(57)【要約】      （修正有）【課題】マールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン、およびエボラウイルス・ザイールに感染した個体を治療するためのワクチンの提供。【解決手段】コンセンサスマールブルグウイルスフィロウイルス糖タンパク質ＭＡＲＶ  ＧＰ免疫原、コンセンサスエボラウイルス・スーダンフィロウイルス糖タンパク質ＳＥＢＯＶ  ＧＰ免疫原、およびコンセンサスエボラウイルス・ザイール糖タンパク質ＺＥＢＯＶ  ＧＰ免疫原を含む、コンセンサスフィロウイルス免疫原をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸分子および組成物。【選択図】図１Ｃ
2019006787.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、
ａ）コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列であって、前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列が、配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、配列番号１に９５％相同なアミノ酸配列、６００個以上のアミノ酸の含む配列番号１に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１に９５％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、核酸配列と、
ｂ）コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列であって、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、配列番号２に９５％相同なアミノ酸配列、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２に９５％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、核酸配列と、
ｃ）マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列であって、前記マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列が、配列番号３（ＭＡＲＶ）、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号３のフラグメント、配列番号３に９５％相同なアミノ酸配列、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号３に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号３（ＭＡＲＶ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号３のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号３に９５％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号３に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、核酸配列と、を含む、組成物。
【請求項２】
前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第１のプラスミドと、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第２のプラスミドと、前記マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第３のプラスミドと、を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ａ）前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の前記アミノ酸配列は、配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、配列番号１に９８％相同なアミノ酸配列、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１に９８％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択され、
ｂ）前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質の前記アミノ酸配列は、配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、配列番号２に９８％相同なアミノ酸配列、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２に９８％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択され、
ｃ）前記マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原の前記アミノ酸配列は、配列番号３（ＭＡＲＶ）、６３５個以上のアミノ酸を含む配列番号３のフラグメント、配列番号３に９８％相同なアミノ酸配列、６３５個以上のアミノ酸を含む配列番号３に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号３（ＭＡＲＶ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３５個以上のアミノ酸を含む配列番号３のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号３に９８％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３５個以上のアミノ酸を含む配列番号３に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第１のプラスミドと、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第２のプラスミドと、前記マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第３のプラスミドと、を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ａ）前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の前記アミノ酸配列は、配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、配列番号１に９９％相同なアミノ酸配列、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１に９９％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択され、
ｂ）前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質の前記アミノ酸配列は、配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、配列番号２に９９％相同なアミノ酸配列、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２に９９％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択され、
ｃ）前記マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原の前記アミノ酸配列は、配列番号３（ＭＡＲＶ）、６７０個以上のアミノ酸を含む配列番号３のフラグメント、配列番号３に９９％相同なアミノ酸配列、６７０個以上のアミノ酸を含む配列番号３に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号３（ＭＡＲＶ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６７０個以上のアミノ酸を含む配列番号３のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号３に９９％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６７０個以上のアミノ酸を含む配列番号３に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第１のプラスミドと、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第２のプラスミドと、前記マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第３のプラスミドと、を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号１およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号２およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号３およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
配列番号１またはＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１をコードする核酸配列を含む第１のプラスミドと、配列番号２またはＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２をコードする核酸配列を含む第２のプラスミドと、配列番号３またはＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号３をコードする核酸配列を含む第３のプラスミドと、を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
組成物であって、
ｉ）コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列であって、前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列が、配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、配列番号１に９５％相同なアミノ酸配列、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１に９５％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、核酸配列と、
ｉｉ）コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列であって、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、配列番号２に９５％相同なアミノ酸配列、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２に９５％相同なアミノ酸配列、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、核酸配列と、
ｉｉｉ）第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列であって、前記第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列が、配列番号４（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ１）、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号４のフラグメント、配列番号４に９５％相同なアミノ酸配列、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号４に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号４（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ１）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号４のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号４に９５％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号４に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、核酸配列と、
ｉｖ）第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列であって、前記第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列が、配列番号５（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ２）、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号５のフラグメント、配列番号５に９５％相同なアミノ酸配列、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号５に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号５（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ２）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号５のフラグメントＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号５に９５％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号５に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、核酸配列と、
ｖ）第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列であって、前記第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列が、配列番号６（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ３）、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号６のフラグメント、配列番号６に９５％相同なアミノ酸配列、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号６に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号６（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号６のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号６に９５％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号６に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、核酸配列と、を含む、組成物。
【請求項１０】
前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第１のプラスミドと、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第２のプラスミドと、前記第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第３のプラスミドと、前記第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第４のプラスミドと、前記第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第５のプラスミドと、を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ｖｉ）マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列であって、前記マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列が、配列番号３（ＭＡＲＶ）、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号３のフラグメント、配列番号３に９５％相同なアミノ酸配列、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号３に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号３（ＭＡＲＶ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号３のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号３に９５％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号３に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメントから選択される、核酸配列を更に含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第１のプラスミドと、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第２のプラスミドと、前記第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第３のプラスミドと、前記第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第４のプラスミドと、前記第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第５のプラスミドと、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第６のプラスミドと、を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ｉ）前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の前記アミノ酸配列は、配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、配列番号１に９８％相同なアミノ酸配列、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１に９８％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメント、からなる群から選択され、
ｉｉ）前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質の前記アミノ酸配列は、配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、配列番号２に９８％相同なアミノ酸配列、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２に９８％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択され、
ｉｉｉ）前記第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の前記アミノ酸配列は、配列番号４（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ１）、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号４のフラグメント、配列番号４に９８％相同なアミノ酸配列、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号４に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号４（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ１）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号４のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号４に９８％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号４に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択され、
ｉｖ）前記第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の前記アミノ酸配列は、配列番号５（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ２）、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号５のフラグメント、配列番号５に９８％相同なアミノ酸配列、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号５に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号５（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ２）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号５のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号５に９８％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号５に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択され、
ｖ）前記第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の前記アミノ酸配列は、配列番号６（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ３）、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号６のフラグメント、配列番号６に９８％相同なアミノ酸配列、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号６に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号６（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号６のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号６に９８％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０＊個以上のアミノ酸を含む配列番号６に９８％＊相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第１のプラスミドと、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第２のプラスミドと、前記第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第３のプラスミドと、前記第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第４のプラスミドと、前記第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第５のプラスミドと、を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ｖｉ）マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列であって、前記マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列が、配列番号３（ＭＡＲＶ）、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号３のフラグメント、配列番号３に９８％相同なアミノ酸配列、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号３に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号３（ＭＡＲＶ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号３のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号３に９８％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号３に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、核酸配列を更に含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第１のプラスミドと、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第２のプラスミドと、前記第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第３のプラスミドと、前記第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第４のプラスミドと、前記第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第５のプラスミドと、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第６のプラスミドと、を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ｉ）前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の前記アミノ酸配列は、配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、配列番号１に９９％相同なアミノ酸配列、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１に９９％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択され、
ｉｉ）前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質の前記アミノ酸配列は、配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、配列番号２に９９％相同なアミノ酸配列、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２に９９％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択され、
ｉｉｉ）前記第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の前記アミノ酸配列は、配列番号４（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ１）、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号４のフラグメント、配列番号４に９９％相同なアミノ酸配列、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号４に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号４（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ１）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号４のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号４に９９％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号４に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択され、
ｉｖ）前記第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の前記アミノ酸配列は、配列番号５（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ２）、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号５のフラグメント、配列番号５に９９％相同なアミノ酸配列、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号５に９９％相同なアミノ酸配列フラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号５（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ２）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号５のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号５に９９％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号５に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択され、
ｖ）前記第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の前記アミノ酸配列は、配列番号６（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ３）、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号６のフラグメント、配列番号６に９９％相同なアミノ酸配列、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号６に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号６（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号６のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号６に９９％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号６に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１８】
前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第１のプラスミドと、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第２のプラスミドと、前記第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第３のプラスミドと、前記第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第４のプラスミドと、前記第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第５のプラスミドと、を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ｖｉ）マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列であって、前記マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列が、配列番号３（ＭＡＲＶ）、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号３のフラグメント、配列番号３に９９％相同なアミノ酸配列、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号３に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号３（ＭＡＲＶ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号３のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号３に９９％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号３に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、核酸配列を更に含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第１のプラスミドと、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第２のプラスミドと、前記第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第３のプラスミドと、前記第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第４のプラスミドと、前記第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第５のプラスミドと、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第６のプラスミドと、を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
ｉ）前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の前記アミノ酸配列は、配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）からなる群から選択され、
ｉｉ）前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質の前記アミノ酸配列は、配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）からなる群から選択され、
ｉｉｉ）前記第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の前記アミノ酸配列は、配列番号４（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ１）およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号４（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ１）からなる群から選択され、
ｉｖ）前記第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の前記アミノ酸配列は、配列番号５（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ２）およびにＩｇＥシグナルペプチド連結される配列番号５（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ２）からなる群から選択され、
ｖ）前記第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の前記アミノ酸配列は、配列番号６（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ３）およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号６（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ）からなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第１のプラスミドと、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第２のプラスミドと、前記第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第３のプラスミドと、前記第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第４のプラスミドと、前記第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第５のプラスミドと、を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ｖｉ）マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列であって、前記マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列が、配列番号３（ＭＡＲＶ）およびＩｇＥシグナルペプチド連結される配列番号３（ＭＡＲＶ）からなる群から選択される、核酸配列を更に含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第１のプラスミドと、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第２のプラスミドと、前記第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第３のプラスミドと、前記第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第４のプラスミドと、前記第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第５のプラスミドと、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第６のプラスミドと、を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列であって、前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列が、配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、配列番号１に９５％相同なアミノ酸配列、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１に９５％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、核酸配列と、
コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列であって、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、配列番号２に９５％相同なアミノ酸配列、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２に９５％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、核酸配列と、を含む、組成物。
【請求項２６】
前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第１のプラスミドと、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第２のプラスミドと、を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の前記アミノ酸配列は、配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、配列番号１に９８％相同なアミノ酸配列、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１に９８％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択され、
前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質の前記アミノ酸配列は、配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、配列番号２に９８％相同なアミノ酸配列、６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２に９８％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６３０個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９８％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第１のプラスミドと、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第２のプラスミドと、前記マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第３のプラスミドと、を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の前記アミノ酸配列は、配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、配列番号１に９９％相同なアミノ酸配列、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１に９９％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択され、
前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質の前記アミノ酸配列は、配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、配列番号２に９９％相同なアミノ酸配列、６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２に９９％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６６０個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９９％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３０】
前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第１のプラスミドと、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む第２のプラスミドと、を含む、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号１およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号２およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３２】
配列番号１またはＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１をコードする核酸配列を含む第１のプラスミドと、配列番号２またはＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２をコードする核酸配列を含む第２のプラスミドと、を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
電気穿孔を用いた個体への送達のために製剤化される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２８からなる群から選択される１個以上のタンパク質をコードする核酸配列を更に含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
フィロウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、個体に、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物を、前記個体に免疫応答を誘導するのに有効な量で投与することを含む、方法。
【請求項３６】
マールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン、およびエボラウイルス・ザイールからなる群から選択されるフィロウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、個体に、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物を、前記個体に免疫応答を誘導するのに有効な量で投与することを含む、方法。
【請求項３７】
フィロウイルスと診断された個体を治療する方法であって、治療的に有効な量の請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物を個体に投与することを含む、方法。
【請求項３８】
マールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン、およびエボラウイルス・ザイールからなる群から選択されるフィロウイルスと診断された個体を治療する方法であって、治療的に有効な量の請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物を個体に投与することを含む、方法。
【請求項３９】
個体のフィロウイルス感染を予防する方法であって、予防的に有効な量の請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物を個体に投与することを含む、方法。
【請求項４０】
個体のフィロウイルス感染を予防する方法であって、前記フィロウイルスは、マールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン、およびエボラウイルス・ザイールからなる群から選択され、予防的に有効な量の請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物を個体に投与することを含む、方法。
【請求項４１】
コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原であって、前記コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列が、配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、配列番号１に９５％相同なアミノ酸配列、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号１のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号１に９５％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号１に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、免疫原、
コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原であって、前記コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント配列番号２に９５％相同なアミノ酸配列、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号２のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号２に９５％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号２に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、免疫原、
マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原であって、前記マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列が、配列番号３（ＭＡＲＶ）、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号３のフラグメント、配列番号３に９５％相同なアミノ酸配列、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号３に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号３（ＭＡＲＶ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号３のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号３に９５％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号３に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、免疫原、
第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原であって、前記第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列が、配列番号４（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ１）、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号４のフラグメント、配列番号４に９５％相同なアミノ酸配列、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号４に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号４（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ１）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号４のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号４に９５％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号４に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、免疫原、
第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原であって、前記第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列が、配列番号５（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ２）、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号５のフラグメント、配列番号５に９５％相同なアミノ酸配列、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号５に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号５（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ２）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号５のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号５に９５％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号５に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、免疫原、ならびに
第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原であって、前記第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列が、配列番号６（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ３）、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号６のフラグメント、配列番号６に９５％相同なアミノ酸配列、６００個以上のアミノ酸を含む配列番号６に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメント、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号６（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ）、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号６のフラグメントＩｇＥシグナルペプチドに連結される配列番号６に９５％相同なアミノ酸配列、およびＩｇＥシグナルペプチドに連結される６００個以上のアミノ酸を含む配列番号６に９５％相同なアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択される、免疫原
からなる群から選択される、２個以上のタンパク質を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫応答を誘導するため、およびフィロウイルス感染を予防するため、および／またはフィロウイルスに感染した、具体的には、マールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン、およびエボラウイルス・ザイールによる感染に感染した個体を治療するためのワクチンに関する。本発明は、コンセンサスフィロウイルスタンパク質、具体的には、マールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン、およびエボラウイルス・ザイールフィロウイルスタンパク質、ならびにそれらをコードする核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
フィロウイルス科は、２つの多岐的な属、マールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）およびエボラウイルス（ＥＢＯＶ）を含有する、非分割型の一本鎖ＲＮＡウイルスである。この各々からのメンバーは、深刻で高度に致死的な出血熱病を引き起こす可能性があり、それに対する治療または認可されたワクチンは存在しない（Ｂｒａｄｆｕｔｅ  Ｓ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ  ７：７０１−７１１、Ｆａｌｚａｒａｎｏ  Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  １０：６３−７７、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｂ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｆｉｅｌｄｓ’ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ．２ｖ．（ｘｉｘ，３０９１，Ｉ−３０８６ｐ．）、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４：ｅ５３０８、およびＴｏｗｎｅｒ  Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｏｕｔｂｒｅａｋ  ｉｎ  Ａｎｇｏｌａ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：６４９７−６５１６）。
【０００３】
最大９０％の致命率のため、これらは世界保健機関によって「人類にとって最も有毒な既知のウイルス性疾患のうちの１つ」として記載されている。アメリカ疾病予防管理センターは、一部には武器として利用された場合の国家の安全に対するその潜在的脅威のため、これらを「カテゴリＡ生物テロ薬剤」と分類している（Ｂｕｒｋｉ  Ｔ．Ｋ．（２０１１）ＵＳＡ  ｆｏｃｕｓｅｓ  ｏｎ  Ｅｂｏｌａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂｕｔ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｇａｐｓ  ｒｅｍａｉｎ．Ｌａｎｃｅｔ  ３７８：３８９）。これらの「優先度の高い」薬剤は、理論上、容易に伝染し、高い致死率をもたらし、公衆衛生上の  大きな衝撃およびパニックを引き起こし、公衆衛生の備えに対する特別な行動を要する可能性がある（ＣＤＣ（２０１１）Ｂｉｏｔｅｒｒｏｒｉｓｍ  Ａｇｅｎｔｓ／Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｔｌａｎｔａ：Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）。
【０００４】
出血熱病は、保菌者状態を伴わない急性感染性であるが、ただし汚染された体液、血液、および組織との直接接触によってヒトおよび非ヒト霊長類に容易に伝染可能である（Ｆｅｌｄｍａｎｎ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ：ｆｒｏｍ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：６７７−６８５）。発生状況において、医療機器の再使用、資源の限られた医療施設、および予防対策の遅れは、疾患の伝染を上昇させ、医療機関における感染を増幅させる。
【０００５】
これらの人畜共通病原体の自然宿主は、アフリカコウモリおよびブタである可能性が高く（Ｋｏｂｉｎｇｅｒ  Ｇ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｓｈｅｄｄｉｎｇ，ａｎｄ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｚａｉｒｅ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｐｉｇｓ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０４：２００−２０８）、後者はより感染を増幅させる宿主である可能性があり、発生開始時にウイルスが初めに出現する様式は、感染した動物と接触したヒトを通じて生じると考えられている。フィリピン、潜在的にヨーロッパ、また主にアフリカにおけるこの疾患の予測不可能な流行の浮上は更に、大きな公衆衛生上の問題を構成する（Ｏｕｔｂｒｅａｋ  ｎｅｗｓ．（２００９）Ｅｂｏｌａ  Ｒｅｓｔｏｎ  ｉｎ  ｐｉｇｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ，Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ．Ｗｋｌｙ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｒｅｃ  ８４：４９−５０）。
【０００６】
齧歯動物の前臨床研究における実験を含む、防御効果および広範なＣＴＬを誘導するワクチンの能力を決定するために、実験が実施されている。Ｆｅｎｉｍｏｒｅ  ＰＷ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｂｒｏａｄｌｙ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｆｉｌｏｖｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｃｏｖｅｒａｇｅ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ４４７６９、Ｈｅｎｓｌｅｙ  ＬＥ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ  Ｓｐｅｃｉｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ６：ｅｌ０００９０４、Ｚａｈｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ（２０１２）．Ａｄ３５  ａｎｄ  ａｄ２６  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ４４１１５、Ｇｅｉｓｂｅｒｔ  ＴＷ，Ｆｅｌｄｍａｎｎ  Ｈ（２０１１）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｂｏｌａ  ａｎｄ  Ｍａｒｂｕｒｇ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０４  Ｓｕｐｐｌ  ３：Ｓ１０７５−１０８１、およびＧｒａｎｔ−Ｋｌｅｉｎ  ＲＪ，Ｖａｎ  Ｄｅｕｓｅｎ  ＮＭ，Ｂａｄｇｅｒ  ＣＶ，Ｈａｎｎａｍａｎ  Ｄ，Ｄｕｐｕｙ  ＬＣ，Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎ  ＣＳ（２０１２）．Ａ  ｍｕｌｔｉａｇｅｎｔ  ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｅｂｏｌａ  ａｎｄ  Ｍａｒｂｕｒｇ  ｖｉｒｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ８、Ｇｒａｎｔ−Ｋｌｅｉｎ  ＲＪ，Ａｌｔａｍｕｒａ  ＬＡ，Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎ  ＣＳ（２０１１）．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｌａｓｓａ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｆｉｌｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  １６２：  １４８−１６１）。
【０００７】
ワクチン誘導適応免疫応答は、多数の前臨床動物モデルにおいて記載されている（Ｂｌａｎｅｙ  ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｏｒ  ｌｉｖｅ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒａｂｉｅｓ  ａｎｄ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８５：１０６０５−１０６１６、Ｄｏｗｌｉｎｇ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ＧＰ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１：１８２１−１８３７、Ｊｏｎｅｓ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｂｏｌａ  ａｎｄ  Ｍａｒｂｕｒｇ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １１：７８６−７９０、Ｋａｌｉｎａ  ＷＶ，Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ＫＬ，Ｏｌｉｎｇｅｒ  ＧＧ，Ｂａｖａｒｉ  Ｓ（２００９）．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎ  ａ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｖｉｒｏｌ  Ｊ  ６：１３２、Ｋｏｂｉｎｇｅｒ  ＧＰ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｚａｉｒｅ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３４６：３９４−４０１、Ｏｌｉｎｇｅｒ  ＧＧ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃｏｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：１４１８９−１４１９６、Ｒａｏ  Ｍ，Ｂｒａｙ  Ｍ，Ａｌｖｉｎｇ  ＣＲ，Ｊａｈｒｌｉｎｇ  Ｐ，Ｍａｔｙａｓ  ＧＲ（２００２）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ｔｏ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ：  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ＣＤ４（＋）  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：９１７６−９１８５、Ｒａｏ  Ｍ，Ｍａｔｙａｓ  ＧＲ，Ｇｒｉｅｄｅｒ  Ｆ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｋ，Ｊａｈｒｌｉｎｇ  ＰＢ，Ａｌｖｉｎｇ  ＣＲ（１９９９）．Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  Ｅｂｏｌａ  Ｚａｉｒｅ  ｖｉｒｕｓ  ａｒｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ  Ａ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：２９９１−２９９８、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅ���ｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４：ｅ５３０８、Ｖａｎｄｅｒｚａｎｄｅｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ（１９９８）．ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｉｔｈｅｒ  ｔｈｅ  ＧＰ  ｏｒ  ＮＰ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｌｅｔｈａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４６：１３４−１４４、Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ＫＬ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｅｔｈａｌ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５：１１８４−１１９１、Ｊｏｎｅｓ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９６  Ｓｕｐｐｌ２：Ｓ４０４−４１２  Ｇｒａｎｔ−Ｋｌｅｉｎ  ＲＪ，Ｖａｎ  Ｄｅｕｓｅｎ  ＮＭ，Ｂａｄｇｅｒ  ＣＶ，Ｈａｎｎａｍａｎ  Ｄ，Ｄｕｐｕｙ  ＬＣ，Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎ  ＣＳ（２０１２）．Ａ  ｍｕｌｔｉａｇｅｎｔ  ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｅｂｏｌａ  ａｎｄ  Ｍａｒｂｕｒｇ  ｖｉｒｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ８．、Ｇｅｉｓｂｅｒｔ  ＴＷ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｖｅｃｔｏｒ  ｃｈｏｉｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ａｎｇｏｌａ  Ｍａｒｂｕｒｇ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８４：１０３８６−１０３９４）。ウイルスワクチンは有望であり、主に組み換えアデノウイルスおよび水胞性口炎ウイルスを含む。組み換えＤＮＡおよびＡｇ共役型ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンなどの非感染性戦略もまた、実証されたレベルの前臨床有効性を有し、概してウイルスベースプラットフォームより安全であると考えられている。ウイルス特異性Ａｂは、受動的に適用される場合、感染前かまたは感染直後かに適用されるときに防御となり得る（Ｇｕｐｔａ  Ｍ，Ｍａｈａｎｔｙ  Ｓ，Ｂｒａｙ  Ｍ，Ａｈｍｅｄ  Ｒ，Ｒｏｌｌｉｎ  ＰＥ（２００１）．Ｐａｓｓｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｅｔｈａｌ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：４６４９−４６５４、Ｍａｒｚｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ａ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｅｂｏｌａ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ３６１９２、Ｐａｒｒｅｎ  ＰＷ，Ｇｅｉｓｂｅｒｔ  ＴＷ，Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｔ，Ｊａｈｒｌｉｎｇ  ＰＢ，Ｂｕｒｔｏｎ  ＤＲ（２００２）．Ｐｒｅ−  ａｎｄ  ｐｏｓｔｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ  ｏｆ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｂｙ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：６４０８−６４１２、Ｑｉｕ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｅｂｏｌａ  ＧＰ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｇｕｉｎｅａ  Ｐｉｇｓ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｔｈａｌ  Ｅｂｏｌａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳＮｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉｓ  ６：  ｅｌ５７５、Ｗｉｌｓｏｎ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１６６４−１６６６、Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＮＪ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．ＣＤ８（＋）ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｒＡｄ５  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １７：１１２８−１１３１、Ｂｒａｄｆｕｔｅ  ＳＢ，Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ＫＬ，Ｂａｖａｒｉ  Ｓ（２００８）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｌｅｔｈａｌ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８０：４０５８−４０６６、Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ＫＬ，Ｏｌｉｎｇｅｒ  ＧＧ（２０１１）．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１１：９８４２４１）。Ｔ細胞はまた、ノックアウトマウスにおいて実施された研究、ＮＨＰにおける枯渇研究、および有効性が養子移入ＣＤ８＋Ｔ細胞の溶解機能に大きく関連したマウス養子移入研究を基に、防御を提供することが示されている。しかしながら、防御ワクチンによって駆動されるようなこの応答の関連分析はほとんど報告されていない。
【０００８】
対策の発展は最終的には、防御的免疫相関物およびそれらが感染中にいかに調節されるかについての向上された理解を必要とするであろう。これは、フィロウイルス性疾患に罹患した感染個体が早期の免疫応答を行うことができないときに、困難であると分かる。これらの動きの速い出血熱病は、ウイルス特異性Ａｂ応答の欠失によって示されるような免疫調節異常、および総Ｔ細胞数の著しい低減をもたらし、制御されていないウイルス複製ならびに多臓器感染および不全につながる。反対に、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）疾患の生存者は、早期で一時的なＩｇＭ応答を示し、その後直ちにウイルス特異性ＩｇＧおよびＣＴＬのレベルの増加が続く。これらの観察は、液性および細胞媒介免疫応答が、疾患への防御の付与に貢献することを示唆している。これらのデータはまた、致死的攻撃への防御に対するワクチン誘導適応免疫の寄与を実証する多数の前臨床有効性研究によっても支持されている。しかしながら、山のような証拠は、防御の提供におけるＴ細胞の決定的役割を実証しており、有効性はＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的表現型に大きく関連している。これらの最近の研究は、防御の提供におけるＴ細胞の重要性を強調しているが、それらの明確な寄与は特徴付けられておらず、議論の余地が残るままである。更に、防御ワクチンによって駆動されるこの応答の詳細な分析はほとんど報告されていない。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、およびマールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物が提供される。コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、配列番号１のフラグメント、配列番号１に相同なアミノ酸配列、または配列番号１に相同なアミノ酸配列のフラグメントであってもよい。配列番号１に相同なアミノ酸配列は、典型的には配列番号１に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号１のフラグメントまたは配列番号１に相同なアミノ酸配列のフラグメントは、典型的には６００個以上、６３０個以上、または６６０個以上のアミノ酸である。コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、配列番号２のフラグメント、配列番号２に相同なアミノ酸配列、または配列番号２に相同なアミノ酸配列のフラグメントであってもよい。配列番号１に相同なアミノ酸配列は、典型的には配列番号２に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号２のフラグメントまたは配列番号２に相同なアミノ酸配列のフラグメントは、典型的には６００個以上、６３０個以上、または６６０個以上のアミノ酸である。マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号３（ＭＡＲＶ  ＡＮＧ）、配列番号３のフラグメント、配列番号３に相同なアミノ酸配列、または配列番号３に相同なアミノ酸配列のフラグメントであってもよい。配列番号３に相同なアミノ酸配列は、典型的には配列番号３に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号３のフラグメントまたは配列番号３に相同なアミノ酸配列のフラグメントは、典型的には６００個以上、６３７個以上、または６７０個以上のアミノ酸である。アミノ酸配列は所望により、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含んでもよい。
【００１０】
コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、マールブルグマールブルグウイルス第１のコンセンサスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、マールブルグマールブルグウイルス第２のコンセンサスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、およびマールブルグマールブルグウイルス第３のコンセンサスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物も、提供される。コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、配列番号１のフラグメント、配列番号１に相同なアミノ酸配列、または配列番号１に相同なアミノ酸配列のフラグメントであってもよい。配列番号１に相同なアミノ酸配列は、典型的には配列番号１に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号１のフラグメントまたは配列番号１に相同なアミノ酸配列のフラグメントは、典型的には６００個以上、６３０個以上、または６６０個以上のアミノ酸である。コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、配列番号２のフラグメント、配列番号２に相同なアミノ酸配列、または配列番号２に相同なアミノ酸配列のフラグメントであってもよい。配列番号１に相同なアミノ酸配列は、典型的には配列番号２に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号２のフラグメントまたは配列番号２に相同なアミノ酸配列のフラグメントは、典型的には６００個以上、６３０個以上、または６６０個以上のアミノ酸である。マールブルグマールブルグウイルス第１のコンセンサスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号４（ＭＡＲＶ  ＲＡＶ）、配列番号４のフラグメント、配列番号４に相同なアミノ酸配列、または配列番号４に相同なアミノ酸配列のフラグメントであってもよい。配列番号４に相同なアミノ酸配列は、典型的には配列番号４に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号４のフラグメントまたは配列番号４に相同なアミノ酸配列のフラグメントは、典型的には６００個以上、６３７個以上、または６７０個以上のアミノ酸である。マールブルグマールブルグウイルス第２のコンセンサスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号５（ＭＡＲＶ  ＯＺＯ）、配列番号５のフラグメント、配列番号５に相同なアミノ酸配列、または配列番号５に相同なアミノ酸配列のフラグメントであってもよい。配列番号５に相同なアミノ酸配列は、典型的には配列番号４に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号５のフラグメントまたは配列番号５に相同なアミノ酸配列のフラグメントは、典型的には６００個以上、６３７個以上、または６７０個以上のアミノ酸である。マールブルグマールブルグウイルス第３のコンセンサスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配���番号６（ＭＡＲＶ  ＭＵＳ）、配列番号６のフラグメント、配列番号６に相同なアミノ酸配列、または配列番号６に相同なアミノ酸配列のフラグメントであってもよい。配列番号６に相同なアミノ酸配列は、典型的には配列番号６に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、また９９％以上相同である。配列番号６フラグメントまたは配列番号６に相同なアミノ酸配列のフラグメントは、典型的には６００個以上、６３７個以上、または６７０個以上のアミノ酸である。アミノ酸配列は所望により、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含んでもよい。幾つかの実施形態では、組成物は更に、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む。マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号３（ＭＡＲＶ  ＡＮＧ）、配列番号３のフラグメント、配列番号３に相同なアミノ酸配列、または配列番号３に相同なアミノ酸配列のフラグメントであってもよい。配列番号３に相同なアミノ酸配列は、典型的には配列番号３に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号３のフラグメントまたは配列番号３に相同なアミノ酸配列のフラグメントは、典型的には６００個以上、６３７個以上、または６７０個以上のアミノ酸である。アミノ酸配列は所望により、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含んでもよい。
【００１１】
コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、およびコンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物も提供される。コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号１（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ）、配列番号１のフラグメント、配列番号１に相同なアミノ酸配列、または配列番号１に相同なアミノ酸配列のフラグメントであってもよい。配列番号１に相同なアミノ酸配列は、典型的には配列番号１に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号１のフラグメントまたは配列番号１に相同なアミノ酸配列のフラグメントは、典型的には６００個以上、６３０個以上、または６６０個以上のアミノ酸である。コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列は、配列番号２（ＳＵＤＶ  ＣＯＮ）、配列番号２のフラグメント、配列番号２に相同なアミノ酸配列、または配列番号２に相同なアミノ酸配列のフラグメントであってもよい。配列番号１に相同なアミノ酸配列は、典型的には配列番号２に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号２のフラグメントまたは配列番号２に相同なアミノ酸配列のフラグメントは、典型的には６００個以上、６３０個以上、または６６０個以上のアミノ酸である。アミノ酸配列は所望により、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含んでもよい。
【００１２】
コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、およびマールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物が提供される。コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列は、配列番号６４、配列番号６４のフラグメント、配列番号６４に相同な核酸配列、または配列番号６４に相同なヌクレオチド配列のフラグメントであってもよい。配列番号６４に相同な核酸酸配列は、典型的には配列番号６４に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号６４のフラグメントまたは配列番号６４に相同なアミノ酸配列のフラグメントは典型的には、配列番号６４によってコードされるコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の６００個以上、６３０個以上、または６６０個以上のアミノ酸をコードする。コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列は、配列番号６５、配列番号６５のフラグメント、配列番号６５に相同な核酸配列、または配列番号６５に相同なヌクレオチド配列のフラグメントであってもよい。配列番号６５に相同な核酸配列は、典型的には配列番号６５に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号６５のフラグメントまたは配列番号６５に相同なアミノ酸配列のフラグメントは典型的には、配列番号６５によってコードされるコンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の６００個以上、６３０個以上、または６６０個以上のアミノ酸をコードする。マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列は、配列番号６６、配列番号６６のフラグメント、配列番号６６に相同な核酸配列、または配列番号６６に相同なヌクレオチド配列のフラグメントであってもよい。配列番号６６に相同な核酸配列は、典型的には配列番号６６に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９９％以上、または９９％以上相同である。配列番号６６のフラグメントまたは配列番号６６に相同なアミノ酸配列のフラグメントは典型的には、配列番号６６によってコードされるマールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原の６００個以上、６３０個以上、または６７０個以上のアミノ酸をコードする。核酸配列は所望により、免疫原をコードする配列に連結されるＩｇＥリーダーなどのリーダー配列をコードする配列を含んでもよい。
【００１３】
異なる核酸配列のそれぞれは、単一の核酸分子上にあってもよく、それぞれ別の核酸分子上または様々な順列にあってもよい。核酸分子は、プラスミドであってもよい。
【００１４】
組成物は、電気穿孔を用いた個体への送達のために製剤化されてもよい。
【００１５】
組成物は、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２８からなる群から選択される１個以上のタンパク質をコードする核酸配列を更に含んでもよい。
【００１６】
組成物は、フィロウイルスに対する免疫応答を誘導する方法において使用されてもよい。フィロウイルスは、マールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン、およびエボラウイルス・ザイールからなる群から選択されてもよい。
【００１７】
治療的に有効な量の組成物を個体に投与することを含む、フィロウイルスと診断された個体を治療する方法が提供される。フィロウイルスは、マールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン、およびエボラウイルス・ザイールからなる群から選択されてもよい。
【００１８】
個体のフィロウイルス感染を予防する方法が提供される。方法は、個体に予防的に有効な量の組成物を投与することを含む。フィロウイルスは、マールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン、およびエボラウイルス・ザイールからなる群から選択されてもよい。
【００１９】
コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原、第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、および第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原からなる群から選択される２個以上のタンパク質を含む組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、実施例１における多価ワクチン構築戦略および発現実験について述べる。図１Ａは、ＭＧＰ（上）、ＳＧＰ（右下）、およびＺＧＰ（左下）に関する系統樹を示す。有意な支持値が、ブートストラップ解析によって検証され、（*）で示される。コンセンサス戦略が、ＺＧＰおよびＳＧＰ免疫原（ＣＯＮワクチン）に適用された。スケールバーは一部位あたりのアミノ酸の距離を表し、解析は、ＭＥＧＡバージョン５ソフトウエアを用いて行った。ＧＰトランス遺伝子は、商業的に合成され、遺伝的に最適化され、改変されたｐＶＡＸ１哺乳動物発現ベクターへとサブクローニングされた。抗原発現は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のその後の形質移入をウエスタン免疫ブロット法およびＦＡＣＳによって解析した。ウエスタン免疫ブロット法の結果が図１Ｂに示され、ＦＡＣＳの結果が図１Ｃに示される。比較対照のため、ＭＧＰ、ＳＧＰ、またはＺＧＰを発現するｒＶＳＶを各ＧＰ  標本と同時に実施し、種特異性抗ＧＰ１  ｍＡｂを検出のために使用した。大きさが示される（ｋＤａ）。ＦＡＣＳのために、形質移入細胞は、マウス由来ＧＰ特異性血清試薬で間接的に染色され、その後広範囲に洗浄され、ヤギ抗マウスＩｇＧおよびＭＨＣクラスＩが続いた。ウエスタン免疫ブロット法およびＦＡＣＳ実験は、少なくとも３回反復され、同様の結果が得られた。無根系統樹に関する有意性は、最大公算法によって決定され、ブートストラップ解析によって検証され、有意な支持値（≧８０％；１，０００ブートストラップ複製）は、ＭＥＧＡバージョン５ソフトウエアによって決定された。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｃは、実施例１における多価ワクチン構築戦略および発現実験について述べる。図１Ａは、ＭＧＰ（上）、ＳＧＰ（右下）、およびＺＧＰ（左下）に関する系統樹を示す。有意な支持値が、ブートストラップ解析によって検証され、（*）で示される。コンセンサス戦略が、ＺＧＰおよびＳＧＰ免疫原（ＣＯＮワクチン）に適用された。スケールバーは一部位あたりのアミノ酸の距離を表し、解析は、ＭＥＧＡバージョン５ソフトウエアを用いて行った。ＧＰトランス遺伝子は、商業的に合成され、遺伝的に最適化され、改変されたｐＶＡＸ１哺乳動物発現ベクターへとサブクローニングされた。抗原発現は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のその後の形質移入をウエスタン免疫ブロット法およびＦＡＣＳによって解析した。ウエスタン免疫ブロット法の結果が図１Ｂに示され、ＦＡＣＳの結果が図１Ｃに示される。比較対照のため、ＭＧＰ、ＳＧＰ、またはＺＧＰを発現するｒＶＳＶを各ＧＰ  標本と同時に実施し、種特異性抗ＧＰ１  ｍＡｂを検出のために使用した。大きさが示される（ｋＤａ）。ＦＡＣＳのために、形質移入細胞は、マウス由来ＧＰ特異性血清試薬で間接的に染色され、その後広範囲に洗浄され、ヤギ抗マウスＩｇＧおよびＭＨＣクラスＩが続いた。ウエスタン免疫ブロット法およびＦＡＣＳ実験は、少なくとも３回反復され、同様の結果が得られた。無根系統樹に関する有意性は、最大公算法によって決定され、ブートストラップ解析によって検証され、有意な支持値（≧８０％；１，０００ブートストラップ複製）は、ＭＥＧＡバージョン５ソフトウエアによって決定された。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、実施例１における多価ワクチン構築戦略および発現実験について述べる。図１Ａは、ＭＧＰ（上）、ＳＧＰ（右下）、およびＺＧＰ（左下）に関する系統樹を示す。有意な支持値が、ブートストラップ解析によって検証され、（*）で示される。コンセンサス戦略が、ＺＧＰおよびＳＧＰ免疫原（ＣＯＮワクチン）に適用された。スケールバーは一部位あたりのアミノ酸の距離を表し、解析は、ＭＥＧＡバージョン５ソフトウエアを用いて行った。ＧＰトランス遺伝子は、商業的に合成され、遺伝的に最適化され、改変されたｐＶＡＸ１哺乳動物発現ベクターへとサブクローニングされた。抗原発現は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のその後の形質移入をウエスタン免疫ブロット法およびＦＡＣＳによって解析した。ウエスタン免疫ブロット法の結果が図１Ｂに示され、ＦＡＣＳの結果が図１Ｃに示される。比較対照のため、ＭＧＰ、ＳＧＰ、またはＺＧＰを発現するｒＶＳＶを各ＧＰ  標本と同時に実施し、種特異性抗ＧＰ１  ｍＡｂを検出のために使用した。大きさが示される（ｋＤａ）。ＦＡＣＳのために、形質移入細胞は、マウス由来ＧＰ特異性血清試薬で間接的に染色され、その後広範囲に洗浄され、ヤギ抗マウスＩｇＧおよびＭＨＣクラスＩが続いた。ウエスタン免疫ブロット法およびＦＡＣＳ実験は、少なくとも３回反復され、同様の結果が得られた。無根系統樹に関する有意性は、最大公算法によって決定され、ブートストラップ解析によって検証され、有意な支持値（≧８０％；１，０００ブートストラップ複製）は、ＭＥＧＡバージョン５ソフトウエアによって決定された。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｈは、ＭＡＲＶおよびＺＥＢＯＶ攻撃に対する完全な防御が観察された、施例１における実験結果を示す。動物の生存データが、図２Ａおよび図２Ｅに示される。図２Ａは、三価ワクチン接種を受けた動物はＭＡＲＶ攻撃後に生存したが、一方対照動物は１０日目までに全て死亡したことを示す。図２Ｅは、三価ワクチン接種を受けた動物は、ＺＥＢＯＶ攻撃後に生存したが、一方対照動物は７日目までに全て死亡したことを示す。ワクチン接種を受けたＭＡＲＶにより攻撃されたものに関して、ワクチン接種を受けた動物および対照動物に関する体重における変化％のデータが図２Ｂに示される。ｙ軸は、図２Ｆに示される通り体重における変化を示す。薄い実線は、三価ワクチン接種を受けた動物に関するものである。薄い破線は、ＴｒｉＡＶＥ、三価ワクチン接種を受けた動物の平均結果に関するものである。濃い実線は、対照動物に関するものである。濃い破線は、対照ＡＶＥ、対照動物の平均結果に関するものである。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜９日目からグラフ上で減少しており、１０日目までに動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。ワクチン接種を受けたＺＥＢＯＶにより攻撃されたものに関して、ワクチン接種を受けた動物および対照動物に関する体重における変化％のデータが、図２Ｆに示される。ｙ軸は、体重における変化をパーセントで示す。薄い実線は、三価ワクチン接種を受けた動物に関するものである。薄い破線は、ＴｒｉＡＶＥ、三価ワクチン接種を受けた動物の平均結果に関するものである。濃い実線は、対照動物に関するものである。濃い破線は、対照ＡＶＥ、対照動物の平均結果に関するものである。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜６日目からグラフ上で減少しており、８日目の前に動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。（ｇｐＭＡＲＶに関してｎ＝３、ｇｐＺＥＢＯＶに関してｎ＝６）。第１（１Ｘ）および第２の（２Ｘ）免疫化の前（Ｐｒｅ）および後に、結合Ａｂ（図２Ｃおよび図２Ｇ）およびＮＡｂ（図２Ｄおよび図２Ｈ）が、ワクチン接種を受けた動物に由来する血清において測定された。解析は、プール血清において行われた（図２Ｈ）。*ｐ＜０．１、***ｐ＜０．００１、****ｐ＜０．０００１。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｈは、ＭＡＲＶおよびＺＥＢＯＶ攻撃に対する完全な防御が観察された、施例１における実験結果を示す。動物の生存データが、図２Ａおよび図２Ｅに示される。図２Ａは、三価ワクチン接種を受けた動物はＭＡＲＶ攻撃後に生存したが、一方対照動物は１０日目までに全て死亡したことを示す。図２Ｅは、三価ワクチン接種を受けた動物は、ＺＥＢＯＶ攻撃後に生存したが、一方対照動物は７日目までに全て死亡したことを示す。ワクチン接種を受けたＭＡＲＶにより攻撃されたものに関して、ワクチン接種を受けた動物および対照動物に関する体重における変化％のデータが図２Ｂに示される。ｙ軸は、図２Ｆに示される通り体重における変化を示す。薄い実線は、三価ワクチン接種を受けた動物に関するものである。薄い破線は、ＴｒｉＡＶＥ、三価ワクチン接種を受けた動物の平均結果に関するものである。濃い実線は、対照動物に関するものである。濃い破線は、対照ＡＶＥ、対照動物の平均結果に関するものである。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜９日目からグラフ上で減少しており、１０日目までに動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。ワクチン接種を受けたＺＥＢＯＶにより攻撃されたものに関して、ワクチン接種を受けた動物および対照動物に関する体重における変化％のデータが、図２Ｆに示される。ｙ軸は、体重における変化をパーセントで示す。薄い実線は、三価ワクチン接種を受けた動物に関するものである。薄い破線は、ＴｒｉＡＶＥ、三価ワクチン接種を受けた動物の平均結果に関するものである。濃い実線は、対照動物に関するものである。濃い破線は、対照ＡＶＥ、対照動物の平均結果に関するものである。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜６日目からグラフ上で減少しており、８日目の前に動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。（ｇｐＭＡＲＶに関してｎ＝３、ｇｐＺＥＢＯＶに関してｎ＝６）。第１（１Ｘ）および第２の（２Ｘ）免疫化の前（Ｐｒｅ）および後に、結合Ａｂ（図２Ｃおよび図２Ｇ）およびＮＡｂ（図２Ｄおよび図２Ｈ）が、ワクチン接種を受けた動物に由来する血清において測定された。解析は、プール血清において行われた（図２Ｈ）。*ｐ＜０．１、***ｐ＜０．００１、****ｐ＜０．０００１。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｈは、ＭＡＲＶおよびＺＥＢＯＶ攻撃に対する完全な防御が観察された、施例１における実験結果を示す。動物の生存データが、図２Ａおよび図２Ｅに示される。図２Ａは、三価ワクチン接種を受けた動物はＭＡＲＶ攻撃後に生存したが、一方対照動物は１０日目までに全て死亡したことを示す。図２Ｅは、三価ワクチン接種を受けた動物は、ＺＥＢＯＶ攻撃後に生存したが、一方対照動物は７日目までに全て死亡したことを示す。ワクチン接種を受けたＭＡＲＶにより攻撃されたものに関して、ワクチン接種を受けた動物および対照動物に関する体重における変化％のデータが図２Ｂに示される。ｙ軸は、図２Ｆに示される通り体重における変化を示す。薄い実線は、三価ワクチン接種を受けた動物に関するものである。薄い破線は、ＴｒｉＡＶＥ、三価ワクチン接種を受けた動物の平均結果に関するものである。濃い実線は、対照動物に関するものである。濃い破線は、対照ＡＶＥ、対照動物の平均結果に関するものである。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜９日目からグラフ上で減少しており、１０日目までに動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。ワクチン接種を受けたＺＥＢＯＶにより攻撃されたものに関して、ワクチン接種を受けた動物および対照動物に関する体重における変化％のデータが、図２Ｆに示される。ｙ軸は、体重における変化をパーセントで示す。薄い実線は、三価ワクチン接種を受けた動物に関するものである。薄い破線は、ＴｒｉＡＶＥ、三価ワクチン接種を受けた動物の平均結果に関するものである。濃い実線は、対照動物に関するものである。濃い破線は、対照ＡＶＥ、対照動物の平均結果に関するものである。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜６日目からグラフ上で減少しており、８日目の前に動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。（ｇｐＭＡＲＶに関してｎ＝３、ｇｐＺＥＢＯＶに関してｎ＝６）。第１（１Ｘ）および第２の（２Ｘ）免疫化の前（Ｐｒｅ）および後に、結合Ａｂ（図２Ｃおよび図２Ｇ）およびＮＡｂ（図２Ｄおよび図２Ｈ）が、ワクチン接種を受けた動物に由来する血清において測定された。解析は、プール血清において行われた（図２Ｈ）。*ｐ＜０．１、***ｐ＜０．００１、****ｐ＜０．０００１。
【図２Ｄ】図２Ａ〜２Ｈは、ＭＡＲＶおよびＺＥＢＯＶ攻撃に対する完全な防御が観察された、実施例１における実験結果を示す。動物の生存データが、図２Ａおよび図２Ｅに示される。図２Ａは、三価ワクチン接種を受けた動物はＭＡＲＶ攻撃後に生存したが、一方対照動物は１０日目までに全て死亡したことを示す。図２Ｅは、三価ワクチン接種を受けた動物は、ＺＥＢＯＶ攻撃後に生存したが、一方対照動物は７日目までに全て死亡したことを示す。ワクチン接種を受けたＭＡＲＶにより攻撃されたものに関して、ワクチン接種を受けた動物および対照動物に関する体重における変化％のデータが図２Ｂに示される。ｙ軸は、図２Ｆに示される通り体重における変化を示す。薄い実線は、三価ワクチン接種を受けた動物に関するものである。薄い破線は、ＴｒｉＡＶＥ、三価ワクチン接種を受けた動物の平均結果に関するものである。濃い実線は、対照動物に関するものである。濃い破線は、対照ＡＶＥ、対照動物の平均結果に関するものである。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜９日目からグラフ上で減少しており、１０日目までに動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。ワクチン接種を受けたＺＥＢＯＶにより攻撃されたものに関して、ワクチン接種を受けた動物および対照動物に関する体重における変化％のデータが、図２Ｆに示される。ｙ軸は、体重における変化をパーセントで示す。薄い実線は、三価ワクチン接種を受けた動物に関するものである。薄い破線は、ＴｒｉＡＶＥ、三価ワクチン接種を受けた動物の平均結果に関するものである。濃い実線は、対照動物に関するものである。濃い破線は、対照ＡＶＥ、対照動物の平均結果に関するものである。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜６日目からグラフ上で減少しており、８日目の前に動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。（ｇｐＭＡＲＶに関してｎ＝３、ｇｐＺＥＢＯＶに関してｎ＝６）。第１（１Ｘ）および第２の（２Ｘ）免疫化の前（Ｐｒｅ）および後に、結合Ａｂ（図２Ｃおよび図２Ｇ）およびＮＡｂ（図２Ｄおよび図２Ｈ）が、ワクチン接種を受けた動物に由来する血清において測定された。解析は、プール血清において行われた（図２Ｈ）。*ｐ＜０．１、***ｐ＜０．００１、****ｐ＜０．０００１。
【図２Ｅ】図２Ａ〜２Ｈは、ＭＡＲＶおよびＺＥＢＯＶ攻撃に対する完全な防御が観察された、実施例１における実験結果を示す。動物の生存データが、図２Ａおよび図２Ｅに示される。図２Ａは、三価ワクチン接種を受けた動物はＭＡＲＶ攻撃後に生存したが、一方対照動物は１０日目までに全て死亡したことを示す。図２Ｅは、三価ワクチン接種を受けた動物は、ＺＥＢＯＶ攻撃後に生存したが、一方対照動物は７日目までに全て死亡したことを示す。ワクチン接種を受けたＭＡＲＶにより攻撃されたものに関して、ワクチン接種を受けた動物および対照動物に関する体重における変化％のデータが図２Ｂに示される。ｙ軸は、図２Ｆに示される通り体重における変化を示す。薄い実線は、三価ワクチン接種を受けた動物に関するものである。薄い破線は、ＴｒｉＡＶＥ、三価ワクチン接種を受けた動物の平均結果に関するものである。濃い実線は、対照動物に関するものである。濃い破線は、対照ＡＶＥ、対照動物の平均結果に関するものである。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜９日目からグラフ上で減少しており、１０日目までに動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。ワクチン接種を受けたＺＥＢＯＶにより攻撃されたものに関して、ワクチン接種を受けた動物および対照動物に関する体重における変化％のデータが、図２Ｆに示される。ｙ軸は、体重における変化をパーセントで示す。薄い実線は、三価ワクチン接種を受けた動物に関するものである。薄い破線は、ＴｒｉＡＶＥ、三価ワクチン接種を受けた動物の平均結果に関するものである。濃い実線は、対照動物に関するものである。濃い破線は、対照ＡＶＥ、対照動物の平均結果に関するものである。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜６日目からグラフ上で減少しており、８日目の前に動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。（ｇｐＭＡＲＶに関してｎ＝３、ｇｐＺＥＢＯＶに関してｎ＝６）。第１（１Ｘ）および第２の（２Ｘ）免疫化の前（Ｐｒｅ）および後に、結合Ａｂ（図２Ｃおよび図２Ｇ）およびＮＡｂ（図２Ｄおよび図２Ｈ）が、ワクチン接種を受けた動物に由来する血清において測定された。解析は、プール血清において行われた（図２Ｈ）。*ｐ＜０．１、***ｐ＜０．００１、****ｐ＜０．０００１。
【図２Ｆ】図２Ａ〜２Ｈは、ＭＡＲＶおよびＺＥＢＯＶ攻撃に対する完全な防御が観察された、実施例１における実験結果を示す。動物の生存データが、図２Ａおよび図２Ｅに示される。図２Ａは、三価ワクチン接種を受けた動物はＭＡＲＶ攻撃後に生存したが、一方対照動物は１０日目までに全て死亡したことを示す。図２Ｅは、三価ワクチン接種を受けた動物は、ＺＥＢＯＶ攻撃後に生存したが、一方対照動物は７日目までに全て死亡したことを示す。ワクチン接種を受けたＭＡＲＶにより攻撃されたものに関して、ワクチン接種を受けた動物および対照動物に関する体重における変化％のデータが図２Ｂに示される。ｙ軸は、図２Ｆに示される通り体重における変化を示す。薄い実線は、三価ワクチン接種を受けた動物に関するものである。薄い破線は、ＴｒｉＡＶＥ、三価ワクチン接種を受けた動物の平均結果に関するものである。濃い実線は、対照動物に関するものである。濃い破線は、対照ＡＶＥ、対照動物の平均結果に関するものである。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜９日目からグラフ上で減少しており、１０日目までに動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。ワクチン接種を受けたＺＥＢＯＶにより攻撃されたものに関して、ワクチン接種を受けた動物および対照動物に関する体重における変化％のデータが、図２Ｆに示される。ｙ軸は、体重における変化をパーセントで示す。薄い実線は、三価ワクチン接種を受けた動物に関するものである。薄い破線は、ＴｒｉＡＶＥ、三価ワクチン接種を受けた動物の平均結果に関するものである。濃い実線は、対照動物に関するものである。濃い破線は、対照ＡＶＥ、対照動物の平均結果に関するものである。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜６日目からグラフ上で減少しており、８日目の前に動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。（ｇｐＭＡＲＶに関してｎ＝３、ｇｐＺＥＢＯＶに関してｎ＝６）。第１（１Ｘ）および第２の（２Ｘ）免疫化の前（Ｐｒｅ）および後に、結合Ａｂ（図２Ｃおよび図２Ｇ）およびＮＡｂ（図２Ｄおよび図２Ｈ）が、ワクチン接種を受けた動物に由来する血清において測定された。解析は、プール血清において行われた（図２Ｈ）。*ｐ＜０．１、***ｐ＜０．００１、****ｐ＜０．０００１。
【図２Ｇ】図２Ａ〜２Ｈは、ＭＡＲＶおよびＺＥＢＯＶ攻撃に対する完全な防御が観察された、実施例１における実験結果を示す。動物の生存データが、図２Ａおよび図２Ｅに示される。図２Ａは、三価ワクチン接種を受けた動物はＭＡＲＶ攻撃後に生存したが、一方対照動物は１０日目までに全て死亡したことを示す。図２Ｅは、三価ワクチン接種を受けた動物は、ＺＥＢＯＶ攻撃後に生存したが、一方対照動物は７日目までに全て死亡したことを示す。ワクチン接種を受けたＭＡＲＶにより攻撃されたものに関して、ワクチン接種を受けた動物および対照動物に関する体重における変化％のデータが図２Ｂに示される。ｙ軸は、図２Ｆに示される通り体重における変化を示す。薄い実線は、三価ワクチン接種を受けた動物に関するものである。薄い破線は、ＴｒｉＡＶＥ、三価ワクチン接種を受けた動物の平均結果に関するものである。濃い実線は、対照動物に関するものである。濃い破線は、対照ＡＶＥ、対照動物の平均結果に関するものである。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜９日目からグラフ上で減少しており、１０日目までに動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。ワクチン接種を受けたＺＥＢＯＶにより攻撃されたものに関して、ワクチン接種を受けた動物および対照動物に関する体重における変化％のデータが、図２Ｆに示される。ｙ軸は、体重における変化をパーセントで示す。薄い実線は、三価ワクチン接種を受けた動物に関するものである。薄い破線は、ＴｒｉＡＶＥ、三価ワクチン接種を受けた動物の平均結果に関するものである。濃い実線は、対照動物に関するものである。濃い破線は、対照ＡＶＥ、対照動物の平均結果に関するものである。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜６日目からグラフ上で減少しており、８日目の前に動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。（ｇｐＭＡＲＶに関してｎ＝３、ｇｐＺＥＢＯＶに関してｎ＝６）。第１（１Ｘ）および第２の（２Ｘ）免疫化の前（Ｐｒｅ）および後に、結合Ａｂ（図２Ｃおよび図２Ｇ）およびＮＡｂ（図２Ｄおよび図２Ｈ）が、ワクチン接種を受けた動物に由来する血清において測定された。解析は、プール血清において行われた（図２Ｈ）。*ｐ＜０．１、***ｐ＜０．００１、****ｐ＜０．０００１。
【図２Ｈ】図２Ａ〜２Ｈは、ＭＡＲＶおよびＺＥＢＯＶ攻撃に対する完全な防御が観察された、実施例１における実験結果を示す。動物の生存データが、図２Ａおよび図２Ｅに示される。図２Ａは、三価ワクチン接種を受けた動物はＭＡＲＶ攻撃後に生存したが、一方対照動物は１０日目までに全て死亡したことを示す。図２Ｅは、三価ワクチン接種を受けた動物は、ＺＥＢＯＶ攻撃後に生存したが、一方対照動物は７日目までに全て死亡したことを示す。ワクチン接種を受けたＭＡＲＶにより攻撃されたものに関して、ワクチン接種を受けた動物および対照動物に関する体重における変化％のデータが図２Ｂに示される。ｙ軸は、図２Ｆに示される通り体重における変化を示す。薄い実線は、三価ワクチン接種を受けた動物に関するものである。薄い破線は、ＴｒｉＡＶＥ、三価ワクチン接種を受けた動物の平均結果に関するものである。濃い実線は、対照動物に関するものである。濃い破線は、対照ＡＶＥ、対照動物の平均結果に関するものである。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜９日目からグラフ上で減少しており、１０日目までに動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。ワクチン接種を受けたＺＥＢＯＶにより攻撃されたものに関して、ワクチン接種を受けた動物および対照動物に関する体重における変化％のデータが、図２Ｆに示される。ｙ軸は、体重における変化をパーセントで示す。薄い実線は、三価ワクチン接種を受けた動物に関するものである。薄い破線は、ＴｒｉＡＶＥ、三価ワクチン接種を受けた動物の平均結果に関するものである。濃い実線は、対照動物に関するものである。濃い破線は、対照ＡＶＥ、対照動物の平均結果に関するものである。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜６日目からグラフ上で減少しており、８日目の前に動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。（ｇｐＭＡＲＶに関してｎ＝３、ｇｐＺＥＢＯＶに関してｎ＝６）。第１（１Ｘ）および第２の（２Ｘ）免疫化の前（Ｐｒｅ）および後に、結合Ａｂ（図２Ｃおよび図２Ｇ）およびＮＡｂ（図２Ｄおよび図２Ｈ）が、ワクチン接種を受けた動物に由来する血清において測定された。解析は、プール血清において行われた（図２Ｈ）。*ｐ＜０．１、***ｐ＜０．００１、****ｐ＜０．０００１。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、中和Ａｂの誘導を実証する実施例１の結果を示す。Ｂ細胞応答が、２つのワクチン接種のそれぞれの後に２０日間、４０μｇのＥ−ＤＮＡワクチン接種注射の間に３週間あけて、マウス（ｎ＝５／群）において評価された。図３Ａは、ＥＬＩＳＡによって測定したワクチン接種を受けた（実線）マウスまたは出血前（点線）マウスからの血清ＧＰ特異性ＩｇＧ応答を示す。データが図３Ｂに要約される。本研究ではＳＧＰは利用可能でなかったため、ｐＥＢＯＳ免疫付与およびｐＥＢＯＺ免疫付与された動物からの全応答をスクロース精製したＺＧＰに対して測定した。ｐＭＡＲＶ免疫付与されたマウスからのＩｇＧ応答が、ＭＡＲＶ−Ｏｚｏｌｉｎ  ＧＰに対して、または負の対照スクロース精製したＮｉｐａｈ  Ｇタンパク質を用いて測定され、血清標本の中和活性が、ＢＳＬ−４の施設にてＺＥＢＯＶ−ＥＧＦＰ、ＳＵＤＶ−Ｂｏｎｉｆａｃｅ、およびＭＡＲＶ−Ａｎｇｏｌａに対して測定され、ＮＡｂ価が図３Ｃに示される。ＳＵＤＶ−Ｂｏｎｉｆａｃｅに対するＮＡｂは、ＣＶ−１細胞における細胞変性効果（ＣＰＥ）に基づいて分析され、ＭＡＲＶ−Ａｎｇｏｌａに対するＮＡｂは、免疫蛍光分析を用いて分析された。平均が図３Ｂおよび図３Ｃに示され、エラーバーは標準誤差を表す。群解析が、マッチされた両側独立ｔ検定によって完了された。実験は、少なくとも２回反復され、同様の結果が得られ、*ｐ＜０．１、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１である。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｃは、中和Ａｂの誘導を実証する実施例１の結果を示す。Ｂ細胞応答が、２つのワクチン接種のそれぞれの後に２０日間、４０μｇのＥ−ＤＮＡワクチン接種注射の間に３週間あけて、マウス（ｎ＝５／群）において評価された。図３Ａは、ＥＬＩＳＡによって測定したワクチン接種を受けた（実線）マウスまたは出血前（点線）マウスからの血清ＧＰ特異性ＩｇＧ応答を示す。データが図３Ｂに要約される。本研究ではＳＧＰは利用可能でなかったため、ｐＥＢＯＳ免疫付与およびｐＥＢＯＺ免疫付与された動物からの全応答をスクロース精製したＺＧＰに対して測定した。ｐＭＡＲＶ免疫付与されたマウスからのＩｇＧ応答が、ＭＡＲＶ−Ｏｚｏｌｉｎ  ＧＰに対して、または負の対照スクロース精製したＮｉｐａｈ  Ｇタンパク質を用いて測定され、血清標本の中和活性が、ＢＳＬ−４の施設にてＺＥＢＯＶ−ＥＧＦＰ、ＳＵＤＶ−Ｂｏｎｉｆａｃｅ、およびＭＡＲＶ−Ａｎｇｏｌａに対して測定され、ＮＡｂ価が図３Ｃに示される。ＳＵＤＶ−Ｂｏｎｉｆａｃｅに対するＮＡｂは、ＣＶ−１細胞における細胞変性効果（ＣＰＥ）に基づいて分析され、ＭＡＲＶ−Ａｎｇｏｌａに対するＮＡｂは、免疫蛍光分析を用いて分析された。平均が図３Ｂおよび図３Ｃに示され、エラーバーは標準誤差を表す。群解析が、マッチされた両側独立ｔ検定によって完了された。実験は、少なくとも２回反復され、同様の結果が得られ、*ｐ＜０．１、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１である。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、中和Ａｂの誘導を実証する実施例１の結果を示す。Ｂ細胞応答が、２つのワクチン接種のそれぞれの後に２０日間、４０μｇのＥ−ＤＮＡワクチン接種注射の間に３週間あけて、マウス（ｎ＝５／群）において評価された。図３Ａは、ＥＬＩＳＡによって測定したワクチン接種を受けた（実線）マウスまたは出血前（点線）マウスからの血清ＧＰ特異性ＩｇＧ応答を示す。データが図３Ｂに要約される。本研究ではＳＧＰは利用可能でなかったため、ｐＥＢＯＳ免疫付与およびｐＥＢＯＺ免疫付与された動物からの全応答をスクロース精製したＺＧＰに対して測定した。ｐＭＡＲＶ免疫付与されたマウスからのＩｇＧ応答が、ＭＡＲＶ−Ｏｚｏｌｉｎ  ＧＰに対して、または負の対照スクロース精製したＮｉｐａｈ  Ｇタンパク質を用いて測定され、血清標本の中和活性が、ＢＳＬ−４の施設にてＺＥＢＯＶ−ＥＧＦＰ、ＳＵＤＶ−Ｂｏｎｉｆａｃｅ、およびＭＡＲＶ−Ａｎｇｏｌａに対して測定され、ＮＡｂ価が図３Ｃに示される。ＳＵＤＶ−Ｂｏｎｉｆａｃｅに対するＮＡｂは、ＣＶ−１細胞における細胞変性効果（ＣＰＥ）に基づいて分析され、ＭＡＲＶ−Ａｎｇｏｌａに対するＮＡｂは、免疫蛍光分析を用いて分析された。平均が図３Ｂおよび図３Ｃに示され、エラーバーは標準誤差を表す。群解析が、マッチされた両側独立ｔ検定によって完了された。実験は、少なくとも２回反復され、同様の結果が得られ、*ｐ＜０．１、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１である。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｄは、ワクチン接種によって生成される広範なＴ細胞応答を示す指す。図４Ａにおいて、Ｈ−２b（薄いバー）およびＨ−２d（濃いバー）マウス（ｎ＝５／群）は、ｐＭＡＲＶか、ｐＥＢＯＳか、またはｐＥＢＯＺ  ＤＮＡかで２回免疫付与され、ＩＦＮγ応答が、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって測定された。第２の免疫化後８日目に採取した脾細胞が、個々のＧＰペプチド（９個のアミノ酸による１５ｍｅｒ重複）の存在下でインキュベートされ、結果が、積み上げバーグラフに示される。エピトープ含有ペプチドが確認され（平均≧１０スポットかつ≧８０％応答率）、フローサイトメトリーによって確証され、総活性化ＩＦＮγ＋およびＣＤ４４＋ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の集団において特徴付けされ（表１〜６）、正の誘導物質のペプチド数が、バーの上に示される。ＣＤ４＋エピトープ単独を含有するペプチド、ＣＤ８＋エピトープ単独を含有するペプチド（*）、ならびに両ＣＤ４＋およびＣＤ８＋エピトープを含有するペプチド（**）が計数される。推定上の共通および／または部分エピトープが、連続した正のペプチド応答に関して検索された（表１〜６）。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｄは、ワクチン接種によって生成される広範なＴ細胞応答を示す指す。図４Ｂは、図１Ａに示されるＭＡＲＶ、ＳＵＤＶ、およびＺＥＢＯＶウイルスからのＧＰ配列を比較するアミノ酸類似性プロットを示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｄは、ワクチン接種によって生成される広範なＴ細胞応答を示す指す。図４Ｃは、ＺＥＢＯＶ  ＧＰ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃ＶＧＰ＿ＥＢＯＺＭ）内の推定上のドメインを示す図である。ＳＰ、シグナルペプチド；ＲＢ、受容体結合；ＭＵＣ、ムチン様領域；ＦＣ、フューリン開裂部位；ＴＭ、膜貫通領域。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｄは、ワクチン接種によって生成される広範なＴ細胞応答を示す指す。図４Ｄでは、合計の亜優勢（濃い塗り潰し）および免疫優勢（薄い塗り潰し）Ｔ細胞エピトープ応答が、各ワクチンによって生成された総ＩＦＮγ応答のパーセンテージとして示される。実験は、少なくとも２回反復され、同様の結果が得られた。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｄは、中和ＡｂおよびＣＴＬを誘導する防御的「単一投与」ワクチン接種を評価する実験からのデータを示す。Ｈ−２kマウス（ｎ＝１０／群）が、ＢＳＬ−４の施設内で、ｐＥＢＯＺ  Ｅ−ＤＮＡで一度筋肉内にワクチン接種を受け、次いで攻撃後２８日目に１，０００ＬＤ50のｍＺＥＢＯＶを受けた。マウスは、毎日体重測定され、疾患進行についてモニタリングされた。動物生存データは、図５Ａにある。ワクチン接種を受けた動物は、攻撃を生き延びたが、それに対し対照動物は７日目までに死亡した。図５Ｂは、攻撃された動物における体重の変化％に関するデータを示す。免疫付与された動物のデータが薄い実線として示され、免疫付与された動物に関する平均データが薄い破線として示される。対照動物のデータが濃い実線として示され、対照動物に関する平均データが濃い破線として示される。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で約８５％〜１２０％の範囲内で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜６日目からグラフ上で減少しており、７日目までに動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。攻撃前に測定したＮＡｂ、データが図５Ｃに示される。ＦＡＣＳによって測定した単一投与ｐＥＢＯＺ免疫化後のＴ細胞応答が、合計のＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋（濃い色）またはＣＤ８＋（薄い色）細胞の平均％として図５Ｄに要約される。Ｔhｌ型エフェクターマーカーが評価され（ＴＮＦおよびＴ−ｂｅｔ）、ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に関するデータが、総Ｔ細胞データと比較され、それは以下の通りであった。総細胞に関して：ＴＮＦ２．９±０．８、Ｔｂｅｔ１３．０±１．１。ＣＤ４＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞に関して：ＴＮＦ６１．４±３．１、Ｔｂｅｔ７２．６±２．０。ＣＤ８＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞に関して：ＴＮＦ３３．０±３．３、Ｔｂｅｔ９９２．１±１．４（*ｐ＜０．１、***ｐ＜０．００１、****ｐ＜０．０００１）。群解析がマッチされた両側独立ｔ検定によって完了され、生存曲線がログランク（マンテル・コックス）検定によって解析された。実験は２回実施され、同様の結果が得られ、エラーバーは標準誤差を表す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｄは、中和ＡｂおよびＣＴＬを誘導する防御的「単一投与」ワクチン接種を評価する実験からのデータを示す。Ｈ−２kマウス（ｎ＝１０／群）が、ＢＳＬ−４の施設内で、ｐＥＢＯＺ  Ｅ−ＤＮＡで一度筋肉内にワクチン接種を受け、次いで攻撃後２８日目に１，０００ＬＤ50のｍＺＥＢＯＶを受けた。マウスは、毎日体重測定され、疾患進行についてモニタリングされた。動物生存データは、図５Ａにある。ワクチン接種を受けた動物は、攻撃を生き延びたが、それに対し対照動物は７日目までに死亡した。図５Ｂは、攻撃された動物における体重の変化％に関するデータを示す。免疫付与された動物のデータが薄い実線として示され、免疫付与された動物に関する平均データが薄い破線として示される。対照動物のデータが濃い実線として示され、対照動物に関する平均データが濃い破線として示される。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で約８５％〜１２０％の範囲内で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜６日目からグラフ上で減少しており、７日目までに動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。攻撃前に測定したＮＡｂ、データが図５Ｃに示される。ＦＡＣＳによって測定した単一投与ｐＥＢＯＺ免疫化後のＴ細胞応答が、合計のＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋（濃い色）またはＣＤ８＋（薄い色）細胞の平均％として図５Ｄに要約される。Ｔhｌ型エフェクターマーカーが評価され（ＴＮＦおよびＴ−ｂｅｔ）、ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に関するデータが、総Ｔ細胞データと比較され、それは以下の通りであった。総細胞に関して：ＴＮＦ２．９±０．８、Ｔｂｅｔ１３．０±１．１。ＣＤ４＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞に関して：ＴＮＦ６１．４±３．１、Ｔｂｅｔ７２．６±２．０。ＣＤ８＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞に関して：ＴＮＦ３３．０±３．３、Ｔｂｅｔ９９２．１±１．４（*ｐ＜０．１、***ｐ＜０．００１、****ｐ＜０．０００１）。群解析がマッチされた両側独立ｔ検定によって完了され、生存曲線がログランク（マンテル・コックス）検定によって解析された。実験は２回実施され、同様の結果が得られ、エラーバーは標準誤差を表す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｄは、中和ＡｂおよびＣＴＬを誘導する防御的「単一投与」ワクチン接種を評価する実験からのデータを示す。Ｈ−２kマウス（ｎ＝１０／群）が、ＢＳＬ−４の施設内で、ｐＥＢＯＺ  Ｅ−ＤＮＡで一度筋肉内にワクチン接種を受け、次いで攻撃後２８日目に１，０００ＬＤ50のｍＺＥＢＯＶを受けた。マウスは、毎日体重測定され、疾患進行についてモニタリングされた。動物生存データは、図５Ａにある。ワクチン接種を受けた動物は、攻撃を生き延びたが、それに対し対照動物は７日目までに死亡した。図５Ｂは、攻撃された動物における体重の変化％に関するデータを示す。免疫付与された動物のデータが薄い実線として示され、免疫付与された動物に関する平均データが薄い破線として示される。対照動物のデータが濃い実線として示され、対照動物に関する平均データが濃い破線として示される。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で約８５％〜１２０％の範囲内で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜６日目からグラフ上で減少しており、７日目までに動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。攻撃前に測定したＮＡｂ、データが図５Ｃに示される。ＦＡＣＳによって測定した単一投与ｐＥＢＯＺ免疫化後のＴ細胞応答が、合計のＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋（濃い色）またはＣＤ８＋（薄い色）細胞の平均％として図５Ｄに要約される。Ｔhｌ型エフェクターマーカーが評価され（ＴＮＦおよびＴ−ｂｅｔ）、ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に関するデータが、総Ｔ細胞データと比較され、それは以下の通りであった。総細胞に関して：ＴＮＦ２．９±０．８、Ｔｂｅｔ１３．０±１．１。ＣＤ４＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞に関して：ＴＮＦ６１．４±３．１、Ｔｂｅｔ７２．６±２．０。ＣＤ８＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞に関して：ＴＮＦ３３．０±３．３、Ｔｂｅｔ９９２．１±１．４（*ｐ＜０．１、***ｐ＜０．００１、****ｐ＜０．０００１）。群解析がマッチされた両側独立ｔ検定によって完了され、生存曲線がログランク（マンテル・コックス）検定によって解析された。実験は２回実施され、同様の結果が得られ、エラーバーは標準誤差を表す。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｄは、中和ＡｂおよびＣＴＬを誘導する防御的「単一投与」ワクチン接種を評価する実験からのデータを示す。Ｈ−２kマウス（ｎ＝１０／群）が、ＢＳＬ−４の施設内で、ｐＥＢＯＺ  Ｅ−ＤＮＡで一度筋肉内にワクチン接種を受け、次いで攻撃後２８日目に１，０００ＬＤ50のｍＺＥＢＯＶを受けた。マウスは、毎日体重測定され、疾患進行についてモニタリングされた。動物生存データは、図５Ａにある。ワクチン接種を受けた動物は、攻撃を生き延びたが、それに対し対照動物は７日目までに死亡した。図５Ｂは、攻撃された動物における体重の変化％に関するデータを示す。免疫付与された動物のデータが薄い実線として示され、免疫付与された動物に関する平均データが薄い破線として示される。対照動物のデータが濃い実線として示され、対照動物に関する平均データが濃い破線として示される。薄い実線および薄い破線は、攻撃後の日においてグラフ上で約８５％〜１２０％の範囲内で安定したままであり、ワクチン接種を受けた動物間で有意な体重減少を示していない。濃い実線および濃い破線は、攻撃後０〜６日目からグラフ上で減少しており、７日目までに動物が疾患により死亡したことを示すダガーで終止している。攻撃前に測定したＮＡｂ、データが図５Ｃに示される。ＦＡＣＳによって測定した単一投与ｐＥＢＯＺ免疫化後のＴ細胞応答が、合計のＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋（濃い色）またはＣＤ８＋（薄い色）細胞の平均％として図５Ｄに要約される。Ｔhｌ型エフェクターマーカーが評価され（ＴＮＦおよびＴ−ｂｅｔ）、ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に関するデータが、総Ｔ細胞データと比較され、それは以下の通りであった。総細胞に関して：ＴＮＦ２．９±０．８、Ｔｂｅｔ１３．０±１．１。ＣＤ４＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞に関して：ＴＮＦ６１．４±３．１、Ｔｂｅｔ７２．６±２．０。ＣＤ８＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞に関して：ＴＮＦ３３．０±３．３、Ｔｂｅｔ９９２．１±１．４（*ｐ＜０．１、***ｐ＜０．００１、****ｐ＜０．０００１）。群解析がマッチされた両側独立ｔ検定によって完了され、生存曲線がログランク（マンテル・コックス）検定によって解析された。実験は２回実施され、同様の結果が得られ、エラーバーは標準誤差を表す。
【図６】実施例１に開示されるＧＰ特異性Ｔ細胞ゲーティングを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、実施例１におけるワクチン接種実験は、強固なＴ細胞を生成したことを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、実施例１におけるワクチン接種実験は、強固なＴ細胞を生成したことを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、実施例１に開示される「単一投与」ワクチン接種によるＴ細胞誘導を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、実施例１に開示される「単一投与」ワクチン接種によるＴ細胞誘導を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
好ましい態様の詳細な説明
本発明の一態様において、コンセンサス抗原は、以下のうちの１つ以上を有することを含む、改善された転写および翻訳を提供することが望ましい：転写を増加するための低いＧＣ含有量のリーダー配列、ｍＲＮＡ安定およびコドン最適化、シス作用配列モチーフ（すなわち、内部ＴＡＴＡ−ボックス）を可能な限り排除すること。
【００２２】
本発明の幾つかの態様において、以下のうちの少なくとも１つを有することを含む、多数の菌株のわたる広範囲の免疫応答を生成するコンセンサス抗原を生成することが望ましい：全ての利用可能な全長配列の組み込み、それぞれの位置に最も一般的に生じるアミノ酸を利用するコンピューター生成配列、および菌株間の交差反応性の増加。
【００２３】
フィロウイルス科における多様性は、比較的高い。最高ヒト死亡率の原因となる複数の種に対する防御を提供するのに理想的となる普遍的で広範に反応性のフィロウイルスワクチンの開発に向けて、多大な努力がなされている。しかしながらこれは、フィロウイルス科の相対的に高レベルの多様性のため、困難である。ＥＢＯＶは現在、ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＵＤＶ）、レストンエボラウイルス（ＲＥＳＴＶ）、ブンディブギョエボラウイルス（ＢＤＢＶ）、およびタイフォレストエボラウイルス（ＴＡＦＶ；以前はコートジボワールエボラウイルス）の５つの別個の種に分類され、最初の２つは最高致命率の原因となり、武器としての利用の候補となる可能性が最も高い。多様性は、マールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）においてはより低く、また最大９０％の致死率であり得る。現在、１つの分類種、マールブルグマールブルグウイルス（以前はビクトリア湖マールブルグウイルス）しか存在しないが、近年の改正は、これはラビンウイルス（Ｒａｖｎ  ｖｉｒｕｓ）（ＲＡＶＶ）を含む２つのウイルスを含有することを提示している。多価ワクチン開発の複雑さに加え、ＭＡＲＶおよびＥＢＯＶは高度に分岐しており、ヌクレオチドレベルで約６７％分岐が存在する。更に、フィロウイルスＧＰにおける系統発生的多様性も非常に高い（全体で８２％）。これらは、２００７のＢＤＢＶの最近の出現によって実証される通り、フィロウイルスのエンベロープする潜在力を示唆している。したがって、フィロウイルス科における相対的な分岐のため、我々は、有効な多価フィロウイルスワクチンの開発は免疫原性成分の混合物を必要とする可能性が高いという仮説をたてた。
【００２４】
マールブルグマールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）、ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）、およびスーダンエボラウイルス（ＳＵＤＶ）に対する合成多価フィロウイルスＤＮＡワクチンが開発された。新規の多価フィロウイルスワクチンは、多剤併用アプローチを適用し、マールブルグマールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＵＤＶ）、またはザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）のエンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）遺伝子をコードする３つのＤＮＡプラスミドを含んだ。フィロウイルスワクチン候補として、増強されたＤＮＡ（ＤＮＡ）ベースのプラットフォームは、近年の遺伝子最適化および送達技術における進歩による多くの利点を示す（Ｂａｇａｒａｚｚｉ  ＭＬ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）。Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ａｇａｉｎｓｔ  ＨＰＶ１６／１８  Ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  Ｐｏｔｅｎｔ  ＴＨ１  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ４：１５５ｒａｌ３８、Ｋｅｅ  ＳＴ，Ｇｅｈｌ  Ｊ，Ｗ．ＬＥ（２０１１）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．、Ｈｉｒａｏ  ＬＡ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｓｍａｌｌｐｏｘ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｄｒｉｖｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｅｔｈａｌ  ｍｏｎｋｅｙｐｏｘ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０３：９５−１０２）。したがって、各ＧＰは、遺伝的に最適化され、改変された哺乳動物発現ベクターへとサブクローニングされ、次にインビボ電気穿孔（ＥＰ）を用いて送達された。
【００２５】
前臨床有効性研究が、齧歯動物に適合したウイルスを用いてモルモットおよびマウスにおいて実施され、マウスＴ細胞応答が、本明細書に記載される新規の改変された分析を用いて大規模に分析された。Ｔ細胞応答は大規模に分析され、本明細書に記載されるエピトープ特定および特徴付けのための新規の方法の使用も含まれた。このモデルは、既存のプラットフォームに適用することが可能な防御的免疫相関物を研究するための重要な前臨床ツールを提供する。
【００２６】
前臨床齧歯動物研究におけるワクチン接種は、非常に有力で誘発された強固な中和抗体（ＮＡｂ）およびＴhｌ型マーカーを発現するＣＴＬであり、ＭＡＲＶおよびＺＥＢＯＶ攻撃に対して完全に防御された。本明細書に記載される新規の改変された分析（Ｓｈｅｄｌｏｃｋ  ＤＪ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ  ｉｓ  ｈｉｇｈｌｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ８：１６６８−１６８１）を用いて大規模に解析された総合的な  Ｔ細胞解析は、大規模な細胞毒性Ｔリンパ球、エピトープ幅、およびＴhｌ型マーカー発現を示した。総じて、２つの異なるマウス遺伝的バックグラウンドからの５２個の新規のＴ細胞エピトープが確認され（２０のＭＡＲＶエピトープのうち１９、１６のＳＵＤＶのうち１５、および２２のＺＥＢＯＶのうち１８）、それらの対応する糖タンパク質（ＧＰ）の高度に保存された領域で主として生じた。これらのデータは、今日までで、前臨床糖タンパク質エピトープの最も総合的な報告を表している。
【００２７】
最高ヒト死亡率の原因となる多数の種に対する防御を提供するための戦略の開発において、我々はＭＡＲＶ、ＳＵＤＶ、およびＺＥＢＯＶに焦点を当てた。その相対的な分岐のため、我々は、多価フィロウイルスワクチンの開発は、将来発生する株および／または種に応じて素早く容易に適合され得る成分の混合物を必要とするであろうという仮説をたてた。ＥＢＯＶの全体の多様性は約３３％であるが、アミノ酸同一性は、ＳＵＤＶおよびＺＥＢＯＶを別々に解析すると、大幅に増加する（それぞれの種において約９４％同一性）。したがって、図１Ａに示される通り、最も致死的なＥＢＯＶに対する適用範囲のため、２つの成分戦略、１つはＳＵＤＶに、もう１つはＺＥＢＯＶに対するプラスミドＧＰワクチンが設計された。それぞれの種におけるＧＰ多様性が比較的低いため（ＳＵＤＶに関して５．６％、およびＺＥＢＯＶに関して７．１％）、これまでにインフルエンザおよびＨＩＶの分岐株における防御を増強することが示されている戦略である、種間適用範囲を増大させる、コンセンサス免疫原を開発した。これらのＧＰ配列は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウエア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，米国）を用いた整列によって判定した際、報告されている全ての発生配列（ＧｅｎＢａｎｋ）に関して一致した。非コンセンサス残基、ＳＵＤＶ（９５、２０３、２６１、および４７２）およびＺＥＢＯＶ（３１４、３７７、４３０、および４４０）における各４個のアミノ酸が、それぞれＧｕｌｕおよびＭｂｏｍｏ／Ｍｂａｎｚａに重みをかけた。Ｇｕｌｕは、フィロウイルス科流行の最高ヒト死亡率の原因であるため選択され（ｎ＝４２５）、一方、Ｍｂｏｍｏ／Ｍｂａｎｚａは、公開されている配列データに伴い直近の最も致死的な流行であるため選択された。ＳＵＤＶ（ＳＵＤＶ  ＣＯＮワクチン）およびＺＥＢＯＶ（ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮワクチン）に関するコンセンサスＧＰは、系統発生的に中間の、親として整列された株であった。
【００２８】
図１Ａのタンパク質の同定は、次の通りである。ＭＡＲＶ  Ｄｕｒｂａ（０５ＤＲＣ９９）’９９：ＡＢＥ２７０８５；Ｕｇａｎｄａ（０１Ｕｇａ０７）’０７：ＡＣＴ７９２２９；Ｄｕｒｂａ（０７ＤＲＣ９９）’９９：ＡＢＥ２７０７８；Ｏｚｏｌｉｎ’７５：ＶＧＰ＿ＭＡＢＶＯ；Ｍｕｓｏｋｅ’８０：ＶＧＰ＿ＭＡＢＶＭ；Ｐｏｐｐ’６７：ＶＧＰ＿ＭＡＢＶＰ；Ｌｅｉｄｅｎ’０８：ＡＥＷ１１９３７；Ａｎｇｏｌａ’０５：ＶＧＰ＿ＭＡＢＶＡ；Ｒａｖｎ’８７：ＶＧＰ＿ＭＡＢＶＲ；Ｄｕｒｂａ（０９ＤＲＣ９９）’９９；ＡＢＥ２７０９２；Ｕｇａｎｄａ（０２Ｕｇａ０７）’０７：ＡＣＴ７９２０１。ＳＵＤＶ：Ｂｏｎｉｆａｃｅ’７６：ＶＧＰ＿ＥＢＯＳＢ；Ｍａｌｅｏ’７９：ＶＧＰ＿ＥＢＯＳＭ；Ｙａｍｂｉｏ’０４：ＡＢＹ７５３２５；Ｇｕｌｕ’００：ＶＧＰ＿ＥＢＯＳＵ。ＺＥＢＯＶ：Ｂｏｏｕｅ’９６：ＡＡＬ２５８１８；Ｍａｙｉｂｏｕｔ’９６：ＡＥＫ２５４９５；Ｍｅｋｏｕｋａ’９４：ＡＡＣ５７９８９，ＶＧＰ＿ＥＢＯＧ４；Ｋｉｋｗｉｔ’９５：ＶＧＰ＿ＥＢＯＺ５；Ｙａｍｂｕｋｕ（Ｅｋｒｏｎ）’７６：ＶＧＰ＿ＥＢＯＥＣ；Ｙａｍｂｕｋｕ（Ｍａｙｉｎｇａ）’７６：ＶＧＰ＿ＥＢＯＺＭ；Ｋａｓａｉ’０８：ＡＥＲ５９７１２；Ｋａｓｓａｉ’０７：ＡＥＲ５９７１８；Ｅｔｏｕｍｂｉ’０５：ＡＢＷ３４７４２；Ｍｂｏｍｏ／Ｍｂａｎｄｚａ’０３：ＡＢＷ３４７４３。
【００２９】
本明細書に提供される配列リストは、以下のものを含む６６の配列のリストを含有する。
【００３０】
配列番号１は、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原である、ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮのアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号２は、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原である、ＳＵＤＶ  ＣＯＮのアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号３は、ＭＡＲＶまたはＭＡＲＶ  ＡＮＧのアミノ酸配列であり、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質およびマールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原のアミノ酸配列であり。
【００３３】
配列番号４は、第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原である、ＭＡＲＶ  ＣＯＮ１のアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号５は、第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原である、ＭＡＲＶ  ＣＯＮ２のアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号６は、第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原である、ＭＡＲＶ  ＣＯＮ３のアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号７〜２５は、ＭＡＲＶ  ＡＮＧに由来するペプチドである。
【００３７】
配列番号２６〜４１は、ＳＵＤＶ  ＣＯＮに由来するペプチドである。
【００３８】
配列番号４２〜６２は、ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮに由来するペプチドである。
【００３９】
配列番号６３は、ＩｇＥシグナルペプチドの配列：  ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳである。
【００４０】
配列番号６４は、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする、プラスミドｐＥＢＯＺ内のヌクレオチド配列挿入物である。
【００４１】
配列番号６５は、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする、プラスミドｐＥＢＯＳ内のヌクレオチド配列挿入物である。
【００４２】
配列番号６６は、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質をコードする、プラスミド  ｐＭＡＲＺ  ＡＮＧ内のヌクレオチド配列挿入物である。
【００４３】
幾つかの実施形態では、戦略は、３つのフィロウイルス免疫原：ＭＡＲＶ、ＳＵＤＶ、およびＺＥＢＯＶに関するコード配列を採用する。ＭＡＲＶ免疫原は、Ａｎｇｏｌａ２００５単離物の糖タンパク質である。ＳＵＤＶおよびＺＥＢＯＶに関しては、コンセンサス糖タンパク質配列が設計された。
【００４４】
幾つかの実施形態では、戦略は、５つのフィロウイルス免疫原に関するコード配列を採用する。３つのＭＡＲＶ免疫原が提供される。３つのクラスターに由来するコンセンサス糖タンパク質Ｏｚｏｌｉｎ、Ｍｕｓｏｋｅ、またはＲａｖｎが設計された。これらの３つのＭＡＲＶ免疫原はともに、設計したＳＵＤＶおよびＺＥＢＯＶコンセンサス糖タンパク質配列の免疫応答に関する標的である。
【００４５】
幾つかの実施形態では、戦略は、６つのフィロウイルス免疫原に関するコード配列を採用する。４つのＭＡＲＶ免疫原が提供される。３つのクラスターに由来する３つのコンセンサス糖タンパク質が設計された。これらの３つのＭＡＲＶ免疫原はともに、設計したＳＵＤＶおよびＺＥＢＯＶコンセンサス糖タンパク質配列の免疫応答に関する標的であり、ＭＡＲＶ免疫原は、Ａｎｇｏｌａ２００５単離物の糖タンパク質である。
【００４６】
フィロウイルスワクチンの候補として、ＤＮＡワクチンは、高速で安価な大規模生産、室温での安定性、および輸送の容易さを含む多数の利点を示し、それらは全て、このプラットフォームを経済的および地理的観点から更に増強する。プラスミドの合成性質のため、Ａｇ配列は、新たな出現種に反応して素早くまた容易に改変することができ、ならびに／または追加のワクチン成分および／もしくは発生状況中の迅速な応答のための治療計画を含むように拡大することができる。例えば、本明細書のＭＡＲＶ戦略は、他の系統発生クラスターに関するコンセンサスＭＡＲＶ  ＧＰ（ＭＧＰ）免疫原をコードする追加のプラスミドの共投与によって、より大きい対応範囲へ容易に拡大することができる。
【００４７】
「第１世代」ＤＮＡワクチンは免疫原性が不十分であったが、近年の技術進歩は、臨床試験においてそれらの免疫原性を劇的に改善している。プラスミドＤＮＡベクターおよびそれらのコードされたＡｇ遺伝子の最適化は、インビボ免疫原性の増加につながった。細胞取り込みおよびその後のＡｇ発現は、高度に濃縮されたプラスミドワクチン製剤をインビボ電気穿孔によって投与するときに実質的に増幅され、これはワクチン接種部位内に短い矩形波電気パルスを用いて一時的に透過性になった細胞内にプラスミドを駆動する技術である。理論上、ＤＮＡプラスミドの混合物は、任意の数の多様なＡｇに対する高度に特殊化された免疫応答を方向付けるために組み立てることができる。免疫は、種特異性サイトカイン遺伝子をコードするプラスミド分子アジュバントとの共送達、およびＡｇアミノ酸配列の「コンセンサス工学」によって、特定の株に対してバイアスワクチン誘導免疫を促進するように更に方向付けることができる。この戦略は、インフルエンザウイルスおよびＨＩＶの分岐株において防御を増強することが示されている。一部にはこれらの技術進歩によって、これらのＤＮＡワクチンを含む免疫化治療計画は、高度に多用途であり、非常にカスタマイズ可能である。
【００４８】
１．定義。
本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を記載するだけの目的であり、限定的であることを意図しない。明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に文脈から明白に示されない限り、複数の対象を含む。
【００４９】
本明細書における数値範囲の列挙では、同じ程度の正確さでその間に介在するそれぞれの数が、明確に考慮される。例えば、６〜９の範囲では、７および８の数が６および９に加えて考慮され、６．０〜７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０の数が明確に考慮される。
【００５０】
ａ．アジュバント
「アジュバント」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に記載されるＤＮＡプラスミドワクチンに添加されて、ＤＮＡプラスミドおよび以下に記載されるコード核酸配列によりコードされる１つ以上のコンセンサスフィロウイルス免疫原の抗原性を増強する任意の分子を意味し得る。
【００５１】
ｂ．抗体
「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの部類の抗体、またはＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｄが含まれるそのフラグメント、フラグメント、もしくは誘導体、ならびに一本鎖抗体、二特異性抗体、二重特異性抗体、二官能性抗体、およびその誘導体を意味し得る。抗体は、哺乳動物の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和精製抗体、または所望のエピトープもしくはそれから誘導される配列に対して十分な結合特異性を示すそれらの混合物であり得る。
【００５２】
ｃ．コード配列
「コード配列」または「コードする核酸」は、本明細書で使用されるとき、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味し得る。コード配列は、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞において発現を指示することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、調節エレメントに機能的に結合している開始および終結シグナルを更に含み得る。幾つかの実施形態では、コード配列は所望により、Ｎ末端メチオニンまたはＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをコードする開始コドンを更に含んでもよい。
【００５３】
ｄ．補体
「補体」または「相補」は、本明細書で使用されるとき、核酸が、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体の間のワトソン・クリック（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を意味し得ることを意味する。
【００５４】
ｅ．コンセンサスまたはコンセンサス配列
「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、本明細書で使用するとき、特定のフィロウイルス抗原の複数の亜型の整列の回析に基づいて構築され、複数の特定のフィロウイルス抗原の亜型または血清型に対する広範な免疫を誘導するために使用することができる、合成核酸配列、または対応するポリペプチド配列を意味し得る。
【００５５】
コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号１、配列番号１のフラグメント、配列番号１の変種、および配列番号１の変種のフラグメントを指す。（ＺＥＢＯＶまたはＺＥＢＯＶ  ＣＯＮまたはＺＥＢＯＶ  ＣＯＮワクチン）。配列番号１のコード配列を含むプラスミドは、ｐＺＥＢＯＶまたはｐＥＢＯＺと称することができる。コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原に関するコード配列としては、配列番号６４、配列番号６４のフラグメント、配列番号６４の変種、および配列番号６４の変種のフラグメントが挙げられる。プラスミドｐＥＢＯＺは、配列番号６４を含む。
【００５６】
コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号２、配列番号２のフラグメント、配列番号２の変種、および配列番号２の変種のフラグメントを指す。（ＳＵＤＶまたはＳＵＤＶ  ＣＯＮまたはＳＵＤＶ  ＣＯＮワクチン）配列番号２のコード配列を含むプラスミドは、ｐＳＵＤＶまたはｐＥＢＯＳと称することができる。コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原に関するコード配列としては、配列番号６５、配列番号６５のフラグメント、配列番号６５の変種、および配列番号６５の変種のフラグメントが挙げられる。プラスミドｐＥＢＯＳは、配列番号６５を含む。
【００５７】
マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質は、コンセンサスでないが、単離物に由来するタンパク質配列である。それは配列、配列番号３を有する。マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号３、配列番号３のフラグメント、配列番号３の変種、および配列番号３の変種のフラグメントを指す。（ＭＡＲＶまたはＭＡＲＶ  ＡＮＧまたはＭＡＲＶ  ＡＮＧまたはＭＡＲＶ  ＡＮＧ  ワクチン）配列番号３のコード配列を含むプラスミドは、ｐＭＡＲＶまたはｐＭＡＲＶ−ＡＮＧと称することができる。マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原に関するコード配列としては、配列番号６６、配列番号６６のフラグメント、配列番号６６の変種、および配列番号６６の変種のフラグメントが挙げられる。プラスミドｐＭＡＲＶ  ＡＮＧは、配列番号６６を含む。
【００５８】
第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号４、配列番号４のフラグメント、配列番号４の変種、および配列番号４の変種のフラグメントを指す。配列番号４は、ラビンクラスターコンセンサス（Ｒａｖｎ，Ｄｕｒｂａ（０９ＤＲＣ９９）およびＵｇａｎｄａ（０２Ｕｇａ０７Ｙ）に由来するマールブルグマールブルグウイルスコンセンサス配列である。（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ１またはＭＡＲＶ−ＲＡＶ  ＣＯＮまたはＭＡＲＶ−ＲＡＶ  ＣＯＮワクチン）配列番号４のコード配列を含むプラスミドは、ｐＭＡＲＶ−ＲＡＶと称することができる。
【００５９】
第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号５、配列番号５のフラグメント、配列番号５の変種、および配列番号５の変種のフラグメントを指す。配列番号５は、オゾリン（Ｏｚｏｌｉｎ）クラスターコンセンサス（Ｏｚｏｌｉｎ，Ｕｇａｎｄａ（０１Ｕｇａ０７）、およびＤｕｒｂａ（０５および０７ＤＲＣ９９））に由来するマールブルグマールブルグウイルスコンセンサス配列である。（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ２またはＭＡＲＶ−ＯＺＯ  ＣＯＮまたはＭＡＲＶ−ＯＺＯ  ＣＯＮ  ワクチン）配列番号５のコード配列を含むプラスミドは、ｐＭＡＲＶ−ＯＺＯと称することもできる。
【００６０】
第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原は、配列番号６、配列番号６のフラグメント、配列番号６の変種、および配列番号６の変種のフラグメントを指す。配列番号６は、ムソーク（Ｍｕｓｏｋｅ）クラスターコンセンサス（Ｍｕｓｏｋｅ、Ｐｏｐｐ、およびＬｅｉｄｅｎ）に由来するマールブルグマールブルグウイルスコンセンサス配列である。（ＭＡＲＶ  ＣＯＮ１またはＭＡＲＶ−ＭＵＳ  ＣＯＮまたはＭＡＲＶ−ＭＵＳ  ＣＯＮワクチン）配列番号６のコード配列を含むプラスミドは、ｐＭＡＲＶ−ＭＵＳと称することができる。
【００６１】
ｆ．定電流
「定電流」は、本明細書で使用されるとき、組織または前記組織を画定する細胞が、その組織に送達される電気パルスの持続時間にわたって受ける、または経験する電流を定義すること。電気パルスは、本明細書に記載されている電気穿孔装置から送達される。この電流は、前記組織に電気バルスの寿命にわたって一定のアンペア数で留まり、それは、本明細書において提供される電気穿孔装置が、好ましくは瞬時のフィードバックを有するフィードバック要素を有するからである。フィードバック要素は、パルスの持続時間の全体にわたって組織（または細胞）の抵抗を測定すること、ならびに電流が同じ組織において電気パルスの全体にわたって（数マイクロ秒台）、およびパルス毎に一定のままであるように、電気穿孔装置に電気エネルギー出力を変更させる（例えば、電圧を増加させる）ことができる。幾つかの実施形態において、フィードバック要素は、制御装置を含む。
【００６２】
ｇ．電流フィードバックまたはフィードバック
「電流フィードバック」または「フィードバック」は、本明細書で使用されるとき、交換可能に使用することができ、提供される電気穿孔装置の能動的応答を意味することができ、それは、電極の間の組織中の電流を測定すること、および電流を一定レベルに維持するため、ＥＰ装置により送達されたエネルギー出力をそれに応じて変えることを含む。この一定レベルは、パルス系列または電気処理を開始する前に、使用者により予め設定される。フィートバックは、電気穿孔装置の電気穿孔構成要素、例えば制御装置により達成することができ、それは、その電気回路が、電極の間の組織中の電流を連続的にモニターすること、ならびにモニターされた電流（または組織内の電流）を比較して、電流を予め設定する、およびモニターされた電流を予め設定されたレベルに維持するためにエネルギー出力調整を連続的に行うことができるからである。フィードバックループは、アナログ閉ループフィートバックであるので、瞬時であり得る。
【００６３】
ｈ．分散電流
「分散電流」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に記載されている電気穿孔装置の様々な針電極配列から送達される電流のパターンを意味し得、パターンは、電気穿孔される組織の任意の領域における電気穿孔関連熱ストレスの発生を最小限にする、または排除する。
【００６４】
ｉ．電気穿孔
「電気穿孔」、「電気透過処理（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」または「電気動力学的促進（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｋｉｎｅｔｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」（「ＥＰ」）は、本明細書で交換可能に使用されるとき、生体膜内の微視的経路（細孔）を誘導するための膜貫通電界パルスの使用を意味し得、それらの存在は、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬剤、イオン、および水のような生体分子が細胞膜の一方の側から他方の側に通過することを可能にする。
【００６５】
ｊ．フィードバック機構
「フィードバック機構」は、本明細書で使用されるとき、ソフトウエアまたはハードウエア（もしくはファームウエア）のいずれかにより実施されるプロセスを意味し得、このプロセスは、所望の組織のインピーダンスを（エネルギーパルスの送達の前、間、および／または後に）受信し、現在の値、好ましくは電流と比較し、送達されるエネルギーのパルスを調整して、予め設定された値を達成する。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路により実施することができる。
【００６６】
ｋ．フラグメント
「フラグメント」は、特定のフィロウイルス抗原を認識することによってフィロウイルスに対する哺乳動物における免疫応答を誘発することが可能な、フィロウイルス免疫原のポリペプチドフラグメントを意味し得る。フィロウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原は所望により、位置１のシグナルペプチドおよび／またはメチオニン、本明細書に記載されるコンセンサス配列に９８％以上相同なタンパク質、本明細書に記載されるコンセンサス配列に９９％以上相同なタンパク質、ならびに本明細書に記載されるコンセンサス配列に１００％同一なタンパク質を含んでもよく、いずれの場合も位置１にシグナルペプチドおよび／またはメチオニンを伴っても伴わなくてもよい。フラグメントは、例えば、シグナルペプチド、例えば、ＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドなどに連結される、フィロウイルス免疫原のフラグメントを含んでも含まなくてもよい。
【００６７】
ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ、ＳＵＤＶ  ＣＯＮ、ＭＡＲＶ  ＡＮＧ、ＭＡＲＶ−ＲＡＶ  ＣＯＮ、ＭＡＲＶ−ＯＺＯ  ＣＯＮ、もしくはＭＡＲＶ−ＭＵＳ  ＣＯＮ、またはそれらの変種のうちのいずれのフラグメントも、いずれの場合も位置１にシグナルペプチドおよび／またはメチオニンを伴って、または伴わずに、特定の全長ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ、ＳＵＤＶ  ＣＯＮ、ＭＡＲＶ  ＡＮＧ、ＭＡＲＶ−ＲＡＶ  ＣＯＮ、ＭＡＲＶ−ＯＺＯ  ＣＯＮ、もしくはＭＡＲＶ−ＭＵＳ  ＣＯＮ、またはそれらの変種の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の割合（％）を含んでもよい。フラグメントは、配列ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ、ＳＵＤＶ  ＣＯＮ、ＭＡＲＶ  ＡＮＧ、ＭＡＲＶ−ＲＡＶ  ＣＯＮ、ＭＡＲＶ−ＯＺＯ  ＣＯＮ、またはＭＡＲＶ−ＭＵＳ  ＣＯＮに１００％同一なフラグメントポリペプチドを指し、いずれの場合も位置１にシグナルペプチドおよび／またはメチオニンを伴うまたは伴わない。フラグメントはまた、変種、すなわち、配列ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ、ＳＵＤＶ  ＣＯＮ、ＭＡＲＶ  ＡＮＧ、ＭＡＲＶ−ＲＡＶ  ＣＯＮ、ＭＡＲＶ−ＯＺＯ  ＣＯＮ、またはＭＡＲＶ−ＭＵＳ  ＣＯＮに９５％以上、９８％以上、または９９％以上相同なポリペプチドのフラグメントを指し、いずれの場合も位置１にシグナルペプチドおよび／またはメチオニンを伴うまたは伴わない。フラグメントは、配列番号１〜６に記載されるフィロウイルス免疫原に９８％以上相同な、９９％以上相同な、または１００％同一なポリペプチドのフラグメントを含んでもよく、それに加えて、相同性パーセントを算出するときに含まれない免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含んでもよい。幾つかの実施形態では、配列番号１〜６のフラグメントは、例えば、ＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドに連結される。フラグメントは、Ｎ末端メチオニンを含む配列番号１〜６のフラグメントを含んでもよい。フラグメントはまた、配列番号１〜６に開示される配列に９５％以上、９８％以上、または９９％以上相同なポリペプチドのフラグメントを指す。シグナルペプチドシス（ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｉｓ）が存在する場合、  それは相同性パーセントの算出の際に含まれない。
【００６８】
幾つかの実施形態では、配列番号１〜６またはその変種のフラグメントは、配列番号１〜６またはその変種のいずれかの１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０個以上の連続したアミノ酸を含んでもよい。幾つかの実施形態では、配列番号１〜６またはその変種のフラグメントは、配列番号１〜６またはその変種のいずれかの１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６７５個以下の連続したアミノ酸を含んでもよい。
【００６９】
「フラグメント」はまた、フィロウイルス免疫抗原をコードする核酸配列のフラグメント、特定のフィロウイルス抗原を認識することによってフィロウイルスに対する哺乳動物における免疫応答を誘発することができる、フィロウイルス免疫原のフラグメントをコードする核酸フラグメントを意味し得る。フィロウイルス免疫原またはその変種をコードする核酸フラグメントのフラグメントは、いずれの場合も位置１にシグナルペプチドおよび／またはメチオニンを伴って、または伴わずに、フィロウイルス免疫原またはその変種をコードする特定の全長核酸配列の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の割合（％）を含んでもよい。フラグメントは、配列番号１〜６に記載されるフィロウイルス免疫原に９８％以上相同な、９９％以上相同な、または１００％同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のフラグメントを含んでもよく、それに加えて、相同性パーセントを算出するときに含まれない免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含んでもよい。幾つかの実施形態では、配列番号１〜６のフラグメントをコードするヌクレオチド配列のフラグメントは、例えば、ＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドに連結される。シグナルペプチドシスのコード配列は存在する、それは相同性パーセントの算出の際に含まれない。幾つかの実施形態では、配列番号１〜６またはその変種のフラグメントをコードするヌクレオチド配列のフラグメントは、配列番号１〜６またはその変種のいずれかの１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０個以上の連続したアミノ酸をコードする配列を含んでもよい。幾つかの実施形態では、配列番号１〜６またはその変種のフラグメントをコードするヌクレオチド配列のフラグメントは、配列番号１〜６またはその変種のいずれかの１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６７５個以下の連続したアミノ酸をコードする配列を含んでもよい。
【００７０】
幾つかの実施形態では、フラグメントは、配列番号６４のフラグメント、配列番号６５、または配列番号６６である。配列番号６４、配列番号６５、または配列番号６６のフラグメントは、いずれの場合も位置１にシグナルペプチドおよび／またはメチオニンを伴ってまたは伴わずに、フィロウイルス免疫原またはその変種をコードする特定の全長核酸配列の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の割合を含んでもよい。配列番号６４、配列番号６４、または配列番号６６のフラグメントは、配列番号６４、配列番号６５、または配列番号６６によってコードされるフィロウイルス免疫原に９８％以上相同な、９９％以上相同な、または１００％同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のフラグメントを含んでもよく、それに加えて、相同性パーセントを算出するときに含まれない免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含んでもよい。配列番号６４、配列番号６５、または配列番号６６のフラグメントは、配列番号６４、配列番号６５、もしくは配列番号６６、またはそれらの変種の１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０個以上の連続したアミノ酸をコードする配列を含んでもよい。配列番号６４、配列番号６５、または配列番号６６のフラグメントは、配列番号６４、配列番号６５、もしくは配列番号６６、またはそれらの変種の１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６７５個以下の連続したアミノ酸をコードする配列を含んでもよい。
【００７１】
iｓ．同一
「同一」または「同一性」は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用されるとき、配列が、特定の領域にわたって同じである残基の特定の率（％）を有することを意味し得る。率（％）は、２つの配列を最適に整列すること、２つの配列を特定の領域にわたって比較すること、同一残基が両方の配列に発生してマッチした位置の数を生じる、位置の数を決定すること、マッチした位置の数を、特定の領域内の位置の総数で割ること、および結果に１００を掛けて、配列同一性の率（％）を生じることによって、計算することができる。２つの配列が異なる長さである、または整列が１つ以上の付着末端を生じ、特定の比較領域が、単一配列のみを含む場合、単一配列の残基は、計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較すると、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は、同等であると考慮することができる。同一性は、手作業により、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０のようなコンピューター配列アルゴリズムを使用して実施することができる。
【００７２】
ｍ．インピーダンス
「インピーダンス」は、本明細書で使用されるとき、フィードバック機構を考察する場合に使用することができ、オームの法則に従って電流値に変換することができ、したがって、予め設定された電流との比較を可能にする。
【００７３】
ｎ．免疫応答
「免疫応答」は、本明細書で使用されるとき、提供されたＤＮＡプラスミドワクチンを介した１つ以上のフィロウイルスコンセンサス抗原の導入に応答した宿主の免疫系、例えば、哺乳動物の免疫系の活性化を意味し得る。免疫応答は、細胞性もしくは液性応答、またはその両方の形態であり得る。
【００７４】
ｏ．核酸
「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用されるとき、一緒に共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。一本鎖の描写は、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、描写される一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変種を、所定の核酸と同じ目的で使用することができる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。一本鎖は、厳密なハイブリッド形成条件下で標的配列とハイブリッド形成することができるプローブを提供する。したがって、核酸は、厳密ハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成するプローブも包含する。
【００７５】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であり得る、または二本鎖と一本鎖の配列の両方の部分を含有し得る。核酸は、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、ここで核酸は、デオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン  ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有し得る。核酸は、化学合成法により、または組み換え法により得ることができる。
【００７６】
ｐ．機能的に連結する
「機能的に連結する」は、本明細書で使用されるとき、遺伝子の発現が、空間的に連結しているプロモーターの制御下にあることを意味し得る。プロモーターは、その制御下の遺伝子の５′（上流）または３′（下流）に位置することができる。プロモーターと遺伝子との間隔は、プロモーターが誘導される遺伝子における、プロモーターと、それが制御する遺伝子との間隔とほぼ同じであり得る。当該技術において知られているように、この間隔の変動は、プロモーター機能を失うことなく適応され得る。
【００７７】
ｑ．プロモーター
「プロモーター」は、本明細書で使用されるとき、細胞において核酸の発現を付与する、活性化する、または増強することができる合成的または天然に誘導される分子を意味し得る。プロモーターは、１つ以上の特定の転写調節配列を含み、発現を更に増強すること、ならびに／またはその空間的発現および／もしくは時間的発現を変更することができる。プロモーターは、遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素も含むことができ、これらは、転写の開始部位から数千塩基対まで位置することができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む供給源から誘導することができる。プロモーターは、遺伝子成分の発現を構造的に、あるいは発現が生じる細胞、組織、もしくは臓器に関して、または発現が生じる発生段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤のような外部刺激に応答して、差別的に調節することができる。プロモーターの代表例には、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ  ＩＥプロモーターが含まれる。
【００７８】
ｒ．厳密なハイブリッド形成条件
「厳密なハイブリッド形成条件」は、本明細書で使用されるとき、核酸の複合混合物におけるように、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が第２の核酸配列（例えば、標的）とハイブリッド形成する条件を意味し得る。厳密な条件は、配列依存性であり、異なる状況において異なる。厳密な条件は、確定されたイオン強度のｐＨで特定の配列の熱融点（Ｔm）よりも約５〜１０℃低くなるように選択することができる。Ｔmは、標的に相補的なプローブの５０％が標的配列と平衡（標的配列がＴmで過剰に存在するので、５０％のプローブが平衡を占める）にハイブリッド形成する（確定されたイオン強度、ｐＨ、および核濃度下での）温度であり得る。厳密な条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度のような約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン（または他の塩）であり、温度が、短プローブ（例えば、約１０〜５０個のヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長プローブ（例えば、約５０個を超えるヌクレオチド）では少なくとも約６０℃であるものであり得る。厳密な条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加により達成することもできる。選択的または特定的なハイブリッド形成では、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリッド形成の少なくとも２〜１０倍であり得る。例示的な厳密なハイブリッド形成条件には、以下が含まれる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーションと、０．２×ＳＳＣでの洗浄および６５℃での０．１％ＳＤＳ。
【００７９】
ｓ．実質的に相補的
「実質的に相補的」は、本明細書で使用されるとき、第１の配列が第２の配列の補体と、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、またはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であること、あるいは２つの配列が厳密なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成することを意味し得る。
【００８０】
ｔ．実質的に同一
「実質的に同一」は、本明細書で使用されるとき、第１の配列および第２の配列が、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、またはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、あるいは第１の配列が第２の配列の補体と実質的に相補的である場合、核酸に関して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味し得る。
【００８１】
ｕ．変種
「変種」は、核酸に関して本明細書で使用されるとき、（ｉ）基準ヌクレオチド配列の一部もしくはフラグメント、（ｉｉ）基準ヌクレオチド配列の補体もしくはその一部、（ｉｉｉ）基準核酸もしくはその補体と実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）厳密な条件下、基準核酸、その補体もしくはそれと実質的に同一の配列とハブリッド形成する核酸を意味する。
【００８２】
「変種」は、ペプチドまたはポリペプチドに関して、アミノ酸の挿入、欠失、または保存置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持する。変種は、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する基準タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存置換、すなわち、アミノ酸を同様の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸と代えることは、典型的には僅かな修正を伴って、当該技術において認識されている。これらの僅かな修正は、部分的には、当該技術において理解されているようにアミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することにより確認することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性および電荷の考慮に基づいている。同様の疎水性親水性指標のアミノ酸を置換して、依然としてタンパク質機能を保持できることは、当該技術において知られている。１つの態様において、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を使用して、タンパク質が生物学的活性を保持することをもたらす置換を明らかにすることもできる。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考慮は、抗原性および免疫原性と十分相関することが報告されている有用な測度である、ペプチドの最大局所平均親水性の計算を可能にする。米国特許第４，５５４，１０１号は参照により完全に本明細書に組み込まれる。同様の親水性値を有するアミノ酸の置換は、ペプチドが生物学的活性、例えば免疫原性を保持することをもたらすことができ、このことは当該技術において理解されている。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で実施することができる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖により影響を受ける。その観察と一致して、生物学的機能に匹敵するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、大きさ、および他の特性により明らかなように、アミノ酸、特にこれらのアミノ酸の側鎖の相対的な類似性に依存していることが理解される。変種は好ましくは、配列番号１〜６に９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上まで相同である。
【００８３】
同じ特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列に関する「変種」は、異なるコドンの使用によってヌクレオチド配列が異なる。配列番号６４、配列番号６５、または配列番号６６によってコードされるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする配列番号６４、配列番号６５、または配列番号６６の変種は、任意の度合いの相同性であってよく、好ましくは８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上であってよい。変種はまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を伴う基準タンパク質に実質的に同一なアミノ酸配列を有する配列番号６４、配列番号６５、または配列番号６６によってコードされるタンパク質の変種であるタンパク質をコードする、配列番号６４、配列番号６５、または配列番号６６の変種であってもよく、典型的には、アミノ酸配列は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上まで相同である。
【００８４】
ｖ．ベクター
本明細書で使用される「ベクター」は、複製の起点を含有する核酸配列を意味し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
【００８５】
２．タンパク質
特定のフィロウイルス抗原の複数の亜型または血清型に対する広範な免疫を誘導するために使用することができるフィロウイルス免疫原が、本明細書に提供される。コンセンサスフィロウイルス抗原はそれぞれ、マールブルグウイルスフィロウイルス糖タンパク質ＭＡＲＶ  ＲＡＶ免疫原のコンセンサスアミノ酸配列、マールブルグウイルスフィロウイルス糖タンパク質ＭＡＲＶ  ＯＺＯ免疫原のコンセンサスアミノ酸配列、マールブルグウイルスフィロウイルス糖タンパク質ＭＡＲＶ  ＭＵＳ免疫原のコンセンサスアミノ酸配列、マールブルグウイルスフィロウイルス糖タンパク質ＭＡＲＶ  ＡＮＧ免疫原の単離アミノ酸配列、ザイールエボラウイルス糖タンパク質ＺＥＢＯＶ免疫原のコンセンサスアミノ酸配列、およびスーダンエボラウイルス糖タンパク質ＳＵＤＶ免疫原のコンセンサスアミノ酸配列を含んでもよい。幾つかの実施形態では、免疫原は、例えば、ＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンタンパク質などの異なるタンパク質に由来するシグナルペプチドを含んでもよい。
【００８６】
免疫原に関するアミノ酸配列は、配列番号１〜６、それらの変種、ならびに配列番号１〜６のフラグメントおよびそれらの変種を含んでもよく、所望により、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含んでもよい。
【００８７】
３．タンパク質をコードするコード配列
本明細書に記載されるタンパク質をコードするコード配列は、定められた方法を用いて生成することができる。コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物が提供され、第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列、および第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を、開示されるアミノ酸配列に基づいて生成することができる。
【００８８】
核酸配列は、全長コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、全長コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、全長マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原、全長第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、全長第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、または全長第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードすることができる。核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６をコードする配列を含んでもよい。核酸配列は、配列番号６４、配列番号６５、または配列番号６６を含んでもよい。核酸配列は所望により、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをコードするコード配列を含んでもよい。
【００８９】
核酸配列は、全長コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のフラグメント、全長コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のフラグメント、全長マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原のフラグメント、全長第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のフラグメント、全長第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のフラグメント、または全長第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のフラグメントをコードすることができる。核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のフラグメントをコードする配列を含んでもよい。核酸配列は、配列番号６４、配列番号６５、または配列番号６６のフラグメントを含んでもよい。フラグメントの大きさは、「フラグメント」と題する節に記載される通りに本明細書に開示される。酸配列は所望により、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをコードするコード配列を含んでもよい。
【００９０】
核酸配列は、全長コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原に相同なタンパク質、全長コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原に相同なタンパク質、全長マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原に相同なタンパク質、全長第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原に相同なタンパク質、全長第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原に相同なタンパク質、または全長第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原に相同なタンパク質をコードしてもよい。核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６に相同なタンパク質をコードする配列を含んでもよい。核酸配列は、配列番号６４、配列番号６５、または配列番号６６に相同であってもよい。相同性の度合いは、変種の節にあるものなどの通りに本明細書に述べられる。核酸配列は所望により、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをコードするコード配列を含んでもよい。
【００９１】
核酸配列は、全長コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のフラグメントに相同なタンパク質、全長コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のフラグメントに相同なタンパク質、全長  マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質免疫原のフラグメントに相同なタンパク質、全長第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のフラグメントに相同なタンパク質、全長第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のフラグメントに相同なタンパク質、または全長第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原のフラグメントに相同なタンパク質をコードしてもよい。核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のフラグメントに相同なタンパク質をコードする配列を含んでもよい。核酸配列は、配列番号６４、配列番号６５、または配列番号６６に相同なフラグメントを含んでもよい。相同性の度合いは、変種の章にあるものなどの通りに本明細書に述べられる。核酸配列は所望により、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをコードするコード配列を含んでもよい。
【００９２】
配列番号６４は、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする、プラスミドｐＥＢＯＺ内のヌクレオチド配列挿入物である。
【００９３】
配列番号６５は、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする、プラスミドｐＥＢＯＳ内のヌクレオチド配列挿入物である。
【００９４】
配列番号６６は、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質をコードする、プラスミド  ｐＭＡＲＺ  ＡＮＧ内のヌクレオチド配列挿入物である。
【００９５】
４．プラスミド
プラスミドは、合成の、フィロタンパク質に対する免疫応答を誘発することができるコンセンサス抗原をコードするコード配列を含む、上述に開示される様々な免疫原のうちの１つ以上をコードする核酸配列を含んでもよい。
【００９６】
単一のプラスミドは、単一のフィロタンパク質免疫原に関するコード配列、２つのフィロタンパク質免疫原に関するコード配列、３つのフィロタンパク質免疫原に関するコード配列、４つのフィロタンパク質免疫原に関するコード配列、５つのフィロタンパク質免疫原に関するコード配列、または６つのフィロタンパク質免疫原に関するコード配列を含有してもよい。単一のプラスミドは、併せて製剤化することができる単一のフィロタンパク質免疫原に関するコード配列を含有してもよい。幾つかの実施形態では、プラスミドは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−２８をコードするコード配列を含んでもよい。
【００９７】
プラスミドは、コード配列の上流にあり得る開始コドン、およびコード配列の下流にあり得る終止コドンを更に含むことができる。開始および終結コドンは、抗原コード配列と共にフレーム内にあり得る。
【００９８】
プラスミドは、コード配列に機能的に結合しているプロモーターも含むことができる。コード配列と機能的に結合しているプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターのようなヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例はＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターは、また、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインのようなヒト遺伝子からのプロモーターであり得る。プロモーターは、また、天然または合成の筋肉または皮膚特異的プロモーターのような組織特異的プロモーターであり得る。そのようなプロモーターの例は、米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９９】
プラスミドは、コード配列の下流にあり得るポリアデニル化シグナルを含むこともできる。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβグロブリンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのポリアデニル化シグナルであり得る。
【０１００】
プラスミドは、コード配列の上流にエンハンサーを含むこともできる。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶのうちの１つのようなウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能の増強は、米国特許第５，９３９，９７２号、同第５，９６２，４２８号、および国際公開公報第９４／０１６７３７号に記載されており、それぞれの内容は参照により完全に組み込まれる。
【０１０１】
プラスミドは、プラスミド染色体外性を維持し、かつ細胞内にプラスミドの複数のコピーを産生するため、哺乳類の複製の起点を含むこともできる。プラスミドは、エプスタイン・バーウイルスの複製の起点を含むことができるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４、および組み込みなしで高コピーエピソーム複製を生じることができる核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域であり得る。プラスミドの主鎖は、ｐＡＶ０２４２であり得る。プラスミドは、複製欠損アデノウイルス型５（Ａｄ５）プラスミドであり得る。
【０１０２】
プラスミはド、プラスミドが投与される細胞における遺伝子発現に十分に適切であり得る調節配列を含むこともできる。コード配列は、宿主細胞におけるコード配列のより効率的な転写を可能にし得るコドンを含むことができる。
【０１０３】
コード配列は、Ｉｇリーダー配列を含むこともできる。リーダー配列は、コード配列の５′であり得る。この配列でコードされるコンセンサス抗原は、Ｎ末端Ｉｇリーダー、続いてコンセンサス抗原タンパク質を含むことができる。Ｎ末端Ｉｇリーダーは、ＩＧＥまたはＩｇＧであり得る。
【０１０４】
プラスミドは、エシェリキア・コリ（大腸菌）におけるタンパク質産生に使用することができるｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）であり得る。プラスミドは、酵母のサッカロマイセス・セレビシエ株におけるタンパク質産生に使用することができるｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）でもあり得る。プラスミドは、昆虫細胞におけるタンパク質産生に使用することができる、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）でもあり得る。プラスミドは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類細胞におけるタンパク質産生に使用することができる、ｐｃＤＮＡ  ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）でもあり得る。
【０１０５】
５．組成物
核酸分子を含む組成物が提供される。組成物は、単一のプラスミドのような単一の核酸分子の複数のコピー、２つ以上の異なるプラスミドのような２つ以上の異なる核酸分子の複数のコピーを含むことができる。例えば、組成物は、複数の２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個、またはそれ以上の異なる核酸分子を含むことができる。そのような組成物は、複数の、２、３、４、５、６個、またはそれ以上の異なるプラスミドを含むことができる。
【０１０６】
組成物は、１つ以上のコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質、第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、および第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原からなる群から選択される単一のフィロタンパク質免疫原に関するコード配列を集合的に含有する、例えば、プラスミドなどの核酸分子を含むことができる。
【０１０７】
組成物は、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原およびコンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原；またはコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、およびマールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質；またはコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、および第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原；またはコンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質、第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、および第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原の組み合わせをコードする核酸配列を含む。各フィロタンパク質免疫原に関する各コード配列は、好ましくは別々のプラスミド上に含まれる。したがって、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原およびコンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物は、単一のプラスミド上にあることができるが、好ましくは２つの別々のプラスミド上にある。コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、およびマールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸配列を含む組成物は、単一のプラスミド上にあってもよく、または任意の順列で２つのプラスミド上にあってもよいが、好ましくは３つの分離したプラスミド上にある。コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、および第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物は、単一のプラスミド上にあってもよく、または任意の順列で２つのプラスミド上にあってもよく、または任意の順列で３つのプラスミド上にあってもよく、または任意のパームエイションで４つのプラスミド上にあってもよいが、好ましくは５つの分離したプラスミド上にある。同様に、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、および第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む組成物は、単一のプラスミド上にあってもよく、または任意の順列で２つのプラスミド上にあってもよく、または任意の順列で３つのプラスミド上にあってもよく、または任意のパームエイションで４つのプラスミド上にあってもよいが、好ましくは５つの分離したプラスミド上にある。
【０１０８】
６．ワクチン
哺乳動物においてフィロウイルス、具体的には、マールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン、および／またはエボラウイルス・ザイールに対して免役応答を生成することができるワクチンが、本明細書に提供される。ワクチンは、上で考察されたそれぞれのプラスミドを含むことができる。ワクチンは、複数のプラスミドまたはそれらの組み合わせを含むことができる。ワクチンは、治療または予防免疫応答を誘導するために提供され得る。
【０１０９】
ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原およびコンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸分子を送達するために使用されてもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、およびマールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸分子を送達するために使用されてもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、および第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸分子を送達するために使用されてもよい。ワクチンは、コンセンサスザイールエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、コンセンサススーダンエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５エンベロープ糖タンパク質、第１のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、第２のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原、および第３のコンセンサスマールブルグマールブルグウイルスエンベロープ糖タンパク質免疫原をコードする核酸分子を送達するために使用されてもよい。ワクチンは好ましくは、プラスミドを含む組成物である。
【０１１０】
ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤を更に含むことができる。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤としての機能分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のような界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類縁体、ムラミルペプチド、キノン類縁体、スクアレンおよびスクアレンのような小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルス粒子、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子が含まれ得る形質移入促進剤、または他の既知の形質移入促進剤であり得る。
【０１１１】
形質移入促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含むポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。形質移入促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸は６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でワクチンに存在する。形質移入促進剤は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のような界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類縁体、ムラミルペプチド、キノン類縁体、ならびにスクアレンおよびスクアレンのような小胞を含むことができ、ヒアルロン酸を遺伝子構築物と一緒に投与に使用することもできる。幾つかの実施形態において、ＤＮＡプラスミドワクチンは、脂質、レクチンリポソーム、もしくはＤＮＡリポソーム混合物（例えば、国際公報第０９３２４６４０号を参照すること）のような当該技術において既知の他のリポソームを含むリポソーム、カルシウムイオン、ウイルス粒子、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子のような形質移入促進剤、または他の既知の形質移入促進剤を含むこともできる。好ましくは、形質移入促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含むポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。ワクチン中の形質移入剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【０１１２】
薬学的に許容される賦形剤は１つ以上のアジュバントであり得る。アジュバントは、ワクチンにおいて、同じもしくは代替的なプラスミドに発現される、または上記のプラスミドと組み合わされたタンパク質として送達される、他の遺伝子であり得る。１つ以上のアジュバントは、ＣＣＬ２０、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、胸腺上皮発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、欠失されたシグナル配列をコードするシグナル配列またはコード配列を有し、かつＩｇＥからのもののような異なるシグナルペプチド、またはＩｇＥからのもののような異なるシグナルペプチドをコードするコード配列を任意に含むＩＬ−１５を含む、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８の突然変異形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびこれらの機能性フラグメント、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質および／またはタンパク質をコードする核酸分子であり得る。幾つかの実施形態において、アジュバントは、ＣＣＬ−２０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、またはＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される１つ以上のタンパク質および／またはタンパク質をコードする核酸分子であり得る。ＩＬ−１２の構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＴＣ／ＵＳ１９９７／０１９５０２号、ならびに対応する米国特許出願第０８／９５６，８６５号および２０１１年１２月１２日に出願の米国特許仮出願第６１／５６９６００号に開示されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−１５の構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１８９６２号および対応する米国特許出願第１０／５６０，６５０号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／００８８６号および対応する米国特許出願第１２／１６０，７６６号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／０４８８２７号に開示されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−２８の構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＴＣ／ＵＳ０９／０３９６４８号および対応する米国特許出願第１２／９３６，１９２号に開示されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳおよび他の構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＴＣ／ＵＳ１９９９／００４３３２号および対応する米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳの構築物および配列の他の例は、ＰＣＴ出願番号ＰＴＣ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳおよび他の構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＴＣ／ＵＳ１９９９／００４３３２号および対応する米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳの構築物および配列の他の例は、ＰＣＴ出願番号ＰＴＣ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。ケモカインのＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、およびＭＥＣの構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＴＣ／ＵＳ２００５／０４２２３１号および対応する米国特許出願第１１／７１９／６４６号に開示されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＯＸ４０および他の免疫調節剤の例は、米国特許出願第１０／５６０，６５３号に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。ＤＲ５および他の免疫調節剤の例は、米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
ワクチンは、１９９４年４月１日に出願の米国特許出願第０２１／５７９号に記載されている遺伝子ワクチン促進剤を更に含むことができる。
【０１１４】
ワクチンは、約１ナノグラムから１００ミリグラム、約１マイクログラムから約１０ミリグラム、または好ましくは約０．１マイクログラムから約１０ミリグラム、またはより好ましくは約１ミリグラムから約２ミリグラムの量でコンセンサス抗原およびプラスミドを含むことができる。幾つかの好ましい実施形態において、本発明による薬学的組成物は、約５ナノグラムから約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。幾つかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約１０ナノグラムから約８００マイクログラムのＤＮＡを含有する。幾つかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含有する。幾つかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。幾つかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラム、約１ナノグラムから１００ミリグラム、約１マイクログラムから約１０ミリグラム、約０．１マイクログラムから約１０ミリグラム、約１ミリグラムから約２ミリグラム、約５ナノグラムから約１０００マイクログラム、約１０ナノグラムから約８００マイクログラム、約０．１〜約５００マイクログラム、約１〜約３５０マイクログラム、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラムのコンセンサス抗原およびそのプラスミドを含有する。
【０１１５】
ワクチンは、使用される投与様式に従って製剤化することができる。注射用ワクチンの薬学的組成物は、滅菌、発熱物質無含有、および粒子無含有であり得る。等張製剤または液剤を使用することができる。等張のための添加剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれ得る。ワクチンは、血管収縮剤を含むことができる。等張液剤には、リン酸緩衝食塩水が含まれ得る。ワクチンは、ゼラチンおよびアルブミンを含む安定剤を更に含むことができる。安定化は、製剤が室温または周囲温度で長時間安定であることを可能にし得、例えば、ワクチン製剤へのＬＧＳ、またはポリカチオンもしくはポリアニオンであり得る。
【０１１６】
７．ワクチンの送達方法
それらに対する免疫応答が誘導され得るフィロウイルス、具体的には、マールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン、および／またはエボラウイルス・ザイールの特に有効な免疫原となるエピトープを含む、コンセンサス抗原の遺伝子構築物およびタンパク質を提供するためのワクチンを送達するため方法が、本明細書において提供される。ワクチンを送達する、またはワクチン接種の方法は、治療的および予防的な免疫応答を誘導するために提供することができる。ワクチン接種プロセスは、フィロウイルス、具体的には、マールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン、および／またはエボラウイルス・ザイールに対する免疫応答を哺乳動物において生成することができる。ワクチンを個体に送達して、哺乳動物の免疫系の活性を調節し、免疫応答を増強することができる。ワクチンの送達は、細胞内で発現し、細胞の表面に送達され、その時点で免疫系が認識し、細胞性、液性、または細胞性および液性の応答を誘導する核酸分子としてのコンセンサス抗原の形質移入であり得る。ワクチンの送達は、上記に考察されたワクチンを哺乳動物に投与することによって、フィロウイルス、具体的には、マールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン、および／またはエボラウイルス・ザイールに対する免疫応答を哺乳動物に誘導または誘発するために使用することができる。
【０１１７】
哺乳動物の細胞へのワクチンおよびプラスミドの送達によって、形質移入細胞が発現し、ワクチンから注入されたそれぞれのプラスミドへコンセンサス抗原を分泌する。これらのタンパク質は、免疫系により外来性であると認識され、これらに対して抗体が作製される。これらの抗体は、免疫系によって維持され、続くフィロウイルス、具体的には、マールブルグウイルス、エボラウイルス・スーダン、および／またはエボラウイルス・ザイールによる感染への有効な応答を可能にする。
【０１１８】
ワクチンを哺乳動物に投与して、免疫応答を哺乳動物に誘発することができる。哺乳動物は、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、スイギュウ、バイソン、ウシ科、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、およびニワトリであり得る。
【０１１９】
ａ．併用治療
ワクチンは、ＣＣＬ２０、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、胸腺上皮発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、欠失されたシグナル配列を有し、かつＩｇＥシグナルペプチドのような異なるシグナルペプチド任意に含むＩＬ−１５を含む、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−２８、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８の突然変異形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ５、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびこれらの機能性フラグメント、またはこれらの組み合わせをコードする、他のタンパク質および／または遺伝子と組み合わせて投与され得る幾つかの実施形態において、ワクチンは、以下の核酸分子および／またはタンパク質の１つ以上と組み合わせて投与され、核酸分子は、ＣＣＬ２０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、およびＲＡＮＴＥＳ、またはこれら機能性のフラグメントの１つ以上をコードするコード配列を含む核酸分子からなる群から選択され、タンパク質は、ＣＣＬ０２、ＩＬ−１２タンパク質、ＩＬ−１５タンパク質、ＩＬ−２８タンパク質、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＫタンパク質、もしくはＲＡＮＴＥＳタンパク質、またはこれらの機能性フラグメントからなる群から選択される。
【０１２０】
ワクチンは、経口、非経口、舌下、経皮、直腸内、経粘膜、局所、吸入、口腔内投与、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、鞘内、および関節内、またはこれらの組み合わせを含む異なる経路で投与することができる。獣医学的使用では、組成物を、通常の獣医学の診療に適切に許容される製剤として投与することができる。獣医師は、特定の動物に最も適した投与レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。ワクチンは、伝統的なシリンジ、無針注射装置、「微粒子銃」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学法」、もしくは超音波のような他の物理的方法により投与することができる。
【０１２１】
ワクチンのプラスミドは、インビボ電気穿孔を用いるおよび用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルス、および組み換えワクシニアのようなリポソーム仲介、ナノ粒子促進組み換えベクターを含む幾つかの周知の技術により哺乳動物に送達することができる。コンセンサス抗原は、ＤＮＡ注入を介し、インビボ電気穿孔を伴って送達することができる。
【０１２２】
ｂ．電気穿孔
ワクチンのプラスミドの電気穿孔を介したワクチンの投与は、細胞膜に可逆的細孔を形成させるのに有効なエネルギーパルスを、哺乳動物の所望の組織に送達すように構成され得る電気穿孔装置を使用して達成することができ、好ましくは、エネルギーパルスは、使用者により予め設定された電流入力に類似した定電流である。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極アセンブリーまたはハンドルアセンブリーを含むことができる。電気穿孔構成要素は、制御装置、電流波形発生器、インピーダンス試験器、波形自動記録器、入力要素、状況報告要素、通信ポート、記憶装置構成要素、電源、および電源スイッチが含まれる、電気穿孔装置の様々な要素の１つ以上を含み、組み込むことができる。電気穿孔は、インビボ電気穿孔装置、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ  ＥＰシステム（ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎ電気穿孔機（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用することにより達成され、プラスミドによる細胞の形質移入を促進することができる。
【０１２３】
電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の１つの要素として機能することができ、他の要素は、電気穿孔構成要素と通信する別個の要素（または構成要素）である。電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の１つを超える要素として機能することができ、これも、電気穿孔構成要素から離れている電気穿孔装置の他の要素と通信し得る。電気機械的または機械的な装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素は、１つの装置として、または互いに通信する別個の要素として機能し得る要素として限定されることはない。電気穿孔構成要素は、所望の組織に定電流を生じるエネルギーパルスを送達することができ得、フィードバック機構を含む。電極アセンブリーは、空間を開けて配置された複数の電極を有する電極配列を含むことができ、ここで電極アセンブリーは、電気穿孔構成要素からのエネルギーパルスを受け取り、これを、電極を介して所望の組織に送達する。複数の電極の少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達の間は中性であり、所望の組織においてインピーダンスを測定し、インピーダンスを電気穿孔構成要素に通信する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受け取ることができ、電気穿孔構成要素により送達されたエネルギーパルスを調整して、定電流を維持することができる。
【０１２４】
複数の電極が、分散パターンでエネルギーパルスを送達することができる。複数の電極は、プログラム化シーケンスによる電極の制御を介する分散パターンでエネルギーパルスを送達することができ、プログラム化シーケンスは、使用者により電気穿孔構成要素に入力される。プログラム化シーケンスは、シーケンスで送達された複数のパルスを含むことができ、複数のパルスのそれぞれのパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極により送達され、後から続く複数のパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極のうちの異なる１つにより送達される。
【０１２５】
フィードバック機構は、ハードウエアまたはソフトウエアのいずれかにより実施することができる。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路により実施することができる。フィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、または１μｓ毎に発生するが、好ましくはリアルタイムフィードバックまたは瞬時（すなわち、応答時間を決定する利用可能な技術により決定される、実質的な瞬時）である。中性電極は、所望の組織においてインピーダンスを測定し、インピーダンスをフィードバック機構に通信することができ、フィードバック機構は、インピーダンス応答し、エネルギーパルスを調整して、予め設定された電流と類似した値に定電流を維持する。フィードバック機構は、エネルギーパルスの送達の間に定電流を連続的または瞬時に維持することができる。
【０１２６】
本発明のＤＮＡワクチンの送達を促進することができる電気穿孔装置および電気穿孔法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されたものが含まれ、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＤＮＡワクチンの送達の促進に使用することができる他の電気穿孔装置および電気穿孔法には、２００６年１０月１７日出願の米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日出願の同第６０／９７８，９８２号の特許法１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する、２００７年１０月１７日出願の同時係属および共有の米国特許出願第１１／８７４０７２号において提供されたものが含まれ、これらは全て、その全体が参照により組み込まれる。
【０１２７】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号は、身体または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのモジュール式電極システムおよびこれらの使用を記載する。モジュール式電極システムは、複数の針電極、皮下注射針、プログラム可能定電流パルス制御装置から複数の針電極へ導電性インクを提供する電気コネクタ、および電源を含むことができる。操作者は、支持構造に装填された複数の針電極をつかみ、それらを身体または植物の選択された組織の中にしっかりと挿入することができる。次に生体分子が、選択された組織内に皮下注射針を介して送達される。プログラム可能定電流パルス制御装置を作動し、定電流電気パルスを複数の針電極に適用する。適用される定電流電気パルスは、複数の電極の間の細胞への生体分子の導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２８】
Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、身体または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を効果的に促進するために使用され得る電気穿孔装置を記載する。電気穿孔装置は、動作がソフトウエアまたはファームウエアにより特定される動電学的装置（「ＥＫＤ装置」）を含む。ＥＫＤ装置は、電極配列の間に一連のプログラム可能定電流パルスパターンを、使用者の制御およびパルスパラメーターの入力に基づいて生成し、電流波形データの記憶および取得を可能にする。電気穿孔装置は、また、針電極の配列を有する交換可能な電極ディスク、注入針の中央注入チャンネル、および取り外し可能なガイドディスクを含む。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されている電極配列および方法を、筋肉のような組織のみならず、他の組織または臓器の中にも深く侵入するように適合させることができる。電極配列の構成のため、（選択された生体分子を送達する）注入針も、標的臓器の中に完全に挿入され、注入は、電極により予め描かれた領域内の標的組織に対して垂直に施用される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されている電極は、好ましくは長さが２０ｍｍであり、ゲージが２１である。
【０１３０】
加えて、電気穿孔装置およびその使用を組み込む幾つかの実施形態において考慮されるように、以下の特許：１９９３年１２月２８日発行の米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日発行の米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日発行の同第６，２６１，２８１号、および２００５年１０月２５日発行の同第６，９５８，０６０号、ならびに２００５年９月６日発行の米国特許第６，９３９，８６２号に記載される電気穿孔装置が存在する。更に、様々な装置のいずれかを使用したＤＮＡの送達に関する２００４年２月２４日発行の米国特許第６，６９７，６６９号、およびＤＮＡを注入する方法を対象とする２００８年２月５日発行の米国特許第７，３２８，０６４号に提供された主題を網羅する特許が、本明細書において考慮される。上記の特許は、その全体が参照により組み込まれる。
【０１３１】
ｃ．ＤＮＡプラスミドの調製方法
本明細書で考察されているＤＮＡワクチンを含むＤＮＡプラスミドを調製する方法が、本明細書において提供される。ＤＮＡプラスミドは、哺乳類発現プラスミドへの最終サブクローニングステップの後、当該技術において既知の方法を使用して、大規模発酵タンク中の細胞培養物への接種に使用することができる。
【０１３２】
本発明のＥＰ装置で使用されるＤＮＡプラスミドは、既知の装置および技術の組み合わせを使用して製剤化および製造することができるが、好ましくは、これらは２００７年５月２３日出願の契約対象同時継続米国特許仮出願第６０／９３９，７９２号に記載されている最適化プラスミド製造技術を使用して製造される。幾つかの例において、これらの研究に使用されたＤＮＡプラスミドを、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化することができる。製造技術は、また、契約対象特許である２００７年７月３日出願の米国特許第７，２３８，５２２号に記載されているものを含む、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されているものに加えて、当業者に一般的に既知の様々な装置およびプロトコールを含む、または組み込む。上で参照された出願および特許である米国特許出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１３３】
本発明は以下の実施例において更に説明される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示のためにのみ提示されていることが理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特長を確認することができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正を行って様々な用途および条件に適合させることができる。したがって、本明細書において示され、記載されているものに加えて、本発明の様々な変更が、前記の記載から当業者には明白となるであろう。そのような変更も、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【０１３４】
実施例１
方法
プラスミドワクチン構築
ｐＭＡＲＶ、ｐＥＢＯＳ、およびｐＥＢＯＺプラスミドＤＮＡ構築物は、全長ＧＰタンパク質をコードする。アミノ酸コンセンサス戦略を、ｐＥＢＯＳおよびｐＥＢＯＺのために使用し、一方２００５Ａｎｇｏｌａ発生株に由来する型マッチ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃ＶＧＰ＿ＭＡＢＶＲ）を、ｐＭＡＲＶのために使用した（Ｔｏｗｎｅｒ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｍａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｏｕｔｂｒｅａｋ  ｉｎ  Ａｎｇｏｌａ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：６４９７−６５１６）。コンセンサス配列を、主流のＺＥＢＯＶおよびＳＵＤＶ  ＧＰアミノ酸配列の整列、およびそれぞれに関するコンセンサスの生成によって決定した。各ワクチンＧＰ遺伝子を、ヒトにおける発現において遺伝的に最適化し（タンパク質発現を増強するためのコドン最適化およびＲＮＡ最適化を含む（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））、商業的に合成し、次にサイトメガロウイルス初期（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で改変されたｐＶＡＸ１哺乳動物の発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へとサブクローニングした（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。改変は、２Ａ＞Ｃ、３Ｃ＞Ｔ、４Ｔ＞Ｇ、２４１Ｃ＞Ｇ、１，９４２Ｃ＞Ｔ、２，８７６Ａ＞−、３，２７７Ｃ＞Ｔ、および３，７５３Ｇ＞Ｃを含む。系統発生分析を、ＭＥＧＡバージョン５ソフトウエアを用いてＣｌｕｓｔａｌＷによる多重整列によって実施した。別法として、ＭＡＲＶ間のＧＰ多様性は、比較において遥かに高かったため（約７０％の同一性）、コンセンサス戦略は適用されなかった。ＭＡＲＶの対応範囲のため、我々は、アンゴラにおける２００５発生に由来するＭＧＰ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃ＶＧＰ＿ＭＡＢＶＲ）が、今日までで最大規模かつ最も致命的なＭＡＲＶ発生の唯一の原因であったため、その利用を選択した。この配列は、Ｍｕｓｏｋｅ、Ｐｏｐｐ、およびＬｅｉｄｅｎ（１０．６％分岐）、またはＵｇａｎｄａ（０１Ｕｇａ０７）、Ｄｕｒｂａ（０５ＤＲＣ９９および０７ＤＲＣ９９）、およびＯｚｏｌｉｎ（１０．３％分岐）を含む、関連株の最も近いクラスターのいずれかからも１０％超分岐した。全体として、３つのプラスミド戦略は、我々の新規の三価多価フィロウイルスワクチン戦略の基盤を形成した。
【０１３５】
形質移入および免疫ブロット
ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を培養し、形質移入し、採取した。手短に述べると、細胞は、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、ピルビン酸ナトリウム、およびＬ−グルタミンと共にＤＭＥＭ中で成長させた。細胞を、１５０ｍｍコーニング皿内で培養し、５％ＣＯ2を伴う３７°インキュベーター内で一晩、７０％集密まで成長させた。皿を、製造者プロトコールに従って、Ｃａｌｐｈｏｓ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔプロトコル（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）かまたはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）かを用いて１０〜２５μｇのフィロウイルス科ｐＤＮＡで形質移入し、次に２４〜４８時間インキュベートした。細胞を、冷たいＰＢＳで採取し、遠心分離および洗浄した後、ウエスタン免疫ブロットまたはＦＡＣＳ解析のためにペレット化した。標準ウエスタンブロットを使用し、ＧＰ１検出のためにＧＰ特異性ＭＡｂを生成した。ウエスタン免疫ブロット法実験からのデータが、図１Ｂに示される。ＦＡＣＳ解析からのデータが、図１Ｃに示される。
【０１３６】
動物、ワクチン接種、および攻撃
成体メスＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b）、ＢＡＬＢ／ｃＪ（Ｈ−２d）、およびＢｌ０．Ｂｒ（Ｈ−２k）マウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入し、一方ハートレイ系モルモットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。全ての動物実験は、ＵＰｅｎｎ  ＩＡＣＵＣ  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、またはＮＭＬ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＨＡＣ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｈｏｕｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｃａｒｅ  ｏｆ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｉｍａｌｓに従って行い、上述の機関による関連チェックおよび認可後に、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｏｆ  ＮＩＨにおける推奨事項に従って実施した。ＵＰｅｎｎおよびＮＭＬは、動物の福祉に関するＮＩＨポリシー、Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ、および他の全ての該当の連邦法、州法、および現地法に適合する。
【０１３７】
マウスを、水中で再懸濁した４０μｇのプラスミドによる筋肉内針注射によって免疫付与し、一方モルモットは、３つの別個のワクチン接種部位にそれぞれ２００μｇ、皮内に免疫付与した。ワクチン接種の直後に、同一部位にＥＰを続けた。手短に述べると、３又のＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）ａｄａｐｔｉｖｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｃｕｒｒｅｎｔＭｉｎｉｍａｌｌｙ  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｄｅｖｉｃｅを、皮内に約２ｍｍ挿入した（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ，ＰＡ）。矩形波パルスを、２６ゲージ固体ステンレス鋼電極からなる三角３電極アレイを通じて送達し、０．１Ａｍｐの２つの一定電流パルスを、１秒の遅延によって分離し５２ｍ秒／パルス送達した。
【０１３８】
致死的攻撃試験のために、攻撃は、齧歯動物に適合したＺＥＢＯＶおよびＭＡＲＶに限定した。モルモットを、１，０００ＬＤ50のモルモットに適合したＺＥＢＯＶ（２１．３ＦＦＵ／動物）（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＪＳ，Ａｂｏｕ  ＭＣ，Ｔｒａｎ  ＫＮ，Ｋｕｍａｒ  Ａ，Ｓａｈａｉ  ＢＭ，Ｋｏｂｉｎｇｅｒ  ＧＰ（２０１１）．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｏｒ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｏｎ  ａｄ−ｂａｓｅｄ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇｓ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０４  Ｓｕｐｐｌ  ３：Ｓ１０３２−１０４２）、または１，０００ＬＤ50ＭＡＲＶ−Ａｎｇｏｌａ（６８１  ＴＣＩＤ５０／動物）による腹腔内注射による最終ワクチン接種の２８日後に攻撃した。手短に述べると、モルモット適合したＭＡＲＶを、非近交系の成体メスハートレイ系モルモットにおける野生型ＭＡＲＶ−Ａｎｇｏｌａの連続継代によって作製した。植菌の７日後、動物を安楽死させ、肝臓を採取し、均質化した。この均等質を、次にナイーブ成体モルモットに腹腔内注入し、動物が体重減少し、毛艶を失い、モルモットにおけるＥＢＯＶ適応と同様の感染にかかるまでプロセスを反復した。マウス致死的試験のために（Ｋｏｂｉｎｇｅｒ  ＧＰ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｚａｉｒｅ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３４６：３９４−４０１）、マウス  に、２００μlの１，０００ＬＤ50（１０  ＦＦＵ／動物）のマウス適合したＺＥＢＯＶを腹腔内注入した。全ての動物を、毎日体重測定し、認可されたスコアシートを用いて少なくともマウスに関して１８日間、モルモットに関して２２日間、疾患進行に関してモニタリングした。全ての感染作業は、ＮＭＬ、ＰＨＡＣにおける「バイオセーフティーレベル４」（ＢＳＬ４）の施設内で実施した。
【０１３９】
ＥＬＩＳＡおよび中和分析
抗体（Ａｂ）価を、スクロース精製したＭＡＲＶ  Ｏｚｏｌｉｎ  ＧＰもしくはＺＧＰか、または負の対照スクロース精製したＮｉｐａｈ  Ｇタンパク質かで１：２，０００の濃度でコーティングした９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを用いて決定した。手短に述べると、プレートを次に、４℃で１８時間インキュベートし、ＰＢＳおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、１００μｌ／標本の血清を三連で試験した（５％スキムミルクおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を伴うＰＢＳ中で１：１００、１：４００、１：１，６００、および１：６，４００の希釈）。湿潤容器中で３７℃にて１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、次に１００μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ−共役ＨＲＰ抗体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を添加し（１：２，０００希釈）、湿潤容器中で更に３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、１００μｌのＡＢＳＴ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンチアゾリン−６−スルホン酸）およびペルオキシダーゼ基質（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を添加して、Ａｂ結合を可視化した。再び湿潤容器中で、プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、次にその後４０５ｎｍで読み取った。正の結合結果を、負の対照血清から正の対照を減じ、３標準偏差超とすることによって特徴付けした。
【０１４０】
ＺＥＢＯＶ中和分析を実施した。手短に述べると、免疫付与したマウスおよびモルモットに由来する血清を、５６℃で４５分間不活性化し、各標本の一連の希釈物（５０μｌのＤＭＥＭ中で、マウスに関して１：２０、１：４０など、またモルモットに関して１：５０）をＥＧＦＰレポーター遺伝子（ＺＥＢＯＶ−ＥＧＦＰ）（１００形質導入単位／ウエル、ＥＧＦＰ発現に従う）を発現する同体積のＺＥＢＯＶと混合し、３７℃で９０分間インキュベートした。次に、混合物を９６ウエル平底プレート内の準密集（ｓｕｂ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）ＶｅｒｏＥ６上に移し、室温にて５〜１０分間インキュベートした。対照ウエルを、血清または非免疫血清の添加を伴わずに、同量のＺＥＢＯＶ−ＥＧＦＰウイルスで感染させた。次に、２０％ＦＢＳを補充した１００μｌのＤＭＥＭを各ウエルに添加し、プレートを５％ＣＯ2中で３７℃で４８時間インキュベートした。
【０１４１】
別法として、ＭＡＲＶ−Ａｎｇｏｌａ３６８の中和を、免疫蛍光分析を用いて評価した。正常ウサギ抗ＭＡＲＶ  Ａｂおよび二次ヤギ抗ウサギＩｇＧ  ＦＩＴＣ共役Ａｂを、検出のために用いた。ＳＵＤＶ  Ｂｏｎｉｆａｃｅに対する中和Ａｂ（ＮＡｂ）を、ＣＶ−１細胞上の細胞変性効果（ＣＰＥ）に基づいて分析した。細胞を、等部の免疫付与した血清およびＳＵＤＶ  Ｂｏｎｉｆａｃｅを用いて１０日間インキュベートし、その後１０％緩衝ホルマリンで２４時間固定し、光学顕微鏡下で検査した。ＥＧＦＰおよびＦＩＴＣに陽性の細胞を、各ウエル内で計数し、対照と比較して緑色細胞の数において５０％超の低減を示す標本希釈を、ＮＡｂに関して陽性スコア化した。別法として、ＳＵＤＶ−Ｂｏｎｉｆａｃｅに対するＮＡｂを、ＣＶ−１細胞上の細胞変性効果（ＣＰＥ）に基づいて分析した。全ての感染作業は、ＮＭＬ、ＰＨＡＣのＢＳＬ４実験室内で実施した。
【０１４２】
脾細胞単離
マウスを、最終免疫化の８〜１１日後に屠殺し、脾臓を採取した。手短に述べると、脾臓を、１０％ＦＢＳ、１ＸＡｎｔｉ−ａｎｔｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および１Ｘ  β−ＭＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）中に定置した。脾細胞を、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ  ｍａｃｈｉｎｅ（Ｓｅｗａｒｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｈｅｍｉａ，ＮＹ）を用いた脾臓の機械的分裂によって単離し、得られた産生物を、４０μｍ細胞濾過器（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を用いて濾過した。細胞を次に、ＲＢＣの溶解のためにＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で５分間処理し、ＰＢＳ中で洗浄し、次にＥＬＩＳＰＯＴまたはＦＡＣＳ分析での使用のためにＲＰＭＩ培地中に再懸濁した。
【０１４３】
ＥＬＩＳＰＯＴ分析
標準ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析を実施した。手短に述べると、９６ウエルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を、抗マウスＩＦＮ−γ捕捉抗体でコーティングし、４℃で２４時間インキュベートした（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄し、次にブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡおよび５％スクロース）で２時間ブロッキングした。脾細胞（１〜２ｘ１０5細胞／ウエル）を、三連で定置し、ＲＰＭＩ  １６４０（負の対照）か、Ｃｏｎ  Ａ（正の対照）か、またはＧＰペプチドかのいずれかの存在下で、個別に（９個のアミノ酸による１５ｍｅｒ重複、およびそれらのそれぞれのＧＰの長さにわたる）、または全てプールして（最終で２．５μｇ／ｍｌ）、５％ＣＯ2内で３７℃にて一晩刺激した。刺激の１８〜２４時間後、プレートをＰＢＳ中で洗浄し、次にビオチン化抗マウスＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で４℃で２４時間インキュベートした。次に、プレートを再びＰＢＳ中で洗浄し、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（ＭａｂＴｅｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎ）を各ウエルに添加し、室温で２時間インキュベートした。最後に、プレートを再びＰＢＳで洗浄し、次にＢＣＩＰ／ＮＢＴ  Ｐｌｕｓ基質（ＭａｂＴｅｃｈ）を、スポット現像のために各ウエルに５〜３０分間添加した。目視上で現像プロセスが完了すると直ちに、プレートを蒸留水で濯ぎ、次に室温にて一晩乾燥した。スポットを、自動ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．，Ｓｈａｋｅｒ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＯＨ）を用いて計数した。
【０１４４】
Ｔ細胞幅の総合的解析のため、標準ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴを、Ｓｈｅｄｌｏｃｋ  ＤＪら（２０１２）．（上記に同じ）にこれまでに記載されている通りに本明細書において改変した。亜優勢および免疫優勢Ｔ細胞エピトープの特定および測定を、全体またはマトリックスペプチドプールに対するものとして個々のペプチドで脾細胞を刺激することによって評価した。標本保存を目的としたペプチドプーリングの伝統的手順、例えば、マトリックスアレイプールの使用は、複数のエピトープを示すペプチドを含有するプール内の総機能性応答は分析の分解能を効率的に低下させる、即ち、より低規模のものを「かき消す」ため、分析感度の低減をもたらす。したがって、改変されたＥＬＩＳＰＯＴを、各ＧＰ免疫原にわたる個々のペプチド（９個のアミノ酸による１５ｍｅｒ重複、最終で２．５μｇ／ｍｌ）で実施した。Ｔ細胞エピトープを含有するペプチドを確認し（平均≧１０ＩＦＮγ＋スポットかつ≧８０％動物応答率、表１〜６に要約される）、次に機能におよび表現型についてＦＡＣＳによって確証した。共通または部分エピトープは確認されず、ＦＡＣＳデータまたはウエブベースエピトープ予測ソフト上も、連続したペプチド内部に保存されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの存在を示唆しなかった。ここで、可能性のある共通／部分Ｔ細胞エピトープに、改変されたＥＬＩＳＰＯＴ分析によって確認された連続したペプチド応答の全事例に関して対応した。細胞を、連続したペプチドの各々で、また直接比較のために組み合わせて対にして個別に刺激し、組み合わされた応答が２つの個々の応答のいずれかより大きくなかった場合に「共通／部分」として定義した。また、ペプチドを生成するための「９個のアミノ酸による１５ｍｅｒ重複」アルゴリズムは、ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープの完全な範囲に向かってバイアスがかかり、それは１５アミノ酸より長いクラスＩＩ拘束性エピトープの性質のためにＣＤ４  Ｔ細胞応答を過小評価する可能性があるため、本明細書におけるエピトープ応答は、完全に総合的ではない可能性があるということに留意すべきである。最後に、アミノ酸類似性プロットを、ベクターＮＴＩソフトウエアを用いて生成し、結果を図４Ｂに示す。
【０１４５】
フローサイトメトリー
脾細胞を、９６ウエルプレート（ｌｘｌ０6細胞／ウエル）に添加し、個々のペプチドか、または「最小ペプチドプール」（最終２．５μｇ／ｍｌ）かのいずれかで５〜６時間刺激した。個々のペプチド刺激を、改変されたＥＬＩＳＰＯＴによって確認された全ペプチド（表１〜６）の機能的確証および表現型特徴付けのために使用した。まず、脾細胞および形質移入２９３Ｔを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で予備染色した。脾細胞に関して、細胞を、ＣＤ１９（Ｖ４５０；クローン１Ｄ３）、ＣＤ４（ＰＥ−Ｃｙ７；クローンＲＭ４−５）、ＣＤ８α（ＡＰＣ−Ｃｙ７；クローン５３−６．７）、およびＣＤ４４（ＰＥ−Ｃｙ５；クローンＩＭ７）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に関して表面染色し、ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ中で３回洗浄し、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）キットで透過化し、次にＩＦＮγ（ＡＰＣ；クローンＸＭＧ１．２）、ＴＮＦ（ＦＩＴＣ；クローンＭＰ６−ＸＴ２２）、ＣＤ３（ＰＥ−ｃｙ５．５；クローン１４５−２Ｃ１１）、およびＴ−ｂｅｔ（ＰＥ；クローン４Ｂ１０）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で細胞内を染色した。形質移入２９３Ｔ細胞におけるＧＰ発現を、形質移入の２４時間後に評価した。各々がその対応するＤＮＡワクチンまたはｐＶＡＸ１空ベクター対照で３回免疫付与されたＨ−２bマウスに由来する血清をプールすることによって産生された指示されたマウス由来ＧＰ特異性ポリクローナル血清試薬（１：２００希釈）を含有するＰＢＳ＋１％ＦＢＳ中で４℃にて３０分間インキュベートした後、間接染色を実施した。細胞を、次にＦＩＴＣ複合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色し、大規模に洗浄し、次にＭＨＣクラスＩに関して染色した（ＨＬＡ−ＡＢＣ；ＰＥ−Ｃｙ７；クローンＧ４６−２．６；ＢＤ）。全細胞を、１％パラホルムアルデヒド中で固定した。全データを、ＬＳＲＩＩ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ）を用いて収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて解析した。脾細胞を、ＣＤ３＋ＣＤ４４＋、ＣＤ４＋、またはＣＤ８＋であり、Ｂ細胞マーカーＣＤ１９および生存率判定染料に関して負である、活性化したＩＦＮγ産生Ｔ細胞に関してゲーティングした。
【０１４６】
図６は、ＧＰ特異性Ｔ細胞ゲーティングを示す。ＥＬＩＳＰＯＴによって確認されたＴ細胞エピトープを含有するペプチドに関する機能解析および表現型解析を、総リンパ球、ＣＤ１９に関して負であった、生きた（ＬＤ）ＣＤ３＋細胞およびＬＩＶＥ−ＤＥＡＤ（ダンプチャネル）、一倍体（ｓｉｎｇｌｅｔ）（細胞二倍体（ｃｅｌｌ  ｄｏｕｂｌｅｔ）を除く）、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞、活性化された細胞（ＣＤ４４＋）、ならびにペプチド特異性ＩＦＮγ産生Ｔ細胞のＦＡＣＳ  ゲーティングによって実施した。
【０１４７】
統計解析
無根系統樹に関する有意性を、最大公算法によって決定し、ブートストラップ解析によって検証し、有意な支持値（≧８０％、１，０００ブートストラップ複製）を、ＭＥＧＡバージョン５ソフトウエアによって決定した。群解析を、マッチされた両側独立ｔ検定によって完了し、生存曲線をログランク（マンテル・コックス）検定によって解析した。全ての値は、平均±標準誤差であり、統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）によって実施した。
【０１４８】
結果
ワクチン構築および発現
系統発生分析は、ＥＢＯＶ  ＧＰにおける相対的保存を示し（ＳＵＤＶに関して９４．４％、およびＺＥＢＯＶに関して９２．９％）、ＭＡＲＶ  ＧＰ（ＭＧＰ）は、より分岐していた（約７０％保存）。したがって、主流のＺＥＢＯＶおよびＳＵＤＶ  ＧＰアミノ酸配列の整列によって決定されるコンセンサス戦略が、ＥＢＯＶ  ＧＰに対して適用され、一方ＭＡＲＶに関しては、最大規模かつ最も致命的なＭＡＲＶ発生の唯一の原因であった２００５Ａｎｇｏｌａ発生配列を採用する型マッチ戦略が使用された。各ＧＰトランス遺伝子が、遺伝的に最適化され、商業的に合成され、次に改変されたｐＶＡＸ１哺乳動物発現ベクターへとサブクローニングされた。全体として、３つのプラスミド戦略は、我々の新規の多価フィロウイルスワクチン戦略の基盤を形成した。
【０１４９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、各プラスミドで別々に形質移入され、ＧＰ発現が、ウエスタン免疫ブロット法およびＦＡＣＳによって評価された。約１３０ｋＤａタンパク質が、検出のための種特異性抗ＧＰ１  ｍＡｂを用いて形質移入の４８時間後に採取した細胞溶解物中でそれぞれに関して観察された。結果が図１Ｂに示される。比較対照として、それぞれのＧＰを発現する組み換え水胞性口炎ウイルス（ｒＶＳＶ）を、同時進行するレーンに投入した。次に、細胞表面上のＧＰ発現を、形質移入の２４時間後に、ＦＡＣＳによるＧＰ特異性または対照ポリクローナル血清による間接染色によって解析した。結果が図１Ｃに示される。細胞表面発現が、全ワクチンプラスミドに関して検出されたが、一方非特異性結合はほとんど観察されなかった。対照血清はＧＰ形質移入細胞と反応せず、また正の血清もｐＶＡＸ１形質移入細胞と反応しなかった（ｐＥＢＯＺに関するデータが示される）。ＥＢＯＶ  ＧＰに関して予測された通り、細胞表面発現は、表面ＭＨＣクラスＩおよびβ１−インテグリンの認識を立体的に閉塞させた（Ｆｒａｎｃｉｃａ  ＪＲ，Ｖａｒｅｌａ−Ｒｏｈｅｎａ  Ａ，Ｍｅｄｖｅｃ  Ａ，Ｐｌｅｓａ  Ｇ，Ｒｉｌｅｙ  ＪＬ，Ｂａｔｅｓ  Ｐ（２０１０）。Ｓｔｅｒｉｃ  ｓｈｉｅｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ６：ｅ１００１０９８）。
【０１５０】
ＭＡＲＶおよびＺＥＢＯＶ攻撃に対する完全な防御
防御効果を決定するため、モルモット前臨床攻撃モデルを採用した。前臨床免疫原性および有効性試験を、モルモットおよびマウスモデルを用いて本明細書で実施した。モルモット前臨床モデルは、フィロウイルスワクチン開発のためのスクリーニングおよび「概念実証」ツールとして広く使用されている。ＭＡＲＶおよびＥＢＯＶの一次単離物は、モルモットに非致死性の疾病を引き起こすが、この宿主の少数継代は、フィロウイルスに感染した霊長類において見られるものに類似の病理学的特徴を伴う致死性疾患を引き起こし得る変種の選択をもたらす。同様に、マウスは、フィロウイルスワクチン開発のために広く使用されているが、しかしながら、モルモットモデルと異なり、免疫およびＴ細胞応答を評価するための免疫検出試薬が、広く利用可能である。マウス適合したＺＥＢＯＶ（ｍＺＥＢＯＶ）による感染は、標的臓器内の高レベルのウイルス、ならびにＥＢＯＶ感染した霊長類において見出されるものと同種の肝臓および脾臓における病理学的変化によって特徴付けられる疾患をもたらす。
【０１５１】
モルモット（ｎ＝２４）が、２００μｇの各プラスミド（ｐＥＢＯＺ、ｐＥＢＯＳ、およびｐＭＡＲＶ）により３つの別個のワクチン接種部位にて、またはｐＶＡＸ１空ベクター対照（ｎ＝９）により、２回皮内に免疫付与され、次に１ヵ月後に同じワクチンにより追加免疫付与された。動物は、第２の免疫化の２８日後に、ＢＳＬ−４の施設内で１，０００ＬＤ50のモルモット適合したＭＡＲＶ−アンゴラ（ｇｐＭＡＲＶ）（ｎ＝９）またはＺＥＢＯＶ（ｇｐＺＥＢＯＶ）（ｎ＝１５）で攻撃され、次に毎日観察および体重測定された。結果が図２Ａ〜２Ｈに示される。ワクチン接種を受けた動物は、完全に防御されたが、一方対照ワクチン接種を受けた動物は、攻撃の１０日後までにｇｐＭＡＲＶで死亡し（ｎ＝３、Ｐ＝０．００５２）、または攻撃の７日後までにｇｐＺＥＢＯＶで死亡した（ｎ＝６、Ｐ＝０．０００８）（図２Ａおよび図２Ｅ）。加えて、ワクチン接種を受けた動物は、体重減少から防御された（図２Ｂおよび図２Ｆ、Ｐ＜０．０００１）。ワクチン誘導Ａｂは、プール血清におけるＧＰ特異性Ａｂが結合（図２Ｃおよび図２Ｇ）および中和（図２Ｄおよび図２Ｈ）力価において著しい増加を示したため、防御に貢献した可能性がありそうである。実験は、ＢＳＬ−４の施設内で実施され、２回反復され、同様の結果を得、図Ａ〜２Ｈ内のエラーバーは標準誤差を表す。群解析がマッチされた両側独立ｔ検定によって完了され、生存曲線がログランク（マンテル・コックス）検定によって解析された。
【０１５２】
プラスミドワクチンは高度に免疫原性であった
防御的ＤＮＡワクチン（プラスミドｐＥＢＯＺ、ｐＥＢＯＳ、およびｐＭＡＲＶ、三価ＤＮＡワクチンとも称する）によって引き起こされた免疫相関物をより良く特徴付けるため、フィロウイルスワクチン開発のためのスクリーニングおよび「概念実証」ツールとして広く使用されており、広範な免疫検出試薬が利用可能であるマウスモデルを次に採用した。まず、Ｂ細胞応答を、２つのワクチン接種のそれぞれの後に２０日間、４０μｇのそれぞれの一価ＤＮＡワクチンの注射の間に３週間あけて、Ｈ−２dマウス（ｎ＝５／群）において評価した。これらの実験からのデータが、図３Ａ〜３Ｃに示される。図３Ａおよび図３Ｂに示される通り、出血前対照標本においてＧＰ特異性ＩｇＧはほとんど観察されなかったが、ワクチン接種後には全動物において著しい増加が検出された。精製されたＳＧＰは利用可能ではなかったため、精製されたＺＧＰを代わりに使用した。ＳＵＤＶワクチン接種を受けたマウスにおけるＩｇＧはＺＧＰに結合し、ワクチン誘導Ａｂ生成能力、および異種種間認識能力を実証している。加えて、セロコンバージョンが、僅か１回の免疫化後にワクチン接種を受けた動物の１００％に生じ、その後、応答は同様の強化によって著しく増加された。ＡＶＥ逆数エンドポイント希釈力価は、ｐＭＡＲＶ免疫付与されたマウスにおいて２２．１倍、またｐＥＢＯＳおよびｐＥＢＯＺワクチン接種を受けた動物においてそれぞれ３．４倍および８．６倍強化された。次に、標本は、ＢＳＬ−４の施設内でＺＥＢＯＶ、ＳＵＤＶ−Ｂｏｎｉｆａｃｅ、およびＭＡＲＶ−Ａｎｇｏｌａの中和に関して分析された。中和分析の結果が図３Ｃに示される。ＮＡｂ価における著しい増加が、全動物においてワクチン接種後に検出された。
【０１５３】
２つの異なる遺伝的バックグラウンドからのマウス（Ｈ−２dおよびＨ−２b、ｎ＝５／群）が、４０μｇのそれぞれのプラスミドｐＥＢＯＺ、ｐＥＢＯＳ、およびｐＭＡＲＶで免疫付与され、２週間後に同様に追加免疫付与され、次に８日後にＴ細胞解析のために屠殺した。脾細胞がマトリックスプールに対するものとして個々のペプチドを用いて刺激される総合的なワクチン誘導Ｔ細胞応答を評価するための新規の改変されたＥＬＩＳＰＯＴ分析からの結果が、図４Ａに示される。ＤＮＡワクチン接種は、Ｔ細胞エピトープの多様性を認識する強固なＩＦＮγ＋応答を誘導した（表１〜６）。全ての正のエピトープ含有ペプチドは、続いてゲーティングされ（図６を参照）、確証され、ＦＡＣＳによって更に特徴付けされた。この改変されたＥＬＩＳＰＯＴアプローチは、対照ウエルからのバックグラウンド応答が低かったため、極めて感度が高いと証明された（Ｈ−２bにおいて７．２±０．２ＩＦＮγ産生ＳＦＣ／１０6脾細胞、およびＨ−２dマウスにおいて９．２±０．５）。図４Ａに示される結果は、これらのそれぞれの株において、ｐＭＡＲＶによるワクチン接種は、Ｈ−２bマウスにおいて９個、またＨ−２dにおいて１１個の測定可能なエピトープを誘導し、ｐＥＢＯＳは９個および８個を誘導し、またｐＥＢＯＺは１０個および１２個を生成したことを明らかにした。ｐＭＡＲＶ免疫付与されたＨ−２bマウスに由来するエピトープ９個のうち５個（５５．６％）はＣＤ８＋であり、それらはＥＬＩＳＰＯＴとＦＡＣＳ確証および表現型解析との双方によって測定した際に総ＭＧＰ特異性ＩＦＮγ＋応答の約５７．３％を占めた。同様に、ｐＥＢＯＳ免疫付与されたＨ−２bおよびＨ−２dマウスにおいて、確証されたエピトープのそれぞれ僅か３３％および３８％がＣＤ８拘束性であった。しかしながら、これらのエピトープは、総応答の約５０〜９０％を含み、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、双方のマウス株において約５６％であると見積もられ、一方ＦＡＣＳは、Ｈ−２bおよびＨ−２dマウスにおいてそれぞれ５１％および９０％であると見積もられた。総ＣＤ８＋応答は、ｐＥＢＯＺ−ワクチン接種を受けた動物においてより低く、３３％〜５７％の間と測定された（ＥＬＩＳＰＯＴにより双方の株に関して３３％、またＦＡＣＳにより、Ｈ−２bおよびＨ−２dマウスに関してそれぞれ６％および５７％）。
【０１５４】
単一の免疫優勢エピトープが、ｐＥＢＯＳを受容する双方のマウス株において検出され、免疫優勢エピトープは、最も高い亜優勢エピトープより少なくとも２倍ＩＦＮγ応答を生成すると概ね定義された。ｐＭＡＲＶは、４つのＨ−２b拘束性免疫優勢ＣＤ８＋エピトープをペプチドＭＧＰ25-39（＃５）、ＭＧＰ67-81（＃１２）、ＭＧＰ181-195（＃３１）、およびＭＧＰ385-399（＃６５）内に誘導し、また１つのＨ−２d拘束性ＣＤ４＋エピトープＭＧＰ151-171（＃２７）内にを誘導した。これらのエピトープのうちの４つは、ＭＡＲＶ  ＧＰ１の高度に保存された領域内に生じ、図４Ｂおよび図４Ｃに示される通り、これらのうちの３つは推定上の受容体結合ドメイン内に位置したが、１つだけは可変ムチン様領域（ＭＧＰ385-399（＃６５））内に生じた。ｐＥＢＯＳは、Ｈ−２bおよびＨ−２dマウスにおいて、どちらもＧＰ１の高度に保存された領域内に、それぞれＳＵＤＶ  ＧＰ（ＳＧＰ）19-33（＃４）およびＳＧＰ241-255（＃４１）内に生じるＣＤ８＋エピトープを刺激した。しかしながら、ｐＥＢＯＺ免疫化は、受容体結合ドメインおよびムチン様領域内にそれぞれ生じる、Ｈ−２dマウスにおける３つの免疫優勢エピトープ（ＺＥＢＯＶ  ＧＰ受容体結合ドメイン（ＧＰ）139-153(＃２４）に位置するＣＤ８拘束性エピトープ、ならびに２つのＣＤ４拘束性エピトープＺＧＰ175-189（＃３０）およびＺＧＰ391-405（＃６６））を示した。ただ１つの免疫優勢エピトープがＨ−２bマウスにおいて定義され、それはＣＤ４＋とＣＤ８＋エピトープ（＃８９）との双方を含有し、ＧＰ２の高度に保存された領域内に生じた。総じて、多様なエピトープヒエラルキーが、それぞれのワクチン群において一貫し、再現可能であった。更に、図４Ｄに示される通り、亜優勢応答は、総応答のうちのかなりの割合を占め、改変されたＥＬＩＳＰＯＴ分析によって測定した際、総平均亜優勢応答は、ｐＭＡＲＶ、ｐＥＢＯＳ、およびｐＥＢＯＺ免疫付与されたＨ−２bマウスにおいてそれぞれ約１２％、６２％、および７４％であり、一方Ｈ−２dマウスにおける応答はそれぞれ４７％、５０％、および３４％であった。
【０１５５】
最後に、総ＧＰ特異性Ｔ細胞応答が、確証されたエピトープを含む確認されたペプチドのみを含有する最小ペプチドプールによる刺激を用いてＦＡＣＳによって測定された。ワクチン接種を受けた動物のそれぞれにおいて強固な応答が検出され、それはほとんどの場合、活性化されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の双方を含んだ。応答は、対照ペプチド（ｈ−Ｃｌｉｐ）ではＩＦＮγ産生はほとんど観察されず、またＥＬＩＳＰＯＴデータと非常に相関があったため、ＧＰ特異性であった。ＦＡＣＳによって測定した際に免疫化が顕著なＣＴＬを誘導しなかった唯一の事例は、ｐＭＡＲＶによるワクチン接種を受けたＨ−２dマウスであり、ＣＤ８拘束性であると確証されたＥＬＩＳＰＯＴによって確認されたエピトープはなかった。総じて、これらのデータは、ワクチンプラスミドのそれぞれは、マウスにおいて高度に免疫原性であり、ＧＰの高度に保存された領域内の免疫優勢エピトープを含むＴ細胞エピトープの多様なアレイを認識する、強固なＧＰ特異性Ｔ細胞応答をもたらしたことを示す。更に、本明細書において特徴付けされた高度に多様な亜優勢Ｔ細胞応答は、エピトープ同定用の従来のマトリックスアレイペプチドプールを用いていた場合に見落とされていた可能性がある。
【０１５６】
Ｔ細胞応答が、ＦＡＣＳによってそれぞれの対応するＧＰに関して正と確認された全ペプチドを含む最少ペプチドプールに対する反応性に関して測定された。図７Ａは、代表的な動物から示されたＤＮＡワクチン誘導Ｔ細胞応答を示し、ＩＦＮγ産生ＣＤ４＋（右）およびＣＤ８＋（左）細胞がゲーティングされる。ＦＡＣＳプロットが示される。ｈ−ＣＬＩＰペプチドによるインキュベーションは、負の対照（対照）として機能した。図７Ｂは合計のＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞の平均％としてまとめた図７Ａにおけるゲーティングされた細胞の結果を示し、エラーバーは標準誤差を表す。実験は、少なくとも２回反復され、同様の結果を得た。
【０１５７】
マウスにおける「単一投与」防御
次に、ＺＥＢＯＶ攻撃に対するワクチン有効性が、前臨床マウスにおいて評価された。マウスは、強いＮＡｂ誘導のため、１回のみワクチン接種を受け、防御データが観察された。マウス（Ｈ−２k、ｎ＝１０／群）は、４０μｇのｐＥＢＯＺ  ＤＮＡで免疫付与され、防御が、１，０００ＬＤ50のマウス適合したＺＥＢＯＶ（ｍＺＥＢＯＶ）による攻撃によって、２８日後にＢＳＬ４の施設の施設内で評定された。全ての対照動物は攻撃後７日目までに感染により死亡したが、図５Ａは、ＤＮＡワクチン接種を受けたマウスは、完全に防御されたことを示す（Ｐ＝０．０００２）。それに加えて、図５Ｂに示される通り、対照マウスは、死亡までに進行性の体重損失を見せた（Ｐ＜０．０００１）。
【０１５８】
「単一投与」モデルにおけるＤＮＡ誘導防御のメカニズムをよりよく理解するために、次にＮＡｂおよびＴ細胞生成が評価された。ＮＡｂが、ワクチン接種の２５日後、攻撃の３日前に評価され、図５Ｃに示される通り、有意な増加（Ｐ＜０．０００１）が、全てのワクチン接種を受けた動物（ｎ＝１０／群）において検出された。逆数エンドポイント希釈力価は、１９〜４２、２７．３±２．５の範囲であった。
【０１５９】
次に、ＺＧＰ特異性Ｔ細胞の生成を評価し、ｐＥＢＯＺ単独かまたは三価製剤かのいずれかで免疫付与したマウスにおける応答を比較するために本解析の範囲を増加させた。ＩＦＮ−γ産生（ｎ＝５）を、全ＺＧＰペプチドプールを用いてＦＡＣＳによって１１日後に評価した。データが、図５Ｄに示される。ＩＦＮγ−産生Ｔ細胞が、全動物において検出され、また対照ペプチドによる刺激はサイトカイン産生を誘導しなかったため、ＺＧＰペプチドに関して特異的であった。一価または三価製剤のいずれによる免疫化は、強固なＩＦＮγ  Ｔ細胞応答を誘導し、それらを比較すると有意差はなかった（Ｐ＝０．０９２０）。
【０１６０】
ＣＴＬは、ウイルスに感染した細胞の除去において重要であり得るため（Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ＫＬ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｅｔｈａｌ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５：１１８４−１１９１、Ｋａｌｉｎａ  ＷＶ，Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ＫＬ，Ｏｌｉｎｇｅｒ  ＧＧ，Ｂａｖａｒｉ  Ｓ（２００９）．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎ  ａ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｖｉｒｏｌ  Ｊ  ６：１３２、Ｏｌｉｎｇｅｒ  ＧＧ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃｏｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：１４１８９−１４１９６、Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＮＪ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．ＣＤ８（＋）ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｒＡｄ５  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １７：１１２８−１１３１、およびＧｅｉｓｂｅｒｔ  ＴＷ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｖｅｃｔｏｒ  ｃｈｏｉｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ａｎｇｏｌａ  Ｍａｒｂｕｒｇ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８４：１０３８６−１０３９４）、追加のエフェクターサイトカイン、ＴＮＦ、ならびにＴhｌ型ＣＴＬ免疫および細胞毒性と相互に関連があることが知られている発達抑制因子、Ｔ−ｂｏｘ転写因子ＴＢＸ２１（Ｔ−ｂｅｔ）の産生が測定され、結果は次の通りであった。総細胞に関して：ＴＮＦ２．９±０．８、Ｔｂｅｔ１３．０±１．１。ＣＤ４＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞に関して：ＴＮＦ６１．４±３．１、Ｔｂｅｔ７２．６±２．０。ＣＤ８＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞に関して：ＴＮＦ３３．０±３．３、Ｔｂｅｔ９９２．１±１．４（*ｐ＜０．１、***ｐ＜０．００１、****ｐ＜０．０００１）。我々は、活性化されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のそれぞれ約６１％および約３３％が、ＩＦＮγに加えてＴＮＦも産生することを見出した。更に、ＩＦＮγ産生Ｔ細胞は、高レベルのＴ−ｂｅｔを発現した。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのそれぞれ約７３％および９２％はＣＤ４４＋であり、ＺＧＰペプチド刺激後にＩＦＮγを産生した。
【０１６１】
図８Ａおよび８Ｂは、「単一投与」ワクチン接種によるＴ細胞誘導を示す。単一のｐＥＢＯＺ免疫化、または別々の部位の３つのワクチンプラスミドによる単一の三価ワクチン接種後の、ＦＡＣＳによって測定した際のＨ−２kマウスにおけるＴ細胞応答が示され（ａ）、総ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋ＣＤ４＋（紫）またはＣＤ８＋（オレンジ）細胞の平均％として要約される（ｂ）。疑似カラーＦＡＣＳプロットは代表動物に由来し、ＩＦＮγ産生ＣＤ４＋（右）およびＣＤ８＋（左）細胞がゲーティングされる。ｈ−ＣＬＩＰペプチドによるインキュベーションは、負の対照（対照）として機能した。実験は２回実施され、同様の結果が得られ、エラーバーは標準誤差、ｎｓは有意差無しを表す。
【０１６２】
考察
我々は、前臨床齧歯動物免疫原性および有効性研究における多価フィロウイルスワクチンの開発および評定について報告する。ｇｐＭＡＲＶおよびｇｐＺＥＢＯＶによる攻撃に対する完全な防御がモルモットにおける２つのＤＮＡワクチン単一投与の後に観察され、またｍＺＥＢＯＶに対して、マウスにおける「単一投与」ＤＮＡワクチンの後に観察された。今日までに、モルモットの遺伝的  ワクチン接種は、裸のＤＮＡの注射を含むか（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＮＪ，Ｓａｎｃｈｅｚ  Ａ，Ｒｏｌｌｉｎ  ＰＥ，Ｙａｎｇ  ＺＹ，Ｎａｂｅｌ  ＧＪ（２０００）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：６０５−６０９）か、または遺伝子銃によって送達されてきたが（Ｄｏｗｌｉｎｇ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ＧＰ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１：１８２１−１８３７、Ｖａｎｄｅｒｚａｎｄｅｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｉｔｈｅｒ  ｔｈｅ  ＧＰ  ｏｒ  ＮＰ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｌｅｔｈａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４６：１３４−１４４、およびＲｉｅｍｅｎｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ（２００３）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｂ．  ａｎｔｈｒａｃｉｓ，Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ，Ｍａｒｂｕｒｇ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：４０７１−４０８０）、しかしながら、いずれの方法も完全な防御を達成するまでに少なくとも３つのワクチン接種を必要とした。本明細書における改善された防御は、単一のＤＮＡワクチン接種が、遺伝子銃投与後の防御された動物における力価に匹敵する規模のＧＰ特異性ＩｇＧ結合剤力価を生成したため、強固なＡｂの誘導に起因する可能性がある。ＤＮＡワクチン接種は、単一の投与後にそれぞれ３．８５および２．１８ｌｏｇ１０のＺＧＰおよびＭＧＰ特異性Ａｂ価を誘導し、対して３つの遺伝子銃ワクチン接種後は２．７および３．０であった。モルモットにおける代替的「単一投与」防御戦略との比較に関して、Ａｇ共役型ウイルス様粒子（ＶＬＰ）プラットフォームは、ＤＮＡワクチン接種後に観察されたものより僅かに高いＡｂ価を生成した（Ｓｗｅｎｓｏｎ  ＤＬ，Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ＫＬ，Ｎｅｇｌｅｙ  ＤＬ，Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎ  Ａ，Ａｍａｎ  ＭＪ，Ｂａｖａｒｉ  Ｓ（２００５）．Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｓ  ａ  ｐａｎ−ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｂｏｔｈ  Ｅｂｏｌａ  ａｎｄ  Ｍａｒｂｕｒｇ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２���：３０３３−３０４２）。更に、組み換えアデノウイルス（ｒＡｄ）アプローチは、単一のＤＮＡワクチン接種からのものより低いＺＧＰ特異性  ＮＡｂ  価を誘導した（５３逆数エンドポイント希釈力価、対して本明細書では８８）（Ｋｏｂｉｎｇｅｒ  ＧＰ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｚａｉｒｅ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３４６：３９４−４０１）。ｒＶＳＶによるワクチン接種（Ｊｏｎｅｓ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ（２００７）．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９６  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ４０４−４１２）は、現在のプラットフォームと同様のＺＧＰ特異性Ａｂ価を生成した。総じて、これらのデータは、ＤＮＡ  ワクチン接種が、非複製ウイルスプラットフォームに匹敵する結合Ａｂおよび中和Ａｂを誘導可能であったこと、またこれらのデータが、本明細書における強いモルモット生存データを説明するのに部分的に役立ち得ることを実証する。
【０１６３】
防御的ＤＮＡワクチン接種によるＮＡｂの生成は、トランス遺伝子発現成熟ＧＰ構造により利益を得た可能性がある。インビボ形質移入研究は、ワクチンコードされたＧＰが、高度に発現され、翻訳後に開裂され（図１Ｂ）、細胞表面に移動し、細胞表面分子の免疫検出を立体的に閉塞させた（図１Ｃ）ことを確証した。したがって、本明細書において形成されたワクチン免疫原が、さもなくば感染中にビリオン集合に機能性である、ヘテロ三量体スパイクに成熟したという可能性は非常に高かった。これは、後に配座依存性Ｎａｂの誘導に決定的となるウイルス学的に関連のある中和決定基の生成および表示に重要な可能性がある（Ｄｏｗｌｉｎｇ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ＧＰ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１：１８２１−１８３７；Ｓｈｅｄｌｏｃｋ  ＤＪ，Ｂａｉｌｅｙ  ＭＡ，Ｐｏｐｅｒｎａｃｋ  ＰＭ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＪＭ，Ｂｕｒｔｏｎ  ＤＲ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＮＪ（２０１０）．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｃａｎ  ｏｃｃｕｒ  ｂｙ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４０１：２２８−２３５）。したがって、この観点から、天然のアンカー構造の発現は、ＮＡｂを生成する能力において可溶性の誘導体に勝る可能性がある（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＮＪ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｉｍｍｕｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｎｇｌｅ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＧＰｓ．ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ３：ｅｌ７７、Ｘｕ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ４：３７−４２）。
【０１６４】
防御ワクチンによって駆動された際のＴ細胞応答をよりよく特徴付けするために、マウスにおける免疫原性および有効性研究を実施し、ＤＮＡワクチン接種によるｍＺＥＢＯＶに対する「単一投与」完全防御を決定した（図５Ａ〜５Ｄ）。現在、このモデルにおいて完全な防御を付与する最も有効なプラットフォームは、アジュバントを伴う（Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ＫＬ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｅｔｈａｌ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５：１１８４−１１９１、Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ＫＬ，Ｓｗｅｎｓｏｎ  ＤＬ，Ｏｌｉｎｇｅｒ  ＧＧ，Ｋａｌｉｎａ  ＷＶ，Ａｍａｎ  ＭＪ，Ｂａｖａｒｉ  Ｓ（２００７）．Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｅｔｈａｌ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９６  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ４３０−４３７）、または伴わない（Ｓｕｎ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｅｔｈａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｂｙ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３８３：１２−２１）ＶＬＰ、ｒＡｄワクチン接種（（Ｋｏｂｉｎｇｅｒ  ＧＰ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＳＵＰＲＡ、Ｃｈｏｉ  ＪＨ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌ  ｄｏｓｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｅｔｈａｌ  Ｅｂｏｌａ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇｓ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ９：１５６−１６７、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４：ｅ５３０８）、またはｒＲＡＢＶワクチン接種（Ｂｌａｎｅｙ  ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｏｒ  ｌｉｖｅ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒａｂｉｅｓ  ａｎｄ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８５：１０６０５−１０６１６）である。しかしながら、Ｔ細胞応答の特徴付けは、これらの研究では非常に限定されており、ＺＧＰＴ細胞エピトープを含有するようにこれまでに記載されている２つ（Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ＫＬ，（２００７）上記に同じ）または１つ（Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ＫＬ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）上記に同じ）のいずれかによる脾細胞刺激に限られていた（Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ＫＬ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）上記に同じ、Ｏｌｉｎｇｅｒ  ＧＧ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）上記に同じ、Ｋｏｂｉｎｇｅｒ  ＧＰ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）���記に同じ、Ｓｕｎ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｃｈｏｉ，ＪＨ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）。本明細書において、我々は、新規の改変されたＴ細胞分析によって大々的に解析した防御ワクチン接種による強固で広範なＣＴＬの誘導を報告する（図４Ａおよび表１〜６）。合計で、５２の新規のＴ細胞エピトープが確認され、ＧＰの高度に保存された領域内に主として生じる多数の免疫優勢エピトープが含まれた。確認された合計２２のＺＧＰエピトープのうち、僅か４つがこれまでに報告されている。更に、２０のＭＧＰのうち僅か１つ（Ｋａｌｉｎａ  ＷＶ，Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ＫＬ，Ｏｌｉｎｇｅｒ  ＧＧ，Ｂａｖａｒｉ  Ｓ（２００９）．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎ  ａ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｖｉｒｏｌ  Ｊ  ６：１３２）、および１６のＳＧＰエピトープのうち僅か１つが、これまでに記載されていた。したがって、これは、２つの異なるマウス遺伝的バックグラウンドにおける複数のフィロウイルスからのＧＰエピトープを記述する前臨床ＧＰエピトープの今日までの最も総合的な報告である。
【０１６５】
これらの分析から得られる別の新しい発見は、ワクチン誘導亜優勢Ｔ細胞応答の評価であり、これは１２％〜７４％の間の広範囲にわたる総Ｔ細胞応答の著しい割合を含んだ（図４Ｄ）ことが示されている。これは、亜優勢応答が防御に著しく寄与し得るため、特に重要であり得る。したがって、これは将来的に、防御に対する亜優勢および免疫優勢エピトープＴ細胞応答の特異的寄与を決定するために有益であると判明するかもしれない。留意すべきことに、これらの応答は、エピトープ特定用の従来のマトリックスアレイペプチドプールを用いていた場合に見落とされていた可能性がある。したがって、先行研究における限定されたエピトープ検出は、より低レベルのワクチン誘導免疫、より感受性の低い標準分析の使用、ならびに／または免疫優勢ＣＤ８＋エピトープの検出を好むペプチド配列および／もしくはアルゴリズムの使用に直接関連していた可能性がある。
【０１６６】
フィロウイルスに対する防御の免疫相関物には議論の余地が残るが、この高度に免疫原性のアプローチによって生成されたデータは、防御ワクチンによって駆動されるＴ細胞免疫を研究する独特の機会を提供する。本明細書におけるＤＮＡワクチン接種は、強いＺＧＰ特異性Ｔ細胞を誘導し、その大部分は、高レベルのＴ−ｂｅｔを発現するＴhｌ型多機能ＣＴＬによって特徴付けられ、またヒトにおけるＴ細胞  細胞毒性と相関があることも示された。主に液性免疫応答およびＣＤ４＋Ｔ細胞に偏る細胞性免疫を生成することが可能なこれまでの独立型ＤＮＡワクチンプラットフォームは、ＮＨＰおよび診療所において有力なＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することが近年実証されているインビボＥＰ送達から利益を得ている可能性があることは、明らかである。主に液性免疫応答およびＣＤ４＋Ｔ細胞に偏る細胞性免疫を生成することが可能なこれまでの独立型ＤＮＡワクチンプラットフォームは、ＮＨＰおよび診療所において有力なＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することが近年実証されているインビボＥＰ送達から利益を得ている可能性があることは、明らかである。したがって、本明細書におけるデータは、ＮＨＰ免疫原性および有効性研究における独立型の様式またはプライムブースト様式として、このアプローチと一致する。このアプローチは、フィロウイルス科の生物学的に脅威である状況および発生中の素早い応答のために、迅速および安価に改変ならびに／または生産することができる、魅力的なワクチン接種戦略を提供する。それに加えて、このモデルアプローチは、フィロウイルス性疾患に対する防御的免疫相関物を研究するための重要なツールを提供し、また将来的な戦略を導くために既存のプラットフォームに適用することが可能である。
【０１６７】
実施例２
３つのプラスミドを含む三価ワクチンが提供される。第１のプラスミドは、ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ、配列番号１に基づき、ザイールエボラウイルスコンセンサス免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変された、ザイールエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第２のプラスミドは、ＳＵＤＶ  ＣＯＮ、配列番号２に基づき、スーダンエボラウイルスコンセンサス免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変された、スーダンエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第３のプラスミドは、ＭＡＲＶ  ＡＮＧ、配列番号３に基づき、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変された、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ（ＭＡＲＶ）免疫原をコードする核酸配列を含む。
【０１６８】
実施例３
５プラスミドのワクチンが提供される。第１のプラスミドは、ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ、配列番号１である、ザイールエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第２のプラスミドは、ＳＵＤＶ  ＣＯＮ、配列番号２である、スーダンエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第３のプラスミドは、マールブルグマールブルグウイルスＲａｖｎ、Ｄｕｒｂａ（０９ＤＲＣ９９）、およびＵｇａｎｄａ（０２Ｕｇａ０７Ｙ）を用い、配列番号４、マールブルグマールブルグウイルス・ラビンクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ−ＲＡＶ  ＣＯＮ）をコードする核酸配列を含む。第４のプラスミドは、Ｏｚｏｌｉｎ、Ｕｇａｎｄａ（０１Ｕｇａ０７）、およびＤｕｒｂａ（０５および０７ＤＲＣ９９）を用い、配列番号５、マールブルグマールブルグウイルス・オゾリンクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ−ＯＺＯ  ＣＯＮ）をコードする核酸配列を含む。第５のプラスミドは、（Ｍｕｓｏｋｅ、Ｐｏｐｐ、およびＬｅｉｄｅｎ）を用い、配列番号６、マールブルグマールブルグウイルス・ムソーククラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ−ＭＵＳ  ＣＯＮ）をコードする核酸配列を含む。
【０１６９】
実施例４
５プラスミドのワクチンが提供される。第１のプラスミドは、ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ、配列番号１に基づき、ザイールエボラウイルスコンセンサス免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変された、ザイールエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第２のプラスミドは、ＳＵＤＶ  ＣＯＮ、配列番号２に基づき、スーダンエボラウイルスコンセンサス免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変された、スーダンエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第３のプラスミドは、マールブルグマールブルグウイルスＲａｖｎ、Ｄｕｒｂａ（０９ＤＲＣ９９）およびＵｇａｎｄａ（０２Ｕｇａ０７Ｙ）を用い、配列番号４、マールブルグマールブルグウイルス・ラビンクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ−ＲＡＶ  ＣＯＮ）に基づき、コンセンサスマールブルグマールブルグウイルス−Ｒａｖ免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変された、マールブルグマールブルグウイルスＲａｖコンセンサスをコードする核酸配列を含む。第４のプラスミドは、Ｏｚｏｌｉｎ、Ｕｇａｎｄａ（０１Ｕｇａ０７）、およびＤｕｒｂａ（０５および０７ＤＲＣ９９）を用い、配列番号５、マールブルグマールブルグウイルス・オゾリンクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ−ＯＺＯ  ＣＯＮ）に基づき、コンセンサスマールブルグマールブルグウイルス−Ｏｚｏ免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変された、マールブルグマールブルグウイルスＯｚｏコンセンサスをコードする核酸配列を含む。第５のプラスミドは、（Ｍｕｓｏｋｅ、Ｐｏｐｐ、およびＬｅｉｄｅｎ）を用い、配列番号６、マールブルグマールブルグウイルス・ムソーククラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ−ＭＵＳ  ＣＯＮ）に基づき、コンセンサスマールブルグマールブルグウイルス−Ｍｕｓ免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変された、マールブルグマールブルグウイルスＭｕｓコンセンサスをコードする核酸配列を含む。
【０１７０】
実施例５
６プラスミドのワクチンが提供される。第１のプラスミドは、ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ、配列番号１である、ザイールエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第２のプラスミドは、ＳＵＤＶ  ＣＯＮ、配列番号２である、スーダンエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第３のプラスミドは、マールブルグマールブルグウイルスＲａｖｎ、Ｄｕｒｂａ（０９ＤＲＣ９９）、およびＵｇａｎｄａ（０２Ｕｇａ０７Ｙ）を用い、配列番号４、マールブルグマールブルグウイルス・ラビンクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ−ＲＡＶ  ＣＯＮ）をコードする核酸配列を含む。第４のプラスミドは、Ｏｚｏｌｉｎ、Ｕｇａｎｄａ（０１Ｕｇａ０７）、およびＤｕｒｂａ（０５および０７ＤＲＣ９９）を用い、配列番号５、マールブルグマールブルグウイルス・オゾリンクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ−ＯＺＯ  ＣＯＮ）をコードする核酸配列を含む。第５のプラスミドは、（Ｍｕｓｏｋｅ、Ｐｏｐｐ、およびＬｅｉｄｅｎ）を用い、配列番号６、マールブルグマールブルグウイルス・ムソーククラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ−ＭＵＳ  ＣＯＮ）をコードする核酸配列を含む。第６のプラスミドは、配列番号３、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５単離物糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む。
【０１７１】
実施例６
５プラスミドのワクチンが提供される。第１のプラスミドは、ＺＥＢＯＶ  ＣＯＮ、配列番号１に基づき、ザイールエボラウイルスコンセンサス免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変された、ザイールエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第２のプラスミドは、ＳＵＤＶ  ＣＯＮ、配列番号２に基づき、スーダンエボラウイルスコンセンサス免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変された、スーダンエボラウイルスコンセンサス免疫原をコードする核酸配列を含む。第３のプラスミドは、マールブルグマールブルグウイルスＲａｖｎ、Ｄｕｒｂａ（０９ＤＲＣ９９）およびＵｇａｎｄａ（０２Ｕｇａ０７Ｙ）を用い、配列番号４、マールブルグマールブルグウイルス・ラビンクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ−ＲＡＶ  ＣＯＮ）に基づき、コンセンサスマールブルグマールブルグウイルス−Ｒａｖ免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変された、マールブルグマールブルグウイルスＲａｖコンセンサスをコードする核酸配列を含む。第４のプラスミドは、Ｏｚｏｌｉｎ、Ｕｇａｎｄａ（０１Ｕｇａ０７）、およびＤｕｒｂａ（０５および０７ＤＲＣ９９）を用い、配列番号５、マールブルグマールブルグウイルス・オゾリンクラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ−ＯＺＯ  ＣＯＮ）に基づき、コンセンサスマールブルグマールブルグウイルス−Ｏｚｏ免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変された、マールブルグマールブルグウイルスＯｚｏコンセンサスをコードする核酸配列を含む。第５のプラスミドは、（Ｍｕｓｏｋｅ、Ｐｏｐｐ、およびＬｅｉｄｅｎ）を用い、配列番号６、マールブルグマールブルグウイルス・ムソーククラスターコンセンサス（ＭＡＲＶ−ＭＵＳ  ＣＯＮ）に基づき、コンセンサスマールブルグマールブルグウイルス−Ｍｕｓ免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変された、マールブルグマールブルグウイルスＭｕｓコンセンサスをコードする核酸配列を含む。第６のプラスミドは、ＭＡＲＶ  ＡＮＧ、配列番号３に基づき、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ免疫原のＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを含むように改変された、マールブルグマールブルグウイルスアンゴラ２００５単離物糖タンパク質免疫原をコードする核酸配列を含む。
【０１７２】
【表１】
2019006787.tif 000003
【０１７３】
「エピトープ含有ペプチド」が、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴによって確認され（≧１０ＳＦＣ／１０6脾細胞かつ≧８０％応答率）、次にＦＡＣＳによって確証された（≧３〜５ｘｌ０4  ＣＤ３＋細胞が獲得された）。それぞれに関する応答が、ＦＡＣＳによって更に特徴付けされた（ＣＤ３＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞によるＣＤ４および／ＣＤ８の発現）。予想されたＣＤ８＋エピトープに下線が引かれ（ＩＥＤＢによる最良コンセンサス％ランク）、これまでに記載されたエピトープが参照される。免疫優勢エピトープが表示される（*）。
【０１７４】
【表２】
2019006787.tif 000004
【０１７５】
「エピトープ含有ペプチド」が、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴによって確認され（≧１０ＳＦＣ／１０6脾細胞かつ≧８０％応答率）、次にＦＡＣＳによって確証された（≧３〜５ｘｌ０4  ＣＤ３＋細胞が獲得された）。それぞれに関する応答が、ＦＡＣＳによって更に特徴付けされた（ＣＤ３＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞によるＣＤ４および／ＣＤ８の発現）。予想されたＣＤ８＋エピトープに下線が引かれ（ＩＥＤＢによる最良コンセンサス％ランク）、これまでに記載されたエピトープが参照される。免疫優勢エピトープが表示される（*）。
【０１７６】
【表３】
2019006787.tif 000005
【０１７７】
「エピトープ含有ペプチド」が、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴによって確認され（≧１０ＳＦＣ／１０6脾細胞かつ≧８０％応答率）、次にＦＡＣＳによって確証された（≧３〜５ｘｌ０4  ＣＤ３＋細胞が獲得された）。それぞれに関する応答が、ＦＡＣＳによって更に特徴付けされた（ＣＤ３＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞によるＣＤ４および／ＣＤ８の発現）。予想されたＣＤ８＋エピトープに下線が引かれ（ＩＥＤＢによる最良コンセンサス％ランク）、これまでに記載されたエピトープが参照される。免疫優勢エピトープが表示される（*）。
【０１７８】
【表４】
2019006787.tif 000006
【０１７９】
「エピトープ含有ペプチド」が、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴによって確認され（≧１０ＳＦＣ／１０6脾細胞かつ≧８０％応答率）、次にＦＡＣＳによって確証された（≧３〜５ｘｌ０4  ＣＤ３＋細胞が獲得された）。それぞれに関する応答が、ＦＡＣＳによって更に特徴付けされた（ＣＤ３＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞によるＣＤ４および／ＣＤ８の発現）。予想されたＣＤ８＋エピトープに下線が引かれ（ＩＥＤＢによる最良コンセンサス％ランク）、これまでに記載されたエピトープが参照される。免疫優勢エピトープが表示される（*）。
【０１８０】
【表５】
2019006787.tif 000007
【０１８１】
「エピトープ含有ペプチド」が、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴによって確認され（≧１０ＳＦＣ／１０6脾細胞かつ≧８０％応答率）、次にＦＡＣＳによって確証された（≧３〜５ｘｌ０4  ＣＤ３＋細胞が獲得された）。それぞれに関する応答が、ＦＡＣＳによって更に特徴付けされた（ＣＤ３＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞によるＣＤ４および／ＣＤ８の発現）。予想されたＣＤ８＋エピトープに下線が引かれ（ＩＥＤＢによる最良コンセンサス％ランク）、これまでに記載されたエピトープが参照される。免疫優勢エピトープが表示される（*）。
【０１８２】
【表６】
2019006787.tif 000008
【０１８３】
「エピトープ含有ペプチド」が、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴによって確認され（≧１０ＳＦＣ／１０6脾細胞かつ≧８０％応答率）、次にＦＡＣＳによって確証された（≧３〜５ｘｌ０4  ＣＤ３＋細胞が獲得された）。それぞれに関する応答が、ＦＡＣＳによって更に特徴付けされた（ＣＤ３＋／ＣＤ４４＋／ＩＦＮγ＋細胞によるＣＤ４および／ＣＤ８の発現）。予想されたＣＤ８＋エピトープに下線が引かれ（ＩＥＤＢによる最良コンセンサス％ランク）、これまでに記載されたエピトープが参照される。免疫優勢エピトープが表示される（*）。
【図１Ａ】
2019006787.tif 000009
【図１Ｂ】
2019006787.tif 000010
【図１Ｃ】
2019006787.tif 000011
【図２Ａ】
2019006787.tif 000012
【図２Ｂ】
2019006787.tif 000013
【図２Ｃ】
2019006787.tif 000014
【図２Ｄ】
2019006787.tif 000015
【図２Ｅ】
2019006787.tif 000016
【図２Ｆ】
2019006787.tif 000017
【図２Ｇ】
2019006787.tif 000018
【図２Ｈ】
2019006787.tif 000019
【図３Ａ】
2019006787.tif 000020
【図３Ｂ】
2019006787.tif 000021
【図３Ｃ】
2019006787.tif 000022
【図４Ａ】
2019006787.tif 000023
【図４Ｂ】
2019006787.tif 000024
【図４Ｃ】
2019006787.tif 000025
【図４Ｄ】
2019006787.tif 000026
【図５Ａ】
2019006787.tif 000027
【図５Ｂ】
2019006787.tif 000028
【図５Ｃ】
2019006787.tif 000029
【図５Ｄ】
2019006787.tif 000030
【図６】
2019006787.tif 000031
【図７Ａ】
2019006787.tif 000032
【図７Ｂ】
2019006787.tif 000033
【図８Ａ】
2019006787.tif 000034
【図８Ｂ】
2019006787.tif 000035
【配列表】
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