(57)【要約】【課題】有効量を提供した下記糖質によって、必要な個体の嗅覚機能を改善する嗅覚機能を改善する医薬組成物を提供する。【解決手段】嗅覚機能を改善する医薬組成物は、糖質を有効成分として含み、且つ該糖質はキチン類物質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、アミノ糖、Ｎ−アシル化アミノ糖からなる群から選択される、或いは、それらを組み合わせたものである。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
嗅覚機能を改善する医薬組成物において、
該医薬組成物は糖質を有効成分として含み、且つ該糖質はプロテオグリカン、グリコサミノグリカン、アミノ糖、Ｎ−アシル化アミノ糖、キチン類（ｃｈｉｔｉｎ−ｂａｓｅｄ）物質からなる群から選択される、或いは、それらを組み合せたものであることを特徴とする嗅覚機能を改善する医薬組成物。
【請求項２】
前記キチン類物質はキトサン、キトサンオリゴ糖、もしくはその水溶性誘導体であることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記プロテオグリカンは、ヘパラン硫酸プリテオグリカンであることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸であることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記アミノ糖は、グルコサミンであることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記Ｎ−アシル化アミノ糖は、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミンからなる群から選択される、或いは、それらを組み合せたものであることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記医薬組成物により改善する嗅覚機能が、嗅神経上皮再生を促進、嗅覚受容体ニューロン分化を促進、シグナル伝達タンパクを増加、からなる群から選択される、或いは、それらを組み合せたものであることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記シグナル伝達タンパクが、嗅覚ニューロン特異プロテインＧ（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ−Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｇｏｌｆ）、アデニル酸シクラーゼ・タイプ３（ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｔｙｐｅ  ３，ＡＤＣＹ３）からなる群から選択される、或いは、それらを組み合わせたものであることを特徴とする請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬組成物は、更に呼吸上皮再生又は繊毛成長を促進する、或いは、それら組み合わせて促進することを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記糖質は、キトサンとヒアルロン酸の組み合わせあることを特徴とする請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物は、溶液であることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記医薬組成物中に占める前記糖質の含有量が、０．００１ｗｔ％以上であることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記医薬組成物が、鼻腔内局部に投薬方式で必要な個体に投与するのに用いられることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嗅覚機能を改善する医薬組成物に関し、特に糖質を含み嗅覚機能を改善する医薬組成物に係わる。
【背景技術】
【０００２】
世界中で嗅覚機能が低い人の平均人口は約１５％である。嗅覚機能が低いと生活の質を大きく下げることになる。例えば、食べ物の匂いを感じる力が下がるので食欲に影響する。また食べ物の腐敗、もしくはガス漏れ等危険要因から身を守ることも困難になる。しかしながら、嗅覚機能異常は即座に生命の危機に関わるわけではないので、往々にして見過ごされがちである。
【０００３】
嗅覚障害のよくある原因は老化、上気道感染、頭部創傷等を含む。そのうち前両者は、主に嗅覚受容体ニューロンの分化数及び分化程度と関係がある。しかしながら、現在、関連する研究に依ると、ステロイド、ビタミンＡ、微量元素等での治療方法は、嗅覚異常の症状が改善しているが、その効果は高くないため、臨床治療はできずにいる。この他、一般のニューロンとは異なり、哺乳類の嗅覚システムは、嗅覚受容体ニューロンが傷ついたり、もしくは死亡更新した時でも再生能力を備えるため、近年では新しい嗅覚障害の治療法として発展しているものとして、幹細胞を傷ついた嗅神経上皮に移植し、自身の嗅覚幹細胞もしくは前駆細胞によって嗅神経上皮の再生を達成し、傷ついた嗅覚機能を修復する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
解決しようとする問題点は、現在のところ、幹細胞移植に依る嗅覚障害の治療技術は未だ成熟していないため、多くの問題を解決しなければならない。
【０００５】
これらを鑑み、現段階において、嗅覚機能異常の症状に関する確立した有効治療法はないため、良好な治療効果を備える成分が嗅覚障害の治療薬が発展し、それに拠って患者の嗅覚機能が改善されることが待たれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
嗅覚機能を改善する医薬組成物は、糖質を含み、且つ該糖質はキチン類物質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、アミノ糖、Ｎ−アシル化アミノ糖からなる群から選択される、或いは、それらを組み合わせたものであることを最も主要な特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の嗅覚機能を改善する医薬組成物は、嗅覚受容体ニューロン分化を促進する有効成分を提供し、それが嗅覚機能を改善する治療物となるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の抑制組及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬキトサン）のラットの嗅神経上皮細胞（９日目）であり、位相差顕微鏡（上段）及び走査型電子顕微鏡（下段、拡大１０００倍）によって観察した細胞タイプ（比例サイズは５０μｍ）である。
【図２】本発明の抑制組及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬキトサン）のラット嗅覚受容体ニューロン（９日目）のβＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ（緑色）、ＯＭＰ（緑色）免疫細胞化学染色分析結果図（比例サイズは２０μｍ）であり、そのうちβＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ及びＯＭＰは緑色Ｄｙｌｉｇｈｔ４８８で標記する。
【図３】本発明の抑制組及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬキトサン）のラットの嗅神経上皮細胞（３日目から９日目）のβＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ及びＯＭＰウエスタンブロッティング分析結果図である。
【図４】本発明の抑制組及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬキトサン）のラットの嗅神経上皮細胞（３日目から９日目）のβＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ／ＧＡＰＤＨウエスタンブロッティング半定量分析結果図であり、ヒストグラムは五サンプルの平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図５】本発明の抑制組及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬキトサン）のラットの嗅神経上皮細胞（３日目から９日目）のＯＭＰ／ＧＡＰＤＨウエスタンブロッティング半定量分析結果図であり、ヒストグラムは五サンプルの平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）を表す。＊はｐ＜０．０５を表す。
【図６】本発明の投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬキトサン）ラットの嗅覚受容体ニューロン（９日目）のＯＭＰ（緑色）、Ｇｏｌｆ（赤色）、ＡＤＣＹ３（赤色）免疫細胞化学染色分析結果図（比例サイズは２０μｍ）であり、そのうちＯＭＰは、緑色Ｄｙｌｉｇｈｔ４８８で標記し、Ｇｏｌｆ及びＡＤＣＹ３は赤色Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５で標記する。
【図７】本発明の抑制組及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬキトサン）のラットの嗅神経上皮細胞（３日目から９日目）のＧｏｌｆ及びＡＤＣＹ３ウエスタンブロッティング分析結果図である。
【図８】本発明の抑制組及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬキトサン）ラットの嗅神経上皮細胞（３日目から９日目）のＧｏｌｆ／ＧＡＰＤＨウエスタンブロッティング半定量分析結果図であり、ヒストグラムは五サンプルの平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）を表す。＊はｐ＜０．０５を表す。
【図９】本発明の抑制組及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬキトサン）のラットの嗅神経上皮細胞（３日目から９日目）のＡＤＣＹ３／ＧＡＰＤ半定量分析結果図であり、ヒストグラムは五サンプルの平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）を表す。＊はｐ＜０．０５を表す。
【図１０】本発明の抑制組及び投薬組（０．０２５％、０．０５％、０．１％キトサン）ラットの嗅神経上皮細胞（９日目）のＯＭＰ、Ｇｏｌｆ及びＡＤＣＹ３ウエスタンブロッティング分析結果図である。
【図１１】本発明の抑制組及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬキトサン、ＨＡ、ＨＳＰＧ）のラットの嗅神経上皮細胞（９日目）のＯＭＰ及びＧｏｌｆウエスタンブロッティング分析結果図である。
【図１２】本発明の抑制組及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬキトサン、ＨＡ、ＨＳＰＧ）のラットの嗅神経上皮細胞（９日目）のＯＭＰ／ＧＡＰＤＨウエスタンブロッティング半定量分析結果図であり、ヒストグラムは三サンプルの平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）を表し、組別間は英語アルファベットが異なり、有意性を備える差異（ｐ＜０．０５）を表す。
【図１３】本発明の抑制組及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬキトサン、ＨＡ、ＨＳＰＧ）のラットの嗅神経上皮細胞（９日目）のＧｏｌｆ／ＧＡＰＤＨウエスタンブロッティング半定量分析結果図であり、ヒストグラムは三サンプルの平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）を表し、組別間は英語アルファベットが異なり、有意性を備える差異（ｐ＜０．０５）を表す。
【図１４】本発明の抑制組及び投薬組０．１ｍｇ／ｍＬ  ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＧｌｃＮ）のラットの嗅神経上皮細胞（９日目）のＯＭＰ及びＧｏｌｆウエスタンブロッティング分析結果図である。
【図１５】本発明の抑制組及び投薬組０．１ｇ／ｍＬ  ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＧｌｃＮ）のラットの嗅神経上皮細胞（９日目）のＯＭＰ／ＧＡＰＤＨウエスタンブロッティング半定量分析結果図であり、ヒストグラムは三サンプルの平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）を表し、組別間は英語アルファベットが異なり、有意性を備える差異（ｐ＜０．０５）を表す。
【図１６】本発明の抑制組及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬ  ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＧｌｃＮ）のラットの嗅神経上皮細胞（９日目）のＧｏｌｆ／ＧＡＰＤＨ  ウエスタンブロッティング半定量分析結果図であり、ヒストグラムは三サンプルの平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）を表し、組別間は英語アルファベットが異なり、有意性を備える差異（ｐ＜０．０５）を表す。
【図１７】本発明の抑制組及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬキトサン）の人の嗅神経上皮細胞（９日目）のＯＭＰ及びＧｏｌｆウエスタンブロッティング分析結果図である。
【図１８】本発明の抑制組及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬキトサン）の人の嗅神経上皮細胞（９日目）のＯＭＰ／ＧＡＰＤＨウエスタンブロッティング半定量分析結果図であり、ヒストグラムは三サンプルの平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）を表し、組別間は英語アルファベットが異なり、有意性を備える差異（ｐ＜０．０５）を表す。
【図１９】本発明の抑制組及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬキトサン）の人の嗅神経上皮細胞（９日目）のＧｏｌｆ／ＧＡＰＤＨウエスタンブロッティング半定量分析結果図であり、ヒストグラムは三サンプルの平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）を表し、組別間は英語アルファベットが異なり、有意性を備える差異（ｐ＜０．０５）を表す。
【図２０】本発明の抑制組及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬ  ＧａｌＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ）の人の嗅神経上皮細胞（９日目）のＯＭＰウエスタンブロッティング分析結果図である。
【図２１】本発明の抑制組及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬキトサン＋２ｍｇ／ｍＬ  ＨＡ）の人の嗅神経上皮細胞（９日目）のβＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ及びＯＭＰウエスタンブロッティング分析結果図である。
【図２２】本発明の抑制組、比較組（ＴＧＦ−β１）及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬキトサン＋２ｍｇ／ｍＬ  ＨＡ）の人の気道上皮細胞（２１日目）を倒立顕微鏡（左側）及び走査型電子顕微鏡（右側）で観察した細胞タイプ（比例サイズは２０μｍ）である。
【図２３】本発明の抑制組、比較組（ＴＧＦ−β１）及び投薬組（０．１ｍｇ／ｍＬキトサン＋２ｍｇ／ｍＬ  ＨＡ）の人の気道上皮細胞（２１日目）を走査型電子顕微鏡（左側）（比例サイズは２μｍ）及び蛍光顕微鏡（右側）（比例サイズは２０μｍ）で繊毛（ｃｉｌｉａ）まで観察したもので、そのうちｃｉｌｉａは緑色Ａｌｅｘａ  ４８８で標記した。
【図２４】本発明の嗅覚喪失を誘発する前、嗅覚喪失を誘発した後、治療一週間、治療二週間及び治療三週間未投薬及び投薬後のラット行為テスト結果図であり、そのうち治療一週間、二週間及び三週間は、嗅覚喪失を誘発した後に一週間休んで何も行わず、その後それぞれ０．１ｍｇ／ｍＬキトサンで一週間、二週間及び三週間治療することを表す。＊はｐ＜０．０５を表す。
【図２５】本発明の嗅覚喪失を誘発した後、治療一週間、治療二週間及び治療三週間のラットの嗅覚上皮Ｈ＆Ｅ染色結果図（比例サイズは２０μｍ）であり、そのうち治療一週間、二週間及び三週間は、それぞれ嗅覚喪失を誘発した後、一週間休んで何も行わず、その後それぞれ０．１ｍｇ／ｍＬキトサンで一週間、二週間及び三週間治療することを表す。黒色の点線は、嗅覚上皮厚みのスタート線である。
【図２６】本発明の嗅覚喪失を誘発する前、嗅覚喪失を誘発した後、治療一週間、治療二週間及び治療三週間のラットの嗅覚上皮の厚み分析結果図であり、そのうち治療一週間、二週間及び三週間は、嗅覚喪失を誘発した後、一週間休んで何も行わず、その後、それぞれ０．１ｍｇ／ｍＬキトサンで一週間、二週間及び三週間治療することを表す。ヒストグラムは三サンプルの平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）であり、組別間は英語アルファベットが異なり、有意性を備える差異（ｐ＜０．０５）を表す。
【図２７】本発明の嗅覚喪失を誘発する前、嗅覚喪失を誘発した後、治療一週間、治療二週間及び治療三週間後のＯＭＰ及びβＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎウエスタンブロッティング分析結果図であり、そのうち治療一週間、二週間及び三週間は、嗅覚喪失を誘発した後、一週間休んで何も行わず、その後０．１ｍｇ／ｍＬキトサンで一週間、二週間及び三週間治療することを表す。
【図２８】本発明の嗅覚喪失を誘発する前、嗅覚喪失を誘発した後、治療一週間、治療二週間及び治療三週間後のＯＭＰ／ＧＡＰＤＨウエスタンブロッティング半定量分析結果図であり、そのうち治療一週間、二週間及び三週間は、嗅覚喪失を誘発した後、一週間休んで何も行わず、その後、それぞれ０．１ｍｇ／ｍＬキトサンで一週間、二週間及び三週間治療することを表す。ヒストグラムは三サンプルの平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）であり、組別間は英語アルファベットが異なり、有意性を備える差異（ｐ＜０．０５）を表す。
【図２９】本発明の嗅覚喪失を誘発する前、嗅覚喪失を誘発した後、治療一週間、治療二週間及び治療三週間後のβＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ／ＧＡＰＤＨウエスタンブロッティング半定量分析結果図であり、そのうち治療一週間、二週間及び三週間は、嗅覚喪失を誘発した後、一週間休んで何も行わず、次に１％キトサンで一週間、二週間及び三週間治療することを表す。ヒストグラムは三サンプルの平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）であり、組別間は英語アルファベットが異なり、有意性を備える差異（ｐ＜０．０５）を表す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
嗅覚受容体ニューロン分化を促進する有効成分を提供し、それが嗅覚機能を改善する治療物となり、現在のビタミン、微量元素、ステロイド等を利用した薬物治療方式に取って代わる嗅覚機能を改善する医薬組成物を提供することを本発明の目的とする。
【００１０】
上述の目的を達成するため、本発明は嗅覚機能を改善する医薬組成物を提供する。それは糖質を含み、且つ該糖質は、キチン類（ｃｈｉｔｉｎ−ｂａｓｅｄ）物質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、アミノ糖、Ｎ−アシル化アミノ糖からなる群から選択される、或いは、それらを組み合せたものである。それにより、本発明は有効量を提供した上述糖質によって、必要な個体の嗅覚機能を改善する。
【００１１】
その他、本発明は更に医薬組成物を製造するために用いる糖質を提供する。該医薬組成物は、嗅覚機能を改善するために用いる。該医薬組成物は更に薬学もしくは生理学で受け入れられている担体、賦形剤もしくは希釈剤等を含み、その使用用途及びタイプは特別に限られたものではないが、良好なものは溶液タイプで製造したものであり、それを鼻腔内局部に投薬方式で必要な個体に投与する。例えば、該医薬組成物を鼻用治療薬として製造し、噴霧形式で鼻腔内に施す。該医薬組成物を含む糖質を鼻粘膜に粘着させて効果を達成する。この他、該医薬組成物は更にその他活性成分を含み、該糖質と共に併用することで更に必要な効果を達成する。
【００１２】
本発明において、該キチン類（ｃｈｉｔｉｎ−ｂａｓｅｄ）物質は例を挙げたものを含むが、キトサン、キトサンオリゴ糖、及びその水溶性誘導体に限らない。本発明は研究によって実証されるとおり、キトサンは嗅神経上皮再生の促進、嗅覚受容体ニューロン分化の促進、シグナル伝達タンパク等を増加させる効果を備えるため、嗅覚失調を修復する有効成分となる。本発明のキトサンの分子量は、本発明の効果が得られる範囲であれば特に制限はなく、適宜分子量を決めればよい。また、キトサンのアセチル化程度についても、本発明の効果が得られる範囲であれば特に制限はなく、適宜アセチル化程度を決めればよい。なお、アセチル化の程度とは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基がキトサン分子の中に含まれるモル分量を表し、市販のキトサンは一般に５％〜３０％のアセチル化程度を備える。アセチル化程度、ｐＨ値等はすべてキトサンの溶液内溶解度に影響するので、キトサン溶液にする時、適したアセチル化程度を備えたキトサン、調整ｐＨ値等を選ぶことに拠って、キトサンが水溶媒内に安定して溶ける。例えば、本発明の良好な実施例は脱アセチル化（ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｅｄ）程度≧７５％のキトサンを選び、ｐＨ値が約７．２の水溶液に案配する。もしくは低めの分子量を備えたキトサンオリゴ糖（例えば、キトビオース、キトトリオース、キトテトロース、キトペンタオース、キトヘキソース等）、もしくはその他水溶性キトサン誘導体を選び、このタイプの物質の水溶性を向上させる。この他、本発明の更なる研究で分かったととして、アミノ糖、Ｎ−アシル化アミノ糖等単体及び該タイプを備える単糖が組成単体となるプロテオグリカン、グリコサミノグリカン等は同様に上述の効果を備える。故に治療嗅覚障害を治療する有効成分となる。本発明のプロテオグリカン、グリコサミノグリカン、アミノ糖、Ｎ−アシル化アミノ糖等は、具体的実施例で採用したヘパラン硫酸プリテオグリカン（ＨＳＰＧ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）及びグルコサミン（ＧｌｃＮ）に限らない。
【００１３】
本発明において、該医薬組成物は、嗅覚機能失調の個体（例えば人）に適用する。例えば、嗅神経上皮退化が原因で嗅覚機能が落ち、更に嗅覚喪失した個体に用いることができ、必要な個体の嗅覚機能を改善する。これらにより、該医薬組成物は、上述糖質を活性成分とする。過去に嗅覚機能異常に対して使用した局部もしくは全身性ステロイド治療方法と比較して、本発明で使用する糖質は治療物として嗅覚障害症状を有効に治療するだけでなく、派生する副作用を下げることができる。その他、本発明は別に、該糖質は更に呼吸上皮及び嗅覚上皮の再生を促進する薬物を作製することができることがわかった。つまり嗅覚機能を改善すると同時に更に呼吸上皮再生及び繊毛成長を促進し、様々な治療効果を発揮する。例えば、本発明の良好な具体的実施例は、キトサン及びヒアルロン酸を合わせて使用することで、同時に呼吸上皮及び嗅覚上皮の再生を促進する効果を達成する。本発明に述べる糖質は鼻病手術後に使用する鼻噴霧剤開発に適用でき、患者の術後の保健に有利である。
【００１４】
本文中「有効量」の用語は、薬物中の活性成分が必要とする医薬もしくは医療効力を誘発する時に足りる含量を指す。有効量は症状の程度、もしくは深刻度、個体の反応、投薬パターン、治療行程、併用の薬物、もしくはその他関連条件に基づき決定する。例えば、医薬組成物中の糖質の有効量は０．００１ｗｔ％以上であり、良好なのは０．００５ｗｔ％以上から１．５ｗｔ％以下であり、更に良好なのは０．００５ｗｔ％以上から１ｗｔ％以下である。
【００１５】
本文中の「キチン類物質」の用語は、Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）及び／又はグルコサミン（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）を含み、組成単体の多糖、オリゴ糖もしくはその誘導体を意味する。該誘導体は母体化合物分子中の原子、もしくは原子団がその他原子もしくは原子団によって代わって形成された化合物を表し、母体化合物に類似する総体生物効果を典型的に示すが一もしくは多種の物理化学及び／もしくは薬物動力学性質（例えば、効能、安定性、溶解度、吸收度、生体内の半減期等）方面が異なる。例えば、本文で提示する「水溶性誘導体」は即ち構造が母体化合物に類似するが、良好な水溶性の誘導体を備える。更に具体的にはキトサンの水溶性を向上させるため、オリゴ糖型のキトサンを除き、現在、多くのその他改良された水溶性キトサン誘導体が開発されている。例えば、キトサン塩酸塩（ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、キトサンアセテート（ｃｈｉｔｏｓａｎ  ａｃｅｔａｔｅ）、キトサン乳酸塩（ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｌａｃｔａｔｅ）、カルボキシル化キトサン（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｉｔｏｓａｎ）、ヒドロキシプロピルキトサン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ  ｃｈｉｔｏｓａｎ）等が挙げられるが、これらに限らない。
【００１６】
本文中の「アミノ糖」の用語は、単糖の一個のヒドロキシ基（−ＯＨ）がアミノ基（−ＮＨ２）によって置換されていることを意味する。例えば、二位炭素にアミノ基が置換した六員環糖（他にピラノースと称する）が挙げられる。
【００１７】
本文中の「Ｎ−アシル化アミノ糖」の用語は、アミノ糖内のアミノ基がアシル化（ａｃｙｌａｔｅｄ）することを意味する。即ち単糖内の一個のヒドロキシ基（−ＯＨ）が−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒによって置換されている。例えば、二位炭素が、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒの六員環糖（ピラノースとも称する）を備え、Ｒは水素もしくはアルキル基（Ｃ１−Ｃ８アルキル基、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられる）である。これらにより、該Ｎ−アシル化アミノ糖は、Ｎ−ホルミル化アミノ糖、Ｎ−アセチル化アミノ糖、Ｎ−プロピオニル化アミノ糖等でもよい。
【実施例】
【００１８】
＜＜材料と方法＞＞
【００１９】
ラットの嗅神経上皮細胞
【００２０】
ラットの嗅神経上皮（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａ）は、ウィスター系ラット（ｗｉｓｔａｒ  ｒａｔ）Ｅ１７胚から分離し、且つ各回試驗は、４０個の胚で嗅神経上皮を取り出した。分離した嗅神経上皮を０．１２５％トリプシン／エチレンジアミン四酢酸Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ）含有のＨａｎｋｓ平衡塩溶液（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）の中に入れ、更に３７℃下に於いて３０分間の酵素消化を行った。続いて細胞懸濁液を７０μｍの細胞ろ過器に通し、細胞塊及び断片を除去し、細胞密度をミリリットル毎に２４×１０４個細胞（５×１０４細胞／ｃｍ２に相当する）に調整した。最後に２ｍＬの細胞懸濁液を０．８５μｇ／ｃｍ２ポリエルリジン（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ，ＰＬＬ）が付着した６孔細胞培養板の中に入れ、５％ＣＯ２及び９５％空気含有の加湿環境の３７℃で培養した。更に倒立位相差顕微鏡（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＴＳ−１００，Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）及び走査型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ−４８００）によって細胞タイプを観察した。ラットの嗅神経上皮細胞培養基は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、２０ｎｇ／ｍＬの表皮成長因子（ＥＧＦ）、２％Ｂ２７及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を含み、更にキトサン含有の培養基（投薬組）は、キトサン（Ｃ−３６４６，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と培養基を混合し（０．１ｍｇ／ｍＬ）、更に水酸化ナトリウムでｐＨを７．２まで調整した。そのうちキトサン溶液は０．５Ｍの酢酸を入れて構成したが、キトサンを含まない培養基（抑制組）は投薬組培養基の酢酸及び水酸化ナトリウムに同じ含量で構成した。
【００２１】
人の嗅神経上皮細胞
【００２２】
内視鏡に依る副鼻腔手術により、成人の嗅神経上皮から人の嗅神経上皮を取り出した。続いて、生体組織サンプルをＨａｎｋｓ平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）の中に入れ、細かく切った。次に３７℃の０．１２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡで酵素を３０分間消化した。遠心で細胞を収集し、１０％のウシ胎児血清及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含有したＩＭＤＭ細胞培養基（ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉａ，ＩＭＤＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）の中に改めて溶かした。最後に細胞をラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）及びフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）が付着した６孔細胞培養板に約２１日間接種し、更に５％ＣＯ2及び９５％空気を含有する加湿環境下で培養した。２１日後、培養基を誘導培養基に交換した。そのうち誘導培養基は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に２％Ｂ−２７無血清添加剤を添加したものであり、そのうち、キトサン含有の誘導培養基（投薬組）は、キトサン（Ｃ−３６４６，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と誘導培養基を混合し（０．１ｍｇ／ｍＬ）、更に水酸化ナトリウムでｐＨを７．２まで調整した。キトサンを含まない培養基（抑制組）は投薬組培養基の酢酸及び水酸化ナトリウムに同じで含量構成する。
【００２３】
人の気道上皮細胞
【００２４】
鼻の中膈鼻道成形術の患者から下鼻甲介（ｈｕｍａｎ  ｎａｓａｌ  ｉｎｆｅｒｉｏｒ  ｔｕｒｂｉｎａｔｅ）を取った。４℃の０．５％プロナーゼ（ＸＩＶ  型プロテアーゼ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）に拠って取得した組織を１６−２０時間処理した。そのうちプロナーゼは、抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）を含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）混合物の中に溶かした。細胞懸濁液を４０μｍ細胞ろ過器に通し、細胞塊及び断片を除去した。続いて遠心後、細胞を抗生物質のＤＭＥＭ／Ｆ１２：ＢＥＧＭ（ＣｌｏｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）（１：１）含有した混合物の中に再度溶かした。０．７５ｍＬの細胞懸濁液をＴｒａｎｓｗｅｌｌ  ｉｎｓｅｒｔ上に接種し、基底側（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ  ｓｉｄｅ）に２．６ｍＬの培養基を加えた。３７℃、５％の二酸化炭素含有の大気に於いて培養した。細胞がコンフルエンスする（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）まで浸漬培養し、且つ培養４８時間後に一回目の培養基交換した。その後、一日ごとに交換した。コンフルエンスするのを待ち、最上部の培養基を取り除いて気液界面（ＡＬＩ）を製造し、基底側部分から培養基を注入した。そのうち炎症因子の刺激処理した比較組は、ＡＬＩ培養過程において０．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１を加え、炎症反応を誘発し、キトサン及びヒアルロン酸（ＨＡ）含有の投薬組は、０．１ｍｇ／ｍＬ（約０．０１ｗｔ％）のキトサン及び２ｍｇ／ｍＬ（約０．２ｗｔ％）のＨＡを培養基に加え、隔日毎に培養器を交換した。
【００２５】
免疫細胞化学染色法
【００２６】
４％のホルマリンで培養細胞を固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加え、室温で細胞膜穴あけ作用を５分間行った。続いて、細胞を３％のウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）で分離作用２０分間行った。更に３％のＢＳＡ希釈の一次抗体希釈液を加えて一夜置いた。使用した一次抗体及びその希釈比例は以下のとおりである。抗−βＩＩＩチューブリン（βＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ）（Ａｂｃａｍ，Ａｂ１１８６２７；１：１０００）、抗−嗅神経マーカータンパク質（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｍａｒｋｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ＯＭＰ）  （Ａｂｃａｍ，  ａｂ６２１４４，１：１００）、抗−嗅神経マーカータンパク質（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｍａｒｋｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＯＭＰ）（Ｎｏｖｕｓ，ＮＢ１１０−７４７５１，１：１００）、抗−嗅覚ニューロン特異プロテインＧ（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ−Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｇｏｌｆ）（ＧｅｎｅＴｅｘ，ＧＴＸ１１０５２０；１：１００）、抗−アデニル酸シクラーゼ・タイプ３（ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｔｙｐｅ  ３，ＡＤＣＹ３）（Ａｂｃａｍ，Ａｂ１２５０９３；１：１０００）、抗−アセチル・チューブリン（ａｃｅｔｙｌ−ｔｕｂｕｌｉｎ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。続いて、緑色Ｄｙｌｉｇｈｔ４８８、赤色Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５もしくは緑色Ａｌｅｘａ  ４８８蛍光標記の二次抗体を加え、室温下で細胞と１．５時間作用させた。この他、青色ＤＡＰＩ及び赤色ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ染色液を用い、細胞核及びＦ−アクチン（Ｆ−ａｃｔｉｎ）をそれぞれ標定した。最後に共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０，Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で細胞を観察した。
【００２７】
ウエスタンブロッティング分析法
【００２８】
プロテアーゼ阻害剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｔａｂｌｅｔ，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を含有する放射免疫沈降法緩衝液（ＲＩＰＡ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を用い、嗅神経上皮細胞のクラッキング物を取得した。続いてサンプルは１２％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分離後、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で吸い取った。そしてＣＩＳブロッキング剤（ＣＩＳｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて室温で６０秒間ブロッキングを行い、膜と各種一次抗体を４℃で一夜置いた。最後に、膜は西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を貼着した二次抗体を１．５時間置くことで、化学発光剤（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，ＥＣＬ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）によって着色された。先の一次抗体を取り除いた後、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）抗体と膜作用を用い、抑制組とする。化学発光ゲルドキュメンテーションシステム（ＵＶＰ  ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｕｍ  ８１０）でウエスタンブロッティング結果図を採取し、ＶｉｓｉｏｎＷｏｒｋ  ＬＳ  ソフト（ＵＶＰ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で分析した。
【００２９】
統計分析
【００３０】
実験結果すべては平均値（ｍｅａｎ）±標準偏差（ＳＤ）の方式で表示した。またＳｉｇｍａ  ｐｌｏｔ  ｖ１２．５で統計分析した。一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）ですべての組を比較し、続いてＬＳＤ（最小有意差）検定法を実施した。ｐ値が０．０５より低いと、統計上有意的意義を備えることを意味する。
【００３１】
＜＜実験結果＞＞
【００３２】
ラットの嗅神経上皮細胞の免疫細胞化学分析及びタイプの観察
【００３３】
ラットの初代培養嗅神経上皮細胞は、ウィスター系ラット（ｗｉｓｔａｒ  ｒａｔ）Ｅ１７胚から取り出した。細胞の培養期間について、キトサン投薬組及び抑制組の嗅神経上皮細胞は、すべて３日目に基材上に貼着した。抑制組の不規則で且つ平坦な細胞タイプ（図１ａ参照）と比較すると、キトサン処理を経た嗅神経上皮細胞は、不対称の突起を備える双極タイプ（図１ｂの矢印箇所参照）となった。その他、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で抑制組（図１ｃ参照）及び投薬組（図１ｄ参照）を観察したら、同様にキトサン投薬組には双極細胞が観察できた（図１ｄの矢印箇所参照）。
【００３４】
嗅覚受容体ニューロンのラットの嗅神経上皮細胞に於けるパフォーマンス
【００３５】
ＯＭＰは成熟嗅覚受容体ニューロンの標記であり、βＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎは未成熟の嗅覚受容体ニューロンを識別できる。細胞培養９日目から免疫蛍光分析を行った。多数の細長い突起を備えたβＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ−陽性細胞が観察できた（図２ａ及び図２ｂ参照）。ＯＭＰを観察していない抑制組と比較すると（図２ｃ参照）、キトサン投薬組の中の各個嗅覚受容体ニューロンの細胞質箇所は、明らかなＯＭＰ免疫反応（図２ｄ参照）が現れていた。ウエスタンブロッティング分析によって、キトサン投薬組はβＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎパフォーマンス量が３日目から９日目に徐々に減り、ＯＭＰパフォーマンス量は上昇する（図３−５参照）ことが再度実証された。特に９日目の時、抑制組のＯＭＰパフォーマンス量（ＧＡＰＤＨに対する相対量）は０．３±０．１７であり、キトサン投薬組の０．８±０．１８のＯＭＰパフォーマンス量（図５参照）より明らかに低く、両組間には明らかな差があった（ｐ＜０．０５）。この結果から、キトサンは嗅覚受容体ニューロン成熟化を促進することが明らかとなった。
【００３６】
ラット嗅覚受容体ニューロンのシグナル伝達タンパクのパフォーマンス
【００３７】
Ｇｏｌｆ及びＡＤＣＹ３は、嗅神経のシグナル伝達タンパクである。免疫染色分析の結果が示すとおり、キトサンによって培養したＯＭＰ陽性細胞はＧｏｌｆ及びＡＤＣＹ３（図６参照）を表し、すべての細胞体及び細胞膜箇所に於いて、それぞれＧｏｌｆ及びＡＤＣＹ３を観察した。その他、ウエスタンブロッティング分析によって、抑制組と比較して、キトサンで処理した嗅覚受容体ニューロン（９日目）は比較的高いシグナル伝達タンパクパフォーマンス（ｐ＜０．０５）（図７−９参照）を備えることを再度実証した。以上から分かるとおり、キトサン処理を経た嗅神経上皮細胞は嗅覚受容体ニューロンに分化するだけでなく、比較的高いシグナル伝達タンパクパフォーマンス量を有する。
【００３８】
上述の実験結果から明らかなとおり、水溶性のキトサンは嗅神経上皮細胞の分化成熟を促進し、且つ機能性の嗅覚受容体ニューロンを備える。キトサンはＤ−グルコサミン（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）及びＮ−アセチルグルコサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）を含み、嗅神経上皮は各種複合糖質（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を豊富に含むため、キトサンは複合糖質作用を通して、機能性の嗅神経上皮の再生を促進する。この他、キトサンは粘性タンパク作用によって鼻粘膜に付着する。故に治療効果が長く続き、且つ鼻腔内局部投薬に適する。同様にオリゴ糖タイプ、もしくは如何なるその他タイプの水溶性キトサンを選択しても上述の効果は達成できる。
【００３９】
異なる濃度のキトサンのラットの嗅神経上皮細胞に対する効果
【００４０】
ラットの嗅神経上皮細胞を０．０２５ｗｔ％、０．０５ｗｔ％及び０．１ｗｔ％のキトサンを含有した培養基の中でそれぞれ培養し、培養９日目の時、ＯＭＰ、Ｇｏｌｆ及びＡＤＣＹ３のパフォーマンス量を観察した。この結果が示すとおり、キトサン濃度の増加に従い、成熟及び機能性を備えた嗅神経細胞のタンパクのパフォーマンスも更に高くなった（図１０参照）。
【００４１】
プロテオグリカン及びグリコサミノグリカンのラットの嗅神経上皮細胞に対する効果
【００４２】
ラットの嗅神経上皮細胞をキトサン、ヒアルロン酸（ＨＡ、ＨＡ２００Ｋ−１，Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，ＭＮから購入）、ヘパラン硫酸プリテオグリカン（ＨＳＰＧ、Ｈ７６４０，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから購入）０．１ｍｇ／ｍＬ含有の培養基の中でそれぞれ培養し、培養９日目の時、ＯＭＰ及びＧｏｌｆのパフォーマンス量を観察した。ラットの嗅神経上皮細胞の実験結果に示すとおり、ＨＡ及びＨＳＰＧは、どちらもキトサンと同様、成熟及び機能性を備えた嗅神経細胞のタンパクのパフォーマンスに有利である（図１１−１３参照）。
【００４３】
グリコサミノグリカン単体のラットの嗅神経上皮細胞に対する効果
【００４４】
ラットの嗅神経上皮細胞をＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）及びグルコサミン（ＧｌｃＮ）０．１ｍｇ／ｍＬ含有する培養基の中でそれぞれ培養し、培養９日目の時、ＯＭＰ及びＧｏｌｆのパフォーマンス量を観察した。ラットの嗅神経上皮細胞の実験結果に示すとおり、単体を添加しても、成熟及び機能性を備えた嗅神経細胞のタンパクのパフォーマンスを刺激した（図１４−１６参照）。
【００４５】
キトサンの人の嗅神経上皮細胞に対する効果
【００４６】
人の嗅神経上皮細胞をキトサン０．１ｍｇ／ｍＬ含有の培養基の中で培養し、培養９日目の時、ＯＭＰ及びＧｏｌｆのパフォーマンス量を観察した。人の嗅神経上皮細胞の実験結果に示すとおり、キトサンは、人の嗅神経上皮細胞に対し有意な有効効果を表した（図１７−１９参照）。
【００４７】
グリコサミノグリカン単体の人の嗅神経上皮細胞に対する効果
【００４８】
人の嗅神経上皮細胞をＧａｌＮＡｃ及びＭａｎＮＡｃ０．１ｍｇ／ｍＬ含有の培養基の中でそれぞれ培養し、培養９日目の時、ＯＭＰのパフォーマンス量を観察した。人の嗅神経上皮細胞の実験結果に示すとおり、グリコサミノグリカン単体の人の嗅神経上皮細胞に対する有意な有効効果を表した（図２０参照）。
【００４９】
キトサン＋グリコサミノグリカンの人の嗅神経上皮細胞に対する効果
【００５０】
人の嗅神経上皮細胞をキトサン０．１ｍｇ／ｍＬ含有及びＨＡ２ｍｇ／ｍＬ含有の培養基の中で培養し、培養９日目の時、βＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ及びＯＭＰのパフォーマンス量を観察した。人の嗅神経上皮細胞の実験結果に示すとおり、キトサンとＨＡの組み合わせは、嗅覚受容体ニューロン成熟化を促進する効果を備える（図２１参照）。
【００５１】
キトサン＋グリコサミノグリカンの人の気道上皮細胞に対する効果
【００５２】
抑制組で観察した多角形気道上皮細胞タイプと比較して、炎症因子（ＴＧＦ−β１）刺激処理（比較組）を経ると、細胞壁が丸くなる。しかし、仮にキトサン０．１ｍｇ／ｍＬ及びＨＡ（投薬組）２ｍｇ／ｍＬを添加すると、炎症反応が抑制できた。上皮細胞の成長及び繊毛（ａｃｅｔｙｌ−ｔｕｂｕｌｉｎで標記する）の成長を促進した（図２２−２３参照）。
【００５３】
動物行為パターン
【００５４】
《嗅覚喪失したラットのパターン》
【００５５】
腹腔注射方式により、２１匹のラット（七週齢のＳＤラットのオス）に対し油液に３−メチルインドール（３−ＭＩ）（注射液濃度：１００ｍｇ／ｍＬ、投与量：３００ｍｇ／ｋｇ）を溶かして注射することで嗅覚喪失を誘発した。１２匹の抑制組ラット（正常ラット）は油液を注射するだけである。毎回異なる時間において（即ち水溶性キトサンで治療一週間、２週間及び３週間）、３３匹のラットの中で、３匹を犠牲にして、嗅覚上皮を取得して免疫組織化学染色分析及びウエスタンブロッティング分析を行った。
【００５６】
《キトサン投薬》
【００５７】
１０ｍｇ／ｍｌ（約１ｗｔ％）の水溶性キトサン（Ｃｈａｒｍｉｎｇ＆ｂｅａｕｔｙ，Ｔａｉｗａｎ）を無菌ＰＢＳの中に溶かし、キトサン溶液を調合した。３−ＭＩを注射した一週間後、イソフルラン吸入麻酔方式に拠って、ラットに麻酔し、ラット鼻孔から約１００μｌのキトサン溶液を点薬し、毎週二回の頻度で投薬し、設定した時間に投薬を続けた。
【００５８】
《ラットの行動テスト》
【００５９】
飼料を木屑下に埋め、ランダムにＴ字型迷宮内のうちの一水平ルート末端に置いた。続いて二日間だけ飼ったラットをＴ字型迷宮に５分間置き、食物を探すテスト方式でその嗅覚機能を評価した。すべてのラットは５回テストを行った。嗅覚喪失を誘発する前後及びキトサン治療後（各治療一週間、二週間及び三週間）それぞれに嗅覚機能テストを行った。結果が示す通り、嗅覚喪失を誘発する前、ラットが食物を探し当てる時間は約８０秒であった。三日間の嗅覚喪失を誘発処理した後、ラットが食物を探し当てるのに３００秒を超えた。しかし、キトサン治療後、治療の回数が増えるにつれ、ラットの嗅覚機能は嗅覚喪失を誘発する前の状態に回復した（図２４参照）。
【００６０】
《免疫組織化学染色分析》
【００６１】
嗅神経上皮の片側を１０％のホルマリンで４℃にして翌日まで固定し、脱カルシウム及びパラフィンで包埋した。４μｍ厚の切片にヘマトキシリン・エオジン染色（Ｈ＆Ｅ染色）を行い、嗅覚上皮の厚みを評価し、デジタル顕微鏡で撮影した。ラット各匹の五個対応エリアに対し、嗅覚上皮の厚み評価を行った。その結果が示す通り、治療回数が増えるに連れて、嗅覚上皮の厚みが嗅覚喪失を誘発する前の状態に回復した（図２５−２６参照）。
【００６２】
《ウエスタンブロッティング法分析》
【００６３】
ＯＭＰは成熟嗅覚受容体ニューロンの標記であり、βＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎが未成熟の嗅覚受容体ニューロンを識別する。０．１ｍｇ／ｍＬのキトサン治療後、治療回数が増えるにつれ、嗅覚受容体ニューロン成熟化が促進される効果を有し、治療第三週間後、嗅覚喪失を誘発する前の状態に回復した（図２７−２９参照）。
【００６４】
以上の実験データにより、本発明はキチン類物質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン及びその単体等すべてに嗅神経上皮再生の促進、嗅覚受容体ニューロン分化促進、シグナル伝達タンパク増加を備える効果が証明された。故に嗅覚機能低下を治療する有効成分となる。特に動物実験によって実証されたことにより、該糖質は毎週少なくとも二回の頻度で鼻腔内から局部投薬する方式で少なくとも二週間投与する。それにより、嗅覚機能が明らかに改善され顕著な治療効果を達成する。また三週間連続投与すると、更に嗅覚機能は正常な状態まで回復する。この他、本発明において、上述糖質は同時に呼吸上皮再生及び繊毛成長促進の効果を発揮し、故に鼻の病気で手術した後の回復に有効成分であることが更に実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月31日(2019.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
嗅覚機能を改善する医薬組成物において、
該医薬組成物は糖質を有効成分として含み、且つ該糖質は、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、アミノ糖、Ｎ−アシル化アミノ糖、キチン類（ｃｈｉｔｉｎ−ｂａｓｅｄ）物質からなる群から選択される、或いは、それらを組み合せたものであることを特徴とする嗅覚機能を改善する医薬組成物。
【請求項２】
前記キチン類物質はキトサン、キトサンオリゴ糖、もしくはその水溶性誘導体であることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記アミノ糖は、グルコサミンであることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記Ｎ−アシル化アミノ糖は、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマンノサミンからなる群から選択される、或いは、それらを組み合せたものであることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記医薬組成物により改善する嗅覚機能が、嗅神経上皮再生を促進、嗅覚受容体ニューロン分化を促進、シグナル伝達タンパクを増加、からなる群から選択される、或いは、それらを組み合せたものであることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記シグナル伝達タンパクが、嗅覚ニューロン特異プロテインＧ（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ−Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｇｏｌｆ）、アデニル酸シクラーゼ・タイプ３（ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｔｙｐｅ  ３，ＡＤＣＹ３）からなる群から選択される、或いは、それらを組み合わせたものであることを特徴とする請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記医薬組成物は、更に呼吸上皮再生又は繊毛成長を促進する、或いは、それら組み合わせて促進することを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項８】
ヒアルロン酸を更に含み、該ヒアルロン酸は前記糖質と組み合わせて用いられることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記糖質は、キトサンであることを特徴とする請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記医薬組成物は、溶液であることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物中に占める前記糖質の含有量が、０．００１ｗｔ％以上であることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記医薬組成物が、鼻腔内局部に投薬方式で必要な個体に投与するのに用いられることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。