(57)【要約】      （修正有）【課題】ペプチドＭＨＣ複合体を標的化できると共に、それぞれの抗原エピトープに結合した際に高い効力を与えるように改善された二重特異性分子の提供。【解決手段】第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含んでなる二重特異性ポリペプチド分子であって、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）関連ペプチドエピトープに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来する結合領域、及び、前記細胞の表面抗原に特異的に結合するヒト免疫エフェクター細胞を動員できる抗体に由来する結合領域とを有する、二重特異性ポリペプチド分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含んでなる分子の群から選択される、二重特異性ポリペプチド分子であって、
前記第１のポリペプチド鎖が、ヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体の可変ドメイン（ＶＤ１）の第１の結合領域を含んでなり、ＴＣＲの可変ドメイン（ＶＲ１）の第１の結合領域がＭＨＣ関連ペプチドエピトープに特異的に結合し、第１のリンカー（ＬＩＮＫ１）が前記ドメインを連結し；
前記第２のポリペプチド鎖が、ＭＨＣ関連ペプチドエピトープに特異的に結合するＴＣＲの可変ドメイン（ＶＲ２）の第２の結合領域を含んでなり、抗体の可変ドメイン（ＶＤ２）の第２の結合領域がヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に特異的に結合し、第２のリンカー（ＬＩＮＫ２）が前記ドメインを連結し；
前記第１の結合領域（ＶＤ１）および前記第２の結合領域（ＶＤ２）が結合して、ヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に結合する第１の結合部位（ＶＤ１）（ＶＤ２）を形成し；
前記第１の結合領域（ＶＲ１）および前記第２の結合領域（ＶＲ２）が結合して、前記ＭＨＣ関連ペプチドエピトープに結合する第２の結合部位（ＶＲ１）（ＶＲ２）を形成し；
前記２つのポリペプチド鎖が、ヒトＩｇＧヒンジドメインおよび／またはヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインまたはその二量体化部分に融合し；
前記２つのポリペプチド鎖が、前記ヒンジドメインおよび／またはＦｃ−ドメイン間の共有結合および／または非共有結合によって連結され；
前記二重特異性ポリペプチド分子が、前記細胞表面分子および前記ＭＨＣ関連ペプチドエピトープに同時に結合でき、
二重特異性ポリペプチド分子中で、前記２つのポリペプチド鎖中の前記結合領域の順序が、ＶＤ１−ＶＲ１およびＶＲ２−ＶＤ２またはＶＤ１−ＶＲ２およびＶＲ１−ＶＤ２、またはＶＤ２−ＶＲ１およびＶＲ２−ＶＤ１またはＶＤ２−ＶＲ２およびＶＲ１−ＶＤ１から選択され、前記ドメインがＬＩＮＫ１またはＬＩＮＫ２のどちらかによって連結される、二重特異性ポリペプチド分子。
【請求項２】
前記ポリペプチド鎖中の前記結合領域の順序がＶＤ１−ＶＲ１およびＶＤ２−ＶＲ２から選択され；前記ドメインがそれぞれＬＩＮＫ１またはＬＩＮＫ２によって連結される、請求項１に記載の二重特異性ポリペプチド分子。
【請求項３】
前記リンカー配列ＬＩＮＫ１および／またはＬＩＮＫ２が、ＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＴＶＬＲＴ、ＴＶＳＳＡＳ、およびＴＶＬＳＳＡＳから選択される、少なくとも１つの配列モチーフを含有する、請求項１に記載の二重特異性ポリペプチド分子。
【請求項４】
前記第１および第２のポリペプチド鎖が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４由来のヒンジドメインおよびＦｃドメインまたはその部分を少なくともさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド分子。
【請求項５】
前記Ｆｃドメインが、２３３、２３４、２３５、２３６、２９７、および３３１位から選択される残基に少なくとも１つのエフェクター機能サイレンシング変異を含んでなり、好ましくは前記エフェクター機能サイレンシング変異が、２３３、２３４、２３５、２３６、および３３１位の少なくとも１つの残基をＩｇＧ２またはＩｇＧ４由来の対応する残基で置換することによって生成される、請求項４に記載の二重特異性ポリペプチド分子。
【請求項６】
前記Ｆｃドメインが、ヘテロ二量体の形成を促進する少なくとも１つの変異を含んでなるＣＨ３ドメインを含んでなる、請求項３〜５のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド分子。
【請求項７】
前記変異が３６６、３６８、４０５、および４０７から選択される任意の位置にあり、好ましくは前記変異がノブ・イン・ホール変異としてＴ３６６ＷおよびＴ３６６’Ｓ、Ｌ３６８Ａ’およびＹ４０７’Ｖを含んでなる、請求項６に記載の二重特異性ポリペプチド分子。
【請求項８】
前記Ｆｃドメインが、例えば、Ｓ３５４ＣおよびＹ３４９ＣまたはＬ２４２ＣおよびＫ３３４Ｃなどの少なくとも２つの追加的なシステイン残基を含んでなるＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含んでなる、請求項３〜７のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド分子。
【請求項９】
前記抗体由来ドメインＶＤ１およびＶＤ２が、ＶＤ１およびＶＤ２の間に共有結合を導入する操作されたジスルフィド架橋を提示し、前記システインが、ＶＬの場合はフレームワーク領域（ＦＲ）４に、ＶＨの場合はフレームワーク領域２に導入される、請求項１〜の８いずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド分子。
【請求項１０】
前記細胞表面分子が、免疫細胞の活性化を誘導することが知られており、またはＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε鎖などのＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ４１、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４９、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ９４、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１６３、ＣＤ１９３、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８７、Ｎｋｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＩＴＲ、ＦｃεＲＩ、ＴＣＲα／βおよびＴＣＲγ／δ、ＨＬＡ−ＤＲなどの免疫応答関連分子からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド分子。
【請求項１１】
前記第１のポリペプチド鎖中の前記領域が、ＶＤ１では配列番号２８、ＶＲ１では配列番号２９、ＬＩＮＫ１では配列番号３０を含んでなり；前記第２のポリペプチド鎖中の前記領域が、ＶＤ２では配列番号３１、ＶＲ２では配列番号３２、ＬＩＮＫ２では配列番号３０を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド分子。
【請求項１２】
前記第１のポリペプチド鎖中の前記Ｆｃ領域が、配列番号２６または配列番号４７（Ｆｃ１）を含んでなり、前記第２のポリペプチド鎖中の前記Ｆｃ領域が、配列番号２７または配列番号４８（Ｆｃ２）を含んでなる、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド分子。
【請求項１３】
配列番号１６または配列番号４３または配列番号４５または配列番号５１、５３、５５、または５７を含んでなる第１のポリペプチド鎖と、配列番号１７または配列番号４４または配列番号４６または配列番号５２、５４、５６、または５８を含んでなる第２のポリペプチド鎖とを含んでなる、二重特異性ポリペプチド分子。
【請求項１４】
前記分子が検出可能な標識を保有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド分子。
【請求項１５】
前記免疫細胞の細胞表面抗原に結合する前記第１の結合部位（ＶＤ１）（ＶＤ２）がヒト化され；および／または前記ＭＨＣ関連ペプチドエピトープに結合する前記第２の結合部位（ＶＲ１）（ＶＲ２）が成熟してより高い親和性および／または安定性を達成する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド分子。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の前記第１のポリペプチド鎖および／または前記第２のポリペプチド鎖をコードする核酸、または前記核酸の少なくとも１つを含んでなる発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを含んでなり、任意選択的にそれを発現する、宿主細胞。
【請求項１８】
１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体または賦形剤と共に、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド分子、請求項１６に記載の核酸または発現ベクター、または請求項１７に記載の細胞を含んでなる、医薬組成物。
【請求項１９】
医療で使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド分子、請求項１６に記載の核酸または発現ベクター、請求項１７に記載の細胞、または請求項１８に記載の医薬品組成物。
【請求項２０】
がん、感染性疾患、および免疫学的障害から選択される疾患または障害の予防または治療で使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド分子、請求項１６に記載の核酸または発現ベクター、請求項１７に記載の細胞、または請求項１８に記載の医薬品組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド分子、請求項１６に記載の核酸または発現ベクター、請求項１７に記載の細胞、または請求項１８に記載の医薬品組成物の治療的有効量を投与するステップを含んでなる、疾患または障害を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）関連ペプチドエピトープに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来する結合領域と、前記細胞の表面抗原に特異的に結合するヒト免疫エフェクター細胞を動員できる抗体に由来する結合領域とを提供する、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含んでなる二重特異性ポリペプチド分子、ならびに二重特異性ポリペプチド分子を製造する方法、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子クローニング技術の開発および抗体工学の深い理解により、最適な生物学的活性および臨床目的を達成するために、多様な二重特異性抗体フォーマット（「二重特異性」）が選択される。がん治療では、腫瘍細胞上のエピトープに特異的な第１の結合ドメインおよび免疫エフェクター細胞上のエピトープに特異的な第２の結合ドメインを通じて、免疫エフェクター細胞の活性を腫瘍部位に向け直す目的で、二重特異性抗体が開発されている。免疫エフェクター細胞の再標的化のための二重特異性抗体は、結晶形成フラグメント（Ｆｃ）領域のないフォーマットや、対称または非対称設計を有するＩｇＧ由来フォーマットなどの異なるフォーマットで開発されている。がんの部位へのエフェクター細胞の再標的化に加えて、二重特異性抗体のための新たな用途が確立された。固有のまたは獲得性の耐性を克服し、より効率的な血管形成阻害剤であるために、同時に２つの相関したシグナル伝達分子を阻害し得る二重特異性が開発され得る。さらに、二重特異性抗体は、がんのような様々な疾患を治療するための有望な免疫賦活剤として使用され得る。二重特異性抗体はまた、第ＶＩＩＩ因子の機能を模倣することによって、血友病Ａを治療するために使用され得る。二重特異性抗体はまた、骨障害および感染症ならびに中枢神経系の疾患における広範な適用の見込みも有する（Ｙａｎｇ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ａ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｎｅｗ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ．２０１６  Ｄｅｃ  ２８；１８（１）で概説される）。
【０００３】
Ｔ細胞は、抗原特異的免疫応答を誘導できるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体を発現する。標的細胞上の抗原ペプチド／主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩとＴＣＲとの結合は、免疫シナプスの形成を誘導し、ＴＣＲシグナル伝達複合体の構成要素であるＣＤ３共受容体を通じたシグナル伝達をもたらす。このシグナル伝達カスケードは、Ｔ細胞から標的細胞へのグランザイムおよびパーフォリンの放出および伝達を通じて、抗原を発現する細胞のＴ細胞媒介死滅を誘導する。
【０００４】
歴史的には、抗体の一本鎖連結可変ドメイン（ｓｃＦｖ、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．１９８８に記載）の発見および生成が、二重特異性抗体の開発の主要な動機となった。この概念は最終的に、ＢｉＴＥ分子の作製および白血病の治療のための強力な薬物としての臨床的検証をもたらした（Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．；Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ，Ｃ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９，６９，４９４１−４９４４）。がんにおいて、ＣＤ３εサブユニットと腫瘍細胞上の表面抗原とに同時係合する二重特異性抗体は、抗原と複合体形成したＴＣＲおよびＭＨＣクラスＩの直接的相互作用に対する必要性を回避しながら、腫瘍細胞のＴ細胞媒介死滅を始動する。これは、腫瘍を認識し、エフェクター細胞として作用できるＴ細胞のレパートリーを拡大する（Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．；Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ，Ｃ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９，６９，４９４１−４９４４）。
【０００５】
Ｓｔｉｅｇｌｍａｉｅｒ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（ｉｎ：Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ＢｉＴＥ（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ）ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１５；１５（８）：１０９３−９）は、Ｔ細胞ベースのがん免疫療法の様々なアプローチが現在検討中であり、これらのうちには独特の設計および作用機序を有するＢｉＴＥ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）抗体コンストラクトが含まれると記載する。それらは、腫瘍関連表面抗原およびＴ細胞受容体関連分子ＣＤ３のモノクローナル抗体の最小結合ドメインを、単一のポリペプチド鎖上に遺伝的に連結することによって構築される。標的細胞抗原とＣＤ３の同時係合は、ポリクローナル細胞傷害性Ｔ細胞の活性化につながり、標的細胞溶解をもたらす。ＣＤ１９を標的化するＢｉＴＥ（登録商標）であるブリナツモマブは、広範なＢ細胞悪性病変において研究されており、米国では米国ＦＤＡによって、ＢＬＩＮＣＹＴＯ（商標）の商品名の下に、フィラデルフィア染色体陰性再発性／難治性Ｂ急性リンパ芽球性白血病のために最近認可されている。ＢｉＴＥ（登録商標）プラットフォームは、臨床的に最も進行したＴ細胞免疫療法の選択肢の１つである。
【０００６】
しかし、ＢｉＴＥ（登録商標）のような小型二重特異性分子の欠点は、低い生産収率、困難な精製プロセス、凝集傾向、および非常に短い血清半減期であることが判明している。このクラスの分子の固有の限界を克服するために、Ｍｏｒｒｉｓｏｎらが、可撓性リンカーペプチドをＩｇＧの重鎖のＣ末端に融合させ、続いて異なる結合特異性を有する一本鎖可変ドメインを融合させた、２０年以上前に考案された組換え二重特異性プロトタイプの免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ様抗体の概念から出発して、ヒトＩｇＧベースの様々な二重特異性フォーマットが開発された（Ｃｏｌｏｍａ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９９７）Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，１５９−１６３）。分子は二重の官能基を有するため、「正常」抗体と区別され得た。技術的なハードルは当初、さらなる開発を妨げ、二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）は、主に学術的および生命工学環境における、研究開発のテーマとして残された。しかし、組換えタンパク質誘導体の操作、製造、開発を可能にした急速に進歩する技術は、製薬産業からの新たな関心と相まって、ｂｓＡｂ研究分野を活性化させた。今日、治療用タンパク質の開発に適した、多くの異なるｂｓＡｂフォーマットが利用可能である（レビューについては、Ｇｒａｍｅｒ，ｍＡｂｓ．２０１３；５（６）：９６２−９７３，Ｗｅｉｄｌｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１３  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１０（６）：２３９−５０，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，ＭＡｂｓ．２０１７  Ｆｅｂ／Ｍａｒ；９（２）：１８２−２１２を参照されたい）。要約すると、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなるＦｃ（結晶形成フラグメント）部分の組み入れにより、生産性が上昇し、精製プロセスが簡素化され、安定性が向上した。さらに、このようなＩｇＧベースの薬物の血清半減期は、ｉ）サイズの増加、およびｉｉ）Ｆｃ部分とヒトＦｃ受容体ＦｃＲｎとの相互作用により延長された。
【０００７】
ＩｇＧベースの二重特異性フォーマットの開発は、２つの異なるＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化を促進し、それによって２つの異なるポリペプチド鎖を連結する、操作された変異体の出現および組み込みによってさらに活発化された。基本的な概念は、ヘテロ二量体化のために抗体重鎖ホモ二量体を操作するための新しくかつ効果的な設計ストラテジーとして「ノブ・イン・ホール」アプローチを開示した、Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．（ｉｎ：’Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ’  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＨ３  ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｏｒ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１９９６  Ｊｕｌ；９（７）：６１７−２１）によって導入された。このアプローチでは、最初にＣＤ４−ＩｇＧイムノアドヘシンのＣＨ３ドメイン中の小型アミノ酸をより大きなもので置換することによって、「ノブ」変異型：Ｔ３６６Ｙが得られた。ノブは、大型残基をより小さなもので賢明に置換することによって作製されたヒト化抗ＣＤ３抗体のＣＨ３ドメインの「ホール」：Ｙ４０７Ｔに、挿入されるように設計された。抗ＣＤ３／ＣＤ４−ＩｇＧハイブリッドは、これらの２つの異なる重鎖の同時発現に続いて、抗ＣＤ３軽鎖と共に、プロテインＡ精製タンパク質プールの９２％までに相当する。対照的に、抗ＣＤ３／ＣＤ４−ＩｇＧハイブリッドの最大５７％のみが、重鎖が野生型ＣＨ３ドメインを含有する同時発現に続いて回収される。したがって、ノブ・イン・ホール操作は、抗体／イムノアドヘシンハイブリッド、そしておそらく二重特異性イムノアドヘシンおよび二重特異性抗体を含むその他のＦｃ含有二官能性治療薬の構築を容易にする。Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（Ｓｔａｂｌｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｏｆ  ａ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）は、改善されたヘテロ二量体化のためのＦｃドメインのＣＨ３ドメインにおけるノブ・イン・ホール変異（ノブ：Ｔ３６６Ｗ／ホール：Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ）を開示する。Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｎ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ）によって記載されたように、この概念は、ヘテロ二量体ＣＨ３ドメインの間に安定化ジスルフィド結合を形成するシステイン残基の追加的な導入によってさらに改善された。
【０００８】
ヘテロ二量体分子を製造するためのさらなる概念は、Ｍｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，ＰＥＤＳ（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＳＥＥＤ：ａ  ｎｅｗ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｍｏｎｏ−ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ＩｇＧ）；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，ＭＡｂｓ（Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏ−ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔａｒｇｅｔ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）；Ｖｏｎ  Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，ＭＡｂｓ（Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｔｏ  ａｉｄ  ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ：ｑｕａｌｉｔｙ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｓｉｇｎ．）によって開示された。これらの概念は、Ｈａ  ｅｔ  ａｌ．２０１６，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｃ  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）およびＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１７，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（Ｆｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｎｏｖｅｌ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）によって要約され概説された。
【０００９】
ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインまたはその部分からなるＦｃ部分を二重特異性分子に含めることにより、Ｆｃ：Ｆｃγ受容体（ＦｃｇＲ）相互作用によって誘導される、これらの分子の非特異的固定化の問題が生じた。ＦｃｇＲは、ＩｇＧ分子のＦｃ部分によって提示されるエピトープとは異なる親和性で結合する、異なる細胞表面分子（ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩｂ、ＦｃｇＲＩＩＩ）から構成される。このような非特異的な（すなわち、二重特異性分子の２つの結合ドメインのどちらによっても誘導されない）固定化は、ｉ）分子の薬物動態への影響、およびｉｉ）免疫エフェクター細胞のオフターゲット活性化のために好ましくないので、ＦｃｇＲ結合を取り除くための様々なＦｃ変異型および変異が同定されている。
【００１０】
Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＨ２  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  ａｎｔｉ−ＨＬＡ−ＤＲ  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  Ｃ１ｑ，ＦｃｙＲＩ  ａｎｄ  ＦｃｙＲＩＩＩ  ｂｉｎｄｉｎｇ）は、ＦｃｇＲＩ結合の消失、Ｃ１ｑ結合の消失、およびＦｃｇＲＩＩＩ結合の減少をもたらす、ヒトＩｇＧ２からの対応する配列による、ヒトＩｇＧ１の残基２３３〜２３６の交換を開示する。
【００１１】
欧州特許第１０７５４９６号明細書は、Ｆｃ領域の多様性（２３３Ｐ、２３４Ｖ、２３５Ａ、２３６位に残基は存在せずまたはＧであり、３２７Ｇ、３３０Ｓ、および３３１Ｓ）を有する抗体およびその他のＦｃ含有分子を開示し、その中で組換え抗体は、標的の顕著な補体依存性溶解または細胞媒介性破壊を始動させることなく、標的分子に結合できる。
【００１２】
二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）分子は、例えば、Ｂ細胞リンパ腫の最適な再誘導Ｔ細胞殺傷を達成するために使用される。元のＤＡＲＴ技術は、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｉｎ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｕａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｏ  ａｃｈｉｅｖｅ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ｂｌｏｏｄ．２０１１  Ａｐｒ  ２８；１１７（１７）：４５４２−５１）に記載される。同一のＣＤ１９およびＣＤ３抗体Ｆｖ配列を保有する一本鎖二重特異性抗体との比較は、ＤＡＲＴ分子が、Ｂ細胞溶解の誘導においてより強力であることを明らかにした。ＤＡＲＴ技術のさらなる進展は、Ｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ，２０１６  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＰＦ−０６６７１００８，ａ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｎｔｉ−Ｐ−ｃａｄｈｅｒｉｎ／Ａｎｔｉ−ＣＤ３  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＡＲＴ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｗｉｔｈ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｈａｌｆ−Ｌｉｆｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）に記載されるように、ＤＡＲＴ−Ｆｃ分子によって達成された。この分子は、ＤＡＲＴの高い効力と、その他の好ましい特性の中でも特に、Ｆｃベースの分子の延長された血清半減期とを組み合わせた。
【００１３】
αβＴＣＲ（ＴＣＲ）は、ＭＨＣによって提示される抗原性ペプチドを認識し、Ｔ細胞の特異性に関与する。ＴＣＲのαおよびβ鎖はどちらも、可変ドメイン（Ｖ）および定常ドメインを保有する。Ｖドメインは抗原性ペプチドの結合に関与し、定常ドメインはＴ細胞膜を横断する。ペプチドＭＨＣ複合体に結合したＴＣＲの結晶構造分析から、ＶαおよびＶβ鎖の双方の相補性決定領域（ＣＤＲ）３は、好ましくはペプチドと相互作用する一方で、ＣＤＲ１および２はＭＨＣと相互作用する。しかし、ＣＤＲ１によるペプチドの認識およびＣＤＲ３によるＭＨＣの認識も記載される（Ｐｉｅｐｅｎｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ＭＨＣ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ，２０１３；４，１９４８）。ＴＣＲαβヘテロ二量体は、ＣＤ３タンパク質、ＣＤ４またはＣＤ８、およびその他の接着およびシグナル伝達タンパク質と密接に関連している。ＴＣＲ  Ｖ領域による抗原性ペプチドの結合は、ＣＤ３およびＣＤ４またはＣＤ８細胞質タンパク質を介したＴＣＲ定常ドメインを介したシグナル伝達によって、Ｔ細胞活性化を引き起こす。
【００１４】
一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）は、完全長ＴＣＲ形態と対比して、遺伝子操作、可溶性タンパク質発現、および臨床的可能性に有意な利点をもたらす。可溶性タンパク質発現（すなわち、製造）の観点から、ｓｃＴＣＲは単一ポリペプチドとして製造され、各ＴＣＲ鎖を個々のポリペプチドとして製造する必要性が回避され、そのペプチドＭＨＣリガンドに結合するより大量の適切に構築されたｓｃＴＣＲの製造が可能になる。この特徴により、臨床使用に必要な生産収率が可能になる。最後に、臨床的観点から、Ｖ領域（ｓｃＴｖ）のみからなるｓｃＴＣＲは、ｓｃＦｖ断片に類似した治療薬または診断試薬としてフォーマットされ得る。
【００１５】
米国特許出願第２００６−０１６６８７５号明細書は、ＴＣＲα鎖定常領域細胞外配列のＮ末端に融合したＴＣＲα鎖可変領域配列によって構成されるセグメント、ＴＣＲβ鎖定常領域細胞外配列のＮ末端に融合したＴＣＲβ鎖可変領域によって構成されるβセグメント、およびセグメントのＣ末端とβセグメントのＮ末端とをまたはその逆を連結するリンカー配列を含んでなり、αおよびβセグメントの定常領域細胞外配列がジスルフィド結合によって連結され、リンカー配列の長さおよびジスルフィド結合の位置が、αおよびβセグメントの可変領域配列が天然α／βＴ細胞受容体と同様に実質的に相互に配向するようなものである、一本鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴＣＲ）を開示する。このようなｓｃＴＣＲの２つ以上の複合体、および治療および様々なスクリーニング用途におけるｓｃＴＣＲの使用もまた開示される。米国特許出願第２００６−０１６６８７５号明細書に記載されるｓｃＴＣＲとは対照的に、米国特許出願第２０１２−０２５２７４２号明細書は、がん、ウイルス性疾患、および自己免疫疾患の治療などの多数の目的のために有用な、ＴＣＲ（ｓｃＴｖ）の可変断片のみからなる定常ドメインのない可溶性ヒト一本鎖ＴＣＲを開示する。
【００１６】
ＭｃＣｏｒｍａｃｋ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ（ｉｎ：Ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴＣＲ−ａｎｔｉ  ＣＤ３  ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＮＹ−ＥＳＯ−１−ａｎｄ  ＬＡＧＥ−１−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１３  Ａｐｒ；６２（４）：７７３−８５）は、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＬＡＧＥ−１が、多数のがん型における上方制御と正常組織における高度に制限された発現とを組み合わせ、共通ＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープである１５７〜１６５を共有する、腫瘍免疫療法のための理想的なプロファイルを有する、がん精巣抗原であることを開示する。彼らは、抗ＣＤ３ｓｃＦｖに融合したＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５に特異的な可溶性の高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含んでなる、二官能性ＩｍｍＴＡＣの特異性および抗腫瘍活性を描写するデータを提示する。この試薬ＩｍｍＴＡＣ−ＮＹＥは、ＨＬＡ−Ａ２、抗原陽性腫瘍細胞株、および新たに単離されたＨＬＡ−Ａ２−およびＬＡＧＥ−１陽性ＮＳＣＬＣ細胞を死滅させることが示されている。生体内光学イメージングを用いた結果は、異種移植マウスにおいて、蛍光標識高親和性ＮＹＥＳＯ特異的ＴＣＲが、ＨＬＡ−Ａ２−、ＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５陽性腫瘍を生体内標的化することを示す。生体内ＩｍｍＴＡＣ−ＮＹＥの有効性は、ヒトリンパ球が、腫瘍異種移植片を保有する免疫不全ＮＳＧマウスに安定して同時移植された腫瘍モデルにおいて試験され；有効性は、ＧＦＰ蛍光読み取りを用いて、腫瘍予防および確立された腫瘍モデルの双方で観察された。定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、１５の正常組織、５のがん細胞株、１０のＮＳＣＬＣ、および１０の卵巣がんサンプルにおいて、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＬＡＧＥ−１抗原の双方の発現が分析された。全体的に、ＬＡＧＥ−１ＲＮＡは、腫瘍サンプル中のＮＹ−ＥＳＯ−１よりも大きな出現頻度およびより高いレベルで発現された。ＩｍｍＴＡＣは、ＴＣＲのαまたはβ鎖のＣまたはＮ末端に共有結合する抗ＣＤ３抗体ＵＣＨＴ−１に由来する、一本鎖Ｆｖを含んでなる。
【００１７】
欧州特許第１８６８６５０号明細書は、二特異性抗体分子と、免疫学的障害、感染症、中毒症、およびがんなどの様々な疾患および障害および治療におけるその使用とに関する。二特異性抗体は２つのポリペプチド鎖を含んでなり、それは結合して、同一または異なる抗原上の同一または異なるエピトープを認識してもよい、少なくとも２つのエピトープ結合部位を形成する。さらに、抗原は、同一または異なる分子に由来してもよい。二特異性抗体分子の個々のポリペプチド鎖は、各ポリペプチド鎖内に位置するシステイン残基のジスルフィド結合などであるが、これに限定されるものではない、非ペプチド結合共有結合を介して共有結合してもよい。特定の実施形態では、二特異性抗体分子は、分子中で抗体様特性の操作（例えば、長い半減期）ができるようにする、本明細書で開示されるＦｃ領域をさらに含んでなる。欧州特許第１８６８６５０号明細書は、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖可変ドメインの結合領域の存在を必要とし、機能的Ｆｃ受容体結合体について広範に議論している。
【００１８】
国際公開第２０１６／１８４５９２Ａ１号パンフレットは、一方の特異性がＴＣＲによって寄与され、他方がリンパ球の表面の抗原またはエピトープを対象とする抗体によって寄与される、二重特異性分子を開示するが、本明細書に開示されるＴＣＲおよび抗体可変領域の要素の特定の配置は開示しない。
【００１９】
欧州特許第２２５８７２０Ａ１号明細書は、少なくとも１つのＭＨＣ提示エピトープを認識して結合し、抗原を認識して結合する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、機能性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）を対象とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、ペプチドＭＨＣ複合体を標的化でき、容易に製造され得て、高い安定性を示し、それぞれの抗原エピトープに結合した際に高い効力を与える、改善された二重特異性分子を提供することである。本発明のその他の目的および利点は、以下の説明およびその好ましい実施形態、ならびにそれぞれの実施例を検討すれば明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の第１の態様では、上記の目的は、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含む分子の群から選択される二重特異性ポリペプチド分子を提供することによって解決され、
第１のポリペプチド鎖は、ヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体の可変ドメイン（ＶＤ１）の第１の結合領域を含んでなり、ＴＣＲの可変ドメイン（ＶＲ１）の第１の結合領域は、ＭＨＣ関連ペプチドエピトープに特異的に結合し、第１のリンカー（ＬＩＮＫ１）は前記ドメインを連結し；
第２のポリペプチド鎖は、ＭＨＣ関連ペプチドエピトープに特異的に結合するＴＣＲの可変ドメイン（ＶＲ２）の第２の結合領域を含んでなり、抗体の可変ドメイン（ＶＤ２）の第２の結合領域は、ヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に特異的に結合し、第２のリンカー（ＬＩＮＫ２）は前記ドメインを連結し；
前記第１の結合領域（ＶＤ１）および前記第２の結合領域（ＶＤ２）は結合して、細胞表面分子のエピトープに結合する第１の結合部位（ＶＤ１）（ＶＤ２）を形成し；
前記第１の結合領域（ＶＲ１）および前記第２の結合領域（ＶＲ２）は結合して、前記ＭＨＣ関連ペプチドエピトープに結合する第２の結合部位（ＶＲ１）（ＶＲ２）を形成し；
前記２つのポリペプチド鎖は、ヒトＩｇＧヒンジドメインおよび／またはヒトＩｇＧＦｃドメインまたはその二量体化部分に融合し；前記２つのポリペプチド鎖は、前記ヒンジドメインおよび／またはＦｃドメイン間の共有結合および／または非共有結合によって連結され；
前記二重特異性ポリペプチド分子は、細胞表面分子およびＭＨＣ関連ペプチドエピトープに同時に結合でき、二重特異性ポリペプチド分子中では、ポリペプチド鎖中の結合領域の順序が、ＶＤ１−ＶＲ１；ＶＤ１−ＶＲ２；ＶＤ２−ＶＲ１；ＶＤ２−ＶＲ２；ＶＲ１−ＶＤ１；ＶＲ１−ＶＤ２；ＶＲ２−ＶＤ１；ＶＲ２−ＶＤ２から選択され、ドメインはＬＩＮＫ１またはＬＩＮＫ２のどちらかによって連結される。
【００２２】
第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含んでなる、二重特異性ポリペプチド分子が好ましく、第１のポリペプチド鎖は、前記細胞の表面抗原に特異的に結合することによってヒト免疫エフェクター細胞を動員できる抗体に由来する、第１の結合領域の可変ドメイン（ＶＤ１）、およびＭＨＣ関連ペプチドエピトープに特異的なＴＣＲに由来する、可変ドメイン（ＶＲ１）の第１の結合領域、および２つのドメインを連結する第１のリンカー部分（ＬＩＮＫ１）を含んでなり；第２のポリペプチド鎖は、ＭＨＣ関連ペプチドエピトープに特異的なＴＣＲに由来する、可変ドメイン（ＶＲ２）の第２の結合領域、および前記細胞の表面抗原に特異的に結合することによってヒト免疫エフェクター細胞動員できる抗体に由来する、第２の結合領域の可変ドメイン（ＶＤ２）、および２つのドメインを連結する第２のリンカー部分（ＬＩＮＫ２）を含んでなり；前記第１の結合領域（ＶＤ１）および前記第２の結合領域（ＶＤ２）は結合して、細胞表面分子のエピトープに結合する第１の結合部位（ＶＤ１）（ＶＤ２）を形成し；前記第１の結合領域（ＶＲ１）および前記第２の結合領域（ＶＲ２）は結合して、前記ＭＨＣ関連ペプチドエピトープに結合する第２の結合部位（ＶＲ１）（ＶＲ２）を形成し；前記ポリペプチド鎖の少なくとも１つは、そのＣ末端で、ヒトＩｇＧ由来のヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインまたはその部分に結合され；前記二重特異性ポリペプチド分子は、免疫エフェクター細胞抗原とＭＨＣ関連ペプチドエピトープとに同時に結合できる。
【００２３】
好ましくは、本発明による二重特異性ポリペプチド分子は、ペプチドＭＨＣ複合体として提示される、免疫エフェクター細胞抗原および特異的抗原エピトープの双方に、例えば、実施例６に記載されるようなバイオレイヤー干渉法による測定で、またはフローサイトメトリーによる判定で、例えば、約１００ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、約１ｎＭ以下の結合親和性（ＫＤ）などの高い特異性で結合する。
【００２４】
本発明による二重特異性ポリペプチド分子は、配列番号１６を含んでなる第１のポリペプチド鎖と配列番号１７を含んでなる第２のポリペプチド鎖とを含んでなる、二重特異性ポリペプチド分子によって、本明細書で例示される。
【００２５】
本発明の第２の態様では、上記の目的は、本明細書で開示されるような第１のポリペプチド鎖および／または第２のポリペプチド鎖をコードする核酸、またはこのような核酸を含んでなる発現ベクターを提供することによって解決される。本発明の第３の態様では、上記の目的は、本明細書で定義されるようなベクターを含んでなる宿主細胞を提供することによって解決される。
【００２６】
本発明の第４番の態様では、上記の目的は、開示されるような適切な宿主細胞内における核酸を含んでなる前記発現ベクターの適切な発現、および細胞および／またはその培地からの分子の適切な精製を含んでなる、本発明による二重特異性ポリペプチド分子を製造する方法を提供することによって解決される。
【００２７】
本発明の第５の態様では，上記の目的は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体または賦形剤と共に、本発明による二重特異性ポリペプチド分子、本発明による核酸または発現ベクター、または本発明による細胞を含んでなる医薬組成物を提供することによって解決される。
【００２８】
本発明の第６の態様では、本発明は、医療で使用するための、本発明による二重特異性ポリペプチド分子、本発明による核酸または発現ベクター、本発明による細胞、または本発明による医薬組成物に関する。
【００２９】
本発明の第７の態様では、本発明は、本明細書で開示されるような、特にがんおよび感染性疾患から選択される疾患または障害の治療で使用するための、本発明による二重特異性ポリペプチド分子、本発明による核酸または発現ベクター、本発明による細胞、または本発明による医薬組成物に関する。
【００３０】
本発明の第８の態様では、本発明は、本発明による二重特異性ポリペプチド分子、本発明による核酸または発現ベクター、本発明による細胞、または本発明による医薬組成物の治療的有効量を投与するステップを含んでなる、疾患または障害を治療する方法に関する。
【００３１】
本発明の第９の態様では、本発明は、本発明による二重特異性ポリペプチド分子または本発明による医薬組成物の治療的有効量を投与するステップを含んでなる、患者または対象において免疫応答を引き起こす方法に関する。
【００３２】
第の１０の態様では、本発明は、本発明による二重特異性ポリペプチド分子の有効量を患者に投与するステップを含んでなる、患者または対象において標的細胞を死滅させる方法に関する。
【００３３】
上述したように、本発明は、新規かつ改善された二重特異性ポリペプチド分子を提供。分子は、一般に第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含んでなり、鎖は、共同して、免疫エフェクター細胞表面抗原のエピトープに特異的な抗体の可変領域と、例えばがするんエピトープ、または例えばＨＩＶウイルス感染症などの感染症のために提示されるエピトープなどのＭＨＣ関連ペプチドエピトープに特異的なＴＣＲの可変領域とを提供する。抗体およびＴＣＲ由来可変ドメインは、双方のポリペプチド鎖上に位置するＦｃ部分またはその部分の間に形成される共有結合および非共有結合によって安定化される。次に、二重特異性ポリペプチド分子は、細胞受容体およびＭＨＣ関連ペプチドエピトープに同時に結合できる。
【００３４】
本発明の文脈では、可変ドメイン（ＶＤ１）および（ＶＤ２）は、前記エフェクター細胞の表面抗原に特異的に結合する、ヒト免疫エフェクター細胞を動員できる抗体に由来する。特定の一実施形態では、前記抗体は、ペプチド鎖ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、およびＣＤ３ζを含んでなる、ヒトＴ細胞のＴＣＲ−ＣＤ３複合体のエピトープに特異的に結合する。
【００３５】
本発明による二重特異性ポリペプチド分子は、前記細胞の表面抗原に特異的に結合することによってヒト免疫エフェクター細胞を動員できる抗体に由来する、可変ドメインの第１の（ＶＤ１）および第２の（ＶＤ２）結合領域をそれぞれ提供する、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド鎖を含んでなる。この第１の結合領域（ＶＤ１）および前記第２の結合領域（ＶＤ２）は結合して、免疫エフェクター細胞表面抗原のエピトープに結合する、第１の結合部位（ＶＤ１）（ＶＤ２）を形成する。さらに、ポリペプチド分子の第１および第２のポリペプチド鎖は、ＭＨＣ関連ペプチドエピトープに特異的なＴＣＲに由来する、可変ドメインの第１の（ＶＲ１）および第２の（ＶＲ２）結合領域をそれぞれ含んでなる。前記第１の結合領域（ＶＲ１）および前記第２の結合領域（ＶＲ２）は結合して、前記ＭＨＣ関連ペプチドエピトープに結合する第２の結合部位（ＶＲ１）（ＶＲ２）を形成する。本発明による二重特異性ポリペプチド分子の一実施形態では、第１のポリペプチド鎖中の領域の順序／配向は、ＶＤ１−ＬＩＮＫ１−ＶＲ１およびＶＲ１−ＬＩＮＫ１−ＶＤ１から選択され；別の実施形態では、第２のポリペプチド鎖中の領域の順序／配向は、ＶＤ２−ＬＩＮＫ２−ＶＲ２およびＶＲ２−ＬＩＮＫ−ＶＤ２から選択され、すなわち、結合部位の配置は、「左回り」または「右回り」分子に再配置され得る（例えば、図５を参照されたい）。さらに、ＴＣＲ関連部分のαおよびβ鎖の立体配置も切り替え得る。
【００３６】
本発明の文脈では、本発明による二重親和性ポリペプチド分子は、ペプチドＭＨＣ複合体として提示される場合、ＳＬＹＮＴＶＡＴＬペプチド（配列番号７）に結合するコンストラクトによって例示される。それにもかかわらず、本発明の概念は、明らかにこの特定のペプチドに限定されず、ＭＨＣ分子との関連で提示される任意の疾患または障害関連エピトープを基本的に含む。この提示は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ関連の双方であり得る。主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）分子は、全ての有核細胞の表面に存在し、ＣＤ８＋Ｔ細胞レパートリーによる監視のために、大規模な一連のペプチドエピトープを提示する。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ウイルス感染症の制御およびクリアランスに、ならびに形質転換および腫瘍形成細胞の排除に必須である。認識される好ましいペプチドエピトープの例は、それぞれの文献に見いだされ得て、特に、国際公開第２０１６／１７０１３９号パンフレットの表１〜５；国際公開第２０１６／１０２２７２号パンフレットの表１〜５；国際公開第２０１６／１５６２０２号パンフレットの表１または２；国際公開第２０１６／１４６７５１号パンフレットの表１〜４；国際公開第２０１１／１１３８１９号パンフレットの表２；国際公開第２０１６／１５６２３０号パンフレットの表１〜４ｂ；国際公開第２０１６／１７７７８４号パンフレットの表１〜４ｂ；国際公開第２０１６／２０２９６３号パンフレットの表１〜４；国際公開第２０１６／２０７１６４号パンフレットの表１および２；国際公開第２０１７／００１４９１号パンフレットの表１〜４；国際公開第２０１７／００５７３３号パンフレットの表１〜４；国際公開第２０１７／０２１５２７号パンフレットの表１〜８；国際公開第２０１７／０３６９３６号パンフレットの表１〜３；がん治療のためのＰＣＴ／ＥＰ出願第２０１６／０７３４１６号明細書の表１〜４、米国特許出願公開第２０１６−０１８７３５１号明細書、米国特許出願公開第２０１７−０１６５３３５号明細書、米国特許出願公開第２０１７−００３５８０７号明細書、米国特許出願公開第２０１６−０２８０７５９号明細書、米国特許出願公開第２０１６−０２８７６８７号明細書、米国特許出願公開第２０１６−０３４６３７１号明細書、米国特許出願公開第２０１６−０３６８９６５号明細書、米国特許出願公開第２０１７−００２２２５１号明細書、米国特許出願公開第２０１７−０００２０５５号明細書、米国特許出願公開第２０１７−００２９４８６号明細書、米国特許出願公開第２０１７−００３７０８９号明細書、米国特許出願公開第２０１７−０１３６１０８号明細書、米国特許出願公開第２０１７−０１０１４７３号明細書、米国特許出願公開第２０１７−００９６４６１号明細書、米国特許出願公開第２０１７−０１６５３３７号明細書、米国特許出願公開第２０１７−０１８９５０５号明細書、米国特許出願公開第２０１７−０１７３１３２号明細書、米国特許出願公開第２０１７−０２９６６４０号明細書、米国特許出願公開第２０１７−０２５３６３３号明細書、および米国特許出願公開第２０１７−０２６０２４９号明細書で開示されるようなペプチドが挙げられ、これらの出願のそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の態様では、本発明による二重親和性ポリペプチド分子は、前述の特許出願に記載されるペプチドのいずれかからなるペプチドを認識する。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
一態様では、本発明による二重親和性ポリペプチド分子は、８〜１００アミノ酸、８〜３０アミノ酸、８〜１６アミノ酸、好ましくは８〜１４アミノ酸の全長、すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４アミノ酸を有する、１つまたは複数のペプチドに結合し、または特異的に認識され／結合でき、伸長されたクラスＩＩ結合ペプチドの場合、長さはまた、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２アミノ酸であり得る。さらに別の態様では、本発明による二重親和性ポリペプチド分子は、８〜１２アミノ酸、８〜１０アミノ酸、９〜１５アミノ酸、９〜１４アミノ酸、９〜１３アミノ酸、９〜１２アミノ酸、９〜１１アミノ酸；１０〜１５アミノ酸、１０〜１４アミノ酸、１０〜１３アミノ酸、または１０〜１２アミノ酸の全長のもう１つのペプチドに結合し、または特異的に認識し／結合できる。
【００３８】
その他の適切なエピトープは、例えば、免疫エピトープデータベース（ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇで利用できる）などのデータベースから同定され得る。
【００３９】
「ヒト免疫エフェクター細胞」という用語は、活性化された場合、標的細胞の生存率の変化をもたらすことができる、ヒト免疫系における細胞の天然レパートリー内の細胞を指す。「標的細胞の生存能力」という用語は、本発明の範囲内で、生存し、増殖しおよび／またはその他の細胞と相互作用する、標的細胞の能力を指してもよい。このような相互作用は、例えば、標的細胞が別の細胞に接触する場合は、直接的であってもよく、または、例えば、標的細胞が別の遠位の細胞の機能に影響を及ぼす物質を分泌する場合は、間接的であってもよい。標的細胞は、ヒトにとって天然または外来性のどちらであってもよい。細胞がヒトに天然である場合、標的細胞は、有利には、悪性細胞になるように形質転換された細胞である。天然細胞はさらに、例えば、ウイルス、プラスモジウムまたは細菌などの生物に感染した天然細胞などの病的に改変された天然細胞であってもよい。細胞がヒトにとって外来性である場合、標的細胞は、有利には、例えば、侵入細菌またはプラスモジウムなどの侵入病原体である。
【００４０】
本発明による二重特異性ポリペプチド分子は、前記第１および第２のポリペプチド鎖が、少なくとも１つのヒンジドメインおよび／またはＦｃドメインまたはその一部をさらに含んでなることが好ましい。抗体において、「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置する重鎖の可撓性の部分を指す。それは約２５アミノ酸長であり、「上部ヒンジ」、「中部ヒンジ」または「コアヒンジ」および「下部ヒンジ」に分けられる。「ヒンジサブドメイン」は、上部ヒンジ、中部（またはコア）ヒンジまたは下部ヒンジを指す。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４分子のヒンジのアミノ酸配列は、次のとおりである（ＥＵ番号が示される）：
ＩｇＧ１：Ｅ２１６ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１）
ＩｇＧ２：Ｅ２１６ＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰ（配列番号２）
ＩｇＧ３：ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥ２１６ＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号３）
ＩｇＧ４：Ｅ２１６ＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧ（配列番号４）。
コアヒンジ領域は、通常、２つの重鎖を連結する少なくとも１つのシステイン架橋を含有する。さらに、望ましくない抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を改善するために、下部ヒンジ領域に変異を作製し得る。
【００４１】
少なくとも１つのＩｇＧ結晶形成フラグメント（Ｆｃ）ドメイン、すなわち、結晶形成フラグメント領域（Ｆｃ領域）、Ｆｃ受容体と相互作用する抗体の尾部領域、および補体系のいくつかのタンパク質を含んでなる、本発明による二重特異性ポリペプチド分子が好ましい。Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖中に、２つまたは３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨドメイン２、３、および４）を含有する。ＩｇＧのＦｃ領域はまた、高度に保存されたＮグリコシル化部位も保有する。Ｆｃ断片のグリコシル化は、Ｆｃ受容体媒介性活性にとって必須である。ＢｉＴＥ（登録商標）およびＤＡＲＴ（約５０ｋＤ）のような小さなサイズの二重特異性抗体フォーマットは、迅速なクリアランスおよび短い半減期をもたらし得る。したがって、改善された薬物動態特性のために、ｓｃＴｖ細胞受容体（例えば、ＣＤ３）二重特異性ポリペプチド分子は、（ヒトＩｇＧ１）Ｆｃドメインに融合され得て、それによって分子量が増加される。Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８ＬおよびＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＋Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４ＦなどのＣＨ２とＣＨ３ドメインの境界面にあるいくつかの変異は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性と、生体内ＩｇＧ１の半減期とを増加させることが示されている、これによって、Ｆｃ含有分子の血清半減期は、さらに延長され得る。
【００４２】
本発明の二重特異性ポリペプチド分子において、前記Ｆｃドメインは、少なくとも１つのエフェクター機能サイレンシング変異を含んでなるＣＨ２ドメインを含んでなり得る。好ましくは、これらの変異体は、エフェクター機能に関連することが知られている、ヒトＩｇＧ１のＥＬＬＧＧＰ（配列番号５０）配列（残基２３３〜２３８）またはその他のアイソタイプの対応する残基）に導入される。原理的に、ＩｇＧ２および／またはＩｇＧ４由来残基に対応する１つまたは複数の変異が、ＩｇＧ１  Ｆｃに導入される。Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａであり、２３６位に残基は存在せずまたはＧであることが好ましい。別の変異は、Ｐ３３１Ｓである。欧州特許第１０７５４９６号明細書は、２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインを含んでなる、組換え抗体を開示し、そのヒト免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４から選択され、キメラドメインは、記載された位置に、ＥＵ番号付与体系に従って２３３Ｐ、２３４Ｖ、２３５Ａ、２３６位に残基は存在せずまたはＧであり、３２７Ｇ、３３０Ｓ、および３３１Ｓのアミノ酸ブロックを有する、ヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインであり、前記修飾アミノ酸を有するヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４由来ＣＨ２配列（残基２３１〜３４０）と、少なくとも９８％同一である。
【００４３】
使用される好ましいＣＨ２部分配列の例は、（完全にまたは部分的に）次のようであり得て：
２３１−ＡＰＰＶＡ−ＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＳＩＥＫ−３３４（配列番号５）；
および
２３１−ＡＰＰＶＡ−ＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＳＩＥＫ−３３４（配列番号６）、変化は下線で強調され、２９７位に、Ｎ（グリコシル化変異型）が、またはＡ、Ｇ、およびＱ（脱グリコシル化変異型）の群から選択される残基がある。
【００４４】
本発明の二重特異性ポリペプチド分子において、前記Ｆｃドメインは、ヘテロ二量体の形成を容易にする、少なくとも１つの変異を含んでなるＣＨ３ドメインを含んでなり得る。所望のヘテロ二量体二重特異性Ｆｃタンパク質の収率を最大化し、精製を単純化するために、「ノブ・イン・ホール」変異がＦｃドメインに組み込まれ得る。この設計により、１つの鎖に突出した嵩高い疎水性残基（「ノブ」）を付加し、もう１つの鎖に相補的疎水性ポケット（「ホール」）を作製することによって、Ｆｃドメインは、それらの通常のホモ二量体の代わりにヘテロ二量体を形成することを促される。「ノブ」変異型は、小型残基で大型残基を置換することによって作製された反対側のドメイン中の「ホール」に挿入するために、より大きなアミノ酸で小型アミノ酸を置換することによって得られ得る（Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．Ｂ．；Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．”Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ”ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＨ３  ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｏｒ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１９９６，９，６１７−６２１；国際公開第２００２／００２７８１号パンフレット）。
【００４５】
前記ノブ・イン・ホール変異が、ＣＨ３ドメイン中でノブとしてのＴ３６６Ｗと、ホールとしてのＴ３６６’Ｓ、Ｌ３６８’Ａ、およびＹ４０７’Ｖとから選択される、本発明による二重特異性ポリペプチド分子が好ましい（例えば、国際公開第９８／５０４３１号パンフレットを参照されたい）。この変異のセットは、Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  Ｆｃ  ｆｏｒ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７）によって記載されるように、Ｋ４０９ＡおよびＦ４０５’Ｋの変異を組み入れることによって、さらに拡張され得る。別のノブはＴ３６６Ｙ、ホールはＹ４０７’Ｔであり得る。
【００４６】
本発明の二重特異性ポリペプチド分子は、分子の安定性を改善するために、至適には二価の分子の結合特性に干渉することなく、および／または改善されたヘテロ二量体化のために、第１のポリペプチド鎖上の少なくとも１つのシステイン残基と、第２のポリペプチド鎖上の少なくとも１つのシステイン残基との間の人工的に導入されたシステイン架橋をさらに含んでなり得る。安定性を高めるために、ノブ鎖およびホール鎖の双方のＣＨ３ドメインに単一のシステインを付加することによって、ジスルフィド結合が導入され得る。Ｆｃドメインが、例えば、Ｓ３５４Ｃおよび／またはＹ３４９Ｃなどの少なくとも１つの追加的なシステイン残基を含んでなる、ＣＨ３ドメインを含んでなる、本発明による二重特異性ポリペプチド分子が好ましい。
【００４７】
前記ＣＤ分子が、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε鎖、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ４１、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４９、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ９４、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１６３、ＣＤ１９３、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８７、Ｎｋｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＩＴＲ、ＦｃεＲＩ、ＴＣＲα／β、ＴＣＲγ／δ、およびＨＬＡ−ＤＲなどの免疫応答関連ＣＤ分子であるＣＤ３の群から選択される、本発明による二重特異性ポリペプチド分子が好ましい。本発明による二重特異性ポリペプチド分子の２つの抗原結合実体の組合せ次第で、分子の機能に関する特定の利点、特に活性の増強が達成され得る。
【００４８】
第１のポリペプチド鎖中の前記領域が、ＶＤ１では配列番号２８、ＶＲ１では配列番号２９、ＬＩＮＫ２では配列番号３０を含んでなり；第２のポリペプチド鎖中の前記領域が、ＶＤ３２では配列番号３１、ＶＲ２では配列番号３２、ＬＩＮＫ２では配列番号３０を含んでなる、本発明による例示的な二重特異性ポリペプチド分子が好ましい。
【００４９】
第１のポリペプチド鎖中のＦｃ領域が配列番号２６（Ｆｃ１）を含んでなり、第２のポリペプチド鎖中のＦｃ領域が配列番号２７（Ｆｃ２）を含んでなる、本発明による例示的な二重特異性ポリペプチド分子もさらに好ましい。
【００５０】
配列番号１６（完全分子の鎖１）を含んでなる第１のポリペプチド鎖と、配列番号１７（完全分子の鎖２）を含んでなる第２のポリペプチド鎖とを含んでなる、本発明による例示的な二重特異性ポリペプチド分子がさらに好ましい。
【００５１】
ヒト免疫細胞（例えば、ＣＤ３）の表面抗原のエピトープに結合する前記第１の結合部位（ＶＤ１）（ＶＤ２）がヒト化され；および／または前記ＭＨＣ関連ペプチドエピトープに結合する前記第２の結合部位（ＶＲ１）（ＶＲ２）が親和性成熟している、本発明による例示的な二重特異性ポリペプチド分子がなおさらに好ましい。
【００５２】
ヒト化抗体は、ヒトで天然に産生された抗体変異型との類似性を高めるために、タンパク質配列が修飾されている非ヒト種由来抗体（またはその部分）である。「ヒト化」のプロセスは、通常、ヒトへの投与のために開発されたモノクローナル抗体で用いられる（例えば、抗がん剤として開発された抗体）。ヒト化に適した方法は文献から公知であり、例えば、Ｏｌｉｍｐｉｅｒｉ，Ｐｉｅｒ  Ｐａｏｌｏ，Ｐａｏｌｏ  Ｍａｒｃａｔｉｌｉ，ａｎｄ  Ａｎｎａ  Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ．”Ｔａｂｈｕ：Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ．”Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３１．３（２０１５）：４３４−４３５．ＰＭＣ；Ｓａｆｄａｒｉ  Ｙ，Ｆａｒａｊｎｉａ  Ｓ，Ａｓｇｈａｒｚａｄｅｈ  Ｍ，Ｋｈａｌｉｌｉ  Ｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ−ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｕｐｄａｔｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｅｎｇ  Ｒｅｖ．２０１３；２９：１７５−８６；またはＡｈｍａｄｚａｄｅｈ  Ｖ，Ｆａｒａｊｎｉａ  Ｓ，Ｆｅｉｚｉ  ＭＡ，Ｎｅｊａｄ  ＲＡ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎ  Ａｎｔｉｂ  Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１４  Ａｐｒ；３３（２）：６７−７３で概説される。
【００５３】
一般に、ＴＣＲおよび抗体の生体外親和性成熟は、文献に記載される方法に従って、特に酵母またはファージ表面提示を用いて実施され得る（例えば、Ｈｏｌｌｅｒ  ＰＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ／ＭＨＣ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０００  Ｍａｙ  ９；９７（１０）：５３８７−９２；Ｂｏｄｅｒ  ＥＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｆｅｍｔｏｍｏｌａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０００  Ｓｅｐ  ２６；９７（２０）：１０７０１−５；および最近の例として、Ｚｈａｏ  Ｑ，ｅｔ  ａｌ．Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｗｉｌｍｓ  ｔｕｍｏｒ  １  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｇｒｅａｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１５；２９（１１）：２２３８−２２４７に基づいて）。
【００５４】
本明細書の結合部位（ＶＤ１）（ＶＤ２）および（ＶＲ１）（ＶＲ２）は、好ましくは、それぞれ、ヒト免疫細胞の表面抗原およびペプチド−ＨＬＡ分子複合体に特異的に結合する。本明細書の用法では、本明細書の結合部位に関連して、「特異的結合」およびその文法的変種は、ペプチド−ＨＬＡ分子複合体および／または抗体エピトープに対して、１００μＭ以下の結合親和性（ＫＤ）を有する部位を意味するために使用される。本明細書の結合部位（ＶＤ１）（ＶＤ２）および（ＶＲ１）（ＶＲ２）は、ＣＤ抗体エピトープまたはペプチド−ＨＬＡ分子複合体に、それぞれ、約１００μＭ以下、約５０μＭ以下、約２５μＭ以下、または約１０μＭ以下の結合親和性（ＫＤ）で結合する。約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約５００ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下の結合親和性を有する、高親和性結合部位がより好ましい。本発明の結合部位の好ましい結合親和性範囲の非限定的例としては、例えば、実施例６に記載されるようなバイオレイヤー干渉法によって測定される、約１０ｐＭ〜約１００ｐＭ、１００ｐＭ〜約１ｎＭ、１ｎＭ〜約１０ｎＭ；約１０ｎＭ〜約２０ｎＭ；約２０ｎＭ〜約３０ｎＭ；約３０ｎＭ〜約４０ｎＭ；約４０ｎＭ〜約５０ｎＭ；約５０ｎＭ〜約６０ｎＭ；約６０ｎＭ〜約７０ｎＭ；約７０ｎＭ〜約８０ｎＭ；約８０ｎＭ〜約９０ｎＭ；および約９０ｎＭ〜約１００ｎＭが挙げられる。一態様では、本開示は、例えば、アミノ酸配列１〜５８などの本明細書に記載されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドを提供する。別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する第１または第２のポリペプチドを提供する。さらに別の態様では、本開示は、本明細書に記載される１つまたは複数のアミノ酸配列と、少なくとも５０％の配列同一性、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、二重特異性ポリペプチド分子を提供する。本開示は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性百分率が、例えば、ＶＤ１、ＶＲ１、Ｌｉｎｋ１、ＶＲ２、ＶＤ２、Ｌｉｎｋ２、またはヒンジ領域などの図１に記載され、本明細書で開示される配列に記載され、またはその部分であるような構造領域の配列のいずれかに適用される態様をさらに提供する。一態様では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは二重特異性ポリペプチド分子は、アミノ酸置換、欠失、切断、および１つまたは複数のアミノ酸の挿入などの様々な様式で改変されてもよい。別の態様では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは二重特異性ポリペプチド分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を含んでもよい。さらに別の態様では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは二重特異性ポリペプチド分子は、１〜５、１〜１０、１〜２０、２〜５、２〜１０、５〜２０、５〜５０、または１０〜１００アミノ酸置換、欠失または挿入を含んでもよい。一態様では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０以上のアミノ酸置換、欠失または挿入が、例えば、ＶＤ１、ＶＲ１、Ｌｉｎｋ１、ＶＲ２、ＶＤ２、Ｌｉｎｋ２、またはヒンジ領域などの図１に記載される構造領域のいずれかに適用される。本開示は、例えば、ＶＤ１、ＶＲ１、Ｌｉｎｋ１、ＶＲ２、ＶＤ２、Ｌｉｎｋ２、またはヒンジ領域などの図１に記載され、本明細書で開示される配列に記載され、またはその部分であるような構造領域のいずれかの配列に、１〜５、１〜１０、１〜２０、２〜５、２〜１０、５〜２０、５〜５０、または１０〜１００アミノ酸の置換、欠失または挿入が適用される態様をさらに提供する。
【００５５】
一態様では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０またはそれ以上アミノ酸が、例えば、アミノ酸配列１〜５８などの本明細書に記載されるポリペプチドまたは二重特異性ポリペプチド分子のＮ末端またはＣ末端に付加されてもよい。
一態様では、ＶＤ１は、配列番号２８のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有してもよい。
【００５６】
一態様では、ＶＲ１は、配列番号２９のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有してもよい。
【００５７】
一態様では、ＬＩＮＫ１またはＬＩＮＫ２は、配列番号３０のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有してもよい。
【００５８】
一態様では、ＶＤ２は、配列番号３１のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有してもよい。
【００５９】
一態様では、ＶＲ２は、配列番号３２のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有してもよい。
【００６０】
一態様では、ヒンジは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有してもよい。一態様では、ＣＨ２ドメインは、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有してもよい。
一態様では、Ｆｃ領域は、配列番号２６または配列番号６のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有してもよい。
【００６１】
一態様では、本開示は、配列番号４３、４４、４５、または４６のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドを提供する。
一態様では、本明細書で開示されるようなポリペプチドまたは二重特異性ポリペプチド分子は、ポリペプチド鎖内の異なる、場合により選択的な部位における、１つまたは複数の残基の置換によって修飾され得る。このような置換は、保存的性質であってもよく、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸によって置換されるなど、構造および特徴の類似したアミノ酸によってアミノ酸が置換される。さらにより保存的な置換は、ロイシンのイソロイシンによる置換などの、同一または類似サイズおよび化学的性質のアミノ酸の置換である。天然起源相同タンパク質ファミリーの配列多様性の研究では、特定のアミノ酸置換は、他よりも耐容されることが多く、これらは、元のアミノ酸とその置換物との間のサイズ、電荷、極性、および疎水性の類似性との相関を示すことが多く、これが「保存的置換」の定義の基礎である。
【００６２】
本発明による二重特異性ポリペプチド分子の別の好ましい実施形態では、前記分子は、それに結合またはコンジュゲートする、活性薬剤またはその一部を保有する。前記活性薬剤は、検出可能な標識、免疫賦活性分子、および治療剤からなる群から選択され得る。
【００６３】
検出可能な標識は、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素またはその触媒的活性断片、放射性核種、ナノ粒子、常磁性金属イオン、または蛍光性、リン光性、または化学発光分子からなる群から選択され得る。診断目的で検出可能な標識としては、例えば、蛍光標識、放射性標識、酵素、核酸プローブ、およびコントラスト試薬が挙げられる。
【００６４】
本発明の分子に関連してもよい治療剤としては、免疫修飾物質、放射性化合物、酵素（例えば、パーフォリン）、化学療法剤（例えば、シスプラチン）または毒素が挙げられる。その他の適切な治療剤としては、小分子細胞傷害性薬、すなわち哺乳類細胞を死滅させる能力を有する７００ダルトン未満の分子量を有する化合物が挙げられる。このような化合物はまた、細胞傷害性効果を有することができる毒性金属を含有し得る。さらに、これらの小分子細胞傷害性薬は、また、プロドラッグ、すなわち崩生理的条件下で崩壊しまたは変換されて、細胞傷害性薬を放出する化合物も含むものと理解される。このような薬剤の例としては、シスプラチン、メイタンシン誘導体、ラケルマイシン、カリケアマイシン、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーナトリウムフォトフリンＩＩ、テモゾロマイド、トポテカン、グルクロン酸トリメトレキサート、オーリスタチンＥビンクリスチン、およびドキソルビシン；ペプチド細胞傷害性薬、すなわち哺乳類細胞を死滅させる能力があるタンパク質またはその断片が挙げられる。例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ；放射性核種、すなわち、αまたはβ粒子またはγ線の１つまたは複数の同時放出で崩壊する元素の不安定同位体。例えば、ヨウ素−１３１、レニウム−１８６、インジウム−１１１、イットリウム−９０、ビスマス−２１０および−２１３、アクチニウム−２２５、およびアスタチン−２１３；これらの放射性核種と分子またはその多量体との会合を容易にするために、キレート剤が使用されてもよい；免疫刺激剤、すなわち、免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子。例えば、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γなどのサイトカイン；ＩＬ−８、血小板因子４、黒色腫増殖刺激タンパク質などのケモカイン；補体活性化因子；または異種タンパク質ドメイン；同種異系タンパク質ドメイン；ウイルス／細菌タンパク質ドメイン；ウイルス／細菌ペプチド。
【００６５】
次に、本発明の別の態様は、本明細書に開示される第１のポリペプチド鎖および／または第２のポリペプチド鎖をコードする核酸分子、またはそのような核酸を含んでなる発現ベクターに関する。核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの組み合わせであり得る。特定のペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然起源であってもよく、またはそれらは合成的に構築されてもよい。一般に、本発明のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質をコードするＤＮＡ断片は、ｃＤＮＡフラグメントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカーから構築され、またはひと続きのオリゴヌクレオチドから構築されて、微生物またはウイルスオペロンに由来する調節因子を含んでなる、組換え転写単位で発現できる合成遺伝子が提供される。「発現産物」という用語は、遺伝子の、そして遺伝コード縮重に起因する同等物をコードし、したがって同一アミノ酸をコードする任意の核酸配列の、天然翻訳産物であるポリペプチドまたはタンパク質を意味する。コード配列に言及する場合、「断片」という用語は、その発現産物が、完全コード領域の発現産物と本質的に同一の生物学的機能または活性を保つ、完全未満のコード領域を含んでなるＤＮＡの部分を意味する。意図される用途に応じて、核酸は、適切な（例えば、微生物）宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得る。遺伝コードの重複は、いくつかのアミノ酸が２つ以上のコドンによってコードされるようにするが、特定のコドンは、適合ｔＲＮＡの相対可用性ならびにその他の要因のために、他のものよりも「最適」でない（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００６６】
核酸は、それがポリペプチド鎖をコードしさえすれば、例えば、一本鎖および／または二本鎖のいずれかのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよく、または例えばホスホロチオエート主鎖を有するポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの未変性または安定化形態であってもよく、それはイントロンを含有してもまたはしなくてもよい。
【００６７】
次に、核酸（例えば、ＤＮＡ）は、本発明のポリペプチド鎖を含んでなるポリペプチドを産生するのに適した宿主に含まれ、および／またはその中で発現されてもよい。したがって、本明細書に含まれる教示を考慮して適切に修正された公知の技術に従って、当該技術分野で公知のように、本発明のポリペプチド鎖をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を使用して発現ベクターを構築し、次にそれを使用して、本発明のポリペプチドの発現および産生に適した宿主細胞を形質転換してもよい。本発明の化合物を構成するポリペプチド鎖をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）は、適切な宿主に導入するために、多種多様なその他の核酸（例えば、ＤＮＡ）配列に連結されてもよい。コンパニオン核酸は、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入様式、およびエピソームの維持または組み込みが所望されるかどうかに依存する。一般に、核酸は、発現のための適切な方向および正しい読み枠で、プラスミドなどの発現ベクターに挿入される。必要ならば、核酸は、所望の宿主によって認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結されてもよいが、このような制御は、一般に発現ベクター中で利用できる。次に、標準的な技術を用いて、ベクターが宿主に導入される。一般に、全ての宿主がベクターによって形質転換されるわけではない。したがって、形質転換された宿主細胞を選択することが必要になる。一選択技術は、抗生物質耐性などの形質転換細胞内で選択可能な形質をコードする、任意の必要な制御因子を有する核酸配列を発現ベクター内に組み込むことを伴う。代案としては、このような選択可能な形質の遺伝子は、所望の宿主細胞を同時形質転換するのに使用される、別のベクター上にあり得る。次に、本明細書で開示される教示を考慮して、当業者に知られている適切な条件下で十分な時間にわたり、本発明の組換え核酸によって形質転換された宿主細胞が培養されてポリペプチドが発現され、次にそれが回収され得る。
【００６８】
細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞、および昆虫細胞をはじめとする多数の発現系が知られている。好ましくは、発現系は、ＡＴＣＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できるＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞であり得る。
【００６９】
一実施形態では、本明細書は、前記鎖の発現を促進するのに適した条件下で、ポリペプチド鎖を発現できる宿主細胞を培養するステップを含んでなる、本明細書に記載の分子を製造する方法を提供する。
【００７０】
一態様では、本明細書の分子を発現する細胞を得るために、ＴＣＲ−αおよび／またはＴＣＲ−β結合ドメインを含んでなるポリペプチド鎖をコードする核酸が、γレトロウィルスまたはレンチウィルスなどの発現ベクターにクローン化される。別の態様では、本明細書の分子を発現する細胞を得るために、例えば、生体外転写システムなどの当該技術分野で公知の技術によって、ＲＮＡが合成される。次に生体外で合成されたＲＮＡは電気穿孔により適切な細胞に導入されて、ポリペプチド鎖が発現される。
【００７１】
発現を増加させるために、本明細書の鎖をコードする核酸は、レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）Ｕ３、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、β−アクチン、ユビキチン、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）／ＣＤ４３複合プロモーター、伸長因子（ＥＦ）−１ａ、および脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーターなどの強力なプロモーターと作動可能に連結されてもよい。好ましい実施形態では、プロモーターは、発現される核酸に対して異種である。強力なプロモーターに加えて、本明細書の発現カセットは、レンチウイルスコンストラクトの核転座を促進する、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）（Ｆｏｌｌｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、およびＲＮＡ安定性を増加させることで導入遺伝子発現のレベルを増加させる、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ｗＰＲＥ）（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）をはじめとする導入遺伝子発現を高め得る追加的な要素を含有してもよい。
【００７２】
本発明の分子のαおよびβ結合ドメイン鎖は、別々のベクターにある核酸によってコードされてもよく、または同一ベクターにあるポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
【００７３】
一実施形態では、宿主細胞は、本細書の分子を発現するように遺伝子操作される。本明細書の宿主細胞は、治療される患者に関して、同種異系または自己由来であり得る。
【００７４】
本発明のさらに別の態様は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体または賦形剤と共に、本発明による二重特異性ポリペプチド分子、本発明による核酸または発現ベクター、または本発明による細胞を含んでなる、医薬組成物に関する。本発明の組成物としては、医薬組成物の製造において有用なバルク製剤組成物（例えば、不純または非滅菌組成物）、および単位用量剤形の調製において使用され得る医薬組成物（すなわち、対象または患者への投与に適した組成物）が挙げられる。このような組成物は、本明細書に開示された予防的および／または治療的有効量の予防的および／または治療的二重特異性ポリペプチド分子（薬剤）または薬剤と薬学的に許容可能な担体との組み合わせを含んでなる。好ましくは、本発明の組成物は、本発明の１つまたは複数の分子の予防的または治療的有効量と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる。
【００７５】
医薬組成物は、好ましくは、遊離形態または塩形態のいずれかの分子を含む。好ましくは、塩は、例えば、塩化物塩または酢酸塩（トリフルオロ酢酸塩）などの、分子の薬学的に許容可能な塩である。分子は生体内で塩ではないので、本発明による分子の塩は、それらの生体内の状態が分子と実質的に異なることに留意すべきである。
【００７６】
したがって、本発明の実施形態は、薬学的に許容可能な塩として合成的に製造された（例えば、合成された）本発明による非天然分子に関する。ペプチドおよび／またはポリペプチドを合成的に製造する方法は、当該技術分野で周知である。生体内で産生される分子は塩ではないので、本発明による分子の塩は、生体内状態にある分子と実質的に異なる。好ましくは、塩は、分子の薬学的に許容可能な塩である。本発明によるこれらの塩としては、ア二オンとしてのＰＯ４３−、ＳＯ４２−、ＣＨ３ＣＯＯ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＮＯ３−、ＣｌＯ４−、Ｉ−、ＳＣＮ−およびカチオンとしてのＮＨ４＋、Ｒｂ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｃｓ＋、Ｌｉ＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、およびＢａ２＋を含んでなるホフマイスター系列の塩類などのアルカリ塩およびアルカリ土類塩類が挙げられる。特に塩類は、（ＮＨ４）３ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮＨ４ＣＨ３ＣＯＯ、ＮＨ４Ｃｌ、ＮＨ４Ｂｒ、ＮＨ４ＮＯ３、ＮＨ４ＣＩＯ４、ＮＨ４Ｉ、ＮＨ４ＳＣＮ、Ｒｂ３ＰＯ４、Ｒｂ２ＨＰＯ４、ＲｂＨ２ＰＯ４、Ｒｂ２ＳＯ４、Ｒｂ４ＣＨ３ＣＯＯ、Ｒｂ４Ｃｌ、Ｒｂ４Ｂｒ、Ｒｂ４ＮＯ３、Ｒｂ４ＣＩＯ４、Ｒｂ４Ｉ、Ｒｂ４ＳＣＮ、Ｋ３ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＫＣＨ３ＣＯＯ、ＫＣｌ、ＫＢｒ、ＫＮＯ３、ＫＣｌＯ４、ＫＩ、ＫＳＣＮ、Ｎａ３ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、ＮａＣＨ３ＣＯＯ、ＮａＣｌ、ＮａＢｒ、ＮａＮＯ３、ＮａＣＩＯ４、ＮａＩ、ＮａＳＣＮ、ＺｎＣＩ２Ｃｓ３ＰＯ４、Ｃｓ２ＨＰＯ４、ＣｓＨ２ＰＯ４、Ｃｓ２ＳＯ４、ＣｓＣＨ３ＣＯＯ、ＣｓＣｌ、ＣｓＢｒ、ＣｓＮＯ３、ＣｓＣＩＯ４、ＣｓＩ、ＣｓＳＣＮ、Ｌｉ３ＰＯ４、Ｌｉ２ＨＰＯ４、ＬｉＨ２ＰＯ４、Ｌｉ２ＳＯ４、ＬｉＣＨ３ＣＯＯ、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＮＯ３、ＬｉＣｌＯ４、ＬｉＩ、ＬｉＳＣＮ、Ｃｕ２ＳＯ４、Ｍｇ３（ＰＯ４）２、Ｍｇ２ＨＰＯ４、Ｍｇ（Ｈ２ＰＯ４）２、Ｍｇ２ＳＯ４、Ｍｇ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＢｒ２、Ｍｇ（ＮＯ３）２、Ｍｇ（ＣｌＯ４）２、ＭｇＩ２、Ｍｇ（ＳＣＮ）２、ＭｎＣｌ２、Ｃａ３（ＰＯ４），、Ｃａ２ＨＰＯ４、Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２、ＣａＳＯ４、Ｃａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、ＣａＣｌ２、ＣａＢｒ２、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｃａ（ＣｌＯ４）２、ＣａＩ２、Ｃａ（ＳＣＮ）２、Ｂａ３（ＰＯ４）２、Ｂａ２ＨＰＯ４、Ｂａ（Ｈ２ＰＯ４）２、ＢａＳＯ４、Ｂａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、ＢａＣｌ２、ＢａＢｒ２、Ｂａ（ＮＯ３）２、Ｂａ（ＣｌＯ４）２、ＢａＩ２、およびＢａ（ＳＣＮ）２から選択される。例えば、塩化物塩または酢酸塩（トリフルオロ酢酸塩）などのＮＨ酢酸塩、ＭｇＣｌ２、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、およびＣａＣｌ２が、特に好ましい。
【００７７】
一態様では、本明細書に記載されるポリペプチドは、薬学的に許容可能な塩の形態である。別の態様では、薬用塩の形態であるポリペプチドは、結晶形態である。
【００７８】
一態様では、本明細書に記載される薬学的に許容可能な塩は、製薬用途に許容される範囲内の毒性プロファイルを有する塩類を指す。
【００７９】
本明細書の用法では、「薬学的に許容可能な塩」は、開示されたペプチドの誘導体を指し、ペプチドは、薬剤の酸性塩または塩基性塩を作製することで修飾される。例えば、適切な酸との反応を伴って、遊離塩基（典型的には中性形態の薬物が中性の−ＮＨ２基を有する）から酸性塩が調製される。酸性塩を調製するための適切な酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸、ならびに例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸リン酸などの無機酸の双方が挙げられる。逆に、ペプチド上に存在してもよい酸部分の塩基性塩の調製物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミンなどの薬学的に許容可能な塩基を使用して調製される。
【００８０】
一態様では、薬学的に許容可能な塩は、本明細書に記載されるペプチドの溶解性および／または安定性を高めてもよい。別の態様では、本明細書に記載の薬用塩類は、例えば、適切な酸または塩基と本明細書に記載のペプチドまたは複合体とを反応させることによって、対応する担体ペプチドまたは複合体から従来の手段によって調製されてもよい。別の態様では、薬学的に許容可能な塩は、結晶形態または半結晶性形態である。さらに別の態様では、薬学的に許容可能な塩としては、例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に援用される、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｂｙ  Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  ２００２）およびＬ．Ｄ．Ｂｉｇｈｌｅｙ，Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，Ｄ．Ｃ．Ｍｏｎｋｈｏｕｓｅ，ｉｎ”Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”．Ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，Ｖｏｌ．１３，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｅｌ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ  １９９５，ｐｐ．４５３−４９９に記載されるものが挙げられる。
【００８１】
本発明はまた、本発明の二重特異性ポリペプチド分子と、特定のがん抗原に特異的な治療用抗体（例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体）と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる、医薬組成物も包含する。
【００８２】
特定の実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、動物、そしてより特にはヒトで使用するために、連邦または州政府の監督官庁によって認可され、または米国薬局方またはその他の一般に認められている薬局方に収載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療剤がそれと共に投与される希釈剤、アジュバント賦形剤、またはビヒクルを指す。このような薬学的担体は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの鉱油、動物、植物または合成起源をはじめとする、水および油などの滅菌液体であり得る。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合の好ましい担体である。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液はまた、特に、注射液のための液体担体として用いられ得る。適切な医薬品賦形剤としては、デンプン、グルコース、乳糖、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、滑石、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、Ｌ−ヒスチジン、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、所望ならば、微量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤もまた、含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、持続放出製剤などの形態を取り得る。通常、本発明の組成物の成分は、例えば、活性薬剤の量を表示するアンプルまたは小袋などの密閉容器内の乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、単位用量剤形で、別々にまたは合わせてのどちらかで提供される。組成物が輸液によって投与される場合、それは滅菌製薬等級水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて、調剤され得る。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与に先だって混合されてもよいように、無菌注射用水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【００８３】
次に本発明の別の態様は、医療で使用するための、本発明による二重特異性ポリペプチド分子、本発明による核酸または発現ベクター、本発明による細胞、または本発明による医薬組成物に関する。一般に、二重特異性ポリペプチド分子の使用は、下でさらに詳しく説明されるように、前記分子によって認識されるペプチド抗原の医学的状況に依存する。
【００８４】
膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、前立腺、子宮頸部、甲状腺、および皮膚のがんなどのがん；扁平上皮がんなど；白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫などのリンパ系の造血器腫瘍；急性および慢性骨髄性白血病および前骨髄球性白血病などの骨髄系の造血器腫瘍；線維肉腫および横紋筋肉腫などの間葉起源の腫瘍；黒色腫、セミノーマ、奇形がん、神経芽腫、および神経膠腫などのその他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、シュワン細胞腫、および骨肉腫などの中枢および末梢神経系の腫瘍；および黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、セミノーマ、甲状腺濾胞性がん、および奇形がんなどのその他の腫瘍をはじめとする（が、これに限定されるものではない）様々ながんまたはその他の異常増殖性疾患治療または予防をはじめとする、免疫学的障害、感染症、中毒症、およびがんから選択される疾患または障害の治療または予防で使用するための、本発明による二重特異性ポリペプチド分子、本発明による核酸または発現ベクター、または本発明による細胞、または本発明による医薬組成物が好ましい。追加的ながんとしては、濾胞性リンパ腫；ｐ５３変異を有するがん腫；乳房、前立腺、および卵巣のホルモン依存性腫瘍、および家族性腺腫様ポリポーシスなどの前がん性病変；および骨髄異形成症候群が挙げられるが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、卵巣、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、膵臓、または子宮において、本発明の方法および組成物によって、悪性変化または異常増殖変化（例えば、化生および異形成）または過剰増殖性障害が治療または予防される。別の特定の実施形態では、本発明の方法および組成物によって、肉腫、黒色腫、または白血病が治療または予防される。
【００８５】
本発明は、本発明による二重特異性ポリペプチド分子または本発明による医薬組成物の治療的有効量を投与するステップを含んでなる、患者または対象において免疫応答を引き起こす方法にさらに関する。一態様では、本発明による二重特異性ポリペプチド分子または本発明による医薬組成物の集団が、それを必要とする患者または対象に投与される。
【００８６】
本発明は、本発明による二重特異性ポリペプチド分子の有効量を患者に投与するステップを含んでなる、患者または対象において標的細胞を死滅させる方法にさらに関する。
【００８７】
本発明はまた、本発明による１つまたは複数の抗炎症剤の治療的または予防的有効量を前記対象に投与するステップをさらに含んでなる、対象における炎症性疾患に伴う１つまたは複数の症状を予防、治療または管理する方法も提供する。本発明はまた、本発明による１つまたは複数の免疫調節剤の治療的または予防的有効量を前記対象に投与するステップをさらに含んでなる、自己免疫疾患に伴う１つまたは複数の症状を予防、治療または管理する方法も提供する。本発明の分子によって治療または予防され得る感染性疾患歯、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、およびウイルスをはじめとするが、これに限定されるものではない感染性因子によって引き起こされる。本発明の方法と併用して本発明の分子を用いて治療または予防され得るウイルス性疾患としては、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、乳頭腫ウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エコーウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、おたふく風邪ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘、エプスタイン・バーウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、およびウイルス髄膜炎や脳炎やデングまたは天然痘などのウイルス性疾患の病原体によって引き起こされるものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８８】
細菌によって引き起こされる、本発明の方法と併用して本発明の分子を用いて治療または予防し得る細菌性疾患細菌としては、マイコバクテリア・リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）（ライム病）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽病）、破傷風、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、マイコバクテリウム、破傷風、百日咳、コレラ、腺ペスト、ジフテリア、クラミジア、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、およびレジオネラが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８９】
原生動物によって引き起こされる、本発明の方法と併用して本発明の分子を用いて治療または予防し得る原生動物性疾患としては、リーシュマニア、コクシジウム、トリパノソーマまたはマラリアが挙げられるが、これに限定されるものではない。寄生生物によって引き起こされる、本発明の方法と併用して本発明の分子を用いて治療または予防し得る寄生虫病としては、クラミジアおよびリケッチアが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９０】
感染性因子および疾患の例としては、細菌（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、スタフィロコッカス・ビリダンス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ）、およびシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、病原体（例えば、Ｂリンパ球向性パポバウイルス（ＬＰＶ）；ボルデテラ・パーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）；ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）；ウシコロナウイルス；脈絡髄膜炎ウイルス；デングウイルス；ウイルス、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）；エボラ；エコーウイルス１；エコーウイルス−１１（ＥＶ）；内毒素（ＬＰＳ）；腸内細菌；腸内オーファンウイルス；エンテロウイルス；ネコ白血病ウイルス；口蹄疫ウイルス；テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）；グラム陰性細菌；ヘリコバクター・ピロリ属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；単純ヘルペスウイルス；ＨＩＶ−Ｉ；ヒトサイトメガロウイルス；ヒトコロナウイルス；Ａ、Ｂ、およびＣ型インフルエンザ；レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）；メキシコリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ）；リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；麻疹ウイルス；髄膜炎菌；モルビリウイルス；マウス肝炎ウイルス；マウス白血病ウイルス；マウスγヘルペスウイルス；マウスレトロウイルス；マウスコロナウイルスマウス肝炎ウイルス；マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）−Ｍ；ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）；ニューカッスル病ウイルス；パルボウイルスＢ１９；熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）；ポックスウイルス；シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）；ロタウイルス；サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）；連鎖球菌；Ｔ細胞リンパ球向性ウイルス１；ワクシニアウイルス）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９１】
次に本発明のさらに別の態様は、本発明による二重特異性ポリペプチド分子、本発明による核酸または発現ベクター、本発明による細胞、または本発明による医薬組成物の治療的有効量を投与するステップを含んでなる、疾患または障害を治療する方法に関する。
【００９２】
本発明の二重特異性ポリペプチド分子は、二重特異性ポリペプチド分子の投与によって改善される疾患または病状を、予防または治療する方法で使用されてもよい。このような治療は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体または賦形剤と共に、医薬組成物中で提供されてもよい。治療用の二重特異性ポリペプチド分子は、薬学的に許容可能な担体を通常含む滅菌医薬組成物の一部として、通常供給される。この医薬組成物は、（患者に投与する所望の方法に応じて）任意の適切な形態であってもよい。それは、単位用量剤形で提供されてもよく、一般に密閉容器内に提供され、キットの一部として提供されてもよい。このようなキットは、通常（必ずしも必要ではないが）使用説明書を含む。それは、複数の前記単位用量剤形を含んでもよい。医薬組成物は、非経口（皮下、筋肉内、または静脈内をはじめとする）経路などの任意の適切な経路による投与に適合されてもよい。このような組成物は、例えば、滅菌条件下における活性成分と担体または賦形剤との混合などの調剤技術分野で公知の任意の方法によって調製されてもよい。
【００９３】
一態様では、本明細書に記載されるペプチドまたはその他の分子は、水性担体と組み合わされてもよい。一態様では、水性担体は、イオン交換体；アルミナ；ステアリン酸アルミニウム；ステアリン酸マグネシウム；レシチン；ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質；リン酸塩などの緩衝物質；グリシン；ソルビン酸；ソルビン酸カリウム；飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二カルシウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩などの塩類または電解質；コロイドシリカ；三ケイ酸マグネシウム；ポリビニルピロリドン；ポリビニルピロリドン酢酸ビニル；セルロースベースの物質（例えば、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸コハク酸メチルセルロースヒドロキシプロピル、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）；デンプン；乳糖一水和物；マンニトール；トレハロースラウリル硫酸ナトリウム；およびクロスカルメロースナトリウム、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂から選択される。
【００９４】
一態様では、水性担体は、本明細書に記載される構成成分などの非水担体成分と共に、水などの複数の成分を含有する。別の態様では、水性担体は、本明細書に記載されるペプチドまたはその他の分子と組み合わされると、例えば、改善された溶解性、有効性、および／または改善された免疫療法などの改善された特性を与えることができる。さらに組成物は、緩衝液、結合剤、ブラスチング剤、希釈剤、香料、潤滑剤などの賦形剤を含有し得る。「薬学的に許容可能な希釈剤」としては、例えば、生理学的適合性である、溶媒、増量剤、安定剤、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に許容可能な希釈剤の例としては、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールの１つまたは複数、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。多くの場合、組成物に、例えば、トレハロースおよびスクロースなどの糖、マンニトールおよびソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムなどの１つまたは複数の等張剤を含めることことが好ましい。例えば、湿潤剤または乳化剤、保存料または緩衝剤などの湿潤剤または少量の補助剤などの薬学的に許容可能な物質もまた、本発明の範囲内である。さらに組成物は、緩衝液、結合剤、ブラスチング剤、希釈剤、香料、および潤滑剤などの賦形剤を含有し得る。
【００９５】
本発明の二重特異性ポリペプチド分子の用量は、治療される疾患または障害、治療される個人の年齢および病状などに応じて、広い範囲内で変動し得て；例えば、二重特異性ポリペプチド分子の適切な用量範囲は、２５ｎｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇであってもよい。医師が最終的に、使用する適切な用量を決定する。
【００９６】
本発明の医薬組成物、ベクター、核酸、および細胞は、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の純度などの実質的に純粋形態で提供されてもよい。
【００９７】
本発明の各態様の好ましい特徴は、変更すべきところは変更して、その他の各態様に対するものである。本明細書で言及される先行技術文献は、法律で許容される最大範囲に組み込まれる。本発明およびその利点が詳述されているが、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の精神と範囲を逸脱することなく、様々な変更、置換、および改変を加え得るものと理解される。例証のみを目的とし、本発明をどのようにも限定することは意図されない以下の実施例によって、本発明をさらに例証する。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】本発明の好ましい実施形態、すなわちヒトＩｇＧ１  Ｆｃ含有二重特異性ポリペプチド分子の概略図を示す。ＶＤ１、ＶＤ２＝抗体由来可変ドメイン；ＶＲ１、ＶＲ２＝ＴＣＲ由来可変ドメイン；Ｌｉｎｋ１、Ｌｉｎｋ２＝連結リンカー；Ｃｙｓ−Ｃｙｓ＝システイン架橋。
【図２】本発明の文脈で試験されたＩｇＧ  Ｆｃ含有二重特異性ポリペプチド分子の４つの異なるコンストラクトの概略図を示す。黒色＝ＴＣＲ由来可変ドメイン；淡灰色＝抗体由来可変ドメイン；白色＝ヒトＩｇＧ由来定常ドメイン。ノブ・ホール変異は、円柱によって示される。二重特異性分子ＩＡ−ＩＤは、本発明によるものである。
【図３】２カラム精製プロセスによって精製された、図２に示されるコンストラクトによる分子設計を有する、異なる二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ分子のＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析を示す。異なる分子の単量体含量は、以下のように判定された。ＩＩ：９３．８４％；ＩＩＩ：９６．５４％；ＩＶ：９８．４９％；ＩＡ＿１：９５．４８％；ＩＡ＿３：９８．４５％；ＩＤ＿１：９５．７５％；ＩＣ＿４：９５．２２％；ＩＣ＿５：９２．７６％；ＩＤ＿４：９９．３１％；ＩＤ＿５：９９．４４％。
【図４】ＩｇＧ４ベースの分子として設計された異なる二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂコンストラクト（図２に示される）の効力アッセイの結果を示す。Ｊｕｒｋａｔ＿ＮＦＡＴＲＥ＿ｌｕｃ２細胞は、漸増する濃度の二重特異性ＴＣＲ（ｂｓｓＴＣＲ）分子の存在下において、ＨＩＶ−ペプチドＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号７）負荷Ｔ２細胞と共インキュベートされた。二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体分子ＩＡ−ＩｇＧ４は、２つの代案の二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ分子よりも高い効力を示した。
【図５】ＩｇＧ１ベースの分子として設計された異なる二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂコンストラクト（図２に示される）の効力アッセイの結果を示す。Ｊｕｒｋａｔ＿ＮＦＡＴＲＥ＿ｌｕｃ２細胞は、漸増する濃度の二重特異性ＴＣＲ（ｂｓｓＴＣＲ）分子の存在下において、ＨＩＶ−ペプチドＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号７）負荷Ｔ２細胞と共インキュベートされた。二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体分子ＩＤ＿１、ＩＡ＿３、およびＩＡ１は、３つの代案の二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ分子よりも顕著に高い効力を示した。
【図６】どちらもＴＣＲ−ＣＤ３複合体を標的化する異なる可変抗体ドメインを用いて、異なるＩｇＧ１ベース二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂコンストラクト（に示される図２）について行った、効力アッセイの結果を示す。コンストラクトＩＤ＿１が、ＵＣＨＴ１（Ｖ９）抗体標的化ＣＤ３の可変ドメインを含んでなるのに対して、コンストラクトＩＤ＿４およびＩＤ＿５は、α／βＴＣＲ特異的抗体ＢＭＡ０３１の可変ドメインを含んでなる。Ｊｕｒｋａｔ＿ＮＦＡＴＲＥ＿ｌｕｃ２細胞は、漸増する濃度の二重特異性ＴＣＲ（ｂｓｓＴＣＲ）分子の存在下において、ＨＩＶ−ペプチドＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号７）負荷Ｔ２細胞と共インキュベートされた。
【図７】本発明の分子中のＶＤおよびＶＲドメインの可能な配向の概略図を示す。ＶＨ：抗体由来ＶＨドメイン、ＶＬ：抗体由来ＶＬドメイン；Ｖα：ＴＣＲ由来Ｖα；Ｖβ：ＴＣＲ由来Ｖβ。
【図８】ＩｇＧ１に基づく異なる二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ分子内の凝集体（ＨＭＷＳ−高分子量化学種）のＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析の結果を示す。凝集物は、それぞれ、精製後に、そして４０℃で１週間および２週間の保存後に分析された。
【図９】ＩｇＧ１ベースの異なる二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ分子に対して行った、効力アッセイの結果を示す。効力は、それぞれ、精製後に、そして４０℃で１週間および２週間の保存後に分析された。４０℃でのストレス保存は、分子の効力の有意な損失をもたらさなかったが、分子ＩＩＩおよびＩＶについて、ジャーカットＴ細胞の非特異的（すなわち、標的非依存性）活性化の劇的な増加が検出された。
【図１０】ＩｇＧ１ベースの分子として設計された異なる二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂコンストラクト（図２に示される）のＬＤＨ放出アッセイの結果を示す。健常ドナーから単離されたＰＢＭＣは、漸増する濃度の二重特異性ＴＣＲ（ｂｓｓＴＣＲ）分子の存在下において、ＨＩＶ−ペプチドＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号７）負荷Ｔ２細胞と共インキュベートされた。二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体分子ＩＡ＿３およびＩＤ＿１は、３つの代案の二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ分子よりも顕著に高い標的細胞の溶解を誘導した。右側のグラフに示されるように、試験した二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂコンストラクトのいずれも、無関係のペプチド（配列番号４９）が負荷されされたＴ２細胞の検出可能な溶解を誘導しなかった。
【図１１】ＨＬＡ−Ａ＊０２上で提示される二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体コンストラクトＩＡ＿５標的化腫瘍関連ペプチドＰＲＡＭＥ−００４（配列番号４９）のＬＤＨ放出アッセイの結果を示す。健常ドナーから単離されたＣＤ８陽性Ｔ細胞は、漸増する濃度のＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体分子の存在下において、５：１のエフェクター：標的比で、細胞表面で異なる量のＰＲＡＭＥ−００４：ＨＬＡ−Ａ＊０２−１複合体を提示する（細胞当たりコピー数それぞれ約１１００、約７７０、および約２４０、Ｍ／Ｓ分析による測定）がん細胞株ＵＡＣＣ−２５７、ＳＷ９８２、およびＵ２ＯＳと共インキュベートされた。４８時間の共培養後、標的細胞溶解は、製造会社の使用説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってＬＤＨ放出アッセイを用いて定量された。
【図１２】ＨＬＡ−Ａ＊０２上で提示される腫瘍関連ペプチドＰＲＡＭＥ−００４（配列番号４９）に対する、安定性／親和性成熟ＴＣＲおよびその増強バージョンをそれぞれ用いた、二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体コンストラクトＩＡ＿５およびＩＡ＿６のＬＤＨ放出アッセイの結果を示す。健常ドナーから単離されたＣＤ８陽性Ｔ細胞は、漸増する濃度のＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体分子の存在下において、細胞当たり約２４０のコピー数のＰＲＡＭＥ−００４：ＨＬＡ−Ａ＊０２−１複合体を提示するがん細胞株Ｕ２ＯＳ、または非負荷Ｔ２細胞（５：１のエフェクター：標的比）と共インキュベートされた。４８時間の共培養後に、標的細胞溶解は、製造会社の使用説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってＬＤＨ放出アッセイを用いて定量された。
【図１３】ＨＬＡ−Ａ＊０２上で提示される腫瘍関連ペプチドＰＲＡＭＥ−００４（配列番号４９）に対する、安定性／親和性成熟ＴＣＲおよびその増強バージョンをそれぞれ用いた、ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体コンストラクトＩＡ＿５およびＩＡ＿６の熱安定性試験の結果を示す。このために、タンパク質は、ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍＬの濃度で配合され、引き続いて４０℃で２週間保存された。タンパク質の完全性および回収率は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣを用いて評価された。それによって、主要ピークの前に溶出するピーク面積の百分率に従って、高分子量化学種の量が判定された。単量体タンパク質の回収率は、ストレスのないサンプルとストレスを受けたサンプルの主要ピーク面積を比較することによって計算された。
【実施例】
【００９９】
実施例１
Ｆｃ含有二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体および対照分子の設計
Ｆｃ含有二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体および対照分子（図２に示される）は、ヒトＴＣＲ−ＣＤ３複合体と、ＨＬＡ−Ａ２＊０１に結合したＨＩＶ由来ペプチドＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号７）を含んでなるペプチド：ＭＨＣ複合体とに、特異的に結合するように設計した。ＴＣＲ−ＣＤ３複合体を標的化するために、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ３  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９５，１５５，１９０３−１９１０）によって記載された、ＣＤ３特異的ヒト化抗体ｈＵＣＨＴ１（Ｖ９）に由来するＶＨおよびＶＬドメイン、またはＳｈｅａｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９１，１４７，４３６６−７３）に記載され、ヒト化バージョン変異型１０で用いられた（自社内データ）、α／βＴＣＲ−特異的抗体ＢＭＡ０３１に由来するＶＨおよびＶＬドメインを使用した。ペプチド：ＭＨＣ複合体を標的化するために、Ａｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ａｌｌｏｗ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＰＥＤＳ，２０１１，２４，３６１−３７２）によって開示された、前述の安定性および親和性成熟ヒト一本鎖Ｔ細胞受容体８６８Ｚ１１のＶαおよびＶβドメインを使用した。
【０１００】
Ｆｃ含有二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体の場合は、ＶＨおよびＶＬ（それぞれ、ＶＤ１およびＶＤ２に対応する）、およびＶａおよびＶｂ（それぞれ、ＶＲ１およびＶＲ２に対応する）の様々な組み合わせをコードする、ならびにリンカーＬｉｎｋ１およびＬｉｎｋ２をコードする、ＤＮＡ配列を遺伝子合成によって得た。得られたＤＮＡ配列は、ヒトＩｇＧ４（受託番号Ｋ０１３１６）およびＩｇＧ１（受託番号Ｐ０１８５７）に由来する、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをそれぞれコードする発現ベクターにインフレームでクローン化し、さらに操作した。操作は、Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｖ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｂｙ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，３３，５４５１−５４５９）によって記載される方法に従って、追加的な鎖間ジスルフィド結合安定化の有無にかかわらず、ＣＨ３ドメインへのノブ・イン・ホール変異を組み込むために；ＣＨ２中のＮ−グリコシル化部位を除去するために（例えば、Ｎ２９７Ｑ変異）；Ｆｃ−サイレンシング変異を導入するために；追加的なジスルフィド結合安定化をＶＬおよびＶＨにそれぞれ導入するために実施した。製造された二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体の概要、変異型、および対応する配列は、表１に列挙される。
【０１０１】
【表１】
2019023184.tif 000002
【０１０２】
上記のように、操作された特徴を含むＩｇＧ１またはＩｇＧ４由来の定常ドメインと組み合わせた前記ＶＨ、ＶＬ、Ｖα、およびＶβドメインを用いて、同一特異性を示す様々な対照分子を表２構築した。
【０１０３】
【表２】
2019023184.tif 000003
【０１０４】
実施例２
Ｆｃ含有二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体の製造および精製
組換えタンパク質の発現のためのベクターは、ＨＣＭＶ由来のプロモーター要素であるｐＵＣ１９誘導体によって制御される単シストロン性として設計した。プラスミドＤＮＡは、標準的な培養法に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において増幅し、引き続いて商業的に入手できるキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  ＆  Ｎａｇｅｌ）を用いて精製した。精製されたプラスミドＤＮＡは、製造業者の取扱説明書（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）システム；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って、ＣＨＯ−Ｓ細胞の一過性形質移入に使用した。形質移入されたＣＨＯ細胞を３２℃〜３７℃で６〜１４日間培養し、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）供給液を１〜２回与えた。
【０１０５】
調整細胞上清を遠心分離（４０００×ｇ；３０分間）によって収集し、濾過によって清澄化した（０．２２μｍ）。二重特異性分子は、インラインでアフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを実施するように装備された、Ａｋｔａ  Ｐｕｒｅ  ２５Ｌ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製した。アフィニティークロマトグラフィーは、標準的なアフィニティークロマトグラフィープロトコルに従って、プロテインＡカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で実施した。標準プロトコルに従ってＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ  １６／６００カラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、アフィニティーカラムからの溶出（ｐＨ２．８）の直後にサイズ排除クロマトグラフィーを実施して、高純度の単量体タンパク質を得た。予測されたタンパク質配列に従って計算された吸光係数を用いて、ＮａｎｏＤｒｏｐシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上でタンパク質濃度を判定した。必要であれば濃縮し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて緩衝液交換を実施した。最後に、精製された分子は、２〜８℃の温度において約１ｍｇ／ｍＬの濃度でリン酸緩衝食塩水中で保存した。
【０１０６】
治療用タンパク質は、酸性曝露時に妥当な安定性を示して堅固な工業的精製プロセスを容易にするべきなので、プロテインＡ捕捉カラムからの単量体タンパク質溶出の百分率を評価した（表３）。分子への安定化変異の導入ならびに結合ドメインの明確な配向の選択が、酸性暴露時の安定性に顕著に影響を及ぼすことは明らかである。
【０１０７】
【表３】
2019023184.tif 000004
【０１０８】
サイズ排除クロマトグラフィー後に、精製された二重特異性分子は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００システム内で３００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．８（図３参照）中で実行されたＭａｂＰａｃＳＥＣ−１カラム（５μｍ、７．８×３００ｍｍ）上のＨＰＬＣ−ＳＥＣによる判定で、高純度（＞９３％の単量体タンパク質）を実証した（図３を参照されたい）。非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、異なる二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ分子の純度および予想を確認した（データ未掲載）。
【０１０９】
実施例３
Ｆｃ含有ＴＣＲ／ｍＡｂ二重特異性抗体によって誘導される特異的かつ標的細胞依存性のＴ細胞活性化
Ｔ細胞活性化に対するＦｃ含有ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体の効力は、細胞活性化生物検定（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。アッセイは、ＮＦＡＴ応答要素（ＮＦＡＴ−ＲＥ）によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する、遺伝子操作されたジャーカット細胞株からなる。アッセイは、製造業者に従って実施した。簡潔に述べると、ＨＩＶ特異的ペプチドＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号７）が負荷されたＴ２細胞、またはペプチド負荷のないＴ２細胞（未負荷対照）を、漸増する濃度の二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ分子の存在下で、Ｐｒｏｍｅｇａの改変ジャーカット細胞と共に引き続いて共培養した。ジャーカットレポーターＴ細胞の活性化は、ルミネセンス強度を測定することによって１６〜２０時間後に分析した。
【０１１０】
代表的な効力アッセイ結果を、それぞれＩｇＧ４ベース（図４）およびＩｇＧ１ベース（図５）の二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ分子について示す。データは、Ｆｃ含有ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体コンストラクトＩＡおよびＩＤが、使用された定常ドメインのＩｇＧアイソタイプに関わりなく、活性化規模および／または各ＥＣ５０値によって測定されるように、代案の二重を示特異性ＴＣＲ／ｍＡｂコンストラクトＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶと比較して、優れたＴ細胞活性化したことを示唆する。さらに、未負荷Ｔ２細胞に対して誘導されたＦｃ含有ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体の非特異的Ｔ細胞活性化は低下し、または少なくとも代案の二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂコンストラクトについて観察された非特異的活性化レベルに等しかった。上記の結果によれば、二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体分子は、高度に標的依存性様式で強力なエフェクターＴ細胞活性化を誘導するので、治療的介入のための好ましい分子である。
【０１１１】
さらに、ＬＤＨ放出アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、異なる二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ分子によって誘導されたＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号７）ペプチド負荷Ｔ２細胞のＰＢＭＣ媒介溶解を定量化した（図１０）。Ｔ細胞活性化生物検定の上記の結果と一致して、標的細胞溶解の絶対レベルの増加と、標的細胞の最大半量（ＥＣ５０）殺傷率を達成するために必要とされるより低いＴＣＲ二重特異性濃とによって示されるように、Ｆｃ含有ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体コンストラクトＩＡおよびＩＤもまた、二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂコンストラクトＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶより優れていた。ＴＣＲ／ｍＡｂコンストラクトＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶについては、ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体コンストラクトＩＡおよびＩＤは、無関係のペプチド（配列番号４９）が負荷されたＴ２細胞の溶解を誘導せず、Ｔ２細胞に対する標的特異的溶解を提供した。
【０１１２】
実施例４
分子プラットフォームとしてのＦｃ含有二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体の開発
Ｆｃ含有二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体コンストラクトは、分子プラットフォームの役割を果たして、異なるペプチド：ＭＨＣ複合体およびエフェクター細胞表面抗原をそれぞれ標的化する、異なるＴＣＲ由来およびｍＡｂ由来可変ドメインにスキャフォールドを提供するように、設計された。プラットフォームとしての適合性を検証するために、ｍＡｂ由来可変ドメインを第１の分子セットで交換した。ｈＵＣＨＴ１（Ｖ９）抗ＣＤ３抗体の可変ドメインは、同一ドメイン配向（コンストラクトＩＤ＿４およびＩＤ＿５）または異なる配向（ＩＣ＿４、ＩＣ＿５）を用いて、ｈＢＭＡ０３１（ｖａｒ１０）抗ＴＣＲ抗体のドメインで交換した。これらの分子の発現、精製、および特性決定は、上述したように実施した。ＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析によれば、最終調製物の純度および完全性は９２％を超えた。
【０１１３】
効力アッセイ結果は、二抗体可変ドメインｈＵＣＨＴ１（コンストラクトＩＤ＿１）およびｈＢＭＡ０３１（コンストラクトＩＤ＿４およびＩＤ＿５）の双方について、標的依存性ジャーカットレポーターＴ細胞活性化と、未負荷Ｔ２細胞に対する最小の非特異的活性とを明らかにし、二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体コンストラクトのプラットフォーム適合性を支持した（図６）。注目すべきことに、コンストラクトＩＤ＿４およびＩＤ＿５の可変ＴＣＲおよびｍＡｂドメインを各ポリペプチド鎖上でスイッチオンした場合、コンストラクトＩＣ＿４およびＩＣ＿５のＴ細胞活性化は観察されなかった（データ未掲載）。後者の知見は、二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体が、異なるＴＣＲおよびｍＡｂ可変ドメインを組み込むためのプラットフォームコンストラクトとして使用され得るにもかかわらず、分子の最適な活性を達成するためにドメイン配向の完全な最適化が要求されることを示唆する。
【０１１４】
実施例５
Ｆｃ含有二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体の安定性
二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ分子の安定性は、最初に、ＰｒｏｔｅｉｎＴｈｅｒｍａｌ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、製造業者の取扱説明書に従って評価した。簡潔に述べると、精製された分子をＰＴＳ緩衝液およびＰＴＳ色素と混合し、サンプルの蛍光を絶えずモニタリングしながら、上昇する温度勾配に供した。記録された蛍光シグナルをＰＴＳソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて分析し、融解温度（ＴＭ）を微分法によって計算した。
【０１１５】
ストレス下の安定性の研究は、ＰＢＳに溶解された精製分子を４０℃で２週間まで保存することによって行った。サンプルは、ＨＰＬＣ−ＳＥＣを用いてタンパク質完全性について分析し、上記のようなＴ細胞活性化アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて効力について分析した。
【０１１６】
予測されたように、４０℃での保存は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析（図８参照）による判定で、凝集体／高分子量化学種の形成を誘導した（図８を参照されたい）。精製後、および４０℃でのインキュベーション後のＩｇＧ１ベース分子の効力アッセイの結果は、図９に示される。試験された分子は、いずれも４０℃での保存後に、効力の有意な低下を示さなかったが、ストレスを受けた分子ＩＩＩおよびＩＶは、相当量の非特異的（すなわち、標的非依存性）ジャーカットＴ細胞活性化を誘導したことが観察された。対照的に、二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣで見られるようないくらかの凝集体の存在にもかかわらず、それらの標的依存性効力を保持した。
【０１１７】
実施例６
がん標的化二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体分子の作製
二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体コンストラクトのプラットフォーム能力をさらに検証するために、ＴＣＲ由来可変ドメインを、以前に記載されている方法（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ，２０１５，Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１３１９：９５−１４１）に従って、酵母ディスプレイによって安定性／親和性成熟された、ＴＣＲの可変ドメインで交換した。ＨＬＡ−Ａ＊０２の文脈で、ＨＩＶ由来ペプチドＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号７）に特異的に結合するＴＣＲ可変ドメインを、ＨＬＡ−Ａ＊０２に結合した腫瘍関連ペプチドＰＲＡＭＥ−００４（配列番号４９）に特異的に結合するＴＣＲ可変ドメインで交換した。さらに、ヒト化Ｔ細胞動員抗体ｈＵＣＨＴ１（Ｖ９）の可変ドメインを、ＵＣＨＴ１抗体の新規ヒト化バージョンであるｈＵＣＨＴ１（Ｖａｒ１７）の可変ドメインで交換し、ＰＲＡＭＥ−００４−標的化ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体分子ＩＡ＿５（配列番号４３および配列番号４４を含んでなる）を得た。この分子の発現、精製、および特性決定は、実施例２に記載したように実施した。ＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析によれば、最終調製物の純度および完全性は９６％を超えた。
【０１１８】
ＰＲＡＭＥ−００４：ＨＬＡ−Ａ＊０２に対する二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体コンストラクトの結合親和性は、バイオレイヤー干渉法によって判定した。測定は、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ３８４システム上で、製造業者が推奨する設定を用いて行った。簡潔に述べると、ＨＬＡ−Ａ＊０２／ＰＲＡＭＥ−００４の連続希釈を分析する前に、精製された二重特異性ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体分子をバイオセンサー（ＡＨＣ）上に負荷した。
【０１１９】
ＨＬＡ−Ａ＊０２の文脈で、腫瘍細胞表面に異なるコピー数のＰＲＡＭＥ−００４ペプチドを提示する（ＵＡＣＣ−２５７−約１１００、ＳＷ９８２−約７７０、Ｕ２ＯＳ−約２４０ＰＲＡＭＥ−００４細胞当たりコピー数、定量的Ｍ／Ｓ分析による判定）ヒトがん細胞株ＵＡＣＣ−２５７、ＳＷ９８２、およびＵ２ＯＳのヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞媒介溶解を、ＬＤＨ放出アッセイによる判定で評価することによって、腫瘍細胞溶解の誘導に関する、このＰＲＡＭＥ−００４標的化ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体コンストラクトの活性を評価した。
【０１２０】
図１１に示されるように、ＰＲＡＭＥ−００４標的化ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体コンストラクトＩＡ＿５は、ＰＲＡＭＥ−００４陽性腫瘍細胞株の濃度依存性溶解を誘導した。このＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体分子によって、腫瘍細胞あたり２４０のＰＲＡＭＥ−００４コピー数を発現する腫瘍細胞Ｕ２ＯＳでさえも、効率的に溶解された。これらの結果は、ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体フォーマットが、異なるＴＣＲの可変ドメインならびに異なるＴ細胞動員抗体の可変ドメインを導入できるようにする分子プラットフォームとして、適用可能であることをさらに実証する。
【０１２１】
実施例７
ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体コンストラクトの操作性
コンストラクトＩＡ＿５で使用された可変ＴＣＲドメインを、ＰＲＡＭＥ−００４に対する親和性およびＴＣＲ安定性に関してさらに増強して使用し、ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体スキャフォールドに操作して、コンストラクトＩＡ＿６（配列番号４５および配列番号４６を含んでなる）をもたらした。ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体分子ＩＡ＿５およびＩＡ＿６の発現、精製、および特性決定は、実施例２に記載のように行った。ＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析によれば、最終調製物の純度および完全性は９７％を超えた。
【０１２２】
標的細胞として、少量のＰＲＡＭＥ−００４：ＨＬＡ−Ａ＊０２を提示する腫瘍細胞株Ｕ２ＯＳまたは非負荷Ｔ２細胞、およびエフェクター細胞として、ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞を用いた細胞傷害性実験において、ＰＲＡＭＥ−００４に対する、安定性および親和性増強ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体変異株ＩＡ＿６の効力を評価した。
【０１２３】
図１２に示されるように、本発明者らは、前駆コンストラクトＩＡ＿５と比較した場合に、安定性／親和性増強されたＴＣＲ変異型の可変ドメインを含んでなるＴＣＲ／Ａｂ二特異性抗体分子ＩＡ＿６の細胞傷害性効力の増加を観察した。ＩＡ＿５およびＩＡ＿６の双方のコンストラクトでは、標的陰性Ｔ２細胞の細胞溶解が検出されなかったので、ＰＲＡＭＥ−００４依存性溶解が確認された。
【０１２４】
タンパク質コンストラクトは、４０℃で２週間までの熱ストレスにさらに供して、ＰＲＡＭＥ−００４特異的ＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体変異型ＩＡ＿５およびＩＡ＿６の安定性を分析した。熱ストレス後のＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析は、前駆コンストラクトＩＡ＿５（図１３参照）と比較した場合に、変異型ＩＡ＿６の有意に改善された安定性を明らかにした（図１３を参照されたい）。コンストラクトの温度誘導性高分子種の増加（すなわち、主要ピーク前の溶出）は、ＩＡ＿６の方がＩＡ＿５よりも顕著ではなかった。この結果と一致して、熱ストレス後の非損傷な単量体タンパク質の回収率は、ＩＡ＿５およびＩＡ＿６について、それぞれ８７％および９２％であった。
【０１２５】
これらの例示的な操作データは、安定性／親和性増強されたＴＣＲ可変ドメインを組み込むことによって、非常に強力で安定したＴＣＲ／ｍＡｂ二特異性抗体コンストラクトがさらに改善され得て、優れた特性を有する治療用タンパク質がもたらされることを実証する。
【０１２６】
実施例８
好ましいコンストラクトの例
本明細書に記載のＨＩＶ特異的ＴＣＲ二重特異性コンストラクト（配列番号１６および配列ＩＤ番号１７、Ｄの配向）に加えて、本発明は、試験されたいくつかのその他の例示的なＨＩＶ特異的コンストラクトをさらに提供する。これらのコンストラクトは、４つの可能な配向の全て（配列番号５１〜配列番号５８、配向Ａ〜Ｄ）で、本明細書で開示されるようなＨＩＶ特異的ＴＣＲ８６８と融合された、基礎となるＣＤ３（ＵＣＨＴ１）に対する抗体の改良されたヒト化変異型に基づいている。
【０１２７】
ＵＣＨＴ１のヒト化は、重鎖および軽鎖ＣＤＲのアクセプターフレームワークとして、それぞれＶＨ−１−４６およびＶＫ１−０１８を使用して行った。選択されたＪセグメントは、軽鎖および重鎖についてそれぞれＪＫ１およびＪＨ４であった。
【０１２８】
得られた結果は、以下の表４に示される：
【０１２９】
【表４】
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【０１３０】
表４のデータは、本発明のヒト化が、潜在的に免疫原性がより低い（より低いＤＲＢ１スコア）こと；分子がより安定していること（融解温度を約３°Ｃ高める）；標準（Ｖ９）と比較してより効力があること（約８倍低下したＥＣ５０）（アッセイについては実施例３を参照されたい）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2019023184000001.pdf