(57)【要約】【課題】非結核性抗酸菌であるMycobacterium abscessus subsp. abscessus、Mycobacterium abscessus subsp. massiliense、及びMycobacterium abscessus subsp. bolletiiの３亜種を識別できるプライマーセットを提供する。【解決手段】第１のプライマーは、配列番号１で示されるフォワードプライマー(Primer F)及び配列番号２で示されるリバースプライマー(Primer R)である。第２のプライマーは、配列番号３で示されるフォワードプライマー(Primer F)及び配列番号４で示されるリバースプライマー(Primer R)である。【選択図】図４
2019097493.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非結核性抗酸菌であるMycobacterium abscessus subsp. abscessus、Mycobacterium abscessus subsp. massiliense、及びMycobacterium abscessus subsp. bolletiiの３亜種を識別できるプライマーセットであって、
第１のプライマーは下記からなり、
フォワードプライマー  gttcggatcgcatggcgttgtgctg      ・・・配列番号１
リバースプライマー    gggatgctgtgatcgaggtcggc        ・・・配列番号２
第２のプライマーは下記からなる
フォワードプライマー  gagggcacgggagagaccaccggag      ・・・配列番号３
リバースプライマー  ccatttcYctatcYcgcccg(Yはc又はt)・・・配列番号４
ことを特徴とする非結核性抗酸菌３亜種の識別プライマーセット。
【請求項２】
請求項１に記載のプライマーセットを用いた核酸増幅により、Mycobacterium abscessus subsp. abscessus、Mycobacterium abscessus subsp. massiliense、及びMycobacterium abscessus subsp. bolletiiの３亜種を識別することを特徴とする非結核性抗酸菌３亜種の識別方法。
【請求項３】
前記核酸増幅は、マルチプレックスPCRを用いることを特徴とする請求項２に記載の非結核性抗酸菌３亜種の識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非結核性抗酸菌３亜種を識別できるプライマーセット、及び、非結核性抗酸菌３亜種の識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗酸菌は結核菌、らい菌、及び非結核性抗酸菌の３つに大別される。非結核性抗酸菌は現在までに１７０種類以上の菌種が報告されており、そのうち３０種類程度がヒトに病原性を示すことがわかっている。非結核性抗酸菌症のなかでも、Mycobacterium abscessus complex症は既存の抗菌薬が効きづらく有効な治療法が確立されていないため、患者数は蓄積し、重症者も増えてきている。本邦においても、肺Mycobacterium abscessus complex症の患者数が急増している。最新の疫学調査から、罹患率は１０万人あたり０．５人と推定され、前回調査から約５倍に増えていることが判明した。
【０００３】
原因菌群であるMycobacterium abscessus complexは、Mycobacterium abscessus subsp. abscessus、Mycobacterium abscessus subsp. massiliense、及びMycobacterium abscessus subsp. bolletiiの３亜種により構成され、それぞれの亜種により抗菌薬に対する感受性や、抗菌薬に対する耐性獲得能、及び治療成績に違いが見られることが報告されていることから、３亜種を鑑別することは適切な治療法を選択する上で重要である。
【０００４】
しかしながら、本邦の臨床現場において頻用されている抗酸菌種鑑別キットDDHマイコバクテリア極東では、Mycobacterium abscessus complexを亜種レベルで鑑別することはできない。Mycobacterium abscessus complex ３亜種を正確かつ客観的に鑑別するためには、ゲノム情報に基づく系統解析、hsp65遺伝子やrpoB遺伝子等のハウスキーピング遺伝子、及びスペーサー領域を用いたマルチローカスシーケンス解析、又はパルスフィールド電気泳動による解析が必要であるが、これらの方法は労力及び費用の負担が大きく、また迅速性の面からも臨床現場における菌種の鑑別には適さない。
【０００５】
非特許文献１には、マルチプレックスPCRプライマーを用いて、Mycobacterium abscessus subsp. abscessusとMycobacterium abscessus subsp. massilienseとの２種を識別する手法が記載されている。しかしながら、上述の亜種３種は治療反応性に差異があり、亜種３種の何れかであるか識別できる手法が求められる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Discrimination of Mycobacterium abscessus subsp. massiliense from Mycobacterium abscessussubsp. abscessusin Clinical Isolates by Multiplex PCR, Kazue Nakanaga, Journal of Clinical Microbiology, January 2014 Volume 52 Number 1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、非結核性抗酸菌であるMycobacterium abscessus subsp. abscessus、Mycobacterium abscessus subsp. massiliense、及びMycobacterium abscessus subsp. bolletiiの３亜種を識別できるプライマーセットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明にかかるプライマーセットは、非結核性抗酸菌であるMycobacterium abscessus subsp. abscessus、Mycobacterium abscessus subsp. massiliense、及びMycobacterium abscessus subsp. bolletiiの３亜種を識別できるプライマーセットであって、
第１のプライマーは下記からなり、
フォワードプライマー(Primer F)  gttcggatcgcatggcgttgtgctg・・配列番号１
リバースプライマー(Primer R)    gggatgctgtgatcgaggtcggc  ・・配列番号２
第２のプライマーは下記からなることを特徴とする。
フォワードプライマー(Primer F)  gagggcacgggagagaccaccggag・・配列番号３
リバースプライマー(Primer R)  ccatttcYctatcYcgcccg(Yはc又はt)・・配列番号４
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、非結核性抗酸菌であるMycobacterium abscessus subsp. abscessus、Mycobacterium abscessus subsp. massiliense、及びMycobacterium abscessus subsp. bolletiiの３亜種を識別できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】非結核性抗酸菌３亜種の系統解析の結果を示す図である。
【図２】配列番号１及び２のプライマーセットについて、偽陽性による増幅反応が起きないことを示す電気泳動写真図である。
【図３】配列番号３及び４のプライマーセットについて、偽陽性による増幅反応が起きないことを示す電気泳動写真図である。
【図４】マルチプレックスPCR用プライマーによるMycobacterium abscessus complexの標準株及び臨床分離株検出を示す電気泳動写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１２】
肺Mycobacterium abscessus complex症は３つの亜種に分けられ、治療無効とされるMycobacterium abscessus subsp. abscessus及び稀だが同等に難治とされるMycobacterium abscessus subsp. bolletiiと、マクロライド治療が有効なMycobacterium abscessus subsp. massilienseと、を明確に区別することは実地臨床でも不可欠となってきている。亜種により治療反応性に差異が生じる原因は、耐性誘導遺伝子(ermgene)の活性の有無により特徴づけられることが分かっている。
【００１３】
本発明者らは、Mycobacterium abscessus complex症の原因菌群であるMycobacterium abscessus subsp. abscessus、Mycobacterium abscessus subsp. massiliense、及びMycobacterium abscessus subsp. bolletiiの標準株及び臨床分離株のゲノム情報を取得し、比較ゲノム解析を行った。この解析により、Mycobacterium abscessus complexに属する３亜種のそれぞれに特異的な挿入・欠損部位を発見した。
【００１４】
本発明にかかるプライマーセットは、マルチプレックスPCR用のプライマーセットである。マルチプレックスPCRは、一つのPCR反応系に複数のプライマー対を同時に使用することで、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。
【００１５】
本発明にかかるプライマーセットは、第１プライマー対及び第２のプライマー対からなる。
【００１６】
第１のプライマーは下記からなる。
フォワードプライマー  gttcggatcgcatggcgttgtgctg      ・・・配列番号１
リバースプライマー    gggatgctgtgatcgaggtcggc        ・・・配列番号２
第２のプライマーは下記からなる。
フォワードプライマー  gagggcacgggagagaccaccggag      ・・・配列番号３
リバースプライマー  ccatttcYctatcYcgcccg(Yはc又はt)・・・配列番号４
これらのプライマーセットを用いた核酸増幅により、非結核性抗酸菌であるMycobacterium abscessus subsp. abscessus、Mycobacterium abscessus subsp. massiliense、及びMycobacterium abscessus subsp. bolletiiの３亜種を識別できる。核酸増幅には前述のようにマルチプレックスPCRを用いる。
【実施例】
【００１７】
Mycobacterium abscessus complex ３亜種の標準株及び臨床分離株のゲノム情報は、純粋培養から調製したDNA及び次世代シークエンサ（MiSeq（illumina））によって得た。
【００１８】
まず初めに、得られたMycobacterium abscessus complexの標準株及び臨床分離株のゲノム情報と、NCBI (National Center for Biotechnology Information)に既に登録されている標準株の配列情報（アクセッション番号NC_010397 (Mycobacterium abscessus subsp. abscessus)、NZ_AP014547 （Mycobacterium abscessus subsp. massiliense）、NZ_AHAS00000000 (Mycobacterium abscessus subsp. bolletii)）を使用した系統解析を行い、Mycobacterium abscessus complex臨床分離株の菌種を亜種レベルで鑑別した。
【００１９】
次に、得られたゲノム情報に対して、Mauveソフトウェア(Darlingら(2005))を用いて核酸配列のアライメントを行い、３亜種それぞれに特異的な挿入・欠損部位を探索・発見し、その部位の上流及び下流の共通配列に相補的なPCRプライマーを作成した。
【００２０】
第１のプライマーは下記であった。
フォワードプライマー  gttcggatcgcatggcgttgtgctg      ・・・配列番号１
リバースプライマー    gggatgctgtgatcgaggtcggc        ・・・配列番号２
第２のプライマーは下記であった。
フォワードプライマー  gagggcacgggagagaccaccggag      ・・・配列番号３
リバースプライマー  ccatttcYctatcYcgcccg(Yはc又はt)・・・配列番号４
まず、本発明のPCR用プライマーセットが、増幅対象領域を正しく増幅できるかを確認するための検証実験を行った。
【００２１】
試験方法は、本発明のPCR用プライマーを含有するPCR反応液を用いてPCR法により増幅反応を行い、増幅産物を電気泳動することで、正しい増幅産物が得られることを確認した。具体的には、二種類のプライマーセットごとに以下の試験１及び２において説明する。
【００２２】
（試験１）
まず、PCRプライマーセットして、配列番号１及び２に示す塩基配列からなるプライマーを備えたものを用いた。増幅対象領域は、Mycobacterium abscessus３亜種それぞれのゲノムDNAに共通する膜輸送体タンパク質（MAB_2613、MMASJCM_RS12825、MBOL_24380）の下流領域である。この下流領域には、Mycobacterium abscessus subsp. abscessusと比較してMycobacterium abscessus subsp. massilienseにおいて８1bpの配列欠損が、Mycobacterium abscessus subsp. bolletiiにおいて７８1bpの配列挿入がみられる。従って増幅産物は、Mycobacterium abscessus subsp. abscessusが503 bpに対して、Mycobacterium abscessus subsp. massilienseが422 bp、Mycobacterium abscessus subsp. bolletiiが1204 bpである。
【００２３】
PCR反応液としては以下の組成のものを用いた。プライマーはSigma-Genosys LP社より合成した。それ以外はapplied biosystems社製である。
・緩衝液、核酸合成基質及び核酸合成酵素の混合溶液2×AmpliTaq Gold 360 Master Mix 10 μl
・PCR補助試薬  10×GC enhancer 2 μl
・primer F (10 ng/μl、final conc. 10 ng) 1 μl
・primer R (10 ng/μl、final conc. 10 ng) 1 μl
・試料のDNA 1 μl
・滅菌水 5 μl
（全量２０ μl） 
また、試料のDNAは、次の１〜１３に示す抗酸菌の供試菌株又は臨床分離株のゲノムDNAをそれぞれ別個に含有させ、個別にPCRを行った。
１．Mycobacterium abscessus subsp. abscessus ATCC 19977
２．Mycobacterium abscessus subsp. abscessusの臨床分離株５株
３．Mycobacterium abscessus subsp. massiliense JCM 15300
４．Mycobacterium abscessus subsp. massilienseの臨床分離株６株
５．Mycobacterium abscessus subsp. bolletii JCM 15297
６．Mycobacterium abscessus subsp. bolletiiの臨床分離株3株
７．Mycobacterium chelonae JCM 6388
８．Mycobacterium conceptionense JCM 15299
９．Mycobacterium fortuitum ATCC 6841
１０．Mycobacterium houstonense JCM 15656
１１．Mycobacterium salmoniphilum ATCC 13758
１２．Mycobacterium senegalense ATCC 35796
１３．Mycobacterium smegmatis ATCC 700084
１４．Negative Cont.
これらの抗酸菌の菌株は次の機関から分譲されたものである。
・ATCC American Type Culture Collection
・JCM Japan Collection of Microorganisms
また、Mycobacterium abscessus subsp. abscessus、Mycobacterium abscessus subsp. massiliense及びMycobacterium abscessus subsp. bolletiiの臨床分離株は、公益財団法人結核予防会結核研究所より分譲されたものである。これらの臨床分離株については、ゲノムシーケンスを行ったのちに供試菌株１、３及び５とともに系統解析を行い、いずれの亜種に分類されるか確認した。系統解析の結果を図１に示す。
【００２４】
なお、供試菌株７〜１３の抗酸菌を含有するPCR反応液を用いた試験は、本実施形態のPCR用プライマーセットについての偽陽性反応を確認するために行った。また１４の試験は、試料のDNAに代えて同量の滅菌水をPCR反応液に加えたものである。
【００２５】
PCR法による遺伝子の増幅には、マスターサイクラー・グラディエント（エッペンドルフ社製）又はPCR Thermal Cycler Dice (タカラ社製)を使用した。また、PCR条件は、次の条件で行った。
（１）９５℃  ２分
（２）９５℃  ４０秒
（３）６２℃  ４０秒
（４）７２℃  １分
（２）〜（４）を３０サイクル
（５）７５℃  ５分
次に、PCR法による産物を、アガロースゲル電気泳動により増幅対象領域ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。電気泳動は、Mupid-2 plus (タカラ社製)を用いて行った。その結果を図２に示す。
【００２６】
図２において、各バンドは各試料のDNA等を含有するPCR反応液を用いて行ったPCRの産物を、それぞれ電気泳動した結果を示している。試験２においても同様である。
【００２７】
試験１のPCRプライマーセットは、配列番号１及び２に示す塩基配列からなるプライマーを備えたものであり、増幅対象領域はMycobacterium abscessus ３亜種に共通する膜輸送体遺伝子の下流領域であり、増幅産物は、Mycobacterium abscessus subsp. abscessusが503 bp、Mycobacterium abscessus subsp. massilienseが422 bp、Mycobacterium abscessus subsp. bolletiiが1204 bpである。
【００２８】
図２では、試料DNAとしてMycobacterium abscessus subsp. abscessusのゲノムDNAを使用した供試菌株１及び臨床分離株２において５００bp付近のバンドが見られる。同様に、供試菌株３及び臨床分離株４において４２０bp付近にバンドが見られ、供試菌株５及び臨床分離株６において１２００bp付近にバンドが見られる。その他共試菌株７〜１３には同付近にバンドは見られない。
【００２９】
以上のことから、試料DNAとしてMycobacterium abscessus subsp. abscessus、Mycobacterium abscessus subsp. massiliense及びMycobacterium abscessus subsp. bolletiiのゲノムDNAを使用した菌株１〜６では、試験１のプライマーセットにより、Mycobacterium abscessus ３亜種に共通する膜輸送体遺伝子の下流領域が正しく増幅されていると判断できる。
【００３０】
一方、試料のDNAとしてその他のゲノムを使用した供試菌株７〜１３のレーンを参照すると、膜輸送体遺伝子の下流領域が増幅されたものと誤認してしまうような、非対象領域の増幅は見られなかった。
【００３１】
これにより、配列番号１及び２に示す塩基配列からなるプライマーを備えたPCR用プライマーセットを用いることで、Mycobacterium abscessus ３亜種に共通する膜輸送体の下流領域を特異的に増幅できることが確認された。
【００３２】
（試験２）
PCR用プライマーとしてセットとして、配列番号３及び４に示す塩基配列からなるプライマーを備えたものを用いた点以外は、試験１と同様にして実験を行った。その結果を図３に示す。
【００３３】
試験２のPCR用プライマーセットの増幅対象領域は、Mycobacterium abscessus ３亜種に共通するATP結合カセット輸送体遺伝子（MAB_1655、MMASJCM_RS08315、MBOL_16200）の下流領域である。この下流領域には、Mycobacterium abscessus subsp. abscessusと比較してMycobacterium abscessus subsp. massilienseにおいて３６１bpの配列欠損が、Mycobacterium abscessus subsp. bolletiiにおいて２００bpの配列欠損がみられる。従って増幅産物は、Mycobacterium abscessus subsp. abscessusが６５２bpに対して、Mycobacterium abscessus subsp. massilienseが２９１bp、Mycobacterium abscessus subsp. bolletiiが４５２bpである。
【００３４】
図３では、試料DNAとしてMycobacterium abscessus subsp. abscessusのゲノムDNAを使用した供試菌株１及び臨床分離株２において６５０bp付近のバンドが見られる。同様に、供試菌株３及び臨床分離株４において４５０bp付近にバンドが見られ、供試菌株５及び臨床分離株６において２９０bp付近にバンドが見られる。その他共試菌株７〜１３には同付近にバンドは見られない。
【００３５】
従って、試料DNAとしてMycobacterium abscessus subsp. abscessus、Mycobacterium abscessus subsp. massiliense及びMycobacterium abscessus subsp. bolletiiのゲノムDNAを使用した菌株１〜６では、試験２のプライマーセットにより、Mycobacterium abscessus ３亜種に共通するATP結合カセット輸送体遺伝子の下流領域が正しく増幅されていると判断できる。
【００３６】
一方、試料のDNAとしてその他のゲノムを使用した供試菌株７〜１３のレーンを参照すると、ATP結合カセット輸送体遺伝子の下流領域が増幅されたものと誤認してしまうような、非対象領域の増幅は見られなかった。
【００３７】
これにより、配列番号３及び４に示す塩基配列からなるプライマーを備えたPCR用プライマーセットを用いることで、Mycobacterium abscessus ３亜種に共通するATP結合カセット輸送体遺伝子の下流領域を特異的に増幅できることが確認された。
【００３８】
以上の通り、本実施形態のPCRプライマーセットは、それぞれ単独で用いた場合には、当該プライマーセットの増幅対象でない他の抗酸菌のゲノムDNAに関し、偽陽性による増幅反応が起きないことが確認された。
【００３９】
次に、これらのPCR用プライマーセットを同時に使用した場合において、対象領域を特異的に増幅できるかを検証した。その結果を以下の実施例において説明する。
【００４０】
まず、PCRプライマーセットとして、試験１及び試験２で使用した全てのプライマーセットを用いて実験を行った。すなわち、本実施例のPCR反応液には、配列番号１〜４に示す塩基配列からなる全てのプライマーを含有させた。
【００４１】
本実施例のPCR反応液は、プライマー、試料のDNA、及び滅菌水以外は試験１と同様であり、以下の組成のものを使用した。
・緩衝液、核酸合成基質及び核酸合成酵素の混合溶液２×AmpliTaq Gold 360 Master Mix 10 μl
・PCR補助試薬  10×GC enhancer 2 μl
・primer F (配列番号１、10 ng/μl、final conc. 10 ng) 1 μl
・primer R (配列番号２、10 ng/μl、final conc. 10 ng) 1 μl
・primer F (配列番号３、10 ng/μl、final conc. 10 ng) 1 μl
・primer R (配列番号４、10 ng/μl、final conc. 10 ng) 1 μl
・試料のDNA 1 μl
・滅菌水 ３μl
（全量２０ μl）
また、試料のDNAは、次の１〜６に示す抗酸菌の供試菌株又は臨床分離株のゲノムDNAをそれぞれ別個に含有させ、個別にPCRを行った。
１．Mycobacterium abscessus subsp. abscessusATCC 19977
２．Mycobacterium abscessus subsp. abscessusの臨床分離株５株
３．Mycobacterium abscessus subsp. massiliense JCM 15300
４．Mycobacterium abscessus subsp. massilienseの臨床分離株６株
５．Mycobacterium abscessus subsp. bolletii JCM 15297
６．Mycobacterium abscessus subsp. bolletiiの臨床分離株3株
PCR法による遺伝子の増幅は、試験１と同様に、マスターサイクラー・グラディエント（エッペンドルフ社製）又はPCR Thermal Cycler Dice (タカラ社製)を使用した。また、PCR条件は、次の条件で行った。
（１）９５℃  ２分
（２）９５℃  ４０秒
（３）６２℃  ４０秒
（４）７２℃  １分
（２）〜（４）を３０サイクル
（５）７５℃  ５分
次に、PCR法による産物を、アガロースゲル電気泳動により増幅対象領域ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。電気泳動は、Mupid-2 plus (タカラ社製)を用いて行った。その結果を図４に示す。
【００４２】
図４において、各バンドは各試料のDNA等を含有するPCR反応液を用いて行ったPCRの産物を、それぞれ電気泳動した結果を示している。
【００４３】
図４では、試料DNAとしてMycobacterium abscessus subsp. abscessusのゲノムDNAを使用した供試菌株１及び臨床分離株群２において５００bp及び６５０bp付近のバンドが見られる。同様に、供試菌株３及び臨床分離株群４において４２０bp及び２９０bp付近にバンドが見られ、供試菌株５及び臨床分離株群６において１２００bp及び４５０bp付近にバンドが見られる。
【００４４】
これらは、それぞれ理論上の増幅産物の塩基配列と近似するものであり、本実施形態のPCRプライマーセットによって、それぞれ対象とする抗酸菌の増幅対象領域が特異的に増幅できていると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
非結核性抗酸菌３亜種の識別に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００４６】
配列番号１〜４：プライマー
【図１】
2019097493.tif 000003
【図２】
2019097493.tif 000004
【図３】
2019097493.tif 000005
【図４】
2019097493.tif 000006
【配列表】
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