(57)【要約】      （修正有）【課題】ＮＲ５Ａ１の発現を抑制可能なＮＲ５Ａ１発現抑制剤の提供。【解決手段】下記化合物の提供。具体的には、ＺがＣＨ基、（Ｒ１）ｐがメタ位にＣｌ基、Ｒ２がカルボキシル基である化合物ＣＸ−４９４５が挙げられる。2019151600.tif 000020【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉで表される化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、ＮＲ５Ａ１発現抑制剤。
【化１】
2019151600.tif 000018
（式中、ＺはＮまたはＣＲ３であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、置換されてもよい炭素数１から８のアルキル基、炭素数２から８のアルケニル基、炭素数２から８のアルキニル基、炭素数２から８のアシル基、炭素数６から１０のアリール基、炭素数５から１２のヘテロアリール基、炭素数７から１２のアリールアルキル基、若しくは炭素数６から１２のヘテロアリールアルキル基、または水素原子、ハロゲン原子、ＯＲ、ＮＲ２、ＮＲＯＲ、ＮＲＮＲ２、ＳＲ、ＳＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＮＲ２、ＮＲＳＯ２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、カルボキシバイオイソスター、ＣＯＮＲ２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、若しくはＮＯ２である。ここで各Ｒは独立して水素原子、炭素数１から８のアルキル基、炭素数２から８のアルケニル基、炭素数２から８のアルキニル基、炭素数２から８のアシル基、炭素数６から１０のアリール基、炭素数５から１０のヘテロアリール基、炭素数７から１２のアリールアルキル基、若しくは炭素数６から１２のヘテロアリールアルキル基であるか、または同じ原子若しくは隣接する原子に結合している２つのＲは結合して１つ若しくは複数のＮ、Ｏ若しくはＳを含んでもよい３員から８員の環を形成してもよい。ｐは０から４の整数である）
【請求項２】
式Ｉで表される化合物が、ＣＸ−４９４５を含む請求項１に記載のＮＲ５Ａ１発現抑制剤。
【請求項３】
下記式Ｉで表される化合物またはその薬学的に許容される塩を含み、副腎皮質腫瘍の処置に用いられる医薬組成物。
【化２】
2019151600.tif 000019
（式中、ＺはＮまたはＣＲ３であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、置換されてもよい炭素数１から８のアルキル基、炭素数２から８のアルケニル基、炭素数２から８のアルキニル基、炭素数２から８のアシル基、炭素数６から１０のアリール基、炭素数５から１２のヘテロアリール基、炭素数７から１２のアリールアルキル基、若しくは炭素数６から１２のヘテロアリールアルキル基、または水素原子、ハロゲン原子、ＯＲ、ＮＲ２、ＮＲＯＲ、ＮＲＮＲ２、ＳＲ、ＳＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＮＲ２、ＮＲＳＯ２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、カルボキシバイオイソスター、ＣＯＮＲ２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、若しくはＮＯ２である。ここで各Ｒは独立して水素原子、炭素数１から８のアルキル基、炭素数２から８のアルケニル基、炭素数２から８のアルキニル基、炭素数２から８のアシル基、炭素数６から１０のアリール基、炭素数５から１０のヘテロアリール基、炭素数７から１２のアリールアルキル基、若しくは炭素数６から１２のヘテロアリールアルキル基であるか、または同じ原子若しくは隣接する原子に結合している２つのＲは結合して１つ若しくは複数のＮ、Ｏ若しくはＳを含んでもよい３員から８員の環を形成してもよい。ｐは０から４の整数である）
【請求項４】
式Ｉで表される化合物が、ＣＸ−４９４５を含む請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
請求項３または請求項４に記載の医薬組成物を、対象に投与することを含む副腎皮質腫瘍の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＲ５Ａ１発現抑制剤および医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＲ５Ａ１（別名：Ａｄ４ＢＰあるいはＳＦ−１）は、ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーに属する核内転写因子である。ＮＲ５Ａ１は、大多数のステロイド合成酵素遺伝子の上流に共通して存在するＡｄ４またはＳＦ−１と呼ばれるＤＮＡ結合部位に特異的に結合するとされている。またＮＲ５Ａ１は、正常副腎皮質、副腎皮質腺腫のすべておよび副腎皮質癌の多くの症例において、副腎皮質細胞の核内で発現していることが知られている。
【０００３】
一方、プロテインキナーゼＣＫ２（カゼインキナーゼ２）は、細胞の生存維持を含む種々の細胞機能に関与する。正常細胞中のＣＫ２レベルは厳密に調節され、細胞増殖の役割を果たしていると考えられている。ＣＫ２は、癌特異的に多様な機能を有することが知られており、多くの癌細胞においてＣＫ２レベルの上昇を示すことが知られている。そのため、抗癌剤として種々のＣＫ２阻害剤が提案されている（例えば、特許文献１および２参照）。例えば、ＣＸ−４９４５は、経口投与可能なＣＫ２阻害剤として、シスプラチン、ゲムシタビンとの併用で胆管癌に対する臨床試験が進行中である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１１−５１５３３７号公報
【特許文献２】特表２０１３−５０６８３６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＮＲ５Ａ１はステロイドホルモン産生における主要転写調節因子であるが、ＮＲ５Ａ１を作用標的とする薬剤は知られていない。そこで本発明は、ＮＲ５Ａ１の発現を抑制可能なＮＲ５Ａ１発現抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第一態様は、下記式Ｉで表される化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、ＮＲ５Ａ１発現抑制剤である。
【０００７】
【化１】
2019151600.tif 000002
【０００８】
式中、ＺはＮまたはＣＲ３であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、置換されてもよい炭素数１から８のアルキル基、炭素数２から８のアルケニル基、炭素数２から８のアルキニル基、炭素数２から８のアシル基、炭素数６から１０のアリール基、炭素数５から１２のヘテロアリール基、炭素数７から１２のアリールアルキル基、若しくは炭素数６から１２のヘテロアリールアルキル基、または水素原子、ハロゲン原子、ＯＲ、ＮＲ２、ＮＲＯＲ、ＮＲＮＲ２、ＳＲ、ＳＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＮＲ２、ＮＲＳＯ２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、カルボキシバイオイソスター、ＣＯＮＲ２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、若しくはＮＯ２である。ここで各Ｒは独立して水素原子、炭素数１から８のアルキル基、炭素数２から８のアルケニル基、炭素数２から８のアルキニル基、炭素数２から８のアシル基、炭素数６から１０のアリール基、炭素数５から１０のヘテロアリール基、炭素数７から１２のアリールアルキル基、若しくは炭素数６から１２のヘテロアリールアルキル基であるか、または同じ原子または隣接する原子に結合している２つのＲは結合して１つまたは複数のＮ、ＯまたはＳを含んでもよい３員から８員の環を形成してもよい。ｐは０から４の整数である。
【０００９】
第二態様は、上記式Ｉで表される化合物またはその薬学的に許容される塩を含み、副腎皮質腫瘍の処置に用いられる医薬組成物である。
【００１０】
第三態様は、前記医薬組成物を対象に投与することを含む、副腎皮質腫瘍の処置方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＮＲ５Ａ１の発現を抑制可能なＮＲ５Ａ１発現抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＣＸ−４９４５の濃度とＮＲ５Ａ１のｍＲＮＡの発現量の関係を示す図である。
【図２】ＣＸ−４９４５の濃度とＮＲ５Ａ１蛋白質の発現量の関係を示す図である。
【図３】ＣＸ−４９４５によるＮＲ５Ａ１のｍＲＮＡに対する影響を示す図である。
【図４Ａ】ＣＫ２α−ｓｉＲＮＡによるＣＫ２α発現阻害を示す図である。
【図４Ｂ】ＣＫ２α−ｓｉＲＮＡによるＮＲ５Ａ１の発現に対する影響を示す図である。
【図５】ＣＸ−４９４５の濃度と、Ｈ２９５Ｒ細胞の生存率との関係を示す図である。
【図６Ａ】ＣＸ−４９４５の濃度と、コルチゾール分泌量との関係を示す図である。
【図６Ｂ】ＣＸ−４９４５の濃度と、アルドステロン分泌量との関係を示す図である。
【図７Ａ】ＣＸ−４９４５の濃度と、アルドステロン産生副腎腫瘍細胞におけるコルチゾール産生との関係を示す図である。
【図７Ｂ】ＣＸ−４９４５の濃度と、アルドステロン産生副腎腫瘍細胞におけるアルドステロン産生との関係を示す図である。
【図８】ＣＸ−４９４５の濃度と、カスパーゼ３／７の活性化との関係を示す図である。
【図９】ＣＸ−４９４５の濃度と、カスパーゼ３の活性化との関係を示す図である。
【図１０】ＣＸ−４９４５の濃度と、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の検出率との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、ＮＲ５Ａ１発現抑制剤等を例示するものであって、本発明は、以下に示すＮＲ５Ａ１発現抑制剤等に限定されない。
【００１４】
ＮＲ５Ａ１発現抑制剤
ＮＲ５Ａ１発現抑制剤は、下記式Ｉで表される化合物（以下、「特定化合物」ともいう）またはその薬学的に許容される塩の少なくとも１種を含む。特定構造の化合物を含むＮＲ５Ａ１発現抑制剤を、ＮＲ５Ａ１を発現する細胞に適用することで当該細胞におけるＮＲ５Ａ１の発現を抑制することができる。
【００１５】
【化２】
2019151600.tif 000003
【００１６】
式Ｉにおいて、ＺはＮまたはＣＲ３である。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して、置換されてもよい炭素数１から８のアルキル基、炭素数２から８のアルケニル基、炭素数２から８のアルキニル基、炭素数２から８のアシル基、炭素数６から１０のアリール基、炭素数５から１２のヘテロアリール基、炭素数７から１２のアリールアルキル基、若しくは炭素数６から１２のヘテロアリールアルキル基、または水素原子、ハロゲン原子、ＯＲ、ＮＲ２、ＮＲＯＲ、ＮＲＮＲ２、ＳＲ、ＳＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＮＲ２、ＮＲＳＯ２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、カルボキシバイオイソスター、ＣＯＮＲ２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、若しくはＮＯ２である。ここで各Ｒは独立して水素原子、炭素数１から８のアルキル基、炭素数２から８のアルケニル基、炭素数２から８のアルキニル基、炭素数２から８のアシル基、炭素数６から１０のアリール基、炭素数５から１０のヘテロアリール基、炭素数７から１２のアリールアルキル基、若しくは炭素数６から１２のヘテロアリールアルキル基であるか、または同じ原子若しくは隣接する原子に結合している２つのＲは結合して１つ若しくは複数のＮ、Ｏ若しくはＳを含んでもよい３員から８員の環を形成してもよい。ｐは０から４の整数である。カルボキシバイオアイソスターには、例えば以下の官能基が含まれる。
【００１７】
【化３】
2019151600.tif 000004
【００１８】
式Ｉにおいて、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アシル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基およびヘテロアリールアルキル基における置換基としては、炭素数１から８のアルキル基、炭素数２から８のアルケニル基、炭素数２から８のアルキニル基、炭素数２から８のアシル基、炭素数６から１０のアリール基、炭素数５から１２のヘテロアリール基、炭素数７から１２のアリールアルキル基、炭素数６から１２のヘテロアリールアルキル基、ハロゲン原子、ＯＲ、ＮＲ２、ＮＲＯＲ、ＮＲＮＲ２、ＳＲ、ＳＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＳＯ２ＮＲ２、ＮＲＳＯ２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、ＮＯ２等を挙げることができる。
【００１９】
式Ｉにおいて、Ｚは例えばＣＲ３であり、Ｒ３は例えば水素原子である。ｐは例えば１であり、Ｒ１は、例えばハロゲン原子等で置換されてもよい炭素数１から８のアルキル基またはハロゲン原子である。Ｒ２は、例えばＣＯＯＲまたはカルボキシバイオイソスターであり、Ｒは例えば水素原子または炭素数１から８のアルキル基である。
【００２０】
特定化合物は、下記式Ｉａで表されるＣＸ−４９４５を含むことが好ましい。
【００２１】
【化４】
2019151600.tif 000005
【００２２】
特定化合物は、例えば、特表２０１１−５１５３３７号公報に記載の方法で製造することができる。特定化合物は１つ又はそれ以上の不斉中心を有していてもよい。従って、特定化合物は、立体異性体混合物（ラセミ体及び非ラセミ体）として、あるいはエナンチオマー又はジアステレオマーとして製造することができる。特定の立体異性体は、光学活性な出発物質を用いることによって、又は、合成のいくつかの適切な段階で中間体のラセミ体若しくは非ラセミ体混合物を分割することによって得ることができる。
【００２３】
特定化合物は、用量依存的にＮＲ５Ａ１の発現を抑制することができる。ＮＲ５Ａ１は、ステロイドホルモン産生の主要な調節因子と考えられている。ＮＲ５Ａ１の発現を制御することでステロイド産生を制御することができると考えられるが、ＮＲ５Ａ１の発現を本明細書の実施例に示す濃度で制御可能な物質は従来知られていない。特定化合物は、例えば、副腎皮質癌細胞株Ｈ２９５Ｒに適用することで、用量依存的にＮＲ５Ａ１の発現を抑制し、さらに細胞増殖とステロイドホルモン産生を抑制することができる。さらに特定化合物は、副腎皮質癌細胞株Ｈ２９５Ｒに適用することで、アポトーシスを誘導することができる。一方、特定化合物はＣＫ２を主要標的とする化合物として知られており、種々の癌細胞においては、ＣＫ２のサブユニットであるＣＫ２αの発現が高いほど特定化合物に対する感受性が高いとされている。しかしながら、例えば、副腎皮質癌細胞株Ｈ２９５ＲにおいてＣＫ２αの発現をｓｉＲＮＡによりノックダウンして抑制しても、細胞増殖、ステロイドホルモン産生は変化せず、ＮＲ５Ａ１の発現量も変化しない。すなわち、特定化合物はＣＫ２を介さない経路によってＮＲ５Ａ１の発現を抑制すると考えられる。
【００２４】
医薬組成物
医薬組成物は、前記特定化合物またはその薬学的に許容される塩を有効量で含み、副腎皮質腫瘍の処置に用いられる。ここで処置とは、疾患について施される何らかの処置であればよく、例えば、疾患の治療、改善、進行の抑制（悪化の防止）等が挙げられる。特定化合物は、副腎皮質癌細胞株の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導することから、特定化合物またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物は、副腎皮質腫瘍の処置に用いることができる。
【００２５】
また特定化合物は、ＮＲ５Ａ１の発現を抑制し、ステロイドホルモン産生を抑制することができることから、特定化合物またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物は、ステロイドホルモン産生過剰を示す疾患の処置に用いることができる。ステロイドホルモン産生過剰を示す疾患としては、副腎癌、クッシング症候群、原発性アルドステロン症等を挙げることができる。
【００２６】
特定化合物は、遊離塩基の形態で、薬学的に許容される塩、水和物、エステル、溶媒和物、プロドラッグ等の形態で、ＮＲ５Ａ１発現抑制剤または医薬組成物に用いられてもよい。
【００２７】
特定化合物は、薬学的に許容される塩として含まれていてもよい。薬学的に許容される塩基付加塩としては、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛等から得られる金属塩、リジン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、プロカインから得られる有機塩が挙げられる。また酸付加塩としては、酢酸、プロピオン酸、アルギン酸、アントラニル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸、メタンスルホン酸、エテンスルホン酸、安息香酸、クエン酸、ギ酸、フマル酸、フロ酸、ガラクツロン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グリコール酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、ムチン酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸等から得られる有機酸塩、臭化水素酸、塩酸、硝酸、リン酸、スルファニル酸、硫酸等から得られる無機酸塩が挙げられる。
【００２８】
医薬組成物は、有効量の特定化合物に加えて、薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。薬学的に許容される担体としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、デンプン等の保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等が挙げられる。
【００２９】
医薬組成物の投与方法としては特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、疾患の状態、その他の条件に応じた方法で投与される。例えば、錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤の場合には経口投与される。また、注射剤の場合には、単独であるいはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内に投与したり、更には必要に応じて単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内に投与したりすることができる。坐剤の場合には、直腸内に投与される。
【００３０】
医薬組成物の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、通常、有効成分である一般式（１）の化合物の量として、１日あたり体重１ｋｇに対して０．００１ｍｇ以上１００ｍｇ以下、好ましくは０．００１ｍｇ以上５０ｍｇ以下を１回から数回に分けて投与される。投与量は、種々の条件で変動するので、上記範囲より少ない投与量で充分な場合もあるし、また上記範囲を超えた投与量が必要な場合もある。
【００３１】
特定化合物を含む医薬組成物は、まったく新しい機序により効能を発揮するので、他の医薬組成物と併用されてもよい。併用される医薬組成物は、目的等に応じて適宜選択される。例えば、副腎癌においては、ミトタン（副腎皮質ホルモン阻害薬（ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１）との併用。あるいは、保険適応外使用だが、ある程度有効と言われているＥＤＰ療法（エトポシド、ドキソルビシン、シスプラチン）との併用の可能性が考えられる。また、クッシング症候群、原発性アルドステロン症などの副腎腫瘍においては、手術不能症例に対して、ミトタンとの併用；コルチゾール異常高値に対して、一過性の効果しか認められないトリロスタン（ＨＳＤ３Ｂ１阻害薬）、ケトコナゾール（ＣＹＰ３Ａ４阻害薬）、メチラポン（ＣＹＰ１１Ｂ阻害薬）との併用が考えられる。
【００３２】
副腎皮質腫瘍の処置方法
副腎皮質腫瘍の処置方法は、有効量の前記医薬組成物を、対象に投与することを含む。医薬組成物の詳細および投与方法は既述の通りである。処置の対象は、例えば、哺乳動物であり、哺乳動物はヒトを含む。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以下では、データを平均値（ｍｅａｎ）±標準誤差（ＳＥＭ）で表す。統計計算は、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔまたはｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔはＴｕｋｅｙ法を用い、ｐ＜０．０５を有意とした。また特定化合物としては、式Ｉａで表されるＣＸ−４９４５を用いた。
【００３４】
（実施例１）
ＮＲ５Ａ１の発現解析  リアルタイムＰＣＲ
９６ウェルプレートの１ウェル当たり、２×１０４個のヒト由来副腎皮質癌細胞株Ｈ２９５Ｒ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２１２８）の細胞を播種し、一晩培養した。培養は、１％ＩＴＳ  ｐｒｅｍｉｘおよび２．５％ＮｕＳｅｒｕｍ  Ｉ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。次いで各濃度でＣＸ−４９４５を含む培地と培地交換し、２４時間培養した。なお、コントロールにはＤＭＳＯを用いた。ＣｅｌｌＡｍｐ（Ｔａｋａｒａｂｉｏ社）にて細胞上清を調製し、Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＰＬＵＳ  ＲＴ−ＰＣＲ−ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａｂｉｏ社）を用い、表１に示すプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。アクチンβ（ＡＣＴＢ）を内因性コントロールとし、ＮＲ５Ａ１のｍＲＮＡの発現量をＡＣＴＢのｍＲＮＡの発現量との比で表した。結果を表２および図１に示す。
【００３５】
【表１】
2019151600.tif 000006
【００３６】
【表２】
2019151600.tif 000007
【００３７】
（実施例２）
ＮＲ５Ａ１の発現解析  ウェスタンブロット
２４ウェルプレートの１ウェル当たり２×１０５個のＨ２９５Ｒ細胞を播種し、一晩培養した。次いで各濃度でＣＸ−４９４５を含む培地と培地交換し、２４時間培養した。なお、コントロールにはＤＭＳＯを用いた。ＲＩＰＡ  Ｂｕｆｆｅｒにて細胞上清を調整し、抗ＳＴＦ−１および抗ＨＳＰ９０抗体（ＣＳＴ社＃１２８００および＃４８７４）を用いてウェスタンブロットを行った。コントロールであるＤＭＳＯでの発現量を基準とし、ＮＲ５Ａ１の強度をＨＳＰ９０にて補正して発現量（ｆｏｌｄ）とした。結果を表３および図２に示す。
【００３８】
【表３】
2019151600.tif 000008
【００３９】
以上により、ＣＸ−４９４５は、用量依存的にＨ２９５Ｒ細胞におけるＮＲ５Ａ１蛋白質の発現を有意（ｐ＜０．０００１）に抑制することが示された。
【００４０】
（実施例３）
ＮＲ５Ａ１の発現解析  ＲＴ−ＰＣＲ
６ウェルプレートの１ウェル当たり２×１０４個のＨ２９５Ｒの細胞を播種し、一晩培養した。培地を５μＭの濃度でＣＸ−４９４５を含む培地と交換し、２４時間培養した。なお、コントロールにはＤＭＳＯを添加した培地を用いた。ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇをｐｒｏｍｅｇａ社のＲＴキットを用いてｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを鋳型としてＫＯＤ  ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、ＮＲ５Ａ１  ｃＤＮＡのコーディング領域を増幅するプライマーでＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動した。プライマーの配列を表４に、電気泳動の結果を図３に示す。
【００４１】
【表４】
2019151600.tif 000009
【００４２】
図３では、特定化合物で処理したＨ２９５Ｒ細胞から、全長のＮＲ５Ａ１よりも短いＰＣＲ産物が検出された。このＰＣＲ産物をプラスミド（ｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ＴＯＰＯ）にサブクローニングし、配列を決定したところ、２種類のＮＲ５Ａ１アイソフォームとして、ＮＲ５Ａ１のエキソン２とエキソン７の間がスプライシングされ、エキソン１−２−７からなるＳＦ−１ｅｘ２−７と、エキソン３とエキソン７の間がスプライシングされ、エキソン１−２−３−７からなるＳＦ−１ｅｘ３−７が検出された。
【００４３】
（実施例４）
ｓｉＲＮＡによるＣＫ２α発現阻害実験
１×１０６個のＨ２９５Ｒの細胞にｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｒ（Ｌｏｎｚａ社）にて、２００ｐｍｏｌのｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｉＲＮＡ（Ｍｉｓｓｉｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＳＩＣ−００１，ＳＩＧＭＡ社）またはＣＫ２α  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、６ウェルプレートに播種後、一晩培養した。培地交換したのち、トランスフェクションから２４時間後にＣｅｌｌＡｍｐ（Ｔａｋａｒａｂｉｏ社）にて細胞上清を調製した。以下に示すプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＣＫ２αとＮＲ５Ａ１の発現量を解析し、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を実施した。なお、ＣＫ２α  ｓｉＲＮＡには、配列番号９で示される配列をターゲット（オーバーハング２残基を含む）としたｓｉＲＮＡ（配列番号１０および１１）を用いた。ＣＫ２αのｍＲＮＡの発現量を図４Ａに、ＮＲ５Ａ１のｍＲＮＡの発現量を図４Ｂに示す。
【００４４】
【表５】
2019151600.tif 000010
【００４５】
ＣＫ２α  ｓｉＲＮＡによって、ＣＫ２αの発現は有意（ｐ＝０．００２３）に抑制されたが、ＮＲ５Ａ１の発現は抑制されなかった。よって、ＣＸ−４９４５によるＮＲ５Ａ１の発現抑制は、ＣＫ２阻害作用とは異なるメカニズムによるものと考えられる。
【００４６】
（実施例５）
細胞増殖抑制効果
２×１０４個のＨ２９５Ｒ細胞を９６ウェルプレートのウェルに播種し、一晩培養した。次いで、Ｈ２９５Ｒ細胞を各濃度のＣＸ−４９４５を含む培地中で２４、４８、７２時間培養した後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を１０μＬ加え、３時間培養後、４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。培地のみのウェルの吸光度を差し引いた後、培養０日目の吸光度に対する比を算出し、細胞生存率とした。結果を表６および図５に示す。
【００４７】
【表６】
2019151600.tif 000011
【００４８】
Ｈ２９５Ｒ細胞の細胞増殖が、ＣＸ−４９４５の添加によって、用量依存的に有意（ｐ＜０．０００１）に抑制されることが示された。
【００４９】
（実施例６）
ステロイドホルモン産生量の測定
２４ウェルプレートの１ウェル当たり２×１０５個のＨ２９５Ｒ細胞を播種し、一晩培養した。次いで各濃度でＣＸ−４９４５を含む培地と培地交換し、４８時間培養した。培地中のコルチゾール、アルドステロン濃度を、Ｃｏｒｔｉｓｏｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ社）にて測定した。各ウェルのタンパク量をＢＣＡ法にて測定し、タンパク１μｇ当たりのステロイドホルモン分泌量を算出した。コルチゾールの分泌量（ｎｇ／μｇ）を表７および図６Ａに、アルドステロンの分泌量（ｐｇ／μｇ）を表８および図６Ｂに示す。
【００５０】
【表７】
2019151600.tif 000012
【００５１】
【表８】
2019151600.tif 000013
【００５２】
Ｈ２９５Ｒ細胞におけるステロイドホルモン産生が、ＣＸ−４９４５の添加によって、用量依存的に抑制されることが示された。
【００５３】
（実施例７）
ステロイドホルモン産生量の測定２
Ｈ２９５Ｒ細胞に代えて、原発性アルドステロン症患者から摘出された副腎腺腫組織の初代培養細胞および付随して得られた正常副腎初代培養細胞を用いたこと以外は、実施例６と同様にしてステロイドホルモン濃度を測定した。コルチゾール濃度を表９および図７Ａに、アルドステロン濃度を表１０および図７Ｂに示す。
【００５４】
【表９】
2019151600.tif 000014
【００５５】
【表１０】
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【００５６】
ＣＸ−４９４５は、副腎腺腫細胞および正常副腎細胞におけるコルチゾール産生に対しては有意な影響を与えなかった（ｐ＝０．０６２４およびｐ＝０．１１３０）。また正常副腎細胞におけるアルドステロン産生に対しては有意な影響を与えなかったが（ｐ＝０．７０９７）、副腎腺腫細胞におけるアルドステロン産生を有意（ｐ＝０．０００２）に抑制した。また、総蛋白で補正してもＣＸ−４９４５によるアルドステロン産生抑制がみられた。このことから、ＣＸ−４９４５は正常細胞のステロイドホルモン産生には影響せずに、ステロイドホルモン過剰産生細胞におけるステロイドホルモン産生を抑制できることが示唆される。
【００５７】
（実施例８）
カスパーゼ３／７活性の測定
９６ウェルプレートの１ウェル当たり２×１０４個のＨ２９５Ｒの細胞を播種し、一晩培養した。次いで各濃度でＣＸ−４９４５を含む培地と交換し２４時間培養した。培地と等量のＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を加えて、１時間、３７℃、インキュベーションした後、ルミノメーターを用いて、化学発光量（ｕｎｉｔ）を測定した。各ウェルの化学発光量をタンパク量で補正し、タンパク質１μｇ当たりの化学発光量（ｕｎｉｔ／μｇ）を算出した。結果を表１１および図８に示す。
【００５８】
【表１１】
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【００５９】
ＣＸ−４９４５の添加によって、用量依存的にＨ２９５Ｒ細胞におけるカスパーゼ３／７が有意に活性化されることが示された。
【００６０】
（実施例９）
切断カスパーゼ３の検出
２４ウェルプレートの１ウェル当たり２×１０５個のＨ２９５Ｒ細胞を播種し、一晩培養した。次いで各濃度でＣＸ−４９４５を含む培地と培地交換し、２４時間培養した。ＲＩＰＡ  Ｂｕｆｆｅｒにて細胞上清を調製し、抗カスパーゼ３抗体（ＣＳＴ社９６６２）を用いてウェスタンブロットを行い、カスパーゼ３および切断カスパーゼ３を検出した。結果を図９に示す。
【００６１】
（実施例１０）
ＴＵＮＥＬ陽性細胞の検出
４ウェルチャンバースライドの１ウェル当たり１×１０５個のＨ２９５Ｒ細胞を播種し、一晩培養した。次いで各濃度でＣＸ−４９４５を含む培地と培地交換し、２４時間培養した。なお、コントロールにはＤＭＳＯを用いた。細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液にて固定した後、ｐｒｏｍｅｇａ社のＤｅａｄＥｎｄ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ＴＵＮＥＬ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ＴＵＮＥＬ陽性細胞を検出、カウントした。ＴＵＮＥＬ陽性細胞数を全細胞数で割り、ＴＵＮＥＬ陽性細胞率（％）とした。結果を表１２および図１０に示す。
【００６２】
【表１２】
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【００６３】
コントロールであるＤＭＳＯで処理したウェルでは、ＴＵＮＥＬ陽性細胞は検出されなかった。
以上から、Ｈ２９５Ｒ細胞では、ＣＸ−４９４５処理によってＴＵＮＥＬ陽性細胞率（％）が有意に上昇することが示された。またＣＸ−４９４５処理によってＨ２９５Ｒ細胞にアポトーシスが誘導されることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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