(57)【要約】【課題】細胞接着性の制御剤、血管新生制御剤、又は細胞接着性又は血管新生の異常に起因する疾患の予防又は治療剤を提供すること。【解決手段】下記（Ａ）又は（Ｂ）のユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を、制御する物質を含むことを特徴とする、細胞外マトリックスへの細胞接着性の制御剤、血管新生制御剤、又は細胞接着性又は血管新生の異常に起因する疾患の予防又は治療剤。（Ａ）ANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質（Ｂ）SNX9、SNX 11、SNX 17からなる群から選択される少なくとも一種の蛋白質【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を、制御する物質を含むことを特徴とする、細胞外マトリックスへの細胞接着性の制御剤。
（Ａ）ANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質
（Ｂ）SNX9、SNX 11、SNX 17からなる群から選択される少なくとも一種の蛋白質
【請求項２】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を、制御する物質を含むことを特徴とする、血管新生制御剤。
（Ａ）ANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質
（Ｂ）SNX9、SNX 11、SNX 17からなる群から選択される少なくとも一種の蛋白質
【請求項３】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を、制御する物質を含むことを特徴とする、細胞接着性又は血管新生の異常に起因する疾患の予防又は治療剤。
（Ａ）ANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質
（Ｂ）SNX9、SNX11、SNX17からなる群から選択される少なくとも一種の蛋白質
【請求項４】
ANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質又はその誘導体からなる、ユビキチンリガーゼコンポーネント。
【請求項５】
リガーゼ活性本体としてCUL3を含むユビキチンリガーゼであって、アダプター部位がANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質であることを特徴とする、ユビキチンリガーゼ。
【請求項６】
下記（Ｉ）又は（II）の制御能を指標とすることを特徴とする、細胞外マトリックスへの細胞接着性の制御剤又は血管新生制御剤のスクリーニング方法。
（Ｉ）下記（Ａ）とCUL3の間の相互作用
（II）下記（Ｂ）のユビキチン化
（Ａ）ANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質
（Ｂ）SNX9、SNX 11、SNX 17からなる群から選択される少なくとも一種の蛋白質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生制御剤及びその利用方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
［血管新生］
「血管新生」には、広義の「血管新生」と狭義の「血管新生」がある。
【０００３】
狭義の「血管新生」とは、既存の血管から新たな血管が分岐する、いわゆる「Angiogenesis」を言う。
広義の「血管新生」には、狭義の「血管新生」に加えて、既存の血管が存在しないところで内皮前駆細胞(血管芽細胞)から新たに血管が形成される、いわゆる「脈管形成（Vasculogenesis）」が含まれる。
尚、本件における「血管新生」とは、「（狭義の）血管新生（Angiogenesis）」と「脈管形成（Vasculogenesis）」の両方を含む、広義の「血管新生」を意味する。
【０００４】
ところで血管新生は、創傷治癒の過程で必要な重要な生理現象である一方、慢性炎症や悪性腫瘍の進展にも関わっている。
【０００５】
従って、血管新生の制御は、様々な疾患の治療に役立つ、重要な手段と考えられている。
【０００６】
そのため、血管新生の詳しい機構が徐々に解明されつつあるが、その一つとして、例えば血管新生の初期段階では、まず血管内皮細胞の細胞膜上に発現する膜蛋白質Integrinの細胞外ドメインが、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、フィブリノーゲン等の糖タンパク質を主な構成成分として含む細胞外マトリックス（Extracellular Matrix：以下「ECM」と記載することがある。）に接着することで、細胞伸展やその先の血管新生に関わっていることが判明している。
【０００７】
［血管新生制御剤］
これまで、様々な血管新生制御剤が研究されてきており、本発明者等も、下記のユビキチンシステムを利用するユビキチンリガーゼ（E3）に関連する血管新生制御剤を、種々見出して来た（特許文献１〜３等）。そしてそれらのE3はいずれも、構成要素の一部（アダプター）としてBTBドメイン含有蛋白質を含むものであった。
そこで、以下ユビキチンシステムについて説明する。
【０００８】
［ユビキチンシステム］
ユビキチンシステムとは、ユビキチン（以下、「Ub」と記載することがある。）という７６個のアミノ酸からなる蛋白質が、他の蛋白質の修飾に用いられることで、蛋白質の分解、シグナル伝達制御、DNA修復等の様々な生命現象に関与している現象である。
【０００９】
他の蛋白質の修飾とは、標的蛋白質へのUbの付加（モノUb化、ジUb化、ポリUb化等のUb化）を意味している。
Ub化は、標的蛋白質の持つリジン（K）の側鎖のアミノ基と、UbのＣ末端のグリシン（Ｇ）のカルボキシル基との間のアミド結合によって起こり、ジUb化やポリUb化等の場合には、Ub内のリジンに、更に次のUbが結合する。
【００１０】
そしてこのユビキチンシステムには、下記の３種類の酵素が用いられている。
E1：ユビキチン活性化酵素
E2：ユビキチン結合酵素
E3：ユビキチン転移酵素（ユビキチンリガーゼ）
【００１１】
従って、これらの酵素は、上記の生命現象に関連する疾患の予防や治療その他に有用である点でも注目されており、種々のUb関連酵素が探索されている。
【００１２】
［ユビキチンリガーゼ（E3）］
ところで、これらの酵素のうち、Ub化の最終段階で作用するE3は、下記の各種の役割を有する複数のコンポーネントからなる複合体であることが知られている。
【００１３】
{１}リガーゼ活性を有するとともに他のコンポーネントをつなぐプラットフォームの役割をも担っている本体部位（[Cullin1(CUL1)、Cullin2(CUL2)、Cullin3(CUL3)]等のCullin(CUL)蛋白質）
{２}基質（Ub化の対象となる蛋白質）を認識するアダプター部位
{３}その他の部位（Rbx1、Nedd8 (N8, Neural Precursor Cell Expressed, Developmentally Down-Regulated 8) 等）
【００１４】
そして、{２}の、基質特異性のあるアダプター部位を変更することで、種々の蛋白質に対するUb化を実現し得るのである。
【００１５】
［E3アダプター］
このアダプター部位に相当する蛋白質には、{１}との結合部位の異なる、F-box含有蛋白質、BC-box含有蛋白質、BTBドメイン含有蛋白質等の種類があることが分かっている（非特許文献１、２等）。
【００１６】
一方、BTBドメインを有するヒト蛋白質としては、既に遺伝子レベルから、183種類が知られている。
【００１７】
しかしながら、BTBドメインを有する蛋白質（以下、「BTB蛋白質」と記載することがある。）について、実際に何らかのデータを示した上でE3アダプターであることを示唆できた例は、まだそれほど多くは無い。
【００１８】
本発明者等はこの度、E3において、アダプターとして機能しうる新たなBTB蛋白質を同定し、それらの制御剤が、血管新生制御剤となり得ることを見出した。
【００１９】
尚、本発明のBTB蛋白質制御による血管新生の制御機構が、血管新生の初期段階である、膜蛋白質「Integrin」の「ECM」への接着の制御に基づくこと、更にはこのECMへの接着制御に先立って、「Integrin」の細胞内での局在が制御されていることも、併せて見い出した。
【００２０】
「Integrin」とは、細胞接着分子の働きを有する膜蛋白質の一種であり、その構造は、「α鎖」と「β鎖」の2種のサブユニットから成るヘテロダイマーである。α鎖とβ鎖のそれぞれが複数の種類を有するため、これらサブユニットを多様に組み合わせることによって、様々な種類のECMへの接着が可能となる。
【００２１】
今回、本発明者等が見出した8種類のBTB蛋白質は、それらのsiRNA等による制御時に、CUL3の制御時とほぼ同様の表現系（Integrinの細胞内挙動の変化、ECMへの細胞接着性変化、又は血管新生の変化等）を示すことから、CUL3とともにE3を構成しているE3アダプターである蓋然性が非常に高い。
【００２２】
そしてこれら8種類のBTB蛋白質のうちKCTD18に関しては、（おそらくはモノUb化対象である）SNX9を、E3基質として確認しており、更にSNX9及びその他の2種類のSNX蛋白質についても、「Integrinβ１」の細胞内局在の制御に関与していることが確認できた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】特許第５６６５２１３号
【特許文献２】特開２０１５−１２６７２２号
【特許文献３】特願２０１７−１１０３６３号
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Natural Cell Biology vol.5 No.11, P.950-951, November 2003
【非特許文献２】Current Biology, vol.14, R59-R61, January 20, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
従って、本発明の目的とするところは、新規E3及びそのシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子の制御物質を用いた、血管新生制御剤等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
上述の目的は、下記第一の発明から第六の発明によって、達成される。
【００２７】
＜第一の発明＞
下記（Ａ）又は（Ｂ）のユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を、制御する物質を含むことを特徴とする、細胞外マトリックスへの細胞接着性の制御剤。
（Ａ）ANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質
（Ｂ）SNX9、SNX 11、SNX 17からなる群から選択される少なくとも一種の蛋白質
【００２８】
＜第二の発明＞
下記（Ａ）又は（Ｂ）のユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を、制御する物質を含むことを特徴とする、血管新生制御剤。
（Ａ）ANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質
（Ｂ）SNX9、SNX 11、SNX 17からなる群から選択される少なくとも一種の蛋白質
【００２９】
＜第三の発明＞
下記（Ａ）又は（Ｂ）のユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質又はその遺伝子を、制御する物質を含むことを特徴とする、細胞接着性又は血管新生の異常に起因する疾患の予防又は治療剤。
（Ａ）ANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質
（Ｂ）SNX9、SNX11、SNX17からなる群から選択される少なくとも一種の蛋白質
【００３０】
＜第四の発明＞
ANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質又はその誘導体からなる、ユビキチンリガーゼコンポーネント。
【００３１】
＜第五の発明＞
リガーゼ活性本体としてCUL3を含むユビキチンリガーゼであって、アダプター部位がANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質であることを特徴とする、ユビキチンリガーゼ。
【００３２】
＜第六の発明＞
下記（Ｉ）又は（II）の制御能を指標とすることを特徴とする、細胞外マトリックスへの細胞接着性の制御剤又は血管新生制御剤のスクリーニング方法。
（Ｉ）下記（Ａ）とCUL3の間の相互作用
（II）下記（Ｂ）のユビキチン化
（Ａ）ANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質
（Ｂ）SNX9、SNX 11、SNX 17からなる群から選択される少なくとも一種の蛋白質
【発明の効果】
【００３３】
本発明の各種制御剤や、新規ユビキチンリガーゼコンポーネント、ユビキチンリガーゼ等は、各種の実験・研究試薬として用いうるほか、Integrinβ１による細胞接着性の制御を介して、血管新生を制御することによって、種々の疾患等の予防又は治療に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１−１Ａ】２種のsiANKFY1（＃１、＃２）を用いたANKFY1遺伝子の阻害による、基底膜上でのHUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の細胞伸展・細胞面積への影響を、Integrinβ１の抗体染色により示した図である。
【図１−１Ｂ】図１−１Ａの各細胞サイズ（面積）の平均値を表す図である。
【図１−２】siANKFY1＃１を用いたANKFY1遺伝子の阻害による血管新生への影響を、蛍光標識ファロイジンによるF-actinの染色により示した図である。
【図１−３】ANKFY1とCUL3が、Nedd8の存在下で相互作用することを、ANKFY1の標識（HA）に対する抗体を用いた、免疫沈降（IP）及びWestern Blottingにより確認した結果を示す図である。
【図１−４Ａ】CUL3遺伝子の阻害（siCUL3＃１）による、基底膜上でのHUVECの細胞伸展・細胞面積への影響を、細胞膜とECMとの接着部位の裏打ち蛋白質の一種であるパキシリンまたはビンキュリンの抗体染色によって示した図である。
【図１−４Ｂ】図１−４Ａのうち、ビンキュリンを抗体染色した方の、各細胞サイズ（面積）の平均値を表す図である。
【図１−４Ｃ】CUL3遺伝子の阻害（siCUL3＃１）による、各種の細胞外マトリックス蛋白質に対するHUVECの付着率への影響を示した図である。
【図１−４Ｄ】CUL3遺伝子の阻害（siCUL3＃１）による、HUVEC中のIntegrinα２及びIntegrinβ１の局在位置への影響を、各Integrin蛋白質の抗体染色によって示した図である。
【図１−４Ｅ】CUL3遺伝子阻害（siCUL3＃１）７２時間後の、HUVEC中の Integrinα２発現量を、Western Blottingにより確認した結果を示す図である。
【図１−５Ａ】siANKFY1（＃３）単独でのトランスフェクト、又はsiANKFY1（＃３）とRNAi耐性ANKFY1（ANKFY1-HA）の同時トランスフェクトによる、HUVEC中でのANKFY1とIntegrinβ１の発現量への影響を、Western Blottingにより確認した結果を示す図である。
【図１−５Ｂ】siANKFY1（＃３）単独でのトランスフェクト、又はsiANKFY1（＃３）とRNAi耐性ANKFY1（ANKFY1-HA）の同時トランスフェクトによる、HUVEC中でのANKFY1とIntegrinβ１の局在位置への影響を、ＨＡ（ANKFY1の標識）又はIntegrinβ１に対する抗体染色によって示した図である。
【図２−１Ａ】定量PCRによるKCTD18のmRNAの測定によって、３種のsiKCTD18（＃１、＃２、＃３）を用いたKCTD18の遺伝子阻害による、KCTD18発現量の低下を確認した図である。
【図２−１Ｂ】３種のsiKCTD18（＃１、＃２、＃３）を用いたKCTD18遺伝子の阻害の、HUVEC中のIntegrinβ１及びSNX9蛋白質の蛋白質量に与える影響を、Western Blottingにより確認した結果を示す図である。
【図２−１Ｃ】３種のsiKCTD18（＃１、＃２、＃３）を用いたKCTD18遺伝子の阻害による、基底膜上でのHUVECの細胞伸展及び細胞面積への影響を、Integrinβ１の抗体染色により示した図である。
【図２−２】３種のsiKCTD18（＃１、＃２、＃３）を用いたKCTD18遺伝子の阻害による、血管新生への影響を、蛍光標識ファロイジンによるF-actinの染色により示した図である。
【図２−３】３種のsiKCTD18（＃１、＃２、＃３）を用いたKCTD18遺伝子の阻害による、HUVEC中のIntegrinβ１の局在位置への影響を、Integrinβ１の抗体染色により確認した結果を示す図である。
【図３−１】３種のsiSNX9（＃１、＃２、＃３）を用いたSNX9遺伝子の阻害による、基底膜上のHUVECの細胞伸展及び細胞面積への影響を、蛍光標識ファロイジンによるF-actinの染色により示した図である。
【図３−２】３種のsiSNX9（＃１、＃２、＃３）を用いたSNX9遺伝子の阻害による、血管新生への影響を、蛍光標識ファロイジンによるF-actinの染色により示した図である。
【図３−３Ａ】３種のsiSNX9（＃１、＃２、＃３）を用いたSNX9遺伝子の阻害による、HUVEC中のIntegrinβ１及びSNX9蛋白質の蛋白質量への影響を、Western Blottingにより確認した結果を示す図である。
【図３−３Ｂ】３種のsiSNX9（＃１、＃２、＃３）を用いたSNX9遺伝子の阻害による、HUVEC中のIntegrinβ１の局在位置への影響を、Integrinβ１の抗体染色により確認した結果を示す図である。
【図４】SNX9以外の各種SNX蛋白質の阻害による、HUVEC中のIntegrinβ１の局在位置への影響を、Integrinβ１の抗体染色により確認した結果を示す図である。
【図５】siRNAを用いた他の各種BTB蛋白質の阻害による、HUVEC中のIntegrinβ１の局在位置への影響を、Integrinβ１の抗体染色により確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３６】
［本発明の各種制御剤］
本発明の「細胞外マトリックスへの細胞接着性の制御剤」、「血管新生制御剤」は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質を制御する物質を含むことを特徴とするものである。
【００３７】
（Ａ）ANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質
（Ｂ）SNX9、SNX 11、SNX 17からなる群から選択される少なくとも一種の蛋白質
【００３８】
ここで、（Ａ）は、BTB構造を有することや、その阻害が、CUL3阻害時と同等の表現型を示すこと等から、E3のアダプター蛋白質としての役割を担う蛋白質であると考えられる。
【００３９】
また、（Ｂ）は、SNX9が（Ａ）のE3アダプター蛋白質（KCTD18）と相互作用すること等から、E3のUb化基質としての役割を担う蛋白質であると考えられる。
更に、siCUL3やsiKCTD18等の、E3構成成分の阻害によっても、その標的基質であるSNX9の細胞内発現量には大きな変化が無いこと（図２−１Ｂ）、及びSNX9、SNX 11、SNX 17がIntegrinβ１の局在化に関わっていること（図３−３Ｂ、図４）等から、（Ｂ）の蛋白質は、特許文献１乃至３に記載されたような（後にプロテアソームにより分解される）「ポリUb化基質」では無く、蛋白質の細胞内局在の制御に関連する「モノUb化基質」であると考えられる。
【００４０】
本発明において、「制御」には、“「量や機能」の「阻害（抑制）」又は「促進（増加）」”が含まれる。
【００４１】
すなわち本発明において、「蛋白質又はその遺伝子の制御」とは、
「投与対象（生体や細胞や実験試料等）における、当該蛋白質又はその遺伝子の、量の抑制（減少）又は促進（増加）」
又は
「投与対象における、当該蛋白質又はその遺伝子の、機能の阻害又は促進」
を意味している。
【００４２】
従って、「（Ａ）又は（Ｂ）のユビキチンリガーゼシグナリング関連蛋白質（以下、単に「（Ａ）又は（Ｂ）蛋白質」あるいは「（Ａ）又は（Ｂ）」と記載することがある。）又はその遺伝子を制御する物質」としては、投与対象における「（Ａ）又は（Ｂ）蛋白質又はその遺伝子の量や機能」を、「阻害（抑制）又は促進（増加）する物質」が挙げられる。
【００４３】
（（Ａ）又は（Ｂ）蛋白質又はその遺伝子の量や機能を、阻害（抑制）する物質）
「（Ａ）又は（Ｂ）蛋白質又はその遺伝子の量や機能を、阻害（抑制）する物質」としては、
「（Ａ）又は（Ｂ）蛋白質又はその遺伝子の発現量を、抑制する物質」
「（Ａ）又は（Ｂ）蛋白質又はその遺伝子を分解する物質」
「（Ａ）又は（Ｂ）蛋白質又はその遺伝子の機能を阻害する物質」
等が挙げられる。
【００４４】
具体的には、下記のようなものが挙げられるが、必ずしもこれらに限られるものでは無い。
【００４５】
（ｉ）（Ａ）又は（Ｂ）の遺伝子に対するsiRNA遺伝子、shRNA遺伝子、miRNA遺伝子、アンチセンスRNA、核酸アプタマー、又はリボザイム等を含む、遺伝子発現制御等に用いられる各種の核酸物質、各種の核酸分解酵素、及び各種の低分子性化合物等。
（ｉｉ）（Ａ）又は（Ｂ）に対する抗体、ペプチドアプタマー、サイクリックマクロペプチド、又は各種のプロテアーゼ等を含む、蛋白質を制御するのに用いられる各種のペプチド或いは蛋白質類、及び各種の低分子性化合物等。
【００４６】
（ｉ）の（Ａ）又は（Ｂ）の遺伝子に対するsiRNA遺伝子、shRNA遺伝子、miRNA遺伝子、アンチセンスRNA、核酸アプタマー、リボザイム等は、公知の知見に基づいて適宜設計することが可能であるが、siRNA遺伝子としては、例えば後述する表１に記載したようなものを購入することが出来るほか、Sigma社等に設計依頼することも可能である。
尚、核酸アプタマーは、ランダム配列からなる公知の巨大ライブラリー等からのスクリーニングによって得ることが一般的である。
【００４７】
（ｉｉ）の（Ａ）又は（Ｂ）に対する抗体は、公知の方法に従い、（Ａ）又は（Ｂ）を抗原として、適当な宿主に免疫することや、常法に従った人工的な合成等によって作製することができるが、公知の抗体として表２記載のようなものを購入することもできる。
【００４８】
本発明において抗体とは、モノクローナル抗体（mAb）、ポリクローナル抗体（pAb）、もしくはキメラ抗体やヒト化抗体のいずれであっても良く、ファージ抗体であっても良い。
【００４９】
本発明において、抗体を各種の「制御剤」や「予防又は治療剤」に用いる場合には、制御ターゲットが明確なため、モノクローナル抗体が好ましい。
但し、後述する本発明のスクリーニング方法に使用する際には、ポリクローナル抗体でも良い。
【００５０】
尚、ペプチドアプタマーも、上述の核酸アプタマー同様、公知の巨大ライブラリー等からのスクリーニングによって得ることが一般的である。
【００５１】
（（Ａ）又は（Ｂ）蛋白質又はその遺伝子の量や機能を、促進（増加）する物質）
「（Ａ）又は（Ｂ）蛋白質又はその遺伝子の量や機能を、促進する物質」としては、
「（Ａ）又は（Ｂ）蛋白質又はその遺伝子の発現量を増加させる物質」
「（Ａ）又は（Ｂ）蛋白質又はその遺伝子」そのもの
「（Ａ）又は（Ｂ）蛋白質又はその遺伝子の機能を促進する物質」
等が挙げられる。
【００５２】
具体的には、下記のようなものが挙げられるが、必ずしもこれらに限られるものでは無い。
【００５３】
（ｉ）（Ａ）又は（Ｂ）の遺伝子又はその改変体
（ｉｉ）（Ａ）又は（Ｂ）蛋白質又はその誘導体
【００５４】
本発明において（ｉ）の「遺伝子」とは、アデニン（A）、グアニン（G）等のプリン塩基や、チミン（T）、ウラシル（U）、シトシン（C）等のピリミジン塩基やそれらの修飾塩基を構成要素として含むポリヌクレオチドであり、一本鎖又は二本鎖のDNA、cDNA、一本鎖又は二本鎖のRNA、一本鎖DNAと一本鎖RNAからなるハイブリッド体、RNAとDNAが結合して一本鎖となったキメラ体をも含むものである。
（ｉ）の「改変体」には、当該遺伝子としての機能を損なわない範囲で、１乃至数個の核酸を「欠失」、「置換」、「付加」、又は「挿入」した、核酸配列自体の改変体の他、「メチル化」、「リン酸化」、「アミノ基修飾」その他の、核酸医薬等に用いられる公知の修飾を施したもの等が含まれる。
【００５５】
本発明において、遺伝子は、プラスミド、ウイルスベクター等の形態で用いることができ、その際には、一本鎖であっても二本鎖であっても構わない。
【００５６】
これらの遺伝子は、常法に従い、DNA合成装置や形質転換細胞等を用いて人工的に合成する、天然に存在するポリヌクレオチドを抽出する、天然からの抽出ポリヌクレオチドの塩基の一部を欠失、置換、付加、挿入する、目的とする配列と相補的な配列を用い、逆転写酵素やDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ等によって目的の配列のものを合成させる、これらの方法で得られたポリヌクレオチドの塩基を修飾する等の方法によって製造することができる。
【００５７】
本発明の（ｉｉ）の（Ａ）又は（Ｂ）蛋白質は、いずれも公知の蛋白質である。
【００５８】
（Ａ）の蛋白質
【００５９】
ANKFY1：Ankyrin repeat and FYVE domain containing 1、あるいは別名: Rabankyrin-5, ANKHZN, BTBD23, ZFYVE14等とも呼ばれる約1200個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC02023」等として、市場から入手可能である。
【００６０】
KCTD18：potassium channel tetramerization domain containing 18、あるいは別名: 6530404F10Rik等とも呼ばれる約400個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC21268E」等として、市場から入手可能である。
【００６１】
BTBD7：BTB (POZ) domain containing 7、あるいは別名: FUP1等とも呼ばれる約1100個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC01173」等として、市場から入手可能である。
【００６２】
CCIN：calicin、あるいは別名: BTBD20, KBTBD14等とも呼ばれる約600個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC08991」等として、市場から入手可能である。
【００６３】
KCTD2：potassium channel tetramerization domain containing 2と呼ばれる約250個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC11364」等として、市場から入手可能である。
【００６４】
KLHL18：kelch like family member 18と呼ばれる約600個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC05762」等として、市場から入手可能である。
【００６５】
KLHL34：kelch like family member 34と呼ばれる約650個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC27326」等として、市場から入手可能である。
【００６６】
ZBTB6：zinc finger and BTB domain containing 6、あるいは別名: ZID, ZNF482等とも呼ばれる約400個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC03234」等として、市場から入手可能である。
【００６７】
（Ｂ）の蛋白質
【００６８】
SNX9：sorting nexin 9、あるいは別名: SDP1, SH3PX1, SH3PXD3A, WISP等とも呼ばれる約600個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC03587」等として、市場から入手可能である。
【００６９】
SNX 11：sorting nexin 11と呼ばれる約250個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC26087M」等として、市場から入手可能である。
【００７０】
SNX 17：sorting nexin 17と呼ばれる約500個のアミノ酸からなる公知のタンパク質であり、例えば、Promega社製の「FHC00391」等として、市場から入手可能である。
【００７１】
また、（ｉｉ）の「誘導体」とは、各蛋白質の前駆体や、反応性官能基を保護したもの、側鎖を各種の置換基や糖鎖等で修飾したもの等が含まれる。
【００７２】
（Ａ）又は（Ｂ）の遺伝子及びアミノ酸の配列は、下記のデータベース等に記載されている。
「NCBI CCDS database 」
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi）
【００７３】
本発明の各種の制御剤は、本発明のユビキチンリガーゼコンポーネント又はユビキチンリガーゼ等と同様に、細胞接着性又は血管新生の異常に起因する疾患の予防又は治療剤としても用いることができる他、実験室内における実験・研究試薬として、例えば本発明のスクリーニング方法等に用いる試薬の一部としても、非常に利用価値の高いものである。
【００７４】
尚、実験・研究試薬としては、上記の成分の他、一般に実験・研究試薬に用いられている溶媒その他の各種添加剤等を含有させることができる。
【００７５】
［本発明の疾患予防又は治療剤］
本発明の疾患の予防又は治療剤は、上記本発明の制御剤を含み、細胞接着性又は血管新生の異常に起因する疾患を予防又は治療し得ることを特徴とするものである。
【００７６】
（その他の成分）
本発明の予防又は治療剤には、上記本発明の「制御剤」の他、本発明の目的を阻害しない範囲で、他の成分を含有させることができ、例えば、以下のようなものが挙げられる。
【００７７】
賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、乳化剤、可溶化剤、吸収促進剤、保湿剤、吸着剤、充填剤、増量剤、付湿剤、防腐剤等。
賦形剤としては、有機系賦形剤及び無機系賦形剤等が挙げられる。
【００７８】
（剤形）
本発明の予防又は治療剤の剤形は、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ、もしくはシロップ剤、注射やカテーテル用の液剤等の形態が挙げられる。
【００７９】
（有効成分の含有量）
本発明の予防又は治療剤中の、有効成分（本発明の各種制御剤）の含有量は、剤形によって様々であり、一概に限定できず、各種剤形化が可能な範囲で、投与量との関係で適宜選択すれば良いが、例えば液剤の場合、好ましくは０．０００１〜１０（ｗ／ｖ％）、より好ましくは０．００１〜５（ｗ／ｖ％）、特に注射剤の場合、好ましくは０．０００２〜０．２（ｗ／ｖ％）、より好ましくは０．００１〜０．１（ｗ／ｖ％）、固形剤の場合、好ましくは０．０１〜５０（ｗ／ｗ％）、より好ましくは０．０２〜２０（ｗ／ｗ％）等として調製できるが、必ずしもこの範囲に限定されるものでは無い。
【００８０】
（製造方法）
本発明の予防又は治療剤は、上記の成分を用いて、周知の方法で製剤化することができる。
【００８１】
《その他の合剤》
本発明の予防又は治療剤は、他の公知の細胞接着性制御剤や血管新生制御剤等との合剤として用いることができる。
【００８２】
（投与経路）
本発明の予防又は治療剤の投与経路としては、全身投与と局所投与があり、いずれでも良く、具体的には、経口投与、静注等の静脈投与、筋注等の筋肉内投与、カテーテル投与、経皮投与、経鼻投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、直腸内投与、粘膜投与、吸入、関節腔内投与等が挙げられ、治療目的の疾患、症状等に応じて、適宜選択することができる。
【００８３】
（投与方法）
本発明の予防又は治療剤が、siRNA等を含む遺伝子治療剤の形態を取っている場合には、例えば、プラスミドを用いる場合、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００８４】
ウイルスベクターを用いる場合、公知の方法に従って、ウイルスに、目的とする遺伝子を組み込むことによって行うことができる。
【００８５】
ウイルスベクターに用いるウイルスとしては、例えば、無毒化した、レトロウイルス（レンチウイルス等）、アデノウイルス、アデノ関連（随伴）ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、ＳＶ（シミアンウイルス）４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等の、各種ＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスが挙げられる。
【００８６】
ウイルスの中では、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等が好ましく、特に感染効率が高いアデノウイルスが好ましい。
【００８７】
遺伝子を実際に医薬として作用させるには、当該遺伝子を直接体内に導入する「ｉｎ  ｖｉｖｏ法」の他、ヒトから採集した細胞に当該遺伝子を導入し、その後、遺伝子導入細胞を体内に戻すという、「ｅｘ  ｖｉｖｏ法」等がある。
【００８８】
「ｉｎ  ｖｉｖｏ法」は費用や手間が少なく、簡便である点で好ましく、「ｅｘ  ｖｉｖｏ法」は、遺伝子の細胞内への導入効率が良いという点で好ましい。
【００８９】
「ｉｎ  ｖｉｖｏ法」により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択することができる。投与経路としては、例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内、胃（カテーテル経由）等が挙げられる。
【００９０】
「ｉｎ  ｖｉｖｏ法」によって投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとることができる。一般的には遺伝子を含有する注射剤等の形態が好ましく、必要に応じて、注射剤等に常用されている各種の成分等を加えることもできる。
【００９１】
また、遺伝子を含有するリポソーム又は膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態として用いることができる。
【００９２】
（投与量）
本発明の予防又は治療剤の投与量は、投与経路、症状、患者の年齢、体重、予防又は治療剤の形態等によって異なるが、例えば、予防又は治療剤中の有効成分の量が、処置を必要としている対象体重１ｋｇ当たり好ましくは０．００５〜５００ｍｇ、より好ましくは、０．１〜１００ｍｇ、但し、成人に対して１日あたり、下限として好ましくは０．０１ｍｇ（より好ましくは０．１ｍｇ）、上限として、好ましくは２０ｇ（より好ましくは２０００ｍｇ、更に好ましくは５００ｍｇ、特に好ましくは１００ｍｇ）となるように、１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。
【００９３】
尚、本発明の予防又は治療剤中の有効成分が、遺伝子の場合、例えば、遺伝子として０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１０ｍｇ等を、数日乃至数ヶ月に１回程度等投与するのが好ましい。
【００９４】
《対象疾患》
本発明の予防又は治療剤の、予防又は治療の対象となる疾患は、細胞接着性又は血管新生の異常に起因する疾患である。
【００９５】
細胞接着性の異常に起因する疾患としては、例えば、癌細胞転移、白血球接着不全（血管内皮細胞への白血球接着不全）、血小板無力症（血管内皮細胞への血小板の付着不全）の他、各種の炎症性疾患（血管内皮細胞間接着の不全）等が挙げられる。
【００９６】
血管新生の異常に起因する疾患としては、例えば、「癌」、「糖尿病」、「動脈硬化」、「心筋梗塞」、「眼内血管新生病（糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、水晶体後線維増殖症、角膜血管新生、血管新生緑内障）」、「関節リュウマチ」、「尋常性乾癬」、「粥状動脈硬化症」、「虚血性心疾患」、「アルツハイマー病」等が挙げられる。
【００９７】
［本発明のユビキチンリガーゼコンポーネント］
本発明のユビキチンリガーゼコンポーネントとしては、下記の（Ａ）又はその誘導体が挙げられる。
【００９８】
（Ａ）は、CUL3をリガーゼ活性本体とする、ユビキチンリガーゼの、アダプターコンポーネントとして機能する蛋白質であることが判明した。
【００９９】
（Ａ）ANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質
【０１００】
本発明のユビキチンリガーゼコンポーネントは単独で、あるいは、他のコンポーネント（CUL3、Rbx１、Nedd8等）と共にユビキチンリガーゼとして用いることで、上記の本発明の制御剤や、疾患の予防又は治療剤として用いることができる。
【０１０１】
［本発明のユビキチンリガーゼ］
本発明のユビキチンリガーゼは、上記本発明のユビキチンリガーゼコンポーネントを含むことを特徴とするものである。
つまり、アダプター部位として（Ａ）を、リガーゼ活性本体としてCUL3を、含むものである。
【０１０２】
本発明のユビキチンリガーゼは、この他、E2と相互作用し、Ub蛋白質を基質に接近させることによってUb化に寄与する部位（Rbx１等）や、ユビキチンリガーゼ活性のスイッチの役割を果たす物質（Nedd8等）等を含むことができる。
【０１０３】
［本発明のスクリーニング方法］
本発明のスクリーニング方法は、下記（Ｉ）又は（II）の制御能を指標とし、「細胞外マトリックスへの細胞接着性の制御剤」又は「血管新生制御剤」をスクリーニングすることを特徴とするものである。
【０１０４】
（Ｉ）下記（Ａ）とCUL3の間の相互作用
（II）下記（Ｂ）のユビキチン（Ub）化
【０１０５】
（Ａ）ANKFY1、KCTD18、BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6からなる群から選択される少なくとも一種のBTB蛋白質
（Ｂ）SNX9、SNX 11、SNX 17からなるから群選択される少なくとも一種の蛋白質
【０１０６】
「（Ｉ）又は（II）の制御能を指標とする」とは、候補物質の添加で、「（Ｉ）又は（II）」が、阻害または促進されるか否かを調べることによって、候補物質の選択の可否を決定することを意味している。
【０１０７】
（Ｉ）の確認方法：
「（Ａ）とCUL3の間の相互作用」は、蛋白質相互作用を確認できる常法によって確認することができ、例えば、酵母ツーハイブリッド法や、共免疫沈降法、プルダウンアッセイ法のほか、下記試験例等でも用いているAlphaScreenTMシステム等が挙げられる。
【０１０８】
（AlphaScreenTMシステム）
AlphaScreenTMシステムとは、PerkinElmer社の公知のシステムであって、主に次のような原理・手法を用いるものである。
（詳細は、"http://www.perkinelmer.com/category/alpha-kits"等参照）
【０１０９】
（原理）
相互作用を確認したい2つの蛋白質を、それぞれ下記（１）、（２）のビーズに結合させる。
2つの蛋白質が相互作用（結合）し、（１）、（２）のビーズが200nm以内の範囲内に近接した時に初めて、（２）内部のチオキシン誘導体の発光が生じる。
この発光シグナルを検出することによって、蛋白質の相互作用を確認することができる。
【０１１０】
（使用ビーズ）
（１）Donor Beads（PerkinElmer社製）：フタロシアニン（680nmの光を受けることで周囲の酸素を励起させ、一重項酸素に変換する、フォトセンシタイザー）を内部に含むビーズ。
（２）Acceptor Beads（PerkinElmer社製）：チオキシン誘導体（一重項酸素から受け取ったエネルギーによって520〜620nmの光を発する）を内部に含むビーズ。
【０１１１】
（各被験蛋白質とビーズの結合）
例えば、下記の関係を利用することができる。
「ストレプトアビジン」−「ビオチン」
「抗原」−「抗体」（例：（「FLAGタグ」及び「抗FLAG抗体」）
【０１１２】
（発光シグナルの検出）
EnVision Reader （PerkinElmer社製）等を用いて検出できる。
尚、AlphaScreenTMシステムによれば、発光シグナルの値が、バックグラウンドの値の10倍を超えている場合に、直接結合していると判断できる。
【０１１３】
（II）の確認方法：
「（Ｂ）のUb化」は、例えば、（Ｂ）へのUbの付加反応を、リコンビナントUb蛋白質を用いて、試験管内で再現することによって確認できるが、付加されたUb蛋白質の個数を検出することによって、「Ub化のタイプ（モノ、ジ、ポリUb化等）」も確認することができる。
【０１１４】
つまり、上記のような（Ｉ）又は(II）の確認方法を用い、候補物質の添加による「（Ｉ）又は（II）」の確認結果への影響を調べることによって、候補物質の中から「細胞接着性の制御剤又は血管新生制御剤」をスクリーニングすることができるのである。
【実施例】
【０１１５】
［実施例１：E3コンポーネント］
上述した、（Ａ）のBTB蛋白質又はその誘導体を用いて、本発明のE3コンポーネントを製造する。
これらのE3コンポーネントを用いることによって、E3の生成を促進し、E3基質のUb化を通じて、Integrinβ１の細胞膜への局在化を促進し、Integrinβ１の細胞外マトリックスへの接着の促進を通じた血管新生促進，ひいては血管新生低下に起因する疾患の予防又は治療が可能と考えられる。
【０１１６】
［実施例２：本発明の各種制御剤］
蛋白質製剤や核酸医薬等を製造する常法を使用し、上述した（Ａ）又は（Ｂ）の蛋白質又はその誘導体、それらの遺伝子又はその改変体、各遺伝子に対するsiRNA分子、shRNA遺伝子、miRNA遺伝子、アンチセンスRNA、核酸アプタマー、リボザイム、各種の核酸分解酵素、各種の低分子性化合物、又は公知の免疫方法等によって得られる（Ａ）又は（Ｂ）の蛋白質に対する抗体、ペプチドアプタマー、サイクリックマクロペプチド、各種のプロテアーゼ、各種の低分子性化合物等を含む、本発明の各種制御剤を製造する。
より具体的には、例えば（Ａ）又は（Ｂ）蛋白質、それらの遺伝子、表１記載の各種のsiRNA遺伝子、又は表２記載の各種の抗体等を使用する。
【０１１７】
これらの各種制御剤によって、SNX蛋白質等のE3基質のUb化制御を介して、Integrinβ１の細胞内局在を制御し、Integrinβ１の細胞外マトリックスへの接着の制御を通じた血管新生の制御，ひいては細胞接着性又は血管新生の異常に起因する疾患の予防又は治療が可能と考えられる。
【０１１８】
［試験例］
以下の試験例によって、本発明の各種の制御剤等の効果を確認した。
【０１１９】
尚、各試験例において用いたsiRNA、蛋白質の分離・検出方法、検出用抗体等は下記の通りである。
【０１２０】
《材料及び方法：Material and method》
（siRNA試薬）
下記のコントロール（siCONT）以外の、各試験例で使用したsiRNA試薬の配列は、表１及び配列表に示した通りである。
【０１２１】
（コントロールsiRNA）：
siCONT＃１：MISSION siRNA Universal Negative Control #1（型番：SIC-001）
siCONT＃２：Stealth RNAi siRNA Negative Control, Med GC (型番：12935300)
【０１２２】
（蛋白質の分離）
７．５％、１５％ゲルまたは、１０−２０％グラジエントゲルによる、SDS-PAGE電気泳動によって、被験試料中の蛋白質を分離し、下記方法による蛋白質の検出に用いた。
【０１２３】
（蛋白質の検出：Western Blotting）
SDS-PAGE電気泳動で用いたゲルから、PVDF膜（Bio-Rad社製）に蛋白質を転写した後、表２記載の一次抗体、二次抗体、二次抗体の標識等を用いて、Western Blottingによる蛋白質検出を行った。
【０１２４】
二次抗体標識の発光基質としては、ECL Prime Western Blotting Detection Reagent （GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた。
【０１２５】
（Western Blottingにおける検出機器）
CCDカメラタイプ画像解析装置：
Image Quant LAS-4000（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）
【０１２６】
（蛋白質の検出：細胞中の免疫染色）
4 % PFA-PBSで細胞を固定し、0.1 % Triton-PBSで膜透過し、3 % BSA-PBSでブロッキングした後、表２記載の一次抗体、二次抗体、二次抗体の標識を用いて、免疫染色法によるタンパク質の細胞内における可視化を行った。
【０１２７】
（免疫染色における検出機器）
顕微鏡は、A1R共焦点顕微鏡 (Nikon社製)を用いた。
【０１２８】
（AlphaScreenTM）
「CUL3」（リガーゼ活性本体）と「（Ａ）のBTB蛋白質（E3アダプター）」間の相互作用、アダプター蛋白質と基質候補蛋白質の相互作用等は、上述の公知のAlphaScreenTMシステムを用いて確認した。
【０１２９】
尚、AlphaScreenTMシステムには、下記の２種のビーズを用いた。
【０１３０】
（ビオチンタグ結合蛋白質の捕獲用ビーズ）
上述の（１）のDonor Beads（PerkinElmer社製）に、ストレプトアビジンを結合したもの。
【０１３１】
（FLAGタグ結合蛋白質の捕獲用ビーズ）
上述の（２）のAcceptor Beads（PerkinElmer社製）に、ProteinAを介して抗FLAG抗体（抗DYKDDDDK抗体、Wako社製）を結合させたもの。
【０１３２】
384-AlphaScreen plateのwellに、相互作用を確認したい蛋白質の一方（FLAGタグ結合蛋白質）を、分注した。
【０１３３】
当該wellに、もう一方の蛋白質（ビオチンタグ結合蛋白質）を分注し、更に、上記のAcceptor Beads及びDonor Beadsを添加後（Total volume :25 μL、 Buffer組成: 100 mM Tris-HCl、pH 7.5、 1 mg/mL bovine serum albumin、0.1% Tween 20、100 mM NaCl）、1時間室温でインキュベートした。
分注にはFlexDrop dispenser (PerkinElmer社製)を用いた。
【０１３４】
発光シグナルは、EnVision Reader （PerkinElmer社製）を用いて検出した。
【０１３５】
【表１】
2019064968.tif 000002
【０１３６】
（上記配列中、小文字はRNA、大文字はDNAを表す。）
【０１３７】
【表２】
2019064968.tif 000003
【０１３８】
［試験例１：ANKFY1遺伝子制御物質の利用］
ANKFY1遺伝子制御物質の一種であるsi ANKFY1を用いた本発明の各種の制御剤の、効果を確認した。
【０１３９】
《試験例１−１：si ANKFY1による、細胞外マトリックスへの細胞接着性の制御》
〈実験手順：Protocol〉
（ANKFY1のノックダウン）
コントロールsiRNA（siCONT＃２）又は表１記載のsiANKFY1 （＃１、＃２）を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションし、細胞外マトリックスタンパク質を含む基底膜（BD Matrigel登録商標）の上に播種した。
【０１４０】
（細胞伸展の確認）
細胞の基底膜への接着１時間後の伸展の状況を、細胞膜蛋白質であるIntegrinβ１を指標に観察した。
Integrinβ１は、表２記載の抗Integrinβ１抗体等を用いた免疫染色により、上述の検出機器で検出した。結果を図１−１Ａに示す（図中のバー：20μm）。
【０１４１】
（細胞面積の測定）
図１−１Ａで検出された細胞の面積を測定し、図１−１Ｂに示した。データは、３つの独立した実験において、７０個以上の細胞で測定した平均値を示す。
データは平均の±標準誤差を示す（***：p＜0.001）。
【０１４２】
〈結果〉
ANKFY1遺伝子の発現を阻害することによって、HUVECの基底膜上での伸展（Integrinβ１のECMへの接着性）が阻害され（図１−１Ａ）、細胞面積も縮小していた（図１−１Ｂ）。
【０１４３】
〈考察〉
上記により、ANKFY1遺伝子制御物質が、Integrinβ１のECMへの接着性の制御を介した、細胞接着性の制御剤となり得ることが分かった。
【０１４４】
《試験例１−２：si ANKFY1による血管新生制御》
〈実験手順：Protocol〉
（ANKFY1又はCUL3のノックダウン）
コントロールsiRNA（siCONT＃２）、表１記載のsiCUL3＃１、又はsiANKFY1 ＃１を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションした。
【０１４５】
（血管新生の確認）
コラーゲンサンドイッチ法を用いて、以下の様にして、上記のHUVECを培養した。
【０１４６】
具体的には、12-wells dishの各wellの底に、コラーゲンゲル（Cellmatrix Type I-A （新田ゼラチン株式会社製）100μLを敷いて固め、その上に各HUVECを播種し、再び100μLのコラーゲンゲルでサンドして固めた。次に、培地中の濃度が50 ng/ mlとなるように、VEGF-A（R&D社製）を添加することで、血管新生を誘導した。 
血管新生の有無は、VEGF-A刺激６６時間後、培地中に、F-actinに特異的に結合するRhodamine phalloidin （Thermo Fisher Scientific社製）の1000倍希釈液を添加して染色した、血管内に存在するF-actinの蛍光写真を、60分後、A1R共焦点顕微鏡（Nikon社製）にて撮影することで、確認した（図１−２：バー：200μm）。
【０１４７】
〈結果〉
siCUL3をトランスフェクションした場合と同様に、ANKFY1遺伝子の発現の阻害によって、血管新生が阻害されていた。
【０１４８】
〈考察〉
上記により、ANKFY1遺伝子制御物質が、血管新生の制御剤となり得ることが分かった。
【０１４９】
《試験例１−３：ANKFY1とCUL3の相互作用の確認》
〈実験手順：Protocol〉
（トランスフェクション）
ANKFY1とCUL3が、実際に細胞内で相互作用していることを確認するため、遺伝子導入効率が良く扱いやすい、ヒト胎児由来腎臓上皮細胞HEK293T細胞（DMEM培地、 Wako株式会社製）に、リポフェクション試薬「GeneJuice」(Millipore社製)を用いて、図１−３に示したような組み合わせで、FLAG標識CUL3、HA標識ANKFY1（ANKFY1-HA又はHA-ANKFY1）又はMyc標識Nedd8をトランスフェクションし、強制発現させた。
【０１５０】
（細胞溶解液の回収）
上記の培養細胞を、Buffer （1% NP40(Nonidet p-40)、150 mM NaCl、25 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、5 % glycerol、pH 7.4）にて処理し、細胞溶解液を回収した。
【０１５１】
（Input試料）
10000 gで遠心分離し、上清を回収後、一部を「Input」試料とした。
【０１５２】
（IP（HA）試料）
「Input」試料を回収した後の残った上清に、表２記載の抗HA抗体（ラビット抗HA pAb）を添加し、HA標識ANKFY1を免疫沈降させ、「IP（HA）」試料とした。
【０１５３】
（蛋白質の分離・検出）
「Input」試料及び「IP（HA）」試料について、表２の一次抗体、二次抗体等を用いて、上述のSDS-PAGE（１０−２０％グラジエントゲル使用）、Western Blottingによって、蛋白質の検出を行った結果を、図１−３に示す。
「＊」で示されているものが、Nedd8化CUL3である。
尚、「＊」と共に「抗CUL3抗体」で検出された真下のバンドは、Nedd8化CUL3（単体）と共に、Nedd8化CUL3とのヘテロダイマーその他の多量体として共に免疫沈降されたフリーのCUL3が、SDS-PAGE処理等によって分離したものや、Nedd8化CUL3の一部のNedd8が脱落したもの等であると思われる。
【０１５４】
また、図中の「heavy chain」、「light chain」とは、Western Blottingの際に用いた変性剤等によって立体構造が破壊された、上記の抗HA抗体（ラビット抗HA pAb）のものと考えられる。
「ラビット抗HA pAb」の「heavy chain」や「light chain」が、Myc標識Nedd8検出用ゲル上で同時に検出されたのは、マウスIgGとラビットIgGの配列が非常に似ていることによって、表２記載のMyc検出用二次抗体（ヤギ抗マウスIgG mAb）が「ラビット抗HA pAb」（「heavy chain」、「light chain」）に反応してしまったためであると思われる。
【０１５５】
更に、免疫沈降前の「Input」試料の検出結果で、Myc-Nedd8無添加の左側の３レーンでも、Nedd8化CUL3（＊印）が検出されているのは、内在性のNedd8によるものと考えられる。
尚、内因性Nedd8によるCUL3の割合が、フリーのCUL3に対して少ないことからも分かる通り、細胞内において、Nedd8化と脱Nedd8のバランスは既知の酵素群によって厳密に制限され、常にNedd8化CUL3の量は低く維持されていることが知られている。
【０１５６】
〈結果〉
図が示す通り、「IP（HA）」試料においては、FLAG標識CUL3、HA標識ANKFY1に加えて、Nedd8を強制発現させた場合に限り、CUL3が明瞭に検出された（図１−３、「IP（HA）」の右端の２レーン）。
【０１５７】
尚、Nedd8阻害剤（MLN-4924、Boston Biochem社製）を添加して同様の実験を行った場合には、Myc標識Nedd8を強制発現させても、CUL3が検出されなかった（図示せず）。
【０１５８】
〈考察〉
上記により、ANKFY1はCUL3と相互作用することが確認された。
つまり、ANKFY1が、基質をUb化するためのアダプターとして、CUL3と共にE3のコンポーネントとなっていることが判明した。
【０１５９】
一方、ANKFY1とCUL3の相互作用には、Nedd8のようなE3用補助因子が必須であることも、同時に判明した。
【０１６０】
尚、HA標識をN末端に付加したANKFY1-HAも、Ｃ末端に付加したHA-ANKFY1も、共にCUL3と相互することが分かったが、細胞内での発現効率は、ANKFY1-HAの方が高かったため、相互作用の確認試薬としては、ANKFY1-HAが適していることが分かった。
【０１６１】
《試験例１−４：siCUL3による表現型》
〈実験手順：Protocol〉
（CUL3のノックダウン）
コントロールsiRNA（siCONT＃１）又は表１記載のsiCUL3＃１を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションし、基底膜（BD Matrigel登録商標）の上に播種した。
【０１６２】
（細胞伸展の確認）
細胞の基底膜への接着１時間後の伸展の状況を、接着斑（Focal adhesion）マーカーであるパキシリン（paxillin）、ビンキュリン（vinculin）に対する表２記載の抗体を用いて免疫染色することにより観察した結果を、図１−４Ａに示す（バー： 20μm）。
【０１６３】
（細胞面積の確認）
また、図１−４Ａのうち、ビンキュリンで観察した細胞面積の平均値を図１−４Ｂに示す（***：p＜０．００１）。
【０１６４】
（ECMへの接着性の確認）
CytoSelect（登録商標）48ウェル細胞接着分析キットを用いて、下記の様にして、siCUL3＃１をトランスフェクトしたHUVECの、各種のECM蛋白質に対する接着性を確認した。
【０１６５】
（トランスフェクション）
siCUL3のトランスフェクション72時間後のHUVECを、トリプシンを含む溶液により処理した後、EGM-2培地で回収した。
【０１６６】
（ECM蛋白質への接触）
次に、上記のトランスフェクト細胞を、1 x 104 cells/wellになるように、well毎に各種のECM蛋白質を予め塗布したCytoSelect（登録商標）48-wellに播種した。
その後、1時間37℃でインキュベートした。
【０１６７】
（細胞の染色）
PBSで4回洗浄し、ECM蛋白質に接着していない細胞を除去した後、Cell Stain Solution (CELL BIOLABS社製)を200 μlずつ各ウェルに加え、10分間室温でインキュベートして、ECM蛋白質接着細胞に取り込ませた。
【０１６８】
（吸光度の測定）
Extraction Solution (CELL BIOLABS社製)を200μlずつ各ウェルに加え、10分間室温でインキュベートして、細胞を破壊し、色素が溶け出した溶液（150μl）を回収し、その吸光度 (OD560)を測定することによって、ECM蛋白質に接着した細胞数の指標とした。
【０１６９】
尚、吸光度が大きいほど、各ECM蛋白質に接着した細胞数が多いことを示す。
【０１７０】
結果を、図１−４Ｃに示す（**：p＜０．０１）。
【０１７１】
（CUL3のノックダウン）
上記と同様にコントロールsiRNA（siCONT＃１）又は表１記載のsiCUL3＃１を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションした。
【０１７２】
（Integrinα２及びIntegrinβ１の細胞内局在）
上記トランスフェクション細胞内の、Integrinα２、Integrinβ１を、表２に記載の抗Integrinα２抗体、及び抗Integrinβ１抗体等を用いて検出した（図１−４Ｄ／バー：20μm）。
尚、図１−４Ｄの左から３列目は、左の２列の写真（「Integrinα２」と「Integrinβ１」の検出結果）を「マージ」したものであり、一番右の列は、「マージ」写真内の枠で囲った部分の拡大図である。
【０１７３】
（Integrinα２の細胞内発現量）
コントロールsiRNA（siCONT＃１）又は表１記載のsiCUL3＃１を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションし、表２の一次抗体、二次抗体等を用いて、上述のSDS-PAGE（７．５％ゲル使用）、Western Blottingによって、Integrinα２及びCUL3の検出を行った結果を、図１−４Ｅに示す。
尚、コントロールとしてGAPDH（SDS-PAGEでは、１５％ゲル使用）を用いた。
【０１７４】
〈結果〉
CUL3がノックダウンされた細胞は、コントロール細胞のような葉状仮足が見られず、細胞はほとんど円形のままであり（図１−４Ａ）、細胞面積もコントロールの３０％程度であった（図１−４Ｂ）。
また、CUL3のノックダウンによって、細胞のIV型コラーゲン（ECMの一種）への接着性が、特に減少していることが分かった（図１−４Ｃ）。
コントロール細胞では、Integrinα２は、Integrinβ１と同様、原形質膜上に主に発現しているのに対し、CUL3がノックダウンされた細胞では、Integrinα２（ヘテロダイマーを形成するIntegrin蛋白質の、もう一方のα鎖サブユニット）も、細胞内の小さな斑点に見られるように、Integrinβ１と共に、細胞内に局在化されていることが判明した (図１−４Ｄ：矢印部分)。
Integrinα２の細胞における全タンパク質発現レベルが、CUL3のノックダウンによって変化しなかったことから(図１−４Ｅ)、局在化したIntegrinα２は、原形質膜上から細胞内に移動したものであることが分かる。
【０１７５】
〈考察〉
上記の図１−４Ａ〜Ｅ及び上述の図１−２中段の結果から、CUL3は、Integrinα２やIntegrinβ１等のIntegrin蛋白質の細胞内局在を仲介することによって、細胞のIV型コラーゲン（ECM）への接着性を阻害し、ひいては血管新生を阻害していることが判明した。
【０１７６】
《試験例１−５：si ANKFY1によるIntegrinβ１の細胞内局在とレスキュー試験》
〈実験手順：Protocol〉
（ANKFY1のノックダウン）
コントロールsiRNA（siCONT＃２）又は表１記載のsiANKFY1＃３を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションし、表２の一次抗体、二次抗体等を用いて、上述のSDS-PAGE（１０−２０％グラジエントゲル使用）、Western Blottingによって、Integrinβ１、ＨＡ、及びANKFY1の検出を行い、その結果を図１−５Ａに示す。
【０１７７】
尚、ANKFY1のノックダウンのレスキュー試験として、siANKFY1と共に、siANKFY1 耐性としたANKFY1-HAをレンチウイルスによって導入したものについても、同様に蛋白質の検出を行った（図１−５Ａ：右端のレーン）。
「siANKFY1耐性のANKFY1-HA」は、siANKFY1＃３のノックダウン標的部位（ANKFY1 mRNAの3'末端非翻訳領域）に対応する配列を含まないANKFY1 cDNAを用い、レンチウイルスによって、HUVECに導入した。
コントロールとしては、GAPDH（SDS-PAGEでは、１５％ゲル使用）を用いた。
【０１７８】
（Integrinβ１とANKFY1-HAの細胞内局在）
上述の通り、ANKFY1のノックダウンとレスキューを施したHUVECについて、Integrinβ１とANKFY1-HAの細胞内局在を、免疫染色によって確認した結果を図１−５Ｂに示す（バー：20μm）。
尚、図１−５Ｂの左から３列目は、左の２列の写真（「ANKFY1-HA」と「Integrinβ１」の検出結果）を「マージ」したものであり、一番右の列は、「マージ」写真内の枠で囲った部分の拡大図である。
【０１７９】
〈結果〉
siANKFY1＃３で内因性のANKFY1をノックダウンした場合と同様に、ノックダウンとともにsiANKFY1 耐性のANKFY1を同時に導入した場合、コントロール（siCONT＃２）と比較して、Integrinβ１の全発現量に変化は無いものの（図１−５Ａ）、siANKFY1によるIntegrinβ１の細胞内局在が、回復した（図１−５Ｂ）。
尚、このsiANKFY1＃３と同様、siANKFY1＃１、＃２によるノックダウンによって、Integrinβ１のみならずIntegrinα２について、コントロールと比較して、細胞内における全発現量に変化が無かったことも、Western Blottingによって確認されている（図示せず。）。
更に、Alexa488標識TS2/16（抗Integrinβ１抗体）を用い、細胞表面のIntegrinβ１のみを検出した実験によって、siANKFY1（＃１、＃２）処理では、細胞表面Integrinβ１が、siCONT処理の、各々４０％、２０％程度まで落ちていることも、免疫染色の蛍光強度の定量化によって確認されている（図示せず。）。
【０１８０】
〈考察〉
上記により、siANKFY1によるIntegrinβ１の細胞内局在が、単にsiRNA導入によるサイドエフェクトではないことが証明された。
【０１８１】
《試験例１の総括》
これらの図１−４Ａ〜Ｅが示す通り、CUL3の阻害によっても、ANKFY1阻害の時と同様の表現型（基底膜における細胞伸展（細胞面積）の縮小、ECM（IV型コラーゲン）への接着阻害、Integrinβ１の細胞内局在（膜からの遊離））を示した。
これらと、上述の図１−２中段のCUL3阻害による血管新生阻害や、図１−３のANKFY1とCUL3の相互作用、図１−５Ａ、ＢのANKFY1阻害によるIntegrinβ１の細胞内局在等の結果を考え合わせた結果、ANKFY1遺伝子制御物質による細胞接着性や血管新生の制御、Integrinβ１の挙動の制御等（図１−１Ａ、Ｂ、図１−２下段）は、E3の制御を意味していた、つまりANKFY1がE3のアダプターの一種であったことが分かる。
【０１８２】
［試験例２：KCTD18遺伝子制御物質の利用］
KCTD18遺伝子制御物質の一種であるsiKCTD18を用いた本発明の各種制御剤の、効果を確認した。
【０１８３】
《試験例２−１：siKCTD18による、細胞外マトリックスへの細胞接着性の制御》
〈実験手順：Protocol〉
（KCTD18のノックダウン）
コントロールsiRNA（siCONT＃１）、又は表１記載のsiKCTD18（＃１〜＃３）を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションし、定量PCRによってKCTD18のmRNA発現量を測定した結果を、図２−１Ａに示す。
【０１８４】
（Integrinβ１及びSNX9の細胞内発現量）
コントロールsiRNA（siCONT＃１）、siCUL3＃１、又は表１記載のsiKCTD18（＃１〜＃３）を、上述と同様の方法でトランスフェクションし、表２の一次抗体、二次抗体等を用いて、上述のSDS-PAGE（７．５％ゲル使用）、Western Blottingによって、Integrinβ１及びSNX9の検出を行った結果を、図２−１Ｂに示す。
尚、コントロールとしてGAPDH（SDS-PAGEでは、１５％ゲル使用）を用いた。
【０１８５】
（細胞伸展の確認）
上述の様にsiCONT＃１、又はsiKCTD18（＃１〜＃３）をトランスフェクションした細胞を、細胞外マトリックスタンパク質を含む基底膜（BD Matrigel登録商標）の上に播種した。
細胞の基底膜への接着１時間後の伸展の状況を、細胞膜蛋白質であるIntegrinβ１を指標に観察した。
Integrinβ１は、表２記載の抗Integrinβ１抗体を用いた免疫染色により、上述の検出機器で検出した。結果を図２−１Ｃに示す。
【０１８６】
〈結果〉
siKCTD18の種類によっては、Integrinβ１やSNX9の発現量に多少影響する場合があるものの（図２−１Ｂ）、いずれのsiKCTD18によっても、HUVECの基底膜上での伸展（Integrinβ１のECMへの接着性）が阻害されていた（図２−１Ｃ）。
【０１８７】
〈考察〉
上記により、KCTD18遺伝子制御物質が、Integrinβ１のECMへの接着性の制御を介した、細胞接着性の制御剤となり得ることが分かった。
【０１８８】
《試験例２−２：si KCTD18による血管新生制御》
〈実験手順：Protocol〉
（KCTD18のノックダウン）
コントロールsiRNA（siCONT＃１）、又は表１記載のsiKCTD18（＃１〜＃３）を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションした。
【０１８９】
（血管新生の確認）
コラーゲンサンドイッチ法を用いて、以下の様にして、上記のHUVECを培養した。
【０１９０】
具体的には、12-wells dishの各wellの底に、コラーゲンゲル（Cellmatrix Type I-A （新田ゼラチン株式会社製）100μLを敷いて固め、その上に各HUVECを播種し、再び100μLのコラーゲンゲルでサンドして固めた。次に、培地中の濃度が50 ng/ mlとなるように、VEGF-A（R&D社製）を添加することで、血管新生を誘導した。
血管新生の有無は、VEGF-A刺激６６時間後、培地中に、、F-actinに特異的に結合するRhodamine phalloidin （Thermo Fisher Scientific社製）の1000倍希釈液を添加して染色した、血管内に存在するF-actinの蛍光写真を、60分後、A1R共焦点顕微鏡（Nikon社製）にて撮影することで、確認した。結果を図２−２に示す。
【０１９１】
〈結果〉
KCTD18遺伝子の発現の阻害によって、血管新生が阻害されていた（図２−２）。
【０１９２】
〈考察〉
上記により、KCTD18遺伝子制御物質が、血管新生の制御剤となり得ることが分かった。
【０１９３】
《試験例２−３：si KCTD18によるIntegrinβ１の細胞内局在》
〈実験手順：Protocol〉
（KCTD18のノックダウン）
コントロールsiRNA（siCONT＃１）又は表１記載のsiKCTD18（＃１〜＃３）を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションした。
【０１９４】
（Integrinβ１の細胞内局在）
上記トランスフェクション細胞内のIntegrinβ１を、表２に記載の抗Integrinβ１抗体等を用いて検出した。結果を図２−３に示す。
【０１９５】
〈結果〉
KCTD18がノックダウンされた細胞では、いずれもIntegrinβ１は、細胞内に局在化されていることが判明した（図２−３）。
【０１９６】
〈考察〉
上記により、KCTD18は、Integrinβ１の細胞内局在を仲介することによって、細胞の接着性を制御し、ひいては血管新生を制御していることが判明した。
【０１９７】
《試験例２の総括》
これらの図２−１Ａ〜Ｃ、図２−２、図２−３等の示す表現型は、上述のCUL3の阻害と同様の表現型（基底膜における細胞伸展（細胞面積）の縮小、血管新生の阻害、Integrinβ１の細胞内局在（膜からの遊離））であった。
つまり、KCTD18遺伝子制御物質による細胞接着性や血管新生の制御、Integrinβ１の挙動の制御等は、E3の制御を意味していた、つまりKCTD18もまた、E3のアダプターの一種であったことが分かる。
【０１９８】
［試験例３：SNX9遺伝子制御物質の利用］
SNX9遺伝子制御物質の一種であるsiSNX9を用いた本発明の各種制御剤の、効果を確認した。
【０１９９】
《試験例３−１：siSNX9による、細胞外マトリックスへの細胞接着性の制御》
〈実験手順：Protocol〉
（SNX9のノックダウン）
コントロールsiRNA（siCONT＃１）、又は表１記載のsiSNX9（＃１〜＃３）を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションし、細胞外マトリックスタンパク質を含む基底膜（BD Matrigel登録商標）の上に播種した。
【０２００】
（細胞伸展の確認）
細胞の基底膜への接着１時間後の伸展の状況を、血管の細胞内骨格を形成するF-actinを指標に観察した。
細胞伸展の有無は、細胞を播種した基底膜に、F-actinに特異的に結合するRhodamine-phalloidin (Thermo Fisher Scientific社製)の1000倍希釈液を添加して染色した（血管内に存在する）F-actinを、上述の検出機器で検出することによって確認した。結果を図３−１に示す。
【０２０１】
〈結果〉
SNX9遺伝子の発現を阻害することによって、HUVECの基底膜上での伸展が阻害されていた（図３−１）。
【０２０２】
〈考察〉
上記により、SNX9遺伝子制御物質が、細胞接着性の制御剤となり得ることが分かった。
【０２０３】
《試験例３−２：siSNX9による血管新生制御》
〈実験手順：Protocol〉
（SNX9のノックダウン）
コントロールsiRNA（siCONT＃１）、又は表１記載のsiSNX9（＃１〜＃３）を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションした。
【０２０４】
（血管新生の確認）
コラーゲンサンドイッチ法を用いて、以下の様にして、上記のHUVECを培養した。
【０２０５】
具体的には、12-wells dishの各wellの底に、コラーゲンゲル（Cellmatrix Type I-A （新田ゼラチン株式会社製）100μLを敷いて固め、その上に各HUVECを播種し、再び100μLのコラーゲンゲルでサンドして固めた。次に、培地中の濃度が50 ng/ mlとなるように、VEGF-A（R&D社製）を添加することで、血管新生を誘導した。
血管新生の有無は、VEGF-A刺激６６時間後、培地中に、F-actinに特異的に結合するRhodamine phalloidin （Thermo Fisher Scientific社製）の1000倍希釈液を添加して染色した、血管内に存在するF-actinの蛍光写真を、60分後、A1R共焦点顕微鏡（Nikon社製）にて撮影することで、確認した。結果を図３−２に示す。
【０２０６】
〈結果〉
SNX9遺伝子の発現の阻害によって、血管新生が阻害されていた（図３−２）。
【０２０７】
〈考察〉
上記により、SNX9遺伝子制御物質が、血管新生の制御剤となり得ることが分かった。
【０２０８】
《試験例３−３：siSNX9によるIntegrinβ１の細胞内局在》
〈実験手順：Protocol〉
（SNX9のノックダウン）
コントロールsiRNA（siCONT＃１）又は表１記載のsiSNX9（＃１〜＃３）を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションした。
【０２０９】
（Integrinβ１及びSNX9の細胞内発現量）
Integrinβ１、SNX9を、上記のSDS-PAGE（７．５％ゲル使用）、及び表２に記載の抗Integrinβ１抗体等を用いたWestern Blottingによって検出した。結果を図３−３Ａに示す。
尚、コントロールとしてGAPDH（SDS-PAGEは、１５％ゲルを使用）を用いた。
【０２１０】
（Integrinβ１の細胞内局在）
また、上記と同様のトランスフェクションを行い、トランスフェクション細胞内のIntegrinβ１を、表２記載の抗体等を用いて検出した。結果を図３−３Ｂに示す。
【０２１１】
〈結果〉
図３−３Ａ及び図３−３Ｂから分かる通り、SNX9がノックダウンされた細胞では、いずれもIntegrinβ１の量には特段の変化は無いものの、Integrinβ１が細胞内に局在化されていることが判明した。
【０２１２】
〈考察〉
上記により、SNX9による上述の試験例３−１の細胞接着性の阻害は、試験例１のANKFY1や試験例２のKCTD18等と同様に、Integrinβ１の細胞内局在に起因するものであることが判明した。
【０２１３】
《試験例３−４：SNX9とKCTD18との相互作用の確認》
〈実験手順：Protocol〉
上述のAlphaScreenTMシステムによって、SNX9とKCTD18との相互作用を確認したところ、発光シグナルの値は144870であった（図示せず）。
【０２１４】
〈結果〉
発光シグナルの値が、相互作用の一つの判断基準であるバックグラウンドの値（1176）の10倍をはるかに超えていることから、SNX9はKCTD18との相互作用があることが確認された。
【０２１５】
〈考察〉
上記により、SNX9はKCTD18をアダプターとするE3のUb化基質である蓋然性が極めて高いことが分かった。
【０２１６】
《試験例３の総括》
これらの図３−１〜図３−３等で示すSNX9のノックダウンの表現型は、上述のCUL3、ANKFY1、又はKCTD18のノックダウンと同様の表現型（基底膜における細胞伸展（細胞面積）の縮小、Integrinβ１の細胞内局在（膜からの遊離））であった。
つまり、SNX9遺伝子制御物質による細胞接着性や血管新生の制御、Integrinβ１の挙動の制御等も、E3の制御と関連するものであった。
【０２１７】
尚、上述の試験例３−４で示した通り、SNX9はKCTD18をアダプターとするE3の基質であると考えられるが、図２−１Ｂによれば、CUL3やKCTD18のノックダウンによって、SNX9の発現量に大きな変化が無いことから、SNX9は、このE3の、「ポリUb化基質」では無く「モノUb化基質」であると考えられる。
【０２１８】
［試験例４：その他のSNX蛋白質遺伝子制御物質の利用］
各種SNX蛋白質遺伝子の制御物質の一種であるsiSNXを用いた本発明の各種制御剤の、効果を確認した。
【０２１９】
〈実験手順：Protocol〉
（各種SNX蛋白質のノックダウン）
コントロールsiRNA（siCONT＃１）又は表１記載のsiSNX1, siSNX5, siSNX6, siSNX10, siSNX11, siSNX16, siSNX17, siSNX20, siSNX33を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションした。
【０２２０】
（各SNX蛋白質の細胞内局在）
上記トランスフェクション細胞内のIntegrinβ１を、表２に記載の抗Integrinβ１抗体等を用いて検出した。結果を図４に示す。
【０２２１】
〈結果〉
試験した9種類のSNX蛋白質のうち、SNX11、17でも、SNX9と同様にIntegrinβ１の細胞内局在が見られた（図４）。
【０２２２】
〈考察〉
試験例１〜３の結果等を総合すると、SNX11、SNX17も、SNX9と同様に何らかのBTB蛋白質をアダプターとするE3の、基質であると考えられる。
但し、SNX11、17は、同じSNX蛋白質であるSNX9のアダプターであるKCTD18（上記試験例３−４参照）とは相互作用しないことが判明した(図示せず）。
従って、SNX11、17のアダプターとしては、下記試験例５において、175種類のBTB蛋白質のうち、Integrinβ１の細胞内局在に関与していることが判明した他の６種類のBTB蛋白質が、有力な候補として考えられる。
というのも、後述の試験例５においてIntegrinβ１の細胞内局在の確認のために用いた175種類のBTB蛋白質は、現在遺伝子レベルで知られている183種類のBTB蛋白質のうち、基質が既に知られているもの等を除く殆どを網羅していることから、その中で、siRNA処理によって（siCUL3、siSNX11、siSNX 17等と同様のIntegrinβ１の細胞内局在を示すものとして抽出された、試験例５の６種類のBTB蛋白質のいずれかが、SNX11、17を基質とするE3アダプターであると考えるのが、妥当だからである。
【０２２３】
［試験例５：その他のBTB蛋白質遺伝子制御物質の利用］
各種BTB蛋白質遺伝子の制御物質の一種であるBTB蛋白質siRNAを用いた「本発明の各種制御剤」の、効果を確認した。
【０２２４】
〈実験手順：Protocol〉
（各種BTB蛋白質のノックダウン）
コントロールsiRNA（siCONT＃１）又は175種類のBTB蛋白質を標的とするsiRNA（siRNA Libraries（Thermo Fisher Scientific社製）を、各々リポフェクタミンRNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いてHUVEC（EGM-2培地、Lonza株式会社製）にトランスフェクションした。
【０２２５】
（Integrinβ１の細胞内局在）
上記トランスフェクション細胞内のIntegrinβ１を、表２に記載の抗Integrinβ１抗体等を用いて検出した結果を図５に示す（バー： 20μm）。
【０２２６】
〈結果〉
図５から分かるように、試験した175種類のうち、６つのBTB蛋白質（BTBD7、CCIN、KCTD2、KLHL18、KLHL34、ZBTB6）についてのsiRNAが、siCUL3やsiANKFY1＃２と同様に、Integrinβ１の細胞内局在を示した。
【０２２７】
一方、HUVECにおいて、VEGFR２（VEGFレセプター２）シグナルやNotchシグナルを制御する公知のE3アダプターである「BAZF」（特許文献１）や 「SPOP」（特許文献２）の発現抑制によっては、integrin β１の細胞内における局在は見られなかった（比較対照例）。
【０２２８】
尚、この６種類の蛋白質のうち、KLHL18及びKLHL34については、上述した公知のAlphaScreenTMシステムを用いた分析による発光シグナルの値が、各々68242、61800であり（相互作用の一つの判断基準であるバックグラウンドの値（1078）の10倍を十分に超えている）、E3のアダプターであることの証明の一つである「CUL3との相互作用」が確認できた（図示せず）。
【０２２９】
また、上述の他のBTB蛋白質（BTBD7、CCIN、KCTD2、ZBTB6、）についても、試験例１−３に示したANKFY1の場合と同様、Nedd8等の因子を更に追加することによって、CUL3との相互作用が確認できると考えられる。
【０２３０】
〈考察〉
上記の結果から、これら６種類のBTB蛋白質遺伝子の制御物質も、ANKFY1遺伝子（試験例１）やKCTD18遺伝子（試験例２）の制御物質と同じく細胞接着性の制御剤や血管新生制御剤となり得ると思われる。
また、試験例４の考察にも示した通り、これら６種類のBTB蛋白質のいずれかが、上記試験例４のSNX11やSNX17等をUb化基質とする、E3のアダプターであると考えられる。
【０２３１】
尚、上記の比較対照例の結果から、Integrinβ１の局在制御に基づく本件の血管新生制御システムは、同じE3の作用を介した血管新生制御システムであっても、特許文献１(BTB蛋白質:BAZF)や特許文献２(BTB蛋白質:SPOP)の様なVEGFR2シグナルやNotchシグナルの制御とは、全く異なるルートの制御システムであることが確認された。
【０２３２】
［まとめ］
試験例１〜５の結果を総合することによって、本発明のE3コンポーネント、E3、E3制御剤が、それぞれ細胞外マトリックスへの細胞接着性の制御剤、及び血管新生の制御剤、ひいては、細胞接着性又は血管新生の異常に起因する疾患の予防又は治療剤となり得ることが判明した。
【０２３３】
また、これらの結果から、下記（Ｉ）又は（II）の制御能を指標とする本発明のスクリーニング方法によって、細胞外マトリックスへの細胞接着性の制御剤や、血管新生制御剤をスクリーニングできることが明らかとなった。
（Ｉ）下記（Ａ）とCUL3の間の相互作用
（II）下記（Ｂ）のユビキチン化
【産業上の利用可能性】
【０２３４】
本発明の各種制御剤や新規ユビキチンリガーゼコンポーネント及びユビキチンリガーゼは、実験室内における試験・研究試薬として有用であるほか、Integrinβ１の細胞内局在の制御と細胞接着性の制御、ひいては血管新生制御を介して、種々の疾患等の予防又は治療に用いることができる。
【図１−１Ａ】
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【図１−１Ｂ】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４Ａ】
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【図１−４Ｂ】
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【図１−４Ｃ】
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【図１−４Ｄ】
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【図１−４Ｅ】
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【図１−５Ａ】
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【図１−５Ｂ】
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【図２−１Ａ】
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【図２−１Ｂ】
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【図２−１Ｃ】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３Ａ】
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【図３−３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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