(57)【要約】【課題】安全性の高い乳酸菌から単離されたべん毛タンパク質抗原の免疫学的活性を、遺伝子組み換えにより向上させる技術を提供する。【解決手段】べん毛を有する乳酸菌由来のフラジェリンを構成するアミノ酸配列のうち、下記（ａ）（ｂ）、下記（ｂ）（ｃ）及び下記（ａ）（ｂ）（ｃ）からなる群から選択された少なくとも１のアミノ酸配列を有することを特徴とする、免疫学的活性が向上した変異型フラジェリンにより解決する。  （ａ）８８番目がグルタミン  （ｂ）２１３番目がイソロイシン  （ｃ）２３３番目がアルギニン【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
べん毛を有する乳酸菌由来のフラジェリンを構成するアミノ酸配列のうち、下記（ａ）（ｂ）、下記（ｂ）（ｃ）及び下記（ａ）（ｂ）（ｃ）からなる群から選択された少なくとも１のアミノ酸配列を有することを特徴とする、免疫学的活性が向上した変異型フラジェリン。
（ａ）８８番目がグルタミン（Q）
（ｂ）２１３番目がイソロイシン（I）
（ｃ）２３３番目がアルギニン（R）
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、配列番号：１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の変異型フラジェリン。
【請求項３】
前記乳酸菌が、ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）である、請求項１又は２に記載の変異型フラジェリン。
【請求項４】
請求項２における変異型フラジェリンをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号：２の塩基配列を有する、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１に記載の変異型フラジェリンを産生するように組換えられた、ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）変異株。
【請求項７】
前記ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）変異株が、ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２５６１）である、請求項６に記載のラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）変異株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学的活性が向上した変異型フラジェリン、該変異型フラジェリンをコードするポリヌクレオチド及び該変異型フラジェリンを産生するラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）変異株に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は一般的に非運動性であるが、そのうちのいくつかはべん毛を有し運動性を示す。ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）は主にウシ、ブタ、鳥類等の恒温動物から単離されているべん毛微生物の代表である。これまでに、ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）についてのいくつかの研究が行われたが、それらの特性はほとんど理解されていない。
【０００３】
べん毛は複雑なタンパク質構造を有し、それらのフィラメントはフラジェリンと呼ばれるサブユニットタンパク質で構成されている。フラジェリンはまた、パターン認識受容体の1つであるToll様受容体5（TLR5）のリガンドとしても知られている。
【０００４】
従前の研究では、Nevilleらがラクトバチルス・ルミニス（Lactobacillus ruminis）の運動性関連遺伝子の遺伝的および転写的解析について報告した。この報告においてラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）のフラジェリンは含まれていなかったが、ラクトバチルス・ルミニス（Lactobacillus ruminis）およびTLR5を介していくつかの他のべん毛乳酸菌から単離されたフラジェリンの免疫学的活性が報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
また、特開２００９−１５５２２１号公報には、病原菌のべん毛を、インターロイキン１２産生誘導能を有する乳酸菌（ラクトバチルス・カゼイ又はラクトバチルス・ラムノーサス）の生菌又は加熱菌体（死菌）に作用させると、インターロイキン１２産生が促進されることが記載されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１５５２２１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Neville et al., PLoS One, 2012 ; 7 : e40592, doi :  10. 1371/journal. pone. 0040592.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌は「乳酸菌」と呼ばれる細菌群の 1 つであり、古くからヨーグルト製造のスターター等として利用されている安全性の高い細菌群であり、また、免疫刺激作用を持つことから、プロバイオティクスやワクチンデリバリーへの応用が可能である。
【０００９】
しかしながら、一般的に乳酸菌が持つ免疫刺激作用は限定的であり、その改善が従来からの課題であった。また、ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）のべん毛タンパク質も、免疫刺激活性は既知のべん毛タンパク質によるものと比較すると著しく弱いという問題があった。一方、病原菌のべん毛を利用する従来技術では、プロバイオティクスやワクチンデリバリーへ応用する場合、その安全性が問題となっていた。
【００１０】
従って本発明の目的は、安全性の高い乳酸菌から単離されたべん毛タンパク質抗原の免疫学的活性を、遺伝子組み換えにより向上させる技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）のべん毛由来のフラジェリンを構成するアミノ酸の一部を他のアミノ酸に組み替えることにより、免疫学的活性が野生株と比較して顕著に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、べん毛を有する乳酸菌由来のフラジェリンを構成するアミノ酸配列のうち、下記（ａ）（ｂ）、下記（ｂ）（ｃ）及び下記（ａ）（ｂ）（ｃ）からなる群から選択された少なくとも１のアミノ酸配列を有することを特徴とする、免疫学的活性が向上した変異型フラジェリンを提供するものである。
（ａ）８８番目がグルタミン（Q）
（ｂ）２１３番目がイソロイシン（I）
（ｃ）２３３番目がアルギニン（R）
【００１３】
また、本発明は、前記変異型フラジェリンをコードする、ポリヌクレオチドを提供するものである。
【００１４】
さらに、本発明は、前記変異型フラジェリンを産生するように組換えられた、ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）変異株を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、1nMのサルモネラ菌由来フラジェリンが示す活性と同等の活性を示すのに、野生型フラジェリンでは1μM（1000倍）の濃度を要していたのに対し、10nM（10倍）で済むような免疫学的活性が向上したべん毛タンパク質抗原を製造することが可能になる。また、フラジェリンが乳酸菌のべん毛タンパク質を由来とすれば、安全性が高まり、プロバイオティクスやワクチンデリバリーへの応用がより現実的なものとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本実施形態に係るフラジェリンタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】変異型フラジェリンタンパク質の免疫学的活性を検討した結果を示す図である。
【図３】ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）変異株と野生株の免疫学的活性を比較した結果を示す図である。
【図４】サルモネラ菌、リステリア菌、乳酸菌（L. agilis）から精製したフラジェリンの免疫学的活性を評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明に係る実施形態について詳細に説明する。本実施形態の変異型フラジェリンは、べん毛を有する乳酸菌由来のフラジェリンを構成するアミノ酸配列のうち、下記（ａ）（ｂ）、下記（ｂ）（ｃ）及び下記（ａ）（ｂ）（ｃ）からなる群から選択された少なくとも１のアミノ酸配列を有することを特徴とする。
（ａ）８８番目がグルタミン（Q）
（ｂ）２１３番目がイソロイシン（I）
（ｃ）２３３番目がアルギニン（R）
【００１８】
本実施形態において、変異型フラジェリンは、アミノ酸配列として、配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
本実施形態において、免疫学的活性とは、動物細胞側のToll-like receptor 5 (TLR5)がフラジェリンと結合したときに適切な動物または細胞において特異的免疫応答を引き起こすサイトカイン産生誘導の能力を意味する。
【００２０】
本実施形態において、べん毛を有する乳酸菌としては、ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）、ラクトバチルス・ガネンシス（L. ghanensis）、ラクトバチルス・マリ（L. mali）、ラクトバチルス・ナジェリー（L. nagelii）、ラクトバチルス・ルミニス（L. ruminis）、ラクトバチルス・サツメンシス（L. satsumensis）、ラクトバチルス・ヴィニ（L. vini）、ラクトバチルス・アシディピシス（L. acidipiscis）、ラクトバチルス・クルバタス（L. curvatus）、ラクトバチルス・ウヴァラム（L. uvarum）、ラクトバチルス・アクアティカス（L. aquaticus）、ラクトバチルス・オエニ（L. oeni）、ラクトバチルス・スシコラ（L. sucicola）、を挙げることができる。発明者による研究では、有べん毛ラクトバチルス属細菌13種の遺伝子情報から調べた限りでは、これらの菌種すべてにおいて８８番目のアミノ酸残基はグルタミン（Q）ではないという共通点を有している。
【００２１】
本実施形態において、前記変異型フラジェリンをコードするポリヌクレオチドの一例として、配列番号：２で示される塩基配列を有する。なお、グルタミン（Q）、イソロイシン（I）、アルギニン（R）に対応するコドンは複数存在するが、それらのいずれも適応可能である。
【００２２】
前記変異型フラジェリンをコードするポリヌクレオチドは、目的の（変異型の）配列を含むオリゴDNA（PCRプライマー）を化学合成し、ラクトバチルス・アジリス（L. agilis）野生株の染色体DNAを鋳型にしたPCRを行うことで、変異型フラジェリン遺伝子断片を得ることができる。このPCRは変異を導入する箇所の数に応じた複数のDNA断片（１か所であれば２断片、２か所であれば３断片、３箇所であれば４断片）をオーバーラップPCRで繋ぎ合わせることで全長の変異型フラジェリン遺伝子となる。
【００２３】
本実施形態のラクトバチルス・アジリス（L. agilis）変異株は、先述した変異型フラジェリンを産生するように組換えられたものである。
【００２４】
ラクトバチルス・アジリス（L. agilis）変異株は、組換え技術を使用する場合、上述の変異型フラジェリン遺伝子断片を含む任意のプラスミドDNAを作製し、これを野生型ラクトバチルス・アジリス（L. agilis）に導入する。その後、当該プラスミドが染色体上の目的部位（野生型フラジェリン遺伝子近傍）に導入された菌株をPCRなどによって選抜する。この時点で、（導入するプラスミドの配列に依存するが）理論上は野生型フラジェリンと変異型フラジェリンの両方を発現する菌株が得られる。その後、野生型フラジェリン（と導入したプラスミド由来の配列）が脱落した菌株を得ることで、変異型フラジェリンのみを発現する菌株となる。
【００２５】
変異原性物質の場合、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン (MNNG)などの物質を一定濃度・時間でラクトバチルス・アジリス（L. agilis）（あるいはフラジェリン遺伝子を導入した大腸菌など）の菌体懸濁液を処理し、その後、寒天培地上に生育させたコロニーの中から、免疫学的活性の高い菌株を選抜することにより、ラクトバチルス・アジリス（L. agilis）変異株を得ることもできる。
【００２６】
前記ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）変異株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、２０１７年（平成２９年）１０月３１日付けで寄託されており、その受領番号はＮＩＴＥ  ＡＰ−０２５６１である。
【実施例】
【００２７】
１．各細菌由来のフラジェリンの免疫学的活性の評価
図４は、ヒト腸管上皮細胞由来Caco-2細胞にサルモネラ菌（S. Typhimurium）、リステリア菌（L. monocytogenes）、乳酸菌（ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）野生株）から精製したフラジェリンを、濃度を変えて添加し、一定時間後のインターロイキン−８（IL-8）産生量を指標として免疫学的活性を評価した結果を示す図である。
【００２８】
一部の乳酸菌はべん毛を持つが、ラクトバチルス・アジリス（L. agilis）野生株から精製したべん毛タンパク質抗原（フラジェリン）は病原菌（サルモネラ菌及びリステリア菌）由来のフラジェリンよりも免疫学的活性が著しく低いことが判明した。
【００２９】
表１は、Toll様受容体5（TLR5）と、サルモネラ菌、リステリア菌、乳酸菌（ラクトバチルス・ルミニス（L. ruminis）及びラクトバチルス・アジリス（L. agilis）野生株）、ピロリ菌、カンピロバクターの各細菌のTLR5反応の強さとアミノ酸シーケンスとの相関関係を検討した結果である。
【００３０】
表１によれば、四角い枠で囲った部分のアミノ酸と、におけるハイライト部分のアミノ酸との不一致が、ラクトバチルス・アジリス（L. agilis）野生株由来のフラジェリンの低い免疫学的活性の原因と推察された。すなわち、フラジェリンの免疫学的活性の違いは、アミノ酸配列のうち特定の３箇所（８８番目がアスパラギン[N]、２１３番目がロイシン[L]、２３３番目がグリシン[G]）が、TLR5活性が強く出るサルモネラ菌及びリステリア菌のアミノ酸配列（８８番目のグルタミン[Q]、２１３番目のイソロイシン[I]、２３３番目のアルギニン[R]）と一致しないことが原因であると示唆された。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
２．変異型フラジェリン
（１）変異型フラジェリンの作製
乳酸菌ラクトバチルス・アジリス（L. agilis）由来のフラジェリン遺伝子をプラスミドpQE31（QIAGEN社）に挿入し、大腸菌へ導入することで、組換えタンパク質（変異型フラジェリン）として発現させた。この際、フラジェリンを構成するアミノ酸配列が変化するような遺伝子変異を、変異用プライマーを用いたオーバーラップPCR法により作製したものを用いた。
【００３３】
図１は、変異型フラジェリンタンパク質をコードする遺伝子(fliC2)の塩基配列（配列番号：１）を示す図である。ハイライト部分は当該アミノ酸をコードするコドン（配列）を示す。この変異型フラジェリンは、８８番目のAAC（アスパラギン）をCAA（グルタミン）に、２１３番目のTTA（ロイシン）をATA（イソロイシン）に、２３３番目のGGT（グリシン）をAGA（アルギニン）に、それぞれ変異させたものである。
【００３４】
上述の手法により、８８番目のAAC（アスパラギン）、２１３番目のTTA（ロイシン）、２３３番目のGGT（グリシン）に、少なくとも１箇所（最大３箇所）に変異を加えた変異型フラジェリンタンパク質を精製した。表２に、各変異型フラジェリンタンパク質の変異箇所を示す。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
（２）変異型フラジェリンの免疫学的活性の評価
作製した各変異型フラジェリンについて、先述と同様のCaco-2を用いた試験により、免疫学的活性を評価した。
【００３７】
図２は、変異型フラジェリンタンパク質の免疫学的活性を検討した結果を示す図である。図２に示すように、８８番目のAAC（アスパラギン）、２１３番目のTTA（ロイシン）、２３３番目のGGT（グリシン）の３箇所をそれぞれCAA（グルタミン）、ATA（イソロイシン）、AGA（アルギニン）に置換した変異型フラジェリンFla[QIR]（N88Q, L213I, G233R）において最も免疫学的活性が向上することが判明した。この変異型フラジェリンは、サルモネラ菌由来フラジェリン（FliC-SE WT）と同等の免疫学的活性であった。
【００３８】
そのほか、８８番目のAAC（アスパラギン）、２３３番目のGGT（グリシン）の２箇所をそれぞれCAA（グルタミン）、AGA（アルギニン）に置換した変異型フラジェリンFla[QR]（N88Q, G233R）や、８８番目のAAC（アスパラギン）、２１３番目のTTA（ロイシン）、の２箇所をそれぞれCAA（グルタミン）、ATA（イソロイシン）に置換した変異型フラジェリンFla[QI]（N88Q, L213I）も、比較的高い免疫学的活性が認められた。
【００３９】
３．ラクトバチルス・アジリス（L. agilis）変異株
（１）ラクトバチルス・アジリス（L. agilis）変異株の作製
変異型フラジェリンFla[QIR]遺伝子を含むポリヌクレオチド（配列番号：１）を用いてラクトバチルス・アジリス（L. agilis）がもつ野生型FliC[NLG]を相同組換えにより置換し、ラクトバチルス・アジリス（L. agilis）変異株FliC[QIR]を作製した。
【００４０】
（２）ラクトバチルス・アジリス（L. agilis）変異株の免疫学的活性の評価
ラクトバチルス・アジリス（L. agilis）の野生株（WT FliC[NLG]）と変異株（Mut FliC[QIR]）の培養上清5%で刺激したCaco-2細胞細胞から産生されたIL-8を定量した。
【００４１】
結果を図３に示す。図３に示すように、ラクトバチルス・アジリス（L. agilis）の変異株（Mut FliC[QIR]）の免疫学的活性は、野生株と比べて大幅に上昇した。具体的には、1nMのサルモネラ菌由来フラジェリンが示す活性と同等の活性を示すのに、野生型フラジェリンでは1μM（1000倍）の濃度を要していたのに対し、10nM（10倍）で済むような免疫学的活性が向上したべん毛タンパク質抗原を製造することが可能になることが判明した。
【００４２】
以上の結果から、フラジェリンに特定のアミノ酸変異を導入することにより、ラクトバチルス・アジリス（L. agilis）の免疫学的活性を顕著に向上させることができることが判明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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