(57)【要約】      （修正有）【課題】がんの予防又は治療に有効的な遺伝子欠失ワクシニアウイルスの提供。【解決手段】ワクシニアウイルス増殖因子ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、ＳＣＲ（ｓｈｏｒｔ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｒｅｐｅａｔ）ドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、組換えワクシニアウイルス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、ＳＣＲ（ｓｈｏｒｔ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｒｅｐｅａｔ）ドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ワクシニアウイルス。
【請求項２】
ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、請求項１に記載のワクシニアウイルス。
【請求項３】
Ｂ５ＲにおけるＳＣＲドメイン１〜４の欠失が、Ｂ５Ｒにおける配列番号１により示されるアミノ酸配列に対応する領域の欠失である、請求項２に記載のワクシニアウイルス。
【請求項４】
ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子が、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を含むポリペプチドをコードする遺伝子である、請求項１から３のいずれか一項に記載のワクシニアウイルス。
【請求項５】
ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒが、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのアミノ酸配列からなる、請求項１から４のいずれか一項に記載のワクシニアウイルス。
【請求項６】
ワクシニアウイルスがＬＣ１６ｍＯ株である、請求項１から５のいずれか一項に記載のワクシニアウイルス。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のワクシニアウイルス及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項８】
がんの予防又は治療用である、請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＣＲ欠失ワクシニアウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ウイルスをがん治療に用いる種々の技術が開発されており、がん治療に用いられるウイルスのひとつとしてワクシニアウイルス（以下、「ＶＶ」と称することがある。）がある。ワクシニアウイルスは治療用遺伝子をがん細胞へ送達するベクターとして、がん細胞において増殖しがん細胞を破壊する腫瘍溶解性ウイルスとして、又はがん抗原や免疫調節分子を発現するがんワクチンとして、がん治療を目的として研究されてきた（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１１、Ｖｏｌ．１１、ｐ．５９５−６０８）。
【０００３】
ウイルス蛋白質であるワクシニアウイルス増殖因子（Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＶＧＦ）及びＯ１Ｌの機能を欠損し、がん細胞内で特異的に増殖してがん細胞を破壊する組換えワクシニアウイルスについて、がん治療へ利用しようとする技術が報告されている（特許文献１）。弱毒化されたワクシニアウイルス株として、Ｂ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失した株を使用してもよいことが説明されている一方で、Ｂ５Ｒタンパク質の作用により癌細胞が傷害されることから、完全なＢ５Ｒ遺伝子を発現することが望ましいことが説明されている。
【０００４】
Ｂ５Ｒ細胞外領域のＳＣＲ（ｓｈｏｒｔ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｒｅｐｅａｔ）１−４ドメインの一部（すなわち、ＳＣＲ４ドメイン中の細胞質側の１２アミノ酸を除く部分）を欠失させたＷＲ株（Ｗ−Ｂ５ＲΔＳＣＲ１−４）及びＩＨＤ−Ｊ株（Ｉ−Ｂ５ＲΔＳＣＲ１−４）が大きなプラークを形成することが報告されている。さらに、Ｗ−Ｂ５ＲΔＳＣＲ１−４について、データは提示されていないものの野生型ＷＲ株に比して最高で１０倍の感染性ウイルスが上清に存在したこと、それ故に細胞外被覆ウイルス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ；ＥＥＶ）放出の促進が示唆されることが説明されている（非特許文献１）。対照的に、Ｗ−Ｂ５ＲΔＳＣＲ１−４のプラーク表現型は野生型よりも小さいことも報告されている（非特許文献２）。
【０００５】
抗ワクシニアウイルス血清による中和に対し、Ｗ−Ｂ５ＲΔＳＣＲ１−４及びＩ−Ｂ５ＲΔＳＣＲ１−４のＥＥＶはそれぞれの野生型のＥＥＶに比べて耐性であることが報告されている（非特許文献３）。
【０００６】
リバージョン（先祖帰り）を起こしにくいワクチン株を作出し、より安全性の高い痘瘡ワクチンを提供することを目的として、ワクシニアウイルス株ＬＣ１６株、ＬＣ１６ｍ８株又はＬＣ１６ｍＯ株のＢ５Ｒ遺伝子の一部又は全部が欠失しており、正常な機能を有するＢ５Ｒ遺伝子産物を産生しないワクシニアウイルスからなる痘瘡ワクチンが報告されている（特許文献２）。Ｂ５Ｒ遺伝子の欠失は、膜貫通ドメインの欠失でもよいし、また、膜貫通ドメインだけではなく、ＳＣＲ１からＳＣＲ４の一部が欠失していてもよいことが説明されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０７６４２２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／０５４４５１号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９８、Ｖｏｌ．７２、Ｎｏ．１、ｐ．２９４−３０２
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００２、Ｖｏｌ．８３、ｐ．３２３−３３２
【非特許文献３】Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００４、Ｖｏｌ．３２５、ｐ．４２５−４３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、がんを治療又は予防するための遺伝子欠失ワクシニアウイルス（特に腫瘍溶解性の遺伝子欠失ワクシニアウイルス）及び医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ワクシニアウイルスの作製において相当の創意検討を重ねた結果、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、Ｂ５Ｒ細胞外領域のＳＣＲドメインをコードする領域を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有するワクシニアウイルスを作製し（実施例２）、Ｂ５Ｒ細胞外領域のＳＣＲドメインを欠失することの重要性を見出し、また、担癌マウスモデルにおいて、前記ワクシニアウイルス数の減少が確認された後においても腫瘍増殖抑制作用が発揮され続けることを見出した（実施例７）。これらの結果、本発明のワクシニアウイルスを提供し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、医学上又は産業上有用な物質又は方法として以下の発明を含んでもよい。
［１］ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、ＳＣＲ（ｓｈｏｒｔ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｒｅｐｅａｔ）ドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ワクシニアウイルス。
［２］ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、［１］に記載のワクシニアウイルス。
［３］Ｂ５ＲにおけるＳＣＲドメイン１〜４の欠失が、Ｂ５Ｒにおける配列番号１により示されるアミノ酸配列に対応する領域の欠失である、［２］に記載のワクシニアウイルス。
［４］ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子が、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を含むポリペプチドをコードする遺伝子である、［１］〜［３］のいずれかに記載のワクシニアウイルス。
［５］ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒが、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのアミノ酸配列からなる、［１］から［４］のいずれかに記載のワクシニアウイルス。
［６］ワクシニアウイルスがＬＣ１６ｍＯ株である、［１］から［５］のいずれかに記載のワクシニアウイルス。
［７］［１］から［６］のいずれかに記載のワクシニアウイルス及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
［８］がんの予防又は治療用である、［７］に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のワクシニアウイルス及び本発明の医薬組成物は、腫瘍増殖抑制作用を示すものであり、がんの予防又は治療に使用できると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】組換えワクシニアウイルスＬＣ１６ｍＯ  ＶＧＦ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１−ＳＰ−ＢＦＰ（Ｂ５Ｒウイルス）（図１Ａ）、及びＬＣ１６ｍＯ  ΔＳＣＲ  ＶＧＦ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１−ＳＰ−ＢＦＰ（ΔＳＣＲウイルス）（図１Ｂ）の構造を示す図である。
【００１４】
【図２−１】Ｂ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルスの細胞内成熟ウイルス（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｕｒｅ  ｖｉｒｕｓ；ＩＭＶ）感染後１２０時間時点での４種の卵巣癌細胞の蛍光観察像を示す図である。
【００１５】
【図２−２】Ｂ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルスのＥＥＶ感染後１２０時間時点での４種の卵巣癌細胞の蛍光観察像を示す図である。
【００１６】
【図３】Ｂ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルスのＩＭＶ（図３Ａ）又はＥＥＶ（図３Ｂ）感染後１２０時間時点での４種の卵巣癌細胞の細胞生存率を示す図である。
【００１７】
【図４】Ｂ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルス由来のＥＥＶ（図４Ａ）又はＩＭＶ（図４Ｂ）とウサギ抗ワクシニアウイルス血清及びウサギ補体とを混合した後の、各ウイルスの増殖を蛍光観察した図である。
【００１８】
【図５】Ｂ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルス由来のＥＥＶ（図５Ａ）又はＩＭＶ（図５Ｂ）とウサギ抗ワクシニアウイルス血清及びウサギ補体とを混合した後の、各ウイルスのハイブリッドカウントを示した図である。
【００１９】
【図６−１】抗ワクシニアウイルス血清を投与したヒト卵巣癌Ａ２７８０腹膜播種マウスモデルにおけるＢ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルス由来ＥＥＶの投与後３日（Ｄａｙ  ３）及び７日（Ｄａｙ  ７）時点のウイルス体内分布を示す図である。
【００２０】
【図６−２】抗ワクシニアウイルス血清を投与したヒト卵巣癌Ａ２７８０腹膜播種マウスモデルにおけるＢ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルス由来ＥＥＶの投与３日前（Ｄａｙ  −３）及び投与後８日（Ｄａｙ  ８）時点の腫瘍増殖を示す図である。
【００２１】
【図７】抗ワクシニアウイルス血清を投与したヒト卵巣癌Ａ２７８０腹膜播種マウスモデルにおけるＢ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルス由来ＥＥＶ投与後のウイルス増殖の数値化結果（図７Ａ）又は腫瘍増殖の数値化結果（図７Ｂ）を示す図である。
【００２２】
【図８】抗ワクシニアウイルス血清存在下又は非存在下のヒト卵巣癌Ａ２７８０腹膜播種マウスモデルにおけるＢ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルス由来ＥＥＶ投与後の生存率を示す図である。
【００２３】
【図９】Ｂ５Ｒ−ＬＬウイルス又はΔＳＣＲ−ＬＬウイルスを投与したマウス大腸癌ＣＴ２６細胞を両側担癌したマウスモデルにおけるウイルス投与側の腫瘍体積（図９上図）又はウイルス非投与側（図９下図）の腫瘍体積を示す図である。
【００２４】
【図１０】Ｂ５Ｒ−ＬＬウイルス又はΔＳＣＲ−ＬＬウイルスを投与したマウス大腸癌ＣＴ２６細胞を両側担癌したマウスモデルにおけるウイルス投与側のウイルス量を示す図である。
【００２５】
【図１１】Ｂ５Ｒ領域の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下に、本発明について詳述する。
【００２７】
＜本発明のワクシニアウイルス＞
本発明は、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ワクシニアウイルスを提供する。本発明はまた、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ワクシニアウイルスを提供する（本明細書中、当該ワクシニアウイルスを「本発明のワクシニアウイルス」ともいう。）。
【００２８】
本発明のワクシニアウイルスは、ポックスウイルス科オルトポックスウイルス属に属するウイルスである。本発明において使用されるワクシニアウイルスの株は限定されないが、例えば、リスター株、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＹＢＨ）株、Ｗｙｅｔｈ株、コペンハーゲン株、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）株、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）株、ＥＭ６３株、池田株、大連株、Ｔｉａｎ  Ｔａｎ株などが挙げられ、リスター株、ＭＶＡ株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ（登録商標））より入手可能である（それぞれＡＴＣＣ（登録商標）  ＶＲ−１５４９及びＡＴＣＣ（登録商標）  ＶＲ−１５０８）。さらに、本発明において使用されるワクシニアウイルスとして、これらの株を由来にして確立されたワクシニアウイルス株も使用することができる。例えば、本発明において使用されるワクシニアウイルスとして、リスター株から確立された、ＬＣ１６株、ＬＣ１６ｍ８株、及びＬＣ１６ｍＯ株を使用することもできる。ＬＣ１６ｍＯ株はリスター株を親株として低温継代し、ＬＣ１６株を経て作出された株である。ＬＣ１６ｍ８株は、ＬＣ１６ｍＯ株をさらに低温継代して作出された、ウイルス膜蛋白質をコードする遺伝子であるＢ５Ｒ遺伝子にフレームシフト変異が認められ、この蛋白質が発現及び機能しなくなったことで弱毒化された株である（蛋白質  核酸  酵素、２００３、Ｖｏｌ．４８、ｐ．１６９３−１７００）。リスター株、ＬＣ１６ｍ８株及びＬＣ１６ｍＯ株の全ゲノム配列として、例えば、それぞれＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ６７８２７６．１、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ６７８２７５．１及びＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ６７８２７７．１が知られている。したがって、リスター株から公知の相同組換えや部位特異的突然変異導入法により、ＬＣ１６ｍ８株、及びＬＣ１６ｍＯ株を作製することができる。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明において使用されるワクシニアウイルスはＬＣ１６ｍＯ株である。
【００３０】
Ｂ５Ｒはワクシニアウイルスの１型膜蛋白質である。Ｂ５Ｒは、細胞内においてウイルスが増殖するとき、そして隣接の細胞又は宿主体内の他の部位にウイルスが伝播するときに、それらの効率を高める働きをする。Ｂ５Ｒとしては、例えば、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列を有するＢ５Ｒが挙げられる。Ｂ５Ｒは、Ｎ末端側からＣ末端側に向けてシグナルペプチド、４つのＳＣＲドメイン（ＳＣＲドメイン１〜４）と呼ばれる領域、ストークと呼ばれる領域、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有する（図１１。図１１中、シグナルペプチド、ストーク、膜貫通ドメイン、細胞質尾部はそれぞれ、ＳＰ、Ｓ、ＴＭ、ＣＴと称される。）。より具体的には、Ｂ５Ｒにおいて、例えば、シグナルペプチドはＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の１番目のアミノ酸から１９番目のアミノ酸に対応するＢ５Ｒの領域であり、ＳＣＲドメイン１〜４はＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２０番目のアミノ酸から２３７番目のアミノ酸に対応するＢ５Ｒの領域であり、ストークはＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２３８番目のアミノ酸から２７５番目のアミノ酸に対応するＢ５Ｒの領域であり、膜貫通ドメインはＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２７６番目のアミノ酸から３０３番目のアミノ酸に対応するＢ５Ｒの領域であり、細胞質尾部はＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の３０４番目のアミノ酸から３１７番目のアミノ酸に対応するＢ５Ｒの領域である（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００５、Ｖｏｌ．７９、ｐ．６２６０−６２７１）。本明細書では、「対応する」とは、この語句により特定されるアミノ酸配列と完全かつ正確に一致するアミノ酸配列を有することに限られず、蛋白質機能解析手法やワクシニアウイルス株の違い等によってこの語句により特定されたアミノ酸配列から変動した（例えば、アミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加された）アミノ酸配列を有することも包含する概念である。当業者であれば、前記アミノ酸配列に基づいて、異なるワクシニアウイルス株それぞれにおいてＢ５Ｒの遺伝子及びＢ５Ｒの各領域を特定することができる。Ｂ５ＲがＥＥＶの外膜上に発現するときには、シグナルペプチドは除去されており、ＥＥＶ外膜上にはＳＣＲドメイン１〜４とストークが露出する（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９８、Ｖｏｌ．７２、ｐ．２９４−３０２）。本明細書では、ＳＣＲドメイン１〜４及びストークからなる領域を「細胞外領域」と呼ぶことがある。
【００３１】
本発明のワクシニアウイルスにおいて「ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子」とは、ＳＣＲドメイン１〜４の一部又は全部を欠失し、それによりその機能が損なわれたＢ５Ｒをコードする遺伝子を包含する。ワクシニアウイルスにおいてＢ５Ｒの機能が損なわれたか否かを判断する方法としては、ＳＣＲドメインを欠失していないワクシニアウイルスに比べて、Ｂ５Ｒを標的とする中和抗体に対する中和回避能が高まっているかどうかを確認する方法が挙げられる。中和回避能を確認する方法の一例として、後記実施例５に記載の方法が挙げられる。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域を有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域及び膜貫通ドメインを有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストークを有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク及び膜貫通ドメインを有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有する。１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＥＥＶ形態となったときに、ＳＣＲドメイン１〜４の一部又は全部を欠失した細胞外領域を有するＢ５Ｒをウイルス表面に提示させうる。
【００３２】
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスにおける「ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒ」とは、４つのＳＣＲドメイン（ＳＣＲドメイン１〜４）を欠失したＢ５Ｒである。本明細書における「ＳＣＲドメイン１〜４の欠失」又は４つのＳＣＲドメインについての文脈で記述されるこれらと類似した表現は、ＳＣＲドメイン１〜４から構成される領域の完全かつ正確な欠失に限られず、該領域内の末端に存在する１、２若しくは３個のアミノ酸がＢ５Ｒに残存することをも包含する概念である。本発明のワクシニアウイルスにおけるＳＣＲドメイン１〜４の欠失としては、例えば、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２２番目のアミノ酸から２３７番目のアミノ酸に対応するＢ５Ｒ領域の欠失が挙げられる。Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２２番目のアミノ酸から２３７番目のアミノ酸配列は配列番号１として示される。１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスのＢ５ＲにおけるＳＣＲドメイン１〜４の欠失は、Ｂ５Ｒにおける配列番号１に示されるアミノ酸配列に対応する領域の欠失である。当業者であれば、異なるワクシニアウイルス株のＢ５Ｒにおいて配列番号１に示されるアミノ酸配列に対応する領域を特定することができる。１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスのＢ５ＲにおけるＳＣＲドメイン１〜４の欠失は、Ｂ５Ｒにおける配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる領域の欠失である。
【００３３】
１つの実施形態において、ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒは、欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域を有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒは、欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域及び膜貫通ドメインを有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒは、欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒは、ストークを有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒは、ストーク及び膜貫通ドメインを有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有する。１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＥＥＶ形態となったときに、ＳＣＲドメイン１〜４を欠失した細胞外領域を有するＢ５Ｒをウイルス表面に提示させうる。
【００３４】
１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２３８番目のアミノ酸から２７５番目のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸番号２２から５９までのアミノ酸配列からなる）に対応するＢ５Ｒの領域を有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２３８番目のアミノ酸から３０３番目のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸番号２２から８７までのアミノ酸配列からなる）に対応するＢ５Ｒの領域を有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２３８番目のアミノ酸から３１７番目のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸番号２２から１０１までのアミノ酸配列からなる）に対応するＢ５Ｒの領域を有する。
【００３５】
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスにおけるＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、Ｂ５Ｒのシグナルペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド及び欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域を含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域及び膜貫通ドメインを含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド及びストークを含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、ストーク及び膜貫通ドメインを含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部から本質的になるポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部から本質的になるポリペプチドをコードする。本明細書では、「から本質的になる」とは、この語句により特定した要素を含むことを意味し、他の要素を含むとしても、列挙された要素について本明細書で開示された活性もしくは作用を妨害しないか、又はこの活性もしくは作用に寄与しない他の要素に限定される。例えば、１個〜数個のアミノ酸が付加又は削除された形態は、「から本質的になる」により特定される形態の一例である。Ｂ５Ｒのシグナルペプチドの例としては、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の１番目のアミノ酸から１９番目のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸番号１から１９までのアミノ酸配列）に対応するＢ５Ｒの領域が挙げられる。Ｂ５Ｒのストークの例としては、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２３８番目のアミノ酸から２７５番目のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸番号２２から５９までのアミノ酸配列）に対応するＢ５Ｒの領域が挙げられる。Ｂ５Ｒの膜貫通ドメインの例としては、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２７６番目のアミノ酸から３０３番目のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸番号６０から８７までのアミノ酸配列）に対応するＢ５Ｒの領域が挙げられる。Ｂ５Ｒの細胞質尾部の例としては、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＡ４���３１６．１に登録されたアミノ酸配列の３０４番目のアミノ酸から３１７番目のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸番号８８から１０１までのアミノ酸配列）に対応するＢ５Ｒの領域が挙げられる。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、配列番号２のアミノ酸番号１から１９までのアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのシグナルペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、配列番号２のアミノ酸番号１から１９までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、配列番号２のアミノ酸番号１から１９までのアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのシグナルペプチド及び配列番号２のアミノ酸番号２２から５９までのアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのストークを含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、配列番号２のアミノ酸番号１から１９までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド及び配列番号２のアミノ酸番号２２から５９までのアミノ酸配列からなるストークを含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、配列番号２のアミノ酸番号１から１９までのアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのシグナルペプチド、配列番号２のアミノ酸番号２２から５９までのアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのストーク及び配列番号２のアミノ酸番号６０から８７までのアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒの膜貫通ドメインを含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、配列番号２のアミノ酸番号１から１９までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド、配列番号２のアミノ酸番号２２から５９までのアミノ酸配列からなるＢ５Ｒのストーク及び配列番号２のアミノ酸番号６０から８７までのアミノ酸配列からなるＢ５Ｒの膜貫通ドメインを含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする。
【００３６】
本発明のワクシニアウイルスがＳＣＲドメイン１〜４の一部又は全部を欠失したＢ５Ｒをコードしているか否かは、公知の方法を用いて判断することができる。例えば、ワクシニアウイルス表面上に発現させたＢ５Ｒに対してＳＣＲドメイン１〜４に結合する抗体を用いた免疫化学的手法によりＳＣＲドメイン１〜４の存在を確認することや、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＢ５Ｒ遺伝子中のＳＣＲドメイン１〜４をコードする領域の存在又はサイズを決定することにより、判断することができる。
【００３７】
本発明のワクシニアウイルスは、１つの実施形態において、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損しているワクシニアウイルスである。国際公開第２０１５／０７６４２２号に記載の方法に基づいて、ワクシニアウイルスからＶＧＦ及び／又はＯ１Ｌの機能を欠損させることができる。
【００３８】
ＶＧＦは上皮増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）と高いアミノ酸配列相同性を有する蛋白質であり、ＥＧＦと同様に上皮増殖因子受容体に結合し、Ｒａｓ、Ｒａｆ、分裂促進因子活性化蛋白質キナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ、ＭＡＰＫ）／細胞外シグナル調節キナーゼ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ、ＥＲＫ）  キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ  キナーゼ、ＭＥＫ）、そしてＥＲＫと続くシグナルカスケードの活性化を引き起こし、細胞分裂を促進する。
【００３９】
Ｏ１ＬはＥＲＫの活性化を維持し、ＶＧＦと共に細胞の分裂に寄与する。
【００４０】
ワクシニアウイルスのＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能の欠損とは、ＶＧＦをコードする遺伝子及びＯ１Ｌをコードする遺伝子が発現しないか、又は発現してもその発現蛋白質がＶＧＦ及びＯ１Ｌの正常な機能を保持していないことをいう。ワクシニアウイルスのＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損させるためには、ＶＧＦをコードする遺伝子及びＯ１Ｌをコードする遺伝子の全て又は一部を欠失させればよい。また、塩基の置換、欠失、挿入又は付加により遺伝子を変異させ、正常なＶＧＦ及びＯ１Ｌが発現できないようにしてもよい。また、ＶＧＦをコードする遺伝子及びＯ１Ｌをコードする遺伝子中に外来遺伝子を挿入してもよい。本発明において、遺伝子の置換、欠失、挿入又は付加などの変異により正常な機能的遺伝子産物が発現されない場合、遺伝子が欠損しているという。例えば、外来遺伝子としては、免疫機能を賦活化させるサイトカインを導入することができる。
【００４１】
本発明のワクシニアウイルスがＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損しているか否かは、公知の方法を用いて判断することができる。例えば、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能評価を行うこと、ＶＧＦに対する抗体又はＯ１Ｌに対する抗体を用いた免疫化学的手法によりＶＧＦ又はＯ１Ｌの存在を確認することや、ＰＣＲによりＶＧＦをコードする遺伝子やＯ１Ｌをコードする遺伝子の存在を決定することにより、判断することができる。
【００４２】
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ワクシニアウイルスである。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストークを有し得る。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク及び膜貫通ドメインを有し得る。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有し得る。
【００４３】
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ワクシニアウイルスである。この実施形態において、ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒは、ストークを有し得る。この実施形態において、ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒは、ストーク及び膜貫通ドメインを有し得る。この実施形態において、ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有し得る。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、配列番号１により示されるアミノ酸配列に対応する領域を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ワクシニアウイルスである。この実施形態において、前記領域を欠失したＢ５Ｒは、ストークを有し得る。この実施形態において、前記領域を欠失したＢ５Ｒは、ストーク及び膜貫通ドメインを有し得る。この実施形態において、前記領域を欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有し得る。
【００４５】
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、Ｂ５ＲのＳＣＲドメインを欠失し、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を含むポリペプチドをコードする、ワクシニアウイルスである。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有する。
【００４６】
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒが、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのアミノ酸配列からなる、ワクシニアウイルスである。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有する。
【００４７】
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ＬＣ１６ｍＯ株ワクシニアウイルスである。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストークを有し得る。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク及び膜貫通ドメインを有し得る。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有し得る。
【００４８】
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ＬＣ１６ｍＯ株ワクシニアウイルスである。この実施形態において、ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒは、ストークを有し得る。この実施形態において、ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒは、ストーク及び膜貫通ドメインを有し得る。この実施形態において、ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有し得る。
【００４９】
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、配列番号１により示されるアミノ酸配列に対応する領域を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ＬＣ１６ｍＯ株ワクシニアウイルスである。この実施形態において、前記領域を欠失したＢ５Ｒは、ストークを有し得る。この実施形態において、前記領域を欠失したＢ５Ｒは、ストーク及び膜貫通ドメインを有し得る。この実施形態において、前記領域を欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有し得る。
【００５０】
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、Ｂ５ＲのＳＣＲドメインを欠失し、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を含むポリペプチドをコードする遺伝子を有する、ＬＣ１６ｍＯ株ワクシニアウイルスである。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有する。
【００５１】
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒが、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのアミノ酸配列からなる、ＬＣ１６ｍＯ株ワクシニアウイルスである。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有する。
【００５２】
本発明において使用されるワクシニアウイルスにおいては、さらに弱毒化及び／又は腫瘍選択性を改変することができる。本明細書では、「弱毒化」とは、正常な細胞（例えば、非腫瘍細胞）に対する毒性（例えば、細胞溶解性）が低いことを意味する。本明細書では、「腫瘍選択性」とは、正常な細胞（例えば、非腫瘍細胞）よりも腫瘍細胞に対する毒性（例えば、腫瘍溶解性）が高いことを意味する。本発明において使用されるワクシニアウイルスにおいては、さらに、特定の蛋白質の機能を欠損したり、特定の遺伝子又は蛋白質の発現を抑制したりするような遺伝子改変（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１１、Ｖｏｌ．１１、ｐ．５９５−６０８）が加えられていてよい。例えば、ワクシニアウイルスの腫瘍選択性を高めるために、チミジンキナーゼ（ＴＫ）の機能の欠損（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９９、Ｖｏｌ．６、ｐ．４０９−４２２）、修飾ＴＫ遺伝子及び修飾ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子並びに修飾Ｆ３遺伝子又は中断されたＦ３遺伝子座の導入（国際公開第２００５／０４７４５８号）、ＴＫ及びＨＡ並びにＦ１４．５Ｌの機能の欠損（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００７、Ｖｏｌ．６７、ｐ．１００３８−１００４６）、ＴＫ及びＢ１８Ｒの機能の欠損（ＰＬｏＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００７、Ｖｏｌ．４、ｐ．ｅ３５３）、ＴＫ及びリボヌクレオチド還元酵素の機能の欠損（ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、２０１０、Ｖｏｌ．６、ｐ．ｅ１０００９８４）、ＳＰＩ−１及びＳＰＩ−２の機能の欠損（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５、Ｖｏｌ．６５、ｐ．９９９１−９９９８）、ＳＰＩ−１、ＳＰＩ−２及びＴＫの機能の欠損（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００７、Ｖｏｌ．１４、ｐ．６３８−６４７）、又は、Ｅ３Ｌ及びＫ３Ｌ領域に変異の導入（国際公開第２００５／００７８２４号）をすることができる。また、生体内において抗ワクシニアウイルス抗体の中和効果によるウイルスの排除を減弱させることを期待し、Ａ３４Ｒ領域を欠損（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１３、Ｖｏｌ．２１、ｐ．１０２４−１０３３）させることができる。また、ワクシニアウイルスによる免疫細胞活性化作用を期待し、インターロイキン−１ｂ（ＩＬ−１ｂ）受容体を欠損（国際公開第２００５／０３０９７１号）させることができる。これらの外来遺伝子の挿入や遺伝子の欠失、変異は例えば公知の相同組換えや部位特異的突然変異導入法により行うことができる。また、本発明のワクシニアウイルスとしては、これらの遺伝子改変の組合せを有していてもよい。本明細書では、「欠損」とは、この用語により特定された遺伝子領域が機能を有しないことを意味し、この用語により特定された遺伝子領域を欠失していることを含む意味で用いられる。例えば、「欠損」とは、特定された遺伝子領域からなる領域において欠失が生じていてもよいし、特定された遺伝子領域を含む周辺の遺伝子領域において欠失が生じていてもよい。
【００５３】
ワクシニアウイルスはＩＭＶの形態及びＥＥＶの形態をとりうる。ＩＭＶは感染性の子孫ウイルスの大多数を占め、感染細胞の溶解まで感染細胞の細胞質にとどまる。ＩＭＶの形態で細胞に感染させると、感染細胞にＥＥＶの形態を産生させ得る。ＥＥＶの形態は、生体内においては感染箇所と離れた細胞への遠隔感染に適した形態であり、ＩＭＶに宿主由来の外膜を被せた形態をとる（ＰＮＡＳ、１９９８、Ｖｏｌ.９５、ｐ．７５４４−７５４９）。ＥＥＶは、ワクシニアウイルス産生ベクター又はワクシニアウイルスを感染させた細胞の培養液の上清から得られ得る。ＩＭＶは、ワクシニアウイルス産生ベクター又はワクシニアウイルスを感染させた細胞の細胞体から得られ得る。ＩＭＶとＥＥＶとの混合物の形態は、ワクシニアウイルス産生ベクター又はワクシニアウイルスを感染させた細胞の培養液の上清を含む細胞溶解液から得られ得る。細胞溶解液は、常法に従って得ることができ、例えば超音波破砕や浸透圧ショック法により細胞を破壊することにより得ることができる。ＩＭＶ形態がワクシニアウイルスの主な投与形態の一例である。
【００５４】
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＥＥＶ形態となったとき、ＳＣＲを欠失したＢ５Ｒの細胞外領域を表出しうるが、必ずしも常時ＥＥＶ形態をとる必要は無く、感染細胞にＥＥＶ形態を産生させたときに、ＳＣＲを欠失したＢ５Ｒの細胞外領域をＥＥＶに表出できればよい。
【００５５】
本発明のワクシニアウイルスは、感染細胞において、ＳＣＲを欠失していない野生型Ｂ５Ｒをコードする遺伝子を有するワクシニアウイルスに比べてより高い免疫回避能をもつＥＥＶを産生し得ることから、遠隔感染形質強化型組換えワクシニアウイルスとも呼ぶことができる。
【００５６】
公知の相同組換えや部位特異的突然変異導入法により外来ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のワクシニアウイルスへ導入することができる。例えば、導入したい部位の塩基配列中に当該ポリヌクレオチドを導入したプラスミド（「トランスファーベクタープラスミドＤＮＡ」とも称する。）を作製し、ワクシニアウイルスを感染させた細胞の中に導入することができる。当該ポリヌクレオチドの導入領域は、ワクシニアウイルスの生活環に必須ではない遺伝子領域である。例えば、ある態様では、該ＶＧＦ遺伝子及び該Ｏ１Ｌ遺伝子のいずれか又は両方の内部とすることができる。上記において、外来ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌ遺伝子の転写方向と同じ向き又は逆向きに転写されるように導入することができる。外来ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、マーカー、細胞毒性や免疫賦活効果を有する治療用産物、又は抗原等をコードするポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
トランスファーベクタープラスミドＤＮＡの細胞への導入方法は、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等を用いることができる。
【００５８】
外来ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する際に、導入される該ポリヌクレオチドの上流に適当なプロモーターを作動可能に連結させることができる。これにより、本発明のワクシニアウイルスでは、外来ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、腫瘍細胞で発現可能なプロモーターに連結され得る。これらのプロモーターとしては、例えば、ＰＳＦＪ１−１０、ＰＳＦＪ２−１６、ｐ７．５Ｋプロモーター、ｐ１１Ｋプロモーター、Ｔ７．１０プロモーター、ＣＰＸプロモーター、ＨＦプロモーター、Ｈ６プロモーター、及びＴ７ハイブリッドプロモーターなどが挙げられる。
【００５９】
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、薬剤選択マーカー遺伝子を有しない。
【００６０】
本発明のワクシニアウイルスは、腫瘍溶解活性を有する。被験ウイルスが腫瘍溶解活性を有するかどうかを評価する方法として、ウイルス添加によるがん細胞の生存率低下を評価する方法が挙げられる。評価に使用するがん細胞としては、例えば、卵巣癌細胞Ａ２７８０（例えば、ＥＣＡＣＣ  ９３１１２５１９）、ＣａＯＶ３（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＨＴＢ−７５）、ＲＭＧ−１（例えば、ＪＣＲＢ  ＪＣＲＢ０１７２）、ＳＫＯＶ３（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＨＴＢ−７７）が挙げられるが、これらに限らない。悪性黒色腫細胞ＲＰＭＩ−７９５１（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＨＴＢ−６６）、肺癌細胞Ａ５４９（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＣＬ−１８５）、肺腺癌細胞ＨＣＣ４００６（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＲＬ−２８７１）、小細胞肺癌細胞ＤＭＳ  ５３（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＲＬ−２０６２）、肺扁平上皮癌細胞ＮＣＩ−Ｈ２２６（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＲＬ−５８２６）、腎癌細胞Ｃａｋｉ−１（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＨＴＢ−４６）、膀胱癌細胞６４７−Ｖ（例えば、ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ４１４）、頭頸部癌細胞Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＣＬ−１３８）、乳癌細胞ＪＩＭＴ−１（例えば、ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ５８９）、乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＨＴＢ−２６）、食道癌細胞ＯＥ３３（例えば、ＥＣＡＣＣ  ９６０７０８０８）、グリア芽細胞腫Ｕ−８７ＭＧ（例えば、ＥＣＡＣＣ  ８９０８１４０２）、神経芽細胞腫ＧＯＴＯ（例えば、ＪＣＲＢ  ＪＣＲＢ０６１２）、骨髄腫ＲＰＭＩ  ８２２６（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＣＬ−１５５）、卵巣癌細胞ＳＫ−ＯＶ−３（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＨＴＢ−７７）、卵巣癌細胞ＯＶＭＡＮＡ（例えば、ＪＣＲＢ  ＪＣＲＢ１０４５）、大腸癌細胞ＲＫＯ（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＲＬ−２５７７）、大腸癌細胞ＨＣＴ  １１６（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＣＬ−２４７）、膵臓癌細胞ＢｘＰＣ３（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＲＬ−１６８７）、前立腺癌細胞ＬＮＣａＰ  ｃｌｏｎｅ  ＦＧＣ（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＲＬ−１７４０）、肝癌細胞ＪＨＨ−４（例えば、ＪＣＲＢ  ＪＣＲＢ０４３５）、中皮腫ＮＣＩ−Ｈ２８（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＲＬ−５８２０）、子宮頸癌細胞ＳｉＨａ（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）  ＨＴＢ−３５）、及び、胃癌細胞Ｋａｔｏ  ＩＩＩ（例えば、ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ  ＲＣＢ２０８８）も挙げられる。具体的な評価方法としては、例えば、後記実施例４に記載されるような方法を用いることができる。
【００６１】
本発明のワクシニアウイルスの発現及び／又は増殖は、ワクシニアウイルスを宿主細胞に感染させ、感染させた宿主細胞を培養することにより行うことができる。ワクシニアウイルスの発現及び／又は増殖は、当該分野で公知の方法により行うことができる。本発明のワクシニアウイルスを発現又は増殖させるために用いる宿主細胞としては、本発明のワクシニアウイルスを発現し、増殖できるものである限り、特に制限されるものではない。このような宿主細胞としては、例えば、ＢＳ−Ｃ−１、Ａ５４９、ＲＫ１３、ＨＴＫ−１４３、Ｈｅｐ−２、ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ、ＣＶ−１、ＣＯＳ、ＢＨＫ−２１、及び初代ウサギ腎臓細胞等の動物細胞が挙げられ、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＣＬ−２６）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＣＬ−１８５）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＣＬ−７０）又はＲＫ１３（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＣＬ−３７）を使用することができる。宿主細胞の培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ、及び培養時間は、適宜選択される。
【００６２】
本発明のワクシニアウイルスを生産する方法は、本発明のワクシニアウイルスを宿主細胞に感染させ、感染させた宿主細胞を培養し、本発明のワクシニアウイルスを発現させる工程に加えて、さらには、本発明のワクシニアウイルスを回収、精製、単離又は濃縮する工程を含むことができる。精製方法、単離方法又は濃縮方法としては、当業者に周知の方法を用いることができ、例えば、ベンゾナーゼを用いたＤＮＡ消化、ショ糖勾配遠心分離法、Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ密度勾配遠心分離法、限外ろ過法、及びダイアフィルトレーション法などを用いることができる。
【００６３】
＜本発明の医薬組成物＞
本発明の医薬組成物には、本発明のワクシニアウイルス及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。
【００６４】
本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、及び点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与、又は腫瘍内投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、又は添加剤等を使用することができる。
【００６５】
有効投与量は患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、又はウイルスの力価等により異なるが、例えば、単独ウイルスの有効投与量として、１０2〜１０10プラーク形成単位（ＰＦＵ）程度を用いることができる。
【００６６】
＜がんの予防又は治療用途＞
本発明の医薬組成物は、がんの予防又は治療剤として用いることができる。
【００６７】
本発明には、本発明のワクシニアウイルスを含む、がんの予防又は治療用医薬組成物が含まれる。
【００６８】
また、本発明には、がんの予防又は治療を必要とする対象（例えば、患者）に本発明のワクシニアウイルスの治療上有効量を投与する工程を包含する、がんを予防又は治療する方法が含まれる。
【００６９】
また、本発明には、がんの予防又は治療に使用するための、本発明のワクシニアウイルスが含まれる。
【００７０】
さらに、本発明には、がんの予防又は治療用の医薬組成物の製造における、本発明のワクシニアウイルスの使用が含まれる。
【００７１】
本明細書では、「予防用」とは「予防することに用いるための」と同義で用いられ、「治療用」とは「治療することに用いるための」と同義で用いられる。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、がんに有効性を示す種々の治療剤と併用することができる。当該併用は、同時投与、又は別個に連続して、若しくは所望の時間間隔をおいて投与してもよい。本発明の医薬組成物は、同時投与の場合には、配合剤であっても別個に製剤化されていてもよい。
【００７３】
本発明のワクシニアウイルス、本発明の医薬組成物、本発明のがんを予防若しくは治療する方法、又は本発明の使用が適用されるがんには、例えば、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、及び胃癌等が含まれ、原発巣以外の臓器、例えばリンパ節や肝臓などへの転移性がんなども含まれる。
【００７４】
本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００７５】
市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。
【００７６】
（実施例１：トランスファーベクタープラスミドＤＮＡの構築）
相同組換え法により組換えワクシニアウイルスを作製するために使用するトランスファーベクタープラスミドＤＮＡを以下の通りに作製した。
【００７７】
（１）ｐＵＣ１９−ＶＧＦトランスファーベクタープラスミドＤＮＡの構築
国際公開第２０１５／０７６４２２号に基づいてｐＵＣ１９−ＶＧＦベクターを作製した。より具体的には、ｐＵＣ１９−ＶＧＦベクター作製のために、ＬＣ１６ｍＯ株のゲノムＤＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ６７８２７７．１）を鋳型に使用し、ＰＣＲでＶＧＦ遺伝子領域を増幅し、そのＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＵＣ１９ベクター（製品コード：５４３５７）の同じ制限酵素部位にクローニングした。
【００７８】
（２）ｐＴＮ−ＶＧＦ−ＳＰ−Ｌｕｃ２トランスファーベクタープラスミドＤＮＡの構築
ｐＴａｇＢＦＰ−Ｎ  ｖｅｃｔｏｒ（ＦＰ１７２、Ｅｖｒｏｇｅｎ社）のＤＮＡを鋳型として、２つのプライマー（配列番号７及び配列番号８）によってＢＦＰ遺伝子領域を増幅した。そのＰＣＲ産物を制限酵素ＳｆｉＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、ｐＴＫ−ＳＰ−ＬＧベクター(国際公開第２０１５／０７６４２２号。但し、鋳型として使用したＬＣ１６ｍＯ株のゲノムＤＮＡとして、ゲノムＤＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ６７８２７７．１）を使用し、ｐＵＣ１９ベクターとしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＵＣ１９ベクター（製品コード：５４３５７）を使用した。また、ｐＶＮＣ１１０−Ｌｕｃ／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰプラスミドは国際公開第２０１１／１２５４６９号に記載のｐＶＮＣ１１０−Ｌｕｃ／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰを使用した。)の同じ制限酵素部位にクローニングし、合成ワクシニアウイルスプロモーター（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９７、Ｖｏｌ．６６、ｐ．１３５−１３８）下にＢＦＰを連結したｐＴＫ−ＳＰ−ＢＦＰを構築した。次に、ｐＴＫ−ＳＰ−ＢＦＰを制限酵素ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、末端を平滑化した。こうして得られたＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１９−ＶＧＦベクターを制限酵素ＡｃｃＩで切断し末端を平滑化した部位へクローニングすることで、ｐＴＮ−ＶＧＦ−ＳＰ−ＢＦＰを構築した。次に、プロメガ社のｐＧＬ４．２０ベクター（製品コード：Ｅ６７５１）をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、末端を平滑化した。そして、ＸｂａＩで切断することによって、ルシフェラーゼＬｕｃ２遺伝子をコードするポリヌクレオチド（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＤＱ１８８８４０の１００番目から１７５２番目）断片を得た。この断片を、ｐＴＮ−ＶＧＦ−ＳＰ−ＢＦＰをＡｇｅＩで切断し、末端を平滑化し、さらにＮｈｅＩで切断した部位へクローニングすることで、合成ワクシニアウイルスプロモータで駆動されるＬｕｃ２遺伝子を有するトランスファーベクタープラスミドＤＮＡを構築した。構築したプラスミドＤＮＡをｐＴＮ−ＶＧＦ−ＳＰ−Ｌｕｃ２と称する。
【００７９】
（３）ｐＴＮ−Ｏ１Ｌ−ＳＰ−ＢＦＰ及びｐＴＮ−Ｏ１Ｌ−ＳＰ−ＬａｃＺトランスファーベクタープラスミドＤＮＡの構築
上記（２）と同様の方法で、ｐＴＫ−ＳＰ−ＢＦＰを制限酵素ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、末端を平滑化して得られたＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１９−Ｏ１Ｌベクター（国際公開第２０１５／０７６４２２号。但し、ＬＣ１６ｍＯ株のゲノムＤＮＡとして、ゲノムＤＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ６７８２７７．１）を使用し、ｐＵＣ１９ベクターとしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＵＣ１９ベクター（製品コード：５４３５７）を使用した。Ｏ１Ｌ遺伝子領域はｐＵＣ１９ベクターのＸｂａＩサイトに挿入した。）を制限酵素ＸｂａＩで切断し末端を平滑化した部位へクローニングすることで、トランスファーベクタープラスミドＤＮＡを作製した。作製したプラスミドＤＮＡをｐＴＮ−Ｏ１Ｌ−ＳＰ−ＢＦＰと称する。次に、ヒトに対してコドンを最適化した大腸菌ＬａｃＺ遺伝子を含むポリヌクレオチド（配列番号９）を制限酵素ＡｇｅＩとＮｈｅＩで切断した。ＬａｃＺをコードするポリヌクレオチド断片をｐＴＮ−Ｏ１Ｌ−ＳＰ−ＢＦＰベクターの同じ制限酵素部位（ＡｇｅＩ部位及びＮｈｅＩ部位）にクローニングしＢＦＰを置き換えることで、合成ワクシニアウイルスプロモータで駆動されるＬａｃＺ遺伝子を有するトランスファーベクタープラスミドＤＮＡを構築した。構築したプラスミドＤＮＡをｐＴＮ−Ｏ１Ｌ−ＳＰ−ＬａｃＺと称する。
【００８０】
（４）ｐＴＮ−ＤｓＲｅｄ（Ｂ５Ｒ−）及びｐＴＮ−Ｂ５ＲΔ１−４トランスファーベクタープラスミドＤＮＡの構築
ｐＢ５Ｒ（国際公開第２０１１／１２５４６９号。但し、ＬＣ１６ｍＯ株のゲノムＤＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ６７８２７７．１）を鋳型に使用した。）のＤＮＡを鋳型として、２つのプライマー（配列番号３及び配列番号４）によってＢ４Ｒ遺伝子領域を増幅した。そのＰＣＲ産物を制限酵素ＮｏｔＩ及びＦｓｐＩで切断した。また、ｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＤＮＡを鋳型として、２つのプライマー（配列番号５及び配列番号６）によってＤｓＲｅｄ遺伝子領域を増幅した。そのＰＣＲ産物を制限酵素ＦｓｐＩ及びＭｆｅＩで切断した。この２種類のＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｏｔＩ及びＭｆｅＩで切断したｐＢ５Ｒにクローニングすることで、トランスファーベクタープラスミドＤＮＡを作製した。作製したプラスミドＤＮＡをｐＴＮ−ＤｓＲｅｄ（Ｂ５Ｒ−）と称する。一方、ｐＢ５Ｒを制限酵素ＮｏｔＩ及びＮｓｐＩで、又は制限酵素ＮｓｐＩ及びＳａｃＩで切断した。この２種類のＤＮＡ断片（前者はＢ４ＲとＢ５Ｒの１番目から２１番目まで（Ｎ末部分）に及ぶ領域に相当し、後者はＢ５Ｒの２３６番目から３１７番目まで（Ｃ末部分）とさらにＢ６Ｒに及ぶ領域に相当する。前者の領域中の突出末端（２０〜２１番目の配列に相当）と後者の領域中の突出末端（２３６番目〜２３７番目の配列に相当）とは互いに相補的である。）を、制限酵素ＮｏｔＩとＳａｃＩで切断したｐＢ５Ｒにクローニングすることで、トランスファーベクタープラスミドＤＮＡを構築した。作製したプラスミドＤＮＡをｐＴＮ−Ｂ５ＲΔ１−４と称する。ｐＴＮ−Ｂ５ＲΔ１−４には４つのＳＣＲドメインが欠失したＢ５Ｒ蛋白質がコードされる。４つのＳＣＲドメインが欠失したＢ５Ｒ蛋白質は配列番号２に示した配列となる。
【００８１】
（実施例２：遺伝子組換えワクシニアウイルスの構築）
国際公開第２０１５／０７６４２２号に記載の方法に基づいてワクシニアウイルスＬＣ１６ｍＯ株からＶＧＦとＯ１Ｌの機能を欠損させた組換えワクシニアウイルス（ＬＣ１６ｍＯ  ＶＧＦ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１Ｌ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄと称する。）を作製した。これについて、次世代シークエンサーＰａｃＢｉｏ  ＲＳＩＩ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、シークエンシングを行い、得られた配列情報から、Ｓｐｒａｉ［ＢＭＣ  ＧＥＮＯＭＩＣＳ、２０１４、Ｖｏｌ．１５、Ｎｏ．６９９、ｐ．１−８］ソフトウェアを利用してウイルスゲノムの再構成を行って塩基配列を決定したところ、配列番号１８で示される塩基配列を有していた。また、当該塩基配列の両末端にはループ配列（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９０、Ｖｏｌ．１７９、ｐ．２４７−２６６）が付加されており、両末端ループ配列は配列番号１６又は配列番号１７で示される塩基配列であった。
【００８２】
（１）図１Ａに示すウイルスゲノムを持つ組換えワクシニアウイルスを回収した。以下、回収手順について具体的に説明する。６ウェルディッシュに８０％コンフルエントに培養されたＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＣＬ−７０）又はＲＫ１３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＣＬ−３７）に上記ＬＣ１６ｍＯ  ＶＧＦ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１Ｌ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄをＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝０．０２〜０．１で感染させ、室温で１時間吸着させた。実施例１（３）で構築したｐＴＮ−Ｏ１Ｌ−ＳＰ−ＢＦＰをＦｕＧＥＮＥ（登録商標）  ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）と混合し、マニュアルに従って細胞に添加して取り込ませ、５％ＣＯ2存在下３７℃にて２〜５日間培養し、培養液と共に感染細胞をスクレーパーにより剥離させ回収した。細胞を凍結融解後、ソニケーション処理し、下記操作により単一のプラークを取得できる程度にＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて希釈した。得られた希釈液１００μＬを６ウェルディッシュにサブコンフルエントになったＢＳ−Ｃ−１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＣＬ−２６）又はＲＫ１３細胞に添加して接種した。０．８％メチルセルロース（和光純薬、１３６−０２１５５）、５％ウシ胎児血清、０．２２５％炭酸水素ナトリウム（和光純薬、１９５−１６４１１）及びＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｉ（ＧＩＢＣＯ、３５０５０−０６１）含有イーグルＭＥＭ培地（ニッスイ、０５９００）を２ｍＬ加え、５％ＣＯ2存在下３７℃で２〜５日間培養した。培地を除き、ＢＦＰ発現を指標にプラークをチップの先で掻き取り、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに浮遊させた。ＢＳ−Ｃ−１細胞又はＲＫ１３細胞にてさらに３回以上この操作を繰り返し、プラーク純化し、組換えウイルスのプラークを回収した（本実施例２において、以下、ここまでの手順を「ウイルスの回収」という。）。回収したプラークをＯｐｔｉ−ＭＥＭに浮遊させ、ソニケーションした。Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いマニュアルに従って、前記ソニケーション溶液２００μＬからゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによるスクリーニングに供した。ＶＧＦに関しては２つのプライマー（配列番号１０及び配列番号１１）によって、Ｏ１Ｌに関しては２つのプライマー（配列番号１２及び配列番号１３）によって、Ｂ５Ｒに関しては２つのプライマー（配列番号１４及び配列番号１５）によってＰＣＲを行った。所定の大きさのＰＣＲ産物が検出されたクローンのうち、ＰＣＲ産物の塩基配列が正しいことをダイレクトシーケンスにより確認したウイルスクローン（ＬＣ１６ｍＯ  ＶＧＦ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１−ＳＰ−ＢＦＰ、又はＢ５Ｒウイルスと称する。図中、単にＢ５Ｒとも称する。図１Ａ）を選択し、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＣＬ−１８５）又はＲＫ１３細胞にて増殖させた後、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定し、実施例４−７に記載の実験に供した。ＬＣ１６ｍＯ  ＶＧＦ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１−ＳＰ−ＢＦＰ及び実施例１（４）で作製したｐＴＮ−ＤｓＲｅｄ（Ｂ５Ｒ−）を用いて、ＢＦＰ発現の代わり���ＤｓＲｅｄ発現を指標に、上記と同様の方法にて組換えウイルスを回収した。回収したウイルスをＬＣ１６ｍＯ  Δ−ＤｓＲｅｄ  ＶＧＦ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１Ｌ−ＳＰ−ＢＦＰと称する。
【００８３】
（２）図１Ｂに示すＢ５Ｒ蛋白質の４つのＳＣＲドメインを欠失した組換えウイルスを回収した。具体的には、実施例２（１）で作製したＬＣ１６ｍＯ  Δ−ＤｓＲｅｄ  ＶＧＦ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１Ｌ−ＳＰ−ＢＦＰ及び実施例１（４）で構築したｐＴＮ−Ｂ５ＲΔ１−４を用いて、ＢＦＰ発現の代わりにＤｓＲｅｄ発現消失を指標に、実施例２（１）と同様の方法にて組換えウイルスを回収した。回収したプラークを実施例２（１）に記載の手順と同じ手順にて、ＰＣＲによるスクリーニングに供し、ＰＣＲ産物をダイレクトシーケンスにより確認した。正しい塩基配列を有するウイルスクローン（ＬＣ１６ｍＯ  ΔＳＣＲ  ＶＧＦ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１−ＳＰ−ＢＦＰ、又はΔＳＣＲウイルスと称する。図中、単にΔＳＣＲとも称する（図１Ｂ））を選択し、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＣＬ−１８５）又はＲＫ１３細胞にて増殖させた後、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定し、実施例４−７に記載の実験に供した。
【００８４】
（３）Ｂ５Ｒウイルス及びΔＳＣＲウイルスにおいて、ＶＧＦ遺伝子内のＬｕｃＧＦＰをコードするポリヌクレオチド及びＯ１Ｌ遺伝子内のＢＦＰをコードするポリヌクレオチドを、それぞれＬｕｃ２をコードするポリヌクレオチド及びＬａｃＺをコードするポリヌクレオチドで置き換えたウイルスを作製するために、実施例２（１）で回収したＢ５Ｒウイルス又は実施例２（２）で回収したΔＳＣＲウイルスと、実施例１（２）で作製したｐＴＮ−ＶＧＦ−ＳＰ−Ｌｕｃ２及び実施例１（３）で作製したｐＴＮ−Ｏ１Ｌ−ＳＰ−ＬａｃＺを用いて、実施例２（１）と同様の方法にて（但し、細胞としてはＣＶ−１細胞を用いる）組換えウイルスを回収した。Ｂ５Ｒウイルスを起源ウイルスとする組換えウイルスをＢ５Ｒ−ＬＬウイルスと、ΔＳＣＲウイルスを起源ウイルスとする組換えウイルスをΔＳＣＲ−ＬＬウイルスと称する。
【００８５】
（実施例３  ＥＥＶ又はＩＭＶの回収及び力価測定）
ＥＥＶは感染初期に細胞上清中に放出され、ＩＭＶは感染初期には細胞内に留まるという性質からウイルス感染細胞の培養液中の上清中のウイルスをＥＥＶとして回収した。すなわち、感染後４８時間で培養液を回収し、７００×ｇ、４℃、１０分の遠心で浮遊細胞を落として上清のみを取り出し、ＥＥＶとして回収し、力価測定を行った。一方、上清を回収した後に残った浮遊細胞と共に、プレート内の接着細胞をダルベッコ−リン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；Ｄ−ＰＢＳ（Ｗａｋｏ）で洗浄後セルスクレーパーにより剥離させＯｐｔｉ−ＭＥＭを加えて回収し、凍結融解及びソニケーション処理により細胞を破砕し、７００×ｇ、４℃、１０分遠心後に上清をＩＭＶとして回収した。
【００８６】
ウイルスの力価測定には、６ウェルプレートにほぼコンフルエントで播種したＲＫ１３細胞へ段階希釈（１０1〜１０7倍希釈、想定するウイルス力価に応じて希釈率は変化）した各ウイルスのＥＥＶ又はＩＭＶを感染させ、０．８％メチルセルロース（和光純薬、１３６−０２１５５）、５％ウシ胎児血清、０．２２５％炭酸水素ナトリウム（和光純薬、１９５−１６４１１）及びＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｉ（ＧＩＢＣＯ、３５０５０−０６１）含有イーグルＭＥＭ培地（ニッスイ、０５９００）を２ｍＬ加え、５％ＣＯ2存在下３７℃で３日間培養後、形成されるウイルスプラーク数を測定することで、ＥＥＶ又はＩＭＶのウイルス力価（産生量）を算出した。
【００８７】
（実施例４  ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスのＥＥＶ又はＩＭＶによる細胞死滅効果）
ＥＥＶ又はＩＭＶによる細胞死滅効果への影響を検証した。
【００８８】
（１）ＩＭＶによる細胞死滅効果
まずＩＭＶによる細胞死滅効果を比較するため、９６ウェルプレートに４種の卵巣癌細胞株（Ａ２７８０（ＥＣＡＣＣ  ９３１１２５１９）、ＣａＯＶ３（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＨＴＢ−７５）、ＲＭＧ−１（ＪＣＲＢ  ＪＣＲＢ０１７２）、ＳＫＯＶ３（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＨＴＢ−７７））を６．０×１０3細胞／ウェルで播種し、３７℃、２４時間培養後６０〜８０％コンフルエントになったところでＢ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルスをＭＯＩ＝０、０．００１、０．０１、０．１、１で各細胞株に感染させた。Ｂ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルスは専らＩＭＶ形態を有すると考えられる。感染から１２０時間後にＢＺ−Ｘ７００（キーエンス）を用いた蛍光観察（図２−１）及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた細胞生存率測定（図３のパネルＡ）を行った。蛍光観察像ではウイルスのＶＧＦ遺伝子内に挿入されたＥＧＦＰ遺伝子の発現により、ウイルス増殖がＧＦＰ蛍光として観察される。細胞を播種していないウェルの値を０％生存、細胞を播種してウイルスを添加していないウェルを１００％生存として細胞生存率を求めた。
【００８９】
（２）ＥＥＶによる細胞死滅効果
次に、ＥＥＶによる細胞死滅効果を測定するため、上記（１）と同様の細胞に各ウイルスをＭＯＩ＝０、０．００１、０．０１、０．１、１で感染させ４８時間培養した。その後、感染細胞の培養液５０μｌを回収し、７００×ｇ、４℃、１０分の遠心で上清のみをＥＥＶとして回収した。回収したＥＥＶを９６ウェルプレートに新たに播種した上記４種の卵巣癌細胞株へ感染させた。ＥＥＶ感染から１２０時間後、上記（１）と同様に蛍光観察（図２−２）及び細胞生存率測定（図３のパネルＢ）を行った。
【００９０】
図２−１及び図３のパネルＡに示されるように、ウイルス増殖と細胞生存率はほぼ一致して見られ、どの細胞でもＩＭＶ感染時には増殖域、細胞生存率共にＢ５Ｒウイルス及びΔＳＣＲウイルス間で大きな差は見られなかった（図２−１、図３のパネルＡ）。これはＥＥＶの量がＩＭＶの約１％又はそれ以下と低く、観察された効果は主にはＩＭＶによる効果と考えられるが、ＩＭＶの産生量はどの細胞でも差が無かったためと考えられる。一方、図２−２及び図３のパネルＢに示されるように、ＥＥＶ感染時はＡ２７８０及びＣａＯＶ３細胞においてＢ５Ｒウイルスと比べΔＳＣＲウイルスで増殖域の増大、細胞生存率の減少が見られ、ＲＭＧ−１、ＳＫＯＶ３細胞では増殖域、細胞生存率共に差は無かった（図２−２、図３のパネルＢ）。
【００９１】
（実施例５  ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス由来ＥＥＶの免疫回避能）
次に、ＳＣＲドメインをコードする領域の欠失によるウイルスの免疫回避能の増大をウイルスの中和実験により検証した。ＥＥＶは抗Ｂ５Ｒ抗体と補体のＣＤＣ活性により中和される（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００９、Ｖｏｌ．８３、Ｎｏ．３、ｐ．１２０１−１２１５）ため、ＥＥＶ及びＩＭＶにウサギ由来の抗ワクシニアウイルス血清とウサギ補体を加えてウイルス中和を行った。
【００９２】
（１）ウイルス中和処理
具体的には、ＥＥＶ及びＩＭＶの産生用に、ウイルス産生・感染細胞として、ＥＥＶ及びＩＭＶ共にＢ５Ｒウイルス／ΔＳＣＲウイルス間での産生量に差が見られなかったＳＫＯＶ３細胞を使用した。２４ウェルプレートにＳＫＯＶ３細胞を５．０×１０4細胞／ウェルで播種し、２４時間培養後６０〜８０％コンフルエントになったところで、Ｂ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルスをＭＯＩ＝０．１で感染させた。感染後、上記実施例３に記載の方法で感染後４８時間時点のＥＥＶ及びＩＭＶを回収した。回収したＢ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルスそれぞれに由来するＥＥＶ  １０μｌ（約１５００〜２０００ＰＦＵ）又はＩＭＶ  １μｌ（約５０００〜７０００ＰＦＵ）を０、０．２、０．５、１％のウサギ抗ワクシニアウイルス血清（Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ、ＩｇＧ  ｆｒａｃｔｉｏｎ、ＥＬＩＳＡ抗体価１：１０００、ＥＬＩＳＡにより抗Ｂ５Ｒ抗体を検出済。図４−５中、抗ＶＶ血清又は単に血清とも称する。）及び０、１、３、１０、２５％のウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、以下及び図４−５において、単に補体とも称する。）とをＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に混合して計５０μｌのウイルス混合液を得、３７℃で３０分反応させた。次にウイルス混合液を前日に９６ウェルプレートへ６．０×１０3細胞／ウェルで播種しておいたＳＫＯＶ３細胞へと感染させ、３７℃で２時間吸着させた。２時間の吸着後にウイルス混合液を除き、新たな培養液として１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｗａｋｏ）を加えて３７℃で９６時間培養した。
【００９３】
（２）中和処理後の蛍光観察像
９６時間培養後、実施例４に記載の方法に従い、感染細胞中で増殖したワクシニアウイルスの蛍光観察を行った。図４は感染後９６時間時点での蛍光観察結果を示す。蛍光観察により緑色に確認される領域は中和を免れて増殖したウイルスを反映する。
【００９４】
図４に示されるように、ＥＥＶのウイルス中和処理後の感染像を見ると、Ｂ５Ｒウイルス由来ＥＥＶが抗体及び補体との混合により効率よく中和されているのに対し、ΔＳＣＲウイルス由来ＥＥＶは抗体及び補体による中和を逃れて増殖可能であることが確認された（図４のパネルＡ）。またＩＭＶのウイルス中和処理後の感染像では、Ｂ５Ｒウイルス、ΔＳＣＲウイルスのどちらも効率よく抗体及び補体により中和されることが確認された（図４のパネルＢ）。この結果はＩＭＶが免疫への耐性を持たず、ＥＥＶが免疫回避能を持つという従来の報告と一致し、さらにΔＳＣＲウイルスが抗Ｂ５Ｒ抗体の認識を逃れることとも合致する。
【００９５】
（３）中和回避能
図５は、図４で観察した蛍光観察結果をキーエンス社のハイブリッドセルカウントによって数値化し（以下、「ハイブリッドカウント」という。）、その結果を示したものである。ハイブリッドカウントの値が高いほど、中和回避能が高いことを示す。ΔＳＣＲウイルス由来ＥＥＶはＢ５Ｒウイルス由来ＥＥＶに比較して中和回避能が高い傾向を示す（図５パネルＡ）。一方、ＩＭＶはΔＳＣＲウイルスを由来とするものであってもＢ５Ｒウイルスを由来とするものであっても大きな差は見られなかった（図５パネルＢ）。
【００９６】
以上より、ΔＳＣＲウイルス由来ＥＥＶはＢ５Ｒウイルス由来ＥＥＶと比べ免疫回避能が向上していることが示唆された。
【００９７】
（実施例６  ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス由来ＥＥＶのＩｎ  ｖｉｖｏでの免疫回避能と抗腫瘍効果）
ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスの免疫回避能及び抗腫瘍効果の向上をマウスを用いた前臨床試験により検証した。
【００９８】
（１）検証手順
具体的には、ｐｍｉｒＧＬＯ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のウミシイタケルシフェラーゼ―ネオマイシン耐性融合遺伝子（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ−ｎｅｏ：以下、「Ｒｌｕｃ」と称することがある。）を恒常的に発現するヒト卵巣癌Ａ２７８０細胞（５×１０6細胞）をＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウス腹腔内へ移植し、１０日間増殖させた。次に、ＥＥＶ産生用にＡ２７８０細胞をＴ−２５フラスコへ１．３５×１０6細胞を播種し、２４時間培養後にＢ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルスをＭＯＩ＝０．０５で感染させ、４８時間培養後に採取した培養液を７００×ｇ、４℃、５分間の遠心分離に供し、上清をＥＥＶとして回収した。ＥＥＶ投与の前日にｎｕ／ｎｕマウス腹腔内へウサギ抗ワクシニアウイルス血清（Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ、ＩｇＧ  ｆｒａｃｔｉｏｎ。以下及び図７−８中、単に血清とも称し、図６−１、６−２中、抗ＶＶ血清と称する。）を１００μｌ投与し、擬似的な免疫環境下とした。回収したＥＥＶを前記ｎｕ／ｎｕマウス腹腔内へ５００μｌ（Ｂ５Ｒウイルス：約１．２×１０5ＰＦＵ、ΔＳＣＲウイルス：約７×１０5ＰＦＵ）投与した。Ｖｉｖｏ  Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（プロメガ）の投与によりウイルスのＦｌｕｃ発光（ウイルス増殖）を、またＶｉｖｉＲｅｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（プロメガ）の投与により移植したＡ２７８０細胞のＲｌｕｃ発光（腫瘍増殖）を、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、ＮｉｇｈｔＤＨＡＤＥ  ＬＢ９８５）を用いて、それぞれ非侵襲的に検出した。
【００９９】
図６−１にＥＥＶ投与後３日（Ｄａｙ  ３）と７日（Ｄａｙ  ７）時点でのウイルスＦｌｕｃ発光の検出結果（すなわち、ウイルスの体内分布）を示し、図６−２にＥＥＶ投与３日前（Ｄａｙ  −３）と投与後８日（Ｄａｙ  ８）時点での腫瘍Ｒｌｕｃ発光の検出結果（すなわち、腫瘍の体内分布）を示す。図６−１及び図６−２において、下からそれぞれ、コントロール（ＥＥＶの代わりにリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）投与）群、Ｂ５Ｒウイルス−ＥＥＶ投与群、ΔＳＣＲウイルス−ＥＥＶ投与群の結果を示す。
【０１００】
（２）ウイルス増殖及び腫瘍増殖
図６−１（ウイルスＦｌｕｃ発光の検出結果）に示されるように、ＥＥＶ投与後３日目ではＢ５Ｒウイルス−ＥＥＶ＋血清投与及びΔＳＣＲウイルス−ＥＥＶ＋血清投与マウスのどちらもウイルス増殖は抑えられているが、ＥＥＶ投与後７日目ではΔＳＣＲウイルス−ＥＥＶ＋血清投与マウスはほぼ全ての個体で腹腔内での強力なウイルス増殖が認められた。一方で、Ｂ５Ｒウイルス−ＥＥＶ＋血清投与マウスはウイルス増殖が抑えられていた。
【０１０１】
図６−２（腫瘍Ｒｌｕｃの検出結果）に示されるように、ＥＥＶ投与後８日目での血清非投与群はＢ５Ｒウイルス−ＥＥＶ、ΔＳＣＲウイルス−ＥＥＶのどちらを投与してもＥＥＶ投与３日前に比較して腫瘍増殖は大きく減衰した。一方、Ｂ５Ｒウイルス−ＥＥＶ＋血清投与マウスではＥＥＶ投与後に１匹のみで腫瘍増殖が減衰したのに対し、ΔＳＣＲウイルス−ＥＥＶ＋血清投与マウスでは投与後には４匹のマウスで腫瘍増殖が減衰した。
【０１０２】
図７のパネルＡにＥＥＶ投与後１０日目までのウイルスＦｌｕｃ発光の検出値を、図７のパネルＢにＥＥＶ投与前からＥＥＶ投与後１５日目までの腫瘍Ｒｌｕｃ発光の検出値を示す。
【０１０３】
図７のパネルＡ（ウイルスＦｌｕｃ発光の検出値）に示されるように、血清非投与群が各ＥＥＶ投与後５日目でピークに到達しているのに対し、ΔＳＣＲウイルス−ＥＥＶ＋血清投与マウスは投与後７日目、Ｂ５Ｒウイルス−ＥＥＶ＋血清投与マウスは投与後１０日目にそれぞれピークに達していた。図７中では、ΔＳＣＲウイルスは、「ｄｅｌＳＣＲ」と表記した。「Ｂａｃｋ」は、マウスが存在しない背景のＦｌｕｃ発光を示す。
【０１０４】
図７のパネルＢ（腫瘍Ｒｌｕｃ発光の検出値）に示されるように、血清非投与群ではＢ５Ｒウイルス−ＥＥＶ、ΔＳＣＲウイルス−ＥＥＶのどちらでも各ＥＥＶ投与後８日目でほぼ腫瘍が消失したのに対し、ΔＳＣＲウイルス−ＥＥＶ＋血清投与マウスはＥＥＶ投与後１１日目で腫瘍が消失し、Ｂ５Ｒウイルス−ＥＥＶ＋血清投与マウスはＥＥＶ投与後１５日目でも腫瘍の残留が見られた。「Ｂａｃｋ」は、マウスが存在しない背景のＲｌｕｃ発光を示す。
【０１０５】
（３）マウス生存率
ＥＥＶ投与後の各マウスの生存率を図８に示す。図８に示されるように、Ｍｏｃｋ（ＰＢＳ、ＰＢＳ＋血清）群と比べると全てのＥＥＶ投与群で生存延長が見られるものの、Ｂ５Ｒウイルス−ＥＥＶ＋血清投与マウスは早期の生存率低下が認められた。一方、ΔＳＣＲウイルス−ＥＥＶ＋血清投与マウスは血清非投与群と中央値において同等の生存延長を示しており（中央値はΔＳＣＲウイルス−ＥＥＶ＋血清投与マウスは７７、血清非投与群（ΔＳＣＲウイルス−ＥＥＶ）は７４．５）、Ｂ５Ｒウイルス−ＥＥＶ＋血清投与マウスと比較し有意な差がＬｏｇ−ｒａｎｋ検定によって確認された（Ｐ＝０．０２９１）。
【０１０６】
このように、Ｂ５ＲウイルスとΔＳＣＲウイルスとでは、血清存在下（すなわち、免疫付与状態）における抗腫瘍効果において顕著に相違し、ΔＳＣＲウイルスは、免疫環境下においても、腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を高めることがマウス体内において実証された。
【０１０７】
（実施例７  ＳＣＲドメイン１〜４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスのＩｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果）
ＳＣＲ欠失による抗腫瘍効果を免疫応答性の同種同系移植モデルにおいて検証した。
【０１０８】
（１）組換えウイルスの精製
精製のために、実施例２（３）で作製したＢ５Ｒ−ＬＬウイルス及びΔＳＣＲ−ＬＬウイルスをＡ５４９細胞又はＲＫ１３細胞に感染させた。５％ＣＯ2存在下３７℃で２〜５日間培養した後、感染細胞を回収した。細胞を凍結融解し、ソニケーション処理、又はベンゾナーゼ処理した。ＯｐｔｉＰｒｅｐ（アクシスシールド社）を用いて密度勾配遠心分離法により精製した。その後、ＲＫ１３細胞にて各ウイルスのウイルス力価を測定し、後記（２）の実験に供した。
【０１０９】
（２）腫瘍体積及びウイルス増殖
同種移植モデルとして、マウス大腸癌ＣＴ２６細胞を５×１０5細胞でＢＡＬＢｃ／ＡＪｊｃｌマウスの左腹部及び右腹部へ皮下移植した。ノギスで腫瘍径を測定した腫瘍体積（短径ｍｍ×短径ｍｍ×長径ｍｍ×０．５）の各群の平均値がウイルス投与側（左側）で４８〜８８ｍｍ3、ウイルス非投与側（右側）で１２〜１１５ｍｍ3になるまで７日間成長させた。腫瘍成長後に、Ｂ５Ｒ−ＬＬウイルス又はΔＳＣＲ−ＬＬウイルスを各５×１０7ＰＦＵでマウス左腹部に植付けた腫瘍内へ直接投与した。各ウイルスの代わりにＰＢＳ（３５μＬ）を腫瘍内投与した群も準備した（各群Ｎ＝５）。投与は１日おきに計３回、Ｄａｙ  ０、２、４の時点で行った。初回投与後２０日までノギスで腫瘍径を測定して腫瘍体積の変動を観察した。さらに、初回投与後７日までＶｉｖｏ  Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（プロメガ）の投与によりウイルスのＦｌｕｃ発光によりウイルス増殖の推移を観察した。
【０１１０】
その結果、図９上図に示されるように、ウイルス初回投与後１７日、２０日に、ウイルス投与側（左側）腫瘍ではＢ５Ｒ−ＬＬウイルス及びΔＳＣＲ−ＬＬウイルス共にＭｏｃｋのＰＢＳ投与に比べて有意に抑えられていることがＴｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ統計解析により確認された（Ｐ＜０．００５）（図９上図）。さらに、ΔＳＣＲ−ＬＬ投与マウスでは５匹中２匹で完全寛解が見られたが、Ｂ５Ｒ−ＬＬウイルス投与マウスで完全寛解は見られなかった。またウイルス非投与側（右側）腫瘍でもＰＢＳ投与に比べてＢ５Ｒ−ＬＬウイルス及びΔＳＣＲ−ＬＬウイルス投与マウスでは、有意に腫瘍増殖が抑えられており（図９下図）、特に２０日後のΔＳＣＲ−ＬＬウイルス投与マウスはその腫瘍体積がＢ５Ｒ−ＬＬウイルス投与マウスに比べて有意に抑えられていることがＴｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ統計解析により確認された（Ｐ＜０．０１）。
【０１１１】
さらに、ウイルス増殖の推移をウイルスに組み込んだＦｌｕｃの発光検出により観察したところ、ウイルス非投与側腫瘍では観察期間（７日間）内のどの時間点でもウイルスは確認されなかった。さらに、ウイルス投与側腫瘍ではＢ５Ｒ−ＬＬウイルスの方がΔＳＣＲ−ＬＬウイルスよりウイルス増殖が多い傾向を示した（図１０）。いずれのウイルスも２回目投与後のＤａｙ  ３でピークを迎え、３回目投与後３日後のＤａｙ  ７でほぼ消失していた。これに対して、ウイルスの抗腫瘍効果は、７日目以降において顕著であった。つまり、ＳＣＲ欠失により惹起される腫瘍増殖抑制作用は、ウイルス量と正に相関しないこと、かつ、ウイルスが検出されなかった腫瘍（ウイルス非投与腫瘍）や、ウイルスが既に消失したことが確認された後においても発揮されることが判明した。
【０１１２】
以上より、ＳＣＲ欠失による抗腫瘍効果にはウイルス自体の抗腫瘍作用だけではなく、むしろ、ウイルスにより惹起される生体による抗腫瘍作用が関与することが示唆された。生体によるこの抗腫瘍作用は、例えば、抗腫瘍免疫の活性化に起因すると考えられた。すなわち、ΔＳＣＲは、ワクシニアウイルスの免疫による排除を抑制した上で、がん細胞に対する免疫反応を活性化させると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明のワクシニアウイルス及び医薬組成物は、各種がんの予防又は治療に有用であると期待される。
【配列表フリーテキスト】
【０１１４】
配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。
配列番号２で示されるアミノ酸配列は、４つのＳＣＲドメインが欠失したＢ５Ｒタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号３〜８及び１０〜１５で示されるヌクレオチド配列はプライマーである。
配列番号９で示される塩基配列は、最適化されたコドンを有する大腸菌ＬａｃＺ遺伝子を含むポリヌクレオチドである。
配列番号１６で示される塩基配列は、ＬＣ１６ｍＯ  ＶＧＦ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１Ｌ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄの末端ループ配列である。
配列番号１７で示される塩基配列は、ＬＣ１６ｍＯ  ＶＧＦ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１Ｌ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄの末端ループ配列である。
配列番号１８で示される塩基配列は、ＬＣ１６ｍＯ  ＶＧＦ−ＳＰ−ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１Ｌ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄのうち、末端ループ配列を除いた配列である。
【図１】
2019097564.tif 000002
【図２−１】
2019097564.tif 000003
【図２−２】
2019097564.tif 000004
【図３】
2019097564.tif 000005
【図４】
2019097564.tif 000006
【図５】
2019097564.tif 000007
【図６−１】
2019097564.tif 000008
【図６−２】
2019097564.tif 000009
【図７】
2019097564.tif 000010
【図８】
2019097564.tif 000011
【図９】
2019097564.tif 000012
【図１０】
2019097564.tif 000013
【図１１】
2019097564.tif 000014
【配列表】
2019097564000001.app