(57)【要約】      （修正有）【課題】ブタ生殖および呼吸症候群（ＰＲＲＳ）から保護するための新しい、改良された修飾生ワクチンの提供。【解決手段】ブタをＰＲＲＳウイルスによる感染から保護するワクチンであって、（ａ）特定の配列のポリヌクレオチド分子、またはその特定類似体にコードされる北米ＰＲＲＳウイルス、（ｂ）前記コードポリヌクレオチド分子、（ｃ）プラスミド形態の前記ポリヌクレオチド分子、あるいは（ｄ）前記ポリヌクレオチド分子を含むウイルスベクターを、感染に対する免疫保護を生成するのに効果的な量で含み、ＰＲＲＳウイルスがＰＲＲＳウイルス感染に対する効果的な免疫保護反応を誘導することが可能であり、さらに家畜への使用に適切なキャリアを含み、前記ワクチンが、子ブタが１日齢の時の早期および安全なワクチン接種を供給し、前記ワクチンが最大６ヶ月の免疫期間を供給するワクチン。【選択図】図５
2019203016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタをＰＲＲＳウイルスによる感染から保護するワクチンであって、（ａ）配列番号６のポリヌクレオチド分子、または、前記ポリヌクレオチド分子に、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡの溶液における６５℃でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーションおよび０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおける６８℃での洗浄を含む高い緊縮条件下でハイブリダイズするあらゆるポリヌクレオチド、にコードされる北米ＰＲＲＳウイルス、（ｂ）前記コードポリヌクレオチド分子、（ｃ）プラスミド形態の前記ポリヌクレオチド分子、あるいは（ｄ）前記ポリヌクレオチド分子を含むウイルスベクターを、感染に対する免疫保護を生成するのに効果的な量で含み、ＰＲＲＳウイルスがＰＲＲＳウイルス感染に対する効果的な免疫保護反応を誘導することが可能であり、さらに家畜への使用に適切なキャリアを含み、前記ワクチンが、子ブタが１日齢の時の早期および安全なワクチン接種を供給し、前記ワクチンが最大６ヶ月の免疫期間を供給するワクチン。
【請求項２】
ワクチン接種の２週間後から開始する、免疫の発現が供給される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
ＰＲＲＳウイルスの感染に対してブタにワクチン接種をする方法であって、生後約１２時間から２週齢の間における前記ワクチンを投与することを含み、前記ワクチンは
（ａ）北米ＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む分離ポリヌクレオチド分子、
（ｂ）北米ＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子、
（ｃ）プラスミド形態の前記ポリヌクレオチド分子（ａ）、または
（ｄ）感染性配列を含むウイルスベクターを含む、方法。
【請求項４】
防御免疫がワクチン接種の約１４日以内に生じる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
防御免疫が、１日齢でのワクチン接種後１５日目、７日齢でのワクチン接種後２１日目、１４日齢でのワクチン接種後約２８日以内に生じる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
供給された防御免疫の期間が最大６ヶ月である、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は動物の健康の分野に関し、陽性極性ＲＮＡウイルスの感染性ｃＤＮＡクローン、新型ＲＮＡウイルスおよびその修飾生形態、およびワクチンの構築、特にそのようなｃＤＮＡクローンを用いたブタワクチンを対象とする。より具体的には、本発明は、生後間もなく（すなわち１日齢以下）から２週齢を含む、離乳前の子ブタへの安全で早期なワクチン接種もまた供給し、常に選択的に、多価混合ブタワクチン、例えば２価ＰＲＲＳＶ／マイコプラズマヒオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）ワクチン、２価ＰＲＲＳＶ／ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）ワクチン、および３価ＰＲＲＳＶ／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＣＶ２ワクチンとの組み合わせ、または単に１価ＰＲＲＳＶワクチンとして接種される。そのような状況下でのＰＲＲＳに対する早期ワクチン接種は、防御免疫の早期発現を供給し、防御免疫はワクチン接種後約１４日以内、すなわち１日齢でのワクチン接種後１５日目、７日齢でのワクチン接種後２１日目、１４日齢でのワクチン接種後約２８日以内に生じる。本明細書は北米ＰＲＲＳウイルスの「Ｐ１２９株」の多数の構築物を供給し（第ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５５００３号および米国第６，５００，６６２号参照）、ワクチンとして非常に効果的で上記の早期で安全な使用を含むが、そのような防御免疫の早期発現（すなわち生後１日齢で早くも与えられた免疫ワクチン接種後約２週間）は他の北米および欧州ＰＲＲＳ株、例えば米国第５，４７６，７７８号、米国第５，８４６，８０５号、米国第６，３８０，３７６号、米国第６，９８２，１６０号および米国第６，１９７，３１０号にも適用可能であるとされる。
【背景技術】
【０００２】
ブタ生殖および呼吸症候群（ＰＲＲＳ）は、流産、死産、および他の雌ブタと未経産ブタにおける生殖に関する問題、ならびに若いブタにおける呼吸器疾患を特徴とする。病原体はＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）であり、アルテリウイルス科およびニドウイルス目の仲間である。ニドウイルス目はエンベロープウイルスであり、陽性極性ＲＮＡの単一ストランドから成るゲノムを有する。陽性ストランドＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡは保存および遺伝情報の発現の両方における二元的役割を果たす。ニドウイルスにおける複製または転写にはＤＮＡは含まれない。非構造タンパク質はニドウイルスのゲノムＲＮＡから大型ポリタンパク質として直接変換され、次にウイルスプロテアーゼによって切断され謙虚で機能的なタンパク質となる。サブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の３’共末端入れ子化セット集合はゲノムから合成され、メッセンジャーＲＮＡとして構造タンパク質の変換に用いられる。ニドウイルスゲノムＲＮＡの再生はこのようにゲノム複製およびｓｇＲＮＡ合成の複合過程である。
【０００３】
１９８０年代後半、ウイルスの異なる２種類の遺伝子型が１つは北米でもう１つは欧州でほぼ同時に表れた。ＰＲＲＳウイルスは現在ほぼ全てのブタ生産国における風土病であり、世界規模のブタ産業に影響を与える経済的に重大な疾患の１つであるとされる。さらに、毒性の高い遺伝子型が中国および隣接国で取り出され、そのような遺伝子型は概して北米遺伝子型に関連するものである。
【０００４】
ＰＲＲＳＶの生物学の理解における大きな進歩にかかわらず、ウイルスの制御は困難なままである。野外の動物へのワクチン接種は概して効果的ではないと証明されている。ＰＲＲＳは一般的にワクチン接種を受けた群れにおいて再発現し、ほとんどの農場でのＰＲＲＳＶワクチン接種キャンペーンは疾患を最終的には抑制できない。
【０００５】
理論に限られず、野生型ＰＲＲＳＶを有するブタの感染、またはそれらのこの病原体の
生減弱形態を用いたワクチン接種は不運にも非中和抗体の豊富な生成を誘導するのみである。この時間間隔の間、例えば、限られた量のインターフェロン（ＩＦＮ）−γ（分泌細胞のみが生成される。したがって、ＰＲＲＳＶは本質的に、常に豊富な体液性（抗体に基づく）免疫、および、多様で限定的だが潜在的に防御的なＴヘルパー（Ｔｈ）１様のＩＦＮ−γ反応によって区別される、不均衡免疫反応を刺激すると考えられる。適応免疫の不均衡進行に最も関与していると思われるＰＲＲＳＶ感染の１つの特徴は、十分な自然免疫反応の欠如である。大抵、ウイルス感染細胞はＩ型インターフェロン「ＩＦＮ」（ＩＦ
Ｎ−αおよびＩＦＮ−βを含む）を分泌し、隣接する細胞を感染から保護する。さらに、放出されたＩ型ＩＦＮは未感作Ｔ細胞のサブセットと相互作用し、ウイルス特有ＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−γ）分泌細胞への転換を促進する。対照的に、ＰＲＲＳＶ露出に対するブタのＩＦＮ−α反応はほぼ実在しない。そのようなＩＦＮ−α生成の病原体による非効果的な刺激は、ＩＦＮ−αがＩＦＮ−γ遺伝子発現を増加させるため、宿主の適応免疫反応の本質において大きな影響を有すると期待されるだろう。したがって、元のサイトカインは優性経路を制御し，適応免疫の発達、すなわちＴ細胞媒介ＩＦＮ−γ反応および最大抗ウイルス免疫防御を促進する。
【０００６】
この点に関して、ウイルス感染における自然免疫と適応免疫との間にあり得るつながりは、大量のＩ型インターフェロンを生成することができるＴ−細胞機能の極性形成にお
いて重要な役割を果たす樹状細胞の特別型によって生じるということが明らかになっている。具体的には、希少だが優れた樹状細胞の型であり自然ＩＦＮ−α／β生成細胞としても知られる形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）は、未感作Ｔ細胞をＩＦＮ−γ分泌細胞に分化させる能力により、抗ウイルス免疫において重要な役割を果たす。希少ではあるが、ＰＤＣは非常に強力なＩＦＮ−α生成細胞であり、それぞれの細胞がウイルスへの反応において３〜１０ｐｇのＩＦＮ−αを生成することが可能である。対照的に、単球は細胞単位で５から１０倍少ないＩＦＮ−αを生成する。ブタＰＤＣの表現型およびいくつかの生物学的特性が記載されている（Ｓｕｍｍｅｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１１０：４４０）。近年の研究は、ＰＲＲＳＶはブタＰＤＣのＩＦＮ−α分泌を刺激しないとする（Ｃａｌｚａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ１３５：２０）ことが明らかにされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この事実は、ワクチン接種時に外から加えられたＩＦＮ−αが、ＰＲＲＳＶ特有のＩＦＮ−γ反応の強度を改善するという観察（Ｗ．Ａ．Ｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．１０２，ｐｐ２９９−３１４，２００４）と組み合わせることで、ＩＦＮ−αがブタのこのウイルスの感染間に果たす重要な役割を強調する。防御免疫の発達におけるＩＦＮ−αの明らかに重要な役割を考えると、異なるＰＲＲＳウイルスストックがＩＦＮ−α生成を刺激および／または抑制する能力を決定づけることが重要である。したがって、ＰＲＲＳから保護するための新しい、改良された修飾生ワクチンが緊急に必要である。下記の通り新型感染性ｃＤＮＡクローン、ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ、および他から生成されたウイルスは、野生型Ｐ１２９ウイルスまたは２種類の商用の修飾生ＰＲＲＳワクチンとは異なる表現型を有するということは明らかである。理論に限られず、本発明は、細胞に基づくウイルスへの免疫反応を促進するワクチンおよびＰＲＲＳワクチンの新しく効果的な生成を供給する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の実施形態においては、本発明は、遺伝学的に修飾され、ワクチンとして、ブタにおけるＰＲＲＳウイルスに対する効果的な免疫保護反応を誘導する、ＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む分離ポリヌクレオチド分子を
供給する。ある態様において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、もしくは配列番号６、またはそれに少なくとも７０％の同一性、好適にはそれに８０％の同一性、さらに好適にはそれに８５％，９０％，９５％，９６％，９７％，９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む、本明細書に記載されているＤＮＡ配列を供給する。
【０００９】
ある実施形態においては、本発明は、本明細書に記載される分離ポリヌクレオチド分子および適切な宿主細胞においてポリヌクレオチド分子を転写することが可能なプロモーター遺伝子を含むプラスミドを供給する。別の実施形態においては、本明細書に記載されたプラスミドの北米または中国ＰＲＲＳコード配列はさらに１つ以上の検出可能な異種抗原性エピトープをコードする。本発明は本明細書に記載されたプラスミドを有する核酸導入された宿主細胞を供給する。
【００１０】
他の態様では、本発明はブタをＰＲＲＳウイルスの感染から保護するワクチンを供給する。本ワクチンは、感染性ＲＮＡ分子によってコードされる北米または中国ＰＲＲＳウイルスを含み得、この感染性ＲＮＡ分子、またはプラスミドはそれぞれ、本明細書に記載された分離ポリヌクレオチド分子によってコードされる。さらに他の態様では、ワクチンは、本明細書に記載されたポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含む。本明細書に記載されたワクチンセットは、家畜への使用に容認可能なワクチンキャリアを選択的に含み得る。ある重要な態様では、ワクチンは野生型Ｐ１２９ＰＲＲＳウイルスに比べて少ないインターフェロン−α抑制効果を有する（ＡＴＣＣ２０３４８８、２０３４８９、米国特許第６，５００，６６２号を参照）。
【００１１】
ある実施形態においては、本発明は、ＰＲＲＳウイルスの野外株に自然に感染したブタと本明細書に記載された修飾生ワクチンセットでワクチン接種を受けたブタを区別する（いわゆるＤＩＶＡ検査）ポリヌクレオチド分子を含む診断キットを供給する。
【００１２】
他の実施形態においては、本発明は、本明細書に記載された特許請求の範囲の免疫原性的に保護的な量のワクチンの動物への投与を含む、ＰＲＲＳウイルス株の感染からブタを守る方法を供給する。
【００１３】
本発明のさらなるそして好適な実施形態は、分離ブタ生殖および呼吸症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、またはそのためのポリヌクレオチド配列コードを含み、ＯＲＦ１ａにコードされたタンパク質があらゆる次のアミノ酸配列を有するものから成る群から選択され、下線の残基は新型であると思われる。ＡＭＡＮＶＹＤ（配列番号９）、ＩＧＨＮＡＶＭ（配列番号１２）、ＴＶＰＤＧＮＣ（配列番号１５）、ＣＷＷＹＬＦＤ（配列番号１８）、ＨＧＶＨＧＫＹ（配列番号２１）、ＡＡＫＶＤＱＹ（配列番号２４）、ＰＳＡＴＤＴＳ（配列番号２７）、ＬＮＳＬＬＳＫ（配列番号３０）、ＡＰＭＣＱＤＥ（配列番号３３）、ＣＡＰＴＧＭＤ（配列番号３６）、ＰＫＶＡＫＶＳ（配列番号３９）、ＡＧＥＩＶＧＶ（配列番号４２）、ＡＤＦＮＰＥＫ（配列番号４５）、およびＱＴＰＩＬＧＲ（配列番号４８）。本発明のさらに好適な実施形態においては、本発明は、ＯＲＦ１ａからコードされたタンパク質内に上記に同定した配列を有し、これらの同定した配列のあらゆる組み合わせ（２、３、４、から最大で１７）を含む、北米または中国ＰＲＲＳ分離を供給する。
【００１４】
発明はさらに分離ブタ生殖および呼吸症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）を供給し、そのＯＲＦ１ａにコードされたタンパク質は次のもののいずれかを含むアミノ酸配列から成る群から選択される。ＡＮＶ（配列番号９参照）、ＨＮＡ（配列番号１２参照）、ＰＤＧ（配列番号１５参照）、ＷＹＬ（配列番号１８参照）、ＶＨＧ（配列番号２１参照）、ＫＶＤ（配列番号２４参照）、ＡＴＤ（配列番号２７参照）、ＳＬＬ（配列番号３０参照）、ＭＣＱ（配列番号３３参照）、ＰＴＧ（配列番号３６参照）、ＶＡＫ（配列番号３９参照）、
ＥＩＶ（配列番号４２参照）、ＦＮＰ（配列番号４５参照）、およびＰＩＬ（配列番号４８参照）、これらの同定した配列のあらゆる組み合わせ（２、３、４、から最大で１７）を含む。
【００１５】
さらに好適な実施形態においては、本発明は分離北米または中国ＰＲＲＳを供給し、そこにおいて、ポリヌクレオチドがウイルスまたはそれからコードされたタンパク質をコードするあらゆる点における、あらゆる他の特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列位置の同一性に関係なく、ＯＲＦ１ａウイルスタンパク質は、
（ａ）以下の特定の配列における特定のアミノ酸のいずれか
アミノ酸配列ＡＮＶにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号９を参照）、
アミノ酸配列ＨＮＡにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号１２を参照）、
アミノ酸配列ＰＤＧにおけるアミノ酸Ｄ（配列番号１５を参照）、
アミノ酸配列ＷＹＬにおけるアミノ酸Ｙ（配列番号１８を参照）、
アミノ酸配列ＶＨＧにおけるアミノ酸Ｈ（配列番号２１を参照）、
アミノ酸配列ＫＶＤにおけるアミノ酸Ｖ（配列番号２４を参照）、
アミノ酸配列ＡＴＤにおけるアミノ酸Ｔ（配列番号２７を参照）、
アミノ酸配列ＳＬＬにおけるアミノ酸Ｌ（配列番号３０を参照）、
アミノ酸配列ＭＣＱにおけるアミノ酸Ｃ（配列番号３３を参照）、
アミノ酸配列ＰＴＧにおけるアミノ酸Ｔ（配列番号３６を参照）、
アミノ酸配列ＶＡＫにおけるアミノ酸Ａ（配列番号３９を参照）、
アミノ酸配列ＥＩＶにおけるアミノ酸Ｉ（配列番号４２を参照）、
アミノ酸配列ＦＮＰにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号４５を参照）および
アミノ酸配列ＰＩＬにおけるアミノ酸Ｉ（配列番号４８を参照）、これらの同定配列のあらゆる組み合わせ（２、３、４、最大で１７）を含み、または、
（ｂ）前記他の特定３残基アミノ酸配列が１つまたは２つの追加的なアミノ配列変更を示し得るがそれでも上記特定配列と一致すると見なされることを考慮し、上記の３残基配列に一致するあらゆる他の北米または中国ＰＲＲＳウイルスの特定３残基ＯＲＦ１ａペプチド配列における前記特定下線単一アミノ酸を含む。発明の本実施形態の目的には、「一致」は関連配列が、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９，ｐｐ．１０９１５−１０９１９，１９９２に記載されるように、ＢＬＯＳＵＭアルゴリズムを用いて最適に並べられ得ることを意味する。
【００１６】
本発明のさらに好適な実施形態においては、分離ブタ生殖および呼吸症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）が供給され、そこにおいて、ＯＲＦ１ａにコードされたそのタンパク質が変化（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の１つ以上を有するアミノ酸配列を有し、それぞれの変化は下のように定義される。
変化（ａ）、
アミノ酸配列ＡＮＶにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号９を参照）
アミノ酸配列ＨＮＡにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号１２を参照）
アミノ酸配列ＰＤＧにおけるアミノ酸Ｄ（配列番号１５を参照）
アミノ酸配列ＷＹＬにおけるアミノ酸Ｙ（配列番号１８を参照）
アミノ酸配列ＶＨＧにおけるアミノ酸Ｈ（配列番号２１を参照）、または変化（ａ）のあらゆるサブセット、
変化（ｂ）、
アミノ酸配列ＫＶＤにおけるアミノ酸Ｖ（配列番号２４を参照）
アミノ酸配列ＡＴＤにおけるアミノ酸Ｔ（配列番号２７を参照）
アミノ酸配列ＳＬＬにおけるアミノ酸Ｌ（配列番号３０を参照）
アミノ酸配列ＭＣＱにおけるアミノ酸Ｃ（配列番号３３を参照）、または変化（ｂ）のあらゆるサブセット、
変化（ｃ）、
アミノ酸配列ＰＴＧにおけるアミノ酸Ｔ（配列番号３６を参照）
アミノ酸配列ＶＡＫにおけるアミノ酸Ａ（配列番号３９を参照）、または変化（ｃ）のあらゆるサブセット、ならびに
変化（ｄ）、
アミノ酸配列ＥＩＶにおけるアミノ酸Ｉ（配列番号４２を参照）、
アミノ酸配列ＦＮＰにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号４５を参照）、
およびアミノ酸配列ＰＩＬにおけるアミノ酸Ｉ（配列番号２０を参照）、またはそれらの変化（ｄ）のあらゆるサブセット。
【００１７】
上記ＰＲＲＳウイルスはさらに、変化（ａ）に同定した５つのアミノ酸配列の２つ以上および／または変化（ｂ）に同定した４つのアミノ酸配列の２つ以上および／または変化（ｃ）に同定した２つのアミノ酸配列、および／または変化（ｄ）に同定した３つのアミノ酸配列の２つ以上を含み得る。
【００１８】
本発明はまた直接的に適切な宿主細胞に核酸導入すること、および核酸導入された適切な宿主細胞からブタ生殖および呼吸症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）を発現することができるプラスミドを供給し、プラスミドは（ａ）ＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列、および（ｂ）前記感染性ＲＮＡ分子を転写することができるプロモーターを含み、そこにおいて前記ウイルスのＯＲＦ１ａにコードされたタンパク質は以下
（１）アミノ酸配列ＡＮＶにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号９を参照）、
アミノ酸配列ＨＮＡにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号１２を参照）、
アミノ酸配列ＰＤＧにおけるアミノ酸Ｄ（配列番号１５を参照）、
アミノ酸配列ＷＹＬにおけるアミノ酸Ｙ（配列番号１８を参照）、
アミノ酸配列ＶＨＧにおけるアミノ酸Ｈ（配列番号２１を参照）、もしくはそれらのあらゆるサブセット、ならびに／または
（２）アミノ酸配列ＫＶＤにおけるアミノ酸Ｖ（配列番号２４を参照）、
アミノ酸配列ＡＴＤにおけるアミノ酸Ｔ（配列番号２７を参照）、
アミノ酸配列ＳＬＬにおけるアミノ酸Ｌ（配列番号３０を参照）、
アミノ酸配列ＭＣＱにおけるアミノ酸Ｃ（配列番号３３を参照）、もしくはそれらのあらゆるサブセット、ならびに／または
（３）アミノ酸配列ＰＴＧにおけるアミノ酸Ｔ（配列番号３６を参照）、
アミノ酸配列ＶＡＫにおけるアミノ酸Ａ（配列番号３９を参照）、もしくはそれらのあらゆるサブセット、ならびに／または
（４）アミノ酸配列ＥＩＶにおけるアミノ酸Ｉ（配列番号４２を参照）、
アミノ酸配列ＦＮＰにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号４５を参照）、
およびアミノ酸配列ＰＩＬにおけるアミノ酸Ｉ（配列番号４８を参照）、もしくはそれらのあらゆるサブセット
を含むアミノ酸配列を有する。
【００１９】
ＯＲＦ１ａはプロアテーゼ機能を備えるポリタンパク質をコードし、ＯＲＦ１ｂはレプリカーゼ（ＲＮＡポリメラーゼ）およびヘリカーゼ機能を備えるポリタンパク質をコードするということが理解されるだろう。ＰＲＲＳの多様なＯＲＦ（翻訳領域）からコードされたタンパク質の機能に関する追加の情報が、例えば米国特許第７，１３２，１０６号において発見され得る。ＯＲＦ７の機能および他の翻訳領域に関しては米国特許第７，５４４，３６２号もまた参照されたい。当業者に理解されるように、ＯＲＦ１コードタンパク質は、既知のものおよび未知のものを含め、追加的な機能を有することを期待され、本発明の実施において有益な新型アミノ酸変化は、ＯＲＦ−１コードタンパク質の特有機能のいずれか１つへの影響を経るものに限られない。
【００２０】
さらなる好適な実施形態において、前記プラスミドはプロモーターを含み、すなわち、標的真核細胞へのＤＮＡ着手を許可することができる真核生物プロモーター、または、プラスミドの生体外転写を誘導することができる原核もしくはファージプロモーターである。本発明は同様にＰＲＲＳウイルスの生成方法を供給し、その方法は適切な宿主細胞を適切なプラスミドと核酸導入することおよび核酸導入された細胞によって生成されたＰＲＲＳウイルスを獲得することを含む。
【００２１】
したがって、特定の好適な実施形態においては、発明は北アメリカＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む分離ポリヌクレオチド分子を供給し、ここにおいて前記ＤＮＡ配列は次から成る群から選択される、
（ａ）配列番号６、
（ｂ）少なくとも（ａ）のＤＮＡ配列と８５％の同一性を有する配列であって、そこにおいてそのＯＲＦ１ａにコードされたタンパク質が以下、
群（ｂ）（１）から
アミノ酸配列ＡＮＶにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号９を参照）、
アミノ酸配列ＨＮＡにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号１２を参照）、
アミノ酸配列ＰＤＧにおけるアミノ酸Ｄ（配列番号１５を参照）、
アミノ酸配列ＷＹＬにおけるアミノ酸Ｙ（配列番号１８を参照）、
アミノ酸配列ＶＨＧにおけるアミノ酸Ｈ（配列番号２１を参照）、もしくはそれらのあらゆるサブセット、ならびに／または
群（ｂ）（２）から
アミノ酸配列ＫＶＤにおけるアミノ酸Ｖ（配列番号２４を参照）、
アミノ酸配列ＡＴＤにおけるアミノ酸Ｔ（配列番号２７を参照）、
アミノ酸配列ＳＬＬにおけるアミノ酸Ｌ（配列番号３０を参照）、
アミノ酸配列ＭＣＱにおけるアミノ酸Ｃ（配列番号３３を参照）、もしくはそれらのあらゆるサブセット、ならびに／または
群（ｂ）（３）から
アミノ酸配列ＰＴＧにおけるアミノ酸Ｔ（配列番号３６を参照）、
アミノ酸配列ＶＡＫにおけるアミノ酸Ａ（配列番号３９を参照）、もしくはそれらのあらゆるサブセット、ならびに／または
群（ｂ）（４）から
アミノ酸配列ＥＩＶにおけるアミノ酸Ｉ（配列番号４２を参照）、
アミノ酸配列ＦＮＰにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号４５を参照）、
およびアミノ酸配列ＰＩＬにおけるアミノ酸Ｉ（配列番号２０を参照）、もしくはそれらのあらゆるサブセット、を含むアミノ酸配列を含む配列、ならびに
（ｃ）０．５ＭのＮａＨＰｏ４、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡの溶液における６５℃でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーションおよび０．１ＳＳＣ／０／１％ＳＤＳにおける６８℃での洗浄を含む高い緊縮条件下で（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ配列の相補体にハイブリタイズするＤＮＡ配列。
【００２２】
本発明はまたポリヌクレオチド分子に核酸導入された宿主細胞を供給、およびブタをＰＲＲＳウイルス感染から保護するワクチンを供給し、そのワクチンは（ａ）そのような前述のポリヌクレオチド分子によってコードされた、遺伝子組換え北米ＰＲＲＳウイルス、または（ｂ）前記感染性分子、または（ｃ）前記プラスミド形態の前記ポリヌクレオチド分子、または（ｄ）前記ポリヌクレオチド分子を含むウイルスベクターを含み、ＰＲＲＳウイルスは感染に対する免疫保護生成に効果的な量のＰＲＲＳウイルス感染に対する効果的免疫保護反応および家畜への使用に適切なキャリアを誘導することができる。
【００２３】
本発明は以下に一致する（すなわち相補的塩基コード配列を有する）ＲＮＡポリヌクレオチド配列もまた供給する。
（ａ）配列番号６のＤＮＡ配列、
（ｂ）ＤＮＡ配列で、（ａ）のＤＮＡ配列と少なくとも８５％の同一性を有し、そのＯＲＦ１ａにコードされたタンパク質が以下のいずれか、および以下のいずれかの組み合わせを含むアミノ酸配列を有するＤＮＡ配列
アミノ酸配列ＡＮＶにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号９を参照）、
アミノ酸配列ＨＮＡにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号１２を参照）、
アミノ酸配列ＰＤＧにおけるアミノ酸Ｄ（配列番号１５を参照）、
アミノ酸配列ＷＹＬにおけるアミノ酸Ｙ（配列番号１８を参照）、
アミノ酸配列ＶＨＧにおけるアミノ酸Ｈ（配列番号２１を参照）、
アミノ酸配列ＫＶＤにおけるアミノ酸Ｖ（配列番号２４を参照）、
アミノ酸配列ＡＴＤにおけるアミノ酸Ｔ（配列番号２７を参照）、
アミノ酸配列ＳＬＬにおけるアミノ酸Ｌ（配列番号３０を参照）、
アミノ酸配列ＭＣＱにおけるアミノ酸Ｃ（配列番号３３を参照）、
アミノ酸配列ＰＴＧにおけるアミノ酸Ｔ（配列番号３６を参照）、
アミノ酸配列ＶＡＫにおけるアミノ酸Ａ（配列番号３９を参照）、
（アミノ酸配列ＥＩＶにおけるアミノ酸Ｉ（配列番号４２を参照）、
アミノ酸配列ＦＮＰにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号４５を参照）、
およびアミノ酸配列ＰＩＬにおけるアミノ酸Ｉ（配列番号２０を参照）、または
（ｃ）０．５ＭのＮａＨＰｏ４、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡの溶液における６５℃でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーションおよび０．１ＳＳＣ／０／１％ＳＤＳにおける６８℃での洗浄を含む高い緊縮条件下で（ａ）もしくは（ｂ）のＤＮＡ配列の相補体にハイブリタイズするＤＮＡ配列。
【００２４】
したがって、本発明はまたＰＲＲＳウイルスの野外株に自然に感染したブタと本明細書に記載されたワクチンでワクチン接種を受けたブタを区別するポリヌクレオチド分子を含む診断キットを供給し、ワクチン（ウイルス）は好適には野生型Ｐ１２９ＰＲＲＳウイルス（配列番号５）と比較して減衰したインターフェロン−α抑制効果を証明する。
【００２５】
表及び図面の簡単な説明
表１は、感染性ｃＤＮＡクローン、およびＰＫ−９細胞への核酸導入によって誘導されたそれに対応するウイルスを示す。
表２は、野生型ＰＲＲＳウイルスおよび細胞培養における成長に適応した誘導体のインターフェロン−α抑制効果を示す。
表３は、野生型ＰＲＲＳウイルスＰ１２９およびＣＤ１６３発現ＰＫ−９細胞における成長に適応した遺伝子操作されたその誘導体のインターフェロン−α抑制効果を示す。
表４は、野生型Ｐ１２９ウイルスおよびＰＲＲＳのＩｎｇｅｌｖａｃワクチンに比べ、低下したＰ１２９−ＰＫ−ＦＬおよびＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ウイルスのインターフェロン−α抑制効果を示す。
表５は、ワクチンウイルスの安全性および有効性を評価するための試験の構想を示す。
表６は、遺伝子位置による、０継代Ｐ１２９と１７継代Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬとの間の全てのヌクレオチド差異および結果として得られるアミノ酸の差異を示す。
表７は、ウイルスタンパク質による、０継代Ｐ１２９と１７継代Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬとの間のヌクレオチドおよびアミノ酸の差異の集計を示す。
表８は、遺伝子位置による、感染性ｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９およびｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬにおいて見つかったＰＲＲＳＶ遺伝子間の全てのヌクレオチドの差異および結果として得られるアミノ酸の差異を示す。
表９および１０は、５２代継代ウイルスの表現型（配列番号６）に貢献するアミノ酸変化を示す。
表１１は、１日齢での修飾生ＰＲＲＳＶワクチンの接種後の臨床症状を有するブタの数を示す。
表１２は、１日齢での修飾生ＰＲＲＳＶワクチンの接種後の血清平均力価を示す。
表１３は、以前１日齢での修飾生ＰＲＲＳＶワクチンの接種を受けた７週齢のブタの抗原投与後の肺病変の割合を示す。
表１４は、以前１日齢での修飾生ＰＲＲＳＶワクチンの接種を受けた１８週齢のブタの抗原投与後の肺病変の割合を示す。
表１５は、以前１日齢での修飾生ＰＲＲＳＶワクチンの接種を受けた２６週齢のブタの抗原投与後の肺病変の割合を示す。
表１６は、以前修飾生ＰＲＲＳＶワクチンの接種を受けた５週齢の子ブタの抗原投与後の肺病変の割合を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、ワクチン接種後の直腸温度を図示する。
【図２】図２は、毒性ＰＲＲＳＶ  ＮＡＤＣ２０での抗原投与後の直腸温度を図示する。
【図３】図３は、ワクチン接種後および抗原投与後の体重を図示する。
【図４】図４は、ＰＲＲＳ病変を有する肺の割合の抗原投与後のデータを図示する。
【図５】図５は、抗原投与後の観察された病変の重症度のための肺評価スコア（ＬＡＳ）を図示する。
【図６】図６は、ワクチン接種後および抗原投与後の血清における抗ＰＲＲＳＶ抗体レベル（ＥＬＩＳＡ  Ｓ／Ｐ比率）を図示するヒストグラムである。
【図７】図７は、抗原投与後の血清中のウイルス負荷（ＰＡＭ細胞におけるｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）のグラフ表示である。
【図８】図８は、本明細書に開示される、配列番号１から配列番号６までを含むワクチンを得るために用いられる方法の図的表示である。
【００２７】
主要な配列の簡単な説明
配列番号１はＰ１２９−ＰＫ−ＦＬ継代１７の完全ゲノムを供給する。
【００２８】
配列番号２はＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４継代１７の完全ゲノムを供給する。
【００２９】
配列番号３はＰ１２９−ＰＫ−ＦＬ継代２４の完全ゲノムを供給する。
【００３０】
配列番号４はＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４継代３４の完全ゲノムを供給する。
【００３１】
配列番号５はＰ１２９継代０の完全ゲノムを供給する。
【００３２】
配列番号６はＰ１２９継代５２の完全ゲノムを供給する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本明細書および添付の請求項で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別の意味を示さない限り、複数形への言及を含む。したがって、例えば、「本方法」への言及は１つ以上の本明細書に記載された方法および／または段階を含み、本開示その他を読むにあたり当業者には明らかなものとなるだろう。
【００３４】
別の方法で定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は本発明が属する当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等のあらゆる方法および物質が発明の実施または検査において使用され得るが、好適な方法および物質がこれから記述される。
【００３５】
本発明の実施は、具体的に反対に指定されない限り、ウイルス学、免疫学、微生物学、
分子生物学および遺伝子組み換え技術の当業者が備えている技能の範囲内の慣習的な方法を用い、その多数が例示の目的で以下に記述される。そのような技術は文献において完全に説明される。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ
Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照されたい。
【００３６】
「北米ＰＲＲＳウイルス」は、北米ＰＲＲＳウイルス分離株に関連する遺伝的特徴を有するあらゆるＰＲＲＳウイルス、例えば１９９０年代初頭頃に米国で最初に分離されたＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．４：１１７−１２６）；Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ＰＲＲＳ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅ  ＭＮ−１ｂ（Ｋｗａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６：２９３−２９６）；ｔｈｅ
Ｑｕｅｂｅｃ  ＬＡＦ−ｅｘｐ９１ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ＰＲＲＳ（Ｍａｒｄａｓｓｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４０：１４０５−１４１８）；およびＮｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ＰＲＲＳ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅ  ＶＲ
２３８５（Ｍｅｎｇ，Ｘ．−Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１７９５−１８０１を参照）を意味するがこれに限られない。遺伝的特徴は、北米ＰＲＲＳウイルス株と共有するゲノムヌクレオチド配列の類似性およびアミノ酸配列の類似性を意味する。中国ＲＰＰＳウイルス株は一般的に北米株と約８０〜９３％のヌクレオチド配列の類似性を表す。
【００３７】
「欧州ＰＲＲＳウイルス」は１９９１年頃に欧州で初めて分離されたＰＲＲＳウイルスに関連する遺伝的特徴を有するあらゆる株のＰＲＲＳウイルスを意味する（例えばＷｅｎｓｖｏｏｒｔ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｖｅｔ．Ｑ．１３：１２１−１３０を参照）。「欧州ＰＲＲＳウイルス」は当業者において「Ｌｅｙｓｔａｄウイルス」を意味することもある。
【００３８】
「効果的な免疫保護反応」、「免疫保護」および類似の用語は、本発明の目的においては、ワクチン接種を受けた動物における病原体による感染から保護するための、１つ以上の病原体の抗原エピトープに向けられる免疫反応を意味する。本発明の目的においては、病原体による感染からの保護は、感染からの完全な保護だけでなく、病原体による感染の程度もしくは比率のあらゆる検出可能な減衰、またはワクチン接種を受けていない感染した動物と比較した、ワクチン接種を受けた動物における病原体による感染がもたらす疾患もしくはあらゆる症状もしくは状態の重症度のあらゆる検出可能な減衰も含む。効果的な免疫保護反応は、以前病原体に感染していないおよび／またはワクチン接種の時点で病原体に感染していない動物において誘導され得る。効果的な免疫保護反応はワクチン接種の時点で既に病原体に感染している動物においても誘導され得る。
【００３９】
遺伝子組換えＰＲＲＳウイルスは、その非修飾親株より毒性が低い場合「減弱」される。疾患の重症度を決定する１つ以上のパラメータにおいて統計的に有意な減衰を示すとき、株は「毒性が低い」。そのようなパラメータはウイルス血症のレベル、熱、呼吸困難の
重症度、生殖症状の重症度、または肺病変の数もしくは重症度等を含み得る。
【００４０】
「ＰＲＲＳウイルス複製の支援をすることが可能な宿主細胞」は、本発明のウイルスに感染したとき感染性ＰＲＲＳを作り出すことが可能な細胞を意味する。そのような細胞は単球／マクロファージ系統のブタ細胞、例えばブタ肺胞マクロファージ細胞および誘導体、ＭＡ−１０４サル腎細胞および誘導体、例えばＭＡＲＣ−１４５細胞、ならびにＰＲＲＳウイルスの受容体と核酸導入した細胞を含む。用語「ＰＲＲＳウイルス複製の支援をすることが可能な宿主細胞」は生きたブタの細胞もまた含み得る。
【００４１】
本明細書で用いられる「翻訳領域」または「ＯＲＦ」は介在終止コドンを伴わずに特定のＰＲＲＳウイルスタンパク質をコードすることを求められる最小ヌクレオチド配列を意味する。
【００４２】
「ブタ（Ｐｏｒｃｉｎｅ）」および「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」は本明細書において交換可能的に用いられ、イノシシ科の仲間であるあらゆる動物、例えば、ブタを意味する。本明細書で用いられる用語「ＰＲＲＳウイルス」は、別の方法が指定されない限り、北米または欧州ＰＲＲＳウイルスのどちらかのいずれかの株を意味する。
【００４３】
「ＰＲＲＳ」はＰＲＲＳウイルス感染によってもたらされるブタにおける疾患症状を含む。そのような症状の例は、発熱、妊娠している雌における流産、呼吸困難、肺病変、食欲不振、および若いブタの死亡率を含むがこれらに限られない。本明細書で用いられる、「ＰＲＲＳを生成できない」ＰＲＲＳウイルスは、ブタに感染できるが、ブタにおけるＰＲＲＳ感染に一般的に関連づけられる疾患症状を生成しないウイルスを意味する。
【００４４】
本明細書で用いられるＰＲＲＳＶ「Ｎタンパク質」または「ＯＲＦ７」は、ＰＲＲＳウイルスの欧州および北米遺伝子型の両者のＯＲＦ７によってコードされるポリペプチドとして定義される。現在知られているＮタンパク質の具体的なアイソタイプの例は、受託番号ＰＲＵ８７３９２によってＧｅｎｂａｎｋにおいて報告された北米ＰＲＲＳ１２３アミノ酸ポリペプチド原型分離株ＶＲ２３２２、およびＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ａ２６８４３において報告された欧州原型ＰＲＲＳ分離株Ｌｅｌｙｓｔａｄの１２８残基Ｎタンパク質である。
【００４５】
「ＰＲＲＳＶ  Ｎタンパク質ＮＬＳ−１領域」または「ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７  ＮＬＳ−１領域」は「ｐａｔ４」または「ｎｕｃ１」核局在化シグナルを意味し（Ｎａｋａｉ＆Ｋａｎｅｈｉｓａ、１９９２；Ｒｏｗｌ＆Ｙｏｏ、２００３）、４つの連続的塩基性アミノ酸（リジンまたはアルギニン）または３つの塩基性残基およびヒスチジンまたはプロリンを含み、成熟Ｎタンパク質のおよそ第１の１５Ｎ末端残基内に位置する。例として、Ｌｅｌｙｓｔａｄ分離株配列はＫＫＫＫであり、Ｎタンパク質の残基１０〜１３に位置する一方で、ＶＲ２３３２ＮＬＳ−１領域配列はＫＲＫＫであり、残基９〜１２に位置する。
【００４６】
「ＰＲＲＳＶ  Ｎタンパク質ＮＬＳ−２領域」または「ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７  ＮＬＳ−２領域」は、Ｎタンパク質内の第２の核局在化シグナルを意味し、２つの形態のうち１つの形態を取ることができる。北米ＰＲＲＳウイルスにおいて、ＮＬＳ−２は、「ｐａｔ８」モチーフと指定したパターンを有し、５つの残基配列による３つの残基内において追随されるプロリンから始まり、５つのうち少なくとも３つの塩基性残基（ＫまたはＲ）を含む（「ｐａｔ７」または「ｎｕｃ２」モチーフのわずかな修飾がＮａｋａｉ＆Ｋａｎｅｈｉｓａ、１９９２、Ｒｏｗｌａｎｄ＆Ｙｏｏ、２００３により記載される）。例として、そのような配列は北米ＰＲＲＳＶ分離株ＶＲ２３３２のＮタンパク質残基４１〜４７に位置し、配列Ｐ．．．Ｋで表される。欧州ＰＲＲＳウイルスにおいてＮＬＳ−２は「ｐａｔ４」または「ｎｕｃ１」モチーフを有し、４つの塩基性アミノ酸またはヒスチジンもし
くはプロリンに関連する３つの塩基性残基の連続的広がりである（Ｎａｋａｉ＆Ｋａｎｅｈｉｓａ，１９９２；Ｒｏｗｌａｎｄ＆Ｙｏｏ，２００３）。欧州ＰＲＲＳＶ分離株ＬｅｌｙｓｔａｄのＮＬＳ−２は残基４７〜５０に位置し、配列Ｋ．．Ｋによって表される。
【００４７】
「ＰＲＲＳＶ  Ｎタンパク質ＮｏＬＳ領域」または「ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７  ＮｏＬＳ領域」は全長約３２アミノ酸を有し、そのアミノ末端付近のＮＬＳ−２領域を包含する核小体局在シグナルを意味する。例として、ＶＲ２３３２ＮｏＬＳ領域配列は残基４１〜７２に位置し、配列Ｐ．．．Ｒによって表され（Ｒｏｗｌ＆Ｙｏｏ、２００３）、それに対応するＬｅｌｙｓｔａｄ分離株配列は、残基４２〜７３に位置し、配列Ｐ．．Ｒによって表される。
【００４８】
「核酸導入された宿主細胞」は実質的に、米国特許第５，６００，６６２号に記載のあらゆる宿主細胞を意味し、ＰＲＲＳウイルスに核酸導入されたとき、ＲＮＡはＰＲＲＳウイルス粒子の少なくとも第１のラウンドを生成することができる。本発明における「感染性ＤＮＡ分子」は複製、転写および適切な宿主細胞から機能的なウイルス粒子への転換を支援するために不可欠な要素をコードする。同様に、「分離ポリヌクレオチド分子」は、自然発生状態から、もしあれば検出可能なあらゆる程度で精製された、本発明のポリヌクレオチド分子を含む物質の組成物を意味する。
【００４９】
本発明において、第２のポリヌクレオチド分子（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）のヌクレオチド配列は、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列と「同族」であるか、または前記第１のポリヌクレオチド分子と「同一性」を有し、第２のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は遺伝子コードの縮退に基づくように第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列と同じポリアミノ酸をコードするか、または、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列にコードされたポリアミノ酸に十分類似するポリアミノ酸をコードし、本発明の実践において有益である場合を意味する。同族ポリヌクレオチド配列はまたセンスおよびアンチセンス鎖、ならびに全ての場合においてあらゆるそのようなストランドの相補体を意味する。本発明において、ポリヌクレオチド分子は本発明の実践に当たり有益であり、したがって同族であるか同一性を有し、感染ブタの体液または組織サンプル内のＰＲＲＳウイルスまたはウイルスポリヌクレオチドの存在を検出する例えば標準ハイブリダイゼーションまたは増幅技術による診断プローブとして用いられ得る。一般的に、第２のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムに基づくように第一のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に少なくとも約７０％のヌクレオチド配列同一性を有するとき、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列と同族である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、またはＮＣＢＩ、（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）。本発明の実施による、計算の具体的な例において、ＢＬＡＳＴＰ２．２．６［Ｔａｔｕｓｏｖａ  ＴＡ  ａｎｄ  ＴＬ  Ｍａｄｄｅｎ，“ＢＬＡＳＴ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”（１９９９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０．］を参照する。簡潔に言えば、２つのアミノ酸配列は整列スコアを最適化するために、ギャップオープニングペナルティ１０、ギャップエクステンションペナルティ０．１、ならびにＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆのマトリクスをスコアする「ブロサム（ｂｌｏｓｕｍ）６２」を用いて整列される（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５‐１０９１９．１９９２）。割合同一性はその後次のように計算される、同一的一致の総数×１００／２つの配列を整列するために長い方の配列に導入されたギャップの長い方の配列＋数の長さ。
【００５０】
好適には、同族ヌクレオチド配列は少なくとも約７５％のヌクレオチド配列同一性を有し、より好適には少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％のヌクレオチド配列同一性を有する。遺伝子コードが縮退されるため、同族ヌクレオチド配列はあらゆる数の「サイレント」塩基変化、すなわちヌクレオチド置換だが同じアミノ酸をコードする塩基変化、を含み得る。
【００５１】
同族ヌクレオチド配列はさらに非サイレント変異、すなわち塩基置換、欠失、または付加を含むことができ、第１のヌクレオチド配列にコードされたポリアミノ酸に少なくとも約７０％同一であるかまたは本発明の実施に有益である限り、コードされたポリアミノ酸におけるアミノ酸の差異をもたらす。この点において、概して全体のタンパク質機能を不活性化しないと認識される特定の保守的アミノ酸置換、例えば、正電荷を持つものとして、アミノ酸（逆もまた同様）、リジン、アリジニンおよびヒスチジン；負電荷を持つものとして、アミノ酸（逆もまた同様）、アスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに中性電荷を持つアミノ酸の群として（全ての場合において逆もまた同様）、（１）アラニンおよびセリン、（２）アスパラギン、グルタミン、およびヒスチジン、（３）システインおよびセリン、（４）グリシンおよびプロリン、（５）イソロイシン、ロイシンおよびバリン（６）メチオニン、ロイシンおよびイソロイシン、（７）フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、およびチロシン、（８）セリンおよびトレオニン、（９）トリプトファンおよびチロシン、（１０）ならびに例えばチロシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンがなされ得る。アミノ酸は物理的特性ならびに２次および３次タンパク質構造への貢献によって分類され得る。保守的な置換は当業者に、あるアミノ酸の類似する特性を持つ別のアミノ酸への置換として認識される。例示的保守的置換は１９９７年３月１３日に公開された国際公開第ＷＯ９７／０９４３３号、頁１０、（１９９６年９月６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ９６／０２１９７号において見られる。または、保守的アミノ酸はＬｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ：ＮＹ（１９７５），ｐｐ．７１−７７）において記載されるように分類され得る。さらなる適切な保守的変化およびその適用は以下で記載される。
【００５２】
同族ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の比較、例えば上記のＢＬＡＳＴＮを使用することによって決定され得る。または、同族ヌクレオチド配列は選択条件下のハイブリダイゼーションによって決定され得る。例えば、中程度の緊縮条件下、例えば０．５ＭのＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡの溶液におけ
る６５℃でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、ならびに０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおける４２oＣでの洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ  ｅｄｉｔ
ｏｒｓ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ
ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９４，ｐｐ．６．０．３〜６．４．１０を参照）、または別の方法で下記に定義されるＰＲＲＳウイルスをコードする配列のハイブリダイゼーションをもたらす条件下で配列番号１の相補体にハイブリダイズする場合、第２のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は配列番号１（または他のあらゆる特定ポリヌクレオチド配列）と同族である。ハイブリダイゼーション条件の修正は、経験的に決定され得、またはプローブのグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対合の長さおよび割合に基づき正確に計算され得る。ハイブリダイゼーション条件はＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９），ｐｐ．９．４７〜９．５１に記載のように計算することができる。
【００５３】
別の実施形態においては、配列番号１の相補体に、高い緊縮条件下、例えば、当業者に周知のように、０．５ＭのＮａＨＰＯ4、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡの溶液におけ
る６５oＣでのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーションおよび、０．１×ＳＳ
Ｃ／０．１％ＳＤＳにおける６８oＣでの洗浄、でハイブリダイズする場合、第２のヌク
レオチド配列は配列番号１（または本発明のあらゆる他の配列）と同族である（Ａｕｓｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９。
【００５４】
さらに、本発明における分離ポリヌクレオチド分子および分離ＲＮＡ分子は、合成分子ならびに、組み換え技術、例えばインビトロクローニングおよび転写によって得られる分子の両者を含む。
【００５５】
ポリヌクレオチド分子は当業者に周知の組み換え技術を用いて遺伝的に変異させられ得、部位特異的変異誘発法、またはランダム変異導入法、例えば当業者に周知のように化学突然変異原または放射線への露出を含む。」変異は当業者に周知の標準方法で実行され得、例えば記載のような感染性コピー（例えばＭｅｕｌｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，４４０：１９９−２０６）の部位特異的変異誘発法（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）による。
【００５６】
したがって、本発明はさらに遺伝子組換え北米ＰＲＲＳウイルスの生成方法を供給し、本方法は、上記のようにＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列に変異を起こさせること、および適切な発現体系を用いて遺伝子組換えＰＲＲＳウイルスを発現することを含む。遺伝子組換えＰＲＲＳウイルスは、当業者に周知の適切な発現体系を用いて分離ポリヌクレオチド分子から発現され得、その例は本出願に記載される。例えば、分離ポリヌクレオチド分子は、以下でより詳細に記載されるように、適切な体外宿主細胞におけるコードされたウイルスを発現することが可能なプラスミド形態であり得る。
【００５７】
北米ＰＲＲＳＶ  Ｎタンパク質配列は高度に保存され、既報告の配列は約９３〜１００％の互いとの同一性を有する。北米および欧州ＰＲＲＳＶ  Ｎタンパク質は約５７〜５９％同一であり、共通の構造モチーフを共有する。一般的に、特定のヌクレオチドまたはコードされたアミノ酸に異なって番号を付けられる可能性があるＰＲＲＳコード配列および分離株を比較するとき、適切な領域の同定は、対象のＰＲＲＳ株における保存された特徴的アミノ酸を同定することおよびそれを参考株と整列させることより、速やかに達成される。
【００５８】
組換えＤＮＡ技術はＤＮＡレベルで核酸を修飾することを目的とする、極めて多様で強力な分子生物学手法を含み、分子レベルでゲノムを分析および修飾することを可能にする。この点において、ＰＲＲＳウイルスのようなウイルスは、そのゲノムの適度なサイズゆえに、上記の操作に特に従順である。しかしながら、これらのウイルスは複製においてＤＮＡ中間段階を含まないため、組換えＤＮＡ技術は非レトロウイルスＲＮＡウイルスに直ちに適用できるわけではない。そのようなウイルスには、修飾ウイルスを生成するためにそれらのゲノムに組換えＤＮＡ技術が適応され得る前に、感染性ｃＤＮＡクローンが開発されなければならない。感染性クローンは試験下のウイルスの全長（ゲノムの長さ）ｃＤＮＡ（ここではＲＮＡのＤＮＡコピーの広い意味で用いられ、ｍＲＮＡのＤＮＡコピーの厳密な意味のみではない）の構造から誘導され得、その後、感染性転写が全長ｃＤＮＡで核酸導入された生体内の細胞において合成され、しかし感染性転写は転写混合物の存在に伴う原核プロモーターを有するプラスミドにおける全長ｃＤＮＡからの生体外の転写によ
っても得られ得、または生体外で全てのウイルスゲノムを含む結紮した部分長ｃＤＮＡ断片を用いることによっても得られ得る。全ての場合において、転写ＲＮＡはｃＤＮＡに導入された全ての修飾を保有し、このように修飾されたウイルスの更なる継代に用いられ得る。
【００５９】
欧州ＰＲＲＳウイルス分離株の感染性クローンまたはＬｅｌｙｓｔａｄウイルスの調製は米国特許第６，２６８，１９９号に記載され、参照することによって全面的に本明細書に組み込まれる。Ｐ１２９に指定された北米ＰＲＲＳウイルス分離株の感染性ｃＤＮＡクローンの調製（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）は米国特許第６，５００，６６２号に記載され、参照することによって全面的に本明細書に組み込まれる。Ｐ１２９ｃＤＮＡの配列はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４９４０４２および米国特許第６，５００，６６２号において開示される。下記の試験はプラスミドとの関連でＣＭＶ最初期プロモーターによって発現され、ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９に指定されるそのような感染性クローンを利用し、米国特許第６，５００，６６２号においても開示される。米国特許第６，５００，６６２号に記載のように、本発明における使用に適切な他のプラスミドおよびプロモーターがある。
【００６０】
対象のあらゆる翻訳領域の完全配列および対象のアミノ酸残基の位置を考慮すると、当業者は望まれる具体的位置における変化を考案するにはコドン表を調べるだけでよい。
【００６１】
コドンはｍＲＮＡにおけるヌクレオチドのトリプレット配列およびそれらに対応するｃＤＮＡ分子を構成する。コドンはｍＲＮＡ分子内に存在するときはウラシル塩基（Ｕ）によって特徴づけられるが、ＤＮＡ内に存在するときはチミジン塩基（Ｔ）によって特徴づけられる。コドンにおけるポリヌクレオチド内の同じアミノ酸残基への単純な変化はコードされたポリペプチドの配列または構造を変化させない。特定の３ヌクレオチド配列がいずれかの特定のアミノ酸を「コードする」と述べるとき、当業者が上記の表が対象の特定のヌクレオチドを同定する手法を供給するということを認識し得るということは明らかである。例として、特定の３ヌクレオチド配列がリジンをコードする場合、上記表は２つの可能性のあるトリプレット配列がＡＡＡおよびＡＡＧであるということを開示する。グリシンはＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＴ（ＲＮＡにおける場合はＧＧＵ）およびＧＧＧによってコードされる。コードされたタンパク質においてリジンをグリシン残基に変化させるためには、コードする核酸内においてＡＡＡまたはＡＡＧのトリプレットをＧＧＡおよびＧＧＣ，ＧＧＴまたはＧＧＧのいずれかに置き換える可能性がある。
【００６２】
前述のように、本発明はＰＲＲＳのワクチン株の供給を対象とし、インターフェロン経路によって媒介されるウイルスに対する宿主反応は、他の反応がある中で下方制御されない。下に詳細に記載されるように、この点において効果的なウイルスゲノムに対する多様な修飾があり、特に本明細書で開示されるようにＯＲＦ１ａにおいて発見されるものおよびその組み合わせがある。注目されるべきは、類似する修飾点がＰＲＲＳゲノムの追加的翻訳領域において、本明細書でも開示されるように（表９参照）発見され得るということである。
【００６３】
特筆すべきは、ＰＲＲＳポリヌクレオチドの修飾へのある他の過去のアプローチがＰＲＲＳウイルスを減弱させることに成功しており、結果としての減弱の正確な要因は一般的に知られていないものの、ワクチン使用への適合性を供給し得るということである。例えば、ウイルスのヌクレオカプシドまたはＮタンパク質（ＯＲＦ７にコードされた）におけるＮＬＳ−２領域、ＮｏＬＳ領域、もしくはＮＥＳ領域を変異させるまたは欠失させることにより毒性ＰＲＲＳウイルスを減弱させること、翻訳領域７（ＯＲＦ７）における欠失を含むことが開示される。別の態様では、ＯＲＦ７の欠失はカプシドタンパク質の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列内における。ＮＬＳをコードする配列内でのＯＲ
Ｆ７の欠失は位置４３〜４８での１つ以上のアミノ酸の欠失を含み得るか、または位置４３および４４の一方もしくは両方でのアミノ酸の欠失を含み得る。例えば参照によって組み込まれる米国特許第７，５４４，３６２号の全開示を参照されたい。ＯＲＦ７にコードされたＰＲＲＳＶのヌクレオカプシドタンパク質は小さい塩基性タンパク質であり、リン酸化しており（Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｒｏｗｌａｎｄ，ａｎｄ  Ｙｏｏ，２００２）ホモ２量体を形成する（Ｗｏｏｔｔｏｎ  ａｎｄ  Ｙｏｏ，２００３）。結晶構造が近年特定された（Ｄｏａｎ  ａｎｄ  Ｄｏｋｌａｎｄ，２００３）。Ｎタンパク質は感染細胞において複数の機能を有するように思われる。細胞質で起こる過程である、内部にゲノムＲＮＡがパッケージされる球状のカプシド構造を形成する過程に加え、Ｎタンパク質の一部が核および特異的に感染細胞の核に輸送される。Ｎタンパク質のアミノ酸配列は２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核小体局在化シグナル（ＮｏＬＳ）、および核輸出シグナル（ＮＥＳ）を含み、核および核小体への輸送ならびに核からの輸出をそれぞれ容易にする（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｒｏｗｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｙｏｏ，２００３）。核小体にある間、Ｎタンパク質は小型核小体ＲＮＡ関連タンパク質フィブラリンと相互作用し、感染細胞におけるｒＲＮＡ処理およびリボソーム生合成を制御しウイルス複製に助力し得る（Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。この型のウイルス変異は、新型ＰＲＲＳワクチンの考案に、単独または他の減弱変異との組み合わせのどちらにおいても価値あるものである。減弱されたＰＲＲＳウイルスの別の例においては、ＯＲＦ１ａへの修飾が用いられた。ＯＲＦ１ａの領域をコードする非構造タンパク質２超可変領域におけるアミノ酸６１６から７５２の間の抗原エピトープをコードするＤＮＡ配列の欠失が用いられた。参照することによって全面的に組み込まれる米国特許第７，６１８，７９７号を参照されたい。
【００６４】
ＰＲＲＳウイルスの免疫生物学に関する試験はＰＲＲＳウイルスとＰＤＣの相互作用は検査に値するということを示唆する。この細胞型はヒト、マウス、ラット、ブタおよびサルの末梢血単核球の０．２％〜０．８％を表す。稀であるにもかかわらず、この細胞は自然免疫系の重要な構成要素であり、ウイルス刺激の後で多量のＩＦＮ−αを分泌することが可能である。ＰＤＣが抗ウイルス性の自然および適応免疫を制御するにあたり主要な役割を果たすのは、それらがナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、およびＴ細胞の機能を促進するためであり、ＩＦＮ−αの分泌を介する。さらに、ブタ単球誘導樹状細胞の成熟化（ＭｏＤＣ）はＰＤＣによって分泌されるＩＦＮ−αにより促進され、ＭｏＤＣが抗原および活性Ｔ細胞を提示する能力の向上をもたらす。ウイルス感染の後期段階で、ＰＤＣは成熟樹状細胞の固有の型に分化し、Ｔ細胞の機能を直接的に制御しＴ細胞の分化を、ＰＲＲＳウイルスを含むウイルスに対する抗ウイルス免疫の主要な媒介物であるＩＦＮ−γ分泌が可能な細胞へ向かわせる。当然のことながら、ＰＤＣがＩＦＮ−αを分泌する能力を抑制するとして知られる呼吸系発疹ウイルスおよび麻疹ウイルスのような、ヒトウイルスがある。この抑制効果は、体液性免疫反応およびこれらのウイルスへの感染の結果として観察される関連する免疫病理学の優性において、ならびに、第２の細菌およびウイルス感染への宿主の易感性において、役割を果たすと思われる。
【００６５】
対照的に、新型Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬおよびＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ウイルスストック（下記参照）がこのＰＤＣ機能に対して最小から無の抑制効果を示した一方で、野生型ＰＲＲＳＶ分離株もＩｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳワクチン株の両者と同様に（例５および下記を参照）純化されたブタＰＤＣの集団がＩＦＮ−αを生成する能力を抑制した。これらの観察の重要性は、部分的に、ウイルスへの適応免疫反応の発展を抑制することにおけるＩＦＮ−αの重要性に帰する。したがって、ＩＦＮ−αを最小に抑制するウイルスから誘導された減弱したウイルスワクチンは強い抗ウイルス保護免疫反応を誘発する可能性が高い。Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶワクチンに対するＩＦＮ−αのアジュバント効果はウイルス特有Ｔ細胞媒介ＩＦＮ−γ反応を誘発すること、および、ワクチンによって誘発されたウイルス特有Ｔ細胞媒介ＩＦＮ−γ反応の強度は野外および実験室条件
下のウイルスに対する防御免疫と正相関を有することが以前に実証された。したがって、理論に限られないが、細胞媒介の免疫反応および非ＩＦＮ−α抑制ＰＲＲＳＶによって誘発される防御免疫のレベルは野生型（ＩＦＮ−α抑制）表現型を示すＰＲＲＳＶ分離株のそれよりも著しく高いと期待することは妥当である。
【００６６】
本発明を参照すると、注目すべきは、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬウイルスはｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ感染性ｃＤＮＡクローンから誘導された５つの欠失変異体の全てと同様に、ＩＦＮ−α生成を抑制する能力を失ったことである。したがって、この異常な表現型は欠失のみによる結果ではなく、少なくとも部分的に、感染性クローンの構築の間に固定された遺伝子変化による結果でもある。興味深いことに、連続的にＰＫ−９細胞上で６３回継代されたクローンされていないＰ１２９ウイルスはＩＦＮ誘発を抑制する能力を維持した（表１）。全ての感染性クローン誘導ウイルスにおいて見られる共通のＩＦＮ表現型に対する最も有望な説明は、感染性クローンの生成の間の１つ以上の変異の取り込みである。これらの変異は、感染性クローンを構築するために用いられるウイルス性ＲＮＡ内に、恐らく低いレベルで存在し得た。究極的に、変異は、ブタにおける元の（継代０）ウイルス内に存在し得たか、またはウイルスをＰＫ−９細胞上での１６継代にわたる生育に適応させる過程の間に生成および濃縮され得た。変異が結果ＰＣＲ誘発エラーまたはクローン人工物であるという可能性は除外され得ない。少なくとも、変異はＩＦＮ−α抑制機能の欠損が感染性クローン構築の間に「固定」されたことの原因であり、この特定の感染性クローンから誘導された全てのウイルス内に存在することが求められる。
【００６７】
変化ＩＦＮ−α抑制表現型の原因である変異がｃＤＮＡクローン構築に用いられるウイルス性ＲＮＡに前から存在していた可能性は、ＰＲＲＳＶがウイルス性ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼによるエラーの結果として容易にランダムな遺伝的多様性を生成するとして知られていることを考慮すると、もっともらしい。ウイルス疑似種は、生体内でのウイルス複製の間自然に現れる、密接に関わる遺伝子変異体の異種性混合物で構成される。より関連があるのは、感染性ｃＤＮＡクローンから誘導されたＰＲＲＳＶの生体外の複数の継代後のウイルス疑似種の観察である。以前行われた試験におけるウイルスゲノムの開始個体群は遺伝的に同種な個体群から成り、配列の多様性は細胞培養における継代の間急速に生成されたため、これは注目すべきである。現在の試験においては、元のＰ１２９ウイルスが１６ＰＫ−９継代の前にクローンされておらず（生物学的にまたは分子的に）、感染性クローンの構築に通じるため、ゲノム異質性のレベルはより高くあり得る。したがってＩＦＮ−α抑制機能の欠損の原因である疑似種の中でＰＲＲＳＶ  ＲＮＡ変異体、およびｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬ感染性ｃＤＮＡクローンへの取り込みの可能性選択はもっともらしい。これらの変異の感染性クローンへの取り込みは、全ての誘導ウイルスが、効果的な次世代ＰＲＲＳワクチンの発達に重要であると証明され得る、この独特な生物学的表現型を共有していることを考慮すると、いくつかの条件下においては、偶発的であり得る。
【００６８】
野生型ＰＲＲＳウイルス株Ｐ１２９は、このウイルスの他の株と同様、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）がインターフェロン（ＩＦＮ）−αを生成する能力に対し強い抑制効果を示した。一方で、Ｐ１２９（ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬ）の感染性ｃＤＮＡクローンから誘導されたウイルスはＩＦＮ−α抑制表現型における有意な減衰を示した。この感染性クローンは、以前ＣＤ１６３発現ブタ腎細胞株ＰＫ―９における１６の連続的継代にわたる培養に適応したウイルスから構築された（参照することによって全面的に組み込まれる米国特許第７，７５４，４６４号を参照）。Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬおよびＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４のＩＦＮ−α抑制表現型は低いものから無視できるものまでの範囲を持ち、どちらも高い抑制性を持つ２つのＩｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ修飾生ウイルスワクチン株のいずれかによって示されたものと著しい対照を成した。これらの結果は、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬおよびＰ１２９−ＰＫ−ｄ４
３／４４ウイルスが生物学的に親低継代Ｐ１２９分離株、他の野生型ＰＲＲＳウイルス、およびＩｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳワクチンの両者とは異なるということを示す。減衰ＩＦＮ−α抑制表現型の潜在的含意は、表現型の変化の考えられる理由と同様に記載される。
本発明のアミノ酸修飾
【００６９】
本発明の実施によれば、ＰＲＲＳの新しい分離株は、北米または中国遺伝子型のいずれかで、ＯＲＦ１からコードされたタンパク質に特定の位置にアミノ酸を含み、それが所望の表現型をこれらのウイルスに与える分野で同定され得る。別の例では、上述のように、コードされたＯＲＦ１タンパク質の遺伝子配列（および、したがってアミノ酸配列）を修飾し、再び、その全てがそのような表現型を有する、修飾北米および中国ＰＲＲＳウイルス、ならびに感染性クローン、ならびにそのワクチンを生成するために、標準遺伝子手順が用いられ得る。好適な実施例では、表現型は、野生型ＰＲＲＳウイルスと比較して減衰したインターフェロン−α抑制効果、および、選択的に、ほとんど検出不可能な病態であるが強い免疫反応を誘発する一方で宿主動物（ブタ）内で繁殖または持続する能力を含むがこれに限られない。
【００７０】
その結果、本発明の実施では、出発点として役立ち得る北米ＰＲＲＳ株または分離株は、例えば開示されている米国特許第６，５００，６６２号、同第７，６１８，７９７号、同第７，６９１，３８９号、同第７，１３２，１０６号、同第６，７７３，９０８号、同第７，２６４，９５７号、同第５，６９５，７６６号、同第５，４７６，７７８号、同第５，８４６，８０５号、同第６，０４２，８３０号、同第６，９８２，１６０号、同第６，２４１，９９０号、および同第６，１１０，４６８号を含む。出発点として役に立ち得る中国ＰＲＲＳ株および分離株については例えば、ＴＪＭ−９２ウイルスに係る公開された中国出願ＣＮ２０１６３３９０９から中国出願ＣＮ２００９１００９１２３３．６を参照されたい。
【００７１】
以下の議論に関して、国際的に認識された単一および３文字の名称は、ＤＮＡによってコードされる最も一般的なアミノ酸である、アラニン、（Ａｌａ，Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、ヒスチジン、（Ｈｉｓ，Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ，Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ，Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ，Ｐ）、セリン（ｓｅｒ，Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ，Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ，Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）およびバリン（Ｖａｌ，Ｖ）に使用される。
【００７２】
表９および１０はインターフェロンアルファ活動の抑制減衰と相関する北米（および中国）ＰＲＲＳにおける、毒性の減弱の原因となる観察されたアミノ酸変化を同定する。その結果、ワクチンへの安全で強い免疫反応を可能にする。表１０は、ＯＲＦ１ａ内におけるこの点で非常に好適なアミノ酸修正を同定し、他のＰ１２９培養菌から継代することに関してこれらの変異がどのように起こったかを示す（またこの経歴の検査は、本発明のアミノ酸変化のいずれかを有するコード化ＤＮＡを（再）構築するための変異誘発方策の考案を必要に応じて容易にするということを特筆すべきである。）。この点に関して、ＯＲＦ１ａへの最も好適なアミノ酸改善は（Ｐ１２９継代５２で明示されているように、１８２のアスパラギン、１８９のアスパラギン、２７３のチロシン、３０２のヒスチジン、６６５のトレオニン、９４３のシステイン、１４２９のトレオニン、１５０５のアラニン、２４１０のアスパラギンを含み、潜在的に多数のグリコシル化の機会を加えて、そのようにしてタンパク質機能をさらに変更し得る。
【００７３】
したがって、本発明は、分離されたブタ生殖および呼吸症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）を供給し、そこにおいて、ＯＲＦ１ａによってコードされたそのタンパク質が以下のいずれかを含むアミノ酸配列を含む群から選択される。
【００７４】
アミノ酸配列ＡＭＡＮＶＹＤにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号９）、
アミノ酸配列ＩＧＨＮＡＶＭにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号１２）、
アミノ酸配列ＴＶＰＤＧＮＣにおけるアミノ酸Ｄ（配列番号１５）、
アミノ酸配列ＣＷＷＹＬＦＤにおけるアミノ酸Ｙ（配列番号１８）、
アミノ酸配列ＨＧＶＨＧＫＹにおけるアミノ酸Ｈ（配列番号２１）、
アミノ酸配列ＡＡＫＶＤＱＹにおけるアミノ酸Ｖ（配列番号２４）、
アミノ酸配列ＰＳＡＴＤＴＳにおけるアミノ酸Ｔ（配列番号２７）
アミノ酸配列ＬＮＳＬＬＳＫにおけるアミノ酸Ｌ（配列番号３０）
アミノ酸配列ＡＰＭＣＱＤＥにおけるアミノ酸Ｃ（配列番号３３）、
アミノ酸配列ＣＡＰＴＧＭＤにおけるアミノ酸Ｔ（配列番号３６）、
アミノ酸配列ＰＫＶＡＫＶＳにおけるアミノ酸Ａ（配列番号３９）、
アミノ酸配列ＡＧＥＩＶＧＶにおけるアミノ酸Ｉ（配列番号４２）、
アミノ酸配列ＡＤＦＮＰＥＫにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号４５）および
アミノ酸配列ＱＴＰＩＬＧＲにおけるアミノ酸Ｉ（配列番号４８）。
【００７５】
より具体的には、本発明は、分離されたブタ生殖および呼吸症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）を供給し、そこにおいて、ＯＲＦ１ａによってコードされたそのタンパク質が以下のいずれかを含むアミノ酸配列を含む群から選択される。
アミノ酸配列ＡＮＶにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号９を参照）、
アミノ酸配列ＨＮＡにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号１２を参照）、
アミノ酸配列ＰＤＧにおけるアミノ酸Ｄ（配列番号１５を参照）、
アミノ酸配列ＷＹＬにおけるアミノ酸Ｙ（配列番号１８を参照）、
アミノ酸配列ＶＨＧにおけるアミノ酸Ｈ（配列番号２１を参照）、
アミノ酸配列ＫＶＤにおけるアミノ酸Ｖ（配列番号２４を参照）、
アミノ酸配列ＡＴＤにおけるアミノ酸Ｔ（配列番号２７を参照）、
アミノ酸配列ＳＬＬにおけるアミノ酸Ｌ（配列番号３０を参照）、
アミノ酸配列ＭＣＱにおけるアミノ酸Ｃ（配列番号３３を参照）、
アミノ酸配列ＰＴＧにおけるアミノ酸Ｔ（配列番号３６を参照）、
アミノ酸配列ＶＡＫにおけるアミノ酸Ａ（配列番号３９を参照）、
アミノ酸配列ＥＩＶにおけるアミノ酸Ｉ（配列番号４２を参照）、
アミノ酸配列ＦＮＰにおけるアミノ酸Ｎ（配列番号４５を参照）および
アミノ酸配列ＰＩＬにおけるアミノ酸Ｉ（配列番号４８を参照）。
【００７６】
前述のように、北米または中国ＰＲＲＳの周知の株および分離株がある。そして新しい株は進化するか、分離され続ける。これら全ての株の間に高レベルのアミノ酸配列の相同性が存在するが、当業者はすぐに、何らかの変種が存在すると認め、これらの相違性と類似性について利点を確かに活用し、全てのワクチン株の表現型特性をさらに改良することができる。
【００７７】
最初に、配列番号によって上記（２７〜２８頁）で直接特定されたような配列番号により規定されたアミノ酸モチーフの全てに関して、下線の好適なアミノ酸（Ｐ１２９継代５２から提供されているように）は、一般的に、隣接するアミノ酸が指定された配列番号配列から別の方法で変化したとしても、完全に有益なままである。したがって、ＡＭＡＮＶＹＤ（配列番号９）に関して、特定および代表的な実施例として、一般に、対応するアミノ酸モチーフを発見するために、あらゆる北米または中国ＰＲＲＳから対応するＯＲＦ１によって発現されたタンパク質配列を検査することは、代用および／または、削除または
追加を引き起こす進展の結果として、付加的な変化がそのような別の株に起きたとしても可能である。当業者に理解されるように、Ｐ１２９継代５２で証明された好適なアミノ酸変化はしたがってまた、継代５２の指定されたアミノ酸に対して直接５’または３’である総合的なアミノ酸配列における別の変化にもかかわらず、操作可能なままである。これは、比較アミノ酸変化が保守的であると考えられる場合において特にそうである。したがって、ＡＭＡＮＶＹＤ（配列番号９）およびその部分系列ＡＮＶに関して、例えば、その中のバリンをイソロイシン、もしくはロイシン、または任意の他の残基で置換されている場合、または残基が単に欠落している、もしくは追加残基が加えられた場合、別のＰＲＲＳ株において、匹敵するモチーフを同定することは容易に可能なはずである。整列を同定し、ひいてはポリペプチド配列モチーフが、例えば、いわゆるＢｌｏｓｕｍテーブル（特定のレベルのパーセントの同一性に基づく）に対応するかどうか決定するための多数のコンピュータ・プログラムが存在する。Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．“Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ
ｂｌｏｃｋｓ”，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８９（２２），ｐｐ．１０９１５−１０９１９，Ｎｏｖ  １５，  １９９２を参照されたい。また、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，ＭａｃＭｉｌｌａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎも参照されたい。また、保守的なアミノ酸変化は５つの総合的な群への分類、スルフィドリル基（Ｃｙｓ）、芳香族（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐ）、塩基性（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、脂肪性（Ｖａｌ、Ｉｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ）、ならびに、親水性（Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＳｅｒおよびＴｈｒ）に基づいて認識される。したがって、指定された位置に隣接する１つ以上の他のアミノ酸が追加、削除または置換されているとしても、Ｐ１２９継代５２に特定されたアミノ酸変化のいずれかを、適切および対応する位置にて組み込むために、ヌクレオチド配列をコードするあらゆる北米または中国ＰＲＲＳを修飾することは、本発明の実施の範疇にある。
【００７８】
さらに、同様の原理に基づいて、当業者は、本発明の実施によってＯＲＦ１ａのために同定された特定の継代５２の変化から好適なアミノ酸を一度同定すると、そのようなあらゆる継代５２アミノ酸の保守的な交換はＰ１２９変異体、またはあらゆる他の北米もしくは中国株に関しても、所期の継代５２表現型の実質上の保存で使用できると認めるだろう。したがって、代表例として、ＳＬＬ（配列番号３０の範囲内）に関しては、指定されたロイシン残基はさらにイソロイシン、バリンまたはメチオニンに置換され得、ＦＮＰ（配列番号４５の範囲内）に関しては、指定されたアスパラギンは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、ＳｅｒおよびＴｈｒのいずれかに置換され得、ＶＡＫ（配列番号３９を参照）に関しては、指定されたアラニンは、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、ＳｅｒおよびＴｈｒのいずれかに置換され得、全ておよび同様であるが、そのような置換アミノ酸のいずれかが元来同定された固有の継代５２アミノ酸変化と特定位置にて同様に機能することは本発明の要求するものではないということは容易に認識されるだろう。もちろん、いかなる他の認識されたモデルによる標準の保守的なアミノ酸変化の使用も本発明で実施される。例えば、全てのケースの逆も含み、ＧｌｕのためのＡｓｐおよびその逆、ＧｌｎのためのＡｓｎ、ＬｙｓのためのＡｒｇ、ＣｙｓまたはＴｈｒのためのＳｅｒ、ＴｙｒのためのＰｈｅ、ＬｅｕまたはＩｌｅｕのためのＶａｌ、ＧｌｙのためのＡｌａ、ならびに同様のものである。
【００７９】
さらに、本発明の実施の中では、所望の表現型の効果で、個々の継代５２アミノ酸変化（上記ＯＲＦ１ａのために同定されるように）のいずれかを中国ＰＲＲＳのあらゆる北米に配置することができるが、最終的な構築物で、コードするポリヌクレオチド配列の適切な修正によって通常提供されるように、できるだけ多くの表９または表１０のアミノ酸選択を含むことがさらに好適である。したがって、本発明の実施は２、３、４、５、６、７、８、９、および約１７までの同定された継代５２ＯＲＦ１ａ変化のいずれかを供給する
、中国または北米ＰＲＲＳウイルス（および対応するコードするポリヌクレオチド）を含み、（表９）最終的なウイルス配列の中の全て、全ての総合的に同定された継代５２アミノ酸変化のあらゆる特定の組、３つの組または別のより高い組み合わせをも含む。そのようなアミノ酸変化は、もちろん、当技術分野でよく知られている、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、および他の技術でウイルスの対応するコードヌクレオチド配列を導入し得る。
【００８０】
特定の遺伝子組換え株が減弱していることを示すために、以下記述の実験を使用し得る。
【００８１】
各試験にはＰＲＲＳＶのない農場から得られる、１群あたり少なくとも１０頭の未経産ブタが含まれている。動物はＰＲＲＳウイルス特異的血清抗体がないことおよびＰＲＲＳＶ陰性であることを検査される。試験に含まれる全ての動物は同じ源および種類である。群への動物の配分は無作為抽出される。
【００８２】
抗原投与は妊娠の９０日目に、鼻孔あたり１０5ＴＣＩＤ50で１ｍｌのＰＲＲＳＶの鼻
内投与によって実行される。それぞれの検査構成あたり少なくとも３つの群があり、１つはＰ１２９抗原投与の群、１つは減弱している可能性があるウイルスでの抗原投与の検査群、および１つは厳密な対照群である。
【００８３】
試験の時間的経過に渡って、厳密な対照群がＰＲＲＳＶ陰性を示し続けるとき、試験は有効であると考えられ、Ｐ１２９を抗原投与された群で生まれる、生きている健康な子ブタは、厳密な対照群と比べ少なくとも２５％少ない。
【００８４】
減弱、言い換えれば、毒性が低いことは、生殖行動または他の症候学を決定する１つ以上のパラメータの統計的な著しい変化と定義される。
非修飾親株感染群と比較した検査群（減弱した可能性のあるウイルス）の次のパラメータの少なくとも１つの著しい減少は、減弱の徴候である。
ａ）死産の頻度
ｂ）妊娠１１２日またはそれより前での流産
ｃ）ミイラ化した子ブタの数
ｄ）元気がなく弱い子ブタの数
ｅ）離乳前死亡率
さらに非修飾親株感染群と比較した検査群の次のパラメータの少なくとも１つの顕著な増加が好適である。
ｆ）雌ブタ１頭につき離乳される子ブタの数
ｇ）雌ブタ１頭につき生まれる、生きている健康な子ブタの数
代替では、呼吸器症状およびＰＲＲＳＶ感染症の他の症状は、減弱を確立するために調べられることができた。
【００８５】
減弱した株は、ワクチン処方のために価値がある。ブタをＰＲＲＳウイルスによる感染から保護するならば、現在のワクチンは効果的である。１頭以上の非罹患ブタへのワクチンの投与後に、生物学的に純粋なウイルス分離株（例えば、ＶＲ２３８５、ＶＲ２３８６、Ｐ１２９その他）によるその後の抗原投与が、一般的に、無防備である類似したブタで分離株に起因するそれらの変化または症状と比較して（すなわち、適切な対照に関連して）、あらゆる肉眼的もしくは組織病理変化（例えば、肺病変）および／または疾患の症状の重症度の減衰をもたらす場合、ワクチンはＰＲＲＳウイルスによる感染からブタを保護する。より具体的には、現在のワクチンは必要に応じて１頭以上の適当なブタにワクチンを投与し、その後適切な長さの時間（例えば、４週間）の後、生物学的に純粋なＰＲＲＳＶ分離株の大きなサンプル（１０(3-7)ＴＣＩＤ(50)）で抗原投与することにより効果的
であることが示され得る。それから、血液サンプルは約１週後に抗原投与を受けたブタか
ら引き出され、次いでウイルスを血液サンプルから分離する試みが実行される。減衰した量のウイルス（またはウイルスなし）の分離が、ワクチンが効果的であり得るという徴候である一方、大量のウイルスの分離は、ワクチンが効果的であり得ないという徴候である。
【００８６】
したがって、現在のワクチンの効果は、量的に（すなわち、適切な対照群と比較した硬変した肺組織のパーセンテージの減少）、または質的に（例えば、血液からのＰＲＲＳＶの分離、肺、扁桃腺またはリンパ節組織サンプルにおける免疫測定によるＰＲＲＳＶ抗原の検出）評価され得る。ブタ生殖および呼吸器疾患の症状は、量的に（例えば、体温／熱）または半定量的に（例えば、１つ以上の症状の有無または１つ以上の症状、例えばチアノーゼ、肺炎、肺障害その他の重症度の減衰）評価され得る。
【００８７】
非罹患ブタとは、ブタ生殖および呼吸症のおよび呼吸器疾患感染病原体に曝露されていなかったか、または、ブタ生殖および呼吸症のおよび呼吸器疾患感染性病原体に曝露されていたが、疾患の症状を示していないブタである。罹患したブタは、ＰＲＲＳの症状を示す、または、ＰＲＲＳを分離できるものである。
【００８８】
本発明のワクチンは、ヒト（該当する場合）を含む動物のために許容可能な担体を含むために、次の許容可能な慣用に従って処方することができる。例えば、標準的なバッファ、安定剤、希釈剤、防腐剤、および／または、可溶化剤である。そして、持続放出を促進するためにも処方することができる。希釈剤は、水、生理的食塩水、ブドウ糖、エタノール、グリセロール、およびそれらと同様のものを含む。等張性のための添加物は、とりわけ塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトールおよびラクトース、を含む。安定剤はとりわけアルブミンを含む。修飾生ワクチンを処方する際特に有益なものを含む、他の適当なワクチン媒体および添加物は、当業者にとって周知であるか、または明らかである。参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８ｔｈ  ｅｄ．，１９９０，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照されたい。
【００８９】
本発明のワクチンはさらに、例えばとりわけアジュバントまたはサイトカインなど、１つ以上の追加免疫調節成分を含むことができる。本発明のワクチンで使用できるアジュバントの非限定的な例は、例えばＲＩＢＩ補助剤系（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲルのような鉱物ゲル類、水中油型乳剤、例えばフロイント完全および不完全アジュバントなどの油中水型乳剤、ブロック共重合体（ＣｙｔＲｘ，Ａｔｌａｎｔａ，Ｇａ．）、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍａｓｓ．）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ  Ｃａｌｉｆ．）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ．ＲＴＭアジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ  Ａまたは他のサポニン断片、モノホスホリルリピドＡ、ならびにアブリジン脂質−アミンアジュバントを含む。本発明のワクチンで有益な水中油型乳剤の非限定的な例は、修飾されたＳＥＡＭ６２およびＳＥＡＭ１／２の製剤を含む。修飾されたＳＥＡＭ６２は、５％（ｖ／ｖ）のスクアレン（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ．ＲＴＭ８５．洗剤（ＩＣＩ界面活性剤）、０．７％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ．ＲＴＭ．８０洗剤（ＩＣＩ界面活性剤）、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、２００ｐｇ／ｍｌのＱｕｉｌ  Ａ、１００［ｍｇｒ］ｇ／ｍｌコレステロール、および０．５％（ｖ／ｖ）のレシチンを含む水中油型乳剤である。修飾されたＳＥＡＭ１／２は、５％（ｖ／ｖ）のスクアレン、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ．ＲＴＭ８５．洗剤（ＩＣＩ界面活性剤）、０．７％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ８０洗剤、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、１００．ｍｕ．ｇ／ｍｌのＱｕｉｌ  Ａ、５０．ｍｕ．ｇ／ｍｌコレステロールを含む水中油型乳剤である。他の免疫調節薬は、例えば１つ以上のインターロイキン、インターフェロン、または他の周知のサイトカインを含むワクチンに含むことができる。
【００９０】
本発明のワクチンは、ウイルスの持続放出、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、または本発明のウイルスベクターのために任意に処方できる。そのような持続放出製剤の例は、例えば、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン、および同様のもののなどのウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミドまたは生体適合ポリマーの複合体と組み合わされたウイルスベクター含む。薬物送達媒体における分解性ポリマーの構造、選択、および使用は、参照することによって本明細書に組み込まれる、Ａ．Ｄｏｍｂ  ｅｔ．  ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ３：２７９−２９２を含む、いくつかの刊行物で概説されている。医薬製剤に重合体を選択および使用することにおける追加指針は、当技術分野で知られていた文章で見ることができる。例えば、Ｍ．Ｃｈａｓｉｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ（ｅｄｓ），１９９０，Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．４５，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙの“Ｂｉｏｄｅｇｒａｄ
ａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”があり、参照することによって本明細書に組み込まれる。あるいは、または加えて、投与および有効性を向上させるためにウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターをマイクロカプセル化できる。抗原をマイクロカプセル化する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第３，１３７，６３１号、米国特許第３，９５９，４５７号、米国特許第４，２０５，０６０号、米国特許第４，６０６，９４０号、米国特許第４，７４４，９３３号、米国特許第５，１３２，１１７号および国際特許公開第ＷＯ９５／２８２２７号に記述された技術を含み、それらの全ては、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【００９１】
リポソームもまた、ウイルスの持続放出、プラスミド、またはウイルスベクターを供給するために使用できる。リポソーム型製剤を製作し使用する方法に関する詳細は、とりわけ米国特許第４，０１６，１００号、米国特許第４，４５２，７４７号、米国特許第４，９２１，７０６号、米国特許第４，９２７，６３７号、米国特許第４，９４４，９４８号、米国特許第５，００８，０５０号、および米国特許第５，００９，９５６号で発見でき、それらの全ては、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【００９２】
上述のワクチンのいずれかの有効な量は、従来の方法で決定することができる。低投与量のウイルス、ウイルスタンパク質プラスミドまたはウイルスベクターから開始し、次に、効果を監視している間、投与量を増加させることができる。有効な量はワクチンの１回の投与の後、またはワクチンの複数回の投与の後に得られ得る。１頭の動物あたり１つの至適投与量を決定するとき、周知の要素を考慮に入れることができる。これらは動物の種類、大きさ、年齢および全身状態、動物の他の薬の存在および同様のものを含む。実際の投与量は、好適には他の動物実験の結果を考慮した後に選択される。（例えば下の実施例２および実施例３を参照）。
【００９３】
適切な免疫反応が達成されたかどうか検出する１つの方法は、ワクチン接種の後に動物で血清変換および抗体価を決定することである。ワクチン接種のタイミングおよび追加免疫の数は、もしあれば、医師または獣医により全ての関連要素の分析に基づいて決定されることが好適であり、そのうちのいくつかは上述される。
【００９４】
本発明のウイルス、タンパク質、感染性ＤＮＡ分子、プラスミドまたはウイルスベクターの有効な投与量は、ワクチン接種される動物の体重など当業者により決定され得る要素を考慮に入れながら、周知の技術を使用して決定できる。本発明のワクチンにおける本発明のウイルスの投与量は、好適には約１０1〜約１０9ｐｆｕ（プラーク形成単位）、より好適には約１０2〜約１０8ｐｆｕ、最も好適には、約１０3〜約１０7ｐｆｕの範囲である。本発明のワクチンにおける本発明のプラスミドの投与量は、好適には約０．１ｍｇ〜約
１００ｍｇ、より好適には約１〜約１０ｍｇ、さらに好適には、約１０〜約１ｍｇの範囲である。本発明のワクチンにおける本発明の感染性ＤＮＡ分子の投与量は、好適には約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ、より好適には約１〜約１０ｍｇ、さらに好適には、約１０〜約１ｍｇの範囲である。本発明のワクチンにおける本発明のウイルスベクターの投与量は、好適には約１０1〜約１０9ｐｆｕ、より好適には約１０2〜約１０8ｐｆｕ、さらに好適には、約１０3〜約１０7ｐｆｕの範囲である。適切な投与量サイズは、約０．５ｍｌ〜約１０ｍｌ、より好適には約１ｍｌ〜約５ｍｌの範囲である。
【００９５】
本発明の実施によるウイルスタンパク質またはペプチドワクチンのための適切な投与量は、一般に１投与量あたり１〜５０マイクログラムの範囲、またはそのような各物質に関して認識された方法で決定するべき量のアジュバントで、標準方法で決定され得るより多い量である。ブタのワクチン接種に関する本発明の好適な実施例では、動物のための最適日齢目標は約１〜２１日間である。また、その日間は離乳前で対マイコプラズマヒオニューモニエまたはＰＣＶなどの他の予定されているワクチン接種に対応できる。さらに、繁殖用雌ブタのためのワクチン接種の好適なスケジュールは、年に一度の再ワクチン接種スケジュールを有する同様の投与量を含んでいる。
【００９６】
上述のワクチンのいずれかの有効な量は、従来の方法で決定される。低投与量のウイルス、プラスミドまたはウイルスベクターから開始し、次に、効果を監視している間、投与量を増加させることができる。有効な量はワクチンの１回の投与の後、またはワクチンの複数回の投与の後に得られ得る。１頭の動物あたり１つの至適投与量を決定するとき、周知の要素を考慮に入れることができる。これらは動物の種類、大きさ、年齢および全身状態、動物の他の薬の存在および同様のものを含む。実際の投与量は、好適には他の動物実験の結果を考慮した後に選択される。
【００９７】
適切な免疫反応が達成されたかどうか検出する１つの方法は、ワクチン接種の後に動物で血清変換および抗体価を決定することである。ワクチン接種のタイミングおよび追加免疫の数は、もしあれば、上述のいくつかが示すように、全ての関連要素の分析に基づく医師または獣医によって決定されることが好適である。
【００９８】
本発明のウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミドまたはウイルスベクターの有効な量は、ワクチン接種を受ける動物の体重など当業者により決定され得る要素を考慮に入れながら、周知の技術を使用して決定できる。例として、ワクチンは経口、非経口、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内または静脈内で送達し得る。経口での送達は、例えば動物の飼料または飲物に組成を加えることを含み得る。ワクチン投与量に関係する要素は、例えばブタの体重と年齢を含む。
【００９９】
本発明はさらに本明細書に記述のＰＲＲＳウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターを含むワクチンを調製する方法、医薬的または獣医科的使用に許容し得る担体で、本発明のＰＲＲＳウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターのうち１つの有効な量の合成を含む方法を提供する。
【０１００】
さらに、米国特許第６，５００，６６２号で記載のように、周知の組換え技術を使用することでＰＲＲＳウイルスゲノムに挿入される異種抗原性エピトープをコードするために本発明の生減弱ワクチンを修飾できる。参照することによって全面的に組み込まれる米国特許第７，１３２，１０６号もまた参照されたい。本発明のための異種抗原性エピトープとして有益な抗原性エピトープは、ブタパルボウイルス、ブタサーコウイルス、ブタロタウイルス、ブタインフルエンザ、仮性狂犬病ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ呼吸器コロナウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、脳心筋炎ウイルス、ブタパラミクソウイルス、トルクテノウイルス、アクチノバチルス・プルロニューモ
ニア、アクチノバチルス・スイス、炭疽菌、気管支敗血症菌、クロストリジウム・ヘモリティクム、ウェルシュ菌、破傷風菌、大腸菌、ブタ丹毒菌、パラインフルエンザ菌、レプトスピラ属細菌、マイコプラズマヒオニューモニエ、マイコプラズマ・ヒオリニス、マイコプラズマ・ヒオシノビエ、パスツレラ・マルトシダ、ブタコレラ菌、ネズミチフス菌、ストレプトコッカス・エクイスミリスおよびブタ連鎖球菌から成る群から選択されるブタ病原体からの抗原性エピトープを含むがこれに限られないＰＲＲＳウイルス以外のブタ病原体からの抗原性エピトープを含む。前述のブタの病原体から抗原性エピトープをコードするヌクレオチド系列は、当技術分野で周知であり、ワールド・ワイド・ウェブ上で（米国）国立生物工学情報センターからのＧｅｎｂａｎｋなどで、公共の遺伝子データベースから取得できる。
【０１０１】
本発明の付加的な特徴と変種は、詳細な説明を含み、この本出願の全体から当業者に明らかになり、そのような全ての特徴が本発明の態様として意図される。同様に、本明細書に記載された発明の特徴はまた、特徴の組み合わせが本発明の態様または実施例として明確に上記言及されるかどうかにかかわらず、本発明の態様として意図する追加実施例と再結合できる。また、本発明に重要である本明細書に記載されるそのような制限だけが、そのように見られるべきである。重要であることが本明細書で記述されていない制限の欠如している本発明の変化は、本発明の態様として意図される。本発明が前述の説明および実施例で具体的に記載されている方法とは別の方法で実施され得ることは明確である。
【０１０２】
本発明の多くの修正および変化は、上記の教示の観点から可能であり、したがって、本発明の範疇にある。
【０１０３】
次の実施例は例示することを意図しているが、本発明を制限するものではない。
【実施例】
【０１０４】
実施例１
ＰＲＲＳＶ分離株Ｐ１２９のＰＫ−９細胞への適応と減弱
【０１０５】
毒性ＰＲＲＳ分離株Ｐ１２９は、１９９５年にＡｎｉｍａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｐｕｒｄｕｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで、インディアナ州の病気のブタから分離された。このブタからの血清試料は、血清および肺ホモジネートストックを膨張させる高い健康状態のブタで１回継代された。ウイルス性ＲＮＡは、血清および肺ホモジネートから抽出され、Ｐ１２９継代０ウイルスの記載の完全ゲノムコンセンサス配列を決定するために使用された。ＲＮＡは、最初に無作為の６量体で刺激され、ｃＤＮＡを統合するために使用された。ゲノムは、高忠実度（校正）ＰＣＲを使用することで３つの重なっている断片に増幅された。３回の別々のＰＣＲ反応（１ゲノム分節あたりの）からのＰＣＲ生成物は、Ｔ／Ａクローンであり、ＤＮＡの配列に全長のゲノムコンセンサス配列を生成させる（配列番号１を参照）ために使用された。
【０１０６】
ＤＮＡ配列に使用された同一ブタ血清の一定分量は、Ｐ１２９継代０を含んでおり、最初にブタの肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）細胞を感染させることにおいて使用された。ＰＡＭ感染（継代１）からの子孫ウイルスは、０．１マイクロメータのスポイトフィルタを通してフィルターにかけられ、ＰＫ−９細胞を感染させることに使用された。
【０１０７】
ＰＫ−９細胞は、ＰＫ０８０９ブタ腎細胞株を、ブタＣＤ１６３の遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子の削除されたバージョンをコードするプラスミドで安定して核酸導入させることによって引き出されたトランスジェニック細胞株である。構築の詳細およびＰＫ−９細胞株の特殊化は以前に記載した。
【０１０８】
ＰＡＭ細胞からの継代１ウイルスのＰＫ−９細胞上での生育への適応は困難であり、複数の平行な系統を有するいくつかの試みを必要とした。感染は、複製ウェルの免疫蛍光によって、ウイルス性のヌクレオカプシドタンパク質（Ｒｕｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｂｒｏｏｋｉｎｇｓ  Ｓｏｕｔｈ  Ｄａｋｏｔａ）に対して特定の、ＦＩＴＣ抱合型モノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７を使用することで監視された。早期の継代は、いくつかの小さい増殖巣をもたらしたが、新しい単分子層の感染を起こすことができるのに十分な無細胞のウイルス粒子を生成しなかった。これらの継代は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（トリプシン代用品）と共に感染した単分子層を扱い、新鮮培地とともに複数のウェルにある細胞を再び蒔くことによって、非感染ＰＫ−９細胞の添加のあるなしにかかわらず、実現された。そのようないくつかの継代の後、いくつかの系統は、蛍光増殖巣の頻度と大きさの明確な増加を示した。これらのいくつかは無細胞のウイルス流体を使用して継代される能力を取得した。継代１７（ＰＡＭ細胞上の１、ＰＫ−９上の１６）によって、以前の継代から無細胞流体の希釈を使用することで１つの系統が確実に維持され、数日以内で全体の単分子層の感染をもたらした。ウイルスはいかなる継代レベルでもＰＫ−９細胞への細胞変性効果を引き起こさなかった。ＲＮＡは、感染したＰＫ−９細胞からウイルス継代１７で抽出され、感染性ｃＤＮＡクローンを構成するために使用された。
【０１０９】
実施例２
Ｐ１２９−ＰＫ継代１７の感染性ｃＤＮＡクローンの構築
【０１１０】
Ｐ１２９−ＰＫ継代１７ウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンは、前述の通りバックボーンプラスミドを使用して構築された。ウイルスのゲノムは、重複領域の独特な制限エンドヌクレアーゼ部位が自然に発生していた状態で、３つの重なる分節で逆転写およびＰＣＲによって増幅された。３回の別々のＰＣＲ反応からの生成物は、各ゲノム分節のためにコンセンサス配列を発生させるようにクローンを作られ、配列され、並べられた。所与のセグメントの３個のクローン化された生成物のいずれもその分節に関する予測されたコンセンサスのアミノ酸配列に一致しなかった場合、予測されたコンセンサスのアミノ酸配列が一致するまで、クローンの１つはサブクローニングおよび／または、部位特異的変異誘発によって変更された。３つのゲノム分節およびプラスミドバックボーンは、標準のクローン技術および制限エンドヌクレアーゼ部位を使用することで接合された。ＰＫ−９セルの中に核酸導入されると、ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬに指定された、結果として生じる全長クローンは、感染した。この感染性ｃＤＮＡクローンの配列は、配列番号２において与えられる。ゲノムは本質的には標準の終端で構築されている継代１７ウイルスと同一であり、継代１７のコンセンサス配列に関連するいかなる挿入または欠失も欠落している。この感染性ｃＤＮＡクローンのウイルスゲノムの中には設計された制限部位または他の目標とされた変化は存在しない。
【０１１１】
Ｐ１２９継代０の完全ゲノムコンセンサス配列および感染性クローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬのゲノム配列の間のヌクレオチドおよびアミノ酸差異は表６に個別に記載されている。表６はゲノム位置による全てのヌクレオチド差異および結果として起こるアミノ酸差異を含む。これら変異のサブセットはＩＦＮ抑制（継代０）からＩＦＮ非抑制（継代１７感染性ｃＤＮＡクローンから得られた全てのウイルス）への表現型における変化の原因である。表７では、ＰＲＲＳＶ翻訳領域（ＯＲＦ）または非構造タンパク質（ｎｓｐ）によるヌクレオチド、アミノ酸、および非保存アミノ酸差異をまとめる。表７の目的のために、アミノ酸の以下の群は保存されていると考えられていたそれらの中にあり、［Ｋ，Ｒ］、［Ｄ，Ｅ］、［Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ａ］、および［Ｓ，Ｔ］である。
【０１１２】
実施例３
Ｐ１２９−ＰＫ継代１７における欠失変異体
【０１１３】
ゲノムの２つの領域での欠失は、５つの遺伝子組換え感染性クローンを生成するために感染性ｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬに設計された。
【０１１４】
修飾を起こすゲノムの１つの領域は、ヌクレオカプシドタンパク質（ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７によってコードされる）のアミノ酸位置４１〜４７に位置する核局在配列（ＮＬＳ）であった。２種類の欠失が作成された。別のＰＲＲＳＶ感染性クローンの文脈の中でこれらの削除について前述された。アミノ酸残基４１〜４９の野生型配列は、ＰＧ．．．ＫＮである。また、「ＰＧ．．．ＫＳ」として知られている、変異体「ｄ４３／４４」では、リジン残基４３および４４は欠失され、アスパラギン残基４９はセリンに変わる。また、「ＰＧ−−Ｓ−ＫＳ」として知られている、変異体「ｄ４３／４４／４６」では、リジン残基４３、４４および４６は欠失され、アスパラギン残基４９はセリンに変わる。これらの欠失を取り入れる、ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬから得られた感染性クローンは、それぞれｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ｄ４３／４４およびｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ｄ４３／４４／４６である。米国特許第７，５４４，３６２号を参照。
【０１１５】
修飾を起こすゲノムの２番目の領域は、ＯＲＦ１ａの中のｎｓｐ２の超可変領域に存在した。別のＰＲＲＳＶ感染性クローンの文脈の中で１３１のアミノ酸（３９３のヌクレオチド）の欠失について前述された。この欠失を取り入れる、ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬから得られた感染性クローンは、ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ｎｓｐ２である。
【０１１６】
ＮＬＳおよびｎｓｐ２欠失を結合する感染性クローンはまた、ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬバックボーンの中で生成され、そしてこれらはｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ｎｓｐ２−ｄ４３／４４およびｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ｎｓｐ２−ｄ４３／４４／４６に指定された。
【０１１７】
実施例４
ＰＫ−９細胞におけるウイルスの世代および成長
【０１１８】
実施例３で記載された６つの感染性クローンが、表１に示されているように、６つのウイルスを生成するためにＰＫ−９細胞の中に核酸導入された。ウイルスは、リポフェクタミン２０００を使用して、これらの感染性クローンからＰＫ−９細胞の中に環状プラスミドの直接核酸導入により生成された。核酸導入に続いて、回復したウイルスはさらに力価を増加し、毒性を減弱するために再度連続的にＰＫ−９細胞で継代された。ストックは生体外検査および生体内評価のためにワクチン候補として作成された。非変更のｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬ感染性クローンから得られたＰ１２９−ＰＫ１７−ＦＬウイルスの症例では、ウイルスはブタからの合計５２の継代に達するまで培養された。このウイルスの完全ゲノムは継代２４（配列番号３）および５２（配列番号６）で配列された。
【０１１９】
実施例５
Ｐ１２９−ＰＫ継代１７感染性ＣＤＮＡクローンから得られたウイルスは、ＩＦＮ−アルファ誘導を抑制する能力を減衰させる
【０１２０】
ウイルスおよび細胞。ＭＡＲＣ−１４５、およびＳＴ細胞は、５％の牛胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質（５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１００ＵＩペニシリンおよび１００のμｇ／ｍｌのストレプトマイシン）で補われた改変イーグル培地（ＭＥＭ）で生育された。ブタ肺胞マクロファージＺＭＡＣ−１細胞は、１０％のＦＢＳで補われたＲＰＭＩ−１６４０で育てられた。ＴＧＥウイルス株Ｐｕｒｄｕｅは、改変イーグル培地の０．
０１の多重度で、集密的なＳＴ細胞単分子層の感染によって調製された。ウイルス接種原は１時間後に除去され、細胞は５％のＣＯ2大気中３７℃で２．５％のＦＢＳで補われた
ＭＥＭで培養された。ウイルスは、８０％の細胞変性効果が観察された後に、細胞単分子層を冷凍し、解凍することによって、放出された。ＴＧＥウイルスストックは、１５分間、４℃で３，５００ｒｐｍで遠心分離され、使用まで−８０℃で貯蔵された。ウイルスストック（ＰＫ−９セルからの）は以下の通りであった。Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬおよびＰ１２９−ＰＫ−ｄｎｓｐ２−ｄ４３／４４／４６は、継代８／２５（感染性クローンから８、ブタから２５）に存在した。他の４つのウイルス（Ｐ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４、Ｐ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４／４６、Ｐ１２９−ＰＫ−ｄｎｓｐ２、およびＰ１２９−ＰＫ−ｄｎｓｐ２−ｄ４３／４４）は、継代２１／３８に存在した。様々なＰＲＲＳウイルスの作用するストックは、商用ワクチンのＩｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶおよびＩｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ  ＡＴＰがメーカーの指示に応じて再編成されて、直接感染に使用されたことを除いて、ＺＭＡＣ−１細胞上で単一継代を作成することによって調製された。
【０１２１】
ブタＰＢＭＣの隔離。新鮮なヘパリン化静脈血はハンクス緩衝液で希釈されＰＢＭＣはフィコール・ハイパック１０７７（Ｓｉｇｍａ）勾配を通して密度遠心により隔離された。ハンクス緩衝液で洗浄された後、細胞は、５％の牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）で補われるＬ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、で中断した、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１×非必須アミノ酸（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）１００Ｕ／ｍｌのゲンタマイシンおよび２５０ｍＭの２メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を有するＲＰＭＩ媒体で懸濁された。
【０１２２】
ブタ形質細胞様樹状細胞の精製。ブタ形質細胞様樹状細胞の精製は前述の通り（Ｃａｌｚａｄａ−Ｎｏｖａ、提出された）は実行され、これらの細胞（Ｓｕｍｍｅｒｆｉｅｌｄ
ｅｔ  ａｌ．，２００３）によってＣＤ４およびＣＤ１７２の特徴的発現に基づいていた。簡潔に、新鮮なブタＰＢＭＣは０．５％のＢＳＡを有するＰＢＳで懸濁され、ブタＣＤ１７２（７４−２２−１５、ＶＭＲＤ）を認識するｍＡｂの最適量で標識化された。１回の洗浄に続いて、次に、二次ヤギ反マウス抗体がＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に抱合した状態、そして洗浄後ＦＩＴＣが反ＣＤ４（７４−１２−４、ＶＭＲＤ）と標識化されている状態で培養された。ＰＤＣは反射セルソータ（ｉＣｙｔ）上で分類され、分類ゲートはＣＤ４+／ＣＤ１７２low個体群に設定された。分類後、細胞の精製は再解析によって確証された。全ての場合で、純度は＞９５％であった。
【０１２３】
測定サイトカイン分泌の試験法。ＰＢＭＣまたはＰＤＣが１６時間（３７℃、５％のＣＯ2）、異なった刺激物質または偽刺激で刺激された。培養の後に、刺激細胞を覆う媒体
は、モノクローナル抗体が商業的に入手可能な状態で調製されたサンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、（反ブタＩＦＮ−α  ｍＡｂ  Ｋ９およびＦ１７）ＩＦＮ−αの存在のために測定された。簡潔に、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）は、４℃で一晩の培養、その後５％の牛胎児血清で補われるＲＰＭＩ媒体でのブロッキングによって、反ブタＩＦＮ−α  ｍＡｂ  Ｆ１７（ＰＢＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で被覆された。１時間後、媒体が廃棄され、５０マイクロリットルの脱離液が複製の測定ウェルに加えられ、検査された。１時間の培養後に、測定ウェルは４回洗浄され、それからビオチン標識、反ブタＩＦＮ−α  ｍＡｂ  Ｋ９（ＰＢＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＨＲＰ抱合型ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、およびＴＭＢ基質（ＫＰＬ）で順番に培養された。光学密度はＥＬＩＳＡプレートリーダーで決定された。
【０１２４】
Ｐ１２９−ＰＫ継代１７感染性ＣＤＮＡクローンから誘導されたウイルスは、ＩＦＮ−アルファ誘導を抑制する能力を欠く。作用するウイルスストックはブタ肺胞マクロファー
ジ細胞株ＺＭＡＣ−１を利用し、４つの異なったＰＲＲＳ野生型ウイルス分離株（Ｐ３４１２、Ｐ１２９、ＩＮＤ５、ＮＡＤＣ２０）の群から調製された。付加的なストックはまた、ＰＫ−９、ＦＫ．Ｄ４またはマーク−１４５細胞の中で繰り返された継代によって細胞培養で成長するように適合させられた最初の２つの野生型ウイルスの誘導体から調製された。４つの野生型分離株のうち３つ（Ｐ１２９、ＩＮＤ５、ＮＡＤＣ２０）はＺＭＡＣ−１細胞の中で容易にまた効率的に成長し、Ｐ３４１２野生型分離株は１０5ＴＣＩＤ50
／ｍｌだけの力価に達したのに対し、約１０7ＴＣＩＤ50／ｍｌの力価に達した。特に、
ＺＭＡＣ−１細胞系で調製されたＰ１２９ウイルスのストックはウイルスが適合させられたＰＫ−９またはＭＡＲＣ−１４５細胞で得られたものよりも１０倍高い力価に達した。これらのウイルスがＰＢＭＣによってＩＦＮ−α分泌を刺激する能力検査は、ただ１つを例外として（Ｐ３４１２クローンＣを隔離する）、ＩＦＮ−αのわずか少量（＜５０ｐｇ）が検査されたＰＲＲＳウイルスストックのいずれかに対するそれらの曝露に反応したこれらの細胞によって分泌されたことを明らかにした。ブタコロナウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥｖ）へのそれらの曝露の結果、同じ細胞によって生成されたＩＦＮ−α（１７，５４０ｐｇ）の豊富な分泌との比較によって無視できる。
【０１２５】
ＰＲＲＳＶはブタＰＢＭＣによるＩＦＮ−α生成の刺激を不可能にするだけではなく、活発にその生成を抑制する。ＰＲＲＳＶストックの抑制効果は、ＰＲＲＳＶの有無で、ＴＧＥｖへの曝露に反応してＰＢＭＣによって分泌されたＩＦＮ−αの量を測定することにより、決定された。表２に示されているように、４つの野生型ＰＲＲＳウイルス分離株全てが検査され、細胞培養の全てが誘導体を適合させたのと同じように、ＴＧＥｖへのＰＢＭＣのＩＦＮ−α反応で強い抑制効果（＞８０％）を示した。全長Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬウイルスおよびいくつかの遺伝子組み換えの欠失変異体を含む、感染性ｃＤＮＡクローン（ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬ）から誘導された、ウイルスストックの群の分析が行われた。表３に示されているように、親の野生型分離株Ｐ１２９（継代１）の強い抑制効果（９５％）と比べると、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬウイルス、および全ての欠失変異体は、ＰＢＭＣでＴＧＥｖによるＩＦＮ−□誘導を抑制する著しく減衰した能力を示した。さらにこれらのウイルスのＩＦＮ−α表現型を評価するために、その後の実験はＰ１２９−ＰＫ−ＦＬおよびＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ウイルス、親Ｐ１２９野生株、および／またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ
ＭＬＶおよびＩｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ  ＡＴＰ）によって生成された、２つの商業的に入手可能に修飾生ＰＲＲＳＶワクチンの間の直接比較を実行することに焦点が向けられた。追加の低い継代参照分離株（ＮＶＳＬ−１４）はまた検査された。表４に示されているように、４つの独立した実験では、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬおよびＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４が親Ｐ１２９ウイルス、２つのＩｎｇｅｌｖａｃ減弱株、または参考株よりかなり少ないＩＦＮ−α抑制効果を示した。１つの例では、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬまたはＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ウイルスへの共同感染はＴＧＥｖへのＩＦＮ−α反応の見かけの増進をもたらした。
【０１２６】
表２に示される結果は、細胞培養での生育に適応した野生型ＰＲＲＳウイルスおよび誘導体のインターフェロン−α抑制効果を示唆している。示されたＰＲＲＳウイルスストックは、ＺＭＡＣ−１細胞で生育され、これらの新たに生成したストックの力価がＺＭＡＣ−１細胞を使用することで決定した。ＴＧＥウイルスの有無で、示されたＰＲＲＳウイルスストックに１８時間曝露されたブタ末梢血単核細胞の培養上清における現在のＩＦＮ−αの量は、ＥＬＩＳＡによって決定された。＊ＴＧＥｖだけへの反応。
【０１２７】
表３に示されている結果は、野生型ＰＲＲＳウイルスＰ１２９およびＣＤ１６３−発現ＰＫ−９細胞で成長に適応したその遺伝子改変誘導体のインターフェロン−α抑制効果を示している。ＴＧＥウイルスの有無で、示されたＰＲＲＳウイルスストック（ＰＢＭＣ）に１８時間曝露されたブタ末梢血単核細胞の培養上清における現在のＩＦＮ−αの量は、
ＥＬＩＳＡによって決定された。ｎａ＝該当なし：＊ＴＧＥｖだけへの反応。
【０１２８】
表４は野生型Ｐ１２９ウイルスおよびＰＲＲＳＩｎｇｅｌｖａｃワクチンと比較して、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬおよびＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ウイルスの減衰するインターフェロン−α抑制効果を示す。ＴＧＥウイルスの有無で、示されたＰＲＲＳウイルスストック（ＰＢＭＣ）に曝露されたブタ末梢血単核細胞の培養上清における現在のＩＦＮ−αの量は、ＥＬＩＳＡによって決定された。ｎａ＝該当なし：＊ＴＧＥｖのみへの反応。
【０１２９】
ＴＧＥＶへのそれらの曝露に対応してＰＢＭＣによって分泌されたＩＦＮ−αの豊富な量は主としてＰＢＭＣ個体群の０．３％未満を含む細胞のサブセットから誘導される。この稀な、しかし、重要な細胞サブセットは形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）で構成され、樹状細胞は特徴的な形質細胞様の形態学のためこの名前を受け入れた。さらにＰ１２９−ＰＫ−ＦＬおよびＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ウイルスのＩＦＮ−α表現型を調べるために、ＰＢＭＣから＞９５％の純度で新たに分離しているＰＤＣが利用されたことを除き、一連の実験は上述したものと同様に行われた。図１に示されているように、この一連の実験はＰ１２９−ＰＫ−ＦＬおよびＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ウイルスがＴＧＥＶによるＩＦＮ−α誘導の無視できる抑制を引き起こすことを確証した。その上、１つの実験では、見かけの増強効果はＰ１２９−ＰＫ−ＦＬおよびＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ＰＲＲＳウイルスに反応してＰＤＣによってＴＧＥＶ媒介ＩＦＮ−α誘導で観察された。対照的に、図１に示されているように、Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶウイルスはＩＦＮ−α反応への強い抑制効果を示した。
【０１３０】
実験セクションで記述した結果は、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬおよびＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ＰＲＲＳウイルス、ならびにｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬ感染性ｃＤＮＡクローンの他の誘導体が、感染したＰＢＭＣまたはＰＤＣ細胞の中でＴＧＥＶによるＩＦＮ−α誘導を抑制する大いに減衰した能力があることを明らかにする。これは、野生型（低い継代）ＰＲＲＳウイルスおよび２つの商業的に入手可能に修飾生ウイルスワクチン（Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶおよびＩｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ  ＡＴＰ）で観察されたＩＦＮ抑制効果と著しい対照をなしている。Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬおよびＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４ウイルスがＰＤＣのこの重要な機能で最小限に抑制的であるという観察は、これらの細胞がウイルス感染に対して先天免疫を媒介する際に果たす主要な役割を与えられ、潜在的に有意である。
【０１３１】
本発明は、組換え型のＣＤ１６３受容体を発現する許容性細胞で生育するために適合させられた臨床上有効な商用ワクチンのウイルスを供給するが、そのようなウイルスおよびワクチンは歴史的な「サルの細胞」培養技術に、依存せず、またはいかなる点も該培養技術を用いて開発されなかったことも注意するべきである。特に米国特許第７，７５４，４６４号を参照のこと。
【０１３２】
実施例６
ワクチンの候補の安全性および有効性
【０１３３】
ワクチンとしてＰＲＲＳに対してそれらの安全性と有効性を評価するために、ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬ感染性ｃＤＮＡクローン、Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬ（継代７／２４）、Ｐ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４（継代１７／３４）、およびＰ１２９−ＰＫ−ｄ４３／４４／４６（継代１７／３４）から誘導された３つのウイルスが、幼若ブタ呼吸器疾患モデルで評価された。これらのウイルスの起源は図８に示されており、実験計画（投与群）は表５に記載されている。低い継代の毒性ＰＲＲＳＶ分離株ＮＡＤＣ２０は、７週齢（ワクチン接種の４週間後）に異種抗原投与のために使用された。対照投与群は偽ワクチンおよび商用ＰＲＲＳワクチンＩｎｇｅｌｖａｃ  ＭＬＶを含む。
【０１３４】
未治療（ＮＴ）群は以下の通りであった：ＮＴ１ブタは、原因ブタの健康状態を監視するセンチネルであった。それらは別々に収容され、ＰＲＲＳＶ抗原投与の前に剖検された。ＮＴ２ブタは、各Ｔ０２からＴ０５のための投与群あたり合計２つの、ワクチン接種を受けたブタの２つの檻の間の檻に別々に収容された接触対照であった。ＮＴ３ブタは、投与群（Ｔ０１からＴ０５）あたり合計２つの、ワクチン接種を受けたブタの檻につき１頭の収容された接触対照であった。ＮＴ３ブタだけが、Ｔ０１群に割り当てられた。
【０１３５】
ワクチン接種を受けた動物の直腸温度はワクチン接種後に測定され、Ｔ０１（偽ワクチン）投与群と比較された。結果は図１に示されている。発熱を引き起したワクチンはなかった。全ての群はワクチン接種後の観察期間を通して平均１０４℃未満であった。
【０１３６】
ブタの直腸温度は抗原投与後に測定された。結果は図２に示されている。ワクチン接種が施されていないＴ０１ブタは１０４℃以上の熱が持続することを示した。対照的に、３種類のワクチンは抗原投与後の熱を著しく下げた。Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬは熱を下げるのに最も有効であった。
【０１３７】
動物の体重は、ワクチン接種前および後に記録された。結果は図３に示されている。体重は、試験の−１日目（ワクチン接種前）、１０、２４、２７（抗原投与の前）日目および、３７日目に記録された。ワクチン接種が施されていないブタでは、毒性ＮＡＤＣ２０ウイルスを有する抗原投与は１０日の観察の期間中、体重増加をほぼ完全に排除した。ワクチンはこの効果を様々な程度で否定した。
【０１３８】
抗原投与を受けた動物の肺は、抗原投与後の剖検で調べられた。病変を含む肺のそれぞれの割合は、図４に示されている。Ｔ０１の偽ワクチン群は平均２５．１％の肺病変併発であった。ワクチンは肺病変を様々な程度で減衰させた。Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬは肺病変併発を１．１％まで減衰させ、最も有効であった。
【０１３９】
肺病変の重症度は、図５に示されているように、肺評価スコア（ＬＡＳ）を使用することで評価された。３種類のワクチンはＬＡＳを減衰させた。Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬは平均ＬＡＳを偽ワクチン接種を受けた群で１．６３から０．１４まで減衰させた。
【０１４０】
ＰＲＲＳＶへの血清抗体はワクチン接種および抗原投与の両方によって引き起こされた。ＩＤＥＸＸ  ＥＬＩＳＡ  Ｓ／Ｐの割合は試験の２７と３７日目に測定された。結果は図６に示される。Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬでのワクチン接種は抗ＰＲＲＳ抗体の最高水準を誘導した。
【０１４１】
抗原投与を受けたブタの血清中のウイルス血症はＰＡＭ細胞上で滴定された。図７で結果（ＴＣＩＤ50／ｍＬ）を示す。Ｐ１２９−ＰＫ−ＦＬは抗原投与後のウイルス血症を減衰させるのに最も効果的であった。
【０１４２】
上記実施例および添付書類を参照し、本発明について説明したが、それらそれぞれの全内容は、参照することによって組み込まれ、本発明の趣旨および範囲内でさまざまな修正および変形を包含することが理解される。したがって、本発明は以下の請求項によってのみ制限される。
【０１４３】
実施例７
感染性ＣＤＮＡクローンＰＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９からの感染性ＣＤＮＡ  ＣＬＯＮＥ  ＰＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬの誘導
【０１４４】
本発明のｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬのＰＲＲＳＶ感染性ｃＤＮＡクローンは、当業者の１人によって部位特異的変異誘発の技術を使用して、前に記述のＰＲＲＳＶ感染性ｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９から容易に誘導することができる。ＰＲＲＳＶ感染性ｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９は米国特許第６，５００，６６２号に記載されており、受託番号２０３４８９の下にＡＴＣＣにて寄託されている。このクローンにおけるＰＲＲＳＶゲノムのＤＮＡ配列はまた、受託番号ＡＦ４９４０４２としてＧｅｎｂａｎｋ（ＮＣＢＩ）データベースで入手可能である。部位特異的変異誘発キットは多くの供給者から商業的に入手可能であり、大きなプラスミドの複数の部位で多数の同時ヌクレオチド変化の作成が可能である。そのようなキットは、Ｃｈａｎｇｅ−ＩＴ（商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ＵＳＢ）、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、およびＡＭＡＰ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含むが、これらに限られない。
【０１４５】
ＰＲＲＳＶ感染性ｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９（ＡＴＣＣから入手可能）および本発明ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬのＰＲＲＳＶ感染性ｃＤＮＡクローンの間のヌクレオチド変化のリストは表８に提示される。全ての変化はゲノムのタンパク質翻訳領域にある。合計７４回のヌクレオチド変化があり、７４の変異原性プライマーおよび商用の部位特異的変異誘発キットとの複数の経時的な反応を使用することで、本明細書に記載されたｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬへの配列と同一のプラスミド分子を生成しｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９感染性クローンに導入できる。実際には、互いの約５０〜６０のヌクレオチド内における変異のクラスターは１つの変異原性プライマーを使用することで変えられ得るため、７４より少ない変異原性プライマーで同じ結果を得ることができる。例えば、１つの変異原性プライマーを使用することで、ヌクレオチド９６５、９９２、および１００９を変えることが可能であるように、ヌクレオチド７３５、７５０、および７５６を変えることが可能である。したがって、プライマーの数は約６０に減少された。
【０１４６】
７４のヌクレオチド変化のうち、大部分（４２）が、同義または「サイレント」であり、同じアミノ酸をコードすることを意味する。これらのヌクレオチド変化は、インターフェロン誘導またはウイルスの抑制表現型への測定可能な効果を有する見込みがない。残りの３２回のヌクレオチド変化は、非同義または「非サイレント」であり、ウイルスタンパク質におけるアミノ酸変化をもたらす。これらの３２のヌクレオチド変化は、直接ウイルスのインターフェロン誘導／抑制表現型に原因があると予測され、感染性クローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬによってコードされたウイルスで示されたように、同じインターフェロン表現型に対して感染性クローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９によってコードされたウイルスを変換するために変えるべきである。そのような変化は、最大で３２個の変異原性プライマーを必要とするが、関連したヌクレオチドのいくつかのクラスター形成を考慮する場合それ以下となる。
【０１４７】
実施例８
感染性ＣＤＮＡクローンＰＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＰＫ１７−ＦＬのデノボ合成
【０１４８】
部位特異的変異誘発に代わる手段として、本発明のＰＲＲＳウイルスゲノムは、適切な５’および３’のアダプター配列を伴う化学的に統合されたデノボであることができ、そして、ＰＲＲＳ感染性ｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９（受託番号２０３４８９としてＡＴＣＣから利用可能）または同様のプラスミドバックボーンにクローン化される
。５０ｋｂより長い遺伝子のカスタム合成（ＰＲＲＳＶゲノムは約１５．５ｋｂ）は、多数の業者からの商用サービスとして入手可能であり、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＤＮＡ２．０、およびＢｉｏ  Ｂａｓｉｃ  Ｉｎｃ．を含むが、これに限られない。合成のウイルスゲノムは、ゲノムに隣接する５’のＰａｃＩおよび３’のＳｐｅＩ制限酵素部位を使用し、感染性クローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９のウイルスゲノムを取り替えることによって、方向的にｐＣＭＶ−Ｓベクターにクローン化される。合成ゲノムを切断するために、２４ヌクレオチド拡張（５’−ＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＡＡＴＴＡＡＡＣＣＧＴＣ−ｇｅｎｏｍｅ−３’，下線ＰａｃＩ部位を含む）が合成ゲノムの５’末端に組み込まれ、８３ヌクレオチド拡張（５’−ｇｅｎｏｍｅ−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴＣＣＣＡＡＧＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＡＧＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’，下線ＳｐｅＩ部位を含む）が合成ゲノムの３’末端に組み込まれる。ＰａｃＩおよびＳｐｅＩでプラスミドおよび合成ゲノムを切断した後に、当業者によく知られた標準のクローン技術を使用することで、適切な断片を精製し、ＤＮＡ連結酵素を使用して接合し、スクリーニングおよび繁殖のために大腸菌に形質転換する。
【０１４９】
【表１】
2019203016.tif 000003
【０１５０】
【表２】
2019203016.tif 000004
【０１５１】
【表３】
2019203016.tif 000005
【０１５２】
【表４】
2019203016.tif 000006
【０１５３】
【表５】
2019203016.tif 000007
【０１５４】
【表６Ａ】
2019203016.tif 000008
【０１５５】
【表６Ｂ】
2019203016.tif 000009
【０１５６】
【表７】
2019203016.tif 000010
【０１５７】
【表８Ａ】
2019203016.tif 000011
【０１５８】
【表８Ｂ】
2019203016.tif 000012
【０１５９】
【表９】
2019203016.tif 000013
【０１６０】
【表１０】
2019203016.tif 000014
【０１６１】
実施例９
Ｐ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬウイルスから成るワクチンは１日齢のブタにおける使用に安全であり、少なくとも２６週間にわたり有効である。
【０１６２】
既存のＰＲＲＳ修飾生ワクチンは、２週齢以上のブタにおける使用にのみ奨励される。継代５７での減弱Ｐ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬウイルス（２ｍＬ投与中に２．１３ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50）が１日齢の新生仔のブタへの使用において安全であるり、ワクチン接種後６ヶ月間（２６週間）にわたり毒性異種抗原投与に対して保護を供給することに十分免疫原性があるかを決定するために試験が行われた。（配列番号６において記載の通り、これは本質的に継代５２ウイルスと同じである）。
【０１６３】
ＰＲＲＳＶ血清陰性で妊娠している雌ブタ２４頭のうち計２２頭が健康な子ブタを生んだ。これらのブタ（子ブタ）は偽ワクチンまたはＰ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬウイルスワクチンの単一の２．０ｍＬ投与量を筋肉内注射として、約１日齢（０日目）で、割り当てに従い、投与された。１つの同腹仔／分娩枠における全ての健康な子ブタは、同じ偽ワクチン（１１の同腹仔、１００頭の子ブタ）または、Ｐ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬウイルスワクチン（１１の同腹仔、９１頭の子ブタ）を同じ日に接種した。
偽ワクチンを接種された雌ブタおよび子ブタはワクチン接種の期間を通じＰＲＲＳＶ陰性を示し続けた。交絡疾患因子は検出されなかった。１日齢でワクチン接種を受けた子ブタにおける安全性を実証するために用いられた主要変数はワクチン接種後の臨床観察である。全ての子ブタの成功的ワクチン接種を確認するために血清学が用いられた。
【０１６４】
臨床観察は全ての子ブタに対してワクチン接種後１日目から１０日目までにわたり観察および記録された。対照生成物（Ｔ０１）を投与された１００頭のブタ（子ブタ）のうち、および検査生成物（Ｔ０２）を投与された９１頭の子ブタのうち、それぞれ１５頭および１４頭のブタが標準でないと観察された（表１１，この具体例内で数字が付けられている通りに表を参照）。標準でないと観察された子ブタは、さらに異常全身状態および／または鬱状態を有すると特筆された。
【０１６５】
【表１１】
2019203016.tif 000015
【０１６６】
ＩＤＥＸＸ  ＥＬＩＳＡの結果は、ワクチン接種前は全てのブタがＰＲＲＳＶに対し陰性であったこと（Ｓ／Ｐ比率＜０．４）および全ての偽ワクチンの対照が本試験のワクチン接種段階の間血清学的に陰性を示し続けたということを確認した。ワクチン接種後、Ｐ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬワクチン群内の全てのブタが２１または２２日目までに血清学的に陽性（Ｓ／Ｐ比率＞０．４）を示した。
【０１６７】
【表１２】
2019203016.tif 000016
【０１６８】
本データは継代５７での減弱Ｐ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬウイルスが単一の２ｍＬのＩＭ投与量として血清学的陰性の雌ブタから生まれた子ブタに対して１日齢で投与される場合に安全であるという結果を、２１または２２日齢での離乳にもかかわらず観測された場合において、支持する。
【０１６９】
抗原投与に先んじて、偽ワクチンおよびＰ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬウイルスをワクチン接種された子ブタは、部屋の中の檻（１つの檻につき同一ワクチン接種群から２頭の子ブタ）に再収容され、それぞれの部屋はそれぞれのワクチン接種群から１２の檻を含むことになった。抗原投与されたのはワクチン接種後７，１８，または２６週間のいずれかでの毒性異種ＰＲＲＳ分離株ＮＡＤＣ２０である。抗原投与量は２．２７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／ｍＬ（２．８７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／４ｍＬ投与量）での４．０ｍＬ（鼻孔につき１．０ｍＬおよび２．０ｍＬの筋肉内注射）のＮＡＤＣ２０保存溶液と同等であった。ＮＡＤＣ−２０は高い毒性の遺伝子型２ＰＲＲＳウイルスであり、国立動物疾病センターＵＳＤＡ（Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ）のＤｒ．ＫｅｌｌｙＬａｇｅｒにより供給される。ＮＡＤＣ−２０ＯＲＦ５アミノ酸配列はＰ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬに９４．５％同一である。
【０１７０】
疾患の予防を決定する主要変数は肺病変の割合であった。肺病変は剖検（抗原投与後１０日）で点数化され、それぞれの葉（左頭部、左中、左尾部、右頭部、右中、右尾部、お
よび付属物）の硬変の割合が、病変を観察された葉のパーセントとして点数化および記録された。
【０１７１】
ワクチン接種後７週間で、肺病変の割合は、偽ワクチン接種を受けたブタにおいて、Ｐ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬウイルスワクチン接種を受けた子ブタに比べ、著しく高かった（Ｐ≦０００１）（表１３）。
【０１７２】
【表１３】
2019203016.tif 000017
【０１７３】
ワクチン接種後１８週間で、肺病変の割合は、偽ワクチン接種を受けた子ブタにおいて、Ｐ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬウイルスワクチン接種を受けた子ブタに比べ、著しく高かった（Ｐ≦０００１）（表１４）。
【０１７４】
【表１４】
2019203016.tif 000018
【０１７５】
ワクチン接種後２６週間で、肺病変の割合は、偽ワクチン接種を受けた子ブタにおいて、Ｐ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬウイルスワクチン接種を受けた子ブタに比べ著しく高かった（Ｐ≦０００１）（表１５）。
【０１７６】
【表１５】
2019203016.tif 000019
【０１７７】
この結果は、減弱ワクチンウイルスＰ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬが１日齢の子ブタにおいて安全であり、免疫の並外れた期間を有する強力な免疫学的反応を誘発することができ
るということを示す。１回の投与量は１日齢の子ブタを毒性異種ＰＲＲＳ抗原投与から少なくとも２６週間にわたり保護する。
【０１７８】
１日齢の子ブタにおける安全性およびＰＲＲＳ免疫の２６週間にわたる期間といったこれらの特性は、多価組み合わせブタワクチン、例えば２価ＰＲＲＳＶ／マイコプラズマ−ヒオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）ワクチン、２価ＰＲＲＳＶ／ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）ワクチン、および３価ＰＲＲＳＶ／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＣＶ２ワクチンにも、１価ＰＲＲＳＶワクチンに対してと同様有益である。
【０１７９】
実施例１０
Ｐ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬウイルスから成るワクチンは防御免疫の早期発現を供給する。
【０１８０】
既存修飾生ＰＲＲＳワクチンは、毒性ＰＲＲＳ株への曝露の少なくとも３〜４週間前にワクチン接種することが奨励される。この時間間隔は防御免疫を確立するために不可欠であると思われる。本明細書に記載される試験はワクチン接種後わずか１４日でのＰ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬウイルスワクチンおよび２つの別の商用のＰＲＲＳワクチンを用いて送達される毒性異種ＰＲＲＳウイルス抗原投与に対して著しい保護を実証する。
ワクチン接種段階の間、１８頭のブタ（３週齢）の投与群は、それぞれ６頭ずつの檻の中の４つの別室に収容された。ブタ（子ブタ）は、偽ワクチン（２ｍＬ）、減弱Ｐ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬ継代５７ウイルスワクチン（２ｍＬ投与中に３．６２ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50）、Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶワクチン、またはＩｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ  ＡＴＰワクチンの、単一の筋肉内注射を、およそ３週齢（０日目）で製造者の指示に従い投与された。
【０１８１】
抗原投与に先んじて、全ての残存する動物が、各収容檻の間に空の檻がある、それぞれ３頭の檻に再収容され、各投与群からの動物の複数の檻が４つの部屋のそれぞれに収容された。抗原投与されたのは、約５週齢に対する毒性異種ＰＲＲＳ分離株ＮＡＤＣ２０である（１４日目）。抗原投与量は２．０７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／ｍＬ（２．６７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／４ｍＬの投与量）での４．０ｍＬ（鼻孔につき１．０ｍＬプラス２．０ｍＬの筋肉内注射）のＮＡＤＣ２０保存溶液に同等であった。
【０１８２】
疾患の減衰を決定する主要な変数は偽ワクチン群に対するワクチン接種群における肺病変の割合であった。偽ワクチン接種群と比較した場合に、有意差が全てのワクチン接種群（Ｐ１２９−ＰＫＣ１２−ＦＬ、Ｐ＝０．０１７７；ＩｎｇｅｌｖａｃＰＲＲＳ  ＡＴＰ、Ｐ＝０．０２５５；Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶ、Ｐ＝０．０１３７）の間において見出された。ワクチン接種群を互いに比較した場合、有意差は見出されなかった（表１６）。
【０１８３】
【表１６】
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【０１８４】
この結果は、部分的免疫および疾患の減衰をワクチン接種後１４日目までに誘発することは修飾生ＰＲＲＳウイルスワクチンの一般的特性であり得るということを実証する。この特性は、早期に獲得した免疫（例えば特有の抗体および細胞毒性Ｔ細胞）、自然免疫（例えば誘発されたインターフェロンおよびナチュラルキラー細胞）の組み合わせおよび／またはワクチンウイルスと攻撃ウイルスとの間の限られた数の許容宿主細胞（例えば肺胞マクロファージ）をめぐるブタ（子ブタ）内における競争によってもたらされるものであり得る。仕組みに関係なく、この特性は自然または意図的なＰＲＲＳ感染（例えば、次に来る代わりの若い雌ブタの毒性ＰＲＲＳの風土性農場株への意図的曝露）に関連する疾患からブタを保護することに活用され得る。
【０１８５】
したがって、上述のように、ＰＲＲＳ免疫の早期発現のこの特性は、多価組み合わせブタワクチン、例えば２価ＰＲＲＳＶ／マイコプラズマ−ヒオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）ワクチン、２価ＰＲＲＳＶ／ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）ワクチン、および３価ＰＲＲＳＶ／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＣＶ２ワクチンにも、１価ＰＲＲＳＶワクチンに対してと同様、有益である。本発明の実施において（すなわち、その後２週間での免疫の発現を選択的に伴う、子ブタが１日齢のときの早期で安全なワクチン接種を供給することに）有益である、上記のワクチンの構成要素に関しては、全ての組み合わせワクチン構成要素に対して２０１２年４月４日に出願された表題「ＰＣＶ／Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ／ＰＲＲＳＺ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ」の、Ｎｉｚｔｅｌらによる米国仮出願第６１／６２０１８９号において記載されるように参照され、その完全で全体の開示は参照することによってその全てが説明されるかのように本明細書に組み込まれる。
【０１８６】
本発明の実施（すなわち、その後２週間での免疫の発現を選択的に伴う、子ブタが１日齢のときの早期で安全なワクチン接種を供給することに）において用いられ得る特有のＰＲＲＳワクチン（またはＰＲＲＳワクチン株）に関しては、Ｍｕｒｔａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ２９，ｐｐ．８１９２−８２０４，（２０１１）の８１９６頁を参照の表１に注意が向けられ、Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶ、Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ  ＡＴＰ、およびＳｕｖａｘｙｎ  ＰＲＲＳ（アイオワ州株ＩＳＵ−５５から誘導された）を含むがこれに限らない、多数の上記ウイルス／ワクチンが同定される。上記の性能特性を供給するワクチンはまた約６ヶ月間の免疫期間を供給することも要求されるということに留意すべきである。
【０１８７】
生物学的材料の寄託
次の生物学的材料（米国特許第６，５００，６６２号も参照）は、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，２０１１０−２２０９，ＵＳＡにあるアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に１９９８年１１月１９
日に寄託され、次の受託番号が与えられた。
【０１８８】
プラスミドｐＴ７Ｐ１２９Ａ、受託番号２０３４８８
プラスミドｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９、受託番号２０３４８９
次の米国特許の完全な原文および開示は参照することにより全てが記載されると同様に本明細書に組み込まれる：米国特許第６，５００，６６２号および米国特許第７，６１８，７９７号。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月6日(2019.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
離乳前のブタにおいて、ブタ生殖および呼吸症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスによる感染に対する保護免疫反応を誘発する方法であって、該方法は、改変された生ＰＲＲＳウイルスおよび家畜への使用に適切なキャリアを含むワクチンを前記離乳前のブタに投与することを含み、
前記ワクチンは前記離乳前のブタに２週齢以下の時点で投与され；
前記ワクチンを前記ブタが１日齢以下の時点で投与しても安全かつ免疫保護性であり；
前記改変された生ＰＲＲＳウイルスは、外来のブタＣＤ１６３受容体タンパク質を発現する許容性の哺乳類非マクロファージ細胞系中で毒性ＰＲＲＳウイルスを複数回継代し、培養からウイルスを回収することにより調製され；および
前記保護免疫反応は、ＰＲＲＳに感染したワクチン投与されていないブタと比較して、ＰＲＲＳ感染中の肺病変の減少をもたらす、前記方法。
【請求項２】
前記保護免疫反応が最長６ヵ月まで持続する、請求項１の方法。
【請求項３】
前記ワクチンが、免疫保護を誘導する豚マイコプラズマ（Mycoplasma hyopneumoniae）抗原、免疫保護を誘導する豚サーコウイルス２型抗原、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項４】
ブタにおいて、ブタ生殖および呼吸症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスによる感染に対する保護免疫反応を誘発する方法であって、該方法は、
（ａ）改変された生ＰＲＲＳウイルス、
（ｂ）前記改変ＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子、
（ｃ）前記感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子、
（ｄ）前記感染性ＲＮＡ分子を含むウイルス性ベクター、または
（ｅ）前記単離されたポリヌクレオチド分子を含むウイルス性ベクター；
および家畜への使用に適切なキャリア
を含有するワクチンを、離乳前に、前記ブタに投与することを含み；
前記ワクチンは前記ブタが２週齢以下のときに投与され；
前記改変ＰＲＲＳウイルスは、外来のブタＣＤ１６３受容体を発現する許容性の哺乳類非マクロファージ細胞上で、複数回、毒性ＰＲＲＳウイルスを継代することにより調製され；
前記改変ＰＲＲＳウイルスは、野生型ＰＲＲＳウイルスまたは改変ウイルスの由来元である未改変のＰＲＲＳウイルスと比べて低減された毒性を前記ブタにおいて示し；
前記投与は、野生型ＰＲＲＳウイルスによる感染に対するブタにおける保護免疫反応を誘発し、該保護免疫反応は、ＰＲＲＳに感染したワクチン投与されていないブタと比較して、ＰＲＲＳ感染中の肺病変の減少をもたらす、前記方法。
【請求項５】
前記ワクチンが改変された生の欧州ＰＲＲＳウイルスを含む、請求項１または４の方法。
【請求項６】
前記ワクチンが改変された生の北米ＰＲＲＳウイルスを含む、請求項１または４の方法。
【請求項７】
免疫の保護が最長６ヵ月まで持続する、請求項４の方法。
【請求項８】
ワクチン接種が生後１日目に行われたとき、前記ワクチンが最長６ヵ月まで持続する免疫をもたらす、請求項４の方法。
【請求項９】
前記ワクチンが前記離乳前のブタに１週齢以下の時点で投与される、請求項１の方法。
【外国語明細書】
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