(57)【要約】      （修正有）【課題】エネルギー代謝を活性化させ得る肥満防止剤及びその投与方法の提供。【解決手段】下記式（Ｉ）で表される化合物。好ましくはイソビテキシン又はイソサポナリン等のフラボノイド化合物特に、フラノボイド又はその配糖体の一種である化合物を肥満防止剤の有効成分として用いる方法。経口投与の場合、フラノボイド化合物を１日当り１０μｇ〜１００ｍｇの投与量を投与する方法。2019064965.tif 000012（ｎは１〜５の整数；ｎが１の場合、Ｒ１は−ＯＨ又は−Ｏ−グルコシル、ｎが２〜５の場合、１つのＲ１は−ＯＨであり、それ以外のＲ１は−Ｏ−グルコシル；Ｒ２は、−グルコシル）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）で表される化合物を有する肥満防止剤。
【化１】
2019064965.tif 000009
（式中、ｎは１から５の整数である。ｎが１の場合、Ｒ１は−ＯＨ又は−Ｏ−グルコシルである。ｎが２から５の整数である場合、１つのＲ１は−ＯＨであり、それ以外のＲ１は−Ｏ−グルコシルである。Ｒ２は、−グルコシルである。）
【請求項２】
前記化合物は、下記の式（ＩＩ）で表される、請求項１に記載の肥満防止剤。
【化２】
2019064965.tif 000010
（式中、Ｒ１２は−ＯＨ又は−Ｏ−グルコシルである。Ｒ１２が−ＯＨである場合、Ｒ１１及びＲ１３は−Ｈである。Ｒ１２が−Ｏ−グルコシルの場合、Ｒ１１及びＲ１３は、いずれも−Ｈであるか、又は一方が−ＯＨであり他方が−Ｈである。Ｒ２は、−グルコシルである。）
【請求項３】
下記の式（ＩＩＩ）で表される化合物を有する請求項１又は２に記載の肥満防止剤。
【化３】
2019064965.tif 000011
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満防止剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、体内に脂肪が過剰に蓄積された状態をいう。摂取されたエネルギーが消費エネルギーを上回ると、余剰のエネルギーが脂肪に変換されて脂肪組織に蓄積される。消費エネルギーを増やすためには、体内の基礎代謝を活性化させて熱産生を増やすことが有効である。体内の基礎代謝に大きな影響を与えているのが、ミトコンドリア脱共役蛋白質（uncoupling protein；UCP）である。ＵＣＰ はミトコンドリア内膜での酸化的リン酸化反応を脱共役させ，エネルギーを熱として放出する機能を持つ。
従来、例えば、特許文献１には、ＵＣＰの中で代表的なＵＣＰ１の遺伝子の発現を調整する技術として、ピセアタンノール（Piceatannol）を含むＵＣＰ１遺伝子発現増強剤が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１６−１８５９２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者は、従来と異なる手法で、エネルギー代謝を活性化させて肥満を防止し得る成分を探索した。
本発明はかかる事情に鑑みてなされたものであり、エネルギー代謝を活性化させ得る肥満防止剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の肥満防止剤は、下記の式（Ｉ）で表される化合物を有することを特徴とする。
【０００６】
【化１】
2019064965.tif 000002
【０００７】
（式中、ｎは１から５の整数である。ｎが１の場合、Ｒ１は−ＯＨ又は−Ｏ−グルコシルである。ｎが２から５の整数である場合、１つのＲ１は−ＯＨであり、それ以外のＲ１は−Ｏ−グルコシルである。Ｒ２は、−グルコシルである。）
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＵＣＰ１遺伝子発現相対値を示す図である。
【図２】脂肪滴の定量結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の実施形態に係る肥満防止剤は、下記の式（Ｉ）で表される化合物を有する。
【００１０】
【化２】
2019064965.tif 000003
【００１１】
式中、ｎは１から５の整数である。ｎは、好ましくは１又は２である。ｎが１の場合、Ｒ１は−ＯＨ又は−Ｏ−グルコシルである。ｎが２から５の整数である場合、１つのＲ１は−ＯＨであり、それ以外のＲ１は−Ｏ−グルコシルである。Ｒ２は、−グルコシルである。
【００１２】
Ｒ１が−Ｏ−グリコシルである場合、−グリコシルは、グルコース、ラムノース、フルクトース及びガラクトースからなる群より選択される１又は２個の糖であるとよい。−グリコシルは単糖又は多糖のいずれでもよいが、単糖が好ましい。
【００１３】
Ｒ２は、−グリコシルである。Ｒ２が−グリコシルである場合、−グリコシルは、グルコース、ラムノース、フルクトース及びガラクトースからなる群より選択される１以上の糖であるとよく、更にグルコースが好ましい。−グリコシルは単糖又は多糖のいずれでもよいが、単糖が好ましい。
【００１４】
Ｒ１、Ｒ２において、単糖とは、単糖分子からなる糖をいう。多糖とは、２以上の単糖分子が結合した糖鎖をいう。多糖は、２以上１０以下の単糖が結合して形成されていることがよく、さらに２以上５以下の単糖が結合して形成されていることが好ましい。Ｒ２は、Ｒ１と同じであっても異なっていてもよい。
【００１５】
本実施形態において、前記化合物は、下記の式（ＩＩ）で表されることが好ましい。
【００１６】
【化３】
2019064965.tif 000004
【００１７】
（式中、Ｒ１２は−ＯＨ又は−Ｏ−グルコシルである。Ｒ１２が−ＯＨである場合、Ｒ１１及びＲ１３は−Ｈである。Ｒ１２が−Ｏ−グルコシルの場合、Ｒ１１及びＲ１３は、いずれも−Ｈであるか、又は一方が−ＯＨであり他方が−Ｈである。Ｒ２は、−グルコシルである。）
本実施形態において、化合物は、下記の式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）で表されるものが好ましい。
【００１８】
【化４】
2019064965.tif 000005
【００１９】
【化５】
2019064965.tif 000006
【００２０】
上記の化合物は、フラボノイド化合物であり、特に、フラボノイド又はその配糖体の一種であるとよい。式（Ｉ）で表される化合物は、従来、毛髪染料の酸化防止剤（特表２０１１−５１８８２９）として用いられたり、抗酸化活性や抗動脈硬化作用を有する成分として抗炎症用組成物（特開２０１３−０３５８５８）に用いられたりした。
【００２１】
本実施形態では、式（Ｉ）で表されるフラノボイド化合物を、肥満防止剤の有効成分として用いる。本実施形態のフラボノイド化合物は、代謝活性化に関与するたんぱく質（例えば、ＵＣＰ）を多く産生させることができる。代謝を活性化させて消費エネルギーを増やす代謝活性剤として機能することで、肥満を抑制することが可能である。
【００２２】
本実施形態のフラボノイド化合物は、ハーブ、そば殻を始め多くの植物に含まれる成分であり、溶媒抽出および化学分離精製により得ることができる。植物の中には、本実施形態のフラボノイド化合物を数％含有する植物も存在し、容易に入手可能である。溶出に用いる溶媒は、水系溶媒および／または有機溶媒いずれでもよいが、水系溶媒用いるのが好ましい。水系溶媒は、水、エタノールあるいはメタノールなどが望ましい。水単独もしくは水とメタノール、エタノールなどの低級アルコールとの任意の混合溶液であってもよい。
【００２３】
本実施形態の肥満防止剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重、用法、用量などを考慮することにより決定される。用法としては、経口投与などが挙げられる。経口投与の場合、肥満防止剤におけるフラボノイド化合物の１日あたりの投与量は１０μｇ〜１００ｍｇ／日がよい。
【００２４】
本実施形態の肥満防止剤は、更に、添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、抗酸化剤、コーティング剤、着色剤、矯味矯臭剤、界面活性剤、可塑剤等を配合することができる。
【００２５】
また、本実施形態の肥満防止剤は、本発明の効果を損なわない範囲で、抗アレルギー剤、清涼剤、ビタミン類、他の生薬を配合することもできる。
本実施形態の肥満防止剤は、食品、医薬部外品、医薬品に含有されてもよい。
【００２６】
本実施形態の肥満防止剤を含有する食品の形態は任意であり、限定されるものではない。具体的な食品の形態としては、例えば、一般食品、一般飲料、サプリメント、健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品などの保健機能食品及び特定用途食品、清涼飲料水、茶飲料、ドリンク剤、ワイン等のアルコール飲料、菓子、米飯類、パン類、麺類、惣菜類、調味料等が挙げられる。
【００２７】
本実施形態の肥満防止剤を含有する医薬部外品及び医薬品の用法は任意であり、限定されるものではないが、例えば、内用・外用剤等が挙げられる。
本実施形態の肥満防止剤を含有する化粧品及び医薬部外品の剤形は限定されるものではないが、例えば、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、液剤、等が挙げられる。
【実施例】
【００２８】
実施例では、以下に説明するように、種々の被験物質それぞれが添加された試験培地で褐色脂肪細胞を培養した後、ＵＣＰ１遺伝子の発現量及びオイルレッドＯ染色の脂肪滴の定量を行った。
【００２９】
（１）被験物質を含む試験培地の準備
ノルアドレナリンは、褐色脂肪細胞のβ３受容体に結合し、そのシグナル伝達系を活性化することによってＵＣＰ１遺伝子を活性化し、熱産生を増加させることが知られている物質である（例えば、ＷＯ２００５／０４２５０８号公報）。ノルアドレナリンは、以下の被験物質を用いた場合のＵＣＰ１遺伝子発現量の参照対象である。被験物質としては、イソビテキシン、及びイソサポナリンを用いた。
【００３０】
ノルアドレナリンは、Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製、商品番号  Ａ９５１２である。イソビテキシンは、ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ社製、商品番号１２３５Ｓである。イソサポナリンは、金印株式会社製、ロット番号２０１１０４１２、分子量５９４．５である。
【００３１】
使用した培地は、増殖用培地（コスモ・バイオ株式会社製）、分化誘導用培地（コスモ・バイオ株式会社製）、及び維持用培地（コスモ・バイオ株式会社製）である。
維持用培地には、ノルアドレナリン、イソビテキシン、及びイソサポナリンをそれぞれ添加した。これらの培地中の終濃度は、ノルアドレナリンについては１μｍｏｌ／Ｌ、イソビテキシンについては、１ｍｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、イソサポナリンについては、１ｍｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌとした。
【００３２】
（２）褐色脂肪細胞の培養
試験に供した褐色脂肪細胞は、ラット由来の初代褐色脂肪細胞キット（コスモ・バイオ株式会社製、コード番号ＢＡＴ０２）に付属する細胞である。上記の増殖用培地を用いて、２４ウェルプレートの各ウェルに、３×１０４cells／ウェルとなるように、褐色脂肪細胞を播種した。二酸化炭素インキュベータ内（５％ＣＯ２、３７℃、パナソニック  ヘルスケア株式会社製、マルチガスインキュベーター、商品番号ＭＣＯ-１９ＭＵＶＨ）で、３日間培養した。次に、各ウェル内の培地を、分化誘導用培地に交換し、二酸化炭素インキュベータ内（５％ＣＯ２、３７℃）で、２日間培養した。次に、各ウェル内の培地を、上記の維持用培地に交換し、二酸化炭素インキュベータ内（５％ＣＯ２、３７℃）で、２日間培養した。次に、各ウェル内の培地を、同じく上記の維持用培地に交換し、二酸化炭素インキュベータ内（５％ＣＯ２、３７℃）で、１日間培養した。その後、以下の遺伝子発現解析及びオイルレッドＯ染色による評価を行った。
【００３３】
（３）ＵＣＰ１遺伝子の発現量の定量
１ウェル当たり０．２ｍＬのＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製造、カタログ番号ＴＲ１１８）を用いて、取扱説明書にしたがって、褐色脂肪細胞からＲＮＡを回収した。各検体ＲＮＡ５００ｎｇを使用して、ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ＜登録商標＞ＶＩＬＯ＜商標＞、製品名ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製造、カタログ番号１１７５４０５０）を用いて、ｃＤＮＡ合成を行った。リアルタイムＰＣＲキット（製品名Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ＜登録商標＞  Ｔａｑｍａｎ＜登録商標＞  Ｍａｓｔｅｒ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製造、カタログ名４７３５５３６）を用いて、取扱説明書にしたがって、リアルタイムＰＣＲ（製品名ＬｉｇｔｈＣｙｃｌｅｒ＜登録商標＞  ４８０  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ、ロシュ・ダイアグノスティックス）を行った。ＧＡＰＤＨを内部標準として、ＵＣＰ１の遺伝子発現解析を行った。
【００３４】
試験に使用したプライマーとプローブを以下に示す。
ＵＣＰ１のプライマー
フォワードプライマー：gcctgcctagcagacatcat（配列番号１、合成先Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｏｒｉｃｈ）
リバースプライマー：tggccttcaccttggatct（配列番号２、合成先Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｏｒｉｃｈ）
プローブ：Universal Probe Liberty probe #130（ロシュ・ライフサイエンス製）
ＧＡＰＤＨのプライマー
フォワードプライマー：aatgtatccgttgtggatctga（配列番号３、合成先Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｏｒｉｃｈ）
リバースプライマー：gcttcaccaccttcttgatgt（配列番号４、合成先Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｏｒｉｃｈ）
プローブ：Universal Probe Liberty probe #80（ロシュ・ライフサイエンス製）
実験数は３回とした。
【００３５】
ＵＣＰ１遺伝子の相対発現量の結果を表１及び図１に示す。表１には、各種被験物質の培地中での濃度（終濃度）、各種被験物質を用いた場合のＵＣＰ１遺伝子の発現相対値の平均値、標準偏差（Ｓ．Ｄ．）及び有意差を示した。有意差については、ｔ検定の有意水準５％の場合には「＜０．０５」と示し、有意水準１％の場合には「＜０．０１」と示した。図１には、各種被験物質を用いた場合のＵＣＰ１遺伝子の発現相対値の平均値及び標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を示した。
【００３６】
【表１】
2019064965.tif 000007
【００３７】
図１に示すように、イソビテキシン又はイソサポナリンを用いた場合には、コントロールの場合よりも有意にＵＣＰ１遺伝子発現の上昇を示した。特に、イソビテキシンを用いた群では、１０μｍｏｌ／Ｌで、イソサポナリンを用いた群では、１００μｍｏｌ／Ｌで、他の被験物質に比べて、ＵＣＰ１遺伝子発現の上昇率が有意に高かった。
【００３８】
ＵＣＰ１遺伝子は、脱共役タンパク質の一つであるＵＣＰ１（Uncoupling protein1）をコードする。ＵＣＰ１は褐色脂肪細胞で特異的に発現し、ミトコンドリアでの酸化的リン酸化を脱共役させ、基質を酸化するときに生産されるエネルギーを熱として放出する機能を有している。この遺伝子に変異が生じると、熱の産生量が抑えられ、太りやすくなることが知られている。
【００３９】
本実施例では、イソビテキシン又はイソサポナリンを用いた場合には、コントロールの場合よりも有意にＵＣＰ１遺伝子発現の上昇を示した。このことから、イソビテキシン及びイソサポナリンなどのフラボノイド化合物は、代謝を活性化させることがわかった。
【００４０】
（４）脂肪滴の定量
（２）において培養後の細胞中の脂肪滴を、リピットアッセイキット（コスモ・バイオ株式会社製、コード番号ＡＫ０９Ｆ）を用いて、説明書に従って以下の手順で定量した。
【００４１】
手順２−１．以下の成分を混合して、固定液を調製した。
37％ホルムアルデヒド液（ホルマリン原液） 100 ｍＬ
精製水 900 ml
りん酸2 水素ナトリウム・1 水和物（NaH2PO4・H2O） ４ｇ
りん酸水素２ナトリウム・無水（Na2HPO4） ６．５ｇ
手順２−２．ウェルプレートから培養液を除去した後、１ ウェルあたり５００μＬ のＰＢＳ で1回洗浄した。
【００４２】
手順２−３．１ウェルあたり、手順２−１で調製した固定液を５００μＬ加え、室温で一晩静置した。これにより、ウェル壁面に細胞が固定された。
手順２−４．固定後、１ウェルあたり精製水５００μＬを用いて各ウェルを洗浄した。
【００４３】
手順２−５．キット中のオイルレッドO 原液と精製水とを６：４の比率（体積比）で混合して混合液を得、これを室温で１０〜１５分間静置した。混合液を、孔径０．５〜１．０μｍのメンブレンフィルターでろ過した。ろ液をオイルレッドO 液とした。
【００４４】
手順２−６．各ウェルに上記のオイルレッドO 液を５００μＬずつ分注し、室温で１５ 分間静置した。
手順２−７．静置後オイルレッドO 液をウェルから除去し、ウェルを、1 ウェルあたり精製水で３ 回以上洗浄した。洗浄した精製水が透明になるまでよく洗浄した。
【００４５】
手順２−８．乾燥させたウェル内に、キット中の抽出液を５００μＬ加えて色素を溶出させた。色素を溶出させた溶出溶液を、９６ウェルプレートに０．１ｍＬ取り分けて、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ＜登録商標＞  Ｍ２００  ＰＲＯ）で波長５４０ｎｍ における吸光度を測定した。コントロールの場合の溶出溶液の吸光度を１００とした場合の、各被験物質を用いた場合の溶出溶液の吸光度の相対値を以下の式により求めた。
【００４６】
被験物質を用いた場合の溶出溶液の吸光度の相対値＝１００×被験物質を用いた場合の溶出溶液の吸光度／コントロールの場合の溶出溶液の吸光度
吸光度の相対値は、コントロールの場合の溶出溶液中の脂肪滴の量を１００とした場合の、各被験物質を用いた場合の溶出溶液中の脂肪滴の相対量に相当する。
【００４７】
実験数は３回とした。結果を図２および表２に示した。表２には、各被験物質を用いた場合の溶出溶液中の脂肪滴の相対量の平均値、標準偏差、及び有意差を示した。有意差については、ｔ検定の有意水準５％の場合には「＜０．０５」と示し、有意水準１％の場合には「＜０．０１」と示した。図２には、各種被験物質を用いた場合のＵＣＰ１遺伝子の発現相対値の平均値及び標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を示した。
【００４８】
【表２】
2019064965.tif 000008
【００４９】
図２に示すように、イソビテキシン又はイソサポナリンを添加した培地で脂肪細胞を培養した場合には、これらを添加していない培地で脂肪細胞を培養した場合に比べて、脂肪滴の生成量が少なくなった。特に、イソビテキシン１０μｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｍｏｌ／Ｌ、及びイソサポナリン１０μｍｏｌ／Ｌについては、脂肪滴の生成量が有意に抑えられた。
【００５０】
以上、肥満防止剤の実施例について説明したが、上述の実施例において例示した構成については種々変形することができる。例えば、上記実施例では、上記式（Ｉ）で表されるフラボノイド化合物の例として、イソビテキシン又はイソサポナリンを用いる例を示したが、これに限定されるものではない。これら以外のフラボノイド化合物を用いることができ、この場合でも、イソビテキシン又はイソサポナリンを用いた場合と同様の脂肪滴の生成量を抑制する効果を期待できる。
【図１】
2019064965.tif 000013
【図２】
2019064965.tif 000014
【配列表】
2019064965000001.app