(57)【要約】【課題】新規のラマン散乱光測定用セルを提供する。【解決手段】微粒子のラマン散乱光を測定するためのラマン散乱光測定用セルであって、微粒子を含む試料の注入口及び排出口を有する微粒子保持部と、前記微粒子保持部の前記注入口に連通する液体供給部と、を備え、前記微粒子保持部は、互いに対向し、傾斜して配置される、第１のガラスプレート及び第２のガラスプレートにより形成されており、前記第１のガラスプレートと前記第２のガラスプレートとの間隔は、前記注入口から前記排出口方向に向かって小さくなっている、ラマン散乱光測定用セル。【選択図】図１
2019100872.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子のラマン散乱光を測定するためのラマン散乱光測定用セルであって、
微粒子を含む試料の注入口及び排出口を有する微粒子保持部と、
前記微粒子保持部の前記注入口に連通する液体供給部と、を備え、
前記微粒子保持部は、互いに対向し、傾斜して配置される、第１のガラスプレート及び第２のガラスプレートにより形成されており、
前記第１のガラスプレートと前記第２のガラスプレートとの間隔は、前記注入口から前記排出口方向に向かって小さくなっている、
ラマン散乱光測定用セル。
【請求項２】
前記微粒子が細胞である、請求項１に記載のラマン散乱光測定用セル。
【請求項３】
前記微粒子が生細胞である、請求項２に記載のラマン散乱光測定用セル。
【請求項４】
前記微粒子保持部は、さらに、前記微粒子保持部からの前記試料の漏出を抑制可能な漏出防止壁を有する、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のラマン散乱光測定用セル。
【請求項５】
前記注入口及び前記排出口は、前記第１のガラスプレートと前記第２のガラスプレートとの隙間により形成される、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のラマン散乱光測定用セル。
【請求項６】
前記注入口は、前記第１のガラスプレートと前記第２のガラスプレートとの間隔が最大となる位置を含むように形成されており、
前記排出口は、前記第１のガラスプレートと前記第２のガラスプレートとの間隔が最小となる位置を含むように形成されている、
請求項１〜５のいずれか一項に記載のラマン散乱光測定用セル。
【請求項７】
前記注入口における、前記第１のガラスプレートと前記第２のガラスプレートとの間隔が、１０〜１００μｍである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のラマン散乱光測定用セル。
【請求項８】
前記排出口における、前記第１のガラスプレートと前記第２のガラスプレートとの間隔が、１〜３μｍである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のラマン散乱光測定用セル。
【請求項９】
前記第１のガラスプレートと、前記第２のガラスプレートとが、スペーサーを介して、相互に固定されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載のラマン散乱光測定用セル。
【請求項１０】
前記第１のガラスプレートは、前記第２のガラスプレートに対向していない領域を有し、前記領域に、前記液体供給部が設けられている、
請求項１〜９のいずれか一項に記載のラマン散乱光測定用セル。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のラマン散乱光測定用セルを用いて、微粒子のラマン散乱光を測定する方法であって、
前記微粒子保持部に、前記注入口から、前記微粒子を含む試料を注入して、前記第１のガラスプレートと前記第２のガラスプレートとの間に、前記微粒子を保持させ、
前記液体供給部から、前記注入口を介して、前記微粒子保持部に液体が供給されている状態で、前記微粒子保持部に保持された前記微粒子に光を照射して、前記微粒子のラマン散乱光を測定する、
微粒子のラマン散乱光の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラマン散乱光測定用セル、及びラマン散乱光の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料のラマン散乱光の測定において、試料を収容している容器由来のラマン散乱光を低減する技術として、ベンゼン環を含まない材質のシート部材を容器内に配し、当該シート部材上に試料を保持して、試料のラマン散乱光を検出する方法が提案されている（特許文献１）。
より簡易な構成で、且つ生きている細胞のラマン散乱光を高感度に検出できる方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１３−１７４４９７号公報
【発明の概要】
【０００４】
本発明の１実施形態は、微粒子のラマン散乱光を測定するためのラマン散乱光測定用セルであって、微粒子を含む試料の注入口及び排出口を有する微粒子保持部と、前記微粒子保持部の前記注入口に連通する液体供給部と、を備え、前記微粒子保持部は、互いに対向し、傾斜して配置される、第１のガラスプレート及び第２のガラスプレートにより形成されており、前記第１のガラスプレートと前記第２のガラスプレートとの間隔は、前記注入口から前記排出口方向に向かって小さくなっている、ラマン散乱光測定用セルである。
【０００５】
また、本発明の１実施形態は、上記実施形態のラマン散乱光測定用セルを用いて、微粒子のラマン散乱光を測定する方法であって、前記微粒子保持部に、前記注入口から、前記微粒子を含む試料を注入して、前記第１のガラスプレートと前記第２のガラスプレートとの間に、前記微粒子を保持させ、前記液体供給部から、前記注入口を介して、前記微粒子保持部に液体が供給されている状態で、前記微粒子保持部に保持された前記微粒子に光を照射して、微粒子のラマン散乱光を測定する、微粒子のラマン散乱光の測定方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】本発明の１実施形態に係るラマン散乱光測定用セルの一例を示す斜視図である。
【図２】図１のラマン散乱光測定用セルを第２のガラスプレート方向から見た平面図である。
【図３】図２のラマン散乱光測定用セルのＩＩＩ−ＩＩＩ切断面における断面図である。
【図４】図２のラマン散乱光測定用セルのＩＶ−ＩＶ切断面における断面図である。
【図５】図２の平面図において、微粒子保持部に微粒子が保持された状態を示す。
【図６】図２の断面図において、微粒子保持部に微粒子が保持された状態を示す。
【図７】本発明の１実施形態に係るラマン散乱光測定用セルの使用方法の一例を示す、第２のガラスプレート方向から見た平面図である。
【図８】図７の使用状態のラマン散乱光測定用セルのＶＩＩ−ＶＩＩ切断面における断面図である。
【図９】本発明の１実施形態に係るラマン散乱光測定用セルの変形例１を示す図である。（Ａ）は、第２のガラスプレート方向から見た平面図、（Ｂ）は（Ａ）のＢ９−Ｂ９切断面における断面図である。
【図１０】本発明の１実施形態に係るラマン散乱光測定用セルの変形例２を示す図である。（Ａ）は、第２のガラスプレート方向から見た平面図、（Ｂ）は（Ａ）のＢ１０−Ｂ１０切断面における断面図、（Ｃ）は（Ａ）のＣ１０−Ｃ１０切断面における断面図である。
【図１１】本発明の１実施形態に係るラマン散乱光測定用セルの変形例３を示す図である。第２のガラスプレート方向から見た平面図である。
【図１２】本発明の１実施形態に係るラマン散乱光測定用セルの変形例４を示す図である。第２のガラスプレート方向から見た平面図である。
【図１３】本発明の１実施形態に係るラマン散乱光測定用セルの変形例５を示す図である。第２のガラスプレート方向から見た平面図である。
【図１４】本発明の１実施形態に係るラマン散乱光測定用セルの変形例６を示す図である。第２のガラスプレート方向から見た平面図である。
【図１５】本発明の１実施形態に係るラマン散乱光測定用セルの変形例７を示す図である。第２のガラスプレート方向から見た平面図である。
【図１６】本発明の１実施形態に係るラマン散乱光測定用セルの変形例８を示す図である。（Ａ）は、第２のガラスプレート方向から見た平面図、（Ｂ）は（Ａ）のＢ１６−Ｂ１６切断面における断面図である。
【図１７】実施例で作製したラマン散乱光測定用セルを示す図である。（Ａ）は、第２のガラスプレート方向から見た平面図、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ切断面における断面図、（Ｃ）は（Ａ）のＣ−Ｃ切断面における断面図である。
【図１８】実施例で作製したラマン散乱光測定用セルを用いて取得された、ヒト卵巣がん細胞（ＯＶＣＡＲ３）のラマンスペクトルの一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
≪ラマン散乱光測定用セル≫
１実施形態において、本発明は、微粒子のラマン散乱光を測定するためのラマン散乱光測定用セルを提供する。本実施形態のラマン散乱光測定用セルは、微粒子を含む試料の注入口及び排出口を有する微粒子保持部と、前記微粒子保持部の前記注入口に連通する液体供給部と、を備え、前記微粒子保持部は、互いに対向し、傾斜して配置される、第１のガラスプレート及び第２のガラスプレートにより形成されており、前記第１のガラスプレートと前記第２のガラスプレートとの間隔は、前記注入口から前記排出口方向に向かって小さくなっている。
【０００８】
本実施形態のラマン散乱光測定用セルは、微粒子のラマン散乱光を測定するために用いられる。微粒子は、例えば、５００μｍ以下、１００μｍ以下、５０μｍ以下、又は３０μｍ以下の粒子である。微粒子は、特に限定されないが、一例として細胞が挙げられる。細胞は、生細胞であってもよく、死細胞であってもよく、観察のために各種の処理（例えば、ホルマリン固定やエタノール固定）を加えた細胞であってもよい。後述するように、本実施形態のラマン散乱光測定用セルは、ラマン散乱光測定中の微粒子の乾燥を防ぐことができる。そのため、生細胞の生存状態を維持したままで、ラマン散乱光を測定するのに適している。
以下、本実施形態のラマン散乱光測定用セルを図面を参照して説明する。
【０００９】
図１は、本実施形態のラマン散乱光測定用セルの構成例を示す斜視図である。ラマン散乱光測定用セル１は、第１のガラスプレート１０及び第２のガラスプレート２０を含み、微粒子保持部３０及び液体供給部４０を備えている。図２は、図１に示すラマン散乱光測定用セル１を、第２のガラスプレート２０方向から見た平面図である。図３は、ラマン散乱光測定用セル１のＩＩＩ−ＩＩＩ切断面における断面図である。図４は、ラマン散乱光測定用セル１のＩＶ−ＩＶ切断面における断面図である。
【００１０】
（微粒子保持部）
微粒子保持部３０は、ラマン散乱光の測定対象である微粒子を保持するためのものである。微粒子保持部３０は、互いに対向し、傾斜して配置される、第１のガラスプレート１０及び第２のガラスプレート２０により形成されている。また、微粒子保持部３０は、微粒子を含む試料（以下、単に「試料」という。）を注入可能な注入口３１と、試料を排出可能な排出口３２と、を有している。
【００１１】
第１のガラスプレート１０は、ガラス製であり、平板形状をしている。ガラスプレート１０の材質は、ガラスであればよく、特に限定されないが、石英ガラス、ケイ酸塩ガラス（例えば、ソーダ石灰ガラス、ホウケイ酸ガラス）等が挙げられる。ガラスは、樹脂に比べて自家蛍光が少ないため、第１のガラスプレート１０を用いることにより、ラマン散乱光測定の際に、ラマン散乱光測定用セル１由来のノイズが低減される。
【００１２】
第１のガラスプレート１０の形状は、特に限定されず、任意の形状とすることができる。ラマン散乱光測定用セル１の例では、ガラスプレート１０のプレート面は、長方形状となっているが、プレート面の形状は、長方形状に限定されない。プレート面の形状は、正方形状であってもよく、台形状であってもよい。また、プレート面の形状は、四角形状に限らず、他の多角形状（六角形、八角形など）であってもよい。また、プレート面の形状は、一部が曲線であってもよく、円形状、半円形状、部分円形状等であってもよい。プレート面の形状としては、１辺が直線である形状、対向する２辺が直線である形状等が例示される。
第１のガラスプレート１０のサイズは、特に限定されず、任意のサイズとすることができる。取扱いの利便性などから、例えば、プレート面が円形状等である場合、最小径が０．５ｃｍ程度以上、最大径が１５ｃｍ程度以下等が例示される。また、プレート面が四角形状等である場合、幅が０．５ｃｍ程度以上、長さが１０ｃｍ以上程度以下等が例示される。
第１のガラスプレート１０の厚さは、特に限定されないが、０．０１〜５ｍｍ、０．０２〜２ｍｍ、０．０５〜０．５ｍｍ、０．１〜０．３ｍｍ等が例示される。
【００１３】
なお、第１のガラスプレート１０は、プレート面が完全に平坦な形状である必要はなく、プレート面に凹凸を有するものであってもよい。また、プレート面に突起物等を有していてもよい。例えば、後述するスペーサーや漏出防止壁等の構造を、プレート面上に有していてもよく、これらの構造が一体的に形成されていてもよい。本明細書において、「ガラスプレート」は、プレート面に凹凸を有するもの、プレート面に突起物等の構造を有するものも包含する。
【００１４】
第２のガラスプレート２０は、ガラス製であり、平板形状をしている。第２のガラスプレート２０の材質は、ガラスであればよく、特に限定されないが、石英ガラス、ケイ酸塩ガラス（例えば、ソーダ石灰ガラス、ホウケイ酸ガラス）等が挙げられる。ガラスは、樹脂に比べて自家蛍光が少ないため、第２のガラスプレート２０を用いることにより、樹脂製のプレートを用いた場合に比較して、ラマン散乱光測定の際に、ラマン散乱光測定用セル１由来のノイズが低減される。
【００１５】
第２のガラスプレート２０の形状は、特に限定されず、任意の形状とすることができる。ラマン散乱光測定用セル１の例では、ガラスプレート２０のプレート面は、正方形状となっているが、プレート面の形状は、正方形状に限定されない。プレート面の形状は、長方形状であってもよく、台形状であってもよい。また、プレート面の形状は、四角形状に限らず、他の多角形状（六角形、八角形など）であってもよい。また、プレート面の形状は、一部が曲線であってもよく、円形状、半円形状、部分円形状等であってもよい。プレート面の形状としては、１辺が直線である形状、対向する２辺が直線である形状等が例示される。
第２のガラスプレート２０のサイズは、特に限定されず、任意のサイズとすることができる。取扱いの利便性などから、例えば、プレート面が円形状等である場合、最小径が０．５ｃｍ程度以上、最大径が１０ｃｍ程度以下等が例示される。また、プレート面が四角形状等である場合、幅が０．５ｃｍ程度以上、長さが１０ｃｍ以上程度以下等が例示される。
第２のガラスプレート２０の厚さは、特に限定されず、ラマン散乱光を測定するための対物レンズの開口数等にあわせて適宜選択される。第２のガラスプレート２０の厚さは、例えば、０．０１〜１ｍｍ、０．０３〜０．３ｍｍ、０．０５〜０．２ｍｍ等が例示される。
【００１６】
なお、第２のガラスプレート２０は、第１のガラスプレート１０と同様に、プレート面が完全に平坦な形状である必要はなく、プレート面に凹凸を有するものであってもよい。また、プレート面に突起物等を有していてもよい。例えば、後述するスペーサーや漏出防止壁等の構造を、プレート面上に有していてもよく、これらの構造が一体的に形成されていてもよい。
【００１７】
ラマン散乱光測定用セル１では、第１のガラスプレート１０の長軸方向の長さが、第２のガラスプレート２０の長軸方向の長さよりも長くなっている。また、第１のガラスプレート１０の短軸方向の長さは、第２のガラスプレート２０の短軸方向の長さと同じになっている。ただし、この態様に限定されず、第１のガラスプレート１０の長軸方向の長さは、第２のガラスプレート２０の長軸方向の長さと同じであってもよく、短くてもよい。また、第１のガラスプレート１０の短軸方向の長さは、第２のガラスプレート２０の短軸方向の長さよりも長くてもよく、短くてもよい。例えば、第１のガラスプレート１０の長軸方向及び短軸方向の長さは、それぞれ、第２のガラスプレート２０の長軸方向及び短軸方向の長さよりも、長いか同じである。
【００１８】
ラマン散乱光測定用セル１では、第２のガラスプレート２０は、そのプレート面の３辺が、第１のガラスプレート１０のプレート面の３辺に揃うように、第１のガラスプレート１０上に配置されている。そして、微粒子保持部３０は、第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０とが、互いに対向する領域（第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０とが重なる領域）に形成されている。
ただし、第１のガラスプレート１０に対する第２のガラスプレート２０の配置は、これに限定されず、第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０とが、互いに対向する領域を有していればよい。例えば、第２のガラスプレート２０の長軸方向及び単軸方向の長さが、それぞれ、第１のガラスプレート１０の長軸方向及び短軸方向の長さよりも同じか短い場合、第２のガラスプレート２０は、そのプレート面の全部が第１のガラスプレート１０に対向するように、第１のガラスプレート１０上に配置される。
【００１９】
第２のガラスプレート２０は、第１のガラスプレート１０に対して、傾斜して配置されている。第２のガラスプレート２０を、第１のガラスプレート１０に対して、傾斜して配置するために、ラマン散乱光測定用セル１では、スペーサー６１ａ，６１ｂ，６２ａ，６２ｂが用いられている。スペーサー６１ａ，６１ｂの径は、スペーサー６２ａ，６２ｂの径よりも大きくなっている。第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０との間に、スペーサー６１ａ，６１ｂを並べて配置し、次いで６２ａ，６２ｂを並べて配置することにより、第１のガラスプレート１０に対して、第２のガラスプレート２０を傾斜して配置することができる。なお、スペーサー６１ａ，６１ｂは、互いに全く同じ径を有するものである必要はなく、異なる径を有していてもよい。同様に、スペーサー６２ａ，６２ｂは、互いに全く同じ径を有するものである必要はなく、異なる径を有していてもよい。
【００２０】
スペーサー６１ａ，６１ｂ，６２ａ，６２ｂの形状、材質等は、特に限定されず、任意のものを用いることができる。一例として、スペーサー６１ａ，６１ｂ，６２ａ，６２ｂとしては、マイクロビーズが挙げられる。スペーサー６１ａ，６１ｂ，６２ａ，６２ｂがマイクロビーズである場合、スペーサー６１ａ，６１ｂの直径としては、１０〜１００μｍ、１５〜８０μｍ、又は２０〜５０μｍ等が例示され、スペーサー６２ａ，６２ｂの直径としては、１〜３μｍ、又は１．５〜２．５μｍ等が例示される。
スペーサーは、４個に限定されず、４個以上使用してもよい。例えば、スペーサー６１ａ，６１ｂの径と、スペーサー６２ａ，６２ｂの径の中間の径を有するスペーサーを用いることができる。
また、スペーサーとして、傾斜面を有する台形柱状のスペーサー等を用いてもよい。この場合、スペーサーの個数は、例えば２個とすることができる。
【００２１】
第１のガラスプレート１０と、第２のガラスプレート２０とは、スペーサーを介して、相互に固定されていてもよい。。接着剤は、ガラスを接着できるものであればよく、特に限定されない。一例として、接着剤としては、紫外線硬化接着剤が挙げられる。
【００２２】
第１のガラスプレート１０に対して、第２のガラスプレート２０が傾斜して配置されるため、微粒子保持部３０において、第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０との間隔は、注入口３１から排出口３２方向に向かって小さくなっている。
【００２３】
注入口３１は、試料を注入するために、微粒子保持部３０に設けられている開口である。また、排出口３２は、微粒子保持部３０に注入された試料を排出するために設けられている開口である。ラマン散乱光測定用セル１では、注入口３１及び排出口３２は、第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０との隙間により形成されている。注入口３１は、第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０との間隔ｄ３０が最大となる位置を含むように形成されている。一方、排出口３２は、第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０との間隔ｄ３０が最小となる位置を含むように形成されている。また、注入口３１と排出口３２とは、互いに対向する位置に形成されている。
ただし、注入口３１及び排出口３２の位置は、これに限定されず。第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０との間隔ｄ３０が、注入口３１から排出口３２に向かって小さくなるように、注入口３１及び排出口３２が配置されていればよい。
【００２４】
注入口３１における、第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０との間隔ｄ３１は、測定対象となる微粒子のサイズよりも大きければ、特に限定されない。間隔ｄ３１は、測定対象の微粒子のサイズに応じて、適宜選択可能である。測定対象の微粒子が、サイズの異なる微粒子の混合物である場合、間隔ｄ３１は、最も大きい微粒子のサイズに応じて選択することができる。また、測定対象の微粒子のサイズが不明である場合には、想定される最も大きいサイズに応じて選択することができる。微粒子が細胞である場合、間隔ｄ３１としては、例えば、１０〜１００μｍ、１５〜８０μｍ、又は２０〜５０μｍ等が例示される。
【００２５】
排出口３２における、第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０との間隔ｄ３２としては、試料に含まれる液体を排出可能な間隔が挙げられる。また、間隔ｄ３２としては、測定対象となる微粒子のサイズよりも小さい間隔が例示される。間隔ｄ３２は、測定対象の微粒子のサイズに応じて、適宜選択可能である。測定対象の微粒子が、サイズの異なる微粒子の混合物である場合、間隔ｄ３２は、最も小さい微粒子のサイズに応じて選択することができる。微粒子が細胞である場合、間隔ｄ３２としては、例えば、１〜３μｍ、又は１．５〜２．５μｍ等が例示される。
【００２６】
第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０との間隔ｄ３０は、注入口３１から排出口３２方向に向かって小さくなっているため、間隔ｄ３１よりも小さく間隔ｄ３２よりも大きい微粒子であれば、注入口３１と排出口３２との間の領域の何れかの位置で、両ガラスプレート間に捕捉される。例えば、図５は、ラマン散乱光測定用セル１の微粒子保持部３０に、微粒子７０を保持させた状態の、第２のガラスプレート２０方向からの平面図であり、図６は、ＶＩ−ＶＩ切断面における断面図である。図５及び図６に示すように、微粒子７０は、サイズの大きいものは、注入口３１に近い位置で捕捉され、サイズの小さいものほど排出口３２に近い位置で捕捉される。
したがって、測定対象の微粒子が複数種類の微粒子の混合物であったり、微粒子のサイズが不明である場合であっても、微粒子保持部３０において、微粒子７０を捕捉することができる。また、微粒子７０は、第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０との間に挟まれた状態で固定される。これにより、微粒子７０が細胞等である場合には、第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０との間に固定された細胞は、ある程度扁平形状になる。そのため、ラマン散乱光を測定する面積を大きくすることができる。
【００２７】
第１のガラスプレート１０に対する第２のガラスプレート２０の傾きは、特に限定されないが、傾きが急すぎると、異なるサイズの微粒子が、近い領域に集まって捕捉される可能性がある。そのため、第１のガラスプレート１０に対する第２のガラスプレート２０の傾きとしては、例えば、０．０１〜１度、０．０３〜０．５度、又は０．０５〜０．２度等が例示される。
【００２８】
微粒子保持部３０は、上記の構成に加えて、微粒子保持部３０からの試料の漏出を抑制可能な漏出防止壁を有していてもよい。ラマン散乱光測定用セル１では、第１のガラスプレート１０の周縁部に、壁５１，５２，５３が設けられており、壁５１，５２の一部が、微粒子保持部３０において漏出防止壁として機能している。
微粒子保持部３０が漏出防止壁を有することにより、排出口３２以外からの試料の漏出が抑制されるため、微粒子保持部３０に注入された試料に含まれる微粒子の大部分又は全部が、微粒子保持部３０に保持される。
【００２９】
漏出防止壁は、微粒子保持部３０からの試料の漏出を抑制可能であれば、形状、材質等は、特に限定されず、任意のものを用いることができる。また、微粒子保持部３０からの試料の漏出を抑制可能であれば、漏出防止壁の配置は特に限定されない。壁５１，５２のようなものでなくてもよく、例えば、後述する実施例のように、第１のガラスプレートと第２のガラスプレートとを接着する接着層により、漏出防止壁を形成してもよい（図９参照）。
また、漏出防止壁は、微粒子保持部３０からの試料の漏出を完全に防止するものであってもよいが、ある程度抑制可能なものであってもよい。漏出防止壁は、第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０との隙間を、注入口３１及び排出口３２を除いて、完全に塞ぐものであってもよく、その一部を塞ぐものであってもよい。
【００３０】
（液体供給部）
液体供給部４０は、微粒子保持部３０に保持される微粒子のラマン散乱光測定中に、微粒子保持部３０に液体を供給するためのものである。液体供給部４０は、微粒子保持部３０の注入口３１に連通しており、注入口３１を介して、微粒子保持部３０に液体を供給する。
【００３１】
ラマン散乱光測定用セル１では、液体供給部４０は、第１のガラスプレート１０の、第２のガラスプレート２０に対向していない領域に設けられている。第１のガラスプレート１０の周縁部には、壁５１，５２，５３が設けられており、第１のガラスプレート１０と共に、液体供給部４０を構成している。なお、壁５１，５２，５３は、第１のガラスプレート１０に、一体的に形成されたものであってもよい。また、壁５１，５２，５３は、第１のガラスプレート１０の側面に設けられたものであってもよい。
液体供給部４０は、第１のガラスプレート１０と、壁５１，５２，５３と、により囲まれた領域に、液体を貯留することができ、当該領域に貯留された液体は、注入口３１を介して、微粒子保持部３０に供給される。
【００３２】
壁５１，５２，５３は、液体供給部４０に貯留される液体を保持できるものであれば、形状、材質等は、特に限定されず、任意のものを用いることができる。また、壁５１，５２，５３は、第１のガラスプレート１０の周縁部に位置する必要はなく、注入口３１に連通し、かつ液体を貯留可能な領域を形成できれば、第１のガラスプレート１０上の位置は特に限定されない。例えば、第１のガラスプレート１０のプレート面上に、壁５１，５２，５３のいずれかを設けてもよい。また、ラマン散乱光測定用セル１では、壁５１，５２，５３の３個の壁を用いているが、壁は２個であってもよく、４個以上であってもよい。
【００３３】
また、液体供給部は、微粒子保持部に液体を供給可能であれば、第１のガラスプレート１０上に設けられたものでなくてもよい。例えば、液体供給部を、微粒子保持部とは別の部材で構成し、当該液体供給部が微粒子保持部の注入口に連通するように、当該液体供給部を微粒子保持部に連結してもよい。この場合、液体供給部を構成する部材の材質は、特に限定されず、例えば、樹脂、ガラス、金属等であってよい。
【００３４】
（使用方法）
上記のような構成を有するラマン散乱光測定用セル１の使用方法を、図５〜８を参照して説明する。
【００３５】
まず、微粒子保持部３０に測定対象の微粒子７０を保持させるために、注入口３１から、微粒子保持部３０に微粒子を含む試料を注入する。通常、試料は、微粒子懸濁液である。微粒子懸濁液は、微粒子７０を適当な液体７１に懸濁することにより調製すればよい。微粒子懸濁液を調製するための液体７１は、微粒子７０の種類に応じて適宜選択すればよい。例えば、微粒子７０が細胞、特に生細胞である場合には、微粒子懸濁液調製のための液体７１として、無機系の溶液（例えば、リン酸緩衝液、リン酸生理食塩水、クエン酸緩衝液、生理食塩水など）が挙げられる。有機物を含む溶液は自家蛍光の原因となり、ラマンスペクトルのシグナル／ノイズ比を低下させる可能性がある。そのため、微粒子を含む試料に有機物が含まれている場合は、事前に無機系の溶液に置換してもよい。置換の方法は後述する。
試料は、細胞を含む体液試料であってもよく、そのような体液試料としては、血液試料が例示される。体液試料の場合も、細胞以外の成分を無機系の溶液に置換してもよい。
【００３６】
注入口３１から微粒子保持部３０に注入された試料は、第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０との隙間を、排出口３２方向に向かって流れていく。このとき、試料に含まれる液体を、排出口３２から、紙などを用いて吸い取ることにより、注入口３１から排出口３２方向への試料の流れを生じさせてもよい。この試料の流れにより、試料中の微粒子７０は、第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０との間に捕捉される。微粒子７０が捕捉される位置は、そのサイズに応じて異なり、サイズが大きいものほど注入口３１に近い位置で捕捉され、サイズの小さいものほど排出口３２に近い位置で捕捉される（図５、図６参照）。
【００３７】
微粒子７０が、細胞のように変形可能な粒子である場合、第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０との間に捕捉された微粒子７０は、浮遊状態のときの形状と比較して、扁平形状になる。そのため、ラマン散乱光を測定可能な面積が大きくなる。
【００３８】
次に、液体供給部４０に、液体８０を入れる。液体８０は、注入口３１を塞ぐ程度の高さまで入れる。これにより、液体供給部４０内の液体８０が、注入口３１を介して、微粒子保持部３０に供給されるようになる。一例として、液体供給部４０における液体８０の量は、注入口３１を超えて第２のガラスプレート２０の上面に流れないように設定する。これにより、第２のガラスプレート２０の上面を乾燥した状態に保ち、液体８０がラマン散乱光の測定の障害となるのを防ぐことができる（図７、８参照）。
液体８０は、微粒子７０の種類に応じて適宜選択すればよい。例えば、微粒子７０が細胞、特に生細胞である場合には、液体８０としても、無機系の溶液（例えば、リン酸緩衝液、リン酸生理食塩水、クエン酸緩衝液、生理食塩水など）が挙げられる。また、液体８０は、微粒子懸濁液の調製に使用した液体７１と同じものを用いてもよい。
【００３９】
試料が、有機物などラマン散乱光の測定に望ましくない物質を含んでいた場合、ラマン散乱光測定用セル１を利用して、試料から望ましくない物質を含む溶液を除去し、無機系の溶液に置換することができる。具体的には、上述のように注入口３１から微粒子保持部３０に試料を注入した後、排出口３２から紙などの吸収材を用いて試料中の液体を完全に吸い取り、続いて、無機系の溶液を、注入口３１から、微粒子保持部３０に行きわたるように加えることができる。さらに、排出口３２から紙などの吸収材で溶液を吸い取った後、注入口３１から無機系の溶液を加えることを複数回繰り返すことにより、試料中の望ましくない物質を十分に除去することが可能である。その後、上述したとおり、液体供給部４０に液体８０を添加すればよい。
なお、遠心分離などによって微粒子７０と試料の液体成分とを予め分離し、微粒子７０を無機系の溶液に懸濁してから注入口３１に注入してもよい。
【００４０】
次に、微粒子保持部３０に保持された微粒子７０に、レーザー光を照射し、微粒子７０から放出されるラマン散乱光を測定する。微粒子保持部３０には、注入口３１を介して、液体供給部４０から液体８０が供給されるため、ラマン散乱光の測定中、微粒子７０の乾燥が防止される。また、微粒子７０のラマン散乱光を１００箇所程度測定するために時間を要した場合であっても、当該測定時間中、微粒子７０は乾燥することがない。そのため、微粒子７０が生細胞である場合であっても、乾燥による細胞死の誘導を防止して、生細胞の状態でラマン散乱光を測定することができる。
【００４１】
また、本実施形態のラマン散乱光測定用セル１は、主要な部材がガラス製であるため、樹脂を用いた場合と比較して、セル由来の自家蛍光が低減され、ノイズの少ないラマン散乱光を測定することができる。ガラスは、樹脂に比べて自家蛍光が少ないが、加工性に難があった。しかし、本実施形態のラマン散乱光測定用セル１では、平板状の第１のガラスプレート１０及び第２のガラスプレート２０を用いており、複雑な加工を要しない。そのため、本実施形態のラマン散乱光測定用セル１は、簡易な方法で、安価に作製することができる。
【００４２】
本実施形態のラマン散乱光測定用セルは、上記で説明した態様に限定されず、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、各構成要素を適宜変更することができる。例えば、以下のような変形例１〜８も、本実施形態のラマン散乱光測定用セルの範囲内である。なお、図９〜１６において、上記態様と同様の構成には同一符号を付し、その詳細な説明は省略する。また、下記変形例１〜８の説明では、第２のガラスプレート２０のプレート面の各辺について、第１のガラスプレートとの距離が最大となる辺を２０ｃ、２０ｃの対辺であり第１のガラスプレートとの距離が最小となる辺を２０ｄ、これらの辺を結ぶ２つの辺を２０ａ，２０ｂと表記する。
【００４３】
［変形例１］
本実施形態のラマン散乱光測定用セルの変形例１を図９に示す。図９（Ａ）は変形例１に係るラマン散乱光測定用セル１０１の平面図であり、図９（Ｂ）は図９（Ａ）のＢ９−Ｂ９切断面における断面図である。ラマン散乱光測定用セル１０１では、壁５４が、第２のガラスプレート２０上における注入口３１上に配置されている。液体供給部４０は、壁５１，５２，５３，５５により囲まれている。そのため、液体供給部４０に、注入口３１を超えて液体８０を入れても、第２のガラスプレート２０の上面を乾燥した状態に保つことができる。
【００４４】
［変形例２］
本実施形態のラマン散乱光測定用セルの変形例２を図１０に示す。図１０（Ａ）は変形例２に係るラマン散乱光測定用セル１０２の平面図であり、図１０（Ｂ）は図１０（Ａ）のＢ１０−Ｂ１０切断面における断面図であり、図１０（Ｃ）は図１０（Ａ）のＣ１０−Ｃ１０切断面における断面図である。ラマン散乱光測定用セル１０２では、液体供給部４０が、プレート１１と壁５２，５３，５６とにより構成されている。プレート１１の材質は、特に限定されず、例えば、樹脂、ガラス、金属等であり得る。プレート１１の幅は、第１のガラスプレート１０、及び第２のガラスプレート２０の幅よりも短くなっている。第２のガラスプレート２０の辺２０ｃの液体供給部４０に接続する部分には、第１のガラスプレート１０との隙間により注入口３１が形成され、注入口３１以外の隙間は壁５５により閉鎖されている。また、第２のガラスプレート２０の辺２０ｄの一部には、第１のガラスプレート１０との隙間により排出口３２が形成され、排出口３２以外の隙間は壁５４により閉鎖されている。なお、壁５４は、必ずしも図１２のように設置されている必要はなく、スペーサー６２ａ，６２ｂ側の辺の任意の位置に設置することができる。また、壁５４を設置しない構成としてもよい。
【００４５】
［変形例３］
本実施形態のラマン散乱光測定用セルの変形例３を図１１に示す。図１１は変形例３に係るラマン散乱光測定用セル１０３の平面図である。ラマン散乱光測定用セル１０３では、第２のガラスプレート２０の辺２０ａの一部に、第１のガラスプレート１０との隙間により注入口３１が形成されている。また、第２のガラスプレート２０の辺２０ｂの一部に、第１のガラスプレート１０との隙間により排出口３２が形成されている。第２のガラスプレート２０の辺２０ａにおいて、注入口３１は、第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０との距離が最大となる位置を含むように配置され、注入口３１以外の隙間は壁５５により閉鎖されている。一方、第２のガラスプレート２０の辺２０ｂにおいて、排出口３２は、第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０との距離が最小となる位置を含むように配置され、排出口３２以外の隙間は壁５１により閉鎖されている。第１のガラスプレート１０は、第２のガラスプレート２０に対して、辺２０ａ側に延長しており、当該延長部分に液体供給部４０が設けられている。
【００４６】
［変形例４］
本実施形態のラマン散乱光測定用セルの変形例４を図１２に示す。図１２は変形例４に係るラマン散乱光測定用セル１０４の平面図である。ラマン散乱光測定用セル１０４は、排出口３２が、第２のガラスプレート２０の辺２０ｄの全体にわたって設けられていること以外は、ラマン散乱光測定用セル１０３と同様の構成である。
【００４７】
［変形例５］
本実施形態のラマン散乱光測定用セルの変形例５を図１３に示す。図１３は変形例５に係るラマン散乱光測定用セル１０５の平面図である。ラマン散乱光測定用セル１０５では、注入口３１が、第２のガラスプレート２０の辺２０ｃの全体にわたって設けられ、注入口３１が連通路４１を介して液体供給部４０に連通していること以外は、ラマン散乱光測定用セル１０４と同様の構成である。
【００４８】
［変形例６］
本実施形態のラマン散乱光測定用セルの変形例６を図１４に示す。図１４は変形例６に係るラマン散乱光測定用セル１０６の平面図である。ラマン散乱光測定用セル１０６では、第２のガラスプレート２０の辺２０ａ，２０ｂの一部に、それぞれ、第１のガラスプレート１０との隙間により、排出口３２ａ，３２ｂが形成されている。排出口３２ａ，３２ｂは、それぞれ、第２のガラスプレート２０の辺２０ａ，２０ｂにおいて、第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０との距離が最小となる位置を含むように配置されている。辺２０ｄにおける第１のガラスプレートとの隙間は、壁５４により閉鎖されている。
【００４９】
［変形例７］
本実施形態のラマン散乱光測定用セルの変形例７を図１５に示す。図１５は変形例７に係るラマン散乱光測定用セル１０７の平面図である。ラマン散乱光測定用セル１０６は、微粒子保持部３０が、壁５６により微粒子保持部３０ａ，３０ｂの２つの区画に分けられている以外は、ラマン散乱光測定用セル１００と同様の構成である。第２のガラスプレート２０は、１枚のガラスプレートでもよく、微粒子保持部３０ａ，３０ｂで異なる２枚のガラスプレートを用いてもよい。微粒子保持部３０ａ，３０ｂは、それぞれ、独立した注入口３１ａ，３１ｂ、及び排出口３２ａ，３２ｂを有し、各区画に注入された微粒子懸濁液は混じることがない。そのため、微粒子保持部３０ａ，３０ｂに、それぞれ異なる種類の微粒子懸濁液を注入することができる。
【００５０】
［変形例８］
本実施形態のラマン散乱光測定用セルの変形例８を図１６に示す。図１６（Ａ）は変形例８に係るラマン散乱光測定用セル１０８の平面図であり、図１６（Ｂ）は図１６（Ａ）のＢ１６−Ｂ１６切断面における断面図である。ラマン散乱光測定用セル１０８では、第２のガラスプレート２０に、注入口３１が形成されている。さらに、第２のガラスプレート２０上における注入口３１と排出口３２との間には、壁５５が設けられ、第２のガラスプレート２０及び壁５１，５２，５３，５５により液体供給部４０が形成されている。ラマン散乱光測定用セル１０８においては、微粒子保持部３０の面積を確保するために、壁５５は、注入口３１に隣接して設けられている。
【００５１】
≪ラマン散乱光測定方法≫
１実施形態において、本発明は、微粒子のラマン散乱光の測定方法を提供する。本実施形態の微粒子のラマン散乱光の測定方法は、上記実施形態のラマン散乱光測定用セルを用いる。上記実施形態のラマン散乱光測定用セルの微粒子保持部に、注入口から、微粒子を含む試料を注入して、第１のガラスプレートと第２のガラスプレートとの間に、前記微粒子を保持させ、液体供給部から、前記注入口を介して、前記微粒子保持部に液体が供給されている状態で、前記微粒子保持部に保持された前記微粒子に光を照射して、微粒子のラマン散乱光を測定する。
【００５２】
本実施形態のラマン散乱光の測定方法は、上記「≪ラマン散乱光測定用セル≫」の項で説明した「（使用方法）」と同様に行うことができる。
【００５３】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５５】
（ラマン散乱光測定用セルの作製）
第１のガラスプレート１０として、松波  ＮＥＯカバーガラス（２５×６０ｍｍ、厚さ０．１２〜０．１７ｍｍ）を用い、第２のガラスプレート２０として、松波  ＮＥＯカバーガラス（１８×１８ｍｍ、厚さ０．１２〜０．１７ｍｍ）を用いた。スペーサー６１ａ，６１ｂとして、積水化学  ミクロパールＳＰ２０（直径２０μｍ）、又は積水化学  ミクロパールＳＰ５０（直径５０μｍ）を用い、スペーサー６２ａ，６２ｂとして、積水化学  ミクロパールＳＰ２（直径２μｍ）を用いた。接着剤として、紫外線硬化接着剤（Ｎｏｒｌａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＮＯＡ６３）を用いた。
第１のガラスプレート１０上に、第２のガラスプレート２０を、図１７に示すように、第２のガラスプレート２０の隣接する２つの辺が、第１のガラスプレート１０の隣接する２つの辺と揃うように配置した。第２のガラスプレートの４角に、スペーサー６１ａ，６１ｂ，６２ａ，６２ｂを配置し、これらのスペーサーを介して、接着剤を用いて、第１のガラスプレート１０と第２のガラスプレート２０とを接着した。スペーサー６１ａと６２ａとの間、及びスペーサー６１ｂと６２ｂとの間は、第１のガラスプレートと第２のガラスプレートとの隙間に接着剤を充填して硬化させ、接着剤層を形成し、漏出防止壁５５、５６とした。第１のガラスプレート１０の周縁部には、第２のガラスプレートの存在する領域を除いて、ビニールテープにより壁５１〜５４を形成した。これにより、第１のガラスプレート１０の、第２のガラスプレート２０と対向していない領域に、液体供給部４０を形成した。
以上により、高さ２０μｍの注入口と高さ２μｍの排出口とを有するラマン散乱光測定用セル（Ｌｏｔ１１）、及び高さ５０μｍの注入口と高さ２μｍの排出口とを有するラマン散乱光測定用セル（Ｌｏｔ１２）を作製した。なお、図１７（Ａ）は、作製したラマン散乱光測定用セルの上面図である。図１７（Ｂ）は、図１７（Ａ）のラマン散乱光測定用セルのＢ−Ｂ切断面における断面図であり、図１７（Ｃ）は、図１７（Ａ）のラマン散乱光測定用セルのＣ−Ｃ切断面における断面図である。
【００５６】
（ラマンスペクトル測定試験）
ラマン散乱光測定対象の微粒子として、ヒト卵巣がん細胞ＯＶＣＡＲ−３（ＡＴＣＣ（登録商標）を用いた。上記のラマン散乱光測定用セル（Ｌｏｔ１）に対して、注入口３１から、微粒子保持部３０に、ＯＶＣＡＲ−３の細胞懸濁液を注入した。液体供給部４０に、注入口３１の高さまで、緩衝液を入れた。排出口３２から、紙等により、細胞懸濁液中の液体を吸い取り、排出口３２方向への細胞懸濁液及び緩衝液の流れを生じさせた。
ラマン散乱光測定用セルの微粒子保持部に保持された細胞に対しておおまかな領域を設定し、当該領域を１００箇所程度の単位領域に分割し、それぞれの単位領域に対し１μｍ程度のビーム径を有する波長５３２ｎｍのレーザー光を照射してラマン散乱光を測定した。各単位領域について取得したスペクトルを平均し、当該スペクトルから、細胞の自家蛍光とガラスの自家蛍光とを公知のアルゴリズムにより除去した。このようにして取得した細胞のラマンスペクトルの一例を図１８に示す。
【符号の説明】
【００５７】
１…ラマン散乱光測定用セル、１０…第１のガラスプレート、２０…第２のガラスプレート、２０ａ，２０ｂ，２０ｃ，２０ｄ…第２のガラスプレートの各辺、３０，３０ａ，３０ｂ…微粒子保持部、３１，３１ａ，３１ｂ…注入口、３２，３２ａ，３２ｂ…排出口、４０…液体供給部、４１…連通路、５１，５２，５３，５４，５５，５６…壁、６１ａ，６１ｂ，６２ａ，６２ｂ…スペーサー、７０…微粒子、７１…微粒子懸濁液の調製に用いた液体、８０…液体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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