(57)【要約】【課題】泳動後のタンパク質の検出において、バックグラウンドノイズを低くし、十分な検出感度を得ることができる無洗浄タンパク質ゲル染色剤を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、無洗浄タンパク質ゲル染色剤としてピレン誘導体を提供するものであり、より具体的には、１−ピレンメタノール、ピレニルメチルエーテル誘導体、１−ピレンカルボン酸誘導体、糖修飾ピレニルメチル誘導体、又はピレン−フルオレセイン結合体を使用することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピレン誘導体を含有する、無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
【請求項２】
前記ピレン誘導体が、１−ピレンメタノール、ピレニルメチルエーテル誘導体、１−ピレンカルボン酸誘導体、糖修飾ピレニルメチル誘導体、及びピレン−フルオレセイン結合体からなる群から選択される、請求項１に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
【請求項３】
前記ピレニルメチルエーテル誘導体が、以下の構造：
【化１】
2019151603.tif 000026
（式中、
Ｒ1は、−ＯＨ、−Ｃ1-6アルキル、−ＯＣ1-6アルキル、−ＯＴｓ、−Ｎ3、−ＮＨ2からなる群から選択され；そしてｍは、０〜１０の整数である）
を有する、請求項２に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
【請求項４】
前記ピレニルメチルエーテル誘導体が、以下：
【化２】
2019151603.tif 000027
である、請求項３に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
【請求項５】
前記１−ピレンカルボン酸誘導体が、以下の構造：
【化３】
2019151603.tif 000028
（式中、
Ｒ2は、−ＯＨ、−Ｃ1-6アルキル、−ＯＣ1-6アルキル、−ＯＴｓ、−Ｎ3、−ＮＨ2からなる群から選択され；そしてｎは、０〜１０の整数である）
を有する、請求項２に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
【請求項６】
前記１−ピレンカルボン酸誘導体が、以下：
【化４】
2019151603.tif 000029
である、請求項２に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
【請求項７】
前記糖修飾ピレニルメチル誘導体が、以下：
【化５】
2019151603.tif 000030
である、請求項２に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
【請求項８】
前記ピレン−フルオレセイン結合体が、以下：
【化６】
2019151603.tif 000031
である、請求項２に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
【請求項９】
ゲル上を電気泳動させたタンパク質を、固定液を用いて前記ゲル上に固定し、請求項１〜８のいずれか１項に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤を含む染色液を用いて、ゲル上に固定されたタンパク質を染色し、染色後の脱色及び洗浄を伴わずに、紫外（ＵＶ）光を照射後、ゲル画像を得ることを特徴とするタンパク質染色検出方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤を含む、タンパク質染色検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動によるタンパク質の泳動ゲルを検出するための、脱色及び洗浄が不要なピレンを基本骨格としてゲル染色剤、及び該染色剤を用いたタンパク質染色検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ペプチド及びタンパク質は通常、ゲル電気泳動を使用して、溶液定量化アッセイによって、又は固体支持体、例えば、フィルター膜上における検出によって、検出かつ評価される。少量のタンパク質は目視できないが、通常、それらを同定する前に染色されなければならない。
【０００３】
ゲル中のタンパク質を染色する最も一般的な２つの方法は、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色、及び銀染色である。特定のタンパク質に関して、銀染色は、ＣＢＢ染色よりも１００〜１０００倍高感度であるが、いずれの方法も不利な点を有する。対照的にタンパク質の検出のために、発光性試薬、例えば蛍光性、リン光性、又は化学発光性試薬の使用は、非常に感度を向上させ、そして直線的な定量化範囲を増大させる可能性があり、一方で染色試薬の使用の容易性を同時に増大させ得る。
【０００４】
２次元電気泳動の泳動パターンの検出法として蛍光染色剤を用いる方法（蛍光検出システム）が広く行われている。例えば、蛍光検出システムにおいて、電気泳動させたタンパク質をゲル染色試薬としてＳｙｐｒｏ（登録商標）Ｒｕｂｙ（ロンザジャパン株式会社）を用いて染色することが知られているが、このような既存の蛍光染色剤は泳動層のゲル自体も強く染色してしまうことから、蛍光色素による染色後に一度ゲルを洗浄し、脱色操作を行うことが必要であり、通常この洗浄脱色操作には３０分以上の時間を要する。一方、染色後にゲル表面をリンスするだけで検出可能な蛍光染色剤（非特許文献１〜３）も報告されているが、研究現場では洗浄やリンスを必要としない迅速で簡便な検出法が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Suzuki, Y.; Takagi, N.; Chimuro, T.; Shinohara, A.; Sakaguchi, N.; Hiratsuka, A.; Yokoyama, K., Electrophoresis 2011, 32, 1403-1413
【非特許文献２】Suzuki, Y., Analytical Methods 2013, 5, 2174
【非特許文献３】Suzuki, Y.; Takagi, N.; Sano, T.; Chimuro, T., Electrophoresis 2013, 34, 2464-2472.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、泳動後のタンパク質の検出において、バックグラウンドノイズを低くし、十分な検出感度を得ることができる、ピレンを基本骨格とした無洗浄タンパク質ゲル染色剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、泳動後のタンパク質の検出において、種々のピレン誘導体が、ゲル自体の染色が従来の蛍光染色剤を用いた場合と比較して生じず、かつ洗浄脱色操作が不要であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］ピレン誘導体を含有する、無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
【０００９】
［２］前記ピレン誘導体が、１−ピレンメタノール、ピレニルメチルエーテル誘導体、１−ピレンカルボン酸誘導体、糖修飾ピレニルメチル誘導体、及びピレン−フルオレセイン結合体からなる群から選択される、［１］に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
【００１０】
［３］前記ピレニルメチルエーテル誘導体が、以下の構造：
【００１１】
【化１】
2019151603.tif 000002
【００１２】
（式中、
Ｒ1は、−ＯＨ、−Ｃ1-6アルキル、−ＯＣ1-6アルキル、−ＯＴｓ、−Ｎ3、−ＮＨ2からなる群から選択され；そして
ｍは、０〜１０の整数である）
を有する、［２］に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
【００１３】
［４］前記ピレニルメチルエーテル誘導体が、以下：
【００１４】
【化２】
2019151603.tif 000003
【００１５】
である、［３］に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
【００１６】
［５］前記１−ピレンカルボン酸誘導体が、以下の構造：
【００１７】
【化３】
2019151603.tif 000004
【００１８】
（式中、
Ｒ2は、−ＯＨ、−Ｃ1-6アルキル、−ＯＣ1-6アルキル、−ＯＴｓ、−Ｎ3、−ＮＨ2からなる群から選択され；そして
ｎは、０〜１０の整数である）
を有する、［２］に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
【００１９】
［６］前記１−ピレンカルボン酸誘導体が、以下：
【００２０】
【化４】
2019151603.tif 000005
【００２１】
である、［２］に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
【００２２】
［７］前記糖修飾ピレニルメチル誘導体が、以下：
【００２３】
【化５】
2019151603.tif 000006
【００２４】
である、［２］に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
【００２５】
［８］
前記ピレン−フルオレセイン結合体が、以下：
【００２６】
【化６】
2019151603.tif 000007
【００２７】
である、［２］に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
【００２８】
［９］ゲル上を電気泳動させたタンパク質を、固定液を用いて前記ゲル上に固定し、［１］〜［８］のいずれか１つに記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤を含む染色液を用いて、ゲル上に固定されたタンパク質を染色し、染色後の脱色及び洗浄を伴わずに、紫外（ＵＶ）光を照射後、ゲル画像を得ることを特徴とするタンパク質染色検出方法。
【００２９】
［１０］［１］〜［８］のいずれか１つに記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤を含む、タンパク質染色検出用キット。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、泳動後のタンパク質の検出において、種々のピレン誘導体が、ゲル自体の染色が従来の蛍光染色剤を用いた場合と比較して生じず、かつ洗浄脱色操作が不要である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】１次元ゲルを用いてピレン誘導体（１９種）の染色能スクリーニングを行った結果を示す。染色能スクリーニングでは、ピレン誘導体は１０μＭになるよう懸濁させた水溶液を用いた（ただし、化合物２については２２μＭの水溶液を用いた）。
【図２】ピレン誘導体の染色能と疎水性度（予測Ｌｏｇ値）の関係を示す図である。図中の番号は、実施例において合成した化合物の番号に対応する。
【図３】２次元電気泳動ゲルの染色を行った結果を示す。Ａは、比較対照としてＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液を用いて染色した撮影画像であり、Ｂ及びＣは、それぞれメチルエーテル（化合物２）及び１−ピレンメタノール（化合物１）を用いて染色した撮影画像である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明によれば、ピレン誘導体を含有する、無洗浄タンパク質ゲル染色剤が提供される。本発明のタンパク質用のゲル染色剤は、ゲルをピレン誘導体によって染色後に、通常のゲル染色では必須となる洗浄工程を要しないことを特徴とする。
【００３３】
１．ピレン誘導体
本発明のゲル染色剤に含まれるピレン誘導体としては、限定されないが、１−ピレンメタノール、ピレニルメチルエーテル誘導体、１−ピレンカルボン酸誘導体、糖修飾ピレニルメチル誘導体、及びピレン−フルオレセイン結合体などが挙げられる。これらのピレン誘導体は、市販のものを用いるか、又は後述する実施例１に記載のように、常法により合成したものを使用に合わせて適宜用いてもよい。
【００３４】
本明細書中で使用するとき、「ピレニルメチルエーテル誘導体」とは、ピレンの１位にメチレン基を介して−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）n−なる基を有する誘導体を指す。典型的には、ピレニルメチルエーテル誘導体は、以下の構造：
【００３５】
【化７】
2019151603.tif 000008
【００３６】
を有することができる。ここで、上記式中、ｍは、０〜１０の整数であり、好ましくは０〜５、より好ましくは０〜３である。また、Ｒ1は、限定されないが、−ＯＨ、−Ｃ1-6アルキル、−ＯＣ1-6アルキル、−Ｎ3、−ＮＨ2からなる群から選択される基であってもよい。また、Ｒ1は、−ＯＨに保護基（例えば、トシル基（Ｔｓ））が導入された基であってもよい。
【００３７】
ピレニルメチルエーテル誘導体は、典型的には、下記の構造であり得る。
【００３８】
【化８】
2019151603.tif 000009
【００３９】
なお、上記化合物の合成については、後述する実施例１を参照されたい。
【００４０】
本明細書中で使用するとき、「１−ピレンカルボン酸誘導体」とは、ピレンの１位にカルボニル基を介して−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）n−なる基を有する誘導体を指す。典型的には、１−ピレンカルボン酸誘導体は、以下の構造：
【００４１】
【化９】
2019151603.tif 000010
【００４２】
を有することができる。ここで、上記式中、ｎは、０〜１０の整数であり、好ましくは０〜５、より好ましくは０〜３である。また、Ｒ1は、限定されないが、−ＯＨ、−Ｃ1-6アルキル、−ＯＣ1-6アルキル、−Ｎ3、−ＮＨ2からなる群から選択される基であってもよい。また、Ｒ1は、−ＯＨを保護基（例えば、トシル基（Ｔｓ））で保護して基であってもよい。
【００４３】
さらに、１−ピレンカルボン酸誘導体は、１分子内にピレンを２つ有する構造であってもよう、すなわち、Ｒ2が、以下の構造：
【００４４】
【化１０】
2019151603.tif 000011
【００４５】
であってもよい。
【００４６】
１−ピレンカルボン酸誘導体は、典型的には、下記の構造であり得る。
【００４７】
【化１１】
2019151603.tif 000012
【００４８】
なお、上記化合物の合成については、後述する実施例１を参照されたい。
【００４９】
本明細書中で使用するとき、「糖修飾ピレニルメチル誘導体」とは、ピレンの１位にメチレン基を介して糖を有する誘導体を指す。「糖」とは、アルデヒド官能基又はケトン官能基を有してもよい１又は複数個のアルコール官能基を含有し、少なくとも4個の炭素原子を含む、酸素を保持する炭化水素系化合物を意味する。これらの糖は、単糖類、オリゴ糖類又は多糖類であってもよい。ピレンを修飾するための糖としては、単糖類が好ましく、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトースが挙げられる。
糖修飾ピレニルメチル誘導体は、典型的には、下記の構造であり得る。
【００５０】
【化１２】
2019151603.tif 000013
【００５１】
なお、上記化合物の合成については、後述する実施例１を参照されたい。
【００５２】
また、上記で列挙したピレン誘導体の他に、ピレン−フルオレセイン結合体を用いることができる。このようなピレン−フルオレセイン結合体としては、限定されないが、下記の構造を有するものであってもよい。
【００５３】
【化１３】
2019151603.tif 000014
【００５４】
２．ゲル染色剤
本発明によれば、ゲル上で電気泳動後に分離された生物学的試料を視認できるようにする染色剤として、上記のピレン誘導体を用いることを特徴とする。本発明中で使用するとき、「ゲル」とは、生物学、化学、医学、薬学、バイオサイエンス等の分野において、生体物質や化学物質を分離分析するための分子ふるい素材のことをいい、好ましくは、電気泳動法による試料成分の分布支持体をいう。ゲルの素材としては、特に制限されないが、例えば、ポリアクリルアミドやアガロース等が挙げられる。本発明の染色方法に用いるゲルとしては、好ましくは、タンパク質の１次元又は２次元の電気泳動後のゲルが挙げられる。ここで、タンパク質の電気泳動としては、特に制限されないが、従来電気泳動、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)、ドデシル硫酸ナトリウムを添加したポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)、オファーレルの２次元電気泳動法、ＲＦＨＲの二次元電気泳動法等が挙げられる。ゲルの大きさや形状もまた制限されず、ディスク式の円柱状のものであっても、スラブ式のシート状のものであってもよい。なお、ゲルを用いた各種電気泳動用の装置及び手段は、当業者に周知である。
【００５５】
ピレン誘導体をゲル染色剤として用いる場合、ゲルへの浸透性を考慮して、水溶液であることが好ましい。このようなゲル染色剤は、前述のピレン誘導体を１〜１００μＭ、好ましくは１〜５０μＭ、より好ましくは１〜１０μＭとなるように水又は水性緩衝液に溶解させて得ることができる。以下、このようにして調製した、ピレン誘導体の水溶液を単に「ピレン誘導体水溶液」ということがある。
【００５６】
３．ゲル染色法及び画像化
本発明によれば、ゲル上を電気泳動させたタンパク質を、固定液を用いて該ゲル上で固定し、上記ゲル染色剤を含む染色液、すなわち、ピレン誘導体水溶液を用いてタンパク質を染色し、染色後の脱色及び洗浄を伴わずに、紫外（ＵＶ）光を照射後、ゲル画像を得ることができる。ここで、固定液として用いることができる固定化剤としては、生体試料を腐敗から保護するために使用される化学薬品が挙げられる。このような固定化剤は、試料に生じる生物学的反応を防ぐことができ、試料の機械的強度と安定性を増加させる。一実施形態において、種々の固定化剤を固定液に含めることができ、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ＥＤＴＡ、界面活性剤、金属塩、金属イオン、尿素、及びアミノ化合物などが挙げられる。また、上記の固定化剤は、酸性条件下で使用することができる。より具体的には、電気泳動後のゲル上のタンパク質の固定化は、限定されないが、容器中でゲルを１〜１０％酢酸水溶液を含む４０〜７０％メタノール中に浸し、５分〜１時間程度の振とうさせることによって達成することができる。さらに、固定化工程は、１回に限定されず、数回繰り返してもよい。
【００５７】
タンパク質がゲルに固定化された後であって、ゲル染色の前の最終洗浄は、水、特に蒸留水、脱塩水、又は脱イオン水（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社からのＭｉｌｌｉ−Ｑシステムにて精製された水、以降「ミリＱ水」と記載する）を用いて行うことが好ましい。該最終洗浄は、例えば、脱イオン水に浸し、５〜３０分程度、振とうさせて行うことができる。その後、上記のピレン誘導体水溶液を用いて、ゲルを染色する。ゲル染色は、ゲルをピレン誘導体水溶液に浸し、一晩振とうすることにより行うことができる。本発明によれば、染色後に洗浄及び脱色工程を必要とせず、撮影し、画像化を行うことができる。一方、本発明によるピレン誘導体水溶液以外の染色剤を使用する場合は、一般的に、染色後、例えば、洗浄及び脱色工程を必要として、そのための水溶液（例えば、メタノール＋酢酸水溶液）を別途調製し、該水溶液にゲルを浸し、３０分〜数時間振とうする操作を行わなければならない。
【００５８】
ゲル上のタンパク質の可視化には、使用される染色剤の特性に応じて適宜選択することができる。本発明によれば、染色剤としてピレン誘導体を用いているため、例えば、ＵＶトランスイルミネーターを用いて、ＵＶ光の照射によってタンパク質を検出することができる。さらに、得られた泳動像を画像解析ソフト（例えば、ＩｍａｇｅＪ）を用いて、スポット又はバンドのシグナル強度を算出することができる。
【００５９】
４．キット
本発明によれば、タンパク質染色検出用キットが提供される。該タンパク質染色検出用キットは、染色剤として本発明のピレン誘導体水溶液の他、タンパク質を固定するための固定液、染色前に使用する洗浄液を含むことができる。
【００６０】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
実施例１：ピレン誘導体の合成
本実施例では、各種ピレン誘導体を合成した。合成に使用した有機合成試薬は、和光純薬工業株式会社、東京化学工業株式会社、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、関東化学より購入した。また、有機合成反応の追跡及び確認、並びに所望のピレン誘導体の精製及び合成確認には、シリカゲル薄層クロマトグラフィー、1Ｈ  ＮＭＲ測定、13Ｃ  ＮＭＲ測定、及びシリカゲルクロマトグラフィーにより行った。より具体的には、シリカゲル薄層クロマトグラフィーでは、Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ）を用い、反応の追跡、確認には、ＵＶ（２５４ｎｍ）、（３６５ｎｍ）の照射、又は発色試薬として１％Ｃｅ（ＳＯ4）2−１．５％（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ−１０％Ｈ2ＳＯ4水溶液に浸し、電熱器を用いて発色させ、検出した。また、単離精製には、Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  Ｃ−６０、又はＷａｋｏ  Ｇｅｌ  Ｃ−３００、Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎを用いた。さらに、合成確認においては、1Ｈ  ＮＭＲ測定では、ＯＸＦＯＲＤ  ＮＭＲ  ＡＳ５００（５００ＭＨｚ）、又はＪＥＯＬＪＮＸ−ＥＸ−２７０（２７０ＭＨｚ）を用いて測定した。化学シフトは、ＣＤＣｌ3中のテトラメチルシラン（δ  1Ｈ＝０ｐｐｍ）溶媒ピークを用い内部標準として示した。
【００６２】
（１）化合物２の合成
【化１４】
2019151603.tif 000015
【００６３】
ピレニルメチルブロミド（２０１ｍｇ、０．６８０ｍｍｏｌ、１当量）にメタノール ３．４ｍＬ、１Ｍナトリウムメトキシドのメタノール溶液（３．４ｍＬ、３．４ｍｍｏｌ、５当量）を加え、室温で２時間撹拌した。その後、ＤＭＦ ０．７ｍＬを加え、終夜撹拌した。反応終了後、水を加えてクエンチした。酢酸エチルを加え水で２回、飽和食塩水で１回洗浄を行った。その後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過を行い、減圧留去を行った。精製はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより行った（収率６４％、１０７ｍｇ）。
化合物２：Rf 0.54 (Hexane-EtOAc, 5:1) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.37 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 8.20 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 8.18-8.13 (m, 2H), 8.08-7.99 (m, 4H), 5.19 (s, 2H), 3.52 (s, 3H).
【００６４】
（２）化合物４の合成
【化１５】
2019151603.tif 000016
【００６５】
ジクロロメタン３ｍＬを溶媒に用い、エチレングリコール（３４５ｍｇ、３．２５ｍｍｏｌ、１０当量）、１−ピレンカルボン酸（５０ｍｇ、０．３２５ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。次に、ＥＤＣ（７５ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ、１．２当量）を加え、ＤＭＡＰ（４０ｍｇ、０．３２５ｍｍｏｌ、１．２当量）を加えて室温で１６時間撹拌した。水でクエンチした後、酢酸エチルで希釈し、水で２回、飽和食塩水で１回洗浄を行った。その後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過を行い、減圧留去を行った。精製はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより行った（収率３４％、１０９ｍｇ）。
化合物４：Rf 0.17 (Hexane-EtOAc, 1:1) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 9.26 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 8.65 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.30-8.22 (m, 3H), 8.20-8.16 (m, 2H), 8.12-8.04 (m, 2H), 4.72-4.67 (m, 2H), 4.00-3.96 (m, 2H), 3.84-3.79 (m, 2H), 3.75-3.72 (m, 2H), 2.10 (s, 1H).
【００６６】
（３）化合物５の合成
【化１６】
2019151603.tif 000017
【００６７】
ジエチレングリコール（１６ｍｇ、０．１５５ｍｍｏｌ、１当量）をジクロロメタン ３ｍＬに懸濁させ、１−ピレンカルボン酸（５０ｍｇ、０．３２５ｍｍｏｌ、２．１当量）を加えた。次に、ＥＤＣ（８９ｍｇ、０．４６５ｍｍｏｌ、３．０当量）を加え、ＤＭＡＰ（３８ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ、２．０当量）を加えて室温で２４時間撹拌した。水を加えてクエンチした後、ジクロロメタンで希釈し、水で２回、飽和食塩水で１回洗浄を行った。その後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過を行い、減圧留去を行った。精製はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより行った（収率４１％、３６ｍｇ）。
化合物５：Rf 0.50 (Hexane-EtOAc, 1:1) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 9.12 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 8.50 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 8.10 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 8.06 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 8.01 (d, J = 9.4 Hz, 2H), 7.96- 7.91 (m, 4H), 7.77 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.73 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.74 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 4.12-4.08 (m, 4H).
【００６８】
（４）化合物６の合成
【化１７】
2019151603.tif 000018
【００６９】
エチレングリコール（９．２ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ、１当量）をジクロロメタンに溶解し、１−ピレンカルボン酸（５０ｍｇ、０．３２５ｍｍｏｌ、２．２当量）を加えた。次に、ＥＤＣ（８５ｍｇ、０．４４４ｍｍｏｌ、３．０当量）を加え、ＤＭＡＰ（１．８ｍｇ、０．０１４８ｍｍｏｌ、０．１当量）を加え、室温で２９時間撹拌した。水でクエンチした後、ジクロロメタンで希釈し、水で２回、飽和食塩水で１回洗浄を行った。その後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過を行い、減圧留去を行った。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、副生成物として化合物６の生成を確認した（収率４６％、３２ｍｇ）。
化合物６：Rf 0.73 (Hexane-EtOAc, 1:1) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 9.54 (d, J = 9.4 Hz, 2H), 8.92 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 8.40-8.33 (m, 6H), 8.30-8.24 (m, 4H), 8.18-8.11 (m, 4H).
【００７０】
（５）化合物７の合成
【化１８】
2019151603.tif 000019
【００７１】
水素化ナトリウム（２４ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、１．５当量）にＴＨＦ ３ｍＬを加え氷冷下撹拌し、ＴＨＦ ３ｍＬに溶かしたジエチレングリコール（７１９ｍｇ、６．７８ｍｍｏｌ、１０当量）を加え、３０分撹拌させた。その後、ＴＨＦ ３ｍＬに溶かした１−（ブロモメチル）ピレン（２００ｍｇ、０．６７８ｍｍｏｌ、１．０当量）を加え、室温で終夜反応させた。反応終了後、水を加えて水素化ナトリウムをクエンチした。酢酸エチルを加え、水で２回、飽和食塩水で１回洗浄を行った。その後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過を行い、減圧留去を行った。精製はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより行った（収率８４％、１８３ｍｇ）。
化合物７:Rf 0.38 (EtOAc) 1H NMR(500 MHz, Chloroform-d) δ 8.40 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.23-8.13 (m, 4H), 8.09-7.99 (m, 4H), 5.29 (s, 2H), 3.78-3.70 (m, 6H
), 3.61 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 2.30 (s, 1H).
【００７２】
（６）化合物８及び化合物９の合成
【化１９】
2019151603.tif 000020
【００７３】
対応する原料のアルコール体（化合物８の前駆体、１３ｍｇ、０．４２８ｍｍｏｌ、１当量；化合物９の前駆体、１４７ｍｇ、０．４０３ｍｍｏｌ、１当量）をピリジン ４ｍＬに溶かし、パラトルエンスルホニルクロリド（化合物８の合成、１２２ｍｇ、０．６４１ｍｍｏｌ、１．５当量；化合物９の合成、１１５ｍｇ、０．６０５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で１６時間撹拌した。水を加えクエンチを行い、溶媒を減圧留去した。次に酢酸エチルで希釈し、飽和食塩水で２回洗浄を行った。その後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過を行い、減圧留去を行った。精製はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより行った。（収率、化合物８：５１％、１０３ｍｇ；化合物９：５２％、１０９ｍｇ）
化合物８:Rf 0.15 (Hexane-EtOAc, 4:1) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.37 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.23-8.18 (m, 2H), 8.17-8.12 (m, 2H), 8.08-7.99 (m, 4H), 7.78-7.74 (m, 2H), 7.22 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.25 (s, 2H), 4.19-4.15 (m, 2H), 3.72-3.68 (m, 4H), 3.67-3.63 (m, 2H), 2.33 (s, 3H).
化合物９:Rf 0.70 (Hexane-EtOAc, 1:4) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.40 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 8.23-8.17 (m, 2H), 8.17-8.12 (m, 2H), 8.08-7.99 (m, 4H), 7.75 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.25-7.23 (m, 2H, with CHCl3), 5.28 (s, 2H), 4.13-4.09 (m, 2H), 3.76-3.72 (m, 2H), 3.69-3.63 (m, 4H), 3.61-3.55 (m, 4H), 2.36 (s, 3H).
【００７４】
（７）化合物１０及び化合物１１の合成
【化２０】
2019151603.tif 000021
【００７５】
対応する原料（化合物８、９８ｍｇ、０．２０７ｍｍｏｌ；化合物９、９１ｍｇ、０．１７５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ ２ｍＬに溶かし、アジ化ナトリウム（化合物１０の合成、１６．３ｍｇ、０．２４８ｍｍｏｌ、１．２当量；化合物１１の合成、１３．７ｍｇ、０．２１１ｍｍｏｌ、１．２当量）を加え、６０℃で１７時間撹拌した。水を加えクエンチした。その後、酢酸エチルで希釈し、水で２回、飽和食塩水で１回洗浄を行った。その後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過を行い、溶媒を減圧留去した。精製はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより行った。（収率、化合物１０：９３％、６６ｍｇ；化合物１１：９６％、６６ｍｇ）
化合物１０:Rf 0.56 (Hexane-EtOAc, 2:1) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.41 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.20 (t, J = 8.2 Hz, 2H), 8.17-8.13 (m, 2H), 8.08-7.99 (m, 4H), 5.30 (s, 2H), 3.80-3.76 (m, 2H), 3.75-3.71 (m, 2H), 3.70-3.66 (m, 2H), 3.39 (t, J = 5.1 Hz, 2H).
化合物１１:Rf 0.40 (Hexane-EtOAc, 2:1) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.41 (dd, J = 9.3, 1H), 8.20 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 8.17-8.13 (m, 2H), 8.08-7.99 (m, 4H), 5.30 (s, 2H), 3.79-3.75 (m, 2H), 3.74-3.70 (m, 2H), 3.69-3.61 (m, 6H), 3.32 (t, J = 5.1 Hz, 2H).
【００７６】
（８）化合物１２及び化合物１３の合成
【化２１】
2019151603.tif 000022
【００７７】
対応する種々の原料（化合物１０、５２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ；化合物１１、５５ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、１当量）をＴＨＦ ２ｍＬに溶かし、トリフェニルホスフィン（化合物１２の合成、５０．３ｍｇ、０．１９１ｍｍｏｌ、１．３当量；化合物１３の合成、４１．３ｍｍｏｌ、０．１６ｍｍｏｌ、１．１当量）をそれぞれの原料に対して加え、室温で２５時間撹拌した。水を加え、さらに７．５ｈ室温で反応を行い、５０℃で１５時間撹拌させた。反応終了後、減圧留去を行った。精製はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより行った。（収率、化合物１２：９２％、４４ｍｇ；化合物１３：９４％、４８ｍｇ）
化合物１２:Rf 0.05 (DCM-MeOH, 95:5) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.41 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.20 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 8.17-8.12 (m, 2H), 8.08-7.98 (m, 4H), 5.29 (s, 2H), 3.77-3.73 (m, 2H), 3.70-3.64 (m, 2H), 3.49 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.84 (t, J = 5.2, 2H).
化合物１３:Rf 0.05 (DCM-MeOH, 95:5) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.41 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.20 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 8.17-8.12 (m, 2H), 8.08-7.98 (m, 4H), 5.29 (s, 2H), 3.79-3.74 (m, 2H), 3.74-3.69 (m, 2H), 3.68-3.63 (m, 2H) 3.63-3.58 (m, 2H), 3.46 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.84-2,76 (m, 2H).
【００７８】
（９）化合物１５及び化合物１６の合成
【化２２】
2019151603.tif 000023
【００７９】
対応する種々の原料のアミノ体（化合物１２、３７ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ、１．０当量；化合物１３、４０ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ、１．０当量）をＤＭＦ １ｍＬに溶解させ、ＴＥＡ（化合物１５の合成、７９μＬ、０．５７ｍｍｏｌ；化合物１６の合成、７７μＬ、０．５６ｍｍｏｌ、全て５当量）を加え、ＦＩＴＣ（化合物１５の合成、４９ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ、１．１当量；化合物１６の合成、４８ｍｇ、０．１２２ｍｍｏｌ、１．１当量）を加え、室温で終夜撹拌した。反応終了後メタノールを加えクエンチした。その後、溶媒を減圧留去した。精製はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより行った（収率、化合物１５：６３ｍｇ、７８％；化合物１６：７４％、６２ｍｇ）。
化合物１５:Rf 0.51 (DCM-MeOH, 9:1) 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.4-9.94 (m, 3H), 8.39 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.31-8.21 (m, 5H), 8.18-8.03 (m, 5H), 7.69 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.57 (d, J = 8.8 Hz 2H), 6.55-6.51 (m, 2H), 5.23 (s, 2H), 3.81-3.76 (m, 2H), 3.74-3.62 (m, 6H).
化合物１６:Rf 0.44 (DCM-MeOH, 9:1) 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.1(s, 2H), 10.0 (s, 1H), 8.38 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.32-8.21 (m, 5H), 8.16 (s, 2H), 8.11-8.04 (m, 3H), 7.69 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.57 (d, 8.7 Hz, 2H), 6.53 (dd, J = 8.7 Hz, 2.3 Hz, 2H), 5.20 (s, 2H), 3.75-3.70 (m, 2H), 3.70-3.55 (m, 10H).
【００８０】
なお、比較化合物として以下の化合物１４及び化合物１７を用いた。
【化２３】
2019151603.tif 000024
【００８１】
化合物１４は、以下の通りに合成し、化合物１７（ＦＩＴＣ）は市販品を使用した。原料のアミノ体（２−（２−アミノエトキシ）エタノール、４１ｍｇ、０．３８６ｍｍｏｌ、１．５当量）をＤＭＦ ３ｍＬに溶解させ、ＴＥＡ（１８０μＬ、１．２９ｍｍｏｌ、５当量）を加え、ＦＩＴＣ（１００ｍｇ、０．２５７ｍｍｏｌ、１．０当量）を加え、室温で終夜撹拌した。反応終了後メタノールを加えクエンチした。その後、溶媒を減圧留去した。精製はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより行った（収率、４０％、５１ｍｇ）。
化合物１４:1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.10 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.72 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.64-6.59 (m, 4H), 6.53 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 2H), 3.61-3.57 (m, 2H), 3.54-3.51 (m, 2H), 3.50-3.36 (m, 4H).
【００８２】
（１０）化合物１８及び化合物１９の合成
化合物１８及び化合物１９を以下の合成スキームに従って合成した。
【化２４】
2019151603.tif 000025
【００８３】
１−ピレンメタノール（６３０ｍｇ、２．７１ｍｍｏｌ、１．６当量）を脱水ジクロロメタンに溶かし、炭酸銀（８１３ｍｇ、２．９５ｍｍｏｌ、１．７当量）を加え、その後、ブロモ２，３，４，６−Ｏ−テトラアセチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（７００ｍｇ、１．７０ｍｍｏｌ、１当量）を加え、５日間反応させた。反応終了後、セライトろ過をした後、減圧留去した。精製はシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いた。その後、ＴＨＦ ５ｍＬ、ＡｃＯＨ ０．５ｍＬ、Ｈ2Ｏ ０．５ｍＬの混合溶液に化合物を溶解し終夜撹拌した。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製し目的物を得た（収率３６％、３４７ｍｇ）。
化合物１９：Rf 0.55 (Hexane-EtOAc, 1:1) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.32 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.22 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 8.17-8.01 (m, 5H), 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.64 (d, J = 12.3 Hz), 5.31 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 5.16-5.01 (m, 3H), 4.53 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.33 (dd, J = 12.2, 4.6 Hz, 1H), 4.25 (dd, J = 12.2, 2.5 Hz, 1H), 3.68-3.63 (m,1H), 2.17 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.70 (s, 3H).
【００８４】
化合物１９（３４７ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）をメタノールに溶解し、１Ｍナトリウムメトキシド ０．５ｍＬを加え、室温で１時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去しシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製を行い目的物１８を得た（収率９１％、２２３ｍｇ）。
化合物１８：Rf 0.70 (DCM-MeOH, 4:1) 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.45 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.34-8.16 (m, 7H), 8.08 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 5.57 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 5.30 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 5.11 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 5.00-4.93 (m, 2H), 4.68-4.63 (m, 1H), 4.40 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.81-3.75 (m, 1H), 3.58-3.51 (m, 1H), 3.46-3.39 (m, 1H), 3.21-3.06 (m, 4H).
【００８５】
実施例２：１次元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）における検証
（１）各種溶液の調製
３０％アクリルアミドモノマー溶液の調製：アクリルアミドモノマー ９．９３ｇ、Ｎ−Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド ０．２７ｇ、ミリＱ水を加え、合計３４ｍＬの溶液を調製した。１０％アクリルアミドモノマー溶液の調製：３０％アクリルアミドモノマー ３３ｍＬ、ミリＱ水 １６ｍＬ、０．７５Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ ５０ｍＬ、１０％ＳＤＳ １ｍＬをそれぞれ加え、合計１００ｍＬの溶液を調製した。濃縮ゲル溶液は、３０％アクリルアミドモノマー ７．５ｍＬ、ミリＱ水 ２９ｍＬ、０．２５Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ６．８）３７．５ｍＬ、１０％ＳＤＳ ０．７５ｍＬをそれぞれ加え、合計７５ｍＬの溶液として調製した。
【００８６】
（２）１次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びゲルの染色・撮影方法
１０％アクリルアミドモノマー溶液２０ｍＬに、２５％ＡＰＳ  ６７μＬ、ＴＥＭＥＤ  １６μＬを加え、電気泳動用ガラス板に混合溶液を流し込み、ゲル化させた。３０分後、ミリＱ水  ２ｍＬを加え、ゲル板を洗浄した。次に、濃縮ゲル溶液７．５ｍＬ、２５％ＡＰＳ  ２５μＬ、ＴＥＭＥＤ  ６μＬを加え、濃縮ゲルとして先述のゲル層の上に濃縮ゲルを注ぎ、ゲル化させた。次に、ゲル電気泳動用サンプルとして、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬ、２×ローディングバッファー１００μＬの計２００μＬの混合溶液を調整し、９９℃で５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いるサンプルとした。各レーンに１０μＬ（ＢＳＡ  ５μｇ）ずつ導入し、１５０Ｖ、約１００分の条件でゲル電気泳動を行った。その後、ゲルを電気泳動用ガラス板から取り出し、各レーンを短冊状に切り出し、１０μＭ、約１０ｍＬ（１％ＤＭＳＯ）のピレン誘導体の染色剤水溶液に浸し、１時間振とうさせた。ただし、化合物２においては濃度を２２μＭとした。振とう後、洗浄を行わずに泳動像を撮影した。
【００８７】
（３）１次元ゲル電気泳動像の撮影及び染色能の算出（評価）
ＵＶトランスイルミネーターＭＤ−２５（λex ３１２ｎｍ）を用い、ゲルの下側からＵＶ光を照射し、デジタルカメラを用いてゲル画像を撮影した。得られた泳動像を、ＩｍａｇｅＪ（画像解析ソフトウェア）を用いて、ＢＳＡバンドのシグナル強度を算出した。化合物１〜１９について染色実験を行ったところ、良好な染色能を示す化合物１、２、及び７を見出した（図１）。
【００８８】
（４）ピレン誘導体の染色能と疎水性度（予測Ｌｏｇ値）の関係
本実施例で用いたピレン誘導体の疎水性度と染色能の相関を調べるため、疎水性パラメーターであるＬｏｇ Ｐ値をＣｈｅｍＤｒａｗを用いて予測値として求めた。染色能が良好結果を与えた化合物２、１、及び７については、予測Ｌｏｇ Ｐ値がおよそ３．５〜４．５の範囲にあり、疎水性度と染色能に一定の相関関係があることが示唆された（図２）。
【００８９】
実施例３：２次元電気泳動における検証
（１）泳動サンプル調製
ＣｅｌＬｙｉｃＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で破砕した大腸菌の菌体サンプルを、２Ｄクリーンアップキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて脱塩処理した後に、２Ｄ  Ｑｕａｎｔキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてタンパク質量を定量した。そのうち５０μｇ分を１回の２次元電気泳動に用いた。
【００９０】
（２）２次元電気泳動
１次元目は、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  Ｄｒｙ  Ｓｔｒｉｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて等電点電気泳動を行った後に、２次元目は、ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＺＯＯＭゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて泳動した。
【００９１】
（３）２次元電気泳動ゲルのタンパク質スポットの固定化
泳動後のゲルを５０％メタノール、７％酢酸水溶液に浸し、３０分振とうした。この操作を２回繰り返した。その後、ミリＱ水に浸し、１０分振とうした。
【００９２】
（４）２次元電気泳動ゲルの染色及び撮影
固定化後のゲルを、Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液又は１０μＭピレン誘導体水溶液４０ｍＬに浸し、終夜振とうして染色した。ピレン誘導体には、ピレニルメチルメチルエーテル（化合物２）及び１−ピレンメタノール（化合物１）を使用した。その後、比較対象のＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙについてのみ、洗浄及び脱色のために、１０％メタノール、７％酢酸水溶液に浸し３０分震とうし、その後、ミリＱ水に浸して３０分振とうさせ脱色を行った。上記の通り、染色後、比較対象のＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙについては脱色を行った後に撮影を行い、一方、ピレン誘導体染色剤については洗浄を行わず撮影を行った。撮影は、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ９５００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、励起波長４７３ｎｍ、ＬＰＧ（５７５ｎｍロングパスフィルター）を使用してスキャンした。結果を図２に示す。さらに、Ｉｍａｇｅ  Ｍａｓｔｅｒを用いてスポットの数をカウントすると、対照のＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙによって染色した画像では、スポット数が１，２４７個であるのに対して、ピレニルメチルメチルエーテル（化合物２）を用いた場合には９２２個であり、１−ピレンメタノール（化合物１）を用いた場合には６８３個であった。これらの結果から、本発明のピレン誘導体を用いると、洗浄及び脱色操作なしに２次元電気泳動ゲルを染色できることが見出された。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明のピレン誘導体を用いることにより、電気泳動によるタンパク質の検出において、ゲル染色後の洗浄及び脱色操作を行うことなく、タンパク質のスポットを感度よく検出できることから、より迅速で簡便なタンパク質の検出法を提供することができる。
【００９４】
本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【図１】
2019151603.tif 000032
【図２】
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【図３】
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