(57)【要約】      （修正有）【課題】ＧＬＩポリペプチドを発現する癌の診断及び治療のための組成物、薬学的調製物、及び方法の提供。【解決手段】３−（４−フルオロ−フェニル）−１−フェニル−５−プロピル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（５−ヒドロキシ−４，４−ジメチル−フェニル）−アミド等、特定の置換基を有するピラゾリル含有化合物又はその類似体、もしくは誘導体。当該化合物を含む薬学的組成物、及び癌を治療するための方法。【選択図】図１
2019006816.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物の単離された鏡像異性体、ならびにその塩、水和物、溶媒和物、立体異性体、及びプロドラッグ：
2019006816.tif 000060
式中、
Ｘ１及びＸ２の各々は独立して、ＮまたはＣであり、環Ｎが、ＣであるＸ１及びＸ２のいずれかと二重結合を形成するように、Ｘ１及びＸ２の一方はＮでありかつＸ１及びＸ２の一方はＣであり、
Ｒ１は、アリールまたは置換アリールであり、
Ｒ２は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、及びアルキルから選択され、
Ｒ３は、アリールまたは置換アリールであり、
Ｙは、直接結合またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
Ｚは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはアリールであり、
Ｒ４は、−ＯＨであり、
Ｒ５は、水素、またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【請求項２】
より緩徐に溶出する鏡像異性体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
より速く溶出する鏡像異性体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ１がＮであり、Ｘ２がＣである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１が、アリールである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２が、アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ３が、置換アリールである、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ５が、水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
ＹがＣ１〜Ｃ４アルキルであり、ＺがＣ１〜Ｃ４アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｙ及びＺが−（ＣＨ２）３−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−を形成するように、ＹがＣ１〜Ｃ４アルキルでありかつＺがＣ１〜Ｃ４アルキルである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ１がアリールであり、Ｒ２がアルキルであり、Ｒ３が置換アリールである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
構造：
2019006816.tif 000061
を有する、３−（４−フルオロ−フェニル）−１−フェニル−５−プロピル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（５−ヒドロキシ−４，４−ジメチル−フェニル）−アミドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
より緩徐に溶出する鏡像異性体である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
より速く溶出する鏡像異性体である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１５】
（ｉ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物と、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体と
を含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
（ｉ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物と、
（ｉｉ）化学療法薬と
を含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
（ｉ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物と、
（ｉｉ）エルロチニブ、ペメトレキセド、ＬＹ２９４００２、ＳＢ４３１５４２、及びシスプラチンから選択される治療薬と
を含む、薬学的組成物。
【請求項１８】
癌性状態を有する対象を治療するための方法であって、
治療有効量の請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含み、
前記癌性状態が、ＧＬＩタンパク質を発現することを特徴とし、前記投与することが、前記対象の治療をもたらす、前記方法。
【請求項１９】
薬物療法において使用するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
癌の治療において使用するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
癌治療のための医薬の製造における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物、または請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の薬学的組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
米国特許法第１１９（ｅ）項に従って、本願は、２０１３年１月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／７５５，８７８号の出願日に対する優先権を主張し、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
序文
ヘッジホッグ（ＳｈｈまたはＨｈ）、ＷＮＴ、ＦＧＦ、及びＢＭＰシグナル伝達経路は、胚形成、組織再生、及び発癌中に一緒に繋がる。Ｈｈシグナル伝達経路の異常な活性化は、様々なヒト腫瘍における病理的帰結につながる。ヘッジホッグは、ＰＡＴＣＨＥＤ１（ｐｔｃｈ１）及びＳＭＯＯＴＨＥＮＥＤ（ｓｍｏ）を含む膜貫通タンパク質複合体に結合し、かつＧＬＩ亜鉛フィンガー転写因子の転写につながるタンパク質キナーゼＡの阻害を含む、細胞質シグナル伝達事象のカスケードを引き起こすことにより、Ｈｈシグナル伝達を開始する分泌糖タンパク質である。その後、亜鉛フィンガー転写因子のＧＬＩファミリーは、コンテキスト依存及び細胞型特異的様式で、細胞外Ｈｈ刺激を定義された転写プログラムに翻訳する（Ｒｕｉｚ  Ｉ  Ａｌｔａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：３６１−７２（非特許文献1））。
【０００３】
ＧＬＩタンパク質を含むいくつかのタンパク質は、Ｈｈシグナル伝達の媒介に関与する（Ｋａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｋａｔｏｈ，  ２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１０５０−４（非特許文献2））。脊椎動物は、少なくとも３つのはっきりと異なるＧＬＩタンパク質、すなわちＧＬＩ（ＧＬＩ１とも称される）、ＧＬＩ２、及びＧＬＩ３を有する。これらのタンパク質は、亜鉛フィンガー転写因子のＧＬＩファミリーであり、ショウジョウバエキュビタスインターラプタス（Ｃｉ）及びカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）性決定遺伝子ｔｒａ−１と高度に保存されたＣ２−Ｈ２亜鉛フィンガードメイン（５つの亜鉛フィンガーＤＮＡ結合モチーフを有する）を共有する（Ｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６２：４０２−１３（非特許文献3））。
【０００４】
ショウジョウバエ及びマウス発生におけるＨｈシグナル伝達についてはあまり知られていないが、ヒト癌におけるＨｈシグナル伝達及びＧＬＩ活性に応答して活性化される分子機構及び腫瘍形成プログラムの理解は、依然として非常に限られている。Ｈｈ関連癌の共通の特性は、１つ以上のＧＬＩタンパク質の発現レベルの上昇である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｒｕｉｚ  Ｉ  Ａｌｔａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：３６１−７２
【非特許文献２】Ｋａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｋａｔｏｈ，  ２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１０５０−４
【非特許文献３】Ｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６２：４０２−１３
【発明の概要】
【０００６】
概要
本開示は、一般的に、腫瘍形成、腫瘍成長、及び腫瘍生存を阻害する組成物及び方法に関する。本組成物は、ヘッジホッグ及びＧＬＩシグナル伝達経路を阻害する小分子化合物を含む。本組成物は、ＧＬＩタンパク質が過剰発現される癌の治療に用途を見出す。
【０００７】
本実施形態は、ＧＬＩタンパク質が過剰発現されるいくつかの癌の検出及び治療に有用な化合物、薬学的組成物、キット、及び方法を提供する。そのような癌は、肺癌、ＮＳＣＬＣ、乳癌、結腸癌、中皮腫、黒色腫、肉腫、前立腺癌、卵巣癌、腎臓癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、上咽頭癌、膵臓癌、神経膠腫等を含む。
【０００８】
本開示の態様は、式（Ｉ）の化合物、ならびにその塩、水和物、溶媒和物、立体異性体、及びプロドラッグを含む：
2019006816.tif 000003
式中、
Ｘ１及びＸ２の各々は独立して、ＮまたはＣであり、環Ｎが、ＣであるＸ１及びＸ２のいずれかと二重結合を形成するように、Ｘ１及びＸ２の一方はＮでありかつＸ１及びＸ２の一方はＣであり、
Ｒ１は、アリールまたは置換アリールであり、
Ｒ２は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、及びアルキルから選択され、
Ｒ３は、アリールまたは置換アリールであり、
Ｙは、直接結合またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
Ｚは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはアリールであり、
Ｒ４は、−ＯＨであり、
Ｒ５は、水素、またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０００９】
本化合物のいくつかの実施形態では、Ｘ１はＮであり、Ｘ２はＣである。
【００１０】
本化合物のいくつかの実施形態では、Ｘ１はＣであり、Ｘ２はＮである。
【００１１】
本化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ１は、アリールである。
【００１２】
本化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ２は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、及びアルキルから選択される。
【００１３】
本化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ２は、ヘテロアリール及びアルキルから選択される。
【００１４】
本化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ３は、アリールである。
【００１５】
本化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ３は、置換アリールである。
【００１６】
本化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ５は、水素である。
【００１７】
本化合物のいくつかの実施形態では、ＹはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、ＺはＣ１〜Ｃ４アルキルである。
【００１８】
本化合物のいくつかの実施形態では、Ｙ及びＺが−（ＣＨ２）３−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−を形成するように、ＹはＣ１〜Ｃ４アルキルでありかつＺはＣ１〜Ｃ４アルキルである。
【００１９】
本化合物のいくつかの実施形態では、ＹはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｚはアリールである。
【００２０】
本化合物のいくつかの実施形態では、Ｙ及びＺが、
2019006816.tif 000004
を形成するように、ＹはＣ１〜Ｃ４アルキルでありかつＺはアリールである。
【００２１】
本化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ１はアリールであり、Ｒ２はヘテロアリールであり、Ｒ３はアリールである。
【００２２】
本化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ１はアリールであり、Ｒ２はアルキルであり、Ｒ３は置換アリールである。
【００２３】
本化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ１はアリールであり、Ｒ２はアリールであり、Ｒ３はアリールである。
【００２４】
本化合物のいくつかの実施形態では、Ｒ１はアリールであり、Ｒ２は置換アリールであり、Ｒ３は置換アリールである。
【００２５】
本化合物のいくつかの実施形態では、本化合物は、構造：
2019006816.tif 000005
を有する、１、３−ジフェニル−５−チオフェン−３−イル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（５−ヒドロキシ−４，４−ジメチル−ペンチル）−アミドである。
【００２６】
本化合物のいくつかの実施形態では、本化合物は、構造：
2019006816.tif 000006
を有する、１、３−ジフェニル−５−チオフェン−３−イル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（５−ヒドロキシ−４，４−ジメチル−ペンチル）−アミドである。
【００２７】
本化合物のいくつかの実施形態では、本化合物は、構造：
2019006816.tif 000007
を有する、３−（４−フルオロ−フェニル）−１−フェニル−５−プロピル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（５−ヒドロキシ−４，４−ジメチル−ペンチル）−アミドである。
【００２８】
本化合物のいくつかの実施形態では、本化合物は、構造：
2019006816.tif 000008
を有する、１，３，５−トリフェニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸４−ヒドロキシ−ベンジルアミドである。
【００２９】
本化合物のいくつかの実施形態では、本化合物は、構造：
2019006816.tif 000009
を有する、３−（４−フルオロ−フェニル）−５−（３−フルオロ−フェニル）−１−フェニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（５−ヒドロキシ−４，４−ジメチル−ペンチル）−アミドである。
【００３０】
本化合物のいくつかの実施形態では、本化合物は、
2019006816.tif 000010
（１−（５−クロロ−２−メチル−フェニル）−５−（２，６−ジメチル−フェニル）−３−（２−フルオロ−フェニル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸［２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−エチル］−アミド、化合物３）、及び
2019006816.tif 000011
（３−（４−フルオロ−フェニル）−１，５−ジフェニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（５−ヒドロキシ−４，４−ジメチル−ペンチル）−アミド、化合物５）から選択される。
【００３１】
本開示の態様は、上述の式（Ｉ）の化合物及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。
【００３２】
本開示の態様は、上述の式（Ｉ）の化合物及び化学療法薬を含む薬学的組成物を含む。
【００３３】
本開示の態様は、上述の式（Ｉ）の化合物、ならびにエルロチニブ、ペメトレキセド、ＬＹ２９４００２、ＳＢ４３１５４２、及びシスプラチンから選択される治療薬を含む薬学的組成物を含む。
【００３４】
本実施形態は、式（Ｉ）の化合物を使用するための方法も提供する。ある特定の実施形態では、癌性状態に罹患する対象を治療するための方法が提供される。本方法は、治療有効量の式（Ｉ）の化合物、または式（Ｉ）の化合物を含む薬学的組成物を対象に投与するステップを含み、癌性状態は、ＧＬＩポリペプチドの発現を特徴とし、投与のステップは、対象の治療をもたらす。
【００３５】
さらに、本実施形態は、薬物療法において使用するための式（Ｉ）の化合物、または式（Ｉ）の化合物を含む薬学的組成物を提供する。さらに、本実施形態は、癌の治療において使用するための式（Ｉ）の化合物、または式（Ｉ）の化合物を含む薬学的組成物を提供する。さらに、本実施形態は、癌治療のための医薬の製造における、式（Ｉ）の化合物、または式（Ｉ）の化合物を含む薬学的組成物の使用を提供する。
[本発明1001]
式（Ｉ）の化合物の単離された鏡像異性体、ならびにその塩、水和物、溶媒和物、立体異性体、及びプロドラッグ：
2019006816.tif 000012
式中、
Ｘ1及びＸ2の各々は独立して、ＮまたはＣであり、環Ｎが、ＣであるＸ1及びＸ2のいずれかと二重結合を形成するように、Ｘ1及びＸ2の一方はＮでありかつＸ1及びＸ2の一方はＣであり、
Ｒ1は、アリールまたは置換アリールであり、
Ｒ2は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、及びアルキルから選択され、
Ｒ3は、アリールまたは置換アリールであり、
Ｙは、直接結合またはＣ1〜Ｃ4アルキルであり、
Ｚは、Ｃ1〜Ｃ4アルキルまたはアリールであり、
Ｒ4は、−ＯＨであり、
Ｒ5は、水素、またはＣ1〜Ｃ6アルキルである。
[本発明1002]
より緩徐に溶出する鏡像異性体である、本発明1001の化合物。
[本発明1003]
より速く溶出する鏡像異性体である、本発明1001の化合物。
[本発明1004]
Ｘ1がＮであり、Ｘ2がＣである、本発明1001の化合物。
[本発明1005]
Ｒ1が、アリールである、本発明1001の化合物。
[本発明1006]
Ｒ2が、アルキルである、本発明1001の化合物。
[本発明1007]
Ｒ3が、置換アリールである、本発明1001の化合物。
[本発明1008]
Ｒ5が、水素である、本発明1001の化合物。
[本発明1009]
ＹがＣ1〜Ｃ4アルキルであり、ＺがＣ1〜Ｃ4アルキルである、本発明1001の化合物。
[本発明1010]
Ｙ及びＺが−（ＣＨ2）3−Ｃ（ＣＨ3）2−ＣＨ2−を形成するように、ＹがＣ1〜Ｃ4アルキルでありかつＺがＣ1〜Ｃ4アルキルである、本発明1009の化合物。
[本発明1011]
Ｒ1がアリールであり、Ｒ2がアルキルであり、Ｒ3が置換アリールである、本発明1001の化合物。
[本発明1012]
構造：
2019006816.tif 000013
を有する、3−（4−フルオロ−フェニル）−1−フェニル−5−プロピル−4，5−ジヒドロ−1Ｈ−ピラゾール−4−カルボン酸（5−ヒドロキシ−4，4−ジメチル−ペンチル）−アミドである、本発明1001の化合物。
[本発明1013]
より緩徐に溶出する鏡像異性体である、本発明1012の化合物。
[本発明1014]
より速く溶出する鏡像異性体である、本発明1012の化合物。
[本発明1015]
（ｉ）本発明1001〜1014のいずれかの化合物と、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体と
を含む、薬学的組成物。
[本発明1016]
（ｉ）本発明1001〜1014のいずれかの化合物と、
（ｉｉ）化学療法薬と
を含む、薬学的組成物。
[本発明1017]
（ｉ）本発明1001〜1014のいずれかの化合物と、
（ｉｉ）エルロチニブ、ペメトレキセド、ＬＹ294002、ＳＢ431542、及びシスプラチンから選択される治療薬と
を含む、薬学的組成物。
[本発明1018]
癌性状態を有する対象を治療するための方法であって、
治療有効量の本発明1001〜1014のいずれかの化合物、または本発明1015〜1017のいずれかの薬学的組成物を前記対象に投与することを含み、
前記癌性状態が、ＧＬＩタンパク質を発現することを特徴とし、前記投与することが、前記対象の治療をもたらす、前記方法。
[本発明1019]
薬物療法において使用するための、本発明1001〜1014のいずれかの化合物、または本発明1015〜1017のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1020]
癌の治療において使用するための、本発明1001〜1014のいずれかの化合物、または本発明1015〜1017のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1021]
癌治療のための医薬の製造における、本発明1001〜1014のいずれかの化合物、または本発明1015〜1017のいずれかの薬学的組成物の使用。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本開示の実施形態による、マウス異種移植片モデル（黒色腫ＭｅｌＪｕｓｏ）を使用した、化合物１、２、４、及び６のインビボ有効性試験を示す。腫瘍重量は、化合物を投与して処置した後に大幅に減少した。結果は、平均±標準偏差（エラーバー）である。矢印は、注入期間を示す。
【図２】本開示の実施形態による、マウス異種移植片モデル（中皮腫ＭＳ−１）を使用した、化合物１及び４のインビボ有効性試験を示す。腫瘍重量は、化合物を投与して処置した後に大幅に減少した。結果は、平均±標準偏差（エラーバー）である。矢印は、注入期間を示す。
【図３】本開示の実施形態による、マウス異種移植片モデル（肺癌Ａ５４９）を使用した化合物１及び４のインビボ有効性試験を示す。腫瘍重量は、化合物を投与して処置した後に大幅に減少した。結果は、平均±標準偏差（エラーバー）である。矢印は、注入期間を示す。
【図４】本開示の実施形態による、化合物１、２、４、及び６によるｈＧｌｉ１、ｈＧｌｉ２、ｈＧｌｉ３、ｈＨＨＩＰ、ｈＷｎｔ２、ｈＡｘｉｎ２、ｈＥＧＦＲ、及びｈＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１活性の調節を示す。
【図５】本開示の実施形態による、インビボ処置後のマウスの白血球集団に対する、化合物１、２、４、及び６の効果を示す。インビボ試験の完了時、全処置群の各動物由来の白血球（ＷＢＣ：白血球細胞、ＮＥ：好中球、ＬＹ：リンパ球、ＭＯ：単球、ＥＯ：好酸球、ＢＡ：好塩基球）を回収し、血液細胞計数器により白血球集団を数えた。結果は、平均±標準偏差（エラーバー）である。
【図６】本開示の実施形態による、インビボ試験の薬物投与期間中のマウスの体重に対する化合物１、２、４、及び６の効果を示す。
【図７】本開示の実施形態による、毒性試験におけるマウスの体重に対する、異なる用量の化合物４及び６の効果を示す。本化合物を、６日間連続、２５、５０、及び１００ｍｇ／ｋｇ体重の３つの異なる用量で、腹部に腹腔内注入した。各投薬量群は、３匹のマウスを含んだ。マウスの体重を、はかりを使用して測定した。結果は、平均±標準偏差（エラーバー）である。
【図８】本開示の実施形態による、細胞毒性アッセイ、ならびにマウス由来の肝細胞、脾臓細胞、腎細胞、及び心臓細胞を使用した化合物２のスクリーニングを示す。
【図９】本開示の実施形態による、細胞毒性アッセイ、ならびにマウス由来の肝細胞、脾臓細胞、腎細胞、及び心臓細胞を使用した化合物１のスクリーニングを示す。
【図１０】本開示の実施形態による、細胞毒性アッセイ、ならびにマウス由来の肝細胞、脾臓細胞、腎細胞、及び心臓細胞を使用した化合物４のスクリーニングを示す。
【図１１】本開示の実施形態による、細胞毒性アッセイ、ならびにマウス由来の肝細胞、脾臓細胞、腎細胞、及び心臓細胞を使用した化合物６のスクリーニングを示す。
【図１２】本開示の実施形態による、肺癌細胞におけるエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）及び化合物４の相乗効果を示す。
【図１３】本開示の実施形態による、中皮腫細胞におけるエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）及び化合物４の相乗効果を示す。
【図１４】本開示の実施形態による、肺癌細胞におけるＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２及び化合物６の相乗効果を示す。
【図１５】本開示の実施形態による、中皮腫細胞におけるＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２及び化合物６の相乗効果を示す。
【図１６】本開示の実施形態による、肺癌細胞におけるＴＧＦβ阻害剤ＳＢ４３１５４２及び化合物６の相乗効果を示す。
【図１７】本開示の実施形態による、中皮腫細胞におけるペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ）及び化合物６の相乗効果を示す。
【図１８】本開示の実施形態による、様々な癌細胞系についてのＧｌｉ阻害剤化合物４、及びその２つの精製された鏡像異性体（Ｐ１及びＰ２）の各々の細胞毒性ＩＣ５０値（μＭ）を示す。
【図１９】本開示の実施形態による、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞におけるＧｌｉ阻害剤化合物４の有効性及びＧｌｉ発現の相関関係のグラフを示す。
【図２０】本開示の実施形態による、癌細胞におけるＧｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２の有効性及びＧｌｉ発現の相関関係のグラフを示す。
【図２１】本開示の実施形態による、Ｇｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２がインビトロでＮＣＳＬＣ細胞系Ａ５４９においてＧｌｉ／ＴＡＦ依存転写活性を阻害することを示す、ルシフェラーゼ活性（％）のグラフを示す。
【図２２】本開示の実施形態による、Ｇｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２がインビトロでＮＳＣＬＣ細胞においてＧｌｉ下流標的を阻害することを示す、Ｇｌｉ下流標的の発現レベルのグラフを示す。
【図２３】本開示の実施形態による、Ｇｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２がインビトロで中皮腫細胞においてＧｌｉ下流標的を阻害することを示す、遺伝子発現のグラフを示す。
【図２４】本開示の実施形態による、Ｇｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２がインビボの腫瘍内の中皮腫細胞においてＧｌｉ下流標的を阻害することを示す、免疫組織化学像（マウス異種移植片モデル：中皮腫ＭＳ−１）を示す。
【図２５】本開示の実施形態による、インビトロでの中皮腫細胞の成長の抑制におけるＧＤＣ０４４９（Ｓｍｏ阻害剤）及びＧｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２の相乗効果を示すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
詳細な説明
本開示の態様は、ＧＬＩタンパク質が過剰発現されるいくつかの癌の検出及び治療に有用な化合物、薬学的組成物、キット、及び方法を含む。本組成物は、ヘッジホッグ及びＧＬＩシグナル伝達経路を阻害する小分子化合物を含む。
【００３８】
本発明及び本発明の特定の例示的な実施形態を説明する前に、本発明は、言うまでもなく、変化し得るので、記載される特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、単に特定の実施形態を説明する目的であり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するよう意図されないことも理解されたい。
【００３９】
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本実施形態内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、表示範囲内の任意の具体的に除外された値に従って本実施形態内にも包含される。表示範囲がそれらの上限値及び下限値のうちの１つまたは両方を含む場合、それらの包含される値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本実施形態に包含される。
【００４０】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載のものと同様もしくは同等の任意の方法及び材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、例示的な方法及び材料が、これから記載される。
【００４１】
本明細書に引用される全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個々に示されるかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が関連して引用される方法及び／または材料を開示及び説明するために参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前にそれを開示するためであり、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の出版日とは異なる場合があり、別々に確認する必要があり得る。
【００４２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数対象を含むことに留意すべきである。よって、例えば、「化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」についての言及は、複数のそのような化合物及び当業者に既知のその等価物などを含む。
【００４３】
用語
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味を有する。以下の参考文献は、本明細書で使用される多くの用語の一般定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）、Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）、Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）、及びＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される、以下の用語は、特記しない限り、それらに属する意味を有する。
【００４４】
本明細書で使用される、「アルキル」という用語は、直鎖または分枝鎖炭化水素ラジカルを指し、指定される炭素原子の数を有する二価及び多価のラジカルを含み得る（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０は１〜１０個の炭素を意味する）。飽和炭化水素ラジカルの例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの相同体及び異性体などの基が挙げられる。
【００４５】
本明細書で使用される、「アルケニル」という用語は、１つ以上の二重結合を有する不飽和アルキル基のものを指す。アルケニル基の例としては、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、ならびにより高次の相同体及び異性体が挙げられる。
【００４６】
本明細書で使用される、「アルキニル」という用語は、１つ以上の３重結合を有する不飽和アルキル基のものを指す。アルキニル基の例としては、エチニル（アセチレニル）、１−プロピニル、１−及び２−ブチニル、ならびにより高次の相同体及び異性体が挙げられる。
【００４７】
本明細書で使用される、「アリール」という用語は、５〜１２環員を有する多価不飽和芳香族炭化水素置換基を指し、これは一緒に縮合されるか、または共有結合される単環もしくは多環（最大３つの環）であり得る。アリール基の非限定的な例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、及びベンジルが挙げられる。他のアリール基も本実施形態において有用である。
【００４８】
本明細書で使用される、「シクロアルキル」という用語は、３〜１５個の炭素、及び縮合または共有結合され得る１〜３つの環を有する飽和環式炭化水素を指す。本実施形態に有用なシクロアルキル基は、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルを含むが、これらに限定されない。本実施形態に有用なビシクロアルキル基は、［３．３．０］ビシクロオクタニル、［２．２．２］ビシクロオクタニル、［４．３．０］ビシクロノナン、［４．４．０］ビシクロデカン（デカリン）、スピロ［３．４］オクタニル、スピロ［２．５］オクタニルなどを含むが、これらに限定されない。
【００４９】
本明細書で使用される、「シクロアルケニル」という用語は、３〜１５個の炭素、及び縮合または共有結合され得る１〜３つの環を有する不飽和環式炭化水素を指す。本実施形態に有用なシクロアルケニル基は、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、及びシクロオクテニルを含むがこれらに限定されない。ビシクロアルケニル基も本実施形態において有用である。
【００５０】
本明細書で使用される、「ハロゲン」という用語は、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、及びヨウ素（Ｉ）を含む元素を指す。
【００５１】
本明細書で使用される、「ヘテロアリール」という用語は、一緒に縮合されるか、または共有結合される単環もしくは多環（最大３つの環）であり得、Ｎ、Ｏ、またはＳなどの環に少なくとも１個のヘテロ原子を有する、５〜１２環員を有する多価不飽和芳香族炭化水素置換基を指す。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を通して分子の残りの部分に付加され得る。ヘテロアリール基の非限定的な例としては、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリール、３−フリール、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、及び６−キノリルが挙げられる。本実施形態に有用なさらなるヘテロアリール基は、ピリジルＮ−オキシド、テトラゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、インダゾリル、またはラジカル置換された、特に、モノ−またはジ−置換された任意のものを含む。
【００５２】
本明細書で使用される、「ヘテロシクリル」という用語は、３〜１５環員、及び縮合または共有結合され得る１〜３つの環を有し、かつＮ、Ｏ、またはＳなどの環に少なくとも１個のヘテロ原子を有する飽和環式炭化水素を指す。加えて、ヘテロ原子は、そのヘテロ環が分子の残りの部分に付加される位置を占有することができる。ヘテロシクリル基の例としては、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。
【００５３】
本明細書で使用される、「立体異性体」という用語は、非対称炭素原子（光学中心）または二重結合を保有する本実施形態の化合物を指す。ラセミ体、ジアステレオマー、鏡像異性体、幾何異性体（すなわち、シス／トランス異性体）及び個々の立体異性体は全て、本実施形態の範囲内に包含されることが意図される。
【００５４】
「標識」または「検出可能な部分」は、分光、光化学、生化学、免疫化学、化学または他の物理手段により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識は、３Ｈ、１２５Ｉ、３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、もしくはハプテン、及び放射標識を小分子化合物内に組み込むことにより検出可能にさせることができるタンパク質または他の実体を含む。標識は、任意の位置で化合物内に組み込むことができる。
【００５５】
「薬学的に許容される」という用語は、生理学的に耐性であり、典型的には、ヒト対象などの対象に投与された場合にアレルギーまたは類似する望ましくない反応をもたらさない組成物を指す。例えば、「薬学的に許容される」という用語は、ヒトなどの動物に使用するために、連邦政府もしくは州政府の規制機関により承認された、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識される薬局方に列記されることも意味し得る。
【００５６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書において、アミノ酸残基のポリマーを指すために同義に使用される。本用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学摸倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー、修飾された残基を含むもの、及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用する。
【００５７】
本明細書で使用される、「プロドラッグ」という用語は、生理条件下で容易に化学変化を受けて本実施形態の化合物を提供する化合物を指す。加えて、プロドラッグは、エクスビボ環境において化学または生化学方法により本実施形態の化合物に変換され得る。例えば、プロドラッグは、好適な酵素または化学試薬と共に経皮パッチリザーバに配置される場合、本実施形態の化合物にゆっくり変換され得る。
【００５８】
本明細書で使用される、「塩」という用語は、本明細書に記載される化合物に見出される置換基により、比較的非毒性の酸または塩基と共に調製される化合物の塩を指す。本実施形態の化合物が比較的酸性の官能基を含む場合、塩基添加塩は、そのような化合物の中性形態を、純粋なまたは好適な不活性溶媒中のいずれかで、十分な量の所望の塩基と接触させることにより得ることができる。薬学的に許容される塩基添加塩の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、もしくはマグネシウムの塩または類似する塩が挙げられる。本実施形態の化合物が比較的塩基性の官能基を含む場合、酸添加塩は、そのような化合物の中性形態を、純粋なまたは好適な不活性溶媒中のいずれかで、十分な量の所望の酸と接触させることにより得ることができる。薬学的に許容される酸添加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｃａｒｂｏｎｉｃ）、リン酸、一水素リン酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ）、二水素リン酸（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ）、硫酸、一水素硫酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｓｕｌｆｕｒｉｃ）、ヨウ化水素酸（ｈｙｄｒｉｏｄｉｃ）、または亜リン酸などの無機酸に由来するもの、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などの比較的非毒性有機酸に由来する塩が挙げられる。アルギニン酸などのアミノ酸の塩、及びグルクロン酸またはガラクツロン酸などの有機酸の塩も含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅ，  Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，"Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ"，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７７，６６，１−１９を参照）。本実施形態のある特定の化合物は、化合物を塩基または酸の添加塩のいずれかに変換させることができる塩基及び酸両方の官能基を含む。
【００５９】
化合物の中性形態は、塩を塩基または酸と接触させ、従来の様式で親化合物を単離することにより再生することができる。化合物の親形態は、極性溶媒における可溶性など、ある特定の物理的性質において様々な塩形態と異なるが、それ以外は、塩は、本実施形態の目的において、化合物の親形態と同等である。
【００６０】
本明細書で使用される、「溶媒和物」という用語は、溶媒に複合される本実施形態の化合物を指す。本実施形態の化合物と溶媒和物を形成することができる溶媒は、アルコール（メタノール、エタノール等）、エーテル、アセトン、酢酸エチル、ハロゲン化溶媒（塩化メチレン、クロロホルム等）、ヘキサン、及びペンタンなどの一般的な有機溶媒を含む。さらなる溶媒は水を含む。水が複合溶媒である場合、複合体は、水和物と呼ばれる。
【００６１】
「置換（Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）」は、１つ以上の水素原子が各々、独立して、同じまたは異なる置換基（複数可）で置換された基を指す。典型的な置換基は、−Ｘ、−Ｒ１４、−Ｏ−、＝Ｏ、−ＯＲ１４、−ＳＲ１４、−Ｓ−、＝Ｓ、−ＮＲ１４Ｒ１５、＝ＮＲ１４、−ＣＸ３、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１４、−ＯＳ（Ｏ２）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ１４、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１４）（Ｏ−）、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１４）（ＯＲ１５）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１４、−Ｃ（Ｓ）Ｒ１４、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１４、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ１４、−ＮＲ１６Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５、−ＮＲ１６Ｃ（Ｓ）ＮＲ１４Ｒ１５、−ＮＲ１７Ｃ（ＮＲ１６）ＮＲ１４Ｒ１５、及び−Ｃ（ＮＲ１６）ＮＲ１４Ｒ１５を含むが、これらに限定されず、式中、各Ｘは独立して、ハロゲンであり、「Ｒ１４」、「Ｒ１５」、「Ｒ１６」、及び「Ｒ１７」は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、−ＮＲ１８Ｒ１９、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１８、もしくはＳ（Ｏ）２Ｒ１８であるか、または任意に、Ｒ１８及びＲ１９は、それらが両方付加される原子と一緒にシクロヘテロアルキルもしくは置換シクロヘテロアルキル環を形成し、「Ｒ１８」、「Ｒ１９」、及び「Ｒ２２」は各々独立して、水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換アリールアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換シクロヘテロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロアリール、及び置換もしくは非置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選択される。
【００６２】
上に定義される全ての置換基において、自体に対してさらなる置換基で置換基を定義することにより到達したポリマー（例えば、置換アリール基等でさらに置換される、自身が置換アリール基で置換される置換アリール基を置換基として有する置換アリール）は、本明細書に含まれることが意図されないことを理解する。そのような場合において、そのような置換の最大数は、３つである。例えば、置換アリール基の連続置換は、置換アリール−（置換アリール）−置換アリールに限定される。
【００６３】
本明細書で使用される、「生体試料」は、核酸またはポリペプチドを含む生体組織または流体の試料である。そのような試料は、典型的には、ヒト由来であるが、非ヒト霊長類または齧歯類、例えば、マウス及びラットから単離された組織を含む。生体試料は、生検及び剖検試料などの組織の切片、組織学的目的用に採取された凍結切片、血液、血漿、血清、痰、便、涙、粘液、毛髪、皮膚等も含み得る。生体試料は、外植片ならびに患者組織に由来する初代及び／または形質転換細胞培養物も含み得る。「生体試料」は、動物由来の細胞もしくは細胞集団または若干量の組織もしくは流体も指す。ほとんどの場合、生体試料は、動物から摘出されたが、用語「生体試料」は、インビボ、すなわち、動物から摘出されることなく分析される細胞または組織を指す場合もある。典型的には、「生体試料」は、動物由来の細胞を含むが、本用語は、癌関連ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドレベルを測定するために使用され得る、血液、唾液、または尿の非細胞画分などの非細胞生体材料を指す場合もある。組織生検、血液試料、頬の切屑、唾液試料、または乳頭分泌を含むが、これらに限定されない多くの種類の生体試料が本実施形態において使用され得る。本明細書で使用される、「組織生検」は、診断分析のために、ヒトなどの動物から摘出された若干量の組織を指す。癌を有する患者において、組織は、腫瘍から摘出され、腫瘍内の細胞の分析を可能にし得る。「組織生検」は、針生検、細径針生検、直視下生検等のいずれの種類の生検を指し得る。
【００６４】
「生体試料を提供する」は、本実施形態において記載される方法に使用するための生体試料を得ることを意味する。多くの場合、これは、患者から細胞の試料を摘出することにより行われるが、前に単離された細胞（例えば、別の個人によって、別の時間に、及び／または別の目的のために単離される）を使用することにより、またはインビボでの本実施形態の方法を行うことによっても達成され得る。治療歴または予後歴を有する記録組織が特に有用である。
【００６５】
組織培養における「癌細胞」、「形質転換」細胞、または「形質転換」は、必ずしも新しい遺伝子材料の取り込みを伴わない自発性または誘発された表現型変化を指す。形質転換は、形質転換ウイルスによる感染、及び新しいゲノムＤＮＡの組み込み、または外因性ＤＮＡの取り込みから生じ得るが、自発的、または発癌物質への曝露後にも生じ得、それによって、内因性遺伝子を突然変異させる。形質転換は、細胞の不死化、異常な成長制御、非形態変化、及び／または悪性度などの表現型変化と関連する（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ  ｅｄ．１９９４））。
【００６６】
「細胞成長における変化」という表現は、病巣の形成、足場非依存性、半固体もしくは軟寒天成長、接触阻害及び成長の密度制限における変化、成長因子もしくは血清必要量の損失、細胞形態における変化、不死化の増加もしくは損失、腫瘍特異的マーカーの増加もしくは損失、好適な動物宿主内に注入された場合に腫瘍を形成もしくは抑制する能力、及び／または細胞の不死化など、インビトロまたはインビボでの細胞成長及び増殖特性における任意の変化を指す。例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｐｐ．２３１−２４１（３ｒｄ  ｅｄ．１９９４）を参照。
【００６７】
「量を関連付ける」は、１つの試料において決定された、ある量の物質、分子、またはマーカー（ＧｌｉまたはＧＬＩなど）を、別の試料において決定された、その量の同じ物質、分子、またはマーカーと比較することを意味する。別の試料において決定された同じ物質、分子、またはマーカーの量は、所与の癌に特定的であり得る。
【００６８】
「量を決定する」という用語の同義語は、本実施形態の範囲内で企図され、ＧｌｉもしくはＧＬＩなどの分子の存在、不在、量、または濃度を検出、測定、試験、または決定することを含むが、これらに限定されない。
【００６９】
「決定する」という用語の同義語は、本実施形態の範囲内で企図され、ＧＬＩポリペプチド、標識、本実施形態の化合物などの分子の存在、不在、量、または濃度を検出、測定、アッセイ、試験、または決定することを含むが、これらに限定されない。本用語は、定性及び定量決定の両方を指す。
【００７０】
Ｓｈｈシグナル伝達、ＧＬＩシグナル伝達、またはＷｎｔ２シグナル伝達の文脈において、「下方調節」または「阻害」という用語は、Ｓｈｈシグナル伝達、ＧＬＩシグナル伝達、またはＷｎｔ２シグナル伝達の既知のアッセイにより測定される、Ｓｈｈシグナル伝達、ＧＬＩシグナル伝達、またはＷｎｔ２シグナル伝達を部分的または完全に阻害することを指す。阻害剤は、例えば、本実施形態の化合物である。
【００７１】
治療に関する本実施形態の化合物の「有効量」、「有効用量」「十分な量」、またはそれらの文法的な等価物は、寛解させる、またはある程度症状を減少させる、または状態の進行を停止もしくは反転するのに十分な量である。特定の薬学的組成物の投与による特定の状態、例えば、癌の症状の寛解は、薬学的組成物の投与に関連し得る任意の緩和、永久的もしくは一時的に関わらず、持続、または移行を指す。「有効量」は、インビボ及びインビトロで投与され得る。
【００７２】
「ＧＬＩ」という用語は、ＧＬＩタンパク質のファミリーを指す。ＧＬＩタンパク質は、ＧＬＩ（ＧＬＩ１とも称される）、ＧＬＩ２、及びＧＬＩ３を含む。ＧＬＩタンパク質の例としては、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、及びＧＬＩ３が挙げられる。
【００７３】
「ＧＬＩ」ポリペプチドは、天然に存在するまたは組換え形態の両方を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＧＬＩポリペプチド及びＧＬＩサブドメインポリペプチドは、ヒトＧＬＩ配列に対応する配列を含み得る。よって、例示的なＧＬＩが本明細書において提供され、当該技術分野において既知である。例えば、いくつかの脊椎動物のＧＬＩ１、ＧＬＩ２、及びＧＬＩ３タンパク質、例えば、ヒトＧＬＩ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２６９，Ｐ０８１５１）、マウスＧＬＩ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１０２９６、ＡＢ０２５９２２、ＡＡＣ０９１６９、Ｐ４７８０６）、ゼブラフィッシュＧＬＩ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７８２９６）、ヒトＧＬＩ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３０３８１、ＮＭ＿０３０３８０、ＮＭ−０３０３７９、ＤＱ０８６８１４）、マウスＧＬＩ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿９２２１０７）、ヒトＧＬＩ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１６８、ＡＪ２５０４０８、Ｍ５７６０９、Ｐ１００７１、ＡＡＹ８７１６５）、チンパンジーＧＬＩ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３４１９０、ＡＹ６６５２７２、Ｑ５ＩＳ５６）、マウスＧＬＩ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ９５２５５、ＮＭ＿００８１３０、ＮＰ＿０３２１５６、Ｑ６１６０２）、ラットＧＬＩ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿２２５４１１）、ゼブラフィッシュＧＬＩ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿２０５７２８、ＡＹ３７７４２９）が特徴付けされている。
【００７４】
ＧＬＩタンパク質は、完全長ＧＬＩタンパク質であるか、またはＧＬＩタンパク質のサブドメインなどの、部分ＧＬＩタンパク質であり得る。例えば、「ＧＬＩ３」ポリペプチドは、（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１６８、ＡＪ２５０４０８、Ｍ５７６０９、Ｐ１００７１、及びＡＡＹ８７１６５）から選択されるヒトＧＬＩ３に対して、少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、３００、５００以上のアミノ酸の領域にわたって、約６０％を超えるアミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、（ｉｉ）アミノ酸配列ＦＤＡＩＩなどのアミノ酸配列モチーフＦＸＸΦΦ（Ｆ＝フェニルアラニン、Ｘ＝任意の残基、Φ＝任意の疎水性残基）を含む、（ｉｉｉ）転写活性ドメインを含む、（ｉｖ）ＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位に結合する、及び／または（ｖ）ＴＡＦに結合するヒトＧＬＩ３のポリペプチド及び多型バリアント、対立遺伝子、変異体を指す。
【００７５】
「ＧＬＩタンパク質活性」という用語は、ＧＬＩシグナル伝達を指し、例えば、ＧＬＩによる下流遺伝子の転写活性化、ＧＬＩタンパク質のＧＬＩ  ＤＮＡ結合部位への結合、及びＧＬＩタンパク質の、他のタンパク質、例えば、ＴＡＦ、またはＣＢＰ（Ｃｒｅｂタンパク質結合タンパク質）などの活性化補助因子への結合を含む。
【００７６】
「Ｇｌｉ」という用語は、ＧＬＩタンパク質をコードする遺伝子を指す。よって、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、及びＧｌｉ３は、それぞれ、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、及びＧＬＩ３タンパク質をコードする遺伝子である。
【００７７】
「Ｇｌｉ核酸」または「ｇｌｉポリヌクレオチド」は、ＧＬＩ、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３タンパク質をコードする脊椎動物の遺伝子を指す。「Ｇｌｉ核酸」は、天然に存在するまたは組換え形態の両方を含む。ＧｌｉポリヌクレオチドまたはＧＬＩポリペプチドコード配列は、典型的には、ヒト由来であるが、非ヒト霊長類、齧歯類（例えば、ラット、マウス、もしくはハムスター）、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、または他の哺乳類由来であり得るが、これらに限定されない他の哺乳類由来であり得る。本実施形態の実施に有用なＧｌｉ核酸、例えば、ヒトＧｌｉ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２６９）、マウスＧｌｉ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１０２９６、ＡＢ０２５９２２）、ゼブラフィッシュＧｌｉ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７８２９６）、ヒトＧｌｉ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３０３８１、ＮＭ＿０３０３８０、ＮＭ−０３０３７９、ＤＱ０８６８１４）、マウスＧｌｉ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿９２２１０７）、ヒトＧｌｉ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１６８、ＡＪ２５０４０８、Ｍ５７６０９）、チンパンジーＧｌｉ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３４１９０、ＡＹ６６５２７２）、マウスＧｌｉ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ９５２５５、ＮＭ＿００８１３０）、ラットＧｌｉ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿２２５４１１）、ゼブラフィッシュＧｌｉ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿２０５７２８、ＡＹ３７７４２９）がクローン化され、特徴付けされている。Ｇｌｉポリヌクレオチドは、完全長Ｇｌｉポリヌクレオチドである、すなわち、完全なＧＬＩタンパク質をコードしているか、またはＧＬＩタンパク質のサブドメインをコードする部分Ｇｌｉポリヌクレオチドであり得る。
【００７８】
「ＧＬＩ経路」、「ＧＬＩシグナル伝達」、または「ＧＬＩシグナル伝達経路」という用語は、同義に使用され、ＧＬＩタンパク質の発現及び／または活性をもたらすその受容体（複数可）に結合するヘッジホッグタンパク質により開始されるシグナル伝達経路を指す。
【００７９】
「ヘッジホッグ」という用語は、「Ｈｈ」という用語と同義に使用され、Ｈｈ受容体に結合し、それによって、ＧＬＩタンパク質の発現及び／または活性化をもたらすＨｈシグナル伝達経路を開始するサイトカインである。哺乳類において、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、インディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）、及びデザートヘッジホッグ（Ｄｈｈ）の３つのＨｈファミリー遺伝子がある。いくつかの脊椎動物ヘッジホッグタンパク質、例えば、ヒトＳＨＨ、マウスＳＨＨ、ラットＳＨＨ、ヒトＩＨＨ、及びマウスＤＨＨが、当該技術分野において知られている。
【００８０】
生体試料における「Ｇｌｉ  ｍＲＮＡのレベル」または「Ｗｎｔ２  ｍＲＮＡのレベル」という用語は、それぞれ、細胞または生体試料に存在する、ＧｌｉまたはＷｎｔ遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を指す。ｍＲＮＡは、一般的に、機能性ＧＬＩまたはＷＮＴタンパク質をコードするが、コードされたタンパク質の機能を変更または排除する突然変異が存在し得る。「Ｇｌｉ  ｍＲＮＡのレベル」または「Ｗｎｔ２  ｍＲＮＡのレベル」は、定量化される必要はないが、対照試料からのレベルもしくは対照試料の予測されるレベルと比較して、または比較することなく、例えば、ヒトにより、主観的な視覚的検出により、単純に検出され得る。
【００８１】
生体試料における「ＧＬＩポリペプチドのレベル」または「Ｗｎｔ２ポリペプチドのレベル」は、それぞれ、細胞または生体試料に存在する、ＧｌｉまたはＷｎｔ２  ｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドの量を指す。ポリペプチドは、ＧＬＩまたはＷＮＴ２タンパク質活性を有しても、有さなくてもよい。「ＧＬＩポリペプチドのレベル」または「ＷＮＴ２ポリペプチド」は、定量化される必要はないが、対照試料からのレベルもしくは対照試料の予測されるレベルと比較して、または比較することなく、例えば、ヒトにより、主観的な視覚的検出により、単純に検出され得る。
【００８２】
本明細書で使用される、ＧＬＩなどのポリペプチドのレベルまたは活性の「調節因子」は、そのポリペプチドの活性化剤及び／または阻害剤を含み、ポリペプチドの発現レベルもしくはポリペプチドの活性を活性化または阻害する化合物を指す。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３である。活性化剤は、例えば、本実施形態のポリペプチドの発現を誘発もしくは活性化するか、または本実施形態のポリペプチドに結合する、それを刺激する、増加させる、開放する、活性化する、促進する、もしくは活性化を強化する、感作する、またはその活性を上方調節する化合物である。活性化剤は、天然に存在する、及び合成の化合物、小化学分子などを含む。活性化剤のアッセイは、例えば、ＧＬＩポリペプチドを発現する細胞に候補化合物を適用し、その後、機能効果を決定することを含む。潜在的な活性化剤で処理されるＧＬＩポリペプチドを含む試料またはアッセイは、効果の程度を検査するために、活性化剤を含まない対照試料と比較される。対照試料（候補化合物で処理されない）は、１００％の相対的活性値が割り当てられる。ポリペプチドの活性化は、対照に対するポリペプチド活性値が、１１０％、任意に１３０％、１５０％、任意に２００％、３００％、４００％、５００％、または１０００〜３０００％以上である場合、達成される。阻害剤は、例えば、本実施形態のポリペプチドの発現を抑制もしくは不活性化するか、または本実施形態のポリペプチドに結合する、それを減少させる、閉鎖する、不活性化する、妨害する、もしくは活性化を減少させる、脱感作する、またはその活性を下方調節する化合物である。阻害剤は、ＧＬＩタンパク質の発現に干渉するｓｉＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡなどの核酸、ならびに天然に存在する、及び合成の化合物、小化学分子などを含む。阻害剤のアッセイは、本明細書に記載される。潜在的な阻害剤で処理されるＧＬＩポリペプチドを含む試料またはアッセイは、効果の程度を検査するために、阻害剤を含まない対照試料と比較される。対照試料（候補化合物で処理されない）は、１００％の相対的活性値が割り当てられる。ポリペプチドの阻害は、対照に対するポリペプチド活性値が、１０％、任意に２０％、任意に３０％、任意に４０％、任意に５０％、６０％、７０％、８０％、または９０〜１００％減少される場合、達成される。
【００８３】
「プロモーター」は、核酸の転写を指向する多くの核酸制御配列として定義される。本明細書で使用されるとき、プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合においては、ＴＡＴＡ要素などの、転写の開始部位の近くに必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、任意に、転写の開始部位から数千の塩基対と同程度の距離に位置し得る、遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素を含む。
【００８４】
「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境及び発達条件下で活性であるプロモーターである。「誘導」プロモーターは、ほとんどの環境及び発達調節下で活性であるプロモーターである。「作動可能に連結される」という用語は、核酸発現制御配列（プロモーター、転写因子結合部位のアレイなど）と第２の核酸配列との間の機能連結を指し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指向する。
【００８５】
「組換え」という用語は、例えば、細胞、または、核酸、タンパク質、もしくはベクターに関して使用される場合、その細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入、または未変性核酸もしくはタンパク質の変更により修飾されているか、または細胞が、そのように修飾された細胞に由来することを示す。よって、組換え細胞は、細胞の未変性（非組換え）形態内には見られない遺伝子を発現するか、またはさもなければ異常に発現される、低発現される、または全く発現されない未変性遺伝子を発現する。本明細書において、「組換え核酸」という用語とは、一般には、天然には通常見られない形態で、例えば、ポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼを使用して核酸を操作することにより、本来インビトロで形成された核酸を意味する。この様式において、異なる配列の作動可能な連結が達成される。よって、直鎖形態の単離された核酸、または通常連結されないＤＮＡ分子を結合することによりインビトロで形成された発現ベクターは両方とも、組換え体と考えられる。組換え核酸が作製され、宿主細胞または生物内に再導入されると、非組換えにより、すなわち、インビトロ操作ではなく、宿主細胞のインビボ細胞機構を使用して複製するが、そのような核酸は、一旦組換えにより生成されると、後に非組換えにより複製されるが、尚も組換え体と考えられることを理解する。同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技法、すなわち、上記のように組換え核酸の発現を通して作製されたタンパク質である。
【００８６】
本明細書において、「化学療法薬耐性」とは、化学療法薬による治療に応答しない、すなわち、そのような治療によって死滅しない、または成長阻害されない腫瘍を意味する。
【００８７】
「対象」または「患者」という用語は、癌などの状態、障害、または疾患の治療を必要とするヒトなどの哺乳類を指す。
【００８８】
「ＴＡＦ」という用語は、ＴＢＰ関連因子を指す。ある特定の実施形態では、ＴＡＦは、ＴＡＦＩＩ、すなわち、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型により転写された真核生物遺伝子の転写活性化の媒介に関与するＴＡＦタンパク質である。ＴＡＦタンパク質は、他の転写活性化剤またはリプレッサーと相互作用する（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｔｊｉａｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ６（３）：４０３−９（１９９４）、Ａｌｂｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｔｊｉａｎ，Ｇｅｎｅ  ２４２（１−２）：１−１３（２０００））。ＴＡＦは、ヒト、マウス、ショウジョウバエ、または酵母由来であり得る。ＧＬＩと相互作用するＴＡＦタンパク質の例としては、ＴＡＦＩＩ３１タンパク質である。Ｋｌｅｍｍらは、ヒトＴＦＩＩＤサブユニットをクローン化し、これを、ｈＴＡＦＩＩ３２と名付けた（Ｋｌｅｍｍ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９２（１３）：５７８８−９２）。３２ｋＤタンパク質は、ＨｅＬａ細胞核抽出物から単離され、部分的に配列決定された。特定されたｃＤＮＡは、２６４残基の推定アミノ酸配列を有し、ショウジョウバエＴＡＦＩＩ４０に関連する。Ｋｌｅｍｍらは、ＴＡＦＩＩ３２がＧＴＦ２Ｂ及びウイルス転写トランス活性化剤ＶＰ１６と相互作用することを示した（Ｋｌｅｍｍ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９２（１３）：５７８８−９２）。著者は、組換えにより発現されたＴＡＦＩＩ３２が部分組換えＴＦＩＩＤ複合体において機能的であり、組換え複合体がＧＡＬ４−ＶＰ１６融合タンパク質により活性化を媒介したことを示した。ＴＡＦＩＩ３２及びＴＡＦＩＩ３１は、同じタンパク質の２つの名前であり、これは、現在、ＴＡＦ９とも称される。Ｌｕらは、ＴＡＦ９をクローン化し、これをＴＡＦＩＩ３１と呼んだ。ＴＡＦ９は、２６４アミノ酸タンパク質をコードする。免疫沈降及び結合分析は、ＴＡＦ９が、ｐ５３活性の主な細胞の負の調節因子であるＭＤＭ２によって結合されたものと同一の部位でｐ５３のＮ末端ドメインと相互作用することを示した。（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９２（１１）：５１５４−８）。ヒトＴＡＦＩＩ３１ヌクレオチド及びタンパク質配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ２５１１２、Ｕ２１８５８、及びＮＭ＿０１６２８３に見出すことができる。
【００８９】
本明細書で使用される、「治療する」、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、及び「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、（１）癌などの疾患を予防する、すなわち、疾患にかかりやすいが、疾患のいずれの症状をまだ経験していない対象において、疾患の臨床症状を発達させない、（２）疾患を阻害する、すなわち、疾患もしくはその臨床症状の発達を停止または減少させる、または（３）疾患を軽減する、すなわち、疾患もしくはその臨床症状の後退をもたらすことを含む。治療は、状態、障害、もしくは疾患の症状または病態が寛解されるか、さもなければ有利に変更される任意の様式を意味する。ある特定の実施形態では、そのような治療を必要とする対象は、ヒトなどの哺乳類である。
【００９０】
「腫瘍細胞」は、腫瘍における前癌性、癌性、及び正常な細胞を指す。
【００９１】
「Ｗｎｔ」という用語は、哺乳類遺伝子のファミリー、及びショウジョウバエセグメント極性遺伝子無羽に関連するコードされたタンパク質を指す。ヒトにおいて、遺伝子のＷｎｔファミリーは、典型的には、疎水性シグナル配列を有する３８〜４３ｋＤａシステイン豊富糖タンパク質、及び保存アスパラギン連結オリゴ糖コンセンサス配列をコードする（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  ８（１２）：１３４９−５８（１９９７））Ｗｎｔファミリーは、少なくとも１９の哺乳類メンバーを含む。Ｗｎｔタンパク質の例としては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１２、Ｗｎｔ１３、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、及びＷｎｔ１６が挙げられる。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔタンパク質は、ヒトＷｎｔ２タンパク質などのＷｎｔ２である。
【００９２】
実施形態の説明において、化合物の構造が論じられる。次いで、化合物を含む薬学的製剤が論じられ、それらの使用方法、及びキットの説明が続く。
【００９３】
小分子化合物
本開示の組成物は、以下に示される式Ｉ〜ＩＩＩの化合物を含む。本開示の薬学的組成物及び方法は、式Ｉ〜ＩＩＩの化合物も含む。
【００９４】
式Ｉ
本開示は、式（Ｉ）の化合物、ならびにその塩、水和物、溶媒和物、立体異性体、及びプロドラッグを提供する：
2019006816.tif 000014
式中、
Ｘ１及びＸ２の各々は独立して、ＮまたはＣであり、環Ｎが、ＣであるＸ１及びＸ２のいずれかと二重結合を形成するように、Ｘ１及びＸ２の一方はＮでありかつＸ１及びＸ２の一方はＣであり、
Ｒ１は、アリールまたは置換アリールであり、
Ｒ２は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、及びアルキルから選択され、
Ｒ３は、アリールまたは置換アリールであり、
Ｙは、直接結合またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
Ｚは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはアリールであり、
Ｒ４は、−ＯＨであり、
Ｒ５は、水素、またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【００９５】
式ＩＩ
本開示は、式（ＩＩ）の化合物、ならびにその塩、水和物、溶媒和物、立体異性体、及びプロドラッグを提供する：
2019006816.tif 000015
式中、
Ｒ１は、アリールまたは置換アリールであり、
Ｒ２は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、及びアルキルから選択され、
Ｒ３は、アリールまたは置換アリールであり、
Ｙは、直接結合またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
Ｚは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはアリールであり、
Ｒ４は、−ＯＨであり、
Ｒ５は、水素、またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【００９６】
式ＩＩＩ
本開示は、式（ＩＩＩ）の化合物、ならびにその塩、水和物、溶媒和物、立体異性体、及びプロドラッグを提供する：
2019006816.tif 000016
式中、
Ｒ１は、アリールまたは置換アリールであり、
Ｒ２は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、及びアルキルから選択され、
Ｒ３は、アリールまたは置換アリールであり、
Ｙは、直接結合またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
Ｚは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはアリールであり、
Ｒ４は、−ＯＨであり、
Ｒ５は、水素、またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【００９７】
式（Ｉ）において、Ｘ１及びＸ２の各々は独立して、ＮまたはＣであり、環Ｎが、ＣであるＸ１及びＸ２のいずれかと二重結合を形成するように、Ｘ１及びＸ２の一方はＮでありかつＸ１及びＸ２の一方はＣである。ある特定の実施形態では、Ｘ１はＮであり、Ｘ２はＣである。ある特定の実施形態では、Ｘ１はＣであり、Ｘ２はＮである。
【００９８】
式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）において、Ｒ１は、アリールまたは置換アリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、アリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換アリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、置換アリールであり、置換基は、アルキルまたはハロゲンである。
【００９９】
式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）において、Ｒ２は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、及びアルキルから選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、アリールまたは置換アリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、アリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換アリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、ヘテロアリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換ヘテロアリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、アルキルである。
【０１００】
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、及びアルキルから選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、ヘテロアリール及びアルキルから選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、置換アリールであり、置換基は、アルキルまたはハロゲンである。
【０１０１】
式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）において、Ｒ３は、アリールまたは置換アリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ３は、アリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換アリールである。ある特定の実施形態では、Ｒ３は、置換アリールであり、置換基は、アルキルまたはハロゲンである。
【０１０２】
式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）において、Ｒ５は、水素であるか、またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ５は、水素である。ある特定の実施形態では、Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１０３】
式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）において、Ｙは、直接結合、またはＣ１〜Ｃ４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｙは、直接結合である。ある特定の実施形態では、Ｙは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルである。
【０１０４】
式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）において、Ｚは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはアリールである。ある特定の実施形態では、Ｚは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｚは、アリールである。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、Ｙは、直接結合であり、Ｚは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｙは、直接結合であり、Ｚは、アリールである。ある特定の実施形態では、Ｙは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｚは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｙは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｚは、アリールである。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、Ｙは直接結合であり、ＺはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｒ５は水素である。ある特定の実施形態では、Ｙは直接結合であり、Ｚはアリールであり、Ｒ５は水素である。ある特定の実施形態では、ＹはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、ＺはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｒ５は水素である。ある特定の実施形態では、ＹはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｚはアリールであり、Ｒ５は水素である。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、Ｒ１はアリールであり、Ｒ２はヘテロアリールであり、Ｒ３はアリールである。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、Ｒ１はアリールであり、Ｒ２はアルキルであり、Ｒ３は置換アリールである。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、Ｒ１はアリールであり、Ｒ２はアリールであり、Ｒ３はアリールである。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、Ｒ１はアリールであり、Ｒ２は置換アリールであり、Ｒ３は置換アリールである。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、Ｙ及びＺが−（ＣＨ２）３−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−を形成するように、ＹはＣ１〜Ｃ４アルキルでありかつＺはＣ１〜Ｃ４アルキルである。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、Ｙ及びＺが、
2019006816.tif 000017
を形成するように、ＹはＣ１〜Ｃ４アルキルでありかつＺはアリールである。
【０１１３】
本化合物のある特定の実施形態は、以下の表に図示される。
2019006816.tif 000018
【０１１４】
本化合物、及びその塩、または溶媒和物、または立体異性体の実施形態は、以下に示される、１，３−ジフェニル−５−チオフェン−３−イル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（５−ヒドロキシ−４，４−ジメチル−ペンチル）−アミド（化合物１）を含む。
2019006816.tif 000019
【０１１５】
本化合物、及びその塩、または溶媒和物、または立体異性体の実施形態は、以下に示される、３−（４−フルオロ−フェニル）−１−フェニル−５−プロピル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（５−ヒドロキシ−４，４−ジメチル−ペンチル）−アミド（化合物４）を含む。
2019006816.tif 000020
【０１１６】
本化合物、及びその塩、または溶媒和物、または立体異性体の実施形態は、以下に示される、１，３，５−トリフェニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸４−ヒドロキシ−ベンジルアミド（化合物２）を含む。
2019006816.tif 000021
【０１１７】
本化合物、及びその塩、または溶媒和物、または立体異性体の実施形態は、以下に示される、３−（４−フルオロ−フェニル）−５−（３−フルオロ−フェニル）−１−フェニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（５−ヒドロキシ−４，４−ジメチル−ペンチル）−アミド（化合物６）を含む。
2019006816.tif 000022
【０１１８】
本化合物、及びその塩、または溶媒和物、または立体異性体の実施形態は、以下に示される、１−（５−クロロ−２−メチル−フェニル）−５−（２，６−ジメチル−フェニル）−３−（２−フルオロ−フェニル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸［２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−エチル］−アミド（化合物３）を含む。
2019006816.tif 000023
【０１１９】
本化合物、及びその塩、または溶媒和物、または立体異性体の実施形態は、以下に示される、３−（４−フルオロ−フェニル）−１，５−ジフェニル−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（５−ヒドロキシ−４，４−ジメチル−ペンチル）−アミド（化合物５）を含む。
2019006816.tif 000024
【０１２０】
小分子化合物の調製
本開示の化合物を合成するために有用な一般的に知られる化学合成スキーム及び条件を提供する多くの一般参照が利用可能である（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ，  Ｍａｒｃｈ'ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００１、またはＶｏｇｅｌ，Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｌｏｎｇｍａｎ，１９７８を参照）。
【０１２１】
本明細書に記載される化合物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、分取薄層クロマトグラフィー、フラッシュカラムクロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー手段を含む、当該技術分野に既知の手段のいずれかによって精製され得る。正相及び逆相ならびにイオン樹脂を含む、任意の好適な固定相が使用され得る。例えば、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ｌ．Ｒ．Ｓｎｙｄｅｒ  ａｎｄ  Ｊ．Ｊ．Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９７９、及びＴｈｉｎ  Ｌａｙｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｅｄ  Ｅ．Ｓｔａｈｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６９を参照。
【０１２２】
本開示の化合物を調製するためのプロセスのいずれか中、考慮される分子のいずれか上の感応性または反応性の基を保護することが必要かつ／または望ましい場合がある。これは、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"，Ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００６などの一般的な研究に記載される従来の保護基の手段により達成され得る。保護基は、当該技術分野に既知の方法を使用して、適宜後続段階で除去することができる。
【０１２３】
本実施形態の化合物は、下の合成スキームに従い調製され得る。図示の目的の合成スキーム１において、Ｒ１及びＲ３はフェニルであり、Ｒｘは脱離基であり、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２、Ｒ５、Ｙ、Ｚ、及びＲ４は前に定義された通りである。
2019006816.tif 000025
【０１２４】
ピラゾール誘導体は、ヒドラゾンと不飽和化合物との間の反応により形成され得る。合成スキーム１において、化合物Ａは、化合物Ｂと縮合され、化合物Ｃを形成する。反応は、そのままで（ｎｅａｔｌｙ）、または好適な溶媒と共に行うことができる。反応は、冷却しながら、室温で、または加熱しながらを含む、様々な温度で行うことができる。ある特定の実施形態では化合物Ａは、好適な溶媒中で化合物Ｂと共に還流される。好適な溶媒は、例えば、メタノール、メチレン、塩化物、ＤＭＦ、またはＴＨＦである。当業者は、特定の反応物により、好適な反応条件を決定することができる。
【０１２５】
合成スキーム１をさらに参照すると、化合物Ｃは、鹸化される。ある特定の実施形態では、化合物Ｃは、エステルを含み、Ｒｘは、アルキル基である。化合物Ｃを鹸化するための条件は、塩基を伴う好適な溶媒中での反応を含む。鹸化に好適な溶媒は、水、アルコール（メタノール及びエタノールなど）、ＴＨＦ、及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。好適な塩基は、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムを含むが、これらに限定されない。
【０１２６】
次いで、鹸化された化合物Ｃは、ペプチドカップリング反応において、アミンＤと反応して、化合物Ｅを形成する。ペプチドカップリング反応は、典型的には、従来のペプチドカップリング試薬を採用し、従来のカップリング反応条件下で行われる。使用に好適なカップリング試薬は、例として、エチル−３−（３−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド（ＥＤＣまたはＥＤＣＩ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などのカルボジイミド、及びＮ，Ｎ'−カルボニルジイミダゾール、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）などの他の周知のカップリング試薬を含む。任意に、そのようなＮ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡＴ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの周知のカップリングプロモーターがこの反応に採用され得る。典型的には、このカップリング反応は、塩化メチレン、ＴＨＦ、またはＤＭＦなどの不活性希釈液中で、約１〜約７２時間、約０℃〜約６０℃の範囲の温度で行われる。
【０１２７】
図示される例では、本実施形態の化合物は、実施例に示されるように、桂皮酸エチルまたは不飽和エステルのベンズアルデヒドフェニルヒドラゾンとの縮合、続いて、エチルエステルの鹸化、及びアミンとの反応により所望のアミド最終生成物を得ることにより調製することができる。あるいは、本実施形態の化合物は、最初に、桂皮酸または不飽和エステルをアミンと反応させて、アミドを調製し、次に、ベンズアルデヒドフェニルヒドラゾンと縮合させることにより調製することができる。当業者は、本実施形態の化合物を調製するために、さらなる方法が存在することを認識する。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、標識を含む。これは、インビボ投与後の、化合物の分布を検出し、試験するのに有用である。例えば、トリチウム（３Ｈ）が、従来の薬物動態／動的調査において、標的として使用され得る。標識を含む化合物は、例えば、分光、光化学、生化学、免疫化学、化学、または他の物理手段により検出され得る。
【０１２９】
本実施形態の化合物は、そのような化合物を構成する原子のうちの１つ以上に不自然な割合の原子同位体も含み得る。例えば、本化合物は、例えば、トリチウム（３Ｈ）または炭素−１４（１４Ｃ）などの放射活性同位体で放射標識され得る。本実施形態の化合物の全ての同位体の変形は、放射活性であるか否かに関わらず、本実施形態の範囲内に包含されることが意図される。
【０１３０】
鏡像異性体特異的活性
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される化合物は、２つ以上の立体異性体を含み得る。本明細書で使用される、「立体異性体」という用語は、非対称炭素原子（光学中心）または二重結合を保有する本実施形態の化合物を指す。例えば、本明細書に記載される化合物は、２つの鏡像異性体を含み得る。本明細書で使用される、「鏡像異性体」は、互いの重ねることができない鏡像である２つの立体異性体のうちの１つである。いくつかの場合では、化合物の鏡像異性体のラセミ混合物は、個々の鏡像異性体に分離され得る。例えば、鏡像異性体は、これらに限定されないが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、キラルＨＰＬＣ）、結晶化などの分離技術を使用して分離され得る。他の実施形態では、個々の鏡像異性体は、例えば、キラル出発材料及び非対称合成法を使用することにより、個別に合成され得る。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、個々の鏡像異性体は、上述のように、キラル分離技術（例えば、キラルＨＰＬＣ）を使用して分離することができる。いくつかの場合では、キラル分離技術は、実質的に純粋な個々の鏡像異性体を提供するように構成される。例えば、個々の鏡像異性体は、９５％以上、または９６％以上、または９７％以上、または９８％以上、または９９％以上、または９９．５％以上、または９９．９％以上、またはさらには１００％の純度など、９０％以上の純度を有し得る。ある特定の場合では、個々の鏡像異性体は、９８％、または９９％、または９９．９％の純度を有する。いくつかの場合では、分離された鏡像異性体は、９５％以上、または９６％以上、または９７％以上、または９８％以上、または９９％以上、または９９．５％以上、または９９．９％以上など、９０％以上の鏡像異性体過剰を有する。
【０１３２】
キラル分離技術（例えば、キラルＨＰＬＣ）が個々の鏡像異性体を分離するために使用される実施形態では、異なる鏡像異性体は、使用される分離条件下で大幅に異なる滞留時間を有し得る（例えば、下の実施例１６を参照）。例えば、第１の鏡像異性体は、第２の鏡像異性体よりも大幅に短い滞留時間を有し得る。これらの場合では、第１の鏡像異性体は、「より速く溶出する」鏡像異性体のように記載され、第２の鏡像異性体は、「より緩徐に溶出する」鏡像異性体のように記載され得る。いくつかの場合では、第１及び第２の鏡像異性体は、０．３分以上、または０．４分以上、または０．５分以上、または０．６分以上、または０．７分以上、または０．８分以上、または０．９分以上、または１分以上、または１．１分以上、または１．２分以上、または１．３分以上、または１．４分以上、または１．５分以上、または１．６分以上、または１．７分以上、または１．８分以上、または１．９分以上、または２分以上、または２．５分以上、または３分以上、または３．５分以上、または４分以上、または４．５分以上、または５分以上など、０．２分以上を含む、０．１分以上の溶出時間の差を有し得る。いくつかの実施形態では、第１及び第２の鏡像異性体は、０．５分〜１．５分、または０．７分〜１．２分など、０．５分〜２分の範囲の溶出時間の差を有する。例えば、第１及び第２の鏡像異性体は、１分の溶出時間の差を有し得る。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、１つの鏡像異性体は、他の鏡像異性体の活性よりも大きい活性を有し得る。例えば、第１の鏡像異性体は、第２の鏡像異性体の活性よりも大きい活性を有し得る。あるいは、第２の鏡像異性体は、第１の鏡像異性体の活性よりも大きい活性を有し得る。いくつかの場合では、上述のように、鏡像異性体は、キラル分離技術（例えば、ＨＰＬＣ）におけるそれらの滞留時間に基づき、互いに区別され得る。これらの場合では、第１の鏡像異性体（例えば、より速く溶出する鏡像異性体）は、第２の鏡像異性体（例えば、より緩徐に溶出する鏡像異性体）とは大幅に異なる活性を有し得る。例えば、より速く溶出する鏡像異性体は、より緩徐に溶出する鏡像異性体よりも大きい活性を有し得る。他の実施形態では、より緩徐に溶出する鏡像異性体は、より速く溶出する鏡像異性体よりも大きい活性を有し得る。
【０１３４】
いくつかの場合では、化合物の活性は、その最大半量の阻害濃度（ＩＣ５０）により測定され得る。ＩＣ５０は、生物学的プロセス（またはプロセスの構成要素、例えば、酵素、細胞、細胞受容体、微生物等）の阻害における化合物の有効性の尺度である。この定量的測定は、生物学的プロセスを半分阻害するためにどのくらいの化合物が必要とされるかを示す。ある特定の実施形態では、上述のように、化合物の鏡像異性体は、大幅に異なる活性を有し得る。例えば、第２の鏡像異性体（例えば、より緩徐に溶出する鏡像異性体）は、第１の鏡像異性体（例えば、より速く溶出する鏡像異性体）より低いＩＣ５０を有し得る、すなわち、第２の鏡像異性体は、第１の鏡像異性体より活性である。いくつかの場合では、第２の鏡像異性体のＩＣ５０は、６５％以下、もしくは６０％以下、もしくは５５％以下、もしくは５０％以下、もしくは４５％以下、もしくは４０％以下、もしくは３５％以下、もしくは３０％以下、もしくは２５％以下、もしくは２０％以下、もしくは１５％以下、もしくは１０％以下、もしくは５％以下、もしくは３％以下を含む７０％以下など、第１の鏡像異性体の７５％以下のＩＣ５０であるか、または第２の鏡像異性体のＩＣ５０は、第１の鏡像異性体の１％以下のＩＣ５０である。
【０１３５】
他の実施形態では、第１の鏡像異性体（例えば、より速く溶出する鏡像異性体）は、第２の鏡像異性体（例えば、より緩徐に溶出する鏡像異性体）より低いＩＣ５０を有する、すなわち、第１の鏡像異性体は、第２の鏡像異性体より活性である。ある特定の場合では、第１の鏡像異性体のＩＣ５０は、６５％以下、もしくは６０％以下、もしくは５５％以下、もしくは５０％以下、もしくは４５％以下、もしくは４０％以下、もしくは３５％以下、もしくは３０％以下、もしくは２５％以下、もしくは２０％以下、もしくは１５％以下、もしくは１０％以下、もしくは５％以下、もしくは３％以下を含む７０％以下など、第２の鏡像異性体の７５％以下のＩＣ５０であるか、または第１の鏡像異性体のＩＣ５０は、第２の鏡像異性体の１％以下のＩＣ５０である。
【０１３６】
細胞に基づくアッセイにおける小分子化合物の試験
本実施形態の化合物は、インビトロ及びインビボでの活性についてスクリーニングされ得る。インビトロアッセイに関して、本開示は、本明細書に記載される、細胞に基づく細胞毒性アッセイを提供する。インビボアッセイに関して、本開示は、本明細書に記載される、マウス異種移植片アッセイを提供する。
【０１３７】
薬学的組成物
本開示は、式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物と、任意に、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物または医薬を提供する。薬学的組成物または医薬は、例えば、癌などの状態の治療のために、患者に投与され得る。
【０１３８】
製剤及び投与
本実施形態の化合物は、薬学的組成物、または腸内もしくは非経口のいずれかの適用に好適な賦形剤または担体と組み合わせて、もしくは混合して、その治療有効量を含む医薬を製造するのに有用である。
【０１３９】
本実施形態において使用するための薬学的組成物または医薬は、１つ以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して、標準的な技法により製剤化され得る。好適な薬学的担体は、本明細書、及びＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"に記載されている。本実施形態の化合物及びそれらの生理学的に許容される塩及び溶媒和物は、吸入を介して、局所的、経鼻的、経口的、非経口的、または直腸的を含む、任意の好適な経路による投与用に製剤化され得る。よって、薬学的組成物の投与は、シリンジもしくは他のデバイスにより、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、脳内、気管内、動脈内、腹腔内、膀胱内、胸膜内、冠内、または腫瘍内注入により行われ得る。吸入またはエアロゾル投与と同様に、経皮投与も想定される。錠剤及びカプセルは、経口、直腸、または膣投与され得る。
【０１４０】
経口投与に関して、薬学的組成物または医薬は、薬学的に許容される賦形剤と共に、従来の手段によって調製される、例えば、錠剤またはカプセルの形態を取ることができる。ある特定の実施形態では、錠剤及びゼラチンカプセルは、（ａ）希釈剤もしくは充填剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース（例えば、エチルセルロース、微結晶セルロース）、グリシン、ペクチン、ポリアクリレート、及び／またはリン酸水素カルシウム、硫酸カルシウム、（ｂ）滑沢剤、例えば、シリカ、タルカム、ステアリン酸、そのマグネシウム塩、もしくはカルシウム塩、ステアリン酸金属塩、コロイド状二酸化ケイ素、水素化植物油、コーンスターチ、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及び／またはポリエチレングリコール、錠剤に関しては、また（ｃ）結合剤、例えば、アルミニウムケイ酸マグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、及び／もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース、所望により、（ｄ）崩壊剤、例えば、デンプン（例えば、ジャガイモデンプンまたはナトリウムデンプン）、グリコール酸、寒天、アルギニン酸、もしくはそのナトリウム塩、または発泡混合物、（ｅ）湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、及び／または（ｆ）吸収剤、着色剤、風味剤、及び甘味剤と一緒に、活性成分、すなわち、本実施形態の化合物を含む。
【０１４１】
錠剤は、当該技術分野において既知の方法により、フィルムコーティングまたは腸溶コーティングのいずれかを施され得る。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態を取るか、または使用前に水または他の好適なビヒクルと構成するための乾燥製品として提示され得る。そのような液体調製物は、従来の手段によって、薬学的に許容される添加剤、例えば、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用油脂）、乳化剤（例えば、レシチンもしくはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール）、または分別植物油、及び防腐剤、例えば、メチル、もしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸、またはソルビン酸と共に調製され得る。調製物は、適切に、緩衝塩、風味剤、着色剤、及び／または甘味剤も含み得る。所望する場合、経口投与用の調製物は、活性化合物を徐放するために、適切に製剤化され得る。
【０１４２】
吸入による投与に関して、化合物は、好適な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガスを使用して、加圧パックまたはネブライザ−からのエアロゾルスプレー提示の形態で便宜的に送達され得る。加圧エアロゾルの場合には、投薬単位は、計量された量を送達するためにバルブを提供することによって決定することができる。吸入器具または通気器において使用するために、化合物及び好適な粉末基剤、例えば、ラクトースまたはデンプンの粉末ミックスを含む、例えば、ゼラチンのカプセル及びカートリッジが製剤化され得る。
【０１４３】
本実施形態の化合物は、注入により、例えば、ボーラス注入または連続輸注により、非経口投与用に製剤化され得る。注入用製剤は、防腐剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器の単位投薬形態で、提示され得る。ある特定の実施形態では、注入可能組成物は、水性の等張溶液または懸濁液であり、坐剤は、脂肪エマルジョンまたは懸濁液から調製される。組成物は、減菌され、かつ／または防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩、及び／もしくは緩衝剤などのアジュバントを含み得る。あるいは、活性成分は、好適なビヒクル、例えば、使用前に減菌の発熱物質を含まない水と構成するための粉末形態であり得る。加えて、それらは、他の治療的に有益な物質も含み得る。組成物は、それぞれ、従来の混合法、造粒法、またはコーティング法により調製され、約０．１〜７５％、または約１〜５０％の活性成分を含む。
【０１４４】
経皮への適用に好適な製剤は、担体と共に、有効量の本実施形態の化合物を含む。ある特定の実施形態では、担体は、宿主の皮膚を通過するのを補助するための吸収性の薬理学的に許容される溶媒を含む。例えば、経皮デバイスは、裏地部材を含むバンドエイド、任意に担体と共に化合物を含むリザーバ、任意に、長期間にわたって制御され、所定の速度で宿主の皮膚に化合物を送達するための速度制御バリア、及び任意に、皮膚にデバイスを固定するための接着性オーバーレイの形態である。マトリックス経皮製剤も使用することができる。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、局所適用、例えば、皮膚及び眼に好適な製剤は、当該技術分野において周知である水溶液、軟膏、クリーム、またはゲルである。そのようなものは、可溶化剤、安定化、等張増強剤、緩衝剤、及び防腐剤を含み得る。
【０１４６】
本化合物は、直腸組成物、例えば、従来の坐剤基剤、例えば、ココアバターもしくは他のグリセリドを含む、例えば、坐剤または滞留浣腸に製剤化され得る。
【０１４７】
さらに、本化合物は、デポ調製物として製剤化され得る。そのような長時間作用製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内）によって、または筋肉内注入によって投与され得る。よって、例えば、本化合物は、好適なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容可能な油中のエマルジョンとして）もしくはイオン交換樹脂と共に、または難溶性誘導体、例えば、難溶性塩として製剤化され得る。
【０１４８】
本組成物は、所望により、活性成分を含む１つ以上の単位投与形態を含み得るパックまたはディスペンサーデバイス中に存在し得る。このパックは、例えば、金属またはプラスチック箔、例えば、ブリスターパックを含み得る。このパックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書を添付することができる。
【０１４９】
組み合わせ製剤
ある特定の実施形態では、薬学的組成物または医薬は、有効量の本明細書に定義される実施形態の化合物、及び化学療法薬などの別の治療薬を含む。
【０１５０】
化学療法薬の例としては、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミスラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホラミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、トリメトレキサート、テニポシド、シスプラチンジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、ビスモデギブ（ＧＤＣ−０４４９）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ（登録商標））、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２、ＴＧＦβ阻害剤ＳＢ４３１５４２、及びシスプラチンが挙げられるが、これらに限定されない。一般的に、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１５ｔｈ  Ｅｄ．１９８７，ｐｐ．１２０６−１２２８，Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．を参照。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物または医薬は、本実施形態の化合物、及びビスモデギブ（ＧＤＣ−０４４９）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ（登録商標））、ＬＹ２９４００２、ＳＢ４３１５４２、及びシスプラチンから選択される別の治療薬を含む。ある特定の実施形態では、薬学的組成物または医薬は、本実施形態の化合物、及びビスモデギブ（ＧＤＣ−０４４９）を含む。ある特定の実施形態では、薬学的組成物または医薬は、本実施形態の化合物、及びエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））を含む。ある特定の実施形態では、薬学的組成物または医薬は、本実施形態の化合物、及びペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ（登録商標））を含む。ある特定の実施形態では、薬学的組成物または医薬は、本実施形態の化合物、及びＬＹ２９４００２を含む。ある特定の実施形態では、薬学的組成物または医薬は、本実施形態の化合物、及びＳＢ４３１５４２を含む。ある特定の実施形態では、薬学的組成物または医薬は、本実施形態の化合物、及びシスプラチンを含む。
【０１５２】
ある特定の実施形態は、化合物１〜６のうちの１つ以上と、例えば、以下の表に示される別の治療薬の組み合わせを提供する。
2019006816.tif 000026
【０１５３】
本実施形態の化合物と共に使用する場合、そのような化学療法薬は、個々に（例えば、５−ＦＵ及び本実施形態の化合物）、順次（例えば、一定の期間の間、５−ＦＵ及び本実施形態の化合物、その後、例えば、ＭＴＸ及び本実施形態の化合物）、または１つ以上の他のそのような治療薬との組み合わせ（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸ、及び本実施形態の化合物、または５−ＦＵ、放射療法、及び本実施形態の化合物）で使用され得る。投与は、同じもしくは異なる投与経路によって、または同じ薬学的製剤に一緒に存在してよい。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、治療有効量の本実施形態の化合物は、外科手術、及び任意に別の化学療法薬の投与と組み合わせて投与される。
【０１５５】
治療有効量及び投薬
ある特定の実施形態では、薬学的組成物または医薬は、癌を予防、治療、または制御するために治療有効量で患者に投与される。薬学的組成物または医薬は、患者において有効な治療応答を引き起こすのに十分な量で患者に投与される。有効な治療応答は、疾患の症状または合併症を少なくとも部分的に停止または遅らせる応答である。これを達成するのに適切な量は、「治療有効量」と定義される。
【０１５６】
投与される化合物の投薬量は、温血動物（哺乳類）の種、体重、年齢、個々の状態、治療される領域の表面積、及び投与形態による。用量の大きさは、特定の対象における特定の化合物の投与に付随する任意の有害作用の存在、性質、及び程度によっても決定される。約５０〜７０ｋｇの哺乳類への経口投与の単位投薬量は、約５〜５００ｍｇの活性成分を含み得る。典型的には、本実施形態の化合物の投薬量は、所望の効果を達成するのに十分である投薬量である。
【０１５７】
最適な投薬スケジュールは、対象の身体における化合物蓄積の測定から計算することができる。一般に、投薬量は、体重の１ｋｇ当り１ｎｇ〜１，０００ｍｇであり、毎日、毎週、毎月、または毎年１回以上与えられ得る。当業者は、最適な投薬量、投薬方法、及び反復速度を決定することができる。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、本実施形態の化合物を含む薬学的組成物または医薬は、複数日間、対象の体重の１ｋｇ当り（１ｍｇ／ｋｇ）約１ｍｇの化合物〜約１ｇ／ｋｇの範囲の日用量で投与される。ある特定の実施形態では、日用量は、約５ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量である。ある特定の実施形態では、日用量は、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇである。ある特定の実施形態では、日用量は、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇである。日用量は、１日１回投与されるか、またはサブ用量に分割し、複数用量で、例えば１日２回、３回、または４回投与され得る。
【０１５９】
所望の治療効果を達成するために、化合物は、複数日間、治療有効日用量で投与され得る。よって、対象における癌を治療するための化合物の治療的に有効な投与は、３日〜２週間以上の範囲の期間の間継続する周期的な（例えば、毎日）投与を必要とする。典型的には、化合物は、少なくとも３日連続、多くの場合、少なくとも５日連続、非常にしばしば、少なくとも１０日、時には、２０、３０、４０日以上連続投与される。連続日用量は、治療有効量を達成するための一経路であるが、治療的に有益な効果は、投与が対象における化合物の治療有効濃度を維持するのに十分に頻繁に反復される限り、化合物が毎日投与されない場合でも達成され得る。例えば、２日に１回、３日に１回、または高用量範囲が採用され、対象が耐えられる場合は１週間に１回、化合物を投与することができる。
【０１６０】
そのような化合物の最適な投与量、毒性、及び治療有効性は、個々の化合物の相対的効力により変動し得、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死の用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定することにより、決定され得る。毒性と治療効果と間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。ある特定の実施形態では、本開示は、大きな治療指数を示す化合物を提供する。毒性副作用を示す化合物が使用され得るが、正常な細胞に対する潜在的な損傷を最小限にし、それによって、副作用を減少させるために、そのような化合物が患部組織部位を標的とする送達系を設計するための注意がとられるべきである。
【０１６１】
例えば、細胞培養アッセイ及び動物試験から得たデータが、ヒトにおいて使用するための投薬量範囲を製剤化するために使用され得る。ある特定の実施形態では、そのような化合物の投薬量は、ほとんど、または全く毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は、採用される投薬形態及び投与経路により、この範囲内で変動し得る。本実施形態の方法に使用される任意の化合物に関して、治療有効量は、最初は、細胞培養アッセイから推定され得る。細胞培養において決定される、ＩＣ５０（症状の最大半量の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおける用量が製剤化され得る。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定され得る。一般に、小分子化合物の用量当量は、典型的な対象に関して、約１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。
【０１６２】
治療成功後、治療される状態、例えば、癌の再発を阻止するために、対象に維持療法を受けさせることが望ましい場合がある。
【０１６３】
小分子化合物を使用した癌の治療
本実施形態は、例えば、ＧＬＩポリペプチドを発現する癌などの状態を治療するために、式（Ｉ）の化合物を使用するための方法を提供する。ＧＬＩポリペプチドを発現するあらゆる細胞または腫瘍細胞が、本実施形態の方法を実施するために使用され得る。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、癌性状態に罹患する対象を治療するための方法が提供される。この方法は、治療有効量の本実施形態の化合物を対象に投与するステップを含み、癌性状態は、ＧＬＩポリペプチドの発現を特徴とし、投与のステップは、対象の治療をもたらす。
【０１６５】
さらに、本実施形態は、薬物療法において使用するための式（Ｉ）の化合物を提供する。さらに、本実施形態は、癌の治療に使用するための式（Ｉ）の化合物を提供する。さらに、本実施形態は、癌の医薬治療の製造における、式（Ｉ）の化合物の使用を提供する。
【０１６６】
ある特定の癌は、ＧＬＩポリペプチドを発現する。よって、対象における大半の癌性状態または癌は、本実施形態の化合物を使用して治療することができる。ある特定の実施形態では、癌性状態または癌は、結腸癌、黒色腫、中皮腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、前立腺癌、肉腫、卵巣癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、上咽頭癌、膵臓癌、及び神経膠腫から選択される。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、化合物は、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドなどのＧＬＩポリペプチドを発現する結腸癌に罹患する対象を治療するために使用される。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、化合物は、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドなどのＧＬＩポリペプチドを発現する乳癌に罹患する対象を治療するために使用される。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、化合物は、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドなどのＧＬＩポリペプチドを発現する上咽頭癌に罹患する対象を治療するために使用される。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、化合物は、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドなどのＧＬＩポリペプチドを発現する肺癌に罹患する対象を治療するために使用される。肺癌は、気管支原性肺癌［扁平細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌］、肺胞［細気管支］癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫、ＳＣＬＣ、及びＮＳＣＬＣを含むが、これらに限定されない。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、化合物は、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドなどのＧＬＩポリペプチドを発現する肉腫に罹患する対象を治療するために使用される。肉腫は、血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫、及び奇形腫などの癌を含むが、これらに限定されない。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、化合物は、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドなどのＧＬＩポリペプチドを発現する消化器癌に罹患する対象を治療するために使用される。消化器癌は、食道［扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫］、胃［癌、リンパ腫、平滑筋肉腫］、膵臓［管腺癌、インスリノーマ、グルカゴン産生腫瘍、ガストリン産生腫瘍、カルチノイド腫瘍、ＶＩＰ産生腫瘍］、小腸［腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫］、及び大腸［腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫］の癌を含むが、これらに限定されない。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、化合物は、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドなどのＧＬＩポリペプチドを発現する泌尿生殖器の癌に罹患する対象を治療するために使用される。泌尿生殖器の癌は、腎臓［腺癌、ウィルムス腫瘍（腎芽腫）、リンパ腫、白血病、腎細胞癌］、膀胱及び尿道［扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌］、前立腺［腺癌、肉腫］、ならびに精巣［精上皮腫、奇形腫、胚性癌腫、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、ライディッヒ細胞腫、線維腫、線維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫］の癌を含むが、これらに限定されない。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、化合物は、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドなどのＧＬＩポリペプチドを発現する肝臓癌に罹患する対象を治療するために使用される。肝臓癌は、肝細胞癌、胆管細胞癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、及び血管腫を含むが、これらに限定されない。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、化合物は、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドなどのＧＬＩポリペプチドを発現する皮膚癌に罹患する対象を治療するために使用される。皮膚癌は、悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、母斑、異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、及び乾癬を含むが、これらに限定されない。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、化合物は、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドなどのＧＬＩポリペプチドを発現する婦人科癌に罹患する対象を治療するために使用される。婦人科癌は、子宮［子宮内膜癌］、子宮頸部［子宮頸癌、前浸潤性子宮頸部異形成］、卵巣［卵巣癌（漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、類内膜癌、明細胞腺癌、未分類癌）、顆粒膜−卵胞膜細胞腫瘍、セルトリ−ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫、及び他の生殖細胞腫瘍］、外陰部［扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫］、膣［明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、ならびにファロピウス管［癌］の癌を含むが、これらに限定されない。
【０１７７】
ある特定の実施形態では、化合物は、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドなどのＧＬＩポリペプチドを発現する骨癌に罹患する対象を治療するために使用される。骨癌は、骨肉腫［骨肉腫］、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫［細網細胞肉腫］、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫瘍、脊索腫、骨軟骨腫［骨軟骨性外骨腫］、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨腫、及び巨細胞腫瘍を含むが、これらに限定されない。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、化合物は、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドなどのＧＬＩポリペプチドを発現する神経系の癌に罹患する対象を治療するために使用される。神経系の癌は、頭蓋［骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、骨パジェット病］、髄膜［髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫］、脳［星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、シュワン腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍］、及び脊髄［神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫］の癌を含むが、これらに限定されない。
【０１７９】
ある特定の実施形態では、化合物は、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドなどのＧＬＩポリペプチドを発現する血液癌に罹患する対象を治療するために使用される。血液癌は、血液［骨髄性白血病（急性及び慢性）、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群］、ホジキン病、及び非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫）の癌を含むが、これらに限定されない。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、化合物は、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドなどのＧＬＩポリペプチドを発現する副腎の癌に罹患する対象を治療するために使用される。副腎の癌は、神経芽細胞腫を含むが、これに限定されない。
【０１８１】
本開示は、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドなどのＧＬＩポリペプチドが発現される癌の治療または予防のための方法を提供する。ある特定の実施形態では、この方法は、薬学的組成物を患者に投与するステップを含む。そのような薬学的組成物は、例えば、式（Ｉ）の化合物を含む。ある特定の実施形態では、本化合物は、化合物１である。ある特定の実施形態では、本化合物は、化合物４である。ある特定の実施形態では、本化合物は、化合物２である。ある特定の実施形態では、本化合物は、化合物６である。ある特定の実施形態では、本化合物は、化合物３である。ある特定の実施形態では、本化合物は、化合物５である。
【０１８２】
本実施形態の薬学的組成物は、単独で、または１つ以上の追加の治療化合物または治療法と併用して投与される。そのような治療化合物または治療法の例としては、タキソール、シクロホスファミド、タモキシフェン、フルオロウラシル、及びドキソルビシンを含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、薬学的組成物または医薬は、本実施形態の化合物、及びエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ（登録商標））、ＬＹ２９４００２、ＳＢ４３１５４２、及びシスプラチンから選択される別の治療薬を含む。加えて、他の化学療法薬が本明細書に記載される。
【０１８３】
癌を治療するための方法は、任意に、以下のステップのうちの１つ以上を含み得る：個人から組織もしくは流体の生体試料を得る、例えば、生体試料を、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３に指向される抗体と接触させることにより、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、またはＧＬＩ３ポリペプチドなどのＧＬＩポリペプチドの発現に関して生体試料をスクリーニングする、または例えば、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、もしくはＧｌｉ３  ｍＲＮＡを検出することにより、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、もしくはＧｌｉ３ポリヌクレオチドの発現に関して生体試料をスクリーニングする。
【０１８４】
多くの癌は、初めに、本明細書に記載される化学療法薬を使用して治療される。しかしながら、非常に多くの場合、癌は、そのような化学療法薬に対して耐性を発達させ、その結果、もはや有効ではない。よって、一実施形態では、癌は、多剤耐性癌、またはさもなければ治療に抵抗性である癌である。したがって、ある特定の実施形態では、本実施形態の化合物は、腫瘍細胞における化学療法薬に対する耐性を克服するために使用される。この方法は、少なくとも１つの化学療法薬に対して耐性である腫瘍細胞に、本実施形態の化合物を投与するステップを含み、投与は、後に腫瘍細胞死をもたらす。ある特定の実施形態では、本化合物は、化合物１である。ある特定の実施形態では、本化合物は、化合物４である。ある特定の実施形態では、本化合物は、化合物２である。ある特定の実施形態では、本化合物は、化合物６である。ある特定の実施形態では、本化合物は、化合物３である。ある特定の実施形態では、本化合物は、化合物５である。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、癌の治療に使用するための本実施形態の化合物が提供される。ある特定の実施形態では、本開示は、ＧＬＩポリペプチドが発現される状態、例えば、癌の治療上及び／もしくは予防処置のための薬学的組成物または医薬の製造における、本実施形態の化合物の使用を提供する。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＧＬＩポリペプチドを発現する癌の治療のために、別の化学療法抗癌剤と併用して使用するための薬学的組成物または医薬の製造における化合物の使用を提供する。本開示により提供される薬学的組成物または医薬は、本明細書に記載される。
【０１８７】
キット
上に提案される診断、研究、及び治療用途における使用に関して、キットも本開示によって提供される。診断及び研究用途では、そのようなキットは、以下のうちのいずれか、または全てを含み得る：アッセイ試薬、緩衝剤、本実施形態の化合物、ＧＬＩポリペプチド、Ｇｌｉ核酸、抗ＧＬＩ抗体、ハイブリダイゼーションプローブ、及び／またはプライマー、Ｇｌｉ発現構築物等。治療用生成物は、減菌生理食塩水、または別の薬学的に許容されるエマルジョン及び懸濁基剤を含み得る。
【０１８８】
加えて、キットは、本実施形態の方法の実施に関する指示（すなわち、プロトコル）を含む説明材料を含み得る。説明書は、様々な形態で対象キットに与えられてよく、それらのうちの１つ以上がキットに与えられてよい。説明材料は、典型的には、筆記物または印刷物を含むが、そのようなものに限定されない。そのような説明書を保存し、それらをエンドユーザに通信することができる任意の媒体が想定される。そのような媒体は、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ、フラッシュメモリ）、光学媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ブルーレイ）などを含むが、これらに限定されない。そのような媒体は、そのような説明材料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含み得る。
【０１８９】
キットの意図されるユーザ及びユーザの特定の必要性に応じて、多種多様のキット及び構成成分が本実施形態により調製され得る。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、本キットは、薬学的キットであり、（ｉ）本実施形態の小分子化合物、及び（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。薬学的キットは、任意に、薬学的組成物がＧＬＩポリペプチドまたはＧｌｉ核酸を発現する癌を治療するために使用され得るか、または使用するべきであると記述される説明書を含む。
【０１９１】
追加のキットの実施形態は、当業者が本明細書に記載される方法の変形のうちのいずれかを実施することを可能にするであろう任意の機能成分を含む。
【０１９２】
対象の組成物、薬学的調製物、及び方法の実施形態の追加の態様は、２０１２年７月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１２／４７６８９に見出され、これは、２０１１年７月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／５１０，１７６号に対して優先権を主張し、それらの各々の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９３】
以下の実施例は、当業者に本発明の実施形態をどのように作製及び使用するかの完全なる開示及び説明を提供するように提示され、本発明者が自身の発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、以下の実験が全てまたは唯一の実施される実験であると表すようにも意図されていない。使用される数値（例えば、量、温度等）に対する正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験による誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。
【実施例】
【０１９４】
実施例１：一般的な方法
Ａ．細胞系
大半のヒト細胞系は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．；Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から得た。これらの細胞系は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞Ａ５４９、Ｈ１７０３、Ｈ４６０、Ｈ３５８、Ｈ３２２、Ｈ８３８、Ｈ１２９９、Ｈ１６５０、Ｈ１９７５、Ｈ５２２、Ｈ４４１、Ｈ１６６６、Ｈ２１７０、Ｈ８２０、ＨＣＣ２９３５、ＨＣＣ４００６、及びＡ４２７、中皮腫細胞２１１Ｈ、Ｈ５１３、Ｈ２０５２、Ｈ２８、及びＨ２４５２、結腸癌細胞ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、Ｌｏｖｏ、ＤＬＤ−１、ＣＯＬＯ−２０５、ＣＯＬＯ−２０１、及びＣａＣＯ２、乳癌細胞ＭＣＦ７、ＨｕＬ１００、ＨＣＣ１５６９、ＳＫＢＲ−３、及びＢＴ４７４、膵臓癌細胞Ｐａｎｃ−１、Ｐａｎｃ０２．１３、ＨＰＡＦ−ＩＩ、ＳＷ１９９０、Ｙｐａｃ、８９０２−１、及び８９８８−１、黒色腫細胞ＬＯＸ、Ａ３７５、Ａ２０５８、Ｃａｌｕ、Ｃａｌｖ６、ＨＡ−Ａ、ＡＳ２５０４、Ｍｅｌ２０２、ＭａＭｅｌ１４４、ＳＫ−Ｍｅｌ−２、ＳＫ−Ｍｅｌ−５、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８、ＳＫ−Ｍｅｌ−３、ＳＫ−Ｍｅｌ−２４、ＳＫ−Ｍｅｌ−３０、及びＭｅｌＪｕｓｏ、多発性骨髄腫細胞ＰＲＭＩ−８２２６、Ｈ９２９、ＭＭ１．Ｒ、及びＵ２６６、前立腺癌細胞系ＬｎＣＡＰ及びＤＵ１４５、正常な肺線維芽細胞ＭＲＣ５を含む。他のヒト中皮腫癌細胞系Ｈ２９０及びＭＳ−１は、国立保健研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から得、ＲＥＮは、親切にもペンシルバニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）のＤｒ．Ｓｔｅｖｅｎ  Ａｌｂｅｌｄａ研究室により提供された。ヒト膵臓癌細胞系ＢｘＰＣ３、Ｐａｎｃ４．２１、及びＣＦＰＡＣ−１は、親切にもサンフランシスコのカリフォルニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＤｒ．Ｍａｔｔｈｉａｓ  Ｈｅｂｒｏｋ研究室により提供された。ヒト胃癌細胞系ＭＮＫ２８及びＡＧＳは、親切にもサンフランシスコのカリフォルニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＤｒ．Ｘｉｎ  Ｃｈｅｎにより提供され、食道癌細胞系ＯＥ１９、ＴＥ−７、ＯＥ３１、及びＯＥ２１は、親切にもサンフランシスコのカリフォルニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＤｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｋｏｒｎにより提供された。
【０１９５】
Ｂ．組織試料
腫瘍の治療的一次切除を受ける患者からの新鮮な癌組織及び周囲正常組織を外科手術時に回収し（ＩＲＢ承認Ｈ８７１４−１５３１９−０４０）、直ちに液体窒素中で急速凍結した。これらの組織試料は、後に使用するまで、−１７０℃の液体窒素冷凍庫で保持された。一次組織培養物を以下のように調製した：切除を受ける患者から同意を得て、新鮮な癌組織を得、細かく切り（直径１〜２ｍｍ）、その後、製造者のプロトコルに従い、室温で２時間、コラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）で消化した。消化からの単一細胞を沈降させ、１０％のウシ胎仔血清、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補足したＲＰＭＩ  １６４０を使用して、細胞ペレットを２回洗浄した。次いで、細胞を同じ培地中に再懸濁し、さらなる処理ができる状態になるまで、５％のＣＯ２の湿ったインキュベータ中、３７℃で、６ウェルプレートで培養した。
【０１９６】
Ｃ．細胞生存数アッセイ（細胞に基づく細胞毒性アッセイ）
典型的には、本実施形態の化合物を、３０ｍＭの濃度のＤＭＳＯに溶解した。次いで、０、１０、３０、５０から１００μＭの範囲の異なる濃度の細胞培養条件下で、化合物を試験した。処理後の細胞生存数を決定するために、６ウェルプレート中で細胞を化合物と共に約３日間インキュベートした。細胞培養培地を除去した後、１ｍｌの０．５％のクリスタルバイオレット溶液（２０％のエタノール及び２０％のメタノール中で調製された）を添加し、細胞を５分間染色した。次いで、水道水でクリスタルバイオレット溶液をきれいにすすいだ。細胞生存数は、クリスタル染色されたプレートの密度に基づき推定された。
【０１９７】
増殖または細胞毒性アッセイにおいて生細胞の数を決定するための別のアッセイは、比色法のＭＴＳアッセイである。ＭＴＳアッセイ試薬は、市販されている（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）。試薬は、テトラゾリウム化合物［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，分子内塩；ＭＴＳ］及び電子カップリング試薬（フェナジンエトスルフェート；ＰＥＳ）を含む。ＰＥＳは、強化された化学安定性を有し、これは、それがＭＴＳと混合され、安定した溶液を形成することを可能にする。ＭＴＳテトラゾリウム化合物（Ｏｗｅｎ試薬）は、細胞によって、組織培養培地において可溶性である着色ホルマザン生成物へと生物還元（ｂｉｏｒｅｄｕｃｅｄ）される。この変換は、代謝的に活性な細胞におけるデヒドロゲナーゼ酵素により生成されるＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨによって達成され得る。４９０ｎｍの吸光度によって測定されるホルマザン生成物の量は、培養物中の生存細胞の数に正比例する。ＭＴＳホルマザン生成物は、組織培養培地において可溶性であるため、このアッセイは、ＭＴＴなどのテトラゾリウム化合物を使用する手順よりも少ないステップを必要とする。ＭＴＴ還元のホルマザン生成物は、５７０ｎｍで読み取る吸光度を記録する前に結晶を溶解するために、手順においてさらなるステップを必要とする結晶沈殿物である。
【０１９８】
Ｄ．定量的ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して単離された。ハイブリダイゼーションプローブ及びプライマー（表１）は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。ｃＤＮＡ合成及びＴａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲは、製造者のプロトコルに従い実施された。遺伝子発現は、ＡＢＩ  ７３００リアルタイムＰＣＲシステムにおいて、３つ組でアッセイされた。試料を、それらのハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して規準化し、その後、２−ｄＣｔ法を使用して計算した。
【０１９９】
（表１）定量的ＲＴ−ＰＣＲのハイブリダイゼーションプローブ及びプライマー
2019006816.tif 000027
【０２００】
Ｅ．インビボ抗腫瘍形成能試験
ヒト癌細胞を保有するマウス異種移植片モデルにおいて、投与化合物がインビボで試験された。簡潔には、雌の胸腺欠損ヌードマウス株ＮＣＲＮＵ−Ｍ（５〜１０週齢、体重２０〜２５グラム；Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を、無菌状態下で維持した。３つのヒト癌細胞系ＮＳＣＬＣ  Ａ５４９、黒色腫ＭｅｌＪｕｓｏ、及び中皮腫ＭＳ−１が使用された。５〜１０匹のマウスが各群において使用され、３×１０６癌細胞を１００μｌの量で、背部領域に皮下注入された。接種後、眼に見える腫瘍結節になるように、ヒト癌細胞を、１０〜１３日間、マウスにおいて成長させた。次いで、５０ｍｇ／ｋｇ体重（１日当り１ｍｇ／マウス）の用量で、本実施形態の化合物を動物に注入した。ビヒクルのみは、対照として使用された。化合物及び対照は、マウスの腹部への腹腔内注入のために、４０μｌの量に調節された。注入は、１４日間、ほぼ同じ時間に毎日実施された。化合物処置完了後、腫瘍をさらに１〜２週間成長させた。腫瘍の大きさは、３〜４日ごとに測定され、腫瘍量は、幅（ｘ）及び長さ（ｙ）（ｘ２ｙ／２、ここでｘ＜ｙ）を使用して計算された。この期間全体を通して、処置の一般的な毒性も、マウスの体重を測定することにより監視された。データは、平均値（±標準偏差）として表された。
【０２０１】
Ｆ．マウスにおける化合物の薬物動態（ＰＫ）試験
マウス（群当り３匹）に、１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量の化合物の各々を用いて、静脈内注入または経口投与のいずれかを行った。次いで、注入または経口投与（ＰＯ）２０分、１時間、３時間、１０時間、及び２４時間後に各マウスの尾静脈から血漿を回収した。各血漿試料の化合物濃度は、マウスの血流内への化合物の吸収を確認するために、質量分析により決定された。
【０２０２】
Ｇ．毒性評価のための組織学的検査
インビボ試験が完了した後、様々な臓器をマウスから切除した。これらの臓器は、肝臓、肺、心臓、腎臓、腸、卵巣、脳、脾臓、皮膚、及び筋肉を含んだ。検体を４％の緩衝ホルムアルデヒドに固定し、パラフィンに包埋し、薄片にし、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）染色により組織学的分析を行った。ビヒクル対照と比較して、全ての臓器由来の毒性のエビデンスに関して、ＨＥ染色したスライドがマウス病理学者によって検査された。加えて、全処置群の各動物由来の白血球（ＷＢＣ：白血球細胞、ＮＥ：好中球、ＬＹ：リンパ球、ＭＯ：単球、ＥＯ：好酸球、ＢＡ：好塩基球）を回収し、血液細胞計数器により白血球集団を計数した。
【０２０３】
Ｈ．統計分析
データは、平均値（±標準偏差）を表す。エクセルにおける独立Ｔ検定を、異なる処置及び細胞系を比較するために使用した。
【０２０４】
Ｉ．小分子化合物の調製
別途記載されない限り、試薬及び溶媒は、市販の供給元から受け取ったまま使用された。プロトンに関して、４００ＭＨｚのＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ分光計でプロトン及び炭素核磁気共鳴スペクトルを得た。スペクトルは、ｐｐｍ（δ）で示され、カップリング定数Ｊは、ヘルツで報告される。溶媒ピークは、プロトンスペクトルの参照ピークとして使用された。ＬＣ−ＭＳスペクトルは、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣ  ＬＣ−ＭＳイオン捕捉エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析で得た。
【０２０５】
実施例２：化合物１の合成
2019006816.tif 000028
Ａ．化合物２−２の調製
2019006816.tif 000029
５００ｍＬの脱水ＴＨＦ中６０％のＮａＨ（３７ｇ、０．９３ｍｏｌ）の混合物に、メチル２−（ジメトキシホスホリル）アセテート（１０２ｇ、０．５６ｍｏｌ）を添加した。次いで、１００ｍＬの脱水ＴＨＦ中の化合物２−１（４１ｇ、０．３７ｍｏｌ）の溶液を、この混合物に添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。反応混合物に飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液を添加した。得られた混合物を濃縮し、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機相を水（３×２５ｍＬ）、ブライン（３×２５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で乾燥させ、粗生成物を得た。残留物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中の酢酸エチル１０％ｖ／ｖ）で精製し、透明の液体として化合物２−２（３０ｇ、収率：４８％）を得た。ｍ／ｚ：１６９［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２０６】
Ｂ．化合物２−４の調製
2019006816.tif 000030
４００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の化合物２−３（１２１ｇ、０．６４ｍｏｌ）及びピリジン（１０１ｇ、１．２８ｍｏｌ）の混合物に、室温の１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の塩化ベンジル（９０ｇ、０．６４ｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を１２時間撹拌した。反応混合物を水（４×５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で乾燥させた。残留物を酢酸エチルで再結晶化し、白色の固体として化合物２−４（７２ｇ、収率５２％）を得た。ｍ／ｚ：２１３［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２０７】
Ｃ．化合物２−５の調製
2019006816.tif 000031
ＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）中の化合物２−４（１５ｇ、７２ｍｍｏｌ）及び化合物２−２（１３ｇ、７９ｍｍｏｌ）ならびにＰｈ３ＰＣｌ２（４８ｇ、１４４ｍｍｏｌ）の溶液に、室温のＥｔ３Ｎ（３６ｇ、３６０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。反応混合物を水（３×３０ｍＬ）、ブライン（３×３０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で乾燥させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中の酢酸エチル１％ｖ／ｖ）で精製し、黄色の固体として化合物２−５（１０ｇ、収率：３８％）を得た。ｍ／ｚ：３６３［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２０８】
Ｄ．化合物２−６の調製
2019006816.tif 000032
ＴＨＦ（１５０ｍＬ）中の化合物２−５（１０ｇ、２８ｍｍｏｌ）の溶液に、水中（８０ｍＬ）のＫＯＨ（４．７ｇ、８４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１２時間撹拌した。反応混合物を、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ値を６に調節し、濃縮し、酢酸エチル（４×３０ｍＬ）で抽出した。有機相を水（２×２０ｍＬ）、ブライン（２×２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で乾燥させ、黄色の固体として粗化合物２−６（９．０ｇ、収率９２％）を得た。ｍ／ｚ：３４９［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２０９】
Ｅ．化合物１の調製
2019006816.tif 000033
ＣＨ２Ｃｌ２中の化合物２−６（９．０ｇ、２６ｍｍｏｌ）、５−アミノ−２，２−ジメチルペンタン−１−オール（５．１ｇ、３９ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（５．２ｇ、５２ｍｍｏｌ）、及びＯ−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、１４．８ｇ、３９ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で１２時間撹拌した。反応混合物を水（３×２０ｍＬ）、ブライン（２×２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で乾燥させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中の酢酸エチル２５％ｖ／ｖ）で精製し、白色の固体として化合物１（６．０ｇ、収率：５０％）を得た。
2019006816.tif 000034
【０２１０】
実施例３：化合物３の合成
2019006816.tif 000035
Ａ．化合物３−２の調製
2019006816.tif 000036
５００ｍＬの脱水ＴＨＦ中６０％のＮａＨ（３７ｇ、０．９３ｍｏｌ）の溶液に、メチル２−（ジメトキシホスホリル）アセテート（１０２ｇ、０．５６ｍｏｌ）を添加した。次いで、１００ｍＬの脱水ＴＨＦ中の化合物３−１（５０ｇ、０．３７ｍｏｌ）の溶液を、この溶液に添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。反応混合物に飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液を添加した。得られた混合物を濃縮し、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機相を水（３×２５ｍＬ）、ブライン（３×２５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮させ、粗生成物を得た。残留物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中の酢酸エチル１０％ｖ／ｖ）で精製し、黄色の液体として化合物３−２（３０ｇ、収率：４３％）を得た。ｍ／ｚ：１９１［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２１１】
Ｂ．化合物３−４の調製
2019006816.tif 000037
４００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の化合物３−３（１００ｇ、０．６４ｍｏｌ）及びピリジン（１０１ｇ、１．２８ｍｏｌ）の混合物に、室温の１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の４−フルオロベンゾイルクロリド（１０１ｇ、０．６４ｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を１２時間撹拌した。反応混合物を水（４×５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮させた。残留物を酢酸エチルで再結晶化し、白色の固体として化合物３−４（７０ｇ、収率３９％）を得た。ｍ／ｚ：２７９［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２１２】
Ｃ．化合物３−５の調製
2019006816.tif 000038
ＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）中の化合物３−４（２０ｇ、７２ｍｍｏｌ）及び化合物３−２（１５ｇ、７９ｍｍｏｌ）ならびにＰｈ３ＰＣｌ２（４８ｇ、１４４ｍｍｏｌ）の溶液に、室温のＥｔ３Ｎ（３６ｇ、３６０ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で１２時間撹拌した。反応混合物を水（３×３０ｍＬ）、ブライン（３×３０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中の酢酸エチル１％ｖ／ｖ）で精製し、黄色の固体として化合物３−５（１０ｇ、収率：３１％）を得た。ｍ／ｚ：４５１［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２１３】
Ｄ．化合物３−６の調製
2019006816.tif 000039
ＴＨＦ（１５０ｍＬ）中の化合物３−５（１０．０ｇ、２２ｍｍｏｌ）の溶液に、水（６０ｍＬ）中のＫＯＨ（３．７ｇ、６７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。反応混合物を、１Ｎ  ＨＣｌで６のｐＨ値に調節し、濃縮し、酢酸エチル（４×３０ｍＬ）で抽出した。有機相を水（２×２０ｍＬ）、ブライン（２×２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮させ、黄色の固体として粗化合物３−６（８．０ｇ、収率８３％）を得た。ｍ／ｚ：４３７［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２１４】
Ｅ．化合物３の調製
2019006816.tif 000040
ＣＨ２Ｃｌ２中の化合物３−６（８．０ｇ、１８ｍｍｏｌ）、４−（２−アミノエチル）フェノール（３．７ｇ、２７ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（３．６ｇ、３６ｍｍｏｌ）、Ｏ−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１０．３ｇ、２７ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で１２時間撹拌した。反応混合物を水（３×２０ｍＬ）、ブライン（２×２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中の酢酸エチル２５％ｖ／ｖ）で精製し、白色の固体として化合物３（５．０ｇ、収率：５０％）を得た。
2019006816.tif 000041
【０２１５】
実施例４：化合物４の合成
2019006816.tif 000042
Ａ．化合物４−２の調製
2019006816.tif 000043
５００ｍＬの脱水ＴＨＦ中６０％のＮａＨ（３４．８ｇ、８７０ｍｍｏｌ）の溶液に、エチル２−（ジメトキシホスホリル）アセテート（１０２ｇ、５２２ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、１００ｍＬの脱水ＴＨＦ中の化合物４−１（３０ｇ、３４８ｍｍｏｌ）の溶液を、この混合物に添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。反応混合物にＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液を添加した。得られた混合物を濃縮し、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機相を水（３×２５ｍＬ）、ブライン（３×２５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮させ、粗生成物を得た。残留物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中の酢酸エチル１０％ｖ／ｖ）で精製し、黄色の液体として化合物４−２（２０ｇ、収率３７％）を得た。ｍ／ｚ：１５７［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２１６】
Ｂ．化合物４−４の調製
2019006816.tif 000044
室温の１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の化合物４−３（１００ｇ、０．９ｍｏｌ）及び４００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中のピリジン（１４６ｇ、１．９ｍｏｌ）の混合物に、４−フルオロベンゾイルクロリド（１４７ｇ、０．９ｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を１２時間撹拌した。反応混合物を水（４×５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮させた。残留物を酢酸エチルで再結晶化し、白色の固体として化合物４−４（２００ｇ、収率９４％）を得た。ｍ／ｚ：２３１［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２１７】
Ｃ．化合物４−５の調製
2019006816.tif 000045
ＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）中の化合物４−４（２０ｇ、８７ｍｍｏｌ）及び化合物４−２（１５ｇ、９６ｍｍｏｌ）ならびにＥｔ３Ｎ（４４ｇ、４３５ｍｍｏｌ）の溶液に、室温のＰｈ３ＰＣｌ２（５８ｇ、１７４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。反応混合物を水（３×３０ｍＬ）、ブライン（３×３０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中の酢酸エチル１％ｖ／ｖ）で精製し、黄色の固体として化合物４−５（９ｇ、収率２８％）を得た。ｍ／ｚ：３６９［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２１８】
Ｄ．化合物４−６の調製
2019006816.tif 000046
ＴＨＦ（１５０ｍＬ）中の化合物４−５（９．０ｇ、２４ｍｍｏｌ）の溶液に、水（６０ｍＬ）中のＬｉＯＨ（４．１ｇ、７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。反応混合物を、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ値を６に調節し、濃縮し、酢酸エチル（４×３０ｍＬ）で抽出した。有機相を水（２×２０ｍＬ）、ブライン（２×２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮させ、黄色の固体として粗化合物４−６（８．０ｇ、収率９８％）を得た。ｍ／ｚ：３４１［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２１９】
Ｅ．化合物４の調製
2019006816.tif 000047
ＣＨ２Ｃｌ２中の化合物４−６（８．０ｇ、２４ｍｍｏｌ）、５−アミノ−２，２−ジメチルペンタン−１−オール（５．３ｇ、４１ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（５．４ｇ、５４ｍｍｏｌ）、Ｏ−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１５．４ｇ、４０．５ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で１２時間撹拌した。反応混合物を水（３×２０ｍＬ）、ブライン（２×２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中の酢酸エチル２５％ｖ／ｖ）で精製し、白色の固体として化合物４（６．０ｇ、収率：５５％）を得た。
2019006816.tif 000048
【０２２０】
実施例５：化合物５の合成
2019006816.tif 000049
Ａ．化合物５−２の調製
2019006816.tif 000050
ＴＨＦ（５００ｍｌ）中のＮａＨ（６０％）（１９．８３ｇ、０．４９６ｍｏｌ、１．５等量）の懸濁液に、氷浴下、メチル２−（ジメトキシホスホリル）アセテート（６６ｇ、０．３６３ｍｏｌ、１．１等量）を滴下して添加した。添加が完了した後、混合物を３０分間撹拌した。次いで、ＴＨＦ（１００ｍｌ）中の化合物５−１（４０ｇ、０．３３ｍｏｌ、１．０等量）を添加した。反応混合物を周囲温度に温め、一晩撹拌した。水（１００ｍｌ）を０〜１０℃で滴下して添加した。反応混合物を層に分離し、水層を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。混合有機層をブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。混合有機相を真空中で濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物を酢酸エチルで再結晶化し、白色の固体として化合物５−２（４５ｇ、収率７３％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  １６３．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２２１】
Ｂ．化合物５−４の調製
2019006816.tif 000051
ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍｌ）中の化合物５−３（１００ｇ、０．９２６ｍｏｌ、１．０等量）及びＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍｌ）中のピリジン（１１０ｇ、１．３９ｍｏｌ、１．５等量）を、４−フルオロベンゾイルクロリド（１４６．３ｇ、０．９２６ｍｏｌ、１．０等量）に添加した。反応混合物を１２時間撹拌した。反応混合物を水（４×１００ｍＬ）で洗浄し、真空中で濃縮させた。残留物を酢酸エチルで再結晶化し、白色の固体として化合物５−４（１５０ｇ、収率７０％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ２３１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２２２】
Ｃ．化合物５−５−１の調製
2019006816.tif 000052
ＣＨ２Ｃｌ２中の化合物５−４（２０．８２ｇ、０．０９１ｍｏｌ、１．０等量）及び化合物５−２（１６．２ｇ、０．１０ｍｏｌ、１．１等量）ならびにＥｔ３Ｎ（４６．０ｇ、０．４５５ｍｏｌ、５．０等量）の溶液に、室温のＰｈ３ＰＣｌ２（６０．４ｇ、０．１８２ｍｏｌ、２．０等量）を添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。反応混合物を水（３×５０ｍＬ）、ブライン（２×５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ＝１：１００）で精製し、白色の固体として化合物５−５−１（９ｇ、収率２６％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ３７５（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２２３】
Ｄ．化合物５−６の調製
2019006816.tif 000053
化合物５−５−１（９ｇ、０．０２４ｍｍｏｌ、１．０等量）ならびにＴＨＦ（５０ｍｌ）及びＨ２Ｏ（５０ｍｌ）中のＮａＯＨ（１．９３ｇ、０．０４８ｍｍｏｌ、２．０等量）の混合物を、室温で４時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、ｐＨを１〜２に調節した。反応混合物を濾過して、白色の固体を分離した。固体をＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。溶液をブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶液を真空中で濃縮し、白色の固体として化合物５−６（７．６５ｇ、収率８８％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ３６１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２２４】
Ｅ．化合物５の調製
2019006816.tif 000054
ＣＨ２Ｃｌ２中の化合物５−６（９ｇ、０．０２５ｍｏｌ、１．０等量）、ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ＼Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（１４．２５ｇ、０．０３８ｍｏｌ、１．５等量）、Ｅｔ３Ｎ（５．０６ｇ、０．０５０ｍｏｌ、２．０等量）の溶液に、２時間室温で撹拌した。反応混合物に、水（１００ｍｌ）を添加し、有機相を分離した。有機層をブライン（２×５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶液を真空中で濃縮し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、白色の固体として化合物５（５．６ｇ、収率４７％）を得た。
2019006816.tif 000055
【０２２５】
実施例６：化合物２の合成
2019006816.tif 000056
実施例２−５と類似する合成手順を使用して、化合物２を合成した。
2019006816.tif 000057
【０２２６】
実施例７：化合物６の合成
2019006816.tif 000058
実施例２−５と類似する合成手順を使用して、化合物６を合成した。
2019006816.tif 000059
【０２２７】
実施例８：本実施形態の化合物はインビボでの腫瘍成長を抑制する（マウス異種移植片モデル：黒色腫ＭｅｌＪｕｓｏ）
マウス異種移植片モデル（黒色腫ＭｅｌＪｕｓｏ）を使用して、化合物１、２、４、及び６のインビボ有効性試験を実施した。マウスに３×１０６細胞を１００μｌの量で、背部領域に皮下注入した。接種１３日後、マウスは、５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で１４日間、毎日、投与化合物で治療を受け始めた（ｎ＝１０）。ビヒクルのみは、対照として使用された（ｎ＝１０）。投与化合物及びビヒクルは、マウスの腹部への腹腔内注入のために、４０μｌの量に調節された。腫瘍の大きさ及び腫瘍量は、上述のように計算された。図１に見られるように、腫瘍成長は、投与化合物での処置後、劇的に抑制された。
【０２２８】
実施例９：本実施例の化合物はインビボでの腫瘍成長を抑制する（マウス異種移植片モデル：中皮腫ＭＳ−１）
マウス異種移植片モデル（中皮腫ＭＳ−１）を使用して、化合物１及び４のインビボ有効性試験を実施した。１群当り５匹の雌の胸腺欠損ヌードマウスに３×１０６細胞を１００μｌの量で、背部領域に皮下注入した。接種１０日後、毎日５０ｍｇ／ｋｇ体重で、１４日間の化合物の腹腔内注入を開始した（ｎ＝５）。ビヒクルのみは、対照として使用された（ｎ＝５）。処置完了後、腫瘍をさらに２週間成長させた。実験が完了するまで、腫瘍の大きさを週２回測定した。対照群と比較して、投与化合物で処置された後に腫瘍重量が減少した（図２）。
【０２２９】
実施例１０：本実施形態の化合物はインビボでの腫瘍成長を抑制する（マウス異種移植片モデル：肺癌Ａ５４９）
マウス異種移植片モデル（ＮＳＣＬＣ  Ａ５４９）において、化合物１及び４のインビボ有効性試験を検査した。マウスに３×１０６細胞を１００μｌの量で、背部領域に皮下注入した。接種１０日後、マウスは、５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で１４日間、毎日（ｎ＝５）、その後、５０ｍｇ／ｋｇ体重で別の一連の処置を１×７日間、毎日、化合物１または４を用いる処置を受け始めた。ビヒクルのみは、対照として使用された（ｎ＝５）。投与された化合物及びＤＭＳＯは、マウスの腹部への腹腔内注入のために、５０μｌの量に調節された。最初の腫瘍接種から４３日後、腫瘍を各群のマウスから切断し、はかりを使用して、それらの重量を測定した。対照群と比較して、投与化合物で処置された後に腫瘍重量が減少した（図３）。この低用量インビボ結果は、本明細書に提示されるインビトロデータと一致する。
【０２３０】
実施例１１：インビボの腫瘍における本実施形態の化合物のヘッジホッグ経路に対する効果
化合物１、２、４、及び６がインビボでヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害を通して腫瘍成長を抑制するかを検査するために、Ｈｈ経路（例えば、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、Ｇｌｉ３、ＨＨＩＰ、及びＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１）の主要成分及び直接標的遺伝子の発現が、異種移植片腫瘍から単離された全ＲＮＡを使用して、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析された。ＧＡＰＤＨは、対照として機能する。このＲＴ−ＰＣＲ分析は、適切な大きさの腫瘍を有する各群の２匹の無作為に選択されたマウス由来の「プールされた」腫瘍を使用して実施された。Ｈｈシグナル伝達が黒色腫の腫瘍（ＭｅｌＪｕｓｏ）において、化合物１、２、４、及び６により阻害されたことが分かった（図４）。結果は図４に示され、Ｃは対照であり、Ｖはビヒクルである。
【０２３１】
実施例１２：インビボの腫瘍における本実施形態の化合物の標準Ｗｎｔ経路に対する効果
化合物１、２、４、及び６がインビボでＷｎｔシグナル伝達経路の阻害を通して腫瘍成長を抑制するかを検査するために、Ｗｎｔ経路（例えば、Ｗｎｔ２、Ａｘｉｎ２、ＥＧＦＲ、及びＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１）の主要成分及び直接標的遺伝子の発現が、異種移植片腫瘍から単離された全ＲＮＡを使用して、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析された。ＧＡＰＤＨは、対照として機能する。このＲＴ−ＰＣＲ分析は、適切な大きさの腫瘍を有する各群の２匹の無作為に選択されたマウス由来の「プールされた」腫瘍を使用して実施された。標準Ｗｎｔ活性化の主要な指標の発現が、対照と比較して、化合物１、２、及び４で処置された黒色腫の腫瘍において大幅に下方調節されたことが分かった（図４）。結果は図４に示され、Ｃは対照であり、Ｖはビヒクルである。
【０２３２】
実施例１３：インビボ処置後のマウスにおける本実施形態の化合物の毒性分析
化合物１、２、４、及び６の予備インビボ毒性試験として、処置後のマウスにおける白血球集団の変化及び体重の損失があるかを検査した。本明細書に記載されるインビボ試験の完了時、全処置群の各動物由来の白血球（ＷＢＣ：白血球細胞、ＮＥ：好中球、ＬＹ：リンパ球、ＭＯ：単球、ＥＯ：好酸球、ＢＡ：好塩基球）を回収し、血液細胞計数器により白血球集団を計数した。薬物投与経過中、対照群（ｎ＝１０）及び処置群（ｎ＝１０）の体重を測定した。白血球集団または体重損失の目立った変化は、投与化合物で処置した後には観察されなかった（図５及び６）。さらなる毒性試験では、異なる用量の化合物４及び６の、マウスの体重に対する効果が検査された。化合物を、マウス（投薬群当り３匹のマウス）に、６日間連続、２５、５０、及び１００ｍｇ／ｋｇ体重の３つの異なる用量で、腹部に腹腔内注入した。一貫して、体重の目立った損失は、投与化合物で処置した後には観察されなかった（図７）。
【０２３３】
実施例１４：マウスにおける本実施形態の化合物の様々な細胞に対する効果
インビボで化合物１、２、４、及び６の毒性を分析するために、各群（３匹）は、６日間、毎日、各化合物の２用量を腹腔内注入され、その後、肝臓、脾臓、腎臓、及び心臓などの主なマウスの臓器が、マウスから切除された。検体を４％の緩衝ホルムアルデヒドに固定し、パラフィンに包埋し、薄片にし、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色により組織学的分析を行う。化合物処置されたマウス由来の臓器において目立った毒性は観察されなかった。結果が図８〜１１に示される。
【０２３４】
実施例１５：癌細胞の治療における本実施形態の化合物及び化学療法薬の相乗効果
化合物といくつかの化学療法薬：エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２、ＴＧＦβ阻害剤ＳＢ４３１５４２、及びペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ（登録商標））の併用処理が、ヒトＮＳＣＬＣ及びＭＭ細胞系において実施された（図１２〜１７）。全ての実験では、ＮＳＣＬＣ及びＭＭ細胞系が、異なる用量の各化合物または組み合わせで７２時間処理され、ＭＴＳアッセイは、細胞増殖を決定するために実施された。ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）により計算された併用指数（ＣＩ）は、２つの化合物の併用効果の効果を説明するために適用され、ＣＩ＜１は相乗効果を示し、ＣＩ＝１は相加効果を示し、ＣＩ＞１は拮抗効果を示す。スチューデントのｔ検定が統計分析に適用された。併用処置はＮＳＣＬＣ及びＭＭ細胞の増殖を相乗的に抑制し得ることが分かった。
【０２３５】
実施例１６：化合物４の鏡像異性体Ｐ１及びＰ２のキラルＨＰＬＣカラム分離
実験は、化合物４の２つの鏡像異性体（Ｐ１及びＰ２）を分離するために実施された。Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈカラム（Ｃｈｉｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ）が使用された。カラムの大きさは、２５ｃｍ×４．６ｍｍ内径であり、ＣＳＰ粒径は５ミクロンであった。１５％（ｖ／ｖ）の二酸化炭素に混入されたＨＰＬＣグレードのメタノールが共溶媒として使用された。カラムの温度は３９．７℃であった。ＣＯ２の流速は２．５５ｍｌ／分であり、共溶媒の流速は０．４５ｍｌ／分であり、総流速は３ｍｌ／分となる。前圧及び背圧は、それぞれ、１８６及び１５０バールであり、３６バールの圧力降下をもたらす。フォトダイオードアレイ開始及び停止波長は、それぞれ、２１４及び３５９ｎｍであった。
【０２３６】
記載される条件下で、化合物４の鏡像異性体Ｐ１は、３．２７分の滞留時間を有することが分かり、一方、化合物４の鏡像異性体Ｐ２は、４．１４分の滞留時間を有した。各鏡像異性体の曲線下パーセンテージ面積は、それぞれ、４９．１％（鏡像異性体Ｐ１）及び４７．７％（鏡像異性体Ｐ２）であった。鏡像異性体Ｐ１及び鏡像異性体Ｐ２の後続の反復クロマトグラフィーは（鏡像異性体Ｐ１に関しては、温度が３９．１℃、圧力降下が４５バールであり、鏡像異性体Ｐ２に関しては、温度が４１．１℃、圧力降下が３３バールであったことを除き、上述に示されるのと同一のＨＰＬＣ条件を用いて）、別々に、それぞれ、９９．９％（鏡像異性体Ｐ１）及び９８．８％（鏡像異性体Ｐ２）の純度を示し、滞留時間は、鏡像異性体Ｐ１に関しては３．５３分であり、鏡像異性体Ｐ２に関しては４．４７分であった。
【０２３７】
実施例１７：キラル化合物４は複数の癌細胞系において鏡像異性体特異的活性を示す
実験は、様々な癌細胞系（肺癌、黒色腫、中皮腫、結腸直腸癌、膵臓癌、及び前立腺癌を含む）における鏡像異性体特異的活性を決定するために実施された。癌細胞系は、０．５％のＦＢＳを含む培地中で、ビヒクルまたは用量範囲０．１μＭ〜２０μＭの化合物４のいずれか、及び２つの精製された化合物４の鏡像異性体（Ｐ１及びＰ２）で４日間処理され、細胞毒性ＩＣ５０値が決定された。データは、鏡像異性体Ｐ２が鏡像異性体Ｐ１よりも癌細胞成長の抑制において活性であったことを示した。結果は、Ｐ２鏡像異性体のＩＣ５０値が化合物４の約５０％であったため（すなわち、Ｐ１及びＰ２鏡像異性体の等量混合）、化合物４及び鏡像異性体Ｐ２の活性が特異的であることも示した。図１８は、様々な癌細胞系についてのＧｌｉ阻害剤化合物４及びその２つの精製された鏡像異性体（Ｐ１及びＰ２）の各々の細胞毒性ＩＣ５０値（μＭ）を示す。
【０２３８】
実施例１８：肺癌細胞系におけるＧｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２の有効性とＧｌｉ発現の相関関係
実験は、肺癌細胞系における化合物４−鏡像異性体Ｐ２（図１８に記載されるＩＣ５０値）の有効性とＧｌｉ１及びＧｌｉ２の発現レベルとの間の相関関係を検査するために実施された。化合物４−鏡像異性体Ｐ２のＩＣ５０値（μＭ）は、これらの細胞系におけるＧｌｉ１及びＧｌｉ２のｍＲＮＡ発現レベル（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定された）と逆に相関し、化合物４−鏡像異性体Ｐ２がヒト肺癌細胞系においてＧｌｉ機能の阻害に特異的であったことを支持する。図１９は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞におけるＧｌｉ阻害剤化合物４の有効性とＧｌｉ発現の相関関係のグラフを示す。
【０２３９】
実施例１９：他の癌細胞におけるＧｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２の有効性とＧｌｉ発現の相関関係
実験は、いくつかの他の種類の癌細胞系（中皮腫、黒色腫、及び結腸直腸癌を含む）における化合物４−鏡像異性体Ｐ２（図１８に記載されるＩＣ５０値）の有効性とＧｌｉ１及びＧｌｉ２の発現レベルとの間の相関関係を検査するために実施された。化合物４−鏡像異性体Ｐ２のＩＣ５０値（μＭ）は、これらの細胞系におけるＧｌｉ１及びＧｌｉ２のｍＲＮＡ発現レベル（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定された）と逆に相関し、化合物４−鏡像異性体Ｐ２が癌細胞系においてＧｌｉ機能の阻害に特異的であったことを支持する。図２０は、中皮腫、黒色腫、及び結腸直腸癌の癌細胞を含むこれらの他の種類の癌細胞系におけるＧｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２の有効性とＧｌｉ発現の相関関係のグラフを示す。
【０２４０】
実施例２０：ＮＳＣＬＣ細胞系Ａ５４９における小Ｇｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２によるＧｌｉ／ＴＡＦ９依存転写活性の阻害
Ｇｌｉ機能の阻害における化合物４−鏡像異性体Ｐ２の特異性を検査し、それがＧｌｉとＴＡＦ９との間の相互作用を遮断するかを実証するために、ＮＳＣＬＣ  Ａ５４９細胞における化合物４−鏡像異性体Ｐ２処置後のルシフェラーゼ活性を検査するためのＧｌｉ依存転写の代替え測定として、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結されたＧｌｉ結合部位の８つの反復物（８×Ｇｌｉ  ＢＳ）を使用して、実験が実施された。結果は、Ｇｌｉ１またはＧｌｉ２単独の過剰発現が８×Ｇｌｉ  ＢＳ−ルシフェラーゼ活性を大幅に増加させ、ＴＡＦ９のＧｌｉ１またはＧｌｉ２のいずれかとの同時発現が８×Ｇｌｉ  ＢＳ−ルシフェラーゼ活性をＧｌｉ単独によるものよりも大幅に高いレベルにさらに増加させたことを示し、Ｇｌｉ１及びＧｌｉ２がＧｌｉ結合部位に特異的に結合し、転写において機能的に活性であり、ＴＡＦ９が活性化補助因子としてＧｌｉタンパク質と相互作用し得ることを確認したことを示した。５μＭで１６〜２０時間処置した後、化合物４−鏡像異性体Ｐ２は、Ａ５４９細胞において、Ｇｌｉ単独及びＧｌｉ／ＴＡＦ９誘発８×Ｇｌｉ  ＢＳ−ルシフェラーゼ活性の両方を大幅に下方調節することが分かった。この結果は、化合物４−鏡像異性体Ｐ２がＧｌｉタンパク質とＴＡＦ９との間の相互作用の阻害に特異的であり得ることを示す。図２１は、Ｇｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２がインビトロでＮＣＳＬＣ細胞系Ａ５４９においてＧｌｉ／ＴＡＦ依存転写活性を阻害することを示す、ルシフェラーゼ活性（％）のグラフを示す。
【０２４１】
実施例２１：Ｇｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２はインビトロでＮＳＣＬＣ細胞におけるＧｌｉ下流標的を阻害する
実験は、化合物４−鏡像異性体Ｐ２がＧｌｉ機能の阻害を通して肺癌細胞の成長を抑制したかを分析するために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して実施された。全ＲＮＡは、化合物４−鏡像異性体Ｐ２で処置された肺癌細胞（Ａ５４９及びＨ１２９９）から単離された。結果は、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、ＨＨＩＰ、及びＰｔｃｈ１などのＧｌｉ下流標的の発現レベルがこれらの肺癌細胞系において化合物４−鏡像異性体Ｐ２により全て大幅に下流調節されたことを示した。これらの結果は、化合物４−鏡像異性体Ｐ２化合物がＧｌｉ機能の阻害を通して肺癌細胞の成長を特異的に抑制し得ることを示唆する。図２２は、Ｇｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２がインビトロでＮＳＣＬＣ細胞においてＧｌｉ下流標的を阻害することを示す、Ｇｌｉ下流標的の発現レベルのグラフを示す。
【０２４２】
実施例２２：Ｇｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２はインビトロで中皮腫細胞におけるＧｌｉ下流標的を阻害する
実験は、化合物４−鏡像異性体Ｐ２がＧｌｉ機能の阻害を通して中皮腫細胞の成長を抑制したかを分析するために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して実施された。全ＲＮＡは、化合物４−鏡像異性体Ｐ２（５μＭ）で処理された中皮腫細胞ＭＳ−１から単離された。結果は、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、ＨＨＩＰ、及びＰｔｃｈ１などのＧｌｉ下流標的の発現レベルがこれらのＭＳ−１細胞において化合物４−鏡像異性体Ｐ２により全て大幅に下流調節されたことを示した。これらの結果は、化合物４−鏡像異性体Ｐ２化合物がＧｌｉ機能の阻害を通して中皮腫細胞の成長を特異的に抑制し得ることを示唆する。図２３は、Ｇｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２がインビトロで中皮腫細胞においてＧｌｉ下流標的を阻害することを示す、遺伝子発現のグラフを示す。
【０２４３】
実施例２３：Ｇｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２はインビボで腫瘍内の中皮腫細胞においてＧｌｉ下流標的を阻害する（マウス異種移植片モデル：中皮腫ＭＳ−１）
実験は、化合物４−鏡像異性体Ｐ２がインビボでのＧｌｉ機能の阻害を通して中皮腫の腫瘍成長を抑制したかを分析するために、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）を使用して実施された。結果は、Ｇｌｉ１及びＧｌｉ２のタンパク質発現レベルがこれらのＭＳ−１腫瘍において化合物４−鏡像異性体Ｐ２により両方とも大幅に下方調節され、これらのインビボ腫瘍における増殖マーカーＫｉ−６７の下方調節と一致したことを示した。これらの結果は、化合物４−鏡像異性体Ｐ２化合物がインビボでのＧｌｉ機能の阻害を通して中皮腫の腫瘍成長を特異的に抑制し得ることを示唆する。図２４は、Ｇｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２がインビボで腫瘍内の中皮腫細胞においてＧｌｉ下流標的を阻害することを示す、免疫組織化学像を示す（マウス異種移植片モデル：中皮腫ＭＳ−１）。
【０２４４】
実施例２４：インビトロでの中皮腫細胞の成長の抑制におけるＧＤＣ０４４９（Ｓｍｏ阻害剤）及びＧｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２の相乗効果
実験は、ＧＤＣ０４４９（Ｓｍｏ阻害剤）及びＧｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２の併用治療を試験するために実施された。中皮腫細胞系Ｈ２８を、Ｇｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２及びＳｍｏ阻害剤ＧＤＣ０４４９を併用することにより処理した。結果は、併用治療が相乗的または相加的にこれらの中皮腫細胞の増殖を抑制したことを示した。ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェア（バイオソフト）は、相乗的、相加的、及び拮抗的薬物相互作用を特定するために、半数有効式を使用するＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ法に基づく併用指数（ＣＩ）を用いて癌細胞系における各併用治療に関して計算するために使用された。ＣＩ値は、２つの化合物の併用効果の効果を説明し、ＣＩ＜１は相乗効果を示し、ＣＩ＝１は相加効果を示し、ＣＩ＞１は拮抗効果を示す。相乗効果は、中程度の相乗効果（ＣＩ＝０．７〜０．９）、相乗効果（ＣＩ＝０．３〜０．７）、及び強い相乗効果（ＣＩ＝０．１〜０．３）としてさらに定義される。図２５は、インビトロでの中皮腫細胞の成長の抑制におけるＧＤＣ０４４９（Ｓｍｏ阻害剤）及びＧｌｉ阻害剤化合物４−鏡像異性体Ｐ２の相乗効果を示すグラフを示す。
【０２４５】
上述の実施形態は、明確さ及び理解のために図示及び実施例によりある程度詳細に記載されてきたが、本開示の教示を考慮して、ある特定の変形、変更、修正、及び等価物の置換が本発明の趣旨及び範囲から必ずしも逸脱することなく行われ得ることは、当業者には容易に明らかであろう。結果として、本明細書に記載される実施形態は、様々な修正、変更などを受け、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲を参照することによってのみ決定される。当業者は、本質的に類似する結果をもたらすように変更、変形、または修正され得る様々な重要でないパラメータを容易に認識する。
【０２４６】
本発明の要素の各々は、本明細書において、複数の実施形態を含むように記載されるが、別途示されない限り、本発明の所与の要素の実施形態の各々は、本発明の他の要素の実施形態の各々と共に使用することができ、各々のそのような使用が本発明の別個の実施形態を形成することが意図されることを理解するべきである。
【０２４７】
上の開示から理解することができるように、本発明は、多種多様の用途を有する。本発明は、単に図示であり、決して本発明の定義及び範囲を制限することが意図されない上記の実施例によりさらに図示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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