(57)【要約】      （修正有）【課題】増大した鋳型識別活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、およびポリヌクレオチド鋳型上でプライマー伸長を行うための方法の提供。【解決手段】ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体群から選択された、対応する未修飾ＤＮＡポリメラーゼ対応物と比較して増大した鋳型識別活性を有する突然変異体ＤＮＡポリメラーゼであって、突然変異体ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの７８３または７８４位に対して構造的および機能的に相同またはオルソロガスである残基位置で少なくとも１つの置換を含むＤＮＡポリメラーゼ突然変異体。プライマー伸長方法に適した条件下で、前記突然変異体ＤＮＡポリメラーゼを、ブロック型切断性プライマー、ポリヌクレオチド鋳型、ヌクレオシド三リン酸、およびＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素と接触させ、それにより伸長されたプライマーを生成することを含む、プライマー伸長を行うための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと比較して増大した鋳型識別活性を有する突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼであって、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列が、未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの残基位置７８３または７８４で少なくとも１つの置換を含む、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
増大した鋳型識別活性が、増大した３’−ミスマッチ識別および増大した３’−ヌクレオチド識別からなる群から選択される少なくとも１つの特性を含む、請求項１に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの約０．０１倍のポリメラーゼ活性と少なくとも同等のポリメラーゼ活性をさらに含む、請求項１に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
増大した鋳型識別活性が、増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約１．０である、請求項１に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
増大した鋳型識別活性が、増大した３’−ヌクレオチド識別を含み、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、定量的ＰＣＲにより、増大した３’−ヌクレオチド識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約１．０である、請求項１に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
増大した鋳型識別活性が、ｒｈＰＣＲによる増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＤＤＤＤｘブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたｒｈＰＣＲにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約１．０である、請求項１に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
増大した鋳型識別活性がｒｈＰＣＲによる増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたｒｈＰＣＲにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約０．５０である、請求項１に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
増大した鋳型識別活性が、ｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイによる増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号７６および７７からなるＲＤＤＤＤｘブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）のｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約１．０である、請求項１に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
増大した鋳型識別活性が、ｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイによる増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号７８および７９からなるＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）のｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約１．０である、請求項１に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
増大した鋳型識別活性が、ｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイによる増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号７８および７９からなるＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）のｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約５．０である、請求項１に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
増大した鋳型識別活性が、増大した低頻度対立遺伝子識別を含み、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号７８および７９からなるＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いた少なくとも３．０のΔＣｑを有するＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）のｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイにより評価される場合、増大した低頻度対立遺伝子識別が少なくとも１：１０，０００である、請求項１に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと比較して増大した鋳型識別活性を有する突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼであって、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列が、以下の選択された置換：（１）Ａ６６１Ｅ；Ｉ６６５Ｗ；Ｆ６６７Ｌ；（２）Ｖ７８３Ｆ；（３）Ｈ７８４Ｑ；または（４）Ｖ７８３Ｌ；Ｈ７８４Ｑのうちの１つを含む、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１３】
［（１）Ａ６６１Ｅ；Ｉ６６５Ｗ；Ｆ６６７Ｌ；（２）Ｖ７８３Ｆ；（３）Ｈ７８４Ｑ；または（４）Ｖ７８３Ｌ；Ｈ７８４Ｑのうちの１つだけを含むＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体に対応する、］配列番号８３、８５、８７または８９のうちの１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１２に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１４】
増大した鋳型識別活性が、増大した３’−ミスマッチ識別および増大した３’−ヌクレオチド識別からなる群から選択される少なくとも１つの特性を含む、請求項１２に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１５】
未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの約０．０２倍のポリメラーゼ活性と少なくとも同等のポリメラーゼ活性をさらに含む、請求項１２に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１６】
増大した鋳型識別活性が、増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約５．０である、請求項１２に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１７】
増大した鋳型識別活性が、増大した３’−ヌクレオチド識別を含み、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、定量的ＰＣＲにより、増大した３’−ヌクレオチド識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約３．０である、請求項１２に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１８】
増大した鋳型識別活性が、増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＤＤＤＤｘブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたｒｈＰＣＲにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約１．０である、請求項１２に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１９】
増大した鋳型識別活性が、増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、がＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたｒｈＰＣＲにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約０．６０である、請求項１２に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２０】
増大した鋳型識別活性が、ｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイによる増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号７６および７７からなるＲＤＤＤＤｘブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）のｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約１．０である、請求項１２に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２１】
増大した鋳型識別活性が、ｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイによる増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号７８および７９からなるＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）のｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約３．５である、請求項１２に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２２】
増大した鋳型識別活性が、ｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイによる増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号７８および７９からなるＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）のｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約１５．０である、請求項１２に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２３】
増大した鋳型識別活性が、増大した低頻度対立遺伝子識別を含み、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号７８および７９からなるＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いた少なくとも３．０のΔＣｑを有するＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）のｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイにより評価される場合、増大した低頻度対立遺伝子識別が少なくとも１：１０，０００である、請求項１２に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２４】
未修飾熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと比較して増大した鋳型識別活性を有する突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであって、突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列が、未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの７８３または７８４位に対してオルソロガスな残基位置で少なくとも１つの置換を含む、突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２５】
未修飾熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、サーマス・イグニテラエ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ）、サーマス・アイスランディカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ）、サーマス属種（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．）ＣＣＢ＿ＵＳ３＿ＵＦ１、サーマス・オシマイ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ）、サーマス属種ＲＬ、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＧ０．５ＪＰ１７−１６、サーマス・スコットダクツ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）、サーマス・カルドフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）、マリニサーマス・ヒドロサーマリス（Ｍａｒｉｎｉｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）ＤＳＭ  １４８８４、サーマス・フィリホルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、メイオサーマス・ティミダス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｉｍｉｄｕｓ）、デスルフォバクテリウム  サーモリソトロファム（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｕｍ）およびカルデイリネア・アエロフィラ（Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ  ａｅｒｏｐｈｉｌａ）からなる種の群から選択される、請求項２４に記載の突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２６】
増大した鋳型識別活性が、増大した３’−ミスマッチ識別および増大した３’−ヌクレオチド識別からなる群から選択される少なくとも１つの特性を含む、請求項２４に記載の突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２７】
未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの約０．０１倍のポリメラーゼ活性と少なくとも同等のポリメラーゼ活性をさらに含む、請求項２４に記載の突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２８】
増大した鋳型識別活性が、増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約１．０である、請求項２４に記載の突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２９】
増大した鋳型識別活性が、増大した３’−ヌクレオチド識別を含み、突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、定量的ＰＣＲにより、増大した３’−ヌクレオチド識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約１．０である、請求項２４に記載の突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３０】
増大した鋳型識別活性が、増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＤＤＤＤｘブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたｒｈＰＣＲにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約１．０である、請求項２４に記載の突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３１】
増大した鋳型識別活性が、ｒｈＰＣＲによる増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたｒｈＰＣＲにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約０．５０である、請求項２４に記載の突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３２】
増大した鋳型識別活性が、ｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイによる増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号７６および７７からなるＲＤＤＤＤｘブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）のｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約１．０である、請求項２４に記載の突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３３】
増大した鋳型識別活性が、ｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイによる増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号７８および７９からなるＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）のｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約１．０である、請求項２４に記載の突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３４】
増大した鋳型識別活性が、ｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイによる増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号７８および７９からなるＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）のｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約５．０である、請求項２４に記載の突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３５】
増大した鋳型識別活性が、増大した低頻度対立遺伝子識別を含み、増大した低頻度対立遺伝子識別が、配列番号７８および７９からなるＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いた少なくとも３．０のΔＣｑを有するＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）のｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイにより、少なくとも１：１０，０００である、請求項２４に記載の突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３６】
対応する未修飾ＤＮＡポリメラーゼと比較して増大した鋳型識別活性を有する突然変異体ＤＮＡポリメラーゼであって、突然変異体ＤＮＡポリメラーゼペプチドのアミノ酸配列が、未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの７８３または７８４位に対してオルソロガスな残基位置で少なくとも１つの置換を含み、突然変異体ＤＮＡポリメラーゼがＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ユウバクテリウム・シラエウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｒａｅｕｍ）、クロストリジウム・レプタム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｅｐｔｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ファクラミア・ホミニス（Ｆａｃｋｌａｍｉａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）およびバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ  １０９８７からなる種の群から選択される、突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３７】
熱安定性ポリメラーゼを含む、請求項３６に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３８】
増大した鋳型識別活性が、増大した３’−ミスマッチ識別および増大した３’−ヌクレオチド識別からなる群から選択される少なくとも１つの特性を含む、請求項３７に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３９】
少なくとも１つのアッセイ条件下で未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの約０．０１倍のポリメラーゼ活性と少なくとも同等のポリメラーゼ活性をさらに含む、請求項３７に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４０】
未修飾の非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼ対応物と比較して増大した鋳型識別活性を有する突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼであって、突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列が、未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの残基位置７８３および／または７８４に対してオルソロガスな残基位置で少なくとも１つの置換を含む、突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４１】
熱安定性ポリメラーゼを含む、請求項４０に記載の突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４２】
増大した鋳型識別活性が、増大した３’−ミスマッチ識別および増大した３’−ヌクレオチド識別からなる群から選択される少なくとも１つの特性を含む、請求項４１に記載の突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４３】
少なくとも１つのアッセイ条件下で未修飾の非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼ対応物の約０．０１倍のポリメラーゼ活性と少なくとも同等のポリメラーゼ活性をさらに含む、請求項４１に記載の突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４４】
増大した鋳型識別活性が、増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼが、対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約１．０である、請求項４１に記載の突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４５】
増大した鋳型識別活性が、増大した３’−ヌクレオチド識別を含み、突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼが、定量的ＰＣＲにより、増大した３’−ヌクレオチド識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約１．０である、請求項４１に記載の突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４６】
増大した鋳型識別活性が、ｒｈＰＣＲによる増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＤＤＤＤｘブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたｒｈＰＣＲにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約１．０である、請求項４１に記載の突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４７】
増大した鋳型識別活性がｒｈＰＣＲによる増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたｒｈＰＣＲにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約０．５０である、請求項４１に記載の突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４８】
増大した鋳型識別活性が、ｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイによる増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号７６および７７からなるＲＤＤＤＤｘブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）のｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約１．０である、請求項４１に記載の突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４９】
増大した鋳型識別活性が、ｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイによる増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼが配列番号７８および７９からなるＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）のｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約１．０である、請求項４１に記載の突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５０】
増大した鋳型識別活性が、ｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイによる増大した３’−ミスマッチ識別を含み、突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号７８および７９からなるＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いたＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）のｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイにより、増大した３’−ミスマッチ識別について評価される場合、平均ΔΔＣｑが少なくとも約５．０である、請求項４１に記載の突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５１】
増大した鋳型識別活性が、増大した低頻度対立遺伝子識別を含み、増大した低頻度対立遺伝子識別が、配列番号７８および７９からなるＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを用いて、少なくとも３．０のΔＣｑを有するＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）のｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイにより、少なくとも１：１０，０００である、請求項４１に記載の突然変異体Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５２】
請求項１、１２、２４、３７または４１に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼのいずれかをコードする組換え核酸。
【請求項５３】
プライマー伸長方法に適した条件下で、請求項１、１２、２４、３７または４１のいずれかに記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼをプライマー、ポリヌクレオチド鋳型およびヌクレオシド三リン酸と接触させ、それにより伸長されたプライマーを生成することを含む、プライマー伸長を行うための方法。
【請求項５４】
プライマーがブロック型切断性プライマーを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素をさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
プライマー伸長方法がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うための方法を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ＰＣＲを行うための方法が対立遺伝子特異的ＰＣＲを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＰＣＲを行うための方法が、１：１０，０００を超える識別のレベルで低頻度対立遺伝子を検出することを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
請求項１、１２、２４、３７または４１に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼを提供する少なくとも１つの容器を含む、伸長されたプライマーを生成するためのキット。
【請求項６０】
（ａ）プライマー伸長条件下で所定のポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズ可能なプライマーを提供する容器；（ｂ）ヌクレオシド三リン酸を提供する容器；および（ｃ）プライマー伸長に適した緩衝液を提供する容器からなる群から選択される１つ以上の追加の容器をさらに含む、請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】
（ａ）ブロック型切断性プライマーを含有する容器、および（ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を含有する容器からなる群から選択される１つ以上の追加の容器をさらに含む、請求項５９に記載のキット。
【請求項６２】
請求項１、１２、２４、３７または４１に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ポリヌクレオチド鋳型およびヌクレオシド三リン酸を含む反応混合物。
【請求項６３】
少なくとも１つのプライマーがブロック型切断性プライマーを含む、請求項６２に記載の反応混合物。
【請求項６４】
ＲＮａｓｅ  Ｈ２をさらに含む、請求項６２に記載の反応混合物。
【請求項６５】
請求項１、１２、２４、３７または４１に記載の突然変異体ＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長を行うことを含む、ｒｈＰＣＲを行うための方法。
【請求項６６】
請求項１２に記載の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長を行うことを含む、ｒｈＰＣＲを行うための方法。
【請求項６７】
（１）Ａ６６１Ｅ；Ｉ６６５Ｗ；Ｆ６６７Ｌ［配列番号８７］；（２）Ｖ７８３Ｆ［配列番号８３］；（３）Ｈ７８４Ｑ［配列番号８５］；（４）Ｖ７８３Ｌ；Ｈ７８４Ｑ［配列番号８９］；（５）Ｈ７８４Ａ［配列番号１４７］；（６）Ｈ７８４Ｓ［配列番号１４９］；（７）Ｈ７８４Ｉ［配列番号１５５］；（８）Ｈ７８４Ｔ［配列番号１５１］；（９）Ｈ７８４Ｖ［配列番号１５３］；（１０）Ｈ７８４Ｍ［配列番号１５７］；（１１）Ｈ７８４Ｆ［配列番号１５９］；または（１２）Ｈ７８４Ｙ［配列番号１６１］からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６８】
（１）Ａ６６１Ｅ；Ｉ６６５Ｗ；Ｆ６６７Ｌ［配列番号１７０］；（２）Ｖ７８３Ｆ［配列番号１７２］；（３）Ｈ７８４Ｑ［配列番号１７４］；（４）Ｖ７８３Ｌ；Ｈ７８４Ｑ［配列番号１７６］；（５）Ｈ７８４Ｓ［配列番号１７８］；または（６）Ｈ７８４Ｙ［配列番号１８０］からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼの突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年１１月１４日に出願され、「増大した鋳型識別活性を有するＤＮＡポリメラーゼ突然変異体」と題する米国仮特許出願第６１／９０４，３３５号の米国特許法１１９条に基づく優先権の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、増大したプライマーおよび／または鋳型識別活性を有する突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに遺伝子診断分析用のポリメラーゼに基づくアッセイのためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
所与の遺伝的状態を正確に診断し、遺伝が原因となった病気を予測可能に治療するための能力は、遺伝子配列情報を正確に決定するための信頼できる方法が必要である。遺伝が原因となった多数の病気は、タンパク質をコードする遺伝子内の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に関連する。癌などの、遺伝が原因となった病気に関連したＳＮＰの存在は、一又は複数の対立遺伝子（「低頻度対立遺伝子」）をコードする集団における遺伝的に改変された少数の細胞により検出することは困難であり得る。
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのポリメラーゼに基づくアッセイは、遺伝子診断および分子医学における重要な影響と広範な使用を有する。ポリメラーゼは、短いオリゴヌクレオチド（以下において「プライマー」と略記する。）の３’末端へのヌクレオチドの付加によってＤＮＡ配列を合成する。プライマーは、増幅されようとしている一本鎖配列（「鋳型」）にハイブリダイズさせる。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーの３’末端の３’−酸素と入ってくるデオキシヌクレオシド三リン酸（「ｄＮＴＰ」）との間にホスホジエステル結合の形成を触媒する。この化学反応（「プライマー伸長」）は、プライマー（例えば、新生成長ＤＮＡ鎖）にヌクレオチドを付加する。プライマー伸長は、鋳型中の塩基に相補的であるデオキシヌクレオシド三リン酸がプライマーに付加される点において塩基特異的である。ＤＮＡポリメラーゼ酵素の忠実度は非常に高く、複製されたＤＮＡ鎖に導入された突然変異率は低い；しかしながら、正確な誤り率は、異なるＤＮＡポリメラーゼ酵素間で変化し、これらの率は十分に特徴付けられている。伸長反応は、鋳型の終わりに到達するまでを繰り返され得る。
【０００５】
ＳＮＰを検出するためのポリメラーゼに基づくアッセイの大部分は、少なくとも２つの異なる基質間でポリメラーゼ酵素識別があることに依存する。第１の基質は、検出されるべき所望のＳＮＰを含む；第２の基質は、検出されるべきではない通常のヌクレオチドを含む。ポリメラーゼに基づく識別は、アッセイのための好ましいポリメラーゼ適格基質として第１の基質を提供することによって達成することができる。この識別は、第１の基質がアッセイのための単にポリメラーゼ適格基質であるという程度まで最大化することができる。
【０００６】
単に単一のヌクレオチド差を含むものなどの、最小限のヌクレオチド差を有する基質中のポリメラーゼに基づく識別を支持する条件を確立するための多くの戦略は、当該技術分野において知られている。１つの戦略は、プライマーの３’−対形成したヌクレオチドを欠損している基質上で合成を効率的に開始しないポリメラーゼの能力に依存する。対立遺伝子特異的なプライマーの設計は、３’−ヌクレオチドが、ＳＮＰ含有対立遺伝子を含む場所で相補的な塩基と完全なマッチを形成し、ＳＮＰを欠損している対立遺伝子にアニールするときにミスマッチ対形成を形成するプライマーである。ＳＮＰ含有対立遺伝子用のプライマー：鋳型は、ポリメラーゼがこのような基質からプライム合成を効率的に開始することができるため、好ましいポリメラーゼ適格基質として役立つ。これらの戦略の例は、Ｃｈｅｎら、「Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｒｏｔｏｃｏｌ，ｃｏｓｔ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ」、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊ．、３（２）：７７−９６頁（２００３）；Ｋｗｏｋら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」、Ｃｕｒｒ．Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５（２）：４３−６０頁（Ａｐｒｉｌ  ２００３）；Ｓｈｉ、「Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｇｅｎｅｓ」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２（３）：１９７−２０５頁（２００２）；およびＫｗｏｋ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、２：２３５−５８頁（２００１）に記載されている。このクラスの対立遺伝子特異的ＰＣＲプライマーの選択性を改善するための戦略は、プライマーの３’末端のヌクレオチドに隣接した（すなわち、ＳＮＰ部位に隣接した）最後から２番目の塩基で第２の突然変異を導入することである。前述と同様に、３’−末端の残基は、試料核酸（ＳＮＰ）において調べている最中の塩基にマッチまたはミスマッチのいずれかであるが、ここで、プライマーは、標的に対して２つの隣接するミスマッチ（３’−末端塩基と最後から２番目の塩基の両方）または標的に対して１つのミスマッチ（最後から２番目の塩基のみで、３’−末端塩基がマッチである。）のいずれかを有する。例えば、Ｎｅｗｔｏｎら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｙ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＤＮＡ．Ｔｈｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＲＭＳ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１７（７）：２５０３−１５頁（１９８９）を参照されたい。このクラスの対立遺伝子特異的ＰＣＲプライマーについての選択性を改善するためのさらに別の戦略は、ＤＮＡポリメラーゼが３’−末端のミスマッチからＤＮＡ合成を開始する能力を低減させる���ロックド核酸（ＬＮＡ）などのプライマーの３’−末端で化学的に修飾された核酸残基を採用することである。例えば、Ｌａｔｏｒｒａら、「ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ３’  ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＬＮＡ）ｐｒｉｍｅｒｓ」、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔ．、２２（１）：７９−８５頁（２００３）を参照されたい。
【０００７】
鋳型基質識別は、ポリメラーゼに基づくアッセイにおいて使用するための１つ以上のプライマーの第２の核酸酵素を触媒とした形成を必要とすることによって、ポリメラーゼに基づくアッセイにおいて増大させることができる。このような１つのアッセイであるリガーゼ連鎖反応アッセイにおいて、ＤＮＡリガーゼは、ＳＮＰを含む鋳型を検出するためにポリメラーゼとともに使用される。ポリメラーゼに基づくアッセイは、鋳型基質にハイブリダイズする最小の長さを有するプライマーを必要とするため、ＤＮＡリガーゼは、準最適な長さのオリゴヌクレオチドからのポリメラーゼのプライマーを生成するために使用することができる。このアッセイは、ＳＮＰ多型部位全体で直接的に２つのプローブをハイブリダイズすることに依存し、それにより、プローブが標的ＤＮＡと同一である場合、ライゲーションが起こり得る。２つのプローブを設計する：３’塩基がＳＮＰヌクレオチド全体で直接的に位置付けられるように、標的ＤＮＡにハイブリダイズする対立遺伝子特異的プローブ、およびライゲーション反応のために５’末端を与えるＳＮＰ多型部位の相補鎖の下流において鋳型にハイブリダイズする第２のプローブ。対立遺伝子特異的プローブが標的ＤＮＡとマッチする場合、それは、標的ＤＮＡに完全にハイブリダイズし、ライゲーションが起こり得る。ライゲーションは、一般的に、ミスマッチの３’−塩基の存在下では起こらない。オリゴヌクレオチド産物が形成されると、それは、ポリメラーゼに基づくアッセイのためのプライマーとしてまたは鋳型として役立ち得る。この戦略の例は、Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｃｌｏｎｅｄ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ｌｉｇａｓｅ．」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、１９９１  Ｊａｎ、１；８８（１）：１８９−９３頁、およびＷｉｅｄｍａｎｎ  Ｍ．、Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗ．Ｊ．、Ｃｚａｊｋａ  Ｊ．、Ｌｕｏ  Ｊ．、Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．、Ｂａｔｔ  Ｃ．Ａ．、「Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）−−ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １９９４  Ｆｅｂ；３（４）：Ｓ５１−６４頁に記載されている。
【０００８】
ポリメラーゼ適格基質は、当該技術分野において知られている別の戦略である、プライマー上の利用可能な３’−ヒドロキシル基を有するプライマー：鋳型を必要とするため、ＲＮａｓｅ  Ｈに基づくＰＣＲ（ｒｈＰＣＲ）はポリメラーゼに基づく識別を改善させるために使用され得る。ｒｈＰＣＲ法は、３’−ヒドロキシル基を欠損しているプライマー（「ブロック型プライマー」）、または他には機能せず、ＰＣＲを支持することができないプライマーを、ＰＣＲを支持することができる３’−ヒドロキシル基を含有するプライマー（「非ブロック型プライマー」）に変換するために、ＲＮアーゼＨ酵素を利用する。ｒｈＰＣＲにおけるブロック型プライマーは、切断部位として機能する、オリゴヌクレオチドおよび内部ＲＮＡ残基のプライミングまたは鋳型機能のいずれかを妨げるブロック型３’−末端または他の修飾を有するオリゴヌクレオチドを含む。タイプＩＩのＲＮａｓｅ  Ｈは、これらのブロック型プライマーを含有する、アニーリングされたプライマー：鋳型二重鎖を認識し、ＲＮＡ残基のプライマー鎖５’を切断して、隣接するＤＡＮ残基で３’−ヒドロキシル基を生じさせる。ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素は、ミスマッチ部位で対形成しないＲＮＡ残基を含有する基質を切断しないため、対立遺伝子特異的な鋳型識別は、選択された対立遺伝子鋳型上のＳＮＰに相補的な位置でＲＮＡ残基を配置することによって達成することができる。得られたタイプＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ切断産物は、ポリメラーゼ適格基質として機能し得る。この酵素切断戦略、類似したＲＮａｓｅ  Ｈ戦略、およびプライマー伸長をブロックしまたは鋳型機能を阻害して、それによりＰＣＲを機能させなくさせる方法は、「ＰＯＬＹＮＯＭＩＡＬ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ」と題するＢｅｈｌｋｅらによる米国特許第７，１１２，４０６号；「ＣＯＮＴＩＮＯＵＳ  ＦＬＵＯＲＯＭＥＴＲＩＣ  ＡＳＳＡＹ  ＦＯＲ  ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＣＬＥＡＶＡＧＥ」と題するＨａｎらによる米国特許第５，７６３，１８１号；「ＭＥＴＨＯＤ  ＯＦ  ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＰＯＬＹＭＯＲＰＨＩＳＭ」と題するＳａｇａｗａらによる米国特許第７，１３５，２９１号；「ＤＵＡＬ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ  ＰＲＩＭＥＲＳ  ＦＯＲ  ＡＭＰＬＩＦＹＩＮＧ  ＤＮＡ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＥ」と題するＢｅｈｌｋｅとＷａｌｄｅｒによる米国特許出願第２００９００６８６４３号；および「ＲＮＡＳＥ  Ｈ−ＢＡＳＥＤ  ＡＳＳＡＹＳ  ＵＴＩＬＩＺＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＲＮＡ  ＭＯＮＯＭＥＲＳ」と題するＷａｌｄｅｒらによる米国特許出願第２０１００１６７３５３号に記載されている。
【０００９】
この領域は、遺伝的差異および低頻度対立遺伝子の検出を向上させるために、上記で例示したものなどの基質に基づくアプローチに焦点を当てている。今のところ、ポリメラーゼに基づくアッセイの感受性は、所望の鋳型とは無関係に異所性または異常なプライマー関連伸長産物から生じる非特異的増幅産物の形成によって制限された状態である。ポリメラーゼの固有の反応性は、増幅中にこのような人工物の生成に大きな原因となっているようである。
【００１０】
したがって、ミスマッチ識別における任意の更なる改善は、記載された戦略の１つ以上を用いて使用される場合、本質的により良好な３’−ヌクレオチド識別に恵まれている、修飾されたポリメラーゼ酵素を必要とする場合がある。未修飾形態とは異なる活性を有する修飾されたポリメラーゼ酵素は、タンパク質の化学的もしくは酵素的修飾、またはタンパク質をコードする対応遺伝子の突然変異誘発によって調製することができる。一般的に、後者のアプローチが好ましく、これは、所与の突然変異体タンパク質をコードする遺伝的に改変された遺伝子が、安定に維持され、発現されおよび精製されて、十分に特徴付けられた特性を有する酵素調製物を得ることができるという事実のためである。
【００１１】
不偏の突然変異誘発戦略は、突然変異体ポリメラーゼ遺伝子のライブラリーを生成するために使用することができるが、このアプローチはある種の欠点を有する。何百万もの突然変異体酵素は、活性についてスクリーニングされなければならず、成功は、多くの場合、効果的な突然変異がランダム突然変異誘発によって生成された限られたプール内に存在しているという可能性に依存している。直接的な遺伝的選択方法は、本質的なポリメラーゼ活性の他にある第２の機能に関連する突然変異を同定するには十分な感受性ではない。陽性選択アッセイにおける突然変異体ポリメラーゼ遺伝子の大半は、おそらく、通常のポリメラーゼ酵素の機能的属性を保持しているタンパク質をコードする。したがって、生化学的アッセイを使用する二次的スクリーニング手順は、任意の突然変異体ポリメラーゼが所望の活性を有するか否かを同定するために行わなければならない。初期の選択プロセスを設定するための技術的困難性にもかかわらず、１００を超えるクローンを精製し、アッセイする必要がある場合、生化学的アッセイを使用した二次的スクリーニングの実施に関連した付随費用は高額である。
【００１２】
別のアプローチは、機能に関与する遺伝子の予め選択された領域を特異的に標的とされる偏った突然変異誘発戦略を適用することである。このアプローチでは、最初に選択方法により遺伝子領域を同定する。１つのこのような選択方法は、多様な起源の生物に必要とされる特定の遺伝子の比較系統発生分析である。比較系統発生分析の原理は、多様な生物が、本質的なタンパク質機能に関連する理由で進化抑制されない場合に、本質的な遺伝子においてタンパク質コード配列を共有しないという仮説を前提としている。
【００１３】
ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の系統学的比較分析は、ポリメラーゼ機能に重要な可能性アミノ酸残基についての洞察を提供することができる。ＤＮＡポリメラーゼの全体的な折りたたみパターンは、ヒトの右手に似て、手のひら、指および親指の３つの異なるサブドメインが含まれる。（例えば、Ｂｅｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：３５２−３５５頁、１９９３；Ｐａｔｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：５３５１−５３６３頁、１９９５を参照されたい。）。指と親指サブドメインの構造は、大きさおよび細胞機能において異なるポリメラーゼ間で大きく変化するが、触媒的な手のひらサブドメインは全て重ね合わせることができる。例えば、モチーフＡは、入ってくるｄＮＴＰと相互作用し、化学触媒反応中に遷移状態を安定化するが、哺乳動物ｐｏｌαおよび原核生物ｐｏｌＩファミリーＤＮＡポリメラーゼ中で約１オングストロームの平均偏差の平方根で重ね合わせることができる（Ｗａｎｇら、Ｃｅｌｌ  ８９：１０８７−１０９９頁、１９９７）。モチーフＡは、構造的に、主に疎水性残基を含む逆平行β−鎖で始まり、α−ヘリックスに続く。ＤＮＡポリメラーゼ活性部位の一次アミノ酸配列は、例外的に保存されている。
【００１４】
十分に保存されることに加えて、さらに、ＤＮＡポリメラーゼの活性部位は、比較的変わり易く、ＤＮＡポリメラーゼ活性を顕著に低下させることなく、特定のアミノ酸置換を受け入れることができることが示されている。（例えば、米国特許第６，６０２，６９５号を参照されたい。）。このような突然変異体ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、核酸合成反応を含む診断および研究用途における様々な選択的利点を提供することができる。本発明者らは、一文字アミノ酸コード、およびタンパク質配列の先頭からの突然変異の位置を示す整数を使用してタンパク質配列における突然変異を同定する。一文字アミノ酸コードは、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓｔｒｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５ｔｈ  ｅｄ．、Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （２００２）が挙げられる。例として、アスパラギン酸（「Ｄ」）は、Ｄ５８０Ｇ突然変異体においてグリシン（「Ｇ」）に変更され、該突然変更は、タンパク質配列の先頭から５８０アミノ酸に位置される。
【００１５】
Ｒｅｉｃｈｅｒｔらは、好熱性細菌由来の熱活性ＤＮＡポリメラーゼ比較系統分析を行った。そこでは、ＤＮＡポリメラーゼＩ酵素のタンパク質コード配列は、１３個の系統発生的に異なる種について整列させた。分析は、アミノ酸位置６４５−６８５（サーマス属種（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．）Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ（「Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ」）に位置した１５アミノ酸長のモチーフ内の８つのアミノ酸位置が、コア酵素の機能を損なうことなしに変化を許容し得ることを明らかにした。
【００１６】
比較系統分析は、非保存アミノ酸がコア酵素機能に重要そうではないことを示唆するというよりも、非保存アミノ酸に関連する特定の機能情報を提供しない。そのため、特定の突然変異は、Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼの変異体（「Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇポリメラーゼ」）をコードする組換え遺伝子内に導入され、得られたＺ０５  Ｄ５８０Ｇポリメラーゼ突然変異体は、鋳型に対して３’−ミスマッチを有するオリゴヌクレオチドプライマーを伸長する能力の減少を与える該突然変異体の能力についてスクリーニングされた。Ｒｅｉｃｈｅｒｔらは、このような１つの突然変異体Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ  Ｖ６６７Ｅポリメラーゼが、親のＺ０５  Ｄ５８０Ｇポリメラーゼよりも良好な識別（約２倍）を示すことを見出した。「ＤＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＳ  ＷＩＴＨ  ＩＮＣＲＥＡＳＥＤ  ３’−ＭＩＳＭＡＴＣＨ  ＤＩＳＣＲＩＭＩＮＡＴＩＯＮ」と題するＲｅｉｃｈｅｒｔらによる米国特許出願第２０１２／００１５４０５号を参照されたい。
【００１７】
比較系統分析には、改善された３’−ヌクレオチド識別を示すＤＮＡポリメラーゼ活性の同定に関して制限がある。これは、所与の酵素クラスの全てのＤＮＡポリメラーゼが、系統発生的に多様な生物のスペクトルにわたって類似した鋳型基質およびヌクレオチドプールに直面しているという事実による。全てのＤＮＡポリメラーゼが娘鋳型鎖の高い忠実度複製を保存するために３’−ヌクレオチドミスマッチ識別を示さなければならないという事実を考えると、ミスマッチ識別に影響を与え得る可能性アミノ酸位置を特定するために比較系統分析を適用することができることは驚くべきことではない。低頻度対立遺伝子検出のためのいくつかのＰＣＲに基づくアッセイに使用されるものなどの、生化学的アッセイにおいてのみポリメラーゼに示される異なった３’−末端修飾を有する鋳型基質について、改善された３’−ヌクレオチド識別を有するＤＮＡポリメラーゼを同定することが必要とされる。
【００１８】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）細菌において発見された酵素である（Ｃｈｉｅｎ，Ａ．ら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９７６、１２７：１５５０−１５５７頁）。酵素は、デオキシリボ核酸ポリメラーゼ、クラスＩ（酵素コード、ＥＣ２．７．７．７）として分類される。この触媒活性はＤＮＡ配列を増幅することである。天然から単離されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素のペプチド配列および遺伝子配列は、当該技術分野において周知であり、表１に列挙される（Ｌａｗｙｅｒ，Ｆ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９、２６４：６４２７−６４３７頁；Ｇｅｎｂａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅ  ＩＤ  Ｊ０４６３９．１）。
【００１９】
【表１】
2019216723.tif 000002
2019216723.tif 000003
【００２０】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシリボヌクレオチドから構成されるプライマーを伸長するが、しかし、プライマーのいくつかの化学的修飾が許容され、プライマー伸長反応の効率を対して低下させない。例えば、３’プライマー末端におけるヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドの代わりにリボヌクレオチドである場合、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、かなりの効率と速度でこのようなプライマーを伸長することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】米国特許第７，１１２，４０６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７６３，１８１号明細書
【特許文献３】米国特許第７，１３５，２９１号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００９／００６８６４３号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１０／０１６７３５３号明細書
【特許文献６】米国特許第６，６０２，６９５号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１２／００１５４０５号明細書
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｃｈｅｎら、「Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｒｏｔｏｃｏｌ，ｃｏｓｔ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ」、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊ．、３（２）：７７−９６頁（２００３）
【非特許文献２】Ｋｗｏｋら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」、Ｃｕｒｒ．Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５（２）：４３−６０頁（Ａｐｒｉｌ  ２００３）
【非特許文献３】Ｓｈｉ、「Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｇｅｎｅｓ」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２（３）：１９７−２０５頁（２００２）
【非特許文献４】Ｋｗｏｋ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、２：２３５−５８頁（２００１）
【非特許文献５】Ｎｅｗｔｏｎら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｙ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＤＮＡ．Ｔｈｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＲＭＳ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１７（７）：２５０３−１５頁（１９８９）
【非特許文献６】Ｌａｔｏｒｒａら、「ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ３’  ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＬＮＡ）ｐｒｉｍｅｒｓ」、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔ．、２２（１）：７９−８５頁（２００３）
【非特許文献７】Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｃｌｏｎｅｄ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ｌｉｇａｓｅ．」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、１９９１  Ｊａｎ、１；８８（１）：１８９−９３頁
【非特許文献８】Ｗｉｅｄｍａｎｎ  Ｍ．、Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗ．Ｊ．、Ｃｚａｊｋａ  Ｊ．、Ｌｕｏ  Ｊ．、Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．、Ｂａｔｔ  Ｃ．Ａ．、「Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）−−ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １９９４  Ｆｅｂ；３（４）：Ｓ５１−６４頁
【非特許文献９】Ｂｅｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：３５２−３５５頁、１９９３；Ｐａｔｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：５３５１−５３６３頁、１９９５
【非特許文献１０】Ｗａｎｇら、Ｃｅｌｌ  ８９：１０８７−１０９９頁、１９９７
【非特許文献１１】Ｓｔｒｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５ｔｈ  ｅｄ．、Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （２００２）
【非特許文献１２】Ｃｈｉｅｎ，Ａ．ら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９７６、１２７：１５５０−１５５７頁
【非特許文献１３】Ｌａｗｙｅｒ，Ｆ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９、２６４：６４２７−６４３７頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
（発明の要旨）
一態様において、未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと比較して増強された鋳型識別活性を有する突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが提供される。突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの残基位置７８３または７８４で少なくとも１つの置換を含む。
【００２４】
別の態様において、未修飾熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと比較して増大した鋳型識別活性を有する突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが提供される。突然変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの７８３または７８４位に対してオルソロガスな残基位置で少なくとも１つの置換を含む。
【００２５】
別の態様において、対応する未修飾ＤＮＡポリメラーゼと比較して増大した鋳型識別活性を有する突然変異体ＤＮＡポリメラーゼが提供され、該突然変異体ＤＮＡポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼを含む。突然変異体ＤＮＡポリメラーゼペプチドのアミノ酸配列は、未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの７８３または７８４位にオルソロガスな残基位置で少なくとも１つの置換を含み、ここで、突然変異体ＤＮＡポリメラーゼは、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ユウバクテリウム・シラエウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｒａｅｕｍ）、クロストリジウム・レプタム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｅｐｔｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ファクラミア・ホミニス（Ｆａｃｋｌａｍｉａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）およびバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ  １０９８７からなる種の群から選択される。
【００２６】
別の態様において、未修飾の非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼ対応物と比較して増大した鋳型識別活性を有する突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼが提供され、突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼを含む。突然変異体非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの残基位置７８３および／または７８４に対してオルソロガスな残基位置で少なくとも１つの置換を含む。
【００２７】
別の態様において、上記した突然変異体ＤＮＡポリメラーゼのいずれかをコードする組換え核酸が提供される。
【００２８】
別の態様において、プライマー伸長を行うための方法が提供される。この方法は、プライマー伸長方法に適した条件下で、上記した突然変異体ＤＮＡポリメラーゼをプライマー、ポリヌクレオチド鋳型およびヌクレオシド三リン酸と接触させ、それにより伸長されたプライマーを生成するステップを含む。
【００２９】
別の態様において、上記した突然変異体ＤＮＡポリメラーゼを与える少なくとも１つの容器を含む、伸長されたプライマーを生成するためのキットが提供される。
【００３０】
別の態様において、上記した突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ポリヌクレオチド鋳型およびヌクレオシド三リン酸を含む反応混合物が提供される。
【００３１】
別の態様において、上記した突然変異体ＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長を行うステップを含む、ｒｈＰＣＲを行うための方法が提供される。
【００３２】
別の態様において、未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと比較して増大した鋳型識別活性を有する突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが提供される。突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、以下の選択された置換のうちの１つを含む：（１）Ａ６６１Ｅ；Ｉ６６５Ｗ；Ｆ６６７Ｌ［配列番号８７］；（２）Ｖ７８３Ｆ［配列番号８３］；（３）Ｈ７８４Ｑ［配列番号８５］；（４）Ｖ７８３Ｌ；Ｈ７８４Ｑ［配列番号８９］；（５）Ｈ７８４Ａ［配列番号１４７］；（６）Ｈ７８４Ｓ［配列番号１４９］；（７）Ｈ７８４Ｉ［配列番号１５５］；（８）Ｈ７８４Ｔ［配列番号１５１］、（９）Ｈ７８４Ｖ［配列番号１５３］；（１０）Ｈ７８４Ｍ［配列番号１５７］；（１１）Ｈ７８４Ｆ［配列番号１５９］；または（１２）Ｈ７８４Ｙ［配列番号１６１］。
【００３３】
別の態様において、欠失した５’エキソヌクレアーゼドメインを有し（ＫｌｅｎＴａｑ）、追加の突然変異を含み、未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと比較して増大した鋳型識別活性を有する突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが提供される。突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、以下の選択された置換のうちの１つを含む：（１）Ａ６６１Ｅ；Ｉ６６５Ｗ；Ｆ６６７Ｌ［配列番号１７０］；（２）Ｖ７８３Ｆ［配列番号１７２］；（３）Ｈ７８４Ｑ［配列番号１７４］；（４）Ｖ７８３Ｌ；Ｈ７８４Ｑ［配列番号１７６］；（５）Ｈ７８４Ｓ［配列番号１７８］；または（６）Ｈ７８４Ｙ［配列番号１８０］。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】公知のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＰＤＢ  ＩＤ  ２ＫＴＱ結晶構造から構築される活性部位のモデルを示す図である。ポリメラーゼ骨格はリボンを使用して示される。「Ｃ２」標識は、プライマー末端ヌクレオチドの２’炭素原子を示す。ｄＮＴＰは、プライマー上のポケットにおいて結合している。
【図２Ａ】Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体と野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼについて精製されたタンパク質を示すゲル画像を示す図である。凡例：精製された組換えタンパク質のアリコートは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離され、クマシーブリリアントブルーを用いて染色された。マーカーレーン（Ｍ）が示され、キロダルトン（ｋＤａ）で同定されたタンパク質サイズマーカーを示す。
【図２Ｂ】Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体と野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼについて精製されたタンパク質を示すゲル画像を示す図である。凡例は図２Ａの通りである。
【図２Ｃ】Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体と野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼについて精製されたタンパク質を示すゲル画像を示す図である。凡例は図２Ａの通りである。
【図２Ｄ】Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体と野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼについて精製されたタンパク質を示すゲル画像を示す図である。凡例は図２Ａの通りである。
【図３Ａ】野生型ＯｐｔｉＴａｑ（サブパネル（ｉ））、突然変異体ＩＤ２（サブパネル（ｉｉ））および突然変異体ＩＤ３（サブパネル（ｉｉｉ））について表１０および３１からの対立遺伝性特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）データのグラフ表示を示す図である。凡例：ＡＳ−ＰＣＲ反応から得られた平均ΔＣｑ値±標準偏差（誤差バー）を示す。（ΔＣｑ＝Ｃｑミスマッチ−Ｃｑマッチ）。野生型ＯｐｔｉＴａｑと突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのミスマッチ識別を比較する。全ての可能な対ミスマッチ塩基組み合わせが含まれる。標的核酸中のＳＮＰ部位の塩基が何であるかは、採用されたＡＳ−ＰＣＲリバースプライマーの３’−ＤＮＡ残基（ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴ）とともに、Ｘ軸上に示される（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）。
【図３Ｂ】野生型ＯｐｔｉＴａｑ（サブパネル（ｉ））、突然変異体ＩＤ１０（サブパネル（ｉｉ））および突然変異体ＩＤ１８（サブパネル（ｉｉｉ））について表１０および３１からの対立遺伝性特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）データのグラフ表示を示す図である。凡例は図３Ａの通りである。
【図３Ｃ】野生型ＯｐｔｉＴａｑ（サブパネル（ｉ））、突然変異体ＩＤ３（サブパネル（ｉｉ））および突然変異体ＩＤ２０（サブパネル（ｉｉｉ））について表１０および３１からの対立遺伝性特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）データのグラフ表示を示す図である。凡例は図３Ａの通りである。
【図３Ｄ】野生型ＯｐｔｉＴａｑ（サブパネル（ｉ））、突然変異体ＩＤ２１（サブパネル（ｉｉ））および突然変異体ＩＤ２２（サブパネル（ｉｉｉ））について表１０および３１からの対立遺伝性特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）データのグラフ表示を示す図である。凡例は図３Ａの通りである。
【図３Ｅ】野生型ＯｐｔｉＴａｑ（サブパネル（ｉ））、突然変異体ＩＤ２４（サブパネル（ｉｉ））および突然変異体ＩＤ２６（サブパネル（ｉｉｉ））について表１０および３１からの対立遺伝性特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）データのグラフ表示を示す図である。凡例は図３Ａの通りである。
【図３Ｆ】野生型ＯｐｔｉＴａｑ（サブパネル（ｉ））、突然変異体ＩＤ２７（サブパネル（ｉｉ））および突然変異体ＩＤ２９（サブパネル（ｉｉｉ））について表１０および３１からの対立遺伝性特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）データのグラフ表示を示す図である。凡例は図３Ａの通りである。
【図３Ｇ】野生型ＯｐｔｉＴａｑ（サブパネル（ｉ））および突然変異体ＩＤ３０（サブパネル（ｉｉ））について表１０および３１からの対立遺伝性特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）データのグラフ表示を示す図である。凡例は図３Ａの通りである。
【図４】野生型ＯｐｔｉＴａｑについて３’−ＲＮＡ残基で終わるプライマーおよび３’−ＤＮＡ残基で終わるプライマーを使用したｑＰＣＲ結果と、４つの突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとの比較から得られたΔＣｑ値（表１３）のグラフ表示を示す図である。ここで、ΔＣｑ＝Ｃｑ３’−ＲＮＡ−Ｃｑ３’−ＤＮＡ；ｒＡはｄＡと比較され、ｒＣはｄＣと比較され、ｒＧはｄＧと比較され、およびｒＵはｄＴと比較される。研究された各々のＤＮＡポリメラーゼが何であるかはＸ軸に示される。
【図５Ａ】定量的ｒｈＰＣＲアッセイにおいてＧｅｎ１  ＲＤＤＤＤｘブロック型切断性プライマーを使用してＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）におけるヒトゲノムＤＮＡ  ＳＮＰを検出する、野生型ＯｐｔｉＴａｑと、突然変異体ＩＤ２、突然変異体ＩＤ３、突然変異体ＩＤ１０および突然変異体ＩＤ１８  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとの間のミスマッチ識別の比較から得られたΔＣｑ値（表２０および３４）のグラフ表示を示す図である。ΔＣｑ＝［Ｃｑミスマッチ−Ｃｑマッチ］。凡例：研究された各々のＤＮＡポリメラーゼが何であるかをＸ軸上に示す。ＲＤＤＤＤｘブロック型切断性プライマーは、示されるように、「Ｃ」または「Ｔ」対立遺伝子に特異的である、切断型塩基としてのｒＣまたはｒＵ残基のいずれかを含んだ。
【図５Ｂ】定量的ｒｈＰＣＲアッセイにおいてＧｅｎ１  ＲＤＤＤＤｘブロック型切断性プライマーを使用してＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）におけるヒトゲノムＤＮＡ  ＳＮＰを検出する、野生型ＯｐｔｉＴａｑと、突然変異体ＩＤ３、突然変異体ＩＤ２０、突然変異体ＩＤ２１、突然変異体ＩＤ２２および突然変異体ＩＤ２４  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとの間のミスマッチ識別の比較から得られたΔＣｑ値（表２０および３４）のグラフ表示を示す図である。ΔＣｑ＝［Ｃｑミスマッチ−Ｃｑマッチ］。凡例は図５Ａの通りである。
【図５Ｃ】定量的ｒｈＰＣＲアッセイにおいてＧｅｎ１  ＲＤＤＤＤｘブロック型切断性プライマーを使用してＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）におけるヒトゲノムＤＮＡ  ＳＮＰを検出する、野生型ＯｐｔｉＴａｑと、突然変異体ＩＤ３、突然変異体ＩＤ２６、突然変異体ＩＤ２７、突然変異体ＩＤ２９および突然変異体ＩＤ３０  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとの間のミスマッチ識別の比較から得られたΔＣｑ値（表２０および３４）のグラフ表示を示す図である。ΔＣｑ＝［Ｃｑミスマッチ−Ｃｑマッチ］。凡例は図５Ａの通りである。
【図６Ａ】定量的ｒｈＰＣＲアッセイにおいてＧｅｎ２  ＲＤｘｘＤブロック型切断性プライマーを使用してＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）におけるヒトゲノムＤＮＡ  ＳＮＰを検出する、野生型ＯｐｔｉＴａｑと、突然変異体ＩＤ２、突然変異体ＩＤ３、突然変異体ＩＤ１０および突然変異体ＩＤ１８  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとの間のミスマッチ識別の比較から得られたΔＣｑ値（表２１および３５）のグラフ表示を示す図である。ΔＣｑ＝［Ｃｑミスマッチ−Ｃｑマッチ］。凡例：研究された各々のＤＮＡポリメラーゼが何であるかをＸ軸上に示す。ＲＤｘｘＤブロック型切断性プライマーは、示されるように、「Ｃ」または「Ｔ」に特異的である、切断型塩基としてのｒＣまたはｒＵ残基のいずれかを含んだ。
【図６Ｂ】定量的ｒｈＰＣＲアッセイにおいてＧｅｎ２  ＲＤｘｘＤブロック型切断性プライマーを使用してＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）におけるヒトゲノムＤＮＡ  ＳＮＰを検出する、野生型ＯｐｔｉＴａｑと、突然変異体ＩＤ３、突然変異体ＩＤ２０、突然変異体ＩＤ２１、突然変異体ＩＤ２２および突然変異体ＩＤ２４  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとの間のミスマッチ識別の比較から得られたΔＣｑ値（表２１および３５）のグラフ表示を示す図である。ΔＣｑ＝［Ｃｑミスマッチ−Ｃｑマッチ］。凡例は図６Ａの通りである。
【図６Ｃ】定量的ｒｈＰＣＲアッセイにおいてＧｅｎ２  ＲＤｘｘＤブロック型切断性プライマーを使用してＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）におけるヒトゲノムＤＮＡ  ＳＮＰを検出する、野生型ＯｐｔｉＴａｑと、突然変異体ＩＤ３、突然変異体ＩＤ２６、突然変異体ＩＤ２７、突然変異体ＩＤ２９および突然変異体ＩＤ３０  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとの間のミスマッチ識別の比較から得られたΔＣｑ値（表２１および３５）のグラフ表示を示す図である。ΔＣｑ＝［Ｃｑミスマッチ−Ｃｑマッチ］。凡例は図６Ａの通りである。
【図７Ａ】ＯｐｔｉＴａｑ  ＫｌｅｎＴａｑ（突然変異体ＩＤ３７）（サブパネル（ｉ））、突然変異体ＩＤ３８（サブパネル（ｉｉ））および突然変異体ＩＤ３９（サブパネル（ｉｉｉ））について表１０および３１からの対立遺伝性特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）データのグラフ表示を示す図である。凡例：ＡＳ−ＰＣＲ反応から得られた平均ΔＣｑ値±標準偏差（誤差バー）を示す。（ΔＣｑ＝Ｃｑミスマッチ−Ｃｑマッチ）。野生型ＯｐｔｉＴａｑと４つの突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのミスマッチ識別を比較する。全ての可能な対ミスマッチ塩基組み合わせが含まれる。標的核酸中のＳＮＰ部位の塩基が何であるかは、採用されたＡＳ−ＰＣＲリバースプライマーの３’−ＤＮＡ残基（ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴ）とともに、Ｘ軸上に示される（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）。
【図７Ｂ】ＯｐｔｉＴａｑ  ＫｌｅｎＴａｑ（突然変異体ＩＤ３７）（サブパネル（ｉ））、突然変異体ＩＤ４０（サブパネル（ｉｉ））および突然変異体ＩＤ４１（サブパネル（ｉｉｉ））について表１０および３１からの対立遺伝性特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）データのグラフ表示を示す図である。凡例は図７Ａの通りである。
【図７Ｃ】ＯｐｔｉＴａｑ  ＫｌｅｎＴａｑ（突然変異体ＩＤ３７）（サブパネル（ｉ））、突然変異体ＩＤ４２（サブパネル（ｉｉ））および突然変異体ＩＤ４３（サブパネル（ｉｉｉ））について表１０および３１からの対立遺伝性特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）データのグラフ表示を示す図である。凡例は図７Ａの通りである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、サーマス・アクアティカス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ由来の具体例を含む、新規な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。これらのポリメラーゼは、核酸増幅、遺伝子型決定および低頻度対立遺伝子の検出についての既存の方法に対する改善を提示する。また、これらの新規な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用を含む新規なアッセイフォーマットが提供される。
【００３６】
定義
本発明の理解を支援するために、いくつかの用語を以下に定義する。
【００３７】
本明細書で使用される用語は「オープン」用語として意図される（例えば、用語「含むこと」は、「限定されないが含むこと」として意図されるべきであり、用語「有すること」は、「少なくとも有すること」として意図されるべきであり、用語「含む」は、「限定されないが含む」として意図されるなど）。
【００３８】
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、その冠詞が付した文法上の目的語の１つまたは１つを超えること（例えば、少なくとも１つ）を意味する。
【００３９】
用語「約」および「およそ」とは、一般的に、測定値の性質または精度を与える、測定された量の誤差の許容の程度を意味するものである。誤差の程度の例は、与えられた値または値の範囲の２０−２５パーセント（％）以内、典型的には１０％以内、より典型的には５％以内である。
【００４０】
さらに、「Ａ、ＢおよびＣなどの少なくとも１つ」に類似の慣例表現が使用されている事例では、通常、このような構文は、当業者がその慣例表現を理解する意味で意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣの少なくとも１つを有するシステム」は、限定されないが、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢを共に、ＡおよびＣを共に、ＢおよびＣを共に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを共に、などを有するシステムを含む）。２つ以上の代替用語を提示する事実上いかなる離接する語および／または句も、明細書または図面において、該用語（複数）の一方、該用語のいずれか、または用語の両方を含む可能性を意図すると理解されるべきであることが、当業者にはさらに理解される。例えば、句「ＡまたはＢ」は、「Ａ」または「Ｂ」もしくは「ＡおよびＢ」の可能性を含むことが理解される。
【００４１】
「から」、「まで（ｔｏ）」、「まで（ｕｐ  ｔｏ）」、「少なくとも」、「より多い」、「より小さい」などのすべての言い回しは、記載された数値を含み、その後に部分範囲に分割することができる範囲を指す。
【００４２】
範囲は、それぞれ個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１−３個のメンバーを有する群は、１、２または３個のメンバーを有する群を意味する。同様に、６個のメンバーを有する群は、１、２、３、４または６個のメンバーを有する群を意味する、などである。
【００４３】
「あり得る」という法動詞は、１つ以上の選択肢の好ましい使用もしくは選択、または同一内に含有されているいくつかの記載の実施形態もしくは特徴のうちの選択を意味する。同一に含有されている特別な実施形態または特徴に関して、選択肢または選択が開示されていない場合、「あり得る」という法動詞は、同一に含有されている記載の実施形態もしくは特徴の態様をどのように作製もしくは使用するのかに関する肯定的行為、または同一に含有されている記載の実施形態もしくは特徴に関する特異的技術を使用するという確定的決定を指す。この後者の文脈において、「あり得る」という法動詞は、「できる」という助動詞と同じ意味および含意を有する。
【００４４】
核酸塩基、ヌクレオシド三リン酸またはヌクレオチドに言及する場合の用語「通常の」または「天然の」とは、記載されるポリヌクレオチドにおいて天然に存在するものを意味する（すなわち、ＤＮＡについては、これらは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰである。）。さらに、ｄＩＴＰおよび７−デアザ−ｄＧＴＰは、ｄＧＴＰに代えて頻繁に利用され、７−デアザ−ｄＡＴＰは、配列決定などのインビトロでのＤＮＡ合成反応において、ｄＡＴＰに代えて利用することができる。総称して、これらはｄＮＴＰ類と呼ぶことができる。
【００４５】
核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドに言及する場合、用語「通常でない」または「修飾された」には、特定のポリヌクレオチドにおいて天然に生じる通常の塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの修飾、誘導または類似が含まれる。ある種の通常でないヌクレオチドは、通常のｄＮＴＰ類と比較して、リボース糖の２’位で修飾される。このようにして、ＲＮＡに関して、天然に存在するヌクレオチドはリボヌクレオチド（すなわち、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、総称してｒＮＴＰ類）であるが、本明細書に記載されるように、これらのヌクレオチドは糖の２’位にヒドロキシル基を有し、比較するとｄＮＴＰが存在しないため、本明細書で使用するとき、リボヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼに対する基質として通常でないヌクレオチドである。本明細書で使用するとき、通常でないヌクレオチドには、限定されないが、核酸配列決定のためのターミネーターとして使用される化合物が挙げられる。例示的なターミネーター化合物としては、限定されないが、２’，３’ジデオキシ構造を有し、ジデオキシヌクレオシド三リン酸と呼ばれる化合物が含まれる。ジデオキシヌクレオシド三リン酸ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＧＴＰは、総称してｄｄＮＴＰ類と呼ばれる。
【００４６】
用語「ヌクレオチド」は、天然に存在するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド単量体を指すことに加えて、本明細書において、その関連した構造的変異体を指すものと理解され、文脈が他に明確に示していない限り、ヌクレオチドが使用されている特定の文脈（例えば、相補性塩基へのハイブリダイゼーション）に関して機能的に同等である誘導体および類似体が含まれる。
【００４７】
用語「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用するとき、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む。）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む。）を指し、プリンまたはピリミジン塩基のＮグリコシドであるポリヌクレオチドの任意の他のタイプを指す。用語「核酸」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」間の長さにおける区別は意図されない。これらの用語は互換的に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、これらの用語には、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡが含まれる。本発明における使用に関して、オリゴヌクレオチドはまた、塩基、糖またはリン酸骨格が修飾されたヌクレオチド類似体、ならびに非プリンまたは非ピリミジンヌクレオチド類似体を含み得る。
【００４８】
オリゴヌクレオチドは、それぞれが参照により本明細書に組み込まれるＮａｒａｎｇら、１９７９、  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９頁のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら、１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１頁のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９８１，、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、２２：１８５９−１８６２頁のジエチルホスホラミダイト法；米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法などの方法による直接的な化学合成を含む任意の適切な方法によって調製することができる。オリゴヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドのコンジュゲートの合成方法の総説は、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｏｄｃｈｉｌｄ、１９９０、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １（３）：１６５−１８７頁に記載されている。
【００４９】
用語「プライマー」は、本明細書で使用するとき、適切な条件下でＤＮＡ合成の開始ポイントとして作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。このような条件には、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成を４つの異なるヌクレオシド三リン酸および伸長するための薬剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下、適した緩衝液中、適切な温度で誘導させる条件が含まれる。プライマー伸長は、１つ以上のヌクレオチド三リン酸の不存在下でも実施され得、この場合、限定された長さの伸長産物が産生される。本明細書で使用するとき、用語「プライマー」は、１つのオリゴヌクレオチドが隣接位置でハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドへのライゲーションによって「伸長される」ライゲーション媒介反応において使用されるオリゴヌクレオチドを包含することが意図される。したがって、用語「プライマー伸長」は、本明細書で使用するとき、ＤＮＡ合成の開始ポイントとしてプライマーを使用する個々のヌクレオシド三リン酸の重合と、伸長産物を形成するための２つのオリゴヌクレオチドのライゲーションの両方を指す。
【００５０】
プライマーは、好ましくは一本鎖ＤＮＡである。プライマーの適した長さは、プライマーの意図される使用に依存するが、典型的には、６から５０ヌクレオチド、好ましくは１５から３５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は、一般的に、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要とする。プライマーは、鋳型核酸の正確な配列を反映させる必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。所望の標的配列の増殖のために適切なプライマーの設計は、当該技術分野において周知であり、本明細書において引用されている文献に記載されている。
【００５１】
プライマーは、プライマーの検出または固定化を可能にするが、ＤＮＡ合成の開始ポイントとして作用するプライマーの基本的な特性を変化させない追加の特徴を組み込み得る。例えば、プライマーは、標的核酸にハイブリダイズしないが、増幅産物のクローニングまたは検出を容易にする追加の核酸配列を５’末端に含んでもよい。ハイブリダイズする鋳型に十分に相補的であるプライマーの領域は、本明細書においてハイブリダイジング領域と称される。プライマーは、変更がプライミングまたは鋳型機能を妨げない限り、ＤＮＡ以外の修飾された残基を組み込んでもよい。
【００５２】
句「３’−ヌクレオチド識別」とは、プライマーの３’末端のヌクレオチドが化学的に修飾されている場合、デオキシリボヌクレオチドに対してより高い特異性でおよびより低い効率でプライマー伸長反応を触媒するためのＤＮＡポリメラーゼの特性を指す。例えば、３’−ヌクレオチド識別を表示する突然変異したＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーが、例えばリボヌクレオチドで修飾される場合、デオキシリボヌクレオチドプライマーの選択性と抑制された触媒活性を示す。
【００５３】
用語「３’−ミスマッチ識別」は、完全に相補的な配列をミスマッチ含有（ほぼ相補的な）配列と区別するためのＤＮＡポリメラーゼの特性を指し、この場合、伸長されるべき核酸（例えば、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチド）は、核酸がハイブリダイズする鋳型と比較して、核酸の３’末端にミスマッチを有する。いくつかの実施形態において、伸長されるべき核酸は、完全に相補的な配列に対して３’末端にミスマッチを含む。
【００５４】
用語「低頻度対立遺伝子識別」は、複数の第２の核酸を含む核酸集団において第１の核酸を優先的に複製するためのＤＮＡポリメラーゼの特性を指し、ここで、第１の核酸は、複数の第２の核酸に対して核酸集団中で過少である。典型的には、第１の核酸は、他の比率のうち１：１００、１：１，０００および１：１００，０００を含む約１：１０から約１：１，０００，０００の範囲の第１の核酸と第２の核酸の比率で複数の第２の核酸を含有する核酸集団において過少であってもよい。典型的には、排他的ではないが、低頻度対立遺伝子識別を有するポリメラーゼは、本明細書においてさらに詳述されるように、第１の核酸と第２の核酸の間のＳＮＰ差を検出するために使用することができる。
【００５５】
句「鋳型識別活性」とは、３’−ヌクレオチド識別、３’−ミスマッチ識別、低頻度対立遺伝子識別およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを有するＤＮＡポリメラーゼを指す。
【００５６】
句「増大された識別活性」とは、３’−ヌクレオチド識別、３’−ミスマッチ識別、および低頻度対立遺伝子識別、またはこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを有するＤＮＡポリメラーゼを指し、ここで、ＤＮＡポリメラーゼは、参照ＤＮＡポリメラーゼよりも高い活性を示す。例えば、「増大した鋳型識別活性」を有するＤＮＡポリメラーゼ突然変異体は、ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体が誘導される、天然に存在する野生型ＤＮＡポリメラーゼの対応する活性より高い、３’−ヌクレオチド識別、３’−ミスマッチ識別、低頻度対立遺伝子識別およびこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを示す。
【００５７】
「鋳型識別活性アッセイ」とは、１つ以上の変数において異なる２つの鋳型間で識別するポリメラーゼの能力を評価するためのアッセイを指す。３’−ヌクレオチド識別、３’−ミスマッチ識別または低頻度対立遺伝子識別を明らかにするために設計されたアッセイは、鋳型識別活性アッセイの例である。
【００５８】
用語「定量サイクル値」は、Ｃｑと記述され、陽性シグナルが最初に検出される増幅サイクル数を指す。
【００５９】
用語「識別定量サイクル値」は、ΔＣｑと記述され、第１の参照状態と第２の参照状態の間の計算された差を指し、ここで、第１と第２の参照状態の両方は、ただ１つの変数の点で相違する。例えば、第１と第２の参照状態は、野生型ポリメラーゼおよびポリメラーゼ突然変異体などのポリメラーゼにおいて相違し、ミスマッチプライマー鋳型とマッチプライマー鋳型などのプライマー鋳型ヌクレオチド配列において相違し、または３’−デオキシリボース部分を含有するプライマー鋳型および３’−リボース部分を含有するプライマー鋳型などのプライマー鋳型３’−ヌクレオチドリボース構造において相違する、同一のポリメラーゼ反応を指すことができる。
【００６０】
用語「差異識別定量サイクル値」は、ΔΔＣｑと記述され、２つの変数において相違するポリメラーゼ反応について、第１の識別定量サイクル値と第２の識別定量サイクル値の間の計算された差を指す。本開示の文脈では、ΔΔＣｑ値は、所与のポリメラーゼ突然変異体が、鋳型識別活性アッセイにおける野生型ポリメラーゼと比較して示す改善の測定値である。好ましいΔΔＣｑ値はアッセイの性質に依存するが、一般的に、好ましいΔΔＣｑ値は少なくとも１．０であり、典型的には１．０よりも大きい。
【００６１】
用語「標的」、「標的配列」、「標的領域」および「標的核酸」は、本明細書で使用するとき、同義であり、増幅され、配列決定されまたは検出されるべきである核酸の領域または配列を指す。
【００６２】
用語「鋳型」は、少なくとも１つの一本鎖領域を含む核酸を指す。「基質」を修飾する場合の「鋳型」なる用語は、プライマーを用いてアニーリングするハイブリダイゼーション反応および／またはポリメラーゼを用いた伸長反応に使用される核酸を指す。
【００６３】
用語「ハイブリダイゼーション」とは、本明細書で使用するとき、相補的塩基対形成のために２つの一本鎖核酸による二重鎖構造の形成を指す。ハイブリダイゼーションは、完全に相補的な核酸鎖間またはミスマッチのマイナー領域を含有する「実質的に相補的な」核酸鎖間で起こり得る。完全に相補的な核酸鎖のハイブリダイゼーションが非常に好ましい条件を「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「配列特異的ハイブリダイゼーション条件」と称する。実質的に相補的な配列の安定な二重鎖は、さほどストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件下で達成され得る；許容されるミスマッチの程度はハイブリダイゼーション条件を適当に調整することによりコントロールされ得る。核酸技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さおよび塩基対組成、イオン強度およびミスマッチ塩基対の頻度を含むいくつかの変数を考慮して、当該技術分野によって提供されているガイドライン（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｗｅｔｍｕｒ、１９９１、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６（３／４）：２２７−２５９頁；およびＯｗｃｚａｒｚｙら、２００８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４７：５３３６−５３５３頁を参照されたい。）に従って二重鎖安定性を経験的に決定することができる。
【００６４】
用語「増幅反応」は、鋳型核酸配列のより多いコピーをもたらす、または鋳型核酸の転写をもたらす酵素反応を含む任意の化学反応を指す。増殖反応には、逆転写、リアルタイムＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号を参照されたい；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、１９９０）を参照されたい。）を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒａｎｙら，米国特許第５，４９４，８１０号を参照されたい。）が含まれる。例示的な「増幅反応条件」または「増幅条件」は、典型的には、２ステップまたは３ステップサイクルのいずれかを含む。２ステップサイクルは、高温変性ステップ、続くハイブリダイゼーション／伸長（またはライゲーション）ステップを含む。３ステップサイクルは、変性ステップ、続くハイブリダイゼーションステップ、その後の別々の伸長ステップまたはライゲーションステップを含む。
【００６５】
「アミノ酸」とは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中に組み込むことができる任意の単量体単位を指す。本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸」とは、以下の２０個の天然のまたは遺伝的にコードされるアルファ−アミノ酸を含む：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。「Ｘ」残基が定義されていない場合、これらは「任意のアミノ酸」として定義する。これらの２０個の天然アミノ酸の構造は、例えば、参照により組み込まれるＳｔｒｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５ｔｈ  ｅｄ、Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（２００２）に示されている。セレノシステインおよびピロリジンなどの追加のアミノ酸もまた、遺伝的にコードされ得る（参照により共に組み込まれるＳｔａｄｔｍａｎ、（１９９６）、「Ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ」、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６５：８３−１００頁、およびＩｂｂａら、（２００２）、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ：ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ」、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．、１２（１３）：Ｒ４６４−Ｒ４６６頁）。また、用語「アミノ酸」には、非天然のアミノ酸、（例えば、修飾された側鎖および／または骨格を有する）修飾アミノ酸、およびアミノ酸類似体が含まれる。例えば、各々が参照により組み込まれるＺｈａｎｇら、（２００４）、「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１（２４）：８８８２−８８８７頁、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、（２００４）、「Ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ  ｃｏｄｏｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０１（２０）：７５６６−７５７１頁、Ｉｋｅｄａら、（２００３）、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．、１６（９）：６９９−７０６頁、Ｃｈｉｎら、（２００３）、「Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０１（５６３５）：９６４−９６７頁、Ｊａｍｅｓら、（２００１）、「Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓ���  Ｓ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈｏｔｏｉｓｏｍｅｒｉｚａｂｌｅ  ｐｈｅｎｙｌａｚｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．、１４（１２）：９８３−９９１頁、Ｋｏｈｒｅｒら、（２００１）、「Ｉｍｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｍｂｅｒ  ａｎｄ  ｏｃｈｒｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９８（２５）：１４３１０−１４３１５頁、Ｂａｃｈｅｒら、（２００１）、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｎ  ａｎ  Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ  Ｔｏｘｉｃ  Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  Ａｎａｌｏｇｕｅ」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８３（１８）：５４１４−５４２５頁、Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕら、（２０００）、「Ａ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｕｔｉｌｉｚｅｓ  ｔｈｅ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｚａｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｍｏｒｅ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｔｈａｎ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５（５１）：４０３２４−４０３２８頁、およびＢｕｄｉｓａら、（２００１）、「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｛ｂｅｔａ｝−（ｔｈｉｅｎｏｐｙｒｒｏｌｙｌ）ａｌａｎｉｎｅｓ  ａｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、１０（７）：１２８１−１２９２頁を参照されたい。
【００６６】
用語「残基」とは、文脈に応じて「アミノ酸」または「ヌクレオチド」と同義であり、置換え可能である。
【００６７】
本明細書で使用するとき、「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素を指す。一般的に、酵素は、核酸鋳型配列にアニーリングされたプライマーの３’末端で合成を開始する。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。公知のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９１、Ｇｅｎｅ、１０８：１）、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼ（ＬｅｃｏｍｔｅおよびＤｏｕｂｌｅｄａｙ、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１１：７５０５）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍら、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６：３１１２）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＭｙｅｒｓおよびＧｅｌｆａｎｄ、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：７６６１）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＳｔｅｎｅｓｈおよびＭｃＧｏｗａｎ、１９７７、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４７５：３２）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる、Ｃａｒｉｅｌｌｏら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１９：４１９３）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｉａｚおよびＳａｂｉｎｏ、１９９８、Ｂｒａｚ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．、３１：１２３９）、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎら、１９７６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ．，１２７：１５５０）、パイロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉら、１９９７、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６３：４５０４）、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第ＷＯ０１３２８８７号）、およびパイロコッカス属種ＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａら、１９９４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１６：８２０）が挙げられる。上記酵素のいずれかのポリメラーゼ活性は、当該技術分野において周知の手段によって決定され得る。
【００６８】
用語「熱安定性ポリメラーゼ」とは、熱に対して安定であり、熱耐性であり、続くポリヌクレオチド伸長反応を達成するのに十分な活性を保持し、二本鎖核酸の変性を達成するのに必要な時間、高温に晒された場合に不可逆的に変性しない（不活性化されない）酵素を指す。核酸変性に必要な加熱条件は、当該技術分野において周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，２０２号、第４，６８３，１９５号および第４，９６５，１８８号に例示されている。本明細書において使用するとき、熱安定性ポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）などの温度サイクリング反応における使用に適している。本明細書における目的のため、不可逆的変性は、酵素活性の永続的で完全な喪失を指す。熱安定性ポリメラーゼに関して、酵素活性とは、適切な方式でヌクレオチドを組み合わせて、鋳型核酸鎖に相補的なポリヌクレオチド伸長産物を形成する触媒作用を指す。好熱性細菌由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、とりわけサーマス・アクアティクス由来のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００６９】
用語「好熱性」とは、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはＰＣＲ反応における逆転写またはアニーリング／伸長ステップのために通常使用される温度（すなわち、４５−８０℃）で触媒特性を維持する酵素を指す。熱安定性酵素は、核酸変性に必要とされる高温に晒されたとき、不可逆的に不活性化および変性されないものある。好熱性酵素は熱安定性であってもよくまたはそうでなくてもよい。好熱性ＤＮＡポリメラーゼは、限定されないが、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、モロニーマウス白血病ウイルスおよびトリ骨髄芽球症ウイルスを含む好熱性種または中等温度好性種由来のＤＮＡまたはＲＮＡ依存性であってもよい。
【００７０】
本明細書で使用するとき、十分にストリンジェントな条件下で増幅反応において使用されるとき、プライマーが標的核酸に主としてハイブリダイズすれば、プライマーは標的配列に対して「特異的」である。典型的には、プライマー−標的二重鎖の安定性がプライマーと試料中に見出されるいずれかの他の配列間で形成される二重鎖の安定性より大きい場合、プライマーは標的配列に対して特異的である。当業者は、塩条件並びにプライマーの塩基組成およびミスマッチ位置などの様々な要因がプライマーの特異性に影響を及ぼし、プライマー特異性の定型的な実験的確認が多くの事例で必要とされることを認識する。プライマーが標的配列のみと安定な二重鎖を形成することができるハイブリダイゼーション条件を選択することができる。したがって、適切にストリンジェントな増幅条件下での標的特異的プライマーの使用は、標的プライマー結合部位を含有する標的配列の選択的増幅を可能にする。
【００７１】
用語「非特異的増幅」とは、本明細書で使用するとき、標的配列以外の配列にハイブリダイズし、次に、プライマー伸長のための基質としての機能するプライマーから生じる、標的配列以外の核酸配列の増幅を指す。非標的配列へのプライマーのハイブリダイゼーションは「非特異的ハイブリダイゼーション」と称され、特に、低温、低下したストリンジェンシー、前増幅条件の間に、または単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の場合、真の標的に極めて密接に関連する配列を有する試料中に変異対立遺伝子が存在する状況で起こる傾向がある。
【００７２】
用語「プライマー二量体」は、本明細書で使用するとき、別のプライマーが鋳型として機能するプライマー伸長から生じると考えられる、鋳型非依存的な非特異的増幅産物を指す。プライマー二量体は、しばしば、２つのプライマー、すなわち二量体のコンカタマーであるようであるが、２つを超えるプライマーのコンカタマーもまた生じ得る。用語「プライマー二量体」は、本明細書において、鋳型非依存的な非特異的増幅産物を包括的に包含するために使用される。
【００７３】
用語「反応混合物」とは、本明細書で使用するとき、所与の反応を実施するために必要とされる試薬を含有する溶液を指す。増幅反応を実施するために必要とされる試薬を含有する溶液を指す「増幅反応混合物」は、典型的には、適切な緩衝液中に、オリゴヌクレオチドプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼを含有する。「ＰＣＲ反応混合物」は、典型的には、オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ（最も典型的には、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、ｄＮＰＴおよび二価の金属陽イオンを適切な緩衝液中に含有する。反応を可能にするために必要とされる全ての試薬を含有していれば、反応混合物は完全と称され、必要な試薬の一部のみを含有していれば、不完全と称される。反応成分は、利便性、保存安定性または成分濃度の用途依存的な調整を可能にする理由で、それぞれが全成分の一部を含有する別個の溶液として通常保存されること、および完全な反応混合物を作製するための反応の前に、反応成分が組み合わされることが、当業者によって理解される。さらに、反応成分は商業化のために別個に梱包されること、および有用な市販のキットは、本発明のブロックされたプライマーを含む反応成分のいずれかの一部を含有し得ることが、当業者によって理解される。
【００７４】
用語「活性化されていない」または「不活化された」とは、本明細書で使用するとき、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼのいずれかがそれらの意図された目的のためにそのオリゴヌクレオチドと相互作用することができないため、プライマー伸長反応またはライゲーション反応に参加することができないプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドがプライマーであるとき、プライマー伸長を妨げるように、プライマーは３’末端でまたは３’末端付近でブロックされるため、活性化されていない状態が生じる。特定の基がプライマーの３’末端にまたは３’末端付近に結合されているとき、ＤＮＡポリメラーゼはプライマーに結合することができず、伸長が起こり得ない。しかしながら、活性化されていないプライマーは、実質的に相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。
【００７５】
用語「活性化された」とは、本明細書で使用するとき、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼとの反応に参加することができるプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを指す。プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドは、実質的に相補的な核酸配列にハイブリダイズした後に活性化された状態になり、切断されて、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼと相互作用することができるように機能的な３’または５’末端を生成する。例えば、オリゴヌクレオチドがプライマーであり、プライマーが鋳型にハイブリダイズされる場合、例えば、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーの３’末端に結合し、プライマー伸長を促進することができるように切断酵素によって３’−ブロッキング基はプライマーから除去され得る。
【００７６】
用語「切断ドメイン」または「切断するドメイン」は、本明細書において使用するとき、同義であり、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを切断する切断化合物、例えば切断酵素によって認識される、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドの５’末端と３’末端の間に位置する領域を指す。本発明の目的のために、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドが相補的な核酸配列にハイブリダイズされたときにのみ切断されるが、一本鎖であるときには切断されないように、切断ドメインが設計される。切断ドメインまたは切断ドメインに隣接する配列には、ａ）ポリメラーゼもしくはリガーゼによるプライマーもしくは他のオリゴヌクレオチドの伸長またはライゲーションを妨げもしくは阻害し、ｂ）変異対立遺伝子を検出するために識別を増大し、またはｃ）所望されない切断反応を抑制する部分が含まれてもよい。１つ以上のこのような部分を、切断ドメインまたは切断ドメインに隣接する配列に含めることができる。
【００７７】
用語「ＲＮａｓｅ  Ｈ切断ドメイン」は、本明細書で使用するとき、１つ以上のリボ核酸残基またはＲＮａｓｅ  Ｈに対する基質を与える代替的類似体を含有する切断ドメインの一種である。ＲＮａｓｅ  Ｈ切断ドメインは、プライマーまたはオリゴヌクレオチド内のいずれの場所にも位置することが可能であり、好ましくは、分子の３’末端もしくは５’末端にまたはその付近に位置する。
【００７８】
「ＲＮａｓｅ  Ｈ１切断ドメイン」は、一般的に、少なくとも３つの連続したＲＮＡ残基を含有する。「ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断ドメイン」は、１つのＲＮＡ残基、連続的に連結されたＲＮＡ残基の配列、またはＤＮＡ残基もしくは他の化学基によって分離されたＲＮＡ残基を含有し得る。例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断ドメインは、とりわけ２’−フルオロヌクレオシド残基を含み得る。
【００７９】
用語「切断化合物」または「切断剤」とは、本明細書で使用するとき、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチド内の切断ドメインを認識し、切断ドメインの存在に基づいてオリゴヌクレオチドを選択的に切断することができる任意の化合物を指す。本発明において利用される切断化合物は、実質的に相補的な核酸配列にハイブリダイズされる場合のみ、切断ドメインを含むプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを選択的に切断するが、一本鎖であるときは、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを切断しない。切断化合物は、切断ドメイン内または切断ドメインに隣接したプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを切断する。用語「隣接した」とは、本明細書で使用するとき、切断化合物が、切断ドメインの５’末端または３’末端のいずれかでプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを切断することを意味する。本発明において好ましい切断反応は、５’−ホスファート基および３’−ＯＨ基を生成する。
【００８０】
好ましい実施形態において、切断化合物は「切断酵素」である。切断酵素は、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドが実質的に相補的な核酸配列にハイブリダイズされる場合、切断ドメインを認識することができるが、相補的な核酸配列を切断しない（すなわち、二重鎖内に一本鎖切断を与える。）。切断酵素はまた、一本鎖である場合、切断ドメインを含むプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを切断しない。切断酵素の例は、ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素および他のニック生成酵素である。
【００８１】
用語「ニック生成」とは、本明細書で使用するとき、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸の二本鎖部分の一本鎖のみを切断することを指す。核酸にニックが生成される位置は、「ニック生成部位」（ＮＳ）と称される。「ニック生成剤」（ＮＡ）とは、部分的にまたは完全に二本鎖の核酸にニックを生成する薬剤である。ニック生成剤は、酵素または任意の他の化合物または組成物であり得る。ある種の実施形態において、ニック生成剤は、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸の特定のヌクレオチド配列を認識し、認識配列の位置に関して特異的な位置（すなわち、ＮＳ）において、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸の一つの鎖のみを切断し得る。このようなニック生成剤（「配列特異的なニック生成剤」と称される。）としては、限定されないが、ニック生成エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ１）が挙げられる。
【００８２】
したがって、「ニック生成エンドヌクレアーゼ」（ＮＥ）は、本明細書で使用するとき、完全にまたは部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列を認識し、認識配列に関して特異的な位置において、核酸分子の１つの鎖のみを切断するエンドヌクレアーゼを指す。このような事例では、認識部位から切断点までの配列全体が「切断ドメイン」を構成する。
【００８３】
用語「ブロッキング基」とは、本明細書で使用するとき、増幅反応が起こらないように、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドに結合されている化学的部分を指す。例えば、プライマー伸長および／またはＤＮＡライゲーションが起こらない。ブロッキング基がプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドから除去されると、オリゴヌクレオチドは、そのために設計されたアッセイ（ＰＣＲ、ライゲーション、配列決定など）に参加することができる。したがって、「ブロッキング基」は、ポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼによる認識を阻害するあらゆる化学的部分であり得る。ブロッキング基は、切断ドメイン中に取り込まれ得るが、一般的に、切断ドメインの５’または３’側のいずれかに位置される。ブロッキング基は、１つを超える化学的部分から構成され得る。本発明において、「ブロッキング基」は、典型的には、その標的配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後に除去される。
【００８４】
用語「ブロック型切断性プライマー」とは、プライマーの３’末端でまたはその近傍でブロッキング基が存在するために、ポリメラーゼからのＤＮＡ合成のプライミングに対して不活性であるまたは不活性化されているプライマーを指す。ブロック型切断性プライマーは、活性プライマーまたは活性されたプライマーをもたらす切断化合物または切断剤（例えば、切断酵素）によって、プライマーの３’末端でまたはその近傍でブロッキング基を除くことにより適格なプライマーに変換され得る。
【００８５】
ＲＤＤＤＤｘブロック型切断性プライマー（「世代１」または「Ｇｅｎ  １」ブロック型切断性プライマーとしても知られている。）は、その３’末端に配列ＲＤＤＤＤｘ（ここで、ＲはＲＮＡ塩基であり、ＤはＤＮＡ塩基であり、ｘはＣ３スペーサー基である。）を有するブロック型切断性プライマーを指す。
【００８６】
ＲＤｘｘＤブロック型切断性プライマー（「世代２」または「Ｇｅｎ  ２」ブロック型切断性プライマーとしても知られている。）は、その３’末端に配列ＲＤｘｘＤ（ここで、ＲはＲＮＡ塩基であり、ＤはＤＮＡ塩基であり、ｘはＣ３スペーサー基である。）を有するブロック型切断性プライマーを指す。
【００８７】
用語「蛍光発生プローブ」は、ａ）フルオロフォアおよびクエンチャーが結合されており、場合によって、副溝結合部が結合されているオリゴヌクレオチド、またはｂ）ＤＮＡ結合試薬、例えばＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ色素のいずれかを指す。
【００８８】
用語「蛍光標識」または「フルオロフォア」は、約３５０から９００ｎｍの最大蛍光放射を有する化合物を指す。多種多様なフルオロフォアが使用され得、限定されないが：５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセインとも称される；スピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ）、９’−（９Ｈ）キサンテン）−５−カルボン酸、３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−６−カルボキシフルオレセインとも称される）；５−ヘキサクロロ−フルオレセイン；（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’，６’−ジピバロイル−フルオレセイニル）−６−カルボン酸］）；６−ヘキサクロロ−フルオレセイン；（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−５−カルボン酸］）；５−テトラクロロ−フルオレセイン；（［４，７，２’，７’−テトラ−クロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−５−カルボン酸］）；６−テトラクロロ−フルオレセイン；（［４，７，２’，７’−テトラクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−６−カルボン酸］）；５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）；キサンチリウム、９−（２，４−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチル−アミノ）；６−ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）；９−（２，５−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）；ＥＤＡＮＳ（５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）；１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ（５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）；Ｃｙ５（インドジカルボシアニン−５）；Ｃｙ３（インド−ジカルボシアニン−３）；およびＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（２，６−ジブロモ−４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）；Ｑｕａｓａｒ（登録商標）−６７０色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｒｏｘ色素；Ｍａｘ色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ならびにこの適切な誘導体が挙げられる。
【００８９】
本明細書で使用するとき、用語「クエンチャー」は、蛍光ドナーに結合または近接すると該ドナーからの放射を低減させ得る分子または化合物の一部分を指す。クエンチングは、いくつかの任意のメカニズムによって、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動、光誘導型電子移動、項間交差の常磁性促進、デクスター交換結合、および励起子結合、例えば暗複合体の形成によって行われ得る。蛍光は、フルオロフォアによって放射された蛍光がクエンチャーの非存在下での蛍光と比べて少なくとも１０％、例えば、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％またはそれ以上低減されている場合、「クエンチ」されている。いくつかの市販のクエンチャーが当該技術分野において公知であり、限定されないが、ＤＡＢＣＹＬ、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ（商標）クエンチャー（ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＢＨＱ−３）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱおよびＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱが挙げられる。これらはいわゆるダーククエンチャーである。これらは、波長が３００から９００ｎｍの範囲にある内在性の蛍光を有しておらず、事実上、内因的に蛍光性である他のクエンチャー、例えばＴＡＭＲＡで見られるバックグラウンドの問題が解消される。
【００９０】
用語「ライゲーション」は、本明細書で使用するとき、２つのポリヌクレオチド末端の共有結合をいう。種々の実施形態において、ライゲーションは、第１のポリヌクレオチド（アクセプター）の３’末端と第２のポリヌクレオチド（ドナー）の５’末端との共有結合を伴う。ライゲーションにより、ポリヌクレオチド末端間にホスホジエステル結合の形成がもたらされる。種々の実施形態において、ライゲーションは、ポリヌクレオチド末端の共有結合をもたらす任意の酵素、化学物質または工程によって媒介され得る。特定の実施形態において、ライゲーションはリガーゼ酵素によって媒介される。
【００９１】
「リガーゼ」とは、本明細書で使用するとき、１つのポリヌクレオチドの３’ヒドロキシル基を第２のポリヌクレオチドの５’リン酸基に共有結合させ得る酵素をいう。リガーゼの例としては、Ｅ．コリＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどが挙げられる。
【００９２】
ライゲーション反応は、ＤＮＡ増幅法において、例えば「リガーゼ連鎖反応」（ＬＣＲ）（「リガーゼ増幅反応」（ＬＡＲ）とも称される、参照により本明細書に組み込まれるＢａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８：１８９（１９９１）；およびＷｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０（１９８９）を参照されたい。）において使用され得る。ＬＣＲでは、２つの隣接しているオリゴヌクレオチド（これは、独自に標的ＤＮＡの一方の鎖にハイブリダイズする。）と相補的な一組の隣接しているオリゴヌクレオチド（これは、反対側の鎖にハイブリダイズする。）の４種類のオリゴヌクレオチドを混合し、この混合物にＤＮＡリガーゼを添加する。標的配列の存在下では、ＤＮＡリガーゼは、ハイブリダイズした分子のセットの各々を共有結合させる。重要なことに、ＬＣＲでは、２つのオリゴヌクレオチドは、ギャップがない配列と塩基対形成した場合のみ互いにライゲーションされる。変性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの反復サイクルによりＤＮＡの短鎖セグメントが増幅される。隣接しているオリゴヌクレオチド間の連結部におけるミスマッチはライゲーションを阻害する。他のオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイと同様、この特性により、ＬＣＲをＳＮＰなどのバリアント対立遺伝子間の識別に使用することが可能になる。また、ＬＣＲは、一塩基変化の検出の向上を得るためにＰＣＲと併用して使用されている。Ｓｅｇｅｖ、国際公開第９００１０６９号（１９９０）を参照されたい。
【００９３】
用語「未修飾形態」は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとの関連で、宿主細胞においてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを発現する宿主細胞特異的なコドン最適化されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を定義する目的で本明細書において使用される用語である。用語「未修飾形態」は、天然に存在するポリメラーゼのアミノ酸配列を有する機能性ＤＮＡポリメラーゼを指す。用語「未修飾形態」は、組換え形態の機能性ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【００９４】
用語「突然変異体」は、開示されているＤＮＡポリメラーゼとの関連で、ＤＮＡポリメラーゼの対応する天然に存在する形態または未修飾形態と比較して、１つ以上のアミノ酸置換を含む、典型的には組換えの、ポリペプチドを意味する。
【００９５】
「組換え体」とは、本明細書で使用するとき、組換え法により意図的に修飾されたアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。本明細書において「組換え核酸」という用語は、一般的に、エンドヌクレアーゼによる核酸の操作により、通常、天然には見られない形で、元々はインビトロで生成された核酸を意味する。したがって、直鎖状の単離された突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ核酸、または通常は結合しないＤＮＡ分子をライゲートさせることによりインビトロで形成された発現ベクターは、いずれも本発明の目的の組換え体とみなす。組換え核酸を作製し、宿主細胞中に再導入されると、それは非組換え的に、すなわち、インビトロでの操作よりもむしろ宿主細胞のインビボの細胞機構を使用して複製する；しかしながら、このような核酸は、組換え的に生成されると、その後は非組換え的に複製されるが、それでも本発明の目的の組換え体とみなされることが理解される。「組換えタンパク質」は、組み換え技術を使用して、すなわち、上述した組換え核酸の発現を通じて作製されたタンパク質である。
【００９６】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合に「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結しており；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に作動可能に連結している。
【００９７】
用語「ベクター」は、典型的には、二本鎖のＤＮＡ断片を指し、外来ＤＮＡ断片がその中に挿入されていてもよい。または、ベクターは例えば、プラスミド由来であってもよい。ベクターは、宿主細胞内でベクターの自律複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含む。外来ＤＮＡは、宿主細胞中に本来存在しないＤＮＡである異種ＤＮＡとして定義され、それは例えば、ベクター分子を複製し、選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーをコードする、または導入遺伝子をコードする。ベクターは、外来または異種ＤＮＡを適切な宿主細胞に輸送するために使用される。宿主細胞に入ると、ベクターは、宿主の染色体ＤＮＡとは独立にまたはそれと同時に複製することができ、ベクターとその挿入ＤＮＡの複数のコピーを生成することができる。さらに、ベクターはまた、挿入ＤＮＡからｍＲＮＡ分子への転写を可能にする、または挿入ＤＮＡからＲＮＡの複数コピーを複製する、必要な因子を含むことができる。発現ベクターの中には、発現したｍＲＮＡの半減期を延ばし、および／またはｍＲＮＡからのタンパク質分子への翻訳を可能にする、挿入ＤＮＡに隣接した配列因子をさらに含むものもある。このように、挿入ＤＮＡによりコードされるｍＲＮＡとポリペプチドの多数の分子を迅速に合成することができる。
【００９８】
用語「アフィニティタグ」は、ポリペプチド配列の検出および／または選択を可能にする短いポリペプチド配列を指す。本開示の目的で、組換えＤＮＡポリメラーゼをコードする組換え遺伝子はアフィニティタグを含んでもよい。具体的には、アフィニティタグは、組み換え技術の使用を通じて、ＤＮＡポリメラーゼのコード配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかに典型的に配置される。例示的なアフィニティタグには、とりわけ、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｎｅ）（例えば、（Ｈｉｓ６））、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸タグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグが含まれる。
【００９９】
用語「宿主細胞」とは、細胞培養において増殖させる際の単細胞原核生物と真核生物の両方（例えば、細菌、酵母および放線菌類）、ならびにより高等の植物または動物由来の単細胞を指す。例示的な適した宿主細胞には、Ｅ．コリ、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびＳ．フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）が含まれる。
【０１００】
本明細書で使用するとき、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウを通じて２つの最適にアラインメントさせた配列を比較することにより決定され、ここで、比較ウィンドウ中の配列部分は、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（付加または欠失を含まない。）と比較して、付加または欠失（すなわちギャップ）を含むことができる。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を求め、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で割り、その結果を１００倍して配列同一性のパーセンテージを求めることにより算出される。
【０１０１】
用語「同一の」または「同一性」は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列との関連で、同じである２つ以上の配列または部分配列を指す。比較ウィンドウ、または下記の配列比較アルゴリズムの１つを使用してもしくは手作業でのアラインメントと目視検査により測定するよう指定された領域にわたって、最大の対応となるように比較、アラインメントした場合に、配列が同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を特定のパーセンテージで有する場合（例えば、特定の領域にわたって少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性）、配列は互いに「実質的に同一」である。また、これらの定義は試験配列の相補体にも言及する。場合によって、同一性は、少なくとも長さ約５０ヌクレオチド、またはより典型的には長さ１００から５００もしくは１０００以上のヌクレオチドの領域にわたって存在する。
【０１０２】
用語「類似性」または「類似性パーセント」は、２つ以上のポリペプチド配列との関連で、比較ウィンドウ、または下記の配列比較アルゴリズムの１つを使用してもしくは手作業でのアラインメントと目視検査により測定するよう指定された領域にわたって、最大の対応となるように比較、アラインメントした場合に、保存されたアミノ酸置換により定義されるものと同一または類似のアミノ酸残基を特定の割合（例えば、特定領域にわたって６０％の類似性、場合によって６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の類似性）で有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％または少なくとも５５％が互いに類似している場合、配列は互いに「実質的に類似」している。場合によって、この類似性は、少なくとも長さ約５０アミノ酸、より典型的には少なくとも長さ約１００から５００または１０００以上のアミノ酸の領域にわたって存在する。
【０１０３】
配列比較に関して、典型的には、１つの配列を参照配列とし、試験配列をその参照配列と比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータが通常使用されるが、または代替パラメータを指定することもできる。続いて、プログラムパラメータに基づき、配列比較アルゴリズムが参照配列に対する試験配列の配列同一性または類似性のパーセントを算出する。
【０１０４】
「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用するとき、２０から６００、一般的には約５０から約２００、より一般的には約１００から約１５０からなる群から選択される連続する位置の数のいずれか１つのセグメントを指すことを含み、ここでは、２つの配列を最適にアラインメントした後で、配列を同じ数の連続する位置の参照配列と比較してもよい。比較のための配列のアラインメント法は当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２：４８２、１９７０）、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３、１９７０）、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４、１９８８）、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）または手作業でのアラインメントおよび目視検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５  補遺）を参照されたい）により実施することができる。
【０１０５】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適切なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９−４０２頁、１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−１０頁、１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウエアは、公衆に利用可能なオンラインおよびインターネットデータベース、ならびに米国国立衛生研究所（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）の国立医学図書館内の国立生物工学情報センターを介して公衆に利用可能である。
【０１０６】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体の合理的設計
上記で概説したように、天然に存在するＤＮＡポリメラーゼを使用しながら、過去において最も頻繁にプライマーに導入された修飾を伴う、単一ヌクレオチド多型の同一性に基づいて、多くの戦略が、特定の核酸配列を選択的に増幅するポリメラーゼ連鎖反応の識別を改善するために開発されてきた。プライマー核酸の３’末端でのマッチとミスマッチ間を識別するＤＮＡポリメラーゼの能力は限定され、存在する特定の塩基対の同一性により大きく変化する。ＰＣＲ増幅の選択性を改善するための別の戦略は、鋳型核酸に対してマッチであるプライマーと、鋳型核酸に対して末端ミスマッチを有するプライマー間の識別を改善するためにＤＮＡポリメラーゼの特性を変更することである。本発明は、プライマーの３’末端で塩基対形成をするための改善されたミスマッチ識別を有するＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を提供し、次の増幅反応の改善された特異性をもたらす。
【０１０７】
ｒｈＰＣＲ法は、増幅が開始し得る前に、ＲＮａｓｅ  Ｈ２の作用によりブロック解除されなければならないブロック型切断性プライマーを採用する。酵素ブロック解除ステップは、典型的には、ＳＮＰ部位に配置されている、プライマー内の単一の内部ＲＮＡ塩基での切断を必要とする。ＲＮａｓｅ  Ｈ２は５’側でＲＮＡを切断し、ＰＣＲをプライミングすることができる３’−ヒドロキシルを有するプライマーを残す。ＲＮａｓｅ  Ｈ２による切断は、プライマーが鋳型にマッチする場合には高効率で生じ、ミスマッチがＳＮＰにより存在する場合には低効率で生じる。したがって、マッチ鋳型は、ミスマッチ鋳型よりも高い効率で増幅される。ミスマッチ鋳型の増幅を可能にする主要なメカニズムは、ＲＮＡ残基の３’側で基質（すなわち、ブロック型切断性プライマー）の代替の切断から始まり、ミスマッチが存在する場合には不適切なプライミング、プライマーにおけるＲＮＡ塩基の保持、およびＰＣＲ産物のプライマー配列への変換をもたらし、次に、続くＰＣＲサイクルにおいてマッチとして忠実に複製すると考えられる。ｒｈＰＣＲプロセスの忠実度は、３’−ＲＮＡ残基を有するプライマーからＤＮＡ合成を開始する能力を制限する、ＤＮＡポリメラーゼの改善を通じて改善することができる。本発明は、３’−ＲＮＡ含有プライマーからのＤＮＡ合成を開始する能力が減少したＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を提供し、次の増幅反応の改善された特異性をもたらす。
【０１０８】
本発明は、プライマー核酸の３’末端で塩基同一性について改善された識別を有する新規なＤＮＡポリメラーゼ突然変異体および／または３’ＲＮＡ残基からプライミング効率を減少させたＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を含む。
【０１０９】
新規な設計戦略は、天然のＤＮＡポリメラーゼの識別と比較して、プライマーの３’末端塩基で改善された識別を有するＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を合理的に設計するために開発され、ミスマッチが存在するまたはＲＮＡ残基が存在する場合、ＤＮＡ合成を開始する能力を制限する。本明細書に記載された方法は、親酵素としてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを採用した；このアプローチは、特に結晶構造が公知である場合、他のＤＮＡポリメラーゼに適用することができる。設計戦略は、天然のＤＮＡポリメラーゼ、およびより少ない程度に、アミノ酸配列が異なる関連したポリメラーゼに関する生物物理学的、生化学的および遺伝情報の理論的分析に基づいて、第１の構成要素を含む。設計戦略は、３’−ヌクレオチド識別を改善するこの場合には、新しい特性を突然変異体ポリメラーゼに合理的に工学的操作する試みにおいて新規な突然変異の効果を予測する際のガイドとして支援するために、公知の遺伝子操作された突然変異体ポリメラーゼの分子生物学的および生化学的分析に基づいて第２の構成要素を含む。
【０１１０】
第１の段階において、公開された突然変異の構造−活性相関（ＳＡＲ）の研究に基づいてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの酵素反応メカニズムを分析し、公知である場合、タンパク質の構造と相関させ、公知でない場合、分子動力学シミュレーションを使用して予測した。酵素触媒メカニズムは、先行技術において報告されている（Ｐａｔｅｌ，Ｐ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２００１、３０８：８２３−８３７頁；Ｌｉ，Ｙ．＆Ｗａｋｓｍａｎ，Ｇ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ２００１、１０：１２２５−１２３３頁）。４２４位から８３２位までのＣ末端に位置したアミノ酸残基は、タンパク質のプライマー伸長触媒活性に関与している。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、二成分複合体を形成するためのプライマー−鋳型二重鎖に結合する。これは、プライマーの３’末端にポケットにおいて、入ってくる基質のｄＮＴＰが結合し得、開いた三重複合体を形成する。ｄＮＴＰが鋳型ヌクレオチドに相補的である場合、活性部位は立体配座を変化させ、この場合、残基６５９から６７１で作られるα−ヘリックスがその部位に向かって回転し、鋳型塩基は、入ってくるｄＮＴＰに向かって回転し、ワトソン−クリック塩基対の形成を促進する。この事象は、三重複合体を「閉じて」、プライマーの３’−ＯＨ基に近いｄＮＴＰのα−リン酸基をもたらす。このヒドロキシル基の酸素は、リンにおける求核攻撃を行い、共有結合を形成し、ピロリン酸が放出される。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの触媒活性は、攻撃するヒドロキシル基の脱プロトン化を促進するために想定されるマグネシウムイオンの存在を必要とする。
【０１１１】
改善された３’−ヌクレオチド識別を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体の合理的な設計のための１つの基準は、天然のＤＮＡポリメラーゼと比較して、正常なまたは正常に近いポリメラーゼ処理能力を有する新規なポリメラーゼ酵素変異体を提供することである。この理由のため、分析の第１のステップは、コア酵素機能を損なうべきではない変化のために利用可能なアミノ酸の配列スペースを狭くするのに役立つ。例えば、残基Ｄ６１０、Ｄ７８５およびＥ７８６は触媒コアを形成する。これらのカルボン酸基は、二価金属イオンに結合し、順番に、入ってくるｄＮＴＰおよびプライマーの末端ヌクレオチドに結合し、安定化することが想定される。これらの３つの必須残基の突然変異は、ポリメラーゼを非活性化にする可能性がある。したがって、残基Ｄ６１０、Ｄ７８５およびＥ７８６の変更を含む突然変異体ポリメラーゼは、考察から除外された。同様に、相補的な塩基認識の忠実度に影響を及ぼす突然変異体、例えば、相補的ｄＮＴＰで閉鎖した三重複合体形成に対して開放を促進する残基、および鋳型塩基を考察から除外された。
【０１１２】
分析の第１の段階の追加の基準は、プライマーの３’末端ヌクレオチドの近傍でポリメラーゼのアミノ酸残基を同定することであった。この目的のため、先行技術（Ｅｏｍ，Ｓ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６、３８２：２７８−２８１頁；Ｌｉ，Ｙ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９８、１７：７５１４−７５２５頁；Ｄｏｕｂｌｉｅ，Ｓ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １９９９、７：Ｒ３１−Ｒ３５頁；Ｌｉ，Ｙ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １９９８、７：１１１６−１１２３頁）から利用可能であるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの原子三次元構造を分析のために選択した。プロテインデータバンク（Ｈ．Ｍ．Ｂｅｒｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００、２８：２３５−２４２頁）から構造をダウンロードした。プライマーおよび鋳型核酸と共結晶されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの大きなフラグメントの開閉の三重複合体を示すため（Ｌｉ，Ｙ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９８、１７：７５１４−７５２５頁）、ＰＤＢ  ＩＤ  ２ＫＴＱと３ＫＴＱの構造を徹底的に分析した。この構造は、活性部位でのプライマー３’末端の位置と、主要なアミノ酸残基との相互作用を示す（図１）。
【０１１３】
構造の可視化のために、２’炭素に結合した水素原子は、３’−リボヌクレオチドで修飾されたプライマーについてヒドロキシル基で置換される。プライマーの３’末端でのヌクレオチドの２’炭素に近接しているこれらのアミノ酸残基を追加の分析のために選択した。これらのアミノ酸残基は表２に列挙され、プライマーの３’−末端ヌクレオチドと相互作用する可能性が高い。ＯＨのようなプライマー修飾がリボースの２’炭素原子に結合されるとき、これらの部位の突然変異はポリメラーゼの触媒活性に影響を及ぼし得る。
【０１１４】
【表２】
2019216723.tif 000004
【０１１５】
この基準のさらなる態様は、ポリメラーゼの触媒活性を保持しながら、特異性を高めるためのアプローチに関する。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの特異性を増加させるための１つのアプローチは、結合ポケットのサイズを減少させることであり、それにより、修飾されたプライマーはその中に収まらない。任意の追加の化学基は、３’ヌクレオチドによって占有される空間体積を増加させる。効果的な触媒および求核攻撃のための原子を並べるために、活性部位ポケットは、追加の一又は複数の原子、例えば、ＲＮＡ残基のＯＨ基の酸素を適合させるために柔軟でなければならない。活性部位の大きさは、隣接アミノ酸をより大きいアミノ酸で置換することによって減少させることができる。さらなる考察は、静電的相互作用およびファンデルワールス相互作用に関与するアミノ酸特性とこれらの側鎖の能力に与えられる。アミノ酸は、正に荷電した側鎖（Ｒ、Ｈ、Ｋ）、負に荷電した側鎖（Ｄ、Ｅ）、非荷電極性側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）、疎水性側鎖（Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）および特別な側鎖（Ｃ、Ｇ、Ｐ）の群に分類することができる。群内の突然変異は、保存的であり、既存の特性を維持する可能性が高く、一方、群全体または特別の群のアミノ酸内での突然変異は、酵素活性および／または特異性の実質的な変化をもたらす可能性が高い。
【０１１６】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの３’−ヌクレオチド識別を増加するための別のアプローチは、結合ポケットの柔軟性を低下させる残基置換を採用することである。例としては、芳香族側鎖を用いたアミノ酸脂肪族側鎖の置換を含み、これは、回転異性体の立体構造を変更するために、より高いエネルギー障壁をもたらす。上記で説明したように、触媒コアの残基は、好ましくは変更されず、空間的に触媒コアに近い残基は、変化のために最大の注意が払われる。例えば、表２の３つの非触媒コア残基であるＨ７８４、Ｖ７８３およびＲ５７３は、側鎖の一般的な物理的特徴を維持しながら、多かれ少なかれ柔軟なアミノ酸について置換されることが本明細書において提案される。これらの残基は、水媒介性水素結合ネットワークを介してプライマーのリボース部分と主要な相互作用を示す。また、Ｒ５７３は、プライマー−鋳型の二重鎖の副溝内のプライマー塩基に結合する。この戦略を使用して、突然変異体ＩＤ１からＩＤ４を設計した（表３）。次の変異体であるＩＤ  ５、Ｑ５８２Ｋは、重要なＨ７８４残基との相互作用およびその残基の位置を変更するように設計された。これは、Ｑ５８２がオリゴヌクレオチドプライマーからＨ７８４の反対側に位置している公知の結晶構造から分かる。Ｑ５８２Ｈの置換は、末端プライマーのヌクレオチドに向けてＨ７８４をシフトさせ、より多くの制約結合ポケットをもたらし得る。また、末端から２番目のヌクレオチドとの残基５８２の相互作用はまた影響を受ける可能性がある。
【０１１７】
また、入ってくるｄＮＴＰ分子上にスタックする残基は、ポリメラーゼ活性部位の結合ポケットの大きさに影響を与え得る。例えば、この位置にあるＦ６６７の置換は、入ってくるｄＮＴＰに対する選択性を変化させることが知られている。例えば、Ｆ６６７Ｙ置換は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによるジデオキシヌクレオシド三リン酸の取り込みを有意に改善し（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．＆  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９５、９２：６３３９−６３４３頁）、サンガー法ターミネーターＤＮＡ配列決定に採用されるＤＮＡポリメラーゼの有用な特性である。突然変異体ＩＤ６は、プライマー末端リボヌクレオチドに対してのｄＮＴＰを押し、２’ヒドロキシル基を収容する結合ポケットの能力を減少させる試みにおいて、フェニルアラニンからトリプトファンのＦ６６７の芳香族側鎖の大きさを増加させ、それにより、３’−ＲＮＡ残基を含有するこの突然変異体にバイアスをかける。突然変異体ＩＤ７は、類似した概念のフレームワークに基づいて設計された。Ｈ６３９は、Ｆ６６７のアミノ酸と相互作用し、Ｈ６３９Ｗ突然変異体はまた、入ってくるｄＮＴＰに向けてＦ６６７を押す場合がある。
【０１１８】
追加の突然変異体は、ポリメラーゼの結合ポケットの大きさを効果的に減少させることができると考えられた。突然変異体ＩＤ８から１６は、「緩和した特異性」突然変異型ポリメラーゼの公表された研究に基づいて、負の推論的分析から設計された。突然変異体は、入ってくるｄＮＴＰのリボースに向かってポリメラーゼ特異性を変更し得ることが報告されている。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体が報告されている先行技術は、選択またはスクリーニングにいずれかを介して大きなランダムライブラリーから進化した。Ｃｈｅｎらは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼがｄＮＴＰとリボース３’炭素原子上の大きな置換を組み合わせることを可能にする突然変異を報告した（Ｃｈｅｎ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２０１０、１０７：１９４８−１９５３頁）。この残基は、Ｆ６６７とも相互作用するため、重要であることが見出された。置換Ｌ６１６Ａは、フェニルアラニン残基に多くのスペースを与えることによって特異性を減少させる。突然変異体ＩＤ８（Ｌ６１６Ｍ）は、反対の効果を生じさせるように設計された。メチオニン置換は、ロイシンと比較して、この部位での立体病気を僅かに増加させ得る。この制限は、活性部位が、ｄＮＴＰまたはプライマーヌクレオチドにおいて余分な置換基を収納する可能性を低くさせてもよく、これは、３’−ＲＮＡを含有するプライマーまたは鋳型に対してミスマッチを有するプライマーの活性を減少させることができ、おそらくは鋳型核酸に対して完全なミスマッチを有するプライマーよりも多くの空間を占有する。
【０１１９】
類似した概念のフレームワークは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体ＩＤ９を設計するために適用された。突然変異Ｉ６１４Ｅ、Ｅ６１５Ｇは、活性部位ポケットを緩和し、そのため、ポリメラーゼは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド三リン酸を用いてプライマーを伸長し得ることが報告された（Ｆａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００４、１２６：１７４８−１７５４頁）。これらの突然変異の性質は、本質的には、残基６１５から６１４のグルタミン酸のシフトである。したがって、反対方向のシフトであるＥ６１５Ｌ、Ｌ６１６Ｅは、活性部位で制約を課し、リボヌクレオチド残基を受け入れないＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を生成し得る。
【０１２０】
３’−ヌクレオチド識別を増加させるための別のアプローチは、塩基選択の忠実度を増加させ、誤対合の塩基対の取り込みを減少させるアミノ酸置換（すなわち、複製忠実度を改善させる突然変異）を報告したＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ研究において同定された、対象とする部位に焦点をあてることである。これらの変化は、同様に、末端プライマーヌクレオチドの修飾に関して、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの選択性に潜在的に影響を及ぼし得る。忠実度を改善することが報告された１つの位置は、Ｆ６６７残基および隣接アミノ酸を伴う（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２０００、２７５：３２７２８−３２７３５頁）。潜在的な対象とする別の部位には、必須アスパラギン酸残基に隣接する残基７８２から７８４を含む（Ｓｔｒｅｒａｔｈ，Ｍ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２００７、８：３９５−４０１頁）。突然変異体ＩＤ１０からＩＤ１３は、これらの位置でアミノ酸の特徴を変更するために設計された。プライマーの末端塩基と相互作用し、入ってくるｄＮＴＰの塩基上にスタックするため、Ｆ６６７は特異性に影響を及ぼす；この残基はＯ−ヘリックスに存在する。残基Ｉ６６５およびＡ６６１は、ヘリックスの反対側に位置される。そのものからより大きなアミノ酸への突然変異（Ａ６６１Ｅ、Ｉ６６５Ｗ）は、活性部位に向けてＯ−ヘリックスを移動させることができ、活性ポケットの大きさを限定し、誤対合塩基またはＲＮＡ残基（突然変異体ＩＤ１０：Ａ６６１Ｅ、Ｉ６６５Ｗ、Ｆ６６７Ｌ）をポリメラーゼが受け入れる能力を制限する。
【０１２１】
また、異なるポリメラーゼの突然変異誘発研究から得られたデータは、修飾のための選択位置を助けるために使用することができるが、このデータの使用は、結晶構造の不在下またはポリメラーゼ間の効果が異なる可能性に起因してより困難である。エシェリキア・コリ由来のポリメラーゼＩ（「Ｅ．コリＰｏｌ」）は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと比較した場合、活性部位で幾分類似した構造を示し、同一の本質的な触媒残基を維持する。両タンパク質配列は、高度の相同性を示す（Ｌｉ，Ｙ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９８、１７：７５１４−７５２５頁）。したがって、エシェリキア・コリＤＮＡポリメラーゼに関して報告された突然変異はまた、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにおいて対応する位置にアミノ酸位置を外挿することにより考慮された。例えば、三重のアミノ酸置換であるＱ８７９Ｐ、Ｖ８８０Ｌ、Ｈ８８１Ｑは、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼの塩基忠実度を改善した（Ｓｕｍｍｅｒｅｒ，Ｄ．ら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００５、４４：４７１２−４７１５頁）。突然変異体ＩＤ１４における置換は、このＥ．コリ残基の三重に対応するように見える、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ活性部位中のＱ７８２、Ｖ７８３、Ｈ７８４での置換を含む。
【０１２２】
Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼにおけるさらなるいくつかの置換は公知であり、プライマー伸長の特異性を減少または増加する（Ｍｉｎｎｉｃｋ，Ｄ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９、２７４：３０６７−３０７５頁）。突然変異体Ｑ８４９ＡおよびＲ７５４Ａは忠実度を改善させた。これらは、それぞれ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ活性部位におけるＱ７５４とＲ６５９に同等の位置を有する。アルギニン６５９は、鋳型塩基に相補的な塩基の選択に大きな影響を与える。これは、ポリメラーゼＡファミリーにおいて一般的な特徴であるようだ。例えば、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ポリメラーゼＩにおいて、同等の残基はＲ７２２である。この残基のヒスチジンへの突然変異は、このポリメラーゼの忠実度を増加させる（Ｙａｎｇ，Ｓ．Ｗ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００２、３０：４３１４−４３２０頁）。これら２つの残基はまた、研究のために選択された（表３の突然変異体ＩＤ１５および１６）。突然変異体ＩＤ１７は、突然変異体ＩＤ２および３において研究された突然変異の組み合わせを表す。突然変異体ＩＤ１８は、Ｑ７８２突然変異の排除により、二重突然変異体（Ｖ７８３Ｌ、Ｈ７８４Ｈ）に減らされた三重突然変異体ＩＤ１４（Ｑ７８２Ｐ、Ｖ７８３Ｌ、Ｈ７８４Ｑ）の修飾を表す；Ｑ残基に対するあまり柔軟性でないＰの置換は、機能を変更する有意な構造摂動を引き起こす可能性があり、突然変異体ＩＤ１８はこの問題を避けることができる。最初の試験は、Ｈ７８４位の１を超える突然変異が改善されたミスマッチ識別を示したことを指示し、この位置がプライマー特異性を決定するために一般的に重要であることが示唆された。したがって、この部位におけるアミノ酸置換の包括的な研究が行われ、突然変異体ＩＤ１９−３６を含む。
【０１２３】
【表３】
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【０１２４】
設計戦略の第２の構成要素は、改善された３‘−ヌクレオチド識別を有する新規な酵素を同定するために、遺伝子操作されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体の分子生物学的および生化学的分析を含む。これは、細菌Ｅ．コリなどの適切な宿主において天然のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび一連の設計された突然変異体の発現を必要とする。発現を最大化するために、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする天然の遺伝子配列のコドンを変更し、この生物のための標準的なコドン使用頻度表を使用して、Ｅ．コリにおける発現のために最適化した（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．、Ｇｏｊｏｂｏｒｉ，Ｔ．およびＩｋｅｍｕｒａ，Ｔ．、（２０００）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２８：２９２を参照されたい。）。コドン最適化は、発現されたタンパク質のアミノ酸配列を変更させない。変更されていないＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼペプチドをコードするコドン最適化遺伝子の組換え形態は、標準的な方法を用いて合成オリゴヌクレオチドから作製された人工遺伝子としてプラスミドベクターに組み込まれ、クローニングされた（実施例１）。この目的のためのプラスミドベクターは、当該技術分野において日常的に利用可能な任意のプラスミドベクターであり得る。特定された所望のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体のシリーズの合成組換え形態（表３、突然変異体ＩＤ１−３６）は、当業者に周知な技術を使用して、部位特異的突然変異誘発（ＳＤＭ）の基質として、先に組み込まれたコドン最適化された組換え天然のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの部位特異的突然変異誘発によって調製された（実施例１）。未修飾および突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、適切な転写および翻訳制御要素に作動可能に連結された遺伝子の対応する組換え形態を含有する発現ベクターの導入後にＥ．コリ宿主細胞から調製された。
【０１２５】
未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの酵素特性は、プライマー伸長アッセイ、熱安定性、ＰＣＲアッセイ、対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイ、３’−リボヌクレオチドを有するプライマーを使用する能力、ならびにｒｈＰＣＲアッセイにおける使用に対するそれらの適合性について評価された。突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、酵素特性の４つのカテゴリー：（１）不活性化ポリメラーゼ活性；（２）通常のポリメラーゼ活性；（３）改善された３’−ヌクレオチド識別活性であるが、減少した活性（例えば、減少した処理能力）を有する；ならびに（４）改善された３’−ヌクレオチド識別、および正常なまたは正常に近い活性を有する（例えば、天然のポリメラーゼと同等の処理能力）のうちの１つを示した。
【０１２６】
酵素特性の第４のカテゴリーを有する突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、同等または増大した３’−ミスマッチ識別（換言すると、野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと比較したとき、標準プライマー伸長アッセイおよび対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイにおける同等または増大した性能）；増大した３’−ヌクレオチド識別（換言すると、野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと比較したとき、ＲＮＡ含有プライマーを含む鋳型から減少したプライマー伸長活性）、および増大した低頻度対立遺伝子識別（例えば、野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと比較したとき、ｒｈＰＣＲアッセイにおける改善された特異性）を示した。これらの突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、以下の残基位置：（１）Ａ６６１Ｅ；Ｉ６６５Ｗ；Ｆ６６７Ｌ三重置換突然変異体ペプチド（表３の突然変異体ＩＤ１０）；（２）Ｖ７８３Ｆ単一置換突然変異体ペプチド（表３の突然変異体ＩＤ２）；Ｈ７８４Ｑ単一置換突然変異体ペプチド（表３の突然変異体ＩＤ３）；およびＶ７８３Ｌ；Ｈ７８４Ｑ二重置換突然変異体ペプチド（表３の突然変異体ＩＤ１８）、Ｈ７８４Ａ、単一置換突然変異体ペプチド（表３の突然変異体ＩＤ２０）；Ｈ７８４Ｓ、単一置換突然変異体ペプチド（表３の突然変異体ＩＤ２１）；Ｈ７８４Ｔ、単一置換突然変異体ペプチド（表３の突然変異体ＩＤ２２）；Ｈ７８４Ｖ、単一置換突然変異体ペプチド（表３の突然変異体ＩＤ２４）；Ｈ７８４Ｉ、単一置換突然変異体ペプチド（表３の突然変異体ＩＤ２６）；Ｈ７８４Ｍ、単一置換突然変異体ペプチド（表３の突然変異体ＩＤ２７）；Ｈ７８４Ｆ、単一置換突然変異体ペプチド（表３の突然変異体ＩＤ２９）；およびＨ７８４Ｙ単一置換突然変異体ペプチド（表３の突然変異体ＩＤ３０）の１つで突然変異を含む。
【０１２７】
このように、新規な設計アルゴリズムは、プライマー中の３’−ＲＮＡ残基の有無にかかわらずに鋳型を利用する、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、低頻度対立遺伝子検出アッセイおよびｒｈＰＣＲアッセイにおけるポリメラーゼ活性によってみなされるように、改善された３’−ヌクレオチド識別を有する突然変異体ＤＮＡポリメラーゼを予測するために強固なアプローチを提供する。具体的には、残基Ｖ７８３およびＨ７８４は、プライマーオリゴヌクレオチドの３’−塩基の状態（例えば、この残基が鋳型とマッチするもしくはマッチしないかどうか、および／またはこの残基はＤＮＡもしくはＲＮＡであるかどうか）を調べるためにポリメラーゼの能力に影響を与える重要な残基として同定された。ポリメラーゼ機能におけるこれらの残基の重要性はこれまで認識されていなかった。実施例において直接試験する突然変異に加えて、本発明はまた、これらの２つの位置で他のアミノ酸置換、またはＶ７８３とＨ７８４部位の両方に影響を及ぼす二重突然変異を意図する。
【０１２８】
これらの突然変異体の特性は、本明細書に示された実施例においてさらに記載される。しかしながら、重要なことには、本明細書において採用される設計戦略は、以前には認識されていないもしくは予期された、または他のアプローチ（例えば、系統学的比較分析またはランダム突然変異誘発を使用した以前の試み）を使用して得られなかった、新規のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体に対する機能的スペースにアクセスすることができる。
【０１２９】
残基位置７８３と７８４のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体の評価
本開示は、残基位置７８３および／または７８４の突然変異が、未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと比較して、増大した鋳型識別活性を有する活性なＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体をもたらすことを実証する。したがって、７８３または７８４の個々の位置で全ての考えられる単一アミノ酸置換、ならびに７８３と７８４の両方の位置で全ての考えられる二重アミノ酸置換を含む配列スペースの全体は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに関連する本開示の範囲内にある。したがって、増大した鋳型識別活性も有する１９個の単一残基７８３突然変異体、１９個の単一残基７８４突然変異体（表３、突然変異体ＩＤ１９−３０）および３６１個の二重残基７８３／７８４突然変異体の変異体のセットから選択される活性なＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体は、本開示の範囲内にある。
【０１３０】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは熱安定性酵素であるため、７８３と７８４残基位置で３９９個の単一および二重置換突然変異体の候補コレクションをスクリーニングする１つの容易なアプローチは、候補Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体酵素をコードする前処理された試料を用いてＰＣＲアッセイを行うことである。試料は、所望の組換えＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体遺伝子を発現する組換えＤＮＡで形質転換された個々のコロニーから得られる、選択された個々のコロニーまたは対応する微小培養物（例えば、５０μＬから１．０ｍＬ培養物）であり得る。前処理レジメンは、７０−９５℃で試料をプレインキュベートするステップ、続く、変性細胞破片を除去するために上清を清澄化するステップを含むことができる。標準的なＰＣＲアッセイ条件下で熱安定性ポリメラーゼ活性を発現する試料について、対応する組換えＤＮＡは、所望の組換えＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体遺伝子型およびさらなる生化学的分析のために精製されたポリメラーゼタンパク質の配列を確認するためにさらに特徴付けることができる。本開示の目的のために、同等のＰＣＲアッセイ条件下で、野生型のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって発現される、少なくとも０．０１のレベルで熱安定性ポリメラーゼ活性を発現するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体は、熱安定性ポリメラーゼ活性を有するようにみなされ得る。
【０１３１】
７８３および７８４残基位置でＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに機能的に相同な他の選択的ポリメラーゼ候補突然変異体の評価
比較系統発生分析ツールは、Ｖ７８３およびＨ７８４に対応する残基位置での未修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに相同な配列情報を有する他の熱活性ポリメラーゼの配列スペースを同定するために使用することができる。上記で説明したように、比較系統発生分析の強力な予測は、系統発生学的に多様な種全体でＤＮＡポリメラーゼ間に共有する構造配列が機能的な理由のために保存されているということである。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの同定されたＶ７８３／Ｈ７８４残基が多様な種由来の野生型ポリメラーゼ中で配列同一性において不変である場合、その観察は、それらの位置でのアミノ酸置換の特異的な変異に対して選択される性質が、本明細書に開示されている工学的に操作されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体の観察された、増大した鋳型識別活性をもたらすという結論を強く支持する。
【０１３２】
実施例１１は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた、広く配列同一性を共有する他種由来の候補野生型ＤＮＡポリメラーゼを同定するための比較ウィンドウとして、Ｖ７８３とＨ７８４位を包含するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ配列を使用した例示的なＢＬＡＳＴ検索を提供する。実施例１１においてさらに詳述されるように、ＢＬＡＳＴ結果は、多様な種由来の事実上すべての同定されたＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのＶ７８３とＨ７８４にオルソロガスな位置でＶａｌとＨｉｓを維持していたことを明らかにした。このように、ＢＬＡＳＴ結果は、増大された鋳型識別活性を有するＤＮＡポリメラーゼに対する天然の対抗選択を確認し、これらの特性を有する開示された、工学的に操作されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体は、新規および非自明であるという強力な証拠を提供する。工学的に操作されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体で観察されたものように、同定された非Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの各々は、それぞれの未修飾対応物と比較して、工学的に操作された突然変異酵素が生じ得て、増大された鋳型識別活性を有する配列スペースを表す。
【０１３３】
比較系統発生分析がより進化の遠い生物の配列スペースにアクセスすることができない場合において、比較生物物理学的結晶学的分析は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＶ７８３とＨ７８４に相同な機能を有する関連した配列残基に手がかりを提供することができる。上記で説明したように、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのＱ７８２、Ｖ７８３およびＨ７８４残基三重は、改善された塩基忠実度と、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに類似した活性部位構造とを有するＥ．コリＤＮＡポリメラーゼの対応する三重アミノ酸置換Ｑ８７９Ｐ、Ｖ８８０ＬおよびＨ８８１Ｑに基づいて、分析のために選択された。逆に、野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと比較して、Ｖ７８３およびＨ７８４のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体の顕著な増大した鋳型識別活性に基づいて、本発明は、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼのＶ８８０およびＨ８８１での対応する置換が、野生型Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼと比較して、増大された鋳型識別活性を有することを意図する。
【０１３４】
増大した鋳型識別活性を有する非ＶＨ関連ポリメラーゼ突然変異体の同定および特徴付け
ＤＮＡポリメラーゼの前述のコレクションは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのＶ７８３およびＨ７８４に対応する領域において広範囲に保存された配列を共有する（「ＶＨ関連ポリメラーゼ」）。比較生物物理学的分析は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのＶ７８３およびＨ７８４として機能的に相同な位置において異なるアミノ酸配列を有する野生型ＤＮＡポリメラーゼの同定に有用である（「非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼ」）。本開示は、ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼについて開示されたものと同じ方法で、これらの非ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼから増大した鋳型識別活性を有する突然変異体ポリメラーゼを工学的に操作することが意図される。増大した鋳型識別活性アッセイによる部位特異的突然変異誘発および分析についての候補非ＶＨ残基は、ポリメラーゼ：鋳型の共結晶構造において明らかにされるように、プライマー末端残基のＣ２’の０．４０−０．４５ｎｍ内のそれらの残基を含む。
【０１３５】
５’−エキソヌクレアーゼドメインの欠失を有する部位特異的Ｔａｑ  ＤＮＡ突然変異体の組み合わせ
本発明は、プライマーオリゴヌクレオチドの３’残基に位置したミスマッチの改善された識別および／またはプライマーオリゴヌクレオチドの３’末端におけるＲＮＡ残基の存在に対する識別を示す新規なＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を開示する。改善されたミスマッチ識別は、５’−エキソヌクレアーゼ活性を有するドメインを完全に除く、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの「ＫｌｅｎＴａｑ」欠失突然変異体について記載されている（Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ、１１２：２９−３５頁、１９９２）。本発明の新規な突然変異体とＫｌｅｎＴａｑ  ５’−エキソヌクレアーゼドメイン欠失の組み合わせは、ミスマッチ識別におけるさらなる改善をもたらす（実施例１８から２２）。しかしながら、この組み合わせは、二重突然変異体のこのファミリーの有用性を低減させ得る酵素活性における減少をもたらした。特にいくつかの状況において、特に、アンプリコンサイズが小さく、限定された処理能力が許容され得る場合、これらの突然変異体の増大した識別は利点を有する。
【０１３６】
反応混合物
別の態様において、増大した３’ヌクレオチド識別活性を有するポリメラーゼを含む反応混合物が提供される。反応混合物は、さらに、例えば、核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｒｈＰＣＲ）、ＤＮＡ配列決定手順、またはＤＮＡ標識手順において使用するための試薬を含むことができる。例えば、特定の実施形態において、反応混合物は、プライマー伸長反応に適切した緩衝液を含む。反応混合物はまた、鋳型核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）、１つ以上のプライマーまたはプローブポリヌクレオチド、ヌクレオシド三リン酸（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、標識ヌクレオチド、非従来型ヌクレオチドを含む。）、塩（例えば、Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋）、および標識（例えば、フルオロフォア）を含有し得る。いくつかの実施形態において、反応混合物は、さらに、二本鎖ＤＮＡ結合色素、例えば、ＳＹＢＲグリーン、または二本鎖ＤＮＡインターカレーティング色素、例えば、エチジウムブロマイドを含む。いくつかの実施形態において、反応混合物は、プライマー伸長条件下で所定のポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズすることができる５’センスプライマー、または５’センスプライマーと対応する３’アンチセンスプライマーを含むプライマー対を含有する。特定の実施形態において、反応混合物は、さらに、増幅鋳型核酸の検出のための蛍光ＦＲＥＴ加水分解プローブ、例えばＴａｑｍａｎ（登録商標）またはＰｒｉｍｅＴｉｍｅ（登録商標）プローブを含む。いくつかの実施形態において、反応混合物は、一塩基多型または複数のヌクレオチド多型に完全に相補的である２つ以上のプライマーを含有する。いくつかの実施形態において、反応混合物は、アルファ−ホスホロチオエートｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰおよび／または標識されたｄＮＴＰ、例えば、フルオレセインまたはシアニン色素ファミリーｄＮＴＰを含有する。いくつかの実施形態において、反応混合物は、ブロック型切断性プライマーおよびＲＮａｓｅ  Ｈ２を含有する。
【０１３７】
キット
別の態様において、本明細書に記載されるプライマー伸長方法において使用するためのキットが提供される。いくつかの実施形態において、キットは、使用の容易さが意図され、本開示に従って、３’−ヌクレオチド識別が増加した本発明のＤＮＡポリメラーゼを提供する少なくとも１つの容器を含む。また、追加の一又は複数の試薬を提供する１つ以上の追加の容器を含むことができる。このような追加の容器は、例えば、核酸増幅手順（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｒｈＰＣＲ）、ＤＮＡ配列決定手順、またはＤＮＡ標識手順において使用するための試薬を含む、上述された方法に従った、プライマー伸長手順において使用するための、当業者によって認識される任意の試薬または他のエレメントを含むことができる。例えば、特定の実施形態において、キットは、さらに、プライマー伸長条件下で所定のポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズすることができる５’センスプライマー、または５’センスプライマーと対応する３’アンチセンスプライマーを含むプライマー対を提供する容器を含む。いくつかの実施形態では、キットは、単一ヌクレオチド多型または複数のヌクレオチド多型に完全に相補的である１つ以上のプライマーを含有する１つ以上の容器を含み、ここで、プライマーは、上述のように複数の反応に有用である。いくつかの実施形態において、反応混合物は、ブロック型切断性プライマーを含有する１つ以上の容器を含有する。いくつかの実施形態において、反応混合物は、ＲＮａｓｅ  Ｈ２を含有する１つ以上の容器を含有する。他の非相互排他的な変形形態において、キットは、（従来型および／または非従来型）ヌクレオシド三リン酸を提供する１つ以上の容器を含む。具体的な実施形態において、キットは、アルファ−ホスホロチオエートｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰおよび／または標識されたｄＮＴＰ、例えば、フルオレセインまたはシアニン色素ファミリーｄＮＴＰを含む。さらに他の非相互排他的な実施形態において、キットは、プライマー伸長反応に適した緩衝液を提供する１つ以上の容器を含む。いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上の標識または非標識プローブを含む。プローブの例としては、二重標識されたＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）プローブおよび分子ビーコンプローブが含まれる。別の実施形態において、キットはアプタマーを含有し、例えば、ホットスタートＰＣＲアッセイ用のアプタマーを含有する。
【０１３８】
本開示は、増大した鋳型識別活性を有する新規なＤＮＡポリメラーゼを提供するキットを意図する。実施例においてより詳細に示されるように、それぞれのＤＮＡポリメラーゼは、増大した鋳型識別活性の固有の特徴を示すことができる。特定のＤＮＡポリメラーゼは、他の活性（３’ミスマッチ識別および低頻度対立遺伝子識別）と比較して、相対的に大きな３’ヌクレオチド識別を提示し得る。一方、他のＤＮＡポリメラーゼは、その他の活性（３’ヌクレオチド識別および３’ミスマッチ識別）と比較して、相対的に大きな低頻度対立遺伝子識別を提示することができ、さらに他のＤＮＡポリメラーゼは、その他の活性（３’ヌクレオチド識別および３’ミスマッチ識別）と比較して、相対的に大きな低頻度対立遺伝子識別を提示することができる。したがって、キットは、特定のアッセイプラットフォームに対して特定の増大した鋳型識別活性に最適に適合した活性プロファイルを有する特定のＤＮＡポリメラーゼの個々の容器を含むことができる。代替的に、キットは、複数のアッセイプラットフォームに必要とされるように、増大した鋳型識別活性を調整するために最適に適合された活性プロファイルを有する複数のＤＮＡポリメラーゼを含む単一の容器を含むことができる。
【実施例】
【０１３９】
本発明は、以下の実施例を参照してさらに例証される。しかしながら、これらの実施例は、上述した実施形態と同様に例示的なものであり、決して本発明の有効範囲を制限するものとして解釈されるべきではないことに留意すべきである。
【０１４０】
［実施例１］
サーマス・アクアティカス由来のコドン最適化されたＤＮＡポリメラーゼのクローニングおよび発現
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列および遺伝子配列は公知である（表１、配列番号１および２）。コドン使用頻度は生物間で異なるため、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする天然の遺伝子配列のコドンは標準的なコドン使用頻度表を使用して、Ｅ．コリにおける発現のために最適化された（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，Ｇｏｊｏｂｏｒｉ，Ｔ．およびＩｋｅｍｕｒａ，Ｔ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２）；同義語コドン変化は、２０アミノ酸ストレッチ全体で同一コドンの反復使用を避けるために導入された。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ未修飾ペプチドをコードする組換えコドン最適化遺伝子は、標準的な方法を使用して、合成オリゴヌクレオチドから組み立てられた。遺伝子は３つのフラグメントで作られ、各々はプラスミドベクターにサブクローニングされた；配列を表４に示す（配列番号３−５）。配列同一性をサンガーＤＮＡ配列決定によって確認した。３つのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼサブフラグメントは、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリー法（Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３４３−３４５頁（２００９））を使用して一緒に組み立てられ、末端ＮｄｅＩとＮｏｔＩ制限部位を使用してプラスミド発現ベクターｐＥＴ−２７ｂ（＋）にクローニングされ、最終の全長コドン最適化Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（「ＯｐｔｉＴａｑ」と称する。）を作製した。配列をサンガーＤＮＡ配列決定により確認した；配列を表４に示す（配列番号６）。新しいコドン最適化遺伝子の翻訳されたアミノ酸配列は、天然のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと同一である（表１、配列番号１）。
【０１４１】
【表４】
2019216723.tif 000007
2019216723.tif 000008
2019216723.tif 000009
【０１４２】
［実施例２］
コドン最適化されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体の生成
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの１８個の突然変異体バージョン（表３、ＭＵＴ  ＩＤ１−１８）は、クローニングされたＯｐｔｉＴａｑコドン最適化Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの部位特異的突然変異誘発によって作製された。特定の突然変異は、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発法を使用してＯｐｔｉＴａｑ配列に導入された（Ｗｅｉｎｅｒ  ＭＰら、Ｇｅｎｅ．、１５１（１−２）：１１９−２３頁（１９９４））。それぞれの突然変異誘発反応は、１×ＫＯＤ  ＰＣＲ緩衝液中の、二本鎖ＯｐｔｉＴａｑプラスミド（２０ｎｇ）にアニーリングされた、所望の塩基変化を含有する１０ｐｍｏｌの２つの相補性オリゴヌクレオチド（表５）、５Ｕ  ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ−ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、１．５ｍＭのＭｇＳＯ４を採用した。熱サイクルパラメータは、９５℃で３分間（９５℃で２０秒間−５５℃で２０秒間−７０℃で２．５分間）の１６サイクル、続く、７０℃で４分間の浸漬であった。ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発後、増幅産物を３７℃で１時間、１０ＵのＤｐｎＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｓｈ、ＭＡ）で処理し、その後、８０℃で２０分間不活性化を行った。１１０分の１の消化材料をＸＬ−１  Ｂｌｕｅコンピテント細菌に形質転換した。細菌クローンを単離し、プラスミドＤＮＡを調製し、個々の突然変異をサンガーＤＮＡ配列決定により確認した。Ｅ．コリにおいて組換えタンパク質を発現するのに適したｐＥＴ−２７ｂ（＋）発現ベクターにすべての突然変異体を残存させた。
【０１４３】
【表５】
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【０１４４】
［実施例３］
組換えＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの発現
以下の実施例は、組換えのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ未修飾および突然変異体ペプチドの発現を実証する。実施例１、２および１２からの合成遺伝子配列をｐＥＴ−２７ｂ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）にクローニングした。このベクターは、発現されるペプチドのカルボキシ末端に６個のヒスチジン残基（ともに「Ｈｉｓ−タグ」を含む）、続いて、終止コドンを配置する。「Ｈｉｓ−タグ」は、当業者に周知であるＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィー法を使用して、組換えタンパク質の迅速であり、簡単な精製の使用を可能にする。代替的に、合成遺伝子は、Ｈｉｓ−タグなしの天然型で発現され、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、または当業者に周知でもある他のこのような方法を使用して精製することができた。
【０１４５】
ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントＥ．コリ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を約１ｎｇの各プラスミドで形質転換した。簡単に言えば、プラスミドを氷上で細胞に添加し、ゆっくりと撹拌した。氷上で５分間インキュベートした後、細胞に４２℃で３０秒間、熱ショックを与え、次いで２分間氷上に戻した。室温でＳＯＣ（８０μＬ）を形質転換された細胞に添加し、続いて、２５０ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で１時間、増殖させた。細胞を３７℃で予め温めたＬＢ／Ｋａｎプレート（５０μｇ／ｍＬカナマイシンを補充したＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ寒天プレート）上に播種し（２０μＬ）、３７℃で終夜置いた。翌朝、１つのコロニーを取り出し、１０ｍＬのＬＢ／Ｋａｎブロス（５０μｇ／ｍＬ）中でｌｏｇフェーズ（ＯＤ６００が０．３−０．９）まで増殖させた（３７℃、２５０ｒｐｍ）。次に、細胞は、製造業者が推奨するプロトコルに従って、３７℃、２５０ｒｐｍでＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ中で終夜発現（商標）自動導入システム１（Ｎｏｖａｇｅｎ）を導入された。培養容量は、野生型ＯｐｔｉＴａｑについては１００ｍＬであり、突然変異体については２００ｍＬであった。増殖飽和は１８時間後に達し、培養物をＢｅｃｋｍａｎ  Ａｖａｎｔｉ（商標）Ｊ−２５遠心分離機で１０分間１０，０００×ｇでペレット化した。ペレット（約６ｇ）は、製造業者の指示書に従って、３０ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）タンパク質発現試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）、３０ｋＵ  ｒリゾチーム（商標）溶液（Ｎｏｖａｇｅｎ）および１５００ＵのＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して溶解させ、可溶性タンパク質を放出され、核酸を分解した。細胞破片を除去するために２０分間、１５，０００×ｇで遠心分離した後、溶解物を７５℃で１５分間加熱し、ＤＮａｓｅ  Ｉおよび他の細胞ヌクレアーゼを不活性化した。次に、溶解物は２０分間、１５，０００×ｇでスピンさせ、変性タンパク質を沈降させた。熱変性ステップおよび遠心分離ステップは、組換え酵素の重要な純度強化を提供する。細菌溶解物の「全体」画分と「可溶性」画分の両方を、１時間、１２５ＶでＳＤＳ４−２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して分析した。タンパク質を１時間のクマシーブルー染色で可視化し、続いて、タンパク質バンドが消失するまで３−４ラウンド脱染色した。
【０１４６】
回収された可溶性タンパク質を、Ｈｉｓバインドレジン（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含有するＮｉ２＋アフィニティーカラムに通過させ、２００ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液（２００ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）を使用して溶出した。次に、精製したタンパク質（約６ｍＬ）は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５，ＰＬＧＣ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−ＰＬ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，１０ＫＤａ濃縮器（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用した、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ６Ｒ卓上遠心分離器スウィング型バケットローターにおいて３２１０×ｇで約２００μＬまで濃縮され、透析を行うまで−２０℃で保存した。次に、濃縮されたタンパク質は、４℃で終夜、続いて３回×２時間（各時間ともタンパク質溶液の透析緩衝液に対する比は１０００倍である。）、保存緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０％グリセロール、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に対して透析された。最終精製されたタンパク質を−２０℃で保存した。このプロトコルを使用すると、自動導入された１００ｍＬの培養物の収率は、ＯｐｔｉＴａｑについて精製された可溶性タンパク質の約１．２ｍｇ／６７．６μＭ／１２，１６８ｐｍｏｌであった。同様の収率は、突然変異体ＤＮＡポリメラーゼについて得られた。
【０１４７】
タンパク質濃度を決定するために、試料は、１時間、ＳＤＳ  ４−２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、公知量のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）と一緒に調べられた。タンパク質を１時間のクマシーブルー染色で可視化し、続いて、タンパク質バンドが消失するまで３−４ラウンドの脱染色を行った。バンド強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウエア（国立衛生研究所、ベセスダ、ＭＤ）を使用して分析した。
【０１４８】
組換えタンパク質調製物の純度および品質を評価するために、各々の組換えタンパク質（野生型ＯｐｔｉＴａｑおよび各突然変異体）の５００ｎｇは、４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離され、クマシーブルーで染色され、可視化された。組換えタンパク質全ては、９７．１ｋＤａの分子量を有するタンパク質について、ゲル上で適切な位置に移動する。調製物は、相対的に高い純度を示し、いくつかの追加種が検出される。ゲル画像を図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄに示す。同様のゲルは、ＭＵＴ  ＩＤ２２（Ｈ７８４Ｔ）、２４（Ｈ７８４Ｖ）、３０（Ｈ７８４Ｙ）、３１（Ｈ７８４Ｗ）および３５（Ｈ７８４Ｋ）について泳動し、所望の組換えタンパク質に対応する単一バンドを可視化した（データ示さず。）。
【０１４９】
精製された酵素は、製造業者が推奨するプロトコルに従って、ＤＮａｓｅＡｌｅｒｔ（商標）とＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ（登録商標）ヌクレアーゼ検出キット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）を使用してヌクレアーゼの混入について試験された。すべての酵素調製物は、ヌクレアーゼの混入がないことが判明した。
【０１５０】
［実施例４］
ＰＣＲにおける１８個の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの特性の特徴付け
実施例３に記載される１８個の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素はポリメラーゼ活性と、プライマーオリゴヌクレオチドにおいて３’−ＲＮＡ残基を識別する能力について特徴付けられた。
【０１５１】
精製された野生型タンパク質の単位活性は、市販の非ホットスタートＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）と比較して、公知量のＯｐｔｉＴａｑと各突然変異体のｑＰＣＲにおける性能を比較することによって決定された。定量サイクル値（Ｃｑ、正のシグナルが最初に検出される増幅サイクル数）と増幅曲線形状は、両酵素がそれぞれに対して最適以下の範囲内で同様に行われるナノグラム量を決定するために分析された。これらのナノグラム量およびＴａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼの公知の単位値を使用すると、相対活性単位値は、ＰＣＲを支持するのに十分な活性を有する突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ酵素のすべてに対して外挿することができた。
【０１５２】
以下の反応条件を採用した：１０μＬの最終体積中の１×ｑＰＣＲ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）、８００μＭ  ｄＮＴＰ（それぞれ２００μＭ）、５００ｎＭ  Ｆｏｒプライマー（Ｈｓ  ＨＰＲＴ  Ｆ５１７、配列番号４３）、５００ｎＭ  Ｒｅｖプライマー（Ｈｓ  ＨＰＲＴ  Ｒ５９１、配列番号４４）、２５０ｎＭプローブ（Ｈｓ  ＨＰＲＴ  Ｐ５５４、配列番号４５）、２×１０３コピーの線形のクローン化されたプラスミド鋳型（ＨＰＲＴ−ｔａｒｇ、配列番号４６）。それぞれ反応液に添加されたＤＮＡポリメラーゼの量を次のように変化させた：野生型（ＯｐｔｉＴａｑ）について、反応は、１０、１、０．１、０．０１、０．００１Ｕ／μＬ（１０μＬ反応あたり２２０、２２、２．２、０．２２または０．０２２ｎｇ）を使用して設定された。突然変異体ポリメラーゼを同様の濃度で駆動した。また、ポリメラーゼ活性を示すそれらの突然変異体酵素は、より細かく滴定され、１０μＬ反応あたり２２０、２２、１０．６、４．８、２．２、１．１、０．４８および０．２２ｎｇのタンパク質を試験した。酵素希釈液を酵素希釈緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０％グリセロール）で作製した。反応は、９５℃で３０秒、続いて［９５℃で１５秒、続いて６０℃で１分間］の６０サイクルというサイクリングパラメータを使用して、ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で３８４ウェルフォーマットにおいて行った。検出は、蛍光をクエンチされたプローブ（５’−ヌクレアーゼアッセイフォーマット、Ｔａｑ突然変異体の本シリーズに導入された突然変異は、５‘−ヌクレアーゼドメインに存在しないことに留意されたい。）を使用して達成された。プライマー、プローブおよび鋳型（プラスミドインサート）の配列を表６に示す。
【０１５３】
【表６】
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【０１５４】
これらの１８個のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を上記で概説したように特徴付けた。結果を表７に要約する。突然変異体ＩＤ４、５、９、１２、１３および１７を含む６つの突然変異体は、検出可能なＤＮＡポリメラーゼ活性を示さず、さらに研究されなかった。６つの突然変異体である突然変異体ＩＤ６、７、１１、１４、１５および１６は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有していた；しかしながら、処理能力は、野生型酵素と比較して４−５０倍減少した。６つの突然変異体である突然変異体ＩＤ１、２、３、８、１０および１８は、野生型ＯｐｔｉＴａｑに類似したＤＮＡポリメラーゼ活性を示した。
【０１５５】
【表７】
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【０１５６】
ＤＮＡポリメラーゼ活性を示したこれらの突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのサブセットは、野生型ＯｐｔｉＴａｑ酵素と比較して、３’−ＲＮＡ残基と対比して３’−ＤＮＡを有するプライマー間を識別する能力について研究された。リアルタイムＰＣＲは、前述のように行われ、１０μＬ反応あたり０．５単位の野生型ＯｐｔｉＴａｑに等しい各突然変異体ＤＮＡポリメラーゼの量を反応において採用した。以下の反応条件を採用した：１０μＬの最終体積中の１×ｑＰＣＲ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）、８００μＭ  ｄＮＴＰ（それぞれ２００μＭ）、５００ｎＭ  Ｆｏｒプライマー（Ｈｓ  ＳＦＲＳ９  Ｆ５６９ｒＵ、配列番号４７）、５００ｎＭ  Ｒｅｖプライマー（Ｈｓ  ＳＦＲＳ９  Ｒ７１２  ｒＡ、配列番号４８）、２５０ｎＭプローブ（Ｈｓ  ＳＦＲＳ９  Ｐ６４４、配列番号４９）、２×１０３コピーの線形のクローン化されたプラスミド鋳型（ＳＦＲＳ９−ｔａｒｇ、配列番号５０）。反応は、９５℃で３０秒、続いて［９５℃で１５秒、続いて６０℃で１分間］の６０サイクルというサイクリングパラメータを使用して、ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で３８４ウェルフォーマットにおいて行った。検出は、蛍光をクエンチされたプローブ（５’−ヌクレアーゼアッセイフォーマット）を使用して達成された。プライマー、プローブおよび鋳型（プラスミドインサート）の配列を表８に示す。
【０１５７】
【表８】
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【０１５８】
ＰＣＲを支持した１２個のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を上記で概説したように、３’−ＲＮＡ修飾されたプライマーを使用する能力について試験された。結果を表７に要約する。突然変異体ＩＤ１および８は、３’−ＲＮＡ残基と比較して３’−ＤＮＡを有するプライマー間の差を示さなかった。突然変異体ＩＤ２、３、６、７、１０、１１、１４、１５、１６および１８は、３’−ＲＮＡプライマーを使用して増幅遅延を示した。したがって、本明細書において採用された合理的な設計戦略は成功し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体が同定され、３’−ＲＮＡ残基からプライミングに対して識別された。ＲＮＡプライミングで幾分遅延を示し、高い処理能力を示したそれらの突然変異体は、プライマー３’−残基ミスマッチ識別において改善のために研究された。
【０１５９】
［実施例５］
突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した対立遺伝子特異的ＰＣＲにおける改善されたミスマッチ識別
実施例４において研究された１８個の突然変異体酵素のうち、突然変異体ＩＤ２、３、１０および１８は、プライマーにおける３’−ＲＮＡ残基を識別する能力を示し、高い酵素活性／処理能力を保持した。これら４つの突然変異体は、対立遺伝子特異的ｑＰＣＲアッセイを使用して、野生型ＯｐｔｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと比較した３’末端ＤＮＡミスマッチを識別する能力について研究された。増幅反応は、合成オリゴヌクレオチド鋳型に対して行われ、この場合、リバースプライマーの３’末端に位置するように配置された単一塩基を変化させた（ＳＮＰ）。この位置で４つの可能な塩基のそれぞれを有する合成鋳型を採用した。３’−末端で４つの可能な塩基のそれぞれを有するリバースプライマーを採用した。すべての対の組み合わせの相対増幅効率をｑＰＣＲを使用して評価した。
【０１６０】
定量的対立遺伝子特異的リアルタイムＰＣＲ（ＡＳ−ｑＰＣＲ）は、２×１０３コピーの１０３ｂｐ合成鋳型（配列番号５１−５４）を使用して、３８４ウェルフォーマットにおいて１０μＬ反応体積中で行われた。使用された最終的な反応条件は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（２５℃でｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣＬ、および３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、８００μＭ総ｄＮＴＰ、ならびに２００ｎＭのユニバーサルフォワードプライマー（配列番号６０）、２００ｎＭのリバースプライマー（別々の反応が、対立遺伝子特異的プライマー配列番号５５−５８の各々または対照ユニバーサルプライマー配列番号５９について設定された。）および２００ｎＭの５’ヌクレアーゼ検出プローブ（配列番号６１）であった。各対立遺伝子特異的プライマーは、それぞれのＳＮＰ鋳型に基づいて試験された。反応は、０．５Ｕ（１０．８ｎｇ／１１．１ｎＭ／１１１ｆｍｏｌ）の野生型ＯｐｔｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたは０．５Ｕの、研究された４つのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体（ＭＵＴ  ＩＤ  Ｎｏ．２  Ｖ７８３Ｆ、ＭＵＴ  ＩＤ  ＮＯ．３  Ｈ７８４Ｑ、ＭＵＴ  ＩＤ  ＮＯ．１０  Ａ６６１Ｅ  Ｉ６６５Ｗ  Ｆ６６７ＬまたはＭＵＴ  ＩＤ  ＮＯ．１８  Ｖ７８３Ｌ  Ｈ７８４Ｑ）のうちの１つのいずれかを利用した。増幅は、以下のサイクリングパラメータ：９５℃で３０秒間の初期変性、続く、９５℃で１０秒間、その後の６０℃で３０秒間の６０サイクルを使用して、ＣＦＸ３８４（商標）Ｃ１０００（商標）サーモサイクラーシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で行われた。本実施例で使用されたオリゴヌクレオチド試薬を表９に示す。
【０１６１】
【表９】
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【０１６２】
最初に、すべての反応を三連で実施した。野生型ＯｐｔｉＴａｑを使用した場合、同様の結果がすべての複製について得られた。しかしながら、結果は、変異体ポリメラーゼについてより大きな変動を示した。したがって、統計学的に意味のある結果を得るために、各反応は、突然変異体ポリメラーゼについて９６回、野生型酵素について８１回行われた。ΔＣｑ値は、各ミスマッチ塩基対について得られたＣｑ値−マッチした塩基対について得られたＣｑ値として計算された（ΔＣｑ＝Ｃｑミスマッチ−Ｃｑマッチ）。すべての９６複製についてのΔＣｑ値を平均し、標準偏差を計算した。結果を表１０に示し、図３Ａおよび３Ｂにおいてグラフ的に要約する。リバースプライマーは対立遺伝子特異的プライマーであることに留意されたい。そのため、「Ｓｙｎ  Ｒｅｖ  Ｔ」プライマー（配列番号５５）は、鋳型Ａ（配列番号５１）に対して完全な一致する、などである。
【０１６３】
【表１０】
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【０１６４】
野生型ＯｐｔｉＴａｑは、１．４から８．０の範囲で４．２のこの合成アンプリコン系において、ＡＳ−ｑＰＣＲについての平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ２（Ｖ７８３Ｆ）は、３．５から１７．９の範囲で９．４の平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ３（Ｈ７８４Ｑ）は、４．６から２１．２の範囲で９．９の平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ１０（Ａ６６１Ｅ、Ｉ６６５Ｗ、Ｆ６６７Ｌ）は、３．３から１９．９の範囲で１０．９の平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ１８（Ｖ７８３Ｌ、Ｈ７８４Ｑ）は、４．９から２６．６の範囲で１２．４の平均ΔＣｑを示した。したがって、４つの鋳型塩基と４つの３’−末端プライマー塩基のすべての対の組み合わせにおいて、本発明の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、野生型ＯｐｔｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼよりもミスマッチに対して大きな識別を示した。各ミスマッチ対に対する改善の大きさは、突然変異体と野生型酵素の間の識別の差であるΔΔＣｑによって定義される（ΔΔＣｑ＝ΔＣｑ突然変異体−ΔＣｑ野生型）。ΔΔＣｑ値を計算し、表１１に示す。
【０１６５】
【表１１】
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【０１６６】
突然変異体ＩＤ２（Ｖ７８３Ｆ）は、野生型ＯｐｔｉＴａｑに比べて５．２の平均ΔΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ３（Ｈ７８４Ｑ）は、野生型ＯｐｔｉＴａｑに比べて５．７の平均ΔΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ１０（Ａ６６１Ｅ、Ｉ６６５Ｗ、Ｆ６６７Ｌ）は、野生型ＯｐｔｉＴａｑに比べて６．７の平均ΔΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ１８（Ｖ７８３Ｌ、Ｈ７８４Ｑ）は、野生型ＯｐｔｉＴａｑに比べて８．２の平均ΔΔＣｑを示した。したがって、本発明の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのそれぞれは、ミスマッチ識別において野生型ＯｐｔｉＴａｑと比較して有意な改善を示し、重要なことには、ミスマッチ識別は、可能なすべてのミスマッチ塩基対の組み合わせについて改善された。全体的に、突然変異体ＩＤ１８（Ｖ７８３Ｌ、Ｈ７８４Ｑ）は、ＡＳ−ＰＣＲアッセイを使用して、この実施例において研究された４つの突然変異体酵素のセット内で最良のＳＮＰ識別を示した。
【０１６７】
［実施例６］
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体によるプライマー３’−ＲＮＡ残基の識別
１８個すべてのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体は、実施例４において３’−ＲＮＡ残基からプライミングに対して識別する能力についてスクリーニングされた。良好な３’−ミスマッチ識別を示した実施例５のＡＳ−ＰＣＲにおいて研究された４つの突然変異体（ＭＵＴ  ＩＤ２、３、１０および１８）は、プライマーにおける３’−末端ＲＮＡ残基の存在に対して識別する能力について、本実施例においてより詳細に研究され、可能な塩基特異的効果について調べた。増幅反応は、合成オリゴヌクレオチド鋳型に対して行われ、この場合、リバースプライマーの３’末端に位置するように配置された単一塩基を変化させた（ＳＮＰ）。この位置で４つの可能な塩基のそれぞれを有する合成鋳型を採用した。３’末端で４つの可能なＲＮＡ塩基のそれぞれを有するリバースプライマーを採用し、結果は３’末端で４つの可能なＤＮＡ塩基のそれぞれを有するプライマーを使用した対照反応と比較された。相対的な増幅効率をｑＰＣＲを使用して評価した。
【０１６８】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、２×１０３コピーの１０３ｂｐ合成鋳型（配列番号５１−５４）を使用して、３８４ウェルフォーマットにおいて１０μＬ反応体積中で行われた。使用された最終的な反応条件は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（２５℃でｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣＬ、および３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、８００μＭ総ｄＮＴＰ、ならびに２００ｎＭのユニバーサルフォワードプライマー（配列番号６０）、２００ｎＭのリバースプライマー（別々の反応が、４つの３’−ＲＮＡプライマー配列番号６２−６５の各々、４つの３’ＤＮＡプライマー配列番号５５−５８の各々、または対照ユニバーサルプライマー配列番号５９について設定された。）および２００ｎＭの５’ヌクレアーゼ検出プローブ（配列番号６１）であった。各プライマーは、相補性鋳型に基づいてのみ試験された（ミスマッチ条件を試験しなかった。）。反応は、０．５Ｕ（１０．８ｎｇ／１１．１ｎＭ／１１１ｆｍｏｌ）の野生型ＯｐｔｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたは０．５Ｕの、研究された４つのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体（ＭＵＴ  ＩＤ  Ｎｏ．２  Ｖ７８３Ｆ、ＭＵＴ  ＩＤ  ＮＯ．３  Ｈ７８４Ｑ、ＭＵＴ  ＩＤ  ＮＯ．１０  Ａ６６１Ｅ  Ｉ６６５Ｗ  Ｆ６６７ＬまたはＭＵＴ  ＩＤ  ＮＯ．１８  Ｖ７８３Ｌ  Ｈ７８４Ｑ）のうちの１つのいずれかを利用した。増幅は、以下のサイクリングパラメータ：９５℃で３０秒間の初期変性、続く、９５℃で１０秒間、その後の６０℃で３０秒間の６０サイクルを使用して、ＣＦＸ３８４（商標）Ｃ１０００（商標）サーモサイクラーシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で行われた。本実施例で使用されたオリゴヌクレオチド試薬を表１２に示す。合計９６複製は、それぞれの対の組み合わせについて行われた。
【０１６９】
【表１２】
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【０１７０】
平均Ｃｑ値は９６複製セットについて計算された。ΔＣｑ値は、３’−ＲＮＡプライマー反応の平均Ｃｑ値と、３’−ＤＮＡプライマー反応の平均Ｃｑ値の間の差として計算された（ΔＣｑ＝Ｃｑ３’ＲＮＡ−Ｃｑ３’−ＤＮＡ）。より高いΔＣｑ値は、３’−ＲＮＡプライマーからのプライミングに対するより大きな程度の識別を示す。結果を表１３に示し、図４においてグラフ的に要約する。
【０１７１】
【表１３】
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【０１７２】
野生型ＯｐｔｉＴａｑは、３’−ＤＮＡプライマーと３’−ＲＮＡプライマーの間にいかなる有意な識別も示さなかった。しかしながら、３’−ＲＮＡプライマーを使用した場合、４つすべての突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはプライミング効率の減少を示した。したがって、プライマーにおける３’−ＲＮＡ残基に対して識別する新規なポリメラーゼを作製する目的は、本明細書に記載されているインテリジェント突然変異誘発設計戦略を使用して達成された。興味深いことに、識別の大きさは、ＲＮＡプリン残基（ｒＡまたはｒＧ）よりもＲＮＡピリミジン残基（ｒＣまたはｒＵ）について非常に大きかった。
【０１７３】
［実施例７］
突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用したｒｈＰＣＲにおける改善されたミスマッチ識別
ＲＮａｓｅ  Ｈに基づくＰＣＲ（ｒｈＰＣＲ）は、ＤＮＡ合成をプライミングすることができないブロック型切断性オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成をプライミングし、ＰＣＲを開始することができる形態に変換するために酵素ＲＮａｓｅ  Ｈ２を採用する。ブロック型切断性オリゴヌクレオチドまたはブロック型切断性プライマーは、（切断部位を含む）オリゴヌクレオチドの３’末端近くの単一のＲＮＡ残基を含有し、３’末端でまたはその近傍で修飾され、そのため、プライマーはＤＮＡ合成をプライミングすることができず、および／または鋳型機能を喪失し、それにより、プライマー伸長が生じ得るとしてもＰＣＲを支持するのに適さない。この方法は、遺伝子型決定（ＳＮＰ識別）のために使用され、標的核酸にハイブリダイズする場合、ＲＮＡ塩基切断部位で塩基対マッチ対ミスマッチを区別するＲＮａｓｅ  Ｈ２の能力に依存する。ｒｈＰＣＲにおいて、ＳＮＰ識別は、プライマーブロック解除ステップで生じ、プライマー伸長ステップでは生じない（ＡＳ−ＰＣＲにおいて、識別はプライマー伸長ステップで生じる）。酵素切断戦略、類似したＲＮａｓｅ  Ｈ戦略、ならびにプライマー伸長をブロックしまたは鋳型機能を阻害し、それによりＰＣＲを無効にする方法の例は、「ＰＯＬＹＮＯＭＩＡＬ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ」と題するＢｅｈｌｋｅらによる米国特許第７，１１２，４０６号；「ＣＯＮＴＩＮＯＵＳ  ＦＬＵＯＲＯＭＥＴＲＩＣ  ＡＳＳＡＹ  ＦＯＲ  ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＣＬＥＡＶＡＧＥ」と題するＨａｎらによる米国特許第５，７６３，１８１号；「ＭＥＴＨＯＤ  ＯＦ  ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＰＯＬＹＭＯＲＰＨＩＳＭ」と題するＳａｇａｗａによる米国特許第７，１３５，２９１号；「ＤＵＡＬ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ  ＰＲＩＭＥＲＳ  ＦＯＲ  ＡＭＰＬＩＦＹＩＮＧ  ＤＮＡ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＥ」と題するＢｅｈｌｋｅおよびＷａｌｄｅｒによる米国特許出願公開第２００９００６８６４３号；「ＲＮＡＳＥ  Ｈ−ＢＡＳＥＤ  ＡＳＳＡＹＳ  ＵＴＩＬＩＺＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＲＮＡ  ＭＯＮＯＭＥＲＳ」と題するＷａｌｄｅｒらによる米国特許出願公開第２０１００１６７３５３号；ならびにＤｏｂｏｓｙら、「ＲＮａｓｅ  Ｈ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＰＣＲ  （ｒｈＰＣＲ）：ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｅｄ  ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ」、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．、１１：ｅ８０（２０１１）に記載されている。
【０１７４】
ＡＳ−ＰＣＲにおいて、ＳＮＰはプライマーの３’末端に位置する。この構成において、ミスプライミング事象（ＤＮＡ合成が３’末端のミスマッチの存在下で開始される）は、プライマーに存在する塩基の新生ＤＮＡ鎖への導入、およびそれによるＰＣＲアンプリコンへの導入をもたらす。この事象はＰＣＲ産物をプライマー配列に変換し、そのため、増幅されたＤＮＡは、ここで、プライマーにマッチし、もはや元々インプットされた試料の核酸配列にマッチしない。アンプリコン配列は、ここで、プライマーにマッチし、インプットされた試料にマッチしないため、増幅は高効率で進行する。
【０１７５】
ｒｈＰＣＲにおいて、ＲＮａｓｅ  Ｈ２によるブロック型切断性プライマーの切断は、ＲＮＡ残基の５’側で生じる；ＳＮＰがＲＮＡ残基（例えば、ＳＮＰを有するＲＮＡ塩基対）に位置している場合、プライマー伸長中のＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲによって取り込まれた最初の塩基はＳＮＰ部位であり、インプットされた核酸配列と同一のままである娘産物をもたらす。稀に、非標準ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断は、ＳＮＰを覆うように配置したプライマーの３’末端でＲＮＡ残基を残すＲＮＡ塩基の３’側で生じる。この場合において、ｒｈＰＣＲ反応はＡＳ−ＰＣＲのように進行し、プライマーの３’末端はＳＮＰ部位に位置し、標的核酸に対してマッチまたはミスマッチのいずれかである。ＡＳ−ＰＣＲと同様に、ミスマッチの場合において、ＤＮＡ伸長産物およびＰＣＲアンプリコンの配列はプライマーの配列に変換し、このようにして、増幅中の試料の配列を忠実に複製しない場合がある。この望ましくないミスプライミング事象の頻度を減少させる任意の方法は、ｒｈＰＣＲアッセイにおけるミスマッチ識別を改善する。したがって、ｒｈＰＣＲにおける塩基識別は、主にプライマー切断段階でＲＮａｓｅ  Ｈ２によって媒介されるが、３’−末端ミスマッチおよび／または３’−末端ＲＮＡ残基に対して識別する改善された能力を有するＤＮＡポリメラーゼの使用は、望ましくない３’−切断事象が生じる場合に伸長を妨げることによって、ｒｈＰＣＲの全体のミスマッチ識別能を改善し得る。本明細書に記載されているＤＮＡポリメラーゼ突然変異体は、野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと比較して、３’−ミスマッチが存在する場合にプライミング効率を減少させ（ミスマッチ識別を改善し）、３’−末端ＲＮＡ残基がプライマーに存在する場合にプライミング効率を減少させる（プライマー３’−ＲＮＡ残基を識別する）。本実施例は、本発明の新規な突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、ｒｈＰＣＲの特異性およびＳＮＰ識別を改善することを実証する。
【０１７６】
野生型ＯｐｔｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの性能と突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体ＩＤ２、３、１０および１８の性能を比較する定量的リアルタイムｒｈＰＣＲを行った。２つの異なるブロック型切断性プライマーの設計が試験され、世代１（Ｇｅｎ１）「ＲＤＤＤＤｘ」プライマーと世代２（Ｇｅｎ２）「ＲＤｘｘＤ」プライマーを含む（「ＲＮＡＳＥ  Ｈ−ＢＡＳＥＤ  ＡＳＳＡＹＳ  ＵＴＩＬＩＺＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＲＮＡ  ＭＯＮＯＭＥＲＳ」と題するＢｅｈｌｋｅらによる米国特許出願公開第２０１２／０２５８４５５号を参照されたい。）。増幅反応は、実施例５において採用された同じ合成オリゴヌクレオチド鋳型を使用して行われ、この場合、Ｇｅｎ１とＧｅｎ２のブロック型切断性（ｒｈＰＣＲ）プライマーの両方にＲＮＡ残基を位置するように配置された単一の塩基を変化させた（ＳＮＰ部位）。この位置で４つの可能な塩基のそれぞれを有する合成鋳型を採用した。この位置で４つの可能な相補的な塩基のそれぞれを有するリバースプライマーを採用した（ＲＮＡ塩基）。同じフォワードプライマーを全ての反応に使用した。相対的な増幅効率をリアルタイムＰＣＲを使用して評価した。
【０１７７】
定量的ｒｈＰＣＲは、２×１０６コピーの１０３ｂｐ合成鋳型（配列番号５１−５４）を使用して、３８４ウェルフォーマットにおいて１０μＬ反応体積中で行われた。使用された最終的な反応条件は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（２５℃でｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣＬ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、８００μＭ総ｄＮＴＰ、２００ｎＭのユニバーサルフォワードプライマー（配列番号６０）、２００ｎＭのリバースプライマー、および２００ｎＭの５’ヌクレアーゼ検出プローブ（配列番号６１）であった。リバースプライマーは、Ｇｅｎ１  ＲＤＤＤＤｘ構成の対立遺伝子特異的ｒｈＰＣＲプライマー（配列番号６６−６９）、Ｇｅｎ２  ＲＤｘｘＤ構成の対立遺伝子特異的ｒｈＰＣＲプライマー（配列番号７０−７３）および制御ユニバーサルリバースプライマー（配列番号５９）を含んだ。ｒｈＰＣＲブロック型切断性リバースプライマーの各々は、４つのＳＮＰ鋳型のそれぞれについて試験された。反応は、０．５Ｕ（１０．８ｎｇ／１１．１ｎＭ／１１１ｆｍｏｌ）の野生型ＯｐｔｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたは０．５Ｕの４つのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体（ＭＵＴ  ＩＤ２  Ｖ７８３Ｆ；ＭＵＴ  ＩＤ３  Ｈ７８４Ｑ；ＭＵＴ  ＩＤ１０、Ａ６６１Ｅ  Ｉ６６５Ｗ  Ｆ６６７Ｌ；またはＭＵＴ  ＩＤ１８、Ｖ７８３Ｌ  Ｈ７８４Ｑ）のうちの１つのいずれかを利用した。Ｐ．アビシ（Ｐ．ａｂｙｓｓｉ）ＲＮａｓｅ  Ｈ２を１μＬ体積内の各反応液に添加した。対照およびＧｅｎ１ブロック型切断性ＲＤＤＤＤｘ  ｒｈＰＣＲプライマーを使用した反応は、２．６ｍＵ  ＲＮａｓｅ  Ｈ２／１０μＬ反応（５ｆｍｏｌｅ、０．５ｎＭ酵素）を採用した。Ｇｅｎ２ブロック型切断性ＲＤｘｘＤ  ｒｈＰＣＲプライマーを使用した反応は、ｒＣとｒＡプライマー（配列番号７１と７２）については２５ｍＭ  ＲＮａｓｅ  Ｈ２  １０μＬ反応（４８ｆｍｏｌｅ、４．８ｎＭ酵素）、およびｒＧとｒＵプライマー（配列番号７０と７３）については２００ｍＵ  ＲＮａｓｅ  Ｈ２／１０μＬ反応（３８４ｆｍｏｌｅ、３８ｎＭ酵素）を採用した。サイクリングは、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）上で、以下の９５℃で３分間、続いて、９５℃で１０秒間と６０℃で３０秒の７５サイクルのように行われた。全ての反応を三連で行った。本実施例で使用されたオリゴヌクレオチド試薬を表１４に示す。
【０１７８】
【表１４】
2019216723.tif 000025
【０１７９】
ＭＵＴ  ＩＤ１０（Ａ６６１Ｅ、Ｉ６６５Ｗ、Ｆ６６７Ｌ）は、予想外に、この合成アンプリコン系を使用したｒｈＰＣＲ反応において標的中のＳＮＰ部位にプライマーがマッチしたとき、大きな増幅遅延を示した。しかしながら、このポリメラーゼは、ｒｈＰＣＲについてヒトゲノムＤＮＡ系を使用したとき、任意の遅延を示さなかった（実施例８および９を参照されたい。）。したがって、ＭＵＴ  ＩＤ１０は合成系実験において分析から除外された。他の３つの突然変異体ポリメラーゼを使用して生成させたデータを分析し、ΔＣｑ値は、マッチ対ミスマッチのプライマー／鋳型対と比較して計算された。この場合、ΔＣｑ＝Ｃｑミスマッチ−Ｃｑマッチである。結果は、Ｇｅｎ１  ＲＤＤＤＤｘブロック型切断性プライマーｒｈＰＣＲプライマーについては表１５、およびＧｅｎ２  ＲＤｘｘＤブロック型切断性プライマーｒｈＰＣＲプライマーについては表１６に示される。
【０１８０】
【表１５】
2019216723.tif 000026
2019216723.tif 000027
【０１８１】
【表１６】
2019216723.tif 000028
2019216723.tif 000029
【０１８２】
ほとんど全ての場合において、ミスマッチ識別は、野生型ＯｐｔｉＴａｑと比較して、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して行われたｒｈＰＣＲ反応について優れていた。改善の大きさは、ΔΔＣｑ値を調べることによって最も良く見られ、これは、野生型ＯｐｔｉＴａｑおよび突然変異体を使用して見られる識別の差である（ΔΔＣｑ＝ΔＣｑ突然変異体−ΔＣｑ野生型）。これらの結果は、Ｇｅｎ１  ＲＤＤＤＤｘプライマーについては表１７に、およびＧｅｎ２  ＲＤｘｘＤプライマーについては表１８に示される。Ｇｅｎ１  ＲＤＤＤＤｘプライマーを使用した場合、全体の最大の利益は、ミスマッチ塩基が標的核酸において「Ｃ」である場合に見られ、最小の利益は、ブロック型切断性プライマーが標的中にミスマッチのＴと対になったｒＧを含有する場合に見られた。最大の改善は、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＭＵＴ  ＩＤ１８（Ｖ７８３Ｌ  Ｈ７８４Ｑ）を使用して得られた。ＭＵＴ  ＩＤ２（Ｖ７８３Ｆ）についての平均ΔΔＣｑは１．０であった。ＭＵＴ  ＩＤ３（Ｈ７８４Ｑ）についての平均ΔΔＣｑは２．０であった。ＭＵＴ  ＩＤ１８（Ｖ７８３Ｌ、Ｈ７８４Ｑ）についての平均ΔΔＣｑは３．６であった。突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して得られた利益は、既に野生型ＯｐｔｉＴａｑを使用して高ΔＣｑ値を示したＧｅｎ２  ＲＤｘｘＤプライマーについてより低かった。実施例において研究された３つの突然変異体ポリメラーゼの平均ΔΔＣｑは０．６、２．１および１．２であった。したがって、Ｇｅｎ２  ＲＤｘｘＤプライマーを使用した場合の最大の利益は、ＭＵＴ  ＩＤ３（Ｈ７８４Ｑ）で見られた。
【０１８３】
【表１７】
2019216723.tif 000030
【０１８４】
【表１８】
2019216723.tif 000031
【０１８５】
［実施例８］
ヒトゲノムＤＮＡ  ＳＮＰアッセイにおいて突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用したｒｈＰＣＲにおける改善されたミスマッチ識別
実施例７は、合成アンプリコンｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイ系において、本発明の新規な突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの有用性を実証した。本実施例は、ヒトゲノムＤＮＡ  ｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイ系における新規な突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの有用性を実証し、ＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）におけるＳＮＰ部位を調べた。アッセイは、コーリエル医学研究所（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）からの標的ＤＮＡ  ＧＭ１８５６２（ホモ接合Ｃ／Ｃ）およびＧＭ１８５３７（ホモ接合Ｔ／Ｔ）を採用した。２つの異なるブロック型切断性プライマー設計を試験し、世代１（Ｇｅｎ１）「ＲＤＤＤＤｘ」プライマーと世代２（Ｇｅｎ２）「ＲＤｘｘＤ」プライマーを含んだ（「ＲＮＡＳＥ  Ｈ−ＢＡＳＥＤ  ＡＳＳＡＹＳ  ＵＴＩＬＩＺＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＲＮＡ  ＭＯＮＯＭＥＲＳ」と題するＢｅｈｌｋｅらによる米国特許出願第２０１２／０２５８４５５号を参照されたい。）。
【０１８６】
定量的リアルタイムｒｈＰＣＲは、２０ｎｇ（標的の６６００コピーに相当）のヒトゲノムＤＮＡ（ＧＭ１８５６２またはＧＭ１８５３７）を含む３８４ウェルフォーマットにおいて１０μＬの反応体積中で行われた。反応は、０．５Ｕ（１０．８ｎｇ／１１．１ｎＭ／１１１ｆｍｏｌ）の野生型ＯｐｔｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたは０．５Ｕの、４つのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体（ＭＵＴ  ＩＤ２、Ｖ７８３Ｆ；ＭＵＴ  ＩＤ３、Ｈ７８４Ｑ；ＭＵＴ  ＩＤ１０、Ａ６６１Ｅ  Ｉ６６５Ｗ  Ｆ６６７Ｌ；またはＭＵＴ  ＩＤ１８、Ｖ７８３Ｌ  Ｈ７８４Ｑ）のうちの１つのいずれかを利用した。使用された最終的な反応条件は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（２５℃でｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣＬ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、８００μＭ総ｄＮＴＰ、２００ｎＭのフォワードプライマー（配列番号７５−７９）、２００ｎＭのユニバーサルリバースプライマー（配列番号７４）および２００ｎＭのＳＭＡＤ７プローブ（配列番号８０）であった。８５ｂｐのＳＭＡＤ７アンプリコンの配列を配列番号８１として示す。フォワードプライマーは、ＲＤＤＤＤｘ構成Ｇｅｎ１対立遺伝子特異的ｒｈＰＣＲプライマー（配列番号７６および７７）、ＲＤｘｘＤ構成Ｇｅｎ２対立遺伝子特異的ｒｈＰＣＲプライマー（配列番号７８および７９）、ならびに対立遺伝子特異的でない対照ユニバーサルフォワードプライマー（配列番号７５）を含んだ。この実施例において採用されたオリゴヌクレオチド試薬を表１９に示す。反応は、Ｇｅｎ１  ＲＤＤＤＤｘプライマーと対照プライマー（配列番号７５−７７）について１０μＬ反応あたり２．６ｍＵの濃度（５ｆｍｏｌｅ、０．５ｎＭ）、またはＧｅｎ２  ＲＤｘｘＤプライマー（配列番号７８および７９）について１０μＬ反応あたり２００ｍＵの濃度（３８４ｆｍｏｌｅ、３８．４ｎＭ）で１μＬのＰ．ａ．ＲＮａｓｅ  Ｈ２を含んだ。増幅は、以下：９５℃で３分間、続く、９５℃で１０秒間と６０℃で３０秒間の７５サイクルのように、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）上で行われた。全ての反応を三連で行った。
【０１８７】
【表１９】
2019216723.tif 000032
2019216723.tif 000033
【０１８８】
Ｇｅｎ１  ＲＤＤＤＤｘ  ｒｈＰＣＲプライマーを使用した結果を表２０に示し、Ｇｅｎ２  ＲＤｘｘＤ  ｒｈＰＣＲプライマーを使用した結果を表２１に示す。全体的に、突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの使用は、Ｇｅｎ１  ＲＤＤＤＤｘプライマーを使用した、このヒトゲノムＤＮＡ  ｒｈＰＣＲアッセイにおいてＳＮＰ識別において小さいが、真の改善を示した。しかしながら、識別の大きな改善は、Ｇｅｎ２  ＲＤｘｘＤプライマーを使用して見られた。Ｇｅｎ２  ＲＤｘｘＤプライマーは、本質的にはより大きなＳＮＰ識別を示し、ΔＣｑ値が、ある場合において、マッチとミスマッチ間で４０を超える増幅サイクルであるようにこれらのレベルは増加した；ｑＰＣＲ反応がほとんど４５−５０サイクルを超えて行われず、正のシグナルが７０サイクル後までこれらの場合において検出されなかったため、識別のこのレベルは、大部分のユーザーにとって「アッセイよりも大きい」ものとなる（表２１）。したがって、新規の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの使用は、ｒｈＰＣＲ遺伝子型決定アッセイにおけるＳＮＰ識別を改善する。
【０１８９】
【表２０】
2019216723.tif 000034
2019216723.tif 000035
【０１９０】
【表２１】
2019216723.tif 000036
2019216723.tif 000037
【０１９１】
ＳＭＡＤ７  ＳＮＰ遺伝子型決定アッセイのためのΔＣｑ値は、Ｇｅｎ１  ＲＤＤＤＤｘプライマーについては図５Ａに、およびＧｅｎ２  ＲＤｘｘＤプライマーについては図６Ａにグラフ的に要約される。実施例８において研究されたｒｈＰＣＲ遺伝子型決定アッセイに関して、ＭＵＴ  ＩＤ１０（Ａ６６１Ｅ  Ｉ６６５Ｗ  Ｆ６６７Ｌ）が、特にＧｅｎ２  ＲＤｘｘＤプライマーを使用した場合、野生型ＯｐｔｉＴａｑと比較して最大の改善を示したことに留意することは興味深い。実施例５は、ＡＳ−ＰＣＲにおける突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの有用性を実証し、この場合において、ＭＵＴ  ＩＤ１８（Ｖ７８３Ｌ  Ｈ７８４Ｑ）の使用は最大の利益を示し、ＭＵＴ  ＩＤ３（Ｈ７８４Ｑ）は次の最大の相対的利益を示した。本発明の種々の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが異なる増幅アッセイにおいて有用性を有するだけでなく、異なる突然変異体が、使用されるアッセイの性質に応じて様々なレベルの利益を示すことも明らかである。したがって、最大利益が得られるように、特性が異なるアッセイ／応用にマッチし得る突然変異体ポリメラーゼのコレクションを有することは有益である。
【０１９２】
［実施例９］
突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによるｒｈＰＣＲを使用したゲノムＤＮＡにおける低頻度対立遺伝子の改善された識別
ｒｈＰＣＲにおけるＧｅｎ２  ＲＤｘｘＤブロック型切断性プライマーの使用は、天然の（野生型）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した野生型ゲノムＤＮＡのバックグラウンドにおいて、１：１，０００から１：１０，０００のレベルでＳＮＰの存在を検出することができる（「ＲＮＡＳＥ  Ｈ−ＢＡＳＥＤ  ＡＳＳＡＹＳ  ＵＴＩＬＩＺＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＲＮＡ  ＭＯＮＯＭＥＲＳ」と題するＢｅｈｌｋｅらによる米国特許出願第２０１２／０２５８４５５号を参照されたい。）。本実施例は、本発明の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼがｒｈＰＣＲアッセイにおいて低頻度対立遺伝子識別を改善することを実証する。
【０１９３】
低頻度対立遺伝子の検出実験は、ＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）におけるＳＮＰ部位の塩基の同一性を検出するように設計され、標的ＤＮＡのＧＭ１８５６２（ホモ接合Ｃ／Ｃ）およびＧＭ１８５３７（ホモ接合Ｔ／Ｔ）（コーリエル医学研究所、Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）を採用した。対照反応は、２ｎｇ（６６０コピー）、０．２ｎｇ（６６コピー）または０．０２ｎｇ（６．６コピー）のインプットされた、マッチした標的ＤＮＡを使用して設定された。低頻度対立遺伝子の検出反応は、１つの対立遺伝子の２ｎｇ（６６０コピー）、０．２ｎｇ（６６コピー）または０．０２ｎｇ（６．６コピー）のインプットされた、マッチした標的ＤＮＡ＋２００ｎｇ（６６，０００コピー）の他の（ミスマッチの）遺伝子を使用して設定された。バックグラウンドは、０コピーのマッチした標的ＤＮＡ＋２００ｎｇ（６６，０００コピー）のミスマッチの標的ＤＮＡを含有した反応において確立された。両方の組み合わせを試験した：過剰ＧＭ１８５３７（Ｔ／Ｔ）の存在下で低頻度対立遺伝子としてＧＭ１８５６２（Ｃ／Ｃ）および過剰ＧＭ１８５６２（Ｃ／Ｃ）の存在下で低頻度対立遺伝子としてＧＭ１８５３７（Ｔ／Ｔ）。
【０１９４】
定量的リアルタイムｒｈＰＣＲは、３８４ウェルフォーマットにおいて１０μＬ反応体積中で行われた。使用された最終的な反応条件は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（２５℃でｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣＬ、３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．８ｍＭ  ｄＮＴＰ、２００ｎＭのＳＭＡＤ７フォワードプライマーの１つ（配列番号７５、７８および７９）、２００ｎＭのＳＭＡＤ７リバースプライマー（配列番号７４）および２００ｎＭのＳＭＡＤ７プローブ（配列番号８０）であった。これらのプライマーによって画定される８５ｂｐのＳＭＡＤ７アンプリコンを配列番号８１として示す。フォワードプライマーは、未修飾である（対照、配列番号７５）、またはブロック型切断性ｒｈＰＣＲ  Ｇｅｎ２  ＲＤｘｘＤ設計を使用してＳＭＡＤ７  Ｃ−対立遺伝子（配列番号７８）もしくはＳＭＡＤ７  Ｔ−対立遺伝子（配列番号７９）に特異的であったことに留意されたい。反応は、０．５Ｕの野生型ＯｐｔｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、または０．５Ｕの、研究された４つのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体（ＭＵＴ  ＩＤ  Ｎｏ．２、Ｖ７８３Ｆ；ＭＵＴ  ＩＤ  ＮＯ．３、Ｈ７８４Ｑ；ＭＵＴ  ＩＤ  ＮＯ．１０、Ａ６６１Ｅ  Ｉ６６５Ｗ  Ｆ６６７Ｌ；もしくはＭＵＴ  ＩＤ  ＮＯ．１８、Ｖ７８３Ｌ  Ｈ７８４Ｑ）のうちの１つのいずれかを利用した。反応は、ＳＭＡＤ７  Ｆｏｒ  ｒＣ  ＤｘｘＤ（配列番号７８）プライマーを使用した場合に１０μＬ反応あたり２００ｍＵ（３８４ｆｍｏｌｅ）の濃度のＰ．アビシＲＮａｓｅ  Ｈ２および対照反応またはＳＭＡＤ７  Ｆｏｒ  ｒＵ  ＤｘｘＤ（配列番号７９）プライマーを使用した場合に１０μＬ反応あたり５００−６００ｍＵ（９６０−１１５２ｆｍｏｌｅ）の濃度のＰ．アビシＲＮａｓｅ  Ｈ２を含んだ。本実施例で使用されたオリゴヌクレオチド試薬を表２２に示す。サイクリングは、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）上で、以下：９５℃で３分間、続いて、９５℃で１０秒間と６０℃で３０秒の６５サイクルのように行われた。全ての反応を三連で行った。
【０１９５】
【表２２】
2019216723.tif 000038
2019216723.tif 000039
【０１９６】
結果を分析し、表２３に示す。対照カラムは、マッチしたプライマー／標的反応についてＣｑ値を示し、ミスマッチの標的は存在せず、定量標準曲線を確立する。低頻度対立遺伝子の検出カラムは、６６，０００コピーのミスマッチ標的の存在下で、マッチしたプライマー／標的の６６０、６６、６または０（バックグラウンド対照）コピーの検出についてのＣｑ値を示す。バックグラウンドと正のシグナル間の少なくとも３サイクル差（ΔＣｑ＝３．０以上）低頻度対立遺伝子検出について「陽性な」反応と呼ぶために必要とされる；５サイクル差（ΔＣｑ＝５．０以上）が好ましいことが、一般的に想定される。この系において、バックグラウンドは、プライマーにマッチするインプットされていない標的を使用して増幅を行った場合に観察されたシグナルであり、そのため、シグナルは、ミスマッチ標的を起源とする増幅からのみ生じる。
【０１９７】
野生型ＯｐｔｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用すると、過剰な「Ｔ」バックグラウンドにおける「Ｃ」対立遺伝子の検出と過剰な「Ｃ」バックグラウンドにおける「Ｔ」対立遺伝子の検出はともに、１：１０００低頻度対立遺伝子検出事象（６６，０００コピーのミスマッチ標的の存在下での６６コピーのマッチ標的）と呼ぶためのストリンジェンシーのΔＣｑ３．０とΔＣｑ５．０レベルを満たした。１：１０，０００反応物（６６，０００コピーのミスマッチ標的の存在下での６コピーのマッチ標的）は、これらのいずれかの基準を満たさなかった。したがって、ｒｈＰＣＲは、このゲノムＤＮＡ  ＳＮＰ系において、野生型ＯｐｔｉＴａｑを使用した１：１０００低頻度対立遺伝子検出限界を有した。
【０１９８】
対照的に、４つの突然変異体の各々を使用したｒｈＰＣＲは、「Ｃ」と「Ｔ」対立遺伝子標的の両方について１：１０，０００の低頻度対立遺伝子検出限界を示し、ΔＣｑストリンジェンシーカットオフは３．０であった。ＭＵＴ  ＩＤ３（Ｈ７８４Ｑ）は、５．０のより高いΔＣｑストリンジェンシーカットオフについてのこのゲノムＳＮＰ系において、「Ｃ」と「Ｔ」標的の両方について１：１０，０００の低頻度対立遺伝子検出限界を示した。他の３つの突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＭＵＴ  ＩＤ  Ｎｏ．２、Ｖ７８３Ｆ；ＭＵＴ  ＩＤ  ＮＯ．１０、Ａ６６１Ｅ  Ｉ６６５Ｗ  Ｆ６６７Ｌ；およびＭＵＴ  ＩＤ  ＮＯ．１８、Ｖ７８３Ｌ  Ｈ７８４Ｑ）は、ΔＣｑストリンジェンシーカットオフは５．０である、「Ｃ」対立遺伝子標的について１：１０，０００の低頻度対立遺伝子検出限界を示し、ΔＣｑストリンジェンシーカットオフは３．０である、「Ｔ」対立遺伝子標的について１：１０，０００の低頻度対立遺伝子検出限界を示した。したがって、本発明者らは、本発明の新規な突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、野生型ＤＮＡポリメラーゼの使用と比較して、ｒｈＰＣＲにおけるブロック型切断性プライマーを使用した、改善された低頻度対立遺伝子検出反応を提供すると結論付ける。
【０１９９】
【表２３】
2019216723.tif 000040
2019216723.tif 000041
【０２００】
［実施例１０］
プライマーの３’末端でのＲＮＡ残基のミスマッチまたは存在についての改善された識別を示すＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体の配列
実施例５−９において採用されたコドン最適化変異体酵素の完全なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を以下に示す。これらの配列は、当業者により表１、３、４および５において提供される情報から容易に誘導されるが、明確にするために、最終的に組み立てられた配列を提供する。塩基変化は、核酸置換およびアミノ酸置換について太字の下線を付したフォントで特定される。
【０２０１】
配列番号８２、突然変異体ＩＤ２（Ｖ７８３Ｆ）のヌクレオチド配列。
【０２０２】
【化１】
2019216723.tif 000042
【０２０３】
配列番号８３、突然変異体ＩＤ２（Ｖ７８３Ｆ）のアミノ酸配列。
【０２０４】
【化２】
2019216723.tif 000043
【０２０５】
配列番号８４、突然変異体ＩＤ３（Ｈ７８４Ｑ）のヌクレオチド配列。
【０２０６】
【化３】
2019216723.tif 000044
【０２０７】
配列番号８５、突然変異体ＩＤ３（Ｈ７８４Ｑ）のアミノ酸配列。
【０２０８】
【化４】
2019216723.tif 000045
【０２０９】
配列番号８６、突然変異体ＩＤ１０（Ａ６６１Ｅ、Ｉ６６５Ｗ、Ｆ６６７Ｌ）のヌクレオチド配列。
【０２１０】
【化５】
2019216723.tif 000046
【０２１１】
配列番号８７、突然変異体ＩＤ１０（Ａ６６１Ｅ、Ｉ６６５Ｗ、Ｆ６６７Ｌ）のアミノ酸配列。
【０２１２】
【化６】
2019216723.tif 000047
【０２１３】
配列番号８８、突然変異体ＩＤ１８（Ｖ７８３Ｌ、Ｈ７８４Ｑ）のヌクレオチド配列。
【０２１４】
【化７】
2019216723.tif 000048
【０２１５】
配列番号８９、突然変異体ＩＤ１８（Ｖ７８３Ｌ、Ｈ７８４Ｑ）のアミノ酸配列。
【０２１６】
【化８】
2019216723.tif 000049
【０２１７】
［実施例１１］
追加の野生型ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼについてのＢＬＡＳＴ検索
比較ウィンドウとしてＰ８１２（配列番号９０）全体でＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ配列Ｇ７５５を使用したＢＬＡＳＴ検索は、米国国立衛生研究所（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）の国立医学図書館内の国立生物工学情報センターを介して利用可能なオンラインデータベースを使用して行われた。ＢＬＡＳＴ検索は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのＶ７８３とＨ７８４位での同一性を含む、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとの大規模な配列同一性を共有する他の種由来の多数の野生型ＤＮＡポリメラーゼを明らかにした（「ＶＨ関連ＤＮＡポリメラーゼ」）。これらの熱安定性ポリメラーゼの例示的なリストを表２４に示し、推定上の熱感受性ポリメラーゼの同様のリストを表２５に示す。１つのポリメラーゼ遺伝子（ファクラミア・ホミニス）を除くすべての同定された野生型ポリメラーゼ遺伝子において、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのＶ７８３およびＨ７８４に対応するアミノ酸を保存した。しかしながら、例外的な場合、すなわち、ファクラミア・ホミニスの場合には、Ｉｌｅは、Ｖ７８３に対応するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの残基位置で天然に存在する。しかしながら、この特定の置換を含む突然変異体ＩＤ１に対応するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、野生型のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのように振る舞う。このようにして、ファクラミア・ホミニスのＤＮＡポリメラーゼは、外見上、この位置でＶａｌの強い選択から生じ、ＶａｌまたはＩｌｅ残基のいずれかが存在する場合、野生型活性を維持することが想定される。これらのＢＬＡＳＴ結果は、増大した鋳型識別活性を有するＤＮＡポリメラーゼに対して天然の対抗選択を確認し、これらの特性を有する開示された、工学的に操作されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体が新規であり、非自明であるという強力な証拠を提供する。
【０２１８】
これらの同定されたＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの残基Ｖ７８３とＶ７８４を含む領域において、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと大規模な配列相同性を共有する。工学的に操作されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体で観察されたように、同定された非Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの各々は、それぞれの未修飾対応物と比較して、増大した鋳型識別活性を有する、工学的に操作された突然変異体酵素が生じ得る配列スペースを表す。非Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼについて同一のアミノ酸置換に関して得られた増大した鋳型識別活性の大きさは、それぞれ未修飾非Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと比較した場合、またはさらには対応するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体について観察された増大した鋳型識別活性の大きさと比較して、同一でなくてもよい。それにもかかわらず、この開示の強力な予測は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの残基Ｖ７８３および／またはＨ７８４に相同性を有する非Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにおける少なくともいくつかのアミノ酸置換は、それぞれの未修飾対応物と比較して増大した鋳型識別活性を示す。
【０２１９】
【表２４】
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2019216723.tif 000051
【０２２０】
【表２５】
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【０２２１】
［実施例１２］
Ｈ７８４位で追加のコドン最適化されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体の生成
Ｔａｑポリメラーゼの最初の１８個の突然変異体バージョン（表３、Ｍｕｔ  ＩＤ１−１８）の特性を決定した後、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの追加の１８個の突然変異体バージョン（表３、Ｍｕｔ  ＩＤ１９−３０）は、クローニングされたＯｐｔｉＴａｑコドン最適化ＷＴ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの部位特異的突然変異誘発によって作製された。完全なセットは、Ｔａｑポリメラーゼ中の７８４位の全ての可能なアミノ酸変化を表す。特定の突然変異は、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発法を使用してＯｐｔｉＴａｑ配列に導入された（Ｗｅｉｎｅｒ  ＭＰら、Ｇｅｎｅ．、１５１（１−２）：１１９−２３頁（１９９４））。それぞれの突然変異誘発反応は、１×ＫＯＤ  ＰＣＲ緩衝液中の、二本鎖ＯｐｔｉＴａｑプラスミド（２０ｎｇ）にアニーリングされた、所望の塩基変化を含有する１０ｐｍｏｌの２つの相補性オリゴヌクレオチド（表２６）、５Ｕ  ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ−ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、１．５ｍＭのＭｇＳＯ４を採用した。熱サイクルパラメータは、９５℃で３分間（９５℃で２０秒間−５５℃で２０秒間−７０℃で２．５分間）の１６サイクル、続く、７０℃で４分間の浸漬であった。ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発後、増幅産物を３７℃で１時間、１０ＵのＤｐｎＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｓｈ、ＭＡ）で処理し、その後、８０℃で２０分間不活性化を行った。消化材料の１１０分の１をＸＬ−１  Ｂｌｕｅコンピテント細菌に形質転換した。細菌クローンを単離し、プラスミドＤＮＡを調製し、個々の突然変異をサンガーＤＮＡ配列決定により確認した。Ｅ．コリにおいて組換えタンパク質を発現するのに適したｐＥＴ−２７ｂ（＋）発現ベクターにすべての突然変異体を残存させた。実施例３に記載したように、Ｔａｑポリメラーゼの組換え突然変異体の発現および精製を行った。
【０２２２】
【表２６】
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2019216723.tif 000054
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【０２２３】
［実施例１３］
ＰＣＲにおいてＨ７８４位で変更された１８個の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの特性の特徴付け
実施例１２に記載された１８個の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、ポリメラーゼ活性と、プライマーオリゴヌクレオチドにおいて３’−ＲＮＡ残基を識別する能力について特徴付けられた。
【０２２４】
精製された野生型タンパク質の単位活性は、市販の天然非ホットスタートＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）と比較して、公知量のＯｐｔｉＴａｑと各突然変異体のｑＰＣＲにおける性能を比較することによって決定された。定量サイクル値（Ｃｑ、正のシグナルが最初に検出される増幅サイクル数）と増幅曲線形状は、両酵素がそれぞれに対して最適以下の範囲内で同様に行われるナノグラム量を決定するために分析された。これらのナノグラム量およびＴａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼの公知の単位値を使用すると、相対活性単位値は、ＰＣＲを支持するのに十分な活性を有する突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ酵素のすべてに対して外挿することができた。
【０２２５】
以下の反応条件を採用した：１０μＬの最終体積中の１×ｑＰＣＲ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）、８００μＭ  ｄＮＴＰ（それぞれ２００μＭ）、５００ｎＭ  Ｆｏｒプライマー（Ｈｓ  ＨＰＲＴ  Ｆ５１７、配列番号４３）、５００ｎＭ  Ｒｅｖプライマー（Ｈｓ  ＨＰＲＴ  Ｒ５９１、配列番号４４）、２５０ｎＭプローブ（Ｈｓ  ＨＰＲＴ  Ｐ５５４、配列番号４５）、２×１０３コピーの線形のクローン化されたプラスミド鋳型（ＨＰＲＴ−ｔａｒｇ、配列番号４６）。それぞれ反応液に添加されたＤＮＡポリメラーゼの量を次のように変化させた：野生型（ＯｐｔｉＴａｑ）について、反応は、１０、１、０．１、０．０１、０．００１Ｕ／μＬ（１０μＬ反応あたり２２０、２２、２．２、０．２２または０．０２２ｎｇのタンパク質）を使用して設定された。突然変異体ポリメラーゼを同様の濃度で駆動した。また、ポリメラーゼ活性を示すそれらの突然変異体酵素は、より細かく滴定され、１０μＬ反応あたり２２０、２２、１０．６、４．８、２．２、１．１、０．４８および０．２２ｎｇのタンパク質を試験した。酵素希釈液を酵素希釈緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０％グリセロール）で作製した。反応は、９５℃で３０秒、続いて［９５℃で１５秒、続いて６０℃で１分間］の６０サイクルというサイクリングパラメータを使用して、ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で３８４ウェルフォーマットにおいて行った。検出は、蛍光をクエンチされたプローブ（５’−ヌクレアーゼアッセイフォーマット、Ｔａｑ突然変異体の本シリーズに導入された突然変異は、５‘−ヌクレアーゼドメインに存在しないことに留意されたい。）を使用して達成された。プライマー、プローブおよび鋳型（プラスミドインサート）の配列を表２７に示す。
【０２２６】
【表２７】
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【０２２７】
これらの１８個のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を上記で概説したように特徴付けた。結果を表２８に要約する。突然変異体ＩＤ１９、２３、２５、２８および３１から３６を含む１０個の突然変異体は、検出可能なＤＮＡポリメラーゼ活性を示さず、さらに研究されなかった。４つの突然変異体である突然変異体ＩＤ２０、２１、２７および２９は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有していた；しかしながら、処理能力は、野生型酵素と比較して４−６倍減少した。３つの突然変異体である突然変異体ＩＤ２４、２６および３０は、野生型ＯｐｔｉＴａｑに類似したＤＮＡポリメラーゼ活性を示した。
【０２２８】
【表２８】
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【０２２９】
ＤＮＡポリメラーゼ活性の適切なレベルを示したこれらの突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのサブセットは、野生型ＯｐｔｉＴａｑ酵素と比較して、３’−ＲＮＡ残基と対比して３’−ＤＮＡを有するプライマー間を識別する能力について研究された。リアルタイムＰＣＲは、前述のように行われ、１０μＬ反応あたり０．５単位の野生型ＯｐｔｉＴａｑに等しい各突然変異体ＤＮＡポリメラーゼの量を反応において採用した。以下の反応条件を採用した：１０μＬの最終体積中の１×ｑＰＣＲ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）、８００μＭ  ｄＮＴＰ（それぞれ２００μＭ）、５００ｎＭ  Ｆｏｒプライマー（Ｈｓ  ＳＦＲＳ９  Ｆ５６９ｒＵ、配列番号４７）、５００ｎＭ  Ｒｅｖプライマー（Ｈｓ  ＳＦＲＳ９  Ｒ７１２  ｒＡ、配列番号４８）、２５０ｎＭプローブ（Ｈｓ  ＳＦＲＳ９  Ｐ６４４、配列番号４９）、２×１０３コピーの線形のクローン化されたプラスミド鋳型（ＳＦＲＳ９−ｔａｒｇ、配列番号５０）。反応は、９５℃で３０秒、続いて［９５℃で１５秒、続いて６０℃で１分間］の６０サイクルというサイクリングパラメータを使用して、ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で３８４ウェルフォーマットにおいて行った。検出は、蛍光をクエンチされたプローブ（５’−ヌクレアーゼアッセイフォーマット）を使用して達成された。プライマー、プローブおよび鋳型（プラスミドインサート）の配列を表２９に示す。
【０２３０】
【表２９】
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【０２３１】
ＰＣＲを支持した８個のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を上記で概説したように、３’−ＲＮＡ修飾されたプライマーを使用する能力について試験された。結果を表２８に要約する。突然変異体ＩＤ２０および２２は、３’−ＲＮＡ残基と比較して３’−ＤＮＡを有するプライマー間の差を示さなかった。突然変異体ＩＤ２１、２４、２６、２７、２９および３０は、３’−ＲＮＡプライマーを使用して増幅遅延を示した。したがって、追加のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体が同定され、３’−ＲＮＡ残基からプライミングに対して識別された。ＲＮＡプライミングで幾分遅延を示し、高い処理能力を示したそれらの突然変異体は、プライマー３’−残基ミスマッチ識別において改善のために研究された。
【０２３２】
［実施例１４］
Ｈ７８４位で変更された突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した対立遺伝子特異的ＰＣＲにおける改善されたミスマッチ識別
実施例１２および１３で研究された１８個の突然変異体酵素のうち、突然変異体ＩＤ２１、２４、２６、２７、２９および３０は、プライマーにおける３’−ＲＮＡ残基を識別する能力を示し、高い酵素活性／処理能力を保持した。これら６つの突然変異体および追加として突然変異体ＩＤ２０と２２は、対立遺伝子特異的ｑＰＣＲアッセイを使用して、野生型ＯｐｔｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと比較した３’末端ＤＮＡミスマッチを識別する能力について研究された。増幅反応は、合成オリゴヌクレオチド鋳型に対して行われ、この場合、リバースプライマーの３’末端に位置するように配置された単一塩基を変化させた（ＳＮＰ）。この位置で４つの可能な塩基のそれぞれを有する合成鋳型を採用した。３’末端で４つの可能な塩基のそれぞれを有するリバースプライマーを採用した。すべての対のプライマー／鋳型組み合わせの相対増幅効率をｑＰＣＲを使用して評価した。
【０２３３】
定量的対立遺伝子特異的リアルタイムＰＣＲ（ＡＳ−ｑＰＣＲ）は、２×１０５コピーの１０３ｂｐ合成鋳型（配列番号５１−５４）を使用して、３８４ウェルフォーマットにおいて１０μＬ反応体積中で行われた。使用された最終的な反応条件は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（２５℃でｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣＬ、および３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、８００μＭ総ｄＮＴＰ、ならびに２００ｎＭのユニバーサルフォワードプライマー（配列番号６０）、２００ｎＭのリバースプライマー（別々の反応が、対立遺伝子特異的プライマー配列番号５５−５８の各々または対照ユニバーサルプライマー配列番号５９について設定された。）および２００ｎＭの５’ヌクレアーゼ検出プローブ（配列番号６１）であった。各対立遺伝子特異的プライマーは、それぞれのＳＮＰ鋳型に基づいて試験された。反応は、０．５Ｕ（１０．８ｎｇ／１１．１ｎＭ／１１１ｆｍｏｌ）の野生型ＯｐｔｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたは０．５Ｕの、研究された９つのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体（突然変異体ＩＤ３（Ｈ７８４Ｑ）（１０．８ｎｇ／１１．１ｎＭ／１１１ｆｍｏｌ）；突然変異体ＩＤ２０  Ｈ７８４Ａ（５４ｎｇ／５５．５ｎＭ／５５５ｆｍｏｌ）；突然変異体ＩＤ２２  Ｈ７８４Ｔ（１０．８ｎｇ／１１．１ｎＭ／１１１ｆｍｏｌ）；突然変異体ＩＤ２４  Ｈ７８４Ｖ（２４ｎｇ／２４．７ｎＭ／２４６．７ｆｍｏｌ）；突然変異体ＩＤ２６  Ｈ７８４Ｉ（２１．６ｎｇ／２２．２ｎＭ／２２２ｆｍｏｌ）；突然変異体ＩＤ２７  Ｈ７８４Ｍ（１０．８ｎｇ／１１．１ｎＭ／１１１ｆｍｏｌ）；突然変異体ＩＤ２９  Ｈ７８４Ｆ（４９．１ｎｇ／４９．４ｎＭ／４９４．５ｆｍｏｌ）；突然変異体ＩＤ３０  Ｈ７８４Ｙ）（２４ｎｇ／２４．７ｎＭ／２４６．７ｆｍｏｌ）のうちの１つのいずれかを利用した。増幅は、以下のサイクリングパラメータ：９５℃で３０秒間の初期変性、続く、９５℃で１０秒間、その後の６０℃で３０秒間の６０サイクルを使用して、ＣＦＸ３８４（商標）Ｃ１０００（商標）サーモサイクラーシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で行われた。本実施例で使用されたオリゴヌクレオチド試薬を表３０に示す。
【０２３４】
【表３０】
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【０２３５】
最初に、すべての反応を三連で実施した。野生型ＯｐｔｉＴａｑを使用した場合、同様の結果がすべての複製について得られた。しかしながら、結果は、変異体ポリメラーゼについてより大きな変動を示した。したがって、統計学的に意味のある結果を得るために、各反応は、突然変異体ポリメラーゼについて２４回、野生型酵素について２１回行われた。ΔＣｑ値は、各ミスマッチ塩基対について得られたＣｑ値−マッチした塩基対について得られたＣｑ値として計算された（ΔＣｑ＝Ｃｑミスマッチ−Ｃｑマッチ）。すべての２４複製についてのΔＣｑ値を平均し、標準偏差を計算した。結果を表３１に示し、図３Ｃ、３Ｄ、３Ｄ、３Ｆおよび３Ｇにおいてグラフ的に要約する。リバースプライマーは対立遺伝子特異的プライマーであることに留意されたい。そのため、「Ｓｙｎ  Ｒｅｖ  Ｔ」プライマー（配列番号５５）は、鋳型Ａ（配列番号５１）に対して完全な一致する、などである。
【０２３６】
【表３１】
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【０２３７】
野生型ＯｐｔｉＴａｑは、−０．８から８．５の範囲で４．１のこの合成アンプリコン系において、ＡＳ−ｑＰＣＲについての平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ３（Ｈ７８４Ｑ）は、４．６から２１．２の範囲で９．９の平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ２０（Ｈ７８４Ａ）は、６．３から１４．９の範囲で１１．２の平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ２１（Ｈ７８４Ｓ）は、６．６から２５．８の範囲で１５．３の平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ２２（Ｈ７８４Ｔ）は、１．５から１３．３の範囲で６．６の平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ２４（Ｈ７８４Ｖ）は、−０．３から１０．２の範囲で４．１の平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ２６（Ｈ７８４Ｉ）は、０．３から１１．３の範囲で５．０の平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ２７（Ｈ７８４Ｍ）は、４．５から１６．７の範囲で９．８の平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ２９（Ｈ７８４Ｆ）は、３．５から１３．３の範囲で７．８の平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ３０（Ｈ７８４Ｙ）は、５．３から１５．７の範囲で８．３の平均ΔＣｑを示した。したがって、４つの鋳型塩基と４つの３’−末端プライマー塩基のほぼすべての対の組み合わせにおいて、本発明の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、野生型ＯｐｔｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼよりもミスマッチに対して大きな識別を示した。各ミスマッチ対に対する改善の大きさは、突然変異体と野生型酵素の間の識別の差であるΔΔＣｑによって定義される（ΔΔＣｑ＝ΔＣｑ突然変異体−ΔＣｑ野生型）。ΔΔＣｑ値を計算し、表３２に示す。
【０２３８】
【表３２】
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【０２３９】
突然変異体ＩＤ３（Ｈ７８４Ｑ）は、野生型ＯｐｔｉＴａｑに比べて４．９の平均ΔΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ２０（Ｈ７８４Ａ）は、野生型ＯｐｔｉＴａｑに比べて７．１の平均ΔΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ２１（Ｈ７８４Ｓ）は、野生型ＯｐｔｉＴａｑに比べて１１．２の平均ΔΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ２２（Ｈ７８４Ｔ）は、野生型ＯｐｔｉＴａｑに比べて２．５の平均ΔΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ２４（Ｈ７８４Ｖ）は、野生型ＯｐｔｉＴａｑに比べて−０．２の平均ΔΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ２６（Ｈ７８４Ｉ）は、野生型ＯｐｔｉＴａｑに比べて１．０の平均ΔΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ２７（Ｈ７８４Ｍ）は、野生型ＯｐｔｉＴａｑに比べて５．７の平均ΔΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ２９（Ｈ７８４Ｆ）は、野生型ＯｐｔｉＴａｑに比べて３．６の平均ΔΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ３０（Ｈ７８４Ｙ）は、野生型ＯｐｔｉＴａｑに比べて４．２の平均ΔΔＣｑを示した。したがって、突然変異体ＩＤ２４（Ｈ７８４Ｖ）を除いて、本発明の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのそれぞれは、ミスマッチ識別において野生型ＯｐｔｉＴａｑと比較して有意な改善を示した。全体的に、突然変異体ＩＤ２１（Ｈ７８４Ｓ）は、ＡＳ−ＰＣＲアッセイを使用して、この実施例において研究された９つの突然変異体酵素のセット内で最良のＳＮＰ識別を示した。
【０２４０】
［実施例１５］
ヒトゲノムＤＮＡ  ＳＮＰアッセイにおいて突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用したｒｈＰＣＲにおける改善されたミスマッチ識別
実施例１４は、合成アンプリコンｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイ系において、本発明の新規な突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの有用性を実証した。本実施例は、ヒトゲノムＤＮＡ  ｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイ系における新規な突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの有用性を実証し、ＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）におけるＳＮＰ部位を調べた。アッセイは、コーリエル医学研究所（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）からの標的ＤＮＡ  ＧＭ１８５６２（ホモ接合Ｃ／Ｃ）およびＧＭ１８５３７（ホモ接合Ｔ／Ｔ）を採用した。２つの異なるブロック型切断性プライマー設計を試験し、世代１（Ｇｅｎ１）「ＲＤＤＤＤｘ」プライマーと世代２（Ｇｅｎ２）「ＲＤｘｘＤ」プライマーを含んだ（ＲＮＡＳＥ  Ｈ−ＢＡＳＥＤ  ＡＳＳＡＹＳ  ＵＴＩＬＩＺＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＲＮＡ  ＭＯＮＯＭＥＲＳと題するＢｅｈｌｋｅらによる米国特許出願第２０１２／０２５８４５５号を参照されたい。）。
【０２４１】
定量的リアルタイムｒｈＰＣＲは、２０ｎｇ（標的の６６００コピーに相当）のヒトゲノムＤＮＡ（ＧＭ１８５６２またはＧＭ１８５３７）を含む３８４ウェルフォーマットにおいて１０μＬの反応体積中で行われた。反応は、０．５Ｕ（１０．８ｎｇ／１１．１ｎＭ／１１１ｆｍｏｌ）の野生型ＯｐｔｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたは０．５Ｕの、９つのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体（ＭＵＴ  ＩＤ３、Ｈ７８４Ｑ；ＭＵＴ  ＩＤ２０、Ｈ７８４Ａ；ＭＵＴ  ＩＤ２１、Ｈ７８４Ｓ；ＭＵＴ  ＩＤ２２、Ｈ７８４Ｔ；ＭＵＴ  ＩＤ２４、Ｈ７８４Ｖ；ＭＵＴ  ＩＤ２６、Ｈ７８４Ｉ；ＭＵＴ  ＩＤ２７  Ｈ７８４Ｍ；ＭＵＴ  ＩＤ２９、Ｈ７８４Ｆ；ＭＵＴ  ＩＤ３０、Ｈ７８４Ｙ）のうちの１つのいずれかを利用した。使用された最終的な反応条件は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（２５℃でｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣＬ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、８００μＭ総ｄＮＴＰ、２００ｎＭのフォワードプライマー（配列番号７５−７９）、２００ｎＭのユニバーサルリバースプライマー（配列番号７４）および２００ｎＭのＳＭＡＤ７プローブ（配列番号８０）であった。８５ｂｐのＳＭＡＤ７アンプリコンの配列を配列番号８１として示す。フォワードプライマーは、ＲＤＤＤＤｘ構成Ｇｅｎ１対立遺伝子特異的ｒｈＰＣＲプライマー（配列番号７６および７７）、ＲＤｘｘＤ構成Ｇｅｎ２対立遺伝子特異的ｒｈＰＣＲプライマー（配列番号７８および７９）、ならびに対立遺伝子特異的でない対照ユニバーサルフォワードプライマー（配列番号７５）を含んだ。この実施例において採用されたオリゴヌクレオチド試薬を表３３に示す。反応は、Ｇｅｎ１  ＲＤＤＤＤｘプライマーと対照プライマー（配列番号７５−７７）について、１０μＬあたり２００ｍＵ（３８４ｆｍｏｌｅ、３８．４ｎＭ）が使用されるＭＵＴ  ＩＤ２１（Ｈ７８４Ｓ）を除いて、１０μＬ反応あたり２．６ｍＵの濃度（５ｆｍｏｌｅ、０．５ｎＭ）、またはＧｅｎ２  ＲＤｘｘＤプライマー（配列番号７８および７９）について１０μＬ反応あたり２００ｍＵの濃度（３８４ｆｍｏｌｅ、３８．４ｎＭ）で１μＬのＰ．ａ．ＲＮａｓｅ  Ｈ２を含んだ。増幅は、以下：９５℃で３分間、続く、９５℃で１０秒間と６０℃で３０秒間の９５サイクルのように、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）上で行われた。全ての反応を三連で行った。
【０２４２】
【表３３】
2019216723.tif 000068
【０２４３】
Ｇｅｎ１  ＲＤＤＤＤｘ  ｒｈＰＣＲプライマーを使用した結果を表３４に示し、Ｇｅｎ２  ＲＤｘｘＤ  ｒｈＰＣＲプライマーを使用した結果を表３５に示す。突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの使用は、Ｇｅｎ１  ＲＤＤＤＤｘプライマーを使用したこのヒトゲノムＤＮＡ  ｒｈＰＣＲアッセイにおけるＳＮＰ識別において有意な改善を示したが、増幅効率は、マッチＣｑの増加によって示されるように、多く場合、減少した。識別における大きな改善は、Ｇｅｎ２  ＲＤｘｘＤプライマーを使用して見られたが、増幅効率は、多くの場合、ここでは同様に喪失した。Ｇｅｎ２  ＲＤｘｘＤプライマーは、本質的にはより大きなＳＮＰ識別を示し、ΔＣｑ値が、ある場合において、マッチとミスマッチ間で４０を超える増幅サイクルであるようにこれらのレベルは増加した；ｑＰＣＲ反応がほとんど４５−５０サイクルを超えて行われず、正のシグナルが７０サイクル後までこれらの場合において検出されなかったため、識別のこのレベルは、大部分のユーザーにとって「アッセイよりも大きい」ものとなる（表３５）。したがって、新規の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの使用は、ｒｈＰＣＲ遺伝子型決定アッセイにおけるＳＮＰ識別を改善する。
【０２４４】
【表３４】
2019216723.tif 000069
2019216723.tif 000070
2019216723.tif 000071
【０２４５】
【表３５】
2019216723.tif 000072
2019216723.tif 000073
2019216723.tif 000074
【０２４６】
ＳＭＡＤ７  ＳＮＰ遺伝子型決定アッセイのためのΔＣｑ値は、Ｇｅｎ１  ＲＤＤＤＤｘプライマーについては図５Ｂと５Ｃに、およびＧｅｎ２  ＲＤｘｘＤプライマーについては図６Ｂと６Ｃにグラフ的に要約される。本発明の種々の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが異なる増幅アッセイにおいて有用性を有するだけでなく、異なる突然変異体が、使用されるアッセイの性質に応じて様々なレベルの利益を示すことも明らかである。したがって、最大利益が得られるように、特性が異なるアッセイ／応用にマッチし得る突然変異体ポリメラーゼのコレクションを有することは有益である。
【０２４７】
［実施例１６］
突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによるｒｈＰＣＲを使用したゲノムＤＮＡにおける低頻度対立遺伝子の改善された識別
ｒｈＰＣＲにおけるＧｅｎ２  ＲＤｘｘＤブロック型切断性プライマーの使用は、天然の（野生型）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した野生型ゲノムＤＮＡのバックグラウンドにおいて、１：１，０００から１：１０，０００のレベルでＳＮＰの存在を検出することができる（ＲＮＡＳＥ  Ｈ−ＢＡＳＥＤ  ＡＳＳＡＹＳ  ＵＴＩＬＩＺＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＲＮＡ  ＭＯＮＯＭＥＲＳと題する、Ｂｅｈｌｋｅらによる米国特許出願第２０１２／０２５８４５５号を参照されたい。）。本実施例は、本発明の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼがｒｈＰＣＲアッセイにおいて低頻度対立遺伝子識別を改善することを実証する。
【０２４８】
低頻度対立遺伝子の検出実験は、ＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）におけるＳＮＰ部位の塩基の同一性を検出するように設計され、標的ＤＮＡのＧＭ１８５６２（ホモ接合Ｃ／Ｃ）およびＧＭ１８５３７（ホモ接合Ｔ／Ｔ）（コーリエル医学研究所、Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）を採用した。対照反応は、２ｎｇ（６６０コピー）、０．２ｎｇ（６６コピー）または０．０２ｎｇ（６．６コピー）のインプットされた、マッチした標的ＤＮＡを使用して設定された。低頻度対立遺伝子の検出反応は、１つの対立遺伝子の２ｎｇ（６６０コピー）、０．２ｎｇ（６６コピー）または０．０２ｎｇ（６．６コピー）のインプットされた、マッチした標的ＤＮＡ＋２００ｎｇ（６６，０００コピー）の他の（ミスマッチの）対立遺伝子を使用して設定された。バックグラウンドは、０コピーのマッチした標的ＤＮＡ＋２００ｎｇ（６６，０００コピー）のミスマッチの標的ＤＮＡを含有した反応において確立された。両方の組み合わせを試験した：過剰ＧＭ１８５３７（Ｔ／Ｔ）の存在下で低頻度対立遺伝子としてＧＭ１８５６２（Ｃ／Ｃ）および過剰ＧＭ１８５６２（Ｃ／Ｃ）の存在下で低頻度対立遺伝子としてＧＭ１８５３７（Ｔ／Ｔ）。
【０２４９】
定量的リアルタイムｒｈＰＣＲは、３８４ウェルフォーマットにおいて１０μＬ反応体積中で行われた。使用された最終的な反応条件は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（２５℃でｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣＬ、３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．８ｍＭ  ｄＮＴＰ、２００ｎＭのＳＭＡＤ７フォワードプライマーの１つ（配列番号７５、７８および７９）、２００ｎＭのＳＭＡＤ７リバースプライマー（配列番号７４）および２００ｎＭのＳＭＡＤ７プローブ（配列番号８０）であった。これらのプライマーによって画定される８５ｂｐのＳＭＡＤ７アンプリコンを配列番号８１として示す。フォワードプライマーは、未修飾である（対照、配列番号７５）、またはブロック型切断性ｒｈＰＣＲ  Ｇｅｎ２  ＲＤｘｘＤ設計を使用してＳＭＡＤ７  Ｃ−対立遺伝子（配列番号７８）もしくはＳＭＡＤ７  Ｔ−対立遺伝子（配列番号７９）に特異的であったことに留意されたい。反応は、０．５Ｕの野生型ＯｐｔｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、または０．５Ｕの、研究された３つのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体の例（ＭＵＴ  ＩＤ２０（Ｈ７８４Ａ）；ＭＵＴ  ＩＤ２７（Ｈ７８４Ｍ）；ＭＵＴ  ＩＤ３０（Ｈ７８４Ｙ））のうちの１つのいずれかを利用した。反応は、ＳＭＡＤ７  Ｆｏｒ  ｒＣ  ＤｘｘＤ（配列番号７８）プライマーを使用した場合に１０μＬ反応あたり２００ｍＵ（３８４ｆｍｏｌｅ）の濃度のＰ．アビシＲＮａｓｅ  Ｈ２および対照反応またはＳＭＡＤ７  Ｆｏｒ  ｒＵ  ＤｘｘＤ（配列番号７９）プライマーを使用した場合に１０μＬ反応あたり５００−６００ｍＵ（９６０−１１５２ｆｍｏｌｅ）の濃度のＰ．アビシＲＮａｓｅ  Ｈ２を含んだ。本実施例で使用されたオリゴヌクレオチド試薬を表３６に示す。サイクリングは、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）上で、以下：９５℃で３分間、続いて、９５℃で１０秒間と６０℃で３０秒の６５サイクルのように行われた。全ての反応を三連で行った。
【０２５０】
【表３６】
2019216723.tif 000075
【０２５１】
結果を分析し、表３７に示す。対照カラムは、マッチしたプライマー／標的反応についてＣｑ値を示し、ミスマッチの標的は存在せず、定量標準曲線を確立する。ＭＵＴ  ＩＤ  ＮＯ．３、Ｈ７８４Ｑを比較のためにデータ分析に含める。低頻度対立遺伝子の検出カラムは、６６，０００コピーのミスマッチ標的の存在下で、マッチしたプライマー／標的の６６０、６６、６または０（バックグラウンド対照）コピーの検出についてのＣｑ値を示す。バックグラウンドと正のシグナル間の少なくとも３サイクル差（ΔＣｑ＝３．０以上）低頻度対立遺伝子検出について「陽性な」反応と呼ぶために必要とされる；５サイクル差（ΔＣｑ＝５．０以上）が好ましいことが、一般的に想定される。この系において、バックグラウンドは、プライマーにマッチするインプットされていない標的を使用して増幅を行った場合に観察されたシグナルであり、そのため、シグナルは、ミスマッチ標的を起源とする増幅からのみ生じる。
【０２５２】
野生型ＯｐｔｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用すると、過剰な「Ｔ」バックグラウンドにおける「Ｃ」対立遺伝子の検出と過剰な「Ｃ」バックグラウンドにおける「Ｔ」対立遺伝子の検出はともに、１：１０００低頻度対立遺伝子検出事象（６６，０００コピーのミスマッチ標的の存在下での６６コピーのマッチ標的）と呼ぶためのストリンジェンシーのΔＣｑ３．０とΔＣｑ５．０レベルを満たした。１：１０，０００反応物（６６，０００コピーのミスマッチ標的の存在下での６コピーのマッチ標的）は、これらのいずれかの基準を満たさなかった。したがって、ｒｈＰＣＲは、このゲノムＤＮＡ  ＳＮＰ系において、野生型ＯｐｔｉＴａｑを使用した１：１０００低頻度対立遺伝子検出限界を有した。
【０２５３】
対照的に、４つの突然変異体の各々を使用したｒｈＰＣＲは、「Ｃ」と「Ｔ」対立遺伝子標的の両方について１：１０，０００の低頻度対立遺伝子検出限界を示し、ΔＣｑストリンジェンシーカットオフは３．０であった。ＭＵＴ  ＩＤ３（Ｈ７８４Ｑ）は、５．０のより高いΔＣｑストリンジェンシーカットオフについてのこのゲノムＳＮＰ系において、「Ｃ」と「Ｔ」標的の両方について１：１０，０００の低頻度対立遺伝子検出限界を示した。他の３つの突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＭＵＴ  ＩＤ２０（Ｈ７８４Ａ）；ＭＵＴ  ＩＤ２７（Ｈ７８４Ｍ）；ＭＵＴ  ＩＤ３０（Ｈ７８４Ｙ））は、ΔＣｑストリンジェンシーカットオフは５．０である、「Ｃ」対立遺伝子標的について１：１０，０００の低頻度対立遺伝子検出限界を示し、ΔＣｑストリンジェンシーカットオフは３．０である、「Ｔ」対立遺伝子標的について１：１０，０００の低頻度対立遺伝子検出限界を示した。したがって、本発明者らは、本発明の新規な突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、野生型ＤＮＡポリメラーゼの使用と比較して、ｒｈＰＣＲにおけるブロック型切断性プライマーを使用した、改善された低頻度対立遺伝子検出反応を提供すると結論付ける。
【０２５４】
【表３７】
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2019216723.tif 000077
【０２５５】
［実施例１７］
プライマーの３’末端でのＲＮＡ残基のミスマッチまたは存在についての改善された識別を示すＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体の配列
実施例１１−１５において採用されたコドン最適化変異体酵素の完全なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を以下に示す。これらの配列は、当業者により表１、３、４および２６において提供される情報から容易に誘導されるが、明確にするために、最終的に組み立てられた配列を提供する。塩基変化は、核酸置換およびアミノ酸置換について太字の下線を付したフォントで特定される。
【０２５６】
配列番号１４６、突然変異体ＩＤ２０（Ｈ７８４Ａ）のヌクレオチド配列。
【０２５７】
【化９】
2019216723.tif 000078
【０２５８】
配列番号１４７、突然変異体ＩＤ２０（Ｈ７８４Ａ）のアミノ酸配列。
【０２５９】
【化１０】
2019216723.tif 000079
【０２６０】
配列番号１４８、突然変異体ＩＤ２１（Ｈ７８４Ｓ）のヌクレオチド配列。
【０２６１】
【化１１】
2019216723.tif 000080
【０２６２】
配列番号１４９、突然変異体ＩＤ２１（Ｈ７８４Ｓ）のアミノ酸配列。
【０２６３】
【化１２】
2019216723.tif 000081
【０２６４】
配列番号１５０、突然変異体ＩＤ２２（Ｈ７８４Ｔ）のヌクレオチド配列。
【０２６５】
【化１３】
2019216723.tif 000082
【０２６６】
配列番号１５１、突然変異体ＩＤ２２（Ｈ７８４Ｔ）のアミノ酸配列。
【０２６７】
【化１４】
2019216723.tif 000083
【０２６８】
配列番号１５２、突然変異体ＩＤ２４（Ｈ７８４Ｖ）のヌクレオチド配列。
【０２６９】
【化１５】
2019216723.tif 000084
【０２７０】
配列番号１５３、突然変異体ＩＤ２４（Ｈ７８４Ｖ）のアミノ酸配列。
【０２７１】
【化１６】
2019216723.tif 000085
【０２７２】
配列番号１５４、突然変異体ＩＤ２６（Ｈ７８４Ｉ）のヌクレオチド配列。
【０２７３】
【化１７】
2019216723.tif 000086
【０２７４】
配列番号１５５、突然変異体ＩＤ２６（Ｈ７８４Ｉ）のアミノ酸配列。
【０２７５】
【化１８】
2019216723.tif 000087
【０２７６】
配列番号１５６、突然変異体ＩＤ２７（Ｈ７８４Ｍ）のヌクレオチド配列。
【０２７７】
【化１９】
2019216723.tif 000088
【０２７８】
配列番号１５７、突然変異体ＩＤ２７（Ｈ７８４Ｍ）のアミノ酸配列。
【０２７９】
【化２０】
2019216723.tif 000089
【０２８０】
配列番号１５８、突然変異体ＩＤ２９（Ｈ７８４Ｆ）のヌクレオチド配列。
【０２８１】
【化２１】
2019216723.tif 000090
【０２８２】
配列番号１５９、突然変異体ＩＤ２９（Ｈ７８４Ｆ）のアミノ酸配列。
【０２８３】
【化２２】
2019216723.tif 000091
【０２８４】
配列番号１６０、突然変異体ＩＤ３０（Ｈ７８４Ｙ）のヌクレオチド配列。
【０２８５】
【化２３】
2019216723.tif 000092
【０２８６】
配列番号１６１、突然変異体ＩＤ３０（Ｈ７８４Ｙ）のアミノ酸配列。
【０２８７】
【化２４】
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【０２８８】
［実施例１８］
５’エキソヌクレアーゼ活性を排除するように修飾されたコドン最適化されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体の生成
表３のいくつかの突然変異体の５’エキソヌクレアーゼ活性を排除した追加のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体を作製した。５’−エキソヌクレアーゼ活性を欠損したＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、従前、「ＫｌｅｎＴａｑ」と命名された（Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．、Ｇｅｎｅ  １１２：２９−３５頁、１９９２）。ＴａｑポリメラーゼのＮ末端５’エキソヌクレアーゼドメインの欠失は、酵素のミスマッチ識別性を向上させる（Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．、Ｇｅｎｅ  １１２：２９−３５頁、１９９２）。本研究は、本発明のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体で見られる特異性改善が５’−エキソヌクレアーゼ活性を排除した突然変異と組み合わせられたかどうかを特徴付けた。本明細書に示された実施例は、例示することを意図し、決して特許請求の範囲を限定するものではない。特定の突然変異は、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発法を使用してＯｐｔｉＴａｑ配列に導入された（Ｗｅｉｎｅｒ  ＭＰら、Ｇｅｎｅ．、１５１（１−２）：１１９−２３頁（１９９４））。各突然変異誘発反応は、５’エキソヌクレアーゼドメインを除いて、ＤＮＡポリメラーゼを含有するプラスミドの周囲を増幅するために、１０ｐｍｏｌの２つのオリゴヌクレオチド（表３８）を採用した。これらのプライマーは、増幅後の再ライゲーション可能にする５’リン酸を含有するように製造された。簡単には、これらのプライマーは、１×ＫＯＤ  ＰＣＲ緩衝液中の、先に特徴付けられた突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ（ＭＵＴ  ＩＤ２、３、１０、１８、２１および３０）（それぞれ２０ｎｇ）、５Ｕ  ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ−ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、１．５ｍＭのＭｇＳＯ４を含有する二本鎖プラスミドにアニーリングされた。熱サイクルパラメータは、９５℃で３分間（９５℃で２０秒間−５５℃で２０秒間−７０℃で２分間）の２５サイクル、続く、７０℃で４分間の浸漬であった。ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発後、増幅産物を３７℃で１時間、１０ＵのＤｐｎＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｓｈ、ＭＡ）で処理し、その後、８０℃で２０分間不活性化を行った。消化材料の６分の１をＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）とともに、１６℃で２０分間ライゲートし、続く、６５℃で１０分間不活性化を行った。ライゲートされた消化材料の１５分の１をＸＬ−１  Ｂｌｕｅコンピテント細菌に形質転換した。細菌クローンを単離し、プラスミドＤＮＡを調製し、５’エキソヌクレアーゼドメインの欠失をサンガーＤＮＡ配列決定により確認した。Ｅ．コリにおいて組換えタンパク質を発現するのに適したｐＥＴ−２７ｂ（＋）発現ベクターにすべての突然変異体を残存させた。実施例３に記載したように、Ｔａｑポリメラーゼの組換え突然変異体の発現および精製を行った。
【０２８９】
【表３８】
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【０２９０】
［実施例１９］
ＰＣＲにおける７つの５’−エキソヌクレアーゼ欠失突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの特性の特徴付け
実施例１８に記載された７つの突然変異Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、ポリメラーゼ活性について特徴付けられた。
【０２９１】
精製された野生型タンパク質の単位活性は、市販の非ホットスタートＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）と比較して、公知量のＯｐｔｉＴａｑと各突然変異体のｑＰＣＲにおける性能を比較することによって決定された。定量サイクル値（Ｃｑ、正のシグナルが最初に検出される増幅サイクル数）と増幅曲線形状は、両酵素がそれぞれに対して最適以下の範囲内で同様に行われるナノグラム量を決定するために分析された。これらのナノグラム量およびＴａｑ−Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼの公知の単位値を使用すると、相対活性単位値は、ＰＣＲを支持するのに十分な活性を有する突然変異体ＤＮＡポリメラーゼ酵素のすべてに対して外挿することができた。また、試験が行われ、ポリメラーゼが最適活性を示すＭｇＣｌ２濃度を決定した。
【０２９２】
以下の反応条件を採用した：１０μＬの最終体積中の１×ｑＰＣＲ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）、８００μＭ  ｄＮＴＰ（それぞれ２００μＭ）、５００ｎＭ  Ｆｏｒプライマー（Ｈｓ  ＨＰＲＴ  Ｆ５１７、配列番号４３）、５００ｎＭ  Ｒｅｖプライマー（Ｈｓ  ＨＰＲＴ  Ｒ５９１、配列番号４４）、２５０ｎＭ  ＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性プローブ（Ｈｓ  ＨＰＲＴ  ＲＮ２プローブ、配列番号１６４）、２０ｍＵパイロコッカス・アビシＲＮａｓｅ  Ｈ２、２×１０３コピーの線形のクローン化されたプラスミド鋳型（ＨＰＲＴ−ｔａｒｇ、配列番号４６）。ＭｇＣｌ２をそれぞれの場合において３、４または５ｍＭで試験した。それぞれ反応液に添加されたＤＮＡポリメラーゼの量を次のように変化させた：野生型（ＯｐｔｉＴａｑ）について、反応は、１０、１、０．１、０．０１、０．００１Ｕ／μＬ（１０μＬ反応あたり２２０、２２、２．２、０．２２または０．０２２ｎｇのタンパク質）を使用して設定された。突然変異体ポリメラーゼを同様の濃度で駆動した。また、ポリメラーゼ活性を示すそれらの突然変異体酵素は、より細かく滴定され、１０μＬ反応あたり２２０、２２、１０．６、４．８、２．２、１．１、０．４８および０．２２ｎｇのタンパク質を試験した。ポリメラーゼ希釈液を酵素希釈緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０％グリセロール）で作製した。反応は、９５℃で３０秒、続いて［９５℃で１５秒、続いて６０℃で１分間］の６０サイクルというサイクリングパラメータを使用して、ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で３８４ウェルフォーマットにおいて行った。検出は、蛍光をクエンチされたプローブ（Ｐ．ａ．ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素の作用によって切断される。）を使用して達成された。プライマー、プローブおよび鋳型（プラスミドインサート）の配列を表３９に示す。
【０２９３】
【表３９】
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【０２９４】
これらの７つのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ５’−エキソヌクレアーゼ欠失突然変異体を上記で概説したように特徴付けた。結果を表４０に要約する。７つ全ての突然変異体はＤＮＡポリメラーゼ活性を有していた；しかしながら、突然変異体ＩＤ３８、３９、４０、４１、４２および４３における処理能力は、野生型酵素と比較して１０−５０倍減少した。１つの突然変異体ＩＤ３７（ＯｐｔｉＴａｑ  ＫｌｅｎＴａｑ）は、野生型ＯｐｔｉＴａｑとほぼ同一であるＤＮＡポリメラーゼ活性を示した。したがって、ポリメラーゼ特異性を改善する点突然変異と一緒に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼドメインの完全な欠失の組み合わせはすべて、酵素活性と処理能力を有意に損なった。
【０２９５】
【表４０】
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【０２９６】
［実施例２０］
５’−エキソヌクレアーゼドメインの欠失も有する突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した対立遺伝子特異的ＰＣＲにおける改善されたミスマッチ識別
実施例１８および１９において研究された７つの突然変異体酵素のうち、突然変異体ＩＤ３７、３８、３９、４０、４１、４２および４３は、特徴付けするには十分な酵素活性／処理能力を保持した。これら７つの突然変異体は、対立遺伝子特異的ｑＰＣＲアッセイを使用して、野生型ＯｐｔｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと比較した３’末端ＤＮＡミスマッチを識別する能力について研究された。増幅反応は、合成オリゴヌクレオチド鋳型に対して行われ、この場合、リバースプライマーの３’末端に位置するように配置された単一塩基を変化させた（ＳＮＰ）。この位置で４つの可能な塩基のそれぞれを有する合成鋳型を採用した。３’末端で４つの可能な塩基のそれぞれを有するリバースプライマーを採用した。相対増幅効率をｑＰＣＲを使用して評価した。
【０２９７】
定量的対立遺伝子特異的リアルタイムＰＣＲ（ＡＳ−ｑＰＣＲ）は、２×１０５コピーの１０３ｂｐ合成鋳型（配列番号５１−５４）を使用して、３８４ウェルフォーマットにおいて１０μＬ反応体積中で行われた。使用された最終的な反応条件は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（２５℃でｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣＬ、実施例１９において各ポリメラーゼについて最適となるように決定された量ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、８００μＭ総ｄＮＴＰ、ならびに２００ｎＭのユニバーサルフォワードプライマー（配列番号６０）、２００ｎＭのリバースプライマー（別々の反応が、対立遺伝子特異的プライマー配列番号５５−５８の各々または対照ユニバーサルプライマー配列番号５９について設定された。）および２００ｎＭのＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性プローブ（配列番号１６５）であった。また、２０ｍＵパイロコッカス・アビシＲＮａｓｅ  Ｈ２を各反応に含めた。各対立遺伝子特異的プライマーは、それぞれのＳＮＰ鋳型に基づいて試験された。反応は、０．５Ｕ（１０．８ｎｇ／１１．１ｎＭ／１１１ｆｍｏｌ）のＯｐｔｉＴａｑ  ＫｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（突然変異体ＩＤ３７）または０．５Ｕの、研究された６つのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体（突然変異体ＩＤ３８（１０８ｎｇ／１１１ｎＭ／１１１０ｆｍｏｌ）；突然変異体ＩＤ３９（２１６ｎｇ／２２２ｎＭ／２２２０ｆｍｏｌ）；突然変異体ＩＤ４０（３６０ｎｇ／３７０ｎＭ／３７００ｆｍｏｌ）；突然変異体ＩＤ４１（１０６０ｎｇ／５５５ｎＭ／５５５０ｆｍｏｌ）；突然変異体ＩＤ４２（１０６０ｎｇ／５５５ｎＭ／５５５０ｆｍｏｌ）；突然変異体ＩＤ４３（２１６ｎｇ／２２２ｎＭ／２２２０ｆｍｏｌ））のうちの１つのいずれかを利用した。増幅は、以下のサイクリングパラメータ：９５℃で３０秒間の初期変性、続く、９５℃で１０秒間、その後の６０℃で３０秒間の６０サイクルを使用して、ＣＦＸ３８４（商標）Ｃ１０００（商標）サーモサイクラーシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で行われた。本実施例で使用されたオリゴヌクレオチド試薬を表４１に示す。
【０２９８】
【表４１】
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2019216723.tif 000099
【０２９９】
最初に、すべての反応を三連で実施した。野生型ＯｐｔｉＴａｑを使用した場合、同様の結果がすべての複製について得られた。しかしながら、結果は、変異体ポリメラーゼについてより大きな変動を示した。したがって、統計学的に意味のある結果を得るために、各反応は、突然変異体ポリメラーゼについて２４回、野生型酵素について２１回行われた。ΔＣｑ値は、各ミスマッチ塩基対について得られたＣｑ値−マッチした塩基対について得られたＣｑ値として計算された（ΔＣｑ＝Ｃｑミスマッチ−Ｃｑマッチ）。すべての２４複製についてのΔＣｑ値を平均し、標準偏差を計算した。結果を表４２に示し、図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃにおいてグラフ的に要約する。リバースプライマーは対立遺伝子特異的プライマーであることに留意されたい。そのため、「Ｓｙｎ  Ｒｅｖ  Ｔ」プライマー（配列番号５５）は、鋳型Ａ（配列番号５１）に対して完全な一致する、などである。
【０３００】
【表４２】
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2019216723.tif 000101
2019216723.tif 000102
【０３０１】
ＯｐｔｉＴａｑ  ＫｌｅｎＴａｑ突然変異体ＩＤ３７は、３．９から１４．７の範囲で９．８のこの合成アンプリコン系において、ＡＳ−ｑＰＣＲについての平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ３８（Ａ６６１Ｅ、Ｉ６６５Ｗ、Ｆ６６７Ｌ  ＫｌｅｎＴａｑ）は、７．９から１７．４の範囲で１１．９の平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ３９（Ｖ７８３Ｆ  ＫｌｅｎＴａｑ）は、６．９から１７．１の範囲で１１．３の平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ４０（Ｈ７８４Ｑ  ＫｌｅｎＴａｑ）は、７．９から１８．２の範囲で１１．９の平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ４１（Ｖ７８３Ｌ  Ｈ７８４Ｑ  ＫｌｅｎＴａｑ）は、５．８から１５．８の範囲で１０．５の平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ４２（Ｈ７８４Ｓ  ＫｌｅｎＴａｑ）は、８．３から１５．８の範囲で１１．９の平均ΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ４３（Ｈ７８４Ｙ  ＫｌｅｎＴａｑ）は、６．５から１５．５の範囲で１１．２の平均ΔＣｑを示した。したがって、４つの鋳型塩基と４つの３’−末端プライマー塩基のすべての対の組み合わせにおいて、本発明の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＯｐｔｉＴａｑまたはＯｐｔｉＴａｑ  ＫｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼよりもミスマッチに対して大きな識別を示した。各ミスマッチ対に対する改善の大きさは、突然変異体と野生型ＫｌｅｎＴａｑ酵素の間の識別の差であるΔΔＣｑによって定義される（ΔΔＣｑ＝ΔＣｑ突然変異体ＫｌｅｎＴａｑ−ΔＣｑＯｐｔｉＴａｑ  ＫｌｅｎＴａｑ）。ΔΔＣｑ値を計算し、表４３に示す。
【０３０２】
【表４３】
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【０３０３】
突然変異体ＩＤ３８（Ａ６６１Ｅ、Ｉ６６５Ｗ、Ｆ６６７Ｌ  ＫｌｅｎＴａｑ）は、ＯｐｔｉＴａｑ  ＫｌｅｎＴａｑに比べて１．７の平均ΔΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ３９（Ｖ７８３Ｆ  ＫｌｅｎＴａｑ）は、ＯｐｔｉＴａｑ  ＫｌｅｎＴａｑに比べて２．０の平均ΔΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ４０（Ｈ７８４Ｑ  ＫｌｅｎＴａｑ）は、ＯｐｔｉＴａｑ  ＫｌｅｎＴａｑに比べて２．１の平均ΔΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ４１（Ｖ７８３Ｌ  Ｈ７８４Ｑ  ＫｌｅｎＴａｑ）は、ＯｐｔｉＴａｑ  ＫｌｅｎＴａｑに比べて０．７の平均ΔΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ４２（Ｖ７８４Ｓ  ＫｌｅｎＴａｑ）は、ＯｐｔｉＴａｑ  ＫｌｅｎＴａｑに比べて２．１の平均ΔΔＣｑを示した。突然変異体ＩＤ４３（Ｈ７８４Ｙ  ＫｌｅｎＴａｑ）は、ＯｐｔｉＴａｑ  ＫｌｅｎＴａｑに比べて２．０の平均ΔΔＣｑを示した。したがって、本発明の突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのそれぞれは、５’−エキソヌクレアーゼドメインの完全な欠失を有するが、他の第２の突然変異を含まないＯｐｔｉＴａｑ  ＫｌｅｎＴａｑと比較してミスマッチ識別において有意な改善を示した。全体的に、突然変異体ＩＤ４０および４２（Ｈ７８４Ｑ  ＫｌｅｎＴａｑおよびＨ７８４Ｓ  ＫｌｅｎＴａｑ）は、ＡＳ−ＰＣＲアッセイを使用して、この実施例において研究された突然変異体酵素のセット内で最良のＳＮＰ識別を示した。
【０３０４】
［実施例２１］
ヒトゲノムＤＮＡ  ＳＮＰアッセイにおいて突然変異体ＫｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用したｒｈＰＣＲにおける改善されたミスマッチ識別
実施例２０は、合成アンプリコンｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイ系において、本発明の新規な突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの有用性を実証した。本実施例は、ヒトゲノムＤＮＡ  ｒｈＰＣＲ  ＳＮＰ識別アッセイ系における新規な突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの有用性を実証し、ＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ＿００５９０４、Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ、ｒｓ４９３９８２７）におけるＳＮＰ部位を調べた。アッセイは、コーリエル医学研究所（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）からの標的ＤＮＡ  ＧＭ１８５６２（ホモ接合Ｃ／Ｃ）およびＧＭ１８５３７（ホモ接合Ｔ／Ｔ）を採用した。１つのブロック型切断性プライマー設計、世代１（Ｇｅｎ１）「ＲＤＤＤＤｘ」プライマー（ＲＮＡＳＥ  Ｈ−ＢＡＳＥＤ  ＡＳＳＡＹＳ  ＵＴＩＬＩＺＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＲＮＡ  ＭＯＮＯＭＥＲＳと題するＢｅｈｌｋｅらによる米国特許出願第２０１２／０２５８４５５号を参照されたい。）を試験した。
【０３０５】
定量的リアルタイムｒｈＰＣＲは、２０ｎｇ（標的の６６００コピーに相当）のヒトゲノムＤＮＡ（ＧＭ１８５６２またはＧＭ１８５３７）を含む３８４ウェルフォーマットにおいて１０μＬの反応体積中で行われた。反応は、０．５Ｕ（１０．８ｎｇ／１１．１ｎＭ／１１１ｆｍｏｌ）のＯｐｔｉＴａｑ  ＫｌｅｎＴａｑＤＮＡポリメラーゼまたは０．５Ｕの、３つのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体（突然変異体ＩＤ４０（３６０ｎｇ／３７０ｎＭ／３７００ｆｍｏｌ）；突然変異体ＩＤ４１（１０６０ｎｇ／５５５ｎＭ／５５５０ｆｍｏｌ）；突然変異体ＩＤ４３（２１６ｎｇ／２２２ｎＭ／２２２０ｆｍｏｌ））のうちの１つのいずれかを利用した。使用された最終的な反応条件は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（２５℃でｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣＬ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、８００μＭ総ｄＮＴＰ、２００ｎＭのフォワードプライマー（配列番号７５−７９）、２００ｎＭのユニバーサルリバースプライマー（配列番号７４）および２００ｎＭのＲＮａｓｅ  Ｈ２切断性ＳＭＡＤ７プローブ（配列番号１６６）であった。８５ｂｐのＳＭＡＤ７アンプリコンを配列番号８１として示す。フォワードプライマーは、ＲＤＤＤＤｘ構成Ｇｅｎ１対立遺伝子特異的ｒｈＰＣＲプライマー（配列番号７６および７７）、および対立遺伝子特異的でない対照ユニバーサルフォワードプライマー（配列番号７５）を含んだ。この実施例において採用されたオリゴヌクレオチド試薬を表４４に示す。反応は、１０μＬ反応あたり２．６ｍＵ（５ｆｍｏｌｅ、０．５ｎＭ）の濃度で１μＬのＰ．ａ．ＲＮａｓｅ  Ｈ２を含んだ。増幅は、以下：９５℃で３分間、続く、９５℃で１０秒間と６０℃で３０秒間の９５サイクルのように、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）上で行われた。全ての反応を三連で行った。
【０３０６】
【表４４】
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【０３０７】
Ｇｅｎ１  ＲＤＤＤＤｘ  ｒｈＰＣＲプライマーを使用した結果を表４５に示す。突然変異体Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの使用は、Ｇｅｎ１  ＲＤＤＤＤｘプライマーを使用したこのヒトゲノムＤＮＡ  ｒｈＰＣＲアッセイにおけるＳＮＰ識別において有意な改善を示したが、増幅効率は、マッチＣｑの増加によって示されるように、多く場合、減少した。したがって、新規な突然変異体ＫｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの使用は、ｒｈＰＣＲ遺伝子型決定アッセイにおいてＳＮＰ識別を改善する。
【０３０８】
【表４５】
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【０３０９】
［実施例２２］
プライマーの３’末端でのＲＮＡ残基のミスマッチまたは存在についての改善された識別を示すＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体の配列
実施例１８−２１において採用されたコドン最適化変異体酵素の完全なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を以下に示す。これらの配列は、当業者により表１、３、４、２６および３８において提供される情報から容易に誘導されるが、明確にするために、最終的に組み立てられた配列を提供する。塩基変化は、核酸置換およびアミノ酸置換について太字の下線を付したフォントで特定される。
【０３１０】
配列番号１６７、突然変異体ＩＤ３７（ＯｐｔｉＴａｑ  ＫｌｅｎＴａｑ）のヌクレオチド配列。
【０３１１】
【化２５】
2019216723.tif 000107
【０３１２】
配列番号１６８、突然変異体ＩＤ３７（ＯｐｔｉＴａｑ  ＫｌｅｎＴａｑ）のアミノ酸配列。
【０３１３】
【化２６】
2019216723.tif 000108
【０３１４】
配列番号１６９、突然変異体ＩＤ３８（Ａ６６１Ｅ、Ｉ６６５Ｗ、Ｆ６６７Ｌ  ＫｌｅｎＴａｑ）のヌクレオチド配列。
【０３１５】
【化２７】
2019216723.tif 000109
【０３１６】
配列番号１７０、突然変異体ＩＤ３８（Ａ６６１Ｅ、Ｉ６６５Ｗ、Ｆ６６７Ｌ  ＫｌｅｎＴａｑ）のアミノ酸配列。
【０３１７】
【化２８】
2019216723.tif 000110
【０３１８】
配列番号１７１、突然変異体ＩＤ３９（Ｖ７８３Ｆ  ＫｌｅｎＴａｑ）のヌクレオチド配列。
【０３１９】
【化２９】
2019216723.tif 000111
2019216723.tif 000112
【０３２０】
配列番号１７２、突然変異体ＩＤ３９（Ｖ７８３Ｆ  ＫｌｅｎＴａｑ）のアミノ酸配列。
【０３２１】
【化３０】
2019216723.tif 000113
【０３２２】
配列番号１７３、突然変異体ＩＤ４０（Ｈ７８４Ｑ  ＫｌｅｎＴａｑ）のヌクレオチド配列。
【０３２３】
【化３１】
2019216723.tif 000114
【０３２４】
配列番号１７４、突然変異体ＩＤ４０（Ｈ７８４Ｑ  ＫｌｅｎＴａｑ）のアミノ酸配列。
【０３２５】
【化３２】
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【０３２６】
配列番号１７５、突然変異体ＩＤ４１（Ｖ７８３Ｌ  Ｈ７８４Ｑ  ＫｌｅｎＴａｑ）のヌクレオチド配列。
【０３２７】
【化３３】
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【０３２８】
配列番号１７６、突然変異体ＩＤ４１（Ｖ７８３Ｌ  Ｈ７８４Ｑ  ＫｌｅｎＴａｑ）のアミノ酸配列。
【０３２９】
【化３４】
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【０３３０】
配列番号１７７、突然変異体ＩＤ４２（Ｈ７８４Ｓ  ＫｌｅｎＴａｑ）のヌクレオチド配列。
【０３３１】
【化３５】
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【０３３２】
配列番号１７８、突然変異体ＩＤ４２（Ｈ７８４Ｓ  ＫｌｅｎＴａｑ）のアミノ酸配列。
【０３３３】
【化３６】
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【０３３４】
配列番号１７９、突然変異体ＩＤ４３（Ｈ７８４Ｙ  ＫｌｅｎＴａｑ）のヌクレオチド配列。
【０３３５】
【化３７】
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【０３３６】
配列番号１８０、突然変異体ＩＤ４３（Ｈ７８４Ｙ  ＫｌｅｎＴａｑ）のアミノ酸配列。
【０３３７】
【化３８】
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【０３３８】
参照による組み込み
それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願または受託番号データが具体的におよび個別に参照により組み込まれることが示されたかのように、本明細書に記載のすべての刊行物、特許、特許出願、受託番号データは、本明細書にその全体が参照により組み込まれる。受託番号データの引用および参照の場合において、対応するＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、このような配列が配列番号により開示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書中のいずれもの定義を含む本出願が支配する。
【０３３９】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態だけを説明する目的のためであり、限定することを意図するものではない。本明細書中の実質的に、任意の複数および／または単数の用語の使用に関して、当業者は、文脈および／または適用に適切であるように複数から翻訳することができる。様々な単数／複数の置換は、明瞭にするために本明細書に明確に記載されてもよい。
【０３４０】
本発明は、特定の実施形態を参照にして記載されてきたが、様々な変更を行うことができ、同等物が本発明の範囲から逸脱することなく置換されていてもよいことは、当業者によって理解される。さらに、多くの修飾は、その範囲から逸脱することなしに本発明の教示に特定の状況または材料を適合させるようにして行ってもよい。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態または実施例に限定されるものではなく、本発明は、添付の特許請求の範囲内に含まれる全ての実施形態を包含することが意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月23日(2019.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチド鋳型上でプライマー伸長を行うための方法であって、
ポリヌクレオチド鋳型を反応混合物と接触させるステップ、並びに、適切な条件下でプライマー伸長を行い、それにより伸長されたプライマーを生成するステップを含み、
前記反応混合物は、
配列番号８７、１４７、１４９、１５１、１５５、１５７、１６１、１７０、１７８及び１８０からなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼ、
ヌクレオシド三リン酸、
ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素、及び
ＲＤＤＤＤｘブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマー及びＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーからなる群から選択されるブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを含み、
前記ＲＤＤＤＤｘブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーは、前記ポリヌクレオチド鋳型に相補的であり、及び、その３’末端に配列ＲＤＤＤＤｘ（ここで、ＲはＲＮＡ塩基であり、ＤはＤＮＡ塩基であり、ｘはＣ３スペーサー基である。）を有するオリゴヌクレオチドからなり、及び
前記ＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーは、前記ポリヌクレオチド鋳型に相補的であり、及び、その３’末端に配列ＲＤｘｘＤ（ここで、ＲはＲＮＡ塩基であり、ＤはＤＮＡ塩基であり、ｘはＣ３スペーサー基である。）を有するオリゴヌクレオチドからなる、方法。
【請求項２】
プライマー伸長方法がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うための方法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＣＲを行うための方法が対立遺伝子特異的ＰＣＲを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＰＣＲを行うための方法が、１：１０，０００を超える識別のレベルで低頻度対立遺伝子を検出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法に従いプライマー伸長を行うことを含む、ｒｈＰＣＲを行うための方法。
【請求項６】
伸長されたプライマーを生成するためのキットであって、当該キットは、
配列番号８７、１４７、１４９、１５１、１５５、１５７、１６１、１７０、１７８及び１８０からなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼを提供する容器、
ＲＮａｓｅ  Ｈ２を含有する容器、及び
ＲＤＤＤＤｘブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマー及びＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーからなる群から選択され、プライマー伸長条件下で所定のポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズ可能なブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを含有する容器を含み、
前記ＲＤＤＤＤｘブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーは、その３’末端に配列ＲＤＤＤＤｘ（ここで、ＲはＲＮＡ塩基であり、ＤはＤＮＡ塩基であり、ｘはＣ３スペーサー基である。）を有するオリゴヌクレオチドからなり、及び
前記ＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーは、その３’末端に配列ＲＤｘｘＤ（ここで、ＲはＲＮＡ塩基であり、ＤはＤＮＡ塩基であり、ｘはＣ３スペーサー基である。）を有するオリゴヌクレオチドからなる、キット。
【請求項７】
ポリヌクレオチド鋳型、
配列番号８７、１４７、１４９、１５１、１５５、１５７、１６１、１７０、１７８及び１８０からなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼ、
ヌクレオシド三リン酸、
ＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素、及び
ＲＤＤＤＤｘブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマー及びＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーからなる群から選択される、少なくとも１つのブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーを含み、
前記ＲＤＤＤＤｘブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーは、前記ポリヌクレオチド鋳型に相補的であり、及び、その３’末端に配列ＲＤＤＤＤｘ（ここで、ＲはＲＮＡ塩基であり、ＤはＤＮＡ塩基であり、ｘはＣ３スペーサー基である。）を有するオリゴヌクレオチドからなり、及び
前記ＲＤｘｘＤブロック型切断性ｒｈＰＣＲプライマーは、前記ポリヌクレオチド鋳型に相補的であり、及び、その３’末端に配列ＲＤｘｘＤ（ここで、ＲはＲＮＡ塩基であり、ＤはＤＮＡ塩基であり、ｘはＣ３スペーサー基である。）を有するオリゴヌクレオチドからなる、反応混合物。
【外国語明細書】
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