(57)【要約】【課題】IL-18の活性に起因する様々な疾患の新たな予防または治療剤を提供すること。【解決手段】下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるペプチドまたはその塩を含む、医薬：（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド、（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるペプチドまたはその塩を含む、医薬：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド。
【請求項２】
ペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
ペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
IL-18活性に起因する疾患の予防または治療用である、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬。
【請求項５】
IL-18活性に起因する疾患が、自己炎症性疾患である、請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるペプチドまたはその塩を含む、IL-18活性阻害剤：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド。
【請求項７】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるペプチドまたはその塩と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド。
【請求項８】
下記（１）または（２）を含む、医薬：
（１）下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド、
（２）（１）のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン（IL）-18に対して阻害作用を有するペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の自然免疫分野の急速な発展の恩恵を受け、これまで診断がつかなかった周期性発熱や易感染等の症状が、実は自然免疫の機能不全に起因していたことが次々に明らかになっている。例えば、自己炎症性疾患の一つである「クライオパイリン関連周期熱症候群(cryopyrin associated periodic syndrome; CAPS)」は、従来の医療水準では各種診断や検査を繰り返しても明確な病因が見当たらず、「不明熱」あるいは「原因不明の慢性炎症性疾患」として扱わざるを得なかった。しかしながら、2000年頃、CIAS1/NLRP3と呼ばれる遺伝子の変異にその原因があることがわかり、遺伝子産物の名称(cryopyrin/NLRP3)から、先の疾患名が与えられた。同様の例は、TNF受容体関連周期性症候群(TRAPS)、PAPA症候群、家族性地中海熱(FMF)など、枚挙に暇が無い。
【０００３】
自然免疫応答は、免疫担当細胞（末梢血単球、マクロファージ、樹状細胞）が有するPRRs（Pattern Recognition Receptors）によって病原体（細菌およびウイルス等）が検知されることから始まる。PRRsは、細菌細胞壁成分またはウイルスdsRNA等の構造上の特徴（パターン）を認識する受容体で、TLR(Toll-Like Receptor)、NLR(NOD-Like Receptor)、RLR(RIG-1-Like Receptor)がある（図１）。TLRは十種あまりが同定されているが、細胞膜上やエンドソーム膜上に存在し、病原体由来の分子（例えば、リポ多糖(LPS)）が結合すると、いわゆる古典的NF-κB経路が活性化され、IL-1βやIL-18の前駆体（Pro-IL-1β、Pro-IL-18）および各種の炎症性サイトカインの発現が誘導される。
【０００４】
他方、NLR群は細胞内に存在し、取り込まれた、あるいは侵入した病原体を検知し、「インフラマソーム」と呼ばれる複合体を形成する。インフラマソーム形成によって活性化されたCaspase-1は、細胞質に蓄積されたPro-IL-1βとPro-IL-18を切断し、成熟型のIL-1βとIL-18を生成する。これらは細胞外に分泌され、周辺細胞からの炎症性サイトカイン産生を促し、炎症を増強する（図１）。自己炎症性疾患は、NLR系の機能不全のため、IL-1βやIL-18が過剰に分泌されてしまい、炎症が制御されなくなった状態で、周期性発熱、関節炎を引き起こすほか、痛風、２型糖尿病や動脈硬化症と言った生活習慣病の原因にもなっている。さらには、アルツハイマー病やパーキンソン病の発症にも関与していると報告されている。一部の自己炎症性疾患には、IL-1βやIL-18の働きを抑制する方法が著効することが知られ、例えば、国内唯一の承認薬（前出のCAPSに対するカナキヌマブ（商品名：イラリス（（株）ノバルティスファーマ））はIL-1βに対するモノクローナル抗体である。
【０００５】
しかしながら、TRAPS、高IgD症候群、PAPA症候群など、他の多くの自己炎症性疾患については未だ有効な治療薬はない。現在開発中のものもあるが、主流は抗体や蛋白質性アンタゴニストであるため薬価が高額にならざるをえない。このような背景の下、自己炎症性疾患に対する廉価かつ効果的な治療薬が求められており、そのためには、病態を担う詳細な分子相互作用の解明が望まれる。
【０００６】
IL-1βの過剰な分泌は、様々な「自己炎症性疾患」を引き起こすことが知られている。IL-18は、IL-1ファミリーの一員であり、IL-1βとともに自己炎症性疾患を引き起こす主要な炎症性サイトカインである。それらに対する治療の主流はIL-1に対する抗体を始めとしたタンパク質製剤の投与である。例えば、IL-1βに対するモノクローナル抗体、カナキヌマブ（商品名：イラリス（（株）ノバルティスファーマ））は、クライオパイリン関連周期熱症候群(cryopyrin associated periodic syndrome:CAPS)の治療薬として、既に、臨床で利用されている。その作用機序は、カナキヌマブが、IL-1βに結合することで、IL-1βが、その受容体（細胞膜に存在する）に結合することを阻害することで、IL-1βの活性を抑制する。
【０００７】
IL-18は、特にアレルギーやリウマチ性疾患、自己炎症性疾患への関与が強く示唆されている。例えば、最近、全身型若年性特発性関節炎(Systemic Juvenile Idiopathic Arthritis)様の慢性炎症性疾患およびマクロファージ活性化症候群(Macrophage Activation Syndrome)を引き起こす要因のひとつとして、NLRC4変異に起因するIL-18の過剰放出が報告された（非特許文献１：Nature Genetics 46, 1140-6(2014)）。そこで、上記カナキヌマブのように、IL-18に結合し、IL-18が受容体に結合することを妨げるような化合物を見出せれば、上記疾患に対する有用な創薬リード化合物となりうる。この点、IL-18に結合する抗体およびタンパク質が数多く開発されている（特許文献１〜４、非特許文献２〜４等）。
【０００８】
ところで、IL-18は免疫細胞内では、前駆体（Pro-IL-18）として、産生される事が知られている。細胞内に蓄積されたPro-IL-18は、外的刺激によって活性化されたカスパーゼ１によって切断され、成熟型のIL-18となる。Pro-IL-18とIL-18のアミノ酸配列上の違いとしては、Pro-IL-18は、アミノ末端側に約30アミノ酸長い。つまり、カスパーゼ１の働きは、この30数残基を切断除去することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開2006-206524
【特許文献２】特開2007-535903
【特許文献３】特表2012-500242
【特許文献４】特開2012-139223
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Nature Genetics 46, 1140-6(2014)
【非特許文献２】J. Biochem. 138, 433(2005)
【非特許文献３】J. Immunol. 170, 5571(2003)
【非特許文献４】J. Biol. Chem. 284, 24478(2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来の抗体およびタンパク質製剤は、製造方法が煩雑であり、製造コストが高い。また、それらは本来生体内に存在しないタンパク質であるため、これらを投与することにより、アナフィラキシーショック等のアレルギー反応、重篤な副作用、中和抗体の産生が引き起こされるリスクがあった。
本発明の課題は、これらの従来の抗体およびタンパク質製剤の問題を解決する、IL-18の活性に起因する様々な疾患の新たな予防または治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記Pro-IL-18から成熟型のIL-18が生成される際に切断される30数残基のアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「proIL-18プロペプチド」と称する）が成熟型のIL-18に結合し、その活性を阻害しうることを見出した。本発明者らは、この知見を基にさらに鋭意検討した結果、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、およびそれらを基に改変したペプチド（以下、「本発明のペプチド」と称する）、並びにそれらの塩が成熟型のIL-18に結合し、その活性を阻害しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるペプチドまたはその塩を含む、医薬：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド。
［２］ペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、［１］に記載の医薬。
［３］ペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、［１］に記載の医薬。
［４］IL-18活性に起因する疾患の予防または治療用である、［１］〜［３］のいずれかに記載の医薬。
［５］IL-18活性に起因する疾患が、自己炎症性疾患である、［４］に記載の医薬。
［６］下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるペプチドまたはその塩を含む、IL-18活性阻害剤：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド。
［７］下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるペプチドまたはその塩と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド。
［８］下記（１）または（２）を含む、医薬：
（１）下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド、
（２）（１）のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のペプチドは、IL-18に結合し、その受容体への結合を阻害することにより、IL-18の生理活性を阻害することができる。したがって、本発明のペプチドは、IL-18の活性に起因する様々な疾患、例えば自己炎症性疾患の予防または治療に有用である。
また、本発明のペプチドは、もともと生体内に存在するproIL-18プロペプチドを基にしているため、毒性および抗原性を全く示さないか、ほとんど示さない。
さらに、本発明のペプチドは、従来の抗体またはタンパク質製剤に比べて、調製および保管も簡便である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、TLRシグナルとNLRシグナルの概要を示す。
【図２】図２は、15Nで均一標識したproIL-18プロペプチド溶液に、IL-18を添加しながらNMR測定（2D 1H-15N HMQCスペクトル）を行い、両者間の結合の有無を観察した結果を示す。
【図３】図３は、15Nで均一標識したproIL-18全長および、アミノ末端側８残基を欠失させたproIL-18の誘導体(proIL-18_9-193)のNMR測定（2D 1H-15N HMQCスペクトル）の結果を示す。
【図４】図４は、Dual-luciferase reporter assay system (Promega)を使用して、proIL-18プロペプチドによるIL-18の活性阻害を調べた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるペプチド（本発明のペプチド）またはその塩を含む、医薬を提供する。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、IL-18活性の阻害作用を有するペプチド。
【００１６】
配列番号１で表されるアミノ酸配列は、下記の通りであり、proIL-18プロペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸残基番号９〜３６のアミノ酸配列と一致する。
配列番号１：Asn-Cys-Ile-Asn-Phe-Val-Ala-Met-Lys-Phe-Ile-Asp-Asn-Thr-Leu-Tyr-Phe-Ile-Ala-Glu-Asp-Asp-Glu-Asn-Leu-Glu-Ser-Asp
配列番号２：Met-Ala-Ala-Glu-Pro-Val-Glu-Asp-Asn-Cys-Ile-Asn-Phe-Val-Ala-Met-Lys-Phe-Ile-Asp-Asn-Thr-Leu-Tyr-Phe-Ile-Ala-Glu-Asp-Asp-Glu-Asn-Leu-Glu-Ser-Asp
【００１７】
本発明のペプチドは、IL-18活性の阻害作用を有する。ペプチドがIL-18活性の阻害作用を有するか否かは、例えば、後述する実施例３に記載されるルシフェラーゼアッセイにより判定することができる。
【００１８】
本明細書に用いられる「アミノ酸」には、天然アミノ酸および非天然アミノ酸のＬ−異性体およびＤ−異性体が含まれる。
天然アミノ酸には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、オルニチン、およびリジンが含まれる。
非天然アミノ酸には、タンパク質に通常含有されていないアミノ酸、例えば、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＤ−フェニルアラニン、その他の修飾アミノ酸等が含まれる。
【００１９】
上記（ｂ）のペプチドに含まれるアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する。
ここで、アミノ酸配列の同一性に関する検索および解析は、既知の数学的アルゴリズムやプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＣｌｕｓｔａｌＷなど）を用いて行うことができる。上記プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者が適宜設定することができ、また、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの検索および解析方法の具体的な手法も、既知の方法を用いることができる。
【００２０】
上記（ｃ）のペプチドに含まれるアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個または複数個（好ましくは１〜９個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列である。同一配列中の任意の場所において、欠失、置換、挿入および付加のうち、２種以上が同時に生じてもよい。
【００２１】
上記アミノ酸残基の置換は、保存的置換であり得る。保存的置換とは、ペプチドのアミノ酸残基が同様の特性を有する別のアミノ酸残基で置換されても、ペプチドの特性が実質的に変化しないことが予期される置換をいう。互いに保存的に置換可能なアミノ酸残基の群としては、一般に以下のものが知られている：
（１）グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニンおよびチロシン；（２）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファン；（３）グリシン、アラニン、セリン、トレオニンおよびメチオニン；（４）ロイシン、イソロイシンおよびバリン；（５）グルタミンおよびアスパラギン；（６）グルタミン酸およびアスパラギン酸；（７）アルギニン、リジンおよびヒスチジン；（８）フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン。
【００２２】
本発明のペプチドの長さは、該ペプチドがIL-18活性の阻害作用を示す限り特に限定されず、例えば、配列番号１または２で表されるアミノ酸配列のアミノ末端側やカルボキシル末端側のいずれかに、或いは、両末端にペプチド鎖を繋いで、その分子量を２０万ダルトン（アミノ酸残基数1800以上）とすることができる。
また、例えば、アミノ酸残基数を2000以下、1000以下、500以下、200以下、100以下、50以下、40以下（例えば、配列番号２に相当する36）、30以下（例えば、配列番号１に相当する28）とすることもできる。
【００２３】
また、本発明のペプチドは、塩の形態であってもよい。塩は、好ましくは医薬的に許容される塩であり、このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
【００２４】
本発明のペプチドの好適な例としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
【００２５】
本発明のペプチドは、例えば、哺乳動物（ラット、マウス、モルモット、トリ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ゴリラ、ヒト等）の生物学的流体（例えば、血液、血清、血漿、滑液）から、カラムクロマトグラフィー等の既知のペプチド精製技術を用いて分離精製することができる。
【００２６】
また、本発明のペプチドは、そのアミノ酸配列に基づき、既知のペプチド合成法、例えば、アミノ酸の保護基としてFmoc（フルオレニルメチルオキシカルボニル）基、tBoc（t-ブチルオキシカルボニル）基などを使用し、固相法または液相法により合成することができる。
【００２７】
さらに、既知の遺伝子工学技術を用いて、本発明のペプチドを得ることができる。例えば、本発明のペプチドを発現し得る発現ベクターを調製し、該ベクターを組み込んだ形質転換体（大腸菌等）を培養し、該培養物から既知のペプチド精製技術を用いて本発明のペプチドを得ることができる。前記発現ベクターは、宿主内において機能し得るプロモーターの下流に機能的に連結された、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。また、本発明のペプチドを発現する遺伝子を導入した形質転換動物（マウス、ラット等）から、本発明のペプチドを得ることもできる。
【００２８】
本発明のペプチドは、既知の修飾、例えば、アミド化、脂肪族アシル化（パルミトイル化、ミリストイル化等）、プレニル化（ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化等）、リン酸化（セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基等におけるリン酸化）、アセチル化、糖鎖の付加（Ｎ-グリコシル化、Ｏ-グリコシル化）等が行われていてもよい。
【００２９】
本発明のペプチドは、IL-18に結合し、その受容体への結合を阻害することにより、その活性を阻害することができるので、IL-18活性阻害剤として有用である。したがって、本発明のペプチドは、IL-18の活性に起因する様々な疾患の予防または治療剤として有用である。
【００３０】
本明細書で用いる「IL-18活性に起因する疾患」とは、IL-18の過剰の分泌または活性化がその疾患の症状の原因であるか、または少なくともその疾患を悪化させる一因であると考えられる疾患を意味する。したがって、IL-18活性に起因する疾患は、IL-18活性の阻害によって、その疾患の症状および／または進行が緩和されることが予測される疾患である。患者がこのような疾患に罹患しているか否かは、例えば、その疾患に罹患している患者の生物学的流体（例えば、血液、血清、血漿、滑液）中のIL-18の濃度を測定することによって確認することができる。
【００３１】
上記「IL-18活性に起因する疾患」としては、例えば、自己免疫性疾患（慢性関節リウマチ、変形性関節症、若年性慢性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、再活性化関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、乾癬、強皮性皮膚炎、川崎病、ヴェーゲナー肉芽腫症、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病、腎臓の顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、血清陰性関節症、関節症、ライター病、乾癬性関節症、潰瘍性丘関節症、腸性滑膜炎、クラミジア、エルジニアおよびサルモネラに関連する関節症、脊椎関節症、サルコイドーシス、自己免疫性水泡性疾患、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ疾患、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、痛風性関節炎、自己免疫性肝炎、１型自己免疫性肝炎（古典的な自己免疫性またはルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎（抗LKM抗体肝炎）、原因不明の自己免疫性肝炎、変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、１型乾癬、２型乾癬、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、ジスコイドエリテマトーデス、多発性硬化症（全てのサブタイプ）、交感性眼炎、結合組織疾患の二次的な肺高血症、グッドパスチャー症候群、結節性多発性動脈炎の肺発現、急性リウマチ熱、リウマチ様脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、シェーグレン症候群、高安病／動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状疾患、甲状腺機能亢進、甲状腺腫自己免疫性甲状腺機能亢進（橋本病）、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性脈管炎および白斑、リウマチ様脊椎炎、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、Th2型およびTh1型媒介疾患）；
アレルギー疾患（喘息、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、蕁麻疹）；
移植関連疾患（対宿主性移植片病、臓器移植拒絶反応、臓器移植に伴う急性または慢性免疫疾患、臓器移植に伴う急性免疫疾患、臓器移植に伴う慢性免疫疾患）；
救急疾患（敗血症性ショック、トキシックショク症候群、敗血症症候群、汎発性血管内凝固症候、呼吸窮迫症候群）；
中枢神経疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病、慢性疲労症候群、筋肉痛脳炎／ロイヤルフリー病、精神障害（例えばうつ病や精神分裂病））；
循環器疾患（心不全、心筋梗塞、アテローム硬化症、アテローム性疾患／動脈硬化症、拡張型心筋症）；
呼吸器疾患（線維性肺疾患、原因不明の線維化肺胞炎、ポスト炎症性間隙性肺疾患、間隙性肺炎、結合組織病に伴う間隙性肺疾患、混合結合組織病に伴う肺疾患、全身性硬化症に伴う間隙性肺疾患、慢性関節リウマチに伴う間隙性肺疾患、全身性エリテマトーデスに伴う肺疾患、皮膚筋炎／多発性筋炎に伴う肺疾患、シェーグレン病に伴う肺疾患、強直性脊椎炎に伴う肺疾患、脈管性びまん性肺疾患、ヘモジデリン沈着症に伴う肺疾患、薬物誘発性の間隙性肺疾患、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間隙性肺疾患）；
腎疾患（ネフローゼ症候群、腎疾患NOS、糸球体腎炎、腎臓の顕微鏡的脈管炎）；
婦人科疾患（女性の不妊症、卵巣不全、早発性卵巣不全、特発性またはNOSの男性不妊症、精子自己免疫）；並びに
自然免疫制御異常により発症する炎症性疾患である自己炎症性疾患、例えば、クライオパイリン関連周期熱症候群（CAPS）（例えば、家族性寒冷蕁麻疹、Muckle-Wells症候群、CINCA症候群/NOMIDなど）、TNF受容体関連周期性症候群（TRAPS）、高IgD症候群（メバロン酸キナーゼ欠損症）、ブラウ症候群／若年発症サルコイドーシス、家族性地中海熱、PAPA（化膿性関節炎・壊疽性膿皮症・座瘡）症候群、中條−西村症候群、Majeed症候群、NLRP12関連周期熱症候群（NAPS12）、インターロイキン１受容体アンタゴニスト欠損症（DIRA）、インターロイキン36受容体アンタゴニスト欠損症（DITRA）、フォスフォリパーゼCγ2関連抗体欠損・免疫異常症（PLAID）、HOIL-1欠損症、SLC29A3欠損症、CARD14異常症、ADA2欠損症、STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy（SAVI）、NLRC4異常症、全身型若年性特発性関節炎、周期性発熱・アフタ性口内炎・咽頭炎・リンパ節炎症候群（PFAPA）、成人発症型スティル病、ベーチェット病、痛風、偽痛風、Schnitzler症候群、II型糖尿病、慢性再発性多発性骨髄炎（CRMO）；
などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明のペプチドは、上記IL-18活性に起因する疾患の中でも、自己炎症性疾患、特に全身型若年性特発性関節炎の予防または治療に有用である。
【００３３】
また、本発明の医薬は、活性成分として本発明のペプチドまたはその塩単独で、あるいは医薬的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤分野において既知の方法により製造することができる。
したがって、本発明は、本発明のペプチドまたはその塩と医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。
【００３４】
上記医薬的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、その具体例としては、固形剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤など、液剤における溶剤、溶解補助剤、界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが挙げられる。製剤化の際には、必要に応じて、安定剤、防腐剤、保存剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤、着香剤、甘味剤、粘稠剤などの製剤分野において既知の添加剤を加えてもよい。
【００３５】
本発明の医薬／医薬組成物の剤形としては、錠剤（口腔内崩壊錠、チュアブル錠、発泡錠、分散錠、溶解錠）、カプセル剤、顆粒剤（発泡顆粒剤）、散剤、経口液剤（エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、リモナーデ剤）、シロップ剤（シロップ用剤）、経口ゼリー剤、口腔用錠剤（トローチ剤、舌下錠、バッカル錠、付着錠、ガム剤）、口腔用スプレー剤、口腔用半固形剤、含嗽剤、注射剤（輸液剤、埋め込み注射剤、持続性注射剤）、透析用剤（腹膜透析用剤、血液透析用剤）、本発明のペプチドを結合させた担体を含む透析用カラム、吸入剤（吸入粉末剤、吸入液剤、吸入エアゾール剤）、坐剤、直腸用半固形剤、注腸剤、点眼剤、眼軟膏剤、点耳剤、点鼻剤（点鼻粉末剤、点鼻液剤）、膣錠、膣用坐剤、外用固形剤（外用散剤）、外用液剤（リニメント剤、ローション剤）、スプレー剤（外用エアゾール剤、ポンプスプレー剤）、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤（テープ剤、パップ剤）等が挙げられる。これらの剤形の中でも、注射剤、透析用剤、透析用カラム、吸入剤が好ましい。これら剤形は、疾患の種類、症状の重篤度、患者の年齢、性別等の条件に応じて適宜選択される。
【００３６】
また、本発明の医薬／医薬組成物は、IL-18または他のILの阻害剤、種々の抗炎症剤などの他の薬剤を含んでいてもよい。本発明のペプチドおよび他の薬剤は、単一組成物として、あるいは別個の製剤として、同時または逐次的に患者に投与することができる。
【００３７】
本発明の医薬／医薬組成物における本発明のペプチドまたはその塩の含有量は、有効量でよく、疾患の種類、症状の重篤度、患者の年齢、体重または性別、剤形の種類等により異なるが、通常、医薬／医薬組成物全体の０．０１〜１００重量％の範囲内である。また、例えば注射剤の場合、本発明のペプチドの含有量は、好ましくは０．０１〜２０重量％の範囲内である。
【００３８】
また、本発明のペプチドまたはその塩の投与量および投与回数は、疾患の種類、症状の重篤度、患者の年齢、体重または性別、剤形の種類等により異なるが、例えば、体重１ｋｇあたり約０．１μｇ〜１０００ｍｇの範囲（好ましくは約１μｇ〜１００ｍｇの範囲）で一日一回ないし数回投与することができる。
【００３９】
本発明は、上記医薬として使用するための、または上記IL-18活性に起因する疾患の予防または治療に使用するための、本発明のペプチドまたはその塩を提供する。
また、本発明は、上記医薬／医薬組成物を製造するための本発明のペプチドまたはその塩の使用を提供する。
【００４０】
さらに、本発明は、患者に本発明のペプチドまたはその塩を投与することを含む、疾患の予防または治療方法、例えば、上記IL-18活性に起因する疾患に罹患している患者に本発明のペプチドまたはその塩の有効量を投与することを含む、該疾患の予防または治療方法を提供する。
【００４１】
本発明を適用できる患者としては、哺乳動物（例、ラット、マウス、モルモット、トリ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ゴリラ、ヒト等）等が挙げられる。
【００４２】
本明細書に用いられる「有効量」は、所定の疾患の臨床症状を治癒、緩和または部分的に抑制するのに十分な量を意味する。
【００４３】
また、本発明は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」と称する）を含む医薬を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡであり得る。本発明のポリヌクレオチドの塩基配列は、本発明のペプチドのアミノ酸配列に基づき決定できる。該ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成方法、ＰＣＲ法などにより製造することができる。
【００４４】
さらに、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター（以下、「本発明の発現ベクター」と称する）を含む医薬を提供する。発現ベクターの種類、上記ポリヌクレオチド配列以外で含まれる配列等は、当該発現ベクターを導入する宿主の種類、目的等に応じて適宜選択できる。
本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを患者に投与し、生体内において本発明のペプチドを産生させ、これにより患者中のIL-18の活性を阻害することで、目的とする疾患の予防または治療を行うことができる。
【００４５】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
実施例１．試料調製
（１）(i)前駆体型のIL-18であるproIL-18（アミノ酸残基番号1-193；GenBank: AAC27787.1）、(ii)成熟型のIL-18（アミノ酸残基番号37-193）および(iii)proIL-18プロペプチド（アミノ酸残基番号1-36）の3つの試料を以下のように調製した。なお、NMR測定のためには、15Nで標識した試料、および、13Cと15Nで2重標識した試料を用いた。
【００４７】
（２）(i)〜(iii)に共通の操作
まず、pET-28aベクター（Novagen）に、N末端側にSUMO3（Small ubiquitin-related modifier 3、アミノ酸残基番号14-92）を融合させた前駆体proIL-18をクローニングする。さらに、これを基にしてKOD-Plus-Mutagenesis Kit（TOYOBO）を使用した部位特異的変異導入により、SUMO3直下に成熟型IL-18（proIL-18プロペプチド領域の欠失）、あるいはproIL-18プロペプチド（Y37Termの置換）を繋いだ発現ベクターを作製する。作製した発現ベクターを用いてBL21(DE3)を形質転換し、カナマイシン（20 μg/mL）を添加したLB寒天培地プレートに播種し、37℃で一晩培養を行う。得たBL21(DE3)のコロニーを、カナマイシン（20 μg/mL）を含む液体培地（200 mL）に添加し、37℃で一晩振とう培養する（前培養）。続いて、前培養で得た飽和培養液を大容量の液体培地（1.8 L）に植え継いで、濁度（OD600）が1.0に達するまで培養を行う（本培養）。その後、15分間水冷し、終濃度1 mMのIPTG（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）を添加して18℃で一晩振とう培養し、タンパク質の発現を誘導する。
なお、使用する液体培地は作成する安定同位体のパターンによって以下のように変える。
A. 安定同位体非標識のサンプルにはLB培地、
B. 15N標識サンプルには15NH4Clを唯一の窒素源とするM9最少培地、
C. 13C、15N 二重標識サンプルには15NH4Clと13Cグルコースを窒素源・炭素源とするM9最少培地。
【００４８】
遠心分離（6kg、4℃、30分間）により大腸菌を集めた後、大腸菌ペレット（約10 g）を破砕バッファー（20 mM TrisHCl pH8.0、150 mM 塩化ナトリウム、2 mMジチオトレイトール、20 mM イミダゾール）100 mL（菌体1 gあたり10 mL） で懸濁し、超音波破砕機で溶菌する。溶菌液を遠心分離（60 kg、4℃、30分）して得られた上澄み液をcOmplete His-Tag Purification Resin (Roche、10 mL) で粗精製した後、脱SUMO化酵素（GST融合SUMO-specific protease 2、約1.0 mg）を加えて4℃で一晩処理し、6×ヒスチジン+SUMO3タグとIL-18を切断する。その後、陰イオン交換カラム（HiTrap Q HP Columns、5 mL、GE Healthcare）による精製を行う。なお、イオン交換にはAバッファー（20 mM HEPES-Na pH7.0) およびBバッファー（20 mM HEPES-Na pH7.0、1 M NaCl）の2種類を使用し、Bバッファーの割合を約33分間（流速3.0 mL/分）で0%から50%へ変化させてサンプルの溶出を行う。溶出液（約15 mL）をGlutathione Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare、10 mL）とcOmplete His-Tag Purification Resin (Roche、10 mL)に通す。
【００４９】
（３）(i) 前駆体proIL-18および(ii) 成熟型IL-18に共通の操作
上記精製物を、限外ろ過膜にて５mLまで濃縮後、NMRバッファー (20 mM リン酸カリウムバッファー (pH 6.0)、150 mM 塩化カリウム、1 mMトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン) で平衡化したゲルろ過カラム（Superdex 75 HiLoad 16/60、GE Healthcare、流速1.0 ml/分）に供す。NMR滴定に使用する濃度に濃縮した後、分注・凍結して-80℃で保存する。
収量は、2 L培地あたり、(i)成熟型IL-18は375 nmol（6.8 mg）、(ii)前駆体proIL-18は210 nmol（4.7 mg）であった（吸光度計（NanoPhotometer P-Class、IMPLEN）を用いて定量）。
【００５０】
（４）(iii) proIL-18プロペプチドのための操作
上記精製物を、凍結乾燥にて5 mLまで濃縮後、300 mM 酢酸アンモニウムバッファーで平衡化したゲルろ過クロマトグラフィーに供する。SDS-PAGE、およびMALDI-TOF MSにて純度を確認後、濃度（NanoPhotometer P-Class、IMPLEN）を測定して分注し、凍結乾燥して-80℃で保存する。
収量は、2 L培地あたり、300 nmol（1.2 mg）であった。
【００５１】
実施例２．プロペプチドとIL-18の相互作用の検出
（１）NMR（nuclear magnetic resonance:核磁気共鳴）実験プロトコール
Ａ．主鎖原子核の化学シフト帰属
13C,15N二重標識した試料(iii)proIL-18プロペプチド（94 nmol）をNMRバッファー250 μL（20 mM リン酸カリウムバッファー pH6.0、150 mM KCl、1 mM TCEP、5% D2O）で溶解し（蛋白濃度380 μM）、Bruker Avance II（700 MHz、cryoprobe装着）を用いて1H-15N 2次元NMR(SOFAST(band-SelectiveOptimized-Flip-Angle Short-Transient)-HMQC(Hetero-nuclear Multiple Quantum Coherence)、及び3D HNCACB、3D CBCA(CO)NHを25℃で測定する。得られたデータから、連鎖帰属法により、主鎖原子核化学シフトの帰属を行なう。
【００５２】
Ｂ．結合部位の同定のためのNMR滴定実験
以下4種類のサンプルを用意して、Bruker Avance II (700 MHz、cryoprobe装着)を用いてSOFAST-HMQCの測定を行い、以下の(ア)と(イ)、(ウ)と(エ)の間でスペクトルの比較を行う。この比較から、成熟型IL-18とproIL-18プロペプチドの相互作用部位の同定を行なう。(ア)15N標識の成熟型IL-18、(イ)凍結乾燥させた非標識のproIL-18プロペプチドに15N標識した成熟型IL-18の水溶液を加えたサンプル、(ウ)凍結乾燥させた、15N標識したproIL-18プロペプチドにNMR測定用バッファーのみを加えたサンプル、(エ)凍結乾燥させた15N標識のproIL-18プロペプチドに非標識の成熟型IL-18の水溶液を加えたサンプル。
【００５３】
（２）proIL-18プロペプチドとIL-18の結合実験
上記の手法にしたがって、15Nで均一標識したproIL-18プロペプチド（proIL-18 P.P.）溶液に、IL-18を添加しながらNMR測定（2D 1H-15N HMQCスペクトル）を行い、両者間の結合の有無を観察した（図２）。
このNMR測定法では、15Nで標識されているproIL-18プロペプチドのアミド基の1Hと15Nのみが観測される。IL-18の有無で全くスペクトルが異なることがわかる（赤色：0等量IL-18、青色：3等量IL-18）。これは、proIL-18プロペプチドが、IL-18と結合することで、観測しているアミド基の周辺環境が大きく変化するためである。これらスペクトルから、proIL-18プロペプチドがIL-18に結合できることがわかる。図２のスペクトルを見ると分かるように、IL-18を添加することで複数の新しいピークが出現している。これらのピークはIL-18に結合した状態にある15N標識proIL-18プロペプチドに由来するNMR信号である。これら出現したピークのうち特に顕著なものを、図２中にPeak AからPeak Hで示した。
【００５４】
次に、前駆体proIL-18を15Nで標識し、NMR測定（2D 1H-15N HMQCスペクトル）を行った（図３の赤色）。そのスペクトル中には、上記のPeak A〜Peak Hに相当する位置に各々ピークが観測された。このことから、IL-18に結合したproIL-18プロペプチドの構造が、前駆体proIL-18中のプロペプチド相当領域の構造と同一であることが言える。さらに、proIL-18中のPeak A〜Peak Hに相当するアミノ酸残基は、IL-18と結合した状態にあるということも結論できる。
【００５５】
続いて、前駆体proIL-18のアミノ末端側の８アミノ酸残基（配列番号２のアミノ酸残基番号１〜８のアミノ酸配列）を欠失させた誘導体（proIL-18_9-193）の15N標識体を作成し、同様のNMR測定を行なった。その結果が図３の青色のスペクトルである。このスペクトルを先のproIL-18全長のスペクトル（図３の赤色）と比較したところ、やはりPeak A〜Peak Hに相当する位置に各々ピークが観測された。この結果から、まず、Peak A〜Peak Hが、欠失させた８アミノ酸残基には相当しないことがわかる。さらに、proIL-18_9-193中のPeak A〜Peak Hに相当するアミノ酸残基は、proIL-18全長で見られた様に、IL-18本体と結合した状態にある、と結論できる。言い換えると、アミノ末端側の８残基はproIL-18のプロペプチド相当部分とIL-18との結合には影響がない、と言うことである。そしてこのことは、３６アミノ酸からなるプロペプチドの場合でも、アミノ末端側の８残基はIL-18との結合には関与しないことを強く示唆する。
【００５６】
なお、図３におけるスペクトルの比較から、欠失させた８アミノ酸残基に相当するピークが同定できる可能性がある。しかし、この部分がIL-18と結合しないとすれば安定な立体構造を保持できない（すなわちランダムコイル状態をとる）と考えられる。ランダムコイルの場合、NMR信号は1Hの化学シフト値として8.0〜8.3 ppmの間に出現することが知られているが、図３を見ると分かるように、この化学シフト領域には多数のピークが重なり合っているため、そのようなピークを同定することはできない。また、8.3 ppmよりも低磁場側（図３では、およそ10.6 ppmまで）には立体構造を保持した部分のピークが出現するが、図３のスペクトルの比較では、その領域において大きな差異が見られない。これは、アミノ末端側の８残基が安定な立体構造を保持していないことを強く示唆する。
【００５７】
実施例３  ルシフェラーゼアッセイを用いたIL-18阻害活性の定量
まず、IL-18によるNF-κBの活性化を、ルシフェラーゼをレポーターとして定量した。次に、IL-18に試験化合物を混合し、静置した後、同様のレポーターアッセイを行った。これにより、試験化合物がIL-18の活性を阻害したかどうかを調べた。実験操作は以下に示すとおりである。
【００５８】
HEK293T細胞を96well coating plateに2.0x105個/mlの細胞密度で播種した翌日に、pcDNA3.1+IL-18Rβ(NM_003853: c.1-1800), NF-κB-ルシフェラーゼレポータージーンベクター(Promega, pGL4.32[luc2P/NF-kB-RE/Hygro])をLipofectamine2000(Invitrogen)を用いてコトランスフェクションした。トランスフェクションした24時間後に、成熟型ヒトIL-18（10 ng/ml）またはIL-1β（20 ng/ml）とproIL-18プロペプチドを混合し、4℃で1時間静置したものを含むか、またはそれぞれ含まない10%FCS含有DMEM培養培地(Invitrogen)と交換し、6時間37℃で培養した。その後、培地を吸引除去し、PBSで細胞を洗浄した。Passive lysis buffer (Promega)で細胞を溶解し、凍結保存した。細胞溶液を融解し、Dual-luciferase reporter assay system (Promega)を使用して、発光を測定した。結果を図４に示す。
【００５９】
細胞をIL-18で刺激した場合、ルシフェラーゼ活性が上昇する。これは、IL-18によりNF-κBが活性化していることを示す。一方、IL-18溶液にproIL-18プロペプチドを混合した場合、ルシフェラーゼ活性は低下した（赤色のバー）。このことは、該proIL-18プロペプチドがIL-18の活性を阻害することを示すものである。proIL-18プロペプチドを終濃度500ng/mlで添加した細胞では、抗IL-18抗体(Clone 125-2H)を添加した細胞と同程度までIL-18依存のルシフェラーゼ活性が低下した。また、IL-1βの刺激によってもNF-κBが活性化され、ルシフェラーゼ活性は上昇する。しかし、ここにIL-18のproIL-18プロペプチドを添加しても、ルシフェラーゼ活性は減弱しなかった（緑色のバー）。このことから、当該proIL-18プロペプチドは、IL-18の活性のみを特異的に阻害することがわかる。
【配列表フリーテキスト】
【００６０】
配列番号１に記載されるアミノ酸配列は、インターロイキン-18の前駆体のアミノ酸残基番号９〜３６のアミノ酸配列である。
配列番号２に記載されるアミノ酸配列は、インターロイキン-18の前駆体のアミノ酸配列である。
【図１】
2019023165.tif 000002
【図２】
2019023165.tif 000003
【図３】
2019023165.tif 000004
【図４】
2019023165.tif 000005
【配列表】
2019023165000001.app