(57)【要約】【課題】収差が良好な状態を、画像を撮影しながら決定する顕微鏡、方法、及びプログラムを提供する。【解決手段】  共焦点顕微鏡１００は、補正環２１ａを有する対物レンズ２１と、試料からの光を検出する検出部２５と、補正環制御部である顕微鏡制御部１０と、を有し、顕微鏡制御部１０は、補正環２１ａの複数の回転位置それぞれにおいて取得された複数の画像に基づいて評価値を算出し、算出した複数の評価値に基づいて補正環２１ａの回転位置を決定する。【選択図】図３
2019215437.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
補正環を有する対物レンズと、
試料からの光を検出する検出部と、
補正環制御部と、
を有し、
前記補正環制御部は、前記補正環の複数の回転位置それぞれにおいて取得された複数の画像に基づいて評価値を算出し、算出した複数の評価値に基づいて補正環の回転位置を決定する
顕微鏡。
【請求項２】
前記補正環制御部は、評価値の最大値に基づいて補正環の回転位置を決定する
請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記補正環制御部は、前記評価値が最大となる前記補正環の回転位置に基づいて補正環の回転位置を決定する
請求項１または２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記補正環制御部は、前記補正環の複数の回転位置それぞれにおいて複数の画像に基づいて評価値を算出することにより、補正環の回転位置を決定する
請求項１〜３のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記補正環制御部は、補間された評価値が最大となる前記補正環の回転位置に基づいて補正環の回転位置を決定する
請求項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記補正環制御部は、決定した補正環の回転位置に基づいて、補正環の回転位置を調整する
請求項１〜５のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項７】
前記評価値は、前記複数の画像間の相関値、又は、画像処理を施した前記複数の画像間の相関値である
請求項１〜６のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項８】
共焦点顕微鏡又は多光子励起蛍光顕微鏡である
請求項１〜７のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項９】
試料に照明光を照射する照明光学系と、
前記試料からの観察光を検出する検出部と、
前記照明光及び前記観察光の少なくとも一方の収差を補正する収差補正光学系と、
収差補正光学系制御部と、
を有し、
前記収差補正光学系制御部は、
前記収差補正光学系の複数の設定状態それぞれにおいて取得された複数の画像に基づいて評価値を算出し、算出した複数の評価値に基づいて収差補正光学系の設定を決定する
顕微鏡。
【請求項１０】
前記収差補正光学系は、前記照明光を放射する光源と前記試料との間に設けられる
請求項９に記載の顕微鏡。
【請求項１１】
前記収差補正光学系は、前記検出部と前記試料との間に設けられる
請求項９に記載の顕微鏡。
【請求項１２】
前記収差補正光学系は、前記対物レンズに含まれる収差補正レンズであり、
前記設定状態は、前記収差補正レンズの光軸方向の位置である
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１３】
前記収差補正光学系は、デフォーマブルミラーであり、前記設定状態は、ミラーの形状である
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１４】
前記収差補正光学系は、液晶素子であり、前記設定状態は前記液晶の分布である
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１５】
前記収差補正光学系は、位相変調素子であり、前記設定状態は位相変調量である
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１６】
前記評価値は、前記複数の画像間の相関値、又は、画像処理を施した前記複数の画像間の相関値である
請求項９〜１５のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１７】
共焦点顕微鏡又は多光子励起蛍光顕微鏡である
請求項９〜１６のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１８】
補正環を有する対物レンズと、
試料からの光を検出する検出部と、
補正環制御部と、
を有し、
前記補正環制御部は、
前記補正環の第１〜ｎ（ｎは２以上の整数）の回転位置それぞれにおいて評価値を算出し、前記第ｎの回転位置で前記評価値を算出した後に、前記第１の回転位置で２回目の評価値を算出して、前記第１の回転位置で取得された１回目の評価値と２回目の評価値とに基づいて前記補正環の第２〜ｎの回転位置における評価値を補正する
顕微鏡。
【請求項１９】
前記補正環制御部は、
前記第１の回転位置で２回目の評価値を算出した後、前記補正環の第ｎ＋１〜ｍ（ｍはｎ＋１以上の整数）の回転位置それぞれにおいて評価値を算出した後に、前記第１の回転位置で３回目の前記評価値を算出し、
前記第１の回転位置で取得された１回目の評価値と２回目の評価値とに基づいて前記補正環の第２〜ｎの回転位置の評価値を補正し、
前記第１の回転位置で取得された２回目の評価値と３回目の評価値とに基づいて前記補正環の第ｎ＋１〜ｍの回転位置における評価値を補正する
請求項１８に記載の顕微鏡。
【請求項２０】
試料に照明光を照射する照明光学系と、
前記試料からの観察光を検出する検出部と、
前記照明光及び前記観察光の少なくとも一方の収差を補正する収差補正光学系と、
収差補正光学系制御部と、
を有し、
前記収差補正光学系制御部は、
前記収差補正光学系の第１〜ｎ（ｎは２以上の整数）の設定状態それぞれにおいて評価値を算出し、前記第ｎの設定状態で前記評価値を算出した後に、前記第１の設定状態で２回目の評価値を算出して、前記第１の設定状態で取得された１回目の評価値と２回目の評価値とに基づいて前記収差補正光学系の第２〜ｎの設定状態における評価値を補正する
顕微鏡。
【請求項２１】
前記補正環制御部は、
前記第１の設定状態で２回目の評価値を算出した後、前記収差補正光学系の第ｎ＋１〜ｍ（ｍはｎ＋１以上の整数）の設定状態それぞれにおいて評価値を算出した後に、前記第１の設定状態で３回目の前記評価値を算出し、
前記第１の設定状態で取得された１回目の評価値と２回目の評価値とに基づいて前記収差補正光学系の第２〜ｎの設定状態の評価値を補正し、
前記第１の設定状態で取得された２回目の評価値と３回目の評価値とに基づいて前記収差補正光学系の第ｎ＋１〜ｍの回転位置における評価値を補正する
請求項２０に記載の顕微鏡。
【請求項２２】
補正環を有する対物レンズと、
試料からの光を検出する検出部と、
補正環制御部と、
を有する顕微鏡の前記補正環制御部で実行される方法であって、
前記補正環の複数の回転位置それぞれにおいて取得された複数の画像に基づいて評価値を算出するステップと、
算出した複数の評価値に基づいて補正環の回転位置を決定するステップと、
を有する方法。
【請求項２３】
試料に照明光を照射する照明光学系と、
前記試料からの観察光を検出する検出部と、
前記照明光及び前記観察光の少なくとも一方の収差を補正する収差補正光学系と、
収差補正光学系制御部と、
を有する顕微鏡の前記収差補正光学系制御部で実行される方法であって、
前記収差補正光学系の複数の設定状態それぞれにおいて取得された複数の画像に基づいて評価値を算出するステップと、
算出した複数の評価値に基づいて収差補正光学系の設定を決定するステップと、
を有する方法。
【請求項２４】
補正環を有する対物レンズと、
試料からの光を検出する検出部と、
補正環制御部と、
を有する顕微鏡の前記補正環制御部で実行される方法であって、
前記補正環の第１〜ｎ（ｎは２以上の整数）の回転位置それぞれにおいて評価値を算出するステップと、
前記第ｎの回転位置で前記評価値を算出した後に、前記第１の回転位置で２回目の評価値を算出するステップと、
前記第１の回転位置で取得された１回目の評価値と２回目の評価値とに基づいて前記補正環の第２〜ｎの回転位置における評価値を補正するステップと、
を有する方法。
【請求項２５】
試料に照明光を照射する照明光学系と、
前記試料からの観察光を検出する検出部と、
前記照明光及び前記観察光の少なくとも一方の収差を補正する収差補正光学系と、
収差補正光学系制御部と、
を有する顕微鏡の前記補正光学系制御部で実行される方法であって、
前記収差補正光学系の第１〜ｎ（ｎは２以上の整数）の設定状態それぞれにおいて評価値を算出するステップと、
前記第ｎの設定状態で前記評価値を算出した後に、前記第１の設定状態で２回目の評価値を算出するステップと、
前記第１の設定状態で取得された１回目の評価値と２回目の評価値とに基づいて前記収差補正光学系の第２〜ｎの設定状態における評価値を補正するステップと、
を有する方法。
【請求項２６】
補正環を有する対物レンズと、
試料からの光を検出する検出部と、
補正環制御部と、
を有する顕微鏡の前記補正環制御部で実行されるプログラムであって、
前記補正環制御部を、
前記補正環の複数の回転位置それぞれにおいて取得された複数の画像に基づいて評価値を算出する手段、及び
算出した複数の評価値に基づいて補正環の回転位置を決定する手段
として機能させるプログラム。
【請求項２７】
試料に照明光を照射する照明光学系と、
前記試料からの観察光を検出する検出部と、
前記照明光及び前記観察光の少なくとも一方の収差を補正する収差補正光学系と、
収差補正光学系制御部と、
を有する顕微鏡の前記収差補正光学系制御部で実行されるプログラムであって、
前記収差補正光学系制御部を、
前記収差補正光学系の複数の設定状態それぞれにおいて取得された複数の画像に基づいて評価値を算出する手段、及び
算出した複数の評価値に基づいて収差補正光学系の設定を決定する手段
として機能させるプログラム。
【請求項２８】
補正環を有する対物レンズと、
試料からの光を検出する検出部と、
補正環制御部と、
を有する顕微鏡の前記補正環制御部で実行されるプログラムであって、
前記補正環制御部を、
前記補正環の第１〜ｎ（ｎは２以上の整数）の回転位置それぞれにおいて評価値を算出する手段、
前記第ｎの回転位置で前記評価値を算出した後に、前記第１の回転位置で２回目の評価値を算出する手段、及び
前記第１の回転位置で取得された１回目の評価値と２回目の評価値とに基づいて前記補正環の第２〜ｎの回転位置における評価値を補正する手段
として機能させるプログラム。
【請求項２９】
試料に照明光を照射する照明光学系と、
前記試料からの観察光を検出する検出部と、
前記照明光及び前記観察光の少なくとも一方の収差を補正する収差補正光学系と、
収差補正光学系制御部と、
を有する顕微鏡の前記補正光学系制御部で実行されるプログラムであって、
前記補正光学系制御部を、
前記収差補正光学系の第１〜ｎ（ｎは２以上の整数）の設定状態それぞれにおいて評価値を算出する手段、
前記第ｎの設定状態で前記評価値を算出した後に、前記第１の設定状態で２回目の評価値を算出する手段、及び
前記第１の設定状態で取得された１回目の評価値と２回目の評価値とに基づいて前記収差補正光学系の第２〜ｎの設定状態における評価値を補正する手段
として機能させるプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡、方法、及びプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、波面変換素子を変調するための制御データに基づいて変調する技術が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−２９２５３８号公報
【発明の概要】
【０００４】
本発明の第一の態様に係る顕微鏡は、補正環を有する対物レンズと、試料からの光を検出する検出部と、補正環制御部と、を有し、前記補正環制御部は、前記補正環の複数の回転位置それぞれにおいて取得された複数の画像に基づいて評価値を算出し、算出した複数の評価値に基づいて補正環の回転位置を決定する。
【０００５】
本発明の第二の態様に係る顕微鏡は、試料に照明光を照射する照明光学系と、前記試料からの観察光を検出する検出部と、前記照明光及び前記観察光の少なくとも一方の収差を補正する収差補正光学系と、収差補正光学系制御部と、を有し、前記収差補正光学系制御部は、前記収差補正光学系の複数の設定状態それぞれにおいて取得された複数の画像に基づいて評価値を算出し、算出した複数の評価値に基づいて収差補正光学系の設定を決定する。
【０００６】
本発明の第三の態様に係る顕微鏡は、補正環を有する対物レンズと、試料からの光を検出する検出部と、補正環制御部と、を有し、前記補正環制御部は、前記補正環の第１〜ｎ（ｎは２以上の整数）の回転位置それぞれにおいて評価値を算出し、前記第ｎの回転位置で前記評価値を算出した後に、前記第１の回転位置で２回目の評価値を算出して、前記第１の回転位置で取得された１回目の評価値と２回目の評価値とに基づいて前記補正環の第２〜ｎの回転位置における評価値を補正する。
【０００７】
本発明の第四の態様に係る顕微鏡は、試料に照明光を照射する照明光学系と、前記試料からの観察光を検出する検出部と、前記照明光及び前記観察光の少なくとも一方の収差を補正する収差補正光学系と、収差補正光学系制御部と、を有し、前記収差補正光学系制御部は、前記収差補正光学系の第１〜ｎ（ｎは２以上の整数）の設定状態それぞれにおいて評価値を算出し、前記第ｎの設定状態で前記評価値を算出した後に、前記第１の設定状態で２回目の評価値を算出して、前記第１の設定状態で取得された１回目の評価値と２回目の評価値とに基づいて前記収差補正光学系の第２〜ｎの設定状態における評価値を補正する。
【０００８】
本発明の第一の態様に係る方法は、補正環を有する対物レンズと、試料からの光を検出する検出部と、補正環制御部と、を有する顕微鏡の前記補正環制御部で実行される方法であって、前記補正環の複数の回転位置それぞれにおいて取得された複数の画像に基づいて評価値を算出するステップと、算出した複数の評価値に基づいて補正環の回転位置を決定するステップと、を有する。
【０００９】
本発明の第二の態様に係る方法は、試料に照明光を照射する照明光学系と、前記試料からの観察光を検出する検出部と、前記照明光及び前記観察光の少なくとも一方の収差を補正する収差補正光学系と、収差補正光学系制御部と、を有する顕微鏡の前記収差補正光学系制御部で実行される方法であって、前記収差補正光学系の複数の設定状態それぞれにおいて取得された複数の画像に基づいて評価値を算出するステップと、算出した複数の評価値に基づいて収差補正光学系の設定を決定するステップと、を有する。
【００１０】
本発明の第三の態様に係る方法は、補正環を有する対物レンズと、試料からの光を検出する検出部と、補正環制御部と、を有する顕微鏡の前記補正環制御部で実行される方法であって、前記補正環の第１〜ｎ（ｎは２以上の整数）の回転位置それぞれにおいて評価値を算出するステップと、前記第ｎの回転位置で前記評価値を算出した後に、前記第１の回転位置で２回目の評価値を算出するステップと、前記第１の回転位置で取得された１回目の評価値と２回目の評価値とに基づいて前記補正環の第２〜ｎの回転位置における評価値を補正するステップと、を有する。
【００１１】
本発明の第四の態様に係る方法は、試料に照明光を照射する照明光学系と、前記試料からの観察光を検出する検出部と、前記照明光及び前記観察光の少なくとも一方の収差を補正する収差補正光学系と、収差補正光学系制御部と、を有する顕微鏡の前記補正光学系制御部で実行される方法であって、前記収差補正光学系の第１〜ｎ（ｎは２以上の整数）の設定状態それぞれにおいて評価値を算出するステップと、前記第ｎの設定状態で前記評価値を算出した後に、前記第１の設定状態で２回目の評価値を算出するステップと、前記第１の設定状態で取得された１回目の評価値と２回目の評価値とに基づいて前記収差補正光学系の第２〜ｎの設定状態における評価値を補正するステップと、を有する。
【００１２】
本発明の第一の態様に係るプログラムは、補正環を有する対物レンズと、試料からの光を検出する検出部と、補正環制御部と、を有する顕微鏡の前記補正環制御部で実行されるプログラムであって、前記補正環制御部を、前記補正環の複数の回転位置それぞれにおいて取得された複数の画像に基づいて評価値を算出する手段、及び算出した複数の評価値に基づいて補正環の回転位置を決定する手段として機能させる。
【００１３】
本発明の第二の態様に係るプログラムは、試料に照明光を照射する照明光学系と、前記試料からの観察光を検出する検出部と、前記照明光及び前記観察光の少なくとも一方の収差を補正する収差補正光学系と、収差補正光学系制御部と、を有する顕微鏡の前記収差補正光学系制御部で実行されるプログラムであって、前記収差補正光学系制御部を、前記収差補正光学系の複数の設定状態それぞれにおいて取得された複数の画像に基づいて評価値を算出する手段、及び算出した複数の評価値に基づいて収差補正光学系の設定を決定する手段として機能させる。
【００１４】
本発明の第三の態様に係るプログラムは、補正環を有する対物レンズと、試料からの光を検出する検出部と、補正環制御部と、を有する顕微鏡の前記補正環制御部で実行されるプログラムであって、前記補正環制御部を、前記補正環の第１〜ｎ（ｎは２以上の整数）の回転位置それぞれにおいて評価値を算出する手段、前記第ｎの回転位置で前記評価値を算出した後に、前記第１の回転位置で２回目の評価値を算出する手段、及び前記第１の回転位置で取得された１回目の評価値と２回目の評価値とに基づいて前記補正環の第２〜ｎの回転位置における評価値を補正する手段として機能させる。
【００１５】
本発明の第四の態様に係るプログラムは、試料に照明光を照射する照明光学系と、前記試料からの観察光を検出する検出部と、前記照明光及び前記観察光の少なくとも一方の収差を補正する収差補正光学系と、収差補正光学系制御部と、を有する顕微鏡の前記補正光学系制御部で実行されるプログラムであって、前記補正光学系制御部を、前記収差補正光学系の第１〜ｎ（ｎは２以上の整数）の設定状態それぞれにおいて評価値を算出する手段、前記第ｎの設定状態で前記評価値を算出した後に、前記第１の設定状態で２回目の評価値を算出する手段、及び前記第１の設定状態で取得された１回目の評価値と２回目の評価値とに基づいて前記収差補正光学系の第２〜ｎの設定状態における評価値を補正する手段として機能させる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】共焦点顕微鏡の外観構成の一例を示す図である。
【図２】共焦点顕微鏡の収差補正部の外観構成の一部分を拡大した図である。
【図３】収差補正算出装置の機能構成の一例を示す図である。
【図４】情報処理装置の表示装置に表示されるユーザインタフェースの一例を示す図である。
【図５】同一画像取得条件で取得した２画像の相関値と収差との関係を示す図である。
【図６】収差量と画像の輝度（強度）との関係を示す図である。
【図７】ＳＮ比と相関値との関係を示すグラフである。
【図８】第１の実施形態に係る収差補正算出装置の動作を示すフローチャートである。
【図９】第１の実施形態における補正環位置で撮像される画像と評価値との関係を示す説明図である。
【図１０】第２の実施形態におけるｚ位置探索の概要を示す説明図である。
【図１１】第２の実施形態における補正環位置と評価値の関係を示すグラフである。
【図１２】第２の実施形態に係る収差補正算出装置の動作を示すフローチャートである。
【図１３】第３の実施形態における補正環位置とｚ方向の探索の関係を示す説明図である。
【図１４】第４の実施形態における退色補正による評価値の取得方法を示す説明図である。
【図１５】第４の実施形態に係る収差補正算出装置の機能構成の一例を示す図である。
【図１６】第４の実施形態に係る収差補正算出装置の動作の前段を示すフローチャートである。
【図１７】第４の実施形態に係る収差補正算出装置の動作の後段を示すフローチャートである。
【図１８】第４の実施形態における退色補正による評価値の取得方法の変形例を示す説明図である。
【図１９】補正環位置と画質との関係を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、好ましい実施形態について図面を参照して説明する。図１は、共焦点顕微鏡１００の外観構成の一例を示す図であり、図２は、共焦点顕微鏡１００の一部である収差補正部２０の外観構成の一部分を拡大した図である。以下、共焦点顕微鏡１００を例示して説明するが、これに限られず、例えば、微分干渉顕微鏡（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＤＩＣ）、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、超解像顕微鏡、多光子励起蛍光顕微鏡であってもよい。この図１に示すように、共焦点顕微鏡１００は、収差補正算出装置である顕微鏡制御部１０と、共焦点顕微鏡１００の光学系に設けられた収差補正部２０とを備える。なお、以降の説明において、図１等に示すように、対物レンズ２１の光軸方向をｚ軸とし、このｚ軸に直交する面内において直交する方向をそれぞれｘ軸及びｙ軸とする。
【００１８】
図２に示すように、収差補正部２０とは、電動モータにより球面収差の補正が可能な収差補正光学系（例えば、補正環２１ａにより光軸ＯＡ方向に移動される収差補正レンズ２１ｂ）を備えた対物レンズ２１により、試料を拡大した観察と観察像の取得に関わる顕微鏡の一部構成である。試料とは、具体的には、観察対象となる生体試料、ビーズなどである。生体試料とは、厚みがある蛍光染色された細胞などの試料である。ビーズとは、蛍光標識されたポリスチレンの微小球体（例えば直径０．２ｕｍなど）である。
【００１９】
また、球面収差とは、点光源から出射される光線が、光学系を通過後に１点の焦点に集束しない収差である。球面収差は、具体的には、観察対象（上述した試料）を通過した光の観察波長や、温度変化、カバーガラス厚、観察面の深さに応じて変化する。補正環は、この球面収差を補正する。
【００２０】
まず、図１を参照して、ステージ２３上に配置された試料（例えば、蛍光色素が添加された細胞）などの観察対象ＴＰの画像を取得する顕微鏡である共焦点顕微鏡１００の構成について説明する。共焦点顕微鏡１００は、光源２６ａ、シャッタ２６ｂ、及び音響光学素子２６ｃから構成される光源部２６、照明用レンズ２７、励起フィルタ２８、及びダイクロイックミラー２９を含む。光源２６ａとしては、所定の波長のレーザ光等の励起光を発光する装置を用いることができる。共焦点顕微鏡１００は、ダイクロイックミラー２９から観察対象ＴＰ側に配置されている、スキャナ２１０、及び対物レンズ２１を含む。スキャナ２１０として、ガルバノスキャナ又はレゾナントスキャナを用いることができる。共焦点顕微鏡１００の照明光学系は、照明用レンズ２７、励起フィルタ２８、ダイクロイックミラー２９、スキャナ２１０、及び対物レンズ２１を含む。共焦点顕微鏡１００は、ダイクロイックミラー２９から観察対象ＴＰ側とは反対側に配置されている、蛍光フィルタ２１１、集光レンズ２１２、検出部２５を含む。検出部２５として、光電子増倍管を用いることができる。共焦点顕微鏡１００の観察光学系は、スキャナ２１０、対物レンズ２１、蛍光フィルタ２１１、及び集光レンズ２１２を含む。共焦点顕微鏡１００は、観察対象ＴＰが配置されたステージ２３を平面状に移動させるステージ駆動部２１３を含む。なお、ステージ駆動部２１３は、ステージ２３を対物レンズ２１の光軸方向に移動させてもよい。共焦点顕微鏡１００は、検出部２５の光の入射側に配置された、観察対象ＴＰの焦点面と共役の位置に配置され、その径により、ある一定以上焦点面から光軸方向にずれた位置の光を除去するピンホール２１４と、ピンホール２１４のサイズを調整するピンホール駆動部２１５とを含む。共焦点顕微鏡１００は、画像を取得するために作動する複数の構成部、例えば、検出部２５、光源部２６、ピンホール駆動部２１５、及びステージ駆動部２１３等の作動を制御する顕微鏡制御部１０を含む。この顕微鏡である共焦点顕微鏡１００は外部の情報処理装置１０１と情報のやり取りが可能に構成されている。
【００２１】
次に、図２を参照して収差補正部２０について説明する。以下の説明では、収差補正部２０が共焦点顕微鏡（倒立顕微鏡）の一部構成である場合について説明するが、これに限られない。収差補正部２０は、微分干渉顕微鏡（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＤＩＣ）、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、超解像顕微鏡、多光子励起蛍光顕微鏡等の一部構成であってもよい。
【００２２】
収差補正部２０（補正環制御部、収差補正光学系制御部）は、対物レンズ２１と、補正環駆動部２２と、ステージ２３と、対物レンズ駆動部２４と、ステージ駆動部２１３と、検出部２５とを備える。対物レンズ駆動部２４は、対物レンズ２１の位置を光軸ＯＡ方向に動かすモータを有しており、対物レンズ２１を保持するレボルバ（不図示）を上下動することで、対物レンズ２１を光軸ＯＡ方向に動かすことができる。なお、対物レンズ２１を光軸ＯＡ方向に移動させるだけでなく、試料が載置されたステージ２３を光軸ＯＡ方向に移動させるように構成してもよい。図２中、対物レンズ２１を観察対象（上述した試料）ＴＰに対して相対移動させて、対物レンズ２１と観察対象ＴＰとの相対位置が変化すると、対物レンズ２１の焦点位置が変化する。以下の説明において、対物レンズ２１の焦点位置を、ＯＦと記載する。
【００２３】
本実施形態において、対物レンズ２１は、補正環２１ａを備える。補正環２１ａを調節し、対物レンズ２１を保持する鏡筒内に設けられる収差補正レンズ２１ｂの光軸方向の位置を変更することにより、対物レンズ２１の球面収差は補正される。対物レンズ２１の球面収差を補正すると、対物レンズ２１の焦点位置ＯＦが光軸ＯＡ方向に移動してしまう。このような補正環２１ａは、必須のものではなく、カム構造を用い収差補正レンズ２１ｂを光軸ＯＡ方向に移動させる構成でもよい。また、収差補正光学系として、収差補正レンズ２１ｂの代わりに、デフォーマブルミラーや液晶素子などの位相変調素子を用いてもよい。収差補正光学系は、対物レンズ２１と光源部２６との間、又は対物レンズ２１と検出部２５との間に配置される。 なお、正立顕微鏡では、収差補正光学系は、試料と光源部２６との間、又は試料と検出部２５との間に配置されてもよい。つまり、収差補正光学系は、試料に光を照明する照明光学系に設けられてもよいし試料からの光を検出器に導く観察光学系に設けられてもよいし照明光と試料からの検出光の両方が通る共通光路に設けられてもよい。位相変調素子は、試料に入射される励起光、及び試料からの検出光の少なくとも一方の位相を変調することにより収差を補正する。
【００２４】
これらのデフォーマブルミラーや液晶素子などの位相変調素子も、補正環２１ａに相当する調整手段を有する。調整手段は、収差補正光学系の設定状態を変更（調整）する。調整手段は、収差補正光学系が対物レンズ２１に含まれる補正レンズ２１ｂである場合、補正レンズ２１ｂの光軸ＯＡ方向の位置（設定状態）を変更（調整）する。調整手段は、収差補正光学系が位相変調素子である場合、位相変調素子の位相変調量（設定状態）を変更（調整）する。例えば、調整手段は、収差補正光学系がデフォーマブルミラーである場合、デフォーマブルミラーに印加される電圧値を制御することにより、ミラーの形状（設定状態）を変更（調整）する。例えば、調整手段は、収差補正光学系が液晶素子である場合、液晶素子に印加される電圧値を制御することにより液晶の分布（設定状態）を変更（調整）する。
【００２５】
補正環駆動部２２は、補正環２１ａの回転位置を移動させて（補正環２１ａを回転させて）収差補正レンズ２１ｂの位置を変更させる。補正環駆動部２２とは、具体的には、電動モータなどの駆動装置であり、電動モータにより補正環２１ａを回転させる（補正環２１ａの回転位置を移動させる）。補正環２１ａが回転することにより（補正環２１ａの回転位置が移動することにより）収差補正レンズ２１ｂは位置が変更される。
【００２６】
光源部２６から射出された励起光は、照明用レンズ２７で略平行光に変換されて励起光フィルタ２８を透過してダイクロイックミラー２９に入射し、ダイクロイックミラー２９で反射されてスキャナ２１０に入射する。スキャナ２１０は、入射した励起光を走査し、走査された光は、対物レンズ２１により、ステージ２３上の観察対象ＴＰに集光される。スキャナ２１０により光の集光位置は２次元的に走査される。
【００２７】
観察対象ＴＰ上の励起光が照射された位置からは、光（蛍光）が発せられる。その観察対象ＴＰから射出した光（蛍光）は、対物レンズ２１、スキャナ２１０を通り、ダイクロイックミラー２９へ入射する。ダイクロイックミラー２９に入射した光（蛍光）は、励起光の波長と異なるので、ダイクロイックミラー２９を透過し、蛍光フィルタ２１１を通り、集光レンズ２１２にて、集光される。集光した光（蛍光）は検出部２５に入射し、検出部２５は、入射された光の光電子変換を行い、大きさがその光の量（明るさ）に対応する値のデジタルデータを生成し、生成したデジタルデータを顕微鏡制御部１０に送信する。
【００２８】
顕微鏡制御部１０はそのデータを１画素のデータとして、顕微鏡制御部１０に備えられたＲＡＭ（図示せず）に記録する。この記録をスキャナ２１０の２次元的に走査するタイミングと同期して並べることで１つの画像として生成することで、画像が取得される。
【００２９】
顕微鏡制御部１０は、画像を取得するために作動する複数の構成部である、光源部２６、ピンホール駆動部２１５、及びステージ駆動部２１３等の作動を制御する。また、顕微鏡制御部１０は、画像の取得条件として、例えば、光源部２６の励起光の強さ、ピンホール２１４のサイズ、観察対象ＴＰ上のスポットの走査速度等を設定する。
【００３０】
上述したように、観察対象ＴＰである細胞に蛍光物質を励起する励起光を照射することで、検出部２５により、細胞に添加された蛍光試薬から発光される蛍光を検出し、検出された結果を顕微鏡制御部１０で画像として生成する。本実施形態においては、細胞を蛍光試薬で染色して、細胞画像を取得する。なお、検出部２５が検出した信号により画像が生成される生体試料は、例えば、固定標本、透明化標本、生きたままの標本であってもよい。
【００３１】
収差補正算出装置（補正環制御部、収差補正光学系制御部）である顕微鏡制御部１０は、補正環２１ａの最適位置を決定（算出）する。本実施形態において、顕微鏡制御部１０は、図３に示すように、制御部１２を有しており、情報処理装置１０１と接続されている。情報処理装置１０１は、制御部を有する。また、情報処理装置１０１の制御部は、入出力制御部１７を備える。また、情報処理装置１０１は、表示装置１１（表示部）と、接続されている。表示装置１１は、例えば液晶ディスプレイ等である。表示装置１１は、例えば、情報処理装置１０１に外付けされる装置であるが、情報処理装置１０１の一部でもよい。また、情報処理装置１０１は入力装置（入力部）９と接続される。入力装置９は、ユーザが操作可能な入力インターフェースである。入力装置９は、例えば、マウス、キーボード、タッチパッド、トラックボールの少なくとも１つを含む。入力装置９は、ユーザによる操作を検出し、その検出結果をユーザが入力した入力情報として情報処理装置１０１に供給する。入力装置９は、例えば、情報処理装置１０１に外付けされる装置であるが、情報処理装置１０１の一部（例、内臓型のタッチパッド）でもよい。また、入力装置９は、表示装置１１と一体のタッチパネル等でもよい。顕微鏡制御部１０は、補正環２１ａの最適位置を決定する。情報処理装置１０１の入出力制御部１７は、観察者が顕微鏡を操作するために必要なＧＵＩや、試料の画像、顕微鏡制御部１０が算出した結果などを表示装置１１に表示する。なお、図３は、収差補正算出装置である顕微鏡制御部１０の機能構成の一例を示す図である。
【００３２】
顕微鏡制御部１０は、上述した制御部１２に加えて、画像生成部１３と、評価値算出部１４と、補正環２１ａの最適位置を決定（算出）する補正環位置決定部１５と、記憶部１６と、ｚ位置算出部１８と、を備える。
【００３３】
本実施形態では、情報処理装置１０１の入出力制御部１７は、補正環位置決定部１５が算出した補正環最適位置ＣＰを表示装置１１に表示する。補正環駆動部２２は、補正環位置決定部１５が決定した補正環最適位置ＣＰを取得する。補正環駆動部２２は、取得した補正環最適位置ＣＰに基づいて、補正環２１ａを駆動させる。
【００３４】
入出力制御部１７は、観察者が入力装置９を用いて入力した観察領域ＲＯＩ、補正環開始位置、基準フォーカス面位置（パラメータ）などを検出し、制御部１２に出力する。
【００３５】
制御部１２は、観察者が入力したパラメータに基づいて、検出部２５、対物レンズ駆動部２４及び補正環駆動部２２に規定の動作をさせる。また、制御部１２は、撮像時の対物レンズ２１の位置と補正環２１ａの位置を記憶部１６へ出力する。
【００３６】
検出部２５は、制御部１２からの入力に従ってスキャナ２１０を制御し、取得した検出信号を画像生成部１３へ出力する。
【００３７】
画像生成部１３は、検出部２５から取得した検出信号に基づいて画像ＴＩを生成し、生成した画像ＴＩを評価値算出部１４及び記憶部１６へ出力する。具体的には、画像生成部１３は、生成した基準画像を記憶部１６へ出力する。また、画像生成部１３は、生成した複数画像（評価値算出用画像）を評価値算出部１４へ出力する。また、画像生成部１３は、生成した複数画像（ｚスタック）をｚ位置算出部１８へ出力する。なお、対物レンズ２１またはステージ２３を対物レンズの光軸方向（ｚ方向）に所定の移動量だけ移動させて画像を取得する処理をｚ方向の所定の範囲で繰り返すことにより取得された画像群をｚスタックと称する。
【００３８】
評価値算出部１４は、画像生成部１３から観察対象ＴＰの画像ＴＩを取得する。評価値算出部１４は、画像生成部１３が生成した画像ＴＩから評価値ｖを算出する。評価値ｖの詳細は後述する。評価値算出部１４は、算出した評価値ｖを、記憶部１６に記憶する。
【００３９】
記憶部１６は、例えば、ＲＡＭ等のメモリやハードディスク等の外部記憶装置である。記憶部１６は、保持する基準画像をｚ位置算出部１８へ出力する。また、記憶部１６は、保持する補正環位置と評価値ｖを補正環位置決定部１５へ出力する。
【００４０】
ｚ位置算出部１８は、画像生成部１３から入力されたｚスタックと記憶部１６から入力された基準画像から複数画像（評価値算出用画像）を取得する対物レンズ２１のｚ位置を算出し、制御部１２へ出力する。
【００４１】
補正環位置決定部１５は、記憶部１６から取得した情報に基づいて、補正環２１ａの最適位置を決定する。補正環位置決定部１５は、算出した補正環２１ａの最適位置に相当する補正環最適位置ＣＰに関する情報を、入出力制御部１７と、制御部１２に対して出力する。入出力制御部１７は上記補正環最適位置ＣＰに関する情報を表示装置１１に出力（表示）する 。
【００４２】
制御部１２は、補正環２１ａを最適位置へ動作させるよう補正環駆動部２２を制御する。
【００４３】
図４は、情報処理装置１０１の表示装置１１に表示される補正環２１ａを調整するためのグラフィカルユーザインタフェース（補正環調整画面）の一例を示す図である。図４（ａ）に示す補正環位置の指定画面において観察者は、補正環位置をバーで指定することにより、指定された位置に補正環２１ａを移動（回転）させることができる。また、観察者が、図４（ａ）に示す補正環位置の指定画面において、右下に表示されている自動調整のボタンを押すと、図４（ｂ）に示す補正環自動調整の設定画面が表示される。
【００４４】
図４（ｂ）は補正環自動調整の設定画面である。この補正環自動調整の設定画面では、補正環位置の探索範囲と探索ステップ数、を設定することができる（図４（ｂ）の例では、補正環の探索範囲は探索範囲の上下限をバーの位置で指定し、探索ステップ数を数値として入力することで指定する場合を示している）。補正環位置の探索範囲とは評価値ｖを取得する補正環位置（補正環の回転位置）の最大値と最小値であり、探索ステップ数は評価値ｖを取得する補正環位置（補正環の回転位置）の数である。観察者が、画面右下の調整開始ボタンを押すと、設定された補正環位置(補正環開始位置)、探索範囲及び探索ステップ数に基づいて、補正環位置の自動調整処理が開始される。図４（ａ）、図４（ｂ）で設定された情報は入出力制御部１７に入力される。なお、調整に用いる基準位置は、現在観察しているｚ位置及びｘ、ｙ位置（光軸に直行する面内の座標）となる。補正環自動調整が完了すると、上述した補正環位置の指定画面（図４（ｃ））が表示される。
【００４５】
図４（ｃ）に示すように、自動調整された結果として、補正環２１ａの最適位置が、バーとして補正環位置の指定画面に表示される。
【００４６】
以下、同一画像取得条件で取得した２画像の相関値を評価値として用いる方法を説明する。図５は、同一画像取得条件で取得した２画像の相関値と収差との関係を示す図であり、図６は収差量と画像の輝度（強度）との関係を示す図である。図５に示すように、収差が大きい場合には２画像の相関値は小さく、収差が小さい場合には２画像の相関値は大きくなるため、２画像の相関値を評価値として用いることができる。以下にその理由を説明する。
【００４７】
１．輝度（共焦点顕微鏡の実効ＰＳＦ（Ｐｏｉｎｔ Ｓｐｒｅａｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ））と収差（球面収差）の関係
図６に示すように、収差量が大きくなるほど（ＰＳＦの強度が低下し）画像の輝度が低下する。
２．輝度とＳＮの関係
輝度が低いほどＳＮ比が低くなる（輝度が高いほどＳＮ比が高くなる）。以下理由を説明する。
【００４８】
共焦点顕微鏡において、ノイズはフォトンノイズが支配的である。画像全体の輝度平均をバー付きのＩとすると、ノイズσN（輝度値のランダムなばらつきの標準偏差）はフォトンノイズの性質より輝度の平方根に比例し、次式（ａ）の関係を有する。
【００４９】
【数１】
2019215437.tif 000003
【００５０】
また、ＳＮ比をＳＮＲとすると、次式（ｂ）の関係を有し、輝度の平方根に比例する。
【００５１】
【数２】
2019215437.tif 000004
【００５２】
例えば、輝度の平均値が４のとき、ノイズは２でＳＮ比は２となり、輝度の平均値が２のとき、ノイズは２の平方根でＳＮ比は２の平方根となる。すなわち、輝度が高いときの方が２の平方根倍、ＳＮ比が高くなる。
【００５３】
上記１により、収差量が大きくなるほど画像の輝度が低下することが分かり、上記２により、輝度が低いほどＳＮ比が低くなることがわかる。これらの関係より、収差が大きいほど（輝度が低下し）ＳＮ比が低くなることが分かる。
【００５４】
したがって、取得した画像のＳＮ比を評価（比較）することにより、収差の大小を判断することができる。ここで、取得した画像のＳＮ比は、同一画像取得条件（対物レンズに対するｚ位置や視野の位置、露光条件など）において取得した２つの画像の相関値と関連があることを説明する。
【００５５】
ノイズのみが異なる２つの画像Ｉ1、Ｉ2の正規化相互相関を計算する。それぞれの画像を、Ｉをノイズのない画像とし、Ｎ1、Ｎ2をノイズとし、ｉ，ｊを画像のピクセル（画素）の座標とすると、次式（ｃ）として表される。
【００５６】
【数３】
2019215437.tif 000005
【００５７】
このとき、ノイズは平均値が０、分散が同じで、ノイズ間に相関がないという以下の条件（ノイズの性質から成り立つ条件）が次式（ｄ）として成り立つ。なお、式（ｄ）において「＜＞」はｉ，ｊについての平均を表す。
【００５８】
【数４】
2019215437.tif 000006
【００５９】
以上に示した式（ｃ）及び式（ｄ）を用いると、２画像の正規化相互相関の相関値Ｒは、次式（ｅ）として表される。
【００６０】
【数５】
2019215437.tif 000007
【００６１】
この式（ｅ）の関係より、相関値Ｒは、ノイズの分散とノイズを含まない画像の分散（シグナルに相当）の比で表される。
【００６２】
また、式（ｅ）からＳＮ比と相関値Ｒの関係が図７のようになることが分かる。図７は、ＳＮ比と相関値との関係を示すグラフである。図７に示されるように、ＳＮ比が高くなるほど相関値が大きくなる。したがって、収差が大きいほど（輝度が低下し）ＳＮ比が低くなるので、相関値は小さくなる。
【００６３】
以上説明したように、収差が大きい場合には２画像の相関値は小さく、収差が小さい場合には２画像の相関値は大きいため、図５に示すように、２画像の相関値を評価値として用いることができる。
【００６４】
以上の説明のように、共焦点顕微鏡等の顕微鏡において補正環を調整することで球面収差を低減し画質を改善することができる（図１９参照）。本実施形態における収差補正算出装置である顕微鏡制御部１０の目的は画質が最もよくなるように補正環２１ａを自動調整することである。補正環位置を変えて同一画像取得条件で画像を取得し、これらの画像からそれぞれの補正環位置での評価値を算出、評価値が最大となる補正環位置を見つける。なお、図１９は、補正環位置と画質との関係を示す説明図である。
【００６５】
以下に、上述した２枚の画像から得られる相関値（以下「評価値」とも呼ぶ）を算出して最適な画像が得られるように補正環の位置を決定する４つの実施形態について説明する。
【００６６】
（第１の実施形態）
第１の実施形態は、ある観察位置において補正環位置を変化させ、評価値が最大となる補正環位置を探索する。図８は、第１の実施形態に係る収差補正算出装置の動作を示すフローチャートであり、図９は、第１の実施形態における補正環位置で取得される画像と評価値との関係を示す説明図である。
【００６７】
図８に示すように、観察者は試料である観察対象ＴＰを観察するために、情報処理装置１０１の入力装置９を用いて対物レンズ２１をｚ方向（光軸ＯＡ方向）に移動させることにより、この対物レンズ２１を任意の観察位置に相対移動させる。また、観察者が、情報処理装置１０１の表示装置１１に表示される補正環２１ａを調整するためのグラフィカルユーザインタフェース（補正環調整画面）において、観察者が入力装置９を用いて収差補正の開始を指示すると（ステップＳ１１０）、制御部１２は、補正環駆動部２２に制御信号を送信し、この制御信号を受信した補正環駆動部２２は、補正環２１ａを初期状態の位置（補正環開始位置ＣＢ）に移動させる（ステップＳ１２０）。なお、補正環２１ａの位置は、この補正環２１ａにより動かされる収差補正レンズ２１ｂの対物レンズ２１内における位置に対応している。また、対物レンズ２１の位置である撮像開始位置ＺＢや、補正環開始位置ＣＢは、観察者により情報処理装置１０１の入力装置９により入力される（これらの説明は、以下の実施形態でも同様とする）。
【００６８】
顕微鏡制御部１０の画像生成部１３は、検出部２５の信号により、観察対象ＴＰの画像ＴＩを複数回取得する（ステップＳ１３０）。ここでは、ステップＳ１３０において２枚の画像を取得する場合で説明する。
【００６９】
顕微鏡制御部１０の評価値算出部１４は、ステップＳ１３０で取得された複数枚（例えば２枚）の画像を用いて、上述した式（ｅ）により評価値（相関値）ｖを算出し、記憶部１６に補正環２１ａの現在の位置とともに記憶させて保持する（ステップＳ１４０）。
【００７０】
制御部１２は、補正環２１ａの位置を規定回数変えたか否かを判断する（ステップＳ１５０）。制御部１２が、補正環２１ａの位置を規定回数変えていないと判断した場合（ステップＳ１５０：Ｎｏ）、制御部１２は、補正環駆動部２２に制御信号を送信し、この制御信号を受信した補正環駆動部２２は、補正環２１ａを規定量だけに移動させ（ステップＳ１６０）、ステップＳ１３０に戻って上述した処理を繰り返す。以上の処理により、補正環２１ａを初期状態から、規定の移動量で規定回数だけ移動させたときの、それぞれの補正環２１ａの位置での評価値を取得することができる。図９に補正環２１ａの位置ｃ０〜Ｃ６、その位置で撮像される２枚の画像、及びそれぞれの画像から算出される評価値（図９におてはｖ０〜ｖ６として表している）の関係を示す。
【００７１】
制御部１２が、補正環２１ａの位置を規定回数変えたと判断した場合（ステップＳ１５０：Ｙｅｓ）、顕微鏡制御部１０の補正環位置決定部１５は記憶部１６に記憶されている補正環２１ａの位置毎の評価値ｖを比較して評価値ｖが最大となる補正環２１ａの位置を決定する（ステップＳ１７０）。顕微鏡制御部１０の補正環位置決定部１５は、ステップＳ１７０で決定された補正環２１ａの位置を補正環駆動部２２に制御信号として送信し、この制御信号を受信した補正環駆動部２２は、補正環２１ａを当該位置となるように（補正環２１ａを評価値が最大となる位置に）移動させ（ステップＳ１８０）、収差補正算出装置の動作を終了する。
【００７２】
この第１の実施形態に係る収差補正算出装置の制御方法（収差補正部の最適位置決定方法）によれば、観察者が任意に選択した観察位置において撮像される画像の球面収差が最適に補正される補正環２１ａの位置を決定することができる。
【００７３】
（第２の実施形態）
上述した第１の実施形態に係る収差補正算出装置の制御方法によると、補正環２１ａの状態（補正環位置（補正環２１ａの回転位置）であって、収差補正レンズ２１ｂの位置に対応する）を変化させたときに、対物レンズ２１のフォーカス位置が変化する。そこで第２の実施形態では、補正環位置（補正環２１ａの回転位置）を変えた後、基準画像（観察者が選択した任意の観察位置での画像（基準フォーカス面情報ＴＦＩ））と同じ画像が取得可能なｚ位置（対物レンズ２１の光軸ＯＡ方向の位置）を探索し、そのz位置において本手法により評価値を取得する。図１０は、ｚ位置探索の概要を示す説明図であり、図１１は、第２の実施形態に係る補正環位置と評価値の関係を示すグラフであり、図１２は、第２の実施形態に係る収差補正算出装置の動作を示すフローチャートである。
【００７４】
z位置の探索は、図１０に示すように、補正環を２１ａ動かした後にｚスタック（対物レンズ２１をｚ方向に所定の移動量だけ移動させて画像を取得する処理をｚ方向の所定の範囲で繰り返すことにより取得された画像群）を取得し、ｚスタックの各画像と基準画像との相関値を計算する。そして相関値の補間を行い、補間後の相関値が最大となるｚ位置へ対物位置を戻す（対物レンズ２１を移動させる）。そのz位置で複数枚画像を取得し評価値を算出後再び補正環２１ａを動かし同様のｚ位置探索を行う。図１１に示すように、規定の全ての補正環位置で評価値を取得後、評価値の補間を行い、最大となる補正環位置(最適補正環位置)を求める。その後、補正環位置を最適補正環位置へ戻し、基準画像と同じ画像取得可能なｚ位置を再び相関により探索する。
【００７５】
以下に、第２の実施形態に係る収差補正算出装置の制御方法について説明する。図１２に示すように、観察者が観察対象ＴＰを観察するために、情報処理装置１０１の入力装置９を用いて対物レンズ２１をｚ方向（光軸ＯＡ方向）に移動させることにより、この対物レンズ２１を任意の観察位置に相対移動させる。また、観察者が、情報処理装置１０１の表示装置１１に表示される補正環２１ａを調整するためのグラフィカルユーザインタフェース（補正環調整画面）において、観察者が入力装置９を用いて収差補正の開始を指示すると（ステップＳ２１０）、制御部１２は、補正環駆動部２２に制御信号を送信し、この制御信号を受信した補正環駆動部２２は、補正環２１ａを初期状態の位置（補正環開始位置ＣＢ）に移動させる（ステップＳ２１２）。
【００７６】
顕微鏡制御部１０の画像生成部１３は、検出部２５からの信号に基づいて、観察対象ＴＰの基準画像（基準フォーカス面情報ＴＦＩ）を取得し、記憶部１６に記憶して保持する（ステップＳ２１４）。
【００７７】
顕微鏡制御部１０の画像生成部１３は、検出部２５の信号により、観察対象ＴＰの画像ＴＩを複数回取得する（ステップＳ２１６）。ここでは、ステップＳ２１６において２枚の画像を取得する場合で説明する。なお、ステップＳ２１４の処理を省略し、最初に取得された（補正環開始位置ＣＢで取得された）観察対象ＴＰの複数の画像ＴＩの少なくとも一方を基準画像（基準フォーカス面情報ＴＦＩ）としてもよい。
【００７８】
顕微鏡制御部１０の評価値算出部１４は、ステップＳ２１６で取得された複数枚（例えば２枚）の画像を用いて、上述した式（ｅ）により評価値（相関値）ｖを算出し、記憶部１６に補正環の現在の位置（補正量ＣＬ）とともに記憶させて保持する（ステップＳ２１８）。
【００７９】
制御部１２は、補正環２１ａの位置を規定回数変えたか否かを判断する（ステップＳ２２０）。制御部１２が、補正環２１ａの位置を規定回数変えていないと判断した場合（ステップＳ２２０：Ｎｏ）、制御部１２は、補正環駆動部２２に制御信号を送信し、この制御信号を受信した補正環駆動部２２は、補正環２１ａを規定量だけ移動させる（ステップＳ２２２）。
【００８０】
制御部１２は、現在の補正環２１ａの位置で、対物レンズ駆動部２４に制御信号を送信して対物レンズ２１を光軸方向に移動させながら検出部２５で信号を取得し、画像生成部１３で上述したｚスタックを取得する（ステップＳ２２４）。ｚスタックの取得方法は、例えば、図１０に示すように、現在の対物レンズ２１の位置からｚ方向（光軸ＯＡ方向）に、所定の範囲で所定の移動量ずつ動かして観察対象ＴＰの画像を取得し、画像が取得されたときの対物レンズ２１のｚ位置（光軸ＯＡ方向の位置）と対応付けてｚ位置算出部１８へ出力する。
【００８１】
顕微鏡制御部１０のｚ位置算出部１８は、ステップＳ２１４で取得した基準画像と、ステップＳ２２４で取得したｚスタックの各画像との相関値を、上述した式（ｅ）により算出する（ステップＳ２２６）。
【００８２】
顕微鏡制御部１０のｚ位置算出部１８は、ステップＳ２２６で算出されたｚスタックの各画像と基準画像との相関値を補間する（ステップＳ２２８）。顕微鏡制御部１０のｚ位置算出部１８は、補間された相関値のうち、最大となる相関値のｚ位置（対物レンズ２１の光軸ＯＡ方向の位置）を算出して制御部１２へ出力し、制御部１２は、ｚ位置算出部１８で算出されたｚ位置に基づいて、対物レンズ駆動部２４に制御信号として送信して対物レンズ２１を当該位置へ移動させる（ステップＳ２３０）。制御部１２は、ステップＳ２１６に戻って上述した処理を繰り返す。以上の処理により、補正環２１ａを初期状態から、規定の移動量で規定回数だけ光軸ＯＡ方向に移動させたときの、それぞれの補正環２１ａの位置で、基準画像と同じ画像の評価値を取得することができる。
【００８３】
制御部１２が、補正環２１ａの位置を規定回数変えたと判断した場合（ステップＳ２２０：Ｙｅｓ）、顕微鏡制御部１０の補正環位置決定部１５は、記憶部１６に記憶されている補正環２１ａの位置毎の評価値ｖを補間する（ステップＳ２３２）。この一例では、補正環位置決定部１５は、評価値ｖ同士を二次曲線フィッティングする。具体的には、補正環位置決定部１５は、最小二乗法により、評価値ｖ同士を二次曲線フィッティングする。なお、補正環位置決定部１５は、評価値ｖによって、一次関数フィッティングや、指数関数フィッティングによって、評価値ｖ同士をフィッティングしてもよい。図１１は、評価値ｖ同士を二次曲線フィッティングした一例を示す図である。
【００８４】
顕微鏡制御部１０の補正環位置決定部１５は、ステップＳ２３２で補間された評価値ｖから、この評価値ｖが最大となる補正環２１ａの位置を決定し、この位置を補正環駆動部２２に制御信号として送信し、この制御信号を受信した補正環駆動部２２は、補正環２１ａを当該位置となるようにｚ方向（光軸ＯＡ方向）に（補正環２１ａを補間された評価値が最大となる位置に）移動させる（ステップＳ２３４）。
【００８５】
最後に、補間された評価値ｖが最大になる位置に補正環２１ａがある状態で、制御部１２は、対物レンズ駆動部２４に制御信号を送信して対物レンズ２１を光軸方向に相対移動させながら検出部２５で信号を取得し、画像生成部１３でｚスタックを取得し、画像が取得されたときの対物レンズ２１のｚ位置（光軸ＯＡ方向の位置）と対応付けてｚ位置算出部１８へ出力する（ステップＳ２３６）。
【００８６】
顕微鏡制御部１０のｚ位置算出部１８は、ステップＳ２１４で取得した基準画像と、ステップＳ２３６で取得したｚスタックの各画像との相関値を、上述した式（ｅ）により算出する（ステップＳ２３８）。
【００８７】
顕微鏡制御部１０のｚ位置算出部１８は、ステップＳ２３８で算出されたｚスタックの各画像と基準画像との相関値を補間する（ステップＳ２４０）。顕微鏡制御部１０のｚ位置算出部１８は、補間された相関値のうち、最大となる相関値のｚ位置を算出して制御部１２へ出力し、制御部１２は、ｚ位置算出部１８で算出されたｚ位置に基づいて、対物レンズ駆動部２４に制御信号として送信して対物レンズ２１を当該位置へ移動させ（ステップＳ２４２）、収差補正算出装置の動作を終了する。
【００８８】
この第２の実施形態に係る収差補正算出装置の制御方法（収差補正部の最適位置決定方法）によれば、観察者が任意に選択した観察位置において撮像される基準画像とほぼ同じフォーカス位置で、かつ、球面収差が最適に補正される補正環２１ａの位置を決定することができる。
【００８９】
（第３の実施形態）
図１３は、第３の実施形態を説明する図である。第３の実施形態では、図１３に示すように、補正環２１ａの位置（補正環位置ｃ）を変え、その位置毎にｚスタックの取得を行うが、このときすべての画像を複数回（本実施形態では２回ずつ）撮影する。規定のすべての補正環位置でzスタックの撮影を終えたら、補正環２１ａの位置毎に、基準画像とｚスタックの各２画像の少なくとも一方との相関値を計算し、相関値が最大となる画像に対応する対物レンズ２１のｚ位置で撮像された２画像を選択する。そして、上述した第２の実施形態と同様に、選択された２画像の相関値を評価値として算出する。その後、上述した第２の実施形態と同様に、図１２のステップＳ２３２〜Ｓ２４２の処理を実行する。
【００９０】
（第４の実施形態）
第４の実施形態は、第２の実施形態に退色補正の処理を追加した構成である。図１５に第４の実施形態に係る収差補正算出装置の構成を示す。図１５に示すように、第４実施形態では、図３の構成に対して、評価値の退色補正を行う評価値補正部１９が設けられている。
【００９１】
以下に、第４の実施形態に係る収差補正算出装置の制御方法について説明する。図１６に示すように、観察者が観察対象ＴＰを観察するために、情報処理装置１０１の入力装置９を用いて対物レンズ２１をｚ方向（光軸ＯＡ方向）に移動させることにより、この対物レンズ２１を任意の観察位置に相対移動させる。また、観察者が、情報処理装置１０１の表示装置１１に表示される補正環２１ａを調整するためのグラフィカルユーザインタフェース（補正環調整画面）において、観察者が入力装置９を用いて収差補正の開始を指示すると（ステップＳ３１０）、制御部１２は、補正環駆動部２２に制御信号を送信し、この制御信号を受信した補正環駆動部２２は、補正環２１ａを初期状態の位置（補正環開始位置ＣＢ）に移動させる（ステップＳ３１２）。
【００９２】
顕微鏡制御部１０の画像生成部１３は、検出部２５の信号により、観察対象ＴＰの基準画像（基準フォーカス面情報ＴＦＩ）を取得し、記憶部１６に記憶して保持する（ステップＳ３１４）。
【００９３】
顕微鏡制御部１０の画像生成部１３は、検出部２５の信号により、観察対象ＴＰの画像ＴＩを複数回取得する（ステップＳ３１６）。ここでは、ステップＳ３１６において２枚の画像を取得する場合で説明する。なお、ステップＳ３１４の処理を省略し、最初に取得された（補正環開始位置ＣＢで取得された）観察対象ＴＰの複数の画像ＴＩの少なくとも一方を基準画像（基準フォーカス面情報ＴＦＩ）としてもよい。
【００９４】
顕微鏡制御部１０の評価値算出部１４は、ステップＳ３１６で取得された複数枚（例えば２枚）の画像を用いて、上述した式（ｅ）により評価値（相関値）ｖを算出し、記憶部１６に補正環の現在の位置（補正量ＣＬ）とともに記憶させて保持する（ステップＳ３１８）。
【００９５】
制御部１２は、補正環２１ａの位置を規定回数変えたか否かを判断する（ステップＳ３２０）。制御部１２が、補正環２１ａの位置を規定回数変えていないと判断した場合（ステップＳ３２０：Ｎｏ）、制御部１２は、補正環駆動部２２に制御信号を送信し、この制御信号を受信した補正環駆動部２２は、補正環２１ａを規定量だけ移動させる（ステップＳ３２２）。
【００９６】
制御部１２は、現在の補正環２１ａの位置で、対物レンズ駆動部２４に制御信号を送信して対物レンズ２１を光軸方向に移動させながら検出部２５で信号を取得し、画像生成部１３でｚスタックを取得し、ｚスタックの画像毎に、当該画像が取得されたときの対物レンズ２１のｚ位置（光軸ＯＡ方向の位置）と対応付けて記憶部１６に記憶させて保持する（ステップＳ３２４）。ｚスタックの取得方法は、第２の実施形態で説明した通りである。
【００９７】
顕微鏡制御部１０のｚ位置算出部１８は、ステップＳ３１４で取得した基準画像と、ステップＳ３２４で取得したｚスタックの各画像との相関値を、上述した式（ｅ）により算出する（ステップＳ３２６）。
【００９８】
顕微鏡制御部１０のｚ位置算出部１８は、ステップＳ３２６で算出されたｚスタックの各画像と基準画像との相関値を補間する（ステップＳ３２８）。顕微鏡制御部１０のｚ位置算出部１８は、補間された相関値のうち、最大となる相関値のｚ位置（対物レンズ２１の光軸ＯＡ方向の位置）を算出して制御部１２へ出力し、制御部１２は、ｚ位置算出部１８で算出されたｚ位置に基づいて、対物レンズ駆動部２４に制御信号として送信して対物レンズ２１を当該位置へ移動させる（ステップＳ３３０）。制御部１２は、ステップＳ３１６に戻って上述した処理を繰り返す。以上の処理により、補正環２１ａを初期状態から、規定の移動量で規定回数だけ光軸ＯＡ方向に移動させたときの、観察者が任意に選択した観察位置において撮像される基準画像とほぼ同じフォーカス位置において、補正環２１ａの位置での評価値を取得することができる。
【００９９】
制御部１２が、補正環２１ａの位置を規定回数変えたと判断した場合（ステップＳ３２０：Ｙｅｓ）、制御部１２は、補正環駆動部２２に制御信号を送信して補正環駆動部２２により補正環２１ａを基準画像取得位置（初期状態）へ移動させる（ステップＳ３３２）。
【０１００】
制御部１２は、現在の補正環２１ａの位置において、対物レンズ駆動部２４に制御信号を送信して対物レンズ２１を光軸方向に移動させながら検出部２５で信号を取得し、画像生成部１３でｚスタックを取得し、画像が取得されたときの対物レンズ２１のｚ位置（光軸ＯＡ方向の位置）と対応付けてｚ位置算出部１８へ出力する（ステップＳ３３４）。
【０１０１】
顕微鏡制御部１０のｚ位置算出部１８は、ステップＳ３１４で取得した基準画像と、ステップＳ３３４で取得したｚスタックの各画像との相関値を、上述した式（ｅ）により算出する（ステップＳ３３６）。
【０１０２】
顕微鏡制御部１０のｚ位置算出部１８は、ステップＳ３３６で算出されたｚスタックの各画像と基準画像との相関値を補間する（ステップＳ３３８）。顕微鏡制御部１０のｚ位置算出部１８は、補間された相関値のうち、最大となる相関値のｚ位置を算出して制御部１２へ出力し、制御部１２は、ｚ位置算出部１８で算出されたｚ位置に基づいて、対物レンズ駆動部２４に制御信号として送信して対物レンズ２１を当該位置へ移動させる（ステップＳ３４０）。
【０１０３】
図１７に示すように、顕微鏡制御部１０の画像生成部１３は、現在の対物レンズ２１及び補正環２１ａの位置で、検出部２５の信号により、観察対象ＴＰの画像ＴＩを複数回（例えば２回）取得する（ステップＳ３４２）。また、顕微鏡制御部１０の評価値算出部１４は、ステップＳ３４２で取得された複数枚（例えば２枚）の画像を用いて、上述した式（ｅ）により評価値（相関値）ｖを算出し、記憶部１６に補正環の現在の位置（補正環最適位置ＣＰ又は補正量ＣＬに相当する）とともに記憶させて保持する（ステップＳ３４４）。
【０１０４】
蛍光顕微鏡では試料（観察対象ＴＰ）の退色により画像の輝度が暗くなる。収差の評価値は評価値算出方法によらず一般に退色の影響を受ける（同じ収差状態でも退色により評価値が変化する）。図１４（ａ）は、１〜６の符号が付けられた６箇所の補正環２１ａの位置で評価値を算出した場合を示している。そして、補正環２１ａを、基準画像を取得したときの位置に戻し、ステップＳ３３４〜Ｓ３４４を実行することで、退色後の観察対象ＴＰの画像から評価値を再度取得する。この評価値は、図１４（ａ）において７の符号が付けられた評価値に相当する。すなわち、符号１〜６の評価値を取得した後に取得された符号７の評価値は、符号１の評価値と比較することにより、この間に発生した退色の影響（補正環２１ａの最適位置を決定する処理の間に試料や装置の状態変化に起因する影響）を表していることになる。したがって、顕微鏡制御部１０の評価値補正部１９は、最初に取得した評価値（符号１）と補正環２１ａが同じ位置にあるときに、最後に取得した評価値（符号７）との差を求め、図１４（ｂ）に示すように、符号２〜６の評価値に対して、その時間経過を考慮して符号１と符号７の評価値の差を用いて退色補正を行い、補正された評価値ｖ′を記憶部１６に記憶する（ステップＳ３４６）。すなわち、最初の評価値が取得されてから最後の評価値が取得されるまでの時間、又は、最初の評価値が取得されてから最後の評価値が取得されるまでの間で画像が取得された回数（試料に励起光が照射された回数）により試料の状態変化度合いを予測し、評価値を補正する。
【０１０５】
最後に、顕微鏡制御部１０の補正環位置決定部１５は、補正環駆動部２２に制御信号を送信して、評価値補正部１９で退色補正された評価値ｖ′が最大になる位置に補正環２１ａを移動させる（ステップＳ３４８）。
【０１０６】
退色補正された評価値ｖ′が最大になる位置に補正環２１ａがある状態で、制御部１２は、対物レンズ駆動部２４に制御信号を送信して対物レンズ２１を光軸方向に移動させながら検出部２５で信号を取得し、画像生成部１３でｚスタックを取得し、画像が取得されたときの対物レンズ２１のｚ位置（光軸ＯＡ方向の位置）と対応付けてｚ位置算出部１８へ出力する（ステップＳ３５０）。
【０１０７】
顕微鏡制御部１０のｚ位置算出部１８は、ステップＳ３１４で取得した基準画像と、ステップＳ３５０で取得したｚスタックの各画像との相関値を、上述した式（ｅ）により算出する（ステップＳ３５２）。
【０１０８】
顕微鏡制御部１０のｚ位置算出部１８は、ステップＳ３５２で算出されたｚスタックの各画像と基準画像との相関値を補間する（ステップＳ３５４）。顕微鏡制御部１０のｚ位置算出部１８は、補間された相関値のうち、最大となる相関値の位置を算出して制御部１２へ出力し、制御部１２は、ｚ位置算出部１８で算出されたｚ位置に基づいて、対物レンズ駆動部２４に制御信号として送信して対物レンズ２１を当該位置へ移動させ（ステップＳ３５６）、収差補正算出装置の動作を終了する。
【０１０９】
この第４の実施形態に係る収差補正算出装置の制御方法（収差補正部の最適位置決定方法）によれば、観察者が任意に選択した観察位置において撮像される画像とほぼ同じフォーカス位置で、かつ、球面収差が最適に補正される補正環２１ａの位置を決定することができる。また、退色補正をすることにより、補正環２１ａの最適位置を決定する処理における観察対象のＴＰの退色の効果を補正できるので、より正確な評価値を求めることができる。
【０１１０】
なお、上述した第４の実施形態に係る収差補正算出装置の制御方法（収差補正部の最適位置決定方法）では、補正環位置を移動させて評価値を算出するときに、最初と最後の評価値（図１４の符号１と符号７の評価値）を比較して、その他の評価値（符号２〜６の評価値）の補正を行っていたが、退色補正をするための評価値の取得は、最初と最後の値の比較に限定されることはない。例えば、図１４と同様に、６箇所の補正環２１ａの位置で評価値を算出する場合について説明すると、図１８に示すように、符号１〜４が付された評価値を算出後に、符号１に対応する位置に補正環２１ａを戻して、符号５の評価値を算出し、続いて、符号６及び７が付された評価値を算出後に、符号１に対応する位置に補正環２１ａを戻して、符号８の評価値を算出する。そして、符号２〜４に対しては、符号１と符号５の評価値の差分から上述した補正を行い、符号６及び７に対しては、符号５と符号８の評価値の差分から上述した補正を行う。移動される補正間の位置が多い場合には、所定の数の位置において評価値を算出したときに、符号１の位置に戻って評価値を算出するという処理を繰り返してもよい。このように、補正環２１ａの位置を最初に取得した位置に戻して評価値を算出するという処理を繰り返すことにより、退色補正の精度を向上させることができる。
【０１１１】
なお、以上で説明した条件及び構成は、それぞれが上述した効果を発揮するものであり、全ての条件及び構成を満たすものに限定されることはなく、いずれかの条件又は構成、或いは、いずれかの条件又は構成の組み合わせを満たすものでも、上述した効果を得ることが可能である。
【０１１２】
以上のような構成により、収差（特に球面収差）が良好な状態を、画像を撮影しながら決定することができる。なお、上述した説明では、電動補正環自動調整を用いた場合について説明したが、補償光学など収差最適化全般に使用可能である。
【符号の説明】
【０１１３】
１０  顕微鏡制御部（補正環制御部、収差補正光学系制御部）
１２  制御部    １３  画像生成部    １４  評価値算出部
１５  補正環位置決定部    １９  評価値補正部
２０  収差補正部    ２１  対物レンズ    ２１ａ  補正環
２１ｂ  収差補正レンズ（収差補正光学系）
２５  検出部    １００  共焦点顕微鏡（顕微鏡）
【図１】
2019215437.tif 000008
【図２】
2019215437.tif 000009
【図３】
2019215437.tif 000010
【図４】
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【図５】
2019215437.tif 000012
【図６】
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【図７】
2019215437.tif 000014
【図８】
2019215437.tif 000015
【図９】
2019215437.tif 000016
【図１０】
2019215437.tif 000017
【図１１】
2019215437.tif 000018
【図１２】
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【図１３】
2019215437.tif 000020
【図１４】
2019215437.tif 000021
【図１５】
2019215437.tif 000022
【図１６】
2019215437.tif 000023
【図１７】
2019215437.tif 000024
【図１８】
2019215437.tif 000025
【図１９】
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