(57)【要約】      （修正有）【課題】本発明の目的は、ウイルス濃度が希薄な試料でも検出が可能となるウイルスを濃縮するための技術の提供すること。【解決手段】ウイルスの濃縮方法であって、（ａ）ウイルスを含有する試料に共沈剤を添加する工程、（ｂ）共沈剤を添加した試料に炭素数３以上の水溶性一価アルコールを添加する工程、および（ｃ）工程（ｂ）で得られた混合液からウイルスを含む沈殿を回収する工程、を包含するウイルスの濃縮方法。更に、該濃縮物を用いた核酸検出方法に関し、食品衛生検査、環境検査等に利用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスの濃縮方法であって、
（ａ）ウイルスを含有する試料に共沈剤を添加する工程、
（ｂ）共沈剤を添加した試料に炭素数３以上の水溶性一価アルコールを添加する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた混合液からウイルスを含む沈殿を回収する工程、
を包含するウイルスの濃縮方法。
【請求項２】
炭素数３以上の水溶性一価アルコールが、ノルマルプロピルアルコール又はイソプロピルアルコールであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
炭素数３以上の水溶性一価アルコールがイソプロピルアルコールであり、イソプロピルアルコールの終濃度がウイルスを含有する試料に対して４０〜６０％（ｖ／ｖ）になるように試料に添加されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
共沈剤がグルコースを構成糖とする多糖類である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
グルコースを構成糖とする多糖類が、グリコーゲン、グリコーゲンアズール、スターチ、ソリュブルスターチ、スターチアズール、アミロペクチン、アミロペクチンアンスラニレート、アミロペクチンアズール、インソリュブルアミロペクチン、ソリュブルアミロース、およびアミロースアズールからなる群より選択される少なくとも１つの多糖類である、請求項４の方法。
【請求項６】
グルコースを構成糖とする多糖類が、グリコーゲン又はその修飾物であることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）においてグリコーゲン又はその修飾物が、終濃度４０〜５００ｕｇ／ｍＬの範囲になるように試料に添加されることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）のウイルスを含有する試料が、拭き取りによる採取物の懸濁液であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項９】
拭き取りによる採取物の懸濁液の溶媒が、滅菌水、リン酸緩衝生理食塩水もしくは生理食塩水からなる群より選択される溶媒である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ウイルスの検出方法であって
（ａ）ウイルスを含有する可能性のある試料に共沈剤を添加する工程、
（ｂ）共沈剤を添加した試料に炭素数３以上の水溶性一価アルコールを添加する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた混合液から沈殿を回収する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた沈殿物に対して核酸回収法で処理する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で得られた処理物に対して核酸合成に供する工程、
を包含するウイルス検出方法。
【請求項１１】
炭素数３以上のアルコールが、ノルマルプロピルアルコール又はイソプロピルアルコールであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｄ）における核酸回収法が、沈殿物への強アルカリの添加を含む工程である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｅ）の核酸合成が逆転写反応を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｅ）における核酸合成が、ＰＣＲによることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの濃縮方法および該濃縮物を用いた核酸検出方法に関する。本発明は、食品衛生検査、環境検査等に利用できる。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を検出可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。
【０００３】
核酸増幅法を利用した検査の対象となる試料は、目的に応じて様々である。感染症原因菌の検出であれば、原因菌が存在しうる試料すなわち、尿、喀痰、糞便、血液、鼻腔液、膣分泌液などである。食品衛生検査であれば食品、あるいは食品取扱者から採取された糞便や尿、環境衛生検査であれば土壌や河川水、雨水、海水などの環境水、製造設備等の拭き取り物などである。特に特徴的な症状が発生するまでの潜伏期間がある微生物が原因の食中毒については被害拡大防止のために迅速な検査法が求められており、その場合の試料としては糞便、製造設備等の拭き取り物などになる。
【０００４】
なお核酸増幅法といえども検出限界はあり、標的核酸量が核酸増幅法の検出限界以上になるよう試料中の核酸や核酸含有物（細胞、ウイルス等）の濃縮が必要になる場合もある。上記食品衛生検査の場合、製造設備等の拭き取り物などが該当する。
【０００５】
核酸や核酸含有物の濃縮方法としては種々の方法が知られている。ウイルスの濃縮方法にも様々な手法があり、例えば、担体へのウイルスの吸着（特許文献１）、有機溶媒を用いた沈殿濃縮技術がある。有機溶媒としてはポリエチレングリコールを用いる方法（特許文献１）エチルアルコールを用いる方法（非特許文献１）などがある。
【０００６】
担体を用いる方法の場合、核酸増幅による検出を行う条件では核酸が担体に吸着する可能性もあり、基本的に担体と核酸との分離を行う必要がある。特に特許文献１の方法では陰イオン交換樹脂を用いているのでさほど塩濃度が高くない核酸増幅反応度条件下では核酸が吸着する可能性が考えられる。担体を利用しない方法ではこのような問題は特に発生しないがウイルスと共に核酸増幅反応を阻害する物質が同時に沈殿する場合は、阻害物質を除去する操作が必要となる。ちなみに特許文献１の方法では担体から溶出したウイルス含有液を更にポリエチレングリコールによる沈殿濃縮を行った後、沈殿物を対象に市販のＲＮＡ調製用製品による核酸精製が行われている。また非特許文献１の方法もエチルアルコール添加により得られた沈殿物を対象に市販のＲＮＡ調製用製品による核酸精製が行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−１２９５４８
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】船越  久司、日本食品微生物学会雑誌、３０（３），  １５６−１５９，  ２０１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ウイルス濃度が希薄な試料でも検出が可能となるウイルスを濃縮するための技術の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討した結果、試料の種類に影響されにくい、安定したウイルス濃縮方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
代表的な本願発明は以下の通りである。
［１］  ウイルスの濃縮方法であって、
（ａ）ウイルスを含有する試料に共沈剤を添加する工程、
（ｂ）共沈剤を添加した試料に炭素数３以上の水溶性一価アルコールを添加する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた混合液からウイルスを含む沈殿を回収する工程、
を包含するウイルスの濃縮方法。
［２］  炭素数３以上の水溶性一価アルコールが、ノルマルプロピルアルコール又はイソプロピルアルコールであることを特徴とする［１］記載の方法。
［３］  炭素数３以上の水溶性一価アルコールがイソプロピルアルコールであり、イソプロピルアルコールの終濃度が４０〜６０％（ｖ／ｖ）になるように試料に添加されることを特徴とする、［１］記載の方法。
［４］  共沈剤がグルコースを構成糖とする多糖類である、［１］記載の方法。
［５］  グルコースを構成糖とする多糖類が、グリコーゲン、グリコーゲンアズール、スターチ、ソリュブルスターチ、スターチアズール、アミロペクチン、アミロペクチンアンスラニレート、アミロペクチンアズール、インソリュブルアミロペクチン、ソリュブルアミロース、およびアミロースアズールからなる群より選択される少なくとも１つの多糖類である、［４］の方法。
［６］  グルコースを構成糖とする多糖類が、グリコーゲン又はその修飾物であることを特徴とする、［５］記載の方法。
［７］  工程（ａ）においてグリコーゲン又はその修飾物が、終濃度４０〜５００ｕｇ／ｍＬの範囲になるように試料に添加されることを特徴とする、［６］記載の方法。
［８］  工程（ａ）のウイルスを含有する試料が、拭き取りによる採取物の懸濁液であることを特徴とする、［１］記載の方法。
［９］  拭き取りによる採取物の懸濁液の溶媒が、滅菌水、リン酸緩衝生理食塩水もしくは生理食塩水からなる群より選択される溶媒である、［８］記載の方法。
［１０］  ウイルスの検出方法であって
（ａ）ウイルスを含有する可能性のある試料に共沈剤を添加する工程、
（ｂ）共沈剤を添加した試料に炭素数３以上の水溶性一価アルコールを添加する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた混合液から沈殿を回収する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた沈殿物に対して核酸回収法で処理する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）で得られた処理物に対して核酸合成に供する工程、
を包含するウイルス検出方法。
［１１］  炭素数３以上のアルコールが、ノルマルプロピルアルコール又はイソプロピルアルコールであることを特徴とする［１０］記載の方法。
［１２］  工程（ｄ）における核酸回収法が、沈殿物への強アルカリの添加を含む工程である、［１０］記載の方法。
［１３］  工程（ｅ）の核酸合成が逆転写反応を含む、［１０］記載の方法。
［１４］  工程（ｅ）における核酸合成が、ＰＣＲによることを特徴とする、［１０］記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、ウイルス濃度が希薄な試料でも従来の検出手段でウイルスの存在を確認することが可能となる。さらに濃縮物からの核酸抽出法によっては核酸を分離精製する際に生じる可能性のあるリスク、すなわち試料ロスやキャリーオーバーの危険性を低減することができる。特に食中毒を未然に防止するための製造設備等の拭き取り物を対象とする検査において、その効果は顕著となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】参考例１の濃縮方法の検討１（エチルアルコール沈殿とＰＥＧ沈殿）を示す。
【図２】参考例２の濃縮方法の検討２（エチルアルコール沈殿とＰＥＧ沈殿）を示す。
【図３】参考例３の拭き取りサンプルの影響を示す。
【図４】実施例１の濃縮方法の検討１（エチルアルコール沈殿とイソプロピルアルコール沈殿）を示す。
【図５】実施例２のウイルスサンプルの調製方法の比較を示す。
【図６】実施例３の拭き取りサンプルの影響を示す。
【図７】実施例４のアルコール添加後の静置時間・遠心時間の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
【００１５】
本発明の１つの態様は、共沈剤と炭素数が３以上の水溶性一価アルコールを組み合わせたウイルスの沈殿形成を特徴とするウイルスの濃縮方法である。当該アルコールは、ノルマルプロピルアルコール又はイソプロピルアルコールが好適に使用できる。
【００１６】
本発明の濃縮方法を適用する試料としては、ウイルスを含有する可能性のある試料であれば特に限定はないが、ウイルス濃度が希薄な液体の試料に特に効果的である。このような試料としては環境水（海水、河川水、湖沼水、下水、家庭排水、産業排水等）、スワブなどによる拭取り操作で得られた採取物の懸濁液が挙げられる。スワブからの懸濁液の調製法は、市販の希釈液付きスワブを使用し、希釈液に拭取り操作を行った後のスワブを入れて採取物を懸濁させる方法が一般的であるが、他の方法としてスワブの先端を切り取り、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（マッハライナーゲル社製）のカップに入れた後、適当な溶媒、例えば生理食塩水、滅菌水あるいはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等に直接懸濁した後、遠心処理による濾液の回収にて実施することもできる。拭取りの対象としては、厨房などの食品製造設備、実験設備、医療設備やトイレなどの床、壁、作業台、シンク、各種の器具・備品等が挙げられる。スワブには特に限定はなく、綿棒や拭取り試験用として市販されているスワブを使用することができる。なお下水など固形物が含まれる場合は、濃縮方法を実施する前にあらかじめ遠心処理やフィルター処理などで濁質を除去しておくのが好ましい。本発明の方法では、通常は試料ごとにウイルスの濃縮を実施するが、複数の試料を混合したうえで濃縮操作に供してもよい。多数の試料を取り扱う場合には、複数の試料をあらかじめ混合してから濃縮する方が有利な場合がある。
【００１７】
本発明の濃縮方法で対象とするウイルスに特に限定は無いが、カリシウイルス科に属するウイルス（ノロウイルス（ＮｏＶ）、サポウイルス（ＳＶ）、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）等）が挙げられる。なお、上記に挙げたネコカリシウイルス（ＦＣＶ）は、容易に培養できないヒトノロウイルス（ＨｕＮｏＶ）に代わって、消毒剤や洗浄剤の評価等に広く用いられている代替ウイルスである。
【００１８】
本発明のウイルス濃縮方法では共沈剤が併用される。共沈剤としては公知の物質、例えば水溶性高分子、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール等が用いられるが、本発明には多糖類が好ましい。多糖類は糖のみから構成されるものの他、修飾されたものも含まれる。例えばそのような修飾例としては、色素修飾が挙げられる。例えばグルコースを構成糖とする多糖類としては、グリコーゲン、スターチ、ソリュブルスターチ、アミロペクチン、インソリュブルアミロペクチン、アミロース、グリコーゲンアズール、スターチアズール、アミロペクチンアズール、アミロースアズール、アミロペクチンアンスラニレート等が挙げられる。本発明には、好ましくはグリコーゲン類（グリコーゲン及びその修飾物）が使用される。本発明には試薬として販売されているグリコーゲン類を用いることが出来る。共沈剤として試料に添加するグリコーゲン類の添加後の終濃度は例えば２０〜２，０００ｕｇ／ｍＬ。あるいは、３０〜１，０００ｕｇ／ｍＬ、好ましくは、４０〜５００ｕｇ／ｍＬ、更に好ましくは、５０〜２５０ｕｇ／ｍＬである。
また共沈剤は一定量以上、試料中に存在すればよいので、試料の液量が８００ｕＬを超える場合は、一律２００ｕｇのグリコーゲンを試料に加えてもよい。
【００１９】
有機溶媒を用いたウイルス濃縮沈殿法では、従来の水溶性有機溶媒によるタンパク濃縮沈殿法に使用されているアルコール、アセトン、アセトニトリル等が用いられているが、本発明には炭素数が３以上の水溶性一価アルコールが好ましい。炭素数が３以上の水溶性一価アルコールとしては特に限定されないが、ノルマルプロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ノルマルブチルアルコール等、又はそれらの構造異性体が好ましい。また、炭素数が３以上の水溶性一価アルコールを複数種混合して使用してもよい。さらに好ましくはノルマルプロピルアルコールあるいはイソプロピルアルコールが本発明に使用される。なお、本発明には特に断りがない限り、市販の試薬用、もしくはそれ以上の純度のアルコールを用いることが出来る。
【００２０】
本発明では炭素数が３以上の水溶性一価アルコールが共沈剤を添加された試料に添加される。前記アルコールの添加量はウイルスが沈殿する量であれば特に限定は無いが、操作の簡便さからするとできるだけ容量を増やさないことが好ましく、例えばイソプロピルアルコールの場合、共沈剤添加試料１容量に対しイソプロピルアルコール１容量程度の割合、すなわちイソプロピルアルコールの終濃度が４０〜６０％（ｖ／ｖ）、好ましくは４５〜５５％（ｖ／ｖ）となるように添加するのが効果的である。なお、非特許文献１では、「エタノールを添加し、数回転倒混和後、３０分間室温で静置した。」と記載があったが、イソプロピルアルコールを使用する本発明の方法では、イソプロピルアルコールを添加して得られた混合液の静置時間に特に限定はなく、直ちに遠心してもウイルスの回収が可能である。
【００２１】
本発明の方法では、試料に炭素数が３以上で水溶性の一価アルコールを添加して得られた混合液からウイルスを含む沈殿の回収が実施される。沈殿物と液相を分離する方法に特に限定は無く、フィルターによる固液分離や遠心力を利用した沈殿形成などが挙げられる。本発明ではとくに遠心力を利用した沈殿形成の場合、遠心力としては特に限定はないが、例えば１，０００×ｇ〜２０，０００×ｇ、あるいは、２，０００×ｇ〜１９，０００×ｇ、好ましくは、３，０００×ｇ〜１８，０００×ｇ、より好ましくは、４，０００×ｇ〜１７，０００×ｇ、更に好ましくは、５，０００×ｇ〜１６，０００×ｇ、特に好ましくは、６，０００×ｇ〜１５，０００×ｇである。また、遠心に掛かる時間も特に限定はなく、ウイルスが沈殿する適切な時間を選択すればよい。例えば、遠心の時間は０分超、１５分以下、または、０分超、１０分以下、好ましくは、０分超、５分以下である。沈殿形成後の上清の除去も特に限定は無く、傾斜法（デカンテーション）、ピペットやアスピレーターなどによる吸引除去などが挙げられる。得られた沈殿は更に風乾などにて残存する水溶性の一価アルコールを除去しても良い。こうして得られた沈殿は、試料中のウイルスの濃縮物に相当する。
【００２２】
本発明の別の態様は、上記濃縮方法を用いたウイルスの検出方法である。核酸を対象とした方法を検出に用いる場合、前記の操作で沈殿として回収された濃縮物から核酸を回収する必要がある。ここで、核酸の回収とは濃縮物中のウイルス由来の核酸を検出可能な状態とする操作を指し、ウイルス由来の核酸を分離もしくは精製する操作に限定されるものではない。核酸の回収法としては市販の核酸抽出用製品が利用できるほか、濃縮物に適切な溶液を添加して加熱処理することでウイルス由来の核酸を検出可能な状態とできる場合もある。
【００２３】
本発明では強アルカリ性の水酸化物溶液による核酸回収法が好適に利用できる。該方法は強アルカリ水酸化物溶液を本発明のウイルス濃縮方法で得られた濃縮物に添加することにより、当該濃縮物に含まれるウイルス中の核酸を核酸合成の鋳型として使用可能な状態に処理する方法である。またこの方法で処理された濃縮物は後工程の核酸合成反応に直接添加して合成を実施することが出来る。該方法で用いられる強アルカリ性の水酸化物は特に限定されないが、１族元素の水酸化物あるいは２族元素の水酸化物、あるいはそれらの混合物が好ましい。あるいは、テトラアルキルアンモニウムの水酸化物であってもよい。特に限定はされないが、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウムあるいはセシウムの水酸化物、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムあるいはラジウムの水酸化物、ユーロピウム、タリウムの水酸化物などが例示される。好ましくは、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、ＬｉＯＨ、もしくはＣａ（ＯＨ）２、またはそれらの組合せを含む。さらに好ましくはＮａＯＨである。
【００２４】
強アルカリ性の水酸化物溶液の濃度は濃縮物との混合比により適宜調整すればよいが、添加、混合後の終濃度は、例えば１０ｍＭ〜１００ｍＭ、あるいは、２０ｍＭ〜７０ｍＭ、好ましくは、３０ｍＭ〜６０ｍＭ、更に好ましくは、３０〜４０ｍＭである。混合比も特に限定されないが、濃縮物と強アルカリ性水酸化物溶液の混合比も、混合後の強アルカリ性水酸化物の終濃度を考慮して適切に選択すればよい。
【００２５】
濃縮物と強アルカリ性の水酸化物溶液の混合には、攪拌、スピンダウン、転倒混和、ピペッティングなどが用いられるが、その方法および使用容器等を限定するものではない。
【００２６】
濃縮物と強アルカリ性の水酸化物溶液とを混合して得られるアルカリ性の混合液は、加熱せずに放置した後、直接ウイルス核酸の検出操作に供することができる。この放置の工程は冷却ブロック、クラッシュアイス等を用いて、低温で作業を行うことは、放置の工程の温度条件を同一にできることから、試験の再現性を高めることに有効である。また、冷蔵庫や冷蔵室での保管を行ってもよい。
この場合の混合液の温度は０℃〜３０℃程度になる。放置の温度は、例えば０℃〜２５℃、好ましくは０℃〜２０℃、より好ましくは０℃〜１５℃、さらに好ましくは０℃〜１０℃、特に好ましくは０℃〜５℃である。
また、本工程を室温で実施することも可能である。室温とは作業員が作業しやすい環境温度をいう。好ましくは３０℃以下、より好ましくは、２５℃以下である。
アルカリ処理時間、すなわち前記の混合液を放置する時間には特に限定はないが、０〜６０分の範囲が例示される。本発明の方法においては、強アルカリ性の水酸化物溶液と混合した後、直ちに遠心操作をしてもよい。なお、検体数に応じて処理時間を適宜調整するのは当然のことである。前記の処理時間の範囲では核酸合成反応に大差ない。
【００２７】
検出対象がカリシウイルス科に属するＲＮＡウイルスの場合、以上のように処理されたアルカリ性の混合液を逆転写反応に供して、当該反応液に含有されるＲＮＡに相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成することができる。
【００２８】
核酸増幅法を利用すると微量のｃＤＮＡを検出することができる。核酸増幅法には特に限定はないが、例えばＬＡＭＰ法やＰＣＲ法を用いることができる。なお逆転写反応とＤＮＡ増幅反応を独立した反応液で行うＴｗｏ−Ｓｔｅｐ法もあるが、作業の簡略化の面では逆転写反応とＤＮＡ増幅反応が１つの反応液で可能なＯｎｅ−Ｓｔｅｐ法、例えばＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ法が好ましい。
【００２９】
逆転写反応の反応液組成の一例としては、検出すべきＲＮＡに相補的な配列を有する逆転写プライマー、塩類、デオキシリボヌクレオチド類、逆転写酵素、及び緩衝液を含むものが挙げられる。上記の塩類は、ＭｇＣｌ２やＫＣｌなどが用いられるが、適宜、他の塩類に変更しても良い。ＰＣＲの反応液組成の一例としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種一組のＰＣＲ用プライマー対、塩類、デオキシリボヌクレオチド類、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び緩衝液を含むものが挙げられる。上記の塩類は、ＭｇＣｌ２やＫＣｌなどが用いられるが、適宜、他の塩類に変更しても良い。ＲＴ−ＰＣＲ法ではｃＤＮＡ合成用プライマーとＰＣＲ用プライマー対の一方のプライマーを兼用することもできる。Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる、１反応で複数種の増幅物を得られるように複数のｃＤＮＡ合成用プライマーやＰＣＲ用プライマー対が含まれる反応の場合もある。なお反応性改善などを目的として逆転写反応液や核酸増幅反応液に添加される公知の物質を包含していても良い。反応液に添加する物質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなタンパク質、Ｔｗｅｅｎ−２０などの界面活性剤、ベタイン、酸性高分子等が例示されるが、これらに限定されるものではない。またｄＮＴＰは通常、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの４種が用いられるが、ＰＣＲ増幅物が他の核酸増幅反応の鋳型となる汚染を防止する目的でさらにｄＵＴＰを反応液に添加しても良い。この反応で得られた核酸増幅物には、ｄＵＴＰが取り込まれることになり、ウラシル含有ＤＮＡの分解活性を有するＵｒａｃｉｌ−Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｒａｓｅ（ＵＮＧ）を核酸増幅反応前に作用させることで、前記核酸増幅物を分解することができる。こうして、先に実施された反応で得られた増幅物が後の反応に混入しておこる汚染を防止することができる。
【００３０】
濃縮物を含むアルカリ性の混合液が酵素反応液（例えば逆転写反応液）へ添加される場合、前記酵素反応液の緩衝能が有効な範囲の量であれば、混合液を直接酵素反応液に添加することができる。酵素反応液のｐＨがアルカリ側に移行し、酵素活性が低下することが懸念される場合には、前記の混合液について強アルカリ性水酸化物を中和する工程を含んでいてもよい。この他、前記混合物を中和可能な物質を酵素反応液にあらかじめ添加しておく方法が例示されるが、当該方法は手順の簡略化の点でより好ましい。
【００３１】
試料に含まれていたＲＮＡ由来のｃＤＮＡを鋳型として、増幅生成されたＤＮＡ断片は、電気泳動法、融解曲線法、各種プローブ法（Ｑプローブ、スコーピオンプローブ、ハイブリプローブなど）で検出、識別することができる。また、温度昇降機能と蛍光測定機能を備えた機器であれば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、インターカレーティング色素などを用いることにより、反応中に増幅生成したＤＮＡ断片をリアルタイムに検出識別することができる。
【００３２】
本発明の一つの態様として、本発明のウイルスの濃縮方法に使用されるキットが例示される。当該キットは、本発明を特に限定するものではないが、拭取り法による採取物に含まれるウイルスを濃縮するためのキットが例示される。例えば拭取り法に使用されるスワブ、スワブで採取された採取物の懸濁液を調製するための溶媒（生理食塩水、滅菌水、ＰＢＳ等）、共沈剤を含むキットが挙げられる。炭素数３以上の水溶性一価アルコールを含むキットであってもよいが、これは使用者が準備するような構成としてもよい。
【００３３】
さらに、前記のウイルス濃縮用のキットをウイルス検出用のキットに組み合わせることもできる。特の本発明を限定するものではないが、前記のウイルス検出用のキットとしては、カリシウイルス科に属するウイルスの検出キットが例示される。このような組み合わせキットに含まれるウイルス検出用のコンポーネントとしては、濃縮されたウイルス由来の核酸を検出可能な状態とするための試薬が挙げられる。例えば、ＲＮＡウイルスを検出する場合は、目的のＲＮＡウイルス由来のＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する逆転写反応のための試薬が例示される。また、前記ｃＤＮＡ若しくはその一部を増幅する核酸増幅反応のための試薬、増幅された核酸断片を検出するための試薬が例示される。これら試薬は本発明のウイルスの検出方法について記載した試薬類の他、公知のＲＮＡ検出技術に使用されているものを利用することができる。また、目的のＲＮＡウイルスを特異的に検出するためのプライマーやプローブは、当該ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡの配列に基づいて合成することができる。
【実施例】
【００３４】
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３５】
参考例１  濃縮方法の検討１（エチルアルコール沈殿とＰＥＧ沈殿）
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）より購入したＶＲ−７８２，Ｆｅｌｉｎｅ  ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ，Ｆ−９  （Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）の原液を生理食塩水（ＮａＣｌ,１５３ｍＭ）で１／１０希釈液、及び１／１００希釈液を調製した。生理食塩水３９９μＬに、ウイルスの原液、１／１０希釈液及び１／１００希釈液１μＬをそれぞれ加えてウイルスサンプルとした。各濃度のウイルスサンプルを１組とした２群を準備し、そのそれぞれに共沈剤として２０ｍｇ／ｍＬのグリコーゲン溶液を５μＬ加えた。１群のウイルスサンプルにはエチルアルコール  ８００μＬを（エチルアルコール沈殿）、もう１群には３２％  ＰＥＧ１００００  ２００μＬ及び１．６Ｍ  ＮａＣｌ溶液  ２００μＬを（ＰＥＧ沈殿）それぞれ加えて混合し、室温で１０分間静置した。各溶液を２５℃、１５分間、１５，０００×ｇで遠心分離し、上清を除き、得られた沈殿物に、製品Ｃｏｄｅ  Ｎｏ，ＲＲ２９６Ａ  ＴａＫａＲａノロウイルスＧＩ／ＧＩＩ検出キット（高速検出用）（タカラバイオ社製）のＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＶ）  ３０μＬを添加しピペッティングで溶解させ、９０℃、３分間加熱しＲＮＡサンプルとした。これを試料とし、前記キットと下記のプライマー対、プローブを使用して、下記の反応条件でＲＴ−ＰＣＲに供し、Ｃｔ値によりウイルスＲＮＡ量を測定した。なお、ウイルス懸濁液のＮ数は２とし、核酸増幅装置には製品Ｃｏｄｅ  Ｎｏ，ＴＰ−９９０  ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩ（タカラバイオ社製）を用いた。
【００３６】
（ＦＣＶ  Ｐｒｉｍｅｒ／Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｘ）
１０μＭ    ＦＣＶ検出プライマーＦ（配列番号１）
１０μＭ    ＦＣＶ検出プライマーＲ（配列番号２）
５μＭ      ＦＣＶ検出プローブ（配列番号３）
【００３７】
（ＲＴ−ＰＣＲ用反応液）
１０μＬ    ＲＮＡサンプル
１２μＬ    ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＶ）４
１μＬ      ＦＣＶ  Ｐｒｉｍｅｒ／Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｘ
１．５μＬ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（ＮＶ）４
０．５μＬ  滅菌水
【００３８】
（反応条件）
前記反応液２５μＬを以下の温度サイクル条件で反応した。
４２℃      ５ｍｉｎ、
９５℃      ３０ｓｅｃ、
９５℃      ５ｓｅｃ−５４℃    ３０ｓｅｃを１サイクルとする４５サイクル（ＦＡＭ、ＲＯＸ、Ｃｙ５蛍光検出）
【００３９】
ＰＣＲ結果を図１に示す。図中、縦軸はＣｔ値、横軸はウイルスの沈殿方法、ならびにウイルス希釈液の希釈率を示す。以下、特に説明がなければ、グラフはＮ数２の結果を示す。図１より、エチルアルコール沈殿によりウイルスサンプルを濃縮した方が、ＰＥＧ沈殿に比べてウイルスＲＮＡが多く得られることが示され、高い回収率でウイルスを濃縮できることが分かった。これは、エチルアルコール沈殿はＰＥＧ沈殿に比べて１オーダー程度高感度にウイルスを検出できることを意味する。
【００４０】
参考例２  濃縮方法の検討２（エチルアルコール沈殿とＰＥＧ沈殿）
参考例１でウイルスサンプルの調製に使用した生理食塩水を、蒸留水又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）に代えて試験を行った。すなわち、生理食塩水、蒸留水、ＰＢＳをそれぞれ３９９μＬ用意し、ウイルスの原液１μＬを加えてウイルスサンプルを調製した以外は参考例１と同様に操作し、ウイルスＲＮＡ量を測定した。結果を図２に示す。図中、縦軸はＣｔ値を示し、横軸の水は蒸留水、生食は生理食塩水をそれぞれ示す。図２より、エチルアルコール沈殿を行った場合は、ウイルスサンプルの調製に蒸留水を使用しても、参考例１と同様にウイルスＲＮＡが多く回収されるが、ＰＢＳを使用すると得られるウイルスＲＮＡが減少することが示された。
【００４１】
参考例３  拭き取りサンプルの影響
事前に生理食塩水で湿らせたスワブ、アスクル型番，１０２２５７  滅菌綿棒Ｎｏ，１０３（オオサキメディカル社製）で、水道蛇口、流し台、冷蔵庫の扉をそれぞれ拭き取った。陰性コントロールとして拭き取らないスワブを用意した。これらのスワブの先端部分を切り取り、製品Ｃｏｄｅ  Ｎｏ，Ｕ０９８８Ａ  ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（マッハライナーゲル社製）のカップ部分に入れ、さらに生理食塩水  ６００μＬをカップに加えた。これらをボルテックスで激しく混合した後、２５℃、１分間、２０，０００×ｇで遠心分離した。得られた濾液を３００μＬずつ分割し、生理食塩水９９μＬとＦＣＶの原液を１／１０希釈した溶液１μをそれぞれに添加し、４００μＬのウイルスサンプルとして、参考例１と同様の方法でウイルスＲＮＡ量を測定した。測定結果を図３に示す。図３より、エチルアルコール沈殿によりウイルスサンプルを濃縮すると、拭き取る環境により得られるウイルスＲＮＡの量に大きな差が生じることが示された。
【００４２】
実施例１  濃縮方法の検討１（エチルアルコール沈殿とイソプロピルアルコール沈殿）
ウイルスサンプルの濃縮方法として、エチルアルコール沈殿とイソプロピルアルコール沈殿を比較した。参考例１のエチルアルコール沈殿、当該方法のエチルアルコールをイソプロピルアルコール４００μＬに置き換えたイソプロピルアルコール沈殿、の２通りの操作で沈殿物を調製した。また、沈殿物を溶解してＲＮＡサンプルを調製する際に、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＶ）に代えて、５０ｍＭ  ＮａＯＨ溶液  ３０μＬに沈殿物を溶解し、５分間室温で静置させたＲＮＡサンプルも同時に調製した。結果を図４に示す。図中、ＲＲ２９６（白色）は沈殿物をＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＶ）に溶解させた結果を示し、ＮａＯＨ（黒色）は沈殿物をＮａＯＨ溶液に溶解させた結果を示す。図４より、ウイルスサンプルをイソプロピルアルコール沈殿で濃縮した場合、イソプロピルアルコールをエチルアルコールの半量添加したが、ウイルスＲＮＡの回収量はエチルアルコール沈殿と同等であることが示された。結果として、濃縮時の液量を３分の２に抑えることができ、作業がより簡便になった。なおウイルスＲＮＡ回収量はエチルアルコール沈殿と同等であることが示された。また、ＮａＯＨ溶液でＲＮＡサンプルを調製すると、ウイルスＲＮＡが多く回収できることが示された。
【００４３】
実施例２  ウイルスサンプルの調製方法の比較
ウイルスサンプルの調製に使用した生理食塩水とリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）で試験を行った。すなわち、生理食塩水、ＰＢＳをそれぞれ３９９μＬ用意し、ウイルスの原液１μＬを加えてウイルスサンプルを調製し、イソプロピルアルコール沈殿で濃縮した場合を実施した。
ウイルスサンプル４００μＬにイソプロピルアルコール４００μＬを添加し、室温で１０分間静置した。各溶液を２５℃、１５分間、１５，０００×ｇで遠心分離し、上清を除き、５０ｍＭ  ＮａＯＨ溶液  ３０μＬに得られた沈殿物を溶解し、２分間室温で静置させたＲＮＡサンプルを調製した。これを試料とし、参考例１で使用したキットおよび条件でＲＴ−ＰＣＲに供した。
結果を図５に示す。図５より、イソプロピルアルコール沈殿により濃縮した場合は、特にＰＢＳでウイルスサンプルを調製しても生理食塩水と同様にウイルスＲＮＡを回収することができ、ウイルスサンプルを調製する溶液の影響が低減させることが示された。
【００４４】
実施例３  拭き取りサンプルの影響
参考例３で実施したエチルアルコール沈殿をイソプロピルアルコール沈殿に代えて実施した。すなわち、それぞれのウイルスサンプルにイソプロピルアルコール  ４００μＬを添加して沈殿物を調製した。これらの沈殿物を３０ｍＭ  ＮａＯＨ溶液  ３０μＬ又は４０ｍＭ  ＮａＯＨ溶液  ３０μＬに溶解し、５分間室温で静置させＲＮＡサンプルを調製した。その他の操作は参考例３と同様に行った。結果を図６に示す。図６より、イソプロピルアルコール沈殿によりウイルス濃縮し、ＮａＯＨ溶液に溶解する方法は、拭き取る環境によるウイルスＲＮＡの測定値の変化が少なく、安定してウイルスＲＮＡを測定できることが示された。
【００４５】
実施例４  イソプロピルアルコール添加後の静置時間と遠心時間の検討
ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ  Ｃｏｒｐｒａｔｉｏｎより購入した、不活性化ノロウイルス、ＣａｔａｌｏｇＮｕｍｂｅｒ：ＮＡＴＮＯＶＩ−６ＭＣ（ＮＡＴｔｒｏｌ（商標）Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩ）とＣａｔａｌｏｇＮｕｍｂｅｒ：ＮＡＴＮＯＶＩＩ−６ＭＣ（ＮＡＴｔｒｏｌ（商標）  Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩＩ）の原液を２μＬずつ取り、１６μＬの生理食塩水（ＮａＣｌ，１５３ｍＭ）に添加し、１０倍希釈液を調製後、さらに、段階的に希釈し、１０００倍希釈液と、１００００倍希釈液を調製した。生理食塩水３９９μＬに１０００倍希釈液と１００００倍希釈液、それぞれの希釈液を１μＬずつ加え、濃度の異なる２群のウイルスサンプルを調製した。２群のウイルスサンプル４００μＬに、共沈剤として２０ｍｇ／ｍＬのグリコーゲン溶液を５μＬ加えた後、イソプロピルアルコール４００μＬを添加し、数回の転倒混和後、室温２５℃で１０分静置し、１５，０００×ｇで１５分間、遠心分離したウイルスサンプル群をＡ処理群とした。一方で、イソプロピルアルコールを４００μＬ添加し、数回の転倒混和後、直ちに１５，０００×ｇで５分間、遠心分離したウイルスサンプル群をＢ処理群として調製した。Ａ処理群、Ｂ処理群の上清を除き、４２ｍＭ  ＮａＯＨ溶液  ６μＬに得られた沈殿物を溶解し、２分間、室温で静置させたＲＮＡサンプルを調製し、その全量をＴａＫａＲａノロウイルスＧＩ／ＧＩＩ検出キット（高速検出用）（タカラバイオ株式会社製ＲＲ２９６Ａ）を用いて、下記の反応条件でＲＴ−ＰＣＲに供した。なお、各ウイルスサンプル群はＮ数を３とし、平均のＣｔ値を求めた。核酸増幅装置には製品Ｃｏｄｅ  Ｎｏ，ＴＰ−９９０  ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩ（タカラバイオ社製）を用いた。
【００４６】
（ＲＴ−ＰＣＲ用反応液）
６．０μＬ  ＲＮＡサンプル
１２．０μＬ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＶ）４
１．５μＬ  ＮＶＰｒｉｍｅｒ／Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｘ４
１．５μＬ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（ＮＶ）４
４．０μＬ  滅菌水
【００４７】
（反応条件）
前記反応液２５μＬを以下の温度サイクルで反応した。なお、最初の５サイクルは蛍光検出を行っていないため、結果は５サイクルを足したＣｔ値を表記した。
４２℃  ５ｍｉｎ、
９５℃  ３０ｓｅｃ、
９５℃  ５ｓｅｃ−５６℃  ４０ｓｅｃ  ５サイクル
９０℃  ５ｓｅｃ−５６℃  ４０ｓｅｃ  ３５サイクル（ＦＡＭ、ＲＯＸ、Ｃｙ５蛍光検出）
【００４８】
測定結果を図７に示す。白棒グラフは不活性化ノロウイルス（ＧＩ／ＧＩＩ）の１０００倍希釈溶液（Ｎ＝３）と１００００倍希釈液（Ｎ＝３）をＡ処理（静置時間１０分、遠心時間１５分）したサンプル群の平均値を示す。黒棒グラフは不活性化ノロウイルス（ＧＩ／ＧＩＩ）の１０００倍希釈溶液（Ｎ＝３）と１００００倍希釈液（Ｎ＝３）を、Ｂ処理（静置時間無し、遠心時間５分）したサンプル群の平均値を示す。Ａ処理もＢ処理も測定結果は、各濃度で同等の反応性を示し、静置時間、遠心時間を短縮しても、問題ないことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、臨床検査や食品衛生管理、食品における品種の特定や遺伝子組み換えの有無の判別などを目的とした検査に用いられる。
【配列表フリーテキスト】
【００５０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１  ；  ＰＣＲ  ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＦＣＶｇｐ２−Ｆ．  
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２  ；  ＰＣＲ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＦＣＶｇｐ２−Ｒ．  
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３  ；  Ｐｒｏｂｅ  ＦＣＶＧＰ２−Ｐ．  ５’−ｅｎｄ  ｉｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ＦＡＭ  ａｎｄ  ３’−ｅｎｄ  ｉｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ＢＨＱ１．
【図１】
2019083789.tif 000002
【図２】
2019083789.tif 000003
【図３】
2019083789.tif 000004
【図４】
2019083789.tif 000005
【図５】
2019083789.tif 000006
【図６】
2019083789.tif 000007
【図７】
2019083789.tif 000008
【配列表】
2019083789000001.app