(57)【要約】【課題】細胞培養セルの電極層にむらなくペプチドを修飾することのできる細胞培養方法を提供することである。【解決手段】電極層１０ｂを有する細胞培養セル１０を用い、細胞培養セル１０の電極層１０ｂの表面にペプチドを修飾し、前記ペプチドを介して細胞Ｃを電極層１０ｂに播種して培養する細胞培養工程Ｓ１２と、電極層１０ｂに所定の電位を印加して前記細胞Ｃを電極層１０ｂから脱離させる細胞脱離工程Ｓ１３と、を有する細胞培養方法であって、細胞培養工程Ｓ１２の前に細胞培養セル１０の電極層１０ｂの表面を洗浄する前洗浄工程１１を有する構成となる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極層を有する細胞培養セルを用い、
前記細胞培養セルの前記電極層の表面にペプチドを修飾し、前記ペプチドを介して細胞を前記電極層に播種して培養する細胞培養工程と、
前記電極層に所定の電位を印加して前記細胞を前記電極層から脱離させる細胞脱離工程と、を有する細胞培養方法であって、
前記細胞培養工程の前に前記細胞培養セルの前記電極層の表面を洗浄する前洗浄工程を有する細胞培養方法。
【請求項２】
前記細胞脱離工程の後に前記細胞培養セルの前記細胞が脱離した前記電極層の表面を洗浄する後洗浄工程を有する請求項１記載の細胞培養方法。
【請求項３】
前記後洗浄工程が終了した後、前記後洗浄工程により前記電極層の表面が洗浄された前記細胞培養セルを用いて、前記細胞培養工程と、前記細胞脱離工程とを、前記前洗浄工程を行なうことなく、実施する請求項２記載の細胞培養方法。
【請求項４】
前記後洗浄工程の終了後、前記細胞培養工程が開始される前まで、前記後洗浄工程により洗浄された前記電極層の表面が洗浄された状態を少なくとも維持する環境下で前記細胞培養セルを保管する細胞培養セル保管工程を有する請求項３記載の細胞培養方法。
【請求項５】
前記細胞培養セル保管工程は、前記後洗浄工程により洗浄された前記電極層の表面に所定波長の紫外線が照射される環境下で前記細胞培養セルを保管する請求項４記載の細胞培養方法。
【請求項６】
電極層を有する細胞培養セルを用い、
前記細胞培養セルの前記電極層の表面にペプチドを修飾し、前記ペプチドを介して細胞を前記電極層に播種して培養する細胞培養工程と、
前記電極層に所定の電位を印加して前記細胞を前記電極層から脱離させる細胞脱離工程と、を有する細胞培養方法であって、
前記細胞脱離工程の後に前記細胞培養セルの前記細胞が脱離した前記電極層の表面を洗浄する後洗浄工程を有する細胞培養方法。
【請求項７】
前記後洗浄工程により前記電極層の表面が洗浄された前記細胞培養セルを用いて、前記細胞培養工程と、前記細胞脱離工程とを実施する請求項６記載の細胞培養方法。
【請求項８】
前記後洗浄の終了後、前記細胞培養工程が開始される前まで、前記後洗浄工程により洗浄された前記電極層の表面が洗浄される環境下で前記細胞培養セルを保管する細胞培養セル保管工程を有する請求項７記載の細胞培養方法。
【請求項９】
前記細胞培養セル保管工程は、前記後洗浄工程により洗浄された前記電極層の表面に所定波長の紫外線が照射される環境下で前記細胞培養セルを保管する請求項８記載の細胞培養方法。
【請求項１０】
前記前洗浄工程又は前記後洗浄工程、または、前記前洗浄工程及び前記後洗浄工程のそれぞれは、前記電極層の表面に所定波長の紫外線を照射して前記電極層の表面を洗浄する紫外線洗浄工程、前記電極層の表面をオゾンガスにさらして前記電極層の表面を洗浄するオゾンガス洗浄工程、及び前記電極層の表面にオゾン水を供給して前記電極層の表面を洗浄するオゾン水洗浄工程の、一又は複数の組合せを含む請求項１乃至９のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項１１】
電極層を有する細胞培養セルを用い、
前記細胞培養セルの前記電極層の表面にペプチドを修飾し、前記ペプチドを介して細胞を前記電極層に播種して培養する細胞培養工程と、
前記電極層に所定の電位を印加して前記細胞を前記電極層から脱離させる細胞脱離工程と、を有する細胞培養方法に用いられる洗浄方法であって、
前記細胞培養工程に供される前の、または、前記細胞脱離工程を経た、前記細胞培養セルの前記電極層の表面を洗浄する洗浄工程を有する洗浄方法。
【請求項１２】
前記洗浄工程は、前記電極層の表面に所定波長の紫外線を照射して前記電極層の表面を洗浄する紫外線洗浄工程、前記電極層の表面をオゾンガスにさらして前記電極層の表面を洗浄するオゾンガス洗浄工程、及び前記電極層の表面にオゾン水を供給して前記電極層の表面を洗浄するオゾン水洗浄工程の、一又は複数の組合せを含む請求項１１に記載の洗浄方法。
【請求項１３】
電極層を有する細胞培養セルを用い、
前記細胞培養セルの前記電極層の表面にペプチドを修飾し、前記ペプチドを介して細胞を前記電極層に播種して培養する細胞培養工程と、
前記電極層に所定の電位を印加して前記細胞を前記電極層から脱離させる細胞脱離工程と、を有する細胞培養方法に用いられる洗浄装置であって、
前記細胞培養工程の前の、または、前記細胞脱離工程を経た、前記細胞培養セルの前記電極層の表面を洗浄する洗浄装置。
【請求項１４】
前記電極層の表面に所定波長の紫外線を照射して前記電極層の表面を洗浄する紫外線洗浄機構、前記電極層の表面をオゾンガスにさらして前記電極層の表面を洗浄するオゾンガス洗浄機構、及び前記電極層の表面にオゾン水を供給して前記電極層の表面を洗浄するオゾン水洗浄機構の、一又は複数の組合せを含む請求項１３に記載の洗浄装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養方法及びその細胞培養方法に用いられる洗浄方法及び洗浄装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、特許文献１に記載された細胞培養方法が知られている。この細胞培養方法では、基板上にスパッタリング等によって金の電極層が形成された構造の細胞培養セルが用いられる。そして、この細胞培養方法は、前記細胞培養セルの前記電極層の表面に、複数のアミノ酸がペプチド結合してなるペプチド、例えば、オリゴペプチドを修飾し、このオリゴペプチドを介して細胞を前記電極層に播種して培養する細胞培養工程（第一工程）と、細胞の培養後、前記電極層に前記オリゴペプチドが還元脱離する電位を印加して前記細胞をオリゴペプチドとともに前記電極層から脱離させる細胞脱離工程（第二工程）とを有している。このような細胞培養方法によれば、細胞培養セルの電極層の表面に培養された細胞を、傷つけることなく、電極層から脱離させることができ、医療への応用に適した細胞及び／又は細胞組織体を効率よく製造することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／０３３１８１公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、上述した細胞培養方法では、電極層にペプチドを介してむらなく細胞を接着させることが望まれている。
【０００５】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、細胞培養セルの電極層への細胞の接着に要するペプチドを前記電極層にむらなく修飾することのできる細胞培養方法を提供するものである。
【０００６】
また、前述した細胞培養工程及び細胞脱離工程を経た細胞培養セルは、通常使い捨てであり、細胞培養セルの再利用については何ら考慮されていなかった。
【０００７】
本発明は、このような事情に鑑みてされたもので、細胞培養セルの再利用を可能にする細胞培養方法を提供するものである。
【０００８】
更に、本発明は、それらの細胞培養方法に用いることのできる洗浄方法及び洗浄装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る細胞培養方法は、電極層を有する細胞培養セルを用い、前記細胞培養セルの前記電極層の表面にペプチドを修飾し、前記ペプチドを介して細胞を前記電極層に播種して培養する細胞培養工程と、前記電極層に所定の電位を印加して前記細胞を前記電極層から脱離させる細胞脱離工程と、を有する細胞培養方法であって、前記細胞培養工程の前に前記細胞培養セルの前記電極層の表面を洗浄する前洗浄工程を有する構成となる。
【００１０】
このような構成によれば、細胞培養工程の前に細胞培養セルの電極層の表面が洗浄されるので、前記細胞培養工程では、既に洗浄された清浄な状態の電極層の表面にペプチドが修飾されるようになる。そして、細胞が、清浄な状態の電極層の表面に修飾されたペプチドを介して前記電極層に播種され培養される。
【００１１】
また、本発明に係る細胞培養方法は、電極層を有する細胞培養セルを用い、前記細胞培養セルの前記電極層の表面にペプチドを修飾し、前記ペプチドを介して細胞を前記電極層に播種して培養する細胞培養工程と、前記電極層に所定の電位を印加して前記細胞を前記電極層から脱離させる細胞脱離工程と、を有する細胞培養方法であって、前記細胞脱離工程の後に前記細胞培養セルの前記細胞が脱離した前記電極層の表面を洗浄する後洗浄工程を有する構成となる。
【００１２】
このような構成により、細胞脱離工程の後に、細胞が脱離した電極層の表面が洗浄されるので、細胞脱離工程後において、使用済みの細胞培養セルの電極層の表面を清浄な状態にすることができる。
【００１３】
また、本発明に係る洗浄方法は、電極層を有する細胞培養セルを用い、前記細胞培養セルの前記電極層の表面にペプチドを修飾し、前記ペプチドを介して細胞を前記電極層に播種して培養する細胞培養工程と、前記電極層に所定の電位を印加して前記細胞を前記電極層から脱離させる細胞脱離工程と、を有する細胞培養方法に用いられる洗浄方法であって、前記細胞培養工程に供される前の、または、前記細胞脱離工程を経た、前記細胞培養セルの前記電極層の表面を洗浄する前洗浄工程を有する構成となる。
【００１４】
更に、本発明に係る洗浄装置は、電極層を有する細胞培養セルを用い、前記細胞培養セルの前記電極層の表面にペプチドを修飾し、前記ペプチドを介して細胞を前記電極層に播種して培養する細胞培養工程と、前記電極層に所定の電位を印加して前記細胞を前記電極層から脱離させる細胞脱離工程と、を有する細胞培養方法に用いられる洗浄装置であって、前記細胞培養工程の前の、または、前記細胞脱離工程を経た、前記細胞培養セルの前記電極層の表面を洗浄する構成となる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、電極層にむらなくペプチドを修飾することができる。その結果、播種された細胞をペプチドを介してむらなく電極層に接着させることができる。つまり、本発明らは、電極層の洗浄度合と、電極層へのペプチドの修飾度合、さらには細胞の接着度合と、の間に相関関係があることを見出し、本発明に至ったものである。
【００１６】
また、本発明によれば、使用済みの細胞培養セルを細胞の培養に再利用することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の第１の実施の形態に係る細胞培養方法に従った工程を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、洗浄装置の第１の構成例を示す平面図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、洗浄装置の第１の構成例を示す正面図である。
【図３】図３は、本発明の第２の実施の形態に係る細胞培養方法の工程を示す図である。
【図４】図４は、本発明の第３の実施の形態に係る細胞培養方法の工程を示す図である。
【図５】図５は、本発明の第４の実施の形態に係る細胞培養方法の工程を示す図である。
【図６】図６は、洗浄装置の第２の構成例を示す図である。
【図７】細胞培養方法に用いられる細胞培養セルの他の例を示す斜視図である。
【図８】図８は、洗浄結果（その１）を示すグラフ図である。
【図９】図９は、洗浄結果（その２）を示すグラフ図である。
【図１０】図１０は、洗浄結果（その３）を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について図面に基づいて説明する。
【００１９】
本発明の第１の実施の形態に係る細胞培養方法は、図１に示す手順に従って行われる。
【００２０】
図１において、この細胞培養方法では、細胞培養セルの生成工程Ｓ１０、前洗浄工程Ｓ１１、細胞培養工程Ｓ１２、及び細胞脱離工程Ｓ１３が順次実行される。細胞培養セルの生成工程Ｓ１０では、ガラス基板１０ａの表面にスパッタリング等の手法により、クロム（Ｃｒ）層、金（Ａｕ）層が順次製膜されて金の電極層１０ｂが形成され、ガラス基板１０ａに金の電極層１０ｂが積層された構造の細胞培養セル１０が生成される。
【００２１】
細胞培養工程Ｓ１２の前に、前洗浄工程１１において、上述したようにして（Ｓ１０参照）生成された細胞培養セル１１の電極層１０ｂの表面の洗浄が行われる。具体的には、細胞培養セル１０の電極層１０ｂの表面に、ＵＶランプ２１からの紫外線（ＵＶ）が照射され、この紫外線により電極層１０ｂの表面が洗浄される。このＵＶランプ２１を用いた洗浄装置は、例えば、図２Ａ及び図２Ｂに示すように構成される。なお、図２Ａは洗浄装置を示す平面図であり、図２Ｂは洗浄装置を示す正面図である。
【００２２】
図２Ａ及び図２Ｂにおいて、洗浄装置２０は、ＵＶランプ２１、セットテーブル２２、回転テーブル２３、支持筐体２４及び、ＵＶランプ２１を昇降動させる昇降機構２５を有している。支持筐体２４の上に回転テーブル２３が設けられ、回転テーブル２３にセットテーブル２２が固定支持されている。支持筐体２４内には、回転テーブル２３を回転させる回転駆動機構（図示されず）が設けられており、回転テーブル２３は、前記回転駆動機構によって所定方向ＤＲに回転することができる。回転駆動機構の動力源（例えば、モータ）を制御する制御装置２６によって、回転テーブル２３の回転速度を調整することができる。回転テーブル２３を連続回転させるようにしてもよいし、図２Ａにおいて、４５度ずつ間欠回転させるようにしてもよい。セットテーブル２２の表面には、その外周縁に沿うように細胞培養セル１０をセットする凹部が等間隔で８つ形成されており、各凹部には、洗浄すべき細胞培養セル１０が電極層１０ｂを上方に向けてセットされる。
【００２３】
ＵＶランプ２１は、セットテーブル２２の所定角度位置（照射位置）の凹部にセットされる細胞培養セル１０に対向するように昇降機構２５によって支持されている。ＵＶランプ２１から照射される紫外線の照射領域２７がセットテーブ２２の照射位置の凹部にセットされた細胞培養セル１０を覆うように、ＵＶランプ２１の上下方向の位置が昇降機構２５によって調整される。ＵＶランプ２１から照射される紫外線の波長は、特に限定されないが、２５４ｎｍ未満が好ましく、例えば、１７２ｎｍに設定される。
【００２４】
このような構造の洗浄装置２０では、回転テーブル２３とともに回転するセットテーブル２２にセットされた各細胞培養セル１０の電極層１０ｂの表面は、ＵＶランプ２１から所定の強度で照射される紫外線の照射領域２７を通過する毎に、紫外線によって洗浄される。回転テーブル２３の所定回転速度での所定の回数の回転が終了すると、各細胞培養セル１０の電極層１０ｂの表面の洗浄が終了する。なお、１つの細胞培養セル１０が、照射領域２７を１回だけ通過するものであってもよい。
【００２５】
図１に戻って、前述した洗浄装置２０による細胞培養セル１０の電極層１０ｂの洗浄（前洗浄工程Ｓ１１）が終了すると、細胞培養工程Ｓ１２及び細胞脱離工程Ｓ１３が行われる。ここで、前洗浄工程Ｓ１１と細胞培養工程Ｓ１２との時間間隔は、前洗浄工程Ｓ１１において洗浄された細胞培養セル１０への、不要細胞（接着対象以外の細胞）の付着等の汚染が無い、と見込まれる所定時間（例えば、１時間）以内とされる。また、細胞培養工程Ｓ１２及び細胞脱離工程Ｓ１３での処理は、例えば、特許文献１に記載される細胞培養方法における第一工程及び第二工程での処理と基本的に同じである。これら、細胞培養工程Ｓ１２及び細胞脱離工程Ｓ１３について、簡単に説明する。
【００２６】
細胞培養工程Ｓ１２では、前洗浄工程Ｓ１１での処理を終えた細胞培養セル１０の電極層１０ｂの表面にオリゴペプチドが修飾され、そのオリゴペプチドを介して細胞Ｃが電極層１０ｂに播種され培養される。オリゴペプチドは、電極層１０ｂにＳＡＭ（Self-Assembled Monolayer 自己組織化単分子膜）を形成するオリゴペプチドであることが好ましい。そこで、図示では、オリゴペプチドに相当する部分にＳＡＭと記載した。 細胞培養セル１０において細胞Ｃが培養され、所定の条件が満足されると、細胞脱離工程Ｓ１３が行われる。細胞脱離工程Ｓ１３では、電極層１０ｂに前記オリゴペプチドが還元脱離する電位が印加され、培養された細胞Ｃがオリゴペプチドとともに電極層１０ｂから脱離する。これにより、培養された細胞Ｃを得ることができる。
【００２７】
図２Ａ及び図２Ｂに示す洗浄装置２０での洗浄結果を図８に示す。実験は、次のようにして行った。まず、基板表面にスパッタリングで電極層を形成し、その基板を室温で保管した後、ＵＶ洗浄を行った。次に、細胞が付着しないペプチドを電極層上に修飾した後、細胞を播種し、３時間後に観察した、ＵＶランプ２１の紫外線（波長１７２ｎｍ）の強度（照度）＝７ｍＷ／ｃｍ２の条件のもとで、回転テーブル２３の回転速度を変えた。洗浄を行った場合、未洗浄の場合と比べて、不要細胞付着率が著しく下がった。ここで、不要細胞付着率とは、細胞培養セル１０に対する、細胞の付着数／未洗浄のときの細胞の付着数×１００（％）で定義される。つまり、細胞培養セル１０を未洗浄とした場合の、細胞付着数を分母とする割合である。この実験結果において、細胞の付着数が多いほど、電極層に対するペプチドの修飾度合がより低いことを意味する。言い換えると、細胞の付着数が少ないほど、ペプチドが電極層上によりむらなく修飾されたことを意味する。そこで、本明細書では、電極層に対して本来接着されるべきではない細胞、細胞培養セル１０に対する接着対象以外の細胞を、総称して不要細胞と称する。
【００２８】
なお、回転テーブル２３の回転速度も変えて検証したが、図８に示す洗浄結果から、回転速度が５ｒｐｍと３０ｒｐｍとでは、不要細胞付着率に、あまり顕著な差は見られなかった。
【００２９】
図２及び図２Ｂに示す洗浄装置２０での他の洗浄結果を図９に示す。図９において、回転テーブル２３の回転速度が５ｒｐｍの条件のもとで、ＵＶランプ２１（波長１７２ｎｍ）の出力を変えた。洗浄を行った場合、未洗浄の場合と比べて、不要細部付着率が著しく下がった。また、ＵＶランプ２１の出力が７ｍＷ／ｃｍ２の場合が、ＵＶランプ２１の出力が２ｍＷ／ｃｍ２の場合より不要細胞付着率が低かった（清浄の度合いが高い）。
【００３０】
洗浄装置２０での前記洗浄結果（図８、図９参照）をふまえ、上述したような細胞培養方法（図１参照）によれば、細胞培養セル１０の電極層１０ｂの表面にオリゴペプチドを修飾する（細胞培養工程Ｓ１２）前に、その電極層１０ｂの表面が洗浄される（前洗浄工程Ｓ１１）ので、細胞培養工程Ｓ１２では、既に洗浄されて、不要細胞付着率の低い、清浄な状態（図８、図９参照）の電極層１０ｂの表面にオリゴペプチドが修飾されるようになる。これにより、細胞培養セル１０の電極層１０ｂの表面にむらなくオリゴペプチドを修飾することができ、その結果、播種された細胞Ｃをオリゴペプチドを介してむらなく電極層１０ｂに接着させることができる。
【００３１】
本発明の第２の実施の形態に係る細胞培養方法について説明する。本発明の第２の実施の形態に係る細胞培養方法は、図３に示す手順に従って行われる。
【００３２】
図３において、この細胞培養方法では、図１に示す細胞培養方法と同様に、細胞培養セルの生成工程Ｓ１０、前洗浄工程Ｓ１１、細胞培養工程Ｓ１２及び細胞脱離工程Ｓ１３が順次実行される。この細胞培養方法では、更に、細胞脱離工程Ｓ１３の後に細胞Ｃが脱離した使用済みの細胞培養セル１０の電極層１０ｂの表面を洗浄する後洗浄工程Ｓ１４が行われる。後洗浄工程Ｓ１４では、前洗浄工程Ｓ１１と同様に、例えば、図２Ａ及び図２Ｂに示すような洗浄装置２０において、ＵＶランプ２１から照射される紫外線によって細胞培養セル１０の電極層１０ｂの表面が洗浄される。
【００３３】
後洗浄工程Ｓ１４が終了すると、洗浄された細胞培養セル１０への、不要細胞の付着等の汚染が無い、と見込まれる所定時間（例えば、１時間程度）以内において、電極層１０ｂの表面が洗浄により清浄な状態になった細胞培養セル１０を用いて、細胞培養工程Ｓ１２及び細胞脱離工程Ｓ１３が、前洗浄工程Ｓ１１を行なうことなく、実施される。以後、細胞脱離工程Ｓ１３が終了する毎に、後洗浄工程Ｓ１４によって、使用済み細胞培養セル１０の電極層１０ｂの表面の洗浄が行われ、その電極層１０ｂの表面が清浄な状態の使用済み細胞培養セル１０を用いて、細胞培養工程Ｓ１２及び細胞脱離工程Ｓ１３が繰り返し行われる。
【００３４】
洗浄装置２０での前記洗浄結果（図８、図９参照）を踏まえ、上述したような細胞培養方法によれば、細胞脱離工程Ｓ１３の後に、使用済み細胞培養セル１０の電極層１０ｂの表面を後洗浄工程Ｓ１４によって、極めて不要細胞付着率の低い（図８、図９参照）、清浄な状態にすることができるので、前述した第１の実施の形態において奏する効果に加えて、その使用済みの細胞培養セル１０を細胞の培養（細胞培養工程１２、細胞脱離工程Ｓ１３）に再利用することができる。
【００３５】
本発明の第３の実施の形態に係る細胞培養方法について説明する。本発明の第３の実施の形態に係る細胞培養方法は、図４に示す手順に従って行われる。
【００３６】
図４において、この細胞培養方法では、図３に示す細胞培養方法と同様に、細胞培養セルの生成工程Ｓ１０、前洗浄工程Ｓ１１、細胞培養工程Ｓ１２、細胞脱離工程Ｓ１３及び後洗浄工程Ｓ１４が行われる。ここで、後洗浄工程Ｓ１４が終了してから、細胞培養セル１０に、不要細胞の付着等の汚染が生じ得る、と予測される時間以上、細胞培養セル１０が放置された場合、細胞培養工程Ｓ１２の前に、その放置された細胞培養セル１０の電極層１０ｂの表面が、例えば、図２Ａ及び図２Ｂに示す洗浄装置２０において、紫外線によって洗浄される（前洗浄工程Ｓ１１）。
【００３７】
洗浄装置２０による前記洗浄結果（図８、図９参照）を踏まえ、このような細胞培養方法によれば、後洗浄工程Ｓ１４によって電極層１０ｂの表面が洗浄された細胞培養セル１０が不要細胞の付着等の汚染が生じ得ると予測される時間放置されたとしても、細胞培養工程Ｓ１２の前に、その細胞培養セル１０の電極層１０ｂが洗浄される（前洗浄工程Ｓ１１）ので、細胞培養工程１２において、再利用される細胞培養セル１０の電極層１０ｂの表面を、極めて不要細胞付着率の低い（図８、図９参照）、清浄な状態にすることができる。それにより、細胞培養工程１２において、電極層１０ｂの表面にむらなくオリゴペプチドを修飾することができる。その結果、再利用される細胞培養セル１０の電極層１０ｂの表面にむらなく細胞Ｃをオリゴペプチドを介して接着させることができる。
【００３８】
本発明の第４の実施の形態に係る細胞培養方法について説明する。本発明の第４の実施の形態に係る細胞培養方法は、図５に示す手順に従って行われる。
【００３９】
図５において、この細胞培養方法では、図３に示す細胞培養方法と同様に、細胞培養セルの生成工程Ｓ１０、前洗浄工程Ｓ１１、細胞培養工程１２、細胞脱離工程Ｓ１３及び後洗浄工程Ｓｌ４が行われる。この細胞培養方法では、更に、後洗浄工程Ｓ１４により電極層１０ｂの表面が洗浄された細胞培養セル１０が、ＵＶランプ３１から紫外線が照射される環境の保管庫３０に保管される（ＵＶ保管工程Ｓ１５：細胞培養セル保管工程）。保管庫３０に保管された細胞培養セル１０は、紫外線により洗浄される状態が維持される。そして、適当なタイミング（例えば、細胞培養セル１０の次の使用時）で、保管庫３０から取り出された細胞培養セル１０を用いて、細胞培養工程Ｓ１２及び細胞脱離工程Ｓ１３が、前洗浄工程Ｓ１１を行うことなく、実施される。以後、後洗浄工程Ｓ１４が終了する毎に、その洗浄済みの細胞培養セル１０が紫外線の照射される環境下にある保管庫３０に保管される。保管庫３０に設けられるＵＶランプ３１は、洗浄装置２０（図２Ａ、図２Ｂ参照）に用いられるＵＶランプ２１と同等のものが用いられる。なお、ＵＶランプ３１は、保管庫３０内に保管されている細胞培養セル１０の洗浄後の状態を少なくとも維持するためのものであって、洗浄を目的としたものではないことから、ＵＶランプ２１の出力より弱いものであっても適用できる。
【００４０】
上述したような細胞培養方法によれば、後洗浄工程Ｓ１４が終了する毎に、その洗浄済みの細胞培養セル１０が紫外線の照射される環境下にある保管庫３０に保管される。従って、任意のタイミングで、その保管された細胞培養セル１０を、前洗浄工程Ｓ１１によって洗浄することなく、細胞培養工程Ｓ１２及び細胞脱離工程Ｓ１３において再利用することができる。なお、この第４の実施の形態において、後洗浄工程Ｓ１４が終了する毎に、その洗浄済みの細胞培養セル１０が紫外線の照射される環境下にある保管庫３０に保管するようにした。しかし、後洗浄工程１４の終了後、図３に示した第２の実施の形態のように、後洗浄された使用済み細胞培養セル１０を用いて、細胞培養工程Ｓ１２、細胞脱離工程Ｓ１３、後洗浄工程Ｓ１４を繰返し、最後の後洗浄工程Ｓ１４が終了した時点で、保管庫３０に洗浄済み細胞培養セル１０を保管するようにしてもよい。
【００４１】
なお、前記第４の実施の形態では、保管庫３０は、ＵＶランプ３１から紫外線が照射される環境に維持されているが、これに限定されない。保管庫３０は、洗浄に用いられるオゾンガスを満たした環境下、あるいは、オゾン水を満たした環境下など、電極層１０ｂの表面が洗浄された状態が少なくとも維持される環境下で細胞培養セル１０を保管するものであればよい。
【００４２】
前述した各実施の形態では、前洗浄工程Ｓ１１及び後洗浄工程Ｓ１４のそれぞれに用いられる洗浄装置２０は、図２Ａ及び図２Ｂに示すような構造で、紫外線を照射することにより細胞培養セル１０の電極層１０ｂを洗浄するものであったが、これに限定されない。例えば、洗浄装置は、オゾン（Ｏ３）水を細胞培養セル１０の電極層１０ｂに供給してその電極層１０ｂの表面を洗浄する機構を有するもの、また、細胞培養セル１０の電極層１０ｂの表面をオゾン（Ｏ３）ガスにさらしてその電極層１０ｂの表面を洗浄する機構を有するものであってもよい。また、前洗浄工程Ｓ１１と後洗浄工程Ｓ１４とで用いる洗浄方法、洗浄装置は、相違しても、同じであってもかまわない。同じものを使用することは、洗浄装置を前洗浄工程Ｓ１１と後洗浄工程Ｓ１４とで共用化できる点で好ましい。
【００４３】
オゾン（Ｏ３）水によって細胞培養セル１０の電極層１０ｂを洗浄する洗浄装置は、例えば、図６に示すように構成することができる。
【００４４】
図６において、この洗浄装置４０は、筐体４１の内部に外槽４２及び内槽４３が設けられた構造になっている。内槽４３には、オゾン水噴出管４４が設けられており、オゾン水噴出管４４には、オゾン（Ｏ３）水をエア（空気）とともに供給する供給管４５が接続されている。オゾン水噴出管４４には、多数の微細孔が形成されており、供給管４５を通して供給されるオゾン水がオゾン水噴出管４４の微細孔からエアとともに噴出する。そして、内槽４３をオーバーフローしたオゾン水は、外槽４２に流れ込む。外槽４２には排水弁が設けられており、外槽４２に溜まったオゾン水は排水弁を通して外部に排出することができる。内槽４３のオゾン水内には複数の細胞培養セル１０が収容されたキャリッジ４６が配置される。
【００４５】
このような構造の洗浄装置４０では、内槽４３にオゾン水が満たされた状態で、複数の細胞培養セル１０が収容されたキャリッジ４６が内槽４３内にセットされる。この状態で、供給管４５からエアとともにオゾン水がオゾン水噴出管４４に供給されると、オゾン水噴出管４４の多数の微細孔からエアとともにオゾン水が噴出する。エアによるバブリングが行われるオゾン水に浸漬されたキャリッジ４６内の各細胞培養セル１０（電極層１０ｂ）は、オゾン水によって洗浄される。オゾン水噴出管４４に供給されるガスは、エアに代えて、窒素ガス等の不活性ガスであってもよい。
【００４６】
なお、オゾン水で洗浄された細胞培養セル１０は、純水によるリンス処理及びエアによる乾燥の各工程を経て、細胞培養工程Ｓ１２において使用される。
【００４７】
図６に示す洗浄装置４０での後洗浄結果を図１０に示す。室温に保持されたオゾン水中に細胞培養セル１０を１０分間浸漬させた。オゾン水による洗浄を行った場合、未洗浄の場合と比べて、不要細胞付着率が著しく低かった。また、２０ｐｐｍの濃度のオゾン水の場合が、１０ｐｐｍの濃度のオゾン水の場合より幾分、不要細胞付着率が低かった（清浄の度合いが高い）。
【００４８】
このような洗浄結果（図１０参照）を踏まえれば、オゾン水により洗浄を行なう洗浄装置４０を用いた場合、図２Ａ及び図２Ｂに示す紫外線により洗浄を行なう洗浄装置２０を用いた場合と同様に、電極層１０の表面が、不要細胞付着率の低い、清浄な状態となった細胞培養セル１０を細胞培養工程Ｓ１２において用いることができる。これにより、細胞培養セル１０の電極層１０ｂの表面にむらなくオリゴペプチドを修飾することができ、その結果、播種された細胞Ｃをオリゴペプチドを介してむらなく電極層１０ｂに接着させることができる。
【００４９】
前述した各実施の形態では、平面的な構造の細胞Ｃを培養するために、ガラス基板１０ａに金の電極層１０ｂが積層された構造の細胞培養セル１０が用いられたが、これに限定されない。立体的な形状となる、例えば、血管内皮細胞を培養する場合、図７に示すように、台座部１５１の上面から複数のニードル１５２が突出する構造の細胞培養セル１５を用いることができる（特開２０１７−５５７３４参照）。この場合、台座部１５１と各ニードル１５２とが金の電極層によって被覆される。
【００５０】
前述した各実施の形態における前洗浄工程Ｓ１１及び後洗浄工程Ｓ１４のそれぞれでは、紫外線により洗浄する洗浄装置２０及びオゾン水により洗浄する洗浄装置４０のいずれか１種の洗浄装置が用いられたが、これに限定されない。紫外線を照射して電極層１０ｂの表面を洗浄する洗浄装置２０（図２Ａ、図２Ｂ参照：紫外線洗浄機構）、電極層１０ｂの表面をオゾンガスにさらして電極層１０ｂの表面を洗浄するオゾンガス洗浄機構、及び電極層１０ｂの表面にオゾン水を供給して前記電極層の表面を洗浄する洗浄装置４０（図６参照：オゾン水洗浄機構）のうちの２または３の複数の組合せにより、電極層１０ｂの洗浄を行なうようにしてもよい。
【００５１】
以上、本発明のいくつかの実施形態及び各部の変形例を説明したが、この実施形態や各部の変形例は、一例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。上述したこれら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明に含まれる。
【符号の説明】
【００５２】
１０、１５  細胞培養セル
１０ａ  ガラス基板
１０ｂ  電極層
２０  洗浄装置
２１  ＵＶランプ
２２  セットテーブル
２３  回転テーブル
２４  支持筐体
２５  昇降機構
２６  制御装置
３０  保管庫
３１  ＵＶランプ
４０  洗浄装置
４１  筐体
４２  内槽
４３  外槽
４４  オゾン水噴出管
４５  供給管
４６  キャリッジ
Ｓ１０  細胞培養セルの生成工程
Ｓ１１  前洗浄工程
Ｓ１２  細胞培養工程
Ｓ１３  細胞脱離工程
Ｓ１４  後洗浄工程
Ｓ１５  ＵＶ保管工程（細胞培養セル保管工程）
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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