(57)【要約】      （修正有）【課題】励起光の波長の切り替えに応じて生じる検出光学系のフォーカス位置のズレを補正することができる技術を提供する。【解決手段】シート照明顕微鏡１００は、媒体へシート状の励起光を照射する照明光学系２と、励起光が照射された媒体が放射する蛍光を検出する、照明光学系２の光軸と交差する光軸を有する検出光学系６と、検出光学系６のフォーカス位置を検出光学系６の光軸方向に変更する駆動モータ８と、検出光学系６で検出する蛍光の波長を第１波長から第２波長へ切り替えるときに、少なくとも第１波長に対する媒体の第１屈折率と、第２波長に対する媒体の第２屈折率とに基づいて、駆動モータ８を制御する制御装置２０と、を備えることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
媒体へシート状の励起光を照射する照明光学系と、
前記励起光が照射された前記媒体が放射する蛍光を検出する、前記照明光学系の光軸と交差する光軸を有する検出光学系と、
前記検出光学系のフォーカス位置を前記検出光学系の光軸方向に変更するフォーカス調整機構と、
前記検出光学系で検出する蛍光の波長を第１波長から第２波長へ切り替えるときに、少なくとも前記第１波長に対する前記媒体の第１屈折率と、前記第２波長に対する前記媒体の第２屈折率とに基づいて、前記フォーカス調整機構を制御する制御装置と、を備える
ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載のシート照明顕微鏡において、
少なくとも、前記第１屈折率と前記第２屈折率とを用いて、前記検出光学系で検出する蛍光の波長を前記第１波長から前記第２波長へ切り替えるときに、前記検出光学系のフォーカス位置を前記励起光の照射平面に合わせるように前記フォーカス調整機構を制御する制御装置と、を備える
ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
【請求項３】
請求項２に記載のシート照明顕微鏡において、
前記制御装置は、前記励起光の照射平面と前記媒体の界面の距離と前記第１屈折率と前記第２屈折率を用いて、前記検出光学系で検出する蛍光の波長が前記第１波長であるときの前記検出光学系のフォーカス位置と前記検出光学系で検出する蛍光の波長が前記第２波長であるときの前記検出光学系のフォーカス位置との間のズレに基づく補正量を算出して、該補正量に基づいて、前記検出光学系で検出する蛍光の波長を前記第１波長から前記第２波長へ切り替えるときに、前記検出光学系のフォーカス位置を前記励起光の照射平面に合わせるように前記フォーカス調整機構を制御する
ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
【請求項４】
請求項２に記載のシート照明顕微鏡において、さらに、
前記媒体を固定するステージと、
前記検出光学系と前記ステージの相対的距離を変更する位置調整機構と、を備え、
前記制御装置は、前記位置調整機構による前記検出光学系と前記ステージの相対的距離の変更量と前記第１屈折率と前記第２屈折率を用いて、前記検出光学系で検出する蛍光の波長が前記第１波長であるときの、前記相対的距離の変更後における前記検出光学系のフォーカス位置の前記励起光の照射平面に対する第１ズレ量と、前記検出光学系で検出する蛍光の波長が前記第２波長であるときの、前記相対的距離の変更後における前記検出光学系のフォーカス位置の前記励起光の照射平面に対する第２ズレ量と、を算出し、前記第１ズレ量と前記第２ズレ量に基づいて、前記検出光学系で検出する蛍光の波長を前記第１波長から前記第２波長へ切り替えるときに、前記検出光学系のフォーカス位置を前記励起光の照射平面に合わせるように前記フォーカス調整機構を制御する
ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
【請求項５】
請求項４に記載のシート照明顕微鏡において、
前記制御装置は、前記位置調整機構による前記相対的距離の変更前における前記蛍光の波長が前記第１波長であるときと前記第２波長であるときの前記検出光学系のフォーカス位置のズレと、前記第１ズレ量と、前記第２ズレ量に基づいて、前記検出光学系で検出する蛍光の波長を前記第１波長から前記第２波長へ切り替えるときに、前記検出光学系のフォーカス位置を前記励起光の照射平面に合わせるように前記フォーカス調整機構を制御する
ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
【請求項６】
請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載のシート照明顕微鏡において、
前記フォーカス調整機構は、前記検出光学系を前記検出光学系の光軸方向へ駆動する駆動モータである
ことを特徴とするシート照明顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
シート照明顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般にシート照明顕微鏡では、検出光学系の光軸方向に標本の位置が変更されることで、標本に対する励起光の照射平面の位置が変わると、蛍光を検出する検出光学系のフォーカス位置がシート光の照射平面に対してずれてしまう現象が起こり得る。これは、検出光学系と励起光の照射平面との間に屈折率の異なる複数の媒体（標本、培養液、空気等）が存在し、標本の位置の変更によって、蛍光が介する各媒体の厚みが変わってしまうからである。
【０００３】
特許文献１には、検出光学系と励起光の照射平面との間の媒体の厚さの変化量を用いて、検出光学系のフォーカス位置を補正する技術が示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１６−１５１７０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一方で、励起光の波長を切り替えることで異なる波長の蛍光を観察する場合、励起光の波長を変更する度に、媒体内での光の屈折率が変化することによってフォーカス位置が変わってしまうという問題も生じる。
【０００６】
従って、標本の位置変更時のみならず、励起光の波長の切り替えに応じて生じるフォーカス位置のシート光の照射平面に対するズレについても、補正を可能とする技術が所望される。
【０００７】
以上の実情を鑑みて、本発明では、励起光の波長の切り替えに応じて生じる検出光学系のフォーカス位置のズレを補正することができる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様におけるシート照明顕微鏡は、媒体へシート状の励起光を照射する照明光学系と、前記励起光が照射された前記媒体が放射する蛍光を検出する、前記照明光学系の光軸と交差する光軸を有する検出光学系と、前記検出光学系のフォーカス位置を前記検出光学系の光軸方向に変更するフォーカス調整機構と、前記検出光学系で検出する蛍光の波長を第１波長から第２波長へ切り替えるときに、少なくとも前記第１波長に対する前記媒体の第１屈折率と、前記第２波長に対する前記媒体の第２屈折率とに基づいて、前記フォーカス調整機構を制御する制御装置と、を備えることを特徴とするシート照明顕微鏡。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のシート照明顕微鏡によれば、励起光の波長の切り替えに応じて生じる検出光学系のフォーカス位置のズレを補正することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施形態におけるシート照明顕微鏡の構成を示す図
【図２】制御装置のハードウェア構成を示す図
【図３】制御装置の機能構成を示す図
【図４】第１実施例における、第１波長（λ１）の励起光照射時の状態と、第１波長から第２波長（λ２）へ励起光を切り替えた後において、オフセット量に基づいてフォーカス位置をオフセットした後の状態を示す図
【図５】第２実施例における、位置変更前の状態と、駆動モータ７（位置調整機構）による位置変更後の状態を示す図
【図６】第２実施例における、位置変更前の状態と、駆動モータ７（位置調整機構）による位置変更後のズレ量をオフセットした後の状態を示す図
【図７】第２実施例におけるオフセット計算部２２が処理を実行するに際して、シート照明顕微鏡１００を用いて行う処理手順の一例を示すフローチャート
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の一実施形態におけるシート照明顕微鏡１００について記載する。図１は、シート照明顕微鏡１００の構成を示す図である。
【００１２】
シート照明顕微鏡１００は、光源１と、照明光学系２と、ステージ５と、検出光学系６と、駆動モータ７、８と、制御装置２０と、を備えている。標本Ｓは、容器９に培養液１０とともに入れられており、容器９はステージ５上に固定される。また、標本Ｓと培養液１０は、ともに等しい屈折率を有しており、以降の記載では、標本Ｓ及び培養液１０を媒体とも表記する。
【００１３】
光源１は、励起光を出力する。また、光源１は、複数の波長の励起光を出力可能であり、制御装置２０の制御により、出力する波長が切り替わる。
【００１４】
照明光学系２は、光源１からの励起光をステージ５上に存在する媒体（標本Ｓ、培養液）へ向けて導光する光学系を有している。照明光学系２は、例えばレンズ３、シリンドリカルレンズ４を有している。
【００１５】
シリンドリカルレンズ４は、Z方向にのみパワーを有し、平面上に広がりを有したシート状の励起光（シート光）を標本Ｓへ照射する。また、照明光軸方向をX方向としたとき、シート光が広がりを有する方向であるY方向をシート光の幅方向とも表記する。
【００１６】
検出光学系６は、照明光学系２の光軸と交差するＺ方向に光軸をもち、励起光が照射されたステージ５上に存在する標本（媒体）が放射する蛍光を検出する。検出光学系６は、対物レンズ６ａを含む光学系と光検出器を有している。また、検出光学系６における検出波長は、発生する蛍光の波長を含むように設定される。
【００１７】
駆動モータ７は、ステージ５をＺ方向に駆動させることで、検出光学系６とステージ５の相対的距離を変更する位置調整機構である。尚、位置調整機構は、検出光学系６とステージ５の相対的距離を変更する構成であればよく、検出光学系６を駆動させることで、検出光学系６とステージ５の相対的距離を変更するような構成でもよい。
【００１８】
駆動モータ８は、検出光学系６をＺ方向に駆動させることで、検出光学系６のフォーカス位置をＺ方向（検出光学系６の光軸方向）に変更するフォーカス調整機構である。
【００１９】
制御装置２０は、シート照明顕微鏡１００の各種構成を制御するコンピュータである。図２は、制御装置２０のハードウェア構成を示す図である。
【００２０】
制御装置２０は、ＣＰＵ１１、ＤＲＡＭ１２、ＲＯＭ１３、記憶部１４、入出力ＩＦ１５を備えている。
【００２１】
ＣＰＵ１１は、ＲＯＭ１３に格納される各種制御プログラム（後述するオフセット計算部２２のプログラム等）を読みこんで実行する。
【００２２】
ＤＲＡＭ１２は、制御プログラムや各種データを一時的に格納するワーキングエリアを提供する。ＲＯＭ１３は、各種制御プログラムを不揮発的に記憶する記憶媒体である。
【００２３】
記憶部１４は、各種データを記憶するものであり、フラッシュメモリやハードディスク等により構成される。入出力ＩＦ１５は、装置外部（例えば入力装置やモニタ等）とデータの送受信を行うものである。以上の各構成は、バス１６により接続される。
【００２４】
図３は、制御装置２０の機能構成を示す図である。
【００２５】
記憶部２１は、後述するオフセット計算部２２による制御を実行する際等に必要となるデータを予め格納している。記憶部２１は、上記のデータとして、発生する蛍光の波長毎にその波長に対する媒体（標本Ｓ、培養液）の屈折率を記憶している。
【００２６】
オフセット計算部２２は、記憶部２１に記憶されたデータを用いて、光源１の励起光の波長切り替えに伴う検出光学系６のフォーカス位置の、励起光の照射平面に対するズレを補正するための補正量（オフセット量）を算出する。一般に、光源１の励起光の波長を切り替えたとき、即ち発生する蛍光の波長が第１波長（λ１）から第２波長（λ２）へ切り替わった際、蛍光の波長に対する媒体中の屈折率が変わることにより、フォーカス位置が励起光の照射平面に対しずれてしまう。オフセット計算部２２は、第１波長（λ１）から第２波長（λ２）へ切り替えた後の上記のフォーカス位置のズレ量を補正するためのオフセット量を、検出光学系６が検出する蛍光が第１波長（λ１）であるときの検出光学系６とその励起光の照射平面との間に存在する媒体の第１屈折率（ｎ１）と、検出光学系６が検出する蛍光が第２波長（λ２）であるときの検出光学系６とその励起光の照射平面との間に存在する媒体の第２屈折率（ｎ２）とを用いて、算出するものである。オフセット計算部２２が実行する詳細な処理の例については、後述する。
【００２７】
フォーカス調節部２３は、オフセット計算部２２によって算出されたオフセット量を用いて検出光学系６のフォーカス位置を励起光の照射平面に合わせるように、駆動モータ８（フォーカス調整機構）を制御する。尚、オフセット量を用いてフォーカス位置を励起光の照射平面に合わせることを、オフセットするとも表記する。
【００２８】
位置調整部２４は、駆動モータ７（位置調整機構）を制御し、検出光学系６とステージ５との相対的な距離を変更するように制御を行う。尚、位置調整部２４は、不図示の入力装置からの入力に基づいて、駆動モータ７の制御を行ってもよい。入力装置は、キーボードやマウス等である。例えば、シート照明顕微鏡１００を用いて観察を行う使用者が、標本Ｓの観察位置の変更を行いたい場合に、入力装置により位置調整部２４へ信号を送り、駆動モータ７を介してステージ５を移動させる。
【００２９】
光源制御部２５は、光源１の励起光の波長の切り替えを制御する。尚、光源制御部２５についても、不図示の入力装置からの入力に基づいて制御が行われてもよい。
【００３０】
[第１実施例]
以下、オフセット計算部２２が行う処理の第１実施例を、図面を用いて説明する。図４は、第１実施例における、検出光学系６が検出する蛍光が第１波長（λ１）の状態（図４左）と、励起光の波長の切り替えに応じて検出する蛍光の波長を第１波長から第２波長（λ２）切り替えた後において、オフセット量に基づいてフォーカス位置をオフセットした後の状態（図４右）を示している。
【００３１】
本実施例では、媒体の界面と照明光学系２からの励起光の照射平面との間の水中の距離ｄを、目盛り等を用いて事前に測定しておき、記憶部２１は、蛍光の検出波長毎の媒体（標本、培養液）の屈折率に加え、距離ｄを記憶する。
【００３２】
まず第１波長（λ１）の蛍光を検出する際、検出光学系６のフォーカス位置がシート光の照射平面に合致している状態であるものとする。
【００３３】
以上の条件において、第１波長（λ１）の蛍光を検出するときに、検出光学系６の対物レンズ６ａの主平面と励起光の照射平面との間の距離の空気換算長Ｌ１を求めると以下のようになる。
【００３４】
L1 = L + d / n1   （１）
【００３５】
ここで、ｄ、Ｌ、ｎ１はそれぞれ、励起光の波長がλ１であるときに発生する蛍光の媒体中の距離、界面と対物レンズ６ａの蛍光の入射面との間の距離、検出波長がλ１であるときの媒体の屈折率である。また、空気中の屈折率は１としている。
【００３６】
次に、第１波長から第２波長（λ２）へ発生させる蛍光及び検出波長を切り替えた後において、対物レンズ６ａの主平面と励起光の照射平面との間の距離の空気換算長Ｌ２を求めると以下のようになる。
【００３７】
L2 = L + d / n2 + g   （２）
【００３８】
ここで、ｎ２、ｇはそれぞれ、検出波長がλ２であるときの蛍光の媒体内での屈折率、媒体中で蛍光が進む距離の一部の空気換算長である。より詳細には、式（２）は、第２波長の励起光を使用している場合において、空気に換算して界面からd / n2 + gだけ離れた位置で検出光学系６のフォーカスが合うものとした場合の式である。つまり、ｇは、励起光の波長が第１波長であるとき蛍光を取り込む際の検出光学系のフォーカス位置と第２波長であるとき蛍光を取り込む際の検出光学系のフォーカス位置との間のズレ量の空気換算長に相当する。
【００３９】
第１波長及び第２波長での蛍光が通過する空気換算長は互いに等しいため、式（１）、（２）式より、ｇは以下のように算出される。
【００４０】
g = d ( 1 / n1 - 1 / n2 )   （３）
【００４１】
従って、フォーカス調節部２３による駆動モータ８を用いたオフセットは、（３）式で求まったズレ量の空気換算長を相殺するオフセット量に基づき実施される。
【００４２】
尚、図４では、波長切り替え後の媒体中の屈折率ｎ２が、屈折率ｎ１よりも大きくなる場合を示している。即ち、図４では、ズレ量の空気換算長ｇは媒体中の距離が増える方向に生じ、オフセットが検出光学系６（対物レンズ６ａ）を照射平面から離す方向へ移動するように行われる例を示している。
【００４３】
以上より、オフセット計算部２２は、記憶部２１から距離ｄ、及び、変更前後の蛍光の波長に対応した媒体の屈折率を抽出し、上記（３）式へ代入することで、第１波長から第２波長へ切り替えた後における、フォーカス位置のオフセット量を求めることができる。従って、本発明の第１実施例によれば、励起光の波長の切り替えに応じて生じる検出光学系のフォーカス位置のズレを補正することができる。
【００４４】
[第２実施例]
以下、オフセット計算部２２が行う処理の第２実施例を、図面を用いて説明する。第２実施例では、駆動モータ７（位置調整機構）による標本Ｓの位置の変更後（検出光学系６とステージ５との相対的な距離が変更された後）において、励起光の波長を切り替え、検出する蛍光の波長を第１波長から第２波長へ切り替えたときのフォーカス位置のオフセット量を算出し、オフセットを実行する。
【００４５】
図５は、位置変更前の状態（図５左）と、駆動モータ７（位置調整機構）による位置変更後（検出光学系６とステージ５との相対的な距離が変更された後）の状態（図５右）を示している。駆動モータ７による位置変更の前後では、照射平面と検出光学系６間に存在する媒体の厚さが変わるため、駆動モータ７の移動前後で発生した蛍光を取り込む際のフォーカス位置のズレが発生する。検出する蛍光の波長が第１波長であるときのそのズレ量（第１ズレ量）の空気換算長g1は、駆動モータ７による位置変更前後での空気換算長が等しいことから以下の（４）式が成り立ち、（５）式のように導かれる。
【００４６】
l1 + l2 / n1 = l1 −ΔZ + (l2 + ΔZ ) / n1 + g1   （４）
【００４７】
g1 = ΔZ ( 1 - 1 / n1 )   （５）
【００４８】
ここで、ｌ１、ｌ２、ΔＺはそれぞれ、駆動モータ７による位置変更前における界面と対物レンズ６ａの主平面との間の距離、駆動モータ７による位置変更前における界面と励起光の照射平面との間の水中の距離、駆動モータ７による移動量（検出光学系６とステージ５との相対的な距離の変更量）である。
【００４９】
従って、駆動モータ７による位置変更の後、フォーカス調節部２３は、上記ｇ１をオフセットするように駆動モータ８を移動させる。図６の右は、ｇ１をオフセットした後の状態を示している。
【００５０】
同様に第２波長の励起光を照射するとき、駆動モータ７によってΔＺだけ移動させた後の発生した蛍光を取り込む際のフォーカス位置のズレ量（第２ズレ量）の空気換算長ｇ２は、（６）式のようになる。
【００５１】
g2 = ΔZ ( 1 - 1 / n2 )   （６）
【００５２】
また、位置変更前において、検出する蛍光の波長が第１波長、第２波長であるときの、励起光の照射平面に検出光学系６のフォーカス位置を合わせたときの検出光学系６（対物レンズ６ａ）の位置をそれぞれ、Ｚ１、Ｚ２とする。Ｚ１、Ｚ２は、予め調整される。例えば、使用者が、検出光学系６により検出される画像を見ながらピントが合う位置を把握して調整を行ってもよい。このとき、フォーカス調節部２３は使用者からの入力に基づいて制御を受けてもよい。
【００５３】
即ち、位置変更前において、蛍光の波長が第１波長であるときと第２波長であるときとのフォーカス位置のズレ量の空気換算長はＺ２−Ｚ１ということになる。
【００５４】
以上から、駆動モータ７によってΔＺだけステージ５を移動させた後（ｇ１はオフセット済みである）、検出する蛍光の波長を第１波長から第２波長へ切り替えたときのフォーカス位置のズレ量の空気換算長ｇは、以下のようになる。
【００５５】
g = g2 - g1 + Z2 - Z1 
=ΔZ ( 1 / n1 - 1 / n2 ) + Z2 - Z1   （７）
【００５６】
従って、フォーカス調節部２３による駆動モータ８を用いたオフセットは、（７）式で求まったズレを相殺するオフセット量に基づき実施される。
【００５７】
図７は、第２実施例におけるオフセット計算部２２が処理を実行するに際して、シート照明顕微鏡１００を用いて行う処理手順の一例を示すフローチャートである。
【００５８】
ステップＳ１では、位置変更前において、検出する蛍光の波長が第１波長、第２波長であるときの、フォーカス位置を合わせたときの検出光学系６（対物レンズ６ａ）の位置Ｚ１、Ｚ２を記録し、フォーカス位置のズレ量の空気換算長であるＺ２−Ｚ１を求める。尚、ステップＳ１終了時点では、ステージ５の位置がＺ１となるように駆動モータ７により調整される。
【００５９】
ステップＳ２では、駆動モータ７（位置調整機構）により例えばΔＺだけステージ５を移動させる。このとき、オフセット計算部２２は、上記（５）式に基づきｇ１を算出し、フォーカス調節部２３は、上記ズレ量の空気換算長ｇ１をオフセットするように駆動モータ８（フォーカス調整機構）を駆動させる。
【００６０】
ステップＳ３では、光源制御部２５が、波長の切り替え（第１波長から第２波長への切り替え）を実行する。
【００６１】
ステップＳ４では、オフセット計算部２２は、上記式（７）に基づき、ステップＳ２におけるステージ５の移動量ΔＺ、ステップＳ１で求めたＺ２−Ｚ１、記憶部２１から抽出した屈折率を用いて、オフセット量を算出する。フォーカス調節部２３は、上記ズレ量の空気換算長ｇをオフセットするように駆動モータ８（フォーカス調整機構）を駆動させる。
【００６２】
以上の第２実施例によれば、オフセット計算部２２は、記憶部２１から変更前後の励起光の波長に対応した媒体の屈折率を抽出し、さらに、駆動モータ８によるステージの移動量（ΔＺ）と、計測された駆動モータ８による位置変更前におけるフォーカス位置のズレ、を上記（７）式へ代入することで、駆動モータ８によるステージ５の位置変更後であり、第１波長から第２波長へ切り替えた後における、フォーカス位置のオフセット量を求めることができる。また、第２実施例によれば、第１実施例のように界面とシート光平面との間の距離を用いずに、オフセット量を算出することができる。
【００６３】
上述した実施形態は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。上述したシート照明顕微鏡は、特許請求の範囲に記載した本発明を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。
【符号の説明】
【００６４】
１００                    シート照明顕微鏡
１                        光源
２                        照明光学系
３                        レンズ
４                        シリンドリカルレンズ
５                        ステージ
６                        検出光学系
７、８                    駆動モータ
９                        容器
１０                      培養液
２０                      制御装置
Ｓ                        標本
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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