(57)【要約】【課題】吐出された液滴に含まれる粒子の計数精度を向上させることができる粒子計数装置の提供。【解決手段】光を受けることで発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出手段と、前記液滴吐出手段から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射手段と、前記光を照射された前記粒子からの発光による光を受光する受光手段と、前記受光手段により受光した前記光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数手段と、を有する粒子計数装置であって、前記粒子計数手段が、前記液滴に含まれる前記粒子の有無を計測する第一の粒子計測手段と、前記液滴に含まれる前記粒子の個数を計測する第二の粒子計測手段とを有する粒子計数装置である。【選択図】図１
2019023629.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光を受けることで発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出手段と、
前記液滴吐出手段から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射手段と、
前記光を照射された前記粒子からの発光による光を受光する受光手段と、
前記受光手段により受光した前記光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数手段と、を有する粒子計数装置であって、
前記粒子計数手段が、前記液滴に含まれる前記粒子の有無を計測する第一の粒子計測手段と、前記液滴に含まれる前記粒子の個数を計測する第二の粒子計測手段とを有することを特徴とする粒子計数装置。
【請求項２】
前記第一の粒子計測手段からの前記液滴に含まれる前記粒子が有との情報に基づいて前記第二の粒子計測手段により前記液滴に含まれる前記粒子の個数を計測する粒子計測手段制御手段と、
前記第二の粒子計測手段からの前記液滴に含まれる前記粒子の個数の情報に基づいて前記液滴吐出手段を制御する液滴吐出手段制御手段と、をさらに有し、
前記液滴吐出手段制御手段が、前記第一の粒子計測手段からの前記液滴に含まれる前記粒子が無との情報に基づいて前記第二の粒子計測手段からの情報を用いることなく前記液滴吐出手段を制御する手段である請求項１に記載の粒子計数装置。
【請求項３】
前記液滴吐出手段制御手段が、前記第一の粒子計測手段からの前記液滴に含まれる前記粒子が無との情報に基づいて、液滴を略同一位置に連続吐出するように液滴吐出位置を制御する手段である請求項２に記載の粒子計数装置。
【請求項４】
前記第一の粒子計測手段が、前記粒子からの発光の発光量情報を取得する発光量取得部を有し、前記第二の粒子計測手段が、前記粒子からの発光による光に基づく２次元画像を取得する２次元画像取得部を有する請求項１から３のいずれかに記載の粒子計数装置。
【請求項５】
前記第一の粒子計測手段に接続される受光手段が、２以上の異なる方向に発光された光を受光する２以上の受光手段を有する請求項１から４のいずれかに記載の粒子計数装置。
【請求項６】
前記第二の粒子計測手段に接続される受光手段が、２以上の異なる方向に発光された光を受光する２以上の受光手段を有する請求項１から５のいずれかに記載の粒子計数装置。
【請求項７】
前記第一の粒子計測手段の前記粒子からの発光の発光量情報を取得する前記発光量取得部が、前記第二の粒子計測手段の前記２次元画像取得部からの２次元画像情報に基づいて前記発光量情報を取得する請求項４から６のいずれかに記載の粒子計数装置。
【請求項８】
前記光照射手段が、２以上の異なる方向から光を照射する手段である請求項１から７のいずれかに記載の粒子計数装置。
【請求項９】
前記光照射手段の２以上の異なる方向が、略対向方向である請求項８に記載の粒子計数装置。
【請求項１０】
２以上の異なる方向から光を照射する前記光照射手段が、略平行光束からなる光を前記液滴に照射する第一の光照射部と、前記略平行光束の光の一部が前記液滴を照射することに対応して前記液滴位置を透過した前記略平行光束の光を偏向させて再度液滴に照射させる偏向光学素子を有する第二の光照射部と、を有する請求項８から９のいずれかに記載の粒子計数装置。
【請求項１１】
光を受けることで発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出工程と、
前記液滴吐出工程から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射工程と、
前記光を照射された前記粒子からの発光による光を受光する受光工程と、
前記受光工程により受光した前記光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数工程と、を含む粒子計数方法であって、
前記粒子計数工程が、前記液滴に含まれる前記粒子の有無を計測する第一の粒子計測工程と、前記液滴に含まれる前記粒子の個数を計測する第二の粒子計測工程とを含むことを特徴とする粒子計数方法。
【請求項１２】
前記第一の粒子計測工程からの前記液滴に含まれる前記粒子が有との情報に基づいて前記第二の粒子計測工程により前記液滴に含まれる前記粒子の個数を計測する粒子計測工程制御工程と、
前記第二の粒子計測工程からの前記液滴に含まれる前記粒子の個数の情報に基づいて液滴吐出工程を制御する液滴吐出工程制御工程と、をさらに含み、
前記液滴吐出工程制御工程が、前記第一の粒子計測工程からの前記液滴に含まれる前記粒子が無との情報に基づいて前記第二の粒子計測工程からの情報を用いることなく前記液滴吐出工程を制御する工程である請求項１１に記載の粒子計数方法。
【請求項１３】
前記液滴吐出工程制御工程が、前記第二の粒子計測工程からの前記液滴に含まれる前記粒子の個数の情報に基づいて前記粒子の個数を積算し、前記液滴吐出工程を制御する工程である請求項１２に記載の粒子計数方法。
【請求項１４】
前記第一の粒子計測工程からの前記液滴に含まれる前記粒子が有との情報に基づいて、液滴を略同一位置に連続吐出するように液滴吐出位置を制御する連続吐出位置制御工程と、
前記連続吐出位置制御工程からの情報に基づいて前記液滴吐出位置を移動させる液滴吐出位置移動工程と、をさらに含む請求項１１から１３のいずれかに記載の粒子計数方法。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれかに記載の粒子計数装置を用いて計数された粒子数に関する情報を記憶した計数情報記録手段を有することを特徴とする粒子含有試料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子計数装置、粒子計数方法、及び粒子含有試料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、幹細胞技術の進展に伴い、複数の細胞をインクジェットで吐出して組織体を形成する技術の開発が行われている。細胞を代表とする粒子状の物質を含む液滴を吐出する際に、吐出された液滴中にどの程度の粒子が含まれているかを計数することは重要である。
【０００３】
このような機能を備えた装置の一例として、液状体に含まれる粒状体の個数を検知する吐出装置が提案されている（例えば、特許文献１参照）。この吐出装置では、吐出装置のキャビティとノズルの間に設けられた検出部を通過する液状体に含まれる粒子の個数を計数することができる。
【０００４】
また、微小粒子を含む液滴に対して励起光を照射することにより微小粒子から発生する蛍光を検出する微小粒子測定装置が提案されている（例えば、特許文献２参照）。この微小粒子測定装置では、飛翔する液滴内の微小粒子が発生する蛍光強度を検出することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、吐出された液滴に含まれる粒子の計数精度を向上させることができる粒子計数装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
課題を解決するための手段としての、本発明の粒子計数装置は、光を受けることで発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出手段と、前記液滴吐出手段から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射手段と、前記光を照射された前記粒子からの発光による光を受光する受光手段と、前記受光手段により受光した前記光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数手段と、を有する粒子計数装置であって、前記粒子計数手段が、前記液滴に含まれる前記粒子の有無を計測する第一の粒子計測手段と、前記液滴に含まれる前記粒子の個数を計測する第二の粒子計測手段とを有する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によると、吐出された液滴に含まれる粒子の計数精度を向上させることができる粒子計数装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、第１の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、図１の受光手段４１より出力された情報の一例を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、図１の受光手段４２より出力された情報の一例を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図１の受光手段４２より出力された情報の他の一例を示す図である。
【図４】図４は、第１の実施の形態にかかる粒子計数装置の動作の一例を示すフローチャートである。
【図５】図５は、第２の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。
【図６】図６は、第２の実施の形態にかかる粒子計数装置の動作の一例を示すフローチャートである。
【図７】図７は、第２の実施の形態にかかる粒子計数装置の計測精度の一例を示す図である。
【図８】図８は、第２の実施の形態にかかる粒子計数装置の別の動作の一例を示すフローチャートである。
【図９】図９は、第３の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。
【図１０】図１０は、第３の実施の形態にかかる粒子計数装置の動作の一例を示すフローチャートである。
【図１１】図１１は、第４の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、第４の実施の形態にかかる粒子計数装置の受光光量分布の一例を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、第４の実施の形態にかかる粒子計数装置の受光光量分布の他の一例を示す図である。
【図１３】図１３は、第５の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。
【図１４】図１４は、第６の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。
【図１５】図１５は、第７の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。
【図１６】図１６は、第１の実施の形態にかかる粒子計数装置のうちレーザー光３０１のみの粒子計数装置の照明状態の一例を示す図である。
【図１７Ａ】図１７Ａは、第１の実施の形態にかかる粒子計数装置の照明光量分布の一例を示す図である。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、第７の実施の形態にかかる粒子計数装置の照明光量分布の他の一例を示す図である。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、第７の実施の形態にかかる粒子計数装置の照明光量分布の他の一例を示す図である。
【図１８】図１８は、第一の粒子計測手段のみを設けた粒子計数装置の場合の実施の形態の一例を示す参考図である。
【図１９】図１９は、第８の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。
【図２０】図２０は、第８の実施の形態にかかる粒子計数装置の照明状態の一例を示す図である。
【図２１】図２１は、第９の実施の形態にかかる粒子計数装置の照明光量分布の一例を示す図である。
【図２２】図２２は、第９の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。
【図２３】図２３は、第９の実施の形態にかかる粒子計数装置の照明光量分布の一例を示す図である。
【図２４】図２４は、第一の粒子計測手段のみを設けた粒子計数装置の場合の実施の形態を他の一例を示す参考図である。
【図２５Ａ】図２５Ａは、第１０の実施の形態にかかる粒子含有試料の一例を示す図である。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、第１０の実施の形態にかかる粒子含有試料の他の一例を示す図である。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、第１０の実施の形態にかかる粒子含有試料の他の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（粒子計数装置、及び粒子計数方法）
本発明の粒子計数装置は、光を受けることで発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出手段と、前記液滴吐出手段から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射手段と、前記光を照射された前記粒子からの発光による光を受光する受光手段と、前記受光手段により受光した前記光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数手段と、を有する粒子計数装置であって、前記粒子計数手段が、前記液滴に含まれる前記粒子の有無を計測する第一の粒子計測手段と、前記液滴に含まれる前記粒子の個数を計測する第二の粒子計測手段とを有し、更に必要に応じてその他の手段を有する。
本発明の粒子計数装置は、従来の吐出装置では、飛翔する直前の液状体に含まれる粒子の個数をカウントしており、飛翔する液滴に含有された粒子の個数を直接カウントしておらず、したがって、飛翔する直前の液状体に含まれる粒子の個数と、飛翔する液滴に含有された粒子の個数とは必ずしも一致しないため、吐出された液滴に含有された粒子の個数の検知精度が低いという問題があるという知見に基づくものである。
また、本発明の粒子計数装置は、従来の微小粒子測定装置では、液滴の形状や蛍光強度を測定することはできるが、液滴内の粒子の個数を計測するものではないという知見に基づくものである。
【００１０】
本発明の粒子計数方法は、光を受けることで発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出工程と、前記液滴吐出工程から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射工程と、前記光を照射された前記粒子からの発光による光を受光する受光工程と、前記受光工程により受光した前記光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数工程と、を含む粒子計数方法であって、前記粒子計数工程が、前記液滴に含まれる前記粒子の有無を計測する第一の粒子計測工程と、前記液滴に含まれる前記粒子の個数を計測する第二の粒子計測工程とを含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
本発明の粒子計数方法は、本発明の粒子計数手段により好適に実施することができ、本発明の粒子計数手段を用いて計数を実施すると、本発明の粒子計数方法を実施することとなる。
【００１１】
以下、図面を参照して本発明を実施するための形態について説明する。各図面において、同一構成部分には同一符号を付し、重複した説明を省略する場合がある。
なお、粒子計数方法を実施すると、粒子計数装置を用いた計数を実施することとなることから、粒子計数装置について説明することにより粒子計数方法の説明とする。
【００１２】
＜第１の実施の形態＞
第１の実施の形態は、光を受けることで発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出手段と、液滴吐出手段から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射手段と、光を照射された粒子からの発光による光を受光する受光手段と、受光手段により受光した前記光に基づき、液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数手段と、を有する粒子計数装置であって、粒子計数手段が、液滴に含まれる粒子の有無を計測する第一の粒子計測手段と、液滴に含まれる粒子の個数を計測する第二の粒子計測手段とを有し、更に必要に応じてその他の手段を有する。
【００１３】
第１の実施の形態にかかる粒子計数方法は、光を受けることで発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出工程と、液滴吐出工程から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射工程と、光を照射された粒子からの発光による光を受光する受光工程と、受光工程により受光した光に基づき、液滴に含まれる粒子を計数する粒子計数工程と、を含む粒子計数方法であって、粒子計数工程が、液滴に含まれる粒子の有無を計測する第一の粒子計測工程と、液滴に含まれる粒子の個数を計測する第二の粒子計測工程とを含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
液滴吐出工程は液滴吐出手段により好適に実施することができ、光照射工程は光照射手段により好適に実施することができ、受光工程は受光手段により好適に実施することができ、粒子計数工程は粒子計数手段により好適に実施することができ、第一の粒子計測工程は第一の粒子計測手段により好適に実施することができ、第二の粒子計測工程は第二の粒子計測手段により好適に実施することができ、その他の工程はその他の手段により好適に実施することができる。
【００１４】
第一の粒子計測手段としては、粒子からの発光の発光量情報を取得する発光量取得部を有することが好ましく、第二の粒子計測手段が、粒子からの発光による光に基づく２次元画像を取得する２次元画像取得部を有することが好ましい。
【００１５】
図１は、第１の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。図１は、本発明の粒子計数装置１００Ａの一例であり、１０は液滴吐出手段であり、１１は液滴吐出手段１０の液室であり、１２は液滴吐出手段のノズルであり、２０は駆動手段であり、３０は光照射手段であり、４１及び４２は受光手段であり、５１は第一の粒子計測手段であり、５２は第二の粒子計測手段であり、２００は粒子懸濁液であり、２０１は粒子懸濁液中に含まれ、光を受けることで発光可能な粒子であり、２１０は液滴吐出手段のノズル１２より吐出された液滴であり、３０１はレーザー光であり、３０２ａは受光手段４１への光であり、３０２ｂは受光手段４２への光であり、３０３は液滴の吐出方向である。受光手段４１は、第一の粒子計測手段５１に接続され、受光手段４２は、第二の粒子計測手段５２に接続されている。
【００１６】
図１に示すように、液滴吐出手段１０は、液室１１内に光を受けることで発光可能な粒子２０１を懸濁した粒子懸濁液２００を収容し、液室１１に配置された図示しない圧電素子の変形により、粒子２０１を含む球体、楕円体又はこれらが若干に変形した液滴２１０を、吐出方向３０３で示す方向に吐出することができる。
【００１７】
液滴吐出手段１０は、光を受けることで発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる手段である。液滴吐出手段１０としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、圧電素子を用いた圧電加圧方式、ヒータを用いたサーマル方式、静電引力によって液を誘導する静電方式、圧電素子を用いたメンブレン振動方式等のインクジェットヘッドなどが挙げられる。これらの中でも、メンブレン振動方式のインクジェットヘッドが好ましい。メンブレン振動方式のインクジェットヘッドは、振動による慣性力で液滴を吐出する方式であり、インクジェットヘッドの上部を大気解放することが可能であるため、特に粒子が細胞である場合、細胞に対する熱、電場、圧力などのダメージを低減できる。メンブレン振動方式のインクジェットヘッドに用いる圧電素子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、チタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）を用いた素子が好ましい。
【００１８】
液室１１は、光を受けることで発光可能な粒子２０１を懸濁した粒子懸濁液２００を保持する液体保持部であり、下面側には貫通孔であるノズル１２が形成されている。液室１１は、例えば、金属やシリコン、セラミック等から形成することができる。駆動手段２０は、液滴吐出手段１０の圧電素子と電気的に接続されており、圧電素子に駆動電圧を印加し、圧電素子を変形させることにより光を受けることで発光可能な粒子２０１を含む液滴２１０を吐出方向３０３に吐出させる。光を受けることで発光可能な粒子２０１は、照明光を受光して蛍光を発光することが可能な粒子（以下、「蛍光粒子」とも称することがある）であり、蛍光粒子２０１としては、例えば、蛍光色素によって染色された無機粒子、蛍光色素によって染色された有機ポリマー粒子、蛍光色素によって染色された細胞、蛍光タンパク質などが挙げられる。また、蛍光に基づく発光ではなく、ラマン散乱光に基づく発光をする粒子を用いることもできる。
【００１９】
蛍光色素により染色された有機ポリマー粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＳＰＨＥＲＯ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＮｉｌｅＲｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ベイバイオサイエンス株式会社製、１％（ｗ／ｖ）、直径１０μｍ〜１４μｍ）などが挙げられる。
【００２０】
蛍光色素によって染色された細胞における細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、すべての細胞について使用することができる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２１】
真核細胞としては、特に制限はなく、目的応じて適宜選択することができ、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌、藻類、原生動物などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞、真菌が好ましい。
【００２２】
接着性細胞としては、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、組織や器官から直接採取した初代細胞を何代か継代させたものでもよく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化した細胞、未分化の細胞などが挙げられる。
【００２３】
分化した細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞；星細胞；クッパー細胞；血管内皮細胞；類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞；骨芽細胞；砕骨細胞；歯根膜由来細胞；表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞；消化管上皮細胞；子宮頸部上皮細胞；角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞；ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞；腎細胞；膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞；骨細胞などが挙げられる。
【００２４】
未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞；ｉＰＳ細胞などが挙げられる。
【００２５】
真菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カビ、酵母菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞周期を調節することができ、１倍体を使用することができる点から、酵母菌が好ましい。
細胞周期とは、細胞が増えるとき、細胞分裂が生じ、細胞分裂で生じた細胞（娘細胞）が再び細胞分裂を行う細胞（母細胞）となって新しい娘細胞を生み出す過程を意味する。
【００２６】
酵母菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞周期をＧ１期に制御するフェロモン（性ホルモン）の感受性が増加したＢａｒ−１欠損酵母が好ましい。酵母菌がＢａｒ−１欠損酵母であると、細胞周期が制御できていない酵母菌の存在比率を低くすることができるため、容器内に収容された細胞の特定の核酸の数の増加等を防ぐことができる。
【００２７】
原核細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真正細菌、古細菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２８】
細胞としては、死細胞が好ましい。死細胞であると、分取後に細胞分裂が起こることを防ぐことができる。
【００２９】
蛍光タンパク質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ：Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ：Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）などが挙げられる。染色細胞における蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、セルトラッカーオレンジ、セルトラッカーレッドなどが挙げられる。
【００３０】
なお、粒子が凝集する場合、液滴吐出手段１０の液室１１に充填する蛍光粒子２０１などの粒子を含む懸濁液の粒子の濃度を調整することにより、懸濁液中の粒子の濃度と、懸濁液中の粒子の個数とがポアソン分布に従う理論から、懸濁液中の粒子の個数を数個以下に調整することができる。懸濁液の液成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン交換水などが挙げられる。液滴の直径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２５μｍ以上１５０μｍ以下が好ましい。液滴の直径が２５μｍ以上であると、液滴の径が小さくなく、内包する粒子の直径が小さいものだけになりにくく、適用できる粒子の種類が少なくなりにくい。１５０μｍ以下であると、液滴としては問題なく、液滴を吐出するためには、インクジェットヘッドの穴径を大きくする必要もなく、液滴の吐出が不安定となりにくい。また、液滴の直径をＲとし、粒子の直径をｒとすると、Ｒ＞３ｒであることが好ましい。Ｒ＞３ｒであると、粒子の直径が液滴の直径に対して大きくないため、液滴の縁の影響を受けにくく、粒子の計数精度が低下しにくい。
【００３１】
光照射手段３０は、液滴吐出手段から吐出された液滴に光を照射する手段である。光照射手段３０は、駆動手段２０と電気的に接続されており、駆動手段２０から同期信号を入力される。同期信号を入力された光照射手段３０は、液滴吐出手段１０による液滴２１０の吐出タイミングに合わせて、照明光となるレーザー光３０１を液滴２１０に照射する。
【００３２】
光照射手段３０としては、液滴吐出手段１０による液滴２１０の吐出に同期して光を照射できることが好ましい。これにより、液滴吐出手段１０から吐出された液滴２１０に、光をより確実に照射することができる。ここで、同期するとは、前記液滴２１０が吐出されて所定位置に達したときに前記光照射手段３０が前記レーザー光３０１を照射することを意味する。つまり、前記光照射手段３０は、前記液滴吐出手段１０による前記液滴２１０の吐出に対して、所定時間だけ遅延して前記光を照射する。
【００３３】
光照射手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、固体レーザー、半導体レーザー、色素レーザーなどが挙げられる。固体レーザーとしては、例えば、ＹＡＧレーザー、ルビーレーザー、ガラスレーザーなどが挙げられる。ＹＡＧレーザーの市販品としては、例えば、Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＯＮＥ−５３２−２００−ＫＥ（スペクトラ・フィジックス株式会社製、ＳＨＧにより出力波長は５３２ｎｍ）などが挙げられる。これらの中でも、パルス発振によりパルス光を照射できることが好ましい。
【００３４】
パルス光のパルス幅としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０μｓ以下が好ましく、１μｓ以下がより好ましい。単位パルスあたりのエネルギーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、集光の有無等の光学系に大きく依存するが、０．１μＪ以上が好ましく、１μＪ以上がより好ましい。ただし、蛍光粒子によってはフォトブリーチングが発生するため、この場合は、単位パルスあたり又は単位時間あたりのエネルギーを制限することが好ましい。同様に、蛍光粒子又はその他の発光粒子の利用目的に応じて、光照射が悪影響を与える場合があり、この場合にも、単位パルスあたり又は単位時間あたりのエネルギーを制限することが好ましい。
【００３５】
受光手段は、光を照射された粒子からの発光による光を受光する手段である。２つの受光手段４１及び４２は、いずれも光照射手段３０を介して駆動手段２０と電気的に接続されており、駆動手段２０から同期信号を入力される。同期信号を入力された受光手段４１及び４２は、光照射手段３０のレーザー光３０１により蛍光粒子２０１が発光するタイミングに合わせて、光３０２ａ及び光３０２ｂを受光する。
【００３６】
受光手段４１は、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測可能な光センシングデバイス／モジュールであり、受光手段４２は、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を計測可能な光センシングデバイス／モジュールである。受光手段４１及び受光手段４２は、それぞれ電気的に接続された第一の粒子計測手段５１と、第二の粒計測手段５２とに受光情報を出力し、これら受光素子の情報を基に、第一の粒子計測手段５１は液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測し、第二の粒子計測手段５２は液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を計測することができる。
【００３７】
受光手段４１は、第一の粒子計測手段５１と連携して蛍光粒子２０１の有無のみを計測することができればよいため、取得情報量の少ない光センシングデバイス／ユニットを用いることができ、例えば、フォトマルチューブ（ＰＭＴ、光電子増倍管）、アバランシュフォトダイオード（ＡＰＤ）、ピンフォトダイオード（ｐｉｎ−ＰＤ）、低解像度ＣＭＯＳ撮像素子などを用いることができる。これらは、高速及び高周波数でのサンプリングが可能であると同時に、光利用効率も高く、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の微弱な蛍光を受光した場合に、必要な信号雑音比（ＳＮＲ）を確保した適切な量の情報を第一の粒子計測手段に出力することができる。
【００３８】
受光手段４１にＡＰＤを用いた場合、ＡＰＤは蛍光粒子２０１から１次元情報となる発光光量を第一の粒子計測手段５１に出力できる。ＡＰＤは、ＡＰＤモジュール、例えば、ＡＰＤ４１０（帯域１００ＭＨｚ、直径１ｍｍ、感度１×１０５Ｖ／Ｗ、松定プレシジョン株式会社製）、ＡＰＤ１３０Ａ（帯域５０ＭＨｚ、直径１ｍｍ、感度２．５×１０６Ｖ／Ｗ、ソーラボジャパン株式会社製）、Ｃ１０５０８−０１（帯域１００ＭＨｚ、直径１ｍｍ、感度１．３×１０７Ｖ／Ｗ、浜松ホトニクス株式会社製）、ＡＰＤ４１０Ａ（帯域１０ＭＨｚ、直径１ｍｍ、感度２．７×１０７Ｖ／Ｗ、ソーラボジャパン株式会社製）などから、目的や利用する照明光の種類などに応じて、適切な帯域と感度とを考慮した選定により用いることができる。
【００３９】
第一の粒子計測手段５１は、例えば、デジタイザーやデータロガーやオシロスコープなどをその一部に用いることができる。デジタイザーは、ＡＤＣ（アナログデジタル変換器）を搭載したモジュール（製品）であり、例えば、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）の増設ボードとして提供されているＡＰＸ−５１０（１６ｂｉｔ・１００ＭＨｚサンプリング、株式会社アバルデータ製）、ＤＩＧ−１００Ｍ１００２−ＰＣＩ（１０ｂｉｔ・１００ＭＨｚサンプリング、株式会社コンテック製）などがある。第一の粒子計測手段５１は、デジタイザーなどにより受光手段４１から出力されたアナログの情報をデジタル化することにより、このデジタイザーと接続された第一の粒子計測手段５１の一部である情報処理部に出力することができ、このデジタル化された蛍光粒子の取得情報が１次元情報と少ない取得情報であるにもかかわらず、前記情報処理部は、定めた発光光量の閾値量基準や発光光量の時間軸プロファイル基準などから蛍光粒子の有無を判断し、結果として第一の粒子計測手段として蛍光粒子の有無を計測することができる。第一の粒子計測手段５１の一部である情報処理部は、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）及びＰＣにインストールした画像処理ソフトなどを用いることができる。
【００４０】
この蛍光粒子の有無のみを計測することは、蛍光粒子に基づく発光のみを確認すればよい定性計測であるため、取得情報量が少ない場合でも蛍光粒子の個数の計測と比べて高精度な計測、つまり高正答率となる計測を実現できる。また、取得情報量が少なくてもよいことの効果として、受光手段４１による光３０２ａに関する情報取得動作及び取得情報の出力、第一の粒子計測手段５１による取得情報の情報処理が単純となるため、同時に高速な計測を実現することができる。
【００４１】
受光手段４１としては、液滴吐出手段１０による液滴２１０の吐出に同期して蛍光粒子２０１からの光３０２ａを受光できることが好ましい。これにより、液滴吐出手段１０から吐出された液滴２１０に、光照射手段３０からレーザー光３０１が照射され、蛍光粒子２０１からの光３０２ａをより確実に受光することができる。なお、ここで、同期するとは、例えば、液滴が吐出されて所定位置に達したときに液滴に光が照射され、粒子が発光するタイミングで、受光手段が光を受光することを意味する。つまり、受光手段は、液滴吐出手段による液滴の吐出、及び光照射手段による光の照射に対して、それぞれ所定時間だけ遅延して光を検出する。また、このような遅延調整は、別途となるファンクションジェネレータと連携することにより、ファンクションジェネレータよりそれぞれに遅延を考慮した同期信号を出力しても実現できる。さらには、このファンクションジェネレータの機能を、液滴吐出手段１０と一体化してもよい。これらは、後述の受光手段４２の場合も同様である。
【００４２】
なお、受光手段４１は、光照射手段３０が照射するレーザー光３０１と比較して粒子からの光が弱い場合、受光手段の受光面側にレーザー光３０１の波長域を減衰させるフィルタを設置することが好ましい。このフィルタを設置することにより、ノイズの少ない状態で受光手段が発光による光を受光できる。フィルタとしては、例えば、光の波長を含む特定波長域を減衰させる光学濃度６以上のノッチフィルタなどが挙げられる。これは後述の受光手段４２の場合も同様である。
【００４３】
受光手段４２は、第二の粒子計測手段５２と連携して蛍光粒子２０１の個数を計測することができる計測手段であり、定量計測であるため、定性計測の受光手段４１と比較して、高精度の計測となり、これを実現させせるためには、受光手段４１と比較して取得情報量のより多い光センシングデバイス／ユニット、さらに、第一の粒子計測手段５１と比較してより複雑な情報処理を実施できる第二の粒子計測手段５２を用いることが好ましい。
【００４４】
取得情報量の多い光センシングデバイス／ユニットとしては、２次元情報となる画像情報を取得できる２次元受光センサー／モジュールがある。例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）撮像素子、ゲートＣＣＤなどが挙げられる。近年、科学実験用字のＣＭＯＳ撮像素子の技術が発展しており、微弱な光に対するノイズ特性が大きく向上しており用いることができる。ＣＭＯＳ撮像素子は、例えば、ｐｃｏ．ｅｄｇｅ  ５．５（株式会社東京インスツルメンツ製）、Ｃ１１４４０（ＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ  Ｖ２、浜松ホトニクス株式会社製）、Ｃ１３４４０（ＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ  Ｖ３、浜松ホトニクス株式会社製）などがある。これらは、数十％以上の高い光電変換量子効率、画素あたり３エレクトロン以下の低い読み出しノイズ、１００Ｈｚレベルの高速伝送、２，０００本以上の高い解像度、１６ｂｉｔ階調性などであり、ノイズが少なく高速高品質であると同時に画像情報としての非常に多くの情報を取得し、第二の粒子計測手段５２に出力することができる。また、２次元受光センサー／モジュールは非常に種類が多く、目的に応じて、適切な解像度を選定して用いることができる。
【００４５】
第二の粒子計測手段５２としては、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）及びＰＣにインストールした画像処理ソフトなどを用いることができる。２次元受光センサー／モジュールから出力された多量の画像情報は、ＰＣの増設ボードとして提供されるカメラリンクボード又はＰＣのインターフェースとして提供されるＵＳＢ３．０により、ＰＣのメモリに高速に入力することができる。ＰＣ及び画像処理ソフトが液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数をこの画像情報に基づいて高精度に計測するプロトコルとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することにより、高精度な個数計測を実現できるが、複数のプロトコルを組み合わせてより高精度な個数計測を実現することもできる。
【００４６】
画像処理のプロトコルとしては、例えば、（１）発光の受光面における形状の曲率半径を求め、求めた曲率半径のうち所定の範囲内にある曲率半径の中心の個数を粒子の個数として計数する処理、（２）発光の受光面における形状の外周の長さが所定の範囲内にある発光の個数を計数する処理、（３）発光の受光面における形状の外周の変曲点の個数を粒子の個数として計数する処理、（４）発光の受光面における形状の外周の接線の傾きの符号が変わる回数を粒子の個数として計数する処理などが挙げられる。
【００４７】
上記（１）の処理では、曲率半径が所定の範囲より小さい場合、粒子からの発光以外の屈折した光や散乱した光などが受光されているため、曲率半径が所定の範囲より小さい発光は除外する。また、曲率半径が所定の範囲より大きい場合、粒子が液滴の外辺部近傍に存在しているとき、光を照射して粒子を発光させると、粒子からの発光が液滴の球面内側に反射する現象により、液滴の外辺部が発光して見えるため、粒子からの発光ではないと判定して除外する。発光の受光面における形状の情報に基づき算出した曲率半径のうち所定の範囲内にある曲率半径を算出した際の円の中心の個数を粒子の個数として計数することができる。
【００４８】
上記（２）の処理は、上記（１）の処理における曲率半径を発光の受光面における形状の外周の長さに置き換えたものである。
【００４９】
上記（３）の処理では、例えば、２つの発光が重なったときには変曲点の個数が２個になり、３つの発光が重なったときには変曲点の個数が３個になるため、変曲点の個数を粒子の個数として計数することができる。
【００５０】
上記（４）の処理では、例えば、２つの発光が重なったときには接線の傾きの符号が２回変わり、３つの発光が重なったときには接線の傾きの符号が３回変わるため、接線の傾きの符号が変わる回数を粒子の個数として計数することができる。
【００５１】
これらの中でも、上記（１）の処理が好ましい。すなわち、粒子計数手段が、発光の受光面における形状の情報に基づき曲率半径を算出し、所定の範囲内にある曲率半径を算出した際の円の中心の個数を粒子の個数として計数する第二の計数処理を行うことがより好ましい。第二の計数処理が上記（１）の処理であると、粒子が複数であっても計数が容易となり、粒子を計数する精度が高まる点で有利である。
【００５２】
上記において、ＰＣは、関連する各動作を制御するＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ  Ｏｎｌｙ  Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）、メインメモリなどを有し、画像処理ソフトに基づいて制御されることにより個数計測を実施する。画像処理ソフトは、汎用の画像処理を行うソフトウェアを用いてもよい。汎用の画像処理ソフトは、例えば、ＩｍａｇｅＪ（アメリカ国立衛生研究所製、オープンソース）などが挙げられる。また、汎用の画像処理ソフトに制限されるわけではなく、Ｃ＃、Ｃ＋＋、Ｐｈｙｔｏｎなどのプログラム言語で作成されたで画像処理ソフトを実施してもよく、また、ＧＰＵ（Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）を利用してもよい。プログラム言語で作成した画像処理ソフトの場合には、液滴吐出手段１０の制御を同様にプログラム言語で実現できることから、液滴吐出制御と蛍光粒子の個数計測との連携動作が容易となる。これは、受光手段４１と第一の粒子計測手段５１との蛍光粒子の有無の計測の場合も同様である。
【００５３】
図１において、第二の粒子計測手段５２による個数計測に用いる受光手段４２は、２次元受光センサー／モジュールに制限されるものではなく、別手段によっても多量の情報量を扱うことができれば、蛍光粒子に対する個数計測を実現できるようになる。例えば、照明手段３０に必要なパルス時間以上のレーザー光を用い、受光手段４２に高帯域のＡＰＤと高帯域のデジタイザーを用い、このＡＰＤの前方に微小スリット又は微小ピンホールを設けることにより、吐出された液滴２１０の位置変化に応じた情報を、ＡＰＤから出力された電圧の時間変化情報として取得することができる。
【００５４】
例えば、ＡＰＤとして、ＡＰＤモジュールである、Ｃ５６５８（帯域１ＧＨｚ、直径０．５ｍｍ、感度２．５×１０Ｅ５Ｖ／Ｗ、浜松ホトニクス株式会社製）を用い、受光手段４２の一部となる結像光学系の像面の結像位置で、かつＡＰＤの前方の位置にスリットを設け、このスリットの幅を上下の幅が１０μｍとなるように設置する。結像光学系の倍率が５倍の場合、このスリットの幅は液滴２１０のある物面では、２μｍの幅に相当する。このとき、約１ｍ／ｓ（＝１μｍ／μｓ）で吐出された直径約８０μｍの液滴２１０は、８０μｓの時間で液滴が下方に吐出されてその位置が変化することに対応して、約２μｍの分解能で吐出方向に４０個相当に空間分割された形状情報と相関性の高い空間情報を取得することができる。この空間情報のプロファイルを解析することにより、蛍光粒子２０１の個数を計測することができる。スリットではなくピンホールを用い、複数のＡＰＤを吐出方向と垂直な方向に設置し、吐出方向と垂直な方向の空間情報を取得することにより、より精度を向上することができる。
【００５５】
図２は、第１の実施の形態にかかる粒子計数装置１００Ａの受光手段４１から出力された情報の一例を示す図である。図２において、蛍光粒子として、ＳＰＨＥＲＯ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（直径２．５μｍ〜４．５μｍ、ベイバイオサイエンス株式会社製）を用い、粒子懸濁液２００中の蛍光粒子２０１の濃度を平均値として約０．２個／滴となるように調整した上で、ノズル１２より液滴吐出手段１０より液滴２１０を吐出させ、光照射手段３０としてその一部にパルス光を照射できるＥｘｐｌｏｒｅｒ  ＯＮＥ−５３２−２００−ＫＥを用い、レーザー出力は１パルス当り約２００μＪとし、受光手段４１としてソーラボジャパン株式会社製を用い、第一の粒子計測手段５１にデジタイザーとしてＤＩＧ−１００Ｍ１００２−ＰＣＩ（１００ＭＨｚサンプリング、インピーダンス５０Ω設定）とデスクトップＰＣとを用いた場合の、デジタイザーから情報処理部に出力された情報を示したものであり、吐出した液滴数は５０個である。図２の横軸は時間軸であり、これは液滴吐出手段１０に印加したトリガー基準で記載した相対値であり、縦軸は受光手段４１よりデジタイザーに出力された情報となる電気信号の電圧値である。
【００５６】
図２に示すように、吐出した５０個の液滴のうち１０個の液滴に相当する１０本の折れ線が、上に凸の折れ線として出力されており、また残り４０個の液滴に相当する４０本の折れ線は、Ｘ軸近傍の電圧値０Ｖ近傍の折れ線として密に重なる状態で出力されている。別途、高精度に計測した受光手段４２として前述のＣ１１４４０を用い、これと第二の粒子計測手段５２による蛍光粒子の個数の計測の結果と比較したところ、上に凸の折れ線となった１０個の液滴には蛍光粒子が含まれおり、電圧値０Ｖ近傍の折れ線となった４０個の液滴には蛍光粒子が含まれていなかった。このことより、受光手段４１と第一の粒子計測手段５１とにより、高精度に液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無の計測を実現できることが確認された。
【００５７】
図２において、液滴２１０に蛍光粒子２０１が含まれる場合の１０個の液滴は、そのピーク電圧が約０．３Ｖ〜１．３Ｖの範囲にあることが示される。これは、含まれる蛍光粒子の数が１個〜３個と幅がある可能性があること、及び液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１への照明手段３０による照明光となるレーザー光の照射強度が液滴２１０内の蛍光粒子２０１の位置により大きくばらつくこと、さらに受光手段４１にて受光する蛍光粒子の光３０２ａの光利用効率が大きくばらつくこと、の３つが大きな原因であると考えられる。
【００５８】
これは、粒子懸濁液２００中の蛍光粒子２０１の濃度を平均値として約０．２個／滴の場合、ポアソン分布から、蛍光粒子が存在する場合には９９．９７％の確率で１個〜３個の蛍光粒子であるが、そのうち、９．６％の確率で２個〜３個の蛍光粒子を含むこととなり、１０個の液滴に蛍光粒子が含まれる場合、１個又は場合により２個の液滴が、２個〜３個の蛍光粒子を含むことは確率的に稀ではない。図２においては、１．１Ｖを超える出力電圧の液滴が２個であるが、これは２個以上の蛍光粒子による可能性が高い。
【００５９】
また、図２において、蛍光粒子２０１が含まれる場合の１０個の液滴のうち１個の蛍光粒子を含む可能性が高い８個の液滴は、その出力電圧が約０．３Ｖ〜０．７Ｖと２倍以上ばらつく。これは、上述の蛍光粒子２０１に対する照明手段３０及び受光手段４１のばらつきに依存すると考えられる。
【００６０】
しかし、実際には、１個の蛍光粒子を含む可能性が高い８個の液滴は、その出力電圧が約０．３Ｖ〜０．７Ｖと２倍以上となる受光手段４１からの出力電圧のばらつきがあり、１個と２個とを精度よく判別した定量計測ができることは難しいことがわかる。一方、液滴２１０が蛍光粒子２０１を含む場合には、約０．３Ｖ以上の出力電圧のピークを必ず有することは確認でき、また、液滴２１０が蛍光粒子２０１を含まない場合には、明瞭なピークが存在せずに必ず最大でも０．１Ｖ以下の出力電圧となることは確認できる。このため、単純に最大電圧を閾値とし、例えば、この閾値を０．２Ｖと設定し、これを第一の粒子計測手段５１が判断することにより、蛍光粒子２０１の有無に関しては高精度に計測できることがわかる。これは、発光の有無を計測する単純な計測であることに基づく。
【００６１】
この受光手段４１との計測手段５１による蛍光粒子２０１の有無の計測は、図２に出力電圧を記載のデジタイザーを用いた出力電圧閾値に対する判断に制限されるわけではなく、アンプなどを併用してのＴＴＬ、ＬＶＴＴＬ、ＣＭＯＳなどによる論理判断により非常に簡単な構成とすることもできる。又、出力電圧閾値だけでは、ノイズなどにより誤計測が発生して精度が低下する場合には、時間軸ウインドウ又は時間軸ゲートに対する積分回路を設けて積算量に閾値を設け、ＴＴＬ、ＬＶＴＴＬ、ＣＭＯＳなどで論理判断してもよい。さらには、設定した時間軸ウインドウ領域に、正常波形プロファイル領域又は異常波形プロファイル領域を設け、この領域内外であるかの判断により蛍光粒子の有無を判断し、計測としてもよい。
【００６２】
図２の出力電圧に基づく蛍光粒子の有無の計測は、蛍光粒子の有無に対応した上に凸のピークの幅が約１００ｎｓであることから、最高１０ＭＨｚでの高速での計測が可能である。図２においては、ＡＰＤに帯域１０ＭＨｚ品を用いたために、ピークの幅が約１００ｎｓとなり、元の照射手段３０によるパルス光の約１５ｎｓから広がっているが、ＡＰＤにより高帯域の仕様品を用いることにより、より高速の計測も可能となる。一方、液滴吐出手段１０は、一般的にはその共振周波数以上での高速吐出は困難であり、機械的な共振周波数に制限される。図２の実施例の場合、含まれる蛍光粒子２０１として数μｍ以上となる液滴２１０を吐出させたいことから、液室１１やノズル１２が、紙への印刷などで利用される液滴径の小さいインクジェットヘッドよりも大きいこともあり、その共振周波数は１ＭＨｋ以下である。このため、液滴吐出手段１０から吐出された液滴２１０に対する計測手段としては十分な高速である。
【００６３】
液滴吐出手段１０の駆動周波数が１００Ｈｚ程度の場合には、２次元受光センサー／モジュールである低解像度のＣＭＯＳ撮像素子を用いて、１次元情報となる発光光量を受光する受光手段４１に用いることができる。ＣＭＯＳ撮像素子の受光動作自体は１ｍｓの分解能のシャッタ動作であり、つまりＣＭＯＳ撮像素子は１ｋＨｚ相当での駆動も可能であるが、高解像度の場合には多量の画像情報の出力に時間がかかり高速動作ができない。低解像度のＣＭＯＳ撮像素子としては、高解像度のＣＭＯＳ撮像素子をビニングやクロッピングにより画素数を低減させて転送することにより、光量検出として最低限の画素を粒子計測手段５１に転送し、粒子計測手段にて画像情報から発光光量情報を計算し、この発光光量情報を基に液滴中の蛍光粒子の有無を判断、及び計測してもよい。
【００６４】
低解像度のＣＭＯＳ撮像素子を用いた場合には、２次元情報として複数画素の情報を利用しながらも、後述の出力や画像処理に時間がかかる形状に着目した画像処理ではなく、複数画素集団の発光光量を閾値とした液滴中の蛍光粒子の有無を判断、及び計測することにより、高精度かつ高速に計測することができる。これは、一定以上の輝度閾値が一定以上の複数の画素が確認された場合、蛍光粒子が有とする判断手段を、第二の粒子計測手段に設けることによって実現される。ここでの輝度とは、ＣＭＯＳ撮像素子に入射した総フォトン数に比例する光量ではなく、階調性１６ｂｉｔで表現される１画素あたりのフォトン入射数に比例する単位面積当たりの光量である。一部の複数画素に関する光量とすることができ、通常の形状に基づく画像処理とは全く異なる単純な光量計算の特殊な手段であり、ＡＰＤのような１次元情報を得るセンサーのセンサー領域を事前又は事後に制限することと等価となる動作である。不要な領域の画素からのノイズを低減することができ、精度を向上することができる。
【００６５】
図３Ａ及び図３Ｂは、第１の実施の形態にかかる粒子計数装置１００Ａの受光手段４２から出力された情報の一例を示す図である。図３Ａ及び図３Ｂにおいて、蛍光粒子として、ＳＰＨＥＲＯ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（直径１０μｍ〜１４μｍ、ベイバイオサイエンス株式会社製）を用い、ノズル１２より液滴吐出手段１０より液滴２１０を吐出させ、光照射手段３０としてその一部に約１５ｎｓ幅のパルス光を照射できるＥｘｐｌｏｒｅｒ  ＯＮＥ−５３２−２００−ＫＥを用い、レーザー出力は１パルス当り約２００μＪとし、２次元受光センサー／モジュールとしてｐｃｏ．ｅｄｇｅ  ５．５（株式会社東京インスツルメンツ製）を用い、結像系として顕微鏡対物レンズＭ−ＰＬＡＮ  ＡＰＯ５×（株式会社ミツトヨ製）及び対応した結像レンズユニット（株式会社ミツトヨ製）を用い、この２次元受光センサー／モジュールにより受光した画像情報のうち、液滴内の粒子としてその画像情報が複雑となる画像の一例を、図３Ａ及び図３Ｂとして示した。
【００６６】
図３Ａは、図１の受光手段４２より出力された情報の一例を示す図である。図３Ａに示すように、紙面に垂直な方向に奥行きがある球体又は楕円体の液滴の中に粒子が２つ存在し、粒子の１つは液滴の中の紙面手前側に存在し、もう１つの粒子は液滴の中の紙面奥側に存在するような受光方向から受光されたときの画像である。液滴の中の紙面奥側に存在する粒子からの発光は、液滴を通過する分だけ、屈折や散乱などにより発光の輝度値が減衰するため、受光手段に対する液滴の中の位置に起因して発光の光量がばらつくときがある。
【００６７】
図３Ｂは、図１の受光手段４２より出力された情報の他の一例を示す図である。図３Ｂに示すように、紙面に垂直な方向に奥行きがある球体又は楕円体の液滴の中に蛍光粒子が３つ存在し、粒子の１つが液滴の外辺部近傍に存在するような受光方向から受光された場合の画像情報である。図３Ｂに示すように、液滴の外辺部近傍に存在する蛍光粒子からの発光は、液滴の球面内側に反射するときがある。
【００６８】
図３Ａ及び図３Ｂに示される場合には、いずれも蛍光粒子からの発光が液滴の球面内側に反射する現象のため、液滴からの発光光量の閾値に基づいてその蛍光粒子の個数を計測することは難しく、このような場合は、既に記載したプロトコルなどの形状に着目した画像処理による高精度計測が最適である。
【００６９】
しかしながら、形状に着目した画像処理による蛍光粒子の個数計測は、多量の情報量を扱うために高精度であっても高速動作させることが難しい。図３Ａ及び図３Ｂにて受光手段４２として用いたｐｃｏ．ｅｄｇｅ  ５．５の場合、この受光手段４２から粒子計測手段５２にこの多量の情報を出力するだけで１００Ｈｚ程度に近く、画像処理込などの粒子計測手段の動作込みで１００Ｈｚ程度の動作をさせることは困難である。
【００７０】
２次元受光センサー／モジュールとして、プログラム可能なＦＰＧＡ（Ｆｉｅｌｄ  Ｐｒｏｇｒａｍａｂｌｅ  Ｇａｔｅ  Ａｒｒａｙ）をモジュールレベルで一体化させた場合には、外部への多量の情報量の出力の前に、形状に着目した画像処理を実施することができるので、ビデオレートとなる３０Ｈｚでの複雑な画像処理、又はこれより高速の６０Ｈｚ〜１００Ｈｚでの簡単な画像処理を実施する製品はあるが、この場合の２次元受光センサー／モジュールは科学用ＣＭＯＳと比較してノイズの多い仕様であるか、情報量が少なく解像度は高くてＨＤＴＶレベルの低解像度仕様であるか、又は諧調性が８ｂｉｔ程度の低い仕様であるかなど、本発明の目的に利用することは難しい製品である。
【００７１】
このため、図１に示す本発明の粒子計数手段においては、この液滴２１０に含まれる粒子の個数を計測する第二の粒子計測手段５２に加えて、既に説明した液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測する第一の粒子計測手段５１を設け、２つの異なる粒子計測手段を有することにより、本発明の課題とする計数精度を向上させ、計測速度を向上させることができる粒子計数装置１００Ａを提供することを実現できる。
【００７２】
もう少し具体的にこの動作を説明する。蛍光粒子の濃度が、平均値として約０．２個／滴の場合、ポアソン分布から、液滴に蛍光粒子が存在する確率は、０．２に近いがこれより小さい、０．１８１である。これは、１／０．１８１≒５．５２から、平均で約５．５２滴に１滴の確率となるため、この１滴を除いた平均で約４．４２滴は、蛍光粒子が０個、つまり蛍光粒子が全く液滴に含有されておらず、第二の粒子計測手段によりその個数を計測する必要がない。このため、第一の粒子計測手段によりその有無を計測し、液滴に蛍光粒子が有と計測した場合にのみ、第二の粒子計測手段により個数を計測する場合には、第二の粒子計測手段と同等の計測手段のみで蛍光粒子の有無や個数を計測する場合に比べて、平均として５．５２倍の計測速度の向上を図ることができる。これは、通常、第二の粒子計測手段と同等の計測手段のみによる蛍光粒子の有無や個数を計測する場合は、前述したが、多量の画像データ転送と画像処理が必要であることからその処理速度が遅く、例えば、高解像度のｐｃｏ．ｅｄｇｅ  ５．５の場合には、平均１０Ｈｚ程度が制御込みで可能な計測速度であるのに対し、本発明では、液滴吐出の周波数を５．５２倍の５５Ｈｚに対応する、５５Ｈｚでの第一の粒子計測手段による高速計測を実現することができる上、個数計測は、引き続き、画像処理を用いた第二の粒子計測手段により行うことにより、高精度を同時に実現できる。
【００７３】
蛍光粒子の濃度が、平均値として約０．０２個／滴の場合、ポアソン分布から、液滴に蛍光粒子が存在する確率は、０．０２に近いがこれより小さい、０．０１９８である。これは、１／０．０１９８≒５０．５から、平均で約５０．５滴に１滴の確率となるため、この１滴を除いた平均で約４９．５滴は、蛍光粒子が０個、つまり蛍光粒子が全く液滴に含有されておらず、第二の粒子計測手段によりその個数を計測する必要がない。このため、上述の蛍光粒子濃度が約０．２個／滴の場合と同様の動作により、液滴吐出の周波数が５０．５倍の５０５Ｈｚに対応する、５０５Ｈｚでの第一の粒子計測手段による非常に高速となる計測を実現することができる上、個数計測は、引き続き、画像処理を用いた第二の粒子計測手段により行うことにより、高精度を同時に実現できる。
【００７４】
蛍光粒子の濃度が濃い場合の、平均値として約１個／滴の場合においても、ポアソン分布から、液滴に蛍光粒子が存在する確率は、１ではなく、これよりかなり小さい、０．６３２である。これは、１／０．６３２≒１．５８から、平均で約１．５８滴に１滴の確率となるため、この１滴を除いた平均で約０．５８滴は、蛍光粒子が０個、つまり蛍光粒子が全く液滴に含有されておらず、第二の粒子計測手段によりその個数を計測する必要がない。このため、上述の蛍光粒子濃度が約０．２個／滴の場合と同様の動作により、液滴吐出の周波数が１．５８倍の約１６Ｈｚに対応する、約１６Ｈｚでの第一の粒子計測手段による高速計測を実現することができる上、個数計測は、引き続き、画像処理を用いた第二の粒子計測手段により行うことにより、高精度を同時に実現できる。
【００７５】
蛍光粒子の濃度が、さらに非常に濃い場合においても、平均値が約２．４個／滴の場合までは、ポアソン分布から、液滴に蛍光粒子が存在する確率は、０．９０７に止まるため、本発明の第一の粒子計測手段と、第二の粒子計測手段とを組み合わせた場合には、上述の蛍光粒子濃度が約０．２個／滴の場合と同様の動作により、１０％以上の高速計測が可能となり、幅広い蛍光粒子濃度において、第二の粒子計測手段のみによる蛍光粒子の有無や個数を計測する場合よりも効果的であることがわかる。
【００７６】
図４は、第一の粒子計測手段５１と第二の粒子計測手段５２とを有する図１に例示した粒子計数装置１００Ａが、上述の計数精度を向上させ、計測速度をも向上させることが可能であり、その動作の一例を示すフローチャートである。図４に示すように、Ｓ１０１では、駆動手段２０から駆動電圧を印加された液滴吐出手段１０により、蛍光粒子２０１を含む液滴２１０を、図１中の３０３で示す液滴の吐出方向にノズル１２から吐出する。また、駆動手段２０は、液滴吐出手段１０に駆動電圧を印加するとともに、光照射手段３０及び２つの受光手段４１及び４２に同期信号を出力する。その後、粒子計数装置１００Ａは、処理をＳ１０２に移行させる。
【００７７】
Ｓ１０２では、駆動手段２０から同期信号を入力された光照射手段３０は、液滴２１０の吐出タイミングに合わせて、光としてのレーザー光３０１を液滴２１０に照射する。また、同期信号を入力された受光手段４１及び４２は、光照射手段３０のレーザー光３０１により蛍光粒子２０１が発光し、光３０２ａ及び光３０２ｂを受光する。これにより、受光手段４１及び４２は、蛍光粒子２０１からの発光による光に関する情報をそれぞれ取得することとなる。その後、粒子計数装置１００Ａは、処理をＳ１０３に移行させる。
【００７８】
Ｓ１０３では、受光手段４１より蛍光粒子２０１の光３０２ａに関する情報を出力された粒子計数手段５１は、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測し、蛍光粒子２０１の有無を判定する。蛍光粒子２０１「有」と判定した場合、その後、粒子計数装置１００Ａは、処理をＳ１０４に移行させる。蛍光粒子２０１「無」と判定すると、粒子計数装置１００Ａは、本処理を終了させる。
【００７９】
Ｓ１０４では、受光手段４２より蛍光粒子２０１の光３０２ｂに関する情報を出力された第二の粒子計測手段５２は、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を計測する。その後、粒子計数装置１００Ａは、処理を終了させる。このようなＳ１０１〜Ｓ１０４に示した動作手順により、粒子計数装置１００Ａは、計数精度を向上させ、計測速度を向上させることができる。
【００８０】
＜第２の実施の形態＞
第２の実施の形態にかかる粒子計数装置は、第１の実施の形態にかかる粒子計数装置に、さらに、第一の粒子計測手段からの液滴に含まれる粒子が有との情報に基づいて第二の粒子計測手段により液滴に含まれる粒子の個数を計測する粒子計測手段制御手段と、第二の粒子計測手段からの液滴に含まれる粒子の個数の情報に基づいて液滴吐出手段を制御する液滴吐出手段制御手段と、をさらに有し、液滴吐出手段制御手段が、第一の粒子計測手段からの液滴に含まれる粒子が無との情報に基づいて第二の粒子計測手段からの情報を用いることなく液滴吐出手段を制御する手段である。
第２の実施の形態にかかる粒子計数方法は、第１の実施の形態にかかる粒子計数装置に、さらに、第一の粒子計測工程からの液滴に含まれる粒子が有との情報に基づいて第二の粒子計測工程により液滴に含まれる粒子の個数を計測する粒子計測工程制御工程と、第二の粒子計測工程からの液滴に含まれる粒子の個数の情報に基づいて液滴吐出工程を制御する液滴吐出工程制御工程と、をさらに含み、前記液滴吐出工程制御工程が、前記第一の粒子計測工程からの前記液滴に含まれる前記粒子が無との情報に基づいて第二の粒子計測工程からの情報を用いることなく液滴吐出工程を制御する工程を含む。
粒子計測工程制御工程は粒子計測手段制御手段により好適に実施することができ、液滴吐出工程制御工程は液滴吐出工程制御手段により好適に実施することができる。
また、液滴吐出工程制御工程が、第二の粒子計測工程からの液滴に含まれる粒子の個数の情報に基づいて粒子の個数を積算し、液滴吐出工程を制御する工程であることが好ましい。
【００８１】
図５は、第２の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。図５は、第１の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である図１と類似の構成であり、この図１の構成に対して、粒子計測手段制御手段及び液滴吐出手段制御手段を設けた点が相違する。１０は液滴吐出手段であり、１１は液滴吐出手段１０の液室であり、１２は液滴吐出手段のノズルであり、２０は駆動手段であり、３０は光照射手段であり、４１および４２は受光手段であり、５１は第一の粒子計測手段であり、５２は第二の粒子計測手段であり、１００Ｂは粒子計数装置であり、２００は粒子懸濁液であり、２０１は粒子懸濁液中の蛍光粒子であり、２１０は液滴吐出手段のノズルより吐出された液滴であり、３０１はレーザー光であり、３０２ａは受光手段４１への光であり、３０２ｂは受光手段４２への光であり、３０３は液滴の吐出方向であり、５３は粒子計測手段制御手段であり、２１は液滴吐出手段制御手段である。
【００８２】
以下、図５に示す第２の実施の形態に関し、図１と同じ構成に関する説明は一部省略し説明する。図５に示すように、液滴吐出手段１０は、液室１１内に蛍光粒子２０１を懸濁した粒子懸濁液２００を収容し、液室１１に配置された図示しない圧電素子の変形により、蛍光粒子２０１を含む球体、楕円体、又はこれらが若干に変形した液滴２１０を、吐出方向３０３で示す方向に吐出することができる。
【００８３】
光照射手段３０は、液滴吐出手段から吐出された液滴に光を照射する手段である。光照射手段３０は、駆動手段２０と電気的に接続されており、駆動手段２０から同期信号を入力される。同期信号を入力された光照射手段３０は、液滴吐出手段１０による液滴２１０の吐出タイミングに合わせて、照明光となるレーザー光３０１を液滴２１０に照射する。
【００８４】
２つの受光手段４１及び４２は、いずれも光照射手段３０を介して駆動手段２０と電気的に接続されており、駆動手段２０から同期信号を入力される。同期信号を入力された受光手段４１及び４２は、光照射手段３０のレーザー光３０１により蛍光粒子２０１が発光するタイミングに合わせて、光３０２ａ及び光３０２ｂを受光する。
【００８５】
受光手段４１は、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測可能な光センシングデバイス／モジュールであり、受光手段４２は、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を計測可能な光センシングデバイス／モジュールである。受光手段４１及び受光手段４２は、それぞれ電気的に接続された第一の粒子計測手段５１と、第二の粒子計測手段５２とに受光情報を出力し、これら受光素子の情報を基に、第一の粒子計測手段５１は液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測し、第二の粒子計測手段５２は液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を計測することができる。
【００８６】
受光手段４２は、第二の粒子計測手段５２と連携して蛍光粒子２０１の個数を計測することができる計測手段であり定量計測であるため、定性計測の受光手段４１と比較して、高精度の計測となりこれを実現させせるためには、受光手段４１と比較して取得情報量のより多い光センシングデバイス／ユニット、さらに第一の粒子計測手段５１と比較してより複雑な情報処理を実施できる第二の粒子計測手段５２を用いる。
【００８７】
第二の粒子計測手段５２は、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）及びＰＣにインストールした画像処理ソフトなどを用いることができる。２次元受光センサー／モジュールから出力された多量の画像情報は、ＰＣの入出力インターフェースを介して、ＰＣのメモリに高速に入力することができる。
【００８８】
粒子計測手段制御手段５３は、第一の粒子計測手段５１から出力された液滴２１０中の蛍光粒子２０１の有無に関する情報に基づいて、計測結果において蛍光粒子２０１が有の場合には、図１及び図４の場合と同様にして、第二の粒子計測手段５２による個数計測を実施する。一方、計測結果において蛍光粒子２０１が無の場合には、液滴吐出手段制御手段２１が、光照射手段３０に再度のレーザー光３０１の発光、液滴吐出手段に再度の液滴吐出、受光手段４１及び４２の受光、さらには第一の粒子計測手段５１及び第二の粒子計測手段５２に再度の粒子計測、などの動作を実施する信号をそれぞれに適切なタイミングで出力する。これにより、２回目の液滴２１０の吐出と、これに付随した液滴２１０中の蛍光粒子２０１の計測が実施される。
【００８９】
この２回目に吐出された液滴２１０中の蛍光粒子２０１の計測に関しては、１回目と同様に、粒子計測手段制御手段５３は、第一の粒子計測手段５１から出力された液滴２１０中の蛍光粒子２０１の有無に関する情報に基づいて、計測結果において蛍光粒子２０１が有の場合には第二の粒子計測手段５２による個数計測を実施し、粒子計測及び液滴吐出を停止する。一方、計測結果において蛍光粒子２０１が無の場合には、１回目と同様に、液滴吐出手段制御手段２１が、光照射手段３０に再度のレーザー光３０１の発光、液滴吐出手段に再度の液滴吐出、受光手段４１及び４２の受光、さらには第一の粒子計測手段５１及び第二の粒子計測手段５２に再度の粒子計測などの動作を実施する信号をそれぞれに適切なタイミングで出力する。これにより、３回目の液滴２１０の吐出と、これに付随した液滴２１０中の蛍光粒子２０１の計測が実施される。以下、粒子計測手段５１により液滴２１０中の蛍光粒子が有と計測されるまで、液滴吐出手段制御手段２１は、同様の動作を繰り返すにように液滴吐出手段及び関連したモジュールを制御する。この動作の繰り返しが停止して終了となるのは、粒子計測手段５１により液滴２１０中の蛍光粒子が有と計測された場合であり、その後、粒子計測手段５２による個数計測の情報を、本粒子計数装置１００Ｂが個数情報として取得した場合である。
【００９０】
これらの動作により、１個以上の蛍光粒子を所定の液滴吐出位置に必要な場合、液滴吐出手段１０からの吐出された液滴２１０中の蛍光粒子２０１の個数を高精度かつ高速に計測する粒子計数装置を提供することができる。また、２個以上の複数個の蛍光粒子が所定の液滴吐出位置に必要な場合においても、上記動作に加えて、粒子計測手段５２による個数計測の情報を加算して所定の個数に積算されたという判断となるまで液滴吐出手段制御手段２１による液滴吐出手段１０への液滴吐出実施の制御と、第一の粒子計測手段５１及び第二の粒子計測手段５２による計測とを続けることにより、高精度かつ高速に計測する粒子計数装置を提供することができる。
【００９１】
液滴吐出手段制御手段２１は、液滴吐出手段１０を制御する信号を、図５に示すように光照射手段３０経由で出力することに制限されるわけではなく、直接、又は間接的にファンクションジェネレータと連携することにより、ファンクションジェネレータ経由でそれぞれに遅延を考慮した同期信号を出力しても実現できる。さらには、このファンクションジェネレータの機能を、液滴吐出手段１０、又はこの液滴吐出手段制御手段２１と一体化してもよい。また、液滴吐出手段制御手段２１は、第一の粒子計測手５１及び第二の粒子計測手５２から情報を取得することにその情報取得先が制限されるわけではなく、その他の複数の構成要素からの情報を取得した上で、液滴吐出手段１０を制御することが好ましい。
粒子計測手段制御手段５３は、第一の粒子計測手段５１と同様に、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）及びＰＣにインストールした制御ソフトや、プログラマブル・ロジック・コントローラ（ＰＬＣ）、又はシーケンサと呼ばれる制御専用機器とこれにインストールするシーケンス・プログラムなどを用いることができる。
【００９２】
この液滴吐出手段制御手段２１は、第一の粒子計測手段５１又は粒子計測手段制御手段５３と同様に、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）及びＰＣにインストールした制御ソフトや、プログラマブル・ロジック・コントローラ（ＰＬＣ）、又はシーケンサと呼ばれる制御専用機器とこれにインストールするシーケンス・プログラムなどを用いることができる。
【００９３】
図６は、第２の実施の形態にかかる粒子計数装置の動作の一例を示すフローチャートである。より詳細には、図６は、第２の実施の形態にかかる粒子計測手段制御手段５３及び液滴吐出手段制御手段２１を有する図５に例示した粒子計数装置１００Ｂが、上述の計数精度を向上させ、計測速度を向上させることができる粒子計数装置１００Ｂとして機能する動作手順の一例を示すものである。図６に示すように、Ｓ２０１では、駆動手段２０から駆動電圧を印加された液滴吐出手段１０により、蛍光粒子２０１を含む液滴２１０を、図５中の３０３で示す吐出方向にノズル１２から吐出する。また、駆動手段２０は、液滴吐出手段１０に駆動電圧を印加するとともに、光照射手段３０及び２つの受光手段４１及び４２に同期信号を出力する。その後、粒子計数装置１００Ｂは、処理をＳ２０２に移行させる。
【００９４】
Ｓ２０２では、駆動手段２０から同期信号を入力された液滴吐出手段１０は、液滴２１０の吐出タイミングに合わせて、光としてのレーザー光３０１を液滴２１０に照射する。また、同期信号を入力された受光手段４１及び４２は、光照射手段３０のレーザー光３０１により蛍光粒子２０１が発光するタイミングに合わせて、光３０２ａ及び光３０２ｂを受光する。これにより、受光手段４１及び４２は、蛍光粒子２０１からの発光に関する情報をそれぞれ取得することとなる。その後、粒子計数装置１００Ｂは、処理をＳ２０３に移行させる。
【００９５】
Ｓ２０３では、受光手段４１より蛍光粒子２０１の発光による光３０２ａに関する情報を出力された粒子計数手段５１は、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測し、蛍光粒子２０１有か否かを判定する。蛍光粒子２０１「有」と判定すると、その後、粒子計数装置１００Ｂは、処理をＳ２０４に移行させる。蛍光粒子２０１「無」と判定すると、液滴吐出手段制御手段２１が作用し、処理をＳ２０１に戻す。
【００９６】
Ｓ２０４では、受光手段４２より蛍光粒子２０１の発光による光３０２ｂに関する情報を出力された第二の粒子計測手段５２は、粒子計測手段制御手段により液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を計測する。その後、粒子計数装置１００Ｂは、処理を終了させる。このようなＳ２０１〜Ｓ２０４に示した動作手順により、粒子計数装置１００Ｂは、計数精度を向上させ、計測速度を向上させることができる。
【００９７】
図７は、第２の実施の形態にかかる粒子計数装置の計測精度の一例を示す図である。図７は、図５の構成にて、図６の動作手順により実施した粒子計数装置１００Ｂの計測精度を例示したものである。粒子計数装置の計測精度の評価に際しては、図５における蛍光粒子としては、平均直径１０μｍ以下の細胞を用いて、これをエバンスブルー蛍光染料で染色したものを用いる。これ以外の実験条件は、図２、図３Ａ、及び図３Ｂでの発光による光に関する情報を取得した実験条件とほぼ同じである。吐出した液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測する第一の粒子計測手段５１と、吐出した液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を計測する第二の粒子計測手段５２とを設ける構成であり、この比較が必要であることから、これらに情報を出力する２つの受光手段の差異の影響を低減するため、受光手段４１と受光手段４２とは同じ感度レベルの製品を用いた。
【００９８】
細胞濃度は、粒子懸濁液２００中の体積当たりの蛍光粒子２０１の濃度ではなく、吐出した液滴２１０の１液滴あたりに含まれる蛍光粒子数の平均値を示したものであり、この細胞濃度が約０．２５個／滴となるように調整した。ただし、液滴吐出中に液室１１中の粒子懸濁液２００を撹拌していないことにより、蛍光粒子の沈降により実験中に濃度変動が生じる。基準とする吐出した液滴２１０中の蛍光粒子２０１の実際の個数は、着弾した液滴に含まれる蛍光粒子を、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｂｅｒ、カールツァイスマイクロスコピー株式会社製）にて２０倍対物レンズを用いて別途画像取得し、この画像に対して蛍光粒子数を目視で判定することにより取得した。
【００９９】
表１は、第一の粒子計測手段５１のみの場合の結果を示すものであり、吐出した液滴２１０中での蛍光粒子２０１の個数ではなく、細胞有り、細胞無し、のみの計測を実施した場合の結果である。着弾した液滴での個数は実際の吐出した液滴２１０中の個数であり、液滴中の液滴２１０に細胞０個、細胞１個、細胞２個、及び細胞４個に対して、細胞有り、細胞無し、を計測した結果を示す。細胞０個の場合には、液滴粒子２１０からの発光がないため、１００％の正答率であるが、細胞１個の場合には、１件の間違いがある。吐出した液滴２１０中の蛍光粒子２０１に対し、光照射手段３０による照明の照明光量分布があり、また、受光手段４１による受光にも光利用効率に分布があり、さらに、蛍光粒子自体の発光効率にもばらつきがあり、これらのうちの１以上の原因によって、蛍光粒子２０１が暗くなり、細胞無し、と誤計測してしまったことが考えられる。ただし、正当率としては９９％以上である。
【０１００】
細胞２個以上の場合は、細胞有り、すべての件数が細胞有り、となっており、正答率はいずれも１００％である。しかしながら、蛍光粒子１個をマイクロプレートの所定の１ウェルに吐出された粒子含有試料を作製する場合には、有り、とした蛍光粒子が、１個か、２個か、３個か、４個か不明であり、この場合は計測精度に影響する。
【０１０１】
【表１】
2019023629.tif 000003
【０１０２】
表２は、第二の粒子計測手段５２のみの場合の結果を示すものであり、表１とは異なり、吐出した液滴２１０中での蛍光粒子２０１の個数を計測したものである。着弾した液滴での個数は、実際の液滴２１０中の個数であり、液滴中の液滴２１０に細胞０個、細胞１個、細胞２個、細胞３個及び細胞４個に対して、細胞０個、細胞１個、細胞２個、細胞３個、及び細胞４個の場合について個数計測した結果を示す。
細胞０個の場合には、蛍光粒子２０１からの発光がないので、１００％の正答率である。これは、表１と同じであり、蛍光粒子２０１の発光による光に基づく信号が有るか、ノイズのみで信号が無いか、による計測結果になることから、今回、受光手段４１と４２に同じ製品を用いたため、感度や雑音比が同じであるため、結果は同じとなる。
【０１０３】
表２において、着弾した液滴中に細胞１個の場合に、１件の間違いがある。これも、細胞０個と同様に、既に記載したが蛍光粒子が暗い場合があり計測が困難となり、この場合も、受光手段が同じであるため、結果が同じとなる。ただし、表１と同様に、正当率としては９９％以上である。
【０１０４】
表１において、着弾した液滴の中に細胞１個の場合に、吐出した液滴の中に細胞２個と計測した間違いが５件ある。これは、図３Ａに示すように、液滴２１０中の蛍光粒子２０１の位置により、その画像情報は複雑となり、細胞１個か、細胞２個かの判断が間違う可能性が生じることによる。同様に、細胞２個の場合も３件の細胞１個とする間違いとなった。正答率自体は、８５％と比較的低くなる。
以下、細胞３個の場合も１件の細胞４個とする間違い、細胞４個の場合も１件の細胞３個の間違い、となる複数の誤計測があり、発生件数が低いために不確かさはあるが、これらは比較的低い正答率となった。
【０１０５】
【表２】
2019023629.tif 000004
【０１０６】
表１、及び表２は、細胞濃度が約０．２５個／滴で調整した懸濁液に基づく結果であること、１滴のみ液滴吐出で細胞０個の場合を当然に確率的に多く含む結果となる液滴吐出であること、実際の液滴吐出では、着弾した細胞濃度は計測時に既知ではないこと、及び着弾液滴の計測結果に対する正答率ではなく、吐出した液滴の計測結果に対する正答率を考慮する必要があること、などから、１液滴ではなく１細胞を吐出する場合の正しい正答率Ｔは、表１及び表２の結果を基にして、実際の目的により適用する細胞濃度の値に対して、正答率Ｔを換算する必要がある。
【０１０７】
１細胞を吐出する場合の正答率Ｔの換算値は、以下の方法で求めることができる。まず、表１及び表２の結果は、細胞濃度が約０．２５個／滴での結果であり、これを目的により適用する細胞濃度の値に換算する。着弾液滴中に各細胞個数が発生する比率は、細胞濃度により決定されるポアソン分布に確率的に従うため、目的により適用する細胞濃度でのポアソン分布を各細胞個数の場合の出現頻度とする。ここでの各細胞数の個数とは、実際の個数を意味し、これは着弾液滴に対する計測個数である。そして、この各細胞個数の出現頻度に合計値がなるように、計測した細胞の有無、又は計測した細胞の個数、でその比率を割り振る。この値は、すべての値の合計値が１となる前提での、実際の各細胞個数と、計測による有無ごと、又は個数ごとに割り振られた、行列の各要素の発生比率を示す値となる。
【０１０８】
次に、それぞれの吐出した液滴に対する計測の正答率を求める。これは、各要素の発生比率の値を、細胞有無、又は細胞個数のいずれかの着目した計測条件ごとに、すべての実際の各細胞個数に対する合計を求め（これは、各要素の発生比率の行の要素の和、つまり横方向の要素の和となる）、これを着目した計測条件が発生する発生比率の和とする。この和を構成する要素のうち、着目した計測条件と、実際の細胞個数の条件とが一致する要素が正答であるため、計測に対する正答率は、この条件が一致した要素の発生比率を、上述の着目した計測条件が発生する発生比率の和で除したものが、着目した計測条件の正答率となる。
【０１０９】
この飛翔液滴に対する計測の正答率を、計測条件ごとに、それぞれ、表１（第一の粒子計測手段のみ）の場合の細胞無をｒ（ＯＦＦ）、細胞有をｒ（ＯＮ）、表２（第二の粒子計測手段のみ）の場合の細胞０個をｒ（０）＝ｒ（ＯＦＦ）、細胞１個をｒ（１）、細胞２個をｒ（２）、細胞３個をｒ（３）、及び細胞４個をｒ（４）とする。また、除した値となる上述のそれぞれの計測条件の和は、着目した計測が発生する確率でもあり、ぞれぞれ、表１の場合の細胞無をｐ（ＯＦＦ）、細胞有をｐ（ＯＮ）、表２の場合の細胞０個をｐ（０）＝ｐ（ＯＦＦ）、細胞１個をｐ（１）、細胞２個をｐ（２）、細胞３個をｐ（３）、細胞４個をｐ（４）とする。
【０１１０】
この計測が発生する確率と、その計測が発生した場合の正答率を基に、１回又は複数回の液滴吐出により、１細胞以上、つまり細胞有の計測結果、又は１細胞の計測結果となった場合の正答率Ｔを求めることができる。液滴吐出回数程度までの可能性に対する事象ごとに確率と正答率を計算して求めることとなるが、この正答率Ｔを近似的に９８％以上の精度を求めるには、細胞濃度の逆数を５倍〜１０倍以上した液滴吐出回数程度までの可能性に対する事象ごとの確率×（飛翔液滴に対する計測の）正答率を積算することが好ましい。例えば、細胞濃度０．０２個／滴の場合、その逆数である５０の５倍は、５０×５＝２５０から、吐出２５０液滴目に初めて細胞有、と計測された事象まで計算することが好ましい。
【０１１１】
しかしながら、このような確率×正答率の和は、細胞無（細胞０個）の計測となることの繰り返しが主たる要素であり、この要素が細胞無の場合の確率×正答率、ｐ（ＯＦＦ）×ｒ（ＯＦＦ）、を等比とする等比数列となることに着目してその積算は、解析的に近似することができ、比較とする第一の粒子計測手段５１のみの場合は、以下の（式１）により正答率Ｔが求まる。
【０１１２】
【数１】
2019023629.tif 000005
【０１１３】
第一の粒子計測手段５１に加えて、第二の粒子計測手段５２の２つを用いた第２の実施の形態の場合、第二の粒子計測手段５２にて細胞２個以上を計測した場合は、この場合を利用しない判断を加えることができ、これを考慮した修正により、（式１）は、以下の（式２）に修正される。
【０１１４】
【数２】
2019023629.tif 000006
【０１１５】
図７は、より詳細には、表１及び表２の１液滴に対する計測結果を基に、上述の式１と式２とを用いて、第一の粒子計測手段５１のみの場合と、第二の実施の形態の場合とに対し、細胞有又は細胞１個を計測した場合の正答率Ｔを、目的により応じて最適に設定される細胞濃度を横軸として示したものである。
【０１１６】
図７に示すように、計測精度となる正答率Ｔは、第２の実施形態の場合と比較とする第一の粒子計測手段５１のみを用いた構成では、細胞濃度が薄い場合には、大きな差はない。例えば、細胞濃度０．００１個／滴の場合には、第２の実施の形態の正答率Ｔは９９．１％に対し、第一の粒子計測手段５１のみでは９９．０％である。これは、細胞濃度が薄い場合には、ポアソン分布に従った確率により、理論的に細胞２個／滴以上の液滴の吐出がほとんど発生しないことによる。
【０１１７】
しかしながら、このような細胞濃度０．００１個／滴といった薄い細胞濃度の場合、１個の細胞を、液滴２１０を吐出させて得るには、平均的な液滴２１０の吐出回数として、１，０００回が必要となる。実際には、精度を維持するためにはこの約５倍、つまり少なくとも５，０００回もの液滴２１０の吐出の場合を容認する必要がある。このため、細胞濃度０．００１個／滴といった薄い細胞濃度は、産業的には高コストとなる細胞濃度となる。
【０１１８】
この２０倍濃縮の濃度となる、細胞濃度０．０２個／滴の場合には、第２の実施の形態の正答率Ｔは９８．９％に対し、第一の粒子計測手段５１のみでは９８．１％と、０．８％以上、正答率Ｔの差が拡大し、第２の実施の形態の優位性が明瞭となる。正答率Ｔの逆となるエラー率として換算すると、第２の実施の形態のエラー率の１．１％に対し、第一の粒子計測手段５１のみでは１．９％と、約２倍であることがわかる。この細胞濃度においては、平均的な液滴２１０の吐出回数は５１回となり、液滴吐出手段１０を１００Ｈｚで動作させた場合には、０．５秒間で１細胞の吐出に相当し、産業的に十分に低いコストとなる。その上で、細胞が有の液滴に対しては、第二の粒子計測手段５２により個数計測を１回のみであるが実施しているため、第二の粒子計測手段５２のみの場合と同程度の高精度を実現することができる。
【０１１９】
この液滴吐出手段１０の１００Ｈｚでの動作に対して、高速計測が可能な第２の実施の形態となる粒子計数装置１００Ｂや、比較とした第一の粒子計測手段５１のみの場合とも、十分に対応できる周波数である。一方、第二の粒子計測手段５２のみの場合は、その正答率Ｔは第２の実施の形態となる粒子計数装置１００Ｂとほぼ同様であるものの、多量の情報となる画像情報の出力（転送）、画像処理に処理時間を要するため、これらすべての処理をして個数計測を終了するには、１００Ｈｚは非常に困難であり、高速度という点で第２の実施の形態となる粒子計数装置１００Ｂの優位性がある。また、正答率Ｔは、細胞の有る液滴に関しては、第２の実施の形態の場合においても最後に第二の粒子計測手段５２で個数計測するため、第二の粒子計測手段５２のみの場合とほぼ同レベルとなる。
【０１２０】
この第２の実施の形態の優位性は、細胞濃度が増加するに増大し、例えば、細胞濃度が０．２個／滴の場合には、第２の実施の形態の正答率Ｔは９７．６％に対し、第一の粒子計測手段５１のみでは、その値が９０％より小さく図示されていないが８９．５％と、非常に大きな差となる。産業的には、分析危機用試料など１個〜１００個の細胞が必要な場合もあるが、これ以外に薬品などの評価用として小型の組織サンプルが必要とされる場合があり、これは細胞数が複数桁異なる１万個レベルの細胞が必要となる。１万個の細胞は、細胞濃度０．２個／滴にて１００Ｈｚの液滴吐出をした場合に１０分間弱の時間が必要であり、産業的なコストを考慮すると細胞濃度をこのレベルまで高くすることが好ましいが、この細胞濃度では、比較とした第一の粒子計測手段５１のみの場合では精度が大きく低下して問題となることから、第２の実施の形態を用いることが非常に効果的であることがわかる。
【０１２１】
ただし、第一の粒子計測手段５１のみの場合は、細胞濃度が低い場合に、具体的には細胞濃度０．０２個／滴以下の場合に、正答率Ｔ９７％以上と十分に高い値であり、図示はしていないが、第二の粒子計測手段５２のみの場合とほぼ同レベルとなる。第一の粒子計測手段５１のみの場合、受光手段４１にＡＰＤのみ設ける、といった簡易な構成を用いることができ、第二の粒子計測手段５２のみの場合と比較して高速性と低コストとを実現できるという効果がある。図７は、第一の粒子計測手段５１のみの場合と、第二の粒子計測手段５２のみの場合の優劣を比較はしていない。
【０１２２】
図８は、第２の実施の形態にかかる粒子計数装置の別の動作の一例を示すフローチャートである。図８は、第２の実施の形態にかかる、複数の蛍光粒子に関する計数精度を向上させ、計測速度を向上させることができる粒子計数装置１００Ｂとして機能する、図６とは別の動作手順の一例を示すものである。図７に示すように、Ｓ３０１では、駆動手段２０から駆動電圧を印加された液滴吐出手段１０により、蛍光粒子２０１を含む液滴２１０を、図５中の３０３で示す液滴の吐出方向にノズル１２から吐出する。また、駆動手段２０は、液滴吐出手段１０に駆動電圧を印加するとともに、光照射手段３０及び２つの受光手段４１及び４２に同期信号を出力する。その後、粒子計数装置１００Ｂは、処理をＳ３０２に移行させる。
【０１２３】
Ｓ３０２では、駆動手段２０から同期信号を入力された液滴吐出手段１０は、液滴２１０の吐出タイミングに合わせて、光としてのレーザー光３０１を液滴２１０に照射する。また、同期信号を入力された受光手段４１及び４２は、光照射手段３０のレーザー光３０１により蛍光粒子２０１が発光するタイミングに合わせて、光３０２ａ及び光３０２ｂを受光する。これにより、受光手段４１及び４２は、蛍光粒子２０１からの発光による光に関する情報をそれぞれ取得することとなる。その後、粒子計数装置１００Ｂは、処理をＳ３０３に移行させる。
【０１２４】
Ｓ３０３では、受光手段４１より蛍光粒子２０１の光３０２ａに関する情報を出力された第一の粒子計測手段５１は、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測し、蛍光粒子２０１が有か否かを判定する。蛍光粒子２０１「有」と判定すると、その後、粒子計数装置１００Ｂは、処理をＳ３０４に移行させる。蛍光粒子２０１「無」と判定すると、液滴吐出手段制御手段２１が作用し、処理をＳ３０１に戻す。
【０１２５】
Ｓ３０４では、受光手段４２より蛍光粒子２０１の光３０２ｂに関する情報を出力された第二の粒子計測手段５２は、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を計測する。その後、粒子計数装置１００Ｂは、処理をＳ３０５に移行させる。
【０１２６】
Ｓ３０５では、液滴吐出手段制御手段２１が、第二の粒子計測手段５２により計測された液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を積算する。この積算個数が、所定の液滴吐出位置に必要な蛍光粒子数に到達したかを判定する。必要な蛍光粒子数に到達したと判定すると、その後、粒子計数装置１００Ｂは、処理を終了させる。必要な蛍光粒子数に到達していないと判定すると、液滴吐出手段制御手段２１が作用し、処理をＳ３０１に戻す。このようなＳ３０１〜Ｓ３０５に示した動作手順により、粒子計数装置１００Ｂは、複数の蛍光粒子に関する計数精度を向上させ、計測速度を向上させることができる。
【０１２７】
＜第３の実施の形態＞
図９は、第３の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。図９は、第２の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である図５と類似の構成であり、図５の構成に対して第一の粒子計測手段からの前記液滴に含まれる前記粒子が無との情報に基づいて、液滴を略同一位置に連続吐出するように液滴吐出位置を制御する連続吐出位置制御手段を設けた点が相違する。
第３の実施の形態にかかる粒子計数方法は、第２の実施の形態にかかる粒子計数方法に、さらに、前記第一の粒子計測工程からの前記液滴に含まれる前記粒子が有との情報に基づいて、液滴を略同一位置に連続吐出する連続吐出位置制御工程と、前記連続吐出位置制御工程からの情報に基づいて液滴吐出位置を移動させる液滴吐出位置移動工程と、を含むことが好ましい。
連続吐出位置制御工程は連続吐出位置制御手段により好適に実施することができる。
【０１２８】
図９において、１０は液滴吐出手段であり、１１は液滴吐出手段１０の液室であり、１２は液滴吐出手段のノズルであり、２０は駆動手段であり、３０は光照射手段であり、４１および４２は受光手段であり、５１は第一の粒子計測手段であり、５２は第二の粒子計測手段であり、１００Ｃは粒子計数装置であり、２００は粒子懸濁液であり、２０１は粒子懸濁液中の蛍光粒子であり、２１０は液滴吐出手段のノズルより吐出された液滴であり、３０１はレーザー光であり、３０２ａは受光手段４１への光であり、３０２ｂは受光手段４２への光であり、３０３は液滴の吐出方向であり、５３は粒子計測手段制御手段であり、２１は液滴吐出手段制御手段であり、２２は連続吐出位置制御手段であり、６０は液滴吐出位置移動手段であり、６１はマイクロプレートである。
【０１２９】
以下、図９に示す第３の実施の形態に関し、図５と同じ構成に関する説明は一部省略し説明する。粒子計測手段制御手段５３は、第一の粒子計測手段５１から出力された液滴２１０中の蛍光粒子２０１の有無に関する情報に基づいて、計測結果において蛍光粒子２０１が有の場合には図１及び図５の場合と同様に、第二の粒子計測手段５２による個数計測を実施するが、計測結果において蛍光粒子２０１が無の場合には、液滴吐出手段制御手段２１が、光照射手段３０に再度のレーザー光３０１の発光、液滴吐出手段に再度の液滴吐出、受光手段４１及び４２の受光、さらには第一の粒子計測手段５１及び第二の粒子計測手段５２に再度の粒子計測などの動作を実施する信号をそれぞれに適切なタイミングで出力する。これにより、２回目の液滴２１０の吐出と、これに付随した液滴２１０中の蛍光粒子２０１の計測が実施される。
【０１３０】
この２回目に吐出された液滴２１０中の蛍光粒子２０１の計測に関しては、１回目と同様にして、液滴吐出手段制御手段２１は、第一の粒子計測手段５１から出力された液滴２１０中の蛍光粒子２０１の有無に関する情報に基づいて、計測結果において蛍光粒子２０１が有の場合には第二の粒子計測手段５２による個数計測を実施し、粒子計測及び液滴吐出を停止するが、計測結果において蛍光粒子２０１が無の場合には、１回目と同様にして、光照射手段２１０に再度のレーザー光３０１の発光、液滴吐出手段に再度の液滴吐出、受光手段４１及び４２の受光、さらには第一の粒子計測手段５１及び第二の粒子計測手段５２に再度の粒子計測などの動作を実施する信号をそれぞれに適切なタイミングで出力する。これにより、３回目の液滴２１０の吐出と、これに付随した液滴２１０中の蛍光粒子２０１の計測が実施される。以下、粒子計測手段５１により液滴２１０中の蛍光粒子２０１が有と計測されるまで、液滴吐出手段制御手段２１は、同様の動作を繰り返すにように液滴吐出手段及び関連したモジュールを制御する。この動作の繰り返しが停止して終了となるのは、粒子計測手段５１により液滴２１０中の蛍光粒子２０１が有と計測された場合であり、その後、粒子計測手段５２による個数計測の情報を、本粒子計数装置１００Ｃが個数情報として取得した場合である。
【０１３１】
これらの動作により、１個以上の蛍光粒子が、この蛍光粒子の被着対象物となるマイクロプレート６１の所定の液滴吐出位置となる特定ウェルに必要な場合、液滴吐出手段１０からの吐出された液滴２１０中の蛍光粒子２０１の個数を高精度かつ高速に計測することができる。また、２個以上の複数個の蛍光粒子が、マイクロプレート６１の所定の液滴吐出位置となる特定ウェルに必要な場合においても、上記動作に加えて、第二の粒子計測手段５２による個数計測の情報を加算して所定の個数に積算されたという判断となるまで液滴吐出手段制御手段２１による液滴吐出手段１０への液滴吐出実施の制御と、第一の粒子計測手段５１及び第二の粒子計測手段５２による計測とを続けることにより、高精度かつ高速に計測することができる。このマイクロプレート６１の所定の液滴吐出位置となる特定ウェルへの連続吐出の間、連続吐出位置制御手段２２はマイクロプレート６１が設定された液滴吐出位置移動手段６０を制御することにより、その位置を移動させない。
マイクロプレート６１としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１穴マイクロチューブ、８連チューブ、９６穴のウェルプレート、３８４穴のウェルプレートなどが挙げられる。
【０１３２】
マイクロプレート６１の所定の液滴吐出位置となる特定ウェルに連続吐出することにより、高精度に計測された所定の個数の蛍光粒子を着弾させる動作が終了した後、液滴吐出手段制御手段２１の作用により、液滴吐出手段１０が液滴吐出を停止している間に、連続吐出位置制御手段２２は、マイクロプレート６１が設定された液滴吐出位置移動手段６０を制御することにより、マイクロプレート６１の一部となるこれまで蛍光粒子を着弾させた位置と異なる新たな別の所定の液滴吐出位置となる特定ウェルが新たな着弾位置となるように、マイクロプレート６１の一部となる連続吐出位置を移動させる。
【０１３３】
この後、新たにマイクロプレート６１の一部となる連続吐出位置に着弾した蛍光粒子の個数０個として、液滴吐出手段制御手段２１が、第一の粒子計測手段５１から出力された液滴２１０中の蛍光粒子２０１の有無に関する情報に基づいて、計測結果において蛍光粒子２０１が有の場合には図５の場合と同様にして、第二の粒子計測手段５２による個数計測を実施し、計測結果において蛍光粒子２０１が無の場合には、光照射手段３０に再度のレーザー光３０１の発光、液滴吐出手段に再度の液滴吐出、受光手段４１及び４２の受光、さらには第一の粒子計測手段５１及び第二の粒子計測手段５２に再度の粒子計測などの動作を実施する信号をそれぞれに適切なタイミングで出力する。これにより、マイクロプレート６１の新たな別の所定の液滴吐出位置となる特定ウェルに対して２回目の液滴２１０の吐出と、これに付随した液滴２１０中の蛍光粒子２０１の計測が実施される。以降、同様の動作を続けることにより、１個以上の蛍光粒子が、マイクロプレート６１の所定の液滴吐出位置となる特定ウェルに必要な場合、液滴吐出手段１０からの吐出された液滴２１０中の蛍光粒子２０１の個数を高精度かつ高速に計測することができる。
【０１３４】
図１０は、第３の実施の形態にかかる粒子計数装置の動作の一例を示すフローチャートである。図１０は、第３の実施の形態にかかる、複数の蛍光粒子に関する計数精度を向上させ、計測速度を向上させることができる粒子計数装置１００Ｃとして機能する動作手順の一例を示すものである。図１０に示すように、Ｓ４０１では、駆動手段２０から駆動電圧を印加された液滴吐出手段１０により、蛍光粒子２０１を含む液滴２１０を、図９中の３０３で示す吐出方向にノズル１２から吐出する。また、駆動手段２０は、液滴吐出手段１０に駆動電圧を印加するとともに、光照射手段３０及び２つの受光手段４１及び４２に同期信号を出力する。その後、粒子計数装置１００Ｃは、処理をＳ４０２に移行させる。
【０１３５】
Ｓ４０２では、駆動手段２０から同期信号を入力された光照射手段３０は、液滴２１０の吐出タイミングに合わせて、光としてのレーザー光３０１を液滴２１０に照射する。また、同期信号を入力された受光手段４１及び４２は、光照射手段３０のレーザー光３０１により蛍光粒子２０１が発光するタイミングに合わせて、光３０２ａ及び光３０２ｂを受光する。これにより、受光手段４１及び４２は、蛍光粒子２０１からの発光による光に関する情報をそれぞれ取得することとなる。その後、粒子計数装置１００Ｃは、処理をＳ４０３に移行させる。
【０１３６】
Ｓ４０３では、受光手段４１より蛍光粒子２０１の光３０２ａに関する情報を出力された粒子計数手段５１は、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測し、蛍光粒子２０１が有か否かを判定する。蛍光粒子２０１「有」と判定すると、その後、粒子計数装置１００Ｃは、処理をＳ４０４に移行させる。蛍光粒子２０１「無」と判定すると、液滴吐出手段制御手段２１が作用し、処理をＳ４０１に戻す。
【０１３７】
Ｓ４０４では、受光手段４２より蛍光粒子２０１の光３０２ｂに関する情報を出力された第二の粒子計測手段５２は、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を計測する。その後、粒子計数装置１００Ｃは、処理をＳ４０５に移行させる。
【０１３８】
Ｓ４０５では、液滴吐出手段制御手段２１が、第二の粒子計測手段５２により計測された液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を積算する。この積算個数が、所定の液滴吐出位置に必要な蛍光粒子数に到達したかを判定する。必要な蛍光粒子数に到達したと判定すると、その後、粒子計数装置１００Ｃは、処理をＳ４０６に移行させる。必要な蛍光粒子数に到達していないと判定すると、液滴吐出手段制御手段２１が作用し、処理をＳ４０１に戻す。
【０１３９】
Ｓ４０６では、連続吐出位置制御手段２２により、マイクロプレート６１の別の液滴吐出位置に液滴が着弾されるように、液滴吐出位置移動手段６０を移動し、マイクロプレート６１の一部となる連続吐出位置を移動させる。その後、粒子計数装置１００Ｃは、処理をＳ４０７に移動させる。
【０１４０】
Ｓ４０７では、所定の液滴吐出位置への必要な蛍光粒子数の蛍光粒子の着弾をすべて完了したかを判定する。蛍光粒子の着弾をすべて完了したと判定すると、その後、粒子計数装置１００Ｃは、処理を終了させる。必要な着弾を完了していないと判定すると、液滴吐出手段制御手段２１と連続吐出位置制御手段２２が作用し、処理をＳ４０１に戻す。
【０１４１】
＜第４の実施の形態＞
図１１は、第４の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。
第４の実施の形態にかかる粒子計数装置は、第一の粒子計測手段に接続される受光手段が、２以上の異なる方向に発光された光を受光する２以上の受光手段を有する。
図１１は、第１の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である図１と類似の構成であり、この図１の構成に対して、第一の粒子計測手段に情報を出力する異なる方向に配置した受光手段を２個設けた点が相違し、１０は液滴吐出手段であり、１１は液滴吐出手段１０の液室であり、１２は液滴吐出手段のノズルであり、２０は駆動手段であり、３０は光照射手段であり、４３ａ、４３ｂ及び４２は受光手段であり、５１は第一の粒子計測手段であり、５２は第二の粒子計測手段であり、１００Ｄは粒子計数装置であり、２００は粒子懸濁液であり、２０１は粒子懸濁液中の蛍光粒子であり、２１０は液滴吐出手段のノズルより吐出された液滴であり、３０１はレーザー光であり、３０２ａは受光手段４３ａへの光であり、３０２ｂは受光手段４２への光であり、３０２ｃは受光手段４３ｂへの光であり、３０３は液滴の吐出方向である。
【０１４２】
以下、図１１に示す第４の実施の形態に関し、図１と同じ構成に関する説明は一部省略し説明する。図１１に示すように、３つの受光手段４３ａ、４３ｂ及び４２は、いずれも光照射手段３０を介して駆動手段２０と電気的に接続されており、駆動手段２０から同期信号を入力される。同期信号を入力された受光手段４３ａ、４３ｂ及び４２は、光照射手段３０のレーザー光３０１により蛍光粒子２０１が発光するタイミングに合わせて、光３０２ａ、光３０２ｃ及び光３０２ｂを受光する。
【０１４３】
受光手段４３ａ及び４３ｂは、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測可能な光センシングデバイス／モジュールであり、受光手段４２は、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を計測可能な光センシングデバイス／モジュールである。受光手段４３ａ、４３ｂ及び４２は、それぞれ電気的に接続された第一の粒子計測手段５１と、第二の粒計測手段５２とに受光情報を出力し、これら受光手段の情報を基に、第一の粒子計測手段５１は液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測し、第二の粒子計測手段５２は液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を計測することができる。
【０１４４】
受光手段４２は、第二の粒子計測手段５２と連携して蛍光粒子２０１の個数を計測することができる計測手段であり定量計測であるため、定性計測の受光手段４３ａ及び４３ｂと比較して、高精度の計測となりこれを実現させるためには、受光手段４３ａ及び４３ｂと比較して取得情報量のより多い光センシングデバイス／ユニット、さらに第一の粒子計測手段５１と比較してより複雑な情報処理を実施できる第二の粒子計測手段５２を用いる。
【０１４５】
このとき、第一の粒子計測手段に情報を出力する受光手段４３ａ、及び４３ｂは、その配置した方向により、受光する液滴２１０中の蛍光粒子２０１からの発光光量が大きく変動する。
これは、液滴２１０の主成分が屈折率ｎ＝１．３３３の水であり、液滴２１０の直径が約４０μｍから１００μｍと非常にその曲率が小さいことによる、液滴のレンズ作用に基づく。受光手段４３ａ、及び４３ｂを配置する方向が異なることは、受光手段４３ａ、及び４３ｂに対する液滴２１０中の蛍光粒子の位置が、異なることとなり、レンズ作用の作用が異なる状態となり、これが液滴２１０中の蛍光粒子２０１からの発光による光を受光する量の違いとなる。
【０１４６】
このため、第１の実施の形態では、その受光手段４１で受光する蛍光粒子２０１の発光光量が、液滴２１０ごとに大きくばらつくことが、計測精度を劣化させる要因となる場合がある。このばらつきは計測するダイナミックレンジの設定や、閾値の設定として問題となる場合があるが、液滴２１０のレンズ作用の問題としては、このばらつきとして発光光量が小さくなった場合に、発光光量が非常に小さくなり、照明光として照射するレーザー光や蛍光粒子の性能にもよるが、ノイズと同レベル近くとなることで計測精度を劣化させる要因となる場合があり問題である。
【０１４７】
図１１に示す第４の実施の形態は、本問題を解決するものであり、２つの異なる方向となる位置に、第一の粒子計測手段５１に情報を出力する受光手段４３ａ、及び４３ｂを配置しているため、液滴２１０のレンズ作用により蛍光粒子２０１からの発光光量が小さくなる場合が発生する頻度を大きく低減することができ、これにより、受光手段４３ａ、及び４３ｂからの受光に関する情報を取得した第一の粒子計測手段５１による、蛍光粒子の有無に関する計測の精度を向上することができる。
【０１４８】
第一の粒子計測手段５１に情報を出力するために設ける異なる方向の受光手段は、２つに制限する必要はなく、３つ、４つとその数を増加するほど、液滴２１０のレンズ作用により蛍光粒子２０１からの発光光量が小さくなる場合が発生する頻度を低減することができ、計測精度を向上することができる。この異なる方向は、水平方向に制限されるわけではなく、垂直方向に異なる方向を設定することも効果的である。
【０１４９】
図１２Ａ及び図１２Ｂは、光学シミュレーションにより求めた、第一の粒子計測手段に情報を出力するために２つ以上の受光手段を異なる方向に設けることにより、発光光量が小さくなる場合が発生する頻度を低減する度合いの例として蛍光粒子からの発光のカメラレンズによる受光光量分布を図示したものである。図１２Ａは、図１に記載の第１の実施の形態となる第一の粒子計測手段に情報を出力する受光手段が１個の場合であり、図１２Ｂは、図１に記載の第４の実施の形態となる第一の粒子計測手段に情報を出力する受光手段を２つの異なる方向となる位置に設けたものである。液滴２１０の断面中心をｚｙ軸の原点とし、水平ｚ軸（単位：μｍ）は図面右側が正とした光軸方向であり、垂直ｙ軸（単位：μｍ）は図面上側が正とした像高方向である。発光光量が小さくなる要因は、上述の受光手段の方向に対する液滴のレンズ作用以外に、蛍光粒子の蛍光特性のばらつき、光照射手段の方向に対する液滴のレンズ作用などがあり、実験的には液滴２１０中の蛍光粒子２０１位置の計測が難しいことから、前述３つの要因のうちの２つの要因に関して実験によって精度を有する定量的比較は難しいことから光学シミュレーションによる比較は適切である。
【０１５０】
光学シミュレーションは、以下により実施した。光学シミュレーションツールとしては、ＬｉｇｈｔＴｏｏｌｓ８．４．０（サイバーネットシステム株式会社製）を用い、ＰＣにより計算した。光学モデルとしては、液滴２１０の直径を８０μｍ、蛍光粒子２０１の直径を５μｍ、液滴を構成する水の屈折率を１．３３３とし、液滴２１０中の蛍光粒子２０１からの発光は、作動距離２２０ｍｍをもって離した６倍カメラレンズ（ＮＡ＝０．６８）と、このカメラレンズの結像面に配置した直径１ｍｍの受光素子から構成される受光手段４１により受光される構成とした。液滴界面は、フレネル計数に基づく透過反射を設定し、３回まで入射までの光線を追跡した。６倍カメラレンズはＶＳ−ＴＣ６−２２０ＣＯ（株式会社ヴイ・エス・テクノロジー製）を想定した無収差に近い仮想レンズを設計し、受光素子はソーラボジャパン社製のＡＰＤを想定した受光径とした。
【０１５１】
液滴２１０の断面中心をｚｙ軸の原点とし、水平ｚ軸（単位：μｍ）は光軸方向であり、垂直ｙ軸（単位：μｍ）は像高方向であり、カメラレンズの前面は右側ｚ＝２２０ｍｍに位置する。液滴２１０中の蛍光粒子２０１の中心位置を、原点を中心に５μｍピッチで配置した場合に対し、蛍光粒子２０１から一定量の発光があった場合の、蛍光粒子のそれぞれの配置での照射光量となる受光光量を計算した。計算は、蛍光粒子が全方向発散光源のため光線本数を５，０００万本で計算し、カメラレンズの結像面における必要精度を確保した。また、分布及び比較検討するため、図１２Ａにおいてカメラレンズ側となる液滴のレンズ作用が比較的に小さい液滴２１０の右端（ｚ，ｙ）＝（３５，０）の位置での受光光量を１．０として正規化した。
【０１５２】
図１２Ａに示すように、液滴２１０内において、蛍光粒子２０１の位置が、光軸上でカメラレンズと反対側の左側に近づくにつれて、右端のレンズ作用の小さい場合と比較して、受光光量が最大１２倍まで増大していることがわかる。液滴２１０が凸レンズとして作用して、カメラレンズで受光できる立体角を増大することがその理由である。一方、蛍光粒子２０１の位置が、光軸からの距離が大きくなる上下端に近づくにつれて、右端のレンズ作用のない場合と比較して、受光光量が最小１０分の１まで減少していることがわかる。また、（ｚ，ｙ）＝（−２５，−２５）及び（−２５，２５）の位置では、受光光量は０である。
【０１５３】
液滴２１０の凸レンズとして作用するが、大きな発光角で出射された発光による光に対してコリメートレンズに類似の作用をすることにより、蛍光粒子２０１から発光のほとんどが、カメラレンズがある方向とは別の方向に光伝播することがその理由である。レンズ作用の問題として液滴２１０内の蛍光粒子２０１の位置により、その発光光量が同じであっても、受光光量が非常に小さくなる場合があり、受光光量が０となる位置では、液滴２１０内に蛍光粒子が存在しても計測できない場合があることがわかる。
【０１５４】
図１２Ｂは、受光手段４３ａ、及び４３ｂを、異なる方向となる対向位置（液滴２１０を中心に１８０度位置）に設けた場合の受光光量を示したものであり、受光手段４３ａ、及び４３ｂの受光光量の加算値を示した。液滴２１０内において、蛍光粒子２０１の位置が、原点から両側の左右端に近づくにつれて、図１２Ａの右端のレンズ作用の小さい場合と比較して、受光光量が最大１３倍まで増大していることがわかる。しかしながら、この値は図１２Ａの場合とほぼ同様である。一方、図１２Ｂにおいて、蛍光粒子２０１の位置が、光軸からの距離が大きくなる上下端に近づくにつれて、右端のレンズ作用のない場合と比較して、受光光量が最大２分の１まで減少していることがわかる。このため、液滴のレンズ作用がない場合の２分の１程度の光量に、受光光量の下限を設定した計測を設計することにより高精度の計測ができることがわかる。又、受光光量の上限は、図１２Ａとほぼ同じでよい。
【０１５５】
図１１において、第一の粒子計測手段に情報を出力するために設ける複数の受光手段の異なる方向は、この設ける数が２つ以上の場合には、少なくともそのうちの２つの受光手段が略対向方向（略１８０度方向、ここでは１６０度〜２００度方向を示す）に配置することが効果的である。この場合は、既に記載の図１２Ｂの場合であり、前述のように図１２Ａにおける受光光量０の位置をなくすと同時に最小の受光光量を大きくすることができるが、例えば、２つの受光手段が略直交方向（略９０度方向、ここでは８０度〜１００度を示す）の場合には、受光光量０の位置が残るなど、その効果が少なくなる。ただし、この直交方向の場合においても、この受光光量０以外の位置においては、最小の受光光量０．４と、受光手段が１つの場合より改良されてはいる。
【０１５６】
図１１で異なる方向に設けた、第一の粒子計測手段に情報を出力するための複数の受光手段は、２個に制限されるわけではなく、その数が多いほど、発光光量が小さくなる場合が発生する頻度を低減することができるようになる。異なる方向も、水平方向に制限されるものではなく、垂直方向が異なるように配置することも効果的である。これらは、要求される検出精度、レイアウト制限、コストなどを基に最適化することが効果的である。
【０１５７】
＜第５の実施の形態＞
図１３は、第５の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。
第５の実施の形態にかかる粒子計数装置は、第二の粒子計測手段に接続される受光手段が、２以上の異なる方向に発光された光を受光する２以上の受光手段を有する。
図１３は、第１の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である図１と類似の構成であり、この図１の構成に対して、第二の粒子計測手段に情報を出力する異なる方向に配置した受光手段を２個設けた点が相違し、１０は液滴吐出手段であり、１１は液滴吐出手段１０の液室であり、１２は液滴吐出手段のノズルであり、２０は駆動手段であり、３０は光照射手段であり、４１、４４ａ及び４４ｂは受光手段であり、５１は第一の粒子計測手段であり、５２は第二の粒子計測手段であり、１００Ｅは粒子計数装置であり、２００は粒子懸濁液であり、２０１は粒子懸濁液中の蛍光粒子であり、２１０は液滴吐出手段のノズルより吐出された液滴であり、３０１はレーザー光であり、３０２ａは受光手段４１への光であり、３０２ｂは受光手段４４ａへの光であり、３０２ｄは受光手段４４ｂへの光であり、３０３は液滴の吐出方向である。
【０１５８】
以下、図１３に示す第５の実施の形態に関し、図１と同じ構成に関する説明は一部省略し説明する。図１３に示すように、２つの受光手段４４ａ、及び４４ｂ、並びに受光手段４２は、いずれも光照射手段３０を介して駆動手段２０と電気的に接続されており、駆動手段２０から同期信号を入力される。同期信号を入力された受光手段４１、４４ａ及び４４ｂは、光照射手段３０のレーザー光３０１により蛍光粒子２０１が発光するタイミングに合わせて、光３０２ａ、光３０２ｂ及び光３０２ｄを受光する。
【０１５９】
受光手段４１は、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測可能な光センシングデバイス／モジュールであり、受光手段４４ａ及び４４ｂは、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を計測可能な光センシングデバイス／モジュールである。受光手段４１、４４ａ及び４４ｂ、それぞれ電気的に接続された第一の粒子計測手段５１と、第二の粒子計測手段５２とに受光情報を出力し、これら受光手段の情報を基に、第一の粒子計測手段５１は液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測し、第二の粒子計測手段５２は液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を計測することができる。
【０１６０】
受光手段４４ａ及び４４ｂは、第二の粒子計測手段５２と連携して蛍光粒子２０１の個数を計測することができる計測手段であり定量計測であるため、定性計測の受光手段４１と比較して高精度の計測となり、これを実現させせるためには受光手段４１と比較して取得情報量のより多い光センシングデバイス／ユニット、さらに第一の粒子計測手段５１と比較してより複雑な情報処理を実施できる第二の粒子計測手段５２を用いる。
【０１６１】
このとき、第二の粒子計測手段に情報を出力する２個以上の受光手段を有することにより、１個の受光手段により発光が重なった状態を受光した場合であっても、他の受光手段により発光が重なっていない状態を受光できていれば、他の受光手段により受光された光に基づいて、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１を精度よく個数計数することができる。
【０１６２】
レーザー光を照射された蛍光粒子からの発光は、蛍光粒子から全方位に発せられる。このため、２個以上の受光手段としては、発光による光を受光可能な位置に配されれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、それぞれの受光方向とのなす角が０度とならない位置に配されることが好ましい。発光の重なりが少ない状態の情報が得られる点で有利である。
【０１６３】
第二の粒子計測手段に情報を出力する２個以上の受光手段のうち少なくとも１個の受光手段は、その受光方向が他の受光手段の受光方向と略直交方向に位置するように配されることが好ましい。これにより、１個目の受光手段及び他の受光手段を用いた場合、１個目の受光手段及び他の受光手段により受光した情報のうち、いずれかの情報を選択する際に、発光の重なりが少ない状態の情報を選択できる。なお、略直交とは、８０度〜１００度を意味する。
【０１６４】
上記の第二の粒子計測手段に情報を出力する２個の受光手段以外の受光手段における受光方向としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。受光手段が２個以上の場合、２個以上の受光手段を同一平面上に位置するように配されるとき、隣り合う受光手段の受光方向がなす角を、３６０度を受光手段の個数で等分した角度になるようにすることが好ましい。例えば、４個の受光手段を同一平面上に位置するように配されるときは、隣り合う受光手段の受光方向をそれぞれ９０度となる位置するように配されることが好ましい。この場合、対向方向の受光手段どうしの組合せは、液滴２１０内における蛍光粒子２０１の位置により発光光量が小さくなる場合が発生する頻度を低減することができるので効果的である。発光光量が小さくなる場合が発生する頻度を低減する目的では、第二の粒子計測手段に情報を出力する受光手段が２個の場合、第一の粒子計測手段に情報を出力する受光手段の場合と同様、略直交ではなく略対向に設置することが効果的である。受光方向を増加させる場合には、液滴吐出手段１０近傍に微小光学素子を用いて、照明光の受光方向を増加させることも効果的である。
【０１６５】
第一の粒子計測手段に情報を出力する受光手段と、第二の粒子計測手段に情報を出力する受光手段とを、同じ方向に配置してもよい。同じ方向に設けた場合、液滴２１０内における蛍光粒子２０１の位置による発光光量の変化が同じであるため、この位置の相違による影響を低減した情報を第一の粒子計測手段及び第二の粒子計測手段に出力することができる。この構成は、ビームスプリッター、スリットなどにより蛍光粒子からの発光を分配することで実現できる。
【０１６６】
＜第６の実施の形態＞
図１４は、第６の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。図１４は、第１の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である図１と類似の構成であり、この図１の構成に対して、第一の粒子計測手段及び第二の粒子計測手段へ発光量に関する情報を出力する受光手段が同一である点が相違し、１０は液滴吐出手段であり、１１は液滴吐出手段１０の液室であり、１２は液滴吐出手段のノズルであり、２０は駆動手段であり、３０は光照射手段であり、４５は受光手段であり、５１は第一の粒子計測手段であり、５２は第二の粒子計測手段であり、１００Ｆは粒子計数装置であり、２００は粒子懸濁液であり、２０１は粒子懸濁液中の蛍光粒子であり、２１０は液滴吐出手段のノズルより吐出された液滴であり、３０１はレーザー光であり、３０２ａは受光手段４５への発光であり、３０３は液滴の吐出方向である。
第６の実施の形態にかかる粒子計数装置は、第一の粒子計測手段の前記粒子からの発光の発光量情報を取得する発光量取得部が、第二の粒子計測手段の２次元画像取得部からの２次元画像情報に基づいて発光量情報を取得する。
【０１６７】
以下、図１４に示す第６の実施の形態に関し、図１と同じ構成に関する説明は一部省略し説明する。図１４に示すように、受光手段４５は、光照射手段３０を介して駆動手段２０と電気的に接続されており、駆動手段２０から同期信号を入力される。同期信号を入力された受光手段４５は、光照射手段３０のレーザー光３０１により蛍光粒子２０１が発光するタイミングに合わせて、光３０２ａを受光する。
【０１６８】
受光手段４５は、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測可能な光センシングデバイス／モジュールであり、受光手段４５は同時に、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を計測可能な光センシングデバイス／モジュールである。受光手段４５に電気的に接続された第一の粒子計測手段５１及び第二の粒子計測手段５２に受光情報を出力し、これら受光手段の情報を基に、第一の粒子計測手段５１は液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測し、第二の粒子計測手段５２は液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を計測することができる。
【０１６９】
受光手段４５は、第二の粒子計測手段５２と連携して蛍光粒子２０１の個数を計測することができる計測手段であり定量計測をする必要があるため、定性計測として機能する場合の受光手段４５と比較して高精度の計測となり、これを実現させせるためには受光手段４５として必要仕様に対して十分となる取得情報量の多い光センシングデバイス／ユニット、さらに第一の粒子計測手段５１と比較してより複雑な情報処理を実施できる第二の粒子計測手段５２を用いる。本実施の形態では、上記に基づき、第二の粒子計測手段５２に多量の情報を出力して定量計測として用いることのできる受光手段４５を、その情報量を低減させた条件で利用することにより、第一の粒子計測手段の受光手段として利用することを特徴とする構成である。
【０１７０】
図１４における本実施の形態の動作を説明する。受光手段４５に高解像度の１６ビットＣＭＯＳを用いた場合、２，０４８画素×２，０４８画素＝約４００万画素分の８ＭＢの多量の画像情報を取得することができる。この画像情報を１００Ｈｚで第一の粒子計測手段又は第二の粒子計測手段に出力するには、８００ＭＢ／ｓ＝６．４ＧＢ／ｓの高速伝送速度が必要であるが、これはカメラリンクを用いることにより実現できる。例えば、ｐｃｏ．ｅｄｇｅ  ５．５（株式会社東京インスツルメンツ製）、Ｃ１１４４０（ＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ  Ｖ２、浜松ホトニクス株式会社製）、Ｃ１３４４０（ＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ  Ｖ３、浜松ホトニクス株式会社製）などにより１００Ｈｚの伝送を実現できるが、この多量の画像情報に対した１００Ｈｚでの画像処理を実施して蛍光粒子の個数計測を実現することは通常のＰＣなどでは困難であることは既に説明した。しかしながら、この画像情報の一部のみを抽出して情報量を低減し、この低減された画像情報に対して簡単な画像処理を実施することは、１００Ｈｚを実現できる場合がある。
【０１７１】
図１４の第一の粒子計測手段５１はこれを利用し、受光手段４５からは多量の画像情報を取得した上で、この画像情報を構成する１６ビット／画素のうちの一部となる８ビットのみを抽出し、この８ビットの画像に対して一定のカウント値の閾値以上の画素数を上位ビットの数値判断により求め、この求めた一定のカウント値の閾値以上の画素数に対して閾値を設定して、蛍光粒子の有無を計測することを、ＧＰＵと連携して高速に処理することができる。
【０１７２】
第二の粒子計測手段５２を用いて、画像処理により個数計測する場合には、１６ビット、約４００万画素に対するメディアンフィルター処理、膨張乃至収縮処理、２値化処理といった通常の前処理の後に、図３Ａ、図３Ｂに示されるように蛍光粒子の個数に対する発光形状が複雑であることから、場合分けした複雑な処理を実施することが必要であるため、前述の第一の粒子計測手段５１が多量の画像情報の一部から蛍光粒子の有無を計測することと比較して、その処理時間が大きく異なる。
【０１７３】
第一の粒子計測手段５１により、蛍光粒子の有無を高速に計測した後、蛍光粒子が無の場合には、処理を終了するか、又は再度の液滴吐出を行う。蛍光粒子が有の場合は、受光手段４５から取得した元の多量の画像情報を第二の粒子計測手段５２に伝送するか、メモリ共有することにより、第二の粒子計測手段５２が画像処理を実施できるようにする。この後、第二の粒子計測手段５２は、１６ビット、約４００万画素に対するメディアンフィルター処理、膨張乃至収縮処理、２値化処理といった通常の前処理の後に、形状に対する場合分けした複雑な処理を実施することで高精度の個数計測を処理する。
【０１７４】
この受光手段１個からの画像情報を、第一の粒子計測手段と第二の粒子計測手段とで共用する構成は、細胞濃度が平均値として１個／滴未満の場合に、第二の粒子計測手段が処理する頻度が、第一の粒子計測手段が処理する頻度より統計的に小さくなるため、効果的な構成である。細胞濃度が０．２個／滴以下の場合が第二の粒子計測手段による画像処理に必要な周波数が５分の１、つまり２０Ｈｚと低減できるため好ましく、より好ましくは０．１個／滴以下の場合の第二の粒子計測手段により画像処理に必要な周波数が１０分の１、つまり１０Ｈｚと低減される場合である。
【０１７５】
これにより、粒子計数装置１００Ｆに必要な部品点数を低減することができ、小型化にしなり、低価格化できると同時に、信頼性を向上することができる。また、小型化できることにより、複数の異なる方向の受光手段を配置し、精度を向上することもできる。
【０１７６】
受光手段４５からは多量の画像情報を低減して、第一の粒子計測手段に用いる方法は、上記に記載の方法に限定されるわけではなく、画像処理領域を低減して画素数を低減する処理（クロッピング、抽出）や複数画素を統合して画素数を低減する処理（ビニング）なども用いることができる。また、第一の粒子計測手段５１と第二の粒子計測手段５２は、別装置を用いてもよいし、同一装置の別シーケーンス構成または別プログラム構成により実現してもよい。
【０１７７】
＜第７の実施の形態＞
図１５は、第７の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。図１５は、第１の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である図１と類似の構成であり、この図１の構成に対して、光照射手段が２以上の異なる方向から光を照射する光照射手段である点が相違し、１０は液滴吐出手段であり、１１は液滴吐出手段１０の液室であり、１２は液滴吐出手段のノズルであり、２０は駆動手段であり、３０は光照射手段であり、３１はビームスプリッターであり、３２ａ、３２ｂは偏向手段であり、４１、及び４２は受光手段であり、５１は第一の粒子計測手段であり、５２は第二の粒子計測手段であり、１００Ｇは粒子計数装置であり、２００は粒子懸濁液であり、２０１は粒子懸濁液中の蛍光粒子であり、２１０は液滴吐出手段のノズルより吐出された液滴であり、３０１及び３１１はレーザー光であり、３０２ａは受光手段４１への発光であり、３０２ｂは受光手段４２への発光であり、３０３は液滴の吐出方向である。
【０１７８】
以下、図１５に示す第７の実施の形態に関し、図１と同じ構成に関する説明は一部省略し説明する。図１５に示すように、液滴吐出手段１０は、液室１１内に蛍光粒子２０１を懸濁した粒子懸濁液２００を収容し、液室１１に配置された図示しない圧電素子の変形により、蛍光粒子２０１を含む球体、楕円体、又はこれらが若干に変形した液滴２１０を、吐出方向３０３で示す方向に吐出することができる。
【０１７９】
光照射手段３０は、液滴吐出手段から吐出された液滴に光を照射する手段である。光照射手段３０は、駆動手段２０と電気的に接続されており、駆動手段２０から同期信号を入力される。同期信号を入力された光照射手段３０は、液滴吐出手段１０による液滴２１０の吐出タイミングに合わせて、照明光となるレーザー光３０１及び３１１を液滴２１０に照射する。
【０１８０】
２つの受光手段４１及び４２は、いずれも光照射手段３０を介して駆動手段２０と電気的に接続されており、駆動手段２０から同期信号を入力される。同期信号を入力された受光手段４１及び４２は、光照射手段３０のレーザー光３０１及び３１１により蛍光粒子２０１が発光するタイミングに合わせて、光３０２ａ及び光３０２ｂを受光する。
【０１８１】
受光手段４１は、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測可能な光センシングデバイス／モジュールであり、受光手段４２は、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を計測可能な光センシングデバイス／モジュールである。受光手段４１及び受光手段４２は、それぞれ電気的に接続された第一の粒子計測手段５１と、第二の粒計測手段５２とに受光情報を出力し、これら受光素子の情報を基に、第一の粒子計測手段５１は液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測し、第二の粒子計測手段５２は液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の個数を計測することができる。
【０１８２】
受光手段４２は、第二の粒子計測手段５２と連携して蛍光粒子２０１の個数を計測することができる計測手段であり定量計測であるため、定性計測の受光手段４１と比較して、高精度の計測となりこれを実現させせるためには、受光手段４１と比較して取得情報量のより多い光センシングデバイス／ユニット、さらに第一の粒子計測手段５１と比較してより複雑な情報処理を実施できる第二の粒子計測手段５２を用いる。
【０１８３】
第二の粒子計測手段５２は、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）及びＰＣにインストールした画像処理ソフトなどを用いることができる。２次元受光センサー／モジュールから出力された多量の画像情報は、ＰＣの入出力インターフェースを介して、ＰＣのメモリに高速に入力することができる。
【０１８４】
このとき、これらビームスプリッター３１、偏向手段３２ａ及び３２ｂは光照射手段３０の一部であり、液滴２１０をレーザー光で照射する照射手段３０は、ビームスプリッター３１にてその照射光量をそれぞれが２分の１となるように分割され、一方の直進成分は、レーザー光３０１からなる照明光として液滴２１０を照明し、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１を発光させる。ビームスプリッター３１にてその照射光量を２分の１に分割されたもう一方の偏向成分は、偏向手段３２ａ、及び３２ｂにより、再度及び再々度偏向された後、一方の直進成分と同様にレーザー光３１１からなる照明光として液滴２１０を照明する。レーザー光３１１からなる照明光は、一方のビームスプリッター３１の直進成分となるレーザー光３０１に対して４５度の角度となる照明光である。なお、偏向手段３２ａ及び３２ｂは、レーザー光３１１の波長、例えば、本実施の形態では５３２ｎｍであるが、この波長に反射率を最適化した多層膜ミラーからなる反射率９９．９％品を用いることにより、ほとんど照明光量の損失のないレーザー光伝播を行うことができる。
【０１８５】
図１５の粒子計数装置１００Ｇにおいては、元のレーザー光の発光光量が同じにもかかわらず、図１に示した第１の実施の形態の場合の照明光がレーザー光３０１のみの場合と比較して、発生する液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１への照明光量が非常に小さくなる場合が発生する頻度を低減することができ、計測精度を向上することができるようになる。照明光がレーザー光３０１のみの場合に、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１への照明光量が非常に小さくなる場合が発生する原因は、液滴のレンズ作用による。液滴２１０の主成分が屈折率ｎ＝１．３３３の水であり、液滴２１０の直径が約４０μｍから１００μｍと非常にその曲率が小さいことから、液滴のレンズ作用による集光力が発生し、液滴２１０の断面中心を通る光軸近傍の照明光量が相対的に増加するが、その分に応じて光軸から離れた領域の照明光量が相対的に減少する。
【０１８６】
図１６は、光学シミュレーションにより求めた、図１に示した第１の実施の形態の場合の照明光がレーザー光３０１のみの場合に、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１への照明光量が、液滴２１０中の蛍光粒子２０１の位置によって大きなばらつきを有することを説明する、レーザー光３０１による蛍光粒子２０１への照明状態の一例を示す模式図である。
【０１８７】
光学シミュレーションは、以下のようにして実施した。光学シミュレーションツールとしては、ＬｉｇｈｔＴｏｏｌｓ８．４．０（サイバーネットシステム株式会社製）を用い、ＰＣにより計算した。光学モデルとしては、液滴２１０の直径を８０μｍ、蛍光粒子２０１の直径を５μｍ、液滴を構成する水の屈折率を１．３３３とし、液滴２１０中の蛍光粒子２０１は、液滴２１０の断面中心をｚｙ軸の原点とし、水平ｚ軸（単位μｍ）は光軸方向であり、垂直ｙ軸（単位μｍ）は像高方向であるが、原点を基準に５μｍピッチにて、蛍光粒子が液滴にすべて含有される座標位置に配置しており、液滴２１０中の蛍光粒子２０１は照明光に対してはｚ軸を中心とした回転対称であるため、ｙ軸が０以上の場合を図示した。レーザー光３０１は、ｚ軸で負側から正側へ伝播する、つまり図１６の左側か右側へ伝播する照明光量分布が均一な平行光束とした。実際の計算は、光線本数を１，０００万本以上で計算したが、図１６おいては、光線追跡した結果としての光線により照明状態の一例を示すために、一部のみ図示し、光線の密な部分が単位面積当たりの照明光量の大きい部分となる。光学モデルは３Ｄモデルであるが、図１６は紙面手前となるｘ軸方向からの図であり、液滴２１０及び蛍光粒子２０１は断面でｘ＝０での断面図が示され、光線はこの断面への投影図が示される。
【０１８８】
図１６に示すように、照明光量分布が均一な照明光を用いても、液滴２１０中の照明光の進行側となるｚ軸正側の領域、つまり右側の領域において、液滴２１０のレンズ作用により照明光が集中して単位面積当たりの照明光量が大きくなる部分と、単位面積当たりの照明光量が小さくなる部分とが発生し、この単位面積当たりの照明光量が小さくなる部分には全く光線が存在していない領域があることがわかる。図示する光線本数を１，０００万本レベルとすると、この全く光線が存在していない領域の面積は小さくはなるが、液低２１０の右上及び右下に確実に存在する。このことから、一方向からの平行光束による液滴への照明には照明されない領域又は照明光量が非常に小さい部分が存在する領域があることがわかる。これらの領域に存在する蛍光粒子は、照明光に対応した発光量が０（ゼロ）又は非常に小さいことなる。この場合、受光手段４１及び４２に非常に高い感度が求められ、また、照明光量０で発光量が０となる場合には、如何なる受光手段４１及び４２を用いても蛍光粒子の有無又は個数を計測することができない。このため、これらの領域に液滴２１０中の蛍光粒子２０１が位置する頻度に基づいて、計測精度が劣化するという問題があり、図１５の第７の実施の形態にかかる粒子計数装置は、本問題を解決するものである。
【０１８９】
照明光を平行光束から、開口数（ＮＡ）で記載される照明角度を有する照明光に変更することにより、この照明されない領域又は照明光量が非常に小さい部分が領域を低減することはできるが、例えば、水を主成分とする液滴２１０に対しては、照明されない領域をなくすには、ＮＡを少なくとも０．４以上とする必要があり、顕微鏡のコンデンサレンズによるハロゲンランプやキセノンランプを用いた照明、又はレーザー光と拡散手段と顕微鏡対物レンズのような高ＮＡの集光レンズを用いる必要があるが、これらはいずれも大型であり、その位置調整は光学系の配置が難しいなど、また、単位面積当りの照明光量が低下するなどの別の問題が生じ、本目的に用いることは困難である。
【０１９０】
図１７Ａ、図１７Ｂ、及び図１７Ｃは、図１５の第７の実施の形態の効果を、照明光量分布の効果として定量的に説明するために、光学シミュレーションにより求めた、液滴２１０中の蛍光粒子２０１の照明光量分布の例を図示したものであり、図１７Ａは、図１に記載の第１の実施の形態となる光照射手段３０におけるレーザー光３０１の場合であり、図１７Ｂは、図１５に記載の第７の実施の形態となる光照射手段３０におけるレーザー光３１１のみをｚ軸に対して４５度入射の場合であり、この場合の照明光量総量は図１７Ａと比較するために２倍として図１７Ａと同一にしており、図１７Ｃは、図１５に記載の第７の実施の形態となる光照射手段３０におけるレーザー光３０１とレーザー光３１１を組み合わせた場合である。図１７Ａ、図１７Ｂ、及び図１７Ｃは、いずれも液滴２１０の断面中心をｚｙ軸の原点とし、水平ｚ軸（単位：μｍ）は図面右側が正とした光軸方向であり、垂直ｙ軸（単位：μｍ）は図面上側が正とした像高方向である。
【０１９１】
このとき、図１７Ａ、及び図１７Ｃは、図１６に記載の液滴２１０中の蛍光粒子２０１の中心位置を、原点を中心に５μｍピッチで配置した光学モデルを用いた場合であり、それぞれの構成においてレーザー光からなる照明光を液滴２１０に照射した場合の、蛍光粒子のそれぞれの配置での照射光量となる受光光量を計算した。計算は、蛍光粒子が全方向発散光源のため光線本数を１，０００万本以上で計算し、それぞれの蛍光粒子における必要精度を確保した。また、分布及び比較検討するため、図１７Ａにおいて、光軸と平行な０度入射となるレーザー光３０１が入射する側となる液滴のレンズ作用が比較的に小さい液滴２１０の左端（ｚ，ｙ）＝（−３５，０）の位置での受光光量を１．０として正規化した。図１７Ｂは、図１７Ａの結果を基に、座標軸を４５度回転した上で、原点を中心に５μｍピッチとなる蛍光粒の座標ごとに、補間計算により求めた。
【０１９２】
図１７Ａに示すように、液滴２１０内において、蛍光粒子２０１の位置が、光軸上でレーザー光３０１の入射側と反対側の右側に近づくにつれて、左端のレンズ作用の小さい場合と比較して、受光光量が最大６．７倍まで増大していることがわかる。液滴２１０が凸レンズとして作用して、光軸近傍に光が集光されると同時に、非常に強い曲率であるので大きな収差が発生しており、これらが組み合わさり、集光面に近く少し光軸近傍ではあるが光軸ではない（ｚ，ｙ）＝（３０，−１５）及び（３０，１５）の位置が最大受光光量となる。一方、照明光が集光された領域が形成されるトレードオフとして照明光が減少する領域が存在することとなるが、この領域は、光軸に対して液滴２１０の周辺となるｙ＝−３５、−３０、３０、３５の領域、及び（ｚ，ｙ）＝（２５，−２５）、（３０，−２０）、（２５，２５）、（３０，２０）となる。ｙ＝−３５、−３０、３０、３５の領域は、図１７Ａの断面積による２Ｄ分布を図示しているが、実際には３Ｄ分布としては、この領域の蛍光粒子２０１の比率は増加する。また、（ｚ，ｙ）＝（２５，−２５）、（３０，−２０）、（２５，２５）、（３０，２０）、及び重複するが、（ｚ，ｙ）＝（１５，−３０）、（２０，−３０）、（１５，３０）、（２０，３０）、（１０，３５）、（１０，−３５）の１０箇所の蛍光粒子は、照明光量が０（ゼロ）であり、この領域の位置に蛍光粒子が存在する頻度で、粒子計測が全くできないので問題である。
【０１９３】
図１７Ｂは、図１５に記載の第７の実施の形態となる光照射手段３０におけるレーザー光３１１をｚ軸に対して４５度入射のみの場合であるが、図１７Ａを４５度回転した状態であるので位置に相違はあるが、図１７Ａと同様に、液滴２１０中の蛍光粒子２０１の位置により、照明されない蛍光粒子、又は照明光量が非常に小さい蛍光粒子があることがわかる。
なお、図１７Ａと比較して、図１７Ｂで受光光量０の蛍光粒子位置の数が減少しているのは、図１７Ｂは、図１７Ａの結果を基に補間計算により求めているため計算精度が相対的に低下していることに基づき、どちらも一方向の平行光束による照明なので、実際には同レベルの照明状態であり、受光光量０〜０．２の１０箇所の蛍光位置は問題となる。
【０１９４】
図１７Ｃは、図１５に記載の第７の実施の形態となる光照射手段３０におけるレーザー光３０１とレーザー光３１１を組み合わせた場合であるが、総受光光量が同じであるにも係わらず、照明されない、又は照明光量が非常に小さい蛍光粒子となる位置が減少していることがわかる。これは、２つの異なる方向から液滴２１０を照射しているため、液滴２１０のレンズ作用による集光作用による影響が２つに分割され、極端な集光による照明光量の増大と同時に、そのトレードオフとなる照明光量の減少が低減されたことに基づく。このとき、照明光量が非常に小さい蛍光粒子となる頻度が減少さるため、粒子計測精度を向上させることができ、より高精度の粒子計数装置１００Ｇを提供することができる。
【０１９５】
図１５において、液滴粒子２１０を照射する異なる方向の照明光となるレーザー光３０１、及び３１１の角度は、図示の４５度に制限されるものではない。また、液滴粒子２１０を照射する異なる方向の照明光となるレーザー光の複数となる数は、図１５に記載の２個に制限されるわけではなく、３個、４個と増加することにより、液滴のレンズ作用による影響が分割されるため、より効果的である。要求される精度、光学系のレイアウト、コストなどを鑑みて最適化されるものである。液滴吐出手段１０近傍に微小光学素子を用いて、照明光の照射方向を増加させることは効果的である。
【０１９６】
図１５に示す第７の実施の形態は、光を受けることで発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出手段と、前記液滴吐出手段から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射手段と、前記光を照射された前記粒子からの発光による光を受光する受光手段と、前記受光手段により受光した前記光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数手段と、を有することを特徴とする粒子計数装置において、前記粒子計数手段が、前記液滴に含まれる前記粒子の有無を計測する第一の粒子計測手段と、前記液滴に含まれる前記粒子の個数を計測する第二の粒子計測手段とを有する粒子計数装置であるが、この粒子計数装置に、その効果が限定されるわけではなく、光を受けることで発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出手段と、前記液滴吐出手段から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射手段と、前記光を照射された前記粒子からの発光による光を受光する受光手段と、前記受光手段により受光した前記光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数手段と、を有する粒子計数装置においても効果的である。
【０１９７】
これは、図１５に示す第７の実施の形態は、光を受けることで発光可能な粒子を含む液滴に照明光を照射した場合に、この照射する照明光の方向を２以上とすることにより液滴中の発光可能な粒子の位置による照明光の照明光量が少ない場合が発生する頻度を低減することができるため、液滴に含まれる発光可能な粒子の有無を計測する第一の粒子計測手段と、液滴に含まれる発光可能な粒子の個数を計測する第二の粒子計測手段とのどちらにも効果的であることから、この第一の粒子計測手段と第二の粒子計測手段とを組み合わせた図１に示す第１の実施の形態に制限されないこととなり、第一の粒子計測手段、又は第二の粒子計測手段のみを設けた粒子計数装置１００Ｇにおいても効果的となる。
【０１９８】
図１８に、第一の粒子計測手段のみを設けた粒子計数装置１００Ｈの場合の実施の形態を参考として示す。以下、図１８の第一の粒子計測手段のみの実施の形態に関し、図１５と同じ構成に関する説明は一部省略し説明する。図１８に示すように、光照射手段３０は、液滴吐出手段から吐出された液滴に光を照射する手段である。光照射手段３０は、駆動手段２０と電気的に接続されており、駆動手段２０から同期信号を入力される。同期信号を入力された光照射手段３０は、液滴吐出手段１０による液滴２１０の吐出タイミングに合わせて、照明光となるレーザー光３０１及び３１１を液滴２１０に照射する。
【０１９９】
１つとなる受光手段４１は、光照射手段３０を介して駆動手段２０と電気的に接続されており、駆動手段２０から同期信号を入力される。同期信号を入力された受光手段４１は、光照射手段３０のレーザー光３０１及び３１１により蛍光粒子２０１が発光するタイミングに合わせて、光３０２ａを受光する。
【０２００】
受光手段４１は、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測可能な光センシングデバイス／モジュールであり、受光手段４１は、それぞれ電気的に接続された第一の粒子計測手段５１に受光情報を出力し、この受光素子の情報を基に、第一の粒子計測手段５１は液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１の有無を計測することができる。
【０２０１】
このとき、第７の実施の形態の図１５と同様に、これらビームスプリッター３１、偏向手段３２ａ及び３２ｂは照射手段３０の一部であり、液滴２１０をレーザー光で照射する光照射手段３０は、ビームスプリッター３１にてその照射光量をそれぞれが２分の１となるように分割され、一方の直進成分は、レーザー光３０１からなる照明光として液滴２１０を照明し、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１を発光させる。ビームスプリッター３１にてその照射光量を２分の１に分割されたもう一方の偏向成分は、偏向手段３２ａ、３２ｂにより再度、及び再々度偏向された後、一方の直進成分と同様にレーザー光３１１からなる照明光として液滴２１０を照明する。レーザー光３１１からなる照明光は、一方のビームスプリッター３１の直進成分となるレーザー光３０１に対して４５度の角度となる照明光である。なお、偏向手段３２ａ及び３２ｂは、レーザー光３１１の波長、例えば、本実施の形態では５３２ｎｍであるが、この波長に反射率を最適化した多層膜ミラーからなる反射率９９．９％品を用いることにより、ほとんど照明光量の損失のないレーザー光伝播を行うことができる。
【０２０２】
図１８の粒子計数装置１００Ｈにおいては、元のレーザー光の発光光量が同じにもかかわらず、図１に示した第１の実施の形態の場合の照明光がレーザー光３０１のみの場合と比較して、発生する液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１への照明光量が非常に小さくなる場合が発生する頻度を低減することができ、計測精度を向上することができるようになる。照明光がレーザー光３０１のみの場合に、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１への照明光量が非常に小さくなる場合が発生する原因は、液滴のレンズ作用による。液滴２１０の主成分が屈折率ｎ＝１．３３３の水であり、液滴２１０の直径が約４０μｍから１００μｍと非常にその曲率が小さいことから、液滴のレンズ作用による集光力が発生し、液滴２１０の断面中心を通る光軸近傍の照明光量が相対的に増加するが、その分に応じて光軸から離れた領域の照明光量が相対的に減少する。
【０２０３】
図１８に示す実施の形態は、上述した液滴のレンズ作用による集光力が発生する場合に効果的となる構成であり、フローサイトメトリのような、流路の内部が液で満たされた状態に存在する蛍光粒子又は細胞に対して計測する計測装置とは全く別の動作であり、蛍光粒子又は細胞を含む吐出された液滴中の蛍光粒子又は細胞を計測する場合に特有の構成である。
【０２０４】
また、図１５に示す第７の実施の形態は、光を受けることで発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出手段と、前記液滴吐出手段から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射手段と、前記光を照射された前記粒子からの発光による光を受光する受光手段と、前記受光手段により受光した前記光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数手段と、を有する粒子計数装置であって、前記液滴に前記光を照射する前記光照射手段が、２以上の異なる方向から光を照射する光照射手段である粒子計数装置である。
【０２０５】
ここで、図１５に示した第７の実施の形態においては、図１に示す第１の実施の形態と同様、第一の粒子計測手段５１に情報を出力する受光手段４１と第二の粒子計測手段５２に情報を出力する受光手段４２との、少なくとも２つ以上の複数の受光手段を有する構成と組み合わせた粒子計数装置１００Ｇである。液滴吐出手段１０から吐出された液滴２１０を前記液滴吐出手段１０のノズル１２の近傍、例えば、０．５ｍｍ〜１ｍｍの距離位置にて計測することが好ましい。この場合、受光手段４１及び４２は、小型の受光手段を用いる必要があるが、受光手段を小型化することにより、受光手段の光学素子の光利用効率、及び受光手段の受光素子の光電変換効率が低下した場合でも、本実施例とすることで、照明光量を増加させることができ、受光素子の小型化による効率低下を補うことができるので、より好適である。
【０２０６】
＜第８の実施の形態＞
図１９は、第８の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。図１９は、第７の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である図１５と類似の構成であり、この図１５の構成に対して、光照射手段の２以上の異なる方向が、略対向方向である点が相違し、１０は液滴吐出手段であり、１１は液滴吐出手段１０の液室であり、１２は液滴吐出手段のノズルであり、２０は駆動手段であり、３０は光照射手段であり、３１はビームスプリッターであり、３３ａ、及び３３ｂは偏向手段であり、４１、及び４２は受光手段であり、５１は第一の粒子計測手段であり、５２は第二の粒子計測手段であり、１００Ｉは粒子計数装置であり、２００は粒子懸濁液であり、２０１は粒子懸濁液中の蛍光粒子であり、２１０は液滴吐出手段のノズルより吐出された液滴であり、３０１及び３１２はレーザー光であり、３０２ａは受光手段４１への光であり、３０２ｂは受光手段４２への光であり、３０３は液滴の吐出方向である。
【０２０７】
以下、図１９に示す第８の実施の形態に関し、図１５と同じ構成に関する説明は一部省略し説明する。図１９に示すように、光照射手段３０は、液滴吐出手段から吐出された液滴に光を照射する手段である。光照射手段３０は、駆動手段２０と電気的に接続されており、駆動手段２０から同期信号を入力される。同期信号を入力された光照射手段３０は、液滴吐出手段１０による液滴２１０の吐出タイミングに合わせて、照明光となるレーザー光３０１及び３１２を液滴２１０に照射する。
【０２０８】
このとき、これらビームスプリッター３１、偏向手段３３ａ及び３３ｂは照射手段３０の一部であり、液滴２１０をレーザー光で照射する照射手段３０は、ビームスプリッター３１にてその照射光量をそれぞれが２分の１となるように分割され、一方の直進成分は、レーザー光３０１からなる照明光として液滴２１０を照明し、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１を発光させる。ビームスプリッター３１にてその照射光量を２分の１に分割されたもう一方の偏向成分は、偏向手段３３ａ、３３ｂにより再度、及び再々度偏向された後、一方の直進成分と同様にレーザー光３１１からなる照明光として液滴２１０を照明する。レーザー光３１２からなる照明光は、一方のビームスプリッター３１の直進成分となるレーザー光３０１に対して対向となる１８０度の角度となる照明光である。
【０２０９】
図１９の粒子計数装置１００Ｉにおいては、元のレーザー光の発光光量が同じにもかかわらず、図１５に示した第１の実施の形態の場合の照明光となるレーザー光３０１とレーザー光３１１の異なる２つの方向から照射された互いの角度が４５度の場合と比較して、発生する液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１への照明光量が非常に小さくなる場合が発生する頻度を低減することができ、計測精度を向上することができるようになる。
【０２１０】
図２０は、上記理由を光学シミュレーションにより計算した結果により定性的に説明するものであり、図２０は、図１９に示した第８の実施の形態の場合の照明光がレーザー光３０１とレーザー光３１２の１８０度となる異なる２つの方向から照射された場合に、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１への照明光量が、液滴２１０中の蛍光粒子２０１の位置によって大きなばらつきを有することを説明する、レーザー光３０１、３１２による蛍光粒子２０１への照明状態の一例を示す模式図である。
【０２１１】
光学シミュレーションは以下の光学モデル及び条件により実施した。（図１６及び）図１７で示した第７の実施の形態と基本的には同様の条件であり、レーザー光３０１は、ｚ軸で負側から正側へ伝播する、つまり、図２０の左側か右側へ伝播する照明光量分布が均一な平行光束とし、レーザー光３１２は、レーザー光３０１とその伝播方向が１８０度異なる、ｚ軸で正側から負側へ伝播する、つまり、図２０の右側か左側へ伝播する照明光量分布が均一な平行光束とした。実際の計算は、光線本数を２，０００万本以上で計算したが、図２０においては、光線追跡した結果としての光線により照明状態の一例を示すために、一部のみ図示し、光線の密な部分が単位面積当たりの照明光量の大きい部分となる。
【０２１２】
図２０に示すように、レーザー光３０１及びレーザー光３１２のどちらの照明光も、それぞれ液滴２１０のレンズ作用により照明光が集中して単位面積当たりの照明光量が大きくなる部分と、単位面積当たりの照明光量が小さくなる部分とが発生している。しかしながら、一方の照明光が伝播した場合の出射側の半球側において、液滴２１０によるレンズ作用により照明光が伝播しない領域は、もう一方の照明光が伝播した場合の入射側の半球側として照明光がほぼその半球全域にわたって伝播している。これは、略対向方向となる２つの異なる角度の照明光により、照明光量分布のばらつきを半球単位で補間していることとなる。これにより、液滴２１０内部において、照明されない領域は無くなり、また、照明光量が非常に少ない領域も大幅に減少する。月のような球体表面を、互いの角度が１８０度の方向の平行光束からなる照明光ですべて照明できるが、これと類似で、球体の内部も、互いの角度が１８０度の方向の平行光束からなる照明光で、すべて照明することができる。図２０においては、図示する光線本数を２，０００万本レベルとすると、この全く光線が存在していない領域が目視認識上無くなることを確認できるが、一方で、照明光量が小さい領域に関しては、定量的な比較をする必要がある。
【０２１３】
図２１は、図１９の第８の実施の形態の効果を、照明光量分布の効果として定量的に説明するために、光学シミュレーションにより求めた、液滴２１０中の蛍光粒子２０１の照明光量分布の例を図示したものであり、照射手段３０においてレーザー光３０１とレーザー光３１２とを組み合わせた場合である。図２１は、いずれも液滴２１０の断面中心をｚｙ軸の原点とし、水平ｚ軸（単位：μｍ）は図面右側が正とした光軸方向であり、垂直ｙ軸（単位：μｍ）は図面上側が正とした像高方向である。このとき、図２１は、液滴２１０中の蛍光粒子２０１の中心位置を、原点を中心に５μｍピッチで配置した光学モデルを用いた場合であり、レーザー光からなる照明光が液滴２１０を照射した場合の、蛍光粒子のそれぞれの配置での照射光量となる受光光量を計算した。計算は、蛍光粒子が全方向発散光源のため光線本数を２，０００万本以上で計算し、それぞれの蛍光粒子における必要精度を確保した。また、分布及び比較検討するため、第１の実施の形態である図１７Ａにおける、光軸と平行な０度入射となるレーザー光３０１が入射する側となる液滴のレンズ作用が比較的に小さい液滴２１０の左端（ｚ，ｙ）＝（−３５，０）の位置での受光光量を１．０として正規化した。このため、それぞれの位置での蛍光粒子２０１に対する照明光量として、図１７Ａ、図１７Ｂ、及び図１７Ｃと直接比較することができる。
【０２１４】
図２１に示すように、液滴２１０内における蛍光粒子２０１のすべての位置において、蛍光粒子２０１に対する照明光の照明光量が０となる位置がないことがわかる。このため、図２１に示した第８の実施の形態においては、受光手段の増幅感度を十分に上げることにより、原理的には検出漏れのない粒子計数装置１００Ｉを提供できることがわかる。また、蛍光粒子２０１の位置が光軸から離れるに従い、蛍光粒子２０１に対する照明光の照明光量が低減するが、その照明光量が、０．１〜０．２と、非常に照明光量が少ない場合は発生していない。これにより、受光手段の増幅感度に余裕ができ、結果として増幅に伴うノイズを低減することができるため、精度をより向上した、又は精度をより向上しやすい粒子計数装置１００Ｉを提供できることがわかる。
【０２１５】
また、液滴のレンズ作用により照明光による平行光束が集光され照明光量分布が増大した蛍光粒子２０１の位置は多く認められるが、その最大値は３．９であり、第１の実施の形態となる図１７Ａの場合の最大値６．７、及び第７の実施の形態となる図１７Ｃの場合の５．１、と比較して、２〜３分の１であり、照明光のばららつきが大幅に改善され小さくなっている。これにより、受光手段にＰＭＴを用いたり、粒子計測手段の一部にデジタイザーを用いたりする場合には、計測時に要求されるダイナミックレンジが小さくて済むようになるため、ＰＭＴの場合には、増幅による飽和のリスクが低減されるので増幅率をより大きくすることができ、より精度向上することができるようになり、デジタイザーの場合は、低ビット、例えば、８ビットのデジタイザーなどを利用できるようになり、高速版デジタイザーによる高精度化や、汎用品デジタイザーによる低価格化などができるようになる。
【０２１６】
＜第９の実施の形態＞
図２２は、第９の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。図２２は、第８の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である図１９と類似の構成であり、この図１９の構成に対して、光照射手段の２以上の異なる方向が、略対向方向であることが相違し、１０は液滴吐出手段であり、１１は液滴吐出手段１０の液室であり、１２は液滴吐出手段のノズルであり、２０は駆動手段であり、３０は光照射手段であり、３５は偏向手段であり、４１、及び４２は受光手段であり、５１は第一の粒子計測手段であり、５２は第二の粒子計測手段であり、１００Ｊは粒子計数装置であり、２００は粒子懸濁液であり、２０１は粒子懸濁液中の蛍光粒子であり、２１０は液滴吐出手段のノズルより吐出された液滴であり、３０１、３１３、及び３１４はレーザー光であり、３０２ａは受光手段４１への光であり、３０２ｂは受光手段４２への光であり、３０３は液滴の吐出方向である。
【０２１７】
第９の実施の形態にかかる粒子計数装置は、２以上の異なる方向から光を照射する前記光照射手段が、略平行光束からなる光を前記液滴に照射する第一の光照射部と、前記略平行光束の光の一部が前記液滴を照射することに対応して前記液滴位置を透過した前記略平行光束の光を偏向させて再度液滴に照射させる偏向光学素子を有する第二の光照射部と、を有する。
【０２１８】
以下、図２２に示す第９の実施の形態に関し、図１９と同じ構成に関する説明は一部省略し説明する。図１９に示すように、光照射手段３０は、液滴吐出手段から吐出された液滴に光を照射する手段である。光照射手段３０は、駆動手段２０と電気的に接続されており、駆動手段２０から同期信号を入力される。同期信号を入力された光照射手段３０は、液滴吐出手段１０による液滴２１０の吐出タイミングに合わせて、照明光となるレーザー光３０１及び３１４を液滴２１０に照射する。
【０２１９】
このとき、偏向手段３５は照射手段３０（第一の光照射部）の一部であり、液滴２１０をレーザー光で照射する照射手段３０は、レーザー光３０１からなる照明光として液滴２１０を照明した後、その進行方向となる液滴２１０の後方を伝播するレーザー光３１３を反射させ１８０度偏向させる偏向手段３５（第二の光照射部）を配置する。これにより、レーザー光３１３は再び液滴２１０に向かって伝播するレーザー光３１４となり、このレーザー光３１４は、再び液滴２１０を照射し、さらには液滴２１０中に存在する蛍光粒子２０１を、レーザー光３０１に対して異なる方向となる１８０度の角度となる照明光として再び照明し、蛍光粒子２０１の照明光量が大きく増大させる。
【０２２０】
図２２の粒子計数装置１００Ｊにおいては、元のレーザー光の発光光量が同じにもかかわらず、図１５に示した第７の実施の形態の場合の照明光となるレーザー光３０１とレーザー光３１１の異なる２つの方向から照射された互いの角度が４５度の場合と比較して、また、図１９に示した第８の実施の形態の場合の異なる２つの方向から照射された互いの角度が１８０度の場合と比較して、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１への照明光量が非常に小さくなる場合を低減することができ、計測精度を向上することができるようになる。
【０２２１】
これは、図１５及び図１９の実施の形態においては、レーザー光３０１を液滴２１０及びこの液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１に照射した後に、液滴２１０の後方に伝播するレーザー光３１３を、再び粒子計数装置１００Ｊの光学系として利用することはなかった。むしろ、ノイズ光の原因となるため光吸収ダンパーなどをその伝播方向に設け、その光出力を大きく低下させるようにしていた。しかし、図２２の実施の形態においては、このレーザー光３１３を再利用するため、２倍の光出力に相当するレーザー光源を用いたのと同レベルの照明光量を実現することができる。
【０２２２】
例えば、レーザー光３０１のビーム径を空間伝播としては細めの１ｍｍとした場合においても、このビーム径が対応する断面積に対する液滴２１０の直径８０μｍが対応する面積の比は、約０．６％であり、液滴２１０及びこの液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１が、直径８０μｍ分のすべての光を吸収し損失になったとしても、照明光としての損失は小さい。また、偏向手段３５に関しても、市販されている多層膜ミラーからなる反射率９９．９％品などを用いることにより、照明光としての損失は小さい。このため、図２２で示される本実施の形態は、図１９で示される第８の実施の形態と比較して、照明光量として約２倍の増加を実現できることとなる。
【０２２３】
実際には、液滴２１０の径が８０μｍと比較的小さいため、回折による光損失は問題となるが、液滴２１０及びこの液滴２１０による蛍光発光に関連した光吸収は小さいため、この分の光吸収による光損失は少なく大きな問題とはならない。また、レーザー光３０１と、これと１８０度という異なる方向で液滴に入射するレーザー光３１４とで、光軸を完全に一致させる必要はないので、レーザー光３０１の入射により液滴２１０が対応したビーム内の位置を外すように実際の光軸が若干に異なるように偏向手段３５を調整することにより、レーザー光３１４によるほぼ同じ照明光量分布を与える照明光の照射は簡単に実現でき、実際には、回折によるロスも問題としなくて構わなく、照明光量として約２倍の増加を実現できる。
【０２２４】
図２３は、図２２に記載の第９の実施の形態を、光学シミュレーションにより計算した結果により定量的に説明するものであり、液滴２１０中の蛍光粒子２０１の照明光量分布の例を図示したものである。図２３の座標や単位、光学シミュレーションの条件は、図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、及び図２１と同様である。光学モデルとしては、偏向手段３５をミラーとして扱い、市販品での反射率９９．９％を有効桁数を考慮し事前に丸めて１００％とした。このため、図２１と図２３とは、照明光量が２倍となる関係となる。
【０２２５】
また、表記している蛍光粒子のそれぞれの配置での照明光量となる受光光量は、図２１と同様に、分布及び比較検討するため、第１の実施の形態である図１７Ａにおける、光軸と平行な０度入射となるレーザー光３０１が入射する側となる液滴のレンズ作用が比較的に小さい液滴２１０の左端（ｚ，ｙ）＝（−３５，０）の位置での受光光量を１．０として正規化した。このため、それぞれの位置での蛍光粒子２０１に対する照明光量として、図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、及び図２１と直接比較することができる。
【０２２６】
図２３に示す第９の実施の形態は、図２１に記載の第８の実施の形態と同様、液滴２１０内における蛍光粒子２０１のすべての位置で、蛍光粒子２０１に対する照明光の照明光量が０となる位置がないことがわかる。その上で、蛍光粒子２０１の位置が光軸から離れるに従って、蛍光粒子２０１に対する照明光の照明光量が低減するが、この蛍光粒子２０１に対する照明光の照明光量が低減した場合においても、その照明光量が、０．６以上と、液滴２１０によるレンズ作用がほとんどない場合の蛍光粒子２０１への照射光量の６割の照射光量を実現しており、さらに、受光手段の増幅感度に余裕ができ、結果として増幅に伴うノイズを低減することができるため、精度をより向上し、また、精度をより向上しやすい粒子計数装置１００Ｊを提供できることがわかる。
【０２２７】
図２３に示す第９の実施の形態は、図２１に記載の第８の実施の形態と光照射手段３０に用いるレーザー光の光源からの光出力は同じであるため、レーザー光の光源コストを大きく低下できるため、非常に効果的である。偏向手段により、液滴２１０を一回照射した後のレーザー光を偏向手段により、再度、液滴２１０に対して２回目の照射することは、１回目の照射と、２回目の照射とで、２以上の異なる方向の照射となるが、この異なる方向の角度は、図２３の略１８０度に限定されるわけではなく、複数の偏向手段を用いることにより、略直交方向となる略９０度、さらには略４５度、略３０度など、粒子計数装置１００Ｋにおけるレイアウトの制約に対応して最適化することが好ましい。
【０２２８】
また、複数の偏向手段を用いることによる異なる方向の角度からの、再度の液滴２１０へのレーザー光の照射回数は、図２３の２回に限定されるわけではなく、３回、４回と、３回以上の複数回とすることは効果的である。この場合、この３回以上の複数回の照射のうちの少なくとも１組の２回の組合せは、この異なる方向の角度を略対向方向に設けることが、液滴２１０のレンズ作用で液滴２１０内における蛍光粒子２０１の位置により照明光量が低下される頻度が低減されるので効果的である。
【０２２９】
図２２及び図２３に示す第９の実施の形態においては、液滴２１０を照射した後のレーザー光３１３を偏向手段３５により偏向させて、再度、液滴２１０に照射しているため、精密な光軸調整を含めた光学系調整を行う必要がある。レーザー光のビームプロファイル、ビーム中心位置を計測できる手段などを設け、この計測手段からの情報を用いて、適宜調整、又は自動調整する手段を設けて、光学系調整を不良により照明光量の低下を防止することが必要である。このとき、光学系調整として、単に光軸位置を最適化するだけではなく、ビームウエスト位置、光照射の時間遅延なども考慮した上で、高い光利用効率、蛍光粒子に対する高い発光効率、及び受光手段の高い光利用効率用を実現させるために最適化設計された光学系システム全体に対し、当初の設計通りに機能している調整することが好ましい。
【０２３０】
図２２及び図２３に示す第９の実施の形態における偏向手段３５は、液滴２１０を照射した後のレーザー光３１３を偏向させる手段として設けると同時に、この偏向手段の光透過スペクトルを最適化することにより、液滴２１０を照射した後のレーザー光３１３の一部を取り出し、この取り出したレーザー光の伝搬方向に、別途の受光手段を設け、これにより液滴２１０自体の有無を計測する手段を設けることは効果的である。偏向手段３５に、多層膜ミラーからなる反射率９９．９％品を用いた場合、０．１％分の光損失のうちミラーの表面散乱やミラー内部光吸収以外となる０．０１％相当の透過率であった場合でも、元のレーザー光が大きな光エネルギーを有するため、別途設けた受光手段による液滴２１０自体の有無の計測は可能である。この別途設ける受光手段には、例えばＣＣＤ、ＣＭＯＳ、ＰＭＴ、ＡＰＤなどを利用することができる。
【０２３１】
図２２に示す第９の実施の形態における、光照射手段の２以上の異なる方向であり、かつこの方向が略対向方向である構成は、図１８に示した、第一の粒子計測手段５１のみを有する構成と同様に、第一の粒子計測手段、又は第二の粒子計測手段のみを設けた粒子計数装置１００Ｊにおいても効果的である。図２４に、第一の粒子計測手段のみを設けた実施の形態を参考として示す。以下、図２４の第一の粒子計測手段のみを実施の形態に関し、図２２と同じ構成に関する説明は一部省略し説明する。
【０２３２】
図２４に示すように、光照射手段３０は、液滴吐出手段から吐出された液滴に光を照射する手段である。光照射手段３０は、駆動手段２０と電気的に接続されており、駆動手段２０から同期信号を入力される。同期信号を入力された光照射手段３０は、液滴吐出手段１０による液滴２１０の吐出タイミングに合わせて、照明光となるレーザー光３０１及び３１４を液滴２１０に照射する。
【０２３３】
このとき、偏向手段３５は光照射手段３０の一部であり、液滴２１０をレーザー光で照射する照射手段３０は、レーザー光３０１からなる照明光として液滴２１０を照明した後、その進行方向となる液滴２１０の後方を伝播するレーザー光３１３を反射させ１８０度偏向させる偏向手段３５を配置する。これにより、レーザー光３１３は再び液滴２１０に向かって伝播するレーザー光３１４となり、このレーザー光３１４は、再び液滴２１０を照射し、さらには液滴２１０中に存在する蛍光粒子２０１を、レーザー光３０１に対して異なる方向となる１８０度の角度となる照明光として再び照明し、蛍光粒子２０１の照明光量が大きく増大させる。
【０２３４】
図２４の粒子計数装置１００Ｋにおいては、元のレーザー光の発光光量が同じにもかかわらず、図１８に示した参考とする実施の形態の場合の照明光となるレーザー光３０１とレーザー光３１１の異なる２つの方向から照射された互いの角度が４５度の場合と比較して、液滴２１０に含まれる蛍光粒子２０１への照明光量が小さくなる場合を低減することができ、計測精度を向上することができるようになる。
【０２３５】
＜第１０の実施の形態＞
図２５Ａ、図２５Ｂ、及び図２５Ｃは、第１０の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である。図２５Ａ、図２５Ｂ、及び図２５Ｃは、第３の実施の形態にかかる粒子計数装置の一例を示す模式図である図９と類似の構成であり、図９の粒子計数装置の構成に対して、蛍光粒子を含む液滴を吐出したマイクロプレートに情報記録手段を設けたことが相異する。
【０２３６】
図２５Ａ、図２５Ｂ、及び図２５Ｃにおいて、１０は液滴吐出手段であり、１１は液滴吐出手段１０の液室であり、１２は液滴吐出手段のノズルであり、２０は駆動手段であり、３０は光照射手段であり、４１及び４２は受光手段であり、５１は第一の粒子計測手段であり、５２は第二の粒子計測手段であり、１００Ｌは粒子計数装置であり、２００は粒子懸濁液であり、２０１は粒子懸濁液中の蛍光粒子であり、２１０は液滴吐出手段のノズルより吐出された液滴であり、３０１はレーザー光であり、３０２ａは受光手段４１への光であり、３０２ｂは受光手段４２への光であり、３０３は液滴の吐出方向であり、５３は粒子計測手段制御手段であり、２１は液滴吐出手段制御手段であり、２２は連続吐出位置制御手段であり、６０は液滴吐出位置移動手段であり、６１はマイクロプレートであり、６２は着弾液滴からなる粒子含有試料であり、６３は粒子含有試料中の蛍光粒子であり、７０は計数情報記憶手段であり、７１は計数情報記憶手段出力手段である。
【０２３７】
以下、図２５Ａ、図２５Ｂ、及び図２５Ｃに示す第１０の実施の形態に関し、図９と同じ構成に関する説明は一部省略し説明する。図９に示すような第３の実施の形態と同様の動作により、図２５Ａに記載の粒子計数装置１００Ｌは、マイクロプレート６１の所定の液滴吐出位置となる特定ウェルに連続吐出することにより、高精度に計測された所定の個数の蛍光粒子を着弾させることができる。これにより、特定ウェルに所定の個数の蛍光粒子６３を含有する粒子含有試料６２を設けることができる。
【０２３８】
図２５Ａにおける粒子計数装置１００Ｌは、第３の実施の形態に加えて、粒子含有試料６２に関する計数情報を第一の粒子計測手段５１及び第二の粒子計測手段５２により取得し、計数情報記憶手段７０に出力する計数情報記憶手段出力手段７１を有する。この計数情報記憶手段出力手段７１は、マイクロプレート６１の所定の特定ウェルすべてに所定の個数の蛍光粒子６３を含有する粒子含有試料６２を設けた後、一括して計数情報記憶手段７０を出力してもよいし、特定ウェルに所定の個数の蛍光粒子６３を含有する粒子含有試料６２を設けるごとに、計数情報記憶手段７０を出力してもよい。
【０２３９】
図２５Ｂに示すように、この出力された計数情報記憶手段７０は、粒子計数装置１００Ｌからマイクロプレート６１を取り外した後、図示はしていない計数情報記憶手段設置手段により、マイクロプレート６１の一部に設置され、粒子含有試料６２とマイクロプレート６１と計数情報記憶手段７０とは一体化した粒子含有試料となる。この計数情報記憶手段７０は、バーコード、画像ラベル、テキストラベルなどを用いることができ、計数情報記憶手段設置手段は、これらの計数情報記憶手段７０に対応した専用出力装置からなる。上述の計数情報記憶手段７０は、上記印刷に制限されるわけではなく、ＲＦ−ＩＤ、メモリーチップ、ホログラム、光メモリ、微小構造を情報とする微小構造体などを、マイクロプレート６１の一部に設置してもよい。
【０２４０】
粒子含有試料６２に計数情報記憶手段７０を設ける構成は、図２５Ｂに記載の構成に制限されるわけではなく、図２５Ｃに示すように、この出力された計数情報記憶手段７０は、粒子計数装置１００Ｌからマイクロプレート６１を取り外した後、図示はしていない計数情報記憶手段設置手段により、マイクロプレート６１と一体化した粒子含有試料６２の上に設置され、マイクロプレート６１と粒子含有試料６２と計数情報記憶手段７０とは一体化した粒子含有試料となる。
【０２４１】
粒子含有試料６２に計数情報記憶手段７０を設ける構成は、図２５の構成に限定されるわけではなく、計数情報記憶手段７０として、タンパク質、低分子化合物、蛍光染料、ＤＮＡ、ビーズなどの化学物質や材料を用いてこれらの種類や量の差異を基に計数情報を情報識別できるようにし、粒子含有試料６２、又は粒子含有試料６２中の蛍光粒子６３と混合し一体化してもよい。さらに、計数情報記憶手段７０を前駆材料として用い、粒子含有試料６２又は粒子含有試料６２中の蛍光粒子６３と反応させた後の化学物質や材料の種類や量の違いを基に計数情報を情報識別してもよい。
【０２４２】
粒子含有試料６２を設ける、又は一体化させる液滴２１０の被着対象物であるマイクロプレート６１は、これに限定されるわけでなく、例えば、印刷シート、ビーズ、試薬ビン、カプセルなど被着可能な構造を有しているものを用いることができる。また、マイクロプレート６１などの被着対象物を、計数情報記憶手段設置手段により形状変形させることにより、被着対象物を直接に計数情報記憶手段７０としてもよい。例えば、計数情報記憶手段設置手段にレーザーマーカを用いてマイクロプレート６１にマーキングしてもよいし、計数情報記憶手段設置手段にインクジェット装置を用いてマイクロプレート６１にマーキングしてもよい。
【０２４３】
粒子含有試料６２に設けた計数情報記憶手段７０は、粒子含有試料６２ごとの計数値に制限されるわけではなく、ＩＤ、ロット、仕様、不確かさ、計数条件、蛍光粒子以外の粒子含有試料に関する情報、粒子含有試料６２の処方情報などに関する周辺情報を情報記憶しておくことは効果的である。また、計数情報記憶手段７０は最小限のＩＤのみを情報記憶しておき、図示はしていない別となる計数情報記憶提供手段と情報連携することにより、必要な計数情報を取得しても構わない。別となる計数情報記憶提供手段としては、例えば、粒子含有試料６２と同時提供する印刷データ以外にも、デジタルデータ、デジタルデータを処理するプログラム、デジタルデータを提供するクラウドシステムなどが挙げられる。
【０２４４】
粒子含有試料６２は、その粒子数が既知であることを利用して、様々な計測の検量線や検出限界検証や精度保障に用いることができる。例えば、蛍光粒子２０１に細胞を用いて、その細胞数を複数変化させたマイクロプレート６１を構成することにより、細胞種に固有遺伝子を分析するリアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌｔｉｍｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）や遺伝子検査ランプ法で定量分析及び定性分析に有用である。細胞の遺伝子の分析は、細胞の検出として用いられる。これは、食品検査に有用であり、例えば、食中毒の予防、原因解明のために、腸管出血性大腸菌（病原性大腸菌、Ｏ１５７）、病原性大腸菌（Ｏ１５７以外）、サルモネラ、カンピロバクター、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオなどの細菌を、１細胞又は数細胞レベルで微量分析することに利用できる。
【０２４５】
このとき、利用者は、粒子含有試料６２を設けたマイクロプレート６１を扱うこととなるが、通常は手袋を装着し、クリーンベンチにて、マイクロプレートの封の開封、試薬ビンの開閉、ピペッティング、溶液の吸引及び破棄などを行う。利用者は、このような状態で、試料の番号や内容などの情報の確認、さらには、自己の作業に対する記録をしていく必要があり、作業性の非常に悪い状態である。図２５Ａ、図２５Ｂ、及び図２５Ｃに示す第１０の実施の形態における粒子含有試料６２は、別途、図示はしない計数情報記憶手段７０の読み出し装置を設けることにより、間違いのない作業性の良好な分析作業をできるようになる。
【０２４６】
（粒子含有試料）
本発明の粒子含有試料は、粒子計数装置を用いて計数された粒子数に関する情報を記憶した計数情報記録手段を有し、更に必要に応じてその他の部材を有する。
【０２４７】
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  光を受けることで発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出手段と、
前記液滴吐出手段から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射手段と、
前記光を照射された前記粒子からの発光による光を受光する受光手段と、
前記受光手段により受光した前記光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数手段と、を有する粒子計数装置であって、
前記粒子計数手段が、前記液滴に含まれる前記粒子の有無を計測する第一の粒子計測手段と、前記液滴に含まれる前記粒子の個数を計測する第二の粒子計測手段とを有することを特徴とする粒子計数装置である。
＜２＞  前記第一の粒子計測手段からの前記液滴に含まれる前記粒子が有との情報に基づいて前記第二の粒子計測手段により前記液滴に含まれる前記粒子の個数を計測する粒子計測手段制御手段と、
前記第二の粒子計測手段からの前記液滴に含まれる前記粒子の個数の情報に基づいて前記液滴吐出手段を制御する液滴吐出手段制御手段と、をさらに有し、
前記液滴吐出手段制御手段が、前記第一の粒子計測手段からの前記液滴に含まれる前記粒子が無との情報に基づいて前記第二の粒子計測手段からの情報を用いることなく前記液滴吐出手段を制御する手段である前記＜１＞に記載の粒子計数装置である。
＜３＞  前記液滴吐出手段制御手段が、前記第一の粒子計測手段からの前記液滴に含まれる前記粒子が無との情報に基づいて、液滴を略同一位置に連続吐出するように液滴吐出位置を制御する手段である前記＜２＞に記載の粒子計数装置である。
＜４＞  前記第一の粒子計測手段が、前記粒子からの発光の発光量情報を取得する発光量取得部を有し、前記第二の粒子計測手段が、前記粒子からの発光による光に基づく２次元画像を取得する２次元画像取得部を有する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の粒子計数装置である。
＜５＞  前記第一の粒子計測手段に接続される受光手段が、２以上の異なる方向に発光された発光による光を受光する２以上の受光手段を有する前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の粒子計数装置である。
＜６＞  前記第二の粒子計測手段に接続される受光手段が、２以上の異なる方向に発光された発光による光を受光する２以上の受光手段を有する前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の粒子計数装置である。
＜７＞  前記第一の粒子計測手段の前記粒子からの発光の発光量情報を取得する前記発光量取得部が、前記第二の粒子計測手段の前記２次元画像取得部からの２次元画像情報に基づいて前記発光量情報を取得する前記＜４＞から＜６＞のいずれかに記載の粒子計数装置である。
＜８＞  前記光照射手段が、２以上の異なる方向から光を照射する手段であることを特徴とする前記＜１＞から＜７＞に記載の粒子計数装置である。
＜９＞  前記光照射手段の２以上の異なる方向が、略対向方向である前記＜８＞に記載の粒子計数装置である。
＜１０＞  ２以上の異なる方向から光を照射する前記光照射手段が、略平行光束からなる光を前記液滴に照射する第一の光照射部と、前記略平行光束の光の一部が前記液滴を照射することに対応して前記液滴位置を透過した前記略平行光束の光を偏向させて再度液滴に照射させる偏向光学素子を有する第二の光照射部と、を有する前記＜８＞から＜９＞のいずれかに記載の粒子計数装置である。
＜１１＞  光を受けることで発光可能な粒子が、蛍光粒子である前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の粒子計数装置である。
＜１２＞  前記蛍光粒子が、染色細胞である前記＜１１＞に記載の粒子計数装置である。
＜１３＞  光を受けることで発光可能な粒子を含む液滴を吐出させる液滴吐出工程と、
前記液滴吐出工程から吐出された前記液滴に前記光を照射する光照射工程と、
前記光を照射された前記粒子からの発光による光を受光する受光工程と、
前記受光工程により受光した前記光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数工程と、を含む粒子計数方法であって、
前記粒子計数工程が、前記液滴に含まれる前記粒子の有無を計測する第一の粒子計測工程と、前記液滴に含まれる前記粒子の個数を計測する第二の粒子計測工程とを含むことを特徴とする粒子計数方法である。
＜１４＞  前記第一の粒子計測工程からの前記液滴に含まれる前記粒子が有との情報に基づいて前記第二の粒子計測工程により前記液滴に含まれる前記粒子の個数を計測する粒子計測工程制御工程と、
前記第二の粒子計測工程からの前記液滴に含まれる前記粒子の個数の情報に基づいて液滴吐出工程を制御する液滴吐出工程制御工程と、をさらに含み、
前記液滴吐出工程制御工程が、前記第一の粒子計測工程からの前記液滴に含まれる前記粒子が無との情報に基づいて前記第二の粒子計測工程からの情報を用いることなく前記液滴吐出工程を制御する工程である前記＜１３＞に記載の粒子計数方法である。
＜１５＞  前記液滴吐出工程制御工程が、前記第二の粒子計測工程からの前記液滴に含まれる前記粒子の個数の情報に基づいて前記粒子の個数を積算し、前記液滴吐出工程を制御する工程である前記＜１４＞に記載の粒子計数方法である。
＜１６＞  前記第一の粒子計測工程からの前記液滴に含まれる前記粒子が有との情報に基づいて、液滴を略同一位置に連続吐出するように液滴吐出位置を制御する連続吐出位置制御工程と、
前記連続吐出位置制御工程からの情報に基づいて前記液滴吐出位置を移動させる液滴吐出位置移動工程と、をさらに含む前記＜１３＞から＜１５＞のいずれかに記載の粒子計数方法である。
＜１７＞  前記光を受けることで発光可能な粒子が、蛍光粒子である前記＜１３＞から＜１６＞のいずれかに記載の粒子計数方法である。
＜１８＞  前記蛍光粒子が、染色細胞である前記＜１７＞に記載の粒子計数方法である。
＜１９＞  前記染色細胞に用いられる細胞が、死細胞である前記＜１８＞に記載の粒子計数方法である。
＜２０＞  前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の粒子計数装置を用いて計数された粒子数に関する情報を記憶した計数情報記録手段を有することを特徴とする粒子含有試料である。
【０２４８】
前記＜１＞から＜１２＞のいずれかに記載の粒子計数装置、前記＜１３＞から＜１９＞のいずれかに記載の粒子計数方法、及び前記＜２０＞に記載の粒子含有試料によると、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０２４９】
【特許文献１】特許第５７１６２１３号公報
【特許文献２】特開２０１４−２０９１８号公報
【符号の説明】
【０２５０】
１０      液滴吐出手段
２０      駆動手段
３０      光照射手段
４１、４２      受光手段
５１      第一の粒子計測手段
５２      第二の粒子計測手段
６０      液滴吐出位置移動手段
１００Ａ、１００Ｂ、１００Ｃ、１００Ｄ、１００Ｅ、１００Ｆ、１００Ｇ、１００Ｈ、１００Ｉ、１００Ｊ、１００Ｋ      粒子計数装置
２００      粒子懸濁液
２０１      光を受けることで発光可能な粒子
２１０      液滴
３０２ａ      受光手段４１への光
３０２ｂ      受光手段４２への光
【図１】
2019023629.tif 000007
【図２】
2019023629.tif 000008
【図３Ａ】
2019023629.tif 000009
【図３Ｂ】
2019023629.tif 000010
【図４】
2019023629.tif 000011
【図５】
2019023629.tif 000012
【図６】
2019023629.tif 000013
【図７】
2019023629.tif 000014
【図８】
2019023629.tif 000015
【図９】
2019023629.tif 000016
【図１０】
2019023629.tif 000017
【図１１】
2019023629.tif 000018
【図１２Ａ】
2019023629.tif 000019
【図１２Ｂ】
2019023629.tif 000020
【図１３】
2019023629.tif 000021
【図１４】
2019023629.tif 000022
【図１５】
2019023629.tif 000023
【図１６】
2019023629.tif 000024
【図１７Ａ】
2019023629.tif 000025
【図１７Ｂ】
2019023629.tif 000026
【図１７Ｃ】
2019023629.tif 000027
【図１８】
2019023629.tif 000028
【図１９】
2019023629.tif 000029
【図２０】
2019023629.tif 000030
【図２１】
2019023629.tif 000031
【図２２】
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【図２３】
2019023629.tif 000033
【図２４】
2019023629.tif 000034
【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
2019023629.tif 000036
【図２５Ｃ】
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