(57)【要約】【課題】クライオトランスファーホルダ軸線周りの回転によってホルダ上のサンプル設置領域へのアクセスの向上及び、撮像後のサンプルの簡単な取り外し及び回収の促進が可能となるワークステーションを提供すること。【解決手段】極低温度に保持された試料を電子顕微鏡内に取り付けるためのクライオトランスファーホルダについて説明する。ホルダは、デュワーの配向に関わらず、ホルダ軸線周りに一定の重心を維持するように構成される円筒形デュワーを含む。ホルダは、シャッターから分離可能で撮像中の振動を軽減できる、サンプルシャッター制御機構を更に含む。また、極低温度においてクライオトランスファーホルダ内へと試料を取り付けるためのワークステーションについても説明する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
極低温度に保持されたサンプルを電子顕微鏡内に取り付けるためのクライオトランスファーホルダであって、
サンプルホルダと、
外側デュワー筐体及び、前記サンプルホルダに熱的に接続された内側デュワー容器を含む円筒形デュワーとを備え、
前記円筒形デュワーが液体寒剤を保持するように構成される、クライオトランスファーホルダ。
【請求項２】
前記サンプルホルダに熱的に接続された熱導体と、
筐体中心軸線を有した熱導体筐体とを更に備え、
前記円筒形デュワーが、
直径と、
長さと、
円筒軸線と、
前記熱導体筐体に取り付けられる外側デュワー筐体と、
内側デュワー容器とを含み、
前記デュワー円筒軸線が、前記熱導体筐体中心軸線と一直線であり、
前記熱導体が、前記熱導体筐体を通過し、且つ前記熱導体筐体中心軸線と一直線であり、
前記内側デュワー容器が中央開口部を有し、前記熱導体が前記中央開口部を前記内側デュワー容器に触れることなく通過して、前記内側デュワー容器内に収容された液体寒剤と接触するようになっている、請求項１に記載のクライオトランスファーホルダ。
【請求項３】
前記デュワー直径が前記デュワー長さよりも大きい、請求項３に記載のクライオトランスファーホルダ。
【請求項４】
前記クライオトランスファーホルダが、前記デュワーが空の際に、前記中心軸線周りに回転させている間、前記中心軸線に対する重心を維持する、請求項２に記載のクライオトランスファーホルダ。
【請求項５】
前記クライオトランスファーホルダが、前記デュワーが液体寒剤を収容している際に、前記中心軸線周りに回転させている間、前記中心軸線に対する重心を維持する、請求項２に記載のクライオトランスファーホルダ。
【請求項６】
サンプルホルダシャッターと、
シャッター制御ロッドと、
シャッター制御ノブとを更に備え、
前記シャッター制御ロッドが、前記サンプルホルダシャッターから前記デュワーを越える位置まで、前記筐体中心軸線に沿って前記熱導体を通過し、
前記シャッター制御ノブが、前記シャッター制御ロッドに対して解放可能に接続される、請求項２に記載のクライオトランスファーホルダ。
【請求項７】
極低温度に保持されたサンプルを電子顕微鏡内に取り付けるためのクライオトランスファーホルダであって、
サンプルホルダと、
前記サンプルホルダ及びデュワーに熱的に取り付けられる中空円筒熱導体と、
筐体中心軸線を有した円筒熱導体筐体と、
摺動して前記サンプルホルダを覆うように構成されるシャッターと、
前記中空円筒熱導体内に配置されて、前記シャッターに接続され、且つ解放可能な接続によって手動シャッター制御ノブに接続されるシャッター制御ロッドとを備え、
前記熱導体が、前記筐体を通過し且つ前記筐体中心軸線と一直線である、クライオトランスファーホルダ。
【請求項８】
極低温度に保持されたサンプルを電子顕微鏡内に取り付けるためのクライオトランスファーホルダであって、
摺動して自身を覆うように構成されるシャッターを含むサンプルホルダと、
前記シャッター、及び、解放可能な接続によって手動シャッター制御ノブに接続されるシャッター制御ロッドとを備え、
前記手動シャッター制御ノブが、前記クライオトランスファーホルダが電子顕微鏡に取り付けられると、電子顕微鏡の外側に配置される、
クライオトランスファーホルダ。
【請求項９】
極低温度において、サンプル支持プラットフォーム及び中心軸線を有するクライオトランスファーホルダ内へと試料を取り付けるためのワークステーションであって、
前記クライオトランスファーホルダを受け入れるための受入冶具を備え、
前記受入冶具が、
固定サンプル輸送容器と、
前記クライオトランスファーホルダを受け入れるための細長チャンバとを含み、
前記細長チャンバが、前記クライオトランスファーホルダを前記受入冶具に取り付けた際にその中心軸線周りの回転を可能にするように構成される軸受表面を含み、
前記クライオトランスファーホルダを前記受入冶具に取り付けると、前記サンプル支持プラットフォームが前記サンプル輸送容器内へと延在する、ワークステーション。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
凍結水和した生物試料や無機材料を含む、極低温度に保持されたサンプルの電子顕微鏡法（低温電子顕微鏡法）は、生物学的構造や無機構造について、タンパク質や高分子のレベルまで掘り下げたより深い理解を一層可能としている発展分野である。クライオトランスファーホルダは、低温電子顕微鏡法用の凍結水和試料の低温移送や観察を要する用途に用いられる。クライオトランスファーホルダは、材料科学の分野では、サンプルを１０００℃の温度まで維持できる内部ヒーターによる加熱形態で使用されることもある。低温ワークステーションは、試料をホルダ内へと装填するために保護された環境を提供する。低温ワークステーションから透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）への大気中移送の間、クライオシールドが凍結水和試料を密閉して汚染から保護する。
【０００２】
低温電子顕微鏡法は、典型的には凍結したサンプルを調製装置内のクライオトランスファーホルダに取り付けることで行われ、調製装置は、取り付け前及び取り付けられている間のサンプルを極低温度に保持する。クライオトランスファーホルダは、サンプルステージへと延在する熱導体を冷却する、典型的には窒素又はヘリウムである低温液体のデュワーを含む。このため、デュワーが十分な寒剤を有している間は、サンプルステージを極低温度に保持することができる。クライオトランスファーホルダは、ホルダをサンプル調製装置から電子顕微鏡カラムへと移動させる間サンプルを覆うシャッターも有する。シャッターは、サンプルが空気中の水分によって霜で覆われるのを防ぐ。顕微鏡カラムは真空に保持されているため、カラムから大気及び水分が実質的に取り除かれるとサンプルシャッターを開くことができるようになっている。クライオトランスファーホルダは、電子顕微鏡のゴニオメーターによって固定される。ゴニオメーターは、試料をｘ、ｙ及びｚに位置決めして、（ホルダを回転させることで）試料を±９０度近い角度に回転させることができる。ホルダの回転は、典型的には、磁極片等のＴＥＭ内の機構に干渉する試料ホルダの大きさによって、更に制限される（±６０度〜±８５度）。
【０００３】
低温電子顕微鏡法の分解能の向上は、画像の処理や、凍結サンプルの振動や状態変化等の外乱に起因する画像の歪みの補正に必要とされる、画像センサーや演算力及び演算方法といった、電子顕微鏡自体の向上によって得られる。低温電子顕微鏡法全体のシステムの分解能が向上すると（例えば、現在では１秒間の露光に対して０．１５ｎｍ未満が可能である）、試料ホルダの安定性が、到達可能な画像分解能に対する最初の制限となることが多い。例えば、図１、図２及び図３に示す先行技術のクライオトランスファーホルダ１００は、垂直に配向された円筒形容器であるデュワー１０を有し、デュワー１０は、図２及び図３に示すように、ホルダ１００及びデュワー１０がサンプルホルダ軸線３０周りに回転する際に、冷却液４０をホルダ軸線３０に対して均等に分配できない。このため、顕微鏡内で、サンプル２０に伝導する振動や動きを検知できるようになってしまう。また、デュワーの底に気泡核が形成される可能性を減らすために、デュワー１０の内面が極めて滑らか且つ欠陥の無い状態であることが重要である。そうでなければ、冷却剤の移動、沸騰及び熱循環によっても熱導体ロッド及びサンプルが振動することがあるため、デュワー１０は、図５の冷却剤容器開口部４２３に直に接触するほど充填されるべきではない。デュワー内の冷却剤の量の制限によって、サンプルを極低温度に保持しながら撮像できる時間が制限される。
【０００４】
サンプルホルダの振動の他の原因としては、サンプルの撮像中は格納されているがサンプルホルダに近接しているシャッターに対する、機械的結合が有り得る。機械的結合は、デュワーを通して後方に延在し、例えばデュワー内の液体の沸騰又は冷却剤の噴出による様々な振動又は移動が、サンプルホルダへのシャッターの結合を通して音響的に後方に伝わることがある。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】先行技術のクライオトランスファーホルダの側面図である。
【図２】図１のクライオトランスファーホルダにおける先行技術のデュワーの断面図である。
【図３】ホルダ軸線周りに回転する様子を示す、図２の先行技術のデュワーの断面図である。
【図４】本明細書に記載の実施例に係る、例示的なクライオトランスファーホルダである。
【図５】図４のクライオトランスファーホルダにおけるデュワーの切り取り等角図である。
【図６】図４のクライオトランスファーホルダにおけるデュワーの断面図である。
【図７】ホルダ軸線周りに回転する様子を示す、図４のクライオトランスファーホルダにおけるデュワーの断面図である。
【図８】本明細書に記載の更なる実施例に係る、ワークステーション内に設置された図４のクライオトランスファーホルダのホルダ軸線に対するサジタル断面図である。
【図９】本明細書に記載の更なる実施例に係る、図４のクライオトランスファーホルダの手動シャッター制御の詳細断面図である。
【図１０】本明細書に記載の更なる実施例に係る、図４のクライオトランスファーホルダの手動シャッター制御の更なる詳細断面図である。
【図１１】本明細書に記載の更なる実施例に係る、図４のクライオトランスファーホルダの手動シャッター制御の更なる詳細断面図である。
【図１２】本明細書に記載の更なる実施例に係る、サンプルホルダの詳細の等角図である。
【図１３】本明細書に記載の更なる実施例に係る、サンプルホルダの詳細の切り取り等角図である。
【図１４】本明細書に記載の更なる実施例に係る、サンプルホルダの詳細の等角図である。
【図１５】本明細書に記載の更なる実施例に係る、サンプルホルダの詳細の切り取り等角図である。
【図１６】本明細書に記載の更なる実施例に係る、ワークステーション内に設置されてワークステーション標準位置に回転する、図４のクライオトランスファーホルダの図である。
【図１７】本明細書に記載の更なる実施例に係る、ワークステーション内に設置されてワークステーション試料装填位置に回転する、図４のクライオトランスファーホルダの図である。
【図１８】本明細書に記載の更なる実施例に係る、ワークステーション内に設置されてワークステーション試料取外し位置に回転する、図４のクライオトランスファーホルダの図である。
【図１９】本明細書に記載の更なる実施例に係る、図１４のクライオトランスファーホルダ先端部及びワークステーションの拡大図である。
【図２０】本明細書に記載の更なる実施例に係る、図１５のクライオトランスファーホルダ先端部及びワークステーションの拡大図である。
【図２１】本明細書に記載の更なる実施例に係る、図１６のクライオトランスファーホルダ先端部及びワークステーションの拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
当業者には、本発明の教示を採用することで、他の詳細な設計や方法の発展が可能であることが理解されよう。本明細書に記載の例は例示的なものであり、添付の請求項によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。以下の詳細な説明では添付の図面を参照する。異なる図面における同一の参照番号によって、同一又は同様の要素を識別できる。
【実施例１】
【０００７】
図４は、本明細書に記載の１つ以上の態様に係るクライオトランスファーホルダ４００の実施例の一例を示す。図示のように、クライオトランスファーホルダ４００は、円筒状の低温導体筐体４５０の端に位置付けられたサンプルホルダ先端部４４０を含む。先端部４４０は、ホルダが顕微鏡ゴニオメーターに取り付けられる際に、低温導体筐体によって電子顕微鏡の内側の適切な位置に配置される。熱導体筐体４５０は、デュワー充填キャップ４１０を含んだデュワーに取り付けられる。この図面におけるデュワーの後方には、手動サンプルシャッター制御ノブ４３０がある。冷却剤はデュワー容器を冷却し、図５に示すように、デュワー容器はデュワー熱導体４２６と熱接触し、デュワー熱導体４２６は更に熱導体４２４と接触している。低温導体は、低温導体筐体４５０を通過して、サンプルホルダ先端部４４０の領域へと出る。低温導体筐体４５０と熱導体４２４との間の空間は真空であるため、熱導体４２４は大気温度から隔離される。
【０００８】
図５は、クライオトランスファーホルダ４００のデュワー４２０及びシャッター制御部４３０の詳細断面図である。デュワー４２０は、デュワー外側筐体４２１と内側冷却剤容器４２２とを含む。冷却剤容器４２２は、熱導体４２４が通る封止開口部４２３を中央に有する。低温導体の内側にはシャッター制御ロッド４２５が存在する。図６及び図７はデュワー４２０の断面図を示し、図６では垂直な充填キャップ４１０、図７では回転したデュワー及び傾斜した充填キャップ４１０を示す。これら２つの図面では、軸線周りの回転の角度に関わらず、流体がクライオトランスファーホルダ４００の中心軸線４０１に対してどのようにして均等に分配されるかを示す。水平に配向された円筒形デュワーは、ホルダが回転する中心軸線周りの角度に関わらず、ホルダの重心をホルダの中心軸線周りに維持する。これは、図２及び図３に示す先行技術のホルダと比較すると、垂直に配向されたデュワー１０では、デュワー及びホルダが軸線周りに回転する際、流体４０が中心軸線３０に対して不均等に分配される。図３では、軸線３０の右側よりも、軸線の左側により多くの流体がある。この、先行技術のホルダ及びデュワーが回転する間常に変化する不均等な分配によって、デュワーを支持する要素に応力がかかり、最終的にはサンプル先端部における振動又は移動として現れる。しかし、図４〜図７の水平に配向されたデュワー円筒では、冷却流体がホルダの中心軸線４０１の両側に常に等しく分配されるため、この力が取り除かれる。不均等な重量分配は、中心軸線４０１周りの円筒対称性から逸脱したデュワーの特徴によって生じうる。こうした特徴を防ぐか最小限に抑えることが重要であり、防止できない場合には、平衡にするための質量を加えることで不均等な重量分配を補正してもよい。
【０００９】
図８は、極低温度でサンプルをホルダに対して装填したり取り外したりするように構成されたワークステーション８００内に設置された、例示的なクライオトランスファーホルダ４００を示す。ワークステーション８００は、サンプルがトランスファーホルダ４００内に設置されていない場合にサンプルを極低温度で撮像し続けられるように、液体窒素等の冷却剤を部分的に充填できるサンプル移送空間８１０を含む。ワークステーションの更なる詳細及びトランスファーホルダとの使用を以下に説明する。また、図８は、熱導体４２４を通って延在するトランスファーホルダシャッター制御ロッド４２５も示す。デュワー筐体４２１の右側には、シャッター用の手動制御ノブ４３０を示す。
【００１０】
図９、図１０及び図１１は、シャッター制御機構の３つの異なる状態を詳細に示す。３つの図面全てにおいて部品は同一である。図示のように、シャッター制御ロッド４２５は、球状基端４３３を有するシャッター制御ヒッチ４３４に接続される。シャッター制御ノブ４３０は、開口端部ショートロッド４３１に接続される。Ｏリング４３２が、ショートロッド４３１の先端における溝に嵌合する。図９に示すように、Ｏリング４３２は、制御ノブ４３０が近付いたり遠ざかったりと摺動することで制御ロッド４２５を動かせるように、シャッター制御ヒッチ４３４を覆う。制御ロッド４２５のシャッター４４２に対する結合について以下に説明する。
【００１１】
本明細書に記載の実施例では、制御ロッド４２５がサンプルホルダの先端におけるストッパーに係合するように制御ノブを近くに引くことで、前述したシャッター制御結合を制御ロッド４２５及びヒッチ４３４から取り外すことができる（図１２及び図１３に示し且つ以下に更に説明される）。図１０は、制御ヒッチ４３４の先端を過ぎるＯリングを示し、図１１は、制御ヒッチ４３４から完全に解放されたＯリング４３２及びショートロッド４３１を示す。図１１に示す解放された状態では、制御ロッド４２５は制御ノブから機械的に分離され、シャッターに伝わってシャッターを介してサンプルホルダ２０に伝わりうる振動が軽減される。真空ベロー４３９が、制御ロッドを囲む真空の完全性を維持しながら先端制御ロッドの動きを可能にする。ここで、図１２及び図１３を参照してシャッター機構について説明する。
【００１２】
図１１は、シャッター閉鎖位置における機構及びＯリング４３２内へと係合するシャッター制御ヒッチ球状端部４３３を示す。この位置では、シャッターカバー４４２は、図１２及び図１３に示すＴＥＭサンプルホルダ４４１を保護している（なお、図１２及び図１３は開口位置にあるカバー４４２を示す）。制御ノブ４３０が反時計回りに回転すると、ノブがデュワー筐体４２１から離間し、制御ロッド４２５が外方へ引っ張られて、シャッターカバー４４２（図１２及び図１３参照）がシャッター開口位置内へと引っ張られるが、端部ストッパー４４４（図１２及び図１３）によって、制御ロッドの更に外方への移動が防止される。一実施例では、制御ノブ４３０が反時計回りに継続的に回転すると、制御ヒッチ球状端部４３３及びＯリング４３２が図１１に示すように分離されて、接続が断たれる。制御ノブ４３０が時計回りに回転すると、ノブがデュワー筐体４２１の方へ移動して、図１０に示すように、Ｏリング４３２がシャッター制御ヒッチ球状端部４３３に接触するように押される。制御ノブ４３０が更に時計回りに回転すると、制御ロッド４２５及びシャッターカバー４４２がシャッター閉鎖位置内へと内方に押される。端部ストッパー４４７によって、制御ロッドの更に内方への移動が防止されて、図９に示すように、Ｏリング４３２がシャッター制御ヒッチ球状端部４３３と再び接続する。
【００１３】
ここで、図１２及び図１３を参照してシャッター機構について説明する。図示のように、一実施例では、シャッター４４２は、制御ロッド先端部４４６を係合するねじ４４４によって制御ロッド４２５に接続する。ねじ４２５は、前述したように作動する制御ロッド４２５の動きと共に、スロット４４５内を近付いたり遠ざかったりして移動する。ねじ４４２が制御ロッドによって動かされるとサンプルカバー４４２も前進し、サンプル保持プラットフォーム４４１を覆うように引っ張られる。スロット４４５の先端４４７が制御ロッド４２５用の移動ストッパーとして機能して、この制御ロッド４２５の近付く動きが制限されることで、上述のように、シャッター制御ノブ４３０が制御ロッド４２５と再び係合できるようになる。端部ストッパー４４３は制御ロッド４２５の遠ざかる動きを止めて、上述のように、ユーザーが制御ロッド４２５から制御ノブ４３０を取り外すことができるようにする。端部ストッパー４４３はサンプル先端部４４０の一部である。サンプル先端部４４０の基端４４８は熱導体４２４の先端内へと嵌合するため、デュワー容器４２２へと戻る直接的な熱的接続が実現される。
【００１４】
ここで、図８及び図１６〜図２１を参照してワークステーション８００機構について説明する。ワークステーション８００によって、クライオトランスファーホルダ先端部４４０及びサンプルを囲むサンプル移送空間８１０を、好適には−１４０℃より低く、より好適には−１７０℃より低く維持しながら、サンプルをクライオトランスファーホルダ４００に対して装填したり取り外したりできる。これは、サンプル移送空間８１０に液体窒素等の冷却剤（不図示）を実質的に充填し続け、且つサンプルを常に冷却剤内、冷却剤の表面から１センチメートル内、又は冷却されたクライオトランスファーホルダ内に浸し続けることで実現される。サンプルホルダ４００が、ワークステーション８００内に設置された状態でサンプルホルダ軸線４０１周りに回転するという性能によって、ユーザーは、最も人間工学的な任意の配向でサンプルを装填することができ、また、サンプルが試料支持プラットフォーム４４１から落ちるように重力によって促される位置に回転させることで、サンプルをホルダから取り外すことができる。この機能は、先行技術の低温ホルダ及びワークステーションでは存在しなかった。
【００１５】
図８を参照すると、例示的なワークステーション８００は、サンプル移送空間８１０とサンプルホルダ受入ブッシュ８３０とを備える。サンプルホルダ受入ブッシュは、サンプルホルダ４００をワークステーション８００内に設置した状態で回転させるために用いられる。また、ワークステーションは、端部品８１２に取り付けられたサンプル先端受部８１４も含む。端部品は、サンプルホルダ熱導体外側筐体４５０の先端を覆うように嵌合する。端部品８１２は、ガスケット８１３内に嵌合して締まりばめを提供する。端部品８１２とガスケット８１３との嵌合は、端部品８１２がガスケット８１３内で回転できるように十分に緩いものである。
【００１６】
サンプルホルダへのサンプルの装填は、図１６〜図１９に示すように、ホルダを直立位置からワークステーション内へと挿入することから始まる。シャッター４４２が開き、デュワー４２０に寒剤が充填される。ワークステーションサンプル移送空間８１０に寒剤が充填され、クライオトランスファーホルダ内へと装填される、サンプルが入ったサンプルボックスが、サンプル移送空間の寒剤内へと入れられる。クランプ制御ねじ８２３を反時計回りに回すことで、図１４及び図１５に示す試料クランプ４４９が試料支持プラットフォーム４４１から離れるように上昇する。ここで、サンプルホルダを、図１７及び図２０に示す試料装填ワークステーション位置へと回転させる。図１６〜図２１に示すように、試料装填冶具８２０及びサンプルホルダ４００が一致して回転し、サンプルをピンセットによって試料クランプ４４９と試料支持プラットフォーム４４１との間に人間工学的に好ましい垂直配向で装填できるようにする。試料クランプ４４９は、クランプ制御ねじ８２３を時計回りに回すことで、試料を試料支持プラットフォーム４４１にクランプするように下降する。シャッターカバー４４２が閉じて、サンプルホルダは安全にワークステーションから取り外される。
【００１７】
サンプルホルダからのサンプルの取り外しは、図１６〜図１９に示すように、ホルダを直立位置からワークステーション内へと挿入することから始まる。デュワー４２０及びワークステーションサンプル移送空間８１０に寒剤が充填され、クライオトランスファーホルダから取り外されるサンプル用のサンプルボックスが、サンプル移送空間の寒剤内へと入れられる。シャッターカバー４４２が開く。試料クランプ４４９は、クランプ制御ねじ８２３を反時計回りに回すことで、試料支持プラットフォーム４４１から離れるように上昇する。ここで、サンプルホルダを、図１８及び図２１に示す試料取外しワークステーション位置へと回転させる。試料装填冶具８００及びサンプルホルダ４００が一致して回転し、サンプルがホルダからワークステーションサンプル移送空間の寒剤内へと落ちるように重力によって促されることでサンプルを取り外すことを可能にする。サンプルはピンセットで回収されてサンプルボックス内に入れられる。
【００１８】
本発明を詳細に上述したが、関連技術分野の当業者にとっては、本発明が本発明の精神から逸脱することなく変更されてもよいことは明白であろうことが明確に理解されよう。本発明には、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、形態、設計又は構造について様々な変更を行うことができる。このため、上述の説明は限定よりも例示として考えられ、本発明の真の範囲は以下の請求項に定義されるものである。
【００１９】
本明細書の説明に用いられるいずれの要素、動作又は指示も、明確に記載されていない限りは本発明に対して不可欠又は必須なものとして考えられるべきではない。また、本明細書で使用されているように、「ａ」という冠詞は１つ以上のものを含むようになっている。また、「に基づいて」という表現は、明確に記載されていない限りは「に少なくとも部分的に基づいて」を意味するようになっている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2019083191.tif 000019
【図１８】
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【図１９】
2019083191.tif 000021
【図２０】
2019083191.tif 000022
【図２１】
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【外国語明細書】
2019083191000001.pdf