(57)【要約】      （修正有）【課題】長期保存することが可能な成長因子混合物およびその製造方法の提供。【解決手段】血液から成長因子混合物を調製する方法であって、血液から多血小板血漿を分離する工程と、多血小板血漿から細胞を除去して無細胞系血漿を得る工程と、無細胞系血漿を凍結乾燥して成長因子混合物を得る工程と、を含む方法。好ましくは、血液から多血小板血漿を分離する工程の前に、０〜１０℃、０〜７２時間に亘って血液を予冷蔵する工程をさらに含むことを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液から成長因子混合物を調製する方法であって、
血液から多血小板血漿を分離する工程と、
多血小板血漿から細胞を除去して無細胞系血漿を得る工程と、
無細胞系血漿を凍結乾燥して成長因子混合物を得る工程と、
を含む方法。
【請求項２】
血液から多血小板血漿を分離する工程の前に、０〜１０℃、０〜７２時間に亘って血液を予冷蔵する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血液から多血小板血漿を分離する工程が、１００〜１０００Ｇ、３〜３０分による遠心分離処理を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
多血小板血漿から細胞を除去して無細胞系血漿を得る工程が、フィルタリング処理を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
無細胞系血漿を凍結乾燥する工程が、−８０〜−３０℃、０〜２０Ｐａ、６〜２４時間の真空凍結乾燥処理を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
多血小板血漿を処理する方法であって、
多血小板血漿から細胞を除去する工程と、その後凍結乾燥する工程と、を含む方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によって製造された成長因子混合物。
【請求項８】
血液から調製される成長因子混合物であって、
血小板由来増殖因子を含み、
細胞を実質的に含有せず、
水分を実質的に含有しない、成長因子混合物。
【請求項９】
凍結乾燥状態にある請求項８に記載の成長因子混合物。
【請求項１０】
血小板由来増殖因子またはこれを含む混合物を保存する方法であって、
血小板が存在しない条件下において凍結乾燥して保存する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成長因子混合物およびその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己の血液を遠心分離することで調製される血小板を濃縮した血漿、多血小板血漿（platelet rich plasma：以下、「ＰＲＰ」とも呼ぶ）を用いる治療法がある。この多血小板血漿は、血小板由来増殖因子（platelet-derived growth factor：以下、「ＰＤＧＦ」とも呼ぶ）などの多種の増殖因子を豊富に含む。これら成長因子が創傷治癒や組織再生に効果的な役割を果たすため、多血小板血漿は再生医療分野において有望な材料である（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−１９５７３９号公報
【０００４】
【非特許文献１】Freeze-Dried Human Platelet-Rich Plasma Retains Activation and Growth Factor Expression after an Eight-Week Preservation Period （Asian spine journal 11(3):329 June 2017）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、多血小板血漿を血液から調製するにはある程度の時間を要するため緊急性の高い治療には使えず、また治療のために予め調製するとしても長期保存することができないなど実際上使用が制限される問題があった。本発明は、多血小板血漿治療の利便性向上を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは前記課題について鋭意研究した結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の第１の態様によれば血液から成長因子混合物を調製する方法であって、
血液から多血小板血漿を分離する工程と、
多血小板血漿から細胞を除去して無細胞系血漿を得る工程と、
無細胞系血漿を凍結乾燥して成長因子混合物を得る工程と、
を含む方法が提供される。
【０００８】
前記方法は、血液から多血小板血漿を分離する工程の前に、０〜１０℃、０〜７２時間に亘って血液を予冷蔵する工程をさらに含んでもよい。
【０００９】
血液から多血小板血漿を分離する工程が、１００〜１０００Ｇ、１〜３０分による遠心分離処理を含んでもよい。
【００１０】
多血小板血漿から細胞を除去して無細胞系血漿を得る工程が、フィルタリング処理を含んでもよい。
【００１１】
無細胞系血漿を凍結乾燥する工程が、−８０〜−３０℃、０〜２０Ｐａ、６〜２４時間の真空凍結乾燥処理を含んでもよい。
【００１２】
また、本発明の第２の態様によれば、多血小板血漿を処理する方法であって、多血小板血漿から細胞を除去する工程と、その後凍結乾燥する工程と、を含む方法が提供される。
【００１３】
上述した第１の態様または第２の態様の方法によって、成長因子混合物が提供される。
【００１４】
また、本発明の第３の態様によれば、血液から調製される成長因子混合物であって、血小板由来増殖因子を含み、細胞を実質的に含有せず、水分を実質的に含有しない、成長因子混合物が提供される。
【００１５】
この成長因子混合物は凍結乾燥状態にあってもよい。
【００１６】
さらに、本発明の第４の態様によれば、血小板由来増殖因子またはこれを含む混合物を保存する方法であって、血小板が存在しない条件下において凍結乾燥して保存する方法が提供される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、多血小板血漿から成長因子群を効率的に回収でき、これを通常の室温下においても長期保存することが可能となった。また多血小板血漿は血小板などの細胞を含んでいるため法令上の制約を受け、自由に輸送できないなどの問題もあった。本発明では、無細胞系であるため法令上の制約を回避し実用上の問題が改善された。さらに驚くべきことに、一部の成長因子の量が増加することが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例および比較例から回収された成長因子の量／濃度の解析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について詳述する。
【００２０】
本発明の方法は、成長因子混合物を調製（または製造）する方法である。
【００２１】
本発明の方法は、血液から多血小板血漿を分離する工程と、多血小板血漿から細胞を除去して無細胞系血漿を得る工程と、無細胞系血漿を凍結乾燥して成長因子混合物を得る工程と、を少なくとも含む方法。本発明の方法は、血液から多血小板血漿を分離する工程の前に血液を予冷蔵する工程をさらに含んでもよい。
【００２２】
血液を予冷蔵する工程における冷蔵温度は０〜１０℃である。血液を予冷蔵する工程の工程時間は通常０〜７２時間である。下限値は１時間以上、２時間以上、４時間以上、８時間以上としてもよい。上限値は６０時間以下、４８時間以下、３６時間以下、２４時間以下としてもよい。
【００２３】
本発明の方法は、血液から多血小板血漿を分離する工程を含む。
【００２４】
この工程の間において、血液および多血小板血漿の温度は、約４〜約２５℃に制御することが好ましい。
【００２５】
血液（全血）から多血小板血漿を分離する手段に制限はなく、公知の任意の手段が使用可能である。通常は、血液について比較的低速度の第１の遠心分離処理を施して、赤血球を含む画分と、多血小板血漿（ＰＲＰ）と、少血小板血漿（platelet poor plasma）とに分離して得られる。
【００２６】
比較的低速度の第１の遠心分離処理は、約１００〜約１０００Ｇ（通常の遠心分離器においては約２００〜約２０００ｒｐｍ程度に相当）の遠心分離である。約１５０〜約７５０Ｇ、約２００〜約５００Ｇとしてもよい。処理時間は約３〜約３０分、約５〜約２０分、約１０〜約１５分である。
【００２７】
比較的低速度の第１の遠心分離処理単独によって多血小板血漿を取得してもよい。また上清である血漿画分全て（多血小板血漿および少血小板血漿）を回収した後、第２の遠心分離処理を施して多血小板血漿を得てもよい。
【００２８】
第１の遠心分離処理後に回収した血漿画分について比較的高速度の第２の遠心分離処理によって血小板をペレット化させ、その後再懸濁させることで純化・濃縮化することができる。
【００２９】
比較的高速度の第２の遠心分離処理は、約１０００〜約２５００Ｇ（通常の遠心分離器においては約２０００〜約５０００ｒｐｍ程度に相当）の遠心分離である。約１１００〜約２０００Ｇ、約１２００〜約１５００Ｇとしてもよい。処理時間は約１〜約３０分、約５〜約２０分、約１０〜約１５分である。
【００３０】
再懸濁させる溶媒は生理学的に許容されるものであれば任意である。例えば、血漿、生理食塩水、緩衝生理食塩水（例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、リンゲル液（例えば乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液）などが挙げられる。なお、いずれの溶媒に再懸濁させたいずれの血小板再懸濁液も、本発明においては『多血小板血漿』と表現する。また濃度調整や添加剤の配合などを目的として、この再懸濁液に上記溶媒や上記溶媒の溶液を添加してもよく、添加後の液も『多血小板血漿』と表現する。
【００３１】
当然のことながら、第１の遠心分離処理並びに第２の遠心分離処理はそれぞれ独立して複数回実行してもよい。
【００３２】
本発明の方法は、得られた多血小板血漿に対して、血小板を活性化する薬剤を添加する工程をさらに含んでもよい。血小板の活性化によって、多数の血小板由来成長因子が放出される。
【００３３】
血小板を活性化する薬剤は、特に制限はないが一般的にはカルシウムイオン源化合物である。カルシウムイオンの存在によって血小板が活性化される。カルシウムイオン源化合物の典型例としては、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、乳酸カルシウム、炭酸カルシウム等が挙げられる。
【００３４】
当該薬剤を固体のまま添加してもよいが、当該薬剤を純水などの溶媒（生理学的に許容されるものが好ましい）に溶解させた溶液を添加してもよい。このとき、溶液における当該薬剤の濃度は特に制限はない。例えば、約０．５質量％以上、約１質量％以上、約１．５質量％以上、約２質量％以上としてもよい。他方、約１０質量％以下、約７質量％以下、約５質量％以下としてもよい。
【００３５】
当該薬剤を溶液として添加する際、その添加量は、多血小板血漿の液量を基準として約０．０１体積倍以上、約０．０５体積倍以上、約０．１体積倍以上、約０．１５体積倍以上、約０．２体積倍以上、約０．２５体積倍以上としてもよい。他方、添加量は多血小板血漿の液量を基準として約０．５体積倍以下、約０．４５体積倍以下、約０．４体積倍以下、約０．３５体積倍以下、約０．３体積倍以下、約０．２５体積倍以下としてもよい。
【００３６】
当該薬剤を多血小板血漿に添加した際のその最終濃度は、多血小板血漿および当該薬剤の混合物全量基準で約０．１質量％〜約２質量％である。下限値を約０．２質量％以上、約０．３質量％以上としてもよい。他方、上限値を約１．５質量％以下、約１質量％以下、約０．８質量％以下、約０．６質量％以下、約０．４質量％以下としてもよい。
【００３７】
当該薬剤を添加して血小板を活性化する工程の時間は、特に制限はない。約１分以上、約５分以上、約１０分以上、約１５分以上、約２０分以上、約２５分以上、約３０分以上としてもよい。他方、約１８０分以下、約１５０分以下、約９０分以下、約６０分以下、約５０分以下、約４０分以下、約３０分以下としてもよい。
【００３８】
本発明の方法は、多血小板血漿から細胞を除去して無細胞系血漿を得る工程を含む。
【００３９】
この工程の間において、多血小板血漿および無細胞系血漿の温度は、約４〜約２５℃に制御することが好ましい。
【００４０】
当然のことながら、多血小板血漿は血小板を含んでいる。また、僅かな量の赤血球および白血球を含む場合もある。本発明においては、これら細胞を完全に除去する。
【００４１】
細胞を完全に除去する手段は、特に制限はなく、任意のものが使用可能である。例えば加熱処理、酸処理、フィルタリング処理等が挙げられる。これらのうち、成長因子の変性を招くリスクが小さいことからフィルタリング処理が好ましい。すなわち本工程は、フィルタリング処理によって多血小板血漿から細胞を除去して無細胞系血漿を得るフィルタリング工程であることが好ましい。
【００４２】
フィルタリング処理に使用するフィルタは、血小板を除去できるものであれば制限はない。血小板の大きさは約２μｍであるため、例えば、孔径が約１μｍ以下、約０．７μｍ以下、約０．５μｍ以下のメンブレンフィルタを使用することができる。なお、メンブレンフィルタの孔径の下限値に制限はないが過度に小さいものは目詰まりを起こすリスクが大きくなる。そのため、孔径は約０．２μｍ以上、約０．３μｍ以上、約０．４μｍ以上が好ましい。通常市販されているメンブレンフィルタのうち、この範囲を満たすものとしては孔径が約０．２μｍのメンブレンフィルタと孔径が約０．４５μｍのメンブレンフィルタがある。本発明においてはいずれも使用可能であり、孔径が約０．４５μｍのメンブレンフィルタが最適なメンブレンフィルタである。
【００４３】
フィルタリング処理は、前述のフィルタを介する遠心分離によって実行されてもよい。この際の遠心分離は、約８００〜約１８００Ｇ（通常の遠心分離器においては約１５００〜約４０００ｒｐｍ程度に相当）の遠心分離である。工程時間は約１〜約３０分、約５〜約１５分、約１０分である。
【００４４】
この処理の結果、フィルタを通過した細胞を含まない液体（すなわち無細胞系血漿）を得ることができる。
【００４５】
本発明の方法は、無細胞系血漿を凍結乾燥して成長因子混合物を得る工程を含む。
【００４６】
凍結乾燥の手法は、従来周知のタンパク質の凍結乾燥手法であれば特に制限はない。
【００４７】
凍結乾燥は、無細胞系血漿を冷凍処理し、その後真空凍結乾燥処理を行う。
【００４８】
冷凍処理は無細胞系血漿を約−６０℃以下、約−７０℃以下、または約−８０℃以下になるよう処理する。これは液体窒素との接触やフリーザー中での保存によって実行されてもよい。
【００４９】
冷凍処理の実行時間は一瞬でもよい。通常は、無細胞系血漿全てが確実に冷凍されるように冷凍処理の上述温度において約６〜約２４時間に亘って実行される。すなわち冷凍処理の開始時刻から真空凍結乾燥処理の開始時刻のインターバルは約０〜約２４時間または約６〜約２４時間でもよい。
【００５０】
真空凍結乾燥処理の条件温度は、特に制限はない。約−３０℃以下、約−３５℃以下、約−４０℃以下、約−４５℃以下としてもよい。下限値に特に制限はないが、約−８０℃以上、約−７５℃以上、約−７０℃以上、−６５℃以上、約−５５℃以上、約−５０℃以上としてもよい。
【００５１】
真空凍結乾燥処理の条件気圧は、特に制限はない。約２０Ｐａ以下、約１８Ｐａ以下、約１６Ｐａ以下、約１５Ｐａ以下としてもよい。下限値は０Ｐａ以上であり、約１Ｐａ以上、約２Ｐａ以上、約３Ｐａ以上、約４Ｐａ以上、約５Ｐａ以上としてもよい。
【００５２】
真空凍結乾燥処理を実行する時間は、特に制限はなく、液量に応じた時間を設定し得る。例えば、約１時間以上、約２時間以上、約３時間以上、約４時間以上、約５時間以上、約６時間以上、約７時間以上、約８時間以上としてもよい。他方、約２４時間以下、約２０時間以下、約１５時間以下、約１０時間以下、約８時間以下としてもよい。
【００５３】
真空凍結乾燥処理を実行する手段は特に制限はなく任意の手段が使用される。例えば、ＦＤＵ−１１１０（東京理化器械株式会社製）を用いて実行してもよい。
【００５４】
真空凍結乾燥処理を終えると、ほぼ完全に乾燥した粒状または粉末状の成長因子混合物を得ることができる。
【００５５】
上述した成長因子混合物の調製方法は、同時に、多血小板血漿の処理方法としても考えられる。
【００５６】
すなわち、上述した調製方法は、多血小板血漿から細胞を除去する工程と、その後凍結乾燥する工程と、を含む多血小板血漿の処理方法でもある。多血小板血漿を処理した結果産物が成長因子混合物である。
【００５７】
上記工程の関係から、成長因子混合物は、細胞（特に血小板）を実質的に含有しない、または全く含有しない。従来の多血小板血漿は細胞（特に血小板）を含有するため、法令や条約によって種々の制限を受ける。しかし、成長因子混合物は、細胞を含有しないことから、これら制約の多くまたは全部を回避することができるため、再生医療の可能性および利便性を向上することができる。
【００５８】
成長因子混合物やその前段階の無細胞系血漿が細胞（特に血小板）を実質的に含有しない、または全く含有しないことは、例えば、セルカウンターを用いて１μｍ以上の細胞が確認されないことによって実証できる。あるいは血球計算盤や血球計測機などを用いて血小板が観測されないことによって実証してもよい。いずれかの手段によって血小板を含まないことが確認できればよい。
【００５９】
成長因子混合物は、通常の多血小板血漿が含有する成長因子を含有する。このような成長因子としては、例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（例えばＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７）、トランスフォーミング増殖因子（例えばＴＧＦ−β１）、成長ホルモン（ＧＨ）、インスリン様成長因子（例えばＩＧＦ−Ｉ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）等が挙げられる。成長因子混合物は少なくともこれら因子を含有する。
【００６０】
成長因子混合物は、長期間に亘って保存することが可能である。保存温度は室温（約２０〜約２５℃）程度でもよい。保存温度は−約８０℃〜約２５℃、−約６０℃〜約１０℃、−約３０℃〜約０℃としてもよい。
【００６１】
成長因子混合物は驚くべきことに、一部の成長因子（例えばＰＤＧＦ−ＡＡ）の量／濃度が、凍結乾燥することなく従来通り冷凍保存した無細胞系血漿の場合よりも、増加することが分かった。
【００６２】
後述する実施例においては、僅か１日（２４時間以下）の間で、本発明の成長因子混合物におけるＰＤＧＦ−ＡＡの量／濃度が、凍結乾燥することなく保存した無細胞系血漿のそれの少なくとも１．５倍以上となった。他の成長因子（例えば、ＥＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＴＧＦ−β１、ＧＨ、ＩＧＦ−Ｉ、ＳＣＦ）では有意な差は見られなかった。
【００６３】
従来の多血小板血漿では、活性化後の血小板を除去することなく成長因子と共に作成直後に使用するか、冷凍保存している。非特許文献１は多血小板血漿の凍結乾燥について検討している。このとき単なる凍結保存と凍結乾燥保存では２週間に亘って成長因子の量／濃度に有意な差は生じなかったことが報告されている。  
【００６４】
あくまで仮説であり、本発明を制限するものではないが、これら成長因子の挙動は例えば以下のように説明できる。血小板が存在している状態において、少なくとも２週間の間は、血小板の存在によって単なる冷凍保存と凍結乾燥保存で、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）の量は変化しない。しかし、血小板が存在しない状態において、単なる冷凍保存では血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は容易に変性、破壊または分解されてしまい、凍結乾燥保存では比較的安定に保存することが可能であると考えられる。これに加えて／これとは別に、凍結乾燥によって既に変性したＰＤＧＦが正しい立体構造にリフォールディングしている可能性もある。使用に際しては、凍結乾燥状態のＰＲＰや成長因子混合物に加水する必要があるが、成長因子混合物の方がこの際により多くのＰＤＧＦが溶解または懸濁されているとも考えられる。そのため、僅か１日（２４時間以下）の時間経過によって、この有意な差が生じたのである。
【００６５】
なお、非特許文献１から、ＥＧＦは１日程度であれば安定的に存在していることが示唆される。そして本発明の実施例は、ＥＧＦについては有意な差がないことから実施例は妥当な検証であると考えられる。
【００６６】
いずれにせよ、血小板由来成長因子やこれを含有する混合物（例えば本発明の成長因子混合物のような他の成長因子も含む混合物）の保存方法としては、細胞（特に血小板）が存在しない状態において凍結乾燥して保存することが好ましいと考えられる。他の成長因子としては、成長因子混合物が含有する成長因子として具体的に例示した前記成長因子が挙げられる。
【００６７】
したがって、本願は、血小板由来成長因子またはこれを含む混合物（例えば、他の成長因子も含む、成長因子混合物）を、血小板（または細胞）が存在しない条件下において凍結乾燥して保存する方法をも提供するものである。保存温度は前記した通りである。
【実施例】
【００６８】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。  
【００６９】
（検体１〜４の作製）
４人（男性１人、女性３人）の協力者からそれぞれ約４０ｍＬの全血を採取した。これらを恒温槽において４℃で一晩（約１６時間）冷蔵保存した。保存後、第１の遠心分離処理（１２００ｒｐｍ（２８０Ｇ相当）、１０分間、２４℃）を行い、上清である血漿（約２０ｍＬ）を回収した。この血漿について第２の遠心分離処理（２６８０ｒｐｍ（１４００Ｇ相当）、１０分間、２４℃）を行い、上清（血漿）を除去した（約１ｍＬの上清は残した）。残った上清によってペレットを再懸濁させ、再懸濁液（多血小板血漿）を得た。この１ｍＬの多血小板血漿に対して、５ｍＬの後述する所定バッファー液および１．５ｍＬの２％塩化カルシウム水溶液（ニプロ株式会社製、商品名：塩化カルシウム注２％「ＮＰ」）を添加し、よく撹拌して、７．５ｍＬの多血小板血漿を得た。これを２５℃において２０分静置した。この間、カルシウムイオンによって血小板が活性化され、ＰＤＧＦが血小板から放出された。
【００７０】
所定時間静置後、これをシリンジに移し替え、孔径０．４５μｍのメンブレンフィルタによってフィルタリングした。このフィルタリングによって多血小板血漿は、フィルタ上に残留する血小板などの細胞と、フィルタを通過した液体（無細胞系血漿）とに分離された。約７．５ｍＬの無細胞系血漿を１ｍＬずつ７本のバイアルに分注して−８０℃で冷凍処理を施し、同温度にて１２日間冷凍保存した。こうして４人の協力者から検体１〜４を得た。
【００７１】
検体１は男性からの検体であり、所定バッファー液として乳酸リンゲル液（扶桑薬品工業株式会社製）を使用した。検体２〜４は女性からの検体であり、所定バッファー液としてＰＢＳ（コージンバイオ株式会社製）を使用した。
【００７２】
（実施例１）
検体１の７本のバイアルのうち３本のバイアルについてＦＤＵ−１１１０（東京理化器械株式会社製）を用いて、約５Ｐａ、約−４５℃の条件下、約１６時間に亘って真空凍結乾燥処理を施した。こうして実施例１の試料を得た。
【００７３】
（比較例１）
検体１の残りのバイアルを、実施例１の真空凍結乾燥処理に要した同一の時間に亘って−８０℃で冷凍保存を続行した。こうして比較例１の試料を得た。
【００７４】
（実施例２〜４）
検体２〜４のそれぞれについて実施例１と同様の凍結乾燥処理を施した。こうして実施例２〜４の試料を得た。
【００７５】
（比較例２〜４）
検体２〜４のそれぞれについて比較例１と同様に冷凍保存を続行した。こうして比較例２〜４の試料を得た。
【００７６】
実施例１〜４および比較例１〜４それぞれの試料について抗体アレイ法によって成長因子の量／濃度を解析した。その結果のグラフが図１である。主要な成長因子について解析したところ、凍結乾燥はほとんどの成長因子の量／濃度に影響を及ぼさないことが分かった。ところが驚くべきことに、血小板由来成長因子の１つＰＤＧＦ−ＡＡは凍結乾燥を経た方が量／濃度が高くなることが分かった。これがどのような機構によって生じた現象なのかは定かではない。しかし、一度保存した試料からより多くのＰＤＧＦが回収できることは事実であり、本発明の優位性を示すものである。
【図１】
2019178116.tif 000002
【手続補正書】
【提出日】平成30年6月27日(2018.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液から成長因子混合物を調製する方法であって、
血液から多血小板血漿を分離する工程と、
血小板を活性化させる薬剤を前記多血小板血漿に添加して血小板を活性化させる工程と、
活性化させた前記多血小板血漿から細胞を除去して無細胞系血漿を得る工程と、
前記無細胞系血漿を凍結乾燥して成長因子混合物を得る工程と、
を含み、
血液から多血小板血漿を分離する工程が、血液について１００〜１０００Ｇ、３〜３０分による第１の遠心分離処理を施して上清を回収すること、および前記上清について１０００〜２５００Ｇ、１〜３０分による第２の遠心分離処理を施して血小板をペレット化させ、その後再懸濁させることを含む、方法。
【請求項２】
血液から多血小板血漿を分離する工程の前に、０〜１０℃、０〜７２時間に亘って血液を予冷蔵する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多血小板血漿から細胞を除去して無細胞系血漿を得る工程が、フィルタリング処理を含むことを特徴とする請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
無細胞系血漿を凍結乾燥する工程が、−８０〜−３０℃、０〜２０Ｐａ、６〜２４時間の真空凍結乾燥処理を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
血液について１００〜１０００Ｇ、３〜３０分による第１の遠心分離処理を施して上清を回収すること、および前記上清について１０００〜２５００Ｇ、１〜３０分による第２の遠心分離処理を施して血小板をペレット化させ、その後再懸濁させることを含む工程によって、血液から得られた多血小板血漿を処理する方法であって、
血小板を活性化させる薬剤を前記多血小板血漿に添加して血小板を活性化させる工程と、活性化させた前記多血小板血漿から細胞を除去する工程と、その後凍結乾燥する工程と、を含む方法。
【請求項６】
血小板由来増殖因子またはこれを含む混合物を保存する方法であって、
血小板由来増殖因子またはこれを含む混合物が、血小板を活性化させる薬剤を多血小板血漿に添加して血小板を活性化させる工程および活性化させた前記多血小板血漿から細胞を除去する工程によって、多血小板血漿から得られるものであり、
前記多血小板血漿が、血液について１００〜１０００Ｇ、３〜３０分による第１の遠心分離処理を施して上清を回収すること、および前記上清について１０００〜２５００Ｇ、１〜３０分による第２の遠心分離処理を施して血小板をペレット化させ、その後再懸濁させることを含む工程によって、血液から得られるものであり、
血小板が存在しない条件下において血小板由来増殖因子またはこれを含む混合物を凍結乾燥して保存する方法。