(57)【要約】      （修正有）【課題】極めて少量の外因性生体材料を含む、特に癌の治療のためのワクチンを、効率的に送達することにより、免疫誘導能を改善する方法の提供。【解決手段】i）酵母細胞壁粒子、（ii）ケイ酸塩、および（iii）該酵母細胞壁粒子内に搭載された外因性生体材料を含んでなる、ワクチンを送達するための組成物であって、前記酵母細胞壁粒子がケイ酸塩でキャップすることにより修飾されている、組成物。１以上のアジュバントが酵母細胞壁粒子内に搭載されていることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）粒子と、（ｉｉ）前記粒子内に搭載された、タンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、またはそれらの組合せを含んでなる外因性生体材料とを含んでなる、ワクチンを送達するための組成物。
【請求項２】
前記ワクチンが、対象に投与した際に免疫応答を誘導する抗原を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗原がタンパク質、ペプチド、エピトープ、核酸、および免疫原性フラグメントもしくはそのサブユニットからなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ワクチンが生ワクチン、死菌ワクチン、または弱毒ワクチンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記粒子が酵母細胞壁粒子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記生体材料搭載粒子が投与前に単離された樹状細胞とともにさらにインキュベートされる、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記樹状細胞がインキュベーション前８日以内単離されていた未熟細胞である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
１以上のアジュバント、賦形剤、および保存剤をさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の組成物を投与することを含んでなる、対象にワクチンを効率的に送達するための方法。
【請求項１０】
請求項１の組成物が、樹状細胞との前インキュベーションなく対象の真皮に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ワクチン搭載粒子を含有するインキュベートされた樹状細胞を生産するための方法であって、
（ｉ）生体材料を粒子に搭載して生体材料搭載粒子を作製すること；
（ｉｉ）前記生体材料搭載粒子を凍結乾燥させること；および
（ｉｉｉ）前記生体材料搭載粒子を樹状細胞とともにインキュベートすること
を含んでなり、
前記生体材料はタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、またはそれらの組合せを含んでなり；かつ
前記生体材料搭載粒子を樹状細胞とともにインキュベートすることにより、樹状細胞に生体材料搭載粒子を貪食させる、方法。
【請求項１２】
（ａ）前記生体材料搭載粒子を溶液に再懸濁させること、および（ｂ）前記再懸溶液を工程（ｉｉｉ）の前に凍結乾燥させることをさらに含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉｉｉ）が（ａ）前記生体材料搭載粒子と樹状細胞を約１：１〜約１００：１の比で接触させること、（ｂ）前記生体材料搭載粒子を樹状細胞とともにインキュベートすること；および（ｃ）前記搭載粒子を含有する樹状細胞を回収し、前記細胞を洗浄することを含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体材料搭載粒子が１時間未満、樹状細胞とともにインキュベートされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１の組成物を対象に投与することを含んでなる、感染性疾患を治療するための方法。
【請求項１６】
請求項６の組成物を対象に投与することを含んでなる、癌を治療するための方法。
【請求項１７】
前記癌が乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、髄芽細胞腫、神経芽腫、ビルムス腫瘍、横紋筋肉腫、骨肉腫、肝臓癌、膵臓癌、黒色腫、前立腺癌および眼の黒色腫からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
酵母細胞壁粒子とケイ酸塩とを含んでなる組成物であって、前記酵母細胞壁粒子がケイ酸塩でキャップすることにより修飾されている、組成物。
【請求項１９】
酵母細胞壁粒子内に搭載された外因性生体材料をさらに含んでなる、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
１以上のアジュバントをさらに含んでなる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記１以上のアジュバントが酵母細胞壁粒子内に搭載されている、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記アジュバントがモノホスホリル脂質ＡまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ケイ酸塩がオルトケイ酸塩の４つの酸素化合物のそれぞれと結合している有機部分を含んでなる、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ケイ酸塩がオルトケイ酸テトラエチル、オルトケイ酸テトラメチル、オルトケイ酸テトラプロピル、またはオルトケイ酸テトラブチルである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２５】
前記生体材料が特定のタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２６】
賦形剤または保存剤をさらに含んでなる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２７】
酵母細胞壁粒子とケイ酸塩とを含んでなる組成物を作製するための方法であって、酵母細胞壁粒子がケイ酸塩でキャップされるように、酵母細胞壁粒子とケイ酸塩をアンモニアの存在下で接触させることを含んでなる、方法。
【請求項２８】
前記ケイ酸塩が、オルトケイ酸塩の４つの酸素化合物のそれぞれと結合している有機部分を含んでなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ケイ酸塩がオルトケイ酸テトラエチル、オルトケイ酸テトラメチル、オルトケイ酸テトラプロピル、またはオルトケイ酸テトラブチルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１９に記載の組成物を投与することを含んでなる、対象に生体材料を効率的に送達するための方法。
【請求項３１】
前記組成物が対象の真皮に直接投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
生体材料が搭載されかつケイ酸塩でキャップされた酵母細胞壁粒子を含有する細胞混合物を生産するための方法であって、
（ｉ）生体材料を酵母細胞壁粒子に搭載して搭載粒子を作製すること；
（ｉｉ）前記搭載粒子をケイ酸塩でキャップすること；
（ｉｉｉ）前記キャップされた搭載粒子を凍結乾燥させること；および
（ｉｖ）前記キャップされた搭載粒子を単球起源の細胞とともにインキュベートすること
を含んでなり、前記インキュベーションにより前記単球起源の細胞に前記キャップされた搭載粒子を貪食させる、方法。
【請求項３３】
前記単球起源の細胞が前駆樹状細胞、樹状細胞、または部分的に分化した樹状細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記生体材料が特定のタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
工程（ｉ）が
（ａ）酵母細胞壁粒子および生体材料を希釈剤に懸濁させ、前記生体材料を前記酵母細胞壁粒子に吸収させる期間インキュベートすること；および
（ｂ）前記生体材料を前記酵母細胞壁粒子内に搭載するために前記懸濁液を凍結乾燥させること
を含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ａ）および（ｂ）が少なくとも１回繰り返される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記生体材料が特定のタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記ケイ酸がオルトケイ酸テトラエチル、オルトケイ酸テトラメチル、オルトケイ酸テトラプロピル、またはオルトケイ酸テトラブチルである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記生体材料が腫瘍溶解物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４０】
請求項３９に記載の組成物を対象に投与することを含んでなる、癌を治療するための方法。
【請求項４１】
前記生体材料が腫瘍溶解物である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項４２】
前記生体材料搭載酵母細胞壁粒子が投与前に樹状細胞とともにさらにインキュベートされる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項４３】
請求項４１の組成物を対象に投与することを含んでなる、癌の治療方法。
【請求項４４】
請求項４２の組成物を対象に投与することを含んでなる、癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、酵母細胞壁粒子を含んでなる組成物およびワクチンを送達するための方法に関する。本明細書に開示される組成物および方法は、予防用および治療用ワクチンを作製する上で特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、対象に投与した際に特定の疾患に対して免疫学的に媒介される耐性を誘導する生体材料である。ワクチンは、感染性疾患および非感染性疾患との戦いにおいて過去２００年間広く使用されてきた。
【０００３】
ワクチンは、対象の体液性および／または細胞媒介性免疫応答を誘導し得る抗原である免疫原を含んでなる。マクロファージおよび単核食細胞系の他の細胞を含む抗原提示細胞は、抗原粒子を能動的に貪食し、免疫応答に中枢的役割を果たす。マクロファージは、単球由来の組織内の細胞である。これらの単球／マクロファージは微生物を貪食し、それらはその後リソソーム／ファゴソーム内で消化されてより小さな抗原部分となる。結果として得られる抗原は体液性および細胞性の免疫系に提示するために表面に送り戻される。従って、単球／マクロファージは、病原体に対する宿主の非特異的防御と特異的防御の両方で重要な役割を果たすので、特に注目される。
【０００４】
また、樹状細胞も、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子を発現する抗原提示細胞である。通常の樹状細胞に加え、真皮樹状細胞は皮膚免疫系の重要なメンバーである。これは真皮樹状細胞が多量のＭＨＣクラスＩＩ分子を保持し、従って極めて有力な抗原提示細胞として働き得るからである。
【０００５】
理想的なワクチンは、実際に感染を確立することや、ＭＨＣクラスＩ経路の抑制を引き起こすこともなく、病原体構造の迅速な取り込みおよび移行を模倣する。
【０００６】
最近、多くの研究が、生体材料の治療効果を改善するために単球起源の細胞に対する生体材料の標的化送達に焦点を当てている。ミクロスフェア／微粒子、リポソーム、ナノ粒子、デンドリマー、ニオソーム、およびカーボンナノチューブを含む多くのビヒクルがこの目的で使用され得ることが報告されている。この新たな送達アプローチで持続的送達、長期作用、用量および有害副作用の低減、ならびに患者コンプライアンスの向上を達成することが望ましい。Jain et al., Expert Opin. Drug Deliv. 10(3): 353-367 (2013)。
【０００７】
酵母細胞壁粒子は、天然源である酵母由来のグルカンシェルにより形成された中空多孔性のミクロスフェア構造のために好ましい送達ビヒクルの１つとなっている。Soto et al., Journal of Drug Delivery 2012 (2011)。酵母細胞壁粒子は、核酸、タンパク質、およびイメージングリポーターなどの種々の物質の送達の細に使用された。例えば、Bioconjug. Chem. 19(4): 840-848 (2008);およびFigueiredo et al., Chemical Communications 47: 10635-10637 (2011)参照。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Jain et al., Expert Opin. Drug Deliv. 10(3): 353-367 (2013)
【非特許文献２】Soto et al., Journal of Drug Delivery 2012 (2011)
【非特許文献３】Bioconjug. Chem. 19(4): 840-848 (2008)
【非特許文献４】Figueiredo et al., Chemical Communications 47: 10635-10637 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
当技術分野ではなお、極めて少量の外因性材料だけで、ＭＨＣ提示のために外因性のタンパク質、エピトープ、抗原、ペプチド、および／または核酸を含んでなるワクチンを効率的に送達することにより免疫誘導を改善することが求められている。加えて、当技術分野では、送達効率を向上させるために生体材料送達用の酵母細胞壁粒子を提供すること、および生体材料の量を低減して単球起源の細胞を標的とする同レベルまたは高レベルの有効性を達成することが求められている。本発明はこれらの要求を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
一態様において、本発明は、（ｉ）粒子と、（ｉｉ）前記粒子内に搭載された、タンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、またはそれらの組合せなどの外因性生体材料とを含んでなる、ワクチンを送達するための組成物に関する。特定の実施形態では、前記ワクチンは、対象に投与した際に免疫応答を誘導する抗原を含んでなる。好ましくは、前記抗原またはそのフラグメントは、最終的にクラスＩ  ＭＨＣ分子またはクラスＩＩ  ＭＨＣ分子上に提示される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、前記タンパク質もしくはそのフラグメント、または核酸は、タンパク質、ペプチド、エピトープ、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、および免疫原性フラグメントもしくはそのサブユニットからなる群から選択される。他の実施形態では、前記ワクチンは、生ワクチン、死菌ワクチン、または弱毒ワクチンである。さらに他の実施形態では、前記ワクチンは、組換えワクチンである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、前記粒子は、消化可能なまたは生分解性粒子である。本発明に好適な粒子は、中空内部または多孔性構造を有する合成品または天然源由来のものである。例示的粒子としては、酵母細胞壁粒子が含まれる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、搭載粒子は、投与前に約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、または約１時間、単離された樹状細胞とともにインキュベートされる。好ましくは、樹状細胞は、８日以内単離されていた未熟細胞である。他の実施形態では、搭載粒子は、樹状細胞集団との前インキュベーションなく投与される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、１以上のアジュバント、賦形剤、および／または保存剤をさらに含んでなる。特定のワクチンに好適なアジュバント、賦形剤および／または保存剤を選択することは当業者の範囲内にある。
【００１５】
好ましい実施形態では、少量の１以上の免疫応答増強アジュバントが組成物に添加される。１以上のアジュバントの添加により、ワクチンの免疫原性効果が増強される。慣用のアジュバントとしては、限定されるものではないが、タンパク質、ペプチド、核酸および炭水化物が含まれる。例示的アジュバントとしては、限定されるものではないが、モノホスホリル脂質Ａ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド(ologonucleotides)（ＣｐＧ  ＤＮＡなど）、ポリＩ：Ｃ、ポリＩＣＬＣ、極力なＭＨＣ  ＩＩエピトープペプチド、βグルカン、および樹状細胞刺激サイトカイン、例えばＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ、ならびにＤＣ成熟サイトカイン、例えばＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦが含まれる。好適なアジュバントは、ＤＣを成熟させること、および樹状細胞を活性化しさらにＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞などのＴ細胞のよりロバストな生成を刺激するために、樹状細胞上の受容体と相互作用することが知られている分子である。
【００１６】
一実施形態では、１以上の免疫応答増強アジュバントの量は、少なくとも約１０ｎｇ、少なくとも約５０ｎｇ、少なくとも約１００ｎｇ、少なくとも約２００ｎｇ、少なくとも約３００ｎｇ、少なくとも約４００ｎｇ、少なくとも約５００ｎｇ、少なくとも約６００ｎｇ、少なくとも約７００ｎｇ、少なくとも約８００ｎｇ、少なくとも約９００ｎｇ、少なくとも約１μｇ、少なくとも約５μｇ、少なくとも約１０μｇ、少なくとも約１５μｇ、少なくとも約２０μｇ、少なくとも約２５μｇ、少なくとも約３０μｇ、少なくとも約３５μｇ、少なくとも約４０μｇ、少なくとも約４５μｇ、少なくとも約５０μｇ、少なくとも約６０μｇ、少なくとも約７０μｇ、少なくとも約８０μｇ、少なくとも約８０μｇ、少なくとも約９０μｇ、または少なくとも約１００μｇである。一実施形態では、アジュバントの量は、組成物の１〜１０％の間に相当する。このアジュバントの量は、樹状細胞上のＴｏｌｌ様受容体などの受容体を刺激するのに十分なものである。
【００１７】
関連の態様では、本発明は、対象の真皮に、上記で開示されるように、（ｉ）粒子と（ｉｉ）粒子内に搭載された外因性のタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、またはそれらの組合せとを含んでなる組成物を直接投与することを含んでなる、対象に対するワクチンの効率的送達のための方法に関する。前記真皮樹状細胞は搭載粒子を貪食し、それによりワクチンに対する免疫応答を誘発する。
【００１８】
さらに別の関連の態様では、本発明は、生体材料搭載粒子を含有するインキュベートされた樹状細胞を生産するための方法であって、（ｉ）生体材料を粒子に搭載して搭載粒子を作製すること；（ｉｉ）前記生体材料搭載粒子を凍結乾燥させること；および（ｉｉｉ）生体材料搭載粒子を樹状細胞とともにインキュベートすることを含んでなり、前記生体材料は、タンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、またはそれらの組合せを含んでなり、搭載粒子を樹状細胞とともにインキュベートすることにより樹状細胞に搭載粒子を貪食させる方法に関する。
【００１９】
特定の実施形態では、以上の方法は、（ａ）前記生体材料搭載粒子を溶液に再懸濁させること、および（ｂ）前記再懸溶液を工程（ｉｉｉ）の前に凍結乾燥させることをさらに含んでなる。生体材料は、タンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、またはそれらの組合せを含んでなる。
【００２０】
特定の実施形態では、工程（ｉｉｉ）は、（ａ）生体材料を酵母細胞壁粒子に加えること、（ｂ）前記酵母細胞壁粒子をインキュベートすること；（ｃ）前記酵母細胞壁粒子を凍結乾燥させること；および（ｄ）前記酵母細胞壁を洗浄することを含んでなり、前記生体材料がタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、またはそれらの組合せを含んでなり、工程（ｂ）〜（ｃ）が少なくとも１回繰り返され、工程（ｂ）の前に酵母細胞壁粒子に水を加える工程が繰り返される。
【００２１】
特定の実施形態では、工程（ｉｉｉ）は、（ａ）ワクチン搭載粒子と樹状細胞を約１：１、約１０：１、約２０：１、約３０：１、約４０：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、および約１００：１を含む約１：１〜約１００：１の比で接触させること；（ｂ）ワクチン搭載粒子を樹状細胞とともに１〜２時間インキュベートすること、および（ｃ）樹状細胞を回収し、前記細胞を洗浄することを含んでなる。
【００２２】
さらに、本発明は、上記で開示されるように、（ｉ）粒子と、（ｉｉ）前記粒子内に搭載された、タンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、またはそれらの組合せを含んでなる外因性生体材料とを含んでなる組成物を投与することを含んでなる、感染性疾患および非感染性疾患を予防および治療するための方法に関する。
【００２３】
特定の実施形態では、前記感染性疾患としては、限定されるものではないが、現状でワクチンにより刺激される防御免疫応答に感受性のあるウイルス媒介疾患、細菌媒介疾患、もしくは寄生虫疾患、または本発明で改善され得る現行のワクチン技術でわずかしか感受性のないものが含まれる。他の実施形態では、非感染性疾患としては、限定されるものではないが、既知および未知の免疫原性腫瘍関連抗原に対して同様の防御免疫応答を生じることによる癌が含まれる。
【００２４】
別の態様では、本発明は、酵母細胞壁粒子とケイ酸塩とを含んでなり、前記酵母細胞壁粒子がケイ酸塩で「キャップする」ことにより修飾されている組成物に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、酵母細胞壁粒子内に搭載された外因性生体材料をさらに含んでなる。他の実施形態では、本発明により包含される組成物は、生体材料が搭載された酵母細胞壁粒子と、場合により１以上のアジュバントとを含んでなる。好ましくは、１以上のアジュバントは、酵母細胞壁粒子内に搭載される。従って、好適な賦形剤および／または保存剤が本発明の組成物中に含まれ得る。好適なアジュバント、賦形剤および／または保存剤を選択することは当業者の範囲内にある。好ましくは、ケイ酸塩は、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）、オルトケイ酸テトラメチル、オルトケイ酸テトラプロピル、またはオルトケイ酸テトラブチルなどのオルトケイ酸塩の４つの酸素化合物のそれぞれと結合している任意の有機部分である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、生体材料としては、限定されるものではないが、特定のタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、またはそれらの組合せが含まれる。タンパク質もしくはそのフラグメント、または核酸は、タンパク質、ペプチド、エピトープ、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、および免疫原性フラグメントもしくはそのサブユニットからなる群から選択される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、少量の１以上の免疫応答増強アジュバントを酵母細胞壁粒子内に搭載することができるか、または搭載ＹＣＷＰを用いて投与することができる。ＹＣＷＰの内部への１以上のアジュバントの添加は、組成物の免疫原性効果を増強する。慣用アジュバントとしては、限定されるものではないが、小分子化合物、タンパク質、ペプチド、核酸および炭水化物が含まれる。好適なアジュバントは、樹状細胞を成熟させること、および樹状細胞を活性化しさらにＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞などのＴ細胞のよりロバストな生成を刺激するために、樹状細胞上の受容体と相互作用することが知られている分子である。例示的アジュバントとしては、限定されるものではないが、モノホスホリル  脂質Ａ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ  ＤＮＡなど）、ポリＩ：Ｃ、ポリＩＣＬＣ、有力なＭＨＣ  ＩＩエピトープペプチド、βグルカン、および樹状細胞刺激サイトカイン、例えばＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＦＮ−γ、イミキモド、ならびにＤＣ成熟サイトカイン、例えばＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦが含まれる。
【００２７】
一実施形態では、１以上の免疫応答増強アジュバントの量は、少なくとも約１０ｎｇ、少なくとも約５０ｎｇ、少なくとも約１００ｎｇ、少なくとも約２００ｎｇ、少なくとも約３００ｎｇ、少なくとも約４００ｎｇ、少なくとも約５００ｎｇ、少なくとも約６００ｎｇ、少なくとも約７００ｎｇ、少なくとも約８００ｎｇ、少なくとも約９００ｎｇ、少なくとも約１μｇ、少なくとも約５μｇ、少なくとも約１０μｇ、少なくとも約１５μｇ、少なくとも約２０μｇ、少なくとも約２５μｇ、少なくとも約３０μｇ、少なくとも約３５μｇ、少なくとも約４０μｇ、少なくとも約４５μｇ、少なくとも約５０μｇ、少なくとも約６０μｇ、少なくとも約７０μｇ、少なくとも約８０μｇ、少なくとも約８０μｇ、少なくとも約９０μｇ、または少なくとも約１００μｇである。一実施形態では、アジュバントの量は、組成物の１〜１０％（ｗ／ｗ）の間に相当する。このアジュバントの量は、樹状細胞上のＴｏｌｌ様受容体などの受容体を刺激するのに十分なものである。
【００２８】
関連の態様では、本発明は、酵母細胞壁粒子とケイ酸とを含んでなる組成物を作製するための方法に関する。この方法は、酵母細胞壁粒子がケイ酸塩でキャップされるように、酵母細胞壁粒子とケイ酸塩をアンモニアの存在下で接触させることを含んでなる。好ましくは、ケイ酸塩は、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）、オルトケイ酸テトラメチル、オルトケイ酸テトラプロピル、またはオルトケイ酸テトラｔブチルである。
【００２９】
別の関連の態様では、本発明は、（ｉ）ケイ酸塩でキャップされた酵母細胞壁粒子と、（ｉｉ）前記粒子内に搭載された生体材料を含んでなる組成物を対象に投与することを含んでなる、対象に生体材料を効率的に送達するための方法に関する。好ましくは、組成物は、真皮樹状細胞が搭載粒子を貪食し、それにより、生体材料に対する免疫応答を誘発するように、対象の真皮へ直接投与される。単球起源の細胞は、生体材料が搭載されかつケイ酸塩でキャップされた酵母細胞壁粒子を含んでなる組成物を貪食し、それにより、適切な抗原提示のために成熟樹状細胞へと分化を促進する。
【００３０】
さらに別の関連の態様では、本発明は、生体材料が搭載されかつケイ酸塩でキャップされた酵母細胞壁粒子を含有する細胞混合物を作製するための方法であって、（ｉ）生体材料を酵母細胞壁粒子に搭載して搭載粒子を作製すること；（ｉｉ）前記搭載粒子をケイ酸塩でキャップすること；（ｉｉｉ）前記キャップされた搭載粒子を凍結乾燥させること；および（ｉｖ）前記キャップされた搭載粒子を、前駆樹状細胞、樹状細胞または部分的に分化した樹状細胞などの単球起源の細胞とともにインキュベートすることを含んでなり、前記インキュベーションが前記単球起源の細胞に前記キャップされた搭載粒子を貪食させる方法に関する。いくつかの実施形態では、前記単球起源の細胞は樹状細胞であり、前記生体材料としては、限定されるものではないが、特定のタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、またはそれらの組合せが含まれる。
【００３１】
特定の実施形態では、キャップされた搭載酵母細胞壁粒子を含有する樹状細胞を生産するための上記方法の搭載工程は、（ａ）酵母細胞壁粒子と生体材料を希釈剤に懸濁させ、前記生体材料を前記酵母細胞壁粒子に吸収させる約２時間などの期間インキュベートすること、および（ｂ）前記生体材料を酵母細胞壁粒子内に搭載するために前記懸濁液を凍結乾燥させることを含んでなる。必要に応じて、搭載効率を高めるために工程（ａ）および（ｂ）は少なくとも１回繰り返される。
【００３２】
特定の実施形態では、キャップされた搭載酵母細胞壁粒子を含有する単離された樹状細胞を生産するための上記方法のインキュベート工程は、（ａ）前記のキャップされた搭載粒子と樹状細胞を、約１：１、約１０：１、約２０：１、約３０：１、約４０：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、および約１００：１を含む約１：１〜約１００：１の比で接触させること、（ｂ）前記のキャップされた搭載粒子を前記樹状細胞と１〜２時間インキュベートすること、および（ｃ）前記樹状細胞を回収し、前記細胞を洗浄することをさらに含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、樹状細胞を生産するための方法を示す。
【図２】図２は、腫瘍溶解物を作製するための方法を示す。
【図３】図３は、酵母細胞壁粒子を作製するための方法を示す。
【図４】図４は、生体材料を酵母細胞壁粒子に搭載するための方法を示す。
【図５】図５は、ワクチン粒子搭載樹状細胞を生産するための方法を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、１００万Ｂ１６腫瘍細胞のＩＶ接種２１日後のワクチン接種マウスの肺（黒い点は黒色腫転移である）を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、１００万Ｂ１６腫瘍細胞のＩＶ接種２１日後のワクチン接種マウスの肺を示し、これらのマウスは腫瘍刺激３日前に単に混合した腫瘍溶解物と酵母細胞壁粒子を接種された。
【図６Ｃ】図６Ｃは、１００万Ｂ１６腫瘍細胞のＩＶ接種２１日後のワクチン接種マウスの肺を示し、これらのマウスは、腫瘍刺激３日前に腫瘍溶解物を搭載した酵母細胞壁粒子を接種された。
【図７】図７は、ケイ酸でキャップされた酵母細胞壁粒子の構造を示す。ケイ素は濃いグレーで示され、薄いグレーは炭素を表す。Ａは、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）の構造を示す。Ｂは、それらのＯＨ基間にＨ結合を形成している反応混合物（オルトケイ酸エチル）においてアンモニアにより開始されるＴＥＯＳの部分的加水分解産物を示す。Ｃは、Ｈ結合したオルトケイ酸エチル分子からの水の消失により生じるシラノール縮合産物を示す。この反応は、ポリマーケイ酸塩が形成している間継続する。Ｄの構造群は、ポリマーケイ酸塩構造間の類似のＨ結合およびポリマーケイ酸塩構造間のβ−グルカン結合の第一ヒドロキシル基および酵母細胞壁粒子のβ−グルカン構造の第一ヒドロキシル基を示す。Ｅは、このシラノール縮合から生じ、搭載酵母細胞壁粒子のキャッピングを生じるポリマーケイ酸と酵母細胞壁粒子の間で得られる共有結合形成を示す。
【図８】図８は、マウスの各群：Ｂ１６黒色腫腫瘍細胞のみのＩＶ注射を受けた「対照」群；Ｂ１６黒色腫腫瘍細胞のＩＶ注射とＢ１６腫瘍溶解物を搭載した非キャップＹＣＷＰの真皮内注射を受けた「標準ＹＣＷＰ」群；Ｂ１６黒色腫腫瘍細胞のＩＶ注射とＢ１６腫瘍溶解物を搭載したケイ酸塩キャップＹＣＷＰの真皮内注射を受けた「ＳｉキャップＹＣＷＰ」群；Ｂ１６黒色腫腫瘍細胞のＩＶ注射と、Ｂ１６腫瘍溶解物とＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびモノホスホリル脂質Ａを含むアジュバントとを搭載した非キャップＹＣＷＰの真皮内注射を受けた「標準ＹＣＷＰ＋ＡＤ」群、ならびにＢ１６黒色腫腫瘍細胞のＩＶ注射と、Ｂ１６腫瘍溶解物とＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびモノホスホリル脂質Ａを含むアジュバントとを搭載したケイ酸塩キャップＹＣＷＰの真皮内注射を受けた「ＳｉキャップＹＣＷＰ＋ＡＤ」群」群の生存パーセンテージを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本明細書では当業者に公知の種々の方法論が引用される。引用されるこのような既知の方法論を示している参照文献および他の資料は、完全に示されているかのようにそれらの内容が引用することにより本明細書の一部とされる。
【００３５】
定義
数値および範囲に関して用語「約」は、包含される数が本明細書に示される正確な数に限定されず、本発明の範囲から逸脱することなく、引用された範囲内に実質的に含むことが意図されることを意味する。本明細書で使用する場合、「約」は当業者により理解され、それが使用される文脈である程度まで変動する。例えば、「約」は、この用語に続く特定の数値の＋／−１０％を意味する。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「対象」または「患者」は、ワクチンによる処置を必要とする任意の動物を表す。例えば、対象は、ワクチンで治療または予防され得る病態に罹患していてもよいし、または病態を発症するリスクがあってもよい。本明細書で使用する場合、「対象」または「患者」はヒトを含む。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「治療上有効な量」および「治療レベル」という句は、対象において本明細書の記載の組成物の、特定の応答をもたらす（そのために生体材料またはワクチンがそのような処置を必要とする対象に投与される）それぞれワクチン用量または血漿濃度を意味する。単に便宜のため、例示的用量、送達量、治療上有効な量および治療レベルを成人対象に関して以下に示す。当業者ならば、特定の対象および／または病態／疾患を治療するために必要とされる標準的な実施に従い、このような量を調整することができる。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語「キャップする」または「キャプされた」は、「メッシュネット」のようなポリマー構造が、酵母細胞壁粒子内に搭載された生体材料がそこに保持または捕捉されるように酵母細胞壁粒子をカバーまたは被覆することを意味する。このポリマー構造は、オルトケイ酸テトラアルキルなどのケイ酸塩により形成され得る。
【００３９】
ワクチン
用語「免疫付与(immunization)」は、対象が通常にはワクチンを受容することにより、特定の病態、１または複数の疾患に対して保護されるようになるプロセスを意味する。
【００４０】
用語「ワクチン」は、例えば、注射、経口投与、またはエアゾール投与による投与の際に対象の身体において免疫応答を誘導する生体材料または製品である。ワクチンは、免疫応答を誘導する抗原などの少なくとも１つの有効成分と、アジュバント、コンジュゲート、保存剤、および他の賦形剤（希釈剤、安定剤などを含む）などの付加的成分とを含んでなる。
【００４１】
ワクチン適用に有用な例示的抗原としては、アレルゲン、ウイルス抗原、細菌抗原および寄生虫由来抗原が含まれる。感染性疾患を予防および治療するためには、細菌抗原およびウイルス抗原が好ましい。好適なウイルス抗原としては、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ、およびヘルペスウイルスが含まれる。加えて、毒素（通常には、細菌により産生される）も抗原として使用可能である。癌などの非感染性疾患のためには、好ましい抗原は腫瘍関連抗原を含み、当業者に熟知される（例えば、癌胎児性抗原、前立腺特異的膜抗原、黒色腫抗原、腺癌抗原、白血病抗原、リンパ腫抗原、肉腫抗原、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＲＴ−１、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｐ５３、ｇｐ  １００、結腸癌関連抗原、ＨＥＲ２およびマンモグロビンＡなどの乳癌関連抗原、Ｍｕｃ１、Ｔｒｐ−２、テロメラーゼ、ＰＳＡならびに腎臓癌関連抗原）、抗原の組合せまたは抗原フラグメントも含み得る。一実施形態では、粒子は、腫瘍細胞溶解物を搭載する。
【００４２】
生体材料
本発明により包含される生体材料としては、限定されるものではないが、特定のタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、またはそれらの組合せが含まれる。当業者ならば、タンパク質のフラグメント、例えば、投与時に対象の免疫原性応答を生じる、任意の長さのペプチド、エピトープ、またはタンパク質のサブユニットが使用できることを理解するであろう。
【００４３】
近年、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそのフラグメントなどの核酸もまたワクチンとして使用される。一般に、ＤＮＡは、感染性因子のＤＮＡから抽出され、その後、エレクトロポレーション、遺伝子銃などによって対象に送達する前に遺伝子工学により修飾／増強される。
【００４４】
本発明の生体材料は、生きている野生型病原体であってもよい。好ましくは、抗原は、死滅ウイルス、細菌片、およびタンパク質のサブユニットまたは免疫原性機能的フラグメント、ポリペプチドまたは核酸などの不活型または弱毒型である。より好ましくは、生体材料は、病気は引き起こさないが、対象の免疫応答を効果的に誘発し、特定の疾患の将来の感染から対象を保護することができる。
【００４５】
酵母細胞壁粒子は少なくとも約３０ｎｍの孔径を有するので、慣性半径３０ｎｍ以下のいずれの分子／物体も酵母細胞壁粒子内に搭載可能であると理解されるべきである。例えば、孔径３０ｎｍ未満の一部のウイルスまたはウイルス粒子（例えば、タバコモザイクウイルス）ならびに腫瘍溶解物を含む他の抗原も酵母細胞壁粒子内に搭載することができる。
【００４６】
アジュバント
いくつかの免疫応答増強剤は、組成物が対象に、例えば、直接対象の真皮に投与された際に、いずれのアジュバントも含まない組成物を投与する場合に比べて免疫応答がアジュバントによって増強されるように、免疫応答を増強するためのアジュバントとして組成物に加えることができる。あるいは、生体材料搭載粒子を含んでなる組成物を樹状細胞とともにインキュベートした際に、アジュバントは、このようなアジュバントからの全身作用を劇的に低減しつつ、樹状細胞に対して増強された効果を示す。生体材料は、タンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、またはそれらの組合せを含んでなる。
【００４７】
いくつかの免疫応答増強剤は、組成物が対象に、例えば、直接対象の真皮に投与された際に、いずれの付加的アジュバントも含まない組成物を投与する場合に比べて免疫応答がアジュバントによって増強されるように、免疫応答を増強するためのアジュバントとして酵母細胞壁粒子内に搭載するための組成物に加えることができる。例えば、酵母細胞壁粒子に生体材料が搭載され、かつ、搭載された酵母細胞壁粒子と樹状細胞とのインキュベーションも行う場合には、これらのアジュバントは、このようなアジュバントからの局所的作用または全身作用を劇的に低減しつつ、樹状細胞に対して増強された効果を示す。
【００４８】
本発明のための１以上の好適なアジュバントを選択することは当業者の範囲内である。例えば、モノホスホリル脂質Ａ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリＩ：Ｃ、ポリＩＣＬＣ、有力なＭＨＣ  ＩＩエピトープペプチド、および樹状細胞刺激サイトカイン、例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、およびＧＭ−ＣＳＦは本発明の良好なアジュバント候補である。
【００４９】
好適なアジュバントは、樹状細胞を成熟させること、および樹状細胞を活性化しさらにＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞などのＴ細胞のよりロバストな生成を刺激するために、樹状細胞上の受容体と相互作用することが知られている分子である。例えば、モノホスホリル脂質Ａ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリＩ：Ｃ、ポリＩＣＬＣ、有力なＭＨＣ  ＩＩエピトープペプチド、および樹状細胞刺激サイトカイン、例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、およびＧＭ−ＣＳＦ、イミキモドなどの小分子は本発明の良好なアジュバント候補である。
【００５０】
粒子
本明細書に記載されるように、「粒子」は、その中にワクチンを含有することができ、ワクチンがその構造から出て行くことも可能とする中空で多孔性のいずれの構造も意味する。いくつかの実施形態では、粒径は、この粒子を樹状細胞などの単球に摂取させるように、細菌の大きさに近い約０．５〜約５μｍである。特定の実施形態では、粒径は約０．５〜約１μｍである。特定の実施形態では、粒径は約０．５〜約２．５μｍである。いくつかの実施形態では、粒子は、粒子が約０．５〜約５μｍの大きさである限り、グリカンネットワークを有するいずれの粒子であってもよい。
【００５１】
好ましくは、粒子は、消化可能なまたは生分解性粒子である。いくつかの実施形態では、粒子は特定の形状または材料に限定されず、中空または多孔性構造を有する、樹状細胞を含む単球による粒子の貪食を可能とするいずれの形状、大きさ、または材料であってもよい。
【００５２】
酵母細胞壁粒子
別の実施形態では、粒子は酵母細胞壁粒子ＹＣＷＰであり、これは酵母細胞壁から、粒子がその中に生体材料を封入するための中空または多孔性構造を有するように調製される。生体材料は、タンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、またはそれらの組合せを含んでなる。一実施形態では、ＹＣＷＰは、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)から調製される。別の実施形態では、ＹＣＷＰは、単核食細胞系の細胞および他の食細胞が一般に摂取する微生物構造の大きさに近い。特定の実施形態では、ＹＣＷＰは約１〜２５μｍ、好ましくは１〜５μｍ、５〜１０μｍ、１０〜１５μｍ、１５〜２０μｍ、１５〜２５μｍ、または２０〜５μｍである。例えば、ＹＣＷＰは約２０μｍである。
【００５３】
一実施形態では、ＹＣＷＰは、（ａ）酵母を懸濁させて懸濁液を作製すること、（ｂ）前記懸濁液をインキュベートすること、（ｃ）前記懸濁液を遠心分離し、上清を除去すること、および（ｄ）生じたＹＣＷＰを回収することにより調製される。別の実施形態では、工程（ａ）〜（ｄ）は少なくとも１、２、３または４回繰り返される。
【００５４】
別の実施形態では、ＹＣＷＰは、（ａ）酵母を溶液に懸濁させて第１の懸濁液を作製すること、（ｂ）第１の懸濁液をインキュベートすること、（ｃ）第１の懸濁液を遠心分離し、上清を除去すること、（ｄ）得られたペレットを懸濁させて第２の懸濁液を作製すること、（ｅ）第２の懸濁液をインキュベートすること、（ｆ）第２の懸濁液を遠心分離し、上清を除去すること、および（ｇ）得られたペレットを洗浄してＹＣＷＰを回収することにより調製される。別の実施形態では、ＹＣＷＰは滅菌される。
【００５５】
特定の実施形態では、酵母は１Ｍ  ＮａＯＨを含むＮａＯＨに懸濁させる。特定の実施形態では、第１の懸濁液は、約８０℃で約１時間または１時間インキュベートする。特定の実施形態では、遠心分離は約２０００重力倍数で約１０分、または２０００重力倍数で１０分間行う。特定の実施形態では、ペレットは、約ｐＨ４．５またはｐＨ４．５の水を含む水に懸濁させる。特定の実施形態では、第２の懸濁液は、約５５℃で約１時間または５５℃で１時間インキュベートする。特定の実施形態では、ペレットは、水で少なくとも１、２、３または４回洗浄する。特定の実施形態では、ペレットは１回洗浄する。
【００５６】
別の実施形態では、ＹＣＷＰは、ペレットの洗浄後にイソプロパノールおよび／またはアセトンを用いて滅菌する。特定の実施形態では、他の既知のアルコールが適当である。特定の実施形態では、ＹＣＷＰは、滅菌後に完全に乾燥させる。別の実施形態では、ＹＣＷＰは、乾燥させた後に再懸濁させる。特定の実施形態では、ＹＣＷＰは、１×ＰＢＳなどのＰＢＳに再懸濁させる。
【００５７】
別の実施形態では、ＹＣＷＰは、生体材料がＹＣＷＰに搭載される前、および／またはケイ酸塩でキャップされる前に、ＹＣＷＰを使用まで保存下に置くために、乾燥させた後に凍結させる。特定の実施形態では、ＹＣＷＰは凍結乾燥させ、約４℃以下で保存する。特定の実施形態では、ＹＣＷＰは凍結乾燥させ、４℃で保存する。生体材料は、特定のタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、またはそれらの組合せを含んでなる。
【００５８】
生体材料搭載粒子
粒子、例えば、酵母細胞壁粒子には、特定のタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、またはそれらの組合せなどの生体材料が搭載される。一実施形態では、生体材料は、生体材料と粒子、例えば、酵母細胞壁粒子の懸濁液を一緒にインキュベートし、生体材料を粒子の内部の中空に浸透させることによって粒子に搭載される。
【００５９】
別の実施形態では、粒子または酵母細胞壁粒子がインキュベートされ、生体材料を搭載した後に、この組合せを凍結乾燥させての粒子内で無水ワクチンを作り出す。凍結乾燥により、生体材料は粒子内に捕捉され、樹状細胞などの単球による貪食に備える。特定の実施形態では、凍結乾燥は、生体材料を粒子内に捕捉するために使用される唯一の機構である。特定の実施形態では、この捕捉は、例えば、物理的捕捉、疎水結合、他の任意の結合によるなど、生体材料が粒子を出て行かないようにする独立した成分によって生じるものではない。特定の実施形態では、この捕捉は、凍結乾燥時に起こり得る結合の外側の粒子に生体材料を架橋またはそうでなければ結合させることにより生じるものではない。特定の実施形態では、本発明の組成物は、リソソームからの脱出を特に助ける付加的成分を含まない。生体材料としては、例えば、特定のタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、またはそれらの組合せが含まれる。
【００６０】
別の実施形態では、生体材料は、酵母細胞壁粒子中に組み込まれる。特定の実施形態では、ＹＣＷＰの数は約１×１０９であり、生体材料の容量は約５０μＬである。特定の実施形態では、インキュベーションは約４℃で約１時間または１時間未満である。いくつかの実施形態では、ＹＣＷＰと生体材料の組合せは、２時間未満または約２時間、凍結乾燥させる。
【００６１】
別の実施形態では、搭載された酵母細胞壁粒子は、ケイ酸塩でキャップされる。具体的には、いくつかの実施形態では、搭載されたＹＣＷＰは、搭載されたＹＣＷＰがケイ酸塩でキャップされるように、アンモニアの存在下でＹＣＷＰとオルトケイ酸テトラアルキルなどのケイ酸塩を接触させることによってキャップされる。好ましい実施形態では、搭載されたＹＣＷＰは、約６０分、約４５分、約３０分、約１５分、約１０分、約５分または約２分以内にケイ酸塩でキャップされる。オルトケイ酸テトラアルキルの反応性は、アンモニアにより媒介される加水分解下で、オルトケイ酸テトラアルキルがＹＣＷＰのβ−グルカン構造の第一ヒドロキシルと反応するものである。オルトケイ酸テトラアルキルはまたこれらの細胞壁ケイ酸塩の末端と自己反応して、−Ｏ−Ｓｉ（ＯＨ）２−Ｏ−などや、三次元で−Ｏ−Ｓｉ（−Ｏ−Ｓｉ−Ｏ−）（ＯＨ）−Ｏ−もしくは−Ｓｉ（−Ｏ−Ｓｉ−Ｏ−）２−Ｏ−などの「ブリッジ」を形成する。これらのブリッジはその中に搭載された薬物または生体材料の保持が増強されるようにＹＣＷＰ中の孔に渡って存在し得る。キャップされたＹＣＷＰの構造を図７Ｅに示す。このようなキャップされた搭載ＹＣＷＰは凍結乾燥させることができる。
【００６２】
本件の発明者は、予期しないことに、ケイ酸塩でキャップされた搭載ＹＣＷＰが有効なワクチン送達系であることを見出した。より具体的には、キャップされたＹＣＷＰは、非キャップＹＣＷＰよりも多くの搭載材料を保持する。いっそうさらに驚くことに、キャップされたＹＣＷＰは、より多くの放出生体材料を食細胞の細胞質へ効率的に送達するだけでなく、実施例に詳細に示すように非キャップＹＣＷＰに比べてより多くの搭載粒子を食細胞に効率的に送達する。
【００６３】
別の実施形態では、搭載粒子を凍結乾燥後に希釈剤または溶液に再懸濁させる。特定の実施形態では、希釈剤または溶液は水である。特定の実施形態では、搭載粒子を再懸濁させ、かつ／または付加的生体材料、例えば、ワクチンとともにインキュベートして粒子を浸透させ、その後、この組合せを再び凍結乾燥させる。他の実施形態では、この組合せに複数回の凍結乾燥と再懸濁を行う。他の実施形態では、生体材料搭載粒子を、凍結乾燥後、使用前にエタノール中で滅菌する。生体材料としては、例えば、タンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、またはそれらの組合せが含まれる。
【００６４】
特定の実施形態では、生体材料は、（ａ）生体材料と粒子懸濁液をインキュベートして、生体粒子を粒子の内部の中空に浸透させ、搭載粒子の懸濁液を凍結乾燥させること、および（ｂ）場合により、粒子を再懸濁させ、再懸濁した粒子をインキュベートし、再懸濁された粒子およびまだ粒子中にないワクチンを凍結乾燥させることにより、粒子中に搭載される。
【００６５】
ＹＣＷＰを使用する特定の実施形態では、ＹＣＷＰの数は約１×１０９であり、生体材料の容量は約５０μＬである。特定の実施形態では、ＹＣＷＰの数は１×１０９であり、生体材料の容量は５０μＬである。特定の実施形態では、工程（ａ）のインキュベーションは約４℃で１時間未満である。特定の実施形態では、工程（ａ）のインキュベーションは、４℃で約１時間である。いくつかの実施形態では、上記懸濁液は工程（ａ）で２時間未満、または約２時間凍結乾燥させる。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）のＹＣＷＰは、約５０μＬの水または５０μＬの水を含む水に再懸濁させる。いくつかの実施形態では、再懸濁したＹＣＷＰは、工程（ｂ）で約４ ℃で１時間未満もしくは約１時間、または４℃で２時間未満もしくは約２時間インキュベートする。生体材料としては、特定のタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、またはそれらの組合せが含まれる。
【００６６】
投与の前に、キャップされた搭載酵母細胞壁粒子は、ＰＢＳまたは生理食塩水などの薬学上許容される賦形剤に再懸濁させる。
【００６７】
樹状細胞
本明細書に記載されるように、「樹状細胞」は、末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）から生じる細胞を意味する。一実施形態では、樹状細胞は、（ａ）血液を採取すること、（ｂ）前記血液を希釈すること、（ｃ）ＰＢＭＣの密度勾配分離を行うこと、（ｄ）赤血球を溶解させ、ＰＢＭＣを洗浄すること、（ｅ）前記ＰＢＭＣをインキュベートすること、（ｆ）非接着細胞を除去すること、および（ｇ）接着細胞を培地中で培養することにより調製される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、樹状細胞は、５日以内で培養された未熟樹状細胞である。他の実施形態では、樹状細胞は６〜８日間培養されたものである。
【００６９】
特定の実施形態では、血液はヘパリン処理される。特定の実施形態では、工程（ｃ）の密度勾配分離は、血液をリンパ球分離培地中に入れ、その後、血液を遠心分離することを含んでなる。特定の実施形態では、遠心分離は約１０００重力倍数で約２０分間または１０００重力倍数で２０分行う。特定の実施形態では、第２の遠心分離を工程（ｄ）の前に行い、約５００ｇで約５分間行うか、または５００ｇで５分間行う。特定の実施形態では、第３の遠心分離を工程（ｄ）の前に行い、約５００ｇで約１０分間行うか、または５００ｇで１０分間行う。特定の実施形態では、遠心分離は約１２００重力倍数で約１０分間、または１２００重力倍数で約１５分間行う。特定の実施形態では、第２の遠心を工程（ｄ）の前に行い、約５００ｇで約５分間行うか、または５００ｇで５分間行う。特定の実施形態では、溶解はＡＣＫ溶解溶液を用いて行い、次いで、好ましくは室温で約５分間インキュベーションを行い、その後、続いての遠心分離を行う。特定の実施形態では、ＰＢＭＣをＲＰＭＩ培地中で洗浄する。特定の実施形態では、ＰＢＭＣは工程（ｅ）においてフラスコにて約３７℃で約１〜２時間または３７℃で１〜２時間インキュベートする。特定の実施形態では、無血清ＤＣ培地をフラスコに加える。
【００７０】
いくつかの実施形態では、限定されるものではないが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（例えば、８００単位／ｍｌ）およびＩＬ−４（例えば、５００単位／ｍｌ）を含む１以上のサイトカインが培養培地に存在する。
【００７１】
ワクチン組成物
いくつかの実施形態では、生体材料搭載粒子は、搭載粒子が真皮樹状細胞により貪食されるように、対象の真皮に直接注射される。いくつかの実施形態では、場合により、生体材料搭載粒子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単球、好ましくは、樹状細胞内により貪食される。いくつかの実施形態では、生体材料が搭載されかつケイ酸塩でキャップされた酵母細胞壁粒子が、前記粒子が真皮樹状細胞により貪食されるように、対象の真皮に直接注射される。一実施形態では、生体材料搭載粒子は、細胞が生体材料搭載粒子を貪食するように、樹状細胞とともにインキュベートされる。生体材料としては、例えば、特定のタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、またはそれらの組合せが含まれる。他の実施形態では、キャップされた搭載粒子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単球により貪食され、単球は好ましくは樹状細胞である。
【００７２】
特定の実施形態では、粒子は、場合によりヒト投与の前に樹状細胞とともに約１：１〜約１００：１の比でインキュベートされる。インキュベーションは、約１時間、１時間または好ましくは１時間未満で行うことができる。
【００７３】
特定の実施形態では、キャップされた搭載粒子を含有する樹状細胞を回収し、例えば、少なくとも１、２、３または４回洗浄する。他の実施形態では、樹状細胞は、洗浄後にインキュベートし、凍結培地に再懸濁させ、使用まで保存するために冷凍する。特定の実施形態では、再濁液により約１０×１０６細胞／ｍｌまたは１０×１０６細胞／ｍｌの濃度となる。特定の実施形態では、再懸濁液は使用まで保存するために冷凍される。
【００７４】
処方物
本発明の組成物は、粘膜投与（例えば、鼻腔内投与および吸入投与）または経皮投与用に処方され得る。本発明の組成物はまた、非経口投与（例えば、筋肉内、静脈内、または皮下注射）用に処方することもでき、患者ならびにマクロファージおよび樹状細胞のような単球起源の標的細胞に直接注射することができる。特定の実施形態では、キャップされた生体材料搭載粒子は、樹状細胞との事前のインキュベーションを行わずに、直接、対象の真皮に注射される。よって、本発明の組成物は、まさに従来のワクチンのように投与することができる。これはまた、必要とされる技術の水準が低いために実質的にコストを低減する。他の実施形態では、対象に投与される前に、キャップされた搭載粒子がまず樹状細胞などの単球起源の細胞とともにインキュベートされる。
【００７５】
注射用の処方物は、単位投与形、例えば、場合により保存剤を添加した、アンプルまたは多用量容器で提供され得る。これらの組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションなどの形態を取ってよく、沈澱防止剤、安定剤および／または分散剤などの処方剤を含み得る。本発明の組成物はまた、薬学上許容される賦形剤を用いて処方してもよい。このような賦形剤は当技術分野で周知であるが、一般には生理学的に容認可能な水溶液であろう。生理学的に容認可能な溶液は、実質的に非毒性のものである。好ましい賦形剤は、不活性のものまたは促進性のもののいずれかであるが、寛容原性応答を達成するために抑制化合物も使用され得る。あるいは、本組成物は、ステロイドなどの他の任意の免疫抑制処置または化学療法とともに投与されない。
【００７６】
治療方法
本発明の組成物は、単球、マクロファージ、樹状細胞または未熟樹状細胞を含む単核食細胞系の細胞などの食細胞を誘引し、従って、ワクチンとして使用可能である。ワクチン接種の分野において、単核食細胞系の細胞は、「専門の」抗原提示細胞と考えられ、従って、ワクチン送達の理想的な標的である。ＡＰＣ内の抗原の提示は、他のいずれの細胞種内でのこの同じ抗原の発現よりも強い細胞性免疫応答を生成する上ではるかに有効であることがよく知られている。従って、本発明の組成物の、クラスＩ  ＭＨＣおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子を介した抗原提示細胞への抗原の提示能は、このようなワクチンの有効性を劇的に増強する。
【００７７】
本発明は、現在ワクチン戦略により標的とされているウイルス媒介疾患、細菌媒介疾患および寄生虫疾患などの感染性疾患または現行のワクチン技術の限界のためにわずかしか感受性のないものおよび癌を含む非感染性疾患に対する本明細書で開示されている組成物の予防的使用と治療的使用の両方を企図する。処置される疾患は特に限定されないが、粒子に搭載される生体材料によって決まる。このような例示的生体材料としては、腫瘍溶解物、タンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、またはそれらの組合せが含まれる。
【００７８】
本発明の組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかにおいて食細胞と接触させる。ゆえに、ｉｎ  ｖｉｖｏ法とｉｎ  ｖｉｔｒｏ法の両方が企図される。ｉｎ  ｖｉｖｏ法については、本発明の組成物は一般に非経口投与、通常には静脈内、筋肉内、皮下、経皮または皮内投与される。それらは、例えば、ボーラス注射または持続的注入により投与され得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法では、単球性細胞を体外で接触させ、次に、接触させた細胞を患者に非経口投与する。
【００７９】
用量
いくつかの実施形態では、生体材料搭載粒子、またはキャップされた生体材料搭載酵母細胞壁粒子を含有する約２００μＬの１０×１０６濃度の樹状細胞が処置の一用量を形成する。別の実施形態では、用量は、対象にその用量を投与する前に２００μＬアリコートを希釈して最終容量１ｍｌとすることにより投与する。特定の実施形態では、アリコートは５％ヒト血清アルブミンを含有する無菌生理食塩水で希釈する。特定の実施形態では、２００μＬアリコートを希釈前に解凍する必要がある。このような場合では、解凍と対象へのその用量の投与の間の時間は２時間以内であろう。いくつかの実施形態では、希釈アリコートは、３ｃｃシリンジで投与される。いくつかの実施形態では、２３ゲージ以上のシリンジの針が使用される。
【００８０】
別の実施形態では、対象に少なくとも１、２、３または４用量の本発明の組成物を投与する。特定の実施形態では、対象に４週間毎に１回再接種を行う。いくつかの実施形態では、生体材料搭載粒子を含んでなる組成物は、最初に樹状細胞と融合させることなく対象に投与する。特定の実施形態では、対象に４週間毎に１回再接種を行う。特定の実施形態では、生体材料搭載粒子またはキャップされた搭載粒子を含有する約１００万〜２００万の樹状細胞を、場合により各接種において注射により投与する。特定の実施形態では、生体材料搭載粒子またはキャップされた搭載粒子は、対象の（１）感染もしくは疾患部位、または（２）リンパ節に、またはその近傍に注射する。生体材料としては、例えば、タンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、またはそれらの組合せが含まれる。
【００８１】
ワクチン組成物はまた、限定されるものではないが、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、タンパク質またはペプチドエピトープ、例えば、破傷風トキソイドＭＨＣクラスＩＩ結合ｐ３０ペプチドなどの核酸を含む生物学的アジュバントも含み得る。
【００８２】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、これらは例示目的であり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００８３】
実施例１：樹状細胞の調製
樹状細胞は、患者のＰＢＭＣから形成した。ＰＢＭＣは、標準的な操作手順に従い、患者から２００ｍｌの採血により採取した。次に、この血液を２５０ｍｌの遠心管に移し、１×ＰＢＳで１：１希釈した。その後、５０ｍｌ管中、１５ｍｌの室温リンパ球分離培地（ＬＳＭ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）上に３５ｍｌの希釈血液を重層し、室温にて１０００ｇで２０分間遠心分離した。ＰＢＭＣ層をＬＳＭ勾配からペピット操作により取り出し、清浄な５０ｍｌ遠心管に入れた。４容量の１×ＰＢＳを加え、これらの管を転倒させて内容物を混合した。次に、ＰＢＭＣを室温にて５００ｇで５分間遠心分離した。１０ｍｌの１×ＰＢＳを各管に加え、細胞を再懸濁させ、１本の管にプールした。ＰＢＭＣを再び室温にて５００ｇで１０分間遠心分離し、２０〜４０ｍｌのＡＣＫ溶解溶液（Ｃａｍｂｒｅｘ）に再懸濁させ、室温で５分間インキュベートした。次に、細胞を再び１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＰＢＭＣを３０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）に再懸濁させた。その後、細胞を２〜４本のＴ７５フラスコに移した。これらのフラスコを３７℃で１〜２時間インキュベートした。次に、すすぐことにより非接着細胞を除去した。その後、１０ｍｌの１×ＰＢＳを各フラスコに加え、このフラスコを旋回させ、ＰＢＳを除去した。その後、１０ｍｌの完全ＤＣ培地（無血清ＤＣ培地＋８００Ｕ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ＋１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−４）を各フラスコに加えた。次に、これらのフラスコを３７℃、５％ＣＯ２で２日間インキュベートした。３日目に、１０ｍｌの完全ＤＣ培地を各フラスコに加えた。その後、細胞をさらに２日間インキュベートした。６日目または７日目に、得られた未熟樹状細胞を使用に備えた。
【００８４】
図１は、樹状細胞の形成の概要を示す。
【００８５】
実施例２：抗原の調製
ペプチドなどの合成抗原は商業的に容易に生産でき、凍結乾燥状態で提供可能である。これらのペプチドは再構成でき、搭載のために調製されたＹＣＷＰとともに共インキュベートすることができる。同様に、組換えタンパク質および／または単離されたタンパク質は溶液中に懸濁させることができ、後述のように搭載のためにＹＣＷＰとともに共インキュベートすることができる。
【００８６】
実施例３：腫瘍溶解物の調製
腫瘍サンプルを患者から得た。腫瘍組織から脂肪および壊死組織を分離し、組織を秤量し、１×ＰＢＳを加え（５０μＬ  ＰＢＳ／２００μｇ組織）、腫瘍を１×ＰＢＳ中、メスでよく刻んだ。次に、腫瘍細胞に凍結および解凍を４回行った。凍結は液体窒素中で２０分間行い、解凍は室温で行った。調製した腫瘍溶解物を分光光度計により定量した。品質管理試験のためにアリコートを採取した。残りをワクチン製剤の調製において≦−１３５℃で保存した。凍結解凍サイクルの後に、場合により少量のアジュバントを加えることができる。
【００８７】
図２は、腫瘍細胞溶解物処理の概要を示す。
【００８８】
実施例４：酵母細胞壁粒子の調製
ＹＣＷＰをＦｌｅｉｓｈｍａｎｓ  Ｂａｋｅｒ’ｓ酵母または等価物から調製した。簡単に述べれば、１０ｇのＦｌｅｉｓｈｍａｎｓ  Ｂａｋｅｒ’ｓ酵母を１００ｍｌの１Ｍ  ＮａＯＨに懸濁させ、１時間８０℃に加熱した。非溶解酵母細胞壁を２０００ｘｇで１０分間の遠心分離により除去した。次に、回収した酵母細胞壁を、ｐＨをＨＣｌで４．５に調整した１００ｍｌの水に再懸濁させ、５５℃でさらに１時間インキュベートし、その後、遠心分離により回収した。次に、回収したＹＣＷＰを水で１回、イソプロパノールで４回、最後にアセトンで２回洗浄した。ＹＣＷＰが完全に乾燥されたところで、それらをＰＢＳに再懸濁させ、計数し、１×１０９粒子の群のアリコートに分け、ワクチン製造に使用するために凍結乾燥させた。
【００８９】
図３は、酵母細胞壁粒子処理の概要を示す。
【００９０】
実施例５：酵母細胞壁粒子の調製
３グラムの活性乾燥酵母（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ’ｓまたは等価物）を、酵母を３０ｍＬの無菌水に懸濁して、ボルテックスにかけ、室温にて８００〜１０００ｘｇで５分間遠心分離することにより水で３回洗浄した。上清をデカントした後、酵母ペレットを５０ｍＬの１Ｍ  ＮａＯＨに再懸濁させ、９０℃の水浴で１時間加熱した。
【００９１】
次に、酵母懸濁液を８００〜１０００ｘｇで５分間遠心分離し、ペレットを２５〜３０ｍＬの酸性水（ｐＨをＨＣｌで４．５に調整）に再懸濁させた。この酸性水洗浄工程を懸濁液のｐＨが＜７．０となるまで繰り返した。次に、このペレットを３０ｍＬの酸性水に再懸濁させ、７５℃の水浴で１時間インキュベートした。酵母ペレットを１０００ｘｇで５分間の遠心分離により回収した後に、１０ｍＬの無菌水で３回、１０ｍＬのイソプロパノールで４回、最後に１０ｍＬのアセトンで２回洗浄した。アセトンを注意深く除去し、ペレットをビーカーのガラス表面に一様に拡げ、一晩、風乾した。
【００９２】
乾燥したＹＷＣＰを回収し、４℃の真空ジャー内に保存した後、１０〜１５ｍＬの濾過済み７０％エタノールで３回洗浄した。最終洗浄時にＹＷＣＰを軽く音波処理し、必要であれば、集塊を分散させるために音波処理を繰り返した。エタノールを除去したところで、ＹＷＣＰを無菌水で洗浄した。１００μｌのアリコートを２．０ｍＬ丸底スナップトップ遠心管に分注し、冷凍庫に１時間置き、凍結乾燥させ、以後の使用のために４℃の真空ジャーで保存した。
【００９３】
実施例６：酵母細胞壁粒子の調製
酵母細胞壁粒子（ＹＣＷＰ）は、サッカロミセス・セレビシエ（１００ｇのＦｌｅｉｓｈｍａｎｓ  Ｂａｋｅｒｓ酵母、ＡＢ  Ｍａｕｒｉ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｃ．、チェスターフィールド、ＭＯ）を１Ｌの１Ｍ  ＮａＯＨに懸濁させ、１時間８０℃に加熱することにより調製した。酵母細胞壁を含有する不溶性材料を２０００ｘｇで１０分間の遠心分離により回収した。次に、この不溶性材料を１Ｌの水に懸濁させ、ＨＣｌでｐＨ４〜５とした後、５５℃で１時間インキュベートした。この不溶性残渣を再び遠心分離により回収し、１Ｌの水で１回、２００ｍＬのイソプロパノールで４回、２００ｍＬのアセトンで２回洗浄した。得られたスラリーを無菌フード内、室温で乾燥させ、１２．４ｇの微細で若干灰白色がかった粉末を得た。乾燥ＹＣＷＰから構成された粉末を注意深く秤量し、無菌蒸留水に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁させ、１ｍｌアリコートを無菌エッペンドルフ管に入れ、−６０℃で凍結させ、０．０１２ミリバールで凍結乾燥させた。イソプロパノールおよびアセトンの沸点は水の沸点よりもかなり低いので、可能性のあるこれら溶媒の混入はこれらの高真空条件下で取り除かれるであろう。
【００９４】
実施例７：腫瘍溶解物の調製およびＹＣＷＰ搭載
腫瘍タンパク質抗原を、３回の凍結（−６０℃）／解凍サイクルにより腫瘍組織から放出させた後、２１，０００ｇで遠心分離を行い、総ての不溶性材料を除去する。可溶性腫瘍抗原材料と場合により含まれるアジュバント材料を、少量の可溶性腫瘍溶解物をＹＣＷＰ内部の中空に完全に浸透させるための４℃で２時間インキュベーションにより、中空ＹＣＷＰの内部に搭載する。使用する可溶性腫瘍溶解物の容量は、可溶性腫瘍溶解物の大部分がインキュベーション後にＹＣＷＰの中空内部に留まるよう、ＹＣＷＰ内部に容積に極めて近くなるように注意深く計算する。インキュベーション後、完全に溶媒和したＹＣＷＰを−６０℃で凍結させ、０．０１２ミリバールの真空で８時間凍結乾燥させることにより総ての水を除去すると、無水腫瘍溶解物抗原材料がほとんど中空ＹＣＷＰ内部に残る。残りの腫瘍溶解物材料もＹＣＷＰ内部に入れるために、ＹＣＷＰ内部の同じ計算された小容積の無菌水を、乾燥された部分的搭載ＹＣＷＰに加え、再び４℃で２時間インキュベートした後、再び０．０１２ミリバールの真空で８時間凍結乾燥させる。
【００９５】
実施例８：生体材料のＹＣＷＰへの搭載
完全に無水のＹＣＷＰ（１×１０９）の懸濁液をＰＢＳ中、５０μＬのペプチドと４℃で２時間接触させ、ペプチドをＹＣＷＰ内部の中空に浸透させて搭載ＹＣＷＰを得る。次に、この懸濁液を２時間凍結乾燥させる。凍結乾燥後、５０μＬの水を搭載ＹＣＷＰに加え、さらに２時間４℃でインキュベートし、再び凍結乾燥させて、それらの中空内部に乾燥生体材料を有するＹＣＷＰを得る。次に、搭載されたＹＣＷＰをエタノール中で洗浄することにより滅菌し、エタノール中で維持する。
【００９６】
図４は、ＹＣＷＰ搭載手順の概要を示す。
【００９７】
実施例９：ＹＣＷＰへの腫瘍溶解物の搭載
混合中に気泡を避けつつ、患者腫瘍生検サンプルを５０〜１００μｌの溶解バッファー（ＰＢＳ）（腫瘍サンプルの量に応じる）と注意深く混合した後、４℃で３０分間インキュベートした。この混合物にアセトン−ドライアイス浴および３７℃の水浴中で凍結−解凍３回を施し、４℃にて１０分間最大速度で遠心分離した。５０μｌの調製腫瘍溶解物を、１０ｍｇの乾燥ＹＣＷＰを含有する無菌２ｍＬ遠心管に、液体の腫瘍溶解物がＹＣＷＰを覆うように加えた。この混合物を液体腫瘍溶解物がＹＣＷＰに浸透するまで４℃で２時間インキュベートした。
【００９８】
次に、この遠心管を、ペレットの急速凍結のために３０分間−８５℃の冷凍庫に入れた。この遠心管を一晩、凍結乾燥機に置いた。５０μｌの無菌水を乾燥酵母ペレットに加え、４℃で２時間インキュベートして、液体をペレットに浸透させた。
【００９９】
この遠心管を、ペレットの急速凍結のために３０分間−８５℃の冷凍庫に入れた。この遠心管を一晩、凍結乾燥機に置いた。次に、乾燥粒子を１ｍＬの７０％エタノールに再懸濁させ、以後の使用のために４℃で保存した。
【０１００】
実施例１０：搭載ＹＣＷＰの対象への投与
上記の実施例に従って調製された搭載ＹＣＷＰを、場合により５％ヒト血清アルブミンを含有する、無菌注射水または注射用無菌生理食塩水などの注射に好適な溶液１ｍＬに無菌条件下で再懸濁させる。搭載ＹＣＷＰを注意深く再懸濁させたところで、全容量を抜き取り、シリンジを用いて患者の真皮に注射する。
【０１０１】
実施例１１：搭載粒子を含有する樹状細胞の調製
上記の実施例に従い７０％エタノール懸濁液中に調製した搭載ＹＣＷＰを遠心分離する。エタノールを注意深く除去し、１ｍＬのＰＢＳに置き換える。搭載ＹＣＷＰを音波処理する。搭載ＹＣＷＰを無菌１×ＰＢＳで洗浄する。最終洗浄の後、搭載ＹＣＷＰをＰＢＳにおよそ１×１０８粒子／１００μｌ  ＰＢＳとなるように再懸濁させる。
【０１０２】
搭載ＹＣＷＰを樹状細胞培養物に１：１００の比で加え、この培養物を３７℃のインキュベーターに戻した。次に、以下の因子を培養物に加える：無菌水中５０μｇ／ｍＬのＴＮＦ−αは、培養物に１：５０００の容量比（２μＬ／１０ｍＬ培養物）の比で加え；無菌水中１０μｇ／ｍＬのＩＬ−１βは、培養物に１：１０００の容量比で加え；無菌水中１０μｇ／ｍＬのＩＬ−６は、培養物に１：１０００の容量比で加え；１００％エタノール中１ｍｇ／ｍＬのＰＧＥ２は、培養物に１：１０００の容量比で加える。総ての因子を加え、培養物に混合した後、培養物を一晩インキュベートする。
【０１０３】
実施例１２：樹状細胞の採取、ワクチン組成物の調製および低温保存
実施例１１に従って調製された樹状細胞培養物をインキュベーターから取り出した。下記の手順をフード内の無菌条件下で行った。１０ｍＬの培地を培養フラスコから取り出した。培養フラスコを４．０〜４．５ｍＬの１×ＰＢＳですすぎ、培地も加えた。
【０１０４】
１．５〜２．０ｍＬのＣｅｌｌＳｔｒｉｐｐｅｒ（登録商標）を培養フラスコに加えた。この培養フラスコを３７℃のインキュベーターに１０〜２０分間入れた。約４ｍＬの培養培地を管からフラスコに戻し、細胞を洗浄し、取り出した。できる限り多くの細胞を採取するためにフラスコを洗浄した。細胞を血球計またはＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標）で計数した。遠心分離の後、上清を除去した。
【０１０５】
次に、これらの細胞をＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）１０に５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させ、適宜、患者ＩＤ番号、日付および細胞濃度１．２５×１０６細胞／ｍＬ／バイアル（約２５０μＬ）を記したラベルを付けたクリオバイアルに小分けした。２５０〜５００μＬ部を無菌性試験のためにクリオバイアルで保存し、残りのバイアルをＳｔｙｒｏｆｏａｍ容器で保存し、ステップダウン凍結のために−８６℃下に置いた。
【０１０６】
実施例１３：患者投与のための固体用量のワクチンの調製
患者細胞のクリオバイアル１本を低温保存から取り出し、水浴中３７℃で注意深く解凍した。無菌条件下で、５％ヒト血清アルブミンを含む注射用無菌生理食塩水１ｍＬ（または無菌１×ＰＢＳ  １ｍＬ）を、細胞を含有するクリオバイアルに穏やかに加えた。細胞を注意深く再懸濁させた後、クリオバイアルからの全容量を抜き取り、ワクチンを含有するシリンジを患者への投与に使用した。
【０１０７】
実施例１４：免疫誘導手順
対象に接種するために、ワクチン搭載粒子を含有する１２５万の樹状細胞の用量を０．２ｍＬの無血清１０％ジメチルスルホキシド凍結培地（ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ−１０、ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｎｏｓ、Ｉｎｃ．）中で低温保存する。注射前に、樹状細胞を解凍し、５％ヒト血清アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎａｒ−２５、Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）を含有する注射用無菌生理食塩水で１ｍＬとなるように希釈する。次に、希釈溶液を注射用の３．０ｃｃシリンジに移し、２３ゲージ以上の針を用い、解凍２時間以内に投与する。注射はリンパ節領域の皮下投与、または皮内投与が可能である。
【０１０８】
実施例１５：ＳｅｐＭａｔｅ−５０システムを用いた全末梢血からの単核細胞の単離
インサートを含むＳｅｐｍａｔｅ−５０管は密度勾配培地（ＬＳＭ）上での希釈血液の迅速な層化を可能とし、層が混合するのを防ぐ。制動をかけた遠心分離の後、富化された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を新しい管に注ぎ、以降の培養のために下記のように処理する。
【０１０９】
手順１：
2019203004.tif 000002
【０１１０】
手順２：
2019203004.tif 000003
2019203004.tif 000004
【０１１１】
実施例１６：搭載ＹＣＷＰと合わせた樹状細胞の生成
実施例１５の手順に従い、以下の方法を行う。
Ｉ．ＹＣＷＰの添加
2019203004.tif 000005
【０１１２】
ＩＩ．サイトカインの調製および添加
2019203004.tif 000006
【０１１３】
実施例１７：細胞の採取、ワクチン組成物の調製および低温保存
以下の方法を行う。
細胞の採取：
2019203004.tif 000007
【０１１４】
ＩＩ．ワクチン組成物の調製および低温保存：
2019203004.tif 000008
【０１１５】
実施例１８：マウスモデルにおける試験
Ｂ１６ネズミ腫瘍溶解物搭載酵母細胞壁粒子をマウス用のワクチンとして使用した。接種を行わず、１００万のＢ１６腫瘍細胞をＩＶ接種したマウスを対照として使用した。同じ腫瘍搭載量のＩＶによる腫瘍投与の３日前に、マウスに以下のワクチンを接種した：（ｉ）単に混合した腫瘍溶解物と酵母細胞壁粒子；または（ｉｉ）腫瘍溶解物を搭載した酵母細胞壁粒子。ワクチン接種マウスの両群の腫瘍溶解物の総タンパク質含量および酵母細胞壁の数は同じであった。１００万のＢ１６腫瘍細胞のＩＶ接種の２１日後に、各群のマウスの肺を検査した。
【０１１６】
図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、腫瘍投与２１日後の各群のマウスの肺の結果を示す。
【０１１７】
実施例１９：ケイ酸塩でキャップされた酵母細胞壁粒子の調製
酵母細胞壁粒子（ＹＣＷＰ）を調製し、上記実施例に記載の通りにペプチドを搭載した。１ｍｇのＹＣＷＰに５００μｇのペプチドを搭載した。次に、凍結乾燥させ、搭載ＹＣＷＰを１ｍｌの無水エタノールに懸濁させ、この懸濁液に１００μｌのオルトケイ酸テトラエチルと１００μｌの１０％アンモニア水溶液を加えた。この混合物を室温で１５分間穏やかに振盪した。次に、ＹＣＷＰを無水エタノールで十分に洗浄し、使用まで４℃にてエタノール中で維持した。
【０１１８】
実施例２０：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ漏出アッセイ
ＹＣＷＰに蛍光標識アルブミンを搭載した後、上記の実施例に従って一部の搭載ＹＣＷＰをケイ酸塩でキャップし、他はキャップせずに残した。
【０１１９】
蛍光標識アルブミンを搭載した非キャップＹＣＷＰおよびケイ酸塩でキャップしたＹＣＷＰの両方をまず、総蛍光数に対する初期読み取り値を得るために、リーダーで読み取り、次に、非キャップＹＣＷＰおよびケイ酸塩でキャップしたＹＣＷＰの両方を激しく振盪した。非キャップＹＣＷＰおよびケイ酸塩でキャップしたＹＣＷＰの両方から１時間目および２時間目に上清を採取し、以下に詳細に示される蛍光読み取り値を得た。
【０１２０】
2019203004.tif 000009
【０１２１】
上記の表に示されるように、１時間の振盪後、非キャップＹＣＷＰは２４．７３％の総蛍光を漏出し、ケイ酸塩でキャップされたＹＣＷＰは１５．８１％の総蛍光を漏出した。２時間の振盪後、非キャップＹＣＷＰは１６．６％の総蛍光を漏出し、ケイ酸塩でキャップされたＹＣＷＰは６．６５％の総蛍光を漏出した。まとめると、２時間後、非キャップＹＣＷＰは４１．３３％の蛍光標識アルブミンを失ったが、ケイ酸塩でキャップされたＹＣＷＰは２２．４６％の搭載アルブミンを失っただけであった。
実施例２１：Ｉｎ  Ｖｉｖｏ搭載放出アッセイ
貪食単球細胞系統マウスマクロファージＲａｗ細胞を６ウェルプレートに播種し、一晩培養した。両方とも蛍光標識アルブミンを搭載した非キャップＹＣＷＰおよびケイ酸塩でキャップされたＹＣＷＰを２日目の朝に細胞に加えた。一晩培養後、細胞をＰＢＳで数回洗浄し、溶解させた。溶解物を遠心分離して上清を回収し、蛍光読み取り値を得た。非キャップＹＣＷＰの上清およびペレットの蛍光数はそれぞれ１０４２および１０９４であったが、ケイ酸塩でキャップされたＹＣＷＰの上清およびペレットの蛍光数はそれぞれ１９４５および８７８であった。従って、ケイ酸塩でキャップされたＹＣＷＰは、非キャップＹＣＷＰの場合より食細胞の細胞質に８６．６％多い放出アルブミンを送達した。
【０１２２】
実施例２２：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ食作用アッセイ
マウスマクロファージＲａｗ細胞を２４ウェルプレートに播種し、一晩培養した。両方とも蛍光標識アルブミンを搭載した非キャップＹＣＷＰおよびケイ酸塩でキャップされたＹＣＷＰを２日目の朝に細胞に加えた。２０分、１時間、および２時間でそれぞれ細胞蛍光読み取り値を測定した。
【０１２３】
2019203004.tif 000010
【０１２４】
上記の表に示されるように、ケイ酸塩でキャップされたＹＣＷＰは非キャップＹＣＷＰの場合より食細胞に８２％多い搭載アルブミンを送達した。
実施例２３：マウス生存試験
生存試験は５群のマウスで行い、群Ｉ〜ＩＶの各群では５個体、群Ｖでは１０個体であった。対照群（群Ｉ）は、ＩＶ注射による０．５×１０６  Ｂ１６黒色腫腫瘍細胞を受容した。「標準ＹＣＷＰ」群（群ＩＩ）は、ＩＶ注射により０．５×１０６  Ｂ１６黒色腫腫瘍細胞を受け、また腫瘍細胞のＩＶ注射の１週間前および注射後各週にて６週まで、真皮内注射によりＢ１６腫瘍溶解物が搭載された非キャップＹＣＷＰでのワクチン接種を受けた。「ＳｉキャップＹＣＷＰ」群（群ＩＩＩ）は、ＩＶ注射により０．５×１０６  Ｂ１６黒色腫腫瘍細胞を受け、また腫瘍細胞のＩＶ注射の１週間前および注射後各週にて６週まで、真皮内注射によりＢ１６腫瘍溶解物が搭載されたケイ酸塩でキャップされたＹＣＷＰでのワクチン接種を受けた。「標準ＹＣＷＰ＋ＡＤ」群（群ＩＶ）は、ＩＶ注射により０．５×１０６  Ｂ１６黒色腫腫瘍細胞を受け、また腫瘍細胞のＩＶ注射の１週間前および注射後各週にて６週まで、真皮内注射によりＢ１６腫瘍溶解物、およびＧｐＣオリゴヌクレオチドおよびモノホスホリル脂質Ａアジュバントが搭載された非キャップＹＣＷＰでのワクチン接種を受容した。「ＳｉキャップＹＣＷＰ＋ＡＤ群」（群Ｖ）は、ＩＶ注射により０．５×１０６  Ｂ１６黒色腫腫瘍細胞を受け、また腫瘍細胞のＩＶ注射の１週間前および注射後各週にて６週まで、真皮内注射によりＢ１６腫瘍溶解物、およびＧｐＣオリゴヌクレオチドおよびモノホスホリル脂質Ａアジュバントが搭載されたケイ酸塩でキャップされたＹＣＷＰでのワクチン接種を受けた。
【０１２５】
図８に示されるように、対照群の全マウスは約２２日以内に死亡した。標準ＹＣＷＰ群の全マウスは約２５日以内に死亡し、ケイ酸塩キャップＹＣＷＰ群の全マウスは約３５日以内に死亡し、標準ＹＣＷＰおよびアジュバント群の全マウスは約４５以内に死亡した。対照的に、ケイ酸塩キャップＹＣＷＰおよびアジュバント群の約４０％のマウスは１００日後も生存した。
【図１】
2019203004.tif 000011
【図２】
2019203004.tif 000012
【図３】
2019203004.tif 000013
【図４】
2019203004.tif 000014
【図５】
2019203004.tif 000015
【図６Ａ】
2019203004.tif 000016
【図６Ｂ】
2019203004.tif 000017
【図６Ｃ】
2019203004.tif 000018
【図７】
2019203004.tif 000019
【図８】
2019203004.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月31日(2019.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）酵母細胞壁粒子、（ii）ケイ酸塩、および（iii）該酵母細胞壁粒子内に搭載された外因性生体材料を含んでなる、ワクチンを送達するための組成物であって、前記酵母細胞壁粒子がケイ酸塩でキャップすることにより修飾されている、組成物。
【請求項２】
１以上のアジュバントをさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記１以上のアジュバントが酵母細胞壁粒子内に搭載されている、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記アジュバントがモノホスホリル脂質ＡまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドである、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ケイ酸塩がオルトケイ酸塩の４つの酸素化合物のそれぞれと結合している有機部分を含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ケイ酸塩がオルトケイ酸テトラエチル、オルトケイ酸テトラメチル、オルトケイ酸テトラプロピル、またはオルトケイ酸テトラブチルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記生体材料が特定のタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記生体材料が腫瘍溶解物である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
賦形剤または保存剤をさらに含んでなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を含んでなる、対象に生体材料を効率的に送達するための組成物。
【請求項１１】
前記組成物が対象の真皮に直接投与される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
生体材料が搭載されかつケイ酸塩でキャップされた酵母細胞壁粒子を含有する細胞混合物を生産するための方法であって、
（ｉ）生体材料を酵母細胞壁粒子に搭載して搭載粒子を作製すること；
（ｉｉ）前記搭載粒子をケイ酸塩でキャップすること；
（ｉｉｉ）前記キャップされた搭載粒子を凍結乾燥させること；および
（ｉｖ）前記キャップされた搭載粒子を単球起源の細胞とともにインキュベートすること
を含んでなり、前記インキュベーションにより前記単球起源の細胞に前記キャップされた搭載粒子を貪食させる、方法。
【請求項１３】
前記単球起源の細胞が前駆樹状細胞、樹状細胞、または部分的に分化した樹状細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体材料が特定のタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｉ）が
（ａ）酵母細胞壁粒子および生体材料を希釈剤に懸濁させ、前記生体材料を前記酵母細胞壁粒子に吸収させる期間インキュベートすること；および
（ｂ）前記生体材料を前記酵母細胞壁粒子内に搭載するために前記懸濁液を凍結乾燥させること
を含んでなる、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ａ）および（ｂ）が少なくとも１回繰り返される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ケイ酸がオルトケイ酸テトラエチル、オルトケイ酸テトラメチル、オルトケイ酸テトラプロピル、またはオルトケイ酸テトラブチルである、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｉｉｉ）が、酵母細胞壁粒子がケイ酸塩でキャップされるように、酵母細胞壁粒子とケイ酸塩をアンモニアの存在下で接触させることを含んでなる、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を含んでなる、癌を治療するための医薬組成物。
【請求項２０】
前記生体材料搭載酵母細胞壁粒子が投与前に樹状細胞とともにさらにインキュベートされる、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記癌が乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、髄芽細胞腫、神経芽腫、ビルムス腫瘍、横紋筋肉腫、骨肉腫、肝臓癌、膵臓癌、黒色腫、前立腺癌および眼の黒色腫からなる群から選択される、請求項１９または２０に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
図８に示されるように、対照群の全マウスは約２２日以内に死亡した。標準ＹＣＷＰ群の全マウスは約２５日以内に死亡し、ケイ酸塩キャップＹＣＷＰ群の全マウスは約３５日以内に死亡し、標準ＹＣＷＰおよびアジュバント群の全マウスは約４５以内に死亡した。対照的に、ケイ酸塩キャップＹＣＷＰおよびアジュバント群の約４０％のマウスは１００日後も生存した。
本発明は以下の実施形態を包含する：
１．（ｉ）粒子と、（ｉｉ）前記粒子内に搭載された、タンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、またはそれらの組合せを含んでなる外因性生体材料とを含んでなる、ワクチンを送達するための組成物。
２．前記ワクチンが、対象に投与した際に免疫応答を誘導する抗原を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
３．前記抗原がタンパク質、ペプチド、エピトープ、核酸、および免疫原性フラグメントもしくはそのサブユニットからなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
４．前記ワクチンが生ワクチン、死菌ワクチン、または弱毒ワクチンである、請求項１に記載の組成物。
５．前記粒子が酵母細胞壁粒子である、請求項１に記載の組成物。
６．前記生体材料搭載粒子が投与前に単離された樹状細胞とともにさらにインキュベートされる、請求項１に記載の組成物。
７．前記樹状細胞がインキュベーション前８日以内単離されていた未熟細胞である、請求項６に記載の組成物。
８．１以上のアジュバント、賦形剤、および保存剤をさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
９．請求項１に記載の組成物を投与することを含んでなる、対象にワクチンを効率的に送達するための方法。
１０．請求項１の組成物が、樹状細胞との前インキュベーションなく対象の真皮に投与される、請求項９に記載の方法。
１１．ワクチン搭載粒子を含有するインキュベートされた樹状細胞を生産するための方法であって、
（ｉ）生体材料を粒子に搭載して生体材料搭載粒子を作製すること；
（ｉｉ）前記生体材料搭載粒子を凍結乾燥させること；および
（ｉｉｉ）前記生体材料搭載粒子を樹状細胞とともにインキュベートすること
を含んでなり、
前記生体材料はタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、またはそれらの組合せを含んでなり；かつ
前記生体材料搭載粒子を樹状細胞とともにインキュベートすることにより、樹状細胞に生体材料搭載粒子を貪食させる、方法。
１２．（ａ）前記生体材料搭載粒子を溶液に再懸濁させること、および（ｂ）前記再懸溶液を工程（ｉｉｉ）の前に凍結乾燥させることをさらに含んでなる、請求項１１に記載の方法。
１３．工程（ｉｉｉ）が（ａ）前記生体材料搭載粒子と樹状細胞を約１：１〜約１００：１の比で接触させること、（ｂ）前記生体材料搭載粒子を樹状細胞とともにインキュベートすること；および（ｃ）前記搭載粒子を含有する樹状細胞を回収し、前記細胞を洗浄することを含んでなる、請求項１１に記載の方法。
１４．前記生体材料搭載粒子が１時間未満、樹状細胞とともにインキュベートされる、請求項１３に記載の方法。
１５．請求項１の組成物を対象に投与することを含んでなる、感染性疾患を治療するための方法。
１６．請求項６の組成物を対象に投与することを含んでなる、癌を治療するための方法。１７．前記癌が乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、髄芽細胞腫、神経芽腫、ビルムス腫瘍、横紋筋肉腫、骨肉腫、肝臓癌、膵臓癌、黒色腫、前立腺癌および眼の黒色腫からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
１８．酵母細胞壁粒子とケイ酸塩とを含んでなる組成物であって、前記酵母細胞壁粒子がケイ酸塩でキャップすることにより修飾されている、組成物。
１９．酵母細胞壁粒子内に搭載された外因性生体材料をさらに含んでなる、請求項１８に記載の組成物。
２０．１以上のアジュバントをさらに含んでなる、請求項１９に記載の組成物。
２１．前記１以上のアジュバントが酵母細胞壁粒子内に搭載されている、請求項２０に記載の組成物。
２２．前記アジュバントがモノホスホリル脂質ＡまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドである、請求項２０に記載の組成物。
２３．前記ケイ酸塩がオルトケイ酸塩の４つの酸素化合物のそれぞれと結合している有機部分を含んでなる、請求項１８に記載の組成物。
２４．前記ケイ酸塩がオルトケイ酸テトラエチル、オルトケイ酸テトラメチル、オルトケイ酸テトラプロピル、またはオルトケイ酸テトラブチルである、請求項１８に記載の組成物。
２５．前記生体材料が特定のタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
２６．賦形剤または保存剤をさらに含んでなる、請求項１９に記載の組成物。
２７．酵母細胞壁粒子とケイ酸塩とを含んでなる組成物を作製するための方法であって、酵母細胞壁粒子がケイ酸塩でキャップされるように、酵母細胞壁粒子とケイ酸塩をアンモニアの存在下で接触させることを含んでなる、方法。
２８．前記ケイ酸塩が、オルトケイ酸塩の４つの酸素化合物のそれぞれと結合している有機部分を含んでなる、請求項２７に記載の方法。
２９．前記ケイ酸塩がオルトケイ酸テトラエチル、オルトケイ酸テトラメチル、オルトケイ酸テトラプロピル、またはオルトケイ酸テトラブチルである、請求項２７に記載の方法。
３０．請求項１９に記載の組成物を投与することを含んでなる、対象に生体材料を効率的に送達するための方法。
３１．前記組成物が対象の真皮に直接投与される、請求項３０に記載の方法。
３２．生体材料が搭載されかつケイ酸塩でキャップされた酵母細胞壁粒子を含有する細胞混合物を生産するための方法であって、
（ｉ）生体材料を酵母細胞壁粒子に搭載して搭載粒子を作製すること；
（ｉｉ）前記搭載粒子をケイ酸塩でキャップすること；
（ｉｉｉ）前記キャップされた搭載粒子を凍結乾燥させること；および
（ｉｖ）前記キャップされた搭載粒子を単球起源の細胞とともにインキュベートすること
を含んでなり、前記インキュベーションにより前記単球起源の細胞に前記キャップされた搭載粒子を貪食させる、方法。
３３．前記単球起源の細胞が前駆樹状細胞、樹状細胞、または部分的に分化した樹状細胞である、請求項３２に記載の方法。
３４．前記生体材料が特定のタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。３５．工程（ｉ）が
（ａ）酵母細胞壁粒子および生体材料を希釈剤に懸濁させ、前記生体材料を前記酵母細胞壁粒子に吸収させる期間インキュベートすること；および
（ｂ）前記生体材料を前記酵母細胞壁粒子内に搭載するために前記懸濁液を凍結乾燥させること
を含んでなる、請求項３２に記載の方法。
３６．工程（ａ）および（ｂ）が少なくとも１回繰り返される、請求項３５に記載の方法。
３７．前記生体材料が特定のタンパク質もしくはそのフラグメント、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。３８．前記ケイ酸がオルトケイ酸テトラエチル、オルトケイ酸テトラメチル、オルトケイ酸テトラプロピル、またはオルトケイ酸テトラブチルである、請求項３２に記載の方法。３９．前記生体材料が腫瘍溶解物である、請求項１に記載の組成物。
４０．請求項３９に記載の組成物を対象に投与することを含んでなる、癌を治療するための方法。
４１．前記生体材料が腫瘍溶解物である、請求項１９に記載の組成物。
４２．前記生体材料搭載酵母細胞壁粒子が投与前に樹状細胞とともにさらにインキュベートされる、請求項１９に記載の組成物。
４３．請求項４１の組成物を対象に投与することを含んでなる、癌の治療方法。
４４．請求項４２の組成物を対象に投与することを含んでなる、癌の治療方法。
【外国語明細書】
2019203004000001.pdf