(57)【要約】【課題】不純物量が少なく、特に結晶化度が低いＰＨＡの場合であっても、不純物量が少なく分散性に優れたＰＨＡ分散液を効率的に製造できる方法を提供する。【解決手段】水系媒体と、該水系媒体中に分散したポリヒドロキシアルカノエート粒子とを含むポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法であって、  水系媒体中で、ポリヒドロキシアルカノエートを細胞内に含有する微生物を、該微生物の細胞壁を構成するペプチドグリカンの一部又は全部を残存させたまま洗浄して、前記微生物の細胞構成成分を除去する工程Ａと、  工程Ａの後、高分子分散剤を添加する工程Ｂと、  工程Ｂの後、前記ペプチドグリカンを分解する工程Ｃと、を含む、ポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水系媒体と、該水系媒体中に分散したポリヒドロキシアルカノエート粒子とを含むポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法であって、
水系媒体中で、ポリヒドロキシアルカノエートを細胞内に含有する微生物を、該微生物の細胞壁を構成するペプチドグリカンの一部又は全部を残存させたまま洗浄して、前記微生物の細胞構成成分を除去する工程Ａと、
工程Ａの後、高分子分散剤を添加する工程Ｂと、
工程Ｂの後、前記ペプチドグリカンを分解する工程Ｃと、
を含む、ポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。
【請求項２】
工程Ａにおいて残存させるペプチドグリカンの量が、固形分（１００重量％）に対して０．１重量％以上である、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。
【請求項３】
水系媒体が水である、請求項１又は２に記載のポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。
【請求項４】
高分子分散剤がポリビニルアルコールである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。
【請求項５】
工程Ｃにおいてペプチドグリカンを分解する方法が、生物学的又は物理的又は化学的破砕方法である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。
【請求項６】
工程Ｂにおける高分子分散剤の添加量が、ポリヒドロキシアルカノエート１００重量部に対して０．１〜５重量部である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。
【請求項７】
ポリヒドロキシアルカノエートが、下記一般式（１）
【化１】
2019097518.tif 000005
（式中、ＲはＣｎＨ２ｎ＋１で表されるアルキル基であり、ｎは１以上１５以下の整数である）
で示される繰り返し単位を含むポリヒドロキシアルカノエートから選択される１種以上である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。
【請求項８】
ポリヒドロキシアルカノエートが、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）、及びポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート）からなる群より選択される１種以上である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。
【請求項９】
ポリヒドロキシアルカノエートが、結晶化度３０％以下のポリヒドロキシアルカノエートである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法によりポリヒドロキシアルカノエート分散液を製造し、その後、当該分散液を乾燥させる、固体状のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【請求項１１】
水系媒体と、該水系媒体中に分散したポリヒドロキシアルカノエート粒子とを含み、
前記ポリヒドロキシアルカノエート粒子の平均粒子径が０．０５〜１０μｍであり、
前記ポリヒドロキシアルカノエートが、結晶化度３０％未満のポリヒドロキシアルカノエートであり、
タンパク質の含有量が固形分に対して１．０重量％以下、ペプチドグリカンの含有量が固形分に対して０．１重量％未満である、ポリヒドロキシアルカノエート分散液。
【請求項１２】
水系媒体と、該水系媒体中に分散したポリヒドロキシアルカノエート粒子とを含み、
前記ポリヒドロキシアルカノエート粒子の平均粒子径が０．０５〜１０μｍであり、
前記ポリヒドロキシアルカノエートが、３ＨＨのモル比が１５ｍｏｌ％以上のＰＨＢＨ、４ＨＢのモル比が３６ｍｏｌ％以上のＰ３ＨＢ４ＨＢ及び３Ｈ４ＭＶのモル比が１３ｍｏｌ％以上のＰ３ＨＢ３Ｈ４ＭＶからなる群より選択される少なくとも１種であり、
タンパク質の含有量が固形分に対して１．０重量％以下、ペプチドグリカンの含有量が固形分に対して０．１重量％未満である、ポリヒドロキシアルカノエート分散液。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載のポリヒドロキシアルカノエート分散液を乾燥させてなる、固体状のポリヒドロキシアルカノエート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと称することがある。）を含む樹脂は、細菌や植物により生産することが出来る。微生物を用いてＰＨＡを製造する場合は、微生物の菌体内にＰＨＡが蓄積されるため、微生物の菌体内からＰＨＡを分離して取り出すという工程が必要である。工業的には、ＰＨＡを微生物の培養によって生産した後、ＰＨＡを有機溶媒等で抽出する方法、または、菌体成分を破砕もしくは可溶化させて取り除く方法、あるいはそれらの組み合わせによって精製し回収する。しかしながら、有機溶剤等で抽出する方法では、ＰＨＡを生産性上実用的な濃度に溶解させると、抽出液は極めて粘稠な液体となるため、溶媒に溶解しない菌体残渣とＰＨＡを含む抽出液との分離が非常に困難となったり、溶媒の回収コストや損失溶媒のコストがかかるという生産性上の課題があった。
【０００３】
ＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化させて取り除くことによりＰＨＡを製造する方法として、特許文献１に、ＰＨＡを含む培養液を破砕処理した後、超遠心分離機にてＰＨＡ成分と菌体構成成分を分離し、菌体構成成分を取り除いた後、ＰＨＡ成分に過酸化水素または界面活性剤を作用させ、加熱によりＰＨＡを凝集させて回収する製造方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第１９９６／００６１７８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載されたような従来の方法では、高純度のＰＨＡを含む樹脂組成物を得るためには、懸濁液を超遠心分離により固液分離する工程を必要とし、しかも、培養により生成されるＰＨＡを含む樹脂組成物の平均粒子径が０．１〜５．０μｍと微小であるため、効果的に分離するためには、５，０００〜１０，０００Ｇのきわめて高い遠心力が必要である。実用上、ノズル型ディスクセパレーターを用いることができるが、ＰＨＡを含む樹脂組成物が、高遠心力下で、圧密されスケール化することによって、セパレーター内を閉塞させて連続運転が困難になる等の課題があった。特に、結晶化度が３０％未満の低結晶性  ＰＨＡを含む樹脂組成物は、ＰＨＡ粒子同士が塊状化してしまい、粒子間への不純物の取り込みが起こり、精製が一層困難になる。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、ＰＨＡが低結晶性ＰＨＡの場合であっても、不純物量が少なく、分散性に優れたＰＨＡ分散液が得られる製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、鋭意検討した結果、特定の工程を特定の順番で含む分散液の製造方法によると、ＰＨＡが低結晶性ＰＨＡの場合であっても、不純物量が少なく、分散性に優れたＰＨＡ分散液を製造できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
即ち、本発明は、例えば、以下の［１］〜［１３］に記載の発明を提供する。
【０００９】
［１］水系媒体と、該水系媒体中に分散したポリヒドロキシアルカノエート粒子とを含むポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法であって、
水系媒体中で、ポリヒドロキシアルカノエートを細胞内に含有する微生物を、該微生物の細胞壁を構成するペプチドグリカンの一部又は全部を残存させたまま洗浄して、前記微生物の細胞構成成分を除去する工程Ａと、
工程Ａの後、高分子分散剤を添加する工程Ｂと、
工程Ｂの後、前記ペプチドグリカンを分解する工程Ｃと、
を含む、ポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。
【００１０】
［２］工程Ａにおいて残存させるペプチドグリカンの量が、固形分（１００重量％）に対して０．１重量％以上である、［１］に記載のポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。
【００１１】
［３］水系媒体が水である、［１］又は［２］に記載のポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。
【００１２】
［４］高分子分散剤がポリビニルアルコールである、［１］〜［３］のいずれか１つに記載のポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。
【００１３】
［５］工程Ｃにおいてペプチドグリカンを分解する方法が、生物学的又は物理的又は化学的破砕方法である、［１］〜［４］のいずれか１つに記載のポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。
【００１４】
［６］工程Ｂにおける高分子分散剤の添加量が、ポリヒドロキシアルカノエート１００重量部に対して０．１〜５重量部である、［１］〜［５］のいずれか１つに記載のポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。
【００１５】
［７］ポリヒドロキシアルカノエートが、下記一般式（１）
【化１】
2019097518.tif 000002
（式中、ＲはＣｎＨ２ｎ＋１で表されるアルキル基であり、ｎは１以上１５以下の整数である）
で示される繰り返し単位を含むポリヒドロキシアルカノエートから選択される１種以上である、［１］〜［６］のいずれか１つに記載のポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。
【００１６】
［８］ポリヒドロキシアルカノエートが、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）、及びポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート）からなる群より選択される１種以上である、［１］〜［７］のいずれか１つに記載のポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。
【００１７】
［９］ポリヒドロキシアルカノエートが、結晶化度３０％以下のポリヒドロキシアルカノエートである、［１］〜［８］のいずれか１つに記載のポリヒドロキシアルカノエート分散液の製造方法。
【００１８】
［１０］［１］〜［９］のいずれか１つに記載の製造方法によりポリヒドロキシアルカノエート分散液を製造し、その後、当該分散液を乾燥させる、固体状のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
【００１９】
［１１］水系媒体と、該水系媒体中に分散したポリヒドロキシアルカノエート粒子とを含み、
前記ポリヒドロキシアルカノエート粒子の平均粒子径が０．０５〜１０μｍであり、
前記ポリヒドロキシアルカノエートが、結晶化度３０％未満のポリヒドロキシアルカノエートであり、
タンパク質の含有量が固形分に対して１．０重量％以下、ペプチドグリカンの含有量が固形分に対して０．１重量％未満である、ポリヒドロキシアルカノエート分散液。
【００２０】
［１２］水系媒体と、該水系媒体中に分散したポリヒドロキシアルカノエート粒子とを含み、
前記ポリヒドロキシアルカノエート粒子の平均粒子径が０．０５〜１０μｍであり、
前記ポリヒドロキシアルカノエートが、３ＨＨのモル比が１５ｍｏｌ％以上のＰＨＢＨ、４ＨＢのモル比が３６ｍｏｌ％以上のＰ３ＨＢ４ＨＢ及び３Ｈ４ＭＶのモル比が１３ｍｏｌ％以上のＰ３ＨＢ３Ｈ４ＭＶからなる群より選択される少なくとも１種であり、
タンパク質の含有量が固形分に対して１．０重量％以下、ペプチドグリカンの含有量が固形分に対して０．１重量％未満である、ポリヒドロキシアルカノエート分散液。
【００２１】
［１３］［１１］又は［１２］に記載のポリヒドロキシアルカノエート分散液を乾燥させてなる、固体状のポリヒドロキシアルカノエート。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は上記構成を有するため、ＰＨＡが低結晶性ＰＨＡの場合であっても、不純物量が少なく、分散性に優れたＰＨＡ分散液を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明に係るＰＨＡ分散液の製造方法の実施の一形態について、詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【００２４】
＜ＰＨＡ分散液の製造方法＞
本発明のＰＨＡ分散液の製造方法は、以下の工程Ａ、工程Ｂ及び工程Ｃを必須の工程として含む方法である。
工程Ａ：水系媒体中で、ＰＨＡを細胞内に含有する微生物を、該微生物の細胞壁を構成するペプチドグリカン（ペプチドグリカン層）の一部又は全部を残存させたまま洗浄して、前記微生物の細胞構成成分を除去する工程
工程Ｂ：工程Ａの後、高分子分散剤を添加する工程
工程Ｃ：工程Ｂの後、前記ペプチドグリカンを分解する工程
【００２５】
まず、本発明のＰＨＡ分散液の製造方法により製造されるＰＨＡ分散液（「本発明のＰＨＡ分散液」と称する場合がある）について説明する。本発明のＰＨＡ分散液は、水系媒体と、該水系媒体中に分散したＰＨＡ粒子とを必須成分として含む分散液である。
【００２６】
１．ＰＨＡ（ポリヒドロキシアルカノエート）
本発明のＰＨＡ分散液に含まれるＰＨＡ粒子を構成するＰＨＡは、下記一般式（１）
【化２】
2019097518.tif 000003
（式中、ＲはＣｎＨ２ｎ＋１で表されるアルキル基で、ｎは１以上１５以下の整数である。）
で示される繰り返し単位を含む少なくとも１種以上のＰＨＡであることが好ましい。
【００２７】
上記ＰＨＡは、前記一般式（１）の繰り返し単位を、全繰り返し単位の５０モル％以上含んでいればよく、さらにその他の繰り返し構造を含んでいてもよい。
【００２８】
上記ＰＨＡとしては、例えば、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）、〔ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３-ヒドロキシバレレート−ｃｏ−３-ヒドロキシヘキサノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＶ３ＨＨ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）（ＰＨＢＨ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート）（Ｐ３ＨＢ４ＨＢ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシオクタノエート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシオクタデカノエート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシ−４−メチルバレレート）（Ｐ３ＨＢ３Ｈ４ＭＶ）等が挙げられる。中でも特に、工業的生産が比較的容易であることから、ＰＨＢ、ＰＨＢＶ、Ｐ３ＨＢ３ＨＶ３ＨＨ、ＰＨＢＨ、Ｐ３ＨＢ４ＨＢが好ましい。
【００２９】
上記ＰＨＡとして、３−ヒドロキシブチレートの繰り返し構造単位を有するものを用いる場合、当該繰り返し構造単位の平均組成比は、ＰＨＡの柔軟性と強度のバランスの観点から、８０〜９９モル％であることが好ましい。
【００３０】
本発明のＰＨＡ分散液は、ＰＨＡとして一種を単独で有するものであってもよいし、二種以上を組み合わせて有するものであってもよい。
【００３１】
上記ＰＨＡの分子量は、成形体を製造できる範囲であることが好ましく、特に限定されないが、本発明のＰＨＡ分散液をペレット状に成形（ペレット化）した際の重量平均分子量（Ｍｗ）を目安とすることができる。当該Ｍｗの下限は、強度、伸び率などの機械的特性や成型性に優れる点で、３０万以上が好ましく、より好ましくは４０万以上、さらに好ましくは５０万以上である。また、上記Ｍｗの上限は、加工性に優れる点で、３００万以下が好ましく、より好ましくは２５０万以下、あらに好ましくは２００万以下である。なお、本発明におけるＭｗは、ゲル浸透クロマトグラフィー（昭和電工社製「Ｓｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ−１０１」）を用い、カラムにポリスチレンゲル（昭和電工社製「Ｓｈｏｄｅｘ  Ｋ−８０４」）を用い、クロロホルムを移動相とし、ポリスチレン換算した場合の分子量として求めることができる。この際、検量線は重量平均分子量３１４００、１９７０００、６６８０００、１９２００００のポリスチレンを使用して作成する。
【００３２】
本発明のＰＨＡ分散液におけるＰＨＡは、通常、微生物由来（つまり、微生物により生産された）ＰＨＡである。微生物によりその細胞内で生産されたＰＨＡ（ＰＨＡを細胞内に含有する微生物）を、本発明のＰＨＡ分散液の製造方法における工程Ａ、工程Ｂ及び工程Ｃに付すことにより、本発明のＰＨＡ分散液が得られる。
【００３３】
上記ＰＨＡの生産に用いる微生物としては、ＰＨＡ類生産能を有する微生物であれば特に限定されない。例えば、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）（以下、「ＰＨＢ」と略称する。）生産菌としては、１９２５年に発見されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍが最初で、他にもカプリアビダス・ネケイター（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）（旧分類：アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、ラルストニア・ユートロフア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ））、アルカリゲネス・ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）などの天然微生物が知られており、これらの微生物ではＰＨＢが菌体内に蓄積される。
【００３４】
また、ヒドロキシブチレートとその他のヒドロキシアルカノエートとの共重合体生産菌としては、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）（以下、「ＰＨＢＶ」と略称する。）およびポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート（以下、「ＰＨＢＨ」と略称する。）生産菌であるアエロモナス・キヤビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート）生産菌であるアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）などが知られている。特に、ＰＨＢＨに関し、ＰＨＢＨの生産性を上げるために、ＰＨＡ合成酵素群の遺伝子を導入したアルカリゲネス・ユートロファス  ＡＣ３２株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＣ３２，  ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３８）（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａｔｅｒｉｏｌ．，１７９，ｐ４８２１−４８３０（１９９７））などがより好ましい。また、上記以外にも、生産したいＰＨＡに合わせて、各種ＰＨＡ合成関連遺伝子を導入した遺伝子組み替え微生物を用いてもよい。
【００３５】
本発明のＰＨＡ分散液の製造方法は、後述のように、特にＰＨＡが低結晶性ＰＨＡである場合であったとしても、不純物が少なく分散性に優れたＰＨＡ分散液が得られる点で有効である。低結晶性ＰＨＡとしては、例えば、文献：Ｙ．Ｄｏｉ，Ｓ．ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｈ．Ａｂｅ．，Ｍａｃｒｏｌｅｃｕｌｅｓ．，２８，ｐ４８２２−４８２８（１９９５）に記載の結晶化度が３０％以下のＰＨＡが挙げられる。低結晶性ＰＨＡとしては、より具体的には、前記ＰＨＢＨにおいて、３−ヒドロキシヘキサノエート（以下、「３ＨＨ」と略称する）の組成が１５ｍｏｌ％以上のＰＨＢＨが好適に用いられる。例えば、３ＨＨの組成が１５ｍｏｌ％の場合、結晶化度は２６±５％となり、３ＨＨの組成比が増えるにつれて結晶化度は低下し、３ＨＨ組成が２５ｍｏｌ％では結晶化度は１８±５％となる。また、３ＨＨ組成が１５ｍｏｌ％を超えると、ＰＨＢＨ粒子の付着性が高まり、２５ｍｏｌ％では、室温でガム状となる。なお、結晶化度は通常、その経時的に又はその環境等により変化し得るが、上述の文献に記載の結晶化度は、とり得る結晶化度の最大値の意味である。
【００３６】
低結晶性ＰＨＡとしては、例えば、ＰＨＢＨであれば、３ＨＨのモル比が１５ｍｏｌ％以上のＰＨＢＨ、特に３ＨＨのモル比が１８ｍｏｌ％以上のＰＨＢＨ等が挙げられる。これらＰＨＢＨの３ＨＨのモル比の上限は特に限定されず、例えば、２５ｍｏｌ％以下であってもよい。また、低結晶性ＰＨＡがＰ３ＨＢ４ＨＢであれば、４ＨＢのモル比が３６ｍｏｌ％以上のＰ３ＨＢ４ＨＢ、特に４ＨＢのモル比が３９ｍｏｌ％以上のＰ３ＨＢ４ＨＢ等が挙げられる。これらＰ３ＨＢ４ＨＢの４ＨＢのモル比の上限は特に限定されず、例えば、５０ｍｏｌ％以下であってもよい。また、低結晶性ＰＨＡがＰ３ＨＢ３Ｈ４ＭＶであれば、３Ｈ４ＭＶのモル比が１３ｍｏｌ％以上のＰ３ＨＢ３Ｈ４ＭＶ、特に３Ｈ４ＭＶのモル比が１５ｍｏｌ％以上のＰ３ＨＢ３Ｈ４ＭＶ等が挙げられる。これらＰ３ＨＢ３Ｈ４ＭＶの３Ｈ４ＭＶのモル比の上限は特に限定されず、例えば、４０ｍｏｌ％以下であってもよい。
【００３７】
上述の微生物によりＰＨＡを生産させる方法としては、公知乃至慣用の方法を適用でき、特に限定されないが、これらの微生物を適切な条件で培養して菌体内にＰＨＡを蓄積させる方法等が挙げられる。生産したＰＨＡに合わせて基質の種類を含む培養条件の最適化を適宜実施することができる。
【００３８】
２．水系媒体
本発明のＰＨＡ分散液を構成する水系媒体としては、例えば、水；メタノール、エタノール、エチレングリコール等のアルコール類；エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル等のエーテル類等が挙げられる。中でも、入手性や取り扱い性に優れている点で、水が好ましい。
【００３９】
［工程Ａ］
本発明のＰＨＡ分散液の製造方法における工程Ａは、上述のように、水系媒体中で、ＰＨＡを細胞内に含有する微生物を、該微生物の細胞壁を構成するペプチドグリカンの一部又は全部を残存させたまま洗浄して、前記微生物の細胞構成成分を除去する工程である。
【００４０】
工程Ａにおける「ＰＨＡを細胞内に含有する微生物」としては、上述のようなＰＨＡを生産可能な微生物を培養したものを用いることができる。例えば、前記微生物を培養後の培養液や当該培養液を水系媒体等で希釈したもの等を用いることができる
【００４１】
工程Ａにおいては、上記微生物をペプチドグリカンの一部又は全部を残存させたまま洗浄する。これにより、残存させるペプチドグリカン以外の微生物構成成分が除去され、これにより、水系媒体と、表面の一部又は全部にペプチドグリカン（ペプチドグリカン層）を有するＰＨＡ粒子とを含む分散液が得られる。
【００４２】
ペプチドグリカンとは、微生物など大部分の原核生物の細胞壁成分をなす糖ペプチドのポリマーである。ペプチドグリカンは、Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｃ  ａｃｉｄまたはＮ−ｇｌｙｃｏｓｙｌｍｕｒａｍｉｃ  ａｃｉｄとＤ−アミノ酸を含み、グリカン鎖とペプチド鎖とが網目状に結合して三次元構造を構築し、物理的に極めて堅固な構造を形成している。
【００４３】
工程Ａにおいて残存させるペプチドグリカンの量は、工程Ａで得られる分散液の固形分１００重量％に対して０．１重量％以上が好ましく、より好ましくは０．２重量％以上、さらに好ましくは０．５重量％以上であり、また、１．０重量％以上が好ましい。ペプチドグリカンの含有量を０．１重量％以上とすることにより、粒子同士が塊状化することなく水分散液が得られる。一方、工程Ａの工程Ｃにより、ペプチドグリカンの含有量を０．１重量％以下とすることにより、菌体由来の不純物を低減することができる。本発明のＰＨＡ粒子におけるペプチドグリカンの含有量は、例えば、実施例に記載した方法により測定できる。
【００４４】
工程Ａにおいてペプチドグリカンを残存させたまま洗浄する方法は、適宜選択可能であるが、例えば、微生物構成成分を破砕するための物理的処理（物理的破砕処理）、化学的処理（化学的破砕処理）、生物学的処理（生物学的破砕処理）等が挙げられる。これらの処理を実施するにあたっては、少なくともペプチドグリカンを残存させる方法や条件をとることが重要である。
【００４５】
物理的破砕処理の方法としては、特に限定されないが、従来公知のフレンチプレスや高圧ホモジナイザー、Ｘ−プレス、ボールミル、コロイドミル、ＤＹＮＯミル、超音波ホモジナイザーなどの、流体せん断力や固体せん断力、磨砕を利用した方法を好適に用いることができる。高圧ホモジナイザーを用いる場合、操作圧力を高めると、微生物由来の不純物が減少する傾向があるので、ペプチドグリカンが０．１重量％以上になるように操作圧力を調整すると良い。
【００４６】
化学的破砕処理、生物学的破砕処理の方法としては、例えば、酸やアルカリ、界面活性剤、有機溶剤、細胞壁合成阻害剤などの薬剤を用いる方法、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、チモリアーゼなどの酵素を用いる方法、超臨界流体を用いる方法や、浸透圧破砕法、凍結法、乾燥粉砕法などが挙げられる。また、細胞自身に含まれるプロテアーゼやエステラーゼなどの作用を利用する自己消化法も破砕法の一種として挙げられる。上記破砕方法においては、一連の処理によるＰＨＡの分子量低下を抑える方法を選択することが望ましい。また、これらの破砕方法は単独で用いても良いし、複数の方法を組み合わせても良い。また、バッチ処理でも良いし、連続処理を行っても良い。
【００４７】
生物学的破砕処理としては、特に限定されないが、例えば、酵素を用いる方法が挙げられる。酵素としては、蛋白質分解酵素、脂質分解酵素、細胞壁分解酵素、核酸分解酵素等が挙げられる。これらの酵素の具体例としては下記のものが挙げられる。これらは、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
（１）蛋白質分解酵素
エスペラーゼ、アルカラーゼ、ペプシン、トリプシン、パパイン、キモトリプシン、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等
（２）脂質分解酵素
リパーゼ、ホスホリパーゼ、コリンエステラーゼ、ホスファターゼ等
（３）核酸分解酵素
リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ等
【００４８】
生物学的破砕処理に用いられる酵素は、上記のものに限定されるわけではなく、工業的な製品に用いられ得るものであれば、微生物由来成分を分解する活性を有する任意の酵素であってよい。また、一般に市販されている洗濯用酵素洗剤等も用いることができる。さらには、例えば、酵素の安定化剤や再汚染防止剤等と酵素とを含有する酵素組成物であってもよく、酵素のみには限定されない。好ましい蛋白質分解酵素としては、上記例示に含まれるもののうち、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＰ、プロテアーゼＮ（以上、天野エンザイム社製）、エスペラーゼ、アルカラーゼ、ザビナーゼ、エバラーゼ（以上、ノボザイム社製）等が工業的に使用可能なものとして挙げられ、分解活性の点からも好適に使用できる。しかし、これらに限られるものではない。
【００４９】
一方、酵素の中でも細胞壁分解酵素は、工程Ａにおいてペプチドグリカンを少なくとも残存させることができる（例えば、０．１重量％以上残存させることができる）ように制御できる範囲で使用してもよい。細胞壁分解酵素としては、例えば、リゾチーム、アミラーゼ、セルラーゼ、マルターゼ、サッカラーゼ、α−グリコシダーゼ、β−グリコシダーゼ、Ｎ−グリコシダーゼ等が挙げられる。
【００５０】
酵素処理時間は、所望の処理度を達成するまで行うのが好ましく、通常０．５〜２時間である。酵素の使用量は、酵素の種類及び活性に依存し、特に制限はされないが、ＰＨＡ１００重量部に対して、０．００１〜１０重量部が好ましく、さらにはコストの点から０．００１〜５重量部がより好ましい。
【００５１】
化学的破砕処理としては、例えば、次亜塩素酸や過酸化水素を用いる方法が挙げられる。次亜塩素酸を用いる際は、系のｐＨをアルカリ領域とし、熱や光、金属との接触を抑制した条件で実施することで、塩素残量の低いＰＨＡ粒子を得ることができる。ｐＨは８以上が望ましく、より望ましくは１０以上、さらに望ましくは１２以上である。処理温度は４０℃以下が望ましく、より望ましくは３０℃以下であり、さらに望ましくは２０℃以下、確実に効果を発揮するためには１０℃以下で実施することが望ましい。
【００５２】
通常、上記方法にてＰＨＡを細胞内に含有する微生物を物理的破砕処理、化学的破砕処理又は生物学的破砕処理して得た水性懸濁液には、細胞中のタンパク質や核酸、脂質、糖成分およびその他の菌体構成成分や、培養基質残分などが混入している。これらのタンパク質等を含む水を分離する操作を実施することが好ましい。これにより、上記水性懸濁液に含まれる不純物の量を低減することができる。当該操作としては特に限定されないが、ろ過や遠心分離、沈降分離による方法が挙げられる。
【００５３】
上述したように工程Ａでは、ろ過や遠心分離等を実施することができる。ろ過の方法は特に制限がないが、ヌッチェなどを用いる方法や、吸引ろ過や加圧ろ過などの方法が望ましい。工業的にはフィルタープレス、チューブプレス、プレートプレス、ゲージプレス、ベルトプレス、スクリュープレス、円板プレスなどの圧搾機能を有したろ過装置や、遠心脱水機、多室円筒ろ過機なども選択可能である。生産性を高める場合には多室円筒ろ過機などの連続式が望ましい。連続式ろ過機の粒子の除滓方法として、ストリング方式、スクレパー方式、プレコートスクレパー方式などが挙げられる。また、膜分離方式を用いてもよい。膜分離を含めたろ過の方法としては、デッドエンドろ過、クロスフローろ過を選択することができる。いずれもろ過性やろ材、膜などへの閉塞の程度などから選択できる。また減圧、あるいは真空にしてもよいし、加圧してもよい。また、遠心力を用いる方法であってもよい。ろ材としては、紙、織布、不織布、スクリーン、焼結板、素焼、高分子膜、パンチングメタル、ウェッジワイヤーなど様々な素材を選択できる。いずれも生産性や閉塞の程度などから選択できる。また、ろ過助剤を用いてもよいし、用いなくともよい。ろ過助剤を用いる場合にも、ろ材に予めプレコートしておく方法（プレコート方式）、ろ過原液に予め添加しておく方法がある（ボディーフィード法）。
【００５４】
工程Ａにおける遠心分離の方法は特に限定されないが、遠心沈降機や遠心脱水機等を使用できる。遠心沈降機であれば分離板型、円筒型、デカンター型が挙げられる。分離板型であれば、ディスク型、セルフクリーニング型、ノズル型、スクリューデカンター型、スキミング型などが挙げられる。それぞれ沈降成分の排出の方法により回分式と連続式がある。また遠心脱水機についても回分式と連続式が挙げられる。これらの機器によって比重差により、ＰＨＡ粒子を含む沈降物と、培養液成分とを分離することが可能である。
【００５５】
前記洗浄工程で使用可能な他の方法としてはフローテーション法、電気泳動法、サイクロン処理などが挙げられる。ろ過や遠心分離、またフローテーションなどの方法を単独で用いてもよいし、組み合わせてもよい。
【００５６】
上述のように、ろ過や遠心分離などの方法でＰＨＡ粒子（ペプチドグリカンが残存したＰＨＡ粒子）を回収した後、当該ＰＨＡ粒子を水等の水系媒体で洗浄することで、更に精製度を高めたＰＨＡ粒子を得ることができる。洗浄は水以外にも有機溶媒を使用してもよいし、水と有機溶媒を混合して用いても良い。また水のｐＨを調整してもよい。有機溶媒を洗浄溶媒として用いる場合、好ましくは、親水性溶媒、具体的にはメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ケトン類、アミン類などを用いる。また界面活性剤などを水に添加してもよい。これらの有機溶媒や水を複数種類混合して用いてもよい。また、短時間であれば水やこれらの有機溶媒を加温あるいは蒸気として噴霧することで洗浄性を高めることもできる。
【００５７】
工程Ａでは、上述の操作を施すことによって、水系媒体と、該水系媒体中に分散したＰＨＡ粒子（ペプチドグリカンが残存したＰＨＡ粒子）とを含む分散液が得られる。
【００５８】
［工程Ｂ］
本発明のＰＨＡ分散液の製造方法における工程Ｂは、上述のように、工程Ａの後、高分子分散剤を添加する工程である。即ち、工程Ａで得られた分散液（水系媒体と、該水系媒体中に分散したＰＨＡ粒子（ペプチドグリカンが残存したＰＨＡ粒子）とを含む分散液）に対して高分子分散剤を添加する工程である。高分子分散剤を添加した後に撹拌することもできる。
【００５９】
工程Ｂにおいて使用される高分子分散剤としては、例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリアクリル酸カリウム、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸ナトリウム等の水溶性高分子が挙げられる。中でも、添加量の割に良好な分散性が得られる点から、ＰＶＡが好ましい。高分子分散剤は、一種を単独で使用することもできるし、二種以上を組み合わせることもできる。
【００６０】
工程Ｂにおける高分子分散剤の添加量は、特に限定されないが、分散液１００重量％に対して０．１重量％以上が好ましく、より好ましくは１重量％以上、さらに好ましくは３重量％以上である。また、工程Ｂにおける高分子分散剤の添加量は、特に限定されないが、ＰＨＡ１００重量部に対して０．１〜５重量部が好ましく、より好ましくは０．５〜４重量部、さらに好ましくは１〜３．５重量部である。添加量を上記範囲に制御することにより、分散安定性にいっそう優れたＰＨＡ分散液が得られる傾向がある。
【００６１】
［工程Ｃ］
本発明のＰＨＡ分散液の製造方法における工程Ｃは、上述のように、工程Ｂの後、前記ペプチドグリカンを分解する工程である。即ち、工程Ａにおいて残存させたペプチドグリカンを分解する工程である。
【００６２】
工程Ｃにおいてペプチドグリカンを分解する方法としては、公知乃至慣用の方法を適用でき、特に限定されないが、生物学的破砕方法、物理的破砕方法、化学的破砕方法等の一種以上が挙げられる。これら方法としては、より具体的には例えば、細胞壁分解酵素処理、高圧破砕処理、超音波処理等が挙げられる。これら処理は、一種を単独で実施してもよいし、二種以上を組み合わせて実施してもよい。細胞壁分解酵素としては、上記で例示したものを使用することができる。高圧破砕処理は、例えば高圧ホモジナイザーを使用することにより実施でき、特にその処理の圧力、時間を制御することにより、細胞壁を効率的に分解することができる。高圧破砕処理時の圧力としては、５００ｋｇ／ｃｍ２以上が好ましく、より好ましくは８００ｋｇ／ｃｍ２以上である。上限は特に限定されないが、圧力を高めすぎると分散液の温度が上昇し、ＰＨＡの分子量が低下する恐れがあるのでで、２０００ｋｇ／ｃｍ２以下が好ましい。高圧破砕処理時間は、特に限定されず、その圧力に応じて適宜変更できる。超音波処理の場合は、特に超音波の照射時間を制御することにより、細胞壁を効果的に分解することができる。超音波照射時間としては、０．５分以上が好ましく、より好ましくは５分以上である。上限は、特に限定されないが、照射時間が長くなると分散液の温度が上昇し、ＰＨＡの分子量が低下する恐れがあるので、２０分以下が好ましい。また、化学的破砕方法としては、例えば、次亜塩素酸又はその塩を使用することにより細胞壁を効果的に分解する方法が挙げられる。例えば、次亜塩素酸又はその塩を用いる場合には、分散液中の固形分当たり有効塩素濃度０．３〜１５重量％の次亜塩素酸又はその塩と１０分〜５時間接触させると良い。
【００６３】
工程Ｃにおいては、細胞壁の分解処理を実施した後、分散液中になお残存する細胞壁やその分解物を分散液から除去することが好ましい。当該除去の方法としては、公知乃至慣用の方法を適用でき、特に限定されないが、例えば、工程Ｃの後、以下の凝集工程（工程Ｄと称する場合がある）及び脱水工程（工程Ｅと称する場合がある）を実施する方法、工程Ｃの後、工程Ｅを実施する方法等が挙げられる。
【００６４】
［工程Ｄ］
工程Ｄは、工程Ｃの後、分散液中のＰＨＡ（ＰＨＡ粒子）を凝集させる工程である。ＰＨＡを凝集させる方法としては、分散液を加熱処理する方法が挙げられる。なお、本願において凝集とは、ＰＨＡ粒子の体積平均粒径が、凝集操作前のＰＨＡ体積平均粒径に対して５倍以上、望ましくは１０倍以上、より望ましくは１５倍以上となることを指している。
【００６５】
本工程において、加熱処理は、ＰＨＡの分子量低下を抑止する点で、できるだけ低温で行うことが好ましい。具体的には、加熱温度の上限は、ＰＨＡ種により適宜選択すれば良いが、１３０℃以下が好ましく、より好ましくは１１０℃以下である。また、加熱温度の下限は特に限定されないが、より大きい粒径のＰＨＡ粒子の凝集体を製造するため、ＰＨＡの融点以上が好ましく、５０℃以上がより好ましい。加熱時間は、使用する装置などにより適宜選択すれば良いが、加熱温度に達してから、１０分以下が好ましく、１分以下がより好ましい。また加熱時間の下限値は少なくとも１秒間以上が好ましい。
【００６６】
加熱処理を実施する際の分散液のｐＨは特に限定されないが、ｐＨ５以下の酸性領域にあってもよい。ｐＨ５以下とすることで、加熱時のＰＨＡ分子量の低下を抑制することができる傾向がある。
【００６７】
［工程Ｅ］
工程Ｅは、工程Ｃ又は工程Ｄの後、分散液中に存在する菌体由来のタンパク質や核酸、脂質、糖成分およびその他の菌体構成成分や、培養基質残分等不純物を、一部の水と共に除去する工程である。本工程により、不純物の除去を効果的に行うことができる。脱水の方法としては特に限定されないが、ろ過や遠心分離、沈降分離等、一般的な脱水方法を好ましく用いることができる。当該方法により脱水して得られた上清を除去することによって、上述の不純物を除去することができる。また、脱水工程において得られる脱水物（脱水樹脂）の含水率は、不純物除去の点で、８０％以下が好ましく、５０％以下がより好ましく、２５％以下がより好ましい。なお、上記含水率は、水分／（水分＋固形分）×１００（％）により算出される。
【００６８】
工程Ｅにより、ペプチドグリカンの含有量を、分散液の固形分１００重量％に対して、０．１重量％未満とすることが好ましく、より好ましくは０．０５重量％未満、さらに好ましくは０．０１重量％未満である。ペプチドグリカンの含有量を０．１重量％未満とすることにより、ＰＨＡ粒子の純度をよりいっそう向上できる傾向がある。ペプチドグリカンの含有量は、実施例に記載の方法により測定することができる。
【００６９】
工程Ｅにおいて得られた脱水物（脱水樹脂）をさらに水系媒体に分散させることにより、不純物のいっそう少ないＰＨＡ分散液（本発明のＰＨＡ分散液）を得ることができる。また、一方、さらに脱水物（脱水樹脂）を乾燥させることによって、固体状のＰＨＡを得ることができる。乾燥方法は適宜選択でき、特に限定されないが、例えば、スプレー乾燥、気流乾燥、流動乾燥、バンド乾燥などの一般的な乾燥方法を好ましく用いることができる。
【００７０】
本発明のＰＨＡ分散液の製造方法は、上述の工程以外の工程（その他の工程）をさらに含んでいてもよい。その他の工程としては、例えば、高分子分散剤以外の成分（「その他の成分」と称する場合がある）を添加する工程が挙げられ、その実施のタイミングは適宜選択可能である。その他の成分としては、界面活性剤、防腐剤等が挙げられる。界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム及びオレイン酸ナトリウム等）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテルやポリオキシアルキレンアルキルエーテル等）等が挙げられる。防腐剤としては、過酸化水素、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、ヒノキチオール、パラベン等が挙げられる。
【００７１】
本発明のＰＨＡ分散液の製造方法は、上述の工程Ａ〜Ｃを上述の順で含むことにより、分散性に優れ、なおかつ不純物が低減されたＰＨＡ分散液（本発明のＰＨＡ分散液）を得ることができる。本発明のＰＨＡ分散液の製造方法によれば、特にＰＨＡが低結晶性ＰＨＡ（例えば、結晶化度３０％以下のＰＨＡ）の場合であっても、その分散液を効率的に得ることが可能である。従来のＰＨＡ分散液の製造方法によると、低結晶性ＰＨＡの分散液を得ることは困難であった（例えば、比較例１参照）。
【００７２】
本発明のＰＨＡ分散液におけるＰＨＡ粒子（特に、低結晶性ＰＨＡ粒子）の平均粒子径は、特に限定されないが、０．０５〜１０μｍが好ましく、より好ましくは０．３〜５．０μｍ、さらに好ましくは０．５〜３．０μｍである。上記平均粒子径は、マイクロトラック粒度計（日機装）などの汎用粒度計を用い、ＰＨＡ水分散液を所定濃度に調整し、正規分布の全粒子５０％蓄積量に対する粒子径（体積平均粒径）として測定される。平均粒子径が上記範囲にあることにより、ハンドリング性、水分散性及び製膜性がいっそう向上する傾向がある。
【００７３】
本発明のＰＨＡ分散液におけるタンパク質の含有量は、その固形分に対して１．０重量％以下が好ましく、より好ましくは０．５重量％以下である。タンパク質の含有量を１．０％以下に制御することにより、ＰＨＡ分散液を使用して製造した成形物の着色が抑制されたり、当該成形物の加熱時の臭気発生が抑制される傾向がある。タンパク質の含有量の下限は、特に限定されず、０重量％であることが最も好ましいが、例えば０．０１重量％以上であってもよい。タンパク質の含有量は、例えば、実施例に記載した方法により牛血清アルブミン換算の量として測定できる。
【００７４】
本発明のＰＨＡ分散液におけるペプチドグリカンの含有量は、その固形分に対して０．１重量％未満が好ましく、より好ましくは０．０５重量％未満、さらに好ましくは０．０１重量％未満である。
【００７５】
本発明のＰＨＡ分散液の固形分に対するＰＨＡの含有量は、９８．０重量％以上が好ましく、より好ましくは９８．５重量％以上、さらに好ましくは９９．０重量％以上である。ＰＨＡの含有量の上限は特に限定されないが、９９．９重量％以下が好ましく、より好ましくは９９．８重量％以下、さらに好ましくは９９．５重量％以下である。ＰＨＡの含有量を９８．０重量％以上とすることにより、溶融加工がしやすく、加熱成形時の臭気がいっそう低減された成形体が得られる傾向がある。一方、ＰＨＡの含有量を９９．９重量％以下とすることにより、高分子分散剤量が確保されるため、ＰＨＡ分散液の分散安定性がいっそう向上する傾向がある。ＰＨＡの含有量は、例えば、ガスクロマトグラフやＴＧ−ＤＴＡより求めることができ、より具体的には実施例に記載した方法により測定できる。
【００７６】
本発明のＰＨＡ分散液に分散したＰＨＡ粒子は、粒子状のＰＨＡである。粒子状であればその形状は特に限定されず、粒状、略球状、球状、繊維状、針状、柱状、棒状、板状、これらに類する形状、不定形状等のいずれであってもよい。微生物産生ＰＨＡから製造した本発明のＰＨＡ分散液におけるＰＨＡ粒子形状は、通常、粒状である。
【００７７】
本発明のＰＨＡ分散液の製造方法によりＰＨＡ分散液を製造し、その後、当該分散液を乾燥させることにより、固体状のＰＨＡを得ることができる。ＰＨＡ分散液の乾燥方法は特に限定されず、公知乃至慣用の方法を採用することができる。
【００７８】
本発明のＰＨＡ分散液の製造方法により製造されるＰＨＡ分散液や当該分散液から得られるＰＨＡは、ＰＨＡに含まれる菌体由来の不純物が少ないため、農業、漁業、林業、園芸、医学、衛生品、食品産業、衣料、非衣料、包装、自動車、建材、その他の分野に好適に用いることができる。特に、薬物担体などの生体適合性プラスチック等の医学、衛生品分野に特に好適に用いることができる。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によりその技術範囲を限定されるものではない。
【００８０】
（残存タンパク量（ＰＨＡ重量あたり）の算出法）
実施例、比較例で得られた乾燥サンプル１ｍｇを、蒸留水１ｍｌに懸濁したのち、（株）タカラバイオBCATM Protein Assay Kitにて調整した溶液を加え、６０℃で３０分間処理した。これを冷却後、（株）島津製作所吸光度計ＵＶ−１７００にて分析して、牛血清アルブミン換算の残存タンパク量を求めた。
【００８１】
（ＹＩ値の測定方法）
実施例、比較例で得られた乾燥サンプル１〜３ｇを１００ｍｍ×１００ｍｍ×０．５ｍｍのステンレス製の板に挟み、１７０℃に熱したプレス機で１０分間溶融させてシートとし、日本電色工業（株）製分光式色彩計ＳＥ−２０００で測定を行い、黄色度指数（ＹＩ値）を求めた。
【００８２】
（重量平均分子量の測定方法）
実施例、比較例で得られた乾燥サンプルについて、ゲル浸透クロマトグラフィー（昭和電工社製「Ｓｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ−１０１」）を用い、カラムにポリスチレンゲル（昭和電工社製「Ｓｈｏｄｅｘ  Ｋ−８０４」）を用い、クロロホルムを移動相として、標準ポリスチレン換算の分子量を測定し、当該分子量から重量平均分子量を算出した。
【００８３】
（平均３ＨＨ組成の測定方法）
乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥し、ＰＨＡを得た。得られたＰＨＡの３ＨＨ組成分析は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。乾燥ＰＨＡ２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱して、ＰＨＡ分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のポリエステル分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィー島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ  ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）により分析した。
【００８４】
（ペプチドグリカンの含有量）
実施例で得られたＰＨＡ分散液に、（株）和光純薬工業 SLP-HS  Single Reagent Setにて調製した溶液を加え、これを３０℃の条件でパワースキャンHT（DSファーマバイオメディカル製）にて、吸光度(６５０ｎｍ)を１２０分間測定した。測定された吸光度から、ペプチドグリカン量を求めた。
【００８５】
（製造例１）ＰＨＡを含む培養液の製造
培養生産にはＫＮＫ−２５２株（ＷＯ２００９／１４５１６４参照）を用いた。
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％  Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％  Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４であり、ｐＨを６．８とした。
前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％  微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、とした。炭素源はパーム油とし、これを１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。
ＰＨＡ生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、０．２９１ｗ／ｖ％  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％  微量金属塩溶液（０．１Ｎ  塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、０．０５ｗ／ｖ％  ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。
【００８６】
まず、ＫＮＫ−２５２株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
【００８７】
次に、前培養液を６Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ−１０００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量６．０Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。培養を、炭素源としてＰＦＡＤ（Ｐａｌｍ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｅ）を使用し、６４時間行い、培養液を製造した。上記で得たＰＨＡ（ＰＨＢＨ）を含む菌体培養液について、遠心分離を行うことによって菌体を回収し、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体を得た。この乾燥菌体の重量を測定したところ、２５５ｇ／Ｌであり、ＰＨＡ濃度は８２％であった。当該ＰＨＡの３ＨＨ組成、重量平均分子量を測定したところ、それぞれ１６．９ｍｏｌ％、１２０万であった。このＰＨＡ（ＰＨＢＨ）の上述の結晶化度は３０％である。
【００８８】
実施例１
＜工程Ａ：洗浄工程＞
製造例１で得られたＰＨＡを含む菌体培養液を、８０℃で１時間加熱して滅菌した。次に、ＰＨＡの１／１００重量部のプロテアーゼ（ノボザイム社、エスペラーゼ）を添加し、ｐＨ８．０で５０℃に保持したまま、２時間攪拌した。その後、この液に対して１．０％重量になるように３０％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加し、さらに、ｐＨが１１．５になるように３０％水酸化ナトリウム水溶液を添加した後、５０℃で１時間保温した。その後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で約２００ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で高圧破砕を行った。高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに６回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてＰＨＡ粒子濃度を５０％に調整し、分散液を得た。本分散液におけるペプチドグリカンの含有量は、固形分に対して０．８重量％であった。
【００８９】
＜工程Ｂ：分散剤添加工程＞
工程Ａで得られた分散液に対して、当該分散液に含まれるＰＨＡ１００重量部に対するＰＶＡの割合が２．５重量部になるように、２０％ＰＶＡ（クラレ製ＰＶＡ２０３）水溶液を添加し、よく攪拌した。
【００９０】
＜工程Ｃ：細胞壁分解工程＞
工程Ｂで得られた分散液を、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で約５００ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で高圧破砕を行って、細胞壁の分解を実施した。当該高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに６回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてＰＨＡ粒子濃度を５０％に調整し、ＰＨＡ分散液を得た。
【００９１】
当該ＰＨＡ分散液におけるＰＨＡ粒子の粒子径を、マイクロトラックＭＴ３３００ＥＸＩＩ（日機装製）にて測定した。また、得られた水分散液をヌッチェで脱水後、加熱・減圧下で乾燥させて乾燥サンプルを取得し、分子量、タンパク質およびペプチドグリカンの量を求めた。結果を表１に示す。
【００９２】
実施例２
＜工程Ａ：洗浄工程＞
製造例１で得られたＰＨＡを含む菌体培養液を、８０℃で１時間加熱して滅菌した。次に、ＰＨＡの１／１００重量部のプロテアーゼ（ノボザイム社、エスペラーゼ）を添加し、ｐＨ８．０で５０℃に保持したまま、２時間攪拌した。その後、この液に対して１．０％重量になるように３０％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加し、さらに、ｐＨが１１．５になるように３０％水酸化ナトリウム水溶液を添加した後、５０℃で１時間保温した。その後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で約２００ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で高圧破砕を行った。高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに６回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてＰＨＡ粒子濃度を５０％に調整し、分散液を得た。本分散液におけるペプチドグリカンの含有量は、固形分に対して０．８重量％であった。
【００９３】
＜工程Ｂ：分散剤添加工程＞
工程Ａで得られた分散液に対して、当該分散液に含まれるＰＨＡ１００重量部に対するＰＶＡの割合が２．５重量部になるように、２０％ＰＶＡ（クラレ製ＰＶＡ２０３）水溶液を添加し、よく攪拌した。
【００９４】
＜工程Ｃ：細胞壁分解工程＞
工程Ｂで得られた分散液を、超音波破砕機（日本精機製作所社製ＵＳ−１５０Ｔ型）で出力１００％、照射時間５ｍｉｎの条件で分散液を冷却しながら超音波破砕を行った。当該超音波破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに６回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてＰＨＡ粒子濃度を５０％に調整し、ＰＨＡ分散液を得た。
【００９５】
当該ＰＨＡ分散液におけるＰＨＡ粒子の粒子径を、マイクロトラックＭＴ３３００ＥＸＩＩ（日機装製）にて測定した。また、得られたＰＨＡ分散液をヌッチェで脱水後、加熱・減圧下で乾燥させて乾燥サンプルを取得し、分子量、タンパク質およびペプチドグリカンの量を求めた。結果を表１に示す。
【００９６】
実施例３
＜工程Ａ：洗浄工程＞
製造例１で得られたＰＨＡを含む菌体培養液を、８０℃で１時間加熱して滅菌した。次に、ＰＨＡの１／１００重量部のプロテアーゼ（ノボザイム社、エスペラーゼ）を添加し、ｐＨ８．０で５０℃に保持したまま、２時間攪拌した。その後、この液に対して１．０％重量になるように３０％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加し、さらに、ｐＨが１１．５になるように３０％水酸化ナトリウム水溶液を添加した後、５０℃で１時間保温した。その後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で約２００ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で高圧破砕を行った。高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに６回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてＰＨＡ粒子濃度を５０％に調整し、分散液を得た。本分散液におけるペプチドグリカンの含有量は、固形分に対して０．８重量％であった。
【００９７】
＜工程Ｂ：分散剤添加工程＞
工程Ａで得られた分散液に対して、当該分散液に含まれるＰＨＡ１００重量部に対するＰＶＡの割合が２．５重量部になるように、２０％ＰＶＡ（クラレ製ＰＶＡ２０３）水溶液を添加し、よく攪拌した。
【００９８】
＜工程Ｃ：細胞壁分解工程＞
工程Ｂで得られた分散液を、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で約５００ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で高圧破砕を行った。
【００９９】
工程Ｃで得られたＰＨＡ分散液について、スプレー乾燥機（ＧＥＡ社製モービルマイナー２０００）にて水分を蒸発させ、平均粒子径１００μｍの粉体を取得した。
【０１００】
実施例４
＜工程Ａ：洗浄工程＞
製造例１で得られたＰＨＡを含む菌体培養液を、８０℃で１時間加熱して滅菌した。次に、ＰＨＡの１／１００重量部のプロテアーゼ（ノボザイム社、エスペラーゼ）を添加し、ｐＨ８．０で５０℃に保持したまま、２時間攪拌した。その後、この液に対して１．０％重量になるように３０％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加し、さらに、ｐＨが１１．５になるように３０％水酸化ナトリウム水溶液を添加した後、５０℃で１時間保温した。その後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で約２００ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で高圧破砕を行った。高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに６回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてＰＨＡ粒子濃度を５０％に調整し、分散液を得た。本分散液におけるペプチドグリカンの含有量は、固形分に対して０．８重量％であった。
【０１０１】
＜工程Ｂ：分散剤添加工程＞
工程Ａで得られた分散液に対して、当該分散液に含まれるＰＨＡ１００重量部に対するＰＶＡの割合が２．５重量部になるように、２０％ＰＶＡ（クラレ製ＰＶＡ２０３）水溶液を添加し、よく攪拌した。
【０１０２】
＜工程Ｃ：細胞壁分解工程＞
工程Ｂで得られた分散液を、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で約５００ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で高圧破砕を行った。当該高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに６回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてＰＨＡ粒子濃度を５０％に調整し、ＰＨＡ分散液を得た。
【０１０３】
＜凝集工程＞
工程Ｃで得られたＰＨＡ分散液を８０℃に昇温し、到達後すぐに冷却した。昇温にかかった時間は１０分であった。凝集工程後のＰＨＡ粒子の平均粒子径は１０００μｍであった。
【０１０４】
＜脱水工程＞
加熱凝集工程後のＰＨＡ分散液を、目開き５０μｍのふるいを用いて脱水した。脱水樹脂の含水率は５５％であった。
【０１０５】
＜乾燥工程＞
脱水工程で得られた湿樹脂を箱型乾燥機にて６０℃で２日間乾燥した。得られた乾燥サンプルについて、分子量、タンパク質およびペプチドグリカンの量を求めた。
【０１０６】
比較例１
製造例１で得られたＰＨＡを含む菌体培養液を、８０℃で１時間加熱して滅菌した。次に、ＰＨＡの１／１００重量部のプロテアーゼ（ノボザイム社、エスペラーゼ）を添加し、ｐＨ８．０で５０℃に保持したまま、２時間攪拌した。その後、この液に対して１．０％重量になるように３０％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加し、さらに、ｐＨが１１．５になるように３０％水酸化ナトリウム水溶液を添加した後、５０℃で１時間保温した。その後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で約５００ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で高圧破砕を行った。高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗を繰り返そうとしたが、沈降物が塊状化した。この沈殿物をヌッチェで脱水後、加熱・減圧下で乾燥させて乾燥サンプルを取得し、分子量、タンパク質およびペプチドグリカンの量を求めた。
【０１０７】
【表１】
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