以下の結合体化抗体を、フローサイトメトリーによる表現型決定および分析のために使用した：ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１３７、ＣＤ４５、アネキシンＶ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ２８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、ＥＧＦＲ抗体（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，  Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，  ＮＪ）；ｓｔｒｅｐＴａｖｉｄｉｎ−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での染色を、生細胞／死細胞弁別のために製造業者によって指示されるとおりに行った。フロー分析を、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで、ソート−精製をＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ）で行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，  Ａｓｈｌａｎｄ，  ＯＲ）を使用してデータを分析した。
【０１４３】
Ｔ−ＣｈＡＲＭの細胞表面発現を調べるために、形質導入したＴ細胞を、ＥＧＦＲｔ発現に関してソートし、蛍光色素標識抗ＳｔｒｅｐタグｍＡｂでの染色によって評価した。ＥＧＦＲ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、Ｔ−ＣｈＡＲＭおよびＣＤ１９−短  ＣＡＲの各々で形質導入したＴ細胞に関して類似であり、このことは、タグをＣＡＲへと導入して、ＣｈＡＲＭを生成することが、導入遺伝子発現に干渉しなかったことを示す（図２１）。抗ＳｔｒｅｐタグｍＡｂは、各ＣｈＡＲＭにおけるタグ配列の位置もしくは数とは無関係に、上記種々のＴ−ＣｈＡＲＭで形質導入したＴ細胞を特異的に染色した。抗Ｓｔｒｅｐタグ染色のＭＦＩは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ１と比較して、抗体−蛍光色素結合体を結合するための各Ｔ−ＣｈＡＲＭ２およびＴ−ＣｈＡＲＭ３上のより多くの部位におそらく起因して、Ｔ−ＣｈＡＲＭ２およびＴ−ＣｈＡＲＭ３で形質導入したＴ細胞に関してより高かった（図２１）。
【０１４４】
実施例３：Ｔ−ＣｈＡＲＭを発現するＴ細胞の細胞溶解活性
抗ＣＤ１９（ｓｃＦｖ）  Ｔ−ＣｈＡＲＭ１、Ｔ−ＣｈＡＲＭ２、もしくはＴ−ＣｈＡＲＭ３を発現するように操作されたＣＤ８＋  バルクＴ細胞のインビトロエフェクター機能を、クロム放出アッセイにおいて、それぞれ、種々の長さ、すなわち、ＩｇＧ４ヒンジのみ（短）、ＩｇＧ４  ＣＨ３およびヒンジ（中間）、およびＩｇＧ４  ＣＨ２ＣＨ３とヒンジ（長）のコネクター領域を含む抗ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞のエフェクター機能と比較した。簡潔には、標的細胞を５１Ｃｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ）で一晩標識し、洗浄し、１〜２×１０３  細胞／ウェルにおいてエフェクターＴ細胞とともに、種々のエフェクター  対  標的（Ｅ：Ｔ）比で、三連でインキュベートした。上清を、４時間インキュベートした後、γカウントのために採取し、標準式を使用して特異的溶解（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｙｓｉｓ）を計算した。上記使用した標的細胞は、Ｒａｊｉ／ＲＯＲ１（天然にはＣＤ１９＋、関係ない抗原ＲＯＲ１を発現するように形質導入した）およびＫ５６２／ＣＤ１９（ＣＤ１９を発現するように形質導入した）であり、Ｋ５６２／ＲＯＲ１（天然にはＣＤ１９−、関係ない抗原ＲＯＲ１を発現するように形質導入した）を陰性コントロールとして使用し、ＬＣＬ−ＯＫＴ３細胞（細胞表面抗ＣＤ３を発現するように形質導入した）を陽性コントロールとして使用した。膜結合した抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを発現するように操作したリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）細胞（ＬＣＬ−ＯＫＴ３）を、Ｔ細胞系統の最大活性化能力の参照標準として使用した。なぜならこれらＯＫＴ３発現細胞は、ＣＤ３複合体を結合することによってＴ細胞を活性化するからである。
【０１４５】
上記種々の抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭおよびＣＡＲ構築物の各々を発現するＴ細胞は、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞に対して細胞傷害性ではなかった（図２Ｃ）が、抗ＣＤ３発現ＬＣＬ／ＯＫＴ３細胞の存在下では細胞溶解性であるように活性化された（図２Ｄ）。さらに、上記Ｔ−ＣｈＡＲＭもしくはＣＡＲ発現Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋細胞、Ｒａｊｉ細胞（図２Ｂ）およびＫ５６２／ＣＤ１９（図２Ａ）に対して特異的細胞溶解活性を付与した。類似の結果は、上記タグがＴ−ＣｈＡＲＭのアミノ末端に位置する場合（Ｎ１ＣｈＡＲＭ）に、もしくはｓｃＦｖの中に埋め込まれている場合（ＶＨ−ｔａｇ−ＶＬ；  Ｃｈ１ＡＲＭ）に得られた（図２２を参照のこと）。さらに、溶解の効率は、エフェクタードメインによっても（４−１ＢＢの代わりにＣＤ２８；図２３Ａを参照のこと）、結合ドメインによっても（抗ＣＤ１９の代わりに抗ＲＯＲ１；図２３Ｂを参照のこと）、使用されたタグによっても（図３２は、Ｍｙｃタグ化ＣｈＡＲＭの細胞溶解効果を示す）影響されなかった。上記Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現細胞は、上記短い、中間および長いＩｇＧ４  Ｆｃスペーサーを含むＣＡＲと同程度に効率的に、腫瘍細胞を死滅させた。
【０１４６】
実施例４：Ｋ５６２細胞と共培養したＴ−ＣｈＡＲＭを発現するＴ細胞によるサイトカイン放出
サイトカイン分泌の分析のために、エフェクター（Ｅ）細胞（抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭおよびＣＡＲを発現するＴ細胞）および標的（Ｔ）細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９およびＫ５６２／ＲＯＲ１、陰性コントロール）を、Ｅ：Ｔ比４：１において三連で共培養し、２４時間インキュベートし、次いで、その上清を、多重サイトカインイムノアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標））を使用して、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−αレベルについて測定した。
【０１４７】
その結果（図３Ｄ）は、短いコネクター領域を有する抗ＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞が、中間もしくは長コネクター領域を有する抗ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するＴ細胞より、標的細胞の結合後により多量のサイトカインを生成することを示す。類似のパターンは、抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現細胞で観察され、ここで（図３Ａ）より短いリンカーおよび単一のタグを有するＴ−ＣｈＡＲＭ１細胞は、Ｔ−ＣｈＡＲＭ２もしくはＴ−ＣｈＡＲＭ３細胞（それぞれ、２個のタグおよび３個のタグを有する）より、標的細胞の結合後により多量のサイトカインを生成する。生成されたサイトカインのレベルは、抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭおよび抗ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞に関して類似であったが、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現細胞は、ＣＡＲ発現細胞より有意に高いレベルのＩＦＮ−γ生成を誘発した。図３Ｂおよび図３Ｅは、サイトカイン産生が、ＣＤ１９を発現しないＫ５６２細胞では誘発されなかったことを示す。図３Ｃおよび図３Ｆは、陽性コントロールの結果（これは、ＰＭＡ／イオノマイシンでの刺激である）を示す。類似の結果を、Ｎ１ＣｈＡＲＭおよびＣｈ１ＡＲＭ構築物を調べた場合に観察した（図２４を参照のこと）。さらに、抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭで形質導入したＴ細胞のサイトカイン産生および増殖の階層は、ＣｈＡＲＭで使用される共刺激ドメイン（４−１ＢＢもしくはＣＤ２８）とは無関係であった（図２５）。
【０１４８】
実施例５：Ｒａｊｉ  Ｂ細胞リンパ腫細胞と共培養されたＴ−ＣｈＡＲＭ分子を発現するＴ細胞によるサイトカイン放出
種々の抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭもしくはＣＡＲを発現するＴ細胞を、ＣＤ１９＋  Ｒａｊｉ細胞とともに２４時間共培養し、その上清を、多重サイトカインアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標））で試験した。サイトカイン分泌の分析のために、エフェクター（Ｅ）細胞（抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭおよびＣＡＲを発現するＴ細胞）および標的（Ｔ）細胞（Ｒａｊｉ）を、Ｅ：Ｔ比  ２：１において三連で共培養し、２４時間インキュベートし、次いで、その上清を、多重サイトカインイムノアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標））を使用して、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−αレベルについて測定した。
【０１４９】
その結果は、１個、２個もしくは３個のタグカセットを有する抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭを発現するＴ細胞が、従来の抗ＣＤ１９  ＣＡＲのうちのいずれかを発現するＴ細胞（図４Ｂ）と比較した場合、Ｒａｊｉ細胞と共培養した場合に、遙かにより高いレベルのＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦを生成できたことを示す（図４Ａ）。
【０１５０】
実施例６：Ｔ−ＣｈＡＲＭ分子を発現するＴ細胞の増殖
細胞増殖の分析のために、抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭもしくはＣＡＲを発現するＴ細胞を、０．２μＭ  カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。これは細胞内タンパク質に結合し、上記細胞をＦＩＴＣチャネルにおいてフローサイトメトリーによって可視化する。標識後、上記細胞を洗浄し、外因性サイトカインなしのＣＴＬ培地の中で刺激細胞とともに比  ４：１（Ｋ５６２／ＣＤ１９もしくはＫ５６２／ＲＯＲ１、陰性コントロール）で三連でプレートした。７２時間インキュベートした後、細胞をＰＩで標識して、上記分析から死細胞を排除した。サンプルをフローサイトメトリーによって分析し、生きているＣＤ３＋  Ｔ細胞の細胞分裂を、ＣＦＳＥ希釈の程度によって評価した（すなわち、色素希釈は、増殖のインジケーターである。なぜなら標識の強度は、各々の細胞分裂で半分に希釈されるからである）。
【０１５１】
分析のために、三連の細胞をプールし、生きているＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を測定した。最も左の列は、細胞の総数の前方散乱／側方散乱プロットであり、中央の列は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞でゲート制御したプロットであり、最も右の列は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞部分セットにおけるＣＦＳＥ希釈を示すヒストグラムである（希釈が左へと増大する）。最も右の列における赤色のピークは、細胞分裂なしを示し、青色のピークは、≧３、２、もしくは１細胞分裂を表し、上記ヒストグラムの各々における３つの数字は、ＣＦＳＥを希釈し、それぞれ、３より大きい、２、もしくは１細胞分裂をおこした細胞のパーセントを示す。このヒストグラムは、Ｔ−ＣｈＡＲＭおよびＣＡＲ発現Ｔ細胞が、Ｋ５６２／ＣＤ１９細胞での共培養刺激後に７２時間の間に激しく増殖した（青色）が、陰性コントロール細胞Ｋ５６２／ＲＯＲ１では増殖しなかった（赤色）ことを示す（図５）。細胞分裂の平均数は、Ｔ−ＣｈＡＲＭ３発現Ｔ細胞もしくはＣＡＲ（長）発現Ｔ細胞のいずれかと比較した場合に、Ｔ−ＣｈＡＲＭ１発現Ｔ細胞およびＴ−ＣｈＡＲＭ２発現Ｔ細胞においてより高かった。同様に、増殖のレベルは、ＣｈＡＲＭにおいて使用される共刺激ドメイン（４−１ＢＢもしくはＣＤ２８）とは無関係であり（図２６）、使用されるタグとは無関係である（図３１は、Ｍｙｃタグが使用される場合の等しい増殖を示す）。
【０１５２】
実施例７：Ｔ−ＣｈＡＲＭ分子を発現するＴ細胞のインビボ養子移入
６〜８週齢の雌性ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）もしくはＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得たか、または施設内で繁殖させた。マウスに、ホタルルシフェラーゼ（Ｒａｊｉ−ｆｆｌｕｃ）でトランスフェクトした０．５×１０６  Ｒａｊｉリンパ腫腫瘍細胞を尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、腫瘍の生着を６日間行った。７日目に、マウスに、抗ＣＤ１９（ｓｃＦｖ）Ｔ−ＣｈＡＲＭ１、Ｔ−ＣｈＡＲＭ２、Ｔ−ＣｈＡＲＭ３、ＣＡＲ（短）、ＣＡＲ（中間）、およびＣＡＲ（長）ヒトＴ細胞のうちの１つでトランスフェクトした５×１０６のＴ細胞の単回静脈内（ｉ．ｖ．）注射を与えた。腫瘍の生着を確認するために、Ｒａｊｉ−ｆｆｌｕｃ接種後６日目に生体発光画像化を行った（図６Ａ）。養子Ｔ細胞治療の抗腫瘍活性をモニターするために、生体発光画像化を、Ｔ細胞投与後の７日目（図６Ｂ）、１１日目（図６Ｃ）、１８日目（図６Ｄ）、および２６日目（図６Ｅ）に行った。
【０１５３】
腫瘍細胞の生体発光画像化のために、マウスに、ＰＢＳ中に再懸濁（１５μｇ／ｇ  体重）したルシフェリン基質（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，  ＭＡ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を与えた。マウスに、誘導チャンバの中でイソフルランにより麻酔し、１秒〜１分間の獲得時間において小ビニングモードでルシフェリンの注射の１０分後、１２分後および１４分後に、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して画像化して、不飽和画像（ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｉｍａｇｅ）を得た。ルシフェラーゼ活性を、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析し、光子フラックスを、各個々のマウスの身体全体を覆った目的の領域内で分析した。
【０１５４】
生体発光画像は、抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ１、Ｔ−ＣｈＡＲＭ２、もしくはＴ−ＣｈＡＲＭ３を発現するＴ細胞が抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（短）もしくはＣＡＲ（中間）を発現するＴ細胞と同程度に効率的に腫瘍を根絶させた一方で、ＣＡＲ（長）を発現するＴ細胞は、この特定の構築物および／もしくは標的に対してそれほど有効ではなかったことを示す（図６）。
【０１５５】
実施例８：Ｔ−ＣｈＡＲＭ分子を発現するＴ細胞のインビボ存続
Ｒａｊｉ腫瘍を有するＮＳＧマウスのコホートを、５×１０６  抗ＣＤ１９  ＣＡＲ／ｈｕＥＧＦＲｔもしくはＴ−ＣｈＡＲＭ／ｈｕＥＧＦＲｔ発現ヒトＴ細胞で処置し、３週間後に、末梢血（眼の出血）を、抗ｈｕＥＧＦＲ、抗ヒトＣＤ８、および抗ヒトＣＤ４５モノクローナル抗体を使用してフローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ８＋  ｈｕＥＧＦＲｔ＋（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）  Ｔ細胞の頻度は、図７において生きている末梢血球のパーセンテージとして示される。検出可能なｈｕＥＧＦＲｔのレベルは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞のレベルに相関する。
【０１５６】
抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（長）発現Ｔ細胞は三週間後に一貫して顕著ではなかったが、他の全ての抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＴ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞は、養子移入および腫瘍根絶後少なくとも３週間にわたって、ＮＳＧマウスの末梢血中で容易に検出された。これら結果は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＴ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が、長期にわたってインビボで存続し得、抗腫瘍活性を媒介し得ることを示す。
【０１５７】
実施例９：Ｔ−ＣｈＡＲＭ分子を発現するＴ細胞の同定
抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ／ｈｕＥＦＲｔ発現Ｔ細胞を、ＥＧＦＲ  Ａｂ−ビオチン／ＳｔｒｅｐＴａｖｉｄｉｎ−ＰＥ、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ−ＦＩＴＣ、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）−ＡＰＣ（アロフィコシアニン）で染色し、次いで、フローサイトメトリーによって分析した。抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（短）形質導入Ｔ細胞を、コントロールとして使用した。形質導入したＴ−ＣｈＡＲＭおよび抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（短）Ｔ細胞は全て、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂで陽性に染色された。このことは、それらが形質導入され、ｈｕＥＧＦＲＴを発現したことを示す（図８Ａ）。
【０１５８】
その結果は、Ｔ−ＣｈＡＲＭ２およびＴ−ＣｈＡＲＭ３形質導入Ｔ細胞が、Ｔ−ＣｈＡＲＭ細胞において発現されるタグ配列を染色した試薬で、形質導入していない細胞から容易に区別できたことを示す（図８Ｂ，Ｃ）。上記Ｔ−ＣｈＡＲＭ１、Ｔ−ＣｈＡＲＭ２およびＴ−ＣｈＡＲＭ３形質導入Ｔ細胞は、抗Ｓｔｒｅｐタグ  ＩＩ−ＦＩＴＣ抗体で陽性に染色したが、上記抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（短）形質導入Ｔ細胞は陽性に染色しなかった（図８Ｂ）。上記タグ配列のより多くのコピーを有するものが、増大した染色シグナルを有した。上記Ｔ−ＣｈＡＲＭ細胞はまた、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  ＡＰＣで染色した（図８Ｃ）。このことは、Ｓｔｒｅｐタグの場合、１種より多くの染色試薬が上記Ｔ細胞を検出するために使用され得ることを示す。
【０１５９】
実施例１０：Ｔ−ＣｈＡＲＭ分子を発現するＴ細胞のソート
Ｔ−ＣｈＡＲＭ２形質導入Ｔ細胞を、抗Ｓｔｒｅｐタグ−ＦＩＴＣ標識抗体で染色し、次いで、卓上型ＦＡＣＳセルソーター（ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩセルソーター、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）を使用してソートした。図９は、ソート前（上の行）およびソート後（下の行）の細胞集団を示す。もっとも右のパネル（ソート後）は、Ｔ−ＣｈＡＲＭ２発現Ｔ細胞が、１５．８％の細胞集団から、９９％超のＴ−ＣｈＡＲＭ２  Ｔ細胞である細胞集団まで富化されたことを示す。
【０１６０】
実施例１１：免疫磁性選択を使用するＴ−ＣｈＡＲＭ分子を発現するＴ細胞の富化
細胞を、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ−マイクロビーズもしくはナノビーズ（ＩＢＡ，  Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）とともにインキュベートし、次いで、マグネティックセパレーターの中でＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）にロードした。カラムを３ｍｌ  ＭＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。次いで、カラムを上記セパレーターから外し、Ｓｔｒｅｐタグを発現するＴ細胞が結合したＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ（登録商標）磁性ビーズを、プランジャーをカラムの中へとしっかりと押し込むことによって流し出した。コントロールＴ細胞と混合したＴ−ＣｈＡＲＭ３形質導入Ｔ細胞を、以下のビーズタイプのうちの１つ：Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマイクロビーズ１＃（一般にタンパク質精製のために使用され、サイズは約０．５〜１．５μｍ）；Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマイクロビーズ２＃（一般にＦａｂ  Ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒｓ（登録商標）［Ｓｔｒｅｐタグ化Ｆａｂフラグメント］での細胞単離のために使用され、サイズは約０．５μｍ）；Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎナノビーズ３＃（一般にＭＨＣ  Ｉ  Ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒｓ［Ｓｔｒｅｐタグ化ＭＨＣＩモノマー］での細胞単離のために使用され、サイズは約１００ｎｍ）で標識し；ＭＡＣＳ（登録商標）カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）にロードし、マグネティックセパレーターへと挿入した。直接流出液および保持された画分を、抗Ｓｔｒｅｐタグ−ＦＩＴＣ標識固体で個々に染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１６１】
図１０の最初の行は、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎビーズカラムに適用される前の細胞集団を示す一方で、図１０の第２の行、第３の行および第４の行は、それぞれ、ビーズカラム１＃、２＃、および３＃を通過した後の各サンプルからの細胞集団を示す。第２の行は、いくらかの細胞喪失があったことを示し、これは、いくらかの細胞をカラムに通過させないＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマイクロビーズ１＃のサイズに起因し得る。全体として、データは、試験したＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎビーズのいずれのタイプも、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞を直接富化するために有用であったことを示す。
【０１６２】
実施例１２：タグ結合試薬での、細胞表面Ｔ−ＣｈＡＲＭを発現するＴ細胞の活性化
Ｔ細胞活性化および増殖は、Ｔ細胞抗原特異的レセプター（ＴＣＲ）の結合を通じて媒介される２つのシグナルおよび共刺激シグナル、最も代表的には、ＣＤ８０およびＣＤ８６によるＣＤ２８の結合を要する（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ７５：１５３１，  １９９０）。よって、抗ＣＤ３／ＣＤ２８  ｍＡｂ被覆マイクロビーズを開発して、両方の必須のシグナルを提供し、臨床適用のためにＴ細胞を非特異的に活性化および増殖させた（Ｒｉｄｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，  １９９０）。Ｔ細胞の抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激はまた、ＣＡＲをコードするレトロウイルスもしくはレンチウイルスベクターでの形質導入を促進するが、形質導入したＴ細胞を選択的に増殖させない。
【０１６３】
抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ３で形質導入したＴ細胞を、いずれの処理もなし（陰性コントロール）もしくは以下の処理のうちの１つを伴って、ＣＴＬ培地中で４８時間培養した：（ａ）Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）マイクロビーズ１＃；（ｂ）Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマイクロビーズ２＃；（ｃ）Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎナノビーズ３＃；（ｄ）プロテインＧビーズに結合体化した抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体（サイズは約２μｍ）；（ｅ）抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体／抗ＣＤ２８抗体二重結合体化プロテインＧビーズ、または（ｆ）照射したＴＭ−ＬＣＬ細胞と５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ２での共培養（陽性コントロール）。上記細胞が、２４時間および４８時間にわたって培養した後に活性化されていたか否かを決定するために、細胞を、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ２５／ＣＤ６９の存在について調べた。Ｔ細胞は、Ｔ細胞表面レセプターを介した活性化後に、またはＣＤ３ζを発現するＣＡＲを介したシグナル伝達によって、デノボ活性化分子（ＣＤ６９およびＣＤ２５を含む）を発現する。ＣＤ６９は、最初期の細胞表面活性化マーカーのうちの１つであり、継続している活性化プロセスと関わっている可能性がある。ＣＤ２５合成（ＩＬ２レセプターα鎖）は、ＩＬ２自体とともに、最初に抗原に遭遇するときのＴ細胞活性化によって誘発される。
【０１６４】
上記データは、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎもしくは抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体被覆ビーズのいずれかを通じたＴ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞のＳｔｒｅｐタグ結合が、これらＴ細胞を有意に活性化したことを予測外にも示し、そしてさらには、ビーズサイズがまた、Ｔ細胞活性化のレベルに対して影響を有し得ることを示す（図１３）。
【０１６５】
さらなる構築物でのさらなる実験において、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマイクロビーズは、ＣｈＡＲＭ２およびＣｈＡＲＭ３を発現するＣＤ８＋  Ｔ細胞（図２７Ａ）およびＣＤ４＋  Ｔ細胞（図２７Ｂ）でのＣＤ２５アップレギュレーションを誘発したが、ＣｈＡＲＭ１もしくはタグを欠いているＣＡＲを発現するＴ細胞では誘発しなかった。このことは、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマイクロビーズを結合するためのＣｈＡＲＭ１アフィニティーが、ＣｈＡＲＭベースのＴ細胞活性化において最適ではないことを示す。しかし、抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体被覆マイクロビーズ（これは、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（ＫＤ＝〜１ｕＭ）より約１００倍高いＳｔｒｅｐタグに対する結合アフィニティー（ＫＤ＝〜１０ｎＭ）を有する）は、ＣｈＡＲＭにおけるタグのコピー数もしくは位置とは無関係に、種々のＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞を活性化した（図２７Ａおよび図２７Ｂ）。顕著なことには、Ｓｔｒｅｐタグ結合媒介性活性化は、４−１ＢＢ  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞およびＣＤ２８  ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞（図２７Ｃ）、ならびに非ＣＤ１９標的化ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞（図２７Ｄ、ＲＯＲ１標的化Ｒ１２  ＣｈＡＲＭ１）の両方において見出され得る。
【０１６６】
実施例１３：タグ結合試薬での、細胞表面Ｔ−ＣｈＡＲＭを発現するＴ細胞の増殖
抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ１、Ｔ−ＣｈＡＲＭ２、Ｔ−ＣｈＡＲＭ３およびＣＡＲ（長）（陰性コントロール）形質導入Ｔ細胞を、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）マイクロビーズおよび５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ２を有するＣＴＬ培地中で個々に培養した。５日目の顕微鏡画像化から、Ｔ−ＣｈＡＲＭ２およびＴ−ＣｈＡＲＭ３発現Ｔ細胞が、上記ビーズの周りに大きなクラスターを驚くべきことに発生させたことが明らかになり、このことは、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎビーズ上での細胞増殖を示し、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（長）発現Ｔ細胞では明らかにならなかった（図１１）。上記Ｔ−ＣｈＡＲＭ１発現Ｔ細胞は、それほど大きくない細胞クラスターを示したが、陰性コントロールと比較すると、プレート上で目に見える細胞がより多く存在したので、細胞増殖は明らかにあった。さらなる実験において、種々の異なるＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞（Ｎ１ＣｈＡＲＭおよびＣｈ１ＡＲＭを含む）は、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎマイクロビーズもしくは抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体マイクロビーズのいずれかでの刺激後ちょうど４８時間以内に出現する増殖クラスターを有した（図２８）。従来の短いスペーサーのＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ１９−Ｈｉ）を、陰性コントロールとして使用した。
【０１６７】
Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）マイクロビーズ上で培養したＴ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の増殖曲線を決定した（図１２および図２９を参照のこと）。合計で約１×１０６  抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ１、Ｔ−ＣｈＡＲＭ２、およびＴ−ＣｈＡＲＭ３形質導入Ｔ細胞を、５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ２および５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ１５の存在下で、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマイクロビーズ、抗Ｓｔｒｅｐタグ  ｍＡｂ、もしくは抗Ｓｔｒｅｐタグ／抗ＣＤ２８  ｍＡｂ被覆マイクロビーズとともにＣＴＬ培地中に個々にプレートし（図２８）、１０日間培養した。各ウェルの細胞数を、３日目、６日目および９日目に計数した。そのデータは、Ｔ−ＣｈＡＲＭ３形質導入Ｔ細胞が、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎビーズによって刺激した場合に９日間にわたって最高の増殖速度を有したことを示す。Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎビーズ刺激があると、ＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋  抗ＣＤ１９  ＣｈＡＲＭ−Ｔ細胞が、約２０〜約１００倍増殖し、ＣｈＡＲＭ３  Ｔ細胞において最大の増殖が観察された（図２９Ａおよび図２９Ｂ）。抗Ｓｔｒｅｐタグおよび抗Ｓｔｒｅｐタグ／抗ＣＤ２８  ｍＡｂ被覆ビーズは、合計ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞数においてさらに大きな増殖（１００〜２５０倍）を誘発し、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎビーズ刺激とは異なって、ＣｈＡＲＭ１を発現するＣＤ８＋およびＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＣｈＡＲＭ２もしくはＣｈＡＲＭ３を発現するＴ細胞より大きな増殖の傾向を示した。ＣＤ２８  ＣｈＡＲＭもしくは抗ＲＯＲ１  ＣｈＡＲＭを発現するＴ細胞はまた、抗Ｓｔｒｅｐタグ／抗ＣＤ２８ビーズで効率的に増殖した。このことは、異なる共刺激ドメインおよび異なる腫瘍標的に対する特異性を有するＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞（データは示さず）を増殖させるためのこのアプローチの適用可能性を示す。
【０１６８】
別の増殖曲線アッセイにおいて、合計で約５×１０５  抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ３形質導入Ｔ細胞を、５０ Ｕ／ｍｌ  ＩＬ２および以下のビーズのうちの１つ：（ａ）Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマイクロビーズ１＃、（ｂ）Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマイクロビーズ２＃、（ｃ）Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎナノビーズ３＃、（ｄ）プロテインＧビーズに結合体化した抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体、（ｅ）抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体／抗ＣＤ２８抗体二重結合体化プロテインＧビーズ、または（ｆ）抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８二重抗体ビーズ（陽性コントロール）を有するＣＴＬ培地にプレートし；７日間培養した。各ウェルの細胞数を、３日目、５日目および７日目に計数した。そのデータは、抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体／抗ＣＤ２８抗体二重結合体化プロテインＧビーズが、５日目までに最大のＴ−ＣｈＡＲＭ３発現Ｔ細胞増殖を促進し、これは、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８陽性コントロールより有意に良好であったことを示す（図１６）。Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマイクロビーズ２＃以外の上記Ｓｔｒｅｐタグ結合試薬は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８陽性コントロールとほぼ同じレベルまでＴ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の増殖を促進した。
【０１６９】
Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の増殖をさらに確認するために、増殖の代理尺度として、Ｋｉ−６７タンパク質のレベルを測定した。Ｋｉ−６７は、細胞増殖と関連してかつおそらく細胞増殖に必要とされる核タンパク質である。抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ３で形質導入されたＴ細胞を、以下の処理のうちの１つの存在下でＣＴＬ培地中、５日間培養した：（ａ）Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）マイクロビーズ１＃；（ｂ）Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマイクロビーズ２＃；（ｃ）Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎナノビーズ３＃；（ｄ）プロテインＧビーズに結合体化した抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体；（ｅ）抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体／抗ＣＤ２８抗体二重結合体化プロテインＧビーズ、または（ｆ）抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８二重抗体ビーズ（陽性コントロール）。５日間培養した後、上記細胞を固定し、透過性にし、抗Ｋｉ−６７−ＦＩＴＣ結合体化抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１７０】
これらデータは、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎビーズもしくは抗Ｓｔｒｅｐタグビーズが選択的細胞増殖を促進し得ることを示し、Ｋｉ−６７染色によって測定した場合の増殖は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８陽性コントロールで観察されたものより良好であった（図１４）。
【０１７１】
Ｋｉ−６７タンパク質のさらなるレベルを、抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ１、Ｔ−ＣｈＡＲＭ２、もしくはＴ−ＣｈＡＲＭ３で形質導入したＴ細胞で行い、以下の存在下でＣＴＬ培地中で７日間培養した：（ａ）処理なし；（ｂ）１×１０６細胞あたり１５μｇ、５０μｇ、もしくは１５０μｇの用量でのＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）マイクロビーズ１＃；または（ｃ）照射したＴＭ−ＬＣＬ細胞と５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ２との共培養（陽性コントロール）。７日間培養した後、上記細胞を固定し、透過性にし、抗Ｋｉ−６７−ＦＩＴＣ結合体化抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。これら結果はまた、使用されるビーズの量に関わらず（特に、Ｔ−ＣｈＡＲＭ２細胞およびＴ−ＣｈＡＲＭ３細胞に関しては）、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎビーズが、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞における増殖を促進し得ることを示す（図１５）。さらに、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の各々は、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎビーズの存在下でおよび／またはＴＭ−ＬＣＬ陽性コントロール刺激より良好に増殖した。
【０１７２】
実施例１４：Ｔ−ＣｈＡＲＭ分子を発現するＴ細胞の選択的増殖
合計で約５×１０５  ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激した。２日目に、上記処理した細胞を、抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ１／ｈｕＥＧＦＲｔをコードする核酸分子を含むレンチウイルスで形質導入した。５日目に、上記抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを除去した。この時点で、上記処理した細胞を２群に分け、一方の群にはいかなる処置もさらには行わず、他方の群は、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）マイクロビーズ（約０．５μｍ〜約１．５μｍ）で処理した。１０日目に、各群の細胞を採取し、免疫蛍光抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。その増殖曲線は、上記抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズの除去後に、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマイクロビーズを添加すると、有意なＴ細胞増殖を促進し続けたことを示す（図１７Ａ）。フローサイトメトリー分析からは、コントロール群（上のパネル）と比較して、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマイクロビーズ処理群（下のパネル）において、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞が有意により高いパーセンテージで存在していたので（ｈｕＥＧＦＲｔ染色によって測定される場合）、増殖していた細胞は実際に、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞であったことが示される（図１７Ｂ）。次いで、各群の細胞を、ｈｕＥＧＦＲｔマーカーを使用してさらにソートし、次いで、５．０×１０５細胞を、ＣＤ１９＋  ＴＭ−ＬＣＬでの刺激によって増殖させた。ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎマイクロビーズで予め処理した細胞は、コントロール群のわずか４．０×１０６細胞と比較して、７日間で約８．０×１０７細胞のレベルへと有意かつ迅速な増殖をおこした。このことは、Ｔ−ＣｈＡＲＭのタグ配列を介するＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマイクロビーズ刺激後に、Ｔ−ＣｈＡＲＭの抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ成分を介する次の再刺激が、非常に有効であることを実証する。
【０１７３】
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ刺激が、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞を増殖させるために本当に必要とされたか否かを決定するために、本発明者らは、Ｔ細胞が、サイトカイン刺激のみで、Ｔ−ＣｈＡＲＭを発現するように形質導入され、その後抗Ｓｔｒｅｐタグビーズのみでの処理によって選択的に増殖され得るか否かを調べた。合計で約５×１０５  ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−７および１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１５とともに２４時間培養し、次いで、２タイプの抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ３（４１ＢＢもしくはＣＤ２８エフェクタードメイン）をコードする同じ力価のウイルスで形質導入した。この形質導入した細胞を、２日目にプロテインＧビーズに結合体化した抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体で処理し、次いで、７日目に採取し、免疫蛍光抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１７４】
データは、プロテインＧビーズに結合体化した抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体が、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ刺激の非存在下での培養物中の細胞の６０％より高くまでＴ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の増殖を促進したことを示す（図１８Ｂおよび１８Ｄ）。形質導入した細胞が抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体ビーズに曝されなかった場合、形質導入した細胞のうちの１％未満が増殖する（図１８Ａおよび１８Ｃ）。
【０１７５】
抗Ｓｔｒｅｐタグ単独もしくは抗Ｓｔｒｅｐタグ／抗ＣＤ２８  ｍＡｂ被覆マイクロビーズで増殖させた後のＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞の機能性を、上記ＣｈＡＲＭを介する刺激が、インビトロもしくはインビボでの腫瘍認識に対して有害な影響を有しないことを確実にするために試験した。設計における共刺激ドメインとは無関係に、抗Ｓｔｒｅｐタグマイクロビーズで増大させたＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞は、強力な細胞溶解活性を示し、サイトカインを効率的に放出し、増殖前のもしくは抗原駆動増殖（ＴＭ−ＬＣＬ）後の細胞と比較して、抗原刺激の間に広範な増殖能を保持した（図３０Ａ〜３０Ｃ）。選択的増殖の後、上記ＣｈＡＲＭ  Ｔ細胞は高い生存性を有し（＞９０％）、そして大部分が共刺激レセプター（ＣＤ２７／ＣＤ２８）ならびにセントラルメモリーＴ細胞マーカーＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌの発現を保持し（図３０Ｄ）、ＮＳＧマウスにおいてＲａｊｉ腫瘍を除去でき（図３０Ｅ）、ＣＤ１９＋  Ｂ細胞での刺激によって増殖したＣＡＲ  Ｔ細胞も同様に存続し得た（図３０Ｆ）。
【０１７６】
実施例１５：Ｔ−ＣｈＡＲＭを発現するＴ細胞によるサイトカイン放出に対するタグ結合試薬の結合の効果
抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（短）発現Ｔ細胞（ＴＭ−ＬＣＬ刺激によって増殖）もしくはＴ−ＣｈＡＲＭ１発現Ｔ細胞（ＴＭ−ＬＣＬもしくはＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎマイクロビーズ刺激によって増殖）を、２４時間にわたってＲａｊｉ細胞（図１９Ｃ）、またはＣＤ１９（図１９Ａ）もしくはＲＯＲ１（陰性コントロール）（図１９Ｂ）のいずれかを発現するＫ５６２細胞とともに共培養した。ＰＭＡ／イオノマイシンを、陽性コントロールとして使用した（図１９Ｄ）。上清を採取し、多重サイトカインアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標））を使用して分析した。Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマイクロビーズで培養した抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ１発現Ｔ細胞によるサイトカイン放出のレベルは、ＴＭ−ＬＣＬ細胞で刺激したＴ−ＣｈＡＲＭ１発現Ｔ細胞について観察されたものより（ＩＦＮ−γを除いて）高かった（図１９Ａ、図１９Ｃ、および図１９Ｄ）。条件に拘わらず、Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞共培養群（陰性コントロール）は、いかなる検出可能なサイトカインをも生じなかった（図１９Ｂ）。興味深いことに、ＴＭ−ＬＣＬ刺激群と比較して、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎビーズ誘発培養物においてＩＬ２生成は有意に高いレベルであった（１０倍より高い増大）。
【０１７７】
実施例１６：抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体と抗ＣＤ２７もしくは抗ＣＤ２８抗体とを組み合わせて増強された増殖
精製抗ＣＤ１９  Ｔ−ＣｈＡＲＭ３発現Ｔ細胞（５×１０５）を、０日目に、ＣＴＬ培地と５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ２中に入れ、次いで、２μｇ  Ｇプロテイン磁性ビーズ（ＮＥＢ）、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ（０．５μｇ）／抗ＣＤ２７抗体（０．５μｇ）結合体化Ｇプロテインビーズ、もしくは抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ（０．５μｇ）／抗ＣＤ２８抗体（０．５μｇ）結合体化Ｇプロテインビーズを、上記細胞培養物に添加した。上記培養培地のみの中の細胞を、陰性コントロールとして使用した。５日目に、上記細胞を顕微鏡下で検査した。
【０１７８】
図２０は、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ抗体結合体化プロテインＧビーズが、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の増殖を促進したこと、および抗ＳｔｒｅｐタグＩＩと抗ＣＤ２８抗体もしくは抗ＣＤ２７抗体のいずれかとを組み合わせると、Ｔ−ＣｈＡＲＭ発現Ｔ細胞の増殖をよりさらに効率的に促進することを示す。
【０１７９】
上記の種々の実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わされ得る。本明細書で参照されるおよび／または出願データシートの中で列挙される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物の全ては、それらの全体において本明細書に参考として援用される。上記実施形態の局面は、まださらなる実施形態を提供するために、種々の特許、出願および刊行物の概念を採用するために必要であれば、改変され得る。
【０１８０】
これらおよび他の変更は、上記の詳細な説明に鑑みて、上記実施形態に対して行われ得る。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書の中および請求項の中で開示される具体的実施形態に限定するとは解釈されるべきでなく、全ての考えられる実施形態を、このような請求項が権利を与えられる均等物の全範囲とともに含むと解釈されるべきである。よって、特許請求の範囲は、開示によって限定されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図８−１０】
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【図８−１１】
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【図８−１２】
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【図８−１３】
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【図８−１４】
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【図８−１５】
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【図８−１６】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１３−８】
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【図１３−９】
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【図１３−１０】
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【図１３−１１】
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【図１３−１２】
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【図１３−１３】
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【図１３−１４】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３０Ｅ】
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【図３０Ｆ】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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