(57)【要約】【課題】sFlt-1タンパクに対して、新規で簡便かつ安価で実用的なsFlt-1測定法を提供すること。【解決手段】ヘパリンと抗sFlt-1抗体でsFlt-1を挟んだ複合体を形成させて検体中のsFlt-1を測定する方法であって、担体に固相化したヘパリンまたは抗sFlt-1抗体に検体を接触させ、該担体上にヘパリンまたは抗sFlt-1抗体と検体中のsFlt-1との複合体を形成させ、該複合体の存在を標識した抗sFlt-1抗体もしくは抗sFlt-1抗体とそれに結合する標識した抗イムノグロブリン抗体、または標識したヘパリンを用いて検出することを含む、検体中のsFlt-1を測定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリンと抗sFlt-1抗体によりsFlt-1を挟んだサンドイッチ複合体を形成させて検体中のsFlt-1を測定する方法であって、担体に固相化したヘパリンまたは抗sFlt-1抗体に検体を接触させ、該担体上にヘパリンまたは抗sFlt-1抗体と検体中のsFlt-1との複合体を形成させ、該複合体の存在を標識した抗sFlt-1抗体もしくは抗sFlt-1抗体とそれに結合する標識した抗イムノグロブリン抗体、または標識したヘパリンを用いて検出することを含む、検体中のsFlt-1を測定する方法。
【請求項２】
ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化する担体が、合成樹脂、合成繊維または天然物由来の繊維により形成された膜状形成物または立体形成物である、請求項１記載のsFlt-1を測定する方法。
【請求項３】
ELISA法またはイムノクロマト法である、請求項１または２に記載のsFlt-1を測定する方法。
【請求項４】
ヘパリンを結合したビーズを用いる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のsFlt-1を測定する方法。
【請求項５】
ヘパリンの代りに、ヘパリンと構造類似性を有し、ヒトを含む哺乳類、鳥類、両生類のsFlt-1と結合する物質を用いる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のsFlt-1を測定する方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法で、被験体から採取した検体中のsFlt-1を測定し、検体中のsFlt-1濃度が健常者に比較して高い場合、該被験体は妊娠高血圧症候群に罹患していると評価する、妊娠高血圧症候群の検出方法。
【請求項７】
少なくともヘパリンもしくは抗sFlt-1抗体を固相化した担体、ならびに標識した抗sFlt-1抗体もしくはヘパリンを含む、検体中のsFlt-１を測定するためのキット。
【請求項８】
少なくともヘパリンを固相化した担体、抗sFlt-1抗体および該抗sFlt-1抗体に結合する標識した二次抗体を含む、検体中のsFlt-１を測定するためのキット。
【請求項９】
ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化する担体が、合成樹脂、合成繊維または天然物由来の繊維により形成された膜状形成物または立体形成物である、請求項７または８に記載の検体中のsFlt-１を測定するためのキット。
【請求項１０】
ELISA法キットまたはイムノクロマト法キットである、請求項７〜９のいずれか１項に記載のsFlt-1を測定するためのキット。
【請求項１１】
ヘパリンを結合したビーズを用いる、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のsFlt-1を測定するためのキット。
【請求項１２】
ヘパリンの代りに、ヘパリンと構造類似性を有し、ヒトを含む哺乳類、鳥類、両生類のsFlt-1と結合する物質を用いる、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のsFlt-1を測定するためのキット。
【請求項１３】
妊娠高血圧症候群を検出するための、請求項７〜１２のいずれか１項に記載のsFlt-1を測定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊娠高血圧症候群の主要な原因であるsFlt-1（soluble Fms-like tyrosine kinase-1）タンパク質(可溶型血管内皮増殖因子受容体-1、sVEGFR-1（soluble vascular endothelial growth factor receptor-1）とも呼ばれるもの)の、１種類の特異抗体とヘパリンを利用することによる、短時間で手技的に単純な、また作製上安価な測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年においては、晩婚化や育児環境の困難さを背景に、世界的な出産児数の減少、すなわち少子化の状態となり、社会的に大きな問題となっている。このような状況においては、胎児や母体を傷害する疾患を克服し、母子ともに健康な出産をより確実にすることが喫緊の課題である。産科における疾患のなかでも妊娠の５〜７％に発症する妊娠高血圧症候群（従来、妊娠中毒症と呼ばれていたもの）は、重症例においては胎児と母体の双方において致死的な結果をもたらすことから、その早期発見と早期治療は極めて重要な医学的課題である。
【０００３】
血管新生の制御機構は、胎児の発育、個体の成熟、創傷治癒等において重要な役割を果たす他、母体側の胎盤の形成と成熟においても重要な役割を果たしていることが明らかになりつつある。血管新生にはVEGF（血管内皮細胞増殖因子）、FGF（fibroblast growth factor；線維芽細胞増殖因子）、Angiopoietinなど多くの因子が関与するが、なかでもVEGFとその受容体であるVEGFRは、中心的な役割を果たすことが明らかになりつつある（非特許文献１および２）。本発明者らは1990年に新規チロシンキナーゼ型受容体遺伝子Flt-1 (Fms-like tyrosine kinase-1)を最初に単離し、報告した（非特許文献３）。Flt-1はVEGFに結合し受容体として働くことから、VEGFR-1とも呼ばれている。Flt-1遺伝子は受容体を発現する成熟型mRNAとともに、Flt-1の細胞外領域のみのタンパク質を産生するための短鎖mRNAを発現するが（非特許文献４）、妊娠高血圧症候群の胎盤からは主に２種類の短鎖Flt-1 mRNAとその産物であるe15a sFlt-1およびi13 sFlt-1タンパク質が正常妊娠時よりも大量に産生され、血清レベルでは正常妊婦の5〜10倍に達することが明らかとなっている（非特許文献５、６および７）。これらの異常に産生されたsFlt-1はVEGFやPlGF(胎盤増殖因子）と結合してその働きを抑制すること、また母体に高血圧やタンパク尿を引き起こすことから、本疾患の重要な原因物質のひとつと考えられており、体内のsFlt-1量、たとえば妊婦血液中のsFlt-1量は、現在では重要な生物学的指標・バイオマーカーとなっている（非特許文献７）。
【０００４】
さらに、昨年(2016年)には、sFlt-1の血中レベルは産科における妊娠高血圧症候群に限らず、急性膵臓炎においても重傷例においては軽症例よりも高値であることが報告された（非特許文献８）。他の疾患では、加齢黄斑変性症における網膜組織のsFlt-1発現低下や、実験動物において腎臓・足細胞のsFlt-1発現低下とネフローゼ様の慢性タンパク尿発症が報告されている（非特許文献９、１０）。今後、血液中や体液中のsFlt-1がバイオマーカーとして利用される疾患がさらに増加する可能性が高い。
【０００５】
これまでにsFlt-1測定法としてはsFlt-1に対する２種類の特異抗体を利用したサンドイッチELISA法が基本であった（非特許文献５−７）。しかし、２種類の適切な特異抗体を開発し測定法を確立するには時間と費用がかかり、その結果、２種類の特異抗体によるサンドイッチELISA法は高価格であり、また測定法も手技的に多段階で時間も必要であることから、バイオマーカー検査法として妊娠早期から産科的に広く利用するには困難があった。本発明はそのようなsFlt-1測定法の困難を克服し、広く利用できる簡便な測定法の開発を目指す。
【０００６】
これまでに、sFlt-1タンパク質はその糖鎖修飾などからヘパリンと結合することが知られていた。この性質により、組織や培養細胞から得られたsFlt-1を精製するためにヘパリンカラムが用いられてきた（非特許文献１１）。妊娠高血圧症候群の治療を試みる方法として、本疾患を発症した妊婦の血液をヘパリンカラムを通して還流させ、sFlt-1を減少させる試みも臨床試験で用いられている（非特許文献１２）。しかし、ヘパリンに結合したsFlt-1が同時に特異抗体と安定に結合し、簡便な測定法として利用できるかは不明であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Endocr. Rev. 25, 581-611, 2004. review
【非特許文献２】Angiogenesis, 9:225-230, 2006. review
【非特許文献３】Oncogene 5, 519-524, 1990.
【非特許文献４】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10705-10709,1993.
【非特許文献５】J. Clin. Invest. 111, 649-658, 2003.
【非特許文献６】J. Clin. Endocrinol. Metab. 88, 2348-2351, 2003.
【非特許文献７】N. Engl. J. Med. 350, 672-683, 2004.
【非特許文献８】Int J Mol Sci. 2016 Dec 6;17(12). pii: E2038.
【非特許文献９】Elife, 2013 Jun 18;2:e00324. doi: 10.7554/eLife.00324.
【非特許文献１０】Cell, 151:384-399, 2012.
【非特許文献１１】Jpn. J. Cancer Res., 88, 867-876, 1997.
【非特許文献１２】Circulation 124, 940-950, 2011.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、sFlt-1タンパク質がヘパリンと結合することを利用して、ヘパリンとsFlt-1に対する特異抗体でsFlt-1を挟むサンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法を用い、新規で安価で実用的なsFlt-1測定法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、sFlt-1試料に、（１）ヘパリンを結合させたビーズ（既に市販されているもの）、（２）抗ヒトsFlt-1特異マウス抗体（以下、一次抗体と称する）、ならびに（３）アルカリフォスファターゼ標識もしくはHRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識の抗マウス免疫グロブリン・ヤギ抗体（以下、二次抗体と称する）、の三者を混ぜることにより、固定化ヘパリンと特異抗体による簡便なサンドイッチsFlt-1測定法が確立し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明において、sFlt-1のヘパリン結合性を利用することにより、必要な抗sFlt-1特異抗体の数を２種類から１種類に減らし、安価で反応時間も短縮された新規sFlt-1測定法を提供することができる。
【００１０】
本発明は以下のとおりである。
[１]  ヘパリンと抗sFlt-1抗体によりsFlt-1を挟んだサンドイッチ複合体を形成させて検体中のsFlt-1を測定する方法であって、担体に固相化したヘパリンまたは抗sFlt-1抗体に検体を接触させ、該担体上にヘパリンまたは抗sFlt-1抗体と検体中のsFlt-1との複合体を形成させ、該複合体の存在を標識した抗sFlt-1抗体もしくは抗sFlt-1抗体とそれに結合する標識した抗イムノグロブリン抗体、または標識したヘパリンを用いて検出することを含む、検体中のsFlt-1を測定する方法。
[２]  ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化する担体が、合成樹脂、合成繊維または天然物由来の繊維により形成された膜状形成物または立体形成物である、[１]のsFlt-1を測定する方法。
[３]  ELISA法またはイムノクロマト法である、[１]または[２]のsFlt-1を測定する方法。
[４]  ヘパリンを結合したビーズを用いる、[１]〜[３]のいずれかのsFlt-1を測定する方法。
[５]  ヘパリンの代りに、ヘパリンと構造類似性を有し、ヒトを含む哺乳類、鳥類、両生類のsFlt-1と結合する物質を用いる、[１]〜[４]のいずれかのsFlt-1を測定する方法。
[６]  [１]〜[５]のいずれかの方法で、被験体から採取した検体中のsFlt-1を測定し、検体中のsFlt-1濃度が健常者に比較して高い場合、該被験体は妊娠高血圧症候群に罹患していると評価する、妊娠高血圧症候群の検出方法。
[７]  少なくともヘパリンもしくは抗sFlt-1抗体を固相化した担体、ならびに標識した抗sFlt-1抗体もしくはヘパリンを含む、検体中のsFlt-１を測定するためのキット。
[８]  少なくともヘパリンを固相化した担体、抗sFlt-1抗体および該抗sFlt-1抗体に結合する標識した二次抗体を含む、検体中のsFlt-１を測定するためのキット。
[９]  ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化する担体が、合成樹脂、合成繊維または天然物由来の繊維により形成された膜状形成物または立体形成物である、[７]または[８]の検体中のsFlt-１を測定するためのキット。
[１０]  ELISA法キットまたはイムノクロマト法キットである、[７]〜[９]のいずれかのsFlt-1を測定するためのキット。
[１１]  ヘパリンを結合したビーズを用いる、[７]〜[１０]のいずれかのsFlt-1を測定するためのキット。
[１２]  ヘパリンの代りに、ヘパリンと構造類似性を有し、ヒトを含む哺乳類、鳥類、両生類のsFlt-1と結合する物質を用いる、[７]〜[１１]のいずれかのsFlt-1を測定するためのキット。
[１３]  妊娠高血圧症候群を検出するための、[７]〜[１２]のいずれかのsFlt-1を測定するためのキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、sFlt-1タンパク質に対する、安価で手技的にも容易で、時間も短縮可能なsFlt-1測定法を提供することができる。すなわち、本発明において、ヘパリンのsFlt-1結合性を利用することにより、必要な抗sFlt-1特異抗体の数を１種類に減らし、固相化ヘパリンと特異抗体１種類のサンドイッチ法による、安価で反応時間も短縮された新規sFlt-1測定法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヘパリンビーズと抗sFlt-1特異抗体による新規サンドイッチsFlt-1 ELISA法の概略を示す図である。この図では抗sFlt-1特異抗体（一次抗体）は酵素などで標識されていない通常の単クローン抗体を用いる例を示しており、一次抗体に結合する標識二次抗体を加えている。
【図２】ヘパリンビーズと抗sFlt-1特異抗体による新規サンドイッチsFlt-1 ELISA法であって、標識された一次抗体を用いる方法の概略を示す図である。この場合には標識二次抗体が不要となるため、図１に示す場合よりも、さらに単純化される。
【図３】ヘパリンビーズと特異抗体を用いたsFlt-1 ELISAアッセイの結果を示す写真である。
【図４】ヘパリンビーズと特異抗体を用いたsFlt-1 ELISAアッセイの測定値を示す図である。
【図５】ヘパリンビーズと特異抗体を用いたsFlt-1 ELISAアッセイの結果を示すグラフである。
【図６】ヘパリンビーズと市販の特異抗体を用いたsFlt-1 ELISAアッセイの結果を示す写真である。
【図７】ヘパリンビーズと市販の特異抗体を用いたsFlt-1 ELISAアッセイの測定値を示す図である。
【図８】酵素としてHRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を用いたsFlt-1 ELISAアッセイの結果を示す写真である。
【図９】酵素としてHRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を用いたsFlt-1 ELISAアッセイの測定値を示す図である。
【図１０】酵素としてHRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を用いたsFlt-1 ELISAアッセイの結果を示すグラフである。
【図１１】妊娠高血圧症候群患者の血清中 sFlt-1の測定-1（反応温度４℃, 反応時間３時間）の例の結果を示す図である。
【図１２】妊娠高血圧症候群患者の血清中 sFlt-1の測定-2（反応温度室温（約25℃）,反応時間、約３０分）の例の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、血液中のsFlt-1をサンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法により測定する方法である。ここで本発明のサンドイッチ法を測定原理とした免疫学的測定法とは、標的物質であるsFlt-1をsFlt-1に結合するヘパリンおよび抗sFlt-1抗体を用いて挟み込むように捕捉して、sFlt-1を測定する方法をいい、単にサンドイッチ法ともいう。ヘパリンおよび抗sFlt-1抗体によりsFlt-1を挟んで形成された複合体をサンドイッチ複合体と呼ぶ。サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法としては、例えばイムノクロマト法、酵素免疫測定吸着法（ELISA（Enzyme-linked immune-sorbent assay）法）、ウエスタンブロット法等が挙げられる。
なお、本発明において、「測定」という場合、定量、半定量、検出のいずれも含む。
【００１４】
本発明の方法の一例として、固相化担体にヘパリンを固相化し、該固相化担体にsFlt-1を含む可能性がある検体を添加して接触させ、固相化担体上でヘパリンとsFlt-1の複合体を形成させる。さらに、ヒトsFlt-1に対する特異的抗体（抗sFlt-1抗体）を添加して接触させ、固相化担体上のヘパリンとsFlt-1の複合体に抗sFlt-1抗体を結合させ、担体上のヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体のサンドイッチ複合体を検出すればよい。
【００１５】
検出は、抗sFlt-1抗体をアルカリフォスファターゼ（ALP)やホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP)等の酵素、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、着色ポリスチレン粒子等の有色粒子や金コロイド等のコロイド粒子などで標識しておき、標識物質が発するシグナルを測定することにより行うことができる。酵素を用いる場合、好ましくは高感度での測定を可能にするホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP)を用いる。測定は、標識が酵素による場合、それぞれの酵素に対する基質を添加し、酵素反応を行わせ、発色を吸光度の測定により測定すればよい。標識が蛍光物質の場合は、蛍光検出器を用いて蛍光を測定すればよい。抗体の標識は公知の方法で行うことができる。
【００１６】
抗sFlt-1抗体は、マウス単クローン抗体に限らず、ラット、ウサギ、ヤギなど、どのような動物で作製した抗体も利用でき、ポリクローナル抗体でもよい。
【００１７】
また、抗sFlt-1抗体を標識する代りに、抗sFlt-1抗体に結合する二次抗体であって標識した二次抗体を用いてもよい。この場合、固相担体上にヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体と二次抗体のサンドイッチ複合体が形成され、二次抗体の標識物質から発するシグナルを測定すればよい。二次抗体としては、抗sFlt-1抗体に特異的に結合する抗体を用いることができ、抗マウス免疫グロブリン・ヤギ抗体等のsFlt-1抗体の作製に用いた動物の免疫グロブリンに対する抗体を用いればよい。
【００１８】
二次抗体を用いる場合のELISA法の概略図を図１に、二次抗体を用いない場合のELISA法の概略図を図２に示す。
【００１９】
抗体は、FabやF(ab’)2のような免疫グロブリン断片、あるいは、組換え体として発現されたscFv、dsFv、diabody、minibody等の組換え抗体であってもよい。本発明において、「抗体」という語は、これらの断片も含む。これらの断片は公知の方法で調製することができる。
【００２０】
担体上のヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体のサンドイッチ複合体、あるいはヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体（一次抗体）と二次抗体のサンドイッチ複合体を形成させる場合、最初にヘパリンとsFlt-1の複合体を形成させ、洗浄し、その後抗sFlt-1抗体を添加し、ヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体のサンドイッチ複合体を形成させる２ステップの方法、あるいは最初にヘパリンとsFlt-1の複合体を形成させ、洗浄し、その後抗sFlt-1抗体を接触させヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体のサンドイッチ複合体を形成させ、洗浄し、その後二次抗体を添加し、ヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体（一次抗体）と二次抗体のサンドイッチ複合体を形成させる３ステップの方法で行ってもよいし、各試薬を同時に添加し、サンドイッチ複合体を形成する反応を同時に行う１ステップの方法で行ってもよい。
【００２１】
ヘパリンとsFlt-1との結合反応、および抗原抗体反応は4℃〜45℃、好ましくは20℃〜40℃、さらに好ましくは25℃〜38℃で行うことができ、また、それぞれの結合反応あるいは１ステップで行うときの反応時間は、10分〜18時間、より好ましくは10分〜３時間、さらに好ましくは30分〜２時間程度である。
【００２２】
上記の方法は、ヘパリンを担体に固相化して行う方法であるが、サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法においては、ヘパリンと特異抗体の位置を逆向きにすることも可能である。すなわち、抗sFlt-1特異抗体を担体に固相化して、試料中のsFlt-1と結合させ、それに対して適切な大きさのヘパリンであって標識したものを結合させてサンドイッチ複合体を形成させて測定することも可能である。
【００２３】
すなわち、本発明は、ヘパリンと抗sFlt-1抗体によりsFlt-1を挟んだサンドイッチ複合体を形成させて検体中のsFlt-1を測定する方法であって、担体に固相化したヘパリンまたは抗sFlt-1抗体に検体を接触させ、該担体上にヘパリンまたは抗sFlt-1抗体と検体中のsFlt-1との複合体を形成させ、該複合体の存在を標識した抗sFlt-1抗体もしくは抗sFlt-1抗体とそれに結合する標識した抗イムノグロブリン抗体、または標識したヘパリンを用いて検出することを含む、検体中のsFlt-1を測定する方法である。
【００２４】
ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化する担体としては、合成樹脂、合成繊維または天然物由来の繊維等により形成された膜状形成物または立体形成物が挙げられ、具体的にはELISA用マイクロタイタープレート、スライドガラス、ニトロセルロース膜、セルロース膜、セファロース膜、セルロースビーズやセファロースビーズなどの樹脂ビーズ、磁性化ビーズ等種々のものを用いることができる。また、ヘパリンを結合させた市販の樹脂ビーズを用いることもでき、例えば、セファロースビーズにヘパリンを結合した市販のヘパリンビーズ（Heparin Sepharose 6 Fast Flow, 17-0998-01, GE Healthcare）を用いることができる。また、ヘパリンを溶出しないように固定化したゲルや繊維膜を用いてもよい。本発明において、担体として、ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化した樹脂ビーズ等を用い、該樹脂ビーズをELISA用マイクロタイタープレートのウエルに添加して測定する方法もELISAという。ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体の担体への結合は、物理的吸着、官能基を利用した共有結合等、公知の方法で行うことができる。固相化量は、特に限定されないが担体が96ウェルマイクロタイタープレートの場合、1ウエル当たり数ngから数十μgが望ましい。固相化は固相化すべきヘパリンまたは抗sFlt-1抗体の溶液を担体と接触させることにより行うことができる。例えば、マイクロタイタープレートを用いる場合、ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体の溶液をマイクロタイタープレートのウエルに分注し一定時間置くことにより固相化することができる。ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化した後は、アッセイ中の非特異的結合を防ぐためにウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、卵白アルブミン等を含んだブロッキング溶液を用いてブロッキングを行うのが好ましい。
【００２５】
ヘパリンは、化学的にはグリコサミノグリカンの一種であり、D-グルクロン酸あるいはL-イズロン酸とグルコサミンが1,4結合により重合し二糖の繰り返し単位を形成している高分子物質である。ヘパリンに限らず、ヘパリンに類似した構造を有しsFlt-1に結合する化合物すべてを利用することができる。ヘパリンに類似した構造を有しsFlt-1に結合する化合物として、例えば、ムコ多糖の多糖硫酸化エステルが挙げられ、代表的な物質として、ヘパラン硫酸が挙げられる。sFlt-1はヒトに限らず、マウスにおいてもi13型sFlt-1が血管内皮細胞や胎盤栄養層細胞などから発現し、ヘパリンと結合することが示されている。従って、本発明をマウスsFlt-1測定系にも応用することができる。また、哺乳類、鳥類、両生類のsFlt-1と結合するヘパリンまたはヘパリンと類似構造を有する物質を用いることによりヒトやマウスを含む哺乳類、鳥類、両性類のsFlt-1の測定にも応用することができる。ヘパリンやヘパリンと類似構造を有する物質の由来は限定されず、例えば、ウシやブタの腸粘膜由来のものを用いることができる。
【００２６】
妊娠高血圧症候群の胎盤では、sFlt-1の短いアイソフォームであるe15a sFlt-1タンパク質およびi13 sFlt-1タンパク質が産生され、これらのタンパク質は、妊娠高血圧症候群の血液中に、正常妊婦の２倍以上、３倍以上、例えば、２〜５倍、３〜５倍、あるいは５〜10倍の濃度で含まれる。本発明の方法において、e15a sFlt-1タンパク質およびi13 sFlt-1タンパク質を区別する必要はなく、どちらを測定してもよい。そのため、抗sFlt-1抗体はe15a sFlt-1タンパク質およびi13 sFlt-1タンパク質の両方に結合するものを用いればよい。本発明において、sFlt-1と言う場合、e15a sFlt-1タンパク質およびi13 sFlt-1タンパク質も含む。
【００２７】
本発明で測定するsFlt-1は、ヒトsFlt-1に限定されず、ヒトを含む哺乳類、鳥類、両性類のsFlt-1も含む。
【００２８】
sFlt-1は身体の多くの組織で発現していることから、本発明において、検体は、血清、血漿、全血のみならず、胸水、腹水、脳髄液、唾液、尿など、ほぼ全ての体液を含む。ただし、血液の抗凝固剤としてヘパリンを用いて調製した血漿は、ヘパリン除去後に使用可能となる。
【００２９】
添加する検体および各試薬の量は数μL〜数百μLである。検体は数倍から十数倍に希釈して用いてもよい。
【００３０】
被験体から採取した検体中のsFlt-1を測定することにより被験体が妊娠高血圧症候群に罹患しているか否かを評価することができ、あるいは評価するための補助的データを得ることができる。すなわち、被験体から採取した検体中のsFlt-1濃度が健常者に比較して高い場合、該被験体は妊娠高血圧症候群に罹患していると評価することができる。
【００３１】
また、あらかじめ健常人の検体中のsFlt-1を測定しておき、該測定値に基づいてsFlt-1の濃度測定値についてカットオフ値(閾値）を定めておいてもよい。該カットオフ値を基準とし、被験体から採取した検体中のsFlt-1濃度がカットオフ値以上か、またはカットオフ値を超えた場合に、該被験体は妊娠高血圧症候群に罹患していると評価することができる。
【００３２】
本発明のヘパリンと抗sFlt-1抗体によりsFlt-1を挟んだサンドイッチ複合体を形成させて検体中のsFlt-1を測定する方法で測定した場合、正常分娩例では血清中のsFlt-1濃度は、12ng/ml程度 (+/- 約7ng/ml)であり、妊娠高血圧症候群症例では平均値56ng/ml程度 (+/- 約33ng/ml)であり、正常分娩例の約4.7倍である。さらに、妊娠37週６日以前に分娩となった前期発症例（いわゆる重症例）では平均値が約70ng/mlであり、正常分娩例の約5.8倍である。さらに、妊娠38週0日以後に出産となった後期発症例ではsFlt-1平均値は約24ng/mlで、正常分娩例の約２倍程度である。
【００３３】
従って、例えば、血清中のsFlt-1濃度のカットオフ値として、12ng/ml×２〜５の値と設定することができる。このカットオフ値は、好ましくは本発明のヘパリンと抗sFlt-1抗体によりsFlt-1を挟んだサンドイッチ複合体を形成させて検体中のsFlt-1を測定する方法で測定したときの値である。
【００３４】
また、本発明は、妊娠高血圧症候群を検出するための補助的データを取得する方法も含む。
【００３５】
本発明は、検体中のsFlt-1を測定するためのキットを包含し、該キットは少なくともヘパリンまたはヘパリンと構造類似性を有する物質を固相化した担体を含み、さらに、標識した抗sFlt-1抗体または抗sFlt-1抗体と該抗sFlt-1抗体に結合する標識した二次抗体を含む。あるいは、該キットは抗sFlt-1抗体を固相化した担体を含み、さらに標識したヘパリンまたはヘパリンと構造類似性を有する物質を含む。
【００３６】
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【００３７】
＜実施例１＞
[ヘパリンビーズと特異抗体を用いたsFlt-1 ELISAアッセイ]
本発明における新規ELISA測定法が効果を発揮するかどうかを確認するために、アルカリフォスファターゼ標識二次抗体を用いて以下のようなアッセイを試みた。
【００３８】
ヘパリンビーズ（GE Healthcare）と抗sFlt-1特異抗体（KM1750, Kanno S. et al. Oncogene 19, 2138-46, 2000）によるサンドイッチELISA法により、ヒトe15a型sFlt-１産生ヒト293細胞株の培養上清の測定を行った。定量化されたヒト7N-Flt-1（遺伝子発現ベクターを用いた昆虫細胞株の培養から得られたもので、ヒトFlt-1受容体タンパク質の細胞外領域のうち１〜７番目までの７個の免疫グロブリンドメインを含むペプチド. Cell, 151:384-399, 2012.）を対照タンパクとした。
【００３９】
（１）反応溶液の作製
1mlの溶液中に、(a)0、20または50ngの対照7N-Flt-1タンパク質(100μl生理的食塩水中)、または、sFlt-1試料（ヒトe15a sFlt-１産生293細胞株の培養上清（CM)100μl）、(b)ウシ胎児血清100μl、(c)ヘパリンビーズ25μl、(d)抗ヒトsFlt-1マウス単クローン特異抗体KM1750約75ng、(e)アルカリフォスファターゼ標識の抗マウス免疫グロブリン・ヤギ抗体(KURABO ZT6550)約0.3μl、(f)スキムミルク（雪印-北海道）約100μg、(g)0.1% Tween-20添加生理的食塩水775μlを含む反応溶液を作製した。(a)については、293細胞親株の培養上清や、培地のみ、あるいは、対照7N-Flt-1タンパクとsFlt-1試料を共に加えたものも測定した。
【００４０】
（２）反応溶液の撹拌と遠心による洗浄
この反応溶液を1.5mlエッペンドルフチューブに入れてふたを閉じ、３〜４時間、4℃において緩やかに回転させ、撹拌した。撹拌後、毎分300回転、7〜8秒の低速・短時間遠心（２回）によりヘパリンビーズ結合体を沈殿させた。上清を十分に除去した後、洗浄の目的で1mlの0.1% Tween-20を含む生理的食塩水を加え、ふたを閉じ、4℃において緩やかに回転させ、５分間、撹拌した。撹拌後、毎分300回転、7〜8秒の低速・短時間遠心（２回）によりヘパリンビーズ結合体を沈殿させ、上清を十分除去した。
【００４１】
（３）アルカリフォスファターゼ反応液による測定
洗浄したヘパリンビーズ結合体（sFlt-1タンパク質、一次抗体、二次抗体、これら三者が結合していると予想されるもの、約15μl）に、アルカリフォスファターゼ測定試薬 (BCIP-NBT, Nacalai tesque社)を含むアルカリ溶液(pH 8.8) 0.2mlを加え、撹拌した後に96穴プレートに移して反応を観察した。約20〜30分後、対照の7N Flt-1タンパク質を含む反応液が青色に変化したことを確認して、プレートリーダーを用いて595nmで計測した。
【００４２】
（４）結果
結果を図３に写真で示す。全て、同一試料を２回（今回は、１と２、３と４、５と６、７と８、９と１０、１１と１２、１３と１４、１５と１６、１７と１８は同じ内容の試料）測定した。対照の7N Flt-1無添加の反応液（No.１、２）はアルカリフォスファターゼ反応による発色は認められず黄色であるが、7N Flt-1を20ng(No.３、４)、50ng(No.５、６)加えたものではアルカリフォスファターゼ反応により青色となっている。293細胞親株の培養上清(293 CM)(No.７、８)は、ほぼ黄色であり、大きな変化は認められないが、e15a sFlt-1 cDNAを発現させた293細胞株の培養上清（e15a CM)(No.１１、１２)では、青色への変化が認められる。
【００４３】
また、293細胞親株の培養上清に対照7N Flt-1タンパク質を20ng添加した試料(No.９、１０)では、No.３、４に近い青色反応が得られたことから、培養上清中に非特異的に反応を抑える物質は含まれていないことが理解できる。
【００４４】
図４に各測定における測定値を示す。
図４中の、[測定値]にプレートリーダーで測定した数値を示した。[平均値]は、１と２、３と４、５と６、７と８、９と１０、１１と１２、１３と１４、１５と１６の平均値を示した。さらに、[平均値-208]は、sFlt-1を添加していないバックグラウンドのNo.1とNo.2の平均値208を差し引いた値である。図５に示すように、反応液中のsFlt-1量は、20ng以下の場合により良い定量性が期待される。
【００４５】
＜実施例２＞
[ヘパリンビーズと市販の特異抗体を用いたsFlt-1 ELISAアッセイ]
本発明における新規ELISA測定法が通常市販されている抗sFlt-1抗体によって効果を発揮するかどうかを確認するために、以下のようなアッセイを試みた。
【００４６】
方法は実施例１と基本的に同じであるが、一次抗体である抗sFlt-1抗体として、実施例１で用いた抗ヒトsFlt-1マウス単クローン抗体KM1750と、それの代わりとして、市販の抗ヒトsFlt-1マウス単クローン抗体(PK-AB704-64426, PromoKine社)の両者を比較した。予備実験から市販抗体は抗体力価がKM1750よりも２分の１程度と考えられたため、抗体量としては２倍量を用いた。その結果を図６に示した。対照として7N Flt-1 20ng、試料としてe15a発現293細胞株の培養上清100μlを測定した。
【００４７】
図６において結果を写真で示す。[A]の１から８までは実施例１と同じ抗ヒトsFlt-1マウス単クローン抗体KM1750を、[B]の9から16までは市販の抗ヒトsFlt-1マウス単クローン抗体を使用して測定した。対照の7N Flt-1は、No.１、２、３、９、１０、１１では0ngの量を用い、No.４、５、６、１２、１３、１４では20ngの量を用いた。No.７、８、１５、１６では、e15a発現293細胞株の培養上清100μl量を測定した。青色の程度には差があるが、２種類の抗sFlt-1抗体を利用しても7N Flt-1 20ngで弱めの青色反応が認められた（No.４、５、６、１２、１３、１４）。一方、e15a発現293細胞株の培養上清で強い青色反応が認められた(No.７、８、１５、１６)。
【００４８】
図７に測定値を示す。図７中の[測定値]にプレートリーダーで測定した数値を示した。[平均値]は、１〜３、４〜６、７と８、９〜１１、１２〜１４、および１５と１６の平均値を示した。さらに、上半分の[平均値-228] 0、170、435は、sFlt-1を添加していないバックグラウンドのNo.１〜３の平均値228を、[平均値] 228、398および663から差し引いた値である。下半分の[平均値-210] 0、78、364は、sFlt-1を添加していないバックグラウンドのNo.９〜１１の平均値210を、[平均値]210、288および574から差し引いた値である。e15a発現293細胞株の培養上清100μl中のsFlt-1の量は、２種類の抗体の間で[435/170 x 20]=51ng、[364/78 x 20]=93ngの値となっている。平均すると72ng/0.1ml (720ng/ml)である。以上から、市販の一次抗体（抗sFlt-1抗体）も十分に利用可能であることが明らかとなった。
【００４９】
＜実施例３＞
（１）反応方法
測定感度を上げるために、実施例１、２で用いたアルカリフォスファターゼ標識二次抗体の代わりに、HRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識二次抗体（ab6789, Abcam社）を用いて測定を行った。sFlt-1量としては、反応チューブ当たり、0、0.1、0.3、1ngを用い、各々について３回の反応を行った。反応液の容量は実施例１、２と同じであるが、一次抗体KM1750 150ng/チューブ、HRP標識二次抗体は約200ng/チューブを用いた。実施例１、２と同様の反応と洗浄の後、HRP測定液(A+B液、R＆D Systems社)200μlを加え、撹拌の後に96穴プレートに移し、約20分間反応の後、595nmで測定した。
【００５０】
（２）結果
図８に、結果を写真で示す。同一のsFlt-1量を含む試料を３回（１〜３、0ng；４〜６、0.1ng; ７〜９、0.3ng; １０〜１２、1 ng）測定した。7N Flt-1無添加の反応液（No.１、２、３）は弱い青色であるが、7N Flt-1量の増加に従って、より強い青色となっている。
【００５１】
（３）測定値
図９に各測定における測定値を示し、図１０にグラフを示す。7N Flt-1が各々0、0.1、0.3および1ngの測定値の平均は、それぞれ303、386、552および807であり、0ngの平均値を差し引いた値は0.1ngで83であり、0.3ngで249であり、1ngで504となり、ある程度、定量的に増加した。このHRP標識二次抗体を用いることにより、実施例１および２で用いたアルカリフォスファターゼ標識二次抗体法（7N Flt-1 10-50ngを測定）に比較して、約１００倍に感度を上げることが出来た。
【００５２】
＜実施例４＞
[臨床検体の測定]
（１）方法
本測定法が実際に臨床の患者血清中のsFlt-1を測定できるか、検討した。共同研究契約・倫理委員会承認、同意書作成のもとで某大学病院産婦人科より供与された、正常分娩例５症例、妊娠高血圧症候群症例１３例の血清を測定した。１測定には、血清20μl, 50μl,あるいは100μlを用いた。また、反応液１ml中のヒト血清とウシ血清の合計量を100μlに合わせた。すなわち、ヒト血清20μlの場合はウシ血清を80μl, ヒト血清50μlの場合はウシ血清を50μl, ヒト血清100μlの場合はウシ血清を0μlとした。反応時間は4℃,3時間（測定-1）、あるいは、室温（約25℃）, 30分（測定-2）、として測定した。
【００５３】
（２）結果
図１１に、妊娠高血圧症候群患者の血清中 sFlt-1の測定-1（反応温度４℃, 反応時間３時間）の例の結果を写真で示す。左のレーンでは、標準のsFlt-1（0ng, 0.3ng, 1ng, 3ng）を測定した。右のレーンでは、妊娠高血圧症候群症例aの分娩前、および、分娩５日後、また、妊娠高血圧症候群症例bの分娩前、および、分娩５日後のsFlt-1を測定した。血清は20μlを用いた。両症例ともに分娩前には血清sFlt-1値が100ng/ml程度の高い値を示したのに対し、分娩５日後でsFlt-1の血清中濃度は速やかに低下することが示された。
【００５４】
図１２に、妊娠高血圧症候群患者の血清中 sFlt-1の測定-2（反応温度室温（約25℃）,反応時間、約３０分）の例の結果を写真で示す。左のレーンでは、標準のsFlt-1（0ng, 0.3ng, 1ng, 3ng）を測定した。右のレーンでは、妊娠高血圧症候群症例c（分娩２日前と分娩直後）および d（分娩直後と分娩前）の血清を測定した。反応温度４℃、反応時間３時間の例（図１１）と比較すると標準のsFlt-1の青色反応は若干低いが、測定法は標準と試料の反応の相対的な比較であり、測定に全く支障はなかった。
【００５５】
正常分娩例５症例、妊娠高血圧症候群症例１３例の血清の測定の結果、sFlt-1 濃度（ng/ml血清）は、正常分娩例では平均値12程度 (+/- 約7)、妊娠高血圧症候群症例では平均値56程度 (+/- 約33)となり、本疾患では正常分娩例に比べて約4.7倍の高い値を示した。さらに、妊娠37週６日以前に分娩となった前期発症例（いわゆる重症例の９例）では平均値が約70となり、正常分娩例の約5.8倍であった。一方、妊娠38週0日以後に出産となった後期発症例（４例）ではsFlt-1平均値は約24で、正常分娩例の約２倍程度に留まった。本測定から得られた結果、すなわち、妊娠高血圧症候群患者の血清中sFlt-1の平均が正常分娩症例の2倍〜5倍程度となることは、これまでの報告（J. Clin. Invest. 111, 649-658, 2003.; J. Clin. Endocrinol. Metab. 88, 2348-2351, 2003.; およびN. Engl. J. Med. 350, 672-683, 2004.）に添うものであり、この新規sFlt-1測定法が臨床検査に十分に利用できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明のsFlt-1測定法は、安価で手技的にも容易で、時間も短縮可能な、臨床的に使い易いsFlt-1スクリーニング法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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