(57)【要約】【課題】優れたＴｉｅ２活性化作用を有し、かつ安全性の高いＴｉｅ２活性化剤、優れた血流促進作用を有し、かつ安全性の高い血流促進剤、優れた抗炎症作用を有し、かつ安全性の高い抗炎症剤、優れた抗酸化作用を有し、かつ安全性の高い抗酸化剤、及び飲食品の提供。【解決手段】日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物、シニグリン、及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドからなる群から選択される少なくとも１種を含有するＴｉｅ２活性化剤、血流促進剤、抗炎症剤、及び抗酸化剤、並びに、前記Ｔｉｅ２活性化剤、血流促進剤、抗炎症剤、及び抗酸化剤からなる群から選択される少なくとも１種を含有する飲食品である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物、シニグリン、及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドからなる群から選択される少なくとも１種を含有することを特徴とするＴｉｅ２活性化剤。
【請求項２】
日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物、シニグリン、及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドからなる群から選択される少なくとも１種を含有し、一酸化窒素産生促進作用、及び血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化作用の少なくともいずれかを有することを特徴とする血流促進剤。
【請求項３】
日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物、シニグリン、及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドからなる群から選択される少なくとも１種を含有し、ＴＮＦ−α産生抑制作用を有することを特徴とする抗炎症剤。
【請求項４】
日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物、シニグリン、及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドからなる群から選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする抗酸化剤。
【請求項５】
スーパーオキサイド消去作用、及びラジカル消去作用の少なくともいずれかを有する請求項４に記載の抗酸化剤。
【請求項６】
請求項１に記載のＴｉｅ２活性化剤、請求項２に記載の血流促進剤、請求項３に記載の抗炎症剤、及び請求項４から５のいずれかに記載の抗酸化剤から選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｉｅ２活性化剤、血流促進剤、抗炎症剤、及び抗酸化剤、並びに飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管は、血管内皮細胞と血管壁細胞（血管平滑筋細胞やペリサイト）とが、細胞外マトリックスを介して間接的に、又は直接的に接着する構造を有しており、酸素及び栄養素を生体組織に供給し、生体組織から老廃物を消去する機能を有している。
【０００３】
一般に、血管の形成は、新たに血管が形成される血管発生（Ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）と、形成された既存の血管が伸長し、分岐することにより、新たな血管のネットワークが形成される血管新生（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）との２段階に分けられる。前者は、血管内皮増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）が作用し、脈管形成とよばれる血管の初期発生からその後の血管新生に至るまで非常に広い範囲の血管形成に関与するものである。後者は、アンジオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ：Ａｎｇ）が作用し、血管内皮細胞と血管壁細胞との接着の制御、血管の構造的安定化に関与するものである。
【０００４】
血管は通常の酸素状況においては、血管内皮細胞とその周囲を裏打ちする血管壁細胞とが強固に接着しており、血管構造が安定に保たれているが、組織で低酸素が生じると血管壁細胞が血管内皮細胞から脱離し、無秩序な血管が増生することがある。このような現象（血管新生）は、腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病網膜症、高脂血症、高血圧などの血管病変を主体とした疾患において、しばしば観察されている。
【０００５】
血管新生は、血管内皮細胞に発現する受容体型チロシンキナーゼであるＴｉｅ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｉｇ  ａｎｄ  ＥＧＦ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎ２）を活性化させることにより、抑制されることが知られている（例えば、特許文献１参照）。
また、血管狭小化又は血管拡大化の抑制が原因となって生じる虚血性疾患においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管腔が拡大化されることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
また、Ｔｉｅ２の活性化により、血管内皮細胞の細胞死を抑制することも報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００６】
このようにＴｉｅ２の活性化により、血管新生が抑制されることが知られているだけでなく、血管を成熟化、正常化、及び安定化させることも知られている。
血管再生医療においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管における血管内皮細胞と血管壁細胞との接着を誘導して、血管を成熟化させることが知られている。また、腫瘍や糖尿病性網膜症などで観察される血管壁細胞が血管内皮細胞に接着しないことによる無秩序な血管が増生するような疾患においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管壁細胞を内皮細胞に接着させ、血管を正常化させることが知られている。また、種々の細胞内外の血管構造を破綻させる環境因子に対しては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管の不安定化を抑制し、血管を安定化させることが知られている。
【０００７】
Ｔｉｅ２の活性化により血管新生を抑制する天然由来の物質としては、桂皮の抽出物（例えば、特許文献１参照）などが知られている。また、血管新生を抑制する物質としては、スラミン（例えば、特許文献２参照）などが知られている。
【０００８】
一酸化窒素（ＮＯ）については、その生理学的作用又は薬理学的作用が注目されており、様々な研究が行われてきている。一酸化窒素（ＮＯ）は、生体内において、Ｌ−アルギニンと分子状酸素とを基質とし、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＮＡＤＰＨ）、フラビンモノヌクレオチド（Ｆｌａｖｉｎ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（Ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＦＡＤ）、テトラヒドロビオプテリンを補酵素として、一酸化窒素合成酵素（Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＮＯＳ）により生成される。
ＮＯＳには、酵素学的にもタンパク質分子としても異なる３種のアイソフォームが存在し、それぞれ誘導型一酸化窒素合成酵素（Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ：ｉＮＯＳ）、血管内皮型一酸化窒素合成酵素（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ：ｅＮＯＳ）、神経型一酸化窒素合成酵素（Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ：ｎＮＯＳ）が知られている。
【０００９】
これらＮＯＳのうちｅＮＯＳは、血管内皮細胞に局在しており細胞膜に結合している。このｅＮＯＳが活性化されると、一酸化窒素が継続的に産生され、その一酸化窒素は直ちに血管平滑筋に取り込まれ、グアニル酸シクラーゼを活性化する。これによりサイクリックグアノシン３’，５’−１リン酸（Ｃｙｃｌｉｃ  ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ｃＧＭＰ）が産生され、ｃＧＭＰ依存性タンパク質リン酸化酵素の活性化を介して血管平滑筋が弛緩されることにより、血管拡張作用を有し、血流が促進される。また、ｅＮＯＳにより産生された一酸化窒素は、血液中の血小板に作用することにより、血小板の凝集を抑制するとともに、凝固した血液の血管壁への接着を阻害することが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。
【００１０】
このような血管内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の産生を促進する天然物としては、例えば、ヒハツの抽出物などが提案されている（例えば、特許文献３参照）。
【００１１】
腫瘍壊死因子の１種であるＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α）は、腫瘍を壊死させる因子として見出されたが、最近では腫瘍に対してだけでなく、正常細胞の機能を調節するメディエーター的な役割を担うサイトカインであると考えられている。
ＴＮＦ−αは炎症の初発から終息までの過程において重要な役割を担っているが、その持続的かつ過剰な産生は、皮膚を含めた組織の障害を引き起こし、全身的には発熱やカケクシアの原因となり、炎症の悪化を引き起こす。そのような炎症としては、例えば、関節リューマチ、変形性関節症などの慢性炎症性疾患が代表的である。したがって、病的な炎症においてはＴＮＦ−αの過剰な産生を抑制することが重要となる。
ＴＮＦ−α産生抑制剤としては、例えば、シソ抽出液（非特許文献４参照）、ヒガンバナ科アルカロイドのリコリン及びリコリシジノール（非特許文献５参照）などが挙げられる。
【００１２】
生体成分を酸化させる要因として、活性酸素が注目されており、その生体への悪影響が問題となっている。活性酸素は、生体細胞内のエネルギー代謝過程で生じるものであり、スーパーオキサイド〔即ち、酸素分子の一電子還元で生じるスーパーオキシドアニオン（・Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素（１Ｏ２）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）〕等がある。このような活性酸素は食細胞の殺菌機構にとって必須であり、ウイルスや癌細胞の消去に重要な働きを果たしている。
しかし、活性酸素の過剰な生成は生体内の膜及び組織を構成する生体内分子を攻撃し、各種疾患を誘発する。生体内で生産され、他の活性酸素の出発物質ともなっているスーパーオキサイドは、通常、細胞内に含まれているスーパーオキシドディスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ；ＳＯＤ）の触媒作用により逐次消去されている。
スーパーオキサイドの産生が過剰な場合、あるいはＳＯＤの作用が低下している場合には、スーパーオキサイドの消去が不十分になってスーパーオキサイド濃度が高くなる。このことが、関節リウマチ、ベーチェット病等の組織障害、心筋梗塞、脳卒中、白内障、シミ、ソバカス、しわ、糖尿病、動脈硬化、肩凝り、冷え性、皮膚の老化などを起こす原因の一つであると考えられている。
【００１３】
したがって、優れたＴｉｅ２活性化作用、血流促進作用、抗炎症作用、及び抗酸化作用を有する安全性の高い物質について、速やかな開発が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００９−２６３３５８号公報
【特許文献２】特表平９−５０３４８８号公報
【特許文献３】特開２００５−２９８４２９号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９  Ｄｅｃ  ２４；２８６（５４４９）：２５１１−４．
【非特許文献２】Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．２００４  Ａｐｒ  １３；１０１（１５）：５５５３−８．
【非特許文献３】中根正樹，「ＮＯ研究の新しい展開」，実験医学，１９９９年，第１７巻，第８号，ｐ．９１４−９１７
【非特許文献４】「炎症」１９９３年，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．４，ｐ．３３７〜３４０
【非特許文献５】「薬学雑誌」２００１年，Ｖｏｌ．１２１，Ｎｏ．２，ｐ．１６７〜１７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れたＴｉｅ２活性化作用を有し、安全性の高いＴｉｅ２活性化剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、優れた血流促進作用を有し、安全性の高い血流促進剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、優れた抗炎症作用を有し、安全性の高い抗炎症剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、優れた抗酸化作用を有し、安全性の高い抗酸化剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、優れたＴｉｅ２活性化作用、血流促進作用、抗炎症作用、及び抗酸化作用からなる群から選択される少なくとも１種を有し、安全性の高い飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
前記課題を解決するために本発明者が鋭意検討を重ねた結果、日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物、シニグリン、及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドからなる群から選択される少なくとも１種が、優れたＴｉｅ２活性化作用、血流促進作用、抗炎症作用、及び抗酸化作用からなる群から選択される少なくとも１種を有することを知見し、本発明を完成したものである。
【００１８】
本発明は、本発明者の前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物、シニグリン、及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドからなる群から選択される少なくとも１種を含有することを特徴とするＴｉｅ２活性化剤である。
＜２＞  日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物、シニグリン、及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドからなる群から選択される少なくとも１種を含有し、一酸化窒素産生促進作用、及び血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化作用の少なくともいずれかを有することを特徴とする血流促進剤である。
＜３＞  日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物、シニグリン、及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドからなる群から選択される少なくとも１種を含有し、ＴＮＦ−α産生抑制作用を有することを特徴とする抗炎症剤である。
＜４＞  日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物、シニグリン、及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドからなる群から選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする抗酸化剤である。
＜５＞  スーパーオキサイド消去作用、及びラジカル消去作用の少なくともいずれかを有する前記＜４＞に記載の抗酸化剤である。
＜６＞  前記＜１＞に記載のＴｉｅ２活性化剤、前記＜２＞に記載の血流促進剤、前記＜３＞に記載の抗炎症剤、及び前記＜４＞から＜５＞のいずれかに記載の抗酸化剤からなる群から選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする飲食品である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のＴｉｅ２活性化剤によると、従来における前記諸問題を解決し、優れたＴｉｅ２活性化作用を有し、安全性の高いＴｉｅ２活性化剤を提供することができる。
本発明の血流促進剤によると、従来における前記諸問題を解決し、優れた血流促進作用を有し、安全性の高い血流促進剤を提供することができる。
本発明の抗炎症剤によると、従来における前記諸問題を解決し、優れた抗炎症作用を有し、安全性の高い抗炎症剤を提供することができる。
本発明の抗酸化剤によると、従来における前記諸問題を解決し、優れた抗酸化作用を有し、安全性の高い抗酸化剤を提供することができる。
本発明の飲食品によると、従来における前記諸問題を解決し、優れたＴｉｅ２活性化作用、血流促進作用、抗炎症作用、及び抗酸化作用からなる群から選択される少なくとも１種を有し、安全性の高い飲食品を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（Ｔｉｅ２活性化剤、血流促進剤、抗炎症剤、及び抗酸化剤）
本発明のＴｉｅ２活性化剤、血流促進剤、抗炎症剤、及び抗酸化剤は、日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物、シニグリン、及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドからなる群から選択される少なくとも１種を含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
【００２１】
前記Ｔｉｅ２活性化剤は、Ｔｉｅ２をリン酸化することで、その活性体（リン酸化Ｔｉｅ２）に変換するＴｉｅ２活性化作用を有する。前記Ｔｉｅ２が活性化されると、細胞内チロシンキナーゼドメインの自己リン酸化を惹起し、血管内皮細胞と血管壁細胞との接着が誘導される。血管狭小化あるいは血管拡大化の抑制が原因となって生じる虚血性疾患においては、Ｔｉｅ２の活性化により、血管腔が拡大化される。また、Ｔｉｅ２の活性化により、血管内皮細胞の細胞死が抑制される。
【００２２】
前記血流促進剤は、一酸化窒素（ＮＯ）産生促進作用に基づく血流促進作用、及び血管内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）活性化作用の少なくともいずれかを有する。内皮細胞が産生する血管拡張作用物質であるＮＯは、ｅＮＯＳによって合成されることが知られている。ｅＮＯＳは、そのアミノ酸１，１７７番目のセリン残基（Ｓｅｒ１１７７）のリン酸化によって活性化され、ＮＯの産生が開始される。血管内皮における前記一酸化窒素の産生が促進されると、ｃＧＭＰ依存性タンパク質リン酸化酵素の活性化を介して血管平滑筋が弛緩されることにより、血管が拡張され、血流が促進される。また、ｅＮＯＳにより産生された一酸化窒素は、血液中の血小板に作用することにより、血小板の凝集を抑制するとともに、凝固した血液の血管壁への接着を阻害することができる。
【００２３】
前記抗炎症剤は、ＴＮＦ−α産生抑制作用に基づく抗炎症作用を有する。前記ＴＮＦ−αは、炎症の初発から終息までの過程において重要な役割を担っており、その持続的かつ過剰な産生は、皮膚を含めた組織の障害を引き起こし、炎症性の疾患、例えば、接触性皮膚炎、乾癬、尋常性天疱瘡、肌荒れを伴う各種皮膚疾患の原因となり、炎症の悪化を引き起こす。そのため、前記ＴＮＦ−αの産生を抑制することにより、上述する炎症を緩和できると考えられている。
【００２４】
前記抗酸化剤は、スーパーオキサイド消去作用、及びラジカル消去作用の少なくともいずれかを有する。
【００２５】
前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物、シニグリン、及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドからなる群から選択される少なくとも１種が、Ｔｉｅ２活性化作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生促進作用、血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化作用、ＴＮＦ−α産生抑制作用、スーパーオキサイド消去作用、及びラジカル消去作用の少なくともいずれかの優れた作用を有し、Ｔｉｅ２活性化剤、血流促進剤、抗炎症剤、及び抗酸化剤として有用であることは、従来は全く知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。
【００２６】
＜日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物＞
前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種は、アブラナ科の植物であり、広島県尾道市因島で栽培されている。
日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種は新品種であり、品種名「千齢三」（ちよみ、チヨミ）として、平成２９年６月２６日に種苗法に基づく品種登録の出願済である（品種登録出願の番号第３２２５６号）。また、日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種は、「シマフリル」（登録商標）で商標登録されている（商標登録第５２４２９８８号）。
日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種は、母親として「日本あざみ菜」と父親として「赤・青大葉高菜」とを交配して育成された植物である。
日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の葉は緑色で光沢が中、裂片が極多、葉肉の辛味が僅な生食向きの品種である。草姿は開であり、分げつ性及び茎の肥大性は無である。葉数は中、葉形は短楕円、葉長はかなり短く、葉緑の切れ込みは深裂、裂片の多少は極多、鋸歯の多少はやや多い。葉色は緑、葉面の着色は無く、葉面の毛じは無く、葉緑の波打ちは多く、葉柄・中助の形は半円形、幅は狭、葉柄の長さは短である。根の肥大性は無く、早晩性は早く、球根性は無く、葉肉の辛味は僅である。
日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種は、葉菜として栽培され、葉茎は油炒め、おひたし、漬物、天ぷら、サラダなどに利用されている。
【００２７】
前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、葉部、茎部等の全草、花部、根部、又はこれらの混合物などが挙げられる。これらの中でも、地上部が好ましい。
前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出部位の調製方法としては、各部位を乾燥させた後、そのまま又は粗砕機を用い粉砕して溶媒抽出に供することにより得ることができる。前記乾燥は、天日で行ってもよいし、通常使用されている乾燥機を用いて行ってもよい。
【００２８】
前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物は、植物の抽出に一般に用いられる方法により容易に得ることができる。前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抽出液の希釈液、濃縮液、抽出液の乾燥物などが挙げられる。
【００２９】
前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抽出溶媒を満たした処理槽に抽出原料である前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の前記抽出部位を投入し、必要に応じて適宜撹拌しながら可溶性成分を溶出した後、濾過して抽出残渣を除くことにより抽出液を得る方法などが挙げられる。
また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００３０】
前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出条件（抽出時間及び抽出温度）、及び前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出溶媒の及びその使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３１】
前記抽出溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、親水性溶媒、又はこれらの混合溶媒が挙げられる。前記水としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水などが挙げられる。
【００３２】
前記親水性溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられる。前記混合溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、低級アルコールを使用する場合は、水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１質量部〜４０質量部、多価アルコールを使用する場合は、水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部、添加することが好ましい。前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出溶媒は、室温乃至溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。これらの中でも、水（例えば、１０℃〜３０℃水）や、水とエタノールとの混合溶媒（例えば、４０質量％〜８０質量％エタノール水溶液）を用いて抽出することが、好ましい。
【００３３】
なお、得られた前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物は、前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物の希釈物、濃縮物、乾燥物、粗精製物、精製物などを得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製などの処理を施してもよい。
前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物の精製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液−液分配抽出、各種クロマトグラフィー、膜分離などの精製方法が挙げられる。
得られた前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物は、そのままでも前記Ｔｉｅ２活性化剤、前記血流促進剤、前記抗炎症剤、及び前記抗酸化剤のいずれかとして使用することができるが、利用しやすい点で、前記濃縮液、前記乾燥物が好ましい。前記乾燥物を得るに当たって、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリンなどのキャリアーを加えてもよい。
【００３４】
＜シニグリン、イソラムネチン３，７−ジグルコシド＞
前記シニグリン（ｓｉｎｉｇｒｉｎ）は、下記構造式（１）で表される化合物であり、前記イソラムネチン３，７−ジグルコシド（ｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ  ３，７−ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）は下記構造式（２）で表される化合物である。
【化１】
2019023180.tif 000002
【化２】
2019023180.tif 000003
【００３５】
前記シニグリン及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドは、日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種等の植物などの天然物から精製されたものであってもよいし、化学合成品であってもよい。
前記シニグリン及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドは、塩の態様であってもよいし、水などの溶媒との溶媒和物の態様であってもよい。
【００３６】
前記シニグリン及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドを植物などの天然物から製造する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、植物抽出物調製工程と、植物抽出物分画工程と、分画物精製工程とを含む方法などが挙げられる。
【００３７】
前記植物抽出物調製工程は、植物の抽出物を調製する工程であり、例えば、上記した日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物の調製と同様にして行うことができる。
【００３８】
前記植物抽出物分画工程は、前記植物抽出物から、前記シニグリン又はイソラムネチン３，７−ジグルコシドを含有するものを分画する工程である。
前記分画の方法としては、特に制限はなく、公知の技術を目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物をダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）に付して、シニグリンを含有する未吸着部、イソラムネチン３，７−ジグルコシドを含有する３０質量％メタノール溶出部などに分画する方法が挙げられる。
【００３９】
前記分画物精製工程は、前記分画物から、シニグリン及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドを精製する工程である。
前記精製の方法としては、特に制限はなく、公知の技術を目的に応じて適宜選択することができる。
例えば、前記未吸着部からシニグリンを精製する方法としては、例えば、前記未吸着部をＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー社製）を用いて精製（移動相  Ｈ２Ｏ→０．３Ｍ  Ｋ２ＳＯ４）する方法などが挙げられる。
また、前記３０質量％メタノール溶出部からイソラムネチン３，７−ジグルコシドを精製する方法としては、例えば、前記３０質量％メタノール溶出部をＣＨＲＯＭＡＴＯＲＥＸ−ＯＤＳ（富士シリシア化学社製）を用いて分画し（移動相  メタノール：水＝２：８→１０：０）、次いで、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０（日本分析工業社製）、移動相  メタノール）により精製する方法などが挙げられる。
【００４０】
前記シニグリン及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドが得られたことを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１Ｈ−ＮＭＲにより確認する方法などが挙げられる。
【００４１】
なお、シニグリンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（溶媒：Ｄ２Ｏ）は、以下に示す通りである。
５．８５（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１６．４，１０．４，５．８，５．６Ｈｚ，Ｈ−１７），５．１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．１，１．３Ｈｚ，Ｈ−１８），５．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．４，１．３Ｈｚ，Ｈ−１８），４．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，Ｈ−１），３．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．５，２．０Ｈｚ，Ｈ−６），３．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．５，５．８Ｈｚ，Ｈ−６），３．４０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），３．３９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３），３．３７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８），３．３５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８），３．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，４．９Ｈｚ，Ｈ−４），３．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，４．６Ｈｚ，Ｈ−２）．
【００４２】
また、イソラムネチン３，７−ジグルコシドの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（溶媒：ＭｅＯＤ）は、以下に示す通りである。
７．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−２’），７．５９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．９Ｈｚ，Ｈ−６’），６．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，Ｈ−５’），６．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−８），６．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−６），５．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ｈ−１’’），５．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−１’），３．９２（３Ｈ，ｓ，３’−ＯＭｅ），３．９０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６’’），３．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．９，２．１Ｈｚ，Ｈ−６’’’），３．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．０，５．７Ｈｚ，Ｈ−６’’），３．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．９，５．５Ｈｚ，Ｈ−６’’’），３．５２−３．４３（５Ｈ，ｍ，Ｈ−２’’，Ｈ−３’’，Ｈ−５’’，Ｈ−２’’’，Ｈ−３’’’），３．３９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．９，５．５Ｈｚ，Ｈ−４’’），３．３０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４’’’），３．２６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝９．３，５．５，２．１Ｈｚ，Ｈ−５’’’）．
【００４３】
前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物、シニグリン、及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００４４】
本発明のＴｉｅ２活性化剤、血流促進剤、抗炎症剤、又は抗酸化剤における前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物、シニグリン、及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドからなる群から選択される少なくとも１種の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記Ｔｉｅ２活性化剤、血流促進剤、抗炎症剤、及び抗酸化剤は、前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物、シニグリン、及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドからなる群から選択される少なくとも１種のみからなるものであってもよい。
【００４５】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、前記Ｔｉｅ２活性化剤、血流促進剤、抗炎症剤、及び抗酸化剤の利用形態に応じて適宜選択することができるが、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料、美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、皮膚栄養剤等が挙げられる。
前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４６】
＜用途＞
本発明のＴｉｅ２活性化剤、血流促進剤、抗炎症剤、及び抗酸化剤は、消化管で消化されるようなものではないことが確認されているので、飲食品として好適に用いることができ、その含有量、用法、及び剤型としては、その使用目的に応じて適宜選択することができる。
前記含有量としては、抽出物の生理活性等によって適宜調整することができるが、前記日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種の抽出物に換算した場合、０．０００１質量％〜２０質量％が好ましく、０．０００１質量％〜１０質量％がより好ましい。
【００４７】
前記用法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口、非経口、外用などの投与形態が挙げられる。
【００４８】
前記剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、及びシロップ剤等の経口投与剤、注射剤、点滴剤、及び坐剤等の非経口投与剤、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、及び浴用剤、頭髪化粧料等の外用剤などが挙げられる。
【００４９】
また、本発明のＴｉｅ２活性化剤、血流促進剤、抗炎症剤、及び抗酸化剤は、Ｔｉｅ２活性化作用、血流促進作用、抗炎症作用、又は抗酸化作用の作用機構に関する研究のための試薬としても用いることができる。
【００５０】
（飲食品）
前記飲食品は、本発明のＴｉｅ２活性化剤、血流促進剤、抗炎症剤、及び抗酸化剤からなる群から選択される少なくとも１種を含有する。
【００５１】
本発明の飲食品における前記Ｔｉｅ２活性化剤、血流促進剤、抗炎症剤、及び抗酸化剤からなる群から選択される少なくとも１種の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記飲食品は、前記Ｔｉｅ２活性化剤、血流促進剤、抗炎症剤、及び抗酸化剤からなる群から選択される少なくとも１種のみからなるものであってもよい。
【００５２】
前記飲食品としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、茶飲料、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、パン等の菓子類；カニ、サケ、アサリ、マグロ、イワシ、エビ、カツオ、サバ、クジラ、カキ、サンマ、イカ、アカガイ、ホタテ、アワビ、ウニ、イクラ、トコブシ等の水産物；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；カレー、シチュー、親子丼、お粥、雑炊、中華丼、かつ丼、天丼、うな丼、ハヤシライス、おでん、マーボドーフ、牛丼、ミートソース、玉子スープ、オムライス、餃子、シューマイ、ハンバーグ、ミートボール等のレトルトパウチ食品サラダ、漬物等の惣菜；種々の形態の健康・美容・栄養補助食品；錠剤、顆粒剤、カプセル剤、ドリンク剤、トローチ等の医薬品、医薬部外品などが挙げられる。なお、前記飲食品は上記例示に限定されるものではない。
【００５３】
本発明のＴｉｅ２活性化剤、血流促進剤、抗炎症剤、抗酸化剤、及び飲食品は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【００５４】
本発明の飲食品は、Ｔｉｅ２活性化用、血流促進用、抗炎症用、及び抗酸化用からなる群から選択される少なくとも１種の用途の飲食品として好適に用いることができる。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
以下の実施例においては、「日本あざみ菜と赤・青大葉高菜との交配種」を品種名である「チヨミ（千齢三）」と称する。
【００５６】
（製造例１）
−チヨミの地上部の熱水抽出物の製造−
チヨミの地上部の粗粉砕物１００ｇを水１，０００ｇに投入し、８５℃浴中で２時間、加熱抽出を行った。その後、ろ過し、得られたろ液を濃縮、乾燥して製造例１のチヨミの地上部の熱水抽出物を得た。なお、得られたチヨミの地上部の熱水抽出物の抽出率を表１に示す。
【００５７】
（製造例２）
−チヨミの地上部の５０質量％エタノール抽出物の製造−
チヨミの地上部の粗粉砕物１００ｇを５０質量％エタノール水溶液１，０００ｇに投入し、８５℃浴中で２時間、加熱抽出を行った。その後、ろ過し、得られたろ液を濃縮、乾燥して製造例２のチヨミの地上部の５０質量％エタノール抽出物を得た。なお、得られたチヨミの地上部の５０質量％エタノール抽出物の抽出率を表１に示す。
【００５８】
（製造例３）
−チヨミの地上部のエタノール抽出物の製造−
チヨミの地上部の粗粉砕物１００ｇをエタノール１，０００ｇに投入し、８５℃浴中で２時間、加熱抽出を行った。その後、ろ過し、得られたろ液を濃縮、乾燥して製造例３のチヨミの地上部のエタノール抽出物を得た。なお、得られたチヨミの地上部のエタノール抽出物の抽出率を表１に示す。
【００５９】
（製造例４）
−チヨミの根の５０質量％エタノール抽出物の製造−
チヨミの根の粗粉砕物１０ｇを５０質量％エタノール水溶液１００ｇに投入し、８５℃浴中で２時間、加熱抽出を行った。その後、ろ過し、得られたろ液を濃縮、乾燥して製造例４のチヨミの根の５０質量％エタノール抽出物を得た。なお、得られたチヨミの根の５０質量％エタノール抽出物の抽出率を表１に示す。
【００６０】
【表１】
2019023180.tif 000004
【００６１】
（製造例５）
−シニグリン及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドの製造−
製造例２で得られたチヨミの地上部の５０％質量エタノール抽出物３５ｇを蒸留水に溶解させ、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）で分画を行い、未吸着部（３１ｇ）、３０質量％メタノール溶出部（１．９ｇ）、メタノール回収部（１．９ｇ）を得た。
【００６２】
前記未吸着部（３１ｇ）を、ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー社製）を用いて精製し（移動相  Ｈ２Ｏ→０．３Ｍ  Ｋ２ＳＯ４）、精製物ａ（３５０ｍｇ）を単離した。
【００６３】
前記３０質量％メタノール溶出部（１．５ｇ）を、ＣＨＲＯＭＡＴＯＲＥＸ−ＯＤＳ（富士シリシア化学社製）を用いて分画し（移動相  メタノール：水＝２：８→１０：０）、フラクション１（６２０ｍｇ）、フラクション２（７００ｍｇ）、フラクション３（１１０ｍｇ）、フラクション４（１１０ｍｇ）を得た。
得られたフラクション３について分取ＨＰＬＣ（カラム：ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０（日本分析工業社製）、移動相  メタノール）により精製し、精製物ｂ（５６ｍｇ）を単離した。
【００６４】
上述のようにして得られた精製物ａ及びｂを１Ｈ−ＮＭＲにより分析した結果を以下に示す。
【００６５】
＜精製物ａ＞
溶媒：Ｄ２Ｏ
１Ｈ−ＮＭＲ：
５．８５（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１６．４，１０．４，５．８，５．６Ｈｚ，Ｈ−１７），５．１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．１，１．３Ｈｚ，Ｈ−１８），５．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．４，１．３Ｈｚ，Ｈ−１８），４．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，Ｈ−１），３．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．５，２．０Ｈｚ，Ｈ−６），３．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．５，５．８Ｈｚ，Ｈ−６），３．４０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），３．３９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３），３．３７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８），３．３５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８），３．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，４．９Ｈｚ，Ｈ−４），３．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，４．６Ｈｚ，Ｈ−２）．
【００６６】
＜精製物ｂ＞
溶媒：ＭｅＯＤ
１Ｈ−ＮＭＲ：
７．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−２’），７．５９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．９Ｈｚ，Ｈ−６’），６．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，Ｈ−５’），６．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−８），６．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−６），５．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ｈ−１’’），５．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−１’），３．９２（３Ｈ，ｓ，３’−ＯＭｅ），３．９０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６’’），３．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．９，２．１Ｈｚ，Ｈ−６’’’），３．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．０，５．７Ｈｚ，Ｈ−６’’），３．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．９，５．５Ｈｚ，Ｈ−６’’’），３．５２−３．４３（５Ｈ，ｍ，Ｈ−２’’，Ｈ−３’’，Ｈ−５’’，Ｈ−２’’’，Ｈ−３’’’），３．３９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．９，５．５Ｈｚ，Ｈ−４’’），３．３０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４’’’），３．２６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝９．３，５．５，２．１Ｈｚ，Ｈ−５’’’）．
【００６７】
以上の結果から、得られた精製物ａが下記構造式（１）で表されるシニグリンであり、精製物ｂが下記構造式（２）で表されるイソラムネチン３，７−ジグルコシドであることが確認された。
【００６８】
【化３】
2019023180.tif 000005
【００６９】
【化４】
2019023180.tif 000006
【００７０】
（実施例１−１）
−Ｔｉｅ２活性化作用試験−
製造例２〜４で得られた各チヨミの抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法によりＴｉｅ２活性化作用を試験した。
【００７１】
コンフルエントまで培養した正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：ＨＵＶＥＣ）を、９６ウェルプレートへ１．０×１０４細胞／０．１ｍＬ／ウェルとなるように播種し、低血清血管内皮細胞増殖用培地（倉敷紡績株式会社製、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＧ２）を用いて一晩培養した。培養後、細胞刺激（被験試料添加）の３時間前に、上記培地を０．１ｍＬの血管内皮細胞基礎培地（倉敷紡績株式会社製、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＢ２）に置換し、再度培養を行った。その後、前記ウェル内に、前記Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＢ２で溶解した被験試料溶液を０．１ｍＬ添加して１５分間のインキュベーションを行った。インキュベーション後、イムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｉｅ２（Ｙ９９２）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を用いてプロトコールに従い、細胞内のリン酸化型Ｔｉｅ２量を評価した。
また、陰性コントロールとして被験試料の溶解に用いたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）についても、同様にリン酸化型Ｔｉｅ２量を測定し、下記数式１−１によりＴｉｅ２活性化率を算出した。結果を表２−１に示す。
＜数式１−１＞
Ｔｉｅ２活性化率（％）＝
［｛（被験試料添加時のリン酸化型Ｔｉｅ２の測定値）／（被験試料添加時の総Ｔｉｅ２の測定値）｝／｛（陰性コントロールでのリン酸化型Ｔｉｅ２の測定値）／（陰性コントロールでの総Ｔｉｅ２の測定値）｝］×１００
【００７２】
【表２−１】
2019023180.tif 000007
【００７３】
（実施例１−２）
−Ｔｉｅ２活性化作用試験−
製造例２で得られたチヨミの抽出物、前記製造例５で得られたシニグリンの水和物及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドを被験試料として用い、下記の試験方法によりＴｉｅ２活性化作用を試験した。
【００７４】
コンフルエントまで培養した正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、９６ウェルプレートへ２．０×１０４細胞／０．１ｍＬ／ウェルとなるように播種し、低血清血管内皮細胞増殖用培地（倉敷紡績株式会社製、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＧ２）を用いて一晩培養した。培養後、細胞刺激（被験試料添加）の３時間前に、上記培地を０．１ｍＬの血管内皮細胞基礎培地（倉敷紡績株式会社製、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＢ２）に置換し、再度培養を行った。その後、前記ウェル内に、前記Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＢ２で溶解した被験試料溶液を０．１ｍＬ添加して１０分間のインキュベーションを行った。インキュベーション後、イムノアッセイキット（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製、ＲａｙＢｉｏ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  ＴＩＥ−２  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ）を用いてプロトコールに従い、細胞内のリン酸化型Ｔｉｅ２量を評価した。
また、陰性コントロールとして被験試料の溶解に用いたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）についても、同様にリン酸化型Ｔｉｅ２量を測定し、下記数式１−２によりＴｉｅ２活性化率を算出した。結果を表２−２〜３に示す。
＜数式１−２＞
Ｔｉｅ２活性化率（％）＝
｛（被験試料添加時のリン酸化型Ｔｉｅ２の測定値）／（陰性コントロールでのリン酸化型Ｔｉｅ２の測定値）｝×１００
【００７５】
【表２−２】
2019023180.tif 000008
【００７６】
【表２−３】
2019023180.tif 000009
【００７７】
表２−１〜３の結果から、チヨミの抽出物、シニグリン及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドがＴｉｅ２活性化作用を有することが認められた。
【００７８】
（実施例２−１）
−内皮細胞由来一酸化窒素（ＮＯ）を指標とした血流促進作用試験−
製造例１〜４で得られた各チヨミの抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法により一酸化窒素（ＮＯ）産生促進作用を試験した。
【００７９】
ヒト正常臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ヒト正常血管内皮細胞増殖培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞をアルギニン（ＮＯの基質）及びフェノールレッドフリーのＨｕＭｅｄｉａ−ＭｖＧ（特別培地）を用いて２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈した後、９６ウェルプレートに０．１ｍＬ播種し一晩培養した。培養終了後、特別培地の溶解した被験試料溶液を０．１ｍＬ添加し、更に４８時間培養した。培養終了後、２００μＬのＰＢＳ（−）にて洗浄した後、５ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン及び０．１μｍｏｌ／ＬのＤｉａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−２（積水メディカル株式会社製）を含む特別培地を０．１ｍＬ添加し、３０分間後に励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５１５ｎｍにおける蛍光強度を測定した。そして、下記数式２−１によりＮＯ産生促進率を測定した。結果を表３−１に示す。
＜数式２−１＞
ＮＯ産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
ただし、前記数式２−１中、Ａは被験試料処理の蛍光強度、及びＢは被験試料無処理の蛍光強度をそれぞれ表す。
【００８０】
【表３−１】
2019023180.tif 000010
【００８１】
（実施例２−２）
−内皮細胞由来一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）のリン酸化を指標とした血流促進作用試験−
製造例２で得られたチヨミの抽出物、前記製造例５で得られたシニグリンの水和物及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドを被験試料として用い、下記の試験方法によりｅＮＯＳ活性化作用を試験した。
【００８２】
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、低血清血管内皮細胞増殖用培地（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＧ２）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞をＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２を用いて２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈した後、コラーゲンコートした９６ウェルプレートに１００μＬ播種し一晩培養した。培養終了後、血管内皮細胞基礎培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ２）に溶解した被験試料１００μＬに交換し、１０分間のインキュベーションを行った。インキュベーション後、ＲａｙＢｉｏ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳ（Ｓ１１７７）  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてプロトコールに従い、細胞内のリン酸化型ｅＮＯＳ量を評価した。
また、陰性コントロールとして被験試料の溶解に用いたジメチルスルホキシドについても、同様にリン酸化型ｅＮＯＳ量を測定し、下記数式２−２によりｅＮＯＳ活性化率を算出した。結果を表３−２〜３に示す。
＜数式２−２＞
ｅＮＯＳ活性化率（％）＝
｛（被験試料添加時のリン酸化型ｅＮＯＳの測定値）／（陰性コントロールでのリン酸化型ｅＮＯＳの測定値）｝×１００
【００８３】
【表３−２】
2019023180.tif 000011
【００８４】
【表３−３】
2019023180.tif 000012
【００８５】
表３−１〜３の結果から、チヨミの抽出物、シニグリン及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドが、一酸化窒素（ＮＯ）産生促進作用又はｅＮＯＳ活性化作用を有し、血流促進作用を有することが認められた。
【００８６】
（実施例３）
−腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）産生抑制作用試験−
前記製造例１〜４で得られた各チヨミの抽出物、前記製造例５で得られたシニグリンの水和物及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドを被験試料として用い、下記の試験方法により腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）産生抑制作用を試験した。
【００８７】
マウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を１０質量％のＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ（日水製薬株式会社製）を用いて培養した後、セルスクレーパーにより細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるように１０質量％のＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭで希釈した後、９６ウェルマイクロプレートに１ウェル当たり１００μＬずつ播種し、４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、終濃度０．５質量％のＤＭＳＯを含む１０質量％のＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭで溶解した被験試料溶液を各ウェルに１００μＬ添加し、終濃度１μｇ／ｍＬで１０質量％のＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解したリポポリサッカライド（ＬＰＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ０１１１；Ｂ４、ＤＩＦＣＯ社製）を１００μＬ加え、２４時間培養した。培養終了後、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて、下記数式３により、培養上清中のＴＮＦ−α量を測定した。結果を表４−１〜２に示す。
＜数式３＞
ＴＮＦ−α産生抑制率（％）＝{（Ｂ−Ａ）／Ｂ}×１００
ただし、前記数式３中、Ａは被験試料溶液添加時のＴＮＦ−α量、及びＢは被験試料溶液無添加時のＴＮＦ−α量をそれぞれ表す。
【００８８】
【表４−１】
2019023180.tif 000013
【００８９】
【表４−２】
2019023180.tif 000014
【００９０】
表４−１〜２の結果から、チヨミの抽出物、シニグリン及びイソラムネチン３，７−ジグルコシドがＴＮＦ−α産生抑制作用を有し、抗炎症作用を有することが認められた。
【００９１】
（実施例４）
−スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用試験−
前記製造例１〜４で得られた各チヨミの抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法によりＳＯＤ様作用を試験した。
【００９２】
３ｍｍｏｌ／Ｌのキサンチン（ナカライテスク株式会社製）０．１ｍＬ、３ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ  ０．１ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン０．１ｍＬ、０．７５ｍｍｏｌ／Ｌのニトロブルーテトラゾリウム（東京化成工業株式会社製）０．１ｍＬ、及び０．０５ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ１０．２）２．４ｍＬを試験管にとり、これに各試料溶液０．１ｍＬを添加し、２５℃で１０分間放置した。次いで、キサンチンオキシダーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）溶液０．１ｍＬを加えて素早く攪拌し、２５℃で２０分間静置した。その後、６ｍｍｏｌ／Ｌの塩化銅０．１ｍＬを加えて反応を停止させ、波長５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
そして、測定結果から、下記数式４によりスーパーオキサイド消去率を求めた。
＜数式４＞
スーパーオキサイド消去率（％）＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００
ただし、前記数式４中、Ａは被験試料溶液の波長５６０ｎｍにおける吸光度、Ｂは被験試料溶液ブランクの波長５６０ｎｍにおける吸光度、Ｃはコントロール溶液の波長５６０ｎｍにおける吸光度、Ｄはコントロール溶液ブランクの波長５６０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ表す。
【００９３】
【表５】
2019023180.tif 000015
表５の結果から、本発明の有効成分の一例であるチヨミの抽出物が、スーパーオキサイド消去作用を有することが認められた。
【００９４】
（実施例５）
−ＤＰＰＨに対するラジカル消去作用試験−
前記製造例１〜４で得られた各チヨミの抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法により非常に安定なラジカルである１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ  ｒａｄｉｃａｌ（ＤＰＰＨ）を使用してラジカル消去作用を試験した。
【００９５】
１．５×１０−４ｍｏｌ／ＬのＤＰＰＨエタノール溶液３ｍＬに各被験試料溶液３ｍＬを加え、容器を密栓して振り混ぜ、３０分間静置した後、波長５２０ｎｍの吸光度を測定した。
そして、測定結果から、下記数式５によりＤＰＰＨ消去率（％）を算出した。
＜数式５＞
ＤＰＰＨ消去率（％）＝｛Ａ−（Ｂ−Ｃ）｝／Ａ×１００
ただし、前記数式５中、Ａはコントロール溶液の波長５２０ｎｍにおける吸光度、Ｂは被験試料溶液の波長５２０ｎｍにおける吸光度、Ｃは被験試料溶液ブランクの波長５２０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ表す。
【００９６】
【表６】
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表６の結果から、本発明の有効成分の一例であるチヨミの抽出物が、ＤＰＰＨラジカル消去作用を有することが認められた。
【００９７】
実施例４及び５の結果から、本発明の有効成分の一例であるチヨミの抽出物は、スーパーオキサイド消去作用、及びラジカル消去作用の少なくともいずれかを有することが確認され、本発明の有効成分の一例であるチヨミの抽出物が、抗酸化剤の有効成分として、好適に利用可能であることがわかった。
【００９８】
（配合例１）
下記組成の錠剤を常法により製造した。
・  チヨミの地上部の５０質量％エタノール抽出物（製造例２）      ５．０ｍｇ
・  ドロマイト（カルシウム２０％、マグネシウム１０％含有）    ８３．４ｍｇ
・  カゼインホスホペプチド                                    １６．７ｍｇ
・  ビタミンＣ                                                ３３．４ｍｇ
・  マルチトール                                            １３６．８ｍｇ
・  コラーゲン                                                １２．７ｍｇ
・  ショ糖脂肪酸エステル                                      １２．０ｍｇ