(57)【要約】      （修正有）【課題】血管新生および／またはリンパ脈管新生を調節するためのリガンド結合分子の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、特定のアミノ酸配列がＮ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しない、精製または単離した水溶性リガンド結合ポリペプチドにおいて、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤおよびＰＩＧＦから選択される少なくとも１つのリガンドポリペプチドと結合することを特徴とするリガンド結合ポリペプチド。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の位置４７〜１１５により規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２の位置１０４〜１０６に対応するポリペプチドの位置がＮ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しない精製または単離した水溶性リガンド結合ポリペプチドにおいて、
前記ポリペプチドが、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤおよびＰＩＧＦから選択される少なくとも１つのリガンドポリペプチドと結合することを特徴とするリガンド結合ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の精製または単離した水溶性リガンド結合ポリペプチドが、配列番号２の位置４７〜２１０により規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２の位置１０４〜１０６に対応するポリペプチドの位置がＮ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しないことを特徴とするリガンド結合ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の精製または単離した水溶性リガンド結合ポリペプチドが、配列番号２の位置４７〜３１４により規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２の位置１０４〜１０６に対応するポリペプチドの位置がＮ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しないことを特徴とするリガンド結合ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載の精製または単離した水溶性リガンド結合ポリペプチドが、配列番号２の位置２５〜３１４により規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２の位置１０４〜１０６に対応するポリペプチドの位置がＮ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しないことを特徴とするリガンド結合ポリペプチド。
【請求項５】
水溶性リガンド結合分子であって、異種ペプチドと連結する請求項４に記載の水溶性リガンド結合ポリペプチドを含むことを特徴とするリガンド結合分子。
【請求項６】
請求項５に記載の水溶性リガンド結合分子において、前記異種ペプチドが、免疫グロブリン定常ドメインフラグメントを含むことを特徴とするリガンド結合分子。
【請求項７】
組成物であって、請求項４に記載の精製または単離した水溶性リガンド結合ポリペプチドまたは水溶性リガンド結合分子と、薬学的に許容される希釈剤、補助剤、賦形剤または担体とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の組成物が、硝子体内投与用に製剤化されていることを特徴とする組成物。
【請求項９】
配列番号２の位置２５〜３１４により規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２の位置１０４〜１０６に対応するポリペプチドの位置がＮ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しない精製または単離したリガンド結合ポリペプチドにおいて、
前記ポリペプチドが、ＶＥＧＦＲ−３のＩｇ様ドメイン４〜７を欠失し、ＶＥＧＦＲ−３の膜貫通ドメインを欠失し、ＶＥＧＦＲ−３の細胞内ドメインを欠失し、
前記ポリペプチドがヒトＶＥＧＦ−ＣまたはヒトＶＥＧＦ−Ｄと結合することを特徴とするリガンド結合ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２の位置２５〜３１４により規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２の位置１０４〜１０６に対応するポリペプチドの位置がＮ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しない精製または単離した水溶性リガンド結合ポリペプチドにおいて、
前記ポリペプチドが、表面上にＶＥＧＦＲ−３を発現する細胞において、ヒトＶＥＧＦ−ＣまたはヒトＶＥＧＦ−Ｄと結合して、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦＲ−３への結合を阻害する、または、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ媒介のＶＥＧＦＲ−３刺激を阻害することを特徴とするリガンド結合ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、特に眼科学および腫瘍学における脈管増殖の調節に関する。
【０００２】
配列表
電子配列表は本明細書の一部を形成する。
【背景技術】
【０００３】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）タンパク質およびその受容体（ＶＥＧＦＲ）は、両方の脈管形成、早期分化段階の内皮細胞からの胚血管系の発生、血管新生、既存血管からの新規血管の形成過程と、リンパ脈管新生、新規リンパ管の形成過程とに重要な役割を果たす。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）タンパク質およびその受容体（ＰＤＧＦＲ）は、いくつかの細胞型の細胞増殖、生存、および遊走の調節に関与する。
【０００４】
内皮細胞調節系の機能障害は、癌ならびに異常な脈管形成、血管新生、およびリンパ脈管新生に関連した種々の疾患の重要な特徴である。
【０００５】
血管新生は、胚発生、ならびに正常組織の増殖、修復、および再生、雌の生殖周期、妊娠の成立および維持、創傷および骨折の修復において生じる。健常個体で起こる血管新生に加えて、血管新生事象は、いくつかの病的過程、特に腫瘍の増殖および転移、ならびに血管増殖、特に微小血管系の増殖が増大する、糖尿病性網膜症、乾癬、および関節症などの他の病態に関与する。血管新生の阻害は、これらの病的過程の防止もしくは緩和に、またはそれらの進行の遅延に有用である。
【０００６】
受容体を介するＶＥＧＦ／ＰＤＧＦシグナル伝達を遮断するように意図した療法が、血管新生および腫瘍増殖の阻害に有望であることが示されているが、このような疾患の治療のための新規または改良された化合物および療法が依然として求められている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、異常な血管新生、リンパ脈管新生、またはその両方の阻害ならびに血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）および血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）の他の作用の阻害のための新規組成物およびその使用方法に関するものであり、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄのそれぞれは、少なくとも１つの増殖因子受容体型チロシンキナーゼ（すなわち、ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦＲ−３）に結合し、そのリン酸化を刺激することができる。本発明の組成物は、ヒトＶＥＧＦ−ＣおよびヒトＶＥＧＦ−Ｄの一方または両方に結合するリガンド結合分子を含む。一部の実施形態では、リガンド結合分子は、ポリペプチド、例えば、増殖因子受容体型チロシンキナーゼの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のフラグメントを含む。このフラグメントは、増殖因子結合を消失させない形で野生型配列と異なっていてもよく、またこのフラグメントは、好ましくは、必要とする被験体／患者に投与するための、治療薬としてのその特性を改善するように本明細書に記載する方法で操作される。
【０００８】
本発明はまた、このようなリガンド結合分子をコードする核酸を提供する。この核酸は、ポリペプチドリガンド結合分子を発現させるために有用であり、また一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏで、生物活性型のポリペプチドリガンド結合分子を発現させるための治療薬としても有用である。
【０００９】
本明細書に記載するリガンド結合分子（またはそれをコードするポリヌクレオチド）を含む組成物を、それを必要とする患者に投与することにより、ＶＥＧＦ受容体の増殖因子刺激が阻害され（例えば、受容体のリン酸化が阻害され）、それによって、以下に限定されるものではないが、ＶＥＧＦＲ媒介の血管新生、リンパ脈管新生、またはその両方を含む、受容体を介して媒介される生物応答が阻害される。
【００１０】
ＶＥＧＦ−ＣおよびＤは、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦ受容体（または受容体ヘテロ二量体）に高親和性で結合し、そのリン酸化を刺激する。この記載は、同族受容体に対する増殖因子の周知の特性について言及するものであり、本発明のリガンド結合分子の特徴それ自体を限定することを意図するものではない。しかしながら、本発明の好ましいリガンド結合分子は、その標的増殖因子に単に結合するだけでなくそれを超えるものである。好ましいリガンド結合分子はまた、それが結合する増殖因子が、その増殖因子が結合する受容体型チロシンキナーゼの少なくとも１つ（および好ましくはすべて）のリン酸化を刺激することを阻害する。チロシンリン酸化の刺激は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞ベースのアッセイおよび抗ホスホチロシン抗体を用いて、容易に測定される。受容体型チロシンキナーゼのリン酸化は、シグナル伝達カスケードの初期段階であるので、リガンド結合分子が、細胞遊走、細胞増殖、および他の応答をもたらす増殖因子媒介シグナル伝達を阻害することができるか否かの好都合な指標となる。いくつかの他の細胞ベースのアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイを、増殖因子を中和する、本発明のリガンド結合分子の特性を確認するために用いることができる。
【００１１】
特定の増殖因子に「特異的」であるリガンド結合分子は、増殖因子の活性型（例えば、体内を循環することが見出されている形態）を特異的に認識するリガンド結合分子である。好ましくは、リガンド結合分子は、増殖因子の他の形態にも同様に特異的に結合する。例として、ＶＥＧＦ−Ｃ（およびＶＥＧＦ−Ｄ）は、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３に結合し、それを刺激するＶＥＧＦ−Ｃ（またはＶＥＧＦ−Ｄ）の「完全にプロセシングされた」形態を、切断されて生じる、広範なアミノ末端およびカルボキシ末端のプレプロペプチドを有するプレプロ分子として翻訳される。ＶＥＧＦ−Ｃ（またはＶＥＧＦ−Ｄ）に特異的なリガンド結合分子は、ＶＥＧＦ−Ｃ（またはＶＥＧＦ−Ｄ）の完全にプロセシングされた形態に少なくとも結合し、好ましくはさらに、部分的にプロセシングされた形態およびプロセシングされていない形態にも結合する。
【００１２】
本明細書に記載する一態様では、リガンド結合分子は、配列番号２の位置４７〜１１５または配列番号２の位置２５〜１１５によって規定されるアミノ酸の配列に対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９２％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するが、配列番号２の位置１０４〜１０６に対応するポリペプチドの位置は、Ｎ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔ（Ｘは任意のアミノ酸を表す）にも一致しない第１のアミノ酸配列を含み、ヒトＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、およびＰＤＧＦ−ＤなどのＶＥＧＦまたはＰＤＧＦ増殖因子ファミリーから選択される少なくとも１つのリガンドポリペプチドに結合する精製または単離リガンド結合ポリペプチドである。配列番号２は、推定上のシグナルペプチドに対応する配列番号２の位置１〜２４と、推定上のシグナルペプチドを欠く、受容体の推定上の成熟形態に対応する配列番号２の位置２５以降とを有する、ヒトＶＥＧＦＲ−３に対するアミノ酸配列を含有する。配列番号２の前方のセグメントは、ヒトＶＥＧＦＲ−３の第１の免疫グロブリン様ドメイン（「ＶＥＧＦＲ−３のＤ１」）におよそ対応するか、またはそれを含む。具体的には、リガンド結合ポリペプチドを生じさせるように結合した、ＶＥＧＦＲ−３受容体または他の受容体のＩｇ様ドメインをさらに含むコンストラクトが企図され、リガンド結合ポリペプチドを作製するために用いられる受容体成分を変えることによって、異なるリガンドに結合するコンストラクトが構築される。一部の変更形態では、リガンド結合ポリペプチドは主としてＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインに基づいており、他の実施形態では、リガンド結合ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ−１および／またはＶＥＧＦＲ−２および／またはＰＤＧＦＲ−αおよび／またはＰＤＧＦＲ−βなどの他の受容体型チロシンキナーゼのセグメントの融合に基づいている。ＶＥＧＦＲ−３に主として基づいた実施形態では、少なくとも１つのリガンドは、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄのポリペプチドなど、ＶＥＧＦＲ−３に対する天然リガンドである。
【００１３】
一部の実施形態では、リガンド結合ポリペプチドは、配列番号２の位置１５４〜２１０または配列番号２の位置２４８〜３１４によって規定されるアミノ酸の配列に対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９２％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である第２のアミノ酸配列を含み、第２のアミノ酸配列のＮ末端残基は、第１のアミノ酸配列のＣ末端残基に直接またはスペーサーを介して結合しており、またこのポリペプチドは、ヒトＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、およびＰＤＧＦ−ＤなどのＶＥＧＦまたはＰＤＧＦ増殖因子ファミリーから選択される少なくとも１つのリガンドポリペプチドに結合する。位置１５４〜２１０に対応するポリペプチドの位置により規定されるアミノ酸の配列は、ヒトＶＥＧＦＲ−３のＥＣＤの第２の免疫グロブリン様ドメイン（「ＶＥＧＦＲ−３のＤ２」）におよそ対応するかまたはそれを含む。位置２４８〜３１４に対応するポリペプチドの位置により規定されるアミノ酸の配列は、ヒトＶＥＧＦＲ−３のＥＣＤの第３の免疫グロブリン様ドメイン（「ＶＥＧＦＲ−３のＤ３」）におよそ対応するかまたはそれを含む。第２のアミノ酸配列がＶＥＧＦＲ−３のＤ２におよそ対応するかまたはそれを含むアミノ酸配列を含む場合、リガンド結合ポリペプチドは、配列番号２の位置２４８〜３１４によって規定されるアミノ酸の配列に対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９２％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である第３のアミノ酸配列を含み、第３のアミノ酸配列のＮ末端残基は、第２のアミノ酸配列のＣ末端残基に直接またはスペーサーを介して結合しており、またこのポリペプチドは、ヒトＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、およびＰＤＧＦ−ＤなどのＶＥＧＦまたはＰＤＧＦ増殖因子ファミリーから選択される少なくとも１つのリガンドポリペプチドに結合することが好ましい。換言すれば、リガンド結合ポリペプチドがＶＥＧＦＲ−３のＤ１およびＤ２におよそ対応するかまたはそれを含むアミノ酸配列を含む実施形態では、リガンド結合ポリペプチドはまた、ＶＥＧＦＲ−３のＤ３におよそ対応するかまたはそれを含むアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００１４】
リガンド結合ポリペプチドがＶＥＧＦＲ−３の２つ以上の成分ドメインにおよそ対応するアミノ酸配列を含む実施形態では、これらの成分ドメインは互いに直接結合していても、または１つまたは複数のスペーサーを介して結合していてもよい。好ましくは、成分ドメインは１つまたは複数のスペーサーによって結合される。一実施形態では、スペーサーは、アミノ酸長が１〜１００、好ましくはアミノ酸長が１〜５０の間である、成分ドメイン間の１つまたは複数のペプチド配列を含む。一実施形態では、２つの成分ドメイン間のスペーサーは、天然ＶＥＧＦＲ−３における成分ドメインに天然に結合されたペプチド配列から実質的になる。
【００１５】
リガンド結合ポリペプチドが、ＶＥＧＦＲ−３（例えば、Ｄ１−Ｄ２またはＤ１−Ｄ２−Ｄ３）の連続した成分ドメインにおよそ対応するかまたはそれらを含むアミノ酸配列を含む実施形態では、これらの成分ドメインは、アミノ酸長が１〜１００、好ましくはアミノ酸長が１〜５０の間である、成分ドメイン間の１つまたは複数のペプチド配列を含む１つまたは複数のスペーサーを介して結合される。一実施形態では、２つの成分ドメイン間のスペーサーは、天然ＶＥＧＦＲ−３におけるそれぞれの連続した成分ドメインを結合するものに対応するペプチド配列から実質的になる。一部の実施形態では、２つの連続した成分ドメイン間のスペーサーは、天然ＶＥＧＦＲ−３における連続したドメインを結合するアミノ酸の配列に対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９２％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
リガンド結合ポリペプチドがＶＥＧＦＲ−３のＤ１およびＤ２におよそ対応するかまたはそれらを含むアミノ酸配列を含む一実施形態では、成分ドメインＤ１およびＤ２は、配列番号２の位置１１６〜１５３によって規定されるアミノ酸の配列に対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９２％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するスペーサーアミノ酸配列を介して結合される。リガンド結合ポリペプチドがＶＥＧＦＲ−３のＤ２およびＤ３におよそ対応するかまたはそれらを含むアミノ酸配列を含む場合、成分ドメインＤ２およびＤ３は、配列番号２の位置２１１〜２４７によって規定されるアミノ酸の配列に対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９２％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するスペーサーアミノ酸配列を介して結合される。
【００１７】
一部の実施形態では、精製または単離リガンド結合ポリペプチドは、配列番号２の位置４７〜２１０、または配列番号２の位置２５〜２１０、または配列番号２の位置４７〜３１４、または配列番号２の位置２５〜３１４、または配列番号２の位置４７〜７５２もしくは４７〜７７５、または配列番号２の位置２５〜７５２もしくは２５〜７７５によって規定されるアミノ酸の配列に対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９２％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むが、配列番号２の位置１０４〜１０６に対応するポリペプチドの位置は、Ｎ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致せず、またこのポリペプチドは、ヒトＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、およびＰｌＧＦから選択される、少なくとも１つのリガンドポリペプチドに結合する。一変更形態では、配列番号２の位置１０４に対応するアミノ酸は、欠失し、別のアミノ酸（グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、およびリジンなど）に置換される。位置４７〜２１０は、ヒトＶＥＧＦＲ−３  ＥＣＤの第１の２つの免疫グロブリン様ドメインおよび第１の２つのＩｇ様モチーフ間のＶＥＧＦＲ−３  ＥＣＤ配列を含む。位置４７〜３１４は、ヒトＶＥＧＦＲ−３  ＥＣＤの第１の３つの免疫グロブリン様ドメインおよびこれらのＩｇ様モチーフ間のＶＥＧＦＲ−３  ＥＣＤ配列を含む。
【００１８】
より一般的には、本発明のリガンド結合ポリペプチドは、配列番号２に示すＶＥＧＦＲ−３のアミノ酸配列のフラグメントに対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９２％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、このフラグメントのアミノ末端は、配列番号２の位置２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０から選択される任意のアミノ酸であり、かつこのフラグメントのカルボキシ末端は、配列番号２の位置１１０〜７７５（例えば、位置１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、．．．．．．７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５）から選択される任意のアミノ酸であるが、配列番号２の位置１０４〜１０６に対応するポリペプチドの位置は、Ｎ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しない。本明細書の記載から容易に明らかになる理由で、許容される変更形態は、野生型ＶＥＧＦＲ−３では見出されない、新規の糖鎖付加シークオンを導入する変更形態ではない。
【００１９】
本明細書に記載する別の態様では、リガンド結合分子は、配列番号２の位置４７〜１１５、配列番号２の４７〜２１０、配列番号２の４７〜３１４、配列番号２の４７〜７５２もしくは４７〜７７５、または配列番号２の２５〜７５２または２５〜７７５に対応するポリペプチドの位置によって規定されるアミノ酸の配列と同一であるアミノ酸配列を含むが、配列番号２の位置１０４〜１０６に対応するポリペプチドの位置が、Ｎ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しない精製または単離リガンド結合ポリペプチドである。一変更形態では、配列番号２の位置１０４に対応するアミノ酸は、欠失し、別のアミノ酸（グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、およびリジンなど）に置換される。
【００２０】
本明細書に記載する別の態様では、リガンド結合分子は、配列番号２の位置４７〜１１５によって規定されるアミノ酸の配列に対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９２％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む精製または単離リガンド結合分子であり、ここで、配列番号２の位置１０４〜１０６に対応するポリペプチドの位置は、推定上のＶＥＧＦＲ−３糖鎖付加シークオンであり、かつ前記推定上の糖鎖付加シークオンは、リガンド結合ポリペプチドのアミノ酸配列から排除される。この文脈で用いられる「排除される」という用語は、Ｎ−Ｘ−Ｔシークオンモチーフを破壊するための、（置換、欠失、または挿入による）少なくとも１つの位置の主要なアミノ酸配列の変更を意味する。
【００２１】
本発明はまた、共有結合的または非共有結合的に互いに結合して二量体または多量体構造を形成する、本明細書に記載する２つ以上のリガンド結合分子を含む多量体リガンド結合コンストラクトを含む。一部の変更形態では、結合は、リガンド結合ポリペプチドのＶＥＧＦＲ−３様配列間で起こり；他の変更形態では、結合は、ＶＥＧＦＲ−３様配列の一方または両方に結合した異種ポリペプチド間で起こる。
【００２２】
本明細書に記載するリガンド結合分子またはリガンド結合ポリペプチドへの本明細書における言及は、上記に規定するその変異体への言及を含むが、そのようなリガンド結合ポリペプチドまたは分子は（単量体、二量体、またはより高度の多量体のいずれにもかかわらず）、ＶＥＧＦＲ−３のＩｇ様モチーフ（例えば、配列番号２のおよそ４７〜１１５）に類似したまたは同一のＩｇ様モチーフを少なくとも含有し、配列番号２の位置１０４〜１０６（天然ＶＥＧＦＲ−３配列におけるＮ連結糖鎖付加シークオンを示す）に対応するポリペプチドの位置は、Ｎ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しない。
【００２３】
別の態様では、本明細書に記載するのは、ＶＥＧＦＲ−３ΔＮ２ポリペプチドの第１の免疫グロブリン様ドメインを含む単離または精製リガンド結合ポリペプチドであるリガンド結合分子である。本明細書で使用する場合、「ＶＥＧＦＲ−３ΔＮ２ポリペプチド」という用語は、ヒトＶＥＧＦＲ−３のＥＣＤを規定するアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するが、第２の推定上の糖鎖付加シークオン、ＮＤＴに対応するポリペプチドの配列の一部が、例えば、これらの位置の１つにおける置換のために、もはやＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔシークオンモチーフに適合しないように突然変異しているポリペプチドを指す。一部の実施形態では、精製ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ−３ΔＮ２ポリペプチドの第１の２つの免疫グロブリン様ドメインを含み、また好ましくはそれらのドメイン間のＶＥＧＦＲ−３配列を含む。一部の実施形態では、精製ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ−３ΔＮ２ポリペプチドの第１の３つの免疫グロブリン様ドメインを含み、また好ましくはそれらのドメイン間のＶＥＧＦＲ−３配列を含む。
【００２４】
さらに別の態様では、本明細書に記載するのは、融合相手に融合したヒトＶＥＧＦＲ−３のＥＣＤフラグメントを含むポリペプチドであるリガンド結合分子であり、ここで、ＶＥＧＦＲ−３のＥＣＤフラグメントのアミノ酸配列は、野生型ＶＥＧＦＲ−３の第２の推定上のＮ連結糖鎖付加シークオンを排除するように、野生型ＶＥＧＦＲ−３から改変されており、このポリペプチドは、ヒト血清に可溶であり、ヒトＶＥＧＦ−ＣまたはヒトＶＥＧＦ−Ｄに結合し；かつ融合相手は、溶解性またはＥＣＤフラグメントの血清半減期を（例えば、融合相手に融合していない同じフラグメントに比較して）改善する。一部の実施形態では、融合相手は、異種ポリペプチドである。
【００２５】
一部の実施形態では、リガンド結合ポリペプチドまたはリガンド結合分子は、ヒトＶＥＧＦ−ＣまたはヒトＶＥＧＦ−Ｄに結合する。一部の実施形態では、リガンド結合ポリペプチドまたはリガンド結合分子は、ＶＥＧＦＲ−３へのＶＥＧＦ−Ｃまたは−ＶＥＧＦ−Ｄの結合を阻害するか、またはその表面上にＶＥＧＦＲ−３を発現する細胞において、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ媒介のＶＥＧＦＲ−３刺激を阻害する。刺激の阻害は、例えば、受容体リン酸化の測定により、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞増殖の測定により、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける脈管増殖または他の組織レベル変化の測定により実証することができる。
【００２６】
リガンド結合分子は、好ましくは、約１ｎＭ以下（例えば、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭ、またはそれ以下）のＫｄでヒトＶＥＧＦ−Ｃに結合する。リガンド結合分子は、好ましくは、約５ｎＭ以下（例えば、２ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭ、またはそれ以下）のＫｄでヒトＶＥＧＦ−Ｄに結合する。
【００２７】
別の態様では、精製または単離リガンド結合分子は、配列番号３のアミノ酸２２〜２９０、配列番号３のアミノ酸２３〜２９０、配列番号３のアミノ酸２３〜５３７、または配列番号３のアミノ酸２２〜５３７を含む。さらに他の変更形態では、この分子は、前述の配列の何れかに対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９２％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むが、ＶＥＧＦＲ−３  Ｎ２シークオンに対応する（アライメントする）ポリペプチドの配列は、糖鎖付加配列ではない。
【００２８】
本明細書に記載するように、リガンド結合分子は、その特異的な増殖因子結合特性を保持しながら、所望の特徴を付与するように化学的に修飾（例えば、糖鎖付加、ペグ化等）することができる。ＶＥＧＦＲ−３のＩｇ様ドメインＩ〜ＩＩＩは、５つの推定上のＮ糖鎖付加部位を含む（それぞれ、ＶＥＧＦＲ−３のＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、およびＮ５シークオンと本明細書では呼ばれる）。Ｎ１は配列番号２のアミノ酸３３〜３５に対応し；Ｎ２は配列番号２のアミノ酸１０４〜１０６に対応し；Ｎ３は配列番号２のアミノ酸１６６〜１６８に対応し；Ｎ４は配列番号２のアミノ酸２５１〜２５３に対応し、Ｎ５は配列番号２のアミノ酸２９９〜３０１に対応する。一部の実施形態では、本明細書に記載するリガンド結合分子は、分子のＮ２シークオンに改変を含む。例えば、一部の実施形態では、配列番号２の位置１０４に対応する、リガンド結合分子中のアミノ酸は、欠失し、別のアミノ酸に置換される。保存的置換が好ましい。一部の実施形態では、配列番号２の位置１０４に対応するアミノ酸は、欠失し、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、およびリジンからなる群から選択されるアミノ酸に置換される。配列番号２のＮ２シークオンが上記のように改変される実施形態では、配列番号２のＮ１、Ｎ３、Ｎ４、およびＮ５のシークオンは、好ましくは、アミノ酸配列に関して不変である。
【００２９】
本明細書に記載するように、リガンド結合分子は、融合相手に直接またはリンカーを介して結合することができる。融合相手は、リガンド結合分子の機能性を増強する任意の異種成分であってよい。例示的なペプチド融合相手は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）フラグメントを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン定常フラグメントは、配列番号３のアミノ酸３０６〜５３７に対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９２％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性、あるいは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３０】
本明細書に記載するように、リガンド結合分子は、例えば、融合相手（例えば、異種ペプチドなど）への結合を容易にするように、または所望の特徴（例えば、血清半減期の延長、水性媒体への溶解性の向上、特定の細胞集団、例えば腫瘍細胞または網膜細胞へのターゲティングを可能にすること）を付与するように化学的に修飾することができる。
【００３１】
一部の実施形態では、本明細書に記載するリガンド結合分子は、任意選択で、分子に結合した少なくとも１つのＰＥＧ部分を含む。例えば、一部の実施形態では、約２０〜４０ｋＤａのＰＥＧが、リガンド結合分子のアミノ末端に結合している。
【００３２】
一部の実施形態では、本明細書に記載するリガンド結合分子は、任意選択で、例えば、第Ｘａ因子リンカー配列ＰＩＥＧＲＧＧＧＧＧ（配列番号４）など、リガンド結合ポリペプチドへの異種ペプチド等の融合相手を連結するリンカーを含む。他の実施形態では、リガンド結合分子は、リガンド結合ポリペプチドのＣ末端アミノ酸が異種ペプチド融合相手のＮ末端アミノ酸にペプチド結合によって直接結合しているポリペプチドを含む。一部の実施形態では、リガンド結合ポリペプチドおよび異種ペプチドは、単一ポリペプチド鎖を形成するように、アミド結合によって（直接またはリンカーポリペプチドを介して）結合している。
【００３３】
一部の変更形態では、リガンド結合分子は、この分子を発現する細胞からの分子の分泌を指示するシグナルペプチドを含む。
【００３４】
本発明の核酸（ポリヌクレオチド）は、ポリペプチドリガンド結合分子をコードする核酸を含み、これは、遺伝子治療およびポリペプチド結合リガンド分子の組換えｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現のような用途に用いることができる。一部の実施形態では、核酸は精製または単離される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列をさらに含み、このプロモーター配列は、宿主細胞においてポリペプチドをコードする配列の転写を促進する。ポリヌクレオチドはまた、ポリアデニル化シグナル配列を含むことができる。一部の変更形態では、核酸は、野生型ヒトＶＥＧＦＲ−３コード化核酸に類似したコード化ヌクレオチド配列を有する。例えば、核酸は、配列番号１に示すヒトＶＥＧＦＲ−３配列またはそのフラグメントに対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９２％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するコード化ヌクレオチド配列を含む。例として、Ｎ２シークオンに改変がある、配列番号２のアミノ酸４７〜３１４をコードするヌクレオチド配列の文脈では、例示的な核酸は、コドン４７〜３１４に対応する、配列番号１の位置１５７〜９６１に示すヒトＶＥＧＦＲ−３配列に対して、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９２％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するコード化ヌクレオチド配列を含む。
【００３５】
ポリヌクレオチドを含むベクターもまた、本発明の態様である。そのようなベクターは、ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された発現制御配列を含むことができる。一部の変更形態では、ベクターは、真核生物の宿主細胞など選ばれた宿主細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え発現が最適化されるように選択される。一部の変更形態では、ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達用に選択される。例えば、ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、リポソームベクター、およびそれらの組合せからなる群から選択することができる。一部の実施形態では、ベクターは、複製欠損アデノウイルスを含み、前記アデノウイルスは、プロモーターに作動可能に連結され、アデノウイルスのポリヌクレオチド配列によって挟まれたポリヌクレオチドを含む。
【００３６】
ポリヌクレオチド、ベクター、および他の核酸を含む宿主細胞、ならびにそれを用いてリガンド結合分子を発現および単離するための方法も本発明の態様である。本明細書に記載するリガンド結合ポリペプチドまたはリガンド結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞および他の哺乳動物細胞株を含む真核生物宿主細胞が具体的に企図される。一部の変更形態では、細胞株は、細胞において産生されるポリペプチドの糖鎖付加シークオンにヒトまたはヒト様糖鎖付加を導入するように選択または操作される。
【００３７】
本明細書に記載するリガンド結合ポリペプチドまたは分子を作製する方法も企図される。（そのような方法は、本発明のポリヌクレオチドまたは細胞の使用として記載することもできよう。）一態様では、この方法は、ポリヌクレオチドによりコードされたリガンド結合ポリペプチドまたはリガンド結合分子が発現される条件下で、本明細書に記載するポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を増殖させることを含む。一部の実施形態では、この方法は、細胞からまたは細胞の増殖培地からリガンド結合ポリペプチドまたはリガンド結合分子を精製または単離することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、発現および精製／単離したポリペプチドに、１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他の部分を結合させることをさらに含む。
【００３８】
本発明はまた、薬学的に許容される希釈剤、補助剤、または担体培地と一緒に、ポリペプチド、リガンド結合分子、またはそれをコードする核酸を含む組成物を含む。一部の実施形態では、組成物は、眼への局所投与用に製剤化される（例えば、軟膏または点眼剤などの局所製剤、または硝子体内注射に適した製剤）。他の実施形態では、組成物は、例えば、静脈内注射もしくは冒された組織への直接注射による、または腫瘍切除中の器具を介する塗布による、腫瘍への局所投与用にまたは腫瘍が外科的に摘出された器官または組織への局所投与用に製剤化される。
【００３９】
本発明はまた、治療または予防の文脈で脈管（血管および／またはリンパ管）増殖を阻害するための、本明細書に記載する物質（ポリペプチド、分子およびコンストラクト、ポリヌクレオチドおよびベクター、形質転換細胞、組成物）を使用する方法を含む。あるいは、本明細書に記載する使用方法は、指定の適応症に対する種々の物質の使用として特徴づけることができる。治療のための例示的な被験体としては、ヒトおよび他の霊長類、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ）、動物園動物（例えば、ネコ、イヌ、厚皮動物、シカ）、およびペット（例えば、イヌ、ネコ）、およびげっ歯類が挙げられる。
【００４０】
一部の変更形態では、本発明は、被験体の血管新生を阻害する方法であって、前述の物質または組成物の何れかを、被験体の血管新生を阻害するために有効な量で被験体に投与することを含む方法を含む。例示的な病原性の血管新生状態には、眼および腫瘍の血管新生状態が含まれる。
【００４１】
一部の変更形態では、本発明は、被験体の網膜血管新生を阻害する方法であって、本明細書に記載する物質または組成物を、被験体の網膜血管新生を阻害するために有効な量で被験体に投与することを含む方法を含む。関連する変更形態では、本発明は、網膜血管新生に関連した眼障害を有する被験体を治療する方法であって、本明細書に記載し、上記に概説した物質または組成物を、被験体の網膜血管新生を阻害するために有効な量で被験体に投与することを含む方法を含む。例えば、本明細書に記載する組成物は、点眼剤または他の局所投与によって、結膜下投与（例えば、注射）によって、硝子体内注射によって、または硝子体内インプラントによってなど、被験体の眼に局所的に投与される。
【００４２】
組成物は、好ましくは、被験体の眼のＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄが、眼の細胞または眼の脈管に発現したＶＥＧＦＲ−２および／またはＶＥＧＦＲ−３に結合することまたはそれを刺激することを阻害するために有効な量ならびに反復投与頻度および期間で投与される。そのような有益な効果は、病的な眼症状（黄斑変性症、糖尿病性網膜症、および黄斑性毛細血管拡張症など）における悪化／進行の遅延もしくは停止、または臨床症状の改善の点から評価することができる。この有益な効果はまた、標的組織の中および周囲の脈管増殖のモニタリングの点から観察可能になることもある。
【００４３】
本明細書に記載する方法および使用は、本明細書に詳細に記載するように、追加の治療剤または治療法（例えば、放射線形態）と併用して実施することができる。
【００４４】
本明細書に記載する本発明の方法（または使用）は、別の治療（癌の治療または眼底障害の治療に対する標準治療など）と併用して、１つまたは複数のリガンド結合分子、または少なくとも１つのリガンド結合分子を用いて実施することができる。リガンド結合分子が眼底障害の治療のためである実施形態では、企図される追加の治療としては、限局性レーザー治療（または光凝固術）、散乱レーザー治療（または、汎網膜光凝固術）、および硝子体切除術が挙げられる。一部の実施形態では、抗生物質もまた治療を受ける被験体に投与される。
【００４５】
本明細書に記載するリガンド結合分子が癌治療における使用のためである実施形態では、企図される標準治療の治療剤としては、増殖因子および／またはその受容体を標的とする、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡ干渉、二重特異性抗体、他の抗体型、および小分子、例えば化学療法剤が挙げられる。サイトカイン、放射線療法剤、または放射線療法もまた、本明細書に記載するリガンド結合分子と併用して用いることができる。化学療法剤または放射線療法剤は、代謝拮抗剤；ＤＮＡ傷害剤；サイトカインまたは増殖因子；共有結合性ＤＮＡ結合薬；トポイソメラーゼ阻害剤；有糸分裂阻害剤；抗腫瘍抗生物質；分化剤；アルキル化剤；メチル化剤；ホルモンまたはホルモン拮抗剤；ナイトロジェンマスタード；放射線増感剤；および光増感剤を含む薬剤クラスのメンバーであり得る。これらの薬剤の具体例が本出願に別記されている。併用療法は相乗的であることが好ましいが、そうである必要はなく、相加的療法も本発明の態様と見なされる。
【００４６】
方法におけるその使用に加えて、リガンド結合分子は、キット中にまたは単位用量として、他の治療剤と組み合わせることもパッケージすることもできる。新生物疾患は、リガンド結合分子で治療することができる唯一の疾患ではない。リガンド結合分子は、異常な血管新生またはリンパ脈管新生と関連した任意の疾患に対する治療剤として用いることができる。
【００４７】
本発明はまた、以下のさらなる実施形態で記載することができる。
【００４８】
配列番号２の位置４７〜１１５により規定されるアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むが、配列番号２の位置１０４〜１０６に対応するポリペプチドの位置は、Ｎ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しない精製または単離リガンド結合ポリペプチドであって、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、およびＰｌＧＦから選択される、少なくとも１つのリガンドポリペプチドに結合する精製または単離リガンド結合ポリペプチド。
【００４９】
段落［００４８］に記載の精製または単離リガンド結合ポリペプチドであって、配列番号２の位置４７〜２１０により規定されるアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むが、配列番号２の位置１０４〜１０６に対応するポリペプチドの位置は、Ｎ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しない、精製または単離リガンド結合ポリペプチド。
【００５０】
段落［００４８］に記載の精製または単離リガンド結合ポリペプチドであって、配列番号２の位置４７〜３１４により規定されるアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むが、配列番号２の位置１０４〜１０６に対応するポリペプチドの位置は、Ｎ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しない、精製または単離リガンド結合ポリペプチド。
【００５１】
段落［００４８］に記載の精製または単離リガンド結合ポリペプチドであって、配列番号２の位置４７〜７５２により規定されるアミノ酸の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むが、配列番号２の位置１０４〜１０６に対応するポリペプチドの位置は、Ｎ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しない、精製または単離リガンド結合ポリペプチド。
【００５２】
段落［００４８］〜［００５１］の何れか１つに記載の精製または単離リガンド結合ポリペプチドであって、配列番号２の位置３３〜３５、配列番号２の位置１６６〜１６８、配列番号２の位置２５１〜２５３、および配列番号２の位置２９９〜３０１に対応する４つのＮ糖鎖付加シークオンを保持する、精製または単離リガンド結合ポリペプチド。
【００５３】
段落［００５２］に記載の精製または単離リガンド結合ポリペプチドであって、前記４つのＮ糖鎖付加シークオン部位でグリコシル化されている、精製または単離リガンド結合ポリペプチド。
【００５４】
段落［００４８］〜［００５３］の何れか１つに記載の精製または単離リガンド結合ポリペプチドであって、可溶性ポリペプチドである、精製または単離リガンド結合ポリペプチド。
【００５５】
段落［００４８］〜［００５４］の何れか１つに記載の精製または単離リガンド結合ポリペプチドであって、配列番号２の位置４７〜１１５、配列番号２の位置４７〜２１０、配列番号２の位置４７〜３１４、または配列番号２の位置４７〜７５２によって規定されるアミノ酸の配列に同一であるアミノ酸配列を含むが、配列番号２の位置１０４〜１０６に対応するポリペプチドの位置はＮ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しない、精製または単離リガンド結合ポリペプチド。
【００５６】
段落［００４８］〜［００５５］の何れか１つに記載の精製または単離リガンド結合ポリペプチドであって、ヒトＶＥＧＦ−ＣまたはヒトＶＥＧＦ−Ｄに結合する、精製または単離リガンド結合ポリペプチド。
【００５７】
段落［００５６］に記載の精製または単離リガンド結合ポリペプチドであって、ＶＥＧＦＲ−３へのＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄの結合を阻害するか、またはその表面上にＶＥＧＦＲ−３を発現する細胞において、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ媒介のＶＥＧＦＲ−３刺激を阻害する、精製または単離リガンド結合ポリペプチド。
【００５８】
段落［００４８］〜［００５７］の何れか１つに記載の精製または単離リガンド結合ポリペプチドであって、Ｋｄまたは１ｎＭ以下でヒトＶＥＧＦ−Ｃに結合する、精製または単離リガンド結合ポリペプチド。
【００５９】
段落［００４８］〜［００５７］の何れか１つに記載の精製または単離リガンド結合ポリペプチドであって、５ｎＭ以下のＫｄでヒトＶＥＧＦ−Ｄに結合する、精製または単離リガンド結合ポリペプチド。
【００６０】
段落［００４８］〜［００５９］の何れか１つに記載の精製または単離リガンド結合ポリペプチドであって、配列番号２の位置１０４に対応する、ポリペプチド中のアミノ酸が欠失しているかまたは他のアミノ酸に置換されている、精製または単離リガンド結合ポリペプチド。
【００６１】
段落［００５５］に記載の精製または単離リガンド結合ポリペプチドおいて、配列番号２の位置１０４のアミノ酸が欠失しているかまたはグルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、およびリジンからなる群から選択される別のアミノ酸に置換されている、精製または単離リガンド結合ポリペプチド。
【００６２】
段落［００４８］〜［００５６］の何れか１つに記載の精製または単離リガンド結合ポリペプチドであって、配列番号３のアミノ酸２３〜２９０を含む、精製または単離リガンド結合ポリペプチド。
【００６３】
段落［００４８］〜［００６２］の何れか１つに記載の精製または単離リガンド結合ポリペプチドであって、シグナルペプチドをさらに含む、精製または単離リガンド結合ポリペプチド。
【００６４】
段落［００４８］〜［００６３］の何れか１つに記載の精製または単離リガンド結合ポリペプチドであって、ポリペプチドに結合した少なくとも１つのポリエチレングリコール部分をさらに含む、精製または単離リガンド結合ポリペプチド。
【００６５】
段落［００６４］に記載の精製または単離リガンド結合ポリペプチドであって、ポリペプチドのアミノ末端に結合した約２０〜４０ｋＤａのポリエチレングリコールを含む、精製または単離リガンド結合ポリペプチド。
【００６６】
異種ペプチドに結合した、段落［００４８］〜［００６５］の何れか１つに記載のリガンド結合ポリペプチドを含むリガンド結合分子。
【００６７】
段落［００６６］に記載のリガンド結合分子であって、異種ペプチドが免疫グロブリン定常ドメインフラグメントを含む、リガンド結合分子。
【００６８】
段落［００６６］に記載のリガンド結合分子において、免疫グロブリン定常ドメインフラグメントがＩｇＧ定常ドメインフラグメントである、リガンド結合分子。
【００６９】
段落［００６７］に記載のリガンド結合分子であって、免疫グロブリン定常フラグメントが配列番号３のアミノ酸３０６〜５３７を含む、リガンド結合分子。
【００７０】
段落１９に記載のリガンド結合分子であって、リガンド結合分子が配列番号３のアミノ酸２２〜５３７を含む、リガンド結合分子。
【００７１】
段落［００６６］〜［００７０］の何れか１つに記載のリガンド結合分子であって、任意選択で、リガンド結合ポリペプチドに異種ペプチドを結合するリンカーを含む、リガンド結合分子。
【００７２】
段落［００６６］〜［００７０］の何れか１つに記載のリガンド結合分子であって、リガンド結合ポリペプチドのＣ末端アミノ酸が異種ペプチドのＮ末端にペプチド結合によって直接結合しているポリペプチドを含む、リガンド結合分子。
【００７３】
段落［００６６］〜［００７２］の何れか１つに記載のリガンド結合分子であって、分子を発現する細胞からの分子の分泌を指示するシグナルペプチドをさらに含む、リガンド結合分子。
【００７４】
段落［００６６］に記載のリガンド結合分子であって、分子が配列番号３に示すアミノ酸配列を含む、リガンド結合分子。
【００７５】
段落［００６６］〜［００７０］の何れか１つに記載のリガンド結合分子であって、リガンド結合ポリペプチドと異種ペプチドとがアミド結合によって連結して単一ポリペプチド鎖を形成している、リガンド結合分子。
【００７６】
段落［００４８］〜［００６５］の何れか１つに記載のリガンド結合ポリペプチドまたは段落１９〜２８の何れか１つに記載のリガンド結合分子であって、検出可能標識をさらに含む、リガンド結合分子。
【００７７】
段落１〜１８の何れか１つに記載のリガンド結合ポリペプチドまたは段落［００６６］〜［００７５］の何れか１つに記載のリガンド結合分子と化学療法剤とを含むコンジュゲート。
【００７８】
段落１〜１８の何れか１つに記載のリガンド結合ポリペプチドまたは段落［００６６］〜［００７５］の何れか１つに記載のリガンド結合分子をコードするコード化ヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【００７９】
段落［００７８］に記載のポリヌクレオチドであって、宿主細胞におけるコード化ヌクレオチド配列の転写を促進するように、コード化ヌクレオチド配列に作動可能に結合したプロモーター配列をさらに含む、ポリヌクレオチド。
【００８０】
段落［００７８］または段落［００７９］のポリヌクレオチドを含むベクター。
【００８１】
段落［００８０］に記載のベクターであって、コード化ヌクレオチド配列に作動可能に結合した発現制御配列をさらに含む、ベクター。
【００８２】
段落［００８０］に記載のベクターであって、前記ベクターが、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、リポソームベクター、およびそれらの組合せからなる群から選択される、ベクター。
【００８３】
段落［００８０」に記載のベクターであって、前記ベクターが、複製欠損アデノウイルスを含み、前記アデノウイルスが、プロモーターに作動可能に連結され、アデノウイルスのポリヌクレオチド配列によって挟まれたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【００８４】
段落［００７８］もしくは［００７９］に記載のポリヌクレオチドまたは段落［００８０］〜［００８３］に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた単離細胞または細胞株。
【００８５】
段落［００８４］に記載の単離細胞または細胞株であって、真核細胞である、単離細胞または細胞株。
【００８６】
段落［００８４］に記載の単離細胞または細胞株であって、ヒト細胞である、単離細胞または細胞株。
【００８７】
段落［００８４］に記載の単離細胞または細胞株であって、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、単離細胞または細胞株。
【００８８】
リガンド結合ポリペプチドを作製する方法であって、ポリヌクレオチドによってコードされたリガンド結合ポリペプチドまたはリガンド結合分子が発現される条件下で、段落［００８４］〜［００８７］の何れか１つに記載の細胞を増殖させることを含む方法。
【００８９】
段落［００８８］に記載の方法であって、細胞または細胞の増殖培地からリガンド結合ポリペプチドまたはリガンド結合分子を精製または単離することをさらに含む、方法。
【００９０】
段落［００４８］〜［００７６］の何れか１つに記載の精製リガンド結合ポリペプチドまたはリガンド結合分子と、薬学的に許容される希釈剤、補助剤、賦形剤、または担体とを含む組成物。
【００９１】
段落［００７８］〜［００８３］の何れか１つに記載のポリペプチドまたはベクターと、薬学的に許容される希釈剤、補助剤、賦形剤、または担体とを含む組成物。
【００９２】
段落［００９０］または段落［００９１］に記載の組成物であって、局所投与用に製剤化されている、組成物。
【００９３】
段落［００９２］に記載の組成物であって、固体、ペースト、軟膏、ゲル、液体、エアロゾル、ミスト、ポリマー、フィルム、エマルジョン、または懸濁液の形態にある、組成物。
【００９４】
段落［００９０］または段落［００９１］に記載の組成物であって、硝子体内投与用に製剤化されている、組成物。
【００９５】
被験体の血管新生を阻害する方法であって、段落［００９０］〜［００９４］の何れか１つに記載の組成物を、被験体の血管新生を阻害するために有効な量で被験体に投与することを含む方法。
【００９６】
被験体の網膜血管新生を阻害する方法であって、段落［００９０］〜［００９４］の何れか１つに記載の組成物を、被験体の網膜血管新生を阻害するために有効な量で被験体に投与することを含む方法。
【００９７】
網膜血管新生に関連した眼障害を有する被験体を治療する方法であって、段落［００９０］〜［００９５］の何れか１つに記載の組成物を、被験体の網膜血管新生を阻害するために有効な量で被験体に投与することを含む方法。
【００９８】
それを必要とする被験体における、網膜血管新生または腫瘍血管新生などの血管新生を阻害するための、段落［００９０］〜［００９４］の何れか１つに記載の組成物の使用。
【００９９】
段落［００９６］〜［００９８］の何れか１つに記載の方法または使用であって、組成物が被験体の眼に局所投与される、方法または使用。
【０１００】
段落［００９９］に記載の方法または使用であって、組成物が硝子体内注射によって投与される、方法または使用。
【０１０１】
段落［００９９］に記載の方法または使用であって、組成物が局所投与によって投与される、方法または使用。
【０１０２】
段落［００９６］〜［００１０１］の何れか１つに記載の方法または使用であって、被験体の眼のＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄが、眼の細胞または眼の脈管に発現したＶＥＧＦＲ−２および／もしくはＶＥＧＦＲ−３に結合することまたはそれを刺激することを阻害するために有効な量で、組成物が投与される、方法または使用。
【０１０３】
段落［００９７］または［００９８］の方法または使用であって、眼障害が、黄斑変性症、糖尿病性網膜症、および黄斑性毛細血管拡張症からなる群から選択される、方法または使用。
【０１０４】
段落［００９６］〜［００１０３］の何れか１つに記載の方法または使用であって、被験体に抗生物質を投与することをさらに含む、方法または使用。
【０１０５】
段落［００１０４］に記載の方法であって、抗生物質が、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、テイコプラニン、バンコマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロザシリン、ジクロキサシリン、フルコザシリン、メズロシリン、ナフシリン、ペニシリン、ピペラシリン、チカルシリン、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、マフェニド、スルファセタミド、スルファメチゾール、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム、コトリモキサゾール、デメクロサイクリン、ソキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、およびテトラサイクリンからなる群から選択される、方法。
【０１０６】
段落［００９５］または［００９８］に記載の方法または使用であって、被験体が腫瘍と診断されており、かつ組成物が腫瘍の血管新生を阻害するために有効な量で投与される、方法または使用。
【０１０７】
段落［００１０６］に記載の方法または使用であって、腫瘍または腫瘍が外科的に摘出された器官もしくは組織に、組成物が局所投与される、方法または使用。
【０１０８】
段落［００１０６］に記載の方法または使用であって、被験体の腫瘍のＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄが、腫瘍細胞に発現されたＶＥＧＦＲ−２および／またはＶＥＧＦＲ−３に結合することまたはそれを刺激することを阻害するために有効な量で、組成物が投与される、方法または使用。
【０１０９】
本発明のこの概要は、限定することまたは包括することを意図するものではなく、さらなる実施形態が、実施例を含む図面および詳細な説明に記載される。そのような実施形態はすべて本発明の態様である。さらに、簡潔さのために、複数の実施形態に適用可能な種々の詳細が、すべての実施形態について繰り返されているわけではない。本明細書に記載する実施形態の組合せおよび再編成を反映する変更形態は、本発明の態様として意図されるものである。前述のものに加えて、本発明は、上記に具体的に述べた変更形態よりも任意の点で範囲が狭くなっている、本発明のすべての実施形態を、さらなる態様として含む。例えば、属または範囲として記載される態様について、すべての亜属、部分範囲、または種が、本発明の実施形態として具体的に企図される。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１Ａは、一過性のＣＨＯ発現により産生されるＶＧＸ−３００およびＶＧＸ−３０１−ΔＮ２のＰＫプロファイルを示す図である。図１Ｂは、一過性のＨＥＫ発現により産生されるＶＧＸ−３００およびＶＧＸ−３０１−ΔＮ２のＰＫプロファイルを示す図である。
【図２】図２は、ＶＧＸ−３００およびＶＧＸ−３０１−ΔＮ２は両方とも、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄの両方に特異的に結合することを実証する図である。
【図３】図３は、ＶＧＸ−３００が、ａ）ＶＥＧＦＲ−２およびｂ）ＶＥＧＦＲ−３のＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄ結合および架橋を遮断することを示す図である。
【図４】図４は、ＶＧＸ−３００およびＶＧＸ−３００−Ｎ２が、細胞ベースのＢａ／Ｆ３アッセイにおいて、ＶＥＧＦＲ−３のａ）ＶＥＧＦ−Ｃおよびｂ）ＶＥＧＦ−Ｄ結合および架橋を遮断することを示す図である。データポイントは、ｎ≧２の平均±ＳＤを表す。
【図５】図５は、硝子体内投与後のウサギにおける薬物動態および眼の生体内分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１１１】
本発明は、ＥＣＤのＮグリカン領域に１つまたは複数の改変を有するヒトＶＥＧＦＲ−３のＥＣＤのフラグメントが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ヒトＶＥＧＦ−ＣおよびヒトＶＥＧＦ−Ｄに結合し中和することができ、また加齢黄斑変性症の動物モデルにおいて、脈管発生を阻害することができることを実証する研究に部分的に基づいている。
【０１１２】
増殖因子受容体型チロシンキナーゼは、一般に、３つの主要なドメイン、すなわち、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。ＥＣＤはリガンドに結合し、膜貫通ドメインは細胞膜に受容体を繋留し、細胞内ドメインは１つまたは複数のチロシンキナーゼ酵素ドメインを有し、下流のシグナル伝達分子と相互作用する。血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）は、そのＥＣＤを介してそのリガンドに結合するが、ＥＣＤは複数の免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｇ様ドメイン）で構成される。Ｉｇ様ドメインは、本明細書では、「Ｄ＃」という名称を用いて特定される。例えば、「Ｄ１」は、特定の受容体のＥＣＤの第１のＩｇ様ドメインを指す。「Ｄ１〜３」は、特定のリガンド結合分子の第１の３つのＩｇ様ドメインを少なくとも含有し、かつドメイン１および２ならびに２および３の間の介在配列を含有するコンストラクトを指す。
【０１１３】
リガンド（増殖因子）結合にＶＥＧＦＲの完全なＥＣＤは必要ではない。ＶＥＧＦＲ−３のＥＣＤは、６つのインタクトなＩｇ様ドメインおよび１つの切断されたＩｇ様ドメインを有する−−ＶＥＧＦＲ−３のＤ５は、ジスルフィド連結サブユニットに翻訳後切断され、ＶＥＧＦＲ−３を離れる。Ｖｅｉｋｋｏｌａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：２０３−２１２（２０００）。一部の実施形態では、このファミリーについて、第１の３つのＩｇ様ドメインを少なくとも含む受容体フラグメントがリガンドに結合するために十分である。ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄに結合し、それによってＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄの活性またはＶＥＧＦＲ−３を介するシグナル伝達を阻害することができる可溶性受容体も、国際公開第２０００／０２３５６５号パンフレット、国際公開第２０００／０２１５６０号パンフレット、国際公開第２００２／０６０９５０号パンフレット、および国際公開第２００５／０８７８０８号パンフレットに開示されており、これらの開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。ΔＮ２シークオンの変化で改変された、また任意選択で本明細書に記載の他の改変を有するこれらの可溶性受容体は、本発明の態様として企図される。
【０１１４】
表１に、ヒトＶＥＧＦＲ−３について、Ｉｇ様ドメインのおよその境界を規定する。選ばれた境界を用いてリガンド結合分子を形成させることができ、そのため、選ばれた境界は得られるコンストラクトの結合特性に影響を及ぼし得るので、これらの境界は重要である。
【０１１５】
2019023198.tif 000003
【０１１６】
完全なＥＣＤは、配列番号２のおよそ位置７７５にまで及ぶ。
【０１１７】
ヒトＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄに対するリガンド結合分子として使用するための可溶性受容体コンストラクトは、好ましくは、表１に記載するＶＥＧＦＲ−３の少なくとも１つから７つまでのＩｇ様ドメインを含む。リガンド結合分子は、任意選択で、最もＮ末端に位置したＩｇ様ドメインの前の配列を含み、任意選択で、最もＣ末端にあるＩｇ様ドメインの後の配列を含み、任意選択で、Ｉｇ様ドメイン間の配列も含むことになる。例えば、１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、または欠失を有する変更形態もまた企図される。一部の実施形態では、リガンド結合分子は、ヒトＶＥＧＦＲ−３の第１の３つのＩｇ様ドメインを少なくとも含む、ヒトＶＥＧＦＲ−３のフラグメントを含む。
【０１１８】
一部の実施形態では、リガンド結合分子は、ヒトＶＥＧＦＲ−３  ＥＣＤの一部を含むポリペプチドであり、この一部は、ヒトＶＥＧＦ−ＣおよびヒトＶＥＧＦ−Ｄの一方または両方に結合し、ＶＥＧＦＲ−３  ＥＣＤの第１、第２、および第３のＩｇ様ドメインを少なくとも含み、ＶＥＧＦＲ−３のＥＣＤフラグメントのアミノ酸配列は、野生型ＶＥＧＦＲ−３の第２の推定上のＮ連結糖鎖付加シークオンを排除するように野生型ＶＥＧＦＲ−３から改変されており、またこのポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ−３  Ｉｇ様ドメイン４〜７、ならびに好ましくはすべての膜貫通ドメインおよび好ましくすべての細胞内ドメインを欠失している。
【０１１９】
一部の実施形態では、リガンド結合分子は、ヒトＶＥＧＦＲ−３ポリペプチド（配列番号２）に対してアミノ酸配列が類似もしくは同一のポリペプチドまたはそのフラグメントを含むが、配列番号２に示すヒトＶＥＧＦＲ−３の位置１０４〜１０６に対応するリガンド結合分子の位置はＮ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致せず、またこのリガンド結合分子は、ヒトＶＥＧＦ−ＣおよびヒトＶＥＧＦ−Ｄからなる群から選択される１つまたは複数の増殖因子に結合する。フラグメントは、リガンドに結合するために十分なＶＥＧＦＲ−３配列を最小限含み、また完全な受容体を含むこともある。ＥＣＤフラグメントが好ましい。好ましいポリペプチドは、そのリガンド結合フラグメントに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する。より類似した、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％のフラグメントは、高度に好ましい。３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、および７５％のフラグメントも企図される。あるいは、類似のポリペプチドに属する種類は、ＶＥＧＦＲ−３受容体をコードするｃＤＮＡ配列に対応するヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイズするコード化ポリヌクレオチドの能力により規定することができる。
【０１２０】
「同一性」という用語は、当技術分野で公知のように、配列比較によって判定されるような、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。当技術分野では、「同一性」はまた、任意選択で、２つ以上のヌクレオチド配列または２つ以上のアミノ酸配列の文字列間のマッチによって判定される、核酸分子配列またはポリペプチド配列の配列関連性度を意味する。「同一性」は、特にコンピュータープログラムの数学モデル（すなわち、「アルゴリズム」）によって処理される、ギャップアライメント（もしあれば）と共に２つ以上の配列のうちの小さい配列間の同一マッチのパーセントを評価するものである。本発明のパーセント同一性を判定するための適切なアルゴリズムとしては、最も一般的で容認されているデフォルトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮが挙げられる。
【０１２１】
リガンド結合分子はまた、ＶＥＧＦＲ−３のリガンド結合フラグメントをコードする、配列番号１のフラグメントに少なくとも８０％同一である核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を有するが、ＶＥＧＦＲ−３のコード化リガンド結合フラグメントの位置１０４〜１０６に対応するリガンド結合分子の位置が、Ｎ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しないものとして記載されることもある。より類似した、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％である核酸フラグメントが高度に好ましい。３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、および７５％であるフラグメントも企図される。例えば、好ましいリガンド結合分子は、ヒトＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはヒトＶＥＧＦ−Ｄに結合するアミノ酸配列であって、本明細書で論じられる中等度または高度ストリンジェントな条件下で配列番号１の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１２２】
一部の実施形態では、リガンド結合分子は、配列番号２の位置１〜２２６または２５〜２２６、配列番号２の位置１〜２２９または２５〜２２９、および配列番号２の位置１〜３２９または２５〜２２９からなる群から選択される、ヒトＶＥＧＦＲ−３（配列番号２）のフラグメントを含むが、ＶＥＧＦＲ−３のコード化リガンド結合フラグメントの位置１０４〜１０６が、Ｎ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しないポリペプチドを含む。一部の実施形態では、リガンド結合分子は、配列番号２の位置４７〜２２４、配列番号２の位置４７〜２２５、配列番号２の位置４７〜２２６、配列番号２の位置４７〜２２７、配列番号２の位置４７〜２２８、配列番号２の位置４７〜２２９、配列番号２の位置４７〜２３０、配列番号２の位置４７〜２３１、配列番号２の位置４７〜２３２、配列番号２の位置４７〜２３６、配列番号２の位置４７〜２４０、および配列番号２の位置４７〜２４５からなる群から選択される、ヒトＶＥＧＦＲ−３（配列番号２）のフラグメントを含むが、ＶＥＧＦＲ−３のコード化リガンド結合フラグメントの位置１０４〜１０６が、Ｎ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しないポリペプチドである。一部の実施形態では、リガンド結合分子は、配列番号２の位置４７〜３１４、配列番号２の位置４７〜２１０、および配列番号２の位置４７〜２４７からなる群から選択される、ヒトＶＥＧＦＲ−３（配列番号２）のフラグメントを含むが、ＶＥＧＦＲ−３のコード化リガンド結合フラグメントの位置１０４〜１０６が、Ｎ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しないポリペプチドである。
【０１２３】
リガンド結合分子はまた、配列番号３に示すアミノ酸配列に類似または同一のアミノ酸配列を有するものとして記載することができる。好ましいポリペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるが、配列番号３に示すポリペプチドの位置８０〜８２がＮ−Ｘ−ＳにもＮ−Ｘ−Ｔにも一致しないアミノ酸配列を有し、このリガンド結合分子は、ヒトＶＥＧＦ−ＣおよびヒトＶＥＧＦ−Ｄからなる群から選択される１つまたは複数の増殖因子に結合する。より類似した、例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％のポリペプチドが、高度に好ましい。３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、および７５％であるフラグメントも企図される。あるいは、類似のポリペプチドに属する種類は、ＶＥＧＦＲ−３受容体をコードするｃＤＮＡ配列に対応するヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイズするコード化ポリヌクレオチドの能力により規定することができる。
【０１２４】
一部の実施形態では、リガンド結合分子は、配列番号３のアミノ酸２２〜２９０を含むアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リガンド結合分子は、配列番号３のアミノ酸２３〜２９０を含むアミノ酸配列を含む。一部の態様では、リガンド結合分子は、配列番号３のアミノ酸２２〜５３７、または配列番号３のアミノ酸２３〜５３７、または配列番号３のアミノ酸１〜５３７を含む。
【０１２５】
本明細書で使用する「成分ドメイン」という用語は、受容体タンパク質の細胞外部分内のタンパク質ドメインに由来するか、またはそれに基づくリガンド結合分子内のドメインを指す。例えば、ＶＥＧＦＲ−３（Ｄ１〜Ｄ７）および他のチロシンキナーゼ受容体ファミリーメンバー（例えば、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２など）の各Ｉｇドメインは、成分ドメインを構成する。本明細書における成分ドメインへの言及には、完全な天然野生型ドメインと、インタクトドメインの機能特性を実質的に保持する、その挿入、欠失、および／または置換変異体の両方が含まれる。野生型ドメインと実質的に同じ機能特性を保持する、上記ドメイン（例えば、Ｉｇドメイン）の数多くの変異体が得られ得ることは、当業者には容易に明らかであろう。
【０１２６】
リガンド結合分子が由来し得る増殖因子受容体には、スプライスバリアントおよび天然対立遺伝子変異体が含まれる。対立遺伝子変異体は当技術分野で周知であり、対立遺伝子形態、または１つもしくは複数のヌクレオチドの置換、欠失、もしくは付加を含むが、コード化ポリペプチドの実質的な機能変化をもたらさないアミノ酸配列を表す。ＶＥＧＦＲ−３の例示的な対立遺伝子変異体は、文献、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ３５９１６に報告されており、ＥＣＤ内の位置１４９、３７８、４９４、５２７、および６４１を含む。ポリヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発または特異的な酵素的切断および連結を含む標準的な方法を用いて、そのようなポリヌクレオチドを容易に作製することができる。同様に、結合活性を保持するペプチドミメティック化合物または１つもしくは複数のアミノ酸残基が非天然アミノ酸もしくはアミノ酸類似体に置換されている化合物の使用が企図される。好ましくは、アミノ酸置換が用いられる場合、置換は保存的である、すなわち、アミノ酸は、類似のサイズでかつ類似の電荷特性を有するアミノ酸に置換される。本明細書で使用する場合、「保存的置換」という用語は、別の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換を表す。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシン、もしくはメチオニンなどのある疎水性残基の別の疎水性残基への置換、またはリジンのアルギニンへの置換、アスパラギン酸のグルタミン酸への置換、もしくはアスパラギンのグルタミンへの置換等のある極性残基の別の極性残基への置換が挙げられる。互いに置換され得る中性親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、およびスレオニンが挙げられる。「保存的置換」という用語はまた、置換されていないアミノ酸の代わりの置換されたアミノ酸の使用を含む。
【０１２７】
あるいは、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ：ＮＹ，ｐｐ．７１−７７（１９７５））に記載されるように、保存的アミノ酸は、以下に示すようにグループ化することができる：
非極性（疎水性）
Ａ．脂肪族：Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、
Ｂ．芳香族：Ｆ、Ｗ、
Ｃ．イオウ含有：Ｍ、
Ｄ．ボーダーライン：Ｇ。
無電荷極性
Ａ．ヒドロキシル：Ｓ、Ｔ、Ｙ、
Ｂ．アミド：Ｎ、Ｑ、
Ｃ．スルフヒドリル：Ｃ、
Ｄ．ボーダーライン：Ｇ。
正電荷（塩基性）：Ｋ、Ｒ、Ｈ。
負電荷（酸性）：Ｄ、Ｅ。
【０１２８】
疑問を回避するために、「成分ドメイン」は、配列番号２の位置１０４〜１０６のＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔシークオンモチーフが、例えば置換により突然変異されている、ＶＥＧＦＲ−３のＤ１に対応するドメインを含む。
【０１２９】
リガンド結合分子が複数の成分ドメイン、例えばＶＥＧＦＲ−３の成分ドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３を含む実施形態では、成分ドメインは、互いに直接結合していても、または１つまたは複数のスペーサーを介して結合していてもよい。一般に、「スペーサー」という用語は、共有結合を形成する１つまたは複数の成分ドメイン間に挿入され得る１つまたは複数の分子、例えば、核酸もしくはアミノ酸、またはポリエチレングリコールもしくはジスルフィド架橋などの非ペプチド部分を意味する。スペーサー配列を用いて、操作を容易にするための、成分間の目的とする望ましい部位を提供することができる。また、スペーサーを提供して、宿主細胞からのリガンド結合ポリペプチドの発現を増強し、成分または１群の成分が、その／それらの最適三次構造を取り得るように、かつ／またはその／それらの標的分子と適切に相互作用し得るように立体障害を低減することができる。スペーサーおよび望ましいスペーサーを特定する方法については、例えば、参照により本明細書に具体的に組み込まれるＧｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １５：８７１−８７９を参照されたい。スペーサー配列は、受容体成分に天然に結合している１つまたは複数のアミノ酸を含んでもよく、あるいはリガンド結合ポリペプチドの発現を増強するために、目的の特別に望ましい部位を提供するために、成分ドメインが最適な三次構造を形成できるにするために、かつ／または成分または１群の成分とその／それらの標的分子との相互作用を増強するために用いられる追加の配列であってもよい。一実施形態では、スペーサーは、アミノ酸長が１〜１００、好ましくはアミノ酸長が１〜５０の間である、１つまたは複数の成分間の１つまたは複数のペプチド配列を含む。好ましい実施形態では、２つの成分ドメイン間のスペーサーは、野生型受容体中の受容体成分に天然に結合しているアミノ酸から実質的になる。例えばＶＥＧＦＲ−３のＤ１、Ｄ２、およびＤ３など、天然受容体中で互いに隣接している、同じ受容体からの複数の成分ドメインを含むリガンド結合分子の場合、一実施形態では、これらのドメインは、天然のアミノ酸連結配列に対応するスペーサーを用いて、互いに（例えば、Ｄ１とＤ２ならびにＤ２とＤ３）結合している。
【０１３０】
一部の変更形態では、各リガンド結合ポリペプチドは、免疫グロブリン定常領域などの融合相手タンパク質との融合体として発現され、異種融合相手が連結してリガンド結合分子が形成される。
【０１３１】
多量体、多量体化成分、融合相手、およびリンカー
融合相手は、リガンド結合分子の機能性を増強する任意の異種成分とすることができる。したがって、例えば、融合相手は、リガンド結合ポリペプチドの溶解性の増大、クリアランスの調節、特定の細胞型または組織型のターゲティングの促進、生物活性の向上、産生および／または回収の補助、薬理学的特性の向上、または薬物動態学（ＰＫ）プロファイルの向上を可能にする。ＰＫプロファイルの向上に関しては、例えば、リガンド結合分子の血清半減期、組織浸透性、免疫原性の欠如、または安定性を向上させることによって達成することができる。好ましい実施形態では、融合相手は、多量体化成分、血清タンパク質、または血清タンパク質に結合することができる分子からなる群から選択される。
【０１３２】
融合相手が血清タンパク質またはそのフラグメントである場合、それは、α−１−ミクログロブリン、ＡＧＰ−１、オロソムコイド、α−１−酸性糖タンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、ヘモペキシン、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）、トランスフェリン、フェリチン、アファミン、ハプトグロビン、α−フェトプロテイン  チログロブリン、α−２−ＨＳ−糖タンパク質、β−２−糖タンパク質、ヒアルロナン結合タンパク質、シンタキシン、Ｃ１Ｒ、Ｃ１ｑａ鎖、ガレクチン３−Ｍａｃ２結合タンパク質、フィブリノーゲン、多量体Ｉｇ受容体（ＰＩＧＲ）、α−２−マクログロブリン、尿素輸送タンパク質、ハプトグロビン、ＩＧＦＢＰ、マクロファージスカベンジャー受容体、フィブロネクチン、ギアンチン（ｇｉａｎｔｉｎ）、Ｆｃ、α−１−アンチキロモトリプシン（ａｎｔｉｃｈｙｒｏｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、α−１−アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−１、アポリポタンパク質Ｂ、β−２−ミクログロブリン、セルロプラスミン、補体成分Ｃ３またはＣ４、ＣＩエステラーゼ阻害因子、Ｃ反応性タンパク質、シスタチンＣ、およびプロテインＣからなる群から選択される。より具体的な実施形態では、融合相手は、α−１−ミクログロブリン、ＡＧＰ−１、オロソムコイド、α−１−酸性糖タンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、ヘモペキシン、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）、アファミン、およびハプトグロビンからなる群から選択される。所望に応じて、融合相手成分を含めると、本発明の融合ポリペプチドの血清半減期を延長させることができる。例えば、血清アルブミン融合ポリペプチドの例については、参照により本明細書にその内容全体が具体的に組み込まれる米国特許第６，４２３，５１２号明細書、同５，８７６，９６９号明細書、同６，５９３，２９５号明細書、および同６，５４８，６５３号明細書を参照されたい。ｈＳＡは、体内全体にわたって、特に腸管および血液成分に広範囲に分布し、モル浸透圧濃度および血漿量の維持に重要な役割を果たしている。それは、肝臓で徐々にクリアランスされ、典型的には、ヒトで１４〜２０日のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する（Ｗａｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ａｌｂｕｍｉｎ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ；Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；ｐｐ．２５５−２７５）。
【０１３３】
融合相手が血清タンパク質に結合することができる分子である場合、この分子は、合成小分子、脂質またはリポソーム、アプトマーなどの合成核酸を含む核酸、ペプチド、またはオリゴ糖とすることができる。この分子はさらに、例えばＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２、ＦｃγＲ３、多量体Ｉｇ受容体（ＰＩＧＲ）、ＳｃＦｖ、および血清タンパク質に特異的な他の抗体フラグメントなどのタンパク質とすることができる。
【０１３４】
融合相手が多量体化成分である場合、それは、第１のリガンド結合分子を別のリガンド結合分子または別のリガンド結合分子の別の多量体化成分と作動可能に連結させて、より高次の構造、例えば、二量体、三量体等を形成させることができる任意の天然または合成の配列または化合物である。適切な多量体化成分としては、ｃ−ｊｕｎもしくはｃ−ｆｏｓに由来するロイシンジッパードメインを含むロイシンジッパー；κまたはλ軽鎖の定常領域に由来する配列；ヘリックス・ループ・ヘリックスモチーフなどの合成配列（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３２：４５−４９）、コイル−コイルモチーフ等、または当技術分野で公知の他の一般に容認されている多量体化ドメインを挙げることができる。一部の実施形態では、融合成分は、例えばヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡからの免疫グロブリン由来ドメインを含む。
【０１３５】
一態様では、本明細書に記載するリガンド結合分子は多量体として生成される。多量体の各サブユニットは、リガンド結合分子、例えばリガンド結合ポリペプチドを含むかまたはそれからなる。これらの多量体は、ホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体の可溶性受容体であり得、多量体受容体は９個以下のサブユニット、好ましくは６個以下のサブユニット、さらに好ましくは３個以下のサブユニット、および最も好ましくは２つのサブユニットからなる。好ましくは、これらの多量体可溶性受容体は、リガンド結合分子のホモ二量体である。
【０１３６】
多量体における少なくとも２個のサブユニットは、互いに作動可能に連結される。「作動可能に連結される」という用語は、サブユニットが共有結合および／または非共有結合を通して結合していることを示す。サブユニットは、架橋試薬またはポリペプチドもしくはペプチドリンカーなどのリンカーを介してなど、任意の適切な手段によって共有結合させることができる。別の実施形態では、サブユニットは非共有結合を介して連結される。一部の変更形態では、２個のサブユニット（例えば、２つのリガンド結合ポリペプチド）は、直接または「ペプチドリンカー」を介してペプチド結合により結合している。サブユニット間に導入されるペプチドリンカーは、長さが１〜３個のアミノ酸残基（好ましくは、グリシン、セリン、スレオニン、もしくはアラニンなどの小さなアミノ酸からなる）ほど短くてもよく、またはより長く、例えば長さが１３、１５、または１６個のアミノ酸残基であってもよい。好ましくは、ペプチドリンカーは、免疫学的に不活性なペプチドである。前記リンカーは、配列Ｅ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）のトリペプチド、例えば、Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ（配列番号７）からなる１３アミノ酸リンカー配列、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号８）からなる１５アミノ酸リンカー配列、ＧＧＳＧＧ  ＳＧＧＧＧ  ＳＧＧＧＧ  Ｓ（配列番号９）からなる１６アミノ酸リンカー配列、またはヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のヒンジ領域とすることができる。一部の変更形態では、２個のサブユニットは、例えばジスルフィド結合または他の結合によって互いに連結される２つの別個のポリペプチド鎖を含むリガンド結合ポリペプチドである。
【０１３７】
一部の実施形態では、リガンド結合分子は、それぞれがリガンド結合ポリペプチドを含む少なくとも２個のサブユニットを含む融合タンパク質の形態をしている。このようにして、融合タンパク質は、単一翻訳領域としてそれをコードする核酸分子の宿主細胞における直接発現により、組換え的に生成させることができる。
【０１３８】
一部の変更形態では、リガンド結合ポリペプチドは、免疫グロブリン定常領域などの異種タンパク質融合相手との融合体として発現され、異種融合相手が連結して多量体リガンド結合分子が形成される。一実施形態では、サブユニットは、多量体化成分に作動可能に連結される。多量体化成分には、２個以上のサブユニットを作動可能に連結して高次構造、例えば二量体、三量体等を形成させることができる任意の天然または合成の配列が含まれる。多量体化成分は、サブユニットと「直接」相互作用することによって２個以上のサブユニットを作動可能に連結することができる。あるいは、あるサブユニットに対する多量体化成分は、別のサブユニットに対する別の多量体化成分と相互作用してこれらのサブユニットを作動可能に連結することができる。
【０１３９】
一実施形態では、サブユニットは、サブユニットの多量体化を提供する追加のアミノ酸ドメインに作動可能に連結される（具体的には、追加のドメインは、サブユニットの二量体化を提供する任意の機能領域を含む）。「作動可能に連結される」という用語は、ＶＥＧＦＲ−３ベースのサブユニットおよび追加のアミノ酸ドメインが、ペプチド結合により直接または「ペプチドリンカー」（本明細書に規定する）を介して結合しており、かつＶＥＧＦＲ−３ベースのサブユニットがリガンド結合特性を保持していることを指す。追加のアミノ酸ドメインは、ＶＥＧＦＲ−３サブユニット配列の上流（Ｎ末端）または下流（Ｃ末端）に位置することができる。好ましくは、それは下流に位置する（すなわち、第１の免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｇ−Ｉドメイン）から離れて）。このようにして、融合タンパク質は、それをコードする核酸分子の宿主細胞における直接発現によって、組換え的に生成させることができる。そのような実施形態では、本明細書に記載するリガンド結合分子は、リガンド結合ポリペプチドと、別の融合タンパク質に存在する多量体化成分に相互作用して二量体などのより高次の構造を形成させることができる多量体化成分とを含有する融合タンパク質の多量体である。これらのタイプの融合タンパク質は、ＶＥＧＦＲ−３サブユニット配列（すなわち、リガンド結合ポリペプチド）を、二量体、三量体等の形成を可能にする、他のタンパク質から単離されたドメインに作動可能に連結することにより調製することができる。本明細書に記載するリガンドポリペプチドの多量体化を可能にするタンパク質配列の例としては、以下に限定されるものではないが、免疫グロブリン、ｈＣＧ（国際公開第９７／３０１６１号パンフレット）、コラーゲンＸ（国際公開第０４／３３４８６号パンフレット）、Ｃ４ＢＰ（国際公開第０４／２０６３９号パンフレット）、Ｅｒｂタンパク質（国際公開第９８／０２５４０号パンフレット）、またはコイルドコイルペプチド（国際公開第０１／００８１４号パンフレット）などのタンパク質から単離されたドメインが挙げられる。これらの開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
多量体化成分は、例えば、（ｉ）１〜約５００アミノ酸長の間のアミノ酸配列、（ｉｉ）ロイシンジッパー、（ｉｉｉ）ヘリックスループモチーフ、および（ｉｖ）コイル−コイルモチーフから選択することができる。多量体化成分が、１〜約５００アミノ酸長の間のアミノ酸配列を含む場合、この配列は、１つまたは複数のシステイン残基を有する多量体化成分を含む別の融合ポリペプチド上の対応するシステイン残基とジスルフィド結合を形成することができる１つまたは複数のシステイン残基を含有することができる。
【０１４１】
特定の態様では、多量体は、多量体化成分としても作用し得る、融合相手としての免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの一部に作動可能に連結されているリガンド結合ポリペプチドの二量体である。「作動可能に連結される」という用語は、リガンド結合ポリペプチドおよび免疫グロブリンまたはその一部が、ペプチド結合によって直接または「ペプチドリンカー」（本明細書に規定される）を介して結合しており、かつリガンド結合ポリペプチドのリガンド結合特性が保持されていることを示す。この実施形態では、リガンド結合ポリペプチドは、免疫グロブリンの全部または一部、具体的にはヒト免疫グロブリン、さらに具体的にはヒト免疫グロブリンのＦｃ部分に作動可能に連結されている。典型的には、ヒト免疫グロブリンのＦｃ部分は、２つの定常領域ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）およびヒンジ領域を含有するが、可変領域を欠失している（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，０１８，０２６号明細書および同５，７５０，３７５号明細書を参照のこと）免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを含む免疫グロブリンの主要なクラス、ならびに任意のサブクラスまたはアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４；ＩｇＡ−ＩおよびＩｇＡ−２の何れかから選択することができる。一実施形態では、Ｆｃ部分は、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分であり、これは溶液中で安定であり、かつ補体活性化活性がほとんどまたはまったくない。別の実施形態では、Ｆｃ部分はヒトＩｇＧｌのＦｃ部分である。Ｆｃ部分は、補体結合、Ｆｃ受容体への結合等の望ましくない活性を防止するために、突然変異させることができる。免疫グロブリンに由来するアミノ酸配列は、リガンド結合ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に連結することができる。そのような融合タンパク質は、ＶＥＧＦＲ−３サブユニット：Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡを細胞にトランスフェクトし、同細胞中で二量体を発現させることにより調製することができる。特定の実施形態では、リガンド結合ポリペプチドは、各単量体サブユニット上で同じである（すなわち、二量体はホモ二量体である）。免疫グロブリン融合タンパク質を作製する方法は、例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、ＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈおよびＡｒｕｆｆｏ（”Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐｐ．１０．１９．１−１０．１９．１１，１９９２）または国際公開第０１／０３７３７号パンフレットに記載されるものなど、当技術分野で周知である。
【０１４２】
あるいは、本発明のリガンド結合ポリペプチドの二量体は、リガンド結合ポリペプチドの一方を免疫グロブリン重鎖の定常領域に作動可能に連結し、他方のリガンド結合ポリペプチドを免疫グロブリン軽鎖の定常領域に作動可能に連結することにより調製することができる。例えば、リガンド結合ポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域に作動可能に連結することができ、もう１つのまたは同じリガンド結合ポリペプチドをＩｇκ軽鎖のＣκ領域に作動可能に連結することができる。一実施形態では、重定常鎖は、ヒトγ４であり、これは、溶液中で安定であり、かつ補体活性化活性がほとんどまたはまったくない。別の実施形態では、重定常鎖はヒトγｌである。重定常鎖は、補体結合、Ｆｃ受容体への結合等の望ましくない活性を防止するために突然変異させることができる。
【０１４３】
また、必要に応じて、本明細書に記載する融合タンパク質は、精製または製造を容易にする任意の機能領域を含むことができる。そのような追加のアミノ酸配列の具体例としては、ＧＳＴ配列またはＨｉｓタグ配列が挙げられる。一部の変更形態では、精製を容易にする領域は、医薬用途用の組成物の製剤のために除去される。
【０１４４】
免疫グロブリンに由来するアミノ酸配列は、リガンド結合ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に連結することができる。免疫グロブリン軽鎖融合タンパク質および免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡをトランスフェクトされた細胞は、それぞれリガンド結合ポリペプチドを含有する重鎖／軽鎖ヘテロ二量体を発現する。両方のリガンド結合ポリペプチドは、有利には、細胞からの分泌を促進するために最初に合成されたときに天然または異種シグナルペプチドを含むが、このシグナルペプチドは、分泌の際に切断される。シグナルペプチドを含む前述の実施形態のいずれについても変更形態が企図される。ヒトＶＥＧＦＲ−３の天然シグナルペプチドは、配列番号２の残基１〜２４を含む。数多くの他のシグナルペプチドタンパク質が文献に教示されている。
【０１４５】
本発明の別の特定の態様では、多量体のリガンド結合ポリペプチドは、非共有結合を介して連結される。サブユニットの非共有結合は、その生物活性（すなわち、ヒトＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄに結合するその能力）に干渉しない任意の適切な手段によって達成することができる。特定の態様では、これらの多量体は、あるリガンド結合ポリペプチドが第１の化合物に作動可能に連結され、別のまたは同じリガンド結合ポリペプチドが、第１の化合物に非共有結合することになる第２の化合物に作動可能に連結されているリガンド結合ポリペプチドの二量体である。そのような化合物の例には、ビオチンおよびアビジンがある。リガンド結合ポリペプチドの二量体は、一方のＶＥＧＦＲ−３サブユニットをビオチンに作動可能に連結し、他方のリガンド結合ポリペプチドをアビジンに連結することにより調製することができる。こうして、ビオチンとアビジンの非共有的相互作用を通して、受容体が形成される。他の例としては、異種二量体のタンパク質性ホルモンのサブユニットが挙げられる。これらの実施形態では、一方のリガンド結合タンパク質をコードするＤＮＡコンストラクトは、ｈＣＧなどの異種二量体のタンパク質性ホルモンのサブユニットをコードするＤＮＡコンストラクトに融合され、他方のリガンド結合タンパク質をコードするＤＮＡコンストラクトは、ｈＣＧなどの異種二量体のタンパク質性ホルモンの他方のサブユニットをコードするＤＮＡコンストラクトに融合される（米国特許第６，１９３，９７２号明細書に開示されるように）。これらのＤＮＡコンストラクトは、リガンド結合分子の発現をもたらす同じ細胞中に同時発現される。というのは、同時発現される各配列は、発現に際して異種二量体を形成するように対応するホルモンサブユニットを含有するからである。異種二量体のタンパク質性ホルモンに由来するアミノ酸配列は、リガンド結合ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に連結することができる。両方のサブユニットは、有利には、細胞からの分泌を促進するために最初に合成されたときに天然または異種シグナルペプチドを含むが、このシグナルペプチドは、分泌の際に切断される。
【０１４６】
一実施形態では、リガンド結合分子は、非ＶＥＧＦＲ−３由来結合ユニット、すなわちＶＥＧＦＲ−３由来成分ドメインを含有しない結合ユニットに作動可能に連結される。そのようなキメラリガンド結合分子は、例えば、他のチロシンキナーゼ受容体に基づく異種結合ユニットを含むことができる。一実施形態では、そのような異種結合ユニットは、ＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、およびＰＤＧＦ−Ｄから選択される少なくとも１つのリガンドポリペプチドに結合する。好ましい実施形態では、そのような異種結合ユニットは、少なくともＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ）に結合する。
【０１４７】
一実施形態では、そのような異種結合ユニットは、ＶＥＧＦＲ−１もしくはＶＥＧＦＲ−２またはその両方に由来する成分ドメインを含む。キメラリガンド結合分子の形態において、本発明のリガンド結合分子と組み合わせて使用することができる異種結合ユニットの例としては、例えば、国際公開第２０００／７５３１９号パンフレット、国際公開第２００５／０００８９５号パンフレット、および国際公開第２００６／０８８６５０号パンフレットに記載されているＶＥＧＦトラップ分子が挙げられる。好ましい異種結合ユニットは、任意選択で免疫グロブリンのＦｃ部分に融合した、ＶＥＧＦＲ−１（Ｒ１Ｄ２）由来のＩｇドメイン２およびＶＥＧＦＲ−２（Ｒ２Ｄ３）由来のＩｇドメイン３を含む。一実施形態では、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合したＲ１Ｄ２Ｒ２Ｄ３結合ユニットと作動可能に連結された免疫グロブリンのＦｃ部分に連結された本発明のリガンド結合ポリペプチドを含むキメラ分子が想定される。２つの結合ユニットは、２つのＦｃ部分間のジスルフィド結合を介して作動可能に連結される。
【０１４８】
リンカー
ヒトＶＥＧＦＲ−３のＩｇ様ドメインは、互いにまたは他の受容体のＩｇ様ドメインに（ペプチド、ジスルフィド、または他のタイプの共有結合を介して）直接結合することができるが、本明細書に記載するリガンド結合分子は、任意選択で、２つ以上の異なるユニット、例えば、ＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤフラグメントと別のＶＥＧＦＲ３  ＥＣＤフラグメント、またはそれ自体のコピーでも互いに結合させる（１つまたは複数の）リンカーをさらに含む。リンカーはまた、結合ユニットを本明細書に記載する他の置換基に連結することができる。一部の実施形態では、リンカーは、異種ポリペプチドを含む。例えば、一部の実施形態では、リンカーは、結合ユニットを連結して、単一リガンド結合分子として発現され得る単一の連続したペプチドを形成させるペプチドを含む。リンカーは、アレルギー反応を誘導する可能性が少ないように選ぶことができる。多糖または他の部分もまた、結合ユニットを連結してリガンド結合分子を形成させるために用いることができる。
【０１４９】
１つのリガンド結合分子当たり２つ以上のリンカーを用いることができる。リンカーは、所望であればそれらが互いに相互作用して、例えば二量体を形成できるように、またはそれらがリガンドと相互作用できるように、種々のリガンド結合ユニット間の最適な配座（立体障害）自由度を求めて選択することができる。リンカーは、一続きの結合ユニットが直列に連結されるように直鎖状であることも、またはリンカー、例えば分枝状リンカーは、種々の結合ユニットが結合するスキャフォールドとして機能することもある。リンカーはまた、例えばＴａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９６：１７（１９９６）に開示されるように、複数の分枝を有することもある。結合ユニットは、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基、側鎖、化学的に修飾された基、側鎖、または他の手段を介して互いにまたはリンカースキャフォールドに結合させることができる。
【０１５０】
リンカーペプチドは、所望の特性を可能にする配列を有するように設計することができる。例えば、グリシル残基の使用は、比較的大きな配座自由度を可能にするが、プロリンは、逆の効果を示す傾向がある。ペプチドリンカーは、特定の二次構造および三次構造、例えばαヘリックス、βシート、βバレルを実現するように選ぶことができる。四次構造もまた、２つの結合ユニットを非共有的に互いに連結するリンカーを作製するために利用することができる。例えば、疎水性面を有するタンパク質ドメインを各結合ユニットに融合させると、２つの分子の疎水的相互作用間の相互作用を介して２つの結合ユニットの連結が可能になり得る。一部の実施形態では、リンカーは極性相互作用を提供することができる。例えば、プロトオンコプロテインＭｙｃおよびＭａｘのロイシンジッパードメインはそれぞれ用いることができる。Ｌｕｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｏｎｇｏｇｅｎｅ  １８：２９５５−２９６６（１９９９）。一部の実施形態では、リンカーは、塩橋またはジスルフィド結合の形成を可能にする。リンカーは、非天然アミノ酸ならびにポリペプチドに天然には組み込まれていない天然アミノ酸を含むことができる。一部の実施形態では、リンカーは、金属または他のイオンとそれによって連結された複数のペプチドからの種々の残基との間の配位化合物を含む。
【０１５１】
少なくとも１つのアミノ酸残基の直鎖状ペプチドリンカーが企図される。一部の実施形態では、リンカーは１０，０００残基超を有する。一部の実施形態では、リンカーは、１〜１０，０００残基、１〜１０００残基、１〜１００残基、１〜５０残基、または１〜１０残基を有する。一部の実施形態では、直鎖状のペプチドリンカーは、比較的不活性な側鎖を有する残基を含む。ペプチドリンカーアミノ酸残基は、α−カルボキシ基およびα−アミノ基を介して連結される必要は完全にまたは全くない。すなわち、ペプチドは、種々の残基の側鎖基を介して連結され得る。
【０１５２】
リンカーは、それが融合しているポリペプチドが互いにまたは別のポリペプチドと二量体化することができるか否かに影響する可能性がある。リンカーはいくつかの機能に役立つ。細胞膜のおよそ二次元平面に拘束されている天然受容体単量体は、比較的高い局所濃度を有し、共受容体（結合ユニット）のアベイラビリティにおいて、相手を見出す確率が増大している。そのような利点を欠く、溶液中に遊離している受容体は、単量体の有効濃度を増大させるリンカーによって助けられる可能性がある。
【０１５３】
一部の実施形態では、リガンド結合分子は、２種以上のタイプのリンカーを含むことができる。適切なリンカーはまた、上記に論じた化学修飾を含むことができる。
【０１５４】
本明細書に記載するリガンド結合分子は、追加のＮ末端アミノ酸残基、好ましくはメチオニンを含むことができる。実際、発現系および条件に応じて、ポリペプチドは開始メチオニンと共に組換え宿主細胞で発現させることができる。次いで、この追加アミノ酸は、文献（Ｖａｎ  Ｖａｌｋｅｎｂｕｒｇｈ  ＨＡ  ａｎｄ  Ｋａｈｎ  ＲＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２００２）３４４：１８６−９３；Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ  Ａ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）１２：１４７−５９）に開示されている方法に従って、得られた組換えタンパク質中に維持されるか、またはメチオニンアミノペプチダーゼなどのエキソペプチダーゼによって除去され得る。
【０１５５】
置換基および他の化学修飾
本明細書に記載するリガンド結合分子は、任意選択で種々の置換基で化学修飾される。そのような修飾は、好ましくは、増殖因子結合親和性またはリガンド結合分子の特異性を実質的に低下させない。むしろ、化学修飾は、本明細書で論じられるようなさらなる望ましい特性を付与する。化学修飾は、異種ペプチド、多糖、脂質、放射性同位元素、非標準的なアミノ酸残基および核酸、金属キレート、ならびに種々の毒素などのいくつかの異なる形態を取り得る。
【０１５６】
本明細書に記載する受容体フラグメント（または「結合ユニット」もしくは「成分ドメイン」）およびリガンド結合分子は、任意選択で、種々の特性（例えば、溶解性の向上、クリアランスの調節、特定の細胞型または組織型へのターゲティング）を付与するために、異種ポリペプチドなどの異種融合相手に融合される。一部の実施形態では、受容体フラグメントは、ＩｇＧまたは他の免疫グロブリンのＦｃドメインに連結される。一部の実施形態では、受容体フラグメントは、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）に融合される。ＦｃまたはＡＰ融合コンストラクトを作製する方法は、国際公開第０２／０６０９５０号パンフレットに見出される。特定の特性（例えば、半減期、バイオアベイラビリティ、相互作用相手）を有するタンパク質ドメインとリガンド結合ポリペプチドまたは分子を融合させることにより、これらの特性をリガンド結合分子に付与することが可能になる（例えば、分子は、特定の組織分布または特定の生物学的半減期を有するように操作される）。一部の実施形態では、リガンド結合分子は、共受容体およびＶＥＧＦＲフラグメントを含む。
【０１５７】
特定のリガンド結合分子に用いられる特定の融合相手（例えば、異種ポリペプチド）は、ＶＥＧＲ−３フラグメントが二量体化するか否かに影響を及ぼし得るものであり、これにより、次にはリガンド結合が影響され得る。
【０１５８】
ヒトＩｇＧのＦｃ領域などの置換基の場合、融合体は、リガンド結合分子に直接融合されるか、または介在配列によって融合され得る。例えば、ヒトＩｇＧヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域は、Ｆｃ領域に結合することになるリガンド結合分子のＮ末端またはＣ末端の何れかで融合することができる。得られるＦｃ融合コンストラクトは、プロテインＡ親和性カラムによる精製が可能である（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）。Ｆｃ領域に融合したペプチドおよびタンパク質は、融合されていない対応物よりもｉｎ  ｖｉｖｏで実質的に長い半減期を示し得る。Ｆｃ領域への融合により、融合ポリペプチドの二量体化／多量体化が可能になる。Ｆｃ領域は、天然のＦｃ領域であっても、または優れた特性、例えば、治療の質、循環時間、凝集の低下のために改変されていてもよい。
【０１５９】
ポリペプチドは、例えば、糖鎖付加、アミド化、カルボキシル化、もしくはリン酸化によって、または酸付加塩、アミド、エステル、特にＣ末端エステル、およびＮ−アシル誘導体の生成によって改変することができる。ＶＥＧＦＲ−３のＩｇ様ドメインＩ〜ＩＩＩは、５つの推定上のＮ糖鎖付加部位を含む（それぞれ、ＶＥＧＦＲ−３のＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、およびＮ５シークオンまたは領域と本明細書では呼ばれる）。Ｎ１は配列番号２のアミノ酸３３〜３５に対応し；Ｎ２は配列番号２のアミノ酸１０４〜１０６に対応し；Ｎ３は配列番号２のアミノ酸１６６〜１６８に対応し；Ｎ４は配列番号２のアミノ酸２５１〜２５３に対応し、Ｎ５は配列番号２のアミノ酸２９９〜３０１に対応する。一部の実施形態では、本明細書に記載するリガンド結合分子は、分子のＮ２領域に改変を含む。例えば、一部の実施形態では、配列番号２の位置１０４に対応する、リガンド結合分子中のアミノ酸は、欠失し、別のアミノ酸に置換される。保存的置換が好ましい。一部の実施形態では、配列番号２の位置１０４に対応するアミノ酸は、欠失し、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、およびリジンからなる群から選択されるアミノ酸に置換される。さらに他の変更形態では、位置１０６はＮ２シークオンを排除するために置換される。配列番号２のＮ２シークオンが上記のように改変される実施形態では、配列番号２のＮ１、Ｎ３、Ｎ４、およびＮ５のシークオンは改変されていないことが好ましい。
【０１６０】
タンパク質はまた、他の部分と共有結合複合体または非共有結合複合体を形成することにより、ペプチド誘導体を生成するように改変することができる。共有結合複合体は、化学部分を、ポリペプチドのアミノ酸の側鎖上にある官能基またはＮ末端またはＣ末端にある官能基に連結することにより調製することができる。
【０１６１】
ポリペプチドは、以下に限定されるものではないが、放射標識、蛍光標識、酵素（例えば、熱量定量的または蛍光定量的な反応を触媒する）、基質、固体マトリックス、または担体（例えば、ビオチンまたはアビジン）を含むレポーター基にコンジュゲートすることができる。アナログの例は、国際公開第９８／２８６２１号パンフレット、ならびにＯｌｏｆｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１１７０９−１１７１４（１９９８）、米国特許第５，５１２，５４５号明細書および同５，４７４，９８２号明細書；米国特許出願公開第２００２０１６４６８７号明細書および同２００２０１６４７１０号明細書に記載されている。
【０１６２】
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのハロアセテート（および対応するアミン）と反応してカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導体化される。
【０１６３】
ジエチルプロカルボネートがヒスチジル側鎖に比較的特異的であるため、ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０でのジエチルプロカルボネートとの反応によって誘導体化される。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり、この反応は、好ましくは、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中、ｐＨ６．０で行なわれる。
【０１６４】
リジニル残基およびアミノ末端残基は、コハク酸無水物またはカルボン酸無水物と反応する。これらの試剤による誘導体化には、リジニル残基の電荷を反対にする効果がある。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素（Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｉｓｓｕｒｅａ）；２，４−ペンタンジオン；およびグリオキシレートとのトラ
ンスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
【０１６５】
アルギニル残基は、１つまたはいくつかの従来の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化では、グアニジン官能基のｐＫａが高いので、アルカリ条件下で反応を行う必要がある。さらに、これらの試薬は、アルギニンだけでなくリジンのε−アミノ基とも反応し得る。
【０１６６】
チロシル残基それ自体の特異的な修飾が広範囲に研究されており、特に、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の導入に関心がもたれている。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、それぞれＯ−アセチルチロシル類および３−ニトロ誘導体を形成させる。チロシル残基は、ラジオイムノアッセイで使用される標識タンパク質を調製するために、１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてヨウ素化される。
【０１６７】
カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチルカルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ１）との反応によって選択的に修飾される。さらに、アスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。
【０１６８】
二官能基試剤による誘導体化は、水不溶性支持マトリックスにリガンド結合分子を架橋するために有用である。そのような誘導はまた、リガンド結合分子中の隣接した結合エレメントを連結し得る、または異種ペプチド、例えばＦｃフラグメントに結合エレメントを連結し得るリンカーを提供することができる。一般に用いられる架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を生じる。あるいは、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性の水不溶性マトリックス、ならびに参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；および同第４，３３０，４４０号に記載される反応性基材がタンパク質固定化のために用いられる。
【０１６９】
グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基に脱アミド化されることが多い。あるいは、これらの残基は、温和な酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内である。
【０１７０】
他の修飾としては、プロリンおよびリジンの水酸化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン側鎖、アルギニン側鎖、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６，１９８３）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに一部の例では、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。このような誘導体は、リガンド結合分子ポリペプチドがポリマーに連結されている、化学修飾されたポリペプチド組成物である。選択されるポリマーは典型的には水溶性であり、そのためそれが結合しているタンパク質は、生理的環境などの水性環境で沈殿しない。選択されるポリマーは、通常、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒドなどの単一反応基を有するように修飾され、その結果、本方法で提供されるように、重合度が制御され得る。ポリマーは、任意の分子量のものでよく、分枝していても分枝していなくてもよい。ポリマーの混合物は、リガンド結合分子ポリペプチドポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、最終製品製剤の治療用途のために、ポリマーは薬学的に許容される。
【０１７１】
ポリマーはそれぞれ、任意の分子量のものでよく、分枝していても分枝していなくてもよい。ポリマーはそれぞれ、典型的には、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの間の平均分子量を有する（「約」という用語は、水溶性ポリマーの調製では、分子の中には指定の分子量よりも重くなるものも、軽くなるものもあることを示す）。各ポリマーの平均分子量は、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの間、より好ましくは約１２ｋＤａ〜約４０ｋＤａの間、最も好ましくは約２０ｋＤａ〜約３５ｋＤａの間である。
【０１７２】
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、以下に限定されるものではないが、Ｎ連結またはＯ連結の炭水化物、糖、ホスフェート、炭水化物；糖；ホスフェート；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導体化するために用いられているＰＥＧの形態を含む）；モノメトキシ−ポリエチレングリコール；デキストラン（例えば約６ｋＤの低分子デキストランなど）、セルロース；セルロース；他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびポリビニルアルコールが挙げられる。また、共有結合多量体を調製するために用いることができる二官能性架橋分子が、本発明に包含される。
【０１７３】
一般に、化学的誘導体化は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるために用いられる任意の適切な条件下で行うことができる。ポリペプチドの化学誘導体を調製するための方法は、一般に、（ａ）リガンド結合分子が１つまたは複数のポリマー分子に結合するようになる条件下で、ポリペプチドを活性化ポリマー分子（ポリマー分子の反応性エスエルまたはアルデヒド誘導体など）と反応させるステップ、および（ｂ）反応生成物を得るステップを含む。最適な反応条件は、既知パラメーターおよび所望の結果に基づいて決定されることになる。例えば、ポリマー分子：タンパク質の比が大きいほど、結合されるポリマー分子の量は多くなる。一実施形態では、リガンド結合分子ポリペプチド誘導体は、アミノ末端に単一ポリマー分子部分を有することができる。（例えば、米国特許第５，２３４，７８４号明細書を参照のこと）。
【０１７４】
本明細書で使用される特に好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本明細書で使用する場合、ポリエチレングリコールは、モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールなど他のタンパク質を誘導体化するために用いることができるＰＥＧの形態をいずれも包含することを意味する。ＰＥＧは直鎖状または分枝状の中性ポリエーテルであり、広範囲の分子量で入手可能であり、水およびほとんどの有機溶媒に可溶性である。ＰＥＧは、主としてその高い動的鎖可動性および親水性によって、したがって、他のタンパク質またはポリマーの表面に結合した場合、水シェルまたは水和層を形成することによって、水中に存在する場合、他のポリマーまたはペプチドを排除するのに効果的である。ＰＥＧは無毒で非免疫原性であり、体内消費について食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）から承認されている。
【０１７５】
タンパク質または酵素は、ＰＥＧにコンジュゲートされた場合、動物に投与されたときの生物活性、非抗原性、および低下したクリアランス率が実証されている。参照により本明細書に組み込まれる、Ｆ．Ｍ．Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｉｎ  Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ  ｅｄ．，Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１２７−３６，１９９２。これらの現象は、免疫系による認識を防止する、ＰＥＧの排除特性による。さらに、ＰＥＧは、タンパク質吸着の低減および血液適合性の改善のための表面修飾手法で広く用いられている。参照により本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｗ．Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１６：１１６−３０  １９８７；Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ  １２：５００−５０１，１９８８；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｏｌｙ．Ｓｃｉ，Ｐａｒｔ  Ａ  ２９：１７２５−３１，１９９１。ポリウレタンおよびポリスチレンなどの疎水性ポリマー表面は、ＰＥＧ（ＭＷ３，４００）の結合により改変することができ、非血栓形成性表面として用いることができる。表面特性（接触角）は、ＰＥＧの水和作用により親水性表面との一致が高まる可能性がある。より重要なことは、タンパク質（アルブミンおよび他の血漿タンパク質）の吸着が大幅に低減され得、その結果ＰＥＧの高い鎖運動性、水和層、およびタンパク質排除特性が得られる。
【０１７６】
ＰＥＧ（ＭＷ３，４００）は、表面固定化試験、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．２６：７３９−４５，１９９２で最適サイズと判定されたが、一方ＰＥＧ（ＭＷ５，０００）は、タンパク質抗原性の低下の点で最も有益であった。（Ｆ．Ｍ．Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１２７−３６．）
【０１７７】
ペグ化リガンド結合分子を調製するための方法は、一般に、（ａ）リガンド分子が１つまたは複数のＰＥＧ基に結合するようになる条件下で、ポリペプチドをポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エスエルまたはアルデヒド誘導体など）と反応させるステップ、および（ｂ）反応生成物を得るステップを含む。一般に、アシル化のための最適な反応条件は、既知パラメーターおよび所望の結果に基づいて決定されることになる。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きいほど、ポリ−ペグ化生成物のパーセントは多くなる。一部の実施形態では、リガンド結合分子はＮ末端に単一ＰＥＧ部分を有することになる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，２３４，７８４号明細書を参照されたい。一部の実施形態では、本明細書に記載するリガンド結合分子は、任意選択で、分子に結合した少なくとも１つのＰＥＧ部分を含む。例えば、一部の実施形態では、約２０〜４０ｋＤａのＰＥＧは、リガンド結合分子のアミノ末端に結合している。
【０１７８】
本明細書に開示する誘導体化リガンド結合分子は、非誘導体化分子に比較して、追加の活性、生物活性の増強もしくは低下、または半減期の延長もしくは短縮などの他の特性を有することがある。
【０１７９】
リガンド結合分子をコードするポリヌクレオチドおよび発現系
本発明は、本明細書に記載するリガンド結合分子、結合ユニット、およびポリペプチドだけでなく、そのような分子をコードする核酸、そのような分子を含むベクター、およびそのようなベクターを含む宿主細胞も含む。分子、ユニット、ポリペプチド、核酸、ベクター、および宿主細胞の何れかを用いる方法はすべて、本発明の態様と見なされる。
【０１８０】
例示的なヒトＶＥＧＦＲ−３コード配列は、配列番号１に示され、配列番号１のフラグメント（Ｎ２シークオンに改変がある）は、本明細書に記載するリガンド結合ポリペプチドに対するコード配列として企図される。（例えば、ＶＥＧＦＲ−３  ＥＣＤの全部または一部をコードするフラグメントが企図される。）遺伝コードの周知の縮重のため、数多くの等価なコード配列がポリペプチドコード配列について可能であり、そのような等価物はすべて本発明の態様として企図される。
【０１８１】
さらに、上記のように、ＶＥＧＦＲ−３野生型ＥＣＤ由来のアミノ酸配列変更形態がまさに企図されるように、核酸配列変更形態も企図される。核酸配列変更形態は、配列番号１に対するパーセント同一性で特徴づけることができる（例えば、少なくとも８０、８５、９０、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性）。
【０１８２】
ヌクレオチド配列変更形態はまた、好ましいコード配列の相補鎖にハイブリダイズする能力によって特徴づけることができる。核酸分子には、配列番号１に示す核酸分子のＥＣＤコード配列、または配列番号２および３に示す受容体型チロシンキナーゼアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする分子のＥＣＤコード配列、または本明細書に記載する核酸フラグメントのＥＣＤコード配列、または本明細書に記載するポリペプチドをコードする核酸フラグメントのＥＣＤコード配列と、本明細書に規定する中等度または高度ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分子が含まれる。
【０１８３】
「高度ストリンジェント条件」という用語は、配列が高度に相補的であるＤＮＡのハイブリダイゼーションを可能にし、顕著にミスマッチしたＤＮＡのハイブリダイゼーションを排除するように設定される条件を指す。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、主として、温度、イオン強度、およびホルムアミドなどの変性剤濃度により決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての「高度ストリンジェント条件」の例には、６５〜６８℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または４２℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミドがある。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，第４章，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照されたい。非特異的および／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを低減する目的のために、他の試剤をハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液に含ませることができる。例には、他の適切な試剤も用いることができるが、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル−ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）、および硫酸デキストランがある。これらの添加物の濃度および種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を及ぼすことなく変更することができる。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施される。しかしながら、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの割合はｐＨにほとんど依存しない。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第４章，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照されたい。
【０１８４】
ＤＮＡ二本鎖の安定性に影響を及ぼす要因には、塩基組成、長さ、および塩基対ミスマッチ度が含まれる。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変量が適合するように、また異なる配列関連度のＤＮＡがハイブリッド形成可能になるように当業者によって調節することができる。完全にマッチしたＤＮＡ二本鎖の融解温度は、以下の式により推定することができる：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
式中、Ｎは、形成された二本鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーションまたは洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセントである。マッチが不完全なハイブリッド鎖については、１％のミスマッチそれぞれにつき融解温度が約１℃低下する。
【０１８５】
「中等度ストリンジェント条件」という用語は、「高度ストリンジェント条件」下で生じ得るものよりも、塩基対ミスマッチ度が高いＤＮＡ二本鎖が形成し得る条件を指す。典型的な「中等度ストリンジェント条件」の例は、５０〜６５℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または３７〜５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミドである。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中で５０℃の「中等度ストリンジェント」条件では、約２１％のミスマッチが許容される。
【０１８６】
約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブについての１Ｍ  ＮａＣｌ＊中における融解温度の良好な推定値は以下の式から得られる：
Ｔｍ＝ＡＴ塩基対当たり２℃＋Ｇ−Ｃ塩基対当たり４℃
＊６Ｘクエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）中のナトリウムイオン濃度は１Ｍである。Ｓｕｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ，ｐ．６８３，Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｆｏｘ（ｅｄｓ．）（１９８１）を参照されたい。
【０１８７】
オリゴヌクレオチドについての高度ストリンジェント洗浄条件は、通常、６ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、オリゴヌクレオチドのＴｍより０〜５℃低い温度である。
【０１８８】
核酸配列の相違によって、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列に対する、アミノ酸配列の保存的および／または非保存的改変がもたらされ得る。本発明はまた、前述のＤＮＡ配列の何れか１つに対応するか、またはそれとストリンジェント条件下でハイブリダイズする単離および／または精製ＤＮＡも対象とする。
【０１８９】
本明細書に記載するリガンド結合分子または結合ユニットなどの本発明のポリペプチドの全部または一部をコードする核酸分子は、限定されるものではないが、化学合成、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニング、発現ライブラリーのスクリーニング、および／またはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を含む、種々の方法で作製することができる。このようなＤＮＡを単離するために有用なこれらの方法および他の方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．編，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４），およびＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９８７）に示されている。好ましい核酸配列は、ヒト、ラット、およびマウスなどの哺乳動物の配列である。
【０１９０】
核酸分子の化学合成は、Ｅｎｇｅｌｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．，２８：７１６−７３４（１９８９）によって示されるものなど、当技術分野で周知の方法を用いて達成することができる。これらの方法には、とりわけ、核酸合成のホスホトリエステル、ホスホラミダイト、およびＨ−ホスホネートの方法が含まれる。約１００ヌクレオチド長よりも大きい核酸は、各フラグメントが最大約１００ヌクレオチド長であるいくつかのフラグメントとして合成することができる。次いで、以下に記載するように、これらのフラグメントを互いに連結して目的の完全長核酸を形成させる。好ましい方法は、標準ホスホラミダイト化学を用いる、ポリマー支持合成である。
【０１９１】
「ベクター」という用語は、多くの場合、プラスミドまたはウイルスＤＮＡもしくはＲＮＡ系に由来するか、あるいはその形態である、核酸分子の増幅、複製、および／または発現のビヒクルを指し、ここで、プラスミドまたはウイルスＤＮＡもしくはＲＮＡは、細菌、酵母、植物、無脊椎動物、および／または哺乳動物の宿主細胞など選択された宿主細胞中で機能的である。ベクターは、宿主細胞のゲノムＤＮＡとは別個に存続することも、またはゲノムＤＮＡに全体もしくは一部が組み込まれることもある。ベクターは、それが適合するいかなる宿主細胞でも機能的であるように必要なエレメントをすべて含有することになる。そのようなエレメントは以下に示される。
【０１９２】
ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸が単離された場合、それは、適切な宿主細胞中で、遺伝子のコピー数を増加させかつ／もしくはコード化ポリペプチドを発現させるために、ならびに／または標的生物中で細胞を形質転換させるために（ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドを発現させるために）、好ましくは増幅および／または発現ベクターに挿入される。数多くの市販ベクターが適切であるが、「注文仕様の」ベクターも同様に用いることができる。ベクターは、特定の宿主細胞または宿主組織で機能的であるように（すなわち、複製および／または発現のために）選択される。ポリペプチドまたはそのフラグメントは、原核生物および／または真核生物の宿主細胞、例えば、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）、植物、および哺乳動物の細胞で増幅／発現させることができる。宿主細胞の選択は、ポリペプチドまたはそのフラグメントがグリコシル化されるか否かに少なくとも一部依存することになる。その場合は、酵母、昆虫、または哺乳動物宿主細胞が好ましい；酵母細胞および哺乳動物細胞は、糖鎖付加部位がアミノ酸配列上に存在すると、ポリペプチドをグリコシル化する。
【０１９３】
典型的には、宿主細胞のいずれにおいても用いられるベクターは、５’フランキング配列およびエンハンサー、プロモーター、複製エレメントの起点、転写終結エレメント、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含有する完全なイントロン配列、シグナルペプチド配列、リボソーム結合部位エレメント、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択可能マーカーエレメントなどの他の調節エレメントを含有する。任意選択で、ベクターは、「タグ」配列、すなわち、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）または別の小さな免疫原性配列をコードする、コード配列の５’もしくは３’末端に位置するオリゴヌクレオチド配列を含有することができる。このタグは、タンパク質と共に発現され、宿主細胞からポリペプチドを精製するための親和性タグとして役立ち得る。任意選択で、次いで、タグは、選択されたペプチダーゼを用いるなどの種々の手段によって、精製ポリペプチドから除去することができる。
【０１９４】
ベクター／発現コンストラクトは、任意選択で、５’フランキング配列、複製起点、転写終結配列、選択可能マーカー配列、リボソーム結合部位、シグナル配列、および１つまたは複数のイントロン配列などのエレメントを含有することができる。５’フランキング配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または系統）、異種（すなわち、宿主細胞の種または系統以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち、２つ以上の供給源に由来する５’フランキング配列の組合せ）、合成であってもよく、天然ポリペプチド５’フランキング配列であってもよい。そのため、５’フランキング配列の供給源は、５’フランキング配列が宿主細胞機構中で機能的でありかつその機構によって活性化され得るならば、任意の単細胞原核生物もしくは真核生物、任意の脊椎生物もしくは無脊椎動物、または任意の植物であってよい。
【０１９５】
転写終結エレメントは、典型的には、ポリペプチドコード配列末端の３’側に位置し、ポリペプチドの転写を終結させる役目をする。通常、原核細胞における転写終結エレメントは、ポリＴ配列が後続するＧ−Ｃリッチフラグメントである。このようなエレメントは、ライブラリーからクローニングすること、ベクターの一部として商業的に購入すること、および容易に合成することが可能である。
【０１９６】
選択可能マーカー遺伝子は、選択培養培地における宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択可能マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば原核宿主細胞についてのアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシンに抵抗性を付与するタンパク質、（ｂ）細胞の栄養要求性の欠乏を補完するタンパク質；または（ｃ）合成培地から入手可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０１９７】
シャイン・ダルガーノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）と一般に呼ばれるリボソーム結合エレメントが、ｍＲＮＡの翻訳開始には必要である。このエレメントは、典型的には、プロモーターの３’側に位置し、合成されるポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。シャイン・ダルガーノ配列は多様であるが、典型的には、ポリプリン（すなわち、高いＡＧ含量を有する）である。多くのシャイン・ダルガーノ配列が同定されており、そのそれぞれは上記に示す方法を用いて容易に合成することができる。
【０１９８】
上記に示すエレメントのすべておよび本発明で有用な他のエレメントは、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）および  Ｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．編，”Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９８７）に記載されている。
【０１９９】
組換えポリペプチドが分泌される、本発明の実施形態ついては、それが合成される細胞からの分泌を指示するためにシグナル配列が含まれることが好ましい。典型的には、シグナル配列をコードするポリヌクレオチドは、コード領域の５’末端に位置する。多くのシグナル配列が同定されており、それらのいずれも、標的細胞または種で機能的であれば、導入遺伝子と共に用いることができる。
【０２００】
多くの場合、遺伝子転写は、ベクター上に１つまたは複数のイントロンが存在すると増大する。イントロンは、特に、導入遺伝子がゲノムＤＮＡ配列の完全長またはフラグメントである場合、天然に存在するものでよい。イントロンは、導入遺伝子に対しておよび／または遺伝子が挿入されるトランスジェニック哺乳動物に対して同種であっても異種であってもよい。イントロンは効果的であるように転写されなければならないので、プロモーターおよび導入遺伝子に対するイントロンの位置は重要である。イントロンの好ましい位置は、転写開始部位の３’側であり、ポリＡ転写終結配列の５’側である。ｃＤＮＡ導入遺伝子の場合、イントロンは、導入遺伝子コード配列の一方側または他方側（すなわち、５’側または３’側）に置かれる。任意のウイルス、原核生物、および真核生物（植物または動物）を含む、任意の供給源に由来するいかなるイントロンも、それが挿入される宿主細胞に適合すれば、ポリペプチドを発現するために用いることができる。合成イントロンも本明細書に含まれる。任意選択で、２つ以上のイントロンをベクターに用いることができる。
【０２０１】
組換え発現のための例示的なベクターは、細菌、昆虫、および哺乳動物の宿主細胞に適合するものである。そのようなベクターとしては、とりわけ、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。
【０２０２】
ベクターを構築し、核酸をベクターの適切な部位に挿入した後、完成したベクターを、増幅および／またはポリペプチド発現に適した宿主細胞に挿入することができる。一般に用いられるものとしては、原核細胞、例えばグラム陰性菌またはグラム陽性菌、すなわち大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）等の任意の菌株；真核細胞、例えばＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞；ヒト腎臓２９３細胞；ＣＯＳ−７細胞；昆虫細胞、例えばＳｆ４、Ｓｆ５、Ｓｆ９、およびＳｆ２１、ならびにＨｉｇｈ５（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．由来）；植物細胞、ならびに種々の酵母細胞、例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）が挙げられる。細菌、酵母、真菌、単子葉植物および双子葉植物、植物細胞、および動物などの任意の生物に由来する、形質転換またはトランスフェクト可能な任意の細胞または細胞株が適切である。
【０２０３】
選択された宿主細胞へのベクターの挿入（「形質転換」または「トランスフェクション」とも呼ばれる）は、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、またはＤＥＡＥデキストラン法のような方法を用いて達成することができる。選択される方法は、用いられる宿主細胞のタイプに一部依存することになる。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．前出、に示されている。
【０２０４】
ベクターを含有する宿主細胞（すなわち、形質転換またはトランスフェクトされた）は、当業者に周知の標準培地を用いて培養することができる。培地は、通常、細胞の増殖および生存に必要な栄養素をすべて含有する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の培養に適した培地は、例えば、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）である。真核細胞の培養に適した培地は、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭであり、これらのすべてに、特定の細胞株の培養に必要とされる血清および／または増殖因子を添加することができる。昆虫培養に適した培地は、必要に応じて、イーストレイト（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解物、および／またはウシ胎仔血清を添加されたグレース培地である。
【０２０５】
典型的には、抗生物質または形質転換細胞のみの選択的な増殖に有用な他の化合物が培地にサプリメントとして加えられる。用いられる化合物は、宿主細胞を形質転換したプラスミド上に存在する選択可能マーカーエレメントにより決定されることになる。例えば、選択可能マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培地に加えられた化合物はカナマイシンになる。
【０２０６】
宿主細胞で産生されるポリペプチドの量は、当技術分野で公知の標準的方法を用いて評価することができる。そのような方法としては、限定されるものではないが、ウエスタンブロット解析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降、および／または結合アッセイが挙げられる。
【０２０７】
ポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計されている場合、大多数のポリペプチドは、おそらく細胞培養培地中に見出されることになる。しかしながら、ポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合は、ポリペプチドは、細胞質中（真核生物、グラム陽性菌、および昆虫の宿主細胞の場合）、または周辺質中（グラム陰性菌の宿主細胞の場合）に存在する。
【０２０８】
細胞内ポリペプチドの場合は、宿主細胞を、機械的または浸透圧的に最初破壊して細胞質含有物を緩衝液中に放出させる。次いで、ポリペプチドをこの溶液から単離する。
【０２０９】
組換えポリペプチドの長期高収率産生のためには、安定な発現が好ましい。例えば、目的のポリペプチドを安定に発現する細胞株を、ウイルスの複製起点および／または内因性発現エレメントおよび同じベクター上もしくは別個のベクター上にある選択可能マーカー遺伝子を含有し得る発現ベクターを用いて形質転換することができる。ベクターの導入後、選択培地に切り替える前に、栄養強化培地中で１〜２日間、細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、それが存在すると、導入配列の発現に成功した細胞の増殖および回収が可能になる。安定して形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。次いで、そのような細胞中で実質的に濃縮された細胞株を単離して、安定な細胞株を提供することができる。
【０２１０】
本発明の組換えポリペプチドの高収率生産に特に好ましい方法は、米国特許第４，８８９，８０３号明細書に記載されているように、漸増させたメトトレキセートレベルを使用することによる、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞におけるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の増幅を使用することによるものである。得られるポリペプチドは、グリコシル化された形態であってもよい。
【０２１１】
溶液からのポリペプチドの精製は、種々の技術を用いて達成することができる。ポリペプチドが、そのカルボキシル末端またはアミノ末端の何れかにヘキサヒスチジンまたは他の小ペプチドなどのタグを含有するように合成された場合、ポリペプチドは、基本的には、タグに対してまたはポリペプチドに対してカラムマトリックスが高親和性を有する（すなわち、ポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体）親和性カラムに直接溶液を通すことによって１段階過程で精製することができる。例えば、ポリヒスチジンは、ニッケルに対して大きな親和性および特異性をもって結合するため、ニッケルの親和性カラム（Ｑｉａｇｅｎニッケルカラムなど）を、Ｈｉｓタグ付きポリペプチドの精製に用いることができる。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｓｅｃｔｉｏｎ  １０．１１．８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照のこと）。
【０２１２】
強い親和性その受容体に対するリガンドにより、リガンド結合分子の親和性精製および、相補的結合相手を含む親和性マトリックスを用いるリガンド結合分子が可能になる。例えば、天然の結合相手（例えば、リガンド結合分子を精製する場合、それに親和性を有するリガンド）または標準的手法（例えば、マウス、ウサギ、または他の動物を適切なポリペプチドで免疫処置すること）を用いて作製された抗体の何れかを用いる親和性クロマトグラフィーを使用することができる。本発明のペプチドはそのような抗体を作製するために用いることができる。公知の抗体または公知の増殖因子受容体に対する抗体は、それらが標的リガンド結合分子とエピトープを共有する場合に用いることができる。
【０２１３】
さらに、精製についての他の周知の手法を用いることができる。そのような手法としては、限定されるものではないが、イオン交換クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲル溶出と組み合わせた天然ゲル電気泳動、および調製用等電点電気泳動（“Ｉｓｏｐｒｉｍｅ”ｍａｃｈｉｎｅ／ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられる。任意選択で、これらの技術を２つ以上組み合わせて純度を高めることができる。精製についての好ましい方法としては、調製用等電点電気泳動と組み合わせたポリヒスチジンタギングおよびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。
【０２１４】
細菌の細胞膜周辺腔または真核細胞の細胞質、プロセシングされたポリペプチドがそのような複合体を形成している場合には封入体（細菌）を含む、周辺質または細胞質の含有物の中に見出されるポリペプチドは、当業者に公知の任意の標準的技術を用いて、宿主細胞から抽出することができる。例えば、宿主細胞を溶解させて、フレンチプレス、ホモジナイゼーション、および／または超音波処理により、周辺質の含有物を放出させることができる。次いで、ホモジネートを遠心分離することができる。
【０２１５】
ポリペプチドが周辺質において封入体を形成した場合、封入体は、多くの場合、内側および／または外側細胞膜に結合することができ、そのため、遠心分離後には主としてペレット物質中に見出されることになる。次いで、ペレット物質をグアニジンまたは尿素などのカオトロピック剤で処理して、封入体を放出させ、粉々に分解し、可溶化することができる。次いで、可溶化したポリペプチドをゲル電気泳動、免疫沈降等を用いて分析することができる。ポリペプチドを単離することが所望される場合には、以下に示すものおよび［Ｍａｒｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−２７５（１９９０）．］にあるものなど標準的方法を用いて、単離を達成することができる。
【０２１６】
遺伝子治療
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子治療を容易にするために追加の配列をさらに含む。一実施形態では、本明細書に記載するリガンド結合分子をコードする「裸の」導入遺伝子（すなわち、トランスフェクションを容易にするためのウイルス、リポソーム、または他のベクターを伴わない導入遺伝子）が、遺伝子治療のために用いられる。
【０２１７】
ベクターもまた、被験体の細胞に本発明のリガンド結合分子をｉｎ  ｖｉｖｏで発現させる形態で、リガンド結合ポリペプチドまたは分子をコードするポリヌクレオチドを血管新生の阻害を必要とする被験体に導入する、「遺伝子治療」の治療レジメンに有用である。両方とも参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００２／０１５１６８０号明細書および国際公開第０１／６２９４２号パンフレットに記載されている遺伝子治療の態様もまた、本明細書に適用可能である。
【０２１８】
本明細書に記載するリガンド結合分子をコードするポリヌクレオチドを宿主に導入するために、任意の適切なベクターを用いることができる。文献に記載されている例示的なベクターとしては、以下に限定されるものではないが、レンチウイルスベクター（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（１）：８１１−８１６，１９９８；Ｋｉｎｇｓｍａｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓｃｒｉｐ  Ｍａｇａｚｉｎｅ，１９９８年１０月，ｐｐ．４３−４６）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（米国特許第５，４７４，９３５ｌ号明細書；同第５，１３９，９４１号明細書；同第５，６２２，８５６号明細書；同第５，６５８，７７６号明細書；同第５，７７３，２８９号明細書；同第５，７８９，３９０号明細書；同第５，８３４，４４１号明細書；同第５，８６３，５４１号明細書；同第５，８５１，５２１号明細書；同第５，２５２，４７９号明細書；Ｇｎａｔｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．，４５：８７−９８，１９９７）；アデノウイルス（ＡＶ）ベクター（米国特許第５，７９２，４５３号明細書；同第５，８２４，５４４号明細書；同第５，７０７，６１８号明細書；同第５，６９３，５０９号明細書；同第５，６７０，４８８号明細書；同第５，５８５，３６２号明細書；Ｑｕａｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：２５８１−２５８４，１９９２；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  Ｐｅｒｒｉｃａｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９０：６２６−６３０，１９９２；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６８：１４３−１５５，１９９２）；アデノウイルスアデノ随伴ウイルスキメラ（米国特許第５，８５６，１５２号明細書）またはワクチニアウイルスまたはヘルペスウイルス（米国特許第５，８７９，９３４号明細書；同第５，８４９，５７１号明細書；同第５，８３０，７２７号明細書；同第５，６６１，０３３号明細書；同第５，３２８，６８８号明細書）；リポフェクチン媒介遺伝子移入（ＢＲＬ）；リポソームベクター（米国特許第５，６３１，２３７号明細書およびセンダイウイルスタンパク質を含むリポソーム）；ならびにそれらの組合せを含む複製欠損レトロウイルスベクターが挙げられる。前述の文献はすべて、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１９】
企図される他の非ウイルス性送達機構としては、以下に限定されるものではないが、リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７，１９７３；Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７：２７４５−２７５２，１９８７；Ｒｉｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０：６８９−６９５，１９９０）ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：１１８８−１１９０，１９８５）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：７１６−７１８，１９８６；Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１６１−７１６５，１９８４）、直接マイクロインジェクション（Ｈａｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０１：１０９４−１０９９，１９８５．）、ＤＮＡ負荷リポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ  ａｎｄ  Ｓｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０，１９８２；Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３３４８−３３５２，１９７９；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｓｃｉ  Ａｍ．２７６（６）：１０２−６，１９９７；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７（１５）：１７９１−３，１９９６）、細胞超音波処理（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：８４６３−８４６７，１９８７）、高速マイクロプロジェクティルを用いる遺伝子打ち込み（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８７：９５６８−９５７２，１９９０）、および受容体媒介トランスフェクション（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９−４４３２，１９８７；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：８８７−８９２，１９８８；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，１２：１５９−１６７，１９９３）が挙げられる。
【０２２０】
発現コンストラクト（または、実際には本明細書に記載するリガンド結合分子）は、リポソーム中に封入され得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内側の水性媒体を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは水性媒体により分離された複数の脂質層を有する。リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると、リポソームが自発的に形成される。脂質成分は自己再配列を起こした後、閉鎖構造を形成し、脂質二重層の間に水および溶解した溶質を封入する（Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｈａｗａｔ，Ｉｎ：Ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｌｉｇａｎｄｓ，Ｗｕ  Ｇ，Ｗｕ  Ｃ編，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ｐｐ．８７−１０４，１９９１）。陽イオン性リポソームにＤＮＡを添加すると、リポソームから光学的に複屈折性の液体−結晶凝縮小滴への形態的な移行が起こる（Ｒａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５（５３０１）：８１０−４，１９９７）。これらのＤＮＡ−脂質複合体は、遺伝子治療および送達に使用するための有望な非ウイルスベクターである。
【０２２１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、外来性ＤＮＡのリポソーム媒介核酸送達および発現は成功している。また、「リポフェクション」技術を含む種々の商業的アプローチも、本発明では企図される。本発明の特定の実施形態では、リポソームは血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）と複合体を形成することができる。これにより、細胞膜との融合が容易になり、リポソームに被包されたＤＮＡの細胞内移行が促進されることが示されている（Ｋａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：３７５−３７８，１９８９）。他の実施形態では、リポソームは、核の非ヒストン性染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体を形成させても、またはそれと一緒に用いてもよい（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：３３６１−３３６４，１９９１）。さらにさらなる実施形態では、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と複合体を形成させても、またはそれらと一緒に用いてもよい。そのような発現コンストラクトが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、核酸の移入および発現に成功裡に用いられている点から、それらは本発明に適用可能である。
【０２２２】
裸のＤＮＡ発現コンストラクトを細胞に移入するための本発明の別の実施形態には、粒子打ち込みが含まれ得る。この方法は、ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクティルを高速に加速して、それが細胞膜を貫通し、細胞を殺傷することなく細胞内に移行することを可能にする、その能力に依存する。（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７０−７３，１９８７）。小粒子を加速するためのいくつかの装置が開発されている。そのような１つの装置は、それによって輸送力が与えられる電流を発生させるための高電圧に依存する（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８７：９５６８−９５７２，１９９０）。用いられるマイクロプロジェクティルは、タングステンまたは金ビーズなどの生物学的に不活性な物質からなっている。
【０２２３】
ウイルスベクターを用いる実施形態では、好ましいポリヌクレオチドはさらに、上記に記載する適切なプロモーターおよびポリアデニル化配列を含む。さらに、これらの実施形態では、ポリヌクレオチドがさらに、本発明のポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結されたベクターポリヌクレオチド配列（例えば、アデノウイルスポリヌクレオチド配列）を含むことが容易に明らかであろう。
【０２２４】
リガンド結合分子の治療用途
本明細書に記載するリガンド結合ポリペプチドおよび分子、ならびにそれらをコードするポリヌクレオチドおよびベクターは、ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦＲ−３を通してシグナル伝達を誘導する内皮増殖因子によって媒介される細胞プロセスを阻害するために有用であり、これらの受容体上のそのような増殖因子の作用により刺激される異常な血管新生および／またはリンパ脈管新生に関連した障害（例えば、種々の眼障害および癌）の予防または治療に対する適応を有する。本明細書に記載するリガンド結合ポリペプチドおよび分子、ならびにそれらをコードするポリヌクレオチドおよびベクターは、ＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄの除去、阻害、または低減により改善、寛解、抑制、または予防される症状のいかなる疾患の治療または予防のためにも治療上有用である。ＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄ（具体的には少なくともＶＥＧＦ−Ｃ）の阻害または低減によって改善される具体的な症状の非網羅的なリストとしては、過度の血管内皮細胞増殖、血管透過性、浮腫、または炎症を特徴とする臨床症状、例えば損傷、脳卒中、または腫瘍に関連した脳浮腫；関節リウマチを含む、乾癬または関節炎などの炎症性障害に関連した浮腫；喘息；熱傷に関連した全身性浮腫；腫瘍、炎症、または外傷に関連した腹水および胸水；慢性的な気道炎症；毛細血管漏出症候群；敗血症；タンパク質漏出の増大に関連した腎臓病；および加齢黄斑変性症および糖尿病性網膜症などの眼疾患が挙げられる。
【０２２５】
簡潔さのために、本方法の多くがリガンド結合分子を含む組成物に関して以下に記載されるが、本明細書に記載するコンストラクトのいずれについても（リガンド結合ポリペプチド、分子、およびコンストラクト、ならびにそれらをコードするポリヌクレオチド、二量体および他の多量体等）本発明の実施が企図されることを理解されたい。
【０２２６】
例示的な治療用途は、それを必要とする被験体において血管新生を阻害する方法であって、本明細書に記載するリガンド結合分子を含む組成物を、被験体の血管新生を阻害するために有効な量で被験体に投与することを含む方法である。一部の実施形態では、血管新生は、脈絡膜または網膜の血管新生を含む。一部の実施形態では、血管新生は、悪性癌および他の腫瘍で生じる腫瘍血管新生である。
【０２２７】
別の態様では、血管新生に関連した眼障害のための予防または治療の方法であって、本明細書に記載するリガンド結合分子を含む組成物を、眼障害の予防または治療を必要とする被験体に投与することを含む方法を本明細書に記載する。
【０２２８】
別の態様では、網膜浮腫をもたらす眼障害のための予防または治療の方法であって、本明細書に記載するリガンド結合分子を含む組成物を、眼障害または眼疾患の予防または治療を必要とする被験体に投与することを含む方法を本明細書に記載する。
【０２２９】
治療することができる眼障害の例としては、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、加齢黄斑変性症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、および角膜血管新生／移植拒絶反応が挙げられる。好ましくは、用いられるリガンド結合分子の量は、ＶＥＧＦＲ−３（および好ましくはＶＥＧＦＲ−２も）へのＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄリガンドの結合、またはＶＥＧＦＲ−３（および好ましくはＶＥＧＦＲ−２も）に対するＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄの刺激作用を阻害するために有効である。
【０２３０】
一実施形態では、眼障害は加齢黄斑変性症である。加齢黄斑変性症の例には、非新生血管（「ドライ」としても知られている）黄斑変性症および新生血管（「ウェット」としても知られている）黄斑変性症がある。好ましい実施形態では、眼障害はウェット加齢黄斑変性症である。ウェット加齢黄斑変性症の治療または予防はまた、脈絡膜血管新生または色素上皮剥離の治療または予防を包含する。
【０２３１】
一実施形態では、眼障害はポリープ状脈絡膜血管症である。ポリープ状脈絡膜血管症は、動脈瘤の膨隆または外部突出をもたらす、内部脈絡膜脈管ネットワークの脈管に由来する病変を特徴とする（Ｃｉａｒｄｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｓｕｒｖ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．４９：２５−３７）。
【０２３２】
一実施形態では、眼障害は脈絡膜血管新生に関連した症状である。脈絡膜血管新生に関連した症状の例としては、変性、炎症性、外傷性、特発性の症状が挙げられる。脈絡膜血管新生に関連した変性障害の治療または予防はまた、遺伝性変性障害の治療および予防を包含する。遺伝性変性障害の例としては、卵黄様黄斑ジストロフィー、黄色斑眼底、および視神経円板ドルーゼが挙げられる。脈絡膜血管新生に関連した変性症状の例としては、近視性変性または網膜色素線条が挙げられる。脈絡膜血管新生に関連した炎症性障害の治療または予防はまた、眼ヒストプラスマ症候群、多巣性脈絡膜炎、蛇行性脈絡膜炎、トキソプラズマ症、トキソカラ症、風疹、フォークト・小柳・原田症候群、ベーチェット病、または交感性眼炎の治療または予防を包含する。脈絡膜血管新生に関連した外傷性障害の治療または予防はまた、脈絡膜破裂または激しい光凝固により引き起こされる外傷性症状の治療または予防を包含する。
【０２３３】
一実施形態では、眼障害は高血圧性網膜症である。
【０２３４】
一実施形態では、眼障害は糖尿病性網膜症である。糖尿病性網膜症は、非増殖性糖尿病性網膜症であることも、増殖性糖尿病性網膜症であることもある非増殖性糖尿病性網膜症の例としては、黄斑浮腫および黄斑虚血が挙げられる。
【０２３５】
一実施形態では、眼障害は鎌状赤血球網膜症である。
【０２３６】
一実施形態では、眼障害は、末梢網膜血管新生に関連した症状である。末梢網膜血管新生に関連した症状の例としては、虚血性血管疾患、虚血を伴い得る炎症性疾患、色素失調症、色素性網膜炎、網膜分離症、または慢性網膜剥離が挙げられる。
【０２３７】
虚血性血管疾患の例としては、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈分枝閉塞症、網膜細動脈分枝閉塞症、頸動脈海綿洞瘻、鎌状異常ヘモグロビン症、非鎌状異常ヘモグロビン症、ＩＲＶＡＮ症候群（特発性網膜血管炎、動脈瘤、および視神経網膜炎を特徴とする網膜血管炎性障害）、網膜塞栓症、末熟児網膜症、家族性滲出性硝子体網膜症、過粘稠度症候群、大動脈弓症候群、またはイールス病が挙げられる。鎌状異常ヘモグロビン症の例としては、ＳＳ異常ヘモグロビン症およびＳＣ異常ヘモグロビン症が挙げられる。非鎌状異常ヘモグロビン症の例としては、ＡＣ異常ヘモグロビン症およびＡＳ異常ヘモグロビン症が挙げられる。過粘稠度症候群の例としては、白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、赤血球増加症、または骨髄増殖性疾患が挙げられる。
【０２３８】
虚血を伴い得る炎症性疾患の治療または予防はまた、全身性疾患に関連した網膜血管炎、感染病原体に関連した網膜血管炎、ぶどう膜炎、またはバードショット網膜症（ｂｉｒｄｓｈｏｔ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）の治療または予防を包含する。全身性疾患の例としては、全身性エリテマトーデス、ベーチェット病、炎症性腸疾患、サルコイドーシス、多発性硬化症、ヴェグナー肉芽腫症、および結節性多発動脈炎が挙げられる。感染病原体の例としては、梅毒、結核、ライム病、またはネコひっかき病の病原体である細菌病原体、ヘルペスウイルスなどのウイルス、またはイヌ回虫またはトキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）などの寄生生物が挙げられる。ぶどう膜炎の例としては、周辺部ぶどう膜炎またはフックスぶどう膜炎症候群が挙げられる。
【０２３９】
一実施形態では、眼障害は末熟児網膜症である。末熟児網膜症は、発生中の網膜を支持する血管床の血管の異常増殖に起因する場合がある（Ｐｏｌｌａｎ  Ｃ（２００９）Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｎｅｔｗ．２８：９３−１０１）。
【０２４０】
一実施形態では、眼障害は静脈閉塞性疾患である。静脈閉塞性疾患の例としては、網膜静脈分枝閉塞症および網膜中心静脈閉塞症が挙げられる。網膜静脈分枝閉塞症は、網膜から血液を排出する血液循環の一部を遮断する場合がある。この遮断により、毛細血管にバックアップ圧力が引き起こされることがあり、それによって出血に加え、液体および他の血液成分の漏出も起こり得る。
【０２４１】
一実施形態では、眼障害は動脈閉塞性疾患である。動脈閉塞性疾患の例としては、網膜動脈分枝閉塞症、網膜中心動脈閉塞症、または眼虚血症候群が挙げられる。網膜への動脈供給の分枝の１つが閉塞されると、網膜動脈分枝閉塞症（ＢＲＡＯ）が起こることがある。
【０２４２】
一実施形態では、眼障害は中心性漿液性脈絡網膜症（ＣＳＣ）である。一実施形態では、ＣＳＣは、中心網膜黄斑における流体の漏出を特徴とする。
【０２４３】
一実施形態では、眼障害は嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）である。一実施形態では、ＣＭＥは中心網膜または網膜黄斑を冒す。別の実施形態では、ＣＭＥは白内障手術の後に生じる。
【０２４４】
一実施形態では、眼障害は網膜末梢血管拡張症である。一実施形態では、網膜末梢血管拡張症は、網膜脈管の拡張および蛇行ならびに多発性動脈瘤の形成を特徴とする。特発性ＪＸＴ、レーバー粟粒動脈瘤、およびコーツ病は、３タイプの網膜末梢血管拡張症である。
【０２４５】
一実施形態では、眼障害は動脈細動脈瘤である。
【０２４６】
一実施形態では、眼障害は網膜血管腫症である。一実施形態では、眼脈管が複数の血管腫を形成すると、網膜血管腫症が生じる。
【０２４７】
一実施形態では、眼障害は放射線誘発性網膜症（ＲＩＲＰ）である。一実施形態では、ＲＩＲＰは、黄斑浮腫ならびに非増殖および増殖性の網膜症などの症候を示すことがある。
【０２４８】
一実施形態では、眼障害は虹彩血管新生である。別の実施形態では、虹彩血管新生は血管新生緑内障の形成をもたらす。別の実施形態では、虹彩血管新生は、糖尿病性網膜症、網膜中心静脈閉塞症、眼虚血症候群、または慢性網膜剥離により引き起こされる。
【０２４９】
一実施形態では、眼障害は新生物である。新生物の例としては、眼瞼腫瘍、結膜腫瘍、脈絡膜腫瘍、虹彩腫瘍、視神経腫瘍、網膜腫瘍、浸潤性眼内腫瘍、または眼窩腫瘍が挙げられる。眼瞼腫瘍の例としては、基底細胞癌、扁平上皮癌、皮脂腺癌、悪性黒色腫、毛細血管腫、水嚢腫、母斑症、または脂漏性角化症が挙げられる。結膜腫瘍の例としては、結膜カポジ肉腫、扁平上皮癌、結膜上皮内新生物、眼球上類皮腫、結膜リンパ腫、黒色腫、瞼裂斑、または翼状片が挙げられる。脈絡膜腫瘍の例としては、脈絡膜母斑、脈絡膜血管腫、転移性脈絡膜腫瘍、脈絡膜骨腫、脈絡膜黒色腫、毛様体黒色腫、または太田母斑が挙げられる。虹彩腫瘍の例としては、前部ぶどう膜転移、虹彩嚢腫、虹彩黒色細胞腫、虹彩黒色腫、または虹彩真珠嚢腫が挙げられる。視神経腫瘍の例としては、視神経黒色細胞腫、視神経鞘髄膜腫、視神経を冒す脈絡膜黒色腫、または視神経症を伴う乳頭周囲転移が挙げられる。網膜腫瘍の例としては、網膜色素上皮（ＲＰＥ）肥大、ＲＰＥ腺腫、ＲＰＥ癌腫、網膜芽細胞腫、ＲＰＥの過誤腫、またはフォンヒッペル血管腫が挙げられる。浸潤性眼内腫瘍の例としては、慢性リンパ球性白血病、浸潤性脈絡膜症、または眼内リンパ腫が挙げられる。眼窩腫瘍の例としては、涙腺の腺様嚢胞癌、眼窩の海綿状血管腫、眼窩のリンパ管腫、眼窩粘液嚢腫、眼窩偽腫瘍、眼窩横紋筋肉腫、小児期の眼周囲血管種、または硬化性眼窩偽腫瘍が挙げられる。
【０２５０】
さらなる態様では、本発明は、眼外傷を治療する方法であって、眼外傷が寛解または改善するように、有効量の本明細書に記載するリガンド結合分子を、それを必要とする被験体に局所投与することを含む方法を特色とする。好ましくは、眼外傷は角膜外傷または結膜外傷であり、この治療方法は、眼外傷に関連した血管新生および炎症を低減する。一部の実施形態では、この方法は、急性および亜急性の角膜外傷または結膜外傷を治療するために有用である。急性角膜外傷は、発生の２４時間以内に治療することができ、貫通物体、異物、または化学的外傷もしくは熱傷を原因とする角膜外傷または結膜外傷を含む。亜急性外傷は、外傷後２週間まで治療することができ、上記に記載の外傷および感染性の病因を含み得る。一部の実施形態では、眼外傷は、外傷、例えば、外科的外傷、化学的熱傷、角膜移植、感染性または炎症性疾患を原因とする。
【０２５１】
治療の長さは、外傷によって異なるが、治療期間は、短期間、例えば最大１ヶ月間である場合も、３〜６ヶ月の観察期間を含む場合もあり、観察期間の間に再治療が施されることもある。投与には、免疫抑制剤、例えばコルチコステロイド、デキサメタゾン、またはサイクロスポリンＡの１つまたは複数などの第２の薬剤が含まれることもある。局所投与には、例えば、眼に適用される点眼剤中のリガンド結合分子の投与、または眼への結膜下注射が含まれる。
【０２５２】
さらなる態様では、眼外傷を治癒させる方法であって、眼外傷を治癒させるように、有効量の本明細書に記載するリガンド結合分子を、それを必要とする被験体に局所投与することを含む方法を本明細書に記載する。
【０２５３】
さらなる態様では、眼外傷に関連した血管新生を低減または寛解する方法であって、眼外傷に関連した血管新生を低減または寛解するように、有効量の本明細書に記載するリガンド結合分子を、それを必要とする被験体に局所投与することを含む方法を本明細書に記載する。
【０２５４】
さらなる態様では、炎症を低減または寛解する方法であって、眼外傷に関連した炎症を低減または寛解するように、有効量の本明細書に記載するリガンド結合分子を、それを必要とする被験体に局所投与することを含む方法を本明細書に記載する。
【０２５５】
さらなる態様では、眼の外傷または感染に関連した血管新生および／炎症のために本発明のリガンド結合分子を投与する方法であって、本明細書に記載するリガンド結合分子を含む点眼剤による局所投与または注射もしくはインプラントによる結膜下投与を含む方法を本明細書に記載する。
【０２５６】
さらなる態様では、本明細書に記載するリガンド結合分子を含有する、有効量の医薬組成物を被験体に投与することによって（それによって患者の角膜における血管新生および／またはリンパ脈管新生が抑制される）、被験体の角膜移植後の角膜移植片の生存を延長する方法を記載する。
【０２５７】
用量応答試験により、使用すべき適量のリガンド結合分子を正確に決定することが可能になる。例えば、標的受容体に対するポリペプチドの結合親和性、標的細胞上に存在する受容体の量、予測される希釈容積（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ実施形態の場合、患者の体重および血液量）、およびポリペプチドクリアランス速度の測定から、有効量を評価することができる。例えば、公知のＶＥＧＦ−Ｃ抗体の投与に関する既存の文献も、本明細書に記載するリガンド結合分子の投与に関する手引きを提供する。ＶＥＧＦＲ−１／ＶＥＧＦＲ−２に基づくリガンドトラップであるアフリベルセプト（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）の投与を記載する文献も、本明細書に記載する治療分子の投与に関する手引きを提供するために用いることができる。
【０２５８】
一部の実施形態では、硝子体内注射により投与される場合、リガンド結合分子は、１眼当たり約２ｍｇ〜約４ｍｇ（または１眼当たり約１ｍｇ〜約３ｍｇ、または約１ｍｇ〜約４ｍｇ、または約３ｍｇ〜約４ｍｇ、または約１ｍｇ〜約２ｍｇ）の濃度で投与される。一部の実施形態では、リガンド結合分子は、１眼当たり約１ｍｇ、または約２ｍｇ、または約３ｍｇ、または約４ｍｇ、または約５ｍｇ、または約６ｍｇの濃度で投与される。リガンド結合分子は、一部の実施形態では、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、６０μｌ、７０μｌ、８０μｌ、９０μｌ、９５μｌ、または１００μｌの容量で、上記に記載の濃度の何れかで存在する。一部の実施形態では、リガンド結合分子は、約２〜４ｍｇ／５０μｌの濃度で投与される。
【０２５９】
本明細書に記載するリガンド結合分子は、血管新生に関連した眼疾患（例えば、糖尿病性網膜症、黄斑変性症）の発症リスクのある被験体の血管新生を予防するために予防的処置として、またはそれを必要とする被験体の眼の血管新生を阻害する目的で眼疾患に罹患した被験体に治療的処置として、純粋に投与することができる。
【０２６０】
糖尿病性網膜症または黄斑変性症を発症するリスクのある被験体には、５０歳を超える被験体；関節リウマチに罹患した被験体、糖尿病の被験体、甲状腺異常の被験体、喘息の被験体、白内障の被験体、緑内障の被験体、ループスの被験体、高血圧の被験体、および網膜剥離の被験体が含まれる。他のリスクファクターとしては、遺伝、食餌、喫煙、および日光曝露が挙げられる。
【０２６１】
一部の実施形態では、それを必要とする被験体に対する治療レジメンを選択する方法であって、網膜血管新生に関連した症候の１つまたは複数について被験体をスクリーニングすること、および本明細書に記載するリガンド結合分子を含む組成物の投与について被験体に対して処方することを含む方法を本明細書に記載する。別の実施形態では、網膜血管新生に関連した眼障害で冒された被験体を治療する方法であって、眼障害の１つまたは複数の症候を有するとして被験体を同定すること、およびリガンド結合分子を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を本明細書に記載する。網膜血管新生に関連した眼障害に関連した症候としては、以下に限定されるものではないが、霧視および時間経過に伴うゆっくりした視力喪失、眼の内部に漂う小粒子、視野の影または欠損、乱視、および夜盲症が挙げられる。
【０２６２】
一部の実施形態では、本明細書に記載する方法は、ドライアイ疾患の治療のための標準治療レジメンを処方（または投与）することをさらに含む。本明細書に記載する方法の文脈では、「標準治療」とは、あるタイプの病気と診断された特定のタイプの患者に対する、臨床医により一般に承認されている治療を指す。糖尿病性網膜症および黄斑変性症の場合、例えば、本発明の一態様は、網膜血管新生を阻害する、本明細書に記載するリガンド結合分子との併用療法により、標準治療を改善することである。糖尿病性網膜症および黄斑変性症のための例示的な標準治療としては、以下に限定されるものではないが、眼瞼衛生、局所用抗生物質（以下に限定されるものではないが、エリスロマイシンまたはバシトラシン軟膏剤が含まれる）、経口テトラサイクリン（テトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはミノサイクリン）、抗炎症性化合物（以下に限定されるものではないが、シクロスポリンが含まれる）、コルチコステロイド、レーザー光凝固術、および光線力学療法が挙げられる。
【０２６３】
また、眼障害の治療のための標準治療レジメンに対して反応性の低下した、網膜血管新生に関連した眼障害の哺乳動物被験体を治療する方法であって、リガンド結合分子を、その疾患を治療するために有効な量で被験体に投与することを含む方法も企図される。
【０２６４】
哺乳動物被験体は、好ましくはヒト被験体である。他の哺乳動物被験体、特にヒトにおける治療効力を実証するためのモデルとして慣用的に用いられている哺乳動物（例えば、霊長類、ブタ、イヌ、またはウサギ）における本発明の方法の実施も企図される。
【０２６５】
併用療法および追加の活性薬剤
本発明の併用療法および予防的な実施形態には、製剤および方法が含まれる。本明細書に記載するリガンド結合分子の１つまたは複数と併用して投与され得る例示的な化合物としては、以下に限定されるものではないが、下記の表２に示す化合物が挙げられる。
【表２】
2019023198.tif 000004
【表３】
2019023198.tif 000005
【表４】
2019023198.tif 000006
【０２６６】
リガンド結合分子は、第２の受容体トラップ分子、細胞傷害性薬剤、外科手術、カテーテルデバイス、および放射線を含む、１つまたは複数の追加の活性化合物または治療と併用して投与することができる。例示的な配合剤には、単一組成物として製剤化されたまたは例えば単位容量パッケージもしくはキットとして別個の組成物で一緒にパッケージされた２つ以上の薬剤が含まれる。例示的な併用方法には、投与について、すなわち、２つ以上の薬剤を同時にまたは一斉にまたはずらして（すなわち、逐次的に）投与するように処方することが含まれる。
【０２６７】
本明細書で使用する「細胞傷害性薬剤」という用語は、細胞の機能を阻害または阻止し、かつ／または細胞の破壊をもたらす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、およびＲｅ１８６）、化学療法剤、および細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素もしくはそのフラグメントを含むことを意図する。
【０２６８】
「化学療法剤」は癌の治療に有用な化学物質である。化学療法剤の例としては、チオテパおよびシクロホスファミド（シトキサン（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、イソプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチローロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；クロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジオリピン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；���酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「アラＣ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えば、パクリタキセル（タキソール（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（登録商標）（タキソテール；Ａｖｅｎｔｉｓ  Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン；ならびに上記の何れかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。また、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼを阻害する４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（フェアストン）を含む抗エストロゲン；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびに上記の何れかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体など、腫瘍へのホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤もこの定義に含まれる。
【０２６９】
本明細書で使用する場合、「増殖阻害剤」は、細胞、特に癌細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの何れかで阻害する化合物または組成物を指す。増殖阻害剤の例としては、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤など、細胞周期進行（Ｓ期以外の場所で）を遮断する薬剤が挙げられる。古典的なＭ期遮断薬としては、ビンカ類（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキソール（登録商標）、ならびにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなどのトポＩＩ阻害剤が挙げられる。Ｇ１停止を起こす薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、およびアラＣなどのＤＮＡアルキル化剤はまた、Ｓ期停止にも及ぶ。
【０２７０】
ＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ）阻害剤製剤
一部の実施形態では、本明細書に記載する方法は、任意選択で、ＶＥＧＦ−Ａのその受容体の１つまたは複数、特にＶＥＧＦＲ−２への結合を阻害する治療活性剤を投与することを含む。ＶＥＧＦ−Ａ阻害剤製剤は、本明細書に記載するリガンド結合分子の１つまたは複数と併用して投与することができる。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａ阻害剤製剤およびリガンド結合分子は、単一組成物で同時投与される。他の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａ阻害剤製剤は、リガンド結合分子とは別個の組成物として投与される。
【０２７１】
一実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａ阻害剤製剤は、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプト、ＫＨ９０２  ＶＥＧＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質、２Ｃ３抗体、ＯＲＡ１０２、ペガプタニブ、ベバシラニブ、ＳＩＲＮＡ−０２７、デクルシン、デクルシノール、ピクロポドフィリン、ググルステロン、ＰＬＧ１０１、エイコサノイドＬＸＡ４、ＰＴＫ７８７、パゾバニブ、アキシチニブ、ＣＤＤＯ−Ｍｅ、ＣＤＤＯ−Ｉｍｍ、シコニン、β−ヒドロキシイソバレリルシコニン、ＥＹＥ００１、ガングリオシドＧＭ３、ＤＣ１０１抗体、Ｍａｂ２５抗体、Ｍａｂ７３抗体、４Ａ５抗体、４Ｅ１０抗体、５Ｆ１２抗体、ＶＡ０１抗体、ＢＬ２抗体、ＶＥＧＦ関連タンパク質、ｓＦＬＴ０１、ｓＦＬＴ０２、ペプチドＢ３、ＴＧ１００８０１、ソラフェニブ、もしくはＧ６−３１抗体、または前述の何れかの薬学的に許容される塩から選択される。
【０２７２】
ヒトＶＥＧＦＲ−２  ＥＣＤのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号５および６で示される。「ＶＥＧＦ−Ａ阻害剤製剤」は、例えば、ＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦＲ−２への結合を遮断することによって、またはＶＥＧＦＲ−２の発現を低減することによって、ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦＲ−２相互作用を特異的に低減するように作用する任意の分子であり得る。本明細書で使用する「ＶＥＧＦ−Ａ」という用語は、血管新生または血管新生プロセスを誘導する血管内皮増殖因子を指し、例えば、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、およびＶＥＧＦ１８９を含む、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の選択的スプライシングによって生じ、血管新生または血管新生プロセスを誘導するＶＥＧＦの種々のサブタイプを含む。「ＶＥＧＦ」という用語は、「ＶＥＧＦ」ポリペプチドまたは遺伝子もしくは核酸をコードする「ＶＥＧＦ」を指すために用いることができる。
【０２７３】
「ＶＥＧＦ−Ａ阻害剤製剤」という用語は、ＶＥＧＦ−Ａの活性または生成を部分的または完全に低減または阻害する薬剤を指す。ＶＥＧＦ−Ａ阻害剤製剤は、ＶＥＧＦ１６５などの特定のＶＥＧＦ−Ａの活性または生成を直接的または間接的に低減または阻害することができる。さらに、「ＶＥＧＦ−Ａ阻害剤製剤」は、ＶＥＧＦ−Ａ関連受容体シグナルを低減または阻害するように、ＶＥＧＦ−Ａリガンドまたはその同族受容体の何れかに作用する薬剤を含む。「ＶＥＧＦ−Ａ阻害剤製剤」の例としては、ＶＥＧＦ−Ａ核酸を標的にするアンチセンス分子、リボザイム、またはＲＮＡｉ；ＶＥＧＦ−Ａアプタマー；ＶＥＧＦ−Ａ抗体；ＶＥＧＦ−Ａのその同族受容体への結合を妨げる可溶性ＶＥＧＦ受容体デコイ；同族ＶＥＧＦ−Ａ受容体（ＶＥＧＦＲ−１および／またはＶＥＧＦＲ−２）核酸を標的にするアンチセンス分子、リボザイム、またはＲＮＡｉ；ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２のアプタマーまたはＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２の抗体；ならびにＶＥＧＦＲ−１および／またはＶＥＧＦＲ−２のチロシンキナーゼ阻害剤が挙げられる。
【０２７４】
ＶＥＧＦ−Ａ阻害剤は、ＶＥＧＦに結合する可溶性ＶＥＧＦＲ−２  ＥＣＤフラグメント（配列番号６のアミノ酸２０〜７６４）を含むポリペプチド；可溶性ＶＥＧＦＲ−１のＥＣＤフラグメント、可溶性ＶＥＧＦＲ−１／Ｒ２ベースのリガンドトラップ、例えばアフリベルセプト（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）；ＶＥＧＦＲ−２アンチセンスポリヌクレオチドまたは短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；抗ＶＥＧＦＲ−２抗体；ＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦの間の結合を阻害する抗ＶＥＧＦＲ−２抗体の抗原結合フラグメントを含むＶＥＧＦＲ−２阻害剤ポリペプチド；ＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦ−Ａの間の結合を阻害するアプタマーであり得る。一部の変更形態では、ＶＥＧＦＲ−２ベースのリガンドトラップは、免疫グロブリン定常領域フラグメント（Ｆｃ）に融合した可溶性ＶＥＧＦＲ−２ポリペプチドフラグメントを含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−２ポリペプチドフラグメントはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）に融合される。ＦｃまたはＡＰの融合コンストラクトを作製する方法は、国際公開第０２／０６０９５０号パンフレットに見出され、この開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７５】
いくつかのＶＥＧＦ−Ａ抗体が記載されており、例えば、米国特許第８，３４９，３２２号明細書；同第８，２３６，３１２号明細書；同第８，２１６，５７１号明細書；同第８，１０１，１７７号明細書；同第８，０９２，７９７号明細書；同第８，０８８，３７５号明細書；同第８，０３４，９０５号明細書；同第５，７３０，９７７号明細書；同第６，３４２，２１９号明細書、同第６，５２４，５８３号明細書、同第６，４５１，７６４号明細書、同第６，４４８，０７７号明細書、同第６，４１６，７５８号明細書、同第６，３４２，２２１号明細書、ならびに国際公開第９６／３００４６号パンフレット、国際公開第９７／４４４５３号パンフレット、および国際公開第９８／４５３３１号パンフレットを参照されたい。これらの内容は、その全体が参照により組み込まれる。例示的なＶＥＧＦ−Ａ抗体としては、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））およびラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載する１つまたは複数のリガンド結合分子は、ベバシズマブと併用して投与される。本明細書に記載する１つまたは複数のリガンド結合分子は、ラニビズマブと併用して投与される。
【０２７６】
一部の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａ阻害剤は、ＥＹＥ００１（以前はＮＸ１８３８と呼ばれた）であり、これは、主要な可溶性ヒトＶＥＧＦアイソフォームに高度かつ特異的な親和性で結合する改変ペグ化アプタマーである（米国特許第６，０１１，０２０号明細書；同第６，０５１，６９８号明細書；および同第６，１４７，２０４号明細書を参照のこと）。アプタマーは、ＶＥＧＦに向けられた高親和性抗体に類似の方法でＶＥＧＦに結合し不活性化する。別の有用なＶＥＧＦアプタマーは、非ペグ化形態のＥＹＥ００１である。
【０２７７】
好ましい実施形態では、本明細書に記載する１つまたは複数のリガンド結合分子は、アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））（Ｈｏｌａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１１３９３−１１３９８，２００２、この開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）と併用して投与される。
【０２７８】
いくつかのＶＥＧＦＲ−２抗体が記載されており、例えば、米国特許第６，３３４，３３９号明細書、米国特許出願公開第２００２／００６４５２８号明細書、同第２００５／０２１４８６０号明細書、および同第２００５／０２３４２２５号明細書（これらはすべて、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。相対的親和性を有する抗体が容易に作製できるため、またヒト治療に抗体を取り入れる技術が継続的に改善されているため、抗体はＶＥＧＦＲ−２／ＶＥＧＦ相互作用を調節するために有用である。したがって、本発明では、ＶＥＧＦＲ−２に特異的な抗体（例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、単一鎖抗体、キメラ抗体、二官能性／二重特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体、また本発明のポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含む化合物を含む）の使用が企図される。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含む、当技術分野で公知の種々の技術を用いて作製することができる［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）］。また、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の技術もヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）］。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されたマウスに導入することによって作製することができる。チャレンジすると、ヒト抗体産生が観察されるが、これは、遺伝子再編成、アセンブリ、および抗体レパートリーを含むすべての点においてヒトで観察されるものに極めて類似している。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書、および以下の科学論文：Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。
【０２７９】
ＰＤＧＦ阻害剤製剤
一部の実施形態では、本明細書に記載する方法は、任意選択で、ＰＤＧＦのその受容体の１つまたは複数への結合を阻害するように、治療活性剤を投与することを含む。ＰＤＧＦ阻害剤製剤は、本明細書に記載するリガンド結合分子の１つまたは複数と併用して投与することができる。一部の実施形態では、ＰＤＧＦ阻害剤製剤およびリガンド結合分子は、単一組成物で同時投与される。他の実施形態では、ＰＤＧＦ阻害剤製剤は、リガンド結合分子とは別個の組成物として投与される。
【０２８０】
「ＰＤＧＦ」という用語は、細胞の増殖または分裂を調節する血小板由来増殖因子を指す。本明細書で使用する場合、「ＰＤＧＦ」という用語は、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、それらの変異形態、およびＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣおよびＰＤＧＦ−ＤＤを含む、それらの二量体化形態を含む。血小板由来増殖因子は、２つの関連受容体型チロシンキナーゼ血小板由来増殖因子細胞表面受容体（すなわち、ＰＤＧＦＲ）、ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βへの結合およびそれらの二量体化を介してその作用を及ぼす、Ａ鎖（ＰＤＧＦ−Ａ）およびＢ鎖（ＰＤＧＦ−Ｂ）のホモ二量体およびヘテロ二量体を含む。さらに、ＰＤＧＦＲ複合体に対する２つのさらなるプロテアーゼ活性化リガンドであるＰＤＧＦ−ＣおよびＰＤＧＦ−Ｄが同定されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：３０２−９；Ｂｅｒｇｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：５１２−６；およびＵｕｔｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：２２４２−４７）。ＰＤＧＦＲの異なるリガンド結合特異性のため、ＰＤＧＦＲ−α／αはＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、およびＰＤＧＦ−ＣＣに結合し、ＰＤＧＦＲ−β／βはＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＤＤに結合するが、ＰＤＧＦＲ−α／βはＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、およびＰＤＧＦ−ＤＤに結合する（Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ２３：４９４−５０７）。本明細書で使用する場合、「ＰＤＧＦ」という用語はまた、応答性の細胞型上のＰＤＧＦＲの結合および活性化を通して、ＤＮＡ合成および有糸分裂を誘導する増殖因子のクラスのメンバーを指す。ＰＤＧＦは、例えば、定方向の細胞移動（走化性）および細胞活性化；ホスホリパーゼ活性化；ホスファチジルイノシトール代謝回転およびプロスタグランジン代謝の増大；応答性細胞によるコラーゲンとコラゲナーゼの両方の合成の刺激；マトリックス合成、サイトカイン産生、およびリポタンパク質取り込みを含む、細胞代謝活性の変化；ＰＤＧＦ受容体を欠く細胞の増殖応答の間接的な誘導；ならびに強力な血管収縮活性をもたらすことができる。「ＰＤＧＦ」という用語は、「ＰＤＧＦ」ポリペプチド、「ＰＤＧＦ」をコードする遺伝子もしくは核酸、またはその二量体化形態を指すために用いることができる。
【０２８１】
「ＰＤＧＦ阻害剤製剤」という用語は、ＰＤＧＦの活性または生成を部分的または完全に低減または阻害する薬剤を指す。ＰＤＧＦ阻害剤製剤は、ＰＤＧＦ−Ｂなどの特定のＰＤＧＦの活性または生成を直接的または間接的に低減または阻害することができる。さらに、「ＰＤＧＦ阻害剤製剤」は、ＰＤＧＦ関連受容体シグナルを低減または阻害するように、ＰＤＧＦリガンドまたはその同族受容体に作用する薬剤を含む。「ＰＤＧＦ阻害剤製剤」の例としては、ＰＤＧＦ核酸を標的にするアンチセンス分子、リボザイム、またはＲＮＡｉ；ＰＤＧＦアプタマー、ＰＤＧＦそれ自体もしくはその受容体に対するＰＤＧＦ抗体、またはＰＤＧＦのその同族受容体への結合を妨げる可溶性ＰＤＧＦ受容体デコイ；同族ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）核酸を標的にするアンチセンス分子、リボザイム、またはＲＮＡｉ；同族ＰＤＧＦＲ受容体に結合するＰＤＧＦＲアプタマーまたはＰＤＧＦＲ抗体；ならびにＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が挙げられる。
【０２８２】
一実施形態では、ＰＤＧＦ阻害剤製剤は、米国特許出願公開第２０１２／０１００１３６号明細書（この内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載および定義される式Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥの化合物、ｐ１Ｂ３抗体、ＣＤＰ８６０、ＩＭＣ−３Ｇ３、１６２．６２抗体、１６３．３１抗体、１６９．１４抗体、１６９．３１抗体、αＲ１抗体、２Ａ１Ｅ２抗体、Ｍ４ＴＳ．１１抗体、Ｍ４ＴＳ．２２抗体、Ｈｙｂ  １２０．１．２．１．２抗体、Ｈｙｂ  １２１．６．１．１．１抗体、Ｈｙｂ  １２７．５．７．３．１抗体、Ｈｙｂ  １２７．８．２．２．２抗体、Ｈｙｂ  １．６．１抗体、Ｈｙｂ  １．１１．１抗体、Ｈｙｂ  １．１７．１抗体、Ｈｙｂ  １．１８．１抗体、Ｈｙｂ  １．１９．１抗体、Ｈｙｂ  １．２３．１抗体、Ｈｙｂ  １．２４抗体、Ｈｙｂ  １．２５抗体、Ｈｙｂ  １．２９抗体、Ｈｙｂ  １．３３抗体、Ｈｙｂ  １．３８抗体、Ｈｙｂ  １．３９抗体、Ｈｙｂ  １．４０抗体、Ｈｙｂ  １．４５抗体、Ｈｙｂ  １．４６抗体、Ｈｙｂ  １．４８抗体、Ｈｙｂ  １．４９抗体、Ｈｙｂ  １．５１抗体、Ｈｙｂ  ６．４．１抗体、Ｆ３抗体、ヒト化Ｆ３抗体、Ｃ１抗体、ヒト化Ｃ１抗体、６．４抗体、抗ｍＰＤＧＦ−ＣヤギＩｇＧ抗体、Ｃ３．１抗体、ＰＤＧＦＲ−Ｂ１モノクローナル抗体、ＰＤＧＦＲ−Ｂ２モノクローナル抗体、６Ｄ１１モノクローナル抗体、Ｓｉｓ  １モノクローナル抗体、ＰＲ７２１２モノクローナル抗体、ＰＲ２９２モノクローナル抗体、ＨＹＢ  ９６１０モノクローナル抗体、ＨＹＢ  ９６１１モノクローナル抗体、ＨＹＢ  ９６１２モノクローナル抗体、ＨＹＢ  ９６１３モノクローナル抗体、または前述の何れかの何れかのその薬学的に許容される塩から選択される。
【０２８３】
好ましい実施形態では、本明細書に記載する１つまたは複数のリガンド結合分子は、ＰＤＧＦＲ−β抗体（眼の適応症についてＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｉｎｃ．により開発されているものなど）または抗ＰＤＧＦアプタマー（眼の適応症についてＯｐｈｔｈｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．により開発されているＥ１００３０など）と併用して投与される。
【０２８４】
例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖを含む、ＶＥＧＦ−ＡおよびＰＧＤＦ阻害剤製剤の抗体フラグメントもまた企図される。「に特異的」という用語は、本発明の抗体を記載するために使用する場合、本発明の抗体の可変領域がもっぱら目的のポリペプチドを認識し結合する（すなわち、ファミリーメンバー間の局所的な配列同一性、相同性、または類似性が存在し得るにもかかわらず、結合親和性の計測可能な差によって、同じファミリーの他の公知のポリペプチドから目的のポリペプチドを識別することができる）ことを示す。特異的抗体が、他のタンパク質（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡまたはＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）とも、抗体の可変領域以外の配列との相互作用によって、特に分子の定常領域において相互作用し得ることは理解されよう。本発明の抗体の結合特異性を決定するスクリーニングアッセイは、当技術分野で周知であり、ルーチン的に実施される。そのようなアッセイの包括的な議論については、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８），Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。本発明の抗体は、当技術分野でルーチン的に実施される、周知の任意の方法を用いて作製することができる。
【０２８５】
別の実施形態では、本明細書に記載する方法は、任意選択で、アンチセンス（例えば、ＶＥＧＦＲ−２に対するアンチセンス）核酸分子を被験体に投与することを含む。特定のタンパク質（例えば、ＶＥＧＦＲ−２）に対するアンチセンス核酸分子は、治療目的に、そのタンパク質の存在を排除するかまたはそのレベルをダウンレギュレートする要求が含まれる場合、そのタンパク質（例えば、ＶＥＧＦＲ−２）をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害するために治療上有用である。ＶＥＧＦＲ−２アンチセンスＲＮＡは、例えば、ＶＥＧＦＲ−２が原因因子として関与する疾患、例えば炎症性疾患の治療において、ＶＥＧＦＲ−２をアンタゴナイズする薬剤として有用になり得よう。
【０２８６】
アンチセンス核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列を含む（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるか、またはｍＲＮＡ配列に相補的である）。（例えば、配列番号１のＶＥＧＦＲ−３  ｃＤＮＡ配列を参照されたい）。アンチセンスヌクレオチドを設計および最適化するための方法は、Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；２７２：６２６−３８．１９９７）およびＫｕｒｒｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．；３０：１９１１−８．２００２）に記載されている。特定の態様では、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０、もしくは５００ヌクレオチド、または全タンパク質（例えば、ＶＥＧＦＲ−２）コード鎖に相補的な配列、またはその一部のみに相補的な配列を含むアンチセンス核酸分子が提供される。タンパク質（例えば、ＶＥＧＦＲ−２）のフラグメント、ホモログ、誘導体、およびアナログをコードする核酸分子、またはタンパク質（ＶＥＧＦＲ−２）核酸配列に相補的なアンチセンス核酸も企図される。
【０２８７】
一実施形態では、アンチセンス核酸分子は、例えばＶＥＧＦＲ−２などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対するアンチセンスである。「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。別の実施形態では、アンチセンス核酸分子は、例えばＶＥＧＦＲ−２などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コンシーディング（ｃｏｎｃｅｄｉｎｇ）領域」に対するアンチセンスである。「コンシーディング領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されない、コード領域に隣接する５’および３’配列（すなわち、５’および３’非翻訳領域とも呼ばれる）を指す。
【０２８８】
本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンおよびクリックの規則またはフーグスティーン塩基対の規則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、タンパク質ｍＲＮＡの全コード領域に対して相補的にすることができるが、より好ましくは、タンパク質ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド長とすることができる。本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野で公知の手法を用いる化学合成または酵素的連結反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然ヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増大させるようにもしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二本鎖の物理的安定性を増大させるように設計された種々に修飾されたヌクレオチドを用いて化学合成することができる（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる）。
【０２８９】
アンチセンス核酸を作製するために用いることができる、修飾ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピルウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンスの配向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に生成させることができる。
【０２９０】
アンチセンス核酸分子は、典型的には、それらが細胞ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質（例えばＶＥＧＦＲ−２）をコードするゲノムＤＮＡとハイブリダイズするかまたは結合し、それによって（例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって）タンパク質の発現を阻害するように、被験体に投与されるかまたはｉｎ  ｓｉｔｕで生成される。安定な二本鎖を形成するための通常のヌクレオチド相補性によって、または例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的相互作用を通して、ハイブリダイゼーションは起こり得る。
【０２９１】
さらに別の実施形態では、タンパク質ＲＮＡは、二本鎖（ｄｓＲＮＡ）（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−８１１．１９９８）または短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９９：６０４７−５２，２００２）を用いてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導するために用いることができる。「ＲＮＡｉ」は、ｄｓＲＮＡが相補的ｍＲＮＡの相同性依存分解を誘導するプロセスである。一実施形態では、本発明の核酸分子は、相補的塩基対形成によって本発明の「センス」リボ核酸とハイブリダイズして、二本鎖ＲＮＡを形成する。少なくとも約２０、２５、５０、１００、２５０、もしくは５００ヌクレオチドまたは全タンパク質（例えばＶＥＧＦＲ−２）コード鎖、またはその一部のみに対応するｄｓＲＮＡアンチセンスおよびセンス核酸分子が提供される。代替実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２〜３ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する、３０ヌクレオチド長以下、より好ましくは、２１〜２３ヌクレオチドであり、これは、より長いｄｓＲＮＡからリボヌクレアーゼＩＩＩ切断により生成する。例えば、Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ．（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４４６−４８．２００２）を参照されたい。ＲＮＡｉ化合物の調製および使用は、米国特許出願公開第２００４／００２３３９０号明細書に記載されており、その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９２】
小型ＲＮＡ分子の細胞内転写は、核内低分子ＲＮＡ（ＳｎＲＮＡ）Ｕ６またはヒトＲＮＡｓｅ  Ｐ  ＲＮＡ  Ｈ１を通常コードするＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）転写単位にｓｉＲＮＡ鋳型をクローニングすることにより達成することができる。ｓｉＲＮＡを発現するために、２つのアプローチを用いることができる、すなわち、一実施形態では、ｓｉＲＮＡ二本鎖を構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれのプロモーターにより転写され（Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，５００−５０５．２００２）；代替実施形態では、ｓｉＲＮＡは、細胞内プロセシング後にｓｉＲＮＡを生じさせるステムループヘアピンＲＮＡ構造として発現される（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３．２００２）（参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２９３】
ｄｓＲＮＡ／ｓｉＲＮＡは、最も一般的には、生物に送達する前に、センスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖をアニーリングすることによって投与される。代替実施形態では、ＲＮＡｉは、投与前にアニーリングすることなく、同じ溶液中の本発明のセンスおよびアンチセンス核酸を投与することによって実施することができ、また極めて短い時間枠内で、別個のビヒクル中の核酸を投与することによって実施することもできる。タンパク質（例えば、ＶＥＧＦＲ−２など）のフラグメント、ホモログ、誘導体、およびアナログをコードする核酸分子またはｍＶＥＧＦＲ−２核酸配列に相補的なアンチセンス核酸も企図される。
【０２９４】
アプタマーは、例えば、ＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦ−ＡならびにＰＤＧＦＲとＰＧＤＦなど受容体とその同族リガンドの相互作用を干渉するための別の核酸ベースの方法である。アプタマーは、他の分子に結合する能力に基づいてランダムなプールから選択されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。核酸、タンパク質、小さな有機化合物、さらには生物全体に結合するアプタマーが選択されている。アプタマーを同定および作製するための方法および組成物は、当業者に公知であり、例えば、その内容全体がそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８４０，８６７号明細書および米国特許第５，５８２，９８１号明細書に記載されている。
【０２９５】
コンビナトリアル科学の分野の最近の進歩により、所与の標的に対して高い親和性および特異性を有する短いポリマー配列が同定されている。例えば、ＳＥＬＥＸ技術を用いて、哺乳動物抗体と競合する結合特性を有するＤＮＡおよびＲＮＡのアプタマーを同定することができ、免疫学の分野では、多種多様の化合物に結合する抗体または抗体フラグメントが作製および単離されており、またファージディスプレイを利用して、極めて好ましい結合特性を有する新規ペプチド配列が発見されている。これらの分子進化技術の成功に基づいて、確かに、任意の標的分子に結合する分子を生成させることができる。相補的な塩基対形成のない短い領域から生成するヘアピンループを利用することが多いアプタマー、ループ状超可変領域のコンビナトリアル配列を利用する、天然由来の抗体、および直鎖状ペプチドのファージディスプレイ結果に比較すると、改善された結果を示している環状ペプチドを利用する新規ファージディスプレイライブラリーの場合のように、ループ構造は、多くの場合、所望の結合属性の提供に関与する。したがって、高親和性リガンドがコンビナトリアル分子進化技術によって作製および同定され得ることを示唆する十分な証拠が得られている。本発明のために、分子進化技術を用いて、本明細書に記載するリガンドに特異的なリガンド結合分子を単離することができる。アプタマーに関する詳細について、全般的には、Ｇｏｌｄ，Ｌ．，Ｓｉｎｇｅｒ，Ｂ．，Ｈｅ，Ｙ．Ｙ．，Ｂｒｏｄｙ．Ｅ．，“Ａｐｔａｍｅｒｓ  Ａｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，”Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：５−１３（２０００）を参照されたい。アプタマーを作製するための関連技術は、その内容全体が参照により組み込まれる米国特許第６，６９９，８４３号明細書に見出すことができる。
【０２９６】
一部の実施形態では、アプタマーは、核酸ライブラリーを準備することと、核酸ライブラリーを増殖因子と接触させることにより作製することができ、増殖因子に対して（他のライブラリー核酸に比較して）より高い結合親和性を有する核酸を選択し増幅して、増殖因子への結合に対して相対的に高い親和性および特異性を有する核酸が濃縮された核酸の混合物を得る。このプロセスは反復することができ、選択された核酸を突然変異させて再スクリーニングし、それによって増殖因子アプタマーを同定する。
【０２９７】
さらに別の変更形態では、ＶＥＧＦ−Ａ阻害剤製剤は、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦＲ−２へのＶＥＧＦ結合を阻害する、ＶＥＧＦＲ−１の可溶性ＥＣＤフラグメントを含む。ＶＥＧＦＲ−１のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、配列番号１０および１１に示す。ＶＥＧＦＲ−１の例示的なＥＣＤフラグメントは、米国特許出願公開第２００６／００３００００号明細書および国際公開第２００５／０８７８０８号パンフレットに記載されており、これらの開示は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９８】
抗炎症剤
別の実施形態では、本明細書に記載する方法は、任意選択で、１つまたは複数の抗炎症剤を被験体に投与することを含む。一部の実施形態では、抗炎症剤およびリガンド結合分子は、単一組成物で同時投与される。他の実施形態では、抗炎症剤は、リガンド結合分子とは別個の組成物として投与される。リガンド結合分子、ＶＥＧＦ−Ａ阻害剤製剤、および抗炎症剤を含む組合せが、具体的に企図される。本明細書で使用する場合、「抗炎症剤」という用語は、一般に、被験体の炎症または腫脹を軽減する任意の薬剤を指す。いくつかの例示的な抗炎症剤を本明細書に列挙するが、本明細書に具体的には列挙されないが本明細書に包含される、さらなる適切な抗炎症剤があり得ることは認識されよう。
【０２９９】
一変形形態では、抗炎症剤は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である。代表的なＮＳＡＩＤとしては、以下に限定されるものではないが、アスピリン、スルファサラジン（商標）、アサコール（商標）、ジペンドタム（Ｄｉｐｅｎｄｔｕｍ）（商標）、ペンタサ（商標）、アナプロックス（商標）、アナプロックスＤＳ（商標）（ナプロキセンナトリウム）；アンセイド（商標）（フルルビプロフェン）；オルソテック（商標）（ジクロフェナクナトリウム＋ミソプロスチル（ｍｉｓｏｐｒｏｓｔｉｌ））；カタフラム（商標）／ボルタレン（商標）（ジクロフェナクカリウム）；クリノリル（商標）（スリンダク）；デイプロ（Ｄａｙｐｒｏ）（商標）（オキサプロジン）；ジサルシド（Ｄｉｓａｌｃｉｄ）（商標）（サルサラート）；ドロビッド（Ｄｏｌｏｂｉｄ）（商標）（ジフルニサル）；ＥＣナプロシン（商標）（ナプロキセンナトリウム）；フェルデン（商標）（ピロキシカム）；インドシン（商標）、インドシンＳＲ（商標）（インドメタシン）；ロディン（Ｌｏｄｉｎｅ）（商標）、ロディンＸＬ（商標）（エトドラック）；モトリン（商標）（イブプロフェン）；ナプレラン（Ｎａｐｒｅｌａｎ）（商標）（ナプロキセン）；ナプロシン（商標）（ナプロキセン）；オルヂス（商標）（ケトプロフェン）；オルベール（Ｏｒｕｖａｉｌ）（商標）（ケトプロフェン）；レラフェン（Ｒｅｌａｆｅｎ）（商標）（ナブメトン）；トレクティン（商標）（トルメチンナトリウム）、；トリリセート（Ｔｒｉｌｉｓａｔｅ）（商標）（トリサリチル酸コリンマグネシウム）；Ｃｏｘ−１阻害剤；ビオックス（商標）（ロフェコキシブ）などのＣｏｘ−２阻害剤；アルコキシア（Ａｒｃｏｘｉａ）（商標）（エトリコキシブ）、セレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）（商標）（セレコキシブ）；モービック（商標）（メロキシカム）；ベクストラ（商標）（バルデコキシブ）、ダイナスタット（Ｄｙｎａｓｔａｔ）（商標）パラコキシブナトリウム）；プレキサイジ（Ｐｒｅｘｉｇｅ）（商標）（ルミラコキシブ）、およびナンブメトン（ｎａｍｂｕｍｅｔｏｎｅ）が挙げられる。さらなる適切なＮＳＡＩＤとしては、これらに限定されないが、下記のものが挙げられる：５−アミノサリチル酸（ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ  ａｃｉｄ）（５−ＡＳＡ、メサラミン、レサラジン（ｌｅｓａｌａｚｉｎｅ））、ε−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、アニトラザフェン（ａｎｉｔｒａｚａｆｅｎ）、アントラフェニン（ａｎｔｒａｆｅｎｉｎｅ）、ベンダザック、ベンダザックリシネート、ベンジダミン、ベプロジン（ｂｅｐｒｏｚｉｎ）、ブロペラモール（ｂｒｏｐｅｒａｍｏｌｅ）、ブコローム、ブフェゾラック（ｂｕｆｅｚｏｌａｃ）、シプロクアゾン（ｃｉｐｒｏｑｕａｚｏｎｅ）、クロキシマート、ダジダミン（ｄａｚｉｄａｍｉｎｅ）、デボキサメット（ｄｅｂｏｘａｍｅｔ）、デトミジン（ｄｅｔｏｍｉｄｉｎｅ）、ジフェンピラミド、ジフェンピラミド（ｄｉｆｅｎｐｙｒａｍｉｄｅ）、ジフィサラミン（ｄｉｆｉｓａｌａｍｉｎｅ）、ジタゾール（ｄｉｔａｚｏｌ）、エモルファゾン、ファネチゾールメシレート（ｆ��ｎｅｔｉｚｏｌｅ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）、フェンフルミゾール（ｆｅｎｆｌｕｍｉｚｏｌｅ）、フロクタフェニン、フルミゾール（ｆｌｕｍｉｚｏｌｅ）、フルニキシン、フルプロクアゾン（ｆｌｕｐｒｏｑｕａｚｏｎｅ）、ホピルトリン（ｆｏｐｉｒｔｏｌｉｎｅ）、ホスホサル（ｆｏｓｆｏｓａｌ）、グアイメサール、グアイアゾレン（ｇｕａｉａｚｏｌｅｎｅ）、イソニキシルン（ｉｓｏｎｉｘｉｒｎ）、レフェタミンＨＣｌ、レフルノミド、ロフェミゾール（ｌｏｆｅｍｉｚｏｌｅ）、ロティファゾール（ｌｏｔｉｆａｚｏｌｅ）、リジンクロニキシネート（ｌｙｓｉｎ  ｃｌｏｎｉｘｉｎａｔｅ）、メセクラゾン（ｍｅｓｅｃｌａｚｏｎｅ）、ナブメトン、ニクチンドール（ｎｉｃｔｉｎｄｏｌｅ）、ニメスリド、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサセプロルム（ｏｘａｃｅｐｒｏｌｍ）、オキサパドール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、クエン酸ペリソキサール、ピフォキシム（ｐｉｆｏｘｉｍｅ）、ピプロキセン（ｐｉｐｒｏｘｅｎ）、ピラゾラック（ｐｉｒａｚｏｌａｃ）、ピルフェニドン、プロカゾン、プロキサゾール、チエラビンＢ（ｔｈｉｅｌａｖｉｎ  Ｂ）、チフラミゾール（ｔｉｆｌａｍｉｚｏｌｅ）、チメガジン（ｔｉｍｅｇａｄｉｎｅ）、トレクティン、トルパドール（ｔｏｌｐａｄｏｌ）、トリプタミド（ｔｒｙｐｔａｍｉｄ）、ならびに４８０１５６Ｓ、ＡＡ８６１、ＡＤ１５９０、ＡＦＰ８０２、ＡＦＰ８６０、ＡＩ７７Ｂ、ＡＰ５０４、ＡＵ８００１、ＢＰＰＣ、ＢＷ５４０Ｃ、ＣＨＩＮＯＩＮ、ＣＮ１００、ＥＢ３８２、ＥＬ５０８、Ｆ１０４４、ＦＫ−５０６、ＧＶ３６５８、ＩＴＦ１８２、ＫＣＮＴＥＩ６０９０、ＫＭＥ４、ＬＡ２８５１、ＭＲ７１４、ＭＲ８９７、ＭＹ３０９、ＯＮＯ３１４４、ＰＲ８２３、ＰＶ１０２、ＰＶ１０８、Ｒ８３０、ＲＳ２１３１、ＳＣＲ１５２、ＳＨ４４０、ＳＩＲ１３３、ＳＰＡＳ５１０、ＳＱ２７２３９、ＳＴ２８１、ＳＹ６００１、ＴＡ６０  １２７、ＴＡＩ−９０１（４−ベンゾイル−１−インダンカルボン酸）、ＴＶＸ２７０６、Ｕ６０２５７、ＵＲ２３０１、およびＷＹ４１７７０などの企業コード番号によって命名されるもの。
【０３００】
別の変更形態では、抗炎症剤は、炎症性サイトカインとその受容体との相互作用を阻害する化合物を含む。本発明の特異的結合薬剤との併用で有用なサイトカイン阻害剤の例としては、例えば、ＴＧＦのアンタゴニスト（抗体など）（例えば、レミケード）、および炎症に関与するインターロイキンに向けられたアンタゴニスト（抗体など）が挙げられる。そのようなインターロイキンは本明細書に記載され、好ましくは、以下に限定されるものではないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ  ６、ＩＬ  ８、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、およびＩＬ−１８を含む。Ｆｅｇｈａｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉ．，２：１２−２６（１９９７）を参照されたい。
【０３０１】
別の変形形態では、抗炎症剤はコルチコステロイドである。例示的なコルチコステロイドとしては、以下にに限定されるものではないが、ジフロロアソンジアセテート（ｄｉｆｌｏｒｏａｓｏｎｅ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ）、プロピオン酸クロベタゾール、プロピオン酸ハロベタゾール、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、フルオシノニド、ハルシノニド  デソキマタゾン（ｄｅｓｏｘｉｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、トリアムシノロン、プロピオン酸フルチカゾン、フルオシノロンアセトニド、フルランドレノロン、フランカルボン酸モメタゾン、ベタメトゾン（ｂｅｔａｍｅｔｈｏｓｏｎｅ）、プロピオン酸フルチカゾン、フルオシノロンアセトニド、アクロメタゾンジプロピオネート（ａｃｌｏｍｅｔａｓｏｍｅ  ｄｉｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアミシノロン（ｔｒｉａｍｉｃｉｎｏｌｏｎｅ）、デソニド、およびヒドロコルチゾンが挙げられる。
【０３０２】
別の変更形態では、抗炎症剤はサイクロスポリンである。
【０３０３】
抗生物質
別の実施形態では、本明細書に記載する方法は、任意選択で、抗生物質を被験体に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、抗生物質およびリガンド結合分子は、単一組成物で同時投与される。他の実施形態では、抗生物質は、リガンド結合分子とは別個の組成物として投与される。例示的な抗生物質としては、以下に限定されるものではないが、テトラサイクリン、アミノグリコシド、ペニシリン、セファロスポリン、スルホンアミド薬、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、エリスロマイシン、バンコマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、ナイスタチン、アンホテリシンＢ、アマンチジン、イドクスウリジン、ｐ−アミノサリチル酸、イソニアジド、リファンピン、アンチノマイシンＤ、ミトラマイシン、ダウノマイシン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、およびイミダゾールカルボキサミドが挙げられる。
【０３０４】
チロシンキナーゼ阻害剤
別の実施形態では、本明細書に記載する方法は、任意選択で、ＶＥＧＦＲ−２および／またはＶＥＧＦＲ−３活性を阻害するチロシンキナーゼ阻害剤を投与することをさらに含む。
【０３０５】
本明細書に記載する方法で使用される例示的なチロシンキナーゼ阻害剤としては、以下に限定されるものではないが、ＡＥＥ７８８（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−２、ＥＧＦＲ：Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＺＤ６４７４（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３、ＥＧＦＲ：ザクチマ（Ｚａｃｔｉｍａ）：ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＡＺＤ２１７１（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２：ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＳＵ  １１２４８（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、ＰＤＧＦＲ：スニチニブ：Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＧ１３９２５（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２：Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＧ０１３７３６（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２：Ｐｆｉｚｅｒ）；ＣＥＰ−７０５５（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、および−３：Ｃｅｐｈａｌｏｎ）；ＣＰ−５４７，６３２（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２：Ｐｆｉｚｅｒ）；ＧＷ７Ｓ６０２４（ＴＫＬ  ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３：ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ＧＷ７８６０３４（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３：ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ソラフェニブ（ＴＫＩ、Ｂａｙ４３−９００６、ＶＥＧＦＲ−１、−２、ＰＤＧＦＲ：Ｂａｙｅｒ／Ｏｎｙｘ）；ＳＵ４３１２（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−２、ＰＤＧＦＲ：Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＭＧ７０６（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３：Ａｍｇｅｎ）；ＸＬ６４７（ＴＫＩ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＶＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ４：Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）；ＸＬ９９９（ＴＫｌ、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、Ｆｌｌ−３：Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）；ＰＫＣ４１２（ＴＫＩ、ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲ、ＰＫＣ、ＦＬＴ３、ＶＥＧＦＲ−２：Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＡＥＥ７８８（ＴＫＩ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ−１：Ｎｏｖａｒｔｉｓ）：ＯＳＩ−０３０（ＴＫＩ、ｃ−ｋｉｌ、ＶＥＧＦＲ：ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＯＳ１−８１７（ＴＫＩ  ｃ−ｋｉｔ、ＶＥＧＦＲ：ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＤＭＰＱ（ＴＫＩ、ＥＲＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＥｒｂＢ２．ｐ５６．ｐｋＡ、ｐｋＣ）；ＭＬＮ５１８（ＴＫＩ、Ｆｌｔ３、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ（Ｔ５３５１８：Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；レスタウリニブ（ｌｅｓｔａｕｒｉｎｉｂ）（ＴＫＩ、ＦＬＴ３、ＣＥＰ−７０１、Ｃｅｐｈａｌｏｎ）；ＺＤ  １８３９（ＴＫＩ、ＥＧＦＲ：ゲフィチニブ、イレッサ：ＡｓｔｒａＺｃｎｅｃａ）；ＯＳＩ−７７４（ＴＫＩ、ＥＧＦＲ：エルロチニブ（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｎｂ）：タルセバ：ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ラパチニブ（ＴＫＩ、ＥｒｂＢ−２、ＥＧＦＲ、およびＧＤ−２０１６：タイケルブ：ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）が挙げられる。
【０３０６】
一部の実施形態では、本明細書に記載する方法は、血管新生を阻害するチロシンキナーゼ阻害剤を被験体に投与することをさらに含む。例示的な抗血管新生チロシンキナーゼは阻害しおよびその標的を下記の表２に示す。
2019023198.tif 000007
【０３０７】
リガンド結合分子は、２つ以上の追加の活性化合物または治療と併用して投与することができる。一実施形態では、本発明のリガンド結合分子は、ＰＤＧＦ阻害剤製剤およびＶＥＧＦ−Ａ阻害剤製剤と併用して投与される。例えば、リガンド結合分子（配列番号３のアミノ酸配列を含むものなど）は、（ｉ）アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））、および（ｉｉ）ＰＤＧＦＲ抗体（眼の適応症についてＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｉｎｃ．により開発されているものなど）と併用して、またはＰＤＧＦアパタマー（眼の適応症についてＯｐｈｔｈｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．により開発されているＥ１００３０（Ｆｏｖｉｓｔａ（商標））など）と併用して投与することができる。
【０３０８】
併用療法の投与
本明細書に記載する追加の活性薬剤の１つまたは複数との併用療法は、リガンド結合分子および１つまたは複数の追加の活性薬剤を含む単一の組成物もしくは医薬製剤を被験体に投与することによって、または２つ（またはそれを超える数）の別個の組成物もしくは製剤（１つの組成物はリガンド結合分子を含み、他の組成物は追加の活性薬剤を含む）を同時に被験体に投与することによって達成することができる。
【０３０９】
あるいは、本明細書に記載するリガンド結合分子を用いる併用療法は、数分から数週間の範囲の間隔を置いて、第２の薬剤に先行してまたはその後に投与してもよい。第２の薬剤およびリガンド結合分子が別々に投与される実施形態では、一般に、薬剤およびリガンド結合分子が依然として有利に併用効果を発揮することができるように、各送達時間の間の意味ある時間が終了していないことを確認することになろう。そのような例では、互いの約１２〜２４時間以内に、より好ましくは互いの６〜１２時間以内に、最も好ましくは約１２時間ほどの遅延時間で、両方の治療を施すことが企図される。一部の状況では、しかしながら、それぞれの投与の間に数日（２、３、４、５、６、または７日）〜数週間（１、２、３、４、５、６、または８週間）が経過する場合、治療期間を顕著に延長することが望ましいことがある。一方または両方の薬剤による反復治療が具体的に企図される。
【０３１０】
製剤および薬学的に許容される担体
本発明はまた、本発明のリガンド結合分子を含む医薬組成物を提供する。そのような組成物は、治療有効量の１つまたは複数のリガンド結合分子および薬学的に許容される担体を含む。一実施形態では、そのような組成物は、１つまたは複数のリガンド結合分子および任意選択で、１つまたは複数の追加の活性薬剤（併用療法の場合）を含む。一実施形態では、そのような組成物は、１つまたは複数のリガンド結合分子ならびに任意選択でＰＤＧＦ阻害剤製剤およびＶＥＧＦ−Ａ阻害剤製剤から選択される１つまたは複数の追加の活性薬剤を含む。別の実施形態では、本発明の１つまたは複数のリガンド結合分子を含む組成物と、ＰＤＧＦ阻害剤製剤またはＶＥＧＦ−Ａ阻害剤製剤を含む別の組成物とが投与される。
【０３１１】
「医薬として許容される」という用語は、動物およびより具体的にはヒトにおける使用に対して、連邦政府もしくは州政府の規制当局により承認されたもの、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に収載されたものを意味する。「担体」という用語は、治療薬と一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は、水、および例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等の、鉱油、動物、植物、または合成起源のものを含む油などの滅菌液体であってもよい。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。本組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤をさらに含むことができる。
【０３１２】
組成物は、溶液、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、ヒドロゲル剤を含むゲル剤、ペースト剤、軟膏剤、クリーム剤、送達装置、除放製剤、坐剤、注射剤、インプラント、噴霧剤、点眼剤、エアゾール剤等の形態であってもよい。リガンド結合分子、１つもしくは複数の追加の活性薬剤、またはその両方を含む組成物は、従来の医薬手段に従って製剤化することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，（第２０版）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．およびＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，編者Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８−２００２，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。
【０３１３】
特定の疾患または障害の治療または予防に有効なリガンド結合分子および／または追加の活性薬剤の量をもたらす任意の適切な手段によって、組成物を投与することができる。各リガンド結合分子は、例えば、適切な担体物質と混合することができ、一般に、組成物の総重量の１〜９５重量％の量で存在する。組成物は、点眼、経口、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、皮下）、直腸、経皮、経鼻、または吸入による投与に適した剤形で提供することができる。一実施形態では、組成物は、眼への直接注射に適した形態である。
【０３１４】
本発明のリガンド結合分子および併用療法の場合には１つまたは複数の追加の活性薬剤は、中性形態または塩形態として製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するものなど、遊離アミノ基と形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものなど、遊離カルボキシル基と形成されるものが挙げられる。
【０３１５】
本発明のリガンド結合分子および追加の活性薬剤は、いくつかの無機酸および有機酸の何れかと反応して薬学的に許容される塩を形成し得る十分塩基性の官能基を有し得る。当技術分野で周知のように、薬学的に許容される酸付加塩は薬学的に許容される酸から形成される。そのような塩には、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２−１９（１９７７）およびＴｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ．Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（編），Ｖｅｒｌａｇ，Ｚｕｒｉｃｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２００２に収戴されている薬学的に許容される塩が含まれる。
【０３１６】
薬学的に許容される塩としては、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコビル酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカル酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、樟脳スルホン酸塩、パモ酸塩、フェニル酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アエリレート（ａｅｒｙ  ｌａｔｅ）、クロロ安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ｏ−アセトキシ安息香酸塩、ナフタレン−２−安息香酸塩、イソ酪酸塩、フェニル酪酸塩、α−ハイドロキシ酪酸塩、ブチン−１，４−ジカルボン酸塩、ヘキシン−１，４−ジカルボン酸塩、カプリン酸塩、カプリル酸塩、桂皮酸塩、グリコール酸塩、ヘプタン酸塩、馬尿酸塩、リンゴ酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、ニコチン酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、プロピオル酸塩、プロピオン酸塩、フェニルプロピオン酸、セバシン酸塩、スベリン酸塩、ｐ−ブロモベンゼンスルホン酸塩、クロロベンゼンスルホン酸塩、エチルスルホン酸塩、２−ヒドロキシエチルスルホン酸塩、メチルスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、ナフタレン−１，５−スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、および酒石酸塩が挙げられる。
【０３１７】
「薬学的に許容される塩」という用語はまた、カルボン酸官能基などの酸性官能基を有するリガンド結合分子および追加の活性薬剤と塩基との塩を指す。適切な塩基としては、以下に限定されるものではないが、ナトリウム、カリウム、およびリチウムなどのアルカリ金属の水酸化物；カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物；アルミニウムおよび亜鉛などの他の金属の水酸化物；アンモニア、および有機アミン、例えば、無置換またはヒドロキシ置換モノ−、ジ−、またはトリ−アルキルアミン、ジシクロヘキシルアミン；トリブチルアミン；ピリジン；Ｎ−メチル、Ｎ−エチルアミン；ジエチルアミン；トリエチルアミン；モノ−、ビス−、またはトリス−（２−ＯＨ−低級アルキルアミン）、例えば、モノ−、ビス−、またはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、２−ヒドロキシ−ｔｅｒｔ−ブチルアミン、またはトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｎ、Ｎ−ジ−低級アルキル−Ｎ（ヒドロキシル−低級アルキル）−アミン、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミンまたはトリ−（２−ヒドロキシエチル）アミン；Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン；ならびにアミノ酸、アルギニン、リジン等が挙げられる。「薬学的に許容される塩」という用語はまた、本発明の化合物の水和物を含む。
【０３１８】
組成物は、有用な一態様では、非経口的に（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、眼内、硝子体内、眼球後、結膜下、眼球鞘下、もしくは皮下への注射またはインプラントによって）または全身に投与される。非経口投与または全身投与の製剤としては、滅菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、または乳剤が挙げられる。種々の水性担体、例えば、水、緩衝水溶液、生理食塩水等を使用することができる。他の適切なビヒクルの例としては、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、ゼラチン、ヒドロゲル、水素化ナファレン（ｎａｐｈａｌｅｎｅ）、およびオレイン酸エチルなど注射可能な有機エステルが挙げられる。そのような製剤はまた、保存剤、湿潤剤、緩衝剤、乳化剤、および／または分散剤などの補助物質を含有することができる。生体適合性、生分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは、有効成分の放出を制御するために用いることができる。
【０３１９】
あるいは、組成物は経口摂取により投与することができる。経口使用を意図した組成物は、医薬組成物の製造技術分野で公知の任意の方法に従って、固体形態または液体形態で調製することができる。
【０３２０】
経口投与のための固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤が挙げられる。一般に、これらの医薬品は、無毒な薬学的に許容される賦形剤と混合した有効成分を含有する。これらの例としては、不活性な希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、セルロース、デンプン、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム、カオリン等が挙げられる。結合剤、緩衝剤、および／または平滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）も用いることができる。さらに、腸溶性コーティングした錠剤および丸剤を調製することができる。組成物は、任意選択で、より美味な調製物を提供するために、甘味料、調味料、着色料、香料、および保存料を含有することができる。
【０３２１】
固体剤形は眼障害の治療に有用になり得る。眼使用に有用な組成物には、薬学的に許容される賦形剤との混合で１つまたは複数のリガンド結合分子を含む錠剤が含まれる。これらの賦形剤は、例えば、不活性な希釈剤または充填剤（例えば、スクロースおよびソルビトール）、平滑剤、流動促進剤、および抗接着剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素添加植物油、またはタルク）であってよい。
【０３２２】
本発明の組成物は、眼の硝子体内注射によって、また結膜下および眼球鞘下注射によって眼内投与することができる。他の投与経路としては、経強膜、眼球後、腹腔内、筋肉内、および静脈内が挙げられる。あるいは、組成物は薬物送達装置または眼内インプラントを用いて投与することができる。
【０３２３】
経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容される乳剤、溶液、懸濁液、シロップ剤、およびゼラチンカプセル剤が挙げられる。これらの剤形は、水または油媒体など、当技術分野で一般に知られている不活性な希釈剤を含有することができ、湿潤剤、乳化剤、および懸濁剤などの補助剤を含むこともできる。
【０３２４】
一部の例では、組成物はまた、例えば、パッチによって、または血管新生障害に感受性のあるもしくはそれに冒されている上皮もしくは眼などの部位への直接適用によって、あるいはイオン導入法によって局所的に投与することができる。
【０３２５】
本発明の併用療法の場合には、リガンド結合分子および１つまたは複数の追加の活性薬剤は、錠剤または他のビヒクルの中で混合してもよく、または分割してもよい。一例では、含有されるリガンド結合分子の放出前に追加の活性薬剤が放出されるように、リガンド結合分子は錠剤の内部に、追加の活性薬剤はその外側に含有される。
【０３２６】
一実施形態では、リガンド結合分子（および任意選択で１つまたは複数の追加の活性薬剤）を含む組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。一実施形態では、そのような賦形剤としては、以下に限定されるものではないが、緩衝剤、非イオン性界面活性剤、防腐剤、等張化剤、アミノ酸、糖、およびｐＨ調整剤が挙げられる。適切な緩衝剤としては、以下に限定されるものではないが、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、および酢酸ナトリウムが挙げられる。適切な非イオン性界面活性剤としては、以下に限定されるものではないが、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが挙げられる。適切な防腐剤としては、以下に限定されるものではないが、ベンジルアルコールが挙げられる。適切な等張化剤としては、以下に限定されるものではないが、塩化ナトリウム、マンニトール、およびソルビトールが挙げられる。適切な糖としては、以下に限定されるものではないが、α，α−トレハロース脱水物が挙げられる。適切なアミノ酸としては、以下に限定されるものではないが、グリシンおよびヒスチジンが挙げられる。適切なｐＨ調整剤としては、以下に限定されるものではないが、塩酸、酢酸、および水酸化ナトリウムが挙げられる。一実施形態では、ｐＨ調整剤は、約３〜約８、約４〜約７、約５〜約６、約６〜約７、または約７〜約７．５のｐＨを提供するために有効な量で与えられる。一実施形態では、リガンド結合分子を含む組成物は防腐剤を含まない。別の実施形態では、リガンド結合分子を含む組成物は抗微生物剤を含まない。別の実施形態では、リガンド結合分子を含む組成物は静菌剤を含まない。
【０３２７】
一実施形態では、リガンド結合分子（および任意選択で１つまたは複数の追加の活性薬剤）を含む組成物は、注射に適した水溶液の形態である。一実施形態では、組成物は、リガンド結合分子、緩衝剤、ｐＨ調整剤、および注射用水を含む。別の実施形態では、組成物は、リガンド結合分子、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、塩酸、および水酸化ナトリウムを含む。別の実施形態では、組成物は、リガンド結合分子、リン酸塩（例えば、リン酸二水素ナトリウム）、トレハロース、塩化ナトリウム、およびポリソルベートを含む。
【０３２８】
眼に関して本発明の方法を実施するために有用な水性組成物は、眼に適合するｐＨおよび重量オスモル濃度を有する。１つまたは複数の眼に許容されるｐＨ調整剤および／または緩衝剤、例えば、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、および塩酸などの酸；水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、および乳酸ナトリウムなどの塩基；ならびにクエン酸塩／デキストロース、炭酸水素ナトリウム、および塩化アンモニウムなどの緩衝剤は、本発明の組成物に含むことができる。そのような酸、塩基、および緩衝剤は、眼に許容される範囲に組成物のｐＨを維持するために必要な量で含まれる。１つまたは複数の眼に許容される塩は、眼に許容される範囲に組成物の重量オスモル濃度をもたらすために十分な量で組成物に含むことができる。そのような塩としては、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウムのカチオン、および塩化物、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、または亜硫酸水素塩のアニオンを有するものが挙げられる。
【０３２９】
一部の実施形態では、本発明のリガンド結合分子を含む組成物は、被験体の眼への送達用に製剤化される。適切な眼科用担体は、当業者に公知であり、そのような従来の担体はすべて本発明で用いることができる。眼組織または付属器組織への局所組成物の経皮送達を促進および推進するために組み込まれる例示的な化合物としては、以下に限定されるものではないが、アルコール（エタノール、プロパノール、およびノナノール）、脂肪アルコール（ラウリルアルコール）、脂肪酸（吉草酸、カプロン酸、およびカプリン酸）、脂肪酸エステル（ミリスチン酸イソプロピルおよびｎ−ヘキサン酸イソプロピル）、アルキルエステル（酢酸エチルおよび酢酸ブチル）、ポリオール（プロピレングリコール、プロパンジオン、およびヘキサントリオール）、スルホキシド（ジメチルスルホキシドおよびデシルメチルスルホキシド）、アミド（尿素、ジメチルアセトアミド、およびピロリドン誘導体）、界面活性剤（ラウリル硫酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ポラキサマー（ｐｏｌａｘａｍｅｒ）、スパン、トゥイーン、胆汁酸塩、およびレシチン）、テルペン（ｄ−リモネン、α−テルペノール、１，８−シネオール、およびメントン）、ならびにアルカノン（Ｎ−ヘプタンおよびＮ−ノナン）が挙げられる。さらに、局所投与される組成物は、以下に限定されるものではないが、カドヘリンアンタゴニスト、セレクチンアンタゴニスト、およびインテグリンアンタゴニストを含む、表面接着分子調節剤を含む。したがって、特定の担体は、滅菌の眼軟膏、クリーム、ゲル、溶液、または分散液の形態を取り得る。適切な眼科用担体として含まれるものには、除放性ポリマー、例えば「Ｏｃｕｓｅｒｔ」ポリマー、「Ｈｙｄｒｏｎ」ポリマー等もある。
【０３３０】
本製剤で用いることができる例示的な眼科用粘性促進剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム；メチルセルロース；ヒドロキシプロピルセルロース；ヒドロキシプロピルメチルセルロース；ヒドロキシエチルセルロース；ポリエチレングリコール３００；ポリエチレングリコール４００；ポリビニルアルコール；およびプロビドンが挙げられる。
【０３３１】
ビーガム、アルギネート、キサンタンガム、ゼラチン、アラビアゴム、およびトラガカントなど、天然物の一部も、点眼液の粘性を増大させるために用いることができる。
【０３３２】
低張の点眼剤は角膜の浮腫を引き起こし、高張の点眼剤は角膜の変形を引き起こすので、浸透圧は重要である。理想的な浸透圧は、約３００ｍＯｓＭである。浸透圧は、当業者に公知のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙに記載の方法によって達成することができる。
【０３３３】
安定剤、例えばキレート剤、例えばＥＤＴＡなども用いることができる。抗酸化剤、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、８−ヒドロキシキノリン、またはアスコルビン酸も用いることができる。滅菌状態は、典型的には、従来の眼科用防腐剤、例えば、水性製剤についてはチオルブタノール（ｃｈｉｏｒｂｕｔａｎｏｌ）、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、フェニル第二水銀塩、チメロサール等によって維持され、これらは、無毒であり、かつ一般に、水溶液の約０．００１〜約０．１重量％の範囲で変動する量で用いられる。軟膏剤用の従来の防腐剤としては、メチルパラベンおよびプロピルパラベンが挙げられる。典型的な軟膏基剤としては、白色ワセリン、鉱油、または流動パラフィンが挙げられる。しかしながら、防腐済み水性担体が好ましい。溶液は、適切な剤形（例えば点眼剤）で眼に手作業で送達することも、典型的には一定量の薬剤を供給する、適切な微小滴または噴霧装置により送達することもできる。適切な眼科用担体の例としては、微量、すなわち約５重量％未満でヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、グリセリン、およびＥＤＴＡを含有する、滅菌状態で実質的に等張の水溶液が挙げられる。溶液は、好ましくは、従来の緩衝剤（例えば、リン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、トリス）の適切な量によって、実質的に中性のｐＨでかつ等張に維持される。
【０３３４】
一部の実施形態では、浸透促進剤が眼科用担体に加えられる。
【０３３５】
目的とする治療用途に有効となるリガンド結合分子の量は、本明細書に基づく標準的な臨床技術により決定することができる。加えて、任意選択で、最適な投薬量範囲の同定を補助するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いることができる。単回投薬量を生成するために担体物質と混合されるリガンド結合分子の量は、治療される哺乳動物および特定の投与方法に応じて異なり得る。
【０３３６】
リガンド結合分子の投薬量は、症状の重症度、症状の治療であるか予防であるか、ならびに治療される人の年齢、体重、および健康状態を含む、いくつかの要因に依存し得る。加えて、特定の患者に関する薬理ゲノミクス（治療剤の薬物動態学、薬力学、または効力プロファイルに対する遺伝子型の影響）情報が、使用される投薬量に影響を与える場合もある。さらに、正確な個体投薬量は、施される特定の併用療法、投与時間、投与経路、製剤の性質、排泄速度、治療される特定の疾患（例えば、治療される特定の眼障害）、障害の重症度、および血管新生障害の解剖学的位置を含む、種々の要因に応じていくぶん調節することができる。投薬量のある程度の変動は予想され得る。
【０３３７】
一般に、哺乳動物に経口投与される場合、本発明のリガンド結合分子の投薬量は、通常、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、または０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日である。一般に、ヒトに経口投与される場合、本発明のアンタゴニストの投薬量は、通常、１日当たり０．００１ｍｇ〜３００ｍｇ、１日当たり１ｍｇ〜２００ｍｇ、または１日当たり５ｍｇ〜５０ｍｇである。１日当たり２００ｍｇまでの投薬量が必要になる場合もある。
【０３３８】
非経口注射による本発明のアンタゴニストの投与については、投薬量は、通常、１日当たり０．１ｍｇ〜２５０ｍｇ、１日当たり１ｍｇ〜２０ｍｇ、または１日当たり３ｍｇ〜５ｍｇである。注射は、毎日４回まで行うことができる。
【０３３９】
一般に、経口的または非経口的に投与される場合、本発明で使用されるリガンド結合分子の投薬量は、通常、１日当たり０．１ｍｇ〜１５００ｍｇ、または１日当たり０．５ｍｇ〜１０ｍｇ、または１日当たり０．５ｍｇ〜５ｍｇである。１日当たり３０００ｍｇまでの投薬量を投与することができる。
【０３４０】
ヒトに対して眼科的に、例えば硝子体内に投与される場合、１投与当たり１眼当たりのリガンド結合分子の投薬量は、通常、０．００３ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．１ｍｇ、もしくは０．５ｍｇ〜５．０ｍｇ、４ｍｇ、３ｍｇ、２ｍｇ、もしくは１ｍｇの範囲、または０．５ｍｇ〜１．０ｍｇである。リガンド結合分子の投薬量は、通常、１投与当たり１眼当たり０．００３ｍｇ〜５．０ｍｇ、または１投与当たり１眼当たり０．０３ｍｇ〜４．０ｍｇ、または１投与当たり１眼当たり０．１ｍｇ〜４．０ｍｇ、または１投与当たり１眼当たり０．０３ｍｇ〜３．０ｍｇ、または１投与当たり１眼当たり０．１ｍｇ〜３．０ｍｇ、または１投与当たり１眼当たり０．１ｍｇ〜１．０ｍｇ、または１投与当たり１眼当たり０．５ｍｇ〜４．０ｍｇ、または１投与当たり１眼当たり０．５ｍｇ〜３．０ｍｇ、１投与当たり１眼当たり０．５ｍｇ〜２．０ｍｇ、または１投与当たり１眼当たり１．０ｍｇ〜４．０ｍｇ、または１投与当たり１眼当たり１．０ｍｇ〜３．０ｍｇ、または１投与当たり１眼当たり１．０ｍｇ〜２．０ｍｇの範囲である。一部の実施形態では、リガンド結合分子は、１眼当たり１投与当たり約１ｍｇ、または約２ｍｇ、または約３ｍｇ、または約４ｍｇ、または約５ｍｇ、または約６ｍｇの濃度で投与される。リガンド結合分子は、一部の実施形態では、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、６０μｌ、７０μｌ、８０μｌ、９０μｌ、９５μｌ、または１００μｌの容量で、上記に記載の濃度の何れかで存在する。一部の実施形態では、リガンド結合分子は、約２〜４ｍｇ／５０μｌの濃度で投与される。投薬容量は、１眼当たり０．０１ｍＬ〜０．２ｍＬ投与、または０．０３ｍＬ〜０．１５ｍＬ投与、または０．０５ｍＬ〜０．１０ｍＬ投与の範囲とすることができる。
【０３４１】
一部の実施形態では、硝子体内注射により投与される場合、リガンド結合分子は、１眼当たり約２ｍｇ〜約４ｍｇ（または１眼当たり約１ｍｇ〜約３ｍｇ、または約１ｍｇ〜約４ｍｇ、または約３ｍｇ〜約４ｍｇ、または約１ｍｇ〜約２ｍｇ）の濃度で投与される。一部の実施形態では、リガンド結合分子は、１眼当たり約１ｍｇ、または約２ｍｇ、または約３ｍｇ、または約４ｍｇ、または約５ｍｇ、または約６ｍｇの濃度で投与される。リガンド結合分子は、一部の実施形態では、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、６０μｌ、７０μｌ、８０μｌ、９０μｌ、９５μｌ、または１００μｌの容量で、上記に記載の濃度の何れかで存在する。一部の実施形態では、リガンド結合分子は、約２〜４ｍｇ／５０μｌの濃度で投与される。
【０３４２】
一般に、静脈内投与に適した投薬量範囲は、キログラム体重当たり約５０〜５０００マイクログラムの活性化合物である。鼻腔内投与に適した投薬量範囲は、一般に、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量応答曲線から外挿することができる。
【０３４３】
全身投与の場合、治療有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから最初に評価することができる。例えば、細胞培養で決定されたＩＣ５０を含む循環濃度を達成するように、動物モデルで用量を処方することができる。そのような情報を用いて、ヒトに有用な用量をより正確に決定することができる。初期用量も、当技術分野で周知の技術を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから評価することができる。当業者は、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができよう。
【０３４４】
投薬の量および間隔は、治療効果を維持するために十分な化合物血漿レベルを提供するように個々に調節することができる。局所投与または選択的摂取の場合には、化合物の有効局所濃度は血漿濃度に関連しない可能性がある。当業者は、過度に実験することなく、治療上有効な局所投薬量を最適化することができよう。
【０３４５】
投与される化合物の量は、当然、治療される被験体、被験体の体重、病気の重症度、投与様式、および処方医師の判断に応じて異なることになる。治療は、症候が検出可能である間、または症候が検出可能でない場合でも、断続的に繰り返すことができる。治療は、単独でまたは他の薬物と併用して施すことができる。
【０３４６】
リガンド結合分子および併用療法の場合の追加の薬剤の投与は、独立して、１日に１回〜４回、または１ヶ月に１回〜４回、または１年に１回〜６回、または２年、３年、４年、もしくは５年ごとに１回とすることができる。投与は、１日、または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年の期間、また患者の生涯にわたっても行うことができる。一実施形態では、投与は３ヶ月間毎月１回行なわれる。常習的な長期投与は多くの症例で指示される。投薬は、単回用量としてまたは複数回用量に分割して行うことができる。一般に、所望の投薬は、数ヶ月または数年以上のより長い投与期間が必要となる場合もあるが、通常は少なくとも数週間または数ヶ月にわたる期間、一定間隔で行うべきである。
【０３４７】
既存の障害を治療することに加えて、組成物は、これらの障害の発症を防止または遅延させるために予防的に投与することができる。予防的な用途では、組成物は、眼障害などの特定の障害に罹患しやすいかまたはそのリスクのある患者に投与することができる。
【０３４８】
投与経路
本明細書に記載するリガンド結合分子を含有する組成物は、投与される薬剤タイプならびに患者の病歴、リスクファクター、および症候に部分的に依存する種々の手段によって、患者に投与することができる。本発明の方法に適した投与経路は、局所投与と全身投与の両方を含む。本明細書で使用する場合、「全身投与」という用語は、基本的に患者の全身に医薬組成物を送達させる投与方法を意味する。全身投与の例示的な方法としては、限定されるものではないが、静脈内注射および経口投与が挙げられる。「局所投与」という用語は、本明細書で使用する場合、眼（または腫瘍もしくは他の標的組織）から遠位の領域よりも眼（または腫瘍もしくは他の標的組織）またはその周辺に、顕著に多くの医薬組成物の送達をもたらす投与方法を意味する。
【０３４９】
本発明の方法に有用な全身および局所の投与経路には、限定されるものではないが、経口胃管栄養；静脈内注射；腹腔内注射；筋肉内注射；皮下注射；経皮拡散および電気泳動；局所用の点眼剤および軟膏剤；結膜下注射を含む眼周囲および眼内の注射；局所的にインプラントされる持続放出装置を含む持続放出送達装置；ならびに生体内分解性でリザーバーベースのインプラントを含む、眼内および眼周囲のインプラントが包含される。
【０３５０】
したがって、一態様では、網膜血管新生に関連した眼障害を治療する方法は、リガンド結合分子の被験体への局所投与により実行される。例えば、一部の実施形態では、リガンド結合分子を含む医薬組成物は、局所的にもしくは局所注射（例えば、眼内注射、例えば硝子体内注射）により投与されるか、または生体内分解性もしくはリザーバーベースのインプラントなどの眼内もしくは眼周囲のインプラントから放出される。組成物は、好ましくは、被験体の眼において、眼の細胞または眼の脈管で発現されるＶＥＧＦＲ−２および／またはＶＥＧＦＲ−３へのＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄの結合もしくは刺激を阻害するために有効な量で投与される。
【０３５１】
併用療法の場合には、リガンド結合分子および追加の薬剤の投与は、時間内に逐次的にまたは同時に行うことができる。逐次的に投与される場合、それぞれの投与は同じ経路であっても異なる経路であってもよい。一実施形態では、追加の薬剤（例えば、ＶＥＧＦ−ＡまたはＰＤＧＦ阻害物質製剤）は、リガンド結合分子の投与の９０日、３０日、１０日、５日、２４時間、１時間、３０分、１０分、５分、または１分以内に投与される。追加の薬剤がリガンド結合分子の前に投与される場合、リガンド結合分子は、時間内に、かつ追加の薬剤とリガンド結合分子の合計量が標的適応症、例えば眼障害の治療または予防に有効になるような量で投与される。リガンド結合分子が追加の薬剤の前に投与される場合、追加の薬剤は、時間内に、かつ追加の薬剤とリガンド結合分子の合計量が標的適応症、例えば眼障害の治療または予防に有効になるような量で投与される。
【０３５２】
本発明に記載の医薬組成物は、リガンド結合分子および任意選択で併用療法における追加の薬剤を、放出制御製剤を用いて、実質的に投与直後にまたは投与後任意の所定時間に放出するように製剤化することができる。例えば、医薬組成物は徐放性製剤で提供することができる。即時放出性組成物または徐放性組成物の使用は、治療される症状の性質に依存する。症状が急性障害からなる場合には、即時放出形態が持続性放出組成物よりも利用されることが多くなり得る特定の予防または長期間治療の場合には、除放性組成物もまた適切になり得る。
【０３５３】
単独または併用の何れかでのリガンド結合分子が、（ｉ）狭い治療係数（例えば、有害な副作用または毒性反応をもたらす血漿濃度と治療効果をもたらす血漿濃度との間の差が小さい；一般に、治療係数（ＴＩ）は、半有効量（ＥＤ５０）に対する半致死量（ＬＤ５０）の比として定義される）；（ｉｉ）胃腸管における狭い吸収ウィンドウ；または（ｉｉｉ）短い生物学的半減期（その結果、血漿レベルを治療レベルに維持するために一日中の頻繁な投薬が必要になる）を有する場合、放出制御製剤におけるリガンド結合分子またはリガンド結合分子と１つまたは複数の追加の薬剤の両方の投与が有用となり得る。
【０３５４】
放出速度が活性成分の分解速度または代謝速度よりも速い放出制御を得るために、多くの戦略を追求することができる。例えば、放出制御は、例えば適切な放出制御組成およびコーティングを含む、製剤パラメーターおよび成分の適切な選択によって得ることができる。例としては、単回または複数回の単位錠剤またはカプセル剤組成物、油剤、懸濁剤、乳剤、マイクロカプセル、マイクロスフェア、ナノ粒子、パッチ、およびリポソームが挙げられる。このような除放性製剤または放出制御製剤を調製するための方法は、当技術分野で周知である。
【０３５５】
リガンド結合分子および存在する場合追加の薬剤はまた、インプラントなどの薬物送達装置を用いて送達することができる。本明細書で使用する場合、「インプラント」という用語は、インプラントされた後挿入部位からあまり移動しない任意の物質を指す。インプラントは、生分解性材料、非生分解性材料、または生分解性と非生分解性の両方の材料で構成することができる。非生分解性のインプラントは、所望により、補充可能なリザーバーを含むことができる。本発明の方法に有用なインプラントは、例えば、パッチ、粒子、シート、プラーク、マイクロカプセル等を含み、限定されるものではないが、後眼房、前眼房、脈絡膜上、または結膜下であり得る、選択された挿入部位に適合する任意の形状およびサイズを有し得る。本発明に有用なインプラントは、一般に、長期間にわたり、患者の眼に有効量で、インプラントされた医薬組成物を放出すると理解されている。眼放出に適した種々の眼のインプラントおよび持続放出性製剤は、例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８６９，０７９号明細書および同第５，４４３，５０５号明細書に記載されるように、当技術分野で周知である。眼の薬物送達装置は、前眼房または後眼房などの眼の房に挿入することができるか、または強膜、脈絡膜腔、もしくは硝子体液の外側の無血管化された領域の中もしくはその上にインプラントすることができる。一実施形態では、インプラントは、リガンド結合分子および任意の追加の薬剤の所望の治療部位、例えば眼の眼内腔および斑への経強膜拡散が可能になるように、強膜上など無血管領域上に位置させることができる。さらに、経強膜拡散の部位は、斑に近位の部位など血管新生部位に近位であり得る。適切な薬物送達装置は、例えば米国特許出願公開第２００８／０２８６３３４号明細書；同第２００８／０１４５４０６号明細書；同第２００７／０１８４０８９号明細書；同第２００６／０２３３８６０号明細書；同第２００５／０２４４５００号明細書；同第２００５／０２４４４７１号明細書；および同第２００５／０２４４４６２号明細書、ならびに米国特許第６，８０８，７１９号明細書および同第５，３２２，６９１号明細書に記載されており、これらのそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３５６】
他の実施形態では、本明細書に記載するリガンド結合分子はリポソームを介して眼に適用される。さらに別の実施形態では、リガンド結合分子は、連続的放出装置または選択的放出装置、例えば、以下に限定されるものではないが、Ｏｃｕｓｅｒｔ  Ｓｙｓｙｅｍ（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）で用いられるものなどの膜の中に含有される。追加の実施形態として、リガンド結合分子は、眼の上に置かれたコンタクトレンズの中に含有されるか、それによって担持されるか、またはそれに付着される。さらに別の実施形態では、リガンド結合分子は、眼の表面に適用することができるスワブまたはスポンジの中に含有される。本発明の別の実施形態は、眼の表面に適用することができる液体噴霧剤の中に含有されたリガンド結合分子を含む。
【０３５７】
一実施形態では、インプラントは、生分解性ポリマーマトリックス中に分散されたリガンド結合分子および任意選択で、存在する場合の追加の薬剤を含む。マトリックスは、ＰＬＧＡ（ポリ乳酸−ポリグリコール酸コポリマー）、エステル末端キャッピングされたはポリマー、またはそれらの混合物を含む。別の実施形態では、インプラントは、リガンド結合分子および任意選択で、存在する場合の追加の薬剤、界面活性剤、ならびに親油性化合物を含む。親油性化合物は、インプラントの約８０〜９９重量％の量で存在させることができる。適切な親油性化合物としては、以下に限定されるものではないが、グリセリルパルミトステアレート、ジエチレングリコールモノステアレート、プロピレングリコールモノステアレート、グリセリルモノステアレート、グリセリルモノリノレート、グリセリルモノオレート、グリセリルモノパルミテート、グリセリルモノラウレート、グリセリルジラウレート、グリセリルモノミリステート、グリセリルジミリステート、グリセリルモノパルミテート、グリセリルジパルミテート、グリセリルモノステアレート、グリセリルジステアレート、グリセリルモノオレート、グリセリルジオレート、グリセリルモノリノレート、グリセリルジリノレート、グリセリルモノアラキデート、グリセリルジアラキデート、グリセリルモノベヘネート、グリセリルジベヘネート、およびそれらの混合物が挙げられる。別の実施形態では、インプラントは、中空のスリーブの中に収容されるリガンド結合分子および任意選択で、存在する場合の追加の薬剤を含む。リガンド結合分子および任意選択で、存在する場合の追加の薬剤は、眼の中にスリーブを挿入し、スリーブから眼の中にインプラントを放出させ、次いで、スリーブを眼から取り出すことによって、眼に送達される。この送達装置の一例が、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０２４４４６２号明細書に記載されている。
【０３５８】
一実施形態では、インプラントは、リガンド結合分子および任意選択で、存在する場合の追加の薬剤の眼の中への制御された持続性放出に適合したフレキシブルな眼用挿入装置である。一実施形態では、この装置は、リガンド結合分子および任意選択で、存在する場合の追加の薬剤を含有するロッドまたはチューブの形態で、かつ本体から放射状に外側に伸びる、少なくとも２つの繋留用突出部を有する、ポリマー材料の細長い本体を含む。装置の長さは、少なくとも８ｍｍとすることができ、突出部を含むその本体部分の直径は１．９ｍｍを超えない。徐放性機序は、例えば、拡散によるものであっても、浸透もしくは生侵食によるものであってもよい。挿入装置は、円蓋解剖学による眼の移動に依存しないように、眼の上部円蓋または下部円蓋に挿入することができる。突出部は、例えば、肋骨、ねじ山、くぼみまたは隆起、円錐台形セグメントまたは巻線組紐セグメント（ｗｉｎｄｉｎｇ  ｂｒａｉｄ  ｓｅｇｍｅｎｔ）などの種々の形状であり得る。さらなる実施形態では、本体のポリマー材料は、液体環境で膨潤するものとして選択される。したがって、最初のサイズがより小さい装置を用いることができる。挿入装置は、上部円蓋または下部円蓋の中に挿入すると、長期の使用にわたり、その場所に十分保持され、またレシピエントにより気づかれないように視野の外側に存続するようなサイズおよび配置にすることができる。この装置は、上部円蓋または下部円蓋の中に７〜１４日間以上保持することができる。この装置の一例は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３２２，６９１号明細書に記載されている。
【０３５９】
別の態様では、リガンド結合分子の被験体への局所投与により実行される腫瘍を有すると診断された被験体における血管新生を阻害する方法。例えば、一部の実施形態では、リガンド結合分子を含む医薬組成物は、腫瘍に対して、または腫瘍が外科的に除去された器官もしくは組織に対して、局所投与される。そのような実施形態では、組成物は、好ましくは、腫瘍における血管新生を阻害するために有効な量で投与される。
【０３６０】
リガンド結合分子が核酸分子である例では、核酸分子を含有する医薬組成物の投与は、遺伝子治療の技術分野で周知の数多くの方法の１つを用いて行なうことができる。そのような方法としては、以下に限定されるものではないが、レンチウイルス形質転換、アデノウイルス形質転換、サイトメガロウイルス形質転換、マイクロインジェクション、およびエレクトロポレーションが挙げられる。
【０３６１】
キットおよび単位用量
本発明はまた、１つまたは複数の医薬組成物および使用説明書を含むキットに関する。リガンド結合分子は、同時投与を可能にするように、別のリガンド結合分子または本明細書に記載する他の治療剤と一緒に、例えばキットもしくはパッケージの中に、または単位用量でパッケージされても製剤化されてもよく；これらの２つの成分は、一緒に（すなわち、混合して）、または別個の組成物で（すなわち、混合しないで）、かつ個々の投薬量で製剤化することができる。キットの組成物のそれぞれは、容器に含有することができる。一部の実施形態では、キット／単位用量の２つの成分は、本明細書に記載する障害および疾患の１つを治療するためのヒト被験体への２つの化合物の投与のための説明書と一緒にパッケージされる。
【０３６２】
キットは容器を含むことができる。容器は成分を分離するために用いることができ、例えば、分割ボトルまたは分割ホイルパケットを含む。別個の組成物はまた、所望により、単一の非分割容器の中に含有することができる。キットはまた、成分の投与のための指示を含むことができる。別個の成分が異なる剤形で投与され、異なる投薬レベルで投与される場合、または個々のアンタゴニストの用量設定が望ましい場合、キットは特に有利になる。
【０３６３】
本明細書に記述のすべての刊行物および特許は、あたかも個々の刊行物または特許がそれぞれ、具体的かつ個別に参照により組み込まれるように指示されたかのように、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。矛盾がある場合は、本出願が、本明細書のいかなる定義も含めて、優先するものとする。
【実施例】
【０３６４】
実施例１  −  ＶＥＧＦＲタンパク質のＥＣＤフラグメント
ＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄおよび／またはＶＥＧＦ−Ａなどの標的リガンドへの結合に有効である、ＶＥＧＦＲ−３および／またはＶＥＧＦＲ−２および／またはＶＥＧＦＲ−１のフラグメントおよび変異体および融合体を特徴づけるために実験を実施した。国際公開第２００５／０８７８０８号パンフレット、国際公開第２００５／０００８９５号パンフレット、国際公開第２００６／０８８６５０号パンフレット、国際公開第２００６／０９９１５４号パンフレット、国際公開第２００４／１０６３７８号パンフレット、国際公開第２００５／１２３１０４号パンフレット、および米国特許第７，８５５，１７８号明細書を参照のこと。これらのすべては、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらの試験から、これらの受容体のＥＣＤを短縮することができること、さらに、異なる受容体からのドメインを再結合してリガンド結合分子を形成させることができることが実証される。
【０３６５】
実施例２  −  ＶＧＸ−３０１−ΔＮ２リガンド結合分子の作製
ＶＥＧＦＲ−３（「ＶＧＸ−３００」としても本明細書で言及される）のＩｇ様ドメインＩ〜ＩＩＩを含むリガンド結合分子を、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれるＭａｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，７：１９９−２０５，２００１に記載されるように調製した。
【０３６６】
ＶＧＸ−３００分子の重要な特徴は、それが１２個の糖鎖付加部位；２×６個の潜在的なＮ連結糖鎖付加部位、各受容体フラグメント（ＶＥＧＦＲ−３のＩｇ様ドメイン、Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ）上に５個および各Ｆｃ領域γ鎖上に１個を含有することである。Ｏ連結糖鎖付加についての証拠はない。
【０３６７】
糖鎖付加特性はＰＫに影響を及ぼし得るが、ＦｃグリカンはＰＫにほとんど影響を及ぼさない（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１７（５），２００７  ｐｐ．５２９−５４０）。手短に言えば、アシアロ糖タンパク質受容体は、２つ以上のシアル酸が欠如し、内在するガラクトース（Ｇａｌ）残基が末端の糖になる複合体型Ｎ連結グリカン構造に結合する。加えて、マンノース（Ｍａｎ）受容体は、高−Ｍａｎ  Ｎ連結グリカンおよび末端Ｎ−アセチルグルコサミン（ｔＧｌｃＮＡｃ）残基を認識する。これらの受容体は両方とも、タンパク質の迅速な代謝クリアランスを引き起こすことができる。
【０３６８】
いずれの糖鎖付加部位が生成物活性にとって重要であるかを同定するために、５個の推定上のＮ連結部位のそれぞれを順次欠失させることを試みた。５個のＮ連結グリカン（Ｎ−Ｑ）のそれぞれについてのコンセンサス結合配列を破壊するために、５つのプライマーペアを用いてＶＧＸ−３００コード領域に単一突然変異を導入した。
【０３６９】
用いたプライマーペアは以下のとおりである：
Ｎ１センス：
2019023198.tif 000008
（配列番号１２）
Ｎ１アンチセンス：
2019023198.tif 000009
（配列番号１３）
Ｎ２センス：
2019023198.tif 000010
（配列番号１４）
Ｎ２アンチセンス：
2019023198.tif 000011
（配列番号１５）
Ｎ３センス：
2019023198.tif 000012
（配列番号１６）
Ｎ３アンチセンス：
2019023198.tif 000013
（配列番号１７）
Ｎ４センス：
2019023198.tif 000014
（配列番号１８）
Ｎ４アンチセンス：
2019023198.tif 000015
（配列番号１９）
Ｎ５センス：
2019023198.tif 000016
（配列番号２０）
Ｎ５アンチセンス：
2019023198.tif 000017
（配列番号２１）
【０３７０】
突然変異の存在を配列決定により確認し、その後、プラスミドベクターを２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ）に一過性にトランスフェクトした。培養物試料をウエスタンブロットにより分析した。次いで、生存可能なコンストラクトを一過性の懸濁液適合２９３Ｆ細胞（ＨＥＫ）に進め、上澄液をＰｒｏＳｅｐＡクロマトグラフィーおよびゲル濾過により精製し、さらに酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）およびＢａＦ／３バイオアッセイにより試験して収率および活性を測定した。下記の表３に、得られた突然変異体それぞれの発現データおよび活性を要約する。
【０３７１】
2019023198.tif 000018
【０３７２】
表３では、Ｎ２突然変異体（「ＶＧＸ−３０１−ΔＮ２」とも本明細書では呼ばれる）のみが、親分子（すなわち、ＶＧＸ−３００）に比較して好ましい発現および活性特性を示した。ＶＧＸ−３０１−ΔＮ２および親ＶＧＸ−３００を、一過性発現によりＣＨＯ細胞およびＨＥＫ細胞で生成させ、各分子の薬物動態（ＰＫ）を以下のように調べた。スプラーグドーリーラットを、各実験において化合物ごとに２、３、または５の何れかの群に割り当てた。各群のラットに、ＶＧＸ−３００またはＶＧＸ−３０１−ΔＮ２を、ボーラス注射としての静脈内投与により１ｍｇ／ｋｇの用量濃度で単回投与した。暫定の血液試料を、−１日目（投与前）および最初の処置後５分〜１４日の範囲にある、合計１２回の投与後時点で側尾静脈穿刺により採取した。各血液試料から血清試料を調製し、定量的ＶＥＧＦ−Ｃリガンド捕捉ＥＬＩＳＡを用いて試験し，各化合物の循環濃度を決定した。次いで、これらの分析結果を用いて、薬物動態学パラメーターを算出した。ＶＧＸ−３００およびＶＧＸ−３０１−ΔＮ２のＰＫデータを、下記の表４に示す。
【０３７３】
2019023198.tif 000019
【０３７４】
ＰＫ曲線を図１に示しているが、表４のデータから、ＶＧＸ−３０１−ΔＮ２は、同じ発現系で生成したＶＧＸ−３００との比較によって、ＰＫに対して有益な効果を有し得ることが示された。
【０３７５】
実施例３  −  ＶＧＸ−３０１−ΔＮ２はＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄに結合する
ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−ＤへのＶＧＸ−３００およびＶＧＸ−３０１−ΔＮの結合の特異性を決定するために、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ（２μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレート上にプレコーティングし、捕捉抗原として用いた。濃度漸増させたＶＧＸ−３００またはＶＧＸ−３０１−ΔＮ２（０〜１０μｇ／ｍＬ）の何れかをプレートに加え、テトラメチルベンジジン基質キットを用いて、ウサギ抗ヒトＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートにより検出した。結果は、ＶＧＸ−３００およびＶＧＸ−３０１−ΔＮは両方とも、ＶＥＧＦ−ＣとＶＥＧＦ−Ｄの両方に結合することを示した。図２を参照されたい。驚くべきことに、ＶＧＸ−３０１−ΔＮ２は、ＶＧＸ−３００よりも両方のリガンドに対して強力に結合することが実証された。
【０３７６】
実施例４  −  ＶＧＸ−３００およびＶＧＸ−３０１−ΔＮ２の結合親和性
ＶＧＸ−３００またはＶＧＸ−３０１−ΔＮ２に対するＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄの結合を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により分析した。ＶＧＸ−３００またはＶＧＸ−３０１−ΔＮ２の何れかをＧＬＭセンサチップ上に固定されたプロテインＧ’上で捕捉し、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄに対する分子の親和性を測定した。親和性実験の結果を下記の表５に示す。
【０３７７】
2019023198.tif 000020
【０３７８】
上記の表５に示すデータから、ＶＧＸ−３００およびＶＧＸ−３０１−ΔＮ２の試料は、ほぼ同一の親和性でヒトＶＥＧＦ−ＣとＶＥＧＦ−Ｄの両方に結合し、両分子とも、ＶＥＧＦ−ＤよりもＶＥＧＦ−Ｃに対して強力に結合することが示された。
【０３７９】
実施例５  −  ＶＧＸ−３０１−ΔＮ２は、ＶＥＧＦＲ−３のＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄ結合およびその架橋を遮断する
ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３に結合し架橋する、ＶＥＧＦファミリーリガンドの能力を評価するために、細胞ベースのアッセイが開発されている。これらのバイオアッセイを用いて、ＶＧＸ−３００およびＶＧＸ−３０１−ΔＮ２の中和活性を試験した。バイオアッセイの細胞株は、マウスエリスロポエチン受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインにインフレームで融合した、ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦＲ−３のＥＣＤからなるキメラ受容体で安定にトランスフェクトされたマウスＩＬ−３依存性プロＢ細胞株Ｂａ／Ｆ３からなる（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００５／０８７８０８号パンフレットの実施例５に記載されるように）。ＩＬ−３の非存在下では、これらの細胞は、それぞれのＶＥＧＦＲのＥＣＤに結合し架橋することができる増殖因子の存在下でのみ生存し増殖する。
【０３８０】
手短に言えば、ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦＲ−３（１０，０００細胞／ウェル；９６ウェルプレート）をトランスフェクトしたＢａ／Ｆ３細胞を、漸増させたＶＧＸ−３０１−ΔＮ２のＶＧＸ−３００相当濃度（０〜１００μｇ／ｍＬ）の存在下、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄを添加した培地で３７℃で４８時間培養した。ＷＳＴ１試薬を用いて細胞増殖を測定した；細胞をＷＳＴ−１と共に３７℃で４時間インキュベートし、吸光度を４５０ｎｍで測定した（ｎ＝３：エラーバー＝平均値の標準誤差、ＳＥＭ）。
【０３８１】
結果から、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３  Ｂａ／Ｆ３バイオアッセイにおける、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄの用量応答的阻害により実証されるように、ＶＧＸ−３００がＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄの活性を中和することが示された。ＶＧＸ−３００は、ＶＥＧＦＲ−２および−３アッセイの両方において、ＶＥＧＦ−Ｄに比較してＶＥＧＦ−Ｃの中和に高い効力を示した。図３および４を参照されたい。
【０３８２】
ＶＧＸ−３０１−ΔＮ２の分析から、この分子も、ＶＥＧＦ−ＣとＶＥＧＦ−Ｄの両方のＶＥＧＦＲ−３への結合を遮断することができることが実証された。ＶＧＸ−３０１−Ｎ２の中和活性はＶＧＸ−３００よりもわずかに強力であった。図４を参照されたい。表６に、ＶＥＧＦＲ−３  Ｂａ／Ｆ３バイオアッセイにおける、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄに対するＶＧＸ−３００およびＶＧＸ−３０１−ΔＮ２の結合（ＩＣ５０）を示す。
【０３８３】
2019023198.tif 000021
【０３８４】
実施例６  −  硝子体内投与後のＶＧＸ−３００およびＶＧＸ−３０１ΔＮ２の眼の分布および薬物動態
この試験は、色素性ウサギへの単回硝子体内投与後の、ＶＧＸ−３００、ＶＧＸ−３０１−ΔＮ２、およびアフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ）の眼の分布および薬物動態を検討するために実施した。
【０３８５】
試験計画は、１群に８匹の雌性ウサギを割り当てた３群からなった。放射標識したＶＧＸ−３００、ＶＧＸ−３０１−ΔＮ２、またはアフリベルセプト５００μｇを、両眼に５０μＬボーラス硝子体内注射をすることによって、動物に投与した。
【０３８６】
2019023198.tif 000022
【０３８７】
用量投与後１２、２４、７２、１６８、３６６、６７２時間に１群当たり１匹の動物を安楽死させた。血液（血清に処理）および選択した眼組織を各時点で採取し、放射化学分析により放射活性濃度を測定した。採取した眼組織には、房水、脈絡膜、角膜、虹彩−毛様体（ＩＣＢ）、水晶体、視神経、網膜、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、強膜、線維柱帯、および硝子体液が含まれた。図５に、モニターした時間にわたる、種々の組織および血清中の放射活性の平均濃度を示す。
【０３８８】
被験物質である［１２５Ｉ］ＶＧＸ−３００、［１２５Ｉ］アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ）、および［１２５Ｉ］ＶＧＸ−３０１−ΔＮ２は、十分な耐容性があり、硝子体液中で安定であり、後区と前区の両方の眼組織に対して長期間曝露した。硝子体内投与後の［１２５Ｉ］ＶＧＸ−３００および［１２５Ｉ］ＶＧＸ−３０１−ΔＮ２の血清曝露には差があるが、［１２５Ｉ］ＶＧＸ−３００および［１２５Ｉ］ＶＧＸ−３０１−ΔＮ２は両方とも、アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ）に比較すると、おそらく脈絡膜中への吸収、さらに房水流出による吸収によるクリアランスの結果として、ほんのわずかな全身曝露であった。この試験で観察された［１２５Ｉ］ＶＧＸ−３００および［１２５Ｉ］ＶＧＸ−３０１−ΔＮ２のＰＫおよび生体内分布は、両方の化合物について同様であり、［１２５Ｉ］アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ）と同等であった。
【０３８９】
実施例７  −  未熟児網膜症のモデル
以下の実施例は、ＲＯＰモデルを用いて、ＶＧＸ−３００およびＶＧＸ−３０１−ΔＮ２について、網膜血管新生の発生を阻害するそれらの能力を評価するための例示的なアッセイである。このモデルでは、生後７日目（Ｐ７）のマウスを、高酸素（７５％酸素）状態に５日間（Ｐ１２まで）曝露した。高酸素曝露後に、Ｐ１２マウスを正常酸素状態に戻し、ヒトアイソタイプ対照抗体、ＶＧＸ−３００、ＶＧＸ−３０１−ΔＮ２、Ｅｙｌｅａ（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、ＶＧＸ−３００＋Ｅｙｌｅａ、またはＶＧＸ−３０１−ΔＮ２＋Ｅｙｌｅａの硝子体内注射を行った。次いで、すべてのマウスを正常酸素状態下に５日間収容した後、Ｐ１７に屠殺し、眼球摘出し、１０％ホルマリン／ＰＢＳで固定した。ヘマトキシリン−エオジン染色法および／またはＩＨＣ染色法を用いて、各群において脈管を定量した。
【０３９０】
実施例８  −  アルゴンレーザー誘導の脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）
加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）のこのモデルでは、ＣＮＶは、０日目における、マウスのブルック膜のアルゴンレーザー誘導の破裂（マウス当たり３回の熱傷）によって誘導される。１０匹のマウス群で試験し、処置は、ヒトアイソタイプ対照抗体、ＶＧＸ−３０１−ΔＮ２、ＶＧＸ−３００、Ｅｙｌｅａ（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ）、ＶＧＸ−３０１−ΔＮ２＋Ｅｙｌｅａ、またはＶＧＸ−３００＋Ｅｙｌｅａの１週１回の硝子体内注射（０日目および７日目）によって行った。１４日目に動物を屠殺し、脈絡膜の平坦マウントを調製し、ＩＣＡＭ−２で染色して、蛍光顕微鏡法による血管新生の視覚化を行った。
【０３９１】
ＶＧＸ−３０１−ΔＮ２は、単剤として、Ｅｙｌｅａ（登録商標）により実証された効果と同等に、新生血管ＡＭＤのマウスモデルにおいて脈絡膜血管新生を顕著に阻害すると考えられる。
【０３９２】
実施例９  −  ＶＥＧＦ−Ｃ媒介の腫瘍増殖および転移に対するリガンド結合分子の阻害効果
本明細書に記載するリガンド結合分子の、腫瘍増殖および／または転移を阻害する能力を実証するために、任意の容認された腫瘍モデルを用いることができる。例示的なモデルとしては、種々のタイプの癌を発症しやすくなっている動物、任意選択でＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄなどの１つまたは複数の増殖因子を組換えで過剰発現するように形質転換された細胞を含む、同種または異種由来の腫瘍または腫瘍細胞または腫瘍細胞株を注射された動物が挙げられる。複数の増殖因子が検出可能である、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルを準備するために、複数の増殖因子の発現を引き起こす外来性ＤＮＡで腫瘍細胞株を形質転換することは可能である。
【０３９３】
本明細書に記載するリガンド結合分子は、例えばタンパク質形態で直接、ｉ．ｖ．輸注により、もしくは埋込型マイクロポンプにより投与するか、または核酸形態で遺伝子治療レジメンの一部として投与することができる。被験体は、好ましくは、被験体間の変動を最小限に抑える助けとなるように、性別、体重、年齢、および病歴によりグループ化する。
【０３９４】
効力は、腫瘍のサイズ（容積）および重量の減少により測定する。腫瘍サイズ、拡散（転移）、および腫瘍の数に対する効果の性質について検討することもできる。例えば、特異的細胞マーカーの使用は、リンパ脈管新生に比較した血管新生に対する効果を示すために用いることができ、ＶＥＧＦ−Ａ結合コンストラクトは後者に対してより大きな効果が期待され、ＶＥＧＦ−Ｃ結合コンストラクトは前者に対してより大きな効果が期待される。動物は、全体としては生存期間および体重変化について注目することができる。腫瘍および検体について、血管新生、リンパ脈管新生、および／または壊死の証拠を調べる。
【０３９５】
ＳＣＩＤマウスは、本明細書に記載するリガンド結合分子の、腫瘍増殖を阻害する能力に関する被験体として用いることができる。治療で用いられるリガンド結合分子は、一般に、それが腫瘍細胞によって発現される増殖因子、特に、被験体の非腫瘍性細胞に比較して腫瘍細胞により過剰発現される増殖因子のリガンドに結合するように選択される。ＳＣＩＤモデルでは、腫瘍細胞、例えばＭＣＦ−７細胞に、国際公開第０２／０６０９５０号パンフレットに記載されているように、増殖因子の過剰発現を提供するプロモーターまたは他の発現制御配列の制御下で特定の増殖因子をコードするウイルスをトランスフェクトすることができる。あるいは、米国特許第６，３７５，９２９号明細書に記載されているように、他の細胞株、例えばＨＴ−１０８０を用いることができる。過剰発現を所望するものと同数の増殖因子リガンドを腫瘍細胞にトランスフェクトすることもでき、目的の１つまたは複数の増殖因子リガンドをすでに過剰発現する腫瘍細胞株を選ぶこともできる。被験体の１群に、ｍｏｃｋ、すなわち増殖因子リガンド挿入断片を欠くベクターをトランスフェクトされた細胞を移植する。
【０３９６】
上記に記載の細胞の腫瘍移植の前、それと同時、またはその後の何れかに、特定のリガンド結合分子で被験体を処置した。リガンド結合分子を投与するいくつかの異なる方法がある。ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療を用いることができる。例えば、リガンド結合分子をコードするアデノウイルスまたは他のベクターを細胞にトランスフェクトし、その細胞を増殖因子を発現する腫瘍細胞と共に移植することができ、リガンド結合分子をトランスフェクトされた細胞は、増殖因子で形質転換された細胞（または増殖因子をすでに過剰発現している）と同じであってもよい。一部の実施形態では、リガンド結合分子をコードするアデノウイルスは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば静脈内に注射される。一部の実施形態では、リガンド結合分子それ自体（例えばタンパク質形態）は、例えばマイクロポンプを用いて、全身的または局所的に投与される。特定の結合コンストラクトの効力を試験する場合、通常、少なくとも１つの対照を用いる。例えば、ベクターベースの治療の場合、空の挿入断片またはＬａｃＺを有するベクターを用いるか、または挿入断片を、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄを結合することができるＶＥＧＦＲ−３の完全なＥＣＤを含むリガンド結合分子とすることができ、そのような対照は、必要に応じて、２つ以上のＥＣＤコンストラクトを用いることができる（例えば、複数のリガンド結合親和性を有する結合コンストラクトを用いる場合、複数のリガンドを結合するため）。
【０３９７】
Ａ．例示的な手法
プラスミド発現ベクターの調製、細胞のトランフェクション、およびその試験
ＶＥＧＦ−ＣもしくはＶＥＧＦ−ＤをコードするｃＤＮＡまたはそれらの組合せは、ｐＥＢＳ７プラスミドに導入される（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｅｇｅｒｓｋｉ，Ｇｅｎｅ，１０７：２７９−８４，１９９１．）。この同じベクターを、リガンド結合分子の発現に用いることができる。
【０３９８】
以前に記載されるように（Ｅｇｅｂｌａｄ  ａｎｄ  Ｊａａｔｔｅｌａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８６：６１７−２５，２０００）、ヒトＭＣＦ−７乳癌細胞株のＭＣＦ−７Ｓ１サブクローンに、エレクトロポレーションによりプラスミドＤＮＡをトランスフェクトし、安定な細胞プールを選択し培養した。１００μＣｉ／ｍｌの［３５Ｓ］−メチオニンおよび［３５Ｓ］システインを添加した、メチオニンおよびシステインを含まないＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で、細胞を代謝的に標識する（Ｒｅｄｉｖｕｅ  Ｐｒｏ−Ｍｉｘ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。発現された増殖因子に対する抗体を用いて、馴化培地から標識された増殖因子を免疫沈殿させる。プロテインＡセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、免疫複合体および結合複合体を沈殿させ、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ、０．０２％トゥイーン２０で２回、ＰＢＳで１回洗浄し、還元条件下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０３９９】
被験体の準備および処置
細胞（２０，０００個／ウェル）を４つ組で２４ウェルに播種し、１、４、または８日後にレプリケートプレート上でトリプシン処理し、血球計数器を用いてカウントする。新鮮培地を４および６日後に提供する。腫瘍形成アッセイのために、サブコンフルエントな培養物をトリプシン処理により回収し、２回洗浄し、ＰＢＳ中の１０７個の細胞を、０．７２ｍｇの１７β−エストラジオール（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を含有する皮下６０日間除放性ペレットを担持する卵巣摘出ＳＣＩＤマウスの第２（腋窩）の乳腺の脂肪パッドに接種する。卵巣を摘出し、ペレットをインプラントすることは、腫瘍細胞接種の４〜８日前に行なう。
【０４００】
結合コンストラクトをコードするｃＤＮＡを、ｐＡｄＢｇｌＩＩプラスミドにサブクローニングし、以前に記載されるようにアデノウイルスを作製する（Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，９：１４８１−６，１９９８）。リガンド結合分子またはＬａｃＺ対照（Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，９：１４８１−６，１９９８）アデノウイルス、１０９ｐｆｕ／マウスを、腫瘍細胞接種の３時間前にＳＣＩＤマウスに静脈内注射する。
【０４０１】
治療効力の分析
腫瘍の長さおよび幅は、盲検法で毎週２回測定し、腫瘍は半楕円体であり、その深さは幅と同じであると仮定して、腫瘍体積を長さ×幅×深さ×０．５として算出する（Ｂｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，２４：８５−９５，１９９３）。
【０４０２】
腫瘍を切除し、４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．０）中で２４時間固定し、パラフィンに包埋する。切片（７μｍ）を、例えば、ＰＥＣＡＭ−１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３（Ｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９６：５４６−５５３，２０００）もしくはＰＣＮＡ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−βに対するモノクローナル抗体、またはＬＹＶＥ−１（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１４４：７８９−８０１，１９９９）、ＶＥＧＦ−Ｃ（Ｊｏｕｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１６：３８９８−９１１，１９９７）、公開されたプロトコールによるラミニン（Ｐａｒｔａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，８６：２４０６−１２，１９９９）、もしくは任意の増殖因子に対するポリクローナル抗体で免疫染色する。ＰＥＣＡＭ−１陽性脈管の数の平均を、切片中の最大脈管密度の３領域（倍率６０倍）から決定する。組織学的分析はすべて盲検化腫瘍試料を用いて行なう。
【０４０３】
アデノウイルスコンストラクトおよび／またはタンパク質療法の注射後３週間に、各群からの４匹のマウスに麻酔をかけ、腹側皮膚を開き、ＰＢＳ中の３％エバン青色色素（Ｓｉｇｍａ）を数マイクロリットル腫瘍内に注入する。腫瘍からの色素のドレナージを肉眼で追跡する。
【０４０４】
被験体の健康状態および腫瘍血管の程度の指標を提供するために血液および血液タンパク質のイメージングおよびモニタリングを実施することもできる。
【０４０５】
実施例１０  −  リガンド結合分子と化学療法剤の併用療法を用いる、被験体の腫瘍進行に対する効果
この試験は、他の抗癌療法と併用して、本明細書に記載するリガンド結合分子を用いることの効力を試験するために実施する。そのような療法には、癌標的に対する化学療法、放射線療法、アンチセンス療法、ＲＮＡ干渉、およびモノクローナル抗体が含まれる。組合せ効果は相加的であり得るが、好ましくは、その抗癌効果、例えば、癌の予防、抑制、退縮、および消失、生存期間の延長、および／または副作用の低減において相乗的である。
【０４０６】
被験体は、定期間隔、例えば毎日、毎週、または毎月１回で、化学療法剤を投与される１群、リガンド結合分子を投与される１群、および化学療法剤とリガンド結合分子の両方を投与される１群の複数の群に分配される。ヒトの試験では、被験体は、一般に、被験体間の変動を最小限に抑える助けとなるように、性別、体重、年齢、および病歴によりグループ化される。理想的には、被験体は同じタイプの癌と診断されている。ヒトまたは非ヒト被験体では、腫瘍サイズ、転移、体重増加／減少、腫瘍の血管新生、および白血球数の測定により、進行を追跡することができる。
【０４０７】
腫瘍の生検は、治療開始前および治療開始後の両方にて定期間隔で行われる。例えば、生検は、治療の直前、１週目、次いで、その後１ヶ月間隔で、または例えば腫瘍が切除されるような可能な場合にいつでも行われる。細胞マーカー、ならびに細胞全体および組織形態についての生検を行って、治療の有効性を評価する。追加的または代替的に、イメージング技術を用いることができる。
【０４０８】
非ヒト動物試験の場合には、さらにプラセボ対照を用いることができる。ＮＩＨガイドラインに従って実施される動物試験はまた、比較的均一の癌細胞集団およびリガンド結合分子により標的にされる１つまたは複数の増殖因子を選択的に過剰生産する腫瘍の挿入という利点を備えている。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【配列表】
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