(57)【要約】      （修正有）【課題】ペプチドを用いた金属バナジウムやバナジウムイオンと結合する材料及びその利用法の提供。【解決手段】当該ペプチドのスクリーニング方法として、以下のアミノ酸配列；ＶＳＶＴＧＶＥＧＧの１個以上８個以下を他のアミノ酸残基に置換した１種又は２種以上のペプチドを準備する工程と、前記１種又は２種以上のペプチドのバナジウム種に対する結合性を評価する工程と、を実施する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列；
Ｖ Ｘ1 Ｘ2 Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｇ Ｇ（配列番号８）
Ｖ Ｘ1 Ｘ2 Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ａ Ｇ（配列番号９）
Ｖ Ｘ1 Ｘ2 Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｌ Ｇ（配列番号１０）
Ｖ Ｘ1 Ｘ2 Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｇ Ｐ（配列番号１１）
（ただし、
Ｘ1は、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）、ロイシン（Ｌ）及びトレオニン（Ｔ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ２は、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びグリシン（Ｇ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ3は、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、リシン（Ｋ）及びセリン（Ｓ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ4は、グリシン（Ｇ）及びアルギニン（Ｒ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ5は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかを表し、
Ｘ6は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかを表す。）
から選択されるアミノ酸配列からなる１種又は２種以上のペプチド鎖を有し、バナジウム種との結合性を有するペプチド。
【請求項２】
Ｘ5は、バリン（Ｖ）、グルタミン酸（Ｄ）及びイソロイシン（Ｉ）から選択されるいずれかを表し、
任意のアミノ酸から選択されるいずれかを表し、
Ｘ6は、グルタミン酸（Ｄ）、アスパラギン酸（Ｅ）、リシン（Ｋ）、アラニン（Ａ）及びグリシン（Ｇ）から選択されるいずれかを表す、
請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
以下のアミノ酸配列；
Ｖ Ｘ1 Ｖ Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｇ Ｇ（配列番号１２）
Ｖ Ｘ1 Ｖ Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ａ Ｇ（配列番号１３）
（ただし、
Ｘ1は、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）及びトレオニン（Ｔ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ3は、トレオニン（Ｔ）及びセリン（Ｓ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ4は、グリシン（Ｇ）及びアルギニン（Ｒ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ5は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかを表し、
Ｘ6は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかを表す。）
から選択されるアミノ酸配列からなる１種又は２種以上のペプチド鎖を有し、バナジウム種との結合性を有するペプチド。
【請求項４】
以下のアミノ酸配列；
Ｖ Ｐ Ｘ２ Ｘ3 Ｇ Ｘ5 Ｘ6 Ｌ Ｇ（配列番号１４）
Ｖ Ｐ Ｘ２ Ｘ3 Ｇ Ｘ5 Ｘ6 Ｇ Ｐ（配列番号１５）
（ただし、
Ｘ２は、ロイシン（Ｌ）及びグリシン（Ｇ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ3は、プロリン（Ｐ）及びリシン（Ｋ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ5は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかを表し、
Ｘ6は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかを表す。）
から選択されるアミノ酸配列からなる１種又は２種以上のペプチド鎖を有し、バナジウム種との結合性を有するペプチド。
【請求項５】
以下のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなる１種又は２種以上のペプチド鎖を有するペプチド。
ＶＳＶＴＧＶＥＧＧ（配列番号１）
ＶＳＶＴＧＶＤＧＧ（配列番号２）
ＶＳＶＳＧＩＧＧＧ（配列番号３）
ＶＬＶＴＲＤＫＧＧ（配列番号４）
ＶＴＶＴＧＶＤＡＧ（配列番号５）
ＶＰＧＰＧＧＤＬＧ（配列番号６）
ＶＰＬＫＧＩＡＧＰ（配列番号７）
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれかに記載のペプチドを含有する、バナジウム種結合剤。
【請求項７】
ペプチドのスクリーニング方法であって、
以下のアミノ酸配列；
ＶＳＶＴＧＶＥＧＧ（配列番号１）
の１個以上８個以下を他のアミノ酸残基に置換した１種又は２種以上のペプチドを準備する工程と、
前記１種又は２種以上のペプチドのバナジウム種に対する結合性を評価する工程と、
を備える、方法。
【請求項８】
ペプチドのスクリーニング方法であって、
以下のアミノ酸配列；
ＶＳＶＴＧＶＤＧＧ（配列番号２）、ＶＳＶＳＧＩＧＧＧ（配列番号３）、ＶＬＶＴＲＤＫＧＧ（配列番号４）、ＶＴＶＴＧＶＤＡＧ（配列番号５）、ＶＰＧＰＧＧＤＬＧ（配列番号６）、ＶＰＬＫＧＩＡＧＰ（配列番号７）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列の１個以上８個以下のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した１種又は２種以上のペプチドを準備する工程と、
前記１種又は２種以上のペプチドのバナジウム種に対する結合性を評価する工程と、
を備える、方法。
【請求項９】
ペプチドのスクリーニング方法であって、
以下の式（１）で表されるアミノ酸配列（配列番号１６）；
ＶＸ1Ｘ２Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8                      （１）
（ただし、
Ｘ1は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかであり、
Ｘ２は、バリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）及びロイシン（Ｌ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ3は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかであり、
Ｘ4は、グリシン（Ｇ）及びアルギニン（Ｒ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ5は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかであり、
Ｘ6は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかであり、
Ｘ7は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）及びロイシン（Ｌ）から選択されるいずれかであり、
Ｘ8は、グリシン（Ｇ）及びプロリン（Ｐ）選択されるいずれかを表す。）
を有する１種又は２種以上ペプチドを準備する工程と、
前記１種又は２種以上ペプチドとパナジウム種との結合性を評価する工程と、
を備える、方法。
【請求項１０】
Ｘ２は、バリンを表す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｘ4は、グリシンを表す、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｘ7は、グリシンを表す、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
Ｘ8は、グリシンを表す、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ペプチドのスクリーニング方法であって、
以下のいずれかのアミノ酸配列；
ＶＸ1ＶＸ3ＧＸ5Ｘ6ＧＸ8（配列番号１７）
ＶＸ1ＶＸ3ＧＸ5Ｘ6Ｘ7Ｇ（配列番号１８）、及び
ＶＸ1ＶＸ3ＧＸ5Ｘ6ＧＧ（配列番号１９）
（ただし、Ｘ1、Ｘ3、Ｘ5及びＸ6は、任意のアミノ酸を表し、Ｘ7は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）及びロイシン（Ｌ）から選択されるいずれかを表し、Ｘ8は、グリシン（Ｇ）又はプロリン（Ｐ）を表す。）を有する１種又は２種以上のペプチドを準備する工程と、
前記１種又は２種以上のペプチドのバナジウム種に対する結合性を評価する工程と、
を備える、方法。
【請求項１５】
Ｘ3は、トレオニン（Ｔ）及びセリン（Ｓ）から選択されるいずれかを表す、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｘ5は、バリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）及びアスパラギン酸（Ｄ）から選択されるいずれかを表す、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｘ6は、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びリシン（Ｋ）から選択されるいずれかを表す、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、バナジウム種結合材料及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
バナジウムは、耐熱性、抗張力向上のための鉄鋼用添加剤、排ガス除去触媒として従来用いられてきている。近年では、燃料電池の高性能化のための添加剤や人工骨格・インプラントへの活用も注目されている。また、生物の体内においても、酵素の活性化や、酸化還元反応に係わる重要金属として知られている。
【０００３】
こうしたバナジウムを分離・回収する技術としては、例えば、イオン交換樹脂を用いる方法が知られている（特許文献１、２）。また、特定のヒドロキシオキシム化合物を抽出剤として使用する方法が知られている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２５６３５４号公報
【特許文献２】特開２００２−３４６５５９号公報
【特許文献３】特開平７−２９２４２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
こうした従来の方法は、イオン交換樹脂を用いた樹脂とバナジウムイオンとの結合や、特定化合物による溶液抽出であり、分離操作が簡易なものではなかった。また、バナジウム化合物の標識やバナジウム含有ナノ材料の構築などが実現すれば、その有用性を生かした種々の新規材料も開発されると考えられる。しかしながら、現在までのところ、バナジウムイオンや金属バナジウムなどのバナジウム化合物と結合し、複合化し、あるいはバナジウムイオンをミネラリゼーションするペプチドは提供されていない。
【０００６】
本明細書は、金属バナジウムやバナジウムイオンと結合する材料及びその利用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ランダムペプチドライブラリを構築し、このペプチドライブラリを対象として、金属バナジウムを結合するペプチドをスクリーニングしたところ、ある種のペプチドが金属バナジウムと相互作用して結合し、複合体を形成するという知見を得た。また、この種のペプチドについてさらに検討したところ、バナジウムイオンをバナジウム含有鉱物にミネラリゼーションするという知見も得た。これらの知見に基づき本明細書は、以下の手段を提供する。
【０００８】
［１］  以下のアミノ酸配列；
Ｖ Ｘ1 Ｘ2 Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｇ Ｇ（配列番号８）
Ｖ Ｘ1 Ｘ2 Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ａ Ｇ（配列番号９）
Ｖ Ｘ1 Ｘ2 Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｌ Ｇ（配列番号１０）
Ｖ Ｘ1 Ｘ2 Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｇ Ｐ（配列番号１１）
（ただし、
Ｘ1は、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）、ロイシン（Ｌ）及びトレオニン（Ｔ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ２は、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びグリシン（Ｇ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ3は、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、リシン（Ｋ）及びセリン（Ｓ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ4は、グリシン（Ｇ）及びアルギニン（Ｒ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ5は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかを表し、
Ｘ6は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかを表す。）
から選択されるアミノ酸配列からなる１種又は２種以上のペプチド鎖を有し、バナジウム種との結合性を有するペプチド。
［２］  Ｘ5は、バリン（Ｖ）、グルタミン酸（Ｄ）及びイソロイシン（Ｉ）から選択されるいずれかを表し、
任意のアミノ酸から選択されるいずれかを表し、
Ｘ6は、グルタミン酸（Ｄ）、アスパラギン酸（Ｅ）、リシン（Ｋ）、アラニン（Ａ）及びグリシン（Ｇ）から選択されるいずれかを表す、
［１］に記載のペプチド。
［３］  以下のアミノ酸配列；
V X1 V X3 X4 X5 X6 G G（配列番号１２）
V X1 V X3 X4 X5 X6 A G（配列番号１３）
（ただし、
Ｘ1は、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）及びトレオニン（Ｔ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ3は、トレオニン（Ｔ）及びセリン（Ｓ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ4は、グリシン（Ｇ）及びアルギニン（Ｒ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ5は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかを表し、
Ｘ6は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかを表す。）
から選択されるアミノ酸配列からなる１種又は２種以上のペプチド鎖を有し、バナジウム種との結合性を有するペプチド。
［４］  以下のアミノ酸配列；
Ｖ Ｐ Ｘ２ Ｘ3 Ｇ Ｘ5 Ｘ6 Ｌ Ｇ（配列番号１４）
Ｖ Ｐ Ｘ２ Ｘ3 Ｇ Ｘ5 Ｘ6 Ｇ Ｐ（配列番号１５）
（ただし、
Ｘ２は、ロイシン（Ｌ）及びグリシン（Ｇ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ3は、プロリン（Ｐ）及びリシン（Ｋ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ5は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかを表し、
Ｘ6は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかを表す。）
から選択されるアミノ酸配列からなる１種又は２種以上のペプチド鎖を有し、バナジウム種との結合性を有するペプチド。
［５］  以下のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなる１種又は２種以上のペプチド鎖を有するペプチド。
ＶＳＶＴＧＶＥＧＧ（配列番号１）
ＶＳＶＴＧＶＤＧＧ（配列番号２）
ＶＳＶＳＧＩＧＧＧ（配列番号３）
ＶＬＶＴＲＤＫＧＧ（配列番号４）
ＶＴＶＴＧＶＤＡＧ（配列番号５）
ＶＰＧＰＧＧＤＬＧ（配列番号６）
ＶＰＬＫＧＩＡＧＰ（配列番号７）
［６］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のペプチドを含有する、バナジウム種結合剤。
［７］  ペプチドのスクリーニング方法であって、
以下のアミノ酸配列；
ＶＳＶＴＧＶＥＧＧ（配列番号１）
の１個以上８個以下を他のアミノ酸残基に置換した１種又は２種以上のペプチドを準備する工程と、
前記１種又は２種以上のペプチドのバナジウム種に対する結合性を評価する工程と、
を備える、方法。
［８］  ペプチドのスクリーニング方法であって、
以下のアミノ酸配列；
ＶＳＶＴＧＶＤＧＧ（配列番号２）、ＶＳＶＳＧＩＧＧＧ（配列番号３）、ＶＬＶＴＲＤＫＧＧ（配列番号４）、ＶＴＶＴＧＶＤＡＧ（配列番号５）、ＶＰＧＰＧＧＤＬＧ（配列番号６）、ＶＰＬＫＧＩＡＧＰ（配列番号７）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列の１個以上８個以下のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した１種又は２種以上のペプチドを準備する工程と、
前記１種又は２種以上のペプチドのバナジウム種に対する結合性を評価する工程と、
を備える、方法。
［９］  ペプチドのスクリーニング方法であって、
以下の式（１）で表されるアミノ酸配列（配列番号１６）；
ＶＸ1Ｘ２Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8                      （１）
（ただし、
Ｘ1は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかであり、
Ｘ２は、バリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）及びロイシン（Ｌ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ3は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかであり、
Ｘ4は、グリシン（Ｇ）及びアルギニン（Ｒ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ5は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかであり、
Ｘ6は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかであり、
Ｘ7は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）及びロイシン（Ｌ）から選択されるいずれかであり、
Ｘ8は、グリシン（Ｇ）及びプロリン（Ｐ）選択されるいずれかを表す。）
を有する１種又は２種以上ペプチドを準備する工程と、
前記１種又は２種以上ペプチドとパナジウム種との結合性を評価する工程と、
を備える、方法。
［１０］  Ｘ２は、バリンを表す、［９］に記載の方法。
［１１］  Ｘ4は、グリシンを表す、［９］又は［１０］に記載の方法。
［１２］  Ｘ7は、グリシンを表す、［９］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］  Ｘ8は、グリシンを表す、［９］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］  ペプチドのスクリーニング方法であって、
以下のいずれかのアミノ酸配列；
ＶＸ1ＶＸ3ＧＸ5Ｘ6ＧＸ8（配列番号１７）
ＶＸ1ＶＸ3ＧＸ5Ｘ6Ｘ7Ｇ（配列番号１８）、及び
ＶＸ1ＶＸ3ＧＸ5Ｘ6ＧＧ（配列番号１９）
（ただし、Ｘ1、Ｘ3、Ｘ5及びＸ6は、任意のアミノ酸を表し、Ｘ7は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）及びロイシン（Ｌ）から選択されるいずれかを表し、Ｘ8は、グリシン（Ｇ）又はプロリン（Ｐ）を表す。）を有する１種又は２種以上のペプチドを準備する工程と、
前記１種又は２種以上のペプチドのバナジウム種に対する結合性を評価する工程と、
を備える、方法。
［１５］  Ｘ3は、トレオニン（Ｔ）及びセリン（Ｓ）から選択されるいずれかを表す、［１４］に記載の方法。
［１６］  Ｘ5は、バリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）及びアスパラギン酸（Ｄ）から選択されるいずれかを表す、［１４］又は［１５］に記載の方法。
［１７］  Ｘ6は、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びリシン（Ｋ）から選択されるいずれかを表す、［１４］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ランダムペプチド提示型T7ファージライブラリから、バナジウム種に結合するペプチドを提示するT7ファージを単離するためのバイオパニングの概要を示す図である。
【図２】バナジウムに結合するペプチドの配列解析結果を示す図である。
【図３】特定のアミノ酸配列のペプチド（ＶＢＰ−１）を提示するファージクローン４Ｂについてのバナジウムに対する結合性評価結果を示す図である。
【図４】特定のアミノ酸配列のペプチド（ＶＢＰ−１）のミネラリゼーション機能の評価結果を示す図である。
【図５】ＶＢＰ−１に基づく二次ペプチドライブラリの遺伝子配列の設計を示す図である。
【図６】構築した二次ペプチドライブラリの配列解析結果を示す図である。
【図７Ａ】二次ペプチドライブラリにおいてバナジウム種と結合性を示したペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
【図７Ｂ】二次ペプチドライブラリにおいてバナジウム種と結合性を示したペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
【図８】二次ペプチドライブラリにおいてバナジウム種と結合性を示しアミノ酸配列の重複が確認されたアミノ酸配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書の開示は、バナジウム種に結合する材料を提供する。本開示の材料はペプチド（以下、単に、本ペプチドともいう。）である。本ペプチドは、金属バナジウムと相互作用し金属バナジウムを捕捉できる。また、本ペプチドは、バナジウムイオンと相互作用し、バナジウムイオンを鉱物化できる。したがって、本ペプチドは、金属バナジウムやバナジウムイオンと相互作用し、これらを金属バナジウム又はバナジウム鉱物として検出、分離、回収等できるほか、金属バナジウム又はバナジウム鉱物と他材料との複合化、金属バナジウム又はバナジウム鉱物の標識や修飾等に用いることができる。
【００１１】
本明細書において、バナジウム種とは、バナジウム（金属バナジウム）、種々の価数のバナジウムイオン（例えば、酸化数１、２、３、４及び５など。）のほか、バナジウムを含む化合物（以下、単に、バナジウム化合物ともいう。）を意味している。バナジウム化合物としては、例えば、バナジウムを含有する酸化物、水酸化物、硫化物、窒化物、酸窒化物、ハロゲン化物、種々の塩である化合物を包含している。
【００１２】
本明細書において、アミノ酸とは、Ｌ−アミノ酸を意味し、天然に存在する公知の２０種のアミノ酸を意味する。なお、システイン（Ｃ）は、ＳＨ基がシスチン結合である状態を包含しる。ペプチドは、アミノ酸がペプチド結合で連結された分子（ポリペプチド）を意味する。アミノ酸残基は、ペプチドに取り込まれて脱水された形態のアミノ酸を意味する。なお、便宜的に、アミノ酸配列中のアミノ酸残基をアミノ酸という場合もある。
【００１３】
本明細書において、結合とは、２つの物質又は化合物が両者にもたらされる相互作用による結びつきをいう。特に、相互作用の種類を限定するものではないが、本明細書における開示を拘束するものではないが、金属バナジウムやバナジウムイオンとペプチドとの結合においては、例えば、イオン結合、水素結合、ファン・デル・ワールス結合などの結合による識別によるものと推測される。
【００１４】
（ペプチド）
本ペプチドは、バナジウムと相互作用して金属バナジウムを捕捉することができる。また、バナジウムイオンと相互作用してバナジウムイオンをミネラリゼーションすることができる。
【００１５】
ペプチドがバナジウム種と相互作用するかないしは結合するか否かは、特定のあるいは一定条件下でランダムに構成したアミノ酸配列のペプチド鎖を含むペプチドを着色プラスチックビーズ等で標識するか又はペプチド呈示ファージとして取得し、金属バナジウム粉末と接触（ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％）等において、２５〜３０℃で一時間静置する。）して遠心分離（２０００ｇ、３分程度）して、上清を除去する洗浄操作を数回〜１０回程度行い、金属バナジウムに結合したペプチドを標識に応じた方法で検出するかあるいは呈示ファージ数をプラークアッセイ法により測定することなどにより、確認することができる。
【００１６】
また、ペプチドがバナジウム種と相互作用ないし結合する他の態様として、ペプチドがバナジウムイオンと相互作用してミネラリゼーションするか態様が挙げられる。ペプチドがバナジウムイオンと相互作用して結合するか否かは、特定のアミノ酸配列のペプチド鎖を含むペプチドを人工合成し、ペプチド濃度が１００μＭ（ＤＭＳＯ１０％）、バナジウムイオン濃度が１０ｍＭ（例えば、塩化バナジウム）の酢酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．０）を調製し、１５〜２５℃で室温下で撹拌しながら７２時間インキュベートする。その後、この混液を２００００〜２２０００ｇ程度（例えば、１５０００ｒｐｍ）で１０分程度遠心分離して、上清を除去して、適量の超純水を加えて撹拌洗浄した。この操作を合計２回繰り返し、ペレットを適量の超純水で分散してナノパーコレータにサンプリングし、ＳＥＭ／ＥＤＸ等で観察してバナジウム含有化合物を検出することにより、確認することができる。
【００１７】
本ペプチドは、例えば、以下のアミノ酸配列Ｉ〜ＩＶから選択される１種又は２種以上のペプチド鎖を備えることができる。本ペプチドは、以下のアミノ酸配列のいずれかのみからなるペプチドであってもよいし、本ペプチドは、以下のアミノ酸配列の２種以上を備えるものであってもよい。２種以上のアミノ酸配列を備える場合、これらを連続して備えていてもよいし、適当なペプチドリンカーなどのリンカーを介して備えていてもよい。
【００１８】
これらのアミノ酸配列Ｉ〜ＩＶは、後述するペプチド提示型Ｔファージランタムペプチドライブラリによる金属バナジウムとの結合性評価に基づいて取得された金属バナジウム結合ペプチドのアミノ酸配列に基づいて決定されたものである。これらのペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。
ＶＳＶＴＧＶＥＧＧ（配列番号１）
ＶＳＶＴＧＶＤＧＧ（配列番号２）
ＶＳＶＳＧＩＧＧＧ（配列番号３）
ＶＬＶＴＲＤＫＧＧ（配列番号４）
ＶＴＶＴＧＶＤＡＧ（配列番号５）
ＶＰＧＰＧＧＤＬＧ（配列番号６）
ＶＰＬＫＧＩＡＧＰ（配列番号７）
【００１９】
アミノ酸配列Ｉ：
Ｖ Ｘ1 Ｘ２（Ｖ/Ｌ/Ｇ） Ｘ3 Ｘ4（Ｇ/Ｒ） Ｘ5 Ｘ6 Ｘ7（Ｇ） Ｘ8（Ｇ）（配列番号８）
アミノ酸配列ＩＩ：
Ｖ Ｘ1 Ｘ２ （Ｖ/Ｌ/Ｇ） Ｘ3 Ｘ4（Ｇ/Ｒ） Ｘ5 Ｘ6 Ｘ7（Ａ） Ｘ8（Ｇ）（配列番号９）
アミノ酸配列ＩＩＩ
Ｖ Ｘ1 Ｘ２（Ｖ/Ｌ/Ｇ）Ｘ3 Ｘ4（Ｇ/Ｒ） Ｘ5 Ｘ6 Ｘ7（Ｌ） Ｘ8（Ｇ）（配列番号１０）
アミノ酸配列ＩＶ：
Ｖ Ｘ1 Ｘ２（Ｖ/Ｌ/Ｇ）Ｘ3 Ｘ4（Ｇ/Ｒ） Ｘ5 Ｘ6 Ｘ7（Ｇ） Ｘ8（Ｐ）（配列番号１１）
（ただし、Ｘ1は、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）、ロイシン（Ｌ）及びトレオニン（Ｔ）から選択されるいずれかを表し、Ｘ3は、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、リシン（Ｋ）及びセリン（Ｓ）から選択されるいずれかを表し、Ｘ5は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかを表し、Ｘ6は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかを表す。）
【００２０】
【表１】
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【００２１】
〔アミノ酸配列Ｉ及びアミノ酸配列ＩＩ〕
アミノ酸配列Ｉ及びＩＩは、主に配列番号１〜５で表されるアミノ酸配列に基づくことができ、アミノ酸配列Ｉは、主に配列番号１〜４で表されるアミノ酸配列、主にアミノ酸配列ＩＩは、配列番号５で表されるアミノ酸配列にそれぞれ基づくことができる。
【００２２】
アミノ酸配列Ｉ及びＩＩにおいては、Ｘ1は、例えば、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）、ロイシン（Ｌ）及びトレオニン（Ｔ）から選択されるいずれかを表すことができるが、例えば、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）及びトレオニン（Ｔ）から選択されるいずれかであり、また例えば、セリン（Ｓ）又はロイシン（Ｌ）であり、また例えば、セリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）である。セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）及びロイシン（Ｌ）は、いずれも、中性アミノ酸である。セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及びロイシンも、同様に中性アミノ酸であり、セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）は、水酸基を有するアミノ酸である。
【００２３】
Ｘ２は、例えば、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びグリシン（Ｇ）から選択されるいずれかを表すことができるが、例えば、バリン（Ｖ）又はグリシン（Ｇ）であり、また例えば、バリン（Ｖ）である。バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びグリシン（Ｇ）は、いずれも、中性アミノ酸であり、疎水性か電荷のないアミノ酸である。
【００２４】
Ｘ3は、例えば、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、リシン（Ｋ）及びセリン（Ｓ）から選択されるいずれかを表すことができるが、また例えば、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）及びプロリン（Ｐ）から選択されるいずれかであり、また例えば、セリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）であり、また例えば、トレオニン（Ｔ）である。トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）及びセリン（Ｓ）は、中性で電荷がないアミノ酸であり、トレオニン（Ｔ）及びセリン（Ｓ）は、極性アミノ酸であり、プロリン（Ｐ）は、非極性アミノ酸であるが、いずれも中性アミノ酸である。
【００２５】
Ｘ4は、例えば、グリシン（Ｇ）又はアルギニン（Ｒ）を表すが、例えば、グリシン（Ｇ）である。
【００２６】
Ｘ5は、例えば、任意のアミノ酸を表すことができるが、例えば、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグリシン（Ｇ）から選択されるいずれかを表すことができるが、また例えば、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）及びアスパラギン酸（Ｄ）から選択されるいずれかであり、また例えば、バリン（Ｖ）又はイソロイシン（Ｉ）である。
【００２７】
Ｘ6は、例えば、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）、リシン（Ｋ）及びアラニン（Ａ）から選択されるいずれかを表すが、例えば、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）及びリシン（Ｋ）から選択されるいずれかを表し、また例えば、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である。
【００２８】
アミノ酸配列Ｉ及びＩＩの「Ｖ Ｘ1〜Ｘ3」は、例えば、ＶＳＶＴ、ＶＳＶＳ、ＶＴＶＳ、ＶＴＶＴ、ＶＬＶＴ、ＶＴＶＬ、ＶＬＶＳ、ＶＳＶＬ、ＶＬＶＬなどとすることができ、また例えば、ＶＳＶＴ、ＶＳＶＳ、ＶＴＶＳ、ＶＴＶＴ、ＶＬＶＴ、ＶＴＶＬ、ＶＬＶＳなどとすることができ、また例えば、ＶＳＶＴ、ＶＳＶＳ、ＶＴＶＴ、ＶＬＶＴなどとすることができる。
【００２９】
また、アミノ酸配列Ｉ及びＩＩの「Ｘ5〜Ｘ6」は、例えば、ＶＥ、ＶＤ、ＶＧ、ＶＫ、ＶＡ；ＩＥ、ＩＤ、ＩＧ、ＩＫ、ＩＡ；ＤＧ、ＤＫ、ＧＥ、ＧＤ、ＧＫ、ＧＡなどとすることができる。
【００３０】
本ペプチドは、バリン（Ｖ）及びグリシン（Ｇ）を含むことができるが、例えば、アミノ酸配列Ｉ〜ＩＶの各配列（アミノ酸残基数は９個）において、例えば、Ｖ及びＧの合計が３個以上であり、また例えば、４個以上であり、また例えば、５個以上であり、また例えば、６個である。
【００３１】
以上のことから、本ペプチドとしては、以下の組み合わせによる本ペプチドが挙げられる。これらのペプチドは、いずれも共通する特徴を備えており、バナジウムやバナジウムイオンと相互作用することができる。
【００３２】
【化１】
2019178115.tif 000003
【００３３】
一例として、以下のアミノ酸配列の本ペプチドが挙げられる。
ＶＳＶＴ（Ｘ1〜Ｘ3） Ｇ／Ｒ（Ｘ4） ＶＥ／ＶＤ／ＩＧ／ＤＫ／ＧＤ（Ｘ5Ｘ6） ＧＧ／ＡＧ（Ｘ7Ｘ8）
ＶＳＶＳ Ｇ／Ｒ ＶＥ／ＶＤ／ＩＧ／ＤＫ／ＧＤ ＧＧ／ＡＧ
ＶＴＶＳ Ｇ／Ｒ ＶＥ／ＶＤ／ＩＧ／ＤＫ／ＧＤ ＧＧ／ＡＧ
ＶＴＶＴ Ｇ／Ｒ ＶＥ／ＶＤ／ＩＧ／ＤＫ／ＧＤ ＧＧ／ＡＧ
ＶＬＶＴ Ｇ／Ｒ ＶＥ／ＶＤ／ＩＧ／ＤＫ／ＧＤ ＧＧ／ＡＧ
ＶＴＶＬ Ｇ／Ｒ ＶＥ／ＶＤ／ＩＧ／ＤＫ／ＧＤ ＧＧ／ＡＧ
ＶＬＶＳ Ｇ／Ｒ ＶＥ／ＶＤ／ＩＧ／ＤＫ／ＧＤ ＧＧ／ＡＧ
ＶＳＶＬ Ｇ／Ｒ ＶＥ／ＶＤ／ＩＧ／ＤＫ／ＧＤ ＧＧ／ＡＧ
ＶＬＶＬ Ｇ／Ｒ ＶＥ／ＶＤ／ＩＧ／ＤＫ／ＧＤ ＧＧ／ＡＧ
【００３４】
〔アミノ酸配列ＩＩＩ及びアミノ酸配列ＩＶ〕
アミノ酸配列ＩＩＩは、主に配列番号６で表されるアミノ酸配列に基づくことができ、アミノ酸配列ＩＶは、主に配列番号７で表されるアミノ酸配列に基づくことができる。
【００３５】
アミノ酸配列ＩＩＩ及びＩＶにおいては、Ｘ1は、例えば、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）、ロイシン（Ｌ）及びトレオニン（Ｔ）から選択されるいずれかを表すが、例えば、プロリン（Ｐ）である。
【００３６】
Ｘ２は、例えば、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びグリシン（Ｇ）から選択されるいずれかを表すが、例えば、バリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）及びロイシン（Ｌ）から選択されるいずれかであり、また例えば、グリシン（Ｇ）又はロイシン（Ｌ）である。グリシン（Ｇ）及びロイシン（Ｌ）は、いずれも、中性アミノ酸であり、電荷のないアミノ酸である。ロイシン（Ｌ）及びバリン（Ｖ）は、疎水性中性アミノ酸である。
【００３７】
Ｘ3は、例えば、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、リシン（Ｋ）及びセリン（Ｓ）から選択されるいずれかを表すが、また例えば、プロリン（Ｐ）又はリシン（Ｋ）である。
【００３８】
Ｘ4は、例えば、グリシン（Ｇ）又はアルギニン（Ｒ）を表すが、例えば、グリシン（Ｇ）である。
【００３９】
Ｘ5は、例えば、任意のアミノ酸を表すが、例えば、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びグリシン（Ｇ）から選択されるいずれかであり、また例えば、バリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）及びイソロイシン（Ｉ）から選択されるいずれかであり、また例えば、グリシン（Ｇ）又はイソロイシン（Ｉ）である。
【００４０】
Ｘ6は、例えば、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）、リシン（Ｋ）及びアラニン（Ａ）から選択されるいずれかを表すが、アスパラギン酸（Ｄ）又はアラニン（Ａ）である。
【００４１】
アミノ酸配列ＩＩＩ及びＩＶの「Ｖ Ｘ1〜Ｘ3」は、例えば、ＶＰＧＰ、ＶＰＧＫ、ＶＰＬＫ、ＶＰＬＰ、ＶＰＶＰ、ＶＰＶＫなどとすることができ、また例えば、ＶＰＧＰ、ＶＰＬＫなどとすることができる。
【００４２】
また、アミノ酸配列ＩＩＩ及びＩＶの「Ｘ5〜Ｘ6」は、例えば、ＧＤ、ＧＡ、ＩＤ、ＩＡ、ＶＡ、ＶＤなどとすることができる。
【００４３】
以上のことから、例えば、アミノ酸配列ＩＩＩ及びＩＶによれば、以下の組み合わせによる本ペプチドが挙げられる。これらのペプチドは、いずれも共通する特徴を備えており、バナジウムやバナジウムイオンと相互作用することができる。
【００４４】
【化２】
2019178115.tif 000004
【００４５】
一例として、以下のアミノ酸配列の本ペプチドが挙げられる。
ＶＰＧＰ Ｇ ＧＤ/ＧＡ/ＩＤ/ＩＡ/ＶＡ/ＶＤ ＬＧ/ＧＰ
ＶＰＧＫ Ｇ ＧＤ/ＧＡ/ＩＤ/ＩＡ/ＶＡ/ＶＤ ＬＧ/ＧＰ
ＶＰＬＫ Ｇ ＧＤ/ＧＡ/ＩＤ/ＩＡ/ＶＡ/ＶＤ ＬＧ/ＧＰ
ＶＰＬＰ Ｇ ＧＤ/ＧＡ/ＩＤ/ＩＡ/ＶＡ/ＶＤ ＬＧ/ＧＰ
ＶＰＶＰ Ｇ ＧＤ/ＧＡ/ＩＤ/ＩＡ/ＶＡ/ＶＤ ＬＧ/ＧＰ
ＶＰＶＫ Ｇ ＧＤ/ＧＡ/ＩＤ/ＩＡ/ＶＡ/ＶＤ ＬＧ/ＧＰ
【００４６】
本ペプチドは、公知の化学的又は遺伝子工学的な方法を利用して製造することができる。本ペプチドは、例えば、公知の方法で修飾されていてもよい。例えば、適当なペプチドリンカーを用いて公知のシグナル要素が結合されていてもよい。シグナル要素としては、タンパク質やペプチドのラベルに用いられる公知の蛍光標識化合物、蛍光タンパク質、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素、発色剤、抗体又はそのフラグメント、金属微粒子、着色ビーズ等が挙げられる。ビオチン等が挙げられる。
【００４７】
本ペプチドは、直鎖状であってもよいし、例えば、Ｎ末端側及びＣ末端側にシステイン（Ｃ）を導入して、ジスルフィド結合を形成させることなどにより環状化されていてもよい。本ペプチドは、Ｔ７ファージに呈示させた状態であってもよいし、また、S. cerevisiaeなどの酵母の表層に提示させたものであってもよい。
【００４８】
また、本ペプチドは、例えば、適当な標識やプローブが備える種々のサイズのポリマー、セラミックス、ガラスなどの粒子材料の表面に結合させたものであってもよい。また、本ペプチドは、ウェルプレートや種々の基板の少なくとも一部の表面に保持させたものであってもよい。
【００４９】
（本ペプチドの利用）
本ペプチドは、バナジウムと相互作用して本ペプチド−バナジウム複合体を形成することができる。このため、本ペプチドは、バナジウムを検出、定量、分離、回収、濃縮するために用いることができる。すなわち、本ペプチドは、バナジウムのセンシング剤、定量剤、分離・回収剤、濃縮剤などとして用いることができる。
【００５０】
また、本ペプチドは、バナジウムと複合体を形成できるため、本ペプチドとバナジウムとの複合材料を形成するための複合化剤として用いることができる。また、同様の観点から、本ペプチドは、さらに他の種々の化合物等と複合化できるため、こうした他の化合物とバナジウムとを複合化するための仲介剤として用いることができる。また、同様の観点から、本ペプチドは、粒子、プレート、フィルムなどの種々の形態のバナジウム含有材料のコート剤（被覆剤）として用いることができる。また、同様の観点から、本ペプチドは、バナジウムの標識剤や修飾剤として用いることもできる。この場合、本ペプチドが標識されていると有利である。
【００５１】
本ペプチドは、バナジウムイオンと相互作用してバナジウム含有化合物を生成させ（ミネラリゼーション）、バナジウム含有化合物と複合体を形成することができる。このため、本ペプチドは、バナジウムイオンのミネラリゼーション剤として用いることができる。本ペプチドがバナジウムイオンのミネラリゼーション剤として用いることができることにより、本ペプチドは、バナジウムイオンのセンシング剤、定量剤、分離・回収剤、濃縮剤、バナジウムイオン（又は生成したバナジウム含有化合物）との複合化剤、バナジウムイオン（又は生成したバナジウム含有化合物）の標識剤や修飾剤として用いることもできる。標識剤や修飾剤として用いる場合には、本ペプチドが標識されていると有利である。
【００５２】
（ペプチドのアミノ酸配列の決定方法及びペプチドのスクリーニング方法）
本明細書に開示される、ペプチドのアミノ酸配列の決定方法（以下、単に、本決定方法ともいう。）は、アミノ酸配列：ＶＳＶＴＧＶＥＧＧ（配列番号１）の１個以上８個以下のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した１種又は２種以上のペプチドを準備する工程と、前記１種又は２種以上のペプチドのバナジウム又はバナジウムイオンとの相互作用を評価する工程と、を備えることができる。このアミノ酸配列は、バナジウム及びバナジウムイオンとの相互作用が高い。このため、本決定方法によれば、バナジウム又はバナジウムイオンと相互作用する能力が高いペプチドのアミノ酸配列を決定できる。また、本決定方法は、バナジウム又はバナジウムイオンと相互作用する能力が高いペプチドをスクリーニングすることになるため、かかるペプチドのスクリーニング方法としても実施できる。なお、置換するアミノ酸残基数は、例えば、２個以上、また例えば３個以上、また例えば４個以上、また例えば５個以上であってもよく、また例えば７個以下、また例えば６個以下、また例えば５個以下であってもよい。
【００５３】
本決定方法は、また、アミノ酸配列：ＶＳＶＴＧＶＤＧＧ（配列番号２）、ＶＳＶＳＧＩＧＧＧ（配列番号３）、ＶＬＶＴＲＤＫＧＧ（配列番号４）、ＶＴＶＴＧＶＤＡＧ（配列番号５）、ＶＰＧＰＧＧＤＬＧ（配列番号６）、ＶＰＬＫＧＩＡＧＰ（配列番号７）からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列の１個以上８個以下のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した１種又は２種以上のペプチドを準備する工程と、前記１種又は２種以上のペプチドのバナジウム種に対する結合性を評価する工程と、を備えることができる。これらのアミノ酸配列も、バナジウム及びバナジウムイオンとの相互作用が高い。このため、本決定方法によれば、バナジウム又はバナジウムイオンと相互作用する能力が高いペプチドのアミノ酸配列を決定できる。置換するアミノ酸残基数は、例えば、２個以上、また例えば３個以上、また例えば４個以上、また例えば５個以上であってもよく、また例えば７個以下、また例えば６個以下、また例えば５個以下であってもよい。
【００５４】
こうしたアミノ酸配列の１個以上８個以下のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した１種又は２種以上のペプチドを準備するには、特に限定するものではないが、例えば、において、規定されるアミノ酸配列の全アミノ酸残基をランダム化対象として、ランダム化率が、例えば、６０％以下、また例えば５０％以下、また例えば４０％以下程度となるようにテンプレートＤＮＡを設計し、当該テンプレートＤＮＡを利用して無細胞タンパク質合成法、ファージ等への提示等などの遺伝子工学的手法により取得することができる。
【００５５】
本決定方法及びスクリーニング方法は、また、以下の式（１）で表されるアミノ酸配列（配列番号１６）；
ＶＸ1Ｘ２Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8                      （１）
（ただし、
Ｘ1は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかであり、
Ｘ２は、バリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）及びロイシン（Ｌ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ3は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかであり、
Ｘ4は、グリシン（Ｇ）及びアルギニン（Ｒ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ5は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかであり、
Ｘ6は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかであり、
Ｘ7は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）及びロイシン（Ｌ）から選択されるいずれかであり、
Ｘ8は、グリシン（Ｇ）及びプロリン（Ｐ）選択されるいずれかを表す。）
を有する１種又は２種以上ペプチドを準備する工程と、前記１種又は２種以上ペプチドとバナジウム又はバナジウムイオンとの相互作用を評価する工程と、を備える方法としても実施できる。
【００５６】
式（１）で表されるアミノ酸配列における、Ｘ1〜Ｘ8のアミノ酸残基の種々の態様は、いずれも、バナジウムと結合することが確認されている９アミノ酸残基からなる特定アミノ酸配列を有する７種のペプチド（配列番号１〜７）のアミノ酸配列をアラインメントしたとき、Ｘ1〜Ｘ8において確認されているアミノ酸残基に基づくものである（以下の表を参照）。したがって、これらのアミノ酸残基を式（１）で表されるアミノ酸配列に適用することで、バナジウムと結合するペプチドを効率的にスクリーニングできると考えられる。
【００５７】
【表２】
2019178115.tif 000005
【００５８】
式（１）で表されるアミノ酸配列（配列番号１６）において、Ｘ1は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかであるが、例えば、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）及びプロリン（Ｐ）から選択されるいずれかであり、また例えば、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及びロイシンから選択されるいずれかであり、また例えば、セリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）である。また例えば、Ｘ1は、プロリン（Ｐ）である。
【００５９】
また、Ｘ２は、例えば、バリン（Ｖ）及びグリシン（Ｇ）から選択されるいずれかを表し、また例えば、バリン（Ｖ）である。
【００６０】
また、Ｘ3は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかであるが、例えば、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）及びリシン（Ｋ）から選択されるいずれかであり、また例えば、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）及びプロリン（Ｐ）から選択されるいずれかを表し、また例えば、トレオニン（Ｔ）又はセリン（Ｓ）である。
【００６１】
また、Ｘ4は、グリシン（Ｇ）又はアルギニン（Ｒ）とすることができるが、例えば、グリシン（Ｇ）である。
【００６２】
また、Ｘ5は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかであるが、例えば、バリン（Ｖ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）及びイソロイシン（Ｉ）から選択されるいずれかであり、また例えば、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）及びグリシン（Ｇ）から選択されるいずれかであり、また例えば、バリン（Ｖ）及びイソロイシン（Ｉ）から選択されるいずれかである。
【００６３】
また、Ｘ6は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかであるが、例えば、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、リシン（Ｋ）、グリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）から選択されるいずれかであり、また例えば、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、リシン（Ｋ）及びグリシン（Ｇ）から選択されるいずれかであり、また例えば、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びリシン（Ｋ）から選択されるいずれかであり、また例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）である。
【００６４】
Ｘ7は、例えば、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）及びロイシン（Ｌ）から選択されるいずれかであり、また例えば、グリシン（Ｇ）である。
【００６５】
Ｘ8は、グリシン（Ｇ）又はプロリン（Ｐ）であるが、例えば、グリシン（Ｇ）である。
【００６６】
かかる１種又は２種以上のペプチドを準備するには、特に限定するものではないが、所定のアミノ酸配列のペプチドを人工合成するか、あるいは所定のアミノ酸配列に対するＤＮＡテンプレートを合成して、無細胞タンパク質合成法やファージ提示法等など遺伝子工学的手法により合成することができる。
【００６７】
本決定方法及びスクリーニング方法は、また、以下のいずれかのアミノ酸配列；
ＶＸ1ＶＸ3ＧＸ5Ｘ6ＧＸ8（配列番号１７）
ＶＸ1ＶＸ3ＧＸ5Ｘ6Ｘ7Ｇ（配列番号１８）、及び
ＶＸ1ＶＸ3ＧＸ5Ｘ6ＧＧ（配列番号１９）
において、Ｘ1、Ｘ3、Ｘ5及びＸ6に任意のアミノ酸を適用し、Ｘ7に、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）及びロイシン（Ｌ）から選択されるいずれかであり、Ｘ8に、グリシン（Ｇ）又はプロリン（Ｐ）を適用して得られる１種又は２種以上のペプチドを準備する工程と、前記１種又は２種以上のペプチドのバナジウム種に対する結合性を評価する工程と、を備えることができる。かかる決定方法及びスクリーニング方法によれば、よりバナジウムに対する結合モチーフがより特定されているので、効率的にバナジウム種結合ペプチドのアミノ酸配列を決定し、当該ペプチドをスクリーニングすることができる。
【００６８】
かかる１種又は２種以上のペプチドを準備するには、特に限定するものではないが、例えば、Ｘで規定される任意のアミノ酸をランダム化対象として、ランダム化率が、例えば、６０％以下、また例えば５０％以下、また例えば４０％以下程度となるようにテンプレートＤＮＡを設計し、当該テンプレートＤＮＡを利用して無細胞タンパク質合成法、ファージ等への提示等などの遺伝子工学的手法により取得することができる。
【００６９】
なお、スクリーニング対象となる１種又は２種以上のペプチドのアミノ酸配列において、バナジウムと結合することがわかっているペプチドのアミノ酸配列に基づくと、例えば、９残基のうち、グリシン（Ｇ）及びバリン（Ｖ）を合計で３個以上６個以下備えることが有利な場合があることがわかっている。
【００７０】
また、スクリーニング対象となる１種又は２種以上のペプチドには、Ｎ末端にセリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）及びＣ末端にシステイン（Ｃ）及びセリン（Ｓ）を備えるようにしてもよい。この場合、ペプチドは直鎖状であってもよいし、システインを利用して環状化されていてもよい。
【実施例】
【００７１】
以下、本明細書の開示をより具体的に説明するために具体例としての実施例を記載する。以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００７２】
（ランダムペプチド提示型T7ファージライブラリの構築）
T7ファージディスプレイシステム（Novagen）を用いて、ランダムペプチドライブラリの構築を試みた。2種類のオリゴムクレオチドプライマーT7-Libup (ATG AAT ACC AGG ATC CGA ATT CAG GTG GAG GTT CG)（配列番号２０）、T7-Libdown (ACT ATC GTC GGC CGC AAG CTT TTA GCT)（配列番号２１）を用いてPCR反応を行い、テンプレートDNA (CGA ATT CAG GTG GAG GTT CGT GT（ここまで配列番号２２）(NNK) 9-12 TGT AGC TAA AAG CTT GCG GCC GA)（ＴＧＴ以降、配列番号２３）を増幅した。ただし、テンプレートDNAにおける(NNK) 9-12は、以下のとおりのヌクレオチド組成で合成した。なお、Nは、A 25%、T 25%、G 25%、C 25%の混合塩基（A/T/G/Cの等量混合塩基であり、Kは、 A 0%、T 50%、G 50%、C 0%の混合塩基である。
【００７３】
増幅したDNA断片は、一般的なプロトコールに従ってフェーノール処理、ブタノール濃縮を行った後、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）を用いて精製した。精製したDNAは、制限酵素Hind III、EcoR I（タカラバイオ）で処理した後、T7 select 10-3 vector arm（Novagen）にライゲーションし、T7ファージゲノムを構築した。
【００７４】
構築したファージゲノムを、Ｔ７ ｓｅｌｅｃｔ ｐａｃｋａｇｉｎｇ溶液（Ｎｏｖａｇｅｎ）と混合することで、ランダムペプチド遺伝子導入型のＴ７ゲノムＤＮＡを有するＴ７ファージを構築した。この際、一部を用いて、構築されたファージ集団の数を計測したところ、１．０×１０6 〜４．０×１０7の配列多様性を有するファージライブラリが構築されていることを確認した。
【００７５】
構築したファージ集団は、ＯＤ６００ｎｍ＝０．６〜１．０まで培養した大腸菌E. coli ＢＬＴ ５４０３ ｓｔｒａｉｎに感染させ増幅後、８％ポリエチレングリコール、０．２２μｍフィルター処理を行うことで濃縮・精製した。精製後にファージ数を計測した結果、各ライブラリは約１．０×１０12 ｐｆｕ／ｍｌのファージを有しており、ペプチドファージ１種あたり１００，０００〜１，０００，０００倍に増幅していることを確認した。
【実施例２】
【００７６】
（ランダムペプチド提示型T7ファージライブラリを用いたバナジウム種に対するバイオパンニング）
実施例１にて作製したランダムペプチド提示型Ｔ７ファージライブラリより、バナジウム種に結合するペプチドを提示するＴ７ファージの単離を試みた。一連の流れを図１に示す。特願２００６−５２９１４８に従って合成したバナジウムをメタノール：アセトン＝１：１溶媒で洗浄し、次いでイソプロパノールにて洗浄後、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０〜３００ｍＭ ＮａＣｌ，Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％）に分散させた。
【００７７】
バナジウム１〜０．５ｍｇを分散させた溶液とＴ７ファージライブラリを混合し、１時間室温にて反応後、遠心（６，０００ｒｐｍ，３ｍｉｎ）により粒子を沈殿させ上清を除去することで、非結合ファージを除去した。
【００７８】
上清除去後、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ，Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％）溶液を加えてバナジウムを分散させ、再度遠心操作し、本材料に非特異的に結合したファージの除去を試みた。本操作（洗浄操作）を３〜１５回繰り返すことで、バナジウムに非特異的に結合するペプチドファージの除去を行った。
【００７９】
非結合ファージ、非特異的に結合しているファージを洗浄により除去した後、ＯＤ600 nm＝０．６〜１．０まで培養した大腸菌E. coli BLT 5403溶液１０ｍｌと混合し、大腸菌が完全に溶菌するまで３７℃で培養を行った。
【００８０】
大腸菌が完全に溶菌した後、培養溶液に対して１／１０量の５Ｍ ＮａＣｌを加え遠心（３，５００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ）し、大腸菌の細胞壁などの不溶性画分を沈殿させ、上清を回収した。
【００８１】
回収した上清に対して１／６量の５０％ポリエチレングリコール６，０００溶液を加え、攪拌後３，５００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心しＴ７ファージを沈殿させた。沈殿したＴ７ファージ集団はＨＥＰＥＳ緩衝液で溶解後、０．２２μｍフィルター処理を行い、使用まで４℃で保存した。
【実施例３】
【００８２】
（バナジウム種ファージの濃縮確認）
実施例２にて得られた1ラウンドから5ラウンド目までのファージプールについて、バナジウム種に対する結合性の評価を行った。
【００８３】
洗浄しＨＥＰＥＳ緩衝液に分散させたバナジウム５００μｇと各ファージプールをそれぞれ混合し１時間室温下にて反応後、遠心分離（６，０００ｒｐｍ，３ｍｉｎ）し上清を除去した。次いで、ＨＥＰＥＳ緩衝液にて１０回洗浄操作を行った。洗浄後、バナジウムに結合したファージ数をプラークアッセイ法により測定した。測定結果から、パンニングのラウンドが進むにつれ、バナジウムに対する結合性の上昇が確認された。ファージプール中にバナジウム結合ファージが濃縮されていると考えられた。
【実施例４】
【００８４】
（単クローンファージの提示ペプチド配列解析）
5ラウンドのパンニングを行った後のファージプールについて単クローン化を行い、ランダムに選択した96種のファージについて提示ペプチド配列解析を行った結果、図２に示すように、2種について配列の重複が確認された。
【実施例５】
【００８５】
（バナジウム種に結合するペプチドを提示する単クローンファージのスクリーニング）
実施例4にて同定されたペプチドファージの内、特徴的な配列を提示するクローンファージ（３Ａ、４Ｂ、３Ｄ、１２Ｅ）について、バナジウム種に対する結合性の評価を行った。洗浄しＨＥＰＥＳ緩衝液に分散させたバナジウム５００μｇと各クローンファージをそれぞれ混合し１時間室温下にて反応後、遠心分離（６，０００ｒｐｍ，３ｍｉｎ）し上清を除去した。次いで、ＨＥＰＥＳ緩衝液にて１０回洗浄操作を行った。洗浄後、バナジウムに結合したファージ数をプラークアッセイ法により測定した。バナジウム種に対する結合評価の結果を、図３に示す。
【００８６】
図３に示すように、配列の重複が確認されたクローンファージ３Ａ、４Ｂについて、野生型と比較して１００倍以上のファージ結合数が確認された。
【実施例６】
【００８７】
（ペプチドの合成及びミネラリゼーション現象の評価）
バナジウム種への結合が確認されたクローンファージ３Ａ及び４Ｂが提示するアミノ酸配列を有するペプチド（VBP-1: CVSVTGVEGGC）を、Fmoc固相合成法により合成した。なお合成ペプチドのN末端には、g10配列由来のGGGSを介してBiotin化を行った。C末端にはSを付加した。
【００８８】
合成したＶＢＰ−１ペプチドを用いて、ミネラリゼーション機能を評価した。ペプチド濃度が１００μＭ（ＤＭＳＯ１０％）、バナジウムイオン濃度が１０ｍＭ（例えば、塩化バナジウム）の酢酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５．０）を調製し、１５〜２５℃で室温下で撹拌しながら７２時間インキュベートした。その後、この液を、約２２０００ｇ程度（１５０００ｒｐｍ）で１０分程度遠心分離して、上清を除去して、適量の超純水を加えて撹拌洗浄した。この遠心と撹拌線上を合計２回繰り返し、黒色沈殿を適量の超純水で分散し、最終的に生成した沈殿物をナノパーコレータにて所定の処理を行った後、乾燥させ、ＳＥＭ／ＥＤＸにて解析した。解析結果を図４に示す。
【００８９】
図４に示すように、沈殿物は、バナジウムを多量に含有する物質であることがわかった。以上のことから、VBP-1は、塩化バナジウム溶液中からバナジウム含有鉱物を生成することを確認した。
【実施例７】
【００９０】
（VBP-1を基にした2次ライブラリの構築）
VBP-1配列を基にした2次ライブラリを構築し、再度バナジウムに対してスクリーニングを行うことで、VBP-1の改良を試みた。
【００９１】
図５に示すように、VBP-1を構成するアミノ酸が39-54%の確立で出現するように、2次ライブラリの遺伝子配列を設計した。すなわち、2次ライブラリ遺伝子の両末端にプライマーアニーリング部位を付加してテンプレート配列（5’…GGATCCGAATTCAGGTGGAGGTTCGTGT（ここまで配列番号２４）WZNZYNWZNXYNWWNWZNWXXWWNWWNTGCAGCTAAAAGCTTGCGGCCG…3’’ＴＧＣ以降配列番号２５））とし、実施例１と同様の手法で、ペプチドライブラリを構築した。なお、N = A 25%、T 25%、G 25%、C 25%の混合塩基（A/T/G/Cの等量混合塩基）、Ｗ＝Ｇが７０％、その他を１０％ずつ含む混合塩基、Ｙは、Ｃが７０％、その他を１０％ずつ含む混合塩基、Ｚは、Ｔが７０％、その他を１０％ずつ含む混合塩基である。
【００９２】
構築した2次ライブラリの配列解析結果を図６に示す。図６に示すように、各部位におけるアミノ酸の出現確立は、おおむね理論値通りであることを確認した。樹脂より切り出し脱保護したペプチドは、分子内ジスルフィド結合を形成させた後、逆相HPLCにて精製し、凍結乾燥した。
【実施例８】
【００９３】
（VBP-1の改良）
実施例２と同様の手法でバナジウムに対するスクリーニングを行った。この際、Ｔｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０〜３００  ｍＭ ＮａＣｌ，Ｔｗｅｅｎ０．１％）にバナジウム５００μｇを分散させ、２次ライブラリと反応させた。洗浄にはＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ，Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％）を用い、３〜２４回処理した。
【００９４】
パンニングの４、５ラウンドのファージプールを単クローン化し、ランダムに選択した91クローンについて、提示ペプチド配列を解析した。結果を図７Ａ、同７Ｂに示し、配列の重複が確認された５種の配列を図８に示す。
【００９５】
図８に示すように、重複が確認された５種の配列において、提示するアミノ酸残基の番号として１番目のバリン（Ｖ）、３番目のバリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）及びロイシン（Ｌ）、５番目のグリシン（Ｇ）及びアルギニン（Ｒ）、８番目のグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）及びロイシン（Ｌ）並びに９番目のグリシン（Ｇ）又はプロリン（Ｐ）は、保存性が高く、バナジウム種への結合に重要な残基と考えられ、結合モチーフとして、以下の式（１）で表されるアミノ酸配列（配列番号１６）；
ＶＸ1Ｘ２Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8                      （１）
（ただし、
Ｘ1は、任意のアミノ酸、好ましくは、プロリン（Ｐ）、ロイシン（Ｌ）、セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ２は、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びグリシン（Ｇ）から選択されるいずれかを表し、好ましくはバリン（Ｖ）を表し、
Ｘ3は、任意のアミノ酸、好ましくは、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）及びリシン（Ｋ）から選択されるいずれかを表し、
Ｘ4は、グリシン（Ｇ）及びアルギニン（Ｒ）から選択されるいずれかを表し、好ましくはグリシン（Ｇ）を表し、
Ｘ5は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかを表し、
Ｘ6は、任意のアミノ酸から選択されるいずれかを表し、
Ｘ7は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）及びロイシン（Ｌ）から選択されるいずれかを表し、好ましくは、グリシン（Ｇ）を表し,
Ｘ8は、グリシン（Ｇ）及びプロリン（Ｐ）から選択されるいずれかを表し、好ましくはグリシン（Ｇ）を表す。）
が得られた。なかでも、結合モチーフとしては、ＶＸ1ＶＸ3ＧＸ5Ｘ6ＧＧが高く推定された。
【００９６】
こうして得られた結合モチーフのＸ1〜Ｘ8に関して、2次ライブラリの作製と同様の手法で、X部位をランダム化したライブラリを作製し、再度スクリーニングを行うことで、バナジウム種への親和性がより高いペプチドの単離が可能となることが容易に推測される。
【配列表フリーテキスト】
【００９７】
配列番号１〜１９：バナジウム結合ペプチド
配列番号２０、２１：プライマー
配列番号２２〜２５：ＰＣＲ用テンプレートＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【配列表】
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