(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト女性被験者において妊娠を検出する検査デバイスを提供する。【解決手段】ラテラルフロー検査ストリップおよび／またはマイクロフルイディクスベースのアッセイを含み、被験者のサンプル中のｈＣＧの絶対量または相対量を測定するアッセイ手段と、被験者のサンプル中のＦＳＨの絶対量または相対量を測定するアッセイ手段と、被験者のサンプル中の１種以上のプロゲステロン代謝物の絶対量または相対量を測定するアッセイ手段とを含むポイントオブケアデバイスまたは「自己検査用」デバイスを提供する工程を含む。【選択図】図６
2019023647.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト女性被験者において妊娠を検出する検査デバイスであって、
前記被験者のサンプル中のｈＣＧの絶対量または相対量を測定するアッセイ手段と、
前記被験者のサンプル中のＦＳＨの絶対量または相対量を測定するアッセイ手段と、
前記被験者のサンプル中のプロゲステロン代謝物の絶対量または相対量を測定するアッセイ手段と
を含む検査デバイス。
【請求項２】
１つ以上のラテラルフロー検査ストリップおよび／またはマイクロフルイディクスベースのアッセイを含む、請求項１に記載の検査デバイス。
【請求項３】
アッセイ結果読取り手段を含む、請求項１または２に記載の検査デバイス。
【請求項４】
マイクロプロセッサー、ＡＳＩＣ、または他のコンピューターコントロール手段と、前記アッセイの結果またはアウトカムをユーザーに表示するためのアッセイ結果ディスプレイとをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項５】
各アナライトに対する少なくとも１つのあらかじめ決められたシグナル値閾値を用いてプログラムされたデジタルメモリーデバイスを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項６】
アナライトアッセイシグナル値とそれらのそれぞれのあらかじめ決められた閾値とを比較することにより検査結果を決定するアルゴリズムを用いてプログラムされた、マイクロプロセッサー、ＡＳＩＣ、または他のプログラマブルコンピューターコントロール手段を含む、請求項５に記載の検査デバイス。
【請求項７】
ポイントオブケアデバイスまたは「自己検査用」デバイスである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項８】
単回使用後に廃棄される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項９】
アッセイ検査結果を解釈し、かつ検査アウトカムを前記ユーザーに表示する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のデジタル検査デバイス。
【請求項１０】
１つ以上のマイクロフルイディクスまたはラテラルフローアッセイ検出ゾーンに照射する１つ以上の光源と、前記検出ゾーンにより反射または透過された光を検出する１つ以上の光検出器とを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項１１】
ｈＣＧに対する少なくとも２つのアッセイを含み、前記アッセイの１つが比較的高感度のアッセイであり、かつ前記アッセイの１つが比較的低感度のアッセイであり、それにより、前記検査デバイスが広範囲にわたるｈＣＧ濃度を測定できる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項１２】
前記比較的高感度のアッセイおよび前記比較的低感度のアッセイが、個別のラテラルフロー検査ストリップ上または個別のマイクロ流体アッセイ流路上で行われる、請求項１１に記載の検査デバイス。
【請求項１３】
前記比較的高感度のアッセイおよび前記比較的低感度のアッセイが、同一のラテラルフロー検査ストリップ上または同一のマイクロ流体アッセイ流路上で行われる、請求項１１
に記載の検査デバイス。
【請求項１４】
プロゲステロン代謝物アッセイにより検出される前記プロゲステロン代謝物がプレグナンジオールまたはその誘導体を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項１５】
前記プロゲステロン代謝物アッセイにより検出される前記プロゲステロン代謝物がグルクロニドを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項１６】
前記プロゲステロン代謝物アッセイにより検出される前記プロゲステロン代謝物がプレグナンジオール−３−グルクロニドを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項１７】
前記検査デバイスが下限ｈＣＧ閾値および上限ｈＣＧ閾値を用いてプログラムされ、それにより、前記下限ｈＣＧ閾値未満のｈＣＧアッセイ結果が、前記被験者が妊娠していないことを意味すると解釈され、かつ前記上限閾値超のｈＣＧアッセイ結果が、他の２つのアナライトのアッセイ結果にかかわらず前記被験者が妊娠していることを意味すると解釈され、かつ前記下限閾値と前記上限閾値との間のｈＣＧアッセイ結果が、ＦＳＨおよびプロゲステロン代謝物のアッセイ結果に依存して、妊娠しているまたは妊娠していないと解釈される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項１８】
前記検査デバイスが下限ｈＣＧ閾値および上限ｈＣＧ閾値を用いてプログラムされ、それにより、前記下限ｈＣＧ閾値未満のｈＣＧアッセイ結果が、前記被験者が妊娠していないことを意味すると解釈され、かつ前記上限閾値超のｈＣＧアッセイ結果が、他の２つのアナライトのアッセイ結果による確認に付されて、前記被験者が妊娠していることを意味すると解釈される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項１９】
少なくとも１つの追加のｈＣＧ閾値をさらに含む、請求項１７または１８に記載の検査デバイス。
【請求項２０】
妊娠している被験者の妊娠のおよその在胎期間を表示するように適合化および構成されている、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項２１】
妊娠している被験者の在胎期間を１〜２週間、２〜３週間、または３＋週間の間隔で適宜表示する、請求項２０に記載の検査デバイス。
【請求項２２】
前記デバイスが適正に機能しているかを示すコントロール機能をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項２３】
前記検査デバイスの要素のほとんどまたはすべてと、ハウジングを越えて突出してサンプルの適用を可能にするサンプル適用部材上のサンプル適用ゾーンとを収容する湿分不透過性ハウジングを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項２４】
共通のサンプル適用ゾーンに適用されたサンプルが２つ以上の個別の流路に進入し、前記２つ以上の個別の流路のそれぞれで少なくとも１つの異なるアナライトアッセイが行われるように、前記共通のサンプル適用ゾーンを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項２５】
ｈＣＧ、ＦＳＨ、およびプロゲステロン代謝物のそれぞれのアッセイがすべて、単一の共通流路上に提供される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項２６】
黄体形成ホルモンの絶対量または相対量を測定するアッセイ手段および／またはヒト胎盤性ラクトゲンの絶対量または相対量を測定するアッセイ手段を追加的に含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項２７】
個別の耐久性アッセイ結果読取りデバイスと組み合わされた使い捨て目視読取りデバイスである、請求項１もしくは２または請求項１もしくは２に従属する請求項７もしくは８、１１〜１６、または２２〜２５のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項２８】
前記個別のアッセイ結果読取りデバイスがカメラを含む、請求項２７に記載の個別の耐久性アッセイ結果読取りデバイスと組み合わされた検査デバイス。
【請求項２９】
前記個別のアッセイ結果読取りデバイスがスマートフォンまたは他のデジタルハンドヘルド読取りデバイスを含む、請求項２７または２８に記載の個別のアッセイ結果読取りデバイスと組み合わされた検査デバイス。
【請求項３０】
ヒト女性被験者において妊娠を検出する方法であって、前記被験者のサンプルと、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の検査デバイスとを接触させる工程を含む方法。
【請求項３１】
ヒト女性のサンプルで行われたｈＣＧ、ＦＳＨ、およびプロゲステロン代謝物のアッセイの結果を解析し、かつ前記アッセイの１つ以上の解析から前記被験者が妊娠しているかおよび／または妊娠の在胎期間を決定するようにプログラムされている電子プログラマブルデバイス。
【請求項３２】
前記解析が、特定のアナライトのアッセイシグナル値と、少なくとも１つのそれぞれの記憶された閾値シグナル値とを比較することを含む、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項３３】
以下に示される特徴（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）９９％以上の感度、
（ｉｉ）９９％以上の特異度、
（ｉｉｉ）検査日が妊娠初期（予想月経日前）の場合でも（ｉ）および（ｉｉ）を達成する能力、
（ｉｖ）検査の実施／アッセイデバイスの使用が単一の時点（すなわち単一の日）で１回の場合でも（ｉ）および（ｉｉ）を達成する能力、
（ｖ）アッセイデバイス／方法が外的情報（たとえば、女性の年齢または前記被験者のなんらかの病歴、たとえば、ｈＣＧ、ＦＳＨ、またはプロゲステロンの事前の測定）をなんら必要としないこと、および
（ｖｉ）前記被験者が閉経周辺期および／または閉経後の女性を含む場合でも（ｉ）および（ｉｉ）を達成する能力
のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上、最も好ましくはすべてを提供する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の検査デバイスまたは請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
請求項３１または３２に記載の、かつさらに請求項１〜２５のいずれか一項に記載の、電子プログラマブルデバイス。
【請求項３５】
実質的に本明細書に記載されるおよび添付の図面が参照される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊娠検査デバイス、妊娠検査の実施方法、およびかかるデバイスの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
流体サンプル中のアナライトの検出のために、単純なラテラルフローイムノアッセイデバイスの開発および商品化が行われてきた（たとえば、欧州特許第２９１１９４号明細書を参照されたい）。かかるデバイスは、典型的には、対象のアナライトに結合可能な乾燥可動性標識結合試薬を含む多孔性担体と、標識結合試薬の下流の検出ゾーンに提供された同様にアナライトに結合可能な固定化結合試薬とを含む。検出ゾーンでの固定化標識結合試薬の検出は、サンプル中のアナライトの存在の指標となる。
【０００３】
他の選択肢として、対象アナライトがハプテンである場合、イムノアッセイデバイスで競合反応を利用しうる。この場合、標識アナライトまたはアナライトアナログが、検出ゾーンでの固定化結合試薬への結合に関して、サンプル中に存在するアナライトと競合する。他の選択肢として、アッセイデバイスで阻害反応を利用しうる。この場合、固定化アナライトまたはアナライトアナログが検出ゾーンに提供され、アッセイデバイスがアナライトに対する可動性標識結合試薬を含む。
【０００４】
アッセイデバイスは、２種以上のアナライトの存在および／または量を検出しうる。たとえば、乱用薬物の存在を検出するアッセイの場合、デバイスは、全薬物パネルを決定可能でありうる。かかるラテラルフローイムノアッセイデバイスは、一般に複数の検出ゾーンを備え、かかるゾーンは、アッセイデバイス内の単一または複数のラテラルフロー担体上に提供される。
【０００５】
アッセイ結果の決定は、従来は目視により行われてきた。しかしながら、かかるデバイスではユーザーが結果を解釈する必要があるため、とくに検出ゾーンの濃度がわずかである低アナライトレベルでは、望ましくない程度に主観性が入り込む。
【０００６】
このため、アッセイ結果を決定するように配置された光学的検出手段の他に、アッセイ結果を表示する表示手段も含むデジタルデバイスが開発されてきた。流体サンプル中のアナライトの濃度および／または量を決定するためのアッセイ検査ストリップと組み合わせて使用されるデジタルアッセイリーダーは公知であり、同様に、一体型デジタルアッセイリーダーを含むアッセイデバイスも公知である。かかるデバイスの例は、欧州特許第１４８４６０１号明細書に開示されている。
【０００７】
発光ダイオード（ＬＥＤ）などの光源からの光が多孔性担体の一部上に照射され、反射光または透過光のいずれかが光検出器により検出される。典型的には、リーダーは、担体の種々のゾーンに照射するための２つ以上のＬＥＤを有し、複数のＬＥＤのそれぞれに対応する光検出器が提供される。欧州特許第１４８４６０１号明細書には、デバイス中の光検出器の数の低減を可能にするバッフル配置を含む、ラテラルフロー検査ストリップのデジタル読取りデバイスの光学配置が開示されている。
【０００８】
上記のタイプのアッセイ技術は、「自己検査用」妊娠検査デバイスに実装されてきた。これは、典型的には、妊娠している可能性があると推測する女性が使用するデバイスである。このため、使用しやすいように（医学的訓練または技術的訓練をなんら必要とすることなく）設計しなければならず、典型的には１回使用後使い捨て可能である。デバイスは
、通常、ラテラルフローイムノアッセイデバイスであり、検査は、通常、ラテラルフローアッセイスティックのサンプリング部を尿サンプルに接触させることによりで開始される。アッセイスティックのサンプリング部は、容器内の尿サンプル中に浸漬されうるか、またはより典型的にはユーザーがサンプリング部上に直接排尿しうる。次いで、女性がさらなる工程をなんら必要とすることなくアッセイが行われ、結果が示されて眼により読み取られるか、または結果がデジタルデバイスにより読み取られ、アッセイ結果読取り手段により決定され、たとえば液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）などのディスプレイを利用してユーザーに表示される。
【０００９】
このような従来の妊娠検査は、サンプル中のヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を測定することにより行われる。ｈＣＧは発生中の胚により産生され、サンプル中のｈＣＧ濃度が一定の閾値を超えると陽性（すなわち「妊娠」）の結果がもたらされる。
【００１０】
改善された妊娠検査、とくに、改善された自己検査用妊娠検査の必要性が存在する。すなわち、多くの女性は、妊娠しているかをできるだけ早く知りたいと思っているため、尿などのサンプル中の非常に低濃度のｈＣＧを検出可能な非常に高感度の検査の必要性が存在する。しかしながら、このことは問題を引き起こす。なぜなら、ｈＣＧは、ときには妊娠以外の理由で比較的低濃度で尿中に存在することがあり、その結果、非常に高感度の妊娠検査は、偽陽性の結果を与える（すなわち、アッセイの特異度が減少する）おそれがあるからである。
【００１１】
この実例として、非妊娠関連ｈＣＧが尿サンプル中に存在しうる。より特定的には、ｈＣＧは、閉経周辺期および閉経後の女性の尿中に存在し、かつ発生中の胚ではなく下垂体に由来しうる。この下垂体由来ｈＣＧまたは他の非妊娠関連ｈＣＧの検出は、妊娠検査では妊娠に関して偽陽性の結果をもたらすであろう。多くの国々では、女性は、たとえば仕事または他の取組みの都合上、第１子をもうける時期をより遅い時期まで延ばす。このため、「家庭用」または自己検査用の妊娠検査デバイスに対する小さいが有意な市場は、高齢の女性により占められ、これらの女性は、閉経周辺期または閉経後のグループに属しうるため、高感度のｈＣＧアッセイを使用すると偽陽性の結果を生じやすい。一研究によれば、ＯＴＣ妊娠検査薬の販売の１０％までは、４０歳を超える女性が対象となってきた（Ｌｅａｖｉｔｔ  ＳＡ  ２００６，“Ａ  ｐｒｉｖａｔｅ  ｌｉｔｔｌｅ  ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：ｔｈｅ  ｈｏｍｅ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｔｅｓｔ  ｉｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｃｕｌｔｕｒｅ”．Ｂｕｌｌ．Ｈｉｓｔ．Ｍｅｄ．２００６；８０：３１７−４５）。
【００１２】
世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）によれば、「閉経」および「閉経周辺期」の公認の定義は以下のとおりである。
【００１３】
閉経（自然閉経）は、卵巣濾胞活動の喪失に起因する月経の永久的停止として定義される。自然閉経は、他の明らかな病理学的または生理学的原因が存在せずに１２ヶ月間連続した無月経の後に生じたものであると認識される。閉経は、思い返してみたときにのみ確信をもってその事象の１年以上後に分かる最終月経期（ＦＭＰ）を伴って生じる。
【００１４】
閉経周辺期  −  この用語は、閉経直前の期間（閉経に近づく内分泌学的、生物学的、および臨床的特徴が始まるとき）および閉経後の最初の１年間を含む。
【００１５】
したがって、本目的では、閉経周辺期の女性は、同様に以上のＷＨＯの定義に準拠した閉経周辺期にある女性として定義され、閉経後の女性は、以上のＷＨＯの定義に準拠した閉経を生じた女性として定義される。
【００１６】
自己検査用または「家庭用」の妊娠検査は、女性が試験結果を受け取って適切な処置を
確実に講じられるように信頼できるものである必要がある。望ましい信頼性の目標は≧９９％の確度である（すなわち、偽陽性率と偽陰性率との合計が１％以下である）。現在利用可能な自己検査用または家庭検査用のデバイスは、≧９９％の感度で２５ｍＩＵ／ｍｌ以上の濃度の尿中ｈＣＧを検出可能である。かかるデバイスは、所望の≧９９％の確度の目標を達成可能であるが、被験者が予想する自分の月経開始日（すなわち、月経出血が予想される初日）以降に使用した場合に限られる。なぜなら、その時点から、ほぼすべての妊娠女性は、２５ｍＩＵ／ｍｌ以上の尿中ｈＣＧ濃度を有し、かつ非妊娠関連ｈＣＧレベルは、通常このレベルには決して達しないからである。しかしながら、女性が自分の予想月経日前に自己検査用デバイスを使用すると、尿中ｈＣＧ濃度が検査により検出可能なレベルにまだ達していないため、偽陰性の結果となる可能性がある。したがって、現在利用可能な従来の自己検査用妊娠検査デバイスは、予想月経日前に使用したときは９９％の確度ではない。実際には、排卵後の１０日間の尿中ｈＣＧのメジアンレベルは、約８．４ｍＩＵ／ｍｌであり、この日からサンプルの約１０％のみが＞２５ｍＩＵ／ｍｌのｈＣＧ濃度を有するであろう。したがって、このように妊娠の早い時期に２５ｍＩＵ／ｍｌの感度を有する従来の自己検査用デバイスを用いると、非常に低い妊娠検出率になるであろう。排卵の１１日後、メジアンレベルは１９．８ｍＩＵ／ｍｌまで上昇するため、この段階では女性の５０％未満が陽性の結果になるであろう。より後の検査の検出率は、２５ｍＩＵ／ｍｌの検査感度に基づいて、約７０％（１２日目）、８０％（１３日目）、および約１００％（１４日目）になるであろう。より高感度の検査を単に使用しただけでは解決にはならない。なぜなら、この場合、非妊娠関連ｈＣＧを検出する可能性が増加して偽陽性の結果を生じるリスクが増加し、その結果、検査は依然として≧９９％の確度にならないであろうからである。
【００１７】
したがって、予想月経日よりも早い妊娠の時点で使用した時でさえも、≧９９％の確度で妊娠を検出可能な妊娠検査デバイス、とくに自己検査用または家庭検査用のデバイスの必要性が存在する。
【００１８】
異なる場面で、多くの国々では、出産可能年齢のほぼすべての女性患者に対して、発生中の胎児を害するおそれのあるいかなる医学的介入を行う前にも、血清中ｈＣＧ検査がルーチン的に行われる。閉経周辺期および閉経後の女性において、「下垂体」ｈＣＧに起因する血清中ｈＣＧレベルの上昇の問題が認識されている。Ｓｎｙｄｅｒら（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００５  ５１，１８３０−１８３５）は、妊娠していない女性の血清中ｈＣＧ濃度の年齢に伴う変化を調べて、予想されるｈＣＧの結果よりも高いことを解釈する一助として血清中濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）測定の利用を検討した。これらの研究者は、血清中ｈＣＧ測定と、被験者の年齢についての知見と、血清中ＦＳＨ測定との組合せを利用して、「偽陽性」妊娠の結果を低減または回避することが可能であることを示唆した。しかしながら、これらの研究者は、自己検査用妊娠検査に取り組んでおらず、とくに、非常に早い段階で妊娠を検出することには取り組んでいなかった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
第１の態様では、本発明は、ヒト女性被験者において妊娠を検出する検査デバイスを提供する。かかる検査デバイスは、
被験者のサンプル中のｈＣＧの絶対量または相対量を測定するアッセイ手段と、
被験者のサンプル中のＦＳＨの絶対量または相対量を測定するアッセイ手段と、
被験者のサンプル中の１種以上のプロゲステロン代謝物の絶対量または相対量を測定するアッセイ手段と
を含む。
【００２０】
サンプルは、全血、血漿、血清、尿などの任意の好適な体液でありうる。しかしながら
、尿サンプルがきわめて好ましい。なぜなら、かかるサンプルは、容易に取得可能であり、侵入的手順を行う必要がないからである。その他に、尿サンプルを使用すれば、ユーザーによる自己検査が容易になる。
【００２１】
これとの関連では、サンプル中に存在するアナライトの量は、絶対的に（たとえば、単位体積あたりの数値により）または相対的に（たとえば、あらかじめ決められた閾値の参照により）決定されうる。特定的には、「１種以上のプロゲステロン代謝物の相対量」とは、サンプル中の異なるプロゲステロン代謝物の濃度を互いに比較するが、１種以上のかかるアナライトの濃度をあらかじめ決められた閾値と比較しないでもよいことを意味することが意図される。アッセイ手段は、それらのそれぞれのアナライトを測定するように適合化および構成されるが、以下で説明されるように、１つのアッセイ手段を２種以上の異なるアナライトを測定するように適合化および構成しうる。
【００２２】
説明すると、受胎後、女性はすでに妊娠しているため、さらなる排卵周期は不要である。したがって、受胎後、ＦＳＨ産生の抑制により濾胞形成が阻害される。それゆえ、妊婦では、上昇レベルのｈＣＧおよび低レベルのＦＳＨが観測されることが予想されよう。したがって、ＦＳＨの測定を利用することにより、わずかに上昇したレベルのｈＣＧの検出の有意性を解釈するのに役立ちうる。とくに、これが非妊娠関連源によることが推測される場合に役立ちうる。
【００２３】
さらに説明すると、妊娠の最初の１０〜１２週間の間、黄体により産生されたプロゲステロンは、子宮内膜を保持することにより妊娠の継続を可能にする。プロゲステロンレベルは、月経周期の黄体期の一部で上昇するが、このレベルは、妊娠が起こらないと（すなわち、被験者が月経を生じると）低下してベースラインレベルに戻る。しかしながら、プロゲステロン（およびその尿代謝物）レベルは、妊娠が起こると上昇状態を維持して妊娠期間を通じて上昇し続けるであろう。その結果、プロゲステロン（およびその尿代謝物）は、妊娠の追加確認としてｈＣＧの補助剤として使用可能である。
【００２４】
検査デバイスは、好ましくは、アッセイ結果を解釈して妊娠検査のアウトカムを決定するための手段、好ましくは、検査のアウトカムを表示するための表示手段をさらに含むであろう。
【００２５】
第２の態様では、本発明は、ヒト女性被験者において妊娠を検出する方法を提供する。かかる方法は、被験者のサンプルと、以上に定義された第１の態様に係る検査デバイスとを接触させる工程を含む。以上に述べたように、サンプルは、好ましくは尿サンプルである。
【００２６】
本発明の好ましい特徴を以下でさらに詳細に説明する。これらは、第１の態様に係る検査デバイスとの関連で説明されているが、文脈上とくに規定されないかぎり、第２の態様に係る方法にも同じようにあてはまることは明らかであろう（その逆も同様である）。
【００２７】
検査デバイスは、液体サンプルが流動しうる１つ以上の作製されたキャピラリーチャネル（典型的には規定の口径のもの）を有するマイクロフルイディクスベースのアッセイを含みうるが、検査デバイスは、より好ましくはラテラルフローアッセイを含む。検査デバイスは、マイクロ流体アッセイおよびラテラルフローアッセイの両方を含みうる。一実施形態では、検査デバイスは、３つの各アナライト（すなわち、ｈＣＧ、ＦＳＨ、およびプロゲステロン代謝物）のそれぞれ１つに対してそれぞれ１つのアッセイを有する３つのラテラルフローアッセイを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、１つの特定のアナライトに対して２つ以上のアッセイを有す
ることが望ましいこともある。たとえば、一方のアッセイはマイクロフルイディクスアッセイでありうるとともに、他方のアッセイはラテラルフローアッセイでありうる。他の選択肢として、アナライトに対するアッセイは両方とも、マイクロフルイディクスアッセイでありうるかまたはラテラルフローアッセイでありうる。アナライトに対するアッセイが両方ともラテラルフローアッセイである場合、それらは、単一のラテラルフロー検査ストリップ上またはそれぞれのラテラルフロー検査ストリップ上で行われうる。
【００２９】
たとえば、ｈＣＧレベルは、妊娠初期に指数関数的に増加するため、妊娠被験者の尿サンプル中のｈＣＧ濃度は、被験者がどの程度長い期間妊娠しているかに依存してかなり変化しうる。したがって、サンプル中のｈＣＧ濃度を広範な濃度範囲にわたり決定できるように、ｈＣＧに対して比較的高感度のアッセイである１つのアッセイと、ｈＣＧに対して比較的低感度のアッセイである１つのアッセイとを提供することが望ましいこともある。（説明すると、高レベルのアナライトは、フック効果として知られる厄介な問題を引き起こしうる。これは、アッセイ範囲が限られていることに起因して高感度のアッセイで不正確さもたらしうるため、低減感度のアッセイを提供して非常に高いアナライトレベルで正確な測定を行えるようにすることが有益でありうる）。
【００３０】
通常、プロゲステロンは、検出可能量で尿中に存在しない。その代わりに、それは代謝されて、種々のプロゲステロン代謝物が尿中に排出される。したがって、本発明に係るアッセイは、尿中の１種以上のプロゲステロン代謝物を測定するように適合化される。プロゲステロン代謝物は、４つのグループ、すなわち、プレグナンジオール類、プレグナノロン類、プレグナンジオン類、およびプレグナンジオールよりも高い極性の化合物を含有する最後のグループに分類されうる。理論上、これらの４つのグループのいずれか１つに由来する１種以上の代謝物が、本発明での測定に好適でありうる。好ましい例としては、プレグナノロン（３α−ヒドロキシ−５β−プレグナン−２０−オン）およびプレグナンジオール（５β−プレグナン−３α−２０α−ジオール）が挙げられる。後者の化合物は、一般に最高濃度で尿中に存在するプロゲステロン代謝物であるため、検査するのにとくに好ましい（Ｃｏｏｋｅ，Ｉ．Ｄ．１９７６，Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ
ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．Ｉｎ：Ｌｏｒｒａｉｎｅ，Ｊ．Ａ．＆Ｂｅｌｌ，Ｅ．Ｔ．（ｅｄｓ）“Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”ｐｐ４４７−５０８）。たとえば、プレグナンジオールおよびプレグナノロンへの参照が、文脈上とくに規定されないかぎり、それらの一般に存在する誘導体を包含することは、当業者には自明であろう。特定的には、プロゲステロン代謝物は、通常はグルクロニドとして、ときにはスルフェートとして尿中に存在する。それゆえ、たとえば、プレグナンジオールへの本明細書での参照は、とくにプレグナンジオール−３−グルクロニド（「Ｐ−３−Ｇ」）（ときにはＰｄＧとしても参照される）を包含する。さらに、「プロゲステロン」または「プロゲステロンアッセイ」への本明細書での参照は、文脈上とくに規定されないかぎり、とくにプロゲステロン代謝物およびプロゲステロン代謝物のアッセイをそれぞれ包含することが意図される。
【００３１】
プロゲステロンの種々の代謝物間の構造相同性つまり抗原類似性の程度が非常に高くなりうることは分かるであろう。したがって、免疫学ベースのアッセイでは、第１の結合親和性で特定のプロゲステロン代謝物に結合する抗体は、第１の結合親和性よりも有意に低くないこともある第２の結合親和性で異なるプロゲステロン代謝物に結合しうるため、抗体はある程度交差反応しうる。他の選択肢として、ヒト尿中に存在する特定のプロゲステロン代謝物に対して他のプロゲステロン代謝物よりもかなり高い結合親和性（たとえば、少なくとも１０倍以上）を有する高特異的抗体を利用することが可能である。したがって、「プロゲステロン代謝物」のアッセイでは、いくつかの異なるプロゲステロン代謝物が頻繁に検出されうる。異なるプロゲステロン代謝物に対する任意の試薬の交差反応性の程度は、本発明に決定的に重要ではないが、以下で説明されるように、とくにこの特徴を試
薬の選択および適切な「閾」値の選択に反映させる必要がありうることは、当業者であれば分かるであろう。
【００３２】
同様に、尿中に存在しうるヒトＦＳＨのいくつかの変異体（たとえば、単離されたβ鎖などの断片）、およびたとえば異なるグリコシル化度を有する異なるアイソフォーム（Ｗａｌｔｏｎ  Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．，８６，３６７５−８５，２００１、Ｄａｈｌ，Ｋ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓｔｏｎｅ  Ｍ．Ｐ．Ｊ  Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ，１３，１１，１９９２、およびＢａｅｎｚｉｇｅｒ，Ｊ．Ｕ．ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｅ．Ｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，９４７，２８７−３０６，１９８８を参照されたい）が存在し、免疫学ベースのアッセイでは、ＦＳＨの単一の変異体、断片、もしくはアイソフォームに比較的特異的に結合する抗体を利用しうるか、または許容しうる程度に高い親和性でいくつかの異なるヒトＦＳＨ変異体に結合するそれほど特異的でない抗体を利用しうる。この場合も、このことは、アッセイで選ばれる試薬の選択および／または閾値の選択に影響を及ぼしうるが、一般的には本発明の機能にそれほど重要ではない。類似の見解は、ｈＣＧおよびその変異体にもあてはまる。
【００３３】
一般的には、本発明の根底をなす概念は、非常に高感度のｈＣＧアッセイを用いて非常に早い時期に妊娠を検出できるようにすること、かつＦＳＨおよびプロゲステロン代謝物の追加測定により被験者の年齢についての知見を必要とすることなく検査の特異度を許容しうる程度に高いレベルに維持できるようにすること（すなわち、非妊娠関連源由来のｈＣＧの検出に起因する多数の偽陽性の結果を回避できるようにすること）である。アッセイデバイスは、単純なＰｏＣとして、より特定的には使用のために医学的訓練または技術的訓練をなんら必要としない自己検査用デバイスとして、とくに好適である。特定的には、アッセイデバイスは、好ましくは１回使用後使い捨て可能である。さらに、デバイスは、望ましくは、デバイスを十分量の尿サンプルに接触させた後はさらなるユーザー介入をなんら必要とすることなく種々のアッセイが自動で行われる、単純なラテラルフローデバイスまたはマイクロフルイディクスベースのデバイスである。デバイスは、デジタルデバイスであることがさらに好ましい。すなわち、デバイスは、アッセイのアウトカムを読み取ってユーザーに表示する。
【００３４】
特定的には、本発明に係るアッセイデバイスは、好ましくは自己検査用または家庭検査用のデバイスである。好ましい実施形態では、アッセイデバイスは、予想月経日前に使用した場合でも≧９９％の確度を有する。より特定的には、本発明に係るアッセイデバイスは、予想月経日よりも２日ほど早く使用した場合でも、好ましくは予想月経日よりも３日ほど早く使用した場合でも、好ましくは予想月経日よりも４日ほど早く使用した場合でも、好ましくは予想月経日よりも５日ほど早く使用した場合でも、より好ましくは予想月経日よりも６日ほど早く使用した場合でも、≧９９％の確度を達成しうる（たとえば、ＬＨピークまたはＬＨサージを基準にして計算される）。
【００３５】
ｈＣＧの検査で陽性（妊娠）の可能性がある結果が示唆された場合（すなわち、尿中ｈＣＧがあらかじめ決められた閾値を超えるサンプルの場合）、これをＦＳＨアッセイおよびプロゲステロン代謝物アッセイの結果により確認（または否定）することが可能である。それゆえ、たとえば、ｈＣＧレベルがあらかじめ決められた閾値をわずかに超えた場合、上昇したＦＳＨレベルおよび低いプロゲステロン代謝物レベルを伴えば、被験者は妊娠していないことが示唆される（かつ、上昇したｈＣＧレベルは非妊娠関連起源であることが示唆される）。
【００３６】
このように、本発明は、高感度（すなわち、妊娠被験者の９９％以上を検出する）、高特異度（すなわち、１％以下の偽陽性率）で妊娠を検出可能な、さらに被験者が閉経周辺
期および閉経後の女性を含む場合でさえも、さらに驚くべきことに妊娠の非常に早い段階の単一の時点（日）で（すなわち予想月経日前でさえも）かつ他の外的情報（たとえば被験者の年齢など）をなんら用いることなく、こうした結果を達成可能な妊娠検査を提供する。
【００３７】
本発明の他の利点は、被験者が非常に高レベルのｈＣＧβコア断片を有する場合にポイントオブケアのｈＣＧベースの妊娠検査デバイスで起こりうる偽陰性の結果を回避しうることである。この問題は、当技術分野で認識されており、たとえば、Ｇｒｏｎｏｗｓｋｉら（２００９  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５５，１３８９−１３９４）により記載されている。この理由は、過剰のβコア断片の阻害作用により引き起こされる不自然に低いｈＣＧシグナルが、過剰のβコア断片の影響を受けないＦＳＨおよびプロゲステロン代謝物のアッセイ結果により補償されることにある。
【００３８】
有利には、本発明に係るアッセイデバイス／方法により行われる（少なくとも）３つのアナライトアッセイのそれぞれに、単一の尿サンプルを用いて検査サンプルが提供される。便宜上、３つのアナライトアッセイはすべて、好ましくは単一の尿サンプルをアッセイデバイスに適用して、実質的に同時に行われる。これは、適宜、とくに以下に記載の実施形態を用いて達成可能である。
【００３９】
本目的では、３つのアナライト検査は「実質的に同時に」行われ、その際、検査は、同一の排尿エピソードに由来する尿サンプルを用いて行われ、かつアッセイの結果は、互いに３分以内、好ましくは互いに５分間以内、より好ましくは互いに１０分以内、最も好ましくは互いに６０秒以内に読み取られる。望ましくは、３つのアナライト検査はすべて、ユーザーが尿サンプルを検査デバイスのサンプル接触部に適用することにより実質的に同時に（すなわち互いに６０秒以内に）開始される。
【００４０】
好ましい実施形態では、本発明の種々の態様は、以下の特徴の１つ以上（望ましくはすべて）を有する。
【００４１】
（ｉ）９９％以上の感度、
（ｉｉ）９９％以上の特異度、
（ｉｉｉ）検査日が妊娠初期（すなわち、本明細書に定義される予想月経日前）の場合でも（ｉ）および（ｉｉ）を達成する能力、
（ｉｖ）検査の実施／アッセイデバイスの使用が単一の時点（すなわち単一の日）で１回の場合でも（ｉ）および（ｉｉ）を達成する能力、
（ｖ）アッセイデバイス／方法が外的情報（たとえば、女性の年齢または被験者のなんらかの病歴、たとえば、ｈＣＧ、ＦＳＨ、またはプロゲステロンの事前の測定）をなんら必要としないこと、ならびに
（ｖｉ）被験者が閉経周辺期および／または閉経後の女性（本明細書に定義されるとおり）を含む場合でも（ｉ）および（ｉｉ）を達成する能力。
【００４２】
本明細書の目的では、妊娠「初期」とは、女性において排卵時またはその近傍で出現し検出される黄体形成ホルモンのピークレベル［「ＬＨピーク」］を基準にして計算される予想月経日前を意味する。説明すると、予想月経日は、通常、ＬＨピークの１５日後であると推定される。
【００４３】
本発明者らは、本発明に係る装置および方法を用いれば、閉経周辺期および閉経後の女性の場合でも、単一の時点でのアッセイから９９％以上の感度および９９％以上の特異度で真の妊娠状態を確認できるはずであると推定した。
【００４４】
予想月経日は、一定の時点を基準にして計算可能である。特定的には、予想月経日は、ＬＨサージ日（すなわち、ＬＨレベルの明確な顕著な増加が周期の最初に検出される日）を基準にして計算可能であり、このＬＨサージイベントは、通常、ＬＨピークの約１２〜２４時間前に起こる。予想月経日はまた、最終月経日に通常の周期の長さ（日数単位）を加えることにより計算されうる。予想月経日を計算する他の方法は、最終月経日に２８日を加えることを含む。
【００４５】
一般的に言えば、特定の時間が経過した後、アナライトアッセイ結果が決定されよう（必ずというわけではないが、通常はサンプルをアッセイデバイスのサンプリング領域と接触させた時刻を基準にして決定される）。アナライトアッセイ結果が決定される時刻は、ｔＥとして参照されうる。アッセイ結果読取りデバイスは、いつｔＥに達するかを決定するためにある種の一体型タイミング手段を含みうる。タイミング手段は、サンプルをアッセイデバイスと接触させることにより自動で作動されうるか（たとえば、電流の流れを可能にする液体サンプルにより）、またはユーザーにより（たとえば、スイッチなどを押して）もしくは任意の他の便利な手段により駆動されうる。アッセイ反応は、適宜ｔＥで平衡に達しうるが、このことは必須ではない。アナライトアッセイのすべてで一斉に同時にｔＥに達しうるか、または異なるアナライトではｔＥは異なりうる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ｔＥでアナライトアッセイシグナルが依然として上限閾値を下回る場合、アッセイ結果は陰性である（対象アナライトの存在がシグナルの生成をもたらす方式で）。アッセイの終点は、必ずしも反応の終了時でなくてもよい。実際上、通常は反応が終了する前に終点ｔＥに達したとみなされよう。
【００４７】
終点ｔＥは、特定の時点を基準にしてリーダーにより適宜決定されうる（すなわち、ｔＥは、アッセイ開始後の特定の時間で、たとえば、リーダーの作動後および／またはリーダーへのアッセイスティックの挿入後および／または検査スティックへのサンプルの適用後に特定の時間間隔で生じるとみなされうる）。例示の目的では、ｔＥは、典型的にはアッセイ開始の１〜１０分後、好ましくは１〜５分後に生じよう。
【００４８】
望ましくは、アッセイ結果リーダーは、中間シグナルを得る場合は検査測定を繰り返すようにプログラムされよう。単純な実施形態では、測定はｔＥで繰り返される。しかしながら、好ましくは、測定は、終点前に１回以上繰り返される。最も好ましくは、リーダーデバイスは、シグナルが上限閾値を超えるまでまたはｔＥに達するまで（いずれか早いほう）、規則的間隔（たとえば、１秒間隔または５秒間隔）で測定を繰り返すようにプログラムされる。
【００４９】
アッセイ結果リーダーが、さらなるユーザー入力を行うことなくあらかじめ決められた時点で自動で測定を行えるように、クロックまたは他のタイミングデバイスをリーダーに組み入れることが望ましい。
【００５０】
それゆえ、たとえば、最初の時点ｔｏで、繰り返し測定を行う必要があれば、以上に記載したように、その後任意の所望の時間間隔でシグナルが上限閾値を超えるまでまたはｔＥに達するまで測定を行うように、リーダーをプログラムしうる。
【００５１】
その他に、クロックまたは他のタイミングデバイスは、読取りデバイスによるシグナル蓄積速度の決定を容易にする。２つ以上の時点（既知の時間分離）でシグナル量の測定を行えば、シグナル蓄積速度を容易に計算しうる。
【００５２】
シグナル蓄積の速度または量は、絶対的にまたは相対値として（たとえば、任意選択で実質的に同時反応から得られる対照値または他の比較値と比較して）測定可能であること
に留意すべきである。
【００５３】
特定的には、アッセイ結果リーダーは、いくつかの実施形態では、ｔＥに達する前に１つ以上のアナライトアッセイ読み値が特定の関連閾値レベルを十分に上回るまたは下回る（必要に応じて）場合、アッセイ結果（すなわち、妊娠しているかまたは妊娠していないか）を決定しうる。このようなアッセイ結果の「早期」決定は、欧州特許第１４８４６１３号明細書に記載されている。たとえば、本例では、サンプル中のＦＳＨ量があらかじめ決められた上限閾値を超えた場合（妊娠が決して観測されないレベル）、ＦＳＨアッセイシグナルは非常に迅速に発生するため、このことから、アッセイ結果リーダー（またはヒト観測者）は、おそらくｈＣＧアッセイおよび／またはプロゲステロン代謝物アッセイの結果の解析を待たずに、ｔＥ前にアッセイのアウトカムを「妊娠していない」結果として決定しうる。同様に、サンプル中のプロゲステロン代謝物レベルが非常に低い場合（たとえば、１μｇ／ｍｌ未満）、強いプロゲステロン代謝物アッセイシグナルは非常に迅速に発生するため、この場合もおそらくｈＣＧアッセイおよび／またはＦＳＨアッセイを読み込むことなく、プロゲステロン代謝物アッセイのｔＥに達する前に「妊娠していない」として早期にアッセイ結果を決定しうる。
【００５４】
アッセイ結果の「早期」決定は、３種のアナライト（すなわち、ｈＣＧ、プロゲステロン代謝物、およびＦＳＨ）がいずれもｔＥに達する前に行われうるか、または３種のアナライトの任意の２つの組合せ（すなわちｈＣＧとプロゲステロン；ｈＣＧとＦＳＨ；またはプロゲステロンとＦＳＨ）がｔＥに達する前に行われうるか、または３種のアナライトの１つのみがｔＥに達する前に（すなわち、３種のアナライトの他の２種のｔＥでもしくはその後で）行われうる。
【００５５】
同様に、３つのアナライトアッセイすべてまたは３つのアナライトアッセイの任意の１つまたは３つのアナライトアッセイの任意の２つの組合せに、下限、中間、および上限の閾値が存在しうる。
【００５６】
検査デバイスには、少なくとも１つの流路、好ましくは少なくとも２つの流路、典型的には３つさらには４つの流路が含まれよう。
【００５７】
「流路」という用語は、本発明の目的では、液体を第１の位置から第２の位置に搬送可能な基材を意味し、たとえば、キャピラリーチャネル、マイクロ流体経路、またはラテラルフロー多孔性担体などの多孔性担体でありうる。多孔性担体は、リニア配置もしくはスタック配置でオーバーラップされていてもよいかまたは流体結合されている１つもしくは複数の多孔性担体材料を含みうる。多孔性担体材料は、同一であっても異なっていてもよい。検査デバイスによる種々のアッセイは、個別の基材上に提供されうるか、または１つのアッセイの流路に沿って搬送される液体が異なるアッセイの流路と交差できないように共通の基材上に提供されうる。たとえば、第１および第２のアッセイは、第１および第２の流路が互い隔離されるように同一の多孔性担体上に提供されうる。これは、たとえば、第１および第２のアッセイが分離されるように多孔性担体の一部をレーザーカットして非多孔性にすることにより達成されうる。他の選択肢として、同一の多孔性担体上に２つ以上（典型的には本質的に平行）の流路が提供されるようにストリップに沿って非多孔性ブロッキング材料を適用しうる。他の実施形態では、２種さらには３種の異なるアナライトに対する検査を単一の流路で行いうる。たとえば、ｈＣＧを検査するための試薬が単一の流路に含まれうるとともに、プロゲステロン代謝物を検査するための試薬もまた含まれうる。他の選択肢として、ｈＣＧおよびＦＳＨを検査するための試薬が単一の流路に含まれうるか、またはＦＳＨおよびプロゲステロン代謝物を検査するための試薬が単一の流路に含まれうる。特定的には、流路は、２つの検出ゾーン（各アナライトに対して１つずつ）を含みうる。この場合、標識試薬は、一般的にはサンプル中の各アナライトの濃度に比例
（正比例または反比例）して蓄積する傾向がありうる。
【００５８】
検査デバイス内の１つまたは複数の流路は、ラテラルフロー多孔性担体を含みうる。多孔性担体として利用しうる好適な材料は、ニトロセルロース、アセテート繊維、セルロースもしくはセルロース誘導体、ポリエステル、ポリアミド、ポリオレフィン、またはガラス繊維を含む。多孔性担体は、ニトロセルロースを含みうる。これには、事前化学処理を行うことなく結合試薬を確実に固定できるという利点がある。たとえば、多孔性固相材料が紙を含む場合、抗体の固定は、たとえば、ＣＮＢｒ、カルボニルジミダゾール、またはトレシルクロリドを用いて、化学結合により行われうる。
【００５９】
本発明に係るアッセイデバイス／方法では、典型的には１種以上の結合試薬が利用される。典型的には、ｈＣＧアッセイでは、ｈＣＧに結合する結合試薬が利用され、ＦＳＨアッセイでは、ＦＳＨに結合する結合試薬が利用され、プロゲステロン代謝物アッセイでは、プロゲステロン代謝物に結合するさらに他の結合試薬が利用される。アッセイは、特定的には、標識結合試薬の使用を含みうる。他の箇所で説明されるように、ｈＣＧおよびＦＳＨの両方に結合する標識結合試薬が使用されうる。なぜなら、これらの２つの分子は、いくつかの共通した構造を有するからである。
【００６０】
本目的では、「結合試薬」という用語は、結合対のメンバー、すなわち、分子の一方が化学的および／または物理的手段を介して第２の分子と結合する２つの異なる分子のメンバーを意味する。２つの分子は、それらの互いの結合が、それらの結合パートナーと、類似の特徴を有する他のアッセイ成分とを識別可能であるという意味で、関連付けられている。結合対のメンバーは、リガンドとレセプター（抗リガンド）、結合対メンバーと結合対パートナーなどとして参照される。分子はまた、分子の凝集の結合対メンバーでありうる。たとえば、第２の抗体とその対応する抗原との免疫複合体に対して生成される抗体は、免疫複合体の結合対メンバーであると考えられうる。
【００６１】
抗原と抗体との結合対メンバーの他に、他の結合対は、例として、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、相補的ペプチド配列、エフェクター分子とレセプター分子、酵素補因子と酵素、酵素阻害剤と酵素、ペプチド配列とその配列または全タンパク質に特異的な抗体、高分子酸と高分子塩基、色素とタンパク質結合剤、ペプチドと特異的タンパク質結合剤（たとえば、リボヌクレアーゼ、Ｓペプチド、およびリボヌクレアーゼＳタンパク質）などを含むが、これらに限定されるものではない。さらに、特異的結合対は、元の特異的結合性メンバーのアナログであるメンバーを含みうる。
【００６２】
標識結合試薬との関連で用いられるときの「標識」とは、目視手段または機器手段により検出可能なシグナルを生成可能な任意の物質を意味する。本発明で使用するのに好適な種々の標識は、化学的手段または物理的手段のいずれかを介してシグナルを生成する標識、たとえば、光学的に検出可能な標識を含む。かかる標識は、酵素および基質、色素原、触媒、蛍光化合物、化学発光化合物、電気活性種、色素分子、放射性標識、ならびに粒子標識を含む。粒子標識は、磁気的または電気化学的手段により検出可能な磁気標識または電子荷電標識を含みうる。標識は、結合試薬に共有結合されうる。特定的には、標識は、光学的に検出可能なものに由来しうる。好ましい光学的に検出可能な標識は、以下のようにコロイド金属粒子標識および色素担持粒子を含む。
【００６３】
標識は、コロイド金属粒子、たとえば、金ゾル、銀ゾル、白金ゾル、銀増強金ゾル、炭素ゾル、もしくは炭素ナノ粒子、コロイド半金属もしくは非金属粒子、たとえば、テルルもしくはセレン、または染色もしくは着色粒子、たとえば、色素が組み込まれたポリマー粒子もしくは色素ゾルを含みうる。色素は、任意の好適な色たとえば青色でありうる。色素は蛍光性でありうるか、または量子ドットを含みうる。好適な蛍光材料は当業者に周知
である。色素ゾルは、Ｆｏｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  ＳＲＰ（Ｓａｎｄｏｚ）およびＲｅｓｏｌｉｎ  Ｂｌｕｅ  ＢＢＬＳ（Ｂａｙｅｒ）などの市販の疎水性色素から調製されうる。好適なポリマー標識は、ポリスチレン、ポリビニルトルエン、ポリスチレン−アクリル酸、ポリアクロレインなどの一連の合成ポリマーから選択されうる。使用されるモノマーは、通常、水不溶性であり、モノマーミセルが形成されるように水性界面活性剤で乳化され、次いで、エマルジョンへの開始剤の添加により重合が誘導される。実質的に球状のポリマー粒子が生成される。かかるポリマー粒子の理想サイズ範囲は、約０．０５μｍ〜約０．５μｍである。例示的な実施形態によれば、標識は、ことから０．０２μｍ〜０．２５μｍの範囲内の好ましい粒子平均直径を有する金コロイドである。
【００６４】
乾燥結合試薬は、マイクロフルイディクスデバイスの流路内に提供されうるか、またはラテラルフロー型デバイスの検出ゾーンを構成する多孔性担体材料の上流に提供された多孔性担体材料上に提供されうる。上流の多孔性担体材料はマクロ多孔性でありうる。マクロ多孔性担体材料は、非特異的結合を最小限に抑えるために、およびマクロ多孔性担体が液体サンプルにより湿潤状態になった後に標識試薬の自由移動を促進するために、低タンパク質結合性もしくは非タンパク質結合性にすべきであるか、またはＢＳＡまたはＰＶＡなどの試薬を利用して容易にブロック可能にすべきである。マクロ多孔性キャリヤー材料は、必要であれば、より親水性にするために、および液体サンプルの迅速な取込みを促進するために、界面活性剤または溶媒で前処理可能である。さらに、標識試薬を安定化させるために、およびその可動化を支援するために、１種以上の糖（たとえば、スクロース、トレハロース）を使用しうる。これらは、標識試薬を多孔性担体に適用するのに用いられる溶液の一部として流路および／または多孔性担体材料に適宜適用されうる。マクロ多孔性担体の好適な材料は、ポリエチレンおよびポリプロピレンなどのプラスチック材料または紙またはガラス繊維などの他の材料を含む。標識結合試薬を検出可能粒子で標識する場合、マクロ多孔性担体は、粒子標識の最大粒子サイズの少なくとも１０倍の細孔サイズを有しうる。より大きい細孔サイズは、標識試薬のより良好な放出を与える。
【００６５】
検査デバイスには、３つ以上の流路、すなわち、各アナライトアッセイのそれぞれの流路が適宜含まれよう。しかしながら、２つ以上のアナライトアッセイが（おそらく、以下に記載される任意選択の共通のサンプル適用ゾーンの他に）共通の流路を共有しうるようにすることが可能である。流路には、典型的には、尿サンプルなどの水性流体が輸送されうるキャピラリーチャネルもしくは他のマイクロ流体フローチャネルまたは１つ以上の多孔性部材が含まれよう。
【００６６】
一実施形態では、検査デバイスは、３つの個別のラテラルフローアッセイストリップ（各アナライトアッセイに対して１つずつ）を含む。他の実施形態では、検査デバイスは、２つのラテラルフローアッセイストリップを含みうる。この場合、ストリップの一方は、アナライトの１つ（たとえばｈＣＧ）のアッセイを行う役割を果たし、他方のストリップは、他の２つのそれぞれのアナライトのそれぞれのアッセイを行う役割を果たす。また、１つの流路またはラテラルフロー検査ストリップを用いて３種のアナライトすべてを検査する実施形態も想定可能である。
【００６７】
検査デバイスは、特定的には、サンプル適用ゾーンを含みうる。これは、尿などの水性サンプルを適用しうる多孔性（典型的には吸収性）材料のゾーンである。サンプル適用ゾーンは共通のゾーンでありうる。すなわち、共通のサンプル適用ゾーンに適用された液体サンプルは、２つ以上の異なるアッセイ流路に輸送されうる。
【００６８】
典型的には、サンプルは、ユーザーがサンプル適用ゾーン上に直接排尿することによりサンプル適用ゾーンに適用される。
【００６９】
好ましい実施形態では、アッセイデバイスは、アッセイの機能要素およびアッセイ試薬のほとんどまたはすべてを収容するハウジングを含む。ハウジングは、防水性合成プラスチック材料から適宜作製され、好ましくは実質的に不透明である。所望の不透明度レベルを達成するために、プラスチック材料に不透明化剤を添加しうる。ハウジングを形成するのに好適な合成プラスチック材料は、特定的には、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、ポリオレフィン、ポリプロピレン、ポリエチレン、およびアクリロニトリルを含む。ハウジングは、望ましくは、２つ以上の部分で形成されうる。これらの部分は、ハウジングの集合部分内またはそれらの間に収容されたアッセイデバイス要素の残りの大部分（またはすべて）と連結一体化される。ハウジングの各部分は、スナップ嵌合処理などの従来の締結手段によりまたはプラスチック溶接などにより連結締結されうる。
【００７０】
好ましい実施形態では、アッセイデバイスは、ハウジング（典型的には、上述の特徴を有する）を含み、サンプル適用部またはゾーンは、尿サンプルをサンプル適用部またはゾーンに適用するのを容易にするためにハウジングを越えて延在する。ハウジングを超えて延在するサンプル適用部またはゾーンは、使用前、除去可能キャップにより覆われていてもよい。キャップはまた、好ましくは、不透明または透明または半透明であってもよい合成プラスチック材料で形成されうる。典型的には、キャップは、サンプルがサンプル適用ゾーンに適用された後、再配置される。
【００７１】
アッセイ流路の遠位下流端に吸収性「シンク」を提供することが可能である。共通のシンクを提供してもよいし、シンクを各アッセイの遠位端に提供してもよい。吸収性シンクは、好ましくは、たとえばＣＦ７  Ｗｈａｔｍａｎ紙などの高吸収性材料を含んでいてもよく、検出ゾーンの近傍からいずれの非結合標識も除去するのに十分な吸収能を提供するべきである。多孔性固相材料が検出ゾーンを越えて延在する長さを有していれば、かかるシンクの代わりとして十分でありうる。高吸収性シンクを提供する利点は、過剰の標識結合試薬がそれぞれのアッセイの流路から除去または実質的に除去されることである。これは、それぞれのゾーンの近傍で非結合標識結合試薬の程度を最小限にする効果を有するため、異なる量の標識結合試薬を有しうるデバイスでアッセイ流路の利用を可能にする。
【００７２】
検査デバイスには、サンプル充足インジケーター（たとえば、ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１３／０６１１７８号明細書に記載される）、「フラッド防止」パッド（たとえば、国際公開第２０１２／０６９６１０号パンフレットに開示される）、アッセイコントロールとしてサンプル流量を使用（たとえば、欧州特許第１，４８４，６１１号明細書、米国特許第６，１９４，２２２号明細書に開示される）、陽性または陰性の結果の「早期」決定（たとえば、欧州特許第１，４８４，６１３号明細書、米国特許第５，６７９，５８４号明細書に開示される）、電子デバイスの自動「ウェイクアップ」（たとえば、サンプルによりデバイスが湿潤されると電気回路が完成して自動作動する）、ならびにデジタルアッセイ進行メーターの使用（たとえば、欧州共同体意匠登録第１３６７３０４号など）またはサンプルが検査デバイスに適用された時の視覚的表示および／またはアッセイが開始された時の視覚的表示をユーザーに与える「色変化ウィック」など（たとえば、国際公開第２００３／０５８２４５号パンフレット）を含めて（限定されるものではないが）、従来の自己検査用または家庭検査用の妊娠検査デバイスでごく普通に見られる当業者に公知の他の特徴が適宜含まれよう。検査デバイスは、有利には防水包装で消費者に提供されよう。包装は、任意選択でシリカゲルのサシェなどのように乾燥剤をさらに含む。
【００７３】
アッセイ対象は、機械的強度および好適な剛性度を提供するために、なんらかの支持体またはバッキング層上に適宜支持されよう。支持体とアッセイ対象は、適宜、検査スティックとして参照および提供されうる。３つのアッセイ対象はすべて、単一のスティック上、または２つ、３つ、さらには４つ（すなわち、１つのアナライトに対して２つ以上のス
ティック）の検査スティック上に存在しうる。１つもしくは複数の検査スティックは、ユーザーにより検査デバイスに挿入されるように適合化および構成されうるか、または１つもしくは複数の検査スティックは、より好ましくは、検査スティックが検査デバイスにあらかじめ挿入もしくは装填された状態で消費者により購入される検査デバイスの構成部分を形成する。
【００７４】
アッセイ結果は、外部アッセイ結果読取り手段によりもしくはユーザーにより直接、読み取られうるか、またはより好ましくは、検査デバイスには、アッセイの結果を読み取るための一体型アッセイ結果リーダーが含まれよう。アッセイ結果リーダーは、好ましくは、３つのアナライトアッセイ結果すべてを読み取る。アッセイ結果リーダーには、有利には、電子部品とくにマイクロプロセッサーなどのデジタル電子部品が含まれよう。典型的には（必ずというわけではないが）、アッセイ結果は、光学手段により読み取られる。すなわち、検出ゾーンで反射および／または透過された光量が測定される。この場合、光学標識試薬は、サンプル中のアナライト濃度に比例（正比例または反比例）して蓄積する傾向がある。他の選択肢として、アッセイ結果は、たとえば、磁気的または電気化学的測定により読み取られうる。明らかに、アッセイ結果の読取り方法は、アッセイ試薬の標識に使用される標識の性質に依存しうる。
【００７５】
外部アッセイ結果読取り手段は、専用の結果読取りデバイス（たとえば、欧州特許第１０６６５３０号明細書に記載のものに類似する）を含みうる。他の選択肢として、外部アッセイ結果リーダーは、好ましくはカメラを備えた移動電話または他の携帯電子機器（たとえばタブレットコンピューター）などのように「非専用」でありうる。この場合、アッセイ結果は、可視標識により発生されたシグナル強度を測定することにより読み取られる。
【００７６】
アッセイ結果リーダーは、外部アッセイ結果リーダーであるか一体型アッセイデバイス／アッセイ結果リーダーの一部を形成するにかかわらず、アッセイ結果を読み取って解釈しうるか、またはアッセイデータを解釈するためにアッセイ結果データを離れた位置にあるデバイスに伝送しうる。アッセイデータは、離れた位置にあるデバイスにリアルタイムで伝送されうる。データは、インターネット接続を介して伝送されうるか、または物理的にリモートデバイスに輸送されるメモリーデバイス（たとえば、「フラッシュ」ドライブなど）に記憶されうるか、またはデータは、無線通信手段（たとえば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、近距離無線通信［ＮＦＣ］など）により伝送されうる。
【００７７】
マイクロプロセッサーは、光学読取り要素もしくは他のアッセイ結果読取り要素の操作を制御しうるとともに、アナライトのそれぞれの関連アッセイシグナル閾値を用いて適宜プログラムされるかまたはかかる閾値にアクセス可能であり、実際のアッセイシグナル値をあらかじめ決められた閾値と比較して、妊娠検査のアウトカムを決定するようにアッセイ結果を解釈する。
【００７８】
それゆえ、アッセイ結果リーダーは、アッセイ結果の読取りに必要な要素を含む。検査デバイスにはまた、有利には、妊娠検査のアウトカムをユーザーに表示のためのアッセイ結果ディスプレイが含まれよう。典型的には、ディスプレイにはＬＣＤが含まれようが、他のタイプのディスプレイも可能である（たとえば、「電子インク」の使用）。アッセイデバイス（より特定的にはその要素）を操作するのに電源を必要とする実施形態では、好ましくはアッセイデバイスに電池などの一体型電源が備えられよう。非常に小さくかつ安価な電池は、市販品として容易に入手可能である。デバイスはまた、一体型電源に接続してデバイスを作動させるためのスイッチを備えうる。
【００７９】
代替実施形態では、アッセイ結果は、従来の「自己検査用」妊娠検査から公知の方法で
ユーザーにより直接読み取られうる。たとえば、ユーザーは、アッセイ検出ゾーンを覆う１つ以上のウィンドウを調べて、検出ゾーンの１つ以上（またはすべて）で検出可能シグナルの存在または不在を決定しうる。ユーザーが検出ゾーンを調べられるように、各検出ゾーンは、不透明なハウジング内に個別のウィンドウを備えうる。他の選択肢として、大きいウィンドウにより検出ゾーンの２つ以上（またはすべて）を収容しうる。典型的には、かかるユーザー読取りデバイスでは、ユーザーによりラテラルフローアッセイまたはマイクロフルイディクスアッセイの検出ゾーンが直接調べられよう。他の方式では、ユーザーは、カラーチャートまたはインジケーターを基準にして結果を決定しうる。検査デバイスには、適宜、アッセイ結果を読み取るための説明書またはガイダンスが一緒に備えられよう（デバイスによりユーザーのアッセイ結果が解釈されない場合）。たとえば、かかる直接読取り目視検査の解釈を容易にするために、ユーザーに印刷されたカラーチャートが提供されよう。
【００８０】
妊娠検査スティック／ディスプレイ付きアッセイ結果リーダーデバイスの組合せは、「デジタル妊娠検査」として参照されうるとともに、かかるデジタル検査デバイスは、市販されており、本開示の利点を生かして本発明に係る検査デバイスを提供するように適合化されうる。
【００８１】
マイクロプロセッサーは、望ましくは、アッセイ結果読取り要素によりアッセイ結果を読み取り、アッセイ結果を解釈し、および結論をユーザーに表示するように、プログラムされよう。
【００８２】
アッセイ結果を読み取るための要素には、好ましくは、少なくとも１つの光源と少なくとも１つの光検出器が含まれよう。少なくとも１つの光源は、好ましくは発光ダイオード（ＬＥＤ）である。少なくとも１つの光検出器は、好ましくはフォトダイオードまたはフォトトランジスターである。光源は、アッセイの検出ゾーンに照射される。このゾーンは、アッセイの実施時、アッセイに適用されたサンプル中の対象アナライトの濃度に依存して標識物質を蓄積する傾向がある。標識物質は、アナライトの濃度と正の相関を有して蓄積しうる（すなわち、アナライトの濃度が高いほど、検出ゾーンに蓄積する標識の量は多い）。典型的には、当業者に周知のサンドイッチアッセイ方式が利用される。他の選択肢として、標識物質の蓄積は、アナライトの濃度と負の相関を有して蓄積しうる（すなわち、アナライトの濃度が高いほど、検出ゾーンに蓄積する標識の量は少ない）。かかる負の相関は、競合型または阻害型のアッセイに特有であり、この型のアッセイは、対象アナライトがハプテンである場合および／または小さすぎて２つの異なる抗体への同時結合に対処できない場合（たとえば、プロゲステロン代謝物の場合）に利用されることが多い。
【００８３】
ＦＳＨおよびｈＣＧは両方とも、αおよびβサブユニットを含むヘテロ二量体分子である。ＦＳＨおよびｈＣＧのαサブユニットは、本質的に同一であるため、αサブユニットに対する抗体は、ＦＳＨおよびｈＣＧの両方に結合しうる。したがって、これらの２つの分子のアッセイでは、たとえば、可動性直接標識（すなわち、光学的に検出可能）抗体でありうる共通の試薬が潜在的に利用されうる。それぞれの検出ゾーンは、βサブユニット（ＦＳＨとｈＣＧとで異なる）に特異的な固定化捕捉抗体を含みうる。明らかに、これはサンドイッチ型免疫学的アッセイに関するものであるが、他のアッセイ方式も周知であり、その代わりに使用可能である。
【００８４】
サンプルが高レベルのｈＣＧを含有する場合（たとえば、妊娠が比較的進行している被験者によりサンプルが提供されるため）、共通のαサブユニット抗体に特異的な抗体には高レベルのｈＣＧが「殺到」し、ＦＳＨへの結合に利用可能な抗体の量が実質的に低減されるため、サンプル中に存在するＦＳＨの量が過小評価される可能性がある。実際には、このことは、おそらくなんら問題を引き起こさないであろう。なぜなら、かかる高レベル
のｈＣＧは、ほぼ常に（＞９９．９％）妊娠に起因し、ＦＳＨアッセイ結果のいかんにかかわらず、検査デバイスにより適正な検出および解釈が行われるであろうからである。ｈＣＧアッセイで二重βサブユニット特異的抗体対およびＦＳＨアッセイで二重β特異的抗体対を使用することも可能である。この方式では、高アナライトレベルで見られた以上の効果が打ち消されるであろう。
【００８５】
コストを最小限に抑える必要性を考慮して（とくに、単回使用後にデバイスが廃棄される実施形態では）、単一の光検出器を用いて、少なくとも２つ、好ましくは３つの異なるアッセイの検出ゾーンから発せられる光を検出することが好ましい。光が真に検出ゾーンに由来するものではないことは分かるであろう。すなわち、光は、光源から発せられるが、場合により、検出ゾーンを介して反射および／または透過され、結果的にそこから発せられたように見える。典型的には、必ずというわけではないが、各検出ゾーンには、ＬＥＤなどのそれぞれの光源が照射される。
【００８６】
ＬＥＤなどの単一の光源を用いて、少なくとも２つの異なるアッセイ、可能であれば３つの異なるアッセイの検出ゾーンに照射することが可能である。しかしながら、複数のＬＥＤを提供することも可能である。たとえば、それぞれの各検出ゾーンに照射するために１つのＬＥＤを提供しうる。複数のＬＥＤを提供する場合、これらは、同一の色照射を生成しうるか、または異なる波長の照射を生成しうる。ＬＥＤ（または他の光源）の数が検出ゾーンの数に等しいか、さらにはそれを上回る実施形態が存在しうる。他の選択肢として、１つのＬＥＤで２つの検出ゾーンに照射するさまざまなジオメトリーを用いて、ＬＥＤの数が検出ゾーンの数を下回るようにすることが可能である。
【００８７】
デバイスは、典型的には、参照ゾーンを利用しうる。これは、マイクロフルイディクスアッセイまたはラテラルフローアッセイの流路の一部であり、検出ゾーンから得られた読み値の参照として使用される。参照ゾーンの使用は当業者に周知である。特定的には、デバイスは「共有」参照ゾーンを利用しうる（欧州特許第２，０３１，３７６号明細書に開示される）。この場合、参照ゾーンは、少なくとも１つが異なる流路上に位置する２つ以上の検出ゾーンの参照として使用される。
【００８８】
マイクロプロセッサーまたはコンピューターコントロールにより光源を１つ以上の検出ゾーンに逐次的に照射し、それぞれの検出ゾーンを介して反射および／または透過された光を識別できるようにしうる。一実施形態では、光源は、異なる時間で異なる波長の光を発し、光検出器は、異なる波長を識別する。追加としてまたは他の選択肢として、光学バッフル（固定または調整可能）を用いて特定の光源によりに照射される領域を制御しうる。使用可能な光学配置の種類についてのより詳細な内容は、たとえば、欧州特許第１，４８４，６０１号明細書、米国特許第６，０５５，０６０号明細書、および米国特許第５，８８９，５８５号明細書に開示されている。疑問を生じないように述べておくが、本明細書で用いられる「光」という用語は、ヒト観測者の眼に見える電磁スペクトルの部分の放射線を単に意味することが意図されるのではなく、たとえば、紫外線および赤外線を包含することが意図される。それにもかかわらず、スペクトルの可視部で要素および感度を操作することが好ましいこともある。
【００８９】
マイクロプロセッサー手段またはコンピューターコントロール手段には、アッセイ結果読取りデバイスによる結果の解釈およびユーザーへの適切な結論（たとえば、妊娠しているか妊娠していないか）の表示を可能にするために、好ましくは、アッセイ結果と比較されるいくつかの記憶されたアナライト閾値が含まれよう。マイクロプロセッサー手段またはコントロール手段は、有利には、試験結果を測定し、それをあらかじめ決められた閾値と比較し、および結論を表示するアルゴリズムでプログラムされよう。
【００９０】
一実施形態では、マイクロプロセッサー手段またはコントロール手段により、最初にｈＣＧアッセイ結果が決定され、あらかじめ決められた下限ｈＣＧ閾値と比較されよう。決定されたｈＣＧアッセイ結果があらかじめ決められた下限ｈＣＧ閾値を下回る場合、被験者は妊娠していないことがただちに確認されうるとともに、この結果はディスプレイによりユーザーに示されうる（たとえば、ＮＯＴ  ＰＲＥＧＮＡＮＴという語もしくは任意の言語の対応する語を生成することにより、または直観的記号、たとえば、マイナス記号もしくはゼロを利用して）。
【００９１】
しかしながら、測定ｈＣＧアッセイ結果があらかじめ決められた下限閾値を上回る場合、アッセイ結果リーダーはＦＳＨアッセイ結果の測定に進みうる。ＦＳＨアッセイ結果からサンプル中のＦＳＨ濃度があらかじめ決められた閾値を上回ることが示唆された場合、被験者は妊娠していないことが確認されうるとともに、これは以上に記載したようにユーザーに示されうる。
【００９２】
しかしながら、サンプル中の測定ＦＳＨレベルがそのそれぞれのあらかじめ決められた閾値を下回る場合、アッセイ結果リーダーはプロゲステロン代謝物アッセイ（この場合、Ｐ３Ｇのアッセイ）の結果を測定しうる。アッセイ結果からサンプル中のＰ３Ｇ濃度がそのそれぞれのあらかじめ決められる閾値を下回ることが示唆された場合、被験者は妊娠していないことが確認されうる。サンプル中のＰ３Ｇ濃度があらかじめ決められた閾値を上回る場合、被験者は妊娠しているため、アッセイ結果リーダーによりディスプレイを介して適切な結論がユーザーに表示されよう。
【００９３】
閾値は、絶対アナライト濃度として（すなわち、単位体積あたりの量またはＩＵにより）および／または吸光度値としてまたは任意の他の便利な方法により、本発明に係るデバイスに記憶されうる。
【００９４】
一実施形態では、デバイスは、ｈＣＧ／ＦＳＨ／プロゲステロンアナライトの１つ、２つ、または３つすべてに対する上限および下限の閾値を備えうる。たとえば、一実施形態では、デバイスは上限ｈＣＧ閾値および下限ｈＣＧ閾値を有しうる。測定ｈＣＧ濃度が上限ｈＣＧ閾値を上回る場合、デバイスは、ＦＳＨ／プロゲステロンアッセイの結果を解析することなく被験者が妊娠していることを宣言しうる。かかる宣言は、ｈＣＧアナライトアッセイ結果が上限閾値を上回ることが明らかである場合、デバイスにより「早期」に行われうる（たとえば、アッセイが平衡に達する前）。他の実施形態では、「妊娠」結果は、ＦＳＨおよびプロゲステロンのアッセイ結果をチェックすることによりさらに確認される。
【００９５】
ｈＣＧアッセイ結果が下限ｈＣＧ閾値を下回る場合、デバイスは被験者が妊娠していないことを宣言する（ＦＳＨおよびプロゲステロンのアッセイ結果による確認を併用してまたは併用せずに）。ｈＣＧアッセイ結果が下限ｈＣＧ閾値を上回るが、上限ｈＣＧ閾値を上回らない場合、デバイスは、妊娠または非妊娠の決定を下すためにＦＳＨおよびプロゲステロンのアッセイ結果が必要とされよう。デバイスは、かかるＦＳＨおよびプロゲステロンのアッセイ結果を逐次的に（たとえば、最初に一方のアナライト、次いで他方のアナライトの順で）または並列に調べうる。
【００９６】
特定的には、デバイスは、ＦＳＨおよび／またはプロゲステロンのアッセイに対する上限または下限の閾値を有しうる。特定の場合に複数の閾値のどれを適用するべきかの選択は、他の２つのアッセイで検出されるアナライトの絶対濃度または相対濃度に依存すると考えられるため、「加重」または「補償」のスキームが利用されうる。たとえば、上限および下限のｈＣＧ閾値の中間範囲の上側にあると決定されたｈＣＧ濃度は、デバイスにより下限プロゲステロン閾値を適用して妊娠しているか／妊娠していないかの決定を下すこ
とにより、比較的低いプロゲステロン濃度を「補償」しうる。反対に、たとえば、低いＦＳＨおよび／または高いプロゲステロンは、サンプル中の比較的低いｈＣＧ濃度を補償しうる。
【００９７】
アッセイ対象の測定および／またはアッセイ結果の解釈は、アッセイデータが１つ以上の計算または他のタイプの処理に付される１つ以上のデータ処理工程を含みうる。かかる処理は、典型的には外部または一体型のアッセイ結果リーダーの一部を形成するマイクロプロセッサーなどのデジタル電子デバイスにより適宜行われよう。たとえば、データ処理は比の計算を含みうる。特定的には、処理工程は、ＦＳＨ：プロゲステロン代謝物またはその逆の比の計算を含みうる。比は、測定シグナル濃度もしくは他の好適な関連パラメーターから導出されるそれぞれのアナライトの相対シグナル強度または濃度計算値に基づきうる。より特定的には、「ボーダーライン」ｈＣＧシグナル強度または導出ｈＣＧ濃度は、ＦＳＨ：プロゲステロン代謝物（またはその逆）の比を計算することにより検証またはチェックされうる。
【００９８】
さらに、デバイスは、ｈＣＧ、ＦＳＨ、およびプロゲステロンの他に、他のアナライトをアッセイしうる。これらの他のアナライトは、特定的には、ホルモン、たとえば、ＬＨ、ｈＰＬ（ヒト胎盤性ラクトゲン）、および／またはリラキシンおよび／またはエストロゲンまたはそれらの代謝物などを含みうる。かかるホルモンの他の例は甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）である。ＴＳＨは、かかるホルモンのすべてが他のホルモンのαサブユニットに非常によく類似したαサブユニットを含むという点で、ｈＣＧ、ＦＳＨ（およびＬＨ）に関連付けられる。ＴＳＨはまた、ＴＳＨに特有のβサブユニットを含む。尿中のＴＳＨレベルは、すでに測定されているが（たとえば、Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｊｐｎ．３５，７３３−７３９を参照されたい）、濃度は若干低い。かかる１種以上の追加のアナライトの濃度もまた、おそらくｈＣＧ／ＦＳＨ／プロゲステロンアナライトの１つ以上の適用可能な閾値の選択に影響を及ぼすことから、妊娠しているか／妊娠していないかの決定を下す際にデバイスにより考慮されうる。１種以上のさらなるアナライトと、ｈＣＧ、ＦＳＨ、およびプロゲステロンの１種以上との比が測定されうる。特定的には、ｈＣＧとＴＳＨとの比（またはその逆）が測定されうる。他のアナライトの測定は、以下に記載の本発明の精密化にとくに有用でありうる。
【００９９】
以上に記載の基本原理の精密化では、被験者が妊娠しているか否かだけではなく、（妊娠している場合には）受胎後のおよその経過期間から見た妊娠の程度（すなわち在胎期間）についても、ユーザーに示すことが望ましいであろう。これは、日数、より好ましくは週数を示すことにより表されうる。次の３つの間隔、すなわち、１〜２週間、２〜３週間、および＞３週間の１が適宜表示されうる。これを容易にするために、検査デバイスは、有利には、受胎後のそれぞれの週数に対応する複数の異なるｈＣＧ濃度閾値（より正確にはｈＣＧアッセイ検査結果閾値）を備えうる。これを達成する方法は、国際公開第２００９／１４７４３７号パンフレットに開示されている。この場合も、この実施形態を容易にするために、検査デバイスは、広範囲にわたりｈＣＧ濃度を検査可能であることが望まれうるとともに（たとえば、ｈＣＧに対して比較的高感度の試験および比較的低感度の試験の両方を含めることにより）、これを達成する好適な方法は、国際公開第２００８／１２２７９６号パンフレットに記載されている。妊娠の在胎期間の推定は、ｈＣＧに加えて他のアナライトたとえばｈＰＬ（国際公開第２０１２／０５５３５５号パンフレットを参照されたい）および／またはプロゲステロン代謝物の濃度を測定することにより容易になりうる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、検査デバイスはまた、なんらかのコントロール機能を含むことが望ましいであろう。このことは、検査が適正に機能したことを示すなんらかの指標を提供するために自己検査用デバイスで従来から行われている。
【０１０１】
典型的には、コントロール機能には、コントロールゾーンの使用が含まれよう。このゾーンでは、十分なサンプルが検査デバイスのサンプル適用ゾーンに適用された場合、標識試薬が蓄積する傾向がある。従来的には、標識試薬は、検査ストリップの上流部または近位部に放出可能に乾燥形態で堆積され、サンプルにより再水和されると可動化され、コントロールゾーンに固定された特異的捕捉剤により捕捉される標識抗体または他の試薬であろう。コントロールは、十分なサンプルが検査デバイスに適用されたかの指標となり、検査試薬がその結合性を適正な程度に維持していたかの指標となり、かつ、標識試薬が十分な程度に可動化されたかの指標となる。
【０１０２】
次に、例示的な実施例を介しておよび添付の図面を参照して、本発明の種々の特徴をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、本発明に係るデバイスの一実施形態の分解図である。
【図２】図２は、本発明に係るデバイスの異なる実施形態で使用されるアッセイ検査ストリップの種々の方式を例示している。
【図３】図３は、本発明に係るデバイスの異なる実施形態で使用されるアッセイ検査ストリップの種々の方式を例示している。
【図４】図４は、本発明に係るデバイスの異なる実施形態で使用されるアッセイ検査ストリップの種々の方式を例示している。
【図５】図５は、本発明に係るデバイスの異なる実施形態で使用されるアッセイ検査ストリップの種々の方式を例示している。
【図６】図６は、本発明に係るデバイスに有用なアルゴリズム／論理ツリーの一実施形態を概略的に示している。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
実施例１
最初の実験では、合計５０個のサンプルが［ｈＣＧ］≧２．５ｍＩＵ／ｍｌを有していた閉経周辺期および閉経後の１１９名の妊娠していない志願者（ＰＰ、年齢４１〜９０歳）コホートで、ならびにうまく妊娠して満期に至ったＤａｙ−７  ＥＭＰ（予想月経停止）からＤａｙ＋３  ＥＭＰまでの７２名（２１〜４０歳）の妊娠している志願者から、尿中ｈＣＧ、尿中ＦＳＨ、および尿中Ｐ３Ｇを測定した。サンプルを検査し、利用可能な場合で、合計５８９個の妊娠初期サンプル（「ＥＰＳ」）が得られ、そのうち４３４個はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）Ｄｅｌｆｉａ（登録商標）アッセイにより評価して［ｈＣＧ］≧２．５ｍＩＵ／ｍｌを有していた。
【０１０５】
これらの結果を分析したところ、１０ｍＩＵ／ｍｌ以下のＦＳＨ閾値および少なくとも４μｇ／ｍｌのＰ３Ｇ閾値の両方と組み合わせて少なくとも２．５ｍＩＵ／ｍｌの尿中ｈＣＧ閾値レベルを用いて妊娠を定義することにより、真の妊娠が１００％陽性予測で予想可能であった（妊娠していないコホート中に偽陽性は存在しなかった）。この研究により確証される妊娠の定義に用いた３種のアナライトの閾値レベルは、より大きなデータセットでは変化する可能性があるが、ＦＳＨおよびＰ３Ｇと組み合わせてｈＣＧを用いることにより、妊娠に由来するｈＣＧと下垂体に由来する閉経周辺期および閉経後のｈＣＧとを識別可能であったことが結果から示される。
【０１０６】
これらの閾値を用いた結果を以下の表１に示す。
【０１０７】
【表１】
2019023647.tif 000003
【０１０８】
表１に示される結果は非常に有意である。グループＡでは、非常に高感度のｈＣＧ検査（２．５ｍＩＵ／ｍｌ程度の少ないｈＣＧを検出する）が、ＦＳＨおよびプロゲステロン代謝物（Ｐ３Ｇ）の検査と組み合わせた場合、統計的に有意な女性のサンプルでゼロの偽陽性率を与え、一方、グループＢでは、妊娠している被験者すべてを同定するのに成功したことが示される。
【０１０９】
実施例２
本発明の一実施形態では、妊娠検査デバイスには、ｈＣＧサンドイッチアッセイが第１のストリップ上にフォーマットされて二ストリップニトロセルロース（ＮＣ）フォーマットで構築されたラテラルフローイムノアッセイが含まれよう。ＦＳＨサンドイッチアッセイおよび競合Ｐ３Ｇアッセイは、２つの個別の捕捉ゾーンを有する第２の個別のストリップ上にフォーマットされよう。両方のストリップは、両方のニトロセルロースストリップに接触する多孔性媒体に接触する共通のサンプル適用ゾーンを介して同時に処理されよう。ＮＣ捕捉ゾーン上では対象アナライトの量に対応してシグナル反応（結合標識）がデバイスによりデジタル方式で測定されよう。アナライトのレベルに依存して内蔵アルゴリズムによりデジタル表示応答（妊娠しているか／妊娠していないかおよび／または在胎期間）がスクリーン上に与えられエンドユーザーに示されよう。
【０１１０】
可能なアルゴリズムの一例を図６に概略的に示す。図６に示されたアルゴリズムは１つの実施形態にすぎず、多くの他の実施形態が使用されうることに留意すべきである。図６に示された絶対アナライト濃度は単に例示されたものであり、他のアナライト閾値が利用されうることにも留意すべきである。
【０１１１】
実施例３
一実施形態の分解図を示す図１を参照して、本出願に係るデバイスは、合成プラスチック材料で形成されたツーパートハウジングを含む。ハウジングは、頂部２および底部４を有する。ハウジングは、ポリカーボネートまたはポリプロピレンなどの不透明プラスチック材料で形成される。必要であれば、不透明化剤を組み込んでもよい。
【０１１２】
ハウジング内には小さいボタン電池６などの電源があり、これによりプリント回路基板集合体（ＰＣＢＡ）８上に取り付けられた要素に電力が送られる。これらは、特定的には、１つ以上のＬＥＤ、フォトダイオード、液晶ディスプレイ１０を含む。ＰＣＢＡ８上に取り付けられた要素は、ハウジング内に取り付けられた２つのラテラルフローアッセイス
トリップ上で行われたアッセイ結果を読み取るのに必要なものを含む。ストリップの１つ１２は、ｈＣＧアッセイを行うためのものであり、他方のストリップ１４は、をストリッピングする、ＦＳＨおよびプレガンジオール−３−グルクロニド（Ｐ３Ｇ）の両方のアッセイを行うためのものである。
【０１１３】
ハウジングの頂部および底部２、４は、協同して上述の要素の周りに実質的に湿分不透過性のシールを形成する。尿サンプルは、サンプリングウィック１６によりラテラルフローアッセイストリップ１２、１４に達する。サンプリングウィック１６の一方の端領域は、アッセイストリップ１２、１４のそれぞれの近接端領域と液体フロー連通している（サンプリングウィックが共通のサンプル適用ゾーンとして作用するように）。
【０１１４】
サンプリングウィック１６の対向端領域は、ハウジングの一方の端のアパーチャーを貫通してかつそれを越えて突出しているため、サンプルをサンプリングウィックに適用することが可能である。サンプリングウィックの突出部は、取外し可能なキャップ１８により保護されている。このキャップは、収容されるハウジングの端と協同して滑嵌合係合を形成するように形状決めおよび寸法決めが行われている。
【０１１５】
例示された実施形態では、尿サンプルをサンプリングウィック１６に適用するために、ユーザーは、キャップ１８を取り外してウィック上に直接排尿する。ウィックは、吸収性材料で作製されているため、サンプルは、ウィックに吸収され、ウィックに沿って受動手段により流動してアッセイストリップ１２、１４に流入する。次いで、ユーザーは、任意選択でキャップ１８を再配置する。サンプルがアッセイストリップに沿って流入するのを支援するために、アッセイストリップは、その遠位端（すなわち、サンプリングウィック１６からさらに離れた端は）で高吸収性材料の「シンク」パッド２０と液体フロー連通している。
【０１１６】
ラテラルフローアッセイは、従来方式で進行し、検査ストリップ１２、１４上の検出ゾーンにアナライト濃度依存的に（場合に応じて比例または反比例して）標識結合試薬の蓄積をもたらし、これは、ＰＣＢＡ８上に取り付けられたアッセイ結果読取り要素により検出され読み込まれる。マイクロプロセッサーＡＳＩＣなどは、読み値の解析および解釈を行って、ハウジングの頂部２の好適な位置に形成されたウィンドウまたはアパーチャー２１を介してユーザーに見えるＬＣＤ１０上にアッセイ結果を表示する。
【０１１７】
使用前、ラテラルフロー検査ストリップ１２、１４を乾燥状態に維持することが重要であるため、ＰＣＢＡは、ハウジングの内側から湿分を吸収する乾燥剤２２のための容器を備えている。
【０１１８】
実施例４
図２を参照して、この実施例は、２つの異なるラテラルフローアッセイストリップが本発明に係るデバイスと組み合わせて使用されるかまたはその構成部分を形成する実施形態に関する。
【０１１９】
図２では、ストリップの一方３０は、ｈＣＧの高感度アッセイを行うために使用される。他方のストリップ３２は、ＦＳＨおよびＰ３Ｇの両方のアッセイを行うために使用される。尿サンプルは、共通のサンプリング部材（明確さを期して省略した）からアッセイストリップ３０、３２の両方に進入し、矢印３４により示された方向にストリップに沿って流動する。それらの近位端（すなわち、尿サンプルが最初に遭遇する端）では、両方のストリップがガラス繊維コンジュゲートパッド３６を有し、遠位端に向って両方のストリップが高吸収性「シンク」３８と液体フロー連通しており、これによりサンプルがアッセイストリップに沿って流動するようになる。両方のストリップはまた、「シンク」３８を越
えて一対の位置合せ孔４０を含む。これらのことから、デバイス内でストリップの適正な位置決めが容易になり、その結果、とくに、アッセイストリップをデバイスのアッセイ結果読取り要素により適正に読み取ることが可能になる。対をなす位置合せ孔４０は対称ではないため、ストリップが偶発的に互いに交換されることはありえないことに留意されたい。
【０１２０】
ストリップ３０を参照して、コンジュゲートパッド３６には、金ゾル（４２）にコンジュゲートされた可動性抗αｈＣＧサブユニットモノクローナル抗体が充填されている。このコンジュゲートは、コンジュゲートパッド上で乾燥され、サンプルにより湿潤されると放出される。
【０１２１】
検出ゾーン４４は、ｈＣＧのβサブユニットに特異的な固定化モノクローナル抗体を含む。それゆえ、サンプル中に存在するｈＣＧはいずれも、標識コンジュゲートに結合し、当業者の熟知するところであろう方法で、検出ゾーンで「捕捉」抗ｈＣＧβ抗体とのサンドイッチを形成する。
【０１２２】
点線により境界付けられたゾーン４６は、参照ゾーンを表し、アッセイ結果読取り手段は、このゾーンを使用してアッセイ読み値を校正する。同一の参照ゾーン４６は、ｈＣＧアッセイ読み値と、さらにはストリップ３２上のＦＳＨおよびＰ３Ｇのアッセイで得られた読み値との両方を校正するために使用されうる（すなわち、共通の参照ゾーンが使用されうる）。
【０１２３】
ストリップ３２を参照して、ガラス繊維コンジュゲートパッドは、２つの異なるコンジュゲート４８を有し、一方は、抗ＦＳＨαサブユニットモノクローナル抗体にコンジュゲートされた金ゾルであり、他方は、抗Ｐ３Ｇモノクローナル抗体にコンジュゲートされた金ゾルである。（この実施例では、抗ｈＣＧαおよび抗ＦＳＨαは同一の抗体クローンである）。
【０１２４】
固定化抗ＦＳＨβサブユニットモノクローナル抗体は、ＦＳＨ検出ゾーン５０で捕捉抗体として使用され、一方、固定化Ｐ３Ｇ−オボアルブミンコンジュゲートは、Ｐ３Ｇ検出ゾーン５２で捕捉分子として使用されている。
【０１２５】
各アッセイストリップ３０、３２の本体は、参照番号５４により示されるようにニトロセルロースで形成される。
【０１２６】
この実施形態では、Ｐ３Ｇ検出ゾーン５２は、ＦＳＨ検出ゾーン５０の下流に示されているが、２つの検出ゾーンの相対位置を逆転しうることが想定されうる。
【０１２７】
さらなる変形形態は、ｈＣＧおよびＰ３Ｇのアッセイが１つのストリップ上で行われ、かつ個別のストリップがＦＳＨアッセイに使用される、フォーマットである。
【０１２８】
実施例４Ａ
他のアッセイ方式を想定することが可能である。これは、この変形形態では、コンジュゲートパッド３６上に堆積された可動性コンジュゲートの１つが、Ｐ３Ｇ−オボアルブミンコンジュゲート（抗Ｐ３ＧｍＡｂの代わりに）で標識された金ゾルであり、Ｐ３Ｇ検出ゾーン５２の固定化捕捉分子が、固定された抗Ｐ３ＧｍＡｂであることを除いて、図２に示されかつ実施例４で説明されたものと本質的に同一である。この構成では、サンプル中のＰ３Ｇは、検出ゾーン５２での捕捉抗体への結合に関して標識コンジュゲートと競合する。
【０１２９】
実施例５
図３を参照して（同じ要素は図２で使用される参照数字を共有する）、この実施形態では、３つのアッセイはすべて、単一のアッセイストリップを用いて行われる。ガラス繊維コンジュゲートパッド３６は、共通の抗ｈＣＧαおよび抗ＦＳＨα金ゾルコンジュゲートならびに抗Ｐ３ＧｍＡｂ金ゾルコンジュゲート（それぞれ４２、４８）で充填されている。
【０１３０】
ｈＣＧ検出ゾーン４４は、固定化抗ｈＣＧβｍＡｂを含む。ＦＳＨ検出ゾーン５０は、固定化抗ＦＳＨβｍＡｂを含み、Ｐ３Ｇ検出ゾーン５２は、固定化Ｐ３Ｇオボアルブミンコンジュゲートを含む。
【０１３１】
以上と同様に、検出ゾーンの相対位置は変化させうる。また、実施例４Ａと同様に、可動性Ｐ３Ｇ試薬は、Ｐ３Ｇ−オボアルブミンコンジュゲートで標識された金ゾルでありうるとともに、Ｐ３Ｇ検出ゾーン５２は、固定化抗Ｐ３Ｇ抗体を含みうる。
【０１３２】
さらに他の変形形態は容易に想定することが可能である。可動性コンジュゲートが、ｈＣＧに対するβサブユニット特異的モノクローナル抗体にコンジュゲートされた第１の金ゾルと、ＦＳＨに対するβサブユニット特異的モノクローナル抗体にコンジュゲートされた第２の金ゾルとを含みうる。それぞれの検出ゾーンは、固定化抗ｈＣＧαおよび抗ＦＳＨα抗体を含む。他の潜在的な変形形態は、可動性コンジュゲートおよび固定化捕捉抗体の両方で抗ｈＣＧβサブユニット抗体を使用することであり、ただし、２つの抗体が異なるエピトープに結合し、それゆえ、ｈＣＧへの結合に関して互いに干渉も競合もしないことを条件とする。ＦＳＨはまた、可動性コンジュゲートおよび固定化捕捉抗体の両方で抗ＦＳＨβサブユニット特異的抗体を用いて同様にアッセイ可能である。
【０１３３】
実施例６
図４に概略的に示されたこの実施例では、個別のラテラルフローアッセイストリップが、各アナライトに対して提供される。ｈＣＧは、ストリップ１００上でアッセイされ、ＦＳＨは、ストリップ１０２上でアッセイされ、およびＰ３Ｇは、ストリップ１０４上でアッセイされる。同じ要素は、図２と同一の参照数字を共有する。
【０１３４】
サンプルは、共通のサンプリング部材（明確さを期して省略した）を介して３つのアッセイストリップすべてに適用される。共通の「シンク」パッド３８は、各アッセイストリップの遠位端に向って液体フロー接触している。この実施形態では、図２とは対照的に、各アッセイストリップ１００、１０２、１０４は、それ自体の参照ゾーン４６を有する。その他に、各アッセイストリップは、結合試薬がその結合性を維持する範囲内で、手順コントロールゾーン６０（アッセイが適正に行われたかの指標となる）を有する。
【０１３５】
実施例７
さらに他の実施形態が図５に例示されている。これもまた、３つのアッセイストリップを利用する。しかしながら、３つのストリップの２つは、ｈＣＧレベルを測定するためのものであり、それゆえ、ストリップの１つ１１０は、高感度ｈＣＧアッセイであり（低レベルのｈＣＧを検出するために）、ストリップの１つ１１２は、低感受性ｈＣＧアッセイであり（高レベルのｈＣＧを検出するために）、および第３のストリップ１１４は、ＦＳＨおよびＰ３Ｇの両方をアッセイするためのものである。同じ要素は、図２に共通する参照数字により示される。
【０１３６】
ストリップ１１２上のｈＣＧアッセイの感度を減少させるために、コンジュゲートパッド３６は、抗ｈＣＧαｍＡｂにコンジュゲートされた可動性金ゾルだけでなく（４２’）、サンプル中に存在するｈＣＧに結合する遊離（非標識）抗ｈＣＧβｍＡｂでも充填され
、それゆえ、検出ゾーン４４に位置する固定化抗ｈＣＧβ捕捉抗体と競合する。それゆえ、サンプル中の高レベルのｈＣＧアナライトで、アッセイ系に殺到することはない。この場合、非標識抗ｈＣＧβモノクローナル抗体は、「スカベンジャー」剤として作用している。スカベンジャー剤は、抗体である必要はないが、ｈＣＧに結合して検出ゾーンでの標識試薬の堆積を（間接的に）妨害する任意の非標識剤でありうる。スカベンジャー剤は、たとえば、流路上／流路内に固定されうるか、標識コンジュゲートと混合されうる（可動形態で）。
【０１３７】
高感度および低感度の両方のｈＣＧアッセイを用いることにより、デバイスは広範な濃度範囲にわたりｈＣＧを正確に測定可能になり、この配置は、被験者が妊娠していることを示す結果をデバイスが表示可能であるだけでなく、被験者がどのくらい長期間妊娠しているか（たとえば、受胎からの週数で）に関する定量的推定値をユーザーに示すことも可能である実施形態に役立つ。
【０１３８】
上記の実施例は種々のラテラルフローアッセイフォーマットの使用を例示しているが、類似のアッセイ構成でマイクロフルイディクスベースのアッセイまたはラテラルフローおよびマイクロフルイディクスの両方をベースとするアッセイが利用可能であることは明らかであろう。
【０１３９】
実施例８
この実施例には、図４に示される本発明に係るデバイスで使用するのに好適なラテラルフローアッセイストリップの製造工程を記載する。
【０１４０】
アッセイ試薬の製造：
Ａ．金ゾル標識抗体の調製：
１．Ｐ３Ｇアッセイ：
方法：
ホウ酸緩衝液（２０ｍｌ、２０ｍＭ、ｐＨ８．５）を８０ｎｍ金ゾル溶液（２０ｍｌ、Ａ５５０ｎｍ＝ＯＤ６．８５、ＢＢＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に添加し、金ゾルを含有する最終溶液を１０ｍＭホウ酸緩衝液中ＯＤ３．４２５で与えた。
【０１４１】
抗Ｐ３Ｇ抗体の溶液（クローン＃５８０６：２、Ａｌｅｒｅ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、４０ｍｌ、１０ｍＭホウ酸緩衝液中１６０μｇ／ｍｌ）を、室温で３０分間にわたりマグネチックスターラーにより金ゾル溶液と急速に混合した。
【０１４２】
３０分間混合した後、６１０μｌの６５．６ｍｇ／ｍｌβ−カゼイン溶液を反応混合物に添加し、室温でさらに３０分間にわたり混合を継続した。
【０１４３】
反応混合物中のβ−カゼインの最終濃度は０．５ｍｇ／ｍｌであった。
ゾル溶液をファルコンチューブ（５０ｍｌ）に注加し、溶液を遠心分離した（４，０００ｇ、１０分、１５℃）。
【０１４４】
透明上清をデカントし、ペレット化ゾルを撹拌し超音波処理した。
ゾル溶液をエッペンドルフチューブに移し、遠心分離した（４，０００ｇ、７分、１５℃）。
【０１４５】
上清を注意深く除去し、ペレット化ゾルを撹拌し超音波処理し、洗浄緩衝液を添加してゾルを再懸濁させた（１ｍｌ、１０ｍＭホウ酸緩衝液中０．５ｍｇ／ｍｌ  β−カゼイン）。再懸濁後、溶液を遠心分離した（４，０００ｇ、７分、１５℃）。
【０１４６】
上清を注意深く除去し、ペレット化ゾルを撹拌し超音波処理し、洗浄緩衝液を添加してゾルを再懸濁させた（１ｍｌ、１０ｍＭホウ酸緩衝液中０．５ｍｇ／ｍｌ  β−カゼイン）。再懸濁後、溶液を遠心分離した（４，０００ｇ、７分、１５℃）。
【０１４７】
上清を除去し、ペレット化ゾルを撹拌し超音波処理し、ゾルを少量の貯蔵緩衝液に再懸濁させ（ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ＋アジド［ＰＢＳＡ］）、最終体積を２ｍｌに調整した。最初の実験では貯蔵緩衝液中０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを使用したが、ＢＳＡの存在がＰ３Ｇアッセイを妨害することが判明した。したがって、続いて、ＢＳＡの代わりに貯蔵緩衝液中０．５ｍｇ／ｍｌカゼインを使用した。Ｐ３Ｇアッセイ成分を他のアッセイの成分に接触させうる本発明の実施形態では（たとえば、Ｐ３ＧアッセイおよびｈＣＧおよび／またはＦＳＨアッセイの両方を単一のアッセイ流路またはラテラルフローストリップ上で行う場合）、Ｐ３Ｇアッセイが影響を受けるのを防ぐために、他のアッセイでもＢＳＡの使用を回避することが必要であろう。
【０１４８】
５５０ｎｍで吸光度を測定することによりゾル調製物の最終ＯＤを決定した。
２．ｈＣＧアッセイおよびＦＳＨアッセイ：
方法：
ホウ酸緩衝液（２０ｍｌ、２０ｍＭ、ｐＨ８．５）を８０ｎｍ金ゾル溶液（２０ｍｌ、Ａ５５０ｎｍ＝ＯＤ  ６．８５、ＢＢＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に添加し、金ゾルを含有する最終溶液を１０ｍＭホウ酸緩衝液中ＯＤ３．４２５で与えた。
【０１４９】
抗α−ｈＣＧ抗体の溶液（クローン＃３２９９：４、Ａｌｅｒｅ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、４０ｍｌ、１０ｍＭホウ酸緩衝液中２０μｇ／ｍｌ）を、室温で３０分間にわたりマグネチックスターラーにより金ゾル溶液と急速に混合した。
【０１５０】
３０分間混合した後、６１０μｌの６５．６ｍｇ／ｍｌ  β−カゼイン溶液を反応混合物に添加し、室温でさらに３０分間にわたり混合を継続した。反応混合物中のβ−カゼインの最終濃度は０．５ｍｇ／ｍｌであった。
【０１５１】
ゾル溶液をファルコンチューブ（５０ｍｌ）に注加し、溶液を遠心分離した（４，０００ｇ、１０分、１５℃）。
【０１５２】
上清をデカントし、ペレット化ゾルを撹拌し超音波処理した。
ゾル溶液をエッペンドルフチューブに移し、遠心分離した（４，０００ｇ、７分、１５℃）。
【０１５３】
上清を注意深く除去し、ペレット化ゾルを撹拌し超音波処理し、洗浄緩衝液を添加してゾルを再懸濁させた（１ｍｌ、１０ｍＭホウ酸緩衝液中０．５ｍｇ／ｍｌ  β−カゼイン）。再懸濁後、溶液を遠心分離した（４，０００ｇ、７分、１５℃）。
【０１５４】
上清を注意深く除去し、ペレット化ゾルを撹拌し超音波処理し、洗浄緩衝液を添加してゾルを再懸濁させた（１ｍｌ、１０ｍＭホウ酸緩衝液中０．５ｍｇ／ｍｌ  β−カゼイン）。再懸濁後、溶液を遠心分離した（４，０００ｇ、７分、１５℃）。
【０１５５】
上清を除去し、ペレット化ゾルを撹拌し超音波処理し、ゾルを少量の貯蔵緩衝液に再懸濁させ（ＰＢＳＡ中０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）、最終体積を２ｍｌに調整した。
【０１５６】
５５０ｎｍで吸光度を測定することによりゾル調製物の最終ＯＤを決定した。
Ｂ．ニトロセルロース上に固定される試薬の調製：
以下の実施例ではオボアルブミンのＰ３Ｇコンジュゲートの調製および使用が記載され
ているが、Ｐ３Ｇの他のタンパク質コンジュゲートまたは合成高分子コンジュゲートを利用しうることが想定されうる。Ｐ３Ｇのタンパク質コンジュゲートには、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリンＧ、ゼラチン、およびβ−カゼインが含まれるが、これらに限定されるものではない。高分子担体の代表例には、ポリアリルアミン、ポリビニルアルコール、ポリリシン、およびポリエチレンイミンが含まれる。
【０１５７】
Ｐ３Ｇアッセイ：
オボアルブミンのＰ３Ｇコンジュゲートの調製（Ｐ３Ｇ対オボアルブミンのモル比１０：１）。
【０１５８】
方法
ＮＨＳ活性化Ｐ３Ｇエステルの調製（１０ｍｇ  Ｐ３Ｇ、１０％ＤＭＳＯスケール）
ＮＨＳ活性化Ｐ３Ｇエステルの調製に水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）を使用した。Ｐ３Ｇ（２．０１３６×１０−５モルＰ３Ｇ）よりもモル過剰のＥＤＣ（１．１×）およびＮＨＳ（１．５×）を用いて反応を行った。
【０１５９】
反応を行う全体積は６００μｌであった。
４８ｍｇのＥＤＣを３．３９ｍｌのＤＭＳＯ（９９．７％エクストラドライ、Ａｃｒｏｓ、Ｃａｔ＃３４８４４００）に溶解させることにより、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドクロリド、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃７７１４９、Ｍ．Ｗ．＝１９１．７）の１４．１５３ｍｇ／ｍｌ溶液を調製した。
【０１６０】
２９ｍｇのＮＨＳを２．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解させることにより、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃１３０６７２、Ｍ．Ｗ．＝１１５．０９）の１１．６ｍｇ／ｍｌ溶液を調製した。
【０１６１】
１０ｍｇのＰ３Ｇ（５β−プレグナン−３α，２０α−ジオールグルクロニド、Ｐ３Ｇ、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃Ｐ３６３５、Ｍ．Ｗ．＝４９６．６３）をガラスバイアル中に秤取し、３００μｌのＥＤＣおよび以上で調製した３００μｌのＮＨＳ溶液を添加して、Ｐ３Ｇの１．１倍超のＥＤＣおよび１．５倍超のＮＨＳを含有する反応混合物を与えた。反応混合物を暗所、室温で４時間撹拌し、反応を２０℃で一晩（約１６ｈｒｓ）進行させた。
【０１６２】
無水ＤＭＳＯ（４００μｌ）を以上の溶液に添加して全体積１０００μｌの溶液を作製した。
【０１６３】
Ｐ３ＧからＰ３Ｇ−ＮＨＳエステルへの転化率を１００％と仮定すれば、１０００μｌ中に２．０１３６×１０−５モルの活性化エステルが存在しよう。それゆえ、この溶液の１００μｌには２．０１３６×１０−６モルが含まれよう。
【０１６４】
Ｐ３Ｇ−オボアルブミンコンジュゲートの調製
１００μｌの活性エステル（２．０１３６×１０−６モル）を使用した。
【０１６５】
９２．４ｍｇのオボアルブミンを２０．８５８ｍｌのＰＢＳに溶解させることによりＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ錠剤、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃Ｐ４４１７）中のオボアルブミンの４．４３ｍｇ／ｍｌ溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃  Ａ５５０３  ＞９８％、ＭＷ＝４４，０００）を調製し、この溶液の２ｍｌを用いて１０倍希釈調製物を得た。
【０１６６】
ＮＨＳ活性化Ｐ３Ｇ溶液（１００μｌ）を添加する直前にＤＭＳＯ（１００μｌ）をオ
ボアルブミン溶液に添加した。それゆえ、反応混合物中のＤＭＳＯの最終濃度は１０％（ｖ／ｖ）に維持された。
【０１６７】
反応溶液を室温で３．５時間撹拌した。３．５時間反応した後、１Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．４（１００μｌ）を溶液に添加して反応をクエンチした。
【０１６８】
次いで、Ｐ３Ｇ−オボアルブミンを遠心分離し、透明上清を除去し、ＰＢＳＡであらかじめ平衡化されたＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃１７−０８５１−０１）で精製した。
【０１６９】
−  コンジュゲート溶液（２．５ｍｌ）を平衡化カラムの頂部に適用し、溶液をすべてゲル床に流入させた。
【０１７０】
−  次いで、溶出緩衝液（ＰＢＳＡ、３ｍｌ）をカラムに適用し、フロースルーを清浄ガラス容器中に捕集した。このフロースルーは、精製Ｐ３Ｇ−オボアルブミンコンジュゲートを含有していた。
【０１７１】
タンパク質濃度を決定するために０．７の吸光係数（Ａ２８０ ０．１％）を使用した。次いで、Ｐ３Ｇ−オボアルブミンコンジュゲートを３ｍｇ／ｍｌに濃縮してニトロセルロース上に固定した。
【０１７２】
１．ｈＣＧアッセイ：
抗β−ｈＣＧ抗体（クローン＃３４６８：２、Ａｌｅｒｅ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）をＰＢＳＡ中で３ｍｇ／ｍｌに希釈した後、ニトロセルロース上に固定した。
【０１７３】
２．ＦＳＨアッセイ：
抗β−ＦＳＨ抗体（クローン＃５９４８：２、Ａｌｅｒｅ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）をＰＢＳＡ中で３ｍｇ／ｍｌに希釈した後、ニトロセルロース上に固定した。
【０１７４】
Ｃ．特異的結合物質の調製ならびに位置決めおよび固定の手段：
方法
１．Ｐ３Ｇアッセイ：
１．１  ＰＶＡブロッキング緩衝液（ｐＨ９）を調製した（Ｔｒｉｓ塩基２０ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）、ＰＶＡ１％ｗ／ｖ（ＰＶＡ８０％加水分解、９〜１０Ｋ  ＭＷ（Ｓｉｇｍａ）、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％ｗ／ｖ（Ｓｉｇｍａ）、およびＮａＣｌ  １５０ｍＭ（Ｓｉｇｍａ））。
【０１７５】
１．２  ２．５ｍｌのエタノール（Ｓｉｇｍａ）が添加された４７．５ｍｌのＰＶＡブロッキング緩衝液に２％ｗ／ｖのスクロース（Ｓｉｇｍａ）を添加することによりＰＶＡブロッキング溶液を調製した。
【０１７６】
１．３  プレスカッターを用いて白色バッカー付きニトロセルロース（Ｗｈａｔｍａｎ）シートを３５ｃｍ×４０ｍｍバンドにカットし、バンドの一端を６ｍｍのピッチでホールパンチした（多種多様なピッチ寸法を使用しうるが、ここに示した例では６ｍｍのホールピッチを使用した）。
【０１７７】
１．４  バイオドットプロッターをセットして１μｌ／ｃｍのプロット量で３ｍｇ／ｍｌの濃度でニトロセルロースバンド上の所望の位置にＰ３Ｇ−オボアルブミンコンジュゲートをプロットした。
【０１７８】
１．５  プロット後、５５℃でバンドを乾燥させ、ＰＶＡブロッキング溶液を用いてブロックし、次いで６５℃で乾燥させ、密閉フォイルパウチに乾燥剤と共に室温で一晩貯蔵した。
【０１７９】
２．ｈＣＧアッセイ：
第Ｃ．１節の工程１．１〜１．３（両端を含む）に従った。
【０１８０】
バイオドットプロッターをセットして１μｌ／ｃｍのプロット量で３ｍｇ／ｍｌの濃度でニトロセルロースバンド上の所望の位置に３４６８抗体をプロットした。
【０１８１】
プロット後、５５℃でバンドを乾燥させ、ＰＶＡブロッキング溶液を用いてブロックし、次いで６５℃で乾燥させ、密閉フォイルパウチに乾燥剤と共に室温で一晩貯蔵した。
【０１８２】
３．ＦＳＨアッセイ：
第Ｃ．１節の工程１．１〜１．３（両端を含む）に従った。
【０１８３】
バイオドットプロッターをセットして１μｌ／ｃｍのプロット量で３ｍｇ／ｍｌの濃度でニトロセルロースバンド上の所望の位置に５９４８抗体をプロットした。
【０１８４】
プロット後、５５℃でバンドを乾燥させ、ＰＶＡブロッキング溶液を用いてブロックし、次いで６５℃で乾燥させ、密閉フォイルパウチに乾燥剤と共に室温で一晩貯蔵した。
【０１８５】
Ｄ．金ゾル標識結合試薬の調製およびその固定手段（実施形態１の実施例に使用するために）：
方法
１．Ｐ３Ｇアッセイ：
第Ａ．１節で調製した５８０６被覆ゾルコンジュゲートを遠心分離機により遠心沈降させ、上清を除去した。得られたペレットを撹拌し、超音波処理し、次いで、金のＯＤが所望の値（この実施例ではＯＤ８０）になるように金ゾルコンジュゲートスプレー緩衝液中にペレットを再構成した。以下の実施例で使用した金ゾルコンジュゲートスプレー緩衝液（ｐＨ７．６）は、１０ｍＭトリス（Ｓｉｇｍａ）、５％ｗ／ｖスクロース（Ｓｉｇｍａ）、および０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ＊（Ｐｒｏｌｉａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＳＫＵ＃６８７００）を含有していた。しかしながら、同様に使用可能なスプレー緩衝液の他の例では、希釈剤溶液中にその他の物質を有していてもよく、以上の実施例に列挙された成分をより高いまたはより低いレベルで有していてもよい。（したがってカゼインを０．５％ｗ／ｖに変化させた）。
【０１８６】
Ｇ０４１  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅガラス繊維（Ｓｕｒｅｗｉｃｋ（登録商標））を２６ｍｍ×３５ｃｍにカットして、バイオドットスプレーリグに装着した。
【０１８７】
バイオドットスプレーリグをセットしてガラス繊維上の所望の位置でガラス繊維に５８０６被覆ゾルコンジュゲートを含浸／注入した。この実施例では、ガラス繊維に各スプレーパスで１．６５μｌ／ｃｍのプロット量でＯＤ８０コンジュゲートの４回の逐次パスでスプレーした。
【０１８８】
金ゾルが注入されたガラス繊維を５５℃で乾燥させ、密閉フォイルパウチ内に乾燥剤と共に室温で一晩貯蔵した。
【０１８９】
２．ｈＣＧアッセイ：
ここでは３２９９被覆金ゾル（第Ａ．２節を参照されたい）を使用したことおよびゾル
コンジュゲートのＯＤがＯＤ１１１であったこと以外は以上と同様に、ｈＣＧアッセイ用に金ゾルが含浸／注入されたガラス繊維バンドを調製した。ここに挙げられた実施例では、１．６５μｌ／ｃｍのプロット量で金コンジュゲートを２パスでガラス繊維にスプレーした。
【０１９０】
３．ＦＳＨアッセイ：
ＦＳＨアッセイでは、１．６５μｌ／ｃｍの用量でＯＤ６２金コンジュゲートの２回の逐次パスを用いて３２９９被覆金ゾル（第Ａ．２節を参照されたい）をガラス繊維上にスプレーした。投与されたバンドを以上の実施例と同等に乾燥させて貯蔵した。
【０１９１】
Ｅ．アッセイストリップの構築／生成：単一ストリップアッセイチップ構築物（チップ／ストリップあたり１回のアッセイ）の実施例
方法
１．Ｐ３Ｇアッセイ：
ｋｉｎｅｍａｔｉｃ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌａｍｉｎａｔｏｒ  Ｍｏｄｕｌｅアセンブリーユニットを利用してＰ３Ｇアッセイ要素をアッセイチップ（ストリップ）に集合させた。
【０１９２】
バッキングラミネート（Ｆｅｒｒｉｓｇａｔｅ）をキネマティックカードプラテン上に配置し、固定化Ｐ３Ｇ−オボアルブミン（第Ｃ．１節）を有するブロック化ニトロセルロースバンドを所定の位置でバッキングラミネートに固着した。
【０１９３】
５８０６ゾルコンジュゲートが注入されたガラス繊維（第Ｄ．１節）のバンドをニトロセルロースバンド上で２ｍｍオーバーラップさせてバッキングラミネートに固着した。
【０１９４】
ローラーマットによりチップのすべての要素とバッキングラミネートとの良好な接触を保証した。
【０１９５】
次いで、バイオドットカッターを用いてバンドを６ｍｍの個別チップにカットし、使用できる状態までフォイルパウチ内に乾燥剤と共に貯蔵した。
【０１９６】
２．ｈＣＧアッセイ：
３４６８が固定されたニトロセルロースバンド（第Ｃ．２節）および３２９９金ゾルコンジュゲートが含浸されたガラス繊維バンド（第Ｄ．２節）を使用した以外はＰ３Ｇアッセイと同等に、ｈＣＧアッセイ要素を集合させた。
【０１９７】
次いで、バイオドットカッターを用いてバンドを６ｍｍの個別チップにカットし、使用できる状態までフォイルパウチ内に乾燥剤と共に貯蔵した。
【０１９８】
３．ＦＳＨアッセイ：
５９４８が固定されたニトロセルロースバンド（第Ｃ．３節）および３２９９金ゾルコンジュゲートが含浸されたガラス繊維バンド（第Ｄ．３節）を使用した以外はＰ３Ｇアッセイと同等に、ＦＳＨアッセイ要素を集合させた。次いで、バイオドットカッターを用いてバンドを６ｍｍの個別チップにカットし、使用できる状態までフォイルパウチ内に乾燥剤と共に貯蔵した。
【０１９９】
実施例９
この実施例では、本発明に係るデバイスに有用な例示的なアルゴリズムに関するさらに詳しい情報を提供する。
【０２００】
本発明に係るアッセイデバイスは、妊娠に対する特異度を維持しつつ、従来の自己使用妊娠検査と比較して予想月経日前により高い妊娠検出率を提供する。それは、ｈＣＧに対してより高い感度を有するだけでなく、非常に低いｈＣＧ濃度で妊娠に対する特異度を維持するために、ＦＳＨおよび１種以上のプロゲステロン代謝物も測定することにより、これを達成する。閉経周辺期および閉経期の女性では上昇したレベルのｈＣＧが見られることもあるため、過度に高感度のｈＣＧ検査では偽陽性の結果を生じる可能性がある。ＦＳＨは、高レベルが閉経周辺期および閉経後の状態に関連付けられるため、妊娠を除外するものとして作用し、一方、プロゲステロン代謝物（たとえば、Ｐ３Ｇ）は、高いレベルが妊娠中で見られるため、妊娠を確定するものとして作用する。
【０２０１】
この概念の単純な一実施形態では、デバイスは、以下の表２にまとめられているように機能しうる。この実施例では、アッセイされるプロゲステロン代謝物はＰ３Ｇである。
【０２０２】
【表２】
2019023647.tif 000004
【０２０３】
検査はすべて、アッセイ検査として特定され、検出された濃度により表される。発色可視ラインの強度の検査では、ラインの強度がアナライト濃度の増加に伴って低減する競合アッセイに対しては、論理を反転させなければならない。
【０２０４】
より徹底したアルゴリズムを用いることにより、おそらく改善された性能を達成しうるであろう。ＦＳＨレベルまたはプロゲステロン代謝物レベルの重要性（加重）は、ｈＣＧレベルに依存する可能性があり、かつ／または使用されるＦＳＨおよびプロゲステロン代謝物の検査に用いられる閾値は、ｈＣＧレベルに依存しうる。より複雑な場合、ＦＳＨ閾値はｈＣＧ濃度に依存する可能性があり、プロゲステロン代謝物閾値はＦＳＨレベルに依存する可能性がある（その逆も同様である）。
【０２０５】
アルゴリズムは、図６に概略的に表される。図を参照して、アルゴリズム／論理ツリーは、２つのラテラルフロー検査ストリップを含む本発明に係る検査デバイスの一実施形態に関する。第１のストリップは、ｈＣＧのアッセイを行うために使用され、第２のストリップは、ＦＳＨのアッセイおよびＰ３Ｇのアッセイを行うために使用される。
【０２０６】
論理ツリーでは、第１のアッセイ結果リーダーは、ｈＣＧアッセイ結果を調べて、アッセイシグナルを２．５ｍＩＵ／ｍｌのｈＣＧ濃度に対応するあらかじめ決められたシグナル値と比較する。アッセイ結果が２．５ｍＩＵ／ｍｌの閾値を下回る場合、リーダーは検査被験者が「妊娠していない」とただちに示しうる（図中「＜」記号に従う）。［しかしながら、３種のアナライトアッセイのすべての結果が決定されるまで、全体的アッセイのアウトカム（すなわち「妊娠している」または「妊娠していない」）は、必ずしもユーザーに示されなくてもよい］。他の選択肢として、決定された尿サンプル中ｈＣＧ濃度が２．５ｍＩＵ／ｍｌの閾値以上である場合、リーダーはＦＳＨアッセイ結果（第２のアッセイストリップ上の第１の検査ラインまたは検出ゾーン）のチェックに進む。２．５ｍＩＵ／ｍｌを上回るｈＣＧ濃度は非妊娠関連源に起因する可能性があるため、アッセイの全般的アウトカムの「早期」決定は、ｈＣＧアッセイ結果のみに基づいて行うことはできないであろう。
【０２０７】
ＦＳＨアッセイは、１０ｍＩＵ／ｍｌの閾値を有する。サンプル中の決定されたＦＳＨ濃度が１０ｍＩＵ／ｍｌの閾値以上である場合、アッセイデバイス／リーダーは「妊娠していない」として検査の結果を宣言する。反対に、サンプル中のＦＳＨ濃度が１０ｍＩＵ／ｍｌの閾値を上回る場合、アッセイデバイス／リーダーは継続してＰ３Ｇアッセイ結果を調べることになろう。
【０２０８】
Ｐ３Ｇアッセイ結果は、第２のラテラルフローアッセイストリップ上の第２の検査ラインまたは検出ゾーンから読み取られる。Ｐ３Ｇアッセイからサンプル中のＰ３Ｇ濃度が４μｇ／ｍｌを下回ることが示唆された場合、被験者は「妊娠している」と宣言される。
【０２０９】
特定の実施形態に対して選択される精密なシグナル値または閾値濃度は、少なくとも部分的には、利用されるアッセイの特異的特性（たとえば、試薬、フローマトリックス、コンジュゲート濃度など）に依存するであろうから、以上に規定された閾値は、他の実施形態ではわずかに異なることもあろうが、相対量は一般的には同一であろうことは、当業者には明らかであろう。
【０２１０】
さらに、図には、ｈＣＧ、ＦＳＨ、およびＰ３Ｇのアッセイ結果を逐次的に検査またはチェックするアッセイデバイス／読取り手段が示されている。それぞれのアッセイ結果が任意の順序でまたは実質的に同時に検査されうることは明らかであろう。さらに、アナライトの濃度が関連閾値濃度をはるかに上回る（または下回る、適宜）のであれば、３種のアナライトアッセイすべての結果を知ることが必ずしも必要ではなく、１または２つのアッセイ結果の「早期」決定により、全体的アッセイ結果のアウトカム（すなわち「妊娠している」または「妊娠していない」）を決定しうる。
【図１】
2019023647.tif 000005
【図２】
2019023647.tif 000006
【図３】
2019023647.tif 000007
【図４】
2019023647.tif 000008
【図５】
2019023647.tif 000009
【図６】
2019023647.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月12日(2018.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト女性被験者において妊娠を検出する検査デバイスであって、
前記被験者のサンプル中のｈＣＧの絶対量または相対量を測定する第１のアッセイ手段と、
前記被験者のサンプル中のＦＳＨの絶対量または相対量を測定する第２のアッセイ手段と、
前記被験者のサンプル中のプロゲステロン代謝物の絶対量または相対量を測定する第３のアッセイ手段と、
前記第１から第３のアッセイ手段の各々に動作可能に接続され、前記第１から第３のアッセイ手段の各々から実質的に同時にアッセイ信号値を受けるコンピュータコントロール手段とを含み、前記コンピュータコントロール手段は、ｈＣＧ、ＦＳＨまたはプロゲステロンの以前の計測を参照せずに前記アッセイ信号値に基づいて結果をユーザーに出力するように構成される、検査デバイス。
【請求項２】
１つ以上のラテラルフロー検査ストリップおよび／またはマイクロフルイディクスベースのアッセイを含む、請求項１に記載の検査デバイス。
【請求項３】
前記コンピュータコントロール手段は、マイクロプロセッサーまたは特定用途向け集積回路（以下ＡＳＩＣと称す）を含み、前記検査デバイスは、前記アッセイの結果またはアウトカムをユーザーに表示するためのアッセイ結果ディスプレイをさらに含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項４】
各アナライトに対する少なくとも１つのあらかじめ決められたシグナル値閾値を用いてプログラムされたデジタルメモリーデバイスを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項５】
アナライトアッセイシグナル値とそれらのそれぞれのあらかじめ決められた閾値とを比較することにより検査結果を決定するアルゴリズムを用いてプログラムされた、マイクロプロセッサー、ＡＳＩＣ、または他のプログラマブルコンピューターコントロール手段を含む、請求項４に記載の検査デバイス。
【請求項６】
ポイントオブケアデバイスまたは「自己検査用」デバイスである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項７】
単回使用後に廃棄される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項８】
アッセイ検査結果を解釈し、かつ検査アウトカムを前記ユーザーに表示する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項９】
１つ以上のマイクロフルイディクスまたはラテラルフローアッセイ検出ゾーンに照射する１つ以上の光源と、前記検出ゾーンにより反射または透過された光を検出する１つ以上の光検出器とを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項１０】
ｈＣＧに対する第１および第２のｈＣＧアッセイを含み、前記第１のｈＣＧアッセイが前記第２のｈＣＧアッセイより高感度のアッセイであり、それにより、前記検査デバイスが広範囲にわたるｈＣＧ濃度を測定できる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項１１】
前記第１のｈＣＧアッセイおよび前記第２のｈＣＧアッセイが、個別のラテラルフロー検査ストリップ上または個別のマイクロ流体アッセイ流路上で行われる、請求項１０に記載の検査デバイス。
【請求項１２】
前記第１のｈＣＧアッセイおよび前記第２のｈＣＧアッセイが、同一のラテラルフロー検査ストリップ上または同一のマイクロ流体アッセイ流路上で行われる、請求項１０に記載の検査デバイス。
【請求項１３】
プロゲステロン代謝物アッセイにより検出される前記プロゲステロン代謝物がプレグナンジオールまたはその誘導体を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項１４】
前記プロゲステロン代謝物アッセイにより検出される前記プロゲステロン代謝物がグルクロニドを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項１５】
前記プロゲステロン代謝物アッセイにより検出される前記プロゲステロン代謝物がプレグナンジオール−３−グルクロニドを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項１６】
前記検査デバイスが下限ｈＣＧ閾値および上限ｈＣＧ閾値を用いてプログラムされ、それにより、前記下限ｈＣＧ閾値未満のｈＣＧアッセイ結果が、前記被験者が妊娠していないことを意味すると解釈され、かつ前記上限閾値超のｈＣＧアッセイ結果が、他の２つのアナライトのアッセイ結果にかかわらず前記被験者が妊娠していることを意味すると解釈され、かつ前記下限閾値と前記上限閾値との間のｈＣＧアッセイ結果が、ＦＳＨおよびプロゲステロン代謝物のアッセイ結果に依存して、妊娠しているまたは妊娠していないと解釈される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項１７】
前記検査デバイスが下限ｈＣＧ閾値および上限ｈＣＧ閾値を用いてプログラムされ、それにより、前記下限ｈＣＧ閾値未満のｈＣＧアッセイ結果が、前記被験者が妊娠していないことを意味すると解釈され、かつ前記上限閾値超のｈＣＧアッセイ結果が、他の２つのアナライトのアッセイ結果による確認に付されて、前記被験者が妊娠していることを意味すると解釈される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項１８】
少なくとも１つの追加のｈＣＧ閾値をさらに含む、請求項１６または１７に記載の検査デバイス。
【請求項１９】
妊娠している被験者の妊娠のおよその在胎期間を表示するように適合化および構成されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項２０】
妊娠している被験者の在胎期間を１〜２週間、２〜３週間、または３週間以上の間隔で表示する、請求項１９に記載の検査デバイス。
【請求項２１】
前記デバイスが適正に機能しているかを示すコントロール機能をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項２２】
前記検査デバイスの要素のほとんどまたはすべてと、ハウジングを越えて突出してサンプルの適用を可能にするサンプル適用部材上のサンプル適用ゾーンとを収容する防水性ハウジングを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項２３】
共通のサンプル適用ゾーンに適用されたサンプルが２つ以上の個別の流路に進入し、前記２つ以上の個別の流路のそれぞれで少なくとも１つの異なるアナライトアッセイが行われるように、前記共通のサンプル適用ゾーンを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項２４】
ｈＣＧ、ＦＳＨ、およびプロゲステロン代謝物のそれぞれのアッセイがすべて、単一の共通流路上に提供される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項２５】
黄体形成ホルモンの絶対量または相対量を測定する第４のアッセイ手段および／またはヒト胎盤性ラクトゲンの絶対量または相対量を測定する第５のアッセイ手段を追加的に含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項２６】
個別のアッセイ結果読取りデバイスと組み合わされた使い捨て目視読取りデバイスである、請求項１もしくは２または請求項１もしくは２に従属する請求項６もしくは７、１０〜１５、または２１〜２４のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項２７】
前記個別のアッセイ結果読取りデバイスがカメラを含む、請求項２６に記載の個別のアッセイ結果読取りデバイスと組み合わされた検査デバイス。
【請求項２８】
前記個別のアッセイ結果読取りデバイスがスマートフォンまたは他のデジタルハンドヘルド読取りデバイスを含む、請求項２６または２７に記載の個別のアッセイ結果読取りデバイスと組み合わされた検査デバイス。
【請求項２９】
ヒト女性被験者において妊娠を検出する方法であって、前記被験者のサンプルと、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の検査デバイスとを接触させる工程を含む方法。
【請求項３０】
ヒト女性のサンプルで行われたｈＣＧ、ＦＳＨ、およびプロゲステロン代謝物のアッセイの結果を解析し、かつ前記アッセイの１つ以上の解析から前記被験者が妊娠しているかおよび／または妊娠の在胎期間を決定し、
ｈＣＧ、ＦＳＨまたはプロゲステロンの以前の計測を参照せずに前記アッセイの結果の解析に基づいて解析結果をユーザーに出力するようにプログラムされている電子プログラマブルデバイス。
【請求項３１】
前記解析が、特定のアナライトのアッセイシグナル値と、少なくとも１つのそれぞれの記憶された閾値シグナル値とを比較することを含む、請求項３０に記載のデバイス。
【請求項３２】
以下に示される特徴（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）９９％以上の感度、
（ｉｉ）９９％以上の特異度、
（ｉｉｉ）検査日が妊娠初期の場合でも（ｉ）および（ｉｉ）を満たすこと、
（ｉｖ）検査の実施／アッセイデバイスの使用が単一の時点で１回の場合でも（ｉ）および（ｉｉ）を満たすこと、
（ｖ）アッセイデバイス／方法が外的情報をなんら必要としないこと、および
（ｖｉ）前記被験者が閉経周辺期および／または閉経後の女性を含む場合でも（ｉ）および（ｉｉ）を満たすこと
のうちの少なくとも１つを提供する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の検査デバイス。
【請求項３３】
請求項３０または３１に記載の、かつさらに請求項１〜２４のいずれか一項に記載の検査デバイスに従う、電子プログラマブルデバイス。
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月5日(2018.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
検査デバイス内の１つまたは複数の流路は、ラテラルフロー多孔性担体を含みうる。多孔性担体として利用しうる好適な材料は、ニトロセルロース、アセテート繊維、セルロースもしくはセルロース誘導体、ポリエステル、ポリアミド、ポリオレフィン、またはガラス繊維を含む。多孔性担体は、ニトロセルロースを含みうる。これには、事前化学処理を行うことなく結合試薬を確実に固定できるという利点がある。たとえば、多孔性固相材料が紙を含む場合、抗体の固定は、たとえば、ＣＮＢｒ、カルボニルジイミダゾール、またはトレシルクロリドを用いて、化学結合により行われうる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
サンプルが高レベルのｈＣＧを含有する場合（たとえば、妊娠が比較的進行している被験者によりサンプルが提供されるため）、共通のαサブユニットに特異的な抗体には高レベルのｈＣＧが「殺到」し、ＦＳＨへの結合に利用可能な抗体の量が実質的に低減されるため、サンプル中に存在するＦＳＨの量が過小評価される可能性がある。実際には、このことは、おそらくなんら問題を引き起こさないであろう。なぜなら、かかる高レベルのｈＣＧは、ほぼ常に（＞９９．９％）妊娠に起因し、ＦＳＨアッセイ結果のいかんにかかわらず、検査デバイスにより適正な検出および解釈が行われるであろうからである。ｈＣＧアッセイで二重βサブユニット特異的抗体対およびＦＳＨアッセイで二重β特異的抗体対を使用することも可能である。この方式では、高アナライトレベルで見られた以上の効果が打ち消されるであろう。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
ハウジング内には小さいボタン電池６などの電源があり、これによりプリント回路基板集合体（ＰＣＢＡ）８上に取り付けられた要素に電力が送られる。これらは、特定的には、１つ以上のＬＥＤ、フォトダイオード、液晶ディスプレイ１０を含む。ＰＣＢＡ８上に取り付けられた要素は、ハウジング内に取り付けられた２つのラテラルフローアッセイストリップ上で行われたアッセイ結果を読み取るのに必要なものを含む。ストリップの１つ１２は、ｈＣＧアッセイを行うためのものであり、他方のストリップ１４は、をストリッピングする、ＦＳＨおよびプレグナンジオール−３−グルクロニド（Ｐ３Ｇ）の両方のアッセイを行うためのものである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
反応を行う全体積は６００μｌであった。
４８ｍｇのＥＤＣを３．３９ｍｌのＤＭＳＯ（９９．７％エクストラドライ、Ａｃｒｏｓ、Ｃａｔ＃３４８４４００）に溶解させることにより、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃７７１４９、Ｍ．Ｗ．＝１９１．７）の１４．１５３ｍｇ／ｍｌ溶液を調製した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０７】
ＦＳＨアッセイは、１０ｍＩＵ／ｍｌの閾値を有する。サンプル中の決定されたＦＳＨ濃度が１０ｍＩＵ／ｍｌの閾値以上である場合、アッセイデバイス／リーダーは「妊娠していない」として検査の結果を宣言する。反対に、サンプル中のＦＳＨ濃度が１０ｍＩＵ／ｍｌの閾値を下回る場合、アッセイデバイス／リーダーは継続してＰ３Ｇアッセイ結果を調べることになろう。
【外国語明細書】
2019023647000001.pdf