(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、MITOL減少抑制又はMITOL産生促進剤を提供することである。【解決方法】表皮角化細胞を用いた試験により、塩化ベルベリン及びその誘導体である塩化ベルベルビンがMITOL遺伝子発現促進作用を有することを見出した。更にマウスを用いた試験により、塩酸ベルベリンが複数臓器においてMITOLタンパク発現促進作用を有することを見出した。すなわち、ベルベリン、その誘導体、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする、MITOL減少抑制又は産生促進剤である。本発明は、化粧品、医薬部外品、医薬品、飲食品又は試薬等として提供可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベルベリン、その誘導体、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする、MITOL減少抑制又は産生促進剤。
【請求項２】
請求項１に記載のMITOL減少抑制又は産生促進剤を含む、医薬品、医薬部外品、化粧品又は飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、MITOL減少抑制又はMITOL産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは細胞内に存在する細胞内小器官の一つであり、主な機能としてエネルギーであるATPを産生することが挙げられる。従って、ミトコンドリア機能を維持することは、細胞ひいては体の機能を維持することに繋がる。ミトコンドリアの機能は、ミトコンドリアダイナミクスとも呼ばれるミトコンドリアの融合および分裂や、他の細胞内小器官との相互作用などにより制御されていることがわかってきている。ミトコンドリア外膜に局在するユビキチンリガーゼであるMITOLは、ミトコンドリアダイナミクスやミトコンドリアと小胞体との接着制御に関与していることが報告されている（非特許文献１）。心臓特異的にMITOLを欠損させたマウスは、心機能の低下が認められ、さらに、心臓老化を示す所見であるリポフスチンの沈着とSA-β-galの発現亢進が観察されている（非特許文献２）。また、皮膚表皮特異的にMITOLを欠損させたマウスは、白髪・脱毛といった皮膚老化様所見が（非特許文献３）、神経特異的にMITOLを欠損させたアルツハイマー病モデルマウスではアルツハイマー病の病態悪化が観察されている（非特許文献２）。これらのことから、MITOL低下が心臓老化、皮膚老化、脳の老化など広く老化症状の促進に関与していると考えられる。また、MITOLをノックダウンしたHELA細胞では老化マーカーであるSA-β-galの発現上昇がみられ、MITOLノックインによりレスキューされることが報告されている（非特許文献４）。このことから、MITOL低下により老化が促進され、低下したMITOLを元に戻すことで老化が回復することが示唆される。以上のことから、MITOL発現を上昇させるまたは活性化させるようなアプローチは抗老化に有用であると考えられる。しかしながら、MITOL発現を上昇させる化合物は見出されていない。
【０００３】
ベルベリンは抗菌（非特許文献５）、抗炎症（非特許文献６）などの様々な生物活性を有するアルカロイドの一種であり、その誘導体においても生物活性が維持されていることが報告されている（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】長島駿  ほか（2014）生化学., 86(1):63-67
【非特許文献２】長島駿  ほか（2017）日本薬理学雑誌., 149(6):254-259
【非特許文献３】柳茂（2016）コスメトロジー研究報告., 24:149-152
【非特許文献４】Park et al. J Cell Sci. 2010;123:619-26.
【非特許文献５】Sarma et al. Folia Microbiol.1999;44:164-166
【非特許文献６】Kuo et al. Cancer let.2004;203:127-137
【非特許文献７】Silvia et al. J Nat Prod.2014;77:766-772
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、MITOL減少抑制又はMITOL産生促進剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで発明者らは鋭意検討した結果、表皮角化細胞を用いた試験により、塩化ベルベリン及びその誘導体である塩化ベルベルビンがMITOL遺伝子発現促進作用を有することを見出した。更にマウスを用いた試験により、塩酸ベルベリンが複数臓器においてMITOLタンパク発現促進作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、
（１）ベルベリン、その誘導体、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする、MITOL減少抑制又は産生促進剤、
（２）請求項1に記載のMITOL減少抑制又は産生促進剤を含むことを特徴とする医薬品、医薬部外品、化粧品又は飲食品
である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のベルベリン、その誘導体、及びそれらの塩は、MITOL減少を抑制又はMITOL産生を促進することより例えば心機能低下などの心臓老化症状、白髪や脱毛といった皮膚老化症状、アルツハイマー病などの脳の老化症状の予防又は改善効果が期待できる。また、素材スクリーニング等に際してポジティブコントロールとして用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、試験例における、ベルベリン及びベルベルビンが表皮角化細胞においてMITOL遺伝子発現促進作用を有することを示したグラフである。
【図２】図２は、試験例における、ベルベリンがマウスにおいて複数臓器のMITOLタンパク発現促進作用を有することを示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明におけるベルベリンとは、2,3-メチレンジオキシ-9,10-ジメトキシ-5,6-ジヒドロジベンゾ[a,g]キノリジニウムで表される化合物である。
本発明における誘導体とは、もとの化合物の分子内の小部分を変化させて得られる化合物のことである。特に限定されるものではないが例えば、ベルベリンのメトキシ基の一つがヒドロキシ基に変化したベルベルビンが挙げられる。
本発明における塩とは、例えば塩化物、塩酸、硫酸やタンニン酸との塩が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００１１】
本発明におけるMITOL産生促進とは、MITOL  mRNA又はMITOLタンパク質の発現促進作用のことである。MITOL減少抑制とはMITOL  mRNA又はMITOLタンパク質の減少抑制作用のことである。MITOL産生促進又は減少抑制作用は、細胞や臓器におけるMITOL発現量を評価することで確認できるが、その方法は特に限定されるものではない。
【００１２】
本発明に用いるベルベリン、その誘導体、及びそれらの塩の市販品としては塩化ベルベリン（Sigma-Aldrich製）、塩化ベルベルビン（長良サイエンス株式会社製）、ベルベリン塩酸塩（ナカライテスク製）等が挙げられる。
【００１３】
投与形態としては、特に限定されるものではないが、外用や内服が挙げられる。本発明を外用で適用する場合の剤形としては、例えば、ローション剤、液剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、スプレー剤、シャンプー、コンディショナー、石鹸等が挙げられ、内服で適用する場合の剤形としては、錠剤、粉末剤、散剤、顆粒剤、液剤、カプセル剤、ドライシロップ剤、ゼリー剤、液状食品、半固形食品、固形食品等が挙げられる。
【００１４】
これらは、公知の方法で製造することができる。製造に際しては、本発明の効果を損なわない範囲で、化粧品、医薬部外品、医薬品、飲食品又は試薬に含有可能な種々の添加物を配合することができる。
【００１５】
本発明のMITOL減少抑制又は産生促進剤は、特に限定されるものではないが例えば心機能低下などの心臓老化症状、白髪や脱毛といった皮膚老化症状、アルツハイマー病などの脳の老化症状を予防又は改善するため、あるいは、MITOL産生を促進するための試薬として用いることも可能であり、好適には素材スクリーニング等を行なうに際し陽性対照薬として利用可能である。また、本発明のMITOL減少抑制又はMITOL産生促進剤は、これを含む製品（医薬品、医薬部外品、化粧品、飲食品、又は試薬）又はその説明書に、MITOL減少抑制又はMITOL産生促進剤を促進するために用いられる旨の表示を付することができる。ここで、「製品またはその説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、申請資料、その他の印刷物又は広告などに表示を付したことを意味する。また、これら表示においては、MITOL減少抑制又はMITOL産生促進に起因する疾患や症状の予防又は治療のために用いられることに関する情報を含むことができる。
【００１６】
本発明のベルベリン、その誘導体、及びそれらの塩の配合量は、化粧品、医薬部外品、医薬品、飲食品又は試薬で提供する場合、それぞれ組成物全体に対して０．０００００１〜１０質量％、好ましくは０．０００１〜５質量％、より好ましくは０．００１〜１質量％である。
【実施例】
【００１７】
以下に実施例および試験例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されない。
【００１８】
（試験例１）塩化ベルベリン及び塩化ベルベルビンのMITOL遺伝子発現促進作用の評価
表皮角化細胞（倉敷紡績製）を培地Humedia-KG2（倉敷紡績，添付サプリメントを添加）にて、2500cells/cm2になるように24穴プレートに播種し、37℃、CO2 5%にセットしたインキュベーター内で72時間培養した。培地を吸引除去し、被験物質を含有する培地に交換し，更に24時間培養した．培養終了後、培地を除去し、ライセートバッファーを添加して細胞を溶解し、細胞溶解液を回収した。細胞溶解液より、RNeasy Mini Kit（キアゲン）を用いて添付のプロトコールに従いRNAを回収し、これを鋳型として、Prime Script RT Master mix（タカラバイオ）を用いた逆転写反応によりcDNAを合成した。合成したcDNAから、リアルタイムPCRシステム（Step One Plus、サーモフィッシャーサイエンティフィック）により、GAPDH、MITOLそれぞれのmRNAの発現量を測定し（SYBR Green法）、MITOLの発現量をGAPDH発現量により補正した。プライマーは、次の型番のものを用いた。GAPDH：HA067812、MITOL：HA192576（いずれもタカラバイオ）。測定したmRNA発現量をコントロール群（被験物質を含有していない培地）と比較し、被験物質によるMITOL遺伝子発現促進作用を評価した。
【００１９】
＜試験結果＞
結果を図１に示す。塩化ベルベリン及び塩化ベルベルビンによりMITOLのmRNA発現量が上昇することが確認された。よって、塩化ベルベリン、塩化ベルベルビンは白髪や脱毛といった皮膚老化症状に対して効果があることが示唆された。
【００２０】
（試験例２）ベルベリン塩酸塩によるMITOLタンパク発現促進作用の評価
（１）動物及びその飼育
C57BL/6J（SLC、♂、8週齢）を購入し、食餌 は標準固形飼料CE-2（オリエンタル酵母工業）を自由摂食させ、純水を自由摂水させた。紫外線照射実験においては、Hos:HR-1（SLC、♂、8週齢）を用いた。TP-102（東洋理工株式会社）マウスケージにて飼育し、床敷にはクリーンチップCL-4161（SLC）を使用した。飼育環境は、室温を25±2°Cとし、明期を7〜19時とした。
（２）ベルベリン投与条件
ベルベリン塩酸塩（ナカライテスク）を、純水を用いて0.2%（w/v）に可溶し、９日間または８週間自由摂水させた。
（３）表皮ウェスタンブロッティング
マウス耳を採取し、Dispase II（Thermo Fisher Scientific）により表皮を分取した後、SDS Sample Bufferを加え超音波処理（BRANSON  SONIFIR 150）を行った。95℃ 5minのヒートショックを行い、12000rpm、4°Cで10分間遠心した上清をタンパク質溶液として得た。
（４）心臓・脳・骨格筋のウェスタンブロッティング
マウスをイソフルラン吸引麻酔科で開胸し、臓器を摘出した。臓器の重さを電子天秤により測定し、1mg/30uLになるようにSDS Sample Bufferを加え超音波処理（BRANSON  SONIFIR 150）を行った。95℃ 5minのヒートショックを行い、12000rpm、4°Cで10分間遠心した上清をタンパク質溶液として得た。
SDS-PAGEは、Immobilon-P Transfer Membrane（Merck Millipore）に転写し、以下の手順でブロッキング、抗体反応を行い、Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate（Millipore）用いて感光、LuminoGraph（ATTO）を用いてバンドを検出した。
5% スキムミルク（雪印メグミルク）/TBS-T、1時間（室温）
↓ TBS-Tにて洗浄
一次抗体/Can Get Signal TM solution1 （TOYOBO）、１時間（室温）
↓ TBS-Tにて洗浄
二次抗体/Can Get Signal TM solution2 （TOYOBO）、３０分（室温）
↓ TBS-Tにて洗浄
検出
（材料）
TBS-T：0.1% Tween20/Tris Buffered Saline（TBS）
SDS Sample Buffer：溶媒を超純水として、トリス0.0625M、２−メルカプトエタノール5%（v/v）、SDS 2%（w/v）、スクロース30%（w/v）、BPB 0.005%（w/v）
一次抗体: anti-MITOL3-2抗体（EMBO J. 2006 Aug 9;25(15):3618-26. Epub 2006 Jul 27. （PMID:16874301）に記載の方法に従って作成）、1000倍希釈
anti-alpha-Tubulin（DM1A）（Sigma T-9026）、5000倍希釈
二次抗体: anti-rabbit IgG, HRP linked（Jackson 111-035-003）、2000倍希釈
anti-mouse IgG, HRP linked（Jackson 115-035-003）、2000倍希釈
（５）実験動物麻酔方法  
実験動物麻酔装置SN-487-0T（SHINANO）を用いてイソフルランによる吸引麻酔を、導入麻酔を0.5%、維持麻酔を0.2%で行った。
（６）紫外線照射方法
UV Bench Lamp、15W、xx-15M、302nm、115V（UVP）を使用し、UVX Radiometer（Digital）を使用し線量を確認した。単匹飼育を行い、UVBをUVB（1週目：70mJ、2週目：80mJ、3週目：90mJ、４週目以降：100mJ）、3回/週の照射を行った。８週の照射が完了後に表皮のサンプルを回収した。
【００２１】
＜試験結果＞
図２にウェスタンブロット及びバンドを定量化した結果を示す。ベルベリン塩酸塩によりMITOLのタンパク発現量が上昇することが確認された。よって、ベルベリン塩酸塩は心臓、皮膚、脳などの老化症状に対して効果があることが示唆された。図１及び図２の結果より、ベルベリン、その誘導体、及びそれらの塩がMITOL発現促進作用を有することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明のMITOL減少抑制又は産生促進剤は、例えば心機能低下などの心臓老化症状、白髪や脱毛といった皮膚老化症状、アルツハイマー病などの脳の老化症状 老化症状を予防又は改善するための化粧品、医薬部外品、医薬品又は飲食品の分野に利用可能である。また、MITOL産生を促進する成分のスクリーニングに際し、ポジティブコントロールとして用いることができる。
【図１】
2019178070.tif 000003
【図２】
2019178070.tif 000004