(57)【要約】【課題】３ＨＢに代えて細胞賦活効果を発揮する新規３ＨＢエステルを提供すること。【解決手段】  下記化学式に示される新規ヒドロキシ酪酸エステル。但しｎ＝８（３ＨＢステアロイルエステル）、ｎ＝７（３ＨＢセチルエステル）もしくはｎ＝６（３ＨＢミリスチルエステル）である。2019178121.tif 000007【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化１に示される新規ヒドロキシ酪酸エステル。
【化１】
2019178121.tif 000006
但しｎは、ｎ＝８（３ヒドロキシ酪酸ステアロイルエステル）、
ｎ＝７（３ヒドロキシ酪酸セチルエステル）および
ｎ＝６（３ヒドロキシ酪酸ミリスチルエステル）のいずれかである。
【請求項２】
不斉炭素の立体配置がＲ体である請求項１に記載の新規ヒドロキシ酪酸エステル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ヒドロキシ酪酸エステルに関する。
【背景技術】
【０００２】
３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）を含むヒドロキシアルカン酸やその塩は生体親和性が高く、糖質に代わる画期的なエネルギー源として期待されている。また、３ＨＢは単なるエネルギー源という役割だけでなく、様々な遺伝子の発現やタンパク質の活性に影響するシグナル伝達物質としての作用があることがわかってきた。３ＨＢは、例えば、遺伝子発現調節作用によって、ヒストン脱アセチル化酵素を阻害することによって認知機能や、長期持続記憶を改善することが知られ、アルツハイマーの予防に有効性が確認されている。例えば、ココナツオイルに多く含まれる中鎖脂肪酸の摂取および体内での代謝により生成される３ＨＢが、脳や体内において糖質をうまく利用できないアルツハイマー病、糖尿病の患者の症状を改善させる効果を持つことが知られている。また、３ＨＢは体内において糖質よりも速やかにエネルギーに変換されること、細胞への脂肪や糖の吸収を抑制する効果を有することから、アスリート向けのエネルギー物質、ダイエット・健康食品分野への応用が期待できる。更には、これらヒドロキシアルカン酸は、嫌気的条件でも容易に生分解を受ける数少ないポリマーの原料としても期待されている（非特許文献１参照）。
【０００３】
３ＨＢの製造方法として、各種微生物にポリ３−ヒドロキシ酪酸（以下ＰＨＢと称する場合がある）を生産させたのち、得られたＰＨＢを酵素等により分解する方法が知られている（特許文献１）。また、このような微生物としてハロモナス菌が、好気条件でＰＨＢを蓄積し、微好気条件に移行することでＰＨＢを分解して生成した３ＨＢを培地中に分泌産生することが見出されている（特許文献２）。
【０００４】
一方、従来より、皮膚の老化に伴う変化（しわ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等）の原因として、コラーゲンやエラスチン等の真皮マトリックスの線維減少や変性等が知られている。この変化を誘導する因子として、コラゲナーゼＭＭＰ１（マトリックスメタロプロテアーゼ）は、皮膚の真皮マトリックスの主な構成成分であるコラーゲンを分解する酵素として知られているが、その発現は紫外線の照射により大きく増加し、コラーゲンの減少変性の原因となり、皮膚のシワの形成等の大きな要因の一つになると考えられている。コラゲナーゼＭＭＰ１の活性を阻害すると、コラーゲンを保護して真皮マトリックスを保護し、皮膚の老化を防ぐことにつながる。従来、コラゲナーゼＭＭＰ１の活性阻害物質として、アセンヤク、柿、ワレモコウ、ペパーミント等の植物抽出物が有効であることが報告されている（特許文献３参照）。また、近年３ＨＢがヒト老化細胞賦活効果を発揮しうる物質として検討されている（特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１６８５９５号公報
【特許文献２】特開２０１３−０８１４０３号公報
【特許文献３】特開２０００−１５９６３１号公報
【特許文献４】特開２０１７−２００８８３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】H. Yagi et al.,Polymer Degradation and Stability,110,p.278(2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、３ＨＢは本来コラゲナーゼＭＭＰ１の活性阻害物質として有効であり、細胞賦活効果を発揮すると考えられるのにもかかわらず、実際にその効果を発揮させることが困難であった。
【０００８】
そこで、上述の問題点を解消すべく、３ＨＢに代えて細胞賦活効果を発揮する新規３ＨＢエステルを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するための本発明の新規ヒドロキシ酪酸エステル（以下３ＨＢエステルのように略称する）の特徴構成は、化１に示される３ＨＢエステルである。
【化１】
2019178121.tif 000002
但しｎは、ｎ＝８（３ＨＢステアロイルエステル）、ｎ＝７（３ＨＢセチルエステル）およびｎ＝６（３ＨＢミリスチルエステル）のいずれかである。
また、不斉炭素の立体配置がＲ体であるものとして得ることもできる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の新規ヒドロキシ酪酸エステルによると、３ＨＢに比べて十分なコラーゲン産生促進効果を発揮することが分かった。また、３ＨＢは老化細胞に対して主にコラーゲン産生促進効果を発揮するのに対して、新規ヒドロキシ酪酸エステルは、正常細胞に対してコラーゲン産生促進効果を発揮することが新たに見出された。その結果、たとえば、化粧料組成物等に添加されたヒト正常細胞賦活化粧料等の形態で提供することが期待される。また、これら新規ヒドロキシ酪酸エステルは、その構造からエモリエント性が期待でき、保湿剤等としての利用も期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】３ＨＢナトリウムを用いたコラーゲン産生試験結果
【図２】３ＨＢエチルエステルを用いたコラーゲン産生試験結果
【図３】３ＨＢセチルエステルを用いたコラーゲン産生試験結果
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明の新規ヒドロキシ酪酸エステルを説明する。尚、以下に好適な実施例を記すが、これら実施例はそれぞれ、本発明をより具体的に例示するために記載されたものであって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々変更が可能であり、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。
【００１３】
〔合成例〕
（３ＨＢ）
３ＨＢは、種々公知の手法（化学合成法、酵素反応法、生物発酵）にて製造することができるが、代表的には、３ＨＢ生産性のハロモナス菌を添加した発酵プロセスを行い、得られた発酵液からハロモナス菌を分離除去し、精製することにより得られる。発酵プロセスは、果汁等の糖質栄養源を含有する原料液に、３ＨＢ生産性のハロモナス菌をそのまま添加し、好気発酵、微好気発酵を順に行うプロセス（特開２０１３−０８１４０３号公報等参照）として実施することができる。これにより、糖質が３ＨＢに変換され、発酵液中に生産されることになる。生産された３ＨＢは、常法にて、膜分離、分離精製を経たのち、純粋な３ＨＢとして用いられる。
【００１４】
（３ＨＢセチルエステル）
（ｐ−トルエンスルホン酸セチルエステルの合成）
フラスコにセチルアルコール５７．７ｇを仕込んで窒素置換した後、ジクロロメタン５００ｍＬおよびピリジン３８．５ｍＬを添加して撹拌溶解させる。次いでｐ−トルエンスホニルクロライド６８．１ｇを１０分間かけて添加し、２４．５時間室温にて撹拌反応させた。反応液に２Ｎ塩酸２５０ｍＬを添加し、３０分間撹拌反応させた。水層をジクロロメタン１００ｍＬで３回抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。硫酸マグネシウムをろ別し、得られた反応液をエバポレータにて濃縮すると、半透明の粘稠液体１１０ｇが得られた。
これをテトラヒドロフラン５００ｍＬに溶解分散し、水酸化ナトリウム１４．３ｇを添加して１９時間撹拌分散させた。エバポレータでテトラヒドロフランを留去した後、ジエチルエーテル７５０ｍＬを添加し、３０分間撹拌した。次いで、不溶部分をろ別し、エバポレータにて濃縮乾固すると、ｐ−トルエンスルホン酸セチルエステルが得られた（淡褐色固体収量７８．３ｇ；収率８３．１％）。
【００１５】
（３ＨＢセチルエステルの合成）
フラスコにｐ−トルエンスルホン酸セチルエステル１．９８ｇおよび３−ヒドロキシ酪酸１．９８ｇ（純度９９％、光学純度Ｒ体９９％ｅｅ以上）を仕込んで窒素置換した後、ジメチルホルムアミド１７ｍＬを添加して撹拌溶解した。次いで、炭酸カリウム２．０７ｇを添加し、１７時間室温にて撹拌反応させた。さらに、４５℃にて４時間撹拌反応させた後、反応液を室温に戻し、精製水４０ｍＬおよび酢酸エチル４０ｍＬを添加して３０分撹拌した後、分液した。水層を酢酸エチル１０ｍＬにて４回抽出し、有機層を精製水２０ｍＬで５回洗浄し、全有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムをろ別し、得られた液体をエバポレータにより濃縮すると、ワックス状固体１．５８ｇが得られた。
生成物をヘキサン／酢酸エチルを移動相とするカラムクロマトグラフィーにより精製し、ワックス状固体を得た（１．４３ｇ；収率８７．２％）。ＮＭＲ分析により、得られたワックス状固体は、化１（ｎ＝７）で示される構造の３ＨＢセチルエステル（化２）であること、および有意な不純物を含有していないことが確認された。
【００１６】
ＮＭＲ分析
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、ｐｐｍ）：
δ＝
０．８８            （ｔ，    ３Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ２−），
１．２５            （ｄ，    ３Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−），
１．２２−１．３６  （ｂｒ，２６Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−），
１．５９−１．６８  （ｍ，    ２Ｈ，−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−），
２．３７−２．５３  （ｄｄ，  ２Ｈ，−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−），
３．０              （ｄ，    １Ｈ，−ＣＨ（ＯＨ）−），
４．１              （ｔ，    ２Ｈ，−ＣＯＯ−ＣＨ２−），
４．２              （ｍ，    １Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ（ＯＨ）−）
【００１７】
【化２】
2019178121.tif 000003
【００１８】
（３ＨＢミリスチルエステル）
（ｐ−トルエンスルホン酸ミリスチルエステルの合成）
フラスコにミリスチルアルコール２０．４ｇを仕込んで窒素置換した後、ジクロロメタン２００ｍＬおよびピリジン１５．４ｍＬを添加して撹拌溶解させる。次いでｐ−トルエンスホニルクロライド２７．２ｇを１０分間かけて添加し、２４．５時間室温にて撹拌反応させた。反応液に２Ｎ塩酸１００ｍＬを添加し、３０分間撹拌反応させた。水層をジクロロメタン１００ｍＬで３回抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。硫酸マグネシウムをろ別し、得られた反応液をエバポレータにて濃縮すると、半透明の粘稠液体が得られた。
これをテトラヒドロフラン２００ｍＬに溶解分散し、水酸化ナトリウム６．２ｇを添加して１９時間撹拌分散させた。エバポレータでテトラヒドロフランを留去した後、ジエチルエーテル３００ｍＬを添加し、３０分間撹拌した。次いで、不溶部分をろ別し、エバポレータにて濃縮乾固すると、ｐ−トルエンスルホン酸ミリスチルエステルが得られた（淡褐色固体収量２２．８ｇ；収率６５．２％）。
【００１９】
（３ＨＢミリスチルエステルの合成）
フラスコにｐ−トルエンスルホン酸ミリスチルエステル２０．８ｇおよび３−ヒドロキシ酪酸６．２２ｇ（純度９９％、光学純度Ｒ体９９％ｅｅ以上）を仕込んで窒素置換した後、ジメチルホルムアミド１９３ｍＬを添加して撹拌溶解した。次いで、炭酸カリウム２３．４５ｇを添加し、１７時間室温にて撹拌反応させた。さらに、４５℃にて４時間撹拌反応させた後、反応液を室温に戻し、精製水５００ｍＬおよび酢酸エチル１２０ｍＬを添加して３０分撹拌した後、分液した。水層を酢酸エチル１５０ｍＬにて３回抽出し、有機層を精製水２００ｍＬで５回洗浄し、全有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムをろ別し、得られた液体をエバポレータにより濃縮すると、ワックス状固体が得られた。
生成物をヘキサン／酢酸エチルを移動相とするカラムクロマトグラフィーにより精製し、ワックス状固体を得た（７．３ｇ；収率４１．７％）。ＮＭＲ分析により、得られたワックス状固体は、化１（ｎ＝６）で示される構造の３ＨＢミリスチルエステル（化３）であること、および有意な不純物を含有していないことが確認された。
【００２０】
ＮＭＲ分析
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、ｐｐｍ）：
δ＝
０．８８            （ｔ，    ３Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ２−），
１．２５            （ｄ，    ３Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−），
１．２２−１．４０  （ｂｒ，２２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−），
１．５９−１．６５  （ｍ，    ２Ｈ，−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−），
２．３７−２．５４  （ｄｄ，  ２Ｈ，−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−），
３．０              （ｄ，    １Ｈ，−ＣＨ（ＯＨ）−），
４．１１            （ｔ，    ２Ｈ，−ＣＯＯ−ＣＨ２−），
４．２０            （ｍ，    １Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ（ＯＨ）−）
【００２１】
【化３】
2019178121.tif 000004
【００２２】
（３ＨＢステアロイルエステル）
（ｐ−トルエンスルホン酸ステアロイルエステルの合成）
フラスコにステアロイルアルコール３．５６ｇを仕込んで窒素置換した後、ジクロロメタン２００ｍＬおよびピリジン２．１２ｍＬを添加して撹拌溶解させる。次いでｐ−トルエンスホニルクロライド３．７５ｇを６分間かけて添加し、２４．５時間室温にて撹拌反応させた。反応液に２Ｎ塩酸２００ｍＬを添加し、３０分間撹拌反応させた。水層をジクロロメタン７０ｍＬで３回抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。硫酸マグネシウムをろ別し、得られた反応液をエバポレータにて濃縮すると、半透明の粘稠液体が得られた。
これをテトラヒドロフラン１００ｍＬに溶解分散し、水酸化ナトリウム８７５ｍｇを添加して１９時間撹拌分散させた。エバポレータでテトラヒドロフランを留去した後、ジエチルエーテル１００ｍＬを添加し、３０分間撹拌した。次いで、不溶部分をろ別し、エバポレータにて濃縮乾固すると、ｐ−トルエンスルホン酸ステアロイルエステルが得られた（淡褐色固体収量４．３７ｇ；収率７２％）。
【００２３】
（３ＨＢステアロイルエステルの合成）
フラスコにｐ−トルエンスルホン酸ステアロイルエステル４．０６ｇおよび３−ヒドロキシ酪酸２．７４ｇを仕込んで窒素置換した後、ジメチルホルムアミド１００ｍＬを添加して撹拌溶解した。次いで、炭酸カリウム３．９６ｇを添加し、１７時間室温にて撹拌反応させた。さらに、４５℃にて４時間撹拌反応させた後、反応液を室温に戻し、精製水２５０ｍＬおよび酢酸エチル１００ｍＬを添加して３０分撹拌した後、分液した。水層を酢酸エチル１００ｍＬにて３回抽出し、有機層を精製水１００ｍＬで３回洗浄し、全有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムをろ別し、得られた液体をエバポレータにより濃縮すると、ワックス状固体が得られた。
生成物をヘキサン／酢酸エチルを移動相とするカラムクロマトグラフィーにより精製し、ワックス状固体を得た（２．１ｇ；収率６２％）。ＮＭＲ分析により、得られたワックス状固体は、化１（ｎ＝８）で示される構造の３ＨＢステアロイルエステル（化４）であること、および有意な不純物を含有していないことが確認された。
【００２４】
ＮＭＲ分析
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、ｐｐｍ）：
δ＝
０．８８            （ｔ，    ３Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ２−），
１．２５            （ｄ，    ３Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−），
１．２２−１．４０  （ｂｒ，３０Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−），
１．６０−１．６６  （ｍ，    ２Ｈ，−ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−），
２．３７−２．５４  （ｄｄ，  ２Ｈ，−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−），
３．０              （ｄ，    １Ｈ，−ＣＨ（ＯＨ）−），
４．１              （ｔ，    ２Ｈ，−ＣＯＯ−ＣＨ２−），
４．２              （ｍ，    １Ｈ，ＣＨ３−ＣＨ（ＯＨ）−）
【００２５】
【化４】
2019178121.tif 000005
【００２６】
〔３ＨＢエステルのヒト細胞賦活効果〕
３ＨＢエステルのヒト細胞賦活効果の検証のため、ヒト線維芽細胞の培養液に対して３ＨＢナトリウム、３ＨＢエチルエステル、３ＨＢセチルエステルをそれぞれ所定濃度で添加した場合のコラーゲン産生促進効果を比較した。ヒト線維芽細胞としては、ヒト正常線維芽細胞（正常細胞）と、ヒト老化線維芽細胞（老化細胞）とを用い効果を比較した。比較試験の方法について以下順に説明する。
【００２７】
（老化細胞の作成）
ヒト正常線維芽細胞に過酸化水素により老化を誘導し、老化細胞（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を作成した。
【００２８】
（コラーゲン産生試験）
細胞を、培養液として０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて、２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で９６穴プレートに播種した。翌日培養液を所定濃度のサンプルを含む０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに交換し、２４時間処理した。
【００２９】
サンプルとしては、３ＨＢナトリウム、３ＨＢエチルエステル、３ＨＢセチルエステルを所定濃度に調整したものを用いた。
【００３０】
（コラーゲン産生量の測定）
培地を回収し、ＥＬＩＳＡにてＴｙｐｅＩコラーゲン含有量を測定した。また、細胞を０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液にて溶解し、ＢＣＡ法により総タンパク量を測定した。これらに基づき、細胞による単位タンパク量あたりのコラーゲン量（測定値）を求め、添加量０の場合のコラーゲン産生量を１００とする相対値として求めた。これらを比較すると、図１〜３のようになった。
【００３１】
（結果）
図３より、３ＨＢセチルエステルは、ヒト正常細胞に対するコラーゲン産生促進効果を有し、ヒト正常細胞賦活剤として機能することが明らかになった。これは、３ＨＢや３ＨＢナトリウムは極性が高いため、細胞内に浸透しにくく、本来３ＨＢが有すると考えられる賦活効果を効率よく発現することが困難であったと考えられるのに対し、３ＨＢセチルエステルは、３ＨＢのエステル化により極性が低下し、細胞内への浸透が容易になったことに起因するものと考えられる。また、３ＨＢと３ＨＢナトリウムとは、酸とその塩の関係にあり、細胞に作用する際には、水溶液中のアニオンとして作用するものと考えられるため、３ＨＢのコラーゲン産生促進効果と、３ＨＢナトリウムによるコラーゲン産生促進効果とは、同等と考えられる。また、この３ＨＢセチルエステルがヒト正常細胞に対してコラーゲン産生促進効果を有することは、３ＨＢナトリウム、３ＨＢエチルエステルがヒト正常細胞に対するコラーゲン産生促進効果を有さず、ヒト老化細胞のみに産生促進効果を発揮する（図１，２）のに対し特異なものとなっていることが分かった。
【００３２】
また、３ＨＢセチルエステルによるコラーゲン産生促進効果は、３ＨＢエチルエステルとの対比にて、アルキル基の長さの違いとして発現しているものと考えられ、３ＨＢセチルエステル（ｎ＝７）に類似する３ヒドロキシ酪酸ステアロイルエステル（ｎ＝８）、３ヒドロキシ酪酸ミリスチルエステル（ｎ＝６）であっても同様の効果が期待でき、コラーゲン産生促進効果を改善するうえで有効である新規物質であるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の新規ヒドロキシ酪酸エステルは、ヒト正常細胞に対するコラーゲン産生促進効果を発揮し、皮膚の老化抑制のために用いることができる。
【図１】
2019178121.tif 000008
【図２】
2019178121.tif 000009
【図３】
2019178121.tif 000010