(57)【要約】【課題】侵襲性歯周炎の原因遺伝子を特定し、侵襲性歯周炎の診断方法および侵襲性歯周炎のモデル動物を提供する。【解決手段】本開示は、対象における侵襲性歯周炎の存在またはリスクを判定する方法であって、  対象から得た試料においてMMD2遺伝子の変異を検出すること、および／または  対象から得た試料において好中球数を測定すること、を含む方法を提供する。本開示はまた、MMD2の機能を欠失する変異を有する非ヒト動物またはMMD2遺伝子のc.347C<T変異を有する非ヒト動物である侵襲性歯周炎のモデル動物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における侵襲性歯周炎の存在またはリスクを判定する方法であって、
対象から得た試料においてMMD2遺伝子の変異を検出すること、および
前記変異が検出された場合に、前記対象が侵襲性歯周炎に罹患している、または侵襲性歯周炎を発症するリスクがあると判定すること、
を含む方法。
【請求項２】
変異が、c.347C<T変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象から得た試料において好中球数を測定することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
MMD2遺伝子の変異位置を含む領域を増幅するためのプライマー。
【請求項５】
変異位置が、配列番号１の347番目に対応する位置である、請求項４に記載のプライマー。
【請求項６】
MMD2遺伝子の変異位置を含む領域に特異的に結合するプローブ。
【請求項７】
変異位置が、配列番号１の347番目に対応する位置である、請求項６に記載のプローブ。
【請求項８】
請求項４または５に記載のプライマーまたは請求項６または７に記載のプローブを含む、侵襲性歯周炎の診断キット。
【請求項９】
変異型MMD2遺伝子または変異型MMD2からなる、侵襲性歯周炎の診断マーカー。
【請求項１０】
変異型MMD2遺伝子が、c.347C<T変異を含む、請求項９に記載の診断マーカー。
【請求項１１】
変異型MMD2が、p.Ala116Val変異を含む、請求項９または１０に記載の診断マーカー。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれかに規定される変異型MMD2遺伝子または変異型MMD2の、侵襲性歯周炎の診断マーカーとしての使用。
【請求項１３】
MMD2の機能を欠失する変異を有する非ヒト動物である、侵襲性歯周炎のモデル動物。
【請求項１４】
MMD2遺伝子のc.347C<T変異を有する非ヒト動物である、侵襲性歯周炎のモデル動物。
【請求項１５】
p.Ala116Val変異を含む配列番号４の配列を含む変異型MMD2をコードする変異型MMD2遺伝子を有する、請求項１４に記載のモデル動物。
【請求項１６】
侵襲性歯周炎のモデル動物としての、請求項１３〜１５のいずれかに規定される非ヒト動物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、侵襲性歯周炎の診断に関する。本開示はまた、侵襲性歯周炎のモデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
侵襲性歯周炎は、10歳〜30歳代の若年者に発症し、急速で高度な歯周組織破壊を特徴とする歯周炎である。侵襲性歯周炎では家系内に集積する症例が存在することが知られているが、分子あるいは遺伝子レベルでの発症機序の解明は十分になされていない。現在の侵襲性歯周炎に対する治療は対症療法であり、経過不良の症例が存在することもあり、可能な限り早期の診断と、発症機序にもとづいた治療法の開発が強く求められている。例えば、侵襲性歯周炎患者の中には好中球の機能異常を示す患者が存在し、かかる患者の好中球において高発現する遺伝子を用いて侵襲性歯周炎を診断することが提案されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−２０６４８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示は、侵襲性歯周炎の原因遺伝子を特定し、侵襲性歯周炎の診断方法および侵襲性歯周炎のモデル動物などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、対象における侵襲性歯周炎の存在またはリスクを判定する方法であって、
対象から得た試料においてMMD2遺伝子の変異を検出すること、および／または
対象から得た試料において好中球数を測定すること、
を含む方法を提供する。
【０００６】
本開示はまた、MMD2遺伝子の変異位置を含む領域を増幅するためのプライマー、MMD2遺伝子の変異位置を含む領域に特異的に結合するプローブ、および前記プライマーおよび／またはプローブを含むキットを提供する。
【０００７】
本開示はまた、変異型MMD2遺伝子または変異型MMD2からなる侵襲性歯周炎の診断マーカー、および変異型MMD2遺伝子または変異型MMD2の侵襲性歯周炎の診断マーカーとしての使用を提供する。
【０００８】
本開示はまた、MMD2の機能を欠失する変異を有する非ヒト動物またはMMD2遺伝子のc.347C<T変異を有する非ヒト動物である侵襲性歯周炎のモデル動物、および前記非ヒト動物の侵襲性歯周炎のモデル動物としての使用を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本開示は、侵襲性歯周炎の早期診断、発症機序の解明、予防薬または治療薬の開発などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例で解析した侵襲性歯周炎患者の家系情報を示す。黒色が侵襲性歯周炎発症者、白色が非発症者を示す。C/CおよびC/Tは、MMD2遺伝子のコーディングDNAの347番目の遺伝子型を示す。四角は男性、丸は女性を示し、斜線は死亡者を示す。＊は、エクソームシークエンスの対象者を示す。矢印は、発端者を示す。
【図２】図２は、マウス第5染色体上のTALEN標的部位を示す。ヒトMMD2遺伝子のc.347C<T変異に相当する塩基を四角で囲み、TALEN標的配列を下線で示す。
【図３】図３は、ssODNの配列およびノックイン（KI）アレルの配列を示す。T : 標的塩基置換, TAG： RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）のための塩基置換。TALEN標的配列を下線で示す。
【図４】図４は、野生型（WT）マウスおよびゲノム編集により得られた遺伝子改変マウスのゲノム配列を示す。下線は塩基の置換または挿入を示す。四角はTALEN標的配列を示す。
【図５】図５は、実験的歯周炎の評価部位を示す。左から、第三臼歯近心、第二臼歯遠心および近心、第一臼歯遠心の計測点を示す。
【図６】図６は、WTマウス（WT/WT）、KIマウス（KI/WT、KI/KI）、およびノックアウト（KO）マウス（KO/KO）における、歯周炎誘発時の歯槽骨吸収を示す。Non-treatedは無処置のマウス、Treatedは絹糸結紮を施したマウスを示す。
【図７】図７は、セメントエナメルジャンクションから歯槽骨裂開部までの距離（CEJ-ABC, mm）（計測４点の総和）を示す。
【図８】図８は、WTマウス、KIマウス（KI/KI）、およびKOマウス（KO/KO）の骨髄有核細胞から顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）刺激により誘導されたコロニー数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
【００１２】
歯周炎（Periodontitis）は，細菌等によって歯周組織に生じる炎症性破壊性疾患である。侵襲性歯周炎（Aggressive periodontitis）は、全身的には健康であるが、急速な歯周組織破壊（歯槽骨吸収、付着の喪失）と、家族内集積を認めることを特徴とする歯周炎であり、主に10歳〜30歳代に発症する。組織破壊の速度が比較的緩慢であり、主に35歳以降に発症する慢性歯周炎（Chronic periodontitis）と区別される。
【００１３】
MMD2（monocyte to macrophage differentiation-associated 2）は、PAQR（progestin and adipoQ receptor）10とも呼ばれる。MMD2のゲノムDNA配列、mRNA配列、アミノ酸配列は公知であり、NCIB（National Center for Biotechnology Information）の提供するデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)などに公開されている。例えば、ヒトMMD2のゲノムDNA配列、mRNA配列、およびアミノ酸配列のGenBankアクセッション番号は、それぞれCH471144.1、NM_001100600.1、およびAAH37881.2である。
【００１４】
本明細書において、MMD2遺伝子の変異とは、野生型MMD2遺伝子のコードするアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列をもたらす変異を意味する。MMD2遺伝子の変異には、非コード領域における変異であってMMD2遺伝子の発現を阻害する変異も含まれる。本明細書において、かかる変異を有するMMD2遺伝子を変異型MMD2遺伝子と、変異型MMD2遺伝子のコードするMMD2を変異型MMD2と称する。変異には、塩基の欠失、置換、および挿入が含まれる。MMD2遺伝子の変異は、MMD2の機能を欠失する（loss-of-function）変異でありうる。機能の欠失は、完全または部分的な機能の欠失であってよい。MMD2遺伝子の変異は、対象における好中球数の減少をもたらす変異でありうる。
【００１５】
ヒトおよびマウスの典型的な野生型MMD2のcDNAおよびアミノ酸配列を、配列番号１〜４に示す。配列番号１の347番目およびこれに対応する配列番号３における位置（350番目）、並びに配列番号２の116番目およびこれに対応する配列番号４における位置（117番目）を四角で示す。
【表１】
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【００１６】
本明細書において、MMD2遺伝子のc.347C<T変異とは、当該MMD2遺伝子における、ヒトMMD2遺伝子のコーディングDNAの347番目に対応する位置におけるCからTへの変異を意味する。ヒトMMD2遺伝子のコーディングDNAの347番目に対応する位置とは、配列番号１の347番目に対応する位置を意味し、配列番号１の配列と、あるMMD2遺伝子のコーディングDNAを最適に（配列の一致が最大となる状態に）アラインメントしたときに、配列番号１の347番目に一致する当該MMD2遺伝子のコーディングDNAにおける位置を意味する。例えば、本明細書においてc.347C<T変異を含む配列番号３の配列とは、配列番号３の350番目のCがTへ変異している配列を意味する。
【００１７】
本明細書において、MMD2のp.Ala116Val変異は、当該MMD2における、ヒトMMD2のアミノ酸配列の116番目に対応する位置におけるAlaからValへの変異を意味する。ヒトMMD2のアミノ酸配列の116番目に対応する位置とは、配列番号２の116番目に対応する位置を意味し、配列番号２のアミノ酸配列と、あるMMD2のアミノ酸配列とを最適に（配列の一致が最大となる状態に）アラインメントしたときに、配列番号２の116番目に一致する当該MMD2のアミノ酸配列における位置を意味する。例えば、本明細書において、p.Ala116Val変異を含む配列番号４の配列とは、配列番号４の117番目のAlaがValへ変異している配列を意味する。
【００１８】
本明細書において、対象には、歯周炎を発症している対象および発症していない対象が含まれる。歯周炎を発症していない対象には、侵襲性歯周炎の素因があるが未だ歯周炎を発症していない対象が含まれる。侵襲性歯周炎の素因がある対象としては、家系内に侵襲性歯周炎患者が存在する対象が挙げられる。歯周炎を発症している対象には、歯周炎を発症しているが侵襲性歯周炎の診断をうけてない対象が含まれる。ある実施形態において、対象は、全身性疾患を有さない対象である。
【００１９】
ある実施形態において、対象がMMD2遺伝子の変異を有する場合、すなわち、対象から得た試料においてMMD2遺伝子の変異が検出された場合、前記対象は侵襲性歯周炎に罹患している、または侵襲性歯周炎を発症するリスクがあると判定される。例えば、侵襲性歯周炎の素因があるが未だ歯周炎を発症していない対象において変異が検出された場合、その対象は侵襲性歯周炎を発症するリスクがあると判定される。また、歯周炎を発症しているが侵襲性歯周炎の診断をうけてない対象において変異が検出された場合、その対象は侵襲性歯周炎に罹患していると判定される。
【００２０】
すなわち、変異型MMD2遺伝子および変異型MMD2は、侵襲性歯周炎の診断マーカーとなる。ある実施形態において、変異型MMD2遺伝子は、c.347C<T変異を含み、配列番号１または３の配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する配列を含むか、前記配列からなる。別の実施形態において、変異型MMD2遺伝子は、c.347C<T変異を含み、配列番号１または３の配列において、0〜100個、0〜90個、0〜80個、0〜70個、0〜60個、0〜50個、0〜40個、0〜30個、0〜20個、0〜10個、0〜5個、0〜3個、0〜2個、または0〜1個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された配列を含むか、前記配列からなる。さらなる実施形態において、変異型MMD2遺伝子は、c.347C<T変異を含む配列番号１または３の配列を含むか、前記配列からなる。
【００２１】
ある実施形態において、変異型MMD2遺伝子は、p.Ala116Val変異を含み、配列番号２または４の配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する配列を含む変異型MMD2をコードする配列を含むか、前記配列からなる。別の実施形態において、変異型MMD2遺伝子は、p.Ala116Val変異を含み、配列番号２または４の配列において、0〜30個、0〜20個、0〜10個、0〜5個、0〜3個、0〜2個、または0〜1個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加された配列を含む変異型MMD2をコードする配列を含むか、前記配列からなる。さらなる実施形態において、変異型MMD2遺伝子は、p.Ala116Val変異を含む配列番号２または４の配列を含む変異型MMD2をコードする配列を含むか、前記配列からなる。
【００２２】
ある実施形態において、変異型MMD2は、p.Ala116Val変異を含み、配列番号２または４の配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する配列を含むか、前記配列からなる。別の実施形態において、変異型MMD2は、p.Ala116Val変異を含み、配列番号２または４の配列において、0〜30個、0〜20個、0〜10個、0〜5個、0〜3個、0〜2個、または0〜1個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加された配列を含むか、前記配列からなる。さらなる実施形態において、変異型MMD2は、p.Ala116Val変異を含む配列番号２または４の配列を含むか、前記配列からなる。
【００２３】
配列同一性とは、2つの配列の類似の程度を意味し、比較対象の配列の領域にわたって最適な状態（配列の一致が最大となる状態）にアラインメントされた2つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は、2つの配列間で一致する塩基またはアミノ酸残基の数を決定し、この数を比較対象の配列領域内の塩基またはアミノ酸残基の総数で割り、得られた数値に100をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、BLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズムなど）が挙げられる。配列同一性は、例えばBLAST、FASTAなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。
【００２４】
変異の検出のため対象から得る試料は、対象由来の核酸またはポリペプチドを取得可能なものであれば特に限定されない。試料としては、血液、血漿、血清、手術時の切除組織、唾液などが挙げられる。通常、これら試料から、対象由来の核酸（例えば、ゲノムDNA、mRNA、またはmRNAから調製されたcDNA）またはポリペプチドを含む試料を得て、変異の検出に使用する。
【００２５】
MMD2遺伝子の変異は、種々の方法により検出することができる。例えば、ゲノムDNAもしくはcDNAまたはその増幅産物などの核酸の配列を決定する；アレル特異的なプローブを前記核酸と結合させる；または、アレル特異的なプライマーを用いて前記核酸を増幅するなどの方法により、検出することができる。変異の検出方法としては、サンガーシーケンス法、PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism)法、PCR-SSCP（single strand conformation polymorphism）法、PCR-SSO（sequence oligonucleotide）法、ASP-PCR（Allele Specific Primer-PCR)法、TaqMan（登録商標）-PCR法、Invader（登録商標)法、サイクリンプローブ法、DNAチップまたはマイクロアレイを用いる方法などが例示される。MMD2遺伝子の変異は、その変異により生じるアミノ酸の変異を検出することによっても（すなわち、変異型MMD2を検出することによっても）検出することができ、例えば、変異型MMD2に特異的に結合する抗体を用いたELISAやウエスタンブロッティングや、プロテインシーケンス法を用いることができる。
【００２６】
ある実施形態では、MMD2遺伝子のc.347C<T変異を検出する。MMD2遺伝子のc.347C<T変異は、例えば、対象由来の核酸から配列番号１の347番目に対応する位置を含む領域を増幅することにより、あるいは対象由来の核酸またはその増幅産物において配列番号１の347番目に対応する位置を含む領域の配列を決定することにより、あるいは前記領域に特異的に結合するプローブを対象由来の核酸またはその増幅産物と結合させることにより、検出することができる。MMD2遺伝子のc.347C<T変異は、p.Ala116Val変異を含む変異型MMD2を検出することにより、検出してもよい。p.Ala116Val変異を含む変異型MMD2は、例えば、p.Ala116Val変異を含む領域をエピトープとして作成した抗体により、検出することができる。
【００２７】
変異の検出に用いるプライマーは、MMD2遺伝子の変異位置を含む領域を増幅する。プライマーは、通常、10〜70塩基長、好ましくは15〜60塩基長、更に好ましくは20〜50塩基長である。増幅する領域は、検出方法に応じて適宜決定されるが、例えば10〜1000塩基長、20〜500塩基長、30〜300塩基長、または50〜100塩基長である。プライマーは、通常、野生型または変異型のMMD2遺伝子の配列（コーディング配列および非コーディング配列を含む）またはその相補配列の一部に相補的であるが、目的の領域を増幅しうる限りミスマッチを含んでもよい。ミスマッチの数は、例えば、1〜3個、1〜2個または1個である。プライマーは、検出対象の変異が存在する場合のみ、または存在しない場合のみ（すなわち、検出対象の変異位置が特定の塩基である場合のみ）、当該変異位置を含む領域を増幅するように設計することもできる。増幅産物にSYBR（登録商標）Greenなどの蛍光試薬をインタカレートさせると、増幅の有無を蛍光により確認することができる。
【００２８】
ある実施形態において、プライマーは、c.347C<T変異を含み、配列番号１または３の配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する配列またはその相補配列の一部に相補的であり、場合により1〜3個、1〜2個または1個のミスマッチを含む。別の実施形態において、プライマーは、c.347C<T変異を含み、配列番号１または３の配列において、0〜100個、0〜90個、0〜80個、0〜70個、0〜60個、0〜50個、0〜40個、0〜30個、0〜20個、0〜10個、0〜5個、0〜3個、0〜2個、または0〜1個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された配列またはその相補配列の一部に相補的であり、場合により1〜3個、1〜2個または1個のミスマッチを含む。さらなる実施形態において、プライマーは、c.347C<T変異を含む配列番号１または３の配列またはその相補配列の一部に相補的であり、場合により1〜3個、1〜2個または1個のミスマッチを含む。
【００２９】
変異の検出に用いるプローブは、MMD2遺伝子の変異位置を含む領域に特異的に結合する。本明細書において、特異的に結合するとは、プローブによる検出に通常使用されるハイブリダイゼーション条件において、変異を含む領域と、その変異を含まない同領域とを識別可能であることを意味する。プローブの長さは、検出方法に応じて適宜決定されるが、例えば10〜500塩基長または16〜300塩基長であり、20〜60塩基であってもよい。プローブは、通常、検出対象の変異位置が特定の塩基である場合に当該変異位置を含む領域に結合するように設計され、変異が存在する場合に結合するよう設計しても、存在しない場合に結合するよう設計してもよい。プローブは、通常、野生型または変異型のMMD2遺伝子の配列（コーディング配列および非コーディング配列を含む）またはその相補配列の一部に相補的であるが、目的の領域に特異的に結合しうる限りミスマッチを含んでもよい。ミスマッチの数は、例えば、1〜3個、1〜2個または1個である。
【００３０】
ある実施形態において、プローブは、c.347C<T変異を含み、配列番号１または３の配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する配列またはその相補配列の一部に相補的であり、場合により1〜3個、1〜2個または1個のミスマッチを含み、前記変異を含む領域に特異的に結合する。別の実施形態において、プローブは、c.347C<T変異を含み、配列番号１または３の配列において、0〜100個、0〜90個、0〜80個、0〜70個、0〜60個、0〜50個、0〜40個、0〜30個、0〜20個、0〜10個、0〜5個、0〜3個、0〜2個、または0〜1個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された配列またはその相補配列の一部に相補的であり、場合により1〜3個、1〜2個または1個のミスマッチを含み、前記変異を含む領域に特異的に結合する。さらなる実施形態において、プローブは、c.347C<T変異を含む配列番号１または３の配列またはその相補配列の一部に相補的であり、場合により1〜3個、1〜2個または1個のミスマッチを含み、前記変異を含む領域に特異的に結合する。
【００３１】
プライマーおよびプローブは、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、またはペペプチド核酸（PNA）、架橋型人工核酸（LNA）、2'-O,4'-C-エチレン架橋核酸（ENA）、モルホリノ核酸などの人工核酸からなっていてよい。プライマーおよびプローブは、ホスホジエステル法など公知の方法によって合成することができる。プライマーおよびプローブは、検出方法に応じて修飾されていてもよく、例えば、蛍光物質、消光物質、発光物質などが結合していてもよい。
【００３２】
プライマーまたはプローブは、侵襲性歯周炎の診断キットに含まれていてもよい。診断キットは、プライマーおよび／またはプローブに加え、その他の試薬、例えば、逆転写やPCRのための酵素、dNTP、バッファー、コントロールの核酸などを含んでもよい。
【００３３】
好中球数は、単独で、またはMMD2遺伝子の変異とともに、侵襲性歯周炎の存在またはリスクの判定に利用することができる。ある実施形態において、対象の好中球数が基準値より低い場合、前記対象は侵襲性歯周炎に罹患している、または侵襲性歯周炎を発症するリスクがあると判定される。基準値は、対象の年齢（または年齢および性別）における正常範囲の下限値またはその付近の値（例えば下限値±１０％）とすることができる。例えば、ヒト成人の場合、末梢血1μLあたり、2000個、1800個、または1500個でありうる。好ましい実施形態において、対象の好中球数が基準値（例えば、2000個/μL、1800個/μL、または1500個/μL、好ましくは1800個/μL）より低く、かつ1000個/μL以上である場合に、前記対象は侵襲性歯周炎に罹患している、または侵襲性歯周炎を発症するリスクがあると判定される。別の実施形態において、MMD2遺伝子の変異の検出および／または好中球数の測定により侵襲性歯周炎を発症するリスクがあると判定された対象は、好中球数が低いほど、侵襲性歯周炎を発症するリスクが高い、または侵襲性歯周炎の症状が重篤と予想されると判定される。
【００３４】
好中球数の測定のため対象から得る試料は、好中球またはその前駆細胞（例えば、
骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、桿状核球）を含むものであればよく、血液または骨髄液が挙げられる。試料中の好中球数は、電気抵抗検出やフローサイトメトリー法などによる、血液検査に通常用いる白血球分類機構を備えた血球測定装置により、あるいは血球計算盤により、測定することができる。また、実施例に記載されるように、これら試料から有核細胞を得て、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）の存在下で培養し、得られるコロニー数を測定してもよい。有核細胞は、遠心分離法などの通常用いる方法により得ることができる。
【００３５】
対象が侵襲性歯周炎に罹患している、または侵襲性歯周炎を発症するリスクがあると判定された場合、その対象に侵襲性歯周炎の処置を施すことができる。処置としては、プラークコントロール、プラークリテンションファクターの除去、スケーリング、ルートプレーニング、歯周外科手術（歯周組織再生療法を含む）などが挙げられる。本明細書において、侵襲性歯周炎の処置には、発症している歯周炎の治療のための処置と、発症の予防のための処置とが含まれる。例えば、予防のための処置としては、プラークコントロール、プラークリテンションファクターの除去、およびスケーリングが、治療のための処置としては、プラークコントロール、プラークリテンションファクターの除去、スケーリング、ルートプレーニング、および歯周外科手術（歯周組織再生療法を含む）が、挙げられる。
【００３６】
変異型MMD2遺伝子を有する動物は、野生型の同動物と比較して歯周炎誘発時に高度の歯周組織破壊が認められ、侵襲性歯周炎のモデル動物として用いることができる。ある実施形態において、侵襲性歯周炎のモデル動物は、MMD2の機能が欠失する変異を有する非ヒト動物である。別の実施形態において、侵襲性歯周炎のモデル動物は、MMD2遺伝子のc.347C<T変異を有する非ヒト動物である。モデル動物は、天然に存在する非ヒト動物であっても、遺伝子工学的手法により人為的に改変された遺伝情報を有する非ヒト動物（本明細書において、遺伝子改変非ヒト動物と称する）であってもよい。ある実施形態において、侵襲性歯周炎のモデル動物は、MMD2の機能が欠失する変異が導入された非ヒト動物である。別の実施形態において、侵襲性歯周炎のモデル動物は、MMD2遺伝子のc.347C<T変異が導入された非ヒト動物である。
【００３７】
ある実施形態において、非ヒト動物は、非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サルなどが例示される。ある実施形態において、非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどの齧歯類、好ましくはマウスである。
【００３８】
MMD2の機能を欠失する変異が導入された遺伝子改変非ヒト動物には、ノックイン動物およびノックアウト動物が含まれる。本明細書において、MMD2の機能を欠失する変異が導入されたノックイン動物とは、ゲノムに特定の配列が導入されたことにより、MMD2の機能が欠失しているか、MMD2の発現が阻害されている動物を意味する。MMD2の機能を欠失する変異が導入されたノックアウト動物とは、ゲノムの二本鎖切断の修復過程で塩基の欠失、置換、または挿入がおこり、フレームシフトまたはアミノ酸置換により、MMD2の機能が欠失しているか、MMD2の発現が阻害されている動物を意味する。MMD2の機能が欠失していることは、例えば好中球数の減少により、確認することができる。遺伝子改変非ヒト動物の好中球数は、例えば、対応する野生型動物の好中球数の70％、60%、50%、40%、30%、または20%以下である。
【００３９】
ある実施形態において、MMD2の機能を欠失する変異を有する非ヒト動物は、MMD2のアミノ酸配列の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％を欠くアミノ酸配列をコードする変異型MMD2遺伝子を有する。ある実施形態において、MMD2の機能を欠失する変異を有する非ヒト動物は、コーディング配列の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％を欠く変異型MMD2遺伝子を有する。
【００４０】
ある実施形態において、MMD2遺伝子のc.347C<T変異を有する非ヒト動物は、c.347C<T変異を含み、配列番号１または３の配列と少なくとも70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する配列を含む変異型MMD2遺伝子；c.347C<T変異を含み、配列番号１または３の配列において、0〜100個、0〜90個、0〜80個、0〜70個、0〜60個、0〜50個、0〜40個、0〜30個、0〜20個、0〜10個、0〜5個、0〜3個、0〜2個、または0〜1個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された配列を含む変異型MMD2遺伝子；またはc.347C<T変異を含む配列番号１または３の配列を含む変異型MMD2遺伝子を有する。さらなる実施形態において、MMD2遺伝子のc.347C<T変異を有する非ヒト動物は、p.Ala116Val変異を含み、配列番号２または４の配列と少なくとも70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する配列を含む変異型MMD2をコードする変異型MMD2遺伝子；p.Ala116Val変異を含み、配列番号２または４の配列において、0〜30個、0〜20個、0〜10個、0〜5個、0〜3個、0〜2個、または0〜1個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加された配列を含む変異型MMD2をコードする変異型MMD2遺伝子；またはp.Ala116Val変異を含む配列番号２または４の配列を含む変異型MMD2をコードする変異型MMD2遺伝子を有する。
【００４１】
遺伝子改変非ヒト動物は、公知の方法により作製することができる。例えば、ターゲィングベクターを用いた相同組み換えにより、あるいはCRISPR/Cas9、TALEN、ZFNなどのゲノム編集技術により、所望の変異がゲノムに導入されたES細胞または受精卵を得る。ゲノム編集では、特定のゲノム配列を認識するよう設計したDNA結合ドメインとヌクレアーゼ活性を有する機能ドメインとを融合したキメラタンパク質を細胞または受精卵に導入し、所望の部位でゲノムを切断する。例えばTALENでは、標的とする切断部位が存在する12〜20塩基程度のスペーサー領域の5’側の15〜30塩基程度の領域に結合するDNA結合ドメインとヌクレアーゼ活性を有する機能ドメインとを含む一対のTALENをコードするmRNAまたはこれを発現するベクターを細胞または受精卵に導入する。ゲノムの二本鎖切断の修復過程で塩基の置換、欠損、または挿入が起こる。TALENをコードするmRNAまたはベクターとともにドナーDNAを導入すると、ドナーの配列がゲノムに挿入された細胞または受精卵を得ることができる。
【００４２】
変異が導入されたES細胞を8細胞期または胚盤胞の胚内に移植したES細胞移植胚、または変異が導入された受精卵を偽妊娠仮親の子宮内に移植し、出産させることにより、キメラ動物が得られる。所望の配列が生殖系列に導入されたキメラ動物を野生型動物と交配すると、ヘテロ接合体が得られ、ヘテロ接合体同士を交配すると、ホモ接合体が得られる。ヘテロ接合体またはホモ接合体が得られたことは、サザンブロットやPCRにより確認することができる。本明細書における遺伝子改変非ヒト動物には、ヘテロ接合体、ホモ接合体およびその子孫が含まれる。
【００４３】
侵襲性歯周炎のモデル動物は、侵襲性歯周炎の予防薬または治療薬のスクリーニングや、侵襲性歯周炎の原因菌のスクリーニングなどに使用することができる。侵襲性歯周炎の予防薬または治療薬のスクリーニングを行う場合、動物における歯周炎の発症前または発症後に候補物質を投与し、その動物の呈する歯周炎の症状を評価すればよい。侵襲性歯周炎の原因菌のスクリーニングを行う場合、動物に候補細菌を播種して、その動物が呈する歯周炎の症状を評価すればよい。
【００４４】
本開示のモデル動物において、絹糸や金属ワイヤーを歯頸部に結紮することにより、あるいはPG（Porphyromonas gingivalis）などの歯周病原因菌を播種することにより、実験的に歯周炎を誘発することができる。
【００４５】
候補物質は、例えば、低分子化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、または抗体、あるいは微生物、植物または動物の細胞抽出物または培養上清などであるが、これらに限定されない。候補物質は、合成低分子化合物ライブラリー、合成ペプチドライブラリー、抗体ライブラリー等の、ライブラリーの形態で提供されてもよい。
【００４６】
候補物質は、経口投与で投与しても、非経口投与（例えば、静脈内投与、経肺投与、皮下投与、筋肉内、腹腔内投与）で投与してもよい。投与回数および投与期間は特に限定されず、1日あたり1回〜数回を、1日〜数日間または数週間、連日または数日おきに行うことが考えられる。
【００４７】
モデル動物の候補物質への応答の評価は、通常、候補物質を投与した動物の侵襲性歯周炎の症状を、対照（通常、候補物質を投与していない、候補物質の投与の有無以外は同一条件の動物の、侵襲性歯周炎の症状）と比較することにより行う。対照と比較して侵襲性歯周炎の症状を改善する候補物質が、侵襲性歯周炎の予防薬または治療薬として選択される。症状の改善には、程度の改善および発現の遅延が含まれる。例えば、侵襲性歯周炎の発症前から候補物質を投与し、対照と比較して候補物質を投与した動物の侵襲性歯周炎の発症が遅れた場合、または侵襲性歯周炎の症状が軽度であった場合、候補物質は侵襲性歯周炎の予防薬として選択されうる。また、侵襲性歯周炎の発症後に候補物質を投与し、対照と比較して候補物質を投与した動物の侵襲性歯周炎の症状が改善した場合、候補物質は侵襲性歯周炎の治療薬として選択されうる。侵襲性歯周炎の症状としては、歯茎の炎症、歯槽骨の吸収が挙げられる。
【００４８】
本発明の例示的実施形態を以下に記載する。
［１］
対象における侵襲性歯周炎の存在またはリスクを判定する方法であって、
対象から得た試料においてMMD2遺伝子の変異を検出すること、および／または
対象から得た試料において好中球数を測定すること、
を含む方法。
［２］
対象から得た試料においてMMD2遺伝子の変異を検出すること、および
前記変異が検出された場合に、前記対象が侵襲性歯周炎に罹患している、または侵襲性歯周炎を発症するリスクがあると判定すること
を含む、前記［１］に記載の方法。
［３］
対象から得た試料において好中球数を測定することをさらに含む、前記［１］または［２］に記載の方法。
［４］
対象から得た試料において好中球数を測定すること、および
前記好中球数が基準値より低い場合に、前記対象が侵襲性歯周炎に罹患している、または侵襲性歯周炎を発症するリスクがあると判定すること
を含む、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
対象から得た試料においてMMD2遺伝子の変異を検出すること、
対象から得た試料において好中球数を測定すること、および
前記変異が検出され、かつ前記好中球数が基準値より低い場合に、前記対象が侵襲性歯周炎に罹患している、または侵襲性歯周炎を発症するリスクがあると判定することを含む、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
変異が、c.347C<T変異である、前記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
変異の検出が、対象由来の核酸を含む試料において配列番号１の347番目に対応する位置を含む領域の配列を決定することを含む、前記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
変異の検出が、対象由来の核酸を含む試料において配列番号１の347番目に対応する位置を含む領域を増幅することを含む、前記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［９］
変異の検出が、さらに前記増幅産物において配列番号１の347番目に対応する位置を含む領域の配列を決定することを含む、前記［８］に記載の方法。
［１０］
変異の検出が、対象由来のポリペプチドを含む試料においてp.Ala116Val変異を含む変異型MMD2を検出することを含む、前記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［１１］
対象が、ヒトである、前記［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］
試料が、血液である、前記［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］
侵襲性歯周炎に罹患している、または侵襲性歯周炎を発症するリスクがあると判定された対象に、侵襲性歯周炎の処置を施すこと推奨することをさらに含む、前記［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］
対象における侵襲性歯周炎を処置する方法であって、
前記［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法により、対象における侵襲性歯周炎の存在またはリスクを判定すること、および
侵襲性歯周炎に罹患している、または侵襲性歯周炎を発症するリスクがあると判定された対象に、侵襲性歯周炎の処置を施すこと、
を含む方法。
［１５］
対象における侵襲性歯周炎を処置する方法であって、前記［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法により侵襲性歯周炎に罹患している、または侵襲性歯周炎を発症するリスクがあると判定された対象に、侵襲性歯周炎の処置を施すことを含む方法。
［１６］
MMD2遺伝子の変異位置を含む領域を増幅するためのプライマー。
［１７］
変異位置が、配列番号１の347番目に対応する位置である、前記［１６］に記載のプライマー。
［１８］
前記領域が、10〜1000塩基長である、前記［１６］または［１７］に記載のプライマー。
［１９］
プライマーが、10〜70塩基長である、前記［１６］〜［１８］のいずれかに記載のプライマー。
［２０］
c.347C<T変異を含む配列番号１の配列またはその相補配列の一部に相補的である、前記［１６］〜［１９］のいずれかに記載のプライマー。
［２１］
MMD2遺伝子の変異位置を含む領域に特異的に結合するプローブ。
［２２］
変異位置が、配列番号１の347番目に対応する位置である、前記［２１］に記載のプローブ。
［２３］
プローブが、10〜500塩基長である、前記［２１］または［２２］に記載のプローブ。
［２４］
c.347C<T変異を含む配列番号１の配列またはその相補配列の一部に相補的であり、前記変異を含む領域に特異的に結合する、前記［２１］〜［２３］のいずれかに記載のプローブ。
［２５］
前記［１６］〜［２０］のいずれかに記載のプライマーまたは前記［２１］〜［２４］のいずれかに記載のプローブを含む、侵襲性歯周炎の診断キット。
［２６］
変異型MMD2遺伝子または変異型MMD2からなる、侵襲性歯周炎の診断マーカー。
［２７］
変異型MMD2遺伝子が、c.347C<T変異を含む、前記［２６］に記載の診断マーカー。
［２８］
変異型MMD2遺伝子が、p.Ala116Val変異を含み、配列番号２の配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する配列を含む変異型MMD2をコードする、前記［２６］または［２７］に記載の診断マーカー。
［２９］
変異型MMD2遺伝子が、p.Ala116Val変異を含み、配列番号２の配列において、0〜30個、0〜20個、0〜10個、0〜5個、0〜3個、0〜2個、または0〜1個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加された配列を含む変異型MMD2をコードする、前記［２６］〜［２８］のいずれかに記載の診断マーカー。
［３０］
変異型MMD2遺伝子が、p.Ala116Val変異を含む配列番号２の配列を含む変異型MMD2をコードする、前記［２６］〜［２９］のいずれかに記載の診断マーカー。
［３１］
変異型MMD2遺伝子が、c.347C<T変異を含み、配列番号１の配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する配列を含む、前記［２６］〜［３０］のいずれかに記載の診断マーカー。
［３２］
変異型MMD2遺伝子が、c.347C<T変異を含み、配列番号１の配列において、0〜100個、0〜90個、0〜80個、0〜70個、0〜60個、0〜50個、0〜40個、0〜30個、0〜20個、0〜10個、0〜5個、0〜3個、0〜2個、または0〜1個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された配列を含む、前記［２６］〜［３１］のいずれかに記載の診断マーカー。
［３３］
変異型MMD2遺伝子が、c.347C<T変異を含む配列番号１の配列を含む、前記［２６］〜［３２］のいずれかに記載の診断マーカー。
［３４］
変異型MMD2が、p.Ala116Val変異を含む、前記［２６］〜［３３］のいずれかに記載の診断マーカー。
［３５］
変異型MMD2が、p.Ala116Val変異を含み、配列番号２の配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する配列を含む、前記［２６］〜［３４］のいずれかに記載の診断マーカー。
［３６］
変異型MMD2が、p.Ala116Val変異を含み、配列番号２の配列において、0〜30個、0〜20個、0〜10個、0〜5個、0〜3個、0〜2個、または0〜1個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加された配列を含む、前記［２６］〜［３５］のいずれかに記載の診断マーカー。
［３７］
変異型MMD2が、p.Ala116Val変異を含む配列番号２の配列を含む、前記［２６］〜［３６］のいずれかに記載の診断マーカー。
［３８］
前記［２６］〜［３７］のいずれかに規定される変異型MMD2遺伝子または変異型MMD2の、侵襲性歯周炎の診断マーカーとしての使用。
［３９］
MMD2の機能を欠失する変異を有する非ヒト動物である、侵襲性歯周炎のモデル動物。
［４０］
前記変異が導入された遺伝子改変動物である、前記［３９］に記載のモデル動物。
［４１］
MMD2のアミノ酸配列の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％を欠くアミノ酸配列をコードする変異型MMD2遺伝子を有する、前記［３９］または［４０］に記載のモデル動物。
［４２］
MMD2遺伝子のc.347C<T変異を有する非ヒト動物である、侵襲性歯周炎のモデル動物。
［４３］
前記変異が導入された遺伝子改変動物である、前記［４２］に記載のモデル動物。
［４４］
p.Ala116Val変異を含み、配列番号４の配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する配列を含む変異型MMD2をコードする変異型MMD2遺伝子を有する、前記［４２］または［４３］に記載のモデル動物。
［４５］
p.Ala116Val変異を含み、配列番号４の配列において、0〜30個、0〜20個、0〜10個、0〜5個、0〜3個、0〜2個、または0〜1個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加された配列を含む変異型MMD2をコードする変異型MMD2遺伝子を有する、前記［４２］〜［４４］のいずれかに記載のモデル動物。
［４６］
p.Ala116Val変異を含む配列番号４の配列を含む変異型MMD2をコードする変異型MMD2遺伝子を有する、前記［４２］〜［４５］のいずれかにに記載のモデル動物。
［４７］
c.347C<T変異を含み、配列番号３の配列と70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％以上の配列同一性を有する配列を含む変異型MMD2遺伝子を有する、前記［４２］〜［４６］のいずれかに記載のモデル動物。
［４８］
c.347C<T変異を含み、配列番号３の配列において、0〜100個、0〜90個、0〜80個、0〜70個、0〜60個、0〜50個、0〜40個、0〜30個、0〜20個、0〜10個、0〜5個、0〜3個、0〜2個、または0〜1個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された配列を含む変異型MMD2遺伝子を有する、前記［４２］〜［４７］のいずれかに記載のモデル動物。
［４９］
c.347C<T変異を含む配列番号３の配列を含む変異型MMD2遺伝子を有する、前記［４２］〜［４８］のいずれかに記載のモデル動物。
［５０］
侵襲性歯周炎のモデル動物としての、前記［３９］〜［４９］のいずれかに規定される非ヒト動物の使用。
［５１］
侵襲性歯周炎の予防薬または治療薬のスクリーニング方法であって、
前記［３９］〜［４９］のいずれかに記載の侵襲性歯周炎のモデル動物に候補物質を投与すること、および
侵襲性歯周炎の発症を抑制する、または侵襲性歯周炎の症状を軽減する候補物質を、侵襲性歯周炎の予防薬または治療薬として選択すること、
を含む方法。
【実施例】
【００４９】
患者情報
広島大学病院に通院する患者家系内に4人の侵襲性歯周炎患者が存在する家系を抽出した。本家系内で、4人の発症者と4人の非発症者から血液を採取し、DNAを抽出した。患者の家系情報を図１に示す。
【００５０】
リンケージ解析
II-1、II-6、II-9、III-2、III-3、III-4、およびIII-5（図１参照）のDNAをリンケージ解析に用いた。一塩基多型（single nucleotide polymorphisms, SNPs)のジェノタイピングにはGenome-Wide Human SNP Array 6.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)を用い、解析はAllegro softwareで行った。第3染色体と第7染色体にロッドスコアの高い領域が存在した。それぞれのロッドスコアは1.8047と1.8058であった。
【００５１】
エクソームシークエンスを用いた候補遺伝子の同定
エクソームシークエンスはGATKとSamtoolsでバリアントコールを行い、Annovarでアノテ―ションを行った。アミノ酸変異のダメージ予測には、PolyPhen-2、Mutation TasterおよびSIFTを用いた。ゲノムDNAライブラリーの作成には、SeqCap EZ Human Exome Library v2.0 (Roche, Basel, Switzerland)を用いた。シークエンスにはHiSeq2000 sequencer (Illumina, San Diego, CA, USA)を用い、100-bp ペアエンドで行った。得られた遺伝子変異は、Applied Biosystems 3130 DNA sequencer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)を用いてサンガ―シークエンスを行い確定した。
【００５２】
発症者3名のDNAから90,000を超える遺伝子変異が検出された。オープンデータベース (dbSNP、1000 Genomes、およびEPS 6400)を用いて候補遺伝子変異の絞り込みを行い、3名に共通した282 変異を抽出した。独自の中枢変性疾患のデータベースを参考にさらに絞り込みを行い、最終的に７つのヘテロ遺伝子変異を抽出した（表２、表３）。
【表２】
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【表３】
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【００５３】
アミノ酸のダメージが高いと予測される遺伝子変異は、NID1、MUC4、MUC21、MMD2、およびLOC100288778に存在した。本家系内の発症者が共通して保有し、非発症者が共通して保有しない遺伝子変異は、MMD2に存在する変異のみであった。この変異は、リンケージ解析においても高いロッドスコアを示すヒト第7染色体の候補領域に存在した。この変異では、ヒトMMD2遺伝子のコーディングDNAの347番目のCがTに置換され（c.347C<T変異）、アミノ酸配列の116番目のAlaがValに置換されていた（c.347C<T, p.Ala116Val変異）。
【００５４】
TALENを用いたゲノム編集によるMMD2ノックインマウスの作成
ヒトMMD2のc.347C<T, p.Ala116Val変異を、マウスにおいてTALENゲノム編集ツールを用いて作成した。TALENは、マウス第5染色体に存在するMMD2遺伝子においてc.347C<T変異の位置付近に二本鎖切断が起こるように設計した（図２）。MEGAscript T7 transcription kit (Thermo Fisher Scientific, Yokohama, JAPAN)を用いてTALENをコードするmRNAを合成し、4つのヌクレオチド変異（ターゲットとなるC>T置換と、オリゴヌクレオチドの導入の確認のため制限酵素PstIの認識部位を導入する置換）を含む87 bpのssODNとともにC57BL/6マウスの受精卵にインジェクションした（図３）。目的とする変異以外にも、フレームシフトを伴う5bp、7bp、および11bpの欠失（deletion）や挿入（insertion）がゲノム編集によって得られた（図４）。以下の実験において、C>T置換を有するマウスをノックイン（KI）マウス、7bp欠失を有するマウスをノックアウト（KO）マウスとして用いた。
【００５５】
絹糸結紮歯周炎誘発モデル
野生型（WT）マウス、KIマウス（KI/WT、KI/KI）、およびKOマウス（KO/KO）において、実験的歯周炎を誘発した。歯周炎とそれに伴う歯槽骨吸収は、8週齢の雄マウスの第二臼歯に5-0絹糸をまくことによって誘発した。結紮7日後に、セメントエナメルジャンクションから歯槽骨裂開部までの距離を、第一臼歯遠心、第二臼歯近心および遠心、第三臼歯近心の4点で計測し評価した（図５）。KIマウスおよびKOマウスにおいて、WTマウスに比べて高度な歯槽骨吸収が認められた（図６、７）
【００５６】
コロニー解析
野生型（WT）マウス、KIマウス（KI/WT、KI/KI）、およびKOマウス（KO/KO）から大腿骨と脛骨を取り出し、フラッシュして骨髄細胞を取り出した後、有核細胞を集めた。5×103細胞/ディッシュになるように細胞を希釈し、MethoCult (M3231)と混和し、3.5cmディッシュにG-CSFの最終濃度10 ng/mlとして播種した。7日後コロニーをカウントした。その結果、G-CSF刺激下において、KIマウスおよびKOマウスともに、WTマウスと比較してコロニー数の減少が認められた。これらの結果から、MMD2遺伝子変異マウスは、免疫システムの最前線において病原体の対応にあたる好中球数に異常を認めることが示された。
【００５７】
好中球数の解析
本家系の患者の好中球数を、白血球分類機構を備えた自動血球測定装置により測定した。ヒト成人の正常範囲の白血球数は4000〜8000個/μL程度、好中球数は1800〜7500個/μL程度であるところ、本家系の患者の白血球数は2500〜4000個/μL程度、好中球数は1300〜1900個/μL程度であった。また、同様にWTマウス、KIマウス（KI/KI）、KOマウス（KO/KO）の好中球数を測定したところ、それぞれ490/μL、200/μL、および72/μLであり、好中球の減少が観察された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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