(57)【要約】【課題】ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制することで、皮膚の細胞の分裂の方向性を調整し、皮膚のバリア機能、保湿力を高めることのできるＲｈｏＧＤＩβ抑制剤及び化粧料を提供する。【解決手段】本発明のＲｈｏＧＤＩβ抑制剤は、炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体を含む。炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体は、炭素数１６の直鎖アルキル基を有する。炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体は、２位及び３位の少なくとも一方に、炭素数１６のアルキル基を有する。２位及び３位の少なくとも一方に、炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体は、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸及び２‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸を含む。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体を含む、ＲｈｏＧＤＩβ抑制剤。
【請求項２】
前記炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体は、炭素数１６の直鎖アルキル基を有する、請求項１に記載のＲｈｏＧＤＩβ抑制剤。
【請求項３】
前記炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体は、２位又は３位の修飾位置のみに、炭素数１６のアルキル基を有する、請求項１又は２に記載のＲｈｏＧＤＩβ抑制剤。
【請求項４】
前記２位又は３位の修飾位置のみに、炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体は、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸及び２‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸を含む、請求項３に記載のＲｈｏＧＤＩβ抑制剤。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載のＲｈｏＧＤＩβ抑制剤を含む、化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲｈｏＧＤＩβ抑制剤及び化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
我々の体の様々な組織では、組織中の細胞が常に新しい細胞に入れ替わることで、恒常性が維持されている。
【０００３】
例えば、皮膚組織では、皮膚表皮の内側の基底膜に接している基底層（基底細胞）と呼ばれる未分化の細胞群が、分裂、増殖を繰り返す。基底層（基底細胞）が、基底膜側から皮膚表皮の外側の有刺層側へと段階的に分化し、皮膚組織の最外表面から剥がれることで、新しい細胞を供給する新陳代謝を繰り返す。
【０００４】
すなわち、皮膚組織では、基底層（基底細胞）が分裂、増殖、分化を繰り返すことで、恒常性が維持され、バリア機能や透明感が維持されている。
【０００５】
基底層（基底細胞）の細胞分裂には方向性があり、基底膜に対して、通常、平行方向或いは垂直方向に分裂する。前者は対称分裂であり、二つの娘細胞は共に基底膜に接するため、増殖能を維持し、表皮シートの拡大に寄与する。
【０００６】
その一方で、後者は非対称分裂であり、基底膜から解離した娘細胞は、増殖を停止して段階的に分化することで、皮膚組織の多層化に寄与する。この分裂の方向性は、皮膚組織の形成と恒常性維持とに重要である。
【０００７】
そして、例えば、加齢や紫外線暴露等によって、皮膚組織の細胞分裂の方向性が乱れ、形成される表皮の構造に乱れを生じさせることが、皮膚の乾燥、くすみ等の好ましくない皮膚症状の一因となり得る。
【０００８】
近年、細胞分裂の方向性の乱れに、Ｒｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質の制御因子であるＲｈｏグアニンヌクレオチド解離阻害因子β（Ｒｈｏ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒβ；ＲｈｏＧＤＩβ）が関与していることが知られるようになった。
【０００９】
ＲｈｏＧＤＩは、細胞形態や細胞運動を支配している重要な細胞内シグナル因子群であるＲｈｏＧＴＰａｓｅｓを制御しており、ＲｈｏからのＧＤＰの解離およびＧＴＰの加水分解を抑制する。ほとんどのＲｈｏタンパク質は、ＲｈｏＧＤＩと結合して細胞質に存在すると考えられている。ＲｈｏＧＤＩは、細胞のシグナル伝達のスイッチ役として機能していると考えられている。
【００１０】
哺乳類においては、３種類のＲｈｏＧＤＩ（ＲｈｏＧＤＩα、ＲｈｏＧＤＩβ、ＲｈｏＧＤＩγ）が知られている。
【００１１】
細胞分裂の方向性を乱すＲｈｏＧＤＩβに関する文献として、例えば、特開２０１４‐１４１４３０号公報（特許文献１）が知られている。
【００１２】
特許文献１には、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制できるＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤が開示されている。
【００１３】
特許文献１に記載のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、オウゴン抽出物を含むことを特徴とする。オウゴン抽出物を含むＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤、皮膚外用剤、及び皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法としても用いられる。
【００１４】
また、近年、細胞分裂の方向性を乱す作用を有するＲｈｏＧＤＩβが、がん細胞に多く見られることが知られるようになった。
【００１５】
ＲｈｏＧＤＩβタンパク質は、紫外線照射等の影響を受けて、ΔＮ‐ＲｈｏＧＤＩβタンパク質に分解される。ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の分断化産物であるΔＮ‐ＲｈｏＧＤＩβタンパク質は、ＲｈｏファミリーＧタンパク質の１種であるＣｄｃ４２と結合する作用を有している。Ｃｄｃ４２は、様々な細胞の形態形成などの過程で重要な役割を担っているタンパク質であり、皮膚表皮細胞の分裂においても、細胞の形態形成に関わっている。
【００１６】
より詳しくは、Ｃｄｃ４２は、皮膚表皮細胞が２つに分裂する際に、通常、細胞の核を通る直線に沿うように２箇所に配される。そして、細胞は、２つのＣｄｃ４２がその直線に沿って互いに離れるように分裂する。すなわち、その直線の延在方向が分裂方向となる。
【００１７】
従って、Ｃｄｃ４２がΔＮ‐ＲｈｏＧＤＩβタンパク質と結合すること等によって、Ｃｄｃ４２の機能が阻害されると、細胞の分裂方向がよりランダムなものとなり得る。
【００１８】
さらに、ＲｈｏＧＤＩβとがんとの関連も報告されている。細胞分裂の方向性の異常とがん化、ＲｈｏＧＤＩβに関する文献として、例えば、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２３１：  ２４９３-２５０５，  ２０１６．（非特許文献１）が知られている。非特許文献１には、以下の内容が開示されている。
【００１９】
ＲｈｏＧＤＩβはカスパーゼ３の直接の切断基質として知られ、カズパーゼ３活性化細胞ではＮ末端切断型ＲｈｏＧＤＩβ（ΔＮ‐ＲｈｏＧＤＩβタンパク質）が蓄積する。
【００２０】
ＲｈｏＧＤＩβは多くの上皮癌において過剰発現している。また、放射線治療や細胞傷害性の抗癌治療によって、カスパーゼ３が活性化することが既に知られている。
【００２１】
ヒト由来子宮頸がん細胞Ｈｅｌａ細胞を用いた実験の結果、ΔＮ‐ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の安定的な発現によりＣｄｃ４２の活性が恒常的に阻害され、放射線誘発性の代償性増殖が亢進することを明らかにした。
【００２２】
すなわち、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質（ΔＮ‐ＲｈｏＧＤＩβタンパク質）は細胞傷害性の抗癌治療時に代償性増殖を促進することで、がん細胞の再増殖に関与している可能性が考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】特開２０１４‐１４１４３０号公報
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２３１：  ２４９３-２５０５，  ２０１６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
上記特許文献１において、発明者らは、表皮細胞の細胞分裂の方向性を乱すＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制する素材として、オウゴン抽出物を見出した。ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制する素材のさらなる解明が望まれている。
【００２６】
また、上記非特許文献１において、多くの上皮性癌において過剰発現しているＲｈｏＧＤＩβタンパク質が、カスパーゼ３の活性化によって誘導される癌進展の新規メカニズムである可能性が示唆された。
【００２７】
しかしながら、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制する素材については、ほとんど知られていない。したがって、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制する素材のさらなる解明が望まれている。
【００２８】
そこで、発明者らは、斯かる実情に鑑み、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制する素材をスクリーニングし、優れたＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制する作用を持つものを見出した。
【００２９】
すなわち、発明者らは、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制する素材についてさらにスクリーニングを実施し、ある種のビタミンＣ誘導体（アスコルビン酸誘導体）が、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制する素材であるという、新たな知見を得た。
【００３０】
本発明は、斯かる実情に鑑み、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制することで、皮膚の細胞の分裂の方向性を調整し、皮膚のバリア機能、保湿力を高めることのできるＲｈｏＧＤＩβ抑制剤及び化粧料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明のＲｈｏＧＤＩβ抑制剤は、炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体を含む、ことを特徴とする。
【００３２】
ビタミンＣは、生体に必須の水溶性ビタミンであり、優れた抗酸化力を有し、美白（シミの元になるメラニンの産生を抑制）、コラーゲン合成、皮脂抑制等の優れた美容効果を奏することが知られている。しかしながら、ビタミンＣは、浸透性に欠け、不安定であるため、経皮吸収されにくい、という特徴がある。
【００３３】
そこで、ビタミンＣに修飾基を付けて、ビタミンＣの安定性、浸透性を改善させたものとして、ビタミンＣ誘導体が使用されている。修飾基の種類としては、グリセリン、リン酸、アルキル基（炭素（有機物）が鎖状に繋がったもの）等が挙げられる。
【００３４】
上記構成のＲｈｏＧＤＩβ抑制剤によれば、炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体を含むため、ビタミンＣ誘導体としての機能に加えて、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制することで、皮膚の細胞の分裂の方向性を調整し、皮膚のバリア機能、保湿力を高めることができる。
【００３５】
本発明の一態様として、前記炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体は、炭素数１６の直鎖アルキル基を有する、のが好ましい。
【００３６】
上記構成のＲｈｏＧＤＩβ抑制剤によれば、炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体は、炭素数１６の直鎖アルキル基を有するため、炭素数１６の直鎖アルキル基を有するビタミンＣ誘導体が、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制することで、皮膚の細胞の分裂の方向性を調整し、皮膚のバリア機能、保湿力を高めることができる。なお、炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体として、直鎖アルキル基で修飾されており、且つ６位には修飾基を有さないことが重要である可能性がある。また、修飾様式（エーテル結合）や修飾数も、重要な因子である可能性が残る。
【００３７】
本発明の一態様として、前記炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体は、２位又は３位の修飾位置のみに、炭素数１６のアルキル基を有する、のが好ましい。
【００３８】
上記構成のＲｈｏＧＤＩβ抑制剤によれば、炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体は、２位又は３位の修飾位置のみに、炭素数１６のアルキル基を有するため、２位及び３位の少なくとも一方に、炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体が、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制することで、皮膚の細胞の分裂の方向性を調整し、皮膚のバリア機能、保湿力を高めることができる。
【００３９】
本発明の一態様として、前記２位及び３位の少なくとも一方に、炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体は、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸及び２‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸を含む、のが好ましい。
【００４０】
上記構成のＲｈｏＧＤＩβ抑制剤によれば、２位及び３位の少なくとも一方に、炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体は、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸及び２‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸を含むため、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸又は２‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸が、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制することで、皮膚の細胞の分裂の方向性を調整し、皮膚のバリア機能、保湿力を高めることができる。
【００４１】
本発明のさらに他の態様として、化粧料は、上記のＲｈｏＧＤＩβ抑制剤を含む、のが好ましい。
【００４２】
上記構成の化粧料によれば、化粧料は、上記のＲｈｏＧＤＩβ抑制剤を含むため、ビタミンＣ誘導体の優れた美容効果を奏することができる。また、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制することで、皮膚の細胞の分裂の方向性を調整し、皮膚のバリア機能、保湿力を高めることができる。
【発明の効果】
【００４３】
以上のように、本発明によれば、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制することで、皮膚の細胞の分裂の方向性を調整し、皮膚のバリア機能、保湿力を高めることのできる、といった優れた効果を奏し得る。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の一実施形態に係るＲｈｏＧＤＩβ抑制剤について、種々の修飾基を有するビタミンＣ誘導体のＲｈｏＧＤＩβに対する抑制作用を示すグラフである。
【図２】同実施形態に係るＲｈｏＧＤＩβ抑制剤について、ビタミンＣ誘導体の修飾基としてのアルキル基の炭素数の違いにおけるＲｈｏＧＤＩβの相対発現量を示すグラフである。
【図３】同実施形態に係るＲｈｏＧＤＩβ抑制剤について、細胞分裂方向に対する垂直方向（８０〜９０°）と水平方向（０〜１０°）の分裂細胞数を示す３次元棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
以下、本発明の一実施形態に係るＲｈｏＧＤＩβ抑制剤について、添付図面を参照して詳細に説明する。
【００４６】
発明者らは、上述のように、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制する素材に関する新たな知見を得た。すなわち、発明者らは、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制する素材について、さらにスクリーニングを実施し、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制する作用を持つものをさらに見出した。
【００４７】
発明者らは、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制する素材をさらにスクリーニングした結果、ある種のビタミンＣ誘導体が、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制することを見出した。
【００４８】
ビタミンＣは、生体に必須の水溶性ビタミンであり、優れた抗酸化力を有し、美白（シミの元になるメラニンの産生を抑制）、コラーゲン合成、皮脂抑制等の優れた美容効果を奏することが知られている。しかしながら、ビタミンＣは、浸透性に欠け、不安定であるため、経皮吸収されにくい、という特徴がある。
【００４９】
そこで、ビタミンＣに修飾基を付けて、ビタミンＣの安定性、浸透性を改善させたものとして、ビタミンＣ誘導体が使用されている。ビタミンＣ誘導体が、ビタミンＣの浸透力と、優れた抗酸化力、美白、コラーゲン合成、皮脂抑制等の優れた効果を高めるようになる。修飾基の種類としては、グリセリン、リン酸、アルキル基（炭素（有機物）が鎖状に繋がったもの）等が挙げられる。
【００５０】
さらに、発明者らは、表皮細胞のＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制するビタミンＣ誘導体の探索を開始した。
【００５１】
本実施形態に係るＲｈｏＧＤＩβ抑制剤は、炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体を含む。
【００５２】
本実施形態において、炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体は、炭素数１６の直鎖アルキル基を有する。なお、本実施形態においては、炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体は、炭素数１６の直鎖アルキル基を有するが、これに限定されるものではない。炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体は、炭素数１６の分岐鎖のアルキル基を有してもよい。
【００５３】
本実施形態において、炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体は、２位又は３位の修飾位置のみに、炭素数１６のアルキル基を有する。２位又は３位の修飾位置のみに、炭素数１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体としては、例えば、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸（３‐Ｏ‐ヘキサデシルアスコルビン酸）、２‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸（２‐Ｏ‐ヘキサデシルアスコルビン酸）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸（３‐Ｏ‐ヘキサデシルアスコルビン酸）は、安定性に優れたビタミンＣ誘導体であり、真皮線維芽細胞におけるＮＯの促進を介して、正常なＩ型コラーゲン線維束の形成を促し、しわ、たるみを防止することが知られている。
【００５５】
３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸（３‐Ｏ‐ヘキサデシルアスコルビン酸）の製造法としては、従来より行われている一般的な製造方法が使用可能である。
【００５６】
本実施形態において、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸又は２‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸の含有量が、０．０００４重量％以上である。３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸又は２‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸の含有量が、０．０００４重量％以上であれば、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制することで、皮膚の細胞の分裂の方向性を調整し、皮膚のバリア機能、保湿力を高めることができる。好ましくは、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸又は２‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸の含有量は、０．０００４〜１０％重量％である。さらに好ましくは、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸又は２‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸の含有量は、０．１〜１０重量％である。
【００５７】
なお、上記３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸又は２‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸の含有量の濃度範囲の根拠としては、以下の実施例において示す細胞実験で、ＲｈｏＧＤＩβ発現に対する効果のある１０μＭを換算すると０．０００４重量%であること、他の同様のビタミンＣ誘導体において、発明者らの化粧品への最大配合実績が、１０％であること、及び３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸の０．１％配合品で、皮膚への浸透性を確認した際に、角層への浸透が確認できたこと、等が挙げられる。
【００５８】
本実施形態において、化粧料は、上記のＲｈｏＧＤＩβ抑制剤を含む。
【００５９】
なお、本発明の効果を損なわない範囲において、一般に化粧料で用いられ、或いは医薬部外品等に用いられる各種任意成分を必要に応じて適宜配合することができる。このような任意成分として、例えば、精製水、エタノール、油性成分、保湿剤、増粘剤、防腐剤、乳化剤、薬効成分、粉体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤等を挙げることができる。
【００６０】
ＲｈｏＧＤＩβ抑制剤として、例えば、３−Ｏ−セチルアスコルビン酸を含む化粧品の処方例を以下に示すが、これに限定されるものではない。
【００６１】
（処方例（クリーム））
配合成分                                                配合量（重量％）
スクワラン                                                    ５．０
オクチルドデカノール                                          ４．５
ミリスチン酸オクチルドデシル                                  ３．５
ジメチコン                                                    ２．０
セタノール                                                    ４．０
ミツロウ                                                      １．５
ステアリン酸グリセリル                                        ２．５
３−Ｏ−セチルアスコルビン酸                                  １．０
（アクリル酸Ｎａ／アクリロイルジメチルタウリン）コポリマー    ０．７
１，３−ブチレングリコール                                    ５．０
濃グリセリン                                                  ４．０
ポリソルベート６０                                            ２．０
イソヘキサデカン                                              ０．４
パーム脂肪酸グルタミン酸Ｎａ                                  ０．５
パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．２
ポリソルベート８０                                            ０．１
オレイン酸ソルビタン                                          ０．０５
エデト酸二ナトリウム                                          ０．１
精製水                                                        残部
【実施例】
【００６２】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６３】
＜ＲｈｏＧＤＩβの発生に対するビタミンＣ誘導体の修飾基の作用＞
ビタミンＣ誘導体の修飾基（グリセリン、リン酸塩、アルキル基）の違いによるＲｈｏＧＤＩβの抑制作用について、被験物質として、下記表１に示す各種ビタミンＣ誘導体を用いて、ＲｈｏＧＤＩβに対する抑制作用を比較検討した。なお、表１には、各種修飾基を有するビタミンＣ誘導体の化合物名と、各ビタミンＣ誘導体の修飾基、修飾位置を示している。
【００６４】
（被験物質：各種ビタミンＣ誘導体）
【００６５】
【表１】
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【００６６】
（実験方法）
２４ｗｅｌｌ培養プレートに、正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ細胞）（クラボウ社製）を、１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７度、５％ＣＯ２下で、２４時間培養した。なお、培地として、ＨｕＭｅｄｉａ‐ＫＧ２（クラボウ社製）を使用した。
【００６７】
培養１日後、表１に示す各種ビタミンＣ誘導体の化合物を、ＨｕＭｅｄｉａ‐ＫＧ２（クラボウ社製）で、５〜２５μＭに調製した薬剤処理用培地に置換し、３７度、５％ＣＯ２下で、２４時間培養した。
【００６８】
そして、翌日、ＲＮＡｉｓｏ  Ｐｌｕｓ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、上記と同様にして、ＲＮＡを抽出／精製した。
【００６９】
さらに、次のようにして、ＴａＫａＲａ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ  Ｐriｍｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＰＬＵＳ  ＲＴ‐ＰＣＲ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲ法にて、ＲｈｏＧＤＩβとＧＡＰＤＨ（コントロール）とのｍＲＮＡ発現量を測定した。結果を図１（ａ）〜図１（ｃ）に示す。図１（ａ）〜図１（ｃ）には、コントロールの値を１としたときの相対値が示されている。なお、ＰＣＲ装置として、７３００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。
【００７０】
（結果：各種ビタミンＣ誘導体によるＲｈｏＧＤＩβの相対発現量）
図１（ａ）〜図１（ｃ）に示すように、グリセリルアスコルビン酸、３‐グリセリルアスコルビン酸、ビスグリセリルアスコルビン酸、ヘキシル３‐グリセリルアスコルビン酸及びリン酸Ｌ‐アスコルビルＭｇについては、コントロールに比し、全ての濃度において、ＲｈｏＧＤＩβの発現が同等又は増加した。また、テトラ２‐ヘキシルデカン酸アスコルビル及びジパルミチン酸アスコルビルについても、コントロールに比し、全ての濃度において、ＲｈｏＧＤＩβの発現が同等又は増加していた。
【００７１】
それに対して、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸については、コントロールに比し、１０μＭの濃度で、ＲｈｏＧＤＩβの発現が顕著に（約０．５倍）低下していた。
【００７２】
以上の結果より、表１に示す各種ビタミンＣ誘導体において、様々な修飾基の種類（グリセリン／分岐鎖アルキル基）、修飾様式（エーテル結合／エステル結合）、修飾位置や修飾数のビタミンＣ誘導体を評価したが、ＲｈｏＧＤＩβの抑制作用が見られたのは、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸（３‐Ｏ‐ヘキサデシルアスコルビン酸）のみであった。
【００７３】
３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸（３‐Ｏ‐ヘキサデシルアスコルビン酸）は、直鎖アルキル基が、エーテル結合したビタミンＣ誘導体である。
【００７４】
以上のことから、ビタミンＣ誘導体がＲｈｏＧＤＩβ抑制作用を示すには、ビタミンＣ誘導体が、直鎖アルキル基で修飾されており、且つ６位には修飾基を有さないことが重要である可能性が推察された。また、修飾様式（エーテル結合）や修飾数も、重要な因子である可能性が残る。
【００７５】
ビタミンＣ誘導体の原料開発においては、市販の化粧品原料として、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸（３‐Ｏ‐ヘキサデシルアスコルビン酸）の採用が最も可能性が高いと考える。なお、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸（３‐Ｏ‐ヘキサデシルアスコルビン酸）は、市販の化粧品原料以外にも、任意に製造された又は同様の手法によって製造された３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸（３‐Ｏ‐ヘキサデシルアスコルビン酸）においても、上記と同様の効果を期待できる。
【００７６】
＜ビタミンＣ誘導体のアルキル基の長さ比較＞
上述のように、直鎖アルキル基を有するビタミンＣ誘導体のみが、表皮細胞のＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制したことから、次に、アルキル基中の炭素数及び修飾位置に着目した。すなわち、ビタミンＣ誘導体のうち、修飾基として、２位又は３位の修飾位置のみに、異なる炭素数のアルキル基を有し、かつ修飾基としてグリセリンを有さないビタミンＣ誘導体について、それぞれ、検討した。
【００７７】
より具体的には、以下の表２に示すように、２位の修飾位置に各炭素数（Ｃ２，Ｃ１２，Ｃ１８）のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体をそれぞれ合成し、ＲｈｏＧＤＩβに対する抑制作用を比較検討した。また、以下の表２に示すように、３位の修飾位置に各炭素数（Ｃ２，Ｃ１２，Ｃ１６，Ｃ１８）のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体をそれぞれ合成し、ＲｈｏＧＤＩβに対する抑制作用を比較検討した。
【００７８】
【表２】
2019064990.tif 000004
【００７９】
（実験方法）
１２ｗｅｌｌ培養プレートに、正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ細胞）（クラボウ社製）を、１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７度、５％ＣＯ２下で、２４時間培養した。なお、培地として、ＨｕＭｅｄｉａ‐ＫＧ２（クラボウ社製）を使用した。
【００８０】
２位又は３位の修飾位置のみに各炭素数（Ｃ２，Ｃ１２，Ｃ１６，Ｃ１８）のアルキル基を有する化合物を、ＨｕＭｅｄｉａ‐ＫＧ２（クラボウ社製）で、５〜２５μＭに調製した薬剤処理用培地に置換し、３７度、５％ＣＯ２下で、２４時間培養した。
【００８１】
そして、ＲＮＡｉｓｏ  Ｐｌｕｓ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、上記と同様にして、ＲＮＡを抽出／精製した。
【００８２】
さらに、次のようにして、ＴａＫａＲａ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ  Ｐｒｉｍｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＰＬＵＳ  ＲＴ‐ＰＣＲ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲ法にて、ＲｈｏＧＤＩβとＧＡＰＤＨ（コントロール）とのｍＲＮＡ発現量を測定した。結果を図２に示す。図２には、コントロールの値を１としたときのＲｈｏＧＤＩβの相対値が示されている。なお、ＰＣＲ装置として、７３００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。
【００８３】
本実験で使用したプライマーの配列を、以下に示す。
【００８４】
＜使用プライマーの配列＞
ＲｈｏＧＤＩβ  ｆｗ ：ＧＡＧ ＡＣＡ ＧＡＧ ＧＣＡ ＣＣＣ ＣＧＧ ＡＣＡ
ＲｈｏＧＤＩβ  ｒｖ ：ＣＡＧ ＧＧＡ ＣＴＴ ＣＴＧ ＴＧＧ ＴＧＧ ＡＧＧ Ｃ
ＧＡＰＤＨ      ｆｗ ：ＧＣＴ ＣＴＣ ＴＧＣ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＧＴ ＴＣ
ＧＡＰＤＨ      ｒｖ ：ＡＣＧ ＡＣＣ ＡＡＡ ＴＣＣ ＧＴＴ ＧＡＣ ＴＣ
【００８５】
（結果：ビタミンＣ＋アルキル基の炭素数の相違によるＲｈｏＧＤＩβの相対発現量）
図２に示すように、２位の修飾位置にアルキル基を有するビタミンＣ誘導体について、ＲｈｏＧＤＩβの相対発現量においては、コントロールに比し、炭素数Ｃ１２以上のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体（Ｃ１２，Ｃ１８）が、それぞれ、２５μＭ以上の濃度で、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制（それぞれ、約０．５５倍、約０．７５倍）したことが分かる。なお、２位の修飾位置に炭素数Ｃ１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体については、市販されておらず容易に入手できないため、評価していない。しかしながら、２位の修飾位置に炭素数Ｃ１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体についても、他のビタミンＣ誘導体の結果から推察すると、同様のＲｈｏＧＤＩβの抑制作用を有すると考えられる。
【００８６】
また、図２に示すように、３位の修飾位置にアルキル基を有するビタミンＣ誘導体について、ＲｈｏＧＤＩβの相対発現量においては、コントロールに比し、炭素数Ｃ１２以上のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体（Ｃ１２，Ｃ１６，Ｃ１８）が、それぞれ、５μＭ，１０μＭ及び２５μＭ以上の濃度で、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制（それぞれ、約０．８倍、約０．５５倍、約０．７５倍）したことが分かる。また、炭素数Ｃ１６のアルキル基を有するビタミンＣ誘導体が、ＲｈｏＧＤＩβの発生を最も抑制（約０．５５倍）したことが分かる。
【００８７】
＜細胞分裂方向に対する作用検証＞
次に、３Ｄ皮膚モデルを用いて、ＲｈｏＧＤＩβ抑制作用を示すビタミンＣ誘導体（３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸）（炭素数Ｃ１６のアルキル基）が、実際に細胞分裂方向に与える作用を評価した。
【００８８】
すなわち、皮膚の基底層（基底細胞）の細胞分裂には方向性があり、基底膜に対して、必ず、平行方向或いは垂直方向に分裂する。そこで、３Ｄ皮膚モデルを用いて、ビタミンＣ誘導体（３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸）による皮膚の基底層（基底細胞）の垂直方向（８０〜９０°）と水平方向（０〜１０°）の分裂細胞数を、以下のように測定し、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸の細胞分裂方向に与える作用を検討した。
【００８９】
（３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸の細胞分裂方向に与える作用）
【００９０】
（実験方法）
６ｗｅｌｌ培養プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製、型番３５３０４６）に、短期培養用の培地として、ＫＧＦ含有のＥＰＩ‐１００培地（クラボウ社製）を添加し、培地中に、皮膚３次元モデル（ＥＰＩ‐２００）（クラボウ社製）を入れて、１時間プレ培養を行った。
【００９１】
そして、１ｍｌのＰＢＳ（−）（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を添加した６ｗｅｌｌ培養プレートに、皮膚３次元モデルを移した。
【００９２】
次に、上記プレートの蓋を外し、ＤＥＲＭＡＲＡＹ  ２００  タイプＡ・Ｂ（東光電気社製）を用いて、皮膚３次元モデルに、ＵＶＢ１００ｍＪ/ｃｍ２、ＵＶＢ２００ｍＪ/ｃｍ２を照射した（ＵＶＢ１００ｍＪ/ｃｍ２は、５００μＷ/ｃｍ２で３分２０秒、ＵＶＢ２００ｍＪ/ｃｍ２は、５００μＷ/ｃｍ２で６分４０秒照射した）。
【００９３】
そして、ＰＢＳ（−）から、ＥＰＩ‐１００‐ＮＭＭ（クラボウ社製）に薬剤を添加した培地に置換し、ワッシャーを２枚重ねて入れ、その上に皮膚３次元モデルを戻し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【００９４】
培養３，５，８，１０日目に培地を交換し、培養１１日目に細胞数を測定した。より具体的には、ＥＰＩ‐１００とＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（プロメガ社製）とを、９：１で混合して反応液を作製し、２４ｗｅｌｌ培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に反応液５００μｌ／ｗｅｌｌを添加した。２４ｗｅｌｌ培養プレートに皮膚３次元モデルを移し、９０分間インキュベートした。
【００９５】
そして、インキュベート後の反応液を、９６ｗｅｌｌ培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に回収し、ＰＯＷＥＲＳＣＡＮ  ＨＴ（大日本製薬社製）で、４５０ｎｍの吸光度を測定し、細胞生存率を算出した。
【００９６】
インキュベート後の皮膚３次元モデルは、生検トレパン８．０ｍｍ（カイ  インダストリーズ社製）を用いて、メンブレンごと切り出し、ＰＢＳ（−）にて洗浄した。
【００９７】
メンブレンごと切り出した皮膚３次元モデルを、４％パラホルムアルデヒド  リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）にて固定し、パラフィン包埋後、切片を作製し、ＨＥ染色を行った。
【００９８】
顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製 型番：ＩＸ７１）で分裂中もしくは分裂直後と思われる基底細胞の写真を撮影し、画像処理ソフトウエアＩｍａｇｅ‐Ｊにて、二つに分裂しつつある細胞と細胞を結んだ線とメンブレンとの角度（０°〜１８０°）を測定した（Ｎ＝８０）。
【００９９】
次に、結果について、３次元棒グラフを用いた垂直方向（８０〜９０°）と水平方向（０〜１０°）の分裂細胞数を、図３に示す。なお、図３における培養条件を、以下に簡潔に纏めて示す。
【０１００】
（培養条件：全サンプルに０．０１％ＤＭＳＯを含有）
（ａ）（コントロール（ＥＰＩ‐１００‐ＮＭＭ培地のみ）
（ｂ）ＵＶＢ１００ｍＪ/ｃｍ２（５００μＷ/ｃｍ２で３分２０秒、以下同様）
（ｃ）ＵＶＢ２００ｍＪ/ｃｍ２（５００ μＷ/ｃｍ２で６分４０秒、以下同様）
（ｄ）５μＭの３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸を添加
（ｅ）ＵＶＢ１００ｍＪ/ｃｍ２ ＋３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸 ５μＭ
（ｆ）ＵＶＢ２００ｍＪ/ｃｍ２  ＋３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸 ５μＭ
（ｇ）１０μＭの３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸を添加
（ｈ）ＵＶＢ１００ｍＪ/ｃｍ２＋３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸 １０μＭ
（ｉ）ＵＶＢ２００ｍＪ/ｃｍ２＋３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸 １０μＭ
【０１０１】
（結果：３次元棒グラフを用いた垂直方向と水平方向の分裂細胞数）
図３（ａ）〜（ｃ）に示すように、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸を添加しない場合、ＵＶＢ照射強度に比例して、垂直方向（８０〜９０°）の分裂細胞数が減少していた。
【０１０２】
図３（ｄ）〜（ｆ）に示すように、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸を５μＭ添加した場合、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸の濃度に比例して、水平方向（０〜１０°）の正常の分裂細胞数が増加していた。この結果から、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸を５μＭ添加することにより、水平方向（０〜１０°）の正常の分裂細胞数が多くなり、水平方向（０〜１０°）において正常に回復している細胞が増えていることが分かる。
【０１０３】
図３（ｇ）〜（ｉ））に示すように、３‐Ｏ‐セチルアスコルビンを酸１０μＭ添加した場合、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸の濃度依存的に、垂直方向（８０〜９０°）の正常の分裂細胞数が増加していた。この結果から、３‐Ｏ‐セチルアスコルビンを酸１０μＭ添加することにより、垂直方向（８０〜９０°）の正常の分裂細胞数が多くなり、垂直方向（８０〜９０°）において正常に回復している細胞が増えていることが分かる。
【０１０４】
以上のように、本実施形態に係るＲｈｏＧＤＩβ抑制剤によれば、２位又は３位の修飾位置のみに、炭素数Ｃ１６の直鎖アルキル基を有するビタミンＣ誘導体が、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制することで、皮膚の細胞の分裂の方向性を調整し、皮膚のバリア機能、保湿力を高めることができる。
【０１０５】
また、２位又は３位の修飾位置のみに、炭素数Ｃ１６の直鎖アルキル基を有するビタミンＣ誘導体としての３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸（３‐Ｏ‐ヘキサデシルアスコルビン酸）が、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制することで、皮膚細胞の分裂の方向性を調整し、皮膚のバリア機能、保湿力を高めることができる可能性が高い。
【０１０６】
また、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸（３‐Ｏ‐ヘキサデシルアスコルビン酸）の含有量が、０．０００４重量％以上であれば、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制することで、皮膚の細胞の分裂の方向性を調整し、皮膚のバリア機能、保湿力を高めることができる可能性が高い。
【０１０７】
なお、本実施例において、３‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸（３‐Ｏ‐ヘキサデシルアスコルビン酸）を用いて、ＲｈｏＧＤＩβの抑制作用について検討を行ったが、これに限定されるものではなく、例えば、２位の修飾位置に炭素数Ｃ１６の直鎖アルキル基を有する２‐Ｏ‐セチルアスコルビン酸（２‐Ｏ‐ヘキサデシルアスコルビン酸）以外に、２位及び３位の修飾位置の少なくとも一方に炭素数Ｃ１６の直鎖アルキル基を有し、且つ６位の修飾位置には修飾基を有さないビタミンＣ誘導体を用いた場合でも、上記と同様の結果が期待できる。
【０１０８】
なお、本実施形態に係るＲｈｏＧＤＩβ抑制剤の形態は、特に限定されるものではなく、一般のＲｈｏＧＤＩβ抑制剤及び化粧品において採用される種々の形態を、本発明の効果を損ねない範囲で採用することができる。
【０１０９】
例えば、ＲｈｏＧＤＩβ抑制剤の形態は、液状、ローション状、乳液状、クリーム状、軟膏状、半固形状、オイルジェル状、及びシート状等の剤型とすることができる。また、本実施形態に係るＲｈｏＧＤＩβ抑制剤の剤型に応じて、例えば、オイル、色素、防腐剤、界面活性剤、香料、顔料等を適宜配合することができる。
【０１１０】
そして、本実施形態のＲｈｏＧＤＩβ抑制剤は、本発明の化粧品以外にも、既存の（従来の）化粧品にも適用可能であり、ビタミンＣ誘導体を含む化粧品の汎用性が高まる。さらに、化粧品以外にも、外用剤や薬剤等にも適用可能である。
【０１１１】
なお、本発明のＲｈｏＧＤＩβ抑制剤は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で適宜変更し得ることは勿論のことである。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明は、ＲｈｏＧＤＩβの発生を抑制することで、肌のバリア機能、保湿力を高めることのできるＲｈｏＧＤＩβ抑制剤及びＲｈｏＧＤＩβ抑制剤を含む化粧品に有効に利用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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