(57)【要約】      （修正有）【課題】ホスホケトラーゼ酵素の異種発現を介し、細胞においてメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、及び／又はイソプレノイドを産生させる方法の提供。【解決手段】イソプレンを産生することのできる組換え細胞であって、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、（ｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、及び（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸と、を含み、好適な培地で前記組換え細胞を培養することにより、イソプレンの産生が得られる、組換え細胞を提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレンを産生することのできる組換え細胞であって、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、（ｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、及び（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸と、を含み、好適な培地で前記組換え細胞を培養することにより、イソプレンの産生が得られる、組換え細胞。
【請求項２】
ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている前記１種以上の異種核酸が、キシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸を合成することができる、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている前記１種以上の異種核酸が、フルクトース６−リン酸からエリスロース４−リン酸及びアセチルリン酸を合成することができる、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている前記異種核酸が、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、エンテロコッカス・ガリニアラム（Enterococcus galliniarum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutilicum）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、パントエア（Pantoea）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatili）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）からなる群から選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている前記異種核酸が、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、エンテロコッカス・ガリニアラム（Enterococcus galliniarum）、及びクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutilicum）からなる群から選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている前記異種核酸が植物のイソプレンシンターゼポリペプチドである、請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）、又はウラジロハコヤナギとヤマナラシの交雑種（Populus alba x Populus tremula）由来のポリペプチドである、請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）又はプエラリア・ロバタ（Pueraria lobata）、ヤマナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、ポプラ・ニグラ（Populus nigra）、及びポプラ・トリコカルパ（Populus trichocarpa）からなる群から選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項９】
前記完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドが、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを生成する酵素；（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素；（ｅ）メバロン酸５−リン酸を５−ジホスホメバロン酸に変換する酵素；及び（ｆ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素から選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項１０】
前記組換え細胞が、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を更に含む、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
前記１種以上の核酸が、誘導型プロモータ又は構成型プロモータ下に配置される、請求項１に記載の細胞。
【請求項１２】
前記１種以上の核酸が、１つ以上の多コピープラスミドにクローニングされる、請求項１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記１種以上の核酸が、前記細胞の染色体に組み込まれる、請求項１に記載の細胞。
【請求項１４】
前記組換え細胞が、グラム陽性菌細胞、グラム陰性菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、藻類細胞、又は酵母細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項１５】
前記組換え細胞が、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、大腸菌（Escherichia coli）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisieae）、及びヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）からなる群から選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項１６】
イソプレノイド前駆体を産生することのできる組換え細胞であって、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸とを含み、好適な培地で前記組換え細胞を培養することによりイソプレノイド前駆体の産生が得られる、組換え細胞。
【請求項１７】
ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている前記１種以上の異種核酸が、キシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸を合成することができる、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている前記１種以上の異種核酸が、フルクトース６−リン酸からエリスロース４−リン酸及びアセチルリン酸を合成することができる、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１９】
ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている前記異種核酸が、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、エンテロコッカス・ガリニアラム（Enterococcus galliniarum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutilicum）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、パントエア（Pantoea）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatili）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）からなる群から選択される、請求項１６に記載の細胞。
【請求項２０】
ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている前記異種核酸が、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、エンテロコッカス・ガリニアラム（Enterococcus galliniarum）、及びクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutilicum）からなる群から選択される、請求項１６に記載の細胞。
【請求項２１】
前記完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドが、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを生成する酵素；（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素；（ｅ）メバロン酸５−リン酸を５−ジホスホメバロン酸に変換する酵素；及び（ｆ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素から選択される、請求項１６に記載の細胞。
【請求項２２】
前記１種以上の核酸が、誘導型プロモータ又は構成型プロモータ下に配置される、請求項１６に記載の細胞。
【請求項２３】
前記１種以上の核酸が、１つ以上の多コピープラスミドにクローニングされる、請求項１６に記載の細胞。
【請求項２４】
前記１種以上の核酸が、前記細胞の染色体に組み込まれる、請求項１６に記載の細胞。
【請求項２５】
前記組換え細胞が、グラム陽性菌細胞、グラム陰性菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、藻類細胞、又は酵母細胞である、請求項１６に記載の細胞。
【請求項２６】
前記組換え細胞が、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、大腸菌（Escherichia coli）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisieae）、及びヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）からなる群から選択される、請求項１６に記載の細胞。
【請求項２７】
イソプレノイドを産生することのできる組換え細胞であって、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、（ｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸及び（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸とを含み、好適な培地で前記組換え細胞を培養することにより、イソプレノイドの産生が得られる、組換え細胞。
【請求項２８】
ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている前記１種以上の異種核酸が、キシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸を合成することができる、請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている前記１種以上の異種核酸が、フルクトース６−リン酸からエリスロース４−リン酸及びアセチルリン酸を合成することができる、請求項２７に記載の細胞。
【請求項３０】
ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている前記異種核酸が、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、エンテロコッカス・ガリニアラム（Enterococcus galliniarum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutilicum）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、パントエア（Pantoea）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatili）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）からなる群から選択される、請求項２７に記載の細胞。
【請求項３１】
ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている前記異種核酸が、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、エンテロコッカス・ガリニアラム（Enterococcus galliniarum）、及びクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutilicum）からなる群から選択される、請求項２７に記載の細胞。
【請求項３２】
前記イソプレノイドが、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン（sequiterpene）及びポリテルペンからなる群から選択される、請求項２７に記載の細胞。
【請求項３３】
前記イソプレノイドが、セスキテルペンである、請求項２７に記載の細胞。
【請求項３４】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン（famesene）、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン（terpindene）及びバレンセンからなる群から選択される、請求項２７に記載の細胞。
【請求項３５】
前記完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドが、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを生成する酵素；（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素；（ｅ）メバロン酸５−リン酸を５−ジホスホメバロン酸に変換する酵素；及び（ｆ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素から選択される、請求項２７に記載の細胞。
【請求項３６】
前記１種以上の核酸が、誘導型プロモータ又は構成型プロモータ下に配置される、請求項２７に記載の細胞。
【請求項３７】
前記１種以上の核酸が、１つ以上の多コピープラスミドにクローニングされる、請求項２７に記載の細胞。
【請求項３８】
前記１種以上の核酸が、前記細胞の染色体に組み込まれる、請求項２７に記載の細胞。
【請求項３９】
前記組換え宿主細胞が、グラム陽性菌細胞、グラム陰性菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、藻類細胞、又は酵母細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項４０】
前記組換え宿主細胞が、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、大腸菌（Escherichia coli）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisieae）、及びヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え細胞。
【請求項４１】
イソプレン産生法であって、（ａ）イソプレン産生に好適な条件下で請求項１に記載の組換え細胞を培養する工程、及び（ｂ）イソプレンを産生させる工程、を含む、方法。
【請求項４２】
イソプレノイド前駆体の産生法であって、（ａ）イソプレノイド前駆体の産生に好適な条件下で請求項１６に記載の組換え細胞を培養する工程、及び（ｂ）イソプレノイド前駆体を産生させる工程、を含む、方法。
【請求項４３】
イソプレノイドの産生法であって、（ａ）イソプレノイドの産生に好適な条件下で請求項２７に記載の組換え細胞を培養する工程、及び（ｂ）イソプレノイドを産生させる工程、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１１年１０月７日出願の、米国特許仮出願番号第６１／５４５，０８３号の優先権を主張する。この特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（参考文献による組み込み）
３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§  １．８２１（ｃ）及び（ｅ）に従い、ＡＳＣＩＩテキストとして提出された配列リストが、参照により本明細書に組み込まれる。テキストファイル名は、「６４３８４２００４０００＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」であり、テキストファイルの作成日は２０１２年１０月４日であり、及びＡＳＣＩＩテキストファイルのサイズは１０２，０７７バイトである。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、ホスホケトラーゼポリペプチドと、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、及びイソプレノイドを産生することのできるメバロン酸（ＭＶＡ）経路の１種以上のポリペプチドとを含む組換え培養細胞、並びにこれらの培養細胞を含む組成物、並びにこれを産生し及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｒ−メバロン酸は、アセチルＣｏＡをイソペンテニルジホスフェート及びジメチルアリールジホスフェートに変換するメバロン酸依存性生合成経路の中間体である。アセチルＣｏＡのメバロン酸への変換は、メバロン酸依存性生合成経路上流（ＭＶＡ経路）の、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性により触媒され得る。商業分野では、メバロン酸は、従来、生分解性ポリマーを製造する際の添加剤として化粧品に使用されており、他の化学物質を合成する際のキラル体の構成成分としての価値を有する。メバロン酸依存性生合成経路の下流は、メバロン酸依存性経路の最終産物であるイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生成する際の基質としてメバロン酸を利用する。ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰは、イソプレン並びにイソプレノイドの前駆体である。
【０００５】
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、各種合成ポリマー、特に合成ゴムの重要な出発物質である。イソプレンは石油の分留によって得ることもできるが、石油材料の精製には費用がかかり、かつ時間もかかる。石油分解生成物中のＣ５留分から生成されるイソプレン量はわずか約１５％にすぎない。イソプレンの重合により、年間約８００，０００トンのｃｉｓ−ポリイソプレンが製造されており、このポリイソプレンのほとんどはタイヤ及びゴム産業で使用されている。また、履物、機械製品、医療用品、スポーツ用品、及びラテックスなどのその他の製品では、共重合させたイソプレンが合成エラストマーとして使用されている。イソプレンはまた、さまざまな微生物、植物、及び動物種によって天然に生成される。特に、天然のイソプレン生合成に関しては、メバロン酸（ＭＶＡ）経路と非メバロン酸（ＤＸＰ）経路の２つの経路が同定されている。メバロン酸及び非メバロン酸経路の生成物は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）である。ＤＭＡＰＰは直接イソプレンに変換され得る。ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰはイソプレノイドに変換され得る。
【０００６】
これまでに２９，０００種以上のイソプレノイド化合物が同定されており、かつ毎年新規のイソプレノイドが発見されている。イソプレノイドは、主な構成単位としてイソプレノイド前駆体分子を使用して、より複雑なイソプレノイド構造を形成する、微生物及び植物種などの天然物から単離することができる。イソプレノイドは、細胞膜の流動性及び電子輸送を維持する手だてとなるため、多くの生命体及び細胞にとって非常に重要である。
天然では、イソプレノイドは、植物に含まれる天然の駆虫成分として多様な役割を果たし、桂皮、丁子及びショウガには特有の香りをもたらす。更に、製薬及び化学業界では、イソプレノイドを、薬剤、栄養補助剤、矯味矯臭剤、及び病害虫防除剤として使用する。これまでに、生態系における重要性及び広範な用途における有用性が考慮され、イソプレノイドは、科学者らによる関心を十分に集めている。
【０００７】
メバロン酸及びイソプレノイドを得る際の従来法としては、生物材料（例えば、植物、微生物及び動物）からの抽出、並びに製造所における部分合成又は全有機合成が挙げられる。しかしながら、このような手法は、殆どの場合十分なものではないことが判明している。特に、多くの場合、イソプレノイドの分子構造が複雑であることを考慮すると、一般的に複数の工程が必要とされる有機合成を実施して、所望の生成物を得るのは難しい。加えて、これらの化学合成の工程は、生物材料からイソプレノイドを抽出することのできる毒性の溶媒を使用することを伴う。更に、一般的に、生物材料はイソプレノイド分子をごく微量でしか含有しないことから、通常、これらの抽出及び精製方法では、所望のイソプレノイドの収率は比較的低くなる。残念なことに、イソプレノイドを比較的大量に得ることが難しいため、生物材料からのイソプレノイドの抽出の実用は限定されていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
イソプレン、イソプレノイド前駆体分子及びイソプレノイドの産生における近年の進歩により、ロバストな商業工程に必要とされる要求を十分に満たすことのできる速度、力価及び純度でのイソプレン及びイソプレノイドの産生方法が開示されているものの（例えば、国際特許公開第２００９／０７６６７６（Ａ２）号及び米国特許第７，９１５，０２６号を参照されたい）、尚もこれらの化合物の産生性及び収率を向上させる代替経路が必要とされている。
【０００９】
本明細書では、組換え培養細胞、これらの細胞の構成、並びにメバロン酸依存性生合成経路の中間体として産生されるメバロン酸を増加させるためのこれらの細胞の使用法、並びにメバロン酸に由来するイソプレノイド前駆体、イソプレン及び／又はイソプレノイドなどの分子の産生を増加させるためのこれらの細胞の使用法が提供される。
【００１０】
本明細書を通じ、各種特許、特許出願及び他の種類の刊行物（例えば、学術論文）を参照する。本明細書に引用する、本開示に関係する全ての特許、特許出願及び刊行物は、すべての目的に関し、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書で提供される発明は、特に、組換え細胞を成分として含む組成物、組換え細胞、並びにメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを産生する際のこれらの組換え細胞の製造及び使用方法を開示する。遺伝子操作を施した組換え細胞を使用して、ホスホケトラーゼポリペプチドを発現させることができる。本発明のホスホケトラーゼ酵素は、以下に更に詳細に記載される通りの多様な基質を利用することができる。適宜に、一態様では、本発明は、イソプレンを産生することのできる組換え細胞であって、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、（ｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、及び（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸と、を含む、細胞を提供し、好適な培地で組換え細胞を培養することにより、イソプレンの産生が得られる。一実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸は、キシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸を合成することができるものである。他の実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸は、フルクトース６−リン酸からエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸を合成することができるものである。他の実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている異種核酸は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、エンテロコッカス・ガリニアラム（Enterococcus galliniarum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutilicum）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、パントエア（Pantoea）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatili）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）からなる群から選択される。他の実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている異種核酸は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、エンテロコッカス・ガリニアラム（Enterococcus galliniarum）、及びクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutilicum）からなる群から選択される。別の実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は植物のイソプレンシンターゼポリペプチドである。別の実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）由来の、あるいはウラジロハコヤナギとヤマナラシの交雑種（Populus alba ｘ Populus tremula）由来のポリペプチドである。別の実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ（Pueraria montana又はPueraria lobata）、アメリカ��マナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、及びコットンウッド（Populus trichocarpa）からなる群から選択される。別の実施形態では、完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドは、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを生成する酵素；（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素；（ｅ）メバロン酸５−リン酸を５−ジホスホメバロン酸に変換する酵素；及び（ｆ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素から選択される。別の実施形態では、組換え細胞は、１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を更に含む。別の実施形態では、１種以上の核酸は、誘導型プロモータ又は構成現型プロモータの下に配置される。別の実施形態では、１種以上の核酸は、１種以上の多コピープラスミドにクローニングされる。別の実施形態では、１種以上の核酸は、細胞の染色体に組み込まれる。別の実施形態では、組換え細胞は、グラム陽性菌細胞、グラム陰性菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、藻類細胞、又は酵母細胞である。別の実施形態では、組換え細胞は、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、大腸菌（E. coli）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisieae）、及びヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）からなる群から選択される。
【００１２】
別の態様では、本発明は、イソプレノイド前駆体を産生することのできる組換え細胞であって、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸とを含む細胞を提供し、好適な培地で組換え細胞を培養することによりイソプレノイド前駆体の産生が得られる。一実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸は、キシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸を合成することができるものである。別の実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸は、フルクトース６−リン酸からエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸を合成することができるものである。他の実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている異種核酸は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、エンテロコッカス・ガリニアラム（Enterococcus galliniarum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutilicum）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、パントエア（Pantoea）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatili）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）からなる群から選択される。他の実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている異種核酸は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、エンテロコッカス・ガリニアラム（Enterococcus galliniarum）、及びクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutilicum）からなる群から選択される。別の実施形態では、完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドは、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを生成する酵素；（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素；（ｅ）メバロン酸５−リン酸を５−ジホスホメバロン酸に変換する酵素；及び（ｆ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素から選択される。別の実施形態では、１種以上の核酸は、誘導型プロモータ又は構成型プロモータの下に配置される。別の実施形態では、１種以上の核酸は、１種以上の多コピープラスミドにクローニングされる。別の実施形態では、１種以上の核酸は、細胞の染色体に組み込まれる。別の実施形態では、組換え細胞は、グラム陽性菌細胞、グラム陰性菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、藻類細胞、又は酵母細胞である。別の実施形態では、組換え��胞は、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、大腸菌（E. coli）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisieae）、及びヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）からなる群から選択される。
【００１３】
別の態様では、本発明は、イソプレノイドを産生することのできる組換え細胞であって、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、（ｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸及び（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸とを含む、細胞を提供し、好適な培地で組換え細胞を培養することにより、イソプレノイドの産生が得られる。一実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸は、キシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸を合成することができるものである。他の実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸は、フルクトース６−リン酸からエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸を合成することができるものである。他の実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている異種核酸は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、エンテロコッカス・ガリニアラム（Enterococcus galliniarum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutilicum）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、パントエア（Pantoea）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatili）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、及びラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）からなる群から選択される。他の実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている異種核酸は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、エンテロコッカス・ガリニアラム（Enterococcus galliniarum）、及びクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutilicum）からなる群から選択される。別の実施形態では、イソプレノイドは、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン（sequiterpene）及びポリテルペンからなる群から選択される。別の実施形態では、イソプレノイドはセスキテルペンである。別の実施形態では、イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン（famesene）、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン（terpindene）及びバレンセンからなる群から選択される。別の実施形態では、完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドは、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを生成する酵素；（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素；（ｅ）メバロン酸５−リン酸を５−ジホスホメバロン酸に変換する酵素；及び（ｆ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素から選択される。別の実施形態では、１種以上の核酸は、誘導型プロモータ又は構成型プロモータの下に配置される。別の実施形態では、１種以上の核酸は、１種以上の多コピープラスミドにクローン化される。別の実施形態では、１種以上の核酸は、細胞の染色体に組み込まれる。別の実施形態では、組換え宿主細胞は、グラム陽性菌細胞、グラム陰性菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、藻類細胞、又は酵母細胞である。別の実施形態では、組換え宿主細胞は、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、大腸菌（E. coli）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisieae）及びヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）からなる群から選択される。
【００１４】
別の態様では、本発明は、（ａ）上記の、及び本明細書に記載の任意の組換え細胞を、イソプレンの産生に好適な条件下で培養すること、及び（ｂ）イソプレンを産生させること、を含む、イソプレンの産生方法を提供する。別の態様では、本発明は、（ａ）上記の、及び本明細書に記載の任意の組換え細胞を、イソプレノイド前駆体の産生に好適な条件下で培養すること、及び（ｂ）イソプレノイド前駆体を産生させること、を含む、イソプレノイド前駆体の産生方法を提供する。別の態様では、本発明は、（ａ）上記の、及び本明細書に記載の任意の組換え細胞を、イソプレノイドの産生に好適な条件下で培養すること、及び（ｂ）イソプレノイドを産生させること、を含む、イソプレノイドの産生方法を提供する。
【００１５】
一部の態様では、組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、ＭＶＡ経路の１種以上の酵素をコードしている１種以上の核酸と、を含む。一部の態様では、組換え細胞は、キシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸を合成することのできるポリペプチドをコードしている異種核酸を含み、アセチルリン酸は、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、及び／又はイソプレノイドに変換される。他の態様では、組換え細胞は、フルクトース６−リン酸からエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸を合成することのできるポリペプチドをコードしている異種核酸を含み、アセチルリン酸は、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、及び／又はイソプレノイドへと変換される。
【００１６】
適宜に、特定の態様では、本発明は、メバロン酸の産生を増強させることのできる組換え細胞であって、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、ＭＶＡ経路上流の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸と、を含む、細胞を提供し、好適な培地で組換え細胞を培養することによりポリぺプチド及びメバロン酸の産生が得られる。特定の実施形態では、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まないメバロン酸産生細胞と比較して多量にメバロン酸を産生する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来するものである。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
【００１７】
他の態様では、本発明は、イソプレノイド前駆体を産生することのできる組換え細胞であって、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸とを含む細胞、を提供し、好適な培地で組換え細胞を培養することによりポリぺプチド及びイソプレノイド前駆体の産生が得られる。特定の実施形態では、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まないイソプレノイド前駆体産生細胞と比較して多量にイソプレノイド前駆体を産生する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来するものである。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
【００１８】
更に別の態様では、本発明は、イソプレンを産生することのできる組換え細胞であって、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、（ｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、及び（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸と、を含む、細胞を提供し、好適な培地で組換え細胞を培養することにより、ポリぺプチド及びイソプレンの産生が得られる。特定の実施形態では、本発明は、イソプレンの産生を増強させることのできる組換え細胞であって、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、（ｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、及び（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸と、を含む、細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まないイソプレン産生細胞と比較して多量にイソプレンを産生する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来するものである。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
【００１９】
更に別の態様では、本発明は、イソプレノイドを産生することのできる組換え細胞であって、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、（ｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、及び（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸と、を含む、細胞を提供し、好適な培地で組換え細胞を培養することによりポリぺプチドの産生が得られ、細胞は、回収可能な量でイソプレノイドを産生することのできるものである。特定の実施形態では、本発明はイソプレノイドの産生を増強させることのできる組換え細胞であって、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、（ｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、及び（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸とを含む、細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まないイソプレノイド産生細胞と比較して多量のイソプレノイドを産生する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来するものである。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。本開示の任意の態様では、イソプレノイドは、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン（sequiterpene）及びポリテルペンからなる群から選択される。一態様では、イソプレノイドはセスキテルペンである。別の態様では、イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン（famesene）、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン（terpindene）及びバレンセンからなる群から選択される。
【００２０】
特定の実施形態では、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを産生することのできる組換え細胞は、キシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸を合成することのできるポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を含む。一態様では、キシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸を合成することのできるポリペプチドをコードしている１種以上の核酸は、ホスホケトラーゼ遺伝子である。別の態様では、ホスホケトラーゼ遺伝子は、（Lactobacillus）属由来の遺伝子である。別の態様では、ホスホケトラーゼ遺伝子は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）属由来のものである。別の態様では、ホスホケトラーゼ遺伝子は、次のアミノ酸配列：
【００２１】
2019030315.tif 000003
を有するタンパク質をコードする。
【００２２】
他の実施形態では、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを産生することのできる組換え細胞は、フルクトース−６−リン酸からエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸を合成することのできるポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を含む。一態様では、フルクトース６−リン酸からエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸を合成することのできるポリペプチドをコードしている１種以上の核酸は、ホスホケトラーゼ遺伝子である。別の態様では、ホスホケトラーゼ遺伝子は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）由来の遺伝子である。別の態様では、ホスホケトラーゼ遺伝子は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）属亜種のインファンティス（infantis）由来である。別の態様では、ホスホケトラーゼ遺伝子は、次のアミノ酸配列：
【００２３】
2019030315.tif 000004
を有するタンパク質をコードする。
【００２４】
一態様では、本明細書に記載の本発明は、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン及び／又はイソプレノイドを産生することのできる組換え細胞であって、キシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸を合成することのできるポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、次の：（ａ）マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成するペプチド；（ｂ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１種以上のポリペプチド、をコードしている１種以上の核酸と、を含む細胞を提供し、好適な培地で組換え細胞を培養することにより、ポリぺプチドの産生及びメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン及び／又はイソプレノイドの合成が得られる。一態様では、キシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸を合成することのできるポリペプチドをコードしている１種以上の核酸は、ホスホケトラーゼ遺伝子である。一態様では、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成するペプチドは、ストレプトマイセス（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０に由来するペプチドである。一態様では、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成するペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００２５】
別の態様では、本発明は、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン及び／又はイソプレノイドイソプレンを産生することができ、フルクトース６−リン酸からエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸を合成することのできるポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、（ａ）マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成するペプチド；（ｂ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１種以上のポリペプチド、をコードしている１種以上の核酸と、を含む、組換え細胞を提供し、好適な培地で組換え細胞を培養することにより、ポリぺプチドの産生、並びにメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン及び／又はイソプレノイドの合成が得られる。一態様では、フルクトース６−リン酸からエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸を合成することのできるポリペプチドをコードしている１種以上の核酸は、ホスホケトラーゼ遺伝子である。一態様では、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成するペプチドは、ストレプトマイセス（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０に由来するペプチドである。
一態様では、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成するペプチドは、配列番号５の酸配列（acid sequence）を有するペプチドである。
【００２６】
別の態様では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸は、配列番号２のアミノ酸配列に対して８０％以上同一であるアミノ酸配列を有し、かつキシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸を合成する機能を有するポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸は、配列番号２のアミノ酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする。別の態様では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸は、配列番号４のアミノ酸配列に対して８０％以上同一であるアミノ酸配列を有し、かつフルクトース６−リン酸からエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸を合成する機能を有するポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸は、配列番号４のアミノ酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
【００２７】
本開示の任意の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、植物のイソプレンシンターゼポリペプチドである。本開示の任意の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）、ウラジロハコヤナギとヤマナラシの交雑種（Populus alba x Populus tremula）由来のポリペプチドである。本開示の任意の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ（Pueraria montana又はPueraria lobata）、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、及びコットンウッド（Populus trichocarpa）からなる群から選択される。他の態様では、植物のイソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ（kudzu）イソプレンシンターゼポリペプチドである。別の態様では、イソプレンシンターゼは、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号及び同第２０１１／００７６７４３号に記載のものなどの遺伝子操作を施されたイソプレンシンターゼである。
【００２８】
本開示の任意の態様では、本発明は、メバロン酸の産生に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作した細胞を含む、組換え宿主細胞、又はそれらの子孫細胞であって、（ａ）クエン酸シンターゼ、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ、（ｃ）酢酸キナーゼ、（ｄ）乳酸脱水素酵素；（ｅ）グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素、（ｆ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、（ｇ）ホスホグルコン酸デヒドラターゼ、（ｈ）２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ、（ｉ）ホスホフルクトキナーゼ、（ｊ）トランスケトラーゼ、（ｋ）トランスアルドラーゼ、（ｌ）リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ、及び／又は（ｍ）リボース−５−リン酸エピメラーゼ、からなる群の１種以上の酵素の活性が調節されている、細胞を提供する。
【００２９】
本明細書において、任意の態様では、細胞には、（ａ）リステリア・グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｂ）エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｃ）エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；（ｄ）エンテロコッカス・カセリフラブス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子；並びに（ｅ）エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子、からなる群から選択されるｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を更に含ませることができる。
【００３０】
特定の態様では、ＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸は異種核酸である。他の態様では、ＭＶＡ経路に関係する１つ以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸は、内在性の核酸の複製である。本開示における任意の態様では、１つ以上のＭＶＡ経路に関係するポリペプチドは、（ａ）２分子のアセチル−ＣｏＡを縮合させてアセトアセチル−ＣｏＡを生成する酵素、（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）、（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素、（ｄ）メバロン酸をリン酸化してメバロン酸５−リン酸を生成する酵素、（ｅ）メバロン酸５−リン酸を５−ジホスホメバロン酸に変換する酵素、（ｆ）メバロン酸５−リン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、並びに（ｇ）イソペンテニルピロリン酸をジメチルアリールジホスフェートへと変換する酵素、から選択できる。本開示における任意の態様では、１つ以上のＭＶＡ経路に関係するポリペプチドは、（ａ）アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素、（ｃ）メバロン酸をリン酸化してメバロン酸５−リン酸を生成する酵素、（ｄ）メバロン酸５−リン酸を５−ジホスホメバロン酸に変換する酵素、並びに（ｅ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、から選択される。
【００３１】
本開示の任意の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸ヘとリン酸化する酵素は、メタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼ、ラクトバチルス（Lactobacillus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセス（Streptomyces）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチド、又はメタノコッコイド・バートニィ（M. burtonii）メバロン酸キナーゼ、からなる群から選択することができる。本開示における任意の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸へとリン酸化する酵素はメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼである。
【００３２】
本開示における任意の態様では、組換え細胞は、１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路に関係する１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を更に含み得る。一態様では、ＤＸＰ経路に関係するポリペプチドを１種以上コードしている１種以上の核酸は、異種核酸である。他の態様では、ＤＸＰ経路に関係する１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸は、内在性の核酸の複製である。特定の態様では、ＤＸＰ経路に関係するポリペプチドは、（ａ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）、（ｂ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）、（ｃ）４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＭＣＴ）、（ｄ）４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＣＭＫ）、（ｅ）２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＭＣＳ）、（ｆ）１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸シンターゼ（ＨＤＳ）、及び（ｇ）１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸レダクターゼ（ＨＤＲ）からなる群から選択される。他の態様では、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチドはＤＸＳである。
【００３３】
本開示の任意の態様では、１種以上の異種核酸は、誘導型プロモータ又は構成型プロモータの下に配置される。本開示の任意の態様では、１種以上の異種核酸は、１種以上の多コピープラスミドにクローン化される。本開示の任意の態様では、１種以上の異種核酸は、細胞の染色体に組み込まれる。
【００３４】
本開示の任意の態様では、組換え宿主細胞は、細菌細胞、藻類細胞、真菌細胞、酵母細胞、又はシアノバクテリア細胞である。一態様では、宿主細胞は細菌細胞である。別の態様では、細菌細胞はグラム陽性菌細胞又はグラム陰性菌細胞である。別の態様では、細菌細胞は、大腸菌（E. coli）、ラクトバチルス・アシドフィルス（L. acidophilus）、シュードアルテロモナス・シトレア（P. citrea）、バチルス・スブチリス（B. subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシィ（B. clausii）、バチルス・ハロドュランス（B. halodurans）、バチルス・メガテリウム（B. megaterium）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サーキュランス（B. circulans）、バチルス・ロータス（B. lautus）、バチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、ストレプトマイセス・アルバス（S. albus）、ストレプトマイセス・リビダンス（S. lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（S. coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（S. griseus）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）及びシュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞からなる群から選択される。別の態様では、細菌細胞は、大腸菌（E. coli）細胞である。別の態様では、細菌細胞は、ラクトバチルス・アシドフィルス（L. acidophilus）細胞である。別の態様では、藻類細胞である。別の態様では、藻類細胞は緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ミドリムシ類、クロミスタ類、又は渦鞭毛藻類からなる群から選択される。別の態様では、宿主細胞は真菌細胞である。別の態様では、真菌細胞は糸状菌である。別の態様では、宿主細胞は酵母細胞である。別の態様では、酵母細胞は、酵母菌（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア（Pichia sp.）、又はカンジダ（Candida sp.）からなる群から選択される。別の態様では、酵母細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞である。
【００３５】
別の態様では、本発明は、イソプレノイドを産生させることのできる組換え宿主細胞であって、キシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸を合成することのできるポリペプチドをコードしている１種以上の核酸と、（ａ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼをコードしている１種以上の核酸；及び（ｂ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、をコードしている１種以上の核酸と、を含む、細胞を提供し、好適な培地で組換え宿主細胞を培養することにより、ポリぺプチドの産生及び１種以上のイソプレノイドの合成が得られる。一態様では、（ｂ）のＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸は、異種核酸である。本開示の任意の態様では、ＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドは、（ａ）アセトアセチルＣｏＡをＨＭＧ−Ｃｏ−Ａに変換する酵素；（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｃ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素；（ｄ）メバロン酸５−リン酸を５−ジホスホメバロン酸に変換する酵素；及び（ｅ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、からなる群から選択される。
【００３６】
別の態様では、本発明は、イソプレノイドを産生させることのできる組換え宿主細胞であって、フルクトース６−リン酸からエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸を合成することのできるポリペプチドをコードしている１種以上の核酸と、（ａ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼをコードしている１種以上の核酸；及び（ｂ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、をコードしている１種以上の核酸と、を含む、細胞を提供し、好適な培地で組換え細胞を培養することにより、ポリぺプチドの産生及び１種以上のイソプレノイドの合成が得られる。一態様では、（ｂ）のＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸は、異種核酸である。本開示の任意の態様では、ＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドは、（ａ）アセトアセチルＣｏＡをＨＭＧ−Ｃｏ−Ａの形態に変換する酵素；（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｃ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素；（ｄ）メバロン酸５−リン酸を５−ジホスホメバロン酸に変換する酵素；及び（ｅ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、からなる群から選択される。
【００３７】
別の態様では、本発明は、メバロン酸の産生方法であって：（ａ）（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチド；（ｉｉ）、をコードしている１種以上の異種核酸を含む組換え宿主細胞を培養すること、及び（ｂ）メバロン酸を産生させること、を含む、産生方法を提供する。一態様では、方法は、組換え宿主細胞により産生されたメバロン酸を回収することを更に含む。特定の実施形態では、本方法により、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まないメバロン酸産生細胞と比較して多量にメバロン酸が産生される。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来するものである。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
【００３８】
他の態様では、本発明は、イソプレノイド前駆体を産生させる方法であって、（ａ）（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸；（ｉｉ）及び完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を含む組換え宿主細胞を培養すること、並びに（ｂ）イソプレノイド前駆体を産生させる工程を含む、方法を提供する。一態様では、方法は、組換え宿主細胞により産生されたイソプレノイドを回収することを更に含む。特定の実施形態では、方法は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まないイソプレノイド前駆体産生細胞と比較して多量にイソプレノイド前駆体を産生する組換え細胞を含む。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来するものである。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
【００３９】
更に別の態様では、本発明は、イソプレンの産生方法であって、（ａ）（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸；（ｉｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸；及び（ｉｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸を含む、組換え宿主細胞を培養すること、並びに（ｂ）イソプレンを産生させることを含む、方法を提供する。一態様では、方法は、組換え宿主細胞により産生されたイソプレノイドを回収することを更に含む。特定の実施形態では、方法は、イソプレンの産生を増強させることのできる組換え細胞を含み、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、（ｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、及び（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸とを含み、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まないイソプレン産生細胞と比較して多量にイソプレンを産生する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来するものである。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
【００４０】
更に他の態様では、本発明は、イソプレノイドの産生方法であって、（ａ）（ｉ）ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸；（ｉｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸；及び（ｉｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸を含む、組換え宿主細胞を培養すること、並びに（ｂ）イソプレノイドを産生させること、を含む、方法を提供する。一態様では、方法は、組換え宿主細胞により産生されたイソプレノイドを回収することを更に含む。特定の実施形態では、方法は、イソプレノイドの産生を増強させることのできる組換え細胞を含み、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、（ｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、及び（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸と、を含み、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まないイソプレノイド産生細胞と比較して多量のイソプレノイドを産生する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来するものである。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。本開示の任意の態様では、イソプレノイドは、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン（sequiterpene）及びポリテルペンからなる群から選択される。一態様では、イソプレノイドはセスキテルペンである。別の態様では、イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン（famesene）、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン（terpindene）及びバレンセンからなる群から選択される。
【００４１】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の組換え細胞を使用してメバロン酸を産生する方法を提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の組換え細胞を使用してイソプレノイド前駆体を産生する方法を提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の組換え細胞を使用してイソプレンを産生する方法を提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の組換え細胞を使用してイソプレノイド前駆体を産生する方法を提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の組換え細胞を使用してイソプレノイドを産生する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】大腸菌（E. coli）における、グルコース代謝の代謝経路を示す図。ＡＴＰ又はＮＡＤＨの産生又は使用に関連する反応、並びに炭素の取り込みに関係する重要な酵素を表す。略記「Ｐ５Ｐ」は、代謝産物キシルロース５リン酸、リブロース−５リン酸、及びリボース−５リン酸を包含して指す。略記「トリオース−３Ｐ」は、代謝生成物グリセルアルデヒド３リン酸及びジヒドロキシアセトンリン酸を包含して指す。
【図２】ホスホケトラーゼ（ＰＫＴ）が存在するよう遺伝子操作された代謝経路を示す図。ＰＫＴは、基質の選好性に基づき２種類、すなわち、Ｘ５Ｐのみに作用するキシルロース−５−リン酸（Ｘ５Ｐ）ホスホケトラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．９）と、同程度の活性でＸ５Ｐ及びＦ６Ｐの両方に作用するキシルロース−５−リン酸／フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）ホスホケトラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．２２）とに分類される。ＰＫＴにより触媒される反応において、Ｆ６Ｐ及び／又はＸ５Ｐから生成されたアセチルリン酸（Ａｃ−Ｐ）は、続いて、ＭＶＡ経路において使用されるアセチル−ＣｏＡへと変換される。ＰＫＴにより触媒される反応のその他の生成物、すなわちそれぞれＸ５Ｐ及びＦ６Ｐから産生されるグリセルアルデヒド３−リン酸（ＧＡＰ）及びエリスロース４−リン酸（Ｅ４Ｐ）を、代謝経路を操作すること介して再生し、収率を最大化することができる。
【図３】ホスホケトラーゼの反応物及び生成物を包含する反応を示す図。反応（１）及び（２）は、ホスホケトラーゼ酵素により触媒される反応を示す。反応（３）は、アセチル−Ｐのアセチル−ＣｏＡへの変換を示し、この変換はホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）酵素により触媒される。
【図４】代表的なホスホケトラーゼポリペプチドの一欄からなる表。この表は、単に例示するものであり、限定を意図するものではなく、したがって、キシルロース５−リン酸をグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸を変換する並びに／又はフルクトース６−リン酸をエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸に変換する任意のホスホケトラーゼポリペプチドが本発明における使用に際し企図される。
【図５】ホスホケトラーゼにより触媒される反応（ＰＫＴ）において、エリトロース４リン酸（Ｅ４Ｐ）及びグルコース−３リン酸（Ｇ３Ｐ）が生成されるよう遺伝子操作された経路が、セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ／フルクトース−１，６−ビスホスフェートアルドラーゼ（ＳＦＡ）及びセドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ／フルクトース−１，６−ビスホスフェートホスファターゼ（ＳＦＰ）により、ＰＫＴ基質へと逆変換されることを示す図。この図に示したその他の略記は、キシルロース５−リン酸（Ｘ５Ｐ）、セドヘプツロース−１，７−ビスホスフェート（Ｓ１，７ＢＰ）、セドヘプツロース−７−リン酸（Ｓ７Ｐ）、フルクトース−１，６−ビスホスフェート（Ｆ１，６ＢＰ）、フルクトース−６−ホスフェート（Ｆ６Ｐ）、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）を示す。Ｘは酵素反応の減弱又は欠失を示す。
【図６】ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）のホスホケトラーゼを発現しているプラスミドマップｐＣＭＰ１０９０。
【図７】ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のホスホケトラーゼを発現しているプラスミドマップｐＣＭＰ１０２９。
【図８】ビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）又はラクトバチルス・ロイテリ（L. reuteri）由来のホスホケトラーゼを発現させた場合、及び対照株による場合に得られる細胞内アセチル−リン酸（ｍＭ）を示すグラフ。
【図９】ビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）又はラクトバチルス・ロイテリ（L. reuteri）由来のホスホケトラーゼを発現している株、及び対照株の増殖曲線（ＯＤとして、時間関数として測定される）を示すグラフ。
【図１０】ビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）又はラクトバチルス・ロイテリ（L. reuteri）由来のホスホケトラーゼを発現している株及び対照株の振盪フラスコにおけるメバロン酸濃度（ｇ／Ｌ）を示すグラフ。
【図１１】１５Ｌ発酵における、グルコースに対する経時的なメバロン酸収率を、ホスホケトラーゼを発現している株（■）と対照株（◇）とを比較して示すグラフ。株は同一条件下で発酵させた。総収率は次の式を使用し算出した：グルコースに対する収率（重量％）＝総メバロン酸（ｔ）／［（供給重量（０）−供給重量（ｔ）＋８３）＊０．５９）］。式中、０．５９、グルコース供給溶液中のグルコースの割合（重量％）であり、８３は、ｔ＝０の時点で発酵槽に供給したバッチのｇ重量である。
【図１２】１５Ｌ発酵における、グルコースに対する経時的なメバロン酸力価を、ホスホケトラーゼを発現している株（■）と対照株（◇）とを比較して示すグラフ。株は同一条件下で発酵させた。力価は次式を用い算出した：力価＝ｇメバロン酸／Ｌ全発酵ブロス量。
【図１３】１５Ｌ発酵における、細胞産生性指数（ＣＰＩ）を、ホスホケトラーゼを発現している株（■）と対照株（◇）とを比較して示すグラフ。株は同一条件下で発酵させた。細胞生産性指数（ＣＰＩ）は、次式を使用して算出した：ＣＰＩ＝メバロン酸総重量（ｇ）／細胞の総乾燥重量（ｇ）。
【図１４】１５Ｌ規模で、ホスホケトラーゼを発現している株（■）を使用して発酵を行った場合、対照株（◇）と比較して発酵ブロス中に蓄積された酢酸が経時的に大幅に少なかったことを示すグラフ。株は同一条件下で発酵させた。酢酸はＨＰＬＣにより測定し、濃度は次式を用い記録した：［酢酸］＝酢酸重（ｇ）／全発酵ブロス（Ｌ）。
【図１５】ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）由来のホスホケトラーゼをコードしている核酸配列のヌクレオチド配列（配列番号１）。
【図１６】ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）由来のホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列（配列番号２）。
【図１７】ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）由来のホスホケトラーゼをコードしている核酸配列のヌクレオチド配列（配列番号３）。
【図１８】ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）由来のホスホケトラーゼ酵素のアミノ酸配列（配列番号４）。
【図１９】ストレプトマイセス（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０由来のアセト−アセチル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸配列（配列番号５）。
【図２０】リステリア・グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＥをコードしている核酸配列のヌクレオチド配列（配列番号６）。
【図２１】エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）由来のｍｖａＥをコードしている核酸配列のヌクレオチド配列（配列番号７）。
【図２２】エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＥをコードしているヌクレオチド配列（配列番号８）。
【図２３】エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＥをコードしているヌクレオチド配列（配列番号９）。
【図２４】リステリア・グレイ（L. grayi）由来のｍｖａＳをコードしている核酸配列のヌクレオチド配列（配列番号１０）。
【図２５】エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）由来のｍｖａＳをコードしている核酸配列のヌクレオチド配列（配列番号１１）。
【図２６】エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）由来のｍｖａＳをコードしている核酸配列のヌクレオチド配列（配列番号１２）。
【図２７】エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）由来のｍｖａＳをコードしている核酸配列のヌクレオチド配列（配列番号１３）。
【図２８】ｐＣＭＰ１０９０のヌクレオチド配列（配列番号１５）。
【図２８−１】ｐＣＭＰ１０９０のヌクレオチド配列（配列番号１５）。
【図２９】ｐＣＭＰ１０２９のヌクレオチド配列（配列番号１６）。
【図２９−１】ｐＣＭＰ１０２９のヌクレオチド配列（配列番号１６）。
【図３０】エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）由来のホスホケトラーゼをコードしているヌクレオチド配列（配列番号１７）。
【図３１】ノストック・パンクチホルム（N. punctiforme）由来のホスホケトラーゼをコードしているヌクレオチド配列（配列番号１８）。
【図３２】ロードシュードモナス・パルストリス（R. palustris）由来のホスホケトラーゼをコードしているヌクレオチド配列（配列番号１９）。
【図３３】パントエア（Pantoea）由来のホスホケトラーゼをコードしているヌクレオチド配列（配列番号２０）。
【図３４】ムチラギニバクター・パルジス（M. paludis）由来のホスホケトラーゼをコードしているヌクレオチド配列（配列番号２１）。
【図３５】サーモビフィダ・フスカ（T. fusca）由来のホスホケトラーゼをコードしているヌクレオチド配列（配列番号２２）。
【図３６】ビフィドバクテリウム・ブレビ（B. breve）由来のホスホケトラーゼをコードしているヌクレオチド配列（配列番号２３）。
【図３７】ラナンキュラス・アクアティリス（R. aquatilis）由来のホスホケトラーゼをコードしているヌクレオチド配列（配列番号２４）。
【図３８】ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）由来ののホスホケトラーゼをコードしているヌクレオチド配列（配列番号２５）。
【図３９】ガードネレラ・バギナリス（G. vaginalis）由来のホスホケトラーゼをコードしているヌクレオチド配列（配列番号２６）。
【図４０】ストレプトマイセス・アベルミティリス（S. avermitilis）由来のホスホケトラーゼをコードしているヌクレオチド配列（配列番号２７）。
【図４１】クロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）由来のホスホケトラーゼをコードしているヌクレオチド配列（配列番号２８）。
【図４２】ラクトバチルス・パラプランタラム（L. paraplantarum）由来のホスホケトラーゼをコードしているヌクレオチド配列（配列番号２９）。
【図４３】Ｆ６Ｐ基質の存在下での、ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）及びエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）由来のＰＫＬ活性を示すグラフで。
【図４４】Ｆ６Ｐ及びＸ５Ｐ基質の存在下での、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）のＰＫＬ活性を示すグラフ。
【図４５】Ｓ７Ｐ基質の存在下での、ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬを発現している株による代謝産物産生を示すグラフ。
【図４６】ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬ（ＥＷＬ１３１９）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬ（ＥＷＬ１３４１）、ノストック・パンクチホルム（N. punctiforme）ＰＫＬ（ＥＷＬ１３４４）、ロードシュードモナス・パルストリス（R. palustris）ＰＫＬ（ＥＷＬ１３４７）、パントエア（Pantoea）ＰＫＬ（ＥＷＬ１３５０）、又はサーモビフィダ・フスカ（T. fusca）ＰＫＬ（ＥＷＬ１３５３）を発現している株によるＭＶＡ収率を、ＰＫＬを発現しない対照（ＣＨＬ８７５）による収率を比較するグラフ。
【図４７】それぞれ、ホスホケトラーゼを発現している株におけるタンパク質発現を示すクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ａ）対照株ＣＨＬ８７５はＰＫＬを発現しておらず、ＥＷＬ１３１９株はビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）のＰＫＬを発現している。Ｂ）ＥＷＬ１３４１株はエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）のＰＫＬを発現しており、ＥＷＬ１３４４株はノストック・パンクチホルム（N. punctiforme）のＰＫＬを発現している。Ｃ）ＥＷＬ１３４７株はロードシュードモナス・パルストリス（R. palustris）のＰＫＬを発現しており、ＥＷＬ１３５０株はパントエア（Pantoea）のＰＫＬを発現している。及びＤ）ＥＷＬ１３５３株はサーモビフィダ・フスカ（T. fusca）のＰＫＬを発現している。それぞれ、誘導用のＩＰＴＧを増加させている。
【図４８】ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）のＰＫＬを発現している株によるタンパク質発現及びＭＶＡ収率を示すグラフ。Ａ）ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬを発現しているＭＶＡ産生株（■）、及びＰＫＬを発現しないＭＶＡ産生対照株（◆）のそれぞれによるＭＶＡ収率の比較。それぞれ、誘導用のＩＰＴＧを増加させている。Ｂ）ＥＷＬ１３１９株由来の全細胞溶解液の可溶性画分中のビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬのタンパク質発現。Ｃ）ＥＷＬ１３１９株由来の全細胞溶解液の不溶性画分中のビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬのタンパク質発現。
【図４９】クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、並びにエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬを発現している株によるタンパク質発現及びＭＶＡ収率を示すグラフ。Ａ）エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬを発現しているＭＶＡ産生株（■）、及びＰＫＬを発現しないＭＶＡ産生対照株（◆）のそれぞれによるＭＶＡ収率の比較。それぞれ、誘導用のＩＰＴＧを増加させている。Ｂ）エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）を発現しているＥＷＬ１３４１株由来の全細胞溶解液中のタンパク質発現。
【図５０】クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、並びにクロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ＰＫＬを発現している株によるタンパク質発現及びＭＶＡ収率を示すグラフ。Ａ）クロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ＰＫＬを発現しているＭＶＡ産生株（■）、及びＰＫＬを発現しないＭＶＡ産生対照株（◆）のそれぞれによるＭＶＡ収率の比較。それぞれ、誘導用のＩＰＴＧを増加させている。Ｂ）クロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）を発現しているＥＷＬ１３４１株由来の全細胞溶解液中のタンパク質発現。
【図５１】それぞれ１５Ｌ規模での発酵における、クロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ＰＫＬ発現株によるグルコースに対する累積ＭＶＡ収率を経時的に示すグラフ。▲は２０１２１０５８に４００μＭ  ＩＰＴＧで発現誘導したＥＷＬ１３５９を示す；ｘは２０１２１０５７に１００μＭ  ＩＰＴＧで発現誘導したＥＷＬ１３５９を示す；△は２０１２１０５６にＩＰＴＧを添加せずに実施したＥＷＬ１３５９を示す；及び◇は２０１２１０５９に１００μＭ  ＩＰＴＧで発現誘導したＣＨＬ８７５を示す。
【図５２】それぞれ１５Ｌ規模での発酵における、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬ発現株によるグルコースに対する累積ＭＶＡ収率を経時的に示すグラフ。■は２０１２０９７９に１００μＭ  ＩＰＴＧで発現誘導したＥＷＬ１３４１を示す；ｘは２０１２０９７８に５０μＭＩＰＴＧで発現誘導したＥＷＬ１３４１を示す；□は２０１２０９７７にＩＰＴＧを添加せずに実施したＥＷＬ１３４１を示す；◇は２０１２０９７６にＩＰＴＧを添加せずに実施したＣＨＬ８７５を示す；及び◆は２０１２０８２１にＩＰＴＧを添加せずに実施したＣＨＬ８７５を示す。
【図５３】エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬ又はクロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ＰＫＬを発現している株による、グルコースに対する累積ＭＶＡ収率を、添加したＩＰＴＧ量に対しプロットして示すグラフ。▲はＥＷＬ１３５９株を示す。■はＥＷＬ１３４１株を示す。◇はＣＨＬ８７５株を示す。
【図５４】エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬ又はクロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ＰＫＬを発現している株による、グルコースに対する累積ＭＶＡ収率を、ホスホケトラーゼ活性に対しプロットして示すグラフ。▲はＥＷＬ１３５９株を示す。■はＥＷＬ１３４１株を示す。◇はＣＨＬ８７５株を示す。
【図５５】それぞれ１５Ｌ規模での発酵における、クロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ＰＫＬ発現株による細胞性能指数を経時的に示すグラフ。●は２０１２１０５８に４００μＭ  ＩＰＴＧで発現誘導したＥＷＬ１３５９を示す；ｘは２０１２１０５７に１００μＭ  ＩＰＴＧで発現誘導したＥＷＬ１３５９を示す；△は２０１２１０５６にＩＰＴＧを添加せずに実施したＥＷＬ１３５９を示す；及び◇は２０１２１０５９に１００μＭ  ＩＰＴＧで発現誘導したＣＨＬ８７５を示す。
【図５６】それぞれ１５Ｌ規模での発酵における、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬ発現株による細胞性能指数を経時的に示すグラフ。■は２０１２０９７９に１００μＭ  ＩＰＴＧで発現誘導したＥＷＬ１３４１を示す；ｘは２０１２０９７８に５０μＭＩＰＴＧで発現誘導したＥＷＬ１３４１を示す；□は２０１２０９７７にＩＰＴＧを添加せずに実施したＥＷＬ１３４１を示す；◇は２０１２０９７６にＩＰＴＧを添加せずに実施したＣＨＬ８７５を示す；及び◆は２０１２０８２１にＩＰＴＧを添加せずに実施したＣＨＬ８７５を示す。
【図５７】ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ホスホケトラーゼ及びウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレンシンターゼ変異体を発現するｐＥＷＬ１４１８プラスミドマップ。
【図５８】エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ホスホケトラーゼ及びウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレンシンターゼ変異体を発現するｐＥＷＬ１４２１のプラスミドマップ。
【図５９】エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ホスホケトラーゼ、ウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレンシンターゼ変異体、及びメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼを発現するｐＥＷＬ１４３８のプラスミドマップ。
【図６０】クロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ホスホケトラーゼ及びウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレンシンターゼ変異体を発現するｐＥＷＬ１４３６のプラスミドマップ。
【図６１】クロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ホスホケトラーゼ、ウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレンシンターゼ変異体、及びメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼを発現するｐＥＷＬ１４４０のプラスミドマップ。
【図６２】ホスホケトラーゼを発現している株によるイソプレン収率を示すグラフ。Ａ）ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬ（ＥＷＬ１４２７株）又はエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬ（ＥＷＬ１４３０株）を発現している株によるイソプレン収率。Ｂ）クロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ＰＫＬを発現している株（ＥＷＬ１４４６）によるイソプレン収率対照株ＭＣＭ２１５８はＰＫＬを発現しない。
【図６３】ＩＰＴＧにより発現誘導されたものとしてタンパク質発現を示す、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ａ）ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬ（ＥＷＬ１４２７）又はエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬ（ＥＷＬ１４３０）を発現している株。Ｂ）クロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ＰＫＬを発現している株（ＥＷＬ１４４６）。対照株ＭＣＭ２１５８はＰＫＬを発現しない。
【図６４】クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、ＰＫＬを発現している株によるタンパク質発現及びイソプレン収率を示すグラフ。Ａ）エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬ（ＥＷＬ１４４９株）又はクロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ＰＫＬ（ＥＷＬ１４５２）を発現しているイソプレン産生株によるイソプレン収率を、ＰＫＬを発現していないＭＶＡ産生対照株（ＤＷ７１９株）によるものと比較する。それぞれ、誘導用のＩＰＴＧを増加させている。Ｂ）ＥＷＬ１４５２及びＥＷＬ１４４９株由来の全細胞溶解液中のタンパク質発現。
【図６５】それぞれ１５Ｌ規模での発酵における、ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬ（ＥＷＬ１４２７株）又はエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬ（ＥＷＬ１４３０株）によるグルコースに対する累積イソプレン収率を経時的に示すグラフ。▲は２０１２１１３６に１００μＭ  ＩＰＴＧで発現誘導したＥＷＬ１４３０を示す；■は２０１２１１３５に１００μＭ  ＩＰＴＧで発現誘導したＥＷＬ１４２７を示す；及び◇は２０１２１１３４に１００μＭ  ＩＰＴＧで発現誘導したＭＣＭ２１５８を示す。
【図６６】それぞれ１５Ｌ規模での発酵における、ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬ（ＥＷＬ１４２７株）又はエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬ（ＥＷＬ１４３０株）によるグルコースに対する瞬間イソプレン収率を経時的に示すグラフ。△は２０１２１１３６に１００μＭ  ＩＰＴＧで発現誘導したＥＷＬ１４３０を示す；□は２０１２１１３５に１００μＭ  ＩＰＴＧで発現誘導したＥＷＬ１４２７を示す；及び◇は２０１２１１３４に１００μＭ  ＩＰＴＧで発現誘導したＭＣＭ２１５８を示す。
【図６７】それぞれ１５Ｌ規模での発酵における、ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬ（ＥＷＬ１４２７）又はエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬ（ＥＷＬ１４３０）を発現している株による細胞性能指数を経時的に示すグラフ。▲は２０１２１１３６に１００μＭ  ＩＰＴＧで発現誘導したＥＷＬ１４３０を示す；■は２０１２１１３５に１００μＭ  ＩＰＴＧで発現誘導したＥＷＬ１４２７を示す；及び◇は２０１２１１３４に１００μＭ  ＩＰＴＧで発現誘導したＭＣＭ２１５８を示す。ｇＤＣＷは、総乾燥細胞重量（ｇ）を示す。
【図６８】エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬのインビトロ活性を示す一連のグラフ。Ａ）インビトロＡｃＰ比産生性Ｂ）インビトロＰＫＬ比活性。
【図６９】クロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ＰＫＬのインビトロ活性を示す一連のグラフ。Ａ）インビトロＡｃＰ比産生性Ｂ）インビトロＰＫＬ比活性。
【図７０】ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬ又はエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬを発現しているイソプレン産生株におけるインビトロＡｃＰ比産生性を示すグラフ。
【図７１】ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬ又はエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬを発現しているイソプレン産生株におけるインビトロＰＫＬ活性を示すグラフ。
【図７２】ホスホケトラーゼ経路に取り込まれる炭素を増加させるよう好ましく上方調節されている宿主変異を示すダイアグラム。炭素の取り込みを調節するため、モヅリボース（modu）−５−リン酸イソメラーゼＡ（ｒｐｉＡ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼＡ（ｔｋｔＡ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、及び／又はリン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）などを対照とする遺伝子として包含する。
【図７３】ホスホケトラーゼ経路に取り込まれる炭素を増加させるよう好ましく下方調節されている宿主変異を示すダイアグラム。炭素の取り込みを調節するために対照とする遺伝子としては、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡ）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素Ａ（ｇａｐＡ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）及び／又はｐｔｓオペロンを包含する。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本明細書で提供される発明は、特に、ホスホケトラーゼポリペプチドを発現するよう遺伝子操作を施した組換え細胞においてメバロン酸、イソプレノイド前駆体分子、イソプレン及び／又はイソプレノイドを産生させるための組成物及び方法を開示するものである。
本発明のホスホケトラーゼ酵素は、以下に更に詳細に記載される通りの多様な基質を利用することができる。特定の実施形態では、本発明は、キシルロース５−リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒することのできるホスホケトラーゼポリペプチドを発現するよう遺伝子操作を施した組換え細胞において、メバロン酸、イソプレノイド前駆体分子、イソプレン及び／又はイソプレノイドを産生させるための組成物及び方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、フルクトース６−リン酸のエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒することのできるホスホケトラーゼポリペプチドを発現するよう遺伝子操作を施した組換え細胞において、メバロン酸、イソプレノイド前駆体分子、イソプレン及び／又はイソプレノイドを産生させるための組成物及び方法を提供する。更に他の実施形態では、本発明は、セドヘプツロース−７−リン酸のリボース−５−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒することのできるホスホケトラーゼポリペプチドを発現するよう遺伝子操作を施した組換え細胞において、メバロン酸、イソプレノイド前駆体分子、イソプレン及び／又はイソプレノイドを産生させるための組成物及び方法を提供する。更に他の実施形態では、本発明は、キシルロース５−リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸への変換、並びに／あるいはフルクトース６−リン酸のエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸への変換、並びに／あるいはセドヘプツロース−７−リン酸のリボース−５−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒することのできる、ホスホケトラーゼポリペプチドを発現するよう遺伝子操作を施した組換え細胞において、メバロン酸、イソプレノイド前駆体分子、イソプレン及び／又はイソプレノイドを産生させるための組成物及び方法を提供する。
【００４４】
宿主細胞において操作された代謝経路には、組換え発現させたホスホケトラーゼが使用される。米国特許第７，７８５，８５８号を参照されたい。Ｓｏｎｄｅｒｅｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，７０：５，２８９２〜９７）は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）においてエタノールを過剰産生させる際のホスホケトラーゼの使用を記載する。Ｆｌｅｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１１，９１：３，７６９〜７６）は、生育用の唯一の炭素源としてフルクトースを利用する能力を回復させたラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）改変株における、ビフィドバクテリウム属（bifidobacterium）のホスホケトラーゼ遺伝子（上掲Ｍｅｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）の発現を報告している。しかしながら、これまでにも、メバロン酸経路への炭素の取り込みを増加させるためのホスホケトラーゼについての記載はなされている。
【００４５】
メバロン酸依存型生合成経路は、メバロン酸、及びその他のイソプレノイド前駆体分子、例えばジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）並びにイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の産生に特に重要である。メバロン酸経路上流の酵素は、グルコースから生成されたアセチルＣｏＡを、３つの酵素反応によりメバロン酸へと変換する。理論に束縛されるものではないが、ホスホケトラーゼポリペプチドを用いアセチルＣｏＡの生合成を増加させることで、上流メバロン酸経路に依存する生合成経路の産生性が向上し、メバロン酸の生合成が大幅に増加し、結果として、ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰなどの下流のイソプレノイド前駆体分子の生合成を増加させることができるものと考えられる。したがって、これらの代替経路によるメバロン酸の産生収率の増加は、商業用途に有利なものである。
【００４６】
理論上は、平衡反応においては、１分子のグルコースから３分子のアセチルＣｏＡを誘導することができる。しかしながら、生物は、通常、２分子のアセチルＣｏＡのみを産生し、残部の質量はＣＯ２として失われてしまう。ＣＯ２の放出は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼにより触媒される、ピルビン酸からのアセチルＣｏＡの生成反応中に生じる。炭素原子が１分子失われることにより、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、及びイソプレノイド分子の産生収率が低下することになる。この反応時の損失を排除したものがＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路であり、この経路は、嫌気的酢酸産生において、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ及びアセチルＣｏＡシンターゼにより二酸化炭素を還元してアセチルＣｏＡを生成する。
【００４７】
本発明は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素を利用しない経路により、１分子のグルコースから３分子のアセチル−ＣｏＡを生成し得る、代替的な代謝過程を提供する。その代わりに、特定の生物、特にビフィドバクテリウム（Bifidobacteria）属において見出されるホスホケトラーゼを使用する［例えば、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ（ｅｄ．Ｌｅｎｇｅｌｅｒ，Ｄｒｅｗｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９，ｐ．２９９〜３０１；Ｍｅｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２００１，１８３：９，２９２９〜３６；Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００７，１７：５，８２２〜８２９を参照されたい］。ホスホケトラーゼ酵素は、典型的な代謝で用いられるピルビン酸の酸化以外の経路により、キシルロース５−リン酸又はフルクトース６−リン酸からのアセチル−ＣｏＡ（リン酸アセチルを介する）の生成を行うことができる。
【００４８】
これまでに、ホスホケトラーゼは、基質選好性に基づき２系統、すなわち、Ｘ５Ｐのみに作用するキシルロース−５−リン酸（Ｘ５Ｐ）ホスホケトラーゼ、並びにＸ５Ｐ及びＦ６Ｐの両方に作用することのできるＸ５Ｐ／フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）ホスホケトラーゼに分類されてきた（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｆ６６，２０１０，６６：８，９４１〜４３）。ホスホケトラーゼは、無機リン酸（Ｐｉ）を利用して、Ｘ５Ｐ又はＦ６Ｐを開裂させることにより、アセチルリン酸（アセチル−Ｐ）、Ｈ２Ｏ及びグリセルアルデヒド３−リン酸又はエリトロース４−リン酸の生成を触媒する。続いて、この経路では、酢酸キナーゼにより、高エネルギー代謝産物のアセチル−Ｐが酢酸へと変換され、ＡＤＰからＡＴＰが生成される。アセチルリン酸に加えて、代謝経路には最高収率、すなわちグルコース１分子毎にアセチルＣｏＡ３分子の生成が得られるよう操作を加え、酵素反応により産生されたグリセルアルデヒド３−リン酸を再利用することができる。有意に、ピルビン酸デヒドロゲナーゼが介在する反応で観察される通り、ホスホケトラーゼによりアセチルＣｏＡを産生させることにより、炭素（例えば、ＣＯ２）の損失は排除される。
【００４９】
本明細書において更に詳述される通り、ホスホケトラーゼは、セドヘプツロース−７−リン酸に対しても作用し、これをリボース−５−リン酸及びアセチルリン酸に変換する。
このようなホスホケトラーゼの非限定例はビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ホスホケトラーゼであり、この酵素はセドヘプツロース−７−リン酸に対し触媒活性を有する。
【００５０】
本発明は、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン及び／又はイソプレノイドの産生においてホスホケトラーゼ酵素を使用して、産生収率を増大させることを目的とする。具体的には、イソプレンの理論収率は、次式に表されるとおりに増大する（生物が、１ｍｏｌのグルコースを６ｍｏｌのＣＯ２に完全酸化して、ＡＴＰを産生できるものと仮定する）：
ＭＶＡ経路のみ
１．５個グルコース＋２．００個Ｏ２→１．００個イソプレン＋４．００個ＣＯ２＋５．００個Ｈ２Ｏ
理論収率−イソプレン０．２５２（ｇ）／グルコース（ｇ）
ＤＸＰ経路
１．２５個グルコース＋０．５０個Ｏ２→１．００個イソプレン＋２．５０個ＣＯ２＋３．５０個Ｈ２Ｏ
理論収率−イソプレン０．３０２（ｇ）／グルコース（ｇ）
ＭＶＡ＋ホスホケトラーゼ経路
１．２２個グルコース＋０．３３個Ｏ２→１．００個イソプレン＋２．３３個ＣＯ２＋３．３２個Ｈ２Ｏ
理論収率−イソプレン０．３０９（ｇ）／グルコース（ｇ）
【００５１】
適宜に、特定の態様では、本発明は、メバロン酸の産生を増強させることのできる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、及びＭＶＡ経路上流の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を含み、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まない細胞と比較して多量にメバロン酸を産生する。
【００５２】
他の態様では、本発明はイソプレノイド前駆体の産生を増強させることのできる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、及び完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を含み、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まない細胞と比較して多量にイソプレノイド前駆体を産生する。
【００５３】
更に他の態様では、本発明はイソプレンを産生することのできる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、並びに（ｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸及び（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸を含み、細胞は、回収可能な量でイソプレンを産生することができる。特定の実施形態では、本発明は、イソプレンの産生を増強させることのできる組換え細胞であって、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、（ｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、及び（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸と、を含む、細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まないイソプレン産生細胞と比較して多量にイソプレンを産生する。
【００５４】
更に別の態様では、本発明は、イソプレノイドを産生することのできる組換え細胞であって、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、（ｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、及び（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸と、を含む、細胞を提供し、細胞は、回収可能な量でイソプレノイドを産生することができる。特定の実施形態では、本発明はイソプレノイドの産生を増強させることのできる組換え細胞であって、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、（ｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、及び（ｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸とを含む、細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まないイソプレノイド産生細胞と比較して多量のイソプレノイドを産生する。
【００５５】
本開示の任意の態様では、本発明は組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含み、更に遺伝子組換えを施して、次の遺伝子：リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡ及び／又はｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ及び／又はｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ及び／又はｅｕｔＤ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、及び／又はｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ及び／又はｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、及び／又はＨＰｒ（ｐｔｓＨ）のうち１つ以上の活性を調節して、ホスホケトラーゼ経路に取り込まれる炭素を増加させることができる。
【００５６】
一部の実施形態では、本発明はイソプレンを産生することのできる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、並びに（ｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸を含み、かつ（ｉｉｉ）ホスホケトラーゼ経路に取り込まれる炭素を増加させるよう１つ以上の遺伝子の活性を調節するため、更に遺伝子操作を施され、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まないイソプレン産生細胞と比較して多量のイソプレンを産生する。
【００５７】
一部の実施形態では、本発明は、イソプレノイドを産生することのできる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、並びに（ｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸を含み、かつ（ｉｉｉ）ホスホケトラーゼ経路に取り込まれる炭素を増加させるよう１つ以上の遺伝子の活性を調節するため、更に遺伝子操作を施され、及び（ｉｖ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸を含み、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まないイソプレノイド産生細胞と比較して多量のイソプレノイドを産生する。
【００５８】
一般的技術
本発明の実施においては、特に断らないかぎりにおいて、当業者の技能の範囲内に含まれる従来の分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の技術を用いる。これらの手法は、次の文献：「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）」第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９年）；「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；「動物細胞の培養（Animal Cell Culture）」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．、１９８７年）；「酵素学的実験法（Methods in Enzymology）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「分子生物学標準プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．、１９８７年、定期的に改定）；「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR:The Polymerase Chain Reaction）」（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４年）．Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、「微生物学及び分子生物学辞典（Dictionary of Microbiology and Molecular Biology）第２版」、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４年）、及びＭａｒｃｈ「有機化学反応、機序及び構造第４版（Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 4th ed.）」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）中に十分に説明されており、これらの文献は、本出願で使用される数多くの用語の一般的な指針を当業者に提供する。
【００５９】
用語の定義
用語「イソプレン」は、２−メチル−１，３−ブタジエン（ＣＡＳ＃  ７８−７９−５）を指す。３，３−ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からピロリン酸を除去することで、揮発性のＣ５炭化水素を、直接的に及び最終的に生成することができる。ＩＰＰ分子をＤＭＡＰＰ分子に結合又は重合させることは包含しない場合がある。用語「イソプレン」は、概して、本明細書に別途記載のない限り、産生方法を限定されることを意図しない。
【００６０】
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」には、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド断片、及び融合ポリペプチドが含まれる。
【００６１】
本明細書で使用するとき、「単離ポリペプチド」は、２、５、１０、２０、又は５０個以上の異なるポリペプチドのライブラリなどといった、ポリペプチドのライブラリの一部を意味するものではなく、天然に生じる少なくとも１つの成分から分離されたポリペプチドを意味する。例えば、ポリペプチドをコードしている組換え核酸を発現させることで単離ポリペプチドを得ることができる。
【００６２】
「異種ポリペプチド」は、宿主細胞と異なる生物、種、又は株由来の核酸配列によりコードされるポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型ポリペプチドと同一ではない。
【００６３】
本明細書で使用するとき、「核酸」は、共有結合により単鎖又は二本鎖のいずれかの形態で連結している、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを指す。
【００６４】
「組換え核酸」とは、対象とする核酸が由来する生物において自然に存在するゲノムにおいて、対象とする核酸に隣接する１種以上の核酸（例えば遺伝子）を含まない、対象とする核酸のことを意味する。したがって、この用語には、例えば、ベクターに組み込まれた、プラスミド又はウィルスに自己複製的に組み込まれた、原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた、又は他の配列とは独立して別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、又はＰＣＲにより産生された若しくは制限エンドヌクレアーゼによる消化により産生されたｃＤＮＡ断片）として存在する、組換えＤＮＡが包含される。
【００６５】
「異種核酸」は、宿主細胞と異なる生物、種又は株由来の核酸配列を意味する。一部の実施形態では、異種核酸は、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型核酸と同一ではない。例えば、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来するホスホケトラーゼ遺伝子によりコードされ、大腸菌（E. coli）の形質転換に使用される核酸は、異種核酸である。
【００６６】
本明細書で使用するとき、用語「ホスホケトラーゼ」、「ホスホケトラーゼ酵素」又は「ホスホケトラーゼポリペプチド」は互換的に使用され、５−リン酸をグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸へと変換し、並びに／又はフルクトース６−リン酸をエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸へと変換するポリペプチドを指す。一般的に、ホスホケトラーゼはケトンに作用する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、キシルロース５−リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、フルクトース６−リン酸のエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、セドヘプツロース−７−リン酸の生成物（例えば、リボース−５−リン酸）及びアセチルリン酸への変換を触媒する。
【００６７】
本明細書において使用するとき、「発現制御配列」とは、対象とする核酸の転写を指示する核酸配列のことを意味する。発現制御配列は、構成型若しくは誘導型のプロモータ、又はエンハンサなどのプロモータであり得る。発現制御配列は「ネイティブ」な配列又は異種性の配列であり得る。ネイティブな発現制御配列は、遺伝子を発現させる生物、種又は株と同様の生物、種又は株に由来する配列である。異種性の発現制御配列は、遺伝子を発現させる生物、種又は株とは異なる生物、種又は株に由来する配列である。「誘導型プロモータ」は、環境下、又は発育制限下で活性であるプロモータである。
【００６８】
「調節可能に連結された」は、核酸発現制御配列（プロモータなど）及び第２の核酸配列間の機能的連結を意味し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指示する。
【００６９】
本明細書で使用するとき、用語「最少培地（「minimal medium」又は「minimal media」）は、細胞の生育に必要とされる最低限の栄養素を含有し、概してアミノ酸は存在していない増殖培地を指す。最少培地は、典型的には：（１）細菌を生育させるための炭素源；（２）細菌種及び生育条件によって異なる様々な塩類；並びに（３）水；を含有する。
炭素源は、グルコースなどの単糖から、本明細書で以下により詳細に記載されるような、その他のバイオマスの、より複雑な加水分解物、例えば、酵母エキスなどといった多様なものであり得る。塩は、概してマグネシウム、窒素、リン及びイオウなどの必須元素を提供し、細胞がタンパク質及び核酸を合成できるようにする。また、最少培地には、特定のプラスミド及び同様物を維持すべく選別するために、抗菌剤などの選択剤を添加することもできる。例えば、微生物が、例えばアンピシリン又はテトラサイクリンなどの特定の抗菌剤に耐性である場合、耐性を欠く細胞の増殖を阻害する目的で培地に抗菌剤を添加することができる。培地には、所望される生理学的又は生化学的特性について選別するのに必要とされる、例えば特定のアミノ酸などといった他の化合物を添加することができる。
【００７０】
本明細書で使用するとき、用語「イソプレノイド」は、２つ以上の炭化水素単位からなり、各単位は、特定の様式で配置された５つの炭素原子からなる、天然に生じる有機化合物類の、広範にわたるかつ多様な部類を指す。本明細書で使用するとき、「イソプレン」は、明らかに「イソプレノイド」の定義から除外される。
【００７１】
本明細書で使用するとき、用語「テルペノイド」は、多様な様式で組み立てられ及び修飾され、構成員として使用されたイソプレノイド単位の数に基づき分類される、炭素数５のイソプレノイド単位に由来する有機分子の、広範にわたるかつ多様な部類を指す。ヘミテルペノイドは、イソプレノイド単位を１つ有する。モノテルペノイドは、イソプレノイド単位を２つ有する。セスキテルペノイドは、イソプレノイド単位を３つ有する。ジテルペノイドは、イソプレン単位を４つ有する。セステルテルペノイドは、イソプレノイド単位を５つ有する。トリテルペノイドは、イソプレノイド単位を６つ有する。テトラテルペノイドは、イソプレノイド単位を８つ有する。ポリテルペノイドは、イソプレノイド単位を８つ超有する。
【００７２】
本明細書で使用するとき、「イソプレノイド前駆体」は、テルペノイド又はイソプレノイドの生合成時に生物により使用される任意の分子を指す。イソプレノイド前駆体分子の非限定例としては、例えば、メバロン酸塩（例えば、メバロン酸（ＭＶＡ））、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）が挙げられる。
【００７３】
本明細書で使用するとき、用語「質量収率」は、組換え細胞により産生された生成物の質量を、組換え細胞により消費されたグルコースの質量により除したものを指し、割合（％）として示す。
【００７４】
「比産生量」は、組換え細胞により産生される産生物の質量を、産生物の産生にかかった時間、細胞密度及び培養体積により除したものを意味する。
【００７５】
「力価」は、組換え細胞により産生される産生物の質量を、培養体積により除したものを意味する。
【００７６】
本明細書で使用するとき、用語「細胞産生性指数（cell productivity index）（ＣＰＩ）」は、組換え細胞により産生される産生物の質量を、培養により産生された組換え細胞の質量により除したものを指す。
【００７７】
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。
【００７８】
本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈に明示されない限り、対象物が複数ある場合をも包含する。
【００７９】
本明細書を通じて与えられるあらゆる最大数の限定は、あらゆるより小さい数値の限定を、あたかもそのようなより小さい数値の限定が明確に書かれているかのように包含するものと理解されることが意図される。本明細書の全体を通じて与えられるすべての最小の数値的限定には、これよりも大きいすべての数値的限定が、あたかもこうしたより大きい数値的限定が本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。本明細書の全体を通じて与えられるすべての数値的範囲には、これよりも狭い数値的範囲が、あたかもこうしたより狭い数値的範囲がすべて本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。
【００８０】
ホスホケトラーゼポリペプチド及びＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドを発現している組換え細胞
メバロン酸依存性生合成経路（ＭＶＡ経路）は、全ての高等真核生物及び特定種の細菌に存在する、重要な代謝経路である。メバロン酸経路は、タンパク質のプレニル化、細胞膜の維持、タンパク質の固定及びＮ−グリコシル化などの、多様な工程において使用される分子の産生に重要であり、並びにテルペン、テルペノイド、イソプレノイド、及びイソプレンの生合成時の主成分として機能するイソプレノイド前駆体分子のＤＭＡＰＰ及びＩＰＰの主要な供給源を提供する。
【００８１】
完全なＭＶＡ経路は、上流及び下流経路の２群に細分することができる。ＭＶＡ経路の上流では、細胞内代謝により産生されたアセチルＣｏ−Ａを、（ａ）（ｉ）チオラーゼ活性又は（ｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ活性、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、及び（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性のいずれかの活性をもつポリペプチドの作用によりメバロン酸に変換する。最初に、チオラーゼ又はアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡを利用する）の作用によりアセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する。次に、アセトアセチル−ＣｏＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの酵素作用により、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）へと変換される。このＣｏ−Ａ誘導体をＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素により還元してメバロン酸を生成する。この反応は、メバロン酸経路によるイソプレノイド産生の律速段階となる。次に、ＭＶＡ経路下流では、メバロン酸は、メバロン酸キナーゼの作用により５−ホスホメバロン酸に変換され、５−ホスホメバロン酸は、続いてホスホメバロン酸キナーゼの酵素活性により、５−ジホスホメバロン酸に変換される。最後に、酵素の５−ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの活性により、５−ジホスホメバロン酸からＩＰＰが形成される。
【００８２】
したがって、特定の実施形態では、本発明の組換え細胞は、ＭＶＡ経路によるメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン又はイソプレノイド産生能を有する組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）キシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸を合成することのできるホスホケトラーゼをコードしている異種遺伝子、（ｉｉ）ＭＶＡポリペプチドを１種以上コードしている１種以上の異種遺伝子、及び（ｉｉｉ）宿主細胞において、アセトアセチルＣｏＡからのメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン又はイソプレノイドの合成を可能にする、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、又はイソプレン又はイソプレノイド生合成に関与する１種以上の異種遺伝子を含む。他の実施形態では、本発明の組換え細胞は、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン又はイソプレノイド産生能を有する組換え細胞であって、組換え細胞は、（ｉ）フルクトース６−リン酸からエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸を合成することのできるホスホケトラーゼをコードしている異種遺伝子、（ｉｉ）ＭＶＡポリペプチド１種以上をコードしている１種以上の異種遺伝子及び（ｉｉｉ）宿主細胞において、アセトアセチルＣｏＡからメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン又はイソプレノイドを合成することのできる、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン又はイソプレノイド生合成に関与する１種以上の異種遺伝子を含む。
【００８３】
ホスホケトラーゼポリぺプチド及び核酸例
ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース５−リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸への変換、並びに／又はフルクトース６−リン酸のエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース５−リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。他の実施形態では、ホスホケトラーゼ酵素は、フルクトース６−リン酸のエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、セドヘプツロース−７−リン酸の生成物（例えば、リボース−５−リン酸）及びアセチルリン酸への変換を触媒する。したがって、理論に束縛されるものではないが、本明細書で説明されるとおりホスホケトラーゼを発現させることにより、炭水化物資源から生成されるアセチルリン酸量を増加させることができる。このアセチルリン酸をアセチルＣｏＡへと変換させ、更にこれを利用して、ＭＶＡ経路に関係する酵素活性により、メバロン酸、イソプレノイド前駆体分子、イソプレン及び／又はイソプレノイドを生成させることができる。したがって、炭水化物基質より生成されるこれらの化合物量を増加させることができる。あるいは、細胞内濃度の上昇という形式で生成性の向上が反映されずとも、アセチル−Ｐ及びＡｃＣｏＡの生成量を増加させることができる。特定の実施形態では、細胞内アセチル−Ｐ又はアセチルＣｏＡ濃度は、ホスホケトラーゼによる反応が生じた場合でさえ変化せず一定であり、又は減少する場合すらある。
【００８４】
ホスホケトラーゼの核酸の例としては、ホスホケトラーゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ホスホケトラーゼのポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる（例については図４を参照されたい）。加えて、表１は、本発明の実施形態に利用することのできるある種のホスホケトラーゼ例に関する、種及び生化学的特徴の非限定的な一欄を提供する。
【００８５】
ホスホケトラーゼ例の生化学的特徴には、限定するものではないが、タンパク質発現、タンパク質溶解度、及び活性が包含される。ホスホケトラーゼは、限定するものではないが、異なる種類の生物間（例えば、グラム陽性菌、シアノバクテリア、放線菌）の多様性、所望の種（例えば、大腸菌（E. coli））に比較的近い、通性低温好気性菌（facultative low temperature aerobe）、及び熱耐性などのその他の特徴に基づき選択することもできる。
【００８６】
本明細書で提供するとき、ホスホケトラーゼ活性は、イソプレノイド前駆体（例えば、メバロン酸）、イソプレン、及び／又はイソプレノイドの産生を向上し得る。本明細書では、ホスホケトラーゼを含む組換え宿主が提供され、細胞は、イソプレノイド前駆体（例えば、メバロン酸）、イソプレン、及び／又はイソプレノイドの産生を増加させる、対象とする少なくとも１つの特性を示す。一部の態様では、対象とする少なくとも１つの特性は、限定するものではないが、比産生性、収率、力価、及び細胞性能指数からなる群から選択される。
【００８７】
特定の実施形態では、本明細書に用いるのに好適なホスホケトラーゼには、可溶性ホスホケトラーゼが包含される。タンパク質の溶解度を測定するための手法は、当該技術分野において周知である。タンパク質溶解度を測定する手法としては、本明細書において実施例で記載されるものが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に用いるためのホスホケトラーゼは、少なくとも２０％の溶解度を有するものを包含する。一部の実施形態では、ホスホケトラーゼの溶解度は、約５％〜約１００％、約１０％〜約１００％、約１５％〜約１００％、約２０％〜約１００％、約２５％〜約１００％、約３０％〜約１００％、約３５％〜約１００％、約４０％〜約１００％、約４５％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約５５％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約６５％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、又は約９０％〜約１００％のうちのいずれかである。一部の実施形態では、ホスホケトラーゼの溶解度は、約５％〜約１００％である。一部の実施形態では、溶解度は５％〜１００％である。一部の実施形態では、ホスホケトラーゼの溶解度は約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０％未満のいずれかであるが、但し約５％未満ではない。一部の実施形態では、溶解度は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％超のいずれかである。
【００８８】
所望の動的特性を有するホスホケトラーゼは、イソプレンの産生を向上させる。動的特性としては、限定するものではないが、非活性、Ｋｃａｔ、Ｋｉ、及びＫｍが挙げられる。一部の態様では、ｋｃａｔは、少なくとも約０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．１、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、２０．０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、又は８００である。他の態様では、ｋｃａｔは、少なくとも約０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９  ２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．１、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、又は１６．６である。
【００８９】
一部の態様では、Ｋｍは、少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１６、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、３３．５、３４、３４．５、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５、４０、４０．５、４１、４１．５、４２、４２．５、４３、４３．５、４４、４４．５、４５、４５．５、４６、４６．５、４７、４７．５、４８、４８．５、４９、４９．５、５０、５０．５、５１、５１．５、５２、５２．５、５３、５３．５、５４、５４．５、５５、５５．５、又は５６である。他の態様では、ｋｍは、少なくとも約２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１６、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、又は２２である。
【００９０】
対象とする特性としては、限定するものではないが、ホスホケトラーゼポリペプチドを含まない組換え細胞と比較して、細胞内活性、比産生性、収率、及び細胞性能指数が向上していることが挙げられる。一部の実施形態では、比産生性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６  ７、８、９、又は１０倍以上増加する。一実施形態では、比産生性は約４０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ／ｈである。一部の実施形態では、収率は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、又は５倍以上向上する。他の実施形態では、ＭＶＡ収率は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、又は５倍以上向上する。他の実施形態では、イソプレン収率は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、又は５倍以上向上する。他の実施形態では、細胞性能指数は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、又は５倍以上向上する。他の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０倍以上向上する。
【００９１】
【表１】
2019030315.tif 000005
【００９２】
使用することのできる他のホスホケトラーゼとしては、限定するものではないが、ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）、ラクトバチルス・プランタルム（L. plantarum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（L. reuteri）、ラクトバチルス・パラプランタラム（L. paraplantarum）、ロードシュードモナス・パルストリス（R. palustris）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（B. breve）、ガードネレラ・バギナリス（G. vaginalis）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、ムチラギニバクター・パルジス（M. paludis）、パントエア（Panteoa sp.）、ラナンキュラス・アクアティリス（R. aquatilis）、ノストック・パンクチホルム（N. punctiforme）、ストレプトマイセス・エバミティリス（S. avermetilis）、及びサーモビフィダ・フスカ（T. fusca）が挙げられる。
【００９３】
標準法を使用し、ペプチドがＤ−フルクトース６−リン酸又はＤ−キシルロース５−リン酸をアセチル−Ｐへと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがホスホケトラーゼペプチド活性を有するかを判断できる。次に、アセチル−Ｐはフェリルアセチルヒドロキサム酸（ferryl acetyl hydroxamate）へと変換され得る。この変換は、分光測定により検出可能である（Ｍｅｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８３：２９２９〜２９３６，２００１）。本発明での使用には、本明細書に記載されるとおりホスホケトラーゼペプチド活性を有するとして判定された任意のポリペプチドが好適である。一部の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、キシルロース５−リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、フルクトース６−リン酸のエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。更に他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、セドヘプツロース−７−リン酸のリブロース−５−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒することができる。更に他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、キシルロース５−リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸への変換、並びに／あるいはフルクトース６−リン酸のエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸への変換、並びに／あるいはセドヘプツロース−７−リン酸のリブロース−５−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。
【００９４】
本明細書においては、微生物から単離されたホスホケトラーゼも提供される。一部の態様では、ホスホケトラーゼは、グラム陽性菌、グラム陰性菌、好気性菌、嫌気性菌、光熱性菌、好冷性菌、好塩菌、又はシアノバクテリアからなる群から単離される。一部の態様では、ホスホケトラーゼは真菌から単離される。他の態様では、ホスホケトラーゼの核酸の例としては、限定するものではないが、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離したホスホケトラーゼが挙げられる。他の態様では、ホスホケトラーゼの核酸の例としては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea sp.）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）から単離されたホスホケトラーゼが挙げられる。他の態様では、ホスホケトラーゼの核酸例としては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼが挙げられる。本明細書に記載の任意の態様では、ホスホケトラーゼの核酸は、本明細書に記載の任意のホスホケトラーゼの核酸配列に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有する。ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のホスホケトラーゼ遺伝子によりコードされているホスホケトラーゼの核酸は、配列番号１に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有する。ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）のホスホケトラーゼ遺伝子によりコードされているホスホケトラーゼの核酸は、配列番号３に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有する。エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）のホスホケトラーゼ遺伝子によりコードされているホスホケトラーゼの核酸は、配列番号１７に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有する。ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）のホスホケトラーゼ遺伝子によりコードされているホスホケトラーゼの核酸は、配列番号１８に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有する。ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）のホスホケトラーゼ遺伝子によりコードされているホスホケトラーゼの核酸は、配列番号１９に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有する。パントエア（Pantoea sp.）のホスホケトラーゼ遺伝子によりコードされているホスホケトラーゼの核酸は、配列番号２０に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有する。ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）のホスホケトラーゼ遺伝子によりコードされているホスホケトラーゼの核酸は、配列番号２１に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有する。サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）のホスホケトラーゼ遺伝子によりコードされているホスホケトラーゼの核酸は、配列番号２２に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有する。ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）のホスホケトラーゼ遺伝子によりコードされているホスホケトラーゼの核酸は、配列番号２３に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有する。ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）のホスホケトラーゼ遺伝子によりコードされているホスホケトラーゼの核酸は、配列番号２４に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有する。ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）のホスホケトラーゼ遺伝子によりコードされているホスホケトラーゼの核酸は、配列番号２５に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有する。ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）のホスホケトラーゼ遺伝子によりコードされているホスホケトラーゼの核酸は、配列番号２６に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有する。
ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）のホスホケトラーゼ遺伝子によりコードされているホスホケトラーゼの核酸は、配列番号２７に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有する。クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）のホスホケトラーゼ遺伝子によりコードされているホスホケトラーゼの核酸は、配列番号２８に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有する。ラクトバチルス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）のホスホケトラーゼ遺伝子によりコードされているホスホケトラーゼの核酸は、配列番号２９に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有する。
【００９５】
一部の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、配列番号１の、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）のホスホケトラーゼの核酸配列によりコードされるホスホケトラーゼポリペプチドに対して、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、配列番号３の、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）のホスホケトラーゼの核酸配列によりコードされるホスホケトラーゼポリペプチドに対して、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、配列番号１７の、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）のホスホケトラーゼの核酸配列によりコードされるホスホケトラーゼポリペプチドに対して、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、配列番号１８の、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）のホスホケトラーゼの核酸配列によりコードされるホスホケトラーゼポリペプチドに対して、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、配列番号１９の、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）ホスホケトラーゼの核酸配列によりコードされるホスホケトラーゼポリペプチドに対して、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、配列番号２０の、パントエア（Pantoea sp.）のホスホケトラーゼの核酸配列によりコードされるホスホケトラーゼポリペプチドに対して、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、配列番号２１の、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）のホスホケトラーゼの核酸配列によりコードされるホスホケトラーゼポリペプチドに対して、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、配列番号２２の、サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）のホスホケトラーゼの核酸配列によりコードされるホスホケトラーゼポリペプチドに対して、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９��％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、配列番号２３の、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）のホスホケトラーゼの核酸配列によりコードされるホスホケトラーゼポリペプチドに対して、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、配列番号２４の、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）おホスホケトラーゼの核酸配列によりコードされるホスホケトラーゼポリペプチドに対して、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、配列番号２５の、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）のホスホケトラーゼの核酸配列によりコードされるホスホケトラーゼポリペプチドに対して、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、配列番号２６の、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）のホスホケトラーゼの核酸配列によりコードされるホスホケトラーゼポリペプチドに対して、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、配列番号２７の、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）のホスホケトラーゼの核酸配列によりコードされるホスホケトラーゼポリペプチドに対して、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、配列番号２８の、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）のホスホケトラーゼの核酸配列によりコードされるホスホケトラーゼポリペプチドに対して、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、配列番号２９の、ラクトバチルス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）のホスホケトラーゼの核酸配列によりコードされるホスホケトラーゼポリペプチドに対して、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る。本明細書に記載の任意の態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、本明細書に記載の任意のホスホケトラーゼの核酸配列によりコードされる任意のホスホケトラーゼポリペプチドに対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る。
【００９６】
本明細書に使用することのできるホスホケトラーゼ酵素の追加例は、米国特許第７，７８５，８５８号及び国際公開第２０１１／１５９８５３号に記載されており、これらの特許文献は、特に、ホスホケトラーゼ酵素に対する開示に関し、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９７】
ＭＶＡ経路上流に関係するポリペプチド
ＭＶＡ経路の上流は、細胞内代謝により産生されるアセチルＣｏ−Ａを、（ａ）（ｉ）チオラーゼ活性又は（ｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡ活性、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、及び（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性のいずれかの活性をもつポリペプチドの作用によりメバロン酸に変換する際の開始基質として利用する。最初に、チオラーゼ又はアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡを利用する）の作用によりアセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する。次に、アセトアセチル−ＣｏＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの酵素作用により、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）へと変換される。このＣｏ−Ａ誘導体をＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素により還元してメバロン酸を生成する。この反応は、メバロン酸経路によるイソプレノイド産生の律速段階となる。
【００９８】
ＭＶＡ経路上流に関係するポリペプチドの非限定例としては、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）ポリペプチドが挙げられる。ＭＶＡ経路上流のポリペプチドには、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが含まれる。ＭＶＡ経路上流に関係する代表的な核酸としては、ＭＶＡ経路上流に関係するポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＭＶＡ経路に含まれる代表的なポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。したがって、本開示では、ＭＶＡ経路上流関連性ポリペプチドをコードしている任意の遺伝子は、本発明において使用できることを企図する。
【００９９】
特定の実施形態では、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来の様々なｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を、単独で、あるいはＭＶＡ経路上流関連性タンパク質をコードしている１つ以上の他のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子と組み合わせて選択することが、本発明の範囲内のものとして企図される。他の実施形態では、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼの遺伝子は、（ｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）ポリペプチドをコードしている１つ以上の他の遺伝子との組み合わせで本発明の範囲内のものとして企図される。したがって、特定の態様では、企図される遺伝子の任意の組み合わせを、本開示に記載される任意の手法により、組換え細胞で発現させることができる。
【０１００】
国際公開出願第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、及び同第２０１０／１４８１５０号に記載の、ＭＶＡ経路上流に関係するポリペプチドのその他の非限定例を、本開示に使用できる。
【０１０１】
ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている遺伝子
特定の実施形態では、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来の様々なｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を、単独で、あるいはＭＶＡ経路上流関連性タンパク質をコードしている１つ以上の他のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子と組み合わせて選択することが、本発明の範囲内のものとして企図される。リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カセリフラブス（E. casseliflavus）、及びエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）では、ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性のいずれをも保有しているポリペプチドをコードする。実際に、ｍｖａＥ遺伝子産物は、真性細菌で見られる、ＩＰＰ生合成に関係する最初の二機能性酵素となるものであり、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の第一例は、天然において他のタンパク質と融合していた（Ｈｅｄｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２  Ａｐｒｉｌ；１８４（８）：２１１６〜２１２２）。それに対しｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０１０２】
したがって、組換え細胞（例えば、大腸菌）は、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を１つ以上発現してメバロン酸を生成するよう設計することができる。１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を多コピープラスミドで発現させることもできる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を宿主細胞の染色体に組み込むことができる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれた、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子のいずれもの異種発現に際し、遺伝子発現は、誘導型プロモータ又は構成的に（恒常的に）発現するプロモータのいずれかにより駆動できる。プロモータは、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
【０１０３】
ｍｖａＥポリペプチド及び核酸例
ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼ活性及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を両方保有しているポリペプチドをコードする。ｍｖａＥ遺伝子によりコードされているポリペプチドのチオラーゼ活性は、アセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換するのに対し、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ポリペプチドの酵素活性は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する。ｍｖａＥポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにｍｖａＥポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【０１０４】
変異型ｍｖａＥポリペプチドとしては、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けており、かつｍｖａＥポリペプチド活性（すなわち、アセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する能力並びに３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する能力）を保持しているものが挙げられる。アミノ酸置換は、保存的なものであっても非保存的なものであってもよく、アミノ酸残基の置換は遺伝子暗号によりコードされていてもコードされていなくてもよい。標準的な２０個のアミノ酸「記号（alphabet）」を、側鎖の類似性に基づき化学的なファミリーに分けた。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性無電荷側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が挙げられる。「保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基は、化学的に類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸により置換される）。「非保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基は、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基で置換される（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸により置換される）。
【０１０５】
ｍｖａＥポリペプチド中にアミノ酸置換を導入することで、分子の官能性を改良することができる。例えば、ｍｖａＥポリペプチドの、基質に対する結合親和性を増加させるアミノ酸置換、あるいはアセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する能力及び／又は３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する能力を改良するアミノ酸置換を、ｍｖａＥポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、ｍｖａＥポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的なアミノ酸置換を含有する。
【０１０６】
一態様では、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、イソプレン及び／又はイソプレノイドを産生する際には、分解されていない又は分解しにくいｍｖａＥタンパク質を使用することができる。使用することのできる、分解されていない又は分解しにくいｍｖａＥ遺伝子産物の例としては、限定するものではないが、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カセリフラブス（E. casseliflavus）、エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）及びリステリア・グレイ（L. grayi）に由来するものが挙げられる。当業者は、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）においてｍｖａＥタンパク質を発現させ、任意の標準的な分子生物学手法により断片が存在していないか調べることができる。例えば、Ｈｉｓタグを利用して精製した後、すなわちメバロン酸、イソプレン又イソプレノイドを産生する大腸菌（E. coli）ＢＬ２１において発現させた後、本明細書に記載の検出法を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをＳａｆｅｓｔａｉｎで染色することにより、断片が存在していないことを確認することができる。
【０１０７】
Ｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２，Ａｐｒｉｌ；１８４（８）：２１１６〜２１２２）に記載のものなどの標準法を使用して、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ活性並びにＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を測定することにより、ポリペプチドがｍｖａＥ活性を有しているか評価することができる。代表的な解析では、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ活性は、アセトアセチルＣｏＡの形成又はリオリシスに伴う吸光度の変化を分光光度計により３０２ｎｍにて監視することで測定できる。アセトアセチルＣｏＡ合成を判定するための各反応に関する標準的な解析条件は、１ｍＭのアセチルＣｏＡ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのトリス（ｐＨ  １０．５）というものであり、反応は酵素の添加により開始される。解析は最終用量２００μＬで実施できる。解析に関し、１酵素単位（ｅｕ）は、１分間で１μｍｏｌのアセトアセチルＣｏＡを合成又はチオリシスすることを意味する。他の代表的な解析では、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性は、分光光度計により、３４０ｎｍでのＮＡＤＰ（Ｈ）の出現又は消失をもとに監視することもできる。ＨＭＧ−ＣｏＡのメバロン酸への還元的脱アシル化について測定した各反応の標準的な解析条件は、０．４ｍＭのＮＡＤＰＨ、１．０ｍＭの（Ｒ，Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡ、１００ｍＭのＫＣｌ及び１００ｍＭのＫｘＰＯ４（ｐＨ  ６．５）というものである。解析は最終用量２００μＬで実施する。反応は酵素の添加により開始される。解析に関し、１ｅｕは、１分間で１μｍｏｌのＮＡＤＰ（Ｈ）が代謝回転されることを意味する。これは、０．５μｍｏｌのＨＭＧ−ＣｏＡ又はメバロン酸が代謝回転することに相当する。
【０１０８】
あるいは、組換え細胞におけるメバロン酸の産生量は、限定するものではないが、ガスクロマトグラフィー（米国特許出願公開番号第２００５／０２８７６５５（Ａ１）号を参照されたい）又はＨＰＬＣ（米国特許出願第公開２０１１／０１５９５５７（Ａ１）号を参照されたい）で測定することができる。代表的な解析の際には、１種以上の抗生物質を添加したＬＢブロスを入れた振とうチューブに培養物を接種し、３４℃にて、２５０ｒｐｍで１４時間インキュベートする。次に、１％グルコース、０．１％酵母エキス及び２００μＭのＩＰＴＧを添加したＴＭ３培地を入れたウェルプレート中で、最終的なＯＤが０．２になるよう培養物を希釈する。次に、プレートを、Ｂｒｅａｔｈ  Ｅａｓｉｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でシールし、振とう／恒温器で、３４℃にて、６００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。次に各培養物１ｍＬを３，０００×ｇで５分遠心分離する。次に、上清に２０％硫酸を添加し、氷上で５分インキュベートする。次に、混合物を３０００×ｇで５分遠心分離し、ＨＰＬＣ解析のため上清を回収する。メバロン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較して、試料中のメバロン酸濃度を測定する。更に、当該技術分野において既知の任意の手法によりグルコースオキシダーゼ解析を実施し、グルコース濃度を測定する。ＨＰＬＣを使用し、各試料により得られた屈折率を、濃度既知の各種メバロン酸溶液のＨＰＬＣをもとに作成した検量線に対し比較して、メバロン酸濃度を定量することができる。
【０１０９】
ｍｖａＥ核酸の例としては、ｍｖａＥポリペプチド活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ｍｖａＥポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。ｍｖａＥ核酸の例としては、例えば、リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、及び／又はエンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）から単離したｍｖａＥ核酸が挙げられる。リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１のｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号６に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）のｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号７に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２のｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号８に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）のｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号９に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）のｍｖａＥ遺伝子によりコードされているｍｖａＥ核酸は、これまでにメバロン酸を産生するための大腸菌（E. coli）において開示されているｍｖａＥ遺伝子に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る（米国特許第２００５／０２８７６５５  Ａ１号；Ｔａｂａｔａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．−Ｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２６：１４８７〜１４９１，２００４を参照されたい）。
【０１１０】
ｍｖａＥ核酸核酸は、組換え細胞において、多コピープラスミド上で発現させることができる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、ｍｖａＥ核酸は、宿主細胞の染色体に組み込むこともできる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれた、ｍｖａＥ核酸の異種発現に際し、核酸の発現は、誘導型プロモータ又は構成的に（恒常的に）発現するプロモータのいずれかにより駆動できる。プロモータは、ｍｖａＥ核酸の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
【０１１１】
ｍｖａＳポリペプチド及び核酸例
ｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を保有するポリペプチドをコードする。このポリペプチドは、アセトアセチルＣｏＡを、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を変換させることができる。ｍｖａＳポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにｍｖａＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【０１１２】
変異型ｍｖａＳポリペプチドとしては、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けており、かつｍｖａＳポリペプチド活性（すなわち、アセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する能力）を保持しているものが挙げられる。ｍｖａＳポリペプチド中にアミノ酸置換を導入することで、分子の官能性を改良することができる。例えば、ｍｖａＳポリペプチドの、基質に対する結合親和性を増加させるアミノ酸置換、あるいはアセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに変換する能力を改良するアミノ酸置換を、ｍｖａＳポリペプチドに導入することができる。一部の態様では、ｍｖａＳポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的なアミノ酸置換を含有する。
【０１１３】
Ｑｕａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，１９８９，２６２：１５９〜１６４）に記載のものなどの標準法を使用して、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの活性を測定することにより、ポリペプチドがｍｖａＳ活性を有するか評価することもできる。代表的な解析では、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの活性は、３０３ｎｍでの吸光度の変化を監視することにより、エノール形態のアセトアセチルＣｏＡの消失を、分光光度を元に評価することで、検定できる。３０℃下で、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．２ｍＭのジチオスレイトールを含有する標準的な１ｍＬの解析系に、５μＬのアセチルリン酸、１０，Ｍ−アセトアセチル−ＣｏＡ及び５ｕｌの抽出試料を加え、続いてアセチルＣｏＡ（１００μＭ）及び１０ユニットのＰＴＡを同時に加えることができる。次に、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの活性を、アセチルＣｏＡ添加前及び添加後の速度（rate）の差として測定する。使用した条件下（ｐＨ  ８．０、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２）での、アセトアセチルＣｏＡの吸収係数は、１２．２×１０３Ｍ−１ｃｍ−１である。定義によると、１ユニットの酵素活性により、１分あたり１μｍｏｌのアセトアセチルＣｏＡが変換されることになる。
【０１１４】
あるいは、組換え細胞におけるメバロン酸の産生量は、限定するものではないが、ガスクロマトグラフィー（米国特許出願公開番号第２００５／０２８７６５５（Ａ１）号を参照されたい）又はＨＰＬＣ（米国特許出願第公開２０１１／０１５９５５７（Ａ１）号を参照されたい）で測定することができる。代表的な解析の際には、１種以上の抗生物質を添加したＬＢブロスを入れた振とうチューブに培養物を接種し、３４℃にて、２５０ｒｐｍで１４時間インキュベートする。次に、１％グルコース、０．１％酵母エキス及び２００μＭのＩＰＴＧを添加したＴＭ３培地を入れたウェルプレート中で、最終的なＯＤが０．２になるよう培養物を希釈する。次に、プレートを、Ｂｒｅａｔｈ  Ｅａｓｉｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でシールし、振とう／恒温器で、３４℃にて、６００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。次に各培養物１ｍＬを３，０００×ｇで５分遠心分離する。次に、上清に２０％硫酸を添加し、氷上で５分インキュベートする。次に、混合物を３０００×ｇで５分遠心分離し、ＨＰＬＣ解析のため上清を回収する。メバロン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較して、試料中のメバロン酸濃度を測定する。更に、当該技術分野において既知の任意の手法によりグルコースオキシダーゼ解析を実施し、グルコース濃度を測定する。ＨＰＬＣを使用し、各試料により得られた屈折率を、濃度既知の各種メバロン酸溶液のＨＰＬＣをもとに作成した検量線に対し比較して、メバロン酸濃度を定量することができる。
【０１１５】
ｍｖａＳ核酸の例としては、ｍｖａＳポリペプチド活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ｍｖａＳポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。ｍｖａＳ核酸の例としては、例えば、リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、及び／又はエンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）から単離したｍｖａＳ核酸が挙げられる。リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１のｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号１０に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）のｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号１１に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２のｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号１２に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）のｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号１３に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされているｍｖａＳ核酸は、これまでにメバロン酸を産生するための大腸菌（E. coli）において開示されているｍｖａＥ遺伝子に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る（米国特許第２００５／０２８７６５５  Ａ１号；Ｔａｂａｔａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．−Ｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２６：１４８７〜１４９１，２００４を参照されたい）。
【０１１６】
ｍｖａＳ核酸核酸は、組換え細胞において、マルチコピープラスミド上で発現させることができる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、ｍｖａＳ核酸は、宿主細胞の染色体に組み込むこともできる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれた、ｍｖａＳ核酸の異種発現に際し、核酸の発現は、誘導型プロモータ又は構成的に（恒常的に）発現するプロモータのいずれかにより駆動できる。プロモータは、ｍｖａＳ核酸の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
【０１１７】
アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子
アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（ｎｐｈＴ７としても知られる）は、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有し、かつ２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性は最小限である（例えば、非活性である）酵素をコードしている遺伝子である。例えば、Ｏｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｖｏｌ  １０７，Ｎｏ．２５，ｐｐ．１１２６５〜１１２７０（２０１０）を参照されたい。この文献中のｎｐｈＴ７に関する教示は、本開示に明確に組み込まれる。日本国特許公開第２００８−６１５０６（Ａ）号及び米国特許出願公開第２０１０／０２８５５４９号には、放線菌のストレプトマイセス属ＣＬ１９０株のアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子が記載されている。アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼも、アセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシル基転移酵素として参照され得る。使用することのできる代表的なアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（又はアセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシル基転移酵素）としては、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢ５４０１３１．１が挙げられる。
【０１１８】
本開示に記載の任意の態様又は実施例では、マロニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを合成する能力を有する酵素を使用できる。このような酵素の非限定例を本明細書に記載する。本開示に記載の特定の実施形態では、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する能力を有する放線菌のストレプトマイセス（Streptomyces）属から誘導されるアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子を使用できる。このようなアセトアセチルＣｏＡシンターゼの遺伝子の一例としては、アミノを有するタンパク質をコードしている遺伝子が挙げられる。このような、配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質は、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有し、２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性は有さないアセトアセチルＣｏＡシンターゼに相当する。
【０１１９】
一実施形態では、配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている遺伝子は、テンプレートとして、放線菌のストレプトマイセス（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０株から得られるゲノムＤＮＡと、日本国特許公開第２００８−６１５０６（Ａ）号を参照して設計することのできるプレマー対と、を使用して核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ）により得ることができる。
【０１２０】
本明細書に記載するとき、本発明での使用に関し、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、放線菌のストレプトマイセス（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０株に由来する配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている遺伝子に限定されない。マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することができかつ２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することはできないタンパク質をコードしている任意の遺伝子を本発明に記載の方法に使用することができる。特定の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、配列番号５のアミノ酸配列と類似性が高く又は実質的に同一であるアミノ酸配列を有しかつマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するタンパク質をコードしている遺伝子であり得る。表現「類似性の高い」又は「実質的に同一」は、例えば、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、及び少なくとも約９９％同一であることを意味する。上記で使用した通り、同一度の値は、異なるアミノ酸配列及び配列番号５のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基間の同一度（％）に相当するものであり、配列類似性について検索するためのプログラムを使用し、配列番号５のアミノ酸配列と、異なるアミノ酸配列とを整列させることで算出される。
【０１２１】
他の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入により、配列番号５のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有しかつマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するタンパク質をコードしている遺伝子であってよい。本明細書において、表現「１つ以上のアミノ酸（more amino acids）」は、例えば、２〜３０個のアミノ酸、好ましくは２〜２０個のアミノ酸、より好ましくは２〜１０個のアミノ酸及び最も好ましくは２〜５個のアミノ酸を指す。
【０１２２】
更に他の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、厳密な条件下で配列番号５のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列と相補的であり、ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドと一部又は完全にハイブリダイゼーションすることのできる、並びにマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するタンパク質をコードすることのできる、ポリヌクレオチドからなる場合がある。本明細書において、厳密な条件下でのハイブリダイゼーションは、６０℃で２回ＳＳＣで洗浄するという条件下で結合を維持させることに相当する。ハイブリダイゼーションは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．「分子クローニング−実験室マニュアル第３版（Molecular Cloning,A Laboratory Manual,3rd Ed.）」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１年）に記載の手法などの、既知の従来法により実施することができる。
【０１２３】
本明細書に記載されるとおり、配列番号５のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルＣｏＡシンターゼをコードしている遺伝子は、任意の生物から単離できる可能性があり、例えば、ストレプトマイセス（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０株ではない放線菌から得ることもできる。加えて、本明細書で用いるアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、配列番号５のアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチドを、当該技術分野において既知の手法により改変することで得ることもできる。ヌクレオチド配列への変異導入は、Ｋｕｎｋｅｌ法又はｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法あるいはこれらのいずれかに類似の手法などの既知の手法により実施することができる。例えば、変異導入は、部位特異的変異導入については、変異導入キット（例えば、製品名；Ｍｕｔａｎｔ−Ｋ及びＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ））及び製品名ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズのキット（タカラバイオ）などを使用することで実施できる。
【０１２４】
配列番号５のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルＣｏＡシンターゼの活性は、以下に記載のとおりに評価することができる。具体的には、評価されることになるタンパク質をコードしている遺伝子は、遺伝子を細胞中で発現させ、続いてクロマトグラフィーなどの手法によりタンパク質を精製することができるような様式で、まずは宿主細胞に導入される。得られた評価すべきタンパク質を含有させた緩衝液に、基質としてマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡを加え、続いて例えば、所望の温度（例えば、１０℃〜６０℃）でインキュベートする。反応の完了後、基質の減少量及び／又は生成物量（アセトアセチルＣｏＡ）を測定する。したがって、試験したタンパク質がマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するか評価すること、並びに合成度を評価することができる。このような場合では、このタンパク質が、２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有しているか否かは、得られた評価すべきタンパク質を含有させた緩衝液に、アセチルＣｏＡのみを基質として加え、基質の減少量及び／又は同様の方法において産生された産生物量を測定することにより、試験することができる。
【０１２５】
メバロン酸の産生量を増加させることのできる組換え細胞
本明細書に記載の組換え細胞（例えば、組換え細菌細胞）は、本明細書に記載の各種酵素経路に対し何ら操作を施していない同様の細胞を上回る量及び／又は濃度でメバロン酸を産生することができる。したがって、本明細書に記載の各種経路において調節がなされるよう遺伝子操作された組換え細胞（例えば、細菌細胞）は、メバロン酸の産生を増強させるのに有用である。
【０１２６】
適宜に、特定の態様では、本発明は、メバロン酸の産生を増強させることのできる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、及びＭＶＡ経路上流の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を含み、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まない細胞と比較して多量にメバロン酸を産生する。
【０１２７】
特定の態様では、本明細書に記載の組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。他の態様では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の態様では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
【０１２８】
一態様では、組換え細胞は、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）、及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを更に含む。別の実施形態では、組換え細胞は、アセトアセチルＣｏＡシンターゼと、ＭＶＡ経路上流の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸とを更に含む。
【０１２９】
一態様では、組換え細胞には、次の、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡ及び／又はｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ及び／又はｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌ  Ｂ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ及び／又はｅｕｔＤ）からなる群から選択される遺伝子のうちの１つ以上の活性を増加させるよう、遺伝子操作を施すことができる。別の実施形態では、組換え細胞は、次の、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、及び／又はｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｇａｐＡ及び／又はｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、及び／又はＨＰｒ（ｐｔｓＨ）といった遺伝子のうち、１つ以上の遺伝子の活性を減少させるよう更に遺伝子操作を施すことができる。
【０１３０】
一態様では、本明細書に記載の組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含まない同様の細胞と比較して、高比産生性でメバロン酸を産生し得る。特定の実施形態では、組換え細胞は、２．００ｇ／Ｌ／ｈ超のメバロン酸を産生し得る。あるいは、組換え細胞は、包括的に、約１．０ｇ／Ｌ／ｈ、１．２ｇ／Ｌ／ｈ、１．４ｇ／Ｌ／ｈ、１．６ｇ／Ｌ／ｈ、１．８ｇ／Ｌ／ｈ、２．０ｇ／Ｌ／ｈ、２．２ｇ／Ｌ／ｈ、２．４ｇ／Ｌ／ｈ、２．６ｇ／Ｌ／ｈ、２．８ｇ／Ｌ／ｈ、３．０ｇ／Ｌ／ｈ、３．２ｇ／Ｌ／ｈ、３．４ｇ／Ｌ／ｈ、３．６ｇ／Ｌ／ｈ、３．８ｇ／Ｌ／ｈ、４．０ｇ／Ｌ／ｈ、４．２ｇ／Ｌ／ｈ、４．４ｇ／Ｌ／ｈ、４．６ｇ／Ｌ／ｈ、４．８ｇ／Ｌ／ｈ、５．０ｇ／Ｌ／ｈ、５．２ｇ／Ｌ／ｈ、５．４ｇ／Ｌ／ｈ、５．６ｇ／Ｌ／ｈ、５．８ｇ／Ｌ／ｈ、６．０ｇ／Ｌ／ｈ超並びにこれらの数字の間の任意の数値でメバロン酸を産生することができる。
【０１３１】
一態様では、本明細書に記載の組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含まない同様の細胞と比較して、高力価でメバロン酸を産生し得る。組換え細胞は、４８時間にわたる発酵後に、約１００ｇ／Ｌ超のピーク力価でメバロン酸を産生し得る。あるいは、組換え細胞は、４８時間にわたる発酵後に、約５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２１０ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２３０ｇ／Ｌ、２４０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌ、２６０ｇ／Ｌ、２７０ｇ／Ｌ、２８０ｇ／Ｌ、２９０ｇ／Ｌ、３００ｇ／Ｌ超並びにこれらの数字の間の任意の数値でメバロン酸を産生することができる。
【０１３２】
他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、ＭＶＡ経路に取り込まれる炭素を増加させ、かつ同様の遺伝子操作をなされていない細胞と比較して高力価のメバロン酸を産生させ得る、１つ以上の変異を更に含む。このような実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含まない同様の細胞と比較して、高ピーク力価でメバロン酸を産生し得る。一態様では、組換え細胞には、次の、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡ及び／又はｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ及び／又はｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌ  Ｂ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ及び／又はｅｕｔＤ）からなる群から選択される遺伝子のうちの１つ以上の活性を増加させるよう、更に遺伝子操作を施すことができる。別の実施形態では、組換え細胞は、次の、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、及び／又はｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｇａｐＡ及び／又はｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、及び／又はＨＰｒ（ｐｔｓＨ）といった遺伝子のうち、１つ以上の遺伝子の活性を減少させるよう、更に遺伝子操作を施すことができる。
【０１３３】
一態様では、本明細書に記載の組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含まない同様の細胞と比較して、高細胞産生指数（ＣＰＩ）でメバロン酸を産生し得る。組換え細胞は、メバロン酸に関し、少なくとも約３．０（ｇ／ｇ）のＣＰＩを有し得る。あるいは、組換え細胞は、メバロン酸に関し、包括的に、少なくとも約１（ｇ／ｇ）、２（ｇ／ｇ）、３（ｇ／ｇ）、４（ｇ／ｇ）、５（ｇ／ｇ）、６（ｇ／ｇ）、７（ｇ／ｇ）、８（ｇ／ｇ）、９（ｇ／ｇ）、１０（ｇ／ｇ）、１１（ｇ／ｇ）、１２（ｇ／ｇ）、１３（ｇ／ｇ）、１４（ｇ／ｇ）、１５（ｇ／ｇ）、２０（ｇ／ｇ）、２５（ｇ／ｇ）又は３０（ｇ／ｇ）のＣＰＩ並びにこれらの数値の間の任意の数値のＣＰＩを有し得る。
【０１３４】
特定の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞には、ＭＶＡ経路に取り込まれる炭素を増加させ、かつ同様の遺伝子操作をなされていない細胞と比較して、メバロン酸に関しより高い細胞産生性指数（ＣＰＩ）をもたらす１つ以上の変異（mutation）を更に含む。加えて、本明細書に記載の組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含まない同様の細胞と比較して高ＣＰＩを有する。一態様では、組換え細胞には、次の、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡ及び／又はｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ及び／又はｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌ  Ｂ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ及び／又はｅｕｔＤ）からなる群から選択される遺伝子のうちの１つ以上の活性を増加させるよう、更に遺伝子操作を施すことができる。別の実施形態では、これらの組換え細胞には、次の、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、及び／又はｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｇａｐＡ及び／又はｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、及び／又はＨＰｒ（ｐｔｓＨ）といった遺伝子のうち、１種以上の遺伝子の活性を減少させるよう更に遺伝子操作を施すことができる。
【０１３５】
加えて、本明細書に記載の組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含まない同様の細胞と比較して、高質量収率でグルコースからメバロン酸を産生する。組換え細胞は、少なくとも約２８％の質量収率でグルコースからメバロン酸を産生できる。あるいは、組換え細胞は、少なくとも約２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％又は５５％並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値の質量収率でグルコースからメバロン酸を産生できる。
【０１３６】
特定の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞には、ＭＶＡ経路に取り込まれる炭素量を増加させかつ同様の遺伝子操作をなされていない細胞と比較して、メバロン酸の質量収率が高くなる１つ以上の変異（mutation）を更に含む。加えて、本明細書に記載の組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含まない同様の細胞と比較して、メバロン酸の高質量収率を有する。一態様では、組換え細胞には、次の、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡ及び／又はｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ及び／又はｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌ  Ｂ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ及び／又はｅｕｔＤ）からなる群から選択される遺伝子のうちの１つ以上の活性を増加させるよう、遺伝子操作を施すことができる。別の実施形態では、これらの組換え細胞には、次の、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、及び／又はｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｇａｐＡ及び／又はｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、及び／又はＨＰｒ（ｐｔｓＨ）といった遺伝子のうち、１種以上の遺伝子の活性を減少させるよう更に遺伝子操作を施すことができる。
【０１３７】
一態様では、本明細書に記載の組換え細胞はメバロン酸を産生し、かつホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含まない同様の細胞と比較して発酵ブロスへの酢酸の蓄積が少ない。組換え細胞は、多量のメバロン酸を産生し、かつ４８時間の発酵後の発酵ブロスへの酢酸の蓄積が４．５ｇ／Ｌ未満であり得る。あるいは、組換え細胞は、メバロン酸を多量に産生することができ、かつ４８時間の発酵後の発酵ブロスへの酢酸の蓄積は約８．０ｇ／Ｌ、７．５ｇ／Ｌ、７．０ｇ／Ｌ、６．５ｇ／Ｌ、６．０ｇ／Ｌ、５．５ｇ／Ｌ、５．０ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、４．０ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、又は１．５ｇ／Ｌ未満、並びにこれらの数値間の任意の数値である。特定の実施形態では、発酵ブロスへの酢酸の蓄積を減少させることにより、発酵中の細胞生存率を向上させることができる。
【０１３８】
特定の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、結果として多量のメバロン酸が得られるようＭＶＡ経路への炭素の取り込みを増加させ、かつ同様の遺伝子操作をなされていない細胞と比較して、発酵ブロスへの酢酸の蓄積を減少させる１つ以上の変異を更に含む。特定の実施形態では、発酵ブロスへの酢酸の蓄積を減少させることにより、発酵中の細胞生存率を向上させることができる。
【０１３９】
組換え細胞を使用して多量にメバロン酸を産生する方法
本明細書では、メバロン酸の産生方法も提供する。一部の態様では、メバロン酸の産生方法は、（ａ）本明細書に記載のとおりに炭素の取り込み量が増加するよう遺伝子操作された組換え細胞（上記の任意の組換え細胞）、又はメバロン酸を産生できるそれらの子孫細胞を含む、組成物を培養する工程並びに（ｂ）メバロン酸を産生する工程、を包含する。一部の態様では、メバロン酸を産生させる方法は、メバロン酸の産生に好適な条件下で、本明細書に記載の任意の組換え細胞を培養する工程、並びに組換え細胞にメバロン酸を産生させる工程、を含む。一部の態様では、メバロン酸の産生方法は、メバロン酸を回収する工程を更に含む。
【０１４０】
本明細書に記載するとき、メバロン酸の産生方法は、（ａ）ホスホケトラーゼポリペプチドを内因的に発現しない組換え細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞など）を培養する工程、細胞は、ＭＶＡ経路の１種以上のペプチドを発現する１種以上の異種核酸とともに、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている遺伝子の１種以上のコピーを異種発現する；並びに（ｂ）メバロン酸を産生する工程、を含む。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）由来のものである。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。加えて、組換え細胞を最少培地で培養した場合、組換え細胞は、ＭＶＡ経路の１種以上のペプチドを発現する１種以上の異種核酸とともに、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）由来のホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている遺伝子の１種以上の異種コピーを含まない同様の細胞と比較して、高濃度でメバロン酸を産生し得る。特定の実施形態では、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）由来のホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーは、宿主細胞の染色体に組み込まれた異種核酸である。
【０１４１】
特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）に由来する。他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）に由来する。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。加えて、組換え細胞を最少培地で培養した場合、組換え細胞は、ＭＶＡ経路の１種以上のペプチドを発現する１種以上の異種核酸とともに、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）由来のホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている遺伝子の１種以上の異種コピーを含まない同様の細胞と比較して、高濃度のメバロン酸を産生し得る。特定の実施形態では、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）由来のホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーは、宿主細胞の染色体に組み込まれた異種核酸である。
【０１４２】
メバロン酸産生に関係する本方法は、２．００ｇ／Ｌ／ｈ超のメバロン酸の体積産生性を有する細胞を使用してメバロン酸を産生させることができる。あるいは、組換え細胞は、包括的に、約１．０ｇ／Ｌ／ｈ、１．２ｇ／Ｌ／ｈ、１．４ｇ／Ｌ／ｈ、１．６ｇ／Ｌ／ｈ、１．８ｇ／Ｌ／ｈ、２．０ｇ／Ｌ／ｈ、２．２ｇ／Ｌ／ｈ、２．４ｇ／Ｌ／ｈ、２．６ｇ／Ｌ／ｈ、２．８ｇ／Ｌ／ｈ、３．０ｇ／Ｌ／ｈ、３．２ｇ／Ｌ／ｈ、３．４ｇ／Ｌ／ｈ、３．６ｇ／Ｌ／ｈ、３．８ｇ／Ｌ／ｈ、４．０ｇ／Ｌ／ｈ、４．２ｇ／Ｌ／ｈ、４．４ｇ／Ｌ／ｈ、４．６ｇ／Ｌ／ｈ、４．８ｇ／Ｌ／ｈ、５．０ｇ／Ｌ／ｈ、５．２ｇ／Ｌ／ｈ、５．４ｇ／Ｌ／ｈ、５．６ｇ／Ｌ／ｈ、５．８ｇ／Ｌ／ｈ、６．０ｇ／Ｌ／ｈ超並びにこれらの数字の間の任意の数値でメバロン酸を産生することができる。一部の態様では、メバロン酸の産生方法は、メバロン酸を回収する工程を更に含む。
【０１４３】
他の実施形態では、メバロン酸の産生方法は、（ａ）ホスホケトラーゼポリペプチドを内因的に発現しない組換え細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞など）を培養する工程、細胞は、ＭＶＡ経路の１種以上のペプチドを発現する１種以上の異種核酸とともに、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている遺伝子の１種以上のコピーを異種発現する；並びに（ｂ）メバロン酸を産生させる工程、組換え細胞は、４８時間の発酵後に、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている遺伝子の１種以上の異種コピーを含まない同様の細胞と比較して、高いピーク力価を有する、を包含し得る。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来する。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
【０１４４】
メバロン酸を産生するための本発明の方法は、発酵開始から４８時間後に、約１００ｇ／Ｌ超のピーク力価でメバロン酸を産生し得る細胞を使用し、メバロン酸を産生し得る。
あるいは、組換え細胞は、４８時間にわたる発酵後に、約５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２１０ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２３０ｇ／Ｌ、２４０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌ、２６０ｇ／Ｌ、２７０ｇ／Ｌ、２８０ｇ／Ｌ、２９０ｇ／Ｌ、３００ｇ／Ｌ超並びにこれらの数字の間の任意の数値でメバロン酸を産生することができる。一部の態様では、メバロン酸の産生方法は、メバロン酸を回収する工程を更に含む。
【０１４５】
他の実施形態では、メバロン酸の産生方法は、（ａ）ホスホケトラーゼポリペプチドを内因的に発現しない組換え細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞など）を培養する工程、細胞は、ＭＶＡ経路の１種以上のペプチドを発現する１種以上の異種核酸とともに、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている遺伝子の１種以上のコピーを異種発現する；並びに（ｂ）メバロン酸を産生させる工程、組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている遺伝子の１種以上の異種コピーを含まない同様の細胞と比較して高ＣＰＩを有する、を包含し得る。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来する。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
【０１４６】
メバロン酸産生に関する本方法は、メバロン酸のＣＰＩが少なくとも約３．０（ｇ／ｇ）である細胞を使用することによりメバロン酸を産生することができる。あるいは、組換え細胞は、メバロン酸に関し、包括的に、少なくとも約１（ｇ／ｇ）、２（ｇ／ｇ）、３（ｇ／ｇ）、４（ｇ／ｇ）、５（ｇ／ｇ）、６（ｇ／ｇ）、７（ｇ／ｇ）、８（ｇ／ｇ）、９（ｇ／ｇ）、１０（ｇ／ｇ）、１１（ｇ／ｇ）、１２（ｇ／ｇ）、１３（ｇ／ｇ）、１４（ｇ／ｇ）、１５（ｇ／ｇ）、２０（ｇ／ｇ）、２５（ｇ／ｇ）又は３０（ｇ／ｇ）のＣＰＩ並びにこれらの数値の間の任意の数値のＣＰＩを有し得る。一部の態様では、メバロン酸の産生方法は、メバロン酸を回収する工程を更に含む。
【０１４７】
特定の実施形態では、メバロン酸の産生方法は、（ａ）ホスホケトラーゼポリペプチドを内因的に発現しない組換え細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞など）を培養する工程、細胞は、ＭＶＡ経路の１種以上のペプチドを発現する１種以上の異種核酸とともに、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている遺伝子の１種以上のコピーを異種発現する；並びに（ｂ）メバロン酸を産生させる工程、組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている遺伝子の１種以上の異種コピーを含まない同様の細胞と比較して減少している酸素の取り込み速度（ＯＵＲ）を示す、を包含し得る。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている遺伝子の１種以上の異種コピーを発現する組換え細胞は、ホスホケトラーゼを発現しない組換え細胞と比較した場合に、ＯＵＲの、最大で１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍又は７倍の減少を示す。
【０１４８】
本明細書では、メバロン酸の産生量を増加させるために上記の任意の細胞を使用する方法を提供する。細胞によるメバロン酸産生は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現させることにより増加させることができる。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来する。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、本明細書に記載の組���え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
【０１４９】
メバロン酸の産生は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現しないメバロン酸産生細胞によるメバロン酸産生と比較して、約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、又は約５０〜約２００倍）だけ増加させることもできる。本明細書に記載の特定の実施形態では、宿主細胞には、ＭＶＡ産生に取り込まれる炭素を増加させるよう更に遺伝子操作することができる。他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
【０１５０】
他の態様では、本明細書に記載の方法は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現しないメバロン酸産生細胞によるメバロン酸の産生と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、又は１，０００，０００倍だけメバロン酸を増産することができるよう提供され得る。本明細書に記載の特定の実施形態では、宿主細胞には、ＭＶＡ産生に取り込まれる炭素を増加させるよう更に遺伝子操作することができる。
【０１５１】
加えて、より具体的な細胞培養条件を使用して、本明細書に記載の方法により細胞を培養することができる。例えば、一部の態様では、メバロン酸の産生方法は、（ａ）ホスホケトラーゼ遺伝子を内因的に有さない組換え細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞）を、３４℃下で最少培地にて培養する工程であって、組換え細胞は、低〜通常コピー数のプラスミドにおいて、高発現型プロモータの調節下で、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている異種遺伝子の１種以上のコピーを異種発現する、培養する工程と、（ｂ）メバロン酸を産生させる工程と、を含む。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来する。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一部の態様では、メバロン酸の産生方法は、メバロン酸を回収する工程を更に含む。
【０１５２】
イソプレン産生能を持つ組換え細胞
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、多様な用途で使用される重要な有機化合物である。例えば、イソプレンは、合成ゴムの製造時など、数多くの化学組成物及びポリマーの合成時に、中間体又は出発物質として使用される。イソプレンはまた、多くの植物及び動物により天然に合成される重要な生体物質でもある。
【０１５３】
イソプレンは、イソプレンシンターゼの触媒作用によりＤＭＡＰＰから製造される。したがって、理論に束縛されるものではないが、上記の任意の組成物及び方法により、組換え細胞（細菌細胞など）において細胞によるメバロン酸産生量を増加させることは、より多量のイソプレンを産生させるのと同様であると考えられる。グルコースからのメバロン酸産生量のモル収率を上昇させ、適切な酵素活性濃度で、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（例えば、ＭＶＡ経路下流）並びにイソプレン及びイソプレノイド産生に好適な他の酵素と組み合わせると、イソプレノイド前駆体、イソプレン分子及び／又はイソプレノイド（イソプレンを含む）のモル収率の上昇につながる。
【０１５４】
本明細書に記載される通り、本発明は、イソプレンを産生することのできる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、（ｉ）完全なＭＶＡ経路（すなわち、ＭＶＡ経路上流、及びＭＶＡ経路下流）の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸及び（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸と、を含み、細胞は、回収可能な量でイソプレンを産生することができる。特定の実施形態では、本発明は、イソプレンの産生を増強させることのできる組換え細胞であって、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸と、（ｉ）完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の核酸、及び（ｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸と、を含む、細胞を提供し、細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まないイソプレン産生細胞と比較して多量にイソプレンを産生する。
【０１５５】
イソプレン産生は、１つ以上の酵素経路を更に操作された、本明細書に記載の任意の組換え宿主細胞を使用することによりなすこともでき、この場合、酵素活性は、メバロン酸産生に取り込まれる炭素を増加させるよう調節される。本明細書に記載の、メバロン酸産生に取り込まれる炭素量が増加するよう操作された各種酵素経路を有する組換え細胞を、イソプレン産生に使用することができる。一態様では、組換え細胞には、次の、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡ及び／又はｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ及び／又はｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌ  Ｂ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ及び／又はｅｕｔＤ）からなる群から選択される遺伝子のうちの１つ以上の活性を増加させるよう、遺伝子操作を施すことができる。別の実施形態では、これらの組換え細胞には、次の、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、及び／又はｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｇａｐＡ及び／又はｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、及び／又はＨＰｒ（ｐｔｓＨ）といった遺伝子のうち、１種以上の遺伝子の活性を減少させるよう更に遺伝子操作を施すことができる。
【０１５６】
ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている核酸
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の組成物又は方法の任意のものに記載の細胞は、メバロン酸（ＭＶＡ）経路下流のポリペプチドをコードしている核酸を１つ以上更に含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように構成型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結される。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ＭＶＡ経路下流のポリペプチドが過剰発現するよう設計する。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結される。
【０１５７】
メバロン酸生合成経路の下流は、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）及びジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）を含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路の下流は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）を更に含む。本明細書に提供される細胞は、イソプレンシンターゼ、ＭＶＡ経路上流の１種以上のポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路下流の１種以上のポリペプチドをコードしている核酸を含み得る。ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素、（ｂ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸へと変換する酵素、（ｃ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、のうちの任意の酵素であり得る。より具体的には、メバロン酸を５−ホスホメバロン酸にリン酸化する酵素は、メタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼ、ラクトバチルス（Lactobacillus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びメタノコッコイド・バートニィ（M. Burtonii）メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群であってもよい。他の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸へとリン酸化する酵素はメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼである。
【０１５８】
一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは異種ポリペプチドである。一部の態様では、細胞は、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸のコピーを１つ以上含む。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように構成型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結される。一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結される。一部の態様では、異種ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のポリペプチドである。
【０１５９】
ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている核酸は、細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている核酸は更に、ベクター上に存在させてもよい。
【０１６０】
ＭＶＡ経路下流のポリペプチドの例としては、次の（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；及び（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）も挙げられる。詳細には、下流のＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ（Methanosarcina）属由来のものであってよく、更に詳細には、下流のＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のものであってよい。一部の実施形態では、下流のＭＶＫポリペプチドは、メタノコッカシド・バートニイ（M. Burtonii）由来のものであってよい。ＭＶＡ経路下流のポリぺプチドのその他の例は、米国特許出願公開第２０１０／００８６９７８号に見出すことができ、この内容は、ＭＶＫ経路下流のポリペプチド及びＭＶＫ経路下流のポリペプチド変異体に関し参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。
【０１６１】
特に、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドとしては、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。ＭＶＡ経路下流の核酸の例としては、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＭＶＡ経路下流のポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。更に、イソプレンの産生量を増加させるような、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド変異体も、良好に使用することができる。
【０１６２】
一部の態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のポリペプチドである。
一部の態様では、ＭＶＫポリペプチドは、ラクトバチルス（Lactobacillus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチド、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びメタノコッカシド・バートニイ（M. Burtonii）メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される。本開示のプロモータのうちのいずれか（例えば、本開示に記載され、本開示の実施例において識別される、誘導型プロモータ及び構成型プロモータなどのプロモータ）を使用して、本開示のいずれかのＭＶＡポリペプチドの発現を駆動させることができる。
【０１６３】
本明細書に記載の細胞のうち任意のものは、ＩＤＩ核酸（例えば、ＩＤＩをコードしている内在性又は異種核酸）を含み得る。イソペンテニルジホスフェートイソメラーゼポリペプチド（イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ又はＩＤＩ）は、イソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の相互変換を触媒する（例えば、ＩＰＰをＤＭＡＰＰへと変換し及び／又はＤＭＡＰＰをＩＰＰヘと変換する）。例示的なＩＤＩポリペプチドとしては、ＩＤＩポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを相互変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＩＤＩポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。ＩＤＩ核酸の例としては、ＩＤＩポリペプチド活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードしている核酸が挙げられる。ＩＤＩポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【０１６４】
イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている核酸
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に記載の細胞（本明細書に記載されるとおりにＭＶＡ経路への炭素の取り込みを増加させるよう遺伝子操作された宿主細胞など）は、イソプレンシンターゼポリペプチド又はイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を更に含む。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは内在性ポリペプチドである。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、構成型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、誘導型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、高発現型プロモータに調節可能なように連結される。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、経路の内在性イソプレンシンターゼポリペプチドを過剰発現するよう遺伝子操作する。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、低発現型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ（Pueraria）又はハコヤナギ（Populus）、又はウラジロハコヤナギとヤマナラシの交雑種（Populus alba x Populus tremula）のような交雑種に由来のポリペプチドである。
【０１６５】
一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは異種ポリペプチドである。一部の態様では、細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸のコピーを１つ以上含む。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、構成型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、誘導型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、高発現型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、低発現型プロモータに調節可能なように連結される。
【０１６６】
イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、更にベクターに組み込むこともできる。
【０１６７】
代表的なイソプレンシンターゼの核酸としては、イソプレンシンターゼポリペプチドの活性を少なくとも１種有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。イソプレンシンターゼポリペプチドは、ジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する。代表的なイソプレンシンターゼポリペプチドとしては、イソプレンシンターゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、並びに融合ポリペプチドが挙げられる。イソプレンシンターゼポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。加えて、イソプレンシンターゼ変異体は、酵素活性が向上しているなどして、活性が向上されていてよい。一部の態様では、イソプレンシンターゼ変異体は、安定性（例えば、熱安定性）が改良されている、及び／又は溶解性が改良されているなどして、その他の特性が改良されている。
【０１６８】
インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボで、ポリペプチドがＤＭＡＰＰをイソプレンへと変換する能力を測定して、ポリペプチドがイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有するか否かを判定する際には、標準法を使用できる。細胞抽出物中のイソプレンシンターゼポリペプチド活性は、例えば、Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３０１０〜１３０１６，１９９５に記載のとおりに測定することができる。代表的な解析では、ＤＭＡＰＰ（Ｓｉｇｍａ）は窒素流下で濃縮させ、乾燥させ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ８．２）を用い１００ｍＭに再水和し、−２０℃で保存する。解析を実施するために、金属製スクリューキャップと、テフロンコーティングのなされたシリコン製隔壁（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とを取り付けた２０ｍＬヘッドスペースバイアル内で、５μＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ（２５０μｇ／ｍＬ）ＤＭＡＰＰ、６５μＬの植物抽出緩衝液（ＰＥＢ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、及び２ｍＭ  ＤＴＴ）に、２５μＬ細胞抽出物を加え、振盪させながら３７℃で１５分間培養した。２００μＬの２５０ｍＭ  ＥＤＴＡを加えて反応をクエンチさせ、ＧＣ／ＭＳにより定量することができる。
【０１６９】
一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物のイソプレンシンターゼポリペプチド又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア（Pueraria）に由来するイソプレンシンターゼ又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ハコヤナギ属（Populus）由来のイソプレンシンターゼ又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ポプラ（poplar）のイソプレンシンターゼポリペプチド又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドはクズのイソプレンシンターゼポリペプチド又はそれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）、ウラジロハコヤナギとヤマナラシの交雑種（Populus alba x Populus tremula）、又はこれらの（変異体（variant）由来のポリペプチドである。
【０１７０】
一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチド又は核酸は、マメ科、例えば、マメ亜科（Faboideae）由来のものである。特定の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチド又は核酸は、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）（クズ）（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３７：７００〜７１２，２００５）、プエラリア・ロバタ（Pueraria lobata）、ポプラ（ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、コットンウッド（Populus trichocarpa）、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘトレムラ（tremula）（ＣＡＣ３５６９６）Ｍｉｌｌｅｒｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔａ  ２１３：４８３〜４８７，２００１）、アスペン（aspen）（ヤマナラシなど）Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ  ２７０（２２）：１３０１０〜１３１６，１９９５）、又はヨーロッパナラ（Quercus robur）（Ｚｉｍｍｅｒｅｔ  ａｌ．，国際特許出願公開第９８／０２５５０号）に由来するポリペプチド又は核酸である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）、プエラリア・ロバタ（Pueraria lobata）、ポプラ・トレムロイド（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、ポプラ・ニグラ（Populus nigra）又はポプラ・トリコカルパ（Populus trichocarpa）由来のイソプレンシンターゼ、又はこれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレンシンターゼであるか、又はこれらの変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）又はこれらの変異体由来のイソプレンシンターゼ）をコードしている核酸は、コドンを最適化されている。
【０１７１】
一部の態様では、イソプレンシンターゼ核酸又はポリペプチドは、天然に生じるポリペプチド又は核酸である（例えば、ハコヤナギ属から天然に生じるポリペプチド又は核酸）。一部の態様では、イソプレンシンターゼ核酸又はポリペプチドは、野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸ではない。一部の態様では、イソプレンシンターゼ核酸又はポリペプチドは、野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸の変異体である（例えば、ハコヤナギ属の野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸の変異体）。
【０１７２】
一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは変異体である。一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、野生型又は天然型イソプレンシンターゼの変異体である。一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼと比較して触媒活性が向上しているなど、活性が向上している。活性（例えば、触媒活性）の向上は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％のうちのいずれかの程度であり得る。一部の態様では、触媒活性などの活性の向上は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、又は１００倍のいずれかである。一部の態様では、触媒活性などの活性の向上は、約１０％〜約１００倍である（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、又は約５倍〜約２０倍）。一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼと比較して可溶性が向上している。
可溶性の向上は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％のうちのいずれかの程度であり得る。可溶性の向上は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、又は１００倍のうちのいずれかの程度であり得る。一部の態様では、溶解性の向上は、約１０％〜約１００倍のうちのいずれかの程度であり得る（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、又は約５倍〜約２０倍）。
一部の態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、天然型イソプレンシンターゼ変異体であり、かつ天然型イソプレンシンターゼと比較して安定性が向上している（熱安定性など）。
【０１７３】
一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼの活性の、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％の活性を有する。変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼとの配列類似性を保有し得る。一部の態様では、野生型又は天然型イソプレンシンターゼの変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼのアミノ酸配列と、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％のうちのいずれかの程度で配列相同性を有する。一部の態様では、野生型又は天然型イソプレンシンターゼの変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼのアミノ酸配列と、約７０％〜約９９．９％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９８％、約８５％〜約９７％、又は約９０％〜約９５％のうちのいずれかの程度で配列相同性を有する。
【０１７４】
一部の態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレンシンターゼ内に変異を持つ。
一部の態様では、変異体は、少なくとも１箇所にアミノ酸置換、少なくとも１箇所にアミノ酸挿入、及び／又は少なくとも１箇所にアミノ酸欠失を有する。一部の態様では、変異体は、少なくとも１箇所にアミノ酸置換を有する。一部の態様では、変異体と、野生型又は天然型イソプレンシンターゼとの間で異なっているアミノ酸残基の数は、１以上であってよく、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、又は５０以上のアミノ酸残基が異なっていてよい。天然型イソプレンシンターゼとしては、植物由来の任意のイソプレンシンターゼを挙げることができ、例えば、クズ（kudzu）イソプレンシンターゼ、ポプラ（poplar）イソプレンシンターゼ、ヨーロッパナラ（English oak）イソプレンシンターゼ、及びヤナギ（willow）イソプレンシンターゼが挙げられる。一部の態様では、変異体は、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレンシンターゼの変異体である。一部の態様では、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレンシンターゼ変異体は、少なくとも一箇所にアミノ酸置換、少なくとも１箇所にアミノ酸挿入、及び／又は少なくとも１箇所にアミノ酸欠失を有する。一部の態様では、変異体は、トランケート型のウラジロハコヤナギ（Populus alba）イソプレンシンターゼである。一部の態様では、変異体（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレンシンターゼの変異体）をコードしている核酸は、コドンを最適化させたものである（例えば、異種イソプレンシンターゼを発現させる宿主細胞に基づきコドンを最適化している）。
【０１７５】
本開示のイソプレンシンターゼポリペプチドは、国際公開第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／１２４１４６号、米国特許出願第２０１０／００８６９７８号に記載のいずれかのイソプレンシンターゼ又はイソプレンシンターゼ変異体であってよい。これらの文献に記載される、イソプレンシンターゼ及びイソプレンシンターゼ変異体に関係するすべての内容は、参照により本開示に明示的に組み込む。
【０１７６】
本開示のプロモータのうちのいずれか（例えば、本開示に記載され、本開示の実施例において識別される、誘導型プロモータ及び構成型プロモータなどのプロモータ）を使用して、本開示のいずれかのイソプレンシンターゼの発現を駆動させることができる。
【０１７７】
好適なイソプレンシンターゼとしては、限定するものではないが、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３４１４３１、ＡＹ３１６６９１、ＡＹ２７９３７９、ＡＪ４５７０７０、及びＡＹ１８２２４１として識別されるものが挙げられる。本開示のイソプレンシンターゼをコードしている細胞の製造法を含む組成物又は方法のうちのいずれか１つに使用することのできるイソプレンシンターゼの種類は、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０１３０７７号、同第２０１０／０３１０７９号、同第２０１０／１４８１５０号、同第２０１０／１２４１４６号、同第２０１０／０７８４５７号、同第２０１０／１４８２５６号、同第２０１２／０５８４９４号、及び米国特許第８，１７３，４１０号にも記載されている。
【０１７８】
ＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている核酸
本発明の一部の態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に記載の細胞（本明細書に記載されるとおりにＭＶＡ経路への炭素の取り込みを増加させるよう遺伝子操作された宿主細胞など）は、ＤＸＳポリペプチド又はＤＸＰ経路の他のポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を更に含む。一部の態様では、細胞は更に、ＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている内在性の核酸の染色体コピーを含む。一部の態様では、大腸菌（E. coli）細胞は更に、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている核酸を１つ以上含む。一部の態様では、核酸は、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。一部の態様では、１つのプラスミドは、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。一部の態様では、複数のプラスミド（multiple plasmids）は、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードしている。
【０１７９】
例示的なＤＸＳポリペプチドとしては、ＤＸＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。
標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸ヘと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。ＤＸＳポリぺプチド及び核酸、並びにＤＸＳ活性の測定方法の例は、国際公開出願第２００９／０７６６７６号、国際公開第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号、同第２０１０／０００３７１６号、及び同第２０１０／００４８９６４号においてより詳細に記載される。
【０１８０】
ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドの例としては、限定するものではないが、次の任意のポリペプチド：ＤＸＳポリペプチド、ＤＸＲポリペプチド、ＭＣＴポリペプチド、ＣＭＫポリペプチド、ＭＣＳポリペプチド、ＨＤＳポリペプチド、ＨＤＲポリペプチド、及びＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を１つ、又は２つ以上有するＤＸＰ経路ポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）、が挙げられる。特に、ＤＸＰ経路ポリペプチドとしては、ＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なＤＸＰ経路に関する核酸としては、ＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＤＸＰ経路に含まれる代表的なポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。ＤＸＰ経路のポリペプチド及び核酸の例としては、並びにＤＸＰ経路のポリペプチド活性を測定する方法については、国際公開第２０１０／１４８１５０号に、より詳細に記載されている。
【０１８１】
例示的なＤＸＳポリペプチドとしては、ＤＸＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。
標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸ヘと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。ＤＸＳポリぺプチド及び核酸、並びにＤＸＳ活性の測定方法の例は、国際公開出願第２００９／０７６６７６号、国際公開第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号、同第２０１０／０００３７１６号、及び同第２０１０／００４８９６４号においてより詳細に記載される。
【０１８２】
特に、ＤＸＳポリペプチドは、ピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１８３】
ＤＸＲポリペプチドは、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＤＸＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＲポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１８４】
ＭＣＴポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）を４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＴポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１８５】
ＣＭＫポリペプチドは、４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）を２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＣＤＰ−ＭＥを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＣＭＫポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１８６】
ＭＣＳポリペプチドは、２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェート（ＭＥ−ＣＰＰ又はｃＭＥＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＣＤＰ−ＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１８７】
ＨＤＳポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートを（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イルジホスフェート（ＨＭＢＰＰ又はＨＤＭＡＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＭＥ−ＣＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１８８】
ＨＤＲポリペプチドは、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イルジホスフェートをイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＨＭＢＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＲポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１８９】
ＭＶＡ経路下流、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ及びＤＸＰ経路のポリペプチドに関する生物資源
イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路及び／又はＭＶＡ経路下流の核酸（及びそれらにコードされるポリペプチド）は、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路及び／又はＭＶＡ経路下流の核酸を天然に含有する任意の生物から得ることができる。イソプレンは、細菌、酵母、植物及び動物などの様々な生物により天然に生成される。一部の生物は、イソプレンの産生に関係するＭＶＡ経路を含有する。イソプレンシンターゼの核酸は、例えば、イソプレンシンターゼを含有する任意の生物から得ることができる。したがってＭＶＡ経路の核酸は、例えば、ＭＶＡ経路を含有する任意の生物から得ることができる。ＩＤＩ及びＤＸＰ経路の核酸は、例えば、ＩＤＩ及びＤＸＰ経路を含有する任意の生物から得ることができる。
【０１９０】
イソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路の核酸の核酸配列は、細菌、真菌、植物、藻類、又はシアノバクテリアから単離することができる。例示的な生物資源としては、例えば、酵母、例えばサッカロマイセス（Saccharomyces）種（例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae））、細菌、例えば、エシェリキア（Escherichia）種（例えば、大腸菌）、又はメタノサルシナ（Methanosarcina）種（例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei））、植物、例えば葛又はポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）又はウラジロハコヤナギｘトレムラＣＡＣ３５６９６（Populus alba x tremula CAC35696））又はヤマナラシ（例えば、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides））が挙げられる。イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドに関係し、使用することのできる資源例は、同様に、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０１３０７７号、同第２０１０／０３１０７９号、同第２０１０／１４８１５０号、同第２０１０／０７８４５７号、及び同第２０１０／１４８２５６号に記載されている。
【０１９１】
一部の態様では、生物資源は酵母であり、例えば、酵母菌（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア（Pichia sp）又はカンジダ（Candida sp.）である。
【０１９２】
一部の態様では、宿主細胞は、バチルス・リケノフォルミス（B. lichenoformis）又はバチルス・サブチリス（B. subtilis）などのバチルス株、シュードアルテロモナス・シトレア（P. citrea）などのパントエア（Pantoea）株、シュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes）などのシュードモナス属（Pseudomonas）株、ストレプトマイセス・リビダンス（S. lividans）又はストレプトマイセス・ルビギノーサス（S. rubiginosus）などのストレプトマイセス（Streptomyces）株、大腸菌（E. coli）などのエシェリキア（Escherichia）株、エンテロバクター株（Enterobacter）、ストレプトコッカス（Streptococcus）株、又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）などの古細菌株である。
【０１９３】
本明細書で使用するとき、「バチルス（Bacillus）属」としては、当業者に既知の「バチルス（Bacillus）」属のすべての種を包含し、限定するものではないが、例えば、バチルス・サブチリス（B. subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシイ（B. clausii）、バチルス・ハロデュランス（B. halodurans）、バチルス・メガテリウム（B. megaterium）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サークランス（B. circulans）、バチルス・ロータス（B. lautus）、及びバチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）が挙げられる。バチルス属は分類上の再編成を受け続けるものと認識される。したがって、この属は、再分類された種を包含することを意図し、例えば、限定するものではないが、現在は「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス」と命名されたバチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）のような生物を包含する。酸素存在下での耐性内生胞子の生成はバチルス属の決定的特徴と考えられるが、この特徴は最近命名されたアリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、アムピバチルス（Amphibacillus）、アネウリニバチルス（Aneurinibacillus）、アノキシバチルス（Anoxybacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、フィロバチルス（Filobacillus）、グラシリバチルス（Gracilibacillus）、ハロバチルス（Halobacillus）、パエニバチルス（Paenibacillus）、サリバチルス（Salibacillus）、サーモバチルス（Thermobacillus）、ウレイバチルス（Ureibacillus）、及びバルジバチルス（Virgibacillus）にも当てはまる。
【０１９４】
一部の態様では、生物資源はグラム陽性細菌である。非限定的な例としては、ストレプトマイセス（treptomyces）株（例えば、ストレプトマイセス・リビダンス（S. lividans）、ストレプトマイセス・コエリカラー（S. coelicolor）、又はストレプトマイセス・グリセウス（S. griseus））及びバチルス株が挙げられる。一部の態様では、生物資源は、大腸菌（E. coli）又はシュードモナス属（Pseudomonas sp.）などのグラム陰性細菌である。
【０１９５】
一部の態様では、微生物源は植物であり、例えば、マメ科（Fabaceae）、例えばマメ亜科（Faboideae）などの植物である。一部の態様では、生物資源はクズ、ポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）×トレムラ（tremula）ＣＡＣ  ３５６９６など）、アスペン（例えば、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides））、又はヨーロッパナラ（Quercus robur）である。
【０１９６】
一部の態様では、微生物源は、藻類、例えば緑藻、紅藻、灰色藻、クロララクニオン藻、ミドリムシ目、クロミスタ、又は渦鞭毛藻類である。
【０１９７】
一部の態様では、生物資源は、形態に基づき次の群：クロオコッカス（Chroococcales）、プレウロカプサ（Pleurocapsales）、ユレモ（Oscillatoriales）、ネンジュモ（Nostocales）、又はスティゴネマ（Stigonematales）のいずれかに分類される、シアノバクテリアである。
【０１９８】
イソプレンの産生量を増大させることのできる組換え細胞
本明細書に記載の組換え細胞（本明細書に記載されるとおりに炭素の取り込みを増加させるよう遺伝子操作された宿主細胞など）は、同一条件下で培養した場合に、ホスホケトラーゼポリペプチドの異種核酸の１種以上のコピー、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピー、及びイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まない同様の細胞と比較して、高濃度でイソプレンを産生することができる。細胞には、ＩＤＩポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を更に含ませてもよい。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来する。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレ��トマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
【０１９９】
一部の態様では、ホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピー、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピー、及びイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸は、宿主細胞の染色体のヌクレオチド配列に組み込まれた異種核酸である。他の態様では、１種以上の異種核酸はプラスミドに組み込まれる。更に他の態様では、１種以上の異種核酸のうち少なくとも１つは、細胞の染色体のヌクレオチド配列に組み込まれ、かつ１種以上の異種核酸配列のうち少なくとも１つはプラスミドに組み込まれる。組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドを含まないイソプレン産生細胞と比較して、少なくとも５％多量にイソプレンを産生することができる。あるいは、組換え細胞は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、又は１５超並びにこれらの数字の間の任意の数値でイソプレンを産生することができる。
【０２００】
本明細書において、本発明の一態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、メバロン酸（ＭＶＡ）経路のポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、ＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、並びにイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、を含む、組換え細胞が提供される。細胞には、ＩＤＩポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を更に含ませてもよい。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来する。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソ��ビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。任意の１種以上の異種核酸を、調節可能なように構成型プロモータに連結させることができ、調節可能なように誘導型プロモータに連結させることができ、あるいは調節可能なように誘導型及び構成型プロモータと組み合わせて連結させることができる。１種以上の異種核酸は、更に、調節可能なように高発現型プロモータ、低発現型プロモータ及び／又は強度が発現が中程度のプロモータに連結させることができる。ホスホケトラーゼ、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＰ経路ポリペプチド、及びイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞において安定的に発現させることができる。加えて、１種以上の異種核酸は、ベクター上に存在させることもできる。
【０２０１】
本明細書に記載の本明細書に記載の任意の組成物又は方法に従う細胞によるイソプレンの産生は、増強させることができる（例えば、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＭＶＡ経路のポリペプチド、及び／又はＤＸＰ経路のポリペプチドの発現を増加させることにより）。本明細書で使用するとき、イソプレン産生の「増強」は、本明細書に記載の任意の組成物及び方法により表される細胞による、イソプレンに関する細胞産生性指数（ＣＰＩ）、イソプレンの力価、イソプレンの質量収率及び／又はイソプレンの比産生量が、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を有さない細胞と比較して増加していることを意味する。本明細書に記載の特定の実施形態では、宿主細胞には、ＭＶＡ産生に取り込まれる炭素を増加させるよう更に遺伝子操作することができる。
【０２０２】
本明細書に記載の組換え細胞によるイソプレンの産生は、約５％〜約１，０００，０００倍だけ増強させることができる。特定の態様では、イソプレン産生は、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現していない細胞によるイソプレン産生と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、又は約５０〜約２００倍）だけ増強させることができる。本明細書に記載の特定の実施形態では、宿主細胞には、ＭＶＡ産生への炭素の取り込みを増加させることにより、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現せずかつメバロン酸産生に取り込まれる炭素を増加させるよう遺伝子操作されていない細胞によるイソプレン産生と比較して、イソプレン産生を増強させる遺伝子操作を更に行うことができる。
【０２０３】
他の態様では、本明細書に記載の組換え細胞によるイソプレンの産生は、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現していない細胞によるイソプレンの産生量と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、又は１，０００，０００倍だけ増強させることもできる。本明細書に記載の特定の実施形態では、宿主細胞には、ＭＶＡ産生への炭素の取り込みを増加させることにより、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現せずかつメバロン酸産生に取り込まれる炭素を増加させるよう遺伝子操作されていない細胞によるイソプレン産生と比較して、イソプレン産生を増強させる遺伝子操作を更に行うことができる。
【０２０４】
組換え細胞を使用してイソプレンを産生する方法
本開示では、本明細書に記載の任意の組換え細胞を培養する工程を含む、イソプレンの産生方法も提供される。一態様では、イソプレンは、ホスホケトラーゼポリペプチド、ＭＶＡ経路のポリペプチドを１種以上、及びイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている、１種以上の異種核酸を含む、組換え細胞を培養することにより産生することができる。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来する。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）から単離されたホスホケト���ーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
【０２０５】
別の態様では、イソプレンは、本明細書に記載のいずれかの酵素経路に調節がなされており、かつホスホケトラーゼペプチド、ＭＶＡ経路のポリペプチド、及びイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含む、組換え細胞を培養することにより産生され得る。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来する。他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
イソプレンは、本開示の任意の方法に従い、本明細書に記載の任意の細胞から産生することができる。限定するものではないが、六炭糖（グルコースなど）などの炭水化物からイソプレンを産生する目的に際し、任意の細胞を使用することができる。他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）に由来する。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
【０２０６】
したがって、本明細書では、ホスホケトラーゼポリペプチド及びイソプレンシンターゼをコードしている１種以上の異種核酸を含む細胞を、イソプレンの産生に好適な条件下で培養する工程と、（ｂ）イソプレンを産生させる工程と、を含む、イソプレンの産生方法が提供される。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来する。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態���は、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
【０２０７】
細胞は、ＭＶＡ経路のポリペプチド（例えば、完全なＭＶＡ経路）及び上記の任意のイソプレンシンターゼポリペプチド（例えば、プエラリア（Pueraria）のイソプレンシンターゼ）をコードしている１種以上の核酸分子を更に含み得る。一部の態様では、組換え細胞は、本明細書に記載の細胞のうちのいずれか１つであり得る。本明細書に記載の任意のイソプレンシンターゼ又はそれらの変異体、本明細書に記載の任意の宿主細胞株、本明細書に記載の任意のプロモータ及び／又は本明細書に記載の任意のベクターも、本明細書に記載の方法において使用することができる、本明細書に記載の任意のエネルギー源（例えば、グルコース又は任意のその他の六炭糖）を使用するイソプレンの産生に使用することができる。一部の態様では、イソプレンの産生方法は更に、イソプレンを回収する工程を含む。他の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）に由来する。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
【０２０８】
特定の態様では、本明細書では、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）由来のホスホケトラーゼポリペプチド、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）、及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含む組換え細胞を、イソプレンの産生に好適な条件下で培養する工程と、並びに（ｂ）イソプレンを産生させる工程と、を含む、イソプレンの産生方法が提供される。細胞には、上記のＭＶＡ経路下流のポリペプチド（例えば、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ及び／又はＩＤＩ）及び上記の任意のイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の核酸分子を更に含ませることができる。一部の態様では、組換え細胞は、本明細書に記載の任意の細胞であってよい。
【０２０９】
特定の態様では、本明細書では、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）由来のホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含む組換え細胞を、イソプレンの産生に好適な条件下で培養する工程と、並びに（ｂ）イソプレンを産生させる工程と、を含む、イソプレンの産生方法が提供される。細胞には、上記のＭＶＡ経路下流のポリペプチド（例えば、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ及び／又はＩＤＩ）及び上記の任意のイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の核酸分子を更に含ませることができる。一部の態様では、組換え細胞は、本明細書に記載の任意の細胞であってよい。本明細書に記載の、メバロン酸産生に取り込まれる炭素量が増加するよう操作された各種酵素経路を有する組換え細胞を、イソプレン産生に使用することができる。一部の態様では、組換え細胞には、次の、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡ及び／又はｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ及び／又はｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌ  Ｂ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ及び／又はｅｕｔＤ）からなる群から選択される遺伝子のうちの１つ以上の活性を増加させるよう、更に遺伝子操作を施すことができる。別の実施形態では、これらの組換え細胞には、次の、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、及び／又はｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｇａｐＡ及び／又はｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、及び／又はＨＰｒ（ｐｔｓＨ）といった遺伝子のうち、１種以上の遺伝子の活性を減少させるよう更に遺伝子操作を施すことができる。
【０２１０】
特定の態様では、本明細書では、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）由来のホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含む組換え細胞を、イソプレンの産生に好適な条件下で培養する工程と、（ｂ）イソプレンを産生させる工程と、を含む、イソプレンの産生方法が提供される。細胞には、上記のＭＶＡ経路下流のポリペプチド（例えば、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ及び／又はＩＤＩ）及び上記の任意のイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の核酸分子を更に含ませることができる。
一部の態様では、組換え細胞は、本明細書に記載の任意の細胞であってよい。本明細書に記載の、メバロン酸産生に取り込まれる炭素量が増加するよう操作された各種酵素経路を有する組換え細胞を、イソプレン産生に使用することができる。一部の態様では、組換え細胞は、次の、ｒｐｉＡ、ｒｐｅ、ｔｋｔＡ、ｔａｌ  Ｂ、ｐｔａ、及び／又はｅｕｔＤからなる群から選択される１種以上の遺伝子の活性を増加させるよう、更に遺伝子操作を施すことができる。別の態様では、これらの株は、次の、ｚｗｆ、ｐｆｋＡ、ｆｂａ、ｇａｐＡ、ａｃｋＡ、ｇｌｔＡ及び／又はｐｔｓを含む遺伝子のうち１つ以上の遺伝子の活性を減少させるよう、更に遺伝子操作を施すことができる。
【０２１１】
一部の態様では、産生されるイソプレン量は、純産生量（absolute productivity）が最大となった時点で測定されたものである。一部の態様では、細胞に関し純産生量が最大であるとは、本明細書で開示される任意のおよそのイソプレン量を指していうものである。一部の態様では、産生されたイソプレンの量は、比産生量が最大となった時点で測定されたものである。一部の態様では、細胞に関し比産生量が最大であるとは、本明細書で開示される、細胞あたりの任意のおよそのイソプレン量を指していうものである。一部の態様では、産生されたイソプレンの総量は累積値として測定される。一部の態様では、細胞の累積産生量は、本明細書で開示される任意のおよそのイソプレン量を指していうものである。
【０２１２】
一部の態様では、本明細書に記載の、任意の細胞（例えば、培養物中の細胞）は、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００又は５，０００以上のうちのいずれかのイソプレン（ｎｍｏｌ）／細胞湿潤重量（ｇ）／時間（ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈ）値でイソプレンを産生する。一部の態様では、イソプレンの量は約２〜約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈであり、例えば、約２〜約１００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１５０〜約５００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈ、約５００〜約１，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１，０００〜約２，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈ又は約２，０００〜約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈである。一部の態様では、イソプレンの量は約２０〜約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約２，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約１，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈ、約３００〜約１，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈ又は約４００〜約１，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈである。
【０２１３】
一部の態様では、細胞は、培養時に、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００又は１００，０００以上のうちのいずれかのイソプレン（ｎｍｏｌ）／細胞湿潤重量（ｇ）／時間（ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ）値でイソプレンを産生する。一部の態様では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈであり、例えば、約２〜約１００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約５００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１，０００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ又は約２，０００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。一部の態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約３００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ又は約４００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。
【０２１４】
一部の態様では、細胞は、培養時に、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００以上のうちのいずれかのイソプレン（ｍｇ）／ブロス（Ｌ）（ｍｇ／Ｌブロス、ブロス体積には、細胞及び細胞培地の体積を含む）値の累積力価（総量）でイソプレンを産生する。一部の態様では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロスであり、例えば、約２〜約１００ｍｇ／Ｌブロス、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌブロス、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、約１，０００〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス、又は約２，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロスなどである。一部の態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス、約１００〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス、約２００〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス、約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、約３００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、又は約４００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロスである。
【０２１５】
一部の態様では、細胞により、培養時に産生されるイソプレンは、発酵時排出気体（fermentation offgas）の体積の少なくとも約１、２、５、１０、１５、２０又は２５％を構成する。一部の態様では、イソプレンは、排出気体の体積の約１〜約２５％を構成し、例えば、約５〜約１５％、約１５〜約２５％、約１０〜約２０％又は約１〜約１０％を構成する。
【０２１６】
特定の実施形態では、イソプレンの産生方法は、（ａ）ホスホケトラーゼポリペプチドを内因的に発現しない組換え細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞など）を培養する工程、細胞は、（ｉ）ＭＶＡ経路の１種以上のペプチドを発現する１種以上の異種核酸、及び（ｉｉ）イソプレンシンターゼとともに、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている遺伝子の１種以上のコピーを異種発現する、並びに（ｂ）イソプレンを産生させる工程、を含んでよく、組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている遺伝子の１つ以上の異種コピーを含まない同様の細胞と比較して、減少している酸素の取り込み速度（ＯＵＲ）を示す特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている遺伝子の１種以上の異種コピーを発現する組換え細胞は、ホスホケトラーゼを発現しない組換え細胞と比較した場合に、ＯＵＲの、最大で１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍又は７倍の減少を示す。
【０２１７】
同様に、本明細書では、増強されたイソプレン産生能を有する細胞を含むイソプレン産生法を提供する。本明細書に記載の細胞によるイソプレンの産生は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピー、及びイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸をコードしている１種以上の異種核酸を発現させることにより増加させることができる。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来する。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプ��ス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。本明細書で使用するとき、イソプレン産生量の「増大」は、本明細書に記載の任意の組成物及び方法により表される細胞による、イソプレンに関する細胞産生性指数（ＣＰＩ）、イソプレンの力価、イソプレンの質量収率及び／又はイソプレンの比産生量が、ホスホケトラーゼポリペプチド、ＭＶＡ経路のポリペプチド、及びイソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を有さない細胞と比較して増加していることを意味する。イソプレンの産生量は、約５％〜約１，０００，０００倍増加させることができる。イソプレン産生量は、ホスホケトラーゼ酵素を内因的に発現しないイソプレン産生細胞によるイソプレンの産生量と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約５０％〜約１，０００，０００倍、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、又は約５０〜約２００倍）だけ増加させることができる。本明細書に記載の特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＭＶＡ産生への炭素の取り込みを増加させることにより、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現せずかつメバロン酸産生に取り込まれる炭素を増加させるよう遺伝子操作されていないイソプレン産生細胞によるイソプレン産生と比較して、イソプレン産生を増強させる遺伝子操作を更に行った宿主細胞を含む。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）に由来する。
【０２１８】
他の態様では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の細胞によるイソプレン産生の増強（例えば、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現させることによる増強）を目的とする特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来する。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・ア���トブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。イソプレンの産生量は、約５％〜約１，０００，０００倍増加させることができる。イソプレン産生は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現しないイソプレン産生細胞によるイソプレンの産生と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約５０％〜約１，０００，０００倍、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、又は約５０〜約２００倍）だけ増強させることができる。イソプレンの産生は、ホスホケトラーゼをコードしている１種以上の異種核酸を発現しないイソプレン産生細胞によるイソプレン産生と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、又は１，０００，０００倍だけ増加させることができる。本明細書に記載の特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＭＶＡ産生への炭素の取り込みを増加させることにより、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現せずかつメバロン酸産生に取り込まれる炭素を増加させるよう遺伝子操作されていない細胞によるイソプレン産生と比較して、イソプレン産生を増強させる遺伝子操作を更に行った宿主細胞を含む。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）に由来する。
【０２１９】
加えて、より具体的な細胞培養条件を使用して、本明細書に記載の方法により細胞を培養することができる。例えば、一部の態様では、イソプレンの産生方法は、（ａ）ホスホケトラーゼ遺伝子を内因的に有さない組換え細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞）を、３４℃下で、最少培地にて、培養する工程であって、組換え細胞が、（ｉ）低〜通常コピー数のプラスミドにおいて、高発現型プロモータの調節下で、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている異種遺伝子の１種以上のコピー、（ｉｉ）ＭＶＡ経路のポリペプチド（ＭＶＡ経路上流及びＭＶＡ経路下流）の１種以上のポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピー、及び（ｉｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を異種発現する、培養する工程；並びに（ｂ）イソプレンを産生させる工程、を含む。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来する。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一部の態様では、イソプレンの産生方法は更に、イソプレンを回収する工程を含む。
【０２２０】
イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生量を増加させることのできる組換え細胞
イソプレノイドは、多くの生物において、ＭＶＡ経路の最終産物であるイソプレノイド前駆体分子の合成によりとができる。上記のように、イソプレノイドは、重要な部類の化合物として存在し、例えば、食品及び飼料用サプリメント、風味及び臭気化合物、並びに抗癌、抗マラリア、抗真菌及び抗菌化合物を含む。
【０２２１】
分子の部類の際には、イソプレノイドは、化合物を構成しているイソプレン単位の数に基づき分類される。モノテルペンは１０個の炭素原子又は２個のイソプレン単位を含み、セスキテルペンは１５個の炭素原子又は３個のイソプレン単位を含み、ジテルペンは２０個の炭素原子又は４個のイソプレン単位を含み、セステルテルペンは２５個の炭素原子又は５個のイソプレン単位を含む。ステロイド（一般的に、炭素原子を約２７個含む）は、イソプレノイドを分解又は再構成した生成物である。
【０２２２】
イソプレノイドは、イソプレノイド前駆体分子のＩＰＰ及びＤＭＡＰＰから生成することができる。これらの多様な化合物は、これらのより単純で一般的な前駆体から誘導され、及び保存されているポリプレニルピロリン酸シンターゼ群により合成される（Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１  Ｍａｒ；１５５（３）：１０７９〜９０）。多様な鎖長を有するこれらの直鎖プレニルピロリン酸はそれぞれに特有の生理機能を示し、及びポリプレニルピロリン酸シンターゼの非常に発達した活性部位により、一般的にアリル基（ジメチルアリル二リン酸（Ｃ５−ＤＭＡＰＰ）、ゲラニルピロリン酸（Ｃ１０−ＧＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（Ｃ１５−ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（Ｃ２０−ＧＧＰＰ））と、相当する数のイソペンテニルピロリン酸との縮合反応を介し、認識される（Ｃ５−ＩＰＰ）（Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１  Ｍａｒ；１５５（３）：１０７９〜９０）。
【０２２３】
イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生は、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生を増加させるため、ホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む、任意の組換え宿主細胞を使用することにより行うことができる。一部の態様では、これらの細胞は、上記のように、ＭＶＡ経路、ＩＤＩ及び／又はＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、並びにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む。理論に束縛されるものではないが、上記の任意の組成物及び方法により、組換え細胞におけるメバロン酸の産生量を増加させることで、同様に、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドなどのより高分子量の生成物の産生量も増加するものと考えられる。グルコースからのメバロン酸産生量のモル収率を上昇させ、適切な酵素活性濃度で、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ並びにイソプレン及びイソプレノイド産生に好適な他の酵素と組み合わせると、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイド（イソプレンを含む）のモル収率の上昇につながる。本明細書に記載の、メバロン酸産生に取り込まれる炭素量が増加するよう遺伝子操作された各種酵素経路を有する組換え細胞を、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生に使用することができる。一部の態様では、組換え細胞は、次の、ｒｐｉＡ、ｒｐｅ、ｔｋｔＡ、ｔａｌ  Ｂ、ｐｔａ、及び／又はｅｕｔＤからなる群から選択される１種以上の遺伝子の活性を増加させるよう、更に遺伝子操作を施すことができる。別の態様では、これらの株は、次の、ｚｗｆ、ｐｆｋＡ、ｆｂａ、ｇａｐＡ、ａｃｋＡ、ｇｌｔＡ及び／又はｐｔｓを含む遺伝子のうち１つ以上の遺伝子の活性を減少させるよう、更に遺伝子操作を施すことができる。
【０２２４】
イソプレノイドの種類
本発明の組換え細胞は、イソプレノイド及びイソプレノイド前駆体分子ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰの産生量を増加させる能力がある。イソプレノイドの例としては、限定するものではないが、ヘミテルペノイド、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セステルテルペノイド、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、及びより高分子量のポリテルペノイドが挙げられる。一部の態様では、ヘミテルペノイドは、プレノール（すなわち、３−メチル−２−ブテン−１−オール）、イソプレノール（すなわち、３−メチル−３−ブテン−１−オール）、２−メチル−３−ブテン−２−オール、又はイソ吉草酸である。一部の態様では、モノテルペノイドは、限定するものではないが、ゲラニルピロリン酸、オイカリプトール、リモネン、又はピネンであってよい。一部の態様では、セスキテルペノイドはファルネシルピロリン酸、アルテミシニン、又はビサボロールである。
一部の態様では、ジテルペノイドは、限定するものではないが、ゲラニルゲラニルピロリン酸、レチノール、レチナール、フィトール、タキソール、フォルスコリン、又はアフィジコリンであってよい。一部の態様では、トリテルペノイドは、スクアレン又はラノステロールであってよい。イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン（α-famesene）、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン（terpindene）及びバレンセンからなる群から選択することもできる。
【０２２５】
一部の態様では、テトラテルペノイドは、リコピン又はカロチン（カロチノイド）である。本明細書で使用するとき、用語「カロテノイド」は、クロロプラスト中で、並びに植物、何らかの他の光合成生物、例えば藻類、ある種の真菌、ある種の細菌、のクロロプラスト中で産生される、天然に生じる有機色素群を指す。カロテノイドとしては、酸素を含有しているキサントフィル及び酸素を含有していないカロテンが挙げられる。一部の態様では、カロテノイドはキサントフィル及びカロテンからなる群から選択される。一部の態様では、キサントフィルはルテイン又はゼアキサンチンである。一部の態様では、カロチノイドは、α−カロチン、β−カロチン、γ−カロチン、β−クリプトキサンチン又はリコピンである。
【０２２６】
ポリプレニルピロリン酸シンターゼのポリペプチドをコードしている異種核酸
本発明の一部の態様では、本明細書において任意の組成物又は方法に記載されるように、細胞は、更に、上記の通りにメバロン酸（ＭＶＡ）経路のポリペプチドを１種以上コードしている核酸、並びにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の核酸を更に含む。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、内在性ポリペプチドであってよい。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、構成型プロモータに調節可能なように連結させてよく、あるいは同様に、調節可能なように誘導型プロモータに連結させてもよい。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている内在性核酸は、更に、調節可能なように高発現型プロモータと連結させてもよい。あるいは、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている内在性の核酸は、調節可能なように低発現型プロモータと連結させてもよい。詳細には、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドを過剰発現するよう遺伝子操作することができる。
【０２２７】
一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、異種ポリペプチドである。本発明の細胞は、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように構成型プロモータに連結されている。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結されている。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結されている。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結されている。
【０２２８】
ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、更にベクター上に存在させてもよい。
【０２２９】
ポリプレニルピロリン酸シンターゼの核酸の例としては、ポリプレニルピロリン酸シンターゼの活性を少なくとも１種有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、イソプレノイド前駆体分子をより複雑なイソプレノイド化合物に変換する。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドの例としては、イソプレンシンターゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、並びに融合ポリペプチドが挙げられる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼのポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。加えて、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ変異体は、酵素活性が向上しているなどして、活性が向上されていてよい。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ変異体は、安定性（例えば、熱安定性）が改良されている、及び／又は溶解性が改良されているなどして、その他の特性が改良されている。ポリプレニルピロリン酸シンターゼの核酸の例としては、限定するものではないが、ゲラニルジホスフェート（geranyl diphosposphate）（ＧＰＰ）シンターゼ、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）シンターゼ、及びゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）シンターゼ、又はその他の任意の既知のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドなど、ポリプレニルピロリン酸シンターゼのポリペプチドをコードしている核酸を挙げることができる。
【０２３０】
本発明の一部の態様では、本明細書において任意の組成物又は方法に記載されるように、細胞は、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）シンターゼをコードしている１種以上の核酸を更に含む。ＦＰＰシンターゼポリペプチドは、内在性遺伝子によりコードされている内在性ポリペプチドであってもよい。一部の態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドは、大腸菌（E. coli）において内在性ｉｓｐＡ遺伝子によりコードされている。ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードしている内在性の核酸は、調節可能なように構成型プロモータに連結させることができ、あるいは同様に調節可能なように誘導型プロモータに連結させることができる。ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードしている内在性の核酸は、更に、調節可能なように高発現型プロモータに連結させることができる。特に、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ＦＰＰシンターゼポリペプチドを過剰発現するよう遺伝子操作することができる。
【０２３１】
一部の態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドは異種ポリペプチドである。本発明の細胞は、ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含み得る。一部の態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、構成型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、誘導型プロモータに調節可能なように連結される。一部の態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている異種核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結されている。
【０２３２】
ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードしている核酸は、更にベクターに組み込むこともできる。
【０２３３】
インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボで、ポリペプチドがＩＰＰをイソプレノイドへと変換する能力を測定して、ポリペプチドがポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド活性を有するか否かを判定する際には、標準法を使用できる。これらの手法は当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第７，９１５，０２６号；Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１  Ｍａｒ；１５５（３）：１０７９〜９０；Ｄａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１１  Ａｐｒ  １２［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１  Ｍａｒ  ２４［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］；Ｋｅｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２０１１  Ｍａｒ  ７；１１：４３；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２０１０  Ｏｃｔ  ２１；１０：２２６；Ｋｕｍｅｔａ  ＆  Ｉｔｏ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０  Ｄｅｃ；１５４（４）：１９９８〜２００７；ａｎｄ  Ｋｏｌｌｎｅｒ  ＆  Ｂｏｌａｎｄ，Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．２０１０  Ａｕｇ  ２０；７５（１６）：５５９０〜６００に記載されている。
【０２３４】
イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生を増強させることのできる組換え細胞
本明細書に記載の組換え細胞（例えば、組換え細菌細胞）は、同一条件下で培養した場合に、ホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピー、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピー、及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まない同様の細胞と比較して、多量に及び／又は高濃度にイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを産生することができる。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来するものである。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。
更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一部の態様では、ホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピー、ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピー、及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸は、宿主細胞の染色体に組み込まれた異種核酸である。組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドを含まないイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体産生組換え細胞と比較した場合に、少なくとも５％多量のイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを産生することができる。あるいは、組換え細胞は、ホスホケトラーゼをコードしている１種以上の異種核酸を発現しないイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体産生細胞によるイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の産生と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、又は１５％超並びにこれらの数字の間の任意の数値だけ多量にイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを産生することができる。本明細書に記載の特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＭＶＡ産生に取り込まれる炭素を増加させることにより、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現せずかつメバロン酸産生に取り込まれる炭素を増加させるよう遺伝子操作されていないイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体産生細胞によるイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の産生と比較して、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の産生を増強させる遺伝子操作を更に行った宿主細胞を含む。
【０２３５】
本発明の一態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、完全なＭＶＡ経路のポリペプチド（すなわち、ＭＶＡ経路上流及びＭＶＡ経路下流）をコードしている１種以上の異種核酸、ポリプレニルピロリン酸シンターゼをコードしている１種以上の異種核酸、及び／又はＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含む組換え細胞を提供する。細胞には、ＩＤＩポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を更に含ませてもよい。更に、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、ＦＰＰシンターゼポリペプチドであってよい。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来するものである。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。１種以上の異種核酸は、調節可能なように構成型プロモータに連結させることができ、調節可能なように誘導型プロモータに連結させることができ、あるいは調節可能なように誘導型及び構成型プロモータと組み合わせて連結させることができる。１種以上の異種核酸は、更に、調節可能なように高発現型プロモータ、低発現型プロモータ及び／又は強度が発現が中程度のプロモータに連結させることができる。ホスホケトラーゼポリペプチド、完全なＭＶＡ経路（すなわち、ＭＶＡ経路上流及びＭＶＡ経路下流）のポリペプチドを１つ以上、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、及び／又はＤＸＰ経路のポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞において安定的に発現させることができる。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーは、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）に由来する。更に他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。１種以上の異種核酸は、更に１種以上のベクターに組み込むことができる。
【０２３６】
本明細書では、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生を増強させ得る組換え細胞が提供される。細胞によるイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、完全なＭＶＡ経路（すなわち、ＭＶＡ経路上流及びＭＶＡ経路下流）の１種以上のポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現させることにより増強させることができる。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている異種核酸の１種以上のコピーは、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）に由来するものである。一実施形態では、組換え細胞は、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、組換え細胞は、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス���Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に他の実施形態では、本明細書に記載の組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。一態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。別の実施形態では、組換え細胞は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。更に別の実施形態では、組換え細胞は、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼをコードしている異種核酸の１種以上のコピーを含む。本明細書で使用するとき、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生の「増強」は、ホスホケトラーゼ、完全なＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチド、及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まない細胞と比較して、記載の細胞による、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイド産生に関係する細胞産生性指数（ＣＰＩ）、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの力価、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの質量収率、並びに／あるいはイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの比産生性が増加していることを指す。イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生量は、約５％〜約１，０００，０００倍増加させることができる。イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生量は、ホスホケトラーゼをコードしている１種以上の異種核酸を発現しない細胞によるイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の産生と比較して約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、又は約５０〜約２００倍）だけ増強させることができる。本明細書に記載の特定の実施形態では、組換え宿主細胞は、ＭＶＡ産生に取り込まれる炭素を増加させることにより、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現せずかつメバロン酸産生に取り込まれる炭素を増加させるよう遺伝子操作されていないイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体産生細胞によるイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の産生と比較して、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の産生を増強させる遺伝子操作を更に行われている。
【０２３７】
本明細書に記載の細胞によるイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生は増強させることができる（例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）由来のホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、並びにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現させることにより増強させることができる）。イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生量は、約５％〜約１，０００，０００倍増加させることができる。イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生は、天然に生じる細胞（例えば、ＭＶＡ経路の１種以上のペプチドを発現する１つ以上の異種核酸とともに、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）由来のホスホケトラーゼポリペプチドをコードしてい��１種以上の異種核酸を発現しておらず、かつメバロン酸産生に取り込まれる炭素が増加するよう遺伝子操作されていない細胞）によるイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、又は約５０〜約２００倍）だけ増強させることができる。
【０２３８】
他の実施形態では、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生を提供することのできる、本明細書に記載の組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現しないイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを産生する組換え細胞によるイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、又は１，０００，０００倍だけイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生を増強させることもできる。
【０２３９】
組換え細胞を使用してイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体分子を産生する方法
本明細書では、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの産生方法も提供され、方法は、ホスホケトラーゼ及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含む組換え細胞（例えば、組換え細菌細胞）を培養することを含む。特定の実施形態では、組換え細胞は、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド及びＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を更に含む。イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドは、本明細書に記載の任意の細胞から、及び本開示の任意の方法に従って、産生することができる。グルコースなどの六炭糖といった炭水化物から、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを産生する目的で、任意の細胞を使用することができる。
【０２４０】
特定の態様では、本明細書では、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの製造方法が提供され、方法は、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの産生に好適な条件下で、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）由来のホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）、及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドを含む組換え細胞を培養すること、及び（ｂ）イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを産生させること、を含む。細胞には、上記のＭＶＡ経路下流のポリペプチド（例えば、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ及び／又はＩＤＩ）及び上記の任意のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の核酸分子を更に含ませることができる。一部の態様では、組換え細胞は、本明細書に記載の任意の細胞であってよい。本明細書に記載の任意のポリプレニルピロリン酸シンターゼ又はそれらの変異体、本明細書に記載の任意の宿主細胞株、本明細書に記載の任意のプロモータ及び／又は本明細書に記載の任意のベクターを使用し、本明細書に記載の任意のエネルギー源（例えば、グルコース又は任意の他の六炭糖）を利用して、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを産生することもできる。一部の態様では、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの産生方法は、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを回収する工程を更に含む。
【０２４１】
特定の態様では、本明細書では、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの製造方法が提供され、方法は、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの産生に好適な条件下で、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）、及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳのポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を含む組換え細胞を培養すること、及び（ｂ）イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを産生させることを含む。細胞には、上記のＭＶＡ経路下流のポリペプチド（例えば、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ及び／又はＩＤＩ）及び上記の任意のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の核酸分子を更に含ませることができる。一部の態様では、組換え細胞は、本明細書に記載の任意の細胞であってよい。本明細書に記載の任意のポリプレニルピロリン酸シンターゼ又はそれらの変異体、本明細書に記載の任意の宿主細胞株、本明細書に記載の任意のプロモータ及び／又は本明細書に記載の任意のベクターを使用し、本明細書に記載の任意のエネルギー源（例えば、グルコース又は任意の他の六炭糖）を利用して、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを産生することもできる。一部の態様では、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの産生方法は、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを回収する工程を更に含む。
【０２４２】
イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを産生する方法には、同様に、（ａ）ホスホケトラーゼを内在的に有さない組換え細胞（限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞）を培養する工程、ここで、組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている遺伝子の１種以上のコピーを異種発現する；並びに（ｂ）イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを産生させる工程、を含ませることができ、組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドを含まないイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体産生細胞と比較して多量にイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを産生する。
【０２４３】
イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの産生に関係する本方法は、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体を産生する、ホスホケトラーゼポリペプチドを含まない組換え細胞と比較して、少なくとも５％多量にイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを産生することができる。あるいは、組換え細胞は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％超、並びに包括的にこれらの数値の間の任意の数値だけイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを産生することができる。一部の態様では、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの産生方法は、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを回収する工程を更に含む。
【０２４４】
本開示では、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体分子の産生を増強させるために、上記の細胞のいずれかを使用する方法を提供する。細胞によるイソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの産生は、ホスホケトラーゼ並びに／又はリステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）、及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸、及びポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現させることにより増強させることができる。本明細書で使用するとき、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生の「増強」は、本明細書に記載の任意の組成物及び方法により、細胞により、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）由来のホスホケトラーゼ、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を含まない細胞と比較して、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの産生に関する細胞産生性指数（ＣＰＩ）、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイド力価、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの質量収率、並びに／あるいはイソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドの比産生性が増加することを意味する。イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの産生量は、約５％〜約１，０００，０００倍増加させることができる。イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの産生は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現しない細胞によるイソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの産生と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、又は約５０〜約２００倍）だけ増強させることができる。本明細書に記載の特定の実施形態では、方法は、ＭＶＡ産生に取り込まれる炭素を増加させることにより、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現せずかつメバロン酸産生に取り込まれる炭素が増加するよう遺伝子操作されていないイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体産生細胞によるイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の産生と比較して、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の産生を増強させる遺伝子操作を更に行った組換え宿主細胞を含む。
【０２４５】
イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの産生は、本明細書に記載の方法により、イソプレノイド前駆体及び／又はイソプレノイドを産生し、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現しない細胞による、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの産生と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、又は１，０００，０００倍だけ増強させることができる。
本明細書に記載の特定の実施形態では、方法は、ＭＶＡ産生に取り込まれる炭素を増加させることにより、ホスホケトラーゼペプチドをコードしている１種以上の異種核酸を発現せずかつメバロン酸産生に取り込まれる炭素が増加するよう遺伝子操作されていないイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体産生細胞によるイソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の産生と比較して、イソプレノイド及び／又はイソプレノイド前駆体の産生を増強させる遺伝子操作を更に行った組換え宿主細胞を含む。
【０２４６】
加えて、より具体的な細胞培養条件を使用して、本明細書に記載の方法により細胞を培養することができる。例えば、一部の態様では、イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドの産生方法は、（ａ）３４℃にて、最少培地においてホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている異種核酸を含み、かつリステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）、及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を内在的に有さない組換え細胞（例えば、限定するものではないが、大腸菌（E. coli）細胞など）を培養する工程、ここで、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アバーミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）由来のホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている遺伝子の１種以上のコピーを異種発現する；並びに（ｂ）イソプレノイド前駆体分子及び／又はイソプレノイドを産生させる工程と、を含む。一部の態様では、イソプレノイド前駆分子及び／又はイソプレノイドを回収する工程を更に含む。一部の態様では、組換え細胞は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）由来のホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーを異種発現する。
【０２４７】
ベクター
本明細書に記載の任意の組成物及び方法には好適なベクターを使用することができる。
例えば、適切なベクターを使用して、ホスホケトラーゼ、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド（限定するものではないが、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド）、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、イソプレンシンターゼ、又はポリプレニルピロリン酸シンターゼをコードしている遺伝子の１つ以上のコピーの、特定の宿主細胞（例えば、大腸菌（E. coli））における発現を最適化することができる。一部の態様では、ベクターには選択マーカーを含有させる。選択可能なマーカーの例としては、これらに限定されるものではないが、抗生物質耐性核酸（例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、フェロマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン又はクロラムフェニコール）、及び／又はホスト細胞に栄養的な利点などの代謝的な利点を与える核酸が挙げられる。一部の態様では、選択マーカーは用いずに、ホスホケトラーゼ、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド（限定するものではないが、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド）、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）、及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ核酸、イソプレンシンターゼ、又はポリプレニルピロリン酸シンターゼの核酸の１つ以上のコピーを宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。
【０２４８】
本明細書において特徴付けられ、本開示の実施例において使用される任意のベクターを本発明に使用することができる。
【０２４９】
形質転換法
好適な技術を使用して、ホスホケトラーゼ、ＭＶＡ経路上流のポリペプチド（限定するものではないが、ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドなど）、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド、及び／又はＭＶＡ経路下流のポリペプチドの１つ以上のコピーをコードしている核酸を細胞に導入することができる。更に、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路及び／又はポリプレニルピロリン酸シンターゼの核酸、又はこれらを含むベクターは、形質転換、電気穿孔法、核マイクロインジェクション、形質導入、形質移入（例えばリポフェクション介在型若しくはＤＥＡＥ−デキストラン介在型トランスフェクション、又は組換えファージウイルスを使用した形質移入）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、ＤＮＡコーティングした微粒子を用いる高速遺伝子銃照射、及びプロトプラスト融合などの、宿主細胞内にＤＮＡコンストラクト又はベクターを導入するための標準的な技術を使用して宿主細胞（例えば本明細書において述べられるような植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、又は細菌細胞）内に挿入することができる。一般的な形質転換法は、当該技術分野で既知である（例えば、分子生物学領域の現行のプロトコル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，「分子クローニング（Molecular Cloning）」：「実験室マニュアル（A Laboratory Manual）第２版」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９；及びＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６，１９８９を参照されたい）。導入された核酸は、染色体ＤＮＡに組み込むことができ、又は染色体外の複製配列として維持することができる。形質転換体は、当該技術分野において既知の任意の方法により選別することができる。形質転換体の選別に好適な方法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６に記載される。
【０２５０】
例示的な宿主細胞
当業者であれば、具体的な宿主株における遺伝子発現を最適化する特定の配列を含有するよう、発現ベクターが設計されることを認識するであろう。このような最適化配列としては、限定するものではないが、複製起点、プロモータ、及びエンハンサが挙げられる。
本明細書で参照するベクター及び配列は例示目的で記載され、本発明の範囲を狭めることを意味するものではない。
【０２５１】
遺伝子を異種発現するために使用することのできる任意の細胞又はそれらの子孫細胞を使用して、ＭＶＡ経路の１種以上のペプチド、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路ポリペプチド、及び／又はポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドを発現する１種以上の異種核酸とともに、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離された１種以上のホスホケトラーゼを発現させることができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、グラム陽性細菌である。非限定的な例としては、ストレプトマイセス株（例えば、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・コエリカラー、又はストレプトマイセス・グリセウス）、バチルス株、リステリア株（例えば、Ｌ．モノサイトゲネス）又はラクトバチルス株（例えば、Ｌ．ｓｐｐ）が挙げられる。一部の実施形態では、生物資源は、大腸菌、シュードモナス属、又はＨ．ピロリなどのグラム陰性細菌である。
【０２５２】
グラム陽性又はグラム陰性細菌などの細菌細胞を使用して、上記の異種遺伝子のうち任意のものを発現させることができる。詳細には、ｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子は、シュードアルテロモナス・シトレア（P. citrea）、バチルス・サブチリス（B. subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシイ（B. clausii）、バチルス・ハロドュランス（B. halodurans）、バチルス・メガテリウム（B. megaterium）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サーキュランス（B. circulans）、バチルス・ロータス（B. lautus）、バチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、ストレプトマイセス・アルバス（S. albus）、ストレプトマイセス・リビダンス（S. lividans）、ストレプトマイセス・コエリカラー（S. coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）及びシュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞のいずれかにおいて発現させることができる。
【０２５３】
本発明の組成物及び方法には、数多くの種類の嫌気性細胞を宿主細胞として使用することができる。本発明の一態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に関し記載される細胞は、絶対嫌気性細胞及びその子孫細胞である。絶対嫌気性菌は、典型的には、条件下に酸素が存在する場合には良好に増殖しない。絶対嫌気性菌が低濃度の酸素に対しある程度の耐性を示す場合には、少量の酸素が存在してもよいことは理解されるであろう。
一態様では、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、及びイソプレノイドを産生するよう遺伝子操作を行った絶対嫌気性菌を、本明細書に記載のいずれかの方法及び／又は組成物用の宿主細胞として提供し、実質的に無酸素条件下で増殖させることができる。この場合、存在する酸素量は嫌気性菌の増殖、維持、及び／又は発酵に有害なものではない。
【０２５４】
本発明の他の態様では、本明細書に記載の組成物又は方法のいずれかにおいて記載され及び／又は使用される宿主細胞は、通性嫌気性細胞及びその子孫細胞である。酸素が存在する場合、通性嫌気性菌は、好気呼吸により（例えば、ＴＣＡサイクルを利用するなどして）細胞ＡＴＰを生成し得る。しかしながら、通性嫌気性菌も、酸素の非存在下で増殖させることができる。絶対嫌気性菌とは対照的に、通性嫌気性菌はより多量の酸素の存在下で死滅し、又は増殖性が乏しくなる。したがって、一態様では、通性嫌気性菌は、本明細書で提供される組成物及び／又は方法のいずれかにおいて、宿主細胞として使用でき、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、及びイソプレノイドを生成するよう遺伝子操作を行うことができる。通性嫌気性宿主細胞は、実質的に無酸素（存在する酸素量が、増殖、嫌気性菌の維持、及び／又は発酵に有害なものではないことを意味する）条件下で増殖させることができ、あるいは酸素がより多量に存在している場合にも増殖することができる。
【０２５５】
宿主細胞は、糸状真菌細胞及びその子孫細胞であってもよい。（例えば、Ｂｅｒｋａ  ＆  Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，（１９８９），７（２）：１２７〜１５４を参照されたい）。一部の態様では、糸状菌細胞はトリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・ビリデ（T. VIRIDE）、トリコデルマ・コニンギ（T. KONINGII）、トリコデルマ・ハルジアナム（T. harzianum）、ペニシリウム（Penicillium sp.）、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ヒュミコラ・ラヌギノス（H. lanuginose）、ヒュミコラ・グリセア（H. grisea）、クリソスポリウム（Chrysosporium sp.）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（C. lucknowense）、グリオクラジウム（Gliocladium sp.）、アスペルギルス（Aspergillus sp.）、例えば、アスペルギルス・オリゼ（A. oryzae）、アスペルギルス・ニガー（A. niger）、ショウユコウジカビ（A sojae）、アスペルギルス・ジャポニクス（A. japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）、又はアワモリコウジカビ（A. awamori）、フザリウム（Fusarium sp.）、例えばフザリウム・ロゼウム（F. roseum）、フザリウム・グラミニウム（F. graminum）、フザリウム・セレアリス（F. cerealis）、フザリウム・オキシスポラム（F. oxysporuim）、又はフザリウム・ベネナタム（F. venenatum）、ニューロスポラ（Neurospora sp.）、例えば、ニューロスポラ・クラッサ（N. crassa）、ヒポクレア（Hypocrea sp.）、ムコール（Mucor sp.,）、例えば、ムコール・ミエヘイ（M. miehei）、リゾプス（Rhizopus sp.）又はエメリセラ（Emericella sp.）のいずれか由来のものであってよい。一部の態様では、真菌は、アスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）、アワモリコウジカビ（A. awamori）、アスペルギルス・オリゼ（A. oryzae）、アスペルギルス・アクレタス（A. aculeatus）、アスペルギルス・ニガー（A. niger）、アスペルギルス・ジャポニクス（A. japonicus）、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）、トリコデルマ・ビリデ（T. VIRIDE）（T. viride）、フザリウム・オキシスポラム（F. oxysporum）又はフザリウム・ソラニ（F. solani）である。
特定の実施形態では、本明細書で使用するためのプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号に記載のものが包含される。
【０２５６】
宿主細胞は、サッカロマイセス（Saccharomyces sp.）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア（Pichia sp.）、又はカンジダ(Candida sp.)などの酵母であってもよい。一部の態様では、サッカロマイセス（Saccharomyces sp.）は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，（１９９２），８（６）：４２３〜４８８を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書で使用するプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許第７，６５９，０９７号、及び米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号に記載のものが包含される。
【０２５７】
宿主細胞は、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ミドリムシ類、クロミスタ類、又は渦鞭毛藻類などの藻類であってもよい。（例えば、Ｓａｕｎｄｅｒｓ及びＷａｒｍｂｒｏｄｔ、「藻類及び酵母などの菌類における遺伝子発現（Gene Expression in Algae and Fungi, Including Yeast）」（１９９３年），Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤを参照されたい）。
特定の実施形態では、本明細書で使用するためのプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号に記載のものが包含される。一部の態様では、宿主細胞は、形態学に基づき次の群：クロオコッカス目（Chroococcales）、プレウロカプサ目（Pleurocapsales）、ユレモ目（Oscillatoriales）、ネンジュモ目（Nostocales）、又はスティゴネマ目（Stigonematales）（例えば、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，（２０１０）１２（１）：７０〜７９を参照されたい）のいずれかに分類されるシアノバクテリアなどの、シアノバクテリアである。特定の実施形態では、本明細書で使用するプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許出願公開第２０１０／０２９７７４９号、同第２００９／０２８２５４５号、及び国際公開第２０１１／０３４８６３号に記載のものが包含される。
【０２５８】
大腸菌（E. coli）宿主細胞を使用して、ＭＶＡ経路の１つ以上ポリペプチド、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路のポリペプチド（ｅ）、及び／又はポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードしている１種以上の異種核酸とともに、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）由来の１つ以上のホスホケトラーゼ酵素を発現させることができる。一態様では、宿主細胞は、ＭＶＡ経路の１種以上のペプチドを発現する１つ以上の異種核酸とともに、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）由来のホスホケトラーゼをコードしている１種以上の核酸を発現し、メバロン酸を産生することのできる大腸菌（E. coli）株の組換え細胞又はこれらの子孫細胞である。大腸菌（E. coli）宿主細胞は、ＭＶＡ経路の１種以上のペプチドを発現する１つ以上の異種核酸とともに、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）由来のホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種核酸を発現しない同様の細胞と比較して多量に、高ピーク力価で、及び高細胞産生性で、メバロン酸を産生することができる。加えて、大腸菌（E. coli）において、ＭＶＡ経路の１種以上のペプチドを発現する１つ以上の異種核酸とともに、異種発現される、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）由来のホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１種以上の核酸は、染色体のコピー（例えば、大腸菌（E. coli）染色体に組み込まれたコピー）であってよい。他の態様では、大腸菌（E. coli）細胞は培養物である。一部の態様では、１つ以上のホスホケトラーゼ酵素は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、及び／又はエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）に由来する。任意の態様では、１��以上のホスホケトラーゼ酵素は、本明細書に記載の通りの任意のホスホケトラーゼである。
【０２５９】
宿主細胞の改変例
クエン酸シンターゼによる経路
クエン酸シンターゼは、オキサロ酢酸とアセチルＣｏＡを縮合させることによるクエン酸（トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路の代謝生成物）の生成を触媒する（Ｎｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．１９８３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２，：５２４３〜５２４９；Ｂｈａｙａｎａ，Ｖ．ａｎｄ  Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ，Ｈ．１９８４．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：２９００〜２９０５）。大腸菌（E. coli）では、ｇｌｔＡによりコードされたこの酵素は、二量体サブユニットからなる三量体様の挙動を示す。六量体の形成により、酵素はＮＡＤＨによりアロステリックに制御されるようになる。この酵素は、これまでに広く研究されている（Ｗｉｅｇａｎｄ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．１９８６．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１５：９７〜１１７；Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．１９８７．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｓｙｍｐ．５４：８３〜９２；Ｓｔｏｃｋｅｌｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３５４３５〜４３；Ｍａｕｒｕｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４２：５５５５〜５５６５）。ＮＡＤＨによるアロステリック阻害を回避するにあたって、これまでに、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼによる置き換え、又はこの酵素の添加が検討されている（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１０７１〜１０８１；Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｍｅｔ．Ｅｎｇ．７：２２９〜２３９）。
【０２６０】
クエン酸シンターゼによる触媒反応は、メバロン酸経路の第一工程を触媒し、同様にアセチルＣｏＡを基質として使用するチオラーゼと直接的に競合する（Ｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：２１１６〜２１２２）。したがって、当業者は、クエン酸シンターゼの発現を調節して（例えば、酵素活性を減少させて）、より多量の炭素がメバロン酸経路に取り込まれるようにすることで、メバロン酸、イソプレン及びイソプレノイドの最終的な産生量を増加させることができる。クエン酸シンターゼ活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％低下させる。
一部の態様では、クエン酸シンターゼに関係する内在性遺伝子の活性を減少させることにより、クエン酸シンターゼの活性を調節する。この調節は、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子により、あるいは枯草菌から誘導したＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードしている導入遺伝子により、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子の染色体を置換することで実施できる。クエン酸シンターゼの活性は、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによっても調節（例えば、低下させる）できる。クエン酸シンターゼをコードしている遺伝子を欠失させることもできる。クエン酸シンターゼの活性を低下させることで、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みを、クエン酸シンターゼの発現を低下させていない細胞と比較して増加させることができる。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつクエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。クエン酸シンターゼイソ酵素の活性の調節（例えば、低下）も本明細書において企図される。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつクエン酸シンターゼイソ酵素の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。
【０２６１】
ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの関与する経路
ホスホトランスアセチラーゼ（（大腸菌（E. coli）において（ｉ）ｐｔａ（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．１９６９．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９１：５５０〜５５８又は（ｉｉ）ｅｕｔＤ（Ｂｏｌｏｇｎａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｊ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．４８：６２９〜６３６によりコードされている）は、アセチル−ＣｏＡ及びアセチルリン酸（アセチル−Ｐ）の可逆的な変換を触媒するのに対し、酢酸キナーゼ（大腸菌（E. coli）においてａｃｋＡによりコードされる）（Ｋａｋｕｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：９１６〜９２２）はアセチル−Ｐを使用して酢酸を生成する。これらの遺伝子は、大腸菌においてオペロンとして転写され得る。これらの遺伝子は共に、ＡＴＰの放出により酢酸の異化を触媒する。したがって、ホスホトランスアセチラーゼの活性を増強させることにより、アセチル−ＣｏＡに変換されるアセチル−Ｐの量を増加させることができる。特定の実施形態では、増強は、染色体中の遺伝子上流に上方調節されたプロモータを配置するか、又はプラスミドにおいて適切なプロモータの下流に遺伝子のコピーを配置するかによりなすことができる。酢酸に変換されるアセチルＣｏＡの量を減少させる目的で、酢酸キナーゼ遺伝子（例えば、内在性酢酸キナーゼ遺伝子）の活性を減少又は減弱させることができる。特定の実施形態では、減弱は、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）を欠失させることにより実施される。このような欠失は、遺伝子をクロラムフェニコールカセットにより置き換えた後、カセットを除去させることにより実施される。一部の態様では、酢酸キナーゼの活性は、内在性酢酸キナーゼの活性を減少させることにより調節される。このような調節は、内在性酢酸キナーゼ遺伝子のプロモータを常時低発現型合成プロモータと置き換えることにより行うことができる。特定の実施形態では、このような酢酸キナーゼ遺伝子の減弱は、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）遺伝子の発現を干渉することによりなされるべきである。酢酸は多様な理由により大腸菌（E. coli）により生成される（Ｗｏｌｆｅ，Ａ．２００５．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６９：１２〜５０）。理論に束縛されるものではないが、ａｃｋＡを欠失させることにより、炭素の酢酸の産生への転用が減少し（ａｃｋＡはアセチル−ＣｏＡを利用するため）、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン及び／又はイソプレノイドの収率が増加することになる。
【０２６２】
一部の態様では、本明細書に記載の組換え細胞は、内在性の酢酸キナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない、あるいはホスホトランスアセチラーゼを増強させていない細胞と比較して減少した量で酢酸を産生する。酢酸生成量の減少は、当業者に既知の所定の解析法により測定できる。酢酸の減少量は、分子的操作を行わずに内在性酢酸キナーゼ遺伝子の発現又はホスホトランスアセチラーゼ遺伝子発現の発現を実施した場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。
【０２６３】
ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ及び／又はｅｕｔＤ）の活性は、酵素に関係する他の分子的操作により増加させることができる。酵素活性を増加させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で増加させることができる。
一部の例では、酵素活性の増加は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％だけ増加させることができる。一実施形態では、ｐｔａの活性は、染色体上のプロモータ及び／又はｒｂｓを変更することにより増加させることができ、又はプラスミドに発現させることにより増加させることができる。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ及び／又はｅｕｔＤ）の活性が増加するよう更に遺伝子操作されている。ホスホトランスアセチラーゼイソ酵素の活性を調節（例えば、増加）することも、本明細書において企図される。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ及び／又はｅｕｔＤ）イソ酵素の活性が増加するよう更に遺伝子操作されている。
【０２６４】
酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の活性は、酵素に関係する他の分子的操作によっても低下させることができる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつ酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。酢酸キナーゼイソ酵素の活性の調節（例えば、低下）も本明細書において企図される。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつ酢酸キナーゼイソ酵素の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。
【０２６５】
一部の場合では、内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性酢酸キナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する。
【０２６６】
乳酸脱水素酵素の関与する経路
大腸菌（E. coli）では、Ｄ−乳酸は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡによりコード：図１）により、ピルビン酸から生成される（Ｂｕｎｃｈ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：１８７〜１９５）。乳酸の生成はＮＡＤＨの酸化によりなされるため、乳酸は、酸素制限下で、かつ還元当量のすべてを収容できない場合に生成されることになる。したがって、乳酸の生成は、炭素消費の原因となり得る。そのため、メバロン酸産生（並びに必要に応じてイソプレン、イソプレノイド前駆体及びイソプレノイドの産生）への炭素の取り込みを向上させるため、当業者は、酵素活性を低下させるなどして乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することができる。
【０２６７】
したがって、一態様では、乳酸脱水素酵素の活性は、内在性乳酸脱水素酵素遺伝子の活性を減弱させることで調節できる。このような減弱は、内在性乳酸脱水素酵素遺伝子の欠失により実施できる。当業者に知られている、乳酸脱水素酵素遺伝子の活性を減弱させる他の手法も使用できる。乳酸脱水素酵素の関与する経路を操作することで、組換え細胞の生成する乳酸量は、内在性乳酸脱水素酵素遺伝子の発現を減弱させていない細胞と比較して、減少することになる。乳酸の生成量の減少は、当業者に知られている所定の解析法により測定できる。乳酸の生成量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％減少する。
【０２６８】
乳酸脱水素酵素の活性は、酵素に関係するその他の分子操作により低下させることもできる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。
【０２６９】
したがって、一部の場合では、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子発現を減弱させていない細胞と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みが増加する。
【０２７０】
グリセルアルデヒド３−リン酸を包含する経路
グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ｇａｐＡ及び／又はｇａｐＢ）は、解糖に重要な酵素であり、グリセルアルデヒド３−リン酸の１，３−ビホスホ−Ｄ−グリセリン酸への変換を触媒する（Ｂｒａｎｌａｎｔ  Ｇ．ａｎｄ  Ｂｒａｎｌａｎｔ  Ｃ．１９８５．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０：６１〜６６）。
【０２７１】
ホスホケトラーゼ酵素を炭素に直接作用させるために、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素の発現を調節（例えば、酵素活性を低下させるなど）して、より多量の炭素をフルクトース６−リン酸及びキシルロース５−リン酸へと変換させ、以降に続くメバロン酸、イソプレン及びイソプレノイドの産生量を増加させることもできる。グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素の活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％低下させる。一部の態様では、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素は、内在性グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素の活性を減少させることにより調節される。このような調節は、内在性グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素遺伝子プロモータを常時低発現型合成プロモータにより置き換えることで実施できる。グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素をコードしている遺伝子を欠失させることもできる。グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素をコードしている遺伝子は、同様の反応を触媒するもののＮＡＤＰＨよりはＮＡＤＨを産生するバチルス（Bacillus）の酵素と置き換えることもできる。グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素の活性を減少させることで、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素の発現を減少させていない細胞と比較して、より多量にメバロン酸依存性生合成経路に炭素を取り込ませることができる。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、異種発現される、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている核酸を１つ以上含み、かつグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ｇａｐＡ及び／又はｇａｐＢ）の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素イソ酵素の活性を調節（例えば、減少）させることも本明細書において企図される。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、異種発現される、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている核酸を１つ以上含み、かつグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ｇａｐＡ及び／又はｇａｐＢ）イソ酵素の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。
【０２７２】
エントナー・ドゥドロフ経路に関与する経路
エントナー・ドゥドロフ（ＥＤ）経路は、エムデン・マイヤーホフ・パルナス（ＥＭＰ−解糖）経路とは異なる経路である。大腸菌（E. coli）などの一部の生物がＥＤ経路及びＥＭＰ経路の両方を内包するのに対し、その他の生物はいずれか１つの経路のみを有する。バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）は、ＥＭＰ経路のみを有するのに対し、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）はＥＤ経路のみを有する（Ｐｅｅｋｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｗａｙ．１９９８．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８０：３４９５〜３５０２；Ｓｔｕｌｋｅ  ａｎｄ  Ｈｉｌｌｅｎ．２０００．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４，８４９〜８８０；Ｄａｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９６６．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．９８：７９５〜８０３）。フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、及び／又はｆｂａＣ）はエントナー・ドゥドロフ経路と相互作用し、フルクトース１，６−２リン酸のジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）及びグリセルアルデヒド３−リン酸（ＧＡＰ）への変換を可逆的に触媒する（Ｂａｌｄｗｉｎ  Ｓ．Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．（１９７８）１６９（３）：６３３〜４１）。
【０２７３】
ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）は、６−ホスホ−Ｄ−グルコネートから一分子のＨ２Ｏを除去して２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネート６−リン酸を生成するのに対し、２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）はアルドール開裂を触媒する（Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１７４：４６３８〜４６４６）。２つの遺伝子はオペロンの関係である。
【０２７４】
ホスホケトラーゼ経路に指向する代謝経路をＥＤ経路に迂回させることもできる。ＥＤ経路に取り込まれる代謝産物が損失することを回避するため、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子（例えば、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子）及び／又は２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ遺伝子（例えば、内在性２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ遺伝子）活性を減弱させる。１つの手法としては、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）及び／又は２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）を欠失させることで減弱を行うことができる。この欠失は、クロラムフェニコール又はカナマイシンカセットにより片方又はいずれもの遺伝子を置き換え、その後カセットを除去することで導入される。これらの酵素活性を存在させずとも、ホスホケトラーゼ酵素によってより多くの炭素を取り込むことができ、ひいてはメバロン酸、イソプレン、又はイソプレノイドの収率を増加させることができる。
【０２７５】
ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）及び／又は２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）の活性は、酵素に関係する他の分子操作により減少させることもできる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。
【０２７６】
一部の場合では、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子及び／又は内在性２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ遺伝子の発現を減弱させていない細胞と比較して、多量の炭素がメバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることになる。
【０２７７】
ホスホケトラーゼ経路に指向する代謝経路をＥＤ経路又はＥＭＰ経路に迂回させることもできる。代謝産物の損失を回避し、フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）濃度を増加させるため、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（例えば、内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼ）活性を減弱させる。場合によっては、内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、及び／又はｆｂａＣ）遺伝子の活性を減弱させることで、内在性のフルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、及び／又はｆｂａＣ）遺伝子の発現を減弱させていない細胞と比較して、より多量にメバロン酸依存性生合成経路に炭素が取り込まれるようになる。一部の態様では、減弱は、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、及び／又はｆｂａＣ）を欠失させることにより実施される。この欠失は、クロラムフェニコール又はカナマイシンカセットにより遺伝子を置き換え、その後カセットを除去することで導入される。一部の態様では、フルクトース二リン酸アルドラーゼの活性は、内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼの活性を減少させることにより調節される。このような調節は、内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子プロモータを常時低発現型合成プロモータにより置き換えることで実施できる。これらの酵素活性を存在させずとも、ホスホケトラーゼ酵素によってより多くの炭素を取り込むことができ、ひいてはメバロン酸、イソプレン、又はイソプレノイドの収率を増加させることができる。フルクトース二リン酸アルドラーゼの活性は、酵素に関係する他の分子的操作によっても減少させることができる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつフルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、及び／又はｆｂａＣ）の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。フルクトース二リン酸アルドラーゼのイソ酵素の活性の調節（例えば、減少）も、本明細書において企図される。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつフルクトース二リン酸アルドラーゼイソ酵素の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。
【０２７８】
ペントースリン酸経路の酸化経路に関与する経路
大腸菌（E. coli）は、ペントースリン酸経路を使用してヘキソース及びペントースを分解し、各種代謝経路に関係する中間体を細胞に提供する。この経路は、ＮＡＤＰＨの主要な生成経路でもある。ペントースリン酸経路は、酸化経路（グルコース６−リン酸１−脱水素酵素（ｚｗｆ）、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ｐｇｌ）又は６−ホスホグルコネート脱水素酵素（ｇｎｄ）などの酵素による）及び非酸化経路（トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ及び／又はｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＡ又はｔａｌＢ）、リボース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼ、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡ及び／又はｒｐｉＢ）及び／又はリブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）などの酵素による）から構成される（Ｓｐｒｅｎｇｅｒ．１９９５．Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６４：３２４〜３３０）。
【０２７９】
炭素にホスホケトラーゼ酵素を作用させるために、ペントースリン酸経路の非酸化経路（トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、リブロース−５−リン酸イソメラーゼＡ、リブロース−５−リン酸イソメラーゼＢ、及び／又はリブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ）の発現を調節して（例えば、酵素活性を増加させて）、より多量の炭素をフルクトース６−リン酸及びキシルロース５−リン酸へと変換させることにより、最終的にメバロン酸、イソプレン及びイソプレノイドの産生を増加させることができる。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼ活性を増加させることで、活性を操作しなかった場合と比較して比活性又は総活性を任意の量で増加させることができる。一部の例では、酵素活性は少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％上昇する。一部の態様では、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性は、内在性トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性を増強させることにより調節される。このような上昇は、内在性トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼ遺伝子のプロモータを常時高発現型の合成プロモータにより置き換えることで得られる。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼをコードしている遺伝子を、プラスミド上の適切なプロモータの後にクローニングさせてもよい。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性を増大させることにより、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの発現を増加させていない細胞と比較して、多量の炭素をメバロン酸依存型の生合成経路に取り込ませることができる。
【０２８０】
本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつトランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ及び／又はｔｋｔＢ）の活性が増加するよう更に遺伝子操作されている。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつトランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ及び／又はｔｋｔＢ）の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつトランスアルドラーゼ（ｔａｌＡ又はｔａｌＢ）の活性が増加するよう更に遺伝子操作されている。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつリボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡ及び／又はｒｐｉＢ）の活性が増加するよう更に遺伝子操作されている。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつリブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）の活性が増加するよう更に遺伝子操作されている。グルコース６−リン酸１−脱水素酵素（ｚｗｆ）、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）、６−ホスホグルコネート脱水素酵素（ｇｎｄ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ及び／又はｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＡ又はｔａｌＢ）、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ、リボース−５−リン酸エピメラーゼ、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡ及び／又はｒｐｉＢ）及び／又はリブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）イソメラーゼの活性の調節（例えば、減少又は増加）も本明細書において企図される。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつグルコース６−リン酸１−脱水素酵素（ｚｗｆ）イソ酵素の活性が増加するよう更に遺伝子操作されている。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつトランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ及び／又はｔｋｔＢ）イソ酵素の活性が増加するよう更に遺伝子操作されている。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつトランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ及び／又はｔｋｔＢ）イソ酵素の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつトランスアルドラーゼ（ｔａｌＡ又はｔａｌＢ）イソ酵素の活性が増加するよう更に遺伝子操作されている。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつリボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡ及び／又はｒｐｉＢ）イソ酵素の活性が増加するよう更に遺伝子操作されている。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつリブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）イソ酵素の活性が増加するよう更に遺伝子操作されている。
【０２８１】
炭素に対しホスホケトラーゼ酵素により触媒反応させるために、グルコース６−リン酸１−脱水素酵素を調節する（例えば、酵素活性を減少させる）ことができる。一部の態様では、グルコース６−リン酸１−脱水素酵素（ｚｗｆ）（例えば、内在性グルコース６−リン酸１−脱水素酵素遺伝子）の活性を減少又は減弱させることができる。特定の実施形態では、減弱は、グルコース６−リン酸１−脱水素酵素を欠失させることによってなされる。一部の態様では、グルコース６−リン酸１−脱水素酵素の活性は、内在性グルコース６−リン酸１−脱水素酵素の活性を減少させることにより調節される。このような調節は、内在性グルコース６−リン酸１−脱水素酵素遺伝子プロモータを常時低発現型合成プロモータにより置き換えることで実施できる。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつグルコース６−リン酸１−脱水素酵素（ｚｗｆ）の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。グルコース６−リン酸１−脱水素酵素イソ酵素の活性の調節（例えば、減少）も、本明細書において企図される。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつグルコース６−リン酸１−脱水素酵素イソ酵素の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。
【０２８２】
ホスホフルクトキナーゼに関与する経路
ホスホフルクトキナーゼは、解糖系でフルクトース６−リン酸のリン酸化を触媒する重要な酵素である。大腸菌（E. coli）はｐｆｋＡ及びｐｆｋＢによりコードされる２種のイソ酵素を有する。細胞におけるホスホフルクトキナーゼ活性の大部分はｐｆｋＡによるものである（Ｋｏｔｌａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．１９７５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，３８１：２５７〜２６８）。
【０２８３】
ホスホケトラーゼ酵素を炭素に直接作用させるために、ホスホフルクトキナーゼの発現を調節（例えば、酵素活性を低下させるなど）して、より多量の炭素をフルクトース６−リン酸及びキシルロース５−リン酸へと変換させ、以降に続くメバロン酸、イソプレン、及びイソプレノイドの産生量を増加させることもできる。ホスホフルクトキナーゼ活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％低下させる。一部の態様では、内在性ホスホフルクトキナーゼの活性を低下させることにより、ホスホフルクトキナーゼの活性を調節する。このような調節は、内在性ホスホフルクトキナーゼ遺伝子プロモータを常時低発現型合成プロモータと置き換えることにより行うことができる。ホスホフルクトキナーゼをコードしている遺伝子を欠失させてもよい。ホスホフルクトキナーゼの活性を低下させることで、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みを、ホスホフルクトキナーゼの発現を低下させていない細胞と比較して、増大させることができる。
【０２８４】
本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつフルクトース６−リン酸（ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ）の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。フルクトース６−リン酸イソ酵素の活性の調節（例えば、減少）も、本明細書において企図される。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつフルクトース６−リン酸イソ酵素の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。
【０２８５】
ピルビン酸脱水素酵素複合体の関与する経路
ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの脱炭酸を触媒するピルビン酸脱水素酵素複合体は、遺伝子ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、及びｌｐｄＡによりコードされるタンパク質から構成される。これらの遺伝子の転写は、複数の制御因子により制御される。したがって、当業者は、ピルビン酸脱水素酵素複合体の活性を調節して、アセチル−ＣｏＡを増加することができる。調節により、ピルビン酸脱水素酵素複合体の活性及び／又は発現（例えば、恒常的発現）を増加させることができる。このような調節は、異なる手法により、例えば、ＰＬ．６（ａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃａｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇ−ラムダプロモーター、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ＿００１４１６（配列番号１４））などの強力な構成型プロモータをオペロンの前に配置することにより、あるいは構成的に（恒常的に）発現する合成プロモータを１種以上用いることにより行うことができる。
【０２８６】
したがって、一態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性は、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼから構成されるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する、１種以上の酵素の活性を増加させることで調節される。これらの酵素をコードしている任意の１、２、又は３つの遺伝子を調節して、ピルビン酸脱水素酵素の活性を増加させることができることは理解される。他の態様では、以降に更に説明するように、ピルビン酸脱水素酵素複合体の活性は、内在性ピルビン酸脱水素酵素複合体のリプレッサーの活性を減弱させることで調節できる。内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のリプレッサーの活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子を欠失させることにより減弱させることができる。
【０２８７】
一部の場合では、ピルビン酸脱水素酵素複合体をコードする遺伝子の１つ以上は内在性遺伝子である。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を増加させるその他の方法としては、細胞に、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなる群に由来するポリペプチを１つ以上コードしている異種核酸を１つ以上導入することによるものが挙げられる。
【０２８８】
これらの方法のうち任意のものを用いることで、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の調節されていない細胞と比較して、組換え細胞によるアセチルＣｏ−Ａの産生量を増加させることができる。ピルビン酸脱水素酵素の活性を調節することで、ピルビン酸脱水素酵素の発現を調節していない細胞と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素原子の取り込みを増加させることができる。
【０２８９】
ホスホトランスフェラーゼ系を包含する経路
ホスホエノールピルビン酸依存型ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）は、工程において、膜を介した糖基質の輸送及びリン酸化を同時に行う多成分系であり、解糖中間体のホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）によるエネルギー供給に依存する系である。ＰＴＳを調節する遺伝子の大部分はオペロンとしてクラスター化している。例えば、大腸菌（E. coli）のｐｔｓオペロン（ｐｔｓＨＩｃｒｒ）は、ホスホエノールピルビン酸依存型ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）に中心的な３種類のタンパク質、すなわちＨＰｒ（ｐｔｓＨ）、酵素Ｉ（ｐｔｓＩ）及びＥＩＩＩＧｌｃ（ｃｒｒ）タンパク質をコードしているｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、及びｃｒｒ遺伝子から構成される。これら３つの遺伝子は複合型オペロンとして構成され、末端遺伝子ｃｒｒの発現の大部分は、ｐｔｓＩ内のプロモータ領域から開始される。ｐｔｓオペロンの遺伝子の他、ｐｔｓＧは、ホスホトランスフェラーゼ系のグルコース特異的な輸送体ｐｔｓＧをコードしている。このプロモータ領域から開始される転写は、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）−環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の正の調節下にあり、グルコース（ＰＴＳ基質）存在下での生育中に増強される。更に、ｐｐｓＡ遺伝子は、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）の活性に必要とされるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の産生に関係するホスホエノールピルビン酸シンターゼをコードする。ピルビン酸脱水素酵素経路又はＰＴＳ経路を介し、ホスホエノールピルビン酸シンターゼにより炭素の取り込みを調整する。Ｐｏｓｔｍａ，Ｐ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．（１９９３），５７（３）：５４３〜９４）を参照されたい。この非特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２９０】
本明細書に記載の特定の実施形態では、ｐｔｓオペロンを下方調節（例えば、減弱）することで、宿主細胞による酢酸の利用を増強させることができる。ＰＴＳオペロンの活性を下方調節することで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の程度で減少させることができる。一部の例では、複合体の活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％だけ減少させる。特定の実施形態では、減弱は、ｐｔｓオペロンの欠失により実施される。一部の態様では、ＰＴＳ系の活性は、内在性ｐｔｓオペロンの活性を減少させることにより調節される。活性の減少は、ｐｔｓオペロン内の内在性プロモータを、常時低発現型合成プロモータにより置き換えることで実施できる。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつｐｔｓオペロンの活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつＥＩ（ｐｔｓＩ）の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつＨＰｒ（ｐｔｓＨ）の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。ピルビン酸脱水素酵素による炭素の損失を減少させ、かつグルコースの取り込みに関係するＰＥＰ類を増加させるため、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ｐｐｓＡ）の活性を向上させることができる。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ｐｐｓＡ）の活性が増加するよう更に遺伝子操作されている。本発明の任意の更なる態様では、ＰＴＳは下方制御され、グルコース輸送経路は上方調節される。グルコース輸送系は、限定するものではないが、ガラクトース（ｇａｌＰ）及びグルコキナーゼ（ｇｌｋ）を包含する。一部の実施形態では、ｐｔｓオペロンは、下方調節され、ガラクトース（ｇａｌＰ）遺伝子は上方調節され、かつグルコキナーゼ（ｇｌｋ）遺伝子は上方調節される。ＰＴＳのイソ酵素の活性の調節（例えば、減少）も、本明細書において企図される。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている１つ以上の異種発現される核酸を含み、かつＰＴＳイソ酵素の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。
【０２９１】
キシロース利用を包含する経路
本明細書に記載の特定の実施形態では、植物バイオマス由来の糖を、メバロン酸など、イソプレノイド前駆体、イソプレン及び／又はイソプレノイドなどの所望の産物へと変換するにあたって、キシロースを利用することが望ましい。一部の生物では、キシロースを利用するにあたり、代謝用のフルクトース−６−リン酸に変換する際に、ペントースリン酸経路を使用する必要がある。生物は、グルコースによる異化代謝抑制を不活性化させることにより、あるいは他の生物において見られるキシロースオペロン由来の遺伝子を異種発現させることにより、キシロースの利用効率を増強させるよう遺伝子操作することができる。以下に記載されるとおりにキシロース経路を遺伝子操作することで、ホスホケトラーゼ経路によるメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン及び／又はイソプレノイドの産生を増強させることができる。
【０２９２】
キシロースの取り込み及びキシルロース−５−リン酸への変換後の、ホスホケトラーゼ経路への直接的な取り込みを増強することは効果的である。理論に束縛されるものではないが、これにより、炭素の取り込みをペントースリン酸経路へと迂回させることができる（ただし、一部のグリセルアルデヒド−３−リン酸は、必要に応じてＰＰＰに回収される）。キシルロキナーゼ（xyulokinase）の発現増強を用い、キシルロース−５−リン酸の総生産量を増加させることができる。キシルロキナーゼの発現及び活性の最適化を用い、ホスホケトラーゼ経路を有する株におけるキシロースの利用を増強させることができる。
所望されるキシルロキナーゼ（xyulokinase）は、宿主に内在する酵素又は宿主に適合性の任意の異種キシルロキナーゼ（xyulokinase）のいずれかであり得る。一態様では、効果を増加させるためキシロースオペロン以外の成分（例えば、キシロースイソメラーゼ）を過剰発現させることができる。別の実施形態では、他のキシロース経路酵素（例えば、キシロース還元酵素）を減弱させる（例えば、活性を減少又は欠失させる）必要がある場合もある。
【０２９３】
適宜に、明細書に記載されるとおりのホスホケトラーゼ酵素を有するよう遺伝子操作した宿主細胞を、内在性又は異種のいずれかの形態のキシルロースイソメラーゼ及び／又はキシルロキナーゼ（xyulokinase）のいずれかを過剰発現するよう更に遺伝子操作して、総収率並びにメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン及び／又はイソプレノイド産生を向上させることができる。
【０２９４】
ペントースリン酸経路に関与するトランスアルドラーゼ及びトランスケトラーゼ酵素
嫌気的に又はヘテロ発酵を行い生育することのできる一部の微生物は、解糖経路の代わりに、あるいは解糖経路に加えて、ホスホケトラーゼ経路を包含する。この経路は、ペントースリン酸経路の酵素、トランスアルドラーゼ及びトランスケトラーゼの活性に依存する。したがって、本明細書に記載のとおりにホスホケトラーゼ酵素を有するよう遺伝子操作した宿主細胞を、内在性又は異種のいずれかの形態のトランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼを過剰発現して、経路の取り込みを増加させ、毒性中間体の濃度を減少させ、非産生的経路への中間体の迂回を減少させ、並びに総収率並びにメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン及び／又はイソプレノイド産生を向上させるよう更に遺伝子操作することができる。
【０２９５】
変異の組み合わせ
本明細書に記載の任意の酵素及び／又は酵素経路、本明細書に記載の任意の組み合わせ（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４）の酵素及び／又は酵素経路を調節する分子操作が明らかに企図されることは理解されたい。組み合わせての記載を容易にするため、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）はＡとして表記し、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）はＢとして表記し、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）はＣとして表記し、乳酸脱水素酵素（ｌｄｈＡ）はＤとして表記し、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ｇａｐ）はＥとして表記し、ピルビン酸脱炭酸酵素（ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、及び／又はｌｐｄＡ）はＦとして表記し、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）はＧとして表記し、２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）はＨとして表記し、ホスホフルクトキナーゼはＩとして表記し、トランスアルドラーゼはＪとして表記し、トランスケトラーゼはＫとして表記し、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼはＬとして表記し、リボース−５−リン酸エピメラーゼはＭとして表記し、キシルキナーゼ（xylukinase）はＮとして表記し、キシロースイソメラーゼはＯとして表記し、及びキシリトール還元酵素はＰとして表記し、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）はＱとして表記し、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）はＲとして表記し、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ｐｐｓ）はＳとして表記し、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）はＴとして表記し、ＥＩ（ｐｔｓＩ）はＵとして表記し、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）はＶとして表記し、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）はＷとして表記し、ＨＰｒ（ｐｔｓＨ）はＸとして表記し、ガラクトース（ｇａｌＰ）はＹとして表記し、グルコキナーゼ（ｇｌｋ）はＺとして表記し、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（ｚｗｆ）はＡＡとして表記する。上記の通り、ピルビン酸脱炭酸酵素複合体のａｃｅＥ、ａｃｅＦ、及び／又はｌｐｄＡ酵素を単独で使用して、又は３つの酵素のうち２つを、又は３つ酵素のうち３つを使用して、ピルビン酸脱炭酸酵素の活性を増加させることができる。したがって、任意の及びすべての酵素の組み合わせは、本明細書においてＡ−Ｍとして表記されることが明示的に企図され、並びに任意の及びすべての酵素の組み合わせはＡ−ＡＡとして表記される。更に、上記の任意の組み合わせを、本明細書に記載の任意の酵素及び／又は酵素経路（例えば、ホスホケトラーゼ、ＭＶＡ経路ポリペプチド、イソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路ポリペプチド）と組み合わせて使用することができる。
【０２９６】
産生性増加に関係する他の制御因子及び要素
他の分子的操作を使用して、メバロン酸産生に指向する炭素取り込みを増加させることができる。このような方法のうちの１つは、メバロン酸経路に合流する経路に対する負の制御効果を減少させ、低下させるか、又は除去するものである。例えば、一部の場合では、遺伝子ａｃｅＥＦ−ｌｐｄＡはオペロンであり、ｐｄｈＲの上流に遺伝子を４つ有する。遺伝子ｐｄｈＲは、このオペロンの転写に対する負の制御因子である。ｐｄｈＲは、ピルビン酸の非存在下で標的プロモータに結合し、転写を抑制する。この制御因子は同様の手法でｎｄｈ及びｃｙｏＡＢＣＤも制御する（Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８９：５５３４〜５５４１）。一態様では、ｐｄｈＲ制御因子を欠失させることにより、ピルビン酸の供給及びそれに伴うメバロン酸、イソプレノイド前駆体、及びイソプレノイドの産生を向上させることができる。
【０２９７】
他の実施形態では、上記で得られる任意の株を更に遺伝子操作して、エントナー・ドゥドロフ経路の活性を調節することもできる。ホスホグルコン酸デヒドラターゼ又はアルドラーゼをコードしている遺伝子を減弱又は欠失させることができる。他の実施形態では、上記で得られる任意の株は、酢酸キナーゼ又はクエン酸シンターゼの活性を減少又は除去するよう遺伝子操作することもできる。他の実施形態では、得られる株のうち任意の株は、ホスホフルクトキナーゼの活性を減少又は除去するよう遺伝子操作することもできる。
他の実施形態では、上記で得られる任意の株は、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の活性を調節するよう遺伝子操作することもできる。グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の活性は、活性を減少させることにより調節することができる。他の実施形態では、ペントースリン酸経路の非酸価経路の、例えば、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼなどの酵素を過剰発現させることができる。
【０２９８】
他の態様では、セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ／フルクトース−１，６−ビスホスフェートアルドラーゼ及びセドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ／フルクトース−１，６−ビスホスフェートホスファターゼをコードしている異種核酸を導入することにより、細胞内アセチル−リン酸濃度を増加させるよう宿主細胞を更に遺伝子操作することができる。特定の実施形態では、これらの分子操作を有する宿主細胞には、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＢ）及びホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ）遺伝子の減弱又は欠失を組み合わせることにより、エリトロース４−リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、及びグリセルアルデヒド３−リン酸を、セドヘプツロース７−リン酸及びフルクトース１−リン酸へと迅速に変換させることができる（図５を参照されたい）。
【０２９９】
他の態様では、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド及びイソプレノイド前駆体の生産を改良させるために、ＰＧＬを欠損している細胞（各種大腸菌（E. coli）株など）に６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）を導入し、使用することができる。染色体の組み込み又はプラスミドなどの染色体外媒体を用い、ＰＧＬをコードしている遺伝子を導入することにより、ＰＧＬを導入することもできる。
【０３００】
本明細書に記載の各種酵素経路を調節して、メバロン酸産生に取り込まれる炭素を増加させるための宿主細胞（例えば、細菌宿主細胞変異）の他、本明細書に記載の宿主細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチド、並びに限定するものではないが、ｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子産物などの上流及びＭＶＡ経路下流由来のその他の酵素をコードしている遺伝子を含む。ＭＶＡ経路に含まれる代表的なポリペプチドの非限定例としては、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＭＶＡ経路ポリペプチドの活性を２つ以上有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）が挙げられる。ＭＶＡ経路のポリペプチドには、ＭＶＡ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが含まれる。ＭＶＡ経路の代表的な核酸としては、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＭＶＡ経路に含まれる代表的なポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。
【０３０１】
国際公開出願第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、及び同第２０１０／１４８１５０号に記載の、ＭＶＡ経路に関係するポリペプチドの非限定例を使用できる。
【０３０２】
例示的な細胞培養培地
本明細書で使用するとき、用語「最少培地（minimal medium又はminimal media）」は、概して細胞増殖に必要とされる最低限の栄養素を含有している増殖培地を指すが、常に１種以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０種以上のアミノ酸）が存在していないわけではない。最少培地は、典型的には：（１）細菌を増殖させるための炭素源；（２）細菌種及び増殖条件によって異なる様々な塩；並びに（３）水；を含有する。炭素源は、グルコースなどの単糖から、本明細書で以下により詳細に記載されるような、他のバイオマスのより複雑な加水分解物、例えば、酵母エキスなどといった多様なものであり得る。塩は、概してマグネシウム、窒素、リン及びイオウなどの必須元素を提供し、細胞がタンパク質及び核酸を合成できるようにする。また、最少培地には、特定のプラスミド及び同様物を維持すべく選別するために、抗菌剤などの選択剤を添加することもできる。例えば、微生物が、例えばアンピシリン又はテトラサイクリンなどの特定の抗菌剤に耐性である場合、耐性を欠く細胞の増殖を阻害する目的で培地に抗菌剤を添加することができる。培地には、所望される生理学的又は生化学的特性について選別するのに必要とされる、例えば特定のアミノ酸などといった他の化合物を添加することができる。
【０３０３】
宿主細胞を培養するにあたり、任意の最少培地処方を使用することができる。例示的な最少培地処方としては、例えば、Ｍ９最少培地及びＴＭ３最少培地が挙げられる。Ｍ９最少培地は、１Ｌにつき（１）２００ｍＬの滅菌Ｍ９塩類（１Ｌ当たり６４ｇのＮａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、１５ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇのＮａＣｌ及び５．０ｇのＮＨ４Ｃｌ）；（２）２ｍＬの１ＭのＭｇＳＯ４（滅菌）；（３）２０ｍＬの２０％（ｗ／ｖ）グルコース（又は他の炭素源）；及び（４）１００μＬの１ＭのＣａＣｌ２（滅菌）を含有する。ＴＭ３最少培地は、１Ｌ中に（１）Ｋ２ＨＰＯ４（１３．６ｇ）；（２）ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ）；（３）ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）；（４）クエン酸一水和物（２ｇ）；（５）クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）；（６）（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．２ｇ）；（７）酵母エキス（０．２ｇ）；及び（８）１０００Ｘ微量元素溶液（１ｍＬ）を含有する。ｐＨは約６．８に調整し、溶液は濾過滅菌する。１０００Ｘ微量元素は、１Ｌ中に（１）クエン酸一水和物（４０ｇ）；（２）ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）；（３）ＮａＣｌ（１０ｇ）；（４）ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）；（４）ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）；（５）ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）；（６）ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）；（７）Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）；及び（８）ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）を含有する。ｐＨは約３．０に調節する。
【０３０４】
その他の最小培地の例は、（１）リン酸カリウムＫ２ＨＰＯ４、（２）硫酸マグネシウムＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、（３）クエン酸一水和物Ｃ６Ｈ８Ｏ７＊Ｈ２Ｏ、（４）クエン酸鉄アンモニウムＮＨ４ＦｅＣ６Ｈ５Ｏ７、（５）酵母エキス（ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ）、（６）１０００Ｘ改変微量金属溶液、（７）硫酸５０％（ｗ／ｖ）、（８）ｆｏａｍｂｌａｓｔ  ８８２（Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）及び（９）微量塩溶液を３．３６ｍＬ含有する。すべての成分を同時に加え、脱イオン水に溶解させた後、加熱滅菌した。続いて室温に冷却し、水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調節し、用量に調整する。滅菌後にビタミン溶液及びスペクチノマイシンを加え、ｐＨを調整する。
【０３０５】
宿主細胞を培養するにあたり任意の炭素源を使用することができる。用語「炭素源」は、宿主細胞又は微生物により代謝させることのできる、１つ以上の炭素を含有している化合物を指す。例えば、宿主細胞を培養するにあたり使用される細胞培地には、宿主細胞の生存能を維持させる又は宿主細胞を増殖させるのに好適な任意の炭素源を包含させることができる。一部の態様では、炭素源は炭水化物（例えば、単糖、二糖、オリゴ糖、又は多糖など）、又は転化糖（例えば、酵素により処理したスクロースシロップ）である。
【０３０６】
一部の態様では、炭素源としては、酵母エキス又は酵母エキスの１つ以上の成分が挙げられる。一部の態様では、酵母エキスの濃度は、酵母エキスの０．１％（ｗ／ｖ）、０．０９％（ｗ／ｖ）、０．０８％（ｗ／ｖ）、０．０７％（ｗ／ｖ）、０．０６％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、又は０．０１％（ｗ／ｖ）である。一部の態様では、炭素源には、酵母エキス（又は酵母エキスの１つ以上の成分）及び他の炭素源、例えばグルコースの両方を含む。
【０３０７】
単糖の例としては、グルコース及びフルクトースが挙げられ、オリゴ糖の一例としては、ラクトース及びスクロースが挙げられ、並びに多糖の例としては、デンプン及びセルロースが挙げられる。例示的な炭水化物としては、Ｃ６糖（例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、又はグルコース）及びＣ５糖（例えば、キシロース又はアラビノース）が挙げられる。
【０３０８】
一部の態様では、本明細書に記載の細胞は、エネルギー源及び／又は炭素源として合成ガスを利用することができる。一部の実施形態では、合成ガスは少なくとも一酸化炭素及び水素を含有する。一部の実施形態では、合成ガスは、二酸化炭素、水、又は窒素のうちの１つ以上を更に含む。一部の実施形態では、合成ガス中の水素対一酸化炭素のモル比は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、３．０、４．０、５．０、又は１０．０である。一部の実施形態では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０体積％の一酸化炭素を含む。
一部の実施形態では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０体積％の水素を含む。一部の実施形態では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０体積％の二酸化炭素を含む。一部の実施形態では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０体積％の水を含む。一部の実施形態では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０体積％の窒素を含む。
【０３０９】
合成ガスは、天然又は合成資源に由来するものであってよい。合成ガスの由来する資源は「原料」と呼ばれる。一部の実施形態では、合成ガスはバイオマス（例えば、木材、スイッチグラス、農業廃棄物、都市ごみ）又は糖質（例えば、糖類）に由来する。他の実施形態では、合成ガスは、石炭、石油、ケロゲン、タールサンド、オイルシェール、又は天然ガスに由来する。他の実施形態では、合成ガスは、ゴムタイヤなどのゴムに由来する。
【０３１０】
合成ガスは、メタン改質、石炭液化、混焼、発酵反応、酵素反応、及びバイオマスの気化などの各種加工により原材料から生成することができる。バイオマスの気化は、バイオマスを、当量未満の酸素の存在下、約７００℃以上の温度にて、反応器内で部分酸化することにより、を実施する。酸素は、気体、純酸素又は蒸気の形態でバイオリアクタに導入される。気化は主に３つの工程：１）バイオマス中に存在する任意の湿分を完全に乾燥させるよう最初に加熱する工程；２）酸化剤の非存在下でバイオマスを３００〜５００℃に加熱して気体、タール類、油類及び固体チャー残渣を生成する熱分解工程；並び３）固体チャー、タール類及び気体を気化して合成ガスの主成分を生成する工程において生じ得る。混焼は、石炭／バイオマス混合の気化により実施される。合成ガスの組成、例えば、合成ガスの成分の同一性及びモル比などは、合成ガスの由来する原材料及び原材料を合成ガスへと変換する方法によって異なる。
【０３１１】
合成ガスは不純物を含有し得るものであり、性質及び量は、産生に使用した原料及び加工法のいずれもに応じて変化する。発酵は一部の不純物に寛容性を示すものの、合成ガス成分から、発酵槽及び関連する装置を汚す恐れのあるタール類及び粒子を除去する必要はある。イソプレン生成物を汚染し得る、揮発性有機化合物、酸性ガス、メタン、ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレン、Ｈ２Ｓ、ＣＯＳ、ＣＳ２、ＨＣｌ、Ｏ３、有機硫黄化合物、アンモニア、酸化窒素、窒素含有有機化合物、及び重金属蒸気などの化合物を除去することも望ましい。合成ガスからの不純物の除去は、ガス洗浄、固相吸着剤による処理、及び気体透過膜を用いる精製などのいくつかの手法により実施することができる。
【０３１２】
例示的な細胞培養条件
本発明の組換え細胞を維持し及び増殖させるのに好適な材料及び方法は、以下、例えば、実施例の節に記載される。微生物培養物の維持及び増殖に好適な他の材料及び方法は当該技術分野において周知である。例示的な手法としては、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第第２００９／０２０３１０２号、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、米国特許出願第２０１０／０００３７１６号、Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，編の一般細菌学に関係する手法についてのマニュアル、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）又はＢｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：テキスト「工業微生物学（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）が挙げられる。一部の態様では、細胞は、宿主細胞に挿入された核酸によりコードされている、ホスホケトラーゼポリペプチド、並びに限定するものではないが、ｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子産物、イソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路（例えば、ＤＸＳ）、ＩＤＩ、又はＰＧＬポリペプチドなどの、上流及びＭＶＡ経路下流由来のその他の酵素の発現を可能にする条件下で培養培地中で培養される。
【０３１３】
細胞を培養するにあたり、標準的な細胞培養条件を使用することができる（例えば、国際公開第２００４／０３３６４６号及び該当特許中に引用される参考文献を参照されたい）。一部の態様では、細胞は適切な温度、気体混合物、及びｐＨ（例えば、約２０℃〜約３７℃、約６％〜約８４％のＣＯ２、及び約５〜約９のｐＨ）にて増殖及び維持される。
一部の態様では、細胞は適切な細胞培地中で３５℃で増殖する。一部の態様では、発酵の際のｐＨ範囲は約ｐＨ  ５．０〜約ｐＨ  ９．０（例えば、約ｐＨ  ６．０〜約ｐＨ  ８．０、又は約６．５〜約７．０）である。細胞は、宿主細胞に必要とされる条件に基づき、好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で生育させることができる。加えて、細胞を培養するにあたり、より特異的な細胞培養条件を使用することができる。例えば一部の実施形態では、組換え細胞（大腸菌（E. coli）細胞など）は、低〜通常コピー数のプラスミド中、高発現型プロモータの調節下で、ホスホケトラーゼポリペプチド並びに限定するものではないが、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子産物のｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド酵素などの上流由来の酵素をコードしている１種以上の異種核酸を含み、３４℃にて培養される。
【０３１４】
使用することのできる標準的な培養条件、並びに回分式、流加式培養、又は連続式発酵などの発酵様式は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に記載されている。回分式発酵及び流加式発酵は一般的かつ当該技術分野では周知のものであり、その例は、Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：テキスト「工業微生物学（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．に見ることができる。
【０３１５】
一部の態様では、細胞はグルコース制限条件下で培養される。「グルコース制限条件」は、添加されるグルコースの量が、細胞により消費されるグルコース量の約１０５％以下（例えば、約１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％）であることを意味する。特定の態様では、培養培地に添加されるグルコース量は、特定の期間中に細胞により消費されるグルコース量とほぼ同様である。一部の態様では、細胞の増殖速度は、細胞培地中のグルコースの量により維持することのできる速度で細胞が増殖するよう、添加するグルコース量を制限することで制御される。一部の態様では、グルコースは細胞培養時に蓄積しない。様々な態様で、細胞はグルコース制限条件下で、約１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、又は７０時間以上培養される。様々な態様で、細胞は、細胞を培養する合計時間の長さの約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５又は１００％以上の時間にわたって、グルコース制限条件下で培養される。任意の特定の理論に束縛されることを意図するものではないが、グルコース制限条件は、細胞をより都合よく制御し得るものであると考えられる。
【０３１６】
一部の態様では、組換え細胞は回分式培養で増殖させる。組換え細胞は、流加式培養又は連続式培養により生育させることもできる。加えて、組換え細胞は、限定するものではないが、上記のいずれかの最少培地などの最少培地で培養することができる。最少培地には、更に１．０％（ｗ／ｖ）グルコース又は任意の他の６単糖以下の糖などを添加してもよい。具体的には、最少培地には１％（ｗ／ｖ）、０．９％（ｗ／ｖ）、０．８％（ｗ／ｖ）、０．７％（ｗ／ｖ）、０．６％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、０．４％（ｗ／ｖ）、０．３％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）、又は０．１％（ｗ／ｖ）のグルコースが添加される。加えて、最少培地には０．１％（ｗ／ｖ）以下の酵母エキスを添加してもよい。具体的には、最少培地には０．１％（ｗ／ｖ）、０．０９％（ｗ／ｖ）、０．０８％（ｗ／ｖ）、０．０７％（ｗ／ｖ）、０．０６％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）又は０．０１％（ｗ／ｖ）の酵母エキスを添加してもよい。あるいは、最少培地には１％（ｗ／ｖ）、０．９％（ｗ／ｖ）、０．８％（ｗ／ｖ）、０．７％（ｗ／ｖ）、０．６％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、０．４％（ｗ／ｖ）、０．３％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）又は０．１％（ｗ／ｖ）のグルコース及び０．１％（ｗ／ｖ）、０．０９％（ｗ／ｖ）、０．０８％（ｗ／ｖ）、０．０７％（ｗ／ｖ）、０．０６％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）又は０．０１％（ｗ／ｖ）の酵母エキスを添加してもよい。
【０３１７】
例示的な精製方法
一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、産生された化合物を回収する工程を包含する。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、イソプレンを回収する工程を包含する。一部の態様では、イソプレンは吸着ストリッピングにより回収される（例えば、米国特許第２０１１／０１７８２６１号を参照されたい）。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に異種ポリペプチドを回収する工程を包含する。一部の態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、テルペノイド又はカロテノイドを回収する工程を含む。
【０３１８】
好適な精製方法は、米国特許出願公開第２０１０／０１９６９７７（Ａ１）号により詳細に記載されている。
【０３１９】
本明細書を通じ、各種特許、特許出願及び他の種類の刊行物（例えば、学術論文）を参照する。本明細書に引用する、本開示に関係する全ての特許、特許出願及び刊行物は、すべての目的に関し、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０３２０】
本発明は、実例として提供され、制限することを意味するものではない以降の実施例を参照することにより更に理解することができる。
【実施例】
【０３２１】
実施例１：ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）由来のホスホケトラーゼ酵素をコードしている遺伝子のクローニング
ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）の染色体ＤＮＡをＡＴＣＣから得た（ＡＴＣＣ＃  １５６９７Ｄ−５，ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））。プライマーＣＭＰ２８３：５’−ｃｔｇｔａｔＴＣＡＴＧＡｃｇａｇｔｃｃｔｇｔｔａｔｔｇｇｃａｃｃ−３’（列番号３０）及びＣＭＰ２８４：５’−ｃｔｃｔａｔＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＣＧＴＴＧＴＣＧＣＣＡＧＣＧ−３’（配列番号３１）、テンプレートとして１００ｎｇのＤＮＡ、並びに製造元に従ってポリメラーゼＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、ホスホケトラーゼ（ＰＫＬ）酵素をコードしている遺伝子を増幅させた。精製後、消化によりＢｓｐＨＩ及びＥｃｏＲＩにより２７９８ｂｐの断片を切り出し、ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩにより消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と連結して、プラスミドｐＣＭＰ１０９０を生成した（配列番号１５−図６）。
【０３２２】
実施例２：ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）株Ｆ２７５由来のホスホケトラーゼ酵素のクローニング
ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）株Ｆ２７５の染色体ＤＮＡをＡＴＣＣ  から得た（ＡＴＣＣ＃  ２３２７２Ｄ−５，ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））。プライマーＣＭＰ３４：５’−ｔａａｇｇａｇｇａａｔａａａｃＡＴＧＧＣＡＧＴＡＧＡＴＴＡＣＧＡＴＴＣＣＡＡＧ−３’（配列番号３２）及びＣＭＰ３３５：５’−ｔｔｃｔａｇａａａｇｃｔｔｃｇｔｔａｃｔｔａａｇａｃｃｃｔｔｃｃａａｇｔｃｃａｇ−３’（配列番号３３）、テンプレートとして１００ｎｇのＤＮＡ、並びに製造元に従ってポリメラーゼＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ））を使用して、ホスホケトラーゼ（ＰＫＬ）酵素をコードしている遺伝子を増幅させた。精製後、２４４２ｂｐの断片を、ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩにより消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にＧＥＮＥＡＲＴシームレス・クローニング・キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して組み込み、プラスミドｐＣＭＰ１０２９を生成した（配列番号１６−図７）。
【０３２３】
実施例３：株ＣＭＰ４５１、ＣＭＰ６７４、ＣＭＰ１０１５及びＣＭＰ１０４７の構築（ＢＬ２１  ＧＩ１．２ｇｌｔＡ  ｌｄｈＡ）
大腸菌（E. coli）株ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）中のクエン酸シンターゼ遺伝子（ｇｌｔＡ）の前に位置するプロモータを、常時低発現型プロモータ、すなわちＧＩ１．２（米国特許第７，３７１，５５８号）によりあらかじめ置き換えた。２つの野生型プロモータはｇｌｔＡに関し記載されている（Ｗｉｌｄｅ，Ｒ，ａｎｄ  Ｊ．Ｇｕｅｓｔ．１９８６．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３２３９〜３２５１）。末端プロモータの−３５領域に直後に合成プロモータを挿入した。プライマーＵｐｇｌｔＡＣｍ−Ｆ（５’−ＴＡＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＴＣＡＴＣＴＡＡＴＴＴＧＡＣＡＡＴＣＡＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＴＧＴＴＡＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＣＧＧ−３’（配列番号３４））及びＤｎｇｌｔＡ１．ｘｇｉＣｍ−Ｒ（５’−ＴＣＡＡＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＧＴＡＴＣＡＧＣＣＡＴＡＴＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＴＧＧＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＴＨＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧ−３’（配列番号３５））、及びテンプレートとしてＧｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）プラスミドＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴを使用し、ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物を精製し、λｒｅｄを用いる組み換えに製造元（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による記載の通りに使用した。更なる評価にあたって、複数種のコロニーを選別した。プロモータ領域は、プライマーｇｌｔＡＰｒｏｍＳｅｑＦ：５’−ＧＧＣＡＧＴＡＴＡＧＧＣＴＧＴＴＣＡＣＡＡＡＡＴＣ−３’（配列番号３６）及びｇｌｔＡｐｒｏｍＳｅｑＲ：５’−ＣＴＴＧＡＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＴＣＡＧＣ−３’（配列番号３７）と、テンプレートとしてコロニーから抽出したＤＮＡ（コロニーを３０μＬのＨ２Ｏに再懸濁し、９５℃で４分加熱し、スピンダウンしたもの。５０μＬのＰＣＲ反応には、この溶液のうち２μＬをテンプレートとして使用する）とを使用しＰＣＲ増幅させた。得られたＰＣＲ産物の配列決定結果を観察した後、ＧＩ１．２プロモータ（米国特許第７，３７１，５５８号）を保有しているコロニーを、ＣＭＰ１４１と命名した。
【０３２４】
ＣＭＰ２５８（米国特許出願第／号を参照されたい）にＭＣＭ５２１株（米国特許出願第／号を参照されたい）のＰ１可溶化液を形質導入し、ＭＤ０９−３１３株を構築し、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有させたルリア・ベルターニ培地のプレートにてコロニーを選択した。Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃに記載の方法に従ってＰ１可溶化液を調製した。製造元により推奨されるプロトコルを用い（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）カナマイシンマーカーを除去し、ＭＤ０９−３１４株を作製する。
【０３２５】
株ＣＭＰ１４１からＰ１可溶化液を作製し、株ＭＤ０９−３１４に形質導入してＣＭＰ４４０を作成するのに使用した。製造元により推奨されるプロトコルを用い（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）クロラムフェニコールマーカーを除去して株ＣＭＰ４５１を作製した。
【０３２６】
テンプレートとしてプラスミドｐＫＤ３（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．２０００．ＰＮＡＳ  ９７：６６４０〜６６４５）を使用し、プライマーＣＭＰ１７１（５’−ＡＡＡＡＴＴＴＴＣＡＴＴＣＴＧＴＧＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＡＧＴＡＧＣＣＧＡＡＧＡＴＧＡＣＧＧＴＴＴＧＴＣＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＡＧＧＡＴＧＴＴＴＧＡＴＴＡＣＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣ−３’（配列番号３８））及びＣＭＰ１７２（５’−ＧＡＣＣＡＧＣＣＧＣＧＴＡＡＣＣＴＧＧＣＡＡＡＡＴＣＧＧＴＴＡＣＧＧＴＴＧＡＧＴＡＡＴＡＡＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＣＧＴＡＡＧＣＧＧＧＧＣＡＴＴＴＴＴＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＧ−３’（配列番号３９））を使用して、ＤＮＡホモログによりλ挿入部位ａｔｔＢの上流及び下流部位とに隣接しているクロラムフェニコールマーカーを含有しているＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ産物を、製造元（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の推奨する通りにＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）における組み換え反応に使用し、λ挿入部位ａｔｔＢに組み入れた。これにより生成されたＣＭＰ６４６株を、ＬＢ＋５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールにて選択した。ＣＭＰ６４６のＰ１可溶化液を調製し、株ＣＭＰ４５１に対する形質導入反応に使用し、この株の染色体からメバロン酸経路下流の遺伝子（メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードしている）を除去した。形質導入物をＬＢ＋クロラムフェニコール５μｇ／ｍＬに播種し、各形質導入からコロニーを１つずつ選択し、ＣＭＰ６７４と名づけた。
【０３２７】
【表２】
2019030315.tif 000006
【０３２８】
テンプレートとしてＫｅｉｏ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２：２００６．０００８）のＪＷ１３７５株を使用し、プライマーはｌｄｈＡｓｅｑＲ（５’−ＧＧＣＴＴＡＣＣＧＴＴＴＡＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＣ−３’）（配列番号４０）及びｌｄｈＡｓｅｑＦ２（５’−ＣＴＡＡＴＧＣＡＡＴＡＣＧＴＧＴＣＣＣＧＡＧＣ−３’）（配列番号４１）と、を使用し、カナマイシンマーカーにより破壊されているｌｄｈＡ遺伝子を含有しているＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、製造元（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の推奨する通りに組み換え反応に使用し、ＣＭＰ６７４株のｌｄｈＡ座に組み入れた。この株をＣＭＰ１０１５と命名した。株に電気穿孔法によりｐＣＰ２０を導入して、クロラムフェニコール及びカナマイシンマーカーを同時に除去し（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ．２０００．ＰＮＡＳ  ９７：６６４０〜６６４５）３０℃下でＬＢ＋５０ｕｇ／ｍＬのカルベニシリンで２つのコロニーを選択し、次に、これらのコロニーを、４２℃下でＬＢプレートに再画線した。これらのプレートからＣｍＳ及びＫａｎＳコロニーを選択し、ＣＭＰ１０４７と名づけた。
【０３２９】
実施例４：株ＣＭＰ１０３６、１０３８及び１０４０の構築
プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ、ｐＣＭＰ１０９０（ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）由来のＰＫＬ）及びｐＣＭＰ１０２９（ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）由来のＰＫＬ）の存在下で、株ＣＭＰ６７４に電気穿孔法を行った。ＬＢ＋カルベニシリン５０μｇ／ｍＬで、コロニーを単離した各形質転換からコロニーを１つ選択し、それぞれＣＭＰ１０３６、ＣＭＰ１０３８及びＣＭＰ１０４０と命名した。
【０３３０】
実施例５：株ＣＭＰ１０３６、１０３８及び１０４０におかるアセチルリン酸の測定
（ｉ）材料
【０３３１】
ＴＭ３培地の組成（発酵培地１Ｌ当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４を１３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１３．６ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを２ｇ、クエン酸一水和物を２ｇ、クエン酸鉄アンモニウムを０．３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を３．２ｇ、酵母エキスを０．２ｇ、１０００Ｘ微量金属溶液を１ｍＬ。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させる。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整する。０．２２μｍフィルタで培地を濾過滅菌する。ｐＨを調整及び滅菌後にグルコース１０．０ｇ及び抗菌剤を加えた。
【０３３２】
１０００Ｘ微量金属溶液（発酵培地１Ｌ当たり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ。各成分を１成分ずつ脱イオン水に溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで３．０に調整した後、溶液を用量に調整し、０．２２μｍフィルタでフィルタ滅菌する。
【０３３３】
（ｉｉ）実験手順
ルリア・ベルターニブロス＋抗生物質で細胞を一晩生育させた。翌日、ＯＤ６００が０．０５になるよう、５０ｕｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有させた２０ｍＬのＴＭ３培地（２５０ｍＬのバッフル付き三角フラスコ）により細胞を希釈し、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートする。２時間生育させた後、ＯＤ６００を測定し、２００ｕＭのＩＰＴＧを加える。３．５時間以上経過後、１．５ｍＬのサンプルを遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを１００μＬの無水冷メタノールに再懸濁した。
【０３３４】
（ｉｉｉ）細胞内アセチル−リン酸の測定
アセチル−リン酸を抽出するため、ＯＤ  ０．５７〜２．２６へと生育させた大腸菌（E. coli）細胞１．５ｍＬを遠心分離によりスピンダウンし、１００μＬの無水冷メタノールをペレットに加えた。メタノールにより急冷したサンプルを−２０℃で数日間保存した。以降のサンプル加工には、細胞を穏やかに再懸濁し、−９℃で５分間遠心分離し、上清を清潔なバイアル瓶に吸引する工程を包含した。２％酢酸を含有させた７５μＬの水により、ペレットを２回再抽出した。各抽出後、−９℃にて遠心分離することにより細胞片をペレット化し、全３つの抽出物由来の上清を一緒に集め、１μＬのトリブチルアミンを添加した。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＴＳＱシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ））を使用し、ＬＣＭＳによるアセチルリン酸の質量分析を実施した。システムの調節、データ収集、及び質量スペクトルデータの評価は、ソフトウェアＸＣａｌｉｂｕｒ及びＬＣＱｕａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ）を使用して行った。移動相を勾配させて、流速０．４ｍＬ／分にてＳｙｎｅｒｇｉ  ＭＡＸ−ＲＰ  ５μＭ  ＨＰＬＣカラム（１５０×２ｍｍ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に加えた。勾配プロファイルは、溶媒Ａは１５ｍＭトリブチルアミン／１０ｍＭ酢酸水溶液、溶媒Ｂはメタノール、及び溶媒Ｃは水として、９９％  Ａ及び１％  Ｂをｔ＝０〜１分；８０％  Ａ及び２０％  Ｂをｔ＝１１分；７５％  Ｂ及び２５％  Ｃをｔ＝１２〜１４分；９９％  Ａ及び１％  Ｂをｔ＝１５〜１６分のように適用した。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）ネガティブモード（ＥＳＩスプレー電位２．５〜３．０ｋＶ、イオントランスファーチューブ温度３９０℃）でを用い、アセチルリン酸の質量検出を実施したところ、前駆体イオンのｍ／ｚ値は１３８．９であった。ＰＯ３−プロダクトイオン（ｍ／ｚ＝７９．０，衝突エネルギー２０Ｖ，衝突ガス圧０．２２ｋＰａ（１．７ｍＴｏｒｒ），Ｒｔ＝１３．２分）により生成されたピークの積分強度をもとに、アセチルリン酸濃度を求めた。標準アセチルリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を注入することにより得られた検量線を使用して、細胞抽出物中の代謝産物濃度を算出した。ＯＤ＝２００の培養液１ｍＬにおける消費に基づき、アセチルリン酸の細胞内濃度を求めた。すべての細胞の総体積は５０Ｍｌである（図８）。
【０３３５】
（ｉｖ）結果
ホスホケトラーゼを発現している株では、ホスホケトラーゼを発現しない対照株よりも高濃度のアセチルリン酸細胞内濃度を有した（ＣＭＰ１０４０及びＣＭＰ１０３８）（図８）。
【０３３６】
実施例６：ＣＭＰ１０５３、１０５５及び１０５７の構築
プラスミドｐＭＣＭ８２（発現ベクターＭＣＭ８２（米国特許出願公開番号第２０１０／０１９６９７７号）とともに、プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、ｐＣＭＰ１０９０（ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）由来のＰＫＬ）又はｐＣＭＰ１０２９（ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）ＰＫＬ）を使用して、ＣＭＰ１０４７を形質転換させた。宿主ＣＭＰ１０４７を対数増殖期の中期まで３４℃にてＬＢで生育させ、電気穿孔に備え、培養物の当量の氷冷ｄｄＨ２Ｏにより２回洗浄し、培養物の１／１０当量の氷冷ｄｄＨ２Ｏに再懸濁した。１００μＬの細胞懸濁液を１μＬの各プラスミドＤＮＡと組み合わせて、２ｍｍの電気穿孔法キュベットに入れ、２５ｕＦＤ、２００オーム、２．５ｋＶで電気穿孔し、直ちに１ｍＬのＬＢにより冷却した。細胞を回収し、３４℃にて１時間振盪し、次に５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン＋５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを添加したＬＢプレートにより３４℃にて一晩形質転換体させた。各形質転換用にコロニーを１つ選択し、それぞれＣＭＰ１０５３、１０５５及び１０５７と命名した。
【０３３７】
他の実施形態では、上記で得られる任意の株を更に遺伝子操作して、エントナー・ドゥドロフ経路の活性を調節することもできる。ホスホグルコン酸デヒドラターゼ又はアルドラーゼをコードしている遺伝子を減弱又は欠失させることができる。他の実施形態では、上記で得られる任意の株は、酢酸キナーゼ又はクエン酸シンターゼの活性を減少又は除去するよう遺伝子操作することもできる。他の実施形態では、得られる株のうち任意の株は、ホスホフルクトキナーゼの活性を減少又は除去するよう遺伝子操作することもできる。
他の実施形態では、上記で得られる任意の株は、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の活性を調節するよう遺伝子操作することもできる。グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素の活性は、活性を減少させることにより調節することができる。他の実施形態では、ペントースリン酸経路の非酸価経路の、例えば、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼなどの酵素を過剰発現させることができる。
【０３３８】
実施例７：株ＣＭＰ１０５３、１０５５及び１０５７によるメバロン酸産生
（ｉ）材料
【０３３９】
ＴＭ３培地の組成（発酵培地１Ｌ当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４を１３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１３．６ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを２ｇ、クエン酸一水和物を２ｇ、クエン酸鉄アンモニウムを０．３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を３．２ｇ、酵母エキスを０．２ｇ、１０００Ｘ微量金属溶液を１ｍＬ。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させる。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整する。０．２２μｍフィルタで培地を濾過滅菌する。ｐＨ調整及び滅菌後にグルコース１０．０ｇ及び抗菌剤を添加する。
【０３４０】
１０００Ｘ微量金属溶液（発酵培地１Ｌ当たり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏを４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏを３０ｇ、ＮａＣｌを１０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを１ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏを１ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを１ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏを１００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３を１００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏを１００ｍｇ。各成分を１成分ずつ脱イオン水に溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで３．０に調整した後、溶液を用量に調整し、０．２２μｍフィルタでフィルタ滅菌する。
【０３４１】
（ｉｉ）実験手順
ルリア・ベルターニブロス＋抗生物質で細胞を一晩生育させる。翌日、ＯＤ６００が０．０５になるよう、２５０ｍＬのバッフル付き三角フラスコにおいて細胞を２０ｍＬのＴＭ３培地（５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン及び５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有）により希釈し、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートする。２時間生育させた後、ＯＤ６００を測定し、２００ｕＭのＩＰＴＧを加える。発酵工程の間、規則的に試料を採取する。各時点でＯＤ６００を測定する。２４時間後、メバロン酸をＨＰＬＣにより解析した。次の様式でＨＰＬＣ解析を実施した：３００μＬのブロスに５４μＬの１０％（ｗ／ｖ）Ｈ２ＳＯ４を加え、混合物を氷上で５分インキュベートした。次に、試料を１４，０００×ｇで５分遠心分離し、ＨＰＬＣ解析のため上清を回収し、次の条件でＨＰＬＣ解析を実施した：（１）ＢｉｏＲａｄ−ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）（カタログ番号１２５−０１４０）（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；（２）カラム温度＝５０℃；（３）ＢｉｏＲａｄ−マイクロガードＣａｒｂｏ−Ｈ詰め替えカートリッジ（３０ｍｍ×４．６ｍｍ）（カタログ番号１２５−０１２９）（ＢｉｏＲａｄ）；（４）移動相＝０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４；（５）流速＝０．６ｍＬ／分；（６）およその圧力＝約６５５０．０ｋＰａ（９５０ｐｓｉ）；（７）装填量＝１００μＬ；（８）実施時間＝２６分。
【０３４２】
（ｉｉｉ）結果：
ホスホケトラーゼを発現している株は、対照株よりも生育が遅かった（図９）。ＣＭＰ１０５７（ラクトバチルス・ロイテリ（L. reuteri）ホスホケトラーゼ遺伝子を発現している）は、対照の空プラスミド又はビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）由来のホスホケトラーゼを含有している株と比較して、多量にメバロン酸を産生した（図１０）。
【０３４３】
実施例８：イソプレンを産生し、ホスホケトラーゼを発現している株の構築
ＭＣＭ５２１可溶化液を使用し、ＣＭＰ６７４にメバロン酸経路の下流を形質導入する（表２を参照されたい）。製造元に従いカナマイシンマーカーを除去する（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＭＣＭ５２１の下流の経路は、別の遺伝子を使用することにより各遺伝子の前に位置するｒｂｓを改変し、オペロン上流のプロモータを変更することで改変することができる。ｌａｃＩ、イソプレンシンターゼ及びメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼを発現している発現プラスミドの、プラスミドｐＭＣＭ８２（発現ベクターＭＣＭ８２（米国特許出願公開番号第２０１０／０１９６９７７号））及びプラスミドｐＣＭＰ１０９０（ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）由来のＰＫＬ）、ｐＣＭＰ１０２９（ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）由来のＰＫＬ）又はｐＴｒｃＨｉｓ２ＢをＣＭＰ１０４７に電気穿孔した（２段階で）。ＬＢ＋スペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬ＋カルベニシリン５０μｇ／ｍＬ＋クロラムフェニコール２５μｇ／ｍＬでコロニーを選別する。
【０３４４】
他の実施形態では、上記で得られる任意の株を更に遺伝子操作して、エントナー・ドゥドロフ経路の活性を調節することもできる。ホスホグルコン酸デヒドラターゼ又はアルドラーゼをコードしている遺伝子を減弱又は欠失させることができる。他の実施形態では、上記で得られる任意の株は、酢酸キナーゼ又はクエン酸シンターゼの活性を減少又は除去するよう遺伝子操作することもできる。他の実施形態では、得られる株のうち任意の株は、ホスホフルクトキナーゼの活性を減少又は除去するよう遺伝子操作することもできる。
他の実施形態では、上記で得られる任意の株は、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の活性を調節するよう遺伝子操作することもできる。グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の活性は、活性を減少させることにより調節することができる。他の実施形態では、ペントースリン酸経路の非酸価経路の、例えば、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼなどの酵素を過剰発現させることができる。
【０３４５】
実施例９：メバロン酸経路上流を発現しているプラスミド、ｌａｃＩ、イソプレンシンターゼ及びメバロン酸キナーゼを発現しているプラスミド、及びホスホケトラーゼを発現しているプラスミドを保有している株によるイソプレンの産生と、メバロン酸経路上流を発現しているプラスミド、ｌａｃＩ、イソプレンシンターゼ及びメバロン酸キナーゼを発現しているプラスミド、並びに空プラスミド（ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ）を保有している細胞によるイソプレンの産生との比較
（ｉ）材料
【０３４６】
ＴＭ３培地の組成（発酵培地１Ｌ当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４を１３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１３．６ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを２ｇ、クエン酸一水和物を２ｇ、クエン酸鉄アンモニウムを０．３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を３．２ｇ、酵母エキスを０．２ｇ、１０００Ｘ微量金属溶液を１ｍＬ。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させる。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整する。０．２２μｍフィルタで培地を濾過滅菌する。ｐＨ調整及び滅菌後にグルコース１０．０ｇ及び抗菌剤を添加する。
【０３４７】
１０００Ｘ微量金属溶液（発酵培地１Ｌ当たり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏを４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏを３０ｇ、ＮａＣｌを１０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを１ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏを１ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを１ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏを１００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３を１００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏを１００ｍｇ。各成分を１成分ずつ脱イオン水に溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで３．０に調整した後、溶液を用量に調整し、０．２２μｍフィルタでフィルタ滅菌する。
【０３４８】
（ｉｉ）実験手順
ルリア・ベルターニブロス＋抗生物質で細胞を一晩生育させる。翌日、ＯＤ６００が０．１になるよう、２５０ｍＬのバッフル付き三角フラスコにおいて細胞を２０ｍＬのＴＭ３培地（５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン、２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、及び５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを含有）により希釈し、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートする。２時間生育させた後、ＯＤ６００を測定し、２００ｕＭのＩＰＴＧを加える。発酵工程の間、規則的に試料を採取する。各時点でＯＤ６００を測定する。また、ガスクロマトグラフ−マススペクトロメータ（ＧＣ−ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるヘッドスペース解析によりイソプレンのオフガス分析を行う。１００μＬの全ブロスをＧＣバイアルに入れ密閉し、３４℃かつ２００ｒｐｍで３０分間インキュベートする。７０℃で７分のインキュベーションからなる熱殺菌工程後、試料をＧＣに装填する。記録される比産生量は、イソプレン量のＧＣによる読み取り値（μｇ／Ｌ）を、インキュベート時間（３０分）及びＯＤ６００測定値で除算した値である。
【０３４９】
（ｉｉｉ）結果：
ホスホケトラーゼを発現している株は、ホスホケトラーゼを発現しない対照株よりも生育が遅かった。ホスホケトラーゼポリペプチドを発現している株において、イソプレンの比産生性、収率、ＣＰＩ、及び／又は力価の増加が観察されたことから、ホスホケトラーゼポリペプチドを発現している株は、対照の空プラスミド（すなわち、ホスホケトラーゼを発現しない株）を含有している株と比較して、イソプレンの産生の増強を示す。
【０３５０】
実施例１０：ホスホケトラーゼを発現しかつアモルファジエン又はファルネセンを産生している株の構築
ＭＣＭ５２１可溶化液を使用し、ＣＭＰ６７４にメバロン酸経路の下流を形質導入する（表２を参照されたい）。製造元に従いカナマイシンマーカーを除去する（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＭＣＭ５２１の下流の経路は、別の遺伝子を使用することにより各遺伝子の前に位置するｒｂｓを改変し、オペロン上流のプロモータを変更することで改変することができる。染色体上のプロモータ及び／又はｒｂｓを変更させるか、又はプラスミドから発現させるかのいずれかにより、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ｉｓｐＡ）を過剰発現させる。
【０３５１】
実施例８の、ｌａｃＩ、イソプレンシンターゼ、及びメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼを発現している発現プラスミドを改変して、イソプレンシンターゼをコードしている遺伝子を、ファルネセンシンターゼ又はアモルファジエンシンターゼをコードしているコドン最適化した遺伝子により置き換えた。次の発現プラスミドをコンピテントな宿主細胞に電気穿孔法により導入した（２段階で）：（ｉ）ｌａｃＩ、ファルネセンシンターゼ又はアモルファジエンシンターゼ、及びメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼを有するプラスミド、（ｉｉ）ｐＭＣＭ８２（発現ベクターＭＣＭ８２（米国特許出願公開番号第２０１０／０１９６９７７号）、並びに（ｉｉｉ）ｐＣＭＰ１０９０（ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）由来のＰＫＬ）、又はｐＣＭＰ１０２９（ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）由来のＰＫＬ）又はｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ。ＬＢ＋スペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬ＋カルベニシリン５０μｇ／ｍＬ＋クロラムフェニコール２５μｇ／ｍＬでコロニーを選別する。
【０３５２】
他の実施形態では、上記で得られる任意の株を更に遺伝子操作して、エントナー・ドゥドロフ経路の活性を調節することもできる。ホスホグルコン酸デヒドラターゼ又はアルドラーゼをコードしている遺伝子を減弱又は欠失させることができる。他の実施形態では、上記で得られる任意の株は、酢酸キナーゼ又はクエン酸シンターゼの活性を減少又は除去するよう遺伝子操作することもできる。他の実施形態では、得られる株のうち任意の株は、ホスホフルクトキナーゼの活性を減少又は除去するよう遺伝子操作することもできる。
他の実施形態では、上記で得られる任意の株は、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の活性を調節するよう遺伝子操作することもできる。グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の活性は、活性を減少させることにより調節することができる。他の実施形態では、ペントースリン酸経路の非酸価経路の、例えば、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リブロース−５−リン酸エピメラーゼなどの酵素を過剰発現させることができる。
【０３５３】
実施例１１：ホスホケトラーゼを発現しているプラスミドを含有している株におけるアモルファジエン又はファルネセンの産生と対照株におけるアモルファジエン又はファルネセンの産生との比較
（ｉ）材料
【０３５４】
ＴＭ３培地の組成（発酵培地１Ｌ当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４を１３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１３．６ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを２ｇ、クエン酸一水和物を２ｇ、クエン酸鉄アンモニウムを０．３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を３．２ｇ、酵母エキスを０．２ｇ、１０００Ｘ微量金属溶液を１ｍＬ。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させる。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整する。次に、０．２２μｍのフィルタを用い培地を濾過滅菌した。滅菌及びｐＨ調整後にグルコース１０．０ｇ及び抗菌剤を添加する。
【０３５５】
１０００Ｘ微量金属溶液（発酵培地１Ｌあたり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏを４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏを３０ｇ、ＮａＣｌを１０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを１ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏを１ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを１ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏを１００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３を１００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏを１００ｍｇ。各成分を１成分ずつ脱イオン水に溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで３．０に調整した後、溶液を用量に調整し、０．２２μｍフィルタでフィルタ滅菌する。
【０３５６】
（ｉｉ）実験手順
ルリア・ベルターニブロス＋抗生物質で細胞を一晩生育させる。翌日、ＯＤ６００が０．０５になるよう、２５０ｍＬのバッフル付き三角フラスコにおいて細胞を２０ｍＬのＴＭ３培地（５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン、２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、及び５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを含有）により希釈し、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートする。接種前に、各培養フラスコには２０％（ｖ／ｖ）ドデカン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を積層し、これまでに記載のとおり、揮発性セスキテルペン産物を捕捉する（Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ．ａｌ．，２００６）。
【０３５７】
２時間生育させた後、ＯＤ６００を測定し、０．０５〜０．４０ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えた。発酵工程の間、規則的に試料を採取する。各時点でＯＤ６００を測定する。また、積層したドデカンを酢酸エチルに希釈し、有機層中のアモルファジエン又はファルネセン濃度を分析する。ドデカン／エチルアセテート抽出物を、従来記載されている通りの（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，２１：９６〜８０２）ＧＣ−ＭＳ法により、アモルファジエンの分子イオン（２０４ｍ／ｚ）及び１８９ｍ／ｚフラグメントイオン又はファルネセンの分子イオン（２０４ｍ／ｚ）の観察により解析する。濃度既知のアモルファジエン又はファルネセン試料を装填して、それぞれアモルファジエン又はファルネセンの標準曲線を生成する。試料中のアモルファジエン又はファルネセンの量は、それぞれアモルファジエン又はファルネセンの標準曲線を使用し算出する。
【０３５８】
（ｉｉｉ）結果
ホスホケトラーゼポリペプチドを発現している株を、同様のバックグラウンドを持ち、空プラスミド（すなわち、ホスホケトラーゼポリペプチドを不含有である）を含有している株と比較する。ホスホケトラーゼポリペプチドを発現している株において、アモルファジエン又はファルネセンの比産生性、収率、ＣＰＩ、及び／又は力価の増加が観察されたことから、ホスホケトラーゼポリペプチドを発現している株は、対照の空プラスミド（すなわち、ホスホケトラーゼを発現しない株）を含有している株と比較して、アモルファジエン又はファルネセンの産生の増強を示す。
【０３５９】
（ｉｖ）引用文献：
Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｍａｒｓｈａｌ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｃ．Ｙ．，Ｎｏｗｒｏｏｚｉ，Ｆ．，Ｐａｒａｄｉｓｅ，Ｅ．Ｍ．，Ｐｉｔｅｒａ，Ｄ．Ｊ．，Ｎｅｗｍａｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｊ．Ｄ．，２００６．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｏｒｐｈａ−４，１１−ｄｉｅｎｅ  ｉｎ  ａ  ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９５，６８４〜６９１。
【０３６０】
Ｍａｒｔｉｎ，Ｖ．Ｊ．，Ｐｉｔｅｒａ，Ｄ．Ｊ．，Ｗｉｔｈｅｒｓ，Ｓ．Ｔ．，Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｊ．Ｄ．，２００３．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａ  ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，７９６〜８０２。
【０３６１】
実施例１２：ホスホケトラーゼを発現している組み換え宿主細胞における１５Ｌ規模でのメバロン酸（ＭＶＡ）産生
ホスホケトラーゼポリペプチドをコードしている異種遺伝子並びにメバロン酸経路由来の遺伝子を発現している大腸菌（E. coli）においてメバロン酸産生を評価し、１５Ｌ規模で流加式培養により生育させた。
【０３６２】
ＭＶＡ産生株ＳＨＧ０８６３（ＣＭＰ１０５３−ＨＭＢ  ＧＩ１．２ｇｌｔＡ  ａｔｔＢ  ｌｄｈＡ，ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ，ｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＥｆａｅｃａｌｉｓ）に、標準的なＭＶＡ産生法においてＭＶＡを産生させた。性能指数（グルコースに対するＭＶＡ産生性及びＭＶＡ収率）は、同一条件下で発現誘導し、ホスホケトラーゼポリペプチドの発現により収率が改善し得るのかを決定した試験株ＳＨＧ０８６４（ＣＭＰ１０５７−ＨＭＢ  ＧＩ１．２ｇｌｔＡ  ａｔｔＢ  ｌｄｈＡ，ｐＴｒｃＰＫＬ＿Ｌｒｅｕｔｅｒｉ，ｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＥｆａｅｃａｌｉｓ）を本明細書において比較するためのものである。
【０３６３】
方法：
培地組成（発酵培地１Ｌあたり）：
Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸（１．６ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、容量にメスアップした。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
【０３６４】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌあたり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０３６５】
ビタミン溶液（１Ｌあたり）：
チアミン塩酸塩（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０３６６】
供給溶液（１ｋｇあたり）：
グルコース（０．５９０ｋｇ）、脱イオン水（０．３９３ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）及び１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。
【０３６７】
マクロ塩溶液（１Ｌあたり）：
ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。更なる添加物は加えずに、このうち１６．８ｍＬを培養槽に直接加えた後に滅菌した。
【０３６８】
本実験は、所望の発酵ｐＨ  ７．０及び温度３４℃でのグルコースからのメバロン酸発酵をモニターするために実施した。大腸菌（E. coli）株を凍結したバイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス及び適切な抗生物質を添加した培地を入れたフラスコに接種した。
５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで接種材料を生育させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌに調整した。
【０３６９】
各バッチの培地には、グルコースを９．７ｇ／Ｌ含有させた。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し実施した。細胞のＯＤ５５０が６になったなら、２５０μＭの濃度になるようＩＰＴＧを反応槽に添加した。細胞のＯＤ５５０が１００になったなら、５００μＭの濃度になるよう２回めのＩＰＴＧを反応槽に添加した。培養によるグルコースの消費がｐＨの上昇により示されたなら、代謝に必要とされる量に足りるよう、１０ｇ／分以下の速度でグルコース供給溶液を供給した。グルコースに対するメバロン酸の最大質量収率を測定するのに十分な時間、すなわち発酵の開始から合計４８時間にわたって発酵を行った。
【０３７０】
分析：
４時間間隔でブロス試料を回収し、発酵ブロス中のメバロン酸濃度をＨＰＬＣ分析により測定した。屈折計の測定値と、予め作成した検量線とを比較して、ブロス試料中のメバロン酸濃度を測定した。
【０３７１】
ＨＰＬＣ情報：
システム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５
カラム：ＢｉｏＲａｄ−ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム３００ｍｍ×７．８ｍｍ（カタログ番号１２５−０１４０
カラム温度：５０℃
ガードカラム：詰め替え用ＢｉｏＲａｄ−Ｍｉｃｒｏｇｕａｒｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｈ（３０ｍＭ×４．６ｍＭ）カタログ番号１２５−０１２９
ランニング緩衝液：０．０１ＮのＨ２ＳＯ４；
ランニング緩衝液流速：０．６ｍＬ／分
最適流圧：約７．５〜８．２ＭＰａ（約１１００〜１２００ｐｓｉ）
注入容量：２０μＬ
検出器：屈折率（Ｋｎａｕｅｒ  Ｋ−２３０１）
実行時間：２６分
【０３７２】
結果：
ホスホケトラーゼを発現している株（ＣＭＰ１０５７）により発酵させた場合、グルコースに対するメバロン酸収率は、空プラスミド対照株（ＣＭＰ１０５３）よりも高かった。下記図１１〜１３及び表３を参照されたい。加えて、ホスホケトラーゼを発現している株（ＣＭＰ１０５７）を有する発酵ブロスでは、空プラスミドの対照株（ＣＭＰ１０５３）と比較して、発酵ブロス中の酢酸の蓄積は少なかった。図１４を参照されたい。
【０３７３】
【表３】
2019030315.tif 000007
【０３７４】
実施例１３−ホスホケトラーゼを発現しているサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）によるイソプレン産生
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの酵母発現系（コンピテントな野生型サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）（ＩＮＶＳｃ１（カタログ番号Ｃ８１０−００））及びプラスミドｐＹＥＳ２／ＣＴ（カタログ番号Ｖ８２５１−２０）を使用して、イソプレンシンターゼ、ＭＶＡ経路上流、ＭＶＡ経路下流及びホスホケトラーゼを発現させるための上記の各種遺伝子コンストラクトを調製する。
【０３７５】
イソプレンシンターゼ、ＭＶＡ経路上流、ＭＶＡ経路下流、及びホスホケトラーゼをコードしている遺伝子を最初にｐＹＥＳ２／ＣＴベクターにサブクローニングする。次に、プラスミドを大腸菌（E. coli）細胞中で増殖させる。次に、精製したプラスミドＤＮＡにより、サッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）（ＩＮＶＳｃ１）を形質転換させる。プラスミドを含有している酵母株を、２％グルコースと指定の選択マーカーを添加したＳＣ最少培地で選択及び維持する。プラスミドを含有している単離コロニーを以降の実験に備え選別する。
【０３７６】
遺伝子操作した酵母株からのイソプレンの比生産性を測定する。プラスミドのコードする遺伝子の発現を誘導するため、選択マーカーを添加した液体ＳＣ最少培地で培養物を一晩生育させた。次に培養物のＯＤ６００が約０．２になるよう希釈し、２〜３時間生育させる。１００μＬのブロスサンプルを２ｍＬヘッドスペースバイアルで３４℃で３０分インキュベートし、続いて７０℃で１２分熱殺菌する。ヘッドスペース中のイソプレン濃度を、例えば、ガスクロマトグラフ（Ｍｏｄｅｌ  Ｇ１５６２Ａ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（Ｍｅｒｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＬＣ  ＧＣ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，２８（７）：５４０〜５４３，２０１０）を連結した水素炎イオン化検出器により測定する。
【０３７７】
実施例１４：多様な各種細菌からのホスホケトラーゼ酵素のクローニング
ＡＴＣＣ１５６９７株、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）亜種のインファンティス（infantis）の染色体ＤＮＡをＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。プライマーＣＭＰ２８３：５’−ｃｔｇｔａｔＴＣＡＴＧＡｃｇａｇｔｃｃｔｇｔｔａｔｔｇｇｃａｃｃ−３’（配列番号４２）及びＣＭＰ２８４：５’−ｃｔｃｔａｔＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＣＧＴＴＧＴＣＧＣＣＡＧＣＧ−３’（配列番号４３）、並びに製造元のプロトコルに従ってポリメラーゼＨｅｒｃｕｌａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longhum）ＰＫＬ（配列番号３）をコードしている遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により染色体ＤＮＡから増幅させた。ＥｃｏＲＩ及びＢｓｐＨＩによりＰＣＲ産物を消化した後、精製した。精製後、約２５００ｂｐの断片を、ＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩにより消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にＧＥＮＥＡＲＴシームレス・クローニング・キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して組み込み、プラスミドｐＣＭＰ１０９０を生成した（配列番号１５−図６）。
【０３７８】
ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）株Ｆ２７５の染色体ＤＮＡをＡＴＣＣから得た（ＡＴＣＣ＃  ２３２７２Ｄ−５，ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））。プライマーＣＭＰ３４：５’−ｔａａｇｇａｇｇａａｔａａａｃＡＴＧＧＣＡＧＴＡＧＡＴＴＡＣＧＡＴＴＣＣＡＡＧ−３’（配列番号４４）及びＣＭＰ３３５：５’−ｔｔｃｔａｇａａａｇｃｔｔｃｇｔｔａｃｔｔａａｇａｃｃｃｔｔｃｃａａｇｔｃｃａｇ−３’（配列番号４５）、テンプレートとして１００ｎｇのＤＮＡ、並びに製造元に従ってポリメラーゼＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ））を使用して、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）（ＰＫＬ）（配列番号１）をコードしている遺伝子を増幅させた。精製後、２４４２ｂｐの断片を、ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩにより消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にＧＥＮＥＡＲＴシームレス・クローニング・キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して組み込み、プラスミドｐＣＭＰ１０２９を生成した（配列番号１６、図７）。
【０３７９】
エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）ＰＫＬアミノ酸配列をＧｅｎｅＢａｎｋから得て、大腸菌（E. coli）での発現を最適化するために、ＧｅｎｅＡｒｔの最適化ソフトウェアで加工した。ＰＫＬ遺伝子の前に２塩基対を加えてＮｃｏＩ認識部位及びＳａｃＩ認識部位を作製し、終止コドンの直後に挿入した。合成したＰＫＬ遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔカナマイシン耐性クローニングプラスミドにクローニングした。次に、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬ遺伝子（配列番号１７）を、ＢｓｐＨＩ／ＳａｃＩにより消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニングして、プラスミドｐＣＭＰ１３２１を作成した。
【０３８０】
ＡＴＣＣ２７８９３株ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）の染色体ＤＮＡをＡＴＣＣから得た（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）。プライマーＮｏｓｔｏｃｐＴｒｃＨｉｓ２ＢＦ：５’−ｔａａｇｇａｇｇａａｔａａａｃｃａｔｇａｃａｔｔａｇｃｃａｇｔｃｃｔｃｔａｃａａａｃ−３’（配列番号４６）及びＮｏｓｔｏｃｐＴｒｃＨｉｓ２ＢＲ：５’−ＴＴＣＴＡＧＡＡＡＧＣＴＴＣＧＴＴＡＡＴＡＧＧＧＣＣＡＣＴＴＣＣＡＧＴＣＡＣＧ−３’（配列番号４７）、並びに製造元のプロトコルに従ってポリメラーゼＨｅｒｃｕｌａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して、ノストック・パンクチホルム（N. punctiforme）ＰＫＬ（配列番号１８）をコードしている遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により染色体ＤＮＡから増幅させた。ＥｃｏＲＩ及びＢｓｐＨＩによりＰＣＲ産物を消化した後、精製した。精製後、約２５００ｂｐの断片を、ＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩにより消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にＧＥＮＥＡＲＴシームレス・クローニング・キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して組み込み、プラスミドｐＣＭＰ１３０５を生成した。
【０３８１】
ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９８株ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）の染色体ＤＮＡをＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。プライマーＲｐａｌｐＴｒｃＨｉｓ２ＢＦ：５’−ｔａａｇｇａｇｇａａｔａａａｃｃａｔｇｔｃｃｇａｃｇｔｇｔｔｇｔｃｃａａｃｇａｔｃ−３’（配列番号４８）及びＲｐａｌｐＴｒｃＨｉｓ２ＢＲ：５’ＴＴＣＴＡＧＡＡＡＧＣＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＣＧＡＣＣＡＧＣＧＣＣＡＧ−３’（配列番号４９）、並びに製造元のプロトコルに従ってポリメラーゼＨｅｒｃｕｌａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ロードシュードモナス・パルストリス（R. palustris）ＰＫＬ（配列番号１９）をコードしている遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により染色体ＤＮＡから増幅させた。ＥｃｏＲＩ及びＢｓｐＨＩによりＰＣＲ産物を消化した後、精製した。精製後、約２５００ｂｐの断片を、ＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩにより消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にＧＥＮＥＡＲＴシームレス・クローニング・キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して組み込み、プラスミドｐＣＭＰ１３０６を生成した。
【０３８２】
パントエア（Pantoea sp.）ＰＫＬアミノ酸配列をＧｅｎｅＢａｎｋから得て、大腸菌（E. coli）での発現を最適化するために、ＧｅｎｅＡｒｔの最適化ソフトウェアで加工した。ＰＫＬ遺伝子の前に２塩基対を加えてＮｃｏＩ認識部位及びＳａｃＩ認識部位を作製し、終止コドンの直後に挿入した。合成したＰＫＬ遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔカナマイシン耐性クローニングプラスミドにクローニングした。次に、パントエア（Pantoea sp.）ＰＫＬＰＫＬ遺伝子（配列番号２０）を、ＢｓｐＨＩ／ＳａｃＩにより消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニングして、プラスミドｐＣＭＰ１３２４を作成した。
【０３８３】
ムチラギニバクター・パルジス（Mucilaginibacter paludis）ＰＫＬアミノ酸配列をＧｅｎｅＢａｎｋから得て、大腸菌（E. coli）での発現を最適化するために、ＧｅｎｅＡｒｔの最適化ソフトウェアで加工した。ＰＫＬ遺伝子の前に２塩基対を加えてＮｃｏＩ認識部位及びＳａｃＩ認識部位を作製し、終止コドンの直後に挿入した。合成したＰＫＬ遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔカナマイシン耐性クローニングプラスミドにクローニングした。次に、ムチラギニバクター・パルジス（M. paludis）ＰＫＬ遺伝子（配列番号２１）を、ＢｓｐＨＩ／ＳａｃＩにより消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニングして、プラスミドｐＣＭＰ１３２３を作成した。
【０３８４】
サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）ＰＫＬアミノ酸配列をＧｅｎｅＢａｎｋから得て、大腸菌（E. coli）での発現を最適化するために、ＧｅｎｅＡｒｔの最適化ソフトウェアで加工した。ＰＫＬ遺伝子の前に２塩基対を加えてＮｃｏＩ認識部位及びＳａｃＩ認識部位を作製し、終止コドンの直後に挿入した。合成したＰＫＬ遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔカナマイシン耐性クローニングプラスミドにクローニングした。次に、サーモビフィダ・フスカ（T. fusca）ＰＫＬ遺伝子（配列番号２２）を、ＢｓｐＨＩ／ＳａｃＩにより消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニングして、プラスミドｐＣＭＰ１３２６を作成した。
【０３８５】
ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bfidobacterium breve）ＰＫＬアミノ酸配列をＧｅｎｅＢａｎｋから得て、大腸菌（E. coli）での発現を最適化するために、ＧｅｎｅＡｒｔの最適化ソフトウェアで加工した。ＰＫＬ遺伝子の前に２塩基対を加えてＮｃｏＩ認識部位及びＳａｃＩ認識部位を作製し、終止コドンの直後に挿入した。合成したＰＫＬ遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔカナマイシン耐性クローニングプラスミドにクローニングした。次に、ビフィドバクテリウム・ブレビ（B. breve）ＰＫＬ遺伝子（配列番号２３）を、ＢｓｐＨＩ／ＳａｃＩにより消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニングして、プラスミドｐＣＭＰ１３２２を作成した。
【０３８６】
ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）ＰＫＬアミノ酸配列をＧｅｎｅＢａｎｋから得て、大腸菌（E. coli）での発現を最適化するために、ＧｅｎｅＡｒｔの最適化ソフトウェアで加工した。ＰＫＬ遺伝子の前に２塩基対を加えてＮｃｏＩ認識部位及びＳａｃＩ認識部位を作製し、終止コドンの直後に挿入した。合成したＰＫＬ遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔカナマイシン耐性クローニングプラスミドにクローニングした。次に、ラーネラ・アクアティリス（R. aquatilis）ＰＫＬ遺伝子（配列番号２４）を、ＢｓｐＨＩ／ＳａｃＩにより消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニングして、プラスミドｐＣＭＰ１３２５を作成した。
【０３８７】
ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）ＰＫＬアミノ酸配列をＧｅｎｅＢａｎｋから得て、大腸菌（E. coli）での発現を最適化するために、ＧｅｎｅＡｒｔの最適化ソフトウェアで加工した。ＰＫＬ遺伝子の前に２塩基対を加えてＮｃｏＩ認識部位及びＳａｃＩ認識部位を作製し、終止コドンの直後に挿入した。合成したＰＫＬ遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔカナマイシン耐性クローニングプラスミドにクローニングした。次に、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）ＰＫＬ遺伝子（配列番号２５）を、ＢｓｐＨＩ／ＳａｃＩにより消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニングして、プラスミドｐＣＭＰ１３２０を作成した。
【０３８８】
ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）ＰＫＬアミノ酸配列をＧｅｎｅＢａｎｋから得て、大腸菌（E. coli）での発現を最適化するために、ＧｅｎｅＡｒｔの最適化ソフトウェアで加工した。ＰＫＬ遺伝子の前に２塩基対を加えてＮｃｏＩ認識部位及びＳａｃＩ認識部位を作製し、終止コドンの直後に挿入した。合成したＰＫＬ遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔカナマイシン耐性クローニングプラスミドにクローニングした。次に、ガードネレラ・バギナリス（G. vaginalis）ＰＫＬ遺伝子（配列番号２６）を、ＢｓｐＨＩ／ＳａｃＩにより消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニングして、プラスミドｐＣＭＰ１３０９を作成した。
【０３８９】
ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）ＰＫＬアミノ酸配列をＧｅｎｅＢａｎｋから得て、大腸菌（E. coli）での発現を最適化するために、ＧｅｎｅＡｒｔの最適化ソフトウェアで加工した。ＰＫＬ遺伝子の前に２塩基対を加えてＮｃｏＩ認識部位及びＳａｃＩ認識部位を作製し、終止コドンの直後に挿入した。合成したＰＫＬ遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔカナマイシン耐性クローニングプラスミドにクローニングした。次に、ストレプトマイセス・アベルミティリス（S. avermitilis）ＰＫＬ遺伝子（配列番号２７）を、ＢｓｐＨＩ／ＳａｃＩにより消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニングして、プラスミドｐＥＷＬ１３６２を作成した。
【０３９０】
ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９８株クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）の染色体ＤＮＡをＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。プライマーＣａｃｅｔｐＴｒｃＨｉｓＢＦ：５’−ｔａａｇｇａｇｇａａｔａａａｃｃａｔｇｃａａａｇｔａｔａａｔａｇｇａａａａｃａｔａａｇｇａｔｇａａｇｇ−３’（配列番号５０）及びＣａｃｅｔｐＴｒｃＨｉｓＢＲ：５’−ｔｔｃｔａｇａａａｇｃｔｔｃｇｔｔａｔａｃａｔｇｃｃａｃｔｇｃｃａａｔｔａｇｔｔａｔｔｔｃ−３’（配列番号５１）、並びに製造元のプロトコルに従ってポリメラーゼＨｅｒｃｕｌａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ＰＫＬ（配列番号２８）をコードしている遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により染色体ＤＮＡから増幅させた。ＥｃｏＲＩ及びＢｓｐＨＩによりＰＣＲ産物を消化した後、精製した。精製後、約２５００ｂｐの断片を、ＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩにより消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にＧＥＮＥＡＲＴシームレス・クローニング・キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して組み込み、プラスミドｐＣＭＰ１３６４を生成した。
【０３９１】
ラクトバチルス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）ＰＫＬのアミノ酸配列をＧｅｎｅＢａｎｋ及びＪｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７，１７：８２２〜８２９）から得て、大腸菌（E. coli）における発現を最適化するために最適化ソフトウェアＧｅｎｅＡｒｔにおいて加工した。合成したＰＫＬ遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔカナマイシン耐性クローニングプラスミドにクローニングした。次に、プライマーＳＭＬ＿ＮｃｏＩ＿ＰｈｏｓｐｈｏｋＬｐｌａｎｔＦ（ｔａａｇｇａｇｇａａｔａａａｃａｔｇａｃｃａｃｃｇａｔｔａｔａｇｃａｇｔｃｃ）及びｖ２ＳＭＬ＿ＥｃｏＲＩ＿ＰｈｏｓｐｈｏｋＬｐｌａｎｔＲ（ｔｔｃｔａｇａａａｇｃｔｔｃｇＴＴＡ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＣＴＧ  ＣＣ）、並びに製造元のプロトコルに従ってポリメラーゼとしてＨｅｒｃｕｌａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して、ラクトバチルス・パラプランタラム（L. paraplantarum）ＰＫＬ遺伝子（配列番号２９）を増幅した。次に、得られたＰＣＲ産物を、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）シームレス・クローニング・アンド・アセンブリ・キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して、ＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩにより消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂプラスミド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））と連結させてプラスミドｐＣＭＰ１１８４を作製した。
【０３９２】
実施例１５：ＣＭＰ１１８３、ＣＭＰ１３２８、ＣＭＰ  １３６６、ＣＭＰ１１８２、ＣＭＰ１３０８、ＣＭＰ１３０９、ＣＭＰ１３３１、ＣＭＰ１３３０、ＣＭＰ１３３３、ＣＭＰ１３２９、ＣＭＰ１１８４、及びＣＭＰ１３３２株の構築
ＣＭＰ１１３３株（ＢＬ２１，Δｐｇｌ  ＰＬ．２ｍＫＫＤｙｌ，ＧＩ１．２ｇｌｔＡ，ｙｈｆＳＦＲＴＰｙｄｄＶＩｓｐＡｙｈｆＳ，ｔｈｉＦＲＴｔｒｕｎｃＩｓｐＡ）を形質転換してＰＫＬ発現株を構築し、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有させたルリア・ベルターニプレートでコロニーを選別した。製造元により推奨されるプロトコルを用い、カナマイシンマーカーを除去して（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）記載の株を作製した（表４）。
【０３９３】
【表４】
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【０３９４】
実施例１６：多様な各種細菌から単離されたホスホケトラーゼの発現、溶解度及び酵素活性の比較
ＴｒｃＰＫＬビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）（ＣＭＰ１１８３株）、ｐＴｒｃＰＫＬエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）（ＣＭＰ１３２８株）、ｐＴｒｃＰＫＬクロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）（ＣＭＰ１３２８株）、ｐＴｒｃＰＫＬラクトバチルス・ロイテリ（L. reuteri）（ＣＭＰ１１８２株）、ｐＴｒｃＰＫＬのストック・パンクチホルム（N. punctiforme）（ＣＭＰ１３０８株）、ｐＴｒｃＰＫＬロードシュードモナス・パルストリス（R. palustris）（ＣＭＰ１３０９）、ｐＴｒｃＰＫＬパントエア（Pantaoea）（ＣＭＰ１３３１）、ｐＴｒｃＰＫＬムチラギニバクター・パルジス（M. paludis）（ＣＭＰ１３３０）、及びｐＴｒｃＰＫＬサーモビフィダ・フスカ（T. fusca）（ＣＭＰ１３３３）発現株をＬＢ培地で生育し、ＯＤ６００が約０．５の時点で２００μＭのＩＰＴＧにより発現誘導し、並びに３０℃又は３４℃の温度で４時間発現誘導した。４ｍＬの培養ブロスを３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して細胞を回収した。細胞ペレットを、０．１％  ＤＮＡａｓｅ及び０．５ｍＭのＡＥＢＳＦを添加した２ｍＬの５０ｍＭ  ＭＥＳ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ６．０）に再懸濁した。９６．５ＭＰａ（１４，０００ｐｓｉ）にて、フレンチ・プレス・セル（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）により細胞懸濁液を溶解した。次に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８０４Ｒ遠心機により、可溶化液を４℃にて１５，０００ＲＰＭで１０分遠心分離した。上清及びペレットを分離した。ペレットを溶解液（５０ｍＭ  ＭＥＳ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ６．０）緩衝液）に再懸濁した。上清及びペレットサンプルを４〜１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により分析した。ホスホケトラーゼの可溶性画分対ペレット（不溶性）画分を比較することにより溶解度を評価した。
【０３９５】
結果として、ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬ、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬ、クロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ＰＫＬ、ラクトバチルス・ロイテリ（L. reuteri）ＰＫＬ、のストック・パンクチホルム（N. punctiforme）ＰＫＬ、ロードシュードモナス・パルストリス（R. palustris）ＰＫＬ、及びサーモビフィダ・フスカ（T. fusca）ＰＫＬが、３０℃の温度にて７０％超の溶解度を有していたことが示された。パントエア（Pantaoea）ＰＫＬ及びムチラギニバクター・パルジス（M. paludis）ＰＫＬは、３４℃の温度にて約５０％増加した（表５）。
【０３９６】
【表５】
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【０３９７】
実施例１７：ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）及びエンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）から単離されたホスホケトラーゼの動態解析
以降の動態試験において使用するため、ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）由来のホスホケトラーゼ（ＰＫＬ）を精製した。ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）由来のＰＫＬを、ｐＴｒｃ  Ｈｉｓ２Ｂプラスミドを入れたＢＬ２１株（ＣＭＰ１１８３）において発現させた。細胞を、５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを添加したルリア・ベルターニ培地にて３４℃にて生育させた後、誘導を行った。２００μＭ  ＩＰＴＧによる誘導後、培地を室温の振盪器に移し、５時間置いた。４℃、１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して細胞を回収した。精製前に−８０℃にて細胞ペレットを保存した。精製に際し、ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬ細胞ペレットを２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．０）、６０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅＩに再懸濁した。フレンチ・プレス・セルを繰り返し通過させて細胞を溶解し、５０，０００ｒｐｍで３０分間、超遠心により清澄化させた。ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）由来のＰＫＬを含有している清澄化させた溶解液を、まずは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７）により平衡化させたＭｏｎｏＱ  １０／１００ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に装填し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１  Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７）までび勾配を用い溶出した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７）により平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００ＧＬ及びＭｏｎｏＱ  １０／３００ＧＬ（ｐＨ  ６．０）を使用し、５０ｍＭ  ＭＥＳ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ〜１Ｍ  ＮａＣｌの勾配を用い、更に精製した。Ａ２８０を用いビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬを定量し、１４９５５０（ベクターＮＴＩにより測定した）のモル吸光係数を求め、及びまたゲルデンシトメトリー法によっても求めた。イオン交換及びゲル濾過クロマトグラフィーを用い精製し、見かけの均一性＞９５％でＰＫＬを調製した。ヒドロキサム酸第二鉄による分析を用いＰＫＬ活性を解析するのに使用するため、ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬを含有している画分をプールした。
【０３９８】
以降の動態試験において使用するため、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）由来のホスホケトラーゼ（ＰＫＬ）を精製した。エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）由来のＰＫＬを、ｐＴｒｃ  Ｈｉｓ２Ｂプラスミドを入れたＢＬ２１株（ＣＭＰ１３２８）において発現させた。細胞を、５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを添加したＬＢ培地にて３７℃にて生育させた後、誘導を行った。２００μＭ  ＩＰＴＧによる誘導後、培地を３０℃の振盪器に移し、５時間置いた。４℃、１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して細胞を回収した。精製前に−８０℃にて細胞ペレットを保存した。精製のため、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬの細胞ペレットを５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ  ６．０）、５０ｍＭ  ＮａＣＬ、０．５ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅＩに再懸濁した。フレンチ・プレス・セルを繰り返し通過させて細胞を溶解し、５０，０００ｒｐｍで６０分間、超遠心により清澄化させた。エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）由来のＰＫＬを含有している清澄化させた溶解液を、５０ｍＭ  ＭＥＳ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ６）により平衡化したＤＥＡＥ  ＨｉＴｒａｐ  ＦＦカラムに装填し、５０ｍＭ  ＭＥＳ／１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ６）までの勾配で溶出した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＰＫＬを含有している画分をプールし、Ｇ２５脱塩カラムを用い５０ｍＭ  ＭＥＳ／５０ｍＭ  ＮａＣＬ（ｐＨ  ６．０）により脱塩した。５０ｍＭ  ＭＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣＬ（ｐＨ  ６）により平衡化したＭｏｎｏＱ  １０／１００ＧＬカラムを使用し、１Ｍ  ＮａＣｌまでの塩勾配を用い、さらなる精製を実施した。ＰＫＬを含有している画分をプールしＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析し、ベクターＮＴＩにより求められたＡ２８０モル吸光係数１３６９８０を用い定量化を行った。イオン交換及びゲル濾過クロマトグラフィーを用い精製し、見かけの均一性＞９５％でＰＫＬを調製した。ヒドロキサム酸第二鉄による分析を用いＰＫＬ活性を解析するのに使用するため、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬを含有している画分をプールした。
【０３９９】
ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬ又はエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬを含有しているプールした画分を、第二鉄ヒドロキサム酸解析を用いＰＫＬ活性について解析した。Ｌ．Ｍｅｉｌｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００１，１８３：２９２９〜２９３６  ａｎｄ  Ｆｒｅｙ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ．，２００８，３６：１２１〜１２７に記載の、スケールダウンさせたヒドロキサム酸解析を使用し、ＰＫＬの触媒活性を測定した。この非特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号９０１７）フォーマットにて、３７℃下で解析を行った。各３００μＬの反応液には、１ｍＭ  ＴＰＰ、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ  ６．０）、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ  ６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  Ｆ６Ｐ及び濃度２５０ｎＭのＰＫＬを含有させた。時点を各間隔にて設定した。反応を停止させるため、６０μＬの反応混合物と、６０μＬの２Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ  ６．５）とを混合し、室温で１０分間インキュベートした。４０μＬの１５％  ＴＣＡ、４０μＬの４Ｍ  ＨＣｌ、及び４０μＬの５％  ＦｅＣｌ３の０．１Ｍ  ＨＣｌ水溶液を使用してタンパク質を沈殿させ、ＡｃＰ検出できるようにした。次にこのサンプルを、３０００ｒｐｍで１０分遠心分離させた。上清の２００μＬのサンプルをマイクロタイタープレートに移し、プレートリーダーを使用してＡ５０５を測定した。定量化のため、１２．５〜０．２ｍＭの範囲のＡｃＰ標準曲線を作成した。飽和濃度Ｐｉ（２０ｍＭ）にて０．３ｍＭ〜２０ｍＭの範囲のＦ６Ｐ濃度を用い、ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）及びエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）由来のＰＫＬに関し、ミカエリス定数、ＫＭを求めた。２５０ｎＭ（７μｇ）の精製したビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）又は５００ｎＭ（４μｇ）のエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）のＰＫＬを添加し、反応を開始した。形成されたＡｃＰ濃度と相関した吸光度変化を５０５ｎｍにてモニターし、時間に対してプロットしてＰＫＬの反応速度を求めた。
【０４００】
飽和濃度のＰｉにてＦ６Ｐに対してビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）及びエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）のＰＫＬの、並びに飽和濃度のＰｉにてＸ５Ｐに対してエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）のＰＫＬの動態パラメータを評価した。速度定数を算出するため、反応速度をミカエリス・メンテン式に代入した（表６、図４３及び図４４）。エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）のＰＫＬは、Ｆ６Ｐ基質に対しては２．８６ｍＭ及びＸ５Ｐ基質に対しては５．８１ｍＭのＫＭを有した一方、ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）のＰＫＬは、Ｆ６Ｐ基質に対し２１．１６ｍＭと、より大きなＫＭを有した。ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）のＰＫＬのｋｃａｔは１６．６ｓ−１であり、及びエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）のＰＫＬのｋｃａｔはＦ６Ｐに対しては１．４ｓ−１であり、Ｘ５Ｐに対しては４．４ｓ−１であった。
【０４０１】
【表６】
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【０４０２】
実施例１８：ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）から単離されたホスホケトラーゼはセドヘプツロース−７−リン酸触媒活性を有する。
フルクトース６−リン酸（陽性対照）、リボース５−リン酸（陰性対照）、又はセドヘプツロース７−リン酸を単独で、又はビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ホスホケトラーゼとともに発現している細胞を生育させ、ＬＣ−ＭＳ検出により、代謝産物の産生について解析した。
【０４０３】
ＬＣ−ＭＳにより代謝産物を検出する解析から、フルクトース６−リン酸（Ｆ６Ｐ）、リボース５−リン酸（Ｒ５Ｐ）、又はセドヘプツロース７−リン酸（Ｓ７Ｐ）のみを発現している細胞においては、それぞれ代謝生成物Ｆ６Ｐ、Ｒ５Ｐ、又はＳ７Ｐが主に検出されたことが示された（図４５）。Ｒ５Ｐをビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）のホスホケトラーゼと共発現している細胞は、主に、一部のＡｃＰ産生に関してはＲ５Ｐとして保持していたことが示された。対照的に、Ｆ６Ｐをビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）のホスホケトラーゼと共発現している細胞は、Ｆ６Ｐの検出が消失し、ＡｃＰの生成が検出されることが示された（図４５）。同様に、Ｓ７Ｐをビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）のホスホケトラーゼと共発現している細胞は、Ｓ７Ｐの検出が消失し、ＡｃＰの生成が検出されることが示された（図４５）。
【０４０４】
実施例１９：ホスホケトラーゼを発現している組み換え宿主細胞による小規模におけるメバロン酸（ＭＶＡ）産生
チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（表７）をコードする遺伝子に加え、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetubutylicum）、ノストック（Nostoc）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、パントエア（Pantoea）、又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）由来のホスホケトラーゼを発現させることにより、メバロン酸（ＭＶＡ）を産生している大腸菌（E. coli）株を作製した。ホスホケトラーゼを発現しないＭＶＡ産生株を対照として使用した（表７）。小規模実験において、グルコース存在下で生育させた場合のホスホケトラーゼ発現及びメバロン酸収率を、ホスホケトラーゼを発現しない対照株と比較して、ホスホケトラーゼ発現株を選別した。
【０４０５】
【表７】
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【０４０６】
（ｉ）材料
酵母エキス及びＭｇＳＯ４を不含有の改変ＴＭ３培地の組成（発酵培地１Ｌあたり）：  Ｋ２ＨＰＯ４を１３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１３．６ｇ、クエン酸一水和物を２ｇ、クエン酸鉄アンモニウムを０．３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を３．２ｇ、１０００Ｘ微量金属溶液を１ｍＬ。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させる。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整する。０．２２μｍフィルタで培地を濾過滅菌する。ｐＨを調整及び滅菌後にグルコース１０．０ｇ及び抗菌剤を加えた。
【０４０７】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌあたり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０４０８】
（ｉｉ）実験手順
増殖速度の測定
必要に応じて抗生物質を添加したＬＢ培地を３ｍＬ入れた振盪チューブに、培養物のグリセロールストックを接種した。培養物を、３０℃にて約１５時間、２２０ｒｐｍでインキュベートした。ＴＭ３培地（ＭｇＳＯ４及び酵母エキスを不含有）、１％グルコース、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．０２％酵母エキス及び必要に応じて抗生物質を組み合わせて、追加のＴＭ３培地を調製した。最終的なＯＤ６００が０．２になるよう、４８ウェル滅菌ブロックの各ウェルに追加のＴＭ３を２ｍＬ加えた。ブロックをＢｒｅａｔｈｅ  Ｅａｓｉｅｒメンブレンによりシールし、３４℃にて２時間、６００ｒｐｍでインキュベートした。２時間生育させた後、マイクロタイタープレートにおいてＯＤ６００を測定し、各種濃度のＩＰＴＧにより細胞に発現誘導した。ＩＰＴＧによる発現誘導から４時間にわたって、１時間毎にＯＤ６００の読み取りを行った。ＯＤ６００の測定は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して行った。細胞を一晩生育させ、ＯＤ６００を測定した。
【０４０９】
グルコース測定
３００μＬの細胞培養物を９６ウェルコニカルプレートにおいて４℃にて３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、グルコースサンプルを回収した。上清を脱イオン水で１０倍希釈し、Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入したグルコースオキシダーゼ解析キットを用いグルコース濃度測定した。
【０４１０】
メバロン酸測定
３４μＬの１０％硫酸と３００μＬの細胞培養物とを組み合わせ、氷上で１０分間インキュベートし、メバロン酸サンプルを加工した。４℃にて１０分後、混合物を４℃、３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。２５０μＬの上清を９６ウェルコニカルプレートに回収し、ＨＰＬＣによるメバロン酸測定のため、Ｚｏｎｅ−Ｆｒｅｅ（商標）Ｆｉｌｍｓプレートシーラーによりシールした。グルコース消費量に対し総メバロン酸量を算出することによりメバロン酸収率を求めた。
【０４１１】
タンパク質発現解析
発現解析のため、発現誘導から４時間の時点の細胞培養全ブロスのうち５０μＬのサンプルを、５０μＬの２Ｘ  ＳＤＳサンプル緩衝液とともに９５℃で５分間ボイルし、１０μＬのサンプルを４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルに装填した。精製したホスホケトラーゼ酵素及び前染色した標準を各ゲルに加えた。ＧｅｌをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）Ｇ−２５０染色により染色し、脱イオン水で脱染色した。
【０４１２】
ホスホケトラーゼの発現及び溶解度特性解析
４ｍＬの培養ブロスを３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して細胞を回収した。細胞ペレットを、０．１％  ＤＮＡａｓｅ及び０．５ｍＭ  ＡＥＢＳＦを添加した２ｍＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．６）に再懸濁した。９６．５ＭＰａ（１４，０００ｐｓｉ）にて、フレンチ・プレス・セル（American Instrument Company）により細胞懸濁液を溶解した。次に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８０４Ｒ遠心機により、可溶化液を４℃にて１５，０００ＲＰＭで１０分遠心分離した。上清及びペレットを分離した。ペレットを溶解緩衝液に再懸濁した。ペレット及び上清の両方を調製するためにゲルサンプルを調製し、電気泳動を実施した。ｉＢｌｏｔ（登録商標）ドライ・ブロッティング・システムを使用し、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した後、１：１０，０００希釈したウサギ抗ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifido longum）ホスホケトラーゼ血清を一次抗体とし、２μｇ／ｍＬ濃度のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧを検出抗体として、製造元のプロトコルに従って免疫検出した。Ｓｔｏｒｍ  ８６０分子イメージャ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して、青色蛍光スキャナスクリーンを用い、タンパク質のバンドを検出し、ソフトウェアＩｍａｇｅＱｕａｎｔを使用してタンパク質濃度を算出した。
【０４１３】
（ｉｉｉ）結果
ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）のＰＫＬ（ＥＷＬ１３１９）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）のＰＫＬ（ＥＷＬ１３４１）、ノストック（Nostoc）のＰＫＬ（ＥＷＬ１３４４）、ロードシュードモナス・パルストリス（R. palustris）ＰＫＬ（ＥＷＬ１３４７）、パントエア（Pantoea）ＰＫＬ（ＥＷＬ１３５０）、又はサーモビフィダ・フスカ（T. fusca）ＰＫＬ（ＥＷＬ１３５３）を発現するよう遺伝子操作された大腸菌（E. coli）株によるＭＶＡ産生の解析により、発現誘導に使用するＩＰＴＧの増加と、メバロン酸収率の増加とが相関することが実証された（図４６）。ＰＫＬを発現するよう遺伝子操作された株から調製した全細胞溶解液におけるタンパク質発現の解析により、ＩＰＴＧによりタンパク質の発現が誘導されたことが示された（図４７Ａ〜Ｄ）。これらの所見により、メバロン酸収率の増加は、ホスホケトラーゼタンパク質の発現が増加した結果であることが示される。ＰＫＬを発現しないＭＶＡ産生対照株（ＣＨＬ８７５）と比較した場合のメバロン酸収率の増加は、ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬ（ＥＷＬ１３１９）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬ（ＥＷＬ１３４１）、又はクロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ＰＫＬ（ＥＷＬ１３５９）発現株においても観察された。ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬ（図４８Ａ）、ガリナラム（gallinarum）ＰＫＬ（図４９Ａ）、又はクロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ＰＫＬ（図５０Ａ）発現株におけるメバロン酸収率の増加は、ＩＰＴＧの発現誘導濃度の増加と相関した。ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬ、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬ、及びクロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）のホスホケトラーゼ発現株のメバロン酸収率は、対照株ＣＨＬ８７５により産生される最大メバロン酸収率と比較して増加していた。ＰＫＬを発現している遺伝子操作株から調製した細胞溶解液におけるタンパク質解析により、ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬ（図４８Ｂ及びＣ）、ガリナラム（gallinarum）ＰＫＬ（図４９Ｂ）、又はクロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）のＰＫＬ（図５０Ｂ）は、ＩＰＴＧによる発現誘導により発現されることが確認された。ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）のＰＫＬ発現株から単離された上清画分及びペレット画分の更なる解析により、ホスホケトラーゼは、不溶性画分（図４８Ｃ）と比較して、主に可溶性画分（図４８Ｂ）に存在することが示された。これらの結果は、メバロン酸収率の増加は、ホスホケトラーゼ発現が増加したことによる結果だという結論と一致する。
【０４１４】
実施例２０：ホスホケトラーゼを発現している組み換え宿主細胞における１５Ｌ規模でのメバロン酸（ＭＶＡ）産生
エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）（ＥＷＬ１３４１株）及びクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetubutylicum）（ＥＷＬ１３５９株）由来のホスホケトラーゼを発現しているメバロン酸（ＭＶＡ）産生株を、ホスホケトラーゼを発現しないＭＶＡ産生株（ＣＨＬ８７５株）と、１５規模の実験において比較した。グルコースに対する累積ＭＶＡ収率、グルコースに対する瞬間収率、ＭＶＡの体積産生性、ＭＶＡの比産生性及び細胞性能指数（ＣＰＩ）を測定し、解析した。
【０４１５】
（ｉ）材料
培地組成（発酵培地１Ｌあたり）：
Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸（１．６ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、容量にメスアップした。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
【０４１６】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌあたり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０４１７】
ビタミン溶液（１Ｌあたり）：
チアミン塩酸塩（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０４１８】
マクロ塩溶液（１Ｌあたり）：
ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
【０４１９】
供給溶液（１ｋｇあたり）：
グルコース（０．５９０ｋｇ）、脱イオン水（０．３９３ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）及び１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。供給溶液をオートクレーブにより処理した後、滅菌フード中で、供給ボトルに栄養塩類を添加する。滅菌後に供給溶液に添加するものは（供給溶液１ｋｇ当たり）マクロ塩溶液５．５４ｍＬ、ビタミン溶液６．５５ｍＬ、１０００Ｘ改変微量金属溶液０．８２ｍＬである。
【０４２０】
（ｉｉ）実験手順
導入されたメバロン酸経路由来の遺伝子及びエンテロコッカス・ガリナラム（E. gllinarum）（ＥＷＬ１３４１株）又はクロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）（ＥＷＬ１３５９株）のいずれかから単離されたＰＫＬを発現している改変大腸菌（E. coli）（ＢＬ２１）宿主（ＣＭＰ１１３３）によるメバロン酸（ＭＶＡ）産生を、この株を１５Ｌ規模の流加式培養において生育させることにより評価した（表９）。導入されたメバロン酸経路由来の遺伝子を発現しているもののＰＫＬ（ＣＨＬ８７５株）は発現しない改変大腸菌（E. coli）（ＢＬ２１）宿主（ＣＭＰ１１３３）と比較して、ＭＶＡ産生を比較し、ホスホケトラーゼの使用により収率が増加するかを決定した。
【０４２１】
【表８】
2019030315.tif 000012
【０４２２】
所望の発酵ｐＨ（７．０）及び温度（３４℃）にて、グルコースからのメバロン酸（ＭＶＡ）生成を求めた。各実験の開始時に、大腸菌（E. coli）（ＢＬ２１）株の適切な凍結バイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス（ＬＢ）培地及び適切な抗生物質を入れたフラスコに接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が約１．０になるまで接種材料を生育させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌに調整した。
【０４２３】
複数種の産生条件において、メバロン酸産生株に産生誘導を行った（表１０）。各バッチの培地には、グルコースを９．７ｇ／Ｌ含有させた。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し実施した。細胞のＯＤ５５０が６になったなら、記載の濃度になるよう発現誘導用のＩＰＴＧを反応槽に添加した。培養によるグルコースの消費がｐＨの上昇により示されたなら、代謝に必要とされる量に足りるよう、１０ｇ／分以下の速度でグルコース供給溶液を供給した。グルコースに対するメバロン酸の累積最大質量収率を測定するのに十分な時間、すなわち発酵の開始から合計６０〜６４時間にわたって発酵を行った。
【０４２４】
対照株（ＣＨＬ８７５）の性能指数を、実験株ＥＷＬ１３４１、ＥＷＬ１３５９のものと比較した。関連する性能指数は、グルコースに対する累積ＭＶＡ収率、グルコースに対するＭＶＡ瞬間収率、ＭＶＡの体積産生性、比ＭＶＡ産生性、及び細胞性能指数であった。実験株（ホスホケトラーゼ発現株）に、対照（ホスホケトラーゼ非発現株）と同一の条件下で発現誘導を行い、ホスホケトラーゼ酵素の使用により何らかの収率改善が生じ得るかを決定した。
【０４２５】
全体的な収率は、次式を用い算出した：
グルコースに対する収率（重量％）＝総ＭＶＡ（ｔ）／［（供給重量（０）−供給重量（ｔ）＋８３．５）＊０．５９）］，
式中、０．５９グルコース供給溶液中のグルコースの割合（重量％）であり、及び８３．５は、ｔ＝０の時点で発酵槽に供給したバッチのｇ重量である。各供給量は、独立して重量％として測定した。
【０４２６】
ＣＰＩは、次式を用い算出した：
ＣＰＩ＝総ＭＶＡ量（ｇ）／総乾燥細胞重量
【０４２７】
２種の質量分析器ｉＳＣＡＮ（ハミルトン・サンドストランド）、及びＨｉｄｅｎ  ＨＰＲ２０（Ｈｉｄｅｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）により、排出気体中の、酸素、窒素、及び二酸化炭素濃度を別個に測定した。発酵ブロス中の溶存酸素は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙにより提供された光学センサーを備えた衛生的であり滅菌可能なプローブにより測定した。４時間間隔でブロス試料にＨＰＬＣ解析を行い、発酵ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸及びメバロン酸濃度を測定した。屈折計による測定値と、濃度既知の標準を使用して予め作成した検量線とを比較して、ブロス試料中の濃度を測定した。
【０４２８】
ＨＰＬＣ情報：
システム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５
カラム：ＢｉｏＲａｄ−Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム３００ｍｍ×７．８ｍｍ（カタログ番号１２５−０１４０
カラム温度：５０℃
ガードカラム：詰め替え用ＢｉｏＲａｄ−Ｍｉｃｒｏｇｕａｒｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｈ（３０ｍｍ×４．６ｍｍ）カタログ番号１２５−０１２９
ランニング緩衝液：０．０１ＮのＨ２ＳＯ４；
ランニング緩衝液流速：０．６ｍＬ／分
最適流圧：約７．５〜８．２ＭＰａ（約１１００〜１２００ｐｓｉ）
注入容量：２０μＬ検出器：屈折率（Ｋｎａｕｅｒ  Ｋ−２３０１）
実行時間：２６分
【０４２９】
【表９】
2019030315.tif 000013
【０４３０】
（ｉｉｉ）結果
クロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ホスホケトラーゼの発現株（ＥＷＬ１３５９、実施番号２０１２１０５６、２０１２０１０５７、２０１２１０５８）は、ホスホケトラーゼ非発現株よりも（ＣＨＬ８７５、実施番号２０１２０８２１、２０１２０９７６、２０１２１０５９）グルコースに対するＭＶＡの累積収率（％）が高かった（表１１及び図５１）。少なくとも１００μＭのＩＰＴＧを槽に加えた場合に（２０１２１０５７及び２０１２１０５８）、ＭＶＡ収率の増加が顕著であった。
【０４３１】
エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ホスホケトラーゼ（ＥＷＬ１３４１、実施番号２０１２０９７７、２０１２００９７８、２０１２０９７９）の発現株は、ホスホケトラーゼ非発現株よりも（ＣＨＬ８７５、実施番号２０１２０８２１、２０１２０９７６、２０１２１０５９）グルコースに対するＭＶＡの累積収率（％）が高かった（表１１及び図５２）。少なくとも５０μＭのＩＰＴＧを槽に加えた場合に（２０１２０９７８及び２０１２０９７９）、ＭＶＡ収率の増加が顕著であった。
【０４３２】
【表１０】
2019030315.tif 000014
【０４３３】
すべての場合において、ＭＶＡ収率は、添加したＩＰＴＧ量と相関した（図５３）。直接比較するため、実施に際し１００μＭ  ＩＰＴＧを添加したところ、ホスホケトラーゼ（２０１２０９７９及び２０１２１０５７）発現株は、ホスホケトラーゼ非発現株（ＣＨＬ８７５、実施番号２０１２０１０５９）と比較して、グルコースに対するＭＶＡの累積収率が著しく高かった（表１２及び図５３）。各実施において、累積ＭＶＡ収率（いずれの場合もホスホケトラーゼを発現していた）はホスホケトラーゼ活性と良好に相関していた（表１２及び図５４）。
【０４３４】
【表１１】
2019030315.tif 000015
【０４３５】
クロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ホスホケトラーゼの発現株（ＥＷＬ１３５９、実施番号２０１２１０５７、１００μＭ  ＩＰＴＧにより発現誘導）は、ホスホケトラーゼ非発現株（ＣＨＬ８７５、実施番号２０１２１０５９、１００μＭ  ＩＰＴＧにより発現誘導）と比較して、細胞性能指数（ＭＶＡ（ｇ）／乾燥細胞重量（ｇ））がわずかに高かった。４００μＭ  ＩＰＴＧ（ＥＷＬ１３５９、実施番号２０１２１０５８）により発現誘導した場合、ＣＰＩは対照（ＣＨＬ８７５、実施番号２０１２１０５９、１００μＭ  ＩＰＴＧにより発現誘導）よりも高かった（図５５）。
【０４３６】
エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ホスホケトラーゼ（ＥＷＬ１３４１、実施番号２０１２０９７８及び２０１２０９７９、それぞれ５０μＭ及び１００μＭ  ＩＰＴＧにより発現誘導）の発現株は、ホスホケトラーゼ非発現株（ＣＨＬ８７５、実施番号２０１２０９７６、ＩＰＴＧ未処理）と比較して、細胞性能指数（ＭＶＡ（ｇ）／乾燥細胞重量（ｇ））が高かった。ＩＰＴＧを添加しなかった場合（ＥＷＬ１３４１、実施番号２０１２０９７７）、ＣＰＩは対照（ＣＨＬ８７５、実施番号２０１２０９７６、ＩＰＴＧ未処理）と比較してほんのわずかに高かった（図５６）。
【０４３７】
実施例２１：ホスホケトラーゼを発現している組み換え宿主細胞による小規模におけるイソプレン産生
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、又はクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）由来のホスホケトラーゼを発現させて、イソプレン産生大腸菌（E. coli）株を作製した。ホスホケトラーゼを発現していないイソプレン産生株を対照として使用した（表１３）。小規模実験において、グルコース存在下で生育させた場合のホスホケトラーゼ発現及びイソプレン収率を、ホスホケトラーゼを発現しない対照株と比較して、ホスホケトラーゼ発現株を選別した。
【０４３８】
ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬを発現している改変大腸菌（E. coli）（ＢＬ２１）宿主（ＭＣＭ２０６５）によりイソプレン産生株を作製し、プラスミドｐＥＷＬ１４１８（図５７）を導入することにより、ＥＷＬ１４２７株を作製した（表１３）。エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬの発現株を作製するため、プラスミドｐＥＷＬ１４２１（図５８）又はｐＥＷＬ１４３８（図５９）を改変大腸菌（E. coli）（ＢＬ２１）宿主（ＭＣＭ２０６５）に導入し、それぞれＥＷＬ１４３０株及びＥＷＬ１４４９株を生成した（表１３）。クロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ＰＫＬ発現株を作製するために、プラスミドｐＥＷＬ１４３６（図６０）及びプラスミドｐＥＷＬ１４４０（図６１）を使用して、それぞれＥＷＬ１４４６株及びＥＷＬ１４５２株を作製した（表１３）。
【０４３９】
【表１２】
2019030315.tif 000016
ｂＭＶＫはメタノコッカシド・バートニイ（M. Burtonii）メバロン酸キナーゼを意味する
ｍＭＶＫはメタノサルシナ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼを意味する
【０４４０】
（ｉ）材料
ＴＭ３培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４を１３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１３．６ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを２ｇ、クエン酸一水和物を２ｇ、クエン酸鉄アンモニウムを０．３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を３．２ｇ、酵母エキスを０．２ｇ、１０００Ｘ微量金属溶液を１ｍＬ。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させる。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整する。０．２２μｍフィルタで培地を濾過滅菌する。ｐＨを調整及び滅菌後にグルコース１０．０ｇ及び抗菌剤を加えた。
【０４４１】
酵母エキス及びＭｇＳＯ４を不含有の改変ＴＭ３培地の組成（発酵培地１Ｌあたり）：  Ｋ２ＨＰＯ４を１３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１３．６ｇ、クエン酸一水和物を２ｇ、クエン酸鉄アンモニウムを０．３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を３．２ｇ、１０００Ｘ微量金属溶液を１ｍＬ。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させる。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整する。０．２２μｍフィルタで培地を濾過滅菌する。ｐＨを調整及び滅菌後にグルコース１０．０ｇ及び抗菌剤を加えた。
【０４４２】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌあたり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０４４３】
（ｉｉ）実験手順
増殖速度の測定
必要に応じて抗生物質を添加したＬＢ培地を３ｍＬ入れた振盪チューブに、培養物のグリセロールストックを接種した。培養物を、３０℃にて約１５時間、２２０ｒｐｍでインキュベートした。ＴＭ３培地（ＭｇＳＯ４及び酵母エキスを不含有）、１％グルコース、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．０２％酵母エキス及び必要に応じて抗生物質を組み合わせて、追加のＴＭ３培地を調製した。最終的なＯＤ６００が０．２になるよう、４８ウェル滅菌ブロックの各ウェルに追加のＴＭ３を２ｍＬ加えた。ブロックをＢｒｅａｔｈｅ  Ｅａｓｉｅｒメンブレンによりシールし、３４℃にて２時間、６００ｒｐｍでインキュベートした。２時間生育させた後、マイクロタイタープレートにおいてＯＤ６００を測定し、各種濃度のＩＰＴＧにより細胞に発現誘導した。ＩＰＴＧによる発現誘導から４時間にわたって、１時間毎にＯＤ６００の読み取りを行った。ＯＤ６００の測定は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して行った。細胞を一晩生育させ、ＯＤ６００を測定した。
【０４４４】
グルコース測定
３００μＬの細胞培養物を９６ウェルコニカルプレートにおいて４℃にて３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、グルコースサンプルを回収した。上清を脱イオン水で１０倍希釈し、Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入したグルコースオキシダーゼ解析キットを用いグルコース濃度測定した。
【０４４５】
イソプレン比産生性測定
ＩＰＴＧによる発現誘導後、４時間にわたって１時間毎に１００μＬのイソプレンサンプルを９６ウェルガラスブロックに回収した。アルミホイルによりガラスブロックをシールし、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを使用し、３４℃にて、４５０ｒｐｍで振盪しながら３０分間インキュベートした。３０分後、ブロックを７０℃の水浴に２時間保持し、ガスクロマトグラフィー質量分析法を使用し、ヘッドスペース測定法において、イソプレン濃度を決定した。
【０４４６】
タンパク質発現解析
発現解析のため、発現誘導から４時間の時点の細胞培養全ブロスのうち５０μＬのサンプルを、５０μＬの２Ｘ  ＳＤＳサンプル緩衝液とともに９５℃で５分間ボイルし、１０μＬのサンプルを４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルに装填した。精製したホスホケトラーゼ酵素及び前染色した標準を各ゲルに加えた。ＧｅｌをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）Ｇ−２５０染色により染色し、脱イオン水で脱染色した。
【０４４７】
（ｉｉｉ）結果
メタノコッカシド・バートニイ（M. Burtonii）のメバロン酸キナーゼの発現存在下でビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）ＰＫＬを（ＥＷＬ１４２７株）、メタノコッカシド・バートニイ（M. Burtonii）メバロン酸キナーゼの発現存在下でエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬを（ＥＷＬ１４３０株）、又はメタノコッカシド・バートニイ（M. Burtonii）メバロン酸キナーゼの発現存在下でクロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ＰＫＬを（ＥＷＬ１４４６株）、発現するよう遺伝子操作された大腸菌（E. coli）株により、グルコースから産生されたイソプレンを、ＰＫＬを発現しない対照株（ＭＣＭ２１５８株）と比較して分析したところ、発現誘導に使用するＩＰＴＧの増加と、イソプレン収率の増加とが相関することが実証された（図６２Ａ及びＢ）。ＰＫＬを発現するよう遺伝子操作された株から調製した全細胞溶解液におけるタンパク質発現の解析により、ＩＰＴＧによりタンパク質の発現が誘導されたことが示された（図６３Ａ及びＢ）。これらの所見により、イソプレン収率の増加は、ホスホケトラーゼタンパク質の発現が増加した結果であることが示される。
【０４４８】
メタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）のメバロン酸キナーゼ発現存在下でエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬを（ＥＷＬ１４４９株）、又はメタノサルシナ・マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼの発現存在下でクロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）を（ＥＷＬ１４５２株）、発現するよう遺伝子操作された大腸菌（E. coli）株により、グルコースから産生されたイソプレンを、ＰＫＬを発現しない対照株（ＤＷ７１９株）と比較して分析したところ、発現誘導に使用するＩＰＴＧの増加と、イソプレン収率の増加とが相関することが実証された（図６４Ａ）。ＰＫＬを発現するよう遺伝子操作された株から調製した全細胞溶解液におけるタンパク質発現の解析により、ＩＰＴＧによりタンパク質の発現が誘導されたことが示された（図６４Ｂ）。
これらの所見により、イソプレン収率の増加は、ホスホケトラーゼタンパク質の発現が増加した結果であることが示される。
【０４４９】
総じてこれらの結果から、異なるメバロン酸キナーゼ遺伝子の存在下で、ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、及びクロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）などの異なる細菌から単離されたＰＫＬ遺伝子を発現する株において、グルコースからイソプレンが産生されることが実証された。
【０４５０】
実施例２２：ホスホケトラーゼを発現している組み換え宿主細胞による１５Ｌ規模におけるイソプレン産生
ビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）（ＥＷＬ１４２７株）又はエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）（ＥＷＬ１４３０株）由来のホスホケトラーゼを発現するイソプレン産生株を、ホスホケトラーゼを発現しないイソプレン産生株（ＭＣＭ２１５８株）と、１５Ｌ規模の実験において、イソプレン産生について比較した。グルコースに対する累積イソプレン収率、グルコースに対するイソプレン瞬間収率及び細胞性能指数（ＣＰＩ）を測定し、解析した。
【０４５１】
（ｉ）材料
培地組成（発酵培地１Ｌあたり）：
Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸（１．６ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、容量にメスアップした。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
【０４５２】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌあたり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０４５３】
ビタミン溶液（１Ｌあたり）：
チアミン塩酸塩（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０４５４】
マクロ塩溶液（１Ｌあたり）：
ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
【０４５５】
供給溶液（１ｋｇあたり）：
グルコース（０．５９０ｋｇ）、脱イオン水（０．３９３ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）及び１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。供給溶液をオートクレーブにより処理した後、滅菌フード中で、供給ボトルに栄養塩類を添加する。滅菌後に供給溶液に添加するものは（供給溶液１ｋｇ当たり）マクロ塩溶液５．５４ｍＬ、ビタミン溶液６．５５ｍＬ、１０００Ｘ改変微量金属溶液０．８２ｍＬである。
【０４５６】
（ｉｉ）実験手順
メバロン酸経路由来の導入遺伝子及びビフィドバクテリウム・ロングム（B. longum）（ＥＷＬ１４２７株）又はエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）（ＥＷＬ１４３０株）のいずれかから単離されたＰＫＬを発現している改変大腸菌（E. coli）（ＢＬ２１）宿主（ＭＣＭ２０６５）によるイソプレン生産を、株を１５Ｌ規模の流加式培養において生育させることにより評価した（表１４）。導入されたメバロン酸経路由来の遺伝子を発現しているもののＰＫＬ（ＭＣＭ２１５８株）は発現しない改変大腸菌（E. coli）（ＢＬ２１）宿主（ＭＣＭ２０６５）と、イソプレン産生を比較し、ホスホケトラーゼの使用により収率が増加するかを決定した。
【０４５７】
【表１３】
2019030315.tif 000017
ｂＭＶＫはメタノコッカシド・バートニイ（M. Burtonii）メバロン酸キナーゼを意味する
【０４５８】
イソプレン産生株に、標準的な産生工程において発現誘導した（表１５）。発酵ｐＨ  ７．０及び温度３４℃にて、グルコースからのイソプレン産生をモニターした。実験の開始時に、大腸菌（E. coli）（ＢＬ２１）株の凍結バイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス（ＬＢ）培地及び適切な抗生物質を入れたフラスコに接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が約１．０になるまで接種材料を生育させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌに調整した。各バッチの培地には、グルコースを９．７ｇ／Ｌ含有させた。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し実施した。細胞のＯＤ５５０が６になったなら、記載の濃度になるよう発現誘導用のＩＰＴＧを反応槽に添加した。培養によるグルコースの消費がｐＨの上昇により示されたなら、代謝に必要とされる量に足りるよう、１０ｇ／分以下の速度でグルコース供給溶液を供給した。グルコースに対するイソプレンの累積最大質量収率を測定するのに十分な時間、すなわち発酵の開始から合計６０〜６４時間にわたって発酵を行った。
【０４５９】
【表１４】
2019030315.tif 000018
【０４６０】
対照株（ＭＣＭ２１５８）の性能指数を、実験株ＥＷＬ１４２７及びＥＷＬ１４３０のものと比較した。性能指数は、グルコースに対する累積イソプレン収率、グルコースに対するイソプレン瞬間収率及び細胞性能指数（ＣＰＩ）であった。実験株（ホスホケトラーゼ発現株）に、対照（ホスホケトラーゼ非発現株）と同一の条件下で発現誘導した。
【０４６１】
次式を用い、総イソプレン収率を算出した：
グルコースに対する収率（重量％）＝総イソプレン（ｔ）／［（供給重量（０）−供給重量（ｔ）＋８３．５）＊０．５９）］，
式中、０．５９グルコース供給溶液中のグルコースの割合（重量％）であり、及び８３．５は、ｔ＝０の時点で発酵槽に供給したバッチのｇ重量である。各供給量は、独立して重量％として測定した。
【０４６２】
次式を用い、イソプレン瞬間収率を算出した：
イソプレン瞬間収率（ｇ／ｇ％）＝産生されたイソプレン（ｔ１−ｔ０）／消費されたグルコース（ｔ１−ｔ０）＊１００
【０４６３】
ＣＰＩは、次式を用い算出した：
ＣＰＩ＝総イソプレン量（ｇ）／総乾燥細胞重量
【０４６４】
２種の質量分析器ｉＳＣＡＮ（ハミルトン・サンドストランド）、及びＨｉｄｅｎ  ＨＰＲ２０（Ｈｉｄｅｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）により、排出気体中の、イソプレン、酸素、窒素、及び二酸化炭素濃度を別個に測定する。発酵ブロス中の溶存酸素は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙにより提供された光学センサーを備えた衛生的であり滅菌可能なプローブにより測定した。４時間間隔でブロス試料にＨＰＬＣ解析を行い、発酵ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸及びメバロン酸濃度を測定した。屈折計による測定値と、濃度既知の標準を使用して予め作成した検量線とを比較して、ブロス試料中の濃度を測定した。
【０４６５】
ＨＰＬＣ情報：
システム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５
カラム：ＢｉｏＲａｄ−ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム３００ｍｍ×７．８ｍｍ（カタログ番号１２５−０１４０
カラム温度：５０℃
ガードカラム：詰め替え用ＢｉｏＲａｄ−Ｍｉｃｒｏｇｕａｒｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｈ（３０ｍｍ×４．６ｍｍ）カタログ番号１２５−０１２９
ランニング緩衝液：０．０１ＮのＨ２ＳＯ４；
ランニング緩衝液流速：０．６ｍＬ／分
最適流圧：約７．５〜８．２ＭＰａ（約１１００〜１２００ｐｓｉ）
注入容量：２０μＬ
検出器：屈折率（Ｋｎａｕｅｒ  Ｋ−２３０１）
実行時間：２６分
【０４６６】
（ｉｉｉ）結果
エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ホスホケトラーゼ（ＥＷＬ１３４０、２０１２１１３６）の発現株は、ホスホケトラーゼ非発現株よりも（ＭＣＭ２１５８、２０１２１１３４）グルコースに対するイソプレンの累積収率（％）が高かった（表１６及び図６５）。エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ホスホケトラーゼ（ＥＷＬ１４３０、２０１２１１３６）発現株は、ホスホケトラーゼ非発現株（ＭＣＭ２１５８、２０１２１１３４）よりもイソプレン瞬間収率（％）が高く（表１６及び図６６）、及びより長期間にわたって高い累積収率を維持したことから累積収率が高くなった（表１６及び図６５）。ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）ホスホケトラーゼ発現株（ＥＷＬ１４２７、２０１２１１３５）は、誘導実験においてより高い瞬間収率を有していたものの（図６６）、この株は最高収率に達するまでにより長時間を要し、かつ終了時のグルコースに対するイソプレンの累積収率は、対照株（ＭＣＭ２１５８、２０１２１１３４）のものとおおよそ同一であった（表１６及び図６５）。
【０４６７】
エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ホスホケトラーゼ（ＥＷＬ１４３０、２０１２１１３６）は、ホスホケトラーゼ非発現株（ＭＣＭ２１５８、２０１２１１３４）と比較して、わずかにＣＰＩが高かった（図６７）。ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）ホスホケトラーゼ（ＥＷＬ１４２７、２０１２１１３５）発現株は、ホスホケトラーゼ非発現株（ＭＣＭ２１５８、２０１２１１３４）と比較してわずかに低いＣＰＩを有した（図６７）。最高累積収率（６０時間ＥＦＴ）は、ＣＰＩと比較した時間であった。
【０４６８】
【表１５】
2019030315.tif 000019
【０４６９】
【表１６】
2019030315.tif 000020
【０４７０】
【表１７】
2019030315.tif 000021
【０４７１】
実施例２３：１４Ｌ規模で生育させた組換え発現細胞におけるホスホケトラーゼのＩｎ  ｖｉｔｒｏ特異的活性解析
エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）（表１９及び表２１）、クロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）（表２０）、又はビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）（表２１）由来のホスホケトラーゼ（ＰＫＬ）発現株を動態試験により解析した。試料を調製する際、細胞ペレットは、１４Ｌの培養工程中に１ｍＬ培養物から得て−８０℃で保管した。１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、０．２ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ、及び０．５ｍＭのＡＥＢＳＦを添加した５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ  ６）にペレット試料を再懸濁し、ＯＤ（６００）＝２０に揃えた。ＯＤを揃えた細胞ペレットを、培養液の割合に対し４．８ＭＰａ（７００ｐｓｉ）に設定したフレンチプレスＭｉｎｉ  Ｃｅｌｌに繰り返し通過させて溶解した。次に、溶解した試料を、４℃にて１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して清澄化させた。溶解物の可溶性画分の活性解析及びタンパク質測定を実施した。０．５〜０．０５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でのＢＳＡ滴定をもとに作成した標準曲線を使用し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（バイオラッド）により総タンパク質を測定した。
【０４７２】
Ｌ．Ｍｅｉｌｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００１，１８３：２９２９〜２９３６  ａｎｄ  Ｆｒｅｙ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ．，２００８，３６：１２１〜１２７に記載の、スケールダウンさせたヒドロキサム酸解析を使用し、ＰＫＬの触媒活性を測定した。この非特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号９０１７）フォーマットにて、３７℃下で解析を行った。標準解析において、反応混合物は、５ｍＭ  Ｆ６Ｐ、１ｍＭ  ＴＰＰ、１０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ  ６）、及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭフッ化ナトリウム、８ｍＭヨードアセトアミド、及び１ｍＭ  ＤＴＴにより構成した。Ｆ６Ｐを加えて反応を開始し、インキュベート開始から３０分後に反応を停止させた。総反応容量は、通常３００μＬである（必要であればより少量を用いる）。１５〜０．２３ｍＭの範囲の濃度に関し、検量線としてＡｃＰを使用した。反応を停止させるため、６０μＬの反応混合物と、６０μＬの２Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ  ６．５）とを混合し、室温で１０分間インキュベートした。４０μＬの１５％  ＴＣＡ、４０μＬの４Ｍ  ＨＣｌ、及び４０μＬの５％  ＦｅＣｌ３の０．１Ｍ  ＨＣｌ水溶液を使用してタンパク質を沈殿させ、ＡｃＰ検出できるようにした。次にこのサンプルを、３０００ｒｐｍで１０分遠心分離させた。吸光度５０５ｎｍにてＡｃＰ生成率を測定するため、２００μＬの上清をマイクロタイタープレートに移した。
【０４７３】
【表１８】
2019030315.tif 000022
【０４７４】
【表１９】
2019030315.tif 000023
【０４７５】
【表２０】
2019030315.tif 000024
【０４７６】
エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬを保有しているＥＷＬ１３４１株によるＡｃＰ生成に関し、インビトロでの比産生性は、誘導濃度に応じ０．７５〜１．７７ｍＭ／Ｌ／時／ＯＤの範囲であった。（表２２及び図６８Ａ）。更に、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬを保有しているＥＷＬ１３４１株によるＡｃＰ生成に関し、インビトロでの比活性は、誘導濃度に応じ、７．１Ｅ−０２及び１．１Ｅ−０１μＭ／ｍｇ／分の範囲であった（表２２及び図６８Ｂ）。
【０４７７】
【表２１】
2019030315.tif 000025
【０４７８】
クロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ＰＫＬを保有しているＥＷＬ１３５９株によるＡｃＰ生成に関し、インビトロでの比産生性は、誘導濃度に応じ、７．１Ｅ−０２及び０．１２〜０．７４ｍＭ／Ｌ／時／ＯＤの範囲であった（表２３及び図６９Ａ）。更に、クロストリジウム・アセトブチリカム（C. acetobutylicum）ＰＫＬを保有しているＥＷＬ１３５９株によるＡｃＰ生成に関し、インビトロでの比活性は、誘導濃度に応じ、１．１Ｅ−０２及び７．６Ｅ−０２μＭ／ｍｇ／分の範囲であった（表２３及び図６９Ｂ）。
【０４７９】
【表２２】
2019030315.tif 000026
【０４８０】
ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）ＰＫＬを保有しているＥＷＬ１４２７株によるＡｃＰ生成に関し、インビトロでの比産生性は、誘導濃度に応じ、７．３０〜１０．０１ｍＭ／Ｌ／時／ＯＤの範囲であった。（表２３及び図７０）。エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬを保有しているＥＷＬ１４３０株によるＡｃＰ生成に関し、インビトロでの比産生性は、１００μＭ  ＩＰＴＧで誘導した場合には０．９８〜１．１３ｍＭ／Ｌ／時／ＯＤの範囲であり、２００μＭ  ＩＰＴＧで誘導した場合には１．３０〜１．３８ｍＭ／Ｌ／時／ＯＤの範囲であった（表２４及び図７０）。
【０４８１】
ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）ＰＫＬを保有しているＥＷＬ１４２７株によるＡｃＰ生成に関し、インビトロでの比活性は、１００μＭ  ＩＰＴＧで誘導した場合には７．１Ｅ−０１〜８．７Ｅ−０１μＭ／ｍｇ／分の範囲であった（表２３及び図７１）。エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）ＰＫＬを保有しているＥＷＬ１４３０株によるＡｃＰ生成に関し、インビトロでの比産生性は、１００μＭ  ＩＰＴＧで誘導した場合には８．０Ｅ−０２〜１．０Ｅ−０１μＭ／ｍｇ／分の範囲であり、２００μＭ  ＩＰＴＧで誘導した場合には１．１Ｅ−０１〜１．２Ｅ−０１μＭ／ｍｇ／分の範囲であった（表２４及び図７１）。
【０４８２】
総じて、これらの所見は、すべての株においてホスホケトラーゼ活性が存在していたことを意味する。
【０４８３】
【表２３】
2019030315.tif 000027
【０４８４】
実施例２４：イソプレンの産生に関係する宿主由来の変異を有するホスホケトラーゼ発現株の構築
上記の通りに活性ホスホケトラーゼポリペプチドを含むイソプレン産生株を更に遺伝子操作して、次の遺伝子：リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡ及び／又はｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ及び／又はｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌ  Ｂ）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ｐｐｓＡ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ及び／又はｅｕｔＤ）のうちの１つ以上の活性を向上させて、ホスホケトラーゼ経路に取り込まれる炭素量を増加させることができる（図７２）。特定の態様では、次の遺伝子、ｒｐｉＡ、ｒｐｉＢ、ｒｐｅ、ｔｋｔＡ、ｔｋｔＢ、ｔａｌＢ、ｐｐｓＡ、ｅｕｔＤ、及び／又はｐｔａの活性は、染色体上のプロモータ及び／又はｒｂｓを変更することにより増加させることができ、又はプラスミドに発現させることにより増加させることができる。一実施形態では、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡ及び／又はｒｐｉＢ）の活性は、染色体上のプロモータ及び／又はｒｂｓを変更することにより増加させることができ、又はプラスミドに発現させることにより増加させることができる。他の実施形態では、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）の活性は、染色体上のプロモータ及び／又はｒｂｓを変更することにより増加させることができ、又はプラスミドに発現させることにより増加させることができる。他の実施形態では、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ及び／又はｔｋｔＢ）の活性は、染色体上のプロモータ及び／又はｒｂｓを変更することにより増加させることができ、又はプラスミドに発現させることにより増加させることができる。更に別の実施形態では、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌ  Ｂ）の活性は、染色体上のプロモータ及び／又はｒｂｓを変更することにより増加させることができ、又はプラスミドに発現させることにより増加させることができる。他の実施形態では、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ｐｐｓＡ）の活性は、染色体上のプロモータ及び／又はｒｂｓを変更することにより増加させることができ、又はプラスミドに発現させることにより増加させることができる。更に他の実施形態では、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ及び／又はｅｕｔＤ）の活性は、染色体上のプロモータ及び／又はｒｂｓを変更することにより増加させることができ、又はプラスミドに発現させることにより増加させることができる。特定の態様では、次の遺伝子、ｒｐｉＡ、ｒｐｉＢ、ｒｐｅ、ｔｋｔＡ、ｔｋｔＢ、ｔａｌ  Ｂ、ｐｐｓＡ、ｅｕｔＤ、及び／又はｐｔａのイソ酵素は、染色体上のプロモータ及び／又はｒｂｓを変更することにより増加させることができ、又はプラスミドに発現させることにより増加させることができる。
【０４８５】
これらの株には、次の遺伝子、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、及び／又はｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｇａｐＡ及び／又はｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ及び／又はｔｋｔＢ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、及び／又はＨＰｒ（ｐｔｓＨ）のうちの１つ以上の活性が低下するよう遺伝子操作を行い、ホスホケトラーゼ経路への炭素の取り込みを増加させることができる（図７３）。一態様では、グルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードしているｚｗｆ遺伝子は、下方調節される。別の実施形態では、６−ホスホフルクトキナーゼ−１ＡをコードしているｐｆｋＡ遺伝子は、下方調節される。別の実施形態では、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素ＡをコードしているｇａｐＡ遺伝子は、下方調節される。別の実施形態では、フルクトースビスリン酸アルドラーゼをコードしているｆｂａ遺伝子は、下方調節される。更に別の実施形態では、クエン酸シンターゼをコードしているｇｌｔＡ遺伝子は、下方調節される。一実施形態では、酢酸キナーゼをコードしているａｃｋＡ遺伝子は、下方調節される。別の実施形態では、ＥＩをコードしているｐｔｓＩ遺伝子は、下方調節される。一実施形態では、ＨＰｒをコードしているｐｔｓＨ遺伝子は、下方調節される。別の実施形態では、ＥＩＩＣＢＧｌｃをコードしているｐｔｓＧ遺伝子は、下方調節される。更に別の実施形態では、ＥＩＩＡＧｌｃをコードしているｃｒｒ遺伝子は、下方調節される。ｐｔｓオペロンは、ホスホトランスフェラーゼ系の遺伝子をコードする。一部の実施形態では、株は、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）の活性が低下するよう遺伝子操作して、ホスホケトラーゼ経路への炭素の取り込みを増加させることができる。一部の実施形態では、ＰＴＳは、ｐｔｓオペロンを下方調節することにより下方調節される。特定の態様では、ＰＴＳは、下方調節され、かつグルコース輸送経路は上方調節される。グルコース輸送系は、限定するものではないが、ガラクトース（ｇａｌＰ）及びグルコキナーゼ（ｇｌｋ）遺伝を包含する。一部の実施形態では、ｐｔｓオペロンは、下方調節され、ガラクトース（ｇａｌＰ）遺伝子は上方調節され、かつグルコキナーゼ（ｇｌｋ）遺伝子は上方調節される。特定の態様では、次の遺伝子ｚｗｆ、ｐｆｋＡ、ｆｂａ、ｇａｐＡ、ａｃｋＡ、ｇｌｔＡ、ｔｋｔＡ、ｐｔｓＧ、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、及び／又はｃｒｒによりコードされるタンパク質のイソ酵素を下方調節することで、ホスホケトラーゼ経路への炭素の取り込みを増加させることができる。一部の実施形態では、ｐｆｋＢ遺伝子は下方調節される。一部の実施形態では、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素Ｂ（ｇａｐＢ）遺伝子は下方調節される。一部の実施形態では、トランスケトラーゼＢ（ｔｋｔＢ）遺伝子は下方調節される。
【０４８６】
実施例２５：宿主由来の変異を有するホスホケトラーゼ発現株による小規模でのイソプレン産生
（ｉ）材料
【０４８７】
ＴＭ３培地の組成（発酵培地１Ｌ当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４を１３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１３．６ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏを２ｇ、クエン酸一水和物を２ｇ、クエン酸鉄アンモニウムを０．３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を３．２ｇ、酵母エキスを０．２ｇ、１０００×微量金属溶液を１ｍＬ。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させる。水酸化アンモニウム（３０％）によりｐＨを６．８に調整し、及び容量を調整する。０．２２μｍフィルタで培地を濾過滅菌する。ｐＨ調整及び滅菌後にグルコース１０．０ｇ及び抗菌剤を添加する。
【０４８８】
１０００Ｘ微量金属溶液（発酵培地１Ｌ当たり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ。各成分を１成分ずつ脱イオン水に溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで３．０に調整した後、溶液を用量に調整し、０．２２μｍフィルタでフィルタ滅菌する。
【０４８９】
（ｉｉ）実験手順
ルリア・ベルターニブロス＋抗生物質で細胞を一晩生育させる。翌日、ＯＤ６００が０．１になるよう、２５０ｍＬのバッフル付き三角フラスコにおいて細胞を２０ｍＬのＴＭ３培地（５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン、２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、及び５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを含有）により希釈し、３４℃かつ２００ｒｐｍでインキュベートする。２時間生育させた後、ＯＤ６００を測定し、２００ｕＭのＩＰＴＧを加える。発酵工程の間、規則的に試料を採取する。各時点でＯＤ６００を測定する。また、ガスクロマトグラフ−マススペクトロメータ（ＧＣ−ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるヘッドスペース解析によりイソプレンのオフガス分析を行う。１００μＬの全ブロスをＧＣバイアルに入れ密閉し、３４℃かつ２００ｒｐｍで３０分間インキュベートする。７０℃で７分のインキュベーションからなる熱殺菌工程後、試料をＧＣに装填する。記録される比産生量は、イソプレン量のＧＣによる読み取り値（μｇ／Ｌ）を、インキュベート時間（３０分）及びＯＤ６００測定値で除算した値である。
【０４９０】
実施例２６：宿主由来の変異を有するホスホケトラーゼ発現株による１５Ｌ規模でのイソプレンの産生
（ｉ）材料
【０４９１】
培地組成（発酵培地１Ｌあたり）：
Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸（１．６ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、容量にメスアップした。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
【０４９２】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌあたり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０４９３】
ビタミン溶液（１Ｌあたり）：
チアミン塩酸塩（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、孔径０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌した。
【０４９４】
マクロ塩溶液（１Ｌあたり）：
ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
【０４９５】
供給溶液（１ｋｇあたり）：
グルコース（０．５９０ｋｇ）、脱イオン水（０．３９３ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．４ｇ）及び１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２（８．９ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。供給溶液をオートクレーブにより処理した後、滅菌フード中で、供給ボトルに栄養塩類を添加する。滅菌後に供給溶液に添加するものは（供給溶液１ｋｇ当たり）マクロ塩溶液５．５４ｍＬ、ビタミン溶液６．５５ｍＬ、１０００Ｘ改変微量金属溶液０．８２ｍＬである。
【０４９６】
（ｉｉ）解析
２種の質量分析器ｉＳＣＡＮ（ハミルトン・サンドストランド）、及びＨｉｄｅｎ  ＨＰＲ２０（Ｈｉｄｅｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）により、排出気体中の、イソプレン、酸素、窒素、及び二酸化炭素濃度を別個に測定した。
【０４９７】
発酵ブロス中の溶存酸素は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙにより提供された光学センサーを備えた衛生的であり滅菌可能なプローブにより測定した。
【０４９８】
４時間間隔でブロス試料にＨＰＬＣ解析を行い、発酵ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸及びメバロン酸濃度を測定する。屈折計による測定値と、濃度既知の標準を使用して予め作成した検量線とを比較して、ブロス試料中の濃度を測定する。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２８−１】
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【図２９】
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【図２９−１】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【配列表】
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