(57)【要約】【課題】ＰＴＭ対応内在性ペプチド検索法によるデータベース検索の偽発見率（ＦＤＲ）を高い精度で推定できるデコイデータベースを提供する。【解決手段】修飾タンパク質の配列が収録されているターゲットＤＢ１２からデータ読込み部１３２がデータを読み込むと、アミノ酸分布統計情報作成部１３３はアミノ酸の出現頻度を示すアミノ酸分布統計情報を作成し、ＰＴＭ分布統計情報作成部１３４は修飾の種類毎に修飾部位の出現頻度を示すＰＴＭ分布統計情報を作成する。デコイ配列生成部１３５はアミノ酸分布統計情報を利用した重み付けにより、元のターゲットＤＢ１２中のエントリの配列数と同じデコイ配列をランダムに作成する。デコイＰＴＭ情報生成部１３６はＰＴＭ分布統計情報を利用した重み付けにより、各デコイ配列に対応するデコイＰＴＭ情報を作成する。こうして作成したデコイ配列とデコイＰＴＭ情報を収集して、ＰＴＭ付加情報のあるデコイデータベースを作成する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析結果に基づくデータベース検索により内在性修飾ペプチドを同定する際の同定品質を評価する方法であり、デコイ配列を用いて同定品質を評価する指標値を算出する内在性修飾ペプチドの同定品質評価方法において、
a)翻訳後修飾情報が付加されたタンパク質配列データベースから、収録されている修飾タンパク質のアミノ酸配列情報及び翻訳後修飾情報を読み込む情報読込みステップと、
b)前記情報読込みステップにより得られた前記アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸の出現頻度を示すアミノ酸分布統計情報を求めるアミノ酸分布統計取得ステップと、
c)前記情報読込みステップにより得られた前記翻訳後修飾情報に基づいて、各翻訳後修飾の出現頻度を示す翻訳後修飾分布統計情報を求める翻訳後修飾分布統計取得ステップと、
d)前記情報読込みステップにより得られたアミノ酸配列情報と前記アミノ酸分布統計情報とに基づいて、正規のアミノ酸配列に類似したデコイ配列を生成するデコイ配列生成ステップと、
e)前記デコイ配列生成ステップで生成されたデコイ配列と前記翻訳後修飾分布統計情報とに基づいて、修飾物の種類と修飾部位とを含むデコイ翻訳後修飾情報を生成するデコイ翻訳後修飾情報生成ステップと、
f)前記デコイ配列生成ステップで生成されたデコイ配列と前記デコイ翻訳後修飾情報生成ステップで生成されたデコイ翻訳後修飾情報とを統合することにより、翻訳後修飾情報が付加されたデコイ配列が収録されたデコイデータベースを作成するデコイデータベース作成ステップと、
を有することを特徴とする内在性修飾ペプチドの同定品質評価方法。
【請求項２】
請求項１に記載の内在性修飾ペプチドの同定品質評価方法であって、
翻訳後修飾情報が付加されたタンパク質配列データベースであるターゲットデータベースを共通のエントリを有さない複数の部分集合データベースに分割するデータベース分割ステップと、
前記複数の部分集合データベースのそれぞれについて、前記情報読込みステップ、前記アミノ酸分布統計取得ステップ、前記翻訳後修飾分布統計取得ステップ、前記デコイ配列生成ステップ、前記デコイ翻訳後修飾情報生成ステップ、及び前記デコイデータベース作成ステップによる処理を実施して部分集合デコイデータベースを作成する部分集合デコイデータベース作成ステップと、
前記部分集合デコイデータベース作成ステップで作成された複数の部分集合デコイデータベースを前記ターゲットデータベースに対応して統合することによりデコイデータベースを作成するデコイデータベース統合ステップと、
を有することを特徴とする内在性修飾ペプチドの同定品質評価方法。
【請求項３】
質量分析結果に基づくデータベース検索により内在性修飾ペプチドを同定する際の同定品質を評価する装置であって、デコイ配列を用いて同定品質を評価する指標値を算出する内在性修飾ペプチドの同定品質評価装置において、
a)翻訳後修飾情報が付加されたタンパク質配列データベースから、収録されている修飾タンパク質のアミノ酸配列情報及び翻訳後修飾情報を読み込む情報読込み部と、
b)前記情報読込み部により得られた前記アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸の出現頻度を示すアミノ酸分布統計情報を求めるアミノ酸分布統計取得部と、
c)前記情報読込み部により得られた翻訳後修飾情報に基づいて、各翻訳後修飾の出現頻度を示す翻訳後修飾分布統計情報を求める翻訳後修飾分布統計取得部と、
d)前記情報読込み部により得られたアミノ酸配列情報と前記アミノ酸分布統計情報とに基づいて、正規のアミノ酸配列に類似したデコイ配列を生成するデコイ配列生成部と、
e)前記デコイ配列生成部により生成されたデコイ配列と前記翻訳後修飾分布統計情報とに基づいて、修飾物の種類と修飾部位とを含むデコイ翻訳後修飾情報を生成するデコイ翻訳後修飾情報生成部と、
f)前記デコイ配列生成部により生成されたデコイ配列と前記デコイ翻訳後修飾情報生成部により生成されたデコイ翻訳後修飾情報とを統合することにより、翻訳後修飾情報が付加されたデコイ配列が収録されたデコイデータベースを作成するデコイデータベース作成部と、
を備えることを特徴とする内在性修飾ペプチドの同定品質評価装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析を利用して翻訳後修飾を受けた内在性ペプチド（内在性修飾ペプチド）を同定する手法の同定品質を評価する方法、及びそのための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ポストゲノム研究としてタンパク質の構造や機能の解析が急速に進められている。質量分析を利用してタンパク質やペプチドを網羅的に同定するためのデータ解析手法として、最も広く使用されているのは、タンパク質配列データベース検索法（以下、単に「データベース検索法」と称す。また場合によっては「ＤＢ検索法」と略す）である。データベース検索法としては、英国マトリクスサイエンス（Matrix Science）社が提供している検索エンジンであるマスコット（Mascot）に含まれるＭＳ／ＭＳイオンサーチ（非特許文献１参照）が広く知られているが、それ以外にもフリーの検索エンジンであるX! Tandemなども類似した機能を有する。
【０００３】
データベース検索法には様々な手法（アルゴリズム）があるため、それら手法の同定品質の比較は適切な手法を選択するうえで重要である。また、同じ手法でも検索によってヒットしたアミノ酸配列のスコアや期待値を判定するための閾値を変えると同定品質は変わるため、そうした閾値を適切に設定することで同定品質を制御することも重要である。こうした際に用いられる同定品質の客観的な評価指標としては偽発見率（ＦＤＲ＝False Discovery Rate）が広く用いられている（非特許文献２参照）。
【０００４】
一般に、データベース検索法において偽発見率を推定する際には、天然タンパク質のアミノ酸配列に似せて作成されているが実在しない偽の配列であるデコイ（Decoy）配列を収録したデコイ配列データベースが用いられる。質量分析により収集したマススペクトル情報についてデコイ配列データベースを利用して検索を実施したときに、偶発的に同定されたデコイ配列の数を計数することによって、偽発見率を推定することができる。
【０００５】
トリプシン等の消化酵素を用いてタンパク質を人為的に断片化したペプチドを分析するプロテオーム解析では、検索対象である天然タンパク質配列データベース（以下「ターゲットデータベース」と称す）に収録されている各タンパク質のアミノ酸配列をタンパク質毎又は断片化されるペプチド毎に反転（Ｎ末端側とＣ末端側との反転）させたものをデコイ配列として用いると、簡便で且つ高い精度で以て偽発見率を推定できることが知られている。これに対し、生体内の不特定の分解酵素により産生された内在性ペプチドを網羅的に同定する場合、上述したような両末端で反転したアミノ酸配列をデコイ配列として採用すると、偽発見率を過大評価するおそれがあることが分かっている。そのため、こうした場合には、ターゲットデータベースに収録されたタンパク質のアミノ酸配列に基づいたランダムな配列の入替えによってデコイ配列を生成する方法が用いられる。
【０００６】
生体内に存在するタンパク質やペプチドの多くは、化学官能基の結合や解離、或いはペプチド結合の加水分解（切断）などによる翻訳後修飾（Post-translational modification、以下、適宜「ＰＴＭ」と略す場合がある）を受けており、それによって、その機能が動的に且つ厳密に調節されている。生体内のタンパク質のアミノ酸配列中のどの部位（どのアミノ酸残基）にどのような修飾が生じているかを解析することは、生命科学研究やその成果を産業に応用する観点からも非常に重要である。しかしながら、従来の一般的なデータベース検索法では、生体内で生じ得る全ての修飾ペプチドを一度の検索により同定することはできない。何故なら、修飾のバリエーションを考慮すると、探索対象となる理論ペプチドの数つまりは探索空間が指数関数的に拡がってしまい、その結果として、ペプチド候補をスコアの統計的な信頼度指標をもとに一意的に絞り込むことができなくなるためである（非特許文献２参照）。
【０００７】
こうしたことから、許容される信頼度で以て多数の修飾ペプチドを同定する、即ち、修飾ペプチドの同定感度を向上させるための制限として、探索対象とする修飾の種類を事前に少数個に絞り込んだ上でデータベース検索を行うのが一般的である（いわゆるバリアブルモディフィケーション法)。ただし、その場合でも、例えばリン酸化のようにタンパク質中に含まれる割合が高い、つまりは存在頻度が高いアミノ酸残基の側鎖に生じる修飾を検索の対象とすると、同定感度が低下することが知られている。また、リン酸化のような官能基の修飾ではなく切断部位を網羅的に探索しようとした場合にも、同様に探索空間が大幅に増大し、同定感度が低下することが知られている。
【０００８】
上述した、修飾ペプチド検索における同定感度低下の要因となる探索空間の増大を抑えるための他の方法として、既知である修飾部位に限定して探索を行う手法が有効である。これに包含される方法として、官能基付加に関しては、既知の修飾部位において特定の官能基修飾を受けているアミノ酸を実在しない疑似的なアミノ酸記号に対応付けて検索を実施する方法がある（特許文献１参照）。また、ペプチド結合の切断については、切断の組み合わせを、過去の測定において測定対象である試料から検出された配列や文献等において測定対象の試料から検出されたと報告されている配列、或いはその配列の中の部分的な配列を少なくとも一つ以上含む配列に限定した上で検索を実施する方法がある（特許文献２参照）。これらいずれの方法も、検索対象としてタンパク質配列データベースをそのまま用いるのではなく、これよりも小規模のペプチド単位のペプチド配列データベースを新たに構築して検索を行う点が一つの特徴である。
【０００９】
よく知られているように、内在性修飾ペプチドは官能基による修飾と切断との双方の修飾を受けたペプチドである。そこで、内在性修飾ペプチドを効果的に同定する方法として、上記特許文献１に記載の手法と特許文献２に記載の手法とを組み合わせる試みは当然考え得る手法の一つである。
【００１０】
しかしながら、特許文献１に記載の手法では、上述したように修飾を受けたアミノ酸を擬似的なアミノ酸として記号化していることから、例えばリン酸化について、一つのペプチドのアミノ酸配列上に３箇所の既知のリン酸化部位があれば、リン酸化の有無の組み合わせとして２3＝８通りのペプチド配列に展開してデータベースに収録する必要がある。また、一般に内在性ペプチドのサイズは大きく、一つのペプチド中に多数の既知の修飾部位が含まれることが想定されるため、特許文献１に記載の手法をそのまま適用すると、想定される修飾部位の組み合わせが膨大となる。一方、特許文献２に記載の手法においても、膨大な数のペプチドをデータベースに収録する必要がある。そのため、上述したように特許文献１、２に記載の方法を組み合わせようとしても、データベースのサイズが大きくなりすぎて実装が困難になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１３−４７６２４号公報
【特許文献２】国際公開第２０１７／０４７５８０号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】「マトリクス・サイエンス−マスコット−ＭＳ／ＭＳ・イオンズ・サーチ（Matrix Science - Mascot - MS/MS Ions Search）」、[online]、マトリクス・サイエンス社（Matrix Science Ltd.）、[平成３０年４月３日検索]、インターネット＜URL : http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=MIS＞
【非特許文献２】吉沢明康、「どのデータベースを使うか〜データベース検索と配列解析・誤解と難題〜」、プロテオミクス・レターズ（Proteomics Letters） 2016 1:63-80、[online]、日本プロテオーム学会、[平成３０年４月３日検索]、インターネット＜URL : https://www.jhupo.org/data/proteomeletters/16008.pdf＞
【非特許文献３】シウィ（Siwy J.）、ほか４名、「ヒューマン・ユーリナリ・ペプタイド・データベース・フォー・マルチプル・ディジーズ・バイオメーカ・ディスカバリー（Human urinary peptide database for multiple disease biomarker discovery）」、プロテオミクス・クリニカル・アプリケーションズ（Proteomics Clinical Applications）、2011年、Vol.5、pp.367-374
【非特許文献４】「PEFF - PSI Extended Fasta Format」、PSI、[online]、[平成３０年４月３日検索]、インターネット＜URL :http://www.psidev.info/node/363 ＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記データベースのサイズを削減するためには、官能基修飾に関する修飾情報を、アミノ酸配列上の個々のアミノ酸残基に対する付加情報としてアミノ酸配列とは独立に扱うこととし、検索時に必要な情報のみを動的にメモリ上に修飾ペプチドとして展開して検索できるようにする、といった工夫が必要である。ところが、こうした工夫を加えた手法による内在性の修飾ペプチド検索法（以下「ＰＴＭ対応内在性ペプチド検索法」と称す）における同定品質を評価するために偽発見率を推定する場合、次のような問題がある。
【００１４】
（１）上述したＰＴＭ対応内在性ペプチド検索法では、アミノ酸配列情報とは別に翻訳後修飾情報が必要となる。しかしながら、上述したような従来の一般的なデコイデータベースの作成方法では、アミノ酸のデコイ配列が収録されたデコイデータベースを作成することはできてもデコイの修飾情報は得られない。そのため、こうしたデータベースを用いた検索を行っても修飾されたペプチドを対象とした適切な検索が実行されず、偽発見率が過小評価されてしまうことになる。即ち、従来の一般的なデコイデータベースの作成方法では、上述したＰＴＭ対応内在性ペプチド検索法における偽発見率を実用上使用できる程度に精度良く推定することができないという問題がある。
【００１５】
（２）上述したＰＴＭ対応内在性ペプチド検索法で使用されるタンパク質配列データベース又はペプチド配列データベースは、一般に用いられるタンパク質のアミノ酸配列から試料特異性を持つタンパク質のアミノ酸配列を抽出した部分集合（サブセット）であるか、或いは、さらにその部分集合となるペプチドのアミノ酸配列が収録されたものである。そこでＰＴＭ対応内在性ペプチド検索法では、複数の異なる配列データベースを用いた各々の検索により得られた検索結果を適切に統合することによって、偽発見率を所定の値に抑えながら同定数を増やすことができる。例えば、複数の異なる配列データベースに対する検索により得られた複数セットの同定結果の間で重複して同定されたペプチドは、異なる検索条件の下で再現性良く同定された信頼度の高いペプチドであると推定し得る。しかしながら、複数の異なるターゲットデータベースについて別々に、ランダムに生成したデコイ配列が一致するという確率は極めて小さい。そのため、従来の一般的なデコイ配列の生成方法を用いた場合、複数の異なるデータベースを用いて同定した結果の間で共通してヒットしたペプチドについての偽発見率を求めることはできない。
【００１６】
本発明は上記課題を解決するために成されたものであり、その主たる目的は、修飾を受けた内在性ペプチド（内在性修飾ペプチド）を同定するデータベース検索法の同定品質を評価するための偽発見率を精度良く求めることができる内在性修飾ペプチドの同定品質評価方法及び装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題を解決するためになされた本発明に係る内在性修飾ペプチドの同定品質評価方法は、質量分析結果に基づくデータベース検索により内在性修飾ペプチドを同定する際の同定品質を評価する方法であり、デコイ配列を用いて同定品質を評価する指標値を算出する内在性修飾ペプチドの同定品質評価方法において、
a)翻訳後修飾情報が付加されたタンパク質配列データベースから、収録されている修飾タンパク質のアミノ酸配列情報及び翻訳後修飾情報を読み込む情報読込みステップと、
b)前記情報読込みステップにより得られた前記アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸の出現頻度を示すアミノ酸分布統計情報を求めるアミノ酸分布統計取得ステップと、
c)前記情報読込みステップにより得られた前記翻訳後修飾情報に基づいて、各翻訳後修飾の出現頻度を示す翻訳後修飾分布統計情報を求める翻訳後修飾分布統計取得ステップと、
d)前記情報読込みステップにより得られたアミノ酸配列情報と前記アミノ酸分布統計情報とに基づいて、正規のアミノ酸配列に類似したデコイ配列を生成するデコイ配列生成ステップと、
e)前記デコイ配列生成ステップで生成されたデコイ配列と前記翻訳後修飾分布統計情報とに基づいて、修飾物の種類と修飾部位とを含むデコイ翻訳後修飾情報を生成するデコイ翻訳後修飾情報生成ステップと、
f)前記デコイ配列生成ステップで生成されたデコイ配列と前記デコイ翻訳後修飾情報生成ステップで生成されたデコイ翻訳後修飾情報とを統合することにより、翻訳後修飾情報が付加されたデコイ配列が収録されたデコイデータベースを作成するデコイデータベース作成ステップと、
を有することを特徴としている。
【００１８】
また、本発明に係る内在性修飾ペプチドの同定品質評価装置は、上記発明に係る内在性修飾ペプチドの同定品質評価方法を実施する装置であり、質量分析結果に基づくデータベース検索により内在性修飾ペプチドを同定する際の同定品質を評価する装置であって、デコイ配列を用いて同定品質を評価する指標値を算出する内在性修飾ペプチドの同定品質評価装置において、
a)翻訳後修飾情報が付加されたタンパク質配列データベースから、収録されている修飾タンパク質のアミノ酸配列情報及び翻訳後修飾情報を読み込む情報読込み部と、
b)前記情報読込み部により得られた前記アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸の出現頻度を示すアミノ酸分布統計情報を求めるアミノ酸分布統計取得部と、
c)前記情報読込み部により得られた翻訳後修飾情報に基づいて、各翻訳後修飾の出現頻度を示す翻訳後修飾分布統計情報を求める翻訳後修飾分布統計取得部と、
d)前記情報読込み部により得られたアミノ酸配列情報と前記アミノ酸分布統計情報とに基づいて、正規のアミノ酸配列に類似したデコイ配列を生成するデコイ配列生成部と、
e)前記デコイ配列生成部により生成されたデコイ配列と前記翻訳後修飾分布統計情報とに基づいて、修飾物の種類と修飾部位とを含むデコイ翻訳後修飾情報を生成するデコイ翻訳後修飾情報生成部と、
f)前記デコイ配列生成部により生成されたデコイ配列と前記デコイ翻訳後修飾情報生成部により生成されたデコイ翻訳後修飾情報とを統合することにより、翻訳後修飾情報が付加されたデコイ配列が収録されたデコイデータベースを作成するデコイデータベース作成部と、
を備えることを特徴としている。
【００１９】
本発明において、「翻訳後修飾情報が付加されたタンパク質配列データベース」としては、例えばスイスバイオインフォマティクス研究所（略称：SIB）等が提供しているUniProtKBなどを用いることができる。また、そうした既存のタンパク質データベース全体ではなく、その中の一部を適宜に抽出したものを「翻訳後修飾情報が付加されたタンパク質配列データベース」として用いてもよい。
【００２０】
本発明は、内在性修飾ペプチドを同定するためのデータベース検索法の同定品質を評価する際に使用されるデコイデータベースの作成の手順やその作成の際の処理に特徴がある。即ち、本発明に係る同定品質評価装置では、上述したような翻訳後修飾情報が付加されたタンパク質配列データベースからアミノ酸配列情報が読み込まれると、アミノ酸分布統計情報取得部は、得られたアミノ酸配列情報に基づいて各アミノ酸配列の出現頻度を示すアミノ酸分布統計情報を作成する。一方、翻訳後修飾情報が付加されたタンパク質配列データベースから翻訳後修飾情報が読み込まれると、翻訳後修飾分布統計取得部は、得られた翻訳後修飾情報に基づいて各翻訳後修飾の出現頻度と各翻訳後修飾が付加する部位の頻度とを示す翻訳後修飾分布統計情報を作成する。
【００２１】
そしてデコイ配列生成部は例えば、上記読み込みにより得られた正規のアミノ酸配列情報に基づき、アミノ酸分布統計情報に従った重み付けでランダムにアミノ酸を置き換えることで偽のデコイ配列を生成する。さらにデコイ翻訳後修飾情報生成部は、生成されたデコイ配列に対し、翻訳後修飾分布統計情報に基づいて付加する翻訳後修飾分子と付加する部位（アミノ酸残基）とをランダムに決定する。本発明では、翻訳後修飾情報が付加されたタンパク質配列データベースに基づいてアミノ酸分布統計情報及び翻訳後修飾分布統計情報をそれぞれ求めておき、それら情報を利用して偽のアミノ酸配列であるデコイ配列と偽の翻訳後修飾であるデコイ修飾とを決定する。そして、デコイデータベース作成部は、生成されたデコイ配列とデコイ翻訳後修飾とを統合することで、翻訳後修飾情報が付加されたデコイ配列が収録されたデコイデータベースを作成する。こうして作成されたデコイデータベースを用いてマススペクトル情報についての所定のデータベース検索法による検索を実施し、同定基準を満たした（同定閾値を超えた）デコイ配列同定数を計数することで、翻訳後修飾されたタンパク質又はペプチドについても高い精度で以て偽発見率を推定することができる。
【００２２】
また本発明に係る内在性修飾ペプチドの同定品質評価方法において、好ましい態様として、
翻訳後修飾情報が付加されたタンパク質配列データベースであるターゲットデータベースを共通のエントリを有さない複数の部分集合データベースに分割するデータベース分割ステップと、
前記複数の部分集合データベースのそれぞれについて、前記情報読込みステップ、前記アミノ酸分布統計取得ステップ、前記翻訳後修飾分布統計取得ステップ、前記デコイ配列生成ステップ、前記デコイ翻訳後修飾情報生成ステップ、及び前記デコイデータベース作成ステップによる処理を実施して部分集合デコイデータベースを作成する部分集合デコイデータベース作成ステップと、
前記部分集合デコイデータベース作成ステップで作成された複数の部分集合デコイデータベースを前記ターゲットデータベースに対応して統合することにより全体集合デコイデータベースを作成するデコイデータベース統合ステップと、
を有するものとすることができる。
【００２３】
この好ましい態様によれば、各部分集合デコイデータベースに含まれるデコイ配列やデコイ翻訳後修飾はその部分集合デコイデータベースに対応する部分集合データベースに含まれる正規のアミノ酸組成や翻訳後修飾が反映されたものとなる。即ち、部分集合デコイデータベースは偽発見率を高い精度で求めることができるデコイデータベースである。そして、全体集合デコイデータベースはこうした部分集合デコイデータベースに含まれる情報を統合したものであるから、この全体集合デコイデータベースを用いることで、複数の部分集合データベースを用いた検索法における検索結果を統合する際の偽発見率についても高い精度で求めることが可能となる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、翻訳後修飾を受けたペプチドを同定するデータベース検索法、具体的にはＰＴＭ対応内在性ペプチド検索法などにおける同定品質を評価するための偽発見率を、精度良く求めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の一実施形態である修飾タンパク質同定評価装置のブロック構成図。
【図２】図１中のデコイデータベース作成部を中心とする要部のブロック構成図。
【図３】デコイデータベース作成時の処理の流れを示すフローチャート。
【図４】デコイデータベース作成の過程で得られる情報の一例を示す模式図。
【図５】内在性ペプチドデータベースの一例を示す図。
【図６】デコイデータベース作成の具体例における、ターゲット配列ＰＴＭ出現頻度に対するデコイ配列ＰＴＭ出現頻度の比とデコイ配列上の登録ＰＴＭサイト総数との関係を示すグラフ。
【図７】デコイデータベース作成の具体例における、真性同定スペクトル数とＦＤＲとの関係の推定結果を示す図。
【図８】デコイデータベース作成の具体例における、バリアブルモディフィケーション法による検索結果とＰＴＭ対応内在性ペプチド検索法による検索結果との比較結果を示す図。
【図９】図８で示した三つの手法による同定結果を示すベン図。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明に係る内在性修飾ペプチド同定品質評価装置の一実施形態について、添付図面を参照して説明する。
図１は本実施形態による内在性修飾ペプチド同定品質評価装置のブロック構成図である。
【００２７】
この内在性修飾ペプチド同定品質評価装置１は、測定対象の試料に含まれる内在性修飾ペプチドのアミノ酸配列及び翻訳後修飾を同定するためのペプチド同定部１１における同定の品質、具体的には偽発見率を推定するものである。内在性修飾ペプチド同定品質評価装置１は、評価対象であるペプチド同定部１１のほかに、ターゲットデータベース１２、デコイデータベース作成部１３、デコイデータベース１４、偽発見率推定部１５などを備える。通常、データベース１２、１４以外の機能は、コンピュータにインストールされた専用のソフトウェアを該コンピュータ上で実行することにより実現される構成とすることができる。この場合、デコイデータベース作成部１３や偽発見率推定部１５は実質的にはソフトウェアで実現される機能である。また、ターゲットデータベース１２、デコイデータベース１４の実体はデータが所定の形式で格納されている記憶装置である。
【００２８】
なお、図１中に記載してある質量分析部２及びスペクトル解析部３は、試料中の内在性修飾ペプチドを同定する際に、ペプチド同定部１１にＭＳ2スペクトル情報を入力するために必要な構成要素であり、ペプチド同定部１１の同定品質を評価する際に用いられるものではない。
【００２９】
即ち、試料中の内在性修飾ペプチドを同定するに際し、質量分析部２は目的とする内在性修飾ペプチドを含む試料に対してＭＳ2測定を実行し、ＭＳ2スペクトル（又はｎが３以上であるＭＳnスペクトル）を取得する。スペクトル解析部３はＭＳ2スペクトル（又はＭＳnスペクトル）においてプロダクトイオン由来のピークを検出し、ピークの質量電荷比、信号強度、価数などの情報を集約したピークリストを作成する。そして、ピークリストをマススペクトル情報としてペプチド同定部１１に入力する。ペプチド同定部１１は、ターゲットデータベース１２に格納されているタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列及び翻訳後修飾の情報を参照して、与えられた実測のマススペクトル情報に基づく検索を実施し目的とする内在性修飾ペプチドを同定する。
【００３０】
ペプチド同定部１１の同定品質として偽発見率を求めるには、本来のペプチド配列や翻訳後修飾情報が収録されているデータベースの代わりに、偽のデコイ配列及び偽のデコイ翻訳後修飾情報（以下「デコイＰＴＭ情報」という）が収録されているデコイデータベースを参照した検索を実施する必要がある。デコイデータベース作成部１３はそのためのデコイデータベース１４を作成する機能を有する。
【００３１】
図２は図１中のデコイデータベース作成部１３を中心とする要部のブロック構成図、図３はデコイデータベース作成時の処理の流れを示すフローチャート、図４はデコイデータベース作成の過程で得られる情報の一例を示す模式図である。
【００３２】
図２に示すように、デコイデータベース作成部１３は機能ブロックとして、データベース分割部、データ読込み部、アミノ酸分布統計情報作成部、ＰＴＭ分布統計情報作成部、デコイ配列生成部１３５、デコイＰＴＭ情報生成部１３６、部分集合デコイデータベース構築部１３７、全体集合デコイデータベース構築部１３８、などを含む。
デコイデータベース作成部１３におけるデコイデータベース作成の処理手順の一例は次の通りである。
【００３３】
データベース分割部１３１は例えばよく知られているUniProtKBなどであるヒトタンパク質データベース等の修飾タンパク質のデータベースであるターゲットデータベース１２を読み込み、これを、共通のエントリを有さないつまりはエントリの重複のない複数の部分集合データベースに分割する（ステップＳ１）。次にデータ読込み部１３２は複数の部分集合データベースの一つからデータを読み込む（ステップＳ２）。
【００３４】
アミノ酸分布統計情報作成部１３３は、読み込まれたデータ中の各修飾タンパク質又は各修飾ペプチドのアミノ酸配列に基づいてアミノ酸毎の出現頻度を調べ、その出現頻度を示すアミノ酸分布統計情報を作成する（ステップＳ３）。一方、ＰＴＭ分布統計情報作成部１３４は、読み込まれたデータ中の修飾タンパク質又は修飾ペプチドにおける各翻訳後修飾分子についての修飾部位（結合しているアミノ酸の種類）の出現頻度を調べ、その出現頻度を示すＰＴＭ分布統計情報を作成する（ステップＳ４）。
【００３５】
次に、デコイ配列生成部１３５は、ステップＳ２においてデータ読込み部１３２により読み込まれた各タンパク質エントリについて、そのエントリに対応するアミノ酸配列と同じ配列長（つまりはアミノ酸残基数）のデコイ配列を、ステップＳ３で作成したアミノ酸分布統計情報に従った重み付けの下でランダムにアミノ酸を配列することにより作成する（ステップＳ５）。また、正規のアミノ酸配列中のアミノ酸をアミノ酸分布統計情報に従った重み付けの下でランダムに置き換えることで又は順列置換（配列の反転を含まない）により並べ替えることで、デコイ配列を作成してもよい。これにより、正規の修飾タンパク質又は修飾ペプチドのアミノ酸配列中に出現するアミノ酸の出現頻度に応じた偽のデコイ配列が生成される。ただし、部分集合データベースの配列によるアミノ酸分布統計情報として、ターゲット配列のスーパーセットとなるタンパク質配列（例えば、UniProtKBに登録されている分析対象生物種の登録タンパク質配列）のアミノ酸分布統計情報を用いてもよい。
【００３６】
次いでデコイＰＴＭ情報生成部１３６は、ステップＳ５で生成されたデコイ配列に対して、ステップＳ４で作成したＰＴＭ分布統計情報に従った重み付けの下で修飾の種類毎にランダムに修飾部位（アミノ酸残基）を決定する（ステップＳ６）。これにより、正規の修飾タンパク質又は修飾ペプチドにおいて出現する翻訳後修飾分子の出現頻度とその修飾部位の出現頻度に応じた偽のデコイＰＴＭ情報が生成される。なお、ステップＳ６では、ターゲット配列から生成されたペプチドとデコイ配列とで修飾部位数の分布（又は、全ペプチドの修飾部位総数）が一致するように重み付けを補正してもよい。
【００３７】
部分集合デコイデータベース構築部１３７は、ステップＳ５で生成されたデコイ配列、ステップＳ６で生成されたデコイＰＴＭ情報を収集し、これを元の部分集合データベースに収録されていた修飾タンパク質又は修飾ペプチドの配列の少なくとも一部と合わせて統合し、偽の情報を含むデコイ部分集合データベースを作成する（ステップＳ７）。そのあと、ステップＳ１において分割により作成された複数の部分集合データベースの全てについてステップＳ２〜Ｓ７の処理を実行したか否かを判定する（ステップＳ８）。そして、未処理の部分集合データベースがあればステップＳ８からＳ２へと戻り、未処理の部分集合データベースについてステップＳ２〜Ｓ７の処理を実行する。これにより、全ての部分集合データベースに対応してデコイ部分集合データベースが作成される。
【００３８】
さらに、全体集合デコイデータベース構築部１３８がステップＳ７で生成された複数の部分集合デコイデータベースを統合することで、ステップＳ１における分割前のターゲットデータベースに対応する全体集合デコイデータベースを作成し、これをデコイデータベース１４として登録する（ステップＳ９）。
以上の処理により、UniProtKB等の修飾タンパク質のデータベースに対応するデコイデータベースを作成することができる。
【００３９】
次に、デコイデータベースの作成の具体例とその評価結果について説明する。
ここでは、独国モザイク（Mosaiques）社が公開している尿中ペプチド配列データベースに登録されているペプチド配列データベース(Mosaiques DB、非特許文献３参照）を元に、特許文献２に記載の方法により、ペプチドの前駆体タンパク質の全長配列を参照して伸縮させることで作成したペプチドバリアント配列（１０〜３０残基）を収集して、内在性ペプチド同定用のペプチド配列データベースを構築した。このペプチド配列データベースに対して、Mosaiques DBに登録されているＰＴＭである酸化（ヒドロキシル化を含む）を受けていた修飾アミノ酸を、既知の翻訳後修飾情報としてデータベースに登録した。データベースのフォーマットとして、ＰＳＩ（Proteomics Standards Initiative）が提唱しているＰＥＦＦフォーマット（非特許文献４参照）を採用し、ペプチド配列エントリのヘッダ情報に翻訳後修飾情報を記載することで、内在性ペプチド同定用のターゲットデータベースを作成した。
【００４０】
図５は作成した内在性ペプチドデータベースの一例である。ここでは、ＰＥＦＦフォーマットを利用して、アクセッション情報に、ペプチドの前駆体タンパク質のアクセッションＩＤ（P02641）と、前駆体全長配列上におけるペプチドのＮ末端アミノ酸残基位置（705）及びＣ末端アミノ酸残基位置（723）とを記載している。また、ModResUnimodヘッダキーに翻訳後修飾情報を列挙している。例えば、図５中の（8|UNIMOD:35|Oxidation）は、ペプチドの８番目のアミノ酸残基であるプロリンが、Unimodの３５番のＩＤを持つ修飾である酸化（Oxidation）を受けることを意味している。
【００４１】
図３中のステップＳ２に相当する処理として、上記内在性ペプチドデータベースであるターゲットデータベースから、登録ペプチドのアミノ酸配列情報と翻訳後修飾情報とを読み込んだ。加えて、このターゲットデータベースのスーパーセットであるSwiss-Protからアミノ酸配列情報を読み込んだ。次に、図３中のステップＳ３に相当する処理として、Swiss-Prot及びターゲットデータベースから読み込んだアミノ酸情報について、タンパク質配列上で重複するアミノ酸を除いて得られたアミノ酸の出現頻度をアミノ酸分布統計情報として取得した。
【００４２】
図３中のステップＳ５に相当する処理として、ターゲットデータベースに登録されているペプチド配列と配列長が一致する配列を、上述したSwiss-Protデータベースから読み込んだアミノ酸分布統計情報に基づいてランダムに生成し、これをデコイ配列とした。一方、図３中のステップＳ４に相当する処理としては、まず、上述したように得られた翻訳後修飾情報に基づいて、タンパク質配列上で重複するアミノ酸を除いたアミノ酸に対するＰＴＭ出現頻度（ターゲット配列ＰＴＭ出現頻度）を求めた。この結果を表１に示す。ここで、Proはプロリン、Lysはリシン、Metはメチオニンである。次に、重複を含むターゲットデータベース登録ペプチド配列上の登録ＰＴＭサイト総数を求めた。この結果を表２に示す。
【表１】
2019185224.tif 000003
【表２】
2019185224.tif 000004
【００４３】
さらにまた、デコイ配列の生成により得られたデコイ配列上（重複あり）の修飾対象アミノ酸総数を求めた。この結果を表３に示す。表３において、合計欄の括弧内の数字は、ターゲットデータベースの修飾対象アミノ酸数に対する割合である。このように、重複ありの場合の修飾対象アミノ酸総数は、ターゲット配列の修飾対象アミノ酸総数の７０％%弱と、十分な信頼度では一致しない。
【表３】
2019185224.tif 000005
【００４４】
そこで、ターゲット配列ＰＴＭ出現頻度に比例したＰＴＭ出現頻度による重み付けに従ってデコイ配列上の修飾対象アミノ酸からＰＴＭサイトをランダムに選択し、デコイ配列上（重複あり）の登録ＰＴＭサイト総数を求めた。図６は、ターゲット配列ＰＴＭ出現頻度に対するデコイ配列ＰＴＭ出現頻度の比と、デコイ配列上の登録ＰＴＭサイト総数との関係を示すグラフである。図５から、上記比が約４．５である場合に、デコイ配列上の登録ＰＴＭサイト総数がターゲットデータベースと同程度になると見積もられる。表４は、この比が４．５であるときのデコイＤＢにおけるデコイＰＴＭサイト数である。表４で、合計欄の括弧内の数値は、ターゲットデータベース上の登録ＰＴＭサイト総数に対する割合である。
【表４】
2019185224.tif 000006
【００４５】
こうして、ターゲット配列ＰＴＭ出現頻度に対するデコイ配列ＰＴＭ出現頻度の比を４．５として求めた修飾物の種類と修飾部位とを、デコイデータベース用のデコイ翻訳後修飾情報として選定した。そして、上述したように得られたデコイ配列及びデコイ翻訳後修飾情報とを統合することで、翻訳後修飾情報が付加されたデコイ配列が収録されたデコイデータベースを作成した。
【００４６】
このようにして作成したデコイデータベースを評価するために、デコイデータベースとターゲットデータベースとを結合したペプチドデータベースについてＦＤＲ精度の比較を実施した。比較対象となるデータベースとして、デコイ配列からデコイ翻訳後修飾情報を除去したデコイ翻訳後修飾情報無しペプチドデータベースと、ＰＴＭ分布統計情報を取得する際にターゲット配列ＰＴＭ出現頻度に対するデコイ配列ＰＴＭ出現頻度の比として１．０（つまり図６において横軸上の位置が１．０）を選定して作成したデコイ配列を用いたＰＴＭ出現頻度補正無しペプチドデータベースと、を選んだ。
【００４７】
上記３種類のペプチドデータベースそれぞれについて、液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）による測定で得られた尿中ペプチド混合物由来のＭＳ／ＭＳスペクトル約７０００個に対して、検索エンジンCometを用いたＰＴＭ対応内在性ペプチド検索法を実施した。それによって同定されたデコイ配列数を元に結合ターゲット・デコイデータベース法に基づいて真性同定スペクトル数とＦＤＲとの関係を推定した。その結果を図７に示す。この結果から、ＦＤＲの実用的な値である０．０１〜０．０５の範囲において、今回作成したペプチドデータベースに対し、デコイ翻訳後修飾情報無しペプチドデータベースやＰＴＭ出現頻度補正無しペプチドデータベースを用いた場合に、真性同定スペクトル数を大きく見積もり過ぎていることが明らかになった。これは、デコイ翻訳後修飾情報無しペプチドデータベース及びＰＴＭ出現頻度補正無しペプチドデータベースのデコイ配列に対するＰＴＭ探索空間がターゲット配列に比べて小さ過ぎるためにＦＤＲを過小評価した結果である。
【００４８】
また、上述したペプチドデータベースに登録されているターゲット配列の前駆体タンパク質（プロプロテイン）の全長配列のみを収録した配列データベースをターゲットデータベースとして、上記と同様の方法により、デコイ配列が収録されたデコイ翻訳後修飾情報無しデコイデータベースを作成し、ターゲットデータベースと統合してプロプロテインデータベースを作成した。このプロプロテインデータベースは、ペプチドデータベースのスーパーセットとなるデータベースであり、登録ペプチド数はペプチドデータベースの約１０倍であった。
【００４９】
このプロプロテインデータベースとペプチドデータベースに対し、検索エンジンCometを用いて上述のＬＣ−ＭＳで測定された尿中ペプチド混合物由来のＭＳ／ＭＳスペクトルをバリアブルモディフィケーション法（データベースに登録された翻訳後修飾情報を用いない従来のＰＴＭ検索法）により検索した結果と、上述のＰＴＭ対応内在性ペプチド検索法によるペプチドデータベースの検索結果との比較を行った。この比較結果を図８に示す。ペプチドデータベースに対してＰＴＭ対応内在性ペプチド検索法を実施することにより、従来のバリアブルモディフィケーション法によるＰＴＭ検索に比べて、ＦＤＲが実用的な値である０．０１〜０．０５の範囲において同定感度が向上することが確認できた。
【００５０】
また、図９は、図８で示した三つの手法による同定結果をベン図にまとめたものである。ペプチドデータベースのアミノ酸配列の集合はプロプロテインデータベースの部分集合であり、そのペプチドの登録数は１／１０程度に過ぎないが、図９から、プロプロテインデータベースで同定されたペプチドのうち、同定信頼度の高い結果の殆どをペプチドデータベースで同定できており、十分な網羅性を有していることが明らかになった。
【００５１】
さらにまた、比較した三つの手法で重複して同定された結果についてのＦＤＲが、同定結果全体のＦＤＲに比べて小さいことが判明した。このような評価が実現できるのは、本発明による同定品質評価方法では、ＰＴＭ対応内在性ペプチド検索法で探索対象となったペプチドデータベースのデコイ修飾ペプチドの全てが、バリアブルモディフィケーション法によりペプチドデータベースやプロプロテインデータベースに対しても探索対象となるために、各データベースやＰＴＭ検索法で重複して同定された結果からも偽発見ペプチド数を見積もることができるためである。
【００５２】
次に、デコイデータベースのより詳細な作成例を、図４により説明する。この例は、３種類の共通するエントリを持つターゲットデータベースに対してそれぞれデコイデータベースを作成する例である。
【００５３】
三つのターゲットデータベースの中で最も多くの情報を含む最上位のデータベース１２ａは、UniProtKB等のヒトタンパク質データベースである。測定対象の試料がヒトの尿内に存在する内在性の修飾ペプチド（尿中ペプチド）である場合、UniProtKBの部分集合であるタンパク質配列データベースとして、既知の文献等で報告されている尿中ペプチドのプロタンパク質配列を収録したものを一つの部分集合データベース（タンパク質配列データベース）とする。これが二つめのターゲットデータベース１２ｂである。さらにまた、特許文献１に記載されているように、生体内で分解されて生じた内在性ペプチド配列として、既知の文献等で報告されている尿中の内在性ペプチド、又はその部分配列を指定個数以上含むペプチド配列を収録したものを最下位の部分集合データベース（ペプチド配列データベース）とする。これが、三つめのターゲットデータベース１２ｃである。
【００５４】
ターゲットデータベース１２に含まれる上記三つのタンパク質又はペプチドの配列データベース１２ａ、１２ｂ、１２ｃは、UniProtKB又はその部分集合の配列である。したがって、それら三つのデータベース間には共通するエントリが含まれる。そのため、尿試料を精製することで得られたペプチドを質量分析（ＭＳ／ＭＳ分析）することで取得されたＭＳ／ＭＳスペクトルから求めたピーク情報に基づくペプチドの検索を実施すると、ターゲットデータベース１２に含まれる複数のデータベースから重複して同じペプチドが同定されるものと推定される。
【００５５】
実際には、部分集合データベースである尿中ペプチドのタンパク質配列データベース１２ｂに収録されている配列のアミノ酸組成と、さらにその部分集合データベースであるペプチド配列データベース１２ｃに収録されている配列のアミノ酸組成との間では殆ど違いがない。そこで、この場合には、アミノ酸分布統計情報及びＰＴＭ分布統計情報とについては尿中ペプチドのタンパク質配列データベース１２ｂに基づいて作成し、これを、尿中ペプチドのタンパク質配列データベース１２ｂに対応するデコイデータベースの作成のみならず、ペプチド配列データベース１２ｃに対応するデコイデータベースの作成にも用いる。
【００５６】
一方、UniProtKB（最上位のタンパク質配列データベース１２ａ）から尿中ペプチドのタンパク質配列データベース１２ｂを除いた残りは、その尿中ペプチドのタンパク質配列データベース１２ｂとは共通のエントリを持たないデータの集合である。即ち、これは、最上位のタンパク質配列データベース１２ａを二つに分割し、一方を尿中ペプチドのタンパク質配列データベース１２ｂとし、他方を差集合データベース１２ｄにしたことと同じであり、この差集合データベース１２ｄも部分集合データベースである。この差集合データベース１２ｄに収録されているタンパク質と尿中ペプチドのタンパク質配列データベース１２ｂに収録されているタンパク質とではアミノ酸組成が異なる。そこで、この差集合データベース１２ｄについては尿中ペプチドのタンパク質配列データベース１２ｂとは別に、アミノ酸分布統計情報及びＰＴＭ分布統計情報を作成する。
【００５７】
こうして、尿中ペプチドのタンパク質配列データベース１２ｂ及び差集合データベース１２ｄに基づいてそれぞれアミノ酸分布統計情報及びＰＴＭ分布統計情報を作成したあと、それを用いて、各データベースの各タンパク質エントリと同じ配列数のデコイ（アミノ酸）配列を上述の手順で作成する。また作成された各デコイ配列に対し、デコイＰＴＭ付加情報としてＰＴＭ分布統計情報に基づいてデコイＰＴＭ付加情報を決定する。そして、作成したデコイ配列とデコイＰＴＭ付加情報を元のデータベース中のデータと統合することで部分集合デコイデータベース１４ｂ及び差集合デコイデータベース１４ｄをそれぞれ作成し、さらにそれらを統合して最上位のデータベース１２ａに対応する最上位デコイデータベース１４ａを作成する。
こうして、UniProtKBに対応するデコイデータベースを作成することができる。
【００５８】
なお、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００５９】
１…内在性修飾ペプチド同定品質評価装置
１１…ペプチド同定部
１２…ターゲットデータベース
１２ａ…最上位タンパク質配列データベース
１２ｂ…部分集合タンパク質配列データベース
１２ｃ…ペプチド配列データベース
１２ｄ…差集合データベース
１３…デコイデータベース作成部
１３１…データベース分割部
１３２…データ読込み部
１３３…アミノ酸分布統計情報作成部
１３４…ＰＴＭ分布統計情報作成部
１３５…デコイ配列生成部
１３６…デコイＰＴＭ情報生成部
１３７…部分集合デコイデータベース構築部
１３８…全体集合デコイデータベース構築部
１４…デコイデータベース
１４ａ…最上位デコイデータベース
１４ｂ…部分集合デコイタンパク質データベース
１４ｂ…部分集合デコイペプチド配列データベース
１４ｄ…差集合デコイデータベース
１５…偽発見率推定部
２…質量分析部
３…スペクトル解析部
【図１】
2019185224.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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