(57)【要約】【課題】抗腫瘍免疫活性化剤のスクリーニング方法およびそれに使用できる抗リン酸化Bach2抗体を提供する。【解決手段】Bach2もしくはその標的遺伝子の発現レベルまたはBach2のリン酸化を指標とし、Bach2の機能を阻害する化合物をスクリーニングすることにより、抗腫瘍免疫活性化剤を得る。Bach2のリン酸化は好ましくは抗リン酸化Bach2抗体を用いて測定される。【選択図】図１
2019006678.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の５３６位に相当するセリン残基がリン酸化されたリン酸化Bach2を特異的に
認識する抗体。
【請求項２】
配列番号２５の７位に相当するセリン残基がリン酸化されたペプチドに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
H鎖CDRの配列として、
配列番号１８または２２の、
アミノ酸番号１８〜２６の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号４４〜５０の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
アミノ酸番号８９〜９５の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、を含む、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
H鎖CDRの配列として、
配列番号１８の
アミノ酸番号１８〜２６の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号４４〜５０の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
アミノ酸番号８９〜９５の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、または
配列番号２２の
アミノ酸番号１８〜２６の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号４４〜５０の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
アミノ酸番号８９〜９５の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
H鎖の配列として、
配列番号１８のアミノ酸配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加または挿入された配列、または
配列番号２２のアミノ酸配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加または挿入された配列を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項６】
L鎖CDRの配列として、
配列番号２０または２４の
アミノ酸番号３２〜４２の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号６０〜６３の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
アミノ酸番号９９〜１０７の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、
を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
L鎖CDRの配列として、
配列番号２０の
アミノ酸番号３２〜４２の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号６０〜６３の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
アミノ酸番号９９〜１０７の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、
または
配列番号２４の
アミノ酸番号３２〜４２の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号６０〜６３の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
アミノ酸番号９９〜１０７の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、
を含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
L鎖の配列として、
配列番号２０のアミノ酸配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加または挿入された配列、または
配列番号２４のアミノ酸配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加または挿入された配列、
を含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体が、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体およびその、F(ab')2 、Fab'、Fab 、Fv（variable fragment of antibody）、ジスルフィド結合Fv、一本鎖抗体（scFv）、お
よびこれらの重合体である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
Bach2の機能を阻害する化合物を選択する工程を含む、抗腫瘍免疫活性化剤のスクリーニ
ング方法。
【請求項１２】
Bach2を発現する細胞に被検化合物を添加する工程、Bach2のリン酸化レベルを測定する工程、およびBach2のリン酸化レベルを増加させる化合物を選択する工程を含む、請求項１
１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
リン酸化レベルの測定が配列番号２の５３６位に相当するセリン残基のリン酸化レベルを測定することによる、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
抗リン酸化Bach2抗体を用いてBach2のリン酸化レベルが測定される、請求項１２または１３に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
抗リン酸化Bach2抗体が請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体である、請求項１４
に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗腫瘍免疫活性化剤のスクリーニング方法およびそれに使用できる抗リン酸化Bach2抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
Bach2はB細胞やT細胞などの免疫細胞で発現する転写抑制因子で、B細胞から形質細胞への分化制御や制御性T細胞の分化制御への関与が報告されている（非特許文献１〜４）。さ
らに、Bach2遺伝子における多型がアレルギー疾患や炎症性疾患や自己免疫疾患などに相
関することが報告されている（非特許文献５〜１１）。
また、本発明者らは、Bach2遺伝子の機能が阻害されたマウスを作製し、このマウスが炎
症性腸疾患およびハイパーIgM症候群のモデル動物として有用であることを報告している
（特許文献１）。しかしながら、Bach2の機能阻害によって抗腫瘍免疫を活性化できるこ
とやリン酸化との関係は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】再表2005/110433
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Immunity 39, 136-147
【非特許文献２】Nature 498,506-510
【非特許文献３】Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 10735-10740
【非特許文献４】Nat Commun 4, 2830
【非特許文献５】PLoS Genet. 2011 Aug;7(8):e1002216
【非特許文献６】Nat Genet. 2010 Dec;42(12):1118-25
【非特許文献７】Nat Genet. 2010 Apr;42(4):295-302
【非特許文献８】PLoS Genet. 2014 Feb 27;10(2):e1004123
【非特許文献９】Arthritis Rheum. 2013 Dec;65(12):3058-62
【非特許文献１０】Lancet. 2011 Sep 10;378(9795):1006-14
【非特許文献１１】Nat Genet. 2012 May 6;44(6):676-80
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新規な抗腫瘍免疫活性化剤のスクリーニング方法を提供することおよびその目的で使用できる試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、Bach2の機能を阻害する
ことにより細胞障害性のCD8＋T細胞が腫瘍部位に誘導されること、およびBach2の転写抑
制活性はBach2のリン酸化・脱リン酸化によって制御されていることを見出し、それによ
り、Bach2のリン酸化等を指標としてBach2の機能を阻害する薬剤をスクリーニングすることにより腫瘍免疫活性化剤が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下を提供する。
[１]  配列番号２の５３６位に相当するセリン残基がリン酸化されたリン酸化Bach2を特
異的に認識する抗体。
[２]  配列番号２５の７位に相当するセリン残基がリン酸化されたペプチドに結合する、
[１]に記載の抗体。
[３]  H鎖CDRの配列として、
配列番号１８または２２の、
アミノ酸番号１８〜２６の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号４４〜５０の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
アミノ酸番号８９〜９５の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、を含む、[１]または[２]に記載の抗体。
[４]  H鎖CDRの配列として、
配列番号１８の
アミノ酸番号１８〜２６の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号４４〜５０の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
アミノ酸番号８９〜９５の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、または
配列番号２２の
アミノ酸番号１８〜２６の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号４４〜５０の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
アミノ酸番号８９〜９５の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、を含む、[３]に記載の抗体。
[５]  H鎖の配列として、
配列番号１８のアミノ酸配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加または挿入された配列、または
配列番号２２のアミノ酸配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加または挿入された配列を含む、[３]に記載の抗体。
[６]  L鎖CDRの配列として、
配列番号２０または２４の
アミノ酸番号３２〜４２の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号６０〜６３の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
アミノ酸番号９９〜１０７の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、
を含む、[１]〜[５]のいずれかに記載の抗体。
[７]  L鎖CDRの配列として、
配列番号２０の
アミノ酸番号３２〜４２の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号６０〜６３の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
アミノ案番号９９〜１０７の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、
または
配列番号２４の
アミノ酸番号３２〜４２の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、アミノ酸番号６０〜６３の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、および
アミノ酸番号９９〜１０７の配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換された配列、
を含む、[６]に記載の抗体。
[８]  L鎖の配列として、
配列番号２０のアミノ酸配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加または挿入された配列、または
配列番号２４のアミノ酸配列もしくはその１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加または挿入された配列、
を含む、[６]に記載の抗体。
[９]  ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である[１]〜[８]のいずれかに記載の抗体。
[１０]  モノクローナル抗体が、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体およびその、F(ab')2 、Fab'、Fab 、Fv（variable fragment of antibody）、ジスルフィド結合Fv、一本鎖抗体（scFv）、およびこれらの重合体である、[９]に記載の抗体。
[１１]  Bach2の機能を阻害する化合物を選択する工程を含む、抗腫瘍免疫活性化剤のス
クリーニング方法。
[１２]  Bach2を発現する細胞に被検化合物を添加する工程、Bach2のリン酸化レベルを測定する工程、およびBach2のリン酸化レベルを増加させる化合物を選択する工程を含む、[１１]に記載のスクリーニング方法。
[１３]  リン酸化レベルの測定が配列番号２の５３６位に相当するセリン残基のリン酸化レベルを測定することによる、[１２]に記載のスクリーニング方法。
[１４]  抗リン酸化Bach2抗体を用いてBach2のリン酸化レベルが測定される、[１２]または[１３]に記載のスクリーニング方法。
[１５]  抗リン酸化Bach2抗体が[１]〜[１０]のいずれかに記載の抗体である、[１４]に
記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、腫瘍免疫活性化剤を効率よくスクリーニングできる。さらには、腫瘍免疫活性化剤のスクリーニングのみならず、Bach2の機能解析をはじめとした免疫研究や診
断目的でも使用可能な抗リン酸化Bach2抗体も提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】腫瘍が移植された、野生型マウスとBach2ノックアウトマウスにおける腫瘍部位の免疫染色結果を示す顕微鏡写真。
【図２】腫瘍が移植された、野生型マウスとBach2ノックアウトマウスにおける腫瘍容積の経時変化を示すグラフ。
【図３】腫瘍が移植された、野生型マウスとBach2ノックアウトマウスの腫瘍組織における、各種免疫細胞をFACSによって解析した結果を示す図。縦軸は解析した細胞10000個あたりの個数を示す。
【図４】腫瘍が移植された、野生型マウスとBach2ノックアウトマウスの腫瘍組織に誘導されたCD8＋T細胞における各種遺伝子の発現レベルをRT-PCRで解析した結果を示す図。
【図５】腫瘍が移植された、野生型マウスとBach2ノックアウトマウスの腫瘍組織に誘導されたCD8＋T細胞のメラノーマ細胞に対する殺傷効果を示す図。
【図６】野生型Bach2、リン酸化部位置換Bach2を発現する細胞に対する抗Bach2抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す写真。
【図７】野生型Bach2またはリン酸化部位置換Bach2を導入した細胞における標的遺伝子の発現をRT-PCRによって解析した結果を示す図。mockの発現を１として発現量の比を表している。
【図８】抗リン酸化Bach2抗体を用いた野生型Bach2またはリン酸化部位置換Bach2に対するウエスタンブロットの結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜Bach2＞
本発明において使用可能なBach2タンパク質としては、哺乳類由来のBach2タンパク質が好ましく、例えば、ヒトのBach2タンパク質としては配列番号２のアミノ酸配列を有するタ
ンパク質が挙げられ、マウスのBach2タンパク質としては配列番号２６のアミノ酸配列を
有するタンパク質が挙げられる。ただし、転写抑制因子としての機能を維持する限り、配列番号２または２６のアミノ酸配列において、１または数個（好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号２または２６の全長配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。
【００１１】
Bach2タンパク質をコードする遺伝子としては配列番号１の塩基配列を有する遺伝子が挙
げられる。ただし、転写抑制因子としての機能を有するタンパク質をコードする限り、配列番号１の塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズ
するDNAであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイ
ブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で洗浄する条件が挙げられる。
【００１２】
＜抗腫瘍免疫活性化剤＞
抗腫瘍免疫活性化剤は、Bach2の転写抑制因子としての機能を抑制することにより、Bach2によって転写制御されているGranzyme Bやインターフェロンγ等の標的遺伝子の発現を増加させ、CD8＋T細胞等の細胞障害性T細胞を腫瘍組織に誘導して腫瘍を殺傷するものであ
ることが好ましい。
【００１３】
本発明の抗腫瘍免疫活性化剤の投与対象となる「腫瘍（がん）」としては、治療すべき悪性腫瘍であれば特に制限されないが、例えば膵臓がん、大腸がん、肝臓がん、胃がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん等の消化器系腫瘍、例えば悪性黒色腫等の皮膚腫瘍、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、腎がん等を挙げることができる。
【００１４】
＜スクリーニング方法＞
スクリーニング方法としては、Bach2の発現量に基づくスクリーニング、Bach2の標的遺伝子の発現量に基づくスクリーニング、Bach2のリン酸化に基づくスクリーニング、などが
例示される。
【００１５】
＜Bach2の発現量に基づくスクリーニング＞
本発明における抗腫瘍免疫活性化剤のスクリーニング方法の態様の一つは、Bach2遺伝子
の発現を抑制する化合物のスクリーニングに関するものである。Bach2遺伝子を発現する
細胞におけるBach2のｍRNA量を測定してもよいし、Bach2遺伝子のエンハンサーやプロモ
ーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞を使用してレ
ポーター遺伝子の発現を測定してもよい。細胞の種類は哺乳動物由来の細胞であることが好ましく、培養T細胞がより好ましい。Bach2遺伝子のエンハンサーやプロモーター領域は公知のゲノム情報を参考にして得ることができ、例えば、データベース上で、Bach2 cDNA配列とBach2ゲノム配列を照らしあわせることで抽出することができるが、Bach2遺伝子の転写開始点より上流に存在する１００ｂｐ〜１０ｋｂｐの領域が例示される。なお、「機能的に結合した」とは、Bach2遺伝子のエンハンサーやプロモーター領域に転写因子が結
合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、Bach2遺伝子のエンハ
ンサーやプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。
【００１６】
レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるCAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、
β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）およびGFP遺伝子等を挙げることができる。
【００１７】
細胞に被検化合物を接触させ、該細胞または該細胞抽出液におけるBach2のｍRNA量またはレポーター遺伝子の発現レベルを測定する。mRNAの発現レベルはノーザンハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、マイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション法などにより測定を行うことができる。レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、クロラムフェニコールのアセチル化を検出することに
より、レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
【００１８】
被検化合物を投与していない場合と比較して、Bach2のｍRNAまたは該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させる化合物を選択する。Bach2のｍRNAまたはレポーター遺伝子の発現レベルを減少させる化合物は、Bach2の機能を抑制して抗腫瘍免疫を向上させるための薬
剤として利用できる。
【００１９】
なお、スクリーニングに供される化合物（医薬候補物質）としては特に制限はなく、例えば、低分子合成化合物であってもよいし、天然物に含まれる化合物であってもよい。また、ペプチドや核酸であってもよい。スクリーニングには個々の被検物質を用いてもよいが、これらの物質を含む化合物ライブラリーを用いてもよい。
【００２０】
＜Bach2の標的遺伝子の発現量に基づくスクリーニング＞
本発明における抗腫瘍免疫活性化剤のスクリーニング方法の他の態様は、Bach2による転
写を制御する化合物のスクリーニングに関するものである。すなわち、Bach2によって転
写制御を受ける標的遺伝子の発現量を指標とする。具体的には、まず、Bach2と、Bach2標的遺伝子またはBach2標的遺伝子の上流に存在する転写制御領域の下流にレポーター遺伝
子が機能的に結合したDNAを有する細胞を提供する。次いで、該細胞に被検化合物を接触
させる。なお、Bach2や標的遺伝子を本来的に発現する細胞を使用してもよいし、Bach2遺伝子やレポーター遺伝子を導入した細胞を使用してもよい。細胞の種類は哺乳動物由来の細胞であることが好ましく、培養T細胞がより好ましい。次いで、該細胞または該細胞抽
出液におけるBach2標的遺伝子のｍRNA量やレポーター遺伝子の発現レベルを測定する。測定は上記と同様にして行うことができる。
【００２１】
なお、Bach2標的遺伝子としては、Granzyme B（Gzmb）（J Biol Chem. 1998 Dec 25;273(52):35326-31.）やインターフェロンγやFas Lなどが挙げられる。
【００２２】
被検化合物を投与していない場合と比較して、Bach2標的遺伝子のｍRNAまたは該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する。通常、Bach2は転写抑制因子とし
て標的遺伝子の発現を抑制しているため、Bach2のｍRNAまたはレポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物は、Bach2の機能を阻害して抗腫瘍免疫を向上させるための薬剤
として利用できる。
【００２３】
＜Bach2のリン酸化に基づくスクリーニング＞
本発明者らの検討により、Bach2の活性はリン酸化によって制御されていることが分かっ
た。すなわち、Bach2はリン酸化を受けて不活性化され、それにより、細胞障害性に関与
するような標的遺伝子の発現抑制が解除され、その結果、CD8＋T細胞が活性化して抗腫瘍免疫効果が発揮されると考えられる。
よって、Bach2のリン酸化を促進する化合物を阻害する化合物をスクリーニングすること
により、抗腫瘍免疫活性を有する化合物が得られる。
【００２４】
したがって、本発明のスクリーニング方法の他の態様は、このようなBach2のリン酸化を
指標にしたものである。すなわち、Bach2を発現する細胞またはその抽出物に化合物を添
加し、Bach2のリン酸化レベルを測定し、Bach2のリン酸化レベルが化合物非添加時または対照化合物添加時と比較して増加した時に、その化合物を抗腫瘍免疫活性を有する化合物（候補化合物）として選択することができる。
【００２５】
Bach2のリン酸化部位としては、好ましくは、５３５位のセリン（配列番号２の５３６位
のセリンに相当するセリン）が挙げられる。なお、配列番号２の５３６位のセリンに相当するセリンとは、対象配列を配列番号２とアラインメントしたときに配列番号２の５３６位のセリンの位置に配置されるセリン残基をいう。例えば、５３６位よりもN末端側でア
ミノ酸残基の欠損や付加が起こった時はそれに応じてN末端から数えた位置は変化するが
、そのような場合も当然に含む。マウスの配列（配列番号２６）においては、５３５位のセリンに該当する。
【００２６】
リン酸化されたBach2を特異的に検出するための方法としては、電気泳動における移動度
の差を指標に検出する方法や、抗リン酸化セリン抗体を用いる方法でもよいが、リン酸化されたBach2を特異的に認識する抗体を用いる方法が好ましい。
【００２７】
＜抗リン酸化Bach2抗体＞
リン酸化されたBach2を特異的に認識する抗体としては、Bach2のリン酸化部位を含む約１０〜２０アミノ酸のペプチドであって、当該部位がリン酸化されたペプチドを用意し、それを抗原として、該抗原をマウス等の哺乳動物に免疫して得られるポリクローナル抗体やモノクローナル抗体、遺伝子組換え技術を用いて製造されるマウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体、並びにヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造されるヒトモノクローナル抗体などが含まれる。
【００２８】
ポリクローナル抗体は、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。例えば、上記のような抗原を非ヒト哺乳動物に免疫することで該免疫感作動物から得た血清などから取得することができる。
【００２９】
モノクローナル抗体は、当業者に周知方法を用いて得ることができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons(1987))、Antibodies:  A Laboratory Manual, Ed.Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)）。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの調製は、上記のような抗原をマウスなどの非ヒト哺乳動物に投与し、免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓に含まれる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞を細胞融合させることにより調製される。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、ウェルの培養上清の免疫抗原に対する反応性をＥＬＩＳＡ等の免疫化学的方法によって測定することにより行うことができる。そして、目的の抗体を産生するハイブリドーマを含むウェルから更に、限界希釈法によってクローニングを行い、クローンを得ることができる。ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロで培養するか、またはマウス、ラット等の哺乳動物の腹水中等でのインビボで増殖させ、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。モノクローナル抗体の単離、精製は、既知の方法を用いればよく、例えば、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体、アフィニティークロマトグラフィー等の手段により容易に達成することができる。
【００３０】
モノクローナル抗体は遺伝子組み換え技術で得られるものでもよい。マウスモノクローナル抗体も含まれるが、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体およびヒトモノクローナル抗体でもよい。さらに、F(ab')2 、Fab'、Fab 、Fv（variable fragment of antibody）、ジスルフィド結合Fv、一本鎖抗体（scFv）、およびこれらの重合体等の
抗体フラグメントでもよい。
【００３１】
例えば、５３５位のセリンがリン酸化されたリン酸化Bach2を認識する抗リン酸化Bach2抗体を得るためには、５３５位のセリンを含む１０〜２０アミノ酸のペプチドを抗原に使用することができる。そのようなペプチドとしては、EDGSGG(pS)PCSLPL（配列番号２５）のペプチドが例示される。
【００３２】
本発明のモノクローナル抗体として具体的には、H鎖（重鎖）可変領域のCDRに配列番号１８または２２のアミノ酸番号１８〜２６（HCDR1）、配列番号１８または２２のアミノ酸
番号４４〜５０（HCDR2）および配列番号１８または２２のアミノ酸番号８９〜９５（HCDR3）のアミノ酸配列を含み、L鎖（軽鎖）可変領域のCDRに配列番号２０または２４のアミノ酸番号３２〜４２（LCDR1）、配列番号２０または２４のアミノ酸番号６０〜６３（LCDR2）および配列番号２０または２４のアミノ酸番号９９〜１０７（LCDR3）のアミノ酸配
列を含むものが挙げられる。
なお、リン酸化Bach2を特異的に認識する限り、これらのCDRの１つ以上において、１〜数個のアミノ酸が置換されてもよい。ここで、１〜数個とは、例えば、１個または２個である。CDRの配列を改変して特異性が改変前と同等以上に向上した抗体を得ることは、公知
のファージディスプレイなどの技術によって行うことができる。
【００３３】
CDR以外の領域は抗体としての構造を維持し、機能を発揮できる配列であれば特に制限さ
れず、マウス由来の配列、ヒト由来の配列、他の哺乳動物由来の配列、それらのキメラ配列、人工配列のいずれであってもよい。定常領域を含む場合においては、H鎖およびL鎖の定常領域のアミノ酸配列は、Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986、The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 およびCell vol.22, p197, 1980 に
記載のものが例示される。
【００３４】
これらのCDRを有するマウス抗体としては、H鎖に配列番号１８または２２のアミノ酸配列を、L鎖に配列番号２０または２４のアミノ酸配列を有する抗体が例示される。なお、こ
れらのアミノ酸配列においては、リン酸化Bach2を特異的に認識する機能が維持される限
り、１〜数個のアミノ酸（１〜２０個、１〜１０個または１〜５個）の置換、欠失、付加または挿入があってもよい。このような置換、欠失、付加はCDRに導入されてもよいが、CDR以外の領域に導入されることが好ましい。
【００３５】
本発明の抗リン酸化Bach2抗体は、抗腫瘍免疫活性化剤のスクリーニング以外に、研究用
試薬や臨床検査用試薬としても使用しうる。例えば、免疫疾患の検査薬としても使用しうる。
【００３６】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。しかしながら、本発明は以下の実施例の態様には限定されない。
【実施例】
【００３７】
＜Bach2ノックアウトによる抗腫瘍効果とその細胞メカニズムの解析＞
野生型マウス（C57BL/6、8-10週齢）またはBach2ノックアウトマウス（再表2005/110433
）に、マウスメラノーマ細胞株である B16-F10 細胞（0.5×106個）を皮下に移植し、腫
瘍投与後10日目に腫瘍組織を取り出し、組織切片を作成し、抗PNL2（メラノーマ特異的に
発現しているタンパク質）抗体を用いて、免疫染色を行った。その結果、図１に示すように、野生型マウスでは腫瘍が広範囲に見られたのに対し、Bach2ノックアウトマウスでは
腫瘍は縮小していた。
【００３８】
図２では、野生型マウスとBach2ノックアウトマウスにおける腫瘍容積の経時変化を示し
た。腫瘍容積は体表から形成された腫瘍の長径と短径を測定し、簡易式（長径×短径2）/2で算出した。
【００３９】
これらの結果から、Bach2の機能を阻害することにより、抗腫瘍免疫効果が達成されうる
ことが示唆された。
【００４０】
次に、図１，２の現象を解析するために、腫瘍部位における免疫細胞の解析を行った。すなわち、腫瘍投与後１３日に野生型マウスおよびBach2ノックアウトマウスから腫瘍組織
を取り出し、CD45抗体を用いて腫瘍をホモジナイズしたサンプルを精製し、各免疫細胞のマーカー分子に対する抗体を用いてFACS（細胞ソーター）で解析を行った。その結果、図３に示すように、Bach2ノックアウトマウスの腫瘍組織ではCD8＋T細胞が特異的に誘導さ
れ、これにより抗腫瘍効果が発揮されていることが示唆された。
【００４１】
＜Bach2ノックアウトマウスにおける標的遺伝子の転写レベルの解析＞
また、上記腫瘍投与13日後の野生型およびBach2ノックアウトマウスの腫瘍組織に誘導さ
れたCD8＋T細胞において、各種遺伝子の発現をRT-PCRによって解析した。
解析した遺伝子と使用したプライマーは下記の通り。
【００４２】
Gzmb（Granzyme B）
Forward : GACCCAAAGACCAAACGTGC（配列番号３）
Reverse : TGAAAGCACGTGGAGGTGAA（配列番号４）
【００４３】
Prf1（perforin 1 (pore forming protein)）
Forward : CCCACTCCAAGGTAGCCAAT（配列番号５）
Reverse : GAGCTGTTAAAGTTGCGGGG（配列番号６）
【００４４】
Ifng（Interferon gamma）
Forward : AGCGTCATTGAATCACACCTG（配列番号７）
Reverse : GAATGCTTGGCGCTGGAC（配列番号８）
【００４５】
GITR (glucocorticoid-induced TNFR family related gene)
Forward : ATCTGCAAGCACTACCCCTG（配列番号９）
Reverse : ACAGGCAACACACCGGAAG（配列番号１０）
【００４６】
PD-1 (Programmed death-1)
Forward : GCCCTAGCTGTCTTCTGCTC（配列番号１１）
Reverse : CACACTAGGGACAGGTGCTG（配列番号１２）
【００４７】
CTLA4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4）
Forward : CTTGTCGCAGTTAGCTTGGG（配列番号１３）
Reverse : GACCCCTGTTGTAAGAGGACTT（配列番号１４）
【００４８】
4-1BB
Forward : CCGTGCAGAACTCCTGTGAT（配列番号１５）
Reverse : TTACAGTTCGGCTGTCCACC（配列番号１６）
【００４９】
その結果、図４に示すように、Bach2ノックアウトマウスにおいて特にGZMBとIFNGの発現
が上昇していることが分かった。これらはBach2に標的遺伝子であり、細胞障害性に関与
する。
【００５０】
＜Bach2ノックアウトマウスにおけるCD8＋T細胞の細胞障害性の評価＞
次に、野生型マウスおよびBach2ノックアウトマウスの腫瘍組織に誘導されたCD8＋T細胞
が細胞障害性を示すかについて調べた。
具体的には、まず、30000個のCD8＋T細胞を、野生型マウスとBach2ノックアウトマウスに移植したB16F10の腫瘍塊からソーティングした。次いで、Target用細胞として、高濃度のCTV（CTV-high）（Life technologies 社）で標識したB16F10細胞3000個とCD8＋T細胞を5時間共培養した。また、T細胞を加えないCTV-highで標識したB16F10細胞3000個をcontrolとして5時間培養した。
同時にReference用細胞として、低濃度の（CTV-low）（Life technologies 社）で標識したB16F10細胞を3000個を5時間培養した。（こちらにはT細胞なし）
Target 細胞とReference細胞を混合し、 CTV-highとCTV-highのB16B10細胞の割合を測定
し、Specific lysis= (Rference-Target)/Reference  の式でCD8陽性T細胞の細胞障害性
を評価した。
その結果、図５に示すように、 Bach2ノックアウトマウスの腫瘍組織に誘導されたCD8＋T細胞はメラノーマ細胞に対して細胞障害性を有することが確かめられた。
【００５１】
＜Bach2のリン酸化部位の解析＞
次に、Bach2のリン酸化部位を調べるため、野生型Bach2またはリン酸化部位と思われるセリン残基およびスレオニン残基をアラニンに置換した変異型Bach2をFLAGタグを付した融
合タンパク質として（HEK293細胞）で発現させ、細胞抽出物を電気泳動にかけたのち、抗Bach2抗体で検出した。
その結果、図６に示すように、５３５位のセリン（配列番号２の５３６位のセリンに相当）を置換したBach2では、野生型で見られるリン酸化によるバンドシフトが消失した。こ
の結果から、Bach2のリン酸化部位として５３５位が含まれることが分かった。
【００５２】
＜Bach2のリン酸化の転写抑制活性への影響＞
次に、Bach2のリン酸化と転写抑制活性の関係を調べるため、野生型Bach2またはS535A Bach2（配列番号２の５３６位のセリンをアラニンに置換）による標的遺伝子の転写への影
響を調べた。具体的には、野生型マウスの脾臓から単離したCD8＋T細胞を抗CD3/CD28抗体で24時間刺激した後に、野生型Bach2、S535A変異Bach2またはmockをインフェクションし
て24時間後に細胞を回収して、RT-PCRを行った。
その結果、図７に示すように、５３５位が置換されたリン酸化されない変異型Bach2が導
入された細胞では、細胞障害性に関わる遺伝子の発現が増加することがわかった。
【００５３】
＜抗リン酸化Bach2抗体の作製と評価＞
抗リン酸化Bach2抗体を以下の通り作製した。
５３５位のセリンを含み、当該セリンがリン酸化されたペプチド（配列番号２５）を合成し、マウスに免疫してハイブリドーマを作製し、その中から、リン酸化Bach2を特異的に
認識するクローンを選択し、その中の２クローンを限界希釈し、リン酸化Bach2特異的抗
体産生ハイブリドーマ株として選択した（クローン７、クローン１７）。
【００５４】
該ハイブリドーマ株より抗体を精製し、以下の手順でリン酸化Bach2に対する特異性を評
価した。
PlatE細胞（293細胞由来レトロウイルスパッケージング細胞株）にpcDNA-Bach2あるいはpcDNA-Bach2S535A (当該セリンをアラニンに置換）をトランスフェクション
24時間後に全細胞抽出液を調製
一部はフォスファターゼ（CIAP）で37℃1時間処理
5μｇ相当抽出液を電気泳動→ウェスタンブロッティングへ
膜は0.5% BSA in T-TBSでブロック処理した後で各抗体（0.1マイクログラム/ml）と反応
二次抗体はanti-mouse HRP結合抗体
HRP検出はPierce Pico ECLキットを使用
【００５５】
その結果、図８に示すように、クローン７および１７はいずれも野生型Bach2に結合し、
その結合バンドのシグナルはCIAP処理によって減少した。一方、５３５位が変異したリン酸化を受けないBach2ではシグナルがほとんど見られなかった。これらのことから、クロ
ーン７および１７は５３５位がリン酸化されたBach2を特異的に認識していると考えられ
た。
【００５６】
クローン７および１７より抗体をコードするDNAを単離し、通常の方法で、抗体をコード
するDNAの配列を解析した。
その結果、クローン７のH鎖のアミノ酸配列は配列番号１８であり、CDRの配列は、アミノ酸番号１８〜２６、４４〜５０および８９〜９５であった。
クローン７のL鎖のアミノ酸配列は配列番号２０であり、CDRの配列は、アミノ酸番号３２〜４２、６０〜６３および９９〜１０７であった。
クローン１７のH鎖のアミノ酸配列は配列番号２２であり、CDRの配列は、アミノ酸番号１８〜２６、４４〜５０および８９〜９５であった。
クローン１７のL鎖のアミノ酸配列は配列番号２４であり、CDRの配列は、アミノ酸番号３２〜４２、６０〜６３および９９〜１０７であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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