(57)【要約】      （修正有）【課題】ジンセノサイドの生産を増大するための組換え酵母及びそれを用いてジンセノサイドを生産する方法の提供を目的とする。【解決手段】ジンセノサイド生産能を有する酵母においてＣＰＲ５、ＰＤＩ１及びＥＲＯ１を過剰発現させることにより、ジンセノサイド生産能が向上した組換え酵母を提供する。更に該酵母の製造方法と、該酵母を用いたジンセノサイドの生産方法を開示する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質フォールディング（protein-folding）関与タンパク質の発現レベルが内在性発現レベルより増加した、ジンセノサイド又はその前駆体生産用組換え酵母。
【請求項２】
前記タンパク質フォールディング（protein-folding）関与タンパク質は、ＣＰＲ５、ＰＤＩ１及びＥＲＯ１からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の組換え酵母。
【請求項３】
前記ＣＰＲ５の遺伝子は配列番号１の塩基配列からなり、ＰＤＩ１の遺伝子は配列番号２の塩基配列からなり、ＥＲＯ１の遺伝子は配列番号３の塩基配列からなる、請求項２に記載の組換え酵母。
【請求項４】
前記酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）、サッカロマイセス・バヤヌス（S. bayanus）、サッカロマイセス・ブラウディ（S. boulardii）、サッカロマイセス・ブルデリ（S. bulderi）、サッカロマイセス・カリオカヌス（S. cariocanus）、サッカロマイセス・カリオカス（S. cariocus）、サッカロマイセス・チェバリエリ（S. chevalieri）、サッカロマイセス・ダイレネンシス（S. dairenensis）、サッカロマイセス・エリプソイデウス（S. ellipsoideus）、サッカロマイセス・ユーバヤヌス（S. eubayanus）、サッカロマイセス・エキシグス（S. exiguus）、サッカロマイセス・フロレンチヌス（S. florentinus）、サッカロマイセス・クルイベリ（S. kluyveri）、サッカロマイセス・マティニアエ（S. martiniae）、サッカロマイセス・モナセンシス（S. monacensis）、サッカロマイセス・ノルベンシス（S. norbensis）、サッカロマイセス・パラドキサス（S. paradoxus）、サッカロマイセス・パストリアヌス（S. pastorianus）、サッカロマイセス・スペンセロラム（S. spencerorum）、サッカロマイセス・トゥリセンシス（S. turicensis）、サッカロマイセス・ユニスポラス（S. unisporus）、サッカロマイセス・ウバラム（S. uvarum）、及びサッカロマイセス・ゾナタス（S. zonatus）からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え酵母。
【請求項５】
前記酵母は、さらにジンセノサイド合成に関与する遺伝子の発現が内在性発現レベルより増加した、請求項１に記載の組換え酵母。
【請求項６】
前記遺伝子は、ＰｇＤＤＳ（Panax ginseng, dammarenediol-II synthase）、ＰｇＰＰＤＳ（Panax ginseng cytochrome P450 CYP716A47）、ＰｇＣＰＲ（Panax ginseng, NADPH-cytochrome P450 reductase）、ｔＨＭＧ１（S. cerevisiae HMG-CoA reductase）及びＰｇＳＥ（Panax ginseng, squalene epoxidase）からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子である、請求項５に記載の組換え酵母。
【請求項７】
前記前駆体は、スクアレン又は２，３−オキシドスクアレンである、請求項１に記載の組換え酵母。
【請求項８】
ジンセノサイド生産酵母菌株のタンパク質フォールディング（protein-folding）関与タンパク質の発現レベルを内在性発現レベルより増加させるステップを含む、ジンセノサイド生産能が向上した組換え酵母の製造方法。
【請求項９】
タンパク質フォールディング（protein-folding）関与タンパク質は、ＣＰＲ５、ＰＤＩ１及びＥＲＯ１からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項８に記載の組換え酵母の製造方法。
【請求項１０】
前記ジンセノサイド生産酵母菌株は、ＰｇＤＤＳ（Panax ginseng, dammarenediol-II synthase）、ＰｇＰＰＤＳ（Panax ginseng cytochrome P450 CYP716A47）、ＰｇＣＰＲ（Panax ginseng, NADPH-cytochrome P450 reductase）、ｔＨＭＧ１（S. cerevisiae HMG-CoA reductase）及びＰｇＳＥ（Panax ginseng, squalene epoxidase）からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが内在性発現レベルより増加した、請求項８に記載の組換え酵母の製造方法。
【請求項１１】
ジンセノサイド前駆体生産酵母菌株のタンパク質フォールディング（protein-folding）関与タンパク質の発現レベルを内在性発現レベルより増加させるステップを含む、ジンセノサイド前駆体生産能が向上した組換え酵母の製造方法。
【請求項１２】
前記ジンセノサイド前駆体は、スクアレン及び２，３−オキシドスクアレンを含む、請求項１１に記載の組換え酵母の製造方法。
【請求項１３】
タンパク質フォールディング（protein-folding）関与タンパク質は、ＣＰＲ５、ＰＤＩ１及びＥＲＯ１からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１１に記載の組換え酵母の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え酵母を培養するステップを含む、ジンセノサイド又はその前駆体の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジンセノサイドの生産を増大するための組換え酵母及びそれを用いてジンセノサイドを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サポニンとは、植物界に広く存在する配糖体において糖でない部分が様々な環式化合物からなる物質を意味する。高麗人参又は紅参に主要生理活性成分として含まれるサポニン成分であるトリテルペンサポニン（triterpene saponin）は、他の植物において見られるサポニンとは化学構造が異なるので、この高麗人参サポニンを他の植物系サポニンと区別するために、高麗人参（Ginseng）配糖体（Glycoside）という意味でジンセノサイド（Ginsenoside）と呼ぶ。
【０００３】
ジンセノサイドは、アグリコン（aglycone）の構造によってプロトパナキサジオール系（Protopanaxadiol-type, ＰＰＤタイプ）ジンセノサイド、プロトパナキサトリオール系（Protopanaxatriol-type, ＰＰＴタイプ）ジンセノサイド、及びオレアノール酸系（Oleanolic acidタイプ）ジンセノサイドの３種類に分類される。これら３つのグループは、さらに化合物構造中の環の３位の炭素、６位の炭素及び２０位の炭素位置にグリコシド結合（glycosicid bond）により付着する糖部分（アグリコン）（sugar moieties（aglycones））の位置及び数によって分類される。オレアノール酸系ジンセノサイドの基本骨格は５環性であり、それには唯一ジンセノサイドＲｏが含まれ、そのアグリコンはオレアノール酸（oleanolic acid）である。現在、４０種以上のジンセノサイドが分離されており、それらのほとんどはＰＰＤタイプのジンセノサイドである。ＰＰＤタイプのジンセノサイドには、Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｃ、Ｒｄ、ギペノシドＸＶＩＩ（Gypenoside XVII）、化合物Ｏ（Compound O）、化合物Ｍｃ１（Compound Mc1）、Ｆ２、化合物Ｙ（Compound Y）、化合物Ｍｃ（Compound Mc）、Ｒｇ３、Ｒｈ２、ＣＫが含まれる。ＰＰＴタイプのジンセノサイドには、Ｒｅ、Ｒｇ１、Ｒｆ、Ｒｇ２、Ｒｈ１などが含まれる。
【０００４】
高麗人参の代表的な薬理効果はジンセノサイドにより現れることが知られており、現在まで約３０種の様々なジンセノサイドが高麗人参及び高麗人参加工品から分離されており（Shibata, 2001）、抗糖尿活性、抗炎症作用、老化防止作用、抗癌作用など各種薬理作用を有することが報告されている。また、ジンセノサイド以外の他の生理活性成分としてフェノール性成分、ポリアセチレン、アルカロイド、多糖体などが知られている。フェノール性成分は老化抑制の有効成分として１０種以上の抗酸化性、フェノール性物質が開示されており、これらは高血圧抑制、抗癌、抗酸化、美白活性などの生理活性としても知られている。最近の研究結果では、様々なストレスに対して非特異的に肉体的、精神的安定状態を維持する抗ストレス効果があるとされている（Leeら, 2008）。
【０００５】
全世界で高麗人参を商業的に栽培している国は、韓国、中国、日本、米国、カナダ、ヨーロッパ諸国などである。１９８０年末までは全世界の高麗人参の約４６％を韓国が生産していたが、１９９０年代になって３９％程度に占有率が減少し、中国が５０％以上、米国とカナダの花旗参が１０％を占めるようになり、最近ではその占有率がさらに減少している現状である。最も大きな理由として、韓国の高麗人参は薬効において非常に優れていることが知られているが、価格競争力においては非常に脆弱な面があることが挙げられる。よって、韓国の高麗人参の特性や長所は非常に多いものの、現在の急変する世界情勢やＷＴＯ、国家間のバイオ産業への重点投資、経済危機などに噛み合った高麗人参製品の国際競争力の向上のための努力が切実に求められている現況である。
【０００６】
高麗人参の薬理学的な研究結果は高麗人参のサポニン成分であるジンセノサイドに対する関心を増大させ、それらの大量生産の必要性が高まっているが、一般の耕作方法により高麗人参の有用物質を大量生産するには、４〜６年の長い栽培期間、遮光栽培による病虫害防除の難しさ、輪作栽培などの問題があるので、新たな代替生産方法の開発が切実に求められている。
【０００７】
近年、生命工学技術に基づいて高麗人参のサポニン関連遺伝子が大量に発見されるにつれ、それらの遺伝子を用いてジンセノサイドを酵母から大量生産するための技術開発も注目を集めてきている。ジンセノサイドは植物体においてメバロン酸生合成経路を含むイソプレノイド合成経路により生合成（Cristensen, 2008）されるので、酵母のエルゴステロール生合成経路を再設計することによりジンセノサイド生産菌株を開発する合成生物学研究が行われている。近年、中国のＨｕａｎｇとＺｈａｎｇの共同研究チームが高麗人参のプロトパナキサジオールダンマレンジオールＩＩシンターゼ（protopanaxadiol dammarenediol-II synthase）、プロトパナキサジオールシンターゼ（protopanaxadiol synthase）遺伝子をシロイヌナズナから確保したＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼ（NADPH-cytochrome P450 reductase）遺伝子と共に酵母サッカロマイセス・セレビシエに発現させることによりプロトパナキサジオールを生産するのに成功したことを報告した。彼らは、スクアレン及び２，３−オキシドスクアレン（2,3-oxidosqualen）供給を増大させるために、Ｎ末端ＨＭＧ遺伝子ｔＨＭＧ１を過剰発現させ、ＦＰＰシンターゼ遺伝子（ＥＲＧ２０）、スクアレンシンターゼ遺伝子（ＥＦＧ９）、２，３−オキシドスクアレンシンターゼ遺伝子（ＥＲＧ１）も同時に過剰発現させることによりプロトパナキサジオール生産に必要な前駆体供給を増大させた。また、酵母コドンに合わせてプロトパナキサジオール合成遺伝子を合成することによりさらにプロトパナキサジオール変換効率を高め、最終的にウリジンジホスフェートグリコシルトランスフェラーゼ（uridin diphosphate glycosyl-transferase）遺伝子を導入することによりジンセノサイド生合成経路を完成した（Dai et al., 2013）。今後、さらなる最適化作業により、ジンセノサイド生産合成酵母は植物体から抽出する複雑な工程過程を代替する経済的な生産工程を提供するものと期待されている。
【０００８】
こうした背景の下、本発明者らは、酵母を用いたジンセノサイド生産量を増大させるために鋭意研究を重ねた結果、ジンセノサイド生産酵母のタンパク質フォールディングに関与するタンパク質の発現が増加した組換え酵母及び前記酵母の製造方法を開発し、前記組換え酵母は従来のジンセノサイド生産能を有する酵母よりジンセノサイド生合成の中間産物であるプロトパナキサジオールの生産量が増加することを確認し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
【非特許文献２】F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York
【非特許文献３】Ju Young Lee, Chang Duk Kang, Seung Hyun Lee, Young Kyoung Park and Kwang Myung Cho (2015) Engineering cellular redox balance in Saccharomyces cerevisiae for improved production of L-lactic acid. Biotechnol. Bioeng., 112, 751-758.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ジンセノサイド又はその前駆体生産用組換え酵母を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、前記組換え酵母を製造する方法を提供することを目的とする。
【００１２】
さらに、本発明は、前記組換え酵母を用いてジンセノサイド又はその前駆体を高収率で生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
以下、これらを具体的に説明する。一方、本発明で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本発明で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、下記の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。
【００１４】
本発明の目的を達成するための本発明の一態様は、タンパク質フォールディング関与タンパク質の発現レベルが内在性発現レベルより増加した、ジンセノサイド又はその前駆体生産用組換え酵母を提供する。
【００１５】
本発明における「タンパク質フォールディング（Protein folding）」とは、線形のアミノ酸複合体であるタンパク質が固有の折り畳まれた構造（folded structure又はnative structure）を作る過程を意味する。前記タンパク質フォールディングが正常に行われないと、正常にフォールディングされていないタンパク質が蓄積され、それにより小胞体ストレスが誘導されることがある。前記ストレスを解決するためにアンフォールディングタンパク質反応（Unfolded protein response: UPR）が起こる。
【００１６】
前記アンフォールディングタンパク質反応は、１）小胞体のタンパク質フォールディング能力の増加、２）タンパク質の流入減少、３）アンフォールディングタンパク質の分解などを含むものであり、前記反応により小胞体内のアンフォールディングタンパク質を減少させることができる。よって、アンフォールディングタンパク質反応も減少する。
【００１７】
本発明は、タンパク質のフォールディングに関与するタンパク質の発現レベルを増加させることにより、小胞体のタンパク質フォールディング能力を増加させてアンフォールディングタンパク質反応を減少させ、その結果ジンセノサイド又はその前駆体の生産を増大させることを特徴とする。
【００１８】
具体的には、タンパク質フォールディングに関与するタンパク質はシャペロン（Chaperone）タンパク質である。
【００１９】
前記「シャペロン（Chaperone）タンパク質」とは、細胞内のタンパク質フォールディングを援助するタンパク質であり、シャペロンタンパク質のほとんどは熱を受けるか、ストレスを受けると発現するが、一般の条件下でも発現して必要とする機能を果たすことができる。前記シャペロンタンパク質は、アンフォールディングタンパク質又はミスフォールディングタンパク質を認識するのが一般的である。細胞内には様々なタンパク質が存在し、前記タンパク質のフォールディング条件も異なるため、様々なタイプのシャペロンタンパク質が存在する。
【００２０】
本発明の実施例において、タンパク質のフォールディングに関与するシャペロンタンパク質の内在性発現レベルが増加するに伴ってスクアレン、２，３−オキシドスクアレン及びプロトパナキサジオールの生産量が増加することを示し（実施例３）、タンパク質フォールディング機構の改良によりジンセノサイド及びその前駆体の生産が増大することが確認された。
【００２１】
具体的には、前記タンパク質のフォールディングに関与するシャペロンタンパク質には、ＣＰＲ５、ＰＤＩ１、ＥＲＯ１、ＫＡＲ２、ＪＥＭ１、ＬＨＳ１、ＨＳＰ８２、ＹＤＪ１、ＳＳＡ２、ＳＳＢ１、ＧＥＴ３、ＳＣＪ１、ＦＰＲ２、ＭＰＤ１などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
本発明の一具体例において、前記タンパク質フォールディング（protein-foldeing）関与タンパク質は、ＣＰＲ５、ＰＤＩ１及びＥＲＯ１からなる群から選択される少なくとも１つである組換え酵母を提供する。
【００２３】
本発明における「ＣＰＲ５（Cyclosporin-sensitive Proline Rotamase 5）」とは、ＥＲのペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ（Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase）であり、プロリン残基にＮ末端ペプチド結合のシス−トランス異性化を触媒する。また、ＣＰＲ５は、ＥＲにおいてＵＰＲにより転写的に誘導される。ＣＰＲ５は、タンパク質フォールディングに関与するシャペロンの１つであり、ＥＲにおいてアンフォールディングタンパク質が蓄積されると発現量が増加してタンパク質フォールディングを誘導する。ＣＰＲ５はアナログとしてＣＰＲ２を有する。
【００２４】
前記ＣＰＲ５及びそれをコードする遺伝子情報は米国国立保健研究所のＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースから得られ、例えば前記ＣＰＲ５遺伝子は配列番号１の塩基配列を有するが、これに限定されるものではない。
【００２５】
また、前記ＣＰＲ５をコードする遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列だけでなく、前記配列と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９９％以上の相同性を示す塩基配列であって実質的に前記転写因子と同一又は相当する効能を示す転写因子をコードする遺伝子配列であれば制限はない。さらに、このような相同性を有する塩基配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加された塩基配列も本発明に含まれることは言うまでもない。
【００２６】
本発明における「ＰＤＩ１（Protein Disulfide Isomerase 1）」とは、ＥＲルーメンの多機能酸化レダクターゼであり、非天然ジスルフィド結合を架け替え、分泌及び細胞表面タンパク質におけるジスルフィド結合に必須である。また、ＭＮＬ１（Manoseidase-like protein 1）と複合体を形成し、アンフォールディングタンパク質に結合されたＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖をＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２で処理し、アンフォールディングタンパク質を除去するＥＲＡＤ（Endoplasmic-reticulum-associated protein degradation）を促進する。ＰＤＩ１はアナログとしてＥＵＧ１を有する。
【００２７】
前記ＰＤＩ１及びそれをコードする遺伝子情報は米国国立保健研究所のＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースから得られ、例えば前記ＰＤＩ１遺伝子は配列番号２の塩基配列を有するが、これに限定されるものではない。
【００２８】
また、前記ＰＤＩ１をコードする遺伝子は、配列番号２で表される塩基配列だけでなく、前記配列と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９９％以上の相同性を示す塩基配列であって実質的に前記転写因子と同一又は相当する効能を示す転写因子をコードする遺伝子配列であれば制限はない。さらに、このような相同性を有する塩基配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加された塩基配列も本発明に含まれることは言うまでもない。
【００２９】
本発明における「ＥＲＯ１（ER Oxidation or Endoplasmic Reticulum Oxidoreductin）」とは、ＥＲにおいて酸化性タンパク質フォールディングのために要求されるチオール酸化酵素であり、調節結合の還元及び酸化により調節されたフィードバックでＥＲ酸化還元の均衡を維持する上で必須の酵素である。また、還元されたＰｄｉ１ｐは、Ｅｒｏ１ｐ調節結合の直接還元によりＥｒｏ１ｐを活性化する。チオール基質の欠乏及び酸化されたＰｄｉ１ｐの蓄積は、Ｐｄｉ１ｐにより媒介された酸化及びＥｒｏ１ｐ調節結合の自発酸化によりＥｒｏ１ｐを不活性化する。
【００３０】
前記ＥＲＯ１及びそれをコードする遺伝子情報は米国国立保健研究所のＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースから得られ、例えば前記ＥＲＯ１遺伝子は配列番号３の塩基配列を有するが、これに限定されるものではない。
【００３１】
また、前記ＥＲＯ１をコードする遺伝子は、配列番号３で表される塩基配列だけでなく、前記配列と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９９％以上の相同性を示す塩基配列であって実質的に前記転写因子と同一又は相当する効能を示す転写因子をコードする遺伝子配列であれば制限はない。さらに、このような相同性を有する塩基配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加された塩基配列も本発明に含まれることは言うまでもない。
【００３２】
前記「相同性」とは、与えられたアミノ酸配列又は塩基配列に一致する程度を意味し、百分率で表される。本発明において、与えられたアミノ酸配列又は塩基配列と同一又は類似の活性を有するその相同性配列は「％の相同性」と表される。例えば、スコア（score）、同一性（identity）、類似度（similarity）などのパラメーター（parameter）を計算する標準ソフトウェア、具体的にはＢＬＡＳＴ ２．０を用いるか、定義されたストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、非特許文献１、２）で決定されてもよい。
【００３３】
本発明における「内在性発現レベル」とは、微生物が天然の状態又は当該遺伝子の発現レベルを改変する前の母菌株において発現するｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルを意味する。これは、本質的に菌株などの細胞や組織などにおいて正常な状況又は特定遺伝子の発現を調節する前の状況で与えられたｍＲＮＡ又はタンパク質を生産する程度である。内在性発現レベルは、菌株の種類、細胞のタイプ及び組織間で比較されてもよく、一部の刺激により誘発された発現レベルと比較されてもよい。具体的には、タンパク質フォールディング関与タンパク質の発現を調節していない微生物において発現するｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルであってもよい。
【００３４】
本発明における「発現レベルが内在性発現レベルより増加」とは、当該ポリペプチドをコードする遺伝子が自然の状態又は改変前の状態より多く発現し、機能性を有する当該ポリペプチドを多く生産することを意味する。
【００３５】
具体的には、本発明におけるＣＰＲ５、ＰＤＩ１及びＥＲＯ１の発現レベルの増加は、１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、２）前記ポリヌクレオチドの発現を増加させる発現調節配列の改変、３）前記タンパク質の活性を強化する染色体上のポリヌクレオチド配列の改変、４）それらの組み合わせにより強化する改変などにより行われるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
前記１）ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれらに限定されるものではないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることにより行われる。具体的には、本発明の酵素をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターが宿主細胞内に導入されることにより行われるか、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターが宿主細胞内に導入されることにより前記宿主細胞の染色体内の前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加する方法で行われる。
【００３７】
本発明における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
【００３８】
本発明に用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当業界で公知の任意のベクターを用いることができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミドとして複製起点、プロモーター及びターミネーターが挙げられる。前記複製起点は、酵母自己複製配列（autonomous replication sequence, ARS）を含んでもよい。前記酵母自己複製配列は、酵母動原体配列（centrometric sequence, CEN）により安定化される。前記プロモーターは、ＣＹＣプロモーター、ＴＥＦプロモーター、ＧＰＤプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどからなる群から選択されてもよい。前記ターミネーターは、ＰＧＫ１、ＣＹＣ１、ＧＡＬ１などからなる群から選択されてもよい。前記ベクターは、選択マーカーをさらに含んでもよい。
【００３９】
このように細胞内染色体導入用ベクターにより、染色体内に標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異したポリヌクレオチドに置換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への導入は、当業界で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００４０】
本発明における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、それら全てを含むものである。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含むことができる。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００４１】
また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本発明の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されたものを意味する。
【００４２】
次に、２）ポリヌクレオチドの発現を増加させる発現調節配列の改変は、特にこれらに限定されるものではないが、前記発現調節配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より強い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれてもよい。
【００４３】
前記ポリヌクレオチド発現単位の上流には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されうるが、前記強力なプロモーターの例としては、ＧＰＤプロモーター、ＴＥＦプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＣＣＷ１２、ＧＡＬプロモーター、ＰＧＫプロモーターなどが挙げられ、より具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ由来のプロモーターであるＰＧＫ１プロモーターに作動可能に連結されることにより、前記酵素をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
また、３）染色体上のポリヌクレオチド配列の改変は、特にこれらに限定されるものではないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。
【００４５】
本発明の一実施例においては、ＣＰＲ５、ＰＤＩ１又はＥＲＯ１の過剰発現を誘導するために、前記遺伝子のプロモーターを高発現構成的プロモーターであるＰＧＫ１プロモーターに置換するためのＰＧＫ１プロモーター置換ベクターを作製し、前記ベクターを用いて作製した置換カセットをＰＰＤ酵母変異株に形質導入することにより、ＣＰＲ５、ＰＤＩ１又はＥＲＯ１過剰発現組換え酵母を作製した（実施例２）。
【００４６】
具体的な一実施例によれば、前記組換え酵母を用いてジンセノサイド生合成の中間産物であるスクアレン、２，３−オキシドスクアレン及びプロトパナキサジオールの生産量を対照群と比較して測定した結果、ＣＰＲ５、ＰＤＩ１又はＥＲＯ１が過剰発現した組換え酵母の全てにおいて対照群と比較して生産量が増加することが確認され、特にＣＰＲ５又はＥＲＯ１過剰発現組換え酵母において生産量が最も大きく増加することが確認された（実施例３、表３、表４及び図４）。
【００４７】
本発明の組換え酵母は、ジンセノサイド、スクアレン及び２，３−オキシドスクアレンの生産量を増加させることができる。
【００４８】
本発明における「ジンセノサイド生産用組換え酵母」とは、自然にジンセノサイド生産能を有する酵母、又はジンセノサイドの生産能のない母菌株にジンセノサイドの生産能が付与された酵母を意味する。
【００４９】
本発明における「ジンセノサイド（ginsenoside）」とは、高麗人参由来のダンマラン（dammarane）系サポニン又はその誘導体を意味するが、他の植物で見出されるサポニンとは異なる特異な化学構造を有する。前記ジンセノサイドは、特にこれらに限定されるものではないが、一例として、ＰＰＤ（protopanaxadiol）系のジンセノサイド、ＰＰＴ（protopanaxatriol）系のジンセノサイドなどが挙げられ、他の例として、ＰＰＤ、ＰＰＴ、Ｒａ３、Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｇ１、Ｒｇ２、Ｒｇ３、Ｒｈ１、Ｒｈ２、Ｒｓ１、Ｃ−Ｏ、Ｃ−Ｙ、Ｃ−Ｍｃ１、Ｃ−Ｍｃ、Ｆ１、Ｆ２、コンパウンドＫ（compound K）、ジペノサイドＸＶＩＩ（Gypenoside XVII）、ジペノサイドＬＸＸＶ（Gypenoside LXXV）、Ｒｓ２、ＰＰＤ、Ｒｅ、Ｒｇ１、Ｒｆ、Ｆ１、Ｒｇ２、ＰＰＴ、Ｒｈ１などの単独又は混合物が挙げられ、さらに他の例として、ＰＰＤ、ＰＰＴ、コンパウンドＫ（compound K）、Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｆ１、Ｆ２、Ｒｇ１、Ｒｇ２、Ｒｇ３、Ｒｈ１、Ｒｈ２などの単独又は混合物が挙げられる。具体的には、プロトパナキサジオール系ジンセノサイドである。
【００５０】
本発明における「ジンセノサイド前駆体生産用組換え酵母」とは、自然にジンセノサイド前駆体生産能を有する酵母、又はジンセノサイド前駆体の生産能のない母菌株にジンセノサイド前駆体の生産能が付与された酵母を意味する。
【００５１】
本発明における「ジンセノサイド前駆体」とは、ジンセノサイド生合成代謝過程の中間生成物である。ジンセノサイド生合成は、メバロン酸代謝経路でイソペンテニル二リン酸及びジメチルアリル二リン酸が生産され、これらはスクアレン及びスクアレンが酸化した２，３−オキシドスクアレンに変形される。２，３−オキシドスクアレンの環化によりダンマレンジオールＩＩが生成され、これは様々なジンセノサイドに合成される。ジンセノサイド前駆体には、これら全ての中間生成物が含まれる。また、この前駆体により生成される他の系列のサポニンなども含まれてもよい。これには、さらにβ−アミリン（β-amyrin）又はオレアネート（Oleanate）が含まれてもよい。
【００５２】
具体的には、ジンセノサイド前駆体生産用組換え酵母はスクアレン又は２，３−オキシドスクアレンを生産することができる。
【００５３】
本発明の一具体例において、前記ジンセノサイド前駆体はスクアレン及び２，３−オキシドスクアレンを含む組換え酵母を提供する。
【００５４】
本発明における「スクアレン」とは、一種のイソプレノイド又はテルペノイド系化合物に属し、６個の二重結合を有する多価不飽和脂肪であり、Ｃ３０Ｈ５０の化学式を有する。スクアレンは、ジンセノサイド生合成の中間生産物であり、メバロン酸経路により生産される。また、体内で強力な抗酸化作用を示すと共に、ステロイドホルモンやビタミンＤ、胆汁酸、細胞膜の構成成分であるコレステロールの生合成にも用いられ、新型インフルエンザなどのワクチン免疫補助剤としても用いられる。
【００５５】
本発明における「２，３−オキシドスクアレン」とは、ジンセノサイドを含むサポニンだけでなく、細胞膜ステロールの前駆体であるラノステロールとシクロアルテノールの合成前駆体でもある。これは、スクアレンがスクアレンエポキシダーゼにより酸化されて生産される。
【００５６】
前記酵母は、サッカロマイセス（Saccharomyces）、ジゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）、ピキア（Pichia）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、カンジダ（Candida）、シゾサッカロマイセス（Shizosaccharomyces）、イッサチェンキア（Issachenkia）、ヤロウィア（Yarrowia）又はハンゼヌラ（Hansenula）に属する菌株であってもよい。
【００５７】
サッカロマイセスに属する菌株は、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）、サッカロマイセス・バヤヌス（S. bayanus）、サッカロマイセス・ブラウディ（S. boulardii）、サッカロマイセス・ブルデリ（S. bulderi）、サッカロマイセス・カリオカヌス（S. cariocanus）、サッカロマイセス・カリオカス（S. cariocus）、サッカロマイセス・チェバリエリ（S. chevalieri）、サッカロマイセス・ダイレネンシス（S. dairenensis）、サッカロマイセス・エリプソイデウス（S. ellipsoideus）、サッカロマイセス・ユーバヤヌス（S. eubayanus）、サッカロマイセス・エキシグス（S. exiguus）、サッカロマイセス・フロレンチヌス（S. florentinus）、サッカロマイセス・クルイベリ（S. kluyveri）、サッカロマイセス・マティニアエ（S. martiniae）、サッカロマイセス・モナセンシス（S. monacensis）、サッカロマイセス・ノルベンシス（S. norbensis）、サッカロマイセス・パラドキサス（S. paradoxus）、サッカロマイセス・パストリアヌス（S. pastorianus）、サッカロマイセス・スペンセロラム（S. spencerorum）、サッカロマイセス・トゥリセンシス（S. turicensis）、サッカロマイセス・ユニスポラス（S. unisporus）、サッカロマイセス・ウバラム（S. uvarum）、又はサッカロマイセス・ゾナタス（S. zonatus）であってもよい。
【００５８】
本発明の一具体例において、前記酵母はサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae: S. cerevisiae）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００５９】
一般に、前記サッカロマイセス・セレビシエは、様々な発酵過程に用いられる酵母菌の一種として知られており、糖分をエタノールに変換する活性を有することが知られている。
【００６０】
前記ジンセノサイドを生産する酵母は、特にこれらに限定されるものではないが、ジンセノサイド生合成に必須の前駆体であるスクアレンの生合成の増大のためのメバロン酸代謝経路を強化するために、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（HMG-CoA reductase; tHMG1）、及びスクアレンを２，３−オキシドスクアレンに変換する高麗人参由来スクアレンエポキシダーゼ（Panax ginseng, squalene epoxidase; PgSE）の活性を内在性活性より増加させるように改変し、ジンセノサイド生合成代謝経路を導入するために、２，３−オキシドスクアレンをダンマレンジオールＩＩに変換する高麗人参由来ダンマレンジオールＩＩシンターゼ（Panax ginseng, dammarenediol-II synthase; PgDDS）、ダンマレンジオールＩＩをプロトパナキサジオールに変換する高麗人参由来シトクロムＰ４５０ ＣＹＰ７１６Ａ４７（Panax ginseng cytochrome P450 CYP716A47; PgPPDS）、及び高麗人参由来ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼ（Panax ginseng NADPH-cytochrome P450 reductase; PgCPR）の活性を導入するように改変されたものであってもよい。
【００６１】
本発明の他の具体例において、前記酵母は、さらにジンセノサイド合成に関与する遺伝子の発現が内在性発現レベルより増加した組換え酵母を提供する。
【００６２】
本発明のさらに他の具体例において、前記遺伝子はＰｇＤＤＳ（Panax ginseng, dammarenediol-II synthase）、ＰｇＰＰＤＳ（Panax ginseng cytochrome P450 CYP716A47）、ＰｇＣＰＲ（Panax ginseng, NADPH-cytochrome P450 reductase）、ｔＨＭＧ１（S. cerevisiae HMG-CoA reductase）及びＰｇＳＥ（Panax ginseng, squalene epoxidase）からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子である組換え酵母を提供する。
【００６３】
本発明の一実施例においては、ジンセノサイド生合成代謝経路に関する酵素は形質転換により導入し、メバロン酸代謝経路に関する酵素は高発現構成的プロモーターであるＧＰＤ１（ＴＤＨ３）プロモーターから転写されて内在性発現より増加して発現するようにした（実施例１）。
【００６４】
ここで、前記ジンセノサイド生合成代謝経路に関する酵素には、それぞれ配列番号４〜８のアミノ酸配列、又はそれと７０％以上、より具体的には８０％以上、さらに具体的には９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列が含まれてもよい。
【００６５】
本発明の他の態様は、ジンセノサイド生産酵母菌株のタンパク質フォールディング関与タンパク質の発現レベルを内在性発現レベルより増加させるステップを含む、ジンセノサイド生産能が向上した組換え酵母の製造方法を提供する。
【００６６】
本発明の一具体例において、ＣＰＲ５、ＰＤＩ１、ＥＲＯ１からなる群から選択される少なくとも１つの前記タンパク質フォールディング関与タンパク質の発現レベルを内在性発現レベルより増加させる、組換え酵母の製造方法を提供する。
【００６７】
前記ジンセノサイド生産酵母菌株、タンパク質フォールディング関与タンパク質、ＣＰＲ５、ＰＤＩ１、ＥＲＯ１、内在性発現レベルなどについては前述した通りである。
【００６８】
本発明の他の具体例において、前記ジンセノサイド生産酵母菌株は、ＰｇＤＤＳ（Panax ginseng, dammarenediol-II synthase）、ＰｇＰＰＤＳ（Panax ginseng cytochrome P450 CYP716A47）、ＰｇＣＰＲ（Panax ginseng, NADPH-cytochrome P450 reductase）、ｔＨＭＧ１（S. cerevisiae HMG-CoA reductase）及びＰｇＳＥ（Panax ginseng, squalene epoxidase）からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが内在性発現レベルより増加したものである。
【００６９】
本発明のさらに他の態様は、ジンセノサイド前駆体生産酵母菌株のタンパク質フォールディング関与タンパク質の発現レベルを内在性発現レベルより増加させるステップを含む、ジンセノサイド前駆体生産能が向上した組換え酵母の製造方法を提供する。
【００７０】
本発明の一具体例において、前記ジンセノサイド前駆体は、スクアレン及び２，３−オキシドスクアレンを含む、組換え酵母の製造方法を提供する。
【００７１】
本発明の他の具体例において、ＣＰＲ５、ＰＤＩ１、ＥＲＯ１からなる群から選択される少なくとも１つの前記タンパク質フォールディング関与タンパク質の発現レベルを内在性発現レベルより増加させる、組換え酵母の製造方法を提供する。
【００７２】
前記タンパク質フォールディング関与タンパク質、ＣＰＲ５、ＰＤＩ１、ＥＲＯ１、内在性発現レベルなどについては前述した通りである。
【００７３】
本発明のさらに他の態様は、前記組換え酵母を培養するステップを含む、ジンセノサイド又はその前駆体の生産方法を提供する。
【００７４】
前記方法において、前記酵母を培養するステップは、特にこれらに限定されるものではないが、公知の回分培養法、連続培養法、流加培養法などにより行われる。ここで、培養条件は、特にこれらに限定されるものではないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア）又は酸性化合物（例えば、リン酸又は硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的にはｐＨ６〜８、最も具体的にはｐＨ６．８）に調節してもよく、酸素又は酸素含有ガス混合物を培養物に導入して好気性条件を維持してもよい。培養温度は２０〜４５℃、具体的には２５〜４０℃に維持してもよく、約１０〜１６０時間培養してもよい。前記培養により生産されたジンセノサイドは、培地中に分泌されるか、細胞内に残留してもよい。
【００７５】
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源として糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセリン及びエタノール）、有機酸（例えば、酢酸）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及びウレア）、無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、それらに相当するナトリウム含有塩などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではなく、その他金属塩（例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長促進物質を含んでもよい。
【００７６】
前記方法は、生産されたジンセノサイドを回収するステップをさらに含んでもよい。この回収ステップは培養された細胞又はその上清から回収するステップであってもよく、当業者が回収に好適な過程を選択することができる。
【００７７】
本発明の前記培養ステップで生産されたジンセノサイドを回収する方法は、培養法、例えば回分、連続、流加培養法などにより当該分野で公知の好適な方法を用いて培養液から目的とする生産物を回収することができる。
【発明の効果】
【００７８】
本発明のジンセノサイド生産性が向上した組換え酵母は、配列番号１の塩基配列を有するＣＰＲ５、配列番号２の塩基配列を有するＰＤＩ１、又は配列番号３の塩基配列を有するＥＲＯ１からなる群から選択される少なくとも１つの発現レベルが内在性発現レベルより増加するように改変されてジンセノサイド生産能が強化されるので、ジンセノサイド生産に効果的に活用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】タンパク質フォールディングの改良によるジンセノサイド生産量の増加について簡単に説明する図である。
【図２】ジンセノサイド生合成代謝経路を示す図である。
【図３】ＣＰＲ５、ＰＤＩ１又はＥＲＯ１遺伝子を過剰発現するために作製されたベクターであるｐＵＣ５７−ＵＲＡ３ＨＡ−ＰＧＫ１のベクターマップを示す図である。
【図４】ＣＰＲ５、ＰＤＩ１又はＥＲＯ１が過剰発現した場合における、対照群と比較したスクアレン、２，３−オキシドスクアレン及びプロトパナキサジオールの生産量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
以下、実施例及び実験例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例及び実験例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明がこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００８１】
ＰＰＤ酵母変異株の作製
本発明の酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae: S. cerevisiae）ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ野生型菌株［(MATα ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3△ 1; MAL2-8; SUC2), EUROSCARF accession number: 30000B］に、ジンセノサイド生合成代謝経路を導入し、ジンセノサイド生合成に必須の前駆体であるスクアレン（squalene）の生合成を増大させるためにメバロン酸代謝経路を強化することにより、プロトパナキサジオール（protopanaxadiol; PPD）を生産する酵母菌株を作製し、前記酵母菌株をＰＰＤ酵母変異株と命名した。
【００８２】
ＰＰＤ菌株の遺伝子型は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ Δｔｒｐ１：：ＰＧＰＤ１ ｔＨＭＧ１ ＋ ＰＧＰＤ１ ＰｇＳＥ ＋ Δｌｅｕ２：：ＰＧＰＤ１ ＰｇＤＤＳ ＋ ＰＧＰＤ１ ＰｇＰＰＤＳ ＋ ＰＧＰＤ１ ＰｇＣＰＲである。ジンセノサイド生合成酵素であるＰｇＤＤＳ（Panax ginseng, dammarenediol-II synthase, 配列番号４）、ＰｇＰＰＤＳ（Panax ginseng cytochrome P450 CYP716A47, 配列番号５）、及びＰｇＣＰＲ（Panax ginseng, NADPH-cytochrome P450 reductase, 配列番号６）と、メバロン酸代謝経路を強化するための代謝経路の酵素であるｔＨＭＧ１（S.cerevisiae HMG-CoA reductase, 配列番号７）及びＰｇＳＥ（Panax ginseng, squalene epoxidase, 配列番号８）をコードする遺伝子をそれぞれ高発現構成的プロモーターであるＧＰＤ１（ＴＤＨ３）プロモーターから転写されて発現するようにした。
【実施例２】
【００８３】
ＣＰＲ５、ＰＤＩ１又はＥＲＯ１過剰発現酵母変異株の作製
ＰＰＤ酵母変異株において、タンパク質フォールディングに関与するタンパク質であるＣＰＲ５、ＰＤＩ１又はＥＲＯ１の過剰発現が前記酵母変異株の成長及びＰＰＤ生産能に関与するか否かを確認するために、前記ＣＰＲ５、ＰＤＩ１又はＥＲＯ１の遺伝子が過剰発現した酵母変異株を作製した。まず、ＣＰＲ５、ＰＤＩ１又はＥＲＯ１遺伝子の過剰発現を誘導するために、前記遺伝子のプロモーターを高発現構成的プロモーターであるＰＧＫ１プロモーターに置換するためのＰＧＫ１プロモーター置換ベクターを作製し、前記ベクターを用いて作製した置換カセットをＰＰＤ酵母変異株に形質導入することにより、ＣＰＲ５、ＰＤＩ１又はＥＲＯ１過剰発現酵母変異株を作製した。
【００８４】
具体的には、ＰＧＫ１プロモーター置換ベクターを作製するために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＥＮ．ＰＫ２−１のゲノムＤＮＡから高発現構成的プロモーターであるＰＧＫ１プロモーター部位配列に、プロモーターの５’及び３’部位にそれぞれ制限酵素ＳａｃＩ及びＸｂａＩ認識部位を有するようにＰＧＫ１ ｐｒｏ Ｆ及びＰＧＫ１ ｐｒｏ Ｒプライマー組み合わせ（表１）を用いたＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を行うことによりＰＣＲ断片を増幅し、その後それを電気泳動することにより目的とする断片を得た。ここで、ＰＣＲ反応は、９５で３０秒間の変性、５６で３０秒間のアニーリング、及び７２で３０秒間の伸長過程を２５回繰り返した。前記増幅した断片をＳａｃＩ及びＸｂａＩで処理し、同じ制限酵素で処理したｐＵＣ５７−ＵＲＡ３ＨＡベクター（非特許文献３）に挿入してｐＵＣ５７−ＵＲＡ３ＨＡ−ＰＧＫ１ベクター（配列番号９）（図３）を作製した。
【００８５】
前記ｐＵＣ５７−ＵＲＡ３ＨＡ−ＰＧＫ１ベクターの作製のためのプライマー配列及び制限酵素を下記表１に示す。
【００８６】
【表１】
2019030293.tif 000003
【００８７】
前述したように作製したｐＵＣ５７−ＵＲＡ３ＨＡ−ＰＧＫ１ベクターを鋳型とし、ＣＰＲ５プロモーター部位の相同組換え配列であるＰ＿ＣＰＲ５ Ｆ及びＰ＿ＣＰＲ５ Ｒプライマー（配列番号１２，１３）組み合わせを用いたＰＣＲを行うことにより、ＣＰＲ５プロモーターをＰＧＫ１プロモーターに置換するカセットを作製した。同様に、ＰＤＩ１プロモーター部位の相同組換え配列であるＰ＿ＰＤＩ１ Ｆ及びＰ＿ＰＤＩ１ Ｒプライマー（配列番号１４，１５）組み合わせを用いたＰＣＲを行うことにより、ＰＤＩ１プロモーターをＰＧＫ１プロモーターに置換するカセットを作製し、またＥＲＯ１プロモーター部位の相同組換え配列であるＰ＿ＥＲＯ１ Ｆ及びＰ＿ＥＲＯ１ Ｒプライマー（配列番号１６，１７）組み合わせを用いたＰＣＲを行うことにより、ＥＲＯ１プロモーターをＰＧＫ１プロモーターに置換するカセットを作製した。ここで、ＰＣＲ反応は、９５で３０秒間の変性、５６で３０秒間のアニーリング、及び７２で２分間の伸長過程を２５回繰り返した。
【００８８】
作製したＣＰＲ５プロモーター、ＰＤＩ１プロモーター又はＥＲＯ１プロモーター置換用カセットを前記ＰＰＤ酵母変異株にそれぞれ導入した。導入は一般的な熱ショック形質転換（heat shock transformation）により行われ、形質転換後にウラシルドロップアウト培地（Yeast Nitrogen Base without amino acids 6.7g, CSM minus uracil 0.77g, Glucose 20g, 1L中）で細胞を培養し、ゲノム上のＣＰＲ５プロモーター、ＰＤＩ１プロモーター又はＥＲＯ１プロモーターが前記カセットによりＰＧＫ１プロモーターに置換されるようにした。
【００８９】
結果として得られた酵母変異株においてＰＧＫ１プロモーターに置換されたことを確認するために、前記細胞のゲノムを鋳型とし、ＣＰＲ５ ｔｏ ＰＧＫ１ Ｆ及びＣＰＲ５ ｔｏ ＰＧＫ１ Ｒプライマー（配列番号１８，１９）組み合わせを用いたＰＣＲを行うことにより、ＣＰＲ５プロモーターがＰＧＫ１プロモーターに置換されたことを確認した。また、ＰＤＩ１ ｔｏ ＰＧＫ１ Ｆ及びＰＤＩ１ ｔｏ ＰＧＫ１ Ｒプライマー（配列番号２０，２１）組み合わせ、又はＥＲＯ１ ｔｏ ＰＧＫ１ Ｆ及びＥＲＯ１ ｔｏ ＰＧＫ１ Ｒプライマー（配列番号２２，２３）組み合わせを用いたＰＣＲを行うことにより、ＰＤＩ１プロモーター又はＥＲＯ１プロモーターがＰＧＫ１プロモーターに置換されたことを確認した。その結果、ＰＰＤ−ＣＰＲ５（ＰＣＰＲ５：：ＰＰＧＫ１）、ＰＰＤ−ＰＤＩ１（ＰＰＤＩ１：：ＰＰＧＫ１）及びＰＰＤ−ＥＲＯ１（PＥＲＯ１：：ＰＰＧＫ１）酵母変異株が作製された。
【００９０】
前記ＰＧＫ１プロモーター置換カセットの作製及び置換の確認のためのプライマー配列を下記表２に示す。
【００９１】
【表２】
2019030293.tif 000004
【実施例３】
【００９２】
形質転換された酵母変異株の成長及びＰＰＤ生産量の確認
前述したように作製した形質転換酵母変異株を２％ブドウ糖含有最小培地（minimal URA drop-out media）５０ｍｌにＯＤ６００値が０．５になるように接種し、３０にて２５０ｒｐｍで攪拌しながら１４４時間好気条件で培養した。培養中の細胞成長については、分光光度計（spectrophotometer）を用いてＯＤ６００値を測定した。培養中の細胞内代謝産物（squalene, 2, 3-oxidosqualene, Protopanaxadiol）については、ＨＰＬＣ（High performance liquid chromatography）を用いて分析を行った。
【００９３】
培養の結果（７２ｈ及び１４４ｈ）、細胞成長、すなわち培養物のＯＤ６００値及び各細胞内代謝産物の濃度は下記の表３、表４及び図４に示すものとなった。
【００９４】
前述したように作製した形質転換酵母変異株の培養による代謝産物濃度を下記表３に示す。
【００９５】
【表３】
2019030293.tif 000005
【００９６】
前述したように作製した形質転換酵母変異株の培養による代謝産物濃度の倍数値（１４４ｈ）を表４に示す。
【００９７】
【表４】
2019030293.tif 000006
【００９８】
表３及び４において、対照群はＰＰＤ酵母変異株（S. cerevisiae CEN.PK2-1D Δtrp1::PGPD1 tHMG1 + PGPD1 PgSE + Δleu2::PGPD1 PgDDS + PGPD1 PgPPDS + PGPD1 PgCPR）であり、ＣＰＲ５強化菌株はＰＰＤ−ＣＰＲ５（ＰＣＰＲ５：：ＰＰＧＫ１）であり、ＰＤＩ１強化菌株はＰＰＤ−ＰＤＩ１（ＰＰＤＩ１：：ＰＰＧＫ１）であり、ＥＲＯ１強化菌株はＰＰＤ−ＥＲＯ１（ＰＥＲＯ１：：ＰＰＧＫ１）である。表４における値は、対照群酵母変異株の各代謝産物（squalene, 2, 3-oxidosqualene, protopnanxadiol）の生産濃度を１とした場合の、作製した酵母変異株から生産された各代謝産物の倍数値を示す。
【００９９】
前記結果から、前記酵母変異株の形質転換は細胞成長に大きな影響を及ぼさないことが確認された。また、細胞内代謝産物の濃度測定結果から、ＣＰＲ５、ＰＤＩ１又はＥＲＯ１を過剰発現させるとタンパク質フォールディングの増加に伴ってＵＰＲ（Unfolded protein response）が減少し、それによりジンセノサイド生合成の代謝産物が増加し、これは最終的にジンセノサイド生産能が向上したものと予測される。
【図１】
2019030293.tif 000007
【図２】
2019030293.tif 000008
【図３】
2019030293.tif 000009
【図４】
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【配列表】
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