(57)【要約】【課題】標的認識部位に付加するヌクレオチド数が少ないにもかかわらず、部位特異的編集を誘導可能な短鎖型の編集ガイドＲＮＡを提供する。【解決手段】標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドとを備え、前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１５から３０残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から４残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第二オリゴヌクレオチドは、２から２４個のヌクレオチド残基からなり、前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチドである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドとを備え、
前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、
前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１５から３０残基のオリゴヌクレオチドと、
前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３又は４残基のオリゴヌクレオチドとからなり、
前記第二オリゴヌクレオチドは、２から２４個のヌクレオチド残基からなり、
前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記第二オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して非相補的な塩基配列を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記第二オリゴヌクレオチドは、前記第一オリゴヌクレオチドに隣接して連結するグアノシン残基又はその誘導体を含む請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記第二オリゴヌクレオチドが、ステムループ構造を形成し得る塩基配列を有する請求項１から３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記第二オリゴヌクレオチドは、５’側のステム部分に、連続する２又は３のグアニンからなる塩基配列、連続するウラシル及びグアニンからなる塩基配列、及び連続するグアニン、ウラシル及びグアニンからなる塩基配列からなる群から選択される少なくとも１種を含み、３’側のステム部分にこれらと相補対を形成可能な塩基配列を含む請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記第二オリゴヌクレオチドは、５’側のステム部分のループ部分に連結する領域に、連続するグアニン、ウラシル及びグアニンからなる塩基配列を含み、３’側のステム部分にこれらと相補対を形成可能な塩基配列を含む請求項４又は５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記標的対応ヌクレオチド残基が、シチジン残基、ウリジン残基、アデノシン残基又はそれらの誘導体である請求項１から６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記部位特異的編集は、アデノシンデアミナーゼによる酵素反応に起因する請求項１から７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドと、標的ＲＮＡとを、アデノシンデアミナーゼの存在下に、接触させることを含む標的ＲＮＡの部位特異的編集方法。
【請求項１０】
真核細胞中で行われる請求項９に記載の編集方法。
【請求項１１】
編集標的となるアデノシン残基を含む標的ＲＮＡを選択することと、
前記標的ＲＮＡが有する、前記アデノシン残基の３’側の１５から３０残基分の第一塩基配列、前記アデノシン残基の５’側の３又は４残基分の第二塩基配列、及び前記第二塩基配列の５’側に隣接する少なくとも２残基分の第三塩基配列を取得することと、
前記第一塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと前記アデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記第二塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記第三塩基配列に対して相補的又は非相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとが、５’側から順に連結したオリゴヌクレオチドを準備することと、
を含むオリゴヌクレオチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチド、その製造方法及び標的ＲＮＡの部位特異的編集方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ゲノム編集技術の開発をきっかけに、生物の設計図である遺伝情報、つまりは細胞内のＤＮＡ情報を改変することで生命現象をコントロールする方法が、疾患治療アプローチとして医療や創薬分野で用いられ始めている。ＤＮＡは細胞内で恒常的且つ不変的な分子であるため、ＤＮＡ改変効果は対象細胞又は対象生物に永続的に残り続ける。一方、ＲＮＡはＤＮＡ情報が写し取られた核酸分子であり、ＤＮＡとは異なり、合成・分解が繰り返される一過的な遺伝情報分子である。従ってＲＮＡ情報の改変は対象生物に永続的ではない一時的な遺伝情報改変効果を与えることができる。つまり、ＲＮＡ改変技術はＤＮＡ改変と同じく遺伝子改変技術ではあるものの、その性質は大きく異なる。
【０００３】
ＲＮＡ改変技術として、例えば、特許文献１には、標的ＲＮＡの一部に相補的なアンチセンス配列を含む標的指向性部分と、細胞に存在し、ヌクレオチドの編集を行うことができるＲＮＡ編集実体に結合してリクルートすることができるリクルート部分とを含む、標的ＲＮＡ配列中のヌクレオチドの部位特異的編集のためのオリゴヌクレオチド構築物が記載されている。また例えば、特許文献２には、標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡとの複合体に二本鎖特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を作用させる部位特異的ＲＮＡ変異導入方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１６／０９７２１２号
【特許文献２】国際公開第２０１７／０１０５５６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載のオリゴヌクレオチド構築物は、標的指向性部位に加えて、リクルート部分として特定の反復配列を有するステムループ構造を有しており、リクルート部分には１６以上のオリゴヌクレオチドを必要とする。また特許文献２に記載の標的編集ガイドＲＮＡは、アンチセンス領域に加えて、４０又は４９残基の特定配列からなるステムループ構造を有するＡＤＡＲ結合領域を必要とする。特許文献１又は２に記載のＲＮＡ改変技術に適用されるオリゴヌクレオチドは、いずれも標的ＲＮＡと二重鎖を形成する部位に加えて、ＡＤＡＲと結合するある程度の長さを有する分子内二本鎖領域が必須であり、必然的にオリゴヌクレオチドとしての全長が長くなる傾向があった。
【０００６】
本発明は、標的認識部位に付加するヌクレオチド数が少ないにもかかわらず、部位特異的編集を誘導可能な短鎖型の標的編集ガイドＲＮＡを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りであり、本発明は以下の態様を包含する。
第一態様は、標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドとを備え、前記第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１５から３０残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３から４残基のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第二オリゴヌクレオチドは、２から２４個のヌクレオチド残基からなり、前記標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチドである。
【０００８】
第二態様は、標的ＲＮＡと標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチドとを、アデノシンデアミナーゼの存在下に、接触させることを含む標的ＲＮＡの部位特異的編集方法である。
【０００９】
第三態様は、編集標的であるアデノシン残基を含む標的ＲＮＡを選択することと、前記標的ＲＮＡが有する、前記アデノシン残基の３’側の１５から３０残基分の第一塩基配列、前記アデノシン残基の５’側の３又は４残基分の第二塩基配列、及び前記第二塩基配列の５’側に隣接する少なくとも２残基分の第三塩基配列を取得することと、前記第一塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、アデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記第二塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記第三塩基配列に対して相補的又は非相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとが５’側から順に連結したオリゴヌクレオチドを準備することと、を含むオリゴヌクレオチドの製造方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、標的認識部位に付加するヌクレオチド数が少ないにもかかわらず、部位特異的編集を誘導可能な短鎖型の標的編集ガイドＲＮＡを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】標的編集ガイドＲＮＡの編集誘導活性を示す図である。
【図２Ａ】標的編集ガイドＲＮＡと標的ＲＮＡの複合体の一例を示す概略図である。
【図２Ｂ】標的編集ガイドＲＮＡの構造の一例を示す概略図である。
【図３】細胞内における標的編集ガイドＲＮＡの編集誘導活性を示す図である。
【図４】細胞内における標的編集ガイドＲＮＡの編集誘導活性を示す図である。
【図５】ＡＤＡＲ結合領域の配列が異なる標的編集ガイドＲＮＡの編集誘導活性を示す図である。
【図６】標的編集ガイドＲＮＡの構造の一例を示す概略図である。
【図７】ｈＡＤＡＲを発現する細胞内における標的編集ガイドＲＮＡの編集誘導活性を示す図である。
【図８】ＡＤＡＲ結合領域の残基数と編集誘導活性の関係を示す図である。
【図９】標的編集ガイドＲＮＡの編集位置の特異性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【００１３】
標的編集ガイドＲＮＡ
標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチド（以下、標的編集ガイドＲＮＡともいう）は、標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドとを備える。第一オリゴヌクレオチドは、前記標的ＲＮＡ中のアデノシン残基に対応し、前記アデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する１５から３０残基のオリゴヌクレオチドと、前記標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、前記標的ＲＮＡに相補的な塩基配列を有する３又は４残基のオリゴヌクレオチドとからなる。第二オリゴヌクレオチドは、２から２４個のヌクレオチド残基からなり、前記標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して相補的又は非相補的な塩基配列を有する。
【００１４】
標的編集ガイドＲＮＡが、標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドの３’側に、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して相補的又は非相補的な配列を有する短鎖の第２オリゴヌクレオチドを有することで、優れた部位特異的編集を誘導することができる。これは例えば、標的編集を触媒するＡＤＡＲが、標的ＲＮＡと第一オリゴヌクレオチドとからなる二本鎖領域を認識した上で、標的ＲＮＡと二本鎖を形成せず、標的ＲＮＡから遊離した状態で存在し得る第二オリゴヌクレオチドによって、その編集活性が増進されるためと考えられる。すなわち、標的編集ガイドＲＮＡにおいては、第一オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡに対する相補領域（アンチセンス領域；ＡＳＲ）として機能し、第二オリゴヌクレオチドが編集増進領域、ＡＤＡＲ結合領域（ＡＤＡＲリクルーティング領域；ＡＲＲ）等として機能すると考えられる。
【００１５】
本実施形態の標的編集ガイドＲＮＡにおいては、従来型の標的編集ガイドＲＮＡと比較して長さが短い分、単純に製造コストが削減される。また、化学合成が容易になることから、遺伝子発現により標的編集ガイドＲＮＡを細胞に導入する方法に加えて、化学的に合成した標的編集ガイドＲＮＡを直接細胞導入する方法が容易になる。またそれに付随して、核酸医薬品開発等で用いられる既存の人工核酸等を標的編集ガイドＲＮＡに適用できる。これにより、細胞内分解耐性の向上、細胞導入効率の向上等により、更なる高機能な標的編集ガイドＲＮＡを提供することが可能になる。さらに標的編集ガイドＲＮＡが編集誘導に必要な最小限残基数で構成されることで、標的ＲＮＡに対する特異性を維持しつつ、編集標的であるアデノシン残基以外の位置におけるオフターゲット編集を抑制することができる。
【００１６】
標的編集ガイドＲＮＡは、例えば、標的編集を触媒するＡＤＡＲを標的ＲＮＡにリクルートすることで、標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導する。ＡＤＡＲは二本鎖ＲＮＡ中のアデノシン残基を加水分解的脱アミノ化反応によりイノシン残基に変換する酵素であり、哺乳動物の細胞に広く存在する。イノシン残基は構造がグアノシン残基と類似しているため、ＲＮＡ情報の翻訳時にはグアノシン残基として翻訳され、その結果としてＲＮＡ情報が編集される。アミノ酸をコードしている部分にこのようなＲＮＡ編集が生じると、ゲノム上にＤＮＡ変異がないにも関わらずアミノ酸置換等が生じることになる。なお、哺乳類におけるＡＤＡＲには、遺伝子の異なるＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２及びＡＤＡＲ３が知られている。標的編集ガイドＲＮＡは、これらのうちＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２の標的編集活性を増進する。
【００１７】
標的編集ガイドＲＮＡは、哺乳動物の細胞に導入されると、細胞中に存在するＡＤＡＲを標的ＲＮＡにリクルートして、標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導することができる。
【００１８】
標的編集ガイドＲＮＡが含む第一オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを特定する。標的ＲＮＡは、編集対象となるアデノシン残基を含むものであれば、特に制限はなく、細胞性ＲＮＡ、ウイルス性ＲＮＡのいずれもよく、通常はタンパク質をコードするｍＲＮＡ前駆体又はｍＲＮＡである。標的ＲＮＡにおける編集部位は、非翻訳領域、スプライス領域、エクソン、イントロン、又はＲＮＡの安定性、構造もしくは機能に影響するいずれの領域に存在してもよい。また標的ＲＮＡは、修正又は変更すべき変異を含むものであってもよい。あるいは標的ＲＮＡはその配列が、天然型とは異なる表現型をコードするように変異されたものであってもよい。
【００１９】
標的ＲＮＡは、タンパク質をコードするＲＮＡであることが好ましく、コードされるタンパク質として具体的には、セロトニン受容体、グルタミン酸受容体、膜電位依存型カリウムチャネル、ＳＴＡＴ３、ＮＦｋＢＩＡ、ＭＡＰＫ１４等のシグナル伝達に関わるリン酸化タンパク質などを挙げることができる。
【００２０】
標的編集ガイドＲＮＡは、例えば遺伝性疾患の治療に適用することができる。遺伝性疾患としては、嚢胞性線維症、白皮症、α−１アンチトリプシン欠損症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β−サラセミア、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺（ＣＯＰＤ）、遠位脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、ジストロフィー表皮水疱症、Ｅｐｉｄｅｒｍｙｌｏｓｉｓ水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連する障害、家族性腺腫、ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース−６−リン酸脱水素酵素欠損症、血友病、遺伝性ヘマクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュニャン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張型ジストロフィー型Ｉ及びＩＩ、神経線維腫症、ニーマン−ピック病Ａ、Ｂ及びＣ型、ＮＹ−ｅｓｏ１関連膵臓癌、パーキンソン病、ポイツ−ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性毛様体病、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ突然変異のようなプロトロンビン変異関連疾患、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホッフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、癌の様々な形態（例えばＢＲＣＡ１及び２関連乳癌、卵巣癌等）などが挙げられる。
【００２１】
第一オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡ中の編集標的となるアデノシン残基に対応し、編集標的のアデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結し、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する１５から３０残基の５’側オリゴヌクレオチドと、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結し、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する３又は４残基の３’側オリゴヌクレオチドとからなる。標的対応ヌクレオチド残基の５’側と３’側にそれぞれ連結するオリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡと二本鎖を形成することで、標的ＲＮＡ、及び標的ＲＮＡにおける編集標的部位が特定される。
【００２２】
標的対応ヌクレオチド残基は、編集標的となるアデノシン残基に対応するヌクレオチド残基であり、例えばシチジン残基、ウリジン残基、アデノシン残基又はそれらの誘導体である。標的対応ヌクレオチド残基は、好ましくは編集標的となるアデノシン残基と塩基対を形成しない塩基であり、より好ましくはシチジン残基又はその誘導体であり、さらに好ましくはシチジン残基である。
【００２３】
標的対応ヌクレオチド残基の５’側又は３’側に連結するオリゴヌクレオチドの塩基配列は、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に相補的な塩基配列である。標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチド残基数は、標的ＲＮＡに対する特異性の観点から、例えば１５から２６、又は１５から２０である。なお、標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドの５’側には、必要に応じて発現を制御する付加配列が、別途１から６残基程度連結していてもよい。また標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチド残基数は、編集活性の観点から、好ましくは３である。
【００２４】
第二オリゴヌクレオチドは、２以上２４以下のヌクレオチド残基からなり、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して相補的又は非相補的な塩基配列を有する。第二オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡに対して相補的な塩基対を形成せず、標的ＲＮＡから遊離した状態となり得ることが好ましい。詳細なメカニズムは不明であるが、この遊離状態のオリゴヌクレオチド鎖の存在が、ＡＤＡＲの編集活性の増進に寄与していると考えられる。また第二オリゴヌクレオチドは、標的対応ヌクレオチド残基に隣接して連結するグアノシン残基を含むことが好ましい。詳細な理由は不明であるが、第二オリゴヌクレオチドが、標的対応ヌクレオチド残基に隣接して連結するグアノシン残基を含む２残基以上のオリゴヌクレオチドであるとＡＤＡＲの編集活性がより増進される傾向がある。
【００２５】
また、第二オリゴヌクレオチド（例えば、ＡＲＲ）は、標的ＲＮＡを特定する第１オリゴヌクレオチドの３’側に連結することで、部位特異的編集を効率的に誘導するが、５’側に連結する場合には部位特異的編集の誘導能が低下する。一方、従来の標的編集ガイドＲＮＡでは、第１オリゴヌクレオチドの３’側及び５’側のいずれにＡＤＡＲ結合領域（ＡＲＲ）が連結しても部位特異的編集を誘導することができる。従って、本実施形態に係る標的編集ガイドＲＮＡは、従来の標的編集ガイドＲＮＡとは、部位特異的編集を誘導するメカニズムが異なるものと考えられる。
【００２６】
第二オリゴヌクレオチドの残基数は２以上２４以下であるが、好ましくは２０以下、より好ましくは１６以下であり、さらに好ましくは１５以下、特に好ましくは１４以下であり、また、例えば、３以上であり、４以上、８以上、１２以上、又は１３以上である。一方、第二オリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して相補的な配列を有する場合、第二オリゴヌクレオチドの残基数は、例えば２２以下である。
【００２７】
第二オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して非相補的な配列を有する場合、全体として非相補的な塩基配列を有していればよく、第二オリゴヌクレオチド中に標的ＲＮＡと相補的な塩基対を形成し得るヌクレオチド残基を含むことを排除するものではない。第二オリゴヌクレオチドとこれに対応する標的ＲＮＡの塩基配列における非相補的な塩基配列の含有率は、例えば５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上である。ここで非相補的な塩基配列の含有率は、対応する塩基対のうち非相補的な塩基の組合せとなるヌクレオチド残基数を、第二オリゴヌクレオチドの残基数で除して算出される。
【００２８】
第二オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して非相補的な配列を有する場合、第二オリゴヌクレオチドの塩基配列は、標的ＲＮＡの対応する塩基配列等に応じて適宜選択されればよい。例えば、標的ＲＮＡの対応する塩基がピリミジン塩基の場合は、第二オリゴヌクレオチドの対応する塩基として、塩基対を形成しないプリン残基又はピリミジン塩基を選択すればよく、好ましくはピリミジン塩基である。また標的ＲＮＡの対応する塩基がプリン残基の場合は、第二オリゴヌクレオチドの対応する塩基として、塩基対を形成しないピリミジン残基又はプリン塩基を選択すればよく、好ましくはプリン残基である。具体的には、標的ＲＮＡの対応する塩基がシトシン（Ｃ）の場合、第二オリゴヌクレオチドの対応する塩基としては、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を選択すればよく、好ましくはＣ又はＵである。標的ＲＮＡの対応する塩基がウラシル（Ｕ）の場合、第二オリゴヌクレオチドの対応する塩基としては、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ）を選択すればよく、好ましくはＵ又はＣである。標的ＲＮＡの対応する塩基がアデニン（Ａ）の場合、第二オリゴヌクレオチドの対応する塩基としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）又はシトシン（Ｃ）を選択すればよく、好ましくはＡ又はＧである。標的ＲＮＡの対応する塩基がグアニン（Ｇ）の場合、第二オリゴヌクレオチドの対応する塩基としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）又はウラシル（Ｕ）を選択すればよく、好ましくはＡ又はＧである。標的ＲＮＡの対応する塩基配列に対して非相補的な配列を有する第二オリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば、ＧＧＧ、ＧＧ、ＧＣ、ＧＡ、ＧＵ、ＵＣ、ＵＧ、ＵＡ、ＵＵ、ＣＧ、ＣＡ、ＣＵ、ＣＣ、ＡＧ、ＡＡ、ＡＣ、ＡＵ等を含む配列を挙げることができる
【００２９】
第二オリゴヌクレオチドは、分子内でステムループ構造を形成し得る塩基配列を有していてもよい。標的編集ガイドＲＮＡがステムループ構造を有することで、編集活性がより増進される傾向がある。これは例えば、第二オリゴヌクレオチドがステムループ構造を形成することによって、標的ＲＮＡからの遊離状態がより安定するためと考えられる。ステムループ構造は、相補的塩基対によって分子内で二重鎖を形成するステム部分と、ステム部分を構成する２つのオリゴヌクレオチドを連結するループ部分とを含む。ステム部分を構成するヌクレオチド残基対の数は、例えば、２対以上であり、好ましくは３対以上、４対以上、５対以上、又は６対以上であり、また、１０対以下であり、９対以下、８対以下、又は７対以下である。またループ部分を構成するヌクレオチド残基数は、例えば４又は５である。
【００３０】
第二オリゴヌクレオチドがステムループ構造を形成する場合、第二オリゴヌクレオチドの塩基配列は、ステムループ構造を形成し得る限り特に制限はされない。但し、第二オリゴヌクレオチドが、（ＲＹ又はＹＲ）ｎＮｍ（ＲＹ又はＹＲ）ｎで表される塩基配列を有する場合は除かれる。ここで、Ｒはアデノシン又はグアノシンであり、Ｙはウリジン又はシチジンであり、Ｎはアデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン又はイノシンである。ｍは３以上であり、ｎは４以上である。また２つの（ＲＹ）ｎ又は（ＹＲ）ｎで表される塩基配列は、相補塩基対によって二重鎖のステム構造を形成する。
【００３１】
ステムループ構造を形成する第二オリゴヌクレオチドの塩基配列として具体的には、ステム部分の塩基配列が、二本鎖構造の安定性の観点から、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）を含むことが好ましい。ステム部分の塩基対中のＧ−Ｃ対の割合は、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上である。なお、シトシン（Ｃ）に代えて、互変異性によりグアニン（Ｇ）と塩基対を形成可能なウラシル（Ｕ）を含んでいてもよい。
【００３２】
また、第二オリゴヌクレオチドの塩基配列は、標的編集活性の観点から、５’側のステム部分に、連続する２又は３のグアニンからなる配列（ＧＧ又はＧＧＧ）、連続するウラシル及びグアニンからなる配列（ＵＧ）、及び連続するグアニン、ウラシル及びグアニンからなる配列（ＧＵＧ）からなる群から選択される少なくとも１種を含み、３’側のステム部分にこれらと相補対を形成可能な配列（例えば、ＣＣ、ＣＣＣ、ＣＣＵ、ＣＡ、ＣＡＣ）を含むことが好ましい。また、５’側のステム部分にループ部分と連続するグアニン、ウラシル及びグアニンからなる配列（ＧＵＧ）を含み、３’側のステム部分にこれと相補対を形成可能な配列（例えば、ＣＡＣ）を含むこともまた好ましい。
【００３３】
第二オリゴヌクレオチドのループ部分は、例えば４又は５残基の任意配列であってよい。ループ部分の配列として具体的には、例えば、ＧＣＵＡＡ；ＵＵＣＧ、ＵＡＣＧ、ＵＧＣＧ、ＵＣＣＧ等のＵＮＣＧフォールド型；ＧＡＡＡ、ＧＵＡＡ、ＧＣＡＡ、ＧＧＡＡ、ＧＡＧＡ、ＧＵＧＡ、ＧＣＧＡ、ＧＧＧＡ等のＧＮＲＡフォールド型；ＧＵＣＡ、ＧＣＣＡ、ＧＧＣＡ、ＧＡＣＡ、ＡＵＣＡ、ＡＣＣＡ、ＡＧＣＡ、ＡＡＣＡ、ＧＵＵＡ、ＧＣＵＡ、ＧＧＵＡ、ＧＡＵＡ、ＡＵＵＡ、ＡＣＵＡ、ＡＧＵＡ、ＡＡＵＡ等のＲＮＹＡフォールド型；ＧＧＵＧフォールド型；ＣＵＵＧフォールド型；ＡＧＵＵ、ＡＧＵＣ、ＡＧＵＧ、ＡＧＵＡ、ＡＧＣＵ、ＡＧＣＣ、ＡＧＣＧ、ＡＧＣＡ等のＡＧＮＮフォールド型などが挙げられる。これらのループ構造の詳細については、例えば、Biophys. J.,113, 257-267, 2017を参照することができる。
【００３４】
以下に、ステムループ構造を形成し得る第二オリゴヌクレオチドの塩基配列の具体例を示すが、本発明はこれらに限定されない。また、ステムループ構造の一例を図２Ｂに併せて示す。
【００３５】
【表１】
2019097555.tif 000003
【００３６】
標的編集ガイドＲＮＡを構成するヌクレオチド残基は、天然型のリボヌクレオチド残基であっても、非天然型の修飾ヌクレオチド残基であってもよい。修飾ヌクレオチド残基には、ヌクレオシド間のホスホジエステル結合を修飾したもの、リボースの２’水酸基を修飾したもの、分子内架橋されたリボースを含むもの、プリン塩基及びピリミジン塩基の少なくとも一方を修飾したもの等が含まれる。ホスホジエステル結合部分の修飾の例としては、例えば、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、ペプチド結合置換等が挙げられる。リボースの２’水酸基の修飾の例としては、２’−Ｏ−メチル化、２’−Ｏ−メトキシエチル化、２’−Ｏ−アミノプロピル（ＡＰ）化、２’−フルオロ化、２’−Ｏ−メチルカルバモイルエチル化、３，３−ジメチルアリル化等が挙げられる。リボースの分子内架橋体の例としては、２’位と４’位が架橋したヌクレオチド（２’，４’−ＢＮＡ）が挙げられる。２’，４’−ＢＮＡには、例えば、ＬＮＡとも称されるロックド核酸（α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ又はβ−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、ＥＮＡとも称されるエチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ）、β−Ｄ−チオ（４’−ＣＨ２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ（Ｒは、Ｈ又はＣＨ３）、２’，４’−ＢＮＡＮＣとも称されるオキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ（Ｒは、Ｈ又はＣＨ３）、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣ、３’アミノ−２’，４’−ＢＮＡ，５’−メチルＢＮＡ，ｃＥｔ−ＢＮＡとも称される（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ，ｃＭＯＥ−ＢＮＡとも称される（４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ，ＡｍＮＡとも称されるアミド型ＢＮＡ（４’−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ（Ｒは、Ｈ又はＣＨ３）等が挙げられる。塩基部分の修飾の例としては、ハロゲン化；メチル化、エチル化、ｎ−プロピル化、イソプロピル化、シクロプロピル化、ｎ−ブチル化、イソブチル化、ｓ−ブチル化、ｔ−ブチル化、シクロブチル化等のアルキル化；水酸化；アミノ化；脱アミノ化；デメチル化等が挙げられる。
【００３７】
標的編集ガイドＲＮＡの製造方法
標的編集ガイドＲＮＡの製造方法は、編集標的であるアデノシン残基を含む標的ＲＮＡを選択する選択工程と、前記標的ＲＮＡが有する、前記アデノシン残基の３’側の１５から３０残基分の第一塩基配列、前記アデノシン残基の５’側の３又は４残基分の第二塩基配列、及び前記第二塩基配列の５’側に隣接する少なくとも２残基分の第三塩基配列を取得する塩基配列取得工程と、前記第一塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記アデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、前記第二塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記第三塩基配列に対して非相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとが、５’側から順に連結したオリゴヌクレオチドを準備する準備工程と、を含む。
【００３８】
標的ＲＮＡの選択工程では、編集標的となるアデノシン残基を含む標的ＲＮＡを選択する。標的ＲＮＡはＲＮＡ編集の目的等に応じて、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって合成されるＲＮＡから選択される。標的ＲＮＡは、ゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ、塩基の修飾を受けていないｍＲＮＡ、スプライシングを受けていないｍＲＮＡ前駆体、ｎｃＲＮＡ等のいずれであってもよく、好ましくはｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ前駆体である。また編集標的となるアデノシン残基は、ＲＮＡ編集の目的等に応じて、非翻訳領域、スプライス領域、エクソン領域、イントロン領域、又はＲＮＡの安定性、構造もしくは機能に影響する領域のいずれの領域に存在していてもよい。
【００３９】
塩基配列取得工程では、選択した標的ＲＮＡの塩基配列を取得する。取得される塩基配列は、編集標的となるアデノシン残基の３’側のオリゴヌクレオチドに対応する第一塩基配列と、前記アデノシン残基の５’側の３又は４残基分の第二塩基配列と、前記第二塩基配列の５’側に隣接する少なくとも２残基分の第三塩基配列である。第一塩基配列に対して相補的な配列が、製造される標的編集ガイドＲＮＡにおける標的対応ヌクレオチド残基の５’側に連結するオリゴヌクレオチドの塩基配列となる。また第二塩基配列に対して相補的な配列と、第三塩基配列に対して相補的又は非相補的な配列とを連結した配列が、製造される標的編集ガイドＲＮＡにおける標的対応ヌクレオチド残基の３’側に連結するオリゴヌクレオチドの塩基配列となる。ここで第三塩基配列に対して相補的又は非相補的な塩基配列は、上述した第二オリゴヌクレオチドの塩基配列を参照して、その塩基配列を適宜選択することができる。
【００４０】
第一塩基配列として塩基が特定されるヌクレオチド残基数は、１５以上３０以下であり、好ましくは１５以上２６以下であり、より好ましくは１５以上２０以下である。第二塩基配列として塩基が特定されるヌクレオチド残基数は、３又は４であり、好ましくは３である。第三塩基配列として塩基が特定されるヌクレオチド残基数は２以上であり、また例えば２４以下であり、好ましくは２０以下、より好ましくは１６以下であり、さらに好ましくは１５以下、特に好ましくは１４以下である。
【００４１】
塩基配列の取得方法は、対象となるオリゴヌクレオチドの塩基配列を特定可能であれば特に制限されず、通常用いられる手法から適宜選択することができる。例えば、標的ＲＮＡの塩基配列がデータベース等で公知であれば、公知の塩基配列から必要な部分の塩基配列を抽出して取得すればよい。また標的ＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、ｃＤＮＡの塩基配列を常法により決定することで塩基配列を取得してもよい。
【００４２】
準備工程では、第一塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、アデノシン残基に対応する標的対応ヌクレオチド残基と、第二塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、第三塩基配列に対して相補的又は非相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとが、５’側から順に連結したオリゴヌクレオチドを準備する。準備されるオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを特定する第一オリゴヌクレオチドと、第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二オリゴヌクレオチドとを備える標的編集ガイドＲＮＡとなる。
【００４３】
所定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、公知の方法で製造することができる。例えば、国際公開第２０１７／０１０５５６号等の記載を参照して、適当な合成オリゴＤＮＡを用いて調製することができる。また標的編集ガイドＲＮＡの塩基配列の５’側にＴ７プロモーター等のプロモーター配列を有する合成オリゴＤＮＡを用いて調製することもできる。さらにはホスホロアミダイト法等の公知の製造方法によって化学合成的に調製することもできる。さらに当該オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するｃＤＮＡを常法により調製し、得られるｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを構築して、得られるプラスミドＤＮＡを適当な細胞に導入してＲＮＡに転写することで調製することもできる。
【００４４】
標的ＲＮＡの部位特異的編集方法
標的ＲＮＡの部位特異的編集方法は、標的ＲＮＡと、標的ＲＮＡに対する部位特異的編集を誘導するオリゴヌクレオチドである標的編集ガイドＲＮＡとを、アデノシンデアミナーゼの存在下に、接触させることを含む。標的編集ガイドＲＮＡが標的ＲＮＡと部分的に二本鎖を形成し、アデノシンデアミナーゼをリクルートすることで、標的ＲＮＡが含むアデノシン残基を部位特異的にイノシン残基に変換することができる。
【００４５】
標的ＲＮＡの部位特異的編集方法は、例えば、標的ＲＮＡを有する真核細胞に、上述した標的編集ガイドＲＮＡを導入又は発現させることで行うことができる。標的編集ガイドＲＮＡの真核細胞への導入方法には、核酸医薬で用いられる種々の手法から適宜選択して適用することができる。また標的編集ガイドＲＮＡを発現可能なプラスミド等を真核細胞に導入することで、真核細胞中に標的編集ガイドＲＮＡを発現させることができる。
【００４６】
標的編集ガイドＲＮＡを用いる標的ＲＮＡの部位特異的編集方法を、糖鎖修飾部位、リン酸化部位、金属配位部位等の細胞内タンパク質の機能発現に関わるアミノ酸の変異に適用することで、細胞内タンパク質機能を一時的に制御するという新たな方法論を提供することが可能になる。また標的編集ガイドＲＮＡを用いる標的ＲＮＡの部位特異的編集方法による生体内タンパク質の機能制御方法を一般化することで、生命科学分野の研究の発展に貢献できる分子技術となる。
【００４７】
従来、ｓｉＲＮＡによる標的タンパク質発現の抑制、又はアプタマーと呼ばれる機能性ＲＮＡによる標的タンパク質の機能制御を利用した核酸医薬が開発されている。しかしながら、ｍＲＮＡの情報を変換し、ｍＲＮＡがコードする標的タンパク質の機能を改変する医薬は未だ例を見ない。従って、標的編集ガイドＲＮＡは、これまでない薬効を示す新規核酸医薬品を生み出す可能性を秘めている。
【００４８】
例えば、ナンセンス変異型遺伝性疾患は、遺伝子上の点変異によって形成された終止コドンにより、本来のタンパク質が合成されなくことに起因する疾患である。ナンセンス変異型遺伝性疾患としては、例えば、筋ジストロフィー、多発性硬化症、アルツハイマー病、神経組織変性、パーキンソン病などの神経疾患、癌などが挙げられる。例えば、標的編集ガイドＲＮＡによって、ＵＡＡ、ＵＡＧ、ＵＧＡ等の終止コドンを編集することにより、上記疾患に対するこれまでにないメカニズムを有する核酸医薬としての用途が考えられる。具体的には例えば、終止コドンであるＵＡＧをトリプトファンコドンであるＵＩＧへと編集することで、タンパク質合成を制御することが考えられる。
【００４９】
また例えば、細胞内で重要な働きを持つタンパク質の多くは、リン酸化・脱リン酸化によって機能のＯＮ／ＯＦＦが精密に制御されており、リン酸化・脱リン酸化の異常が癌を含む様々な疾患に深く関与していることが示唆されている。タンパク質のリン酸化部位としてはＴｙｒ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ等を挙げることができる。標的編集ガイドＲＮＡによってこれらのアミノ酸をコードするコドンを他のアミノ酸をコードするコドンへと編集することにより、タンパク質のリン酸化を抑制することが可能になる。具体的には例えば、ＴｙｒコドンであるＵＡＣを、ＣｙｓコドンであるＵＩＣへと編集することで細胞内タンパク質のリン酸化を制御することができる。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５１】
（参考例１）
モデル標的ＲＮＡの調製
ＧＦＰ−Ｇｑ−ＴＫ  Ｐｌａｓｍｉｄを鋳型とし、１００ｍＭ  ＡｃＧＦＰ＿ｓＲＮＡ０２＿Ｔ７Ｆ０１プライマー、１００ｍＭ  ＡｃＧＦＰ＿ｓＲＮＡ０２＿Ｒ０１プライマー、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１．２５Ｕ／ｍＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒ  ＧＸＬ（タカラバイオ社製）を含む反応溶液中でＰＣＲ（１サイクル（９８℃１０秒間、５５℃３０秒間、６８℃３０秒間）、３０サイクル）によって増幅した（終濃度：ＧＦＰ−Ｇｑ−ＴＫ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ４．０ｐｇ／ｍＬ、ＡｃＧＦＰ＿ｓＲＮＡ０２＿Ｔ７  Ｆ／Ｒ  ０．３ｍＭ、ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬ  ２．５Ｕ）。増幅したＰＣＲ製品をフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によりＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを鋳型とし、Ｔ７−Ｓｃｒｉｂｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＮＡ  ＩＶＴ  ＫＩＴ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（３７℃、３時間）によりＲＮＡを合成した。その後、ＤＮＡｓｅ（終濃度：２Ｕ）を加えて処理し（３７℃、１５分間）、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によってＲＮＡを精製した。得られたＲＮＡを８Ｍ  Ｕｒｅａ  ＰＡＧＥ  （８％）で精製して、粉砕・浸漬によって抽出し、０．２２ｍｍフィルター（ＤＵＲＡＰＯＲＥ社製）及びゲル濾過（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）によって精製して残基数１６０ｎｔのモデル標的ＲＮＡ（ｓＧＦＰ）を調製した。使用したプライマー及び得られたモデル標的ＲＮＡの配列を表２に示す。
【００５２】
【表２】
2019097555.tif 000004
【００５３】
（実施例１）
標的編集ガイドＲＮＡの調製
合成オリゴＤＮＡ（Ｆ）（ｇＲＮＡ３ｒ＿Ｔ７Ｆ）１００ｍＭと合成オリゴＤＮＡ（Ｒ）（ｇＲＮＡ３ｒ＿ｄｅｌ０２）１００ｍＭを含む反応溶液を９５℃で３分間、続いて２５度に減温して１５分間処理してアニーリング反応を行って、Ｔ７プロモーター領域のみが２本鎖を形成したＤＮＡ（ｇＲＮＡ３ｒ＿ｄｅｌ０２Ｆ／Ｒ）を得た。続いて、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰと５０００  Ｕ／ｍＬ  Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔを加え（終濃度：ｇＲＮＡ３ｒ＿ｄｅｌ０２Ｆ／Ｒ  ２ｍＭ、ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ、Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ２．５Ｕ）を２５℃で３０分間伸長し、フェノール／クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿によりＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを鋳型とし、Ｔ７−Ｓｃｒｉｂｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＮＡ  ＩＶＴ  ＫＩＴ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ社製）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（３７℃、３時間）によりＲＮＡ（標的編集ガイドＲＮＡ）を合成した。その後、ＤＮＡｓｅ（終濃度：２Ｕ）を加え、３７℃で１５分間処理し、フェノール／クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿によってＲＮＡを精製した。得られたＲＮＡを８Ｍ  Ｕｒｅａ  ＰＡＧＥ  （８％）で精製して、粉砕・浸漬によって抽出し、０．２２ｍｍフィルター（ＤＵＲＡＰＯＲＥ社製）及びゲル濾過（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）によって精製して、目的とする標的編集ガイドＲＮＡ（ｄｅｌ０２）を得た。使用した合成オリゴＤＮＡの配列を表３に、得られた標的編集ガイドＲＮＡの配列を表４に示す。また、標的編集ガイドＲＮＡのＡＤＡＲ結合領域（ＡＲＲ；第二オリゴヌクレオチド）のみを表６に示す。
【００５４】
（実施例２から９）
合成オリゴＤＮＡ（Ｒ）として、表３に示す合成オリゴＤＮＡを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、実施例２から９の標的編集ガイドＲＮＡを得た。得られた標的編集ガイドＲＮＡの配列を表４に示す。また、標的編集ガイドＲＮＡのＡＤＡＲ結合領域（ＡＲＲ；第二オリゴヌクレオチド）のみを表６に示す。
【００５５】
（比較例１、２）
合成オリゴＤＮＡ（Ｒ）として、表３に示す合成オリゴＤＮＡを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、比較例１２の標的編集ガイドＲＮＡを得た。得られた標的編集ガイドＲＮＡの配列を表４に示す。
【００５６】
（参考例２）
国際公開第２０１７／０１０５５６号の実施例１の記載を参照して、アンチセンス領域の３’側にステムループ構造を形成する４９残基からなるＡＤＡＲ結合領域が連結した、従来型の標的編集ガイドＲＮＡ（以下、ＳＬ４９ともいう）を調製した。具体的には合成オリゴＤＮＡ（１）としてｇＲＮＡ３ｒ＿Ｇｌｕ＿Ｔ７Ｆを、合成オリゴＤＮＡ（２）としてｇＲＮＡ３ｒ＿Ｇｌｕ＿ｃｏｎｓｅｑ＿Ｒを用いて、参考例２の標的編集ガイドＲＮＡを得た。使用した合成オリゴＤＮＡの配列と、得られた標的編集ガイドＲＮＡ（ＳＬ４９）の配列を表５に示す。
【００５７】
【表３】
2019097555.tif 000005
【００５８】
【表４】
2019097555.tif 000006
【００５９】
【表５】
2019097555.tif 000007
【００６０】
【表６】
2019097555.tif 000008
【００６１】
＜評価１＞
上記で調製した標的編集ガイドＲＮＡの編集誘導活性を、モデル標的ＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。まず、モデル標的ＲＮＡと標的編集ガイドＲＮＡとをアニーリング反応により複合体を形成させ、精製した組換えｈＡＤＡＲ２を加えて編集反応を行った。標的部位の編集効率を解析するため、ＲＴ−ＰＣＲにより標的ＲＮＡのｃＤＮＡを増幅し、ダイレクトシークエンシングにより得られるクロマトチャートから編集割合を算出した。具体的なプロトコールは以下の通りである。
【００６２】
標的編集ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の編集誘導能評価（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
０．３μＭのモデル標的ＲＮＡと０．９μＭのｇＲＮＡをアニーリングバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６））中で熱変性（８０℃、３分間）させ、２５℃まで１５分間かけて冷却することでアニーリング反応を行った。５ｎＭ  ＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘと１２．５ｎＭ  ｈＡＤＡＲ２を編集反応緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ［ｐＨ７．５］、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１Ｕ／μＬ  Ｍｕｒｉｎｅ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製））中で、３７℃、１時間、編集反応を行った。反応後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿によりＲＮＡを精製し、５μＬのＴＥ  ｂｕｆｆｅｒで溶解した。回収したＲＮＡサンプルをＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＩＩ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型に、０．３μＭ  Ｔ７ＧＦＰ＿ｓＲＮＡ＿Ｆ０１プライマー、０．３μＭ  ＧＦＰ＿ｓＲＮＡ＿Ｒ０１プライマーを用いてＰＣＲによりｄｓＤＮＡの増幅を行った。Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、０．１６５μＭ  Ｔ７ｐｒｏＧＧＧプライマーにより増幅したｄｓＤＮＡのダイレクトシークエンシングを行った。最後に、得られたクロマトチャートのピークの高さの比Ｇ／（Ｇ＋Ａ）により編集割合（％）を算出した。結果を表８及び図１に示す。
【００６３】
【表７】
2019097555.tif 000009
【００６４】
【表８】
2019097555.tif 000010
【００６５】
標的編集ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）ｄｅｌ０２、ｄｅｌ０３及びｄｅｌ０３．５が、従来型（ＳＬ４９）と遜色のない編集誘導活性を示した。またアンチセンス領域（ＡＳＲ）の３’側に任意の２残基を付加した標的編集ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、実質的にアンチセンス領域のみのＩｒｄｅｌと比べて、増強された編集誘導活性を示した。特にＡＳＲの３’側に隣接して連続する２つのグアノシン残基を有する標的編集ガイドＲＮＡ（ｄｅｌ０６）がより増強された編集誘導活性を示した。
【００６６】
例えば、標的編集ガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡ（ＴａｒｇｅｔＲＮＡ）と図２Ａに示すような部分的に２重鎖が形成された複合体を形成すると考えられる。図２Ａの複合体では第一オリゴヌクレオチド部分がアンチセンス領域（ＡＳＲ）として機能して標的ＲＮＡと２重鎖を形成し、第一オリゴヌクレオチドの３’側に連結する第二ヌクレオチドが、標的ＲＮＡから遊離した状態で存在すると考えられる。特に第二ヌクレオチドが４残基程度までの短鎖の場合には、標的ＲＮＡの対応する塩基配列と相補的な配列を第二ヌクレオチドが有していても、熱的揺らぎによって遊離した状態を取り得ると考えられる。この遊離状態によって第二オリゴヌクレオチド部分が編集増進領域として機能すると考えられる。なお、上記の標的編集ガイドＲＮＡの調製においては、Ｔ７プロモーターの３’側に、発現を調整するための付加配列ＧＧＧが付加された合成オリゴＤＮＡ（Ｆ）を用いているため、標的編集ガイドＲＮＡの５’末端にＧＧＧが付加されている。
【００６７】
標的編集ガイドＲＮＡの第二オリゴヌクレオチドは、図２Ｂに示すように分子内でステムループ構造を形成してもよい。例えば、第二オリゴヌクレオチドの残基数が１４以上であると、より安定したステムループ構造が形成され、これにより編集活性がより向上すると考えられる。
【００６８】
＜評価２＞
次に標的編集ガイドＲＮＡの培養細胞内における編集誘導活性について、編集蛍光レポーター（ＧＦＰ＿Ｗ５８Ｘ）を用いて検証した。標的ＲＮＡであるＧＦＰ＿Ｗ５８Ｘでは、野生型（ＷＴ）ＧＦＰのＴｒｐ５８のコドン（ＵＧＧ）が終止コドン（ＵＡＧ）に変異している。そのため、そのままでは成熟型ＧＦＰを発現しないが、終止コドンのアデノシン残基がイノシン残基にＲＮＡレベルで編集され、イノシン残基がグアノシン残基として翻訳されることにより、成熟型ＧＦＰを発現するようになる。具体的なプロトコールは以下の通りである。
【００６９】
（参考例３）
基質ＧＦＰ＿Ｗ５８Ｘ発現プラスミドの構築
ｐＵＣ１９ベクターにＡｃＧＦＰをクローニングしたプラスミドであるｐＵＣ１９−ＧＦＰ−ＴＫプラスミドを鋳型に、０．３μＭ  ＡｃＧＦＰ＿ＸｈｏＩ＿ｋｏｚＦ０１プライマー、０．３μＭ  ＡｃＧＦＰ＿Ｗ５８Ｘ＿Ｒ０１プライマー、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲにより５’側の鋳型ＤＮＡを作製した。ＰＣＲ条件は、９８℃／１０秒、５５℃／１５秒、６８℃／２０秒、３０サイクルであった。次に、ｐＵＣ１９−ＧＦＰ−ＴＫプラスミドを鋳型に、０．３μＭ  ＡｃＧＦＰ＿Ｗ５８Ｘ＿Ｆ０１プライマー及び０．３μＭ  ＡｃＧＦＰ＿ＲＮＡ＿ＨｉｎｄＩＩＩ＿Ｒ０１プライマー、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲにより３’側の鋳型ＤＮＡを作製した。ＰＣＲ条件は、９８℃／１０秒、５５℃／１５秒、６８℃／４０秒、３０サイクルであった。それぞれを１００倍希釈したＳａｍｐｌｅに対して０．３μＭ  ＡｃＧＦＰ＿ＸｈｏＩ＿ｋｏｚＦ０１プライマー、０．３μＭ  ＡｃＧＦＰ＿ＲＮＡ＿ＨｉｎｄＩＩＩ＿Ｒ０１プライマー、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲにより鋳型ＤＮＡを作製した。ＰＣＲ条件は、９８℃／１０秒、５５℃／１５秒、６８℃／６０秒、３０サイクルであった。得られた鋳型ＤＮＡ及びｐｃＤＮＡ３．１（−）ＨｙｇｒｏをＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いて、３７℃、１時間で制限酵素処理を行った。ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＴａＫａＲａ社製）を用いてベクター：プラスミドのモル比を１：５にし、１６℃、３０分でＬｉｇａｔｉｏｎ反応を行った。Ｌｉｇａｔｉｏｎ後の溶液２μＬを２０μＬのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ（ＴａＫａＲａ社製）に加え形質転換を行い、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中、３７℃、昼夜で培養した。Ｅｘ  Ｔａｑ  （ＴａＫａＲａ社製）を用いてコロニーＰＣＲ（０．３μＭ  ｐｃＤＮＡ３＿１ｐｒｏ＿Ｆ０１プライマー、０．３μＭ  ｐｃＤＮＡ３＿１−ｓｅｑＲ０１プライマー、９８℃／１０秒、５５℃／３０秒、７２℃／３０秒、３０サイクル）によりインサートチェックを行った。その後、インサートが挿入されているプラスミドが形質転換されているコロニーを液体培地で培養し、プラスミドを抽出した。最終的に、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、０．１６５μＭ  ｐｃＤＮＡ３＿１ｐｒｏ＿Ｆ０１プライマー、０．１６５μＭ  ｐｃＤＮＡ３＿１−ｓｅｑＲ０１プライマーを用いて塩基配列解析を行い、挿入されたインサートが正しい配列であることを確認した。以上により、基質ＲＮＡであるＧＦＰ＿Ｗ５８Ｘを発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｈｙｇｒｏ−ＡｃＧＦＰＷ５８Ｘ）を構築した。構築に用いたプライマーの配列を表９に示す。
【００７０】
【表９】
2019097555.tif 000011
【００７１】
（実施例１０）
短鎖型５ＡＳ−ｓｈＡＤｇ＿ＧＦＰ１７３発現プラスミドの構築
２μＭ  ＡＤｇｒＧＦＰ１７３＿ｄｅｌ３＿ＢｇｌＦ及びＡＤｇｒＧＦＰ１７３＿ｄｅｌ３＿ＨｉｎｄＲをアニ−リング反応後（９５℃、３分、ｓｌｏｐｅ  ｔｏ  ２５℃／１５分）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ及びＫｌｅｎｏｗ  ｆｌａｇｍｅｎｔを用いて伸長反応を行った（２５℃、３０分）。フェノール／クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿により鋳型ＤＮＡを精製した。鋳型ＤＮＡ及びｐＳｕｐｅｒ−ｎｅｏをＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限酵素処理を行った（３７℃、１時間）。ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＴａＫａＲａ社製）を用いてベクター：プラスミドのモル比を１：５にし、１６℃  ３０分でＬｉｇａｔｉｏｎ反応を行った。Ｌｉｇａｔｉｏｎ後の溶液２μＬを２０μＬのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ（ＴａＫａＲａ社製）に加え形質転換を行い、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で培養した（３７℃、昼夜）。Ｅｘ  Ｔａｑ  （ＴａＫａＲａ社製）を用いてコロニーＰＣＲ（０．３μＭ  ｐＳｕｐｅｒ．ｎｅｏ−ＩｎｓＣｈｅｃｋ＿Ｆ０１プライマー、０．３μＭ  ｐＳｕｐｅｒ．ｎｅｏ−ＩｎｓＣｈｅｃｋ＿Ｒ０１プライマー、９８℃／１０秒、５５℃／３０秒、７２℃／３０秒、３０サイクル）によりインサートチェックを行った。その後、インサートが挿入されプラスミドが形質転換されているコロニーを液体培地で培養し、プラスミドを抽出した。最終的に、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、０．１６５μＭ  ｐＳｕｐｅｒ．ｎｅｏ−ＩｎｓＣｈｅｃｋ＿Ｆ０１プライマー、０．１６５μＭ  ｐＳｕｐｅｒ．ｎｅｏ−ＩｎｓＣｈｅｃｋ＿Ｒ０１プライマーを用いて塩基配列解析を行い、挿入されたインサートが正しい配列であることを確認して、プラスミド（ｐＳｕｐｅｒ＿ｎｅｏ＿５ＡＳ−ｓｈＡＤｇ＿ＧＦＰ１７３）を得た。プラスミドの構築に用いたプライマーの配列を表１０に示す。また得られたプラスミドは、実施例２の標的編集ガイドＲＮＡ（ｄｅｌ０３）に相当する標的編集ガイドＲＮＡ（５ＡＳ−ｓｈＡＤｇ＿ＧＦＰ１７３）を発現する。
【００７２】
（実施例１１）
短鎖型ＡＤｇ＿ｒＧＦＰ＿ｄｅｌ０３５発現プラスミドの構築
プライマーとして、ｇｒＧＦＰ１７３＿ｄｅｌ３５＿ＢｇｌＦ及びｇｒＧＦＰ１７３＿ｄｅｌ３５＿ＨｉｎｄＲを用いたこと以外は実施例１０と同様にして、プラスミドを構築した。用いたプライマーの配列を表１０に示す。また得られたプラスミド（ｐＳｕｐｅｒ＿ＡＤｇ＿ｒＧＦＰ＿ｄｅｌ０３．５）は、実施例３の標的編集ガイドＲＮＡ（ｄｅｌ０３．５）に相当する標的編集ガイドＲＮＡ（ＡＤｇ＿ｒＧＦＰ＿ｄｅｌ０３５）を発現する。
【００７３】
（参考例４）
従来型５ＡＳ−ＡＤｇ＿ＧＦＰ１７３発現プラスミドの構築
プライマーとして、ｇＲ３ｒｍｉｎｉＧＷ５８Ｘ＿ＢｇｌＦ及びｇＲＮＡ３ｒｍｉｎｉＵ５＿ＨｉｎｄＲ０１を用いたこと以外は実施例１０と同様にして、プラスミド（ｐＳｕｐｅｒ＿ｎｅｏ＿５ＡＳ−ＡＤｇ＿ＧＦＰ１７３）を構築した。用いたプライマーの配列を表１０に示す。また得られたプラスミドは、参考例２の標的編集ガイドＲＮＡ（ＳＬ４９）に相当する標的編集ガイドＲＮＡ（５ＡＳ−ＡＤｇ＿ｒＧＦＰ１７３）を発現する。
【００７４】
【表１０】
2019097555.tif 000012
【００７５】
また、ヒトアデノシンデアミナーゼ２（ｈＡＤＡＲ２）を発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｈｙｇｒｏ＿ｈＡＤＡＲ２）を以下のようにして構築した。
（参考例５）
ｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｈｙｇｒｏ＿ＨｉｓＡＤＡＲ２の構築
ｐＹＥＳ／ＮＴ＿Ａ＿ＡＤＡＲ２を鋳型とし、０．２５μＭ  ＨｉｓＡＤＡＲ２＿ＸｂａＦ０１プライマー、０．２５μＭ  ＨｉｓＡＤＡＲ２＿ＫｐｎＲ０１プライマーを用いて伸長反応２分の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲでインサートを増幅した。インサートとｐｃＤＮＡ３．１（−）ＨｙｇｒｏをＸｂａＩ及びＫｐｎＩを用いて３７℃で１時間酵素反応を行った。フェノール／クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿により精製した後、２μＬを２０μＬのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  （ＴａＫａＲａ）に加えて形質転換を行い、ＬＢアンピシリン寒天培地で一晩培養した。生じたコロニーを鋳型とし、０．３μＭ  Ｔ７ｐｒｏＧＧＧプライマー、０．３μＭ  ＢＧＨ  ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて、伸長反応２分の条件でＰＣＲをし、インサートチェックを行い、目的断片長の増幅産物を生じたクローンを液培した。抽出したプラスミドの配列を０．１６５μＭ  Ｔ７ｐｒｏＧＧＧプライマー、０．１６５μＭ  ＢＧＨ  ｒｅｖｅｒｓｅプライマー、０．１６５μＭ  ＨｉｓＡＤＡＲ２＿ｓｅｑｆｗプライマーを用いてＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ）を用いてシークエンシング反応し、塩基配列解析を行った。用いたプライマーの配列を表１１に示す。
【００７６】
【表１１】
2019097555.tif 000013
【００７７】
標的編集ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の細胞内編集誘導能評価１
３５ｍｍガラス皿にＨＥＫ２９３細胞を１．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、４８時間培養した。その後、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ＨＰ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、７００ｎｇのＡＤＡＲ２発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｈｙｇｒｏ＿Ｈｉｓ−ＡＤＡＲ２）、７００ｎｇの基質ＲＮＡ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｈｙｇｒｏ＿ＡｃＧＦＰＷ５８Ｘ）及び７００ｎｇのｇＲＮＡ発現プラスミド（ｐＳｕｐｅｒ＿ｎｅｏ＿５ＡＳ−ＡＤｇ＿ＧＦＰ１７３又はｐＳｕｐｅｒ＿ｎｅｏ＿５ＡＳ−ｓｈＡＤｇ＿ＧＦＰ１７３）を形質導入し７２時間培養した。培地を除去しＤ−ＰＢＳ（−）で置換した後、共焦点蛍光顕微鏡を用いた観察を行った。結果を図３に示す。図３におけるＰｈａｓｅは位相差観察の結果であり、ＧＦＰは蛍光観察の結果であり、Ｍｅｒｇｅはそれらの合成である。
【００７８】
また編集効率の解析については以下の通りである。細胞を回収後、１０００μＬのセパゾール  ＲＮＡ  Ｉ  Ｓｕｐｅｒ  Ｇ（ナカライ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮａｓｅ  Ｉを１０Ｕ用いてＤＮａｓｅ処理を行い、フェノール／クロロホルム抽出、及び酢酸ナトリウム存在下のエタノール沈殿によりＲＮＡを精製した。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （Ｒｏｃｈｅ社製）、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ０．５μｇ、０．２５μＭ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１７を用いた逆転写反応（変性：８０℃、３分、ｈｅａｔ−ｃｈｉｌｌ；アニーリング：６５℃、１０分；伸長：５５℃、３０分；加熱処理：８５℃、５分）を行い、ｃＤＮＡを増幅した。０．２５Ｕ  ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．２５μＭ  ＡｃＧＦＰ＿ＲＮＡｆ＿Ｔ７Ｆ０１プライマー、０．２５μＭ  ３’−ＡＤＰプライマーを用いた伸長６０秒の１ｓｔ  ＰＣＲ及び０．２５μＭ  ＡｃＧＦＰ＿ＲＮＡｆ＿Ｔ７Ｆ０１プライマー、０．２５μＭ  ＡｃＧＦＰ−ＲＮＡｆＲ０１プライマーを用いた伸長６０秒の２ｎｄ  ＰＣＲを行い、ＡｃＧＦＰフラグメントを増幅した。Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （ＡＢＩ社製）と０．１６５μＭ  ＡｃＧＦＰ＿ＲＮＡｆ＿Ｔ７Ｆ０１プライマーを用いた伸長６０秒のシークエンシング反応を行い、クロマトチャートを得た。クロマトチャート（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ）を図３に併せて示す。
【００７９】
標的編集ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の細胞内編集誘導能評価２
ｇＲＮＡ発現プラスミドとして、実施例１１で得られたｐＳｕｐｅｒ＿ＡＤｇ＿ｒＧＦＰ＿ｄｅｌ０３．５を用いたこと以外は上記と同様にして細胞内編集誘導能を評価した。結果を図４に示す。
【００８０】
図３から、ＧＦＰ＿Ｗ５８Ｘのみ、又はＧＦＰ＿Ｗ５８ＸとｈＡＤＡＲ２のみを発現させた細胞では、蛍光を発する細胞は観測されなかった。一方で、それら細胞にＡＤ−ｇＲＮＡ発現プラスミドを形質導入することで、蛍光を発する、すなわちＧＦＰを発現する多数の細胞が確認された。さらに、抽出したＧＦＰ＿Ｗ５８Ｘのダイレクトシークエンスにより得られたクロマトチャートから、Ａ１７３はＡＤ−ｇＲＮＡ依存的に編集されることが確認された。なお、図３におけるＧＦＰ＿ＷＴは、野生型ＧＦＰのｍＲＮＡを発現させた系である。図４では、第二オリゴヌクレオチドの残基数を１４残基まで減らしても、従来型の標的編集ガイドＲＮＡと同程度の編集活性を示した。
【００８１】
（実施例１２から２２）
第二オリゴヌクレオチド（ＡＲＲ）が表１２に示す塩基配列を有する標的編集ガイドＲＮＡを、実施例１に記載の方法に準じて作製した。得られた標的編集ガイドＲＮＡの編集誘導活性を、実施例３で得られた標的編集ガイドＲＮＡ（ＡＲＲ＿ｗｔ）と共に、上述した評価１と同様の方法で評価した。結果を表１３及び図５に示す。
【００８２】
【表１２】
2019097555.tif 000014
【００８３】
【表１３】
2019097555.tif 000015
【００８４】
以上より、標的編集ガイドＲＮＡの好ましい一態様は、第一オリゴヌクレオチドが、標的対応ヌクレオチド残基（例えば、Ｃ）の５’側に標的ＲＮＡの対応する塩基配列と相補的な塩基配列を有する１５から３０残基のオリゴヌクレオチドと、標的対応ヌクレオチド残基の３’側に標的ＲＮＡの対応する塩基配列と相補的な塩基配列を有する３残基のオリゴヌクレオチドとを有し、第二オリゴヌクレオチドが、５’側のステム部分として２残基の任意配列（ＮＮ）と、連続するグアニン、ウラシル及びグアニンからなる配列（ＧＵＧ）とを含み、４残基の任意配列からなるループ部分を介して、３’側のステム部分に５’側のステム部分と相補対を形成可能な配列を含む。係る編集ガイドＲＮＡは、例えば図６で模式的に表される。
【００８５】
（実施例２３）
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用し、以下のようにして内在性ＡＤＡＲによる編集誘導活性を確認した。レポーター発現プラスミドとして、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２＿Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘを構築した。ｐｓｉＣＨＥＣＫ２＿Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘは、市販のｐｓｉＣＨＥＣＫ（登録商標）−２（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に対して、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｒｌｕｃ）をコードする領域の１０４Ｗ（トリプトファン）を１０４Ｘ（終止コドン）に、４１Ｋ（リシン）を４１Ｒ（アルギニン）に変換させて得た。具体的には１０４番目のトリプトファンに対応する３１１Ｇを３１１Ａに変異させて編集標的を設定した。また、ＡＤＡＲによって標的編集ガイドＲＮＡに非依存的に編集される部位である４１Ｋが４１Ｒに変換されているが、この変異による発光測定への影響は無いことは確認ずみである。標的ＲＮＡ（Ｒｌｕｃ＿Ｗ１０４Ｘ）の配列を表１４に示す。
【００８６】
標的編集ガイドＲＮＡ発現プラスミドとして、ｐＳｕｐｅｒ＿ｓｈＡＤｇ＿Ｒｌｕｃ＿Ａ３１１を構築した。ｐＳｕｐｅｒ＿ｓｈＡＤｇ＿Ｒｌｕｃ＿Ａ３１１は、３１１Ａを編集標的とし、ＡＤＡＲ結合領域（ＡＲＲ；第二オリゴヌクレオチド）として実施例３と同じ１４残基の配列を有する標的編集ガイドＲＮＡ（ｓｈＡＤｇ＿Ｒｌｕｃ＿Ａ３１１）を発現する。また、コントロールとしてアンチセンス領域（ＡＳＲ；第一オリゴヌクレオチド；５ＡＳ＿Ｒｌｕｃ＿Ａ３１１）のみを発現するプラスミドとして、ｐＳｕｐｅｒ＿ｓｈＡＤｇ＿Ｒｌｕｃ＿Ａ３１１を構築した。各プラスミドが発現するＲＮＡの配列を表１４に示す。
【００８７】
【表１４】
2019097555.tif 000016
【００８８】
ヒトＡＤＡＲ２の発現制御が可能なＴｅｔ−ＡＤＡＲ２細胞を２４−ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅに８．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように継代し、Ｄｏｘ  ５．０μｇ／ｍＬを含む培地中で４８時間培養した。ＦｕＧＥＮＥ  ＨＰ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて１５ｎｇのｐｓｉＣＨＥＣＫ２＿Ｒｌｕｃ＿Ｋ４１Ｒ＿Ｗ１０４Ｘと、５００ｎｇのｐＳｕｐｅｒ＿ｓｈＡＤｇ＿Ｒｌｕｃ＿Ａ３１１（標的編集ガイドＲＮＡ発現プラスミド）、又はｐＳｕｐｅｒ＿５ＡＳ＿Ｒｌｕｃ＿Ａ３１１（アンチセンス領域のみを発現するプラスミド）をトランスフェクトし、Ｄｏｘ  ５．０μｇ／ｍＬを含む培地中で７２時間培養した。なお、Ｔｅｔ−ＡＤＡＲ２細胞については、ＲＮＡ，１８，１７３５−１７４４（２０１２）に記載されている。
【００８９】
培養した細胞に対して１００μＬのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞抽出液を得た。得られた細胞抽出液２０μＬにＬＡＲＩＩの１００μＬを添加した６０秒後に、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）２０／２０  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）によりＦｌｕｃの発光強度を測定した。その後、Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ  Ｒｅａｇｅｎｔを１００μＬ添加し、６０秒後にＲｌｕｃの発光強度を測定した。Ｒｌｕｃの発光強度をＦｌｕｃの発光強度で規格化して図７に示す。
【００９０】
図７に示すように、ＡＲＲが１４残基の標的編集ガイドＲＮＡ（ｓｈＡＤｇ＿Ｒｌｕｃ＿Ａ３１１）を発現させることで、内在性のｈＡＤＡＲ２によって標的ＲＮＡが編集された。
【００９１】
アンチセンス領域をＡＤＡＲ結合領域の５’側に有する場合と３’側に有する場合の標的編集活性の相違について、以下のようにして検討した。
【００９２】
（実施例２４）
実施例１から５及び参考例２で得られたアンチセンス領域（ＡＳＲ；第一オリゴヌクレオチド）をＡＤＡＲ結合領域（ＡＲＲ；第二オリゴヌクレオチド；表中の下線部）の５’側に有する標的編集ガイドＲＮＡ（５’−ＡＳ  ＡＤｇ）に加えて、アンチセンス領域（ＡＳＲ）を、実施例１から５及び参考例２におけるＡＤＡＲ結合領域（ＡＲＲ；表中の下線部）の３’側に有する標的編集ガイドＲＮＡ（３’−ＡＳ  ＡＤｇ）を、上記と同様にして準備した。準備した標的編集ガイドＲＮＡの配列を表１５に示す。併せてＡＳＲを４０残基及び３４残基のＡＲＲの５’側又は３’に有する標的編集ガイドＲＮＡを、上記と同様にして準備した。準備した標的編集ガイドＲＮＡについて、編集誘導活性を上述した評価１と同様の方法で評価した。結果を図８に示す。
【００９３】
【表１５】
2019097555.tif 000017
【００９４】
図８から、ＡＲＲの残基数が４９残基（参考例２）、４０残基及び３４残基の標的編集ガイドＲＮＡでは、ＡＳＲがＡＲＲの５’側である５’−ＡＳ型（５’−ＡＳ  ＡＤｇ）と、３’側である３’−ＡＳ型（３’−ＡＳ  ＡＤｇ）のいずれにも良好な編集誘導活性が認められた。一方、ＡＲＲの残基数が２４残基以下（実施例１から５に相当）の標的編集ガイドＲＮＡでは、５’−ＡＳ型のみが良好な編集誘導活性を示し、３’−ＡＳ型は充分な編集誘導活性を示さなかった。これは、例えば、５’−ＡＳ型と３’−ＡＳ型の標的編集ガイドＲＮＡでは、ＡＤＡＲの編集活性を誘導するメカニズムが異なることを示していると考えられる。
【００９５】
次に、ＡＲＲが短鎖型である標的編集ガイドＲＮＡによる編集位置の選択性について、以下のようにして評価した。
【００９６】
（実施例２５）
編集位置の選択性の評価
ｓＧＦＰ＿ＲＮＡを基盤として、設定した位置に編集標的となるＡを配置した標的ＲＮＡを以下の方法に従って設計、合成した。
・前後１塩基（−１，１）の選択性を評価する際の標的ＲＮＡには、ＡＡＡ（真ん中のＡがＧＦＰ＿Ａ２００に相当）を導入した。
・前後２塩基の選択性を評価する際の標的ＲＮＡには、ＵＡＵＡＵＡＵを導入した。
・３塩基以上離れた位置の選択性を評価する際の標的ＲＮＡには、前後の塩基が変わらないようにＵＡＣという配列を固定し、離れた位置に配置することにより作製した。例えば、３と８を評価する場合の標的配列として、ＵＡＣＵＡＣＣＧＵＡＣを導入した。
【００９７】
標的ＲＮＡの配列を標的部分に下線を付して表１６に示す。ｓＧＦＰ＿ｓＲＮＡ＿ＡＡＡは、前後１塩基の位置選択性を評価するための標的ＲＮＡ、ｓＧＦＰ＿ｓＲＮＡ＿ＵＡＵは、前後２塩基離れた位置の選択性を評価するための標的ＲＮＡ、ｓＧＦＰ＿ｓＲＮＡ＿３．８は、３塩基及び８塩基離れた位置の選択性を評価するための標的ＲＮＡ、ｓＧＦＰ＿ｓＲＮＡ＿４．９は、４塩基及び９塩基離れた位置の選択性を評価するための標的ＲＮＡ、ｓＧＦＰ＿ｓＲＮＡ＿５．１０は、５塩基及び１０塩基離れた位置の選択性を評価するための標的ＲＮＡ、ｓＧＦＰ＿ｓＲＮＡ＿６．１１は、６塩基及び１１塩基離れた位置の選択性を評価するための標的ＲＮＡ、ｓＧＦＰ＿ｓＲＮＡ＿７．１２は、７塩基及び１２塩基離れた位置の選択性を評価するための標的ＲＮＡである。
【００９８】
【表１６】
2019097555.tif 000018
【００９９】
それぞれの標的ＲＮＡの配列に合わせて設計した標的編集ガイドＲＮＡ（ｓｈＡＤ−ｇＲＮＡ及びＡＤ−ｇＲＮＡ）を合成した。ｓｈＡＤ−ｇＲＮＡにおけるＡＲＲは、実施例３の標的編集ガイドＲＮＡ（配列番号１８）のＡＲＲと同一の１４残基の短鎖型である。また比較例であるＡＤ−ｇＲＮＡにおけるＡＲＲは、ＳＬ４９（配列番号２９）のＡＲＲと同一の４９残基である。ｓｈＡＤ−ｇＲＮＡの配列を、標的ＲＮＡを認識するＡＳＲ（第一オリゴヌクレオチド）に下線を付してを表１７に示す。得られた標的編集ガイドＲＮＡについて、編集誘導活性を上述した評価１と同様の方法で評価して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ編集解析を行った。各部位での編集割合を算出し、編集標的Ａとオフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）部位の相対編集割合（Ａｏｆｆ−ｔａｒｇｅ／Ａｔａｒｇｅｔ）を求めた。結果を図９に示す。
【０１００】
【表１７】
2019097555.tif 000019
【０１０１】
図９から、ＡＲＲ（第二オリゴヌクレオチド）の残基数が１４と短鎖型の標的編集ガイドＲＮＡ（ｓｈＡＤ−ｇＲＮＡ）は、ＡＲＲの残基数が４９残基の標的編集ガイドＲＮＡ（ＡＤ−ｇＲＮＡ）と比べて、編集位置の選択性が高いことが分かる。
【図１】
2019097555.tif 000020
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
2019097555.tif 000024
【図５】
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【図６】
2019097555.tif 000026
【図７】
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【図８】
2019097555.tif 000028
【図９】
2019097555.tif 000029
【配列表】
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