(57)【要約】【課題】より安定して形成率（収率）を向上することができる医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の製造方法を提供する。【解決手段】ポリアミノ酸とアルコールまたは親水性ポリマーの少なくとも一方とを含む溶液Ａと、医療用タンパク質を含む溶液Ｂと、を混合して得られる混合液中に複合体を形成することを有する、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアミノ酸とアルコール（親水性ポリマーを除く）または親水性ポリマー（ポリアミノ酸を除く）の少なくとも一方とを含む溶液Ａと、医療用タンパク質を含む溶液Ｂと、を混合して得られる混合液中に複合体を形成することを有する、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の製造方法。
【請求項２】
前記混合液のｐＨが、４．５超９．０以下である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ポリアミノ酸がポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアルギニンおよびこれらの水溶性塩からなる群から選択される、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記アルコールがエタノール、メタノールおよびトリフルオロエタノールからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記親水性ポリマーがポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、グリコール酸／Ｌ−乳酸共重合体、ポリビニルピロリドンおよびヒアルロン酸からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記アルコールの含有量が、前記混合液の総量に対して、２質量％以上２５質量％以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記親水性ポリマーの含有量が、前記混合液の総量に対して、２質量％以上１５質量％以下である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記溶液Ａがアルコールを含み、
粒子径１μｍ以上５μｍ未満である前記医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の粒子数に対する粒子径５μｍ以上１０μｍ以下である前記医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の粒子数の割合が、０．５％超である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
医療用タンパク質と、ポリアミノ酸と、親水性ポリマーと、の複合体。
【請求項１０】
前記ポリアミノ酸がポリグルタミン酸、ポリリジンおよびこれらの水溶性塩からなる群から選択される、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
前記親水性ポリマーがポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、グリコール酸／Ｌ−乳酸共重合体、ポリビニルピロリドンおよびヒアルロン酸からなる群から選択される、請求項９または１０に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療用タンパク質とポリアミノ酸とを含む複合体の製造方法および医療用タンパク質とポリアミノ酸とを含む複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術の進歩により、１９８０年代以降、さまざまなタンパク質医薬品が開発されてきた。特に、分子標的薬として知られている抗体の進歩は目覚ましく、これまでに治療が困難だったがんや関節リウマチなどの難病治療に貢献してきた。
【０００３】
タンパク質医薬品の経口投与は、低分子化合物の医薬品とは異なり困難なので、注射によって体内に投与されることが多い。なかでも皮下注射は痛みも少なく、簡便で自己投与（患者の自己注射）も可能なので、新しい投与法として期待されている。しかし、皮下注射は投与量が１．５ｍＬ以下に制限されるため、通常、１００ｍｇ／ｍＬ以上の高濃度のタンパク質溶液を調製する必要がある。
【０００４】
タンパク質医薬品の高濃度化には、粉末製剤を再溶解する方法が広く用いられている。凍結乾燥されたタンパク質の粉末を少量の溶液で溶かすだけだが、現実には難しい点がいくつかある。まず、タンパク質が不安定であることを考慮しなければならない。粉末状態のタンパク質を溶解させると、せん断応力や表面張力などの物理化学的ストレスがかかり、不可逆に変性することがある。さらに、変性タンパク質の凝集は、調製するタンパク質溶液の濃度が高いほど起こりやすい。凝集体はタンパク質医薬品の有効性を低下させるだけでなく、好ましくない免疫反応を引き起こすなど安全面にも悪影響を及ぼす。このようなタンパク質の不安定性のほかに、溶解に要する時間も現実的な課題になっている。高濃度の塩溶液を調製するような場合には、スターラーやボルテックスで撹拌すれば溶かすことが可能だが、タンパク質は不安定なので、変性させないよう慎重に取り扱う必要がある。実際の製剤では、バイアル中の粉末製剤に生理食塩水などの溶媒を加えたあと、バイアルを泡立てないようゆっくり振ることで溶解させる．そのため、タンパク質のすべての粉末を溶解させるために、数十分間から数時間かかってしまうこともある。
【０００５】
ほかのアプローチとして、タンパク質の濃縮がある。すなわち、低濃度のタンパク質溶液から溶媒を選択的に取り除き、溶媒量を減らして高濃度のタンパク質溶液を調製する方法である。代表的な濃縮法には限外ろ過やクロマトグラフィー、エバポレーション法があり、粉末製剤にして再溶解する方法では、凍結乾燥、スプレードライ法などが挙げられる。
【０００６】
しかし、操作工程が増えるので、設備や時間のコストが課題として残される。近年では、液−液相分離やゲル化、結晶化など、装置が不要な新しい濃縮法の開発も進んでいるが、処理に伴うタンパク質の不可逆な変性などの課題は残されてしまう。このように、高濃度のタンパク質溶液を得るために、１）タンパク質を変性させずに、２）簡便で迅速な工程で、３）装置などの投資が不要な方法の開発が期待されている。さらに、今後もタンパク質医薬品の種類が増えることを考えると、抗体や酵素やホルモンなどによらず、４）多様なタンパク質に利用できる汎用的な方法であることが望ましい。
【０００７】
例えば、特許文献１には、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁剤が開示されている。医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁剤は、溶媒を除去して濃縮することが可能であり、低濃度の電解質を添加して当該タンパク質を解離して医薬品として利用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０６４５９１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
確かに、特許文献１では、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁剤は、溶媒を除去して濃縮することが可能であり、低濃度の電解質を添加して当該タンパク質を解離して医薬品として利用することができることが示されている。
【００１０】
しかし、ｐＨや緩衝液の種類などの条件によっては、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の形成が困難である場合もある。よって、より安定して医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の形成率（収率）を向上させたいという要求がある。
【００１１】
そこで、本発明は、より安定して形成率（収率）を向上することができる医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を積み重ねた。その結果、ポリアミノ酸とアルコールまたは親水性ポリマーの少なくとも一方とを含む溶液Ａと、医療用タンパク質を含む溶液Ｂと、を混合して得られる混合液中に複合体を形成することを有する、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の製造方法によって上記課題を解決することを見出し、本発明の完成に至った。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、より安定して形成率（収率）を向上することができる医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】図１−１は、試験例１で作製した溶液Ａ１〜Ａ５および溶液Ａ’１のｐｏｌｙＥの遠紫外ＣＤスペクトルの結果を示す。
【図１−２】図１−２は、実施例１−１〜１−１５および比較例１におけるＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成率を示す。
【図２−１】図２−１は、試験例２で形成したＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の１ｍＬあたりの粒子数を示す。
【図２−２】図２−２は、比較例２−１で形成したＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の各粒子径に対する、実施例２−１〜２−４で形成したＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の各粒子径における粒子数の割合を示す。
【図２−３】図２−３は、実施例２−４および比較例２−１で形成したＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体粒子の画像、ならびに複合体形成後の混合液の外観を示す。
【図３】図３は、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体沈殿物を１５０〜９００ｍＭ  ＮａＣｌ−１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再溶解させた場合のＩｇＧ濃度（左軸；■および●）と再溶解後のＩｇＧ収率（右軸；□および■）とを示す；■および□は、エタノール存在下での結果、ならびに●および○は、エタノール非存在下での結果を示す。
【図４】図４は、試験例４におけるＩｇＧの波長２００〜２５０ｎｍの遠紫外ＣＤスペクトルの結果を示す。
【図５】図５は、試験例５における洗浄操作の回数と再溶解させたＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体からのＩｇＧの回収率との関係を示す。
【図６−１】図６−１は、試験例６で作製した溶液Ａ１７〜Ａ２１および溶液Ａ’１のｐｏｌｙＥの遠紫外ＣＤスペクトルの結果を示す。
【図６−２】図６−２は、実施例６−１〜６−５および比較例６におけるＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成率を示す。
【図７】図７は、試験例７におけるＩｇＧの波長２００〜２５０ｎｍの遠紫外ＣＤスペクトルの結果を示す。
【図８】図８は、試験例８における再溶解させたＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体からのＩｇＧの回収率を示す。
【図９】図９は、試験例９におけるＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧまたはＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成率を示す。
【図１０】図１０は、試験例１０におけるＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧまたはＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の一形態に係る実施の形態を説明する。本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。
【００１６】
本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％ＲＨの条件で測定する。
【００１７】
本明細書中、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体とは、後述の医療用タンパク質とポリアミノ酸とが複合体を形成したものであり、医療用タンパク質およびポリアミノ酸以外の成分、例えば親水性ポリマーなどが複合体に含まれていてもよい。
【００１８】
≪医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の製造方法≫
本発明の一形態は、ポリアミノ酸とアルコール（親水性ポリマーを除く）または親水性ポリマー（ポリアミノ酸を除く）の少なくとも一方とを含む溶液Ａと、医療用タンパク質を含む溶液Ｂと、を混合して得られる混合液中に複合体を形成することを有する、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の製造方法である。このような構成により、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体をより安定して形成することができ、よって当該複合体の形成率（収率）を向上することができる。
【００１９】
本形態の好ましい一実施形態は、ポリアミノ酸とアルコールとを含む溶液Ａと、医療用タンパク質を含む溶液Ｂと、を混合して得られる混合液中に複合体を形成することを有する、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の製造方法である。溶液Ａがアルコールを含む、つまり混合液がアルコールを含むことにより、上記本発明の効果に加え、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の粒子径（円相当直径）を大きくすることができる。また医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体では、患者などへの投与時に医療用タンパク質の速やかな放出が期待できる。さらに、混合液中のアルコール濃度を調整することにより、徐放期間をコントロールできる。よって、本実施形態で製造された医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体は、速やかに血中濃度を上げたい薬剤（抗ウイルス抗体など）に好適である。
【００２０】
本形態の好ましい一実施形態は、ポリアミノ酸と親水性ポリマー（ポリアミノ酸を除く）とを含む溶液Ａと、医療用タンパク質を含む溶液Ｂと、を混合して得られる混合液中に複合体を形成することを有する、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の製造方法である。溶液Ａが親水性ポリマーを含む、つまり混合液が親水性ポリマーを含むことにより、上記本発明の効果に加え、患者などへの投与時に医療用タンパク質の徐放効果が期待でき、混合液中の親水性ポリマーの濃度を調整することにより、徐放期間をコントロールできる。よって、本実施形態で製造された医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体は、投与回数を減らしたい場合（ホルモン製剤など頻回投与のもの）、局所的に作用させたい場合（抗がん剤用抗体など）などに好適である。
【００２１】
＜溶液Ａ＞
本形態の製造方法において、溶液Ａは、ポリアミノ酸とアルコールまたは親水性ポリマーの少なくとも一方とを含む。
【００２２】
［ポリアミノ酸］
本形態の製造方法において、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体は、主として静電相互作用を介して形成することができる。そのため、使用する医療用タンパク質と反対の電荷を有するポリアミノ酸を適宜選択することが好ましい。
【００２３】
アニオン性のポリアミノ酸の例としては、ポリグルタミン酸（質量：７５０〜５０００Ｄａ、ｐＩ：２．８１〜３．４６）、ポリグルタミン酸（質量：３０００〜１５０００Ｄａ、ｐＩ：２．３６〜３．００）、ポリグルタミン酸（質量：１５０００〜５００００Ｄａ、ｐＩ：１．８５〜２．３６）、ポリグルタミン酸（質量：５００００〜１０００００Ｄａ、ｐＩ：１．５６〜１．８５）、ポリアスパラギン酸（質量：２０００〜１１０００Ｄａ、ｐＩ：２．０６〜２．７５）、ポリアスパラギン酸（質量：５０００〜１５０００Ｄａ、ｐＩ：１．９３〜２．３９）およびこれらの水溶性塩などが挙げられる。
【００２４】
カチオン性のポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（質量：１０００〜５０００Ｄａ、ｐＩ：１０．８５〜１１．５８）、ポリリジン（質量：４０００〜１５０００Ｄａ、ｐＩ：１１．４９〜１２．０６）、ポリリジン（質量：１５０００〜３００００Ｄａ、ｐＩ：１２．０６〜１２．３７）、ポリリジン（質量：３００００Ｄａ〜、ｐＩ：１２．３７〜）、ポリアルギニン（質量：５０００〜１５０００Ｄａ、ｐＩ：１３．４９〜１３．９７）、ポリアルギニン（質量：１５０００〜７００００Ｄａ、ｐＩ：１３．９８〜１４．００）、ポリアルギニン（質量：７００００Ｄａ〜、ｐＩ：１４．００）、ポリヒスチジン（質量：５０００〜２５０００Ｄａ、ｐＩ：７．７４〜８．３０）およびこれらの水溶性塩などが挙げられる。
【００２５】
これらのうち、ポリアミノ酸は、生体適合性および医療用タンパク質と複合体を形成しやすいｐＩを有することなどの観点から、好ましくはポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアルギニンおよびこれらの水溶性塩からなる群から選択される。
【００２６】
ポリアミノ酸は、使用する医療用タンパク質に合わせて、１種単独でまたは２種以上を組み合わせて用いることができる。なお、本明細書中、アルコールは、後述の親水性ポリマーを除く。
【００２７】
［アルコール］
本形態の製造方法において、溶液Ａに含まれるアルコールとしては、特に制限されず、例えばエタノール、メタノール、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）などを用いることができる。アルコールは、１種単独でまたは２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２８】
アルコールは、エタノール、メタノールおよびＴＦＥからなる群から選択されることが好ましく、エタノールであることがより好ましい。
【００２９】
本形態の製造方法において、アルコールを用いることにより、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の収率（形成率）が向上するメカニズムは、以下のように推定される。
【００３０】
溶液中にポリアミノ酸とアルコールとが存在することにより、アルコールにより、ポリアミノ酸の構造が変化すると考えられる。具体的には、アルコールが溶液の誘電率を下げる効果を持つことに起因して、ポリアミノ酸の立体構造を担う水素結合を強め、ポリアミノ酸の二次構造がαへリックス豊富な構造へと変化すると考えられる（図１−１参照）。この構造変化によって、ポリアミノ酸の荷電部位の露出が増加したため、混合液中において、ポリアミノ酸と医療用タンパク質との静電相互作用が強まり、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の形成が促進されたと考えられる。
【００３１】
また、アルコールが溶液の誘電率を下げることで、医療用タンパク質およびポリアミノ酸の間の静電相互作用が強まり、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体同士の架橋が促進されたと考えられる。
【００３２】
さらに、アルコールを用いることにより形成された医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体は、主に静電相互作用を駆動力に形成されるため、その複合体を解離するために塩を加えると、塩の静電遮蔽効果により速やかに解離する（医療用タンパク質が放出される）と考えられる。
【００３３】
当該メカニズムは推測に基づくものであり、その正誤によって本発明の技術的範囲が影響を受けることはない。
【００３４】
上記のとおり、溶液Ａがアルコールを含む、つまり混合液中にアルコールが含まれることにより、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の粒子径（円相当直径：ＥＣＤ）を大きくすることができる。具体的には、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体において、粒子径１μｍ以上５μｍ未満の粒子数に対する粒子径５μｍ以上１０μｍ以下の粒子数の割合を増加できる。よって、本形態の好ましい実施形態は、溶液Ａがアルコールを含み、粒子径１μｍ以上５μｍ未満である前記医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の粒子数に対する粒子径５μｍ以上１０μｍ以下である前記医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の粒子数の割合が、０．５％超である、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の製造方法が提供される。なお、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の粒子径は、実施例に記載の方法により測定した値を採用する。
【００３５】
［親水性ポリマー］
本形態の製造方法における溶液Ａに含まれる親水性ポリマーとしては、特に制限されず、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、グリコール酸／Ｌ−乳酸共重合体、ポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸などが挙げられる。親水性ポリマーとしては、好ましくはポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、グリコール酸／Ｌ−乳酸共重合体、ポリビニルピロリドンおよびヒアルロン酸からなる群から選択され、より好ましくはポリエチレングリコールおよびポリビニルピロリドンから選択され、さらに好ましくはポリエチレングリコールである。なお、本明細書中、親水性ポリマーは、ポリアミノ酸を除く。また、親水性ポリマーとは、生理食塩水に浸漬した際の吸水率が１％以上の高分子化合物をいう。
【００３６】
親水性ポリマーは、１種単独でまたは２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３７】
本形態の製造方法において、親水性ポリマーを用いることにより、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の収率（形成率）が向上するメカニズムは、以下のように推定される。
【００３８】
溶液Ａ中にポリアミノ酸と親水性ポリマーとが存在することにより、親水性ポリマー（例えばポリエチレングリコール）の排除体積効果でポリアミノ酸（例えばポリグルタミン酸）を選択的に水和させると考えられる。すなわち、ポリアミノ酸の周辺が極性環境になるため、ポリアミノ酸は、表面に荷電部位を露出した状態が安定になると考えられる。そのため、荷電部位を露出し疎水性部位を内部にしまおうとすることによりポリアミノ酸の二次構造がαへリックス豊富な構造へと変化すると考えられる（図６−１参照）。この構造変化によって、ポリアミノ酸の荷電部位の露出が増加したため、ポリアミノ酸と医療用タンパク質との静電相互作用が強まり、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の形成が促進されたと考えられる。また、質量が大きい親水性ポリマーを使用することで、親水性ポリマーが混合液中に占める体積の割合が大きくなり、医療用タンパク質やポリアミノ酸が存在できる体積が減少して、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の形成が促進されたと考えられる。
【００３９】
また、混合液中に親水性ポリマー（例えば両親媒性のポリエチレングリコール）が存在すると、親水性である一方で疎水性相互作用を介しても、医療用タンパク質とポリアミノ酸と親水性ポリマーとが複合体を形成すると考えられる。さらに、前記複合体と複合体を形成していないポリアミノ酸とが混在した状態であるため、これらの沈殿物のネットワークに静電相互作用と疎水性相互作用との両方が寄与しており、複合体からの医療用タンパク質の放出（複合体の解離）に時間がかかると考えられる。
【００４０】
当該メカニズムは推測に基づくものであり、その正誤によって本発明の技術的範囲が影響を受けることはない。
【００４１】
親水性ポリマーの質量は、使用する医療用タンパク質やポリアミノ酸によって適宜調整することができる。親水性ポリマーの質量は、好ましくは２０００〜１０００００Ｄａであり、より好ましくは２５００〜５００００Ｄａであり、さらに好ましくは、３０００〜２００００Ｄａである。
【００４２】
［溶媒］
本形態の製造方法において、溶液Ａに用いられる溶媒としては、特に制限されず、例えば一般的に注射剤に使用でき、塩を含まず、ｐＨを４．５超９．０以下に調整できる緩衝液を用いることができる。
【００４３】
緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液などが挙げられる。
【００４４】
［溶液Ａの調製方法］
本形態の製造方法において、溶液Ａの調製方法は、特に制限されず、例えば、（ｉ）緩衝液中において、所望のポリアミノ酸を所定の濃度となるように調製すること；（ｉｉ）緩衝液中において、アルコールまたは親水性ポリマーの少なくとも一方を所定の濃度となるように調製すること；および（ｉｉｉ）（ｉ）の溶液と（ｉｉ）の溶液を混合することにより、溶液Ａを調製することができる。
【００４５】
本形態の好ましい実施形態では、ポリアミノ酸とアルコールまたは親水性ポリマーの少なくとも一方とを混合して、溶液Ａを調製することをさらに有する。
【００４６】
なお、溶液Ａ中のポリアミノ酸、アルコールおよび親水性ポリマーの濃度は、後述の混合液中の濃度となるように、適宜調整することができる。
【００４７】
＜溶液Ｂ＞
本形態の製造方法において、溶液Ｂは、医療用タンパク質を含む。
【００４８】
［医療用タンパク質］
本形態の製造方法において、溶液Ｂに含まれる医療用タンパク質としては、特に制限されず、例えば抗体およびそのフラグメント、融合タンパク質、酵素、ホルモン、サイトカイン類などが挙げられる。
【００４９】
抗体としては、例えばムロモナブ−ＣＤ３、卜ラスツズマブ、リツキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、卜シリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ベパシズマブ、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、セツキシマブ、ラニビズマブ、オマリズマブ、エクリズマブ、パニツムマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、モガムリズマブ、セル卜リズマブペゴル、オファツムマブ、ペルツズマブ、卜ラスツズマブエムタンシン、ブレンツキシマブベドチン、ナタリズマブ、ニポルマブ、アレムツズマブ、ヨウ素１３１修飾卜シツモマブ、カツマキソマブ、アデカツムマブ、エドレコロマブ、アブシキシマブ、シルツキシマブ、ダクリズマブ、エファリズマブ、オビヌツズマブ、ベドリズマブ、ペムブロリズマブ、イクセキズマブ、ジリダブマブ、イピリムマブ、ベリムマブ、ラキシバクマブ、ラムシルマフなどが挙げられる。
【００５０】
融合タンパク質としては、例えばエタネルセプ卜、アバタセプ卜、ロミプロスチム、アフリベルセプ卜などが挙げられる。
【００５１】
酵素としては、例えばアルテプラーゼ、モンテプラーゼ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、アガルシダーゼアルファ、アガルシダーゼベータ、ラロニダーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、イデュルスルファーゼ、ガルスルファーゼ、ラスブリカーゼ、ドルナーゼアルファ、アスパラギナーゼ、ペグアスパラギナーゼ、コンドリアーゼなどが挙げられる。
【００５２】
ホルモンとしては、例えばヒトインスリン、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリングルリジン、インスリンデグルデク、リラグリチド、ソマトロピン、ペグビソマント、メカセルミン、カルペリチド、グルカゴン、ホリトロピンアルファ、ホリトロピンベータ、テリパラチド、メトレレプチンなどが挙げられる。
【００５３】
サイトカインとしては、例えばフィルグラスチム、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモロイキン、テセロイキン、トラフェルミンなどが挙げられる。
【００５４】
上記医療用タンパク質以外にも、医療用タンパク質としては、血液凝固線溶系因子、血清タンパク質、ワクチン、インターフェロン類、エリスロポエチン類などを用いることができる。
【００５５】
溶液Ｂに用いられる溶媒としては、上記溶液Ａで用いられる溶媒と同じものを使用することができる。
【００５６】
［溶液Ｂの調製方法］
本形態の製造方法において、溶液Ｂの調製方法は、特に制限されず、例えば、緩衝液中において、所望の医療用タンパク質を所定の濃度となるように混合して、溶液Ｂを調製することができる。緩衝液は、溶液Ａの調製方法で使用した緩衝液を使用できる。
【００５７】
＜混合液＞
本形態の製造方法では、溶液Ａと溶液Ｂとを混合して、混合液を得ることを有する。
【００５８】
溶液Ａと溶液Ｂとを混合する方法は、特に制限されない。溶液Ａに溶液Ｂを添加してもよいし、溶液Ｂに溶液Ａを添加してもよい。また、別の容器などに溶液Ａと溶液Ｂとを同時に添加してもよい。
【００５９】
混合液中のポリアミノ酸の含有量は、特に制限されないが、好ましくは０．０４〜２．００ｍｇ／ｍＬである。また、混合液中のポリアミノ酸の含有量は、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の形成率をより向上させるとの観点から、医療用タンパク質２質量部に対して、０．２５〜１．００質量部であることが好ましい。
【００６０】
混合液中のアルコールの含有量は、本発明の効果をより効率的に発現させるとの観点から、混合液の総量に対して、好ましくは２〜２５質量％であり、より好ましくは３〜２０質量％、さらに好ましくは３〜１５質量％である。混合液中のアルコールの含有量により、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体を再溶解した場合の医療用タンパク質の解離を調整できる。前記含有量が９質量％以下であると、より速やかな放出が期待でき、前記含有量が９質量％超、好ましくは１２質量％以上であると、徐放効果が期待できる。
【００６１】
混合液中の親水性ポリマーの含有量は、本発明の効果をより効率的に発現させるとの観点から、混合液の総量に対して、好ましくは２〜１５質量％であり、より好ましくは３〜１５質量％である。混合液中の親水性ポリマーの含有量により、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体を再溶解した場合の医療用タンパク質の解離を調整できる。前記含有量を増加させることで、徐放効果を得ることができる。
【００６２】
混合液中の医療用タンパク質の含有量は、特に制限されないが、好ましくは０．５〜２００ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは１〜１００ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍＬである。
【００６３】
混合液の温度、すなわち溶液Ａと溶液Ｂとを混合した直後の温度は、医療用タンパク質に悪影響を与えない限り、特に制限されないが、好ましくは２〜５５℃、さらに好ましくは４〜２５℃である。
【００６４】
混合液のｐＨは、特に制限されないが、一般的に注射剤に使用可能である４．５超９．０以下であることが好ましい。特許文献１では、タンパク質／ポリアミノ酸複合体の最大の形成率は、タンパク質のｐＩから２．０離れたｐＨで得られるとされており、ｐＩが中性付近にあるタンパク質（例えばヒトＩｇＧ（ｐＩ＝７．３））を用いる場合、高い複合体形成率を得ることが困難であった。一方、本形態の製造方法では、混合液のｐＨが生体のｐＨに近い値であっても、高い医療用タンパク質／ポリアミノ複合体の形成率を達成でき、かつ使用する際において、当該複合体を十分に解離させることができる。
【００６５】
混合液は、溶液Ａおよび溶液Ｂ以外にも、本発明の効果を阻害しない限り、添加剤をさらに加えることができる。添加剤は、生体適合性があり、生体に投与しても悪影響がない物質を含む。添加剤の例としては、糖、アミノ酸、ポリソルベートなどの界面活性剤、塩化ベンザルコニウムなどの保存剤、グリセリンなどの等張化剤などが挙げられる。
【００６６】
＜医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の形成＞
本形態の製造方法は、上記で得られた混合液中に複合体を形成することを有する。
【００６７】
得られた混合液中では、上述のとおり、主にポリアミノ酸と医療用タンパク質との静電相互作用により、複合体が形成されると考えられる。よって、得られた混合液を、静置または撹拌することにより、ポリアミノ酸／医療用タンパク質複合体を形成することができる。静置または撹拌する時間は、混合液の量、混合液に含まれる各成分の量などによるが、例えば１０〜３０分間である。好ましい実施形態では、上記得られた混合液を静置することにより、ポリアミノ酸／医療用タンパク質複合体を形成する。また、ポリアミノ酸／医療用タンパク質複合体の形成する際の温度は、上記混合液の温度と同じであればよい。
【００６８】
形成した医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体は、例えば遠心分離を行って回収することができる。回収した医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体は、必要に応じて、洗浄することができる。
【００６９】
例えば、溶液Ａがアルコールを含む場合、回収した医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体を洗浄することで、アルコールを除去することができる。洗浄は、従来公知の方法で行うことができる。後述のとおり、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体は、電解質を用いて解離することができるため、洗浄は、電解質を含まない溶液を使用する。電解質を含まない溶液としては、上記緩衝液を用いることができる。
【００７０】
本形態の製造方法により得られた医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体は、強い静電相互作用によって複合体を形成しているため、緩衝液で撹拌しても解離しない不可逆な複合体であると考えられる。よって、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体を洗浄しても、当該複合体を解離して得られる医療用タンパク質の収率を維持することができる。
【００７１】
＜医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の解離（再溶解）＞
本形態に係る医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体は、電解質を用いて複合体を解離（再溶解）させて、医療用タンパク質を得ることができる。そのため、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体は、下記の用途に用いることができる。
【００７２】
医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体を再溶解する方法としては、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体を含む液（例えば上記混合液）に電解質を添加することにより、複合体を解離させることができる。
【００７３】
電解質としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２などが例示できる。電解質は、生体適合性の観点から、好ましくはＮａＣｌである。
【００７４】
電解質の濃度は、特に制限されないが、１５０〜３００ｍＭであることが好ましい。
【００７５】
＜医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の用途＞
本形態に係る医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体は、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体を含む混合液のまま用いることができる。また混合液から医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体を回収して用いることもできる。特に、本形態の製造方法では、医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の収率を安定して向上させることができるため、遠心分離などにより医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体を沈殿させて、電解質を含む溶液を用いて、高濃度の医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体を含む溶液として用いることができる。
【００７６】
本形態に係る医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体およびこれを含む溶液は、タンパク質医薬品として、経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内を含む任意の投与の経路用として用いることができ、必要に応じて、局部治療や病変内投与用として用いることができる。また、本形態に係る医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体は、注射剤の形態として、所望の部位の近くに置かれたカテーテル用の薬剤の形態として、製剤化してもよい。また、投与形態や投与の経路に応じて、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤を含んでもよい。
【００７７】
≪医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体≫
本発明の一形態は、医療用タンパク質と、ポリアミノ酸と、の複合体である。医療用タンパク質とポリアミノ酸とが複合体を形成することによって、医療用タンパク質の簡便な濃縮やストレス耐性の獲得が可能である。
【００７８】
本形態における「医療用タンパク質」、「ポリアミノ酸」、「親水性ポリマー」および「医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の用途」の説明については、上記医療用タンパク質／ポリアミノ酸複合体の製造方法と同様であるため、説明を省略する。
【００７９】
本形態の好ましい実施形態は、医療用タンパク質と、ポリアミノ酸と、親水性ポリマーと、の複合体である。医療用タンパク質とポリアミノ酸と親水性ポリマーとが複合体を形成することで、複合体に含まれる親水性ポリマーの量を調節することにより、患者などへの投与時に医療用タンパク質の徐放期間をコントロールできる。複合体に含まれる親水性ポリマーの量は、混合液中の親水性ポリマーの含有量により調節することができる。
【００８０】
本形態において、ポリアミノ酸は、生体適合性および医療用タンパク質と複合体を形成しやすいｐＩを有することなどの観点から、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアルギニンおよびこれらの水溶性塩からなる群から選択されることが好ましい。
【００８１】
本形態において、親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、グリコール酸／Ｌ−乳酸共重合体、ポリビニルピロリドンおよびヒアルロン酸からなる群から選択されることが好ましい。
【実施例】
【００８２】
以下に具体例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。
【００８３】
≪試験例１≫
＜実施例１−１＞
（ポリアミノ酸を含む溶液ｅ１の作製）
１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中において、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ｐｏｌｙＥ、質量：３ｋＤａ〜１５ｋＤａ）を１．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製して、溶液ｅ１を作製した。
【００８４】
（アルコールを含む溶液ａ１の作製）
１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中において、エタノールを９％（ｖ／ｖ）の濃度となるように調製して、溶液ａ１を作製した。
【００８５】
（溶液Ａ１の作製）
溶液ｅ１と溶液ａ１とを５０μＬずつ混合して、１００μＬの溶液Ａ１を作製した。
【００８６】
（ｐｏｌｙＥの遠紫外ＣＤスペクトルの測定）
上記とは別に、溶液ｅ１と溶液ａ１と１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）とを５０μＬずつ混合して、１５０μＬの溶液Ａ１を作製した。当該溶液Ａ１について、ｐｏｌｙＥの遠紫外ＣＤスペクトル（測定機器：ＪＡＳＣＯ  Ｊ−７２０、日本分光株式会社製）を測定した。結果を図１−１に示す。
【００８７】
（溶液Ｂの作製）
１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中において、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）を６．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製して、溶液Ｂを作製した。
【００８８】
（複合体の形成）
上記で作製した１００μＬの溶液Ａ１に溶液Ｂを５０μＬ混合して、混合液を調製した。前記混合液を２５℃で３０分間静置して、ヒト免疫グロブリン／ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ）複合体を形成した。
【００８９】
（複合体の形成率の算出）
ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成後、９０００×ｇで５分間遠心分離を行い、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を沈殿させた。上清を採取して、ＵＶ測定器（株式会社エル・エム・エス社製ＮＤ−１０００）により上清中のＩｇＧ濃度を測定して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成率を算出した。例えば、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成率は、上清中のＩｇＧ濃度が０％であれば、すべてのＩｇＧが複合体を形成しているとして、形成率１００％とする。結果を図１−２に示す。
【００９０】
＜実施例１−２〜１−１５＞
下記変更以外は、実施例１−１と同様にして、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を形成して、その形成率を算出した：
・アルコールを含む溶液ａ１の作製において、エタノール、メタノールまたはトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）を下記表１に示される濃度となるように調製して、溶液ａ２〜ａ１５を作製した；
・溶液Ａ１の作製において、溶液ａ１の代わりに溶液ａ２〜ａ１５を用いて、溶液Ａ２〜Ａ１５を作製した。また、溶液Ａ２〜Ａ５について、実施例１−１と同様にして、ｐｏｌｙＥの遠紫外ＣＤスペクトルを測定した。結果を図１−１に示す；
・ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成において、溶液Ａ１の代わりに溶液Ａ２〜Ａ１５を用いて、混合液を調製した。
【００９１】
複合体の形成率を算出した結果を図１−２に示す。
【００９２】
【表１】
2019023175.tif 000002
【００９３】
溶液Ａ１の作製において、溶液ａ１の代わりに１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて、溶液Ａ’１を作製したこと以外は、上記実施例１−１と同様にして、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を形成し、その形成率を算出した。結果を図１−２に示す。
【００９４】
また、実施例１−１と同様にして、溶液Ａ’１について、ｐｏｌｙＥの遠紫外ＣＤスペクトルを測定した。結果を図１−１に示す。
【００９５】
試験例１で作製した混合液を表２に示す。
【００９６】
【表２】
2019023175.tif 000003
【００９７】
（考察）
図１−１に示すように、混合液中のアルコールの含有量が増加するにしたがって、ポリグルタミン酸がαへリックス豊富な構造を形成していることが分かる。
【００９８】
また、図１−２に示すように、溶液Ａがアルコールを含む、つまり混合液中にアルコールが存在することによって、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成率を向上できることが分かる。
【００９９】
≪試験例２≫
＜実施例２−１〜２−４＞
（アルコールを含む溶液ａ１６の作製）
１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中において、エタノールを６０％（ｖ／ｖ）の濃度となるように調製して、溶液ａ１６を作製した。
【０１００】
（溶液Ａ１６の作製）
溶液ｅ１と溶液ａ１６とを５０μＬずつ混合して、１００μＬの溶液Ａ１を作製した。
【０１０１】
（複合体の形成）
上記で作製した１００μＬの溶液Ａ１、Ａ３、Ａ５およびＡ１６それぞれに溶液Ｂを５０μＬ混合して、混合液を調製した。各混合液を２５℃で３０分間静置して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を形成した。
【０１０２】
（粒子径および粒子形状）
ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成後、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で約３００倍希釈し、ＭｉｃｒｏＦｌｏｗ  Ｉｍａｇｉｎｇ（Ｂｒｉｇｈｔｗｅｌｌ社製）を用いて粒子径（円相当直径：ＥＣＤ）の分布および粒子形状データを取得した。結果を図２−１〜２−２に示す。
【０１０３】
＜比較例２−１＞
上記で作製した１００μＬのＡ’１に溶液Ｂを５０μＬ混合して、混合液を調製した。前記混合液を２５℃で３０分間静置して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を形成した。その後、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で約３００倍希釈し、ＭｉｃｒｏＦｌｏｗ  Ｉｍａｇｉｎｇ（Ｂｒｉｇｈｔｗｅｌｌ社製）を用いて粒子径の分布および粒子形状データを取得した。結果を図２−１〜２−２に示す。
【０１０４】
＜比較例２−２＞
１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中において、エタノールを６０％（ｖ／ｖ）の濃度となるように調製して、溶液ａ１６を作製した。５０μＬの溶液ａ１６と５０μＬの１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）とを混合して、１００μＬの溶液Ａ’２を作製した。前記１００μＬの溶液Ａ’２に溶液Ｂを５０μＬ混合して、混合液を調製した。前記混合液を２５℃で３０分間静置した。その後、測定に適した濃度に１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で希釈し、ＭｉｃｒｏＦｌｏｗ  Ｉｍａｇｉｎｇ（Ｂｒｉｇｈｔｗｅｌｌ社製）を用いて粒子径（円相当直径：ＥＣＤ）の分布および粒子形状データを取得した。結果を図２−１〜２−２に示す。
【０１０５】
＜比較例２−３＞
５０μＬの溶液Ｂに１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１００μＬ混合し、２５℃で３０分間静置した。その後、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で約３００倍希釈し、ＭｉｃｒｏＦｌｏｗ  Ｉｍａｇｉｎｇ（Ｂｒｉｇｈｔｗｅｌｌ社製）を用いて粒子径の分布および粒子形状データを取得した。結果を図２−１〜２−２に示す。
【０１０６】
試験例２で作製した混合液を表３に示す。
【０１０７】
【表３】
2019023175.tif 000004
【０１０８】
（考察）
図２−１に示すように、比較例２−２および２−３では、複合体を形成しておらず、よって粒子がほぼ認められなかったことが分かる。
【０１０９】
また、図２−１に示すように、実施例２−１〜２−４および比較例２−１では、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体が形成され、そのＥＣＤが１〜５μｍ程度の粒子が多く認められたことがわかる。
【０１１０】
図２−２に示すように、比較例２−１とは異なり、実施例２−１〜２−４では、混合液がアルコールを含むことにより、６μｍ以上のＥＣＤを有する粒子の割合が多くなることが分かる。
【０１１１】
ＥＣＤ１μｍ以上５μｍ未満の粒子数に対するＥＣＤ５μｍ以上１０μｍ以下の粒子数の割合を表４に示す。
【０１１２】
【表４】
2019023175.tif 000005
【０１１３】
表４に示すように、アルコールを添加することにより、ＥＣＤ１μｍ以上５μｍ未満の粒子数に対するＥＣＤ５μｍ以上１０μｍ以下の粒子数の割合が０．５％超になることが分かる。また、アルコールの濃度を上げることにより、より大きな構造体を有する粒子の割合を増加できることが分かる。
【０１１４】
≪試験例３≫
＜実施例３＞
溶液ｅ１と溶液ａ５とを３００μＬずつ混合して、６００μＬの溶液Ａ５を作製した。６００μＬの溶液Ａ５に溶液Ｂを３００μＬ混合して、混合液を調製した。前記混合液を２５℃で３０分間静置して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を形成した。ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成後、９０００×ｇで５分間遠心分離を行い、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を沈殿させた。上清８８５μＬを採取して、２８０ｎｍのＵＶスペクトルで上清のＩｇＧ濃度を測定し、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成率を求めて、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体として沈殿したＩｇＧ量を算出した。
【０１１５】
上清を除いたＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を含む液に、ＮａＣｌ濃度が１５０ｍＭとなるよう、１５０〜９００ｍＭ  ＮａＣｌ−１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて、２５℃で１時間静置して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を再溶解させた。９０００×ｇで５分間遠心分離を行い、未解離のＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を沈殿させた。上清を採取して、２８０ｎｍのＵＶスペクトルで上清のＩｇＧ濃度を測定し、ＩｇＧの収率を求めて、再溶解時に回収されたＩｇＧ量を算出した。
【０１１６】
なお、１５０ｍＭは、生体のＮａＣｌ濃度に等しく、この実施例は、生体内にＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を注入した際の放出を模倣したものである。
【０１１７】
＜比較例３＞
６００μＬの溶液Ａ’１に溶液Ｂを３００μＬ混合して、混合液を調製した。前記混合液を２５℃で３０分間静置して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を形成した。ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成後、９０００×ｇで５分間遠心分離を行い、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を沈殿させた。上清８８５μＬを採取して、２８０ｎｍのＵＶスペクトルで上清のＩｇＧ濃度を測定し、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成率を求めて、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体として沈殿したＩｇＧ量を算出した。
【０１１８】
上清を除いたＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を含む液に、ＮａＣｌ濃度が１５０ｍＭとなるよう、１５０〜９００ｍＭ  ＮａＣｌ−１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて、２５℃で１時間静置して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を再溶解（解離）させた。９０００×ｇで５分間遠心分離を行い、未解離のＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を沈殿させた。上清を採取して、２８０ｎｍのＵＶスペクトルで上清のＩｇＧ濃度を測定して、ＩｇＧの収率を求めて、再溶解時に回収されたＩｇＧ量を算出した。
【０１１９】
（再溶解後の収率）
再溶解後のＩｇＧ回収率を下記式（１）を用いて算出した。
【０１２０】
【数１】
2019023175.tif 000006
【０１２１】
結果を図３に示す。なお、図３において、濃縮倍率は、以下の式で算出した。
【０１２２】
【数２】
2019023175.tif 000007
【０１２３】
（考察）
図３に示すように、実施例３では、エタノールが混合液に含まれるため、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体は、１時間の静置で９５％以上解離したことが分かる。
【０１２４】
また、実施例３では、５０倍濃縮時（約１００ｍｇ／ｍＬ）においても、８０％のＩｇＧを回収できることが分かる。比較例３と比較すると、ＩｇＧの回収率が１．６倍であった。
【０１２５】
≪試験例４≫
＜実施例４−１〜４−５＞
溶液ｅ１と溶液ａ１〜ａ５それぞれとを３００μＬずつ混合して、６００μＬの溶液Ａ１〜Ａ５を作製した。６００μＬの溶液Ａ１〜Ａ５それぞれに溶液Ｂを３００μＬ混合して、混合液を調製した。前記混合液を２５℃で３０分間静置して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を形成した。ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成後、９０００×ｇで５分間遠心分離を行い、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を沈殿させて、上清８８５μＬを除去した。
【０１２６】
上清を除いたＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を含む液に、１５０〜９００ｍＭ  ＮａＣｌ−１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３〜８８５μＬ加えて、２５℃で１時間静置して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を再溶解させた。９０００×ｇで５分間遠心分離を行い、未解離のＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を沈殿させた。上清を採取して、２８０ｎｍのＵＶスペクトルで上清のＩｇＧ濃度を測定した。１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、当該上清に含まれるＩｇＧの濃度を０．１ｍｇ／ｍＬに調整した。調整した上清について、ＩｇＧの波長２００〜２５０ｎｍの遠紫外ＣＤスペクトル（測定機器：ＪＡＳＣＯ  Ｊ−７２０、日本分光株式会社製）を測定した。測定は、積算回数１５回行った。結果を図４に示す。
【０１２７】
なお、図４では、溶液Ｂについて、ＩｇＧの波長２００〜２５０ｎｍの遠紫外ＣＤスペクトル（測定機器：ＪＡＳＣＯ  Ｊ−７２０、日本分光株式会社製）を測定し、スタンダードとした。
【０１２８】
＜参考例４＞
溶液Ａ１〜Ａ５の代わりに溶液Ａ’１を用いたこと以外は、実施例４−１〜４−５と同様にして、ＩｇＧの波長２００〜２５０ｎｍの遠紫外ＣＤスペクトル（測定機器：ＪＡＳＣＯ  Ｊ−７２０、日本分光株式会社製）を測定した。結果を図４に示す。
【０１２９】
（考察）
図４に示すように、エタノールを用いてＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成および解離を行った後も、ＩｇＧの構造に変化が認められないことが分かる。
【０１３０】
≪試験例５≫
溶液ｅ１と溶液ａ５とを５０μＬずつ混合して、１００μＬの溶液Ａ５を作製した。１００μＬの溶液Ａ５に溶液Ｂを５０μＬ混合して、混合液を調製した。前記混合液を２５℃で３０分間静置して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を形成した。ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成後、９０００×ｇで５分間遠心分離を行い、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を沈殿させた。
【０１３１】
得られたＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で０〜３回洗浄した（０回洗浄では、下記（ｉｉ）の手順を行わなかった）。洗浄操作は、下記の手順で行った。
【０１３２】
（ｉ）上清１３５μＬを取り除いた後、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１３５μＬ加える；
（ｉｉ）１５〜３０回ピペッティングする；
（ｉｉｉ）９０００×ｇで５分間遠心分離する；
（ｉｖ）上清１３５μＬを取り除く。
【０１３３】
（ｉ）〜（ｉｖ）の操作を１〜３回繰り返した後、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再溶解し、２８０ｎｍのＵＶスペクトルでＩｇＧの濃度を測定して、ＩｇＧの収率を求めた。なお、３回の洗浄により、理論上エタノール濃度は、０．０１５％（＝１５％×１０−３）まで低下する。結果を図５に示す。
【０１３４】
（考察）
図５に示すように、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体沈殿後の洗浄操作は、ＩｇＧの収率に影響を与えなかった。よって、洗浄操作を繰り返すことにより、アルコールを除去できることが分かる。
【０１３５】
≪試験例６≫
＜実施例６−１〜６−５＞
（ポリエチレングリコールを含む溶液ｐ１〜ｐ５の作製）
１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（４０００Ｄａ）を下記表５に示される濃度となるように調製して、溶液ｐ１〜ｐ５を作製した。
【０１３６】
【表５】
2019023175.tif 000008
【０１３７】
（溶液Ａ１７〜Ａ２１の作製）
溶液ｅ１と溶液ｐ１〜ｐ５それぞれとを５０μＬずつ混合して、１００μＬの溶液Ａ１６〜Ａ２０を作製した。
【０１３８】
（ｐｏｌｙＥの遠紫外ＣＤスペクトルの測定）
上記とは別に、溶液ｅ１と溶液ｐ１〜ｐ５それぞれと１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．）とを５０μＬずつ混合して、１５０μＬの溶液Ａ１６〜Ａ２０を作製した。当該溶液Ａ１７〜Ａ２１について、ｐｏｌｙＥの遠紫外ＣＤスペクトル（測定機器：ＪＡＳＣＯ  Ｊ−７２０、日本分光株式会社製）を測定した。結果を図６−１に示す。
【０１３９】
（複合体の形成）
前記１００μＬの溶液Ａ１７〜Ａ２１それぞれに溶液Ｂを５０μＬ混合して、混合液を調製した。各混合液を２５℃で３０分間静置して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体を形成した。
【０１４０】
（複合体の形成率の算出）
ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体の形成後、９０００×ｇで５分間遠心分離を行い、複合体を沈殿させた。上清を採取して、株式会社エル・エム・エス社製ＮＤ−１０００を用いて上清中のＩｇＧ濃度を測定し、複合体の形成率を算出した。結果を図６−２に示す。なお、複合体の形成率は、以下の式により算出した。
【０１４１】
【数３】
2019023175.tif 000009
【０１４２】
＜比較例６＞
溶液Ａ１７〜Ａ２１の代わりに溶液Ａ’１を用いたこと以外は、実施例６−１〜６−５と同様にして、複合体の形成率を算出した。結果を図６−２に示す。
【０１４３】
また、溶液Ａ’１について、ｐｏｌｙＥの遠紫外ＣＤスペクトルを測定した。結果を図６−１に示す。
【０１４４】
試験例６で作製した混合液を表６に示す。
【０１４５】
【表６】
2019023175.tif 000010
【０１４６】
（考察）
図６−１に示すように、混合液中のＰＥＧ濃度が増加するにしたがって、ポリグルタミン酸がαへリックス豊富な構造を形成していることが分かる。
【０１４７】
また、図６−２に示すように、混合液がＰＥＧを含むことによって、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体の形成率を向上できることが分かる。
【０１４８】
≪試験例７≫
＜実施例７−１〜７−５＞
溶液ｅ１と溶液ｐ１〜ｐ５それぞれとを５０μＬずつ混合して、１００μＬの溶液Ａ１７〜Ａ２１を作製した。１００μＬの溶液Ａ１７〜Ａ２１それぞれに溶液Ｂを５０μＬ混合して、混合液を調製した。各混合液を２５℃で３０分間静置して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体を形成した。ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体の形成後、９０００×ｇで５分間遠心分離を行い、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体を沈殿させて、上清１３５μＬを除去した。
【０１４９】
上清を除いたＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体を含む液に、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１３５μＬ加えて、２５℃で１時間静置して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体を再溶解させた。９０００×ｇで５分間遠心分離を行い、未解離のＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を沈殿させた。上清を採取して、２８０ｎｍのＵＶスペクトルで上清のＩｇＧ濃度を測定した。１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、当該上清に含まれるＩｇＧの濃度を０．１ｍｇ／ｍＬに調整した。調整した上清について、ＩｇＧの波長２００〜２５０ｎｍの遠紫外ＣＤスペクトル（測定機器：ＪＡＳＣＯ  Ｊ−７２０、日本分光株式会社製）を測定した。測定は、積算回数１５回行った。結果を図７に示す。
【０１５０】
なお、図７では、溶液Ｂについて、ＩｇＧの波長２００〜２５０ｎｍの遠紫外ＣＤスペクトル（測定機器：ＪＡＳＣＯ  Ｊ−７２０、日本分光株式会社製）を測定し、スタンダードとした。
【０１５１】
＜参考例７＞
溶液Ａ１７〜Ａ２１の代わりに溶液Ａ’１を用いたこと以外は、実施例７−１〜７−５と同様にして、ＩｇＧの波長２００〜２５０ｎｍの遠紫外ＣＤスペクトル（測定機器：ＪＡＳＣＯ  Ｊ−７２０、日本分光株式会社製）を測定した。結果を図７に示す。
【０１５２】
（考察）
図７に示すように、ＰＥＧを添加してＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体を形成し、その複合体を解離させた後であっても、ＩｇＧの構造が変化しなかったことが分かる。
【０１５３】
≪試験例８≫
＜実施例８−１〜８−５＞
溶液ｅ１と溶液ｐ１〜ｐ５それぞれとを５０μＬずつ混合して、１００μＬの溶液Ａ１７〜Ａ２１を作製した。１００μＬの溶液Ａ１７〜Ａ２１それぞれに溶液Ｂを５０μＬ混合して、混合液を調製した。各混合液を２５℃で３０分間静置して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体を形成した。ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体の形成後、９０００×ｇで５分間遠心分離を行い、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体を沈殿させて、上清１３５μＬを除去した。
【０１５４】
上清を除いたＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体を含む液に、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１３５μＬ加えて、２５℃で１時間（０日）および１〜５日間静置して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体を再溶解（解離）させた。９０００×ｇで５分間遠心分離を行い、未解離の複合体を沈殿させた。上清を採取し、２８０ｎｍのＵＶスペクトルで上清のＩｇＧ濃度を測定して、ＩｇＧの回収率を算出した。結果を図８に示す。
【０１５５】
＜参考例８＞
溶液Ａ１７〜Ａ２１の代わりに溶液Ａ’１を用いたこと以外は、実施例８−１〜８−５と同様にして、ＩｇＧ濃度を測定して、ＩｇＧの回収率を算出した。結果を図８に示す。
【０１５６】
（考察）
図８に示すように、混合液に含まれるＰＥＧの濃度が３または６％であると、９５％のＩｇＧが速やかに放出された（回収率：９５％）。また、混合液に含まれるＰＥＧの濃度が９〜１５％であると、徐放効果が観察された。実施例８−１〜８−５のいずれのサンプルにおいても、複合体に含まれるＩｇＧは、再溶解開始後４日までに、回収率をほぼ１００％にすることが可能であった。
【０１５７】
≪試験例９≫
＜実施例９−１〜９−３＞
（ポリアミノ酸を含む溶液ｅ２の作製）
１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中において、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ｐｏｌｙＥ、質量：５０ｋＤａ〜１００ｋＤａ）を１．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製して、溶液ｅ２を作製した。
【０１５８】
（ポリエチレングリコールを含む溶液ｐ６〜ｐ８の作製）
１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（４０００Ｄａ）を下記表７に示される混合液中の濃度となるように調製して、溶液ｐ６〜ｐ８を作製した。
【０１５９】
（溶液Ａ２２〜Ａ２４の作製）
溶液ｅ２と溶液ｐ６〜ｐ８それぞれとを５０μＬずつ混合して、１００μＬの溶液Ａ２２〜Ａ２４を作製した。
【０１６０】
（複合体の形成）
１００μＬの溶液Ａ２２〜Ａ２４それぞれに溶液Ｂを５０μＬ混合して、混合液を調製した。各混合液を２５℃で３０分間静置して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体を形成した。
【０１６１】
（複合体の形成率の算出）
ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体の形成後、９０００×ｇで５分間遠心分離を行い、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体を沈殿させた。上清を採取して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（使用カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ、粒子径５μｍ、東ソー、測定機器：高速液体クロマトグラフィー  ＬＣ２０Ａ、株式会社島津製作所）により上清中のＩｇＧ濃度を測定して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体の形成率を算出した。結果を図９および表７に示す。
【０１６２】
（比較例９）
（溶液Ａ’３の作製）
溶液ｅ２と１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）とを５０μＬずつ混合して、１００μＬの溶液Ａ’３を作製した。
【０１６３】
（複合体の形成）
１００μＬの溶液Ａ’３に溶液Ｂを５０μＬ混合して、混合液を調製した。各混合液を２５℃で３０分間静置して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を形成した。
【０１６４】
（複合体の形成率の算出）
ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成後、９０００×ｇで５分間遠心分離を行い、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を沈殿させた。上清を採取して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（使用カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ、粒子径５μｍ、東ソー、測定機器：高速液体クロマトグラフィー  ＬＣ２０Ａ、島津製作所）により上清中のＩｇＧ濃度を測定して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体の形成率を算出した。結果を図９および表７に示す。
【０１６５】
試験例９で作製した混合液を表７に示す。
【０１６６】
【表７】
2019023175.tif 000011
【０１６７】
（考察）
図９および表７に示すように、混合液のｐＨが６．０であり、長鎖（５０ｋＤａ〜１００ｋＤａ）のポリ−Ｌ−グルタミン酸を用いた場合、ＰＥＧを添加しないと複合体の形成率は、１０％以下であることが分かる。
【０１６８】
一方、ＰＥＧ（４ｋＤａ）を添加することにより、複合体の形成率が７０％以上まで回復したことが分かる。
【０１６９】
≪試験例１０≫
＜実施例１０−１〜１０−３＞
（ポリエチレングリコールを含む溶液ｐ９〜ｐ１１の作製）
１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（２００００Ｄａ）を下記表８に示される混合液中の濃度となるように調製して、溶液ｐ９〜ｐ１１を作製した。
【０１７０】
（溶液Ａ２５〜Ａ２７の作製）
溶液ｅ２と溶液ｐ９〜ｐ１１それぞれとを５０μＬずつ混合して、１００μＬの溶液Ａ２５〜Ａ２７を作製した。
【０１７１】
（複合体の形成）
１００μＬの溶液Ａ２５〜Ａ２７それぞれに溶液Ｂを５０μＬ混合して、混合液を調製した。各混合液を２５℃で３０分間静置して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体を形成した。
【０１７２】
（複合体の形成率の算出）
ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体の形成後、９０００×ｇで５分間遠心分離を行い、複合体を沈殿させた。上清を採取して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（使用カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ、粒子径５μｍ、東ソー、測定機器：高速液体クロマトグラフィー  ＬＣ２０Ａ、株式会社島津製作所）により上清中のＩｇＧ濃度を測定して、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ／ＰＥＧ複合体の形成率を算出した。結果を図１０および表８に示す。
【０１７３】
＜比較例１０＞
比較例９と同様にして、ＩｇＧ／ｐｏｌｙＥ複合体を形成し、その形成率を算出した。結果を図１０および表８に示す。
【０１７４】
【表８】
2019023175.tif 000012
【０１７５】
（考察）
図１０および表８に示すように、混合液のｐＨが６．０であり、長鎖（５０ｋＤａ〜１００ｋＤａ）のポリ−Ｌ−グルタミン酸を用いた場合、ＰＥＧを添加しないと複合体の形成率は、１０％以下であることが分かる。
【０１７６】
一方、ＰＥＧ（２０ｋＤａ）を添加することにより、複合体の形成率が８０％以上まで回復したことが分かる。
【図１−１】
2019023175.tif 000013
【図１−２】
2019023175.tif 000014
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
2019023175.tif 000019
【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
2019023175.tif 000023
【図８】
2019023175.tif 000024
【図９】
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【図１０】
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