(57)【要約】【課題】黒大豆種皮抽出物の有する血管内皮機能改善効果を相乗的に高めることができる可食性組成物を提供する。【解決手段】黒大豆種皮抽出物およびヒハツ抽出物を必須成分として含有することにより、血清中ＮＯ産生増強、肝臓中抗酸化機能改善および血清中中性脂肪量低下機能改善を促進させ、相乗的に血管内皮機能改善効果を高めることができる可食性組成物および血管内皮機能改善剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
黒大豆種皮抽出物およびヒハツ抽出物を必須成分として含有することを特徴とする、血清中一酸化窒素産生増強用可食性組成物。
【請求項２】
黒大豆種皮抽出物およびヒハツ抽出物を必須成分として含有することを特徴とする、肝臓中抗酸化機能改善促進用可食性組成物。
【請求項３】
黒大豆種皮抽出物およびヒハツ抽出物を必須成分として含有することを特徴とする、血清中中性脂肪量低下機能促進用可食性組成物。
【請求項４】
黒大豆種皮抽出物およびヒハツ抽出物を必須成分として含有し、血清中一酸化窒素産生増強作用を有することを特徴とする、請求項１記載の血管内皮機能改善剤。
【請求項５】
黒大豆種皮抽出物およびヒハツ抽出物を必須成分として含有し、肝臓中抗酸化機能改善促進作用を有することを特徴とする、請求項２記載の血管内皮機能改善剤。
【請求項６】
黒大豆種皮抽出物およびヒハツ抽出物を必須成分として含有し、血清中中性脂肪量低下機能促進作用を有することを特徴とする、請求項３記載の血管内皮機能改善剤。
【請求項７】
黒大豆種皮抽出物およびヒハツ抽出物を必須成分として含有し、血清中一酸化窒素産生増強作用、肝臓中抗酸化機能改善促進作用および血清中中性脂肪量低下機能促進作用を有することを特徴とする、血管内皮機能改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黒大豆種皮抽出物とヒハツ抽出物を必須成分として含有し、血清中一酸化窒素産生増強、肝臓中抗酸化機能改善および血清中中性脂肪量低下機能改善を促進させ、血管内皮機能改善効果を有する可食性組成物および血管内皮機能改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮細胞から産生される一酸化窒素（ＮＯ）は、血管弛緩作用、ＬＤＬコレステロールの酸化抑制作用、血小板凝集抑制作用、抗平滑筋細胞増殖作用など、多様な生理活性を発揮する。そのため、老化や生活習慣病による血管内皮機能の低下に起因するＮＯ産生量の低下は、動脈硬化の進展、さらにはプラーク（粥腫）の不安定化を惹き起こし、最終的には脳卒中や心筋梗塞などの重篤な疾患につながることが知られている。
【０００３】
生体内の抗酸化機能が弱まると、消去しきれなくなった活性酸素によって血管内皮細胞が傷害を受ける。また、血清中の中性脂肪が増加するとＬＤＬコレステロールが小型化しやすくなり、ＬＤＬコレステロールが酸化されて動脈硬化が進む。すなわち、生体内の抗酸化機能の低下や血清中中性脂肪の増加によって、血管内皮機能の低下が惹き起こされる。
【０００４】
そこで、生体内の血清中ＮＯ産生機能、肝臓中抗酸化機能、および血清中中性脂肪量を改善することは、血管内皮機能の低下や、そこから進展する動脈硬化をはじめとする疾病を予防する上で大変重要になる。
【０００５】
黒大豆種皮抽出物には、プロアントシアニジン、アントシアニンなどのポリフェノールが多量に含まれる。黒大豆ポリフェノールは、高い抗酸化機能を有し、これまでに、血管内皮機能改善効果や血糖値上昇抑制効果、美白効果、肝機能改善効果、脳機能改善効果、血清中脂質量改善効果などの生理機能調節作用が多数報告されている（非特許文献１）。
【０００６】
一方、ヒハツ抽出物には、血流改善効果やむくみ感改善作用が報告されており、その作用メカニズムのひとつとして、ＮＯ合成酵素産生促進による血管の拡張が挙げられている（特許文献１）。
【０００７】
しかし、黒大豆種皮抽出物とヒハツ抽出物を併用した際の血清中ＮＯ産生増強、肝臓中抗酸化機能改善および血清中中性脂肪量低下機能改善の促進効果に関しては知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−２９８４２９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】難波文男，日本醸造協会誌，１０８巻６号，４１３−４１９（２０１３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、黒大豆種皮抽出物の有する血管内皮機能改善効果を相乗的に高めることができる組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、黒大豆種皮抽出物とヒハツ抽出物を併用すると血清中ＮＯ産生増強促進、肝臓中抗酸化機能改善促進および血清中中性脂肪量低下機能改善促進の効果によって、相乗的に血管内皮機能改善効果が高められることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下に関するものである。
（１）黒大豆種皮抽出物およびヒハツ抽出物を必須成分として含有することを特徴とする、血清中一酸化窒素産生増強用可食性組成物に関する。
（２）黒大豆種皮抽出物およびヒハツ抽出物を必須成分として含有することを特徴とする、肝臓中抗酸化機能改善促進用可食性組成物に関する。
（３）黒大豆種皮抽出物およびヒハツ抽出物を必須成分として含有することを特徴とする、血清中中性脂肪量低下機能促進用可食性組成物に関する。
（４）黒大豆種皮抽出物およびヒハツ抽出物を必須成分として含有し、血清中一酸化窒素産生増強作用を有することを特徴とする、（１）記載の血管内皮機能改善剤に関する。
（５）黒大豆種皮抽出物およびヒハツ抽出物を必須成分として含有し、肝臓中抗酸化機能改善促進作用を有することを特徴とする、（２）記載の血管内皮機能改善剤に関する。
（６）黒大豆種皮抽出物およびヒハツ抽出物を必須成分として含有し、血清中中性脂肪量低下機能促進作用を有することを特徴とする、（３）記載の血管内皮機能改善剤に関する。
（７）黒大豆種皮抽出物およびヒハツ抽出物を必須成分として含有し、血清中一酸化窒素産生増強作用、肝臓中抗酸化機能改善促進作用および血清中中性脂肪量低下機能促進作用を有することを特徴とする、血管内皮機能改善剤に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、黒大豆種皮抽出物とヒハツ抽出物を必須成分として含有する、安全で効果的な、血清中ＮＯ産生機能、肝臓中抗酸化機能、および血清中中性脂肪量低下機能の改善を向上、促進させる可食性組成物および血管内皮機能改善剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において用いられる黒大豆とは、マメ科ダイズ属Glycine max(L.)Merrillに属する短日性の一年生草木の黒い種子（子実）である。黒大豆には、例えば中生光黒、トカチクロ、いわいくろ、玉大黒、丹波黒、信濃黒及び雁喰などの品種があるが、黒大豆であればどの品種の種子を使用しても良い。
【００１５】
本発明では黒大豆をそのまま加工原料として使用できる。またそれを粉砕、破砕等により粉末状にしたものであっても良い。さらに、黒大豆を、例えば分別機等に供することで種皮と胚（子葉および胚軸）とに分別することができる。本発明では当該分別により得られる黒大豆の種皮を加工原料として使用することができる。加工処理に際して、黒大豆の種皮は、分別したそのままの状態（生または乾燥物）のものであっても、またそれを破砕若しくは粉砕した状態のもの（破砕物、粉砕物、及び粉末状物を含む）であってもよい。
【００１６】
黒大豆または黒大豆種皮からの抽出方法としては、一般に用いられる方法を利用することができ、その方法は特に限定はされないが、例えば水溶性溶媒中に生または乾燥処理した黒大豆種皮（そのままの形状、若しくは粗末、細切、破砕、粉砕状）を浸漬する方法；必要に応じて攪拌しながら抽出する方法；またはパーコレーション法等を挙げることができる。抽出に使用する温度条件は、特に制限されず、低温、常温、加温条件（高温を含む）のいずれの条件でもよいが、好ましくは加温条件（高温を含む）である。より具体的には、後述の含水低級アルコールで抽出する場合は３０℃以上、好ましくは４０℃〜６０℃の範囲であり、制限されないものの、かかる温度条件での抽出を６０分以上、好ましくは９０分〜１２０分程度行なう。また、水で抽出する場合は、５０℃以上、好ましくは６０〜８０℃の範囲であり、制限されないものの、かかる温度条件での抽出を１０分以上、好ましくは２０分〜１２０分程度行う。
【００１７】
抽出に使用する水溶性溶媒としては、特に制限されないが、水、低級アルコール、またはこれらの混合物を挙げることができる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロピルアルコール、ブタノール等の炭素数１〜４の低級アルコールを例示することができる。低級アルコールとして好ましくはエタノールを挙げることができる。水溶性溶媒として好ましくは、水、または含水低級アルコール（特に含水エタノール）であり、より好ましくは水である。尚、含水低級アルコールを溶媒として使用する場合、それに含まれる低級アルコール量は８０容量％以下であることが好ましい。
【００１８】
本発明の効果を奏することを限度として、得られた抽出液に対し、必要に応じて、さらにろ過、共沈または遠心分離による固形物の除去、抽出処理、吸着処理等の精製処理を行ってもよい。
【００１９】
本発明で使用する黒大豆種皮抽出物の投与量としては、成人1日あたり５０〜５００ｍｇが好ましい。
【００２０】
本発明において用いられるヒハツとは、コショウ科に属するヒハツ（Piper longum Linn.（別名：インドナガコショウ）である。ヒハツは、成熟した、または未成熟の果穂、葉、葉柄、枝、根等が用いられ、これらの原料はそのまま利用しても良いが必要により粉砕、抽出等の操作を行ってから利用することもできる。ヒハツの抽出に際しては、飲食物の抽出に使用する溶媒が使用でき、例えば水、アルコールなどの親水性有機溶媒やヘキサンなどの疎水性有機溶媒を使用し、常法の植物抽出物製造に従った抽出操作を行うだけでよい。
【００２１】
本発明で使用するヒハツ抽出物の投与量としては、成人1日あたり５０〜５００ｍｇが好ましい。
【００２２】
本発明で使用する黒大豆種皮抽出物とヒハツ抽出物の重量比としては、１：５〜５：１であるのが好ましく、４：３であるのが特に好ましい。
【００２３】
本発明の血管内皮機能改善剤は、経口投与形態であれば、その形態を特に問わない。また経口投与（経口摂取）形態を有するものである限り、その用途の別（医薬品、医薬部外品、飲食物［特定保健用食品や栄養機能性食品などの保健機能性食品やサプリメントを含む］）は、特に制限されるものではない。
【００２４】
経口投与形態として、具体的には、上記の抽出液（黒大豆種皮抽出液とヒハツ抽出液）を液剤（エキス形態やシロップを含む）またはゼリー剤の形態に調製したもの；抽出液を常法により粉末状または顆粒状に製剤化した散剤、細粒剤、または顆粒剤；液剤や散剤または顆粒剤をカプセルに充填したカプセル剤（硬質カプセル剤、軟質カプセル剤）；または粉末または顆粒をさらに打錠して錠剤形態としたものなどを挙げることができる（固形製剤）。
【００２５】
本発明の血管内皮機能改善剤は、上記の抽出液（黒大豆種皮抽出液とヒハツ抽出液）と薬学的にまたは食品として許容される従来公知の可食性の担体、賦形剤等を組み合わせて各種剤型（経口投与形態）に調製することもできる。
【００２６】
本発明の血管内皮機能改善剤を液状製剤の形態とする場合、凍結保存することもでき、また凍結乾燥等により水分を除去して保存してもよい。凍結乾燥製剤やドライシロップ等は、使用時に滅菌水等を加え、再度溶解して使用される。
【００２７】
本発明の血管内皮機能改善剤を固形剤の形態とする場合、例えば、錠剤の場合であれば、担体として当該分野で従来公知のものを広く使用することができる。このような担体としては、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒプロメロース、アルギン酸ナトリウム等の結合剤；乾燥デンプン、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、クロスポビドン、ポビドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等の崩壊剤；ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン等の保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用できる。さらに錠剤は、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。また、前記有効成分を含有する組成物を、ゼラチン、プルラン、デンプン、アラビアガム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）等を原料とする従来公知のカプセルに充填して、カプセル剤とすることができる。
【００２８】
また、丸剤の形態とする場合、担体として当該分野で従来公知のものを広く使用できる。その例としては、例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。
【００２９】
上記以外に、添加剤として、例えば、界面活性剤、吸収促進剤、吸着剤、充填剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、可溶化剤など、製剤の形態に応じて適宜選択し使用することができる。
【００３０】
これらの形態はいずれも当該分野における通常の方法を用いて調製でき、例えば、錠剤は、上記有効成分とその他錠剤を得るために必要な賦形剤等を適宜添加し、よく混合分散させたのち打錠して得ることができる。また、散剤は、上記有効成分とその他散剤を得る為に必要な賦形剤等を適宜添加し、好適な方法にて混合、粉体化して得ることができる。
【実施例】
【００３１】
次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実験例１  黒大豆種皮抽出物の血清中ＮＯ産生増強作用を高める試料のスクリーニング
黒大豆種皮抽出物と併用する試料には、血清中ＮＯ産生増強作用、または、抗酸化機能改善作用が報告されている５種類の試料を用いた。すなわち、ヒハツ抽出物、イソフラボン、ビタミンＥ、黄金生姜粉末、Ｌ-シトルリンを併用する試料としてスクリーニングを行った。マウス（ＩＣＲマウス）を被験動物として、飼料のみの対照群（比較例１）、黒大豆種皮抽出物単独投与群（比較例２）、黒大豆種皮抽出物とヒハツ抽出物の併用投与群（実施例１）、黒大豆種皮抽出物とイソフラボンの併用投与群（比較例３）、黒大豆種皮抽出物とビタミンＥの併用投与群（比較例４）、黒大豆種皮抽出物と黄金生姜粉末の併用投与群（比較例５）、黒大豆種皮抽出物とL-シトルリンの併用投与群（比較例６）のそれぞれについて血清中ＮＯ産生増強作用を評価した。
【００３３】
（Ａ）被験試料の調製
（ａ）黒大豆種皮抽出物
（１）黒大豆種皮（生）５００ｇを抽出溶媒として希硫酸（０．３％ｗ／ｖ）１５Ｌに浸漬し、５５〜６０℃に加熱しなら２０分間攪拌抽出する。
（２）抽出後、黒大豆種皮と液を固液分離し、液を回収する。
（３）回収した液を遠心分離し固液分離では取り除けない浮遊固形物を除去する。
（４）得られた抽出液を合成吸着樹脂（セパビーズＳＰ７００：三菱化学（株）製）を入れたカラムに投入し、樹脂に吸着させる。
（５）カラム内に残存する硫酸を洗い流すため、カラムに水を通液して樹脂を洗浄する。
（６）カラムに５９容量％濃度のアルコール水溶液を通液して、樹脂に吸着されたポリフェノールを溶出させる。
（７）回収した溶出液（アルコール溶液）を減圧下で加熱することにより蒸発させ、濃縮する。
（８）得られた濃縮液に、賦形剤としてデキストリンを添加する。
（９）８０〜９０℃で３〜５分間加熱殺菌する。
（１０）加熱殺菌後の濃縮液を噴霧乾燥で粉末（合計４２．５ｇ、黒大豆種皮酸性熱水抽出物３４ｇ含有）にして用いた。
【００３４】
（ｂ）ヒハツ抽出物
ヒハツエキスパウダーＭＦ（丸善製薬（株））を用いた。
（ｃ）イソフラボン
フジフラボンＫ−２５（フジッコ（株），イソフラボン２５％含有）を用いた。
（ｄ）ビタミンＥ
理研ドライＥミックスＦ−２０Ｓ（理研ビタミン（株），トコフェロール２０％以上含有））を用いた。
（ｅ）黄金生姜粉末
黄金生姜粉末（（株）サンフコ）を用いた。
（ｆ）Ｌ−シトルリン
Ｌ−シトルリン（プロテインケミカル（株），Ｌ−シトルリン１００％含有）を用いた。
【００３５】
（Ｂ）実験方法
供試動物には馴化飼育後のＩＣＲマウス（オス５週齢）を使用し、被験試料を混餌した高脂肪食飼料（Ｑｕｉｃｋ  Ｆａｔ（日本クレア（株）））を１４日間自由摂取させた。解剖の前日は１２時間の絶食をかけた。ジエチルエーテルによる麻酔後、マウスを解剖して心臓穿刺により採血し、血清を調製した。血清中ＮＯ産生増強作用は、NO2/NO3 Assay Kit-C II(Colorimetric)（（株）同仁化学研究所）を使用して測定した血清中ＮＯ代謝物量で評価した。
【００３６】
実施例１と比較例３〜６については黒大豆種皮抽出物を１０００ｍｇ／体重ｋｇ／日と各試験試料を７５０ｍｇ／体重ｋｇ／日になるように飼料に混合したものを投与した。
【００３７】
比較例１は飼料のみを投与した。
【００３８】
比較例２は黒大豆種皮抽出物を１０００ｍｇ／体重ｋｇ／日になるように飼料に混合したものを投与した。
【００３９】
（Ｃ）実験結果
表１に実施例１および比較例１〜６の血清中ＮＯ代謝物量の量を示す。比較例１（対照群）と比べて、比較例２（単独投与群：黒大豆種皮抽出物）および実施例１と比較例３〜６（併用投与群）はそれよりも優れた血清中ＮＯ産生増強作用を示すことが確認された。特に、実施例１（併用投与群：黒大豆種皮抽出物+ヒハツ抽出物）では最も優れた血清中ＮＯ産生増強作用が確認された。このことから、以下の実験ではヒハツ抽出物に絞って黒大豆種皮抽出物との併用効果について検証した。
【表１】
2019178080.tif 000002
【００４０】
実験例２  黒大豆種皮抽出物とヒハツ抽出物の併用による血清中ＮＯ産生増強作用
ＩＣＲマウスを被験動物として、黒大豆種皮抽出物とヒハツ抽出物の併用投与群（実施例２）、飼料のみの対照群（比較例７）、黒大豆種皮抽出物単独投与群（比較例８）、およびヒハツ抽出物単独投与群（比較例９）のそれぞれについて血清中ＮＯ産生増強作用を評価した。
【００４１】
（Ａ）実験方法
実験例１と同様の方法で実施し、血清中ＮＯ産生増強作用をＮＯ代謝物量で評価した。
【００４２】
実施例２は黒大豆種皮抽出物を１０００ｍｇ／体重ｋｇ／日とヒハツ抽出物を７５０ｍｇ／体重ｋｇ／日になるように飼料に混合したものを投与した。
【００４３】
比較例７は飼料のみを投与した。
【００４４】
比較例８は黒大豆種皮抽出物を１０００ｍｇ／体重ｋｇ／日になるように飼料に混合したものを投与した。
【００４５】
比較例９はヒハツ抽出物を７５０ｍｇ／体重ｋｇ／日になるように飼料に混合したものを投与した。
（Ｂ）実験結果
表２に実施例２および比較例７〜９の血清中ＮＯ代謝物量の量を示す。比較例７（対照群）と比べて、比較例８（単独投与群：黒大豆種皮抽出物）と比較例９（単独投与群：ヒハツ抽出物）はそれよりも優れた血清中ＮＯ産生増強作用を示すことが確認された。また、実施例２（併用投与群：黒大豆種皮抽出物+ヒハツ抽出物）では、比較例８（単独投与群：黒大豆種皮抽出物）と比較例９（単独投与群：ヒハツ抽出物）に比べて更に優れた血清中ＮＯ産生増強作用が確認された。併用による相乗効果は、Ｂｕｒｇｉ法（高木敬次郎他，薬物学（南山堂），１９８７）（中瀬清一他，日薬理誌，９１，３８５−３９２，１９８８）で評価した。すなわち、対照群の値を１とした時の各群の相対値を血清中ＮＯ産生増強指数として算出し、単独群の指数の積よりも併用群の指数の方が大きければ相乗効果と判断した。各群平均の血清中ＮＯ産生増強指数は、対照群を１とした時、比較例８（単独投与群：黒大豆種皮抽出物）で１．１９、比較例９（単独投与群：ヒハツ抽出物）で１．１６であり、その積（１．３８）よりも実施例２（併用投与群：黒大豆種皮抽出物+ヒハツ抽出物）の血清中ＮＯ産生増強指数は１．４３と大であり、血清中ＮＯ産生増強作用は黒大豆種皮抽出物とヒハツ抽出物の併用により相乗的に促進されたと判断できた（実施例２vs 比較例７（対照群）, ｐ＜０．０５, n=６, t-test）。
【００４６】
【表２】
2019178080.tif 000003
【００４７】
実験例３  黒大豆種皮抽出物とヒハツ抽出物の併用による肝臓中抗酸化機能改善作用
ＩＣＲマウスを被験動物として、黒大豆種皮抽出物とヒハツ抽出物の併用投与群（実施例３）、飼料のみの対照群（比較例１０）、黒大豆種皮抽出物単独投与群（比較例１１）、およびヒハツ抽出物単独投与群（比較例１２）のそれぞれについて肝臓中抗酸化機能改善作用を評価した。
【００４８】
（Ａ）実験方法
実験例２で解剖したマウスから肝臓を摘出し、生理食塩水で灌流した。得られた肝臓の過酸化脂質（TBARS）量を測定することで抗酸化機能改善作用を評価した。なお、TBARSはチオバルビツール酸反応性基質である。過酸化脂質（TBARS）量の測定には、以下のTBARS法を用いた。
（1）肝臓に湿重量で30(w/v)%になるように1.15％KCl 水溶液を加え、ホモジナイズした。
（2）得られた肝臓ホモジネート10μLに以下の試薬を順番に加え、攪拌後、5℃で60分インキュベートした。
・8.1%SDS 水溶液      20μL（SDS：ドデシル硫酸ナトリウム）
・酢酸バッファー      150μL（20％酢酸を10N NaOHでpH3.5に調整したもの）
・0.8%BHT酢酸溶液     5μL（BHT：ジブチルヒドロキシトルエン）
・0.8%TBA水溶液       150μL（TBA：チオバルビツール酸）
・蒸留水               70μL
（3）100℃で60minインキュベートした。
（4）却後、100μLの蒸留水と300μLのブタノール-ピリジン混液（15：1）を加えて撹拌した。
（5）3000rpm-10min遠心分離し、上清液を96穴プレートに200μLずつ分注した。
（6）532nmの吸光度を測定した。
※血清を含まない対照液（水）についても同様に行ない、吸光度を測定した。
※マロンジアルデヒド（MDA）をスタンダードとし、検量線を作成した。 
この試験により、肝臓中の過酸化脂質（TBARS）量を測定し、抗酸化作用を評価した。
【００４９】
（Ｂ）実験結果
表３に実施例３および比較例１０〜１２の肝臓中の過酸化脂質（TBARS）量を示す。比較例１０（対照群）と比べて、比較例１１（単独投与群：黒大豆種皮抽出物）と比較例１２（単独投与群：ヒハツ抽出物）はそれよりも優れた肝臓中抗酸化作用を示すことが確認された。また、実施例３（併用投与群：黒大豆種皮抽出物+ヒハツ抽出物）では、比較例１１（単独投与群：黒大豆種皮抽出物））と比較例１２（単独投与群：ヒハツ抽出物）に比べて更に優れた肝臓中抗酸化作用が確認された。併用による相乗効果は、Ｂｕｒｇｉ法（高木敬次郎他，薬物学（南山堂），１９８７）（中瀬清一他，日薬理誌，９１，３８５−３９２，１９８８）で評価した。すなわち、対照群の値を１とした時の各群の相対値を肝臓中抗酸化機能改善指数として算出し、単独群の指数の積よりも併用群の指数の方が小さければ相乗効果と判断した。各群平均の肝臓中抗酸化機能改善指数は、対照群を１とした時、比較例１１（単独投与群：黒大豆種皮抽出物）で０．６６、比較例１２（単独投与群：ヒハツ抽出物）で０．８４であり、その積（０．５５）よりも実施例３（併用投与群：黒大豆種皮抽出物+ヒハツ抽出物）の肝臓中抗酸化機能改善指数は０．４９と小であり、肝臓中抗酸化機能改善作用は黒大豆種皮抽出物とヒハツ抽出物の併用により相乗的に促進されたと判断できた（実施例３vs 比較例１０（対照群）, ｐ＜０．０５, n=６, t-test）。
【００５０】
【表３】
2019178080.tif 000004
【００５１】
実験例４  黒大豆種皮抽出物とヒハツ抽出物の併用による血清中中性脂肪量改善作用
ＩＣＲマウスを被験動物として、黒大豆種皮抽出物とヒハツ抽出物の併用投与群（実施例４）、飼料のみの対照群（比較例１３）、黒大豆種皮抽出物単独投与群（比較例１４）、およびヒハツ抽出物単独投与群（比較例１５）のそれぞれについて血清中中性脂肪量改善作用を評価した。
【００５２】
（Ａ）実験方法
実験例２で調製した血清中の中性脂肪量を、トリグリセライドEテストワコー（和光純薬）を用いて測定することで血清中中性脂肪量改善作用を評価した。
【００５３】
（Ｂ）実験結果
表４に実施例４および比較例１３〜１５の血清中の中性脂肪量を示す。比較例１３（対照群）と比べて、比較例１４（単独投与群：黒大豆種皮抽出物）と比較例１５（単独投与群：ヒハツ抽出物）はそれよりも優れた血清中中性脂肪量改善作用を示すことが確認された。また、実施例４（併用投与群：黒大豆種皮抽出物+ヒハツ抽出物）では、比較例１４（単独投与群：黒大豆種皮抽出物）と比較例１５（単独投与群：ヒハツ抽出物）に比べて更に優れた血清中中性脂肪量改善作用が確認された。併用による相乗効果は、Ｂｕｒｇｉ法（高木敬次郎他，薬物学（南山堂），１９８７）（中瀬清一他，日薬理誌，９１，３８５−３９２，１９８８）で評価した。すなわち、対照群の値を１とした時の各群の相対値を血清中中性脂肪量改善指数として算出し、単独群の指数の積よりも併用群の指数の方が小さければ相乗効果と判断した。各群平均の血清中中性脂肪量改善指数は、対照群を１とした時、比較例１４（単独投与群：黒大豆種皮抽出物）で０．９１、比較例１５（単独投与群：ヒハツ抽出物）で０．８４であり、その積（０．７６）よりも実施例４（併用投与群：黒大豆種皮抽出物+ヒハツ抽出物）の血清中中性脂肪量改善指数は０．７５と小であり、血清中中性脂肪量改善作用は黒大豆種皮抽出物とヒハツ抽出物の併用により相乗的に促進されたと判断できた（実施例４vs 比較例１３（対照群）, ｐ＜０．０５, n=６, t-test）。
【００５４】
【表４】
2019178080.tif 000005
【００５５】
黒大豆種皮抽出物とヒハツ抽出物を含有する血管内皮機能改善剤の処方例を以下に示すが、本発明はこれらの処方例に限定されるものではない。
【００５６】
処方例１  ソフトカプセル
下記の原料を用いて、定法に従ってソフトカプセルを調製した。
植物性油脂：１０４．６ｍｇ
ゼラチン：１３５．２ｍｇ
黒大豆種皮抽出物：１００ｍｇ
ヒハツ抽出物：７５ｍｇ
グリセリン：３０．２ｍｇ
レシチン：２２ｍｇ
ミツロウ：１９ｍｇ
ビタミンＥ：１４ｍｇ
【００５７】
処方例２  錠剤
下記の原料を用いて、定法に従って錠剤を調製した。
デキストリン：１１６．７６ｍｇ
黒大豆種皮抽出物：１００ｍｇ
ヒハツ抽出物：７５ｍｇ
還元水あめ：２３ｍｇ
結晶セルロース：２０ｍｇ
ステアリン酸カルシウム：５．２５ｍｇ
微粒二酸化ケイ素：５．２５ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース：４．７７ｍｇ