(57)【要約】      （修正有）【課題】ウナギ性成熟度を測定することができる抗体及び性成熟を探知する方法の提供。【解決手段】特定の配列からなる３種のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含むウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＬＨ）探知用ペプチドマーカを抗原として製造され、ウナギのＬＨを特異的に結合するポリクローナル抗体およびこれを用いたＬＨを特異的に探知する方法。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、および配列番号３のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含むウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＬＨ）探知用ペプチドマーカを抗原として使用して製造され、ウナギのＬＨと特異的に結合する抗体。
【請求項２】
前記抗体は、ウナギの濾胞刺激ホルモン（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ＴＳＨ）、および性腺刺激ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、ＧＴＨ）には結合せず、ウナギのＬＨに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体は、ポリクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗原は、キャリア蛋白質を追加的に含むことを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記キャリア蛋白質は、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）、ＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、Ｔｇ（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、ＴＴ（ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ）、ジフテリアトキソイド（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｏｉｄ、Ｔｄ）、およびＰＰＤ（ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）からなる群より選択された１種以上である、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項の抗体を含む、生物学的試料内ウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＬＨ）の特異的探知用組成物。
【請求項７】
前記生物学的試料は、ウナギのＴＳＨ、ＦＳＨおよびＧＴＨからなる群より選択された１種以上をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか一項の抗体を生物学的試料と接触させる工程、および前記試料内で抗原−抗体複合体の形成有無を探知する工程を含む、
生物学的試料内ウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＬＨ）を特異的に探知する方法。
【請求項９】
前記抗原−抗体複合体の形成有無を探知する工程は、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、放射能免疫分析法（ＲＩＡ）、免疫蛍光法（ＩＦＡ）、ウェスタンブロッティング（ＷＢ）およびフローサイトメトリー分析法（ＦＣＡ）のうちの少なくとも一つの方法によって行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号１、配列番号２、および配列番号３のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上のペプチド、または
配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択された１種以上のポリヌクレオチドを含む、
ウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＬＨ）探知用マーカ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウナギの黄体形成ホルモンを特異的に認識する抗体およびこれを用いた黄体形成ホルモンを特異的に検出する方法、並びに検出用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
魚類の養殖において、魚類種苗（ｆｉｓｈ  ｓｅｅｄｉｎｇ）の安定的な生産、供給と純血種（ｂｌｏｏｄｓｔｏｃｋ）の性成熟調節と評価は重要である。ウナギを含む一部魚種は不適切な養殖環境では性成熟（ｇｏｎａｄａｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）、排卵（ｏｖｕｌａｔｉｏｎ）、精子遊離（ｓｐｅｒｍｉａｔｉｏｎ）などが発生しないので、養殖魚類の生殖活性を人工的に調節するためには光周期（ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ）、水温（ｗａｔｅｒ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）、ホルモン処理（ｈｏｒｍｏｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）のような環境要素を複合的でありながらも細心に調節する必要がある。
【０００３】
ウナギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｅｌ）は、脊索動物門、硬骨魚類綱、ウナギ目、ウナギ科に属し、海と淡水習性を有する複雑な生活史を有する降河性魚類（ｃａｔａｄｒｏｍｏｕｓ  ｆｉｓｈ）である。ウナギは稚魚の時、海から河に移動し、移動する間に黄色（ｙｅｌｌｏｗ）から銀色（ｓｉｌｖｅｒ）ウナギへと形態的、生理的な変化を経て、河で６〜２０年間成長し、成長が終わったウナギは性成熟過程を経た後、海に再び移住し、移住する間に配偶子形成（ｇａｍｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）を完全になす。ウナギは極東産ウナギ、ニホンウナギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｅｌ、Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）とも呼ばれ、日本と中国に広く生息している。ウナギは北方限界線として北海道、渤海湾沿岸（ｔｈｅ  ｇｕｌｆ  ｏｆ  Ｐｏｈａｉ）と遼河（Ｌｉａｏ  ｒｉｖｅｒ）まで分布生息しており、南方限界線として中国の海南島（Ｈａｉｎａｎ  ｉｓｌａｎｄ）と中国とベトナムの間にあるトンキン湾（ｔｈｅ  ｇｕｌｆ  ｏｆ  Ｔｏｎｋｉｎ）まで生息し、その他にも台湾、フィリピン、ヨーロッパなどに生息する。ウナギ成体は主に甲殻類、魚類、昆虫類を捕食し、回遊様相によって川ウナギ（ｒｉｖｅｒ  ｅｅｌｓ）、河口ウナギ（ｅｓｔｕａｒｉｎｅ  ｅｅｌｓ）、海ウナギ（ｓｅａ  ｅｅｌｓ）に大きく３部類に分けられる。
【０００４】
ウナギを人工飼育する場合、性的に未熟な状態で産卵を行う場合が多い。未だに自然系の未成熟なウナギの産卵行動が十分に研究されておらず、繁殖生理学分野でウナギの繁殖産卵行動に関しては知られていることが多くない。現在までの研究結果によれば、自然状態の雌ウナギは１０月〜１２月に性成熟を始めるが、卵母細胞は卵黄形成初期までのみなされ、雄の場合は精子形成が開始されないまま河下流に移動して産卵場所に移住すると推測され、未成熟状態の養殖ウナギを海水養殖する場合、天然雌ウナギのような卵黄形成初期に至ると知られている（Ｋａｇａｗａ  Ｈ．，  Ｉｉｎｕｍａ  Ｎ．，  Ｔａｎａｋａ  Ｈ．，  Ｏｈｔａ  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｏｋｕｚａｗａ  Ｋ．，１９９８．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｒｅａｒｉｎｇ  ｐｅｒｉｏｄ  ｉｎ  ｓｅａｗａｔｅｒ  ｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｅｍａｌｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｅｌ  Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ．  Ｆｉｓｈ  Ｓｃｉ．，  ６４  ７７−８２．）。
【０００５】
従来はウナギ飼育において天然または養殖雌ウナギの性成熟を進行させることが非常に難しかった。最近になってサケ脳下垂体抽出物（ｓａｌｍｏｎ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｅｘｔｒａｃｔ、ＳＰＥ）で性成熟誘導を成功した事例が報告されたことがあるが、まだその成功頻度が低く、サケ脳下垂体抽出物、組換え蛋白質などを反復投与する場合、他の性成熟誘導ホルモンとの拮抗作用（ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）、上昇作用（ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ）または速い活性喪失などによって卵母細胞と排卵された卵子内の染色体異常を誘発することがあり、卵質に影響を与えて受精率（ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）が低くなり、奇形魚発生率が高くなる危険がある。また、サケ脳下垂体抽出物と組換え蛋白質の需給が難しいため、人工養殖場でウナギ種苗生産が依然として難しいという問題点がある。
【０００６】
一方、現在まで人工種苗養殖においてホルモンの反復投与または環境調節などで行われる性成熟度を判定する基準は大部分肉眼に依存してきたところ、人ごとに差があるため正確度が非常に落ちた。したがって、ウナギの性成熟程度に直接的な影響を及ぼす各ホルモンのマーカ（ｍａｒｋｅｒ）または基準因子（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｆａｃｔｏｒ）開発が要求されているのが実情である。
【０００７】
一般的な脊椎動物の性成熟度を判断できる糖蛋白質ホルモン（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ；ＧＰＨ）には甲状腺刺激ホルモン（Ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ；ＴＳＨ）、濾胞刺激ホルモン（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ｆｏｌｌｉｔｒｏｐｉｎ；ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ｌｕｔｒｏｐｉｎ；ＬＨ）、絨毛性性腺刺激ホルモン（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、ＣＧ）などがある。前記ホルモンは共通的に二つの互いに異なるサブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）アルファ（−α）とベータ（−β）から構成され、同一種（ｓｐｅｃｉｅｓ）は同一のアルファサブユニットアミノ酸配列を有しているが、ベータサブユニットは各種別およびホルモン別に特異的なアミノ酸配列を有している。よって、ベータサブユニットは各ホルモンの特異的な活性および種特異性（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を示す。したがって、全ての脊椎動物の各種（ｓｐｅｃｉｅｓ）において互いに異なる性ホルモンのベータサブユニットをコードするために少なくとも３つの遺伝子（ＦＳＨβ、ＬＨβ、ＴＳＨβ）が存在する。アルファとベータサブユニットは互いに異なる遺伝子によって蛋白質で形成され、生物学的活性を有するホルモン分子を形成するために前記アルファサブユニットとベータサブユニットは非共有結合（ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｂｏｎｄｉｎｇ）によって連結される。
【０００８】
従って、本発明は前記問題点を解決し、ウナギの性成熟程度を正確に測定するために、性成熟度に直接的な影響を及ぼす黄体形成ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ＬＨ）特異的なペプチドマーカ（ｍａｒｋｅｒ）、およびこれに結合するポリクローナル抗体を開発し、前記抗体はウナギのＪｅＬＨ−βと結合することによって他の性ホルモンと異なりＪｅＬＨのみに特異的に結合して、ウナギ生物学的試料内のＪｅＬＨを特異的に探知可能であり、これを用いてウナギの性成熟度を測定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−１５３１１２８６号公報
【特許文献２】韓国登録特許第１０−１４９３９５７号公報
【特許文献３】韓国登録特許第１０−０７４２１１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は前述の従来技術の問題点を解決するために提案されたものであって、ウナギの性成熟の変化を探知するために、ウナギの黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＬＨ）を特異的に探知することができる抗体を提供する。
【００１１】
本発明の一例は、配列番号１、配列番号２、および配列番号３のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含むＬＨ探知用ペプチドマーカを抗原として使用して製造され、ウナギのＬＨと特異的に結合する抗体を提供する。
また、本発明は、前記抗体を含む、生物学的試料内ウナギＬＨホルモンの特異的探知用組成物を提供し、また、本発明は、前記抗体を生物学的試料と接触させて、抗原−抗体複合体形成を探知する工程を含む、生物学的試料内ウナギＬＨホルモンを特異的に探知する方法を提供する。
【００１２】
また、本発明の一例は、配列番号１、配列番号２、および配列番号３のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上のペプチド、または配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択された１種以上のポリヌクレオチドを含む、ウナギのＬＨ探知用マーカを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ウナギの類似ホルモンは除いてウナギの黄体形成ホルモン（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＬＨ）のみを特異的に認識、判別することができるマーカ抗原およびこれと結合する抗体に関するものであって、前記抗体を用いてウナギの性成熟度を測定することができ、ウナギ完全養殖の実現に役立つ。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
【００１４】
本発明は、下記表１の配列番号１（ＥＰＩＮＥＴＮＳＶＥＫＤＧＣ）、配列番号２（ＣＩＴＫＤＰＳＹＫＧＰＬＳ）、および配列番号３（ＳＤＣＡＩＱＳＬＲＰＤ）のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含むウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）のＬＨ探知用ペプチドマーカを抗原として使用して製造され、ウナギのＬＨと特異的に結合する抗体を提供する。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
前記“ウナギＬＨ探知用ペプチドマーカ”とは、ウナギの他の性成熟ホルモン（ＦＳＨ、ＴＳＨ、ＧＴＨ、ＣＧなど）および他魚種由来の性成熟ホルモンから、ウナギのＬＨのみを特異的に探知することができるマーカを意味する。
【００１７】
前記“ペプチドマーカを抗原として使用して製造され、ウナギのＬＨを特異的に認識する抗体”とは、甲状腺刺激ホルモン（Ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ；ＴＳＨ）、濾胞刺激ホルモン（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＦＳＨ）、性腺刺激ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、ＧＴＨ）には結合せず、ウナギのＬＨに特異的に結合する抗体であってもよい。
【００１８】
本発明の一例によれば、前記ウナギＬＨ探知用ペプチドマーカ抗原はキャリア蛋白質を追加的に含んでもよく、前記キャリア蛋白質はＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）、ＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、Ｔｇ（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、ＴＴ（ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ）、ジフテリアトキソイド（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｏｉｄ、Ｔｄ）、およびＰＰＤ（ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）などからなる群より選択された１種以上であってもよく、例えばマーカのＮ−末端にシステイン（Ｃｙｓ）を導入し、システインの−ＳＨ官能基とＮ−（７−ジメチルアミノ−４−メチルクマリニル）マレイミドを結合させ、キャリア蛋白質を結合させて製作した架橋ペプチドを免疫感作（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ）に用いることも可能である。
【００１９】
本発明の前記“抗体”とは、当該分野で公知された用語であって抗原性部位に対して指示される特異的な蛋白質分子を意味する。本発明の目的上、抗体は本発明の配列番号１（ＥＰＩＮＥＴＮＳＶＥＫＤＧＣ）、配列番号２（ＣＩＴＫＤＰＳＹＫＧＰＬＳ）、および配列番号３（ＳＤＣＡＩＱＳＬＲＰＤ）のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上を含むウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）のＬＨ探知用ペプチドマーカに特異的に結合する抗体を意味し、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドマーカ（以下、第１マーカ）、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドマーカ（以下、第２マーカ）、および配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドマーカ（以下、第３マーカ）の三つのマーカ全部に特異的に結合する抗体であってもよい。
【００２０】
本発明の抗体の形態は特に制限されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体または抗原結合性を有するものであればそれの一部も本発明の抗体に含まれ、全ての免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、Ｉｇ）抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体にはヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。前記免疫グロブリン抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのクラスの中の最も普遍的な抗体であり、大部分血液や体液の全体Ｉｇの７５％を占めるＩｇＧであるのが好ましい。また、本発明の抗体の由来は特に制限しないが、マウス、ラット、ウサギ、鶏、昆虫細胞などを用いることができ、製作の便宜、大量生産を考慮してウサギ由来ポリクローナル抗体であるのが好ましい。
【００２１】
また、本発明で抗体は、前記ＬＨ−βアミノ酸配列の一部の第１マーカ、第２マーカ、および第３マーカからなる群より選択されるいずれか一つ以上のマーカ全部に特異的に結合する抗体、抗原結合断片またはアプタマーであってもよい。好ましくは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、さらに好ましくは体液の中で複雑且つ微細なホルモンの変化を感作することができ、正確にＪｅＬＨのみを検出することができるポリクローナル抗体であるのが好ましい。
【００２２】
本発明の一例は前記抗体を含む、生物学的試料内ウナギＪｅＬＨホルモン特異的探知用組成物を提供する。
【００２３】
前記生物学的試料はウナギＴＳＨ、ＦＳＨおよびＧＴＨからなる群より選択された１種以上を含むことができ、本発明の抗体を含む、生物学的試料内ウナギＬＨホルモン探知用組成物は、生物学的試料に含まれているウナギＴＳＨ、ＦＳＨまたはＧＴＨとは結合せず、ＬＨに特異的に結合する。生物学的試料にＬＨが含まれていない場合、結合反応が起こらないことがある。
【００２４】
本発明の抗体の特徴は前述のとおりであり、前記抗体を含むウナギのＬＨホルモン探知用組成物の活用形態を特に限定しないが、キットの形態に実現されて提供されてもよい。
【００２５】
本発明のキットは、ＪｅＬＨホルモンを検出するためのものであって、抗体の免疫学的検出のために基質、適当な緩衝溶液、発色酵素または蛍光物質で標識された２次抗体、発色基質などを含んでもよい。前記基質はニトロセルロース膜、ポリビニル樹脂で合成された９６ウェルプレート、ポリスチレン樹脂で合成された９６ウェルプレートおよびガラスからなるスライドガラスなどが用いられてもよく、発色酵素はペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）が用いられてもよく、蛍光物質はＦＩＴＣ、ＲＩＴＣなどが用いられてもよく、発色基質液はＡＢＴＳ（２，２'−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））またはＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）が用いられてもよい。
【００２６】
本発明の一例は、前記抗体を生物学的試料と接触させ、前記試料内で抗原−抗体複合体の形成有無を探知する工程を含む、生物学的試料内ウナギＪｅＬＨホルモンを特異的に探知する方法を提供する。
【００２７】
前記生物学的試料の特徴は前述のとおりであり、前記抗原−抗体複合体の形成は酵素免疫吸着法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）、例えば、直接ＥＬＩＳＡ（Ｄｉｒｅｃｔ  ＥＬＩＳＡ）、間接ＥＬＩＳＡ（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ＥＬＩＳＡ）、競合ＥＬＩＳＡ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ）、サンドウィッチＥＬＩＳＡ（ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ）、放射能免疫分析法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、免疫蛍光法（Ｉｍｍｕｎｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｅｓｔ、ＩＦＡ）、ウェスタンブロッティングおよびフローサイトメトリー分析法のうちの少なくとも一つ以上の方法で検出することができ、検出方法をこれに制限するのではない。前記分析方法を通じて、ＬＨホルモン蛋白質とこれに対する抗体の間の“抗原−抗体複合体”形成有無を判断して、試料内ＬＨの存在有無と含量を測定することができる。
【００２８】
本願で“抗原−抗体複合体”とはＪｅＬＨホルモン蛋白質とこれに特異的な抗体の結合物を意味し、抗原−抗体複合体の形成有無は検出ラベル（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｌａｂｅｌ）のシグナルを通じて測定可能である。このような検出ラベルは酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、レドックス（ｒｅｄｏｘ）分子および放射線同位元素からなる群より選択することができ、必ずしもこれに制限されるのではない。
【００２９】
一具体例として、ＪｅＬＨホルモン蛋白質とこれに対する抗体の間の抗原−抗体複合体測定は、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）を用いることができる。また、ＪｅＬＨホルモン蛋白質に対する一つ以上の抗体が基板上の定められた位置に配列され、高密度で固定化されている蛋白質チップを用いることもできる。
【００３０】
また、本発明は前記ウナギＪｅＬＨ特異的な抗体を生物学的試料と接触させ、前記試料内で抗原−抗体複合体の形成有無を探知してウナギの性成熟度を測定する工程を含む、ウナギの性成熟度測定方法を提供する。
【００３１】
現在までウナギの性ホルモンを高い正確度で探知する抗体が開発されていなくてウナギの性成熟機序、ホルモンの作用機序が十分に明らかになっておらず、明確なウナギの性成熟度測定方法が開発されていない状態である。本願発明はウナギの複雑な性ホルモンの生理変化を性ホルモン中のＬＨを高い正確度で探知して予測可能であり、ウナギの生理変化を明らかにすることができる端緒を提供し、ウナギの性成熟度を簡単に高い効率で測定できる方法を提供することができる。
【００３２】
ウナギの成体の性成熟度を判断する既存の方法の一つとして、成体ウナギの血液を採血して血清を分離した後、テストステロンが存在すれば雄、エストロゲン２が存在すれば雌と判断する方法があるが、この方法ではウナギの雄雌区分のみ可能であり、ウナギが性成熟度のどの位置にあるかまでは明確に判断しにくい。
【００３３】
また他の方法として、ウナギ稚魚を飼育して４〜６週後にウナギの急激な体重増加が起こるかどうかによってウナギの性成熟度を確認する方法があるが、これは正確度が非常に落ちる方法であり、雌の卵母細胞を一部摘出して１次減数分裂によって卵核胞の核膜消失を確認するか、生殖腺重量指数を測定する方法があるが、これは測定方法が複雑であり、費用と時間が多くかかるという短所がある。
【００３４】
本発明の前記抗体を用いて生物学的試料内の抗原−抗体複合体の形成有無を探知してウナギの性成熟度を測定する方法は、ウナギの既存の方法より遥かに簡単であり、検体内ＪｅＬＨの存在を特異的に探知し、定量的に分析可能であって、より正確にウナギの性ホルモン生理変化、それによる性成熟程度を判断可能である。
【００３５】
本発明の一例は、配列番号１、配列番号２、および配列番号３のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上のペプチド、または配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択された１種以上のポリヌクレオチドを含む、ウナギのＪｅＬＨ探知用マーカを提供する。
【００３６】
前記配列番号１のアミノ酸から構成されたペプチドマーカ（以下、第１マーカ）または配列番号２のアミノ酸から構成されたペプチドマーカ（以下、第２マーカ）または配列番号３のアミノ酸から構成されたペプチドマーカ（以下、第３マーカ）はＪｅＬＨ−βサブユニット（配列番号６）の一部であり、下記の実施例１で確認したように、前記三つのマーカはＬＨの遺伝子配列とウナギの他のホルモン（ＪｅＦＳＨ、ＪｅＴＳＨなど）との類似性を考慮してＬＨベータで膜蛋白質（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）サイトがないのを確認し、シグナルペプチド部位除外、Ｎ−グリコシル化（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）修飾位置を除外、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）部分を除いて親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）部分を選択すると同時に、ウナギの性成熟ホルモン配列の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を比較して最も有力な候補ペプチドを選抜したものである。本発明のペプチドマーカ抗原は、第１マーカ、第２マーカおよび第３マーカからなる群より選択された１種以上を含んでもよいが、好ましくは第１マーカ、第２マーカ、および第３マーカを全て含むことが適切である。
【００３７】
現在、ウナギの性成熟ホルモンを免疫学的に分析するための努力が諸所で起こっており、ウナギ体内の病原菌による内分泌系変化、一般的生理状態のウナギ血液内に含まれている性成熟ホルモンの濃度を測定するためのシステムを構築する試みが起こっている。以前に知られたＪｅＬＨ−β／ｍＧＴＨ−α（ｍｏｕｓｅ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ  α）キメラ抗原に対するポリクローナル抗体は、ＪｅＬＨだけでなくその他の性成熟ホルモン（ＪｅＦＳＨ、ＪｅＴＳＨ、ＧＴＨなど）とも抗原−抗体結合反応を起こすためＪｅＬＨのみを特異的に検出するための抗体として使用するには不適切であった。
【００３８】
これとは異なり、本発明の第１マーカ、第２マーカおよび第３マーカからなる群より選択された１種以上を含むペプチドマーカはウナギのＪｅＬＨのみを特異的に検出することができ、前記ペプチドマーカを抗原として使用して製造された抗体は他のウナギ性成熟ホルモンとは結合せず、ただＪｅＬＨのみに特異的に抗原−抗体反応が起こるので、ＪｅＬＨ特異検出抗体として使用するのに適切である。
【００３９】
また、本発明は、前記ＪｅＬＨ探知用ペプチドマーカ（第１マーカ、第２マーカ、第３マーカ）および／または前記マーカをコードするポリヌクレオチドを検出できる製剤を含むＪｅＬＨ検出用組成物およびキットを提供し、ウナギの性成熟度を判断するために、ウナギの生物学的試料から配列番号１、配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上のペプチド、または配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択された１種以上のポリヌクレオチドまたはＪｅＬＨ蛋白質を検出する方法を提供する。
【００４０】
また、本発明は、前記配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列からなる群より選択された１種以上のポリヌクレオチドを含む、ウナギのＪｅＬＨ探知用マーカを提供することができ、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を全て含むＪｅＬＨ探知用マーカを提供することができる。
【００４１】
前記“ポリヌクレオチドを検出できる製剤”は、生物学的試料内でＬＨをコードするポリヌクレオチドを検出するために用いることができる物質を意味する。具体的な一例として、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１マーカまたは配列番号２のアミノ酸配列を有する第２マーカまたは配列番号３のアミノ酸配列を有する第３マーカをコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）、プローブ（ｐｒｏｂｅ）、アンチセンス核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｓ）などであってもよい。
【００４２】
この時、相補的に結合するということは、所定の混成化またはアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）条件、好ましくは生理学的条件下でアンチセンス核酸がターゲットに選択的に混成化できる程度に十分に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）および完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）なことを全て含む意味を有し、好ましくは完全に相補的なことを意味する。
【００４３】
本発明で“蛋白質を検出できる製剤”は、試料内でＬＨ蛋白質を検出するために用いることができる物質を意味する。好ましく、前記ＬＨ蛋白質をターゲット（ｔａｒｇｅｔ）とする特定化合物または合成物質であってもよい。具体的な一例として、前記ＬＨ−βアミノ酸配列の一部の第１マーカまたは第２マーカまたは第３マーカまたはこの三つのマーカ全部に特異的な抗体、抗原結合断片またはアプタマーであってもよい。好ましくはモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、さらに好ましくは体液の中で複雑且つ微細なホルモンの変化を感作することができ、正確にＬＨのみを検出することができるポリクローナル抗体であってもよい。
【発明の効果】
【００４４】
本発明は、ウナギの黄体形成ホルモン（ＬＨ）に特異的に結合する抗体を生物学的試料と接触させ、抗原−抗体複合体が形成されるかを探知して、当該試料内にウナギ黄体形成ホルモンの存在有無を容易に検出することができ、複合体形成程度によってウナギ黄体形成ホルモンを定量的に分析可能であり、ウナギの性成熟程度を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】実施例１−１によって、ウナギＪｅＬＨ−βサブユニットのトランスメンブレン領域を分析した結果である。
【図２】実施例１−１によって、ウナギＪｅＬＨ−βサブユニットの信号配列（ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ、成熟蛋白質後に脱落する部分）部分分析結果を示したものである。
【図３】実施例１−１によって、ウナギＪｅＬＨ−βサブユニットの糖鎖修飾（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）部分分析結果を示したものである。
【図４】実施例１−１によって、ウナギＪｅＬＨ−βサブユニットの疎水性分析（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）後、一番目に予測された親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）配列部分を示したものである。
【図５】実施例１−１によって、ウナギＪｅＬＨ−βサブユニットの疎水性分析（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）後、二番目に予測された親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）配列部分を示したものである。
【図６】実施例１−１によって、ウナギＪｅＬＨ−βサブユニットの疎水性分析（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）後、三番目に予測された親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）配列部分を示したものである。
【図７】（Ａ）実施例２のウナギＪｅＬＨ−βサブユニットに対するポリクローナル抗体、（Ｂ）比較例１のウナギＪｅＬＨ−βサブユニットとマウスのＧＴＨ−αサブユニットがキメラポリクローナル抗体の抗体生産の全過程の模式図を示す。
【図８】実施例１−２によって、ウナギＪｅＦＳＨ、ＪｅＬＨ、ＪｅＴＳＨのβサブユニットのアミノ酸配列の相同性を比較したものであって、黒い部分は三種類のホルモンの全てに共通的に存在する配列であり、灰色部分は三種類のホルモンのうちの二種類のホルモンに共通的に存在する配列であり、赤いボックスで表示した部分はウナギＪｅＬＨ−βアミノ酸配列の中の抗体を生産するために使用した部分を表示したものである。
【図９】比較例１によって、ウナギＪｅＬＨ−βサブユニットのアミノ酸配列とマウスのＧＴＨ−αアミノ酸配列が連結されたキメラＬＨ抗原をＳＤＳ電気泳動で確認したものである。
【図１０】実施例２によって、ＪｅＬＨ−βのＮ−末端から３１−４４番目のアミノ酸から構成されたペプチド抗原（配列番号１）、ウナギのＪｅＬＨ−βのＮ−末端から５９−７１番目のアミノ酸から構成されたペプチド抗原（配列番号２）、およびウナギのＪｅＬＨ−βのＮ−末端から１１９−１２９番目のアミノ酸から構成されたペプチド抗原（配列番号３）の混合物をウサギに免疫した後に血液を採取して抗体価をＥＬＩＳＡを用いて分析したものであって、二回反復した結果を示す。
【図１１】比較例１によって、ウナギＪｅＬＨ−βサブユニットとマウスのＧＴＨ−αサブユニットを組換えしたキメラＪｅＬＨ抗原をウサギに免疫した後に血液を採取して抗体価をＥＬＩＳＡを用いて分析したものであって、二回反復実験の結果を示したものである。
【図１２】実施例２によって、ＪｅＬＨ−βのＮ−末端から３１−４４番目のアミノ酸から構成されたペプチド抗原（配列番号１）、ウナギのＪｅＬＨ−βのＮ−末端から５９−７１番目のアミノ酸から構成されたペプチド抗原（配列番号２）、およびウナギのＪｅＬＨ−βのＮ−末端から１１９−１２９番目のアミノ酸から構成されたペプチド抗原（配列番号３）の混合物をウサギに免疫して得られたポリクローナル抗体の中のＩｇＧを精製した後、ＳＤＳ電気泳動した結果を示す。
【図１３】比較例１によって、ウナギＪｅＬＨ−βサブユニットとマウスのＧＴＨ−αサブユニットを組換えしたキメラＬＨ抗原をウサギに免疫して得られたポリクローナル抗体の中のＩｇＧを精製した後、ＳＤＳ電気泳動した結果を示す。
【図１４】実験例１−１によって、蚕蛹から生産したＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαを対象にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥしてＣＢＢ染色した結果である。
【図１５】実験例１−２によって、蚕蛹から生産したＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαを対象にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移して、Ｈｉｓ抗体でウェスタンブロッティングした結果である。
【図１６】実験例１−３によって、蚕蛹から生産したＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαを対象にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移した後、比較例１でＪｅＬＨ−βサブユニットとマウスのＧＴＨ−αサブユニットのキメラ抗原に対するポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングした結果である。
【図１７】実験例１−４によって、蚕蛹から生産したＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαを対象にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移して実施例２で製造したウナギＪｅＬＨ−βペプチドに対するポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングした結果である。
【図１８】実験例２によって、蚕蛹から生産したＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβを対象にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥしてニトロセルロースメンブレンに移した後、１：５，０００、１：１０，０００、１：２０，０００の比率で希釈した実施例２で製造したウナギＬＨ−βペプチドに対するポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングした結果である。
【図１９】実験例３によって、蚕蛹から生産したＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβを１．６μｇ混合後、ＪｅＬＨの含量を１．４、１．２、１．０、０．８、０．４、０．２、０μｇの順に減少させ他のホルモンは同量で混合した試料を対象にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移して、ウナギＪｅＬＨベータペプチドに対するポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングした結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例によって限定されるのではない。
【実施例】
【００４７】
実施例１：ウナギのＪｅＬＨに特異的なマーカ選定
１−１：ＪｅＬＨ−βサブユニットの分析
ウナギＪｅＬＨ−βサブユニットの構造確認のために、トランスメンブレンおよび信号配列を検索し、蛋白質の親水性と疎水性をコンピュータプログラムを用いて分析した。具体的に、ウナギＬＨ−βサブユニット（配列番号６）においてトランスメンブレン（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ、ＴＭ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）領域、分泌信号配列（Ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＳＰ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）、糖鎖修飾（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）と疎水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ、ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ／）、親水性（ｈｙｄｏｐｈｉｌｉｃ  ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ／）部位を分析し、分析結果を図１乃至図６に示した。トランスメンブレン領域は図１に示し、分泌信号配列は図２に、糖鎖修飾部分を図３に、疎水性および親水性部分分析結果は図４乃至６に示した。
【００４８】
図１乃至図６から分かるように、ウナギＬＨ−βサブユニットの構造においてトランスメンブレン（ＴＭ）領域は存在せず（図１）、分泌信号配列はＮ−末端から１−２４番目アミノ酸配列部分（配列番号７）が存在するのを確認し（図２）、Ｎ−末端から３４番目アミノ酸のＮ（Ｎ−Ｅ−Ｔ、ＮＥＴ配列においてＮの位置）部分がＮ−糖鎖修飾されており（図３）、Ｎ−末端から２１〜５０番目までアミノ酸配列（配列番号８）が親水性の高い部分であって、そのうちのＥＰＩＮＥＴＮＳＶＥＫＤＧＣ（配列番号１）が親水性領域であり（図４）、二番目に確認した親水性の高い部分はＮ−末端から５１〜８０番目までアミノ酸配列（配列番号９）領域であり、そのうちのＣＩＴＫＤＰＳＹＫＧＰＬＳ（配列番号２）が親水性領域であるのを確認し（図５）、三番目に確認した親水性の高い部分はＮ−末端から１１１番目〜１４０番目までアミノ酸配列（配列番号１０）領域であり、そのうちのＳＤＣＡＩＱＳＬＲＰＤ（配列番号３）が親水性領域（図６）であるのを確認した。
【００４９】
１−２：ＪｅＬＨ−βサブユニットをＪｅＦＳＨおよびＪｅＴＳＨのβサブユニットと比較分析
ウナギ脳下垂体糖蛋白質ホルモンのＪｅＦＳＨ−βサブユニット、ＪｅＬＨ−βサブユニット、およびＪｅＴＳＨ−βサブユニットのアミノ酸配列の相同性をｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ−ｂｉｎ／ｃｌｕｓｔａｌｗで多重配列アラインメント（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ、ＭＳＡ）方法を用いて比較分析した。
【００５０】
ＪｅＬＨとＪｅＦＳＨのホモロジースコア（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｃｏｒｅ）は３９、ＪｅＬＨとＪｅＴＳＨは２９と示され、具体的な三種類の糖蛋白質ホルモンのβサブユニット配列の相同性分析結果を図８に示した。図８において黒い色で表示した部分は三種類のホルモン全部に共通的に存在する配列を示し、灰色部分は三種類のホルモンのうちの二種類のホルモンに共通的に存在する配列であり、赤いボックスで表示した部分はウナギＪｅＬＨベータサブユニットの配列のうちのＪｅＦＳＨとＪｅＴＳＨには存在せず、ＬＨのみに存在するアミノ酸配列領域であって、本発明のポリクローナル抗体を生産するために用いたポリペプチド部分を表示したものである。
【００５１】
１−３：ＪｅＬＨ抗体製造用抗原ポリペプチドの選定
前記実施例１−１から得られた分泌信号配列、Ｎ−糖鎖修飾配列および疎水性領域に関する情報と、前記実施例１−２によってＪｅＦＳＨおよびＪｅＴＳＨのβサブユニットのアミノ酸配列相同性分析結果から、アミノ酸配列相同性の低い配列を総合して、最終的にＪｅＬＨ−βサブユニットのＮ末端から３１−４４番目のアミノ酸配列部分（ＥＰＩＮＥＴＮＳＶＥＫＤＧＣ−配列番号１）、５９−７１番目アミノ酸配列部分（ＣＩＴＫＤＰＳＹＫＧＰＬＳ−配列番号２）、および１１９−１２９アミノ酸配列部分（ＳＤＣＡＩＱＳＬＲＰＤ−配列番号３）をＪｅＬＨポリクローナル抗体製造用マーカペプチドに選定した。
【００５２】
実施例２：マーカペプチドを用いたポリクローナル抗体製作
前記実施例１で選抜した配列番号１のアミノ酸から構成されたペプチドマーカ（以下、第１マーカ）、配列番号２のアミノ酸から構成されたペプチドマーカ（以下、第２マーカ）、および配列番号３のアミノ酸から構成されたペプチドマーカ（以下、第３マーカ）を混合しウサギに免疫化してウサギポリクローナル抗体を製造した。
【００５３】
より具体的に、前記第１マーカ、第２マーカ、および第３マーカを混合してウサギの腹腔内に総３回注射してポリクローナル抗体を製造した。まず、２００μｇの精製されたマーカ抗原混合物に２μＬの１０％ＳＤＳを添加した後に２分間加熱し、２００μＬのコンプリートアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ´ｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｕｖａｎｔ、Ｓｉｇｍａ）を添加して超音波処理した。その後、ウサギの腹腔に１次に抗原を注入してから４−５週経過後に採血し、２次の抗原注入を実施した。これから２週経過後に採血し、３次の抗原を注入し、抗原をウサギに３次ブースティング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）し、９週後に血液を採取した後、血液とＴＢＳＴバッファーを１：１００、１：１，０００、１：５，０００、１：１０，０００、１：５０，０００、１：１００，０００の比率で混合したウナギＬＨ探知用組成物を処理して１時間室温で反応させた。その後、ＴＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ基質を用いて４５０ｎｍ波長で（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ  ｖｉｃｔｏｒ  Ｘ３）で測定して直接ＥＬＩＳＡ（ｄｉｒｅｃｔ  ＥＬＩＳＡ）分析を行った（図１０）。
【００５４】
ＥＬＩＳＡ分析結果、血液とＴＢＳＴバッファーを１：５０，０００〜１：１００，０００の比率で混合したウナギＪｅＬＨ探知用組成物を処理した時にＯＤ値が１．０以下と測定され、以後免疫反応活性が高い水準に示されるのを確認した。二匹のウサギに免疫したサンプルは全て同一な傾向を示した。
【００５５】
追加的に、前記で生産したＪｅＬＨ−βサブユニットを特異的に認識するポリクローナル抗体の中のＩｇＧを精製した後にＳＤＳ電気泳動し、その結果を図１２に示した。図１２の１−３番レーンは前記精製したポリクローナル抗体をそれぞれ０．５、１、２μｇローディングしたものであり、４、５番レーンは濃度確認のためにＢＧＧ（ｂｏｖｉｎ  ｇａｍｍａ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ）１、２μｇをそれぞれローディングしたものであり、６番は蛋白質サイズマーカである。矢印で提示した部分が本発明抗体の重鎖（Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）を示す。
【００５６】
比較例１：ＪｅＬＨβ／ｍＧＴＨαキメラ抗原を用いたポリクローナル抗体生産
ウナギＬＨのβサブユニットは維持し、αサブユニットをマウスのＧＴＨ（Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ）−αサブユニットで置換した配列番号４のアミノ酸からなるキメラ形態（ＪｅＬＨ−β／ｍＧＴＨ−α）のＬＨ抗原をウサギに注射して、前記キメラ抗原を特異的に認識するポリクローナル抗体を製造した（図７の（Ｂ））。
【００５７】
より具体的に、ＪｅＬＨ−β／ｍＧＴＨ−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号５）と韓国登録特許１０−１４９３９５７号公報に開示されたカイコの幼虫および蛹発現システムを用いて配列番号４のアミノ酸からなるキメラ形態のＬＨ抗原を製造し、ＳＤＳ電気泳動を通じて確認した（図９参照）。図９に示されているように、ＳＤＳ電気泳動確認結果、キメラ形態のＬＨ抗原は約３５ｋＤａ分子量を有し糖鎖付加効果によるスメア（ｓｍｅａｒ）な状態であるのを確認することができた。
前記で製造したキメラ形態のＬＨ抗原を実施例２と同様な方法でウサギに注射して、キメラ抗原を特異的に認識するポリクローナル抗体を製造した。
【００５８】
その次に、ＪｅＬＨβ／ｍＧＴＨαキメラ抗原をウサギに３次ブースティング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）し、９週後に血液を採取し、これを１：１００、１：１，０００、１：５，０００、１：１０，０００、１：５０，０００、１：１００，０００の比率でＴＢＳＴバッファーと混合して抗原との反応をテストした。抗体価をＥＬＩＳＡを用いて二回反復して分析し、その結果を図１１に示した。
【００５９】
ＥＬＩＳＡ分析結果、１：１０，０００でＯＤ値が約１．０と測定され、この比率が以後抗原−抗体反応などの実験において最小反応比率であるのが分かった。前記結果は、二匹のウサギに免疫したサンプルで類似な傾向を示した（図１１）。
【００６０】
追加的に、前記で生産したキメラ抗原を特異的に認識するポリクローナル抗体の中のＩｇＧを精製した後にＳＤＳ電気泳動し、その結果を図１３に示した。図１の１−３番レーンは前記精製したポリクローナル抗体をそれぞれ０．５、１、２μｇローディングしたものであり、４、５番レーンは濃度確認のためにＢＧＧ（ｂｏｖｉｎ  ｇａｍｍａ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ）１、２μｇをそれぞれローディングしたものであり、６番は蛋白質サイズマーカである。矢印で提示した部分が本発明抗体の重鎖（Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）を示す。
【００６１】
実験例１：抗体のＪｅＬＨ特異性評価
１−１．ＣＢＢ染色結果
韓国登録特許１０−１４９３９５７号公報に開示されたカイコの幼虫および蛹発現システムと実質的に同様な方法を用いて製造し分離したＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動し、クマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌａｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ、ＣＢＢ）染色を行い、その結果を図１４に示した。
【００６２】
具体的に、それぞれのポリペプチドホルモンを製造するために、ホルモンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（ＪｅＬＨ：配列番号１１、ＪｅＬＨβ：配列番号６、ＪｅＦＳＨ：配列番号１２、ＪｅＦＳＨβ：配列番号１３、ＪｅＴＳＨ：配列番号１４、ＪｅＴＳＨβ：配列番号１５、ＪｅＧＴＨα：配列番号１６）を市販されるバキュロウイルス転移ベクター（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ）に製造会社から提供されるプロトコルに沿ってクローニングして組換え転移ベクターを製造し、このように製造した組換え転移ベクターを宿主細胞（ＢｍＤＨ１０Ｂａｃコンフィデント細胞）に形質転換させて組換えバクミドを製造する。形成されたバクミドを通常のプラスミド抽出法を用いて細胞から分離する。分離した組換えバクミドをカイコ（ＢｍＮ）細胞内に形質感染させ、形質感染された昆虫細胞から組換えバキュロウイルスを分離して、これをカイコの幼虫または蛹生体に注入し形質転換してそれぞれのＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨα蛋白質を発現させる。その次に、前記カイコの幼虫または蛹の細胞または体液からそれぞれの発現させた蛋白質を通常の方法を用いて分離、精製した。
【００６３】
図１４から分かるように、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαはそれぞれ３３、１８、１８、３３、１９、１８、３３、１８、１８ｋＤａの分子量を有するのを確認し、これはそれぞれの塩基配列から予想されたサイズより約７−８ｋＤａ高い値であって、糖鎖付加による結果である。
【００６４】
【表２】
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【００６５】
１−２．Ｈｉｓ抗体ウェスタンブロット分析
実験例１−１と同様な方法で合成して分離したＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαをＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移してＨｉｓ抗体でウェスタンブロッティングを行い、その結果を図１５に示した。
【００６６】
図１５から分かるように、ＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαそれぞれの分子量がＣＢＢ染色結果と同様に確認され、これは組換えタンパク質の製作時にタグとして使用されたＨｉｓ抗体は全てのウナギの性ホルモン蛋白質と結合を形成するのを確認した。
【００６７】
１−３．比較例１抗体ウェスタンブロット分析
実験例１−１と同様な方法で合成して分離したＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαをＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移して、前記比較例１で製造したウナギＬＨβとマウスのＧＴＨαのキメラポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングを行い、その結果を図１６に示した。
【００６８】
図１６から分かるように、比較例１の抗体はＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβと結合して２番と３番レーンでバンドが明確に現れるが、その他のＧＴＨα蛋白質とも弱いが結合し、抗体が種間類似性を認識してＦＳＨ（５レーン）、ＦＳＨβ（６レーン）、ＧＴＨα（７レーン）とＴＳＨ（８レーン）、ＴＳＨβ（９レーン）、ＧＴＨα（１０レーン）とも弱くても結合を形成するのを確認した。
したがって、比較例１抗体はＪｅＬＨのみを特異的に検出するに不適切であるのを確認することができた。
【００６９】
１−４．本発明のポリクローナル抗体ウェスタンブロット分析
実験例１−１と同様な方法で合成して分離したＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβ、ＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβ、ＪｅＧＴＨαをＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ニトロセルロースメンブレンに移して前記実施例２で製造した本発明の配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチド、配列番号２のアミノ酸からなるポリペプチド、および配列番号３のアミノ酸からなるポリペプチド混合物をウサギに注射して得られたポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングを行い、その結果を図１７に示した。
【００７０】
図１７から分かるように、本発明のポリクローナル抗体はただＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβと特異的に結合し、ウナギの脳下垂体ホルモンの共通配列のＧＴＨαはもちろん（４、７、１０レーン）、ＪｅＦＳＨとＪｅＴＳＨの特異配列のベータ（５、６、８、９レーン）にもバンドが現れず、これから本発明のポリクローナル抗体はＧＴＨ、ＪｅＧＴＨα、ＪｅＦＳＨ、ＪｅＦＳＨβ、ＪｅＴＳＨ、ＪｅＴＳＨβとは結合せず、ＪｅＬＨのみを特異的に認識して選別することができる抗体であるのを確認した。
【００７１】
本発明のポリクローナル抗体は比較例１のＪｅＬＨβ／ｍＧＴＨαを連結したキメラ抗原から得られたポリクローナル抗体のＬＨ以外の他のホルモンとも非特異的に結合する問題点を解決したものであって、ＬＨ検出特異性において本発明のポリクローナル抗体が優れた効能を有するのが分かった。
【００７２】
実験例２：抗体の検出感度測定
実験例１−１と同様な方法で合成して分離したＪｅＬＨ、ＪｅＬＨβをＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ニトロセルロースメンブレンに移した後、前記実施例２で製造した本発明の配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチド、配列番号２のアミノ酸からなるポリペプチド、および配列番号３のアミノ酸からなるポリペプチドの混合物をウサギに注射して得られたポリクローナル抗体を１：５，０００、１：１０，０００および１：２０，０００の比率で希釈した後にウェスタンブロッティングを行い、その結果を図１８に示した。
【００７３】
図１８に示されているように、本発明ポリクローナル抗体ＬＨ結合特異性を確認することができ、ポリクローナル抗体を１：２０，０００の比率で希釈した時も抗原−抗体反応が起こり、これは以前のＥＬＩＳＡ結果とも一致する結果である。
【００７４】
実験例３：抗体を用いた試料中のＪｅＬＨ検出
ウナギの血液には多様なホルモンが混合されており、このような血液と類似な環境を形成して本願発明ポリクローナル抗体のＪｅＬＨ検出特異性を確認した。ウナギの血液と類似な環境をセッティングするために、実験例１−１と同様な方法で合成して分離したＪｅＦＳＨ、ＪｅＬＨおよびＪｅＴＳＨをそれぞれ１．６μｇずつ混合した試料、その次にそれぞれの混合量を０．２μｇずつ減少させて（１．６、１．４、１．２、１．０、０．８、０．６、０．４、０．２、０）混合した試料を対象にして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ニトロセルロースメンブレンに移し、前記実施例２で製造した本発明のポリクローナル抗体を処理してウェスタンブロッティングを行い、その結果を図１９に示した。
【００７５】
図１９に示されているように、ＪｅＦＳＨとＪｅＴＳＨが検出されなければならない部分でバンドが現れず、本発明のポリクローナル抗体がＪｅＬＨに特異的に結合するのを確認することができた。また、競争法（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）を通じて本願のポリクローナル抗体を用いる場合、ホルモンが混合された状態の検体でもＪｅＬＨのみを特異的に検出することができるのを確認した。
【配列フリーテキスト】
【００７６】
配列番号１：  JeLHβ  N'31-44番目アミノ酸配列
配列番号２：  JeLHβ  N'59-71番目アミノ酸配列
配列番号３：  JeLHβ  N'119-129番目アミノ酸配列
配列番号４：  JeLH-β/mGTH-α  キメラ抗原アミノ酸配列
配列番号５：  JeLH-β/mGTH-α  キメラ抗原塩基配列
配列番号６：  JeLHβ  Fullアミノ酸配列
配列番号７：  JeLH-β  分泌信号配列  N'1-24番目アミノ酸配列
配列番号８：  JeLH-β親水性部分1
配列番号９：  JeLH-β親水性部分2
配列番号１０：  JeLH-β親水性部分3
配列番号１１：  JeLHのポリペプチド配列
配列番号１２：  JeFSHのポリペプチド配列
配列番号１３：  JeFSH-βサブユニットのポリペプチド配列
配列番号１４：  JeTSHのポリペプチド配列
配列番号１５：  JeTSH-βサブユニットのポリペプチド配列
配列番号１６：  JeGTH-αのポリペプチド配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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