(57)【要約】【課題】フィブロインの等の非水溶性タンパク質を溶剤に溶解させる際に変質させることなく、短時間且つ簡便に任意の濃度に調製することのできるタンパク質溶液の調製方法、およびタンパク質の分子量測定方法を提供する。【解決手段】ヘキサフルオロアセトン水和物を含む溶剤に非水溶性タンパク質を溶解させ、第１のタンパク質溶液を得る第１の工程と、第１のタンパク質溶液に、１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールを含む溶剤を加え第２のンパク質溶液を得る第２の工程と、を含む、タンパク質溶液の調製方法およびそれを用いたタンパク質の分子量測定方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘキサフルオロアセトン水和物を含む溶剤に非水溶性タンパク質を溶解させ、第１のタンパク質溶液を得る第１の工程と、
第１のタンパク質溶液に、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールを含む溶剤を加え第２のタンパク質溶液を得る第２の工程と、
を含む、
タンパク質溶液の調製方法。
【請求項２】
ヘキサフルオロアセトン水和物を２５質量％以上、１００質量％以下含む溶剤に非水溶性タンパク質を溶解させ、タンパク質濃度が０．０１質量％以上、５０質量％以下である第１のタンパク質溶液を得る第１の工程と、
第１のタンパク質溶液に、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールを８０質量％以上、１００質量％以下含む溶剤を加え、タンパク質濃度が０．００１質量％以上、２０質量％以下の第２のタンパク質溶液を得る第２の工程を含む、
請求項１に記載のタンパク質溶液の調製方法。
【請求項３】
非水溶性タンパク質がフィブロインである、請求項１または請求項２に記載のタンパク質溶液の調製方法。
【請求項４】
ヘキサフルオロアセトン水和物または１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールを含む非水溶性タンパク質溶液を、
溶離液を用いてカラム中に流す、
ゲル浸透クロマトグラフィによる、
タンパク質の分子量測定方法。
【請求項５】
溶離液が１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールである、請求項４に記載のタンパク質の分子量測定方法。
【請求項６】
非水溶性タンパク質溶液が、ヘキサフルオロアセトン水和物：１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール＝１：２〜１：５００の質量比で含むタンパク質溶液である、
請求項４または請求項５に記載のタンパク質の分子量測定方法。
【請求項７】
非水溶性タンパク質溶液が、
ヘキサフルオロアセトン水和物を含む溶剤に非水溶性タンパク質を溶解させ、第１のタンパク質溶液を得る第１の工程と、
第１のタンパク質溶液に、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールを含む溶剤を加え第２のンパク質溶液を得る第２の工程と、
を含む、
タンパク質溶液の調製方法で調製されたタンパク質溶液である、
請求項４乃至請求項６のいずれか１項に記載のタンパク質溶液の分子量測定方法。タンパク質溶液の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質溶液の調製方法およびそれを用いた分子量測定方法に関する。特に蚕が産生するフィブロイン等の非水溶性のタンパク質溶液の調製方法およびそれを用いた分子量測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、生体材料分野または医療分野において、フィブロインが注目されている。フィブロインは、主には昆虫の繭糸とクモ類の糸の主要成分である。本明細書では蚕の繭から採れるフィブロインを、特にシルクフィブロインと呼ぶ。シルクフィブロインは、医療用縫合糸として使用される生体適合性の高い材料である。フィブロインは水のみには溶解せず、特定の塩水溶液、酸、または有機溶媒にのみ溶解する。
【０００３】
通常、タンパク質の分子量の測定には、ゲル浸透クロマトグラフィ（Gel Permeation Chromatography、以下、ＧＰＣと呼ぶことがある）またはポリアクリルアミド電気泳動法（Sodium  Dodecyl Sulfate−Poly  Acrylamide  Gel Electrophoresis、以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと呼ぶことがある）が使用される。
【０００４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、水溶性のタンパク質、糖およびデオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid、ＤＮＡ）の分子量を測定するため、タンパク質をミセルとし、陰性に帯電させて水中を電気泳動させる方法である。しかしながら、フィブロインは、塩化カルシウム、臭化リチウムまたは炭酸水素ナトリウム等の塩溶液には溶解するが、これらの塩を含まない単なる水のみには溶解しないため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるフィブロインの分子量の測定は困難である。
【０００５】
一方、ＧＰＣは、高分子溶液等の分子量測定のための試料（高分子溶液）を、溶離液を用いゲルを充填したカラム中に流し、ゲルの篩い分け効果によるカラム通過時間の違いから分子量を測定する方法である。フィブロインの分子量の測定は、前述したように、塩の水溶液中にフィブロインを入れ攪拌または加熱する等して溶解させた上澄み液から透析により塩を除いたものを分子量測定用試料とし、緩衝液を溶離液に用いたカラム中に流すことで測定する方法が知られている。
【０００６】
例えば、非特許文献１にはシルクフィブロインを塩化カルシウムまたは臭化リチウム等の中性塩の水アルコール溶液中で攪拌した後の上澄み液を試料とし、溶離液に尿素およびトリス硫酸の水溶液を用いカラム中に流し、分子量が既知のタンパク質と溶出時間を比べて分子量を算定する方法が記載される。非特許文献１には、透析により前記中性塩を除いた試料と行わない試料の分子量の測定値を比較したところ、透析により中性塩を除くことで正確な分子量が得られていたことが記載されている。
【０００７】
特許文献１には、シルクフィブロインを炭酸ナトリウム水溶液中で加熱し溶解させた後の上澄み液から透析により炭酸ナトリウムを除き、分子量測定用試料を調製し、溶離液にリン酸緩衝生理食塩水を用いカラム中に本試料を流し、シルクフィブロインの分子量を測定する方法が記載されている。
【０００８】
一方でフィブロインは、特定の有機溶剤または化合物に可溶であることが知られている。例えば、特許文献２〜４には、シルクフィブロインは、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＣ（ＣＦ３）２ＯＨ、ＣＡＳ番号、９２０−６６−１、以下、ＨＦＩＰと呼ぶことがある）、ヘキサフルオロアセトン３水和物（以下、ＨＦＡ３水和物と呼ぶことがある。）、蟻酸、トリフルオロ酢酸、２，２，２−トリフルオロエタノールまたはペンタフルオロプロピオン酸に溶解することが開示されている。
【０００９】
特許文献５には、シルクフィブロインの繊維化に際し、低分子量化を起こしにくい方法として、シルクフィブロインまたは絹をヘキサフルオロアセトン水和物または、それを主成分とする溶剤に溶解した溶液から紡糸し、必要に応じて延伸する、絹または絹様繊維の製造方法が開示されている。
【００１０】
特許文献６には、シルクフィブロインを塩化カルシウム水溶液に溶解し、次いで脱塩して得られるシルクフィブロイン溶解物を、塩化カルシウムとともに有機溶剤に溶解する方法が開示される。また、家蚕シルクフィブロインを溶解する際に臭化リチウム等の中性塩や、銅エチレンジアミン等の錯塩水溶液などの溶媒中に長時間置くと、シルクフィブロインの分子鎖が分解し、再生絹糸が得られたとしても力学物性は極めて低い等の欠点があると記載されている。
【００１１】
特許文献７には、クモ糸由来のフィブロインをＨＦＩＰに溶解させることが記載されている。
【００１２】
特許文献８には、溶離液としてトリフルオロ酢酸ナトリウムを溶解させたＨＦＩＰを用い、トナー中の樹脂成分であるポリエステルの分子量をＧＰＣにより測定する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００７−２４６４６１号公報
【特許文献２】特開２０１１−１９６００１号公報
【特許文献３】特開２０１３−１３６７８６号公報
【特許文献４】特開２０１７−０６１７５６号公報
【特許文献５】特開２００４−０６８１６１号公報
【特許文献６】特開２００９−２２１４０１号公報
【特許文献７】特開２０１４−０２９０５４号公報
【特許文献８】特開２００６−３０５３４号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】第49回日本シルク学会研究発表要旨10 巻 (2001年 S21-S22頁)「絹の中性塩による溶解とフィブロインの分子量」独立行政法人農業生物資源研究所、坪内紘三、山田弘生、高須陽子
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らが、シルクフィブロインを種々溶剤に対する溶解性を試したところ、シルクフィブロインはＨＦＡ３水和物、蟻酸（ｐＫａ３．７５）およびトリフルオロ酢酸（ｐＫａ０．５）に溶解した。しかしながら、蟻酸およびトリフルオロ酢酸は強酸であり、フィブロイン溶解後の溶液が黄色く着色しており、シルクフィブロインを変質させた（実施例の［表１］参照）。
【００１６】
また、シルクフィブロインはＨＦＩＰに溶解することは既知であるが、２５℃近傍の室温下では、シルクフィブロインはＨＦＩＰに対し溶解速度が極めて遅く、０．００２５質量％の低濃度であっても、溶解するには月単位の時間を要した。溶解時間が遅いことより、ＨＦＩＰのみを溶剤としてシルクフィブロインの分子量を測定することは、実際には困難であった（実施例の［表２］参照）。
【００１７】
また、塩化カルシウム水溶液または臭化リチウム水溶液等の塩溶液にフィブロインを溶解させたフィブロインの塩溶液を分子量測定試料とする、従来のフィブロインの分子量の測定方法は、フィブロインの溶解に時間がかかるとともに、フィブロインの正確な分子量を測定するのは、フィブロインの塩溶液から塩を取り除く透析等の煩雑な操作を行わなければならない。
【００１８】
本発明は、フィブロイン等の非水溶性タンパク質を溶剤に溶解させる際に、分子量の低下または黄変等の変質を起こすことなく、短時間かつ簡便に任意の濃度に調製することのできるタンパク質溶液の調製方法、およびそれを用いたタンパク質の分子量測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らが、予め調製したＨＦＡ３水和物とＨＦＩＰの混合溶剤を用いたところ、室温下において、シルクフィブロインは本混合溶剤に可溶であり、シルクフィブロイン溶液を調製することができた。しかしながら、シルクフィブロインの溶解には、日単位の時間がかかった（実施例の［表２］参照）。
【００２０】
そこで、本発明者らが、短時間且つ簡便にシルクフィブロイン溶液を調製できる方法を鋭意検討したところ、室温下において、シルクフィブロインを一旦、ＨＦＡ３水和物に溶解させた後、ＨＦＩＰを加えて希釈し、最終的にＨＦＡ３水和物とＨＦＩＰを溶剤とするシルクフィブロイン溶液を調製することで、短時間でシルクフィブロインを任意の濃度に調製したＨＦＡ３水和物とＨＦＩＰを溶剤とするシルクフィブロイン溶液が得られた（実施例の［表４］参照）。このようにして、本発明者らは本発明のタンパク質溶液の調製方法を完成させるに至った。
【００２１】
さらに、本発明者らは、シルクフィブロインのＨＦＡ３水和物単独溶液、ＨＦＩＰ単独溶液を測定試料とし、ＧＰＣによるシルクフィブロインの分子量測定を行い、分子量の測定が可能であることがわかった。
【００２２】
さらに、本発明者らは、本発明のタンパク質溶液の調製方法によって、最終的にＨＦＡ３水和物：ＨＦＩＰ＝１：４、１：４０、１：４００の質量比である溶剤にシルクフィブロインを溶解させた溶液を調製し、これら溶液を分子量測定用試料としてＧＰＣにより、シルクフィブロインの分子量を測定したところ、各試料ともほぼ同一の分子量であった（実施例の［表５］参照）。
【００２３】
尚、本発明のタンパク質溶液の調製方法およびそれを用いた分子量測定方法において、非水溶性タンパク質とは、水のみには溶解しないタンパク質を指し、水のみには溶解しないが特定の塩を含む塩水溶液には溶解するフィブロイン等のタンパク質を含む。以下、本明細書において、単にタンパク質といえば、前記非水溶性タンパク質を指す。
【００２４】
本発明は、以下の発明１〜７を含む。
［発明１］
ヘキサフルオロアセトン水和物を含む溶剤に非水溶性タンパク質を溶解させ、第１のタンパク質溶液を得る第１の工程と、第１のタンパク質溶液に、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールを含む溶剤を加え第２のタンパク質溶液を得る第２の工程と、
を含む、
タンパク質溶液の調製方法。
【００２５】
［発明２］
ヘキサフルオロアセトン水和物を２５質量％以上、１００質量％以下含む溶剤に非水溶性タンパク質を溶解させ、タンパク質濃度が０．０１質量％以上、５０質量％以下である第１のタンパク質溶液を得る第１の工程と、第１のタンパク質溶液に、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールを８０質量％以上、１００質量％以下含む溶剤を加え、タンパク質濃度が０．００１質量％以上、２０質量％以下の第２のタンパク質溶液を得る第２の工程を含む
発明１のタンパク質溶液の調製方法。
【００２６】
［発明３］
非水溶性タンパク質がフィブロインである、発明１または発明２のタンパク質溶液の調製方法。
【００２７】
［発明４］
ヘキサフルオロアセトン水和物または１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールを含む非水溶性タンパク質溶液を、
溶離液を用いてカラム中に流す、
ゲル浸透クロマトグラフィによる、
タンパク質の分子量測定方法。
【００２８】
［発明５］溶離液が１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールである、発明４のタンパク質の分子量測定方法。
【００２９】
［発明６］
非水溶性タンパク質溶液が、ヘキサフルオロアセトン水和物：１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール＝１：２〜１：５００の質量比で含むタンパク質溶液である、
発明４または発明５のタンパク質の分子量測定方法。
【００３０】
［発明７］
非水溶性タンパク質溶液が、
ヘキサフルオロアセトン水和物を含む溶剤に非水溶性タンパク質を溶解させ、第１のタンパク質溶液を得る第１の工程と、
第１のタンパク質溶液に、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールを含む溶剤を加え第２のンパク質溶液を得る第２の工程と、
を含む、タンパク質溶液の調製方法で調製されたタンパク質溶液である、
発明４〜６のタンパク質溶液の分子量測定方法。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のタンパク質溶液の調製方法により、フィブロイン等の非水溶性タンパク質を溶剤に短時間且つ簡便に溶解させ、変質させることなく任意の濃度に調製したタンパク質溶液を得ることができる。
【００３２】
さらに、本発明のタンパク質溶液の調製方法により、所定の濃度に調製したタンパク質溶液を試料に用いることができ、ＧＰＣによる分子量測定を短時間且つ簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】実施例１〜４にけるシルクフィブロインの重量平均分子量のＧＰＣ測定において得られたクロマトグラムである。
【図２】図１に示すクロマトグラム曲線の１０〜２０分の範囲を拡大した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明についてさらに詳しく説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
１．非水溶性タンパク質溶液
本発明のタンパク質溶液の調製方法で調製されるタンパク質溶液は、ヘキサフルオロアセトン水和物（以下、ＨＦＡ水和物と呼ぶことがある。）および１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールを含む溶剤に非水溶性タンパク質が溶解しているタンパク質溶液である。
【００３５】
なお、上記タンパク質溶液において、ＧＰＣで分子量を測定する際の非水溶性タンパク質濃度は０．００１質量％以上、２０質量％以下であり、溶剤濃度が８０質量％以上であることが好ましい。非水溶性タンパク質濃度が０．００１質量％より薄いとＧＰＣによる分子量測定において正確な分子量を得ることができず、２０質量％より濃いと非水溶性タンパク質が析出することがある。
【００３６】
［非水溶性タンパク質］
前記タンパク質溶液中の非水溶性タンパク質としては、フィブロインまたは腱の成分であるエラスチンを挙げることができる。フィブロインは、昆虫の繭糸と蜘蛛の巣に含まれる繊維状の非水溶性タンパク質で、主として、グリシン、アラニン、セリン、チロシンが連結したものである。フィブロインを含むものとして、例えば、蚕の繭糸（シルクフィブロインと呼ばれる）、蜘蛛糸（スパイダーシルクと呼ばれる）を挙げることができる。蚕の種類は、各種の家蚕、野蚕を問わない。本発明の非水溶性タンパク質溶液の調製方法に用いる非水溶性タンパク質としては、シルクフィブロインが好ましい。シルクフィブロインは、繭や精練されたシルクに含まれるシルクフィブロインでもよく、シルクを一度、良溶媒に溶解させ、乾燥し、得られたシルクフィブロイン（再生シルクと呼ぶことがある）でもよく、蚕の絹糸腺から直接得たシルクフィブロインでもよい。
【００３７】
シルクフィブロインは、株式会社自然化粧品研究所、株式会社リリィフォース等からシルクパウダー等の商品名で、粉末の状態で市販されている。
【００３８】
［ＨＦＡ水和物］
本発明にかかるタンパク質溶液の調製方法においてＨＦＡ水和物とは、ヘキサフルオロアセトンと水を含む混合物を指す。具体的には、ＨＦＡ１水和物、ＨＦＡ１．５水和物、ＨＦＡ３水和物等を挙げることができ、これらのいずれかを含むものであり、２種以上を含んでいてもよい。入手し易く、且つ取り扱いが容易であることから、ＨＦＡ３水和物を用いることが好ましく、ＨＦＡ３水和物のみでもよい。
【００３９】
２．タンパク質溶液の調製方法
本発明のタンパク質溶液の調製方法は、ＨＦＡ水和物を含む溶剤に非水溶性タンパク質を溶解させ、第１のタンパク質溶液を得る第１の工程と、第１のタンパク質溶液に、ＨＦＩＰを含む溶剤を加え第２のタンパク質溶液を得る第２の工程とを含む、タンパク質溶液の調製方法である。
【００４０】
フィブロイン等の非水溶性タンパク質は、室温でＨＦＡ水和物に易溶であり、静置したフラスコ内で、加温および攪拌を行うことなく、ＨＦＡ水和物に溶ける。しかしながら、室温下で静置したフラスコ内では、前記非水溶性タンパク質は、ＨＦＩＰには殆ど溶けない。このため、前記非水溶性タンパク質をＨＦＩＰに溶解させるためには、ＨＦＩＰの攪拌を必要とする。しかしながら、攪拌したとしても、溶解には長時間を要する（［実施例］の１．タンパク質の各種溶剤に対する溶解性評価を参照）。
【００４１】
本発明のタンパク質溶液の調製方法において、ＨＦＡ水和物を多く含む溶剤に非水溶性タンパク質を溶解させ第１のタンパク質溶液を得た後、ＨＦＩＰを多く含む溶剤で第１のタンパク質溶液を希釈し、第２のタンパク質溶液を調製する。本発明のタンパク質溶液の調製方法において、ＨＦＡ水和物のみに非水溶性タンパク質を溶解させ第１のタンパク質溶液を得た後で、ＨＦＩＰのみで第１のタンパク質溶液を希釈して、第２のタンパク質溶液を調製してもよく、溶解および希釈に掛かる操作が簡単であり好ましい。本操作は、非水溶性タンパク質を溶剤に溶解させる場合、加温または攪拌を行うことなく、室温で非水溶性タンパク質が溶解したタンパク質溶液を得ることができる。
【００４２】
タンパク質の加水分解は温度が高くなるほどに進むことが知られており、本発明のタンパク質溶液の調製方法における非水溶性タンパク質の溶解の際の溶解温度は低い方がよい。また、ＨＦＩＰの沸点が５８．２℃、水の凝固点が０℃であること、また、扱いが簡便なことにより、非水溶性タンパク質の溶解の際の溶解温度は、０℃以上、４５℃以下である。好ましくは、室温、例えば、１０℃以上、３０℃以下である。本発明のタンパク質溶液の調製方法を用いれば、最終的に、室温下でタンパク質をＨＦＡ水和物およびＨＦＩＰを含む溶剤に溶解させたタンパク質溶液を得ることができる。
【００４３】
さらに、本発明のタンパク質溶液の調製方法は、ＨＦＡ水和物を２５質量％以上、１００質量％以下含む溶剤にタンパク質を溶解させ、タンパク質濃度が０．０１質量％以上、５０質量％以下である第１のタンパク質溶液を得る第１の工程と、第１のタンパク質溶液に、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールを８０質量％以上、１００質量％以下含む溶剤を加え、タンパク質濃度が０．００１質量％以上、２０質量％以下の第２のタンパク質溶液を得る第２の工程を含む、上記のタンパク質溶液の調製方法である。
【００４４】
［第１の工程］
第１の工程において、ＨＦＡ水和物を２５質量％以上、１００質量％以下含む溶剤を用いることで、非水溶性タンパク質を速やかに溶解させることができる。
【００４５】
第１の工程において、タンパク質濃度が０．０１質量％以上、５０質量％以下の範囲内であれば、非水溶性タンパク質はＨＦＡ水和物を含む上記溶剤に短時間で溶解し、第１のタンパク質溶液が得られる。
【００４６】
第１の工程で使用する溶剤は、タンパク質を溶解させるためにＨＦＡ水和物単独もしくは、ＨＦＡ水和物を２５質量％以上、その他の溶剤７５質量％以下含んでいる溶剤であればよい。その他の溶剤としては、ＨＦＩＰ、アセトン、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、トルエンまたは水の中から適宜選択することができる。
【００４７】
［第２の工程］
第２の工程において、ＨＦＩＰを含む溶剤を加え希釈することで、タンパク質濃度０．００１質量％以上、２０質量％以下の第２のタンパク質溶液が容易に得られる。第２のタンパク質溶液の濃度は、好ましくは０．００２質量％以上、２０質量％以下である。
【００４８】
第２の工程で使用する溶剤はＨＦＩＰであり、その他の溶剤２０質量％以下含んでいる溶剤であってもよい。その他の溶剤としては、タンパク質を析出させないよう第1のタンパク質溶液を希釈できればよい。アセトン、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、トルエンまたは水等の中から適宜選択することができる。
【００４９】
３．タンパク質の分子量測定方法
本発明のタンパク質の分子量測定方法は、ＨＦＡ水和物または１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールを含む非水溶性タンパク質溶液を、溶離液を用いカラム中に流し、ゲル浸透クロマトグラフィによりタンパク質の分子量を測定する方法である。
【００５０】
本発明のタンパク質の分子量測定方法において、分子量測定用試料として用いる非水溶性タンパク質溶液には、予め調製した、ＨＦＡ水和物とＨＦＩＰの混合液に非水溶性タンパク質を溶解させた溶液を用いることができる。しかしながら、本発明のタンパク質溶液の調製方法により調製したタンパク質溶液を用いると、調製が短時間で済み且つ調製操作が簡便であり、好ましい。
【００５１】
従来の、塩水溶液にフィブロインを溶解させたフィブロイン溶液を試料に用いるフィブロインの分子量の測定方法は、中性塩水溶液へのフィブロインの溶解に時間を要し、正確な分子量を得るには透析により中性塩の除去が必要である。比較して、本発明のタンパク質溶液の調製方法はフィブロイン溶液の調製が短時間で済み、透析を要しない。
【００５２】
本発明のタンパク質の分子量測定方法において、分子量を測定する非水溶性タンパク質としては、フィブロインおよびエラスチン等が挙げられる。フィブロインとしては昆虫の繭糸および蜘蛛の糸が挙げられ、繭糸に含まれるシルクフィブロインまたは蜘蛛糸に含まれるスパイダーシルクを例示することができる。
【００５３】
溶離液としては、具体的には、ＨＦＩＰを例示することができ、緩衝剤としてトリフルオロ酢酸ナトリウムを加えてもよい。
【００５４】
ＧＰＣによる分子量測定において、溶剤として酸性のＨＦＡ水和物のみを含むタンパク質溶液を測定試料として用いたとしても、強酸性である蟻酸またはトリフルオロ酢酸に比べ、測定までの時間の間にタンパク質の分子量の低下は軽度である。また、酸性のＨＦＡ水和物の含有割合が少ない方が、ＧＰＣのカラムを痛めることなく測定が安定し、安定した分子量の測定ができる。
【００５５】
本発明のタンパク質の分子量測定方法において、タンパク質溶液の溶剤がＨＦＡ水和物とＨＦＩＰをともに含む溶剤である場合、ＨＦＡ水和物とＨＦＩＰの比は、質量比で表わして、ＨＦＡ水和物：ＨＦＩＰ＝１：２〜１：５００の範囲である。好ましくは、ＨＦＡ水和物：ＨＦＩＰ＝１：４〜１：５００の範囲であり、より好ましくは、ＨＦＡ水和物：ＨＦＩＰ＝１：１０〜１：５００の範囲であり、特に好ましくは、ＨＦＡ水和物：ＨＦＩＰ＝１：４０〜１：５００の範囲である。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５７】
１．タンパク質の各種溶剤に対する溶解性評価
非水溶性タンパク質としてシルクフィブロインを用い、室温（２５℃）におけるシルクフィブロインの各種溶剤中の溶解性を観察した。
【００５８】
［シルクフィブロイン］
シルクフィブロインには、株式会社リリィフォース製の、フィブロイン１００％の平均粒径１０μｍの粉末（商品名、シルクパウダー）を使用した。
【００５９】
［溶剤］
ＨＦＡ３水和物、ＨＦＩＰ、２，２，２−トリフルオロエタノール、トリフルオロ酢酸、蟻酸、メタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、トルエン、ジクロロメタン、またはイオン交換水を用いた。
【００６０】
［溶解性試験］
溶解した際にシルクフィブロインの濃度が０．００２５質量％となるように、０．００１ｇのシルクフィブロインと４００ｇの各溶剤を各々、三角フラスコに入れ、室温（２５℃）下、攪拌を行わず、１時間静置した後の溶解性を目視で確認した。
【００６１】
結果を表１に示す。目視観察にて溶解し透明になり白濁および固形物が見られないものを「溶解」、白濁または固形物が残ったものを「未溶解」、白濁および固形物が見られないものの黄色く着色したものを「黄変」とした。ＨＦＡ３水和物は、シルクフィブロインの溶解性に優れるとともに、溶解後の液が黄変することもなかった。
【００６２】
【表１】
2019151834.tif 000003
【００６３】
２．シルクフィブロインのＨＦＡ３水和物とＨＦＩＰとの混合溶剤に対する溶解性の評価
シルクフィブロインを用い、ＨＦＡ３水和物とＨＦＩＰとの混合溶剤に対する室温（２５℃）下の溶解性を評価した。また、ＨＦＡ３水和物のみ、およびＨＦＩＰのみの溶解性を評価した。
【００６４】
［混合溶剤］
質量比で、ＨＦＡ３水和物：ＨＦＩＰ＝１：０、１：４、１：４０、１：４００である溶剤を用いた。
【００６５】
［溶解性試験］
シルクフィブロインを、質量比でＨＦＡ３水和物：ＨＦＩＰ＝１：４、１：４０、１：４００とした混合溶剤、ＨＦＡ３水和物のみ、およびＨＦＩＰのみに室温（２５℃）下で、静置したフラスコ内で攪拌を行わず溶解させ、濃度が０．００２５質量％になるように調製し、シルクフィブロイン溶液１〜５を得た。
【００６６】
表２に、シルクフィブロイン溶液１〜５を得る際に、目視観察にて溶解し透明になり、白濁および固形物が見られなくなるまでに溶解するのに要した時間を示す。ＨＦＡ３水和物の質量比（組成比）が多い程に、シルクフィブロインの溶解時間が短くなった。
【００６７】
【表２】
2019151834.tif 000004
【００６８】
なお、表３に示す様に、ＨＦＩＰのみを用いた上記のシルクフィブロイン溶液5を得る際に、室温（２５℃）下、フラスコ内でマグネチックスターラーによる攪拌を行ったところ、シルクフィブロインがＨＦＩＰのみに溶解するには、２カ月を要した。また、４０℃に加温した状態で攪拌したところ、シルクフィブロインがＨＦＩＰのみに溶解するには、２１日を要した。
【００６９】
【表３】
2019151834.tif 000005
【００７０】
３．シルクフィブロインのＨＦＡ３水和物溶液のＨＦＩＰでの希釈性の評価
１００ｍｌフラスコ中に、シルクフィブロインの濃度が１質量％となるように、シルクフィブロイン（０．１ｇ）とＨＦＡ３水和物（１０ｇ）を加え、室温（２５℃）で静置して溶解させた。シルクフィブロインはＨＦＡ３水和物に１時間以内で溶解した。
【００７１】
図１が、後述する実施例１〜４におけるシルクフィブロインの重量平均分子量のＧＰＣ測定において得られたクロマトグラムであり、図２が、図１に示すクロマトグラム曲線の１０〜２０分の拡大図である。
【００７２】
次いで、三角フラスコ内で、調製したシルクフィブロインの濃度１質量％の溶液１ｍＬをＨＦＩＰに室温（２５℃）下で希釈し、質量比で、ＨＦＡ３水和物：ＨＦＩＰが１：４、１：４０、１：４００となるように、シルクフィブロイン溶液６〜８を調製した。
【００７３】
表４に結果を示す。目視で確認し溶け残りがなく透明となり、二相分離および析出物がなかったものを「溶解」とした。また、希釈した後、溶解するまでに要した時間を測定した。シルクフィブロイン溶液６〜８全て、１０秒以内に溶解した。
【００７４】
【表４】
2019151834.tif 000006
【００７５】
４．ＧＰＣによるシルクフィブロインの重量平均分子量（Ｍｗ）の測定
シルクフィブロインの分子量を測定した。ＧＰＣ装置には東ソー株式会社製、製品名、ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣを用い、カラムには東ソー株式会社製、製品名、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＨＭ−Ｈ  ｘ２を用いた。カラム中には溶離液として、５×１０−３モル濃度のトリフルオロ酢酸ナトリウムを含むＨＦＩＰを流した。ポリメチルメタクリレートを基準物質として検量線を作成した。シルクフィブロインの重量平均分子量は、ＧＰＣ測定におけるクロマトグラム曲線において、溶出時間１２分から１６分の範囲に位置するシルクフィブロインの紫外吸収のピークの面積から算出した。
【００７６】
実施例１
３００ｍｌフラスコ中に、シルクフィブロインの濃度が０．０１２５質量％となるように、シルクフィブロインとＨＦＡ３水和物を加え、室温（２５℃）で静置して溶解させ、第１のシルクフィブロイン溶液を得た。その後、質量比が第１のシルクフィブロイン溶液：ＨＦＩＰ＝１：４で第１のシルクフィブロイン溶液を希釈し、シルクフィブロインの濃度が０．００２５質量％である第２のシルクフィブロイン溶液を調製した。
【００７７】
調製した第２のシルクフィブロイン溶液２５ｍｌをＧＰＣ装置に注入し重量平均分子量を測定したところ、重量平均分子量は２．９×１０４であった。
【００７８】
実施例２
３００ｍｌフラスコ中に、シルクフィブロインの濃度が０．１質量％となるように、シルクフィブロインとＨＦＡ３水和物を加え、室温（２５℃）で静置して溶解させ、第１のシルクフィブロイン溶液を得た。その後、質量比が第１のシルクフィブロイン溶液：ＨＦＩＰ＝１：４０で第１のシルクフィブロイン溶液を希釈し、シルクフィブロインの濃度が０．００２５質量％である第２のシルクフィブロイン溶液を調製した。
【００７９】
調製した第２のシルクフィブロイン溶液２５ｍｌをＧＰＣ装置に注入し重量平均分子量を測定したところ、重量平均分子量は３．０×１０４であった。
【００８０】
実施例３
３００ｍｌフラスコ中に、シルクフィブロインの濃度が１．０質量％となるように、シルクフィブロインとＨＦＡ３水和物を加え、室温（２５℃）で静置して溶解させ、第１のシルクフィブロイン溶液を得た。その後、質量比が第１のシルクフィブロイン溶液：ＨＦＩＰ＝１：４００で第１のシルクフィブロイン溶液を希釈し、シルクフィブロインの濃度が０．００２５質量％である第２のシルクフィブロイン溶液を調製した。
【００８１】
調製した第２のシルクフィブロイン溶液２５ｍｌをＧＰＣ装置に注入し重量平均分子量を測定したところ、重量平均分子量は３．０×１０４であった。
【００８２】
実施例４
静置したフラスコ内で攪拌を行わず、シルクフィブロインの濃度が０．００２５質量％となるように、ＨＦＡ３水和物にシルクフィブロインを室温（２５℃）で溶解させ、シルクフィブロイン溶液を調製した。
【００８３】
調製したシルクフィブロイン溶液２５ｍｌをＧＰＣ装置に注入し重量平均分子量を測定したところ、重量平均分子量は２．８×１０４であった。
【００８４】
参考例１
静置したフラスコ内で攪拌を行わず、シルクフィブロインの濃度が０．００２５質量％となるように、ＨＦＩＰにシルクフィブロインを室温（２５℃）で溶解させ、シルクフィブロイン溶液を調製した。シルクフィブロインのＨＦＩＰへの溶解には３ヶ月を要した。
【００８５】
調製したシルクフィブロイン溶液２５ｍｌをＧＰＣ装置に注入し重量平均分子量を測定したところ、重量平均分子量は３．０×１０４であった。
【００８６】
表５に、実施例１〜４、参考例１において使用した溶剤のＨＦＡ３水和物とＨＦＩＰの比（ＨＦＡ３水和物：ＨＦＩＰ）、およびＧＰＣ測定で得た重量平均分子量を示す。
【００８７】
【表５】
2019151834.tif 000007
【００８８】
表５の実施例１〜４、参考例１が示すように、ＧＰＣによる分子量の測定において、シルクフィブロインの重量平均分子量はほぼ一致した。表５に示すように、溶剤にＨＦＡ３水和物のみを用いた実施例４のシルクフィブロインの重量平均分子量の測定値が２．８×１０４、溶剤にＨＦＡ３水和物：ＨＦＩＰ＝１：４に比率を用いた実施例１のシルクフィブロインの重量平均分子量の測定値が２．９×１０４であり、実施例２、３、５のシルクフィブロインの重量平均分子量の測定値、３．０×１０４よりわずかに低くなった。
【００８９】
図１は、実施例１〜４にけるシルクフィブロインの重量平均分子量のＧＰＣ測定において得られた、クロマトグラムである。図２は、図１に示したクロマトグラム曲線の１０〜２０分の範囲の拡大図である。
【００９０】
図１に示したＧＰＣの、クロマトグラム曲線によれば、ＨＦＡ３水和物：ＨＦＩＰ＝１：４の比の混合溶剤を用いた実施例１、ＨＦＡ３水和物を単独で用いた実施例４は、測定３０分以降のベースラインへの回復が遅いが、４０分から５０分経過した後では、ベースラインまで戻った。このことから、カラムの劣化はなく、本発明のタンパク質の分子量測定方法により、シルクフィブロインの正確な分子量が測定されていると推測された。
【図１】
2019151834.tif 000008
【図２】
2019151834.tif 000009