(57)【要約】      （修正有）【課題】より簡便で、高い精度で、効率的なウメのクローン識別方法の提供。【解決手段】ＰＣＲ法によりウメのマイクロサテライト領域を増幅するための、ウメのクローン識別方法に用いられる２種以上のプライマーペアからなるプライマーセットであって、特定の塩基配列を有するフォワードプライマー及び前記各フォワードプライマーに順次対応する特定の塩基配列を有するリバースプライマーからなる２０種類のプライマーペアから選ばれるプライマーペアからなる、プライマーセット；ただし上記各プライマーには、該プライマーの塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し該プライマーと同様にプライマーとしての機能を有するその変異体が包含される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
PCR 法によりウメのマイクロサテライト領域を増幅するための、ウメのクローン識別方法に用いられる２種以上のプライマーペアからなるプライマーセットであって、配列番号１〜２０で示される塩基配列を有するフォワードプライマー及び前記各フォワードプライマーに順次対応する配列番号２１〜４０で示される塩基配列を有するリバースプライマーからなる２０種類のプライマーペアから選ばれるプライマーペアからなる、プライマーセット；
ただし上記各プライマーには、該プライマーの塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し該プライマーと同様にプライマーとしての機能を有するその変異体が包含される。
【請求項２】
下記プライマーペアの少なくとも１つを含む、請求項１のプライマーセット：
・配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２３で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS49）、
・配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号３２で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS149）、
・配列番号１６で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号３６で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS187）、
・配列番号９で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２９で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS133）、
・配列番号１で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２１で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS21）、
・配列番号１４で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号３４で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS175）、
・配列番号５で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２５で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS75）、及び
・配列番号４で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２４で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS59）。
【請求項３】
配列番号１〜４０で示される塩基配列を有するプライマーをすべて含む、請求項２のプライマーセット。
【請求項４】
以下の工程を含むウメのクローン識別方法：
請求項１に記載の２０種類のプライマーペアから選ばれる２種以上のプライマーペアからなるプライマーセットを用いて識別の対象である２個体以上のウメの組織より抽出した DNA について PCR 法により増幅し、増幅された各 DNA の塩基長の相違により、前記２個体以上のウメのクローンを識別する。
【請求項５】
プライマーセットが、下記プライマーペアの少なくとも１つを含む、請求項４のウメのクローン識別方法：
・配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２３で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS49）、
・配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号３２で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS149）、
・配列番号１６で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号３６で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS187）、
・配列番号９で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２９で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS133）、
・配列番号１で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２１で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS21）、
・配列番号１４で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号３４で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS175）、
・配列番号５で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２５で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS75）、及び
・配列番号４で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２４で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS59）。
【請求項６】
プライマーセットが、配列番号１〜４０で示される塩基配列を有するプライマーをすべて含む、請求項５のウメのクローン識別方法。
【請求項７】
以下の工程を含むウメのクローン及び品種を特定する方法：
請求項１に記載の２０種類のプライマーペアから選ばれる２種以上のプライマーペアからなるプライマーセットを用いて特定の対象であるウメの組織より抽出した DNA について PCR 法により増幅し、増幅された DNA の塩基長の相違により、ウメのクローンを識別する識別によって得られた２個体以上のウメのクローン名、
前記クローン名に対応する品種名、及び
前記クローン名により示されるクローンのそれぞれについての前記プライマーセットを用いて増幅されたDNAの塩基長、
とを示すデータベースを用いて、前記特定の対象であるウメのクローン及び品種を特定する。
【請求項８】
２個体以上のウメの個体数が５０個体以上である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウメのクローン識別用プライマーセット及びそれを用いるウメのクローン識別方法に関する。より詳細には、PCR 法によりウメのマイクロサテライト領域を増幅するためのプライマーセット、及び該プライマーセットを用いて、ウメの組織より抽出した DNA について PCR 法により増幅し、増幅された DNA の塩基長の相違により、ウメのクローンを識別するウメのクローン識別方法ならびに品種を特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウメ（Prunus mume）は、バラ科サクラ属の落葉高木であり、古来和歌にも詠まれているように日本国民に最も親しまれている花木の一つである。ウメの樹木と花は主に鑑賞用とされ、実は梅干しなどにされて食用とされるほか梅酒の原料にもなる。
【０００３】
ウメの品種識別は、花の形態観察によってなされているほか、DNA分析による方法も行われている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−５７０７３号公報
【特許文献２】特開２００２−３４５６２号公報
【特許文献３】特許第５８９２４８１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】林恭平、「DNAマーカーによるウメの遺伝的多様性解析」、筑波大学大学院  博士学位論文
【非特許文献２】Hayashi, Kyohei, et al. "Genetic diversity in fruiting and flower-ornamental Japanese apricot (Prunus mume) germplasms assessed by SSR markers." Breeding Science 58.4 (2008): 401-410.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のようにウメの品種識別の手法として花の形態観察やDNA分析による方法があるところ、花の形態観察による手法においては品種の識別のために花が必要であるため、識別を行える時期に制限がある。DNA分析による方法は、時期的な制限はないがモモやアンズのDNAマーカーをウメのDNAマーカーに代用しているため、近縁なウメ品種間については識別ができていないと考えられた。
他方において北野天満宮の「御神木」のウメのような由緒正しいウメの木もあることから、本発明者らはウメの後継樹の育成や品種識別の需要が高くなると予想し、ウメのクローン鑑定や品種識別を、より簡便かつ高精度で行う手法が必要になると考え、かかる手法を構築することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題に鑑み、本発明者らは鋭意研究を行い、PCR 法によりウメのマイクロサテライト領域を増幅するための新たなプライマーのうち、適切なプライマーを用いたPCR 法により得られるＤＮＡ増幅断片の長さにウメのクローン間で極めて大きな相違と多型性があることを見出し、さらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、少なくとも以下の発明に関する：
[１]  PCR 法によりウメのマイクロサテライト領域を増幅するための、ウメのクローン識別方法に用いられる２種以上のプライマーペアからなるプライマーセットであって、配列番号１〜２０で示される塩基配列を有するフォワードプライマー及び前記各フォワードプライマーに順次対応する配列番号２１〜４０で示される塩基配列を有するリバースプライマーからなる２０種類のプライマーペアから選ばれるプライマーペアからなる、プライマーセット；
ただし上記各プライマーには、該プライマーの塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し該プライマーと同様にプライマーとしての機能を有するその変異体が包含される。
[２]  選ばれるプライマーセットが、下記プライマーペアの少なくとも１つを含む、[１]のプライマーセット：
・配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２３で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS49）、
・配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号３２で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS149）、
・配列番号１６で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号３６で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS187）、
・配列番号９で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２９で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS133）、
・配列番号１で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２１で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS21）、
・配列番号１４で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号３４で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS175）、
・配列番号５で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２５で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS75）、及び
・配列番号４で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２４で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS59）。
[３]  配列番号１〜４０で示される塩基配列を有するプライマーをすべて含む、 [２]のプライマーセット。
[４]  以下の工程を含むウメのクローン識別方法：
[１]に記載の２０種類のプライマーペアから選ばれる２種以上のプライマーペアからなるプライマーセットを用いて識別の対象である２個体以上のウメの組織より抽出した DNA について PCR 法により増幅し、増幅された各 DNA の塩基長の相違により、前記２個体以上のウメのクローンを識別する。
[５]  プライマーセットが、下記プライマーペアの少なくとも１つを含む、[４]のウメのクローン識別方法：
・配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２３で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS49）、
・配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号３２で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS149）、
・配列番号１６で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号３６で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS187）、
・配列番号９で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２９で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS133）、
・配列番号１で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２１で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS21）、
・配列番号１４で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号３４で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS175）、
・配列番号５で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２５で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS75）、及び
・配列番号４で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２４で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS59）。
[６]  プライマーセットが、配列番号１〜４０で示される塩基配列を有するプライマーをすべて含む、[５]のウメのクローン識別方法。
[７]  以下の工程を含むウメのクローン及び品種を特定する方法：
[１]に記載の２０種類のプライマーペアから選ばれる２種以上のプライマーペアからなるプライマーセットを用いて特定の対象であるウメの組織より抽出した DNA について PCR 法により増幅し、増幅された DNA の塩基長の相違により、ウメのクローンを識別する識別によって得られた２個体以上のウメのクローン名、
前記クローン名に対応する品種名、及び
前記クローン名により示されるクローンのそれぞれについての前記プライマーセットを用いて増幅されたDNAの塩基長、
とを示すデータベースを用いて、前記特定の対象であるウメのクローン及び品種を特定する。
[８]  ２個体以上のウメの個体数が５０個体以上である、[７]の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ウメのゲノム中のマイクロサテライト領域を得るための１組のフォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーの組み合わせ、すなわちプライマーペアが提供され、このプライマーペアの２種以上の組み合わせからなるプライマーセットとして使用して PCR 法によってマイクロサテライト領域を増幅し、そのサイズを特定し遺伝子型を決定することができる。したがって本発明によれば、専門的な形態観察力に頼ることなく、ウメのクローン識別を従来の方法より高い効率及び高い精度で行うことができる。また本発明によれば、品種の識別のように花を観察する必要がないため、季節に限定されることなく１年中ウメの品種識別を行うことができる。
さらに本発明によれば、サンプルとしてウメの生体組織のみならず梅干しやジャムといった加工品も原料としても用いられたウメの品種識別に用いることができるため、製品の品質管理も行うことができる。
【００１０】
なお、植物や動物のゲノム中には、シトシンとアデニン、チミンとグアニンなどの数塩基からなるモチーフの繰り返し配列であるマイクロサテライトと呼ばれる領域が、高頻度で広く分布することが知られている。マイクロサテライトを含む領域を増幅するように設計された PCR マーカーの多くは、多型性が抜きん出て高くしかも共優性であることから、精密な遺伝子解析に適しており、育種学、集団遺伝学などの分野に重用されている。例えば、特許文献１には、イネの DNA を鋳型とし、マイクロサテライトを含むマイクロサテライトマーカーを PCR によって増幅し、増幅されたマイクロサテライトマーカーのサイズによってイネの品種を特定することが記載されている。特許文献２には、ナシ類植物のマイクロサテライト DNA に基づき、ナシ類植物の種や品種の識別、有用形質の選択などに利用することが記載されている。特許文献３にはサクラのクローン識別用プライマーセットおよびそれを用いるクローン識別方法について開示されている。
本発明は、ウメのゲノムに含まれるマイクロサテライト領域を増幅するためのプライマーペアのうち、ＰＣＲによる増幅の効率及び得られる増幅断片の多型性が高い、とくに好適なものを選抜したことに基礎をおくものであり、上記従来技術によって達成することができないウメのクローン識別用プライマーセット及びそれを用いるウメのクローン識別方法を提供するものである。したがって本願発明が奏する効果は、従来技術からは予測不能な格別なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】本発明において用いられるデータベースの例の部分である。なお、図中においてクローン名と品種名は、それぞれ記号で示した。例えば、クローン「AA」は品種が「aa」であることを示し、クローン「AP」は品種が「ap」または「aq」であることを示す。各プライマーペアの列に記載されている３桁の数値は、当該プライマーにより増幅されたDNAの塩基数である。当該プライマーペアによって挟まれたマイクロサテライトはクローンによって繰り返しの回数が異なり、その結果、増幅されるDNAの塩基数も異なる。この増幅されるDNAの塩基数を対立遺伝子とし、各クローンについて塩基数により特定される対立遺伝子の組み合わせを遺伝子型とした。ウメは多くが２倍体であり、２倍体においては各プライマーペアあたり２つの対立遺伝子が得られる。これに対し対立遺伝子が１つしか得られないものは、対立遺伝子がホモであるか、またはPCRによって父系遺伝子又は母系遺伝子の一方が増幅されないヌル遺伝子であるものである。対立遺伝子が１つしか得られない品種の場合、図１Ａにおいて、各プライマーペアの列に記載されている３桁の数値は１種のみである。
【図１Ｂ】図１Ａに示したデータベースの続きである。図１Ａに示したサンプルと同じサンプルについて、図１Ａに示されたプライマーペアとは異なる１０組のプライマーペアにおける各プライマーにより増幅されたDNAの塩基数を示す。
【図２Ａ】本発明において用いられるデータベースの例の他の部分である。
【図２Ｂ】図２Ａに示したデータベースの続きである。図２Ａに示したサンプルと同じサンプルについて、図２Ａに示されたプライマーペアとは異なる１０組のプライマーペアにおける各プライマーにより増幅されたDNAの塩基数を示す。
【図３Ａ】本発明において用いられるデータベースの例のさらに他の部分である。
【図３Ｂ】図３Ａに示したデータベースの続きである。図３Ａに示したサンプルと同じサンプルについて、図３Ａに示されたプライマーペアとは異なる１０組のプライマーペアにおける各プライマーにより増幅されたDNAの塩基数を示す。
【図４】PCR増幅性が高いマーカーの例（PMKS140）、及び増幅性が低いマーカーの例（PMKS73）を示す写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（１）プライマーセット
本発明のプライマーセットは、上記のとおりPCR 法によりウメのマイクロサテライト領域を増幅するための、ウメのクローン識別方法に用いられる２種以上のプライマーペアからなるプライマーセットであって、配列番号１〜２０で示される塩基配列を有するフォワードプライマー及び前記各フォワードプライマーに順次対応する配列番号２１〜４０で示される塩基配列を有するリバースプライマーからなる２０種類のプライマーペアから選ばれるプライマーペアからなるものである。該プライマーセットを構成するプライマー及びその変異体は、市販されている DNA シンセサイザーを用いて容易に合成することができる。本発明においては、これらのプライマー及びその変異体は、いかなる機器あるいは方法によってこのプライマーが合成されたかは問題とならず、その機器・方法等の相違によって本発明の目的とする効果が左右されることはない。
【００１３】
本発明のプライマーセットを特定する方法は限定されないところ、ゲノムDNA配列を用いる方法は簡便で好ましい。ウメのゲノムDNA配列はThe genome of Prunus mume. Zhang Q, et al. Nat Commun 2012により公開されており用いることができる。当該ゲノム情報を用いて、DNAマーカーを任意の種類設計し、これらのDNAマーカーを用いて任意の品種数のウメ品種のDNAを簡易な方法で分析し、品種識別にとくに有効と思われるDNAマーカーを選抜することにより、本発明のプライマーセットは特定される。 
【００１４】
最終的に選抜されたプライマーペアは、増幅の効率がよく、増幅断片長の多型性も高いウメのゲノム中のマイクロサテライト領域を PCR により増幅するためのプライマーペアとなるものが好ましい。
これらのプライマーペアは、下記表１に示すように、本明細書においては、それぞれPMKS21、PMKS15、PMKS49、PMKS59、PMKS75、PMKS68、PMKS113、PMKS99、PMKS133、PMKS131、PMKS164、PMKS149、PMKS179、PMKS175、PMKS193、PMKS187、PMKS197、PMKS201、PMKS121及びPMKS191と呼ぶこともある。
上記各プライマーペアの塩基配列とその配列番号との関係は以下のとおりである：
プライマーペアPMKS21を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１及び２１に、
プライマーペアPMKS15を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号２及び２２に、
プライマーペアPMKS49を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号３及び２３に、
プライマーペア PMKS59を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号４及び２４に、
プライマーペアPMKS75を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号５及び２５に、
プライマーペアPMKS68を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号６及び２６に、
プライマーペアPMKS113を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号７及び２７に、
プライマーペアPMKS99を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号８及び２８に、
プライマーペアPMKS133を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号９及び２９に、
プライマーペアPMKS131を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１０及び４０に、
プライマーペアPMKS164を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１１及び３１に、
プライマーペアPMKS149を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１２及び３２に、
プライマーペアPMKS179を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１３及び３３に、
プライマーペア PMKS175を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１４及び３４に、
プライマーペアPMKS193を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１５及び３５に、
プライマーペアPMKS187を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１６及び３６に、
プライマーペアPMKS197を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１７及び３７に、
プライマーペアPMKS201を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１８及び３８に、
プライマーペアPMKS121を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１９及び３９に、
プライマーペアPMKS191を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号２０及び４０に、
それぞれ示した。
【００１５】
【表１】
2019083780.tif 000002
【００１６】
なお、これらのプライマーは、それぞれのプライマーの配列番号１から４０に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体であってもよい。ここでいうストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、PCR 法による増幅における、２本鎖 DNA の変性後のアニーリングの工程で、アニーリングと同様の条件下で、配列番号１から４０に示す塩基配列に相補的な塩基配列とハイブリダイズすることを指す。このようなアニーリングと同様の条件としては、例えば、通常の PCR 反応用緩衝液中で、dNTP (dATP、dTTP、dGTP、dCTP）及び DNA ポリメラーゼと混合し、混合物を、例えば 43℃から 68℃の温度で反応させる条件が挙げられる。より具体的には、以後に説明する本発明のクローン識別方法において採用される PCR におけるアニーリング条件が挙げられる。
【００１７】
また、同様にプライマーとしての機能を有するとは、PCR による同一個体からのゲノム DNA の増幅において、プライマーとして使用した場合に、変異していない元のプライマーと同様にマイクロサテライト領域を増幅できることを指す。
上記のような変異体の設計は、本技術分野における当業者であれば容易に行うことができる。したがって、当該変異体も当然に本願発明の範囲に包含されるのである。
これらのプライマー及びその変異体は、市販されている DNA シンセサイザーを用いて容易に合成することができる。本発明においては、これらのプライマー及びその変異体は、いかなる機器あるいは方法によってこのプライマーが合成されたかは問題とならず、その機器・方法等の相違によって本発明の目的とする効果が左右されることはない。
【００１８】
本発明のプライマーセットのうち、選ばれるプライマーペアが、下記プライマーペアの少なくとも１つを含むものは好ましい。対立遺伝子数数が多い程多型性が高い、すなわち識別能が高い、ためである。
・配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２３で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS49）、
・配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号３２で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS149）、
・配列番号１６で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号３６で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS187）、
・配列番号９で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２９で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS133）、
・配列番号１で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２１で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS21）、
・配列番号１４で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号３４で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS175）、
・配列番号５で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２５で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS75）、及び
・配列番号４で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２４で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーペア（PMKS59）。
「対立遺伝子数」とは、様々なクローンについて該プライマーペアを用いてPCRによりDNAを増幅した際に、各プライマーペアに表れる対立遺伝子の種類の個数を意味する。
【００１９】
上記好ましいプライマーセットに含まれるべきプライマーペアについて、図１Ａ〜３Ｂに示されるデータベースに示されるクローンについての対立遺伝子数を配列番号とともに表２に示す：
【表２】
2019083780.tif 000003
【００２０】
これらのプライマーペアにおける対立遺伝子数は、非特許文献２に開示されているプライマーペアにおける対立遺伝子数と同じか又はより大きいものである。
本発明のプライマーペアのうち、PMKS59、PMKS75、PMKS175、PMKS21、PMKS133及びPMKS187の少なくとも１つを含むプライマーセットはより好ましく、PMKS59、PMKS75及びPMKS175の少なくとも１つを含むプライマーセットは一層より好ましい。
【００２１】
（２）ウメの品種識別方法
本発明においては、上記２０個（２０種類）のプライマーペアPMKS21、PMKS15、PMKS49、PMKS59、PMKS75、PMKS68、PMKS113、PMKS99、PMKS133、PMKS131、PMKS164、PMKS149、PMKS179、PMKS175、PMKS193、PMKS187、PMKS197、PMKS201、PMKS121及びPMKS191ならびにそれぞれのプライマーの変異体から構成されるプライマーペアから２種以上のプライマーペアを選択し、該選択されたプライマーペアからなるプライマーセットを用いて、識別対象であるそれぞれのウメの組織より抽出した DNA を鋳型として PCR を行い、次いで、この PCR により増幅した DNA について増幅断片長の分析を行うことにより、ウメのクローンの識別を行うことができる。
識別対象であるウメのサンプルは限定されず、いかなる組織又は加工品からのサンプルであってもよい。組織として葉、果実、枝、花等が挙げられるところ、葉は入手しやすく用いられる時期の限定も実質的にないため好適である。加工品としては梅干し、梅酒及びその他の調理品が挙げられる。
さらに、本発明の方法にサンプルとしてウメの植物体由来のものを用いる場合、植物体はとくに限定されず、苗又は成木であってよい。また、かかる対象は、植栽前のものであっても植栽後のものであってもよい。
本発明のプライマーペアはいずれも、PCR においてウメのマイクロサテライト領域を増幅することができ、この結果より、ウメのクローン識別が可能となるのである。
本発明のプライマーペアにより増幅されるマイクロサテライト領域は、より具体的には、上記したプライマーセットの塩基配列を決定する際に用いたマイクロサテライト（SSR）が、グアニンとアデニンまたはシトシンとチミンの２塩基の繰り返し配列であるため、グアニンとアデニンまたはシトシンとチミンの繰り返し配列を含むマイクロサテライト領域である。
【００２２】
ウメの組織からの DNA 抽出は、CTAB 法や SDS 法等の定法、又はこれらの方法を適宜改良した方法により実施することができる。抽出法の相違によって本発明の目的とする効果が左右されることはない。PCR は、こうして得られたDNA を、PCR 反応用緩衝液中で、上記のようにして選択されたプライマーペア、dNTP (dATP、dTTP、dGTP、dCTP）及び DNA ポリメラーゼと混合し、この混合物を適当な温度サイクルで繰返し反応させることにより行えばよい。なお、このときの PCR 条件は、最もクリアな電気泳動パターンが得られるよう、適宜設定すればよい。通常は、DNA 25 〜50 ng、10×PCR 反応用緩衝液 1〜10μl、プライマーをそれぞれ 0.2〜2μM、dNTP 20〜200μM、DNA ポリメラーゼ 0.5〜25 Uを混合した後、全液量が 10〜100μlとなるように希釈したものについて、次に示すような温度サイクルで反応させた場合に、良好な結果を得ることができる。10×PCR 反応用緩衝液、dNTP 及び DNA ポリメラーゼについては市販されているので、これを用いることができる。
【００２３】
PCR における温度条件
ステップ１：94〜96℃  約 9 分    1 サイクル
ステップ２：94〜96℃  約 0.5 分→52〜58℃  約 0.5〜１分→70〜74℃  
約0.5〜1 分  28〜40 サイクル
ステップ３：70〜74℃  約 3〜5 分  1 サイクル
【００２４】
PCR 反応後の増幅した DNA 断片長の解析は、DNA シークエンサーを用いたキャピラリー電気泳動や、ガラス板を用いたポリアクリルアミド電気泳動、マススペクトル法等によって行うことができる。キャピラリー電気泳動の場合には、プライマーの片側を蛍光標識して蛍光検出器で検出すればよく、ガラス板を用いたポリアクリルアミド電気泳動の場合には、エチジウムブロマイドや銀染色等の定法を用いて検出することができる。
上記したように、本発明の上記２０個（２０種類）のプライマーペアPMKS21、PMKS15、PMKS49、PMKS59、PMKS75、PMKS68、PMKS113、PMKS99、PMKS133、PMKS131、PMKS164、PMKS149、PMKS179、PMKS175、PMKS193、PMKS187、PMKS197、PMKS201、PMKS121及びPMKS191ならびにそれぞれのプライマーの変異体から構成されるプライマーペアは、これを用いて PCR を行った場合、マイクロサテライト領域を増幅するが、その増幅される部分は、プライマーペアごとに異なっている。したがって、同一個体の組織より抽出された DNAであっても、プライマーペアが異なれば、PCR により増幅される DNA は異なってくる。一方、異なる個体の組織より抽出された DNA に対しては、同じプライマーペアを用いても、PCR により増幅される DNA は、塩基数の違いが互いに異なる場合が生じる。本発明によるウメのクローン識別方法は、このようなプライマーペアごとの挙動の相違を指標として行われるのである。
【００２５】
本発明によるウメのクローン識別方法には、上記２０個（２０種類）のプライマーペアから選択される２種以上のプライマーペアが用いられるところ、用いられるプライマーペアの種類の数は識別対象であるウメの個体数に応じて改変することができる。例えば、識別対象であるウメの個体数が約５０個体の場合、１０種類〜２０種類のプライマーペアを用いればよく、かかる方法は好ましい。本発明によるウメのクローン識別方法のうち、２種類〜１０種類のプライマーペアを用いるものはより好ましく、２種類〜６種類のプライマーペアを用いるものは一層より好ましい。個体数がより少ない場合には、２種類のプライマーペアを用いるものが好ましい。
【００２６】
用いられるプライマーセットとして、表２において好ましいプライマーセットを構成するものとして列挙されたプライマーペアを含むものは、増幅断片長の多型性が比較的高く、識別能がより高いため好ましい。
また用いられるプライマーペアとして、PMKS59、PMKS75、PMKS175、PMKS21、PMKS133及びPMKS187の少なくとも１つを含む本発明の識別方法はより好ましく、PMKS59、PMKS75及びPMKS175の少なくとも１つを含む本発明の識別方法は一層より好ましい。
【００２７】
また、本発明によるウメのクローン識別方法のうち、上記２０種類のプライマーペアをすべて用いるものは、識別の精度がより高いため好ましい。
さらに、本発明によるウメのクローン識別方法のうち、本発明において特定される遺伝子型におけるＤＮＡ長についての誤差が、０．１％以下であるものは好ましく、０．０５％以下であるものはより好ましく、０．０１％以下であるものは一層より好ましい。
【００２８】
（３）クローンを特定する方法
上記いずれかの本発明によるウメのクローン識別方法を用いて種々のウメについての遺伝子型のデータベースを作成することができる。
また、分類が不明なウメについて、その遺伝子型（PCR 法により増幅されたDNA の塩基長の組み合わせ）を上記データベースのデータと比較することによって、当該ウメの品種を特定することができる。
上記データベースの作成及びウメの品種の特定には、２０個（２０種類）のプライマーペアPMKS21、PMKS15、PMKS49、PMKS59、PMKS75、PMKS68、PMKS113、PMKS99、PMKS133、PMKS131、PMKS164、PMKS149、PMKS179、PMKS175、PMKS193、PMKS187、PMKS197、PMKS201、PMKS121及びPMKS191ならびにそれぞれのプライマーの変異体から構成されるプライマーペアから２種以上のプライマーペアを選択し、該選択されたプライマーペアからなるプライマーセットを用いて、識別対象であるそれぞれのウメの組織より抽出した DNA を鋳型として PCR を行い、次いで、この PCR により増幅した DNA について増幅断片長の分析を行うことにより行うことができる。
より具体的には、調査対象であるウメの葉からDNAを抽出し、抽出されたDNAをDNAマーカーを用いてPCRにより増幅し、増幅されたDNA断片を分析装置にかけて分析し、分析結果を予め構築したデータベースと照合して品種識別することができる。DNAの増幅は、PCRによる自体公知の方法により行うことができる。
【００２９】
上記データベースの作成には、前記２０種類のプライマーペアから選ばれる２種以上のプライマーペアを用いる。かかるデータベースの作成のうち、２種類〜１０種類のプライマーペアを用いるものはより好ましく、２種類〜６種類のプライマーペアを用いるものは一層より好ましい。
用いられるプライマーペアとして、表２において好ましいプライマーペアを構成するものとして列挙されたプライマーペアを含むものは、増幅断片長の多型性が比較的高く、識別能がより高いため好ましい。
また用いられるプライマーペアとして、PMKS59、PMKS75、PMKS175、PMKS21、PMKS133及びPMKS187の少なくとも１つを含む本発明のクローンを特定する方法はより好ましく、PMKS59、PMKS75及びPMKS175の少なくとも１つを含む本発明のクローンを特定する方法は一層より好ましい。
【００３０】
データベースに示されるウメのクローンの数は限定されないところ、かかるクローンの数として、５０クローン以上は好ましく、１００クローン以上はより好ましく、１５０クローン以上は一層より好ましく、２００クローン以上はさらに好ましい。
本発明において用いられるデータベースの例は図１Ａ〜３Ｂに示すとおりである。
本発明において用いられるデータベースの上記例においては、ウメの品種のクローンとして、少なくとも錦光、楊貴妃、酔心梅、パープルクィーン、白玉、旭竜、田子の月、冬至、甲州最小、紀の宝、淋朱梅、幾夜寝覚、台湾、曙及び柳川絞りといった品種のクローンが包含されている。クローンの識別に際しては、図１Ａ〜３Ｂに示されるデータベースの全体又は部分を、識別のために用いられるプライマーペアの種類に応じて用いてよい。
【００３１】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。本発明は以下の実施例によってなんら限定されるものではなく、本発明の属する技術分野における通常の変更を加えて実施することができることはいうまでもない。
【実施例】
【００３２】
＜実施例１＞プライマーセットを得る方法
中国の研究機関によって解読され公開されているウメのゲノムDNA配列（The genome of Prunus mume. Zhang Q, et al. Nat Commun 2012）を用いて、DNAマーカーを１３５ペア設計した。これらのDNAマーカーを用いて１６品種のウメのDNAをガラス板を用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、品種識別にとくに有効と思われるDNAマーカーを選抜した。
さらに選抜された上記DNAマーカーを用いて、和歌山県のウメ204個体、約130品種を高精度なキャピラリーDNAシーケンサーで分析し、本発明の方法に用いられるウメクローンのデータベースを構築した。
【００３３】
より具体的には、以下のようにして本発明のプライマーセットは特定された。
NCBI Genome
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome?Db=genome&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=13911
からウメのゲノム配列を取得し、得られた配列情報をWEBプログラムである「Tandem Repeats Finder」https://tandem.bu.edu/trf/trf.html  で解析し、マイクロサテライト領域を探索した。
探索されたマイクロサテライト領域のうち、GA/CTリピートがおよそ20回以上のものを選択し、これらマイクロサテライト領域を増幅するようなプライマーをプライマー設計支援ソフト「Primer3」を用いてTm=60℃に設定し、探索された各マイクロサテライト領域についてプライマーを設計した。設計されたプライマーの中から部分的にGCあるいはATに偏った配列は避け、GC%（配列中のGCの割合）が40〜60%程度であり、かつTm値（二本鎖DNAの50%が解離して一本鎖DNAになる温度）が60℃前後となる135種類のマーカーを合成し、最適なマーカーを選抜するためのスクリーニングに供試した。
スクリーニングは選抜の効率向上のため、２段階に分けて実施した。すなわち、まずアンズウメや台湾由来のウメなど、遠縁な８品種を用いた１段階目の選抜を実施してPCR増幅性に優れる５０種類を選抜した。次に、近縁なウメ１６品種（南高、白加賀、改良内田、剣先、林州等）を用いた２段階目の選抜を、多型性の高さを基準に行うことによりマーカーを選抜した。
ポリアクリルアミド電気泳動によってDNAをDNA断片長順に分離し、銀染色によって可視化した。例えば図４においてPCR増幅性が高いマーカーがPMKS140であり、増幅性が低いマーカーがPMKS73である。
【００３４】
プライマーペアのスクリーニング
上記１３５セットのプライマーペアのうち、２０セットのプライマーペア(表１を参照)は、PCRでの増幅効率及び／又は増幅断片長の多型性の高さ等の点で、他の１１５セットのプライマーペアより優れていた。
【００３５】
＜実施例２＞ウメのクローン識別
得られた上記２０セットのプライマーペア（マーカー）を用いて、以下のような手順によりウメのクローン識別を行った。
（１）全DNA の抽出
DNeasy plant mini kit（キアゲン社製）を用い、以下のようにして DNA を抽出した。
ウメの葉の２１０個体のサンプルを乳鉢と乳棒を使用して液体窒素中で粉末状にすり潰し、すり潰した粉末を2mlマイクロチューブに移した。これに400μl のBuffer AP１と4μl の100mg/ml RNase A を加え、激しくボルテックスした後、インキュベート（65℃、10 分、途中で2〜3 回転倒混和）した。さらに、130μl のBuffer AP2 を加え、混和し、インキュベート（氷上、5 分）した後、遠心（14,500rpm (20,000×g)、5 分、室温）し、上清をQIAsherdder Mini スピンカラムに移した。これをさらに遠心(14,500rpm (20,000×g)、2 分、室温)し、上清をカラムに通し、通過したろ液画分を新しい2ml マイクロチューブに移した。これに1.5 倍容量のBuffer AP3/E を加え、ピペットで混和し、混和液650μl をDNeasy Mini スピンカラムに移し、遠心（8,000rpm (6,000×g)、1 分、室温）し、ろ液を捨て、DNeasy Mini スピンカラムを新しい2ml マイクロチューブに移し、500μl のBuffer AW を加えた。これをさらに遠心（8,000rpm (6,000×g)、1 分、室温）し、ろ液を捨て、DNeasy Mini スピンカラムに500μl のBuffer AW を加えた後、さらに遠心（14,500rpm (20,000×g)、2 分、室温）し、フィルタを乾燥させた。DNeasy Mini スピンカラムを新しい1.5ml のマイクロチューブに移し、100μl のBuffer AE を加え、インキュベート（室温、5 分）し、遠心（8,000rpm (6,000×g)、1 分、室温）した。得られた濾液を以後の操作に供した。
【００３６】
（２）クローンの識別
上記抽出した DNA を用い、実施例１に記載の方法で PCR を行った。プライマーペアPMKS21、PMKS15、PMKS49、PMKS59、PMKS75、PMKS68、PMKS113、PMKS99、PMKS133、PMKS131、PMKS164、PMKS149、PMKS179、PMKS175、PMKS193、PMKS187、PMKS197、PMKS201、PMKS121及びPMKS191を用いた PCR 産物を実施例１と同様に、ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (アプライドバイオシステムズ(株)製) を用いて増幅断片長を求めた。その結果、２１０サンプルのすべてについて、上記２０セットのプライマーペアからそれぞれ遺伝子型を得ることが可能であった。とくに、PMKS59、PMKS75、PMKS175、PMKS21、PMKS133、PMKS187、PMKS149及びPMKS49における増幅断片長の多型性が高く、これら８セットのプライマーペアのうち少なくとも１ペアを用いると識別の効率が一層高かった。
また、各サンプルについてのクローン及び品種と対応する各増幅断片長とのデータにより、当該２１０種のクローンについてのデータベースが構築された（図１Ａ〜３Ｂ）。  
【００３７】
同データベースを用いることによって、同一クローンであるとされていた品種についてのクローン識別も可能であった。例えば、品種名coは品種名ceおよびcpと同様に、従来技術（非特許文献１に開示されている技術。以下において同様）においてはいずれもBSとされていた。これに対し、品種名coが実際には品種名ceおよびcpとは異なるクローンであることが、本発明のプライマーセットであるPMKS21を用いることによって明らかになった。品種名coが上記他の品種と異なるクローンであることを示すプライマーセットについてのデータを表３に示す。
なお、品種名ce、品種名cp及び品種名coの外観の相違として、品種名cpにおいては果皮が赤紫色になることが挙げられる。しかしながらこれら３品種間において、果実品質についての実質的な差異はない。
【表３】
2019083780.tif 000004
【００３８】
品種名ce及びcpとcoとの関係は「枝変わり」に相当する。「枝変わり」とは、植物の複数の品種において、外観や果実の質といった性質が異なるが、DNA分析による同定結果は同じになり遺伝子的な区別が一般的には困難な場合の当該複数複数の品種間の関係をいう。
本発明の方法によれば、枝変わりであるce及びcpとcoとの識別も可能であった。
【００３９】
また品種名dc及び品種名dgのサンプルについては、クローンはいずれも従来技術においてはいずれもDCとされていた。これらが実際には異なるクローンであることが、本発明のプライマーペアであるPMKS113又はPMKS193を用いることによって、明らかになった。品種名dc及び品種名dgのサンプルが、相互に異なるクローンであることを示すプライマーペアについてのデータを表４に示す。
なお、品種名dcと品種名dgの生体間における外観の相違として、花に関する形質（色、大きさなど）が相互にやや異なることが挙げられる。すなわち、花の色および大きさは、品種名dcにおいては赤ピンク及び小であり、dgにおいては赤及び中である。このような差異は、専門家でなければ特定できない程度の極めて小さいものである。
【表４】
2019083780.tif 000005
【００４０】
品種名dcと品種名dgとの関係も「枝変わり」に相当する。本発明の方法によれば、当該枝変わりである品種名dcと品種名dgとの識別も可能であった。
上記のとおり本発明によれば、ウメのクローン識別を、従来の遺伝子解析手法においては識別が困難であった品種又はクローンについても、高精度かつ高い効率で、行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明により提供される、マイクロサテライト領域を増幅するためのプライマーペアを複数使用して PCR 法によって、ウメのゲノム DNA を増幅し、増幅されるマイクロサテライト DNA のサイズを調べることで、ウメのクローン識別及び種の品種の同定を精度高く、かつ高い効率で行うことができる。葉等の新鮮な組織に限定されず、伐採後、長時間経過した丸太や、合板等の加工品ですらクローン識別することができる。また、成長や材質などの形質パラメーターと遺伝的な特性とを比較検討することにより、集団における遺伝的特性と形質との関連についての知見を得ることが期待される。育種の効率化が期待される。
【図１Ａ】
2019083780.tif 000006
【図１Ｂ】
2019083780.tif 000007
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【配列表】
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