(57)【要約】【課題】充分な厚み、形状及び力学的強度を有する軟骨組織を製造することができる軟骨組織の製造方法、及び、該軟骨組織の製造方法により製造された軟骨組織を提供する。【解決手段】生体吸収性材料からなる多孔質基材上に、コラゲナーゼ処理が施された、一辺の長さが５０〜１０００μｍのブロック状の軟骨組織片を播種する軟骨組織片播種工程を有する軟骨組織の製造方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体吸収性材料からなる多孔質基材上に、コラゲナーゼ処理が施された、一辺の長さが５０〜１０００μｍのブロック状の軟骨組織片を播種する軟骨組織片播種工程を有することを特徴とする軟骨組織の製造方法。
【請求項２】
軟骨組織片は、一辺の長さが１００〜８００μｍのブロック状であることを特徴とする請求項１記載の軟骨組織の製造方法。
【請求項３】
多孔質基材は、平均孔径が２０〜５０μｍである不織布であることを特徴とする請求項１又は２記載の軟骨組織の製造方法。
【請求項４】
多孔質基材を構成する生体吸収材料がポリグリコリドであることを特徴とする請求項１、２又は３記載の軟骨組織の製造方法。
【請求項５】
多孔質基材は、生体吸収性材料からなる型枠に固定され複合一体化されていることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の軟骨組織の製造方法。
【請求項６】
型枠を構成する生体吸収材料がポリカプロラクトンであることを特徴とする請求項５記載の軟骨組織の製造方法。
【請求項７】
生体吸収性材料からなる多孔質基材上に、コラゲナーゼ処理が施された、一辺が５０〜１０００μｍのブロック状の軟骨組織片が播種されたものであることを特徴とする軟骨組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、充分な厚み、形状及び力学的強度を有する軟骨組織を製造することができる軟骨組織の製造方法、及び、該軟骨組織の製造方法により製造された軟骨組織に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の細胞工学技術の進展によって、ヒト細胞を含む数々の動物細胞の培養が可能となり、また、それらの細胞を用いてヒトの組織や器官を再構築しようとする、いわゆる再生医療の研究が急速に進んでいる。再生医療においては、細胞が増殖分化して三次元的な生体組織様の構造物を構築できるかがポイントであり、細胞、成長因子を用いる方法、組織又は器官の再生の足場になる支持体を患者に移植する方法等がある。このような支持体としては、例えば、特許文献１に、コラーゲン単糸からなる移植用基材が開示されている。
また、特許文献２及び特許文献３には、生体吸収性素材の発泡体と、同様素材により補強した心血管系組織培養基材、並びにチューブ状の神経再生基材が開示されている。
更に、特許文献４には、スポンジ状または、不織布状の高分子材料成形物からなる骨格の内部に細胞を分散したゲルを有する医用材料が開示されている。
【０００３】
再生医療の対象の一つとして、軟骨組織の再生が挙げられている。軟骨組織は、大型で厚みのある組織であることに加え、耳介軟骨等においては複雑な形状を有する。また、軟骨組織には、比較的高い力学的強度も求められる。しかしながら、従来の支持体を用いた生体組織の製造方法では、このような大型で厚みのある軟骨組織の製造は困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−１９３３２８号公報
【特許文献２】特開２００１−７８７５０号公報
【特許文献３】特開２００３−１９１９６号公報
【特許文献４】特開２００３−２０４８０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記現状に鑑み、充分な厚み、形状及び力学的強度を有する軟骨組織を製造することができる軟骨組織の製造方法、及び、該軟骨組織の製造方法により製造された軟骨組織を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、生体吸収性材料からなる多孔質基材上に、コラゲナーゼ処理が施された、一辺の長さが５０〜１０００μｍのブロック状の軟骨組織片を播種する軟骨組織片播種工程を有する軟骨組織の製造方法である。
以下に本発明を詳述する。
【０００７】
従来の軟骨組織の製造方法では、生体から採取した軟骨組織から軟骨細胞を単離し、該軟骨細胞を支持体に播種していた。本発明者らは、このような従来の軟骨組織の製造方法では、大型で厚みのある軟骨組織の製造が困難である原因について検討した。その結果、軟骨組織から軟骨細胞を単離する際の操作により、軟骨細胞がダメージ（攪拌等による物理的なダメージ、及び、酵素処理等による化学的ダメージ）を蓄積して、増殖する能力が低下してしまっていることにあることを見出した。そして更に鋭意検討の結果、軟骨組織から軟骨細胞を単離して該軟骨細胞を播種するのではなく、採取した軟骨組織をもとに、一定範囲の大きさのブロック状に切り出し、更にコラゲナーゼ処理を施した軟骨組織片とし、これを生体吸収性材料からなる多孔質基材上に播種することにとした。これにより、極めて高い効率で充分な厚み、形状及び力学的強度を有する軟骨組織を製造できる。
【０００８】
本発明の軟骨組織の製造方法は、生体吸収性材料からなる多孔質基材上に、コラゲナーゼ処理が施された、一辺の長さが５０〜１０００μｍのブロック状の軟骨組織片を播種する軟骨組織片播種工程を有する。
原料となる軟骨組織から軟骨細胞を回収して播種した場合、回収時に軟骨細胞にダメージが蓄積し、軟骨組織の再生が困難となることがある。これに対して、一辺の長さが５０〜１０００μｍのブロック状に切り出した軟骨組織片にコラゲナーゼ処理を施し、該軟骨組織片を播種することにより、ダメージの蓄積を最小限に抑え、安定した軟骨組織の再生を行うことができる。
従来の技術常識では、このような小片のブロック状に切り出した軟骨組織片を播種しても、ほとんど軟骨組織を製造することはできないと言われていた。しかしながら、本発明の発明者らは、コラゲナーゼ処理を施した軟骨組織片を用いることにより、安定して軟骨組織を製造できる。
なお、原料となる軟骨組織は、例えば、人や動物等から得た耳介から、皮膚、結合織、軟骨膜を除去する等の従来公知の方法により採取することができる。また、原料となる軟骨組織は、軟骨膜付の軟骨組織であってもよく、軟骨膜を取り除いた軟骨組織であってもよい。
【０００９】
上記軟骨組織片は、一辺の長さが５０〜１０００μｍのブロック状である。軟骨組織片の大きさをこの範囲内とすることにより、確実かつ短期間のうちに軟骨組織を形成させることができる。上記軟骨組織片の一辺の長さの好ましい下限は１００μｍ、好ましい上限は８００μｍであり、より好ましい上限は４００μｍである。
【００１０】
上記軟骨組織をブロック状に切り出す方法としては特に限定されないが、微細加工装置を用いて切断する方法が好適である。メス刃等を用いて手動で軟骨組織片を細切しようとしても、５０〜１０００μｍという極小サイズに切断することは困難であり、得られる軟骨組織片の大きさや形状にもばらつきが生じる。また、切断時の衝撃により軟骨細胞にダメージが蓄積することもある。微細加工装置を用いて切断した軟骨組織片を用いることにより、安定した軟骨組織の再生を行うことができる。
上記微細加工装置としては特に限定されないが、例えば、図５に示したマイクロスライサーを用いることができる。マイクロスライサーを用いれば、ｘ軸、ｙ軸及びｚ軸方向に自在に軟骨組織を細切することができ、最小限のダメージで、容易に一辺の長さが５０〜１０００μｍのブロック状に軟骨組織片を切り出すことができる。
【００１１】
上記軟骨組織片には、コラゲナーゼ処理が施される。このようなコラゲナーゼ処理が施された軟骨組織片を用いることにより、軟骨組織片から軟骨細胞が這い出しやすくなり、確実かつ短期間のうちに軟骨組織を形成させることができる。一方、コラゲナーゼ処理は、軟骨細胞にダメージを与える原因ともなる。従って、軟骨細胞にダメージを与えることなく、軟骨組織片から軟骨細胞が這い出しやすくなる範囲でコラゲナーゼ処理を施す。具体的には、軟骨組織片の大きさ（一辺の長さ）にあわせて、最適なコラゲナーゼ処理条件を検討する。
【００１２】
上記コラゲナーゼ処理の方法は特に限定されないが、例えば、一辺が５０〜１０００μｍのブロック状に切り出した軟骨組織片を、コラゲナーゼを溶解した緩衝液（コラゲナーゼ溶液）中に浸漬する方法等が挙げられる。具体的には例えば、濃度０．３％のコラゲナーゼ溶液中で、温度３７℃、回転数１６０ｒｐｍの条件で１５〜６０分間振盪する方法が挙げられる。上述のように、軟骨細胞にダメージを与えることなく、軟骨組織片から軟骨細胞が這い出しやすくなる範囲でコラゲナーゼ処理を行うが、軟骨組織片の大きさ（一辺の長さ）が小さい場合には短い時間で、大きい場合には長い時間となるようにコラゲナーゼ処理条件を調整する。
【００１３】
上記軟骨組織片播種工程では、生体吸収性材料からなる多孔質基材上に上記コラゲナーゼ処理が施された軟骨組織片を播種する。
上記播種の方法は特に限定されないが、例えば、上記コラゲナーゼ処理が施された軟骨組織片を適当な緩衝液や培養液に懸濁した懸濁液を調製し、該懸濁液を上記生体吸収性材料からなる多孔質基材上に注ぐ方法等が挙げられる。
上記コラゲナーゼ処理が施された軟骨組織片を播種する際の播種密度は特に限定されないが、播種する軟骨組織片の面積が、目標とする軟骨組織の面積の１／４程度となるよう播種することが好ましい。この範囲内であれば、確実かつ短期間のうちに軟骨組織を形成させることができる。
【００１４】
上記軟骨組織片を播種した多孔質基材は、上記コラゲナーゼ処理が施された軟骨組織片が充分に付着するまで、１０分間程度静置することが好ましい。また、必要に応じて、数時間から数日間程度の間、培養を行ってもよい。培養を行う場合の培養液としては、例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ等の一般的な培養液に、１〜１０重量％程度のウシ胎児血清を添加した血清添加培地を用いることができる。
【００１５】
上記生体吸収性材料からなる多孔質基材の形態は特に限定されず、例えば、不織布やスポンジ等の形態が挙げられる。なかでも、不織布は、取り扱い性に優れ、軟骨組織片を播種したときに、播種した軟骨組織片から軟骨細胞が這い出して増殖して軟骨組織を形成するための足場として好適である。
【００１６】
上記多孔質基材を構成する生体吸収性材料は特に限定されず、例えば、ポリグリコリド、ポリラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）、ポリカプロラクトン、グリコール酸−乳酸（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）共重合体、グリコール酸−ε−カプロラクトン共重合体、乳酸（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体、ポリ（ｐ−ジオキサノン）等が挙げられる。これらは単独で用いられてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１７】
なかでもポリグリコリドからなる不織布は、細胞の侵入性に優れ、軟骨組織の再生に優れた効果を発揮する。ポリグリコリドからなる不織布は、例えば３７℃の生理食塩水中に浸漬した場合に、引張強度が浸漬前の１／２になるまでの期間が約１４日である。このような分解性を有することにより、細胞が増殖して組織が再生する時期に不織布が徐々に分解吸収されることとなり、不織布内部まで再生した組織が構築され、その結果として良質な軟骨組織が構築される。
なお、本明細書においてポリグリコリドは、ポリグリコール酸等のグリコリドの重合体を意味するが、本願発明の効果を阻害しない範囲で、乳酸、ε−カプロラクトン、ｐ−ジオキサノン、炭酸トリメチレン等の他の生体吸収性の成分との共重合体としてもよい。また、本願発明の効果を阻害しない範囲で、ポリラクチド等の他の生体吸収性材料との混合物としてもよい。
【００１８】
上記不織布を構成する生体吸収性材料としてポリグリコリドを用いる場合、該ポリグリコリドの重量平均分子量は特に限定されないが、好ましい下限は３００００、好ましい上限は２５００００である。上記ポリグリコリドの重量平均分子量が３００００未満であると、力学的強度が不足することがあり、２５００００を超えると、生体内における分解速度が遅くなり、異物反応を起こすことがある。上記ポリグリコリドの重量平均分子量のより好ましい下限は５００００、より好ましい上限は２２００００である。
【００１９】
上記不織布は、平均孔径の好ましい下限が２０μｍ、好ましい上限が５０μｍである。上記不織布がこのような平均孔径を満たす場合に、特に大型で厚みのある軟骨組織を容易に製造することができる。これは、不織布中の孔径が２０〜５０μｍの孔には、細胞が容易に侵入することができ、細胞侵入層中で増殖、分化して組織を形成することができるためと考えられる。これに対して、平均孔径が２０μｍ未満であると、細胞が効率よく侵入することができないことがある。また、平均孔径が５０μｍを超えると、細胞の侵入は可能であるものの、細胞間の距離が離れすぎるため、不織布に接着した細胞が充分に増殖、分化することができないことがある。上記不織布の平均孔径のより好ましい下限は２２μｍ、より好ましい上限は４０μｍであり、更に好ましい下限は２４μｍ、更に好ましい上限は３０μｍである。
なお、本明細書において不織布の平均孔径は、バブルポイント法により測定された平均孔径を意味する。
【００２０】
上記バブルポイント法による不織布の孔径分布の測定について説明する。
バブルポイント法とは、測定対象となる膜をよく濡らす液体を予め膜の細孔内に吸収させておき、図１に示したような器具に設置し、膜の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力（バブルポイント）を測定し、液体の表面張力とバブルポイントとの関係式から孔径分布を推算する（図２）方法である。
具体的には、測定対象となる不織布に湿潤液（例えば、フッ素系溶媒、商品名Ｐｏｒｏｆｉｌ（商標））を吸収させた後、図１に示したような器具（例えば、日本ベル社製、Ｐｏｒｏｍｅｔｅｒ  ３Ｇ）に試験片寸法が直径２５ｍｍの円状になるように設置した後、不織布の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力（バブルポイント）を測定する。
なお、図２に記載された細孔径を算出する式において、γは浸潤液の表面張力を表し、θは不織布素材上の浸潤液の接触角を表し、ΔＰはバブルポイント圧を表す。
【００２１】
上記不織布の平均繊維径は特に限定されないが、好ましい下限は１０μｍ、好ましい上限は５０μｍである。上記不織布の平均繊維径がこの範囲にある場合には、平均孔径を上記規定の範囲に調整することが容易となる。上記不織布の平均繊維径のより好ましい下限は１５μｍ、より好ましい上限は４０μｍである。
なお、不織布の平均繊維径は、走査型電子顕微鏡を用いて１０００倍で撮影した不織布の像をもとに、繊維径を測定可能な全ての繊維についてその中点の直径を計測し、その平均値を算出することにより得ることができる。
【００２２】
上記不織布を構成する繊維はモノフィラメント、マルチフィラメントいずれでもよいが、組織片を確実に包含し、かつ、柔軟性を保たせるために、マルチフィラメントで構成された不織布がより好ましい。
上記不織布を構成する繊維がマルチフィラメントである場合、当該マルチフィラメントを構成する単繊維の繊度は特に限定されないが、不織布の組織片保持性や柔軟性の観点から、好ましい下限は１デニール、好ましい上限は１０デニールである。
上記不織布を構成する繊維がマルチフィラメントである場合、当該マルチフィラメントを構成する単繊維の本数は特に限定されないが、不織布の組織片保持性や柔軟性の観点から、好ましい下限は８本、好ましい上限は１５本である。
【００２３】
上記不織布を製造する方法は特に限定されず、例えば、エレクトロスピニングデポジション法、メルトブロー法、ニードルパンチ法、スパンボンド法、フラッシュ紡糸法、水流交絡法、エアレイド法、サーマルボンド法、レジンボンド法、湿式法等の従来公知の方法を用いることができる。なかでも、ニードルパンチ法が好適である。
なお、上記方法により得られた不織布を、更に熱圧縮することにより厚みや平均孔径を調整した不織布を用いることもできるが、細胞進入性の観点からは、熱圧縮されていない不織布を用いることが好ましい。熱圧縮されていない不織布は、綿毛状の外観を有し、細胞進入性に極めて優れる。
【００２４】
上記多孔質基材は、厚みの好ましい下限が１５０μｍ、好ましい上限が１０００μｍである。１５０μｍ未満では脆弱な組織しか再生しない場合があり、１０００μｍを超えると多孔質基材内への栄養拡散が不十分となり組織が壊死する場合がる。上記多孔質基材のより好ましい厚みの下限は２５０μｍ、より好ましい上限は８００μｍである。
【００２５】
上記多孔質基材は、平均孔径が５〜２０μｍである多孔質基材（以下、「小孔径多孔質基材」ともいう。）と併用してもよい。上記小孔径多孔質基材は、体液や血液等はスムーズに通過させることができる一方、細胞は通過させにくい。従って、上記多孔質基材に小孔径多孔質基材を併用することにより、上記多孔質基材中に播種した軟骨組織片や軟骨組織片から這い出した細胞に充分な栄養を供給しながら、上記多孔質基材から軟骨組織片や細胞が脱落するのを防止することができ、より高効率で軟骨組織を製造することができる。上記小孔径多孔質基材の平均孔径の好ましい下限は６μｍ、好ましい上限は１８μｍであり、より好ましい下限は７μｍ、より好ましい上限は１６μｍである。
【００２６】
上記小孔径多孔質基材の形態は特に限定されず、例えば、不織布やスポンジ等の形態が挙げられる。
上記小孔径多孔質基材を構成する生体吸収性材料としては、上記多孔質基材に用いるものと同様の生体吸収性材料を用いることができる。上記小孔径多孔質基材を構成する生体吸収性材料は、上記多孔質基材を構成する生体吸収性材料と同じであってもよく、異なっていてもよい。
【００２７】
上記多孔質基材は、生体吸収性材料からなる型枠（以下、単に「型枠」ともいう。）に固定され複合一体化されていることが好ましい。上記型枠は、得られる軟骨組織の形状を整えるとともに、軟骨組織に充分な力学的強度を付与する役割を発揮する。型枠に複合一体化された多孔質基材上に軟骨組織片を播種することにより、より厚く、高い力学的強度を有する軟骨組織を製造することができる。
【００２８】
上記型枠を構成する生体吸収性材料は特に限定されず、上記多孔質基材に用いるものと同様の生体吸収性材料を用いることができる。
得られる軟骨組織の形状を整えるとともに、軟骨組織に充分な力学的強度を付与するという型枠の役割から、上記型枠を構成する生体吸収性材料は上記多孔質基材を構成する生体吸収性材料よりも分解に長期間を要するものを選択することが好ましい。上記多孔質基材を構成する生体吸収性材料よりも分解に長期間を要する生体吸収性材料を用いて型枠を構成することにより、上記多孔質基材中において軟骨細胞が増殖して軟骨組織が再生するとともに、多孔質基材が徐々に分解吸収される間も、軟骨組織の形状を維持することができる。
例えば、上記多孔質基材を構成する生体吸収性材料としてポリグリコリドを用いる場合、上記型枠を構成する生体吸収性材料としてはポリカプロラクトンが好適である。ポリカプロラクトンは、ポリグリコリドよりも分解に長期間を要することに加え、適度な力学的強度と柔軟性とを有する。
【００２９】
なお、上記型枠を構成する生体吸収性材料としてポリカプロラクトンを用いる場合、ポリカプロラクトンは疎水性が高いことから、型枠上又は型枠の周辺部において軟骨組織の形成が妨げられる恐れがある。そのような場合には、ポリカプロラクトンからなる型枠に予め親水化処理を施すことが好ましい。
上記親水化処理としては特に限定されず、従来公知の親水化処理を用いることができる。なかでも、簡便、かつ、生体に対する影響が少ないことから、エタノール等のアルコールによる処理が好適である。
【００３０】
上記型枠の形状は、例えば、フィルム状、格子状、メッシュ状、同心円状等が挙げられる。
耳介軟骨等の、特定の形状を有する軟骨組織を製造する場合には、上記型枠の形状を製造しようとする軟骨組織の形状にあわせて成形することで、任意の形状の軟骨組織を得ることができる。
【００３１】
上記多孔質基材と上記型枠とは複合一体化していることが好ましい。上記型枠と上記多孔質基材とが複合一体化していないと、上記多孔質基材に軟骨組織片を播種したり、組織又は器官に移植したりする際に、上記型枠と上記多孔質基材との一部又は全部が剥離してしまうことがある。上記型枠と上記多孔質基材が一部でも剥離すると、該剥離部に形成された空間に細胞溜まりが生じて、正常な組織又は器官が再生されないことがある。
なお、本明細書において上記型枠と上記多孔質基材とが複合一体化しているとは、得られた軟骨組織を組織又は器官に移植する際に、折り畳んで移植しても上記型枠が上記多孔質基材から剥離しないことを意味する。
【００３２】
上記型枠と上記多孔質基材とを複合一体化させる方法としては、例えば、上記型枠又は上記多孔質基材の表面の一部を熱溶融してから貼り合わせる方法や、医療用接着剤を用いて貼り合わせる方法や、上記型枠又は上記多孔質基材の表面の一部を溶剤で溶解してから貼り合わせる方法等が考えられる。
【００３３】
上記型枠は上記多孔質基材を囲むように配置しても良いし、上記型枠を上記多孔質基材で包むように配置してもよい。より好ましくは上記型枠を上記多孔質基材で包むように配置したものである。このように配置することにより、より充分な厚み、形状を有し、かつ、より高い力学的強度を有する軟骨組織を製造することができる。
上記型枠に複合一体化された多孔質基材の態様の一例を示す模式図を図３に示した。
図３（ａ）に記載した型枠に複合一体化された多孔質基材１では、矩形の多孔質基材１１の周りを取り囲むように型枠１２が配置されている。また、図３（ｂ）に記載した型枠に複合一体化された多孔質基材１’では、型枠１２を挟み込むようにして２枚の矩形の多孔質基材１１が配置されている。
図４（ａ）に記載した型枠に複合一体化された多孔質基材２では、型枠２２の形状を外耳状に整え、該型枠２２の内側に多孔質基材２１を配置している。また、図４（ｂ）に記載した型枠に複合一体化された多孔質基材２’では、形状を外耳状に整えた型枠２２を挟み込むようにして２枚の多孔質基材２１が配置されている。
【００３４】
本発明の軟骨組織の製造方法により製造された軟骨組織を、生体内に移植することにより、充分な厚み、形状及び力学的強度を有する軟骨組織が再生される。
生体吸収性材料からなる多孔質基材上に、コラゲナーゼ処理が施された、一辺が５０〜１０００μｍのブロック状の軟骨組織片が播種されたものである軟骨組織もまた、本発明の１つである。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、充分な厚み、形状及び力学的強度を有する軟骨組織を製造することができる軟骨組織の製造方法、及び、該軟骨組織の製造方法により製造された軟骨組織を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】バブルポイント法による多孔質基材の孔径分布の測定方法を説明する模式図である。
【図２】バブルポイント法によって得られたデータから多孔質基材の孔径分布を推算する方法を説明する模式図である。
【図３】本発明の軟骨組織の製造方法に用いる型枠に複合一体化された多孔質基材の態様の一例を示す模式図である。
【図４】本発明の軟骨組織の製造方法に用いる型枠に複合一体化された多孔質基材の態様の一例を示す模式図である。
【図５】微細加工装置として用いることができるマイクロスライサーの一例を示す模式図である。
【図６】実施例１における移植後１０週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像（ａ）及びヴェノホッフ染色像（ｂ）である。
【図７】実施例２における各コラゲナーゼ処理軟骨組織片を移植後１０週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像（ａ）及びヴェノホッフ染色像（ｂ）である。
【図８】比較例１における未処理軟骨組織片移植後１０週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像（ａ）及びヴェノホッフ染色像（ｂ）である。
【図９】実施例３における移植後１０週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像（ａ）及びヴェノホッフ染色像（ｂ）である。
【図１０】実施例４における各コラゲナーゼ処理軟骨組織片を移植後１０週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像（ａ）及びヴェノホッフ染色像（ｂ）である。
【図１１】比較例２における未処理軟骨組織片移植後１０週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像（ａ）及びヴェノホッフ染色像（ｂ）である。
【図１２】実施例５における、コラゲナーゼ処理を１５分間施した一辺の長さが１００μｍのブロック状の軟骨組織片を移植後２０週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像（ａ）及びヴェノホッフ染色像（ｂ）である。
【図１３】実施例５における、コラゲナーゼ処理を１５分間施した一辺の長さが２００μｍのブロック状の軟骨組織片を移植後２０週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像（ａ）及びヴェノホッフ染色像（ｂ）である。
【図１４】実施例５における、コラゲナーゼ処理を６０分間施した一辺の長さが４００μｍのブロック状の軟骨組織片を移植後２０週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像（ａ）及びヴェノホッフ染色像（ｂ）である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【００３８】
（実施例１）
（１）不織布の調製
生体吸収性材料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、これを紡糸して得た糸からなる布をニードルパンチ法により不織布化する方法により、平均繊維径が約１６μｍ、厚さが約０．５ｍｍの綿毛状の不織布を得た。
なお、得られた細胞侵入層に、湿潤液としてフッ素系溶媒（商品名Ｐｏｒｏｆｉｌ（商標））を吸収させた後、日本ベル社製のＰｏｒｏｍｅｔｅｒ  ３Ｇに試験片寸法が直径２５ｍｍの円状になるように設置し、細胞侵入層の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力（バブルポイント）を測定した。得られたバブルポイントをもとに不織布の孔径分布を示すグラフを得て、該グラフより平均孔径を算出したところ、２８μｍであった。
【００３９】
（２）軟骨組織片の調製と播種
Ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ  ｅａｒ（たち耳）治療のために切除して得られたヒト耳介軟骨を、皮膚、結合組織、軟骨膜を除去し、長さ５ｍｍ、幅５ｍｍ、厚さ１ｍｍのヒト耳介軟骨を得た。該ヒト耳介軟骨を、微細加工装置を用いて細切し、一辺が約８００μｍの軟骨組織片を得た。
得られた軟骨組織片を、濃度０．３％のコラゲナーゼ溶液中で、温度３７℃、回転数１６０ｒｐｍの条件で６０分間振盪することにより、コラゲナーゼ処理を施した。
コラゲナーゼ処理が施された軟骨組織片を５０μＬのリン酸バッファー中に懸濁した後、ピペットを用いて不織布に均等に播種した。ここで、目標とする軟骨組織の面積１ｃｍ２に対して、播種する軟骨組織片の面積が５ｍｍ２となるように播種を行った。
【００４０】
（３）移植及び軟骨組織再生の評価
得られた軟骨組織片を播種した不織布を４〜６週齢無胸腺マウス（平均体重２８ｇ、雄）に移植した。全身麻酔後、後頸部に切開し、皮下に軟骨組織を移植した。移植後１０週間後に犠牲死させて、各々のサンプルを取り出した。
図６に、移植後１０週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像（ａ）及びヴェノホッフ染色像（ｂ）を示した。図６（ａ）より、プロテオグリカンの生成が認められ、再生軟骨が誘導されていることが確認できた。また、図６（ｂ）において、黒く染まったエリアは移植軟骨片を示し、薄く暗く染まったエリアが再生軟骨を示している。黒く染まったエリアが少なくことからも、再生軟骨が誘導されていることが確認できた。また、不織布を構成するポリグリコリドは全て分解していた。
【００４１】
（実施例２）
軟骨組織片に施すコラゲナーゼ処理条件を（１）１５分間、（２）３０分間、（３）４５分間及び（４）６０分間とした以外は、実施例１と同様にして不織布に軟骨組織片を播種し、移植及び軟骨組織再生の評価を行った。
図７に、各コラゲナーゼ処理軟骨組織片を移植後１０週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像（ａ）及びヴェノホッフ染色像（ｂ）を示した。
【００４２】
（比較例１）
軟骨組織片にコラゲナーゼ処理を施さなかった以外は、実施例１と同様にして不織布に
軟骨組織片を播種し、移植及び軟骨組織再生の評価を行った。
図８に、移植後１０週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像（ａ）及びヴェノホッフ染色像（ｂ）を示した。図８より、比較例１では、プロテオグリカンの生成が少なく、再生軟骨の誘導はほとんど認められなかったことがわかった。また、軟骨組織片は残存していたが、吸収像が見られた。
【００４３】
（実施例３）
（１）不織布の調製
生体吸収性材料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、これを紡糸して得た糸からなる布をニードルパンチ法により不織布化する方法により、平均繊維径が約１６μｍ、厚さが約０．５ｍｍの綿毛状の不織布を得た。
なお、得られた細胞侵入層に、湿潤液としてフッ素系溶媒（商品名Ｐｏｒｏｆｉｌ（商標））を吸収させた後、日本ベル社製のＰｏｒｏｍｅｔｅｒ  ３Ｇに試験片寸法が直径２５ｍｍの円状になるように設置し、細胞侵入層の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力（バブルポイント）を測定した。得られたバブルポイントをもとに不織布の孔径分布を示すグラフを得て、該グラフより平均孔径を算出したところ、２８μｍであった。
【００４４】
（２）小孔径不織布の調製
生体吸収性材料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、メルトブロー法により、平均繊維径が約２μｍ、厚さが約５０μｍの小孔径不織布を得た。
なお、得られた小孔径不織布について、バブルポイント法により平均孔径を算出したところ、１２μｍであった。 
【００４５】
（３）不織布と小孔径不織布との積層 
厚さが５０μｍの小孔径不織布と、厚さが０．５ｍｍの不織布とを重ね、四隅を５−０ナイロン縫合糸で縫合して積層体を得た。
【００４６】
（４）軟骨組織片の調製と播種
Ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ  ｅａｒ（たち耳）治療のために切除して得られたヒト耳介軟骨を、皮膚、結合組織、軟骨膜を除去し、長さ５ｍｍ、幅５ｍｍ、厚さ１ｍｍのヒト耳介軟骨を得た。該ヒト耳介軟骨を、微細加工装置を用いて細切し、一辺が約８００μｍの軟骨組織片を得た。
得られた軟骨組織片を、濃度０．３％のコラゲナーゼ溶液中で、温度３７℃、回転数１６０ｒｐｍの条件で６０分間振盪することにより、コラゲナーゼ処理を施した。
コラゲナーゼ処理が施された軟骨組織片を５０μＬのリン酸バッファー中に懸濁した後、ピペットを用いて積層体の不織布側に均等に播種した。ここで、目標とする軟骨組織の面積１ｃｍ２に対して、播種する軟骨組織片の面積が５ｍｍ２となるように播種を行った。
【００４７】
（５）移植及び軟骨組織再生の評価
得られた軟骨組織片を播種した不織布を４〜６週齢無胸腺マウス（平均体重２８ｇ、雄）に移植した。全身麻酔後、後頸部に切開し、皮下に軟骨組織を移植した。移植後１０週間後に犠牲死させて、各々のサンプルを取り出した。
図９に、移植後１０週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像（ａ）及びヴェノホッフ染色像（ｂ）を示した。図９（ａ）より、多くのプロテオグリカンの生成が認められ、実施例１よりも更に再生軟骨が誘導されていることが確認できた。また、図９（ｂ）において暗く染まったエリアが少ないことからも、再生軟骨が誘導されていることが確認できた。また、不織布を構成するポリグリコリドは全て分解していた。
【００４８】
（実施例４）
軟骨組織片に施すコラゲナーゼ処理条件を（１）１５分間、（２）３０分間、（３）４５分間及び（４）６０分間とした以外は、実施例３と同様にして不織布に軟骨組織片を播種し、移植及び軟骨組織再生の評価を行った。
図１０に、各コラゲナーゼ処理軟骨組織片を移植後１０週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像（ａ）及びヴェノホッフ染色像（ｂ）を示した。
【００４９】
（比較例２）
軟骨組織片にコラゲナーゼ処理を施さなかった以外は、実施例３と同様にして不織布に
軟骨組織片を播種し、移植及び軟骨組織再生の評価を行った。
図１１に、移植後１０週間後の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像（ａ）及びヴェノホッフ染色像（ｂ）を示した。図１１より、比較例２では、プロテオグリカンの生成が少なく、再生軟骨の誘導はほとんど認められなかったことがわかった。また、軟骨組織片は残存していたが、吸収像が見られた。
【００５０】
（実施例５）
（１）軟骨組織片の調製と播種
イヌから片耳を切除し、皮膚、結合組織、軟骨膜を除去して、イヌ耳介軟骨組織を得た。該イヌ耳介軟骨を、微細加工装置を用いて細切し、一辺の長さが１００μｍ、２００μｍ及び４００μｍのブロック状の軟骨組織片を得た。
得られた各大きさの軟骨組織片を、濃度０．３％のコラゲナーゼ溶液中で、温度３７℃、回転数１６０ｒｐｍの条件で、０分間、１５分間及び６０分間振盪することにより、コラゲナーゼ処理を施した。
コラゲナーゼ処理が施された各大きさの軟骨組織片を５０μＬのリン酸バッファー中に懸濁して懸濁液を得た。実施例３と同様の方法により調製た積層体の不織布側に、ピペットを用いて懸濁液を均等に播種した。ここで、目標とする軟骨組織の面積１ｃｍ２に対して、播種する軟骨組織片の面積が５ｍｍ２となるように播種を行った。
【００５１】
（２）移植及び軟骨組織再生の評価
軟骨組織片を播種した不織布を上記（１）で片耳を切除したイヌに移植した。全身麻酔後、頭部を切開し、皮下に軟骨組織を移植した。移植後２０週間後に犠牲死させて、各々の不織布を取り出した。
移植後２０週間後の不織布の断面切片を作製し、サフラニン染色及びヴェノホッフ染色像を行った。図１２に、移植後２０週間後の、コラゲナーゼ処理を１５分間施した一辺の長さが１００μｍのブロック状の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像（ａ）及びヴェノホッフ染色像（ｂ）を示した。図１３に、移植後２０週間後の、コラゲナーゼ処理を１５分間施した一辺の長さが２００μｍのブロック状の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像（ａ）及びヴェノホッフ染色像（ｂ）を示した。図１４に、移植後２０週間後の、コラゲナーゼ処理を６０分間施した一辺の長さが４００μｍのブロック状の軟骨組織片を播種した不織布の断面のサフラニン染色像（ａ）及びヴェノホッフ染色像（ｂ）を示した。
【００５２】
サフラニン染色によれば軟骨組織が赤く染色される。図１２〜１４には、赤く染色された軟骨組織部が多数認められ、軟骨組織が再生していることが確認できる。このサフラニン染色像を画像処理して、再生された軟骨組織部の面積（赤く染色された軟骨組織部の面積）を算出することもできる。この方法より、一辺の長さが１００μｍのブロック状の軟骨組織片、及び、一辺の長さが２００μｍのブロック状の軟骨組織片の場合には、コラゲナーゼ処理を１５分間施した場合において、特に軟骨の再生が良好であることがわかった。一方、一辺の長さが４００μｍのブロック状の軟骨組織片の場合には、コラゲナーゼ処理を６０分間施した場合において、特に軟骨の再生が良好であることがわかった。
この結果より、軟骨組織片の大きさ（一辺の長さ）によって、最適なコラゲナーゼ処理条件があることがわかる。
【００５３】
（実施例６）
（１）軟骨組織片の調製と播種
イヌから片耳を切除し、皮膚、結合組織、軟骨膜を除去して、イヌ耳介軟骨組織を得た。得られたイヌ耳介軟骨を１ｃｍ×１ｃｍ（１ｃｍ２）で切り出し、微細加工装置を用いて細切し、一辺の長さが４００μｍのブロック状の軟骨組織片を得た。
得られた軟骨組織片を、濃度０．３％のコラゲナーゼ溶液中で、温度３７℃、回転数１６０ｒｐｍの条件で１５分間振盪することにより、コラゲナーゼ処理を施した。
コラゲナーゼ処理が施された軟骨組織片を５０μＬのリン酸バッファー中に懸濁して懸濁液を得た。実施例３と同様の方法により調製し、２ｃｍ×２ｃｍ（４ｃｍ２）の大きさに切断した積層体の不織布側に、ピペットを用いて懸濁液の全量を均等に播種した。
【００５４】
（２）移植及び軟骨組織再生の評価
軟骨組織片を播種した不織布を上記（１）で片耳を切除したイヌに移植した。全身麻酔後、頭部を切開し、皮下に軟骨組織を移植した。移植後２０週間後に犠牲死させて、不織布を取り出した。
移植後２０週間後の不織布の断面切片を作製し、サフラニン染色を行ったところ、赤く染色された軟骨組織部が不織布の全面に形成されていることが確認された。
この結果より、ごくわずかな軟骨組織片があれば、より大きな軟骨組織を再生できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明によれば、充分な厚み、形状及び力学的強度を有する軟骨組織を製造することができる軟骨組織の製造方法、及び、該軟骨組織の製造方法により製造された軟骨組織を提供することができる。
【符号の説明】
【００５６】
１、１’  型枠に複合一体化された多孔質基材
１１  矩形の多孔質基材
１２  型枠
２、２’  型枠に複合一体化された多孔質基材
２１  多孔質基材
２２  形状を外耳状に整えた型枠
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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