(57)【要約】      （修正有）【課題】反応特異性の高い抗デヒドロエピアンドロステロンサルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）抗体の提供。【解決手段】デヒドロエピアンドロステロンサルフェート類似化合物との交叉反応性が２０％以下であることを特徴とする抗デヒドロエピアンドロステロンサルフェート抗体であって、デヒドロエピアンドロステロンサフェートを抗原としてＩＣＲ系統のマウスへ免疫することにより抗ＤＨＨＥＡ−Ｓ抗体を取得する。【選択図】図２
2019064925.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デヒドロエピアンドロステロンサルフェート類似化合物との交叉反応性が２０％以下であることを特徴とする抗デヒドロエピアンドロステロンサルフェート抗体。
【請求項２】
デヒドロエピアンドロステロンサルフェート類似化合物がアンドロステロンサルフェート、デヒドロエピアンドロステロンサルフェートグルクロナイド、デヒドロエピアンドロステロンのいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
デヒドロエピアンドロステロンサルフェートを抗原としてＩＣＲ系統のマウスへ免疫することを特徴とする請求項１又は２に記載の抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗デヒドロエピアンドロステロンサルフェート抗体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
デヒドロエピアンドロステロンサルフェート（ＤＨＥＡ−Ｓ）は主に副腎皮質から分泌されるステロイドホルモンの一種として知られている。このホルモンは、副腎皮質に疾患があると異常な血中濃度を示すことが分かっている。そのためＤＨＥＡ―Ｓは、各種副腎皮質疾患の診断マーカーとして広く利用されている。
【０００３】
ＤＨＥＡ−Ｓの血中濃度測定では通常、抗ＤＨＥＡ−Ｓ抗体を用いた競合法が利用されている。この方法ではまず、固相化された抗ＤＨＥＡ−Ｓ抗体をアルカリホスファターゼなどの酵素で標識されたＤＨＥＡ−Ｓ（以下、標識ＤＨＥＡ−Ｓ）と検体との混合物に加え反応させる。その後、これを洗浄し、固相に結合している標識ＤＨＥＡ−Ｓから出るシグナルを測定する。検体中のＤＨＥＡ−Ｓ濃度が低い時には多くの標識ＤＨＥＡ−Ｓが固相に結合して強いシグナルとなるが、血中ＤＨＥＡ−Ｓ濃度が高くなると固相に結合する標識ＤＨＥＡ−Ｓが減り、弱いシグナルとなる。このシグナル変化の割合を調べることにより、血中のＤＨＥＡ−Ｓ濃度を求めることができる（図１参照）。
【０００４】
血中には、ＤＨＥＡ−Ｓと類似の構造をもつ化合物が多数存在しているため、これらの化合物が抗ＤＨＥＡ−Ｓ抗体へ誤って結合（交叉反応）することがあり、正確な血中濃度を測定できなくなってしまうことがある。そのため、ＤＨＥＡ−Ｓ測定系の構築では、この交叉反応の起こりにくい高性能な抗体が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、反応特異性の高い抗ＤＨＥＡ−Ｓ抗体を取得することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下のとおりである。
（１）デヒドロエピアンドロステロンサルフェート類似化合物との交叉反応性が２０％以下であることを特徴とする抗デヒドロエピアンドロステロンサルフェート抗体。
（２）デヒドロエピアンドロステロンサルフェート類似化合物がアンドロステロンサルフェート、デヒドロエピアンドロステロンサルフェートグルクロナイド、デヒドロエピアンドロステロンのいずれかであることを特徴とする（１）に記載の抗体。
（３）デヒドロエピアンドロステロンサルフェートを抗原としてＩＣＲ系統のマウスへ免疫することを特徴とする（１）又は（２）に記載の抗体の製造方法。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明は反応特異性の高い抗デヒドロエピアンドロステロンサルフェート抗体（抗ＤＨＥＡ−Ｓ抗体）に関するものであり、具体的には、ＤＨＥＡ−Ｓ類似化合物との交叉反応性が２０％以下であることを特徴とする。ＤＨＥＡ−Ｓ類似化合物としては、アンドロステロンサルフェート（Ａｎｄ−Ｓ）やデヒドロエピアンドロステロンサルフェートグルクロナイド（ＤＨＥＡ−Ｇ）、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）が挙げられる。
【０００９】
【化１】
2019064925.tif 000003
【００１０】
次に、本発明の抗体を製造する方法について説明する。
【００１１】
本発明の抗体を製造するには、ＤＨＥＡ−Ｓを抗原としてＩＣＲ系統のマウスへ免疫する。抗原として使用されるＤＨＥＡ−Ｓはそれ単独で用いてもよいし、抗原性のあるキャリアタンパク質へ結合させた形で用いてもよい。キャリアタンパク質として使用されるタンパク質は抗原性さえあれば特にその種類が限定されるものではないが、アルブミンやブルーキャリアプロテイン（ＢＣＰ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、アビジンなどを用いることができる。また、キャリアタンパク質との結合のためにＤＨＥＡ−Ｓへ導入されるリンカーに関しては特に限定されるものではないが、Ｎ−ヒドロキシエステルやイミドエステル、マレイミド、ピリジルジスルフィド、ヒドラジド、アルコキシアミンなどを用いることができる。また、これら以外のものでもキャリアタンパク質との反応性があれば特にその種類が限定されるわけではなく、ビオチンなどを用いることもできる。
【００１２】
免疫によって得られる抗体はＤＨＥＡ−Ｓとの反応性を有していれば特にその種類やサブクラスが限定されるわけではなく、ＩｇＧ１やＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、一本鎖抗体などを取得することができる。また、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体でもよく、これらの抗体の混合物であっても構わない。
【００１３】
このような免疫抗原を用いてＩＣＲへ免疫した後、生成した抗ＤＨＥＡ−Ｓ抗体を回収することにより、反応特異性の高い抗体を得ることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、反応特異性の高い抗ＤＨＥＡ−Ｓ抗体を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】競合法によるＤＨＥＡ−Ｓ測定の原理図である。
【図２】ＤＨＥＡ−Ｓ類似化合物との交叉反応性を、各種マウスから得られた抗血清で比較した結果を示したものある。
【実施例】
【００１６】
以下、実施例によって本発明を具体的に示すが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００１７】
（１）免疫抗原の調製
ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡ）を１００ｍｇ量り取り、１０ｍｌの５０ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）へ溶かした。次にリンカーが導入されているＤＨＥＡ−Ｓを１４ｍｇ量り取り、２００μｌのジメチルホルムアミドヘ溶かした。その後、このＤＨＥＡ−Ｓ溶液をＢＳＡ溶液へ加え、室温で３０分反応させた。そして、この反応液を透析チューブの中へ入れてからＰＢＳ溶液に対して透析し、未反応のＤＨＥＡ−Ｓを除去した。透析後は透析チューブの中からＤＨＥＡ−Ｓで標識されたＢＳＡを回収し、免疫用の抗原として利用した。
【００１８】
（２）実験動物への免疫
免疫動物として３系統（ＢＡＬＢ／ｃ、Ａ／Ｊ、ＩＣＲ）のマウス（雌、４週齢）を７匹ずつ用意した。次に１ｍｇ／ｍｌの抗原溶液とフロイントコンプリートアジュバンドの１：１混合溶液を調製した。そして、この混合液を氷上で超音波にかけ、乳化させた。その後、この溶液を用意してあるマウスの腹腔へ１００μｌずつ注入し、免疫した。
初回の免疫を行った１週間後、下記の通り再度免疫を行った。まず、１ｍｇ／ｍｌの抗原溶液とフロイントインコンプリートアジュバンドの１：１混合溶液を調製した。そして、この混合液を氷上で超音波にかけ、乳化させた。その後、この溶液を用意してあるマウスの皮下へ１００μｌずつ注入し、免疫した。２回目の免疫以降は、フロイントインコンプリートアジュバンドを用いたこの免疫作業を１週間おきに３か月間繰り返し行った。
【００１９】
（３）抗血清の性能評価
３か月間の免疫後、免疫したマウスからそれぞれ少量採血した。そして、この血液から抗血清を調製し、ＤＨＥＡ−Ｓと類似の構造をもつ化合物との交叉反応性をそれぞれ以下の通り評価した。
まず、調整した全ての抗血清についてそれぞれ以下の手順で検量線を作成した。初めに、アルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰ）を標識したＤＨＥＡ−Ｓ（以下、ＣＪ）を抗マウスＩｇＧ抗体固定化粒子へ一定量加えて混ぜた。次に、ＤＨＥＡ−Ｓ濃度が既知であるキャリブレーター溶液（Ｃａｌ１〜６）を用意し、ここにそれぞれ一定量加えた。更に前述の抗血清の希釈液をここに一定量加え、１０分間インキュベーションした。その後、Ｂ／Ｆ分離を行なってからＡＬＰの基質を加え、固相に結合しているＣＪから発せられるシグナルを検出した。そして、ＤＨＥＡ−Ｓが全く含まれないキャリブレーター溶液（Ｃａｌ１）を加えた時のシグナル（Ｂ０）を１００％として、各キャリブレーター溶液（Ｃａｌ２〜６）を加えた時のシグナル（Ｂ）をそれぞれ相対的な値［（Ｂ／Ｂ０）×１００］として算出した。ＤＨＥＡ−Ｓ濃度を横軸（対数）、Ｂ／Ｂ０（％）を縦軸にとり、各キャリブレーター溶液使用時の測定結果をプロットして検量線を作成した。なお、この一連の操作は、東ソー社製ＡＩＡ−６００ＩＩを用いて３７℃にて全自動で行った。
【００２０】
検量線作成後、Ｃａｌ１に１μｇ／ｍｌとなるようＤＨＥＡ−Ｓ類似化合物（Ａｎｄ−Ｓ、ＤＨＥＡ−Ｇ、ＤＨＥＡ）を加えた溶液（ＣａｌＸ、ＣａｌＹ、ＣａｌＺとする）をそれぞれ作製した。そして、これらの溶液をそれぞれＣＪと一緒に抗マウスＩｇＧ抗体固定化粒子へ一定量加え、混ぜた。更に前述の抗血清の希釈液をここに一定量加え、１０分間インキュベーションした。その後Ｂ／Ｆ分離を行なってからＡＬＰの基質を加え、固相に結合しているＣＪから発せられるシグナルを検出した。そして、Ｃａｌ１を加えた時のシグナル（Ｂ０）を１００％として、ＣａｌＸ、ＣａｌＹ、ＣａｌＺを加えた時のシグナル（Ｃｒｏｓｓ  Ｂ）を相対的な値［（Ｃｒｏｓｓ  Ｂ／Ｂ０）×１００］として算出した。この値を先程作成した検量線上にそれぞれプロットし、各抗血清を使用した時にＤＨＥＡ−Ｓとして誤って検出される濃度を求めた。そして、ＤＨＥＡ−Ｓとして誤って検出されるＤＨＥＡ−Ｓ類似化合物量の割合（交叉反応率）を計算した。なお、この一連の操作は、東ソー社製ＡＩＡ−６００ＩＩを用いて３７℃にて全自動で行なった。
【００２１】
各種マウスから得られた抗血清を用い、上記の方法でＤＨＥＡ−Ｓ類似化合物（Ａｎｄ−Ｓ、ＤＨＥＡ−Ｇ、ＤＨＥＡ）との交叉反応率（７匹のマウスの平均値）を求めて比較した。実験の結果、ＩＣＲを免疫動物とすると、他の系統を用いた時と比較して、ＤＨＥＡ−Ｓ類似化合物との交叉反応性の低い抗体が得られると分かった（図２参照）。以上の結果から、ＩＣＲを免疫動物として利用することにより、反応特異性の高い抗ＤＨＥＡ−Ｓ抗体を取得できることが明らかとなった。
【図１】
2019064925.tif 000004
【図２】
2019064925.tif 000005