(57)【要約】【課題】抗体ライブラリーを提供すること。【解決手段】本発明は、特に、指定の配列および長さの多様性を有するライブラリーを設計することによって、抗体をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを生成するための知られている方法における本質的で不十分な点を克服する。例えば、抗原に結合する抗体を単離するために本願発明のライブラリーを使用する方法であって、前記ライブラリーのポリペプチド発現産物を抗原と接触させるステップおよび前記抗原に結合するポリペプチド発現産物を単離するステップを含む、方法もまた提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１０年７月１６日に提出された米国仮特許出願第６１／３６５，１９４号に対する優先権を主張し、参照によってその全体が本明細書において組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、研究ツールとしてかつ診断上および治療上の適用において深い関係を有する。しかしながら、有用な抗体の同定は、困難であり、また、一度、同定されたら、抗体は、それらがヒトにおける治療上の適用に適するようになる前に、相当な再設計または「ヒト化」を必要とすることが多い。
【０００３】
抗体を同定するための多くの方法は、Ｂ細胞または組織由来の核酸の増幅によって誘導される抗体のライブラリーのディスプレイを含む。これらの方法のうちのいくつかは、合成ライブラリーを利用してきた。しかしながら、これらのアプローチの多くは、限界を有する。たとえば、当技術分野において知られているほとんどのヒト抗体ライブラリーは、実験的に獲得することができるまたは生物学的供給源（たとえばＢ細胞）からクローニングすることができる抗体配列多様性のみを含有する。したがって、そのようなライブラリーは、いくつかの配列を不釣合いに多くし得、一方、他の配列、特に、ヒト抗原に結合するものを完全に欠くまたは不釣合いに少なくする。当技術分野において知られているほとんどの合成ライブラリーは、免疫原性となる可能性を有する非天然（つまり非ヒト）アミノ酸配列モチーフの発生などのような他の限界を有する。
【０００４】
したがって、非免疫原性であり（つまりヒトの抗体であり）、所望の特性（たとえば、広く様々な抗原を認識する能力）を有する候補抗体を含有する多様な抗体ライブラリーに対する必要性が存在する。しかしながら、そのようなライブラリーの達成は、ライブラリー内で配列のヒトの特徴をなお維持しながら多様なライブラリーを生成するための、競合する目的のバランスを保つことを必要とする。本発明は、これらおよび他の望ましい特徴を有する抗体ライブラリーならびにそのようなライブラリーを作製するおよび使用するための方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、とりわけ、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ３、重鎖、軽鎖、および／または完全長（完全）抗体配列の天然ヒトレパートリーの多様性を模倣する合成ライブラリーの設計および産生における改善を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＤＲＨ３配列を含むまたはコードするライブラリー（たとえばポリヌクレオチドまたはポリペプチド）（たとえば抗体ライブラリー）の物理的発現における包含を考慮するためのＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントの理論的セグメントプールを生成するための方法を定め、提供する。ある実施形態では、本発明は、理論的セグメントプールにおけるセグメントのそれぞれの、参照セットにおける出現頻度（またはセグメント使用ウエイト）を決定するために、ＣＤＲＨ３配列の参照セットにこれらの理論的セグメントプールの個々のメンバーをマッチさせるための方法を定め、提供する。ＣＤＲＨ３配列の任意のセットが参照セットとして使用されていてもよいが、本発明はまた、対象特定の参照セットまたはサブセットを生成するための方法をも定め、提供する。たとえば、とりわけ、本発明は、免疫前の特徴を有する提供された参照セットを得るために、もとの参照セットをフィルターにかけるための方法を提供する。理論的セグメントプールではなく、参照セットにおけるＣＤＲＨ３配列内に存在するセグメントを定めるおよび／または同定するための方法もまた、提供される。そのようなセグメントは、たとえば、物理的ライブラリーにおける包含を考慮するために理論的セグメントプールに追加することができる。参照セットにおける特定のセグメントの出現頻度は、物理的ライブラリーにおける包含のためにセグメントを選択するのに有用であるが、本発明はまた、物理的ライブラリーにおける包含のためにセグメントを選択するために使用することができる（単独でまたは任意の他の判断基準もしくは基準と一緒に）、多くの物理化学的および生物学的特性をも提供する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本発明は、それらが組成または配列において部位毎に確率的（ｓｉｔｅｗｉｓｅ−ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ）ではなく、そのため、当技術分野のこれらのある種の他のライブラリーほど本質的にランダムではないという点で、当技術分野において知られているある種の他のライブラリーと異なるライブラリーを提供する（たとえば、情報内容およびランダム性の議論については、参照によってその全体が組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号の実施例１４を参照されたい）。いくつかの実施形態では、縮退オリゴヌクレオチドは、配列（たとえばＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ３、重鎖、軽鎖、および／または完全長（完全）抗体配列）の参照セットとのマッチングをさらに改善しながら、ライブラリーのメンバーの多様性をさらに増加させるために使用されてもよい。
【０００７】
本発明はまた、それらが、本明細書において記載される分析を実行することによって、たとえば、実施例３におけるように、ＣＤＲＨ３参照セットを生成することによって；実施例５〜７におけるように、理論的セグメントプールを生成することによって；実施例４および８におけるように、参照セットに理論的セグメントプールのメンバーをマッチさせることによって；ならびに実施例８〜９におけるように、物理的ライブラリーにおける包含のために理論的セグメントプールのメンバーを選択することによって、物理的ライブラリーにおける包含のために選択されるという点で、そのメンバーが互いに関係する配列を有するライブラリーを提供する。実施例１２〜１６におけるように、縮退オリゴヌクレオチドを利用することによってある種の配列の多様性をさらに増加させるための方法もまた、提供される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ３、重鎖、軽鎖、および／または完全長（完全）抗体配列を含むポリヌクレオチドライブラリーおよびポリペプチドライブラリーならびにそのようなライブラリーを作製するおよび使用するための方法を提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書において記載されるライブラリーまたは理論的セグメントプールのいずれかを含む、本質的にそれから成る、またはそれから成るライブラリーを提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、計算的に、酵素ＴｄＴのｉｎ  ｖｉｖｏにおける活性を模倣することによって、理論的セグメントプールを、生成し、続いて、ライブラリーにおける包含のために選ぶために、ＣＤＲ配列の大きな参照データセットにマッチさせることができ、それらの理論的セグメントは、参照データセットにおけるＣＤＲ配列を最も再現することを認識する。
【００１１】
ある実施形態では、本発明は、構造：［ＴＮ１］−［ＤＨ］−［Ｎ２］−［Ｈ３−ＪＨ］を有するＣＤＲＨ３ポリペプチドをコードする少なくとも約１０４のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドのライブラリーであって、ＴＮ１は、表９〜１０および１８〜２６のＴＮ１ポリペプチドのいずれかに相当するポリペプチドまたは表２５〜２６のＴＮ１ポリヌクレオチドのいずれかの翻訳によって産生されるポリペプチドであり、ＤＨは、表９、１１、１７〜２５、および２８のＤＨポリペプチドのいずれかに相当するポリペプチドまたは表１６、２５、および２７のＤＨコードポリヌクレオチドのいずれかの翻訳によって産生されるポリペプチドであり、Ｎ２は、表９、１２、１８〜２５、および３０のＮ２ポリペプチドのいずれかに相当するポリペプチドまたは表２５および２９のＮ２コードポリヌクレオチドのいずれかの翻訳によって産生されるポリペプチドであり、Ｈ３−ＪＨは、表９、１３、１５、１８〜２５、および３２のＨ３−ＪＨポリペプチドのいずれかに相当するポリペプチドまたは表１４、２５、および３１のＨ３−ＪＨコードするポリヌクレオチドのいずれかの翻訳によって産生されるポリペプチドである、ポリヌクレオチドのライブラリーを提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明は、ライブラリーにおける配列の少なくとも約１％、５％、または１０％が、上記に提供される構造または本明細書において提供されるライブラリーのいずれかの構造を有する、ライブラリーを提供する。
【００１３】
ある実施形態では、本発明は、表２３〜２５のいずれか１つにおいて提供されるＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨポリペプチドのセットによって産生されるＣＤＲＨ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むライブラリーを提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明は、表２６に提供されるＴＮ１ポリペプチドのセット、表２８に提供されるＤＨポリペプチドのセット、表３０に提供されるＮ２ポリペプチドのセット、および表３２に提供されるＨ３−ＪＨポリペプチドのセットによって産生されるＣＤＲＨ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むライブラリーを提供する。
【００１５】
ある実施形態では、本発明は、そのメンバーが、上記に記載されるポリペプチドと少なくとも１つの一定のパーセント同一性を示す（またはを示すポリペプチドをコードする）ライブラリー、たとえば、構造：［ＴＮ１］−［ＤＨ］−［Ｎ２］−［Ｈ３−ＪＨ］を有するＣＤＲＨ３ポリペプチドをコードする少なくとも約１０４のポリヌクレオチドを含むライブラリーであって、ＴＮ１は、表９〜１０および１８〜２６のＴＮ１ポリペプチドのいずれかと少なくとも約８０％、９０％、もしくは９５％同一であるポリペプチドまたは表２５〜２６のＴＮ１ポリヌクレオチドのいずれかの翻訳によって産生されるポリペプチドと少なくとも約８０％、９０％、もしくは９５％同一であるポリペプチドであり、ＤＨは、表９、１１、１７〜２５、および２８のＤＨポリペプチドのいずれかと少なくとも約８０％、９０％、もしくは９５％同一であるポリペプチドまたは表１６、２５、および２７のＤＨコードポリヌクレオチドのいずれかの翻訳によって産生されるポリペプチドと少なくとも約８０％、９０％、もしくは９５％同一であるポリペプチドであり、Ｎ２は、表９、１２、１８〜２５、および３０のＮ２ポリペプチドのいずれかと少なくとも約８０％、９０％、もしくは９５％同一であるポリペプチドまたは表２５および２９のＮ２コードポリヌクレオチドのいずれかの翻訳によって産生されるポリペプチドと少なくとも約８０％、９０％、もしくは９５％同一であるポリペプチドであり、Ｈ３−ＪＨは、表９、１３、１５、１８〜２５、および３２のＨ３−ＪＨポリペプチドのいずれかと少なくとも約８０％、９０％、もしくは９５％同一であるポリペプチドまたは表１４、２５、および３１のＨ３−ＪＨコードポリヌクレオチドのいずれかの翻訳によって産生されるポリペプチドと少なくとも約８０％、９０％、もしくは９５％同一であるポリペプチドであるライブラリーを提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含むライブラリーであって、軽鎖可変領域は、（ａ）１つもしくは複数の位置４、４９、および４６で異なるＶＫ１−０５配列；（ｂ）１つもしくは複数の位置４、４９、４６、および６６で異なるＶＫ１−１２配列；（ｃ）１つもしくは複数の位置４、４９、および６６で異なるＶＫ１−３３配列；（ｄ）１つもしくは複数の位置４、４９、および４６で異なるＶＫ１−３９配列；（ｅ）１つもしくは複数の位置２、４、４６、および４９で異なるＶＫ２−２８配列；（ｆ）１つもしくは複数の位置２、４、３６、および４９で異なるＶＫ３−１１配列；（ｇ）１つもしくは複数の位置２、４、４８、および４９で異なるＶＫ３−１５配列；（ｈ）１つもしくは複数の位置２、４、４８、および４９で異なるＶＫ３−２０配列；ならびに／または（ｉ）１つもしくは複数の位置４、４６、４９、および６６で異なるＶＫ４−１配列から成る群から選択される、ライブラリーを提供する。
【００１７】
ある実施形態では、本発明は、表３において提供される２つ以上の軽鎖ポリペプチド配列と少なくとも約８０％、９０％、または９５％同一であるポリペプチド配列を含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含むライブラリーを提供する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、軽鎖可変領域が表３において提供されるポリペプチド配列を含む、ライブラリーを提供する。
【００１９】
ある実施形態では、本発明は、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含むライブラリーであって、軽鎖可変領域のＬ３−ＶＬポリペプチド配列は、Ｌ３−ＶＬ生殖系列配列と比較して、位置８９〜９４の２つまたは３つの残基で異なる、ライブラリーを提供する。いくつかの実施形態では、単一の軽鎖生殖系列配列およびその変異体を含有するライブラリーが、提供される。ある実施形態では、異なる軽鎖生殖系列配列から産生される変異体は、複数の軽鎖生殖系列配列およびそれらの変異体をコードするライブラリーを産生するために組み合わせることができる。本明細書において提供される軽鎖Ｌ３−ＶＬ生殖系列配列のいずれも、位置８９〜９４の２つまたは３つの残基で異なっていてもよく、当業者は、任意の他のＬ３−ＶＬ配列もまた、本発明によって提供されるライブラリーを産生するために本明細書において記載される原理に従って多様化することができることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、本発明は、抗体軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含有するライブラリーを含み、抗体軽鎖可変領域は、１つまたは複数の以下のＬ３−ＶＬ配列を含む：（ｉ）Ｌ３−ＶＬ生殖系列配列と同一のアミノ酸配列（たとえば表１を参照されたい）；（ｉｉ）Ｌ３−ＶＬ生殖系列配列と比較して、残基８９〜９４に２つの置換を含有するアミノ酸配列；および（ｉｉｉ）Ｌ３−ＶＬ生殖系列配列と比較して、残基８９〜９４に３つの置換を含有するアミノ酸配列。いくつかの実施形態では、ライブラリーの抗体軽鎖可変領域はそれぞれ、１つまたは複数の上記のＬ３−ＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態では、そのようなライブラリーは、抗体軽鎖可変領域をコードしてもよくまたはコードしなくてもよく、そのようなＬ３−ＶＬ配列を含有してもよくまたは含有しなくてもよい他の核酸の１つまたは複数のセットと組み合わせられる。いくつかの実施形態では、本発明は、表４において記載されるアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドまたは１つもしくは複数の表５〜７において記載されるポリヌクレオチド配列を含有するライブラリーを含み、位置８９〜９４の２つまたは３つの残基は、異なる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含有するライブラリーを含み、ライブラリーにわたって、すべてのコード抗体軽鎖可変領域は、残基８９〜残基９４の位置の残基の置換を除いて互いに同一であり、さらに、ライブラリーにわたって、任意の２つのコード抗体軽鎖可変領域の配列は、３つ以下の位置で互いに異なる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本発明は、表５〜７において提供される２つ以上のポリヌクレオチド配列の翻訳によって産生されるポリペプチドと少なくとも約８０％、９０％、または９５％同一であるポリペプチド配列を含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含むライブラリーを提供する。ある実施形態では、ライブラリーのすべてのメンバーは、表５〜７において提供される２つ以上のポリヌクレオチド配列の翻訳によって産生されるポリペプチドと少なくとも約８０％、９０％、または９５％同一である。
【００２２】
ある実施形態では、本発明は、表５〜７において提供されるポリヌクレオチド配列の翻訳によって産生されるポリペプチドを含む軽鎖可変領域を含むライブラリーを提供する。ある実施形態では、ライブラリーのすべてのメンバーは、表５〜７において提供されるポリヌクレオチド配列の翻訳によって産生されるポリペプチドを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲＬ３および／または軽鎖可変領域を含有するまたはコードする本明細書において記載されるライブラリーのいずれも、完全軽鎖と関連したそのようなＣＤＲＬ３および／または軽鎖可変領域を含有する。さらに、いくつかの実施形態では、そのようなライブラリー（および／または完全軽鎖ライブラリー）は、１つまたは複数の重鎖ＣＤＲＨ３、可変ドメイン、または完全重鎖をさらに含有するまたはコードする。いくつかの実施形態では、提供されるライブラリーは、たとえば完全なＩｇＧなどのような完全な抗体を含むまたはコードする。
【００２４】
いくつかの実施形態では、提供されるライブラリーは、ヒト抗体または抗体断片を含みまたはコードし、いくつかのそのような実施形態では、提供されるライブラリーは、完全なヒト抗体を含むまたはコードする。
【００２５】
ある実施形態では、本発明は、本明細書において記載されるライブラリー核酸を含有する核酸ベクターを含むライブラリーを提供する。多くの実施形態では、そのようなライブラリーメンバーはそれぞれ、同じベクターを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本発明は、たとえばベクターを含めて、１つまたは複数の提供されるライブラリーを含有する宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、酵母であり、ある実施形態では、酵母は、出芽酵母（Saccharomyces  cerevisiae）である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書において記載されるライブラリーから単離される抗体を提供する。
【００２８】
ある実施形態では、本発明は、本明細書において記載されるライブラリーのいずれかを含有するキットを提供する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明は、コンピューター読み取り可能な形式の、ライブラリーおよび／または理論的セグメントプール、たとえば表１０、２３〜２５、および２６のＴＮ１ポリペプチド；表１１、２３〜２５、および２８のＤＨポリペプチド；表１２、２３〜２５、および３０のＮ２ポリペプチド；表１３、１５、１７、２３〜２５、および３２のＨ３−ＪＨポリペプチド；表２５〜２６のＴＮ１ポリヌクレオチド；表２５および２７のＤＨポリヌクレオチド；表２５および２９のＮ２ポリヌクレオチド；ならびに／または表２５および３１のＨ３−ＪＨポリヌクレオチドの代理物（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を提供する。
【００３０】
ある実施形態では、本発明は、ヒト免疫前セットのポリヌクレオチド配列の代理物（付録Ａ）またはコンピューター読み取り可能な形式の、そのポリペプチド発現産物を提供する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＤＲＨ３ライブラリーをコードする合成ポリヌクレオチドを作製するための方法であって、（ａ）ＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントを含有する理論的セグメントプールを提供するステップ；（ｂ）ＣＤＲＨ３配列の参照セットを提供するステップ；（ｃ）（ｂ）の参照セットにおけるそれぞれのＣＤＲＨ３配列に最も近いマッチ（複数可）を同定するために（ａ）の理論的セグメントプールを利用するステップ；（ｄ）合成ライブラリーにおける包含のために理論的セグメントプールからセグメントを選択するステップ；ならびに（ｅ）合成ＣＤＲＨ３ライブラリーを合成するステップを含む、方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、この方法によって作製されるライブラリーを提供する。いくつかの実施形態では、合成ライブラリーにおける包含のために選択されるセグメントは、ＣＤＲＨ３配列の参照セットにおけるそれらのセグメント使用ウエイトに従って選択される。
【００３２】
ある実施形態では、本発明は、ＣＤＲＬ３ライブラリーをコードする合成ポリヌクレオチドを作製するための方法であって、（ｉ）軽鎖配列の参照セットを得るステップであって、参照セットは、同じＩＧＶＬ生殖系列遺伝子および／またはその対立遺伝子変異体に由来するＶＬセグメントを有する軽鎖配列を含有するステップ；（ｉｉ）ＩＧＶＬ遺伝子によってコードされる参照セットにおけるＣＤＲＬ３位置のそれぞれでどのアミノ酸が存在するかを決定するステップ；（ｉｉｉ）軽鎖可変ドメインコード配列を合成するステップであって、位置８９〜９４の２つの位置は、参照セットにおける相当する位置に、２つ以上の、５つの最も頻繁に生じるアミノ酸残基をコードする縮退コドンを含有するステップ；および（ｉｖ）ＣＤＲＬ３ライブラリーをコードするポリヌクレオチドを合成するステップを含む、方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、この方法によって作製されるライブラリーを提供する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗原に結合する抗体を単離するために本発明のライブラリーのいずれかを使用するための方法であって、当該ライブラリーのポリペプチド発現産物を抗原と接触させるステップおよび抗原に結合するポリペプチド発現産物を単離するステップを含む、方法を提供する。
【００３４】
ある実施形態では、本発明のライブラリーにおけるＮ結合型グリコシル化部位、脱アミド化モチーフ、および／またはＣｙｓ残基の数は、生物学的供給源由来のレパートリーの増幅によって産生されるライブラリーと比較して低下しているまたは削減されている。
【００３５】
本発明は、多くのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列ならびにより大きなポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を構築するために使用することができるセグメント（たとえば、ＣＤＲＨ３を構築するために使用することができるＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメント）を提供する。当業者は、いくつかの実例では、これらの配列は、本発明によって提供される配列のアライメントの後にコンセンサス配列を提供することによってより簡潔に示すことができ、これらのコンセンサス配列は、本発明の範囲内にあり、本明細書において提供される配列のいずれも、より簡潔に示すために使用されてもよいことを容易に認識するであろう。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
構造：［ＴＮ１］−［ＤＨ］−［Ｎ２］−［Ｈ３−ＪＨ］を有するＣＤＲＨ３配列を含むポリペプチドをコードする少なくとも約１０４のポリヌクレオチドを含む合成ポリヌクレオチドのライブラリーであって、
ＴＮ１は、表９〜１０および１８〜２６のＴＮ１ポリペプチドのいずれかに相当するポリペプチド、または表２５〜２６のＴＮ１ポリヌクレオチドのいずれかの翻訳によって産生されるポリペプチドであり、
ＤＨは、表９、１１、１７〜２５、および２８のＤＨポリペプチドのいずれかに相当するポリペプチド、または表１６、２５、および２７のＤＨコードポリヌクレオチドのいずれかの翻訳によって産生されるポリペプチドであり、
Ｎ２は、表９、１２、１８〜２５、および３０のＮ２ポリペプチドのいずれかに相当するポリペプチド、または表２５および２９のＮ２コードポリヌクレオチドのいずれかの翻訳によって産生されるポリペプチドであり、及び
Ｈ３−ＪＨは、表９、１３、１５、１８〜２５、および３２のＨ３−ＪＨポリペプチドのいずれかに相当するポリペプチドまたは表１４、２５、および３１のＨ３−ＪＨコードポリヌクレオチドのいずれかの翻訳によって産生されるポリペプチドである、ライブラリー。
（項目２）
前記ライブラリーにおける配列の少なくとも約１％、５％、または１０％が、提供される構造を有する、項目１に記載のライブラリー。
（項目３）
前記ポリヌクレオチドが、表２３〜２５のいずれか１つにおいて提供されるＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨポリペプチドのセットによって産生されるＣＤＲＨ３ポリペプチドをコードする、項目１に記載のライブラリー。
（項目４）
前記ポリヌクレオチドが、表２６において提供されるＴＮ１ポリペプチドのセット、表２８において提供されるＤＨポリペプチドのセット、表３０において提供されるＮ２ポリペプチドのセット、および表３２において提供されるＨ３−ＪＨポリペプチドのセットによって産生されるＣＤＲＨ３ポリペプチドをコードする、項目１に記載のライブラリー。
（項目５）
抗原に結合する抗体を単離するために項目１に記載のライブラリーを使用する方法であって、前記ライブラリーのポリペプチド発現産物を抗原と接触させるステップおよび前記抗原に結合するポリペプチド発現産物を単離するステップを含む、方法。
（項目６）
Ｎ結合型グリコシル化部位、脱アミド化モチーフ、および／またはＣｙｓ残基の数は、生物学的供給源由来のレパートリーの増幅によって産生されるライブラリーと比較して低下しているまたは削減されている、項目１に記載のライブラリー。
（項目７）
１つまたは複数の軽鎖可変ドメインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目１に記載のライブラリー。
（項目８）
前記ポリペプチドは、完全長ＩｇＧとして発現される、項目７に記載のライブラリー。
（項目９）
項目８に記載のライブラリーのポリペプチド発現産物。
（項目１０）
項目９に記載のポリペプチド発現産物から単離される抗体。
（項目１１）
項目１に記載のライブラリーを含有するベクター。
（項目１２）
項目１１に記載のベクターを含有する宿主細胞。
（項目１３）
前記宿主細胞は、酵母細胞である、項目１２に記載の宿主細胞。
（項目１４）
前記酵母は、出芽酵母である、項目１３に記載の酵母細胞。
（項目１５）
項目１に記載のライブラリーを含有するキット。
（項目１６）
コンピューター読み取り可能な形式の、項目１に記載のライブラリーの代理物。
（項目１７）
構造：［ＴＮ１］−［ＤＨ］−［Ｎ２］−［Ｈ３−ＪＨ］を有するＣＤＲＨ３配列を含むポリペプチドをコードする少なくとも約１０４のポリヌクレオチドを含む合成ポリヌクレオチドのライブラリーであって、
ＴＮ１は、表９〜１０および１８〜２６のＴＮ１ポリペプチドのいずれかと少なくとも約８０％、９０％、もしくは９５％同一であるポリペプチドまたは表２５〜２６のＴＮ１ポリヌクレオチドのいずれかの翻訳によって産生されるポリペプチドと少なくとも約８０％、９０％、もしくは９５％同一であるポリペプチドであり、
ＤＨは、表９、１１、１７〜２５、および２８のＤＨポリペプチドのいずれかと少なくとも約８０％、９０％、もしくは９５％同一であるポリペプチドまたは表１６、２５、および２７のＤＨコードポリヌクレオチドのいずれかの翻訳によって産生されるポリペプチドと少なくとも約８０％、９０％、もしくは９５％同一であるポリペプチドであり、
Ｎ２は、表９、１２、１８〜２５、および３０のＮ２ポリペプチドのいずれかと少なくとも約８０％、９０％、もしくは９５％同一であるポリペプチドまたは表２５および２９のＮ２コードポリヌクレオチドのいずれかの翻訳によって産生されるポリペプチドと少なくとも約８０％、９０％、もしくは９５％同一であるポリペプチドであり、及び
Ｈ３−ＪＨは、表９、１３、１５、１８〜２５、および３２のＨ３−ＪＨポリペプチドのいずれかと少なくとも約８０％、９０％、もしくは９５％同一であるポリペプチドまたは表１４、２５、および３１のＨ３−ＪＨコードポリヌクレオチドのいずれかの翻訳によって産生されるポリペプチドと少なくとも約８０％、９０％、もしくは９５％同一であるポリペプチドである、ライブラリー。
（項目１８）
軽鎖可変領域をコードする合成ポリヌクレオチドのライブラリーであって、
前記軽鎖可変領域は、
（ａ）１つもしくは複数の位置４、４９、および４６で異なるＶＫ１−０５配列；
（ｂ）１つもしくは複数の位置４、４９、４６、および６６で異なるＶＫ１−１２配列；
（ｃ）１つもしくは複数の位置４、４９、および６６で異なるＶＫ１−３３配列；
（ｄ）１つもしくは複数の位置４、４９、および４６で異なるＶＫ１−３９配列；
（ｅ）１つもしくは複数の位置２、４、４６、および４９で異なるＶＫ２−２８配列；
（ｆ）１つもしくは複数の位置２、４、３６、および４９で異なるＶＫ３−１１配列；
（ｇ）１つもしくは複数の位置２、４、４８、および４９で異なるＶＫ３−１５配列；
（ｈ）１つもしくは複数の位置２、４、４８、および４９で異なるＶＫ３−２０配列；ならびに
（ｉ）１つもしくは複数の位置４、４６、４９、および６６で異なるＶＫ４−１配列から成る群から選択される、ライブラリー。
（項目１９）
前記ライブラリーは、表３において提供される２つ以上の軽鎖ポリペプチド配列と少なくとも約８０％、９０％、または９５％同一であるポリペプチド配列を含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む、項目１８に記載のライブラリー。
（項目２０）
前記軽鎖可変領域は、表３において提供されるポリペプチド配列を含む、項目１８に記載のライブラリー。
（項目２１）
軽鎖可変領域をコードする合成ポリヌクレオチドのライブラリーであって、前記軽鎖可変領域のポリペプチド配列は、可変軽鎖ポリペプチド配列の位置８９〜９４の２つまたは３つの残基で異なる、ライブラリー。
（項目２２）
前記ライブラリーは、表５〜７において提供される２つ以上のポリヌクレオチド配列の翻訳によって産生されるポリペプチドと少なくとも約８０％、９０％、または９５％同一であるポリペプチド配列を含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む、項目２１に記載のライブラリー。
（項目２３）
前記軽鎖可変領域は、表５〜７において提供されるポリヌクレオチド配列の翻訳によって産生されるポリペプチドを含む、項目２１に記載のライブラリー。
（項目２４）
コンピューター読み取り可能な形式の、以下のいずれかの代理物：
表１０、２３〜２５、および２６のＴＮ１ポリペプチド；
表１１、２３〜２５、および２８のＤＨポリペプチド；
表１２、２３〜２５、および３０のＮ２ポリペプチド；
表１３、１５、１７、２３〜２５、および３２のＨ３−ＪＨポリペプチド；
表２５〜２６のＴＮ１ポリヌクレオチド；
表２５および２７のＤＨポリヌクレオチド；
表２５および２９のＮ２ポリヌクレオチド；ならびに
表２５および３１のＨ３−ＪＨポリヌクレオチド。
（項目２５）
ヒト免疫前セットのポリヌクレオチド配列の代理物（付録Ａ）またはコンピューター読み取り可能な形式の、そのポリペプチド発現産物。
（項目２６）
ＣＤＲＨ３配列を含むポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドのライブラリーを作製するための方法であって、
（ａ）ＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントを含有する理論的セグメントプールを提供するステップ；
（ｂ）ＣＤＲＨ３配列の参照セットを提供するステップ；
（ｃ）（ｂ）の参照セットにおけるそれぞれのＣＤＲＨ３配列に最も近いマッチ（複数可）を同定するために（ａ）の理論的セグメントプールを利用するステップ；
（ｄ）合成ライブラリーにおける包含のために理論的セグメントプールからセグメントを選択するステップ；ならびに
（ｅ）合成ＣＤＲＨ３ライブラリーを合成するステップを含む、方法。
（項目２７）
項目２６の方法に従って作製されるポリヌクレオチドのライブラリー。
（項目２８）
前記合成ライブラリーにおける包含のために選択されるセグメントは、ＣＤＲＨ３配列の参照セットにおけるそれらのセグメント使用ウエイトに従って選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記合成ライブラリーにおける包含のために選択されるセグメントは、１つまたは複数の物理化学的特性に従って選択される、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
前記ＣＤＲＨ３配列の参照セットは、免疫前ＣＤＲＨ３配列の参照セットである、請求項２６に記載の方法。
（項目３１）
理論的セグメントプールではなく、参照セットにおいて存在するさらなるＴＮ１およびＮ２セグメントを選択するステップをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目３２）
終止コドンは、前記ライブラリーから低下しているまたは削減されている、項目２６に記載の方法。
（項目３３）
対がないＣｙｓ残基、Ｎ結合型グリコシル化モチーフ、および脱アミド化モチーフは、前記ライブラリーの翻訳産物において低下しているまたは削減されている、項目２６に記載の方法。
（項目３４）
前記ＤＨセグメントおよびＨ３−ＪＨセグメントは、前記参照セットにおけるＣＤＲＨ３配列とのマッチング前に連続的に切断される、項目２６に記載の方法。
（項目３５）
ＤＨおよびＮ２またはその組み合わせから成る群から選択されるセグメント中に１つまたは２つの縮退コドンを導入するステップをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目３６）
Ｈ３−ＪＨセグメント中に１つの縮退コドンを導入するステップをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目３７）
項目２６に記載のライブラリーのポリペプチド発現産物。
（項目３８）
項目３７に記載のポリペプチド発現産物から単離される抗体。
（項目３９）
ＣＤＲＬ３ライブラリーをコードする合成ポリヌクレオチドを作製するための方法であって、
（ｉ）軽鎖配列の参照セットを得るステップであって、参照セットは、同じＩＧＶＬ生殖系列遺伝子および／またはその対立遺伝子変異体に由来するＶＬセグメントを有する軽鎖配列を含有するステップ；
（ｉｉ）ＩＧＶＬ遺伝子によってコードされる参照セットにおけるＣＤＲＬ３位置のそれぞれでどのアミノ酸が存在するかを決定するステップ；
（ｉｉｉ）軽鎖可変ドメインコード配列を合成するステップであって、位置８９〜９４の２つまたは３つの位置は、参照セットにおける相当する位置に、２つ以上の、５つの最も頻繁に生じるアミノ酸残基をコードする縮退コドンを含有するステップ；および
（ｉｖ）前記ＣＤＲＬ３ライブラリーをコードするポリヌクレオチドを合成するステップ
を含む、方法。
（項目４０）
項目３９の方法に従って作製されるポリヌクレオチドのライブラリー。
（項目４１）
ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドのライブラリーであって、
ヒトＩＧＨＶ配列のＫａｂａｔ残基１〜９４を含む１つまたは複数のＶＨシャーシ；
ヒトＣＤＲＨ３配列の参照セットから選択される１つまたは複数のＴＮ１セグメント；
ヒトＣＤＲＨ３配列の参照セットにマッチした理論的セグメントプールから選択される１つまたは複数のＤＨセグメント；
ヒトＣＤＲＨ３配列の参照セットから選択される１つまたは複数のＮ２セグメント；および
ヒトＣＤＲＨ３配列の参照セットにマッチした理論的セグメントプールから選択される１つまたは複数のＨ３−ＪＨセグメントを含む、ライブラリー。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＶＫ１−３９におけるバーニア残基（Ｖｅｒｎｉｅｒ  ｒｅｓｉｄｕｅ）４および４９（星印）が、ＣＤＲ位置の多様性指標と同等のまたはそれを超える（つまり、本実施例において０．０７以上の）多様性指標を有することを示す。
【図２】臨床的に検証されたＣＤＲＬ３配列が、生殖系列様配列からほとんど外れていないことを示す（ｎ＝３５）。
【図３】生殖系列からＸ以下の突然変異を有する、本発明のジャンピング二量体ＣＤＲＬ３ライブラリーおよび以前のＣＤＲＬ３ライブラリー、ＶＫ−ｖ１．０における配列のパーセントを示す。ここで、ＦＸは、生殖系列からＸ以下の突然変異を有する、ライブラリーにおける配列の割合である。
【図４】親Ｈ３−ＪＨセグメントをコードするヌクレオチド配列を生成するために使用される、提供された方法の適用を示す。
【図５】理論的および／または合成ライブラリーにおける包含のために理論的セグメントプールからセグメントを選択するために使用されるアプローチの概略図を示す。
【図６】ＤＨセグメント疎水性（右に向かって増加）に応じた、米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号において記載される酵母ベースのライブラリーから単離される「好適な」および「不十分な」発現のＣＤＲＨ３配列の度数ならびにその中に記載されるライブラリー設計において含有される配列（「設計」）に対するそれらの比較を示す。
【図７】０、１、２、３、または３つを超えるアミノ酸ミスマッチで、Ｌｅｅ−６６６およびＢｏｙｄ−３０００由来のＣＤＲＨ３配列にマッチする、ＬＵＡ−１４１ライブラリーおよびＥｘｅｍｐｌａｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３（ＥＬＤ−３）におけるＣＤＲＨ３配列の割合を示す。
【図８】Ｅｘｅｍｐｌａｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３（ＥＬＤ−３）およびＥｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎの両方が、ＬＵＡ−１４１ライブラリーよりも、臨床的に適切なＣＤＲＨ３配列に対する、より好適なマッチをもたらすことを示す。
【図９】Ｅｘｅｍｐｌａｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３（ＥＬＤ−３）のコンビナトリアル効率が、ＬＵＡ−１４１ライブラリーを超えることを示す。特に、ＥＬＤ−３セグメントは、ＬＵＡ−１４１ライブラリーセグメントよりも、ユニークなＣＤＲＨ３を得る可能性が高い。
【図１０】ＬＵＡ−１４１、Ｅｘｅｍｐｌａｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３（ＥＬＤ−３）、およびＨＰＳ由来のヒトＣＤＲＨ３配列（Ｈｕｍａｎ  Ｈ３）のＫａｂａｔ−ＣＤＲＨ３のアミノ酸組成を示す。
【図１１】ＬＵＡ−１４１、Ｅｘｅｍｐｌａｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３（ＥＬＤ−３）、およびＨＰＳ由来のヒトＣＤＲＨ３配列（Ｈｕｍａｎ  Ｈ３）のＫａｂａｔ−ＣＤＲＨ３の長さの分布を示す。
【図１２】０〜３２のアミノ酸ミスマッチで、Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．由来のＣＤＲＨ３配列にマッチする、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｌｉｂｒａｒｙにおけるＣＤＲＨ３配列の割合を示す。
【図１３】Ｅｘｅｍｐｌａｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３（「ＥＬＤ−３」）、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ（「Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ」）、およびＢｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．のデータセット由来のヒトＣＤＲＨ３配列（「Ｂｏｙｄ  ２００９」）のＫａｂａｔ−ＣＤＲＨ３の長さの分布を示す。
【図１４】Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ（「Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ」）およびＢｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．のデータセット由来のヒトＣＤＲＨ３配列（「Ｂｏｙｄ  ２００９」）のＫａｂａｔ−ＣＤＲＨ３のアミノ酸組成を示す。
【図１５】（同じ）設計由来の２０，０００のランダムに選択された配列とマッチさせることによる、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎのコンビナトリアル効率を示す。配列の約６５％は、設計において１回だけ現れ、約１７％は、２回現れる。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、とりわけ、ポリヌクレオチドライブラリーおよびポリペプチドライブラリー、ライブラリーを産生するおよび使用するための方法、ライブラリーを含有するキット、ならびに本明細書において開示されるライブラリーおよび／または理論的セグメントプールの代理物のコンピューター読み取り可能な形態を提供する。本出願において教示されるライブラリーは、それらが構築される構成成分（たとえばポリヌクレオチドまたはポリペプチド「セグメント」）の点から、少なくとも部分的に記載することができる。とりわけ、本発明は、特に、これらのポリヌクレオチドまたはポリペプチドセグメント、そのようなセグメントを産生するおよび使用するための方法、ならびにそのようなライブラリーセグメントを含むキットおよび代理物のコンピューター読み取り可能な形態を提供し、企図する。
【００３８】
ある実施形態では、本発明は、天然に存在するヒト抗体レパートリーにおける配列およびＣＤＲの長さの分布に基づいて特に設計される抗体ライブラリーを提供する。抗原性刺激の非存在下においてでさえ、個々のヒトは、少なくとも約１０７の異なる抗体分子を作製することが推定される（Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２００９，  １：  １）。多くの抗体の抗原結合性部位は、様々な、関連するが異なるエピトープと交差反応することができる。さらに、ヒト抗体レパートリーは、可能性として低親和性でとはいえ、ほとんどあらゆる可能性のあるエピトープに適合する抗原結合性部位があることを確実にすることができるほど十分に大きい。
【００３９】
哺乳動物の免疫系は、転写に先立って、染色体が分離している遺伝子セグメントをコンビナトリアルに連結させることによって、それが、著しく経済的な方法でほとんど無限の異なる軽鎖および重鎖を生成するのを可能にするユニークな遺伝的メカニズムを進化させてきた。それぞれのタイプの免疫グロブリン（Ｉｇ）鎖（つまりカッパ軽鎖、ラムダ軽鎖、および重鎖）は、単一ポリペプチド鎖を産生するために、遺伝子セグメントの２つ以上のファミリーから選択されるＤＮＡ配列のコンビナトリアル構築によって合成される。特に、重鎖および軽鎖はそれぞれ、可変領域および定常（Ｃ）領域から成る。重鎖の可変領域は、遺伝子配列の３つのファミリーから構築されるＤＮＡ配列によってコードされる：可変（ＩＧＨＶ）、多様（ＩＧＨＤ）、および連結（ＩＧＨＪ）。軽鎖の可変領域は、カッパおよびラムダ軽鎖のそれぞれについての遺伝子配列の２つのファミリーから構築されるＤＮＡ配列によってコードされる：可変（ＩＧＬＶ）および連結（ＩＧＬＪ）。それぞれの可変領域（重および軽）はまた、完全長免疫グロブリン鎖を産生するために定常領域と組換えられる。
【００４０】
Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントのコンビナトリアル構築が、抗体可変領域多様性に対して実質的な貢献を成すが、さらに、多様性は、これらの遺伝子セグメントの不正確な連結および遺伝子セグメントの間の接合部での非鋳型ヌクレオチドの導入を介して、プレＢ細胞段階で、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて導入される（より詳細には、たとえば、その全体が参照によって組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号を参照されたい）。
【００４１】
Ｂ細胞が抗原を認識した後、それは、増殖するように誘発される。増殖の間に、Ｂ細胞受容体座は、ゲノム突然変異の通常の速度をはるかに超える、非常に高速の体細胞突然変異を受ける。生じる突然変異は、主としてＩｇ可変領域に局在化し、置換、挿入、および欠失を含む。この体細胞超変異は、抗原に対する親和性が増強した抗体を発現するＢ細胞の産生を可能にする。そのような抗原駆動体細胞超変異は、所与の抗原に対する抗体応答を微調整する。
【００４２】
本発明の合成抗体ライブラリーは、ヒト起源の抗原を含む、いかなる抗原をも認識する可能性を有する。自己反応性抗体がネガティブセレクションを介してドナーの免疫系によって除去されるので、ヒト起源の抗原を認識する能力は、ヒト生物学的起源から（たとえばヒトｃＤＮＡから）調製される抗体ライブラリーなどのような他の抗体ライブラリーにおいて存在し得ない。
【００４３】
さらに、本発明は、ライブラリー開発および／またはスクリーニングのある態様を簡易化するおよび／または能率的にする戦略を提供する。たとえば、いくつかの実施形態では、本発明は、陽性クローンを同定するために、セルソーティング技術（たとえば蛍光活性化セルソーター、ＦＡＣＳ）の使用を可能にし、そのため、ハイブリドーマライブラリーの生成および上清スクリーニングの標準的で冗長な方法の必要性を回避するまたは除く。
【００４４】
さらに、いくつかの実施形態では、本発明は、複数のスクリーニングパスを提供するライブラリーおよび／またはサブライブラリーを提供する。たとえば、いくつかの実施形態では、提供されるライブラリーおよび／またはサブライブラリーは、複数回、スクリーニングすることができる。いくつかのそのような実施形態では、個々の提供されるライブラリーおよび／またはサブライブラリーは、多くの標的に対するさらなる抗体を発見するために使用することができる。
【００４５】
さらに本発明について記載する前に、いくらかの用語を定義する。
【００４６】
定義
その他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、当業者によって一般に理解される意味を有する。別段の定めがない限り、Ｋａｂａｔのナンバリング方式は、出願の全体にわたって使用される。下記の定義は、当技術分野における用語を補足するものであり、本出願において記載される実施形態に関するものである。
【００４７】
用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、当業者によって理解されるように、典型的に、アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）：ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；リシン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；プロリン（ＰｒｏまたはＰ）；セリン（ＳｅｒまたはＳ）；トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；およびバリン（ＶａｌまたはＶ）から成る群から選択されるアミノ酸などのような、当技術分野で認識される定義を有するアミノ酸を指すが、修飾アミノ酸、合成アミノ酸、またはまれなアミノ酸が、所望されるように使用されてもよい。一般に、アミノ酸は、無極性側鎖（たとえばＡｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）；負荷電側鎖（たとえばＡｓｐ、Ｇｌｕ）；正荷電側鎖（たとえばＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；または無電荷極性側鎖（たとえばＡｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒ）を有するものとして分類することができる。
【００４８】
当業者らによって理解されるように、用語「抗体」は、最も広い意味で本明細書において使用され、特に、少なくとも、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（たとえば二重特異性抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および抗体断片を包含する。抗体は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にまたは部分的にコードされる、１つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質である。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変部領域遺伝子を含む。
【００４９】
用語「抗体結合領域」は、抗原に結合することができる免疫グロブリンまたは抗体可変領域の１つまたは複数の部分を指す。典型的に、抗体結合領域は、たとえば、抗体軽鎖（または可変領域またはその１つもしくは複数のＣＤＲ）、抗体重鎖（または可変領域またはその１つもしくは複数のＣＤＲ）、重鎖Ｆｄ領域、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン、もしくは単鎖抗体（ｓｃＦｖ）などのような組み合わせられた抗体軽鎖および重鎖（またはその可変領域）、または抗原を認識する完全長抗体、たとえばＩｇＧ（たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体の任意の領域である。
【００５０】
「抗体断片」は、完全な抗体の一部分、たとえば、その抗原結合性領域の１つまたは複数の部分を含む。抗体断片の例は、完全な抗体および抗体断片から形成されるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、二重特異性抗体、直鎖状抗体、単鎖抗体、ならびに多特異性抗体を含む。
【００５１】
用語「対象抗体」は、本発明のライブラリーから同定されるおよび／または単離される、対象特性を有する抗体を指す。対象の例示的な特性は、特定の抗原もしくはエピトープへの結合、ある親和性による結合、交差反応性、２つの分子の間の結合相互作用のブロック、および／またはある生物学的作用の誘発を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
用語「カノニカル構造」は、当業者らによって理解されるように、抗原結合（ＣＤＲ）ループによって取られる主な鎖立体構造を指す。比較構造研究から、６つの抗原結合ループのうちの５つが、利用可能な立体構造の限られたレパートリーのみを有することが分かった。カノニカル構造はそれぞれ、ポリペプチド主鎖のねじれ角によって特徴付けることができる。抗体の間の対応するループは、そのため、ループの大部分における高度なアミノ酸配列多様性にもかかわらず、非常に類似した三次元構造を有し得る（それぞれ、その全体が参照によって組み込まれるＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９８７，  １９６：  ９０１；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  １９８９，  ３４２：  ８７７；  Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９６，  ２６３：  ８００）。さらに、取られるループ構造およびそれを囲むアミノ酸配列の間に関係がある。当技術分野において知られているように、特定のカノニカルクラスの立体構造は、ループの長さならびにループ内および保存フレームワーク内の（つまりループの外側の）重要な位置に存在するおよびアミノ酸残基によって決定される。そのため、特定のカノニカルクラスに対する割り当ては、これらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて行うことができる。たとえば、用語「カノニカル構造」はまた、Ｋａｂａｔによって分類されるように、抗体の直鎖状配列に関する考慮を含んでいてもよい（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  ”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”  ５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  １９９２）。Ｋａｂａｔナンバリング手法は、一貫した方法で、抗体可変ドメインのアミノ酸残基をナンバリングするために、広く採用されている基準であり、他に示されない限り、本明細書において使用される。さらなる構造の考慮もまた、抗体のカノニカル構造を決定するために使用することができる。たとえば、Ｋａｂａｔのナンバリングによって完全には反映されない違いは、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．のナンバリング方式によって説明することができるならびに／または他の技術、たとえば結晶構造解析および二もしくは三次元計算モデリングによって明らかにすることができる。したがって、所与の抗体配列は、とりわけ、適切なシャーシ配列（ｃｈａｓｓｉｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を同定することを可能にするカノニカルクラスに分類されてもよい（たとえば、ライブラリーにおいて様々なカノニカル構造を含むための要望に基づいて）。抗体アミノ酸配列のＫａｂａｔナンバリングおよびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されるような構造の考慮ならびに抗体構造のカノニカルの側面を解釈するためのそれらの関連は、文献において記載されている。
【００５３】
用語「ＣＤＲ」およびその複数形「ＣＤＲｓ」は、その３つが軽鎖可変領域（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３）の結合特徴を構成し、３つが重鎖可変領域（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３）の結合特徴を構成する相補性決定領域（ＣＤＲ）を指す。ＣＤＲは、抗体分子の機能的活性に寄与し、フレームワーク領域を含むアミノ酸配列によって分離されている。厳密な定義のＣＤＲの境界および長さは、様々な分類およびナンバリング方式に従う。そのため、ＣＤＲは、たとえば、下記に記載されるＣＤＲＨ３ナンバリング方式を含めて、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、接点（ｃｏｎｔａｃｔ）、または他の境界定義によって言及されてもよい。異なる境界にもかかわらず、これらの方式のそれぞれは、可変領域内のいわゆる「超可変領域」を構成するものにおいてある程度の重複を有する。そのため、これらの方式によるＣＤＲ定義は、隣接するフレームワーク領域に関して、長さおよぶ境界エリアが異なっていてもよい。たとえば、それぞれ、その全体が参照によって組み込まれる、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  ”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”  ５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  １９９２；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９８７，  １９６：  ９０１；およびＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９６，  ２６２：  ７３２を参照されたい。
【００５４】
本明細書において使用される「ＣＤＲＨ３ナンバリング方式」は、位置９５にあるＣＤＲＨ３の第１のアミノ酸および位置１０２としてのＣＤＲＨ３の最後のアミノ酸を定義する。これは、Ｋａｂａｔに従っていない特注のナンバリング方式であることに注意されたい。位置９５で始まるアミノ酸セグメントは、「ＴＮ１」と呼ばれ、存在する場合、番号９５、９６、９６Ａ、９６Ｂなどが割り当てられる。本出願において使用される命名法は、米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号および第２０１０／００５６３８６号および国際公開番号ＷＯ／２００９／０３６３７９において使用されるものとわずかに異なることに注意されたい。それらの出願では、位置９５は、「Ｔａｉｌ」残基と称されるが、ここで、Ｔａｉｌ（Ｔ）は、Ｎ１セグメントと組み合わせられており、「ＴＮ１」と称される１つのセグメントがもたらされる。ＴＮ１セグメントに、「ＤＨ」セグメントが続き、これは、番号９７、９７Ａ、９７Ｂ、９７Ｃなどが割り当てられる。ＤＨセグメントに、「Ｎ２」セグメントが続き、これは、存在する場合、９８、９８Ａ、９８Ｂなどとナンバリングされる。最後に、「Ｈ３−ＪＨ」セグメントの最もＣ末端のアミノ酸残基は、番号１０２として指定される。その直前（Ｎ末端）の残基は、存在する場合、１０１であり、１つ前は、（存在する場合）１００である。残りのＨ３−ＪＨアミノ酸は、逆の順でナンバリングされ、１００に対してすぐＮ末端のアミノ酸についての９９から始まり、９９に対してＮ末端の残基について９９Ａ、９９Ｂ、９９Ｃなどについてその他同様である。そのため、ＣＤＲＨ３配列残基番号の例は、以下を含んでいてもよい：
【化１】
2019023247.tif 000002
【００５５】
本発明の「シャーシ（ｃｈａｓｓｉｓ）」は、それぞれＣＤＲＨ３またはＣＤＲＬ３の一部ではない、抗体重鎖可変（ＩＧＨＶ）または軽鎖可変（ＩＧＬＶ）ドメインの一部分である。本発明のシャーシは、ＦＲＭ１の第１のアミノ酸から始まり、ＦＲＭ３の最後のアミノ酸で終わる抗体の可変領域の一部分として定義される。重鎖の場合には、シャーシは、位置１〜位置９４を含むアミノ酸を含む。軽鎖（カッパおよびラムダ）の場合には、シャーシは、位置１〜位置８８を含むとして定義される。本発明のシャーシは、相当する生殖系列可変ドメイン配列に比べてある種の修飾を含有してもよい。これらの修飾は、操作されてもよい（たとえばＮ結合型グリコシル化部位を除去するように）または天然に存在してもよい（たとえば天然に存在する対立遺伝子変異を引き起こすように）。たとえば、免疫グロブリン遺伝子レパートリーが多型であることは、当技術分野において知られている（それぞれその全体が参照によって組み込まれるＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２００８，  ８６：  １１１；  Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２００８，  ６０：  ６６９）；これらの対立遺伝子変異体を代表するシャーシ、ＣＤＲ、および定常領域もまた、本発明によって包含される。いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態において使用される対立遺伝子変異体（複数可）は、たとえば、これらの患者集団において非免疫原性の抗体を同定するために、様々な患者集団において存在する対立遺伝子変異に基づいて選択されてもよい。ある実施形態では、本発明の抗体の免疫原性は、患者集団の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子における対立遺伝子変異に依存してもよい。そのような対立遺伝子変異はまた、本発明のライブラリーの設計において考慮されてもよい。本発明のある実施形態では、シャーシおよび定常領域は、ベクター中に含有され、ＣＤＲ３領域は、相同組換えを介してそれらの間に導入される。
【００５６】
本明細書において使用されるように、「指定多様性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）」により設計される配列は、配列の多様性および長さの多様性の両方を含有するように特に設計される。指定多様性は、確率的なものではない。
【００５７】
本明細書において使用されるように、用語「多様性」は、多種性または顕著な異種性を指す。用語「配列多様性」は、総体として、配列、たとえば天然ヒト抗体において見つけられるもののいくつかの可能性を代表する様々な配列を指す。たとえば、ＣＤＲＨ３配列多様性は、ＣＤＲＨ３配列を形成するために、知られているヒトＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントを組み合わせる様々な可能性を指してもよい。ＣＤＲＬ３配列多様性（カッパまたはラムダ）は、ＣＤＲＬ３配列を形成するために、天然に存在する軽鎖可変領域に寄与するＣＤＲＬ３（つまり「Ｌ３−ＶＬ」）および連結（つまり「Ｌ３−ＪＬ」）セグメントを組み合わせる様々な可能性を指してもよい。本明細書において使用されるように、「Ｈ３−ＪＨ」は、ＣＤＲＨ３に寄与するＩＧＨＪ遺伝子の部分を指す。本明細書において使用されるように、「Ｌ３−ＶＬ」および「Ｌ３−ＪＬ」は、それぞれ、ＣＤＲＬ３に寄与するＩＧＬＶおよびＩＧＬＪ遺伝子（カッパまたはラムダ）の部分を指す。
【００５８】
本明細書において使用されるように、用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含むが、これらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与するステップを指す。
【００５９】
用語「フレームワーク領域」は、より相違する（つまり超可変）ＣＤＲの間に存在する、抗体可変領域の当技術分野により認識される部分を指す。そのようなフレームワーク領域は、典型的に、フレームワーク１〜４（ＦＲＭ１、ＦＲＭ２、ＦＲＭ３、およびＦＲＭ４）と呼ばれ、抗原結合性表面を形成するための三次元空間における６つのＣＤＲ（重鎖由来の３つおよび軽鎖由来の３つ）の提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）のために足場を提供する。
【００６０】
用語「完全長重鎖」は、４つのフレームワーク領域、３つのＣＤＲ、および定常領域を含む、免疫グロブリン重鎖のカノニカル構造ドメインのそれぞれを含有する免疫グロブリン重鎖を指す。
【００６１】
用語「完全長軽鎖」は、４つのフレームワーク領域、３つのＣＤＲ、および定常領域を含む、免疫グロブリン軽鎖のカノニカル構造ドメインのそれぞれを含有する免疫グロブリン軽鎖を指す。
【００６２】
用語「生殖系列様」は、本発明の軽鎖のＣＤＲＬ３配列に関して使用される場合、（ｉ）ＩＧＶＬ生殖系列遺伝子によってＣＤＲＬ３に寄与する最初の６つの野生型残基（つまり、Ｋａｂａｔのナンバリング方式における位置８９〜９４；「Ｌ」はカッパまたはラムダである）；および（ｉｉ）もっぱらではないが、大部分はＪＬセグメントに由来する長さが２、１〜４のアミノ酸のいくつかのアミノ酸配列のうちの１つ（「Ｌ」はまた、カッパまたはラムダである）の組み合わせから成る配列を意味する。最もよくある長さ（つまり８、９、および１０残基）のカッパＣＤＲＬ３配列については、（ｉｉ）の配列は、２０に達し、ＦＴ、ＬＴ、ＩＴ、ＲＴ、ＷＴ、ＹＴ、［Ｘ］Ｔ、［Ｘ］ＰＴ、［Ｘ］ＦＴ、［Ｘ］ＬＴ、［Ｘ］ＩＴ、［Ｘ］ＲＴ、［Ｘ］ＷＴ、［Ｘ］ＹＴ、［Ｘ］ＰＦＴ、［Ｘ］ＰＬＴ、［Ｘ］ＰＩＴ、［Ｘ］ＰＲＴ、［Ｘ］ＰＷＴ、および［Ｘ］ＰＹＴであり、［Ｘ］は、それぞれのＶＫ生殖系列配列において位置９５（Ｋａｂａｔ）に見つけられるアミノ酸残基に相当する。Ｘは、最も一般的にはＰであるが、また、ＳまたはＶＫ生殖系列配列の位置９５で見つけられる任意の他のアミノ酸残基であってもよい。本明細書において例示される、８つの例示されるＶＫシャーシについては、相当する１６０の生殖系列様配列（つまり、８つのＶＫ生殖系列配列のそれぞれの位置８９〜９４と組み合わせられた、長さが２〜４のアミノ酸の２０の配列）が、表１において提供される。同様のアプローチは、ラムダ軽鎖についての生殖系列様ＣＤＲＬ３配列を定めるために適用される。上記に記載されるカッパ配列に関しては、ＩＧＶＬ遺伝子（この場合ＩＧＶλ）によってコードされるＣＤＲＬ３の完全な非突然変異部分は、もっぱらではないが、大部分はＪλセグメントに由来する配列と組み合わせられるであろう。ここで、後の配列（上記の（ｉｉ）に相当する）は、５に達し、ＹＶ、ＶＶ、ＷＶ、ＡＶ、またはＶである。さらに、また、米国特許出願公開第２００９／０８１８１５５号の実施例７において記載されるように、結果として生じる、「生殖系列様」の配列をなお考慮しながら部分的なコドンを考慮することによって、ＣＤＲＬ３のＶλ−遺伝子によりコードされる部分の最後の位置での変異をさらに考慮に入れることができる。より具体的には、米国特許出願公開第２００９／０８１８１５５号における実施例７の「ミニマリスト（ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔ）ライブラリー」全体は、「生殖系列様」と定義されるであろう。当業者は、他のＶＫおよびＶλ配列にこれらの方法を拡張することができることを容易に認識するであろう。
【００６３】
用語「遺伝子型−表現型の連結」は、当業者らによって理解されるように、特定の表現型を有する（たとえば、抗原に結合する）タンパク質をコードする核酸（遺伝子型）をライブラリーから単離することができるという事実を指す。例証の目的のために、ファージの表面上に発現される抗体断片は、抗原へのその結合に基づいて単離することができる（たとえば米国特許第５，８３７，５００号）。抗原への抗体の結合は、同時に、抗体断片をコードする核酸を含有するファージの単離を可能にする。したがって、表現型（抗体断片の抗原結合性の特徴）は、遺伝子型（抗体断片をコードする核酸）に「連結されている」。遺伝子型−表現型の連結を維持するための他の方法は、Ｗｉｔｔｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（それぞれ、その全体が参照によって組み込まれる米国特許第６，３００，０６５号、第６，３３１，３９１号、第６，４２３，５３８号、第６，６９６，２５１号、第６，６９９，６５８号、および米国特許出願公開第２００４０１４６９７６号）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（その全体が参照によって組み込まれる米国特許第７，１６６，４２３号）、Ｆａｎｄｌ（それぞれ、その全体が参照によって組み込まれる米国特許第６，９１９，１８３号、米国特許出願公開第２００６０２３４３１１号）、Ｃｌａｕｓｅｌｌ−Ｔｏｒｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（その全体が参照によって組み込まれるＣｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ２００８，  １５：  ４２７）、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（その全体が参照によって組み込まれるＮａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００６，  ２４：  ７０３）、ならびにＫｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（その全体が参照によって組み込まれるＣｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２００７，  １４：  １７７３）の方法を含む。用語は、それらの間の連結が維持されながら、それらを両方とも回収することができる方法で、抗体タンパク質をコードする遺伝子と一緒に抗体タンパク質の場所を突き止める任意の方法を指すために使用することができる。
【００６４】
用語「異種成分」は、抗体への成分の追加を示すために本明細書において使用され、成分は、天然に存在する抗体の一部ではない。例示的な異種成分は、薬剤、毒素、造影剤、および抗体自体において本質的でない活性を提供する任意の他の組成物を含む。
【００６５】
本明細書において使用されるように、用語「宿主細胞」は、本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を指すように意図される。そのような用語が、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をも指すことが理解されたい。ある種の修飾が、突然変異または環境上の影響により次の世代において生じ得るので、そのような子孫は、実際、親細胞と同一でなくてもよいが、本明細書において使用される用語の範囲内になお含まれる。
【００６６】
本明細書において使用されるように、用語「ヒト抗体ＣＤＲライブラリー」は、ヒト抗体における天然に存在するＣＤＲの配列の多様性および長さの多様性を示すように設計された、少なくとも１つのポリヌクレオチドライブラリーまたはポリペプチドライブラリーを含む（たとえば、「ヒト抗体ＣＤＲライブラリー」における「ＣＤＲ」という用語は、「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、「ＣＤＲＬ３」、「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」、および／または「ＣＤＲＨ３」と置換されてもよい）。知られているヒトＣＤＲ配列は、それぞれ、その全体が参照によって組み込まれるＪａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２００７，  ３２４：  ２６；Ｍａｒｔｉｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  １９９６，  ２５：  １３０；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２００６，  ５７：  ９１７、Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２００９，  １：  １、および国際公開番号ＷＯ／２００９／０３６３７９を含む、様々なデータセットならびに付録Ａにおいて提供されるＨＰＳにおいて示される。
【００６７】
用語「ヒト免疫前セット」または「ＨＰＳ」は、付録Ａにおいて提供されるＧＩ番号に相当する３，５７１の管理された（ｃｕｒａｔｅｄ）ヒト免疫前重鎖配列の参照セットを指す。
【００６８】
「完全な抗体」は、完全長重鎖および軽鎖（つまり重鎖および軽鎖のそれぞれについての４つのフレームワーク、３つのＣＤＲ、および定常領域）を含む抗体である。完全な抗体はまた、「完全長」抗体とも呼ばれる。
【００６９】
用語「長さの多様性」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のファミリーの長さにおける多種性を指す。たとえば、天然に存在するヒト抗体において、重鎖ＣＤＲ３配列は、たとえば約２アミノ酸〜約３５アミノ酸以上まで長さが変動し、軽鎖ＣＤＲ３配列は、たとえば約５〜約１６のアミノ酸まで長さが変動する。
【００７０】
用語「ライブラリー」は、本明細書において記載される多様性を有するおよび／または本発明の方法に従って設計される２つ以上の要素を含む要素のセットを指す。たとえば、「ポリヌクレオチドのライブラリー」は、本明細書において記載される多様性を有するおよび／または本発明の方法に従って設計される２つ以上のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのセットを指す。「ポリペプチドのライブラリー」は、本明細書において記載される多様性を有するおよび／または本発明の方法に従って設計される２つ以上のポリペプチドを含むポリペプチドのセットを指す。「合成ポリヌクレオチドのライブラリー」は、本明細書において記載される多様性を有するおよび／または本発明の方法に従って設計される２つ以上の合成ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのセットを指す。すべてのメンバーが合成であるライブラリーもまた、本発明によって包含される。「ヒト抗体ライブラリー」は、本明細書において記載される多様性を有するおよび／または本発明の方法に従って設計される２つ以上のポリペプチドを含むポリペプチドのセット、たとえば、天然に存在するヒト抗体の配列の多様性および長さの多様性を示すように設計されたライブラリーを指す。いくつかの実施形態では、用語「ライブラリー」は、同様の構造の特徴または配列の特徴を共有する要素のセット、たとえば「重鎖ライブラリー」、「軽鎖ライブラリー」、「抗体ライブラリー」、および／または「ＣＤＲＨ３ライブラリー」を指してもよい。
【００７１】
用語「物理的な実現」は、たとえば任意のディスプレイ方法によって実際に物理的にサンプリングすることができる理論的（たとえばコンピューターベースの）または合成（たとえばオリゴヌクレオチドベースの）多様性の一部分を指す。例示的なディスプレイ方法は、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、および酵母ディスプレイを含む。合成配列については、ライブラリーの物理的な実現のサイズは、（１）実際に合成することができる理論的な多様性の割合および（２）特定のスクリーニング方法の限界に依存する。スクリーニング方法の例示的な限界は、特定のアッセイ（たとえばリボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ）においてスクリーニングすることができる変異体の数ならびにスクリーニングアッセイにおいて使用される宿主細胞（たとえば酵母、哺乳動物細胞、細菌）の形質転換効率を含む。例証の目的のために、１０１２のメンバーの理論的な多様性を有するライブラリーを考慮すれば、最大１０１１のメンバーを含むことができるライブラリーの例示的な物理的な実現（たとえば酵母、細菌細胞、またはリボソームディスプレイにおける）は、そのため、ライブラリーの理論的な多様性の約１０％をサンプリングするであろう。しかしながら、１０１２の理論的な多様性を有するライブラリーの１０１１未満のメンバーが合成される場合、ライブラリーの物理的な実現は、最大１０１１のメンバーを含むことができ、ライブラリーの理論的な多様性の１０％未満が、ライブラリーの物理的な実現においてサンプリングされる。同様に、最大１０１２を超えるメンバーを含み得るライブラリーの物理的な実現は、理論的な多様性を「オーバーサンプリングし」、それぞれのメンバーが繰り返し存在することを意味するであろう（１０１２の理論的な多様性の全体が合成されることを想定）。
【００７２】
用語「ポリヌクレオチド（複数可）」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子などのような核酸ならびにそのアナログ（たとえば、ヌクレオチドアナログを使用してまたは核酸の化学的性質を使用して生成されるＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。所望されるように、ポリヌクレオチドは、たとえば、当技術分野に認識される核酸の化学的性質を使用して、合成的にまたはたとえば、ポリメラーゼを使用して、酵素により作製されてもよく、所望の場合は、修飾されてもよい。典型的な修飾は、メチル化、ビオチン化、および他の当技術分野に知られている修飾を含む。さらに、核酸分子は、一本鎖または二本鎖とすることができ、所望の場合には、検出可能な成分に連結することができる。本明細書におけるヌクレオチド塩基の表現は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＩＵＰＡＣ）の命名法に従う（その全体が参照によって組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号を参照されたい）。
【００７３】
「免疫前」抗体ライブラリーは、天然に存在するヒト抗体配列がネガティブセレクションおよび／または体細胞超変異を受ける前の天然に存在するヒト抗体配列に類似する配列の多様性および長さの多様性を有する。たとえば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（その全体が参照によって組み込まれるＩｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２００６，  ５７：  ９１７）において記載される配列のセットおよび本明細書において記載されるヒト免疫前セット（ＨＰＳ）（付録Ａを参照されたい）は、免疫前のレパートリー由来の配列を示すと考えられる。本発明のある実施形態では、本発明の配列は、これらの配列に類似するであろう（たとえば組成および長さの点から）。
【００７４】
本明細書において使用されるように、用語「部位毎に確率的」は、アミノ酸の配列を生成するためのプロセスを記載し、個々の位置でのアミノ酸の存在のみが考慮され、高次モチーフ（たとえばペアワイズ相関（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ））は説明されない（たとえば、それぞれその全体が参照によって組み込まれるＫｎａｐｐｉｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ２０００，  ２９６：  ５７および米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号において提供される分析を参照されたい）。
【００７５】
用語「スプリットプール（ｓｐｌｉｔ−ｐｏｏｌ）合成」は、複数の個々の第１の反応の産物が組み合わせられ（プールされ）、次いで、複数の第２の反応に参加する前に分離される（スプリットされる）手順を指す。たとえば、米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号（その全体が参照によって組み込まれる）は、それぞれ別々の反応での２７８のＤＨセグメント（産物）の合成を記載する。合成の後、これらの２７８のセグメントは、組み合わせられ（プールされ）、次いで、セグメントは、Ｎ２の合成のために１４１カラムの中に分配される（スプリットされる）。これは、それぞれの１４１のＮ２セグメントとの２７８のＤＨセグメントのそれぞれの対形成を可能にする。
【００７６】
本明細書において使用されるように、「確率的」は、確率分布からのあるエレメントのサンプルと考えられる、ヌクレオチドまたはアミノ酸のランダム配列を生成するプロセスを説明する（たとえば米国特許第５，７２３，３２３号を参照されたい）。
【００７７】
本明細書において使用されるように、用語「合成ポリヌクレオチド」は、天然起源の分子とは対照的に、化学プロセスを通して形成される分子または天然起源の分子の鋳型ベースの増幅を介して誘導される分子を指す（たとえば、ＰＣＲ増幅を介してＢ細胞の集団からクローニングされる免疫グロブリン鎖は、本明細書において使用されるように、「合成ではない」）。いくつかの実例では、たとえば、複数のセグメント（たとえばＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、および／またはＨ３−ＪＨ）を含む、本発明のライブラリーを指す場合、本発明は、前述の構成成分の少なくとも１、２、３、または４つが合成であるライブラリーを包含する。例証として、ある種の構成成分は合成であるが、他の構成成分は天然起源のものであるまたは天然起源の分子の鋳型ベースの増幅を介して誘導されるライブラリーは、本発明によって包含されるであろう。完全に合成であるライブラリーもまた、もちろん、本発明によって包含されるであろう。
【００７８】
用語「理論的な多様性」は、ライブラリー設計における変異体の最大数を指す。たとえば、３つの残基のアミノ酸配列を考慮すれば、残基１および３が、それぞれ、５つのアミノ酸タイプのいずれか１つであってもよく、残基２が、２０のアミノ酸タイプのいずれか１つであってもよい場合、理論的な多様性は、５×２０×５＝５００の可能な配列である。同様に、配列Ｘが、４つのアミノ酸セグメントの組み合わせによって構築される場合、セグメント１が、１００の可能な配列を有し、セグメント２が、７５の可能な配列を有し、セグメント３が、２５０の可能な配列を有し、セグメント４が、３０の可能な配列を有する場合、断片Ｘの理論的な多様性は、１００×７５×２００×３０または５．６×１０５の可能な配列になるであろう。
【００７９】
用語「理論的セグメントプール」は、より大きなポリヌクレオチドまたはポリペプチドを構築するためにビルディングブロックとして使用することができるポリヌクレオチドまたはポリペプチドセグメントのセットを指す。たとえば、ＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントを含有する理論的セグメントプールは、［ＴＮ１］−［ＤＨ］−［Ｎ２］−［Ｈ３−ＪＨ］によって示される配列を形成するためにそれらをコンビナトリアルにつなぎ、相当するオリゴヌクレオチドを合成することによって、ＣＤＲＨ３配列のライブラリーを構築するために使用することができる。用語「理論的セグメントプール」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドセグメントの任意のセットに適用することができる。したがって、ＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントのセットは、総体として、理論的セグメントプールと考えられるが、セグメントの個々のセットのそれぞれもまた、理論的セグメントプール、特にＴＮ１理論的セグメントプール、ＤＨ理論的セグメントプール、Ｎ２理論的セグメントプール、およびＨ３−ＪＨ理論的セグメントプールを含む。２つ以上の配列を含有する理論的セグメントプールのいかなるサブセットもまた、理論的セグメントプールと考えることができる。
【００８０】
本明細書において使用されるように、用語「ユニークな」は、設計されたセット（たとえば理論的な多様性）内のすべての他の配列とは異なる（たとえば、異なる化学構造を有する）配列を指す。特定の物理的な実現において理論的な多様性からの多くのユニークな配列の１つを超えるコピーがある可能性があることが理解されたい。たとえば、それぞれの配列がライブラリーの物理的な実現において３回生じる場合、理論的なレベルで３つのユニークな配列を含むライブラリーは、合計９つのメンバーを含み得る。しかしながら、ある実施形態で、それぞれのユニークな配列は、１回のみ、１回未満、１回を超えて存在してもよい。
【００８１】
用語「可変」は、それらの配列において多様性を示し、特定の抗体の特異性および結合親和性の決定に関与する、免疫グロブリンドメインの一部分（つまり「可変ドメイン」（複数可））を指す。多様性は、抗体の可変ドメインの全体にわたって均一には分布せず、それは、重鎖および軽鎖可変領域のそれぞれのサブドメインに集中する。これらのサブドメインは、「超可変」領域または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存された（つまり非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲＭ）と呼ばれる。天然に存在する重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、４つのＦＲＭ領域を含み、大部分は、β−シート構造の一部を結び付ける、いくつかの場合ではそれを形成するループを形成する３つの超可変領域によって結び付けられるβ−シート立体配置を取っている。それぞれの鎖における超可変領域は、他方の鎖由来の超可変領域と、ＦＲＭによって、極めて接近した状態で一緒に保持され、抗原結合性部位の形成に寄与する（その全体が参照によって組み込まれるＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．，  １９９１を参照されたい）。定常ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、たとえば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害および補体活性化などのような、様々なエフェクター機能を示す。
【００８２】
「ＶΚＣＤＲ３」配列および「ＶλＣＤＲ３」配列を含有する本発明のライブラリーは、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）配列のカッパおよびラムダサブセットを指す。そのようなライブラリーは、総体としてヒト抗体ＣＤＲＬ３レパートリーの長さおよび配列の多様性を示すように指定多様性により設計されてもよい。これらのライブラリーの「免疫前」バージョンは、天然に存在するヒト抗体ＣＤＲＬ３配列がネガティブセレクションおよび／または体細胞超変異を受ける前の天然に存在するヒト抗体ＣＤＲＬ３配列に類似する配列の多様性および長さの多様性を有する。知られているヒトＣＤＲＬ３配列は、それぞれ、その全体が参照によって組み込まれるＮＣＢＩデータベース、国際公開番号ＷＯ／２００９／０３６３７９、およびＭａｒｔｉｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  １９９６，  ２５：  １３０を含む、様々なデータセットにおいて示される。
【００８３】
ライブラリーの一般的な設計
本発明によって提供された抗体ライブラリーは、ヒト免疫系によって生成される免疫前のレパートリーのある種の側面を反映するように設計されてもよい。本発明のある種のライブラリーは、ヒトＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子の集合によって特徴付けられる合理的な設計ならびにヒト重鎖および軽鎖配列（たとえば、それぞれ、その全体が参照によって組み込まれるＪａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２００７，  ３２４：  ２６；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２００６，  ５７：  ９１７；Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２００９，  １：  １−８から公的に知られている生殖系列配列および配列ならびに再配列されたＶＫおよびＶλ配列から編成された配列（これもまたその全体が参照によって組み込まれる国際公開番号ＷＯ／２００９／０３６３７９を参照されたい）の大きなデータベースに基づく。たとえば、さらなる情報は、それぞれ、その全体が参照によって組み込まれるＳｃａｖｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，  １９９９，  １６：  ２３４；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９２，  ２２７：  ７９９；およびＭａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １９９８，  １８８：  ２１５１において見つけられてもよい。
【００８４】
本発明のある実施形態では、ヒトレパートリーにおいて見つけられる、可能なＶ、Ｄ、およびＪ多様性ならびに接合部の多様性（つまりＴＮ１およびＮ２）を示すセグメントは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして新たに合成される。本発明のある実施形態では、ＣＤＲ配列をコードするオリゴヌクレオチドは、重鎖または軽鎖シャーシ配列および定常ドメインを含有する１つまたは複数アクセプターベクターと共に酵母の中に導入される。哺乳動物のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡからのプライマーベースのＰＣＲ増幅または鋳型特異的な（ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）クローニングステップは、用いられない。標準的な相同組換えを通して、レシピエント酵母は、シャーシ配列および定常領域を含有するアクセプターベクターとＣＤＲセグメントを組換え、遺伝学的に増やし、発現し、提示し、かつスクリーニングすることができる、適切に順序付けられた合成完全長ヒト重鎖および／または軽鎖免疫グロブリンライブラリーを生成する。当業者は、アクセプターベクターが、完全長ヒト重鎖および／または軽鎖以外の構築物をもたらすように設計することができることを容易に認識するであろう。たとえば、本発明のある実施形態では、シャーシは、抗体断片または抗体断片のサブユニットをコードするポリペプチドの部分をコードするように設計されてもよく、ＣＤＲを含有するオリゴヌクレオチドカセットがアクセプターベクターと組換えられる場合に、抗体断片またはそのサブユニットをコードする配列は、産生される。
【００８５】
したがって、ある実施形態では、本発明は合成免疫前ヒト抗体レパートリーであって、
（ａ）１つまたは複数の選択されるヒト抗体重鎖シャーシ（つまり、Ｋａｂａｔの定義を使用すると、重鎖可変領域のアミノ酸１〜９４）；
（ｂ）ヒトＣＤＲＨ３配列の参照セットからのヒトＩＧＨＤおよびＩＧＨＪ生殖系列配列ならびにＴＮ１およびＮ２配列の抽出に基づいて設計されるＣＤＲＨ３レパートリー（下記により完全に記載される）であって、（ｉ）ＴＮ１セグメント；（ｉｉ）ＤＨセグメント；（ｉｉｉ）Ｎ２セグメント；（ｉｖ）Ｈ３−ＪＨセグメントを含むＣＤＲＨ３レパートリー、
（ｃ）１つまたは複数の選択されるヒト抗体カッパおよび／またはラムダ軽鎖シャーシ、ならびに
（ｄ）ヒトＩＧＬＶおよびＩＧＬＪ生殖系列配列に基づいて設計されるＣＤＲＬ３レパートリーであって、「Ｌ」はカッパまたはラムダ軽鎖であってもよいＣＤＲＬ３レパートリーを含む、レパートリーを提供する。
【００８６】
本発明はまた、そのようなライブラリーおよび１つまたは複数の免疫グロブリンドメインまたは抗体断片を含むライブラリーを産生し、使用するための方法を提供する。本発明の抗体ライブラリーのそれぞれの構成成分の設計および合成は、下記により詳細に提供される。
【００８７】
抗体ライブラリーシャーシ配列の設計
ある実施形態では、提供されるライブラリーは、天然に存在する可変ドメイン配列（たとえばＩＧＨＶおよびＩＧＬＶ遺伝子）に基づく、選択されるシャーシ配列から構築される。そのようなシャーシ配列の選択は、任意にまたはある種のあらかじめ決定された基準の定義を通して行うことができる。たとえば、非重複再配列抗体配列を含有する電子データベースであるＫａｂａｔデータベースは、最も頻繁に示される重鎖および軽鎖生殖系列配列について問い合わせることができる。ＢＬＡＳＴなどのようなアルゴリズムまたはＳｏＤＡなどのようなより特殊化したツール（その全体が参照によって組み込まれるＶｏｌｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  ２００６，  ２２：  ４３８−４４）は、機能的な抗体を生成するために最も頻繁に使用される生殖系列ファミリーを同定するために、生殖系列配列（たとえばＶ  ＢＡＳＥ２データベースを使用；たとえば、その全体が参照によって組み込まれるＲｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２００５，  ３３：  Ｄ６７１−Ｄ６７４を参照されたい）またはヒトＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子の類似する集合と再配列抗体配列を比較するために使用することができる。
【００８８】
いくつかの基準は、本発明のライブラリーにおける包含のためにシャーシの選択のために利用することができる。たとえば、酵母または本発明において使用される他の生物（たとえば細菌、哺乳動物細胞、菌類、もしくは植物）において不十分にしか発現しないことが知られている（または決定されている）配列は、ライブラリーから除くことができる。シャーシはまた、ヒトの末梢血における、それらの相当する生殖系列遺伝子の表現に基づいて選ばれてもよい。本発明のある実施形態では、ヒトの末梢血において高度に示される生殖系列配列に相当するシャーシを選択することが望ましくてもよい。いくつかの実施形態では、たとえば、ライブラリーのカノニカル多様性を増加させるために、それほど頻繁に示されない生殖系列配列に相当するシャーシを選択することが望ましくてもよい。そのため、シャーシは、機能的なヒト抗体の最大で最も構造的に多様な群を示すライブラリーを産生するために選択されてもよい。
【００８９】
本発明のある実施形態では、たとえば、シャーシ多様性をそれほど有しておらず、より多くのＣＤＲ多様性を有する、より小さく、より焦点を絞ったライブラリーを産生することが望ましい場合、それほど多様でないシャーシが、利用されてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、シャーシは、本発明の細胞（たとえば酵母細胞）におけるそれらの発現および選択される配列によって示されるカノニカル構造の多様性の両方に基づいて選択されてもよい。そのため、本発明の細胞において十分に発現するカノニカル構造の多様性を有するライブラリーが産生されてもよい。
【００９０】
重鎖シャーシ配列の設計
本発明において使用することができる重鎖シャーシ配列の設計および選択は、米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号および米国特許出願公開第２０１０／００５６３８６号および国際公開番号ＷＯ／２００９／０３６３７９において詳細に記載されており、それぞれ、その全体が参照によって組み込まれ、そのため、本明細書で簡潔に記載されるのみである。
【００９１】
一般に、ライブラリーのＶＨドメインは、３つの構成成分を含む：（１）アミノ酸１〜９４を含む（Ｋａｂａｔのナンバリングを使用）ＶＨ「シャーシ」、（２）適切なＫａｂａｔ  ＣＤＲＨ３（位置９５〜１０２）を含むように本明細書において定義されるＣＤＲＨ３、および（３）アミノ酸１０３〜１１３（Ｋａｂａｔのナンバリング）を含むＦＲＭ４領域。そのため、全体的なＶＨドメイン構造は、以下のように概略的に示されてもよい（正確な縮尺ではない）。
【化２】
2019023247.tif 000003
【００９２】
本発明のある実施形態では、ライブラリーのＶＨシャーシは、１つまたは複数の以下のＩＧＨＶ生殖系列配列のＫａｂａｔ残基約１〜Ｋａｂａｔ残基約９４を含んでいてもよい：ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ１−４５、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ１−５８、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨ８、ＩＧＨ５６、ＩＧＨ１００、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−１３、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−４３、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−６４、ＩＧＨＶ３−６６、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ４−４、ＩＧＨＶ４−２８、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ４−６１、ＩＧＨＶ４−Ｂ、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ６−１、および／またはＩＧＨＶ７−４−１。本発明のいくつかの実施形態では、ライブラリーは、１つもしくは複数のこれらの配列、これらの配列の１つもしくは複数の対立遺伝子変異体を含有してもよいまたは１つもしくは複数のこれらの配列に少なくとも約９９．９％、９９．５％、９９％、９８．５％、９８％、９７．５％、９７％、９６．５％、９６％、９５．５％、９５％、９４．５％、９４％、９３．５％、９３％、９２．５％、９２％、９１．５％、９１％、９０．５％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７７．５％、７５％、７３．５％、７０％、６５％、６０％、５５％、もしくは５０％同一であるアミノ酸配列をコードしてもよい。当業者は、上記に提供されるシャーシの定義を考慮して、任意のＩＧＨＶコード配列を、本発明のシャーシとしての使用に適応させることができることを認識するであろう。米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号および第２０１０／００５６３８６号ならびに国際公開番号ＷＯ／２００９／０３６３７９（それぞれ、その全体が参照によって組み込まれる）において例示されるように、これらのシャーシはまた、特にＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２領域におけるアミノ酸残基を改変することによって多様化し、ライブラリーの多様性をさらに増加させることもできる。
【００９３】
軽鎖シャーシ配列の設計
本発明において使用することができる軽鎖シャーシ配列の設計および選択は、米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号および米国特許出願公開第２０１０／００５６３８６号および国際公開番号ＷＯ／２００９／０３６３７９において詳細に記載されており、それぞれ、その全体が参照によって組み込まれ、そのため、本明細書で簡潔に記載されるのみである。本発明の軽鎖シャーシは、カッパおよび／またはラムダ軽鎖配列に基づくものであってもよい。
【００９４】
ライブラリーのＶＬドメインは、３つの主要な構成成分を含む：（１）ＶＬ「シャーシ」（アミノ酸１〜８８を含む（Ｋａｂａｔのナンバリングを使用））、（２）適切なＫａｂａｔ  ＣＤＲＬ３（位置８９〜９７）を含むように本明細書において定義されるＣＤＲＬ３、および（３）アミノ酸９８〜１０７（Ｋａｂａｔのナンバリング）を含むＦＲＭ４領域。そのため、全体的なＶＬドメイン構造は、以下のように概略的に示されてもよい（正確な縮尺ではない）。
【化３】
2019023247.tif 000004
【００９５】
本発明のある実施形態では、ライブラリーのＶＬシャーシは、ＩＧＫＶ生殖系列配列に基づく１つまたは複数のシャーシを含む。本発明のある実施形態では、ライブラリーのＶＬシャーシは、１つまたは複数の以下のＩＧＫＶ生殖系列配列のＫａｂａｔ残基約１〜Ｋａｂａｔ残基約８８を含んでいてもよい：ＩＧＫＶ１−０５、ＩＧＫＶ１−０６、ＩＧＫＶ１−０８、ＩＧＫＶ１−０９、ＩＧＫＶ１−１２、ＩＧＫＶ１−１３、ＩＧＫＶ１−１６、ＩＧＫＶ１−１７、ＩＧＫＶ１−２７、ＩＧＫＶ１−３３、ＩＧＫＶ１−３７、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ１Ｄ−１６、ＩＧＫＶ１Ｄ−１７、ＩＧＫＶ１Ｄ−４３、ＩＧＫＶ１Ｄ−８、ＩＧＫ５４、ＩＧＫ５８、ＩＧＫ５９、ＩＧＫ６０、ＩＧＫ７０、ＩＧＫＶ２Ｄ−２６、ＩＧＫＶ２Ｄ−２９、ＩＧＫＶ２Ｄ−３０、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＫＶ３Ｄ−０７、ＩＧＫＶ３Ｄ−１１、ＩＧＫＶ３Ｄ−２０、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＫＶ５−２、ＩＧＫＶ６−２１、および／またはＩＧＫＶ６Ｄ−４１。本発明のいくつかの実施形態では、ライブラリーは、１つもしくは複数のこれらの配列、これらの配列の１つもしくは複数の対立遺伝子変異体を含有してもよいまたは１つもしくは複数のこれらの配列に少なくとも約９９．９％、９９．５％、９９％、９８．５％、９８％、９７．５％、９７％、９６．５％、９６％、９５．５％、９５％、９４．５％、９４％、９３．５％、９３％、９２．５％、９２％、９１．５％、９１％、９０．５％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７７．５％、７５％、７３．５％、７０％、６５％、６０％、５５％、もしくは５０％同一であるアミノ酸配列をコードしてもよい。
【００９６】
本発明のある実施形態では、ライブラリーのＶＬシャーシは、ＩＧλＶ生殖系列配列に基づく１つまたは複数のシャーシを含む。本発明のある実施形態では、ライブラリーのＶＬシャーシは、１つまたは複数の以下のＩＧλＶ生殖系列配列のＫａｂａｔ残基約１〜Ｋａｂａｔ残基約８８を含んでいてもよい：ＩＧλＶ３−１、ＩＧλＶ３−２１、ＩＧλ４４、ＩＧλＶ１−４０、ＩＧλＶ３−１９、ＩＧλＶ１−５１、ＩＧλＶ１−４４、ＩＧλＶ６−５７、ＩＧλ１１、ＩＧλＶ３−２５、ＩＧλ５３、ＩＧλＶ３−１０、ＩＧλＶ４−６９、ＩＧλＶ１−４７、ＩＧλ４１、ＩＧλＶ７−４３、ＩＧλＶ７−４６、ＩＧλＶ５−４５、ＩＧλＶ４−６０、ＩＧλＶ１０−５４、ＩＧλＶ８−６１、ＩＧλＶ３−９、ＩＧλＶ１−３６、ＩＧλ４８、ＩＧλＶ３−１６、ＩＧλＶ３−２７、ＩＧλＶ４−３、ＩＧλＶ５−３９、ＩＧλＶ９−４９、および／またはＩＧλＶ３−１２。本発明のいくつかの実施形態では、ライブラリーは、１つもしくは複数のこれらの配列、これらの配列の１つもしくは複数の対立遺伝子変異体を含有してもよいまたは１つもしくは複数のこれらの配列に少なくとも約９９．９％、９９．５％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、もしくは５０％同一であるアミノ酸配列をコードしてもよい。
【００９７】
当業者は、上記に提供されるシャーシの定義を考慮して、任意のＩＧＫＶまたはＩＧλＶコード配列を、本発明のシャーシとしての使用に適応させることができることを認識するであろう。
【００９８】
ＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントの設計および選択
ヒト生殖系列レパートリーは、少なくとも６つのＩＧＨＪ遺伝子（ＩＧＨＪ１、ＩＧＨＪ２、ＩＧＨＪ３、ＩＧＨＪ４、ＩＧＨＪ５、およびＩＧＨＪ６；表１４に含まれる、主要な対立遺伝子は「０１」と称され、選択される対立遺伝子変異体は、「０２」または「０３」と称される）ならびに少なくとも２７のＩＧＨＤ遺伝子（表１６、対立遺伝子変異体を含む）を含有する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＤＲＨ３ポリペプチド配列またはＣＤＲＨ３配列をコードするポリヌクレオチド配列のライブラリーおよび本明細書において開示される理論的セグメントプールのいずれかのメンバーを含むライブラリーを含む。
【００９９】
当業者は、本明細書において提供される理論的セグメントプールにおけるすべてのセグメントが、本発明の機能的なＣＤＲＨ３ライブラリーを産生するのに必要であるとは限らないことを認識するであろう。そのため、ある実施形態では、本発明のＣＤＲＨ３ライブラリーは、本明細書において記載される理論的セグメントプールのいずれかのセグメントのサブセットを含有するであろう。たとえば、本発明のある実施形態では、本明細書において提供されるまたは本明細書において記載される方法によって生成される理論的セグメントプールのいずれかの少なくとも約１５、３０、４５、６０、７５、９０、１００、１０５、１２０、１３５、１５０、１６５、１８０、１９５、２００、２１０、２２５、２４０、２５５、２７０、２８５、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０、６４０、または６４３のＨ３−ＪＨセグメントは、ライブラリーに含まれる。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書において提供されるまたは本明細書において記載される方法によって生成される理論的セグメントプールのいずれかの少なくとも約１５、３０、４５、６０、７５、９０、１００、１０５、１２０、１３５、１５０、１６５、１８０、１９５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１１１、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、１４０００、２１０００、２８０００、３５０００、４２０００、４９０００、５６０００、６３０００、または６８３７４のＤＨセグメントは、ライブラリーに含まれる。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書において提供されるまたは本明細書において記載される方法によって生成される理論的セグメントプールのいずれかの少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１４１、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４２４、４４０、４６０、４８０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７２７、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００のＴＮ１および／またはＮ２セグメントは、ライブラリーに含まれる。ある実施形態では、本発明のライブラリーは、特定の数未満のポリヌクレオチドまたはポリペプチドセグメントを含有してもよく、セグメントの数は、それぞれのセグメントについて上記に提供される整数のいずれか１つを使用して定められる。本発明のいくつかの実施形態では、特定の数の範囲は、包含的なまたは排他的な範囲の下限および上限として、上記に提供される整数のいずれか２つを使用して定められる。上限および下限を定める、提供される整数の組み合わせはすべて、企図される。
【０１００】
ある実施形態では、本発明は、本明細書において提供される理論的セグメントプールのいずれか由来のセグメントの少なくとも約１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を含むＣＤＲＨ３ライブラリー提供する。たとえば、本発明は、本明細書において提供される理論的セグメントプールのいずれか由来のＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、および／またはＨ３−ＪＨセグメントの少なくとも約１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を含むライブラリーを提供する。本発明のいくつかの実施形態では、特定のパーセンテージの範囲は、包含的なまたは排他的な範囲の下限および上限として、上記に提供されるパーセンテージのいずれか２つを使用して定められる。上限および下限を定める、提供されるパーセンテージの組み合わせはすべて、企図される。
【０１０１】
本発明のいくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３ライブラリーにおけるＨ３−ＪＨ、ＤＨ、ＴＮ１、および／またはＮ２セグメントの少なくとも約１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％は、本明細書において提供されるまたは本明細書において記載される方法によって生成される理論的セグメントプールのいずれかのＨ３−ＪＨ、ＤＨ、ＴＮ１、および／またはＮ２セグメントである。本発明のいくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３ライブラリーから単離される（たとえば、１回または複数回の選択を通して特定の抗原および／または一般的なリガンドに結合することによって）抗体のＨ３−ＪＨ、ＤＨ、ＴＮ１、および／またはＮ２セグメントの少なくとも約１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％は、本明細書において提供されるまたは本明細書において記載される方法によって生成される理論的セグメントプールのいずれかのＨ３−ＪＨ、ＤＨ、ＴＮ１、および／またはＮ２セグメントである。ある実施形態では、本発明のＣＤＲＨ３ライブラリーは、特定のパーセンテージ未満の、本明細書において提供されるまたは本明細書において記載される方法によって生成される理論的セグメントプールのいずれかのＨ３−ＪＨ、ＤＨ、ＴＮ１、および／またはＮ２セグメントを含有してもよく、セグメントの数は、それぞれのセグメントについて上記に提供されるパーセンテージのいずれか１つを使用して定められる。本発明のいくつかの実施形態では、特定のパーセンテージの範囲は、包含的なまたは排他的な範囲の下限および上限として、上記に提供されるパーセンテージのいずれか２つを使用して定められる。上限および下限を定める、提供されるパーセンテージの組み合わせはすべて、企図される。
【０１０２】
当業者は、本明細書における開示の理解に際して、本明細書において提供されるまたは本明細書において記載される方法によって生成される理論的セグメントプールのいずれかのＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、および／またはＨ３−ＪＨセグメントを考慮して、それらの配列の点から提供されるものに１００％同一ではないが、機能的に非常に類似していてもよい、類似するＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、および／またはＨ３−ＪＨセグメントならびに相当するＣＤＲＨ３ライブラリーを産生することができることを十分に理解するであろう。そのような理論的セグメントプールおよびＣＤＲＨ３ライブラリーもまた、本発明の範囲内にある。本明細書において提供される突然変異誘発技術を含む、当技術分野においてよく知られている様々な技術は、これらのさらなる配列を得るために使用することができる。そのため、本発明の明示的に列挙されるそれぞれの実施形態はまた、本明細書において提供されるまたは本明細書において記載される方法によって生成される理論的セグメントプールのいずれかのセグメントのいずれかに特定の同一性パーセントを共有するセグメントを使用して実施することもできる。たとえば、本発明の先に記載されるそれぞれの実施形態は、本明細書において提供されるまたは本明細書において記載される方法によって生成される理論的セグメントプールのいずれかのＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、および／またはＨ３−ＪＨセグメントに少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％同一であるＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、および／またはＨ３−ＪＨセグメントを使用して実施することができる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本発明は、１つまたは複数のＴＮ１セグメント、１つまたは複数のＤＨセグメント、１つまたは複数のＮ２セグメント、および１つまたは複数のＨ３−ＪＨセグメントと組み合わせられた１つまたは複数のＶＨシャーシ配列から産生されるライブラリーを提供する。ある実施形態では、少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、７５、または１００のそれぞれのシャーシ、ＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、またはＨ３−ＪＨセグメントは、本発明のライブラリーに含まれる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本発明は、合成ＣＤＲＨ３ライブラリーにおける包含のために理論的セグメントプールからＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントを選択するための方法であって、
（ｉ）１つまたは複数のＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントを含有する理論的セグメントプールを提供するステップ；
（ｉｉ）ＣＤＲＨ３配列の参照セットを提供するステップ；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の参照セットにおけるそれぞれのＣＤＲＨ３配列に最も近いマッチ（複数可）を同定するために（ｉ）の理論的セグメントプールを利用するステップ；ならびに
（ｉｖ）合成ライブラリーにおける包含のために理論的セグメントプールからセグメントを選択するステップを含む、方法を提供する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、（ｉｖ）の選択プロセスは、任意選択で、（ｉｉ）の参照セットにおける（ｉ）のセグメントの出現頻度；相当するセグメント使用ウエイト；ならびにセグメントの任意の物理化学的特性（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ａａｉｎｄｅｘ／ですべての数的な指標を参照されたい）（たとえば疎水性、アルファヘリックス傾向、および／または等電点）を含む、任意の数の基準を含むことができる。任意選択で、（ｉ）の理論的セグメントプールにおいて存在しないが、（ｉｉ）の参照セットにおいて見つけられるＴＮ１および／またはＮ２セグメントは、同定されてもよく、可能性のある理論的セグメントプールおよび／または本発明の合成ライブラリーにおいて、ＴＮ１および／またはＮ２多様性が増加した理論的セグメントプールを産生するために、可能性のある理論的セグメントプールに追加されてもよい。
【０１０６】
たとえば、１つもしくは複数の生物学的特性（たとえば免疫原性、安定性、半減期）および／または上記に提供される数的な指標などのような１つもしくは複数の物理化学的特性を含む、セグメントの任意の特徴または特徴のセットは、ライブラリーにおける包含のためにそれらを選ぶために使用することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のそのような特性は、本発明のライブラリーにおける包含のためにセグメントを選択するために使用される。上記に提供される指標に含まれる生理化学的特性は、たとえば、ＡＮＤＮ９２０１０１  アルファ−ＣＨ化学シフト（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）；ＡＲＧＰ８２０１０１  疎水性指標（Ａｒｇｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２）；ＡＲＧＰ８２０１０２  シグナル配列ヘリックスポテンシャル（ｈｅｌｉｃａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（Ａｒｇｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２）；ＡＲＧＰ８２０１０３  膜埋込選択パラメーター（Ａｒｇｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２）；ＢＥＧＦ７５０１０１  内部ヘリックスの立体構造パラメーター（Ｂｅｇｈｉｎ−Ｄｉｒｋｘ，  １９７５）；ＢＥＧＦ７５０１０２  ベータ構造の立体構造パラメーター（Ｂｅｇｈｉｎ−Ｄｉｒｋｘ，  １９７５）；ＢＥＧＦ７５０１０３  ベータターンの立体構造パラメーター（Ｂｅｇｈｉｎ−Ｄｉｒｋｘ，  １９７５）；ＢＨＡＲ８８０１０１  平均可動性指標（Ｂｈａｓｋａｒａｎ−Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ，  １９８８）；ＢＩＧＣ６７０１０１  残基体積（Ｂｉｇｅｌｏｗ，  １９６７）；ＢＩＯＶ８８０１０１  到達性についての情報価値；平均画分３５％（Ｂｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）；ＢＩＯＶ８８０１０２  到達性についての情報価値；平均画分２３％（Ｂｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）；ＢＲＯＣ８２０１０１  ＴＦＡにおける保持係数（Ｂｒｏｗｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２）；ＢＲＯＣ８２０１０２  ＨＦＢＡにおける保持係数（Ｂｒｏｗｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２）；ＢＵＬＨ７４０１０１  表面への移動自由エネルギー（Ｂｕｌｌ−Ｂｒｅｅｓｅ，  １９７４）；ＢＵＬＨ７４０１０２  見かけ上の部分比容（Ｂｕｌｌ−Ｂｒｅｅｓｅ，  １９７４）；ＢＵＮＡ７９０１０１  アルファ−ＮＨ化学シフト（Ｂｕｎｄｉ−Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，  １９７９）；ＢＵＮＡ７９０１０２  アルファ−ＣＨ化学シフト（Ｂｕｎｄｉ−Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，  １９７９）；ＢＵＮＡ７９０１０３  スピン−スピン結合定数３ＪＨａｌｐｈａ−ＮＨ（Ｂｕｎｄｉ−Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，  １９７９）；ＢＵＲＡ７４０１０１  αヘリックスの標準化頻度（Ｂｕｒｇｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７４）；ＢＵＲＡ７４０１０２  拡張構造の標準化頻度（Ｂｕｒｇｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７４）；ＣＨＡＭ８１０１０１  立体的パラメーター（Ｃｈａｒｔｏｎ，  １９８１）；ＣＨＡＭ８２０１０１  分極率パラメーター（Ｃｈａｒｔｏｎ−Ｃｈａｒｔｏｎ，  １９８２）；ＣＨＡＭ８２０１０２  水溶液の自由エネルギー、ｋｃａｌ／モル（Ｃｈａｒｔｏｎ−Ｃｈａｒｔｏｎ，  １９８２）；ＣＨＡＭ８３０１０１  コイル立体構造のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎパラメーター（Ｃｈａｒｔｏｎ−Ｃｈａｒｔｏｎ，  １９８３）；ＣＨＡＭ８３０１０２  ベータシートのＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎパラメーターの最良の相関性から得られる誤差から定義されるパラメーター（Ｃｈａｒｔｏｎ−Ｃｈａｒｔｏｎ，  １９８３）；ＣＨＡＭ８３０１０３  １＋１と標識される側鎖における原子の数（Ｃｈａｒｔｏｎ−Ｃｈａｒｔｏｎ，  １９８３）；ＣＨＡＭ８３０１０４  ２＋１と標識される側鎖における原子の数（Ｃｈａｒｔｏｎ−Ｃｈａｒｔｏｎ，  １９８３）；ＣＨＡＭ８３０１０５  ３＋１と標識される側鎖における原子の数（Ｃｈａｒｔｏｎ−Ｃｈａｒｔｏｎ，  １９８３）；ＣＨＡＭ８３０１０６、最も長い鎖における結合の数（Ｃｈａｒｔｏｎ−Ｃｈａｒｔｏｎ，  １９８３）；ＣＨＡＭ８３０１０７  電荷移動能力のパラメーター（Ｃｈａｒｔｏｎ−Ｃｈａｒｔｏｎ，  １９８３）；ＣＨＡＭ８３０１０８  電荷移動ドナー能力のパラメーター（Ｃｈａｒｔｏｎ−Ｃｈａｒｔｏｎ，  １９８３）；ＣＨＯＣ７５０１０１  埋込残基の平均体積（Ｃｈｏｔｈｉａ，  １９７５）；ＣＨＯＣ７６０１０１  トリペプチドにおける残基最近接包絡面積（Ｃｈｏｔｈｉａ，  １９７６）；ＣＨＯＣ７６０１０２  フォールドタンパク質における残基最近接包絡面積（Ｃｈｏｔｈｉａ，  １９７６）；ＣＨＯＣ７６０１０３  ９５％埋込残基の割合（Ｃｈｏｔｈｉａ，  １９７６）；ＣＨＯＣ７６０１０４  １００％埋込残基の割合（Ｃｈｏｔｈｉａ，  １９７６）；ＣＨＯＰ７８０１０１  ベータターンの標準化頻度（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，  １９７８ａ）；ＣＨＯＰ７８０２０１  アルファヘリックスの標準化頻度（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，  １９７８ｂ）；ＣＨＯＰ７８０２０２  ベータシートの標準化頻度（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，  １９７８ｂ）；ＣＨＯＰ７８０２０３  ベータターンの標準化頻度（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，  １９７８ｂ）；ＣＨＯＰ７８０２０４  Ｎ末端ヘリックスの標準化頻度（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，  １９７８ｂ）；ＣＨＯＰ７８０２０５  Ｃ末端ヘリックスの標準化頻度（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，  １９７８ｂ）；ＣＨＯＰ７８０２０６  Ｎ末端非ヘリックス領域の標準化頻度（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，  １９７８ｂ）；ＣＨＯＰ７８０２０７  Ｃ末端非ヘリックス領域の標準化頻度（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，  １９７８ｂ）；ＣＨＯＰ７８０２０８  Ｎ末端ベータシートの標準化頻度（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，  １９７８ｂ）；ＣＨＯＰ７８０２０９  Ｃ末端ベータシートの標準化頻度（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，  １９７８ｂ）；ＣＨＯＰ７８０２１０  Ｎ末端非ベータ領域の標準化頻度（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，  １９７８ｂ）；ＣＨＯＰ７８０２１１  Ｃ末端非ベータ領域の標準化頻度；ＣＨＯＰ７８０２１２  ターンにおける第１の残基の頻度（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，  １９７８ｂ）；ＣＨＯＰ７８０２１３  ターンにおける第２の残基の頻度（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，  １９７８ｂ）；ＣＨＯＰ７８０２１４  ターンにおける第３の残基の頻度（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，  １９７８ｂ）；ＣＨＯＰ７８０２１５  ターンにおける第４の残基の頻度（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，  １９７８ｂ）；ＣＨＯＰ７８０２１６  ターンにおける第２および第３の残基の標準化頻度（Ｃ��ｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，  １９７８ｂ）；ＣＩＤＨ９２０１０１  アルファタンパク質についての標準化疎水性スケール（Ｃｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）；ＣＩＤＨ９２０１０２  ベータタンパク質についての標準化疎水性スケール（Ｃｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）；ＣＩＤＨ９２０１０３  アルファ＋ベータタンパク質についての標準化疎水性スケール（Ｃｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）；ＣＩＤＨ９２０１０４  アルファ／ベータタンパク質についての標準化疎水性スケール（Ｃｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）；ＣＩＤＨ９２０１０５  標準化平均疎水性スケール（Ｃｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）；ＣＯＨＥ４３０１０１  部分比容（Ｃｏｈｎ−Ｅｄｓａｌｌ，  １９４３）；ＣＲＡＪ７３０１０１  中央のヘリックスの標準化頻度（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７３）；ＣＲＡＪ７３０１０２  ベータシートの標準化頻度（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７３）；ＣＲＡＪ７３０１０３  ターンの標準化頻度（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７３）；ＤＡＷＤ７２０１０１  サイズ（Ｄａｗｓｏｎ，  １９７２）；ＤＡＹＭ７８０１０１  アミノ酸組成（Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８ａ）；ＤＡＹＭ７８０２０１  相対的突然変異性（Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８ｂ）；ＤＥＳＭ９００１０１  シトクロムｂについての膜選択：ＭＰＨ８９  （Ｄｅｇｌｉ  Ｅｓｐｏｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）；ＤＥＳＭ９００１０２  平均膜選択：ＡＭＰ０７  （Ｄｅｇｌｉ  Ｅｓｐｏｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）；ＥＩＳＤ８４０１０１  コンセンサス標準化疎水性スケール（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，  １９８４）；ＥＩＳＤ８６０１０１  溶媒和自由エネルギー（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ−ＭｃＬａｃｈｌａｎ，  １９８６）；ＥＩＳＤ８６０１０２  原子ベースの疎水性モーメント（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ−ＭｃＬａｃｈｌａｎ，  １９８６）；ＥＩＳＤ８６０１０３  疎水性モーメントの方向；ＦＡＳＧ７６０１０１  分子量（Ｆａｓｍａｎ，  １９７６）；ＦＡＳＧ７６０１０２  融点（Ｆａｓｍａｎ，  １９７６）；ＦＡＳＧ７６０１０３  旋光度（Ｆａｓｍａｎ，  １９７６）；ＦＡＳＧ７６０１０４  ｐＫ−Ｎ  （Ｆａｓｍａｎ，  １９７６）；ＦＡＳＧ７６０１０５  ｐＫ−Ｃ  （Ｆａｓｍａｎ，  １９７６）；ＦＡＵＪ８３０１０１  疎水性パラメーターｐｉ（Ｆａｕｃｈｅｒｅ−Ｐｌｉｓｋａ，  １９８３）；ＦＡＵＪ８８０１０１  グラフシェープインデックス（Ｆａｕｃｈｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）；ＦＡＵＪ８８０１０２  平滑化ユプシロン立体的パラメーター（Ｆａｕｃｈｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）；ＦＡＵＪ８８０１０３  標準化ファンデルワールス体積（Ｆａｕｃｈｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）；ＦＡＵＪ８８０１０４  側鎖のＳＴＥＲＩＭＯＬ長（Ｆａｕｃｈｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）；ＦＡＵＪ８８０１０５  側鎖のＳＴＥＲＩＭＯＬ最小幅（Ｆａｕｃｈｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）；ＦＡＵＪ８８０１０６  側鎖のＳＴＥＲＩＭＯＬ最大幅；ＦＡＵＪ８８０１０７  アルファ炭素のｎ．ｍ．ｒ．化学シフト（Ｆａｕｃｈｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）；ＦＡＵＪ８８０１０８  局所的な電気的効果（Ｆａｕｃｈｅ���ｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）；ＦＡＵＪ８８０１０９  水素結合ドナーの数（Ｆａｕｃｈｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）；ＦＡＵＪ８８０１１０  全非結合軌道の数（Ｆａｕｃｈｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）；ＦＡＵＪ８８０１１１  正電荷（Ｆａｕｃｈｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）；ＦＡＵＪ８８０１１２  負電荷（Ｆａｕｃｈｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）；ＦＡＵＪ８８０１１３  ｐＫ−ａ（ＲＣＯＯＨ）  （Ｆａｕｃｈｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）；ＦＩＮＡ７７０１０１  ヘリックスコイル平衡定数（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ−Ｐｔｉｔｓｙｎ，  １９７７）；ＦＩＮＡ９１０１０１  位置ｉ−１でのヘリックス開始パラメーター（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）；ＦＩＮＡ９１０１０２  位置ｉ、ｉ＋１、ｉ＋２でのヘリックス開始パラメーター（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）；ＦＩＮＡ９１０１０３  位置ｊ−２、ｊ−１、ｊでのヘリックス終了パラメーター（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）；ＦＩＮＡ９１０１０４  位置ｊ＋１でのヘリックス終了パラメーター（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）；ＧＡＲＪ７３０１０１  分配係数（Ｇａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７３）；ＧＥＩＭ８００１０１  アルファヘリックス指標（Ｇｅｉｓｏｗ−Ｒｏｂｅｒｔｓ，  １９８０）；ＧＥＩＭ８００１０２  アルファタンパク質についてのアルファヘリックス指標（Ｇｅｉｓｏｗ−Ｒｏｂｅｒｔｓ，  １９８０）；ＧＥＩＭ８００１０３  ベータタンパク質についてのアルファヘリックス指標（Ｇｅｉｓｏｗ−Ｒｏｂｅｒｔｓ，  １９８０）；ＧＥＩＭ８００１０４  アルファ／ベータタンパク質についてのアルファヘリックス指標（Ｇｅｉｓｏｗ−Ｒｏｂｅｒｔｓ，  １９８０）；ＧＥＩＭ８００１０５  ベータストランド指標（Ｇｅｉｓｏｗ−Ｒｏｂｅｒｔｓ，  １９８０）；ＧＥＩＭ８００１０６  ベータタンパク質についてのベータストランド指標（Ｇｅｉｓｏｗ−Ｒｏｂｅｒｔｓ，  １９８０）；ＧＥＩＭ８００１０７アルファ／ベータタンパク質についてのベータストランド指標、ＧＥＩＭ８００１０８  非周期的指標（Ｇｅｉｓｏｗ−Ｒ
ｏｂｅｒｔｓ，  １９８０）；ＧＥＩ  Ｍ８００１０９  アルファタンパク質についての非周期的指標（Ｇｅｉｓｏｗ−Ｒｏｂｅｒｔｓ，  １９８０）；ＧＥＩＭ８００１１０  ベータタンパク質についての非周期的指標（Ｇｅｉｓｏｗ−Ｒｏｂｅｒｔｓ，  １９８０）；ＧＥＩＭ８００１１１  アルファ／ベータタンパク質についての非周期的指標（Ｇｅｉｓｏｗ−Ｒｏｂｅｒｔｓ，  １９８０）；ＧＯＬＤ７３０１０１  疎水性因子（Ｇｏｌｄｓａｃｋ−Ｃｈａｌｉｆｏｕｘ，  １９７３）；ＧＯＬＤ７３０１０２  残基体積（Ｇｏｌｄｓａｃｋ−Ｃｈａｌｉｆｏｕｘ，  １９７３）；ＧＲＡＲ７４０１０１  組成（Ｇｒａｎｔｈａｍ，  １９７４）；ＧＲＡＲ７４０１０２  極性（Ｇｒａｎｔｈａｍ，  １９７４）、ＧＲＡＲ７４０１０３  体積（Ｇｒａｎｔｈａｍ，  １９７４）；ＧＵＹＨ８５０１０１  分配エネルギー（Ｇｕｙ，  １９８５）；Ｃｈａｒｔｏｎ−Ｃｈａｒｔｏｎ（１９８２）によって引用されるＨＯＰＡ７７０１０１  水和数（Ｈｏｐｆｉｎｇｅｒ，  １９７１）、ＨＯＰＴ８１０１０１  親水性値（Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ，  １９８１）；ＨＵＴＪ７００１０１  熱容量（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ，  １９７０）；ＨＵＴＪ７００１０２  絶対エントロピー（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ，  １９７０）；ＨＵＴＪ７００１０３  生成エントロピー（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ，  １９７０）；ＩＳＯＹ８００１０１  アルファヘリックスの相対的標準化頻度  （Ｉｓｏｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＩＳＯＹ８００１０２  拡張構造の相対的標準化頻度（Ｉｓｏｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＩＳＯＹ８００１０３  屈曲の相対的標準化頻度（Ｉｓｏｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＩＳＯＹ８００１０４  屈曲Ｒの相対的標準化頻度（Ｉｓｏｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＩＳＯＹ８００１０５  屈曲Ｓの相対的標準化頻度（Ｉｓｏｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＩＳＯＹ８００１０６  ヘリックス末端の相対的標準化頻度（Ｉｓｏｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＩＳＯＹ８００１０７  ２重屈曲の相対的標準化頻度（Ｉｓｏｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＩＳＯＹ８００１０８  コイルの相対的標準化頻度（Ｉｓｏｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＪＡＮＪ７８０１０１  平均最近接包絡面積（Ｊａｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８）；ＪＡＮＪ７８０１０２  埋込残基のパーセンテージ（Ｊａｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８）；ＪＡＮＪ７８０１０３  露出残基のパーセンテージ（Ｊａｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８）；ＪＡＮＪ７９０１０１  埋込および接触可能モル分率の比（Ｊａｎｉｎ，  １９７９）；ＪＡＮＪ７９０１０２  移動自由エネルギー（Ｊａｎｉｎ，  １９７９）；ＪＯＮＤ７５０１０１  疎水性（Ｊｏｎｅｓ，  １９７５）；ＪＯＮＤ７５０１０２  ｐＫ  （−ＣＯＯＨ）  （Ｊｏｎｅｓ，  １９７５）；ＪＯＮＤ９２０１０１  相対的出現頻度（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）；ＪＯＮＤ９２０１０２  相対的突然変異性（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）、ＪＵＫＴ７５０１０１  アミノ酸分布（Ｊｕｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７５）；ＪＵＮＪ７８０１０１  配列頻度（Ｊｕｎｇｃｋ，  １９７８）；ＫＡＮＭ８００１０１  ヘリックスの平均相対的可能性（Ｋａ���ｅｈｉｓａ−Ｔｓｏｎｇ，  １９８０）；ＫＡＮＭ８００１０２  ベータシートの平均相対的可能性（Ｋａｎｅｈｉｓａ−Ｔｓｏｎｇ，  １９８０）；ＫＡＮＭ８００１０３  内部ヘリックスの平均相対的可能性（Ｋａｎｅｈｉｓａ−Ｔｓｏｎｇ，  １９８０）；ＫＡＮＭ８００１０４  内部ベータシートの平均相対的可能性（Ｋａｎｅｈｉｓａ−Ｔｓｏｎｇ，  １９８０）；ＫＡＲＰ８５０１０１  強固な隣接物がないことについての可動性パラメーター（Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ，  １９８５）；ＫＡＲＰ８５０１０２  １つの強固な隣接物についての可動性パラメーター（Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ，  １９８５）；ＫＡＲＰ８５０１０３  ２つの強固な隣接物についての可動性パラメーター（Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ，  １９８５）；ＫＨＡＧ８００１０１  カー定数インクリメント（Ｋｈａｎａｒｉａｎ−Ｍｏｏｒｅ，  １９８０）；ＫＬＥＰ８４０１０１  正味の電荷（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４）；ＫＲＩＷ７１０１０１  側鎖相互作用パラメーター（Ｋｒｉｇｂａｕｍ−Ｒｕｂｉｎ，  １９７１）；ＫＲＩＷ７９０１０１  側鎖相互作用パラメーター（Ｋｒｉｇｂａｕｍ−Ｋｏｍｏｒｉｙａ，  １９７９）；ＫＲＩＷ７９０１０２  水によって占められる部位の画分（Ｋｒｉｇｂａｕｍ−Ｋｏｍｏｒｉｙａ，  １９７９）；ＫＲＩＷ７９０１０３  側鎖体積（Ｋｒｉｇｂａｕｍ−Ｋｏｍｏｒｉｙａ，  １９７９）；ＫＹＴＪ８２０１０１  ヒドロパシー指標（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  １９８２）；ＬＡＷＥ８４０１０１  移動自由エネルギー、ＣＨＰ／水（Ｌａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４）；ＬＥＶＭ７６０１０１  疎水性パラメーター（Ｌｅｖｉｔｔ，  １９７６）；ＬＥＶＭ７６０１０２  側鎖のＣ−アルファおよび重心の間の距離（Ｌｅｖｉｔｔ，  １９７６）；ＬＥＶＭ７６０１０３  側鎖角度シータ（ＡＡＲ）（Ｌｅｖｉｔｔ，  １９７６）；ＬＥＶＭ７６０１０４  側鎖ねじれ角ファイ（ＡＡＡＲ）（Ｌｅｖｉｔｔ，  １９７６）；ＬＥＶＭ７６０１０５  側鎖の回転半径（Ｌｅｖｉｔｔ，  １９７６）；ＬＥＶＭ７６０１０６  ファンデルワールスパラメーターＲ０（Ｌｅｖｉｔｔ，  １９７６）、ＬＥＶＭ７６０１０７  ファンデルワールスパラメーターイプシロン（Ｌｅｖｉｔｔ，  １９７６）；ＬＥＶＭ７８０１０１  重要性を有するアルファヘリックスの標準化頻度（Ｌｅｖｉｔｔ，  １９７８）；ＬＥＶＭ７８０１０２  重要性を有するベータシートの標準化頻度（Ｌｅｖｉｔｔ，  １９７８）；ＬＥＶＭ７８０１０３  重要性を有する逆ターンの標準化頻度（Ｌｅｖｉｔｔ，  １９７８）；ＬＥＶＭ７８０１０４  重要と考えられないアルファヘリックスの標準化頻度（Ｌｅｖｉｔｔ，  １９７８）；ＬＥＶＭ７８０１０５  重要と考えられないベータシートの標準化頻度（Ｌｅｖｉｔｔ，  １９７８）；ＬＥＶＭ７８０１０６  重要と考えられない逆ターンの標準化頻度（Ｌｅｖｉｔｔ，  １９７８）；ＬＥＷＰ７１０１０１  ベータ屈曲における存在の頻度（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７１）；ＬＩＦＳ７９０１０１  すべてのベータストランドについての立体構造選択（Ｌｉｆｓｏｎ−Ｓａｎｄｅｒ，  １９７９）；ＬＩＦＳ７９０１０２  パラレルベータストラン���についての立体構造選択（Ｌｉｆｓｏｎ−Ｓａｎｄｅｒ，  １９７９）；ＬＩＦＳ７９０１０３  アンチパラレルベータストランドについての立体構造選択（Ｌｉｆｓｏｎ−Ｓａｎｄｅｒ，  １９７９）；ＭＡＮＰ７８０１０１  平均周囲疎水性（Ｍａｎａｖａｌａｎ−Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ，  １９７８）；ＭＡＸＦ７６０１０１  アルファヘリックスの標準化頻度（Ｍａｘｆｉｅｌｄ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７６）；ＭＡＸＦ７６０１０２  拡張構造の標準化頻度（Ｍａｘｆｉｅｌｄ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７６）；ＭＡＸＦ７６０１０３  ゼータＲの標準化頻度（Ｍａｘｆｉｅｌｄ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７６）；ＭＡＸＦ７６０１０４  左回りのアルファヘリックスの標準化頻度（Ｍａｘｆｉｅｌｄ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７６）；ＭＡＸＦ７６０１０５  ゼータＬの標準化頻度（Ｍａｘｆｉｅｌｄ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７６）；ＭＡＸＦ７６０１０６  アルファ領域の標準化頻度（Ｍａｘｆｉｅｌｄ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７６）；ＭＣＭＴ６４０１０１  Ｊｏｎｅｓ  （１９７５）によって引用される屈折力（ＭｃＭｅｅｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６４）；ＭＥＥＪ８００１０１  ＨＰＬＣ、ｐＨ７．４における保持係数（Ｍｅｅｋ，  １９８０）；ＭＥＥＪ８００１０２  ＨＰＬＣ、ｐＨ２．１における保持係数（Ｍｅｅｋ，  １９８０）；ＭＥＥＪ８１０１０１  ＮａＣｌＯ４における保持係数（Ｍｅｅｋ−Ｒｏｓｓｅｔｔｉ，  １９８１）；ＭＥＥＪ８１０１０２  ＮａＨ２ＰＯ４における保持係数（Ｍｅｅｋ−Ｒｏｓｓｅｔｔｉ，  １９８１）；ＭＥＩＨ８００１０１  Ｃ−アルファについての平均換算距離（Ｍｅｉｒｏｖｉｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＭＥＩＨ８００１０２  側鎖についての平均換算距離（Ｍｅｉｒｏｖｉｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＭＥＩＨ８００１０３  平均側鎖配向角（Ｍｅｉｒｏｖｉｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＭＩＹＳ８５０１０１  有効な分配エネルギー（Ｍｉｙａｚａｗａ−Ｊｅｒｎｉｇａｎ，  １９８５）；ＮＡＧＫ７３０１０１  アルファヘリックスの標準化頻度（Ｎａｇａｎｏ，  １９７３）；ＮＡＧＫ７３０１０２  ベータ構造の標準化頻度（Ｎａｇａｎｏ，  １９７３）、ＮＡＧＫ７３０１０３  コイルの標準化頻度（Ｎａｇａｎｏ，  １９７３）；ＮＡＫＨ９００１０１  総タンパク質のアミノ酸組成（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）；ＮＡＫＨ９００１０２  総タンパク質のアミノ酸組成のＳＤ（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）；ＮＡＫＨ９００１０３  ｍｔ−タンパク質のアミノ酸組成（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）；ＮＡＫＨ９００１０４  ｍｔ−タンパク質の標準化組成（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）；ＮＡＫＨ９００１０５  動物由来のｍｔ−タンパク質のアミノ酸組成（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）；ＮＡＫＨ９００１０６  動物由来の標準化組成（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）；ＮＡＫＨ９００１０７  菌類および植物由来のｍｔ−タンパク質のアミノ酸組成（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）；ＮＡＫＨ９００１０８  菌類および植物由来の標準化組成（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．���  １９９０）；ＮＡＫＨ９００１０９  膜タンパク質のアミノ酸組成（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）；ＮＡＫＨ９００１１０  膜タンパク質の標準化組成（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）；ＮＡＫＨ９００１１１  非ｍｔ−タンパク質の膜貫通領域（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）；ＮＡＫＨ９００１１２  ｍｔ−タンパク質の膜貫通領域（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）；ＮＡＫＨ９００１１３  平均および算出組成の比（Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）；ＮＡＫＨ９２０１０１  １回貫通タンパク質のＣＹＴのアミノ酸組成（Ｎａｋａｓｈｉｍａ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  １９９２）；ＮＡＫＨ９２０１０２  １回貫通タンパク質のＣＹＴ２のアミノ酸組成（Ｎａｋａｓｈｉｍａ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  １９９２）；ＮＡＫＨ９２０１０３  １回貫通タンパク質のＥＸＴのアミノ酸組成（Ｎａｋａｓｈｉｍａ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  １９９２）；ＮＡＫＨ９２０１０４  １回貫通タンパク質のＥＸＴ２のアミノ酸組成（Ｎａｋａｓｈｉｍａ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  １９９２）；ＮＡＫＨ９２０１０５  １回貫通タンパク質のＭＥＭのアミノ酸組成（Ｎａｋａｓｈｉｍａ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  １９９２）；ＮＡＫＨ９２０１０６  複数回貫通タンパク質のＣＹＴのアミノ酸組成（Ｎａｋａｓｈｉｍａ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  １９９２）；ＮＡＫＨ９２０１０７  複数回貫通タンパク質のＥＸＴのアミノ酸組成（Ｎａｋａｓｈｉｍａ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  １９９２）；ＮＡＫＨ９２０１０８  複数回貫通タンパク質のＭＥＭのアミノ酸組成（Ｎａｋａｓｈｉｍａ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  １９９２）；ＮＩＳＫ８００１０１  ８  接触数（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ−Ｏｏｉ，  １９８０）；ＮＩＳＫ８６０１０１  １４  接触数（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ−Ｏｏｉ，  １９８６）；ＮＯＺＹ７１０１０１  移動エネルギー、有機溶媒／水（Ｎｏｚａｋｉ−Ｔａｎｆｏｒｄ，  １９７１）；ＯＯＢＭ７７０１０１  原子当たりの平均非結合エネルギー（Ｏｏｂａｔａｋｅ−Ｏｏｉ，  １９７７）；ＯＯＢＭ７７０１０２  原子当たりの短および中距離非結合エネルギー（Ｏｏｂａｔａｋｅ
−Ｏｏｉ，  １９７７）；ＯＯＢＭ７７０１０３  原子当たりの長距離非結合エネルギー（Ｏｏｂａｔａｋｅ−Ｏｏｉ，  １９７７）、ＯＯＢＭ７７０１０４  残基当たりの平均非結合エネルギー（Ｏｏｂａｔａｋｅ−Ｏｏｉ，  １９７７）；ＯＯＢＭ７７０１０５  残基当たりの短および中距離非結合エネルギー（Ｏｏｂａｔａｋｅ−Ｏｏｉ，  １９７７）；ＯＯＢＭ８５０１０１  最適化ベータ構造コイル平衡定数（Ｏｏｂａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５）；ＯＯＢＭ８５０１０２  逆ターンを形成する最適化傾向（Ｏｏｂａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５）；ＯＯＢＭ８５０１０３  最適化移動エネルギーパラメーター（Ｏｏｂａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５）；ＯＯＢＭ８５０１０４  原子当たりの最適化平均非結合エネルギー（Ｏｏｂａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５）；ＯＯＢＭ８５０１０５  最適化側鎖相互作用パラメーター（Ｏｏｂａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５）；ＰＡＬＪ８１０１０１  ＬＧ由来のアルファヘリックスの標準化頻度  （Ｐａｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）；ＰＡＬＪ８１０１０２ＣＦ由来のアルファヘリックスの標準化頻度（Ｐａｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）；ＰＡＬＪ８１０１０３ＬＧ由来のベータシートの標準化頻度（Ｐａｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）；ＰＡＬＪ８１０１０４  ＣＦ由来のベータシートの標準化頻度（Ｐａｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）；ＰＡＬＪ８１０１０５  ＬＧ由来のターンの標準化頻度（Ｐａｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）；ＰＡＬＪ８１０１０６  ＣＦ由来のターンの標準化頻度（Ｐａｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）；ＰＡＬＪ８１０１０７  全アルファクラスにおけるアルファヘリックスの標準化頻度（Ｐａｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）；ＰＡＬＪ８１０１０８  アルファ＋ベータクラスにおけるアルファヘリックスの標準化頻度（Ｐａｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）；ＰＡＬＪ８１０１０９  アルファ／ベータクラスにおけるアルファヘリックスの標準化頻度（Ｐａｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）；ＰＡＬＪ８１０１１０  全ベータクラスにおけるベータシートの標準化頻度（Ｐａｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）；ＰＡＬＪ８１０１１１  アルファ＋ベータクラスにおけるベータシートの標準化頻度（Ｐａｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）；ＰＡＬＪ８１０１１２  アルファ／ベータクラスにおけるベータシートの標準化頻度（Ｐａｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）；ＰＡＬＪ８１０１１３  全アルファクラスにおけるターンの標準化頻度（Ｐａｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）；ＰＡＬＪ８１０１１４  全ベータクラスにおけるターンの標準化頻度（Ｐａｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）；ＰＡＬＪ８１０１１５  アルファ＋ベータクラスにおけるターンの標準化頻度（Ｐａｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）；ＰＡＬＪ８１０１１６  アルファ／ベータクラスにおけるターンの標準化頻度（Ｐａｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）；ＰＡＲＪ８６０１０１  ＨＰＬＣパラメーター（Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６）；ＰＬＩＶ８１０１０１  分配係数（Ｐｌｉｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）；ＰＯＮＰ８００１０１  フォールド形態における周囲疎水性（Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＰＯＮＰ８００１０２  周囲疎水性におけるの平均増加（Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＰＯＮＰ８００１０３  周囲疎水性におけるの平均増加比（Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＰＯＮＰ８００１０４  アルファヘリックスにおける周囲疎水性（Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＰＯＮＰ８００１０５  ベータシートにおける周囲疎水性（Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＰＯＮＰ８００１０６  ターンにおける周囲疎水性（Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＰＯＮＰ８００１０７  到達性低下比（Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＰＯＮＰ８００１０８  周囲残基の平均数（Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）；ＰＲＡＭ８２０１０１  回帰分析における切片（Ｐｒａｂｈａｋａｒａｎ−Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ，  １９８２）；ＰＲＡＭ８２０１０２  回帰分析ｘ  １．０Ｅ１における傾斜（Ｐｒａｂｈａｋａｒａｎ−Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ，  １９８２）；ＰＲＡＭ８２０１０３  回帰分析における相関係数（Ｐｒａｂｈａｋａｒａｎ−Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ，  １９８２）；ＰＲＡＭ９００１０１  疎水性（Ｐｒａｂｈａｋａｒａｎ，  １９９０）；ＰＲＡＭ９００１０２  アルファヘリックスにおけるの相対的頻度（Ｐｒａｂｈａｋａｒａｎ，  １９９０）；ＰＲＡＭ９００１０３  ベータシートにおける相対的頻度（Ｐｒａｂｈａｋａｒａｎ，  １９９０）；ＰＲＡＭ９００１０４  逆ターンにおける相対的頻度（Ｐｒａｂｈａｋａｒａｎ，  １９９０）；ＰＴＩＯ８３０１０１  ヘリックスコイル平衡定数（Ｐｔｉｔｓｙｎ−Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，  １９８３）；ＰＴＩＯ８３０１０２  ベータコイル平衡定数（Ｐｔｉｔｓｙｎ−Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，  １９８３）；ＱＩＡＮ８８０１０１  −６のウィンドウ位置でのアルファヘリックスについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１０２  −５のウィンドウ位置でのアルファヘリックスについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１０３  −４のウィンドウ位置でのアルファヘリックスについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１０４  −３のウィンドウ位置でのアルファヘリックスについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１０５  −２のウィンドウ位置でのアルファヘリックスについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１０６  −１のウィンドウ位置でのアルファヘリックスについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１０７  ０のウィンドウ位置でのアルファヘリックスについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１０８  １のウィンドウ位置でのアルファヘリックスについてのウエイト  （Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１０９  ２のウィンドウ位置でのアルファヘリックスについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１１０  ���のウィンドウ位置でのアルファヘリックスについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１１１  ４のウィンドウ位置でのアルファヘリックスについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１１２  ５のウィンドウ位置でのアルファヘリックスについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１１３  ６のウィンドウ位置でのアルファヘリックスについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１１４  −６のウィンドウ位置でのベータシートについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１１５  −５のウィンドウ位置でのベータシートについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１１６  −４のウィンドウ位置でのベータシートについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１１７  −３のウィンドウ位置でのベータシートについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１１８  −２のウィンドウ位置でのベータシートについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１１９  −１のウィンドウ位置でのベータシートについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１２０  ０のウィンドウ位置でのベータシートについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１２１  １のウィンドウ位置でのベータシートについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１２２  ２のウィンドウ位置でのベータシートについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１２３  ３のウィンドウ位置でのベータシートについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１２４  ４のウィンドウ位置でのベータシートについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１２５  ５のウィンドウ位置でのベータシートについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１２６  ６のウィンドウ位置でのベータシートについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１２７  −６のウィンドウ位置でのコイルについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１２８  −５のウィンドウ位置でのコイルについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１２９  −４のウィンドウ位置でのコイルについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１３０  −３のウィンドウ位置でのコイルについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１３１  −２のウィンドウ位置でのコイルについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１３２  −１のウィンドウ位置でのコイルについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８���０１３３  ０のウィンドウ位置でのコイルについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１３４  １のウィンドウ位置でのコイルについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１３５  ２のウィンドウ位置でのコイルについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１３６  ３のウィンドウ位置でのコイルについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１３７  ４のウィンドウ位置でのコイルについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１３８  ５のウィンドウ位置でのコイルについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＱＩＡＮ８８０１３９  ６のウィンドウ位置でのコイルについてのウエイト（Ｑｉａｎ−Ｓｅｊｎｏｗｓｋｉ，  １９８８）；ＲＡＣＳ７７０１０１  Ｃ−アルファについてのの平均換算距離（Ｒａｃｋｏｖｓｋｙ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７７）；ＲＡＣＳ７７０１０２  側鎖についての平均換算距離（Ｒａｃｋｏｖｓｋｙ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７７）；ＲＡＣＳ７７０１０３  側鎖の配向性の選択（Ｒａｃｋｏｖｓｋｙ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７７）；ＲＡＣＳ８２０１０１  Ａ０（ｉ）におけるの平均の相対的な断片の存在（Ｒａｃｋｏｖｓｋｙ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９８２）；ＲＡＣＳ８２０１０２  ＡＲ（ｉ）におけるの平均の相対的な断片の存在（Ｒａｃｋｏｖｓｋｙ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９８２）；ＲＡＣＳ８２０１０３  ＡＬ（ｉ）におけるの平均の相対的な断片の存在（Ｒａｃｋｏｖｓｋｙ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９８２）；ＲＡＣＳ８２０１０４  ＥＬ（ｉ）におけるの平均の相対的な断片の存在（Ｒａｃｋｏｖｓｋｙ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９８２）；ＲＡＣＳ８２０１０５  Ｅ０（ｉ）におけるの平均の相対的な断片の存在（Ｒａｃｋｏｖｓｋｙ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９８２）；ＲＡＣＳ８２０１０６  ＥＲ（ｉ）におけるの平均の相対的な断片の存在（Ｒａｃｋｏｖｓｋｙ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９８２）；ＲＡＣＳ８２０１０７  Ａ０（ｉ−１）におけるの平均の相対的な断片の存在（Ｒａｃｋｏｖｓｋｙ−Ｓ
ｃｈｅｒａｇａ，  １９８２）；ＲＡＣＳ８２０１０８  ＡＲ（ｉ−１）におけるの平均の相対的な断片の存在（Ｒａｃｋｏｖｓｋｙ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９８２）；ＲＡＣＳ８２０１０９  ＡＬ（ｉ−１）におけるの平均の相対的な断片の存在（Ｒａｃｋｏｖｓｋｙ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９８２）；ＲＡＣＳ８２０１１０  ＥＬ（ｉ−１）におけるの平均の相対的な断片の存在（Ｒａｃｋｏｖｓｋｙ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９８２）；ＲＡＣＳ８２０１１１  Ｅ０（ｉ−１）におけるの平均の相対的な断片の存在（Ｒａｃｋｏｖｓｋｙ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９８２）；ＲＡＣＳ８２０１１２  ＥＲ（ｉ−１）におけるの平均の相対的な断片の存在（Ｒａｃｋｏｖｓｋｙ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９８２）；ＲＡＣＳ８２０１１３  シータ（ｉ）の値（Ｒａｃｋｏｖｓｋｙ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９８２）；ＲＡＣＳ８２０１１４  シータ（ｉ−１）の値（Ｒａｃｋｏｖｓｋｙ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９８２）；ＲＡＤＡ８８０１０１  ｃｈｘ〜ｗａｔの移動自由エネルギー（Ｒａｄｚｉｃｋａ−Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ，  １９８８）；ＲＡＤＡ８８０１０２  ｏｃｔ〜ｗａｔの移動自由エネルギー（Ｒａｄｚｉｃｋａ−Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ，  １９８８）；ＲＡＤＡ８８０１０３  ｖａｐ〜ｃｈｘの移動自由エネルギー（Ｒａｄｚｉｃｋａ−Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ，  １９８８）；ＲＡＤＡ８８０１０４  ｃｈｘ〜ｏｃｔの移動自由エネルギー（Ｒａｄｚｉｃｋａ−Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ，  １９８８）；ＲＡＤＡ８８０１０５  ｖａｐ〜ｏｃｔの移動自由エネルギー（Ｒａｄｚｉｃｋａ−Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ，  １９８８）；ＲＡＤＡ８８０１０６  最近接包絡面積（Ｒａｄｚｉｃｋａ−Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ，  １９８８）；ＲＡＤＡ８８０１０７  外から内へのエネルギー移動（９５％埋込）（Ｒａｄｚｉｃｋａ−Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ，  １９８８）；ＲＡＤＡ８８０１０８  平均極性（Ｒａｄｚｉｃｋａ−Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ，  １９８８）；ＲＩＣＪ８８０１０１  Ｎ”での相対的な選択値（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９８８）；ＲＩＣＪ８８０１０２  Ｎ’での相対的な選択値（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９８８）；ＲＩＣＪ８８０１０３  Ｎ−ｃａｐでの相対的な選択値（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９８８）；ＲＩＣＪ８８０１０４  Ｎ１での相対的な選択値（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９８８）；ＲＩＣＪ８８０１０５  Ｎ２での相対的な選択値（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９８８）；ＲＩＣＪ８８０１０６  Ｎ３での相対的な選択値（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９８８）；ＲＩＣＪ８８０１０７  Ｎ４での相対的な選択値（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９８８）；ＲＩＣＪ８８０１０８  Ｎ５での相対的な選択値（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９８８）；ＲＩＣＪ８８０１０９  Ｍｉｄでの相対的な選択値（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９８８）；ＲＩＣＪ８８０１１０  Ｃ５での相対的な選択値（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９８８）；ＲＩＣＪ８８０１１１  Ｃ４での相対的な���択値（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９８８）；ＲＩＣＪ８８０１１２  Ｃ３での相対的な選択値（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９８８）；ＲＩＣＪ８８０１１３  Ｃ２での相対的な選択値（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９８８）；ＲＩＣＪ８８０１１４  Ｃ１での相対的な選択値（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９８８）；ＲＩＣＪ８８０１１５  Ｃ−ｃａｐでの相対的な選択値（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９８８）；ＲＩＣＪ８８０１１６  Ｃ’での相対的な選択値（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９８８）；ＲＩＣＪ８８０１１７  Ｃ’’での相対的な選択値（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  １９８８）；ＲＯＢＢ７６０１０１  アルファヘリックスについての情報測定値（Ｒｏｂｓｏｎ−Ｓｕｚｕｋｉ，  １９７６）；ＲＯＢＢ７６０１０２  Ｎ末端ヘリックスについての情報測定値（Ｒｏｂｓｏｎ−Ｓｕｚｕｋｉ，  １９７６）；ＲＯＢＢ７６０１０３  中央のヘリックスについての情報測定値（Ｒｏｂｓｏｎ−Ｓｕｚｕｋｉ，  １９７６）；ＲＯＢＢ７６０１０４  Ｃ末端ヘリックスについての情報測定値（Ｒｏｂｓｏｎ−Ｓｕｚｕｋｉ，  １９７６）；ＲＯＢＢ７６０１０５  拡張についての情報測定値（Ｒｏｂｓｏｎ−Ｓｕｚｕｋｉ，  １９７６）；ＲＯＢＢ７６０１０６  プリーツシートについての情報測定値（Ｒｏｂｓｏｎ−Ｓｕｚｕｋｉ，  １９７６）；ＲＯＢＢ７６０１０７  Ｈ結合を伴わない拡張についての情報測定値（Ｒｏｂｓｏｎ−Ｓｕｚｕｋｉ，  １９７６）；ＲＯＢＢ７６０１０８  ターンについての情報測定値（Ｒｏｂｓｏｎ−Ｓｕｚｕｋｉ，  １９７６）；ＲＯＢＢ７６０１０９  Ｎ末端ターンについての情報測定値（Ｒｏｂｓｏｎ−Ｓｕｚｕｋｉ，  １９７６）；ＲＯＢＢ７６０１１０  中央のターンについての情報測定値（Ｒｏｂｓｏｎ−Ｓｕｚｕｋｉ，  １９７６）；ＲＯＢＢ７６０１１１  Ｃ末端ターンについての情報測定値（Ｒｏｂｓｏｎ−Ｓｕｚｕｋｉ，  １９７６）；ＲＯＢＢ７６０１１２  コイルについての情報測定値（Ｒｏｂｓｏｎ−Ｓｕｚｕｋｉ，  １９７６）；ＲＯＢＢ７６０１１３  ループについての情報測定値（Ｒｏｂｓｏｎ−Ｓｕｚｕｋｉ，  １９７６）；ＲＯＢＢ７９０１０１  水和自由エネルギー（Ｒｏｂｓｏｎ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ，  １９７９）；ＲＯＳＧ８５０１０１  移動によって埋込される平均占有面積（Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５）；ＲＯＳＧ８５０１０２  平均断片エリア損失（Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５）；ＲＯＳＭ８８０１０１  溶媒和について未修正の側鎖ヒドロパシー（Ｒｏｓｅｍａｎ，  １９８８）；ＲＯＳＭ８８０１０２  溶媒和について修正された側鎖ヒドロパシー（Ｒｏｓｅｍａｎ，  １９８８）；ＲＯＳＭ８８０１０３  ヘリックス形成による側鎖ヒドロパシーの損失（Ｒｏｓｅｍａｎ，  １９８８）；ＳＩＭＺ７６０１０１  Ｃｈａｒｔｏｎ−Ｃｈａｒｔｏｎ（１９８２）によって引用される移動自由エネルギー（Ｓｉｍｏｎ，  １９７６）；ＳＮＥＰ６６０１０１  主成分Ｉ（Ｓｎｅａｔｈ，  １９６６）；ＳＮＥＰ６６０１０２  主成分ＩＩ（Ｓｎｅａｔｈ，  １９６６��；ＳＮＥＰ６６０１０３  主成分ＩＩＩ（Ｓｎｅａｔｈ，  １９６６）；ＳＮＥＰ６６０１０４  主成分ＩＶ（Ｓｎｅａｔｈ，  １９６６）；ＳＵＥＭ８４０１０１  ２０ＣでのＺｉｍｍ−Ｂｒａｇｇパラメーター（Ｓｕｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４）；ＳＵＥＭ８４０１０２  Ｚｉｍｍ−Ｂｒａｇｇパラメーター  シグマｘ  １．０Ｅ４（Ｓｕｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４）；ＳＷＥＲ８３０１０１  最適マッチング疎水性（Ｓｗｅｅｔ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，  １９８３）；ＴＡＮＳ７７０１０１  アルファヘリックスの標準化頻度（Ｔａｎａｋａ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７７）；ＴＡＮＳ７７０１０２  単離ヘリックスの標準化頻度（Ｔａｎａｋａ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７７）；ＴＡＮＳ７７０１０３  拡張構造の標準化頻度（Ｔａｎａｋａ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７７）；ＴＡＮＳ７７０１０４  鎖反転Ｒの標準化頻度（Ｔａｎａｋａ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７７）；ＴＡＮＳ７７０１０５  鎖反転Ｓの標準化頻度（Ｔａｎａｋａ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７７）；ＴＡＮＳ７７０１０６  鎖反転Ｄの標準化頻度（Ｔａｎａｋａ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７７）；ＴＡＮＳ７７０１０７  左回りのヘリックスの標準化頻度（Ｔａｎａｋａ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７７）；ＴＡＮＳ７７０１０８  ゼータＲの標準化頻度（Ｔａｎａｋａ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７７）；ＴＡＮＳ７７０１０９  コイルの標準化頻度（Ｔａｎａｋａ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７７）、ＴＡＮＳ７７０１１０  鎖反転の標準化頻度（Ｔａｎａｋａ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７７）；ＶＡＳＭ８３０１０１  立体構造状態Ａの相対的な占有率（Ｖａｓｑｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３）；ＶＡＳＭ８３０１０２  立体構造状態Ｃの相対的な占有率（Ｖａｓｑｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３）；ＶＡＳＭ８３０１０３  立体構造状態Ｅの相対的な占有率（Ｖａｓｑｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３）；ＶＥＬＶ８５０１０１  電子イオン相互作用ポテンシャル（Ｖｅｌｊｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５）；ＶＥＮＴ８４０１０１  苦味（Ｖｅｎａｎｚｉ，  １９８４）；ＶＨＥＧ７９０１０１  親油性相への移動自由エネルギー（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ−Ｂｌｏｍｂｅｒｇ，  １９７９）；ＷＡＲＰ７８０１０１  側鎖原子当たりの平均相互作用（Ｗａｒｍｅ−Ｍｏｒｇａｎ，  １９７８）；ＷＥＢＡ７８０１０１  高塩クロマトグラフィーにおけるＲＦ値（Ｗｅｂｅｒ−Ｌａｃｅｙ，  １９７８）；ＷＥＲＤ７８０１０１  内部に埋込まれる傾向（Ｗｅｒｔｚ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７８）；ＷＥＲＤ７８０１０２  イプシロン（ｉ）〜イプシロン（ｅｘ）の自由エネルギー変化（Ｗｅｒｔｚ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７８）；ＷＥＲＤ７８０１０３  アルファ（Ｒｉ）〜アルファ（Ｒｈ）の自由エネルギー変化（Ｗｅｒｔｚ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７８）；ＷＥＲＤ７８０１０４  イプシロン（ｉ）〜アルファ（Ｒｈ）の自由エネルギー変化（Ｗｅｒｔｚ−Ｓｃｈｅｒａｇａ，  １９７８）；ＷＯＥＣ７３０１０１  極性要求  （Ｗｏｅｓｅ，  １９７３）；ＷＯＬＲ８１０１０１  水和ポテンシャル（Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１）；ＷＯＬＳ８７０１０１  主要な属性値ｚ１（Ｗｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）；ＷＯＬＳ８７０１０２  主要な属性値ｚ２（Ｗｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）；ＷＯＬＳ８７０１０３  主要な属性値ｚ３（Ｗｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）；ＹＵＴＫ８７０１０１  水、ｐＨ７．０における変性ギブズエネルギー（Ｙｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）；ＹＵＴＫ８７０１０２  水、ｐＨ９．０における変性ギブズエネルギー（Ｙｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）；ＹＵＴＫ８７０１０３  変性、ｐＨ７．０の活性化ギブズエネルギー（Ｙｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）；ＹＵＴＫ８７０１０４  変性、ｐＨ９．０の活性化ギブズエネルギー（Ｙｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）；ＺＡＳＢ８２０１０１  イオン強度への分配係数の依存（Ｚａｓｌａｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２）；ＺＩＭＪ６８０１０１  疎水性（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６８）；ＺＩＭＪ６８０１０２  かさばり（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６８）；ＺＩＭＪ６８０１０３  極性（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６８）；ＺＩＭＪ６８０１０４  等電点（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６８）；ＺＩＭＪ６８０１０５  ＲＦランク（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６８）；ＡＵＲＲ９８０１０１  ヘリックス末端Ｎ４’での標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８）；ＡＵＲＲ９８０１０２  ヘリックス末端Ｎ”’での標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８）；ＡＵＲＲ９８０１０３  ヘリックス末端Ｎ”での標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８）；ＡＵＲＲ９８０１０４  ヘリックス末端Ｎ’での標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８）；ＡＵＲＲ９８０１０５  ヘリックス末端Ｎｃでの標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８）；ＡＵＲＲ９８０１０６  ヘリックス末端Ｎ１での標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，１９９８）；ＡＵＲＲ９８０１０７  ヘリックス末端Ｎ２での標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８）；ＡＵＲＲ９８０１０８  ヘリックス末端Ｎ３での標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８
）；ＡＵＲＲ９８０１０９  ヘリックス末端Ｎ４での標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８）；ＡＵＲＲ９８０１１０  ヘリックス末端Ｎ５での標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８）；ＡＵＲＲ９８０１１１  ヘリックス末端Ｃ５での標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８）；ＡＵＲＲ９８０１１２  ヘリックス末端Ｃ４での標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８）；ＡＵＲＲ９８０１１３  ヘリックス末端Ｃ３での標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８）；ＡＵＲＲ９８０１１４  ヘリックス末端Ｃ２での標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８）；ＡＵＲＲ９８０１１５  ヘリックス末端Ｃ１での標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８）；ＡＵＲＲ９８０１１６  ヘリックス末端Ｃｃでの標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８）；ＡＵＲＲ９８０１１７  ヘリックス末端Ｃ’での標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８）；ＡＵＲＲ９８０１１８  ヘリックス末端Ｃ”での標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８）；ＡＵＲＲ９８０１１９  ヘリックス末端Ｃ”’での標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８）；ＡＵＲＲ９８０１２０  ヘリックス末端Ｃ４’での標準化位置的残基頻度（Ａｕｒｏｒａ−Ｒｏｓｅ，  １９９８）；ＯＮＥＫ９００１０１  ０Ｍ尿素に合わせた推定されるペプチドについてのデルタＧ値（Ｏ’Ｎｅｉｌ−ＤｅＧｒａｄｏ，  １９９０）；ＯＮＥＫ９００１０２  ヘリックス形成パラメーター（デルタ  デルタＧ）（Ｏ’Ｎｅｉｌ−ＤｅＧｒａｄｏ，  １９９０）；ＶＩＮＭ９４０１０１  標準化可動性パラメーター（Ｂ−値）、平均（Ｖｉｈｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）；ＶＩＮＭ９４０１０２  強固な隣接物によって囲まれないそれぞれの残基についての標準化可動性パラメーター（Ｂ−値）（Ｖｉｈｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）；ＶＩＮＭ９４０１０３  １つの強固な隣接物によって囲まれるそれぞれの残基についての標準化可動性パラメーター（Ｂ−値）（Ｖｉｈｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）；ＶＩＮＭ９４０１０４  ２つの強固な隣接物によって囲まれるそれぞれの残基についての標準化可動性パラメーター（Ｂ−値）（Ｖｉｈｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）；ＭＵＮＶ９４０１０１  アルファヘリックス立体構造における自由エネルギー（Ｍｕｎｏｚ−Ｓｅｒｒａｎｏ，  １９９４）；ＭＵＮＶ９４０１０２  アルファヘリックス領域における自由エネルギー（Ｍｕｎｏｚ−Ｓｅｒｒａｎｏ，  １９９４）；ＭＵＮＶ９４０１０３  ベータストランド立体構造における自由エネルギー（Ｍｕｎｏｚ−Ｓｅｒｒａｎｏ，  １９９４）；ＭＵＮＶ９４０１０４  ベータストランド領域における自由エネルギー（Ｍｕｎｏｚ−Ｓｅｒｒａｎｏ，  １９９４）；ＭＵＮＶ９４０１０５  ベータストランド領域における自由エネルギー（Ｍｕｎｏｚ−Ｓｅｒｒａｎｏ，  １９９４）、ＷＩＭＷ９６０１０１  二重層界面から水へのＡｃＷｌ−Ｘ−ＬＬペプチドの移動の自由エネルギー（Ｗｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ，  １９９６）；ＫＩＭＣ９３０１０１  熱力学ベータシート傾向（Ｋｉｍ−Ｂｅｒｇ，  １９９３）；ＭＯＮＭ９９０１０１  膜貫通ヘリックスについてのターン傾向スケール（Ｍｏｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）；ＢＬＡＭ９３０１０１  Ｔ４リゾチームにおける位置４４のアルファヘリックス傾向（Ｂｌａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）；ＰＡＲＳ０００１０１  Ｂ値の分布に基づく中温性のタンパク質のｐ値（Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ−Ｍｕｒｔｈｙ，  ２０００）；ＰＡＲＳ０００１０２  Ｂ値の分布に基づく好熱性のタンパク質のｐ値（Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ−Ｍｕｒｔｈｙ，  ２０００）；ＫＵＭＳ０００１０１  好熱性のタンパク質の１８の非重複ファミリーにおけるアミノ酸残基の分布（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）；ＫＵＭＳ０００１０２  中温性のタンパク質の１８の非重複ファミリーにおけるアミノ酸残基の分布（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）；ＫＵＭＳ０００１０３  好熱性のタンパク質におけるアルファヘリックスにおけるアミノ酸残基の分布（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）；ＫＵＭＳ０００１０４  中温性のタンパク質におけるアルファヘリックスにおけるアミノ酸残基の分布（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）；ＴＡＫＫ０１０１０１  タンパク質安定性への側鎖寄与（ｋＪ／ｍｏｌ）（Ｔａｋａｎｏ−Ｙｕｔａｎｉ，  ２００１）；ＦＯＤＭ０２０１０１  ｐｉヘリックス内のアミノ酸の傾向（Ｆｏｄｊｅ−Ａｌ−Ｋａｒａｄａｇｈｉ，  ２００２）；ＮＡＤＨ０１０１０１  二状態モデルにおける自己情報価値に基づくヒドロパシースケール（５％到達性）（Ｎａｄｅｒｉ−Ｍａｎｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）；ＮＡＤＨ０１０１０２  二状態モデルにおける自己情報価値に基づくヒドロパシースケール（９％到達性）（Ｎａｄｅｒｉ−Ｍａｎｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）；ＮＡＤＨ０１０１０３  二状態モデルにおける自己情報価値に基づくヒドロパシースケール（１６％到達性）（Ｎａｄｅｒｉ−Ｍａｎｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）；ＮＡＤＨ０１０１０４  二状態モデルにおける自己情報価値に基づくヒドロパシースケール（２０％到達性）（Ｎａｄｅｒｉ−Ｍａｎｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）；ＮＡＤＨ０１０１０５  二状態モデルにおける自己情報価値に基づくヒドロパシースケール（２５％到達性）（Ｎａｄｅｒｉ−Ｍａｎｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）；ＮＡＤＨ０１０１０６  二状態モデルにおける自己情報価値に基づくヒドロパシースケール（３６％到達性）（Ｎａｄｅｒｉ−Ｍａｎｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）；ＮＡＤＨ０１０１０７  二状態モデルにおける自己情報価値に基づくヒドロパシースケール（５０％到達性）（Ｎａｄｅｒｉ−Ｍａｎｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）；ＭＯＮＭ９９０２０１  膜貫通ヘリックスにおける平均ターン傾向（Ｍｏｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）；ＫＯＥＰ９９０１０１  設計された配列に由来するアルファヘリックス傾向；ＫＯＥＰ９９０１０２  設計された配列に由来するベータシート傾向；ＣＥＤＪ９７０１０１  細胞外タンパク質におけるアミノ酸の組成（パーセント）（Ｃｅｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）；ＣＥＤＪ９７０１０２  固定されたタンパク質���おけるアミノ酸の組成（パーセント）（Ｃｅｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）；ＣＥＤＪ９７０１０３  膜タンパク質におけるアミノ酸の組成（パーセント）（Ｃｅｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）；ＣＥＤＪ９７０１０４  細胞内タンパク質におけるアミノ酸の組成（パーセント）（Ｃｅｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）；ＣＥＤＪ９７０１０５  核タンパク質におけるアミノ酸の組成（パーセント）（Ｃｅｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）；ＦＵＫＳ０１０１０１  好熱菌の細胞内タンパク質におけるアミノ酸の表面組成（パーセント）（Ｆｕｋｕｃｈｉ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  ２００１）；ＦＵＫＳ０１０１０２  中温菌の細胞内タンパク質におけるアミノ酸の表面組成（パーセント）（Ｆｕｋｕｃｈｉ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  ２００１）；ＦＵＫＳ０１０１０３  中温菌の細胞外タンパク質におけるアミノ酸の表面組成（パーセント）（Ｆｕｋｕｃｈｉ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  ２００１）；ＦＵＫＳ０１０１０４  核タンパク質におけるアミノ酸の表面組成（パーセント）（Ｆｕｋｕｃｈｉ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  ２００１）；ＦＵＫＳ０１０１０５  好熱菌の細胞内タンパク質におけるアミノ酸の内部組成（パーセント）（Ｆｕｋｕｃｈｉ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  ２００１）；ＦＵＫＳ０１０１０６  中温菌の細胞内タンパク質におけるアミノ酸の内部組成（パーセント）（Ｆｕｋｕｃｈｉ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  ２００１）；ＦＵＫＳ０１０１０７２  中温菌の細胞外タンパク質におけるアミノ酸の内部組成（パーセント）（Ｆｕｋｕｃｈｉ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  ２００１）；ＦＵＫＳ０１０１０８  核タンパク質におけるアミノ酸の内部組成（パーセント）（Ｆｕｋｕｃｈｉ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  ２００１）；ＦＵＫＳ０１０１０９  好熱菌の細胞内タンパク質におけるアミノ酸の全鎖組成（パーセント）（Ｆｕｋｕｃｈｉ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  ２００１）；ＦＵＫＳ０１０１１０    中温菌の細胞内タンパク質におけるアミノ酸の全鎖組成（パーセント）（Ｆｕｋｕｃｈｉ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  ２００１）；ＦＵＫＳ０１０１１１  中温菌の細胞外タンパク質におけるアミノ酸の全鎖組成（パーセント）（Ｆｕｋｕｃｈｉ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  ２００１）；ＦＵＫＳ０１０１１２  核タンパク質におけるアミノ酸の全鎖組成（パーセント）（Ｆｕｋｕｃｈｉ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，  ２００１）；ＡＶＢＦ０００１０１  スクリーニング係数ガンマ、局所的（Ａｖｂｅｌｊ，  ２０００）；ＡＶＢＦ０００１０２  スクリーニング係数ガンマ、非局所的（Ａｖｂｅｌｊ，  ２０００）；ＡＶＢＦ０００１０３  斜面トリペプチド、ＦＤＰＢ  ＶＦＦ  中性（Ａｖｂｅｌｊ，  ２０００）；ＡＶＢＦ０００１０４  斜面トリペプチド、ＬＤ  ＶＦＦ  中性（Ａｖｂｅｌｊ，  ２０００）；ＡＶＢＦ０００１０５  斜面トリペプチド、ＦＤＰＢ  ＶＦＦ  ノーサイド（Ａｖｂｅｌｊ，  ２０００）；ＡＶＢＦ０００１０６  斜面トリペプチド  ＦＤＰＢ  ＶＦＦ  すべて（Ａｖｂｅｌｊ，  ２０００）；ＡＶＢＦ０００１０７  斜面トリペプチド  ＦＤＰＢ  ＰＡＲＳＥ  中性（Ａｖｂｅｌｊ，  ２０００）；ＡＶＢＦ０００１０８  斜面デカペプチド  ＦＤＰＢ  ＶＦＦ  中性（Ａｖｂｅｌｊ，  ２０００）；ＡＶＢＦ０００１０９  斜面タンパク質、ＦＤＰＢ  ＶＦＦ  中性（Ａｖｂｅｌｊ，  ２０００）；ＹＡＮＪ０２０１０１  ｇａｕｓｓｉａｎ進化的手法による側鎖立体構造（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）；ＭＩＴＳ０２０１０１  両親媒性指標（Ｍｉｔａｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）；ＴＳＡＪ９９０１０１  ＰｒｏｔＯｒを使用する、結晶水を含む体積（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）；ＴＳＡＪ９９０１０２  ＰｒｏｔＯｒを使用する、結晶水を含まない体積；ＣＯＳＩ９４０１０１  電子イオン相互作用ポテンシャル値（Ｃｏｓｉｃ，  １９９４）；ＰＯＮＰ９３０１０１  疎水性スケール（Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ，  １９９３）；ＷＩＬＭ９５０１０１  ０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏを用いるＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ１８における疎水性係数（Ｗｉｌｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５）；ＷＩＬＭ９５０１０２  ０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏを用いるＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ８における疎水性係数（Ｗｉｌｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５）；ＷＩＬＭ９５０１０３  ０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏを用いるＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ４における疎水性係数（Ｗｉｌｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５）；ＷＩＬＭ９５０１０４  ０．１％ＴＦＡ／２−ＰｒＯＨ／ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏを用いるＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ１８における疎水性係数（Ｗｉｌｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５）；ＫＵＨＬ９５０１０１  親水性スケール（Ｋｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）；ＧＵＯＤ８６０１０１  ｐＨ２での保持係数（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６）；ＪＵＲＤ９８０１０１  修飾Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性スケール（Ｊｕｒｅｔｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）；ＢＡＳＵ０５０１０１  接触マトリックスから得られる相互作用スケール（Ｂａｓｔｏｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）；ＢＡＳＵ０５０１０２  単一ドメイン球状タンパク質に対する相関係数の平均を最大限にすることによって得られる相互作用スケール（Ｂａｓｔｏｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）；ＢＡＳＵ０５０１０３  ＴＩＭバレルフォールドを共有する配列のペアに対する相関係数の平均を最大限にすることによって得られる相互作用スケール（Ｂａｓｔｏｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）；ＳＵ
ＹＭ０３０１０１  リンカー傾向指標（Ｓｕｙａｍａ−Ｏｈａｒａ，  ２００３）；ＰＵＮＴ０３０１０１  ＭＰｔｏｐｏデータベースにおける１ｄ＿Ｈｅｌｉｘ由来の情報ベースの膜傾向スケール（Ｐｕｎｔａ−Ｍａｒｉｔａｎ，  ２００３）；ＰＵＮＴ０３０１０２  ＭＰｔｏｐｏデータベースにおける３Ｄ＿Ｈｅｌｉｘ由来の情報ベースの膜傾向スケール（Ｐｕｎｔａ−Ｍａｒｉｔａｎ，  ２００３）；ＧＥＯＲ０３０１０１  すべてのデータセットからのリンカー傾向（Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｅｒｉｎｇａ，  ２００３）；ＧＥＯＲ０３０１０２  １−リンカーデータセットからのリンカー傾向（Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｅｒｉｎｇａ，  ２００３）；ＧＥＯＲ０３０１０３  ２−リンカーデータセットからのリンカー傾向（Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｅｒｉｎｇａ，  ２００３）；ＧＥＯＲ０３０１０４  ３−リンカーデータセットからの（Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｅｒｉｎｇａ，  ２００３）；ＧＥＯＲ０３０１０５  小さなデータセット（リンカー長は６残基未満）からのリンカー傾向（Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｅｒｉｎｇａ，  ２００３）；ＧＥＯＲ０３０１０６  中程度のデータセット（リンカー長は６〜１４残基）からのリンカー傾向（Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｅｒｉｎｇａ，  ２００３）；ＧＥＯＲ０３０１０７  長いデータセット（リンカー長は１４残基を超える）からのリンカー傾向（Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｅｒｉｎｇａ，  ２００３）；ＧＥＯＲ０３０１０８  ヘリックス（ＤＳＳＰによって注釈）データセットからのリンカー傾向（Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｅｒｉｎｇａ，  ２００３）；ＧＥＯＲ０３０１０９  非ヘリックス（ＤＳＳＰによって注釈）データセットからのリンカー傾向（Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｅｒｉｎｇａ，  ２００３）；ＺＨＯＨ０４０１０１  情報ベースの原子−原子ポテンシャルの安定性スケール（Ｚｈｏｕ−Ｚｈｏｕ，  ２００４）；ＺＨＯＨ０４０１０２  突然変異実験から抽出される相対的な安定性スケール（Ｚｈｏｕ−Ｚｈｏｕ，  ２００４）；ＺＨＯＨ０４０１０３  埋没性（ｂｕｒｉａｂｉｌｉｔｙ）（Ｚｈｏｕ−Ｚｈｏｕ，  ２００４）；ＢＡＥＫ０５０１０１  リンカー指標（Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）；ＨＡＲＹ９４０１０１  タンパク質内部に埋込まれる残基の平均体積（Ｈａｒｐａｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）；ＰＯＮＪ９６０１０１  残基の平均体積（Ｐｏｎｔｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）；ＤＩＧＭ０５０１０１  静水圧非対称指標、ＰＡＩ（Ｄｉ  Ｇｉｕｌｉｏ，  ２００５）；ＷＯＬＲ７９０１０１  疎水性指標（Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７９）；ＯＬＳＫ８００１０１  平均内部選択（Ｏｌｓｅｎ，  １９８０）；ＫＩＤＡ８５０１０１  疎水性関連指標（Ｋｉｄｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５）；ＧＵＹＨ８５０１０２  Ｗｅｒｔｚ−Ｓｃｈｅｒａｇａ指標から計算される見かけ上の分配エネルギー（Ｇｕｙ，  １９８５）；ＧＵＹＨ８５０１０３  Ｒｏｂｓｏｎ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ指標から計算される見かけ上の分配エネルギー（Ｇｕｙ，  １９８５）；ＧＵＹＨ８５０１０４  Ｊａｎｉｎ指標から計算される見かけ上の分配エネルギー（Ｇｕｙ，  １９８５）；ＧＵＹＨ８５０１０５  Ｃｈｏｔｈｉａ指標から計算される見かけ上の分配エネルギー（Ｇｕｙ，  １９８５）；ＲＯＳＭ８８０１０４  アミノ酸側鎖、中性形態のヒドロパシー（Ｒｏｓｅｍａｎ，  １９８８）；ＲＯＳＭ８８０１０５  アミノ酸側鎖のヒドロパシー、ｐＨ７．０におけるｐｉ値（Ｒｏｓｅｍａｎ，  １９８８）；ＪＡＣＲ８９０１０１  ＩＦＨスケールからのウエイト（Ｊａｃｏｂｓ−Ｗｈｉｔｅ，  １９８９）；ＣＯＷＲ９００１０１  疎水性指標、３．０ｐＨ（Ｃｏｗａｎ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，  １９９０）、ＢＬＡＳ９１０１０１  側鎖疎水性値（Ｂｌａｃｋ−Ｍｏｕｌｄ，  １９９１）；ＣＡＳＧ９２０１０１  天然のタンパク質構造からの疎水性スケール（Ｃａｓａｒｉ−Ｓｉｐｐｌ，  １９９２）；ＣＯＲＪ８７０１０１  ＮＮＥＩＧ指標（Ｃｏｒｎｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）；ＣＯＲＪ８７０１０２  ＳＷＥＩＧ指標（Ｃｏｒｎｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）；ＣＯＲＪ８７０１０３  ＰＲＩＦＴ指標（Ｃｏｒｎｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）；ＣＯＲＪ８７０１０４  ＰＲＩＬＳ指標（Ｃｏｒｎｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）；ＣＯＲＪ８７０１０５  ＡＬＴＦＴ指標（Ｃｏｒｎｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）、ＣＯＲＪ８７０１０６  ＡＬＴＬＳ指標（Ｃｏｒｎｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）；ＣＯＲＪ８７０１０７  ＴＯＴＦＴ指標（Ｃｏｒｎｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）；ＣＯＲＪ８７０１０８  ＴＯＴＬＳ指標（Ｃｏｒｎｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）；ＭＩＹＳ９９０１０１  Ｂｅｔｈｅ近似によって誘導される相対的分配エネルギー（Ｍｉｙａｚａｗａ−Ｊｅｒｎｉｇａｎ，  １９９９）；ＭＩＹＳ９９０１０２  最適化相対的分配エネルギー−方法Ａ（Ｍｉｙａｚａｗａ−Ｊｅｒｎｉｇａｎ，  １９９９）；ＭＩＹＳ９９０１０３  最適化相対的分配エネルギー−方法Ｂ（Ｍｉｙａｚａｗａ−Ｊｅｒｎｉｇａｎ，  １９９９）；ＭＩＹＳ９９０１０４  最適化相対的分配エネルギー−方法Ｃ（Ｍｉｙａｚａｗａ−Ｊｅｒｎｉｇａｎ，  １９９９）；ＭＩＹＳ９９０１０５  最適化相対的分配エネルギー−方法Ｄ（Ｍｉｙａｚａｗａ−Ｊｅｒｎｉｇａｎ，  １９９９）；ＥＮＧＤ８６０１０１  疎水性指標（Ｅｎｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６）；ならびにＦＡＳＧ８９０１０１  疎水性指標（Ｆａｓｍａｎ，  １９８９）を含むことができる。
【０１０７】
本発明のいくつかの実施形態では、縮退オリゴヌクレオチドは、本発明の１つまたは複数のＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、および／またはＨ３−ＪＨセグメントを合成するために使用される。本発明のある実施形態では、Ｈ３−ＪＨセグメントをコードするオリゴヌクレオチドの５’末端のまたはその近くのコドンは、縮退コドンである。そのような縮退コドンは、５’末端から１番目のコドン、５’末端から２番目のコドン、５’末端から３番目のコドン、５’末端から４番目のコドン、５’末端から５番目のコドン、および／または上記の任意の組み合わせであってもよい。本発明のいくつかの実施形態では、ＤＨセグメントの５’および／または３’末端のまたはその近くの１つまたは複数のコドンは、縮退コドンである。そのような縮退コドンは、５’および／もしくは３’末端から１番目のコドン、５’および／もしくは３’末端から２番目のコドン、５’および／もしくは３’末端から３番目のコドン、５’および／もしくは３’末端から４番目のコドン、５’および／もしくは３’末端から５番目のコドン、ならびに／または上記の任意の組み合わせであってもよい。セグメントをコードするオリゴヌクレオチドのそれぞれにおいて使用される縮退コドンは、理論的セグメントプールおよび／またはＣＤＲＨ３参照セットにおける配列を最適に再現するそれらの能力について選択されてもよい。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本発明は、実施例において記載されるように、Ｈ３−ＪＨセグメントの理論的セグメントプールを産生するための方法を提供する。実施例５において記載されるＮＮダブレットの代わりにまたはそれに加えて、ＮＮＮトリプレットを利用して生成される理論的セグメントプールもまた、これらの理論的セグメントプールからのセグメントを組み込む合成ライブラリーのように、本発明の範囲内にある。いくつかの実施形態では、本発明は、実施例において記載されるように、ＤＨセグメントの理論的セグメントプールを産生するための方法を提供する。特に、たとえば、本発明は、実施例６のＰＹＴＨＯＮプログラムによって記載されるＤＨセグメントの理論的セグメントプールを産生するための方法を提供する。実施例６は、６８Ｋ理論的セグメントプールを産生するためのこのプログラムの適用を記載する。（段階的な欠失後のＤＮＡ配列の最小長＝４塩基；および理論的セグメントプールにおける包含のためのペプチド配列の最小長＝２）。段階的な欠失後のＤＮＡ配列の最小長が１塩基であり、ペプチド配列の最小長が１アミノ酸である代替の実施例が、提供される。他の値をこれらのパラメーターに使用することができることもまた、企図される。たとえば、段階的な欠失後のＤＮＡ配列の最小長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５と設定することができ、理論的セグメントプールにおけるペプチド配列の最小長は、１、２、３、４、または５と設定することができる。
【０１０９】
ＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントを使用するＣＤＲＨ３ライブラリーの設計
本発明のＣＤＲＨ３ライブラリーは、ＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントを含む。したがって、本発明のある実施形態では、ＣＤＲＨ３ライブラリーの全体的な設計は、以下の式によって示すことができる：
［ＴＮ１］−［ＤＨ］−［Ｎ２］−［Ｈ３−ＪＨ］。
【０１１０】
本発明のある実施形態では、合成ＣＤＲＨ３レパートリーは、選択されるＶＨシャーシ配列および重鎖定常領域と相同組換えを介して組み合わせられる。そのため、本発明のある実施形態では、合成ＣＤＲＨ３ライブラリーならびに選択されるシャーシおよび定常領域を含有するベクターの間の相同組換えを促進するために、合成ＣＤＲＨ３ライブラリーの５’および３’末端の側面に位置するＤＮＡ配列を含むことは望ましくてもよい。ある実施形態では、ベクターはまた、ＩＧＨＪ遺伝子（つまりＦＲＭ４−ＪＨ）の非切断型領域の少なくとも１つの一部分をコードする配列を含有する。したがって、Ｎ末端配列をコードするポリヌクレオチド（たとえばＣＡ（Ｋ／Ｒ／Ｔ））は、合成ＣＤＲＨ３配列に追加されてもよく、Ｎ末端ポリヌクレオチドは、シャーシのＦＲＭ３と相同であり、一方、Ｃ末端配列をコードするポリヌクレオチド（たとえばＷＧ（Ｑ／Ｒ／Ｋ）Ｇ）が、合成ＣＤＲＨ３に追加されていてもよく、Ｃ末端ポリヌクレオチドは、ＦＲＭ４−ＪＨと相同である。配列ＷＧ（Ｑ／Ｒ）Ｇが、例示的な本実施形態において示されるが、ＦＲＭ４−ＪＨにおけるこの配列に対してＣ末端のさらなるアミノ酸もまた、Ｃ末端配列をコードするポリヌクレオチドにおいて含まれてもよい。Ｎ末端およびＣ末端配列をコードするポリヌクレオチドの目的は、この場合、相同組換えを促進することであり、当業者は、これらの配列が、下記に示されるものよりも長くてもよいまたは短くてもよいことを認識するであろう。したがって、本発明のある実施形態では、選択されるシャーシとの相同組換えを促進するのに必要な配列を含むＣＤＲＨ３レパートリーの全体的な設計は、以下の式によって示すことができる（ベクターと相同な領域に下線を引く）：
CA[R/K/T]-[TN1]-[DH]-[N2]-[H3-JH]-[WG(Q/R/K)G]。
【０１１１】
本発明のいくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３レパートリーは、以下の式によって示すことができ、これは、上記の設計図において提示されるＴ残基を除く：
CA[R/K]-[TN1]-[DH]-[N2]-[H3-JH]-[WG(Q/R/K)G]。
【０１１２】
Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子の集合について記載する参考文献は、それぞれ、その全体が参照によって組み込まれるＳｃａｖｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，  １９９９，  １６：  ２４３およびＲｕｉｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ，  １９９９，  １６：  １７３を含む。相同組換えは、本発明のライブラリーを産生するための１つの方法であるが、当業者は、ライゲーションもしくは部位特異的組換えなどのようなＤＮＡ構築および／またはＤＮＡ合成のその他の方法を、本発明のライブラリーを産生するために使用することができることを容易に認識するであろう。
【０１１３】
ＣＤＲＨ３長
セグメントの長さもまた、たとえば、ＣＤＲＨ３長の特定の分布を有するライブラリーを産生するために多様化されてもよい。本発明の一実施形態では、Ｈ３−ＪＨセグメントは、約０〜約１０アミノ酸長であり、ＤＨセグメントは、約０〜約１２アミノ酸長であり、ＴＮ１セグメントは、約０〜約４アミノ酸長であり、Ｎ２セグメントは、約０〜約４アミノ酸長である。ある実施形態では、Ｈ３−ＪＨセグメントは、少なくとも約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および／または１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ＤＨセグメントは、少なくとも約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および／または１２アミノ酸長である。ある実施形態では、ＴＮ１セグメントは、少なくとも約０、１、２、３、または４アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、Ｎ２アミノ酸は、少なくとも約０、１、２、３、または４アミノ酸長である。本発明のある実施形態では、ＣＤＲＨ３は、約２〜約３５、約２〜約２８、または約５〜約２６アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および／または３５アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、本発明のセグメントまたはＣＤＲＨ３のいずれかの長さは、アミノ酸の特定の数未満であってもよく、アミノ酸の数は、それぞれのセグメントまたはＣＤＲＨ３について上記に提供される整数のいずれか１つを使用して定められる。本発明のある実施形態では、特定の数の範囲は、包含的なまたは排他的な範囲の下限および上限として、上記に提供される整数のいずれか２つを使用して定められる。上限および下限を定める、提供される整数の組み合わせはすべて、企図される。
【０１１４】
ＣＤＲＬ３ライブラリーの設計
ＣＤＲＬ３ライブラリーの設計および軽鎖配列は、米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号および第２０１０／００５６３８６号ならびに国際公開番号ＷＯ／２００９／０３６３７９において詳細に記載されており、それぞれ、その全体が参照によって組み込まれ、そのため、本明細書で簡潔に記載されるのみである。本明細書において記載されるライブラリーは、同様の原理に従って設計されるが、３つの重要な差異を伴う、すなわち、本発明のライブラリーは、（１）ＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ２における多様性、（２）フレームワーク領域における多様性、ならびに／または（３）上記に定義されるように、ヒト生殖系列様ＣＤＲＬ３配列に厳密に類似するＣＤＲＬ３を有する軽鎖ライブラリーを産生するように設計されるＣＤＲＬ３における多様性（表１）を含有する。
【０１１５】
本発明のＣＤＲＬ３ライブラリーは。ＶＫＣＤＲ３ライブラリーおよび／またはＶλＣＤＲ３ライブラリーであってもよい。本発明のある実施形態では、ＶＬ配列内の定められる位置での特定のアミノ酸の存在のパターンは、公的に入手可能なデータまたは他のデータベース、たとえばＮＣＢＩデータベースを分析することによって決定される（たとえば国際公開番号ＷＯ／２００９／０３６３７９を参照されたい）。本発明のある実施形態では、これらの配列は、同一性に基づいて比較され、それらが由来する生殖系列遺伝子にファミリーに割り当てられる。次いで、それぞれの生殖系列ファミリーにおける、配列のそれぞれの位置でのアミノ酸組成は、決定されてもよい。このプロセスは、本明細書において提供される実施例において例証される。
【０１１６】
フレームワーク多様性を有する軽鎖
いくつかの実施形態では、本発明は、軽鎖可変ドメインが、１つまたは複数のフレームワーク位置２、４、３６、４６、４８、４９、および６６で異なる、軽鎖可変ドメインのライブラリーを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列が１つまたは複数の位置２、４、３６、４６、４８、４９、および６６での置換を除いて互いに同一である、少なくとも複数の軽鎖可変ドメインを含む、軽鎖可変ドメインのライブラリーを提供する。ある実施形態では、本発明は、アミノ酸配列が、本明細書において開示される軽鎖可変ドメイン配列のいずれかの少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または９９．５％であり、１つまたは複数の位置２、４、３６、４６、４８、４９、および６６に置換をさらに有する、少なくとも複数の軽鎖可変ドメインを含む軽鎖可変ドメインのライブラリーを提供する。いくつかの実施形態では、これらの位置における包含のために選択されるアミノ酸は、軽鎖可変ドメインの参照セットにおける相当する位置で約２、３、４、５、６、７、８、９、および／または１０の最も頻繁に存在するアミノ酸の中から選択される。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本発明は、軽鎖可変ドメインにおいて多様化されることとなるフレームワーク位置を選択するための系および方法であって、
（ｉ）軽鎖配列の参照セットを得るステップであって、参照セットは、単一のＩＧＶＬ生殖系列遺伝子において見つけられるもしくはそれによってコードされる配列および／または単一のＩＧＶＬ生殖系列遺伝子の対立遺伝子変異体において見つけられるもしくはそれによってコードされる配列から成る群から選択されるＶＬセグメントを有する軽鎖配列を含有する、ステップ、
（ｉｉ）参照セット内のどのフレームワーク位置が、参照セットにおける配列の１つまたは複数のＣＤＲ位置に存在する多様性の程度に類似する多様性の程度を有するかを決定するステップ（たとえば、フレームワーク位置における多様性は、参照セットにおける配列のＣＤＲ位置に見つけられる多様性の少なくとも約７０％、８０％、９０％、もしくは９５％、１００％、またはそれ以上である）、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において同定されるフレームワーク位置のそれぞれについてのアミノ酸残基の出現頻度を決定するステップ、
（ｉｖ）軽鎖可変ドメインコード配列を合成するステップであって、（ｉｉ）において同定されるフレームワーク位置は、相当する位置に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の最も頻繁に存在するアミノ酸残基（（ｉｉｉ）において同定される）を含むように多様化される、系および方法を提供する。
【０１１８】
当業者は、本開示を理解し、本発明が、重鎖配列のフレームワーク変異体を開発するための類似の方法を提供することを十分に理解するであろう。
【０１１９】
ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２多様性を有する軽鎖
いくつかの実施形態では、本発明は、軽鎖可変ドメインが、１つまたは複数のＣＤＲＬ１位置２８、２９、３０、３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｅ、３１、および３２で異なる、軽鎖可変ドメインのライブラリーを提供する（Ｃｈｏｔｈｉａ−Ｌｅｓｋナンバリング手法；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９８７，  １９６：  ９０１）。いくつかの実施形態では、本発明は、軽鎖可変ドメインが、１つまたは複数のＣＤＲＬ２位置５０、５１、５３、および５５で異なる、軽鎖可変ドメインのライブラリーを提供する。いくつかの実施形態では、これらのＣＤＲＬ１および／またはＣＤＲＬ２位置における包含のために選択されるアミノ酸は、軽鎖可変ドメインの参照セットにおける相当する位置で約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および／または２０の最も頻繁に存在するアミノ酸の中から選択される。いくつかの実施形態では、本発明は、軽鎖可変ドメインにおいて多様化されることとなるＣＤＲＬ１および／またはＣＤＲＬ２位置を選択するための系および方法であって、
（ｉ）軽鎖配列の参照セットを得るステップであって、参照セットは、単一のＩＧＶＬ生殖系列遺伝子において見つけられるもしくはそれによってコードされる配列および単一のＩＧＶＬ生殖系列遺伝子の対立遺伝子変異体において見つけられるもしくはそれによってコードされる配列から成る群から選択されるＶＬセグメントを有する軽鎖配列を含有する、ステップ、
（ｉｉ）どのＣＤＲＬ１および／またはＣＤＲＬ２位置が参照セット内で多様であるかを決定するステップ、
（ｉｉｉ）軽鎖可変ドメインコード配列を合成するステップであって、（ｉｉ）において同定されるＣＤＲＬ１および／またはＣＤＲＬ２位置は、相当する位置に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の最も頻繁に存在するアミノ酸残基を含むように多様化される、系および方法を提供する。当業者は、本開示を理解し、本発明が、重鎖配列のＣＤＲＨ２および／またはＣＤＲＨ２変異体を開発するための類似の方法を提供することを十分に理解するであろう。
【０１２０】
軽鎖配列
いくつかの実施形態では、本発明は、１つまたは複数の、本明細書において提供される軽鎖配列、たとえば表３および／もしくは表４のポリペプチド配列ならびに／または表５、表６、および／もしくは表７のポリヌクレオチド配列のいずれかを含む軽鎖ライブラリーを提供する。当業者は、本明細書において提供されるすべての軽鎖配列が、本発明の機能的な軽鎖ライブラリーを産生するのに必要であるとは限らないことを認識するであろう。そのため、ある実施形態では、本発明の軽鎖ライブラリーは、上記に記載される配列のサブセットを含有するであろう。たとえば、本発明のある実施形態では、本明細書において提供される軽鎖ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド配列の少なくとも約１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０３、１０４、および／または１０５は、ライブラリーに含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のライブラリーは、特定の数未満のポリヌクレオチドまたはポリペプチドセグメントを含有してもよく、セグメントの数は、それぞれのセグメントについて上記に提供される整数のいずれか１つを使用して定められる。本発明のある実施形態では、特定の数の範囲は、包含的なまたは排他的な範囲の下限および上限として、上記に提供される整数のいずれか２つを使用して定められる。上限および下限を定める、提供される整数の組み合わせはすべて、企図される。
【０１２１】
ある実施形態では、本発明は、本明細書において提供される軽鎖配列のセットのいずれか由来の配列の少なくとも約１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を含む軽鎖ライブラリー提供する。たとえば、本発明は、表３、表４、表５、表６、および／または表７において提供される軽鎖配列の少なくとも約１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％含むライブラリーを提供する。本発明のいくつかの実施形態では、特定のパーセンテージの範囲は、包含的なまたは排他的な範囲の下限および上限として、上記に提供されるパーセンテージのいずれか２つを使用して定められる。上限および下限を定める、提供されるパーセンテージの組み合わせはすべて、企図される。
【０１２２】
本発明のいくつかの実施形態では、ライブラリーにおける軽鎖配列の少なくとも約１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％は、本明細書において提供される軽鎖配列である。本発明のある実施形態では、軽鎖ライブラリーから単離される（たとえば、特定の抗原および／または一般的なリガンドに結合することによって）軽鎖配列の少なくとも約１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％は、本明細書において提供される軽鎖配列である。いくつかの実施形態では、本発明の軽鎖ライブラリーは、特定の割合未満の、本明細書において提供される軽鎖配列を含有してもよく、軽鎖配列のパーセンテージは、上記に提供されるパーセンテージのいずれか１つを使用して定義される。本発明のある実施形態では、特定のパーセンテージの範囲は、包含的なまたは排他的な範囲の下限および上限として、上記に提供されるパーセンテージのいずれか２つを使用して定められる。上限および下限を定める、提供されるパーセンテージの組み合わせはすべて、企図される。
【０１２３】
当業者は、本明細書において提供される軽鎖配列を考慮して、指定されるレベルの全体的な配列同一性および／または本明細書において記載される１つもしくは複数の特徴的な配列エレメントを共有する、類似する軽鎖配列を産生することができ、その配列同一性の全体的な程度および／または特徴的な配列エレメントが、一般的な機能的属性を与え得ることをさらに認識するであろう。当業者らは、本明細書において提供される突然変異誘発技術を含めて、そのような関連する配列を調製するための様々な技術に十分に精通しているであろう。そのため、本発明の明示的に列挙される実施形態のそれぞれはまた、本明細書において提供される軽鎖配列のいずれかに特定の同一性パーセントを共有する軽鎖配列を使用して実施することもできる。たとえば、本発明の先に記載されるそれぞれの実施形態は、本明細書において提供される軽鎖配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％同一である軽鎖配列を使用して実施することができる。たとえば、いくつかの実施形態では、本発明によって提供される軽鎖ライブラリーは、本明細書において提供される軽鎖配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％同一である軽鎖可変ドメインを含み、１つまたは複数のフレームワーク位置２、４、３６、４６、４８、４９、および６６、ＣＤＲＬ１位置２８、２９、３０、３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｅ、３１、および３２（Ｃｈｏｔｈｉａ−Ｌｅｓｋナンバリング手法）、ならびに／またはＣＤＲＬ２位置５０、５１、５３、および５５において置換を有する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本発明は、特定のＩＧＶＬ生殖系列遺伝子によってコードされるＣＤＲＬ３の部分内の位置を多様化するための系および方法であって、
（ｉ）軽鎖配列の参照セットを得るステップであって、参照セットは、同じＩＧＶＬ生殖系列遺伝子および／またはその対立遺伝子変異体に由来するＶＬセグメントを有する軽鎖配列を含有するステップ；
（ｉｉ）ＩＧＶＬ遺伝子によってコードされる参照セットにおけるＣＤＲＬ３位置のそれぞれでどのアミノ酸が存在するかを決定するステップ（つまり、位置８９〜９４、包含的）；
（ｉｉｉ）軽鎖可変ドメインコード配列を合成するステップであって、配列をコードするそれぞれの軽鎖可変ドメインにおける２つの位置は、参照セットにおける相当する位置に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の最も頻繁に存在するアミノ酸残基をコードする縮退コドンを含有する、ステップを含む、系および方法を提供する。
【０１２５】
実施例において記載されるように、（ｉｉｉ）の縮退コドンは、それぞれの軽鎖において異なる２つの位置のそれぞれについて参照セットにおいて含有されるアミノ酸多様性を最も再現するように選ぶことができる。最後に、上記に記載される方法および系は、ＣＤＲＬ３に関して記載されるが、当業者は、ＩＧＨＶ遺伝子によって全体的にコードされる重鎖のＣＤＲＨ１および／またはＣＤＲＨ２に同じ原理を適用することができることを容易に認識するであろう。
【０１２６】
ＣＤＲＬ３長
いくつかの実施形態では、もう１つの方法としてまたは本明細書において記載される他の特徴に加えて、本発明は、ＣＤＲＬ３の長さが異なっていてもよいライブラリーを提供する。そのため、本発明は、とりわけ、特定の分布のＣＤＲＬ３長を有するライブラリーを提供する。長さが８、９、および１０のＣＤＲＬ３ライブラリーが例示されるが、当業者は、本明細書において記載される方法を、これもまた本発明の範囲内にある、異なる長さ（たとえば約５、６、７、１１、１２、１３、１４、１５、および／または１６）のＣＤＲＬ３を有する軽鎖を産生するために適用することができることを容易に認識するであろう。いくつかの実施形態では、本発明のＣＤＲＬ３のいずれかの長さは、アミノ酸の特定の数未満であってもよく、アミノ酸の数は、上記に提供される整数のいずれか１つを使用して定義される。本発明のいくつかの実施形態では、特定の数の範囲は、包含的なまたは排他的な範囲の下限および上限として、上記に提供される整数のいずれか２つを使用して定められる。上限および下限を定める、提供される整数の組み合わせはすべて、企図される。
【０１２７】
合成抗体ライブラリー
本発明のいくつかの実施形態では、提供されるライブラリーは、１つまたは複数の合成ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、提供されるライブラリーは、（ａ）重鎖シャーシポリヌクレオチド；（ｂ）軽鎖シャーシポリヌクレオチド；（ｃ）ＣＤＲ３ポリヌクレオチド；（ｄ）定常ドメインポリヌクレオチド；および（ｅ）その組み合わせから選択される合成ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。当業者らは、そのような合成ポリヌクレオチドが、提供されるライブラリーにおける他の合成または非合成ポリヌクレオチドに連結されてもよいことを十分に理解するであろう。本明細書において提供される合成ポリヌクレオチドは、任意の入手可能な方法によって調製されてもよい。
【０１２８】
たとえば、いくつかの実施形態では、合成ポリヌクレオチドは、Ｆｅｌｄｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０００，  ２８：  ５３４；Ｏｍｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，  １９７８，  １７：  ２３４１；Ｂｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｒｎｅｒ，  ＰＮＡＳ，  １９９２，  ８７：  ６３７８、米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号および第２０１０／００５６３８６号、ならびに国際公開番号ＷＯ／２００９／０３６３７９（それぞれその全体が参照によって組み込まれる）において記載されるように、スプリットプールＤＮＡ合成によって合成することができる。
【０１２９】
本発明のいくつかの実施形態では、ヒトレパートリーにおいて見つけられる可能性のあるＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＪＨ多様性を示すセグメントは、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、コード鎖を代表する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、または非コード鎖を代表する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして新たに合成される。次いで、そのような配列は、シャーシ配列ならびにいくつかの場合ではＦＲＭ４の一部分および定常領域を含有するアクセプターベクターと共に宿主細胞の中に導入することができる。哺乳動物のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡからのプライマーベースのＰＣＲ増幅または哺乳動物のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡからの鋳型特異的なクローニングステップは、用いられる必要はない。
【０１３０】
酵母相同組換えによるライブラリーの構築
ある実施形態では、本発明は、酵母細胞が相同組換えを高効率で促進する本質的な能力を利用する。酵母における相同組換えのメカニズムおよびその出願は、下記に簡潔に記載される（たとえば、それぞれ、その全体が参照によって組み込まれる米国特許第６，４０６，８６３号；第６，４１０，２４６号；第６，４１０，２７１号；第６，６１０，４７２号；および第７，７００，３０２号もまた参照されたい）。
【０１３１】
例証となる実施形態として、相同組換えは、たとえば、高効率で相同組換えを実行するように設計された遺伝的な機構を有する出芽酵母において実行することができる。例示的な出芽酵母株は、ＥＭ９３、ＣＥＮ．ＰＫ２、ＲＭ１１−１ａ、ＹＪＭ７８９、およびＢＪ５４６５を含む。このメカニズムは、染色体修復の目的で進化したと考えられ、「ギャップ修復（ｇａｐ  ｒｅｐａｉｒ）」または「ギャップ充填（ｇａｐ  ｆｉｌｌｉｎｇ）」と呼ばれる。このメカニズムを利用することによって、突然変異は、酵母ゲノムの特定の座の中に導入することができる。たとえば、突然変異遺伝子を運搬するベクターは、中断されるまたは突然変異させられるように意図される遺伝子の５’および３’オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列に相同な２つの配列セグメントを含有することができる。ベクターはまた、２つの相同なＤＮＡセグメントが側面に位置する栄養酵素対立遺伝子（たとえばＵＲＡ３）および／または抗生物質抵抗性マーカー（たとえばＧｅｎｅｔｉｃｉｎ／Ｇ４１８）などのようなポジティブ選択マーカーをコードしてもよい。他の選択マーカーおよび抗生物質抵抗性マーカーは、当業者に知られている。
【０１３２】
本発明のいくつかの実施形態では、このベクター（たとえばプラスミド）は、直線化され、酵母細胞に形質転換される。２つの相同組換え部位でのプラスミドおよび酵母ゲノムの間の相同組換えを通して、ＤＮＡ内容物の相互交換は、２つの相同な配列セグメントが側面に位置する酵母ゲノムにおける野生型遺伝子および突然変異遺伝子（選択マーカー遺伝子（複数可）を含む）の間で行われる。１つまたは複数の選択マーカーを選択することによって、生存する酵母細胞は、野生型遺伝子が突然変異遺伝子と交換された細胞となるであろう（その全体が参照によって組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｓｔ，  １９９８，  １４：  ３９１）。このメカニズムは、機能ゲノム科学研究についての６，０００の酵母遺伝子またはオープンリーディングフレーム）（ＯＲＦ）すべてにおいて系統的な突然変異を作製するために使用されてきた。交換が相互的であるので、同様のアプローチはまた、プラスミドベクターの中に酵母ゲノムＤＮＡ断片をクローニングするためにもうまく使用されてきた。（その全体が参照によって組み込まれるＩｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  １９９１，  １０９：  ８１）。
【０１３３】
酵母中に存在する内因性相同組換え機構を利用することによって、遺伝子断片または合成オリゴヌクレオチドはまた、ライゲーションステップを伴わないでプラスミドベクターの中にクローニングすることもできる。相同組換えのこの適用において、標的遺伝子断片（つまりプラスミドベクターに挿入されることとなる断片、たとえばＣＤＲ３）が得られる（たとえば、オリゴヌクレオチド合成、ＰＣＲ増幅、他のベクターからの制限消化などによって）。プラスミドベクターの選択される領域に相同なＤＮＡ配列は、標的遺伝子断片の５’および３’末端に追加される。これらの相同な領域は、完全に合成であってもよいまたは相同な配列を組み込むプライマーによる標的遺伝子断片のＰＣＲ増幅を介して追加される。プラスミドベクターは、栄養酵素対立遺伝子（たとえばＵＲＡ３）または抗生物質抵抗性マーカー（たとえばＧｅｎｅｔｉｃｉｎ／Ｇ４１８）などのようなポジティブ選択マーカーを含んでいてもよい。次いで、プラスミドベクターは、標的遺伝子断片と共有される配列相同性の領域の中間に位置する、ユニークな制限切断箇所（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｃｕｔ）によって直線化され、それによって、切断部位で人工ギャップを生成する。直線化されたプラスミドベクターおよびプラスミドベクターに相同な配列が側面に位置する標的遺伝子断片は、酵母宿主株に同時形質転換される。酵母は、次いで、ベクターおよび標的遺伝子断片の間の配列相同性の２つのストレッチを認識し、ギャップでの相同組換えを通してＤＮＡ内容物の相互交換を促進することができる。結果として、標的遺伝子断片は、ライゲーションを伴わないでベクターに挿入される。
【０１３４】
上記に記載される方法はまた、標的遺伝子断片が、たとえば、環状Ｍ１３ファージ由来の形態としてまたは一本鎖オリゴヌクレオチドとして一本鎖ＤＮＡの形態をしている場合にも作用することが示されている（それぞれ、その全体が参照によって組み込まれるＳｉｍｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １９８７，  ７：  ２３２９；  Ｉｖａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １９９６，  １４２：  ６９３；  ａｎｄ  ＤｅＭａｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  ３０：  ５２０．）。したがって、ギャップトベクター（ｇａｐｐｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ）の中に組換えることができる標的の形態は、二本鎖また一本鎖とすることができ、化学合成、ＰＣＲ、制限消化、または他の方法から誘導することができる。
【０１３５】
いくつかの因子が、酵母における相同組換えの効率に作用し得る。たとえば、ギャップ修復の効率は、直線化されたベクターおよび標的遺伝子の両方の側面に位置する相同な配列の長さと関連する。ある実施形態では、約２０以上の塩基対が、相同な配列の長さに使用されてもよく、約８０の塩基対が、ほぼ最適化された結果を示してもよい（それぞれ、その全体が参照によって組み込まれるＨｕａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｓｍｉｄ，  １９９７，  ３８：  ９１；  Ｒａｙｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  ２００２，  １２：  １９０）。本発明のある実施形態では、少なくとも約５、１０、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４  ３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１８７、１９０、または２００の相同な塩基対が、組換えを促進するために使用されてもよい。ある実施形態では、約２０〜約４０の塩基ペアが、利用される。さらに、ベクターおよび遺伝子断片の間の相互交換は、厳密に配列依存性である、つまり、それはフレームシフトを引き起こさない。そのため、ギャップ修復クローニングは、高効率および高精度の両方により遺伝子断片の挿入を確実にする。高効率は、１回の形質転換の試みにおいて同じベクターの中に２、３、またはそれ以上の標的遺伝子断片を同時にクローニングするのを可能にする（その全体が参照によって組み込まれるＲａｙｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １９９９，  ２６：  １３４）。さらに、相同組換えを通しての高精度の配列保存の性質は、直接的な機能的検査のために、選択される遺伝子または遺伝子断片を発現ベクターまたは融合ベクターの中にクローニングするのを可能にする（それぞれ、その全体が参照によって組み込まれるＥｌ−Ｄｅｉｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １９９２，  １：  ４５４９；  Ｉｓｈｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  １９９７，  ９４：  ２４４９）。
【０１３６】
遺伝子断片のライブラリーもまた、相同組換えを使用して、酵母において構築されてきた。たとえば、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーは、ベクターｐＪＧ４−５においてツーハイブリッド融合ライブラリーとして構築された（その全体が参照によって組み込まれるＧｕｉｄｏｔｔｉ  ａｎｄ  Ｚｅｒｖｏｓ，  Ｙｅａｓｔ，  １９９９，  １５：  ７１５）。合計６，０００ペアのＰＣＲプライマーが、酵母ゲノムタンパク質相互作用の研究のための６，０００の知られている酵母ＯＲＦの増幅のために使用されたこともまた報告されている（その全体が参照によって組み込まれるＨｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  １９９７，  ７：  １１６９）。２０００年には、Ｕｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．は、出芽酵母におけるタンパク質間相互作用の包括的分析を行った（その全体が参照によって組み込まれるＵｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２０００，  ４０３：  ６２３）。出芽酵母のタンパク質間相互作用地図は、酵母タンパク質の間のあらゆる組み合わせにおいてツーハイブリッド相互作用を検査するために包括的な系を使用することによって研究され（その全体が参照によって組み込まれるＩｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ２０００，  ９７：  １１４３）、ワクシニアウイルスのゲノムのタンパク質連鎖地図は、この系を使用して研究された（その全体が参照によって組み込まれるＭｃＣｒａｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ２０００，  ９７：  ４８７９）。
【０１３７】
本発明のある実施形態では、合成ＣＤＲ３（重鎖または軽鎖）は、完全長重鎖または軽鎖を形成するために、相同組換えによって重鎖シャーシまたは軽鎖シャーシ、ＦＲＭ４の一部分、および定常領域をコードするベクターに連結されてもよい。本発明のある実施形態では、相同組換えは、酵母細胞において直接実行される。いくつかの実施形態では、そのような方法は、
（ａ）酵母細胞の中に、
（ｉ）重鎖シャーシまたは軽鎖シャーシ、ＦＲＭ４の一部分、および定常領域をコードする、直線化されたベクターであって、直線化の部位が、シャーシのＦＲＭ３の末端および定常領域の最初の間にある、直線化されたベクターならびに
（ｉｉ）直線状で二本鎖のＣＤＲ３挿入ヌクレオチド配列のライブラリーであって、ＣＤＲ３挿入配列のそれぞれが、ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列ならびに相同組換えがベクターおよびＣＤＲ３挿入配列のライブラリーの間で行われるのを可能にするのに、直線化の部位の（ｉ）のベクターの末端に十分に相同である５’および３’フランキング配列を含む、ＣＤＲ３挿入ヌクレオチド配列のライブラリー、を形質転換するステップならびに
（ｂ）完全長重鎖または軽鎖をコードするベクターを産生するために、ＣＤＲ３挿入配列がベクターの中に組み込まれるように、形質転換酵母細胞において、ベクターおよびＣＤＲ３挿入配列の間で相同組換えが行われるのを可能にするステップを含む。
【０１３８】
上記に特定されるように、ＣＤＲ３挿入物は、直線化されたベクターの末端に相同な５’フランキング配列および３’フランキング配列を有してもよい。ＣＤＲ３挿入物および直線化されたベクターが宿主細胞、たとえば酵母細胞の中に導入される場合、ベクターの直線化によって生成された「ギャップ」（直線化部位）は、これらの２つの直線状二本鎖ＤＮＡ（つまりベクターおよび挿入物）の５’および３’末端での相同な配列の組換えを通してＣＤＲ３断片挿入物によって充填される。相同組換えのこの事象を通して、可変ＣＤＲ３挿入物を含む完全長重鎖または軽鎖をコードする環状ベクターのライブラリーが生成される。これらの方法の特定の実例は、実施例において示される。
【０１３９】
続く分析は、たとえば、ベクターの中へのＣＤＲ３配列の正確な挿入をもたらす相同組換えの効率を決定するために実行されてもよい。たとえば、選択された酵母クローンからの直接のＣＤＲ３挿入物のＰＣＲ増幅は、どれだけのクローンが組換えであるかを明らかにしてもよい。ある実施形態では、最低限約９０％の組換えクローンを有するライブラリーが、利用される。ある実施形態では、最小約１％、５％  １０％  １５％  ２０％）２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％ま、たは９９％の組換えクローンを有するライブラリーが、利用される。選択されたクローンの同様のＰＣＲ増幅はまた、挿入物サイズを明らかにしてもよい。
【０１４０】
選択されたクローンにおける挿入物の配列多様性を検証するために、正確なサイズの挿入物を有するＰＣＲ増幅産物は、増幅された領域内で切断するまたは切断しないことが知られている制限酵素を用いて「フィンガープリントされてもよい」。ゲル電気泳動パターンから、分析されたクローンが、同じ同一性のものまたは別個のもしくは様々な同一性のものであるかどうかが決定されてもよい。ＰＣＲ産物はまた、挿入物の同一性およびクローニング手順の適合度を明らかにするために、また、クローンの非依存性および多様性を証明するために、直接、配列決定されてもよい。
【０１４１】
発現系およびスクリーニング系
本明細書において記載された技術のいずれかまたは他の適した技術によって生成されるポリヌクレオチドのライブラリーは、所望の構造および／または活性を有する抗体を同定するために発現させ、スクリーニングすることができる。抗体の発現は、たとえば、無細胞抽出物（およびたとえばリボソームディスプレイ）、ファージディスプレイ、原核細胞（たとえば細菌ディスプレイ）、または真核細胞（たとえば酵母ディスプレイ）を使用して実行することができる。本発明のある実施形態では、抗体ライブラリーは、酵母において発現される。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、無細胞抽出物において発現させることができる鋳型として果たすように操作される。たとえば米国特許第５，３２４，６３７号；第５，４９２，８１７号；第５，６６５，５６３号（それぞれ、その全体が参照によって組み込まれる）において記載されるベクターおよび抽出物は、使用することができ、また、多数が市販で入手可能である。ポリヌクレオチド（つまり遺伝子型）をポリペプチド（つまり表現型）に連結するためのリボソームディスプレイおよび他の無細胞技術、たとえばＰｒｏｆｕｓｉｏｎ（商標）を使用することができる（たとえば、それぞれ、その全体が参照によって組み込まれる米国特許第６，３４８，３１５号；第６，２６１，８０４号；第６，２５８，５５８号；および第６，２１４，５５３号を参照されたい）。
【０１４３】
その代わりにまたはさらに、本発明のポリヌクレオチドは、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ（それぞれ、その全体が参照によって組み込まれるＭｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９８９，  １７８：  ４７６；  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９９１，  ９：  ２７３）によって記載されるものなどのようなＥ．  ｃｏｌｉ発現系において発現させることができる。突然変異タンパク質は、その全体が参照によって組み込まれるＢｅｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９８９，  １７８：  ４７６によって記載されるように、培地へのおよび／または細菌の細胞質への分泌のために発現させることができる。いくつかの実施形態では、ＶＨおよびＶＬをコードする単一ドメインはそれぞれ、ｏｍｐＡ、ｐｈｏＡ、またはｐｅｌＢシグナル配列などのようなシグナル配列をコードする配列の３’末端に付加される（その全体が参照によって組み込まれるＬｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９８７，  １６９：  ４３７９）。これらの遺伝子融合物は、それらが単一のベクターから発現することができるように、ジシストロニック構築物において構築され、それらがリフォールドする、Ｅ．  ｃｏｌｉの細胞周辺腔の中に分泌され、活性形態で回収することができる（その全体が参照によって組み込まれるＳｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９９１，  ９：  ２７３）。たとえば、抗体重鎖遺伝子は、抗体または抗体断片を産生するために抗体軽鎖遺伝子と同時に発現させることができる。
【０１４４】
本発明のいくつかの実施形態では、抗体配列は、米国特許出願公開第２００４／００７２７４０号；米国特許出願公開第２００３／０１０００２３号；および米国特許出願公開第２００３／００３６０９２号（それぞれ、その全体が参照によって組み込まれる）において記載されるように、たとえば分泌シグナルおよび脂質付加成分を使用して、原核生物、たとえばＥ．  ｃｏｌｉの膜表面上に発現される。
【０１４５】
哺乳動物細胞、たとえばミエローマ細胞（たとえばＮＳ／０細胞）、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞などのような高等真核細胞もまた、本発明の抗体の発現のために使用することができる。典型的に、哺乳動物細胞において発現される抗体は、培地の中に分泌されるようにまたは細胞の表面上に発現されるように設計される。抗体または抗体断片は、たとえば、完全な抗体分子としてまたは個々のＶＨおよびＶＬ断片、Ｆａｂ断片、単一ドメインとしてまたは単鎖（ｓｃＦｖ）として産生することができる（その全体が参照によって組み込まれるＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  １９８８，  ８５：  ５８７９）。
【０１４６】
その代わりにまたはさらに、抗体は、たとえばＪｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ２００７，  １０４：  ８２４７（その全体が参照によって組み込まれる）において記載される固定細胞周辺発現（ＡＰＥｘ２ハイブリッド表面ディスプレイ）によってまたはたとえばＭａｚｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２００７，  ２５：  ５６３（その全体が参照によって組み込まれる）において記載される他の固定方法によって発現させ、スクリーニングすることができる
【０１４７】
本発明のいくつかの実施形態では、抗体は、哺乳動物細胞ディスプレイを使用して選択することができる（その全体が参照によって組み込まれるＨｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ２００６，  １０３：  ９６３７）。
【０１４８】
本発明のライブラリーに由来する抗体のスクリーニングは、任意の適切な手段によって実行することができる。たとえば、結合活性は、標準的なイムノアッセイおよび／またはアフィニティークロマトグラフィーによって評価することができる。触媒機能、たとえばタンパク分解性機能についての本発明の抗体のスクリーニングは、標準的なアッセイ、たとえば、米国特許第５，７９８，２０８号（その全体が参照によって組み込まれる）において記載されるヘモグロビンプラークアッセイを使用して達成することができる。候補抗体が治療上の標的に結合する能力の決定は、たとえば、表面プラズモン共鳴に基づいて所与の標的または抗原への抗体の結合速度を測定するＢＩＡＣＯＲＥＴＭ機器を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてアッセイすることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、多くの動物モデルのいずれかを使用して行うことができ、次いで、続いて、ヒトにおいて、必要に応じて試験することができる。細胞ベースの生物学的アッセイもまた、企図される。
【０１４９】
本発明の１つの特徴は、ライブラリーの抗体が発現され、スクリーニングすることができる速さである。本発明のある実施形態では、抗体ライブラリーは、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間未満の倍増時間を有する酵母において発現させることができる。いくつかの実施形態では、倍加時間は、約１〜約３時間、約２〜約４、約３〜約８時間、約３〜約２４、約５〜約２４、約４〜約６、約５〜約２２、約６〜約８、約７〜約２２、約８〜約１０時間、約７〜約２０、約９〜約２０、約９〜約１８、約１１〜約１８、約１１〜約１６、約１３〜約１６、約１６〜約２０、または約２０〜約３０時間である。本発明のある実施形態では、抗体ライブラリーは、約１６〜約２０時間、約８〜約１６時間、または約４〜約８時間の倍加時間を有する酵母において発現される。したがって、本発明の抗体ライブラリーは、抗体ライブラリーを発現し、かつスクリーニングするのに数日かかる、先に知られている技術と比較して、数時間で発現させ、スクリーニングすることができる。哺乳動物細胞におけるそのようなスクリーニングプロセスのスループットにおける制限ステップは、典型的に、単離された細胞の集団を反復して再成長させるのに必要とされる時間であり、これらは、いくつかの場合において、本発明において使用される酵母の倍加時間を超える倍加時間を有する。
【０１５０】
本発明のある実施形態では、ライブラリーの組成物は、１つまたは複数の濃縮ステップ（たとえば、抗原結合、一般的なリガンドへの結合、または他の特性についてのスクリーニングによる）の後に定められてもよい。たとえば、本発明の約ｘ％の配列またはライブラリーを含む組成物を有するライブラリーは、１つまたは複数のスクリーニングステップの後に、本発明の約２ｘ％、３ｘ％、４ｘ％、５ｘ％、６ｘ％、７ｘ％、８ｘ％、９ｘ％、１０ｘ％、２０ｘ％、２５ｘ％、４０ｘ％、５０ｘ％、６０ｘ％  ７５ｘ％、８０ｘ％、９０ｘ％、９５ｘ％、または９９ｘ％の配列またはライブラリーを含有するように濃縮されてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の配列またはライブラリーは、１つまたは複数の濃縮ステップ前のそれらの出現率に比べて、約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１００倍、１，０００倍、またはそれ以上、濃縮されてもよい。本発明のある実施形態では、ライブラリーは、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ３、重鎖、軽鎖、または抗体全体などのような、少なくとも１つのある数の特定のタイプの配列を含有してもよい（たとえば少なくとも約１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、または１０２０）。ある実施形態では、これらの配列は、少なくとも約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、または１０１９のそれぞれの配列を含むライブラリーを提供するために１つまたは複数の濃縮ステップの間に濃縮されてもよい。
【０１５１】
親和性成熟のための突然変異誘発アプローチ
上記に記載されるように、抗体リードは、１つもしくは複数の抗原への結合についてまたは生物学的活性について本発明のライブラリーの抗体をスクリーニングすることを含む選択プロセスを通して同定することができる。これらの抗体リードのコード配列は、最初の抗体リードとの関連において導入される多様性を有する二次ライブラリーを生成するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてさらに突然変異誘発されてもよい。そのような突然変異誘発された抗体リードは、次いで、一次ライブラリーからの最初の抗体リードの選択のために使用される手順に類似する手順に従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて標的抗原への結合または生物学的活性についてさらにスクリーニングすることができる。一次抗体リードのそのような突然変異誘発および選択は、抗原に対する親和性における段階的な増加を有する抗体を産生する哺乳動物において天然に存在する親和性成熟プロセスを有効に模倣する。
【０１５２】
本発明のいくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３領域のみが、突然変異誘発される。本発明のいくつかの実施形態では、可変領域全体が、突然変異誘発される。本発明のいくつかの実施形態では、１つまたは複数のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、および／ＣＤＲＬ３が、突然変異誘発されてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、「軽鎖シャフリング」は、親和性成熟プロトコールの一部として使用されてもよい。ある実施形態では、これは、抗体の親和性および／または生物学的活性を増強する軽鎖を選択するために、多くの軽鎖と１つまたは複数の重鎖を対形成することを含んでいてもよい。本発明のある実施形態では、１つまたは複数の重鎖が対形成することができる軽鎖の数は、少なくとも約２、５、１０、１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０である。本発明のある実施形態では、これらの軽鎖は、プラスミドによってコードされる。本発明のいくつかの実施形態では、軽鎖は、宿主細胞のゲノムの中に統合されてもよい。
【０１５３】
抗体リードのコード配列は、多種多様の方法のいずれかを使用して、突然変異誘発されてもよい。突然変異誘発の方法の例は、部位特異的突然変異誘発、エラープローンＰＣＲ突然変異誘発、カセット突然変異誘発、およびランダムＰＣＲ突然変異誘発を含むが、これらに限定されない。その代わりにまたはさらに、所望の突然変異を有する領域をコードするオリゴヌクレオチドは、合成され、たとえば組換えまたはライゲーションを介して、突然変異誘発されることとなる配列の中に導入することができる。
【０１５４】
部位特異的突然変異誘発または点突然変異誘発は、特定の領域においてＣＤＲ配列を徐々に変化させるために使用されてもよい。たとえば、これは、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発またはＰＣＲを使用することによって、達成されてもよい。たとえば、抗体リードの短い配列は、重鎖もしくは軽鎖領域またはその両方において、合成的に突然変異誘発されたオリゴヌクレオチドと交換されてもよい。そのような方法は、多くのＣＤＲ配列を突然変異誘発するのに効率的でなくてもよいが、特異的な標的タンパク質に対するより高度な親和性を達成するために特定のリードの微調整のために使用されてもよい。
【０１５５】
カセット突然変異誘発は、特異的な領域においてＣＤＲ配列を突然変異誘発するためにその代わりにまたはさらに使用されてもよい。典型的なカセット突然変異誘発では、単一の鋳型の配列ブロックまたは領域は、完全にまたは部分的にランダム化された配列と交換される。しかしながら、得ることができる最大の情報内容は、オリゴヌクレオチドのランダム配列の数によって統計的に制限されてもよい。点突然変異誘発と同様に、この方法もまた、特異的な標的タンパク質に対するより高度な親和性を達成するために、特定のリードの微調整のために使用されてもよい。
【０１５６】
エラープローンＰＣＲまたは「ポイズン」ＰＣＲは、たとえば米国特許第６，１５３，７４５号；Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  １９９２，  ２：  ２８；Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  １９８９，  １：  １１；Ｓｈａｆｉｋｈａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １９９７，  ２３：  ３０４；およびＳｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  １９９４，  ９１：  １０７４７（それぞれ、その全体が参照によって組み込まれる）において記載されるプロトコールに従って、ＣＤＲ配列を突然変異誘発するために使用されてもよい。
【０１５７】
エラープローンＰＣＲのための条件は、たとえば、（ａ）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの機能障害を効率的に誘導する高濃度のＭｎ２＋（たとえば約０．４〜約０．６ｍＭ）および／または（ｂ）鋳型の中への不釣り合いに高濃度の基質の不正確な組み込みを引き起こし、突然変異をもたらす、ＰＣＲ反応における不釣り合いに高濃度の１つのヌクレオチド基質（たとえばｄＧＴＰ）を含む。その代わりにまたはさらに、ＰＣＲサイクルの数、使用されるＤＮＡポリメラーゼの種類、および鋳型の長さなどのような他の因子は、ＰＣＲ産物の中への「間違った」ヌクレオチドの誤取り込みの速度に影響を与え得る。「多様性ＰＣＲランダム突然変異誘発キット」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ（商標））などのような市販で入手可能なキットは、選択された抗体ライブラリーの突然変異誘発のために利用されてもよい。
【０１５８】
ＰＣＲベースの突然変異誘発において使用されるプライマー対は、ある実施形態では、発現ベクターにおける相同組換え部位とマッチする領域を含んでいてもよい。そのような設計は、相同組換えを介して、突然変異誘発の後に、重鎖または軽鎖シャーシベクターの中へのＰＣＲ産物の容易な再導入をして戻すのを可能にする。
【０１５９】
他のＰＣＲベースの突然変異誘発方法もまた、単独でまたは上記に記載されるエラープローンＰＣＲと共に使用することができる。たとえば、ＰＣＲにより増幅されたＣＤＲセグメントは、二本鎖のＤＮＡにおいてニックを生成するために、ＤＮアーゼにより消化されてもよい。これらのニックは、Ｂａｌ  ３１などのような他のエキソヌクレアーゼによってギャップへと拡張することができる。次いで、ギャップは、不釣り合いに高濃度の１つの基質（たとえばｄＧＴＰ）と共に、通常の基質ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＣＴＰの低濃度でＤＮＡ  Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを使用することによってランダム配列によって充填されてもよい。この充填反応は、充填されたギャップ領域において高頻度の突然変異をもたらすはずである。ＤＮアーゼ消化のそのような方法は、所望のＣＤＲセグメントにおいて高頻度の突然変異を生成するために、エラープローンＰＣＲと共に使用されてもよい。
【０１６０】
一次抗体リードから増幅されたＣＤＲまたは抗体セグメントは、プレＢ細胞における突然変異の本質的な能力を利用することによってｉｎ  ｖｉｖｏにおいて突然変異誘発されてもよい。プレＢ細胞におけるＩｇ遺伝子は、高速の突然変異に特に感受性である。プレＢ細胞が増殖すると同時に、Ｉｇプロモーターおよびエンハンサーは、プレＢ細胞環境においてそのような高速の突然変異を促進する。したがって、ＣＤＲ遺伝子セグメントは、ヒトＩｇエンハンサーおよびプロモーターを含有する哺乳動物発現ベクターの中にクローニングされてもよい。そのような構築物は、３８Ｂ９などのようなプレＢ細胞系の中に導入されてもよく、これは、プレＢ細胞においてＶＨおよびＶＬ遺伝子セグメントの突然変異を天然に可能にする（その全体が参照によって組み込まれるＬｉｕ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９９９，  ３６：  ４６１）。突然変異誘発されたＣＤＲセグメントは、培養されたプレＢ細胞系から増幅し、たとえば相同組換えを介してシャーシ含有ベクター（複数可）の中に再導入することができる。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、ライブラリーのスクリーニングから単離されたＣＤＲ「ヒット」は、たとえば縮退コドンまたはトリヌクレオチドを使用して再合成し、ギャップ修復を使用して重鎖または軽鎖ベクターの中に再クローニングすることができる。
【０１６２】
本発明のポリヌクレオチド配列の他の変異体
ある実施形態では、本発明は、本明細書において教示されるポリヌクレオチドとハイブリダイズするまたは本明細書において教示されるポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。たとえば、本明細書において教示されるポリヌクレオチドに、低、中、または高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションおよび洗浄後にハイブリダイズしたままの単離ポリヌクレオチドまたは本明細書において教示されるポリヌクレオチドの相補体は、本発明によって包含される。
【０１６３】
例示的な低ストリンジェンシー条件は、約３７℃での約３０％〜約３５％ホルムアミド、約１Ｍ  ＮａＣｌ、約１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝剤溶液を用いるハイブリダイゼーションおよび約５０℃〜約５５℃での約１×〜約２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中での洗浄を含む。
【０１６４】
例示的な中ストリンジェンシー条件は、約３７℃での約４０％〜約４５％ホルムアミド、約１Ｍ  ＮａＣｌ、約１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションおよび約５５℃〜約６０℃での約０．５×〜約１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。
【０１６５】
例示的な高ストリンジェンシー条件は、約３７℃での約５０％ホルムアミド、約１Ｍ  ＮａＣｌ、約１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションおよび約６０℃〜約６５℃での約０．１×ＳＳＣ中での洗浄を含む。
【０１６６】
任意選択で、洗浄緩衝剤は、約０．１％〜約１％ＳＤＳを含んでいてもよい。
【０１６７】
ハイブリダイゼーションの期間は、一般に、約２４時間未満、通常約４〜約１２時間である。
【０１６８】
本発明のサブライブラリーおよびライブラリーまたはサブライブラリーを含むより大きなライブラリー
本明細書において記載されるライブラリー（たとえばＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３ライブラリー）の組み合わせを含むライブラリーは、本発明によって包含される。本明細書において記載されるライブラリーの一部分を含むサブライブラリーもまた、本発明によって包含されるたとえば、特定の重鎖シャーシのＣＤＲＨ３ライブラリーまたはたとえば長さに基づくＣＤＲＨ３ライブラリーのサブセット）。
【０１６９】
さらに、本発明のライブラリーまたはサブライブラリーのうちの１つを含有するライブラリーもまた、本発明の範囲内にある。たとえば、本発明のある実施形態では、本発明の１つまたは複数のライブラリーまたはサブライブラリーは、より大きなライブラリー（理論的または物理的）内に含有されてもよく、これは、他の手段によって誘導された配列、たとえば、確率的または部位毎に確率的な合成によって誘導された非ヒトまたはヒト配列を含んでいてもよい。本発明のある実施形態では、ポリヌクレオチドライブラリーにおける配列の少なくとも約１％は、配列の他の９９％の組成物に関係なく、本発明のものであってもよい（たとえばＣＤＲＨ３配列、ＣＤＲＬ３配列、ＶＨ配列、ＶＬ配列）。例証のみの目的のために、当業者は、１０７のメンバーが本発明のライブラリーのメンバーである（つまり１％）、合計１０９のメンバーを含有するライブラリーが有用性を有し、本発明のライブラリーのメンバーをそのようなライブラリーから単離することができることを容易に認識するであろう。本発明のいくつかの実施形態では、任意のポリヌクレオチドライブラリーにおける少なくとも約０．００１％、０．０１％  ０．１％  ２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列は、他の配列の組成物に関係なく、本発明のものであってもよい。いくつかの実施形態では、本発明の配列は、他の配列の組成物に関係なく、任意のポリヌクレオチドライブラリーにおける約０．００１％〜約１％、約１％〜約２％、約２％〜約５％、約５％〜約１０％、約１０％〜約１５％、約１５％〜約２０％、約２０％〜約２５％、約２５％〜約３０％、約３０％〜約３５％、約３５％〜約４０％、約４０％〜約４５％、約４５％〜約５０％、約５０％〜約５５％、約５５％〜約６０％、約６０％〜約６５％、約６５％〜約７０％、約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、または約９５％〜約９９％の配列を含んでいてもよい。本発明の１つまたは複数のライブラリーまたはサブライブラリーよりも多様であるが、本発明の１つまたは複数のライブラリーまたはサブライブラリーを効率的にスクリーニングすることができる量の本発明の１つまたは複数のライブラリーまたはサブライブラリーをなお含み、本発明の１つまたは複数のライブラリーまたはサブライブラリーによってコードされる配列を単離することができるライブラリーもまた、本発明の範囲内にある。
【０１７０】
代替の足場
当業者に明らかであるように、本発明によって提供されるＣＤＲＨ３および／またはＣＤＲＬ３ポリペプチドはまた、代替の足場上にディスプレイされてもよい。いくつかのそのような足場は、抗体に匹敵する特異性および親和性を有する分子をもたらすことが示されてきた。例示的な代替の足場は、フィブロネクチン（たとえばＡｄＮｅｃｔｉｎ）、β−サンドイッチ（たとえばｉＭａｂ）、リポカリン（たとえばＡｎｔｉｃａｌｉｎ）、ＥＥＴＩ−ＩＩ／ＡＧＲＰ、ＢＰＴＩ／ＬＡＣＩ−Ｄ１／ＩＴＩ−Ｄ２（たとえばＫｕｎｉｔｚドメイン）、チオレドキシン（たとえばペプチドアプタマー）、プロテインＡ（たとえばＡｆｆｉｂｏｄｙ）、アンキリンリピート（たとえばＤＡＲＰｉｎ）、γＢクリスタリン／ユビキチン（たとえばＡｆｆｉｌｉｎ）、ＣＴＬＤ３（たとえばテトラネクチン）、および（ＬＤＬＲ−Ａモジュール）３（たとえばＡｖｉｍｅｒ）に由来するものを含む。たとえば、代替の足場についてのさらなる情報は、たとえば、それぞれ、その全体が参照によって組み込まれるＢｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００５  ２３：  １２５７およびＳｋｅｒｒａ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ２００７  １８：  ２９５−３０４において提供される。
【０１７１】
本発明のさらなる実施形態
ライブラリーサイズ
本発明のいくつかの実施形態では、ライブラリーは、約１０１〜約１０２０の異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を含む（たとえば抗体、重鎖、ＣＤＲＨ３、軽鎖、および／またはＣＤＲＬ３をコードするまたはそれを含む）。いくつかの実施形態では、本発明のライブラリーは、少なくとも約１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、もしくは１０２０またはそれ以上の異なる抗体、重鎖、ＣＤＲＨ３、軽鎖、および／またはＣＤＲＬ３ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を含むように設計される。いくつかの実施形態では、本発明のライブラリーは、特定の数未満のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を含有してもよく、配列の数は、上記に提供される整数のいずれか１つを使用して定義される。本発明のある実施形態では、特定の数の範囲は、包含的なまたは排他的な範囲の下限および上限として、上記に提供される整数のいずれか２つを使用して定められる。上限および下限を定める、提供される整数の組み合わせはすべて、企図される。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本発明は、ライブラリーのメンバーのほんの一部分が、本明細書において提供される方法、系、および組成物に従って産生されるメンバーであるライブラリーを提供する。本発明のライブラリーの１つの重要な特性は、それらが、長さの多様性および配列の多様性を含むヒト免疫前レパートリーのある種の側面を有利に模倣するということである。当業者は、本発明によって提供されるライブラリーが、本明細書において提供される方法、系、および組成物に従ってライブラリーのメンバーのサブセットが産生されるメンバーである、ライブラリーを含むことを容易に認識するであろう。たとえば、１０６のメンバーが本明細書において提供される方法、系、および組成物に従って産生される１０８のメンバーを含有するライブラリーは、本明細書において提供される方法、系、および組成物に従って産生される１％の配列を含有するであろう。当業者は、１つまたは複数の１０６のメンバーが当技術分野において知られているスクリーニング技術を使用して容易に単離することができることを認識するであろう。そのため、当該ライブラリーは、本発明の範囲内にある。より具体的には、少なくとも約１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％  ６０％  ６５％  ７０％  ７５％  ８０％  ８５％  ９０％  ９５％、または９９％の本明細書において提供されるＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ３、軽鎖、もしくは重鎖、および／または完全長抗体配列を含むライブラリーは、本発明の範囲内にある。少なくとも約１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５の本明細書において提供されるＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ３、軽鎖、重鎖、および／または完全長抗体配列を含むライブラリーもまた、本発明の範囲内にある。
【０１７３】
ヒト免疫前セット
いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＰＳ内に含有される３，５７１の管理されたヒト免疫前抗体配列のセット、それらの相当するＣＤＲＨ３配列（付録Ａ）、ならびに／またはコンピューター読み取り可能な形式のこれらのＣＤＲＨ３配列（ならびに／またはそのＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、および／またはＨ３−ＪＨセグメント）の代理物を含む。ある実施形態では、本発明は、ＣＤＲＨ３ライブラリーを産生するための方法であって、理論的セグメントプール由来の候補セグメント（つまりＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨ）を、ＨＰＳにおけるＣＤＲＨ３配列および／またはＣＤＲＨ３配列の任意の他のレパートリーとマッチさせるステップを含む、方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書において開示される理論的セグメントプール由来の候補セグメントおよび／または物理的ライブラリーへの包含のために選択されるセグメントを含む。
【０１７４】
実施形態
本明細書において記載される方法は、限られた数の対立遺伝子変異体を使用する、Ｈ３−ＪＨおよびＤＨのセグメントの理論的セグメントプールの産生を示すが、当業者は、本明細書において教示される方法が、任意の他の対立遺伝子変異体ならびにすべての非ヒトＩＧＨＪおよびＩＧＨＤ遺伝子を含む任意のＩＧＨＪおよびＩＧＨＤ遺伝子に適用されてもよいことを認識するであろう。その代わりにまたはさらに、本明細書において記載される方法は、たとえば、さらなるＴＮ１および／またはＮ２セグメントを抽出するために、ＣＤＲＨ３配列の任意の参照セットに適用されてもよい。その代わりにまたはさらに、当業者は、本発明の記載される実施形態のそれぞれが、ベクター、ウイルス、または微生物（たとえば酵母もしくは細菌）内でポリヌクレオチドまたはポリペプチドの形態をしていてもよいことを認識するであろう。さらに、本発明が、完全に列挙される合成ライブラリーを含むので、本発明のある実施形態は、コンピューター読み取り可能な形式の、上記に記載される実施形態のいずれかおよびその使用に関する。
【０１７５】
非ヒト抗体ライブラリーもまた、本発明の範囲内にある。
【０１７６】
本開示は、本発明のライブラリーからの、Ｃｙｓ残基、Ｎ結合型グリコシル化モチーフ、脱アミド化モチーフ、および高度に疎水性の配列を含有する配列の除去を記載する。当業者は、これらの基準の１つまたは複数が（つまり必ずしもすべてではない）、本発明の任意のライブラリーから望ましくない配列を除去するために適用することができることを認識するであろう。しかしながら、配列の１つまたは複数のこれらのタイプを含有するライブラリーもまた、本発明の範囲内にある。他の基準もまた、使用することができる；本明細書において記載されるものは、限定的ではない。
【０１７７】
ある実施形態では、本発明は、ライブラリー（理論的、合成、または物理的な実現）内の特定の配列が繰り返される回数が制限されているライブラリーを提供する。たとえば、いくつかの実施形態では、本発明は、ライブラリー（たとえばＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ３、重鎖、軽鎖、完全長抗体）における配列のいずれかの出現頻度が、約２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００未満であるライブラリーを提供する。いくつかの実施形態では、ライブラリーにおける配列のいずれかの出現頻度は、ライブラリーにおける任意の他の配列の出現頻度の倍数未満である、たとえば、ライブラリーにおける任意の他の配列の出現頻度の約２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００倍未満である。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、ライブラリーは、ＣＤＲＨ３配列を産生するために使用されるセグメントのコンビナトリアルな多様性、特に、特定のＣＤＲＨ３配列を産生するために使用することができる非縮退セグメントの組み合わせの数によって定義される。いくつかの実施形態では、この測定基準は、たとえば、ＣＤＲＨ３ライブラリー由来の約２０００、５０００、１００００、２００００、５００００、１０００００、またはそれ以上の配列のサンプルおよびそのライブラリーのＣＤＲＨ３配列を生成するために使用されるセグメントを使用する「セルフマッチング」を使用して計算されてもよい。ある実施形態では、本発明は、ライブラリーにおける少なくとも約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のＣＤＲＨ３配列がセグメントの単一の組み合わせによって形成されてもよいライブラリーを提供する。
【０１７９】
本発明のある実施形態では、統計ブートストラップ分析が、ＣＤＲＨ３参照セットを生成するために使用された。この方法を使用することは好都合となり得るが、それは、本発明のすべての実施形態に必要であるとは限らない。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするようにポリヌクレオチドを選択するための方法および系であって、個々におよび／または他のセグメントとのコンビナトリアル連結の後にある種の制限部位を欠く（または含有する）ポリヌクレオチドセグメントを選択するステップを含む、方法および系を提供する（たとえば実施例９．３．７を参照されたい）。
【０１８１】
本明細書において提供される例示的なライブラリーは、限定的なものではなく、例証のみのために提供される。
【実施例】
【０１８２】
（実施例）
本発明は、限定として解釈されるべきでない以下の実施例によってさらに例証される。本出願の全体にわたって引用されるすべての参考文献、特許、および公開特許出願の内容は、参照によってこれによって組み込まれる。
【０１８３】
一般に、本発明の実施は、その他に示されない限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ技術、免疫学（とりわけ、たとえば抗体技術）発現系（たとえば酵母発現、無細胞発現、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、およびＰＲＯＦＵＳＩＯＮ（商標））、ならびに当技術分野の技術の範囲内にあり、文献において説明される任意の必要な細胞培養の通常の技術を用いる。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｖｏｌｓ．  １  ａｎｄ  ２，  （Ｄ．Ｎ．  Ｇｌｏｖｅｒ，  Ｅｄ．  １９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｍ．Ｊ．  Ｇａｉｔ，  Ｅｄ．  １９８４）；ＰＣＲ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｅａｕｃａｇｅ，  Ｅｄ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９９９）  （Ｅｄｉｔｏｒ）；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｎｅｉｄｌｅ，  Ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９９）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９０）；ＰＣＲ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｂｕｒｋｅ，  Ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ  Ｌｔｄ  （１９９６）；Ｔｈｅ  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：  ＲＴ−ＰＣＲ，  Ｓｉｅｂｅｒｔ，  Ｅｄ．，  Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．  （１９９８）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），  ５１０，  Ｐａｕｌ，  Ｓ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒ  （１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，  １６９），  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，  Ｅｄ．，  Ｉｒｌ  Ｐｒ  （１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｕｂ．  （１９９９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｅｄｓ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９９２）；Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｌｕｂｉｎｉｅｃｋｉ，  Ａ．，  Ｅｄ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｐｕｂ．，  （１９９０）；Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃ．  Ｂａｒｂａｓ  （Ｅｄ．），  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，  （２００１）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，  Ｐ  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  （Ｅｄ．），  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  （２００１）；Ｂｏｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉ���ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９９７，  １５：  ５５３；Ｂｏｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ２０００，  ３２８：  ４３０；米国特許第６，３４８，３１５号においてＰｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されるリボソームディスプレイならびに米国特許第６，２５８，５５８号；第６，２６１，８０４号；および第６，２１４，５５３号においてＳｚｏｓｔａｋ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されるＰｒｏｆｕｓｉｏｎ（商標）；ならびに米国特許出願公開第２００４００５８４０３号Ａ１において記載される細菌細胞周辺発現を参照されたい。この段落において引用される参考文献のそれぞれは、その全体が参照によって組み込まれる。
【０１８４】
Ｋａｂａｔの規則を使用する抗体配列分析ならびにアライメントされたヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を分析するためのプログラムに関するさらなる詳細は、たとえばＪｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２００４，  ２４８：  １１；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９９８，  １０：  １８０１；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９５，  ５１：  １；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  １９９３，  １６：  １；およびＭａｒｔｉｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  １９９６，  ２５：  １３０において見つけられてもよい。この段落において引用される参考文献のそれぞれは、その全体が参照によって組み込まれる。
【０１８５】
Ｃｈｏｔｈｉａの規則を使用する抗体配列分析に関するさらなる詳細は、たとえばＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９８，  ２７８：  ４５７；Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９７，  ６８：  ９；Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９８，  ２７５：  ２６９；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９７，  ２７３：  ９２７．Ｂａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９４，  １：  ９１５；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９２，  ２２７：  ７９９；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  １９８９，  ３４２：  ８７７；およびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９８７，  １９６：  ９０１において見つけられてもよい。ＣＤＲＨ３立体構造のさらなる分析は、Ｓｈｉｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  １９９９，  ４５５：  １８８およびＳｈｉｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  １９９６，  ３９９：  １において見つけられてもよい。Ｃｈｏｔｈｉａの分析に関するさらなる詳細は、たとえばＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ．，  １９８７，  ５２：  ３９９において記載されている。この段落において引用される参考文献のそれぞれは、その全体が参照によって組み込まれる。
【０１８６】
ＣＤＲの接触の問題に関するさらなる詳細は、たとえば、その全体が参照によって組み込まれるＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９６，  ２６２：  ７３２において記載されている。
【０１８７】
本明細書において言及される抗体配列およびデータベースに関するさらなる詳細は、たとえばＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９２，  ２２７：  ７７６、ＶＢＡＳＥ２  （Ｒｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２００５，  ３３：  Ｄ６７１）；ＢＬＡＳＴ  （ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）；ＣＤＨＩＴ  （ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｌｊｃｒｆ．ｅｄｕ／ｃｄ−ｈｉ／）；ＥＭＢＯＳＳ  （ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＥＭＢＯＳＳ／）；ＰＨＹＬＩＰ  （ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｙｌｉｐ．ｈｔｍｌ）；およびＦＡＳＴＡ  （ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ）において見つけられる。この段落において引用される参考文献のそれぞれは、その全体が参照によって組み込まれる。
【０１８８】
軽鎖ライブラリー
実施例１．フレームワークおよび／またはＣＤＲＬ１および／またはＣＤＲＬ２多様性を有する軽鎖ライブラリー
抗体配列における多様性は、ＣＤＲに集中するが、フレームワーク領域におけるある種の残基もまた、抗原認識に影響を及ぼし得るおよび／または親和性を変え得る（それぞれ、その全体が参照によって組み込まれるＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９８９，  ８６：  １００２９；  Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９９２，  ８９：  ４２８５）。これらの残基は、分類されており、たとえば抗体ヒト化のプロセスの間に抗体親和性を改善するフレームワーク置換を行うために使用されてきた（たとえば、参照によってその全体が組み込まれるＦｏｏｔｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９２，  ２２４：  ４８７中の”Ｖｅｒｎｉｅｒ”  ｒｅｓｉｄｕｅｓを参照されたい）。重鎖では、バーニア残基は、Ｋａｂａｔナンバリング残基２、２７〜３０、４７〜４９、６７、６９、７１、７３、７８、９３〜９４、および１０３を含む。軽鎖では、バーニア残基は、Ｋａｂａｔ残基２、４、３５〜３６、４６〜４９、６４、６６、６８〜６９、７１、および９８を含む。バーニア残基数は、カッパおよびラムダ軽鎖の配列について同じである（その全体が参照によって組み込まれるＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９８５，  １８６：  ６５１における表４を参照されたい）。さらに、ＶＬ−ＶＨ界面のフレームワーク位置もまた、親和性に影響を及ぼし得る。重鎖では、界面残基は、Ｋａｂａｔ残基３５、３７、３９、４５、４７、９１、９３、９５、１００、および１０３を含む（その全体が参照によって組み込まれるＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９８５，  １８６：  ６５１）。軽鎖では、界面残基は、Ｋａｂａｔ残基３４、３６、３８  ４４、４６、８７、８９、９１、９６、および９８を含む。
【０１８９】
以下の手順は、多様化されることとなるフレームワーク残基および多様化されるべきアミノ酸を選択するために使用した。
【０１９０】
ａ．ヒトＶＫ軽鎖ＤＮＡ配列の集合は、ＮＣＢＩから得た（ＧＩ番号については国際公開番号ＷＯ／２００９／０３６３７９の付録Ａを参照されたい）。これらの配列は、それらのＶＫ生殖系列セグメントの生殖系列起源に従って分類した。
ｂ．バーニアおよび界面位置のそれぞれでの変異のパターンは、以下のように検査した：
ｉ．式１（その全体が参照によって組み込まれるＭａｋｏｗｓｋｉ  ＆  Ｓｏａｒｅｓ，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  ２００３，  １９：  ４８３からの）は、バーニア位置、界面位置、ＣＤＲＬ１、およびＣＤＲＬ２についての多様性指標を計算するために使用した。
【数１】
2019023247.tif 000005
ここで、ｄは、多様性指標であり、Ｎは、２０、アミノ酸タイプの総数であり、ｐｉは、対象位置でのタイプ「ｉ」のアミノ酸の割合である。総計は、２０のアミノ酸タイプに対して実行する。パラメーターｄは、単一のアミノ酸タイプが所与の位置で観察される場合、０．０５または１／２０のその最小値に至るであろう：ｐｉは、１つのタイプについては１となり、残りすべてについてはゼロとなる。反対に、アミノ酸タイプがすべて同等に可能性が高い（たとえば、ｐｉがすべてのｉについて０．０５である）場合、ｄは、１．０のその最大値に至るであろう。
ｉｉ．バーニア位置および界面位置のそれぞれについての多様性指標は、ＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ２における位置についての多様性指標と比較した。
ｉｉｉ．界面位置は、比較的不変であり、ｄ値は最小の０．０５に非常に近いことが分かり、したがって、改変しなかった。ＣＤＲ位置と同等のまたはそれよりも大きな多様性指標を有するバーニア残基（つまり、図１において提供される特定の実施例について０．０７のまたはそれを上回る）は、変異のための候補として選択した（図１を参照されたい）。これらの位置に含まれるアミノ酸残基は、それぞれの特定のＶＫ生殖系列についてのヒトＶＫ軽鎖の集合における配列におけるその位置において最も頻繁に存在する２〜３のアミノ酸の中から選択した。
ｉｖ．表２は、それぞれの９つの例示される軽鎖生殖系列における変異のために選択された位置を示す。代替のフレームワーク位置は、一次フレームワーク位置未満の多様性指標を有するが、抗原結合に影響を及ぼすように多様性がなお組み込まれてもよい位置を示す。
ｖ．変異のために選択されるフレームワーク位置におけるアミノ酸残基は、以下のように多様化される（表３は、これらの変異体のポリペプチド配列を提供する）。
１．位置２：生殖系列Ｉは、任意選択でＶに変化させた。
２．位置４：生殖系列ＭまたはＬは、任意選択でＬまたはＭに変化させた。いくつかの実施形態では、その逆ではなくＭからＬへの変化は、Ｍが産生、処理、または保存の間に酸化を受け、可能性として抗体の特性を改変し得るので、好ましいくてもよい。
３．位置３６：生殖系列Ｙは、任意選択でＦおよびＨに変化させた。
４．位置４６：生殖系列Ｌは、任意選択でＶに変化させた。
５．位置４８：生殖系列Ｉは、任意選択でＬに変化させた。
６．位置４９：生殖系列Ｙは、任意選択でＳ、Ｆ、およびＨに変化させた。
７．位置６６：生殖系列Ｇは、任意選択でＲおよびＥに変化させた。
【０１９１】
当業者は、上記に概説される手順がまた、Ｖγ生殖系列配列において多様化するための位置を選択するためにも使用することができ、Ｖγ鎖を含有するライブラリーもまた、本発明の範囲内にあることを容易に認識するであろう。
【０１９２】
フレームワーク突然変異に加えて、多様性はまた、ＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ２の中にも導入した。これは、ＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ２におけるどの残基が、上記に使用されるＶＫデータセットにおける特定の生殖系列内で多様であるかを決定し、本発明の合成ライブラリーにおけるＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ２の中に最も頻繁に存在する２〜４の変異体を組み込むことによって実行した。ＶＫ１−５生殖系列のＣＤＲＬ２の位置５０を除いて、これらの代替物は、対立遺伝子変異から生じなかった。表３は、本発明の現在例示されている実施形態についての９つの軽鎖シャーシおよびそれらのフレームワークおよびＣＤＲ  Ｌ１／Ｌ２変異体のポリペプチド配列を示す。変異のために選択されるＣＤＲＬ１／Ｌ２位置におけるアミノ酸残基は、以下のように多様化される（Ｃｈｏｔｈｉａ−Ｌｅｓｋナンバリング方式を使用；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９８７，  １９６：  ９０１）。
１．位置２８：生殖系列ＳまたはＧは、任意選択でＧ、Ａ、またはＤに変化させた。
２．位置２９：生殖系列Ｖは、任意選択でＩに変化させた。
３．位置３０：生殖系列Ｓは、任意選択でＮ、Ｄ、Ｇ、Ｔ、Ａ、またはＲに変化させた。
４．位置３０Ａ：生殖系列Ｈは、任意選択でＹに変化させた。
５．位置３０Ｂ：生殖系列Ｓは、任意選択でＲまたはＴに変化させた。
６．位置３０Ｅ：生殖系列Ｙは、任意選択でＮに変化させた。
７．位置３１：生殖系列Ｓは、任意選択でＤ、Ｒ、Ｉ、Ｎ、またはＴに変化させた。
８．位置３２：
生殖系列ＹまたはＮは、任意選択でＦ、Ｓ、またはＤに変化させた。
９．位置５０：
生殖系列Ａ、Ｄ、またはＧは、任意選択でＧ、Ｓ、Ｅ、Ｋ、またはＤに変化させた。
１０．位置５１：
生殖系列ＧまたはＡは、任意選択でＡ、Ｓ、またはＴに変化させた。
１１．位置５３：
生殖系列ＳまたはＮは、任意選択でＮ、Ｈ、Ｓ、Ｋ、またはＲに変化させた。
１２．位置５５：
生殖系列Ｅは、任意選択でＡまたはＱに変化させた。
【０１９３】
実施例２．ＣＤＲＬ３における多様性が増強した軽鎖ライブラリー
軽鎖ライブラリーを産生するための様々な方法は、当技術分野において知られている（たとえば米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号、第２０１０／００５６３８６号、および国際公開番号ＷＯ／２００９／０３６３７９を参照されたい）。臨床的に検証した抗体配列の分析は、これらの配列が体細胞突然変異前の生殖系列様ＶＬ−ＪＬ（ここで「Ｌ」はカッパまたはラムダ生殖系列配列とすることができる）再配列からのずれをほとんど有していないことを示した（図２）。ここで、生殖系列様再配列は、Ｖ部分もＪ部分もそれぞれの生殖系列遺伝子と異ならない再配列、特定の例の目的のために、ＣＤＲＬ３の長さが８、９、または１０アミノ酸に制限される再配列である（米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号、第２０１０／００５６３８６号、および国際公開番号ＷＯ／２００９／０３６３７９を参照されたい）。しかしながら、ＩＧＨＪＫ１遺伝子については、ＷＴ（Ｔｒｐ−Ｔｈｒ）およびＲＴ（Ａｒｇ−Ｔｈｒ）配列（最初の２つのＮ末端残基）の両方は、「生殖系列様」であると考えられ、したがって、そのような配列を含有する全Ｌ３再配列が「生殖系列様」であると考えられ。そのため、新しい軽鎖ライブラリーは、同時に、（１）上記に定義されるように、生殖系列様配列からのずれを最小限にし、（２）最大の多様性を生成する目的で設計し、構築した。特に、重要な目的は、臨床的に検証された抗体配列によって最も好都合であることが示される多様性のタイプを最大限にすることであった。特に、設計されたライブラリーは、長さがマッチした生殖系列配列と２つ以下のアミノ酸が異なるＣＤＲＬ３配列の多様性を最大限にするよう努めた。
【０１９４】
これは、軽鎖オリゴヌクレオチド設計に「ジャンピング二量体」または「ジャンピング三量体」アプローチを利用することによって達成した。ジャンピング二量体アプローチは、ＶＬセグメントによってコードされるＣＤＲＬ３（Ｌ３−ＶＬ）の６つの位置のそれぞれでの縮退コドンの組み込みを伴う。多くとも２つの位置がそれぞれの個々のＬ３−ＶＬ配列における生殖系列と異なるが、２つの位置は、互いに隣接する必要はない。したがって、ＶＬシャーシ当たりに合成した、設計された縮退オリゴヌクレオチドの総数は、６！／（４！２！）または１５である（それぞれのカッパ生殖系列シャーシについてのＶＬおよびＪＬの間の接合部（位置９６）で最も一般的に存在するアミノ酸のうちの６つを説明する（すなわちＦ、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｗ、Ｙ、およびＰ；位置９６での接合部のアミノ酸についてのより詳細については、それぞれ、その全体が参照によって組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号および第２０１０／００５６３８６号ならびに国際公開番号ＷＯ／２００９／０３６３７９を参照されたい）。ジャンピング三量体アプローチは、ジャンピング二量体アプローチに類似しているが、ジャンピング二量体における２つの代わりに、３つの位置が個々のＬ３−ＶＬ配列における生殖系列と異なっている。ジャンピング二量体および三量体アプローチにおけるそれぞれの位置に選択される縮退コドンは、（１）公的に入手可能なヒトＶＫ配列の知られているレパートリーに含有される多様性を再現するように（国際公開番号ＷＯ／２００９／０３６３７９の付録Ａを参照されたい）ならびに（２）Ｎ結合型グリコシル化モチーフ（ＮＸＳ／ＮＸＴ）、Ｃｙｓ残基、終止コドン、および脱アミド化傾向のあるＮＧモチーフなどのような、結果として生じる合成軽鎖のＣＤＲＬ３内の望ましくない配列を最小限にするまたは削減するように選んだ。表４は、ＶＫ１−３９  ９アミノ酸長および接合部のアミノ酸としてＦまたはＹを有するＣＤＲＬ３配列をコードする１５の縮退オリゴヌクレオチドならびに相当する縮退ポリペプチド配列を示す。表５、表６、および表７は、それぞれ、８、９、および１０のＣＤＲＬ３長についての例示的なジャンピング二量体および三量体ライブラリーのＶＫ配列のそれぞれについてのオリゴヌクレオチド配列ならびに相当するＣＤＲＬ３についての配列を提供する。
【０１９５】
次いで、それぞれの生殖系列ライブラリー内のユニークなＣＤＲＬ３配列の数を数え、３つの長さのそれぞれについて、「ＶＫ−ｖ１．０」と称される異なる軽鎖ライブラリーにおけるユニークなＣＤＲＬ３配列の数と比較した（米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号における実施例６．２を参照されたい）。表８は、それぞれの生殖系列ライブラリーのそれぞれにおけるユニークなＣＤＲＬ３配列の数を提供する。
【０１９６】
図３は、生殖系列様配列（表１）からの突然変異を含有していないまたは生殖系列様配列から１、２、３、もしくは４またはそれ以下の突然変異を含有する、９アミノ酸のＣＤＲＬ３長を有するジャンピング二量体およびＶＫ−ｖ１．０ライブラリーにおける配列のパーセンテージを提供する。天然に存在するＶＫ１−０５配列は、Ｋａｂａｔの位置９５に、Ｓｅｒ（生殖系列アミノ酸タイプ）をＰｒｏとほとんど同じくらい有し、したがって、両方の残基（ＳおよびＰ）は、ＶＫ１−０５レパートリーを示す合成ライブラリーに組み込まれた。しかしながら、表１において示されるように、ＶＫ遺伝子がＶＫ１−０５である場合、Ｓｅｒのみが、この分析の目的のための位置９５の生殖系列様残基であると考えられた。ＶＫ３−２０についてのプロットは、長さ９については、ライブラリーにおける残りのシャーシの代表である。ＶＫ１−０５ライブラリーにおける配列はすべてヒト生殖系列配列の３アミノ酸の範囲内にあり、配列のおよそ６３％は、ヒト生殖系列様配列の２アミノ酸の範囲内にあった。ライブラリーの残りについては、また設計されるように、配列の１００％がヒト生殖系列様配列の２アミノ酸の範囲内にあり、したがって、全体として考慮したジャンピング二量体ライブラリーにおける長さ９の配列の９５％以上は、生殖系列様配列の２アミノ酸の範囲内にあった。比較すると、長さ９アミノ酸のＶＫ−ｖ１．０ライブラリーのメンバーの１６％のみが、相当するヒト生殖系列様配列の２アミノ酸の範囲内にある。長さ８については、ジャンピング二量体ライブラリーにおける配列の約９８％が、ＶＫ−ｖ１．０についての約１９％に対して生殖系列様の２アミノ酸の範囲内にあった。長さ１０については、ジャンピング二量体ライブラリーの配列の９５％以上が、ＶＫ−ｖ１．０についての約８％に対して生殖系列様の２アミノ酸の範囲内にあった。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、フォールドした抗体において溶媒に暴露される可能性が最も高い位置における多様性に集中するために、位置８９および９０（Ｋａｂａｔのナンバリング）は、生殖系列から修飾しない−これらはほとんどの場合ＱＱであるが、配列はＶＫ２−２８シャーシについてはＭＱである。他のＶＫ生殖系列遺伝子は、位置８８〜８９で異なる配列を有し、シャーシとしてのこれらの遺伝子の使用もまた、本発明の範囲内にある。たとえば、ＶＫ１−２７は、ＱＫを有し、ＶＫ１−１７およびＶＫ１−６は両方ともＬＱを有する、などである。これらの位置における配列は、当技術分野において知られており、たとえば、その全体が参照によって組み込まれるＳｃａｖｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，  １９９９，  １６：  ２３４（図２を参照されたい）から得ることができる。
【０１９８】
ＣＤＲＨ３ライブラリー
以下の実施例は、当技術分野において知られているライブラリーと比較して改善されたＣＤＲＨ３配列を有する抗体ライブラリーの設計および合成に有用な方法および組成物を記載する。本発明のＣＤＲＨ３配列は、当技術分野において知られているライブラリーと比較して多様性が増強しているが、ヒト配列の特徴を保持する、合成ＣＤＲＨ３セグメントのコンビナトリアル効率を改善する、ならびに／または合成ＣＤＲＨ３配列および１つもしくは複数の参照セットにおけるヒトＣＤＲＨ３配列の間のマッチングを改善する。
【０１９９】
実施例３．ヒト免疫前ＣＤＲＨ３配列の管理された参照セットの生成
およそ８４，０００のヒトおよびマウス重鎖ＤＮＡ配列を含有するファイルは、ＢＬＡＳＴの公的なリソースからダウンロードした（ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｄｂ／ＦＡＳＴＡ／；ファイル名：ｉｇＳｅｑＮｔ．ｇｚ；ダウンロード日：２００８年８月２９日）。これらのおよそ８４，０００の配列のうち、およそ３４，０００の配列は、配列ヘッダーアノテーション（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｅａｄｅｒ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）の分析に基づいてヒト重鎖配列として同定された。次いで、これらの配列は、以下のようにフィルターにかけた：第１に、配列はすべて、それらの相当する（最も近いマッチの）ＶＨ生殖系列に従ってそれらのＶＨ領域によって分類した。不正確なもしくは不十分な長さであったまたは広範囲な突然変異によりマッチすることができなかった配列は切り捨てた。第２に、それらの相当する生殖系列ＶＨ配列と比較した場合にＤＮＡレベルで５つを超える突然変異を含有するあらゆる配列もまた、切り捨てた。Ｒａｄａ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２００１，  ２０：  ４５７０と一致して、可変領域のＮ末端部分における突然変異（またはその欠如）が、可変領域のＣ末端部分における、特にＣＤＲＨ３における突然変異（またはその欠如）についての保守的な代用物（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）として使用されてもよいことを想定した。ＣＤＲＨ３に対してＮ末端のＶＨにおいて５以下のヌクレオチド突然変異を有する配列のみの選択はまた、少し突然変異しているまたは全く突然変異していない（つまり免疫前の特徴を有する）ＣＤＲＨ３配列を選択する可能性も高い。
【０２００】
残りのＤＮＡ配列をそれらのアミノ酸対応物に翻訳した後、重鎖生殖系列アミノ酸配列を含有する適切なリーディングフレームを同定し、ＣＤＲＨ３の配列を含めて、ＣＤＲの配列を同定するために使用した。この時点で得られたＣＤＲＨ３配列のリストは、少なくとも３つのアミノ酸がセットにおける任意の他の配列と異ならなかった（長さについてのマッチング後に）メンバーを削減するためにさらにフィルターにかけた。このプロセスにより、１１，４１１のＣＤＲＨ３配列がもたらされ、３，５７１の配列は、健康な成人に由来するとして注釈を付け（「健康な免疫前セット」または「ＨＰＳ」；ＧＩ番号については付録Ａを参照されたい）、他の７，８４０の配列は、疾患に罹患している個人に由来するとして注釈を付けたまたは胎児起源のものであったまたは抗原特異的な起源のものであった。次いで、下記に記載される方法は、ＣＤＲＨ３を構成する４つのセグメント：（１）ＴＮ１、（２）ＤＨ、（３）Ｎ２、および（４）Ｈ３−ＪＨにＨＰＳにおける配列のそれぞれをデコンボリューションする（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅ）ために使用した。
【０２０１】
実施例４．理論的セグメントプール由来のセグメントを参照セットにおけるＣＤＲＨ３にマッチさせるための方法
本実施例は、ＨＰＳにおけるＣＤＲＨ３のＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントを同定するために使用される方法を記載する。ヒトＣＤＲＨ３配列の設計および合成に対する現在例示されるアプローチは、ヒト免疫系が免疫前ＣＤＲＨ３レパートリーを生成するセグメントＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子組換えプロセスを模倣する。本明細書で記載されるマッチング方法は、ＣＤＲＨ３の参照セット（たとえばＨＰＳ）にわたって、特定のＣＤＲＨ３を産生するために、どのＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントが使用されているかを決定する。次いで、この情報は、理論的セグメントプール由来のどのＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメント（またはＴＮ１およびＮ２の場合には参照セットにおけるＣＤＲＨ３配列から抽出されたセグメント）が合成ＣＤＲＨ３ライブラリーに含まれるべきかを決定するために、任意選択で、下記に記載される他の情報（たとえば物理化学的特性）と共に使用される。
【０２０２】
マッチング方法に対する入力は、（１）ＣＤＲＨ３配列の参照セット（たとえばＨＰＳにおけるヒトＣＤＲＨ３配列）および（２）複数のＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、および／またはＨ３−ＪＨセグメントを含有する理論的セグメントプールである。理論的セグメントプールのメンバーが生成される方法は、より完全に下記に記載される。参照セットにおけるそれぞれのＣＤＲＨ３について、マッチング方法は、２つの出力を生成する：（ｉ）理論的セグメントプールのセグメントを使用して生成することができる、最も近いマッチしたＣＤＲＨ３配列のリストおよび（ｉｉ）これらの最も近いマッチしたＣＤＲＨ３配列を生成するために使用することができる理論的セグメントプール由来の１つまたは複数のセグメントの組み合わせ。
【０２０３】
マッチング方法は、以下のように実行した：理論的セグメントプールにおけるＴＮ１セグメントはそれぞれ、参照セット由来のＣＤＲＨ３配列の第１のアミノ酸（位置９５）とその第１のアミノ酸でアライメントした。それぞれのセグメント長について、最良のマッチをもたらすすべての（つまり１つまたは複数の）セグメントは保持し、残りのセグメントは、切り捨てる。次いで、保持したＴＮ１セグメントは、［ＴＮ１］−［ＤＨ］セグメントを生成するために理論的セグメントプール由来のすべてのＤＨセグメントとつなぐ。次いで、これらのセグメントは、上記のようにアライメントし、［ＴＮ１］−［ＤＨ］セグメントのそれぞれについての最良のマッチを保持する。手順は、参照セット由来のＣＤＲＨ３配列の長さが、理論的セグメントプール由来のセグメントの組み合わせによって同様に再現されるまで、［ＴＮ１］−［ＤＨ］−［Ｎ２］および［ＴＮ１］−［ＤＨ］−［Ｎ２］−［Ｈ３−ＪＨ］セグメントにより繰り返す。参照セットにおけるＣＤＲＨ３に対する最良のマッチをもたらすセグメントの組み合わせはすべて、マッチング方法の出力として保持する。
【０２０４】
表９は、「理論的セグメントプール１」または「ＴＳＰ１」と称される理論的セグメントプールを使用する、マッチング方法の出力、特に、ＨＰＳ由来の４つの個々の配列についての出力の例を提供する。ＴＳＰ１は、いくつかの理論的セグメントプール、すなわち、２１２のＴＮ１セグメント（表１０）、１，１１１のＤＨセグメント（表１１）、１４１のＮ２セグメント（表１２）、および２８５のＨ３−ＪＨセグメント（表１３）を含有する。テストケース１におけるＣＤＲＨ３配列は、４つのセグメントのユニークな組み合わせによって到達するＴＳＰ１における同一のマッチを含有する。テストケース２．１および２．２はそれぞれ、ＴＮ１およびＤＨセグメントが異なる２つの別個の組み合わせによってであるが、同一のマッチをもたらす。テストケース３．１、４．１および４．２では、最も近いマッチはすべて、参照ＣＤＲＨ３からただ一つのアミノ酸が外れており、ＴＳＰ１由来のセグメントの１つ（３．１）または２つの（４．１および４．２）組み合わせによって到達することができる。このアプローチは、任意の理論的セグメントプール内の、任意の参照ＣＤＲＨ３配列に対するすべての最も近いマッチならびに参照ＣＤＲＨ３配列を正確に産生することができる、理論的セグメントプール内のセグメントのすべての組み合わせおよび／またはその最も近いマッチを見つけるために一般化することができる。
【０２０５】
実施例５．Ｈ３−ＪＨセグメントの理論的セグメントプールの誘導
合成ＣＤＲＨ３ライブラリーにおける包含を考慮してＨ３−ＪＨセグメントの理論的セグメントプールを産生するために、以下方法は、表１４の１２の生殖系列ＩＧＨＪ配列のうちの７つ（ＩＧＨＪ１−０１、ＩＧＨＪ２−０１、ＩＧＨＪ３−０２、ＩＧＨＪ４−０２、ＩＧＨＪ５−０２、ＩＧＨＪ６−０２、およびＩＧＨＪ６−０３）の突然変異体を生成するために適用した。これらの７つの対立遺伝子は、それらがヒト配列において最も一般的に存在する対立遺伝子の中にあったので選んだ。Ｈ３−ＪＨおよび／またはＪＨ（つまりＨ３−ＪＨおよびＦＲＭ４）を生成するために、表１４のすべての配列（いくつかはＦＲＭ４においてのみ異なる）を使用するライブラリーもまた、本発明の範囲内にある。方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＶ−Ｄ−Ｊ組換えプロセスの間の接合部の多様性の生成をシミュレートするように意図され、これは、生殖系列遺伝子セグメントに対するヌクレオチドの酵素媒介性の追加および欠失によって行われる。方法は、以下のように進行し、Ｈ３−ＪＨセグメントの完全に列挙される理論的セグメントプールをもたらす。
１．前処理は、よく知られているＪＨフレームワーク領域を産生するＪＨセグメントの翻訳をコードする第１のヌクレオチドの前に、それらの５’末端に２つのヌクレオチド塩基から成る部分的なコドンを含有するＩＧＨＪ遺伝子（ＩＧＨＪ３−０２、ＩＧＨＪ４−０２、ＩＧＨＪ５−０２、ＩＧＨＪ６−０２、およびＩＧＨＪ６−０３）に適用した。たとえば、ＩＧＨＪ３−０２遺伝子は、ＪＨフレームワーク領域を産生するＪＨセグメントの翻訳をコードする第１のヌクレオチドの前にＡＴジヌクレオチド配列を含有する（図４、上）。２つのヌクレオチド塩基から成る部分的なコドンはすべて、それらの２つの最も５’の位置にすべての可能なヌクレオチドダブレット（つまりＮＮ）を使用して完成させた（図４、上、ＩＧＨＪ３−０２については２列目）。より具体的には、生殖系列配列におけるほとんどの５’ヌクレオチドは、Ｎに突然変異させ、さらなるＮを、そのヌクレオチドに対して５’に追加した。
２．ＩＧＨＪ遺伝子ＩＧＨＪ１−０１（図４、中央）およびＩＧＨＪ２−０１（図４、下）は、ＪＨフレームワーク領域を産生するＪＨセグメントの翻訳をコードする第１のヌクレオチドの前に、それらの５’末端にゼロおよび１つのヌクレオチド塩基を含有する。これらの遺伝子については、ステップ１において記載する前処理は実行しなかった。代わりに、５’ダブレットは、ＮＮに突然変異させた（図４、中央および下、それぞれの２列目）。そのため、このステップを実行した後、上記に列挙される７つのＩＧＨＪ遺伝子のそれぞれは、その最初の２つの５’位置としてＮＮダブレットを有する変異体に変換された。
３．次いで、ステップ１および２によって産生された配列の５’コドンは、欠失させ、結果として生じるＤＮＡ配列の最初の２つの塩基は、続いてＮＮダブレットに突然変異させた（図４、すべてについて列３〜４）。
４．次いで、ステップ３において産生された配列の５’コドンは、欠失させ、結果として生じるＤＮＡ配列の最初の２つの塩基は、続いてＮＮダブレットに突然変異させた（図４、すべてについて列５〜６）。
５．次いで、ステップ（１）〜（４）によって生成されたポリヌクレオチド配列のそれぞれは、ＪＨフレームワーク領域を産生したそれぞれの配列についてのリーディングフレームから２４８の親Ｈ３−ＪＨポリペプチドセグメント（表１５）から成る理論的セグメントプールを得るために翻訳した。
６．親Ｈ３−ＪＨポリペプチドセグメントは、ＦＷ４を含むＪＨセグメントの一部分のみが残るまで（つまりゼロアミノ酸長を有するＨ３−ＪＨセグメント）、一度に１つのアミノ酸を除去することによって、それらのＮ−末端で切断した。上記に記載される方法は、２８５のＨ３−ＪＨセグメントの理論的セグメントプールの産生をもたらした（表１３）。
【０２０６】
実施例６．ＤＨセグメントの理論的セグメントプールの誘導
ＤＨセグメントの理論的な２つのプールは、「翻訳方法０」（ＴＭ０）または「翻訳方法１」（「ＴＭ１」）と称される２つの翻訳方法の１つまたは複数を使用して生成し、それぞれ、２７のヒト生殖系列ＩＧＨＤ  ＤＮＡ配列またはそれに由来するセグメントの３つフォワードリーディングフレームにおいて実行した（表１６）。
【０２０７】
１Ｋ  ＤＨ理論的セグメントプール（１Ｋ  ＤＨ）
ＴＭ１は、「１Ｋ  ＤＨ理論的セグメントプール」（「１Ｋ  ＤＨ」；表１１の１，１１１のＤＨセグメントを参照されたい）を生成するために使用した。ＴＭ１では、３つのフォワードリーディングフレームのいずれかにおいて翻訳の後にも２つの非翻訳塩基を含有する部分的なコドンを有するＩＧＨＤ配列は、２つの塩基が完成に際してただ一つのアミノ酸のみをコードすることができる場合のみ、完全なコドンを産生するように完成させた。たとえば、ＴＴＡ−ＧＣＴ−ＣＧなどのようなＤＮＡ配列は、ＬＡに翻訳される２つの完全なコドンおよびＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、またはＣＧＴのいずれもＲをコードするので、Ｒのみをコードすることができる残りの部分的なコドン（ＣＧ）を有する。したがって、この配列にＴＭ１を適用することにより、ＬＡＲがもたらされるであろう。１つを超えるアミノ酸をコードすることができる部分的なコドン（たとえばＧＡまたはＡＧ）を有する配列については、部分的なコドンは、無視した。表１６の２７のＩＧＨＤ配列にＴＭ１を適用することにより、表１７の７３のＤＨ親セグメントを含有する理論的セグメントプールを生成した（いくつかは終止コドン（「Ｚ」）および対がないＣｙｓ残基を含有する）。次いで、これらの配列は、２つのアミノ酸のみが残るまで、それらのＮおよびＣ末端でアミノ酸レベルで連続的に欠失させた。切断したセグメントは、それらが終止コドン、対がないＣｙｓ残基、Ｎ結合型グリコシル化モチーフ、または脱アミド化モチーフを含有した場合、切り捨てた。このプロセスにより、表１１の１，１１１のＤＨセグメントがもたらされた。
【０２０８】
６８Ｋ  ＤＨ理論的セグメントプール（６８Ｋ  ＤＨ）
表１６の２７のＩＧＨＤ遺伝子および対立遺伝子は、４つの塩基が残るまで、それらの５’および３’末端のどちらかまたはその両方で連続的に欠失させ、４つ以上のヌクレオチドの５，０７６のユニークなポリヌクレオチド配列がもたらされた。これらの５，０７６の配列は、それらの５’および／または３’末端の０、１、および／または２Ｎヌクレオチドの系統的な追加にかけた。結果として生じる配列は、ＴＭ０を使用して翻訳した。ＴＭ０では、完全なコドンのみが翻訳され、部分的なコドン（つまり１または２塩基）は無視される。この方法は、終止コドン、対がないＣｙｓ残基、Ｎ結合型グリコシル化モチーフに至り得る最後のまたは最後の位置の隣のＡｓｎ、および脱アミド化モチーフを有するセグメントの排除の後に６８，３７４のユニークなＤＨポリペプチドセグメントをもたらした（「６８Ｋ  ＤＨ理論的セグメントプール」）。ＰＹＴＨＯＮに対する入力として表１６のＩＧＨＤ遺伝子を使用すると、下記に提供されるコンピューターコードは、６８，３７４のＤＨセグメントの厳密な理論的セグメントプールを再現するであろう。このプログラムにおいて２つの自由なパラメーターがある：（１）段階的な欠失後の残りのＤＮＡ配列の最小長（本実施例において４塩基）および（２）理論的セグメントプールにおける包含のために許容できるペプチド配列の最小長（本実施例において２アミノ酸）。これらのパラメーターは、プログラムの出力を改変するために変更することができる。たとえば、１塩基への第１のパラメーターの変更および１アミノ酸への第２のパラメーターの変更は、１８の単一アミノ酸のセグメントを含む、６８，３９６のユニークな配列を有するより大きな理論的セグメントプールに至るであろう。異なる長さに連続的に切断されたＤＨセグメント、たとえば、１、２、３、もしくは４またはそれ以上のアミノ酸または翻訳前に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチドに切断されたものもまた、本発明の範囲内にある。
【０２０９】
６８，３７４のＤＨセグメントを生成するためのＰＹＴＨＯＮコンピュータープログラム
【数３−１】
2019023247.tif 000006
【数３−２】
2019023247.tif 000007
【数３−３】
2019023247.tif 000008
【数３−４】
2019023247.tif 000009
【数３−５】
2019023247.tif 000010
【数３−６】
2019023247.tif 000011
【０２１０】
実施例７．ＴＮ１およびＮ２セグメントの理論的セグメントプールの誘導
本実施例のライブラリーは、いくつかの実例において、当技術分野において知られている他のライブラリーと比較して、それらのＴＮ１およびＮ２セグメントにおいてより大きな多様性を有するように設計される。ＴＮ１およびＮ２セグメントの多様性は、ＨＰＳにおけるＣＤＲＨ３配列をそれらの構成成分セグメント（つまりＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨ）にデコンボリューションし、その後に、下記に記載される方法において「新規な」ＴＮ１およびＮ２セグメントを抽出するために、実施例４において記載されるマッチング方法を使用することによって増加させた。本発明の目的のために、「新規な」ＴＮ１およびＮ２セグメントは、ＣＤＲＨ３配列の参照セットにマッチする理論的セグメントプールにおいて現れないＴＮ１およびＮ２セグメントである。以下は、ＨＰＳから新規なＴＮ１およびＮ２セグメントを抽出するために使用される方法の例である。この方法は、ＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、および／またはＨ３−ＪＨセグメントを含有する任意の理論的セグメントプールを使用して、ＣＤＲＨ３配列の任意の参照セットから新規なＴＮ１およびＮ２セグメントを抽出するために一般化することができる。
【０２１１】
表９は、理論的セグメントプール１（「ＴＳＰ１」）を使用する、ＨＰＳ由来の参照ＣＤＲＨ３配列ＥＲＴＩＮＷＧＷＧＶＹＡＦＤＩ（テストケース５．１〜５．４）についてのマッチング結果を提供する。参照ＣＤＲＨ３に対する最良のマッチは、４つのＣＤＲＨ３配列であり、それぞれ、参照ＣＤＲＨ３配列の３アミノ酸の範囲内にある。これらのマッチのそれぞれにおいて、ＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントは、それぞれ長さ４、３、３、および５のアミノ酸である。したがって、参照ＣＤＲＨ３は、以下のセグメントにデコンボリューションすることができる：ＥＲＴＩ−ＮＷＧ−ＷＧＷ−ＹＡＦＤＩ（つまり、それぞれ［ＴＮ１］−［ＤＨ］−［Ｎ２］−［Ｈ３−ＪＨ］）。参照ＣＤＲＨ３由来のＤＨおよびＨ３−ＪＨセグメントであるＮＷＧおよびＹＡＦＤＩは、それぞれ、ＴＳＰ１中に同様に存在する。しかしながら、参照ＣＤＲＨ３由来のＴＮ１（ＥＲＴＩ）およびＮ２（ＷＧＷ）セグメントは、ＴＳＰ１において不在であり、１つまたは複数のアミノ酸ミスマッチでＴＳＰ１セグメントにマッチする。これらの「新規な」ＴＮ１およびＮ２セグメントは、参照ＣＤＲＨ３から抽出し、包含について可能性のある理論的セグメントプールおよび／または合成ライブラリーと考えられる。さらなる新規なＴＮ１およびＮ２セグメントは、ＨＰＳのすべてのメンバーにこの分析を適用することによって蓄積した。ＴＮ１およびＮ２配列を確実に同定するために、抽出は、参照ＣＤＲＨ３およびＴＳＰ１におけるＤＨおよびＨ３−ＪＨセグメントが累積的に多くとも３つのアミノ酸ミスマッチしかもたらさないＣＤＲＨ３配列についてのみ実行し、これは、参照ＣＤＲＨ３のＤＨおよびＨ３−ＪＨセグメントが確実に割り当てられたことを暗示した。
【０２１２】
実施例８．セグメント使用ウエイトの計算
セグメント使用ウエイトは、理論的セグメントプール（たとえばＴＳＰ１ならびにＴＳＰ１および実施例７において記載されるように同定された新規なＴＮ１およびＮ２セグメント）由来のどのセグメントを合成ライブラリーに含むべきかを決定する際にそれらの有用性について計算した。セグメント使用ウエイトは、上記に記載されるマッチング方法および式２の利用によって得た：
【数２】
2019023247.tif 000012
ここで、
・ｗ（ｉ）：セグメントｉについてのウエイト。０≦ｗ（ｉ）≦１。
・Ｓｍ：参照ＣＤＲＨ３配列の特定された領域において多くともｍのアミノ酸ミスマッチで、１つまたは複数の最良のマッチを含有する配列の数（参照ＣＤＲＨ３セットにおける合計Ｓのうちの）。ここで、ミスマッチは、Ｋａｂａｔ−ＣＤＲＨ３領域に対して算出されるが、ＣＤＲＨ３配列の他の断片もまた、考慮されてもよい。ｍ＝３の一定値がここで使用されたが、他の値が使用されてもよいまたは値は、参照ＣＤＲＨ３配列の長さに依存してもよい。
・ｇ（ｊ）：参照ＣＤＲＨ３配列ｊに対する最良のマッチをもたらす縮退セグメントの組み合わせの総数。
・ｆｉ（ｋ）：参照ＣＤＲＨ３配列ｊにおける相当する配列断片と比べた、縮退マッチｋにおける、ＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、またはＨ３−ＪＨセグメントの断片のアミノ酸同一性。セグメントがマッチｋにおいて現れない場合、断片のアミノ酸同一性はゼロと等しい。アミノ酸類似性（たとえば、疎水性などのようなアミノ酸の物理化学的特性に基づく）などのようなｆの他の定義もまた、同一性の代わりに使用されてもよい。
【０２１３】
セグメント使用ウエイトを計算するための手順は、下記にさらに例示する。これらの実施例のそれぞれにおいて、ＴＳＰ１由来の最良のマッチの組み合わせは、ただ一つのＣＤＲＨ３配列について提供され（Ｓｍ＝１）、縮退（ｋ）および断片のミスマッチ（ｆ）に依存性のウエイト計算が説明される。
【０２１４】
実施例８．１．表９におけるテストケース１についてのセグメント使用ウエイト
表９におけるテストケース１を参照されたい。ＣＤＲＨ３配列ＲＴＡＨＨＦＤＹは、ユニークなセグメントの組み合わせ（ｇ＝１）によってＴＳＰ１（ｆ＝１、簡潔さのために添字は省略する）において同様に位置する。表１８は、テストケース１のＣＤＲＨ３についてのＴＳＰ１由来の最良のマッチに相当するセグメントについての使用ウエイトを提供する。
【０２１５】
実施例８．２．表９におけるテストケース２．１および２．２についてのセグメント使用ウエイト
表９におけるテストケース２．１および２．２を参照されたい。ＣＤＲＨ３配列ＶＧＩＶＧＡＡＳＹは、２つの別個のセグメントの組み合わせ（ｇ＝２）によってＴＳＰ１（ｆ＝１）において同様に位置し得る。表１９は、テストケース２．１および２．２のＣＤＲＨ３についてのＴＳＰ１由来の最良のマッチに相当するセグメントについての使用ウエイトを提供する。
【０２１６】
実施例８．３．表９におけるテストケース３．１についてのセグメント使用ウエイト
表９におけるテストケース３．１を参照されたい。ＣＤＲＨ３配列ＤＲＹＳＧＨＤＬＧＹは、ただ一つのアミノ酸差異で、ユニークなセグメントの組み合わせ（ｇ＝１）によってＴＳＰ１において同様に位置し得る。下記に提供されるように、ＴＮ１、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントは、相当する参照配列断片に同様にマッチするが、５つのＤＨアミノ酸のうちの４つが、同様にマッチする。
ＨＰＳ由来の配列：ＤＲ−ＹＳＧＨＤ−ＬＧ−Ｙ
ＴＳＰ１において最も近い隣接物：ＤＲ−ＹＳＧＹＤ−ＬＧ−Ｙ
したがって、ここで、
ｆ＝ＤＨセグメントについて４／５および＝ＴＮ１、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントについて１となる（表２０）。
【０２１７】
実施例８．４．表９におけるテストケース４．１および４．２のマッチング
表９におけるテストケース４．１および４．２を参照されたい。ＣＤＲＨ３配列ＧＩＡＡＡＤＳＮＷＬＤＰは、それぞれただ一つのアミノ酸差異で、２つの別個のセグメントの組み合わせ（ｇ＝２）によってＴＳＰ１において位置し得る。下記に提供されるように、ＴＮ１、ＤＨ、およびＮ２セグメントは、相当する参照配列断片と同様にマッチするが、６つのＨ３−ＪＨアミノ酸のうちの５つが同様にマッチする。
ＨＰＳ由来の配列：（−）−ＧＩＡＡＡ−Ｄ−ＳＮＷＬＤＰ
ＴＳＰ１において最も近い隣接物：（−）−ＧＩＡＡＡ−Ｄ−ＳＮＷＦＤＰ
ＨＰＳ由来の配列：Ｇ−ＩＡＡＡ−Ｄ−ＳＮＷＬＤＰ
ＴＳＰ１において最も近い隣接物：Ｇ−ＩＡＡＡ−Ｄ−ＳＮＷＦＤＰ
ここで、（−）は、「空の」ＴＮ１セグメントを示す。
式２の適用により、表２１において提供されるセグメント使用ウエイトがもたらされる。
【０２１８】
実施例８．５．表９のテストケース１〜４．２についてのセグメント使用ウエイトの計算
表９のテストケース１〜４．２をすべて同時に含むように上記に記載される個々の計算を拡張することにより、表２２のセグメント使用ウエイトがもたらされる。
【０２１９】
実施例８．６．表９のテストケース５．１〜５．４についてのセグメント使用ウエイトの計算
ＣＤＲＨ３配列ＥＲＴＩＮＷＧＷＧＶＹＡＦＤＩならびに実施例７においてＣＤＲＨ３配列から抽出した新規なＴＮ１およびＮ２セグメントを参照されたい。この場合、新規なＴＮ１およびＮ２セグメント（それぞれＥＲＴＩおよびＷＧＶ）ならびにＴＳＰ１由来のＤＨおよびＨ３−ＪＨセグメント（それぞれＮＷＧおよびＹＡＦＤＩ）はそれぞれ、単一の使用ウエイトが割り当てられる。
【０２２０】
実施例９．合成ライブラリーにおける包含のためのＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＪＨセグメントの選択
図５は、合成ＣＤＲＨ３ライブラリーの設計のために使用した一般的な方法を提供する。方法は、入力として、（１）ＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントを含有する理論的セグメントプール（たとえばＴＳＰおよび新規なＴＮ１およびＮ２セグメント）ならびに（２）参照ＣＤＲＨ３配列の集合（たとえばＨＰＳ）を使用する。これらの入力から、理論的セグメントプール由来のセグメントの特定のサブセットが、物理的ＣＤＲＨ３ライブラリーへの包含のために選択される。
【０２２１】
第１に、ＨＰＳのＣＤＲＨ３に対する最良のマッチは、上記に記載されるマッチング方法を使用して、新規なＴＮ１およびＮ２セグメントを有するまたは有していないＴＳＰ１セット内から得た。次いで、このデータは、式２によってセグメント使用ウエイトを算出するために使用した。セグメントは、ＨＰＳのＣＤＲＨ３配列におけるそれらの相対的な出現頻度（セグメント使用ウエイトによって示される）ならびに疎水性、アルファヘリックス傾向、および酵母における発現能力（ｅｘｐｒｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）などのような他の因子（より完全に下記に記載される）に基づいて物理的ライブラリーにおける包含のために優先順位をつけた。
【０２２２】
実施例９．１．Ｅｘｅｍｐｌａｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ（ＥＬＤ−１）
ＥＬＤ−１は、入力として、ＨＰＳおよびＴＳＰ１  １由来のセグメント（９．５×１０９メンバー）を使用し、ＨＰＳにおけるそれらの使用ウエイトによって順番に並べられた、ＴＳＰ１から、それぞれ、１００のＴＮ１、２００のＤＨ、１４１のＮ２、および１００のＨ３−ＪＨセグメントの出力をもたらし、２．８２×１０８の理論的な複雑性を有するライブラリーを産生する。ＥＬＤ−１に相当するセグメントは、表２３に提供される。ここで、セグメントのすべての組み合わせ（つまりＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨ）ならびにセグメントの個々のセット（つまりＴＮ１のみ、ＤＨのみ、Ｎ２のみ、およびＨ３−ＪＨのみ）はそれぞれ、理論的セグメントプールを構成することに注意されたい。
【０２２３】
実施例９．２．Ｅｘｅｍｐｌａｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ２（ＥＬＤ−２）
この設計のための入力は、ＨＰＳならびにＴＳＰ１由来のセグメントおよびＨＰＳから抽出された新規なＴＮ１およびＮ２セグメント（実施例７）である。出力は、（１）ＴＳＰ１由来のそれぞれ２００のＤＨおよび１００のＨ３−ＪＨセグメントならびに（２）もともとＴＳＰ１のＴＮ１およびＮ２セグメントを含む１００のＴＮ１および２００のＮ２セグメントならびにＨＰＳにおける配列から抽出されたものである。新規なＴＮ１およびＮ２セグメント（つまりＴＳＰ１に含まれていない）を抽出するための実施例７において記載される方法の適用は、１，７１０の新規なＴＮ１セグメントおよび１，０２４の新規なＮ２セグメントの同定をもたらした。ＥＬＤ−２に相当するセグメントは、表２４に提供される。ここで、セグメントのすべての組み合わせ（つまりＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨ）ならびにセグメントの個々のセット（つまりＴＮ１のみ、ＤＨのみ、Ｎ２のみ、およびＨ３−ＪＨのみ）はそれぞれ、理論的セグメントプールを構成することに注意されたい。ＥＬＤ−１におけるように、ＥＬＤ−２におけるセグメントはすべて、もっぱらＨＰＳにおけるそれらの使用ウエイトに基づいて包含のために選択した。
【０２２４】
実施例９．３．Ｅｘｅｍｐｌａｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ３（ＥＬＤ−３）
この設計についての入力は、ＥＬＤ−２と同一である。ＥＬＤ−２におけるように、出力は、（１）ＴＳＰ１由来のそれぞれ２００のＤＨおよび１００のＨ３−ＪＨセグメントのセットそして（２）もともとＴＳＰ１のＴＮ１およびＮ２セグメントを含む１００のＴＮ１および２００のＮ２セグメントのセットならびにＨＰＳにおける配列から抽出されたものである（実施例７）。しかしながら、ＥＬＤ−３についてのセグメントの選択のために使用したアプローチは、２点において異なる。セグメントの第１の選択された物理化学的特性（疎水性、等電点、およびアルファヘリックス傾向）は、物理的ライブラリーにおける包含のためにセグメントに優先順位をつけるためにセグメント使用ウエイトに加えて使用した。疎水性は、酵母ベースから単離される、発現が不十分な抗体において実験的に不釣合いに多い疎水性ＤＨセグメントを優先順位から外す（ｄｅ−ｐｒｉｏｒｉｔｉｚｅ）ために使用した。等電点およびアルファヘリックス形成に対する傾向は、当技術分野において知られているＣＤＲＨ３ライブラリーにおいて比較的未調査であった物理化学的特性空間の領域に位置するセグメントを同定するために利用した（たとえば米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号および第２０１０／００５６３８６号ならびに国際公開番号ＷＯ／２００９／０３６３７９）。第２に、セグメント使用ウエイトは、ＨＰＳデータセットのブートストラップ分析によって計算した。これらの方法は、より完全に下記に記載される。ＥＬＤ−３に相当するセグメントは、表２５に提供される。ここで、セグメントのすべての組み合わせ（つまりＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨ）ならびにセグメントの個々のセット（つまりＴＮ１のみ、ＤＨのみ、Ｎ２のみ、およびＨ３−ＪＨのみ）はそれぞれ、理論的セグメントプールを構成することに注意されたい。
【０２２５】
実施例９．３．１．ブートストラップ分析によるセグメント使用ウエイトの生成
ブートストラップ分析（Ｅｆｒｏｎ  ＆  Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，  Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ，  １９９４  Ｃｈａｐｍａｎ  Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）は、所与のサンプルの統計値の多様性を推定するための広く使用される統計的処理である。この推定は、もとのサンプルにサイズが等しく、復元サンプリングによってそれに由来するいくつかのサブサンプルについて計算された統計値の値に基づく。もとのサンプルのメンバーは、サブサンプルを形成するようにランダムに選び、典型的に、それぞれのサブサンプルにおいて複数回、含まれる（よって「復元サンプリング」）。
【０２２６】
ここで、もとのサンプルは、ｎ＝３，５７１メンバーを有するＨＰＳデータセットであり、統計値は、セグメント使用ウエイトである。それぞれ３，５７１のメンバーを有する１０００のサブサンプルは、ＨＰＳデータセットからランダムに配列を選ぶことによって生成した（所与の配列の多くとも１０のリピートをそれぞれのサブサンプルにおいて許可した）。次いで、上記に記載されるマッチング方法をそれぞれのサブサンプルに適用し、最終のセグメント使用ウエイトは、個々のサブサンプルについて得られた値の平均として計算した。このブートストラップ手順によって誘導した平均値は、親ＨＰＳデータセットのみから計算された値よりも確実である。その他に示されない限り、１，０００のサブサンプルのこれらの平均値は、ＥＬＤ−３のためのセグメントの選択において使用した。
【０２２７】
実施例９．３．２．アミノ酸特性指数
ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ａａｉｎｄｅｘ／でオンラインで入手可能なＡＡｉｎｄｅｘデータベースは、アミノ酸およびペアのアミノ酸の様々な物理化学的および生化学的特性を示す５００を超える数的な指数を提供する。これらの特性は、所与の特性に対して多くの場合、有効ないくつかの指数と共に、疎水性、静電気的挙動、二次構造の傾向、および他の特徴を含む。以下の３つの指数は、十分に理解されているＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅヒドロパシー指標（ＫＹＪＴ８２０１０１）から始めて、それと、また、互いに最も数的に非相関の（ｄｅ−ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ）指数を追加することによって選んだ。それらは、したがって、可能性として、アミノ酸特性空間の非重複領域を説明し、ＥＬＤ−３についてのＤＨおよびＨ３−ＪＨセグメントの分析および選択のために使用した。
１．ＫＹＴＪ８２０１０１（ヒドロパシー指標）
２．ＬＥＶＭ７８０１０１（アルファヘリックスの標準化頻度）
３．ＺＩＭＪ６８０１０４（等電点）
【０２２８】
実施例９．３．３．疎水性ＤＨセグメントは、酵母ベースのライブラリーから単離される、発現が不十分な抗体において不釣合いに多い
出芽酵母において発現されるおよそ１２００の抗体のタンパク質発現レベルに基づいて、抗体は、「好適な」または「不十分な」発現体（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）として分類した。それぞれの部類におけるそれぞれの抗体のＣＤＲＨ３配列は、発現レベルと相関する配列特徴を同定するために検査した。１つのそのような配列特徴は、ＫＹＴＪ８２０１０１指標を使用して計算されるＤＨセグメントの疎水性である。図６は、ＤＨセグメント疎水性（右に向かって増加）に応じた、「好適な」および「不十分な」発現体の度数を提供する。これらの抗体を単離するために使用される合成ライブラリーから期待される分布もまた、参照（「設計」）として提供する。最も高度な疎水性値（プロットの右端）を有するＤＨセグメントは、「不十分な」発現体の間で不釣合いに多く（設計に基づく期待に比べて）、「好適な」発現体の間で不釣合いに少なかった。同様に、親水性ＤＨセグメント（左端）は、「好適な」発現体の間で不釣合いに多く、「不十分な」発現体の間で不釣合いに少なかった。このデータから、ライブラリーの抗体の全体的な発現能力は、疎水性ＤＨセグメントがより少ないＣＤＲＨ３配列を合成することによって改善され得ることが推測された。
【０２２９】
実施例９．３．４．ＥＬＤ−３における包含のための２００のＤＨセグメントの選択
ＴＳＰ１由来の７１のＤＨセグメントのセットは、ＥＬＤ−３における自動的な包含のための「コア」ＤＨセグメントとして称された。これらのセグメントは、以下の望ましい特性を有した：
１．７１のうちの５３は、ブートストラップ分析由来のセグメント使用ウエイトによって順番を付けられたＤＨセグメントの上位７％内に存在した。
２．７１のうちの１８は、出芽酵母において発現されたライブラリーから単離された抗体に由来する使用ウエイトによって順番を付けられたＤＨセグメントの上位７％内に存在した。
【０２３０】
残りの１，０４０のセグメントは、「非コア」として称された。ＥＬＤ−３における２００のセグメントのセットを完成されるために、１２９のセグメントを以下の方法においてセグメントの「非コア」プールから選んだ。
１．６５のセグメントは、それらが、（ａ）Ｎ２アミノ酸との組み合わせを介してＮ結合型グリコシル化モチーフを形成する可能性を有する最後のもしくは最後の位置の隣のＡｓｎ残基または（ｂ）脱アミド化に関係するアミノ酸配列ＮＧを含有するので、削減した。
２．ＫＹＴＪ８２０１０１ヒドロパシー指標についての中央値（中央値＝１Ｋ  ＤＨについて２．９）よりも高度なセグメントは、さらなる考察から削減した。抗原認識のためのＴｙｒの知られている重要性を考慮して（それぞれ、その全体が参照によって組み込まれＦｅｌｌｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ２００４，  １０１：  １２４６７；およびＨｏｆｓｔａｄｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９９，  ２８５：  ８０５）、少なくとも１つのＴｙｒの残基を含有するセグメントは、最も高度な疎水性四分位値（９．４よりも高度なＫＹＴＪ８２０１０１値）に位置しない限り、保持された。これにより４４３のセグメントを削減した。
３．１２９のセグメントの最終のセットは、以下の変数：（１）最も近い隣接物に対するアミノ酸ミスマッチおよび（２）３つの物理化学的特性指数の値によって定義される多次元空間における「コア」および残りの４４３の「非コア」セグメントの間のユークリッドの距離を最大限にすることを目標とした目的関数を使用することによって得た。
【０２３１】
実施例９．３．５．ＥＬＤ−３における包含のための１００のＨ３−ＪＨセグメントの選択
１００のＨ３−ＪＨセグメントは、以下の方法においてＥＬＤ−３における包含のために選んだ。
１．２８のＨ３−ＪＨセグメントは、これらのＨ３−ＪＨセグメントのみを含有する他のライブラリーにおいて実験的に検証した後に選択した（米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号および第２０１０／００５６３８６号ならびに国際公開番号ＷＯ／２００９／０３６３７９を参照されたい）。
２．５７のセグメントは、上記に記載されるブートストラップ分析由来の使用ウエイトによって順番を付けられたＨ３−ＪＨセグメントの上位２５％内のそれらの存在に基づいて選択した。（１）これらの５７のＨ３−ＪＨセグメントおよび２８のＨ３−ＪＨセグメント（つまり合計８５のセグメント）は、「コア」Ｈ３−ＪＨセグメントとして称され、これらは、コアＤＨセグメントのように、ＥＬＤ−３に自動的に含まれた。
４．１５のさらなるセグメントは、以下の変数：（１）最も近い隣接物に対するアミノ酸ミスマッチおよび（２）３つの物理化学的特性指数の値によって定義される多次元空間における「コア」および残りの２００の「非コア」セグメントの間のユークリッドの距離を最大限にすることを目標とした目的関数を使用することによって選んだ。
【０２３２】
実施例９．３．６．ＥＬＤ−３における包含のための１００のＴＮ１および２００のＮ２セグメントの選択
ＴＮ１およびＮ２セグメントは、ブートストラップ手順のそれぞれのサブサンプルにおける配列から抽出し、最も高度な平均セグメント使用ウエイトを有する１００のＴＮ１および２００のＮ２セグメントは、望ましくないモチーフ、すなわちＣｙｓおよびＡｓｎ残基を有する配列の排除の後にライブラリーへの包含のために選んだ。
【０２３３】
実施例９．３．７．ＥＬＤ−３における包含のために選ばれたセグメントをコードするヌクレオチド配列の選択
ライブラリーにおける包含のために選ばれたポリペプチドセグメントのそれぞれは、相当するオリゴヌクレオチド配列に翻訳し戻さなければならない（ポリペプチドからＤＮＡに）。多くのオリゴヌクレオチドが、遺伝子コードの縮退により、それぞれのポリペプチドセグメントをおそらくコードすることができるが、より望ましいオリゴヌクレオチドを選択するためにある種の制約を課した。第１に、ＥＬＤ−３が酵母（出芽酵母）において発現されたので、酵母においてめったに使用されないコドンは回避した。たとえば、Ａｒｇについての６つの可能なコドンのうちで、３つのＣＧＡ、ＣＧＣ、およびＣＧＧは、１０％未満の割合で酵母タンパク質をコードするために使用され（たとえばＮａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２０００，  ２８：２９２を参照されたい）、そのため、それらの３つのコドンは、可能な程度まで回避した。第２に、多くの抗体がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において産生されるので（たとえば酵母における発見の後に）、ＣＣＧコドン（Ｐｒｏをコードする）もまた、それがハムスターによってめったに使用されないので（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．
）、回避した。
【０２３４】
多くの制限酵素を、ＣＤＲＨ３オリゴヌクレオチドライブラリーの実際の構築の間に用いる（米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号の実施例１０を参照されたい）。したがって、ＣＤＲＨ３ポリヌクレオチド配列内でこれらの制限酵素についての認識モチーフの存在を回避することは望ましい。コドンは、下流で使用され得る制限酵素についての認識モチーフを導入しないようにするために、個々のセグメントレベルで選択する。そのようなモチーフもまた、セグメントのコンビナトリアル構築によって生成され得るので、セグメントの組み合わせもまた、チェックし、コドンは、可能な場合は常に、そのようなモチーフの存在を削減するために変化させた。特に、３つの制限酵素を、現在例示されるＣＤＲＨ３ライブラリーの構築の間に使用した：ＢｓｒＤＩ、ＢｂｓＩ、およびＡｖｒＩＩ。最初の２つは、非パリンドローム認識部位を有するＩＩ型酵素である。セグメントをコードするオリゴヌクレオチドの逆の鎖を、これらの２つの酵素に対する認識部位について明確にチェックした。特に、逆の鎖は、モチーフＧＣＡＡＴＧおよびＣＡＴＴＧＣ（ＢｓｒＤＩについて）ならびにＧＡＡＧＡＣおよびＧＴＣＴＴＣ（ＢｂｓＩについて）についてチェックした。ＡｖｒＩＩについての認識モチーフは、パリンドロームであり、したがって、オリゴヌクレオチドは、配列ＣＣＴＡＧＧについてのみチェックした。しかしながら、ＡｖｒＩＩは、ＴＮ１セグメントを処理するためにのみ使用され、したがって、他のセグメントまたはそれらの組み合わせにおけるその存在を評価する必要はない。
【０２３５】
ポリヌクレオチド変換に対するポリペプチドのエンジニアリングを改善するために課されたさらなる制約は、固相オリゴヌクレオチド合成の間に誤差を増加させると考えられるので、連続する一続きの６以上の同じタイプの塩基の回避であった。そのため、ＥＬＤ−３のセグメントについてのＤＮＡ配列は、そのようなモチーフを回避するように選んだ。ＥＬＤ−３セグメントについてのＤＮＡ配列は、表２５においてそれぞれのポリペプチド配列と共に含まれる。当業者は、これらの方法がまた、任意の他のライブラリー、任意の制限部位、任意の数のヌクレオチドリピートに、および／または任意の生物において望ましくないと考えられる任意のコドンの存在を回避するために適用することもできることを容易に認識するであろう。
【０２３６】
実施例１０．ヒトＣＤＲＨ３データセットおよび臨床的に適切な抗体に対するＥＬＤ−３のマッチング
本発明の目的の中には、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヒトＣＤＲＨ３レパートリーの生成の根底にあるＶ−Ｄ−Ｊ組換えプロセスを模倣し、それによって、ＣＤＲＨ３のヒトの特徴を維持しながら、当技術分野において知られている他のライブラリーと比較してＣＤＲＨ３ライブラリーの多様性を増加させることがある。成功についての１つの測定値は、ヒト参照ＣＤＲＨ３配列の集合が、本発明の任意のライブラリーにおいて同様にまたは近いマッチ（たとえば約５、４、３、または２未満のアミノ酸差異）によって示される程度である。発明者らは、両方とも互いに非重複である２つのヒトＣＤＲＨ３配列参照データセットならびにＨＰＳ：（１）６６６のヒトＣＤＲＨ３配列の集合（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２００６，  ５７：  ９１７；  ”Ｌｅｅ−６６６”）；および（２）Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２００９，  １：  １−８  （”Ｂｏｙｄ−３０００”）において開示される２００，０００以上の配列からランダムに選ばれた３，０００のヒトＣＤＲＨ３配列の集合を使用して、この測定基準を評価した。Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．由来の３，０００のヒトＣＤＲＨ３配列のランダムサンプルの結果は、Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．  のセットのすべてのメンバー（＞２００，０００  ＣＤＲＨ３配列）に適用された同じ分析の結果の代表であった。
【０２３７】
図７は、ゼロ、１、２、３または３つを超えるアミノ酸ミスマッチで、Ｌｅｅ−６６６またはＢｏｙｄ−３０００のセット由来の配列にマッチする２つの合成ライブラリー、「ＬＵＡ−１４１」およびＥＬＤ−３におけるＣＤＲＨ３配列のパーセンテージを提供する。ここで、「ＬＵＡ−１４１」は、２１２のＴＮ１、２７８のＤＨ、１４１のＮ２、および２８のＨ３−ＪＨを含有するライブラリーを示す（詳細については米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号を参照されたい）。特に、ＥＬＤ−３が、ＬＵＡ−１４１よりも参照ＣＤＲＨ３配列に同様にマッチする（それぞれＬｅｅ−６６６およびＢｏｙｄ−３０００のセットについて８．４％および６．３％）配列のより高度なパーセンテージを示すことは重要である（それぞれＬｅｅ−６６６およびＢｏｙｄ−３０００のセットについて１２．９％および１２．１％）。ＥＬＤ−３が、ＬＵＡ−１４１（それぞれＬｅｅ−６６６およびＢｏｙｄ−３０００のセットについて４１．２％および４３．７％）に比べて、多くとも２つのアミノ酸ミスマッチで発見されたヒトＣＤＲＨ３配列のより高度な累積的なパーセンテージを示すこともまた、重要である（それぞれＬｅｅ−６６６およびＢｏｙｄ−３０００のセットについて５４．１％および５２．５％）。
【０２３８】
抗体ライブラリーを評価することができる他の測定基準は、「臨床的に適切な」参照ＣＤＲＨ３配列にマッチするそれらの能力である。図８は、ＥＬＤ−３がＬＵＡ−１４１ライブラリーよりも臨床的に適切なＣＤＲＨ３配列に対するよりよいマッチをもたらすことを実証する。特に、ＥＬＤ−３は、１つのアミノ酸内で５５の臨床的に検証された抗体のうちの３４（６２％）とマッチするが、ＬＵＡ−１４１ライブラリーは、５５のうちの２０（３７％）とマッチするのみである。
【０２３９】
実施例１１．ＥＬＤ−３とＬＵＡ−１４１の比較
ＥＬＤ−３は、ＬＵＡ−１４１と同様に、７３のＴＮ１、９２のＤＨ、１１９のＮ２、および２８のＨ３−ＪＨを有する。したがって、ＥＬＤ−３（４．０×１０８メンバー）における配列の９４．５％は、ＬＵＡ−１４１ライブラリー（２．３×１０８メンバー）とは異なる。図９は、ＥＬＤ−３におけるセグメントのコンビナトリアル効率がＬＵＡ−１４１におけるセグメントを超えることを示す。特に、ＥＬＤ−３セグメントは、ＬＵＡ−１４１ライブラリーセグメントよりも、ユニークなＣＤＲＨ３を得る可能性が高い。それが、より少ないセグメントを使用してＣＤＲＨ３多様性が増加したライブラリーを合成するのを可能にするので、これは好都合である。
【０２４０】
図１０は、ＬＵＡ−１４１、ＥＬＤ−３、およびＨＰＳ由来のヒトＣＤＲＨ３配列のＫａｂａｔ−ＣＤＲＨ３のアミノ酸組成を提供する。
【０２４１】
図１１は、ＬＵＡ−１４１、ＥＬＤ−３、およびＨＰＳ由来のヒトＣＤＲＨ３配列のＫａｂａｔ−ＣＤＲＨ３の長さの分布を提供する。
縮退オリゴヌクレオチドにより合成されたＣＤＲＨ３ライブラリー
【０２４２】
実施例１２．縮退オリゴヌクレオチドを利用することによるＣＤＲＨ３多様性のさらなる増加
本実施例において記載される方法は、上記に記載されるライブラリーよりも多くのメンバーを有するＣＤＲＨ３ライブラリーを産生するために、上記に教示される方法を拡張する。特に、１つまたは２つの縮退コドンは、ＤＨおよび／またはＮ２ポリヌクレオチドセグメントの中に導入し、（一般に）縮退コドンはＨ３−ＪＨセグメントの中に導入しなかったまたは１つの縮退コドンを導入した。異なる数の縮退コドンを有するセグメント、たとえば０、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上の縮退コドンを有するＤＨセグメントおよび０、１、２、３、４、５、またはそれ以上の縮退コドンを有するＨ３−ＪＨセグメントもまた、企図される。これは、とりわけヒトＣＤＲＨ３配列の参照セットの長さおよび組成などのような特性を厳密に反映する約１０１１（約２×１０１１）を超える別個のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含有するＣＤＲＨ３ライブラリーをもたらす。下記に記載されるように、ＤＨセグメントにおける縮退位置は、相当するオリゴヌクレオチド配列を考慮すると、それぞれ、常にではないが、通常、きわめてＮおよび／もしくはＣ末端の位置または５’および３’末端コドン（つまり必ずしもではないが最初もしくは最後の塩基のみ）である。縮退コドンは、Ｎ２セグメントを合成するために同様に使用した。ＴＮ１セグメントのうちの２００は、ＥＬＤ−３において記載されるとおりであったが、縮退ＴＮ１セグメントを有するまたはＴＮ１セグメント配列の代替の選択肢を有するライブラリーは、本発明の範囲内にある。さらなる１００のＴＮ１セグメントは、このライブラリーについての３００のＴＮ１セグメントのセットを完成する。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、表２６において列挙される。縮退オリゴヌクレオチドの代わりにまたはそれに加えて、トリヌクレオチドの混合物を使用することもまた、「ベース」または「シード」セグメント配列（下記に定義される）内の１つまたは複数の選択される位置でのアミノ酸タイプの変異を可能にするために、可能である。
【０２４３】
実施例１３．縮退オリゴヌクレオチドによる合成のためのＤＨセグメントの選択
セグメント使用ウエイトは、Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．において含有される配列に対する比較によって６８Ｋ  ＤＨ理論的セグメントプールについて計算した。３つ以上のアミノ酸長を有するＤＨセグメントは、それらのセグメント使用ウエイト（上記に記載されるように）に従ってランク付けし、上位２０１は「シード」配列として称された。これらのシード配列は、次いで、縮退コドンを組み込むためにある位置を選択することによって多様化した。変異、それらが多様化されるアミノ酸タイプのために選択される位置は、６８Ｋ  ＤＨ理論的セグメントプールのサブセットである９，１７１のＤＨセグメントの参照セットとシード配列を比較することによって決定した。これらの９，１７１のＤＨセグメントは、Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．におけるそれらのセグメント使用ウエイトが有意であり、累積的なセグメント使用ウエイト（実施例８）が少なくとも１．０であることを意味したので、選択した。
【０２４４】
２０１のシード配列のそれぞれは、９，１７１のＤＨセグメントの参照セットにおける配列のそれぞれと比較し、同一の長さで一つの位置で異なるものは、さらに、シードの可能な変異体を特徴付けると考えられた。このように、それぞれのシードについての最も多様な位置を同定し、候補アミノ酸タイプのセットもまた、それぞれの位置について同定した。最後に、縮退コドンのセットは、それぞれの特定の位置についての候補アミノ酸タイプのセットを最も忠実に示したコドンを同定するために考慮した。終止コドン、Ｃｙｓ残基、Ｎ結合型グリコシル化モチーフ（つまりＸが任意のアミノ酸タイプであるＮＸＳもしくはＮＸＴ）、または脱アミド化モチーフ（ＮＧ）をコードする縮退コドンは、考察から削減した。このプロセスは１４９のユニークな縮退オリゴヌクレオチド配列を生成し、これは、総体として、３，５６６のユニークなポリペプチド配列をコードする。同じ原理に従って生成された代替の設計もまた、考慮し、より大きな多様性（ユニークなポリペプチド配列の数で）およびより小さなＲＭＡＸ値（以下を参照されたい）を有するものは、本発明のライブラリーにおける包含のための優先権を与えた。しかしながら、６８Ｋ  ＤＨ理論的セグメントプールからＤＨセグメントを選択するために異なる基準を使用することができ、これらの異なる基準によって選択されたＤＨセグメントを含むそのライブラリーもまた、本発明の範囲内にあることもまた、考えられる。
【０２４５】
すべての縮退オリゴヌクレオチドが同一の数のポリペプチドをコードするとは限らないので、後者は、本発明のＣＤＲＨ３ライブラリー内に含有される所与の理論的セグメントプール（つまりＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨ）の全体に対して一様に同一のウエイトで生じない。たとえば、合計の縮退が４のオリゴヌクレオチドによってコードされる個々のアミノ酸配列Ｘは、１／４の「ウエイト」を有するが、縮退が６のオリゴヌクレオチドによってコードされる他の個々のアミノ酸配列、Ｙは、１／６のウエイトを有するであろう。さらに、ある種のアミノ酸配列は、１つを超える縮退オリゴヌクレオチドによってコードすることができ、したがって、それらのウエイトは、それぞれのオリゴヌクレオチドによる個々の寄与率の総計になるであろう。所与の理論的セグメントプール内で、最も重みが小さなウエイトのポリペプチドに対する、最も重みが大きなウエイトのポリペプチドのウエイトの比、ＲＭＡＸは、理想的には最小限にしたい重要な設計基準である。ＲＭＡＸ値は、所定のタイプのセグメントのすべてについて長さによってまたは全体的に定義されてもよい（つまり、すべてのＤＨセグメントまたはすべてのＨ３−ＪＨセグメントなど、ＴＮ１および／またはＮ２セグメントについて）。表２７は、縮退オリゴヌクレオチド配列を列挙するが、表２８は、これらのオリゴヌクレオチドから結果として生じるユニークなポリペプチド配列を列挙する。これらの２つの表は、設計が下記に詳述されるＤＨ二量体セグメントを含む。
【０２４６】
実施例１３．１．ＤＨ二量体セグメントの選択
異なる方法は、ＤＨ二量体配列をコードする縮退オリゴヌクレオチドのセットを設計するために用いた。方法は、Ａｓｎ（Ｎ）残基および過度に疎水性の二量体（つまりＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、および／またはＶ残基のみを含む任意の二量体の組み合わせ）を含有するセグメントを引いた、ＥＬＤ−３における４５の二量体配列のすべておよび他の４００の理論上可能な二量体配列（つまり、それぞれの２つの位置において可能な２０の残基＝２０＊２０）を含むことを目標とした。この設計プロセスは、２１３のユニークなペプチド二量体配列をコードする３５の縮退オリゴヌクレオチド配列を最終的にもたらした。本発明の他のセグメントのすべてについて使用される選択プロセスと同様に、当業者は、ＤＨ二量体セグメントを選択するために他の基準を使用することができ、これらのセグメントを含むライブラリーもまた、本発明の範囲内にあることを容易に認識するであろう。
【０２４７】
実施例１３のより長いＤＨセグメントとＤＨ二量体セグメントを組み合わせることにより、ＥＬＤ−３の２００のオリゴヌクレオチドに対して、合計１８４のオリゴヌクレオチド（３５のコード二量体および３つ以上のアミノ酸を有する１４９のコードセグメント）によってコードされた、現在例示されるライブラリーのＤＨセグメントの最終のセットがもたらされた。１８４のオリゴヌクレオチドは、合計３，７７９のユニークなポリペプチド配列：２１３の二量体および３つ以上のアミノ酸の３，５６６のより長いセグメントをコードする。
【０２４８】
実施例１４．拡張されたＮ２多様性の生成
上記に記載されるように、ＥＬＤ−３は、２００のＮ２セグメントを含有する。現在例示されるライブラリーでは、空のＮ２セグメント（つまり、Ｎ２はなく、その結果、ＤＨセグメントは、Ｈ３−ＪＨセグメントに直接連結される）および単量体Ｎ２セグメントは、ＥＬＤ−３と同じであった。しかしながら、縮退オリゴヌクレオチドは、ＥＬＤ−３における相当する配列のすべてを再現するだけではなく、さらなる多様性をももたらす２、３、および４塩基長のセットを生成するために使用した。ＤＨセグメントと同様に、これらの縮退オリゴヌクレオチドは、Ａｓｎ（不適当な位置における）およびＣｙｓ残基および終止コドンを削減するように設計した。より具体的には、Ａｓｎ残基は、続くアミノ酸がＧｌｙではなく、次のアミノ酸がＳｅｒまたはＴｈｒではない場合は常に、三量体の１番目の位置および四量体の１番目または２番目の位置にし、したがって、候補Ｎ２セグメント内の脱アミド化またはＮ結合型グリコシル化モチーフを回避した。現在例示されるライブラリーについてのＮ２理論的セグメントプールは、合計で、１つのゼロ量体（ｚｅｒｏ−ｍｅｒ）（つまり、Ｎ２セグメントはない）、１８の単量体、２７９の二量体、３３９の三量体、および９０の四量体のＮ２アミノ酸配列または７２７のセグメントを含有する。これらのアミノ酸配列は、合計１４６のオリゴヌクレオチドについて、１、１８、８１、３６、および１０オリゴヌクレオチドによってそれぞれコードされる。最初の１９のオリゴヌクレオチド以外、ゼロおよび１量体をコードするものは縮退である。表２９は、１４６のオリゴヌクレオチド配列を列挙するが、表３０は、結果として生じる７２７のユニークなポリペプチド配列を列挙する。
【０２４９】
実施例１５．拡張されたＨ３−ＪＨ多様性の生成
ＦＲＭ４に相当するＤＮＡ配列のみが残る（つまり、Ｈ３−ＪＨは残らない）点までの、ヒトＩＧＨＪポリヌクレオチドセグメントの５’末端に対するヌクレオチドレベルの段階的な欠失、その後に続く、同じ５’末端に対する系統的な１または２ｂｐによる完成の適用は、翻訳の後に６４３のユニークなＨ３−ＪＨペプチドセグメントをもたらした（「６４３のＨ３−ＪＨ  セット」）。ＤＨセグメントのように、Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．由来のおよそ２３７，０００のヒト配列に対する比較の後に得られたそれらの使用ウエイトによって６４３のセグメントのそれぞれに順番を付けることが可能であり、上記に記載される望まれないモチーフがないものからの上位２００の個々の配列は、現在例示されるライブラリーのためのＨ３−ＪＨセグメントのセットを提供するために選んだ。
【０２５０】
その代わりに例示される実施形態では、２００のＨ３−ＪＨセグメントのうちの４６は、全体的に、２００のオリゴヌクレオチドが２４６のユニークなペプチド配列をコードするように、１番目の位置において２倍の縮退コドンで設計した（つまり、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドレベルでそれぞれ、Ｎ末端または５’末端）。
【０２５１】
他のその代わりに例示させる実施形態では、縮退コドンのさらなる使用は、５００までの別個のポリペプチド配列を示す９０、１００、２００、またはそれ以上のオリゴヌクレオチドによってコードされるライブラリーを産生するために考えられてもよい。好ましくは、必ずしもではないが、これらの５００までのユニークな配列は、上記に記載される６４３のＨ３−ＪＨ参照セットにおける配列のサブセットまたはこれらの配列の変異体のサブセットとすることができる。上記に例示されるように、望ましくないポリペプチドモチーフを含有するＨ３−ＪＨセグメントは、設計から削減されてもよい。ＪＨセグメントのためのオリゴヌクレオチド配列は、表３１に列挙されるが、結果として生じるユニークなポリペプチド配列は、表３２に提供される。表３１では、ＦＲＭ４領域に相当するヌクレオチド配列もまた提供されるが、「ペプチド長」の値は、Ｈ３−ＪＨ部分のみを指す。簡潔さのために、Ｈ３−ＪＨペプチド配列のみが表３２に含まれる。
【０２５２】
実施例１６．Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ（ＥＤＬＤ）
上記に選択された、表２６〜３２において提供されるＴＮ１、ＤＨ、Ｈ３−ＪＨ、およびＮ２セグメントは、約２×１０１１（３００のＴＮ１×３，７７９のＤＨ×７２７のＮ２×２４６のＨ３−ＪＨ）の理論的多様性を有するＥｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ（ＥＤＬＤ）を生成するために組み合わせた。選択されたセグメントをコードするオリゴヌクレオチドは、実施例９．３．７の原理に従って選んだ。
【０２５３】
図１２〜１５は、この設計のある種の特徴を示す。たとえば、Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．におけるおよそ２３７，０００のＣＤＲＨ３配列の約５０％が、１つのミスマッチを有するまたはミスマッチを有していないライブラリー配列によって再現され得ることを示す（つまり、図１２の「０」および「１」のビン（ｂｉｎ）を合計することによって）。これらのライブラリーの理論的な長さ分布（図１３）およびアミノ酸組成（図１４）もまた、ヒトＣＤＲＨ３配列の同じセットにおいて観察されるそれぞれの特徴と厳密にマッチする。図１５は、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎのコンビナトリアル効率を示す。配列のおよそ６５％は、設計において１回だけ現れる（つまり、セグメントの１つの非縮退組み合わせによって生成される）。先に示される図８は、臨床的に適切なヒト抗体配列に対するマッチングの点から、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎが、ＬＵＡ−１４１およびＥＬＤ−３の両方より優れていることを示す。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表２】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表３−１２】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【表５−９】
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【表５−１０】
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【表５−１１】
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【表５−１２】
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【表５−１３】
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【表５−１４】
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【表５−１５】
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【表５−１６】
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【表５−１７】
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【表５−１８】
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【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
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【表６−８】
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【表６−９】
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【表６−１０】
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【表６−１１】
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【表６−１２】
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【表６−１３】
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【表６−１４】
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【表６−１５】
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【表６−１６】
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【表６−１７】
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【表６−１８】
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【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
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【表７−９】
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【表７−１０】
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【表７−１１】
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【表７−１２】
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【表７−１３】
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【表７−１４】
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【表８】
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【表９】
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【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【０２５４】
等価物
当業者らは、ルーチン的な実験作業のみを使用して、本明細書において記載される、本発明の特定の実施形態および方法の多くの等価物を認識するであろうまたは確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の請求項の範囲によって包含されるように意図される。
【０２５５】
付録Ａ
健康な免疫前セット（ＨＰＳ）における３，５７１の配列のＧＩ番号
【表３３−１】
2019023247.tif 000342
【表３３−２】
2019023247.tif 000343
【表３３−３】
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【表３３−４】
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【表３３−５】
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【表３３−６】
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【表３３−７】
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【表３３−８】
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【表３３−９】
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【表３３−１０】
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【表３３−１１】
2019023247.tif 000352
【表３３−１２】
2019023247.tif 000353
【表３３−１３】
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【表３３−１４】
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【表３３−１５】
2019023247.tif 000356
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2019023247.tif 000361
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019023247.tif 000366
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
2019023247000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月26日(2018.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
【図１】ＶＫ１−３９におけるバーニア残基（Ｖｅｒｎｉｅｒ  ｒｅｓｉｄｕｅ）４および４９（星印）が、ＣＤＲ位置の多様性指標と同等のまたはそれを超える（つまり、本実施例において０．０７以上の）多様性指標を有することを示す。
【図２】臨床的に検証されたＣＤＲＬ３配列が、生殖系列様配列からほとんど外れていないことを示す（ｎ＝３５）。
【図３】生殖系列からＸ以下の突然変異を有する、本発明のジャンピング二量体ＣＤＲＬ３ライブラリーおよび以前のＣＤＲＬ３ライブラリー、ＶＫ−ｖ１．０における配列のパーセントを示す。ここで、ＦＸは、生殖系列からＸ以下の突然変異を有する、ライブラリーにおける配列の割合である。
【図４】親Ｈ３−ＪＨセグメントをコードするヌクレオチド配列（出現順にそれぞれ、配列番号８７４８〜８７５９）を生成するために使用される、提供された方法の適用を示す。
【図５】理論的および／または合成ライブラリーにおける包含のために理論的セグメントプールからセグメントを選択するために使用されるアプローチの概略図を示す。
【図６】ＤＨセグメント疎水性（右に向かって増加）に応じた、米国特許出願公開第２００９／０１８１８５５号において記載される酵母ベースのライブラリーから単離される「好適な」および「不十分な」発現のＣＤＲＨ３配列の度数ならびにその中に記載されるライブラリー設計において含有される配列（「設計」）に対するそれらの比較を示す。
【図７】０、１、２、３、または３つを超えるアミノ酸ミスマッチで、Ｌｅｅ−６６６およびＢｏｙｄ−３０００由来のＣＤＲＨ３配列にマッチする、ＬＵＡ−１４１ライブラリーおよびＥｘｅｍｐｌａｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３（ＥＬＤ−３）におけるＣＤＲＨ３配列の割合を示す。
【図８】Ｅｘｅｍｐｌａｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３（ＥＬＤ−３）およびＥｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎの両方が、ＬＵＡ−１４１ライブラリーよりも、臨床的に適切なＣＤＲＨ３配列に対する、より好適なマッチをもたらすことを示す。
【図９】Ｅｘｅｍｐｌａｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３（ＥＬＤ−３）のコンビナトリアル効率が、ＬＵＡ−１４１ライブラリーを超えることを示す。特に、ＥＬＤ−３セグメントは、ＬＵＡ−１４１ライブラリーセグメントよりも、ユニークなＣＤＲＨ３を得る可能性が高い。
【図１０】ＬＵＡ−１４１、Ｅｘｅｍｐｌａｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３（ＥＬＤ−３）、およびＨＰＳ由来のヒトＣＤＲＨ３配列（Ｈｕｍａｎ  Ｈ３）のＫａｂａｔ−ＣＤＲＨ３のアミノ酸組成を示す。
【図１１】ＬＵＡ−１４１、Ｅｘｅｍｐｌａｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３（ＥＬＤ−３）、およびＨＰＳ由来のヒトＣＤＲＨ３配列（Ｈｕｍａｎ  Ｈ３）のＫａｂａｔ−ＣＤＲＨ３の長さの分布を示す。
【図１２】０〜３２のアミノ酸ミスマッチで、Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．由来のＣＤＲＨ３配列にマッチする、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｌｉｂｒａｒｙにおけるＣＤＲＨ３配列の割合を示す。
【図１３】Ｅｘｅｍｐｌａｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３（「ＥＬＤ−３」）、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ（「Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ」）、およびＢｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．のデータセット由来のヒトＣＤＲＨ３配列（「Ｂｏｙｄ  ２００９」）のＫａｂａｔ−ＣＤＲＨ３の長さの分布を示す。
【図１４】Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ（「Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ」）およびＢｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．のデータセット由来のヒトＣＤＲＨ３配列（「Ｂｏｙｄ  ２００９」）のＫａｂａｔ−ＣＤＲＨ３のアミノ酸組成を示す。
【図１５】（同じ）設計由来の２０，０００のランダムに選択された配列とマッチさせることによる、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎのコンビナトリアル効率を示す。配列の約６５％は、設計において１回だけ現れ、約１７％は、２回現れる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１１】
表９は、理論的セグメントプール１（「ＴＳＰ１」）を使用する、ＨＰＳ由来の参照ＣＤＲＨ３配列ＥＲＴＩＮＷＧＷＧＶＹＡＦＤＩ（配列番号８７６０）（テストケース５．１〜５．４）についてのマッチング結果を提供する。参照ＣＤＲＨ３に対する最良のマッチは、４つのＣＤＲＨ３配列であり、それぞれ、参照ＣＤＲＨ３配列の３アミノ酸の範囲内にある。これらのマッチのそれぞれにおいて、ＴＮ１、ＤＨ、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントは、それぞれ長さ４、３、３、および５のアミノ酸である。したがって、参照ＣＤＲＨ３は、以下のセグメントにデコンボリューションすることができる：ＥＲＴＩ−ＮＷＧ−ＷＧＷ−ＹＡＦＤＩ（配列番号８７６１）（つまり、それぞれ［ＴＮ１］−［ＤＨ］−［Ｎ２］−［Ｈ３−ＪＨ］）。参照ＣＤＲＨ３由来のＤＨおよびＨ３−ＪＨセグメントであるＮＷＧおよびＹＡＦＤＩ（配列番号４５４０）は、それぞれ、ＴＳＰ１中に同様に存在する。しかしながら、参照ＣＤＲＨ３由来のＴＮ１（ＥＲＴＩ）（配列番号８７１８）およびＮ２（ＷＧＷ）セグメントは、ＴＳＰ１において不在であり、１つまたは複数のアミノ酸ミスマッチでＴＳＰ１セグメントにマッチする。これらの「新規な」ＴＮ１およびＮ２セグメントは、参照ＣＤＲＨ３から抽出し、包含について可能性のある理論的セグメントプールおよび／または合成ライブラリーと考えられる。さらなる新規なＴＮ１およびＮ２セグメントは、ＨＰＳのすべてのメンバーにこの分析を適用することによって蓄積した。ＴＮ１およびＮ２配列を確実に同定するために、抽出は、参照ＣＤＲＨ３およびＴＳＰ１におけるＤＨおよびＨ３−ＪＨセグメントが累積的に多くとも３つのアミノ酸ミスマッチしかもたらさないＣＤＲＨ３配列についてのみ実行し、これは、参照ＣＤＲＨ３のＤＨおよびＨ３−ＪＨセグメントが確実に割り当てられたことを暗示した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
実施例８．１．表９におけるテストケース１についてのセグメント使用ウエイト
表９におけるテストケース１を参照されたい。ＣＤＲＨ３配列ＲＴＡＨＨＦＤＹ（配列番号３６６０）は、ユニークなセグメントの組み合わせ（ｇ＝１）によってＴＳＰ１（ｆ＝１、簡潔さのために添字は省略する）において同様に位置する。表１８は、テストケース１のＣＤＲＨ３についてのＴＳＰ１由来の最良のマッチに相当するセグメントについての使用ウエイトを提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１５】
実施例８．２．表９におけるテストケース２．１および２．２についてのセグメント使用ウエイト
表９におけるテストケース２．１および２．２を参照されたい。ＣＤＲＨ３配列ＶＧＩＶＧＡＡＳＹ（配列番号３６６１）は、２つの別個のセグメントの組み合わせ（ｇ＝２）によってＴＳＰ１（ｆ＝１）において同様に位置し得る。表１９は、テストケース２．１および２．２のＣＤＲＨ３についてのＴＳＰ１由来の最良のマッチに相当するセグメントについての使用ウエイトを提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１６】
実施例８．３．表９におけるテストケース３．１についてのセグメント使用ウエイト
表９におけるテストケース３．１を参照されたい。ＣＤＲＨ３配列ＤＲＹＳＧＨＤＬＧＹ（配列番号３６６２）は、ただ一つのアミノ酸差異で、ユニークなセグメントの組み合わせ（ｇ＝１）によってＴＳＰ１において同様に位置し得る。下記に提供されるように、ＴＮ１、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントは、相当する参照配列断片に同様にマッチするが、５つのＤＨアミノ酸のうちの４つが、同様にマッチする。
ＨＰＳ由来の配列：ＤＲ−ＹＳＧＨＤ−ＬＧ−Ｙ（配列番号３６６２）
ＴＳＰ１において最も近い隣接物：ＤＲ−ＹＳＧＹＤ−ＬＧ−Ｙ（配列番号８７１９）
したがって、ここで、
ｆ＝ＤＨセグメントについて４／５および＝ＴＮ１、Ｎ２、およびＨ３−ＪＨセグメントについて１となる（表２０）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１７】
実施例８．４．表９におけるテストケース４．１および４．２のマッチング
表９におけるテストケース４．１および４．２を参照されたい。ＣＤＲＨ３配列ＧＩＡＡＡＤＳＮＷＬＤＰ（配列番号３６６３）は、それぞれただ一つのアミノ酸差異で、２つの別個のセグメントの組み合わせ（ｇ＝２）によってＴＳＰ１において位置し得る。下記に提供されるように、ＴＮ１、ＤＨ、およびＮ２セグメントは、相当する参照配列断片と同様にマッチするが、６つのＨ３−ＪＨアミノ酸のうちの５つが同様にマッチする。
ＨＰＳ由来の配列：（−）−ＧＩＡＡＡ−Ｄ−ＳＮＷＬＤＰ（配列番号３６６３）
ＴＳＰ１において最も近い隣接物：（−）−ＧＩＡＡＡ−Ｄ−ＳＮＷＦＤＰ（配列番号８７２０）
ＨＰＳ由来の配列：Ｇ−ＩＡＡＡ−Ｄ−ＳＮＷＬＤＰ（配列番号３６６３）
ＴＳＰ１において最も近い隣接物：Ｇ−ＩＡＡＡ−Ｄ−ＳＮＷＦＤＰ（配列番号８７２０）
ここで、（−）は、「空の」ＴＮ１セグメントを示す。
式２の適用により、表２１において提供されるセグメント使用ウエイトがもたらされる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１９】
実施例８．６．表９のテストケース５．１〜５．４についてのセグメント使用ウエイトの計算
ＣＤＲＨ３配列ＥＲＴＩＮＷＧＷＧＶＹＡＦＤＩ（配列番号８７６０）ならびに実施例７においてＣＤＲＨ３配列から抽出した新規なＴＮ１およびＮ２セグメントを参照されたい。この場合、新規なＴＮ１およびＮ２セグメント（それぞれＥＲＴＩ（配列番号８７１８）およびＷＧＶ）ならびにＴＳＰ１由来のＤＨおよびＨ３−ＪＨセグメント（それぞれＮＷＧおよびＹＡＦＤＩ（配列番号４５４０））はそれぞれ、単一の使用ウエイトが割り当てられる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５３】
図１２〜１５は、この設計のある種の特徴を示す。たとえば、Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．におけるおよそ２３７，０００のＣＤＲＨ３配列の約５０％が、１つのミスマッチを有するまたはミスマッチを有していないライブラリー配列によって再現され得ることを示す（つまり、図１２の「０」および「１」のビン（ｂｉｎ）を合計することによって）。これらのライブラリーの理論的な長さ分布（図１３）およびアミノ酸組成（図１４）もまた、ヒトＣＤＲＨ３配列の同じセットにおいて観察されるそれぞれの特徴と厳密にマッチする。図１５は、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎのコンビナトリアル効率を示す。配列のおよそ６５％は、設計において１回だけ現れる（つまり、セグメントの１つの非縮退組み合わせによって生成される）。先に示される図８は、臨床的に適切なヒト抗体配列に対するマッチングの点から、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎが、ＬＵＡ−１４１およびＥＬＤ−３の両方より優れていることを示す。
【表１−１】
2019023247.tif 000372
【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表２】
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【表３−１】
2019023247.tif 000377
【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【表５−９】
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【表５−１０】
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【表５−１１】
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【表５−１２】
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【表５−１３】
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【表５−１４】
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【表５−１５】
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【表５−１６】
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【表５−１７】
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【表５−１８】
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【表５−１９】
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【表５−２０】
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【表５−２１】
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【表５−２２】
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【表５−２３】
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【表５−２４】
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【表５−２５】
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【表５−２６】
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【表５−２７】
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【表５−２８】
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【表５−２９】
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【表５−３０】
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【表５−３１】
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【表５−３２】
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【表５−３３】
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【表５−３４】
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【表５−３５】
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【表５−３６】
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【表５−３７】
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【表５−３８】
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【表５−３９】
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【表５−４０】
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【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
2019023247.tif 000434
【表６−７】
2019023247.tif 000435
【表６−８】
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【表６−９】
2019023247.tif 000437
【表６−１０】
2019023247.tif 000438
【表６−１１】
2019023247.tif 000439
【表６−１２】
2019023247.tif 000440
【表６−１３】
2019023247.tif 000441
【表６−１４】
2019023247.tif 000442
【表６−１５】
2019023247.tif 000443
【表６−１６】
2019023247.tif 000444
【表６−１７】
2019023247.tif 000445
【表６−１８】
2019023247.tif 000446
【表６−１９】
2019023247.tif 000447
【表６−２０】
2019023247.tif 000448
【表６−２１】
2019023247.tif 000449
【表６−２２】
2019023247.tif 000450
【表６−２３】
2019023247.tif 000451
【表６−２４】
2019023247.tif 000452
【表６−２５】
2019023247.tif 000453
【表６−２６】
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【表６−２７】
2019023247.tif 000455
【表６−２８】
2019023247.tif 000456
【表６−２９】
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【表６−３０】
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【表６−３１】
2019023247.tif 000459
【表６−３２】
2019023247.tif 000460
【表６−３３】
2019023247.tif 000461
【表６−３４】
2019023247.tif 000462
【表６−３５】
2019023247.tif 000463
【表６−３６】
2019023247.tif 000464
【表６−３７】
2019023247.tif 000465
【表６−３８】
2019023247.tif 000466
【表６−３９】
2019023247.tif 000467
【表７−１】
2019023247.tif 000468
【表７−２】
2019023247.tif 000469
【表７−３】
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【表７−４】
2019023247.tif 000471
【表７−５】
2019023247.tif 000472
【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
2019023247.tif 000475
【表７−９】
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【表７−１０】
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【表７−１１】
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【表３１−２】
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【表３１−３】
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【表３１−４】
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【表３１−５】
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【表３１−６】
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【表３１−７】
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【表３２−１】
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【表３２−２】
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【表３２−３】
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【表３２−４】
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【表３２−５】
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【表３２−６】
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【表３２−７】
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【表３２−８】
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【表３２−９】
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【外国語明細書】
2019023247000001.pdf