(57)【要約】      （修正有）【課題】高度な制御機構を持つ冷凍庫あるいは極低温の装置あるいは液体を用いることなく、低コストで、安全性が高く、汎用性の高い植物苗の冷凍保存技術を提供。【解決手段】高い温度で凍結を促す氷核活性細菌を、植物苗に噴霧、あるいは塗布することにより、生きたまま凍結保存する植物苗の冷凍保存方法。凍結を１０℃／分以上の速度で進行させ、凍結した苗を常温で緩慢に自然解凍させる、植物苗の冷凍保存方法。永核活性細菌が氷核活性細菌がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓに属するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐ．ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ、などであるか、Ｅｒｗｉｎｉａに属するＥ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｖｉｃｏｌａ、Ｅ．ｓｔｅｗａｒｔｉｉ、もしくはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓに属するＸ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓなどを含み、さらにこれら細菌由来の遺伝子をクローニングして得られた菌液、もしくは抽出液を用いる植物苗の冷凍保存方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生長期にある植物苗の生理活性を損なうことなく、凍結保存する技術であって、非イオン界面活性剤を含む氷核活性細菌もしくは破砕液、あるいはその活性をもつタンパク質を塗布、または散布し、凍結させ、保存することを特徴とする、植物苗の保存方法
【請求項２】
凍結を１０℃／分以上の速度で進行させることを特徴とする、請求項１に記載の植物内の保存方法
【請求項３】
請求項１に記載の方法で凍結した植物苗を、常温で緩慢に自然解凍させることを特徴とする、請求項１および２に記載の植物苗の保存方法
【請求項４】
氷核活性細菌がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓに属するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐ．ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ、などであるか、Ｅｒｗｉｎｉａに属するＥ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｖｉｃｏｌａ、Ｅ．ｓｔｅｗａｒｔｉｉ、もしくはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓに属するＸ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓなどを含み、さらにこれら細菌由来の遺伝子をクローニングして得られた菌液、もしくは抽出液であり、これらのうち、１０６／ｍＬ以上の細胞を生存したまま、あるいは、同濃度の細胞懸濁液を圧力、研磨あるいは超音波などで破砕した破砕液、もしくは紫外線、γ線などで処理して生理活性を奪った細菌懸濁液を用いることを特徴とする、請求項１〜３のそれぞれに記載の植物苗の保存方法
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、植物苗を冷凍保存し、活性を持ったまま解凍する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】  鮮度を保つための冷凍技術は最近急速冷凍法や、低い冷凍温度などが一般化され、日々進化している。
しかしながら、成長期にある植物苗を損壊なく冷凍し、解凍することは極めて困難である。特に保存温度は液体窒素などを用いる必要があり、これを用いても、動物胚とは異なり、通常の方法では解凍後、蘇生させることはほとんど不可能であった。
細胞を損壊なく冷凍するには、効率的な脱水が不可欠であり、細胞内に氷の結晶が形成されないようにガラス化することが肝要である。動物や植物の培養細胞あるいは細菌類では糖質、ＤＭＳＯなどが古くから用いられており、その液中で一定時間処理し、液体窒素中に入れ急速に凍結させる。【０００３】  近年、茶葉の表面から氷核活性細菌（ＩＮＡ）が見出されている。この細菌は氷核となるタンパク質を生成し、細胞の生死に拘らず氷結の際の核を提供し、−２℃という高い温度で水を凍結させることが判明している（文献１）。また、これまですでに、概タンパク質の分離、遺伝子（ｉｎａ群）の単離と解析（文献２、３）、大腸菌系プラスミドへのクローニングも完了している。【０００４】
【文献１】
Ｓ．Ｗ．Ｌｉｎｄｏｗ  Ａｎｎｕｎａｌ  Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｔｈｏｌｏｇｙ  ２１：３６３（１９８２）
【文献２】
Ｒ．Ｌ．Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｇ．Ｊ．Ｗａｒｒｅｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：６４６５（１９８５）
【文献３】
Ｇ．Ｊ．Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｇｏｒｏｔｔｏ  ａｎｄ  Ｐ．Ｗｏｌｂｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４４：８０４７（１９８６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本発明の目的は、通常の冷凍庫（−２０℃前後）で安定に植物苗を冷凍保存し、保存後の解凍においても再現よく細胞を復活させ、維持させることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、植物苗を氷核活性細菌懸濁液で処理することにより、上記の問題を解決できるとの知見を得た。
本発明は、この知見に基づいて、
１．生長期にある植物苗の生理活性を損なうことなく、凍結保存する技術であって、非イオン界面活性剤を含む氷核活性細菌もしくは破砕液、あるいはその活性をもつタンパク質を塗布、または散布し、凍結させ、保存することを特徴とする、植物苗の保存方法、
２．凍結を１０℃／分以上の速度で進行させることを特徴とする、１に記載の植物内の保存方法、
３．１に記載の方法で凍結した植物苗を、常温で緩慢に自然解凍させることを特徴とする、１に記載の植物苗の保存方法、
４．氷核活性細菌がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓに属するＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐ．ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ、などであるか、Ｅｒｗｉｎｉａに属するＥ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｖｉｃｏｌａ、Ｅ．ｓｔｅｗａｒｔｉｉ、もしくはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓに属するＸ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓなどを含み、さらにこれら細菌由来の遺伝子をクローニングして得られた菌液、もしくは抽出液であり、これらのうち、１０６／ｍＬ以上の細胞を生存したまま、あるいは、同濃度の細胞懸濁液を圧力、研磨あるいは超音波などで破砕した破砕液、もしくは紫外線、γ線などで処理して生理活性を奪った細菌懸濁液を用いることを特徴とする、１〜３のそれぞれに記載の植物苗の保存方法、
を提供するものである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】  氷核細菌の培養は、容易であること、安全であること、また対象植物苗に対して噴霧あるいは塗布などの簡便な作業で実行できること、さらに、高度に制御された冷凍庫が必要なく、一般に使用されているものが利用できることなどから経済的であること、などのように利点は多い。
【実施例及び比較例】
次に、本発明の実施例及び比較例について説明する。なお、以下に示す実施例は、本発明の理解を容易にするためのものであって、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。すなわち、本発明の技術思想に基づく、他の例又は変形は、当然本発明に包含されるものである。
【実施例１】
【０００８】ガラス化溶液の検討
高等動物の胚などの冷凍保存にはガラス化溶液などが必須であり、この処理によって胚の生存率を高めている。本発明者はまず動物細胞保存技術のアナロジーから、同様に植物においても有効に作用するかどうかを検討した。ガラス化溶液には多種多様なものが提案されており、実際に用いられているが、試みたものは、１）２０％エチレングリコール（ＥＧ）、２）３０％Ｆｉｃｏｌｌ７０−０．５Ｍ蔗糖−２０％ＥＧ−２０％ＤＭＳＯ、３）１５％ＤＭＳＯ−２０％ソルビトール、４）３０％グリセロール−１５％ＥＧ−１５％ＤＭＳＯ−１４％蔗糖、であった。いずれも高張液であるため、浸漬、あるいは塗布によっても、数分後には脱水され、萎びてしまい、枯死してしまった。上記ガラス化溶液を１／１０に希釈しても試みたが、同様の結果となった。従って、動物胚と同様な手法は用いることができないことが判明した。
【実施例２】
【０００９】氷核活性細菌を用いた凍結速度の検討
発明者は氷核活性細菌のみで植物苗の凍結保存が出来ることを見いだした。しかしながら、凍結速度は植物苗凍結に重大な影響を与えることも観察されたため、次に凍結速度を検討した。凍結速度の検討には、時間及び温度が同時記録されるデジタル温度計、および温度調節の可能な冷凍庫を用いた。
氷核活性細菌の培養液（１０９／ｍＬ）を、刷毛で朝顔の苗（本葉が出たもの）の全体に塗り、軽くティッシュペーパーで拭ったものを、プラスチックトレイに乗せ、これをそのまま（１）、発泡スチロールの箱（厚さ１ｃｍ）（２）、厚さ２ｃｍの発泡スチロール箱（３）、厚さ１ｃｍの発泡スチロールを二重にしたもの（４）を、冷凍庫（−２０℃）に入れ、１時間後、そのまま発泡スチロール箱を冷凍庫から取り出し、室温（２４℃）に放置し、結果を確認した。結果は表１に示している。その結果、そのまま凍結したものが約１１℃／分の凍結速度となり、苗が安全に保存された。このことから、理想の凍結速度は約１０℃／分であり、これは凍結温度を−２０℃にすることで実現できることが判明した。
［表１］
さらに刷毛で塗る際に、葉の表面にあるクチクラ層のため、水溶性の菌液は弾き返されることがある。これを一様に塗布できるように、菌液に影響のない非イオン性の界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ８０など）を混合することを試みた。０．５〜１％のＴｗｅｅｎ８０を用いた場合、斑なく塗ることが出来、解凍後にムラになることもなく、再現性が高かった。
【実施例３】
【００１０】解凍速度の検討
凍結保存で次に重要な要素は解凍速度である。動物胚の場合には瞬間に解凍することが勧められている。植物苗の場合にはどうかを検討した。実施例２と同様に処理した朝顔の苗について、発泡スチロールの箱から取り出し、すぐに３０℃の恒温機に入れたもの（１）、室温に置いたもの（２）、発泡スチロールの箱に入れ、室温に置いたもの（３）について比較を行なった。その結果、恒温機で解凍したもの、および室温に置いて解凍したものはいずれも葉焼けが起き、安全な保存は出来なかった。一方、箱に入れ室温に置いたものでは、よく保存されていた。
従って、解凍する場合には、急速に解凍するより、ゆっくり解凍した方が安全に保存できることが判明した。
【実施例４】
【００１１】  次に、冷凍保存温度についての検討を行なった。氷核活性細菌は、氷核を−２℃で形成させ、一気に概温度で凍結させることが知られている。概温度で凍結した苗がより低い温度で長期の保存が可能かどうかを検討した。一般に用いられている冷凍庫は−２０℃で維持されているが、温度調節の可能な冷凍庫を用いて、−５℃、−１０℃、−２０℃、−４０℃、−６０℃、−８０℃の各保存温度で、一昼夜保存後、実施例３（３）で示したような解凍を行ない、朝顔苗の保存状態を観察した。
その結果、保存温度に拘わらず、いずれも安全に保存が出来ており、凍結保存に差はなかった。一度凍結した苗はどの温度で保存しても良いことが示された。
【実施例５】
【００１２】長期保存性
長期保存性についての検討を行なった。実施例２に示す方法で朝顔の苗を処理し、保存を行なった。一般の冷凍庫の−２０℃を保存温度とし、約１ヶ月保存した。解凍も実施例３（３）のように行ない、苗の保存状態を観察した。ただし、氷核活性細菌そのまま、および研磨破砕したものの両方で行なった。
その結果、いずれも−２０℃で約１ヶ月間の苗保存が可能であることが示された。
【発明の効果】
【００１３】  本発明の植物苗の冷凍保存法は、一般に流通している冷凍庫の保存温度（約−２０℃）を用いることができること、操作が簡単で特別な技術を要しないこと、さらに氷核活性細菌の培養も一般細菌と同様に容易であり、一夜培養で１０９／ｍＬの濃度が確保できるため、経済的であることである。また、氷核活性細菌に病原性はないが、そのまま用いずとも、圧力、研磨、あるいは超音波、紫外線あるいはγ線で完全に破壊した抽出液においても同様の活性があり、さらに安全が高まる。また、植物苗以外でも植物一般に応用可能であると考えられるため、汎用性が高い。
【００１４】  ［表１］凍結速度の検討
凍結温度が異なる場合の植物苗の保存状態を比較した表である。
【表１】
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