(57)【要約】【課題】高い感染防御効果を示すマラリアワクチンを提供すること。【解決手段】マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスを含むマラリアワクチンを、該マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むワクシニアウイルス以外の組換えウイルス、又は該マラリア抗原のアミノ酸配列を有するタンパク質を人または動物に投与する前又は投与した後に、該人または動物に投与することにより、高い感染防御効果を示すことを見出して、本発明を完成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスを含むマラリアワクチンであって、
さらに、該組換えワクシニアウイルスは、該マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むワクシニアウイルス以外の組換えウイルス、該マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子が導入されたプラスミドDNA、又は該マラリア抗原のアミノ酸配列を有するタンパク質を人または動物に投与する前又は投与した後に、該人または動物に投与することを特徴とする、
マラリアワクチン。
【請求項２】
前記ワクシニアウイルス以外の組換えウイルスが、組換えバキュロウイルス、組換えアデノウイルス、又は組換えアデノ随伴ウイルスである請求項１に記載のマラリアワクチン。
【請求項３】
前記ワクシニアウイルスが、LC16mO株である請求項１又は２に記載のマラリアワクチン。
【請求項４】
前記マラリア抗原が、CSPである請求項１〜３のいずれか１に記載のマラリアワクチン。
【請求項５】
前記ワクシニアウイルスがLC16mO株であり、
前記マラリア抗原がCSPであり、
該組換えワクシニアウイルスは、CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを人または動物に投与する前又は投与した後に、該人または動物に投与することを特徴とする、請求項１に記載のマラリアワクチン。
【請求項６】
前記ワクシニアウイルスがLC16mO株であり、
前記マラリア抗原がCSPであり、
該組換えワクシニアウイルスは、CSPのアミノ酸配列を有するタンパク質を人または動物に投与する前又は投与した後に、該人または動物に投与することを特徴とする、請求項１に記載のマラリアワクチン。
【請求項７】
前記ワクシニアウイルスがLC16mO株であり、
前記マラリア抗原がCSPであり、
該組換えワクシニアウイルスは、CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えアデノウイルスを人または動物に投与する前又は投与した後に、該人または動物に投与することを特徴とする、請求項１に記載のマラリアワクチン。
【請求項８】
前記ワクシニアウイルスがLC16mO株であり、
前記マラリア抗原がCSPであり、
該組換えワクシニアウイルスは、CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルスを人または動物に投与する前又は投与した後に、該人または動物に投与することを特徴とする、請求項１に記載のマラリアワクチン。
【請求項９】
以下を含むマラリアワクチン組成物。
（１）CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスLC16mO株
（２）CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えバキュロウイルス
【請求項１０】
以下を含むマラリアワクチン組成物。
（１）CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスLC16mO株
（２）CSPのアミノ酸配列を有するタンパク質
【請求項１１】
以下を含むマラリアワクチン組成物。
（１）CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスLC16mO株
（２）CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えアデノウイルス
【請求項１２】
以下を含むマラリアワクチン組成物。
（１）CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスLC16mO株
（２）CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルス
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスを含むマラリアワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
（マラリア）
マラリアは、マラリア原虫に感染したハマダラカによって伝播される感染症で、毎年2億人が感染し、60万人以上の人が死亡している。マラリア感染症に対する理想的な対策は、効果的なワクチンの接種である。しかし、ワクチン開発に多大な努力が払われてきたにも関わらず、未だ実用化されていない。マラリアは、複雑な生活環を持ち、さらに１つの生活ステージの中でも多様な抗原性がある。これらがワクチン開発を非常に困難なこととしている。
現在、効果のあるマラリア対策は、殺虫剤を施した蚊帳で眠ること及びアルテミシニンベース混合治療（ACT:artemisinin-based combination therapy）である。
しかし、殺虫剤耐性蚊、アルテミシニン耐性原虫の出現の報告もあり、早急にマラリアワクチンの開発が必要とされている（参照：非特許文献１）。
【０００３】
（マラリアワクチンの開発状況）
現在最も開発が進んでいるマラリアワクチンとしてRTS,S（MosquirixTM）が知られている。RTS,Sは、熱帯熱マラリア原虫が宿主となるヒトの血流に初めて入る時、あるいは原虫が肝細胞に感染する時に、免疫を活性化することで原虫からヒトを守ることを目的として開発されている。RTS,Sは、マラリア原虫の感染、成熟、肝臓での増殖を妨げるように設計されており、肝臓で増殖した原虫が再度血流に入り赤血球への感染を経てマラリアを発症するリスクを軽減する（参照：非特許文献２）。
しかし、RTS,Sの第III相臨床試験の有効率はわずか30%であるので、新しい戦略・コンセプトのマラリアの開発が求められている（参照：非特許文献５）。
【０００４】
（マラリアの治療方法）
マラリアの治療方法、特にマラリアワクチンに関して、下記の複数の報告がある。
【０００５】
（特許文献１）
特許文献１は、「以下を含む組換えバキュロウイルスを含むマラリアワクチンであって、（１）マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子及びDAFのアミノ酸配列をコードする遺伝子、又は、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子、（２）該遺伝子を発現可能なプロモーター、さらに、該組換えバキュロウイルスは、該マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むバキュロウイルス以外の組換えウイルス、該マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子が導入されたプラスミドDNA、又は該マラリア抗原のアミノ酸配列を有するタンパク質を患者に投与した後に、該患者に投与することを特徴とする、該組換えバキュロウイルスを含むマラリアワクチン」を開示している。
しかし、特許文献１は、「本発明のマラリアワクチンの構成」を開示又は示唆していない。
【０００６】
（特許文献２）
特許文献２は、「一方が脊椎動物プロモーターで、他方がバキュロウイルスのプロモーターである連結したデュアル・プロモーターの下流に、少なくとも一つのウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質をコードする遺伝子と、少なくとも一つの免疫原性外来遺伝子とを含む融合遺伝子を連結することを特徴とする、デュアル・プロモーターと融合遺伝子が組み込まれた構造体を含むトランスファーベクターの製造方法」を開示している。
しかし、特許文献２は、「本発明のマラリアワクチンの構成」を開示又は示唆していない。
【０００７】
（特許文献３）
特許文献３は、「組換えオートグラファ核多角体病ウイルス（AcNPV）を有効成分とする医薬組成物であって、該組換えAcNPVが、少なくともポリヘドリンプロモーター及びCAGプロモーターが連結したデュアルプロモーターの制御下に以下のいずれかの融合遺伝子を含有することを特徴とする、医薬組成物」を開示している。
しかし、特許文献３は、「本発明のマラリアワクチンの構成」を開示又は示唆していない。
【０００８】
（特許文献４）
特許文献４は、「(ａ)ウイルスの外来エンベロープ蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列と、(ｂ)前記エンベロープコーディング配列に作動的に連結された第１プロモーターと、(ｃ)抗原蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列と、(ｄ)前記抗原コーディング配列に作動的に連結された第２プロモーターとを含む組換えバキュロウイルス」を開示している。
しかし、特許文献４は、「本発明のマラリアワクチンの構成」を開示又は示唆していない。
【０００９】
（特許文献５）
特許文献５は、「下記第１構成要素および第２構成要素を含み、前記第１構成要素および第２構成要素が、任意に、薬学的に許容可能な担体をさらに含む、キット。ａ）１以上の外来タンパク質、もしくは、前記外来タンパク質をコードする核酸、または、それらの機能的部分を含む第１構成要素；および、ｂ）組換え修飾ワクシニアウィルスアンカラ（ＭＶＡ）を含み、前記ＭＶＡは、融合タンパク質をコードする核酸配列を有し、前記融合タンパク質は、ユビキチンまたはその機能的部分、および、１以上の外来タンパク質またはそれらの機能的部分を含む、第２構成要素。」を開示している。
しかし、特許文献５は、「本発明のマラリアワクチンの構成」を開示又は示唆していない。
【００１０】
（特許文献６）
特許文献６は、「Ｃ４ｂｐドメイン又はその変異体若しくはその断片をコードする核酸配列と、対象とする抗原をコードする核酸配列とを含むウイルスベクターを含む免疫原性組成物」を開示している。
しかし、特許文献６は、「本発明のマラリアワクチンの構成」を開示又は示唆していない。
【００１１】
（非特許文献３）
非特許文献３は、「Priming-boosting法により、アデノウイルスワクチン (ChAd63)接種後にワクシニアウイルスワクチン(MVA)を接種することによりマラリア感染防御効果が40％に達したこと」を開示している。
しかし、非特許文献３は、「本発明のマラリアワクチンの構成」を開示又は示唆していない。
【００１２】
（非特許文献４）
非特許文献４は、「FP9-CS（鶏痘ウイルスにCSPを組込んだ組換えウイルス）接種後にMVA-CS（ワクシニアウイルスにCSPを組込んだ組換えウイルス）を接種することによりマラリア感染防御効果が90％に達したこと」を開示している。
しかし、非特許文献４に記載の方法では、アジュバントを使用しており、該アジュバントを使用しなかった場合には、マラリア感染防御効果が35％まで低下する。
さらに、非特許文献４は、「本発明のマラリアワクチンの構成」を開示又は示唆していない。
【００１３】
以上により、現状のマラリア感染防御効果は不十分であり、さらに向上させる必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Review Article Malaria in developingcountries, (2007), 2-5.doi:10.3855/jidc.4610
【非特許文献２】グラクソ・スミスクライン株式会社、"GSKのマラリアワクチンMosquirixTM（RTS,S）、 サハラ以南のアフリカ諸国における 幼児でのマラリア予防について欧州の規制当局から承認勧告を受領"、［online］、２０１５年７月３１日、［平成３０年３月２日検索］、インターネット＜URL：jp.gsk.com/jp/media/press-releases/2015/20150731-malaria_1/＞
【非特許文献３】Infection and Immunity, March 2014 Volume 82Number 3, p.1277-1286
【非特許文献４】Human Vaccine 2010 Jan;6(1):78-83. Epub 2010Jan 18.
【非特許文献５】N Engl J Med 367:2284-95, 2012.
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開2016/059911号公報
【特許文献２】国際公開2007/091624号公報
【特許文献３】国際公開2009/020236号公報
【特許文献４】国際公開2009/088256号公報
【特許文献５】国際公開2006/077161号公報
【特許文献６】国際公開2008/122817号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の課題は、従来のマラリアワクチンと比較して、高い感染防御効果を示すマラリアワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究した結果、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスを含むマラリアワクチンを、該マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むワクシニアウイルス以外の組換えウイルス、又は該マラリア抗原のアミノ酸配列を有するタンパク質を人または動物に投与する前又は投与した後に、該人または動物に投与することにより、高い感染防御効果を示すことを見出して、本発明を完成した。
【００１８】
本発明は以下の通りである。
１．マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスを含むマラリアワクチンであって、
さらに、該組換えワクシニアウイルスは、該マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むワクシニアウイルス以外の組換えウイルス、該マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子が導入されたプラスミドDNA、又は該マラリア抗原のアミノ酸配列を有するタンパク質を人または動物に投与する前又は投与した後に、該人または動物に投与することを特徴とする、
マラリアワクチン。
２．前記ワクシニアウイルス以外の組換えウイルスが、組換えバキュロウイルス、組換えアデノウイルス、又は組換えアデノ随伴ウイルスである前項１に記載のマラリアワクチン。
３．前記ワクシニアウイルスが、LC16mO株である前項１又は２に記載のマラリアワクチン。
４．前記マラリア抗原が、CSPである前項１〜３のいずれか１に記載のマラリアワクチン。
５．前記ワクシニアウイルスがLC16mO株であり、
前記マラリア抗原がCSPであり、
該組換えワクシニアウイルスは、CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを人または動物に投与する前又は投与した後に、該人または動物に投与することを特徴とする、前項１に記載のマラリアワクチン。
６．前記ワクシニアウイルスがLC16mO株であり、
前記マラリア抗原がCSPであり、
該組換えワクシニアウイルスは、CSPのアミノ酸配列を有するタンパク質を人または動物に投与する前又は投与した後に、該人または動物に投与することを特徴とする、前項１に記載のマラリアワクチン。
７．前記ワクシニアウイルスがLC16mO株であり、
前記マラリア抗原がCSPであり、
該組換えワクシニアウイルスは、CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えアデノウイルスを人または動物に投与する前又は投与した後に、該人または動物に投与することを特徴とする、前項１に記載のマラリアワクチン。
８．前記ワクシニアウイルスがLC16mO株であり、
前記マラリア抗原がCSPであり、
該組換えワクシニアウイルスは、CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルスを人または動物に投与する前又は投与した後に、該人または動物に投与することを特徴とする、前項１に記載のマラリアワクチン。
９．以下を含むマラリアワクチン組成物。
（１）CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスLC16mO株
（２）CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えバキュロウイルス
１０．以下を含むマラリアワクチン組成物。
（１）CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスLC16mO株
（２）CSPのアミノ酸配列を有するタンパク質
１１．以下を含むマラリアワクチン組成物。
（１）CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスLC16mO株
（２）CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えアデノウイルス
１２．以下を含むマラリアワクチン組成物。
（１）CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスLC16mO株
（２）CSPのアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルス
【発明の効果】
【００１９】
本発明のマラリアワクチンは、従来のマラリアワクチンと比較して、下記の効果を有する。
（１）高い感染防御効果。
（２）感染しても、発症が遅い発症遅延効果、それに伴う治療猶予期間の延長効果。
（３）アジュバントが不要、より詳しくはアジュバントなしでも高い感染防御効果。
（４）高い安全性。
天然痘の弱毒ワクチン株であるLC16m8株は過去に１０万人の子供に接種され、安全性が確認されているワクチンとして厚生省に認可されている。LC16m8Δ株は、LC16m8株からの強毒リバータント生成の可能性をなくし安全性をさらに増した株である。
バキュロウイルスは、カイコに感染する昆虫ウイルスで、人には感染しない。日本の長い養蚕業の歴史からその駆除法のノウハウを蓄積されている。また、現在、タンパク質の高発現ベクターとして広く世界中で使用されている。これらにより、安全性・汎用性が高く、技術的にも確立されている。
以上により、本発明のマラリアワクチンは、実用化までの課題が少ない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】sPfCSP2の概要図。
【図２】PfCSPの塩基配列及びアミノ酸配列。
【図３】sPfCSP2の塩基配列及びアミノ酸配列。
【図４】組換えワクシニアウイルス作製用プラスミドpVR2-sPfCSP-WPRE(-)-VV。ＨＡ：ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８Δ株が保持するゲノムのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子、Ｇ２：水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質Ｇ(VSVG：GenBank Accession No.M21416 )のトランスメンブレン領域（膜結合部位）のタンパク質。
【図５】実施例５のマウス群のうちグループ１、２、３、４、５、６の1%マラリア血症の結果を示す。縦軸は1％マラリア血症に到達しなかったマウスの割合（％）を示す。横軸はマラリア感染後の日数を示す。
【図６】実施例５のマウス群のうちグループ１、７、８の1%マラリア血症の結果を示す。縦軸は1％マラリア血症に到達しなかったマウスの割合（％）を示す。横軸はマラリア感染後の日数を示す。
【図７】実施例６のELISA（total IgG）の結果（グループ２〜８）を示す。縦軸はシグナル強度を示す。
【図８】実施例６のEx-vivo ELISpotの結果（グループ２〜８）を示す。縦軸は脾細胞100万個あたりのIFN-γスポット数を示す。
【図９】実施例６のEx-vivo ELISpotの結果（グループ９、１１）を示す。縦軸は脾細胞100万個あたりのIFN-γスポット数を示す。
【図１０】実施例６の細胞内サイトカイン発現の確認結果（グループ２〜８）を示す。上図は各サイトカインを分泌しているCD8+T細胞の割合を示す。下図は複数のサイトカインを分泌しているCD8+T細胞の割合を示す。下図の横軸の＋及び−は、CD107a、IFN-γ、IL-2及びTNFαの発現パターン（発現の有無）を示す。縦軸は各サイトカインで染色されたCD8+T細胞の割合を示す。下図の各バーは、各発現パターンごとに、左から順にぞれぞれ免疫接種やマラリアチャレンジ感染を行っていないマウス（naive）、グループ２、３、４、５、６、７及び８を示す。
【図１１】実施例６の細胞内サイトカイン発現の確認結果（グループ９、１１）を示す。上図は各サイトカインを分泌しているCD8+T細胞の割合を示す。下図は複数のサイトカインを分泌しているCD8+T細胞の割合を示す。下図の横軸の＋及び−は、CD107a、IFN-γ、IL-2及びTNFαの発現パターン（発現の有無）を示す。縦軸は各サイトカインで染色されたCD8+T細胞の割合を示す。下図の各バーは、各発現パターンごとに、左から順にぞれぞれ免疫接種やマラリアチャレンジ感染を行っていないマウス（naive）、グループ９及び１１を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（本発明のマラリアワクチン）
本発明の「マラリアワクチン」は、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子並びに必要に応じて該遺伝子を発現可能なプロモーターを含む組換えワクシニアウイルスを含み、該組換えワクシニアウイルスを、該マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むワクシニアウイルス以外の組換えウイルス、該マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子が導入されたプラスミドDNA又は該マラリア抗原のアミノ酸配列を有するタンパク質を人または動物に投与する前又は投与した後に、該人または動物に投与することを特徴とするマラリアワクチンである。
以下に本発明のマラリアワクチンを説明する。
【００２２】
（遺伝子）
本明細書において、遺伝子（DNA分子）とは、2本鎖DNAのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖という各1本鎖DNAを包含する趣旨であり、またその長さに制限されるものではない。
従って、本発明のマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子（ポリヌクレオチド)には、特に言及しない限り、ゲノムDNAを含む2本鎖DNA及びcDNAを含む1本鎖DNA(センス鎖)並びに該センス鎖と相補的な配列を有する1本鎖DNA(アンチセンス鎖)及び合成DNA、それらの断片のいずれもが含まれる。
【００２３】
（マラリア抗原）
本発明の「マラリア抗原」とは、マラリア原虫のスポロゾイト期の抗原CSP（CircumsporozoiteProtein）、TRAP（Thrombospondin-RelatedAdhesive Protein:トロンボスポンジン関連接着タンパク質）、メトロゾイト期抗原のMSP (Merozoite Surface Protein)1、AMA1（ApicalMembrane Antigen 1）等を例示することができるが、特に好ましいのはCSPである。
【００２４】
（マラリア抗原のアミノ酸配列を有するタンパク質）
本発明で使用する「マラリア抗原のアミノ酸配列を有するタンパク質」は、ワクシニアウイルスが提示する（提示可能な）マラリア抗原のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列又は同じ機能を有しかつ相同性が90%以上、95%以上、98％以上、99%以上であれば、特に限定されない。さらに、自体公知の方法により、該アミノ酸配列に修飾等をしても良い。
【００２５】
（CSP）
CSPは、蚊から人に侵入するスポロゾイト期原虫の主要膜タンパク質である。約５０kＤａの分子量で、中央部には高い抗原性を有するアスパラギン-アラニン-アスパラギン-プロリンの４つのアミノ酸配列(NANP)の約40回の繰り返し配列が存在する。NANPに対するモノクローナル抗体をスポロゾイトと混ぜて肝細胞に振りかける侵入阻害実験により非常に高い侵入阻害を示すことから、CSPは肝細胞への侵入に重要な役割を果たしていると考えられている。
数あるマラリアの抗原の中でもCSPは、特にワクチン候補抗原として期待されており長年研究されている。マラリアのワクチンとして最も開発の進んでいるRTS,SもCSPを抗原としている。また、熱帯熱マラリア原虫に発現しているPfCSPは4つのシステインで、立体構造を維持しており、この立体構造がマラリア原虫の肝臓侵入機構に重要な働きをしているという報告もある。
なお、本発明で使用するCSPは、好ましくは、原虫由来の塩基配列であるPfCSP（参照：図２、配列番号１）又は哺乳類に塩基配列を最適化し更に4つめのシステインを含んだsPfCSP2（参照：図１、図３、配列番号２）を用いる。
【００２６】
加えて、本発明で使用するCSPは、以下も含む。
（１）上記いずれか１に記載のCSPの保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体。
（２）上記いずれか１に記載のCSPと90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ該CSPと実質的同質の作用を持つタンパク質。
（３）上記いずれか１に記載のCSPにおいて、１００〜１０個、５０〜３０個、４０〜２０個、１０〜５個、５〜１個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ該CSPと実質的同質の作用を持つタンパク質。
さらに、本発明で使用するCSPの遺伝子は、以下を含む。
（１）上記いずれか１以上のCSPのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子。
（２）上記いずれか１以上のCSPのアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつCSPと実質的同質の作用を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
（３）上記いずれか１以上のCSPのアミノ酸配列と90%以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつCSPと実質的同質の作用を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
【００２７】
上記変異を有するタンパク質は、天然に存在するものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖反応（以下、PCRと略称する）などを単独でまたは適宜組合せて使用できる。
例えば成書に記載の方法（サムブルック（Sambrook）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第2版」、1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、1988年、丸善株式会社）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（ウルマー（Ulmer, K.M.）、「サイエンス（Science）」、1983年、第219巻、p.666-671）を利用することもできる。ペプチドの場合、変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される
【００２８】
（組換えワクシニアウイルス）
本発明に用いるワクシニアウイルス（ベクター）は、その安全性に加え、人に対して好適な免疫反応を誘発する点において優れている。例えば、ＬＣ１６株、ＬＣ１６ｍ８株、ＬＣ１６ｍＯ株、ＤＩｓ株、ＭＶＡ株などを挙げることができるが、特に、それらのＢ５Ｒ遺伝子において１または複数のヌクレオチドが置換、付加、挿入および／または欠失されていて正常な機能を有するＢ５Ｒ遺伝子産物を産生しないワクシニアウイルスベクターを用いるのが好ましい。正常な機能を有するＢ５Ｒ遺伝子産物を産生しないことによって、ワクシニアウイルスのリバージョンによる強毒化、すなわち復帰突然変異及び先祖返りという問題は解消され得る。この様な正常な機能を有するＢ５Ｒ遺伝子産物を産生しないワクシニアウイルスベクターには、Ｂ５Ｒ遺伝子を欠失したＬＣ１６株、ｍ８ΔＢ５Ｒ（ＬＣ１６ｍ８Δ株）、ｍＯΔＢ５Ｒ（ＬＣ１６ｍＯΔ株）、ｍ８ｐｒｏＢ５ＲｄＴＭ、ｍＯｐｒｏＢ５ＲｄＴＭなどがあるが、中でもＢ５Ｒ遺伝子を欠失したＬＣ１６株、ｍ８ΔＢ５Ｒ（ＬＣ１６ｍ８Δ株、ＬＣ１６ｍ８Δ２株）およびｍＯΔＢ５Ｒ（ＬＣ１６ｍＯΔ株）を用いることが特に好ましい（参照：国際公開2012/053646号公報）。
なお、本明細書では、ＬＣ１６ｍＯ株には、ＬＣ１６ｍＯ株自体だけでなく、ＬＣ１６ｍＯ株由来の株であるＬＣ１６ｍ８Δ２株、ＬＣ１６ｍ８株、ＬＣ１６ｍＯΔ株、ＬＣ１６ｍ８Δ株、LC16m8&#8710;VNC110株（参照：Vaccines (Basel). 2014 Dec;2(4): 755&#8211;771.）等が含まれ、好ましくは、ＬＣ１６ｍ８Δ２株である。
【００２９】
（組換えワクシニアウイルスの製造方法）
本発明に用いるマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスの製造方法は、導入すべきマラリア抗原のポリペプチドをコードする遺伝子を連結したプラスミド（トランスファーベクター）を作製し、該プラスミドを、ワクシニアウイルスを感染させた細胞の中に導入し、その細胞の中で相同組み換えを生じさせることにより作製することができる。また、別の方法としては、導入すべきマラリア抗原のポリペプチドをコードする遺伝子断片を制限酵素で消化して、同酵素で消化したワクシニアウイルスゲノムに直接連結し、この組み換えワクシニアウイルスゲノムを、ウイルス感染細胞に導入することによっても、作製することができる。
ワクシニアウイルスベクターの作製において、使用することができるプラスミドとしては、例えば、ｐＳＦＪ１−１０、ｐＳＦＪ２−１６、ｐＭＭ４、ｐＧＳ２０、ｐＳＣ１１、ｐＭＪ６０１、ｐ２００１、ｐＢＣＢ０１−３，０６、ｐＴＫｇｐｔ−Ｆ１−３ｓ、ｐＴＭ１、ｐＴＭ３、ｐＰＲ３４，３５、ｐｇｐｔ−ＡＴＡ１８−２、ｐＨＥＳ１−３、ｐＪＷ３２２、ｐＶＲ１、ｐＣＡ、ｐＢＨＡＲなどを挙げることができる。
マラリア抗原のポリペプチドをコードする遺伝子の導入領域は、ワクシニアウイルスの生活環に必須でない遺伝子領域であり、例えば、赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、Ｂ５Ｒ遺伝子（Ｂ４Ｒ遺伝子とＢ６Ｒ遺伝子の間）、Ｆフラグメントなどの領域を挙げることができる。例えば、ＨＡ遺伝子中にマラリア抗原のポリペプチドをコードする遺伝子が導入された組換え体では、ＨＡ遺伝子が導入された外来遺伝子によって分断され、機能を失う。そのためプラークはニワトリの赤血球を吸着しなくなるため白く見えるようになるので、組換え体を容易に選別することができる。なお、導入する遺伝子は、１または複数のヌクレオチドが置換、付加、挿入および／または欠失されていることによりウイルスの形質に変化し組換え体の選択が容易になるものが望ましい。
ワクシニアウイルスベクターを感染させる細胞としては、ＲＫ１３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ１細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、初代ウサギ腎細胞、ＢＳＣ−１細胞、ＨＴＫ−１４３細胞、Ｈｅｐ２細胞、ＭＤＣＫ細胞等を例示することができる（参照：国際公開2012/053646号公報）。
マラリア抗原のポリペプチドをコードする遺伝子を導入する際、該ペプチドをコードする遺伝子の上流に適当なプロモーターを機能し得る形で連結させることができる。そのようなプロモーターは特に限定されないが、例えば、ｐ７．５プロモーター、ＡＴ１プロモーター、ＰＳＦＪ１−１０や、ＰＳＦＪ２−１６ｐ７．５プロモーターの改良型プロモーター（７．５Ｅ）、ｐ１１Ｋプロモーター、Ｔ７．１０プロモーター、ＣＰＸプロモーター、ＨＦプロモーター、Ｈ６プロモーター、Ｔ７ハイブリッドプロモーター等を例示することができる。
【００３０】
（組換えワクシニアウイルス以外の組換えウイルス）
本発明で使用する「ワクシニアウイルス以外の組換えウイルス」は、ワクシニアウイルスが保有するマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子と同じ遺伝子（又は実質的に同じ遺伝子）を含み、ワクシニアウイルス以外のウイルスを意味する。
例えば、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、鶏痘ウイルスレンチウイルス等を例示することができるが、好ましくはバキュロウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスである。
【００３１】
（組換えバキュロウイルス）
本発明に用いるバキュロウイルスは、昆虫に感染を起す昆虫病原ウイルスで環状の二本鎖DNAを遺伝子として保有するDNAウイルスの一群(バキュロウイルス科)である。その中で、核多角体病ウイルス(Nuclear Polyhedorosis Virus: NPV)といわれる一群のウイルスは感染後期には感染細胞の核内に多角体と呼ばれる封入体を作る。多角体遺伝子の代わりに発現したい外来遺伝子を挿入してもウイルスは問題なく感染、増殖し、所望の外来遺伝子産物を大量に産生することから、所望のタンパク質の製造に利用されている。
本発明に用いられるバキュロウイルスとしては、オートグラファ核多角体病ウイルス(AutographaCalifornica Nuclear Polyhedorosis Virus: AcNPV)、及びカイコガ核多角体病ウイルス(Bombyxmori Nuclear Polyhedorosis Virus: BmNPV)、オルギア・シュードツガタ核多角体病ウイルス（Orgyia pseudotsugata Nuclear Polyhedorosis Virus: OpNPV）、マイマイガ核多角大病ウイルス(Lymantriadisper Nuclear Polyhedorosis Virus: LdNPV)を例示できる。
なお、野生型、変異型、及び組換えバキュロウイルスのいずれであってもよい。コトランスフェクトされる宿主細胞として、例えばヨトウガ細胞(Spodoptera frugiperda)などの昆虫細胞等が挙げられる。
【００３２】
（組換えバキュロウイルスの製造方法）
組換えバキュロウイルスの製造は、所望のマラリア抗原遺伝子と必要に応じてウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子とが融合した遺伝子が組み込まれたトランスファーベクターを製造する工程、該トランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとを宿主細胞にコトランスフェクションする工程、組換えバキュロウイルスを分離する工程を含む。
上記組換えバキュロウイルスの製造方法において、トランスファーベクターの宿主細胞への導入法及びこれによる形質転換法としては、特に限定されず一般的なこの分野で周知慣用技術となっている各種方法を採用することができる。
得られる組換えバキュロウイルスは、常法に従い培養でき、該培養によりマラリア抗原タンパク質がウイルス粒子の構成成分に融合した融合タンパク質がウイルス粒子上に提示されて、昆虫細胞の細胞内、細胞外又は細胞膜上に発現、生産(蓄積、分泌)される。
本発明で使用可能なプロモーターは、組換えバキュロウイルス（特に、組換えバキュロウイルスの表面）にマラリア抗原（マラリア抗原のアミノ酸配列）を発現させることができれば特に限定されない。
特に、本発明者である吉田博士が開発したデュアル・プロモーター｛哺乳類細胞内で働くプロモーター（例、CMVプロモーター）と昆虫細胞内で働くプロモーター（例、ポリへドリンプロモーター、pPolh）の２つのプロモーター制御下に、所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入することを特徴とするプロモーター｝が好ましい。
１つの実施形態において、一方が脊椎動物プロモーターで他方がバキュロウイルスのプロモーターである連結したデュアル・プロモーターの制御下に、一つのマラリア抗原をコードした遺伝子と昆虫細胞で発現可能なウイルス膜タンパク質をコードする遺伝子とを含む融合遺伝子が組み込まれた構造体を含むトランスファーベクターを提供する。
このトランスファーベクターを、昆虫細胞中でバキュロウイルスDNAとコトランスフェクトすることにより、相同組換えを誘発し、バキュロウイルスのプロモーターの制御下にあり、昆虫細胞で発現し、発芽したウイルス粒子の構成成分となり得る融合タンパク質を産生することが可能な前記融合遺伝子をバキュロウイルスに組み込んだ組換えバキュロウイルスを得ることができる。
【００３３】
（ウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質）
前記ウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸をコードする遺伝子としては、例えば、gp64タンパク質(GenBank Accession No. L22858)、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質Ｇ(VSVG：GenBank Accession No. M21416 )、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質(KOS：GenBank Accession No. K01760)、1型ヒト免疫不全ウイルスgp120 (GenBank Accession No.U47783)、ヒト呼吸器合胞体ウイルス膜糖タンパク質(GenBank AccessionNo.M86651)、A型インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質(GenBank Accession No. U38242)などの遺伝子又は該遺伝子の一部、或いはバキュロウイルスに近縁のウイルスエンベロープタンパク質などの遺伝子又は該遺伝子の一部を例示できる。
【００３４】
（組換えアデノ随伴ウイルス及びその製造方法）
アデノ随伴ウイルスは、自己増殖能はなく、パルボウイルス科の一属に分類され、一本鎖DNAからなるウイルスである。
組換えアデノ随伴ウイルスの製造方法として、マラリア抗原遺伝子を自体公知（市販）のアデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドに導入し、導入後のプラスミドを公知の方法によりヒト胎児腎臓由来細胞に形質導入し、培養する。次に、培養上清、あるいは培養細胞から、マラリア抗原を発現する組換えアデノ随伴ウイルスを得る。
【００３５】
（アデノウイルス及びその製造方法）
アデノウイルスは、単一の二重鎖直鎖状DNAからなるウイルスである。
組換えアデノウイルスの製造方法として、マラリア抗原遺伝子を自体公知（市販）のアデノウイルスベクター作製用プラスミドに導入し、導入後のプラスミドを公知の方法によりヒト胎児腎臓由来細胞に形質導入し、培養する。次に、培養上清、あるいは培養細胞から、マラリア抗原を発現する組換えアデノウイルスを得る。
【００３６】
（マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子が導入されたプラスミドDNA）
本発明で使用する「マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子が導入されたプラスミドDNA」は、組換えワクシニアウイルスが保有するマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子と同じ遺伝子（又は実質的に同じ遺伝子）をプラスミドDNAに導入されていれば、特に限定されない。
なお、プラスミドDNAは自体公知の方法により作製することができる。
【００３７】
（組換えワクシニアウイルスをワクチンとしての使用例）
本発明の組換えワクシニアウイルスをワクチンとしての使用方法としては、Priming-boosting法を例示することができる。該方法では、以下のような組合せの組換えワクチンを人又は動物（特に、哺乳動物を含む脊椎動物、例、愛玩動物、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ウサギ、競馬ウマ）に筋肉内、経鼻的、又は経気道的に１回又は複数回投与する。
（１）マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスによるプライム及びブースト
（２）マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えバキュロウイルスによるブースト
（３）マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えアデノウイルスによるブースト
（４）マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルスによるブースト
（５）マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスによるプライム及びマラリア抗原のリコンビナントタンパク質によるブースト
（６）マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えバキュロウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスによるブースト
（７）マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスによるブースト
（８）マラリア抗原のリコンビナントタンパク質によるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスによるブースト
（９）マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えアデノウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスによるブースト
より詳しくは、人への投与方法は、すでに知られている投与方法も採用することができ、以下を例示することができるが、特に限定されない。
GSKのRTS,S/AS01ワクチンの第三相臨床試験 (N EnglJ Med 367 (2012) 2284-95)を基にして行う。
１回目免疫：6-12週の乳児に筋肉注射  ChAd63-CS(5x1010vp) (オックスフォード  ジェンナー研究所作製、参考文献：J Infect Dis 211 (2014)1076-86)
２回目免疫：1-3ヶ月後に筋肉注射  本発明のワクチン(1x109pfu)
【００３８】
（マラリアワクチン又はマラリアワクチン組成物）
本発明のマラリアワクチン又はマラリアワクチン組成物の組合せは、以下を例示することができるが特に限定されない。
（１）マラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルス
（２）マラリア抗原を発現するワクシニアウイルス及びマラリア抗原を発現するバキュロウイルス
（３）マラリア抗原を発現するワクシニアウイルス及びマラリア抗原を発現するアデノウイルス
（４）マラリア抗原を発現するワクシニアウイルス及びマラリア抗原を発現するアデノ随伴ウイルス
（５）マラリア抗原を発現するワクシニアウイルス及びマラリア抗原のリコンビナントタンパク質
【００３９】
本発明のマラリアワクチン組成物は、下記の実施例の結果より、アジュバントと併用することなく高い防御効果を示したので、アジュバントを必須の成分とする必要はないが、含めても良い。
本発明のマラリアワクチン組成物（マラリアワクチンも含む）は、PBS（リン酸緩衝化生理食塩水）又は生理食塩水等に懸濁した組換えワクシニアウイルス懸濁液を局所（例えば、肺組織内、肝臓内、筋肉内及び脳内など）への直接注入、経鼻的・経気道的に吸入、又は血管内（例えば、動脈内、静脈内及び門脈内）への投与を行うことができる。
【００４０】
（マラリアの予防方法及び治療方法）
本発明では、マラリアの予防方法及び治療方法も対象とする。より詳しくは、Priming-boosting法により、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスを、該マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むワクシニアウイルス以外の組換えウイルス、該マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子が導入されたプラスミドDNA又は該マラリア抗原のアミノ酸配列を有するタンパク質をマラリア患者（マラリア発症前の予防対象者も含む）に筋肉内、経鼻的、又は経気道的に１回又は複数回投与する前又は投与した後に、該患者に筋肉内、経鼻的、又は経気道的に１回又は複数回投与する。
【００４１】
（本発明のマラリアワクチン組成物の特徴）
本発明において、組換えワクシニアウイルスを脊椎動物に投与するとワクシニアウイルス感染細胞表面に提示されたマラリア抗原タンパク質がコンポーネントワクチンとして機能する。さらにマラリア抗原タンパク質が哺乳動物の細胞内で産生され、その免疫賦活作用により、マラリア感染症の予防ないし治療剤として機能する。
【００４２】
（本発明のマラリアワクチン組成物の感染防御機序の特徴）
本発明において、組換えワクシニアウイルスを脊椎動物に投与すると、様々なサイトカインが分泌され、CD107aが発現し、高いサイトカイン／タンパク質（IFN-γ＋TNFα＋、IFN-γ＋CD107a＋及びIFN-γ＋TNFα＋CD107a＋）を誘導／発現することにより、肝細胞内の寄生虫を殺滅できる細胞内免疫応答を増強しうると考えられる。
【００４３】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４４】
（CSPを発現する各ワクチンの作製）
文献（Malaria J. 2017, 16:390及びJ.Gen. Virol. 1990, 71:1293）に記載の作製例を基にして、各ウイルスでCSPが発現するためプラスミドを作成した。詳しくは、文献（Malaria J. 2017, 16:390）に記載されているプラスミドpFast-sPfCSP2-Spiderに挿入されている遺伝子カセット｛sPfCSP2遺伝子 + VSV-Gタンパク膜アンカー領域（配列番号３） + wpre配列（配列番号４)およびP10プロモーター + ヒトDAF遺伝子（配列番号５） +VSV-Gタンパク膜アンカー領域（配列番号３）｝を用いて、新たに遺伝子カセット｛sPfCSP2遺伝子 + VSV-Gタンパク膜アンカー領域（配列番号３）｝をもつプラスミド(pVR2-sPfCSP-WPRE(-)-VV)を作製した。図４に該プラスミドの模式図を示す。
なお、使用したCSPは、sPfCSP（配列番号２）である。
【００４５】
（PfCSPを発現するワクシニアウイルスの作製）
（１）ワクシニアウイルスのゲノムの分離
ＬＣ１６ｍ８Δ２株（ＬＣ１６ｍ８株のＢ５Ｒ遺伝子を完全に欠失させることによって遺伝的安定性をさらに向上させた改良型ワクチン。ＬＣ１６ｍ８Δのゲノムにはコンストラクションの都合上制限酵素サイト配列が挿入されているが、ＬＣ１６ｍ８Δ２株はその制限酵素サイトは含まない。参照：国際公開２００５／０５４４５１号公報）のワクシニアウイルスをRK13細胞（ウサギ腎細胞）に感染させ、増殖させ回収後に、ショ糖密度勾配遠心法によりワクシニアウイルスを精製し、フェノールクロロホルム抽出を行い、ゲノムを分離した。
（２）組換えワクシニアウイルスLC16m8Δ-sPfCSP2-G-WPRE(-)の作製方法
BHK細胞（ベビーハムスター細胞）に、トリポックスウイルスであるcanarypoxを感染させた後、リポフェクション法で、上記プラスミド(pVR2-sPfCSP-WPRE(-)-VV)と上記ワクシニアウイルスのゲノムを同時に遺伝子導入した。生じた子孫ウイルスをRK13細胞単層培養に感染させてプラークを作らせ、ニワトリ赤血球を用いたHA testによってHA(-)プラークを採取し、組換えワクシニアウイルスを分離した。
【００４６】
（PfCSPを発現するバキュロウイルス）
PfCSPを発現するバキュロウイルス（BDES-sPfCSP2-Spider）の作製方法は文献（Malaria J. 2017, 16:390）に記載されている。プラスミドpFast-sPfCSP2-Spider｛sPfCSP2遺伝子 + VSV-Gタンパク膜アンカー領域（配列番号３）+ wpre配列（配列番号４)およびP10プロモーター + ヒトDAF遺伝子（配列番号５）+ VSV-Gタンパク膜アンカー領域（配列番号３）｝を市販のBac-to-Bac(登録商標)（ライフテクノロジーズ・ジャパン株式会社販売）を用いBacmidに遺伝子導入した。作製したBacmid  1000ngをSf900(-)に加え、さらにSf900(-)で希釈したCell fectinを加え、室温で45min静置した。
さらに、Sf900(-)を加え1mlにし、5mlフラスコに撒いたSf-9細胞に1h感染させた。その後、Sf900(+)を5ml加え、5日間培養した。培養上清をもう１度、Sf-9細胞に感染させ、5日間培養した。
次に、培養上清を回収し、作製した組換えバキュロウイルスをタイトレーションした。1.2×107cells/mlの浮遊細胞にmoi＝0.5で感染させ、125rpm,27.5℃で4日間、振とう培養した。4日後に回収し、40%スクロースを用いて密度勾配遠心し、沈殿をPBSで懸濁し、4℃,暗所で保存した。
なお、Sf-9細胞は、抗生物質入りのSF900-IImedium（Invitrogen,San Diego,CA）中、27℃で培養した。Sf-9浮遊細胞は、抗生物質入りのSF900-IImedium中、125rpm,27.5℃で振とう培養した。
【００４７】
（PfCSPを発現するアデノウイルス）
PfCSPを発現するアデノウイルスとして、AdHu5-sPfCSP2-Gを使用した。
AdHu5-sPfCSP2の作製方法は、文献（Scientific Reports. 2018,8:3896）に記載されている。プラスミド pFast-sPfCSP2-Spider（Malaria J. 2017, 16:390に記載）をEcoRI/XhoIで切断し得られた遺伝子カセット｛sPfCSP2遺伝子 + VSV-Gタンパク膜アンカー領域（配列番号３）+ wpre配列（配列番号４)｝を公知のアデノウイルスベクター作製用プラスミドであるpAd/PL-DESTに導入し、HEK293A細胞にトランスフェクションして、培養、精製して得た。
【００４８】
（PfCSPを発現するアデノ随伴ウイルス）
PfCSPを発現するアデノ随伴ウイルスとして、AAV1-sPfCSP2-G及びAAV1-sPfCSP2を使用した。
AAV1-sPfCSP2-Gの作製方法は上記アデノウイルス作製に使用した遺伝子カセットと同じカセットを公知のアデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドであるpAAV-MCSに導入し、HEK293A細胞にトランスフェクションして、培養及び精製して得た。
AAV1-sPfCSP2の作製方法は上記アデノウイルス作製に使用した遺伝子カセットからVSV-Gタンパク膜アンカー領域断片を除いた遺伝子カセット（sPfCSP2遺伝子 + wpre 配列）を公知のアデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドであるpAAV-MCSに導入し、HEK293A細胞にトランスフェクションして、培養及び精製して得た。
【００４９】
（リコンビナントPfCSP（rPfCSP）タンパク質）
rPfCSPタンパク質の作製・精製方法は文献（PLoSONE. 2013, 8:e70819）に記載される方法を参照した。詳しくは、sPfCSP（配列番号２）を公知の大腸菌発現プラスミドであるpET32に導入し、BL21株に形質転換して培養及び精製して得た。
【実施例２】
【００５０】
（マラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルスを使用した感染防御効果実験１）
本実施例では、実施例１で作製した本発明のマラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルスを含むマラリアワクチンの感染防御効果を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００５１】
（使用したマラリアワクチン）
使用したマラリアワクチンは、以下の通りである。
○PfCSPを発現するワクシニアウイルス(LC16m8Δ-sPfCSP2-G-WPRE(-))
○PfCSPを発現するバキュロウイルス(BDES-sPfCSP2-Spider)
○PfCSPを発現するアデノウイルス(Ad-sPfCSP2-G)
○PfCSPを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV-sPfCSP2)
○リコンビナントPfCSP（rPfCSP）タンパク質
【００５２】
（使用した哺乳動物及び原虫）
使用した哺乳動物及び原虫は、以下の通りである。
マウス：BALB/c雌マウス6週齢を日本エスエルシー株式会社から入手し、1週間後に使用した。
マウスマラリア原虫：遺伝子組換えネズミマラリア｛PfCSP発現P. berghei（Pb）PfCSP-Tcell/Pb｝(Insect Mol. Biol.2013, 22:41に記載) に感染したハマダラカ(Anopheles stephensi SDA500 strain)の唾液腺を解剖し、遺伝子組換えネズミマラリア原虫スポロゾイトを単離した。RPMI 1640 Medium（gibco）を加えてホモジェナイズした後、遠心して上清を回収し、光学顕微鏡を用いてスポロゾイト数を計測した。500スポロゾイト/匹（body）となるように調製した。
【００５３】
（免疫スケジュール）
免疫スケジュールは、以下の通りである（表1の実施例２参照）。
グループ１：PBS [10μl/shot] をBALB/cマウス(N=5)に6週間隔で2回scarification法で接種した。
グループ２：PfCSPを発現するワクシニアウイルス[1×107 pfu(plaque forming unit)/10μl/shot] をBALB/cマウス(N=5)に6週間隔で2回scarification法で接種した。
グループ３：PfCSPを発現するワクシニアウイルス[1×107 pfu /10μl/shot] をBALB/cマウス(N=5)に1回scarification法で接種後、6週間後にPfCSPを発現するバキュロウイルス [108pfu/100μl/shot]を1回筋肉注射した。
グループ４：PfCSPを発現するワクシニアウイルス[1×107 pfu/10μl/shot] をBALB/cマウス(N=5)に1回scarification法で接種後、6週間後にPfCSPを発現するアデノウイルス [5×107 pfu (plaque forming unit)/100μl/shot] を1回筋肉内（im）注射した。
グループ５：PfCSPを発現するワクシニアウイルス[1×107 pfu/10μl/shot] をBALB/cマウス(N=5)に1回scarification法で接種後、6週間後にPfCSPを発現するアデノ随伴ウイルス [1×1011 pfu /100μl/shot] を1回筋肉内注射した。
グループ６：PfCSPを発現するワクシニアウイルス[1×107 pfu/10μl/shot] をBALB/cマウス(N=5)に1回scarification法で接種後、6週間後にリコンビナントPfCSPタンパク質[10μg/shot]とImject Alumの混合物を1回筋肉内注射した。
グループ７：PfCSPを発現するバキュロウイルス [108pfu/100μl/shot] をBALB/cマウス(N=5)に1回筋肉注射後、6週間後にPfCSPを発現するワクシニアウイルス [1×107 pfu /10μl/shot] を1回scarification法で接種した。
グループ８：リコンビナントPfCSPタンパク質[10μg/shot]とImject Alumの混合物をBALB/cマウス(N=5)に1回筋肉注射後、6週間後にPfCSPを発現するワクシニアウイルス [1×107 pfu/10μl/shot]を1回scarification法で接種した。
【００５４】
（マウスへのマラリア感染）
最終免疫の24日後に、遺伝子組換えマウスマラリア原虫PfCSP-Tcell/Pb500スポロゾイト/匹を29Gのインシュリン注射用シリンジを用いて尾静脈より投与することで、マラリア原虫をチャレンジ感染させた。
【００５５】
（マウスの感染防御効果の算出）
マラリアチャレンジ感染の5−14日後にマウスの末梢血液を採取し、血液塗沫標本を作製しギムザ染色した。マラリア感染を行ったマウスに占める感染が確認されなかったマウスの割合を感染防御効果（Protected/Challenged、%）として算出した。
【００５６】
（結果）
マラリアワクチンの感染防御効果実験１の結果は以下の表１の通りである。
グループ２における2回のワクシニアウイルス接種では、マラリア感染防御効果は20％であった。一方グループ３〜８において、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、リコンビナントPfCSPタンパク質の接種前又は後にワクシニアウイルスを接種することにより40%以上の高いマラリア感染防御効果を達成することに成功した。
【００５７】
以上の結果より、マラリア抗原（特に、CSP）のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスを、該マラリア抗原（特に、CSP）のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むワクシニアウイルス以外の組換えウイルス（特に、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス）、又は該マラリア抗原のアミノ酸配列を有するタンパク質を人または動物に投与する前又は投与した後に、該人または動物に投与することにより高い感染防御効果を示すことを見出した。
【００５８】
【表１】
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【実施例３】
【００５９】
（マラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルスを使用した感染防御効果実験２）
本実施例では、実施例１で作製した本発明のマラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルスと組換えアデノウイルスよりなるマラリアワクチンの感染防御効果を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００６０】
（使用したマラリアワクチン）
使用したマラリアワクチンは、以下の通りである。
○PfCSPを発現するワクシニアウイルス(LC16m8Δ-sPfCSP2-G-WPRE(-))
○PfCSPを発現するアデノウイルス(Ad-sPfCSP2-G)
○PfCSPを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV-sPfCSP2)
【００６１】
（使用した哺乳動物及び原虫）
使用した哺乳動物及び原虫は、以下の通りである。
マウス：BALB/c雌マウス6週齢を日本エスエルシー株式会社から入手し、1週間後に使用した。
マウスマラリア原虫：遺伝子組換えネズミマラリア｛PfCSP発現P. berghei（Pb）PfCSP-Tcell/Pb｝(Insect Mol. Biol.2013, 22:41に記載) 
【００６２】
（免疫スケジュール）
免疫スケジュールは、以下の通りである（表１の実施例３参照）。
グループ１：PBS [10μl/shot] をBALB/cマウス(N=10)に3週間隔で2回scarification法で接種した。
グループ９：PfCSPを発現するアデノウイルス [5×107pfu/100μl/shot] をBALB/cマウス(N=10)に1回筋肉内接種後、8週間後にPfCSPを発現するワクシニアウイルス [1×107 pfu/10μl/shot] を1回scarification法で接種した。
グループ１１：PfCSPを発現するアデノウイルス [5×107pfu/100μl/shot] をBALB/cマウス(N=10)に1回筋肉内接種後、3週間後にPfCSPを発現するアデノ随伴ウイルス [1×1011 pfu/100μl/shot] を1回筋肉内注射した。
【００６３】
（マウスへのマラリア感染）
アデノウイルス/ワクシニアウイルス接種群は最終免疫の24日後に、アデノウイルス/アデノ随伴ウイルス接種群は最終免疫の45日後に、それぞれ遺伝子組換えマウスマラリア原虫PfCSP-Tcell/Pb 1,000スポロゾイト/匹を29Gのインシュリン注射用シリンジを用いて尾静脈より投与することで、マラリア原虫をチャレンジ感染させた。
【００６４】
（マウスの感染防御効果の算出）
マラリアチャレンジ感染の5−14日後にマウスの末梢血液を採取し、血液塗沫標本を作製しギムザ染色した。マラリア感染を行ったマウスに占める感染が確認されなかったマウスの割合を感染防御効果（Protected/Challenged、%）として算出した。
【００６５】
（結果）
マラリアワクチンの感染防御効果実験２の結果は上記の表1の通りである。
グループ９のアデノウイルス/ワクシニアウイルス接種群では、マラリア感染防御効果は40％であった。一方、グループ１１において、アデノウイルス/アデノ随伴ウイルス接種群では、マラリア感染防御効果は10％であった。ワクシニアウイルスワクチンを接種することにより、より高いマラリア感染防御効果を達成すること成功した。
【実施例４】
【００６６】
（マラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルスを使用した感染防御効果実験３）
本実施例では、実施例１で作製した本発明のマラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルスを含むマラリアワクチンの感染防御効果を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００６７】
（使用したマラリアワクチン）
使用したマラリアワクチンは、以下の通りである。
○PfCSPを発現するワクシニアウイルス(LC16m8Δ-sPfCSP2-G-WPRE(-))
○PfCSPを発現するバキュロウイルス(BDES-sPfCSP2-Spider)
○PfCSPを発現するアデノウイルス(Ad-sPfCSP2-G)
○PfCSPを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV-sPfCSP2-G)
○リコンビナントPfCSP（rPfCSP）タンパク質
【００６８】
（使用した哺乳動物及び原虫）
使用した哺乳動物及び原虫は、以下の通りである。
マウス：BALB/c雌マウス6週齢を日本エスエルシー株式会社から入手し、1週間後に使用した。
マウスマラリア原虫：遺伝子組換えネズミマラリア｛PfCSP発現P. berghei（Pb）PfCSP-Tcell/Pb｝(Insect Mol. Biol.2013, 22:41に記載) に感染したハマダラカ(Anopheles stephensi SDA500 strain)の唾液腺を解剖し、遺伝子組換えネズミマラリア原虫スポロゾイトを単離した。RPMI 1640 Medium（gibco）を加えてホモジェナイズした後、遠心して上清を回収し、光学顕微鏡を用いてスポロゾイト数を計測した。500スポロゾイト/匹（body）となるように調製した。
【００６９】
（免疫スケジュール）
免疫スケジュールは、以下の通りである（表1の実施例４参照）。
グループ１：PBS [10μl/shot] をBALB/cマウス(N=5)に6週間隔で2回scarification法で接種した。
グループ３：PfCSPを発現するワクシニアウイルス[1×107 pfu /10μl/shot] をBALB/cマウス(N=5)に1回scarification法で接種後、6週間後にPfCSPを発現するバキュロウイルス [108pfu/100μl/shot]を1回筋肉注射した。
グループ４：PfCSPを発現するワクシニアウイルス[1×107 pfu/10μl/shot] をBALB/cマウス(N=5)に1回scarification法で接種後、6週間後にPfCSP-Gを発現するアデノウイルス [5×107pfu (plaque forming unit)/100μl/shot] を1回筋肉内（im）注射した。
グループ５：PfCSPを発現するワクシニアウイルス[1×107 pfu/10μl/shot] をBALB/cマウス(N=5)に1回scarification法で接種後、6週間後にPfCSP-Gを発現するアデノ随伴ウイルス [1×1011pfu /100μl/shot] を1回筋肉内注射した。
グループ６：PfCSPを発現するワクシニアウイルス[1×107 pfu/10μl/shot] をBALB/cマウス(N=5)に1回scarification法で接種後、6週間後にリコンビナントPfCSPタンパク質[10μg/shot]とImject Alumの混合物を1回筋肉内注射した。
【００７０】
（マウスへのマラリア感染）
最終免疫の24日後に、遺伝子組換えマウスマラリア原虫PfCSP-Tcell/Pb500スポロゾイト/匹を29Gのインシュリン注射用シリンジを用いて尾静脈より投与することで、マラリア原虫をチャレンジ感染させた。
【００７１】
（マウスの感染防御効果の算出）
マラリアチャレンジ感染の5−14日後にマウスの末梢血液を採取し、血液塗沫標本を作製しギムザ染色した。マラリア感染を行ったマウスに占める感染が確認されなかったマウスの割合を感染防御効果（Protected/Challenged、%）として算出した。
【００７２】
（結果）
マラリアワクチンの感染防御効果実験３の結果は以下の表１の通りである。
グループ３〜６において、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、リコンビナントPfCSPタンパク質の接種前又は後にワクシニアウイルスを接種することにより80%以上の高いマラリア感染防御効果を達成することに成功した。
【００７３】
以上の結果より、組換えアデノウイルス/組換えワクシニアウイルスよりなるマラリアワクチンの感染防御効果が、組換えワクシニアウイルスを使用しない組換えアデノウイルス/組換えアデノ随伴ウイルスよりなるマラリアワクチンの効果を上回ることを見出した。
加えて、実施例２、３の感染防御効果実験は、RTS,Sの第III相臨床試験で使用した感染防御効果実験と比較して、厳しい条件（すべてのコントロール群が100%感染する条件：  表1 実施例２，３のグループ１参照）を採用している。よって、本発明のマラリアワクチンは、RTS,Sと比較して、高いマラリア感染防御効果を有すると考えられる。
【比較例】
【００７４】
（マラリア抗原を発現する組換えウイルスを使用した感染防御効果実験４）
本比較例では、実施例１で作製した本発明のマラリア抗原を発現する組換えウイルスワクチンのうち、ワクシニアウイルス以外の組み合わせによるマラリア感染防御効果を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００７５】
（使用したマラリアワクチン）
使用したマラリアワクチンは、以下の通りである。
○PfCSPを発現するバキュロウイルス(BDES-sPfCSP2-Spider)
○PfCSPを発現するアデノウイルス(Ad-sPfCSP2-G)
○PfCSPを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV-sPfCSP2)
【００７６】
（使用した哺乳動物及び原虫）
使用した哺乳動物及び原虫は、以下の通りである。
マウス：BALB/c雌マウス6週齢を日本エスエルシー株式会社から購入し、1週間後に使用した。
マウスマラリア原虫：遺伝子組換えネズミマラリア｛PfCSP発現P. berghei（Pb）PfCSP-Tcell/Pb｝(Insect Mol. Biol.2013, 22:41に記載) 
【００７７】
（免疫スケジュール）
免疫スケジュールは、以下の通りである（表１の比較例参照）。
グループ１０：PfCSPを発現するアデノウイルス [5×107pfu/100μl/shot] をBALB/cマウス(N=10)に３週間隔で2回筋肉注射した。
グループ１１：PfCSPを発現するアデノウイルス [5×107pfu/100μl/shot] をBALB/cマウス(N=10)に1回筋肉内接種後、３週間後にPfCSPを発現するアデノ随伴ウイルス [1×1011 pfu/100μl/shot] を1回筋肉内注射した。
グループ１２：PfCSPを発現するアデノウイルス [5×107pfu/100μl/shot] をBALB/cマウス(N=10)に1回筋肉内接種後、３週間後にPfCSPを発現するバキュロウイルス [1×108 pfu/100μl/shot] を1回筋肉内注射した。
グループ１３：PfCSPを発現するアデノ随伴ウイルス[1×1011 pfu /100μl/shot] をBALB/cマウス(N=10)に３週間隔で2回筋肉注射した。
グループ１４：アデノ随伴ウイルス [1×1011 pfu /100μl/shot] をBALB/cマウス(N=10)に1回筋肉内注射後、３週間後にPfCSPを発現するアデノウイルス [5×107 pfu/100μl/shot]を1回筋肉内接種した。
【００７８】
（マウスへのマラリア感染）
最終免疫の１４日後に、遺伝子組換えマウスマラリア原虫PfCSP-Tcell/Pb 1,000スポロゾイト/匹を29Gのインシュリン注射用シリンジを用いて尾静脈より投与することで、マラリア原虫をチャレンジ感染させた。
【００７９】
（マウスの感染防御効果の算出）
マラリアチャレンジ感染の5-14日後にマウスの末梢血液を採取し、血液塗沫標本を作製しギムザ染色した。マラリア感染を行ったマウスに占める感染が確認されなかったマウスの割合を感染防御効果（Protected/Challenged、%）として算出した。
【００８０】
（結果）
マラリアワクチンの感染防御効果実験４の結果は表1の通りである。比較例のグループ１１（アデノウイルス/アデノ随伴ウイルス接種群）のマラリア感染防御効果は50%であった。しかし、実施例３のグループ１１（アデノウイルス/アデノ随伴ウイルス接種群）では、わずか１０％であった。すなわち、実施例のマラリア感染防御結果は、比較例と比較して、より厳しい結果になると考えられる。実施例３及び比較例の結果を考慮すると、グループ２〜８のマラリア感染防御結果は、非常に高いことを確認した。
【００８１】
以上の結果より、実施例２〜４及び比較例の結果を総合すると、ワクシニアウイルスを組み合わせることによりマラリアワクチン感染防御効果が顕著に高まることを確認した。
【実施例５】
【００８２】
（1%マラリア血症による病状進行遅延効果の解析）
実施例２の実験群において、本発明のマラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルスを含むマラリアワクチンの1%マラリア血症に達する日数を算出し、病状進行遅延効果を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００８３】
（免疫スケジュール及びマラリア感染）
免疫スケジュール及びマラリア感染方法は、上記の実施例２の通りである。
【００８４】
（1%マラリア血症）
実施例２のグループ１〜８のマラリアチャレンジ感染後5、6、7、8、9及び10日目に調製した尾静脈血をギムザ染色した薄い塗抹標本の顕微鏡検査によりマラリア血症率（blood-stage）を測定した。1%マラリア血症に達するのに必要な時間は文献（Science2011, 334:475）に記載されたように決定した。全赤血球に対するマラリア原虫が感染した赤血球の割合を油浸光学顕微鏡（×1,000）で20視野以上観察し、感染率として算出した。
【００８５】
（結果）
1%マラリア血症の結果は図５及び６の通りである。
グループ１のPBSコントロール接種群と比較して、その他のすべての群において有意な病状進行遅延効果を確認した。
【００８６】
以上の結果より、マラリア抗原（特に、CSP）のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスを、該マラリア抗原（特に、CSP）のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むワクシニアウイルス以外の組換えウイルス（特に、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス）、又は該マラリア抗原のアミノ酸配列を有するタンパク質を人または動物に投与する前又は投与した後に、該人または動物に投与することにより病状進行遅延効果を示すことを確認した。
【実施例６】
【００８７】
（マラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルスを使用した感染防御機序の確認）
本実施例では、上記実施例２で得られたマラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルスを使用した感染防御効果の機序を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００８８】
（total IgGの発現の確認）
実施例２のグループ２〜８のブースト（２回目の注射）から3週間後のマウスの末梢血液を採取し、遠心により血清を分離した。前日にPfCSP抗原をコーティングしておいたウェルに血清を加えインキュベートした。インキュベート後、ウェルを洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)で標識した二次抗体とインキュベートし、ウェルを洗浄し、酵素基質を加え発色させ、ELISAでtotal IgGを検出した。
【００８９】
（total IgGの結果）
total IgGの結果は図７の通りである。
実施例２の実験群において、マラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルス接種（特に、ワクシニアウイルスワクチンの接種後のアデノウイルスワクチンまたはアデノ随伴ウイルスワクチン接種）により、total IgGが増強した。
【００９０】
（IFN-γの発現の確認）
実施例２のグループ２〜８のマラリアチャレンジ感染後14日目の非感染マウスと、新たに購入した免疫接種やマラリアチャレンジ感染を行っていないマウス（naive）の脾細胞を採取した。前日に抗IFN-γ抗体をコーティングしておいたウェルに脾細胞を加えインキュベートした。この時、脾細胞と一緒にCD8 エピトープを加え脾細胞を刺激した。インキュベート後、ウェルを洗浄し、抗IFN抗体でインキュベートした。インキュベート後、ウェルを洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）で標識した二次抗体とインキュベートし、ウェルを洗浄し、酵素基質を加え発色させ、Ex-vivoELISpotでIFN-γスポット数を検出した。また、実施例3のグループ９及び１１のマラリアチャレンジ感染後14日目の非感染マウスと、新たに購入した免疫接種やマラリアチャレンジ感染を行っていないマウス（naive）の脾細胞を採取し、同様に行った。
【００９１】
（IFN-γの発現の結果）
Ex-vivo ELISpotの結果は図８及び９の通りである。
実施例２の実験群において、マラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルス接種（特に、ワクシニアウイルスワクチンの接種後のアデノウイルスワクチンまたはアデノ随伴ウイルスワクチン接種）により、免疫接種やマラリアチャレンジ感染を行っていないマウス（naive）と比較して有意にIFN-γ産生が高かった。
実施例３の実験群において、マラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルス接種（特に、アデノウイルスワクチンの接種後のワクシニアウイルスワクチン接種）により、免疫接種やマラリアチャレンジ感染を行っていないマウス（naive）と比較して有意にIFN-γ産生が高かった。
当該結果は、マラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルス接種（特に、アデノウイルスワクチンの接種後のワクシニアウイルスワクチン接種）によるマラリア原虫排除はIFN-γが介在していることを確認した。
【００９２】
（細胞内サイトカイン発現の確認）
実施例２のグループ２〜８のマラリアチャレンジ感染後14日目の非感染マウスと、新たに購入した免疫接種やマラリアチャレンジ感染を行っていないマウス（naive）の脾細胞を採取した。ウェルに脾細胞を加えインキュベートした。この時、CD8 エピトープを加え脾細胞を刺激し、ゴルジプラグを加え細胞からのタンパク輸送を阻害させた。インキュベート後、洗浄し、抗CD8抗体を用いてCD8+T細胞を蛍光標識した。標識後に、洗浄し、細胞を固定し、膜透過処理を行い、T細胞内のサイトカインを蛍光標識した。その後、洗浄し、フローサイトメトリーでサイトカインを検出した。また、実施例３のグループ９、１１のマラリアチャレンジ感染後14日目の非感染マウスと、新たに購入した免疫接種やマラリアチャレンジ感染を行っていないマウス（naive）の脾細胞を採取し、同様に行った。
【００９３】
（細胞内サイトカイン発現の結果）
細胞内サイトカイン染色の結果は図１０及び１１の通りである。
実施例２の実験群において、マラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルス接種（特に、ワクシニアウイルスワクチンの接種後のアデノウイルスワクチンまたはアデノ随伴ウイルスワクチン接種）は、免疫接種やマラリアチャレンジ感染を行っていないマウス（naive）と比較してIFN-γ分泌CD8+T細胞、TNFα分泌CD8+ T細胞及びCD107a発現CD8+ T細胞の割合が有意に高いことを確認した。
さらに単一細胞から複数のサイトカインを産生するmultifunctional CD8+T細胞を調べた結果、マラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルス接種（特に、ワクシニアウイルスワクチンの接種後のアデノウイルスワクチンまたはアデノ随伴ウイルスワクチン接種）は、免疫接種やマラリアチャレンジ感染を行っていないマウス（naive）と比較してIFN-γ＋TNFα＋、IFN-γ＋CD107a＋及びIFN-γ＋TNFα＋CD107a＋産生するmultifunctional CD8+ T細胞の割合が有意に高いことを確認した。
実施例３のグループ９及び１１のマラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルス接種（特に、アデノウイルスワクチンの接種後のワクシニアウイルスワクチン接種）は、免疫接種やマラリアチャレンジ感染を行っていないマウス（naive）と比較してIFN-γ分泌CD8+T細胞、TNFα分泌CD8+ T細胞及びCD107a発現CD8+ T細胞の割合が有意に高いことを確認した。
さらに単一細胞から複数のサイトカインを産生するmultifunctional CD8+T細胞を調べた結果、マラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルス接種（特に、アデノウイルスワクチンの接種後のワクシニアウイルスワクチン接種）は、免疫接種やマラリアチャレンジ感染を行っていないマウス（naive）と比較してIFN-γ＋TNFα＋、IFN-γ＋CD107a＋及びIFN-γ＋TNFα＋CD107a＋産生するmultifunctional CD8+ T細胞の割合が有意に高いことを確認した。
以上の結果より、マラリア抗原を発現する組換えワクシニアウイルス接種（特に、ワクシニアウイルスワクチンの接種後のアデノウイルスワクチンまたはアデノ随伴ウイルスワクチン接種、もしくはアデノウイルスワクチンの接種後のワクシニアウイルスワクチン接種）では、CD8 エピトープに応答して様々なサイトカインが分泌され、CD107aが発現し、高いサイトカイン／タンパク質（IFN-γ＋TNFα＋、IFN-γ＋CD107a＋及びIFN-γ＋TNFα＋CD107a＋）を誘導／発現した。
ワクシニアウイルスワクチンによるプライムもしくはブーストは、上記誘導／発現により、肝細胞内の寄生虫を殺滅できる細胞内免疫応答を増強することを確認した。
【００９４】
（総論）
以上の実施例より以下の事項を確認した。
（１）マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるプライム及びブースト（グループ２）、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するバキュロウイルスによるブースト（グループ３）、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するアデノウイルスによるブースト（グループ４）、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルスによるブースト（グループ５）、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるプライム及びマラリア抗原のリコンビナントタンパク質によるブースト（グループ６）、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するバキュロウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるブースト（グループ７）、マラリア抗原のリコンビナントタンパク質によるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるブースト（グループ８）、並びに、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するアデノウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるブースト（グループ９）は、ワクシニアウイルス以外によるプライム及びブーストの組み合わせ、又は単独種のウイルスによるプライム及びブーストと比較して、マラリア感染に対する感染防御効果が高いことを確認した（実施例２〜３）。
（２）マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるプライム及びブースト（グループ２）、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するバキュロウイルスによるブースト（グループ３）、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するアデノウイルスによるブースト（グループ４）、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルスによるブースト（グループ５）、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるプライム及びマラリア抗原のリコンビナントタンパク質によるブースト（グループ６）、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するバキュロウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるブースト（グループ７）、マラリア抗原のリコンビナントタンパク質によるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるブースト（グループ８）、並びに、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するアデノウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるブースト（グループ９）は、ワクシニアウイルス以外によるプライム及びブーストの組み合わせ、又は単独種のウイルスによるプライム及びブーストと比較して、マラリア血症に対する有意な病状進行遅延効果を確認した（実施例５）。
（３）マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるプライム及びブースト（グループ２）、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するバキュロウイルスによるブースト（グループ３）、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するアデノウイルスによるブースト（グループ４）、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルスによるブースト（グループ５）、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるプライム及びマラリア抗原のリコンビナントタンパク質によるブースト（グループ６）、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するバキュロウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるブースト（グループ７）、マラリア抗原のリコンビナントタンパク質によるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるブースト（グループ８）、並びに、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するアデノウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるブースト（グループ９）｛特に、マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するアデノウイルスによるブースト（グループ４）又はマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するワクシニアウイルスによるプライム及びマラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルスによるブースト（グループ５）｝は、CD8 エピトープに応答して様々なサイトカインが分泌され、CD107aが発現し、高いサイトカイン／タンパク質（IFN-γ＋TNFα＋、IFN-γ＋CD107a＋及びIFN-γ＋TNFα＋CD107a＋）を誘導／発現することにより、肝細胞内の寄生虫を殺滅できる細胞内免疫応答を増強しうること、並びに、ワクシニアウイルス以外によるプライム及びブーストの組み合わせ、又は単独種のウイルスによるプライム及びブーストと比較してサイトカイン産生誘導能が高いことを確認した（実施例６）。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明では、従来のマラリアワクチンと比較して、高い感染防御効果を示すマラリアワクチンを提供することができる。
【図１】
2019151617.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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