(57)【要約】      （修正有）【課題】ストレプトコッカス・サーモフィルス(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ)ＣＲＩＳＰＲ3/ＣａｓシステムのＣａｓ9-ｃｒＲＮＡ複合体の単離またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ組み立ておよびｃｔＲＮＡおよびプロトスペーサー隣接モチーフと相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡの切断のための使用。【解決手段】少なくとも1つの点突然変異によってポリペプチド中の活性部位(ＰｕｖＣおよびＨＮＨ)のうち一方を不活化することによる、Ｃａｓ9ポリペプチドの、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を切断するニッカーゼへの変換のための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの活性ポリペプチド-ポリリボヌクレオチド複合体の組み立てのための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣａｓ9-ｃｒＲＮＡ複合体特異性のリプログラミングのための標的ＤＮＡ分子の部位特異的修飾のための方法。【選択図】図２０
2019030321.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的DNA分子を修飾するためのCas9-crRNA複合体を調製する方法であって、
前記方法は、in vitroにおいてCas9ポリペプチドをcrRNAおよびtracrRNAと接触させてCas9-crRNA複合体を形成する工程を含み、
ここで、前記crRNAは、標的ＤＮＡ分子のポリヌクレオチド配列に部位特異的に結合するように設計されており、前記crRNAは標的ＤＮＡ分子のポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記の標的DNA分子の修飾が、前記Cas9-crRNA複合体を標的ＤＮＡ分子に接触させ、それによって部位特異的にCas9-crRNA複合体を標的ＤＮＡ分子に結合するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的ＤＮＡ分子が二本鎖である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Cas9ポリペプチドが、組換えＤＮＡ技術または化学合成によって製造されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Cas9ポリペプチドが、遺伝子改変された微生物から単離されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記の標的DNA分子の修飾が、前記Cas9-crRNA複合体を標的DNA分子と接触させ、それによってCas9-crRNA複合体が標的DNA分子を部位特異的に切断するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
標的DNA分子のポリヌクレオチド配列に相補的なcrRNAのポリヌクレオチド配列が約20ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
化学合成によって前記crRNAを製造することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記Cas9-crRNA複合体がＲＮアーゼＩＩＩの不存在下において形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Cas9ポリペプチドが、RuvC活性部位モチーフまたはHNH活性部位モチーフ中に突然変異を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
異種標的DNA分子を修飾するためのCas9-crRNA複合体を調製する方法であって、
in vitroにおいてCas9ポリペプチドをcrRNAおよびtracrRNAと接触させてCas9-crRNA複合体を形成する工程であって、前記crRNAが、Cas9ポリペプチドに対して異種であり、かつ、Cas9-crRNA複合体が標的DNA分子に結合するように設計されている工程; および
標的DNA分子をCas9-crRNA複合体と接触させ、それによってCas9-crRNA複合体が標的DNA分子を修飾する工程、
を含む方法。
【請求項１２】
前記crRNAが、
標的DNA分子のポリヌクレオチド配列を同定し; そして
crRNAがDNA分子のポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を含むように調製することによって得られたものである、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記crRNAが、化学合成によって調製されたものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記Cas9ポリペプチドが、RuvC活性部位モチーフまたはHNH活性部位モチーフ中に突然変異を含有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記crRNAが、標的ＤＮＡ分子のポリヌクレオチド配列に相補的な少なくとも２０ヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を含有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記Cas9ポリペプチドが、ＲＮアーゼＩＩＩの不存在下にcrRNAおよびtracrRNAと接触される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的ＤＮＡ分子が、プロトスペーサー隣接モチーフを含有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的ＤＮＡ分子が二本鎖であり、Cas9-crRNA複合体が、標的DNA分子の部位特異的二本鎖開裂によって標的ＤＮＡ分子を修飾する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
標的DNA分子を修飾するためのCas9-crRNA複合体を調製する方法であって、
標的ＤＮＡ分子のポリヌクレオチド配列を同定する工程；
前記標的ＤＮＡ分子のポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を持つcrRNAを調製する工程；および、
Cas9ポリペプチドをcrRNAおよびtracrRNAと接触させてCas9-crRNA複合体を形成する工程であって、前記crRNAが、部位特異的に標的DNA分子に結合するように設計されており、かつ、Cas9ポリペプチドに対して異種である、工程；
を含む方法。
【請求項２０】
前記Cas9ポリペプチドが、RuvC活性部位モチーフまたはHNH活性部位モチーフ中に突然変異を含有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記Cas9ポリペプチドが、遺伝子改変された微生物から単離されたものであるか、前記Cas9ポリペプチドが、組換えＤＮＡ技術または化学合成によって製造されたものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記の標的DNA分子の修飾が、標的DNA分子をCas9-crRNA複合体に接触させて、それによってCas9-crRNA複合体が標的DNA分子を部位特異的に切断するものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
crRNAが、標的DNA分子に対して異種である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
標的DNA分子を修飾するためのCas9-crRNA複合体を調製する方法であって、
組換えCas9ポリペプチドをcrRNAおよびtracrRNAと接触させて、Cas9-crRNA複合体を形成する工程であって、ここで、前記crRNAは標的DNA分子に部位特異的に結合するようにプログラムされ、前記crRNAは前記Cas9ポリペプチドおよび標的DNA分子に対して異種である工程; および、
標的DNA分子をCas9-crRNA複合体と接触させ、それによってCas9-crRNA複合体が標的DNA分子を部位特異的に修飾する工程；
を含む方法。
【請求項２５】
前記Cas9ポリペプチドが、RuvC活性部位モチーフまたはHNH活性部位モチーフ中に突然変異を含有すし、それによって、Cas9ポリペプチドがニッカーゼであり；
標的DNA分子をニッキングすることにより、前記Cas9-crRNA複合体が部位特異的に標的DNA分子を修飾する；
請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記Cas9-crRNA複合体が、ＲＮアーゼＩＩＩの不存在下に形成される、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、各々、参照によりその全文が本明細書に明確に組み込まれる同時係属中の2012年3月20日に出願された米国特許出願番号第61/613,373号および2012年4月17日に出願された第61/625,420号の優先権を主張する。
【０００２】
CRISPR/Casシステムは、細菌および古細菌においてウイルスおよびプラスミドに対する適応免疫を提供する。侵入核酸のサイレンシングは、外来核酸ターゲッティングおよび分解のガイドとして作用する低分子干渉crRNAを予め負荷されたリボ核タンパク質(RNP)複合体によって実行される。本発明において、本発明者らは、Cas9-crRNA複合体の単離を記載し、この複合体が、in vitroで、crRNA配列と相補的であり、対応する配列のすぐ近くに短いプロトスペーサー隣接モチーフ(proto-spacer adjacent motif)(PAM)を有する標的DNA分子中の特定の部位で、二本鎖分解をもたらすことを実証する。本発明者らは、DNA切断が、Cas9内の2つの別個の活性部位(RuvCおよびHNH)によって実行されて、反対側のDNA鎖に部位特異的ニックを生成することを示す。Cas9-crRNA複合体の配列特異性は、標的DNA中のプロトスペーサー配列と相補的である20ntの断片を含む42ntのcrRNAによって決定される。複合体は、in vitroまたはin vivoで組み立てられ得る。要するに、本発明者らのデータは、Cas9-crRNA複合体が、配列特異的標的部位認識および2つの別個の鎖のニックによる切断を用いて、RNA誘導性エンドヌクレアーゼとして機能することを実証する。
【背景技術】
【０００３】
クラスター化して規則的な配置の短い回文反復配列(Clusterd Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)は、cas(CRISPR関連)遺伝子と一緒に、細菌および古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成する(Barrangouら、2007. Science 315:1709〜12頁)。CRISPRは、ファージまたはプラスミドDNAに起因することが多い、大きさの類似するスペーサーと呼ばれる独特の可変DNA配列が間に入った短い保存された反復配列からなる(Barrangouら、2007. Science 315:1709〜12頁;Bolotinら、2005. Microbiology 151:2551〜61頁;Mojicaら、2005. J Mol Evol 60:174〜82頁)。CRISPR-Casシステムは、CRISPR領域中に挿入され、対応する配列を保持するファージおよびプラスミドに対するその後の曝露に対する免疫を提供する、外来DNA(スペーサー)の短い部分を獲得することによって機能する(Barrangouら、2007. Science 315:1709〜12頁;Brounsら、2008. Science 321:960〜4頁)。CRISPR-Cas免疫は、一般に、i)適応/免疫化/スペーサー獲得、ii)CRISPR発現/crRNA生合成、iii)干渉/免疫と呼ばれる3つの段階によって実施される(Horvath & Barrangou、2010. Science 327:167〜70頁;Deveauら、2010.Annu Rev Microbiol. 64:475〜93頁;Marraffini & Sontheimer、2010.Nat Rev Genet 11、181〜90頁;Bhayaら、Annu Rev Genet 45:273〜97頁;Wiedenheftら、2012. Nature 482:331〜338頁)。本発明において、本発明者らは、具体的に、外来核酸のcrRNA媒介性サイレンシングを可能にする干渉/免疫ステップに焦点を当てている。
【０００４】
高度に多様なCRISPR-Casシステムは、コアエレメントの内容および配列に基づいて、3つの主要なタイプに分類され、これらは10種のサブタイプにさらに細分される(Makarovaら、2011. Nat Rev Microbiol 9:467〜77頁)。外来核酸のcrRNA媒介性サイレンシングに関与する核タンパク質複合体の構造的組織化および機能は、個別のCRISPR/Casの種類間で異なっている(Wiedenheftら、2012. Nature 482:331〜338頁)。タイプI-Eシステムでは、大腸菌(Escherichia coli)によって例示されるように、crRNAが、Cascade(CRISPR-associated complex for antiviral defence)と呼ばれるマルチサブユニットエフェクター複合体(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)に組み込まれており(Brounsら、2008. Science 321:960〜4頁)、ターゲッティングされるDNAと結合し、シグネチャーCas3タンパク質による分解を誘発する(Sinkunasら、2011. EMBO J 30:1335〜42頁;Beloglazovaら、2011. EMBO J 30:616〜27頁)。スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)およびパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)のタイプIII CRISPR/Casシステムでは、Cas RAMPモジュール(Cmr)およびcrRNA複合体は、in vitroで合成RNAを認識し、切断するが(Haleら、2012. Mol Cell 45:292〜302頁;Zhangら、2012. Mol Cell、45:303〜13頁)、スタフィロコッカス・エピデルミデス(Staphylococcus epidermidis)のCRISPR/Casシステムは、in vivoでDNAを標的とする(Marraffini & Sontheimer、Science. 322:1843〜5頁)。
【０００５】
タイプII CRISPR/Casシステム、より具体的には、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)DGCC7710のCRISPR3/Casシステム(Horvath & Barrangou, 2010. Science 327:167-70頁)によるDNAサイレンシングに関与するRNP複合体は、12のリピート-スペーサー単位の上流に位置する遺伝子cas9、casl、cas2およびcsn2からなる(図1A)。Cas9(cas5またはcsn1と以前は名付けられていた)は、タイプIIシステムのシグネチャー遺伝子である(Makarovaら、2011. Nat Rev Microbiol 9:467〜77頁)。密接に関連しているS.サーモフィルスCRISPR1/Casシステムでは、cas9の破壊は、crRNA媒介性DNA干渉を無効にする(Barrangouら、2007. Science 315:1709〜12頁)。本発明者らは、最近、S.サーモフィルスCRISPR3/Casシステムが、大腸菌に移動され、この異種システムがプラスミド形質転換およびファージ感染に対する保護を新規に提供することを示した(Sapranauskasら、2011. Nucleic Acids Res 39:9275〜82頁)。S.サーモフィルスCRISPR3によって提供されるファージおよびプラスミドDNAに対する干渉は、スペーサー由来crRNAと相補的であるプロトスペーサー配列およびプロトスペーサーのすぐ下流に位置する、保存されたPAM(プロトスペーサー隣接モチーフ)配列、NGGNGの標的DNA内での存在を必要とする(Deveauら、2008. J Bacteriol 190:1390〜400頁;Horvathら、2008. J Bacteriol 190:1401〜12頁;Mojicaら、2009. Microbiology 155:733〜40頁)。PAMまたは定義されたプロトスペーサー位置における単一点突然変異によって、ファージまたはプラスミドがCRISPR媒介性免疫を回避することが可能となる(Deveauら、2008. J Bacteriol 190:1390〜400頁;Garneauら、2010. Nature 468:67〜71頁;Sapranauskasら、2011. Nucleic Acids Res 39:9275〜82頁)。本発明者らは、異種システムにおいて、cas9がCRISPRによってコードされる干渉に必要な唯一のcas遺伝子であるということを確立し(Sapranauskasら、2011. Nucleic Acids Res 39:9275〜82頁)、このタンパク質が侵入DNAのcrRNAプロセシングおよび/またはcrRNA媒介性サイレンシングに関与していることを示唆する。S.サーモフィルスCRISPR3/CasシステムのCas9は、1,409個のaa残基からなる大きなマルチドメインタンパク質である(Sapranauskasら、2011. Nucleic Acids Res 39:9275〜82頁)。Cas9は、アミノ末端付近のRuvC様ヌクレアーゼドメインおよびタンパク質の中央のHNH様ヌクレアーゼドメインの2つのヌクレアーゼドメインを含有する。突然変異解析によって、Cas9によってin vivoで提供される干渉は、RuvC-およびHNH-モチーフの両方を必要とするということが確立された(Sapranauskasら、2011. Nucleic Acids Res 39:9275〜82頁)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Makarovaら、2011. Nat Rev Microbiol 9:467〜77頁
【非特許文献２】Wiedenheftら、2012. Nature 482:331〜338頁
【非特許文献３】Brounsら、2008. Science 321:960〜4頁
【非特許文献４】Sinkunasら、2011. EMBO J 30:1335〜42頁;Beloglazovaら、2011. EMBO J 30:616〜27頁
【非特許文献５】Haleら、2012. Mol Cell 45:292〜302頁
【非特許文献６】Zhangら、2012. Mol Cell、45:303〜13頁
【非特許文献７】Marraffini & Sontheimer、Science. 322:1843〜5頁
【非特許文献８】Horvath & Barrangou, 2010. Science 327:167-70頁
【非特許文献９】Barrangouら、2007. Science 315:1709〜12頁
【非特許文献１０】Sapranauskasら、2011. Nucleic Acids Res 39:9275〜82頁
【非特許文献１１】Deveauら、2008. J Bacteriol 190:1390〜400頁
【非特許文献１２】Horvathら、2008. J Bacteriol 190:1401〜12頁;Mojicaら、2009. Microbiology 155:733〜40頁
【非特許文献１３】Garneauら、2010. Nature 468:67〜71頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
S.サーモフィルスCRISPR3/CasシステムのCas9-crRNA複合体の単離ならびに別個の構成要素からのin vitroでの複合体組み立ておよびcrRNAと相補的であるヌクレオチド配列を有する合成オリゴデオキシヌクレオチドおよびプラスミドDNAを両方ともPAM依存的に切断するという実証が提供される。さらに、本発明者らは、PAMが、二本鎖DNAとの関連で認識され、in vitro DNA結合および切断にとって重要であるという実験的証拠を提供する。最後に、本発明者らは、Cas9 RuvC-およびHNH-活性部位が、反対側のDNA鎖の切断に関与していることを示す。総合すると、本発明者らのデータは、Cas9-crRNA複合体が、標的部位認識のためにRNAを、DNA切断のためにCas9を使用するRNA誘導性エンドヌクレアーゼとして機能することを実証する。DNA標的の特異性が小さいcrRNAによってコードされ、切断機構が単一ドメイン、マルチドメインCasタンパク質からなるCas9-crRNA複合体の簡単なモジュラー組織化は、ユニバーサルなRNA誘導性DNAエンドヌクレアーゼの操作のための多用途なプラットフォームを提供する。実際、本発明者らは、Cas9-crRNA複合体内のRNA配列を変更することによって、in vitroおよびin vivo適用の両方のために、プログラム可能なエンドヌクレアーゼが設計され得るという証拠を提供し、本発明者らは、この新規適用のための概念の証明を提供する。これらの知見は、RNA指向性DNA処置(RNA-directed DNA surgery)のための新規分子ツールを開発するための道を開く。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
適した条件下で、標的ポリデオキシヌクレオチド分子と、少なくとも1種のRNA配列ならびにRuvC活性部位モチーフおよびHNH活性部位モチーフのうち少なくとも一方を含むRNA誘導性DNAエンドヌクレアーゼを接触させることによって、RNA配列と標的DNA分子の相補的結合によって決定される領域において修飾された標的ポリデオキシヌクレオチド分子をもたらす、標的DNA分子を部位特異的に修飾するための方法が提供される。本方法は、標的二本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは一本鎖ポリデオキシヌクレオチドを含む組成物を適した条件下でインキュベートする工程を含み、これでは、二本鎖ポリデオキシヌクレオチドは、一本鎖ポリデオキシヌクレオチドにとって必須ではない短いプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を含有し、PAMは、5'NGGNG-3'配列を含み、3'および5'領域を含むポリリボヌクレオチド(crRNA)を含有し、これでは、3'領域は、CRISPR遺伝子座を含有する微生物中に存在する少なくとも22ntのリピートを含み、5'領域は、CRISPR遺伝子座中のリピートのすぐ下流の少なくとも20ntのスペーサー配列からなり、これは、標的ポリヌクレオチド、ポリペプチドの一部に対して実質的に相補的であり、所望により、相補的であり、ここで、ポリペプチドのアミノ酸配列およびS.サーモフィルスまたは遺伝子改変された大腸菌を含めた遺伝子改変された微生物から単離された配列番号1のアミノ酸配列は、少なくとも80%の同一性を有するか、またはポリペプチドは、組換えDNA技術もしくは化学合成から選択される方法によって製造され;5'および3'領域を含む配列番号5(または少なくとも80%の同一性を有する)のヌクレオチド配列のポリリボヌクレオチドtracrRNAを含有し、ここで、5'領域は、少なくとも22のヌクレオチドからなり、crRNAの22ヌクレオチドの3'領域に対して相補的であり、ならびに3'領域を含有する。ここで、ポリリボヌクレオチドは、in vitro転写または化学合成によって製造される。適した条件は、反応が起こり得るin vitroまたはin vivo条件を意味する。
【０００９】
D31A(配列番号2)、N891A(配列番号3)およびH868A(配列番号4)点突然変異によって例示される、少なくとも1つの(on)点突然変異によってポリペプチド中の活性部位(RuvCまたはHNH)の一方を不活化することによって、Cas9ポリペプチドを、二本鎖DNAの一方の鎖のみを切断するニッカーゼに変換する方法が提供される。RuvCモチーフ突然変異体は、5'NGGNG-3'モチーフに関して下側のDNA鎖のみを切断し、一方で、HNHモチーフ突然変異体は、上側の鎖を切断する。
【００１０】
ポリペプチド-ポリリボヌクレオチド複合体は、遺伝子改変された微生物(例えば、大腸菌またはストレプトコッカス・サーモフィルス)から単離されてもよく、または別個の構成要素からin vitroで組み立てられてもよい。遺伝子改変された微生物では、複合体の構成要素は、遺伝子改変された微生物の宿主プロモーターまたは天然宿主ゲノムに由来するプロモーターを含有する1、2または3種の別個のプラスミドでコードされ得る。
【００１１】
複合体組み立てに適した条件下で、複合体の構成要素をインキュベートする工程を含む、in vitroで活性ポリペプチド-ポリリボヌクレオチド複合体を組み立てる方法が提供される。複合体は、3種または4種の構成要素を使用して組み立てられ得る。3種の構成要素を組み立てる方法は、複合体組み立てに適した条件下で、Cas9ポリペプチド、78ntのtracrRNAポリリボヌクレオチド(配列番号5)および42ntのcrRNAポリリボヌクレオチド(5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3')(配列番号15)をインキュベートする工程を含む。4種の構成要素を組み立てる方法は、Cas9ポリペプチド、102ntのtracrRNAポリリボヌクレオチド(配列番号6)、配列5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3'(配列番号15)を含有するポリリボヌクレオチド、およびそれぞれの両端に位置する領域およびRNアーゼIIIポリペプチドをインキュベートする工程、二本鎖RNAポリヌクレオチドを切断する工程を含む。配列5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3'(配列番号15)を含有するポリリボヌクレオチドの例として、配列番号8、配列番号9、配列番号10,配列番号11および配列番号12がある。適したRNアーゼIIIの供給源の例として、大腸菌またはストレプトコッカス・サーモフィルスが挙げられる。
【００１２】
別個の構成要素を混合することによって、または単一のリピート-スペーサー-リピート単位を含有するカセットを使用することによって、Cas9-crRNA複合体特異性をリプログラミングするための方法が提供される。適した制限エンドヌクレアーゼを使用してカセット中の2つのリピートの間に任意の配列が挿入され得る。カセットは、in vivoで配列をターゲッティングするために、またはin vitroでの複合体組み立てに適したRNAリボヌクレオチドを製造するために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Cas9タンパク質がcrRNAと同時精製することを示す図である。(A)S.サーモフィルスのCRISPR3/Casシステムの模式図。4種のcas遺伝子(cas9、casl、cas2、csn2)が、13のリピート(R)配列および12の独特なスペーサー(S1〜S12)からなるCRISPRリピート-スペーサーアレイの上流に位置している。タイプII CRISPRシステムにおいてcrRNA成熟に必要なtracrRNA(Deltchevaら、2011. Nature 471:602〜7頁)は、cas9遺伝子の上流に位置しており、CRISPR3/Casシステムのその他のエレメントに関して反対側のDNA鎖上にコードされる(矢印によって示される)。(B)Cas9-crRNA複合体の同時発現のために使用される2種のプラスミドの異種遺伝子座の模式図。大腸菌(E.coli)RR1株は、pCas9(-)1 SP(Cas1、Cas2、Csn2、SP1およびtracrRNAをコードする)およびpASKIBA-Cas9(Cas9のStrepタグが付いた型をコードする)プラスミドを含有していた。(C)プローブとして抗crDNAオリゴヌクレオチドを使用するCas9-crRNA複合体のノーザン解析。M1-スペーサーS1-リピート単位に対応する84ntのオリゴデオキシヌクレオチド;M2-予測されたS.サーモフィルスCRISPR3 crRNAに対応する42ntの合成オリゴリボヌクレオチド(図4を参照のこと);crRNA(wt)-wt Cas9複合体から単離されたcrRNA;K1-DNアーゼIを用いて15分間処理したcrRNA(wt);K2-RNアーゼIを用いて15分間処理したcrRNA(wt)、D31A-Cas9 D31A突然変異体複合体から精製されたcrRNA;N891A-Cas9 N891 A突然変異体複合体から精製されたcrRNA。
【図２】全長CRISPR遺伝子座とのCas9同時発現によって得られたCas9-crRNA複合体によるDNA切断を示す図である。(A)SthCRISPR3/Casシステムの常在性の12のスペーサー-リピートアレイを保持する組換えpCas9(-)プラスミドおよびC末端にStrep-タグを有するcas9遺伝子を保持するpASKIBA-Cas9プラスミドのCRISPR/Cas遺伝子座の模式図。(B)オリゴ二本鎖切断アッセイ。pCas9(-)およびpASKIBA-Cas9プラスミドの両方が、大腸菌において同時発現され、Cas9-crRNA複合体が精製され、(+)鎖の5'末端で33Pを用いて標識されたSP1(第1のプロトスペーサー)およびSP2(第2のプロトスペーサー)オリゴ二本鎖(oligoduplexes)を使用する切断解析に付された。反応生成物をPAAゲルで解析した。
【図３】SthCRISPR3/Casシステムによって提供された大腸菌細胞におけるプラスミド形質転換に対する免疫性を示す図である。(A)SthCRISPR3/Casシステムの常在性の12のスペーサー-リピートアレイを保持する組換えプラスミドpCRISPR3および1つのスペーサー-リピート単位を保持する操作されたpCRISPR3-SP1プラスミドのCRISPR/Cas遺伝子座の模式図。(B)大腸菌細胞におけるSthCRISPR3/Casシステムによるプラスミド形質転換の干渉。プラスミドpACYC184、pCRISPR3またはpCRISPR3-SP1を保持する大腸菌RR1レシピエント株を、プロトスペーサーおよびPAMを保持するプラスミドpSP1またはpUC18を用いて形質転換した(1)。形質転換効率は、プラスミドDNA1ナノグラムあたりのcfu(平均±SD)として表される。
【図４】S.サーモフィルスDGCC7710、LMD-9およびS.ピオゲネス(pyogenes)SF370株由来のタイプIIA CRISPR/Casシステムの比較を示す図である。(A)CRISPR/Casシステムの模式的な組織構成。S.ピオゲネスにおいてcrRNA成熟に必要なtracrRNAに対応するヌクレオチド配列(2)が、LMD-9およびDGCC7710において存在する。破線によってつながっている対応するタンパク質配列間の同一および類似の残基のパーセンテージ(括弧内)。(B)保存されたリピート配列およびtracrRNAのアラインメント。DGCC7710およびLMD-9に由来する対応する配列は同一である。3種の株すべてにおいて同一であるヌクレオチド位置が、アラインされた配列の下にアスタリスクで標識されている。図4(B)は、現れる順に、配列番号50、50〜52および52〜53をそれぞれ開示する。(C)crRNA配列の比較。S.ピオゲネスcrRNAの配列および長さを、大規模シークエンシング(deep sequencing)解析によって決定した(2)。S.サーモフィルスLMD-9(2)およびDGCC7710(本研究)株由来のcrRNAのおよその長さを、ノーザンブロット解析によって決定した。図4(C)は、現れる順に配列番号54〜56をそれぞれ開示する。
【図５】Cas9-crRNA複合体が、in vitroでプロトスペーサー内の二本鎖DNAを切断することを示す図である。(A)切断アッセイにおいて使用されるオリゴ二本鎖基質。55ntのオリゴ二本鎖SP1は、プロトスペーサー1(赤色文字)、PAM(青色文字)およびpSP1プラスミド中のものと同一である両側の10ntのそれぞれの両端に位置する配列を含有する。SP1中、crRNAの5'末端断片と相補的であるオリゴ二本鎖DNA鎖(赤色文字)は、(+)鎖と名付けられ、反対側のDNA鎖は、(-)鎖と名付けられている。図5(A)は、現れる順に、配列番号31、7および34をそれぞれ開示する。(B)オリゴ二本鎖SP1切断。2.5nMのCas9-crRNA複合体および1nMの(+)または(-)鎖いずれかの5'末端で33Pで標識されたSP1オリゴ二本鎖を、37℃の反応バッファー(10mM Tris-HCI pH=7.5、10mM NaCl、10mM MgCl2、0.1mg/ml BSA)中、変動する時間間隔の間(30秒〜10分間)インキュベートし、反応生成物を20% PAAゲルで解析した。レーンM1およびM2は、それぞれ、(-)および(+)DNA鎖の切断生成物に相当する化学合成された5'末端33P標識された37ntおよび18ntのオリゴデオキシヌクレオチドを含有する。切断位置は、矢印によって指定されている。図5(B)は、配列番号31を開示する。(C)プラスミド切断アッセイにおいて使用されるpSP1プラスミド(Sapranauskasら、2011. Nuclic Acids Res 39:9275〜82頁)の模式図。図5(C)は、配列番号57を開示する。(D)pSP1プラスミド切断。pSP1切断生成物のアガロースゲル解析(左パネル)。SC(スーパーコイルプラスミドDNA)、OC(鎖の一方にニックの入った開環DNA)、FLL(両方の鎖で切断された全長直鎖DNA)。37℃で最終反応混合物は、反応バッファー中に2.5nMのpSP1プラスミドおよび2.5nMのCas9-crRNA複合体を含有していた(セクションB)。pSP1プラスミド切断生成物の(+)(上側部分)および(-)(下側部分)鎖の直接配列決定電気泳動図(右パネル)。配列の端でのアデニン(ここで示される逆相補配列におけるT)の鋳型によらない付加は、ポリメラーゼによって引き起こされるシークエンシングのアーチファクトである。図5(D)は、現れる順に、それぞれ、配列番号57〜59、58および60を開示する
【図６】crRNAを欠くCas9-Chisタンパク質のDNA結合および切断解析を示す。(A)二本鎖SP1オリゴ二本鎖と、(B)一本鎖s(+)SP1オリゴヌクレオチドと結合するCas9-Chisタンパク質の電気泳動移動度シフト解析(EMSA)。結合バッファー(25℃の40mM酢酸Tris、pH8.3、0.1EDTA、0.1mg/ml BSA、10% v/vグリセロール)中で電気泳動移動度シフト実験を実施した。反応物は、0.5nMの33P標識オリゴ二本鎖および各レーンの上に示される濃度のタンパク質を含有していた。(C)オリゴヌクレオチド切断アッセイ。5nMのCas9-Chisタンパク質を、1nMオリゴヌクレオチドとともに、37℃の反応バッファー(10mM Tris-HCl、pH=7.5、10mM NaCl、10mM MgCl2、0.1mg/ml BSA)中でインキュベートした。SP1オリゴ二本鎖を、(+)または(-)鎖の5'で33Pで標識した。一本鎖オリゴヌクレオチドs(+)SP1を、5'末端で33Pで標識した。
【図７】Cas9-crRNA複合体のリプログラミングを示す図である。(A)Cas9-crRNA複合体のリプログラミングに使用される2種のプラスミド中の異種遺伝子座の模式図。pCas(-)SPNを、新規スペーサー配列(SN)(5'-CC ACC CAG CAA AAT TCG GTT TTC TGG CTG-3'(配列番号16))を挿入することおよび(1)に記載されるCas9遺伝子を不活化することによって、pCas9(-)プラスミドから構築した(図2Aを参照のこと)。(B)プラスミドDNA切断生成物のアガロースゲル解析。pSP1およびpSP1 +SPN(Aatll部位上に、新規プロトスペーサーおよびPAMが挿入されたpSP1プラスミド)を2.5nMの濃度で、2nMのCas9-crRNA複合体とともに、37℃の反応バッファー(10mM Tris-HCl pH=7.5、10mM NaCl、10mM MgCl2、0.1mg/ml BSA)中で、可変の時間間隔の間インキュベートし、反応生成物をアガロースゲルで解析した。SC(スーパーコイルプラスミドDNA)、OC(DNA鎖の一方にニックの入った開環DNA)、FLL(両方の鎖で切断された全長直鎖DNA)。(C)オリゴ二本鎖SP1切断。2.5nMのCas9-crRNA複合体および1nMの(+)または(-)鎖のいずれかの5'末端で33Pで標識されたSPNオリゴ二本鎖(表S2)を、37℃の反応バッファー(10mM Tris-HCl pH=7.5、10mM NaCl、10mM MgCl2、0.1mg/ml BSA)中でインキュベートした。M1-18ntの長さのマーカー。レーンM1およびM2は、それぞれ、(+)および(-)DNA鎖の切断生成物に相当する、化学合成された5'末端33P標識された18ntおよび37ntのオリゴデオキシヌクレオチドを含有する。(D)SPNオリゴ二本鎖基質および切断生成物の模式図。SPNオリゴ二本鎖は、新規プロトスペーサー(赤色文字)、PAM(青色文字)を含有する。切断位置は矢印によって指定されている。図7(D)は、配列番号39を開示する。
【図８】CRISPRによってコードされる免疫性に対するスペーサーの長さの影響を示す図である。(A)形質転換プラスミド中に挿入されたプロトスペーサーの短い型の模式図。図8(A)は、現れた順に、それぞれ、配列番号7および61〜66を開示する。(B)プラスミド形質転換効率に対するプロトスペーサーの長さの効果。形質転換効率は、プラスミドDNA1ナノグラムあたりのcfu(平均±SD)として表される。(C)in vitro切断および結合実験において使用されるオリゴ二本鎖の模式図。図8(C)は、現れた順に、それぞれ、配列番号31および38を開示する。(D)Cas9-crRNA複合体による27bpのオリゴ二本鎖(全長プロトスペーサーSP1、黒丸)および20bpのオリゴ二本鎖(末端切断型プロトスペーサーSP1-20、四角)切断の経時的推移。(E)Cas9-crRNA複合体による、SP1およびSP1-20オリゴ二本鎖結合の電気泳動移動度シフト解析。
【図９】PAMが、Cas9-crRNA複合体によるin vitro DNA結合および切断にとって必要であることを示す図である。(A)プラスミドDNA切断生成物のアガロースゲル解析。3種の異なるプラスミド:PAM+プロトスペーサー+(プロトスペーサーおよびPAMの両方を含有するpSP1プラスミド)、PAM-プロトスペーサー-(複数のPAMを含有するが、プロトスペーサーを含有しないpUC18プラスミド)およびPAM-プロトスペーサー+(プロトスペーサーを含有するが、PAMを含有しないpSP1-pΔ(Sapranauskasら、2011. Mucleic Acids Res 39:9275〜82頁))を、2.5nMの濃度で、2nMのCas9-crRNA複合体とともに、37℃の反応バッファー(10mM Tris-HCl pH=7.5、10mM NaCl、10mM MgCl2、0.1mg/ml BSA)中で、可変の時間間隔の間インキュベートし、反応生成物をアガロースゲルで解析した。SC(スーパーコイルプラスミドDNA)、OC(DNA鎖の一方にニックの入った開環DNA)、FLL(両方の鎖で切断された全長直鎖DNA)。(B)一本鎖および二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドにおける(+)鎖加水分解の経時的推移。2nMのCas9-crRNAおよび1nMのオリゴデオキシヌクレオチドを含有する反応を、反応バッファー(セクションA)中、37℃で実施した。SP1(黒丸)およびSP1-pΔ(白四角)オリゴ二本鎖を、dsDNAとして使用した。s(+)SP1(白三角)およびs(+)SP1-pΔ(黒四角)を、ssDNAとして使用した。(C)および(D)Cas9-crRNA複合体によって結合するdsDNAおよびssDNA(+)鎖。反応物は、0.5nMの33P標識されたssDNAまたはdsDNAオリゴヌクレオチド、および各レーンの上に示される濃度のタンパク質を含有していた。室温で15分後、サンプルをPAGEに2時間付し、「材料および方法」に記載される通りに解析した。
【図１０】Cas9-crRNA複合体のRNA結合および切断解析を示す図である。(A)プロトスペーサー1、PAMを含有する84ntのRNA断片との、および両側の24ntのそれぞれの両端に位置する配列とのCas9-crRNA複合体結合の電気泳動移動度シフト解析(EMSA)。左パネル:RNA(-)鎖;中央パネル:RNA(+)鎖;右パネル:二本鎖RNA。解析に使用されたRNA断片は、RNAコード配列の前面でT7プロモーターが挿入されたPCR断片からのin vitro転写(TranscriptAid(商標)T7高収率転写キット、Fermentas)によって生成した。PCR断片コーディング(+)および(-)RNA鎖を、以下のプライマー対をそれに応じて用いてpSP1プラスミド(1)から得た:5' taatacgactcactataGggtaccgagctcgaattg 3'(配列番号17)/5'GGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTC-3'(配列番号18)および5'gggtaccgagctcgaattgaaattcTAAACG3'(配列番号19)/5'taatacgactcactataGggAAACAGCTATGACCATGATTACG3'(配列番号20)(T7 RNAポリメラーゼプロモーターに下線、転写開始を太字)。反応物は、1nMの33P標識されたRNA断片および各レーンの上に示される濃度のタンパク質を含有していた。室温で15分後、サンプルを、PAGEに2時間付し、「材料および方法」に記載される通りに解析した。(B)RNA切断アッセイ。2.5nMのCas9-crRNA複合体を、1nM(+)および(-)RNA鎖(左パネル)または(+)もしくは(-)鎖で標識された二本鎖RNA(右パネル)の存在下、37℃の反応バッファー(10mM Tris-HCl pH=7.5、10mM NaCl、10mM MgCl2、0.1mg/ml BSA)中でインキュベートした。反応生成物を変性PAAゲルで解析した。
【図１１】Cas9のRuvCおよびHNH活性部位モチーフが、反対側のDNA鎖の切断に寄与することを示す図である。(A)Cas9タンパク質内の保存された活性部位モチーフの局在性。Cas9 in vivo活性にとって重要であると同定されたアミノ酸残基(Sapranauskasら、2011. Nucleic Acids Res 39:9275〜82頁)が示されている。(B)Cas9および突然変異体タンパク質によるpSP1プラスミド切断のアガロースゲル解析。反応は、「材料および方法」に記載される通りに実施した。(C)D31A突然変異体の鎖の優先性。反応は、図2Aおよび「材料および方法」に記載の通りに実施した。D31突然変異体は、SP1オリゴ二本鎖の(+)鎖のみを切断する。図11(C)は、現れる順に、それぞれ、配列番号31および67を開示する。(D)N891A突然変異体の鎖の優先性。N891突然変異体は、SP1オリゴ二本鎖の(-)鎖のみを切断する。切断位置は、矢印によって指定されている。図11(D)は、現れる順に、それぞれ、配列番号31および68を開示する。
【図１２】Cas9活性部位突然変異体-crRNA複合体の特性を示す図である。(A)Cas9突然変異体D31A(RuvC様活性部位モチーフ)を用いて得られた反応生成物の直接配列決定。図12(A)は、現れる順に、それぞれ、配列番号58、59、58および58を開示する。(B)Cas9 N891A突然変異体(HNH様活性部位モチーフ)を用いて得られた反応生成物の直接配列決定。図12(B)は、現れる順に、それぞれ、配列番号58、58、58および60を開示する。(C)wt Cas9-crRNAおよび活性部位突然変異体複合体によるSP1オリゴ二本鎖結合。(D)Cas9-crRNA突然変異体複合体による(+)SP1鎖の切断。
【図１３】wt Cas9-Chisタンパク質の分子量を示す図である。室温で、500mM塩化ナトリウムを含有する10mMリン酸ナトリウム(pH7.4)バッファーを用いて予め平衡化されたSuperdex200 10/300 GLカラム(GE healthcare)を使用するゲルろ過実験を実施した。既知Mwのタンパク質のセットを使用して得られた標準曲線(黒丸)からの内挿によって、Cas9の見かけのMw(黒色三角)を算出した(Bio-Rad Gel Filtration Standards)。
【図１４】Cas9-crRNA複合体によるcrRNA指向性DNA切断の模式的配置および機序を示す図である。Cas9のドメイン構造が上部に模式的に示されている。Cas9-crRNA複合体は、PAMを含有するdsDNAと結合する。crRNAは、相補的(+)鎖と結合し、DNA鎖分離およびR-ループ形成をもたらす。三重複合体では、Cas9のRuvC活性部位は対を形成していない(-)鎖上の解離しやすいリン酸に位置するのに対し、HNH活性部位はcrRNAと結合されるDNA(+)鎖上の解離しやすいリン酸に位置する。両活性部位の協調作用は、PAMから4nt離れた二本鎖分解をもたらし、平滑末端DNAを生成する。図14は、現れる順に、それぞれ、配列番号31および69を開示する。
【図１５】Cas9-crRNAおよび切断生成物の未変性電気泳動を示す図である。0.5nM SP1オリゴ二本鎖の存在下、37℃の反応バッファー(10mM Tris-HCl pH=7.5、10mM NaCl、10mM MgCl2、0.1mg/ml BSA)中で、30分間インキュベートされた、各レーンの上に示される濃度のタンパク質。サンプルを、ローディングダイ溶液(50% v/vグリセロール中、0.01%ブロモフェノールブルーおよび75mM EDTA)と混合し、非変性PAGEによって解析した。Mと印を付けたゲルレーン(切断反応生成物の融解した形態)。ゲルの両側の画像はタンパク質-DNA複合体および各バンドに対応するDNAを例示し、ゲルの下の画像は反応後の主な基質の形態を例示する。
【図１６】Cas9-crRNA複合体によるプラスミドDNA切断を示す図である。(A)pSP1およびpUC18プラスミドDNA切断。Cas9-crRNA複合体を、実施例1において提供される反応バッファー中でpSP1およびpUC18プラスミドとともにインキュベートした。pSP1プラスミドは、5'-GGNG-3'PAM配列によってフランキングされた(が両端に位置する)プロトスペーサー1配列を含有していた。プロトスペーサー1配列は、pUC18中には存在しなかった。反応生成物を、アガロースゲルにおいて解析した。これらの条件下で、pSP1プラスミドは、直鎖形態に変換されるが、プロトスペーサー1配列を欠くpUC18プラスミドは、切断に対して耐性である。(B)構成要素のうち1種の非存在下でのpSP1切断反応。構成要素のうち1種(それぞれ、Cas9、crRNAまたはtracrRNA)を欠く反応混合物中では、pSP1プラスミドは切断されない。SC(スーパーコイルプラスミドDNA)、OC(DNA鎖の一方でニックの入った開環DNA)、FLL(両鎖で切断された全長直鎖DNA)。
【図１７】Cas9-crRNA複合体によるDNAオリゴ二本鎖切断を示す図である。crRNAと相補的であるオリゴ二本鎖の鎖は、(+)鎖と記されるのに対し、もう一方の鎖は(-)鎖と記される。切断反応をモニタリングするために、オリゴ二本鎖の(+)または(-)鎖のいずれかを、5'末端でP33標識した。M1およびM2は、切断生成物の大きさおよび切断位置のマップを決定するために使用される37ntの(-)鎖および18ntの(+)鎖に相当する合成オリゴヌクレオチドマーカーである。Cas9タンパク質は、プロトスペーサーの内側のオリゴ二本鎖の両鎖を切断し、37番目のヌクレオチドの後ろに5'末端を形成し、PAM(5'-GGNG-3')の4nt上流に平滑末端を残す。非特異的基質(K1およびK2)の両鎖は、Cas9-crRNA複合体とともに30分間インキュベートされた場合には切断されない。図17は、配列番号31を開示する。
【図１８】RNアーゼIIIの非存在下で組み立てられたCas9-crRNA複合体によるプラスミドDNA切断を示す図である。Cas9-crRNA複合体をpSP1プラスミドとともにインキュベートし、反応生成物をアガロースゲルで解析した。pSP1プラスミドは、crRNAを伴わずに組み立てられた複合体の存在下での切断に対して耐性である(左パネル)。pSP1プラスミドは、合成42nt crRNAを使用して(RNアーゼIIIなし)組み立てられた複合体の存在下で直鎖形態に変換される(中央パネル)。pSP1プラスミドは、CRISPR RNA転写物を使用して(RNアーゼIIIなし)組み立てられた複合体の存在下で直鎖および環状DNA形態の混合物に変換される(右パネル)。
【図１９】Cas9-crRNA複合体によるDNAオリゴ二本鎖切断を示す図である。crRNAと相補的であるオリゴ二本鎖の鎖は、(+)鎖と記されるのに対し、もう一方の鎖は(-)鎖と記される。切断反応をモニタリングするために、オリゴ二本鎖の(+)または(-)鎖のいずれかを、5'末端でP33標識した。M1およびM2は、切断生成物の大きさおよび切断位置のマップを決定するために使用される37ntの(-)鎖および18ntの(+)鎖に相当する合成オリゴヌクレオチドマーカーである。Cas9タンパク質は、プロトスペーサーの内側のオリゴ二本鎖の両鎖を切断し、37番目のヌクレオチドの後ろに5'末端を形成し、PAM(5'-GGNG-3')の4nt上流に平滑末端を残す。非特異的基質(K1およびK2)の両鎖は、Cas9-crRNA複合体とともに30分間インキュベートされた場合には切断されない。図19は、配列番号31を開示する。
【図２０】S.サーモフィルスDGCC7710のCRISPR3/Casシステムの(A)模式図を示す図である。4種のcas遺伝子(cas9、cas1、cas2、csn2)は、13のリピート(R)配列および12の独特なスペーサー(S1〜S12)からなるCRISPRリピート-スペーサーアレイの上流に位置する。タイプII CRISPR/CasシステムにおいてcrRNA成熟に必要なtracrRNA(Deltchevaら、2011. Nature 471、602〜7頁)は、cas9遺伝子の上流に位置しており、このシステムのその他のエレメントに関して反対側のDNA鎖上にコードされる(矢印によって示される)。(B) CRISPR領域への新規スペーサー挿入およびCRISPR RNA合成についての経路。所望のスペーサー配列をコードし、SapIおよびEco31I制限適合末端を含有する合成オリゴ二本鎖を、2つのリピート間に挿入した。PCRを使用してCRISPR領域を増幅した。CRISPR RNAをコードする新規スペーサーは、in vitro転写によって得た。(C)Cas9-RNA複合体のin vitro組み立て。CRISPR RNAおよびtracrRNA転写物を二本鎖に組み立てた。Cas9タンパク質をまず、RNA二本鎖とともにプレインキュベートし、続いて、RNアーゼIIIとともにその後のインキュベーションを行い、触媒的に適格なCas9-RNA複合体を作製した。
【図２１】A.pUC18プラスミドの模式図を示す図である。SapIおよびAatII制限部位の間の距離は775bpであるが、2つのスペーサー間の距離は612bpである。B.リプログラムされたCas9-crRNA複合体によるpUC18プラスミド切断。「1」-pUC18プラスミド;「2」-AatIIで切断されたpUC18;「3」-crRNA対応プロトスペーサー1を含有する複合体で切断されたpUC18;「4」-SapIで切断されたpUC18;「5」-crRNA対応プロトスペース2を含有する複合体で切断されたpUC18;「6」-AatIIおよびSapIで切断されたpUC18;「7」-レーン3および5において使用された複合体の混合物で切断されたpUC18。
【図２２】in vitroで組み立てられたCas9-RNA複合体を用いるゲノムDNA切断を示す図である。(A)直鎖λDNA切断生成物のアガロースゲル解析。ファージλDNAを、反応バッファー中、種々の時間間隔の間、Cas9-RNA複合体とともにインキュベートした。Cas9-RNA複合体の標的部位は、cos部位から8kb離れて位置する。(B)サザンブロット実験のためのプローブ選択。ゲノムDNAを、PstI酵素を用いて処理することによって断片化した。プロトスペーサーは、2つのPstI部位の間に位置する。ゲノムDNAがCas9-RNA複合体で切断される場合には、466bpの断片が検出されるはずである。そうでなければ、プローブは、1499bpの長さの断片とハイブリダイズする。(C)ゲノムDNA断片のサザンブロット解析。Cライン-PstIで断片化された大腸菌ゲノムDNA。Cas9-RNA-ゲノムDNAを、Cas9-RNA複合体とともにインキュベートし、その後断片化した。(D).Cas9-crRNA複合体によるヒトゲノムDNA切断。qPCRによって、無傷のDNA DNA断片の相対量を推定した。
【図２３】リポータープラスミド(pMTC-DSR+eGFP)中に含有されるターゲッティング配列を模式的に例示する図である。eGFPコード配列は、GAPDH遺伝子からイントロンによって分離される。5'および3' RFPコード配列が示されており、homolは相同組換えが生じるのに必要なRFP遺伝子中の相同配列を示す。A、B、CおよびDは、Cas9媒介性切断の4つの別個の標的部位を示す。標的AおよびBは、イントロン中に位置する。標的CおよびDは、eGFPのコーディング領域中に位置する。Creは、Creエンドヌクレアーゼの標的部位を示し、イントロン配列中に位置する。
【図２４】Cas9/RNA複合体の導入後にeGFP-陽性細胞の減少を示す図である。CHO-K1細胞を、リポータープラスミドおよびeGFP配列A(イントロンの)、eGFP配列C(コーディング)または非特異的配列KのいずれかをターゲッティングするcrRNAを含有するCas9/RNA複合体を用いてトランスフェクトした。eGFP-陽性細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって決定した。陰性対照として、細胞をトランスフェクトしなかったか(NC)、またはリポータープラスミド単独を用いて(DNA)、もしくはリポータープラスミドおよびCas9タンパク質単独を用いて、ならびにリポータープラスミドおよびCas9非特異的crRNA複合体(DNA+K)を用いてトランスフェクトした。
【図２５】RFPの出現が、相同組換え(HR)によるCas9/RNA媒介性二本鎖切断修復を示唆した細胞イメージを示す図である。リポータープラスミドおよびeGFP配列CをターゲッティングするCas9/RNA複合体を用いた同時トランスフェクションの48時間後、CHO-k1細胞を、eGFPおよびRFPのために蛍光顕微鏡によって可視化した。
【図２６】リポータープラスミド(pMTC-DSR+eGFP)中に含有されるターゲッティング配列を模式的に例示する図である。eGFPコード配列は、ゲノムDNAからコピーされたGAPDHイントロンによって分断されている。RFP N-およびC-コード配列は示される通りである。RFP遺伝子中の相同配列は、相同組換えが生じるのに必要である。eGFPのイントロン内に位置する標的Eは太字で示されている。
【図２７】合成crRNAおよびin vitro転写されたtracrRNAを使用するCas9/RNA複合体に対する、合成crRNAおよびtracRNAを使用するCas9/RNA複合体の機能類似性を示すゲルを示す図である。アガロースゲル電気泳動後にプラスミドを可視化した。レーンC:切断されていないプラスミド。レーン1〜3:Cas9+crRNAおよび1:対照in vitro転写されたtracrRNA;2:非修飾合成tracrRNA(89nt);または3:非修飾合成tracrRNA(74nt)のいずれかを用いて切断されたプラスミド。
【図２８】図28A〜Eは、リポータープラスミド(pMTC-DSR+eGFP)中に含有されるターゲッティング配列および可能性あるプロセシング/遺伝子再構成結果を模式的に示す図である。
【図２９】Cas9/RNA複合体の導入後のeGFP-陽性細胞の減少を示す図である。CHO-K1細胞を、リポータープラスミドおよびeGFP配列A(イントロン)、eGFP配列C(コーディング)または非特異的配列KのいずれかをターゲッティングするcrRNAを含有するCas9/RNA複合体を用いてトランスフェクトした。eGFP-陽性細胞のパーセンテージはフローサイトメトリーによって決定した。陰性対照として、細胞をトランスフェクトしなかったか(NC)、またはリポータープラスミド単独を用いて(DNA)、もしくはリポータープラスミドおよびCas9タンパク質単独を用いて、ならびにリポータープラスミドおよびCas9非特異的crRNA複合体(DNA+K)を用いてトランスフェクトした。
【図３０】リポータープラスミド(pMTC-DSR+eGFP)中に含有されるターゲッティング配列を模式的に示す図である。eGFPコード配列は、黒色で示されており、ゲノムDNAからコピーされたGAPDHイントロンによって分断されている。RFP N-およびC-コード配列は、灰色で示されている。RFP遺伝子中の相同配列(明るい灰色)は、相同組換えが生じるのに必要である。eGFPのイントロン内に位置する標的Eは、太字で示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下の限定されない例は、方法、組成物、使用および実施形態をさらに説明する。
【実施例１】
【００１５】
この実施例では、本発明者らは、S.サーモフィルスCRISPR3/CasシステムのCas9-crRNA複合体を単離し、それがPAM依存的に、合成オリゴデオキシヌクレオチドおよびcrRNAと相補的であるヌクレオチド配列を有するプラスミドDNAの両方を切断することを実証する。
さらに、本発明者らは、二本鎖DNAとの関連でPAMが認識され、in vitro DNA結合および切断にとって重要であるという実験的証拠を提供する。最後に、本発明者らは、Cas9のRuvCおよびHNHモチーフが、反対側のDNA鎖の切断に寄与することを示す。総合すると、本発明者らのデータは、Cas9-crRNA複合体が、標的部位認識のためにRNAモジュールを使用し、DNA切断のためにタンパク質モジュール中の2つの別個の活性部位を用いるRNA誘導性エンドヌクレアーゼとして機能することを実証する。これらの知見は、ユニバーサルなRNA誘導性エンドヌクレアーゼとして、プログラム可能なCas9-crRNA複合体を操作するための道を開く。
【００１６】
材料および方法
DNA操作。ストレプトコッカス・サーモフィルスDGCC7710株のゲノムDNAを、PCR反応において鋳型として使用して、cas9をクローニングした。C末端Strepタグを付けたCas9タンパク質変異体の発現のために使用されたpASKIBA3-Cas9プラスミドを作製するために、以下のプライマー:5'-ACGTCTCAAATGTTGTTTAATAAGTGTATAATAATTTC-3'(配列番号21)および5'-ACGTCTCCGCGCTACCCTCTCCTAGTTTG-3'(配列番号22)を用いて増幅されたPCR断片を、Esp3I部位によってpASK-IBA3発現ベクター中にクローニングした。C末端6xHisタグを付けたCas9タンパク質変異体(配列番号23として開示された「6xHis」)の発現のために使用された、pBAD-Cas9プラスミドを作製するために、以下のプライマー対:5'-ACGTCTCACATGACTAAGCCATACTCAATTGGAC-3'(配列番号24)および5'-ACTCGAGACCCTCTCCTAGTTTGGCAA-3'(配列番号25)を用いて増幅したPCR断片を、NcoIおよびXhoI部位によってpBAD24-Chis発現ベクター中にクローニングした。pASKIBA3-Cas9およびpBAD-Cas9プラスミド中のcas9遺伝子の完全シークエンシングは、元のcas9配列と相違を示さなかった。単一のスペーサー1を有するプラスミドpCas9(-)SP1(図1B)およびpCRISPR3-SP1(図2A)を得るために、以下のプライマー対:5'GACCACTTATTGAGGTAAATGAG3'(配列番号26)/5'CAAACCAGGATCCAAGCTAATACAGCAG-3'(配列番号27)((BamHI(GGATCC)部位に下線が引かれている)を用いてpCRISPR3プラスミドから増幅したPCR断片を、それぞれ、pCas9(-)およびpCRISPR3プラスミド中にクローニングした(Sapranauskasら、2011. Nucleic Acids Res 39:9275〜82頁)。
【００１７】
Cas9タンパク質およびCas9-crRNA複合体の発現および精製。Cas9タンパク質の(His)6タグを付けた(配列番号23として開示される「(His)6」)型を、S.サーモフィルスCRISPR4/Casシステム由来のCas3タンパク質について記載されたスキームを使用して発現させ、精製した(Sinkunasら、2011. EMBO J 30:1335〜42頁)。Cas9-crRNA複合体の精製のために、Cas9タンパク質のStrepタグを付けた型を、pCas9(-)SP1プラスミドを有する大腸菌RR1株において発現させた(図1B)。LB培養液にAp(100pg/μl)およびCm(10μg/ml)を補給した。Cas9-crRNA複合体単離のために、大腸菌細胞を2段階で増殖させた。第1に、4mlの細胞培養物を37℃で約0.5のOD600に増殖させ、0.2μg/mlのアンヒドロテトラサイクリン(AHT)(Sigma)を添加することによって発現を誘導した。4時間後、予め誘導した培養物の1/400を、Ap(100μg/ml)、Cm(12μg/ml)およびAHT(0.2μg/ml)を補給した新鮮なLB培地に播種し、37℃で一晩増殖させた。回収した細胞を、超音波処理によって破壊し、細胞片を遠心分離によって除去した。上清を1mlのStrepTrap HPカラム(GE Healthcare)にロードし、2.5mMのデスチオビオチンを用いて溶出した。大腸菌培養物1Lから単回の実施でおよそ1.5μgのCas9タンパク質を得た。Cas9を含有する画分を、+4℃で数日間保存した。SDS-PAGEによってタンパク質調製物の均一性を推定した。Cas9-crRNA複合体中のタンパク質濃度は、Strep-Tactin精製されたCas9タンパク質のサンプルを、既知量のHisタグを付けたCas9タンパク質とともに含有するSDS-PAGEゲルの濃度測定解析によって決定した。Cas9-crRNA複合体の濃度は、Cas9がモノマーであり、複合体中で1:1の化学量論でcrRNAと結合すると仮定して、Cas9タンパク質濃度として表されている。
【００１８】
ノーザンブロット解析。miRNeasy Miniキット(Qiagen)を使用して、pCas9(-)SP1プラスミドと同時発現された、Strep-Tactin精製されたCas9から、Cas9が結合しているRNAを単離した。RNAを、20mM MOPS/NaOH pH8バッファー中7M尿素を有する10%ポリアクリルアミドゲルに流すことによって、ノーザンブロットを実施した。Trans-blot SD(Bio-Rad)を使用するセミドライブロッティングによって、RNAをSensiBlot(商標)Plusナイロンメンブレン(Fermentas)にトランスファーした。60℃で0.16M 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)(Pierce)/0.13M 1-メチルイミダゾール(Sigma)pH8を用いて1時間、RNAをメンブレンに架橋した。メンブレンは、1% SDSおよび0.1mg/mlの魚精巣由来の変性DNA(Ambion)を含有する2×SSCバッファーを用いて、40℃で1時間プレハイブリダイズした。ブロットを、20ntのスペーサー1および22ntのリピート配列(5-TCGAAACAACACAGCTCTAAAACTGTCCTCTTCCTCTTTAGC-3'(配列番号28))を含有する、32P-5'標識した42ntの抗crRNA DNAオリゴヌクレオチドを用いて12時間プローブした。ブロットを、0.2% SDSを含有する0.2×SSCバッファーを用いて3回15分間洗浄し、蛍光体イメージングを使用して可視化した。
42ntの合成オリゴリボヌクレオチド(5'-CGCUAAAGAGGAAGAGGACAGUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3'(配列番号7))および84ntのDNAオリゴヌクレオチド。
【００１９】
オリゴヌクレオチド基質。本研究において使用されたすべてのオリゴヌクレオチド基質は、表1に示されている。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、Metabion(Martinsried, Germany)から購入した。オリゴヌクレオチドの5'末端を、PNK(Fermentas)および[γ-33P]ATP(Hartmann Analytic)を使用して放射標識した。相補配列(SP1、SP1-Δp、SP2)を有する2種のオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、二本鎖を作製した。非標識鎖とのアニーリングに先立って、放射性標識を個々のDNA鎖の5'末端に導入した。
【００２０】
オリゴヌクレオチド基質を用いる反応。反応は、通常、37℃の、10mM Tris-HCl(37℃でpH7.5)、10mM NaCl、0.1mg/ml BSAおよび10mM MgCl2中、1nMの標識されたオリゴヌクレオチドに、2nMのCas9-crRNA複合体を添加することによって実施した。アリコートを時限間隔で採取し、ローディングダイ(95% v/vホルムアミド、0.01%ブロモフェノールブルー、25mM EDTA、pH9.0)を用いてクエンチし、20%ポリアクリルアミドによる変性ゲル電気泳動と、それに続くFLA-5100ホスホルイメージャー(phosphorimager)(Fujilm)検出に付した。
【００２１】
プラスミド基質を用いる反応。pUC18プラスミドおよびその誘導体での反応(Sapranauskasら、2011. Nucleic Acids Res 39:9275〜82頁)を、オリゴヌクレオチド基質での反応に使用されるバッファーにおいて37℃で実施した。反応混合物は、通常、2.5nMのスーパーコイルプラスミドおよび2nMのCas9-crRNA複合体を含有していた。反応は、タンパク質をその他の構成要素の混合物に添加することによって開始した。アリコートを時限間隔で採取し、フェノール/クロロホルムを用いてクエンチした。水相をローディングダイ溶液(50% v/vグリセロール中、0.01%ブロモフェノールブルーおよび75mMのEDTA)と混合し、アガロースによる電気泳動によって解析した。
【００２２】
プラスミド切断位置決定。プラスミド基質の完全切断を達成するために、8nMのCas9-crRNA複合体を、2.5nMのスーパーコイルプラスミドとともに37℃の反応バッファー中で、10分間インキュベートした。反応生成物を精製し、GeneJET PCR精製キット(Fermentas)を使用して濃縮した。Cas9線状化され、ニックの入ったプラスミドのスペーサー1周囲の領域を、以下のプライマー:5'-ccgcatcaggcgccattcgcc-3'(配列番号29)((+)鎖のシークエンシング)および5'-gcgaggaagcggaagagcgccc-3'(配列番号30)((-)鎖のシークエンシング)を用いて直接配列決定した。
【００２３】
結合アッセイ。漸増量のタンパク質-crRNA複合体を、結合バッファー(40mM酢酸Tris、25℃でpH8.3、0.1 EDTA, 0.1mg/ml BSA、10% v/vグリセロール)中、0.5nMの33P標識した二本鎖および一本鎖DNA基質(表1)と混合し、室温で15分間インキュベートした。遊離DNAおよびタンパク質-DNA複合体を、非変性8%ポリアクリルアミドゲル(アクリルアミド/N,N'-メチレンビスアクリルアミド29:1の比)上でランニングバッファーとして、0.1mM EDTAを補給した40mM酢酸Tris(pH8.3)を使用して分離した。電気泳動は室温で3時間、6V/cmで実施した。
【００２４】
突然変異誘発。突然変異体D31AおよびN891Aを、これまでに記載されたように部位特異的突然変異誘発によって得た(Tamulaitisら、2007. Nucleic Acids Res 35:4792〜9頁)。
各突然変異体の全遺伝子のシークエンシングによって、設計された突然変異のみが導入されていることが確認された。
【００２５】
【表１】
2019030321.tif 000003
【００２６】
結果
Cas9-crRNA複合体の発現および精製。S.サーモフィルスDGCC7710株のCRISR3システムに由来するcas9遺伝子を、pASK-IBA3ベクター中にクローニングして、C末端Strep(II)-タグを含有するCas9タンパク質融合物をコードする構築物を製造した(図1B)。最初に、本発明者らは、pASK-IBA3ベクターでCas9タンパク質を、その他のCasタンパク質(Cas9を除く)をpCas9(-)プラスミドで発現する大腸菌株RR1からCas9-crRNA複合体を精製しようとした(Sapranauskasら、2011)。pCas9(-)はまた、12のスペーサー-リピート単位からなる完全CRISPR3アレイも含有していた(図2A)。本発明者らは、すべての標的遺伝子の同時転写を達成するために、cas9遺伝子発現を2段階で実施した。第1に、本発明者らは、少容量の大腸菌培養物においてCas9発現を誘導し、4時間後、予め誘導した培養物のアリコートを、誘導源をすでに含有している大容量の新鮮LB培地に移し、一晩インキュベートした。Cas9タンパク質複合体を、Strep-Tactinセファロースを使用して粗細胞抽出物から精製した。本発明者らは、少量のCas9-crRNA複合体を何とか単離し、これは、プロトスペーサー1およびPAMを含有するオリゴ二本鎖SP1に対して核酸分解活性の痕跡のみを示した。本発明者らは、低い切断活性は、12のスペーサー-リピート単位の転写に起因するCas9-crRNA複合体の内因性の不均一性によるものであり得ると仮定した。すべてのスペーサー-リピート単位は、成熟したcrRNAに均一に転写される場合には、スペーサー1に対するcrRNAを含有するCas9複合体の濃度は、総Cas9-crRNA濃度の1/12の割合を占めることとなる。プロトスペーサー2およびPAMを含有するSP2オリゴ二本鎖に対するCas9-crRNA調製物の切断活性は、Cas9-crRNA複合体の不均一性と一致する(図2B)。本発明者らは、特定のCas9-crRNA複合体の収率を高めるために、CRISPRアレイ中に単一のR-スペーサー1-R単位を含有するpCas9(-)SP1プラスミドを操作した(図1B)。プラスミド形質転換干渉アッセイによって、単一のスペーサー1を保持するCRISPR3/Casシステムは、大腸菌におけるプラスミドpSP1形質転換を、完全なCRISPR領域を保持するCRISPR3/Casシステムと同一効率で妨げると確認された(図3B)。本発明者らは、上記の手順に従ってCas9-crRNA複合体を単離し、Cas9タンパク質と結合しているcrRNAを解析した。
【００２７】
Cas9タンパク質は、crRNAと同時精製する。S.サーモフィルスのCRISPR3/Casシステムは、CRISPR/CasシステムのタイプIIAサブタイプ(以前はNmeniまたはCASS4)に属する(Makarovaら、2011. Nat Rev Microbiol 9:467〜77頁)。ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)のタイプIIA CRISPR/Casシステムでは、トランスコードされた小RNA(tracrRNA)および細菌RNアーゼIIIが、crRNAの生成に関与していることがわかっている(Deltchevaら、2011. Nature 471:602〜7頁)。ストレプトコッカス・ピオゲネスcrRNAは、わずか42ntの長さであり、タイプIおよびIII CRISPRシステムではcrRNAにおいて保存されている「5'-ハンドル」を有さない(Haleら、2009. Cell 139:945〜56頁;Joreら、2011. Nat Struct Mol Biol 18:529〜36頁)。ノーザンブロット解析によれば、S.サーモフィルスLMD-9 CRISPR3/Casシステムにおいて長さが類似するcrRNAが作製され(Makarovaら、2011. Nat Rev Microbiol 9:467〜77頁)、これは、DGCC7710株のCRISPR3/Casシステムとほとんど同一である(図4AおよびB)。本発明者らは、異種大腸菌株において発現されたCas9-crRNA複合体から単離されたcrRNA(図1)は、同一の長さを有し得る(図4)と仮定した。したがって、Strep-Tactin精製されたCas9複合体から抽出された核酸をプローブするために、本発明者らは、リピート配列の3'末端に相当する22ntの領域およびSP1断片の5'末端の20ntからなる42ntの抗crRNA DNAオリゴヌクレオチドを使用した。抗crRNAオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされたCas9複合体中に存在する核酸は、RNアーゼに対して感受性であったが、DNアーゼ処置に対しては感受性ではなかった(図1C)。抽出されたcrRNAの大きさは、S.サーモフィルスDGCC7710株のCRISPR3システムの推定crRNAに相当する42ntの合成オリゴリボヌクレオチドと同一であった(図3A、図4C)。総合すると、これらのデータによって、Cas9 Strep-タグタンパク質は、CRISPR3領域に由来する42ntのcrRNAと同時精製するということが確認される。
【００２８】
Cas9タンパク質は、プロトスペーサー内の二本鎖DNAを切断する。精製されたCas9-crRNA複合体のin vitro活性を調べるために、本発明者らは、まず、CRISPR3アレイ中のスペーサーSP1と同一であるプロトスペーサー配列、プロトスペーサーの下流のPAM配列5'-TGGTG-3'およびpSP1プラスミドから得られた10ntのそれぞれの両端に位置する配列を含有する(Sapranauskasら、2011. Nucleic  Acids Res 39:9275〜82頁)(図5A)SP1オリゴ二本鎖(表1)を使用した。crRNAと相補的であるオリゴ二本鎖鎖は、(+)鎖と名付けられるのに対して、反対側の二本鎖は、(-)鎖と呼ばれる。切断反応をモニタリングするために、SP1オリゴ二本鎖の(+)または(-)鎖のいずれかを、5'末端でP33標識した。図5Bに示されるデータは、Cas9-crRNA複合体が、オリゴ二本鎖の両方の鎖を固定位置で切断することを実証する。
合成オリゴヌクレオチドをサイズマーカーとして使用する切断位置のマッピングは、Cas9-crRNA複合体は、PAMの4nt上流のプロトスペーサー内でSP1オリゴ二本鎖の両方の鎖を切断し(図5B)、平滑末端を残すことを示した。SP1オリゴ二本鎖を、crRNAを欠くCas9タンパク質とともに2時間インキュベートした後に切断が観察されないことは注記する価値がある(図6C)。
【００２９】
Cas9-crRNA複合体が、プロトスペーサーを位置付け、in vitroで、in vivo侵入外来DNAを模倣する長いDNA基質中でDNAを切断できるかどうかを調べるために、本発明者らは、プロトスペーサー1およびPAMを保持するpSP1プラスミド(Sapranauskasら, 2011. Nucleic Acids Res 39:9275〜82頁)の切断を解析した(図5C)。Cas9-crRNA複合体の存在下で、pSP1プラスミドのスーパーコイル形態は、直鎖形態に変換された(図5D)のに対し、プロトスペーサー1を欠くpUC18プラスミドは切断されなかった。これは、pSC1プラスミドの両方の鎖は、プロトスペーサー領域内で特異的に切断されることを意味する。本発明者らは、直接配列決定を使用して、Cas9-crRNA切断後に形成された直鎖DNA形態の末端を決定した。シークエンシング結果によって、プラスミドDNAの切断は、SP1オリゴ二本鎖切断と類似して(図5D)PAM配列から4nt離れて起こることが確認された。S.サーモフィルスのCRISPR3/Casシステムのin vitro実験において同定された切断位置(図4)は、S.サーモフィルスにおけるCRISPR1/Casシステムについてのin vivo切断実験において決定されたものと同一である(Garneauら、2010. Nature 468:67〜71頁)。Cas9-crRNAによって誘導された切断が、その他のプロトスペーサー配列において同一位置で起こるかどうかを調べるために、本発明者らは、プロトスペーサー2およびPAM配列を保持するSP2オリゴ二本鎖の、12のスペーサー-リピート単位を保持する宿主から単離された異種Cas9-crRNA複合体による切断を解析した。本発明者らは、異種Cas9-crRNA複合体は、SP2オリゴ二本鎖の(+)鎖を、SP1オリゴ二本鎖と同一位置で正確に切断することを見出した。
【００３０】
Cas9-crRNA切断特異性は、crRNA配列によって指示される。Cas9-crRNA複合体特異性が、リボヌクレオタンパク質複合体中のcrRNAを変更することによってリプログラムされ得ることを直接的に実証するために、本発明者らは、CRISPR領域中のスペーサーS1の代わりに新規スペーサー(SN)を挿入して、最小のCRISPR領域のみおよびtracrRNAをコードする配列を含有するpCas(-)SNプラスミドを作製し(図7)、このプラスミドをpASKIBA-Cas9と同時発現させ、Cas9-crRNA複合体を精製した。プラスミドpSP1+SPNおよびpSP1を使用して、Cas9-crRNA複合体の切断特異性を解析した。CRISPR領域中のSNスペーサーに対応するプロトスペーサー配列を含有するpSP1+SPNプラスミドは、Cas9-crRNA複合体によって直線化されたのに対し、相補配列を欠くpSP1プラスミドは無傷のままであった(図7B)。本発明者らは、SPNスペーサー配列内の切断位置を決定するために、スペーサーSNと相補的であるプロトスペーサーおよびPAMを含有するSPNオリゴ二本鎖を用いて実験を実施した(図7D)。オリゴ二本鎖切断アッセイによって(図7CおよびD)、再操作された特異性を有するCas9-crRNA複合体が、その他のCas9-crRNA複合体と同一に、PAMの4 nt上流のSNプロトスペーサー内の両DNA鎖を切断することが確認された。
【００３１】
S.サーモフィルスのCRISPR3領域中のスペーサーの長さは、30ntである。図1Cに提供されるデータによれば、Cas9タンパク質と同時精製された成熟crRNAは、42ntからなる。crRNAの20ntのみが、プロトスペーサーの(+)鎖と相補的であることを意味する。プロトスペーサーの5'末端が、S.サーモフィルスのCRISPR3システムによるプラスミド干渉にとって重要であるかどうかを評価するために、本発明者らは、5'-末端切断型プロトスペーサー1(それぞれ、プロトスペーサー27bp、23bp、19bp、15bp、11bpの長さ)を用いて、プラスミドpSP1-27、pSP1-23、pSP1-19、pSP1-15、pSP1-11を操作し、pCRISPR3を含有するレシピエント株の形質転換効率を解析した(図8B)。プロトスペーサー1の5'末端に4または7bpの末端切断を含有するプラスミドは、レシピエント株のプラスミド形質転換を干渉する能力に対して効果がなかった。プロトスペーサーの短い型(11、15、19bp)は、レシピエント株のプラスミド形質転換を妨げる能力を無効にした。これらのデータは、成熟crRNAに対して相補性を有さないプロトスペーサーの5'末端は、CRISPR3/Cas機能にとって重要ではないことを示す。in vivo実験への全面的支援において、プロトスペーサー1の20ntのみを含有するSP1-20オリゴ二本鎖は、Cas9-crRNAによって効率的に切断される(図8DおよびE)。
【００３２】
PAMは、Cas9-crRNAによるDNA結合および切断にとって必要である。プロトスペーサーを保持するが、PAMは保持しないプラスミド(pSPI-pΔ)または複数のPAMを保持するが、プロトスペーサーを保持しないプラスミド(pUC18)は、Cas9-crRNA切断に対して耐性である(図8A)。したがって、in vivoデータに一致して、PAMおよびプロトスペーサーの両方ともCas9-crRNA複合体による二本鎖DNA切断にとって必要である(Sapranauskasら、2011. Nucleic Acids Res 39:9275〜82頁)。PAMが二本鎖または一本鎖DNAに関連して認識されるかどうかを見出すために、本発明者らは、オリゴデオキシヌクレオチドi)SP1(プロトスペーサーおよびPAMの両方を含有する)、ii)SPI-Δp(プロトスペーサーのみを含有する)およびiii)SP2(PAMのみを含有する)のCas9-crRNA結合および切断を解析した。これらのオリゴデオキシヌクレオチドの(+)鎖を、一本鎖DNA基質(それに応じて、s(+)SP1、s(+)SP1-Δp、s(+)SP2)(表1)として使用した。
【００３３】
プラスミド切断実験と一致して、プロトスペーサーのみを有するが、PAMを有さないオリゴ二本鎖は、Cas9-crRNAによって切断されない(図9B)。他方、一本鎖形態の(+)鎖は、PAMを有する、有さないに関わらず、独立に、類似する割合で切断される(図9B)。これらのデータは、PAMが二本鎖にとってのみ必要であって、一本鎖DNA切断にとっては必要ではないことを明確に示す。
【００３４】
PAMが、Cas9-crRNA複合体によるDNA結合にとって重要であるかどうかを調べるために、電気泳動移動度シフト実験を実施した。切断を避けるために、結合実験を、切断に必要であるMg2+イオンの非存在下で実施した。Cas9-crRNAは、二本鎖および一本鎖オリゴヌクレオチドについて異なる結合パターンを示した。SP1オリゴ二本鎖の場合には、1nM濃度で低移動度複合体がすでに観察されている(図9C)。他方、PAMを伴わずに(SP1-Δp)またはプロトスペーサーを伴わずに(SP2)、オリゴ二本鎖について同一実験条件下で結合が観察されない。さらに、crRNA(図6A)を伴わないCas9タンパク質の場合には低移動度複合体は観察されず、これによって、crRNAは複合体形成にとって重要であるということが確認される。したがって、総合すると、結合実験は、Cas9タンパク質複合体が、プロトスペーサーと相補的であるcrRNAを含有する場合であっても、PAMの非存在下で二本鎖DNAと結合できないことを明確に示す。その他の言葉にすると、PAMを欠く二本鎖DNA基質は、PAMがCas9-crRNA結合にとって必要であるので切断されない。
【００３５】
他方、一本鎖オリゴヌクレオチド((+)鎖)は、PAMの存在とは独立に、同一親和性でCas9-crRNAによって結合される(図9D)。やはり、プロトスペーサーを有さない一本鎖DNAオリゴヌクレオチドについては(図9D)、またはcrRNAを欠くCas9タンパク質については、結合は観察されなかった(図6C)。総合すると、これらのデータは、Cas9-crRNA複合体は、二本鎖中のPAMのみを識別するが、一本鎖DNA中のPAMを識別しないということを示す。
【００３６】
いくつかのタイプIII CRISPRシステムは、DNA干渉よりもRNAを提供するので、本発明者らは、Cas9-crRNA複合体によるRNA結合および切断を研究した。Cas9-crRNAは、プロトスペーサーおよびPAMを有する一本鎖RNAまたは二本鎖RNAのいずれかを特異的に切断しなかった(図10B)。この知見によって、DNAが、S.サーモフィルスのCRISPR3/Casシステムの主な標的であることがもう一度確認される。Cas9-crRNA複合体は、プロトスペーサーを含有する相補的RNAと結合するが、一本鎖RNAが、プロトスペーサー内のCas9によって特異的に切断されないので、この相互作用は、おそらくは、機能的に重要ではない。
【００３７】
Cas9タンパク質RuvCおよびHNHモチーフの突然変異誘発。プラスミド形質転換実験は、RuvCおよびHNHモチーフ(図11A)が、Cas9機能にとって重要であることを示す(Sapranauskasら、2011. Nucleic Acids Res 39:9275〜82頁)。これらのモチーフが、標的DNA切断に関与しているかどうかを調べるために、本発明者らは、wt Cas9について記載された手順に従って、D31AおよびN891A突然変異体を発現させ、精製した。両突然変異体は、wt Cas9複合体中のcrRNAと同一であるcrRNAを同時精製した(図11C)。突然変異体タンパク質が、切断活性を保持するかどうかを調べるために、本発明者らは、突然変異体Cas9-crRNA複合体によるpSP1プラスミド切断をモニタリングした。驚くべきことに、wt Cas9タンパク質について観察された直鎖反応生成物の代わりに、両突然変異体は、ニックの入ったDNAの形態を製造し(図11B)、これは、両活性部位突然変異体が、プロトスペーサー内のプラスミド基質の一方のDNA鎖のみを切断することを示した。
【００３８】
突然変異体タンパク質が、鎖の優先性を示すかどうかを調べるために、本発明者らは、SP1オリゴ二本鎖のD31AおよびN891A突然変異体切断を解析した。RuvC活性部位突然変異体(D31A)は、オリゴ二本鎖の(+)鎖を、wt Cas9-crRNAタンパク質と同一の位置で切断するが、(-)鎖は無傷のままであった(図11C)。逆に、HNH活性部位突然変異体(N891A)は、SP1オリゴ二本鎖の(-)鎖のみを切断したが、(+)鎖は切断しなかった(図11D)。総合すると、これらのデータは、RuvCおよびHNH活性部位は、反対側のDNA鎖に作用して、二本鎖切断をもたらすことを示す。プラスミドDNA切断の際に同一切断パターンが保存されているかどうかを調べるために、本発明者らは、ニックの入ったプラスミドのプロトスペーサー領域を配列決定した。Run-off配列データによって、RuvC活性部位突然変異体が、(+)DNA鎖のみを切断するのに対し、HNH/McrA突然変異体が(-)鎖のみを切断することが確認された(図12AおよびB)。さらに、本発明者らは、RuvC突然変異体は、一本鎖DNAの(+)鎖を切断するが、このような切断は、HNH突然変異体については検出されないことを見出した(図12D)。
【００３９】
突然変異体が、突然変異体タンパク質-crRNA複合体のDNA結合親和性を変更したかどうかを調べるために、電気泳動移動度シフト解析を使用してDNA結合を研究した。両突然変異体タンパク質-crRNA複合体は、オリゴ二本鎖SP1と、野生型タンパク質と同一の親和性で結合した(図12C)。したがって、Cas9の推定活性部位中の突然変異は、Cas9-crRNA複合体の二本鎖DNA結合特性に対して大きな効果を有さない。突然変異体タンパク質複合体中に42ntのcrRNAが存在したので(図12C)、本発明者らは、突然変異体Cas9-crRNA複合体が、活性部位突然変異のために標的DNA鎖の一方を切断する能力を失ったと結論付ける。Cas9-HisTagタンパク質は、溶液中でモノマーであるので(図13)、Cas9タンパク質がモノマーとして機能的であり、反対側のDNA鎖の切断のために2つの活性部位を使用するという可能性が高い。類似するの戦略が、いくつかの制限エンドヌクレアーゼによって利用されている(Armalyteら、2005. J Biol Chem 280:41584〜94頁)。
【００４０】
考察
S.サーモフィルスのCRISPR3/CasシステムのCas9-crRNA複合体は、crRNA誘導性(crRNA-guided)エンドヌクレアーゼである。この研究によって、S.サーモフィルスのCRISPR3/CasシステムのCas9-crRNA複合体は、Mg2+イオンの存在下、PAM配列の4nt下流のプロトスペーサー内で両DNA鎖を切断して、平滑末端切断生成物を生成するcrRNA指向性エンドヌクレアーゼであることが実証される。Cas9-crRNA複合体の配列特異性は、標的DNA中のプロトスペーサー配列と相補的である約20ntの断片を含む42ntのcrRNAによって決定される。この点において、S.サーモフィルスのCRISPR3/CasシステムのCas9複合体中の成熟crRNAは、リピート配列の3'ハンドルを有するが、スペーサー配列の一部およびリピート断片に対応する5'ハンドルを欠くストレプトコッカス・ピオゲネスのcrRNAと類似する(Deltchevaら、2011)。したがって、S.サーモフィルスのCRISPR3/CasシステムのCas9-crRNA複合体中に存在するcrRNAは、PAMから遠位のプロトスペーサー配列の一部に対してのみ相補的である。
驚くべきことではないが、プロトスペーサー配列の3'末端の10ヌクレオチドの末端切断は、合成オリゴ二本鎖またはプラスミドDNAのCas9-crRNA切断に対して効果がない(図8)。
【００４１】
Cas9-crRNA複合体の切断機序は、リン酸ジエステル結合切断のための2つの活性部位を提供するCas9タンパク質中にある。Cas9タンパク質のRuvC-およびHNH-様活性部位は、異なるドメイン上に位置し、個々のDNA鎖で独立に作用する。RuvC-およびHNH-モチーフ中の活性部位残基のアラニン置換は、Cas9-crRNA複合体を、ニッキング酵素と類似する鎖特異的にニックを入れるエンドヌクレアーゼに変換する(Chanら、2011. Nucleic Acids Res 39:1〜18頁)。in vivo研究と一致して、in vitroでのCas9-crRNA複合体の機能活性は、プロトスペーサー配列の上流のプロトスペーサー隣接モチーフNGGNGの存在に絶対的に左右される。図3に示されるデータは、PAMが、二本鎖DNAとのCas9-crRNA結合に必要であることを示す。二本鎖DNAにおいてPAM配列が失われている場合には、Cas9-crRNA複合体は、相補定なプロトスペーサー配列を含有する場合であってもこのようなDNAと結合しない。他方、Cas9-crRNAは、PAM(または複数のPAM)が存在するが、プロトスペーサー配列が存在しない場合にDNA結合を示さない。したがって、in vivoデータと一貫して、二本鎖DNA結合およびその後の切断にとって、PAMおよびプロトスペーサー配列の両方が必要条件である。二本鎖DNAとのCas9-crRNA結合とは対照的に、PAM配列モチーフは、一本鎖DNA結合に対して効果を有さず、PAM配列を伴うか、伴わない、プロトスペーサーを含有する一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドは、同等に良好に結合されるが、二本鎖DNAよりも親和性は低い。Mg2+イオンの存在下で、Cas9は、そのHNH-活性部位を使用してcrRNAと結合している一本鎖DNAを切断する。
【００４２】
タイプIIシステムにおけるDNA干渉の機序。本発明者らの結果は、S.サーモフィルスのCRISPR3/CasシステムにおけるCas9-crRNA複合体による二本鎖DNA切断機序の簡単なモデルを確立する(図14)。さらに位置が規定されなくてはならない、PAM依存的プロセスで二本鎖DNA内のプロトスペーサー配列と結合する機序を使用するCas9-crRNA複合体。二本鎖DNAのPAMが、鎖分離の開始部位(シグナル)として働き、crRNAの、DNAの相補(+)鎖とのその後の対合を促進することが可能である。Cas9タンパク質モジュールまたはCas9が結合しているcrRNA(例えば、保存されたリピート配列の保存された「3'-ハンドル」中のヌクレオチドを使用して)が、PAM配列を認識するかどうかは、まだ確立されていない。これらの機序の詳細が欠如しているにもかかわらず、本発明者らのデータは、PAMが、二本鎖DNAとの関連でCas9-crRNAによって認識されることを明確に実証する。ds DNA中の標的配列とのCas9-crRNA結合は、おそらくは、(-)鎖が置換され、相補(+)DNA鎖がcrRNAと対を形成するR-ループ構造をもたらす。Mg2+イオンの存在下で、リン酸ジエステル結合切断は、PAM配列の4nt 5'-上流の両鎖で起こり、平滑DNA末端を生成する。RuvC-またはHNH-モチーフ突然変異体によるDNA切断解析は、Cas9タンパク質のRuvC-およびHNH-様活性部位が、それぞれ、(-)および(+)鎖に作用することを実証する。したがって、触媒的に適格なCas9-crRNA複合体では、RuvCモチーフの触媒D31A残基を含有するN末端ドメインは、置換された(-)DNA鎖に位置するのに対し、HNHモチーフを含有するCas9の中央部分は、crRNAと対を形成する(+)DNA鎖の解離しやすいリン酸ジエステル結合の近くに位置する。DNA切断後に、Cas9-crRNAは、反応生成物と結合しているままである(図15)。総合すると、本明細書において提示されたデータは、S.サーモフィルスのCRISPR3/CasシステムによるDNA干渉ステップのための第1の分子機序を示唆する。cas9は、タイプIIAおよびタイプIIBシステムシグネチャー遺伝子であるので(Makarovaら、2011. Nat Rev Microbiol 9:467〜77)、本明細書において提案される切断機序は、その他のタイプIIAおよびタイプIIBシステムにおいて保存されている可能性が高い。CRISPRシステムの一部ではない、Cas9様タンパク質の独立した型が、生物情報科学によって同定された(Makarovaら、2011. Biol Direct 6: 38)。本明細書において提供されたデータを踏まえて、本発明者らは、これらのタンパク質は、CRISPRとは異なる経路によって生成され得る小さいcrRNA分子とともに負荷されると、Cas9と類似する外来DNAに対する干渉を提供し得ることを示唆する。
【００４３】
その他のRNA干渉複合体との比較。Cas9-crRNA複合体による二本鎖DNA切断のための本明細書において提案された機序は、タイプI-E(以前は、大腸菌またはCASS2)システムのものとは大幅に異なる(Joreら、2011. Nat Struct Mol Biol 18:529〜36頁)。大腸菌システムでは、crRNAおよびCasタンパク質は、CRISPR RNAおよび相補的標的配列間の配列特異的ハイブリダイゼーションを増強することによって標的認識を促進する、Cascadeと名付けられた大きなリボヌクレオタンパク質複合体に組み立てられる(Joreら、2011 . Nat Struct Mol Biol 18:529〜36頁)。標的認識は、PAMに依存しており、スペーサー領域の5'末端に位置する「シード」crRNA配列によって支配されている(Semenovaら、2011. Proc Natl Acad Sci USA 108:10098〜103頁)。しかし、Cascade-crRNA複合体は、PAMおよびプロトスペーサーを含有する二本鎖DNAと単独で結合できるが、DNA切断にはアクセサリーCas3タンパク質を必要とする。Cas3は、一本鎖DNAを切断して、複数の切断部分を生成できる一本鎖DNAヌクレアーゼおよびヘリカーゼである(Sinkunasら、2011. EMBO J 30:1335〜42頁)。適切な生物学的基質(例えば、R-ループ様複合体において二本鎖DNAと結合しているCascade-crRNA)に対するCas3作用の機序の詳細は、まだ確立されていない。しかし、M.ヤンナスキイ(jannaschii)のCas3は、R-ループを模倣する合成基質の存在下で、DNA鎖の両方を単独で切断できることが最近実証された(Beloglazovaら、2011.EMBO J 30:616〜27)。Cas3は、Cascade-crRNA複合体の存在下で、DNA切断のために類似する機序をたどる可能性があるということが提案されている。したがって、現在のデータは、タイプI-Eシステムの干渉ステップの機序の詳細は、触媒機構ならびに機序および複雑性の両方によってCRISPR3システムのものとは異なることを明確に示す。
【００４４】
多数の古細菌およびいくつかの細菌において存在するIII-BサブタイプCRISPRシステムでは、CasモジュールRAMP(Cmr)タンパク質およびcRNAは、侵入RNAを標的とするエフェクター複合体に組み立てられる(Haleら、2009. Cell 139:945〜56頁;Haleら、2012. Mol Cell 45:292〜302頁)。パイロコッカス・フリオサス(Pyroccus furiosus)では、6種のCmr1〜6タンパク質およびcrRNAからなるRNAサイレンシング複合体は、標的RNAと結合し、それを、3'末端psiRNAに関して固定距離で切断する。切断活性は、Mg2+イオンに応じて異なるが、標的RNA切断に関与する個々のCmrタンパク質は、まだ同定されていない。7種のCmr1〜7タンパク質およびcrRNAからなるスルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)のエフェクター複合体は、UAジヌクレオチドでヌクレオチド鎖切断反応において侵入RNAを切断する(Zhangら、2012. Mol Cell 45:303〜13頁)。重要なことに、Cmr-crRNA複合体は、RNA切断をPAM独立的に実施する。
【００４５】
本明細書において提供されたデータは、CRISPR3システムのCas9-crRNA複合体は、これまでのところ、単一の、crRNA分子と結合しているCas9タンパク質からなる最も簡単なDNA干渉システムであるということを示す。DNA標的の特異性が、crRNAによってコードされ、切断機構がCasタンパク質によってもたらされる、Cas9-crRNA複合体の簡単なモジュール組織化は、ユニバーサルなRNA誘導性DNAエンドヌクレアーゼの操作のための多用途なプラットフォームを提供する。
【実施例２】
【００４６】
4種の構成要素からのCas9-crRNA複合体のIn vitro組み立て
この実施例では、本発明者らは、触媒的に活性なCas9-crRNA複合体が、4種の個々の構成要素:Cas9タンパク質のC末端(His)6タグを付けた変異体(配列番号23として開示される「(His)6」)、tracrRNA転写物(配列番号5)、CRISPR RNA転写物(配列番号8)および大腸菌RNアーゼIII(Abgene)を混合することによってin vitroで組み立てられ得ることを実証する。Cas9タンパク質をまず、tracrRNAおよびCRISPR RNA転写物とともにプレインキュベートし、続いて、RNアーゼIIIとともにその後のインキュベーションを行い、触媒的に適格なCas9-RNA複合体を作製し、これが部位特異的DNA切断に使用される。
【００４７】
より詳しくは、複合体組み立てに必要なRNA断片は、RNAコード配列の近位末端でT7プロモーターを含有するPCRによって作製された断片のin vitro転写(TranscriptAid(商標)T7高収率転写キット、Fermentas)によって製造した。CRISPR RNAおよびtracrRNAをコードするPCRによって作製されたDNA断片を、以下のプライマー対:5'-taatacgactcactataGggtagaaaagatatcctacgagg-3'(配列番号40)/5'-CAACAACCAAGCTAATACAGCAG-3'(配列番号41)および5'-aaaaacaccgaatcggtgccac-3'(配列番号42)/5'-taatacgactcactataGggTAATAATAATTGTGGTTTGAAACCATTC-3'(配列番号43)(T7 RNAポリメラーゼプロモーターには下線が引かれており、転写開始は、太字で示されている)を用い、鋳型としてpCas9(-)SP1プラスミドを使用して製造した。150ntのCRISPR RNA転写物は、プライマーアニーリングに必要な23ntの上流および25ntの下流の領域がそれぞれの両端に位置する102ntのリピート-スペーサー1-リピート配列からなる。tracrRNAの105ntの転写物は、16ntの上流および51ntの下流領域がそれぞれの両端に位置する、S.サーモフィルスDCGG7710 CRISPR3リピート配列断片に対して部分的に相補的な38ntのストレッチ(アンチリピート配列)からなる。in vitro転写によって製造されたRNA断片を、RNeasy MinElute Cleanupキット(Qiagen)を使用して精製した。
【００４８】
触媒的に適格なCas9-crRNA複合体のin vitro組み立てのために、(His)6タグを付けたCas9タンパク質(配列番号23として開示される「(His)6」)を、CRISPR RNAおよびtracrRNA転写物と、1:0.5:1の比で混合し、10mM Tris-HCl(37℃でpH7.5)、100mM NaClを含有するバッファー中、37℃で30分間プレインキュベートし、続いて、RNアーゼIII(Ambion)、MgCl2およびDTTを添加し、その後、さらに30分間インキュベートした。組み立て混合物中の構成要素の最終濃度は以下とした:100nMの(His)6タグを付けたCas9タンパク質(配列番号23として開示される「(His)6」)、50nMのCRISPR RNA、100nMのtracrRNA、50nMのRNアーゼIII、10mM MgCl2および1mM DTT。
【００４９】
以下で、本発明者らは、crRNA配列によって誘導される、in vitroで組み立てられたCas9-crRNA複合体は、DNAを特定の部位で切断して、平滑末端を生成するという実験的証拠を提供する。この点においてCas9-crRNA複合体は、in vitroでの部位特異的DNA切断のための制限エンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼの代替物として使用され得る。複合体の配列特異性は、望ましいDNA標的に対応するよう操作され得るcrRNA配列によって決定される。
【００５０】
まず、in vitroで組み立てられたCas9-crRNA複合体のDNA切断活性を、プラスミド基質pSP1およびpUC18でアッセイした。pSP1プラスミドは、5'-GGNG-3'PAM配列がそれぞれの両側に位置するプロトスペーサー1配列を含有していた。プロトスペーサー1配列は、pUC18中には存在しなかった。pUC18およびpSP1プラスミドで(Sapranauskasら、2011. Nucleic Acids Res 39:9275〜82頁)、10mM Tris HCl(37℃でpH7.5)、50mM NaCl、0.05mg/ml BSA、0.5mM DTTおよび10mM MgCl2中、37℃で反応を実施した。反応混合物は、通常、3.0nMのスーパーコイルプラスミドDNAを含有していた。反応バッファー中で、50μlの容積のCas9-crRNA複合体およびプラスミドDNAを(1:1 v/v比)混合することによって、反応を開始した。
アリコートを時限間隔で採取し、フェノール/クロロホルムでクエンチした。水相を、ローディングダイ溶液(50% v/vグリセロール中、0.01%ブロモフェノールブルーおよび75mM EDTA)と混合し、反応生成物をアガロースによる電気泳動によって解析した(図16)。Cas9-crRNA複合体によって予め切断されたpSP1プラスミドが、再度ライゲーションされ得るかどうかを調べるために、本発明者らは、GeneJETゲル抽出キット(Fermentas)を使用して、アガロースゲルから直鎖pSP1切断生成物を精製し、T4 DNAリガーゼ(Fermentas)を使用して再度ライゲーションした。ライゲーション混合物によって大腸菌細胞を形質転換した後、得られた形質転換体から5種の個々のクローンを選択し、プラスミドDNAを精製し、以下のプライマー:5'-ccgcatcaggcgccattcgcc-3'(配列番号29)((+)鎖のシークエンシング)および5'-gcgaggaagcggaagagcgccc-3'(配列番号30)((-)鎖のシークエンシング)を使用するシークエンシングに付した。配列解析によって、Cas9-crRNA複合体によって切断され、再度ライゲーションされた遺伝子座中のpSP1プラスミドのDNA配列は、非処理プラスミドの配列と同一であったことが示された。T4 DNAリガーゼの非存在下でのライゲーション混合物による大腸菌形質転換は、形質転換体をもたらさず、これは、スーパーコイルプラスミドの痕跡は、直鎖反応生成物と同時精製されないことを示す。
【００５１】
次いで、in vitroで組み立てられたCas9-crRNA複合体の切断活性を、crRNAのスペーサー配列に対応するプロトスペーサー配列を含有する合成55bpオリゴデオキシヌクレオチド二本鎖SP1でアッセイした(図17)。反応条件は、1nMのオリゴ二本鎖が使用された点を除いて、プラスミドDNA切断について上記のものと同一とした。反応生成物解析は、in vitroで組み立てられたCas9-crRNA複合体は、オリゴ二本鎖の両方の鎖を固定された位置、プロトスペーサーの内側、5'末端から37番目のヌクレオチドの後ろ、PAM配列5'-GGNG-3'の4nt上流で切断し、平滑末端を残すということを示した(図17)。
【実施例３】
【００５２】
3種の構成要素からのCas9-crRNA複合体のin vitro組み立て
この実施例では、本発明者らは、活性Cas9-crRNA複合体は、3種の個々の構成要素:Cas9タンパク質のC末端(His)6タグを付けた変異体(配列番号23として開示される「(His)6」)、実施例1において提供されたtracrRNA転写物(配列番号5および配列番号6)および実施例1において提供されたCRISPR RNA転写物(配列番号8)またはS.サーモフィルスDGCC7710株のCRISPR3/Casシステムの推定crRNAに対応する合成crRNA(配列番号8)を混合することによって、in vitroで組み立てられ得ることを実証する。合成42ntオリゴリボヌクレオチドは、5'末端のCRISPR3領域のスペーサー1と同一である20ntおよび3'末端の22ntのリピート配列からなる。より詳しくは、tracrRNAおよびCRISPR RNA転写物は実施例1に記載の通りに入手した。Cas9-crRNA複合体を作製するために、(His)6タグを付けたCas9タンパク質(配列番号23として開示される「(His)6」)を、tracrRNAおよびCRISPR RNA転写物または42ntの合成crRNAと、1:0.5:1モル比で混合し、10mM Tris-HCl(37℃でpH7.5)、100mM NaClを含有するバッファー中、37℃で1時間インキュベートした。組み立て混合物中の構成要素の最終濃度は、以下とした:100nMの(His)6タグを付けたCas9タンパク質(配列番号23として開示される「(His)6」)、50nMのCRISPR RNAまたは42ntの合成crRNA、100nMのtracrRNA。
【００５３】
以下に、本発明者らは、crRNA配列によって誘導されるin vitroで組み立てられたCas9-crRNA複合体は、DNAを特定の部位で切断して、平滑末端を生成するという証拠を提供する。この点においてCas9-crRNA複合体は、in vitroでの部位特異的DNA切断のための制限エンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼの代替物として使用され得る。複合体の配列特異性は、望ましいDNA標的に対応するよう操作され得るcrRNA配列によって決定される。
【００５４】
まず、in vitroで組み立てられたCas9-crRNA複合体のDNA切断活性を、プラスミド基質pSP1およびpUC18でアッセイした。pSP1プラスミドは、5'-GGNG-3'PAM配列がそれぞれの両側に位置するプロトスペーサー1配列を含有していた。プロトスペーサー1配列は、pUC18中には存在しなかった。プラスミド基質(Sapranauskasら、2011. Nucleic Acids Res 39:9275〜82頁)で、10mM Tris HCl(37℃でpH7.5)、50mM NaCl、0.05mg/ml BSA、0.5mM DTTおよび10mM MgCl2中、37℃で反応を実施した。反応混合物は、通常、3.0nMのスーパーコイルプラスミドDNAを含有していた。反応バッファー中で、50μlの容積のCas9-crRNA複合体およびプラスミドDNAを(1:1 v/v比)混合することによって、反応を開始した。アリコートを時限間隔で採取し、フェノール/クロロホルムでクエンチした。水相を、ローディングダイ溶液(50% v/vグリセロール中、0.01%ブロモフェノールブルーおよび75mM EDTA)と混合し、反応生成物をアガロースによる電気泳動によって解析した(図18)。
【００５５】
次いで、in vitroで組み立てられたCas9-crRNA複合体の切断活性を、crRNAのスペーサー配列と対応するプロトスペーサー配列を含有する合成55bpのオリゴデオキシヌクレオチド二本鎖SP1でアッセイした(図19)。反応条件は、1nMのオリゴ二本鎖が使用された点を除いて、プラスミドDNA切断について上記のものと同一であった。反応生成物解析は、in vitroで組み立てられたCas9-crRNA複合体は、オリゴ二本鎖の両方の鎖を固定された位置、プロトスペーサーの内側、5'末端から37番目のヌクレオチドの後ろ、PAM配列5'-GGNG-3'の4nt上流で切断し、平滑末端を残すことを示した(図19)。
【実施例４】
【００５６】
Cas9-crRNA複合体特異性をリプログラミングするための交換可能なスペーサーカセット
この実施例では、本発明者らは、実施例1および2において記載されるCas9-crRNA複合体の組み立てのために使用され得る任意の望ましいDNA標的に対するヌクレオチド配列を保持するcrRNAを製造することを可能にする交換可能なスペーサーカセットを記載する(図20B)。カセットは、所望のcrRNAを作製するのに必要な新規スペーサー配列を保持するオリゴ二本鎖の挿入を可能にする単一のリピート-スペーサー-リピート単位を保持する。カセットを操作するために、本発明者らは、まず、リーダー配列、リピート配列およびリピート配列の近くに独特のSapI認識部位と、それに続くBamHI部位を含有するカセットを構築した(図20C)。独特の所望のスペーサーを含有するCRISPR領域を作製するために、本発明者らは、独特のスペーサー配列およびリピート単位を含有する合成オリゴ二本鎖を、SapIおよびBamHI制限酵素で予め切断されたプラスミド中に挿入した。本発明者らは、このカセットを使用して、pUC18プラスミド中に存在するプロトスペーサーN1およびN2と相補的であるヌクレオチド配列を含有していたcrRNA転写物を製造した(以下を参照のこと)。
【００５７】
本発明者らは、原理実証の証拠として、交換可能なスペーサーカセットを使用して、crRNA1およびcrRNA2を作製し、これを、それぞれ、プロトスペーサー1およびプロトスペーサー2でpUC18プラスミドを標的とするよう操作し、実施例1に記載されるようなCas9複合体中にcrRNA1およびcrRNA2を組み込み、pUC18プラスミドの切断のためにこれらの複合体を使用した。プロトスペーサーN1は、SapI制限エンドヌクレアーゼ部位の付近に位置するのに対し、プロトスペーサーN2は、AatII部位の近くに位置する。SapIおよびAatII制限部位間の距離は、775bpであるのに対し、スペーサーN1およびN2中に位置する推定Cas9-crRNA複合体切断部位間の距離は、612bpである(図21A)。近位末端にT7プロモーターを含有するcrRNA1およびcrRNA2 PCR断片を、対応する交換可能なスペーサーカセットプラスミドから得、これを使用し、in vitro転写によって、スペーサーN1またはスペーサーN2配列に対応する配列を保持するCRISPR RNA転写物を製造した。crRNAIおよびcrRNA2を有するCas9の触媒的に活性な複合体を、実施例1に記載されるようなDNA切断のために組み立てた。crRNA1またはcrRNA2のいずれかを含有するin vitroで組み立てられた複合体は、pUC18プラスミドを直線化した(図21B)。両複合体がpUC18プラスミドとともにインキュベートされると、2種のDNA断片(2074および612bp)が得られ(図21B)、これは、プラスミド切断が、複合体中に存在するcrRNA分子によってターゲッティングされる部位で生じたことを示す。
【実施例５】
【００５８】
Cas9-crRNA複合体を使用するクローニング手順
この実施例では、本発明者らは、クローニング手順のためのベクターを調製するために、Cas9-crRNA複合体が使用され得ることを実証する。まず、本発明者らは、Cas9-crRNA複合体によって得られた切断生成物が、DNAリガーゼによって再ライゲーションされ得ることを実証した。本発明者らは、直鎖pSP1切断生成物をアガロースゲルから精製し、DNAリガーゼを使用してそれを再ライゲーションした。ライゲーション混合物による大腸菌細胞の形質転換後、得られた形質転換体から5種の個々のクローンを選択し、プラスミドDNAを精製し、シークエンシングに付した。配列解析によって、Cas9-RNA複合体によって切断され、再ライゲーションされた遺伝子座中のpSP1プラスミドのDNA配列は、非処理プラスミドの配列と同一であると示された。T4 DNAリガーゼの非存在下でのライゲーション混合物による大腸菌形質転換は、形質転換体を生成せず、これは、スーパーコイルプラスミドの痕跡は直鎖反応生成物と同時精製されないということを示す。この結果は、Cas9切断によって生成したDNA末端が、T4 DNAリガーゼの基質であり、従って、5'末端にリン酸を、3'末端にOH基を含有するはずであるということを例示する(Lehman, 1974)。
【００５９】
次いで、本発明者らは、実施例5において記載されるcrRNA1およびcrRNA2を負荷されたCas9複合体を用いるpUC18プラスミドの切断を解析した(図21A)。まず、pUC18を、1種の複合体を用いて切断し、精製し、再ライゲーションした。各場合における10種のクローンのシークエンシングによって、切断され、再ライゲーションされたプラスミドの配列は、非処理プラスミドの配列と同一であるということが確認された(図21C)。この実験は、Cas9-crRNA複合体による切断およびライゲーション後にさらなる突然変異が導入されず、Cas9-crRNA複合体は、クローニング実験のために使用され得るということを示唆する。両複合体が、pUC18プラスミドとともにインキュベートされると、2種のDNA断片(2074および612bp)が得られ(図21B)、これは、プラスミド切断が、複合体中に存在するcrRNA分子によってターゲッティングされる部位で生じたことを示す。Cas9-RNA複合体を用いて切断されたpUC18プラスミドが遺伝子工学に適していることを実証するために、本発明者らは、pACYC184プラスミドから得られたプロモーターおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含有するPCR断片を、crRNA1またはcrRNA2の両方を含有するCas9複合体混合物を用いて予め切断されたpUC18ベクターにクローニングした。テトラサイクリンおよびアンピシリンによって強化された培地上でクローンを選択した。4種の選択されたクローンのシークエンシングによって、無傷のPCR断片が、所望の位置に挿入されたことが確認された(図21C)。
【００６０】
より詳しくは、2μgのpUC18を、異なるcrRNAを含有する別個に組み立てられたCas9-RNA複合体(各250nM)の混合物とともに、100μlの反応容量(10mM Tris-HCl(37℃でpH7.5)、100mM NaCl、1mM DTTおよび10mM MgCl2)中、37℃で1時間インキュベートした。GeneJETゲル抽出キット(Thermo Fisher scientific)を使用して、得られたベクター断片をアガロースゲルから精製し、2つの等しい部分に分けた。予め切断したベクターの一方の部分を、FastAPアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化し、もう一方の部分は処理しなかった。
プロモーターおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含有する1282bpの挿入部分を、PCRによってpACYC184プラスミドから得た。GeneJET PCR精製キット(Thermo Fisher scientific)を使用して精製した後、PCR断片を含有する溶液を2つの部分に分けた。一方の部分をT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Thermo Fisher scientific)リン酸化し、もう一方の部分は処理しなかった。T4 DNAリガーゼ(Thermo Fisher scientific)使用して、未処理ベクターを、未処理PCR断片とライゲーションし、脱リン酸化したベクターを、リン酸化した断片とライゲーションした。100pg/mlのApおよび25μg/ml Tcを補給した培地上でクローンを選択した。
【実施例６】
【００６１】
Cas9 crRNA複合体による長いDNA基質の切断
この実施例では、本発明者らは、Cas9-crRNAが、ファージλ、大腸菌およびヒトゲノムDNAを含めた長いDNA分子中の標的を切断するよう対処され得ることを実証する。
【００６２】
より詳しくは、本発明者らは、Cas9-RNA複合体が、λバクテリオファージ(48kb)、大腸菌BL-21株(4.6Mb)およびヒト(3.2Gb)ゲノムDNA中の特定の部位を切断するよう対処した。
Cas9-crRNA複合体は、実施例2および実施例3に記載されるように組み立てた。本発明者らは、実施例4に記載されたように作製した鋳型からin vitro転写を使用して合成された、42ntの長さの合成crRNA、150ntのプレcrRNAおよびtracrRNAを使用した。
【００６３】
λDNA切断反応は、λDNA(Thermo Fisher Scientific)を、組み立てられたCas9-RNA複合体と混合すること(1:1 v/v比)および37℃でインキュベートすることによって開始した。
最終反応混合物は、100μlの反応容量中、2μgのλDNA、50nM Cas9-RNA複合体、10mM Tris-HCl(37℃でpH7.5)、100mM NaCl、1mM DTTおよび10mM MgCl2含有していた。アリコートを時限間隔で採取し、フェノール/クロロホルムでクエンチした。水相を3Xローディングダイ溶液(50 % v/vグリセロール中、0.01%ブロモフェノールブルーおよび75mM EDTA)と混合し、反応生成物を、アガロースゲルによる電気泳動および臭化エチジウム染色によって解析した。アガロースゲルにおける直鎖λファージゲノムDNA切断生成物の解析によって、単一の部位で約40bpの長さのDNAが効率的に切断されることが確認された(図22A)。
【００６４】
大腸菌BL21(DE3)株に由来するDNAを、ゲノムDNA精製キット(Thermo Fisher Scientific)を使用して単離した。切断アッセイのために、大腸菌ゲノムDNAを、組み立てられたCas9-RNA複合体と組み合わせ(1:1 v/v比)、37℃で3時間インキュベートした。最終反応混合物は、300μlの反応容量中、30μgのゲノムDNA、1μΜのCas9-RNA複合体、10mM Tris-HCl(37℃でpH7.5)、100mM NaCl、1mM DTTおよび10mM MgCl2を含有していた。インキュベーション後、30μlのFastDigest PstI(Thermo Fisher Scientific)を添加し、反応混合物を37℃でさらに16時間インキュベートした。反応混合物をプロテイナーゼK(0.5mg/ml; Thermo Fisher Scientific)およびSDS(0.5%、w/v)とともに55℃で30分間加熱し、続いて、室温でRNアーゼA(0.25mg/ml;Thermo Fisher Scientific)とともに30分間インキュベートすることによって反応を終結させた。フェノール/クロロホルム抽出した後、DNAをイソプロパノールによって沈殿させ、TEバッファー(10mM Tris-HCl、pH8.0および1mM EDTA)に溶解した。
10μgのDNAを3Xローディングダイ溶液(50% v/vグリセロール中、0.01%ブロモフェノールブルーおよび75mM EDTA)と混合し、1%アガロースゲルで電気泳動した。
【００６５】
大腸菌ゲノムDNAのCas9-crRNA切断生成物を解析するために、本発明者らは、Cas9-RNA複合体標的(プロトスペーサー)を含有するDNA断片に対するプローブを設計し(図22B)、サザンブロット解析を実施した。サザンブロット解析は、以下の修飾を加えて、(Sambrook et al, 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual)に記載されるように実施した。
分画したDNAを、セミドライトランスファーによって、アガロースゲルからSensiBlot Plusナイロンメンブレン(Thermo Fisher Scientific)にトランスファーした。0.4M NaOHで飽和させたペーパータオル上に10分間置き、2XSSCですすぎ、風乾させることによって、DNAを変性させ、メンブレン上に固定した。メンブレンを、0.5% SDSおよび100μg/ml変性サケ精子DNA(Amresco)を含有する6X SSCバッファーを用いて、65℃で1時間プレハイブリダイズした。鋳型としてゲノム大腸菌BL21(DE3)DNAを使用するPCRによってハイブリダイゼーションプローブを作製し、397bpの生成物が得られた。5'末端をFastAPホスファターゼ(Thermo Fisher Scientific)を用いて脱リン酸化し、[γ-32P]ATP(Hartmann Analytic)およびT4 PNK(Thermo Fisher Scientific)とともにインキュベートすることによって放射標識した。標識されたプローブを、GeneJET PCR精製キット(Thermo Fisher Scientific)を使用して精製し、95℃で5分間加熱し、氷上で迅速に冷却することによって変性させ、プレハイブリダイゼーション溶液に直接的に添加した。メンブレンを65℃で16時間プローブし、室温で2XSSC、0.5% SDSを用いて2回、2XSSC、0.1% SDSを用いて2回洗浄し、風乾し、蛍光体イメージング(FLA-5100; Fujifilm)によって可視化した。
【００６６】
Cas9-RNA複合体の標的(プロトスペーサー)を含有する標的DNA断片に対するプローブを設計した(図22B)。2つのPstI標的間の距離は、約1500bpであるのに対し、プロトスペーサーと左のPstI標的の間の距離は466bpである。Cas9複合体を用いて切断した後、本発明者らは、466bpのDNA断片のみを検出し(図22C)、これは、すべてのDNA標的が、Cas9タンパク質によって所望の位置で切断されることを意味する。これらのデータは、Cas9タンパク質が、ウイルスおよび細菌DNAなどの極めて長い、複雑な分子中で標的を効率的に見出すことを明確に実証する。
【００６７】
ヒトゲノムDNAのCas9-crRNA切断生成物を解析するために、本発明者らは、ヒト脳から抽出したDNAを使用した。ヒトゲノムDNAを、組み立てられたCas9-crRNA複合体と組み合わせ(1:1 v/v比)、37℃で30分間インキュベートした。最終反応混合物は、100μlの反応容量中、1μgのゲノムDNA、100nM Cas9、10mM Tris-HCl(37℃でpH7.5)、100mM NaCl、1mM DTTおよび10mM MgCl2を含有していた。Cas9-crRNA-HS1(配列番号13)およびCas9-crRNA-HS2(配列番号14)複合体を、それぞれ、RASGEF1CまたはARL15遺伝子座をターゲッティングするよう組み立てた。qPCRを使用して切断生成物を解析した(図22D)。Cas9-crRNA複合体を用いて処理した後、無傷のDNA標的の量が、25倍超減少した。qPCRデータから得られた結果の解析によって、Cas9-RNA複合体は、所望の遺伝子座中のヒトゲノムDNAを効率的に切断することが示された。これらのデータは、Cas9タンパク質が、ウイルス、細菌および哺乳動物DNAなどの、極めて長い、複雑な分子中で標的を効果的に見出すことを明確に実証する。
【実施例７】
【００６８】
Cas9/RNA複合体のトランスフェクション後の、哺乳動物細胞におけるリポータープラスミドの遺伝子編集の証拠
非相同末端結合(NHEJ)または相同組換え(HR)のいずれかによる二本鎖切断修復をモニタリングするために、リポータープラスミドを構築した。プラスミドは、イントロンおよびそれぞれの両端に位置するeGFP配列を有するGFPならびにRFPの5'および3'配列ならびに相同性の部位を含有していた(図23)。リポータープラスミドを使用するeGFP蛍光の減少は、標的CまたはDでのCas9/RNA媒介性二本鎖切断が、NHEJによって不十分に修復され、それによって、eGFPコード配列が破壊されたNHEJを示すものであった。NHEJによって誘導される突然変異は、普通、<20bpを欠失または挿入し、従って、eGFPコーディング領域またはスプライス部位結合に影響を及ぼさないので、イントロン標的AおよびBのターゲッティングおよびNHEJによる修復は、eGFP蛍光の減少をもたらさない可能性が高い。他方、RFP蛍光の出現は、Cas9/RNA媒介性二本鎖切断が、示されるRFPの相同配列を使用するHRによって修復されるHRを示すものであった。
【００６９】
crRNAターゲッティングは、リピート配列である22ヌクレオチドを有し、20ヌクレオチド(スペーサー配列)は、特異的標的のためのものである、上記のような42ヌクレオチドのRNA分子を使用した。上記のように、標的DNAは、標的中にS.サーモフィルスモチーフまたはプロトスペーサーの下流の「NGGNG」であるPAMを必要とする。GFPは、このPAMモチーフを含有するよう「操作」されなかったが、eGFP内のいくつかの標的配列は、天然にPAM配列とともに生じ、crRNAは、隣接スペーサー配列をターゲッティングするよう設計された。RFPは、Cas9/RNAによってeGFPにおける二本鎖切断が作出された後の相同組換えのマーカーとした。
【００７０】
図28Aは、真核細胞におけるin vivoでのCas9タンパク質活性解析のためのリポーター遺伝子構築物を示す。イントロン配列は、3つのcas9標的部位(A、E、B)を含有し;GFP遺伝子は、2つの(C、D)cas9標的部位を含有する。RFP遺伝子は、Y196位で分かれており、これでは、RFP蛍光は消滅されている。図28Bは、in vivoでのイントロンプロセシング後にGFP蛍光が観察されることを示す。図28Cは、上記のヌクレアーゼ標的部位のいずれかにおけるCas9/crRNA複合体によって促進されたdsDNA切断が、HRを誘導し、RFP遺伝子の再構築およびRFP蛍光の出現をもたらし得ることを示す。図28DおよびEは、上記のヌクレアーゼ標的部位のいずれかにおける、Cas9/crRNA複合体によって促進されたdsDNA切断が、NHEJを誘導し得ることを示す。GFP遺伝子配列中の突然変異は、GFP蛍光の喪失または減少をもたらすであろう;イントロンにおける突然変異は、GFP蛍光に対して影響を及ぼさない可能性があるが、別個の場合には、不適切にスプライシングされたイントロン配列を有する成熟したメッセンジャーRNAをもたらし、GFP蛍光の喪失もしくは減少をもたらす可能性がある。
【００７１】
大腸菌から精製されたS.サーモフィルスCas9タンパク質を、in vitro転写されたtracrRNAおよびeGFP配列A(イントロン)または配列C(コーディング)のいずれかをターゲッティングする合成非修飾crRNAと複合体を形成させた。トランスフェクションのために、Cas9/RNA複合体(AまたはCのいずれかをターゲッティングする)を、トランスフェクション試薬TurboFECTとともにインキュベートし、別個の試験管中でリポータープラスミドDNAも、TurboFECTとともにインキュベートし、それらを、CHO-K1細胞に両方とも添加した。eGFP-陽性細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーによって決定した。図24および29において示されるように、細胞が、リポータープラスミド単独で、またはリポータープラスミドおよびCas9タンパク質単独でトランスフェクトされると、GFP-陽性細胞のパーセンテージは、全体的なトランスフェクション効率を示す約40〜50%であった。しかし、eGFPの配列CをターゲッティングするCas9/RNA複合体を、リポータープラスミドとともに細胞に添加した場合には、eGFP-陽性細胞のパーセンテージは、約15%に低下した。eGFP-陽性細胞におけるこの低減は、配列CをターゲッティングするCas9/RNA複合体のみを用いた場合にも見られ、配列AをターゲッティングするCas9/RNA複合体を用いた場合または非特異的RNAを用いた場合には、eGFP-陽性細胞の大幅な低下は見られなかった。この結果は、eGFPの配列CをターゲッティングするCas9/RNAは、二本鎖切断の導入およびNHEJによる不十分な修正によってeGFPの遺伝子編集をもたらし、eGFPのコード配列において欠失を作出することを示した。
【００７２】
eGFP-陽性細胞のパーセンテージを解析することに加えて、NHEJではなくHRによるCas9媒介性二本鎖切断の修復を示すものであるRFP-陽性細胞の出現をモニタリングするために、トランスフェクトされた細胞をまた、蛍光顕微鏡によって可視化した。図25に見られるように、リポータープラスミドおよびeGFP配列CをターゲッティングするCas9/RNA複合体を用いるトランスフェクション後に、いくつかの細胞においてRFPが見られ、これは、HRによる二本鎖切断修復を示唆する。
【実施例８】
【００７３】
合成非修飾tracrRNAおよびcrRNAを使用して製造されたCas9/RNA複合体は、in vitroで機能的である
上記の実施例7に記載される実験は、精製Cas9、合成crRNAおよびin vitro転写されたtracrRNAからなるCas9/RNA複合体を使用した。完全合成RNA構成要素(crRNAおよびtracrRNA)を使用して製造された場合にCas9/RNA複合体が機能的であるかどうかを調べるために、非修飾S.サーモフィルスtracrRNA(内因性89マーおよび機能を維持すると期待されるより短い74マーの型の両方)を合成した。非修飾合成crRNAは、上記のリポータープラスミド中のeGFPのイントロン内に位置する標的Eに対して作製し(図26および30を参照のこと)、Cas9/RNA(crRNAおよびtracrRNA)複合体を作製した。これらの複合体を調べるために、上記で使用したリポータープラスミドをin vitroで複合体とともにインキュベートし、ゲル電気泳動による制限についてモニタリングした。
【００７４】
図27に見られるように、完全合成RNAからなるCas9/RNA複合体は、in vitroアッセイにおいて、合成crRNAおよびin vitro転写されたtracrRNAからなるCas9/RNA複合体と同等に機能的であった。
【００７５】
本願は、ASCII形式で提出されており、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。2013年3月20日に作成されたASCIIコピーは、078981_6_SL.txtと名付けられており、64.4キロバイトの大きさである。
【００７６】
本明細書において示され、記載される実施形態は、単に、当業者である本発明者らの特定の実施形態であり、決して制限ではない。したがって、それらの実施形態への種々の変法、改変または変更が、以下の特許請求の範囲において、本発明の精神から逸脱することなく行われ得る。引用された参考文献は、参照によりその全文が本明細書に明確に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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