(57)【要約】【課題】がんの治療のための組合せ調製物を提供すること。【解決手段】組合せ調製物は、（ａ）ＬＡＧ−３タンパク質またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できるその誘導体；および（ｂ）白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポイソメラーゼＩ阻害剤である抗悪性腫瘍剤を含む。組合せ調製物を使用するがんの治療のための方法も記載される。がんを予防する、治療するまたは回復させる方法であって、ＬＡＧ−３タンパク質またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できるその誘導体および抗悪性腫瘍剤をそのような予防、治療または回復を必要とする対象に投与することを含み、抗悪性腫瘍剤が白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポイソメラーゼＩ阻害剤である、方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組合せ調製物および医薬組成物、ならびに医薬としての、特にがんの治療のためのそれらの使用、ならびにがんの治療のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、標準化されたレジメンの一部として１つまたは複数の細胞傷害性抗悪性腫瘍薬（「化学療法剤」）で治療され得る。化学療法は、患者を治癒すること、または延命することまたは症状を軽減することを目的とし得る。
【０００３】
従来の化学療法剤は、大部分のがん細胞の特性の１つを利用して、急速に分割している細胞を殺すことによって作用する。しかし化学療法は、通常の環境下で急速に分割する細胞、例えば骨髄、消化管および毛包の細胞にも害を与える。これは、化学療法の最も一般的な副作用：骨髄抑制（血液細胞の産生の減少、それにより免疫抑制も）、粘膜炎（消化管の内膜の炎症）および脱毛症（毛髪喪失）を生じさせる。
【０００４】
より有効ながん治療を提供すること、および副作用が低減した有効ながん治療を提供することが必要である。
【０００５】
リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）は、４個の細胞外Ｉｇスーパーファミリードメインを有するＣＤ４ホモログＩ型膜タンパク質である。ＣＤ４と同様に、ＬＡＧ−３はＴ細胞の表面でオリゴマー形成し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するがＣＤ４よりも顕著に高い親和性を有する。ＬＡＧ−３は、細胞表面でＣＤ３−ＴＣＲ複合体と会合する活性化ＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性Ｔリンパ球上に発現され、シグナル伝達を負に調節する。結果としてそれは、Ｔ細胞増殖、機能および恒常性を負に調節する。
【０００６】
ＬＡＧ−３由来可溶性融合タンパク質はＣＤ４よりもはるかに高いアビディティーでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、ＭＨＣクラスＩＩ陽性マクロファージおよび未成熟樹状細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞応答を誘導する能力を増加させ、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞および腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導を増強することが示されている。したがってＬＡＧ−３融合タンパク質は、全身性免疫賦活薬としておよびがんワクチンのためのアジュバントとして使用される。
【０００７】
ＷＯ  ２００９／０４４２７３は単球媒介免疫応答をブーストするため、特にがんの治療のための血液中の単球の数の増加を誘導するための組換えＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体の使用を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００９／０４４２７３号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ＬＡＧ−３タンパク質、またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できるその誘導体、および白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポイソメラーゼＩ阻害剤の投与が、腫瘍成長を低減することに相乗効果を有することが、いまや驚くべきことに見出された。
【００１０】
本発明により（ａ）ＬＡＧ−３タンパク質またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できるその誘導体；および（ｂ）白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポイソメラーゼＩ阻害剤である抗悪性腫瘍剤を含む、組合せ調製物が提供される。
【００１１】
本明細書において使用される用語「組合せ調製物」は、上に規定される組合せ構成成分（ａ）および（ｂ）が独立にまたは組合せ構成成分（ａ）および（ｂ）の区別される量のさまざまな固定された組合せの使用によって投与され得るという意味で「キットオブパーツ」を指す。構成成分は、同時にまたは順々に投与されてよい。構成成分が順々に投与される場合、好ましくは投与間の時間間隔は、構成成分の併用の治療効果が組合せ構成成分（ａ）および（ｂ）のいずれか１つだけの使用によって得られる効果よりも大きいように選択される。
【００１２】
組合せ調製物の構成成分は、１つの組合せ単位剤形中に、または構成成分（ａ）の第１の単位剤形および構成成分（ｂ）の別の第２の単位剤形として存在してよい。組合せ調製物中で投与される組合せ構成成分（ａ）と組合せ構成成分（ｂ）との総量の比は、例えば、患者の特定の疾患、年齢、性別または体重に起因するものであり得る、治療される患者亜集団の要求または患者個人の要求に対処するために変えることができる。
【００１３】
好ましくは少なくとも１つの有益な効果、例えば、抗悪性腫瘍剤の効果の増強、あるいは組合せ構成成分（ａ）および（ｂ）の効果の相互増強、例えば、相加効果を上回る効果、追加的な有利な効果、より少ない副作用、より少ない毒性、または組合せ構成成分（ａ）および（ｂ）の１つもしくは両方の有効投与量と比較した併用治療効果、ならびに非常に好ましくは組合せ構成成分（ａ）および（ｂ）の相乗作用がある。
【００１４】
本発明の組合せ調製物は、哺乳動物、好ましくはヒトへの投与のための医薬用組合せ調製物として提供され得る。ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体は、任意選択で薬学的に許容される担体、賦形剤もしくは希釈剤と一緒に提供されてよく、および／または抗悪性腫瘍剤は任意選択で薬学的に許容される担体、賦形剤もしくは希釈剤と一緒に提供されてよい。
【００１５】
ＬＡＧ−３またはその誘導体は、ＬＡＧ−３誘導体ＬＡＧ−３Ｉｇ融合タンパク質ＩＭＰ３２１の０．２５〜３０ｍｇ、１〜３０ｍｇまたは６〜３０ｍｇのモル当量である用量で存在してよい。ＩＭＰ３２１の皮下（ｓ．ｃ．）注射１回あたり６〜３０ｍｇの用量は、安全であることが示されており、転移性腎細胞がん患者において得られた薬物動態データの結果に基づいて許容可能な全身性曝露を提供する。ｓ．ｃ．注射後少なくとも２４時間１ｎｇ／ｍｌを上回るＩＭＰ３２１の血液濃度が、６ｍｇを超えるＩＭＰ３２１用量を注射された患者において得られる。
【００１６】
本発明の組合せ調製物は、ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体の複数の用量を含む場合がある。
【００１７】
抗悪性腫瘍剤の用量は、使用される特定の抗悪性腫瘍剤に依存する。
【００１８】
白金ベースの抗悪性腫瘍剤は、がん化学療法において使用される白金の配位錯体である。それらはＤＮＡ修復および／またはＤＮＡ合成を阻害し、細胞死を生じさせるＤＮＡ中の架橋結合を形成すると考えられている。白金化合物を使用するがん治療の主な用量制限副作用は、抹消神経毒性である。白金ベースの抗悪性腫瘍剤の例は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチンおよびトリプラチンを含む。
【００１９】
カルボプラチンまたはｃｉｓ−ジアンミン（シクロブタン−１，１−ジカルボキシレート−Ｏ，Ｏ’）白金（ＩＩ）（商品名ＰａｒａｐｌａｔｉｎおよびＰａｒａｐｌａｔｉｎ−ＡＱ）は、一部の形態のがんに対して使用される（主に卵巣癌、肺がん、頭頸部がんおよび子宮内膜、食道、膀胱、乳房および子宮頸部；中枢神経系腫瘍または生殖細胞腫瘍；骨肉腫、ならびに幹細胞移植または骨髄移植のための準備として）。それは、その親化合物シスプラチンと比較して大きく低減した副作用を有する。カルボプラチン投薬についての指針は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）から利用可能である。
【００２０】
オキサリプラチンまたは［（１Ｒ，２Ｒ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン］（エタンジオエート−Ｏ，Ｏ’）白金（ＩＩ）（商品名Ｅｌｏｘａｔｉｎ）は、平面正方形（ｓｑｕａｒｅ  ｐｌａｎａｒ）白金（ＩＩ）中心を含む。シスプラチンおよびカルボプラチンとは対照的に、オキサリプラチンは、２つの単座アミンリガンドの位置に二座リガンド１，２−ジアミノシクロヘキサンを含む。それは二座オキサレート基も有する。オキサリプラチンは、結腸癌に対する抗腫瘍活性を有する。オキサリプラチンは、ＤＮＡ中に鎖間および鎖内の両方の架橋結合を形成することによって機能する。ＤＮＡ中の架橋結合はＤＮＡ複製および転写を妨げ、細胞死を生じさせる。アジュバント設定におけるオキサリプラチンの推奨用量は、２週間ごとに１２サイクル静脈内で反復される８５ｍｇ／ｍ２である。転移性結腸直腸がんの治療におけるオキサリプラチンについての推奨用量は、疾患進行または容認できない毒性まで２週間ごとに静脈内で反復される８５ｍｇ／ｍ２である。
【００２１】
トポイソメラーゼ阻害剤は、通常の細胞周期の際にＤＮＡ鎖のリン酸ジエステル骨格の切断および再結合を触媒することによってＤＮＡ構造における変化を制御する酵素である、トポイソメラーゼ酵素（トポイソメラーゼＩおよびＩＩ）の作用を妨害するように設計された薬剤である。トポイソメラーゼ阻害剤は、細胞周期のライゲーションステップを遮断し、ゲノムの完全性を害する１本鎖および２本鎖切断を生成すると考えられている。これらの切断の導入は続いてアポトーシスおよび細胞死を導く。
【００２２】
ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩ（Ｔｏｐ１）は、複製および転写の際にＤＮＡ高次コイル構造をほどく不可欠な酵素である。Ｔｏｐ１は、二重ヘリックス軸周囲での切断された鎖の回転を可能にするＤＮＡ１本鎖切断を生成する。Ｔｏｐ１は、無傷の二重鎖ＤＮＡを再構築するために切断された鎖を再ライゲーションもする。切断複合体として知られているＴｏｐ１−ＤＮＡ中間体は、一過性であり、通常の環境下では低レベルで存在する。しかし、カンプトテシンなどのＴｏｐ１阻害剤での治療は、切断可能な複合体を安定化し、ＤＮＡ再ライゲーションを妨げ、致死性ＤＮＡ鎖切断を誘導する。がん細胞は、これらのＤＮＡ損傷の生成に選択的に感受性である。
【００２３】
トポテカン、または（Ｓ）−１０−［（ジメチルアミノ）メチル］−４−エチル−４，９−ジヒドロキシ−１Ｈ−ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）−ジオンモノハイドロクロライド（商品名Ｈｙｃａｍｔｉｎ）は、トポイソメラーゼＩ阻害剤である化学療法剤である。それはカンプトテシンの水溶性誘導体である。それは、卵巣がんおよび肺がんならびに他のがんの種類を治療するために塩酸塩の形態で使用される。トポテカンはカンプトテシンの半合成誘導体である。カンプトテシンは、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ  ａｃｕｍｉｎａｔａの木の樹皮から抽出される天然産生物である。トポイソメラーゼ−Ｉは、１本鎖切断を開くことによってＤＮＡ中のねじれひずみを解放する核酵素である。トポイソメラーゼ−Ｉが１本鎖切断を作り出すと、ＤＮＡは前進している複製フォークの前で回転できる。トポテカンはＤＮＡ塩基の間にインターカレートする。ＤＮＡ複製機構が、トポテカンがインターカレートされている部位に達すると、このインターカレーションはＤＮＡ複製機構を破壊する。この破壊は、ＤＮＡ複製を妨げ、最終的には細胞死を導く。哺乳動物細胞は、これらの二本鎖切断を効率的に修復できない。この工程は、ＤＮＡ鎖中に切断をもたらし、アポトーシスを生じさせる。
【００２４】
Ｈｙｃａｍｔｉｎカプセル剤の推奨用量は、各コースの開始の間に３週間の間隔を含んで５日間連続で投与される２．３ｍｇ／ｍ２体表面積／日である。
【００２５】
別のカンプトテシン誘導体イリノテカン（ＣＰＴ１１）は、結腸がんの治療のために承認されている。
【００２６】
本発明の組合せ調製物は、抗悪性腫瘍剤の複数の用量を含んでよい。
【００２７】
ＬＡＧ−３タンパク質は、単離された天然または組換えＬＡＧ−３タンパク質であってよい。ＬＡＧ−３タンパク質は、霊長類またはマウスＬＡＧ−３タンパク質などの任意の好適な種由来のＬＡＧ−３タンパク質のアミノ配列を含んでもよいが、好ましくはヒトＬＡＧ−３タンパク質のアミノ配列である。ヒトおよびマウスＬＡＧ−３タンパク質のアミノ酸配列は、Huardら（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、１１巻:５７４４〜５７４９頁、１９９７年）の図１に提供されている。ヒトＬＡＧ−３タンパク質の配列は、下の図１３に反復されている（配列番号１）。ヒトＬＡＧ−３の４個の細胞外Ｉｇスーパーファミリードメイン（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４）のアミノ酸配列も、Huardらの図１のアミノ酸残基：１〜１４９（Ｄ１）；１５０〜２３９（Ｄ２）；２４０〜３３０（Ｄ３）；および３３１〜４１２（Ｄ４）に同定されている。
【００２８】
ＬＡＧ−３タンパク質の誘導体は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できるＬＡＧ−３タンパク質の断片、バリアントまたは変異体を含む。ＬＡＧ−３タンパク質のいくつかの誘導体は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できることが知られている。そのような誘導体の多数の例はHuardら（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、１１巻:５７４４〜５７４９頁、１９９７年）に記載されている。この文書は、ＬＡＧ−３タンパク質上のＭＨＣクラスＩＩ結合部位の特徴付けを記載している。ＬＡＧ−３の変異体を作るための方法ならびにクラスＩＩ陽性Ｄａｕｄｉ細胞に結合するＬＡＧ−３変異体の能力を決定するための定量的細胞接着アッセイが記載されている。ＬＡＧ−３の一部の異なる変異体のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合が決定された。いくつかの変異は、クラスＩＩ結合を低減することができる一方で、他の変異はクラスＩＩ分子に対するＬＡＧ−３の親和性を増加させた。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質に結合するために不可欠な残基の多くは、ＬＡＧ−３  Ｄ１ドメイン中の大きな３０アミノ酸エクストラループ（ｅｘｔｒａ−ｌｏｏｐ）構造の塩基にクラスター化されている。ヒトＬＡＧ−３タンパク質のＤ１ドメインのエクストラループ構造のアミノ酸配列は、図１３中の下線付き配列であるＧＰＰＡＡＡＰＧＨＰＬＡＰＧＰＨＰＡＡＰＳＳＷＧＰＲＰＲＲＹ（配列番号２）である。
【００２９】
ＬＡＧ−３タンパク質誘導体は、ヒトＬＡＧ−３  Ｄ１ドメインの３０アミノ酸エクストラループ配列、または１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を含むそのような配列のバリアントを含んでよい。バリアントは、ヒトＬＡＧ−３  Ｄ１ドメインの３０アミノ酸エクストラループ配列と少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。
【００３０】
ＬＡＧ−３タンパク質の誘導体は、ＬＡＧ−３タンパク質、好ましくはヒトＬＡＧ−３タンパク質のドメインＤ１および任意選択でドメインＤ２のアミノ酸配列を含んでよい。
【００３１】
ＬＡＧ−３タンパク質の誘導体は、ＬＡＧ−３タンパク質、好ましくはヒトＬＡＧ−３タンパク質のドメインＤ１と、またはドメインＤ１およびＤ２と少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。
【００３２】
ＬＡＧ−３タンパク質の誘導体は、ＬＡＧ−３タンパク質、好ましくはヒトＬＡＧ−３タンパク質のドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３および任意選択でＤ４のアミノ酸配列を含んでよい。
【００３３】
ＬＡＧ−３タンパク質の誘導体は、ＬＡＧ−３タンパク質、好ましくはヒトＬＡＧ−３のドメインＤ１、Ｄ２およびＤ３と、またはドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４と少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。
【００３４】
アミノ酸配列間の配列同一性は、配列のアライメントを比較することによって決定され得る。比較される配列中の相当する位置が同じアミノ酸によって占められている場合、それにより分子はその位置で同一である。同一性の百分率としてのアライメントをスコアリングは、比較される配列によって共有される位置での同一のアミノ酸の数の関数である。配列を比較するときに、最適なアライメントは、配列中の可能性がある挿入および欠失を考慮に入れるために１つまたは複数の配列に導入されるギャップを必要とする場合がある。配列比較方法は、比較される配列中の同じ数の同一分子についてギャップペナルティーを用いる場合があり、可能な限り少ないギャップを含む配列アライメントは、２つの比較される配列間のより高い関連性を反映しており、多数のギャップを含むものよりも高いスコアを達成する。最大同一性パーセントの算出は、ギャップペナルティーを考慮に入れる最適なアライメントの作成を含む。
【００３５】
配列比較を実行するために好適なコンピュータープログラムは、商業的におよび公共部門において広く入手可能である。例はＭａｔＧａｔ（Campanellaら、２００３年、BMC  Bioinformatics  ４巻:２９頁;プログラムはhttp://bitincka.com/ledion/matgatから入手可能）、Ｇａｐ（NeedlemanおよびWunsch、１９７０年、J.  Mol.  Biol.  ４８巻:４４３〜４５３頁）、ＦＡＳＴＡ（Altschulら、１９９０年、J.  Mol.  Biol.  ２１５巻:４０３〜４１０頁;プログラムはhttp://www.ebi.ac.uk/fastaから入手可能）、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ２．０およびＸ  ２．０（Larkinら、２００７年、Bioinformatics  ２３巻:
２９４７〜２９４８頁;プログラムはhttp://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2から入手可能）およびＥＭＢＯＳＳ  Ｐａｉｒｗｉｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ（NeedlemanおよびWunsch、１９７０年、上記;  Kruskal、１９８３年、Time  warps,  string  edits  and  macromolecules:  the  theory  and  practice  of  sequence  comparison、SankoffおよびKruskal（編）、１〜４４頁、Addison  Wesley;プログラムはhttp://www.ebi.ac.uk/tools/emboss/alignから入手可能）を含む。すべてのプログラムは初期パラメーターを使用して実行できる。
【００３６】
例えば配列比較は、それらの長さ全体を考慮して百分率同一性スコアを提供する場合に、２つの配列の最適なアライメント（ギャップを含む）を決定するＥＭＢＯＳＳ  Ｐａｉｒｗｉｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓの「ニードル」法を使用して行われてよい。アミノ酸配列比較についての初期パラメーター（「タンパク質分子」選択肢）は、ギャップ伸長ペナルティー：０．５、ギャップオープンペナルティー：１０．０、マトリクス：Ｂｌｏｓｕｍ  ６２であってよい。
【００３７】
配列比較は、参照配列の全長にわたって実施されてよい。
【００３８】
ＬＡＧ−３タンパク質誘導体は、免疫グロブリンＦｃアミノ酸配列、好ましくはヒトＩｇＧ１  Ｆｃアミノ酸配列に、任意選択でリンカーアミノ酸配列によって融合されてよい。
【００３９】
ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するＬＡＧ−３タンパク質の誘導体の能力は、Huardら（上記）に記載の定量的細胞接着アッセイを使用して決定され得る。ＬＡＧ−３タンパク質の誘導体のＭＨＣクラスＩＩ分子への親和性は、ヒトＬＡＧ−３タンパク質のクラスＩＩ分子への親和性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％であってよい。好ましくはＬＡＧ−３タンパク質の誘導体のＭＨＣクラスＩＩ分子への親和性は、ヒトＬＡＧ−３タンパク質のクラスＩＩ分子への親和性の少なくとも５０％である。
【００４０】
ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できるＬＡＧ−３タンパク質の好適な誘導体の例は：
ヒトＬＡＧ−３配列のアミノ酸残基２３から４４８；
ＬＡＧ−３のドメインＤ１およびＤ２のアミノ酸配列；
次の位置：ＡＲＧがＧＬＵで置換されている７３位；ＡＲＧがＡＬＡまたはＧＬＵで置換されている７５位；ＡＲＧがＧＬＵで置換されている７６位；ＡＳＰがＡＬＡで置換されている３０位；ＨＩＳがＡＬＡで置換されている５６位；ＴＹＲがＰＨＥで置換されている７７位；ＡＲＧがＡＬＡで置換されている８８位；ＡＲＧがＡＬＡで置換されている１０３位；ＡＳＰがＧＬＵで置換されている１０９位；ＡＲＧがＡＬＡで置換されている１１５位、の１つまたは複数にアミノ酸置換を有するＬＡＧ−３のドメインＤ１およびＤ２のアミノ酸配列；
アミノ酸残基５４から６６の欠失を有するＬＡＧ−３のドメインＤ１のアミノ酸配列；
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合されたｈＬＡＧ−３の細胞外ドメインをコードするプラスミドでトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞で産生された組換え可溶性ヒトＬＡＧ−３Ｉｇ融合タンパク質（ＩＭＰ３２１）−２００ｋＤａ二量体
を含む誘導体を含む。
【００４１】
本発明により（ａ）ＬＡＧ−３タンパク質、またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できるその誘導体；（ｂ）白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポイソメラーゼＩ阻害剤である抗悪性腫瘍剤；および（ｃ）薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物も提供される。
【００４２】
本発明により医薬としての使用のための本発明の組合せ調製物または医薬組成物がさらに提供される。
【００４３】
本発明は、がんを予防する、治療するまたは回復させるための本発明の組合せ調製物または医薬組成物も提供する。
【００４４】
本発明により、がんを予防する、治療するまたは回復させるための医薬の製造における本発明の組合せ調製物または医薬組成物の使用がさらに提供される。
【００４５】
本発明によりがんを予防する、治療するまたは回復させる方法であって、ＬＡＧ−３タンパク質またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できるその誘導体および抗悪性腫瘍剤をそのような予防、治療または回復を必要とする対象に投与することを含み、抗悪性腫瘍剤が白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポイソメラーゼＩ阻害剤である、方法も提供される。
【００４６】
ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体および抗悪性腫瘍剤は、対象に逐次投与されてよい、すなわちＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体は、抗悪性腫瘍剤より前に、共にまたは後に投与されてよい。
【００４７】
ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体および抗悪性腫瘍剤は、対象に互いに９６時間、７２時間、４８時間、２４時間または１２時間以内に投与されてよい。
【００４８】
代替的に、ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体および抗悪性腫瘍剤は、例えばＬＡＧ−３タンパク質もしくはその誘導体および抗悪性腫瘍剤を含む組成物として、またはＬＡＧ−３タンパク質もしくはその誘導体および抗悪性腫瘍剤の別々の用量の同時投与によって対象に共投与されてよい。
【００４９】
一部の実施形態によれば、ＬＡＧ−３タンパク質もしくはその誘導体の複数の用量および／または抗悪性腫瘍剤の複数の用量が、対象に投与される。
【００５０】
一部の実施形態によれば、ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体の用量は、抗悪性腫瘍剤の２またはそれを超える用量の各投与の前に、それと共にまたはその後に投与される。
【００５１】
例えば、ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体の用量は、抗悪性腫瘍剤の２またはそれを超える用量の各投与の９６時間、７２時間、４８時間、２４時間または１２時間以内に投与されてよい。
【００５２】
本発明による併用療法において使用される構成成分の適切な投与量の選択は、例えば、患者の健康全般および併用療法への応答を含む患者の所見によって、当業者によって決定および最適化され得る。最適化は、例えば、患者が望ましい治療効果を示さないことが決定された場合に、または反対に数が多すぎるもしくは困難な重症度である望ましくないもしくは有害な副作用を患者が経験している場合に必要である場合がある。
【００５３】
本発明による併用療法において使用される構成成分の用量は、組合せにおける構成成分の治療有効量を提供するために選択されるべきである。併用療法の「有効量」は、がんに関連する少なくとも１つの病理学的パラメーターの低減をもたらす量である。例えば、一部の実施形態では、併用療法の有効量は、併用療法を伴わずにがんに関連するパラメーターにおいて期待される低減と比較して少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％のパラメーターにおける低減を達成するために有効な量である。例えば、パラメーターは腫瘍成長であってよい。
【００５４】
本発明により併用治療は、単剤療法としての抗悪性腫瘍剤またはＬＡＧ−３タンパク質もしくはその誘導体の効果と比較して抗悪性腫瘍剤またはＬＡＧ−３タンパク質もしくはその誘導体の治療効果を増加させるために、あるいは個々の構成成分の望まれないまたは有害な副作用の危険性を予防するまたはさらに低減すると同時に、得られる組合せ中での個々の構成成分の用量を減少させるために用いられ得る。
【００５５】
一実施形態では、ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体および抗悪性腫瘍剤は、単剤療法としての各化合物についての典型的な規定用量範囲内である用量にそれぞれ規定される。化合物は、別々の投与量としてまたは組合せ投与量として規定されてよい。そのような組合せは、単剤療法としてのいずれかの化合物の効果と比較して有効性の増加を提供する。
【００５６】
別の実施形態では、ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体および抗悪性腫瘍剤は、単剤療法としての各構成成分についての典型的な規定用量より低い用量だが、組合せで治療有効性を有する用量でそれぞれ規定される。構成成分は、別々の投与量としてまたは組合せ投与量として規定されてよい。組合せにおける構成成分の投与量は、単剤療法としてのＬＡＧ−３タンパク質もしくはその誘導体または抗悪性腫瘍剤と同様のレベルの治療有効性を提供するが、ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体および抗悪性腫瘍剤のより低い用量が、単剤療法としての各化合物の規定投与量と比較して有害な副作用の危険性を低減する有利点を伴うように選択され得る。
【００５７】
別の実施形態では、抗悪性腫瘍剤の規定投与量は、単剤療法のための典型的な規定用量範囲内であり、ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体は、単剤療法のための典型的な規定用量より低い投与量に規定される。
【００５８】
さらなる実施形態では、抗悪性腫瘍剤の規定投与量は、単剤療法のための典型的な規定用量より低く、ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体は、単剤療法のための典型的な規定用量範囲内である投与量に規定される。
【００５９】
単剤療法のための典型的な規定用量より低い好ましい投与量は、典型的な規定用量の５０％までまたは２５％までである用量である。
【００６０】
別々の投与量で投与される場合、ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体および抗悪性腫瘍剤は、実質的に同時に（例えば、互いに約６０分間、約５０分間、約４０分間、約３０分間、約２０分間、約１０分間、約５分間または約１分間以内）、あるいは約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約１０時間、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約７２時間もしくは約９６時間またはそれを超えるだけ時間を離して投与されてよい。
【００６１】
当業者は、ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体および抗悪性腫瘍剤の特定の組合せに応じて逐次投与のために好適な時間経過を決定および最適化できる。時間経過の選択は好ましくは、少なくとも１つの有益な効果、例えば、ＬＡＧ−３タンパク質もしくはその誘導体または抗悪性腫瘍剤の効果の増強、または組合せ構成成分の効果の相互増強、例えば、相加効果を上回る効果、追加的な有利な効果、より少ない副作用、より少ない毒性、もしくは組合せ構成成分の１つもしくは両方の非有効投与量と比較した併用治療効果、および非常に好ましくは組合せ構成成分の相乗作用が認められるように行われる。
【００６２】
最適な時間経過が、投与後に化合物のピーク血漿濃度に達するまでにかかる時間、各化合物の排出半減期などの要因に依存することが理解される。好ましくは時間の差異は、投与される第１の構成成分の半減期未満である。
【００６３】
当業者は、また、投与のための適切な時期を決定できる。ある特定の実施形態では、抗悪性腫瘍剤は朝に投与されてよく、ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体は、少なくとも１度その日の内に投与されてよい。他の実施形態では、抗悪性腫瘍剤およびＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体は、実質的に同じ時に投与されてよい。
【００６４】
一部の実施形態では、抗悪性腫瘍剤は、例えば、医師によって対象に投与されてよく、対象は、ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体の用量を、後に（例えばその日の内にまたは翌日に）投与するための、例えば予め充填されたシリンジ中で提供されてよい。
【００６５】
対象は、抗悪性腫瘍剤およびＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体の用量を週、月または年の期間にわたって受ける場合がある。例えば、１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、２年、３年、４年、５年またはそれを超える。
【００６６】
好ましくは、対象は、哺乳動物対象、より好ましくはヒト対象である。
【００６７】
本発明により治療され得るがんの例は、乳房、卵巣、肺、頭部、首、子宮内膜、食道、膀胱、子宮頸部、骨肉腫、結腸、結腸直腸がん、リンパ腫および中枢神経系または生殖細胞腫瘍を含む。
【００６８】
一般に、本発明の組合せの構成成分または本発明の組成物は、公知の手段によって、任意の好適な製剤中で、任意の好適な経路によって投与されてよい。一部の実施形態では、ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体は、非経口的に（例えば、皮下、静脈内または筋肉内注射によって）投与される。一部の実施形態では、抗悪性腫瘍剤は、静脈内に投与される。特定の実施形態では、ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体は皮下に投与され、抗悪性腫瘍剤は静脈内に投与される。
【００６９】
好適な医薬組成物および剤形は、医薬用製剤の分野の当業者に公知のならびに関連テキストおよび文献、例えばRemington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy  (Easton,  Pa.:  Mack  Publishing  Co.、１９９５年)に記載されている従来の方法を使用して調製されてよい。
【００７０】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために本発明の組合せまたは組成物を単位剤形に製剤化することは特に有利である。本明細書において使用される用語「単位剤形」は、治療される個体のための単位の投与量として適する物理的に別個の単位を指す。すなわち、組成物は、必要とされる医薬用担体と関連して所望の治療効果を産生するように算出された活性剤の予め決定された「単位投与量」の分量をそれぞれ含有する別個の投与量単位に製剤化される。本発明の単位剤形の規格は、送達される活性剤の固有の特徴に依存する。投与量は、常用量および成分の投与の様式を参照してさらに決定されてよい。一部の場合では、組合わせにおける２つまたはそれを超える個々の投与単位が活性剤の治療有効量を提供する、例えば一緒に摂取される２個の錠剤またはカプセル剤が、各錠剤またはカプセル剤中の単位投与量が治療有効量のおよそ５０％であるように、治療有効投与量を提供できることは留意されるべきである。
【００７１】
非経口投与のための本発明による調製物は、滅菌水溶液および非水溶液、懸濁液ならびにエマルションを含む。注射用水溶液は、活性剤を水溶性形態で含有する。非水性溶媒またはビヒクルの例は、オリーブ油およびコーン油などの脂肪油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、プロピレングリコールなどの低分子量アルコール、ポリエチレングリコールなどの合成親水性ポリマー、リポソームなどを含む。非経口製剤は、可溶化剤、保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤および安定化剤などのアジュバントも含有する場合があり、水性懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、およびデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有する場合がある。注射用製剤は、滅菌剤の組み込み、細菌保持フィルターを通じた濾過、照射または加熱によって滅菌状態にされてよい。それらは、滅菌注射用媒体を使用して製造されてもよい。活性剤は、注射を介する投与の直前に好適なビヒクルで再水和され得る乾燥形態、例えば凍結乾燥形態であってもよい。
【００７２】
既に記載の製剤に加えて、活性剤は、活性剤の制御放出、好ましくは長期間にわたる徐放のためのデポー調製物として製剤化されてよい。これらの徐放剤形は、インプラント術（例えば、皮下もしくは筋肉内にまたは筋肉内注射によって）によって一般に投与される。
【００７３】
本発明の組合せ調製物は、組合せでの構成成分の投与のための説明書と共に包装されてよい。説明書は、好適な記録媒体または基板上に記録されてよい。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの基板上に印刷されてよい。説明書は、添付文書として、容器またはその構成成分のラベル（すなわち、包装または小分け包装に付随する）に存在してよい。他の実施形態では、説明書は、好適なコンピュータ可読保存媒体上に存在する電子的保存データファイル、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケットとして存在する。組合せ調製物の構成成分の一部またはすべては、滅菌性を維持するために好適な包装中に包装されてよい。
【００７４】
本発明の実施形態は、添付の図面を参照して下の実施例に記載される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）ＬＡＧ−３タンパク質またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できるその誘導体；および（ｂ）白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポイソメラーゼＩ阻害剤である抗悪性腫瘍剤を含む、組合せ調製物。
（項目２）
前記ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体および前記抗悪性腫瘍剤の共投与または逐次投与のための、項目１に記載の組合せ調製物。
（項目３）
前記ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体が、前記抗悪性腫瘍剤から分離されている、項目１または２に記載の組合せ調製物。
（項目４）
前記ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体が、ＬＡＧ−３Ｉｇ融合タンパク質ＩＭＰ３２１の０．２５〜３０ｍｇのモル当量である用量で存在する、先行する項目のいずれかに記載の組合せ調製物。
（項目５）
前記ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体の複数の用量を含む、先行する項目のいずれかに記載の組合せ調製物。
（項目６）
前記抗悪性腫瘍剤の複数の用量を含む、先行する項目のいずれかに記載の組合せ調製物。
（項目７）
前記白金ベースの抗悪性腫瘍剤が、オキサリプラチンまたはカルボプラチンを含む、先行する項目のいずれかに記載の組合せ調製物。
（項目８）
前記トポイソメラーゼＩ阻害剤が、トポテカンを含む、項目１から６のいずれかに記載の組合せ調製物。
（項目９）
ＬＡＧ−３タンパク質の前記誘導体が、ＬＡＧ−３タンパク質、好ましくはヒトＬＡＧ−３タンパク質のドメインＤ１および任意選択でドメインＤ２と少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行する項目のいずれかに記載の組合せ調製物。
（項目１０）
ＬＡＧ−３タンパク質の前記誘導体が、ＬＡＧ−３タンパク質、好ましくはヒトＬＡＧ−３タンパク質のドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３および任意選択でＤ４と少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行する項目のいずれかに記載の組合せ調製物。
（項目１１）
ＬＡＧ−３タンパク質の前記誘導体が、免疫グロブリンＦｃ配列に融合されている、先行する項目のいずれかに記載の組合せ調製物。
（項目１２）
（ａ）ＬＡＧ−３タンパク質、またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できるその誘導体；（ｂ）白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポイソメラーゼＩ阻害剤である抗悪性腫瘍剤；および（ｃ）薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物。
（項目１３）
医薬としての使用のための、項目１から１１のいずれかに記載の組合せ調製物または項目１２に記載の医薬組成物。
（項目１４）
がんを予防する、治療するまたは回復させるための、項目１から１１のいずれかに記載の組合せ調製物または項目１２に記載の医薬組成物。
（項目１５）
がんを予防する、治療するまたは回復させるための医薬の製造における、項目１から１１のいずれかに記載の組合せ調製物または項目１２に記載の医薬組成物の使用。
（項目１６）
がんを予防する、治療するまたは回復させる方法であって、ＬＡＧ−３タンパク質またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できるその誘導体および抗悪性腫瘍剤を、そのような予防、治療または回復を必要とする対象に投与することを含み、該抗悪性腫瘍剤が白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポイソメラーゼＩ阻害剤である、方法。
（項目１７）
前記ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体および前記抗悪性腫瘍剤が、前記対象に逐次投与される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体が、前記抗悪性腫瘍剤の後に投与される、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体および前記抗悪性腫瘍剤が、互いに９６時間以内に前記対象に投与される、項目１７または１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体および前記抗悪性腫瘍剤が、前記対象に共投与される、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
前記ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体が、ＬＡＧ−３Ｉｇ融合タンパク質ＩＭＰ３２１の０．２５〜３０ｍｇのモル当量である用量で前記対象に投与される、項目１６から２０のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体の複数の用量が、前記対象に投与される、項目１６から２１のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記抗悪性腫瘍剤の複数の用量が、前記対象に投与される、項目１６から２２のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
前記ＬＡＧ−３タンパク質またはその誘導体の用量が、２またはそれを超える用量の前記抗悪性腫瘍剤の各投与の前に、それと共にまたはその後に投与される、項目２２または２３に記載の方法。
（項目２５）
前記白金ベースの抗悪性腫瘍剤が、オキサリプラチンまたはカルボプラチンを含む、項目１６から２４のいずれかに記載の方法。
（項目２６）
前記トポイソメラーゼＩ阻害剤が、トポテカンを含む、項目１６から２５のいずれかに記載の方法。
（項目２７）
ＬＡＧ−３タンパク質の前記誘導体が、ＬＡＧ−３タンパク質、好ましくはヒトＬＡＧ−３タンパク質のドメインＤ１、および任意選択でＤ２と少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１６から２６のいずれかに記載の方法。
（項目２８）
ＬＡＧ−３タンパク質の前記誘導体が、ＬＡＧ−３タンパク質、好ましくはヒトＬＡＧ−３タンパク質のドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３および任意選択でＤ４と少なくとも７０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１６から２７のいずれかに記載の方法。
（項目２９）
ＬＡＧ−３タンパク質の前記誘導体が、免疫グロブリンＦｃ配列に融合されている、項目１６から２８のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、がんの治療でのＬＡＧ−３誘導体およびトポテカンの投与の効果を示す。
【００７６】
【図２】図２は、がんの治療でのＬＡＧ−３誘導体およびカルボプラチンの投与の効果を示す。
【００７７】
【図３】図３は、がんの治療での（Ａ）ＬＡＧ−３誘導体およびカルボプラチン、または（Ｂ）ＬＡＧ−３誘導体およびオキサリプラチンの投与の効果を示す。
【００７８】
【図４】図４は、がんの治療でのＬＡＧ−３誘導体およびオキサリプラチンの投与の効果を示す。（Ａ）は腫瘍サイズへの効果を示し、（Ｂ）は生存への効果を示す。
【００７９】
【図５】図５は、免疫グロブリンＦｃ（ＩｇＦｃ）配列に融合されたＬＡＧ−３タンパク質の誘導体を示す説明図である。
【００８０】
【図６】図６は、ＬＡＧ−３誘導体のＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞への結合を示す。
【００８１】
【図７】図７は、ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を遮断する抗体によるＬＡＧ−３誘導体のＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞への結合の阻害を示す。
【００８２】
【図８】図８は、ＣＣＬ４分泌によって決定されたＬＡＧ−３誘導体によるＴＨＰ−１細胞の活性化を示す。
【００８３】
【図９】図９は、ＴＮＦ−α分泌によって決定されたＬＡＧ−３誘導体によるＴＨＰ−１細胞の活性化を示す。
【００８４】
【図１０】図１０は、ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を遮断する抗体によるＬＡＧ誘導体誘導単球活性化の阻害を示す。
【００８５】
【図１１】図１１は、ＬＡＧ−３誘導体による抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化を示す。
【００８６】
【図１２】図１２は、ＬＡＧ−３誘導体によるＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化を示す。
【００８７】
【図１３】図１３は、成熟ヒトＬＡＧ−３タンパク質のアミノ酸配列を示す。４個の細胞外Ｉｇスーパーファミリードメインは、アミノ酸残基：１〜１４９（Ｄ１）；１５０〜２３９（Ｄ２）；２４０〜３３０（Ｄ３）；および３３１〜４１２（Ｄ４）にある。ヒトＬＡＧ−３タンパク質のＤ１ドメインのエクストラループ構造のアミノ酸配列を太字下線付きで示す。
【実施例】
【００８８】
（実施例１）
がんの治療でのＬＡＧ−３誘導体およびトポイソメラーゼＩ阻害剤の投与の効果
マウス同系皮膚腫瘍モデルを、結腸直腸腺癌細胞株ＣＴ２６を使用して確立した。
【００８９】
腫瘍細胞の最小腫瘍形成量（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｄｏｓｅ）（ＭＴＤ）（細胞０．５ｘ１０５個）の４分の１を０日目に、４つの群のＢＡＬＢ／ｃマウス（５週齢）の右側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）注射によってインプラントした。マウスに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（群１のマウス）、ＬＡＧ−３誘導体ＩＭＰ３２１（群２のマウス）、ＩＭＰ３２１およびトポテカン（群３のマウス）またはトポテカン単独（群４のマウス）を次のスケジュールに従って注射した：
群１（マウス８匹）：陰性対照：Ｄ１１、Ｄ１４、Ｄ１８、Ｄ２１、Ｄ２５およびＤ２８にＰＢＳ  ｓ．ｃ．注射；
群２（マウス７匹）：Ｄ１１、Ｄ１４、Ｄ１８、Ｄ２１、Ｄ２５およびＤ２８にＩＭＰ３２１  ｓ．ｃ．注射（５０μｇ、１．９ｍｇ／ｍｌ）；
群３（マウス８匹）：Ｄ１１、Ｄ１４、Ｄ１８、Ｄ２１、Ｄ２５およびＤ２８にＩＭＰ３２１  ｓ．ｃ．注射（５０μｇ、１．９ｍｇ／ｍｌ）、加えてＤ１０、Ｄ１３およびＤ１７にトポテカンｉ．ｐ．注射（４５μｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ）；
群４（マウス８匹）：Ｄ１０、Ｄ１３およびＤ１７にトポテカンｉ．ｐ．注射（４５μｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ）。
【００９０】
腫瘍成長を、ノギスを使用して２つの直交する腫瘍直径を測定することによって１週間に２回モニターした。結果を図１に示す。腫瘍サイズは、ｍｍ２での断面積を意味する。
【００９１】
結果は、ＩＭＰ３２１単独は腫瘍成長に効果を有さず、トポテカンは腫瘍成長の低減にいくらかの効果を有したが、ＩＭＰ３２１およびトポテカンでの併用治療がより大きな（すなわち相乗的）効果を有することを示している。
【００９２】
（実施例２）
がんの治療でのＬＡＧ−３誘導体および白金ベースの抗悪性腫瘍剤の投与の効果
マウス同系皮膚腫瘍モデルを、リンパ腫細胞株ＥＬ４を使用して確立した。
【００９３】
腫瘍細胞の最小腫瘍形成量（ＭＴＤ）（細胞５ｘ１０５個）を０日目にＣ５７Ｂｌ／６マウス（５週齢）の右側腹部にｓ．ｃ．注射によってインプラントした。マウスに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（群１のマウス）、ＩＭＰ３２１（群２のマウス）、ＩＭＰ３２１およびカルボプラチン（群３のマウス）またはカルボプラチン単独（群４のマウス）を次のスケジュールに従って注射した：
群１（マウス８匹）：陰性対照：Ｄ７、Ｄ１１、Ｄ１４、Ｄ１９、Ｄ２１およびＤ２４にＰＢＳ  ｓ．ｃ．注射；
群２（マウス８匹）：Ｄ７、Ｄ１１、Ｄ１４、Ｄ１９、Ｄ２１およびＤ２４にＩＭＰ３２１  ｓ．ｃ．注射（５０μｇ、３．９６ｍｇ／ｍｌ）；
群３（マウス８匹）：Ｄ７、Ｄ１１、Ｄ１４、Ｄ１９、Ｄ２１およびＤ２４にＩＭＰ３２１  ｓ．ｃ．注射（５０μｇ、３．９６ｍｇ／ｍｌ）、加えてＤ６、Ｄ１０、Ｄ１３およびＤ１７にカルボプラチンｉ．ｐ．注射（２８８μｇ、１６ｍｇ／ｋｇ）；
群４（マウス８匹）：Ｄ６、Ｄ１０、Ｄ１３およびＤ１７にカルボプラチンｉ．ｐ．注射（２８８μｇ、１６ｍｇ／ｋｇ）。
【００９４】
腫瘍成長を、ノギスを使用して２つの直交する腫瘍直径を測定することによって１週間に２回モニターした。結果を図２に示す。腫瘍サイズは、ｍｍ２での断面積を意味する。
【００９５】
結果は、ＩＭＰ３２１単独は腫瘍成長に効果を有さず、カルボプラチン単独はあるとしても非常にわずかな効果を有したが、ＩＭＰ３２１およびカルボプラチンでの併用治療は腫瘍成長を低減したことを示し、それにより併用投与の相乗効果を実証している。
【００９６】
（実施例３）
がんの治療でのＬＡＧ−３誘導体およびさまざまな白金ベースの抗悪性腫瘍剤の投与の効果
マウス同系皮膚腫瘍モデルを、リンパ腫細胞株ＥＬ４を使用して確立した。
【００９７】
腫瘍細胞の最小腫瘍形成量（ＭＴＤ）（細胞５ｘ１０５個）を０日目にＣ５７Ｂｌ／６マウス（５週齢）の右側腹部にｓ．ｃ．注射によってインプラントした。マウスに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（群１のマウス）、ＩＭＰ３２１（群２のマウス）、ＩＭＰ３２１およびカルボプラチン（群３のマウス）、カルボプラチン単独（群４のマウス）、ＩＭＰ３２１およびオキサリプラチン（群５のマウス）またはオキサリプラチン単独（群６のマウス）を次のスケジュールに従って注射した：
群１（マウス１０匹）：陰性対照：Ｄ７、Ｄ１１、Ｄ１４、Ｄ１８、Ｄ２１およびＤ２５にＰＢＳ  ｓ．ｃ．注射；
群２（マウス１０匹）：Ｄ７、Ｄ１１、Ｄ１４、Ｄ１８、Ｄ２１およびＤ２５にＩＭＰ３２１  ｓ．ｃ．注射（５０μｇ、１．９ｍｇ／ｍｌ）；
群３（マウス９匹）：Ｄ７、Ｄ１１、Ｄ１４、Ｄ１８、Ｄ２１およびＤ２５にＩＭＰ３２１  ｓ．ｃ．注射（５０μｇ、１．９ｍｇ／ｍｌ）、加えてＤ６、Ｄ１０、Ｄ１３およびＤ１７にカルボプラチンｉ．ｐ．注射（２８８μｇ、１６ｍｇ／ｋｇ）；
群４（マウス１０匹）：Ｄ６、Ｄ１０、Ｄ１３およびＤ１７にカルボプラチンｉ．ｐ．注射（２８８μｇ、１６ｍｇ／ｋｇ）；
群５（マウス１０匹）：Ｄ７、Ｄ１１、Ｄ１４、Ｄ１８、Ｄ２１およびＤ２５にＩＭＰ３２１  ｓ．ｃ．注射（５０μｇ、１．９ｍｇ／ｍｌ）に加えてＤ６およびＤ１０にオキサリプラチンｉ．ｐ．注射（５４μｇ、３ｍｇ／ｋｇ）；
群６（マウス１０匹）：Ｄ６およびＤ１０にオキサリプラチンｉ．ｐ．注射（５４μｇ、３ｍｇ／ｋｇ）。
【００９８】
腫瘍成長を、ノギスを使用して２つの直交する腫瘍直径を測定することによって１週間に２回モニターした。結果を図３Ａ（カルボプラチンについて）および図３Ｂ（オキサリプラチンについて）に示す。腫瘍サイズは、ｍｍ２での断面積を意味する。
【００９９】
結果は、ＩＭＰ３２１単独はあるとしてもわずかな効果を有し、カルボプラチン単独はいくらかの効果を有し、ＩＭＰ３２１およびカルボプラチンでの併用治療がより大きな（すなわち相乗的）効果を有したことを示している。オキサリプラチン単独は効果を有するが、ＩＭＰ３２１およびオキサリプラチンでの併用治療は、さらに大きな（すなわち相乗的）効果を有し、１７日目までに腫瘍成長が完全に阻害された。
【０１００】
（実施例４）
がんの治療でのＬＡＧ−３誘導体および白金ベースの抗悪性腫瘍剤の投与の効果
Ｃ３８結腸腺癌腫瘍モデルでのＬＡＧ−３誘導体ＩＭＰ３２１（ｈＬＡＧ−３Ｉｇとも称される）およびオキサリプラチンでの併用治療の効果を評価した。このモデルでは、腫瘍断片は外科的に皮下にインプラントした。治療が始まったときに（１２日目、平均腫瘍体積が２００ｍｍ３であるとき）、腫瘍は比較的成熟しており、実際の腫瘍についての良いモデルを提供する。
【０１０１】
マウス結腸３８（Ｃ３８）腫瘍断片は、ｔｈｅ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、ＮＣＩ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ、ＵＳＡ）から冷凍で得た。Ｃ３８断片は、使用まで液体窒素中でＤＭＳＯ／ＳＶＦ／ＲＰＭＩ  １６４０培地（１０／１０／８０）中で冷凍保存した。断片を３７℃で５分間解凍し、マウスでの皮下（ＳＣ）インプラント術の前にＲＰＭＩ  １６４０培地中で２回すすいだ。Ｃ３８腫瘍をＣ５７Ｂｌ／６マウスに連続的に移植した。
【０１０２】
小さなＣ３８腫瘍断片（２０〜３０ｍｇ）を１２匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部の皮下にインプラントした。腫瘍サイズが５００〜１０００ｍｍ３に達したときに、腫瘍を外科的に切除し、小さなＣ３８腫瘍断片（２０〜３０ｍｇ）をレシピエントＣ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部の皮下にインプラントした。
【０１０３】
治療は腫瘍が２００〜３００ｍｍ３の平均体積に達した時に開始した。治療スケジュールは次のとおりであった：
群１（マウス１０匹）：４週連続での週１回のＰＢＳのＳＣ注射；
群２（マウス１０匹）：４週連続での週１回の５ｍｇ／ｋｇ／注射でのオキサリプラチンのＩＶ注射；
群３（マウス１０匹）：４週連続での週１回の２０μｇ  ＩＭＰ３２１のＳＣ注射；
群４（マウス１０匹）：４週連続での週１回の２０μｇ  ＩＭＰ３２１のＳＣ注射と組み合わされた週１回のオキサリプラチン５ｍｇ／ｋｇ／注射のＩＶ注射。
【０１０４】
治療は、さまざまな群が２００ｍｍ３の平均腫瘍体積を有した１２日目（Ｄ１２）に開始した。ＰＢＳまたはオキサリプラチンをＤ１２、Ｄ１９、Ｄ２６およびＤ３３に注射した。ＩＭＰ３２１をオキサリプラチンの翌日、つまり、Ｄ１３、Ｄ２０、２７およびＤ３４に注射した。皮下腫瘍が２，０００ｍｍ３の最大体積に達したときに動物を屠殺した：
【表１】
2019203035.tif 000002
【０１０５】
結果を図４Ａに示す。結果は、ＩＭＰ３２１単独が腫瘍成長を遅らせることに効果を有さなかったことを示している。オキサリプラチンはわずかな効果を有した。オキサリプラチンおよびＩＭＰ３２１の組合せはより大きな効果を有した。同じ相乗効果が図４Ｂに示す生存曲線に見られる。
【０１０６】
（実施例５）
ＬＡＧ−３誘導体のＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞への結合
ＬＡＧ−３のいくつかの誘導体をＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞に結合するそれらの能力について検査した：
ｉ）第１のリンカーによって免疫グロブリンＦｃ（Ｉｇ  Ｆｃ）配列に連結されたＬＡＧ−３のドメインＤ１〜Ｄ４（ＬＡＧ−３  Ｄ１Ｄ４−リンカー１−Ｉｇ、ｓＬＡＧ−３  Ｄ１Ｄ４−ＩｇまたはＩＭＰ３２１）；
ｉｉ）第２のリンカーによってＩｇ  Ｆｃ配列に連結されたＬＡＧ−３のドメインＤ１〜Ｄ４（ＬＡＧ−３  Ｄ１Ｄ４−リンカー２−ＩｇまたはｓＬＡＧ−３  Ｄ１Ｄ４−リンカーＢ−Ｉｇ）；
ｉｉｉ）第２のリンカーによってＩｇ  Ｆｃ配列に連結されたＬＡＧ−３のドメインＤ１およびＤ２（ＬＡＧ−３  Ｄ１Ｄ２−リンカー２−ＩｇまたはｓＬＡＧ−３  Ｄ１Ｄ２−リンカーＢ−Ｉｇ）；ならびに
ｉｖ）第１のリンカーによってＩｇ  Ｆｃ配列に連結されたＬＡＧ−３のドメインＤ１〜Ｄ４だが、３倍またはそれを超えるまでＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を増強する変異をＬＡＧ−３のＤ１ドメインのＭＨＣクラスＩＩ結合部位中のＲ７５位（Ｒ７５Ａ）に有する（Huardら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、１９９７年、９４巻:５７４４頁）（ＩＭＰ３２１  Ｒ７５Ａ）。
【０１０７】
誘導体を図５に例示する。
【０１０８】
ＭＨＣクラスＩＩ＋Ｒａｊｉ細胞を種々の濃度のＬＡＧ−３誘導体と、または陰性対照としてのヒトＩｇＧ１抗体（ｈＩｇＧ１）と４５分間、４℃でインキュベートした。細胞表面に結合したＬＡＧ−３分子がＦＩＴＣ−コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）で明らかになった。細胞をフローサイトメトリーによって分析した。蛍光強度単位として表される結果を、図６に示す。結果は、すべてのＬＡＧ−３誘導体がＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞に結合したことを示している。
【０１０９】
（実施例６）
ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を遮断する抗体によるＬＡＧ−３誘導体ＩＭＰ３２１のＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞への結合の阻害
１７Ｂ４および１１Ｅ３は、ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を遮断することが知られている抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体である。ＩＭＰ３２１−標識コンジュゲート（ＬＡＧ−３Ｉｇ−Ａｌｅｘａ４８８）のＭＨＣクラスＩＩ陽性Ｂ細胞（Ｒａｊｉ細胞）への結合を、１７Ｂ４もしくは１１Ｅ３遮断抗体またはアイソタイプ適合（ｉｓｏｔｙｐｅ  ｍａｔｃｈｅｄ）陰性対照モノクローナル抗体（ｍＩｇＧ１）とのコンジュゲートの予備インキュベーション（４μｇ／ｍｌ、４℃）に続いて決定した。細胞結合蛍光の分析を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して実行した。結果を図７に示す。
【０１１０】
結果は、ＩＭＰ３２１のＲａｊｉ細胞への結合が、ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を遮断するＬＡＧ−３−特異的モノクローナル抗体によって阻害されたことを示している。
【０１１１】
（実施例７）
ＬＡＧ−３誘導体による単球の活性化
ＴＨＰ−１細胞を図５に例示するＬＡＧ−３誘導体と、または陰性対照としてのヒトＩｇＧ１と４時間、４℃でインキュベートした。ケモカインＣＣＬ４、およびサイトカイン腫瘍壊死因子−α、ＴＮＦ−αのＴＨＰ−１細胞による分泌の量を決定し、単球活性化の測定値として使用した。ＣＣＬ４およびＴＮＦ−α分泌をＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ａｒｒａｙを使用して細胞上清中で定量した。ＣＣＬ４決定の結果を図８に示し、ＴＮＦ−α決定の結果を図９に示す。
【０１１２】
結果は、ＬＡＧ−３誘導体がすべてＴＨＰ−１単球細胞を活性化できたことを示している。
【０１１３】
（実施例８）
ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を遮断する抗体によるＩＭＰ３２１誘導単球活性化の阻害
ＴＨＰ−１細胞との混合物の４時間のインキュベーションの前にＩＭＰ３２１（２０ｎｇ／ｍｌ）を１７Ｂ４または１１Ｅ３抗体と予備インキュベート（＋３７℃で）した。ＴＨＰ−１細胞によるＣＣＬ４分泌の量を単球活性化のレベルを決定するために使用した。２つの実験の結果を図１０に示す。
【０１１４】
結果は、ＩＭＰ３２１誘導単球活性化が遮断抗ＬＡＧ−３  ｍＡｂｓ  １７Ｂ４および１１Ｅ３によって阻害されることを実証している。これは、単球を活性化するＩＭＰ３２１の能力がＩＭＰ３２１のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合に依存することを示している。
【０１１５】
（実施例９）
ＬＡＧ−３誘導体による初代抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化
ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を図５に例示するＬＡＧ−３誘導体と、または陰性対照としてのヒトＩｇＧ１と、分泌阻害物質であるブレフェルジンの存在下で４時間インキュベートした。ＰＢＭＣに存在するＡＰＣのサイトカイン応答をＣＣＬ４（Ｔｈ１およびＣＤ８陽性応答を支持することが知られているケモカイン）ならびにＴＮＦ−α（腫瘍形成を直接阻害する多機能性サイトカイン）の細胞内染色によって決定した。結果をサイトメトリーによって分析した。結果をＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞においてＣＣＬ４および／またはＴＮＦ−αを発現している細胞の百分率によって表し、図１１に示す。
【０１１６】
結果は、検査したすべてのＬＡＧ−３誘導体がＣＣＬ４およびＴＮＦ−αの産生を誘導したことを示している。
【０１１７】
（実施例１０）
ＬＡＧ−３誘導体によるＴ細胞の活性化
ヒトＰＢＭＣを図５に例示するＬＡＧ−３誘導体と、または陰性対照としてのヒトＩｇＧ１と１８時間インキュベートした。ブレフェルジンは、インキュベーションの最後の１６時間に存在した。ＬＡＧ−３誘導体への１８時間曝露後のＣＤ８陽性Ｔ細胞のサイトカイン応答をＣＣＬ４、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの細胞内染色によって追跡し、サイトメトリーによって分析した。結果をＣＤ３陽性／ＣＤ８陽性Ｔ細胞においてＣＣＬ４、ＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−αを発現している細胞の百分率として表し、図１２に示す。
【０１１８】
結果は、検査したすべてのＬＡＧ−３誘導体が１型細胞傷害性ＣＤ８陽性Ｔ細胞（Ｔｃ１細胞）の活性化を誘導したことを示している。ＡＰＣによって発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を通じて、ＬＡＧ−３誘導体はＴｃ１細胞の活性化を誘導したことが結論付けられる。Ｔｃ１細胞の活性化は主な抗腫瘍免疫応答を形成する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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