(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳動物の受精卵に物質を導入する方法であって、受精卵への物質の導入効率が０％〜１００％となる条件を設定できる方法を提供する。【解決手段】哺乳動物の受精卵に物質を導入する方法であって、該方法は受精卵を内部に含む卵管を哺乳動物から露出させる卵管露出工程、前記受精卵に導入する物質を前記卵管に注入する物質注入工程、前記卵管を挟むようにエレクトロポレーション電極を配置する電極配置工程、前記エレクトロポレーション電極の間に、予め設定した値の電流を流す電流印加工程、を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の受精卵に物質を導入する方法であって、該方法は
受精卵を内部に含む卵管を哺乳動物から露出させる卵管露出工程、
前記受精卵に導入する物質を前記卵管に注入する物質注入工程、
前記卵管を挟むようにエレクトロポレーション電極を配置する電極配置工程、
前記エレクトロポレーション電極の間に、予め設定した値の電流を流す電流印加工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記電流印加工程で印加される電流の値が、１００ｍＡ〜４００ｍＡの範囲から設定される、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電流の値が、２００ｍＡ〜４００ｍＡの範囲から設定される、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物がマウスである、
請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、哺乳動物の受精卵に物質を導入する方法であって、特に、哺乳動物の受精卵にエレクトロポレーションを用いて物質を導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子改変動物は、現在、医学および生物学を含む様々な研究分野において、生物の基本的メカニズムの解明のために、あるいは、ヒトの疾患のモデルとして、使用されている。迅速な遺伝子改変動物の作製手段として、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ−Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ））、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ））およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（群生性等間隔短回文反復関連システム（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ））などの人工制限酵素を利用する系が、近年注目を集めている。これらの新しい技術はゲノム編集と呼ばれ、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を利用せずに、幅広い生物のゲノムを改変することを可能にした。
【０００３】
ゲノム編集による遺伝子改変動物の作製は、通常、前核期胚に人工制限酵素の遺伝子をマイクロインジェクションすることにより行われる。マウスのゲノム編集も、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ（またはタンパク質）およびｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）、または、これらのＲＮＡを発現するプラスミドを受精卵の細胞質または前核に１つずつマイクロインジェクションすることにより実施されてきた。現在はこの方法が主流であるが、細胞の損傷を防ぐには、熟練された手技を要する。さらに、マイクロインジェクションでは、専用の機械を使用して前核期胚に１つずつ遺伝子を注入しなければならず、かなりの時間を必要とする。ブタ、ウシ、ヒツジ等の大型動物の遺伝子改変には、遺伝子改変されたドナー細胞を使用する体細胞核移植（ＳＣＮＴ）が現在最も広範に使用されているが、エピジェネティック修飾の初期化が不完全であるために出産前または後に仔が死亡することがあり、成功率は低い。
【０００４】
エレクトロポレーションは、目的の核酸またはタンパク質を、細胞または組織に導入するのに有用な手段であり、多くの生物種で幅広く用いられてきた。マウスでは、この技法は、胎児および出生後の個体の脳、精巣および筋肉を含む様々な組織に使用されてきた。エレクトロポレーションにより哺乳動物の受精卵に核酸またはタンパク質を導入したことが数例報告されており、最近、ラットまたはマウス受精卵へのエレクトロポレーションによるＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの導入が報告された（特許文献１）。
【０００５】
また、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡを哺乳動物の受精卵にエレクトロポレーションにより導入する際に、導入効率を高めるために、電圧と通電時間の最適条件を設定することも知られている（特許文献２参照）。
【０００６】
ところで、特許文献１および２に記載されているエレクトロポレーションは、何れの方法も受精卵をマウス個体から採取しｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で操作するため、受精卵を偽妊娠マウスへ移植する操作が必要になる。偽妊娠マウスを準備するためには、そのためのメスマウス、および精管結紮オスマウスの維持も必要となる。また、採卵に使用する妊娠メスマウスは、採卵の際に屠殺されるという問題がある。
【０００７】
上記問題を解決するため、受精卵をマウスの体外に取り出さず、受精卵が存在する卵管に目的分子が含まれる溶液を注入後、卵管を直接エレクトロポレーションすることで、卵管内にある受精卵に分子を導入する方法も知られている。当該方法は、ＧＯＮＡＤ（Ｇｅｎｏｍｅ−ｅｄｉｔｉｎｇ  ｖｉａ  Ｏｖｉｄｕｃｔａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）法と命名されている。ＧＯＮＡＤ法を用いることで、マウスを屠殺することなく、物質を受精卵に導入することができる（非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０４９８９７号
【特許文献２】国際公開第２０１６／１３３１６５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｇｏｕ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，“ＧＯＮＡＤ：  Ｇｅｎｏｍｅ−ｅｄｉｔｉｎｇ  ｖｉａ  Ｏｖｉｄｕｃｔａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  ｍｉｃｅ”，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ，  ２０１５；  ５：  １１４０６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ところで、エレクトロポレーションにより受精卵に物質を導入する操作をした後、実際に物質が導入されたか否かは、生まれた哺乳動物の子供毎（又は胎児毎）に調べる必要がある。ところで、物質が導入されたか否かが、例えば、色素の有無、手や足の有無、毛の有無等、子供（又は胎児）の表現型から明らかに判別できる場合がある。その場合は、物質の導入効率と子供の出生率を考慮し、物質が導入された子供が最も得られる条件でエレクトロポレーションを実施すればよい。
【００１１】
しかしながら、物質が導入されたか否かが、表現型から明らかに判別できない場合もある。その場合、物質を導入した目的に応じて、生まれた子供（又は胎児）の遺伝子またはタンパク質の発現を調べる、または、薬剤等を投与して薬剤の効果の有無を調べる等、物質の導入の有無の確認作業が必要となる。確認作業を不要とするためには、出生率は低くなっても、１００％の確率で物質が導入された子供を得た方が効率的な場合もある。したがって、物質を導入する目的に応じて、物質の導入効率を調整できることが好ましい。しかしながら、非特許文献１に記載のＧＯＮＡＤ法では、物質の導入効率を１００％とすることはできないという問題がある。
【００１２】
本開示は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、（１）従来は、エレクトロポレーション電極間に印加する電圧値が一定となる装置を用いていたが、（２）エレクトロポレーション電極の間に、予め設定した値の電流を流すことで、受精卵への物質の導入効率が０％〜１００％となる条件を設定できること、を新たに見出した。
【００１３】
すなわち、本開示の目的は、哺乳動物の受精卵に物質を導入する方法であって、受精卵への物質の導入効率が０％〜１００％となる条件を設定できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本開示は、以下に示す、哺乳動物の受精卵に物質を導入する方法に関する。
【００１５】
（１）哺乳動物の受精卵に物質を導入する方法であって、該方法は
受精卵を内部に含む卵管を哺乳動物から露出させる卵管露出工程、
前記受精卵に導入する物質を前記卵管に注入する物質注入工程、
前記卵管を挟むようにエレクトロポレーション電極を配置する電極配置工程、
前記エレクトロポレーション電極の間に、予め設定した値の電流を流す電流印加工程、
を含む、方法。
（２）前記電流印加工程で印加される電流の値が、１００ｍＡ〜４００ｍＡの範囲から設定される、
上記（１）に記載の方法。
（３）前記電流の値が、２００ｍＡ〜４００ｍＡの範囲から設定される、
上記（２）に記載の方法。
（４）前記哺乳動物がマウスである、
上記（１）〜（３）の何れか一つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本明細書で開示する哺乳動物の受精卵に物質を導入する方法により、受精卵への物質の導入効率を０％〜１００％まで設定することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に、哺乳動物の受精卵に物質を導入する方法（以下、「導入方法」と記載することがある。）について詳しく説明する。
【００１８】
導入方法の実施形態は、
（１）受精卵を内部に含む卵管を哺乳動物から露出させる卵管露出工程、
（２）受精卵に導入する物質を卵管に注入する物質注入工程、
（３）卵管を挟むようにエレクトロポレーション電極を配置する電極配置工程、
（４）エレクトロポレーション電極の間に電流を流す電流印加工程、
を少なくとも含んでいる。
また、上記（４）電流印加工程の後には、
（５）卵管を体内に戻して縫合する縫合工程、
を含んでいてもよい。
【００１９】
（１）卵管露出工程において、「哺乳動物」は、哺乳綱に分類されるあらゆる生物を含む。哺乳動物は、例えば、霊長目（例えば、サル、ヒトなど）、齧歯目（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなど）、鯨偶蹄目（例えば、ブタ、イノシシ、ウシ、ヒツジ、ヤギ）、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギなどを含む。ある実施態様では、哺乳動物は非ヒト哺乳動物である。ある実施態様では、哺乳動物は齧歯目、特にマウスである。ある実施態様では、哺乳動物は鯨偶蹄目、特にブタである。
【００２０】
また、「受精卵」は、受精後の卵または胚を意味し、受精卵（１細胞期）および２細胞期から胚盤胞期までの発生初期胚を含む。ある実施態様では、受精卵は、１細胞期ないし桑実胚期、好ましくは１細胞期ないし８細胞期、より好ましくは１細胞期ないし４細胞期、より好ましくは１細胞期ないし２細胞期、例えば１細胞期のものである。ある実施態様では、受精の約６時間後以降、好ましくは約９時間後以降、より好ましくは約１２時間後以降にエレクトロポレーションを実施する。ある実施態様では、受精の約６時間〜約２０時間後、好ましくは約９時間〜約１６時間後、より好ましくは約１１時間〜１４時間後、例えば約１２時間〜１３時間後にエレクトロポレーションを実施する。
【００２１】
卵管の露出は、哺乳動物を麻酔後にメスで切開し、卵管を体外から露出すればよい。
【００２２】
（２）物質注入工程において、受精卵に導入する物質としては、受精卵を改変できるものであれば特に制限はなく、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、タンパク質、複合体、有機化合物等が挙げられる。ＤＮＡの種類としては、所期の遺伝子を含むプラスミド、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、１本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）等が挙げられる。また、ＲＮＡの種類としては、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）等が挙げられる。受精卵に物質を導入する目的としては、例えば、ゲノム編集による遺伝子改変動物の作製が挙げられる。そのため、タンパク質として、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系等のゲノム編集用の人工制限酵素等が挙げられ、前記ＤＮＡやＲＮＡとしては、前記人工制限酵素のｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ、または、これらのＲＮＡを発現するプラスミドが挙げられる。また、複合体としては、リボ核酸とタンパク質の複合体であるリボ核ンパク質（ＲＮＰ）が挙げられ、具体的には、ｓｇＲＮＡと人工制限酵素の組み合わせが挙げられる。上記物質は、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、公知の培養液等に溶解し、注射針により卵管内に注入すればよい。
【００２３】
（３）電極配置工程では、卵管を挟むようにエレクトロポレーション電極を配置すればよい。エレクトロポレーション電極としては、公知の電極を用いることができ、例えば、白金、金、アルミニウムなどの金属からなる電極が挙げられる。電極は、例えば、ＢｉｏＲａｄ社、ＢＴＸ社、ＢＥＸ社、Ｉｎｔｒａｃｅｌ社、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社などから購入できる。なお、エレクトロポレーション電極は、卵管に直接接触するように配置してもよいし、導電性の液体を含浸した布、紙等を卵管の外側に配置し、布、紙等を介して電極の間に電流が流れるようにしてもよい。
【００２４】
（４）電流印加工程では、電源装置からパルス状の電気を電極に流すことで、エレクトロポレーション電極の間に、予め設定した値の電流を流せばよい。ところで、従来のエレクトロポレーションでは、所定の値の電圧を所定回数印加していた。電圧を印加した際に流れる電流の関係は、オームの法則にしたがい、具体的には以下の式で表される。
電流（Ｉ）＝電圧（Ｖ）÷抵抗（Ｒ）
【００２５】
非特許文献１に記載されているＧＯＮＡＤ法では、所定の電圧を印加していることから、抵抗となる卵管の状況が同じであれば、卵管に流れる電流値は同じになるはずである。しかしながら、本発明者らは、後述する実施例で示すとおり、印加する電流が同じであっても測定した電圧の値が異なること、つまり、卵管の抵抗は、マウスの個体間あるいはエレクトロポレーション電極を配置する場所により大幅に異なることを新たに見出した。そのため、従来の所定の電圧値を印加する電源装置では、印加する電圧が一定であるにも拘らず、対象となる哺乳動物の卵管に流れる電流値は異なっていたことになる。
【００２６】
一方、実施形態に係る導入方法では、エレクトロポレーション電極の間に流す電流の値を予め設定すると、電流を印加する時の卵管の抵抗値に応じて必要な電圧を印加できる装置を用いている。そのため、哺乳動物の個体差、あるいは、同じ哺乳動物の卵管内の状況が変化しても、同じ強さの電流を卵管に印加することができる。後述する実施例及び比較例に示すとおり、卵管に予め設定した値の電流を流すことで、物質の導入効率を１００％にすることができる。エレクトロポレーションにおいて、予め設定した値の電流を流すことは今まで実施されておらず、実施形態に示す導入方法は新規の方法である。そして、実施形態に示す導入方法は、哺乳動物の個体差や実施者の手順によらず、設定したとおりの電流値がエレクトロポレーション電極の間に流れることから、物質の導入効率の再現性を高くすることができる。なお、本明細書において、「予め設定した値の電流を流す」とは、文字通り、予め設定した値の電流を流すことが好ましいが、予め設定した値から多少の誤差を含んでいてもよい。誤差は小さいほうが好ましく、例えば、５％以下、３％以下、２％以下、１％以下にすればよい。
【００２７】
ところで、従来のエレクトロポレーションによる受精卵への物質の導入は、通常、複数回の電圧を印加する。その際、電源装置の種類により、同じ値の電圧を複数回印加する場合、あるいは、印加する電圧の値を徐々に変化させる場合もある。実施形態に示す導入方法においても、予め設定した値の電流を複数回印加する場合、同じ値の電流を印加してもよいし、徐々に印加する電流の値を小さくしてもよい（徐々に電流の値を小さくすることを「減衰率」と記載することがある）。減衰率は、物質の導入効率や出生率等を考慮して適宜設定すればよく、例えば、３％以内、５％以内、１０％以内、１５％以内、２０％以内等、適宜設定すればよい。
【００２８】
電流印加工程で印加される電流の値は、物質を受精卵に導入できれば特に制限はなく、哺乳動物の卵管の厚さ、導入効率、受精卵への負荷等を考慮しながら適宜設定すればよい。電流値が小さすぎると、胎児の生存率は高くなるが物質の導入効率が低くなる。一方、電流の値が高すぎると受精卵への負荷が大きくなり、出生率が低下する。電流値としては、例えば、１００ｍＡ以上、１５０ｍＡ以上、２００ｍＡ以上、２５０ｍＡ以上が挙げられる。一方、電流値の上限は、１０００ｍＡ以下、７５０ｍＡ以下、５００ｍＡ以下、４００ｍＡ以下、３５０ｍＡ以下、３００ｍＡ以下が挙げられる。導入効率が１００％となる条件でエレクトロポレーションを実施した場合は、生まれた子供に物質が導入されたか否かを確認する作業が不要になるという顕著な効果を奏する。また、生まれた子供の表現型により、物質が導入されたか否かを容易に判別できる場合は、受精卵に負荷がかかりすぎないエレクトロポレーション条件にすることで、出生率を高くすることができる。
【００２９】
電流印加工程で印加される一回当たりの電流の印加時間（パルスの印加時間）は、１ｍｓｅｃ〜５０ｍｓｅｃが好ましく、２ｍｓｅｃ〜２０ｍｓｅｃがより好ましく、５ｍｓｅｃ〜１０ｍｓｅｃが更に好ましい。
【００３０】
電流印加工程で印加されるパルスとパルスの間隔は、５ｍｓｅｃ〜９００ｍｓｅｃが好ましく、１０ｍｓｅｃ〜５００ｍｓｅｃがより好ましく、５０ｍｓｅｃ〜１００ｍｓｅｃが更に好ましい。
【００３１】
電流印加工程で印加されるパルスの回数は、１〜２０回が好ましく、２〜１０回がより好ましく、３〜６回が更に好ましい。印加するパルスの回数が多いほど、哺乳動物や受精卵にダメージを与える。後述する実施例及び比較例に示すとおり、実施形態に係る導入方法では、電圧を一定にする物質の導入方法と比較して、少ないパルス回数で高率で物質を導入することができる。
【００３２】
実施形態の導入方法に用いる電源装置は、卵管の抵抗に応じて電圧を調整することで、所定値の電流を流すことができ、並びに、上記のパルス印加時間、パルス印加間隔、及びパルス回数を印加できれば特に制限はなく、自作してもよいし市販の電源装置を用いてもよい。市販の電源装置としては、例えば、ＢＥＸ社製のＣＵＹ２１ＥＤＩＴ  ＩＩが挙げられる。ＢＥＸ社製のＣＵＹ２１ＥＤＩＴ  ＩＩを用いると、予め設定した値の電流を流し、瞬時に最適な電圧を印加できるようにして、矩形状の電流を印加できる。
【００３３】
以下に実施例を掲げ、実施形態を具体的に説明するが、この実施例は単にその具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は、発明の範囲を限定したり、あるいは制限するものではない。
【実施例】
【００３４】
＜実施例１＞
以下の手順で、エレクトロポレーションによる物質の導入を行った。
（１）系統がＭＣＨ（ＩＣＲ）の雌マウス及び雄マウスを交配し、妊娠期間０．７日経った雌マウスを準備した（受精卵の一細胞期後期に相当）。雌雄のマウスは、日本クレア株式会社から入手した。
（２）三種混合麻酔で、雌マウスを麻酔した。
（３）実体顕微鏡（オリンパス社製ＳＺ１１）下に設置した３７度に温めた温熱プレート上に、麻酔したマウスをうつ伏せになるように置いた。
（４）雌マウスの背中にメスを入れ、その切開部の付近にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に浸したキムワイプの切片を置いた。
（５）背中の切開部より卵巣、卵管、子宮の一部を取り出し、卵管を切開部近くに設置したキムワイプの上に静置した。
（６）マウスピースに装着したガラスキャピラリーにあらかじめ３７℃で１０分間温めたエレクトロポレーション溶液を充填した。なお、エレクトロポレーション溶液は、「Ｍａｓａｔｏ  Ｏｈｔｓｕｋａ１  ｅｔ．  ａｌ．，  “Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ”，  ｂｉｏＲｘｉｖ，  Ａｕｇ．４，２０１７，ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１７２７１８」、第２１頁、“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”に記載の手順で作製した。
（７）ガラスキャピラリーにて、約１．０〜１．５μＬのエレクトロポレーション溶液を卵管膨大部の上方より卵管内に注入した。
（８）エクレトロポレーション溶液注入後、すぐに、溶液を注入した卵管部分をＰＢＳで浸したキムワイプで覆った。
（９）キムワイプで覆った卵管をピンセット型白金電極（ＢＥＸ社製ＬＦ６５０Ｐ３）で挟んだ。
（１０）卵管をピンセット型電極で挟み込んだまま、電源装置としてＢＥＸ社製ＣＵＹ２１ＥＤＩＴ  ＩＩを用い、表１に示す条件で、予め設定した値の電流が流れるようにエレクトロポレーションを実施した。
（１１）キムワイプの覆いを卵管からはがし、卵管を体内に戻し切開部を縫合した後、マウスを飼育した。
（１２）妊娠１３．５日後、妊娠マウスから胎児を回収し、Ａｌｌ−Ｉｎ−Ｏｎｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｔａｉｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（クラボウ社製ＡＢＰ−ＰＰ−ＭＴ０１５００）を用いて胎児からゲノムＤＮＡを抽出した。
（１３）ｇＲＮＡの標的配列を含むＴｙｒローカスをＰＣＲにて増幅させた。
（１４）上記（１３）で得られたＰＣＲ産物をダイレクトシークエンスし、Ｔｙｒローカスの配列を確認することで、胎児のゲノム編集の有無を確認した。表２にゲノム編集された胎児の数、及び導入効率について示す。なお、（１３）及び（１４）は、上記（６）に記載の文献の第２３頁“Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ”に記載の手順により行った。
【００３５】
【表１】
2019097499.tif 000002
【００３６】
【表２】
2019097499.tif 000003
【００３７】
＜比較例１＞
電圧が一定となる電源装置（ＢＴＸ  Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ社製、Ｔ８２０）を用い、表３に示す条件で、印加する電圧値が一定となるようにエレクトロポレーションを実施した以外は、実施例１と同様の手順で実験を行った。なお、表３に示す条件は、ＢＴＸ  Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ社製、Ｔ８２０を用いてエレクトロポレーションを実施する際に、最も好ましいとされる条件である。表４にゲノム編集された胎児の数、及び導入効率について示す。
【００３８】
【表３】
2019097499.tif 000004
【００３９】
【表４】
2019097499.tif 000005
【００４０】
＜比較例２＞
電圧が一定となる電源装置（Ｎｅｐａｇｅｎｅ社製、ＮＥＰＡ２１）を用い、表５に示す条件で、印加する電圧値が一定となるようにエレクトロポレーションを実施した以外は、実施例１と同様の手順で実験を行った。なお、表５に示す条件は、Ｎｅｐａｇｅｎｅ社製、ＮＥＰＡ２１を用いてエレクトロポレーションを実施する際に、最も好ましいとされる条件である。表６にゲノム編集された胎児の数、及び導入効率について示す。
【００４１】
【表５】
2019097499.tif 000006
【００４２】
【表６】
2019097499.tif 000007
【００４３】
先ず、表４及び６から明らかなように、従来の電圧値を一定にする電源装置を用いてエレクトロポレーションを実施した比較例１及び２では、最も好適な条件でも物質の導入効率１００％は達成できなかった。一方、表２に示すように、予め設定した値の電流を流す電源装置を用いてエレクトロポレーションを実施した実施例１では、電流値を２００ｍＡ〜４００ｍＡに設定した場合、導入効率を１００％とすることができた。そして、実施例１では、電流値を１００ｍＡとした場合、導入効率が８１％となったが、雌マウス１匹から得られたゲノム編集がされたマウスの胎児数は、２００ｍＡ〜４００ｍＡより多かった。これは、電流値を高くしたことで胎児に悪影響を与えたためと考えられる。
【００４４】
また、ゲノム編集されたマウス胎児は、比較例１では雌マウス１匹あたり５．８匹（導入効率９１％）、比較例２では雌マウス１匹あたり４．５匹（導入効率８４％）得られた。一方、実施例１では、１００ｍＡを印加した時には雌マウス１匹あたり６．５匹（導入効率８１％）、２００ｍＡを印加した時には雌マウス１匹あたり５．０匹（導入効率１００％）得られた。雌マウスの排卵数は個体により変動するので誤差はあるものの、実施例１と比較例２の結果を対比すると、雌マウス一匹から得られた胎児数と胎児への物質の導入効率は、実施例１の方が優れていることは明らかである。また、実施例１と比較例１とは、導入効率が近い数値がないため一概に比較はできないが、仮に、実施例１の１００ｍＡと２００ｍＡの中間値をとると、雌マウス１匹あたり５．７５匹（導入効率９０．５％）となり、比較例１とほぼ同様の結果となる。
【００４５】
以上の結果より、実施例１に示す方法では、印加する電流値の大きさを予め設定することで、物質の導入効率が低くても多くの胎児を得る条件、又は、得られる胎児数は少なくなるが物質の導入効率が１００％となる条件、を選択できる。また、印加する電圧値が一定となる条件と比較した場合、使用する電源装置により異なるものの、実施例１に示す方法は、従来と同等以上の胎児の出生数と導入効率が得られる。
【００４６】
＜実施例２＞
次に、実施例１に記載の方法で、予め設定した値の電流を流した際の電圧を測定することで、卵管の抵抗を調べた。実験には５匹のマウスを用い、予め設定した電流値を１５０ｍＡ、パルスの印加回数を極性（＋）のパルスを３回印加とした以外は、実施例１と同様の手順で実験を行った。なお、実施例１では減衰率を１０％に設定していることから、第１パルスの電流値は１５０ｍＡ、第２パルスの電流値は１３５ｍＡ、第３パルスの電流値は１２２ｍＡとなる。また、パルス印加時の電圧及び電流は、ＣＵＹ２１ＥＤＩＴ  ＩＩに搭載されている測定機能により測定した。電流値と測定した電圧値を表７に示す。
【００４７】
【表７】
2019097499.tif 000008
【００４８】
表７に示すように、Ｎｏ．１〜５のマススに同じ値の電流を印加しても、マウスが異なると、例えば、Ｎｏ．２とＮｏ．３に示すように、測定した電圧値の差は約２倍もあった。つまり、エレクトロポレーション電極の間の抵抗の差は、約２倍であることを意味している。その理由としては、エレクトロポレーション電極の挟み方（角度や強さ）、エレクトロポレーション電極で挟んだ部位の組織の違い等が考えられる。そして、印加する電圧値を設定する従来のエレクトロポレーションでは、導入効率が１００％にならなかったが、予め設定した値の電流を印加する本実施形態に係る導入方法では、導入効率が１００％となった。この結果より、エレクトロポレーションによる物質の導入効率には、受精卵に印加される電圧より、電流の影響が大きいことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本明細書で開示する哺乳動物の受精卵に物質を導入する方法により、受精卵への物質の導入効率を１００％まで設定することができる。したがって、遺伝子改変動物を用いる製薬企業や研究開発期間にとって有用である。