(57)【要約】      （修正有）【課題】幹細胞からメラノサイトへの分化誘導抑制活性を有するメラノサイト分化誘導抑制剤の提供。【解決手段】クロメ、アナメ、及びホンダワラから選ばれる１種又は２種以上の海藻の抽出物を有効成分として含有する、幹細胞からメラノサイトへの分化誘導抑制剤の提供。【効果】幹細胞からメラノサイトへの分化誘導を顕著に抑制することでメラノサイトの分化を根本的に制御することができ、メラノサイトが関与する色素異常症及びシミの治療、予防及び改善が可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロメ、アナメ、及びホンダワラから選ばれる１種又は２種以上の海藻の抽出物を有効成分として含有する、幹細胞からメラノサイトへの分化誘導抑制剤。
【請求項２】
請求項１記載の幹細胞からメラノサイトへの分化誘導抑制剤を含有する色素異常症改善又は治療用組成物。
【請求項３】
請求項１記載の幹細胞からメラノサイトへの分化誘導抑制剤を含有するシミ改善用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞からメラノサイトへの分化誘導抑制剤及び当該分化誘導抑制剤を含有する色素異常症改善若しくは治療用又はシミ改善用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラノサイトは、メラニン色素を合成し、動物の皮膚の色や毛色を決めている細胞である。メラノサイトは、脊椎動物発生の基本となる神経管から派生する神経堤細胞に由来する。神経堤細胞は、神経管から真皮内に左右対称に腹側に遊走し、増殖しながら成熟する。最終的に、神経堤細胞は毛包に定着した後、さらに分化し、且つ成熟することで、メラノサイトへと分化し、且つ成熟する。
【０００３】
また、毛包内では、成熟したメラノサイトとともに、バルジ領域付近に未分化な色素幹細胞が存在する。当該未分化色素幹細胞は、自己増殖するとともに、必要に応じて未熟なメラノブラストを経て、成熟したメラノサイトを表皮や毛母に供給していると考えられている。供給された成熟メラノサイトは周辺のケラチノサイトにメラノソームを移送することで、皮膚や毛に色素を供給している。このように、メラノサイトには様々な分化段階が存在する。
【０００４】
メラノサイトの分化及び増殖並びにメラニン合成機構の異常は、様々な色素異常症やシミの原因となる。例えば、神経堤細胞の遊走に異常が起きると、表皮層へ移動するはずの神経堤細胞が真皮に残存することとなる。当該真皮への残存は、生後様々な刺激で遅発性に顕在化してくる対称性真皮メラノサイトーシスを引き起こす。本症の病変は褐色調で左右対称性である。当該疾患は圧倒的に女性に多く、また10歳代後半から20歳代に発症が多い。従って、対称性真皮メラノサイトーシスに対する女性ホルモンの関与が考えられている。しかしながら、その原因は未だ不明な点が多い。
【０００５】
また、肝斑は、圧倒的に女性に多く、特に30歳代の女性に多く発症するシミである。肝斑の臨床症状は左右対称性の扁平な褐色斑であり、頬や口周囲及び前額部に生じる。肝斑の発症は、妊娠2〜3ヶ月に始まり、漸次高度となり、分娩後月経開始とともに徐々に消退する。しかしながら、肝斑が長期に持続して閉経後に及ぶこともある。さらに、女性ホルモンを含有する経口避妊薬により肝斑が誘発されることが知られている。
【０００６】
ところで、メラノサイトの増殖や分化に働く代表的な外的要因としては、紫外線が挙げられる。紫外線は、表皮細胞に働きかけ、各種のメラノサイト増殖及び分化促進因子の分泌を促す。また、紫外線はメラノサイトに直接作用し、各種メラノサイト活性化因子に対する受容体の発現を向上させることも知られている。老人性色素斑は、この紫外線によるメラノサイトの増加及びメラニン合成の亢進が長年繰り返されることによって引き起こされる。日本人では、60歳台になると、ほぼ100％の人に老人性色素斑が認められ、頻度に男女差はない。顔、肩、背、手等の日光に比較的当たりやすい部位が老人性色素斑の好発部位であり、褐色から黒褐色の平らな斑を生じる。
【０００７】
以上のように、メラノサイトの発生、分化及び増殖並びにメラニン合成に異常が生じると、様々な色素異常症及びシミを生じる。これらの疾患は直接外面の表現系として現れるため、患者の精神的負担が重く、QOL(生活の質)を妨げる要因の一つとなっている。従って、これらの疾患を根本的に改善するためにメラノサイト制御因子の同定が不可欠である。
【０００８】
一方、これまでにメラノサイトを制御する美白剤として、メラニン合成に関わる酵素であるチロシナーゼの活性阻害効果に着目した美白剤が多く開発されている。チロシナーゼ活性阻害効果を有する物質としては、例えばコウジ酸、ハイドロキノン、L-アスコルビン酸等がよく知られている。また、バショウ属植物の抽出液(特許文献１)やヤブコウジ科植物エンベリアの抽出物(特許文献２）等の天然成分を有効成分とするチロシナーゼ活性阻害及びメラニン生成抑制剤が開発されている。しかしながら、これらチロシナーゼ阻害剤は、主に成熟したメラノサイト(チロシナーゼを発現し、且つメラニン合成能を有する)に作用しているに過ぎず、根本的にメラノサイトを制御するものとは言えない。
【０００９】
上述のように、メラノサイトには、成熟メラノサイトへ至るまでに様々な分化段階(神経堤細胞、色素幹細胞、メラノブラスト等)が存在しており、その分化異常により様々な色素異常症やシミが引き起こされる。よって、このメラノサイトの分化自体を制御する因子の同定が根本的な色素異常症及びシミの解決のために重要である。しかしながら、従来においては、メラノサイト制御因子の探索には、主にメラノーマ細胞(メラノサイトの癌化により生じる)、最終分化後のメラノサイト及びマッシュルーム由来チロシナーゼ等を用いて行うスクリーニング系が用いられていた。そのため、メラノサイトの分化を制御する因子の探索は従来において行われていなかった。
【００１０】
これまでに、海藻抽出物についてもメラニン生成の制御（阻害又は促進）に関与するものが報告されている。例えば、メラニン生成阻害作用を有するものとしては、コンブ目チガイソ科アイヌワカメ属のアイヌワカメ(Ａｌａｒｉａ  ｐｒａｅｌｏｎｇａ  Ｋｊｅｌｌｍａｎ)の抽出物がある（特許文献３）。
【００１１】
一方、コンブ目コンブ科カジメ属のクロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ  ｋｕｒｏｍｅ）の抽出物は、β−グルクロニダーゼ阻害作用を有し、食品や化粧品に適用されること（特許文献４）、コンブ目スジメ科アナメ属のアナメ（Ａｇａｒｕｍ  ｃｌａｔｈｒａｔｕｍ、又は、Ａｇａｒｕｍ  ｃｒｉｂｒｏｓｕｍ）の抽出物は、養毛料組成物（特許文献５）や化粧料組成物（特許文献６）として用いられることが知られている。また、ヒバマタ目ホンダワラ科ホンダワラ属のホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｆｕｌｖｅｌｌｕｍ）の抽出物は、アポトーシス抑制作用（特許文献７）、毛乳頭細胞増殖促進作用（特許文献８）、メラニン生成抑制作用（特許文献９）を有することが知られており、皮膚外用剤や育毛剤、美白剤として用いることが提案されている。しかしながら、これらの海藻が、メラノサイトの分化自体に及ぼす影響については何ら知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００８−５６５８７号公報
【特許文献２】特開２００５−２８９９２２号公報
【特許文献３】特開２０１３−１０３９２７号公報
【特許文献４】特開２００６−０４５１８８号公報
【特許文献５】特開２００３−８１８６１号公報
【特許文献６】特開２０１７−０５２７０６号公報
【特許文献７】特開２００９−２４２３２５号公報
【特許文献８】特開２００７−１３１５７１号公報
【特許文献９】特開平１０−３３０２２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述のように、メラノサイトの分化自体を制御する因子の同定が根本的な色素異常症及びシミの解決のために重要である。
【００１４】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、幹細胞からメラノサイトへの分化抑制活性を有する素材を見出し、これまでにない根本的な色素異常症改善又は治療用組成物及びシミ改善用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するため、メラノーマ細胞や最終分化後のメラノサイト及びマッシュルーム由来チロシナーゼ等を用いて行う従来のスクリーニング系ではなく、メラノサイトの発生、分化、増殖及びメラニン合成の全てを試験管内(in vitro)で再現できる、幹細胞からメラノサイトへの分化誘導が可能なスクリーニング系を用いて幹細胞からメラノサイトへの分化自体を阻害する素材を探索した結果、クロメ、アナメ、及びホンダワラから選ばれる１種又は２種以上の海藻の抽出物が、幹細胞からメラノサイトへの分化を抑制する優れた効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）クロメ、アナメ、及びホンダワラから選ばれる１種又は２種以上の海藻の抽出物を有効成分として含有する、幹細胞からメラノサイトへの分化誘導抑制剤。
（２）（１）に記載の幹細胞からメラノサイトへの分化誘導抑制剤を含有する色素異常症改善又は治療用組成物。
（３）（１）に記載の幹細胞からメラノサイトへの分化誘導抑制剤を含有するシミ改善用組成物。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、幹細胞からメラノサイトへの分化誘導を顕著に抑制することでメラノサイトの分化を根本的に制御することができる。従って、本発明は、メラノサイトが関与する色素異常症及びシミの治療、予防及び改善の分野において大きく貢献できるものであり、医学、医薬品、医薬部外品、美容及び健康分野への応用が可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の幹細胞からメラノサイトへの分化誘導抑制剤（以下、「メラノサイト分化誘導抑制剤」という）は、クロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ  ｋｕｒｏｍｅ）、アナメ（Ａｇａｒｕｍ  ｃｌａｔｈｒａｔｕｍ、又は、Ａｇａｒｕｍ  ｃｒｉｂｒｏｓｕｍ）、及びホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｆｕｌｖｅｌｌｕｍ）から選ばれる１種又は２種以上の海藻の抽出物を有効成分として含有する。
【００１９】
本発明のメラノサイト分化誘導抑制剤によれば、幹細胞からメラノサイトへの分化を抑制することで、メラノサイトの分化を制御することができる。また、本発明のメラノサイト分化誘導抑制剤によれば、幹細胞からメラノサイトへの分化を制御することで、メラノサイトが関連する色素異常症及びシミ等の疾患を根本的に予防、改善及び治療することができる。さらに、幹細胞からメラノサイトへの分化を抑制するための研究用試薬として、本発明のメラノサイト分化誘導抑制剤を使用することもできる。
【００２０】
本発明に用いるクロメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ  ｋｕｒｏｍｅ）は、コンブ目コンブ科カジメ属の海藻で、主に本州太平洋岸の中南部から九州にかけて、および瀬戸内海、日本海側は新潟県以南に分布しており、藻体の大きさは４０−５０ｃｍで、大きいものは１ｍにもなり、主に食用として用いられている。
【００２１】
本発明に用いるアナメ（Ａｇａｒｕｍ  ｃｌａｔｈｒａｔｕｍ、又は、Ａｇａｒｕｍ  ｃｒｉｂｒｏｓｕｍ）は、コンブ目スジメ科アナメ属の海藻で、主に北海道一円に分布しており、無数の孔があいていることが特徴である。生育水深が深く、潜水しなければその姿を見ることはできない。
【００２２】
本発明に用いるホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｆｕｌｖｅｌｌｕｍ）は、ヒバマタ目ホンダワラ科ホンダワラ属の海藻で、主に九州から本州の太平洋沿岸の全面、日本海では越後付近まで分布している。藻体は披針形をしており、切れ込みがあるのが特徴である。
【００２３】
クロメ、アナメ、及びホンダワラは、それぞれ上記の生育地域から入手することができる。本発明において、上記海藻の抽出原料としては、海藻全体（全草）を使用することが好ましいが、その一部、例えば、葉部（葉体・成葉）、茎部（中芯・中肋）、胞子葉部、根部等であってもよい。また、抽出には、海藻本体をそのまま使用してもよく、乾燥、粉砕、細切等の処理を行ってもよい。
【００２４】
抽出方法は、特に限定されないが、水もしくは熱水、または水と有機溶媒の混合溶媒を用い、撹拌またはカラム抽出する方法により行うことができる。有機溶媒としては、アルコール類、エーテル類、エステル類などを用いることができるが、エタノール、メタノール、アセトン、ｎ−プロパノール、ｔ−ブタノール、プロピレングリコール、１，３ブチレングリコール等の水溶性有機溶媒が好ましく、これらの一種又は二種以上を用いてもよい。特に好ましい抽出溶媒としては、水、または水―エタノール系の混合極性溶媒が挙げられる。溶媒の使用量については、特に限定はなく、例えば上記海藻（乾燥重量）に対し、１０倍以上、好ましくは２０倍以上であればよいが、抽出後に濃縮を行ったり、単離したりする場合の操作の便宜上１００倍以下であることが好ましい。また、抽出温度や時間は、用いる溶媒の種類によるが、例えば、１０〜１００℃、好ましくは３０〜９０℃で３０分〜２４時間、好ましくは１〜１０時間を例示することができる。また、抽出物は、抽出した溶液のまま用いてもよいが、必要に応じて、その効果に影響のない範囲で、濃縮（有機溶媒、減圧濃縮、膜濃縮などによる濃縮）、希釈、濾過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理を行ってから用いてもよい。さらには、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いてもよい。
【００２５】
このようにして得られた海藻抽出物を本発明のメラノサイト分化誘導抑制剤の有効成分とする。本発明のメラノサイト分化誘導抑制剤は、医薬、医薬部外品、化粧料又は飲食品として使用することができる。また、上述のクロメ、アナメ、及びホンダワラから選ばれる１種又は２種以上の海藻の抽出物を、医薬、医薬部外品、化粧料又は飲食品の製造のために使用することもできる。特に、本発明のメラノサイト分化誘導抑制剤は、色素異常症改善若しくは治療用組成物又はシミ改善用組成物として、又は当該組成物の製造のために使用することができる。クロメ、アナメ、及びホンダワラの抽出物は、１種を用いてもよいが、２種又は３種を併用してもよい。クロメ、アナメ、及びホンダワラの抽出物を併用する場合、その組み合わせや混合比率は限定されない。
【００２６】
ここで、色素異常症としては、例えば対称性真皮メラノサイトーシス、肝斑、老人性色素斑、雀卵斑、Riehl黒皮症、摩擦黒皮症、遺伝性対側性色素異常症、Addison病、光線性花弁状色素斑、色素異常性固定紅斑等が挙げられる。
【００２７】
さらに、本発明のメラノサイト分化誘導抑制剤を医薬、医薬部外品、化粧料又は飲食品として利用する場合には、その取扱い説明書又はパッケージに、クロメ、アナメ、及びホンダワラから選ばれる１種又は２種以上の海藻の抽出物を含有し、メラノサイト分化誘導抑制活性を有することを特徴とする旨を表示することができる。
【００２８】
本発明のメラノサイト分化誘導抑制剤を、医薬又は医薬部外品として使用する場合には、剤形としては、特に限定されるものではないが、例えば、内服剤(錠剤、カプセル剤等)、外用剤(軟膏(クリーム)、水剤、エキス剤、ローション剤、乳剤等)並びに注射剤が挙げられる。当該医薬又は医薬部外品には、クロメ、アナメ、及びホンダワラから選ばれる１種又は２種以上の海藻の抽出物の他に、助剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、吸収促進剤及び界面活性剤等の薬学的に許容される担体を任意に組合せて配合することができる。
【００２９】
本発明のメラノサイト分化誘導抑制剤を化粧料として使用する場合には、剤形としては、特に限定されるものではないが、例えば、クリーム、ローション、フォーム、エッセンス、ファンデーション、パック、スティック及びパウダー等が挙げられる。当該化粧料には、クロメ、アナメ、及びホンダワラから選ばれる１種又は２種以上の海藻の抽出物の他に、化粧料成分として一般に使用されている油分、界面活性剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート剤、pH調整剤、防腐剤、増粘剤、色素類、香料等を任意に組合せて配合することができる。
【００３０】
本発明のメラノサイト分化誘導抑制剤におけるクロメ、アナメ、及びホンダワラから選ばれる１種又は２種以上の海藻の抽出物の配合量は、特に限定されるものではないが、全組成の0.00001〜10重量％とすることが好ましく、0.0001〜1重量％とすることが最も好ましい。全組成の0.00001重量％未満とすると、メラノサイト分化誘導抑制効果が十分に発揮されにくい場合がある。
【００３１】
以上に説明した本発明のメラノサイト分化誘導抑制剤を、ヒトを含めた動物に適用することで、幹細胞からメラノサイトへの分化誘導を抑制でき、また色素異常症又はシミを治療、予防又は改善することができる。本発明のメラノサイト分化誘導抑制剤の幹細胞からメラノサイトへの分化誘導抑制活性は、例えばメラノサイトマーカー遺伝子であるMitf-M(メラノサイト特異的小眼球症関連転写因子：Melanocyte-specific Microphthalmia-associated transcription factor)(Tachibana M. Pigment Cell Res.(2000)13(4):230-40.)及びTyrp1(チロシナーゼ関連タンパク質1：Tyrosinase-related protein 1)(Sarangarajan R, Boissy RE. Pigment Cell Res. (2001) 14(6):437-44.)の発現量により評価及び確認することができる。これらのメラノサイトマーカー遺伝子発現量の測定は、当業者に公知の任意の方法により行えばよい。例えば、mRNAレベルでは、上記メラノサイトマーカー遺伝子に特異的なプライマーやプローブを用いたRT-PCR、定量PCRやノーザンブロッティングによって行うことができ、タンパク質レベルでは、上記メラノサイトマーカー遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的な抗体を用いたELISA、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッテイング等の免疫学的方法によって行うことができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３３】
［実施例１］クロメ、アナメ、及びホンダワラの抽出物の製造例
クロメ、アナメ、及びホンダワラの各海藻の抽出物を以下のとおり製造した。製造例１〜１２において抽出材料には海藻の全藻を用いた。
【００３４】
（製造例１）クロメの熱水抽出物の調製
クロメの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの水を加え、９５〜１００℃で２時間抽出した。得られた抽出液を濾過し、そのろ液を濃縮し、凍結乾燥してクロメの熱水抽出物を２．１ｇ得た。
【００３５】
（製造例２）クロメの５０％エタノール抽出物の調製
クロメの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液に室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してクロメの５０％エタノール抽出物を１．１ｇ得た。
【００３６】
（製造例３）クロメのエタノール抽出物の調製
クロメの乾燥物１０ｇを２００ｍＬのエタノールに室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してクロメのエタノール抽出物を０．２ｇ得た。
【００３７】
（製造例４）クロメの１，３−ブチレングリコール（１，３−ＢＧ）抽出物の調製
クロメの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％（Ｖ／Ｖ）１，３−ＢＧ水溶液に室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過してクロメの１，３−ＢＧ抽出物を１９２ｇ得た。
【００３８】
（製造例５）アナメの熱水抽出物の調製
アナメの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの水を加え、９５〜１００℃で２時間抽出した。得られた抽出液を濾過し、そのろ液を濃縮し、凍結乾燥してアナメの熱水抽出物を２．０ｇ得た。
【００３９】
（製造例６）アナメの５０％エタノール抽出物の調製
アナメの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液に室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してアナメの５０％エタノール抽出物を１．０ｇ得た。
【００４０】
（製造例７）アナメのエタノール抽出物の調製
アナメの乾燥物１０ｇを２００ｍＬのエタノールに室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してアナメのエタノール抽出物を０．１ｇ得た。
【００４１】
（製造例８）アナメの１，３−ブチレングリコール（１，３−ＢＧ）抽出物の調製
アナメの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％（Ｖ／Ｖ）１，３−ＢＧ水溶液に室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過してアナメの１，３−ＢＧ抽出物を１９０ｇ得た。
【００４２】
（製造例９）ホンダワラの熱水抽出物の調製
ホンダワラの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの水を加え、９５〜１００℃で２時間抽出した。得られた抽出液を濾過し、そのろ液を濃縮し、凍結乾燥してホンダワラの熱水抽出物を２．０ｇ得た。
【００４３】
（製造例１０）ホンダワラの５０％エタノール抽出物の調製
ホンダワラの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液に室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してホンダワラの５０％エタノール抽出物を１．０ｇ得た。
【００４４】
（製造例１１）ホンダワラのエタノール抽出物の調製
ホンダワラの乾燥物１０ｇを２００ｍＬのエタノールに室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してホンダワラのエタノール抽出物を０．２ｇ得た。
【００４５】
（製造例１２）ホンダワラの１，３−ブチレングリコール（１，３−ＢＧ）抽出物の調製
ホンダワラの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％（Ｖ／Ｖ）１，３−ＢＧ水溶液に室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過してホンダワラの１，３−ＢＧ抽出物を１８５ｇ得た。
【００４６】
［実施例２］幹細胞からメラノサイトへのクロメ、アナメ、及びホンダワラの抽出物の分化誘導抑制効果の評価
以下に、実施例１で製造したクロメ、アナメ、及びホンダワラの抽出物を用いて、幹細胞からメラノサイトへの分化誘導抑制効果を評価し、クロメ、アナメ、及びホンダワラの抽出物のメラノサイト分化誘導抑制剤としての効果について確認した。
【００４７】
１．実験例１  クロメ、アナメ、及びホンダワラの抽出物の幹細胞からメラノサイトへの分化誘導抑制効果の評価(メラニン定量試験)
本実験例では、過去に山根らが開発したマウスES細胞からのメラノサイト分化誘導系(Yamane T., Hayashi S., Mizoguchi M., Yamazaki H., Kunisada T., Developmental Dynamics, 1999年, Vol. 216, Issue 4-5, pp. 450-458)を用いて、クロメ、アナメ、及びホンダワラ抽出物の効果を検討した。本誘導系を用いることで、メラノサイトの発生から成熟までの全ての段階において素材の評価を行うことが可能となる。以下に詳細を説明する。
【００４８】
35mmシャーレにMMC処理したMEFをコンフルエントの状態で培養し、その上にマウスES細胞を1×105〜2×105個播種し、37℃において5％CO2インキュベーターで前培養した。使用した培地は、DMEMにchemicon社製のES細胞用添加因子(L-グルタミン液、2-メルカプトエタノール液、ヌクレオシド液、非必須アミノ酸液及びESGRO)を推奨濃度で添加した後、FBSを15％添加したものであった。
【００４９】
次いで、ST2細胞を24wellプレート上でコンフルエントになるまで培養し、そこにMEFから分離した上述の培養ES細胞を250〜500個播種した。当該培養物を、α-MEMに10％ FBS、100nM DEX、20pM bFGF、10pM CT及び100ng/mL EDN3を添加した分化誘導培地で培養し、ES細胞をメラノサイトへ分化誘導した。顕微鏡観察により、誘導後6日目にはST2細胞上に形成されたES細胞のコロニーが広がり始め、18日目前後でコロニーの周りにメラノサイトが出現した。誘導後24日目までに、出現したメラノサイトがさらにメラニン合成を行う様子が観察された。以上より、本誘導系を用いることにより、メラノサイトの発生、分化及びメラニン合成の全てを再現できることを確認した。
【００５０】
本誘導系において、上述の分化誘導培地に濃度10μg/mLでクロメ、アナメ、及びホンダワラの抽出物を継続して添加し、24日間の分化誘導を実施した。その後、Cell Counting Kit-8を用いて相対細胞数を定量した。一方、細胞数定量後、細胞をPBS(-)で3回洗浄した後、2N NaOHを用いて60℃で2時間溶解し、溶解物について475nmの吸光度を測定した。その結果、細胞数当たりのメラニン合成量は濃度依存的に減少した。
これらの試験結果を以下の表１に示す。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
表１に示すように、クロメ、アナメ、及びホンダワラの抽出物(製造例１〜１２）に、顕著なメラノサイト分化誘導抑制効果が認められた。以上より、クロメ、アナメ、及びホンダワラの抽出物が極めて優れた幹細胞からのメラノサイト分化誘導抑制効果を有することが明らかとなり、クロメ、アナメ、及びホンダワラの抽出物のメラノサイト分化誘導抑制剤としての効果を確認した。
【００５３】
２．実験例２  クロメ、アナメ、及びホンダワラの抽出物の幹細胞からメラノサイトへの分化誘導抑制効果の評価(遺伝子発現解析)
試験例１と同様に、マウスES細胞からメラノサイトへの分化誘導を実施し、メラノサイトへの分化効率についてメラノサイトの特異的マーカー遺伝子(Mitf-M及びTyrp1）の発現を指標に評価した。
【００５４】
具体的には、上述の分化誘導培地に10μg/mLの濃度でクロメ、アナメ、及びホンダワラの抽出物を継続して添加し、24日間の分化誘導を実施した。分化誘導24日目において、細胞を回収し、PBS(-)にて2回洗浄し、Trizol Reagent(Invitrogen)によって細胞からRNAを抽出した。次いで、2-STEPリアルタイムPCRキット(Applied Biosystems)を用いて、抽出したRNAをcDNAに逆転写した後、ABI7300(Applied Biosystems)により、得られたcDNAをテンプレートとして、下記の各プライマーセットを用いたリアルタイムPCR(95℃：15秒間、60℃：30秒間、40cycles)を実施した。その他の操作は定められた方法に従って実施した。
【００５５】
Mitf-M用のプライマーセット：
5'-TGCCTTGTTTATGGTGCCTTCT-3'(配列番号１)、及び
5'-TCCCTCTACTTTCTGTAATTCCAATTC-3'(配列番号２)
Tyrp1用のプライマーセット：
5'-CAACGCTATGCTGAGGACTATGA-3'(配列番号３)、及び
5'-GCGGCTATCAGACCATGGA-3'(配列番号４)
Gapdh用のプライマーセット：
5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'(配列番号５)、及び
5'-TCTTCTGGGTGGCAGTGATG-3'(配列番号６)
【００５６】
各細胞のメラノサイトへの分化誘導効率については、クロメ、アナメ、及びホンダワラの抽出物を添加せずに分化誘導した細胞におけるメラノサイトマーカー遺伝子(Mitf-M及びTyrp1）の発現量を内部標準であるGapdh mRNAの発現量に対する割合として算出したメラノサイト特異的マーカー遺伝子相対発現量の値を100とし、これに対し、クロメ、アナメ、及びホンダワラの抽出物を添加して分化誘導した各細胞におけるメラノサイト特異的マーカー遺伝子相対発現量の値を算出し、評価した。
その結果を下記の表２に示す。
【００５７】
【表２】
2019006745.tif 000003
【００５８】
表２に示すように、クロメ、アナメ、及びホンダワラの抽出物は顕著なメラノサイト分化誘導抑制効果を示した。一方で、従来の美白剤であるアルブチンは、メラノサイト分化誘導抑制効果を示さなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のメラノサイト分化誘導抑制剤によれば、色素異常症及びシミを治療、予防及び改善することができる。例えば、本発明において見出されたクロメ、アナメ、及びホンダワラから選ばれる１種又は２種以上の海藻の抽出物を用いることにより根本からの色素異常症及びシミの解決に繋がる。本発明で見出されたクロメ、アナメ、及びホンダワラから選ばれる１種又は２種以上の海藻の抽出物を経口投与、皮膚への直接注入、塗布、貼付等により導入することで、組織に存在する未分化細胞のメラノサイトへの分化を抑制させることができる。従って、本発明は、色素異常症やシミの治療及び／又は予防用の医薬品、医薬部外品、化粧品の製造分野において利用できる。
【配列表】
2019006745000001.app