(57)【要約】【課題】  本発明は、新規ＮＯ産生抑制剤及び固形腫瘍に対する新規転移・浸潤抑制剤を提供することを目的とする。【解決手段】  下記構造式（Ｉ）を有する化合物またはその薬学的に許容できる塩を有効成分として含有する、ＮＯ産生抑制剤または固形腫瘍に対する新規転移・浸潤抑制剤とする。2019064973.tif 000010【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
固形腫瘍に対する腫瘍転移抑制剤であって、
下記構造式（Ｉ）を有する化合物またはその薬学的に許容できる塩を有効成分として含有する腫瘍転移抑制剤。
2019064973.tif 000007
【請求項２】
卵巣癌に対する腫瘍転移抑制剤である、請求項１に記載の腫瘍転移抑制剤。
【請求項３】
前記固形腫瘍に対する腫瘍細胞増殖抑制効果を有する抗腫瘍剤と併用される、請求項１または２に記載の腫瘍転移抑制剤。
【請求項４】
固形腫瘍に対する腫瘍浸潤抑制剤であって、
下記構造式（Ｉ）を有する化合物またはその薬学的に許容できる塩を有効成分として含有する腫瘍浸潤抑制剤。
2019064973.tif 000008
【請求項５】
卵巣癌に対する腫瘍浸潤抑制剤である、請求項４に記載の腫瘍浸潤抑制剤。
【請求項６】
前記固形腫瘍に対する腫瘍細胞増殖抑制効果を有する抗腫瘍剤と併用される、請求項４または５に記載の腫瘍浸潤抑制剤。
【請求項７】
下記構造式（Ｉ）を有する化合物またはその薬学的に許容できる塩を有効成分として含有する、ＮＯ産生抑制剤。
2019064973.tif 000009
【請求項８】
抗炎症剤または抗アレルギー剤として用いられる、請求項７に記載のＮＯ産生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＯ産生抑制剤及び固形腫瘍に対する転移・浸潤抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＫＤ-８３４４は、放線菌から単離された２８員環のマクロライド系の抗生物質であるが、殺虫剤など（例えば、特許文献１参照）や、医薬としての抗菌剤や白血病細胞に対する増殖抑制剤（例えば、特許文献２参照）としても知られている。現在まで、化学合成の方法も報告されている（例えば、特許文献２、非特許文献１〜３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平４-９１０２４号公開公報
【特許文献２】特開平０２-９３８２号公開公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Jiang W et al. Org Lett. 2000 Jul 27;2(15):2181-4.
【非特許文献２】Kim WH et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2006 Oct 27;45(42):7072-5
【非特許文献３】Zou Y and Wu Y. Angew Chem Int Ed Engl. 2012 May 14;51(20):4968-71.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新規ＮＯ産生抑制剤及び固形腫瘍に対する新規転移・浸潤抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一実施態様は、下記構造式（Ｉ）を有する化合物またはその薬学的に許容できる塩を有効成分として含有する、ＮＯ産生抑制剤である。
【０００７】
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このＮＯ産生抑制剤は、抗炎症剤または抗アレルギー剤として用いられてもよい。
【０００８】
本発明の他の一実施態様は、固形腫瘍に対する腫瘍転移抑制剤であって、下記構造式（Ｉ）を有する化合物またはその薬学的に許容できる塩を有効成分として含有する腫瘍転移抑制剤である。
【０００９】
2019064973.tif 000004
この腫瘍転移抑制剤が、卵巣癌に対する腫瘍転移抑制剤であってもよい。
【００１０】
また、この腫瘍転移抑制剤は、前記固形腫瘍に対する腫瘍細胞増殖抑制効果を有する抗腫瘍剤と併用されてもよい。
【００１１】
本発明のさらなる一実施態様は、固形腫瘍に対する腫瘍浸潤抑制剤であって、下記構造式（Ｉ）を有する化合物またはその薬学的に許容できる塩を有効成分として含有する腫瘍浸潤抑制剤である。
【００１２】
2019064973.tif 000005
この腫瘍浸潤抑制剤が、卵巣癌に対する腫瘍浸潤抑制剤であってもよい。
【００１３】
また、この腫瘍浸潤抑制剤は、前記固形腫瘍に対する腫瘍細胞増殖抑制効果を有する抗腫瘍剤と併用されてもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によって、新規ＮＯ産生抑制剤及び固形腫瘍に対する新規転移・浸潤抑制剤を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施例において、ＩＫＤ-８３４４が白血病細胞ＲＡＷ２６４．７に対してＮＯ産生抑制効果を有することを示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、ＩＫＤ-８３４４が卵巣癌細胞ＥＳ-２に対する増殖抑制活性を有しないことを示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、ＩＫＤ-８３４４が卵巣癌細胞ＥＳ-２に対して浸潤抑制効果を有することを示す図である。
【図４】本発明の一実施例において、ＩＫＤ-８３４４が卵巣癌細胞ＥＳ-２に対して細胞移動（cellular migration）抑制効果を有することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１７】
なお、本発明の目的、特徴、利点、および、そのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をこれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１８】
＝＝ＮＯ産生抑制剤＝＝
本発明の一実施形態は、下記構造式（Ｉ）を有する化合物ＩＫＤ-８３４４またはその薬学的に許容できる塩を有効成分として含有する、ＮＯ産生抑制剤である。このＮＯ産生抑制剤は、医薬・試薬などの薬剤、化粧品、機能性食品などに有用である。医薬としては、炎症性疾患、虚血性疾患、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、などに対する抗炎症剤、抗アレルギー剤などとして、利用できる。
【００１９】
＝＝転移及び／又は浸潤抑制剤＝＝
また、本発明の他の一実施形態は、下記構造式（Ｉ）を有する化合物ＩＫＤ-８３４４またはその薬学的に許容できる塩を有効成分として含有する、固形腫瘍に対する転移及び／又は浸潤抑制剤である。ここで、治療対象の固形腫瘍は特に限定されず、血液細胞やリンパ球以外の腫瘍であればよく、例えば、線維腫、脂肪腫、粘液腫、軟骨腫、骨腫、血管腫、黒色腫、筋腫、神経腫、神経膠腫、骨肉腫、筋肉腫、線維肉腫、乳頭腫、腺腫、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、十二指腸・空腸・回腸等の小腸癌、結腸・盲腸・直腸等の大腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、胆嚢癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、咽頭癌、皮膚癌などが例示できるが、好ましくは卵巣癌である。
【００２０】
【化１】
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【００２１】
なお、薬理学的に許容される塩とは、その化合物と塩を形成するものであれば限定されないが、具体的には例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩などの無機酸の付加塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩などの有機酸の付加塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩などのスルホン酸の付加塩、アミノ酸の付加塩などを挙げることができる。さらに、それらの化合物またはその薬理学的に許容される塩は、無水物のみならず水和物や結晶多形も含まれることは言うまでもない。
【００２２】
この抗腫瘍剤は、固形腫瘍細胞の増殖を抑制したり、生存率を低下させたりするのではなく、固形腫瘍細胞の転移及び／又は浸潤を抑制することで、その効力を発揮する。従って、この抗腫瘍剤を、上記のような固形腫瘍に対する増殖抑制効果を有する抗腫瘍剤（細胞増殖抑制剤）と併用することによって、相乗効果が得られる。併用する抗腫瘍剤は、固形腫瘍に対する増殖抑制効果を有するものであれば特に限定されず、例えばシクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、チオテパなどのナイトロジェンマスタード類や、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバシン、プロカルバシン、テモゾロマイド、カルムスチン、ストレプトゾトシン、ベンダムスチンなどのニトロソウレア類などのアルキル化薬；シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチンなどの白金製剤；フルオロウラシルなどのピリミジン代謝阻害薬や、６−メルカプトプリンなどのプリン代謝阻害薬や、プリンアナログ、ピリミジンアナログなどのヌクレオチドアナログなどの代謝拮抗薬；アントラサイクリン系、エピポドフィロトキシン系、キノロン系などのトポイソメラーゼ阻害薬などが挙げられる。
【００２３】
これらの医薬の形状、投与形態、投与量は特に限定されず、患者の症状、体重、年齢、性別等に従って、最適な形状、投与形態、投与量を容易に決定できる。
【実施例】
【００２４】
（実施例１）ＩＫＤ-８３４４は腫瘍細胞に対し、ＮＯ産生抑制効果を有する。
【００２５】
本実施例では、マウス単球由来の白血病細胞株であるＲＡＷ２６４．７を用い、ＩＫＤ-８３４４がＮＯ産生抑制効果を有することを示す。
【００２６】
（生存率の測定）１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地で培養したＲＡＷ２６４．７細胞の懸濁液（１ｘ１０４個／ｍＬ）を１００μＬ／ウエルで９６穴プレートに播種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２存在下で、２４時間培養した。そしてＩＫＤ-８３４４（終濃度０．００１、０．０１、０．１、１、１０μｇ／ｍＬ）を添加し、さらに２４時間培養した。その後、各ウエルに１０μＬのＭＴＴ溶液（Cayman社 Cat No 10009591）を添加し、２時間培養後、培地を吸引除去し、１００μＬ／ウエルでＤＭＳＯを添加した。こうしてformazanを細胞から溶出させ、５７０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー(Bio-Rad社)で測定した。各条件ごとに３連で実験を行い、その平均値を求めてグラフにプロットした（図１の折れ線グラフ）。なお、コントロールとして、ＩＫＤ-８３４４非存在下（図ではＣｏｎｔ）以外は同様の条件で実験した細胞を用いた。
【００２７】
その結果、細胞生存率は、ＩＫＤ-８３４４が０．１μｇ／ｍＬまでは有意な低下は観察されず、１μｇ／ｍＬ以上で若干の低下傾向にあった。
【００２８】
（ＮＯ産生量の測定）次に、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地で培養したＲＡＷ２６４．７細胞の懸濁液（３ｘ１０６個／ｍＬ）を１００μＬ／ウエルで９６穴プレートに播種し、ＬＰＳ（終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＫＤ-８３４４（終濃度０．００１、０．０１、０．１、１、１０μｇ／ｍＬ）を添加し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２存在下で、２４時間培養した。その後、５０μＬの上清を回収して５０μＬのGriess液（０．１％Ｎ-１-ナフチルエチレンジアミン  二塩酸，ｌ％スルファニルアミド，２．５％Ｈ３ＰＯ４）を加え、亜硝酸塩量を熱量測定法で測定した。各条件ごとに３連で実験を行い、その平均値を求めてグラフを作成した（図１の棒グラフ）。なお、コントロールとして、ＩＫＤ-８３４４非存在下でＬＰＳで刺激しない細胞（図ではＣｏｎｔ）、及びＩＫＤ-８３４４非存在下でＬＰＳで刺激した細胞（図ではＬＰＳ）を用いた。
【００２９】
その結果、ＩＫＤ-８３４４が増加するにつれて、細胞の生存率とともにＮＯ産生量が低下するが、ＮＯ産生量低下率は細胞生存率の低下率より顕著に大きい。例えば、細胞生存率がほぼ低下しない０．１μｇ／ｍＬのＩＫＤ-８３４４の場合、ＮＯ産生量は約３分の１に低下する。また、１０μｇ／ｍＬのＩＫＤ-８３４４の場合、コントロールに比べ、生存率は半分程度に低下するが、ＮＯ産生量は１０分の１以下にまで低下する。従って、この濃度では、ＩＫＤ-８３４４は、ＮＯ産生量を細胞あたり５分の１程度に抑制する効果を有する。
【００３０】
このように、ＩＫＤ-８３４４は、ＬＰＳで刺激した腫瘍細胞に対し、ＮＯ産生量を抑制する効果を有する。炎症巣においては、好中球やマクロファージはＮＯと同時に活性酸素の一種であるＯ２−を産生する。ＮＯは速やかにＯ２−と反応し、ＮＯより反応性の高いＯＮＯＯ−を生成し、この結果、炎症、アレルギー、糖尿病、動脈硬化などが引き起こされる。従って、ＩＫＤ-８３４４は、抗炎症剤、抗アレルギー剤などとして有用である。
【００３１】
（実施例２）ＩＫＤ-８３４４は固形腫瘍細胞に対し、細胞増殖抑制効果を有しない
【００３２】
本実施例では、ヒト卵巣癌細胞株ＥＳ-２を用い、ＩＫＤ-８３４４が固形腫瘍細胞に対して細胞生存率抑制効果を有しないことを示す。
【００３３】
１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用い、各濃度のＩＫＤ-８３４４存在下で培養したＥＳ-２に対し、実施例１と同様にして細胞生存率を測定した。ＩＫＤ-８３４４非存在下での細胞生存率を１００％としてグラフ化したものを図２に示した。
【００３４】
ＩＫＤ-８３４４については、ヒト卵巣癌細胞株ＥＳ-２に対し、高濃度の３μg／mLでも８０％の生存率を維持し、有意な細胞増殖抑制効果は観察されなかった。これに対し、マウス白血病細胞に対しては、０．００１μg／mLの濃度で、５８．０％の増殖抑制率を示している（特開平０２-９３８２号公開公報参照）。
【００３５】
このように、固形腫瘍に対しては、ＩＫＤ-８３４４は顕著な増殖抑制効果を有しない。
【００３６】
（実施例３）ＩＫＤ-８３４４は固形腫瘍細胞に対して浸潤抑制効果を有する。
【００３７】
本実施例では、ヒト卵巣癌細胞株ＥＳ-２を用い、ＩＫＤ-８３４４が固形腫瘍細胞に対して浸潤抑制効果を有することを示す。
【００３８】
各濃度のＩＫＤ-８３４４存在下で培養したＥＳ-２に対し、invasion assayによって浸潤を調べた。具体的には、BD Matrigel Basement Membrane Matrix membrane (Corning Inc., Corning, NY)を用いたボイデンチャンバー法を適用した。まず、ＥＳ-２細胞を各濃度のＩＫＤ-８３４４を含有し、５００μＬのＦＢＳを含有しないＤＭＥＭに懸濁し、上層に入れた。下層には上層と同じ濃度のＩＫＤ-８３４４を含有した７５０μＬの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを満たした。３７°Ｃ、５％ＣＯ２存在下で、２４時間培養後、membraneを固定して、下の層に浸潤した細胞を残し、浸潤せずに上の層に残った細胞を綿でこすって除いた。そして、Diff-Quick solution (Sysmex, Kobe, Japan)を用いて染色し、浸潤細胞数を計測した。ＩＫＤ-８３４４非存在下での浸潤を１００％としてグラフ化したものを図３に示した。
【００３９】
ＩＫＤ-８３４４は、ヒト卵巣癌細胞株ＥＳ-２に対して、増殖抑制効果を示さない１μg／mLまたは３μg／mLで有意な浸潤抑制効果を発揮している。
【００４０】
このように、固形腫瘍に対しては、ＩＫＤ-８３４４は浸潤抑制剤として有用である。
【００４１】
（実施例４）ＩＫＤ-８３４４は固形腫瘍細胞に対して腫瘍転移抑制効果を有する。
【００４２】
本実施例では、ヒト卵巣癌細胞株ＥＳ-２を用い、ＩＫＤ-８３４４が固形腫瘍細胞に対して細胞移動抑制効果を有することを示す。
【００４３】
具体的には、wound healing assayによって細胞移動（migration）を調べた。まず、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて、ＥＳ-２細胞を２４穴プレートにコンフルエントになるまで培養し、ピペットマンのチップで長方形状（約１ｍｍｘ１５ｍｍ）に細胞を除去し、各濃度のＩＫＤ-８３４４を添加して２４時間培養後に写真撮影を行い、培養後の長方形の短径幅を測定した。ＩＫＤ-８３４４非存在下での長方形の幅を１００％としてグラフ化したものを図４に示した。
【００４４】
ＩＫＤ-８３４４は、ヒト卵巣癌細胞株ＥＳ-２に対して、増殖抑制効果を示さない０．３μｇ／ｍＬ〜３μｇ／ｍＬの濃度で有意な腫瘍細胞移動抑制効果を発揮している。
【００４５】
このように、固形腫瘍に対しては、ＩＫＤ-８３４４は腫瘍転移抑制剤として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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