(57)【要約】【課題】基材へ所望の性質を付与する改質剤、基材に抗菌性を付与する抗菌剤、および、基材に抗菌性が付与されてなる抗菌性材料を提供する。【解決手段】本発明の抗菌剤は、分解酵素が結合しているＬ２タンパク質を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材の性質を改変するための改質剤であって、
機能性物質が結合しているＬ２タンパク質を含んでおり、
上記基材は、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、酸化銅、酸化チタン、酸化ニッケル、酸化亜鉛、酸化ジルコニウム、ステンレス、またはセルロースを含んでいるものである、改質剤。
【請求項２】
基材の性質を改変するための改質剤であって、
機能性物質が結合している、バシラス属細菌または大腸菌に由来するＬ２タンパク質を含んでおり、
上記基材は、リン酸カルシウムを含んでいるものである、改質剤。
【請求項３】
基材に抗菌性を付与するための抗菌剤であって、
分解酵素が結合しているＬ２タンパク質を含んでおり、
上記基材は、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、酸化銅、酸化チタン、酸化ニッケル、酸化亜鉛、酸化ジルコニウム、ステンレス、またはセルロースを含んでいるものである、抗菌剤。
【請求項４】
基材に抗菌性を付与するための抗菌剤であって、
分解酵素が結合している、バシラス属細菌または大腸菌に由来するＬ２タンパク質を含んでおり、
上記基材は、リン酸カルシウムを含んでいるものである、抗菌剤。
【請求項５】
上記分解酵素は、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ポリサッカラーゼ、またはリパーゼである、請求項３または４に記載の抗菌剤。
【請求項６】
請求項３〜５の何れか１項に記載の抗菌剤が、上記基材に吸着している、抗菌性材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改質剤、抗菌剤および抗菌性材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、基材の表面に、様々な性質を付与するための技術が求められている。基材の表面に付与される性質として、例えば、微生物からなる膜上物質（以降、バイオフィルムと称する）が基材上に形成されることを防ぐ性質が挙げられる。
【０００３】
バイオフィルムは、人体における感染症の原因となる。そのため、近年、基材の表面上におけるバイオフィルムの形成を防ぐための研究が急速に進められている。例えば、特許文献１には、バイオフィルムの形成を抑制するバイオフィルム抑制剤が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−２４５１８７号公報（２０１３年１２月９日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、基材の表面に様々な性質を付与する従来の技術には改良の余地が多く残されており、新たな技術の開発が求められていた。
【０００６】
本発明の態様は、基材へ所望の性質を付与する改質剤、基材に抗菌性を付与する抗菌剤、および、基材に抗菌性が付与されてなる抗菌性材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の改質剤は、基材の性質を改変するための改質剤であって、機能性物質が結合しているＬ２タンパク質を含んでおり、上記基材は、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、酸化銅、酸化チタン、酸化ニッケル、酸化亜鉛、酸化ジルコニウム、ステンレス、またはセルロースを含んでいるものである。
【０００８】
本発明の改質剤は、基材の性質を改変するための改質剤であって、機能性物質が結合している、バシラス属細菌または大腸菌に由来するＬ２タンパク質を含んでおり、上記基材は、リン酸カルシウムを含んでいるものである。
【０００９】
本発明の抗菌剤は、基材に抗菌性を付与するための抗菌剤であって、分解酵素が結合しているＬ２タンパク質を含んでおり、上記基材は、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、酸化銅、酸化チタン、酸化ニッケル、酸化亜鉛、酸化ジルコニウム、ステンレス、またはセルロースを含んでいるものである。
【００１０】
本発明の抗菌剤は、基材に抗菌性を付与するための抗菌剤であって、分解酵素が結合している、バシラス属細菌または大腸菌に由来するＬ２タンパク質を含んでおり、上記基材は、リン酸カルシウムを含んでいるものである。
【００１１】
本発明の抗菌剤では、上記分解酵素は、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ポリサッカラーゼ、またはリパーゼであることが好ましい。
【００１２】
本発明の抗菌性材料は、上記抗菌剤が上記基材に吸着している、抗菌性材料であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の一実施形態に係る改質剤によれば、所望の性質が付与された基材を作製することができる。
【００１４】
本発明の一実施形態に係る抗菌剤によれば、抗菌性が付与された基材を得ることができる。当該基材は、基材の表面上にバイオフィルムが形成されることを防ぐことができる。
【００１５】
本発明の一実施形態に係る抗菌性材料よれば、バイオフィルムの形成を防ぐ性質を備える医療用材料を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｌ２タンパク質の粒子への結合結果を示す電気泳動像である。
【図２】Ｌ２タンパク質の粒子への結合結果を示す電気泳動像である。
【図３】Ｌ２タンパク質の粒子への結合結果を示す電気泳動像である。
【図４】Ｌ２タンパク質の粒子への結合結果を示す電気泳動像である。
【図５】Ｌ２タンパク質の粒子への結合結果を示す電気泳動像である。
【図６】カバーガラス上に形成されたバイオフィルムを形成する細菌を示す顕微鏡像である。
【図７】カバーガラス上に形成されたバイオフィルムを形成する細菌を示す顕微鏡像である。
【図８】バイオフィルムの形成量を定量した結果を示すグラフである。
【図９】プロテアーゼの活性を定量した結果を示すグラフである。
【図１０】プロテアーゼ活性を定量した結果を示すグラフである。
【図１１】カバーガラス上に形成されたバイオフィルムを形成する細菌を示す顕微鏡像である。
【図１２】プロテアーゼの活性を定量した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の一実施形態について、詳細に説明する。なお、本発明は、以下に説示する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００１８】
本明細書において、「Ａ〜Ｂ」は「Ａ以上Ｂ以下」を意図するものとする。また、本明細書において、「タンパク質」は、「ポリペプチド」と交換可能に使用される。
【００１９】
＜１．改質剤＞
本実施の形態の改質剤は、基材の性質を改変するための改質剤であって、機能性物質が結合しているＬ２タンパク質を含んでおり、上記基材は、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、酸化銅、酸化チタン、酸化ニッケル、酸化亜鉛、酸化ジルコニウム、ステンレス、またはセルロースを含んでいるものである。本実施の形態では、Ｌ２タンパク質が由来する生物は、限定されない。
【００２０】
また、本実施の形態の改質剤は、基材の性質を改変するための改質剤であって、機能性物質が結合している、バシラス属細菌または大腸菌に由来するＬ２タンパク質（バシラス属細菌または大腸菌に由来するＬ２タンパク質の変異タンパク質も包含される）を含んでおり、上記基材は、リン酸カルシウムを含んでいるものである。本実施の形態では、Ｌ２タンパク質が由来する生物は、バシラス属細菌または大腸菌である。
【００２１】
Ｌ２タンパク質は、上記基材に対する結合能力を有している。一方、機能性物質は、様々な機能を発現する物質である。機能性物質が結合しているＬ２タンパク質（換言すれば、機能性物質とＬ２タンパク質との複合体）は、Ｌ２タンパク質を介して基材に結合し、当該基材の近傍に機能性物質を保持することができる。その結果、所望の性質が付与された基材を作製することができる。
【００２２】
本明細書において、「改質剤」とは、「基材の性質を、所望の性質へ改変する機能を有する組成物」を意図する。なお、「所望の性質」としては、特に限定されず、抗菌性、防汚性、接着性、抗ＵＶ性、滑り性、濡れ性、撥水性、撥油性、および、保湿性を挙げることができる。それ故に、当該「改質剤」は、より具体的に、抗菌剤、防汚剤、接着剤、抗ＵＶ剤、撥水剤、撥油剤、または、保湿剤であり得る。
【００２３】
上記改質剤には、上記Ｌ２タンパク質が含まれる。上記Ｌ２タンパク質は、リボソームＬ２タンパク質（例えば、原核生物に由来するリボソームＬ２タンパク質）を意図する。ここで、原核生物として、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）等を挙げることができる。上記ポリペプチドのうち、Escherichia coli由来のＬ２タンパク質の全長のアミノ酸配列を配列番号１にて示す。また、Bacillus subtilis由来のＬ２タンパク質の全長のアミノ酸配列を配列番号２にて示す。さらに、Lactobacillus plantarum由来のＬ２タンパク質の全長のアミノ酸配列を配列番号３にて示す。
【００２４】
Ｌ２タンパク質の具体的な構成（換言すれば、アミノ酸配列）は、特に限定されない。Ｌ２タンパク質は、例えば、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含んでいるものであり得るが、本発明は、これらに限定されない；
（ａ）配列番号１、２または３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１、２または３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、上記基材に対する結合能を有するポリペプチド。
【００２５】
上記（ｂ）に記載のポリペプチドには、例えば、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により作製された変異型Ｌ２タンパク質、および、異なる生物種に由来する野生型Ｌ２タンパク質が包含され得る。
【００２６】
配列番号１と配列番号２とを比較すると、アミノ酸配列の同一性（Identity）は５８．５％であり、アミノ酸配列の相同性（Similarity）は７３．６％である。このとき、配列番号１と配列番号２とでは、１１５個のアミノ酸が異なっている。
【００２７】
配列番号１と配列番号３とを比較すると、アミノ酸配列の同一性は５７．０％であり、アミノ酸配列の相同性は７１．７％である。このとき、配列番号１と配列番号３とでは、１２０個のアミノ酸が異なっている。
【００２８】
配列番号２と配列番号３とを比較すると、アミノ酸配列の同一性は７２．４％であり、アミノ酸配列の相同性は８３．２％である。このとき、配列番号２と配列番号３とでは、７７個のアミノ酸が異なっている。
【００２９】
上記（ｂ）に記載のポリペプチドにおいて、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された」とは、１２０個以下、好ましくは１１０個以下、より好ましくは１００個以下、より好ましくは９０個以下、より好ましくは８０個以下、より好ましくは７０個以下、より好ましくは６０個以下、より好ましくは５０個以下、より好ましくは４０個以下、より好ましくは３０個以下、より好ましくは２０個以下、最も好ましくは１０個以下（例えば、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または、１個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。
【００３０】
また、上記（ｂ）に記載のポリペプチドは、配列番号１、２または３に記載のアミノ酸配列と、５０％以上、好ましくは６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、上記基材に対する結合能を有するポリペプチドであってもよい。
【００３１】
なお、アミノ酸配列の同一性は、公知の方法で求めることができる。具体的には、GＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（株式会社ゼネティックス社製）を、GＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮのマニュアルに従って使用し、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列と比較対象のアミノ酸配列とのホモロジーサーチ（ｈｏｍｏｌｏgｙ  ｓｅａｒｃｈ）を行い、一致するアミノ酸配列の割合（％）として同一性を算出することができる。
【００３２】
このような変異ペプチドは、公知の方法によって人為的に導入された変異を有するペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００３３】
ペプチド中のいくつかのアミノ酸が、このペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のペプチドにおいて、当該ペプチドの構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００３４】
本実施の形態に用いるＬ２タンパク質は、上述したポリペプチド（換言すれば、配列番号１〜３に示される）のみからなるものであってもよいし、上述したポリペプチド以外の部分を含むものであってもよい。
【００３５】
上述したポリペプチド以外の部分に対応するペプチドのアミノ酸配列および長さは特に限定されず、適宜、所望のアミノ酸配列および長さであり得る。上述したポリペプチド以外の部分に対応するペプチドは、例えば、５〜１０個のアミノ酸、５〜１５個のアミノ酸、５〜２０個のアミノ酸、５〜３０個のアミノ酸、５〜４０個のアミノ酸、または、５〜５０個のアミノ酸からなるペプチドであり得る。
【００３６】
本実施の形態に用いるポリペプチドは、当該分野において公知の任意の手法に従って容易に作製することができ、上記手法としては、例えば、化学合成、または組換え発現が挙げられる。化学合成法としては、固相法または液相法を挙げることができる。固相法において、例えば、市販の各種ペプチド合成装置（Ｍｏｄｅｌ  ＭｕｌｔｉＰｅｐ  ＲＳ（Ｉｎｔａｖｉｓ  ＡG）など）を利用することができる。また、組換え発現の手法としては、公知の遺伝子組換え技術により、上記Ｌ２タンパク質をコードする遺伝子と、上記分解酵素をコードする遺伝子とを微生物等に組換え、遺伝子組換え生物を作製する手法が挙げられる。
【００３７】
本明細書中において、「基材に対する結合能を有するポリペプチド」とは、「基材（後述）へ結合し、かつ結合状態を維持する能力を有するポリペプチド」を意図する。また、「基材に対する結合能を有するポリペプチド」であるか否かは、過剰量の基材（例えば、ポリペプチドの１００倍の質量の基材）とポリペプチドとを、室温にて３０分間接触させて、当該基材に結合するポリペプチドの量を測定することによって調べることができる。例えば、全ポリペプチドの好ましくは５％以上、更に好ましくは１０％以上、更に好ましくは３０％以上、更に好ましくは５０％以上、更に好ましくは７０％以上、最も好ましくは９０％以上が基材に結合することができれば、当該ポリペプチドは、基材に対する結合能を有すると判定することができる。なお、全ポリペプチドの何％が基材に結合したかは、電気泳動上のポリペプチドに対応するバンドの濃さを確認すること等によって算出することができる。
【００３８】
上記Ｌ２タンパク質には、機能性物質が結合している。本明細書において、「機能性物質」とは、「基材の性質を所望の性質へ改変する機能を有する成分」を意図する。
【００３９】
上記機能性物質としては、基材の性質を所望の性質へ改変する機能を有する物質であれば特に限定されず、例えば、ペプチド、低分子化合物および高分子化合物等が挙げられる。
【００４０】
上記機能性物質としては、より具体的に、後述する分解酵素、修復酵素、結合酵素、親水性タンパク質、および、疎水性タンパク質を挙げることができる。ただし、改質剤に与える「所望の性質」に応じて機能性物質を変更することが可能であって、機能性物質は、限定されない。
【００４１】
上記機能性物質と上記Ｌ２結合タンパク質とを結合させる手段としては、特に限定されず、公知の手法を用いることが可能である。上記手法としては、例えば、上記機能性物質と、上記Ｌ２結合タンパク質とを、周知の架橋剤によって連結させる手法を挙げることができる。また、上記機能性物質がペプチドである場合は、上記機能性物質と上記Ｌ２結合タンパク質とを、１つの融合タンパク質として作製してもよい。
【００４２】
上記基材は、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、酸化銅、酸化チタン、酸化ニッケル、酸化亜鉛、酸化ジルコニウム、ステンレス、またはセルロースを含むものであり得る。当該実施形態の場合、用いられるＬ２タンパク質は、限定されない。
【００４３】
上記基材は、リン酸カルシウムを含むものであり得る。当該実施形態の場合、用いられるＬ２タンパク質は、バシラス属細菌または大腸菌に由来するＬ２タンパク質（バシラス属細菌または大腸菌に由来するＬ２タンパク質の変異タンパク質も包含される）であり得る。
【００４４】
基材の性質をより容易に改変させるという観点から（より具体的に、Ｌ２タンパク質との吸着力がより高いという観点から）、上記基材は、上述した材料の中でも、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化ジルコニウム、または、ステンレスを含むものであることが好ましい。上記基材は、上述した材料を１つ、または複数含んでいるものであってもよい。
【００４５】
上記基材の形状としては、当該基材へ上記改質剤（換言すれば、上記機能性物質）が結合するために十分な表面積を有しているものであれば特に限定されず、例えば、シート状、粒子状、ポーラス状、または、針状であっても良い。
【００４６】
上記改質剤は、上記機能性物質が結合しているＬ２タンパク質以外に、他の成分を含んでいても良い。上記成分としては、上記機能性物質、上記Ｌ２タンパク質、または上記機能性物質が結合しているＬ２タンパク質の有する能力へ影響を与えることが無ければ、限定されない。上記成分として、例えば、緩衝剤、プロテアーゼ阻害剤、安定化剤、界面活性剤、および、塩類等が挙げられる。
【００４７】
本実施の形態の改質剤に含有されている「機能性物質が結合しているＬ２タンパク質」の量は、特に限定されず、例えば、改質剤を１００重量％とした場合に、０．００１重量％〜１００重量％であってもよく、０．０１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜９５重量％であってもよく、０．１重量％〜９０重量％であってもよく、０．１重量％〜８０重量％であってもよく、０．１重量％〜７０重量％であってもよく、０．１重量％〜６０重量％であってもよく、０．１重量％〜５０重量％であってもよく、０．１重量％〜４０重量％であってもよく、０．１重量％〜３０重量％であってもよく、０．１重量％〜２０重量％であってもよく、０．１重量％〜１０重量％であってもよい。
【００４８】
本実施の形態の改質剤に含有されている「機能性物質が結合しているＬ２タンパク質以外の成分」の量は、特に限定されず、例えば、改質剤を１００重量％とした場合に、０重量％〜９９．９９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５重量％〜９９．９重量％であってもよく、１０重量％〜９９．９重量％であってもよく、２０重量％〜９９．９重量％であってもよく、３０重量％〜９９．９重量％であってもよく、４０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５０重量％〜９９．９重量％であってもよく、６０重量％〜９９．９重量％であってもよく、７０重量％〜９９．９重量％であってもよく、８０重量％〜９９．９重量％であってもよく、９０重量％〜９９．９重量％であってもよい。
【００４９】
上記改質剤を、上記基材へ接触させる方法としては特に限定されず、例えば、噴霧や塗布、または、滴下等が挙げられる。
【００５０】
＜２．抗菌剤＞
本実施の形態の抗菌剤は、基材に抗菌性を付与するための抗菌剤であって、分解酵素が結合しているＬ２タンパク質を含んでおり、上記基材は、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、酸化銅、酸化チタン、酸化ニッケル、酸化亜鉛、酸化ジルコニウム、ステンレス、またはセルロースを含んでいるものである。
【００５１】
また、本実施の形態の抗菌剤は、基材に抗菌性を付与するための抗菌剤であって、分解酵素が結合している、バシラス属細菌または大腸菌に由来するＬ２タンパク質（バシラス属細菌または大腸菌に由来するＬ２タンパク質の変異タンパク質も包含される）を含んでおり、上記基材は、リン酸カルシウムを含んでいるものである。
【００５２】
Ｌ２タンパク質は、基材に対する結合能力を有している。一方、分解酵素は、菌の構成成分を分解する酵素である。分解酵素が結合しているＬ２タンパク質（換言すれば、分解酵素とＬ２タンパク質との複合体）は、Ｌ２タンパク質を介して基材に結合し、当該基材の近傍に分解酵素を保持することができる。その結果、抗菌性が付与された基材を得ることができる。そして、当該基材であれば、基材の表面上にバイオフィルムが形成されることを防ぐことができる。
【００５３】
本明細書において、「抗菌性」とは、「上記基材の表面上に、バイオフィルムが形成されることを防ぐ性質」を意図する。また、「バイオフィルム」とは、「フィルム状の細菌（例えば、黄色ブドウ球菌等）の集合体」を意図する。また、「抗菌剤」とは、「抗菌性を有する組成物」を意図する。
【００５４】
上記抗菌剤には、分解酵素が結合しているＬ２タンパク質が含まれる。なお、上記Ｌ２タンパク質、および、基材に対する結合能を有するポリペプチド等については、＜１．改質剤＞中に説明したため、ここではその説明を省略する。
【００５５】
上記Ｌ２タンパク質には、分解酵素が結合している。本明細書において、「分解酵素」とは、「バイオフィルムを分解する能力を有する酵素」を意図する。より具体的に、「分解酵素」とは、「バイオフィルム中の細菌の構成成分を分解することによって、バイオフィルムを分解する酵素」を意図する。
【００５６】
上記分解酵素としては、例えば、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ポリサッカラーゼ、および、リパーゼ等が挙げられる。
【００５７】
上記プロテアーゼとしては、例えば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、ニュートラルプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、および、酸性プロテアーゼ等が挙げられる。
【００５８】
上記ヌクレアーゼとしては、ＤＮａｓｅ、および、ＲＮａｓｅ等が挙げられる。
【００５９】
上記ポリサッカラーゼとしては、アルギナーゼ等が挙げられる。
【００６０】
上記基材に付与される抗菌性をより高めるという観点から、分解酵素は、上述したものの中でも、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、または、ポリサッカラーゼであることが好ましい。
【００６１】
上記分解酵素は、ヒトまたは動物由来のものであってもよいし、合成されたものまたは天然のものであってもよい。
【００６２】
上記分解酵素と上記Ｌ２結合タンパク質とを結合させる手段としては、特に限定されず、公知の手法を用いることが可能である。上記手法としては、例えば、上記分解酵素と、上記Ｌ２結合タンパク質とを、周知の架橋剤によって連結させる手法を挙げることができる。また、上記分解酵素と上記Ｌ２タンパク質とを、１つの融合タンパク質として作製してもよい。
【００６３】
また、上記Ｌ２タンパク質は、１つまたは複数の上記分解酵素と結合したものであってもよい。上記基材に対する抗菌性をより高めるという観点から、複数の分解酵素と結合したものであることが好ましい。
【００６４】
上記基材は、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、酸化銅、酸化チタン、酸化ニッケル、酸化亜鉛、酸化ジルコニウム、ステンレス、またはセルロースを含むものであり得る。当該実施形態の場合、用いられるＬ２タンパク質は、限定されない。
【００６５】
上記基材は、リン酸カルシウムを含むものであり得る。当該実施形態の場合、用いられるＬ２タンパク質は、バシラス属細菌または大腸菌に由来するＬ２タンパク質（バシラス属細菌または大腸菌に由来するＬ２タンパク質の変異タンパク質も包含される）であり得る。
【００６６】
上記基材へより高い抗菌性を与えるという観点から（より具体的に、Ｌ２タンパク質との吸着力がより高いという観点から）、上記基材は、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化ジルコニウム、ステンレスを含むものであることが好ましい。また上記基材は、上述した材料を１つ、または複数含んでいるものであってもよい。
【００６７】
上記基材の形状としては、当該基材へ上記抗菌剤（換言すれば、上記分解酵素）が結合するために十分な面積を有しているものであれば特に限定されず、例えば、シート状、粒子状、ポーラス状、または、針状であっても良い。上記構成によれば、基材（例えば、医療材料を構成する基材）へ、抗菌性を付与することができる。
【００６８】
上記抗菌剤は、上記分解酵素が結合しているＬ２タンパク質以外の成分を含んでいても良い。上記他の成分としては、上記分解酵素、上記Ｌ２タンパク質、または上記分解酵素が結合しているＬ２タンパク質の有する能力へ影響を与えることが無ければ、限定されない。該成分としては、例えば、緩衝剤、プロテアーゼ阻害剤、安定化剤、界面活性剤、および、塩類等が挙げられる。
【００６９】
本実施の形態の抗菌剤に含有されている「分解酵素が結合しているＬ２タンパク質」の量は、特に限定されず、例えば、抗菌剤を１００重量％とした場合に、０．００１重量％〜１００重量％であってもよく、０．０１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜９５重量％であってもよく、０．１重量％〜９０重量％であってもよく、０．１重量％〜８０重量％であってもよく、０．１重量％〜７０重量％であってもよく、０．１重量％〜６０重量％であってもよく、０．１重量％〜５０重量％であってもよく、０．１重量％〜４０重量％であってもよく、０．１重量％〜３０重量％であってもよく、０．１重量％〜２０重量％であってもよく、０．１重量％〜１０重量％であってもよい。
【００７０】
本実施の形態の抗菌剤に含有されている「分解酵素が結合しているＬ２タンパク質以外の成分」の量は、特に限定されず、例えば、改質剤を１００重量％とした場合に、０重量％〜９９．９９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５重量％〜９９．９重量％であってもよく、１０重量％〜９９．９重量％であってもよく、２０重量％〜９９．９重量％であってもよく、３０重量％〜９９．９重量％であってもよく、４０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５０重量％〜９９．９重量％であってもよく、６０重量％〜９９．９重量％であってもよく、７０重量％〜９９．９重量％であってもよく、８０
上記抗菌剤を、上記基材へ接触させる方法としては特に限定されず、例えば、噴霧や塗布、または滴下等が挙げられる。
【００７１】
上記抗菌剤を接触させた基材の抗菌性を測定する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、２，３，５−Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＴＣ）を、バイオフィルムが形成されている基材の表面上へ添加し、バイオフィルム中の細菌によって変化するＴＴＣの吸光度を測定すればよい。また、バイオフィルムが形成されている基材の表面へ、細菌に取り込まれる公知の蛍光色素を添加し、吸収した蛍光に基づいて、抗バイオフィルム活性を測定することも可能である。
【００７２】
＜３．抗菌性材料＞
本実施の形態の抗菌性材料は、上記抗菌剤が基材に吸着している、抗菌性材料であることが好ましい。上記構成によれば、バイオフィルムの形成を防ぐ性質を備える抗菌性材料を製造することができる。
【００７３】
本願明細書において、「抗菌性材料」とは、「表面上にバイオフィルムが形成されることを防ぐ性質を有する材料」を意図する。
【００７４】
上記抗菌性材料は、その構成成分として基材を備えている。そして、当該基材の表面上には、分解酵素が結合しているＬ２タンパク質が吸着している。なお、Ｌ２タンパク質、基材に対する結合能を有するポリペプチド、および、分解酵素については、＜１．改質剤＞および＜２．抗菌剤＞中に説明したため、ここではその説明を省略する。また、上記分解酵素とＬ２タンパク質とを結合させる手段についても、＜２．抗菌剤＞中に上述したため、ここでは説明を省略する。また、上記基材についても、＜２．抗菌剤＞に上述したため、ここでは説明を省略する。
【００７５】
得られた抗菌性材料は、所望の形に加工され、細菌が多く生存する環境下において使用される。使用される例としては、バイオフィルムが形成されやすい医療材料の製造等に使用され得る。
【００７６】
抗菌性材料の抗菌性については、＜２．抗菌剤＞に上述した方法により、確認することができる。
【００７７】
本実施の形態の抗菌性材料は、以下のように構成することも可能である。
【００７８】
上記分解酵素は、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ポリサッカラーゼ、または、リパーゼであることが好ましい。
【実施例】
【００７９】
本発明の一実施例について以下に説明する。
【００８０】
（実施例１．Ｌ２タンパク質の結合能に関する試験）
＜１．プラスミドの作製＞
周知の方法にしたがって、ｐＥＴ−２１ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）の制限酵素認識部位の中に、Bacillus subtilis由来のＬ２タンパク質（ＢｓｕＬ２：配列番号２）をコードするＤＮＡ、または、Lactobacillus plantarum由来のＬ２タンパク質（ＬｐｌＬ２：配列番号３）を挿入した。これによって、ＨｉｓタグとＬ２タンパク質（ＢｓｕＬ２、または、ＬｐｌＬ２）との融合タンパク質を発現するための、２つのプラスミドを作製した。
【００８１】
なお、本実施例では、Escherichia coli由来のＬ２タンパク質（配列番号１）も用いたが、当該Ｌ２タンパク質としては、特許第５１８６６８９号の、段落〔０１２６〕を参照して精製したものを用いた。Escherichia coli由来のＬ２タンパク質（ＥｃｏＬ２）の作製方法の詳細な説明は、省略する。
【００８２】
＜２．タンパク質（ＢｓｕＬ２、ＬｐｌＬ２）の発現＞
各プラスミドを用いて、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換した。
【００８３】
各形質転換体をカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）、およびクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレートに塗布した後、３７℃にて一晩培養した。
【００８４】
ＬＢ寒天プレート上でコロニーを形成した形質転換体を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）、および１％グルコースを含む、２×ＹＴ培地に植菌し、一晩振盪培養した。
【００８５】
この培養液を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）、およびクロラムフェニコール（３０ μｇ／ｍｌ）を含む２×ＹＴ培地に対して、当該２×ＹＴ培地の体積１％の量だけ加え、３７℃にて振盪培養した。
【００８６】
培地の濁度が所望の濁度（ＯＤ６００＝０．５）になったときに、当該培地に対して、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を終濃度が０．２ｍＭになるように添加し、２８℃にて６時間、振盪培養した。６時間の培養後、培養液を遠心分離処理に供して形質転換体を回収し、当該形質転換体を、−８０℃にて保存した。
【００８７】
＜３．タンパク質（ＢｓｕＬ２、ＬｐｌＬ２）の精製＞
−８０℃にて保存した各形質転換体（２×ＹＴ培地５０ｍＬ相当）を、Ｂｉｎｄｉｎｇ  
ｂｕｆｆｅｒ  １（Ａ  ＋  ４％  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ；Ａ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、Ｂ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、２０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）１０  ｍｌに懸濁し、氷上で冷却しながら、ＢＲＡＮＳＯＮ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ（登録商標）を用いて超音波破砕（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  １７  ％、０．５ｓｅｃ−ｏｎ／１．０ｓｅｃ−ｏｆｆ、１ｍｉｎ）を５回程度行った。
【００８８】
超音波破砕によって得られた懸濁液を２回の遠心分離処理（１５０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）に供し、上清を回収した。当該上清を０．２μｍ  Ｍｉｎｉｓａｒｔ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｆｉｌｔｅｒ（登録商標）（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｃｅｔａｔｅ、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ、ｓｔｅｒｉｌｅ）を用いてフィルター濾過し、濾過された菌体破砕液を回収した。当該菌体破砕液を，ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒを用いて精製した。カラムとしては、Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ  １ｍｌを使用し、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  １としては、「Ａ  ＋  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ」を使用し、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒとしては、Ｂ  ｂｕｆｆｅｒを使用した。カラムから溶出されたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し，ＤＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙによって、タンパク質を定量した。精製されたタンパク質を、−８０℃にて保存した。
【００８９】
＜４．タンパク質（ＥｃｏＬ２、ＢｓｕＬ２、ＬｐｌＬ２）の各種粒子への結合テスト＞
まず、０．０４４ｇのシリカ粒子（ＳｉＯ２（ｑｕａｒｔｚ）ｃａ．  ０．８μｍφ  高純度化学研究所）、０．１１９ｇのガラス粒子（ＧＢ−０５  ガラス  ０．５ｍｍφ  ＴＯＭＹ）、０．３６９ｇのステンレス粒子（ステンレス  ０．８ｍｍφ  ＴＯＭＹ）、および１．６１１ｇのジルコニア粒子（ＺＢ−２０  ジルコニア  ２．０ｍｍφ）を、それぞれ１．５ｍｌチューブへ入れた。
【００９０】
次に、各タンパク質（ＥｃｏＬ２、ＢｓｕＬ２、ＬｐｌＬ２）の濃度が、それぞれ２５μｇ／ｍＬの濃度になるように、各タンパク質をＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ２（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）中に懸濁し、得られた懸濁液を１００μｌずつ、上記１．５ｍｌチューブ内へ添加した（ジルコニア粒子入りのチューブのみ、５００μｌの懸濁液を添加した）。
【００９１】
該１．５ｍｌチューブを４℃下にて３０分間回転させながら内容物を混合し、つぎに２分間遠心（５０００ｇ）して得られた上清を非結合画分とした。一方、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ２  １００μｌ（ジルコニアは５００μｌ）にて２回洗浄して得られた粒子を結合画分とした。
【００９２】
結合画分に対して１×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ２００μｌを加えて懸濁し、一方、１０μｌの非結合画分に対して２×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ  １０μｌを加えて懸濁した。各懸濁液を９５℃にて５分間熱処理した。いずれも２０μｌのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＥｃｏＬ２、ＢｓｕＬ２、およびＬｐｌＬ２の各粒子に対する結合能の有無を確認した。
【００９３】
図１は、ＢｓｕＬ２、ＬｐｌＬ２およびＥｃｏＬ２の各粒子への結合結果を示す電気泳動像である。なお、図１中の「Ｂ」は、結合画分の試験結果示し、「Ｕ」は、非結合画分の試験結果を示す。
【００９４】
図１に示す通り、いずれの粒子も結合画分にてバンドが検出された。つまり、ＥｃｏＬ２、ＢｓｕＬ２、およびＬｐｌＬ２が、上記粒子に結合することが確認された。なお、シリカ粒子の場合は、結合画分でのみバンドが見られるのに対し、シリカ粒子以外の粒子の場合は、結合画分および非結合画分いずれにおいてもバンドが見られた。この原因として、シリカ粒子以外の粒子は、シリカ粒子に比べて重量あたりの比表面積が非常に小さいことが考えられる（粒径が小さい程、重量あたりの比表面積が大きくなる）。つまり、本試験では、重量あたりの比表面積が非常に小さい粒子（具体的には、シリカ粒子以外の粒子）に対して、当該粒子に結合できる量よりも過剰なタンパク質が添加され、その結果、タンパク質の一部が、当該粒子に結合することができなかったと考えられる。
【００９５】
次に、ＥｃｏＬ２、ＢｓｕＬ２、およびＬｐｌＬ２の、酸化ケイ素粒子、窒化ケイ素粒子、酸化アルミニウム粒子、酸化チタン粒子、酸化銅粒子、酸化ニッケル粒子、酸化マグネシウム粒子、酸化亜鉛粒子、および酸化ジルコニウム粒子に対する結合性を調べた。
【００９６】
酸化ケイ素粒子（高純度科学研究所製）、窒化ケイ素粒子（和光純薬工業製）、酸化アルミニウム粒子（和光純薬工業製）、酸化チタン粒子（シグマアルドリッチ社製）、酸化銅粒子（ナカライテスク社製）、酸化ニッケル粒子（和光純薬工業製）、酸化マグネシウム粒子（和光純薬工業製）、酸化亜鉛粒子（シグマアルドリッチ社製）、および酸化ジルコニウム粒子（和光純薬工業製）の各々１ｍｇを、それぞれ１．５ｍｌチューブへ入れた。
【００９７】
ＥｃｏＬ２、ＢｓｕＬ２、またはＬｐｌＬ２（各１０μg）と、各粒子とを、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ２  ２００μｌ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）中で混合した。
【００９８】
該１．５ｍｌチューブを４℃下にて３０分間回転させながら内容物を混合した。つぎに２分間遠心（５０００ｇ）して得られた上清を非結合画分とした。一方、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ２  １００μｌにて２回洗浄して得られた粒子を結合画分とした。
【００９９】
結合画分に対して１×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ  １００μｌを加えて懸濁し、一方、１０μｌの非結合画分に対して２×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ  １０μｌを加えて懸濁した。各懸濁液を９５℃にて５分間熱処理した。いずれも２０μｌのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＥｃｏＬ２、ＢｓｕＬ２、およびＬｐｌＬ２の各粒子に対する結合能の有無を確認した。
【０１００】
図２は、ＢｓｕＬ２の、粒子への結合結果を示す電気泳動像である。なお、図２中の「Ｂ」は、結合画分の試験結果を示し、「Ｕ」は、非結合画分の試験結果を示す。図２に示す通り、いずれの粒子も結合画分にてバンドが検出された。つまり、ＢｓｕＬ２が上記粒子に結合することが確認された。
【０１０１】
図３は、ＬｐｌＬ２の、粒子への結合結果を示す電気泳動像である。なお、図３中の「Ｂ」は、結合画分の試験結果を示し、「Ｕ」は、非結合画分の試験結果を示す。図３に示す通り、いずれの粒子も結合画分にてバンドが検出された。つまり、ＬｐｌＬ２が上記粒子に結合することが確認された。
【０１０２】
図４は、ＥｃｏＬ２の、粒子への結合結果を示す電気泳動像である。なお、図４中の「Ｂ」は、結合画分の試験結果を示し、「Ｕ」は、非結合画分の試験結果を示す。図４に示す通り、いずれの粒子も結合画分にてバンドが検出された。つまり、大腸菌Ｌ２が上記粒子に結合することが確認された。
【０１０３】
さらに、ＢｓｕＬ２、ＬｐｌＬ２、およびＥｃｏＬ２の、α−ＴＣＰ粒子（和光純薬工業製）、セルロース粒子（ナカライテスク社製）に対する結合性も検討した（図５）。試験条件は、上述した試験の条件と同じである。
【０１０４】
図５は、ＢｓｕＬ２、ＬｐｌＬ２、およびＥｃｏＬ２の、粒子への結合結果を示す電気泳動像である。図５に示す通り、ＢｓｕＬ２およびＥｃｏＬ２が、α−ＴＣＰ粒子に結合することが確認できた。ＢｓｕＬ２、ＬｐｌＬ２、およびＥｃｏＬ２が、セルロース粒子に結合することが確認できた。
【０１０５】
（実施例２．ＮＰＲを用いた抗バイオフィルム活性の評価）
＜１．プラスミドの作製＞
まず、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉａｓｅ（ＮＰＲ：配列番号５）の発現プラスミド（以下、ＮＰＲプラスミドと称する）を作製した。次いで、当該ＮＰＲプラスミドを用いて、ＮＰＲとＢｓｕＬ２との融合タンパク質を発現させるためのＮＰＲ−ＢｓｕＬ２プラスミド、および、ＮＰＲとＬｐｌＬ２との融合タンパク質を発現させるためＮＰＲ−ＬｐｌＬ２プラスミドを作製した。
【０１０６】
ＮＰＲプラスミドは、ｐＥＴ−２１ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトとの間に、ＮＰＲのＯＲＦ（Bacillus amyloliquefaciens由来）を挿入することにより得た。
【０１０７】
ＮＰＲ−ＢｓｕＬ２プラスミドは、上記ＮＰＲプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩサイトとＸｈｏＩサイトとの間にＢｓｕＬ２のＯＲＦ（Bacillus subtilis由来）を挿入することにより得た。
【０１０８】
ＮＰＲ−ＬｐｌＬ２プラスミドは、上記ＮＰＲプラスミドのＥｃｏＲＩサイトとＸｈｏＩサイトとの間にＬｐｌＬ２のＯＲＦ（Lactobacillus plantarum由来）を挿入することにより得た。
【０１０９】
＜２．融合タンパク質（ＮＰＲ−ＢｓｕＬ２、ＮＰＲ−ＬｐＩＬ２）の発現＞
上記ＮＰＲ-ＢｓｕＬ２プラスミドと、上記ＮＰＲ-ＬｐｌＬ２プラスミドとを、それぞれＥ．  ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（Ｎｏｖａgｅｎ）に導入し、形質転換体を得た。
【０１１０】
各形質転換体をカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）、およびクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレートに塗布した後、３７℃にて一晩培養した。
【０１１１】
ＬＢ寒天プレート上でコロニーを形成した形質転換体を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３０μｇ/ｍｌ）、および１％グルコースを含む、２×ＹＴ培地に植菌し、一晩振盪培養した。
【０１１２】
この培養液を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）、およびクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）を含む２×ＹＴ培地に対して、当該２×ＹＴ培地の体積１％の量だけ加え、３７℃にて振盪培養した。
【０１１３】
培地の濁度が所望の濁度（ＯＤ６００＝０．５）になったときに、当該培地に対して、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を終濃度が０．２ｍＭになるように添加し、２８℃にて６時間、振盪培養した。６時間の培養後、培養液を遠心分離処理に供して形質転換体を回収し、当該形質転換体を、−８０℃にて保存した。
【０１１４】
＜３．融合タンパク質（ＮＰＲ−ＢｓｕＬ２、ＮＰＲ−ＬｐＩＬ２）の精製＞
１００ｍｌの培養液から回収した、ＮＰＲ−ＢｓｕＬ２の発現菌体、および、ＮＰＲ−ＬｐｌＬ２の発現菌体の各々に、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  １（Ａ  ＋  ４％  Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ;Ａ:５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、Ｂ:５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、２０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）１０ｍｌを加えて撹拌し、懸濁液を得た。
【０１１５】
該懸濁液を、氷上で冷却しながら、ＢＲＡＮＳＯＮ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ（登録商標）を用いて、５回程度の超音波破砕（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  １７％、０．５ｓｅｃ−ｏｎ／１．０ｓｅｃ−ｏｆｆ、１ｍｉｎ）を行った。
【０１１６】
その後、破砕物を２回の遠心分離処理（１５０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）に供し、上清を回収した。当該上清を０．２μｍ  Ｍｉｎｉｓａｒｔ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｆｉｌｔｅｒ（登録商標）（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｃｅｔａｔｅ、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ、ｓｔｅｒｉｌｅ）を用いて濾過し、濾液を菌体破砕液として回収した。
【０１１７】
該菌体破砕液を、ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒを用いて精製した。ここで、カラムとしては、Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ  １ｍｌを用い、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒとしては、Ｂ  ｂｕｆｆｅｒを使用した。
【０１１８】
カラムからサンプルを溶出する時には、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ濃度にグラジエントをかけたＢ  ｂｕｆｆｅｒを用いた。
【０１１９】
カラムから溶出されたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、ＤＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙによって、タンパク質を定量した。精製されたタンパク質を、−８０℃下にて保存した。
【０１２０】
＜４．カバーガラス上における抗バイオフィルム活性の測定＞
ＮＰＲ−ＢｓｕＬ２、または、ＮＰＲ−ＬｐＩＬ２を、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ２を用いて希釈した。該希釈液へ、オゾン処理により表面を親水化加工したカバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩＭＩＣＲＯ  ＣＯＶＥＲ  ＧＬＡＳＳ  ６×１５  ｍｍ松波硝子工業）を浸し、４℃下にて３０分間混合した。
【０１２１】
Ｂｉｎｄｉｎg  ｂｕｆｆｅｒ  ２を用いて、カバーガラスを２回洗浄し、洗浄後のカバーガラスへＢｒａｉｎ−ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）培地（＋１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０μＭ  ＺｎＣｌ２）５００μｌを添加し、該カバーガラスを３７℃にて１４時間静置した。その後、再びＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ２を用いてカバーガラスを２回洗浄した。
【０１２２】
Ｂｒａｉｎ−ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）培地（＋１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０μＭ  ＺｎＣｌ２）にて１０５ ＣＦＵ/ｍｌに調整したＳ．  ａｕｒｅｕｓの培養液５００μｌを洗浄後のカバーガラスへ添加し、該カバーガラスを３７℃にて４８時間静置し、カバーガラス上でバイオフィルムを形成させた。
【０１２３】
カバーガラスを、１ｍｌのＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）を用いて３回洗浄した。該カバーガラスの片面をふき取り、ふき取った面と反対側の面へ１００μｇ／ｍｌ  ４’，６-ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ、シグマアルドリッチ社）を３μｌ滴下して、バイオフィルムを染色し、当該バイオフィルムをＯＬＹＭＰＵＳ  ＢＸ５１を用いて顕微鏡観察した。
【０１２４】
図６は、カバーガラス上に形成されたバイオフィルムを示す顕微鏡像である。図６に示す通り、ＮＰＲ−ＢｓｕＬ２およびＮＰＲ−ＬｐｌＬ２をカバーガラスの表面上に結合させた場合は、上記タンパク質をカバーガラスの表面上に結合させていないコントロールと比べ、バイオフィルムが認められなかった。この結果から、ＮＰＲ−ＢｓｕＬ２およびＮＰＲ−ＬｐｌＬ２は、バイオフィルムの形成を抑制することが確認された。
【０１２５】
図７は、ＡＫＴＡで精製を行ったＮＰＲ−ＢｓｕＬ２を用いた場合の、カバーガラス上に形成されたバイオフィルムを示す顕微鏡像である。図７に示す通り、ＮＰＲ−ＢｓｕＬ２をカバーガラスの表面上に結合した場合は、上記タンパク質をカバーガラスの表面上に結合させていないコントロールと比べ、バイオフィルムが認められなかった。この結果から、ＮＰＲ−ＢｓｕＬ２は、バイオフィルムの形成を抑制することが確認された。
【０１２６】
＜５．シリカ粒子上における抗バイオフィルムの活性測定＞
ＮＰＲ−ＢｓｕＬ２およびＮＰＲ−ＬｐｌＬ２の各々を、Ｂｉｎｄｉｎg  ｂｕｆｆｅｒ  ２（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ  ７．４］、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で希釈し、希釈液を得た。該希釈液へシリカ粒子（ワコーゲル（登録商標）  Ｃ−４００ＨＧ  φ２０−４０μｍ和光純薬工業）２０ｍgを添加し、４℃下にて３０分間混合した。
【０１２７】
シリカ粒子を自然沈降させた後、該希釈液からシリカ粒子を回収した。その後、Ｂｉｎｄｉｎg  ｂｕｆｆｅｒ  ２を用いて上記シリカ粒子を２回洗浄した。
【０１２８】
１０ｍＭ  ＣａＣｌ２および５０μＭ  ＺｎＣｌ２を添加したＢｒａｉｎ−ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）培地へ、１０５ ＣＦＵ／ｍｌに調整したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ６５３８の培養液５００μｌを添加し、更に、洗浄後のシリカ粒子を添加し、当該混合物を３７℃にて４８時間静置培養し、シリカ粒子上にバイオフィルムを形成させた。
【０１２９】
このシリカ粒子を、５００  μｌのＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で３回洗浄した後、当該シリカ粒子に０．１％  ２，３，５−Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＴＣ）を含むＢｒａｉｎ−ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）培地（＋１０ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ５０μＭ  ＺｎＣｌ２）５００μｌを添加し、３７℃で１ｈ混合しながら反応させた。上清を適当に希釈した後、当該上清における４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【０１３０】
図８は、バイオフィルムの形成量を定量した結果を示すグラフである。図８に示す通り、シリカ粒子の表面上に何も結合させていないコントロールに比べ、ＮＰＲ−ＢｓｕＬ２およびＮＰＲ−ＬｐｌＬ２をシリカ粒子の表面上に結合させている場合では、バイオフィルム形成が抑制されていた。
【０１３１】
（実施例３．ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎを用いた抗バイオフィルム活性の評価）
＜１．プラスミドの作製＞
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株由来のリボソームタンパク質Ｌ２をコードする遺伝子を増幅するために、以下の２種類のプラーマーを作製し、同株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った：
プライマー１：５’−AAGAATTCGGCAGTTGTTAAATGTAAACCG−３’（配列番号６）、
プライマー２：５’−CTCTACTCGAGTTTGCTACGGCGACG−３’    （配列番号７）。
【０１３２】
得られたＰＣＲ産物、および発現ベクターｐＥＴ−２１ｂ（Ｎｏｖａgｅｎ）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩにより３７℃にて２時間消化した後、当該消化物をアガロースゲル電気泳動に供した。それぞれのＤＮＡ断片をアガロースゲルから精製した後、当該ＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  （ＴＯＹＯＢＯ）を用いて１６℃で２時間ライゲーションした。その後、当該ライゲーション産物を用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた同株のコロニーから目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを抽出し、当該プラスミドをｐＥＴ−Ｌ２とした。
【０１３３】
また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株のｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎタンパク質（配列番号４）をコードする遺伝子の配列を増幅するために、以下の２種類のプラーマーを作製し、同株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。なお、ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎタンパク質は、プロテアーゼの一種である。
【０１３４】
プライマー３：５’−TCTGTGGCTAGCGCCGGAAAAAGCAGTAC−３’（配列番号８）、
プライマー４：５’−ACGAATTCTGTGCAGCTGCTTGTACG−３’   （配列番号９）。
【０１３５】
得られたＰＣＲ産物、および、上述したｐＥＴ−Ｌ２を制限酵素ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩにより３７℃にて２時間消化した後、当該消化物をアガロースゲル電気泳動に供した。それぞれのＤＮＡ断片をアガロースゲルから精製した後、当該ＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  （ＴＯＹＯＢＯ）を用いて１６℃で２時間ライゲーションした。その後、当該ライゲーション産物を用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた同株のコロニーから目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを抽出し、当該プラスミドをｐＥＴ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−Ｌ２とした。当該ｐＥＴ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−Ｌ２が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株由来のリボソームタンパク質Ｌ２と、ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎタンパク質との融合タンパク質（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−Ｌ２）を発現するための発現ベクターである。
【０１３６】
＜２．融合タンパク質（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−Ｌ２）の発現＞
上記ｐＥＴ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−Ｌ２をＥ．  ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（Ｎｏｖａgｅｎ）に導入し、形質転換体を得た。
【０１３７】
当該形質転換体をカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）、およびクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上に塗布した後、３７℃にて一晩培養した。
【０１３８】
ＬＢ寒天プレート上でコロニーを形成した形質転換体を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）、および１％グルコースを含む２×ＹＴ培地に植菌し、一晩振盪培養した。
【０１３９】
この培養液を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）、およびクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）を含む２×ＹＴ培地に対して、当該２×ＹＴ培地の体積１％の量だけ加え、３７℃にて振盪培養した。
【０１４０】
培地の濁度が所望の濁度（ＯＤ６００＝０．５）になったときに、当該培地に対して、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を終濃度が０．２ｍＭになるように添加し、２８℃にて６時間、振盪培養した。６時間の培養後、培養液を遠心分離処理に供して形質転換体を回収し、当該形質転換体を、−８０℃にて保存した。
【０１４１】
＜３．プロテアーゼ活性測定＞
ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−Ｌ２の発現菌体１ｍｌ分を、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）５００μｌに懸濁し、ＢＲＡＮＳＯＮ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ（登録商標）を用いて超音波破砕（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  １７％、０．５  ｓｅｃ−ｏｎ／１．０  ｓｅｃ−ｏｆｆ、４０ｓｅｃ）した。
【０１４２】
その後、破砕物を遠心分離（２００００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）し、上清（菌体破砕液）を回収し、周知のアゾカゼイン法により、上清中のプロテアーゼ活性を測定した。具体的に、上清７５μｌにＡｚｏｃａｓｅｉｎ  ｂｕｆｆｅｒ（４％  Ａｚｏｃａｓｅｉｎ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ９．０］、５ｍＭ  ＣａＣｌ２）７５μｌを添加した反応溶液を、３７℃にて３時間インキュベーションした。
【０１４３】
インキュベーションを開始してから０時間後、１．５時間後、または、３時間後において、上記反応溶液に１００μｌの１５％トリクロロ酢酸を添加し、よく混合した後、氷中に静置させることで反応を停止した。
【０１４４】
反応溶液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）して上清を回収し、当該上清８０μｌに２Ｍ  ＮａＯＨを２０μｌ添加した後、ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ  ＤＵ８００  ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲを用いて４４０ｎｍの吸光度を測定した。この時、４４０ｎｍの吸光度が１時間に１上昇したときを１単位（１Ｕ）と定義した。
【０１４５】
図９は、プロテアーゼ活性測定の結果を示すグラフである。ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎとＬ２タンパク質との融合タンパク質を発現させた菌体破砕液では、ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎのみを発現させた菌体破砕液と同程度のプロテアーゼ活性を確認できた。そのため、ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎとＬ２タンパク質との融合タンパク質の効果と、ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎの効果とを比較する以下の実験では、特に断らない限り、等量の発現菌体から調製した破砕液を使用した。
【０１４６】
＜４．シリカ粒子上におけるプロテアーゼ活性測定＞
菌体破砕液にシリカ粒子（ＳｉＯ２（ｑｕａｒｔｓ）、φ０．８μｍ、高純度化学研究所）２０ｍｇを添加し、４℃にて３０分間混合した。該菌体破砕液を遠心分離処理（５０００×ｇ、１ｍｉｎ、４℃）し、シリカ粒子と上清（換言すれば、未結合画分）とに分けた。
【０１４７】
シリカ粒子を２２５μｌの超純水（ＭｉｌｌｉＱ）に懸濁し、７５μｌずつ分注した。未結合画分も７５μｌずつ分注した。シリカ粒子懸濁液および未結合画分のプロテアーゼ活性をアゾカゼイン法により測定した。
【０１４８】
図１０は、シリカ粒子上におけるｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−Ｌ２のプロテアーゼ活性を定量した結果を示すグラフである。シリカ粒子と、上清（未結合画分）とで、プロテアーゼ活性を確認したところ、図１０に示す通り、ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−Ｌ２はシリカに結合するので、シリカ粒子において強い活性がみられた。一方ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎはシリカに結合しないので、未結合画分に高いプロテアーゼ活性が確認された。
【０１４９】
＜５．カバーガラス上における抗バイオフィルム活性測定＞
上記菌体破砕液を、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ２を用いて希釈した。該希釈液へ、カバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩＭＩＣＲＯ  ＣＯＶＥＲ  ＧＬＡＳＳ  ６×１５ｍｍ松波硝子工業）を浸し、４℃下にて３０分間混合した。
【０１５０】
Ｂｉｎｄｉｎg  ｂｕｆｆｅｒ  ２を用いて、カバーガラスを２回洗浄し、洗浄後のカバーガラスへ、Ｂｒａｉｎ−ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）培地（＋１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０μＭ  ＺｎＣｌ２）にて１０５ ＣＦＵ/ｍｌに調整したＰ．  ａｅｒｕｈｉｎｏｓａおよびＳ．  ａｕｒｅｕｓの培養液５００μｌを添加し、該カバーガラスを３７℃にて４８時間静置培養し、カバーガラス上でバイオフィルムを形成させた。
【０１５１】
培養後のカバーガラスを、１ｍｌのＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）を用いて３回洗浄した。該カバーガラスの片面をふき取り、ふき取った面と反対側の面へ１００μｇ／ｍｌ  ４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ、シグマアルドリッチ社）を３μｌ滴下して、バイオフィルムを染色し、当該バイオフィルムをＯＬＹＭＰＵＳ  ＢＸ５１を用いて顕微鏡観察した。
【０１５２】
図１１は、カバーガラス上に形成されたバイオフィルムを示す顕微鏡像である。ここで、図１１の（Ａ）、（Ｃ）および（Ｅ）は、Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを用いた場合の試験結果を示す。また、図１１の（Ｂ）、（Ｄ）および（Ｆ）は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓを用いた場合の試験結果を示す。図１１に示す通り、ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−Ｌ２をカバーガラスの表面上に結合させた場合（図１１の（Ｅ）および（Ｆ））は、上記タンパク質を含まないコントロール（図１１の（Ａ）および（Ｂ））、およびＬ２タンパク質をカバーガラスの表面上に結合させた場合（図１１の（Ｃ）および（Ｄ））と比べ、バイオフィルムが認められなかった。この結果から、ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−Ｌ２は、バイオフィルムの活性を抑制することが確認された。
【０１５３】
＜６．粒子上におけるプロテアーゼ活性の安定性＞
菌体破砕液にシリカ粒子（ＳｉＯ２（ｑｕａｒｔｓ）、φ０．８μｍ  高純度化学研究所）２０ｍｇを添加し、４℃にて３０分間混合した。該菌体破砕液を遠心分離処理（５０００×ｇ、１ｍｉｎ、４℃）し、上清を除去した。当該シリカ粒子をＢｒａｉｎ−ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）培地５００μｌに懸濁し、３７℃にて静置培養した。任意の時間が経過した後に当該シリカ粒子を取り出し、遠心分離処理（５０００×ｇ、１ｍｉｎ、４℃）した。当該シリカ粒子を２２５μｌの超純水（ＭｉｌｌｉＱ）に懸濁し、７５μｌずつ分注した。当該シリカ粒子懸濁液のプロテアーゼ活性を、アゾカゼイン法により測定した。
【０１５４】
図１２は、シリカ粒子上におけるｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−Ｌ２に由来するプロテアーゼ活性を定量した結果を示すグラフである。測定開始直後から、高いプロテアーゼ活性が検出された。測定開始から約２４時間後において、測定開始直後と比較するとプロテアーゼ活性は低下したが、測定開始から約２４時間後においても、有意なプロテアーゼ活性が検出された。また、測定開始から約８０時間以上にわたり、ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−Ｌ２のプロテアーゼ活性が保持されていることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１５５】
本発明は、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、酸化銅、酸化チタン、酸化ニッケル、酸化亜鉛、酸化ジルコニウム、ステンレス、またはセルロースを含む基材を用いる産業において利用できる。特に、上記基材に抗菌性を付与することによって得られた抗菌性材料は、医療用材料として好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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