(57)【要約】【課題】三重らせん状態で中性の水に不溶なβ−１，３−グルカンを、生理活性や生体適合性等を損なうことなく中性の水に溶解させることを可能にするβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法、該方法を用いて得られるβ−１，３−グルカン複合体及びそれを含む医薬組成物を提供する。【解決手段】工程（１）：中性で水に難溶性のβ−１，３−グルカンをアルカリ水溶液に溶解する工程、（２）：前記β−１，３−グルカンのアルカリ水溶液と、当該β−１，３−グルカンの１重量％以上８０重量％以下のオリゴヌクレオチド又はその誘導体を含む緩衝液とを混合する工程及び（３）：前記β−１，３−グルカンを含むアルカリ水溶液を中和する工程を、（１）、（２）、（３）又は（１）、（３）、（２）の順序で含む、中性の水中で３本のβ−１，３−グルカンの分子鎖が三重らせん構造を有する複合体を形成しているβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
中性の水中で、３本のβ−１，３−グルカンの分子鎖が三重らせん構造を有する複合体を形成しているβ−１，３−グルカンの水溶液を製造する方法であって、次の工程（１）、（２）及び（３）を、（１）、（２）、（３）又は（１）、（３）、（２）の順序で含むことを特徴とするβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法。
（１）中性で水に難溶性のβ−１，３−グルカンをアルカリ水溶液に溶解する工程、
（２）前記β−１，３−グルカンのアルカリ水溶液と、当該β−１，３−グルカンの１重量％以上８０重量％以下のオリゴヌクレオチド又はその誘導体を含む緩衝液とを混合する工程、及び、
（３）前記β−１，３−グルカンを含むアルカリ水溶液を中和する工程。
【請求項２】
前記工程（１）、（２）及び（３）を、（１）、（３）、（２）の順序で含むことを特徴とする請求項１に記載のβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチド又はその誘導体がオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）又はその誘導体であることを特徴とする請求項１又は２に記載のβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチド又はその誘導体が、ホスホジエステル結合の一部又は全部がホスホロチオエート結合又はジホスホロチオエート結合で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法。
【請求項５】
前記β−１，３−グルカンが、レンチナン又はカードランであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法。
【請求項６】
前記β−１，３−グルカンの分子量が１．０×１０５以上であることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載のβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法。
【請求項７】
前記β−１，３−グルカンの主鎖に含まれるグルコース残基数ｍＧ及び前記オリゴヌクレオチド又はその誘導体に含まれる核酸塩基数Ｂについて、０．０１＜Ｂ／ｍＧ＜０．５が成立することを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載のβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法。
【請求項８】
中性で水に不溶なβ−１，３−グルカンと、前記β−１，３−グルカンの０．５重量％以上４０重量％以下のオリゴヌクレオチド又はその誘導体とを含み、
３本の前記β−１，３−グルカンの分子鎖が三重らせん構造を有する複合体を形成しており、中性の水に可溶であることを特徴とするβ−１，３−グルカン複合体。
【請求項９】
前記三重らせん構造を有する複合体において、前記β−１，３−グルカンの分子鎖の一部が前記オリゴヌクレオチド又はその誘導体に置換されていることを特徴とする請求項８に記載のβ−１，３−グルカン複合体。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチド又はその誘導体がオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）又はその誘導体であることを特徴とする請求項８又は９に記載のβ−１，３−グルカン複合体。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチド又はその誘導体が、ホスホジエステル結合の一部又は全部がホスホロチオエート結合又はジホスホロチオエート結合で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体であることを特徴とする請求項８から１０のいずれか１項に記載のβ−１，３−グルカン複合体。
【請求項１２】
前記β−１，３−グルカンが、レンチナン又はカードランであることを特徴とする請求項８から１１のいずれか１項に記載のβ−１，３−グルカン複合体。
【請求項１３】
前記β−１，３−グルカンの分子量が１．０×１０５以上であることを特徴とする請求項８から１２のいずれか１項に記載のβ−１，３−グルカン複合体。
【請求項１４】
前記β−１，３−グルカンの主鎖に含まれるグルコース残基数ｍＧ及び前記オリゴヌクレオチド又はその誘導体に含まれる核酸塩基数Ｂについて、０．０１＜Ｂ／ｍＧ＜０．５が成立することを特徴とする請求項８から１３のいずれか１項に記載のβ−１，３−グルカン複合体。
【請求項１５】
前記複合体のモル質量が、１×１０５以上３×１０６以下の範囲内であることを特徴とする請求項８から１４のいずれか１項に記載のβ−１，３−グルカン複合体。
【請求項１６】
多角度光散乱又はＸ線小角散乱により測定した前記複合体の慣性半径が２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項８から１５のいずれか１項に記載のβ−１，３−グルカン複合体。
【請求項１７】
Ｘ線小角散乱を用いて測定した前記複合体のＸ線の散乱強度Ｉを、下記の式（Ｉ）で定義されるｑ値の対数に対しプロットした場合、ｑが１０−１ｎｍ−１から１ｎｍ−１までの範囲における傾きａが−１．５以上−０．５以下であることを特徴とする請求項８から１６のいずれか１項に記載のβ−１，３−グルカン複合体。
【数１】
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なお、式（Ｉ）において、θはＸ線の散乱角を表し、λはＸ線の波長を表す。
【請求項１８】
請求項８から１７のいずれか１項に記載のβ−１，３−グルカン複合体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中性で水に不溶なβ−１，３−グルカンを含むβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法及びそれにより得られるβ−１，３−グルカン複合体並びにそれを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−１，３−グルカンは、グルコースが１→３方向で共有結合（β−１，３−グリコシド結合）した生体高分子である多糖の総称である。この多糖には、１→６の側鎖グルコースや、その他の長い糖鎖を側鎖に持つものもある。β−１，３−グルカンは、免疫刺激剤、ゲル化剤、頭髪のセット剤等の用途に用いられている。また、近年では、ＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）の製剤としても使われている（例えば、非特許文献１参照）。多くのβ−１，３−グルカンは、天然では３本の分子鎖が、水素結合及び疎水性相互作用を介して会合した三重らせん構造を取っており、この三重らせん構造が免疫賦活に有用であると報告されている。
【０００３】
高分子量のβ−１，３−グルカンや、側鎖グルコースが存在しないβ−１，３−グルカンは、三重らせん構造のままでは中性の水に不溶である場合がある。水に不溶であると、工業的に取扱いが困難になると共に、生体適合性も低下する。
【０００４】
不溶性の多糖であるセルロースの可溶化のために、水酸基の一部をカルボキシメチル基等で置換する化学修飾が用いられることがあるが（例えば、非特許文献１参照）、β−１，３−グルカンにおいてこのような化学修飾を行うと、三重らせん構造をとることができなくなる。
【０００５】
β−１，３−グルカンを水に可溶化するために、従来はｐＨの高いアルカリ水溶液（ｐＨ１２以上）にβ−１，３−グルカンを溶解させ、得られた溶液を中和して中性に戻し、β−１，３−グルカン懸濁液や顆粒状の粒子を形成する方法が用いられている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−６９９１３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「水溶性高分子の基礎と応用技術 (ＣＭＣテクニカルライブラリー−ファインケミカルシリーズ)」、野田公彦監修、シーエムシー出版、２００９年１１月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、β−１，３−グルカンをアルカリ水溶液に溶解させると、三重らせん構造が崩壊し、中和しても完全に元の三重らせん構造に戻らないため、β−１，３−グルカンの生理活性や生体適合性が変化するおそれがある。
【０００９】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであって、三重らせん状態で中性の水に不溶なβ−１，３−グルカンを、生理活性や生体適合性等を損なうことなく中性の水に溶解させることを可能にするβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法、該方法を用いて得られるβ−１，３−グルカン複合体及びそれを含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、アルカリを中和する過程に、β−１，３−グルカンの重量に対して、１重量％以上のＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を混合することで、三重らせん構造が完全に回復し、かつ、水に分子分散したβ−１，３−グルカン複合体が得られることを見出し、本発明に至った。
【００１１】
本発明の第１の側面は、中性の水中で、３本のβ−１，３−グルカンの分子鎖が三重らせん構造を有する複合体を形成しているβ−１，３−グルカンの水溶液を製造する方法であって、次の工程（１）、（２）及び（３）を、（１）、（２）、（３）又は（１）、（３）、（２）の順序で含むことを特徴とするβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
（１）中性で水に難溶性のβ−１，３−グルカンをアルカリ水溶液に溶解する工程、
（２）前記β−１，３−グルカンのアルカリ水溶液と、当該β−１，３−グルカンの１重量％以上８０重量％以下のオリゴヌクレオチド又はその誘導体を含む緩衝液とを混合する工程、及び、
（３）前記β−１，３−グルカンを含むアルカリ水溶液を中和する工程。
なお、本願において、オリゴヌクレオチド又はその誘導体の重量は、β−１，３−グルカンとともに三重らせん構造を形成する部分、例えばポリデオキシアデニンが連なる鎖の部分の換算重量として表す。
【００１２】
本発明の第１の側面に係るβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法において、前記工程（１）、（２）及び（３）を、（１）、（３）、（２）の順序で含むことが好ましい。
【００１３】
本発明の第２の側面は、中性で水に不溶なβ−１，３−グルカンと、前記β−１，３−グルカンの０．５重量％以上４０重量％以下のオリゴヌクレオチド又はその誘導体とを含み、３本の前記β−１，３−グルカンの分子鎖が三重らせん構造を有する複合体を形成しており、中性の水に可溶であることを特徴とするβ−１，３−グルカン複合体を提供することにより上記課題を解決するものである。
【００１４】
本発明の第２の側面に係るβ−１，３−グルカン複合体において、前記三重らせん構造を有する複合体において、前記β−１，３−グルカンの分子鎖の一部が前記オリゴヌクレオチド又はその誘導体に置換されていてもよい。
【００１５】
本発明の第１の側面に係るβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法及び本発明の第２の側面に係るβ−１，３−グルカン複合体において、前記オリゴヌクレオチド又はその誘導体がオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）又はその誘導体であってもよい。
【００１６】
本発明の第１の側面に係るβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法及び本発明の第２の側面に係るβ−１，３−グルカン複合体において、前記オリゴヌクレオチド又はその誘導体が、ホスホジエステル結合の一部又は全部がホスホロチオエート結合又はジホスホロチオエート結合で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体であってもよい。
【００１７】
本発明の第１の側面に係るβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法及び本発明の第２の側面に係るβ−１，３−グルカン複合体において、前記β−１，３−グルカンが、レンチナン又はカードランであってもよい。
【００１８】
本発明の第１の側面に係るβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法及び本発明の第２の側面に係るβ−１，３−グルカン複合体において、前記β−１，３−グルカンの分子量が１．０×１０５以上であることが好ましい。
【００１９】
本発明の第１の側面に係るβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法及び本発明の第２の側面に係るβ−１，３−グルカン複合体において、前記β−１，３−グルカンの主鎖に含まれるグルコース残基数ｍＧ及び前記オリゴヌクレオチド又はその誘導体に含まれる核酸塩基数Ｂについて、０．０１＜Ｂ／ｍＧ＜０．５が成立することが好ましい。
【００２０】
本発明の第２の側面に係るβ−１，３−グルカン複合体において、前記複合体のモル質量が、１×１０５以上３×１０６以下の範囲内であってもよい。
【００２１】
本発明の第２の側面に係るβ−１，３−グルカン複合体において、多角度光散乱又はＸ線小角散乱により測定した前記複合体の慣性半径が２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが好ましい。
【００２２】
本発明の第２の側面に係るβ−１，３−グルカン複合体において、Ｘ線小角散乱を用いて測定した前記複合体のＸ線の散乱強度Ｉを、下記の式（Ｉ）で定義されるｑ値の対数に対しプロットした場合、ｑが１０−１ｎｍ−１から１ｎｍ−１までの範囲における傾きａが−１．５以上−０．５以下であることが好ましい。
【００２３】
【数１】
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【００２４】
なお、式（Ｉ）において、θはＸ線の散乱角を表し、λはＸ線の波長を表す。
【００２５】
本発明の第３の側面は、本発明の第２の側面に係るβ−１，３−グルカン複合体を含む医薬組成物を提供することにより上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によると、三重らせん状態で中性の水に不溶なβ−１，３−グルカンを、生理活性や生体適合性等を損なうことなく中性の水に溶解させることが可能になる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の一実施の形態に係るβ−１，３−グルカンの水溶液の製造方法（以下、「β−１，３−グルカンの水溶液の製造方法」又は「製造方法」と略称される場合がある。）は、中性の水中で、３本のβ−１，３−グルカンの分子鎖が三重らせん構造を有する複合体を形成しているβ−１，３−グルカンの水溶液を製造する方法であって、次の工程（１）、（２）及び（３）を、（１）、（２）、（３）又は（１）、（３）、（２）の順序で含んでいる。
（１）中性で水に難溶性のβ−１，３−グルカンをアルカリ水溶液に溶解する工程、
（２）β−１，３−グルカンの水溶液と、β−１，３−グルカンの１重量％以上８０重量％以下のオリゴヌクレオチド又はその誘導体を含む緩衝液とを混合する工程、及び、
（３）β−１，３−グルカンを含むアルカリ水溶液を中和する工程。
【００２８】
以下、各工程について具体的に説明する。
【００２９】
＜工程（１）＞
工程（１）では、中性で水に難溶性のβ−１，３−グルカンをアルカリ水溶液に溶解させる。β−１，３−グルカン複合体の製造に用いられるβ−１，３−グルカンとしては、中性で水に難溶性のものであれば特に制限されないが、シゾフィラン、レンチナン、カードラン、カロース等が挙げられる。また、β−１，３−グルカン複合体の製造に用いられるβ−１，３−グルカンの分子量は、β−１，３−グルカンの種類により異なるが、例えば、１．０×１０５以上である。なお、β−１，３−グルカンの分子量の上限は特に制限されない。
【００３０】
アルカリ水溶液の調製に用いられるアルカリの具体例としては、アルカリ金属、アルカリ土類金属の水酸化物が挙げられる。アルカリの濃度は、０．０１Ｎ以上２．５Ｎ以下である。β−１，３−グルカンの濃度は特に限定されないが、例えば、１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下である。
【００３１】
＜工程（２）＞
工程（２）では、β−１，３−グルカンの水溶液と、オリゴヌクレオチド又はその誘導体を含む緩衝液とを混合する。β−１，３−グルカンの水溶液と混合する緩衝液の調製に用いられるオリゴヌクレオチドとして、β−１，３−グルカンと水素結合を介して会合し、β−１，３−グルカンの分子鎖２本とオリゴヌクレオチドの分子鎖１本からなる三重らせん構造を有する複合体を形成できる塩基配列を有する任意のオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデオキシリボヌクレオチドが用いられる。
【００３２】
オリゴヌクレオチドの好ましい塩基配列としては、（ｄＡ）ｎが挙げられる。塩基長ｎは、好ましくは１０以上の整数である。ｎの上限は特に制限されないが、例えば１００である。好ましいｎの範囲は、１０以上５０以下である。
【００３３】
オリゴヌクレオチドの誘導体としては、上記の塩基配列を有するオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデオキシリボヌクレオチドと上記以外の塩基配列を有するオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデオキシリボヌクレオチドとが結合した塩基配列を有するオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデオキシリボヌクレオチド、リン酸ジエステルの酸素原子の一部又は全部がイオウ原子に置換されたオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデオキシリボヌクレオチドのアナローグ等が挙げられる。緩衝液に含まれるオリゴヌクレオチド又はその誘導体の量は、β−１，３−グルカンの１重量％以上８０重量％以下である。
【００３４】
用いることのできる緩衝液は特に制限されないが、例えば、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）等が挙げられる。
【００３５】
＜工程（３）＞
工程３では、β−１，３−グルカンを含むアルカリ水溶液を中和する。アルカリ水溶液の中和には、酸性の水溶液が使用されるが、酸の種類としては、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、乳酸、酒石酸等の有機酸、無機又は有機多塩基酸の部分塩等が挙げられる。
【００３６】
工程（３）は、最初に実施される工程（１）の直後に実施されてもよく、工程（１）に次いで工程（２）を実施後に実施してもよいが、工程（１）の直後に実施されるのが好ましい。なお、ここで言う「直後」は、単に順序を限定するに過ぎず、各工程の時間間隔を限定するものではない。
【００３７】
＜複合体＞
上記のようにして得られるβ−１，３−グルカンの水溶液において、３本のβ−１，３−グルカンの分子鎖は、三重らせん構造を有する複合体を形成している。なお、三重らせん構造を有する複合体において、前記β−１，３−グルカンの分子鎖の一部が前記オリゴヌクレオチド又はその誘導体に置換されていてもよい。
【００３８】
複合体の分子量（モル質量）は、好ましくは１×１０５以上３×１０６以下の範囲内である。複合体の分子量は、光散乱法、ゲルろ過クロマトグラフィー等の方法を用いて測定することができる。
【００３９】
複合体は、三重らせん構造を形成しているため、ロッド状の分子構造を有している。複合体の分子構造は、多角度光散乱又はＸ線小角散乱等の任意の方法を用いて評価することができる。多角度光散乱又はＸ線小角散乱により測定した複合体の慣性半径は、好ましくは２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下である。また、Ｘ線小角散乱を用いて測定した複合体のＸ線の散乱強度Ｉを、下記の式（Ｉ）で定義されるｑ値の対数に対しプロットした場合、ｑが１０−１ｎｍ−１から１ｎｍ−１までの範囲における傾きａが、ロッド状の構造に対応する−１．５以上−０．５以下であることが好ましい。
【００４０】
【数２】
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【００４１】
なお、式（Ｉ）において、θはＸ線の散乱角を表し、λはＸ線の波長を表す。
【００４２】
β−１，３−グルカン複合体は、医薬組成物の有効成分として用いることができる。β−１，３−グルカン複合体は、中性の水溶液に可溶であり、β−１，３−グルカンの有する、免疫賦活活性等の生理活性を損なうことなく有しているため、免疫賦活剤や、Ｄｅｃｔｉｎ−１発現細胞へのドラッグデリバリー用の担体等の用途に用いることができる。また、β−１，３−グルカン複合体に含まれるオリゴヌクレオチド又はその誘導体の有する生理活性を有する医薬組成物として用いることもできる。例えば、オリゴヌクレオチド又はその誘導体が、ＣｐＧ配列等の免疫賦活活性を有する塩基配列を有している場合、アジュバントとして用いることもできる。
【００４３】
医薬組成物は、β−１，３−グルカン複合体以外に、その他の薬効成分、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤等の医薬として用いることができる任意の成分を更に含んでいてもよい。
【実施例】
【００４４】
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
実施例１：Ｋ３−ｄＡ４０とＬＮＴとの複合体（Ｋ３−ＬＮＴ複合体）の調製
レンチナン（ＬＮＴ：味の素製薬株式会社）６．０ｍｇを、５０ｍｇ／ｍＬとなるように、０．２５Ｎ  ＮａＯＨ溶液１２０μＬに溶解した。溶解後、注射用水３６０μＬを添加し、続いて３３０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４溶液１２０μＬを添加して、中和を行った（ＬＮＴ濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）。４℃で一晩静置した。１．０ｍｇのＫ３−ｄＡ４０（塩基配列は、下記の配列番号１参照）を２．０８ｍｇ／ｍＬとなるように、注射用水４８０．３μＬに溶解し、上述の１０ｍｇ／ｍＬのＬＮＴ溶液１０８．９μＬ（１０８９．３μｇ）と混合した。更に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を４１０．８μＬ添加した後、４℃にて３日間静置して反応を完了した。各成分の終濃度は、Ｋ３−ｄＡ４０が１０００μｇ／ｍＬ、ＬＮＴが１０８９μｇ／ｍＬとなった。Ｋ３−ｄＡ４０とＬＮＴとの複合体（以後、Ｋ３−ＬＮＴと表記する）の形成は、サイズ排除クロマトグラフィーを用い、Ｋ３−ｄＡ４０の高分子量側へのシフトを、２６０ｎｍにおける吸収をモニタリングすることによって確認した。
【００４５】
配列番号１：ＡＴＣＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣ−ｄＡ４０（全てホスホロチオエート体）
【００４６】
分析条件は下記のとおりである。
システム：Agilent 1260 series
カラム：Asahipak GS−520 HQ (Shodex)−GS−320 HQ (Shodex)
流速：0.5 mL/min
バッファー：100 mM Phosphate Buffer, pH7.4
温度：４０℃
【００４７】
上記の分析条件における、Ｋ３−ｄＡ４０及びＫ３−ＬＮＴ複合体の保持時間、Ｋ３−ｄＡ４０の複合体形成率（仕込みのＫ３−ｄＡ４０のうち、ＬＮＴとの複合体を形成した割合）（％）を表１に示す。その結果、Ｋ３−ｄＡ４０のピークシフトの割合から、約４５％のＫ３−ｄＡ４０がＫ３−ＬＮＴ複合体を形成することが証明された。すなわちＬＮＴを中和処理した後にＫ３−ｄＡ４０を添加した場合でも、ＬＮＴとＫ３−ｄＡ４０が複合体を形成することが示された。
【００４８】
実施例２：Ｋ３−ｄＡ４０とＬＮＴとの複合体（Ｋ３−ＬＮＴ複合体）の調製
実施例１と同様にしてＫ３−ｄＡ４０とＬＮＴを混合した。反応完了前に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて５倍希釈し、サンプル中の各成分の終濃度を、Ｋ３−ｄＡ４０については２００μｇ／ｍＬ、ＬＮＴについては２１８μｇ／ｍＬとして、３日間静置し反応を完了した。
【００４９】
実施例１に記載の分析条件における、Ｋ３−ｄＡ４０及びＫ３−ＬＮＴ複合体の保持時間、Ｋ３−ｄＡ４０の複合体形成率（％）を表１に示す。その結果、Ｋ３−ｄＡ４０のピークシフトの割合から、約４２％のＫ３−ｄＡ４０がＫ３−ＬＮＴ複合体を形成することが証明された。ＬＮＴを中和処理した後にＫ３−ｄＡ４０を添加した場合でも、ＬＮＴとＫ３−ｄＡ４０が複合体を形成することが示された。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
実施例３：Ｋ３−ｄＡ４０とＬＮＴとの複合体（Ｋ３−ＬＮＴ複合体）の調製
実施例１と同様にして、反応を行った。ただし、ＬＮＴを０．２５Ｎ  ＮａＯＨにて５０ｍｇ／ｍＬに溶解後、２４時間静置した後に、それに続く操作を実施した。
【００５２】
実施例１に記載の分析条件における、Ｋ３−ｄＡ４０及びＫ３−ＬＮＴ複合体の保持時間、Ｋ３−ｄＡ４０の複合体形成率（％）を表１に示す。その結果、Ｋ３−ｄＡ４０のピークシフトの割合から、約５５％のＫ３−ｄＡ４０がＫ３−ＬＮＴ複合体を形成することが証明された。ＬＮＴを中和処理した後にＫ３−ｄＡ４０を添加した場合でも、ＬＮＴとＫ３−ｄＡ４０が複合体を形成することが示された。
【配列表】
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