(57)【要約】【課題】ウイルス突然変異の影響を受けにくい、インフルエンザウイルスの感染を効果的に予防するためのワクチンとして有用なポリペプチド結合リポソームの提供を目的とする。【解決手段】リポソームの表面にポリペプチドが結合しており、前記ポリペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、５８〜６６番目のアミノ酸残基以外の領域に変異を有するアミノ酸配列、または、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち３〜１１番目および５１〜６８番目のアミノ酸残基以外の領域、もしくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち３〜１１番目および２７〜７２番目のアミノ酸残基以外の領域以外に変異を有するアミノ酸配列、を含むことを特徴とする、ポリペプチド結合リポソーム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームの表面にポリペプチドが結合しており、
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、５８〜６６番目のアミノ酸残基以外の領域において１〜２０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、５８〜６６番目のアミノ酸残基以外の領域中のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失しており、かつ当該アミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、３〜１１番目および５１〜６８番目のアミノ酸残基以外の領域において１〜２０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、３〜１１番目および５１〜６８番目のアミノ酸残基以外の領域中のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失しており、かつ当該アミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、３〜１１番目および２７〜７２番目のアミノ酸残基以外の領域において１〜２０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、または
（ｇ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、３〜１１番目および２７〜７２番目のアミノ酸残基以外の領域中のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失しており、かつ当該アミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
を含むことを特徴とする、ポリペプチド結合リポソーム。
【請求項２】
前記リポソームが、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基または不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質を含む、請求項１に記載のポリペプチド結合リポソーム。
【請求項３】
前記リン脂質が、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル−ジアシルホスファチジルエタノールアミン、およびマレイミド−ジアシルホスファチジルエタノールアミンからなる群より選択される１種以上である、請求項２に記載のポリペプチド結合リポソーム。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド結合リポソームを有効成分とする医薬組成物。
【請求項５】
インフルエンザワクチンとして用いられる、請求項４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザワクチンとして有用な、細胞性免疫を誘導し得るポリペプチド結合リポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは非常に感染力が強く、また、高齢者および乳幼児等のハイリスク群が感染した場合には、肺炎等への重症化の危険性が高い。そこで、感染予防のために、インフルエンザワクチンの接種が広く行われている。
【０００３】
従来のワクチンでは、インフルエンザウイルスの表面蛋白質をワクチン抗原として用いることで、それに特異的に結合する抗体の産生を誘導し、該抗体の作用によってウイルスの感染能力を失わせる。しかし、インフルエンザウイルスの表面蛋白質は変異しやすいことが知られている。このため、接種したワクチンとは異なる亜型のインフルエンザウイルスに感染した場合には、インフルエンザの発症は防止できない課題がある。
【０００４】
インフルエンザウイルスを構成する蛋白質のうち、変異が生じ難いウイルスエンベロープ内部蛋白質をワクチン抗原とすることにより、ウイルス亜型によく見られる突然変異の影響を受けにくい汎用性ワクチンとなることが期待できる。たとえば、特許文献１には、高病原性鳥インフルエンザウイルスの、保存性の高い内部蛋白質のうち、ＰＡ、ＰＢ１、およびＰＢ２のアミノ酸配列中に、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋Ｔ細胞、サイトトキシックリンホサイト：ＣＴＬ）の標的となるエピトープ（ＣＴＬエピトープ）があること、および該エピトープを含む９〜１１アミノ酸からなるペプチドが結合したリポソームが、細胞性免疫を誘導するインフルエンザワクチンとなることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−１２６８５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明では、ウイルス突然変異の影響を受けにくく、広いＨＬＡ型に対して有効であり、かつアジュバントと併用しなくても充分効果を発揮しうる、インフルエンザウイルスの感染を効果的に予防するためのワクチンとして有用なポリペプチド結合リポソームを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、インフルエンザウイルスの内部蛋白質であるマトリックス蛋白質１（matrix protein M1；以下、「Ｍ１」と記載する。）の、Ｎ末端からＣＴＬエピトープ領域（５８〜６６番目のアミノ酸残基からなる領域）を含む部分蛋白質を表面に結合させたリポソームが、ＣＴＬを誘導し、インフルエンザウイルスワクチンとして有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下［１］〜［５］を提供する。
［１］  リポソームの表面にポリペプチドが結合しており、
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、５８〜６６番目のアミノ酸残基以外の領域において１〜２０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、５８〜６６番目のアミノ酸残基以外の領域中のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失しており、かつ当該アミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、３〜１１番目および５１〜６８番目のアミノ酸残基以外の領域において１〜２０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、３〜１１番目および５１〜６８番目のアミノ酸残基以外の領域中のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失しており、かつ当該アミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、３〜１１番目および２７〜７２番目のアミノ酸残基以外の領域において１〜２０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列、または
（ｇ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、３〜１１番目および２７〜７２番目のアミノ酸残基以外の領域中のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失しており、かつ当該アミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
を含むことを特徴とする、ポリペプチド結合リポソーム。
［２］  前記リポソームが、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基または不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質を含む、前記［１］のポリペプチド結合リポソーム。
［３］  前記リン脂質が、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル−ジアシルホスファチジルエタノールアミン、およびマレイミド−ジアシルホスファチジルエタノールアミンからなる群より選択される１種以上である、前記［２］のポリペプチド結合リポソーム。
［４］  前記［１］〜［３］のいずれかのポリペプチド結合リポソームを有効成分とする医薬組成物。
［５］  インフルエンザワクチンとして用いられる、前記［４］の医薬組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のポリペプチド結合リポソームを用いることにより、ウイルス表面蛋白質変異の影響を受けにくく、流行ウイルス株（型・亜型）の正確な予測を要しない、汎用性の高いインフルエンザワクチンを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、Ｍ１の全長アミノ酸配列（配列番号２）と、該配列中のＣＴＬエピトープ領域（四角で囲った領域）およびエピトープ予測領域（下線を付した領域）を示した図である。
【図２】図２は、実施例１において大腸菌で発現させたＭ１Ｈ６（Ｍ１の全長蛋白質に、Ｈｉｓタグと２個のアミノ酸置換変異を導入した）の３つの断片蛋白質（Ｆｒ．１〜３）の領域を示した図である。
【図３】図３は、実施例１において、各リポソームで免疫したマウスについて、インビボ細胞障害性アッセイを行い、各リポソームのＣＴＬ誘導活性を調べた結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のポリペプチド結合リポソームは、リポソームの表面に、インフルエンザウイルスの内部蛋白質のＭ１のＣＴＬエピトープ領域を含む部分蛋白質が結合したものである。表面にＭ１のＣＴＬエピトープ領域を含むため、該ポリペプチド結合リポソームは、動物に投与されると、ＣＴＬを誘導し、細胞性免疫が活性化する。したがって、該ポリペプチド結合リポソームは、ＣＴＬ活性化剤またはインフルエンザワクチンの有効成分として有用である。特に、Ｍ１のＣＴＬエピトープは、ＨＬＡ−Ａ２に対応するＣＴＬが認識するエピトープであるため、該ポリペプチド結合リポソームは、ＨＬＡ−Ａ２を有するヒトに対し、自然免疫を誘導し得る。
【００１２】
図１に、Ａ型インフルエンザウイルスの典型的な亜種である「Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／ＣＬ０１／２００４（Ｈ５Ｎ１）」のＭ１の全長アミノ酸配列（配列番号２）と、ＣＴＬエピトープ領域（実際にＣＴＬエピトープであることが確認された領域）、および公知のエピトープ領域検索エンジンにより、エピトープ領域と予測される領域（エピトープ予測領域）を示す。図中、下線を付した領域が、エピトープ予測領域であり、四角で囲った領域（５８〜６６番目の領域）がＣＴＬエピトープ領域である。エピトープ予測領域は、インターネット上に一般公開されているＣＴＬエピトープ検索エンジンのうち、ＢＩＭＡＳ、ＩＥＤＢ、ＰｒｏＰｒｅｄ、およびＮｅｔＣＴＬに、それぞれＭ１の全長アミノ酸配列情報を入力し、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１、およびＨＬＡ−Ａ２６のそれぞれに対応するＣＴＬエピトープとして、Ｓｃｏｒｅの高い９−ｍｅｒペプチド（＝ＭＨＣ ｃｌａｓｓ−Ｉとの親和性が高いもの）を上位から順に選択して決定した。図中、左端に「Ａ２」、「Ａ２４」と記載されているアミノ酸配列中の下線を付した領域が、それぞれＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ２４に対応するＣＴＬエピトープとして予測された領域であり、左端に「Ａ３１，Ａ１１，Ａ２６」と記載されているアミノ酸配列中の下線を付した領域が、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１、およびＨＬＡ−Ａ２６に対応するＣＴＬエピトープとして予測された領域である。図中の最上段のアミノ酸配列（図中、「Ｍｅｒｇｅｄ」）中の下線を付した領域が、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１、およびＨＬＡ−Ａ２６の少なくともいずれかに対応するＣＴＬエピトープとして予測された領域である。エピトープ予測領域のうち、ＣＴＬエピトープ以外の領域は、ヘルパーＴ細胞の標的となるエピトープ領域（ヘルパーエピトープ領域）である可能性がある。
【００１３】
具体的には、本発明のポリペプチド結合リポソームのリポソーム表面に結合しているポリペプチド（以下、単に「本発明のポリペプチド」ということがある。）は、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列を含む。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、５８〜６６番目のアミノ酸残基以外の領域において１〜２０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列。
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、５８〜６６番目のアミノ酸残基以外の領域中のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失しており、かつ当該アミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
（ｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、３〜１１番目および５１〜６８番目のアミノ酸残基以外の領域において１〜２０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列。
（ｅ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、３〜１１番目および５１〜６８番目のアミノ酸残基以外の領域中のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失しており、かつ当該アミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
（ｆ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、３〜１１番目および２７〜７２番目のアミノ酸残基以外の領域において１〜２０個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列。
（ｇ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、３〜１１番目および２７〜７２番目のアミノ酸残基以外の領域中のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失しており、かつ当該アミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
【００１４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列は、Ｍ１の全長アミノ酸配列（配列番号２）のうち、１〜７６番目のアミノ酸残基からなる部分塩基配列である。つまり、図１に示すように、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、５８〜６６番目のアミノ酸残基からなる領域は、ＣＴＬエピトープ領域であり、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、３〜１１番目のアミノ酸残基からなる領域と５１〜６８番目のアミノ酸残基からなる領域が、ＨＬＡ−Ａ２に対応するＣＴＬエピトープ予測領域であり、３〜１１番目のアミノ酸残基からなる領域と２７〜７２番目のアミノ酸残基からなる領域が、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ１１、およびＨＬＡ−Ａ２６のいずれかに対応するＣＴＬエピトープ予測領域である。
【００１５】
後記実施例に示すように、該（ａ）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを表面に結合させたリポソームは、動物に投与した場合に、ＣＴＬを誘導する、すなわち、ＣＴＬ誘導活性を有する。
【００１６】
ＣＴＬの誘導は、ＣＴＬエピトープに主に依存する。このため、該（ａ）のアミノ酸配列を含むポリペプチドのうち、ＣＴＬ領域以外のアミノ酸残基を置換、付加、または欠失させたポリペプチドも、該（ａ）のアミノ酸配列を含むポリペプチドと同様にＣＴＬを誘導できる。言い換えると、該（ｂ）〜（ｇ）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを表面に結合させたリポソームも、該（ａ）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを表面に結合させたリポソームと同様に、ＣＴＬ誘導活性を有する。
【００１７】
ＣＴＬの誘導は、ヘルパーＴ細胞も活性化される必要がある。このため、該（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列において、エピトープ予測領域は保存されており、エピトープ予測領域以外の領域のアミノ酸残基が置換、付加、または欠失していることが好ましい。すなわち、本発明のポリペプチドとしては、該（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列を有するものよりも、該（ｄ）〜（ｇ）のアミノ酸配列を有するものが好ましい。
【００１８】
該（ｂ）、（ｄ）、および（ｆ）のアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して置換、付加、または欠失されるアミノ酸の数は、１〜１６個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜６個がさらに好ましい。
【００１９】
該（ｃ）、（ｅ）、および（ｇ）のアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上であれば特に限定されず、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがよりさらに好ましい。
【００２０】
アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入および欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求められる。
【００２１】
ＣＴＬエピトープからなるポリペプチドのみを表面に結合させたリポソームは、アジュバントなしではＣＴＬ誘導活性が不充分である。これに対して、本発明のポリペプチド結合リポソームは、アジュバントなしでも充分なＣＴＬ誘導活性を有する。該理由は明らかではないが、リポソーム表面に結合したポリペプチドがある程度の大きさを有するため、ＣＴＬエピトープ領域がリポソーム表面からある程度の距離を有し、ＣＴＬとの相互作用がより生じやすくなっていること、および、ヘルパーエピトープとして機能し得る領域を含んでいることから、自然免疫の誘導がより生じやすくなっていること、が考えられる。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、該（ａ）〜（ｇ）のいずれかのアミノ酸配列からなる領域に加えて、そのＮ末端側またはＣ末端側に、その他のアミノ酸配列からなる領域を含んでいてもよい。該その他のアミノ酸配列からなる領域としては、該（ａ）〜（ｇ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するＣＴＬ誘導活性を損なわないものであれば特に限定されない。該その他のアミノ酸配列からなる領域としては、たとえば、組換えタンパク質の発現・精製において汎用されているタグ、リポソームとの結合のリンカーとなる反応性基で修飾されたペプチドが挙げられる。該タグとしては、たとえば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、およびＦｌａｇタグが挙げられる。なお、該タグは、該（ａ）〜（ｇ）のいずれかのアミノ酸配列からなる領域内にあってもよい。本発明のポリペプチドのアミノ酸鎖長において、該（ａ）〜（ｇ）のいずれかのアミノ酸配列からなる領域が占める割合は、６０％以上が好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、９０％以上がよりさらに好ましい。
【００２３】
本発明のポリペプチドは、たとえば、液相合成または固相ペプチド合成等の公知のペプチド合成技術によって調製できる。または、本発明のポリペプチドを発現し得る発現ベクターを導入した形質変換体（大腸菌等）を培養し、その培養物からアフィニティカラム等の周知の精製技術で単離することにより、該ポリペプチドを製造できる。本発明のポリペプチドを発現し得る発現ベクターは、周知の遺伝子工学的技術を用いて、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適切な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより構築できる。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、それが有する官能基を介してリポソームの表面に結合できる。リポソーム表面への結合に用いられる本発明のポリペプチド中の官能基としては、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、ジスルフィド基またはメチレン鎖を有する炭化水素基（アルキル基等）からなる疎水基が挙げられる。これらの内、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基およびジスルフィド基は共有結合により、アミノ基およびカルボキシル基はイオン結合により、疎水基は疎水基同士で疎水結合により、本発明のポリペプチドをリポソームの表面に結合できる。リポソームと結合した状態で安定して生体内に存在し得ることから、本発明のポリペプチドは、リポソーム表面に、共有結合により結合することが好ましく、アミノ基、カルボキシル基またはチオール基を介して共有結合により結合することがより好ましい。特に、Ｎ末端のアミノ基を介してリポソーム表面に結合することにより、本発明のポリペプチド中のＣＴＬエピトープ部分がリポソーム表面から充分に離れ、ＣＴＬとの相互作用が生じやすくなり好ましい。
【００２５】
本発明のポリペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、両親媒性界面活性剤であるリン脂質が、極性基を水相側に向けて界面を形成し、疎水基が界面の反対側に向く構造を有する。リポソームとは閉鎖空間を有するリン脂質二重膜のことを指す。
【００２６】
本発明のポリペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、本発明のポリペプチドが有する官能基と直接または間接的に結合し得る官能基を有する。該官能基としては、アミノ基、サクシンイミド基、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、ジスルフィド基、メチレン鎖を有する炭化水素基（アルキル基等）からなる疎水基が挙げられ、アミノ基、サクシンイミド基、またはマレイミド基が好ましい。
【００２７】
本発明のポリペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基または不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質を１種または２種以上含むことが好ましい。
【００２８】
不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有するリン脂質における、該アシル基の炭素数は、好ましくは１６〜２２であり、さらに好ましくは１８〜２２であり、最も好ましくは１８である。該アシル基としては、具体的には、パルミトオレオイル基、オレオイル基、エルコイル基が挙げられ、最も好ましくはオレオイル基である。
不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質における、該炭化水素基の炭素数は、好ましくは１６〜２２であリ、さらに好ましくは１８〜２２であり、最も好ましくは１８である。該炭化水素基としては、具体的には、テトラデセニル基、ヘキサデセニル基、オクタデセニル基、Ｃ２０モノエン基、Ｃ２２モノエン基、Ｃ２４モノエン基が挙げられる。
リン脂質が有するグリセリン残基の１−位および２−位に結合する不飽和のアシル基または不飽和炭化水素基は、同一でも異なっていてもよい。工業的な生産性の観点から、１−位および２−位の基が同一であることが好ましい。
本発明のポリペプチド結合リポソームを構成するリン脂質としては、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有するリン脂質が好ましい。
【００２９】
不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基または不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質としては、酸性リン脂質、中性リン脂質、ペプチドを結合できる官能基を有する反応性リン脂質が挙げられる。これらは、種々の要求に応じて、その種類、割合を適宜選択できる。
【００３０】
酸性リン脂質としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール等を使用できる。ＣＴＬ活性を実用上充分なレベルに増強する点、および工業的な供給性、医薬品として用いるための品質等の点から、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有するジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、およびジアシルホスファチジルイノシトールが好ましい。
中性リン脂質としては、たとえば、ホスファチジルコリンを使用できる。
【００３１】
反応性リン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミンまたはその末端変性体が挙げられる。また、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトールおよびこれらの末端変性体も反応性リン脂質として用いられる。
【００３２】
末端変性体としては、ジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に２価反応性化合物の一方の末端を結合させたジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体が挙げられる。２価反応性化合物としては、ジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基と反応できるアルデヒド基またはコハク酸イミド基を少なくとも片方の末端に有する化合物が利用できる。アルデヒド基を有する２価反応性化合物として、グリオキサール、グルタルアルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒドが挙げられる。好ましくは、グルタルアルデヒドが挙げられる。コハク酸イミド基を有する２価反応性化合物として、ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコール−ビス（サクシンイミジルサクシネート）、ジサクシンイミジルサクシネート、ジサクシンイミジルスベレート、またはジサクシンイミジルグルタレートが挙げられる。
【００３３】
また、一方の末端にサクシンイミド基、他方の片末端にマレイミド基を有する２価反応性化合物として、Ｎ−サクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、スルホサクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−サクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート、Ｎ−サクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）プロピオネート、サクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドエチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホサクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドエチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）サクシンイミド、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミドが挙げられる。該２価反応性化合物を用いると、官能基としてマレイミド基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体が得られる。該２価反応性化合物の一方の末端の官能基をジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に結合し、ジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体を得られる。
【００３４】
本発明の効果を損なわない限り、本発明のポリペプチド結合リポソームのリポソーム部分を構成するリン脂質膜は、リポソームを構成できる、公知の構成成分を含んでいてもよい。
【００３５】
たとえば、該リン脂質膜には、リポソームの安定化剤が含まれていてもよい。リポソームの安定化剤としては、ステロール類またはトコフェロール類を使用できる。該ステロール類としては、一般にステロール類として知られるものであればよく、たとえば、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロールが挙げられ、入手性等の点から、特に好ましくは、コレステロールが用いられる。該トコフェロール類としては、一般にトコフェロールとして知られるものであればよく、たとえば、入手性等の点から、市販のα−トコフェロールが好ましく挙げられる。
【００３６】
本発明のポリペプチド結合リポソームのリポソーム部分は、構成成分であるリン脂質、反応性リン脂質、リポソームの安定化剤等を用い、一般的なリポソームの製造方法により製造できる。該リポソームの製造方法としては、たとえば、エクスツルージョン法、ボルテックスミキサー法、超音波法、界面活性剤除去法、逆相蒸発法、エタノール注入法、プレベシクル法、フレンチプレス法、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョン法、アニーリング法、凍結融解法が挙げられる。リポソームの形態は、特に限定されず、該リポソーム製造方法を適宜選択することにより、多重層リポソーム、小さな一枚膜リポソーム、大きな一枚膜リポソーム等、種々の大きさおよび形態を有するリポソームを製造できる。
【００３７】
リポソームの粒径は特に限定されるものではなく、保存安定性等の点から、粒径は２０〜６００ｎｍが挙げられ、好ましくは３０〜５００ｎｍ、より好ましくは４０〜４００ｎｍであり、さらに好ましくは、５０〜３００ｎｍであり、最も好ましくは７０〜２３０ｎｍである。
【００３８】
リポソームの物理化学的安定性を向上させるために、リポソーム調製過程または調製後に、リポソームの内水相および外水相のいずれか一方または両方に、糖類または多価アルコール類を添加してもよい。特に、長期保存または製剤化途上での保管が必要な場合には、リポソームの保護剤として、糖または多価アルコールを添加・溶解し、凍結乾燥により水分を除いてリン脂質組成物の凍結乾燥物とすることが好ましい。
【００３９】
糖類としては、たとえばグルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース等の単糖類；サッカロース、ラクトース、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース等の三糖類；シクロデキストリン等のオリゴ糖；デキストリン等の多糖類；キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコールが挙げられる。これらの糖類の中では単糖類または二糖類が好ましく、中でもグルコースまたはサッカロースが入手性等の点からより好ましく挙げられる。
【００４０】
該多価アルコール類としては、たとえば、グリセリン、ジグリセリン、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、ヘプタグリセリン、オクタグリセリン、ノナグリセリン、デカグリセリン、ポリグリセリン等のグリセリン系化合物；ソルビトール、マンニトール等の糖アルコール系化合物；エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ペンタエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ヘプタエチレングリコール、オクタエチレングリコール、ノナエチレングリコールが挙げられる。このうち、グリセリン、ジグリセリン、トリグリセリン、ソルビトール、マンニトール、分子量４００〜１０，０００のポリエチレングリコールが入手性の点から好ましく挙げられる。
リポソームの内水相および外水相のいずれか一方または両方に含ませる、糖類または多価アルコール類の濃度は、リポソーム液に対する重量濃度で、たとえば１〜２０重量％が挙げられ、好ましくは２〜１０重量％が挙げられる。
【００４１】
本発明のポリペプチド結合リポソームは、たとえば、本発明のポリペプチドを結合させる前のリポソームを製造した後、本発明のポリペプチドを結合させることにより簡便に製造できる。リポソームに含まれる反応性リン脂質の官能基と、本発明のポリペプチドの官能基を直接連結して結合させてもよく、両者を２価反応性化合物を介して結合させてもよい。該２価反応性化合物としては、前述のものが挙げられる。
【００４２】
たとえば、リポソームと本発明のポリペプチドは、シッフ塩基結合を利用して結合させられる。具体的には、アミノ基を表面に有するリポソームを調製し、本発明のポリペプチドを該リポソームの懸濁液に添加し、次に、２価反応性化合物としてジアルデヒドを加え、リポソーム表面のアミノ基と本発明のポリペプチド中のアミノ基とをシッフ塩基を解して結合することにより、本発明のポリペプチド結合リポソームが製造できる。
【００４３】
リポソームと本発明のポリペプチドの結合は、アミノ基とサクシンイミド基との反応によるシッフ塩基結合、チオール基とマレイミド基との反応によるチオエーテル結合が好ましい。たとえば、ジサクシンイミジルサクシネート結合ジアシルホスファチジルエタノールアミンのようにサクシンイミド基を末端に有する反応性リン脂質を含むリポソームと、本発明のポリペプチド中のアミノ基とを反応させてシッフ塩基結合を形成させられる。
【００４４】
リポソームと本発明のポリペプチドの結合反応の反応物から、未反応のポリペプチド、２価反応性化合物、および反応副生物等を、ゲルろ過、透析、限外ろ過、遠心分離等の方法により除去し、本発明のポリペプチド結合リポソームを精製することも好ましい。
【００４５】
本発明のポリペプチド結合リポソームは、医薬組成物の有効成分にできる。該医薬組成物としては、インフルエンザワクチンまたはＣＴＬ活性化剤として用いられるものが好ましい。該医薬組成物は、たとえば、ヒト、非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）、鳥類（ニワトリ、ガチョウ、アヒル、ダチョウ、ウズラ等）等に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与等）に投与できる。
【００４６】
該医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。該医薬組成物は、本発明のポリペプチド結合リポソームに、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、たとえば、賦形剤、希釈剤、懸濁化剤、乳化剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、安定化剤等を配合して、常法により製剤化できる。
【００４７】
該医薬組成物としては、非経口投与に適した剤形が好ましく、注射剤、坐剤が好ましく、注射剤が特に好ましい。注射剤としては、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤が挙げられる。注射剤の調製方法としては、たとえば、本発明のポリペプチド結合リポソームを通常注射剤に用いられる無菌の水性溶媒に溶解または懸濁することによって調製できる。注射用の水性溶媒としては、たとえば、蒸留水；生理的食塩水；リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液が使用できる。該水系溶媒のｐＨは５〜１０が好ましく、６〜８がより好ましい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。
【００４８】
また、本発明のポリペプチド結合リポソームの懸濁液を、真空乾燥、凍結乾燥等の処理に付すことにより、該ポリペプチド結合リポソームの粉末製剤を調製できる。本発明のポリペプチド結合リポソームを粉末状態で保存し、使用時に該粉末を注射用の水系溶媒で分散することにより、使用に供できる。
【００４９】
該医薬組成物中の本発明のポリペプチド結合リポソームの含有量は、通常、医薬組成物全体の約０．１〜１００質量％、好ましくは約１〜９９質量％、さらに好ましくは約１０〜９０質量％程度である。
【００５０】
該医薬組成物は、本発明のポリペプチド結合リポソームに加えて、アジュバントをさらに含有してもよい。アジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲル、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント、ポリ（I,C）、ＣｐＧ−ＤＮＡ等が挙げられ、ＣｐＧ−ＤＮＡが特に好ましい。ＣｐＧ−ＤＮＡは細菌の非メチル化ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡであり、特定の受容体（Toll-like receptor 9）のリガンドとして働くことが知られている（Biochim. Biophys. Acta, vol.1489, p.107-116 (1999) および Curr. Opin. Microbiol., vol.6, p.472-477 (2003)参照）。
【００５１】
該医薬組成物がアジュバントを含む場合、該アジュバント（たとえばＣｐＧ−ＤＮＡ）の含有量は、ＣＴＬの誘導を増強し得る範囲で適宜設定できる。通常、アジュバント含有量は、医薬組成物全体の約０．０１〜１０質量％、好ましくは約０．１〜５質量％程度である。
【００５２】
該医薬組成物の動物への投与量は、投与する対象、投与方法、投与形態等によって異なる。たとえば、皮下投与または経鼻投与により生体内のＣＴＬを活性化する場合には、通常成人１人（体重６０ｋｇ）あたり、本発明のポリペプチドとして一回当たり１μｇ〜１０００μｇの範囲、好ましくは２０μｇ〜１００μｇの範囲となるように、通常４週間から１８ヶ月に亘って、２回から３回投与する。また、皮下投与により鳥インフルエンザウイルス感染に対して予防する場合には、本発明のポリペプチドとして一回当たり１μｇ〜１０００μｇの範囲、好ましくは２０μｇ〜１００μｇの範囲で、通常４週間から１８ヶ月に亘って、２回から３回投与する。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
【００５４】
［実施例１］
Ｍ１の全長蛋白質とＣＴＬエピトープ領域を含む部分蛋白質をそれぞれリポソーム表面に結合させたものについて、ＣＴＬ誘導活性を調べた。
【００５５】
＜Ｍ１Ｈ６＞
リポソーム表面に結合させるＭ１の全長蛋白質としては、「Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／ＣＬ０１／２００４（Ｈ５Ｎ１）」のＭ１の全長（２５２残基）アミノ酸配列（配列番号２）の情報（http://www.uniprot.org/uniprot/Q1KJI2）に基づき、Ｍ１のＣ末端にＨｉｓタグ（６個のＨｉｓ残基）を連結し、かつ２個のアミノ酸変異（Ｎ２２４ＳおよびＫ２４２Ｎ）を導入した変異蛋白質（以下、「Ｍ１Ｈ６」という。配列番号３）を用いた。変異で入れたアミノ酸は、他のＭ１ホモログのアミノ配列を参考に決定した。Ｍ１Ｈ６をコードする遺伝子の塩基配列は、「Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／ＣＬ０１／２００４（Ｈ５Ｎ１）」のＭ１遺伝子の塩基配列に、該２個のアミノ酸変異を導入し、Ｃ末端のＨｉｓタグをコードする塩基配列を付加し、５’末端（開始コドンＡＴＧ）の外側に制限酵素サイトＰｃｉＩを導入し、３’末端（終止コドンＴＡＡ）の外側に制限酵素サイトＸｂａＩを導入し、さらに宿主とする大腸菌において使用頻度の高いコドンに改変して設計した。制限酵素サイトＰｃｉＩとＸｂａＩは、発現ベクターへの遺伝子クローニングために導入した。設計されたＭ１Ｈ６人工合成遺伝子の塩基配列（配列番号４）は、天然のＭ１遺伝子の塩基配列と約７６％の配列同一性を示した。配列番号４で表される塩基配列からなるＭ１Ｈ６人工合成遺伝子は、化学合成により調製した。
【００５６】
＜Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．１〜３＞
次いで、図１のエピトープ予測領域の情報に基づき、図２に示すように、Ｍ１Ｈ６を３つの断片領域（Ｆｒ．１〜３）に分けた。図２中、実線で囲んだ領域が断片１領域（Ｆｒ．１）であり、点線で囲んだ領域が断片２領域（Ｆｒ．２）であり、破線で囲んだ３つの領域（上流側から、断片３−１領域、断片３−２領域、および断片３−３領域という。）を連結した領域が断片３領域（Ｆｒ．３）である。断片１領域のＣ末端に６個のＨｉｓ残基と終止コドンを付加したアミノ酸配列（配列番号５）からなるポリペプチドをＭ１Ｈ６−Ｆｒ．１、断片２領域のＣ末端に６個のＨｉｓ残基と終止コドンを付加したアミノ酸配列（配列番号６）からなるポリペプチドをＭ１Ｈ６−Ｆｒ．２とし、断片３−１領域と断片３−２領域と断片３−３領域とを連結したアミノ酸配列（配列番号７）からなるポリペプチドをＭ１Ｈ６−Ｆｒ．３とした。
【００５７】
＜Ｍ１Ｈ６およびＭ１Ｈ６−Ｆｒ．１〜３の発現ベクター＞
Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．１〜３をコードするポリヌクレオチドを、Ｍ１Ｈ６人工合成遺伝子を鋳型とし、表１に記載のプライマーを用いたＰＣＲにより調製した。Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．３をコードするポリヌクレオチドは、プライマーＦｒ．３（Ｆｗ）とプライマーＦｒ．３−１（Ｒｖ）のセットを用いて得たＰＣＲ産物と、プライマーＦｒ．３−２（Ｆｗ）とプライマーＦｒ.３（Ｒｖ） のセットを用いて得たＰＣＲ産物とを連結して得られた。
【００５８】
【表１】
2019064924.tif 000002
【００５９】
調製された各ポリヌクレオチドおよびＭ１Ｈ６人工合成遺伝子を、それぞれ、制限酵素ＰｃｉＩおよびＸｂａＩで消化し切断した断片を、市販の大腸菌ＩＰＴＧ誘導発現型ベクターｐＥＴ−２８ａ（＋）をＴ７プロモーターとＴ７ターミネーターの間にあるマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）中のＮｃｏＩとＮｈｅＩで消化し切断した断片に連結し、発現ベクターを構築した。Ｍ１Ｈ６人工合成遺伝子を挿入した発現ベクターをｐＥＴ−２８ａ（＋）＿Ｍ１Ｈ６、またＭ１Ｈ６−Ｆｒ．１〜Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．３をコードするポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターをそれぞれｐＥＴ−２８ａ（＋）＿Ｍ１Ｈ６（Ｆｒ．１）〜ｐＥＴ−２８ａ（＋）＿Ｍ１Ｈ６（Ｆｒ．３）とした。
【００６０】
＜Ｍ１Ｈ６およびＭ１Ｈ６−Ｆｒ．１〜３のＧＳＴ融合蛋白質発現ベクター＞
Ｍ１Ｈ６およびＭ１Ｈ６−Ｆｒ．１〜３のＮ末端に、トロンビンで切断可能なようにＧＳＴを融合させて構築したＧＳＴ融合蛋白質（ＧＳＴ−Ｍ１Ｈ６、ＧＳＴ−Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．１〜３）を発現させるために、まずＣ末端にトロンビン切断サイトを有するＧＳＴ蛋白質（配列番号１６）をコードする塩基配列（配列番号１７）とＭ１Ｈ６およびＭ１Ｈ６−Ｆｒ．１〜３のそれぞれの断片をコードする塩基配列（配列番号４〜７）を２段階ＰＣＲ法（ｆｕｓｉｏｎ−ＰＣＲ法）で融合させることによって、ＧＳＴ付きの各断片を調製した。ＰＣＲの際には、各断片の増幅に用いるフォワードプライマー側には制限酵素ＡａｒＩを、リバースプライマー側には制限酵素ＸｂａＩを付加することによって、各断片の両端に同じ制限酵素認識サイトを導入した。ＰＣＲで増幅・調製された各ポリヌクレオチド断片を、それぞれ、制限酵素ＡａｒＩおよびＸｂａＩで消化し切断した断片を、市販の大腸菌ＩＰＴＧ誘導発現型ベクターｐＥＴ−２８ａ（＋）をＴ７プロモーターとＴ７ターミネーターの間にあるマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）中のＮｃｏＩとＮｈｅＩで消化し切断した断片に連結し、ＧＳＴ融合発現ベクターを構築した。得られたＧＳＴ融合蛋白質発現ベクターをそれぞれｐＥＴ−２８ａ（＋）＿ＧＳＴ−Ｍ１Ｈ６、ｐＥＴ−２８ａ（＋）＿ＧＳＴ−Ｍ１Ｈ６（Ｆｒ．１）〜ｐＥＴ−２８ａ（＋）＿ＧＳＴ−Ｍ１Ｈ６（Ｆｒ．３）とした。
【００６１】
＜組換え体の作製＞
構築した全８種の発現ベクターのそれぞれのプラスミドＤＮＡを用いて、大腸菌宿主株Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）の形質転換を行い、カナマイシン含有ＬＢ培地で、３７℃で一晩静止培養し、形成されたコロニーを数個ずつ遺伝子組換えクローンとして選び、―８０℃でストックした。
【００６２】
＜組換え蛋白質の発現＞
各遺伝子組換えクローンを、カナマイシン含有ＬＢ培地（５ｍＬ）で前培養した後、全量を１００ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ培地に添加し、５００ｍＬ容のフラスコで約３時間振とう培養して菌体を増殖させた。その後、菌体培養液に１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、各発現ベクターにコードした蛋白質を誘導発現させた。誘導発現後に得られた菌体を超音波で破砕し、菌体内蛋白質を抽出した。
【００６３】
各蛋白質抽出物について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図示せず。）。この結果、ＧＳＴ融合蛋白質では、４種類全てのＧＳＴ融合蛋白質の発現が確認された。ＧＳＴを融合させていない蛋白質では、Ｍ１Ｈ６およびＭ１Ｈ６−Ｆｒ．１は、アミノ酸残基長から予想される大きさに蛋白質のバンドがあり、発現が確認されたが、Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．２およびＭ１Ｈ６−Ｆｒ．３は発現が確認されなかった。
【００６４】
ＧＳＴ融合蛋白質について、蛋白質抽出物の一部を遠心分離処理し、上清を可溶性画分、沈殿物を不溶性画分とした。各蛋白質抽出物について、遠心分離処理前のサンプル、可溶性画分、および不溶性画分をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図示せず。）。この結果、ＧＳＴ−Ｍ１Ｈ６およびＧＳＴ−Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．１は、可溶性画分にバンドが確認されたが、ＧＳＴ−Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．２およびＧＳＴ−Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．３は、不溶性画分にバンドが確認された。
【００６５】
＜組換え蛋白質の精製＞
不溶性蛋白質として発現が確認できたＭ１Ｈ６およびＧＳＴ−Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．１について、Ｍ１Ｈ６およびＧＳＴを切断したＭ１Ｈ６−Ｆｒ．１を精製した。
まず、発現ベクターｐＥＴ−２８ａ（＋）＿Ｍ１Ｈ６およびｐＥＴ−２８ａ（＋）＿ＧＳＴ−Ｍ１Ｈ６（Ｆｒ．１）をそれぞれ大腸菌宿主株Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）に導入した組換えクローンを、ＬＢ培地（１００ｍＬずつ、フラスコ数本）に植菌し、３７℃で約３時間振とう培養して菌体を増殖させた。その後、菌体培養液にＩＰＴＧを添加して、Ｍ１Ｈ６またはＧＳＴ−Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．１を誘導発現させ、それぞれの封入体を回収した。
回収したＭ１Ｈ６封入体は、洗浄後に５Ｍ  Ｕｒｅａ水溶液で可溶化させ、Ｎｉカラムを用いてＨｉｓ−ｔａｇ精製した後、市販のリフォールディングキット（片山化学工業、Z-drive refolding kit）を用いて巻き戻しを行った。それによって得られた可溶化サンプルを、透析膜にかけてバッファー交換し、一旦凍結保存した。さらに同じ方法で６回精製を行った。得られた精製サンプルをまとめて限外濾過フィルター「Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４／ＲＣ」にかけてサンプル濃縮し、約２ｍｇ／ｍＬのＭ１Ｈ６蛋白質溶液を調製した。
【００６６】
一方、回収したＧＳＴ−Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．１の封入体は、洗浄後に８Ｍの塩酸グアニジンで可溶化させ、さらにリフォールディングバッファー（０．５％  Ｔｗｅｅｎ−４０、０．６％とシクロアミロースを含有するＰＢＳ）中で、室温で１４時間インキュベートすることにより、可溶化させた蛋白質のリフォールディングを行った。リフォールディング後の反応液の上清画分をＧＳＴ精製カラムにかけて、適切にリフォールディングしたＧＳＴ融合蛋白質を該カラムに結合させた。次いで、該カラムにトロンビン液を入れ、室温で１４〜１６時間静止することによって、該カラム内でＧＳＴとＭ１Ｈ６−Ｆｒ．１の融合部位に導入してあるトロンビン認識サイトをトロンビンで消化した後、該カラムからＧＳＴから切り離されたＭ１Ｈ６−Ｆｒ．１をＰＢＳで溶出して精製した。該カラムからの溶出物にはトロンビンも含まれているため、該溶出物をＨｉｓ−ｔａｇ精製カラムにかけて、Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．１を精製して回収した。Ｈｉｓ−ｔａｇ精製カラムによる精製工程を合計５回繰り返し、精製サンプルを得た。得られた精製サンプルは、透析膜にかけて２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐ Ｈ７．５, ０．１Ｍ ＮａＣｌ）にバッファー交換した後、最終的にまとめて限外濾過フィルター「Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４／ＲＣ」を用いて濃縮し、約１ｍｇ／ｍＬのポリペプチド溶液を調製した。
【００６７】
＜ポリペプチド結合リポソームの調製＞
１０ｍＬの０．１３６ｍＭのジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）および２４ｍＬのトリエチルアミン（ＴＥＡ）の混合物を、０．６８１ｍＭのジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）を含む２６．６ｍＬの無水クロロホルム溶液中に滴下して加え、４０℃で５時間撹拌した。減圧下で溶媒を蒸発させ、酢酸エチルおよびテトラヒドロフランの２：１混合物１８ｍＬを加えて残渣を溶解した。該溶液に３６ｍＬの１００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ ５．５）および９０ｍＬの飽和ＮａＣｌ水溶液を加えた。得られた混合物を１分間震盪して分離させた後、不要な物質を除去するために同一の緩衝液で上層を洗浄した。該上層から溶媒を蒸発させた後、３ｍＬのアセトンを加えて残渣を溶解した。次いで、溶解させた残渣に１００ｍＬの氷冷アセトンを滴下して加え、氷上に３０分間保持して沈殿させた。得られた結晶を回収して５ｍＬのクロロホルム中に溶解させた。クロロホルムを蒸発させた後、３４．４ｍｇのＤＯＰＥ−ＤＳＳを得、次いで０．１８ｍＭのジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、０．０３ｍＭのＤＯＰＥ−ＤＳＳ、０．２１ｍＭのコレステロールおよび０．０６ｍＭのジオレオイルホスファチジルグリセロールを１０ｍＬのクロロホルム／メタノール中に溶解した。該溶液から溶媒を減圧下で蒸発させ、５．８ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．２）を加えて４．８％の脂質懸濁液を作成した。ベシクルの分散液を０．２μｍのポリカーボネート膜を通して押し出し、リポソームサイズを調整した。
【００６８】
ＤＳＳを導入したリポソームの懸濁液２ｍＬおよび１０ｍｇ／ｍＬのポリペプチド溶液０．５ｍＬを混合して４℃で３日間撹拌した。次いで、ＣＬ−４Ｂカラムクロマトグラフィーを用いて、リポソームと結合したポリペプチドと結合していないポリペプチドを分離した。こうして得られたＭ１Ｈ６を結合させたリポソーム（Ｍ１リポソーム）と、Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．１を結合させたリポソーム（Ｍ１−Ｆｒ．１リポソーム）を、以降の実験に用いた。
【００６９】
対照として、図１中のＭ１のＣＴＬエピトープ領域のみからなるＭ１＿５８−６６ペプチド（配列番号１８）を合成し、該ペプチドを表面に結合させたリポソーム（Ｍ１＿５８−６６リポソーム）を用いた。Ｍ１＿５８−６６リポソームは、１０ｍｇ／ｍＬのポリペプチド溶液に代えて、１０ｍｇ／ｍＬの該Ｍ１＿５８−６６ペプチド溶液を用い、同様にして調製できる。
【００７０】
＜ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ＞  
Ｍ１−Ｆｒ．１リポソームについて、細胞内サイトカイン染色を、J Virol 78, 9093-9104（2004）に記載された通りに行った。マウス本来のＭＨＣクラスＩ分子（Ｈ２−ＤおよびＨ２−Ｋ）を持たず、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を発現する遺伝子導入マウス（ＨＨＤマウス）（J.Exp.Med. vol.185 (1997) p.2043-2051）を使用した。
具体的には、１０ｍｇ／ｍＬのＭ１−Ｆｒ．１リポソーム１００μＬを、５μｇのＣｐＧ５００２（５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＴＧＡＴＧＴＴ−３’；配列番号１９）と共に２匹のＨＨＤマウスへ皮下注射により投与して免疫し、２週間後、同量のＭ１−Ｆｒ．１リポソームおよびＣｐＧ５００２を下注射により投与して免疫し、さらに２週間後に安楽殺した後に脾臓を回収した。回収した脾臓細胞を９６ウェルプレートに３×１０５個／ウェルとなるようにまき、ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（GolgiPlug（登録商標）, BD Biosciences社製）存在下、３７℃で５時間、１０μｇ／ｍＬのＭ１Ｈ６−Ｆｒ．１とインキュベートした。ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体（FcBlock（登録商標）, BD Biosciences社製）によりＦｃ受容体をブロッキングした後、細胞をＦＩＴＣ結合ラット抗マウスＣＤ８αモノクローナル抗体（BD Biosciences社製）により４℃で３０分間染色した。次いで細胞を固定し、透過性を高め、フィコエリトリン（ＰＥ）結合ラット抗マウスインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）モノクローナル抗体（BD Biosciences社製）により染色した。細胞を洗浄後、各ウェルの蛍光強度を測定した。対照として、Ｍ１−Ｆｒ．１リポソームを免疫していないＨＤＤマウスについても同様に実験を行った。
【００７１】
各ウェルの細胞数（／１００μＬ／ウェル）の平均値とＳＤ、およびｐ値を表２に示す。表中、「ｎｏ  Ａｇ」はポリペプチドを添加せずにインキュベートしたウェルの結果であり、「ＰＨＡ」はＴ細胞マイトジェンに対する反応（Ｔ細胞が含まれていることを確認する陽性コントロール）の結果であり、「Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．１」はＭ１Ｈ６−Ｆｒ．１を添加してインキュベートしたウェルの結果である。Ｍ１−Ｆｒ．１リポソームを免疫していない対照マウスから採取された脾臓細胞は、Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．１とインキュベートしてもＩＦＮ−γは産生されておらず、Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．１は非特異的にリンパ球を活性化することはなかった。一方で、Ｍ１−Ｆｒ．１リポソームで免疫したマウスから採取された脾臓細胞は、Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．１とインキュベートすることによってＩＦＮ−γを産生した。すなわち、Ｍ１−Ｆｒ．１リポソームにより、抗原特異的な免疫誘導が生じることが確認された。
【００７２】
【表２】
2019064924.tif 000003
【００７３】
＜インビボ細胞障害性アッセイ＞
Ｍ１リポソーム、Ｍ１−Ｆｒ．１リポソーム、およびＭ１＿５８−６６リポソームを免疫したマウスにおけるＣＴＬ誘導を調べた。
まず、１０ｍｇ／ｍＬの各リポソーム５０μＬを、５μｇのＣｐＧ５００２と共にＨＨＤマウスへ皮下注射により投与して免疫した。免疫から２週間後、免疫したリポソームの表面に結合していたポリペプチドまたはペプチド（Ｍ１Ｈ６、Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．１、またはＭ１＿５８−６６ペプチド）でパルスした蛍光標識標的細胞混合物（２×１０７個／匹）を静脈内投与し、８時間後に各マウスから脾臓細胞を回収し、蛍光標識標的細胞の特異的溶解をフローサイトメトリーにより解析した。
該蛍光標識標的細胞混合物は、次のようにして調製した。まず、Ａ２Ｔｇマウス（ヒトＨＬＡ−Ａ２を遺伝子導入したマウス）の脾細胞を０．２５または２．５μＭ の蛍光色素ＣＦＳＥ（Molecular probes社製）により室温で１５分間標識した後、２回洗浄した。次にＣＦＳＥが明るい細胞を、１０μＭの各ポリペプチドによりパルスし、これを蛍光標識標的細胞とした。ＣＦＳＥが暗い細胞はパルスせず、対照細胞として用いた。蛍光標識標的細胞と対照細胞を１：1の比で混合したものを、蛍光標識標的細胞混合物とした。
【００７４】
フローサイトメトリーによる解析結果を図３に示す。図中、「ＣＯＮＴＲＯＬ」はリポソームによる免疫を行わなかったＨＨＤマウスの脾臓細胞の結果であり、「Ｍ１Ｈ６」、「Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．１」および「Ｍ１＿５８−６６」はそれぞれ、Ｍ１リポソーム、Ｍ１−Ｆｒ．１リポソーム、およびＭ１＿５８−６６リポソームによる免疫を行ったマウスの脾臓細胞の結果である。横軸にＣＦＳＥによる蛍光染色レベルを、縦軸に細胞数を示す。グラフ中に表示した数値は、溶解した細胞の割合を示す。データは３回の独立した実験の代表例である。溶解した細胞の割合（％）が高いほど、リポソームによりＣＴＬ誘導が強く生じていることを示す。この結果、Ｍ１リポソームで免疫したマウスの脾臓細胞では、溶解した細胞は４％しかなく、ほとんどＣＴＬ誘導が生じていなかった。これに対して、Ｍ１−Ｆｒ．１リポソームで免疫したマウスの脾臓細胞では、５０〜６８．１％もの細胞が溶解しており、Ｍ１＿５８−６６リポソームと同様に、顕著なＣＴＬ誘導が観察された。
【００７５】
［実施例２］
Ｍ１−Ｆｒ．１リポソームをアジュバントなしでマウスに免疫した場合に、ＣＴＬ誘導を起こすかどうかを調べた。
免疫は、１０ｍｇ／ｍＬのＭ１−Ｆｒ．１リポソーム５０μＬのみ、または５μｇのＣｐＧ５００２と共に、ＨＨＤマウスへ皮下注射により投与して行った。１週間前に免疫したマウスと、１週間ごとに２回免疫を行った（２週間前と１週間前に免疫を行った）マウスについて、Ｍ１Ｈ６−Ｆｒ．１でパルスした蛍光標識標的細胞混合物を用い、実施例１と同様にしてインビボ細胞障害性アッセイを行い、蛍光標識標的細胞の特異的溶解をフローサイトメトリーにより解析した。
【００７６】
表３に、各マウスから回収された脾臓細胞の溶解した細胞の割合（％）を示す。Ｍ１−Ｆｒ．１リポソームのみを免疫したマウスから回収された脾臓細胞では、溶解した細胞の割合は、免疫回数が１回の場合に９６．８％、２回の場合に９４．７％と非常に高かった。特に２回免疫の場合には、アジュバントと共に免疫した場合の溶解した細胞の割合は８４．５％であり、アジュバントなしのほうが溶解した細胞の割合が高かった。これらの結果から、Ｍ１−Ｆｒ．１リポソームは、アジュバントを用いなくても、免疫１週間で顕著なＣＴＬを誘導できることがわかった。
【００７７】
【表３】
2019064924.tif 000004
【００７８】
なお、Ｍ１＿５８−６６リポソームを用いて同様のインビボ細胞障害性アッセイを行ったところ、ＣｐＧ５００２と共に免疫したマウスから回収された脾臓細胞では、７８．１％の細胞が溶解したが、アジュバントを用いずにＭ１＿５８−６６リポソームのみを免疫したマウスから回収された脾臓細胞では、２．４％の細胞しか溶解しなかった。つまり、ＣＴＬエピトープペプチドがリポソーム表面に結合したＭ１＿５８−６６リポソームでは、充分なＣＴＬ誘導を起こすためにはアジュバントの併用投与が必要であった。
【図１】
2019064924.tif 000005
【図２】
2019064924.tif 000006
【図３】
2019064924.tif 000007
【配列表】
2019064924000001.app