(57)【要約】【課題】  メラニン色素の産生を抑制することができる作用を有するベリー系の抽出物を提供する。【解決手段】  本発明のブラックラズベリー抽出物は、メラノサイトにおけるチロシナーゼ酵素の活性阻害効果を有する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラノサイトにおけるチロシナーゼ酵素の活性阻害効果を有するブラックラズベリー抽出物。
【請求項２】
請求項１に記載のブラックラズベリー抽出物を含む美白剤。
【請求項３】
請求項１に記載のブラックラズベリー抽出物を含む飲食物。
【請求項４】
請求項１に記載のブラックラズベリー抽出物の製造方法であって、
ブラックラズベリーの果実を冷凍する冷凍工程と、
前記ブラックラズベリーの果実を解凍する解凍工程と、
前記解凍工程にて解凍した前記ブラックラズベリーの果実に溶媒を加えて撹拌する撹拌工程と、
前記撹拌工程により撹拌した前記ブラックラズベリーの果実および溶媒を静置し抽出を行う抽出工程と
を含むブラックラズベリー抽出物の製造方法。
【請求項５】
請求項１に記載のブラックラズベリー抽出物を用いた美白方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブラックラズベリー抽出物、ブラックラズベリー抽出物を含む美白剤および飲食物、ブラックラズベリー抽出物の製造方法およびブラックラズベリー抽出物を用いた美白方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどの生物にとって酸素は不可欠であるが、体内に取り込まれた酸素の数％は活性酸素となり、細菌感染などの防御に使用される。しかし、余剰の活性酸素は、恒常性を維持するために生体内の抗酸化酵素や食品中の外来の抗酸化物質により消去されることが必要である。
【０００３】
また紫外線、喫煙、排気ガス、大気汚染、ストレスなどによって過剰の活性酸素が産生されると生体組織へ酸化的障害を与える（例えば、非特許文献１参照）。その結果、生活習慣病、加齢性疾患をはじめ、がん、痴呆症などを引き起こし、９０％以上の疾病は過剰に産生される活性酸素と因果関係があると言われている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００４】
そこで、体内のSuperoxide dismutase (SOD)の活性化とともに食品中の抗酸化物質が注目され、アメリカ農務省（USDA）で開発された抗酸化力の測定方法（ＯＲＡＣ；Oxygen Radical Absorbance Capacity）が確立され、それが普及している（例えば、非特許文献３参照）。また、ＯＲＡＣ値の高い食品、即ち抗酸化力の高い食品ベスト１００の中に１２品目のベリー系食品が存在している（例えば、非特許文献４参照）。
【０００５】
皮膚における色素沈着の原因となるメラニン色素の合成は種々の外来性及び内因性の刺激によって促進される。たとえば、太陽光の中の紫外線、ストレス、大気汚染などに曝されると皮膚の表面で活性酸素が発生し、その刺激によってメラノサイトが活性化され、チロシナーゼの発現が亢進する。こうして発現したチロシナーゼはチロシンを代謝し、いくつかの段階を経てメラニン色素が産生される。この活性酸素を抗酸化物質により捕捉することでメラニン色素の産生が抑制されることが報告されている（例えば、非特許文献５参照）。また、メラノサイトにおいてチロシナーゼの活性を阻害することができれば、肌の美白効果についても期待することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Oberdanner, C. ROS and Antioxidant Systems in Apoptosis. VDM Verlag, 2008. ISBN 978-3836482110
【非特許文献２】Slavin JL et al. Health benefits of fruits and vegetables. Adv Nutr. 2012. 1; 3(4):506-516
【非特許文献３】Cao G et al. Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants. Free Radical Biol. Med. 1993. 14: 303-311
【非特許文献４】「ORAC値の高い（抗酸化作用の高い）食品トップ１００リスト」［online］(平成２９年６月３０日検索)  http://www.anteaoxidant.com/orac_top100.html
【非特許文献５】Choi MY1, Song HS, Hur HS, Sim SS. Whitening activity of luteolin related to the inhibition of cAMP pathway in alpha-MSH-stimulated B16 melanoma cells. Arch Pharm Res. 2008 Sep;31(9):1166-71.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、メラニン色素の産生を抑制する作用を有するベリー系のブラックラズベリー抽出物、ブラックラズベリー抽出物を含む美白剤および飲食物、ブラックラズベリー抽出物の製造方法およびブラックラズベリー抽出物を用いた美白方法を提供することである。
【０００８】
本発明者らは、抗酸化力を有する食品として、ベリー系食品に着目し、ベリー系食品と上記メラニン色素の産生を抑制する作用との相関性について検討し、その結果、ブラックラズベリーの抽出物が上記目的を達成することを発見し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
即ち、本発明によれば、
（１）  メラノサイトにおけるチロシナーゼ酵素の活性阻害効果を有するブラックラズベリー抽出物、
（２）  （１）に記載のブラックラズベリー抽出物を含む美白剤、
（３）  （１）に記載のブラックラズベリー抽出物を含む飲食物、
（４）  （１）に記載のブラックラズベリー抽出物の製造方法であって、ブラックラズベリーの果実を冷凍する冷凍工程と、前記ブラックラズベリーの果実を解凍する解凍工程と、
前記解凍工程にて解凍した前記ブラックラズベリーの果実に溶媒を加えて撹拌する撹拌工程と、前記撹拌工程により撹拌した前記ブラックラズベリーの果実および溶媒を静置し抽出を行う抽出工程とを含むブラックラズベリー抽出物の製造方法、
（５）  （１）に記載のブラックラズベリー抽出物を用いた美白方法
が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ブラックラズベリー抽出物、ブラックラズベリー抽出物を含む美白剤および飲食物、ブラックラズベリー抽出物の製造方法およびブラックラズベリー抽出物を用いた美白方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】メラノサイトにおけるチロシナーゼ酵素の活性阻害効果の検討結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明のブラックラズベリー抽出物について説明する。本発明のブラックラズベリー抽出物は、メラノサイトにおけるチロシナーゼ酵素の活性阻害効果を有する。
【００１３】
ブラックラズベリー抽出物の原料となるブラックラズベリーはバラ科キイチゴ属に属する。また、本発明のブラックラズベリー抽出物は、主にブラックラズベリーの果実からの抽出物が好適に用いられる。
ブラックラズベリー抽出物をブラックラズベリーの果実から抽出する方法は、特に限定されないが、溶媒抽出、超臨界抽出等を用いることができる。
【００１４】
溶媒抽出を行う場合に用いる抽出溶媒としては、特に限定されず、水、有機溶媒およびこれらの混合溶媒を用いることができる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等のアルコール類、エチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、酢酸エチル、アセトン等を用いることができる。これらの有機溶媒は一種類を単独で用いてもよいし、二種類以上を組み合わせて用いてもよい。また、水等の水系溶媒と有機溶媒とを混合して用いてもよい。
【００１５】
これらの中でも、エタノール、エタノールと水とを混合したエタノール水溶液が好ましく、エタノール水溶液中のエタノールの濃度は、好ましくは１〜８０ｖ／ｖ％（ＥｔＯＨ）、より好ましくは１０〜６０ｖ／ｖ％（ＥｔＯＨ）、さらに好ましくは２０〜４０ｖ／ｖ％（ＥｔＯＨ）である。
なお、超臨界抽出を行う場合には、超臨界状態とした二酸化炭素を用いることが好ましい。
【００１６】
また、溶媒抽出を行う場合の抽出方法としては、撹拌抽出、浸漬抽出、振とう抽出、還流抽出、超音波抽出等を用いることができる。これらのなかでも、攪拌抽出が好ましい。攪拌抽出の方法は、特に限定されないが、撹拌子を用いた攪拌、ブレンダーを用いた撹拌等を行うことができる。
【００１７】
また、攪拌抽出を行う際は、好ましくは５００〜２００００ｒｐｍ、より好ましくは１０００〜１００００ｒｐｍ、さらに好ましくは６０００〜１００００ｒｐｍの撹拌速度にて攪拌しながら好ましくは数分〜６０分間、より好ましくは３０分〜６０分間抽出を行う。なお、攪拌後、静置し、静置抽出を行うことが好ましい。より具体的には、ホモジナイザーを用い、６０００〜１００００ｒｐｍで３０分〜６０分間ホモジナイズを行い、その後２４時間静置し抽出を行うことが好ましい。なお、静置し、抽出を行うことにより、固液分離を行うことができる。
【００１８】
また、溶媒抽出を行う場合の温度は、室温であってもよいし、加熱条件下であってもよい。また、溶媒抽出を行う場合の圧力は常圧であってもよいし、加圧下であってもよい。
また、溶媒抽出によって得られた抽出液は、必要に応じて濾過等の処理を行ってもよい。
【００１９】
また、溶媒抽出によって得られた抽出液を乾燥させて粉末としてもよい。乾燥方法としては、公知の方法を用いることができるが、噴霧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥等の手法を用いることができる。
なお、ブラックラズベリー抽出物としては、液体や粉末状とされた市販品または既製品を用いてもよい。
【００２０】
本発明のブラックラズベリー抽出物は、食品や飲料等に配合することができる。食品としては、パン類、麺類、菓子類、食肉加工品、魚介加工品、冷凍食品、ゼリー類、アイスクリーム類、乳製品、各種調味料等が挙げられる。また、一般食品の他、特定保健用食品、医薬部外品、健康食品、サプリメントにも配合させることができる。飲料としては、清涼飲料水、乳飲料、酒類、茶、紅茶飲料、コーヒー、果汁飲料、炭酸飲料、ミネラルウォーター類、果実・野菜飲料等が挙げられる。
また、本発明のブラックラズベリー抽出物を配合させた食品や飲料を、錠剤、カプセル剤、シロップ等の経口投与製剤と同様の形態としてもよい。
【００２１】
また、本発明のブラックラズベリー抽出物を配合させた食品や飲料を製造する際に、本発明の効果を妨げない範囲で必要に応じて、甘味料、着色料、保存料、増粘剤、安定化剤、ゲル化剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、乳化剤、膨張剤、酸味料、光沢剤、香料等の添加剤、溶剤、油を添加してもよい。これらの添加剤は一種類を単独で用いてもよいし、二種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２２】
上記食品や飲料中に配合されるブラックラズベリー抽出物の割合は、使用目的に応じて適宜調整することができるが、上記食品や飲料中に配合されるブラックラズベリー抽出物の割合は、好ましくは０．０００１〜８０重量％、より好ましくは０．００３〜５０重量％、さらに好ましくは０．００５〜３０重量％である。
本発明のブラックラズベリー抽出物は、肌の美白効果を得るために有用である。
【実施例】
【００２３】
以下に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本実施例における部および％は、特記しない限り重量基準である。実施例及び比較例においては、ＯＲＡＣ値による抗酸化作用の評価および、メラノサイトにおけるチロシナーゼ酵素の活性阻害効果について検討を行った。
【００２４】
試料について
（試料の準備）
試料としては、ベリー系試料３種（ブラックラズベリー（バラ科キイチゴ属）（以下、「ＢＲ」ということがある。）、ブルーベリー（ツツジ科スノキ属）（以下、「ＢＢ」ということがある。）およびラズベリー（バラ科キイチゴ属）（以下、「ＲＢ」ということがある。））の抽出物、およびブラックラズベリーの抽出物を配合した粉末製剤であるBlabina（登録商標）を用いた。
【００２５】
（抽出液の調製）
ブラックラズベリー、ブルーベリーおよびラズベリーの抽出液は、以下の手法により得た。
まず、ブラックラズベリー、ブルーベリーおよびラズベリーの果実をそれぞれ冷凍状態にて保存した。次に、それぞれの果実を解凍してカットした。ブラックラズベリー、ブルーベリーおよびラズベリーをそれぞれ秤量（約１００ｇ）し、５倍量の３０ｖ／ｖ％（ＥｔＯＨ）エタノール水溶液（およそ５００ｍＬ）を加え、ブレンダーを用いて８０００ｒｐｍ、３０分の条件にて撹拌抽出を行った。さらに、室温にて２４時間静置することにより、静置抽出を行い、１５０メッシュで濾過して上記ブラックラズベリー、ブルーベリーおよびラズベリーのエタノール抽出液をそれぞれ得た。後述するＯＲＡＣの測定はエタノール溶解状態で行うため、エタノール抽出液を用いて測定を行った。
なお、Blabinaについては、３０ｖ／ｖ％（ＥｔＯＨ）にBlabinaを９ｍｇ／ｍLとなるように溶解させた。
【００２６】
（抽出物の調製）
上記抽出液の調製にて得られたブラックラズベリー、ブルーベリーおよびラズベリーそれぞれについてのエタノール抽出液、さらにBlabinaのエタノール溶液から、それぞれエバポレーターを用いてエタノール成分を蒸発させ、除去し、抽出物を得た。なお、ブラックラズベリー、ブルーベリーおよびラズベリーのエタノール抽出液は、９ｍｇ／ｍＬの抽出物（エキス）を含んでいた。
【００２７】
測定及び評価
（ＯＲＡＣ値による抗酸化作用の評価）
上記にて得られたベリー系検体３種（ブラックラズベリー、ブルーベリーおよびラズベリーのエタノール抽出液）のＯＲＡＣ値を測定した。結果を表１に示す。なお、Blabinaについては、ＯＲＡＣ値の測定を行わなかった。
【００２８】
【表１】
2019030267.tif 000002
【００２９】
一般的な抗酸化食品と比較して、ベリー系検体３種のＯＲＡＣ値はいずれも高い値を示した（一般的な抗酸化食品のＯＲＡＣ値については、上記非特許文献４参照）。ベリー系検体３種の中ではブルーベリーが最も高い値を示したが、これはエタノール抽出液を用いて測定した結果であるため、水溶性成分について言及することはできない。
【００３０】
また、エタノール濃度が０．１％程度以上では細胞への影響があるため、細胞を用いた測定および評価を行う場合には、３０ｖｏｌ％エタノール水溶液を用いたエタノール抽出液を用いることは適切ではない。そのため、以下のメラノサイトにおけるチロシナーゼ酵素の活性阻害効果の検討では、それぞれエタノール抽出液から、エバポレーターによってエタノール成分を蒸発除去した検体を用いた（上記「抽出物の調製」参照）。
【００３１】
（メラノサイトにおけるチロシナーゼ酵素の活性阻害効果）
実験に用いる細胞としては、メラノサイトを用いた。メラノサイトとしては、Normal Human Epidermal Melanocytes, juvenile foreskin（C-12400, PromoCell社より購入）を用い、専用培地（Melanocyte Growth Medium Supplement Pack; C-39410, PromoCell社より購入）を使用して３７℃、５％ＣＯ２の条件にて培養した。実験の直前に０．２５％Trypsin/EDTA溶液で細胞を回収し、細胞数をトリパンブルー染色処理後、Countess（Invitrogen）にて算出した。その後、２４ウェルプレートまたは９６ウェルプレートに播種し、２４時間、前培養したのち実験に用いた。
【００３２】
また、上記抽出物の調製において得られた３種のベリー系（ブラックラズベリー、ブルーベリーおよびラズベリー）抽出物、Blabinaのエタノール除去抽出物を、それぞれ超純水に溶解させて約１１．５ｍｇ／ｍＬとし、検体を得た。次にそれぞれの検体を段階希釈（１０００００倍希釈から１０倍希釈）し、それぞれメラノサイトに加えた。
【００３３】
次に、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）６０μＬに、２．５ｍＭ Tyrosine水溶液を３３．３μＬ加えた（２５℃）。そこに、３．３μＬのＬ−チロシン基質溶液を加え撹拌し、３．３μＬのチロシナーゼ水溶液（約１３００ｕｎｉｔ／ｍＬ)を加えて酵素反応を開始させた。プレートリーダー内を２５℃に設定し、酵素反応を行った。
【００３４】
酵素活性の評価はチロシナーゼにより合成されるＤＯＰＡクロムの吸光度（４７５nm）を指標とした。なお、Positive controlとしてビタミン−Ｃ  ２０ｍｇ／ｍＬを用いた（例えば、上記非特許文献５およびMatsuki M, Watanabe T, Ogasawara A, Mikami T, Matsumoto T. Inhibitory mechanism of melanin synthesis by glutathione. [Article in Japanese] Yakugaku Zasshi. 2008 Aug;128(8):1203-7 12. 参照）。
【００３５】
結果を図１に示す。ＤＯＰＡクロムの５０％Inhibition（ＩＣ５０）は、概算でpositive control（ビタミン−Ｃ）で１０００００倍希釈、Blabinaで５００００倍希釈、ＢＲで１００００倍希釈、ＢＢで２００倍希釈、ＲＢで１００希釈となった。これはBlabinaおよびＢＲが、ＢＢ及びＲＢに比較して数百倍以上の阻害活性を有することを示すものである。
【図１】
2019030267.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月10日(2018.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブラックラズベリー抽出物を有効成分とするメラノサイトにおけるチロシナーゼ酵素の活性阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載の活性阻害剤を含む美白剤。
【請求項３】
請求項１に記載の活性阻害剤を含む飲食物。
【請求項４】
請求項１に記載の活性阻害剤の製造方法であって、
ブラックラズベリーの果実を冷凍する冷凍工程と、
前記ブラックラズベリーの果実を解凍する解凍工程と、
前記解凍工程にて解凍した前記ブラックラズベリーの果実に溶媒を加えて撹拌する撹拌工程と、
前記撹拌工程により撹拌した前記ブラックラズベリーの果実および溶媒を静置し抽出を行う抽出工程と
を含む活性阻害剤の製造方法。