(57)【要約】【課題】感作又は未感作の不溶性担体粒子を含有する免疫測定用試薬が凍結した場合の、当該不溶性担体粒子の非特異的な凝集を抑制する成分を見出し、当該免疫測定試薬の劣化防止手段を提供すること。【解決手段】上記の不溶性担体粒子の非特異的な凝集を抑制する成分として、下記のω-アミノカルボン酸（１）：【化１】2019028050.tif 000006［式中、ｎは２−６の整数である。］を得て、当該ω-アミノカルボン酸（１）を含有することを特徴とする不溶性担体粒子を用いた免疫測定用試薬と、当該ω-アミノカルボン酸（１）を用いる免疫測定用試薬の劣化防止方法を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶媒中に、感作又は未感作の不溶性担体粒子、及び、下記化学式（１）のω−アミノカルボン酸を含有する免疫測定試薬。
【化１】
2019028050.tif 000004
［式中、ｎは２−６の整数である。］
【請求項２】
ｎは２−５の整数である、請求項１に記載の免疫測定試薬。
【請求項３】
ｎは５である、請求項１に記載の免疫測定試薬。
【請求項４】
不溶性担体粒子は未感作不溶性担体粒子であり、試薬中のω−アミノカルボン酸の濃度は、試薬の０．１−１０質量％である、請求項１に記載の免疫測定試薬。
【請求項５】
不溶性担体粒子は感作不溶性担体粒子であり、ｎは２−５の整数であり、試薬中のω−アミノカルボン酸の濃度は、試薬の３−１０質量％である、請求項１に記載の免疫測定試薬。
【請求項６】
不溶性担体粒子は感作不溶性担体粒子であり、ｎは６であり、試薬中のω−アミノカルボン酸の濃度は、試薬の０．１−０．３質量％である、請求項１に記載の免疫測定試薬。
【請求項７】
凝集法による免疫測定試薬である、請求項１−６のいずれか１項に記載の免疫測定試薬。
【請求項８】
不溶性担体粒子は、ラテックス粒子又は金コロイド粒子である、請求項１−７のいずれか１項に記載の免疫測定試薬。
【請求項９】
感作又は未感作の不溶性担体粒子を含有する免疫測定試薬中に、下記化学式（１）のω−アミノカルボン酸を共存させることにより、当該不溶性担体粒子の非特異的な凝集を防止する、免疫測定試薬の劣化防止方法。
【化２】
2019028050.tif 000005
［式中、ｎは２−６の整数である。］
【請求項１０】
ｎは２−５の整数である、請求項９に記載の劣化防止方法。
【請求項１１】
ｎは５である、請求項９に記載の劣化防止方法。
【請求項１２】
不溶性担体粒子は未感作不溶性担体粒子であり、試薬中のω−アミノカルボン酸の濃度は、試薬の０．１−１０質量％である、請求項９に記載の劣化防止方法。
【請求項１３】
不溶性担体粒子は感作不溶性担体粒子であり、ｎは２−５の整数であり、試薬中のω−アミノカルボン酸の濃度は、試薬の３−１０質量％である、請求項９に記載の劣化防止方法。
【請求項１４】
不溶性担体粒子は感作不溶性担体粒子であり、ｎは６であり、試薬中のω−アミノカルボン酸の濃度は、試薬の０．１−０．３質量％である、請求項９に記載の劣化防止方法。
【請求項１５】
免疫測定試薬は、凝集法による免疫測定試薬である、請求項９−１４のいずれか１項に記載の劣化防止方法。
【請求項１６】
不溶性担体粒子は、ラテックス粒子又は金コロイド粒子である、請求項９−１５のいずれか１項に記載の劣化防止方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不溶性担体粒子を含有する免疫測定試薬の劣化防止手段に関する発明である。本発明に依ると、未感作不溶性担体粒子と感作不溶性担体粒子とを問わずに、凍結・融解のプロセスに伴う不溶性担体粒子同士の非特異的な凝集による液状態様試薬の劣化を防止することができる。代表的な不溶性担体粒子として、ラテックス粒子、金コロイド粒子がある。
【背景技術】
【０００２】
現在、ラテックス粒子、金コロイド粒子等の不溶性担体粒子を用いる免疫測定試薬は、種々の臨床検査項目において用いられている。
【０００３】
例えば、ラテックス凝集法や金コロイド凝集法を用いる免疫測定試薬では、液相中において抗原又は抗体を感作させたラテックス又は金コロイド、あるいは、未感作ラテックス又は金コロイドを用い、抗体又は抗原を検出する測定系を形成する。免疫複合体の形成によりラテックス粒子や金コロイド粒子が凝集する性質に基づき、凝集の程度を目視により確認するか、濁度の増加を吸光度又は散乱光強度の光学的な変化として測定を行うことができる。
【０００４】
ラテックス凝集法や金コロイド凝集法は、操作が簡便であり、自動分析装置にも比較的容易に適用でき、現在盛んに用いられている検査方式の一つである。
【０００５】
ラテックス粒子、金コロイド粒子等の不溶性担体粒子を用いる免疫測定試薬は、販売時には凍結乾燥状態であったとしても、少なくとも用時には不溶性担体粒子の分散液として用いられる。従って、予め分散液の態様であることが現場での取扱いの簡便性の観点から好適である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１４／１３２８３３  国際公開パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の分散液の態様のラテックス粒子、金コロイド粒子等の不溶性担体粒子液を用いる免疫測定試薬（以下、液状態様試薬ともいう）は、２−８℃の適切な冷蔵環境で保存され、通常、凍結劣化は起こり難い。しかしながら、輸送時や温度制御が不十分な冷蔵設備では、過冷却や局所冷却により液状態様試薬の全部又は一部が凍結し、それが融解する際に不溶性担体粒子同士が非特異的に凝集してしまうことが問題となっている。このような非特異的な凝集が起こると試薬の反応性が変わってしまい、肝心な測定値の正確性が損なわれ、誤った診断結果に繋がることになり好ましくない。
【０００８】
液状態様試薬における凍結劣化の防止対策として、一般的にはグリセリンやエチレングリコール等の不凍アルコール、トレハロース等の糖類の添加が行われていたが、いずれも効果は不十分であった。近年では、トリメチルグリシン（ベタイン）を５−３０質量％添加することで、効果的に未感作ラテックス試薬における凍結劣化を防止する方法が報告されている（特許文献１）。
【０００９】
そこで本発明の課題は、その適用対象の範囲を、未感作のみならず感作の不溶性担体粒子まで拡大することが可能であり、かつ、比較的少量の使用で済む凍結劣化防止成分、を見出し、液状態様試薬を安定化する技術の豊富化と、さらなる技術的向上を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、所定のω−アミノカルボン酸を凍結劣化防止成分として用いることで、上記の課題を解決することを見出した。
【００１１】
本発明では、第１に、溶媒中に、感作又は未感作の不溶性担体粒子、及び、下記化学式（１）のω−アミノカルボン酸（以下、ω−アミノカルボン酸（１）ともいう）を含有する免疫測定試薬（以下、本発明の免疫測定試薬ともいう）を提供する。
【００１２】
【化１】
2019028050.tif 000002
【００１３】
［式中、ｎは２−６の整数である。］
【００１４】
第２に、感作又は未感作の不溶性担体粒子を含有する免疫測定試薬中に、上記のω−アミノカルボン酸（１）を共存させることにより、当該不溶性担体粒子の非特異的な凝集を防止する、免疫測定試薬の劣化防止方法（以下、本発明の劣化防止方法ともいう）を提供する。
【００１５】
なお、本発明において「感作」とは、不溶性担体粒子において抗原又は抗体を付着させる行為又は付着された状態であり、「担持」と同意義である。
【００１６】
上記本発明の免疫測定試薬と、本発明の劣化防止方法についての概要を説明する。
【００１７】
不溶性担体粒子は、免疫測定試薬として用いることが可能であれば限定されず、例えば、ラテックス粒子、シリカ粒子、金コロイド粒子等の無機粒子；ゼラチン粒子、赤血球等が挙げられる。これらの中でも、ラテックス粒子、金コロイド粒子が代表的な不溶性担体粒子である。
【００１８】
ラテックスは、ポリマーエマルジョンとも呼ばれ、ポリマーが水等の水性溶媒に分散したものであり、当該水性溶媒が連続相となり、真球又は球に近い形のポリマー粒子が不連続相としてなるものである。ラテックス粒子とは、このラテックスの不連続相をなすポリマー粒子のことである。本明細書では、ラテックス粒子を含む総体的な表現として「ラテックス」を用いる場合もある。
【００１９】
ラテックスの種類は、上記のように免疫測定試薬として用いることができるものであれば限定されない。例えば、ポリスチレンラテックス、極低カルボン酸変性ラテックス、親水基局在化ラテックス等の物理吸着用ラテックス；カルボン酸変性ラテックス、アミノ変性ラテックス、ヒドロキシ変性ラテックス、グリシジル変性ラテックス、アルデヒド変性ラテックス、アミド変性ラテックス等の化学結合用ラテックス；各種の着色ラテックス；高比重ポリスチレンラテックス等の血液凝集反応用ラテックス；磁性ラテックス等が挙げられる。
【００２０】
金コロイドは、金原子が結合してなる微粒子の分散液であり、テトラクロロ金(III)酸を液中で還元する等の方法で合成される。ここではＡｕ3+イオンが金原子に還元され、これがいくつか結合し、過飽和状態になった後、１ｎｍ以下の核粒子が発生し、これに未結合の金原子が次々と結合して、粒子が成長することによって合成される。合成過程で攪拌を十分に行うことで、粒子の大きさを均一化することが可能である。微粒子（金コロイド粒子）同士が凝集しないようにするために、クエン酸等の安定剤が加えられているが、それでも潜在的に凝集しやすい性質を有している。
【００２１】
金コロイドが有色であるのは、表面プラズモン共鳴によるものであり、単分散の粒径が揃った金コロイドは、単一波長の吸収を持っている。
【００２２】
金コロイドにおける金コロイド粒子の粒子径は、上記のラテックス粒子よりも小さく、単位重量に対する比表面積が大きい為、特に高濃度に存在する物質の定量に適している。
【００２３】
感作不溶性担体粒子とは、不溶性担体粒子表面に何らかの物質が感作されている不溶性担体粒子であり、具体的には、免疫測定に必要な抗原抗体反応を惹起するための、抗体又は抗原が感作されている不溶性担体粒子である。当該抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよく、さらに、所望する抗原との抗原抗体反応を惹起することができる限り、免疫グロブリン分子の全部であっても、一部であってもよい。当該抗原は、所望する抗体と、抗原抗体反応により結合するものであれば特に限定されない。未感作不溶性担体粒子は、このような抗体又は抗原が感作されていない不溶性担体粒子である。
【００２４】
水性溶媒は、水を主体とする溶媒であり、水、あるいは各種の緩衝液等が挙げられる。ω−アミノカルボン酸（１）は、例えば、所定の炭素数のα−ハロカルボン酸のアミノ化等の公知の方法により合成することも可能であるが、市販品を用いることも可能である。免疫測定試薬の態様は、不溶性担体粒子を用いており、かつ、免疫測定時以外の当該粒子の凝集が免疫測定値に悪影響を与えるものである限り、特に限定されないが、不溶性担体粒子の凝集を抗原抗体反応の指標とする「凝集法を用いる免疫測定試薬」であることが好適である。凝集法としては、スライドテスト法、光学測定法、マイクロタイター法、フィルター分離法等が挙げられる。凝集法以外の手法としては、サンドイッチ法、イムノクロマト法、ウエスタンブロット法等が挙げられる。免疫測定の標識も、ラジオアイソトープ、蛍光物質、着色物質、発色酵素、ビオチン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。未感作不溶性担体粒子を用いる手法として、未感作ラテックス粒子を検体試料（分離された生体成分のサンプル）と接触させることにより、測定対象蛋白質を粒子表面に吸着させ、これに対象蛋白質に対する抗体を反応させて粒子の凝集を生じさせ、反応液の濁度により対象蛋白質の量を測定する方法が知られており（特許第２６７７７５３号）、このような未感作不溶性担体粒子を用いる手法に基づく免疫測定試薬に対して、本発明を適用することも可能である。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、免疫測定試薬において用いられるラテックス、金コロイド等の不溶性担体粒子液の凍結・融解に伴う非特異的な凝集による当該試薬の劣化手段が、「免疫測定試薬」と「免疫測定試薬の劣化防止方法」として提供される。本発明の劣化防止成分であるω−アミノカルボン酸（１）は、不溶性担体粒子が感作であるか未感作であるかを問わずに、かつ、比較的少量の配合で、不溶性担体粒子の凍結・融解に伴う非特異的な凝集を防止して、免疫測定試薬の劣化を防止することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する未感作ラテックス試薬の水中粒子径の変動を検討した結果を示す図面である。
【図２−１】凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する未感作ラテックス試薬における非特異的なラテックス粒子の凝集を、「添加剤無し」として検討した結果を示す図面である。
【図２−２】凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する未感作ラテックス試薬における非特異的なラテックス粒子の凝集を、「トレハロース二水和物添加」にて検討した結果を示す図面である。図中ａは、０．３質量％トレハロース二水和物、ｂは、１質量％トレハロース二水和物、ｃは、３質量％トレハロース二水和物の場合である。
【図２−３】凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する未感作ラテックス試薬における非特異的なラテックス粒子の凝集を、「グリセリン添加」にて検討した結果を示す図面である。図中ａは、０．３質量％グリセリン、ｂは、１質量％グリセリン、ｃは、３質量％グリセリンの場合である。
【図２−４Ａ】凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する未感作ラテックス試薬における非特異的なラテックス粒子の凝集を、「グリシン添加」にて検討した結果を示す図面である。図中ａは、０．１質量％グリシン、ｂは、０．３質量％グリシン、ｃは、１質量％グリシンの場合である。
【図２−４Ｂ】上記図２−４Ａの続きとして、図中ｄは、３質量％グリシン、ｅは、１０質量％グリシンの場合である。
【図２−５Ａ】凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する未感作ラテックス試薬における非特異的なラテックス粒子の凝集を、「β−アラニン添加」にて検討した結果を示す図面である。図中ａは、０．１質量％β−アラニン、ｂは、０．３質量％β−アラニン、ｃは、１質量％β−アラニンの場合である。
【図２−５Ｂ】上記図２−５Ａの続きとして、図中ｄは、３質量％β−アラニン、ｅは、１０質量％β−アラニンの場合である。
【図２−６Ａ】凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する未感作ラテックス試薬における非特異的なラテックス粒子の凝集を、「４−アミノ酪酸添加」にて検討した結果を示す図面である。図中ａは、０．１質量％４−アミノ酪酸、ｂは、０．３質量％４−アミノ酪酸、ｃは、１質量％４−アミノ酪酸の場合である。
【図２−６Ｂ】上記図２−６Ａの続きとして、図中ｄは、３質量％４−アミノ酪酸、ｅは、１０質量％４−アミノ酪酸の場合である。
【図２−７Ａ】凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する未感作ラテックス試薬における非特異的なラテックス粒子の凝集を、「５−アミノ吉草酸添加」にて検討した結果を示す図面である。図中ａは、０．１質量％５−アミノ吉草酸、ｂは、０．３質量％５−アミノ吉草酸、ｃは、１質量％５−アミノ吉草酸の場合である。
【図２−７Ｂ】上記図２−７Ａの続きとして、図中ｄは、３質量％５−アミノ吉草酸、ｅは、１０質量％５−アミノ吉草酸の場合である。
【図２−８Ａ】凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する未感作ラテックス試薬における非特異的なラテックス粒子の凝集を、「６−アミノヘキサン酸添加」にて検討した結果を示す図面である。図中ａは、０．１質量％６−アミノヘキサン酸、ｂは、０．３質量％６−アミノヘキサン酸、ｃは、１質量％６−アミノヘキサン酸の場合である。
【図２−８Ｂ】上記図２−８Ａの続きとして、図中ｄは、３質量％６−アミノヘキサン酸、ｅは、１０質量％６−アミノヘキサン酸の場合である。
【図２−９Ａ】凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する未感作ラテックス試薬における非特異的なラテックス粒子の凝集を、「７−アミノヘプタン酸添加」にて検討した結果を示す図面である。図中ａは、０．１質量％７−アミノヘプタン酸、ｂは、０．３質量％７−アミノヘプタン酸、ｃは、１質量％７−アミノヘプタン酸の場合である。
【図２−９Ｂ】上記図２−９Ａの続きとして、図中ｄは、３質量％７−アミノヘプタン酸、ｅは、１０質量％７−アミノヘプタン酸の場合である。
【図３−１】凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する感作ラテックス試薬における非特異的なラテックス粒子の凝集を、「添加剤無し」として検討した結果を示す図面である。
【図３−２Ａ】凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する感作ラテックス試薬における非特異的なラテックス粒子の凝集を、「グリシン添加」にて検討した結果を示す図面である。図中ａは、０．１質量％グリシン、ｂは、０．３質量％グリシンの場合である。
【図３−２Ｂ】上記図３−２Ａの続きとして、図中ｃは、３質量％グリシン、ｄは、１０質量％グリシンの場合である。
【図３−３Ａ】凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する感作ラテックス試薬における非特異的なラテックス粒子の凝集を、「β−アラニン添加」にて検討した結果を示す図面である。図中ａは、０．１質量％β−アラニン、ｂは、０．３質量％β−アラニンの場合である。
【図３−３Ｂ】上記図３−３Ａの続きとして、図中ｃは、３質量％β−アラニン、ｄは、１０質量％β−アラニンの場合である。
【図３−４Ａ】凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する感作ラテックス試薬における非特異的なラテックス粒子の凝集を、「４−アミノ酪酸添加」にて検討した結果を示す図面である。図中ａは、０．１質量％４−アミノ酪酸、ｂは、０．３質量％４−アミノ酪酸の場合である。
【図３−４Ｂ】上記図３−４Ａの続きとして、図中ｃは、３質量％４−アミノ酪酸、ｄは、１０質量％４−アミノ酪酸の場合である。
【図３−５Ａ】凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する感作ラテックス試薬における非特異的なラテックス粒子の凝集を、「５−アミノ吉草酸添加」にて検討した結果を示す図面である。図中ａは、０．１質量％５−アミノ吉草酸、ｂは、０．３質量％５−アミノ吉草酸の場合である。
【図３−５Ｂ】上記図３−５Ａの続きとして、図中ｃは、３質量％５−アミノ吉草酸、ｄは、１０質量％５−アミノ吉草酸の場合である。
【図３−６Ａ】凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する感作ラテックス試薬における非特異的なラテックス粒子の凝集を、「６−アミノヘキサン酸添加」にて検討した結果を示す図面である。図中ａは、０．１質量％６−アミノヘキサン酸、ｂは、０．３質量％６−アミノヘキサン酸、ｃは、１質量％６−アミノヘキサン酸の場合である。
【図３−６Ｂ】上記図３−６Ｂの続きとして、図中ｄは、３質量％６−アミノヘキサン酸、ｅは、１０質量％６−アミノヘキサン酸の場合である。
【図３−７Ａ】凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する感作ラテックス試薬における非特異的なラテックス粒子の凝集を、「７−アミノヘプタン酸添加」にて検討した結果を示す図面である。図中ａは、０．１質量％７−アミノヘプタン酸、ｂは、０．３質量％７−アミノヘプタン酸の場合である。
【図３−７Ｂ】上記図３−７Ａの続きとして、図中ｃは、３質量％７−アミノヘプタン酸、ｄは、１０質量％７−アミノヘプタン酸の場合である。
【図４Ａ】凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する感作金コロイド試薬における非特異的な金コロイド粒子の凝集を、「６−アミノヘキサン酸添加」にて検討した結果を示す図面である。図中ａは、０質量％６−アミノヘキサン酸、ｂは、０．３質量％６−アミノヘキサン酸の場合である。
【図４Ｂ】上記図４Ａの続きとして、図中ｃは、１質量％６−アミノヘキサン酸、ｄは、３質量％６−アミノヘキサン酸の場合である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
［免疫測定試薬］
本発明の免疫測定試薬における劣化防止成分であるω−アミノカルボン酸（１）における炭素原子数ｎは２−６の整数、具体的には、２、３、４、５、又は、６である。
【００２８】
すなわち、不溶性担体粒子が未感作であっても感作であってもｎは２−５の整数であることが好適である。最も好ましいｎは未感作であっても、感作であっても「５」、すなわち６−アミノヘキサン酸である。
【００２９】
試薬中のω−アミノカルボン酸（１）の濃度は、未感作の場合は、試薬の０．１−１０質量％が好ましく、さらに好ましくは同０．３−３質量％である。感作の場合には、ｎが２−５の整数の場合には、試薬の３−１０質量％が好適であり、ｎが６の場合には、試薬の０．１−０．３質量％が好適である。
【００３０】
凍結・融解後の測定値の変動幅が同等であれば、ω−アミノカルボン酸（１）の濃度はより低い方が好ましい。濃度が高いと測定感度が低下する傾向が認められるからである。
【００３１】
本発明の免疫測定試薬の水性溶媒としては、上記のように水又は各種の緩衝液が挙げられ、当該緩衝液としては、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、ＢＳＡ、アラビアゴム、界面活性剤、コリン、キレート剤、防腐剤等の添加剤も、本発明の効果を実質的に損なわない質的、量的な限度で添加を行うことができる。当該水性溶媒のｐＨは抗原抗体反応に支障が無い範囲、具体的には４−９程度が好ましく、特に好ましくは６−９程度である。
【００３２】
不溶性担体粒子の平均粒子径は、免疫測定試薬に用いることができる限り特に限定されない。例えば、ラテックス粒子であれば、概ね０．０１−１μｍの平均粒子径から広く粒子径を選択することが可能であり、金コロイド粒子であれば０．００５−０．１μｍの平均粒子径から選択することが可能である。
【００３３】
ラテックス粒子、金コロイド粒子等の不溶性担体粒子が未感作の場合は、上記のように検体試料中の測定対象蛋白質を直接担体粒子に吸着させて、それに対象蛋白質に対する抗体を反応させる手法を用いることができる。この手法における測定対象蛋白質としては、例えば、ヘモグロビンＡ１ｃが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３４】
また、不溶性担体粒子が感作の場合には、感作された抗原又は抗体の結合方式、例えば、ラテックス粒子であれば、物理吸着又は化学結合はいずれであってもよい。また、感作抗原は、標的の体内抗体に応じて自由に選択することが可能である。例えば、梅毒抗原、ストレプトリジンＯ等が感作抗原として挙げられるが、全くこれらには限定されない。感作抗体は、捕捉する標的抗原に応じて自由に選択することができる。さらに、感作抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよく、グロブリン分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのいずれのクラスであってもよく、サブクラスも限定されず、さらにこれらのグロブリン分子の全部であっても一部のみの断片であってもよい。
【００３５】
［劣化防止方法］
本発明の劣化防止方法における、感作又は未感作の不溶性担体粒子を含有する免疫測定試薬中における、上記のω−アミノカルボン酸（１）の共存は、免疫測定試薬を作成する工程のいずれかの段階で、ω−アミノカルボン酸（１）を所定の濃度になるように、試薬中に添加することにより行うことができる。このω−アミノカルボン酸（１）の添加は、不溶性担体粒子の添加に先行していても、その後であってもよい。
【００３６】
本発明の劣化防止方法が施された免疫測定試薬は、凍結・融解のプロセスにおける不溶性担体粒子の不特異吸着が抑止され、これにより当該免疫測定試薬の劣化防止を行うことができる。
【００３７】
このようにして作成される免疫測定試薬が、本発明の免疫測定試薬である。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明の具体例としての実施例を記載する。なお、「％」は特に断らない限り、配合対象に対する質量％である。また、「ｎの数」、例えば「ｎ＝５」と記した場合には、特に断らない限り、「ｎ＝５のω−アミノカルボン酸（１）」の意味である。上述したように、ω−アミノカルボン酸（１）は、下記化学式（１）にて示される。
【００３９】
【化２】
2019028050.tif 000003
【００４０】
［式中、ｎは２−６の整数である。］
【００４１】
［実施例１］  未感作ラテックスにおける検討
＜第１試薬（未感作ラテックス分散液）の調製＞
１０ｍｍｏｌ／ｍＬ  ＨＥＰＥＳを含む緩衝液に、（１）未添加（比較例）、（２）トレハロース二水和物（比較例：林原社製）、（３）グリセリン（比較例：和光純薬工業社製）、（４）グリシン（比較例：和光純薬工業社製）、（５）β−アラニン（ｎ＝２：東京化成工業社製）、（６）４−アミノ酪酸（ｎ＝３：東京化成工業社製）、（７）５−アミノ吉草酸（ｎ＝４：東京化成工業社製）、（８）６−アミノヘキサン酸（ｎ＝５：和光純薬工業社製）、又は、（９）７−アミノヘプタン酸（ｎ＝６：東京化成工業社製）を、それぞれ［０．３％、１％、３％］（上記（２）、（３））、又は、［０．１％、０．３％、１％、３％、１０％］（上記（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９））溶解させ、それぞれの系に未感作ポリスチレンラテックス粒子（平均粒子径０．１２μｍ：藤倉化成社製）を、０．１％となるように添加し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨが７．９になるように、未感作ラテックス分散液３７種類を調製した。
【００４２】
＜第１試薬の凍結・融解による水中粒子径の変動の確認＞
上記の第１試薬に対してそれぞれ０−１０回（詳しくは、０，１，３，６，１０回）凍結・融解を繰り返し、当該凍結・融解回数による各試料のラテックス粒子の水中平均粒子径を計測した。凍結・融解は、試薬を−３０℃のフリーザーに３時間以上入れて凍結を行い、その後２５℃程度の室温に放置し、完全に液状になるまで融解を行った。この凍結・融解の過程を凍結・融解の「１回」とした。また、水中平均粒子径は、濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子社製）を用いて測定した。結果を図１に示す。
【００４３】
図１の結果より、ω−アミノカルボン酸（１）を所定量添加した系のラテックス粒子径は、凍結・融解前後で安定していることが明らかになった。
【００４４】
＜第２試薬（抗体希釈液）の調製＞
１０ｍｍｏｌ／ｍＬ  ＨＥＰＥＳを含む緩衝液に、塩化ナトリウムを２０ｇ／Ｌとなるように添加し、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を添加し、ｐＨを７．０に調製した。この緩衝液適量に対して、抗ヒトＨｂＡ１ｃマウスモノクローナル抗体（藤倉化成社製）を０．０５ｍｇ／ｍＬ、抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（和光純薬工業社製）を０．２ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、さらにヒドロキシプロピルセルロースを１％添加して、抗体希釈液を調製した。
【００４５】
＜第１試薬と第２試薬を用いた凍結・融解による検量線の変動の確認＞
上記の第１試薬に対してそれぞれ０−１０回凍結・融解を、上記と同じ要領で繰り返し、凍結・融解回数による各試料の検量線を作成・確認した。検量線は、ＨｂＡ１ｃ値が０％、４．２％、８．５％、１２．０％、１６．４％に調製された精製ヒトＨｂＡ１ｃを検体として用いて、検体量６μＬ、第１試薬を１５０μＬ混合し、３７℃で５分間反応させた後、第２試薬を５０μＬ添加して、５分間の吸光度変化量を測定することで行った。測定機器は、日立自動分析装置７１８０を用い、主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍの２ポイントエンド法で行った。結果を図２（図２−１、２−２、２−３、２−４Ａ、２−４Ｂ、２−５Ａ、２−５Ｂ、２−６Ａ、２−６Ｂ、２−７Ａ、２−７Ｂ、２−８Ａ、２−８Ｂ、２−９Ａ、２−９Ｂ）に示す。
【００４６】
上記の図２に示した結果より、ω−アミノカルボン酸（１）を所定量添加した系のラテックス粒子は、凍結・融解によっても非特異的な凝集を起こしにくくなることが明らかになった。その中でもｎが２−５であることが好適であり、ｎが５の場合が総合的に最も好適であった。
【００４７】
［実施例２］  感作ラテックスにおける検討
＜第３試薬（検体希釈液）の調製＞
５０ｍＭグリシンを含む緩衝液に、０．１５ｍｏｌ／ｍＬとなるように塩化ナトリウムを添加し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを９．０となるように、検体希釈液を調製した。
【００４８】
＜第４試薬（抗体感作ラテックス分散液）の調製＞
５０ｍＭホウ酸緩衝液２０ｍＬに、抗ヒトＬｐ（ａ）ヤギポリクローナル抗体（トリナバイオリアクティブス社製）を１００ｍｇ添加して、さらに未感作ポリスチレンラテックス粒子（平均粒子径０．１２μｍ：藤倉化成社製）の１０％ラテックス分散液を１２．５ｍＬ混合し、超音波装置ＶＣＸ７５０（ＳＯＮＩＣ＆ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ  ＩＮＣ．）を用いて、氷冷下で超音波処理を１分間行った。その後、室温で３０分間撹拌した後、５％ＢＳＡ水溶液を７ｍＬ添加し、５０℃で３０分間攪拌した。その後、２００００Ｇで２０分間遠心し、上澄みを除いた後、１０ｍｍｏｌ／ｍＬ  ＨＥＰＥＳと共に、（１）未添加（比較例）、（２）グリシン（比較例：和光純薬工業社製）、（３）β−アラニン（ｎ＝２：東京化成工業社製）、（４）４−アミノ酪酸（ｎ＝３：東京化成工業社製）、（５）５−アミノ吉草酸（ｎ＝４：東京化成工業社製）、（６）６−アミノヘキサン酸（ｎ＝５：和光純薬工業社製）、又は、（７）７−アミノヘプタン酸（ｎ＝６：東京化成工業社製）を、それぞれ０．１％、０．３％、３％、１０％溶解させ（（６）は、０．１％、０．３％、１％、３％、１０％、それぞれの系に上記感作ポリスチレンラテックス粒子（平均粒子径０．１２μｍ：藤倉化成社製）を、０．３％となるように添加し、抗体感作ラテックス分散液２６種類を調製した。
【００４９】
＜第３試薬と第４試薬を用いた凍結・融解による検量線の変動確認＞
第４試薬を、それぞれ０−１０回、上記の要領で凍結・融解を行い、凍結・融解回数による各試料の検量線を確認した。検量線は、Ｌｐ（ａ）値が０ｍｇ／ｄＬ、１５ｍｇ／ｄＬ、３０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬに調製された、精製Ｌｐ（ａ）を検体として用いて、当該検体量２．１μＬに対して第３試薬を２１０μＬ混合し、３７℃で５分間反応させた後、これに第４試薬を７０μＬ添加して、５分間における吸光度の変化量を測定することで行った。測定機器は、日立自動分析装置７１８０を用い、主波長６００ｎｍの２ポイントエンド法で行った。結果を図３（図３−１、３−２Ａ、３−２Ｂ、３−３Ａ、３−３Ｂ、３−４Ａ、３−４Ｂ、３−５Ａ、３−５Ｂ、３−６Ａ、３−６Ｂ、３−７Ａ、３−７Ｂ、３−８Ａ、３−８Ｂ）に示す。
【００５０】
図３の結果より、ｎ＝２−６の整数のω−アミノカルボン酸（１）のそれぞれにおいて、感作ラテックス粒子の凍結・融解による非特異的な凝集を抑制できることが明らかになった。この非特異的な凝集の抑制作用は、ｎ＝２−５の整数の場合には、３−１０％の濃度であることが好適であり、ｎ＝６の場合には０．１−０．３％の濃度であることが好適であった。特に、ｎ＝５のω−アミノカルボン酸（１）である６−アミノヘキサン酸が、３％の濃度において感度と非特異性の凝集の抑制の観点から、最も好適に感作ラテックス粒子の凍結・融解による非特異的な凝集を抑制できることが明らかになった。
【００５１】
［実施例３］  感作金コロイドにおける検討
＜第５試薬（抗体感作金コロイド分散液）の調製＞
金コロイド分散液（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）３５０ｍＬに、５００ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）を７ｍＬ混合し、さらに抗ヒトＣＲＰヤギポリクローナル抗体（ＡＤＶＹ社製）を２．１ｍｇ添加し、室温で１時間撹拌した。その後、０．１％ＢＳＡ水溶液を３８．５ｍＬ添加し、室温で３０分間攪拌した。その後、２００００Ｇで２０分間遠心し、上澄みを除いた後、１０ｍｍｏｌ／ｍＬ  ＨＥＰＥＳ、０．３％、１％、３％  ６−アミノヘキサン酸を添加した緩衝液をそれぞれ４２ｍＬ添加して抗体感作金コロイド分散液を調製した。
【００５２】
＜第３試薬と第５試薬を用いた凍結・融解による検量線の変動確認＞
第４試薬を、それぞれ０−１０回、上記の要領で凍結・融解を行い、凍結・融解回数による各試料の検量線を確認した。検量線は、ＣＲＰ値が０ｍｇ／ｄＬ、０．０２ｍｇ／ｄＬ、０．０５ｍｇ／ｄＬ、０．０９ｍｇ／ｄＬ、０．１９ｍｇ／ｄＬ、０．３８ｍｇ／ｄＬ、０．７５ｍｇ／ｄＬに調製された、精製ＣＲＰを検体として用いて、当該検体量２．１μＬに対して第３試薬を１４０μＬ混合し、３７℃で５分間反応させた後、これに第５試薬を１４０μＬ添加して、５分間における吸光度の変化量を測定することで行った。測定機器は、日立自動分析装置７１８０を用い、主波長６００ｎｍの２ポイントエンド法で行った。
【００５３】
結果を図４（図４Ａ、Ｂ）に示す。
【００５４】
図４の結果から、ｎ＝５のω−アミノカルボン酸（１）である６−アミノヘキサン酸が、感作金コロイドの凍結・融解による非特異的な凝集を抑制できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の免疫測定試薬ないし本発明の劣化防止方法が施された免疫測定試薬は、液状態様試薬が凍結するような過酷な保存環境や輸送時の不安定な温度制御下であっても、ラテックス粒子、金コロイド粒子等の不溶性担体粒子の非特異的な凝集が抑制され、検出性能を劣化させずに保存が可能となり、免疫測定試薬の保存や輸送の便宜に著しく貢献する。また、本発明は、感作不溶性担体粒子であっても適用可能である点が、従来とは大きく異なるところである。このことは、感作不溶性担体粒子を用いる検出系の免疫測定試薬においても、安定した保存を可能にしたことのみならず、例えば、感作と未感作の不溶性担体粒子が検出系において共存する、小型専用分析装置を用いる複数診断項目測定等を行う場合にも、保存や輸送の便宜を提供することを可能にした。
【図１】
2019028050.tif 000007
【図２−１】
2019028050.tif 000008
【図２−２】
2019028050.tif 000009
【図２−３】
2019028050.tif 000010
【図２−４Ａ】
2019028050.tif 000011
【図２−４Ｂ】
2019028050.tif 000012
【図２−５Ａ】
2019028050.tif 000013
【図２−５Ｂ】
2019028050.tif 000014
【図２−６Ａ】
2019028050.tif 000015
【図２−６Ｂ】
2019028050.tif 000016
【図２−７Ａ】
2019028050.tif 000017
【図２−７Ｂ】
2019028050.tif 000018
【図２−８Ａ】
2019028050.tif 000019
【図２−８Ｂ】
2019028050.tif 000020
【図２−９Ａ】
2019028050.tif 000021
【図２−９Ｂ】
2019028050.tif 000022
【図３−１】
2019028050.tif 000023
【図３−２Ａ】
2019028050.tif 000024
【図３−２Ｂ】
2019028050.tif 000025
【図３−３Ａ】
2019028050.tif 000026
【図３−３Ｂ】
2019028050.tif 000027
【図３−４Ａ】
2019028050.tif 000028
【図３−４Ｂ】
2019028050.tif 000029
【図３−５Ａ】
2019028050.tif 000030
【図３−５Ｂ】
2019028050.tif 000031
【図３−６Ａ】
2019028050.tif 000032
【図３−６Ｂ】
2019028050.tif 000033
【図３−７Ａ】
2019028050.tif 000034
【図３−７Ｂ】
2019028050.tif 000035
【図４Ａ】
2019028050.tif 000036
【図４Ｂ】
2019028050.tif 000037