(57)【要約】【課題】Bcr-Ablタンパク質をイメージング可能な新たな放射性化合物を提供する。【解決手段】  下記式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩。2019064986.tif 000031【選択図】図１０
2019064986.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩。
【化１】
2019064986.tif 000025
［式（Ｉ）中、
Ｘは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｒ1は、
【化２】
2019064986.tif 000026
であり、
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、放射性ハロゲン原子、及びフッ化メチル基であり、Ｒ2及びＲ3の一方は、放射性ハロゲン原子である。］
【請求項２】
式（Ｉ）で表される化合物は、下記式（１）から（４）のいずれかで表される化合物である、請求項１記載の化合物又はその製薬上許容される塩。
【化３】
2019064986.tif 000027
［式（１）中のＲ2及び式（２）〜（４）中のＲ3は、放射性ハロゲン原子である。］
【請求項３】
放射性ハロゲン原子は、123Ｉ、124Ｉ、又は125Ｉである、請求項１又は２に記載の化合物又はその製薬上許容される塩。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の化合物又はその製薬上許容される塩を含む、Bcr-Ablタンパク質イメージング用分子プローブ。
【請求項５】
式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を含む、放射性標識のための前駆体組成物。
【化４】
2019064986.tif 000028
［式（ＩＩ）中、
Ｘは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｒ1は、
【化５】
2019064986.tif 000029
であり、
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、フッ化メチル基、トリアルキルスタニル基、ニトロ基、トシレート基、メシレート基、トリフレート基、ノシレート基又はブロシレート基であり、Ｒ4及びＲ5の一方は、ハロゲン原子、トリアルキルスタニル基、ニトロ基、トシレート基、メシレート基、トリフレート基、ノシレート基又はブロシレート基である。］
【請求項６】
式（ＩＩ）で表される化合物は、下記式（５）〜（８）のいずれかで表される化合物である、請求項５記載の前駆体組成物。
【化６】
2019064986.tif 000030
［式（５）中のＲ4及び式（６）〜（８）中のＲ4は、ハロゲン原子、トリアルキルスタニル基、ニトロ基、トシレート基、メシレート基、トリフレート基、ノシレート基又はブロシレート基である。］
【請求項７】
請求項１から３のいずれかに記載の化合物又はその製薬上許容される塩又は請求項４記載の分子プローブが投与された被検体から前記化合物の放射性シグナルを検出することを含む、イメージング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、Bcr-Ablタンパク質に結合可能な化合物及び該化合物を含むBcr-Ablタンパク質イメージング用分子プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
Bcr-Abl遺伝子及びそれから産生されるBcr-Ablタンパク質は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療効果の評価や寛解の判断の指標の一つとされている（非特許文献１及び２）。なぜなら、ＣＭＬは、９番目の染色体と２２番目の染色体の相互転座が生じることによりフィラデルフィア染色体が形成され、その染色体上で形成されたBｃｒ−Ａｂｌ遺伝子産生するBcr-Ablタンパク質が白血球細胞の無制限な増殖を引き起こすことにより発症するとされているからである。
【０００３】
一方、イマチニブ等のチロシンキナーゼ阻害剤（Bcr-Abl TKI）はＣＭＬ治療においてもっとも有効性が高いとされているが、これらによる治療が有効ではない患者も中にはいる。このため、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤耐性によりBcr-Abl TKIによる治療が失敗する可能性を回避するために、核医学診断用放射性イメージングプローブの検討が行われている（非特許文献３及び４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】造血器腫瘍診療ガイドライン  2013年版
【非特許文献２】Michele Baccarani et al., European LeukemiaNet recommendations for the management of chronic myeloid leukemia: 2013, BLOOD, 8 AUGUST 2013, VOLUME 122, NUMBER 6, 872-884
【非特許文献３】Mikhail Doubrovin et al., 124I-Iodopyridopyrimidinone for PET of Abl Kinase−Expressing Tumors In Vivo, THE JOURNAL OF NUCLEAR MEDICINE, Vol. 51, No. 1, January 2010 121-129
【非特許文献４】Athanasios P. Glekas, In Vivo Imaging of Bcr-Abl Overexpressing Tumors with a Radiolabeled Imatinib Analog as an Imaging Surrogate for Imatinib, THE JOURNAL OF NUCLEAR MEDICINE, Vol. 52, No. 8, August 2011 1301-1307
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、Bcr-Ablタンパク質を鮮明にイメージング可能な放射性化合物は未だ開発されていない。そこで、本開示は、Bcr-Ablタンパク質をイメージング可能な新たな放射性化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、一態様において、下記式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩（以下、「本開示の放射性化合物」ともいう）に関する。
【化１】
2019064986.tif 000003
式（Ｉ）中、
Ｘは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｒ1は、
【化２】
2019064986.tif 000004
であり、
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、放射性ハロゲン原子、及びフッ化メチル基であり、Ｒ2及びＲ3の一方は、放射性ハロゲン原子である。
【０００７】
本開示は、一態様において、式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を含む、Bcr-Ablタンパク質イメージング用分子プローブに関する。
【０００８】
本開示は、一態様において、下記式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を含む、放射性標識のための前駆体組成物に関する。
【化３】
2019064986.tif 000005
式（ＩＩ）中、
Ｘは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｒ1は、
【化４】
2019064986.tif 000006
であり、
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、トリアルキルスタニル基、ニトロ基、トシレート基、メシレート基、トリフレート基、ノシレート基又はブロシレート基であり、Ｒ4及びＲ5の一方は、ハロゲン原子、トリアルキルスタニル基、ニトロ基、トシレート基、メシレート基、トリフレート基、ノシレート基又はブロシレート基である。
【０００９】
本開示は、一態様において、Bcr-Ablチロシンキナーゼ阻害剤と、上記式（Ｉ）で表される化合物、その製薬上許容される塩又は上記分子プローブとが投与された被検体から前記化合物の放射性シグナルを検出することを含むイメージング方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本開示は、一態様において、Bcr-Ablタンパク質をイメージング可能な新たな放射性化合物を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、K562担がんマウスにおける[125I]PON-1の血液、骨、腫瘍及び筋肉における集積量の経時変化の一例を示すグラフである。
【図２】図２は、K562担がんマウスにおける[125I]PON-1の腫瘍/臓器比の経時変化の一例を示すグラフであって、左から順に腫瘍／血液比、腫瘍／筋肉比及び腫瘍／骨比を示す。
【図３】図３は、K562担がんマウスにおける[125I]PON-2の血液、骨、腫瘍及び筋肉における集積量の経時変化の一例を示すグラフである。
【図４】図４は、K562担がんマウスにおける[125I]PON-2の腫瘍/臓器比の経時変化の一例を示すグラフであって、左から順に腫瘍／血液比、腫瘍／筋肉比及び腫瘍／骨比を示す。
【図５】図５は、K562担がんマウスにおける[125I]PON-3の血液、骨、腫瘍及び筋肉における集積量の経時変化の一例を示すグラフである。
【図６】図６は、K562担がんマウスにおける[125I]PON-3の腫瘍/臓器比の経時変化の一例を示すグラフであって、左から順に腫瘍／血液比、腫瘍／筋肉比及び腫瘍／骨比を示す。
【図７】図７は、K562担がんマウスにおける[125I]PON-4の血液、骨、腫瘍及び筋肉における集積量の経時変化の一例を示すグラフである。
【図８】図８は、K562担がんマウスにおける[125I]PON-4の腫瘍/臓器比の経時変化の一例を示すグラフであって、左から順に腫瘍／血液比、腫瘍／筋肉比及び腫瘍／骨比を示す。
【図９】図９は、Ba/F Bcr-AblT315I担がんマウスにおける[125I]PON-2の腫瘍/臓器比の経時変化の一例を示すグラフであって、左から順に腫瘍／血液比、腫瘍／筋肉比及び腫瘍／骨比を示す。
【図１０】図１０は、[123I]PON-2を投与したK562担がんマウスのＳＰＥＣＴ／ＣＴ撮像により得られた画像の一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示は、下記の放射性標識された化合物が、Bcr-Abl negative細胞であるA431細胞と比較して、Bcr-Abl positive細胞であるK562細胞及びBcr-Abl変異細胞であるBa/F Bcr-AblT315Iに特異的に結合するという知見に基づく。中でも、[125I]PON-2は、K562細胞により構成された腫瘍をSPECTによって鮮明にイメージングできる、という知見に基づく。
【化５】
2019064986.tif 000007
【００１３】
本開示の放射性化合物は、一又は複数の実施形態において、Bcr-Ablタンパク質に高い親和性を有し、かつ優れた腫瘍／血液比及び腫瘍／筋肉比を示すことができるという効果を奏しうる。このため、本開示の放射性化合物は、一又は複数の実施形態において、Bcr-Ablタンパク質の発現を非侵襲的に検出することができうるという効果を奏しうる。本開示の放射性化合物は、一又は複数の実施形態において、Bcr-Ablタンパク質が過剰に発現した腫瘍を非侵襲的に画像化、好ましくは定量できうるという効果を奏しうる。
【００１４】
本開示の放射性化合物は、一又は複数の実施形態において、野生型Bcr-Ablタンパク質及び薬剤耐性変異型Bcr-Ablタンパク質（例えば、T315I変異型Bcr-Ablタンパク質）のいずれにも特異的に結合することができる。本開示の放射性化合物によれば、Bcr-Abl依存性耐性の被検体においても、Bcr-Ablタンパク質の発現を非侵襲的に検出することができる。
【００１５】
本開示において「Bcr-Ablタンパク質イメージング用分子プローブ」とは、可視化するための放射性同位元素を含み、標的となるBcr-Ablタンパク質を認識することができる分子をいう。イメージング用分子プローブは、一又は複数の実施形態において、陽電子断層撮影（ＰＥＴ）又は単光子断層撮影（ＳＰＥＣＴ）に用いることができる。
【００１６】
本明細書において「製薬上許容される塩」とは、薬理上及び／又は医薬上許容される塩を含有し、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性又は塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。本開示において「化合物の塩」には、化合物が大気中に放置されることにより、水分を吸収して形成されうる水和物が包含され得る。また、本開示において「化合物の塩」には、化合物が他のある種の溶媒を吸収して形成されうる溶媒和物も包含され得る。
【００１７】
本明細書において「放射性ハロゲン原子」とは、ハロゲン原子の放射性同位体をいう。放射性ハロゲン原子としては、18Ｆ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、及び77Ｂｒが挙げられる。本明細書において「ハロゲン原子」とは、ハロゲン原子の非放射性同位体をいう。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子が挙げられる。
【００１８】
［式（Ｉ）で表される化合物］
本開示は、一又は複数の実施形態において、下記式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩に関する。
【化６】
2019064986.tif 000008
式（Ｉ）中、
Ｘは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｒ1は、
【化７】
2019064986.tif 000009
であり、
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、放射性ハロゲン原子、及びフッ化メチル基であり、Ｒ2及びＲ3の一方は、放射性ハロゲン原子である。Ｒ1において、波線を付した結合手は、式（Ｉ）との結合部分を示す。フッ化メチル基としては、トリフルオロメチル基が挙げられる。式（I）において、薬剤耐性変異型Bcr-Ablタンパク質（中でもT315I変異型Bcr-Ablタンパク質）に対する結合親和性の向上の点からは、Ｒ3が放射性ハロゲン原子であることが好ましい。
【００１９】
式（Ｉ）で表される化合物としては、一又は複数の実施形態において、下記式（１）〜（４）で表される化合物が挙げられる。
【化８】
2019064986.tif 000010
式（１）中、Ｒ2は放射性ハロゲン原子であり、式（２）〜（４）中、Ｒ3は放射性ハロゲン原子である。
式（Ｉ）で表される化合物としては、薬剤耐性変異型Bcr-Ablタンパク質（中でもT315I変異型Bcr-Ablタンパク質）に対する結合親和性の向上の点からは、式（２）〜（４）で表される化合物が好ましい。
【００２０】
本開示の放射性化合物は、一又は複数の実施形態において、Bcr-Ablタンパク質のイメージングに用いることができる。本開示の放射性化合物は、一又は複数の実施形態において、Bcr-Abl陽性腫瘍のイメージングに用いることができる。イメージングとしては、一又は複数の実施形態において、ＰＥＴやＳＰＥＣＴ等のインビボ核医学イメージングが挙げられる。その他には、本開示の放射性化合物は、一又は複数の実施形態において、ＣＭＬと診断された被検体におけるBcr-Abl阻害作用を有するチロシンキナーゼ阻害剤による治療効果の有効性の評価を行うための情報を得ることを目的としたイメージングに用いることができる。よって、本開示の放射性化合物は、一又は複数の実施形態において、Bcr-Abl阻害作用を有するチロシンキナーゼ阻害剤のコンパニオン診断薬として使用することができる。さらにその他には、本開示の放射性化合物は、一又は複数の実施形態において、Bcr-Abl TKIが標的とする又は結合するタンパク質のイメージングに用いることができる。
【００２１】
本開示の放射性化合物は、一又は複数の実施形態において、薬剤耐性変異型Bcr-Ablタンパク質（例えば、T315I変異型Bcr-Ablタンパク質）に結合し、該タンパク質をイメージングすることができる。したがって、本開示の放射性化合物は、一又は複数の実施形態において、野生型Bcr-Ablタンパク質（T315I変異を含まないBcr-Ablタンパク質）に特異的な分子プローブ（すなわち、野生型Bcr-Ablタンパク質に対して親和性が優位に高く、かつT315I変異型Bcr-Ablタンパク質に対して親和性が優位に低い分子プローブ）と併用することにより、Bcr-Abl TKI投与後の被検体におけるＴ３１５I変異発生の評価を行うための情報を得ることを目的としたイメージングに用いることができる。
【００２２】
したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の放射性化合物を含む、Bcr-Ablタンパク質イメージング用分子プローブ又はイメージング用組成物に関する。本開示において、イメージング用分子プローブ及びイメージング用組成物の形態は、特に限定されるものではないが、一又は複数の実施形態において、溶液又は粉末が挙げられる。これらは、担体等の医薬品添加物を含んでいてもよい。
【００２３】
［式（Ｉ）で表される化合物の製造方法］
本開示の放射性化合物は、一又は複数の実施形態において、下記式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を放射性標識することにより製造できる。したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を放射性標識することを含む、放射性化合物の製造方法に関する。
【化９】
2019064986.tif 000011
式（ＩＩ）中、
Ｘは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｒ1は、
【化１０】
2019064986.tif 000012
であり、
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、フッ化メチル基、トリアルキルスタニル基、ニトロ基、トシレート基、メシレート基、トリフレート基、ノシレート基又はブロシレート基であり、Ｒ4及びＲ5の一方は、ハロゲン原子、トリアルキルスタニル基、ニトロ基、トシレート基、メシレート基、トリフレート基、ノシレート基又はブロシレート基である。Ｒ1において、波線を付した結合手は、式（ＩＩ）との結合部分を示す。
【００２４】
式（ＩＩ）において、薬剤耐性変異型Bcr-Ablタンパク質（中でもT315I変異型Bcr-Ablタンパク質）に対する結合親和性の高い分子プローブが得られる点からは、Ｒ4が水素原子であり、Ｒ5がハロゲン原子、トリアルキルスタニル基、ニトロ基、トシレート基、メシレート基、トリフレート基、ノシレート基又はブロシレート基であることが好ましい。
【００２５】
式（ＩＩ）で表される化合物としては、一又は複数の実施形態において、下記式（５）〜（８）で表される化合物が挙げられる。
【化１１】
2019064986.tif 000013
上記式中、Ｒ4及びＲ4は、ハロゲン原子、トリアルキルスタニル基、ニトロ基、トシレート基、メシレート基、トリフレート基、ノシレート基又はブロシレート基である。
式（ＩＩ）で表される化合物としては、薬剤耐性変異型Bcr-Ablタンパク質（中でもT315I変異型Bcr-Ablタンパク質）に対する結合親和性の高い分子プローブが得られる点からは、式（６）〜（８）で表される化合物であることが好ましい。
【００２６】
本開示は、一又は複数の実施形態において、式（５）で表される化合物を放射性標識することを含む、式（１）で表される化合物の製造方法に関する。本開示は、一又は複数の実施形態において、式（６）で表される化合物を放射性標識することを含む、式（２）で表される化合物の製造方法に関する。本開示は、一又は複数の実施形態において、式（６）で表される化合物を放射性標識することを含む、式（３）で表される化合物の製造方法に関する。本開示は、一又は複数の実施形態において、式（７）で表される化合物を放射性標識することを含む、式（４）で表される化合物の製造方法に関する。
【００２７】
放射性標識は、一又は複数の実施形態において、［123/124/125Ｉ］ＮａＩ等を用いて直接標識法により行うことができる。
【００２８】
式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩は、上述のとおり、標識前駆体として使用することができる。したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩（以下、「本開示の標識前駆体化合物」という）に関する。また、本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の放射性化合物を合成するための標識前駆体として使用する本開示の標識前駆体化合物を含む組成物に関する。また、本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の標識前駆体化合物を含む本開示の放射性化合物を調製するためのキットに関する。本開示のキットは、一又は複数の実施形態において、放射性ハロゲン原子を含む標識試薬をさらに含んでいてもよい。
【００２９】
［イメージング方法］
本開示は、一態様において、本開示の放射性化合物又は本開示の分子プローブが投与された被検体から前記化合物の放射性シグナルを検出することを含むイメージング方法（以下、「本開示のイメージング方法」ともいう）に関する。被検体は、特に限定されないが、一又は複数の実施形態において、ヒト、ヒト以外の哺乳類、培養細胞、又はBcr-Ablが発現している可能性のある対象等が挙げられる。
【００３０】
本開示は、その他の態様において、Bcr-Ablチロシンキナーゼ阻害剤と、本開示の放射性化合物又は本開示の分子プローブとが投与された被検体から前記化合物の放射性シグナルを検出することを含むイメージング方法に関する。
【００３１】
本開示のイメージング方法は、一又は複数の実施形態において、Bcr-Ablの発現レベルの測定、Bcr-Abl陽性腫瘍のイメージング、及びＣＭＬと診断された被検体におけるBcr-Abl阻害作用を有するチロシンキナーゼ阻害剤による治療効果の有効性の評価等の用途に用いることができる。
【００３２】
シグナルの検出は、一又は複数の実施形態において、使用する本開示の化合物に含まれる放射性同位元素の種類に応じて適宜決定でき、例えば、ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴ等を用いて行うことができる。
【実施例】
【００３３】
以下に実施例を用いて本開示をさらに説明するが、これらは例示的なものであって、本開示は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
【００３４】
［機器及び試薬］
1H(400 MHz or 500 MHz) NMRスペクトルはLNM-AL 400又は500（日本電子株式会社）にて測定し、内部標準物質としてテトラメチルシランを用いた。
逆相HPLCはLC-20AD（株式会社  島津製作所）を用い、検出器としてSPD-20A UV（株式会社  島津製作所）とサーベイメーター NDW-351（日立アロカメディカル株式会社）を使用した。
逆相HPLC用カラムにはCOSMOSIL C18-AR-II(10 x 250 mm)（ナカライテスク株式会社）を用い、移動相には(A) 0.1% TFA水溶液及び (B) 0.1% TFAアセトニトリル溶液を使用した。TLCにはsilica gel 60 F254（メルク株式会社）を用いた。
カラムクロマトグラフィーによる精製には中圧カラムW-Prep 2XY（株式会社  山善）を用い、シリカゲルはHi Flash silica gel 40 mm, 60Å（株式会社  山善）を使用した。
[125I]NaIは、PerkinElmer社より購入し、[123I]NH4Iは、日本メジフィジックス社より購入した。体内動態評価における放射能は、オートウェルガンマカウンターWallac 1480 WIARD 3（PerkinElmer社）を用いて測定した。
SPECT/CTによる画像収集は、GMI FX-3300 Pre-Clinical Imaging Systemを用い、データ解析には3D OSEMを使用した。
【００３５】
（製造例１）
下記スキームに従って下記式で表されるPON-1を製造した。
【化１２】
2019064986.tif 000014
【００３６】
3,5-Diiodo-4-methyl-N-[4-[(4-methyl-1-piperazinyl)methyl]-3-(trifluoromethyl)phenyl]-benzamide(化合物1)  
3,5-Diiodo-4-methylbenzoic acid (194.0 mg, 0.5 mmol)にSOCl2 (0.73 mL, 10 mmol)加え、DMFを触媒量滴下し、室温で20時間攪拌した。溶液を減圧乾燥させ、中間体 (3,5-Diiodo-4-methyl-benzoyl chloride) (178.9mg, 0.44 mmol, 88%, white solid)を得た。
4-[(4-methyl-1-piperazinyl)methyl]-3-(trifluoromethyl)-benzenamine (94.6 mg, 0.35 mmol)、N,N-Diisopropylethylamine (73 μL, 0.42 mmol)、DMAP (1.2 mg, 0.01 mmol)をTHF (2.4 mL)に溶解させ、そこへ中間体 (170.7 mg, 0.42 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。水を加え酢酸エチルで抽出し、エバポレーターで減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム : メタノール = 10 : 1) により精製し化合物1 (180.0 mg, 0.28 mmol, 80%, pale yellow solid)を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.30 (2H, s), 8.04 (1H, s), 7.89 (1H, d, J=8.0Hz), 7.86 (1H, s), 7.76 (1H, d, J=8.0Hz), 3.65 (2H, s), 2.81 (3H, s), 2.72-2.42 (8H, m), 2.38 (3H, s).
【００３７】
PON-1
3-Ethynyl-imidazo[1,2-b]pyridazine (30.5 mg, 2.0 mmol)、Pd(PPh3)4 (11.6 mg, 0.01 mmol)、CuI (3.05 mg, 0.016 mmol)、化合物1 (137.0 mg, 0.21 mmol)をDMF (1.6 mL)に溶解させ、そこへN,N-Diisopropylethylamine (55.8 μL, 0.32 mmol)を加え、室温で2.5時間攪拌した。水を加え、酢酸エチルで抽出し、エバポレーターで減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム : メタノール = 5 : 1) により精製しPON-1 (33.3 mg, 0.051 mmol, 24%, pale yellow solid)を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.50 (1H, dd, J=4.5, 1.0Hz), 8.34 (1H, d, J=1.5Hz), 8.09 (1H, s), 8.04 (1H, d, J=1.5Hz), 8.01 (1H, dd, J=9.0, 1.0Hz), 7.91 (1H, dd, J=8.0, 2.5Hz), 7.88 (1H, d, J=2.5Hz), 7.77 (1H, d, J=8.0Hz), 7.16 (1H, dd, J=9.0, 4.5Hz), 3.67 (2H, s), 2.81 (3H,  s), 2.70-2.48 (8H, m), 2.40 (3H, s).
【００３８】
（製造例２）
下記スキームに従って下記式で表されるPON-2を製造した。
【化１３】
2019064986.tif 000015
【００３９】
1-[(2-iodo-4-aminophenyl)methyl]-4-methyl-Piperazine(化合物2)
1-[(2-iodo-4-nitrophenyl)methyl]-4-methyl-Piperazine (638.2 mg, 1.77 mmol)、Na2S2O4 (3.08 g, 17.7 mmol)をAcetone / H2O = 1 : 1 (8.8 mL)に溶解させ75 ℃で24時間加熱攪拌した。エバポレーターで濃縮し、酢酸エチルを加え、水、sat-NaHCO3 aq.で洗浄、硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過した後、エバポレーターで溶媒を留去し、化合物2 (145 mg, 0.44 mmol, 25%, pale yellow solid)を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.19 (1H, d, J=2.0Hz), 7.11 (1H, d, J=8.0Hz), 6.63 (1H, dd, J=8.0, 2.0Hz), 3.61 (2H, br), 3.43 (2H, s), 2.70-2.25 (8H, m), 2.29 (3H, s).
【００４０】
PON-2
Methyl 3-(2-imidazo[1,2-b]pyridazin-3-ylethynyl)-4-methyl-benzoate (156.0 mg, 0.54 mmol)をH2O (251 μL)、濃塩酸 (771.8 μL)に溶解させ100℃で1.5時間加熱還流した。その後、溶媒を減圧留去し乾固した。そこへ塩化チオニル(622.6 μL)、DMF (3 drops)を加え室温にて17時間攪拌した。その後、溶媒を減圧留去し乾固した。得られた中間体(142.5 mg, 0.48 mmol)をTHF (7.5 mL)に溶解させ、化合物2 (145.0 mg, 0.44 mmol)、DMAP (1.2 mg, 0.01 mmol)、N,N-Diisopropylethylamine (83.6 μL, 0.48 mmol)を加え室温にて17時間攪拌した。水と酢酸エチルを加え、飽和NaHCO3溶液、水で洗浄後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム : メタノール = 5 : 1) により精製しPON-2 (133.4 mg, 0.23 mmol, 53%, pale yellow solid)を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.50 (dd, J = 4.3, 1.4 Hz, 1H), 8.16 (d, J = 2.0 Hz 1H), 8.08−8.00 (m, 3H), 7.82 − 7.77 (m, 2H), 7.66 (dd, J = 8.3, 2.0 Hz, 1H), 7.40 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.15 (dd, J = 9.2, 4.6 Hz, 1H), 3.52 (s, 2H), 2.66 − 2.28 (m, 14H).
【００４１】
（製造例３）
下記スキームに従って下記式で表されるPON-3を製造した。
【化１４】
2019064986.tif 000016
PON-3
Methyl 3-iodo-4-((4-methylpiperazin-1-yl)methyl)benzoate (237.0 mg, 0.63 mmol)をH2O (296.6 μL)、濃塩酸 (953.0 μL)に溶解させ100℃で4時間加熱還流した。その後、溶媒を減圧留去し乾固した。そこへ塩化チオニル(904 μL)、DMF (3 drops)を加え室温にて17時間攪拌した。その後、溶媒を減圧留去し乾固した。得られた中間体(90.9 mg, 0.24 mmol)をTHF (3.8 mL)で溶解させ、3-(Imidazo[1,2-b]pyridazin-3-ylethynyl)-4-methylaniline (54.6 mg, 0.22 mmol)、DMAP (1.2 mg, 0.01 mmol)、N,N-Diisopropylethylamine (41.7 μL, 0.24 mmol)を加え室温にて2時間攪拌した。水と酢酸エチルを加え、飽和NaHCO3溶液、水で洗浄後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム : メタノール = 10 : 1) により精製しPON-3 (80.4 mg, 0.13 mmol, 60%, white solid)を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.48 (1H, dd, J=4.0, 2.0Hz), 8.32 (1H, d, J=2.0Hz), 8.05 (1H, s), 8.00 (1H, dd, J=9.0, 2.0Hz), 7.83 (1H, d, J=2.0Hz), 7.82 (1H, dd, J=8.0, 2.0Hz), 7.73 (1H, br), 7.62 (1H, dd, J=8.0, 2.0Hz), 7.55 (1H, d, J=8.0Hz), 7.28 (1H, d, J=8.0Hz), 7.13 (1H, dd, J=9.0, 4.0Hz), 3.57 (2H, s), 2.57 (3H, s), 2.56-2.40 (8H, m), 2.31 (3H, s).
【００４２】
（製造例４）
下記スキームに従って下記式で表されるPON-4を製造した。
【化１５】
2019064986.tif 000017
PON-4
Methyl 3-(2-imidazo[1,2-a]pyridazin-3-ylethynyl)-4-methyl-benzoate (50.0 mg, 0.17 mmol)をH2O (80 μL)、濃塩酸 (245 μL)に溶解させ100℃で2時間加熱還流した。その後、溶媒を減圧留去し乾固した。そこへ塩化チオニル(243 μL)、DMF (3 drops)を加え室温にて17時間攪拌した。その後、溶媒を減圧留去し乾固した。得られた中間体をTHF (2.5 mL)に溶解させ、化合物2 (49.7 mg, 0.15 mmol)、DMAP (1.2 mg, 0.01 mmol)、N,N-Diisopropylethylamine (26 μL, 0.15 mmol)を加え室温にて2.5時間攪拌した。水と酢酸エチルを加え、飽和NaHCO3溶液、水で洗浄後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム : メタノール = 5 : 1) により精製しPON-4 (77.3 mg, 0.13 mmol, 87%, off white solid)を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.36 (1H, s), 9.21 (1H, s), 8.69 (1H, d, J=4.5Hz), 8.35 (1H, s), 8.31-8.25 (2H, m), 8.14 (1H, d, J=4.5Hz), 7.93 (1H, d, J=8.0Hz), 7.80 (1H, d, J=8.0Hz), 7.55 (1H, d, J=8.0Hz), 7.34 (1H, d, J=8.0Hz), 3.42 (2H, s), 2.61 (3H, s), 2.50-2.20 (8H, m), 2.15 (3H, s).
【００４３】
［標識前駆体合成］
標識前駆体となるPON-1 precursor、PON-2 precursor、PON-3 precursor、及びPON-4 precursorを合成した。
【００４４】
（製造例５）
下記スキームに従って下記式で表されるPON-1 precursorを製造した。
【化１６】
2019064986.tif 000018
【００４５】
3,5-Dibromo-4-methyl-N-[4-[(4-methyl-1-piperazinyl)methyl]-3-(trifluoromethyl)phenyl]-benzamide(化合物3)
4-[(4-methyl-1-piperazinyl)methyl]-3-(trifluoromethyl)-benzenamine (360 mg, 1.33 mmol)、N,N-Diisopropylethylamine (273 μL, 1.60 mmol)、DMAP (1.2 mg, 0.01 mmol)をTHF (5.0 mL)に溶解させ、3,5-Dibromo-4-methyl-benzoyl chloride (500 mg, 1.6 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。水を加え酢酸エチルで抽出し、エバポレーターで減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム : メタノール = 10 : 1) により精製し化合物3 (540.0 mg, 0.98 mmol, 73.8%, pale yellow solid)を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.00 (1H, br), 7.97 (2H, s), 7.92 (1H, d, J=8.5Hz), 7.89 (1H, s), 7.68 (1H, d, J=8.5Hz), 3.63 (2H, s), 2.76-2.46 (11H, m), 2.42 (3H, s).
【００４６】
PON-1 precursor
化合物3 (265.0 mg, 0.48 mmol)、3-Ethynyl-imidazo[1,2-b]pyridazine (116.0 mg, 0.81 mmol)、Pd(PPh3)4 (56.8 mg, 0.05 mmol)、CuI (9.4 mg, 0.05 mmol)をDMF (2.5 mL)に溶解させ、そこへN,N-Diisopropylethylamine (130 μL, 0.75 mmol)を加え、室温で4時間攪拌した。水を加え、クロロホルムで抽出し、エバポレーターで減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム : メタノール = 5 : 1) により精製しPON-1 precursor (77.0 mg, 0.144 mmol, 30%, pale yellow solid)を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.60 (1H, br), 8.48 (1H, dd, J=4.5, 2.0Hz), 8.11 (1H, s), 8.09 (1H, d, J=2.0Hz), 7.99 (1H, d, J=2.0Hz), 7.97-7.90 (3H, m), 7.78 (1H, d, J=8.0Hz), 7.14 (1H, dd, J=9.0, 4.5Hz), 3.64 (2H, s), 2.71 (3H, s), 2.65-2.35 (8H, m), 2.32 (3H, s).
【００４７】
（製造例６）
下記スキームに従って下記式で表されるＰＯＮ−２  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒを製造した。
【化１７】
2019064986.tif 000019
PON-2 precursor
Methyl 3-(2-imidazo[1,2-b]pyridazin-3-ylethynyl)-4-methyl-benzoate (127.0 mg, 0.44 mmol)をH2O (217 μL)、濃塩酸 (222 μL)に溶解させ100℃で2時間加熱還流した。その後、溶媒を減圧留去し乾固した。そこへ塩化チオニル(622.6 μL)、DMF (3 drops)を加え室温にて17時間攪拌した。その後、溶媒を減圧留去し乾固した。得られた中間体(100.5 mg, 0.34 mmol)をTHF (5.3 mL)に溶解させ1-[(2-bromo-4-aminophenyl)methyl]-4-methyl-Piperazine (86.8 mg, 0.31 mmol)、DMAP (1.2 mg, 0.01 mmol)、N,N-Diisopropylethylamine (59.3 μL, 0.34 mmol)を加え室温にて2.5時間攪拌した。水と酢酸エチルを加え、飽和NaHCO3溶液、水で洗浄後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム : メタノール = 5 : 1) により精製しPON-2 precursor (108.1 mg, 0.20 mmol, 64%, white solid)を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.49 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.10 - 8.08 (m, 2H), 8.04 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 8.0 − 7.95 (m, 2H), 7.81 (dd, J = 7.7, 2.0 Hz, 1H), 7.60 (dd, J = 8.3, 2.0 Hz, 1H), 7.46 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 8.0 Hz, 1H), , 7.14 (dd, J = 9.2, 4.6 Hz, 1H), 3.59 (s, 2H), 2.64−2.28 (m, 14H).
【００４８】
（製造例７）
下記スキームに従って下記式で表されるPON-2 precursor（スズ化合物）を製造した。
【化１８】
2019064986.tif 000020
化合物C (235 mg)を1,4-ジオキサン溶液（8 mL）に溶解させ、(SnMe3)2 (523 μL)、Pd(PPh3)(4191.8 mg)を加えて、120℃で撹拌させた。一晩撹拌後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣をクロロホルムに溶解させた。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで脱水しろ過した。得られたろ液を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム : メタノール = 95 : 5→9:1) により精製し化合物D (126.4 mg, 淡黄色固体)を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.00 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 8.0 Hz, 2.5H), 6.57 (dd, J = 2.5, 8.0 Hz, 1H), 3.59 (s, 1H), 3.34 (s, 1H), 2.41 (brs, 6H), 2.28 (s, 3H), 1.62 (brs, 2H), 0.26 (s, 9H).
【００４９】
化合物D (58.9 mg)とMethyl 3-(2-imidazo[1,2-b]pyridazin-3-ylethynyl) -4-methyl- -benzoic acid hydrocloride（50 mg）をCH2Cl2 (1.5 mL)に溶解させ、N,N-ジイソプロピルアミン (84 μL)、N,N−ジメチル-4-アミノピリジン (3.9 mg)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (36.8 mg)を加え室温で撹拌させた。一晩撹拌後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水しろ過した。得られたろ液を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム : メタノール = 95 : 5→9:1) により精製し (60.0 mg,淡黄色固体)を得た。
δ 8.50 (ｄd, J = 2.0, 5.0 Hz, 1H), 8.10 - 8.05 (m, 2H), 8.00(dd, J = 2.0, 9.0 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.83 (dd, J = 2.0, 8.0 Hz, 1H), 7.73 (dd, J = 2.5, 8.0 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.14 (dd, J = 5.0, 9.0 Hz, 1H), 3.45 (s, 2H), 2.65 (s, 3H), 2.43 (brs, 6H), 2.29 (s, 3H), 1.67 (s, 2H), 0.31 (s, 9H).
【００５０】
（製造例７）
下記スキームに従って下記式で表されるPON-3 precursorを製造した。
【化１９】
2019064986.tif 000021
PON-3 precursor
Methyl 3-bromo-4-((4-methylpiperazin-1-yl)methyl)benzoate (150.0 mg, 0.46 mmol)をH2O (214.6 μL)、濃塩酸 (659.5 μL)に溶解させ100℃で2時間加熱還流した。その後、溶媒を減圧留去し乾固した。そこへ塩化チオニル(654 μL)、DMF (3 drops)を加え室温にて17時間攪拌した。その後、溶媒を減圧留去し乾固した。そこへTHF (2.9 mL)で溶解させ、3-(Imidazo[1,2-b]pyridazin-3-ylethynyl)-4-methylaniline (42.2 mg, 0.17 mmol)、DMAP (1.2 mg, 0.01 mmol)、N,N-Diisopropylethylamine (33.0 μL, 0.19 mmol)を加え室温にて2.5時間攪拌した。水と酢酸エチルを加え、飽和NaHCO3溶液、水で洗浄後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム : メタノール = 10 : 1) により精製しPON-3 precursor (46.2 mg, 0.085 mmol, 60%, pale yellow solid)を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.48 (1H, dd, J=4.5, 2.0Hz), 8.05 (1H, d, J=2.0Hz), 8.04 (1H, s), 8.00 (1H, dd, J=9.0, 2.0Hz), 7.83 (1H, d, J=2.0Hz), 7.78 (1H, dd, J=8.0, 2.0Hz), 7.75 (1H, br), 7.63 (1H, d, J=8.0Hz), 7.61 (1H, dd, J=8.0, 2.0Hz), 7.28 (1H, d, J=8.0Hz), 7.13 (1H, dd, J=9.0, 4.5Hz), 3.65 (2H, s), 2.65-2.40 (11H, m), 2.32 (3H, s).
【００５１】
（製造例８）
下記スキームに従って下記式で表されるPON-4 precursorを製造した。
【化２０】
2019064986.tif 000022
PON-4 precursor
Methyl 3-(2-imidazo[1,2-a]pyridazin-3-ylethynyl)-4-methyl-benzoate (77.0 mg, 0.26 mmol)をH2O (124 μL)、濃塩酸 (380 μL)に溶解させ100℃で2時間加熱還流した。その後、溶媒を減圧留去し乾固した。そこへ塩化チオニル(377 μL)、DMF (3 drops)を加え室温にて17時間攪拌した。その後、溶媒を減圧留去し乾固した。そこへTHF (4.1 mL)に溶解させ1-[(2-bromo-4-aminophenyl)methyl]-4-methyl-Piperazine (68.2 mg, 0.24 mmol)、DMAP (1.2 mg, 0.01 mmol)、N,N-Diisopropylethylamine (42 μL, 0.24 mmol)を加え室温にて2.5時間攪拌した。水と酢酸エチルを加え、飽和NaHCO3溶液、水で洗浄後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム : メタノール = 10 : 1) により精製しPON-4 precursor (92.9 mg, 0.17 mmol, 70%, pale yellow solid)を得た。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.21 (1H, s), 8.68 (1H, d, J=5.0Hz), 8.30 (1H, s), 8.28-8.25 (2H, m), 8.15-8.12 (2H, m), 7.93 (1H, dd, J=8.0, 2.0Hz), 7.75 (1H, dd, J=8.0, 2.0Hz), 7.55 (1H, d, J=8.0Hz), 7.42 (1H, d, J=8.0Hz), 3.49 (2H, s), 2.61 (3H, s), 2.50-2.25 (8H, m), 2.15 (3H, s).
【００５２】
［放射化学合成］
放射性標識化合物である[125I]PON-1、[123/125I]PON-2、[125I]PON-3、及び[125I]PON-4を下記スキームに従って合成した。
【化２１】
2019064986.tif 000023
【００５３】
（製造例９）
[125I]PON-1
PON-1 precursor (6.6 mg)、CuSO4・5H2O (7.25 mg)、(NH4)2SO4 (6.41 mg)を反応バイアルへ入れ、MeOH (200 μL)、H2O (200 μL)に懸濁させ、[125I]NaI (237 μCi)を加えた後、封緘中150℃で加熱した。10分後から反応バイアルへ26Gの注射針、ルアーアダプタ、輸液ポンプ用延長チューブを経由し溶媒を留去しながら、50分間加熱した。MeCN (200 μL)、MeOH (200 μL)で反応物を洗浄した後、MeCN (200 μL)、H2O (200 μL)を加え、溶液をCosmonicefilter Sを通し、逆相HPLC (COSMOSIL 5C18-AR-II, 10 x 250 mm, eluent 50% (A) and (B), flow rate 1.0 mL/min, λ = 220, 254 nm, Rt = 32.25-34.75 min)にて精製し、[125I]PON-1を放射化学的収率10%、放射化学的純度>99%で得た。
【００５４】
（製造例１０）
[125I]PON-2
PON-2 precursor (2.2 mg)、CuSO4・5H2O (2.8 mg)、(NH4)2SO4 (3.2 mg)を反応バイアルへ入れ、MeOH (200 μL)、H2O (200 μL)に懸濁させ、[125I]NaI (252 μCi)を加えた後、封緘中150℃で加熱した。10分後から反応バイアルへ26Gの注射針、ルアーアダプタ、輸液ポンプ用延長チューブを経由し溶媒を留去しながら、50分間加熱した。MeCN (200 μL)、MeOH (200 μL)で反応物を洗浄した後、MeCN (800 μL)、H2O (800 μL)を加え、溶液をCosmonicefilter Sを通し、逆相HPLC (COSMOSIL 5C18-AR-II, 10 x 250 mm, eluent 65% (A) and 35% (B), flow rate 2.0 mL/min, λ = 220, 254 nm, Rt = 14.5-16.5 min)にて精製し、[125I]PON-2を放射化学的収率50%、放射化学的純度>99%で得た。
【００５５】
（製造例１１）
[125I]PON-3
PON-3 precursor (1.54 mg)、CuSO4・5H2O (2.51 mg)、(NH4)2SO4 (2.62 mg)を反応バイアルへ入れ、MeOH (200 μL)、H2O (200 μL)に懸濁させ、[125I]NaI (251 μCi)を加えた後、封緘中150℃で加熱した。10分後から反応バイアルへ26Gの注射針、ルアーアダプタ、輸液ポンプ用延長チューブを経由し溶媒を留去しながら、50分間加熱した。MeCN (200 μL)、MeOH (200 μL)、MeOH/H2O=1/1 (400 μL) で反応物を洗浄した後、MeCN (200 μL)、H2O (200 μL)を加え、溶液をCosmonicefilter Sを通し、逆相HPLC (COSMOSIL 5C18-AR-II, 10 x 250 mm, eluent 60% (A) and 40% (B), flow rate 1.0 mL/min, λ = 220, 254 nm, Rt = 26.5-28.0 min)にて精製し、[125I]PON-3を放射化学的収率38%、放射化学的純度>99%で得た。
【００５６】
（製造例１２）
[125I]PON-4
PON-4 precursor (3.1 mg)、CuSO4・5H2O (5.3 mg)、(NH4)2SO4 (4.3 mg)を反応バイアルへ入れ、MeOH (200 μL)、H2O (200 μL)に懸濁させ、[125I]NaI (383 μCi)を加えた後、封緘中150℃で加熱した。10分後から反応バイアルへ26Gの注射針、ルアーアダプタ、輸液ポンプ用延長チューブを経由し溶媒を留去しながら、50分間加熱した。MeCN (200 μL)、MeOH (200 μL)、MeOH/H2O=1/1 (400 μL)で反応物を洗浄した後、MeCN (600 μL)、H2O (600 μL)を加え、溶液をCosmonicefilter Sを通し、逆相HPLC (COSMOSIL 5C18-AR-II, 10 x 250 mm, eluent 65% (A) and 35% (B), flow rate 1.0 mL/min, λ = 220, 254 nm, Rt = 31.0-32.0 min)にて精製し、[125I]PON-3を放射化学的収率33%、放射化学的純度>99%で得た。
【００５７】
（製造例１３）
[123I]PON-2
PON-2 precursor (1.71 mg)、CuSO4・5H2O (2.61 mg)、(NH4)2SO4 (2.62 mg)を反応バイアルへ入れ、MeOH (200 μL)、H2O (200 μL)に懸濁させ、[123I]NH4I (29.1 mCi)を加えた後、封緘中150℃で加熱した。10分後から反応バイアルへ26Gの注射針、ルアーアダプタ、輸液ポンプ用延長チューブを経由し溶媒を留去しながら、50分間加熱した。MeCN (400 μL)、MeOH (400 μL)、MeOH/H2O=1/1 (400 μL)で反応物を洗浄した後、MeCN (400 μL)、H2O (400 μL)を加え、溶液をCosmonicefilter Sを通し、逆相HPLC (COSMOSIL 5C18-AR-II, 10 x 250 mm, eluent 65% (A) and 35% (B), flow rate 1.0 mL/min, λ = 220, 254 nm, Rt = 30.0-32.0 min)にて精製し、[123I]PON-2を放射化学的収率37%、放射化学的純度>99%で得た。
【００５８】
［細胞増殖抑制活性の測定］
96ウェルプレート上にK562細胞(3.0×103 cells/well)またはBa/F3 Bcr-AblT315細胞(3.0×103 cells/well)を播種し、10％ Fetal Bovine Serum含有RPMI1640培地中にて1晩培養した。各ウェルにPON-1, -2, -3, -4を終濃度が0.03-1000 nMになるように添加し、CO2インキュベーター中で７２時間インキュベートした。７２時間後、Cell Counting Kit-8（同仁科学株式会社）を用いて生存細胞数をカウントし、各濃度のカウント数から各化合物のIC50値を算出した。
【００５９】
【表１】
2019064986.tif 000024
【００６０】
表１に示すように、PON-1, -2, -3, -4はBcr-Abl positive細胞であるK562細胞に対して結合親和性を示した。また、PON -2, -3, -4はBcr-Abl変異細胞であるBa/F Bcr-AblT315Iに対して結合親和性を示した。
【００６１】
［K562担がんマウスを用いた[125I]PON-1体内動態評価］
Bcr-Abl positive細胞であるK562担がんマウスへ[125I]PON-1(18.5 kBq/100 μL)をマウス尾静注より投与した。投与後60、120、180、240分に各臓器(腫瘍、血液、心臓、肺、肝臓、膵臓、胃、小腸、脾臓、腎臓、筋肉、骨)を摘出した。各臓器の重量と放射能を測定し、単位重量あたりの放射能から放射集積量(ID%/g)を算出した。その結果を図１及び３に示す。図１は、血液、骨、腫瘍及び筋肉における集積量の経時変化を示すグラフである。図２は、左から順に腫瘍／血液比、腫瘍／筋肉比及び腫瘍／骨比の経時変化を示すグラフである。図１に示すように、投与後240分において、腫瘍への集積は2.3 ID%/gであった。また、図２に示すように、画像化に重要な臓器比は腫瘍/血液比13.8、腫瘍/筋肉比3.1、腫瘍/骨比4.1と高い臓器比が得られた。
【００６２】
［K562担がんマウスを用いた[125I]PON-2体内動態評価］
Bcr-Abl positive細胞であるK562担がんマウスへ[125I]PON-2(18.5 kBq/100 μL)をマウス尾静注より投与した。投与後60、120、180分に各臓器(腫瘍、血液、心臓、肺、肝臓、膵臓、胃、小腸、脾臓、腎臓、筋肉、骨)を摘出した。各臓器の重量と放射能を測定し、単位重量あたりの放射能から放射集積量(ID%/g)を算出した。その結果を図３及び４に示す。図３は、血液、骨、腫瘍及び筋肉における集積量の経時変化を示すグラフである。図４は、左から順に腫瘍／血液比、腫瘍／筋肉比及び腫瘍／骨比の経時変化を示すグラフである。図３に示すように、投与後180分において、腫瘍への集積は4.1 ID%/gであった。また、図４に示すように、画像化に重要な臓器比は腫瘍/血液比9.6、腫瘍/筋肉比4.6、腫瘍/骨比3.7と高い臓器比が得られた。
【００６３】
［A431担がんマウスを用いた[125I]PON-2体内動態評価］
Bcr-Abl negative細胞であるA431担がんマウスへ[125I]PON-2(18.5 kBq/100 μL)をマウス尾静注より投与した。投与後180分に各臓器(腫瘍、血液、心臓、肺、肝臓、膵臓、胃、小腸、脾臓、腎臓、筋肉、骨)を摘出した。各臓器の重量と放射能を測定し、単位重量あたりの放射能から放射集積量(ID%/g)を算出した。投与後180分において、腫瘍への集積は0.6 ID%/gであり、画像化に重要な臓器比は腫瘍/血液比2.9、腫瘍/筋肉比1.3、腫瘍/骨比0.9と低い臓器比が認められた。
【００６４】
［K562担がんマウスを用いた[125I]PON-3体内動態評価］
Bcr-Abl positive細胞であるK562担がんマウスへ[125I]PON-3(18.5 kBq/100 μL)をマウス尾静注より投与した。投与後60、120、180分に各臓器(腫瘍、血液、心臓、肺、肝臓、膵臓、胃、小腸、脾臓、腎臓、筋肉、骨)を摘出した。各臓器の重量と放射能を測定し、単位重量あたりの放射能から放射集積量(ID%/g)を算出した。その結果を図５及び７に示す。図５は、血液、骨、腫瘍及び筋肉における集積量の経時変化を示すグラフである。図６は、左から順に腫瘍／血液比、腫瘍／筋肉比及び腫瘍／骨比の経時変化を示すグラフである。図５に示すように、投与後180分において、腫瘍への集積は1.3 ID%/gであった。また、図６に示すように、画像化に重要な臓器比は腫瘍/血液比5.8、腫瘍/筋肉比7.2、腫瘍/骨比1.6と高い臓器比が得られた。
【００６５】
［A431担がんマウスを用いた[125I]PON-3体内動態評価］
Bcr-Abl negative細胞であるA431担がんマウスへ[125I]PON-3(18.5 kBq/100 μL)をマウス尾静注より投与した。投与後180分に各臓器(腫瘍、血液、心臓、肺、肝臓、膵臓、胃、小腸、脾臓、腎臓、筋肉、骨)を摘出した。各臓器の重量と放射能を測定し、単位重量あたりの放射能から放射集積量(ID%/g)を算出した。その結果、投与後180分において、腫瘍への集積は0.3 ID%/gであり、画像化に重要な臓器比は腫瘍/血液比2.1、腫瘍/筋肉比4.4、腫瘍/骨比1.8と低い臓器比が認められた。
【００６６】
［K562担がんマウスを用いた[125I]PON-4体内動態評価］
Bcr-Abl positive細胞であるK562担がんマウスへ[125I]PON-4(18.5 kBq/100 μL)をマウス尾静注より投与した。投与後60、120、180分に各臓器(腫瘍、血液、心臓、肺、肝臓、膵臓、胃、小腸、脾臓、腎臓、筋肉、骨)を摘出した。各臓器の重量と放射能を測定し、単位重量あたりの放射能から放射集積量(ID%/g)を算出した。その結果を図７及び８に示す。図７は、血液、骨、腫瘍及び筋肉における集積量の経時変化を示すグラフである。図８は、左から順に腫瘍／血液比、腫瘍／筋肉比及び腫瘍／骨比の経時変化を示すグラフである。図８に示すように、投与後180分において、腫瘍への集積は1.5 ID%/gであった。また、図８に示すように、画像化に重要な臓器比は腫瘍/血液比10.2、腫瘍/筋肉比3.9、腫瘍/骨比3.9と高い臓器比が得られた。
【００６７】
［A431担がんマウスを用いた[125I]PON-4体内動態評価］
Bcr-Abl negative細胞であるA431担がんマウスへ[125I]PON-4(18.5 kBq/100 μL)をマウス尾静注より投与した。投与後180分に各臓器(腫瘍、血液、心臓、肺、肝臓、膵臓、胃、小腸、脾臓、腎臓、筋肉、骨)を摘出した。各臓器の重量と放射能を測定し、単位重量あたりの放射能から放射集積量(ID%/g)を算出した。その結果、投与後180分において、腫瘍への集積は0.3 ID%/gであり、画像化に重要な臓器比は腫瘍/血液比1.5、腫瘍/筋肉1.9、腫瘍/骨比1.2と低い臓器比が認められた。
【００６８】
［Ba/F Bcr-AblT315I担がんマウスを用いた[125I]PON-2体内動態評価］
Bcr-Abl変異細胞であるBa/F Bcr-AblT315I担がんマウスへ[125I]PON-2(18.5 kBq/100 μL)をマウス尾静注より投与した。投与後１、３、２４時間に各臓器(腫瘍、血液、心臓、肺、肝臓、膵臓、胃、小腸、脾臓、腎臓、筋肉、骨)を摘出した。各臓器の重量と放射能を測定し、単位重量あたりの放射能から放射集積量(ID%/g)を算出した。その結果を図９に示す。図９は、左から順に腫瘍／血液比、腫瘍／筋肉比及び腫瘍／骨比の経時変化を示すグラフである。投与後３時間の時点において、腫瘍への集積は1.7 ID%/gであった。また、図９に示すように、投与後24時間において画像化に重要な臓器比は腫瘍/血液比7.5、腫瘍/筋肉比6.2、腫瘍/骨比2.9と高い臓器比が得られた。
【００６９】
［SPECT/CT撮像］
K562担がんマウスへ[123I]PON-2(87.3 MBq/100 μL)をマウス尾静脈より投与した。投与後1074分からイソフルラン(2.0%)吸引麻酔し投与後1084分からSPECT/CT装置(FX-3300)を用いて48分間撮像した。その後、CT撮像(60 kV, 320 μA)を行った。画像再構成は、3D-OSEMを用いて行った。得られた画像を図１０に示す。図１０に示すように、移植したＫ５６２細胞で構成された腫瘍をイメージングできた。撮像終了後、屠殺し各臓器を摘出し、各臓器の重量と放射能を測定し、単位重量あたりの放射能から集積量(%ID/g)を算出した。その結果、腫瘍/血液比12.1、腫瘍/筋肉比7.4、腫瘍/骨比10.5と高い近接臓器比が認められた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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