(57)【要約】      （修正有）【課題】クロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減する（例えば、殺菌する）方法を提供する。【解決手段】クロマトグラフィー樹脂ならびにクロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を改善するのに充分な量で存在する少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む組成物を含む容器を、容器およびクロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射に曝露する。また、低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂を含む低減したバイオバーデンのクロマトグラフィーカラム、クロマトグラフィー樹脂ならびに少なくとも１種のキレート剤および／または酸化防止剤を含む組成物、これらを用いて低減したバイオバーデンのカラムクロマトグラフィーを実行する方法、ならびに精製された組換えタンパク質を低減したバイオバーデンで製造するための一体化され、クローズドな、連続的な方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減する方法であって、
クロマトグラフィー樹脂ならびに少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む組成物を含む容器を、該容器および該クロマトグラフィー樹脂の該バイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射に曝露すること：を含み、該少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤は、該線量のガンマ線照射への曝露後の該クロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を改善するのに充分な量で存在する、前記方法。
【請求項２】
曝露に先立って、組成物を容器中に配置することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
容器が貯蔵容器である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
容器がクロマトグラフィーカラムである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
容器が充填されたクロマトグラフィーカラムである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
組成物が、少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む液体中の堆積したクロマトグラフィー樹脂のスラリーである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
組成物が固体混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
組成物が、還元グルタチオン、還元チオレドキシン、還元システイン、カロテノイド、メラトニン、リコピン、トコフェロール、還元ユビキノン、アスコルベート、ビリルビン、尿酸、リポ酸、フラボノイド、フェノールプロパノイド酸、リドカイン、ナリンゲニン、フラーレン、グルコース、マンニトール、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、およびジメチルメトキシクロマノール：からなる群から選択される少なくとも１種の酸化防止剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
組成物が、マンニトール、アスコルビン酸ナトリウム、ヒスチジン、およびメチオニン：からなる群から選択される少なくとも１種の酸化防止剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
組成物がマンニトール、アスコルビン酸ナトリウム、ヒスチジン、およびメチオニンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
液体が：
（ｉ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭのマンニトール；
（ｉｉ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭのメチオニン；
（ｉｉｉ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム；
（ｉｖ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭのヒスチジン；
（ｖ）３０ｍＭ〜約７０ｍＭのメチオニンおよび約３０ｍＭ〜約７０ｍＭのヒスチジン；（ｖｉ）約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのメチオニン、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのヒスチジン、および約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム；または
（ｖｉｉ）約５ｍＭ〜約４５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、約５ｍＭ〜約４５ｍＭのメチオニン、約５ｍＭ〜約４５ｍＭのマンニトール、および約５ｍＭ〜約４５ｍＭのヒスチジン
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
液体が緩衝溶液である、請求項６または１１に記載の方法。
【請求項１３】
組成物が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム（ＤＭＰＳ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、メタロチオネイン、およびデスフェロキサミン：からなる群から選択される少なくとも１種のキレート剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
組成物が、アニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、およびサイズ排除クロマトグラフィー樹脂：からなる群から選択される少なくとも１種のクロマトグラフィー樹脂を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
組成物が、タンパク質リガンドを含むアフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質リガンドがプロテインＡである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
組成物がアニオン交換クロマトグラフィー樹脂を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
アニオン交換クロマトグラフィー樹脂がＮ−ベンジル−Ｎ−メチル−エタノールアミン基を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
線量が約１５ｋＧｙ〜約４５ｋＧｙである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
線量が約２０ｋＧｙ〜約３０ｋＧｙである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
線量が約２３ｋＧｙ〜約２７ｋＧｙである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
曝露が、約−２５℃〜約０℃（両端を含む）の温度で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
曝露が、約０℃〜約２５℃（両端を含む）の温度で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項３に記載の方法により生産される低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２５】
約１×１０−８〜約１×１０−５の滅菌保証レベル（ＳＡＬ）を有する、請求項２４に記載の低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２６】
約１×１０−７〜約１×１０−６の滅菌保証レベル（ＳＡＬ）を有する、請求項２５に記載の低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２７】
アニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、およびサイズ排除クロマトグラフィー樹脂：からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂を含む、請求項２４に記載の低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２８】
タンパク質リガンドを含むアフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む、請求項２７に記載の低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２９】
タンパク質リガンドがプロテインＡである、請求項２８に記載の低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂。
【請求項３０】
アニオン交換クロマトグラフィー樹脂を含む、請求項２７に記載の低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂。
【請求項３１】
アニオン交換クロマトグラフィー樹脂がＮ−ベンジル−Ｎ−メチル−エタノールアミン基を含む、請求項３０に記載の低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂。
【請求項３２】
低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを作成する方法であって、
請求項２４に記載の低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂を準備すること；および
該クロマトグラフィー樹脂を殺菌環境中で低減したバイオバーデンのカラムに充填すること：
を含む、前記方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法により生産される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム。
【請求項３４】
請求項５に記載の方法により生産される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム。
【請求項３５】
充填されたカラム内の樹脂が、約１×１０−８〜約１×１０−５の滅菌保証レベル（ＳＡＬ）を有する、請求項３４に記載の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム。
【請求項３６】
樹脂が約１×１０−７〜約１×１０−６の滅菌保証レベル（ＳＡＬ）を有する、請求項３５に記載の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム。
【請求項３７】
充填されたカラム内の樹脂が、アニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、およびサイズ排除クロマトグラフィー樹脂：からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂を含む、請求項３４に記載の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム。
【請求項３８】
樹脂が、タンパク質リガンドを含むアフィニティーまたは擬似アフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む、請求項３７に記載の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム。
【請求項３９】
リガンドがプロテインＡである、請求項３８に記載の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム。
【請求項４０】
樹脂がアニオン交換クロマトグラフィー樹脂を含む、請求項３７に記載の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム。
【請求項４１】
アニオン交換クロマトグラフィー樹脂がＮ−ベンジル−Ｎ−メチル−エタノールアミン基を含む、請求項４０に記載の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム。
【請求項４２】
クロマトグラフィー樹脂ならびに少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む組成物であって、該少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤は、該組成物のバイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射による処理の際に該クロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を改善するのに充分な量で存在する、前記組成物。
【請求項４３】
少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む液体中の堆積したクロマトグラフィー樹脂のスラリーである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
固体混合物である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４５】
還元グルタチオン、還元チオレドキシン、還元システイン、カロテノイド、メラトニン、リコピン、トコフェロール、還元ユビキノン、アスコルベート、ビリルビン、尿酸、リポ酸、フラボノイド、フェノールプロパノイド酸、リドカイン、ナリンゲニン、フラーレン、グルコース、マンニトール、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、およびジメチルメトキシクロマノール：からなる群から選択される少なくとも１種の酸化防止剤を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４６】
マンニトール、アスコルビン酸ナトリウム、ヒスチジン、およびメチオニン：からなる群から選択される少なくとも１種の酸化防止剤を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４７】
マンニトール、アスコルビン酸ナトリウム、ヒスチジン、およびメチオニンを含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４８】
液体が：
（ｉ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭのマンニトール；
（ｉｉ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭのメチオニン；
（ｉｉｉ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム；
（ｉｖ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭのヒスチジン；
（ｖ）３０ｍＭ〜約７０ｍＭのメチオニンおよび約３０ｍＭ〜約７０ｍＭのヒスチジン；（ｖｉ）約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのメチオニン、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのヒスチジン、および約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム；または
（ｖｉｉ）約５ｍＭ〜約４５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、約５ｍＭ〜約４５ｍＭのメチオニン、約５ｍＭ〜約４５ｍＭのマンニトール、および約５ｍＭ〜約４５ｍＭのヒスチジン
を含む、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４９】
液体が緩衝溶液である、請求項４３または４８に記載の組成物。
【請求項５０】
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム（ＤＭＰＳ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、メタロチオネイン、およびデスフェロキサミン：からなる群から選択される少なくとも１種のキレート剤を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項５１】
クロマトグラフィー樹脂が、アニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、およびサイズ排除クロマトグラフィー樹脂：からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項５２】
樹脂が、タンパク質リガンドを含むアフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
タンパク質リガンドがプロテインＡである、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
低減したバイオバーデンのカラムクロマトグラフィーを実行する方法であって、
（ａ）請求項３３または３４に記載の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを準備すること；および
（ｂ）該低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムおよび低減したバイオバーデンの緩衝液を用いて閉鎖系でカラムクロマトグラフィーを実行すること
を含む、前記方法。
【請求項５５】
低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを用いる低減したバイオバーデンのカラムクロマトグラフィーが、少なくとも４日の期間連続的に実行される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを用いる低減したバイオバーデンのカラムクロマトグラフィーが、少なくとも５日の期間連続的に実行される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを用いる低減したバイオバーデンのカラムクロマトグラフィーが、少なくとも７日の期間連続的に実行される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを用いる低減したバイオバーデンのカラムクロマトグラフィーが、少なくとも１４日の期間連続的に実行される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを用いる低減したバイオバーデンのカラムクロマトグラフィーが、少なくとも２８日の期間連続的に実行される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
（ａ）の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム内の樹脂が、ガンマ線照射で処理されてない同じ樹脂と比較して約７５％〜約１００％の結合能力パーセントを有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム内の樹脂が、アニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、およびサイズ排除クロマトグラフィー樹脂：からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
樹脂が、タンパク質リガンドを含むアフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
タンパク質リガンドがプロテインＡである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
樹脂がアニオン交換クロマトグラフィー樹脂を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
精製された組換えタンパク質を低減したバイオバーデンで製造するための一体化され、
クローズドな、連続的な方法であって、
（ａ）実質的に細胞を含まない、組換えタンパク質を含む液体培養培地を準備すること；および
（ｂ）請求項３３または３４に記載の少なくとも１つの低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを含むマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）に該液体培養培地を連続的に供給すること：
を含み
低減したバイオバーデンの緩衝液を利用し、一体化されており、該液体培養培地から、該精製された組換えタンパク質である該ＭＣＣＳからの溶出液まで連続的に稼動する、前記方法。
【請求項６６】
ＭＣＣＳが少なくとも２つの異なる単位操作を実行する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
カラム切り替えを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
ＭＣＣＳが組換えタンパク質を捕獲する、およびウィルスを不活化するという単位操作を実行する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
ＭＣＣＳが組換えタンパク質を捕獲する、および精製するという単位操作を実行する、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
ＭＣＣＳが少なくとも２つの低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
ＭＣＣＳが定期的向流クロマトグラフィーシステムである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
ＭＣＣＳが、アフィニティーもしくは擬似アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、もしくはサイズ排除クロマトグラフィー、またはこれらの任意の組合せのための複数のカラムを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７３】
ＭＣＣＳがアフィニティークロマトグラフィー用のカラムを含み、アフィニティークロマトグラフィーがプロテインＡ結合捕獲機構、基質結合捕獲機構、抗体−または抗体フラグメント結合捕獲機構、アプタマー結合捕獲機構、および補因子結合捕獲機構：からなる群から選択される捕獲機構によって方法において実行される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
アフィニティークロマトグラフィーがプロテインＡ結合捕獲機構によって方法において実行され、組換えタンパク質が抗体または抗体フラグメントである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
精製された組換えタンパク質を低減したバイオバーデンで製造するための一体化され、クローズドな、連続的な方法であって、
（ａ）実質的に細胞を含まない、組換えタンパク質を含む液体培養培地を準備すること；（ｂ）該液体培養培地を第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）に連続的に供給すること；
（ｃ）該ＭＣＣＳ１を用いて該液体培養培地中の該組換えタンパク質を捕獲すること；
（ｄ）該組換えタンパク質を含む該ＭＣＣＳ１からの溶出液を生産し、該溶出液を第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）に連続的に供給すること；
（ｅ）該組換えタンパク質を該溶出液から該ＭＣＣＳ２に連続的に供給し、その後該組換えタンパク質を溶出することにより該精製された組換えタンパク質を生産すること：
を含み、
該方法は低減したバイオバーデンの緩衝液を利用し、一体化されており、該液体培養培地から、該精製された組換えタンパク質まで連続的に稼動し、ならびに
該ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内の少なくとも１つのカラムは請求項３３または３４に記載の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを含有する、前記方法。
【請求項７６】
ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２が少なくとも２つの異なる単位操作を実行する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
カラム切り替えを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
ＭＣＣＳ１が組換え治療用タンパク質を捕獲する、およびウィルスを不活化するという単位操作を実行する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
ＭＣＣＳ２が組換えタンパク質を精製する、およびポリッシュするという単位操作を実行する、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２が少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
ＭＣＣＳ１が第１の定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ１）である、請求項７５に記載の方法。
【請求項８２】
捕獲が、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、もしくはサイズ排除クロマトグラフィー、またはこれらの任意の組合せを用いて実行される、請求項７５に記載の方法。
【請求項８３】
アフィニティークロマトグラフィーが、プロテインＡ結合捕獲機構、基質結合捕獲機構、抗体−または抗体フラグメント結合捕獲機構、アプタマー結合捕獲機構、および補因子結合捕獲機構：からなる群から選択される捕獲機構によって実行される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
アフィニティークロマトグラフィーがプロテインＡ結合捕獲機構によって実行され、組換えタンパク質が抗体または抗体フラグメントである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
ＭＣＣＳ２が第２の定期的向流（ＰＣＣＳ２）クロマトグラフィーシステムである、請求項７５に記載の方法。
【請求項８６】
組換えタンパク質が治療用の組換えタンパク質である、請求項６５または７５に記載の方法。
【請求項８７】
精製された治療用の組換えタンパク質を医薬組成物中に配合することをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
少なくとも４日の期間連続的に実行される、請求項６５または７５に記載の方法。
【請求項８９】
少なくとも５日の期間連続的に実行される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
少なくとも７日の期間連続的に実行される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
少なくとも１４日の期間連続的に実行される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
少なくとも２８日の期間連続的に実行される、請求項９１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１月１７日に出願された米国仮特許出願６１／９２８，９２９号、および２０１４年５月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／００１，４９８号の優先権を主張し、これらは各々その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、組換えタンパク質に関するバイオテクノロジーおよびバイオ製造の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞は、しばしば、治療用または商業用に重要なタンパク質を製造するために使用されている。多様な製品パイプラインに関する現在の環境において、バイオテクノロジー系の会社は、非常に自由度が高くて対費用効果の良い治療用タンパク質原薬製造のための革新的な解決策の開発へと増々駆り立てられている。組換えタンパク質を効率的に単離する方策の１つは、（例えば、閉鎖系を用いる）連続クロマトグラフィーを包含するプロセスによるものである。連続クロマトグラフィーの１つの知られている制限は、夾雑製品、生産収率の低下、および系内の流量の減少（または圧力の上昇）をもたらすことになる系内の夾雑する作用物質（例えば、増大したバイオバーデン）の存在である。例えば、系内の増大したバイオバーデンはその系の完全なシャットダウンを引き起こす可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、クロマトグラフィー樹脂のガンマ線照射がクロマトグラフィー樹脂の結合能力を低下させるという発見に少なくとも部分的に基づいている。この発見に鑑みて、本明細書に、クロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減する方法であって、クロマトグラフィー樹脂および少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む組成物を含む容器を、容器およびクロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射に曝露することを含み、少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤は、その線量のガンマ線照射への曝露後／その際にクロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を改善するのに充分な量で存在する、方法が提供される。また、クロマトグラフィー樹脂（および場合により、ガンマ線照射の曝露後／その際にクロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を改善するのに充分な量の少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤）を含む組成物を含む容器を、約０．１ｋＧｙ／時〜約６ｋＧｙ／時の割合で、および／または約４℃〜約２５℃の温度で、容器およびクロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射に相当するガンマ線照射に曝露することを含む、クロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減する方法も提供される。また、本明細書に記載の方法のいずれかにより製造された低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂を含有する低減したバイオバーデンのクロマトグラフィーカラム、クロマトグラフィー樹脂および少なくとも１種のキレート剤および／または酸化防止剤を含む組成物、これらの低減したバイオバーデンのクロマトグラフィーカラムの少なくとも１つを使用する低減したバイオバーデンのカラムクロマトグラフィーを実行する方法、ならびにこれらの低減したバイオバーデンのクロマトグラフィーカラムの少なくとも１つの使用を含む精製された組換えタンパク質を低減したバイオバーデンで製造する一体化され、クローズドなまたは実質的にクローズドな、連続的な方法も提供される。本明細書に記載の方法のいずれかにより生産されるクロマトグラフィー樹脂のいずれも、本明細書に記載の方法のいずれかにより生産される充填されたクロマトグラフィーカラムのいずれ
も、カラムクロマトグラフィーを実行する方法のいずれも、また本明細書に記載された方法のいずれも、無菌、絶対的に無菌、殺菌、または低減したバイオバーデンであることができる。本明細書に記載の方法のいずれかにより生産されるクロマトグラフィー樹脂のいずれも、本明細書に記載の方法のいずれかにより生産されるクロマトグラフィーカラムのいずれも、また本明細書に記載された方法のいずれも、殺菌された無菌、絶対的に無菌、殺菌、または低減したバイオバーデンであることができる。
【０００５】
本明細書に、クロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減する方法であって、クロマトグラフィー樹脂ならびに少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む組成物を含む容器を、容器およびクロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射に曝露することを含み、少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤は、その線量のガンマ線照射に曝露した後にクロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を改善するのに充分な量で存在する、方法が提供される。これらの方法のいくつかの実施形態は、曝露に先立って組成物を容器中に配置することをさらに含む。いくつかの例において、照射は、約０．１ｋＧｙ／時〜約６ｋＧｙ／時の割合で、および／または約４℃〜約２５℃の温度で実行する。これらの方法のいずれかのいくつかの例において、容器は貯蔵容器、クロマトグラフィーカラム、または充填されたクロマトグラフィーカラムである。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、組成物は少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む液体中の堆積したクロマトグラフィー樹脂のスラリーである。いくつかの例において、液体は：（ｉ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ（例えば、８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約８５ｍＭ〜約１１５ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、または約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ）のマンニトール；（ｉｉ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ（例えば、約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約８５ｍＭ〜約１１５ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、または約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ）のメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）；（ｉｉｉ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ（例えば、約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約８５ｍＭ〜約１１５ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、または約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ）のアスコルビン酸ナトリウム；（ｉｖ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ（例えば、約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約８５ｍＭ〜約１１５ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、または約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ）のヒスチジン；（ｖ）３０ｍＭ〜約７０ｍＭ（例えば、約３５ｍＭ〜約６５ｍＭ、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭ、または約４５ｍＭ〜約５５ｍＭ）のメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）および約３０ｍＭ〜約７０ｍＭ（例えば、約３５ｍＭ〜約６５ｍＭ、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭ、または約４５ｍＭ〜約５５ｍＭ）のヒスチジン；（ｖｉ）約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、または約２５ｍＭ〜約３５ｍＭ）のメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、または約２５ｍＭ〜約３５ｍＭ）のヒスチジン、および約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、または約２５ｍＭ〜約３５ｍＭ）のアスコルビン酸ナトリウム；または（ｖｉｉ）約５ｍＭ〜約４５ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ）のアスコルビン酸ナトリウム、約５ｍＭ〜約４５ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ）のメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）、約５ｍＭ〜約４５ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ）のマンニトール、および約５ｍＭ〜約４５ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ）のヒスチジンを含む。いくつかの例において、液体は緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝溶液、例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０のようなリン酸ナトリウム緩衝溶液）である。
【０００６】
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、組成物は固体混合物である
。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、組成物は：還元グルタチオン、還元チオレドキシン、還元システイン、カロテノイド、メラトニン、リコピン、トコフェロール、還元ユビキノン、アスコルベート、ビリルビン、尿酸、リポ酸、フラボノイド、フェノールプロパノイド酸（ｐｈｅｎｏｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ  ａｃｉｄ）、リドカイン、ナリンゲニン、フラーレン、グルコース、マンニトール、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ｏｘｙｌ）、およびジメチルメトキシクロマノールからなる群から選択される少なくとも１種の酸化防止剤を含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、組成物はマンニトール、アスコルビン酸ナトリウム、メチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）、およびヒスチジンから選択される少なくとも１（１、２、３、または４）種の酸化防止剤を含む。いくつかの実施形態において、組成物はマンニトール、アスコルビン酸ナトリウム、メチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）、およびヒスチジンを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、組成物は：エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム（ＤＭＰＳ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、メタロチオネイン、およびデスフェロキサミンからなる群から選択される少なくとも１種のキレート剤を含む。
【０００７】
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、組成物は：アニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティーまたは擬似アフィニティークロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、およびサイズ排除クロマトグラフィー樹脂（またはこれらの任意の組合せ）からなる群から選択される少なくとも１種のクロマトグラフィー樹脂を含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、クロマトグラフィー樹脂は多モード（例えば、二モード）クロマトグラフィー樹脂（例えば、アニオン交換基および疎水性相互作用基を有するクロマトグラフィー樹脂、またはカチオン交換基および疎水性相互作用基の両方を有するクロマトグラフィー樹脂）であることができる。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、組成物は、タンパク質リガンド（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）を含むアフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、組成物はアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（例えば、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル−エタノールアミン基を含むアニオン交換クロマトグラフィー樹脂）を含む。
【０００８】
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、線量は約２ｋＧｙ〜約４５ｋＧｙ（例えば、約２０ｋＧｙ〜約３０ｋＧｙ、約２３ｋＧｙ〜約２７ｋＧｙ、約２ｋＧｙ〜約４０ｋＧｙ、約２ｋＧｙ〜約３５ｋＧｙ、約２ｋＧｙ〜約３０ｋＧｙ、約２ｋＧｙ〜約２５ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜約４５ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜約４０ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜約３５ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜約３０ｋＧｙ、または約１０ｋＧｙ〜約２５ｋＧｙ）である。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、曝露は約−２５℃〜約０℃（両端を含む）、または約０℃〜約２５℃（両端を含む）（例えば、約４℃〜約２５℃）の温度で実行される。
【０００９】
また本明細書に記載の方法のいずれかにより生産される低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂も提供される。本明細書に提供される低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂のいずれかのいくつかの例においては、約１×１０−８〜約１×１０−５（例えば、約１×１０−７〜約１×１０−６）の滅菌保証レベル（ＳＡＬ）を有する。例えば、本明細書に記載の方法のいずれかにより生産されるクロマトグラフィー樹脂は低減したバイオバーデンを有し、無菌であり、殺菌され、または絶対的に無菌であることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法のいずれかにより生産されるクロマトグラフィー樹脂は殺菌されており、かつ低減したバイオバーデンを有し、無
菌であり、または絶対的に無菌であることができる。本明細書に提供される低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂のいずれかのいくつかの例は：アニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティーまたは擬似アフィニティークロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、およびサイズ排除クロマトグラフィー樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂はタンパク質リガンド（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）を含むアフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂はアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（例えば、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル−エタノールアミン基を含むアニオン交換クロマトグラフィー樹脂）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂は多モードのクロマトグラフィー樹脂（例えば、二モードのクロマトグラフィー樹脂）である。
【００１０】
また、低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを作成する方法であって、本明細書に記載の方法のいずれかにより生産される低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂のいずれかを準備すること；およびそのクロマトグラフィー樹脂を殺菌環境で低減したバイオバーデンのカラム中に充填すること：を含む、方法も提供される。また、クロマトグラフィーカラム内に含まれている充填されたクロマトグラフィー樹脂ならびに少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤（例えば、本明細書に提供される代表的な組成物のいずれか）を含む組成物にガンマ線を照射することにより生産される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムも提供される。本明細書に提供される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムのいずれも約１×１０−８〜約１×１０−５（例えば、約１×１０−７〜約１×１０−６）の滅菌保証レベル（ＳＡＬ）を有することができる。本明細書に記載の方法のいずれかにより生産されるクロマトグラフィーカラムのいずれも低減したバイオバーデンを有し、無菌であり、絶対的に無菌であり、または殺菌されていることができる。例えば、本明細書に記載の方法のいずれかにより生産されるクロマトグラフィーカラムのいずれも殺菌されていることができ、かつ低減したバイオバーデンを有し、無菌であり、または絶対的に無菌であることができる。
【００１１】
本明細書に提供される低減され充填されたクロマトグラフィーカラムのいずれかのいくつかの実施形態において、充填されたカラム内の樹脂は：アニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、およびサイズ排除クロマトグラフィー樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂を含む。本明細書に提供される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムのいずれかのいくつかの実施形態において、樹脂はタンパク質リガンド（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）を含むアフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む。本明細書に提供される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムのいずれかのいくつかの例において、樹脂はアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（例えば、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル−エタノールアミン基を含むアニオン交換クロマトグラフィー樹脂）を含む。
【００１２】
また、クロマトグラフィー樹脂ならびに少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む組成物であって、少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤が、組成物のバイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射による処理の際にクロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を改善するのに充分な量で存在する、組成物も提供される。本明細書に提供される組成物のいずれかのいくつかの例において、組成物は少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む液体中の堆積したクロマトグラフィー樹脂のスラリーである。いくつかの例において、液体は：（ｉ）７５ｍＭ〜約
１２５ｍＭ（例えば、８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約８５ｍＭ〜約１１５ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、または約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ）のマンニトール；（ｉｉ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ（例えば、約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約８５ｍＭ〜約１１５ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、または約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ）のメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）；（ｉｉｉ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ（例えば、約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約８５ｍＭ〜約１１５ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、または約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ）のアスコルビン酸ナトリウム；（ｉｖ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ（例えば、約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約８５ｍＭ〜約１１５ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、または約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ）のヒスチジン；（ｖ）３０ｍＭ〜約７０ｍＭ（例えば、約３５ｍＭ〜約６５ｍＭ、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭ、または約４５ｍＭ〜約５５ｍＭ）のメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）および約３０ｍＭ〜約７０ｍＭ（例えば、約３５ｍＭ〜約６５ｍＭ、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭ、または約４５ｍＭ〜約５５ｍＭ）のヒスチジン；（ｖｉ）約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、または約２５ｍＭ〜約３５ｍＭ）のメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、または約２５ｍＭ〜約３５ｍＭ）のヒスチジン、および約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、または約２５ｍＭ〜約３５ｍＭ）のアスコルビン酸ナトリウム；または（ｖｉｉ）約５ｍＭ〜約４５ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ）のアスコルビン酸ナトリウム、約５ｍＭ〜約４５ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ）のメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）、約５ｍＭ〜約４５ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ）のマンニトール、および約５ｍＭ〜約４５ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ）のヒスチジンを含む。いくつかの例において、液体は緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝溶液、例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０のようなリン酸ナトリウム緩衝溶液）である。
【００１３】
本明細書に提供される組成物のいずれかのいくつかの例において、組成物は固体混合物である。
【００１４】
本明細書に提供される組成物のいずれかのいくつかの実施形態は：還元グルタチオン、還元チオレドキシン、還元システイン、カロテノイド、メラトニン、リコピン、トコフェロール、還元ユビキノン、アスコルベート、ビリルビン、尿酸、リポ酸、フラボノイド、フェノールプロパノイド酸、リドカイン、ナリンゲニン、フラーレン、グルコース、マンニトール、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、およびジメチルメトキシクロマノールからなる群から選択される少なくとも１種の酸化防止剤を含むことができる。本明細書に提供される組成物のいずれかのいくつかの実施形態はマンニトール、アスコルビン酸ナトリウム、メチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）、およびヒスチジンから選択される少なくとも１（１、２、３、または４）種の酸化防止剤を含むことができる。本明細書に提供される組成物のいずれかのいくつかの例はマンニトール、アスコルビン酸ナトリウム、メチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）、およびヒスチジンを含む。本明細書に提供される組成物のいずれかのいくつかの例は：エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム（ＤＭＰＳ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、メタロチオネイン、およびデスフェロキサミンからなる群から選択される少なくとも１種のキレート剤を含むことができる。本明細書に提供される組成物のいずれかのいくつかの例において、クロマトグラフィー樹脂は：アニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、疎
水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、およびサイズ排除クロマトグラフィー樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂を含むことができる。本明細書に提供される組成物のいずれかのいくつかの例において、樹脂はタンパク質リガンド（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）を含むアフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む。
【００１５】
また、低減したバイオバーデンのカラムクロマトグラフィーを実行する方法であって、（ａ）本明細書に記載の方法のいずれかにより生産された低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムのいずれかを準備すること；および（ｂ）低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムおよび低減したバイオバーデンの緩衝液を閉鎖系で用いてカラムクロマトグラフィーを実行すること：を含む、方法も提供される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを用いる低減したバイオバーデンのカラムクロマトグラフィーは、少なくとも４日（例えば、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１４日、少なくとも２８日、または少なくとも６０日）の期間連続的に実行される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、（ａ）における低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム内の樹脂は、ガンマ線照射で処理されてない同じ樹脂と比較して約６５％〜約１００％（例えば、約７５％〜約１００％）の結合能力パーセントを有する。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム内の樹脂は：アニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティーまたは擬似アフィニティークロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、およびサイズ排除クロマトグラフィー樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂を含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、樹脂はタンパク質リガンド（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）を含むアフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、樹脂はアニオン交換クロマトグラフィー樹脂を含む。
【００１６】
また、精製された組換えタンパク質を低減したバイオバーデンで製造するための一体化され、クローズドなまたは実質的にクローズドな、連続的な方法であって、（ａ）実質的に細胞を含まない組換えタンパク質を含む液体培養培地を準備すること；および（ｂ）その液体培養培地を、本明細書に記載の方法のいずれかにより生産された低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムのいずれかの少なくとも１つを含むマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）に連続的に供給すること：を含み、低減したバイオバーデンの緩衝液を利用し、一体化されており、液体培養培地から、精製された組換えタンパク質であるＭＣＣＳからの溶出液まで連続的に稼動する、方法が提供される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳは少なくとも２つの異なる単位操作を実行する。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法はカラム切り替えを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、ＭＣＣＳは組換えタンパク質を捕獲する、およびウィルスを不活化するという単位操作を実行するか、または組換えタンパク質を捕獲し精製するという単位操作を実行する。
【００１７】
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳは少なくとも２つの低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、ＭＣＣＳは定期的向流クロマトグラフィーシステムである。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、ＭＣＣＳはアフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、もしくはサイズ排除クロマトグラフィー、またはこれらの任意の組合せのための複数のカラムを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳはアフィニティークロマトグラフィーのためのカラムを含み、
アフィニティークロマトグラフィーはプロテインＡ結合捕獲機構、基質結合捕獲機構、抗体または抗体フラグメント結合捕獲機構、アプタマー結合捕獲機構、および補因子結合捕獲機構：からなる群から選択される捕獲機構によって方法において実行される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、アフィニティークロマトグラフィーはプロテインＡ結合捕獲機構によって方法において実行され、組換えタンパク質は抗体または抗体フラグメントである。
【００１８】
また、精製された組換えタンパク質を低減したバイオバーデンで製造するための一体化され、クローズドなまたは実質的にクローズドな、連続的な方法であって、（ａ）実質的に細胞を含まない組換えタンパク質を含む液体培養培地を準備すること；（ｂ）その液体培養培地を第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）に連続的に供給すること；（ｃ）ＭＣＣＳ１を用いて液体培養培地中の組換えタンパク質を捕獲すること；（ｄ）組換えタンパク質を含むＭＣＣＳ１から溶出液を生成し、その溶出液を第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）に連続的に供給すること；および（ｅ）溶出液から組換えタンパク質をＭＣＣＳ２中に連続的に供給し、続いて組換えタンパク質を溶出することにより精製された組換えタンパク質を生産すること：を含み、この方法は、低減したバイオバーデンの緩衝液を利用し、一体化されており、液体培養培地から、精製された組換えタンパク質まで連続的に稼動し、ならびにＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内の少なくとも１つのカラムは本明細書に記載の方法のいずれかにより生産された低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムのいずれかの少なくとも１つを含有する、方法も提供される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は少なくとも２つの異なる単位操作を実行する。本明細書に記載の方法のいくつかの例はカラム切り替えを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、ＭＣＣＳ１は組換え治療用タンパク質を捕獲する、およびウィルスを不活化するという単位操作を実行する。本明細書に提供される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ２は組換えタンパク質を精製しポリッシュするという単位操作を実行する。本明細書に提供される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、ＭＣＣＳ１は第１の定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ１）である。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、捕獲はアフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、もしくはサイズ排除クロマトグラフィー、またはこれらの任意の組合せを用いて実行される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、アフィニティークロマトグラフィーは：プロテインＡ結合捕獲機構、基質結合捕獲機構、抗体または抗体フラグメント結合捕獲機構、アプタマー結合捕獲機構、および補因子結合捕獲機構からなる群から選択される捕獲機構によって実行される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーはプロテインＡ結合捕獲機構によって実行され、組換えタンパク質は抗体または抗体フラグメントである。
【００１９】
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ２は第２の定期的向流（ＰＣＣＳ２）クロマトグラフィーシステムである。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、組換えタンパク質は治療用の組換えタンパク質である。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態は、精製された治療用組換えタンパク質を医薬組成物中に配合することをさらに含む。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態は少なくとも４日（例えば、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１４日、または少なくとも２８日）の期間連続的に実行することができる。
【００２０】
また、（ａ）実質的に乾燥したクロマトグラフィー樹脂を含む容器を、容器およびクロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射に曝露す
ることを含む、クロマトグラフィーのバイオバーデンを低減する方法も提供される。これらの方法のいくつかの実施形態は、工程（ａ）の前に、クロマトグラフィー樹脂を乾燥してクロマトグラフィー樹脂から液体を除去することをさらに含む。いくつかの実施形態において、実質的に乾燥したクロマトグラフィー樹脂は有意な量の酸化防止剤または有意な量のキレート剤を含有しない。いくつかの実施形態において、容器は貯蔵容器である。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー樹脂は物品（例えば、チップ、膜、またはカセット）の表面に共有結合される。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー樹脂はタンパク質リガンド（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）を含む。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー樹脂はアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（例えば、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル−エタノールアミン基を含むクロマトグラフィー樹脂）である。いくつかの実施形態において、線量は約１５ｋＧｙ〜約４５ｋＧｙ（例えば、約２０ｋＧｙ〜約３０ｋＧｙ）である。また、本明細書に記載の方法のいずれかにより生産される低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂も提供される。いくつかの実施形態において、生産される低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂は約１×１０−８〜約１×１０−５の滅菌保証レベル（ＳＡＬ）（例えば、約１×１０−７〜約１×１０−６のＳＡＬ）を有する。いくつかの実施形態において、低減したクロマトグラフィー樹脂は：アニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、およびサイズ排除クロマトグラフィー樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂を含む。いくつかの実施形態において、低減したクロマトグラフィー樹脂はタンパク質リガンド（例えば、プロテインＡ）を含むアフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む。いくつかの実施形態において、低減したクロマトグラフィー樹脂はアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（例えば、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル−エタノールアミン基を含むアニオン交換クロマトグラフィー樹脂）を含む。また、低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを作成する方法であって、本明細書に記載の方法のいずれかにより生産される低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂を準備すること；およびそのクロマトグラフィー樹脂を殺菌環境で低減したバイオバーデンのカラムに充填することを含む、方法も提供される。また、本明細書に記載の方法のいずれかにより生産される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムも提供される。
【００２１】
また、精製された組換えタンパク質を低減したバイオバーデンで製造する一体化され、クローズドな、連続的な方法であって、（ａ）実質的に細胞を含まない組換えタンパク質を含む液体培養培地を準備すること；および（ｂ）その液体培養培地を、本明細書に提供される方法のいずれかにより生産される少なくとも１つの低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを含むマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）に連続的に供給すること：を含み、低減したバイオバーデンの緩衝液を利用し、一体化されており、液体培養培地から、精製された組換えタンパク質であるＭＣＣＳからの溶出液まで連続的に稼動する、方法も提供される。また、精製された組換えタンパク質を低減したバイオバーデンで製造する一体化され、クローズドな、連続的な方法であって、（ａ）実質的に細胞を含まない組換えタンパク質を含む液体培養培地を準備すること；（ｂ）その液体培養培地を第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）に連続的に供給すること；（ｃ）ＭＣＣＳ１を用いて液体培養培地中の組換えタンパク質を捕獲すること；（ｄ）組換えタンパク質を含むＭＣＣＳ１から溶出液を生成し、その溶出液を第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）に連続的に供給すること；および（ｅ）組換えタンパク質を溶出液からＭＣＣＳ２に連続的に供給し、その後組換えタンパク質を溶出することにより精製された組換えタンパク質を生産すること：を含み、この方法は、低減したバイオバーデンの緩衝液を利用し、一体化されており、液体培養培地から、精製された組換えタンパク質まで連続的に稼動し、ならびにＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内の少なくとも１つのカラムは本明細書に提供される方法のいずれかにより生産される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム
を含有する、方法が提供される。
【００２２】
本明細書で使用する場合、ある名詞の前の不定冠詞、または「１つの」という単語は１つまたはそれ以上のその特定の名詞を表す。例えば、語句「低減したバイオバーデンのクロマトグラフィーカラム」は「１つまたはそれ以上の低減したバイオバーデンのクロマトグラフィーカラム」を表す。
【００２３】
用語「バイオバーデン」は業界で公知であり、組成物（例えば、固体または液体）中および／または物品（複数可）の表面（例えば、外部および／または内部の表面）上に存在する自己複製する生物学的夾雑物のレベルを指す。例えば、バイオバーデンは、クロマトグラフィー樹脂または充填されたクロマトグラフィー樹脂を含有する組成物中に存在する自己複製する生物学的夾雑物（例えば、充填されたクロマトグラフィーカラム内の充填されたクロマトグラフィー樹脂中に存在する自己複製する生物学的夾雑物）を指すことができる。他の例において、バイオバーデンは、クロマトグラフィーカラムの内側の表面上および／またはクロマトグラフィーカラム内のクロマトグラフィー樹脂の内部の自己複製する生物学的夾雑物（例えば、クロマトグラフィーカラムの内側の表面上の生物学的夾雑物およびクロマトグラフィーカラム内の充填されたクロマトグラフィー樹脂内の生物学的夾雑物）を指すことができる。バイオバーデンはまた、液体（例えば、本明細書に記載の方法またはプロセスのいずれかで使用される緩衝液）中に存在する自己複製する生物学的夾雑物を指すこともできる。自己複製する生物学的夾雑物の非限定例は細菌（例えば、グラム陽性もしくはグラム陰性細菌、または細菌胞子）、マイコバクテリア、ウィルス（例えば、ベシウィルス、Ｃａｃｈｅ  Ｖａｌｌｅｙウィルス、パルボウィルス、ヘルペスウィルス、およびブニヤウィルス）、寄生虫、真菌、酵母、および原虫であることができる。バイオバーデンを決定するための代表的な方法は本明細書に記載されている。バイオバーデンを決定するためのさらなる方法は当技術分野で公知である。
【００２４】
「バイオバーデンの低減」という用語は、組成物（例えば、固体または液体）中および／または物品（複数可）の表面（例えば、外部および／または内部の表面）上に存在する自己複製する生物学的夾雑物のレベルの減少（例えば、検出可能な減少）を指すことが業界で公知である。クロマトグラフィー樹脂（例えば、充填されたクロマトグラフィー樹脂）、緩衝液、および／またはクロマトグラフィーカラム（例えば、充填されたクロマトグラフィーカラム）のバイオバーデンを低減する方法の非限定例は本明細書に記載されている。本明細書に記載の組成物のいずれかのバイオバーデンを低減する追加の方法は当技術分野で公知である。
【００２５】
「低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂」という用語は、クロマトグラフィー樹脂中に存在する自己複製する生物学的夾雑物のレベルを減少させる（例えば、クロマトグラフィー樹脂を含有する組成物、例えばスラリー中に存在する自己複製する生物学的夾雑物のレベルの検出可能な減少）ように処理されているクロマトグラフィー樹脂を意味する。例えば、低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂は、クロマトグラフィー樹脂中の自己複製する生物学的夾雑物のレベルを減少させるのに充分な線量のガンマ線照射に曝露された樹脂（例えば、クロマトグラフィー樹脂中の自己複製する生物学的夾雑物のレベルを減少させるのに充分な線量のガンマ線照射に曝露されたクロマトグラフィー樹脂を含有する組成物）であることができる。例えば、低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂は、約１ｋＧｙ〜約１５ｋＧｙの線量、約１ｋＧｙ〜約２０ｋＧｙのガンマ線照射、約１ｋＧｙ〜約２５ｋＧｙのガンマ線照射、約１ｋＧｙ〜約３０ｋＧｙのガンマ線照射、または約１ｋＧｙ〜約３５ｋＧｙのガンマ線照射に曝露されている樹脂であることができる。クロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減するための代表的な方法は本明細書に記載されている。クロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減するためのさらなる方法は当技術分野で公知である。
【００２６】
用語「低減したバイオバーデンのクロマトグラフィーカラム」は、未処理のクロマトグラフィー樹脂を含む同じクロマトグラフィーカラム内に存在する自己複製する生物学的夾雑物のレベル未満のレベルの自己複製する生物学的夾雑物を有する処理されたクロマトグラフィー樹脂（例えば、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂）を含むクロマトグラフィーカラム（例えば、充填されたクロマトグラフィーカラム）を意味する。例えば、低減したバイオバーデンのクロマトグラフィーカラムは少なくともまたは約１×１０−６、１×１０−７、１×１０−８、１×１０−９、または１×１０−１０の滅菌保証レベルを有する処理されたクロマトグラフィー樹脂を含むことができる。
【００２７】
用語「低減したバイオバーデンの緩衝液」は業界で公知であり、同じ未処理の液体で見られる自己複製する夾雑作用物質（複数可）のレベル未満のレベルの自己複製する夾雑作用物質（複数可）を有する処理された（例えば、ろ過、オートクレーブ処理、および／またはガンマ線照射された）液体（例えば、処理された緩衝溶液）を意味する。例えば、低減したバイオバーデンの緩衝液は少なくともまたは約１×１０−６、１×１０−７、１×１０−８、１×１０−９、または１×１０−１０の滅菌保証レベルを有することができる。
【００２８】
「絶対無菌」または「絶対的に無菌」は自己複製する生物学的夾雑物を完全に含まない組成物または方法を記述するために使用される用語である。例えば、この用語は、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂、クロマトグラフィーカラムの内面および内容物（例えば、クロマトグラフィー樹脂）、および／または緩衝液に適用することができる。絶対的に無菌の組成物または方法は（当技術分野で公知のように）クリーンであることができる。
【００２９】
「無菌の」または「無菌」は約または１．０×１０−６未満（例えば、約または１．０×１０−７未満、約または１．０×１０−８未満、約または１．０×１０−９もしくは１×１０−１０未満）の滅菌保証レベルを有する組成物または方法を記述するのに使用される用語である。組成物または方法が無菌であるかどうかの決定は当技術分野で公知の多くの確認された生産方法を用いて試験することができる。例えば、無菌の組成物または方法は生きている自己複製する生物学的夾雑物（例えば、本明細書に記載されている自己複製する生物学的夾雑物のいずれか）を完全に含まないことができる。無菌の組成物または方法もまた（当技術分野で公知のように）クリーンであることができる。
【００３０】
用語「滅菌」は組成物を（本明細書に定義されているように）無菌にするのに使用される確立された方法を意味する。ある組成物に対して（本明細書に定義されている）無菌が達成されたかどうかを決定するために、処理プロセス中耐性指示菌の自己複製する生物学的夾雑物（例えば、細菌）の不活化率を測定することができる。
【００３１】
用語「滅菌保証レベル」すなわち「ＳＡＬ」は業界で公知であり、１つのバッチの処理単位で絶対無菌を達成する信頼度レベルを意味する。この確率は通常、検証中に実行される不活化研究の結果に基づいて計算され、１×１０−ｎの形で表される。
【００３２】
用語「殺菌」は疾患を起こすかまたは症状を引き起こす自己複製する生物学的夾雑物（例えば、本明細書に記載された自己複製する生物学的夾雑物のいずれか）を含まない組成物または方法を記述するために使用される。殺菌された組成物または方法も（当技術分野で公知のように）クリーンであることができる。
【００３３】
用語「単位操作」は専門用語であり、液体培養培地から組換えタンパク質を精製する方法において実行することができる機能的な工程を意味する。例えば、一単位の動作は、ろ
過すること（例えば、夾雑物細菌、酵母、ウイルスおよび／もしくはマイコバクテリア、および／または、組換えタンパク質を含む流体から出てくる微粒子状物質の除去）、捕獲すること、エピトープタグ除去、精製すること、保持もしくは貯蔵すること、ポリッシュすること、ウイルス不活性化、組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨを調節すること、ならびに、望ましくない塩を除去することであってよい。
【００３４】
用語「捕獲する」は、液体培養培地または希釈された液体培養培地中に存在する１つまたはそれ以上の他の成分（例えば、哺乳類細胞中に存在するかまたはそれから分泌される培養培地タンパク質または１つもしくはそれ以上の他の成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のタンパク質））から、組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を部分的に精製または単離し（例えば、重量で少なくともまたは約５％、例えば、少なくとももしくは約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとももしくは約９５％純粋）、濃縮するために実行される工程を意味する。典型的には、捕獲は、（例えば、アフィニティークロマトグラフィーの使用によって）組換えタンパク質が結合するクロマトグラフィー樹脂を用いて実行される。液体培養培地または希釈済み液体培養培地から組換えタンパク質を捕獲する非限定的な方法は、本明細書で記載されており、他の方法も当技術分野で公知である。組換えタンパク質は、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜（例えば、本明細書に記載のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜のいずれか）を用いて、液体培養培地から捕獲することができる。
【００３５】
用語「精製する」は、組換えタンパク質を含む流体中に存在する１つもしくはそれ以上の他の不純物（例えば、かさ高い不純物）または成分（例えば、哺乳類細胞中に存在するかまたはそれから分泌される液体培養培地タンパク質または１つもしくはそれ以上の他の成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、他のタンパク質、内毒素、ウィルス、等））から組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を単離するために実行される工程を意味する。例えば、精製することは、最初にある捕獲する工程の最中または後に実行することができる。精製は、組換えタンパク質または夾雑物のいずれかに結合するクロマトグラフィー樹脂、膜または任意の他の固体担体を用いて（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アニオン交換もしくはカチオン交換クロマトグラフィー、または分子ふるいクロマトグラフィーの使用によって）、実行することができる。組換えタンパク質は、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜（例えば、本明細書に記載のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜のいずれか）を用いて、組換えタンパク質を含む流体から精製することができる。
【００３６】
「ポリッシュすること」という用語は専門用語であり、所望される最終的な純度に近い組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を含む流体から、微量または少量の残留夾雑物または残留不純物を除去するために実行される、工程を意味する。例えば、ポリッシュすることは、組換えタンパク質を含む流体が、標的とする組換えタンパク質に選択的に結合しまたは組換えタンパク質を含む流体中に存在する少量の夾雑物もしくは不純物に選択的に結合する、クロマトグラフィーカラム（複数可）または膜型吸着材（複数可）を通過することにより、実行することができる。このような例において、クロマトグラフィーカラム（複数可）または膜型吸着材（複数可）の溶出液／ろ液は、組換えタンパク質を含む。
【００３７】
「ろ過すること」という用語は、液体（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかにおいて存在する液体培養培地または流体）から望ましくない生物型夾雑物（例えば、哺乳類細胞、細菌、酵母細胞、ウイルスまたはマイコバクテリア）および／または粒子状物質（
例えば、沈殿したタンパク質）の少なくとも一部（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）を除去することを意味する。
【００３８】
「溶出液／ろ液」という用語は専門用語であり、検出可能な量の組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を含んでいるクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から排出される、流体を意味する。
【００３９】
用語「一体化された方法」は、特定の結果（例えば、組換えタンパク質の液体培養培地からの精製）を達成するように協力して機能する構造要素を用いて実行される方法を意味する。
【００４０】
用語「連続的な方法」は、システムの少なくとも一部を介して流体を連続的に供給する方法を意味する。例えば、連続的な方法は、組換えタンパク質を含む液体培養培地をバイオリアクターからＭＣＣＳを介して連続的に供給する方法である。連続的な方法の別の例は、組換えタンパク質を含む液体培養培地をバイオリアクターから第１および第２のＭＣＣＳ（ＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２）を介して連続的に供給する方法である。さらなる例は、組換えタンパク質を含む液体培養培地をＭＣＣＳを介して連続的に供給する方法、組換えタンパク質を含む液体培養培地をＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２を介して連続的に供給する方法、または組換えタンパク質を含む流体をＭＣＣＳ２を介して連続的に供給する方法を含む。
【００４１】
用語「クローズドな方法」は専門用語であり、組換えタンパク質と接触する方法の構成要素（例えば、クロマトグラフィー樹脂および／または緩衝液）または組換えタンパク質を含む液体が、かなりの時間夾雑作用物質に意図的に曝露されない（例えば、かなりの時間意図的に空気に曝露されない）ように実行される方法を意味する。
【００４２】
「治療用タンパク質原薬」という用語は、十分に精製されており、または、汚染をもたらすタンパク質、脂質および核酸（例えば、液体培養培地中に存在するまたは宿主細胞に由来した（例えば、哺乳類宿主細胞、酵母宿主細胞または細菌宿主細胞に由来した）夾雑タンパク質、脂質および核酸）、ならびに、生物型夾雑物（例えば、ウイルス型夾雑物および細菌型夾雑物）から十分に単離されており、さらなる大幅な精製および／または汚染除去工程（複数可）を全く用いないで医薬品中に配合することができる、組換えタンパク質（例えば、免疫グロブリン、タンパク質フラグメント、人為的改変タンパク質または酵素）を意味する。
【００４３】
「マルチカラムクロマトグラフィーシステム」または「ＭＣＣＳ」という用語は、相互接続されているまたは切り替え処理を受けることになる合計で２つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜からできたシステムを意味する。マルチカラムクロマトグラフィーシステムの非限定的な例は、相互接続されているまたは切り替え処理を受けることになる合計で２つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜を含んでいる、定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣ）である。マルチカラムクロマトグラフィーシステムのさらなる例は、本明細書で記載されており、当技術分野で公知でもある。
【００４４】
用語「実質的に含まない」は、指定された物質（例えば、哺乳類細胞または哺乳類細胞に由来する夾雑タンパク質、核酸、炭水化物、もしくは脂質）を少なくともまたは約９０％含まない（例えば、少なくとももしくは約９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとももしくは約９９％含まない、または約１００％含まない）組成物（例えば、液体培養培地）を意味する。
【００４５】
「哺乳類細胞」という用語は、任意の哺乳類（例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ミドリザル、ラット、ブタ、ウシまたはウサギ）から作られたまたは任意の哺乳類に由来した任意の細胞を意味する。例えば、哺乳類細胞は、不死化細胞であってよい。いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、分化細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、未分化細胞である。哺乳類細胞の非限定的な例は、本明細書で記載されている。哺乳類細胞のさらなる例は、当技術分野で公知である。
【００４６】
「培養」または「細胞培養」という用語は、制御下にある一組の物理的条件下における哺乳類細胞の維持または増殖を意味する。
【００４７】
「哺乳類細胞の培養物」という用語は、制御下にある一組の物理的条件下で維持または増殖される複数の哺乳類細胞を含有する、液体培養培地を意味する。
【００４８】
「液体培養培地」という用語は、細胞（例えば、哺乳類細胞）がインビトロで成長または増殖できるようにするのに十分な栄養素を含む、流体を意味する。例えば、液体培養培地は、次のうち１つまたはそれ以上を含み得る：アミノ酸（例えば、２０個のアミノ酸）、プリン（例えば、ヒポキサンチン）、ピリミジン（例えば、チミジン）、コリン、イノシトール、チアミン、葉酸、ビオチン、カルシウム、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チミジン、シアノコバラミン、ピルベート、リポ酸、マグネシウム、グルコース、ナトリウム、カリウム、鉄、銅、亜鉛および重炭酸ナトリウム。いくつかの実施形態において、液体培養培地は、哺乳類由来の血清を含み得る。いくつかの実施形態において、液体培養培地は、哺乳類由来の血清または別の抽出物を含まない（組成が明らかな液体培養培地（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ））。いくつかの実施形態において、液体培養培地は、微量金属、哺乳類成長ホルモンおよび／または哺乳類成長因子を含み得る。液体培養培地の別の例は、最少培地（例えば、無機塩、炭素源および水のみを含む培地）である。液体培養培地の非限定的な例は、本明細書で記載されている。液体培養培地のさらなる例が、当技術分野で公知であり、市販されてもいる。液体培養培地は、任意の密度の哺乳類細胞を含み得る。例えば、本明細書で使用されるとき、バイオリアクターから抜き出されたある体積の液体培養培地は、哺乳類細胞を実質的に含み得ない。
【００４９】
「動物由来成分無含有の液体培養培地」という用語は、哺乳類に由来したいかなる成分（例えば、タンパク質または血清）も含まない液体培養培地を意味する。
【００５０】
「血清無含有の液体培養培地」という用語は、哺乳類血清を含まない液体培養培地を意味する。
【００５１】
「血清含有液体培養培地」という用語は、哺乳類血清を含む液体培養培地を意味する。
【００５２】
「既知組成液体培養培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）」という用語は専門用語であり、化学的組成のすべてが既知になっている液体培養培地を意味する。例えば、既知組成液体培養培地は、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含まないが、こうした製造物はアルブミンと脂質との複雑な混合物を典型的には含む。
【００５３】
「タンパク質無含有の液体培養培地」という用語は、いかなるタンパク質も（例えば、検出可能ないかなるタンパク質も）含まない、液体培養培地を意味する。
【００５４】
「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリンタンパク質（例えば、可変ドメイン配列、フレームワーク配列および／または定常ドメイン配列）に関する少なくとも１５個
のアミノ酸（例えば、少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個または１００個のアミノ酸）からできたアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを意味する。免疫グロブリンは、例えば少なくともアミノ酸１５個の軽鎖免疫グロブリン、例えば少なくともアミノ酸１５個の重鎖免疫グロブリンを含み得る。免疫グロブリンは単離された抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ）、例えば、ＩｇＧのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）である。免疫グロブリンは、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントであってよい。免疫グロブリンは、二重特異性抗体もしくは三重特異性抗体、または二量体抗体、三量体抗体もしくは多量体抗体、またはジアボディ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）もしくはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）であってもよい。免疫グロブリンは、少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む人為的改変タンパク質（例えば、融合タンパク質）であってもよい。免疫グロブリンの非限定的な例は、本明細書で記載されており、免疫グロブリンのさらなる例は、当技術分野で公知である。
【００５５】
「タンパク質フラグメント」または「ポリペプチドフラグメント」という用語は、長さがアミノ酸少なくとももしくは約４個分、アミノ酸少なくとももしくは約５個分、アミノ酸少なくとももしくは約６個分、アミノ酸少なくとももしくは約７個分、アミノ酸少なくとももしくは約８個分、アミノ酸少なくとももしくは約９個分、アミノ酸少なくとももしくは約１０個分、アミノ酸少なくとももしくは約１１個分、アミノ酸少なくとももしくは約１２個分、アミノ酸少なくとももしくは約１３個分、アミノ酸少なくとももしくは約１４個分、アミノ酸少なくとももしくは約１５個分、アミノ酸少なくとももしくは約１６個分、アミノ酸少なくとももしくは約１７個分、アミノ酸少なくとももしくは約１８個分、アミノ酸少なくとももしくは約１９個分、またはアミノ酸少なくとももしくは約２０個分、または長さがアミノ酸２０個分超になっている、ポリペプチド配列の一部を意味する。組換えタンパク質フラグメントは、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて製造することができる。
【００５６】
「人為的改変タンパク質」という用語は、有機体（例えば、哺乳類）内部に存在する内因性核酸によって自然にコードされない、ポリペプチドを意味する。人為的改変タンパク質の例には、酵素（例えば、人為的改変酵素の安定性および／または触媒活性の増大をもたらす１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を受けている）、融合タンパク質、抗体（例えば、二価抗体、三価抗体またはジアボディ）、および、少なくとも１つの組換え足場配列を含む抗原結合性タンパク質が挙げられる。
【００５７】
「分泌されたタンパク質」または「分泌された組換えタンパク質」という用語は、元々含まれていた少なくとも１つの分泌シグナル配列が、哺乳類細胞内部で翻訳され、哺乳類細胞中の分泌シグナル配列が酵素によって少なくとも部分的に開裂されると、細胞外の空間（例えば、液体培養培地）に少なくとも一部が分泌される、タンパク質（例えば、組換えタンパク質）を意味する。分泌されたタンパク質として取り扱われるために、「分泌された」タンパク質が、細胞から完全にかい離している必要がないことについては、当業者ならば理解されよう。
【００５８】
「潅流型バイオリアクター」という用語は、第１の液体培養培地中の複数の細胞（例えば、哺乳類細胞）を含んでいるバイオリアクターを意味し、ここで、バイオリアクター内に存在する細胞の培養は、第１の液体培養培地を定期的または連続的に抜き出すこと、および同時またはすぐ後に、実質的に同じ体積の第２の液体培養培地をバイオリアクターに添加することを含む。いくつかの例において、培養期間（例えば、１日を基準とした際の培養培地再供給比率）中における増分による期間（例えば、約２４時間の期間、約１分から約２４時間の間の期間、または２４時間超の期間）にわたって、抜き出しおよび添加が
実行される第１の液体培養培地の体積の増分による変化（例えば、増大または減少）がある。毎日抜き出して置き換える培地の割合は、培養されている特定の細胞、初期の播種密度、および、特定の時間における細胞密度に応じて変動し得る。「ＲＶ」または「反応器容積」は、培養プロセスの開始時に存在する培養培地の体積（例えば、播種後に存在する培養培地の合計体積）を意味する。
【００５９】
「流加型バイオリアクター」という用語は専門用語であり、第１の液体培養培地中の複数の細胞（例えば、哺乳類細胞）を含んでいるバイオリアクターを意味し、ここで、バイオリアクター内に存在する細胞の培養は、細胞培養物から第１の液体培養培地または第２の液体培養培地が大幅にまたは顕著に抜き出されることなく、第１の液体培養培地に第２の液体培養培地を定期的または連続的に添加することを含む。第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地と同じであってよい。流加型培養のいくつかの例において、第２の液体培養培地は、濃縮された形態になった第１の液体培養培地である。流加型培養のいくつかの例において、第２の液体培養培地は、乾燥粉末として添加される。
【００６０】
「清澄化済み液体培養培地」という用語は、細菌細胞または酵母細胞を実質的に無含有（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％または９９％無含有）である、細菌細胞培養または酵母細胞培養から入手した液体培養培地を意味する。
【００６１】
そうではないとの規定がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書で記載されているが、当技術分野で公知になっている適切な他の方法および材料もまた、使用され得る。材料、方法および例は、説明用のものにすぎず、限定を加えるものになる意図はない。本明細書で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリおよび他の参考資料は、参照によって全部分を本明細書に組み入れる。矛盾する場合、本明細書の方が、規定を含めて支配する。
【００６２】
本発明に関する他の特色および利点については、下記の詳細な記載および図面および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、未処理のＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭ樹脂、２５ｋＧｙガンマ線を照射したＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭ樹脂、１５ｋＧｙガンマ線を照射したＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂、および１５ｋＧｙガンマ線を照射したＫａｎｅｋａ  ＫａｎＣａｐ  Ａ樹脂に対する樹脂の静的結合曲線を示すグラフである（ｍｇ／ｍＬタンパク質）。
【図２】図２は、３０ｋＧｙガンマ線照射後のＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭ樹脂および３０ｋＧｙガンマ線照射後のＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂に由来する上澄みの２８０ｎｍ吸光度（プロテインＡ吸光度）を示す表である。
【図３】図３は、未処理のＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂（バージン溶出液）または１５ｋＧｙガンマ線を照射したＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂（ガンマ溶出液）を用いて実行された複数のサイクルのクロマトグラフィーでの溶出液中のタンパク質の量を示すグラフである。
【図４】図４は、未処理のＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂を用いて実行された連続クロマトグラフィー中のサイクル７およびサイクル１１の溶出プロファイルを示すクロマトグラフである。
【図５】図５は、１５ｋＧｙガンマ線を照射したＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂を用いて実行された連続クロマトグラフィー中のサイクル７およびサイクル１１の溶出プロファイルを示すクロマトグラフである。
【図６】図６は、未処理のＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂（バージン）または１５ｋＧｙガンマ線を照射したＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂（ガンマ）を用いて実行された複数のサイクルの連続クロマトグラフィーでの溶出液中のタンパク質の量を示すグラフである。
【図７】図７は、未処理のＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂（バージン）または１５ｋＧｙガンマ線を照射したＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂（ガンマ）を用いて実行された複数のサイクルのクロマトグラフィーで結合したタンパク質のグラフである。
【図８】図８は、未処理のＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂（バージン）または２９ｋＧｙガンマ線を照射したＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂（ガンマ）を用いて実行された複数のサイクルのクロマトグラフィーでの溶出液中のタンパク質の量を示すグラフである。
【図９】図９は、未処理のＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂（バージン）、１５ｋＧｙガンマ線を照射したＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂（１５ｋＧｙ）、または２９ｋＧｙガンマ線を照射したＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂（２９ｋＧｙ）を用いて実行された複数のサイクルのクロマトグラフィーでの溶出液中のタンパク質（抗−αβＴＣＲ（ＩｇＧ１）または抗−ＴＧＦβ（ＩｇＧ４））の量を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ヒトで特定の病気を治療するのに使用することができる酵素である代表的な組換えタンパク質のリストである。
【図１１】図１１は、モノクローナルＩｇＧ１を含有する培養培地を使用して各々の樹脂を装填したとき、複数のクロマトグラフィーサイクルでの未処理（バージン）および２９−ｋＧｙガンマ線を照射したＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭ樹脂の溶出液中のタンパク質のグラフである。
【図１２】図１２は、モノクローナルＩｇＧ１を含有する培養培地を使用して各々の樹脂を装填したとき、複数のクロマトグラフィーサイクルでの未処理（バージン）および２９−ｋＧｙガンマ線を照射したＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭ樹脂に結合したタンパク質の量のグラフである。
【図１３】図１３は、いろいろな平衡濃度のモノクローナルＩｇＧ４抗体を装填した後未処理（バージン）および２９−ｋＧｙガンマ線を照射したＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭＬＸ樹脂に結合したタンパク質の量のグラフである（ｍｇ結合タンパク質／ｍＬ樹脂）。
【図１４】図１４は、未処理のＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭＬＸ樹脂（バージンＬＸ）、２９−ｋＧｙガンマ線を照射したＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭＬＸ樹脂（２９ｋＧＹ  ＬＸ）、乾燥した未処理のＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭＬＸ樹脂、および乾燥した２９−ｋＧｙガンマ線を照射したＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭＬＸ樹脂、ならびに少なくとも１種の酸化防止剤を含有する７種の異なる供試緩衝液の１つの存在下で２９ｋＧｙの線量のガンマ線を照射したＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭＬＸ樹脂の２ｍｇ／ｍＬの平衡ＩｇＧ４抗体濃度における静的結合能力（ｍｇタンパク質／ｍＬ樹脂）のグラフである。
【図１５】図１５は、未処理のＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭＬＸ樹脂（バージン）または２５ｍＭマンニトール、２５ｍＭヒスチジン、２５ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、２５ｍＭメチオニン、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ  ６．０の存在下２９ｋＧｙの線量でガンマ線を照射したＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭＬＸ樹脂を用いて実行された複数のクロマトグラフィーサイクルでの溶出液中のタンパク質の量のグラフである。
【図１６】図１６は、未処理のＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭＬＸ樹脂（バージン）または２５ｍＭマンニトール、２５ｍＭヒスチジン、２５ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、２５ｍＭメチオニン、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０の存在下２９ｋＧｙの線量でガンマ線を照射したＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭＬＸ樹脂を用いて実行された複数のクロマトグラフィーサイクルで結合したタンパク質の量のグラフである。
【図１７】図１７は、未処理のＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭＬＸ樹脂（バージンＬＸ）および２５ｍＭマンニトール、２５ｍＭヒスチジン、２５ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、２５ｍＭメチオニン、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０の存在下２９ｋＧｙの線量でガンマ線を照射したＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭＬＸ樹脂を用いた複数のクロマトグラフィーサイクルでのＩｇＧ１抗体溶出液を示す非還元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルである。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
本明細書に、クロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減する方法であって、クロマトグラフィー樹脂ならびに少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む組成物を含む容器を、容器およびクロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射に曝露することを含み、少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤は、その線量のガンマ線照射への曝露後／その際にクロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を改善するのに充分な量で存在する、方法が提供される。また、本明細書に記載の方法のいずれかにより製造された低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂を含有する低減したバイオバーデンのクロマトグラフィーカラム、クロマトグラフィー樹脂ならびに少なくとも１種のキレート剤および／または酸化防止剤を含む組成物、これらの低減したバイオバーデンのクロマトグラフィーカラムの少なくとも１つを用いて低減したバイオバーデンのカラムクロマトグラフィーを実行する方法、ならびにこれらの低減したバイオバーデンのクロマトグラフィーカラムの少なくとも１つを使用することを含む、精製された組換えタンパク質を低減したバイオバーデンで製造するための一体化され、クローズドなまたは実質的にクローズドな、連続的な方法が提供される。これらの方法およびプロセスの非限定的な局面は以下に記載される。当技術分野では理解できるように、以下に記載する様々な局面は制限されることなく任意の組合せで使用することができる。
【００６５】
クロマトグラフィー樹脂ならびに抗酸化物質および／またはキレート剤を含有する組成物
本明細書に、クロマトグラフィー樹脂（例えば、本明細書に記載または当技術分野で公知のクロマトグラフィー樹脂のいずれか）ならびに少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤（例えば、本明細書に記載または当技術分野で公知の酸化防止剤および／またはキレート剤のいずれか）を含む組成物であって、少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤は組成物のバイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射での処理の際にクロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を改善するのに充分な量で存在する、組成物が提供される。例えば、クロマトグラフィー樹脂はアニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティーもしくは擬似アフィニティークロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、およびサイズ排除クロマトグラフィー樹脂の少なくとも１種、またはこれらの任意の組合せであることができる。いくつかの例において、クロマトグラフィー樹脂はタンパク質またはペプチドリガンドを含む樹脂（例えば、タンパク質またはペプチドリガンドを有するアフ
ィニティークロマトグラフィー樹脂、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧクロマトグラフィー樹脂）である。
【００６６】
組成物は、例えば、少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む液体中の堆積したクロマトグラフィー樹脂のスラリーであることができる。例えば、液体はメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）、アスコルビン酸ナトリウム、ヒスチジン、およびマンニトールの少なくとも１（例えば、１、２、３、または４）種を含有することができる。いくつかの例において、液体はメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）、アスコルビン酸ナトリウム、ヒスチジン、およびマンニトールを含有する。いくつかの例において、液体は：（ｉ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ（例えば、８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約８５ｍＭ〜約１１５ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、または約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ）のマンニトール；（ｉｉ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ（例えば、約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約８５ｍＭ〜約１１５ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、または約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ）のメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）；（ｉｉｉ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ（例えば、約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約８５ｍＭ〜約１１５ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、または約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ）のアスコルビン酸ナトリウム；（ｉｖ）７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ（例えば、約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約８５ｍＭ〜約１１５ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、または約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ）のヒスチジン；（ｖ）約３０ｍＭ〜約７０ｍＭ（例えば、約３５ｍＭ〜約６５ｍＭ、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭ、または約４５ｍＭ〜約５５ｍＭ）のメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）および約３０ｍＭ〜約７０ｍＭ（例えば、約３５ｍＭ〜約６５ｍＭ、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭ、または約４５ｍＭ〜約５５ｍＭ）のヒスチジン；（ｖｉ）約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、または約２５ｍＭ〜約３５ｍＭ）のメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、または約２５ｍＭ〜約３５ｍＭ）のヒスチジン、および約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、または約２５ｍＭ〜約３５ｍＭ）のアスコルビン酸ナトリウム；または（ｖｉｉ）約５ｍＭ〜約４５ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ）のアスコルビン酸ナトリウム、約５ｍＭ〜約４５ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ）のメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）、約５ｍＭ〜約４５ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ）のマンニトール、および約５ｍＭ〜約４５ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ）のヒスチジンを含む。いくつかの例において、液体は緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝溶液、例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０のようなリン酸ナトリウム緩衝溶液）である。いくつかの例において、液体は緩衝溶液（例えば、リン酸ナトリウム緩衝溶液（例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）のようなリン酸緩衝溶液である。
【００６７】
いくつかの例において、組成物は固体混合物（例えば、乾燥した固体混合物または湿潤したもしくは湿った固体混合物）であることができる。固体混合物はメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）、アスコルビン酸ナトリウム、ヒスチジン、およびマンニトールのうちの少なくとも１（例えば、１、２、３、または４）種を含むことができる。いくつかの例において、固体混合物はメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）、アスコルビン酸ナトリウム、ヒスチジン、およびマンニトールを含有する。いくつかの例において、組成物は少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む液体に充填されたクロマトグラフィー樹脂である。このような液体の非限定例は本明細書に記載されている。
【００６８】
また、本明細書に、クロマトグラフィー樹脂（例えば、本明細書に記載または当技術分野で公知のクロマトグラフィー樹脂のいずれか）ならびに少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤（例えば、本明細書に記載または当技術分野で公知の酸化防止剤および／またはキレート剤のいずれか）を含む容器（例えば、プラスチック容器またはクロマトグラフィーカラム）であって、少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤は組成物のバイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射での処理の際にクロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を改善するのに充分な量で存在する、容器も提供される。例えば、容器（例えば、プラスチック容器またはクロマトグラフィーカラム）は、例えば、少なくとも約１ｍＬ、５ｍＬ、少なくとも約１０ｍＬ、少なくとも約２０ｍＬ、少なくとも約３０ｍＬ、少なくとも約４０ｍＬ、少なくとも約５０ｍＬ、少なくとも約６０ｍＬ、少なくとも約７０ｍＬ、少なくとも約８０ｍＬ、少なくとも約９０ｍＬ、少なくとも約１００ｍＬ、少なくとも約１１０ｍＬ、少なくとも約１２０ｍＬ、少なくとも約１３０ｍＬ、少なくとも約１４０ｍＬ、少なくとも約１５０ｍＬ、少なくとも約１６０ｍＬ、少なくとも約１７０ｍＬ、少なくとも約１８０ｍＬ、少なくとも約１９０ｍＬ、少なくとも約２００ｍＬ、少なくとも約２１０ｍＬ、少なくとも約２２０ｍＬ、少なくとも約２３０ｍＬ、少なくとも約２４０ｍＬ、少なくとも約２５０ｍＬ、少なくとも３００ｍＬ、少なくとも３５０ｍＬ、少なくとも４００ｍＬ、または少なくとも５００ｍＬの内容積を有することができる。例えば、容器は、例えば、約１ｍＬ〜約５００ｍＬ、約１ｍＬ〜約５０ｍＬ、約５ｍＬ〜約５００ｍＬ、約５ｍＬ〜約４００ｍＬ、約５ｍＬ〜約３５０ｍＬ、約５ｍＬ〜約３００ｍＬ、約５ｍＬ〜約２５０ｍＬ、約５ｍＬ〜約２００ｍＬ、約５ｍＬ〜約１５０ｍＬ、約５ｍＬ〜約１００ｍＬ、または約５ｍＬ〜約５０ｍＬの内容積を有することができる。いくつかの例において、容器内のクロマトグラフィー樹脂は少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む液体中の堆積したクロマトグラフィー樹脂のスラリーである。いくつかの例において、容器は充填されたクロマトグラフィー樹脂（例えば、少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む液体中に充填された）を含む。
【００６９】
本明細書に提供される組成物のいずれも少なくとも１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）種の酸化防止剤および／または少なくとも１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）種のキレート剤を含有することができる。本明細書に提供される組成物のいずれかに含まれる酸化防止剤（複数可）のいずれも、次の反応性の酸素および／または窒素種：ヒドロキシルラジカル、カーボネートラジカル、スーパーオキシドアニオン、ペルオキシルラジカル、ペルオキシナイトライト、二酸化窒素、および一酸化窒素の１つまたはそれ以上をクエンチする能力を有することができる。本明細書に提供される組成物のいずれかに含まれることができる酸化防止剤の非限定例には：還元グルタチオン、還元チオレドキシン、還元システイン、カロテノイド、メラトニン、リコピン、トコフェロール、還元ユビキノン、アスコルベート、ビリルビン、尿酸、リポ酸、フラボノイド、フェノールプロパノイド酸、リドカイン、ナリンゲニン、フラーレン、グルコース、マンニトール、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、およびジメチルメトキシクロマノールがある。酸化防止剤の追加の非限定例には、抗酸化酵素（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、カタラーゼ、およびチオレドキシンレダクターゼ）がある。本明細書に提供される組成物のいずれかに含まれることができる酸化防止剤のさらなる例としては、マンニトール、アスコルビン酸ナトリウム、メチオニン、およびヒスチジンがある。酸化防止剤のさらなる例には、システイン、タウリン、メルカプトプロピオニルグリシン、Ｎ−アセチルシステイン、ニンニク油、ジアリルスルフィド、ジヒドロリポ酸、およびジアリルトリスルフィドである。抗酸化酵素を酸化防止剤として含むいくつかの実施形態はその酵素に対する１つまたはそれ以上の基質をさらに含むことができる。酸化防止剤は、例えばスピントラップ、酸化還元感受性染料（ｒｅｄｏｘ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｙｅ）、および化学発光アッセイを含めて当技術分野で公知の幾つかの
方法を用いて確認することができる。
【００７０】
本明細書に提供される組成物のいずれかに含まれるキレート剤（複数可）のいずれも、高い親和性（例えば、約１μＭ以下、約８００ｎＭ以下、約７００ｎＭ以下、約６００ｎＭ以下、約５００ｎＭ以下、約４００ｎＭ以下、約３００ｎＭ以下、約２５０ｎＭ以下、約２００ｎＭ以下、約１５０ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約８０ｎＭ以下、約６０ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、または約１ｎｍ以下）で酸化還元活性金属（ｒｅｄｏｘ  ａｃｔｉｖｅ  ｍｅｔａｌ）（例えば、Ｃｕ２＋およびＦｅ２＋）と結合する能力を有することができる。本明細書に提供される組成物のいずれかに含まれることができるキレート剤（複数可）の非限定例にはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム（ＤＭＰＳ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、メタロチオネイン、およびデスフェロキサミンがある。
【００７１】
本明細書に提供される組成物のいずれかの中のキレート剤（複数可）および／または抗酸化物質（複数可）の各々の濃度は、約０．１ｍＭ〜約１５０ｍＭ（例えば、約０．１ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１２５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約８０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約６０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約４０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約３０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約５．０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭ、約１ｍＭ〜約１２５ｍＭ、約１ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１ｍＭ〜約８０ｍＭ、約１ｍＭ〜約６０ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１ｍＭ〜約２５ｍＭ、約５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約１２５ｍＭ、約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５ｍＭ〜約８０ｍＭ、約５ｍＭ〜約６０ｍＭ、約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約５ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１２５ｍＭ、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約８０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１２５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約８０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約１２５ｍＭ、約３０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約８０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１２５ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約９０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約８０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約７０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１２５ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約８０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約８０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約８０ｍＭ〜約１２５ｍＭ、約８０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭ、または約１００ｍＭ〜約１２５ｍＭ）であることができる。
【００７２】
いくつかの例において、本明細書に提供される組成物は５ｍＭ〜約１５０ｍＭのマンニトール（例えば、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約６０ｍＭ〜約１４０ｍＭ、約７０ｍＭ〜約１３０ｍＭ、約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ、約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約５ｍＭ〜約３５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３５ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３０ｍＭのマンニトール）；５ｍＭ〜約１５０ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約６０ｍＭ〜約１４０ｍ
Ｍ、約７０ｍＭ〜約１３０ｍＭ、約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ、約３０ｍＭ〜約７０ｍＭ、約３５ｍＭ〜約６５ｍＭ、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約５５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約３０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約３５ｍＭ、約５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約２５ｍＭ）のメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）；５ｍＭ〜１５０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム（例えば、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約６０ｍＭ〜約１４０ｍＭ、約７０ｍＭ〜約１３０ｍＭ、約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約３５ｍＭ、約３０ｍＭ〜約３５ｍＭ、約５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約２５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム）；および５ｍＭ〜約１５０ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約６０ｍＭ〜約１４０ｍＭ、約７０ｍＭ〜約１３０ｍＭ、約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ、約３０ｍＭ〜約７０ｍＭ、約３５ｍＭ〜約６５ｍＭ、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約４５ｍＭ〜約５５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約３０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約３５ｍＭ、約５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約２５ｍＭ）のヒスチジンのうちの１つまたはそれ以上を含有する。
【００７３】
組成物のいずれかの非限定例は（ｉ）約７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ（例えば、約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約８５ｍＭ〜約１１５ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、または約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ）のマンニトール（例えば、緩衝溶液中、例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０のようなリン酸塩緩衝液中）；（ｉｉ）約７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ（例えば、約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約８５ｍＭ〜約１１５ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、または約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ）のメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）（例えば、緩衝溶液中、例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０のようなリン酸塩緩衝液中）；（ｉｉｉ）約７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ（例えば、約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約８５ｍＭ〜約１１５ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、または約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ）のアスコルビン酸ナトリウム（例えば、緩衝溶液中、例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０のようなリン酸塩緩衝液中）；（ｉｖ）約７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ（例えば、約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約８５ｍＭ〜約１１５ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、または約９５ｍＭ〜約１０５ｍＭ）のヒスチジン（例えば、緩衝溶液中、例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０のようなリン酸塩緩衝液中）；（ｖ）約３０ｍＭ〜約７０ｍＭ（例えば、約３５ｍＭ〜約６５ｍＭ、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭ、または約４５ｍＭ〜約５５ｍＭ）のメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）および約３０ｍＭ〜約７０ｍＭ（例えば、約３５ｍＭ〜約６５ｍＭ、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭ、または約４５ｍＭ〜約５５ｍＭ）のヒスチジン（例えば、緩衝溶液中、例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０のようなリン酸塩緩衝液中）；（ｖｉ）約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約３５ｍＭ、または約３０ｍＭ〜約３５ｍＭ）のメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約３５ｍＭ、または約３０ｍＭ〜約３５ｍＭ）のヒスチジン、および約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約３５ｍＭ、または約３０ｍＭ〜約３５ｍＭ）のアスコルビン酸ナトリウム（例えば、緩衝溶液中、例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０のようなリン酸塩緩衝液中）；または（ｖｉｉ）約５ｍＭ
〜約４５ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ、または約２３ｍＭ〜約２７ｍＭ）のアスコルビン酸ナトリウム、約５ｍＭ〜約４５ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ、または約２３ｍＭ〜約２７ｍＭ）のメチオニン（または代わりにシステインもしくはグルタチオン）、約５ｍＭ〜約４５ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ、または約２３ｍＭ〜約２７ｍＭ）のマンニトール、および約５ｍＭ〜約４５ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭ、または約２３ｍＭ〜約２７ｍＭ）のヒスチジン（例えば、緩衝溶液中、例えば、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０のようなリン酸塩緩衝液中）を含有する。
【００７４】
本明細書に提供される組成物のいずれかのバイオバーデンを低減するのに充分なガンマ線照射の非限定的な線量は以下に記載される。本明細書に提供される組成物のいずれかのバイオバーデンを低減するのに充分なガンマ線照射の追加の線量は当技術分野で公知である。例えば、本明細書に記載の組成物のいずれも、本明細書に記載されている線量のいずれかで、ガンマ線照射の割合のいずれかで、および／またはガンマ線照射を実行する温度のいずれかで（任意の組合せで）ガンマ線を照射することができる。組成物のバイオバーデンは、例えば、組成物中に存在する自己複製する生物学的夾雑物（複数可）を含有するであろう組成物から、例えば消化、超音波処理、振盪、ボルテックス混合、フラッシュ、ブレンド、または綿棒で拭き取ることによりサンプルをとり、サンプル中に存在する自己複製する生物学的夾雑物（複数可）のレベルを（例えば、生物学的夾雑物が自己複製するのを可能にする成長培地にサンプルを入れることにより、例えばサンプルをシャーレに蒔くか、またはサンプルを膜に通すことにより）定性化または定量化することによって決定することができる。
【００７５】
組成物のバイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射での処理の際にクロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を改善するのに充分な少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤の量は、例えば実施例に記載されている方法を用いて決定することができる。例えば、ある量の少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤の存在下でガンマ線照射により処理されたクロマトグラフィー樹脂の結合能力の低減のレベルを、少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤の不在下で同じ線量のガンマ線照射により処理されたクロマトグラフィー樹脂の結合能力の低減のレベルと比較することができ、ここで少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤の不在下でガンマ線を照射したクロマトグラフィー樹脂と比較したときの少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤の存在下でガンマ線を照射したクロマトグラフィー樹脂の結合能力の低減のレベルの減少は、その少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤がガンマ線照射による処理の際にクロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を改善するのに充分な量で存在していたことを示す。クロマトグラフィー樹脂の結合能力を決定するための代表的な方法は実施例に記載されている。クロマトグラフィー樹脂の結合能力を決定する方法のさらなる例は当技術分野で公知である。
【００７６】
クロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減する方法
本明細書に、クロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減する方法が提供される。これらの方法は、クロマトグラフィー樹脂ならびに少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む組成物を含む容器を、容器およびクロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射に曝露する工程を含み、ここで少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤は、その線量のガンマ線照射への曝露後（またはその際）クロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を改善するのに充分な量で存在する。
【００７７】
また、クロマトグラフィー樹脂（ならびに場合によりガンマ線照射への曝露後／その際にクロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を改善するのに充分な量の少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤）を含む組成物を含む容器を、約０．１ｋＧｙ／時〜約６ｋＧｙ／時（例えば、約０．１ｋＧｙ／時〜約５．５ｋＧｙ／時、約０．１ｋＧｙ／時〜約５．０ｋＧｙ／時、約０．１ｋＧｙ／時〜約４．５ｋＧｙ／時、約０．１ｋＧｙ／時〜約４．０ｋＧｙ／時、約０．１ｋＧｙ／時〜約３．５ｋＧｙ／時、約０．１ｋＧｙ／時〜約３．０ｋＧｙ／時、約０．１ｋＧｙ／時〜約２．５ｋＧｙ／時、約０．１ｋＧｙ／時〜約２．０ｋＧｙ／時、約０．１ｋＧｙ／時〜約１．５ｋＧｙ／時、約０．１ｋＧｙ／時〜約１．０ｋＧｙ／時、約０．５ｋＧｙ／時〜約６ｋＧｙ／時、約０．５ｋＧｙ／時〜約５．５ｋＧｙ／時、約０．５ｋＧｙ／時〜約５．０ｋＧｙ／時、約０．５ｋＧｙ／時〜約４．５ｋＧｙ／時、約０．５ｋＧｙ／時〜約４．０ｋＧｙ／時、約０．５ｋＧｙ／時〜約３．５ｋＧｙ／時、約０．５ｋＧｙ／時〜約３．０ｋＧｙ／時、約０．５ｋＧｙ／時〜約２．５ｋＧｙ／時、約０．５ｋＧｙ／時〜約２．０ｋＧｙ／時）の割合で、および／または約４℃〜約２５℃（例えば、約４℃〜約２０℃、約４℃〜約１５℃、約４℃〜約１０℃、約１０℃〜約２５℃、約１０℃〜約２０℃、約１０℃〜約１５℃、または約１５℃〜約２５℃）の温度で、容器およびクロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減するのに充分なガンマ線の線量でガンマ線照射に曝露することを含む、クロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減する方法が提供される。この段落に記載された方法において、これらの方法により生産されるガンマ線を照射したクロマトグラフィー樹脂の結合能力のレベルは、６．１ｋＧｙ／時より大きい割合および／または２５℃より高い温度の一方または両方でガンマ線が照射されたガンマ線を照射したクロマトグラフィー樹脂の結合能力のレベルより高い。
【００７８】
クロマトグラフィー樹脂は当技術分野で公知の方法を用いてガンマ線照射に曝露することができる。例えば、コバルト−６０またはセシウム−１３７のような同位体をガンマ線源として使用することができる。クロマトグラフィー樹脂は約−２５℃〜約０℃（両端を含む）、または約０℃〜約２５℃（両端を含む）の温度でガンマ線照射に曝露することができる。クロマトグラフィー樹脂は約０．１ｋＧｙ〜約１００ｋＧｙ、約１ｋＧｙ〜約１００ｋＧｙ、約１ｋＧｙ〜約９０ｋＧｙ、約１ｋＧｙ〜約８０ｋＧｙ、約１ｋＧｙ〜約７０ｋＧｙ、約１ｋＧｙ〜約６５ｋＧｙ、約５ｋＧｙ〜約６５ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜約６０ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜約５５ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜約５０ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜約４５ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜約４０ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜約３５ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜約３０ｋＧｙ、約１５ｋＧｙ〜約５０ｋＧｙ、約１５ｋＧｙ〜約４５ｋＧｙ、約１５ｋＧｙ〜約４０ｋＧｙ、約１５ｋＧｙ〜約３５ｋＧｙ、約２０ｋＧｙ〜約３０ｋＧｙ、または約２３ｋＧｙ〜約２７ｋＧｙの線量のガンマ線照射に曝露することができる。クロマトグラフィー樹脂は約１×１０−６以下、約１×１０−７以下、約１０×１０−８以下、約１×１０−１１以下、もしくは約１×１０−１２以下、または約１×１０−６〜約１×１０−１２、約１×１０−６〜約１×１０−１１、約１×１０−６〜約１×１０−１０、約１×１０−６〜約１×１０−９、約１×１０−６〜約１×１０−８、１×１０−６〜約１×１０−７、約１×１０−７〜約１×１０−１２、約１×１０−７〜約１×１０−１１、約１×１０−７〜約１×１０−１０、約１×１０−７〜約１×１０−９、約１×１０−７〜約１×１０−８、約１×１０−８〜約１×１０−１２、約１×１０−８〜約１×１０−１１、約１×１０−８〜約１×１０−１０、もしくは約１×１０−８〜約１×１０−９のクロマトグラフィー樹脂の滅菌保証レベルをもたらすのに充分な線量のガンマ線照射に曝露することができる。
【００７９】
クロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減するのに充分なガンマ線照射の線量は当技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。例えば、ある線量のガンマ線照射で処理されたクロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンレベルを未処理の（例えば、コントロールの、ガンマ線照射されてない）クロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンレベ
ルと比較することができ、未処理のクロマトグラフィー樹脂と比較したときのガンマ線を照射したクロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンのレベルの減少は、その線量のガンマ線照射がクロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減するのに充分であることを示す。組成物（例えば、クロマトグラフィー樹脂）中のバイオバーデンのレベルを決定する代表的な方法は本明細書に記載されている。組成物（例えば、クロマトグラフィー樹脂）中のバイオバーデンのレベルを決定するさらなる方法は当技術分野で公知である。
【００８０】
これらの方法のいずれかにおけるクロマトグラフィー樹脂はアニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、もしくはアフィニティークロマトグラフィー樹脂、またはこれらの任意の組合せであることができる。アフィニティークロマトグラフィー樹脂の非限定例としては、タンパク質またはペプチドリガンド（例えば、約５個のアミノ酸〜約１００個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約９０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約８０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約７０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約６０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、または約５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸）、酵素の小分子基質もしくは補因子、アプタマー、阻害剤（例えば、競合タンパク質阻害剤）または金属を挙げることができる。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー樹脂はタンパク質リガンド（例えば、プロテインＡ）を含む。アフィニティークロマトグラフィー樹脂の追加の例は補因子リガンド、基質リガンド、金属リガンド、製品リガンド、またはアプタマーリガンドを含む。いくつかの例において、クロマトグラフィー樹脂は二モードの（ｂｉｏｍｏｄａｌ）クロマトグラフィー樹脂（例えば、アニオン交換クロマトグラフィー樹脂および疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂）である。クロマトグラフィー樹脂はアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（例えば、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル−エタノールアミン基を含むアニオン交換クロマトグラフィー樹脂）であることができる。
【００８１】
クロマトグラフィー樹脂を含む容器はプラスチック容器（例えば、円筒状のチューブ、密閉もしくはクランプ留めしたボックス、または密閉したバッグ）であることができる。これらの方法で使用される容器の非限定例には貯蔵容器またはクロマトグラフィーカラムがある。例えば、クロマトグラフィー樹脂ならびに少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む組成物は密閉容器中に存在することができる（例えば、密閉容器中のスラリーまたは密閉容器（例えば、クロマトグラフィーカラム）中の充填されたクロマトグラフィー樹脂）。本明細書に記載の方法で使用される容器は使い捨て式のクロマトグラフィーカラムであることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法で使用される容器はブリスターパック内に入れた使い捨て式クロマトグラフィーカラムである。容器（例えば、貯蔵容器またはクロマトグラフィーカラム）は約１ｍＬ〜約１Ｌ（例えば、約１ｍＬ〜約９００ｍＬ、約１ｍＬ〜約８００ｍＬ、約１ｍＬ〜約７００ｍＬ、約１ｍＬ〜約６００ｍＬ、約１ｍＬ〜約５００ｍＬ、約１ｍＬ〜約４５０ｍＬ、約１ｍＬ〜約４００ｍＬ、約１ｍＬ〜約３５０ｍＬ、約１ｍＬ〜約３００ｍＬ、約１ｍＬ〜約２５０ｍＬ、約１ｍＬ〜約２００ｍＬ、約１ｍＬ〜約１５０ｍＬ、約１ｍＬ〜約１００ｍＬ、約１ｍＬ〜約７５ｍＬ、約１ｍＬ〜約５０ｍＬ、約１ｍＬ〜約４０ｍＬ、約１ｍＬ〜約３０ｍＬ、または約１ｍＬ〜約２０ｍＬ）の内部総容積を有することができる。
【００８２】
容器中に含まれるクロマトグラフィー樹脂ならびに少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含有する組成物は固体混合物（例えば、乾燥または湿潤固体混合物）で存在することができる。例えば、容器は少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含有する液体（例えば、緩衝溶液）中の堆積したクロマトグラフィー樹脂のスラリーを含むことができる。いくつかの実施形態において、容器は充填されたクロマトグラフィー樹脂を含むことができる。例えば、クロマトグラフィー樹脂ならびに少なくと
も１種の酸化防止剤および／またはクロマトグラフィー樹脂を含む組成物を含む容器は充填されたクロマトグラフィーカラム（例えば、樹脂が少なくとも１種の酸化防止剤および／またはクロマトグラフィー樹脂を含有する液体（例えば、緩衝溶液）に充填された場合）である。いくつかの実施形態は、曝露に先立って、クロマトグラフィー樹脂ならびに少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含有する組成物を容器内に配置することを含む。
【００８３】
本明細書に記載の酸化防止剤および／またはキレート剤のいずれも本明細書に記載の代表的な濃度の任意の組合せを用いて任意の組合せで使用することができる。例えば、組成物は：還元グルタチオン、還元チオレドキシン、還元システイン、カロテノイド、メラトニン、リコピン、トコフェロール、還元ユビキノン、アスコルベート、ビリルビン、尿酸、リポ酸、フラボノイド、フェノールプロパノイド酸、リドカイン、ナリンゲニン、フラーレン、グルコース、マンニトール、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、およびジメチルメトキシクロマノールから選択される少なくとも１種の酸化防止剤、および／または：ＥＤＴＡ、ＤＭＰＳ、ＤＭＳＡ、メタロチオネイン、およびデスフェロキサミンから選択される少なくとも１種のキレート剤を含むことができる。
【００８４】
組成物のバイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射による処理の際にクロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を改善するのに充分な少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤の量を決定／確認するための代表的な方法は本明細書に記載されている。組成物のバイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射による処理の際にクロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を改善するのに充分な少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤の量を決定／確認するためのさらなる方法は当技術分野で公知である。
【００８５】
また、本明細書に、本明細書に記載の方法のいずれかにより生産される低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂（例えば、貯蔵容器、例えば密閉された貯蔵容器に入れて提供される低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂）も提供される。本明細書に記載の方法のいずれかを用いて生成される低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂は約１×１０−６以下、約１×１０−７以下、約１０×１０−８以下、約１×１０−１１以下、もしくは約１×１０−１２以下、または約１×１０−６〜約１×１０−１２、約１×１０−６〜約１×１０−１１、約１×１０−６〜約１×１０−１０、約１×１０−６〜約１×１０−９、約１×１０−６〜約１×１０−８、１×１０−６〜約１×１０−７、約１×１０−７〜約１×１０−１２、約１×１０−７〜約１×１０−１１、約１×１０−７〜約１×１０−１０、約１×１０−７〜約１×１０−９、約１×１０−７〜約１×１０−８、約１×１０−８〜約１×１０−１２、約１×１０−８〜約１×１０−１１、約１×１０−８〜約１×１０−１０、または約１×１０−８〜約１×１０−９の滅菌保証レベルを有することができる。本明細書に記載の方法のいずれかにより生産される低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂は、同じタンパク質を使用して、本明細書に記載の方法により生産されたクロマトグラフィー樹脂およびコントロールの未処理のクロマトグラフィー樹脂の両方の結合能力を試験するとき、そのバイオバーデンを低減するために処理されてない（例えば、ガンマ線を照射されてない）同じクロマトグラフィー樹脂の結合能力の少なくとも７４％（例えば、少なくとも７６％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）または約７４％〜９５％、約７４％〜約９５％、約７６％〜約９５％、少なくとも約７８％〜約９５％、約８０％〜約９５％、もしくは約７４％〜約９０％、約
７６％〜約９０％、約７８％〜約９０％、または約８０％〜約９０％である結合能力を有することができる。
【００８６】
低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを作成する方法
また、本明細書に、低減した充填されたクロマトグラフィーカラムを作成する方法であって、本明細書に記載の方法のいずれかにより生産された低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂を準備すること、およびそのクロマトグラフィー樹脂を殺菌したまたは低減したバイオバーデンの環境で低減したバイオバーデンのカラム中に充填することを含む、方法も提供される。いくつかの実施形態において、低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムは、充填されたクロマトグラフィー樹脂ならびに少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含むカラムを、カラムおよび充填されたクロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射に曝露することによって生産することができ、ここで少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤は、その線量のガンマ線照射への曝露後充填されたクロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を改善するのに充分な量で存在する。
【００８７】
また、本明細書に記載の方法により生産される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム（複数可）も提供される。本明細書に記載の方法により生産される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム（複数可）のいずれも、約１×１０−６以下、約１×１０−７以下、約１０×１０−８以下、約１×１０−１１以下、または約１×１０−１２以下、または約１×１０−６〜約１×１０−１２、約１×１０−６〜約１×１０−１１、約１×１０−６〜約１×１０−１０、約１×１０−６〜約１×１０−９、約１×１０−６〜約１×１０−８、１×１０−６〜約１×１０−７、約１×１０−７〜約１×１０−１２、約１×１０−７〜約１×１０−１１、約１×１０−７〜約１×１０−１０、約１×１０−７〜約１×１０−９、約１×１０−７〜約１×１０−８、約１×１０−８〜約１×１０−１２、約１×１０−８〜約１×１０−１１、約１×１０−８〜約１×１０−１０、または約１×１０−８〜約１×１０−９の滅菌保証レベルを有することができる。本明細書に記載の方法により生産される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム（複数可）のいずれも：アニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂（例えば、本明細書に記載または当技術分野で公知のアフィニティークロマトグラフィー樹脂のいずれか）、親水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、およびサイズ排除クロマトグラフィー樹脂からなる群から選択される少なくとも１種のクロマトグラフィー樹脂を含有することができる。例えば、本明細書に記載の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムのいずれもタンパク質リガンド（例えば、プロテインＡ）を含むアフィニティークロマトグラフィー樹脂を含むことができる。本明細書に記載の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムはアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（例えば、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル−エタノールアミン基を含むアニオン交換クロマトグラフィー樹脂）を含むことができる。
【００８８】
低減したバイオバーデンのクロマトグラフィーを実行する方法
本明細書に記載の方法は本明細書に提供される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムの使用を含み、また本明細書に記載の方法は本明細書に提供される少なくとも１つの低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを含む１つまたは２つのＭＣＣＳの使用を含む。ガンマ線を照射されたクロマトグラフィー樹脂は本明細書に記載の任意の種類の樹脂（または当技術分野で公知の任意の種類のクロマトグラフィー樹脂）であることができる。
【００８９】
低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムは本明細書に記載の方法のいずれかを用いて製造することができる。例えば、低減したバイオバーデンの充填さ
れたクロマトグラフィーカラムは、クロマトグラフィー樹脂（複数可）ならびに少なくとも１種の抗酸化物質および／またはキレート剤（例えば、本明細書に記載のような組成物のいずれか）を含む組成物をクロマトグラフィーカラムに充填し、その充填されたカラムを（例えば、本明細書に記載の曝露および条件のいずれかを用いて）ガンマ線照射に曝露することによって生産することができる。他の例において、低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムは、クロマトグラフィー樹脂ならびに少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む容器をある線量のガンマ線照射に曝露し、得られた低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂をクロマトグラフィーカラムに充填することによって生産することができる。このような方法において、（ガンマ線照射への曝露中容器内に存在する）クロマトグラフィー樹脂は容器内のスラリーとして存在することができ、クロマトグラフィーカラムは低減したバイオバーデンのフード内で充填される。他の方法において、少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤と共に容器内に存在するクロマトグラフィー樹脂を容器内で固体混合物としてガンマ線照射に曝露することができ、得られた低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂のスラリーを（例えば、低減したバイオバーデンのフード内で製造された）低減したバイオバーデンの緩衝液を用いて製造することができ、低減したバイオバーデンのフード内で得られたスラリーを使用してクロマトグラフィーカラムを充填する。これらの例のいくつかにおいて、充填に先立って、クロマトグラフィーカラムを処理（例えば、オートクレーブ処理、ガンマ線照射、またはエチレンオキサイドへの曝露）してバイオバーデンを低減することができる。
【００９０】
本明細書に記載の方法のいずれかで使用される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムは約１×１０−３〜約１×１０−１２、約１×１０−４〜約１×１０−１２、１×１０−５〜約１×１０−１１、約１×１０−５〜約１×１０−１０、約１×１０−５〜約１×１０−９、約１×１０−６〜約１×１０−９、または約１×１０−６〜約１×１０−８（両端を含む）の滅菌保証レベル（ＳＡＬ）を有することができる。
【００９１】
低減したバイオバーデンの緩衝液
本明細書に記載の方法およびプロセスは１種またはそれ以上の低減したバイオバーデンの緩衝液を用いて実行することができる。当技術分野では理解されるように、低減したバイオバーデンの緩衝液はクロマトグラフィーのサイクルで使用される任意の種類の緩衝液（例えば、クロマトグラフィーのサイクルまたは本明細書に記載の単位操作のいずれかの工程で使用される緩衝液）であることができる。緩衝液のバイオバーデンを低減するための代表的な方法には、ろ過（０．２μｍ孔径のろ過）、オートクレーブ処理、およびガンマ線照射がある。緩衝液のバイオバーデンを低減するさらなる方法は当技術分野で公知である。低減したバイオバーデンの緩衝液は約１×１０−３〜約１×１０−１２、約１×１０−４〜約１×１０−１２、１×１０−５〜約１×１０−１１、約１×１０−５〜約１×１０−１０、約１×１０−５〜約１×１０−９、約１×１０−６〜約１×１０−９、または約１×１０−６〜約１×１０−８（両端を含む）の滅菌保証レベルを有することができる。
【００９２】
組換え治療用タンパク質
本明細書に記載の組換えタンパク質は組換え治療用タンパク質であることができる。本明細書で提供された方法によって製造され得る組換え治療用タンパク質の非限定的な例には、免疫グロブリン（軽鎖および重鎖免疫グロブリンを含める）、抗体または抗体フラグメント（例えば、本明細書に記載の抗体フラグメントのいずれか）、酵素（例えば、ガラクトシダーゼ（例えば、アルファ−ガラクトシダーゼ）、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）またはＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標））、タンパク質（例えば、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、またはインターフェロンアルファもしくはベータ）、または免疫原性もしくは抗原性タンパク質もしくはタンパク質フラグメント（例えば、ワクチンにお
ける使用のためのタンパク質）が挙げられる。各種のリソソーム貯蔵疾患を治療するのに使用することができる組換え治療用酵素の非限定例が図１０に示されている。組換え治療用タンパク質は、少なくとも１つの多機能性組換えタンパク質足場を含む、人為的改変抗原結合性ポリペプチドであってよい（例えば、Ｇｅｂａｕｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：２４５〜２５５、２００９年；および米国特許出願公開第２０１２／０１６４０６６号（参照によって全部分を本明細書に組み入れる）で記載された、抗原結合性組換えタンパク質を参照されたい。）。抗体である組換え治療用タンパク質の非限定的な例には、パニツムマブ、オマリズマブ、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ（ａｌａｃｉｚｕｍａｂ）、アラシズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）、アポリズマブ、アチヌマブ（ａｔｉｎｕｍａｂ）、トシリズマブ、バシリキシマブ（ｂａｓｉｌｉｚｉｍａｂ）、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビシロマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、デンスマブ（ｄｅｎｓｕｍａｂ）、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エファングマブ、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブおよびトラスツズマブが挙げられる。本明細書に記載の方法によって製造され得る組換え治療用抗体のさらなる例は、当技術分野で公知である。本方法によって製造および精製され得る組換え治療用タンパク質のさらなる非限定的な例には、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、アバタセプト、ガルスルファーゼ、ルトロピンアルファ、抗血友病因子、アガルシダーゼベータ、インターフェロンベータ−１ａ、ダーベポエチンアルファ、テネクテプラーゼ、エタネルセプト、凝固第ＩＸ因子、卵胞刺激ホルモン、インターフェロンベータ−１ａ、イミグルセラーゼ、ドルナーゼアルファ、エポエチンアルファおよびアルテプラーゼが挙げられる。
【００９３】
分泌された可溶性組換え治療用タンパク質は、細胞（例えば、哺乳類細胞）から液体培養培地を除去または物理的に分離することにより、液体培養培地（例えば、第１の液体培養培地および／または第２の液体培養培地）から回収することができる。細胞（例えば、哺乳類細胞）から液体培養培地を除去するための相異なる種々の方法は、当技術分野で公知であり、例えば、遠心分離、ろ過、ピペット操作および／または吸引が挙げられる。分泌された組換え治療用タンパク質は、その後、様々な種類のクロマトグラフィー（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、もしくは疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはこれらの任意の組合せ）および／またはろ過（例えば、分子量カットオフろ過）を始めとする様々な生化学的技術を用いて、液体培養培地から回収し、さらに精製することができる。
【００９４】
クロマトグラフィーのサイクル
当技術分野で周知のように、クロマトグラフィーのサイクルにおける工程は、クロマトグラフィー樹脂、サイクルにおいて各々の工程を実行するのに使用される緩衝液、および標的とする組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）の生物物理学的な特性に応じて異なることができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラムは、標的とする組換えタンパク質を含む流体をアフィニティークロマトグラフィーカラムに装填し、カラムを洗浄して望ましくない生物学的材料（例えば、夾雑するタンパク質および／または小分子）を除去し、カラムに結合した標的とする組換えタンパク質を溶出し、カラムを再平衡化する工程を含むことができる。標的とする組換えタンパク質が装填工程でクロマトグラフィー樹脂に結合するカチオンおよび／またはアニオン交換クロマトグラフィーカラムを用いるクロマトグラフィーのサイクルは、標的とするタンパク質を含む流体をカラムに装填し、カラムを洗浄して望ましくない生物学的材料を除去し、カラムに結合し
た標的とする組換えタンパク質を溶出し、カラムを再平衡化する工程を含むことができる。他の例において、望ましくない生物学的材料が装填工程中にクロマトグラフィー樹脂に結合するが標的とする組換えタンパク質は結合しないカチオンおよび／またはアニオン交換クロマトグラフィーカラムを用いるクロマトグラフィーのサイクルは、標的とするタンパク質を含む流体をカラムに装填し、通過画分中の標的とする組換えタンパク質を収集し、カラムを再平衡化する工程を含むことができる。当技術分野で周知のように、クロマトグラフィーサイクルにおける単一の工程のいずれも単一の緩衝液または複数の緩衝液（例えば、２種またはそれ以上の緩衝液）を含むことができ、クロマトグラフィーサイクルにおける単一の工程のいずれか１つまたはそれ以上が緩衝液勾配を含むことができる。クロマトグラフィーの単一のサイクルの様々な周知の局面の組合せのいずれも、例えば、異なるクロマトグラフィー樹脂（複数可）、流量（複数可）、緩衝液（複数可）、カラムのボイド容積（複数可）、カラムのベッド容積（複数可）、各々の工程で使用される緩衝液の体積（複数可）、標的とするタンパク質を含む流体の体積（複数可）、ならびに各々の工程で使用される緩衝液（複数可）の数および種類を、任意の組合せでこれらの方法に使用することができる。
【００９５】
低減したバイオバーデンのカラムクロマトグラフィーを実行する方法
本明細書に、低減したバイオバーデンのクロマトグラフィーを実行する方法が提供される。これらの方法は、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて生産される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを準備すること、およびその低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを用いてカラムクロマトグラフィーを実行することを含む。低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムは本明細書に記載のクロマトグラフィー樹脂のいずれかの少なくとも１種を任意の組合せを含むことができる。例えば、低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム内に存在するクロマトグラフィー樹脂は、タンパク質リガンド（例えば、プロテインＡ）を含むアフィニティー樹脂であることができ、またはアニオン交換クロマトグラフィー樹脂を含むことができる。低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムは本明細書に記載の代表的な内容積のいずれかを有することができる。低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムは本明細書に記載または当技術分野で公知の任意の形状（例えば、円筒、近円筒状形、楕円形状）を有することができる。これらの方法で実行されるカラムクロマトグラフィーは組換えタンパク質（例えば、本明細書に記載または当技術分野で公知の組換え治療用タンパク質のいずれか）を精製または単離するために使用することができる。いくつかの例において、低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムは、マルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）の一部であり、例えば、定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）の一部であることができる。
【００９６】
実行されるカラムクロマトグラフィーは本明細書に記載または当技術分野で公知の少なくとも１つのサイクルのクロマトグラフィーを含むことができる。例えば、少なくとも１つのサイクルのクロマトグラフィーは：組換えタンパク質を含む液体にクロマトグラフィー樹脂を曝露することにより組換えタンパク質を捕獲し；クロマトグラフィー樹脂を洗浄緩衝液に曝露することによりクロマトグラフィー樹脂を洗浄し、クロマトグラフィー樹脂を溶出緩衝液に曝露することにより組換えタンパク質を溶出し；クロマトグラフィー樹脂を再生緩衝液に曝露することによりクロマトグラフィー樹脂を再生する工程を含むことができる。いくつかの例において、組換えタンパク質を含む液体は液体培養培地（例えば、潅流またはバッチ培養物から収集された液体培養培地）または希釈された液体培養培地（例えば、緩衝液中に希釈された培養培地）である。
【００９７】
カラムクロマトグラフィーは、閉鎖され一体化されたシステム（例えば、本明細書に記載または当技術分野で公知の代表的な閉鎖され一体化されたシステムのいずれか）を用い
て実行することができる。例えば、カラムクロマトグラフィーは、緩衝液が低減したバイオバーデンの緩衝液である閉鎖され一体化されたシステムを用いて実行することができる。当技術分野で周知のように、低減したバイオバーデンの緩衝液は様々な異なる方法を用いて生産することができる（例えば、ろ過、オートクレーブ処理、または加熱処理により製造される）。
【００９８】
カラムクロマトグラフィーは２またはそれ以上（例えば、３もしくはそれ以上、４もしくはそれ以上、５もしくはそれ以上、６もしくはそれ以上、７もしくはそれ以上、８もしくはそれ以上、９もしくはそれ以上、１０もしくはそれ以上、１１もしくはそれ以上、１２もしくはそれ以上、１３もしくはそれ以上、１４もしくはそれ以上、１５もしくはそれ以上、２０もしくはそれ以上、２５もしくはそれ以上、３０もしくはそれ以上、３５もしくはそれ以上、４０もしくはそれ以上、４５もしくはそれ以上、５０もしくはそれ以上、５５もしくはそれ以上、６０もしくはそれ以上、６５もしくはそれ以上、７０もしくはそれ以上、７５もしくはそれ以上、８０もしくはそれ以上、８５もしくはそれ以上、９０もしくはそれ以上、９５もしくはそれ以上、または１００もしくはそれ以上）のサイクルのクロマトグラフィーを含むことができる。いくつかの例において、カラムクロマトグラフィーは少なくとも３日（例えば、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、少なくとも１８日、少なくとも１９日、少なくとも２０日、少なくとも２１日、少なくとも２２日、少なくとも２３日、少なくとも２４日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、少なくとも６５日、少なくとも７５日、少なくとも８０日、少なくとも８５日、少なくとも９０日、少なくとも９５日、または少なくとも１００日）の期間にわたって連続的に実行される。
【００９９】
いくつかの実施形態において、低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム内のクロマトグラフィー樹脂は、ガンマ線照射で処理してない同じ樹脂と比較して（両方の樹脂の結合能力を試験するのに同じタンパク質を使用したとき）（例えば、ガンマ線照射への曝露の直後に評価する）、約７５％〜約１００％（例えば、約７６％〜約９８％、約７６％〜約９６％、約７６％〜約９４％、約７６％〜約９２％、約７６％〜約９０％、約７８％〜約１００％、約７８％〜約９８％、約７８％〜約９６％、約７８％〜約９４％、約７８％〜約９２％、約７８％〜約９０％、約８０％〜約１００％、約８０％〜約９８％、約８０％〜約９６％、約８０％〜約９４％、約８０％〜約９２％、約８０％〜約９０％、約８２％〜約１００％、約８２％〜約９８％、約８２％〜約９６％、約８２％〜約９４％、約８２％〜約９２％、約８２％〜約９０％、約８４％〜約１００％、約８４％〜約９８％、約８４％〜約９６％、約８４％〜約９４％、約８４％〜約９２％、約８４％〜約９０％、約８６％〜約１００％、約８６％〜約９８％、約８６％〜約９６％、約８６％〜約９４％、約８６％〜約９２％、約８８％〜約１００％、約８８％〜約９８％、約８８％〜約９６％、約８８％〜約９４％、約９０％〜約１００％、約９０％〜約９８％、約９０％〜約９６％、約９２％〜約１００％、または約９２％〜約９８％）の結合能力パーセントを有する。
【０１００】
組換えタンパク質を製造するための一体化され、クローズドなまたは実質的にクローズドな、連続的な方法
本明細書に、精製された組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を製造するための一体化され、クローズドなまたは実質的にクローズドな、連続的な方法が提供される。これらの方法は、実質的に細胞を含まない組換えタンパク質（例えば組換え治療用タンパク質）を含有する液体培養培地を準備することを含む。
【０１０１】
いくつかの方法は、本明細書に提供される少なくとも１つの低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを含むマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）に液体培養培地を連続的に供給することを含み、ここでこれらの方法は低減したバイオバーデンの緩衝液を利用し、一体化され、かつ液体培養培地から、精製された組換えタンパク質（例えば治療用タンパク質原薬）であるＭＣＣＳからの溶出液まで連続的に稼動する。
【０１０２】
いくつかの方法は、液体培養培地を第１のＭＣＣＳ（ＭＣＣＳ１）に連続的に供給し、ＭＣＣＳ１を用いて液体培養培地から組換えタンパク質を捕獲し、組換えタンパク質を含むＭＣＣＳ１からの溶出液を生成し、その溶出液を第２のＭＣＣＳ（ＭＣＣＳ２）に連続的に供給し、溶出液からの組換えタンパク質をＭＣＣＳ２に連続的に供給し、その後組換えタンパク質を溶出することにより、精製された組換えタンパク質を生産することを含み、ここでＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内の少なくとも１つのカラムは本明細書に提供される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムであり、これらの方法は低減したバイオバーデンの緩衝液を利用し、一体化され、かつ液体培養培地から、精製された組換えタンパク質まで連続的に稼動する。
【０１０３】
いくつかの例において、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１、および／またはＭＣＣＳ２で使用されるクロマトグラフィーカラムは各々が本明細書に提供される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムである。いくつかの実施形態は、精製された組換えタンパク質を医薬組成物に配合する工程をさらに含む。
【０１０４】
本明細書に記載の方法により、組換えタンパク質を含む液体培養培地からの精製された組換えタンパク質の連続的で時間効率の良い生産が提供される。例えば、治療用タンパク質を含む液体培養培地のＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１への供給から、それぞれＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ２からの組換えタンパク質の溶出までの経過時間は、例えば、約４時間〜約４８時間（両端を含む）、例えば、約４時間〜約４０時間、約４時間〜約３５時間、約４時間〜約３０時間、約４時間〜約２８時間、約４時間〜約２６時間、約４時間〜約２４時間、約４時間〜約２２時間、約４時間〜約２０時間、約４時間〜約１８時間、約４時間〜約１６時間、約４時間〜約１４時間、約４時間〜約１２時間、約６時間〜約１２時間、約８時間〜約１２時間、約６時間〜約２０時間、約６時間〜約１８時間、約６時間〜約１４時間、約８時間〜約１６時間、約８時間〜約１４時間、約８時間〜約１２時間、約１０時間〜２０時間、約１０時間〜１８時間、約１０時間〜１６時間、約１０時間〜１４時間、約１２時間〜約１４時間、約１０時間〜約４０時間、約１０時間〜約３５時間、約１０時間〜約３０時間、約１０時間〜約２５時間、約１５時間〜約４０時間、約１５時間〜約３５時間、約１５時間〜約３０時間、約２０時間〜約４０時間、約２０時間〜約３５時間、または約２０時間〜約３０時間（両端を含む）であることができる。他の例において、組換えタンパク質を含む液体培養培地のＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１への供給から、それぞれＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ２からの組換えタンパク質の溶出までの経過時間は、例えば、約４時間超〜約４０時間未満（両端を含む）、例えば、約４時間超〜約３９時間未満、約３８時間、約３７時間、約３６時間、約３５時間、約３４時間、約３３時間、約３２時間、約３１時間、約３０時間、約２９時間、約２８時間、約２７時間、約２６時間、約２５時間、約２４時間、約２３時間、約２２時間、約２１時間、約２０時間、約１９時間、約１８時間、約１７時間、約１６時間、約１５時間、約１４時間、約１３時間、約１２時間、約１１時間、約１０時間、約９時間、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、または約４．５時間（両端を含む）である。
【０１０５】
これらの方法のいずれかで使用することができるＭＣＣＳ（ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１、および／またはＭＣＣＳ２）の非限定的な局面は米国仮特許出願第６１／７７５，０６０号および同第６１／８５６，３９０号（各々参照によって本明細書に組み入れる）に記載さ
れている。
【０１０６】
いくつかの代表的な方法は保持する工程を利用しない（例えば、方法全体でリザーバ（例えば、停留タンク（ｂｒｅａｋ  ｔａｎｋ））を使用しない）。他の方法においては、方法全体で最大１、２、３、４、または５個のリザーバ（例えば、停留タンク）が使用される。本明細書に記載の方法のいずれも方法全体で最大１、２、３、４、または５個のリザーバ（例えば、停留タンク）を利用することができ、ここで各々の停留タンクは、例えば、約５分〜約６時間未満（両端を含む）、例えば、約５分〜約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、または約３０分（両端を含む）の全期間の間組換えタンパク質のみを保持する。
【０１０７】
いくつかの方法は１、２、３、４、５、または６個のリザーバ（例えば、停留タンク）を利用し、例えば、１ｍＬ〜約３００ｍＬ（両端を含む）、例えば、１ｍＬ〜約２８０ｍＬ、約２６０ｍＬ、約２４０ｍＬ、約２２０ｍＬ、約２００ｍＬ、約１８０ｍＬ、約１６０ｍＬ、約１４０ｍＬ、約１２０ｍＬ、約１００ｍＬ、約８０ｍＬ、約６０ｍＬ、約４０ｍＬ、約２０ｍＬ、または約１０ｍＬ（両端を含む）である容量を有することができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に供給される前に流体を保持するために（本明細書に記載の方法のいずれかで）使用されるいずれのリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））も、例えば、ＭＣＣＳの第１のカラムすなわちＭＣＣＳ１の装填体積の１ｍＬ〜約１００％（両端を含む）、例えば、１ｍＬ〜約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、または約５％（両端を含む）である容量を有することができる。ＭＣＣＳ１からの溶出液がＭＣＣＳ２に入る前にその溶出液を保持するためにリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））を使用することができ、このリザーバは、例えば、ＭＣＣＳ２の第１のカラムの装填体積の１ｍＬ〜約１００％（両端を含む）、例えば、１ｍＬ〜約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、または約５％（両端を含む）である容量を有することができる。
【０１０８】
これらの方法の様々なさらなる局面は以下に詳細に記載され、本明細書に提供される方法において制限されることなく任意の組合せで使用することができる。提供される方法の代表的な局面が以下に記載されているが、当業者には理解されるように、本明細書に記載の方法に追加の工程を加えることができ、他の材料を使用して本明細書に記載の方法のいずれかの工程を実行することができる。
【０１０９】
液体培養培地
実質的に細胞を含まない組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を含む液体培養培地は任意の起源に由来することができる。例えば、液体培養培地は組換え細胞培養物（例えば、組換え細菌、酵母、または哺乳類細胞培養物）から得ることができる。液体培養培地は、流加式細胞（例えば、哺乳類細胞）培養物（例えば、組換えタンパク質を分泌する哺乳類細胞の培養物を含む流加式バイオリアクター）または潅流細胞（例えば、哺乳類細胞）培養物（例えば、組換えタンパク質を分泌する哺乳類細胞の培養物を含む潅流バイオリアクター）から得ることができる。液体培養培地はまた、組換えタンパク質を分泌する細菌または酵母細胞の培養物からの清澄化液体培養培地であることもできる。
【０１１０】
組換え細胞培養物から得た液体培養培地をろ過または清澄化して、細胞および／またはウィルスを実質的に含まない液体培養培地を得ることができる。細胞を除去するために液体培養培地をろ過または清澄化する方法は当技術分野で公知である（例えば、０．２−μｍのろ過およびＡｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ（ＡＴＦＴＭ）システムを用いるろ過）。組換え細胞はまた、遠心分離を用い、実質的に細胞を含まない液体培養培地である上澄みを除去して液体培養培地から除去することもでき、または液
体培養培地を含む容器（例えば、バイオリアクター）の重力方向の底部（ｇｒａｖｉｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｏｔｔｏｍ）に細胞を沈降させ、沈降した組換え細胞から遠い液体培養培地（実質的に細胞を含まない液体培養培地を除去することによっても液体培養培地から除去することができる。
【０１１１】
液体培養培地は、本明細書に記載または当技術分野で公知の組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）のいずれかを産生する組換え細胞（例えば、組換え細菌、酵母、または哺乳類細胞）の培養物から得ることができる。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの例は、組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を産生する組換え細胞（例えば、組換え細菌、酵母、または哺乳類細胞）を培養する工程をさらに含むことができる。
【０１１２】
液体培養培地は本明細書に記載または当技術分野で公知のあらゆる種類の液体培養培地であることができる。例えば、液体培養培地は：動物由来の成分を含まない液体培養培地、血清を含まない液体培養培地、血清を含有する液体培養培地、既知組成の液体培養培地、およびタンパク質を含まない液体培養培地からなる群から選択することができる。本明細書に記載の方法のいずれにおいても、培養物から得られた液体培養培地は、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に供給される前に第２の流体（例えば、緩衝液）の添加により希釈することができる。
【０１１３】
実質的に細胞を含まない組換えタンパク質を含む液体培養培地は、液体培養培地をＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に供給する前に（例えば、約１５℃未満（例えば、約１０℃未満、約４℃未満、約０℃未満、約−２０℃未満、約−５０℃未満、約−７０℃未満、または約−８０℃未満）の温度で）少なくとも１日（例えば、少なくとも約２日、少なくとも約５日、少なくとも約１０日、少なくとも約１５日、少なくとも約２０日、または少なくとも約３０日）貯蔵することができる。あるいは、いくつかの例において、液体培養培地はバイオリアクターから直接ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に供給される（例えば、ろ過または清澄化工程の後バイオリアクターから直接ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に供給される）。
【０１１４】
マルチカラムクロマトグラフィーシステム
本明細書に記載の方法は、ＭＣＣＳまたは２つまたはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つのまたは６つの）マルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）（例えば、ＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２）の使用を含む。ＭＣＣＳは、２つもしくはそれ以上のクロマトグラフィーカラム、２つもしくはそれ以上のクロマトグラフィー膜、または少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムと少なくとも１つのクロマトグラフィー膜との組合せを含み得る。非限定的な例において、ＭＣＣＳ（例えば、本明細書の方法のいずれかにおけるＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）は、４つのクロマトグラフィーカラム、３つのクロマトグラフィーカラムおよび１つのクロマトグラフィー膜、３つのクロマトグラフィーカラム、２つのクロマトグラフィーカラム、２つのクロマトグラフィー膜、ならびに、２つのクロマトグラフィーカラムおよび１つのクロマトグラフィー膜を含み得る。クロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜の組合せのさらなる例については、当業者ならば限定を伴うことなく、ＭＣＣＳ（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかにおけるＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）における使用のために想定することができる。ＭＣＣＳ内に存在する個々のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は、同一であってもよいし（例えば、同じ形状、容積、樹脂、捕獲機構および単位操作を有していてもよいし）、または異なっていてもよい（例えば、異なる形状、容積、樹脂、捕獲機構および／または単位操作のうち１つまたはそれ以上を有していてもよい）。ＭＣＣＳ（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかにおけるＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）内に存在する個々のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は
、同じ単位操作（例えば、捕獲する単位操作、精製する単位操作またはポリッシュする単位操作）を実行することもできるし、または異なる単位操作（例えば、例えば捕獲すること、精製すること、ポリッシュすること、ウイルスを不活性化すること、組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨを調節すること、ならびにろ過することからできた群より選択される異なる単位操作）を実行することもできる。例えば、本明細書に記載の方法の例において、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は組換えタンパク質を捕獲するという単位操作を実行する。
【０１１５】
ＭＣＣＳ内に存在し得る（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内に存在し得る）１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）は、例えば、上下限も含めて約１ｍＬから約２ｍＬの間、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、約２５ｍＬ、約３０ｍＬ、約３５ｍＬ、約４０ｍＬ、約４５ｍＬ、約５０ｍＬ、約５５ｍＬ、約６０ｍＬ、約６５ｍＬ、約７０ｍＬ、約７５ｍＬ、約８０ｍＬ、約８５ｍＬ、約９０ｍＬ、約９５ｍＬ、または約１００ｍＬの間の樹脂体積を有し得る。ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内に存在し得る）内に存在し得る１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）は、約２ｍＬから約１００ｍＬの間、約２ｍＬから約９０ｍＬの間、約２ｍＬから約８０ｍＬの間、約２ｍＬから約７０ｍＬの間、約２ｍＬから約６０ｍＬの間、約２ｍＬから約５０ｍＬの間、約５ｍＬから約５０ｍＬの間、約２ｍＬから約４５ｍＬの間、約５ｍＬから約４５ｍＬの間、約２ｍＬから約４０ｍＬの間、約５ｍＬから約４０ｍＬの間、約２ｍＬから約３５ｍＬの間、約５ｍＬから約３５ｍＬの間、約２ｍＬから約３０ｍＬの間、約５ｍＬから約３０ｍＬの間、約２ｍＬから約２５ｍＬの間、約５ｍＬから約２５ｍＬの間、約１５ｍＬから約６０ｍＬの間、約１０ｍＬから約６０ｍＬの間、約１０ｍＬから約５０ｍＬの間、および約１５ｍＬから約５０ｍＬの間の樹脂体積を有し得る。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて使用される、ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）内の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）は、実質的に同じ樹脂体積を有していてもよいし、または相異なる樹脂体積を有していてもよい。ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）内の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）のために使用される流量は、例えば約０．２ｍＬ／分から約２５ｍＬ／分の間（例えば、約０．２ｍＬ／分から約２０ｍＬ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約２０ｍＬ／分の間、約０．２ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１０ｍＬ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、または約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）であってよい。
【０１１６】
ＭＣＣＳ内（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内）の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）は、実質的に同じ形状を有していてもよいし、または実質的に異なる形状を有していてもよい。例えば、ＭＣＣＳ内（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内）の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）は、円形シリンダー状になった実質的に同じ形状を有していてもよいし、または、長円形シリンダー状になった実質的に同じ形状を有していてもよい。
【０１１７】
ＭＣＣＳ内に存在し得る（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内に存在し得る）１つまたはそれ以上のクロマトグラフィー膜（複数可）は、例えば約１ｍＬから約５００ｍＬの間（例えば、約１ｍＬから約４７５ｍＬの間、約１ｍＬ〜約４５０ｍＬ、約１ｍＬ〜約４２５ｍＬ、約１ｍＬ〜約４００ｍＬ、約１ｍＬ〜約３７５ｍＬ、約１ｍＬ〜約３５０ｍＬ、約１ｍＬ〜約３２５ｍＬ、約１ｍＬ〜約３００ｍＬ、約１ｍＬ〜約２７５ｍＬ、約１ｍＬ〜約２５０ｍＬ、約１ｍＬ〜約２２５ｍＬ、約１ｍＬ〜約２００ｍＬ、約１ｍＬ〜約１７５ｍＬ、約１ｍＬ〜約１５０ｍＬ、約１ｍＬ〜約１２５ｍＬ、約
１ｍＬ〜約１００ｍＬ、約２ｍＬ〜約１００ｍＬ、約５ｍＬ〜約１００ｍＬ、約１ｍＬ〜約８０ｍＬ、約２ｍＬ〜約８０ｍＬ、約５ｍＬ〜約８０ｍＬ、約１ｍＬ〜約６０ｍＬ、約２ｍＬ〜約６０ｍＬ、約５ｍＬ〜約６０ｍＬ、約１ｍＬ〜約４０ｍＬ、約２ｍＬ〜約４０ｍＬ、約５ｍＬ〜約４０ｍＬ、約１ｍＬ〜約３０ｍＬ、約２ｍＬ〜約３０ｍＬ、約５ｍＬ〜約３０ｍＬ、約１ｍＬから約２５ｍＬの間、約２ｍＬから約２５ｍＬの間、約１ｍＬから約２０ｍＬの間、約２ｍＬから約２０ｍＬの間、約１ｍＬから約１５ｍＬの間、約２ｍＬから約１５ｍＬの間、約１ｍＬから約１０ｍＬの間、または約２ｍＬから約１０ｍＬの間）のベッドボリュームを有し得る。
【０１１８】
１つまたはそれ以上の（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４）異なる種類の低減したバイオバーデンの緩衝液が、本明細書に記載の方法のいずれかにおけるＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２の使用中に用いられ得る。当技術分野で公知のように、本明細書に記載の方法でＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１、および／またはＭＣＣＳ２に使用される低減したバイオバーデンの緩衝液の１つまたはそれ以上の種類は、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１、および／またはＭＣＣＳ２のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）に存在する樹脂、組換えタンパク質の生物物理学的な性質、ならびにＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１、および／またはＭＣＣＳ２の特定のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜により実行される単位操作（例えば、本明細書に記載の代表的な単位操作のいずれか）に依存する。本明細書に記載の方法のいずれかにおけるＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２の使用中に用いられるバッファーの体積および種類は、当業者によって決定することもできる（例えば、以下でより詳細に論述している）。例えば、本明細書に記載の方法のいずれかにおけるＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２の使用中に用いられるバッファーの体積および種類（複数可）は、精製された組換えタンパク質（例えば、組換えタンパク質薬物生成物）における次のもののうち１つまたはそれ以上を最適化するために選択することができる：組換えタンパク質の総合的収率、組換えタンパク質の活性、組換えタンパク質の純度の水準、および、組換えタンパク質を含む流体（例えば、液体培養培地）からの生物型夾雑物の除去（例えば、活性ウイルス、マイコバクテリア、酵母、細菌または哺乳類細胞の非存在）。
【０１１９】
ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）であってよい。ＰＣＣＳは例えば、２つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムからの組換えタンパク質の連続的な溶出を可能にするために切り替えられる、２つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（例えば、３つのカラムまたは４つのカラム）を含み得る。ＰＣＣＳは、２つもしくはそれ以上のクロマトグラフィーカラムを含み得、２つもしくはそれ以上のクロマトグラフィー膜を含み得、または少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび少なくとも１つのクロマトグラフィー膜を含み得る。カラム動作（サイクル）は一般に、装填工程、洗浄工程、溶出工程および再生工程からなる。ＰＣＣＳにおいては、サイクル方式にして同じ工程を別々に連続的に稼働させるために、複数のカラムが使用される。カラムが直列で動作するため、１つのカラムから出てくる通過画分および洗浄剤は、別のカラムによって捕捉される。こうしたＰＣＣＳに特有の特色は、バッチモード時のクロマトグラフィー中に典型的であるのと同様に、動的結合能力ではなく静的結合能力に近くなった樹脂のローディングを可能にする。連続的なサイクル運転および溶出の結果として、ＰＣＣＳに入り込む流体が連続的に処理され、組換えタンパク質を含む溶出液が連続的に製造される。
【０１２０】
ＰＣＣＳサイクルで１つの工程から別の工程に進むためにカラム切り替え方策が使用される。ＰＣＣＳで使用することができるカラム切り替えの例は米国仮特許出願第６１／７７５，０６０号および同第６１／８５６，３９０号に記載されている。例えば、カラム切
り替え方法はカラム毎に２つの自動化された切り替え操作を使用することができる：その第１は最初の生成物の破過に関連し、第２はカラム飽和に対応する。カラム切り替え操作をいつ発生させるべきかという決定は、ＰＣＣＳ内に存在する各クロマトグラフィーカラムから出てくる溶出液中の組換えタンパク質濃度を監視すること（例えば、ＵＶ監視によって実行される監視）によって決定することができる。例えば、カラム切り替えは、フィードバック制御を用いた組換えタンパク質濃度のインライン測定が可能な任意のＰＡＴツールにより、決定することができる。ＰＡＴツールは、フィードバック制御を用いた組換えタンパク質濃度の実時間インライン測定が可能である。当技術分野で公知になっているのと同様に、カラム転換は、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜を流体（例えば、バッファー）が通過する時間または通過する量に基づいて設計することもできる。
【０１２１】
ＰＣＣＳにおいて、ＰＣＣＳ内に存在する各クロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜上における組換えタンパク質の滞留時間（ＲＴ）は、第１のカラム／膜からの破過がＰＣＣＳ内の別のカラム／膜によって捕捉され得るため、カラム／膜のサイズ増大を伴うことなく短縮され得る。連続的な方法によるシステムは、式：Ｖ＝Ｄ＊ＲＴを用いてカラム／膜容積（Ｖ）およびＲＴを変化させることにより、任意の潅流速度（Ｄ）で液体培養培地を処理するように設計され得る。
【０１２２】
本記載の方法において使用されるＭＣＣＳまたはＭＣＣ１および／もしくはＭＣＣＳ２によって実行され得る１つまたはそれ以上の単位操作には例えば、捕組換えタンパク質を捕獲すること、組換えタンパク質を含む流体中に存在するウイルスを不活性化すること、組換えタンパク質を精製すること、組換えタンパク質をポリッシュすること、（例えば、本明細書に記載の例示的な任意の停留タンク（複数可）を用いて）組換えタンパク質を含む流体を保持すること、組換えタンパク質を含む流体から出てくる粒子状材料および／または細胞をろ過または除去すること、ならびに、組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨを調節することが挙げられる。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は組換えタンパク質を捕獲するという単位操作を実行する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜を含む。捕獲する単位操作は、例えば捕獲機構を利用する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー樹脂を用いて、実行することができる。捕獲機構の非限定的な例には、タンパク質Ａ結合式捕獲機構、抗体結合式または抗体フラグメント結合式捕獲機構、基質結合式捕獲機構、アプタマー結合式捕獲機構、タグ結合式捕獲機構（例えば、ポリＨｉｓタグに基づいた捕獲機構）および補因子結合式捕獲機構が挙げられる。捕獲はまた、カチオン交換もしくはアニオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行するのに使用することができる樹脂を用いて実行することもできる。組換えタンパク質を捕捉するために使用され得る非限定的な樹脂は、本明細書で記載されている。組換えタンパク質を捕捉するために使用され得る樹脂のさらなる例は、当技術分野で公知である。
【０１２４】
組換えタンパク質を含む流体中に存在するウイルスを不活性化する単位操作は、（例えば、少なくとも３０分の期間（例えば、約３０分から１．５時間の間の期間、約３０分から１．２５時間の間の期間、約０．７５時間から１．２５時間の間の期間、または約１時間の期間）にわたって約３．０から５．０の間（例えば、約３．５から約４．５の間、約３．５から約４．２５の間、約３．５から約４．０の間、約３．５から約３．８の間、または約３．７５）のｐＨで組換えタンパク質を含む流体をインキュベートすることができる、例えばクロマトグラフィーカラム、クロマトグラフィー膜または保持タンクを含む）
ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２を用いて、実行することができる。
【０１２５】
組換えタンパク質を精製する単位操作は、例えば捕捉システムを利用する樹脂を含んでいる例えばクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を含む、１つまたはそれ以上のＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）を用いて、実行することができる。捕獲機構の非限定的な例には、タンパク質Ａ結合式捕獲機構、抗体結合式または抗体フラグメント結合式捕獲機構、基質結合式捕獲機構、アプタマー結合式捕獲機構、タグ結合式捕獲機構（例えば、ポリＨｉｓタグに基づいた捕獲機構）および補因子結合式捕獲機構が挙げられる。精製することは、カチオン交換もしくはアニオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行するために使用され得る樹脂を用いて、実行することもできる。組換えタンパク質を精製するために使用され得る非限定的な樹脂は、本明細書で記載されている。組換えタンパク質を精製するために使用され得る樹脂のさらなる例は、当技術分野で公知である。
【０１２６】
組換えタンパク質をポリッシュする単位操作は、例えばカチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行するために使用され得る樹脂を含んでいる、例えばクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を含む、１つまたはそれ以上のＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）を用いて、実行することができる。組換えタンパク質をポリッシュするために使用され得る非限定的な樹脂は、本明細書で記載されている。組換えタンパク質をポリッシュするために使用され得る樹脂のさらなる例は、当技術分野で公知である。
【０１２７】
組換えタンパク質を含む流体を保持する単位操作は、少なくとも１つのリザーバ（例えば、停留タンク）を含む、またはＭＣＣＳもしくはＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２とを合算して最大で１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））を含む、ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）を用いて、実行することができる。例えば、上記保持する単位操作を達成するために使用され得るリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））はそれぞれ、約１ｍＬから約１Ｌの間（例えば、約１ｍＬから約８００ｍＬの間、約１ｍＬから約６００ｍＬの間、約１ｍＬから約５００ｍＬの間、約１ｍＬから約４００ｍＬの間、約１ｍＬから約３５０ｍＬの間、約１ｍＬから約３００ｍＬの間、約１０ｍＬから約２５０ｍＬの間、約１０ｍＬから約２００ｍＬの間、約１０ｍＬから約１５０ｍＬの間または約１０ｍＬから約１００ｍＬの間）の体積を有し得る。本明細書に記載の方法において使用されるリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））は、例えば上下限も含めて１ｍＬから約３００ｍＬの間、例えば、上下限も含めて１ｍＬから約２８０ｍＬ、約２６０ｍＬ、約２４０ｍＬ、約２２０ｍＬ、約２００ｍＬ、約１８０ｍＬ、約１６０ｍＬ、約１４０ｍＬ、約１２０ｍＬ、約１００ｍＬ、約８０ｍＬ、約６０ｍＬ、約４０ｍＬ、約２０ｍＬまたは約１０ｍＬの間である、容量を有し得る。流体がＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に進入するまで流体を保持しておくために（本明細書に記載の方法のいずれかにおいて）使用される、任意のリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））は、例えば上下限も含めて１ｍＬから第１のＭＣＣＳの第１のカラムの負荷量の約１００％の間、上下限も含めて約１ｍＬからＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１の第１のカラムの負荷量の約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％または約５％の間である、容量を有し得る。溶出液がＭＣＣＳ２に入る前に（組換えタンパク質を含む）ＭＣＣＳ１からの溶出液を保持するのに使用されるリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））のいずれも、例えば、ＭＣＣＳ２の第１のカラムの装填体積の１ｍＬ〜約１００％（両端を含む）、例えば、約１ｍＬ〜約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、または約５％（両端を含む
）の容量を有することができる。
【０１２８】
リザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））はそれぞれ、少なくとも１０分（例えば、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間または少なくとも６時間）にわたって、組換えタンパク質を含む流体を保持することができる。他の例において、リザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））は、例えば上下限も含めて約５分から約６時間未満の間、例えば上下限も含めて約５分から約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間または約３０分の間という合計時間での期間にわたって、組換えタンパク質のみを保持する。リザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））は、組換えタンパク質を含む流体の保持と（例えば、２５℃未満、１５℃未満または１０℃未満の温度における）冷蔵の両方を実行するために使用され得る。リザーバは、円形シリンダー、長円形シリンダー、または、ほぼ長方形で密封済みの不透過性袋を含めて、任意の形状を有し得る。
【０１２９】
組換えタンパク質を含む流体をろ過する単位操作は、例えばフィルターを含むまたは分子ふるい樹脂を含んでいるクロマトグラフィーカラムもしくはクロマトグラフィー膜を含む、ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）を用いて、実行することができる。当技術分野で公知であるとおり、沈殿した任意の材料および／または細胞（例えば、沈殿した折り畳まれていないタンパク質；沈殿した望ましくない宿主細胞タンパク質；沈殿した脂質；細菌；酵母細胞；真菌細胞；マイコバクテリア；および／または哺乳類細胞）を除去することができる、多種多様なサブミクロンフィルター（例えば、１μｍ未満、０．５μｍ未満、０．３μｍ未満、約０．２μｍ、０．２μｍ未満、１００ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満または１０ｎｍ未満の細孔径を有するフィルター）が、当技術分野で入手可能である。約０．２μｍまたは０．２μｍ未満の細孔径を有するフィルターは、組換えタンパク質を含む流体から細菌を効果的に除去することが知られている。当技術分野で公知であるとおり、分子ふるい樹脂を含んでいるクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜もまた、組換えタンパク質を含む流体をろ過する単位操作を実行するために、ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）内に使用することができる。
【０１３０】
組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨを調節する単位操作は、バッファー調節リザーバ（例えば、インラインバッファー調節リザーバ）を含んでいて利用する、ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）を用いて、実行することができ、このバッファー調節リザーバは、（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／もしくはＭＣＣＳ２内部にあるカラムどうしの間、または、終わりから二番目のＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ１）内にある最後のカラムの後から、組換えタンパク質を含む流体が次のＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ２）の第１のカラムに送り込まれる前までの間に）組換えタンパク質を含む流体中に新たなバッファー溶液を添加する。当技術分野で理解され得るのと同様に、インラインバッファー調節リザーバは、任意のサイズ（例えば、１００ｍＬ超）であってよく、任意の緩衝液（例えば、次のもののうち１つまたはそれ以上を有する緩衝液：組換えタンパク質を含む流体に比較して増大もしくは減少するｐＨ、組換えタンパク質を含む流体に比較して増大もしくは減少するイオン（例えば、塩）濃度、および／または、ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムもしくは少なくとも１つのクロマトグラフィー膜中に存在する樹脂への結合において組換えタンパク質と競合して濃度が増大もしくは減少する作用物質）を収容し得る。
【０１３１】
ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、２つまたはそれ以上の単位操作を実行することができる。例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２はそれぞれ、少なくとも次の単位操作を実行することができる：組換えタンパク質を捕獲するこ
と、および組換えタンパク質を含む流体中に存在するウイルスを不活性化すること；組換えタンパク質を捕獲すること、組換えタンパク質を含む流体中に存在するウイルスを不活性化すること、ならびに組換えタンパク質を含む液体のイオン濃度および／またはｐＨを調節すること；組換えタンパク質を精製すること、および組換えタンパク質をポリッシュすること；組換えタンパク質を精製すること、組換えタンパク質をポリッシュすること、ならびに、組換えタンパク質を含む流体をろ過することまたは組換えタンパク質を含む流体から沈殿物および／もしくは特定の物質を除去すること；ならびに、組換えタンパク質を精製すること、組換えタンパク質をポリッシュすること、組換えタンパク質を含む流体をろ過することまたは組換えタンパク質を含む流体から沈殿物および／もしくは特定の微粒子状物質を除去すること、ならびに組換えタンパク質を含む液体のイオン濃度および／またはｐＨを調節すること。
【０１３２】
組換えタンパク質を捕獲する
本方法は、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１を用いて組換えタンパク質を捕獲する工程を含む。当技術分野において認識することができるように、組換えタンパク質を含む液体培養培地は、種々の異なる手段を用いてＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１上に連続的に供給することができる。例えば、液体培養培地はＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１中に能動的にポンプで送ることができ、または液体培養培地は重力を用いてＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１中に供給することができる。液体培養培地はＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１中に供給する前にリザーバ（例えば、保持タンク）に貯蔵することができ、または、液体培養培地は細胞（例えば、組換えタンパク質を培地中に分泌する哺乳類細胞）の培養物を含むバイオリアクターからＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１中に能動的にポンプで送ることができる。
【０１３３】
液体培養培地は約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１４ｍＬ／分、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量でＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１中に供給する（装填する）ことができる。組換えタンパク質を含む液体培養培地は本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の典型的な出所のいずれかに由来することができる。
【０１３４】
いくつかの例は、さらに、液体培養培地をＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１中に供給する前にろ過する任意選択の工程を含む。本明細書に記載の組換えタンパク質を含む液体培養培地もしくは流体をろ過する典型的な手段のいずれか、または当技術分野で公知の任意のろ過手段を、組換えタンパク質を含む液体培養培地をＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１中に供給する前にろ過するために使用することができる。
【０１３５】
本明細書に記載の方法において、組換えタンパク質の液体培養培地からの捕獲はＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１を用いて実行される。当技術分野において認識することができるように、組換えタンパク質の捕獲を達成するためには、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたは少なくとも１つのクロマトグラフィー膜が、捕獲機構（例えば、本明細書に記載の典型的な捕獲機構のいずれか）を利用する樹脂を含むか、またはカチオン交換、アニオン交換、もしくは分子ふるいクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行することができる樹脂を含まなければならない。例えば、組換えタンパク質が抗体または抗体フラグメントであれば、捕獲システムはプロテインＡ−結合捕獲機構または抗原−結合捕獲機構（この場合捕獲抗原は組換え抗体または抗体フラグメントにより特異的に認識される）であることができる。組換えタンパク質が酵素であれば、捕獲機構は、組換え酵素を捕獲するために酵素に特異的に結合する抗体もしくは抗体フラグメントを、組換え酵素を捕獲するために酵素の基質を、組換え酵素を捕獲するために酵素の補因子を、または、組換え酵素がタグを含む場合、組換え酵素内
に存在するタグに特異的に結合するタンパク質、金属キレート、もしくは抗体（もしくは抗体フラグメント）を使用することができる。組換えタンパク質を捕獲するために使用することができる非限定的な樹脂は本明細書に記載されており、組換えタンパク質を捕獲するのに使用することができる追加の樹脂は当技術分野で公知である。プロテインＡ−結合捕獲機構を利用する樹脂の１つの非限定的な例はＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＪＳＲ  ＬｉｆｅＳＣｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）、およびＫａｎｅｋａ  ＫａｎＣａｐ  Ａ（Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）である。
【０１３６】
組換えタンパク質を捕獲するために使用することができるＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在するクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の典型的な非限定的な大きさおよび形状は本明細書中に記載されている。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１中に供給される（装填される）液体培養培地は、例えば、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質（例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約８０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質）を含むことができる。捕獲する単位操作を実行するために使用される樹脂に組換えタンパク質が結合するのに必要とされる平均時間は、例えば、約５秒〜約１０分（例えば、約１０秒〜約８分、約１０秒〜約７分、約１０秒〜約６分、約１０秒〜約５分、約３０秒〜約５分、約１分〜約５分、約１０秒〜約４分、約３０秒〜約４分、または約１分〜約４分）であることができる。
【０１３７】
当技術分野において認識することができるように、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在するクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を用いて組換えタンパク質を捕獲するためには、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在するクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を装填し、洗浄し、溶離し、再生するという連続したクロマトグラフィー工程を実行しなければならない。本明細書に記載の連続したクロマトグラフィー工程の各々に割り当てられる典型的な流量、バッファー容積、および／または時間の長さのいずれかを、これらの異なる連続したクロマトグラフィー工程の１つまたはそれ以上（例えば、組換えタンパク質を捕獲するのに使用されるＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在するクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を装填し、洗浄し、溶離し、再生するという連続したクロマトグラフィー工程の１つまたはそれ以上）で使用することができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１（例えば、ＰＣＣＳまたはＰＣＣＳ１）でクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜を捕獲するのに使用することができる各々の連続したクロマトグラフィー工程に割り当てられる非限定的な流量、バッファー容積、および／または時間の長さは以下に提供される。加えて、ＭＣＣＳおよび／またはＭＣＣＳ１に使用することができる典型的なバッファーは以下に記載される。
【０１３８】
捕獲する単位操作を実行することができる樹脂（例えば、本明細書に記載の捕獲するのに使用することができる典型的な樹脂のいずれか）を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜を含むＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、上に記載した装填流量（供給速度）のいずれかを用いて、組換えタンパク質を含む液体培養培地を装填することができる。いくつかの例において、捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含有する単一のクロマトグラフィーカラムまたは単一のクロマトグラフィー膜が、例えば、約１０分〜約９０分（例えば、約１５分から約９０分の間、約２０分
から約８０分の間、約３０分から約８０分の間、約４０分から約８０分の間、約５０分から約８０分の間、および約６０分から約８０分の間）で装填される。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１が、捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含む少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムを直列に含むいくつかの例において、２つのクロマトグラフィーカラムを連続して装填するのに必要とされる時間は、例えば、約５０分〜約１８０分（例えば、約６０分から約１８０分の間、約７０分から約１８０分の間、約８０分から約１８０分の間、約９０分から約１８０分の間、約１００分から約１８０分の間、約１１０分から１５０分の間、および約１２５分から約１４５分の間）である。
【０１３９】
捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含むＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上への組換えタンパク質の装填の後、その少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を少なくとも１種の洗浄用バッファーで洗浄する。当技術分野において認識することができるように、少なくとも１種（例えば、２、３、または４種）の洗浄用バッファーとは、組換えタンパク質ではない全てのまたは大部分のタンパク質を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から溶出する一方で、組換えタンパク質と樹脂との相互作用を乱さないことを意味する。
【０１４０】
洗浄バッファーは、約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１４ｍＬ／分、約１．０ｍＬ／分〜約２５．０ｍＬ／分、約１．０ｍＬ／分〜約１５．０ｍＬ／分）の流量で少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を通過させることができる。使用される洗浄バッファーの容積（例えば、１より多くの洗浄バッファーを使用するときの洗浄バッファーの合計総容積）は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約１５ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。洗浄の合計時間は、例えば、約２分〜約３時間（例えば、約２分〜約２．５時間、約２分〜約２．０時間、約５分〜約１．５時間、約１０分〜約１．５時間、約１０分〜約１．２５時間、約２０分〜約１．２５時間、または約３０分〜約１時間）であることができる。
【０１４１】
捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含むＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の洗浄の後、捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含むＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に溶出バッファーを通すことによって、組換えタンパク質を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から溶離する。溶出バッファーは、捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を、約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約６．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約５．０ｍｇ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通過することができる。精製する単位操作を実行することができる樹脂を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の各々から組換えタンパク質を溶離するために使用される溶出バッファーの容積は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約１５ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約
１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。溶離する合計時間は、例えば、約２分〜約３時間（例えば、約２分〜約２．５時間、約２分〜約２．０時間、約２分〜約１．５時間、約２分〜約１．５時間、約２分〜約１．２５時間、約２分〜約１．２５時間、約２分〜約１時間、約２分から約４０分の間、約１０分から約４０分の間、または約２０分から約４０分の間）であることができる。これらの方法で使用することができる溶出バッファーの非限定的な例は捕獲機構および／または組換えタンパク質に依存する。例えば、溶出バッファーは、異なる濃度の塩（例えば、増大した塩濃度）、異なるｐＨ（例えば、増大または低減した塩濃度）、または捕獲する単位操作を実行することができる樹脂に対する結合に関して組換えタンパク質と競合する分子を含むことができる。本明細書に記載の各々の典型的な捕獲機構に対するかかる溶出バッファーの例は当技術分野で周知である。
【０１４２】
捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含むＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から組換えタンパク質を溶離した後、次の容積の液体培養培地を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に装填することができる前に、その少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を、再生バッファーを用いて平衡化しなければならない。再生バッファーは、捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を、例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約６．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約５．０ｍｇ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約５．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間、または約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通すことができる。捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を平衡化するために使用される再生バッファーの容積は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約１５ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約５ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。
【０１４３】
本明細書に記載の方法のいくつかで、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、組換えタンパク質を含む流体を、低いｐＨ（例えば、ｐＨ４．６未満、４．４未満、４．２未満、４．０未満、３．８未満、３．６未満、３．４未満、３．２未満、または３．０未満）に、例えば、約１分〜１．５時間（例えば、約１時間）保持し、組換えタンパク質を含む流体中に存在するウイルスを不活化するリザーバを含んでいる。ウイルスを不活化する単位操作を実行するために使用することができるリザーバの一例は、例えば、組換えタンパク質を含む流体をＭＣＣＳ２中に供給する前に、その組換えタンパク質を含む流体を例えば約１分〜１．５時間保持することができる撹拌フラスコ（ｓｔｉｒ  ｆｌａｓｋ）（例えば、５００−ｍＬ撹拌フラスコ、例えば、プログラムされた撹拌プレート（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ
ｓｔｉｒ  ｐｌａｔｅ）付きの５００−ｍＬ撹拌フラスコ）である。ウイルスの不活化の単位操作を実行するために使用されるリザーバは、プログラムされた撹拌プレート（例えば、リザーバ内で流体を、例えば４時間毎に混合する（例えば、定期的に混合する）ようにプログラムされた撹拌プレート）付きの５００−ｍＬ撹拌フラスコであることができる。ウイルスの不活化の単位操作を実行するために使用することができるリザーバのもう１つ別の例は、例えば、組換えタンパク質を含む流体をＭＣＣＳ２中に供給する前に、その組換えタンパク質を含む流体を例えば約１分〜１．５時間保持することができるプラス
チックバッグ（例えば、５００−ｍＬプラスチックバッグ）である。いくつかの例において、組換えタンパク質を含む流体は、ウイルスの不活化の単位操作を実行するために使用されるリザーバ中に供給されるとき、既に低いｐＨ（例えば、ｐＨ４．６未満、４．４未満、４．２未満、４．０未満、３．８未満、３．６未満、３．４未満、３．２未満、または３．０未満）を有していることができる。当業者には認識することができるように、ウイルスを不活化する単位操作を実行するために様々な他の手段を使用することができる。例えば、組換えタンパク質を含む流体のＵＶ照射も、ウイルスを不活化する単位操作を実行するために使用することができる。組換えタンパク質を含む流体中に存在するウイルスの不活化の単位操作を実行するために使用することができるリザーバの非限定的な例が本明細書中に記載されている。
【０１４４】
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は４つのクロマトグラフィーカラムを含むＰＣＣＳを含むことができ、ここで４つのクロマトグラフィーカラムのうちの少なくとも３つは（例えば、捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムのいずれか（例えば、本明細書に記載されているもののいずれか））を含むＭＣＣＳを用いて、組換えタンパク質を液体培養培地から捕獲する単位操作を実行する。これらの例において、ＰＣＣの第４のカラムは、組換えタンパク質を含む流体中のウイルスを不活化する単位操作を実行することができる（例えば、組換えタンパク質を含む流体のウイルスの不活化を達成するために使用することができる本明細書中に記載の典型的なカラムのいずれか）。
【０１４５】
いくつかの例において、組換えタンパク質を含む流体がＭＣＣＳ１（例えば、ＰＣＣＳ１）から連続的に溶出され、ＭＣＣＳ２（例えば、ＰＣＣＳ２）に連続的に供給される。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１（例えば、ＰＣＣＳまたはＰＣＣＳ１）の溶出液中に回収される組換えタンパク質の割合（％）は、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７２％、少なくとも７４％、少なくとも７６％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、または少なくとも９８％であることができる。ＭＣＣＳ１（例えば、ＰＣＣＳ１）からの溶出液は当技術分野で公知の種々の手段（例えば、配管）を用いてＭＣＣＳ２（例えば、ＰＣＣＳ２）中に供給することができる。ＭＣＣＳ１（例えば、ＰＣＣＳ１）の溶出液は、例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約６．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約５．０ｍｇ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約５．０ｍＬ／分〜約１５．０ｍＬ／分、約１５ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分、または約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量でＭＣＣＳ２（例えば、ＰＣＣＳ２）中に供給することができる。
【０１４６】
本明細書に記載のいくつかの方法は、さらに、ＭＣＣＳ１（例えば、ＰＣＣＳ１）からの溶出液のイオン濃度および／またはｐＨを、その溶出液がＭＣＣＳ２（例えば、ＰＣＣＳ２）中に供給される前に調節する工程を含むことができる。本明細書に記載されているように、ＭＣＣＳ１（例えば、ＰＣＣＳ１）からの溶出液のイオン濃度および／またはｐＨは、（その溶出液がＭＣＣＳ２中に供給される前に）その溶出液に（例えば、インラインバッファー調節リザーバを使用することにより）バッファーを添加することによって調節することができる。このバッファーは、例えば、約０．１ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分（例えば、約０．１ｍＬ／分〜約１２．５ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約１０．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約８．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約６ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約４ｍＬ／分、または約０．５ｍＬ／分〜約５ｍＬ／分）の流量でＭＣＣＳ１からの溶出液に添加することができる。
【０１４７】
本明細書に記載の方法は、さらに、ＭＣＣＳ１からの溶出液をＭＣＣＳ２中に供給する前にそのＭＣＣＳ１からの溶出液を保持または貯蔵する（かつ場合により冷蔵する）工程を含むことができる。本明細書に記載されているように、この保持または貯蔵する工程は本明細書に記載のリザーバのいずれか（例えば、バックアップタンク）を用いて実行することができる。
【０１４８】
本明細書に記載の方法はまた、ＭＣＣＳ１からの溶出液をＭＣＣＳ２中に供給する前にその溶出液をろ過する工程も含むことができる。本明細書に記載のろ過方法または典型的なフィルターのいずれもＭＣＣＳ１からの溶出液をＭＣＣＳ２中に供給する前にその溶出液をろ過するために使用することができる。
【０１４９】
組換えタンパク質をポリッシュおよび精製する
ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１、および／またはＭＣＣＳ２は組換えタンパク質を精製しポリッシュするという単位操作を実行するのに使用することができる。例えば、ＭＣＣＳ２を使用して組換えタンパク質を精製しポリッシュする操作を実行することができ、ＭＣＣＳ２からの溶出液はタンパク質原薬である。ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つ（例えば、２つ、３つ、または４つ）のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜、および組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つ（例えば、２つ、３つ、または４つ）のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を含むことができる。
【０１５０】
組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜は、捕獲機構（例えば、本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知の捕獲機構のいずれか）を利用する樹脂、またはアニオン交換、カチオン交換、分子ふるいクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行するために使用することができる樹脂を含むことができる。組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜はアニオン交換、カチオン交換、分子ふるいクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行するために使用することができる樹脂（例えば、本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知のアニオン交換、カチオン交換、分子ふるいクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行するための典型的な樹脂のいずれか）を含むことができる。
【０１５１】
組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムもしくはクロマトグラフィー膜の大きさ、形状、および容積、ならびに／または組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィー膜の大きさおよび形状は、本明細書に記載のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の典型的な大きさ、形状、および容積の組合せのいずれかであることができる。当業者には認識することができるように、組換えタンパク質を精製またはポリッシュする工程は、例えば、組換えタンパク質を精製またはポリッシュする単位操作を実行するために使用される少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を装填する工程、洗浄する工程、溶離する工程、および平衡化する工程を含むことができる。通例、精製する単位操作を実行するために使用されるクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から出て来る溶出バッファーは組換えタンパク質を含む。通例、ポリッシュする単位操作を実行するために使用されるクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から出て来る装填および／または洗浄バッファーは組換えタンパク質を含む。
【０１５２】
例えば、組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の大きさは、例えば、約２．０ｍＬ〜約２００ｍＬ（例えば、約２．０ｍＬ〜約１８０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約１６０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約１４０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約１２０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約１００ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約８０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約６０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約４０ｍＬ、約５．０ｍＬ〜約４０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約３０ｍＬ、約５．０ｍＬ〜約３０ｍＬ、または約２．０ｍＬ〜約２５ｍＬ）の容積を有することができる。組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたは少なくとも１つのクロマトグラフィー膜上に装填されるときの組換えタンパク質を含む流体の流量は、例えば、約０．１ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．１ｍＬ／分〜約１２．５ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約１０．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約８．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約６ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約４ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約３ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約２ｍＬ／分、または約０．２ｍＬ／分〜約４ｍＬ／分）であることができる。組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に装填される流体中の組換えタンパク質の濃度は、例えば、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質（例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約８０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質）であることができる。精製する単位操作を実行するために使用される少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜内の樹脂は、アニオン交換またはカチオン交換クロマトグラフィーを実行するために使用することができる樹脂であることができる。精製する単位操作を実行するために使用される少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜内の樹脂はカチオン交換樹脂（例えば、Ｃａｐｔｏ−Ｓ樹脂、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）であることができる。
【０１５３】
組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上への組換えタンパク質の装填の後、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を少なくとも１種の洗浄用バッファーで洗浄する。当技術分野において認識することができるように、少なくとも１種（例えば、２種、３種、または４種）の洗浄用バッファーは、組換えタンパク質ではないあらゆるタンパク質を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から溶離する一方で、組換えタンパク質と樹脂の相互作用またはその他の点で組換えタンパク質の溶離を乱さないことを意味する。
【０１５４】
洗浄バッファーは少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、または約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通ることができる。使用される洗浄バッファーの容積（例えば、１種より多くの洗浄バッファーを使用する場合は洗浄バッファーの合計総容積）は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約１５ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ
〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２．５ＸＣＶ〜約５．０ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。洗浄の合計時間は、例えば、約２分〜約３時間（例えば、約２分〜約２．５時間、約２分〜約２．０時間、約５分〜約１．５時間、約１０分〜約１．５時間、約１０分〜約１．２５時間、約２０分〜約１．２５時間、約３０分〜約１時間、約２分から約１０分の間、約２分から約１５分の間、または約２分から約３０分の間）であることができる。
【０１５５】
組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の洗浄後、組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に溶出バッファーを通すことによって組換えタンパク質を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から溶離する。溶出バッファーは、組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に、約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約６．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約５．０ｍｇ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、または約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通すことができる。組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の各々から組換えタンパク質を溶離するために使用される溶出バッファーの容積は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約２５ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約２０ＸＣＶ、約１５ＸＣＶ〜約２５ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。溶離する合計時間は、例えば、約２分〜約３時間（例えば、約２分〜約２．５時間、約２分〜約２．０時間、約２分〜約１．５時間、約２分〜約１．５時間、約２分〜約１．２５時間、約２分〜約１．２５時間、約２分〜約１時間、約２分から約４０分の間、約１０分から約４０分の間、約２０分から約４０分の間、または約３０分から１．０時間の間）であることができる。これらの方法に使用することができる溶出バッファーの非限定的な例は樹脂および／または組換えタンパク質の生物物理学的な性質に依存する。例えば、溶出バッファーは、異なる濃度の塩（例えば、増大した塩濃度）、異なるｐＨ（例えば、上昇または低下した塩濃度）、または樹脂と結合することに関して組換えタンパク質と競合する分子を含むことができる。本明細書に記載の典型的な捕獲機構の各々に対してかかる溶出バッファーの例は当技術分野で周知である。
【０１５６】
組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜からの組換えタンパク質の溶離の後、かつ組換えタンパク質を含む流体の次の容積を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に装填することができる前に、その少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を、再生バッファーを用いて平衡化しなければならない。再生バッファーは、組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に、例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／
分から約６．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約５．０ｍｇ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約５．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間、または約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通すことができる。組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる樹脂を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を平衡化するために使用される再生バッファーの容積は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約１５ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約５ＸＣＶ、約２．５ＸＣＶ〜約７．５ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の溶出液中の組換えタンパク質の濃度は、例えば、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質（例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約８０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬ〜約７．５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質）であることができる。
【０１５７】
組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜は、カチオン交換、アニオン交換、または分子篩クロマトグラフィーを実行するために使用することができる樹脂を含むことができる。当技術分野において認識することができるように、組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を用いて組換えタンパク質をポリッシュすることは、例えば、組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を装填する工程、追跡する（ｃｈａｓｉｎｇ）工程、および再生する工程を含むことができる。例えば、装填、追跡、および再生する工程を用いてポリッシュを実行する場合、組換えタンパク質は、組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用される少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜中の樹脂と結合せず、組換えタンパク質は装填および追跡工程で少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から溶離され、再生工程は、組換えタンパク質を含む追加の流体を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に装填することができる前に、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜からあらゆる不純物を除去するために使用される。装填、追跡、および再生工程の各々で使用される典型的な流量とバッファー容積は以下に記載する。
【０１５８】
組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の大きさ、形状、および容積、ならびに／または組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィー膜の大きさおよび形状は、本明細書に記載のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の典型的な大きさ、形状、および容積の組合せのいずれかであることができる。例えば、組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の大きさは、例えば、約０．５ｍＬ〜約２００ｍＬ（例えば、約０．５ｍＬ〜約１８０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約１６０ｍＬ
、約０．５ｍＬ〜約１４０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約１２０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約１００ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約８０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約６０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約４０ｍＬ、約５．０ｍＬ〜約４０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約３０ｍＬ、約５．０ｍＬ〜約３０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約２５ｍＬ、約０．２ｍＬ〜約１０ｍＬ、または約０．２ｍＬ〜約５ｍＬ）の容積を有することができる。組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に装填されるときの組換えタンパク質を含む流体の流量は、例えば、約０．１ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．１ｍＬ／分〜約１２．５ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約１０．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約８．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約６ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約４ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約３ｍＬ／分、約２ｍＬ／分〜約６ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約２ｍＬ／分、または約０．２ｍＬ／分〜約４ｍＬ／分）であることができる。組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に装填される組換えタンパク質を含む流体の総容積は、例えば、約１．０ｍＬ〜約２５０ｍＬ（例えば、約１．０ｍＬ〜約２２５ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約２００ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約１７５ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約１５０ｍＬ、約１００ｍＬ〜約１２５ｍＬ、約１００ｍＬ〜約１５０ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約１５０ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約１２５ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約１００ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約７５ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約５０ｍＬ、または約１．０ｍＬ〜約２５ｍＬ）であることができる。ポリッシュを実行するために使用される少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜内の樹脂はアニオン交換またはカチオン交換樹脂であることができる。ポリッシュする単位操作を実行するために使用される少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜内の樹脂はカチオン交換樹脂（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ樹脂，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）であることができる。
【０１５９】
装填工程後、追跡工程を実行する（例えば、追跡バッファーを少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に通して、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に実質的に結合しない組換えタンパク質を収集する）。これらの例において、追跡バッファーは、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に、約０．２ｍＬ／分〜約５０ｍＬ／分（例えば、約１ｍＬ／分〜約４０ｍＬ／分、約１ｍＬ／分〜約３０ｍＬ／分、約５ｍＬ／分〜約４５ｍＬ／分、約１０ｍＬ／分〜約４０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、または約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通すことができる。使用される追跡バッファーの容積は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約１００ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約９０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約８０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約７０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約６０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約５０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約４０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約３０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約２０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１５ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約２０ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約３０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２．５ＸＣＶ〜約５．０ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。追跡の合計時間は、例えば、約１分〜約３時間（例えば、約１分〜約２．５時間、約１分〜約２．０時間、約１分〜約１．５時間、約２分〜約１．５時間、約１分〜約１．２５時間、約２分〜約１．２５時間、約１分〜約５分、約１分〜約１０分、約２分〜約４分、約３０分〜約１時間、約２分から約１０分の間、約２分から約１５分の間、または約２分から約３０分の間）であることができる。装填工程および追跡工程でカラムを通っ
て来る溶出液中に存在する組換えタンパク質の合わせた濃度は、例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質（例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約８０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬから約７．５ｍｇ／ｍＬの間、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約１ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質）であることができる。
【０１６０】
追跡する工程の後、そしてポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に組換えタンパク質を含む流体の次の容積を装填することができる前に、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を再生バッファーを用いて再生しなければならない。再生バッファーは、組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に、例えば、約０．２ｍＬ／分〜約５０ｍＬ／分（例えば、約１ｍＬ／分〜約４０ｍＬ／分、約１ｍＬ／分〜約３０ｍＬ／分、約５ｍＬ／分〜約４５ｍＬ／分、約１０ｍＬ／分〜約４０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、または約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通すことができる。ポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を再生するために使用される再生バッファーの容積は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約５００ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約４５０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約４００ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約３５０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約３００ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約２５０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約２００ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１５０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１００ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約９０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約８０ＸＣＶ、または約１ＸＣＶ〜約７０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約６０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約５０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約４０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約３０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約２０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１５ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約２０ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約３０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２．５ＸＣＶ〜約５．０ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。
【０１６１】
他の例において、ポリッシュする単位操作を実行するために使用される１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は、組換えタンパク質を含む流体中に存在する不純物を選択的に結合するかまたは保持する樹脂を含み、１つまたはそれ以上のカラムおよび／または膜の樹脂の結合能力に達するかまたは達したと実質的に同等になったら、１つまたはそれ以上のカラムおよび／または膜を再生する代わりに、１つまたはそれ以上のカラムおよび／または膜を取り替える（例えば、実質的に類似のカラムおよび／または膜と取り替える）。
【０１６２】
本明細書に記載のこれらの方法のいくつかの例において、ＭＣＣＳ２は、例えば、３つのクロマトグラフィーカラムおよび１つのクロマトグラフィー膜を含むＰＣＣＳを含み、ここでＰＣＣＳ内の３つのクロマトグラフィーカラムは（例えば、タンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカ
ラムを用いて）組換えタンパク質を精製する単位操作を実行し、ＰＣＣＳ内のクロマトグラフィー膜は組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行する。これらの例で、治療用タンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができるＰＣＣＳ内のクロマトグラフィー膜は、組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる、本明細書に記載の典型的なクロマトグラフィー膜のいずれかであることができる。本明細書に記載のカラムスイッチング法のいずれかを使用して、この例においてＰＣＣＳ内の第１の３つのクロマトグラフィーカラムおよびクロマトグラフィー膜を切り替えることができる時を決定することができる。
【０１６３】
この例のいくつかの実施形態は、さらに、ＰＣＣＳ内の３つのクロマトグラフィーカラムからの溶出液をＰＣＣＳ内のクロマトグラフィー膜中に供給する前にその溶出液のイオン濃度および／またはｐＨを調節する工程を含むことができる。本明細書に記載されているように、ＰＣＣＳ内の３つのクロマトグラフィーカラムからの溶出液のイオン濃度および／またはｐＨは（この例においてはこの溶出液をＰＣＣＳ内のクロマトグラフィー膜中に供給する前に）（例えば、インラインバッファー調節リザーバの使用により）ＰＣＣＳ内の３つのクロマトグラフィーカラムの溶出液にバッファーを添加することによって調節することができる。バッファーは、例えば、約０．１ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分（例えば、約０．１ｍＬ／分〜約１２．５ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約１０．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約８．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約６ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜４ｍＬ／分、または約０．５ｍＬ／分〜約５ｍＬ／分）の流量で溶出液に添加することができる。
【０１６４】
これらの例は、さらに、この例においてはＰＣＣＳ内の３つのクロマトグラフィーカラムからの溶出液をクロマトグラフィー膜（組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができるクロマトグラフィー膜）中に供給する前にその溶出液を保持または貯蔵する工程を含むことができる。本明細書に記載されているように、この保持または貯蔵する工程は本明細書に記載のリザーバのいずれか（例えば、バックアップタンク）を用いて実行することができる。
【０１６５】
これらの例はまた、典型的なＰＣＣＳシステム内におけるクロマトグラフィー膜からの溶出液（組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができるクロマトグラフィー膜の溶出液）をろ過する工程を含むこともできる。本明細書に記載のろ過のための典型的なフィルターまたは方法のいずれかを用いて、この典型的なＰＣＣＳにおけるクロマトグラフィー膜からの溶出液（組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができるクロマトグラフィー膜の溶出液）をろ過することができる。
【０１６６】
当技術分野において認識することができるように、精製された組換えタンパク質は、本明細書に記載の方法のいずれかを用いてＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ２から定期的に溶離することができる。例えば、本明細書に記載の方法のいずれも、例えば、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２に使用されるクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜に応じて、例えば、約３０秒〜約５時間（例えば、約１分から約４時間の間、約１分から約３時間の間、約１分から約２時間の間、約１分から約１．５時間の間、約１分から約１時間の間、または約１分から約３０分の間）の持続時間の間、例えば、約１分〜約６時間（例えば、約１分から約５時間の間、約１分から約４時間の間、約１分から約３時間の間、約１分から約２時間の間、約１分から約１時間の間、または約１分から３０分の間）の頻度で、精製された組換えタンパク質を溶離することができる。
【０１６７】
培養する方法
本明細書に記載の方法のいくつかは、さらに、液体培養培地を含むバイオリアクター（
例えば、潅流またはフェドバッチバイオリアクター）で、組換えタンパク質を分泌する細胞（例えば、組換え哺乳類細胞）を培養する工程を含み、ここでは細胞（例えば、哺乳類細胞）を実質的に含まないある容積の液体培養培地がバイオリアクター（例えば、潅流バイオリアクター）から連続的または定期的に除去され、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１中に供給される。バイオリアクターは、例えば、約１Ｌ〜約１０，０００Ｌ（例えば、約１Ｌ〜約５０Ｌ、約５０Ｌ〜約５００Ｌ、約５００Ｌ〜約１０００Ｌ、５００Ｌ〜約５０００Ｌ、約５００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約５０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約１Ｌから約１０，０００Ｌの間、約１Ｌから約８，０００Ｌの間、約１Ｌ〜約６，０００Ｌ、約１Ｌから約５，０００Ｌの間、約１００Ｌから約５，０００Ｌの間、約１０Ｌから約１００Ｌの間、約１０Ｌから約４，０００Ｌの間、約１０Ｌから約３，０００Ｌの間、約１０Ｌから約２，０００Ｌの間、または約１０Ｌから約１，０００Ｌの間）の容積を有することができる。バイオリアクター内に存在する液体培養培地の量は、例えば、約０．５Ｌ〜約５，０００Ｌ（例えば、約０．５Ｌ〜約２５Ｌ、約２５Ｌ〜約２５０Ｌ、約２５０Ｌ〜約５００Ｌ、２５０Ｌ〜約２５００Ｌ、約２５０Ｌ〜約５，０００Ｌ、約２５００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約０．５Ｌから約５，０００Ｌの間、約０．５Ｌから約４，０００Ｌの間、約０．５Ｌから約３，０００Ｌの間、約０．５Ｌから約２，５００Ｌの間、約５０Ｌから約２，５００Ｌの間、約５Ｌから約５０Ｌの間、約５Ｌから約２，０００Ｌの間、約５Ｌから約１，５００Ｌの間、約５Ｌから約１，０００Ｌの間、または約５Ｌから約５００Ｌの間）であることができる。細胞の培養は、例えば、フェドバッチバイオリアクターまたは潅流バイオリアクターを用いて実行することができる。細胞の培養（例えば、哺乳類細胞の培養）の非限定的な例およびいろいろな局面は以下に記載されており、いかなる組合せで使用することもできる。
【０１６８】
細胞
本明細書に記載の方法のいくつかで培養される細胞は細菌（例えば、グラム陰性細菌）、酵母（例えば、サッカロマイセス・セリビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、またはアークスュラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ））、または哺乳類細胞であることができる。哺乳類細胞は懸濁液中で、または接着細胞として増殖する細胞であることができる。本明細書に記載の方法のいずれかで培養することができる哺乳類細胞の非限定的な例として：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞またはＣＨＯ−Ｋ１ｓ細胞）、Ｓｐ２．０、骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ／０）、Ｂ−細胞、ハイブリドーマ細胞、Ｔ−細胞、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ  ２９３ＥおよびＨＥＫ  ２９３Ｆ）、アフリカミドリザル腎臓上皮（Ｖｅｒｏ）細胞、およびメイディン・ダービー（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ（コッカースパニエル（Ｃｏｃｋｅｒ  Ｓｐａｎｉｅｌ））腎臓上皮（ＭＤＣＫ）細胞がある。接着細胞を培養するいくつかの例で、培養物はまた複数のマイクロキャリア（例えば、１つまたはそれ以上の細孔を含むマイクロキャリア）を含むこともできる。本明細書に記載の方法のいずれかで培養することができる追加の哺乳類細胞は当技術分野で公知である。
【０１６９】
哺乳類細胞は、組換えタンパク質（例えば、組換えタンパク質）をコードする組換え核酸（例えば、哺乳類細胞のゲノムに安定に組み込まれた核酸）を含むことができる。典型的な組換えタンパク質をコードする組換え核酸の非限定的な例は、本明細書に記載の方法を用いて生成することができる組換えタンパク質と共に以下に記載する。いくつかの例において、バイオリアクター（例えば、本明細書に記載のバイオリアクターのいずれか）で培養される哺乳類細胞はより大きい培養物から誘導された。
【０１７０】
組換えタンパク質をコードする核酸は分子生物学および分子遺伝学で公知の多種多様な方法を用いて哺乳類細胞中に導入することができる。非限定的な例として、トランスフェクション（例えば、リポフェクション）、形質導入（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、またはレトロウイルス感染）、およびエレクトロポレーションがある。いくつかの例において組換えタンパク質をコードする核酸は哺乳類細胞の染色体中に安定に組み込まれない（一過性トランスフェクション）が、他の場合には核酸が組み込まれる。あるいは、または加えて、組換えタンパク質をコードする核酸はプラスミド内および／または哺乳類の人工染色体（例えば、ヒト人工染色体）内に存在することができる。あるいは、または加えて、核酸はウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルスベクター）を用いて細胞に導入することができる。核酸はプロモーター配列（例えば、β−アクチンプロモーターおよびＣＭＶプロモーターのような強力なプロモーター、または誘導性プロモーター）に機能可能に結合することができる。所望により、核酸を含むベクターはまた、選択可能なマーカー（例えば、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、またはネオマイシン耐性を哺乳類細胞に授与する遺伝子）を含むこともできる。
【０１７１】
いくつかの例において、組換えタンパク質は分泌タンパク質であり、哺乳類細胞により細胞外培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）中に放出される。例えば、可溶性の組換えタンパク質をコードする核酸配列は、組換えタンパク質のＮ−またはＣ−末端に、分泌シグナルペプチドをコードする配列を含むことができ、これは哺乳類細胞内に存在する酵素により開裂され、その後細胞外培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）中に放出される。
【０１７２】
培養培地
液体培養培地は当技術分野で公知である。液体培養培地（例えば、第１および／または第２の組織培養培地）は哺乳類の血清（例えば、ウシ胎児血清およびウシ血清）、および／または成長ホルモンまたは増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、および上皮増殖因子）を補充することができる。あるいは、または加えて、液体培養培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）は既知組成液体培養培地、動物由来成分を含まない液体培養培地、無血清液体培養培地、または血清含有液体培養培地であることができる。既知組成液体培養培地、動物由来成分を含まない液体培養培地、無血清液体培養培地、および血清含有液体培養培地の非限定的な例は市販されている。
【０１７３】
液体培養培地は通例エネルギー源（例えば、グルコースのような炭水化物）、必須アミノ酸（例えば、２０のアミノ酸＋システインの基本的な組）、低濃度で必要とされるビタミンおよび／または他の有機化合物、遊離脂肪酸、および／または微量元素を含む。液体培養培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）は、所望により、例えば、哺乳類ホルモンもしくは増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩およびバッファー（例えば、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、ヌクレオシドおよび塩基（例えば、アデノシン、チミジン、およびヒポキサンチン）、タンパク質および組織加水分解物、および／またはこれらの添加物の任意の組合せを補充することができる。
【０１７４】
本明細書に記載の方法のいずれかで細胞（例えば、哺乳類細胞）を培養するために使用することができる多種多様な異なる液体培養培地は当技術分野で公知である。同様に本方法で有用であり得る培地成分には、限定されることはないが、既知組成（ＣＤ）加水分解物、例えば、ＣＤペプトン、ＣＤポリペプチド（２またはそれ以上のアミノ酸）、およびＣＤ増殖因子がある。液体の組織培養培地および培地成分の追加の例は当技術分野で公知である。
【０１７５】
熟練した実務者には認識されるように、本明細書に記載の第１の液体培養培地と第２の液体培養培地は同じタイプの培地または異なる培地であることができる。
【０１７６】
典型的なバイオリアクターの追加の特徴
本明細書に記載のバイオリアクターのいずれかの内面は、少なくとも１つのコーティング（例えば、ゼラチン、コラーゲン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリスチレン、およびラミニンの少なくとも１つのコーティング）、ならびに当技術分野で公知のように、Ｏ２、ＣＯ２、およびＮ２を液体培養培地中にスパージするための１つまたはそれ以上の口、および液体培養培地をかき混ぜるための撹拌機構を有し得る。バイオリアクターは制御加湿雰囲気中で（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％より高い湿度、または１００％の湿度で）細胞培養物をインキュベートすることができる。バイオリアクターはまた、バイオリアクターからある体積の液体培養培地を取り出すことができる機械的装置、および場合により、その機械的装置内に、液体培養培地のバイオリアクターからの移動過程の間に液体培養培地から細胞を除去するフィルター（例えば、米国仮特許出願第６１／８７８，５０２号に記載されているＡＴＦシステムまたは細胞ろ過システム）を装備することもできる。
【０１７７】
温度
哺乳類細胞の培養工程は約３１℃〜約４０℃の温度で実行することができる。熟練した実務者には認識されるように、温度は、培養工程中特定の時点で、例えば、１時間または１日単位で変えることができる。例えば、温度は、バイオリアクターに細胞（例えば、哺乳類細胞）を最初に播種した後約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、もしくは約２０日またはそれ以上で変化またはシフトする（例えば、上昇もしくは低下する）ことができる。例えば、温度は上方へシフト（例えば、最大もしくは約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または最大もしくは約２０℃の変化）することができる。例えば、温度は下方へシフト（例えば、最大もしくは約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または最大もしくは約２０℃の変化）することができる。
【０１７８】
ＣＯ２
本明細書に記載の培養工程は、さらに、バイオリアクター内の液体培養培地を最高または約１５％のＣＯ２（例えば、最高もしくは約１４％ＣＯ２、１２％ＣＯ２、１０％ＣＯ２、８％ＣＯ２、６％ＣＯ２、５％ＣＯ２、４％ＣＯ２、３％ＣＯ２、２％ＣＯ２、または最高もしくは約１％ＣＯ２）を含む雰囲気に曝露することを含むことができる。
【０１７９】
潅流バイオリアクター
本明細書に記載の培養工程は潅流バイオリアクターを用いて実行することができる。潅流バイオリアクター内での細胞（例えば、哺乳類細胞）の培養は、第１の容積の第１の液体培養培地（例えば、任意の濃度の哺乳類細胞を含む、例えば、実質的に細胞を含まない第１の容積の第１の液体培養培地）のバイオリアクターからの除去、および第２の容積の第２の液体培養培地を第１の液体培養培地に添加することを含む。除去と添加は同時もしくは順次に、またはこれら２つの組合せで実行することができる。さらに、除去と添加は、（例えば、バイオリアクターの容積または第１の液体培養培地の容積の０．１％〜８０
０％（例えば、１％から７００％の間、１％から６００％の間、１％から５００％の間、１％から４００％の間、１％から３５０％の間、１％から３００％の間、１％から２５０％の間、１％から１００％の間、１００％から２００％の間、５％から１５０％の間、１０％から５０％の間、１５％から４０％の間、８％から８０％の間、または４％から３０％の間）の容積をある所与の時間期間にわたって（例えば、２４時間の期間にわたって、約１時間〜約２４時間の増加する時間期間にわたって、または２４時間を超える増加する時間期間にわたって）除去し取り替える速度で）連続的に、または定期的に（例えば、３日毎に一回、２日毎に一回、１日に一回、１日に二回、１日に三回、１日に四回、または１日に五回）、またはこれらの任意の組合せで実行することができる。定期的に実行する場合、（例えば、約２４時間の期間内、約１時間〜約２４時間の増加する時間期間内、または２４時間を超える増加する時間期間内に）除去されるかまたは取り替えられる容積は、例えば、バイオリアクターの容積または第１の液体培養培地の容積の０．１％〜８００％（例えば、１％から７００％の間、１％から６００％の間、１％から５００％の間、１％から４００％の間、１％から３００％の間、１％から２００％の間、１％から１００％の間、１００％から２００％の間、５％から１５０％の間、１０％から５０％の間、１５％から４０％の間、８％から８０％の間、または４％から３０％の間）であることができる。除去される第１の液体培養培地の第１の容積および添加される第２の液体培養培地の第２の容積は、いくつかの例において、培養期間の全体または一部の間、各々の２４時間の期間（または代わりに、約１時間〜約２４時間の増加する時間期間もしくは２４時間を超える増加する時間期間）にわたっておよそ同じに保つことができる。当技術分野で公知のように、第１の液体培養培地の第１の容積を除去する速度（容積／単位時間）および第２の液体培養培地の第２の容積を添加する速度（容積／単位時間）は変えることができる。第１の液体培養培地の第１の容積を除去する速度（容積／単位時間）および第２の液体培養培地の第２の容積を添加する速度（容積／単位時間）はほぼ同じであることができ、または異なることができる。
【０１８０】
あるいは、除去され添加される容積は培養期間中各々の２４時間の期間（または代わりに、１時間〜約２４時間の増加する時間期間もしくは２４時間を超える増加する時間期間）にわたって変化する（例えば、次第に増大する）ことができる。例えば、培養期間中各々の２４時間の期間（あるいは、約１時間〜２４時間超の増加する時間期間または２４時間を超える増加する時間期間）内に除去される第１の液体培養培地の容積および添加される第２の液体培養培地の容積は、培養期間中、バイオリアクター容積または第１の液体培養培地容積の０．５％〜約２０％である容積から、バイオリアクター容積または第１の液体培養培地容積の約２５％〜約１５０％まで（例えば、次第に、または互い違いの増加量によって）増大することができる。
【０１８１】
熟練した実務者には認識されるように、第１の液体培養培地と第２の液体培養培地は同じタイプの培地であることができる。他の例において、第１の液体培養培地と第２の液体培養培地は異なることができる。
【０１８２】
第１の液体培養培地の第１の容積は、例えば、第１の容積の第１の液体培養培地をバイオリアクターから（例えば、実質的に細胞を含まない第１の容積の第１の液体培養培地をバイオリアクターから）除去することができる機械系により除去することができる。代わりに、または加えて、第１の容積の第１の液体培養培地は、細胞（例えば、哺乳類細胞）を排除する分子量カットオフを有する無菌膜を通る第１の容積の第１の液体培養培地の染み出しまたは重力流により除去することができる。
【０１８３】
第２の容積の第２の液体培養培地は、自動的に、例えば、注入ポンプにより第１の液体培養培地に添加することができる。
【０１８４】
いくつかの例において、第１の容積の第１の液体培養培地（例えば、実質的に哺乳類細胞を含まない第１の容積の第１の液体培養培地）の除去、および第２の容積の第２の液体培養培地の第１の液体培養培地への添加は、バイオリアクターに哺乳類細胞を播種した後少なくとも１時間以内（例えば、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、７時間以内、８時間以内、９時間以内、１０時間以内、１２時間以内、１４時間以内、１６時間以内、１８時間以内、２４時間以内、３６時間以内、４８時間以内、７２時間以内、９６時間以内、または９６時間後）には起こらない。
【０１８５】
フェドバッチバイオリアクター
本明細書に記載の培養工程はフェドバッチバイオリアクターを用いて実行することができる。フェドバッチバイオリアクターでの細胞の培養は、大半の培養期間にわたって、第１の液体培養培地への第２の容積の第２の液体培養培地の添加（例えば、定期的または連続的な添加）を含む。第２の液体培養培地の添加は、連続的に（例えば、バイオリアクターの容積または第１の液体培養培地容積の０．１％〜３００％（例えば、１％〜２５０％、１％〜１００％、１００％〜２００％、５％〜１５０％、１０％〜５０％、１５％〜４０％、８％〜８０％、または４％〜３０％）の容積をある所与の時間期間にわたって（例えば、２４時間の期間にわたって、約１時間〜約２４時間の増加する時間期間にわたって、または２４時間を超える増加する時間期間にわたって）添加する速度で）、または定期的に（例えば、３日毎に一回、２日毎に一回、１日に一回、１日に二回、１日に三回、１日に四回、または１日に五回）、またはこれらの任意の組合せで実行することができる。定期的に実行する場合、（例えば、約２４時間の期間内、約１時間〜約２４時間の増加する時間期間内、または２４時間を超える増加する時間期間内に）添加される容積は、バイオリアクターの容積または第１の液体培養培地容積の、例えば、０．１％〜３００％（例えば、１％〜２００％、１％〜１００％、１００％〜２００％、５％〜１５０％、１０％〜５０％、１５％〜４０％、８％〜８０％、または４％〜３０％）であることができる。添加される第２の液体培養培地の第２の容積は、いくつかの例において、培養期間の全体または一部の間、各々の２４時間の期間（または、代わりに、約１時間〜約２４時間の増加する時間期間または２４時間を超える増加する時間期間）にわたってほぼ同じに保つことができる。当技術分野で公知のように、第２の容積の第２の液体培養培地を添加する速度（容積／単位時間）は培養期間の全体または一部の間変えることができる。例えば、添加される第２の液体培養培地の容積は、培養期間中、各々の２４時間の期間（または代わりに、１時間〜約２４時間の増加する時間期間または２４時間を超える増加する時間期間）にわたって変化する（例えば、次第に増大する）ことができる。例えば、培養期間中、各々の２４時間の期間（または代わりに、約１時間〜２４時間超の増加する時間期間または２４時間を超える増加する時間期間）内に添加される第２の液体培養培地の容積は、培養期間の間中、（例えば、次第にまたは互い違いの増加によって）バイオリアクター容積または第１の液体培養培地容積の０．５％〜約２０％である容積からバイオリアクター容積または第１の液体培養培地容積の約２５％〜約１５０％まで増大することができる。第２の容積の第２の液体培養培地を添加する速度（容積／単位時間）は培養期間の全体または一部にわたってほぼ同じであることができる。
【０１８６】
熟練した実務者には認識されるように、第１の液体培養培地と第２の液体培養培地は同じタイプの培地であることができる。他の例において、第１の液体培養培地と第２の液体培養培地は異なることができる。第２の液体培養培地の容積は自動的に、例えば、注入ポンプにより第１の液体培養培地に添加することができる。
【０１８７】
いくつかの例において、第１の液体培養培地への第２の容積の第２の液体培養培地の添加は、バイオリアクターへの哺乳類細胞の播種から少なくとも１時間以内（例えば、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、７時間以内、８時間以内、９時間以内、１０時間以内、１２時間以内、１４時間以内、１６時間以内、１８時間以内
、２４時間以内、３６時間以内、４８時間以内、７２時間以内、９６時間以内、または９６時間後）には起こらない。フェドバッチ培養における細胞培養培地は通例培養期間の終了時に収穫され、本明細書に記載の方法のいずれかで使用される。しかし、フェドバッチ培養の細胞培養培地はまた培養期間中の１つまたはそれ以上の時点で収穫され、本明細書に記載の方法のいずれかで使用されることもできる。
【０１８８】
熟練した実務者には認識されるように、種々の培養パラメーター（例えば、容器、容積、培養物容積を交換する頻度率、撹拌頻度、温度、培地、およびＣＯ２濃度）のいずれかをこれらの方法を実行するためにいかなる組合せで使用することもできる。さらに、本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知の哺乳類細胞のいずれも組換えタンパク質を産生するために使用することができる。
【０１８９】
代表的な生物学的製造システム
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２を含む本明細書に記載の方法を実行するのに有用な生物学的製造システムの例は米国仮特許出願第６１／７７５，０６０号および同第６１／８５６，３９０号（参照によって組み入れる）に記載されている。これらの代表的なシステムでは、本明細書に提供される少なくとも１（例えば、少なくとも２、３、４、５、または６）の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムがＭＣＣＳ内またはＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内に存在する。例えば、システム全体は本明細書に提供される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを合計で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０含むことができる。例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１、および／またはＭＣＣＳ２は（または各々が）１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の本明細書に提供される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを含むことができる。
【０１９０】
例えば、有用なシステムは、入口を含むＭＣＣＳ１および出口を含むＭＣＣＳ２、または入口および出口を含むＭＣＣＳを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２は互いに流体連通している。これらのシステムはまた、流体が入口に流入し、ＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２を通過し、出口を通って製造システムから出て行くことができるように構成することもできる。これらのシステムにより、液体培養培地からの治療用原薬の連続的で時間効率の良い生産が可能になる。例えば、治療用のタンパク質を含む流体（例えば、液体培養培地）のＭＣＣＳ１への供給から、精製された組換えタンパク質（例えば、治療用タンパク質原薬）のＭＣＣＳ２の出口からの溶出までの経過時間は、例えば、約４時間〜約４８時間（両端を含む）であることができる。
【０１９１】
いくつかの代表的なシステムは停留タンクを含まない。他の例において、システムは（例えば、各々の停留タンクが、例えば約５分〜約６時間（両端を含む）の全期間の間治療用のタンパク質を保持するのみである場合）システム全体で最大１、２、３、４、または５の停留タンクを含むことができる。停留タンク（複数可）は１ｍＬ〜約３００ｍＬ（両端を含む）の容量を有することができる。流体がＭＣＣＳ１またはＭＣＣＳに入る前に停留タンク（複数可）に入るようにシステム内に配置された停留タンク（複数可）はいずれも、それぞれＭＣＣＳ１またはＭＣＣＳの第１のカラムの装填体積の１ｍＬ〜約１００％（両端を含む）である容量を有することができる。流体がＭＣＣＳ２に入る前に（そしてＭＣＣＳ１を出た後に）停留タンク（複数可）に入るようにシステム内に配置された停留タンク（複数可）はいずれも、例えば、ＭＣＣＳ２の第１のカラムの装填体積の１ｍＬ〜約１００％（両端を含む）である容量を有することができる。
【０１９２】
追加の代表的なシステムの構造および特徴
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、流体（例えば、実質的に細胞を含まない液体培養培地）
がそれぞれＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に入るために通過することができる入口を含むことができる。入口はこのような目的のために当技術分野で公知のいかなる構造であることもできる。入口への流体管の挿入後その入口からの流体の有意な漏出を起こすことなく流体がその入口を通ってＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に入るように流体管を挿入することが可能な、例えば、ネジ、リブ、またはシールを含むことができる。本システムに使用することができる非限定的な入口は公知であり、当業者は理解できるであろう。
【０１９３】
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は少なくとも２つのクロマトグラフィーカラム、少なくとも２つのクロマトグラフィー膜、または少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび少なくとも１つのクロマトグラフィー膜、ならびに入口を有することができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、本明細書に記載の代表的なＭＣＣＳのいずれかであることができるか、または本明細書に記載のＭＣＣＳの（任意の組合せの）代表的な特徴のいずれか１つまたはそれ以上を有することができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は本明細書に記載の代表的な形状、大きさ、体積（ベッド容積）、および／または単位操作のいずれか１つまたはそれ以上を有することができる。
【０１９４】
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は本明細書に記載または当技術分野で公知の代表的な樹脂のいずれか１つまたはそれ以上を含むことができる。例えば、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）の１つまたはそれ以上に含まれる樹脂は、ある捕獲機構（例えば、プロテインＡ結合捕獲機構、プロテインＧ結合捕獲機構、抗体または抗体フラグメント結合捕獲機構、基質結合捕獲機構、補因子結合捕獲機構、アプタマー結合捕獲機構、および／またはタグ結合捕獲機構）を利用する樹脂であることができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）の１つまたはそれ以上に含まれる樹脂はカチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂、分子ふるい樹脂、もしくは疎水性相互作用樹脂、またはこれらの任意の組合せであることができる。組換えタンパク質を精製するのに使用することができる樹脂のさらなる例は当技術分野で公知であり、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在する１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜に含ませることができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜は同じおよび／または異なる樹脂（例えば、本明細書に記載または組換えタンパク質の精製に使用されることが当技術分野で公知の樹脂のいずれか）を含むことができる。
【０１９５】
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在する２つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー樹脂は１つまたはそれ以上の単位操作（例えば、組換えタンパク質の捕獲、組換えタンパク質の精製、組換えタンパク質のポリッシュ、ウィルスの不活化、組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨの調節、または組換えタンパク質を含む流体のろ過）を実行することができる。非限定例において、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、流体（例えば、液体培養培地）から組換えタンパク質を捕獲する、および組換えタンパク質を含む流体中に存在するウィルスを不活化するという単位操作を実行することができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は本明細書に記載または当技術分野で公知の２またはそれ以上の単位操作の任意の組合せを実行することができる。
【０１９６】
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は切り替え機構（例えば、カラム切り替え機構）により互いに連結または移動することができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１はまた１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、または５つ）のポンプ（例えば、自動化された、例
えば、自動化されたぜん動ポンプ）を含むこともできる。カラム切り替え事象は、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１を通過する流体（例えば、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜への投入物および／またはそれ（ら）からの溶出液）中のある特定のレベルの組換えタンパク質に対応するＵＶ吸光度、ある特定の体積の液体（例えば、緩衝液）、または特定の経過時間により検出されるある一定レベルの組換えタンパク質の検出によって始動させることができる。カラム切り替えとは一般に、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内の少なくとも２つの異なるクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜（例えば、ＭＣＣＳ１またはＭＣＣＳ２内に存在する２つまたはそれ以上の異なるクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜）が、本方法の少なくとも一部の間異なる工程（例えば、平衡化、装填、溶出、または洗浄）を実質的に同時に通過できるようにする機構を意味する。
【０１９７】
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）であることができる。例えば、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１であるＰＣＣＳ（すなわち、それぞれ、ＰＣＣＳまたはＰＣＣＳ１）は４つのクロマトグラフィーカラムを含むことができ、ここで最初の３つのカラムは流体（例えば、液体培養培地）から組換えタンパク質を捕獲するという単位操作を実行し、ＰＣＣＳの４つめのカラムは組換えタンパク質を含む流体中のウィルスを不活化するという単位操作を実行する。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１であるＰＣＣＳはカラム切り替え機構を利用することができる。ＰＣＣシステムは、例えば４、５、６、７、または８つのカラム、またはそれ以上までのカラムを稼動させることができる改良されたＡＫＴＡシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を利用することができる。
【０１９８】
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は：１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のＵＶ監視装置、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のバルブ、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のｐＨ計、および／または１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の導電率計を装備することができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１はまた、（例えば、ＵＶ吸光度、液体の体積、または経過時間に基づいて）カラム切り替えがいつ起こるべきかを検知し、カラム切り替え事象に影響を及ぼす（始動させる）ためのソフトウェア（例えば、Ｕｎｉｃｏｒｎベースのソフトウェア、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を利用するオペレーティングシステムも装備することができる。
【０１９９】
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２０−１、２０−２、２０−３、または２０−４）のインライン緩衝液調節リザーバおよび／または緩衝液リザーバをさらに含むことができる。他の例において、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜中に容易には通過することができない流体を保持することができる１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、または６つ）の停留タンクを含むことができる。本明細書に記載のシステムはＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１、および／またはＭＣＣＳ２内に１つまたはそれ以上の停留タンク（例えば、本明細書に記載の停留タンク）を含むことができる。本明細書に記載のシステムの他の例は、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１、またはＭＣＣＳ２内に停留タンクを含まないか、またはシステム全体に停留タンクを含まない。本明細書に記載のシステムの他の例はシステム全体に最大で１、２、３、４、または５つの停留タンク（例えば、本明細書に記載のいずれかの停留タンク（複数可））を含む。
【０２００】
第２のＭＣＣＳ
代表的なシステムにおける第２のＭＣＣＳ（ＭＣＣＳ２）は少なくとも２つのクロマトグラフィーカラム、少なくとも２つのクロマトグラフィー膜、または少なくとも１つのクロマトグラフィーカラム（複数可）および少なくとも１つのクロマトグラフィー膜（複数可）、ならびに出口を含む。ＭＣＣＳ２は、本明細書に記載の代表的なＭＣＣＳのいずれかであることができ、または本明細書に記載のＭＣＣＳの代表的な特徴のいずれか１つまたはそれ以上を（任意の組合せで）有することができる。ＭＣＣＳ２内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は：本明細書に記載の形状、大きさ、体積（ベッド容積）、および／または単位操作のいずれか１つまたはそれ以上を有することができる。クロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は本明細書に記載または当技術分野で公知の代表的な樹脂のいずれかを含むことができる。例えば、ＭＣＣＳ２内に存在する１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜に含まれる樹脂は、捕獲機構（例えば、プロテインＡ結合捕獲機構、プロテインＧ結合捕獲機構、抗体もしくは抗体フラグメント結合捕獲機構、基質結合捕獲機構、補因子結合捕獲機構、タグ結合捕獲機構、および／またはアプタマー結合捕獲機構）を利用する樹脂であることができる。有用な樹脂としては、例えば、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂、分子ふるい樹脂、および疎水性相互作用樹脂がある。樹脂のさらなる例は当技術分野で公知である。ＭＣＣＳ２内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜は同じおよび／または異なる樹脂（例えば、本明細書に記載の、または当技術分野で組換えタンパク質の精製に使用することが知られている樹脂のいずれか）を含むことができる。
【０２０１】
ＭＣＣＳ２内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は１つまたはそれ以上の単位操作（例えば、本明細書に記載の単位操作のいずれかまたは本明細書に記載の単位操作の任意の組合せ）を実行することができる。非限定例において、ＭＣＣＳ２は流体から組換えタンパク質を精製する、および組換えタンパク質を含む流体中に存在する組換えタンパク質をポリッシュするという単位操作を実行することができる。他の非限定例において、ＭＣＣＳ２は流体中に存在する組換えタンパク質を精製する、流体中に存在する組換えタンパク質をポリッシュする、および組換えタンパク質を含む流体をろ過するという単位操作を実行することができる。別の例において、ＭＣＣＳ２は流体中に存在する組換えタンパク質を精製する、流体中に存在する組換えタンパク質をポリッシュする、組換えタンパク質を含む流体をろ過する、および組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨを調節するという単位操作を実行することができる。ＭＣＣＳ２は本明細書に記載または当技術分野で公知の単位操作の２つまたはそれ以上の任意の組合せを実行することができる。
【０２０２】
ＭＣＣＳ２内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は切り替え機構（例えば、カラム切り替え機構）により互いに対して連結または移動することができる。ＭＣＣＳ２はまた、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、または５）のポンプ（例えば、自動化された、例えば、自動化されたぜん動ポンプ）を含むこともできる。カラム切り替え事象は、ＭＣＣＳ２を通過する流体（例えば、ＭＣＣＳ２内の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜への投入物および／またはそれからの溶出液）中のある特定のレベルの組換えタンパク質に対応するＵＶ吸光度、特定の体積の液体（例えば、緩衝液）、または特定の経過時間により検出されるあるレベルの組換えタンパク質の検出によって始動させることができる。
【０２０３】
ＭＣＣＳ２は定期的向流クロマトグラフィーシステム（すなわち、ＰＣＣＳ２）であることができる。例えば、ＰＣＣＳ２は、組換えタンパク質を流体から精製するという単位
操作を実行する３つのカラム、および流体中に存在する組換えタンパク質をポリッシュするという単位操作を実行するクロマトグラフィー膜を含むことができる。例えば、組換えタンパク質を流体から精製するという単位操作を実行する３つのカラムは、例えば、カチオン交換樹脂を含むことができ、ポリッシュするという単位操作を実行するクロマトグラフィー膜はカチオン交換樹脂を含むことができる。ＰＣＣＳ２はカラム切り替え機構を利用することができる。ＰＣＣＳ２は、例えば、４、５、６、７、または８つのカラム、またはそれ以上まで稼動させることができる改良されたＡＫＴＡシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を利用することができる。
【０２０４】
ＭＣＣＳ２は：１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のＵＶ監視装置、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のバルブ、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のｐＨ計、および／または１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の導電率計を装備することができる。ＭＣＣＳ２はまた、（例えば、ＵＶ吸光度、液体の体積、または経過時間に基づいて）カラム切り替え事象がいつ起こるべきかを検知し、カラム切り替え事象に影響を及ぼすためのソフトウェア（例えば、Ｕｎｉｃｏｒｎベースのソフトウェア、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を利用するオペレーティングシステムを装備することもできる。
【０２０５】
ＭＣＣＳ２は、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２０−１、２０−２、２０−３、または２０−４）のインライン緩衝液調節リザーバおよび／または緩衝液リザーバをさらに含むことができる。他の例において、ＭＣＣＳ２は、ＭＣＣＳ２内の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜中に容易に通過することができない流体を保持することができる１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、または６つ）の停留タンク（例えば、本明細書に記載の停留タンクのいずれか）を含むことができる。
【０２０６】
ＭＣＣＳ２は、治療用タンパク質原薬がシステムを出て行くのに通ることができる出口を含む。出口は、例えば、流体管を挿入することができるネジ、リブ、もしくはシール、または精製された組換えタンパク質（例えば、治療用タンパク質原薬）を保持もしくは貯蔵するように設計されたバイアルを含むことができる。出口は、精製された組換えタンパク質（例えば、治療用タンパク質原薬）が低減したバイオバーデンのバイアルまたは貯蔵容器中に直接流入することができるように、低減したバイオバーデンのバイアルまたはその他のこのような貯蔵容器を出口に対して密閉するために使用することができる表面を含むことができる。本システムに使用することができる非限定的な出口は公知であり、当業者により理解されよう。
【０２０７】
本明細書に記載のシステムはまた、ＭＣＣＳ１とＭＣＣＳ２との間に配置された流体管を含むこともできる。本明細書に記載の流体管のいずれも、例えば、例えばポリエチレン、ポリカーボネート、またはプラスチックで作成されたチューブであることができる。ＭＣＣＳ１とＭＣＣＳ２との間に配置された流体管は、次のもの：流体管と流体連通しており、当該インライン緩衝液調節リザーバ（複数可）内に貯蔵されている緩衝液が流体管内に存在する流体に加えられるように位置している１つまたはそれ以上のインライン緩衝液調節リザーバ；流体管と流体連通しており、ＭＣＣＳ２中に容易に供給することができない、流体管内に存在するあらゆる過剰の流体を保持することができるように位置している停留タンク（例えば、本明細書に記載の停留タンク（複数可）のいずれか）；ならびに流体管内に存在する流体をろ過する（例えば、細菌を除去する）ことができるように流体管内に配置された１つまたはそれ以上のフィルターの１つまたはそれ以上を任意の組合せで
さらに含むことができる。インライン緩衝液調節リザーバのいずれも、例えば、約０．５Ｌ〜５０Ｌの体積の緩衝液を（例えば、２５℃、１５℃、または１０℃以下の温度で）含むことができる。
【０２０８】
本明細書に記載のシステムは場合により、ＭＣＣＳ２内の最終のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜と出口との間に配置された流体管を含むことができる。本明細書に記載のシステムは、ＭＣＣＳ２内の最終のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜と出口との間に配置された流体管と流体接続している１つまたはそれ以上のフィルターをさらに含むことができ、その結果このフィルターはＭＣＣＳ２内の最終のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜と出口との間に配置された流体管中に存在する流体から、例えば沈殿した物質、微粒子状物質、または細菌を除去することができる。
【０２０９】
本明細書に提供されるシステムのいくつかの例はまた、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１の入口と流体連通しているバイオリアクターも含む。本明細書に記載または当技術分野で公知の代表的なバイオリアクターのいずれも本システムに使用することができる。
【０２１０】
本明細書に提供されるシステムのいくつかの例はまたポンプシステムも含む。ポンプシステムは１つまたはそれ以上の次のもの：１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のポンプ（例えば、本明細書に記載または当技術分野で公知のポンプのいずれか）、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、または５つ）のフィルター（例えば、本明細書に記載または当技術分野で公知のフィルターのいずれか）、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のＵＶ検出器、および１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、または５つ）の停留タンク（例えば、本明細書に記載の停留タンクのいずれか）を含むことができる。本明細書に提供されるシステムのいくつかの例は、ポンプとＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１の入口との間に配置された流体管（例えば、本明細書に記載または当技術分野で公知の代表的な流体管のいずれか）をさらに含む。いくつかの例において、この特定の流体管は１つまたはそれ以上（例えば、２、３、または４つ）のポンプ（例えば、本明細書に記載または当技術分野で公知のポンプのいずれか）および／または１つまたはそれ以上（例えば、２、３、または４つ）の停留タンク（例えば、本明細書に記載の代表的な停留タンクのいずれか）を含むことができ、ここでこれらのポンプ（複数可）および／または停留タンク（複数可）は流体管内に存在する流体と流体接続している。
【０２１１】
本明細書に記載のシステムのいくつかの例は、ポンプと入口との間で流体管に連結されたさらなる流体管をさらに含み、このさらなる流体管の一端はバイオリアクターに流体接続し、他端はポンプと入口との間の流体管と流体接続する。このさらなる流体管は、バイオリアクターから除去された液体培養培地から細胞を除去することができるフィルター（例えば、ＡＴＦ細胞保持システム）を含むことができる。
【０２１２】
本明細書に提供されるシステムによって、精製された組換えタンパク質（例えば、治療用タンパク質原薬）の連続的な生産が可能になる。当技術分野で公知のように、本システムにより、精製された組換えタンパク質（例えば、治療用タンパク質原薬）の定期的な溶出が可能になり得る。本明細書に記載のシステムはまた、少なくとも約５日、少なくとも約１０日、少なくとも約１５日、少なくとも約２０日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約４０日、少なくとも約５０日、少なくとも約６０日、少なくとも約７０日、少なくとも約８０日、少なくとも約９０日、または少なくとも約１００日の連続的な期間にわたり、少なくとも約５ｇ／日、少なくとも約１０ｇ／日、少なくとも約１５ｇ／日、少なくとも約２０ｇ／日、少なくとも約３０ｇ／日、または少なくとも約４０ｇ／日の正味の収率の精製された組換えタンパク質（例えば、治療用タンパク質原薬）を
もたらし得る。
【０２１３】
実質的に乾燥したクロマトグラフィー樹脂の使用を含む、クロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減する方法
また、本明細書に、（ａ）実質的に乾燥したクロマトグラフィー樹脂を含む容器を、容器およびクロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射に曝露することを含む、クロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減する方法も提供される。これらの方法のいくつかの実施形態は、工程（ａ）に先立って、クロマトグラフィー樹脂を乾燥してクロマトグラフィー樹脂から液体を除去することをさらに含む。クロマトグラフィー樹脂の乾燥は加熱処理（例えば、オーブン）または乾燥器を用いて実行することができる。クロマトグラフィー樹脂を乾燥するための別の方法は当技術分野で公知である。
【０２１４】
本明細書に記載のガンマ線照射のための条件および線量のいずれもこれらの方法に使用することができる。例えば、ガンマ線照射の線量は約１５ｋＧｙ〜約４５ｋＧｙ（例えば、約２０ｋＧｙ〜約３０ｋＧｙ）であることができる。本明細書に記載の容器およびクロマトグラフィー樹脂のいずれもこれらの方法に使用することができる。例えば、容器は貯蔵容器またはクロマトグラフィーカラムであることができる。これらの方法におけるクロマトグラフィー樹脂はタンパク質リガンド（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）を含むことができる。いくつかの例において、クロマトグラフィー樹脂はアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（例えば、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル−エタノールアミン基を含むクロマトグラフィー樹脂）を含むことができる。いくつかの例において、クロマトグラフィー樹脂は物品（例えば、チップ、膜、またはカセット）の表面に共有結合される。いくつかの実施形態において、実質的に乾燥したクロマトグラフィー樹脂は有意な量の酸化防止剤も有意な量のキレート剤も含有しない。また、本明細書に記載の方法のいずれかにより生産される低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂も提供される。
【０２１５】
いくつかの例において、生産される低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂は約１×１０−８〜約１×１０−５の滅菌保証レベル（ＳＡＬ）（例えば、約１×１０−７〜約１×１０−６のＳＡＬ）を有する。生産される低減したクロマトグラフィー樹脂は：アニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、およびサイズ排除クロマトグラフィー樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂を含むことができる。いくつかの例において、生産される低減したクロマトグラフィー樹脂はタンパク質リガンド（例えば、プロテインＡ）を含むアフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む。いくつかの例において、生産される低減したクロマトグラフィー樹脂はアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（例えば、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル−エタノールアミン基を含むアニオン交換クロマトグラフィー樹脂）を含む。また、低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを作成する方法であって、本明細書に記載の方法のいずれかにより生産された低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂を準備すること；およびそのクロマトグラフィー樹脂を殺菌環境中で低減したバイオバーデンのカラムに充填することを含む、方法も提供される。また、本明細書に記載の方法のいずれかにより生産される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムも提供される。
【０２１６】
また、精製された組換えタンパク質を低減したバイオバーデンで製造するための一体化され、クローズドな、連続的な方法であって、（ａ）実質的に細胞を含まない、組換えタンパク質を含む液体培養培地を準備すること；および（ｂ）その液体培養培地を、本明細書に提供される方法のいずれかにより生産された少なくとも１つの低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを含むマルチカラムクロマトグラフィーシステ
ム（ＭＣＣＳ）中に連続的に供給すること：を含み、低減したバイオバーデンの緩衝液を利用し、一体化されており、液体培養培地から、精製された組換えタンパク質であるＭＣＣＳからの溶出液まで連続的に稼動する、方法も提供される。また、精製された組換えタンパク質を低減したバイオバーデンで製造するための一体化され、クローズドな、連続的な方法であって、（ａ）実質的に細胞を含まない、組換えタンパク質を含む液体培養培地を準備すること；（ｂ）その液体培養培地を第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）に連続的に供給すること；（ｃ）ＭＣＣＳ１を用いて液体培養培地中の組換えタンパク質を捕獲すること；（ｄ）組換えタンパク質を含むＭＣＣＳ１から溶出液を生成し、その溶出液を第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）に連続的に供給すること；および（ｅ）組換えタンパク質を溶出液からＭＣＣＳ２中に連続的に供給し、その後組換えタンパク質を溶出することにより精製された組換えタンパク質を生産すること：を含み、この方法は低減したバイオバーデンの緩衝液を利用し、一体化されており、液体培養培地から、精製された組換えタンパク質まで連続的に稼動し、ならびにＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内の少なくとも１つのカラムは本明細書に提供される方法のいずれかにより生産された低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを含有する、方法も提供される。本明細書に記載の精製された組換えタンパク質を低減したバイオバーデンで製造するための一体化され、クローズドな、連続的な方法の代表的な局面のいずれもこれらの方法に使用することができる。
【０２１７】
低減したバイオバーデンの膜、樹脂、コートされた材料、チップ、およびカセットを生産する方法
また、本明細書に、低減したバイオバーデンの膜、樹脂、コートされた材料、チップ、またはカセットを生産する方法であって、膜、樹脂、コートされた材料、チップ、またはカセット（例えば、セルロース−、アガロース−、もしくは糖をベースとする膜、樹脂、コートされた材料、チップ、もしくはカセット）；および少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む組成物を含む容器を、容器および膜、樹脂、コートされた材料、チップ、またはカセットのバイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射に曝露する：ことを含み、少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤は、その線量のガンマ線照射への曝露後膜、樹脂、コートされた材料、チップ、およびカセットに対する損傷を改善するのに充分な量で存在する、方法も提供される。いくつかの例において、カセットは樹脂を含有するカセット（例えば、本明細書に記載または当技術分野で公知の代表的な樹脂のいずれか）である。いくつかの実施形態において、膜、樹脂、コートされた材料、チップ、またはカセットはその表面の少なくとも１つまたは一部に共有結合したプロテインＡまたはプロテインＧリガンドを含む。いくつかの実施形態において、組成物は膜、樹脂、コートされた材料、チップ、またはカセット、ならびに少なくとも１種の酸化防止剤および／または少なくとも１種のキレート剤を含む液体を含む。本明細書に記載の酸化防止剤（複数可）および／またはキレート剤（複数可）の代表的な組合せおよび濃度のいずれもこれらの方法のいずれかで使用することができる。本明細書に記載の代表的な液体のいずれもこれらの方法のいずれかで使用することができる。いくつかの実施形態において、組成物は乾燥した材料である。また、本明細書に、本明細書に記載の方法のいずれかにより生産される低減したバイオバーデンの膜、樹脂、コートされた材料、チップ、またはカセットも提供される。いくつかの例において、容器は密閉された貯蔵容器または器である。
【０２１８】
また、本明細書に、実質的に乾燥した膜、樹脂、コートされた材料、チップ、またはカセット（例えば、セルロース−、アガロース−、または糖をベースとする膜、樹脂、コートされた材料、チップ、またはカセット）を含む容器を、容器および膜、樹脂、コートされた材料、チップ、またはカセットのバイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射に曝露する：ことを含む、低減したバイオバーデンの膜、樹脂、コートされた材料、チップ、およびカセットを生産する方法も提供される。いくつかの例は、曝露する工程
に先立って膜、樹脂、コートされた材料、チップ、またはカセットを乾燥する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、膜、樹脂、コートされた材料、チップ、またはカセットはその表面に共有結合しているプロテインＡまたはプロテインＧリガンドを含む。いくつかの例において、カセットは樹脂を含有するカセット（例えば、本明細書に記載または当技術分野で公知の代表的な樹脂のいずれか）である。また、本明細書に、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて生産される低減したバイオバーデンの膜、樹脂、コートされた材料、チップ、またはカセットも提供される。
【０２１９】
以下の実施例で本発明をさらに例証するが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０２２０】
いろいろなクロマトグラフィー樹脂の静的結合能力に対するガンマ線照射の効果
３つの異なるプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂：すなわち、ＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）（８５μｍの粒径、およびプロテインＡをアガロースに連結するエポキシ官能基を有する、高度に架橋したアガロース樹脂）、ＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３（〜５０μｍの粒径、およびプロテインＡをポリ−メタクリレートに連結するエポキシ官能基を有する多孔質ポリ−メタクリレート樹脂）、ならびにＫａｎｅｋａ  ＫａｎＣａｐ  Ａ（６５〜８５μｍの粒径、および還元的アミノ化を介してセルロースに結合されたプロテインＡを有する高度に架橋したセルロース）の静的結合能力に対するガンマ線照射の効果を試験するために一組の実験を実行した。３種の樹脂の各々を１５ｋＧｙのガンマ線照射で処理したが、Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）は２５ｋＧｙの放射線量で処理し、ＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂のコントロールサンプルは未処理のままとし、抗−ＴＧＦβ抗体（ＩｇＧ４）を装填し、溶出液中の抗−ＴＧＦβ抗体のレベルを決定した。この実施例での各々の樹脂のガンマ線照射は５０ｍＭホスフェート、ｐＨ７．０中で実行した。ガンマ線を照射した樹脂および未処理のコントロール樹脂の各々の静的結合曲線を図１に示す。これらのデータは、ガンマ線照射が３種の試験したプロテインＡクロマトグラフィー樹脂の各々の結合能力を低下させ、ＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ
Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂が１５ｋＧｙのガンマ線照射に応答して最も小さい結合能力の低下を示すことを示している。
【０２２１】
ＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂またはＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂のガンマ線照射の結果プロテインＡのクロマトグラフィー樹脂からの開裂（および放出）が起こるかどうかを決定するために次の実験を実行した。これらの実験において、ＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ
Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂またはＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂は３０ｋＧｙのガンマ線照射で処理した後、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって上澄み中のプロテインＡのレベルを決定した。この実験からのデータは、これらの２つの試験した樹脂のいずれもガンマ線照射処理の後殆どプロテインＡを放出しないことを示している（図２）。
【０２２２】
これらのデータは、ガンマ線照射の結果アフィニティークロマトグラフィー樹脂の結合能力が即時に低下すること、および結合能力のこのような損失は樹脂からのタンパク質リガンドの開裂に起因するのではないことを示している。
【実施例２】
【０２２３】
複数サイクルのクロマトグラフィーの間の樹脂の結合能力に対する複数のガンマ線照射
複数サイクルのクロマトグラフィーの間のクロマトグラフィー樹脂の結合能力に対するガンマ線照射の効果を試験するために次の一組の実験を実行した。これらの実験はＪＳＲ
ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂を用いて実行した。というのは、この樹脂が実施例１でガンマ線照射に応答して最少量の結合能力の損失を示したからである。この実施例における各々の樹脂のガンマ線照射は５０ｍＭホスフェート、ｐＨ７．０中で実行した。
【０２２４】
複数サイクルのクロマトグラフィーにわたってＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂の抗−ＴＧＦβ抗体（ＩｇＧ４）に結合する能力に対する１５ｋＧｙのガンマ線照射の効果を試験するために第１の実験を実行した。未処理のＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂も陽性のコントロールとして使用して複数サイクルのクロマトグラフィーを実行した。各々のサイクルの終了時に、樹脂を０．１ＮのＮａＯＨで洗浄した。各々のサイクルからの溶出液中の抗−ＴＧＦβ抗体の量を決定した。データは、１５ｋＧｙのガンマ線照射の結果、ＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂の結合能力は即時に（すなわち、第１のサイクルで）約２０％〜２５％低下するが、結合能力は複数の追加のサイクルのクロマトグラフィーにわたって非常に遅い割合で（すなわち、未処理の樹脂の結合能力の低下の割合に匹敵する割合で）低下するだけであることを示している（図３、６、および７）。
【０２２５】
１５ｋＧｙのガンマ線を照射したＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂の最初のサイクルのクロマトグラフィー後の結合能力の最小の低下も、これらの実験におけるサイクル７およびサイクル１１のクロマトグラフの比較から明らかである（図４および５）。これらの図は、未処理および１５ｋＧｙのガンマ線を照射したＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂の両方で、複数サイクルのクロマトグラフィーにわたってこれらの樹脂の結合能力の観察可能な変化があるとしても控えめなだけであることを示している。
【０２２６】
複数サイクルのクロマトグラフィーにわたる、未処理のまま、または２９ｋＧｙのガンマ線照射で処理したＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂の結合能力の変化を試験するために追加の実験を実行した。これらの実験では、各々のサイクルの終了時に樹脂を０．１ＮのＮａＯＨで洗浄し、各々のサイクルの開始時に樹脂に抗−αβＴＣＲモノクローナル抗体（ＩｇＧ１）を装填した。得られたデータは再び、未処理の樹脂と比較して、２９ｋＧｙのガンマ線を照射した樹脂の結合能力の約２０％〜２５％の最初の降下を示す（図８）。未処理および２９ｋＧｙのガンマ線を照射した樹脂の結合能力は複数の追加のサイクルのクロマトグラフィーの間（未処理および２９ｋＧｙのガンマ線を照射した樹脂に対してほぼ同じ割合で）控えめに低下したのみである（図８）。
【０２２７】
複数サイクルのクロマトグラフィーにわたって、未処理の、１５ｋＧｙのガンマ線を照射した、および２９ｋＧｙのガンマ線を照射したＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂の結合能力を試験するために最終の組の実験を実行した。各々のサイクルの終了時に樹脂を０．１ＮのＮａＯＨで洗浄し、樹脂にモノクローナル抗−ＴＧＦβ（ＩｇＧ４）抗体またはモノクローナル抗−αβＴＣＲ（ＩｇＧ１）抗体（ａｂＴＣＲ）のいずれかを装填した。データは、１５ｋＧｙおよび２９ｋＧｙのガンマ線照射による照射の結果ＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂の結合能力が実質的に同じレベルで低下すること、また、１５ｋＧｙおよび２９ｋＧｙのガンマ線を照射したＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ
Ａｍｓｐｈｅｒｅ  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３樹脂の結合能力のレベルが複数サイクルのクロマトグラフィーにわたって未処理の樹脂と同じ割合で控えめに低下すること（図９）を示している。
【０２２８】
これらのデータは、タンパク質リガンドを有するクロマトグラフィー樹脂のガンマ線照射の結果結合能力が即時に低下すること、また、結合能力の損失が複数ラウンドのクロマトグラフィーにわたって比較的に安定なままであることを示している。これらのデータは、ガンマ線照射の結果ガンマ線照射中にクロマトグラフィー樹脂（例えば、アフィニティークロマトグラフィー樹脂のような、タンパク質またはペプチドリガンドを含有するクロマトグラフィー樹脂）に対して酸化的損傷が起こること、また、ガンマ線照射中のクロマトグラフィー樹脂（例えば、アフィニティークロマトグラフィー樹脂のような、タンパク質またはペプチドリガンドを含有するクロマトグラフィー樹脂）の結合能力の損失が少なくとも１種のキレート剤および／または酸化防止剤の存在下でクロマトグラフィー樹脂にガンマ線を照射することによって防止、改善、または低減することができるということを示唆している。
【実施例３】
【０２２９】
ＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂の結合能力に対するガンマ線照射の効果
複数サイクルのクロマトグラフィーの間の別のタンパク質リガンドクロマトグラフィー樹脂（ＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂）の結合能力に対するガンマ線照射の効果を決定するために一組の実験を実行した。樹脂を５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中に交換した後、３０ｍＬのＮａｌｇｅｎｅボトル内で２９ｋＧｙのガンマ線照射により処理した。次いで、樹脂を直径０．６６ｃｍ、床高さ３ｃｍのカラム（１ｍＬカラム）に充填した。その後このカラムを、複数サイクルのクロマトグラフィーにわたって細胞培養培地中のモノクローナルＩｇＧ１抗体を捕獲するのに使用した。未処理のＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂も陽性のコントロールとして使用して複数のサイクルのクロマトグラフィーを実行した。各々のサイクルの終了時に、樹脂を０．１ＮのＮａＯＨで洗浄した。各々のサイクルからの溶出液中のＩｇＧ１の量を決定した。データは、２９ｋＧｙのガンマ線照射の結果ＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂の結合能力が即時に（すなわち、第１のサイクルで）約２５％〜約３０％低下したことを示している。（図１１および１２）。第１のサイクルのクロマトグラフィーの後、２９ｋＧｙのガンマ線を照射したＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂は複数の追加のサイクルのクロマトグラフィーにわたり結合能力の非常に遅い割合（すなわち、複数のクロマトグラフィーサイクルの間の未処理の樹脂の結合能力の低下の割合に匹敵する割合）の低下を示したのみである（図１１および１２）。これらのデータは実施例２に記載したＪＳＲプロテインＡ樹脂に対して得られたデータと同様であり、ガンマ線照射に起因する樹脂結合能力の損失の機構は類似であるように見える。
【実施例４】
【０２３０】
ＭＡｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）ＬＸ樹脂の静的結合能力に対するガンマ線照射の効果
実施例１に記載したデータは、ガンマ線照射が３つの異なるプロテインＡクロマトグラフィー樹脂（ＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）、ＪＳＲ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｍｓｐｈｅｒｅ（商標）  ＰｒｏＡ  ＪＷＴ２０３、およびＫａｎｅｋａ
ＫａｎＣａｐＡ（商標））の静的結合能力を低下させることを示している。ガンマ線照射を別のプロテインＡクロマトグラフィー樹脂：ＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）ＬＸで試験した。ＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）ＬＸ樹脂はアガロース骨格およびＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂と同様なプロテインＡリガンドを有しているが、Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂と比較してそれより高いリガンド密度を有する。樹脂緩衝液を２０％エタノールから５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０に交換した後、２９ｋＧｙのガンマ線照射に供した。樹脂の静的結合は実施例１に記載したように決定した（但し、樹脂の静的結合能力はガンマ線照射の前後に決定した）。データは、ガンマ線照射の後樹脂の静的結合能力の同様な降下を示す（図
１３）。このＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）ＬＸ樹脂の静的結合能力のガンマ線照射で誘発された低下は、実施例１で試験したガンマ線照射後の３つのプロテインＡクロマトグラフィー樹脂で観察された静的結合能力の降下と同様である（図１）。図１３のデータは、Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）ＬＸのガンマ線照射の結果樹脂の静的結合能力が即時に低下することを示している。
【実施例５】
【０２３１】
クロマトグラフィー樹脂の結合能力のガンマ線照射で誘発される低下の低減
先の実施例のデータは、樹脂のバイオバーデンを低減する線量でのクロマトグラフィー樹脂のガンマ線照射が、樹脂の結合能力の降下：すなわち、コントロールの未処理樹脂の結合能力と比較して約２０％〜約４０％の樹脂の結合能力の低下も起こすことを示している。ガンマ線照射により引き起こされる結合能力の低下の程度は樹脂に結合したプロテインＡリガンドおよび／または樹脂のビーズ化学に依存するようには見えない。この追加の組の実験は、ガンマ線照射の間に起こるクロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を防止する緩衝溶液を確認するために実行した。これらの実験でＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）ＬＸをクロマトグラフィー樹脂として使用した。ＧＥ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）ＬＸは各々のビーズの多孔質マトリクス上に共有結合的に固定化されたプロテインＡを有する。この樹脂は最初に２０％エタノールから１つまたはそれ以上の酸化防止剤を含む異なる緩衝液または酸化防止剤を含まないコントロールの緩衝液に緩衝液を交換した。試験した緩衝溶液を下記表１に示す。コントロール実験では、酸化防止剤の不在下で乾燥した組成物として樹脂にガンマ線を照射した。これらの樹脂サンプルを、含水率がガンマ線照射の間最小になるように２３℃のオーブンで２日間乾燥した。表１に示した各々の樹脂サンプルに３０ｍＬのＮａｌｇｅｎｅボトル内で２９ｋＧｙの線量のガンマ線を照射した。実施例１に記載した方法を用いてガンマ線を照射した樹脂サンプルおよび未処理の（非照射の）樹脂サンプルに対して静的結合能力を決定した。
【０２３２】
【表１】
2019215352.tif 000002
【０２３３】
データは、１種またはそれ以上の酸化防止剤の存在下でクロマトグラフィー樹脂をガンマ線照射するとガンマ線照射により引き起こされる結合能力の損失を減少させることを示している（図１４および表２）。２５ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、２５ｍＭメチオニン、２５ｍＭマンニトール、２５ｍＭヒスチジン、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０の緩衝液（以後「ＳＭＭＨ」緩衝液という）は樹脂の結合能力のガンマ線照射で誘発される損失を完全に軽減した（すなわち、未処理のコントロール樹脂と、ＳＭＭＨ緩衝液の存在下で２９ｋＧｙの線量のガンマ線を照射した樹脂との間には結合能力の損失が全く観察されなかった）（図１４および表２）。２９−ｋＧｙのガンマ線を照射した乾燥樹脂サンプルは未処理の樹脂サンプルと同じ結合能力を有していた。これらのデータは、乾燥したクロマトグラフィー樹脂のガンマ線照射が樹脂の結合能力のガンマ線照射で誘発される損失の程度を減少させる別の手段であることを示している。
【０２３４】
【表２】
2019215352.tif 000003
【０２３５】
複数のクロマトグラフィーサイクルにわたるＳＭＭＨ緩衝液の存在下で２９ｋＧｙの線量でガンマ線を照射した樹脂および未処理の樹脂の性能を試験するためにさらなる実験を実行した。各々の試験した樹脂を０．６６−ｃｍの直径、３−ｃｍの高さのカラムに充填した。カラムにモノクローナルＩｇＧ１抗体を含有する細胞培養培地を装填した。静的結合能力実験で観察されたように（図１４）、動的結合能力は全てのサイクルの間未処理の樹脂と、ＳＭＭＨ緩衝液の存在下で２９ｋＧｙの線量のガンマ線を照射した樹脂とで匹敵していた（図１５および１６）。加えて、他の重要な品質およびプロセス性能指標：サイズ排除クロマトグラフィー−高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）で測定
される高分子量化学種の割合および溶出液中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の濃度も匹敵していた（表３）。図１７は、未処理の樹脂およびＳＭＭＨ緩衝液の存在下で２９ｋＧｙの線量のガンマ線を照射した樹脂からの複数のサイクルにわたる溶出液の匹敵する純度を示す非変性ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルである。
【０２３６】
【表３】
2019215352.tif 000004
【０２３７】
クロマトグラフィー樹脂の結合能力のガンマ線照射で誘発される損失を低減する能力について追加の緩衝溶液を試験した。これらの実験では、単一のクロマトグラフィーサイクルを実行して結合能力を動的モードで決定した。各々の試験した緩衝液について、上記と同様なカラム（０．６６−ｃｍ直径×３−ｃｍ高さ）に充填し、モノクローナルＩｇＧ１を含有する細胞培養培地を装填した。静的結合能力実験で観察されたように（図１４）、少なくとも１種の酸化防止剤を含有する各々の緩衝液はガンマ線照射により引き起こされる樹脂の結合能力の損失を低減した（表４）。これらのデータは、少なくとも１種の酸化防止剤の存在がガンマ線照射により引き起こされる樹脂の結合能力の損失を低減することができるということを示している。加えて、これらのデータはまた、（酸化還元活性金属に結合して反応性の酸素および窒素種を生成するのを防止する）キレート剤もまたガンマ線照射により引き起こされる樹脂の結合能力の損失を減少させることができるということも示唆している。
【０２３８】
【表４】
2019215352.tif 000005
【０２３９】
概して、これらのデータは、少なくとも１種の酸化防止剤および／または少なくとも１種のキレート剤の存在下でのクロマトグラフィー樹脂のガンマ線照射が、ガンマ線照射により引き起こされる樹脂の結合能力の損失を減少させることができるということを示唆している。データはまた、少なくとも１種の酸化防止剤および／または少なくとも１種のキレート剤の存在が、固定化されたプロテインＡリガンド、ならびに樹脂ベースマトリクスを、ガンマ線照射中に形成されるフリーラジカルにより引き起こされる損傷から保護することも示唆している。少なくとも１種の酸化防止剤および／または少なくとも１種のキレート剤の存在はまた、マトリクスおよび／または官能基に対して損傷を引き起こす可能性がある線量での材料のガンマ線照射を含む他のバイオプロセス用途にも使用することができる。例えば、少なくとも１種の酸化防止剤および／または少なくとも１種のキレート剤を含有する組成物は、セルロース膜およびその他のセルロース−、アガロース−、もしくは糖をベースとする樹脂、膜、または材料に対するガンマ線照射で誘発される損傷を防止するために使用することができる。
【０２４０】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に記載して来たが、以上の記載は説明することを意図したものであり、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではないことと理解されたい。他の局面、利点、および変更は以下の特許請求の範囲内に入る。
【図１】
2019215352.tif 000006
【図２】
2019215352.tif 000007
【図３】
2019215352.tif 000008
【図４】
2019215352.tif 000009
【図５】
2019215352.tif 000010
【図６】
2019215352.tif 000011
【図７】
2019215352.tif 000012
【図８】
2019215352.tif 000013
【図９】
2019215352.tif 000014
【図１０】
2019215352.tif 000015
【図１１】
2019215352.tif 000016
【図１２】
2019215352.tif 000017
【図１３】
2019215352.tif 000018
【図１４】
2019215352.tif 000019
【図１５】
2019215352.tif 000020
【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年7月19日(2019.7.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減する方法であって、
（ｉ）クロマトグラフィー樹脂ならびに（ｉｉ）少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤を含む液体を含む湿潤固体混合物を含む容器を、該容器および該クロマトグラフィー樹脂の該バイオバーデンを低減するのに充分な線量のガンマ線照射に曝露すること：を含み、該少なくとも１種の酸化防止剤および／またはキレート剤は、該線量のガンマ線照射への曝露後の該クロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を改善するのに充分な量で存在する、前記方法。
【請求項２】
曝露に先立って、湿潤固体混合物を容器中に配置することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
容器が貯蔵容器である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
容器がクロマトグラフィーカラムである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
液体が、還元グルタチオン、還元チオレドキシン、還元システイン、カロテノイド、メラトニン、リコピン、トコフェロール、還元ユビキノン、アスコルベート、ビリルビン、尿酸、リポ酸、フラボノイド、フェノールプロパノイド酸、リドカイン、ナリンゲニン、フラーレン、グルコース、マンニトール、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、およびジメチルメトキシクロマノール：からなる群から選択される少なくとも１種の酸化防止剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
液体が、マンニトール、アスコルビン酸ナトリウム、ヒスチジン、およびメチオニン：からなる群から選択される少なくとも１種の酸化防止剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
液体がマンニトール、アスコルビン酸ナトリウム、ヒスチジン、およびメチオニンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
液体が：
（ｉ）７５ｍＭ〜１２５ｍＭのマンニトール；
（ｉｉ）７５ｍＭ〜１２５ｍＭのメチオニン；
（ｉｉｉ）７５ｍＭ〜１２５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム；
（ｉｖ）７５ｍＭ〜１２５ｍＭのヒスチジン；
（ｖ）３０ｍＭ〜７０ｍＭのメチオニンおよび３０ｍＭ〜７０ｍＭのヒスチジン；
（ｖｉ）１０ｍＭ〜５０ｍＭのメチオニン、１０ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、および１０ｍＭ〜５０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム；または
（ｖｉｉ）５ｍＭ〜４５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、５ｍＭ〜４５ｍＭのメチオニン、５ｍＭ〜４５ｍＭのマンニトール、および５ｍＭ〜４５ｍＭのヒスチジン
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
液体が緩衝溶液である、請求項１または８に記載の方法。
【請求項１０】
液体が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム（ＤＭＰＳ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、メタロチオネイン、およびデスフェロキサミン：からなる群から選択される少なくとも１種のキレート剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
湿潤固体混合物が、アニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、およびサイズ排除クロマトグラフィー樹脂：からなる群から選択される少なくとも１種のクロマトグラフィー樹脂を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
湿潤固体混合物が、タンパク質リガンドを含むアフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質リガンドがプロテインＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
湿潤固体混合物がアニオン交換クロマトグラフィー樹脂を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
アニオン交換クロマトグラフィー樹脂がＮ−ベンジル−Ｎ−メチル−エタノールアミン基を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
線量が１５ｋＧｙ〜４５ｋＧｙである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
線量が２０ｋＧｙ〜３０ｋＧｙである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
線量が２３ｋＧｙ〜２７ｋＧｙである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
曝露が、−２５℃〜０℃（両端を含む）の温度で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
曝露が、０℃〜２５℃（両端を含む）の温度で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
請求項３に記載の方法により生産される低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２２】
１×１０-8〜１×１０-5の滅菌保証レベル（ＳＡＬ）を有する、請求項２１に記載の低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２３】
１×１０-7〜１×１０-6の滅菌保証レベル（ＳＡＬ）を有する、請求項２２に記載の低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２４】
アニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、およびサイズ排除クロマトグラフィー樹脂：からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂を含む、請求項２１に記載の低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２５】
タンパク質リガンドを含むアフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む、請求項２４に記載の低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２６】
タンパク質リガンドがプロテインＡである、請求項２５に記載の低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２７】
アニオン交換クロマトグラフィー樹脂を含む、請求項２４に記載の低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２８】
アニオン交換クロマトグラフィー樹脂がＮ−ベンジル−Ｎ−メチル−エタノールアミン基を含む、請求項２７に記載の低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂。
【請求項２９】
低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラムを作成する方法であって、
請求項２１に記載の低減したバイオバーデンのクロマトグラフィー樹脂を準備すること；および
該クロマトグラフィー樹脂を殺菌環境中で低減したバイオバーデンのカラムに充填すること：
を含む、前記方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法により生産される低減したバイオバーデンの充填されたクロマトラフィーカラム。
【請求項３１】
充填されたカラム内の樹脂が、１×１０-8〜１×１０-5の滅菌保証レベル（ＳＡＬ）を有する、請求項３０に記載の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム。
【請求項３２】
樹脂が１×１０-7〜１×１０-6の滅菌保証レベル（ＳＡＬ）を有する、請求項３１に記載の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム。
【請求項３３】
充填されたカラム内の樹脂が、アニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、およびサイズ排除クロマトグラフィー樹脂：からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂を含む、請求項３０に記載の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム。
【請求項３４】
樹脂が、タンパク質リガンドを含むアフィニティーまたは擬似アフィニティークロマトグラフィー樹脂を含む、請求項３３に記載の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム。
【請求項３５】
リガンドがプロテインＡである、請求項３４に記載の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム。
【請求項３６】
樹脂がアニオン交換クロマトグラフィー樹脂を含む、請求項３３に記載の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム。
【請求項３７】
アニオン交換クロマトグラフィー樹脂がＮ−ベンジル−Ｎ−メチル−エタノールアミン基を含む、請求項３６に記載の低減したバイオバーデンの充填されたクロマトグラフィーカラム。
【外国語明細書】
2019215352000001.pdf