(57)【要約】      （修正有）【課題】キノリン酸を生産する組み換え微生物、及びそれを利用したキノリン酸の生産方法の提供。【解決手段】大腸菌などの微生物に存在する機械受容チャネル（ＭＳ（mechanosensitive）channel）に属する膜タンパク質であるＫｅｆＡの活性が低下されるか、あるいは除去された、キノリン酸を生産するエシェリキア属組み換え微生物、前記微生物からさらに、アスパラギン酸酸化酵素及びキノリン酸シンターゼから成る群から選択された１以上の酵素の活性が追加して強化されるように変異されたことを特徴とする、キノリン酸を生産するエシェリキア属組み換え微生物。前記組み換え微生物を培地で培養する段階と、前記培地又は前記微生物からキノリン酸を回収する段階と、を含む、キノリン酸を生産する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のタンパク質の活性が低下されるか、あるいは除去された、キノリン酸を生産するエシェリキア属組み換え微生物。
【請求項２】
前記微生物は、追加してキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性が低下されるか、あるいは除去されたことを特徴とする、請求項１に記載のキノリン酸を生産するエシェリキア属組み換え微生物。
【請求項３】
前記微生物は、アスパラギン酸酸化酵素及びキノリン酸シンターゼからなる群から選択された１以上の酵素の活性が追加して強化されるように変異されたことを特徴とする、請求項１または２に記載のキノリン酸を生産するエシェリキア属組み換え微生物。
【請求項４】
前記キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、配列番号２９のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項２に記載のキノリン酸を生産するエシェリキア属組み換え微生物。
【請求項５】
前記アスパラギン酸酸化酵素は、配列番号３０のアミノ酸配列を有し、前記キノリン酸シンターゼは、配列番号３１のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項３に記載のキノリン酸を生産するエシェリキア属組み換え微生物。
【請求項６】
前記微生物は、大腸菌であることを特徴とする、請求項１に記載のキノリン酸を生産するエシェリキア属組み換え微生物。
【請求項７】
請求項１に記載の組み換え微生物を培養する段階と、
培養物からキノリン酸を回収する段階と、
を含む、キノリン酸を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キノリン酸を生産する組み換え微生物、及びそれを利用してキノリン酸を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キノリン酸（２，３−ピリジン−ジカルボン酸）は、医薬物質、農業用化学物質、染色物質など非常に多様な分野で使用される化学物質の前駆体として利用される。
【０００３】
前記キノリン酸は、化学的または生物学的な合成方法を介して製造される。化学的には、一般的に、キノリン（quinoline）の酸化によって製造される。生物学的には、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮａｄＣ）の活性が除去された大腸菌に、２つの酵素、Ｌ−アスパラギン酸酸化酵素（ＮａｄＢ）、キノリン酸シンターゼ（ＮａｄＡ）の発現を強化させた大腸菌菌株を利用して、キノリン酸を生産する方法が開示されている。
【０００４】
一方、ＫｅｆＡは、大腸菌などの微生物に存在する機械受容チャネル（ＭＳ（mechanosensitive） channel）に属する膜タンパク質であり、非特異的に細胞膜を介して、イオンと溶質とを細胞内に流入させる機能が知られている。大腸菌においてＫｅｆＡは、ＫｅｆＢ及びＫｅｆＣと共に、Ｋ＋流出システム（Ｋ＋ efflux system）を構成し、特に、ＫｅｆＡが浸透圧衝撃（osmotic down shock）時、Ｋ＋流出に重要な役割を果たすことが知られている（J. Bacteriol. 169, 3743-3749, 1987）。また、大腸菌においてＫｅｆＡの遺伝子を突然変異させる場合、細胞が、野生型よりＫ＋濃度及び圧力に対してさらに感受性を有する（sensitive）ということが報告されている（J. membrane Biol. 150, 143-152）。しかし、前述のように、ほとんどの研究は、ＫｅｆＡの細胞内のカリウムイオン調節との関連性に主に焦点を置いているのみ、ＫｅｆＡとキノリン酸生産との関連性については、いかなる研究報告もなされていない。
【０００５】
それにより、本発明者らは、機械受容チャネルタンパク質の活性変形と、キノリン酸の高濃度生産との関連性に係わる研究を行い、キノリン酸を高収率で生産する方法を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、配列番号１のタンパク質の活性が低下されるか、あるいは除去された、キノリン酸を生産する組み換え微生物を提供することである。
【０００７】
本発明が解決しようとする課題はまた、前記微生物を利用してキノリン酸を生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するために、配列番号１のタンパク質の活性が低下されるか、あるいは除去された、キノリン酸を生産するエシェリキア属組み換え微生物を提供する。
【０００９】
前記課題を解決するために、また、前記組み換え微生物を培養する段階と、培養物からキノリン酸を回収する段階と、を含むキノリン酸を生産する方法が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
一様態による配列番号１のタンパク質の活性が低下または除去された微生物は、キノリン酸生産のために利用される。
【００１１】
他の様態によるキノリン酸を生産する方法によれば、キノリン酸を効率的に生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一様態は、ＫｅｆＡの活性が低下されるか、あるいは除去された、キノリン酸を生産する組み換え微生物を提供する。
【００１３】
本明細書で使用された用語「ＫｅｆＡ」は、機械受容チャネル（ＭＳ（mechanosensitive） channel）に属する膜タンパク質であり、「ＭｓｃＫ」とも呼ばれる。前記ＫｅｆＡは、カリウム依存的であり、細胞膜を介して、非特異的にイオンと溶質とを細胞内に流入させる活性を有するものでもある。特に、ＫｅｆＡは、カリウム流出タンパク質（potassium efflux protein）のうち一つであり、例えば、バクテリアが浸透圧衝撃を受ける場合、カリウム流出を介して調節することができる。
【００１４】
前記ＫｅｆＡは、エシェリキア属微生物に由来したものでもあり、具体的には、配列番号１のアミノ酸配列を有し、それと、相同性が８０％、具体的には、９０％以上であるアミノ酸配列であって、実質的に、ＫｅｆＡの活性を有するタンパク質であるならば、制限なしに含んでもよい。また、かような相同性を有する配列であって、実質的に、配列番号１のタンパク質と同一であるか、あるいは相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であるならば、一部配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本発明の範疇に含まれるということも自明である。
【００１５】
また、前記ｋｅｆＡ遺伝子配列は、前記配列番号１、またはそれと相同性が８０％以上であるアミノ酸配列をコーディングするポリヌクレオチド配列を含んでもよく、前記ＫｅｆＡタンパク質をコーディングするポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（degeneracy）によって、または前記タンパク質を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、コーディング領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内で、コーディング領域に多様な変形がなされる。前記ｋｅｆＡのポリヌクレオチド配列は、公開された大腸菌のゲノム配列（ＧＩ：８９１０７８７２）、またはアメリカ生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）及び日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のようなデータベースから得ることができ、例えば、配列番号１０の塩基配列を有し、それと、相同性が８０％、具体的には、９０％以上の塩基配列を有することができる。しかし、それに限定されるものではない。
【００１６】
本発明で使用された用語「相同性」は、前記アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に係わる相同性は、与えられたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列と一致する程度を意味し、百分率で表示される。本発明においては、与えられたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列と同一であるか、あるいは類似した活性を有するその相同性配列が、「％相同性」と表示される。例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［参照：Karlin及びAltschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)］や、PearsonによるＦＡＳＴＡ［参照：Methods Enzymol., 183, 63 (1990)］を使用して決定することができる。かようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている［参照：http://www.ncbi.nlm.nih.gov］。
【００１７】
本明細書で使用された用語「キノリン酸（quinolinic acid）」は、キノリン酸（quinolinate）またはその塩を含む。前記「塩」は、キノリン酸の陰イオンと、塩基の陽イオンとによって作られる化合物であり、例えば、キノリン酸ナトリウム塩、キノリン酸カリウム塩、キノリン酸アムモニウム塩、キノリン酸カルシウム塩、キノリン酸マグネシウム塩などを含んでもよい。
【００１８】
本明細書で使用された用語「組み換え微生物（recombinant microorganism）」は、自然的または人工的に突然変異化された微生物であるか、遺伝的に操作された微生物でもある。遺伝工学によって製造された微生物、例えば、遺伝工学方法によって、微生物内に、外因性（exogenous）核酸が導入されたり、微生物の内因性（endogenous）遺伝子の配列または位置が変形されたりするものでもある。
【００１９】
本発明の「キノリン酸を生産する組み換え微生物」は、培地中の炭素源からキノリン酸を生産して蓄積させることができる微生物であり、ＫｅｆＡ活性の低下または除去によって、変形前より高い生産性でキノリン酸を生産することができる。前記組み換え微生物は、キノリン酸を生産して蓄積させることができる微生物であるならば、制限されるものではないが、エシェリキア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterbacter）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物でもある。具体的には、前記微生物は、エシェリキア属に属する微生物でもある。さらに具体的には、前記エシェリキア属微生物は、大腸菌（Escherichia coli）でもあるが、それに限定されるものではない。
【００２０】
本明細書で使用された用語、酵素またはポリペプチドの「活性除去」は、微生物において、言及されたタンパク質が全く発現されないか、あるいは発現されたとしても、全く活性を有さないということを意味する。また用語「活性低下」は、言及されたタンパク質の活性が、内在的活性に比べて弱化されたことを意味する。用語「内在的活性」とは、微生物が天然の状態、すなわち、微生物が本来有していた、遺伝子組み換えを経ないタンパク質の活性を意味する。
【００２１】
具体的な例として、前記ＫｅｆＡの活性の低下または除去は、前記ＫｅｆＡタンパク質を暗号化する、１）遺伝子の除去または欠失、２）前記遺伝子の発現が減少するように、発現調節配列の変形、３）前記ＫｅｆＡの活性が弱化されるように、染色体上の前記遺伝子配列の変形、または前記遺伝子のプローモーターを、内在的プローモーターより弱いプローモーターへの交替の方法によって行われたり、それら方法の１以上の組み合わせによって遂行されたりする。しかし、それらに制限されるものではない。
【００２２】
さらに具体的には、前記ＫｅｆＡの活性の低下または除去は、前記ＫｅｆＡ膜タンパク質を暗号化する遺伝子の除去または欠失によるものでもある。前記「遺伝子の除去または欠失」は、遺伝子が発現されないか、発現量が減少するか、あるいは発現されても、酵素活性を示さなかったり、活性が低下したりするように、遺伝子の一部または全部、またはそのプローモーター、そのターミネーター領域などの調節因子の一部または全部が、変異、置換、削除されとか、あるいは遺伝子に１以上の塩基が挿入されることをいう。例えば、前記遺伝子の除去または欠失は、相同組み換えのような遺伝子操作、突然変異誘発、分子進化を介して達成される。細胞が、複数個の同じ遺伝子を含むか、あるいは２個以上の異なるポリペプチド同種相同遺伝子（paralog）を含む場合、１またはそれ以上の遺伝子が除去または欠失される。
【００２３】
本発明において、前記組み換え微生物は、追加してキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮａｄＣ：quinolinate phosphoribosyltransferase）の活性が低下または除去されたものでもある。
【００２４】
本明細書で使用された用語「キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ」は、キノリン酸を、ニコチン酸モノヌクレオチドに転換させる活性を有するものを意味する。前記キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性を有する遺伝子を除去するか、あるいはその発現を弱化させる場合、細胞内にキノリン酸の生産を増加させることができる。
【００２５】
前記キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、エシェリキア属微生物に由来したものでもあり、具体的には、配列番号２９のアミノ酸配列を有し、それと、相同性が８０％、具体的には、９０％以上であるアミノ酸配列であり、実質的に、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質であるならば、制限なしに含み、かような相同性を有する配列であって、実質的に、配列番号２９のタンパク質と同一であるか、あるいは相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であるならば、一部配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本発明の範疇に含まれるということは自明である。
【００２６】
前記キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコーディングするｎａｄＣ遺伝子の配列は、配列番号２９のアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド配列を含むものでもある。前記ｎａｄＣ遺伝子配列は、文献に公開された大腸菌のゲノム配列（ＧＩ：８９１０６９９０）、またはＮＣＢＩ、ＤＤＢＪのようなデータベースから得ることができる。また前記ｎａｄＣ遺伝子、は配列番号１１の塩基配列、またはそれと８０％、具体的には、９０％以上の相同性を有する塩基配列を有するものでもある。前記キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性を低下または除去させることにより、細胞内にキノリン酸の蓄積を増加させることができる。
【００２７】
前記キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの「活性の低下または除去」は、前述のＫｅｆＡの「活性の低下または除去」と同一意味であるということは、本発明の当業者に自明な内容である。
【００２８】
また、前記組み換え微生物は、さらに、アスパラギン酸酸化酵素（Ｌ−aspartate oxidase）（ＮａｄＢ）及びキノリン酸シンターゼ（quinolinate synthase）（ＮａｄＡ）からなる群から選択される１以上の活性が、さらに上昇したものでもある。その結果として、細胞内に、キノリン酸の前駆物質であるα−イミノスクシネートの蓄積と、α−イミノスクシネートからキノリン酸への生合成が増大し、キノリン酸の生産が増加する。
【００２９】
本明細書で使用された用語「アスパラギン酸酸化酵素」は、Ｌ−アスパラギン酸を酸化させる活性を有する酵素を意味し、「Ｌ−アスパラギン酸酸化酵素」と命名される。
【００３０】
従って、アスパラギン酸酸化酵素の活性が強化されれば、細胞内に、キノリン酸の前駆物質であるイミノコハク酸の蓄積が増加し、それによって、キノリン酸の生産が増加する。
【００３１】
前記アスパラギン酸酸化酵素は、エシェリキア属微生物に由来したものでもあり、具体的には、配列番号３０のアミノ酸配列を有し、それと、相同性が８０％、具体的には、９０％以上であるアミノ酸配列であって、実質的に、アスパラギン酸酸化酵素の活性を有するタンパク質であるならば、制限なしに含み、かような相同性を有する配列であって、実質的に、配列番号３０のタンパク質と同一であるか、あるいは相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であるならば、一部配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本発明の範疇に含まれるということは自明である。
【００３２】
前記アスパラギン酸酸化酵素を暗号化するｎａｄＢ遺伝子は、配列番号３０のアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。前記遺伝子ｎａｄＢの配列は、文献に公開された大腸菌（Escherichia coli）のゲノム配列（ＧＩ：８９１０９３８０）や、ＮＣＢＩ、ＤＤＢＪのようなデータベースから得ることができる。前記ｎａｄＢ遺伝子は、配列番号１８の塩基配列でもあり、またはそれと、相同性が８０％以上、具体的には、９０％以上の配列を有することができる。しかし、それに限定されるものではない。
【００３３】
本明細書で使用された用語「キノリン酸シンターゼ」は、イミノコハク酸からキノリン酸を合成する活性を有する酵素を意味する。
【００３４】
前記アスパラギン酸酸化酵素の活性によって生成されるα−イミノスクシネートから、キノリン酸シンターゼの触媒作用を介して、キノリン酸を合成する速度を速め、さらに高い生産性でキノリン酸を生産することができる。従って、キノリン酸シンターゼをコーディングする遺伝子の発現や、該酵素の活性を強化する場合、細胞内において、キノリン酸の生産を増加させることができる。
【００３５】
前記キノリン酸シンターゼは、エシェリキア属微生物に由来したものでもあり、具体的には、配列番号３１のアミノ酸配列を有し、それと、相同性が８０％、具体的には、９０％以上であるアミノ酸配列であって、実質的に、キノリン酸シンターゼの活性を有するタンパク質であるならば、制限なしに含む。かような相同性を有する配列であって、実質的に、配列番号３１のタンパク質と同一であるか、あるいは相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であるならば、一部配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本発明の範疇に含まれるということは自明である。
【００３６】
前記キノリン酸シンターゼを暗号化するｎａｄＡ遺伝子は、前記配列番号３１のアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。前記遺伝子ｎａｄＡの配列は、文献に公開された大腸菌のゲノム配列（ＧＩ：８９１０７６０１）や、ＮＣＢＩ及びＤＤＢＪのようなデータベースから得ることができる。前記キノリン酸シンターゼを暗号化するｎａｄＡ遺伝子は、配列番号２１の塩基配列でもあり、またはそれと、相同性が８０％以上、具体的には、９０％以上の配列を有することができる。しかし、それに限定されるものではない。
【００３７】
本発明で使用された用語「活性の上昇」は、言及されたタンパク質の活性が、内在的活性に比べて「強化」されたことを意味する。具体的には、言及されたタンパク質を暗号化する遺伝子のコピー数増加、前記各遺伝子の発現が増加するように、発現調節配列の変形、前記各タンパク質の活性が強化されるように、染色体上の前記各遺伝子配列の変形、前記遺伝子のプローモーターを内在的プローモーターより強いプローモーターへの交替、またはそれらの組み合わせによっても遂行されるが、それらに限定されるものではない。
【００３８】
具体的には、前記アスパラギン酸酸化酵素またはキノリン酸シンターゼの活性の上昇は、前記酵素を暗号化するポリヌクレオチドを含む組み換えベクターに形質転換ことによる。用語「形質転換」とは、遺伝子を宿主細胞内に導入し、宿主細胞内で発現させることを意味する。形質転換された遺伝子は、宿主細胞内で発現されれば、宿主細胞の染色体内に挿入されているものでも、または染色体外に位置しているのでも、制限なしに含まれる。また、前記遺伝子は、宿主細胞内に導入されて発現されるものであるならば、いかなる形態で導入されてもよい。例えば、前記遺伝子は、自主的に発現されるのに必要な全ての要素を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入される。前記発現カセットは、一般的に、前記遺伝子に作動可能に連結されているプローモーター、転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含む。前記発現カセットは、自体複製が可能な発現ベクター形態でもある。また、前記遺伝子は、それ自体、またはポリヌクレオチド構造体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものでもある。前記組み換えベクターは、宿主細胞にＤＮＡを導入し、タンパク質を発現させるための手段として、プラスミドベクター、コズミドベクター、バクテリオファージベクターなど公知の発現ベクターを使用することができる。前記ベクターは、ＤＮＡ組み換え技術を利用した任意の公知された方法によって、当業者が容易に製造することができるが、それに限定されるものではない。
【００３９】
さらに具体的には、前記酵素の活性上昇は、遺伝子に作動可能に連結されたプローモーターを、強化されたプローモーターに交替することにもよる。本発明の一具体例において、ｎａｄＡと作動可能に連結されたプローモーターを、ｐＣｙｓＫの代わりに、さらに強いプローモーターであるｐＣＪ１（大韓民国特許登録番号１０−０６２００９２）に交替したとき、キノリン酸生産が大きく増加するということを確認したが（表８）、それに限定されるものではない。
【００４０】
本発明の他の様態は、前記キノリン酸を生産する組み換え微生物を培養する段階と、培養物からキノリン酸を回収する段階と、を含む、キノリン酸を生産する方法を提供する。
【００４１】
前記キノリン酸を生産する微生物については、前述の通りである。
【００４２】
前記培養は、当業界に公知の適する培地及び培養条件によってなされる。当業者であるならば、選択される微生物によって、培地及び培養条件を容易に調整して使用することができるであろう。培養方法は、回分式、連続式、流加式、またはそれらの組み合わせの培養を含んでもよいが、それらに限定されるものではない。
【００４３】
前記培地は、多様な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含んでもよい。
【００４４】
具体的な例として、前記炭素源は、ブドウ糖（グルコース）、ショ糖、乳糖、果糖、マルトース、澱粉、セルロースのような炭水化物；大豆油、ひまわり油、ひまし油、ココナッツ油のような脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸；グリセロール及びエタノールのようなアルコール；酢酸のような有機酸；またはそれらの組み合わせを含んでもよく、具体的には、グルコースを炭素源にして遂行される。
【００４５】
前記窒素源は、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液（ＣＳＬ）及び大豆ミールのような有機窒素源；及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【００４６】
前記培地は、リンの供給源であり、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、及び相応するナトリウム含有塩、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含んでもよい。また、アミノ酸、ビタミン及び適切な前駆体などが培地に含まれてもよい。前記培地または個別成分は、培養液に、回分式または連続式によって添加されるが、前述の例は、例示であるのみ、それらに限定されるものではない。
【００４７】
また、培養中に、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を、微生物培養液に適切な方式によって添加し、培養液のｐＨを調整することができる。また、培養中に、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して、気泡生成を抑制することができる。培養液の好気状態を維持するために、培養液内に、酸素または酸素含有気体（例えば、空気）を注入することができる。培養液の温度は、一般的に、２０℃ないし４５℃、例えば、２５℃ないし４０℃でもある。培養期間は、所望のキノリン酸の生成量が得られるまで持続することができ、例えば、１０ないし１６０時間でもある。
【００４８】
前記培養物から、キノリン酸を回収する方法は、培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式の培養方法などにより、当該分野に公知された適する方法を利用して、培養液物から生産されたキノリン酸を収集または回収することができる。
【００４９】
以下、本発明について、実施例によって、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例によって制限されるものではない。
【実施例】
【００５０】
実施例１．キノリン酸を生産する菌株作製
１−１．キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ除去菌株の作製
大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートにしたＰＣＲを介して、キノリン酸分解経路のｎａｄＣ遺伝子を得た。アメリカ国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から、ｎａｄＣ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号「ＧＩ：８９１０６９９０」）を得て、ｎａｄＣ塩基配列１１に基づいて、ｎａｄＣ遺伝子の下流（downstream）部分を増幅する配列番号１２及び１３のプライマー、ｎａｄＣの上流（upstream）及び下流部分とｌｏｘｐＣｍとを増幅する配列番号１４及び１５のプライマー、上流部分を増幅する配列番号１６及び１７のプライマーを合成した。
【００５１】
大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートにして、配列番号１２及び１３オリゴヌクレオチド、並びに１６及び１７のオリゴヌクレオチドをプライマーにしてＰＣＲを行い、それぞれ０．５ｋｂ及び０．３ｋｂのｎａｄＣ遺伝子の上流部分及び下流部分を増幅した。また、ｌｏｘｐＣｍを含んでいるプラスミドベクターｐＬｏｘｐＣａｔ２ベクター（Ｇｅｎｂａｎｋ Accession Ｎｏ．ＡＪ４０１０４７）をテンプレートにして、配列番号１４及び１５のオリゴヌクレオチドをプライマーにしてＰＣＲを行い、１．０ｋｂの両末端に、ｎａｄＣ遺伝子と相同配列を有するｌｏｘｐＣｍ遺伝子を増幅した。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社、米国）を使用し、ＰＣＲは、９６℃で３０秒の変性、５３℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１分の伸張で構成されたサイクルを３０回反復して行った。
【００５２】
その後、前記のＰＣＲ反応を介して得られたｎａｄＣ−上流切片、ｎａｄＣ−下流切片、ｌｏｘｐＣｍ切片をテンプレートにしてＰＣＲを行い、ＰＣＲ条件は、９６℃での６０秒の変性、５０℃での６０秒の変性、及び７２℃での１分の伸張で構成されたサイクル１０回、及び配列番号１２及び１７のプライマー添加後サイクル２０回であった。その結果、１．８ｋｂのｎａｄＣ遺伝子上流−ｌｏｘｐＣｍ−下流を含んだｎａｄＣ欠損カセットを獲得した。
【００５３】
作製されたｎａｄＣ欠損カセットをラムダレッド組み換え酵素（lambda red recombinase）発現ベクターであるｐＫＤ４６を含んだ大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０上において、電気穿孔を介して形質転換させ、選別マーカーであるクロラムフェニコールが含有されたＬＢ（Luria-Bertani）平板培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ及びアガール１．５％）上に塗抹し、３７℃で一晩中培養した後、クロラムフェニコールに対する耐性を示す菌株を選別した。
【００５４】
選別された菌株を直接テンプレートにし、配列番号１３及び１６のプライマーを利用して、同じ条件でＰＣＲを行った後、１．０％アガロースゲル上で、遺伝子の大きさが、野生菌株の場合、１．６ｋｂであり、ｎａｄＣ除去菌株の場合、１．３ｋｂであるということを確認することにより、ｎａｄＣ遺伝子の欠失を確認した。それをＷ３１１０−ΔｎａｄＣと命名した。
【００５５】
また、前述のところと同一方法で、Ｋ１２ ＭＧ１６５５菌株を基にｎａｄＣ遺伝子を欠失させ、それをＭＧ１６５５−ΔｎａｄＣと命名した。
【００５６】
１−２．ＫｅｆＡ除去菌株の作製
米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から、配列番号１０のｋｅｆＡ遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩ登録番号「ＧＩ：：８９１０７８７２」）を得て、それに基づいて、ｋｅｆＡ遺伝子の下流部分を増幅する配列番号２及び３のプライマー、ｋｅｆＡの上流部分及び下流部分、とＦＲＴ−ＫＭとを増幅する配列番号４及び５のプライマー、上流部分を増幅する配列番号６及び７のプライマーを合成した。
【００５７】
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートにして、配列番号２及び３プライマー、並びに６及び７のプライマーを利用してＰＣＲを行い、それぞれ０．８Ｋｂ及び０．６ＫｂのｋｅｆＡ遺伝子の上流部分及び下流部分を増幅した。また、ＦＲＴ−Ｋｍを含むｐＫＤ４ベクターをテンプレートにして、配列番号４及び５のオリゴヌクレオチドをプライマーにしてＰＣＲを行い、１．４Ｋｂの両末端に、ｋｅｆＡと相同配列を有するＦＲＴ−Ｋｍ遺伝子を増幅した。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を使用し、ＰＣＲは、９６℃で３０秒の変性、５３℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で２分の伸張で構成されたサイクルを３０回反復して行った。その後、前記のＰＣＲ反応を介して得られたｋｅｆＡ−上流切片、ｋｅｆＡ−下流切片、ＦＲＴ−Ｋｍ切片をテンプレートにしてＰＣＲを行い、ＰＣＲ条件は、９６℃での６０秒の変性、５０℃での６０秒の変性、及び７２℃での２分の伸張で構成されたサイクル１０回、及び配列番号６及び７のプライマー添加後サイクル２０回であった。その結果、２．６ｋｂのｋｅｆＡ上流−ＦＲＴ−Ｋｍ−ｋｅｆＡ下流を含んだｋｅｆＡ除去カセットを獲得した。
【００５８】
作製されたｋｅｆＡ除去カセットを、ラムダレッド組み換え酵素（lambda red recombinase）発現ベクターであるｐＫＤ４６を含んだ大腸菌Ｗ３１１０−ΔＮａｄＣ上において、電気穿孔を介して形質転換させ、選別マーカーであるカナマイシンが含有されたＬＢ（Luria-Bertani）平板培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ及びアガール１．５％）上に塗抹し、３７℃で一晩中培養した後、カナマイシンに対する耐性を示す菌株を選別した。選別された菌株を直接テンプレートにし、配列番号８及び９のプライマーを利用して、前記のような条件でＰＣＲを行った後、１．０％アガロースゲル上で、遺伝子の大きさが野生菌株の場合、４．２ｋｂであり、ｋｅｆＡ除去菌株の場合、１．５ｋｂであるということを確認することにより、ｋｅｆＡ遺伝子の欠失を確認した。かように作製された菌株をＷ３１１０−ΔｎａｄＣΔｋｅｆＡと命名した。
【００５９】
また、前記作製されたｋｅｆＡ除去カセットを利用して、同一方法で、ＭＧ１６５５−ΔｎａｄＣ菌株において、ｋｅｆＡ遺伝子を欠失させ、それをＭＧ１６５５−ΔｎａｄＣΔｋｅｆＡと命名した。
【００６０】
１−３．大腸菌Ｌ−アスパラギン酸酸化酵素発現用プラスミドの作製
大腸菌由来の野生型Ｌ−アスパラギン酸酸化酵素をコーディングするｎａｄＢ遺伝子を、発現ベクターにクローニングした。そのために、テンプレートとしては、大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０菌株（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２３２５７）の染色体を使用した。遺伝子配列は、米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から、配列番号１８の遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩ登録番号「ＧＩ：８９１０９３８０」）を活用した。ｎａｄＢ遺伝子のＯＲＦ部分を増幅し、制限酵素認識部位ＮｄｅＩと制限酵素認識部位ＢａｍＨＩを有する配列番号１９及び２０のプライマーを合成した。
【００６１】
前記大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、配列番号１９及び２０のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してＰＣＲを行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社、米国）を使用し、ＰＣＲは、９６℃で３０秒変性、５０℃で３０秒アニーリング及び７２℃で２分の伸張で構成されたサイクルを３０回反復して遂行した。ＰＣＲを介して、ｎａｄＢＯＲＦ遺伝子と、制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＢａｍＨＩの認識部位とを含んだ約１．９ｋｂの増幅された遺伝子を得た。
【００６２】
前記ＰＣＲを介して得られたｎａｄＢ遺伝子は、アガロースゲル溶出（agarose gel elution）を介して回収した後、制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＢａｍＨＩで処理した。その後、制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＢａｍＨＩで処理したｐＰｒｏＬａｒ（CloneTech社、米国）ベクターに接合（ligation）し、ｐＰｒｏプローモーターに連結されたｎａｄＢ遺伝子から、Ｌ−アスパラギン酸酸化酵素が発現されるようにした。前記の方法によって作製されたベクターをｐＰｒｏ−ｎａｄＢベクターと命名した。
【００６３】
１−４．アスパラギン酸酸化酵素及びキノリン酸シンターゼ発現用プラスミド作製
（１）ｐＰｒｏ−ｎａｄＢ＿ｐＣｙｓＫ−ｎａｄＡベクター作製
まず、大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートにしたＰＣＲを介して、キノリン酸シンターゼをコーディングする遺伝子ｎａｄＡを得た。米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から、配列番号２１のｎａｄＡ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号「ＧＩ：８９１０７６０１」）を活用した。それに基づいて、ｎａｄＡ遺伝子のＡＴＧ部分と、ＴＡＡを含むＯＲＦ部分とを増幅し、制限酵素ＡｐａＩ及び制限酵素ＮｏｔＩの認識部位を有する配列番号２２及び２３のプライマーを合成した。
【００６４】
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートにして、前記配列番号２２及び２３のオリゴヌクレオチドをプライマーにしてＰＣＲを行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社、米国）を使用して、ＰＣＲは、９６℃での３０秒の変性、５０℃での３０秒のアニーリング、及び７２℃での２分の伸張から構成されたサイクルを３０回反復して遂行した。その結果、ｎａｄＡ遺伝子と、制限酵素ＡｐａＩ及び制限酵素ＮｏｔＩの認識部位とを含んだ約１．０ｋｂの増幅された遺伝子を獲得した。
【００６５】
また、大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートにしたＰＣＲを介して、ｃｙｓＫプローモーターを得た。米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から、ｃｙｓＫ遺伝子の上流０．３ｋｂ内に位置したプローモーターの塩基配列情報を得て（配列番号２４）、それに基づいて、ｃｙｓＫプローモーターと、前述のところにおいて増幅されたｎａｄＡ遺伝子とを接合させるために、制限酵素ＢａｍＨＩと制限酵素ＡｐａＩとの認識部位を有する配列番号２５及び２６のプライマーを合成した。
【００６６】
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートにして、前記配列番号２５及び２６のオリゴヌクレオチドをプライマーにしてＰＣＲを行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を使用し、ＰＣＲ条件は、９６℃で３０秒の変性、５０℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１分の伸張で構成されたサイクルを３０回反復した。その結果、ｃｙｓＫプローモーターと、制限酵素ＢａｍＨＩ及び制限酵素ＡｐａＩとを含んだ約０．３ｋｂの増幅された遺伝子を獲得した。
【００６７】
前記ＰＣＲを介して獲得したｎａｄＡ遺伝子を、制限酵素ＡｐａＩ及び制限酵素ＮｏｔＩで処理し、増幅されたｃｙｓＫプローモーター切片を、ＡｐａＩ及びＢａｍＨＩで処理した。制限酵素で処理したｎａｄＡ及びｃｙｓＫプローモーターの切片を制限酵素ＮｏｔＩ及び制限酵素ＢａｍＨＩで処理した前記１−２で得たｐＰｒｏ−ｎａｄＢベクターに、接合を介してクローニングし、最終的に、構成的プローモーターであるｐＰｒｏプローモーターによって発現調節を受けるｎａｄＢ遺伝子、及びｃｙｓＫ遺伝子プローモーターによって発現調節を受けるｎａｄＡ遺伝子がクローニングされた５．９ＫｂのｐＰｒｏ−ｎａｄＢ＿ｐＣｙｓＫ−ｎａｄＡベクターを作製した。
【００６８】
（２）ｐＰｒｏ−ｎａｄＢ＿ｐＣＪ１−ｎａｄＡベクター作製
キノリン酸生合成過程において、最も末端にあるキノリン酸シンターゼをコーディングするｎａｄＡ遺伝子の発現をさらに強化させるために、前記のｐＣｙｓＫプローモーターの代わりに、Ｋ１２ Ｗ３１１０において活性がさらに強いｐＣＪ１プローモーターを利用した。韓国特許公開公報ＫＲ２００６−００６８５０５Ａを基に、ｐＣＪ１プローモーターを含んだプラスミドをＤＮＡをテンプレートにしたＰＣＲを介して、ｐＣＪ１プローモーターを得た。ｐＣＪ１プローモーターと、前述のところで増幅されたｎａｄＡ遺伝子とを接合させるために、制限酵素ＢａｍＨＩ及び制限酵素ＡｐａＩの認識部位を有する配列番号２７及び２８のプライマーを合成した。
【００６９】
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートにして、前記配列番号２７及び２８のオリゴヌクレオチドをプライマーにしてＰＣＲを行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を使用し、ＰＣＲ条件は、９６℃での３０秒の変性、５０℃での３０秒のアニーリング、及び７２℃での１分の伸張で構成されたサイクルを３０回反復した。その結果、ｐＣＪ１プローモーターと、制限酵素ＢａｍＨＩ及び制限酵素ＡｐａＩを含んだ約０．３ｋｂの増幅された遺伝子を獲得した。
【００７０】
前記ＰＣＲを介して獲得したｎａｄＡ遺伝子を、制限酵素ＡｐａＩ及び制限酵素ＮｏｔＩで処理し、増幅されたｐＣＪ１プローモーター切片を、ＡｐａＩ及びＢａｍＨＩで処理した。前記制限酵素で処理したｎａｄＡ及びｐＣＪ１プローモーターの切片を、制限酵素ＮｏｔＩ及び制限酵素ＢａｍＨＩで処理した前記１−２で得られたｐＰｒｏ−ｎａｄＢベクターに、接合を介してクローニングし、最終的に、構成的プローモーターであるｐＰｒｏプローモーターによって発現調節を受けるｎａｄＢ遺伝子と、ｐＣＪ１遺伝子プローモーターによって発現調節を受けるｎａｄＡ遺伝子とがクローニングされた５．９ＫｂのｐＰｒｏ−ｎａｄＢ＿ｐＣＪ１−ｎａｄＡ組み換えベクターを作製した。
【００７１】
実施例２．キノリン酸生産菌株の生成能評価
２−１．キノリン酸生産菌株の生産能力の比較のための力価確認
キノリン酸生産能を評価するために、ｎａｄＢ、ｎａｄＡが強化されたプラスミドを、Ｗ３１１０−ΔｎａｄＣ，ＭＧ１６５５−ΔｎａｄＣ菌株にそれぞれ導入した。導入方法は、ＣａＣｌ２方法を利用して形質転換し、３７℃の培養器で、ＬＢ−Ｋｍ（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、アガール１．５％、カナマイシン５０μｇ／Ｌ）平板培地に塗抹し、一晩中培養した。その後、カナマイシン耐性を有する得られた単一コロニーを、２５ｍＬのキノリン酸力価培地に１白金耳ずつ接種し、３３℃で２５０ｒｐｍで、２４ないし７２時間培養した。下記表１は、キノリン酸生産用培地の組成を示している。
【００７２】
【表１】
2019030314.tif 000002
【００７３】
培養液中のキノリン酸をＨＰＬＣで分析し、その結果を下記表２に示した。それは、菌株のキノリン酸生成能を示している。表２から確認することができるように、キノリン酸基盤菌株及びｎａｄＢＡの発現程度によって、キノリン酸生産の差を確認した。特に、ｐＣｙｓＫプローモーターより発現強度が強いｐＣＪ１において、ｎａｄＡ遺伝子発現を強化させた場合、大腸菌Ｋ１２野生型基盤のＷ３１１０−ΔｎａｄＣ及びＭＧ１６５５−ΔｎａｄＣにおいて、キノリン酸の生産が大きく増加するということを確認した。
【００７４】
【表２】
2019030314.tif 000003
【００７５】
２−２．ＫｅｆＡ除去菌株キノリン酸生成能の評価
ｋｅｆＡ除去菌株のキノリン酸生成能を比較するために、前記１−４で作製されたＷ３１１０−ΔｎａｄＣΔｋｅｆＡ，ＭＧ１６５５−ΔｎａｄＣΔｋｅｆＡ菌株を、それぞれｐＰｒｏ−ｎａｄＢ＿ｐＣＪ１−ｎａｄＡプラスミドにおいて、ＣａＣｌ２方法を利用して形質転換した。形質転換された前記各菌株を、３７℃の培養器において、ＬＢ−Ｋｍ（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、アガール１．５％、カナマイシン５０μｇ／Ｌ）平板培地に塗抹し、一晩中培養した。その後、カナマイシン耐性を有するコロニーを得た単一コロニーを、２５ｍＬのキノリン酸力価培地（表１）に、１白金耳ずつ接種し、３３℃で２５０ｒｐｍで、２４ないし７２時間培養した。
【００７６】
培養液中のキノリン酸をＨＰＬＣによって分析し、結果を表３に示した。下記表３に表示されているように、ｋｅｆＡ除去菌株において、対照群対比でキノリン酸濃度が上昇し、特に、野生型菌株基盤において、ｋｅｆＡ欠損によるキノリン酸濃度上昇が１５％以上レベルであると確認された。
【００７７】
【表３】
2019030314.tif 000004
【００７８】
２−３．ＫｅｆＡ活性低下効果の確認
（１）ＫｅｆＡ開始コドン（start codon）置換プラスミド作製
キノリン酸生産菌株において、ＫｅｆＡの弱化効果を確認するために、ｋｅｆＡが弱化されたプラスミドを作製した。遺伝子配列は、米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）の配列番号１０の遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩ登録番号「ＧＩ：：８９１０７８７２」）を活用した。ｋｅｆＡ開始コドンを、ＡＴＧからＴＴＧに変異させ、ｋｅｆＡ遺伝子のＯＲＦ部分を増幅し、制限酵素認識部位ｂｌｕｎｔ及び制限酵素認識部位ＢａｍＨＩを有する配列番号３２及び３３のプライマーを合成した。また、ｋｅｆＡ遺伝子の自家プローモーター部位を増幅し、制限酵素認識部位ＳａｃＩ及び制限酵素認識部位ｂｌｕｎｔを有する配列番号３４及び３５のプライマーを合成した。
【００７９】
大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０菌株（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２３２５７）の染色体ＤＮＡをテンプレートにして、配列番号３２及び３３のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してＰＣＲを行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を使用し、ＰＣＲは、９６℃で３０秒変性、５０℃で３０秒アニーリング及び７２℃で３０秒の伸張で構成されたサイクルを３０回反復して行った。ＰＣＲを介して、ｋｅｆＡＯＲＦ部位と、制限酵素ＢａｍＨＩの認識部位とを含んだ約０．１５ｋｂの増幅された遺伝子を得た。
【００８０】
また、Ｋ１２ Ｗ３１１０染色体ＤＮＡをテンプレートとして、配列番号３４及び３５のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してＰＣＲを行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を使用し、ＰＣＲは、９６℃で３０秒変性、５０℃で３０秒アニーリング及び７２℃で３０秒の伸張で構成されたサイクルを３０回反復して行った。ＰＣＲを介して、ｋｅｆＡ自家プローモーター部位と、制限酵素ＳａｃＩＩの認識部位とを含んだ約０．１５ｋｂの増幅されたｐＫｅｆＡプローモーターを得た。
【００８１】
前記ＰＣＲを介して得られたｋｅｆＡＯＲＦ部位とｐＫｅｆＡプローモーターは、アガロースゲル溶出（agarose gel elution）を介して回収した後、それぞれＢａｍＨＩ制限酵素及びＳａｃＩ制限酵素で処理した。その後、制限酵素ＢａｍＨＩ及び制限酵素ＳａｃＩで処理したｐＳＧ７６Ｃ（J. Bacteriol. 179 (13), 4426-4428 (1997)，ＮＣＢＩ ｇｅｎｅｂａｎｋ Ｙ０９８９２）ベクターに接合（ligation）した。
【００８２】
それを介して、自家プローモーターを有しながら、開始コドンがＡＴＧからＴＴＧに置換されたｋｅｆＡＯＲＦ部位を有したベクターを作製し、ｐＳＧ７６Ｃ＿ｋｅｆＡ＊（ＡＴＧ→ＴＴＧ）ベクターと命名した。
【００８３】
（２）ｋｅｆＡ開始コドン置換菌株の作製、及びキノリン酸生成能の評価
前記（１）で作製されたｐＳＧ７６Ｃ＿ｋｅｆＡ＊（ＡＴＧ→ＴＴＧ）ベクターを、大腸菌Ｗ３１１０−ΔＮａｄＣ上において、電気穿孔を介して形質転換させ、選別マーカーであるクロラムフェニコールが含有されたＬＢ（Luria-Bertani）平板培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ及びアガール１．５％）上に塗抹し、３７℃で一晩中培養した後、クロラムフェニコールに対する耐性を示す菌株を選別した。選別された菌株を直接テンプレートにして、配列番号３３及び３４のプライマーを利用して、同じ条件でＰＣＲを行った後、１．０％アガロースゲル上において、０．３０ｋｂサイズのＰＣＲ産物を獲得し、シーケンシングを介して、ｋｅｆＡの開始コドンがＡＴＧからＴＴＧに置換された菌株を最終的に選別した。それを、Ｗ３１１０−ＤｎａｄＣ＿ｋｅｆＡ＊（ＡＴＧ→ＴＴＧ）と命名した。
【００８４】
また、前記ｐＳＧ７６Ｃ＿ｋｅｆＡ＊（ＡＴＧ→ＴＴＧ）ベクターを利用して、同一方法で、ＭＧ１６５５−ΔｎａｄＣを形質転換させ、ｋｅｆＡの開始コドン置換を確認し、それを、ＭＧ１６５５−ΔｎａｄＣ＿ｋｅｆＡ＊（ＡＴＧ→ＴＴＧ）と命名した。
【００８５】
それぞれ形質転換された菌株のキノリン酸の生成能を比較するために、下記表４の菌株のクロラムフェニコール耐性を有する得られた単一コロニーを、２５ｍＬのキノリン酸力価培地（表１）に１白金耳ずつ接種し、３３℃で２５０ｒｐｍで、２４ないし７２時間培養した。培養液中のＨＰＬＣによるキノリン酸分析結果を、表４に示した。結果として、ｋｅｆＡ弱化菌株、すなわち、ｋｅｆＡの開始コドンが置換された菌株が生産したキノリン酸濃度が、対照群対比で１０％レベル上昇した。
【００８６】
【表４】
2019030314.tif 000005
【００８７】
実施例３．ｋｅｆＡ除去菌株ｋｅｆＡ及び強化菌株のキノリン酸敏感性の評価
３．１ キノリン酸生産菌株のキノリン酸に対する敏感性評価
前述のキノリン酸生産能評価結果を基に、ＫｅｆＡ除去が、外部のキノリン酸の細胞内部への再流入を弱化させ、キノリン酸の生産能が上昇したと予測した。それに基づいて、ｋｅｆＡ除去菌株とｋｅｆＡ強化菌株とのキノリン酸敏感性を評価した。
【００８８】
まず、生産菌株に生育低下を起こすように、ＫＯＨでＰＨ７．０で、適正な１３ｇ／Ｌキノリン酸添加有無による影響性を把握した。そのために、キノリン酸生産菌株の単一コロニーを、２５ｍＬのＬＢ＋１％グルコース（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、カナマイシン５０μｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌグルコース）液体培地に１白金耳ずつ接種し、３７℃で２５０ｒｐｍで、１６ないし２４時間培養し、ＯＤ６００、消耗糖及び残存キノリン酸を測定した。
【００８９】
【表５】
2019030314.tif 000006
【００９０】
前記の表５から分かるように、追加して培地にキノリン酸を添加した場合、細胞内部にキノリン酸が流入されながら、生育及び糖消耗速度が４０％レベル低下するということを確認した。
【００９１】
それにより、前記操作したｎａｄＣが欠損され、ｎａｄＢＡが強化された、Ｗ３１１０ΔｎａｄＣΔｋｅｆＡに対するｐＰｒｏ−ｎａｄＢ＿ｐＣＪ１−ｎａｄＡプラスミド導入菌株を、ブダペスト条約下で、２０１３年１１月０７日付けで、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１１４７０Ｐを受けた。
【００９２】
３．２ ｋｅｆＡ除去菌株ｋｅｆＡ及び強化菌株のキノリン酸に対する敏感性評価
（１）ＫｅｆＡタンパク質の過発現ベクター作製
大腸菌由来のｋｅｆＡ遺伝子を過発現するベクターを作製するために、テンプレートとしては、大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０菌株（ＡＴＣＣ Ｎｏ２３２５７）の染色体をテンプレートとして利用し、遺伝子配列は、米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）の配列番号１０の遺伝子塩基配列（ＮＣＢＩ登録番号「ＧＩ：：８９１０７８７２」）を活用した。ｋｅｆＡ遺伝子のＯＲＦ部分を増幅し、制限酵素認識部位ＥｃｏＲＶ及び制限酵素認識部位ＨｉｎｄＩＩＩを有する配列番号３６及び３７のプライマーを合成した。
【００９３】
前記大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、配列番号３６及び３７のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してＰＣＲを行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を使用し、ＰＣＲは、９６℃で３０秒変性、５０℃で３０秒アニーリング及び７２℃で２分の伸張で構成されたサイクルを３０回反復して行った。ＰＣＲを介して、ｋｅｆＡＯＲＦ遺伝子と、制限酵素ＥｃｏＲＶ及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位とを含んだ約３．３ｋｂの増幅された遺伝子を得た。
【００９４】
前記ＰＣＲを介して得られたｋｅｆＡ遺伝子は、アガロースゲル溶出（agarose gel elution）を介して回収した後、制限酵素ＥｃｏＲＶ及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理した。その後、制限酵素ＥｃｏＲＶ及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理したｐＣＬ１９２０＿ｐＲｈｔＢベクターに接合（ligation）した。それを介して、ｐＲｈｔＢプローモーターに連結されたｋｅｆＡ遺伝子から発現されるようにした。前記の方法によって作製されたベクターを、ｐＣＬ＿ｐＲｈｔＢ−ｋｅｆＡベクターと命名した。
【００９５】
（２）ＫｅｆＡ除去菌株、及びＫｅｆＡ強化菌株キノリン酸敏感性の評価
ＫｅｆＡ膜タンパク質が、キノリン酸流入に影響を及ぼすか否かということを把握するために、前記の２−４．（１）の方法と同一方法で、ｋｅｆＡ遺伝子の除去菌株と強化菌株とのキノリン酸敏感性評価を行った。
【００９６】
【表６】
2019030314.tif 000007
【００９７】
前記表６から分かるように、ＬＢ液体培地上でも、ｋｅｆＡ遺伝子を強化させた場合、キノリン酸生産菌株の生育及び糖消耗速度が、Ｗ３１１０−ΔｎａｄＣにｎａｄＢＡ遺伝子が強化された対照群菌株対比で４０％レベル顕著に低減し、キノリン酸生産も、全くないということを確認した。また、培地に追加してキノリン酸を添加した条件で、ｋｅｆＡ除去菌株の場合、対照群菌株対比で、生育及び糖消耗速度が１１０％レベル向上し、ｋｅｆＡ強化菌株は、対照群菌株対比で、生育及び糖消耗速度が５０％レベル低下した。
【００９８】
前記結果を介して、ＫｅｆＡ膜タンパク質が、細胞内部でキノリン酸流入に関与すると判断される。また、ｋｅｆＡ除去によって、キノリン酸生産菌株のキノリン酸に対する敏感性が低くなり、同時にキノリン酸生産増加までなされるということを確認した。
【受託番号】
【００９９】
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１４７０Ｐ
受託日付け：２０１３１１０７
2019030314.tif 000008
【配列表】
2019030314000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月12日(2018.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のタンパク質の活性が低下されるか、あるいは除去され、且つ親の微生物と比較してキノリン酸生産性が強化され、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性が低下されるか、あるいは除去された、キノリン酸を生産するエシェリキア属組み換え微生物。
【請求項２】
前記微生物は、アスパラギン酸酸化酵素及びキノリン酸シンターゼから成る群から選択された１以上の酵素の活性が追加して強化されるように変異されたことを特徴とする、請求項１記載のキノリン酸を生産するエシェリキア属組み換え微生物。
【請求項３】
前記キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、配列番号２９のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１記載のキノリン酸を生産するエシェリキア属組み換え微生物。
【請求項４】
前記アスパラギン酸酸化酵素は、配列番号３０のアミノ酸配列を有し、前記キノリン酸シンターゼは、配列番号３１のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項２記載のキノリン酸を生産するエシェリキア属組み換え微生物。
【請求項５】
前記微生物は、大腸菌であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載のキノリン酸を生産するエシェリキア属組み換え微生物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の組み換え微生物を培地で培養する段階と、
前記培地又は前記微生物からキノリン酸を回収する段階と、
を含む、キノリン酸を生産する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
前記課題を解決するために、また、前記組み換え微生物を培地で培養する段階と、前記培地または微生物からキノリン酸を回収する段階と、を含むキノリン酸を生産する方法が提供される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
本発明の他の様態は、前記キノリン酸を生産する組み換え微生物を培地で培養する段階と、前記培地または前記微生物からキノリン酸を回収する段階と、を含む、キノリン酸を生産する方法を提供する。
【外国語明細書】
2019030314000001.pdf