(57)【要約】      （修正有）【課題】エンドリボヌクレアーゼと、結合により前記活性を抑制する阻害物質等を提供する。【解決手段】特定な配列からなるアミノ酸配列、または該配列において０〜１０個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列で示されるエンドリボヌクレアーゼである。ＲＮＡに含まれる５’−ＵＧＧ−３’配列を認識し、当該配列の１番目の塩基の３’側のリン酸ジエステル結合を加水分解する。一本鎖ＲＮＡにこのエンドリボヌクレアーゼを作用させるとＲＮＡの所定配列を認識して分解するが、このエンドリボヌクレアーゼに阻害物質を結合すると前記分解が停止する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２記載のアミノ酸配列、または該配列において０〜１０個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列で示され、ＲＮＡに含まれる５’−ＵＧＧ−３’配列を認識し、当該配列の１番目の残基の３’側のリン酸ジエステル結合を加水分解するエンドリボヌクレアーゼ。
【請求項２】
配列番号３記載のアミノ酸配列で示されることを特徴とする、請求項１記載のエンドリボヌクレアーゼ。
【請求項３】
配列番号１記載のＤＮＡ配列において０〜１００個のＤＮＡ塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有し、かつ配列番号１記載のＤＮＡ配列がコードするポリペプチドと５０〜１００％のホモロジーを有する、請求項１または請求項２記載のエンドリボヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む核酸。
【請求項４】
請求項１または請求項２記載のエンドリボヌクレアーゼと結合し、エンドリボヌクレアーゼ活性を抑制する、阻害物質。
【請求項５】
配列番号５記載のアミノ酸配列、または該配列において０〜７個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列で示されることを特徴とする、請求項４記載の阻害物質。
【請求項６】
配列番号６記載のアミノ酸配列で示される、請求項５記載の阻害物質。
【請求項７】
配列番号４記載のＤＮＡ配列において０〜１００個のＤＮＡ塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有し、かつ配列番号４記載のＤＮＡ配列がコードするポリペプチドと５０〜１００％のホモロジーを有する、請求項４または請求項５記載の阻害物質をコードする遺伝子を含む核酸。
【請求項８】
一本鎖ＲＮＡに請求項１または請求項２記載のエンドリボヌクレアーゼを作用させてＲＮＡを分解することを特徴とする、ＲＮＡ分解物の製造方法。
【請求項９】
前記エンドリボヌクレアーゼに、請求項４または請求項５記載の阻害物質を結合させて前記ＲＮＡ分解を停止することを特徴とする、請求項８記載のＲＮＡ分解物の製造方法。
【請求項１０】
請求項１または請求項２記載のエンドリボヌクレアーゼを、環状ベクターを用いて原核細胞および／または真核細胞で発現させ、前記エンドリボヌクレアーゼによる細胞内ＲＮＡ分解反応を促進させ、細胞の増殖を阻害することを特徴とする、細胞制御方法。
【請求項１１】
請求項１または請求項２記載のエンドリボヌクレアーゼおよび請求項４または請求項５記載の阻害物質を、環状ベクターを用いて原核細胞および／または真核細胞で共に発現させ、細胞の増殖阻害を停止することを特徴とする、細胞制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドリボヌクレアーゼ、前記エンドリボヌクレアーゼに結合して前記エンドリボヌクレアーゼ活性を抑制する阻害物質、前記エンドリボヌクレアーゼまたは阻害物質をコードする遺伝子を含む核酸、ＲＮＡ分解物の製造方法、および細胞制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の中には、環境ストレス条件下でＤＮＡ複製反応やタンパク質合成反応を抑制し、自らの増殖を抑えるトキシン−アンチトキシン機構（ＴＡ機構）を有するものがある。通常、アンチトキシンがトキシンの発現あるいは機能を抑制しているが、細胞環境の変化等によってアンチトキシンが減少するとトキシンが活性化する。活性化したトキシンは微生物の増殖を阻害し、場合によっては細胞死を引き起こす。ＴＡ機構は、アンチトキシンの中和メカニズムに基づきＩ型からＶＩ型に分類され、ＩＩ型は、トキシンとアンチトキシンとが共にタンパク質であり，トキシン−アンチトキシン複合体を形成するものである。ＴＡ機構では、アンチトキシン遺伝子とトキシン遺伝子とが共通のプロモーターで制御されるオペロンを構成することが多い。翻訳されたアンチトキシンタンパクにトキシンタンパクが結合して複合体を構成し、これによってトキシンの活性が抑制される（非特許文献１）。一方、ストレスなどによって細胞内プロテアーゼが活性化するとアンチトキシンが分解され、トキシンが遊離すると、トキシンによる増殖抑制機能が発揮される。トキシンによる増殖抑制機構としては、ＤＮＡｇｙｒａｓｅの阻害による複製の抑制、ｍＲＮＡの開裂、リボソーム伸長因子やグルタミル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＧｌｔＸ）の不活性化による翻訳抑制がある。
【０００３】
ＩＩ型トキシンの多くはエンドリボヌクレアーゼとして機能し、このようなトキシンとしてＭａｚＦがある。種々の原核生物のゲノムやプラスミドに多くのＭａｚＦホモログがあり、これらのＲＮＡ開裂様式は、ＭａｚＦの認識部位の長さ、認識配列によって異なり、多様である。ＭａｚＦのエンドリボヌクレアーゼとしての機能を解明すべく、超並列的シークエンシング解析を用いて切断特異性を同定する方法が開発されている（非特許文献２）。これは、多様な配列を含む人工的に合成したＲＮＡ鎖にＭａｚＦを作用させ、開裂断片の末端配列からＭａｚＦの認識配列を同定するものである。この方法で分析したところ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＭａｚＦにはＡＣＡを認識するものがあり、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのＭａｚＦにはＵＡＣを認識するものがあるという。
【０００４】
また、データバンクにあるＤＮＡ情報を所定のパラメーターを用いて検索し、ＴＡ遺伝子を検出する方法（ＲＡＳＴＡ−Ｂａｃｔｅｒｉａ）がある（非特許文献３）。ＲＡＳＴＡ−Ｂａｃｔｅｒｉａによれば、自動化された方法で、アノテーションがなされている遺伝子に限定されず、原核生物ゲノム中のＴＡ遺伝子座を迅速かつ確実に同定することができるという。ＲＡＳＴＡ−Ｂａｃｔｅｒｉａの結果、Ｎｉｔｏｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ（以下、Ｎ．ｅｕｒｏｐａｅａとも称する）は、ｍａｚＥＦ、ｒｅｌＢＥ、ｖａｐＢＣ、ｈｉｇＢＡなど多くのＴＡ機構を有するという。また、ＩＩ型トキシン―アンシトキシン遺伝子座の包括的情報を提供する統合データベースであるＴＡＤＢ（非特許文献４）や、ＢＬＡＳＴＰとＴＢＬＡＳＴＮのアルゴリズムを用いて原核生物のＴＡ遺伝子を調査した研究（非特許文献５）においても、Ｎ．ｅｕｒｏｐａｅａは、多くのＴＡ機構を有することが示されている。
【０００５】
ニトロソモナス属（Ｎｉｔｏｒｏｓｏｍｏｎａｓ）は、アンモニアを亜硝酸に酸化することでエネルギーを獲得する硝化細菌であり、主に土壌や水中に生息する独立栄養細菌である。温度、アンモニア濃度、ｐＨ、窒素濃度などの環境変化に敏感に順応し、ストレス応答性遺伝モジュールであるＴＡ機構を多数保有していると考えられる。Ｎ．ｅｕｒｏｐａｅａのＴＡ機構を調べたところ、ＮＥ１１８１遺伝子のＭａｚＦ（以下、ＭａｚＦＮＥ１１８１と称す）とＮＥ１１８２遺伝子のＭａｚＥ（以下、ＭａｚＥＮＥ１１８２と称す）とがＴＡ機構を構成し、ＭａｚＦＮＥ１１８１はエンドリボヌクレアーゼ活性を有し、その活性は、ＭａｚＥＮＥ１１８２の添加により阻害されるという（非特許文献６）。更に、ＭａｚＦＮＥ１１８１のエンドリボヌクレアーゼ活性は、ＲＮＡのＡＡＵ配列を認識して開裂する、という。
【０００６】
このような特定配列を認識して切断できるエンドリボヌクレアーゼの利用例は多い。例えば、一本鎖ＲＮＡを配列特異的に切断するエンドリボヌクレアーゼをｍＲＮＡに作用させて一本鎖ｍＲＮＡの分解物を製造する方法がある（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。特許文献１記載のエンドリボヌクレアーゼは、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）のＰＨ１１８２遺伝子にコードされるポリペプチドであり、ＲＮＡ中に５’−ＵＧＧ−３’、５’−ＵＵＧ−３’、５’−ＵＧＡ−３’、５’−ＡＧＧ−３’、５’−ＡＡＧ−３’の配列が存在した場合、これら配列の１番目の残基の３’側のリン酸ジエステル結合を加水分解するという。また、特許文献２記載のエンドリボヌクレアーゼは、ＮＥ１１８１遺伝子にコードされるポリペプチドであり、５’−ＧＡＡＵ−３’、５’−ＡＡＡＵ−３’配列の２番目のＡ残基の５’側または３’側のリン酸ジエステル結合を加水分解するという。また、特許文献３記載のエンドリボヌクレアーゼは、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ・ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  ＤＲ０６６２、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧのＭｂ２０１４ｃとホモロジーを有する遺伝子にコードされるポリペプチドであり、ＲＮＡの中にＵＵＣＣＵＵＵ配列が存在した場合、当該配列の２番目のＵ残基と３番目のＣ残基間のリン酸ジエステル結合を加水分解し、またはＵＣＣＵＵの配列が存在した場合、当該配列の１番目のＵ残基と２番目のＣ残基間のリン酸ジエステル結合を加水分解するという。
【０００７】
また、エンドリボヌクレアーゼを使用して、異なる組織の形成異常および化生、炎症性状態、自己免疫疾患などの過剰増殖障害患者や細菌感染症患者の症状を緩和する組成物を調製する方法もある（特許文献４）。特許文献４で使用するエンドリボヌクレアーゼは、病原性細菌である結核菌由来のＭａｚＦホモログであり、ＲＮＡ中のＵＡＣ配列等を切断してタンパク合成を阻害するという。また、ｐｅｍＩ−ｐｅｍＫアディクションモジュールによってコードされる毒素である精製ＰｅｍＫは、ＲＮＡの中のＵＡＸ（式中、ＸはＣ、Ａ、またはＵである）配列を認識してＲＮＡを切断するという。
【０００８】
更に、遺伝子クローニングを利用して効率的にタンパク質を製造する方法もある（特許文献５）。宿主内で発現させたい核酸のＡＣＡ配列を異なる配列に置換し、ＡＣＡ配列を認識して切断するエンドリボヌクレアーゼ活性を有するＭａｚＦとともに共役発現させて、目的タンパク質を製造する方法である。ｍＲＮＡがＡＣＡ配列を有するとＭａｚＦにより分解され新規の発現が抑制されるが、ＡＣＡ配列のない目的タンパク質遺伝子のｍＲＮＡは切断されず、かつＭａｚＦにより他のｍＲＮＡが分解されるため、目的タンパク質の発現のみを効率的に行うことができるという。更に、ＡＣＡ配列以外を認識するエンドリボヌクレアーゼがあれば、宿主内で発現させたい核酸の配列置換も簡便になる。
【０００９】
また、ＴＡ機構を利用する方法もある。プロモーターの制御下に発現するように配置されたトキシンをコードする塩基配列内にクローニングサイトを形成したクローニングベクターを、トキシンに対してアンチトキシンを発現する宿主細胞に導入して培養することを特徴とする、クローニングベクターの増幅方法である（特許文献６）。このベクターを利用すれば、クローニングサイトに所望のＤＮＡ断片が導入されなかった形質転換体は、トキシンによって細胞死が引き起こされるため生存している細胞には必ず目的の遺伝子が導入されるという。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第４８８９６４７号公報
【特許文献２】特許第４９７４８９１号公報
【特許文献３】国際公開第２００７／０１３２６５号
【特許文献４】特開２０１１−４６７２７号公報
【特許文献５】特許第４８９５２９１号公報
【特許文献６】国際公開第２０１４／４６１１１号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Rebecca Page et al., ”Toxin-antitoxin systems in bacterial growth arrest and persistence”, Nature Chemical Biology Vol. 12, p208-214 (2016)
【非特許文献２】Tatsuki Miyamoto1 et al., ”Characterization of MazF-Mediated Sequence-Specific RNA Cleavage in Pseudomonas putida Using Massive Parallel Sequencing”, PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0149494 February 17, (2016)
【非特許文献３】Emeric W Sevin et al., ”RASTA-Bacteria: a web-based tool for identifying toxin-antitoxin loci in prokaryotes”, Genome Biology, Volume 8, Issue 8, Artile R155, (2007)
【非特許文献４】Yucheng Shao et al., ”TADB: A web-based resource for type 2 toxin-antitoxin loci in bacteria and archaea., ”Nucleic Acids Research, Vol. 39, pp.606, (2011)
【非特許文献５】Deo Prakash Pandey, et al., ”Toxin−antitoxin loci are highly abundant in free-living but lost from host-associated prokaryotes”, Nucleic Acids Research (2005), Vol. 33, pp.966
【非特許文献６】Tatsuki Miyamoto, et al., ”AAU-specific RNA Cleavage Mediated by MazF Toxin Endoribonuclease Conserved in Nitorosomonas europaea”, Toxins (2016),8 174
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
二本鎖ＤＮＡの特定の配列を切断する制限酵素は、遺伝子工学分野で広く利用されているが、一本鎖ＲＮＡを配列特異的に切断する酵素の種類は少ない。認識配列の異なる新たなエンドリボヌクレアーゼは、単独で使用できるほか、従来のエンドリボヌクレアーゼと併用することができる。特に、３塩基配列あるいはそれ以上の塩基数を特異的に認識して切断するエンドリボヌクレアーゼは、医療分野、環境分野、遺伝子工学やタンパク質工学を含む種々の研究分野に応用される事が期待されている。
【００１３】
また、エンドリボヌクレアーゼが、ＴＡ機構を構成するトキシンであれば、アンチトキシンとの組み合わせによって、人為的な環境変化などの操作によってエンドリボヌクレアーゼの活性を調整することができる。したがって、従来のエンドリボヌクレアーゼと異なる新規配列を切断できるトキシンと対応するアンチトキシンとからなるＴＡ機構の開発が望まれる。
【００１４】
加えて、新たな認識部位で切断できるエンドリボヌクレアーゼは、ＲＮＡ分子の切断技術、ＲＮＡの切断を介した細胞制御技術といった遺伝子工学的技術の基盤構築の一助とすることもできる。さらに、このようなエンドリボヌクレアーゼに対するアンチトキシンを同定することで、これらタンパク質間の相互作用をターゲットとする細胞制御技術を構築することができる。
【００１５】
上記現状に鑑み、本発明は、微生物のＴＡ機構を構成するポリペプチドを取得し、その機能を解析することで、従来知られていなかった特定配列を切断するエンドリボヌクレアーゼを提供することを目的とする。また、このエンドリボヌクレアーゼに対応するアンチトキシンを阻害物質として提供することを目的とする。
【００１６】
更に、エンドリボヌクレアーゼの配列特異性を特定し、ＲＮＡ分解物を製造する方法等を提供することを目的とする。
【００１７】
加えて、前記エンドリボヌクレアーゼや阻害物質を生成できる核酸を提供することを目的とする。
【００１８】
更に、前記エンドリボヌクレアーゼの阻害物質の探索方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、硝化細菌であって汚水処理などにも使用されるＮ．ｅｕｒｏｐａｅａを対象にエンドリボヌクレアーゼをスクリーニングしたところ、Ｎ．ｅｕｒｏｐａｅａのＡＬＷ８５  ＲＳ０４８２０遺伝子にコードされるポリペプチドが、ＲＮＡの特定配列を認識する新規エンドリボヌクレアーゼであること等を見出し、本発明を完成させた。
【００２０】
すなわち本発明は、配列番号２記載のアミノ酸配列、または該配列において０〜１０個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列で示され、ＲＮＡに含まれる５’−ＵＧＧ−３’配列を認識し、当該配列の１番目の残基の３’側のリン酸ジエステル結合を加水分解するエンドリボヌクレアーゼを提供するものである。
【００２１】
また本発明は、配列番号３記載のアミノ酸配列で示されることを特徴とする、前記エンドリボヌクレアーゼを提供するものである。
【００２２】
本発明は、配列番号１記載のＤＮＡ配列において０〜１００個のＤＮＡ塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有し、かつ配列番号１記載のＤＮＡ配列がコードするポリペプチドと５０〜１００％のホモロジーを有する、前記エンドリボヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む核酸を提供するものである。
【００２３】
また本発明は、前記エンドリボヌクレアーゼと結合し、エンドリボヌクレアーゼ活性を抑制する、阻害物質を提供するものである。
【００２４】
本発明は、配列番号５記載のアミノ酸配列、または該配列において０〜７個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列で示されることを特徴とする、前記阻害物質を提供するものである。
【００２５】
本発明は、配列番号６記載のアミノ酸配列で示される、前記阻害物質を提供するものである。
【００２６】
本発明は、配列番号４記載のＤＮＡ配列において０〜１００個のＤＮＡ塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有し、かつ配列番号４記載のＤＮＡ配列がコードするポリペプチドと５０〜１００％のホモロジーを有する、前記阻害物質をコードする遺伝子を含む核酸を提供するものである。
【００２７】
本発明は、一本鎖ＲＮＡに前記エンドリボヌクレアーゼを作用させてＲＮＡを分解することを特徴とする、ＲＮＡ分解物の製造方法を提供するものである。
【００２８】
本発明は、前記エンドリボヌクレアーゼに、前記阻害物質を結合させて前記ＲＮＡ分解を停止することを特徴とする、前記ＲＮＡ分解物の製造方法を提供するものである。
【００２９】
本発明は、前記エンドリボヌクレアーゼを、環状ベクターを用いて原核細胞および／または真核細胞で発現させ、前記エンドリボヌクレアーゼによる細胞内ＲＮＡ分解反応を促進させ、細胞の増殖を阻害することを特徴とする、細胞制御方法を提供するものである。
【００３０】
本発明は、前記エンドリボヌクレアーゼおよび前記阻害物質を、環状ベクターを用いて原核細胞および／または真核細胞で共に発現させ、細胞の増殖阻害を停止することを特徴とする、細胞制御方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、ＲＮＡに含まれる５’−ＵＧＧ−３’の配列を認識し、当該配列の１番目の残基の３’側のリン酸ジエステル結合を優先的に開裂し、５’末端が５’−ＧＧ−３’のＲＮＡ分解物を製造するエンドリボヌクレアーゼが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ネイティブＭａｚＦのＤＮＡ配列(配列番号１）とそのアミノ酸配列(配列番号２）と、本発明のエンドリボヌクレアーゼのＤＮＡ配列(配列番号７）とそのアミノ酸配列(配列番号３）との関係を説明する図である。
【図２】ネイティブＭａｚＥのＤＮＡ配列(配列番号４）とアミノ酸配列(配列番号５）と、本発明の阻害物質のＤＮＡ配列(配列番号８）とそのアミノ酸配列(配列番号６）との関係を説明する図である。
【図３】実施例３の結果を示す図であり、エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦの活性と、阻害物質ＭａｚＥによるエンドリボヌクレアーゼ活性の抑制を示す図である。
【図４】実施例４における、超並列的シークエンシング解析の結果を示す図である。
【図５】実施例５の開裂配列の特異性の結果を示す図である。図５（Ａ）は、基質として蛍光修飾オリゴヌクレオチドＤＲ−１３−ＵＧＧを、図５（Ｂ）は同ＤＲ−１３−ＵＧＣを、図５（Ｃ）は同ＤＲ−１３−ＵＧＵを、図５（Ｄ）は同ＤＲ−１３−ＵＧＡを使用した場合の結果である。エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦは、ＲＮＡの５’−ＵＧＧ−３’配列を特に強く開裂するが、５’−ＵＧＣ−３’、５’−ＵＧＵ−３’、５’−ＵＧＡ−３’は同じ実験条件ではほとんど開裂しなかった。なお、前記エンドリボヌクレアーゼ活性は、阻害物質ＭａｚＥによって阻害された。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
（１）エンドリボヌクレアーゼ
本発明の第一は、ＲＮＡに含まれる５’−ＵＧＧ−３’配列を認識し、当該配列の１番目の残基の３’側のリン酸ジエステル結合を加水分解するエンドリボヌクレアーゼである。
【００３４】
ＴＡ機構を有する微生物として、Ｎ．ｅｕｒｏｐａｅａがある。汚水処理などにも使用される硝化細菌であり、温度、アンモニア濃度、ｐＨ、亜硝酸濃度などの環境変化に敏感に応答する微生物である。特許文献２は、Ｎ．ｅｕｒｏｐａｅａのＮＥ１１８１遺伝子にコードされるポリペプチドであって、一本鎖ＲＮＡの開裂部位を「／」で示すと、５’−ＧＡ／ＡＵ−３’、５’−ＡＡ／ＡＵ−３’配列で分解することを開示する。Ｎ．ｅｕｒｏｐａｅａの環境順応性に鑑みて、ストレス応答性遺伝モジュールであるＴＡ機構を更に保有する可能性がある。Ｎ．ｅｕｒｏｐａｅａのＴＡ機構を調査したところ、ＩＩ型ＴＡ機構のＰｅｍＫ／ＭａｚＦファミリーを構成するトキシンとして、ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ＝ＡＬＷ８５＿ＲＳ０４８２０で特定される遺伝子（以下、’８２０遺伝子と称する）があり、対応するアンチトキシン遺伝子としてｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ＝ＡＬＷ８５＿ＲＳ０４８２５（以下、’８２５遺伝子と称する）が存在した。驚いたことに、このＤＮＡ配列で特定されるペプチドがエンドリボヌクレアーゼ活性を有すること、および認識部位はＲＮＡに含まれる５’−ＵＧＧ−３’配列であることが判明した。’８２０遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号１に、その翻訳ポリペプチド（以下、ネイティブＭａｚＦと称す）のアミノ酸配列を配列番号２に示す。ネイティブＭａｚＦは、一本鎖ＲＮＡに含まれる５’−ＵＧＧ−３’配列を認識し、５’末端が５’−ＧＧ−３’のＲＮＡ分解物を生成する。
【００３５】
本発明のエンドリボヌクレアーゼは、ネイティブＭａｚＦ（配列番号２）と同じアミノ酸配列で構成されるものであってもよく、この配列、すなわち配列番号１の開始コドンＧＴＧから終止コドンＴＡＡに対応するポリペプチドにおいて０〜１０個、好ましくは０〜８個、より好ましくは０〜５個、特に好ましくは０〜３個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
【００３６】
ここで、配列番号２記載のアミノ酸配列において０〜１０個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列としては、例えば配列番号２記載のポリペプチドに５０％〜１００％のホモロジーを有するアミノ酸配列、好ましくは７０〜１００％のホモロジーを有するアミノ酸配列、特に好ましくは９０〜１００％、特には９５〜１００％のホモロジーを有するアミノ酸配列が例示される。なお、本発明において、上記ホモロジー比較のための配列間での適切な整列は、例えば、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて決定することができる。
【００３７】
更に本発明のエンドリボヌクレアーゼは、エンドリボヌクレアーゼ活性に影響を及ぼさないことを条件に、前記した開始コドンＧＴＧから終止コドンＴＡＡに対応するアミノ酸配列の他に、翻訳の効率を向上させるためのペプチドや、前記ポリペプチドの精製を容易とするためのペプチド（例えばヒスチジン−タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等）、シャペロンなど発現効率を向上させるアミノ酸配列を、更に付加するものであってよい。
【００３８】
本発明のエンドリボヌクレアーゼとしては、配列番号３記載のアミノ酸配列であってもよい。配列番号２記載のアミノ酸配列に、更にＮ末端側およびＣ末端側に付加配列を有するものである。これら付加配列は、対応するＤＮＡに設けた制限酵素サイト、開始コドン、Ｈｉｓ−Ｔａｇ用コドン、終止コドンなどに由来する配列である。
【００３９】
本発明で使用するエンドリボヌクレアーゼの活性は、一本鎖ＲＮＡに含まれる５’−ＵＧＧ−３’配列を認識し、当該配列の１番目の残基の３’側のリン酸ジエステル結合を加水分解して開裂するものである。Ｎ．ｅｕｒｏｐａｅａが発現するトキシンに、上記配列を認識するエンドリボヌクレアーゼは知られていない。しかも、本発明のエンドリボヌクレアーゼ活性について各種配列を調製して評価したところ、後記するように、極めて強く５’−ＵＧＧ−３’配列を認識して切断することが判明した。この点、ＲＮＡ中の５’−ＵＧＧ−３’配列の他、５’−ＵＧＡ−３’配列その他を認識して切断する特許文献１記載のパイロコッカス・ホリコシイのＰＨ１１８２遺伝子にコードされるポリペプチドと相違する。なお、本発明のエンドリボヌクレアーゼは、後記実施例に示すようにリボソームの共存なしにエンドリボヌクレアーゼ活性を発現されるためリボソーム非依存性である。
【００４０】
（２）阻害物質
本発明の第二は、前記エンドリボヌクレアーゼと結合し、前記エンドリボヌクレアーゼ活性を抑制する、阻害物質である。
【００４１】
Ｎ．ｅｕｒｏｐａｅａのＴＡ機構を構成する’８２５遺伝子の翻訳ポリペプチド（以下、ネイティブＭａｚＥと称す）を調製し、その活性を評価したところ、前記エンドリボヌクレアーゼのエンドリボヌクレアーゼ活性を抑制することが判明した。’８２５遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号４に、その翻訳ペプチドであるネイティブＭａｚＥのアミノ酸配列を配列番号５に示す。本発明の阻害物質は、配列番号５に示すネイティブＭａｚＥと同じアミノ酸配列で構成されるものであってもよい。更に、前記エンドリボヌクレアーゼと結合してエンドリボヌクレアーゼ活性を抑制することを条件に、この配列、すなわち配列番号４の開始コドンＡＴＧから終止コドンＴＧＡに対応するポリペプチドにおいて０〜７個、好ましくは０〜５個、より好ましくは０〜３個、特に好ましくは０〜２個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
【００４２】
ここで、配列番号５記載のアミノ酸配列において０〜７個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列としては、例えば配列番号５記載のポリペプチドに５０〜１００％のホモロジーを有するアミノ酸配列、好ましくは７０〜１００％のホモロジーを有するアミノ酸配列、特に好ましくは９０〜１００％、特には９５〜１００％のホモロジーを有するアミノ酸配列が例示される。なお、本発明において、上記ホモロジー比較のための配列間での適切な整列は、例えば、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて決定することができる。
【００４３】
本発明の阻害物質は、阻害物質活性に影響を及ぼさないことを条件に、前記した開始コドンＧＴＧから終止コドンＴＡＡに対応するアミノ酸の他に、翻訳の効率を向上させるためのペプチドや、前記ポリペプチドの精製を容易とするためのペプチド（例えばヒスチジン−タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等）、シャペロンなど発現効率を向上させるアミノ酸配列を付加するものであってもよい。
【００４４】
本発明の阻害物質としては、配列番号６記載のアミノ酸配列であってもよい。配列番号５記載のアミノ酸配列に、更にＮ末端側およびＣ末端側に付加配列を有するものである。これら付加配列は、対応するＤＮＡに設けた制限酵素サイト、開始コドン、Ｈｉｓ−Ｔａｇ用コドン、終止コドンなどに由来する配列である。
【００４５】
（３）エンドリボヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む核酸
本発明で使用するエンドリボヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む核酸としては、’８２０遺伝子、すなわちネイティブＭａｚＦのＤＮＡ配列（配列番号１）で特定される核酸、または該配列、すなわち配列番号１の開始コドンＧＴＧから終止コドンＴＧＡにおいて１〜１００個、好ましくは１〜７５個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜３０個、特に好ましくは１〜１５個のＤＮＡ塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するＤＮＡを含む核酸である。
【００４６】
例えば、ネイティブＭａｚＦのＤＮＡ配列(配列番号１）には、多数の５’−ＴＧＧ−３’が存在する。このため、この核酸を含むベクターを宿主に導入して形質転換した場合、宿主細胞内で生成するｍＲＮＡの５’−ＵＧＧ−３’配列がエンドリボヌクレアーゼに認識され切断される可能性がある。そこで、ｍＲＮＡの切断を回避して翻訳効率を高く確保するため、ネイティブＭａｚＦのアミノ酸配列（配列番号２）を変えずにトリプレットを変更して５’−ＵＧＧ−３’配列を低減させ、発現効率を向上させることができる。これにより、例えば、配列番号２で示す本発明のエンドリボヌクレアーゼを形質転換体から効率的に製造することができる。
ここで、配列番号１記載のＤＮＡ配列において、１〜１００個のＤＮＡ塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するＤＮＡを含む核酸としては、クエリー配列が核酸で、それをアミノ酸配列に翻訳してから、タンパク質データベースに対して相同性検索を行うアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴＸアルゴリズムで相同性を比較した場合に、配列番号１記載のＤＮＡ配列がコードするポリペプチドに５０〜１００％のホモロジーを有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、好ましくは７０〜１００％の、特に好ましくは９０〜１００％の、特には９５〜１００％のホモロジーを有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が例示される。
【００４７】
更に、本発明で使用するエンドリボヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む核酸としては、本発明のエンドリボヌクレアーゼを構成するポリペプチド、すなわち、配列番号１の開始コドンＧＴＧから終止コドンＴＡＡに対応するポリペプチドにおいて０〜１０個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列に対して、当該ＤＮＡ配列で特定される核酸の１〜１００個、好ましくは１〜７５個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜３０個、特に好ましくは１〜１５個のＤＮＡ塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するＤＮＡを含む核酸であってもよい。上記したように、宿主細胞内で生成するｍＲＮＡの５’−ＵＧＧ−３’配列がエンドリボヌクレアーゼに認識され切断される可能性があるため、エンドリボヌクレアーゼのアミノ酸配列を変えずにトリプレットを変更して５’−ＵＧＧ−３’配列を低減させ、発現効率を向上させることができる。これにより、配列番号２以外のエンドリボヌクレアーゼを形質転換体から効率的に製造することができる。
【００４８】
なお、本発明で使用するエンドリボヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む核酸は、上記の他、更に、この遺伝子を組み込んだ発現ベクターの調製や発現産物の精製を容易にするため、制限酵素に対応するＤＮＡ配列やヒスチジン−タグなどのペプチド配列に対応するＤＮＡ配列などを付加するものであってもよい。
【００４９】
このような核酸として、配列番号７に示す核酸がある。配列番号７では、配列番号１に示すＤＮＡ配列の５’末端側にクローニングのための制限酵素サイトを付加し、３’末端側に、クローニングのための制限酵素サイト、ヒスチジンタグ用コドン等を付加している。
【００５０】
配列番号７に示す核酸は、以下の方法で作成することができる。例えば、データベースＮＣＢＩ等を使用し、’８２０遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１）と、この配列によって翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列(配列番号２）とを入手する。発現ベクターへの組み込みに適するように、配列番号１の５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩの配列を付加し、３’末端側に制限酵素ＸｈｏＩの配列とヒスチジンタグ用コドンと終止コドンとを付加する。更に、ネイティブＭａｚＦのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸を変えずに配列番号１のトリプレットを変更して、宿主のコドン使用頻度等を考慮して最適化するとともに、５’−ＵＧＧ−３’配列を低減させ、発現効率を向上させる。このような核酸は、ＤＮＡの化学的合成によって製造することができる。
【００５１】
本発明のエンドリボヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む核酸のＤＮＡ配列（配列番号７）とその翻訳ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３）、ネイティブＭａｚＦのＤＮＡ配列（配列番号１）とその翻訳ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）との関係を図１に示す。
【００５２】
（４）阻害物質をコードする遺伝子を含む核酸
本発明の阻害物質をコードする遺伝子を含む核酸としては、’８２５遺伝子、すなわちネイティブＭａｚＥのＤＮＡ配列（配列番号４）で特定される核酸であってもよく、または該配列、すなわち配列番号４の開始コドンＡＴＧから終止コドンＴＧＡにおいて１〜１００個、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜４５個、さらに好ましくは１〜２０個、特に好ましくは１〜１０個のＤＮＡ塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するＤＮＡを含む核酸である。
ここで、配列番号４記載のＤＮＡ配列において、１〜１００個のＤＮＡ塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するＤＮＡを含む核酸としては、クエリー配列が核酸で、それをアミノ酸配列に翻訳してから、タンパク質データベースに対して相同性検索を行うアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴＸアルゴリズムで相同性を比較した場合に、配列番号４記載のＤＮＡ配列がコードするポリペプチドに５０〜１００％のホモロジーを有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、好ましくは７０〜１００％の、特に好ましくは９０〜１００％の、特には９５〜１００％のホモロジーを有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が例示される。
【００５３】
更に、本発明で使用する阻害物質をコードする遺伝子を含む核酸としては、本発明の阻害物質を構成するポリペプチド、すなわち、すなわち配列番号４の開始コドンＡＴＧから終止コドンＴＧＡに対応するポリペプチドにおいて０〜７個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列に対して、当該ＤＮＡ配列で特定される核酸の１〜１００個、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜４５個、さらに好ましくは１〜２５個、特に好ましくは１〜１０個のＤＮＡ塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有するＤＮＡを含む核酸であってもよい。例えば、阻害物質のアミノ酸配列を変えずにトリプレットを変更することで発現効率を向上させ、本発明の阻害物質を形質転換体から効率的に製造することも可能である。
【００５４】
更に、本発明で使用する阻害物質をコードする遺伝子を含む核酸は、上記の他、この遺伝子を組み込んだ発現ベクターの調製や発現産物の精製を容易にするため、制限酵素に対応するＤＮＡ配列やヒスチジン−タグなどのペプチド配列に対応するＤＮＡ配列などを付加するものであってもよい。
【００５５】
このような阻害物質をコードする核酸として、配列番号８記載のＤＮＡ配列がある。配列番号８は、ネイティブＭａｚＥのアミノ酸配列（配列番号５）のアミノ酸を変えずに配列番号４で示すトリプレットを変更して発現効率を向上させ、更に、配列番号４に示すＤＮＡ配列の５’末端側にクローニングのための制限酵素サイトを付加し、３’末端側に、クローニングのための制限酵素サイト、Ｈｉｓ−Ｔａｇ用コドン等を付加している。
【００５６】
配列番号８に示す核酸は、以下の方法で作成することができる。例えば、データベースＮＣＢＩ等を使用し、’８２５遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号４）と、この配列によって翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列(配列番号５）とを入手する。発現ベクターへの組み込みに適するように、配列番号４の５’末端側に制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩの配列を付加し、３’末端側に制限酵素ＸｈｏＩの配列とヒスチジンタグ用コドンと終止コドンとを付加する。更に、ネイティブＭａｚＥ（配列番号５）のアミノ酸を変えずにトリプレットを変更して発現効率を向上させる。このような核酸は、ＤＮＡの化学的合成によって製造することができる。
【００５７】
本発明の阻害物質をコードする核酸のＤＮＡ配列（配列番号８）とその翻訳ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号６）、ネイティブＭａｚＥのＤＮＡ配列（配列番号４）とその翻訳ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５）との関係を図２に示す。
【００５８】
本発明のエンドリボヌクレアーゼは、配列番号７に示す核酸を適切な発現ベクターに組み込み、組み換えプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株等を形質転換し、宿主内でタンパク発現を誘導し、宿主大腸菌を破砕後、沈殿法（硫安塩析等）による分画、各種のクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー）等、あるいはこれらの組み合わせにより精製することで、調製できる。
【００５９】
形質転換に供試される宿主には特段の限定はなく、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物、動物、植物培養細胞、動物培養細胞等、組換えＤＮＡの分野で通常使用されている宿主が挙げられる。
【００６０】
本発明のエンドリボヌクレアーゼをコードする核酸として配列番号７で示す核酸を使用すると、前記ポリペプチドの精製を容易とするためのペプチド配列が付加されているため、精製が容易となる。付加されたペプチドに応じた精製手法、例えば、ヒスチジン−タグに対しては金属キレート樹脂を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに対してはグルタチオン固定化樹脂を、それぞれ使用することにより、高純度なポリペプチドを簡便な操作により得ることができる。
【００６１】
本発明の阻害物質は、配列番号８に示すＤＮＡを適切な発現ベクターに組み込み、組み換えプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株等を形質転換し、宿主内でタンパク発現を誘導し、その宿主大腸菌を破砕後、前記エンドリボヌクレアーゼと同様に精製すればよい。形質転換に供試される宿主には特段の限定はなく、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物、動物、植物培養細胞、動物培養細胞等、組換えＤＮＡの分野で通常使用されている宿主が挙げられる。
【００６２】
本発明の阻害物質をコードする核酸として配列番号８で示すＤＮＡを使用すると、前記ポリペプチドの精製を容易とするためのペプチド配列が付加されているため、精製が容易となる。付加されたペプチドに応じた精製手法、例えば、ヒスチジン−タグに対しては金属キレート樹脂を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに対してはグルタチオン固定化樹脂を、それぞれ使用することにより、高純度なポリペプチドを容易な操作で得ることができる。
【００６３】
（５）エンドリボヌクレアーゼの認識配列
本発明のエンドリボヌクレアーゼのエンドリボヌクレアーゼ活性は、例えば人工的に合成したＲＮＡに本発明のエンドリボヌクレアーゼを作用させ、より小分子の分解物を生成するかを確認することで評価することができる。エンドリボヌクレアーゼとして作用する場合、ＲＮＡの認識配列や切断位置などは、非特許文献２に記載される超並列的シークエンシング解析などを利用して確認することができる。
【００６４】
例えば、本発明のエンドリボヌクレアーゼで、配列が明確な人工的に合成したＲＮＡを基質として分解させ、ＲＮＡ分解物を得る。ＲＮＡ分解物の５’末端の配列は、本発明のエンドリボヌクレアーゼの切断部位に相当する。このＲＮＡ分解物の５’末端側にバーコード配列を付加し、バーコード付加ＲＮＡ分解物とする。バーコード配列の３’末端の次の塩基が、ＲＮＡ分解物の５’末端となっている。バーコード配列の３’末端以降の塩基配列を読み取ることで、ＲＮＡ分解物の５’末端配列を特定することができる。ついで、基質として使用した合成ＲＮＡの配列に重ねて、バーコード配列が５’末端側となるようにＲＮＡ分解物を整列させる。これにより、ＲＮＡ分解物の５’末端前後の配列を特定することができる。これにより、エンドリボヌクレアーゼのＲＮＡの認識部位と切断部位を特定することができる。
【００６５】
上記解析の結果、本発明のエンドリボヌクレアーゼは、ＲＮＡを基質とし、５’−ＵＧＧ−３’配列を認識して切断することが判明した。ＲＮＡには、ｍ−ＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｔ−ＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｒ−ＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｎｃＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）、触媒として作用するリボザイム、ｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ）などがある。本発明のエンドリボヌクレアーゼは、これら上記ＲＮＡの一本鎖領域に対してエンドリボヌクレアーゼとして作用する。
【００６６】
（６）ＲＮＡ分解物の製造方法
本発明では、ＲＮＡを基質として、エンドリボヌクレアーゼを作用させてＲＮＡ分解物を製造する。基質のＲＮＡとしては、塩基構成としてリボヌクレオチドを含有する核酸であり、リボヌクレオチドの３’側のリン酸ジエステル結合を加水分解することができる。本発明のエンドリボヌクレアーゼの基質としては、少なくとも１分子のリボヌクレオチドを有する核酸であればよく、例えばＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチドを含有するＲＮＡ、リボヌクレオチドを含有するＤＮＡ等が例示されるが、これらに限定されるものではない。本発明のエンドリボヌクレアーゼの作用を阻害しない範囲で通常の核酸中に含有されているものとは異なるヌクレオチド、例えばデオキシイノシン、デオキシウリジン、ヒドロキシメチルデオキシウリジン等を含有していてもよい。
【００６７】
本発明のエンドリボヌクレアーゼを一本鎖ＲＮＡに作用させると、ＲＮＡの５’−ＵＧＧ−３’配列を認識して、当該配列の１番目の残基の３’側のリン酸ジエステル結合を加水分解するため、５’末端がＧＧ−のＲＮＡ分解物を製造することができる。しかも、５’−ＵＧＣ−３’、５’−ＵＧＵ−３’、５’−ＵＧＡ−３’を認識して強く切断するものではないため、高い特異性で５’−ＵＧＧ−３’配列を切断することができる。
【００６８】
本発明のエンドリボヌクレアーゼの至適温度は３７℃付近、至適ｐＨは中性付近である。
【００６９】
本発明のエンドリボヌクレアーゼは、ＴＡ機構のＰｅｍＫ／ＭａｚＦファミリーを構成する’８２０遺伝子に由来するトキシンであり、阻害物質は、’８２５遺伝子に由来するアンチトキシンである。ＴＡ機構では、トキシンにアンチトキシンが結合して複合体を形成するとトキシンの作用が抑制され、アンチトキシンの分解によってトキシンが遊離するとトキシンの作用が発揮される。本発明のエンドリボヌクレアーゼと阻害物質も、典型的なＴＡ機構と同様の相互作用を有し、阻害物質が本発明のエンドリボヌクレアーゼと結合するとエンドリボヌクレアーゼ活性が抑制される。したがって、ＲＮＡに本発明のエンドリボヌクレアーゼを作用させてＲＮＡ分解物を調製する反応系に阻害物質を添加すると、本発明のエンドリボヌクレアーゼと阻害物質とが結合し、本発明のエンドリボヌクレアーゼの活性を停止させることができる。
【００７０】
（７）探索方法
本発明のエンドリボヌクレアーゼの阻害物質の探索方法は、一本鎖ＲＮＡに本発明のエンドリボヌクレアーゼを作用させてＲＮＡを分解し、この反応系にポリペプチドＸを添加して前記エンドリボヌクレアーゼと結合させ、前記エンドリボヌクレアーゼによるＲＮＡの分解反応が抑制された場合に、このポリペプチドＸを前記エンドリボヌクレアーゼの阻害物質と評価することを特徴とする。
微生物のＴＡ機構を構成するトキシンには、エンドリボヌクレアーゼ活性を有するものが多く、ＴＡ機構の解析は、新たなエンドリボヌクレアーゼ開発の一助となる。特に、新たな活性を有するトキシンを見出した場合に、対応するアンチトキシンを見出すことができれば、前記トキシンに対する阻害物質として使用することができる。本発明では、エンドリボヌクレアーゼの活性を阻害する物質として上記した阻害物質が存在するが、これ以外にエンドリボヌクレアーゼの作用を抑制する物質が存在する可能性がある。このような阻害物質は、エンドリボヌクレアーゼとの新たな組み合わせとなる。具体的には、本発明のエンドリボヌクレアーゼを、配列が明確な合成ＲＮＡに作用させ、ＲＮＡ分解量や分解速度などのエンドリボヌクレアーゼ活性を評価する。次いで、評価対象ペプチドであるポリペプチドＸを前記反応系に添加する。ポリペプチドＸがエンドリボヌクレアーゼに対して何らかの相互作用を発揮すると、エンドリボヌクレアーゼによるＲＮＡ分解量や分解速度などが変動する。このような変動を観察することで、ポリペプチドＸが本発明のエンドリボヌクレアーゼの阻害物質であるかを評価することができる。ポリペプチドＸが阻害物質である場合には、ＲＮＡ分解活性が抑制される。
【００７１】
（８）細胞制御方法
本発明のエンドリボヌクレアーゼを、プラスミドベクター、ウイルスベクター、その他の環状ベクターを用いて原核細胞や真核細胞で発現させると、ＲＮＡの５’−ＵＧＧ−３’配列が切断される。したがって、当該配列を含む転写産物は本発明のエンドリボヌクレアーゼにより分解され、その翻訳が阻害されるため細胞の増殖を制御することができる。また、翻訳阻害の結果、細胞の増殖抑制、場合によっては細胞死を誘起することができる。阻害物質を同様の手法を用いて共発現させた際は、トキシンエンドリボヌクレアーゼとアンチトキシンが結合して複合体を形成することでトキシンの作用が抑制され、細胞の増殖抑制を制御することが出来る。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７３】
実施例１：エンドリボヌクレアーゼの調製
配列番号１のＤＮＡ配列において対応するアミノ酸を変えずにトリプレットを変更し、５’末端側にクローニングのための制限酵素サイトを付加し、３’末端側に、クローニングのための制限酵素サイト、ヒスチジンタグ用コドン等を付加した配列番号７を設計し、その遺伝子合成と発現ベクターｐＥＴ２４ａへの挿入をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社に依頼した。このようにして入手した配列番号７が組み込まれた発現用プラスミドｐＥＴ２４ａを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
【００７４】
形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１ＬのＬＢ培地中、３７℃で培養し、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように添加して発現を誘導した。誘導開始３．５時間後に培養を終了し、菌体を遠心分離により回収した。菌体をバインディングバッファー（２０ｍＭ  リン酸バッファー、４０ｍＭ  イミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  β-メルカプトエタノール、ｐＨ８．０）にて懸濁した後、菌体をＨａｎｄｙ  Ｓｏｎｉｃ  ＵＲ−２０Ｐ（トミーセイコ製）で１５分間超音波破砕し、７，０００ｇ、１５分遠心分離した。上清を０．４５μｍのメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ製）でろ過した。ＡＫＴＡ  ｐｕｒｅ  ２５（ＧＥヘルスケア製）を使用して、１ｍＬのＨｉｓ−Ｔｒａｐ  ＦＦ  ｃｒｕｄｅカラム（ＧＥヘルスケア製）へろ過済みの上清をアプライした。非特異タンパクをカラム５５倍容のバインディングバッファーで洗浄、除去し、目的タンパク質を、イミダゾール濃度を漸増させて抽出した。その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して予想されるサイズのタンパク質の存在を確認した。得られたタンパクをエンドリボヌクレアーゼとする。エンドリボヌクレアーゼをＭａｚＦと称し、そのアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００７５】
実施例２：阻害物質の調製
配列番号４のＤＮＡ配列において対応するアミノ酸を変えずにトリプレットを変更し、５’末端側にクローニングのための制限酵素サイトを付加し、３’末端側に、クローニングのための制限酵素サイト、ヒスチジンタグ用コドン等を付加した配列番号８を設計し、その遺伝子合成と発現ベクターｐＥＴ２４ａへの挿入をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社に依頼した。このようにして入手した配列番号８が組み込まれた発現用プラスミドｐＥＴ２４ａを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
【００７６】
形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１ＬのＬＢ培地中、３７℃で培養し、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように添加して発現を誘導した。誘導開始３．５時間後に培養を終了し、菌体を遠心分離により回収した。菌体をバインディングバッファー（２０ｍＭ  リン酸バッファー、４０ｍＭ  イミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  β-メルカプトエタノール、ｐＨ８．０）にて懸濁した後、菌体をＨａｎｄｙ  Ｓｏｎｉｃ  ＵＲ−２０Ｐ（トミーセイコ製）で１５分間超音波破砕し、７，０００ｇ、１５分遠心分離した。上清を０．４５μｍのメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ製）でろ過した。ＡＫＴＡ  ｐｕｒｅ  ２５（ＧＥヘルスケア製）を使用して、１ｍＬのＨｉｓ−Ｔｒａｐ  ＦＦ  ｃｒｕｄｅカラム（ＧＥヘルスケア製）へろ過済みの上清をアプライした。非特異タンパクをカラム４０倍容のバインディングバッファーで洗浄、除去し、目的タンパク質を、イミダゾール濃度を漸増させて抽出した。その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して予想されるサイズのタンパク質の存在を確認した。得られたタンパクを阻害物質とする。阻害物質をＭａｚＥと称し、そのアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００７７】
実施例３：エンドリボヌクレアーゼ活性
基質として、配列番号９に示す人工ＲＮＡ（５００−２）を調製し、１００ｎｇの人工ＲＮＡ（５００−２）、１ｐｍｏｌの実施例１で調製したエンドリボヌクレアーゼＭａｚＦ、ＭａｚＦリアクションバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ジチオトレイトール、０．０１％（ｖ／ｖ）  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ-１００、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｒｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＡＫＡＲＡ）  ４Ｕ)を含む反応液を、３７℃で９０分間インキュベートした。また、エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦの添加量１ｐｍｏｌを、３ｐｍｏｌ、１０ｐｍｏｌに代えて同様に操作した。更に、エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦ添加量を１ｐｍｏｌから１０ｐｍｏｌに代え、更に実施例２で調製した阻害物質ＭａｚＥ５０ｐｍｏｌを添加して同様に操作した。反応後ＲＮＡを精製し、９５℃で５分間熱変性を行い、１０％変性アクリルアミドゲル（１０％アクリルアミド、１×ＴＢＥ、７Ｍ  尿素、０．０５％（ｗ／ｖ）過硫酸アンモニウム、０．１％（ｖ／ｖ）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’-テトラメチルエチレンジアミン）に供した。電気泳動後にＲＮＡをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色し、バリアブルイメージアナライザー（ＧＥヘルスケア製：Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９２１０イメージャー）にて蛍光画像を取得し、解析を行った。結果を図３に示す。人工ＲＮＡ（５００−２）は、エンドリボヌクレアーゼの添加量に依存して切断されることが確認された。また、エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦに阻害物質ＭａｚＥを添加すると人工ＲＮＡ（５００−２）の分解物が検出されず、エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦによるＲＮＡ切断活性が阻害物質ＭａｚＥによって抑制されることが確認された。
【００７８】
実施例４：エンドリボヌクレアーゼの塩基配列特異性の同定−１
配列番号１０〜配列番号１４で示す配列既知の人工ＲＮＡ（１０００−１：配列番号１０）、人工ＲＮＡ（１０００−２：配列番号１１）、人工ＲＮＡ（１０００−３：配列番号１２）、人工ＲＮＡ（１０００−４：配列番号１３）、人工ＲＮＡ（１０００−５：配列番号１４）を調製した。上記人工ＲＮＡ１０００−１、１０００−２、１０００−３、１０００−４、１０００−５を１ｐｍｏｌずつ混合して基質とした。
ＭａｚＦリアクションバッファーに上記基質と５０ｎｇの実施例１で調製したエンドリボヌクレアーゼＭａｚＦを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。得られたＲＮＡ分解物を精製キット（ザイモリサーチ製、ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）を用いて精製して精製ＲＮＡ分解物を得た。これを、１ｍＭのＡＴＰと２０ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含むＴ４ポリヌクレオチドキナーゼバッファー中で３７℃、１時間インキュベートし、ＲＮＡ分解物の５’末端にＡＴＰのγ位のリン酸基を添加した。このリン酸基付加ＲＮＡ分解物を精製キット（ザイモリサーチ製、ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）を用いて精製した。次いで、精製されたリン酸基付加ＲＮＡ分解物を、５０ＵのＴ４ＲＮＡリガーゼと１２５ｐｍｏｌのバーコードＲＮＡ（配列番号１５）と共に、Ｔ４ＲＮＡリガーゼバッファー中において、１５℃で１８時間インキュベートした。次いで、得られたバーコード付加ＲＮＡ分解物を精製キット（ザイモリサーチ製、ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）を用いて精製した。ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａプロトコル（ニューイングランドバイオラブス）に従ってバーコード付加ＲＮＡ分解物をｃＤＮＡに逆転写した。逆転写産物に対して、末端修復、アダプターライゲーション、エンリッチメントＰＣＲを行い、ライブラリーを調製した。このライブラリーを次世代シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製、ＭｉＳｅｑ  ５００  ｃｙｃｌｅｓ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ  ｖ２）を使用して、超並列的シークエンシング解析を行った。得られた配列情報を基に、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを用いて切断箇所周辺の配列を解析した。得られたリードをリファレンスシーケンスにマッピングし、カバーレッジが上昇した塩基を同定した。これら塩基の周辺配列を抽出し、各ポジションにおける塩基の出現頻度をＷｅｂｌｏｇｏにより可視化した結果、図４に示した通り、本エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦの認識・切断配列が、５’−Ｕ／ＧＧ−３’であることが判明した。
【００７９】
実施例５：エンドリボヌクレアーゼの塩基配列特異性の同定−２
表１に示すＤＮＡ／ＲＮＡのキメラ配列の５’末端に６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（６−ＦＡＭ）を、３’末端にＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）１（ＢＨＱ−１）を付加した４種類の短鎖オリゴヌクレオチドを使用した。ＭａｚＦリアクションバッファーに２０ｐｍｏｌのＤＲ−１３−ＵＧＧ（配列番号１６）と０．５６８ｐｍｏｌの実施例１で調製したエンドリボヌクレアーゼＭａｚＦとを加えた反応液を調製し、トータル２０μＬとした。比較のために、エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦに代えて一本鎖ＲＮＡのピリミジン残基を切断するリボヌクレアーゼＡ（ノバジェン製）を加えた反応液、エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦと共に２．８４ｐｍｏｌの実施例２で調製した阻害物質ＭａｚＥを加えた反応液、エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦに代えて阻害物質ＭａｚＥのみを加えた反応液、およびエンドリボヌクレアーゼＭａｚＦに代えて同量のバッファーを添加した反応液を調製した。これらの反応液をＬｉｇｈｔ  ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（ロシュ製）を用いて、３７℃で６０分間蛍光強度を測定した。結果を図５（Ａ）に示す。６−ＦＡＭは、ＢＨＱ−１との距離が長くなると蛍光強度が増加する。図５（Ａ）に示すように、エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦの添加によって蛍光強度が上昇し、ＤＲ−１３−ＵＧＧに含まれるＵＧＧ配列がエンドリボヌクレアーゼＭａｚＦによって開裂したことが確認された。また、この蛍光強度の増加は、阻害物質ＭａｚＥの添加によって抑制されることも確認された。したがって、阻害物質ＭａｚＥは、エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦのエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害するタンパクであることが証明された。
【００８０】
ＤＲ−１３−ＵＧＧに代えてＤＲ−１３−ＵＧＣ（配列番号１７）、ＤＲ−１３−ＵＧＵ（配列番号１８）、ＤＲ−１３−ＵＧＡ（配列番号１９）を使用し、上記と同様に操作した。結果をそれぞれ図５（Ｂ）、図５（Ｃ）、図５（Ｄ）に示す。
実施例１で調製したエンドリボヌクレアーゼＭａｚＦは、ＤＲ−１３−ＵＧＣ、ＤＲ−１３−ＵＧＵ、ＤＲ−１３−ＵＧＡを基質とした場合には、蛍光強度の増加が観察されなかった。このことは、エンドリボヌクレアーゼＭａｚＦが、ＲＮＡ中の、５’−ＵＧＧ−３’配列を特異的に認識し切断するが、５’−ＵＧＣ−３’配列、５’−ＵＧＵ−３’配列、５’−ＵＧＡ−３’配列を強く切断するものではないことを示す。
【００８１】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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