(57)【要約】      （修正有）【課題】ペントラキシン３（ＰＴＸ３）とインターαインヒビター（ＩαＩ）の重鎖１（ＨＣ１）を含む天然の再構成されたヒアルロナン（ＨＡ）複合体を生成するための方法、及び複合体を含む組成物と複合体を用いる治療方法の提供。【解決手段】組織再生を誘導または促進するための製剤の製造における、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体又は、単離された天然型ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、の使用。前記組織は、骨、歯ぐき、角膜の組織、皮膚、神経、軟組織、又は結膜の組織である、前記使用。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体を生体外で生成する方法であって、
固定化したｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を形成するために、（ｉ）固形の支持体に固定した高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、（ｉｉ）ペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）タンパク質、（ｉｉｉ）重鎖１（ＨＣ１）を含むインターαインヒビター（ＩαＩ）タンパク質、および、（ｉｖ）腫瘍壊死因子αで刺激された遺伝子６（ＴＳＧ−６）を接触させる工程を含む、方法。
【請求項２】
（ａ）ＰＴＸ３とＨＭＷ  ＨＡの固定化した複合体（固定化したＰＴＸ３／ＨＡ）を形成するために、（ｉ）固形の支持体に固定化した高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）と、（ｉｉ）ペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）タンパク質を接触させる工程、および、
（ｂ）固定化したｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を形成するために、重鎖１（ＨＣ１）を含むインターαインヒビター（ＩαＩ）タンパク質と、腫瘍壊死因子αで刺激した遺伝子６（ＴＳＧ−６）とに、固定化したＰＴＸ３／ＨＡを接触させる工程、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）ＴＳＧ−６にあらかじめ結合したｒｃＨＣ−ＨＡ複合体を形成するために、（ｉ）固形の支持体に固定された高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、（ｉｉ）重鎖１（ＨＣ１）を含むインターαインヒビター（ＩαＩ）タンパク質、および、（ｉｉｉ）ＴＳＧ−６を接触させる工程、および、
（ｂ）ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を形成するために、ＴＳＧ−６にあらかじめ結合したｒｃＨＣ−ＨＡ複合体を、ペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）タンパク質に接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＴＳＧ−６は、ＨＡとのＩαＩ  ＨＣ１の共有結合を触媒する、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）の後で、かつ、工程（ｂ）を行う前に、結合していないＰＴＸ３タンパク質を取り除く工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）の後に、結合していないＴＳＧ−６を取り除く工程をさらに含む、請求項２乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＰＴＸ３タンパク質は、天然のＰＴＸ３タンパク質または組み換えのＰＴＸ３タンパク質であり、ＴＳＧ−６タンパク質は、天然のＴＳＧ−６タンパク質または組み換えのＴＳＧ−６タンパク質である、請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＩαＩタンパク質はＨＣ２、ビクニン、コンドロイチン硫酸鎖、または、これらの組み合わせをさらに含む、請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＩαＩタンパク質は、血液、血漿、血清、羊膜、絨毛膜、羊水、またはその組み合わせから単離される、請求項１乃至８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＩαＩタンパク質、天然のＴＳＧ−６タンパク質、および／または、天然のＰＴＸ３タンパク質は、羊膜細胞から生成される、請求項７乃至９に記載の方法。
【請求項１１】
羊膜細胞は、羊膜の上皮細胞、臍の緒の上皮細胞、羊膜の間質細胞、または、臍の緒の間質細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＴＸ３タンパク質はホモ多量体である、請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ＰＴＸ３ホモ多量体は八量体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＴＸ３は、修飾された多量体化ドメインまたは異種起源の多量体化ドメインを含む、請求項１乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＰＴＸ３、ＩαＩ  ＨＣ１、またはＴＳＧ−６のポリペプチドは、アフィニティタグを含む、請求項１乃至１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
親和性タグは、ヘマグルチニンタグ、ポリ−ヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）タグの中から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＩαＩとＴＳＧ−６のタンパク質は３：１のモル比で接触する、請求項１乃至１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ＨＭＷ  ＨＡの重量平均分子量は３，０００ｋＤａである、請求項１乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ＨＭＷ  ＨＡは固形の支持体に直接結合によって固定される、請求項１乃至１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ＨＭＷ  ＨＡは固形の支持体に間接結合によって固定される、請求項１乃至１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ＨＭＷ  ＨＡは、切断可能なリンカーを介して固形の支持体に対する結合によって固定化される、請求項１乃至１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
切断可能なリンカーは、化学的に、または、酵素的に切断可能なリンカーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＨＭＷ  ＨＡは、固形の支持体に共有結合または非共有結合によって固定化される、請求項１乃至１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ＨＭＷ  ＨＡは、中間ポリペプチドにＨＭＷ  ＨＡを結合することによって固定化される、請求項１乃至１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
中間ポリペプチドは、固形の支持体に共有結合される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＨＭＷ  ＨＡは、非共有結合によって中間ポリペプチドに結合される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
中間ポリペプチドはＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）である、請求項２４乃至２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
ＨＡＢＰは、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、ＴＳＧ−６、ＣＤ４４、スタビリン−１、スタビリン−２、または、ＨＡと結合するのに十分なこれらの一部の中から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＨＡＢＰはバーシカンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
中間ポリペプチドはリンクモジュールを含む、請求項２４乃至２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
リンクモジュールは、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、ＴＳＧ−６、ＣＤ４４、スタビリン−１、またはスタビリン−２のリンクモジュールである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
中間ポリペプチドはポリペプチドリンカーを含む、請求項２４乃至３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
ポリペプチドリンカーは固形の支持体に結合する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
中間ポリペプチドはタンパク質切断配列を含む、請求項２４乃至３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
解離したｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を形成するために、固定化したｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を解離する工程をさらに含む、請求項１乃至２２のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
固定化したｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体からの解離は、切断リンカーの切断を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
固定化したｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の解離は、複合体を解離剤と接触させる工程を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
解離剤は、塩酸グアニジンまたは尿素である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
解離したｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を精製する工程をさらに含む、請求項３５乃至３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
精製は、アフィニティ精製、遠心分離、ろ過、クロマトグラフィー、またはその組み合わせを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
固定化したＰＴＸ３／ＨＡ複合体またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を、小ロイシン豊富なプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）に接触させる工程をさらに含む、請求項１乃至４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
ＳＬＲＰは、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、ＰＲＥＬＰ（プロリンアルギニン豊富な末端を有するロイシン豊富なタンパク質）、ケラトカン、オステオアドへリン、エピピカン、および、オステオグリシンの中から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＳＬＲＰは、デコリン、バイグリカン、および、オステオグリシンの中から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
ＳＬＲＰは、グリコサミノグリカンに共有結合する、請求項４１乃至４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
グリコサミノグリカンは硫酸ケラタンである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項１乃至４５の方法によって生成された再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体。
【請求項４７】
（ｉ）高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、（ｉｉ）ペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）タンパク質、および、（ｉｉｉ）重鎖１（ＨＣ１）を含むインターαインヒビター（ＩαＩ）タンパク質を含む、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体。
【請求項４８】
固形の支持体に固定した請求項４７のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３。
【請求項４９】
羊膜抽出物または臍の緒の抽出物から精製された、単離した天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体。
【請求項５０】
羊膜抽出物または臍の緒の抽出物は、羊膜、臍の緒の羊膜、臍の緒の間質、または、その組み合わせから調製される、請求項４９に記載の単離した天然のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体。
【請求項５１】
ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、羊膜抽出物または臍の緒の抽出物の超遠心分離によって精製される、請求項４９または５０に記載の単離した天然のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体。
【請求項５２】
羊膜抽出物または臍の緒の抽出物は、非水溶性の抽出物である、請求項５１に記載の単離した天然のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体。
【請求項５３】
非水溶性の抽出物は塩酸グアニジンを用いて抽出される、請求項５２に記載の単離した天然のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体。
【請求項５４】
小ロイシン豊富なプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）をさらに含む、請求項５１乃至５３のいずれかに記載の単離した天然のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体。
【請求項５５】
ＳＬＲＰは、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、ＰＲＥＬＰ（プロリンアルギニン豊富な末端を有するロイシン豊富なタンパク質）、ケラトカン、オステオアドへリン、エピピカン、および、オステオグリシンの中から選択される、請求項５４に記載の単離した天然のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体。
【請求項５６】
ＳＬＲＰは、デコリン、バイグリカン、および、オステオグリシンの中から選択される、請求項５４に記載の単離した天然のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体。  
【請求項５７】
ＳＬＲＰは、グリコサミノグリカンに共有結合する、請求項５４乃至５６のいずれかに記載の単離した天然のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体。
【請求項５８】
グリコサミノグリカンは硫酸ケラタンである、請求項５７に記載の単離した天然のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体。
【請求項５９】
羊膜抽出物または臍の緒の抽出物は、水溶性の抽出物である、請求項４９乃至５１のいずれかに記載の単離した天然のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体。
【請求項６０】
水溶性の抽出物は等張塩溶液で抽出される、請求項５９に記載の単離した天然のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体。
【請求項６１】
等張塩溶液はＰＢＳである、請求項６０に記載の単離した天然のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体。
【請求項６２】
複合体がマクロファージのＭ２極性化を促す、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体。
【請求項６３】
（ｉ）ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ中のＩＬ−１２ｐ４０の発現を減少させ、ＬＰＳで刺激したマクロファージによって発現されたＩＬ−１２ｐ４０の値は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の不在下でＬＰＳで刺激したマクロファージによって発現されたＩＬ−１２ｐ４０の値と比較すると、ＬＰＳで刺激したマクロファージにｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体が接触した際の方が一層低く、
（ｉｉ）ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ中のＩＬ−１２ｐ７０タンパク質の発現を減少させ、ＬＰＳで刺激したマクロファージによって発現されたＩＬ−１２ｐ７０タンパク質の量は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の不在下でＬＰＳで刺激したマクロファージによって発現されたＩＬ−１２ｐ７０タンパク質の量と比較すると、ＬＰＳで刺激したマクロファージにｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体が接触した際の方が一層低く、
（ｉｉｉ）ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ中のＩＬ−２３の発現を減少させ、ＬＰＳで刺激したマクロファージによって発現されたＩＬ−２３の値は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の不在下でＬＰＳで刺激したマクロファージによって発現されたＩＬ−２３の値と比較すると、ＬＰＳで刺激したマクロファージにｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体が接触した際の方が一層低く、
（ｉｖ）ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ中のＩＬ−１０の発現を増加させ、ＬＰＳで刺激したマクロファージによって発現されたＩＬ−１０の値は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の不在下でＬＰＳで刺激したマクロファージによって発現されたＩＬ−１０の値と比較すると、ＬＰＳで刺激したマクロファージにｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体が接触した際の方が一層高く、
（ｖ）ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＬＰＳで刺激された好中球のアポトーシスを促し、ＬＰＳで刺激された好中球のサンプル中でアポトーシス性のＬＰＳで刺激された好中球の数は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の不在下で、サンプル中でアポトーシス性のＬＰＳで刺激された好中球の数と比較すると、サンプルがｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に接触する際の方が多く、
（ｖｉ）ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、アポトーシス性の好中球の貪食を促進し、アポトーシス性の好中球のサンプル中のＬＰＳで刺激されたまたは休止したマクロファージと、ＬＰＳで刺激されたマクロファージとによって貪食されるアポトーシス性の好中球の数は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下で、サンプル中のＬＰＳ刺激されたマクロファージによって貪食される好中球の数と比較すると、サンプルがｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に接触する際の方が多い、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体。
【請求項６４】
（ｉ）ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＩＬ−１２ｐ４０ｍＲＮＡまたはＩＬ−１２ｐ４０タンパク質のレベルを減少させ、
（ｉｉ）ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＩＬ−１２ｐ７０タンパク質のレベルを減少させ、
（ｉｉｉ）ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＩＬ−２３ｍＲＮＡまたはＩＬ−２３タンパク質のレベルを減少させ、
（ｉｖ）ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＩＬ−１０ｍＲＮＡまたはＩＬ−１０タンパク質のレベルを増加させ、あるいは、
（ｉ）乃至（ｉｖ）の任意の組み合わせである、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体。
【請求項６５】
複合体は、ヒトの羊膜から単離した天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）と少なくとも同じレベルに達するまで、ＬＰＳで刺激されたマクロファージの結合を促進し、結合は、固形の支持体に固定されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３または単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体に、ＬＰＳで刺激されたマクロファージを接触させることを含む、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体。
【請求項６６】
マクロファージのＭ２極性化を誘導する方法であって、
ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３または単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体に、ＬＰＳで刺激されたマクロファージを接触させる工程を含む、方法。
【請求項６７】
ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３または単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３または単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体に、ＬＰＳで刺激されたマクロファージを接触させる工程は、
（ｉ）マクロファージによって発現されたＩＬ−１２ｐ４０のレベルを減少させ、
（ｉｉ）マクロファージによって発現されたＩＬ−１２ｐ７０のレベルを減少させ、
（ｉｉｉ）マクロファージによって発現されたＩＬ−２３のレベルを減少させ、あるいは、
（ｉｖ）マクロファージによって発現されたＩＬ−１０のレベルを増加させ、
（ｖ）ＬＰＳで刺激された好中球のアポトーシスを誘導し、
（ｖｉ）アポトーシス性の好中球の貪食を促し、または、
（ｉ）乃至（ｖｉ）の任意の組み合わせを含む、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、および、薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項７０】
フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノゲン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項６９に記載の医薬組成物
【請求項７１】
抗炎症剤、抗瘢痕剤、抗腫瘍薬、化学療法剤、免疫抑制剤、細胞毒性薬、抗菌剤、またはその組み合わせをさらに含む、請求項６９または７０に記載の医薬組成物。
【請求項７２】
医薬組成物は、溶液、懸濁液、ゲル、粉末、軟膏、錠剤、カプセル、またはエアロゾルである、請求項６９乃至７１のいずれかに記載の医薬組成物。  
【請求項７３】
ゲルは架橋ゲルまたはリポソームである、請求項７２に記載の医薬組成物。
【請求項７４】
ゲルは架橋ヒアルロナンヒドロゲルである、請求項７２に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
組織内の瘢痕形成または繊維症を予防するまたは逆行させるための、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の有効な量の使用であって、
請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の有効な量に、組織を接触させる工程を含む、使用。
【請求項７６】
瘢痕は、皮膚炎の瘢痕、ケロイド瘢痕、痙縮瘢痕、肥厚性瘢痕、ざ瘡に由来する瘢痕である、請求項７５に記載の使用。
【請求項７７】
被験体の炎症を防ぐまたは減少させるための、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の有効な量の使用。
【請求項７８】
炎症は急性炎症または慢性炎症である、請求項７７に記載の使用。
【請求項７９】
炎症は、マクロファージ媒介性の炎症性疾患、Ｔｈ−１７−媒介性の免疫障害、または、Ｔ細胞媒介性の炎症性疾患である、請求項７７または７８に記載の使用。
【請求項８０】
炎症は、自己免疫疾患、アレルギー、白血球欠損、感染症、移植片対宿主病、組織移植拒絶反応、またはその組み合わせに関連付けられる、請求項７７乃至７９のいずれかに記載の使用。
【請求項８１】
炎症は関節リウマチに関連付けられる、請求項７７乃至７９のいずれかに記載の使用。
【請求項８２】
炎症は、結膜炎、角膜炎、眼瞼炎、眼瞼結膜炎、強膜炎、上強膜炎、ぶどう膜炎、網膜炎、または脈絡膜炎に関連付けられる、請求項７７乃至７９のいずれかに記載の使用。
【請求項８３】
炎症は、心筋梗塞、脳卒中、エンドトキシンショック、または敗血症に関連付けられる、請求項７７乃至７９のいずれかに記載の使用。
【請求項８４】
炎症はアテローム性動脈硬化に関連付けられる、請求項７７乃至７９のいずれかに記載の使用。
【請求項８５】
被験体は癌を患っている、請求項７７乃至７９のいずれかに記載の使用。
【請求項８６】
被験体への追加の抗炎症剤と併せて投与するための、請求項７７乃至８５のいずれかに記載の使用。
【請求項８７】
追加の抗炎症剤は、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＴＧＦ−β受容体遮断抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＴＮＦ受容体遮断抗体、抗ＩＬ１β抗体、抗ＩＬ１β受容体遮断抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ２受容体遮断抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ６受容体遮断抗体、抗ＩＬ１２抗体、抗ＩＬ１２受容体遮断抗体、抗ＩＬ１７抗体、抗ＩＬ１７受容体遮断抗体、抗ＩＬ２３抗体、または、抗ＩＬ２３受容体遮断抗体の中から選択される、請求項８６に記載の使用。
【請求項８８】
１型インターフェロンは、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βである、請求項８７に記載の使用。
【請求項８９】
被験体の皮膚創傷または潰瘍を処置するための、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の有効な量の使用。
【請求項９０】
皮膚創傷または潰瘍は、非治癒性である、請求項８９に記載の使用。
【請求項９１】
被験体の骨形成を促進するまたは引き起こすための、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の有効な量の使用。
【請求項９２】
被験体は、関節炎、骨粗鬆症、歯槽骨の劣化、パジェット病、または骨腫瘍を患っている、請求項９１に記載の使用。
【請求項９３】
被験体の望ましくない血管新生を防ぐまたは減少させるための、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の有効な量の使用。
【請求項９４】
望ましくない血管新生は、滲出型加齢黄斑変性（ｗＡＲＭＤ）または糖尿病性の増殖網膜症に関連付けられる、請求項９３に記載の使用。
【請求項９５】
望ましくない血管新生は、癌に関連付けられる、請求項９３に記載の使用。
【請求項９６】
被験体は固形腫瘍を患っている、請求項９３に記載の使用。
【請求項９７】
抗癌治療とともに投与するための、請求項９５または９６のいずれかに記載の使用。
【請求項９８】
抗癌治療は、抗腫瘍薬、細胞毒性薬、抗血管新生薬、化学療法剤の投与、または、放射線療法を含む、請求項９７に記載の使用。
【請求項９９】
移植レシピエントでの移植拒絶反応を防ぐための、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の有効な量の使用。
【請求項１００】
移植手順の前、移植手順の後、または移植手順中に、投与するための、請求項９９に記載の使用。
【請求項１０１】
免疫抑制剤と組み合わせて投与するための、請求項９９または１００に記載の使用。
【請求項１０２】
被験体の幹細胞の拡張を引き起こす方法であって、有効な量の、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に、幹細胞を生体外で接触させる工程を含む、方法。
【請求項１０３】
被験体に細胞治療を施すために、治療用細胞と組み合わせた、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の有効な量の使用。
【請求項１０４】
ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、および、治療用細胞に、損傷を受けた細胞を接触させる工程をさらに含む、請求項１０３に記載の使用。
【請求項１０５】
ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、および、治療用細胞は、１つの組成物で、または、別々の組成物で、調剤される、請求項１０３に記載の使用。
【請求項１０６】
治療用細胞はマイクロカプセルに入れられる、請求項１０３に記載の使用。
【請求項１０７】
ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、マイクロカプセルに結合する、請求項１０４に記載の使用。
【請求項１０８】
治療用細胞は幹細胞である、請求項１０３乃至１０７のいずれかに記載の使用。
【請求項１０９】
治療用細胞は成体幹細胞または誘導多能性幹細胞である、請求項１０８に記載の使用。
【請求項１１０】
治療用細胞は角膜縁上皮前駆細胞、角膜縁間質ニッチ細胞、臍の緒の幹細胞、羊膜幹細胞、または脂肪の幹細胞である、請求項１０８に記載の使用。
【請求項１１１】
治療用細胞は分化細胞である、請求項１０３乃至１０８に記載の使用。
【請求項１１２】
治療用細胞はインスリン産生細胞である、請求項１０３乃至１０８に記載の使用。
【請求項１１３】
インスリン産生細胞は島細胞である、請求項１１２に記載の使用。
【請求項１１４】
被験体は１型糖尿病を患っている、請求項１１２または１１３に記載の使用。
【請求項１１５】
被験体の組織再生を引き起こすまたは促進するための、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の有効な量の使用。
【請求項１１６】
組織は、骨または歯ぐき、角膜の組織、または、結膜の組織である、請求項１１５に記載の使用。
【請求項１１７】
治療用細胞または組織移植片と組み合わせて投与するための、請求項１１５または１１６に記載の使用。
【請求項１１８】
組織移植片は同種移植片または自家移植片である、請求項１１７に記載の使用。
【請求項１１９】
被験体のＭ１脂肪組織マクロファージの量を抑制するまたは減少させるための、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の有効な量の使用。
【請求項１２０】
被験体は、肥満またはインスリン抵抗性であると診断される、請求項１１９に記載の使用。
【請求項１２１】
被験体の結膜弛緩症を処置するための、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の有効な量の使用。
【請求項１２２】
細胞を培養するのに適した基質と、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体とを含む、細胞培養物。
【請求項１２３】
ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、基質に固定化される、請求項１２２に記載の細胞培養物。
【請求項１２４】
請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体でコーティングした基質を含む、医療装置。
【請求項１２５】
基質は、ステント、ジョイント、ねじ、ロッド、ピン、プレート、留め金、シャント、鉗子、クリップ、縫合糸、縫合糸アンカー、電極、カテーテル、リード線、移植片、包帯材、ペースメーカー、ペースメーカーの筐体、電気除細動器、電気除細動器の筐体、除細動器、除細動器の筐体、装具、耳のドレナージ管、眼の移植組織、整形外科装置、椎間板、骨の代用品、吻合装置、血管周囲用包装材料、結腸瘻バッグ取り付け装置、止血バリア、血管移植片、血管支持部、組織接着剤、組織シーラント、組織スキャフォールド、および、腔内の装置の少なくとも１つを含む、請求項１２４に記載の医療装置。
【請求項１２６】
基質は、マイクロカプセル、ナノ粒子、または、ビーズである、請求項１２４に記載の医療装置。
【請求項１２７】
マイクロカプセルは幹細胞を含む、請求項１２６に記載の医療装置。
【請求項１２８】
基質はコンタクトレンズである、請求項１２４に記載の医療装置。
【請求項１２９】
基質は手術移植片または装具である、請求項１２４に記載の医療装置。
【請求項１３０】
移植組織片または装具は、人工関節、骨インプラント、縫合糸、またはステントである、請求項１２９に記載の医療装置。
【請求項１３１】
人工関節は、人工股関節、人工膝、人工の肩関節、または人工膝である、請求項１３０に記載の医療装置。
【請求項１３２】
ステントは、冠動脈ステント、尿管ステント、尿道ステント、前立腺ステント、食道ステント、または骨ステントである、請求項１３０に記載の医療装置。
【請求項１３３】
ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体または単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、細菌性バイオフィルムの形成を阻害する、請求項１２４乃至１３２のいずれかに記載の医療装置。
【請求項１３４】
マクロファージ活性を調節するための方法であって、
（ｉ）ＩＬ−１２またはＩＬ−２３の発現を減少させるまたは阻害するか、または、（ｉｉ）ＩＬ−１０の発現を促進するのに十分な量の、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に、マクロファージを接触させる工程を含む、方法。
【請求項１３５】
マクロファージは炎症誘発性メディエーターで刺激された、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
炎症誘発性メディエーターは、リポ多糖類（ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮγ）、または、これらの組み合わせである、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体または単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、生体外でマクロファージに接触する、請求項１３４乃至１３６のいずれかに記載の方法。
【請求項１３８】
請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、組成物を投与するための装置、および、随意に投与の説明書を含む、キット。
【請求項１３９】
細胞の多能性を誘導するまたは維持するための方法であって、
ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を含む細胞を培養する工程を含み、それによって、細胞の多能性を誘導するまたは維持する、方法。
【請求項１４０】
細胞は、Ｓｏｘ２、ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、および、ＫＬＦ４の中から選択されたタンパク質を異種発現する、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
細胞は、Ｓｏｘ２、ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、および、ＫＬＦ４の中から選択された１つ、２つ、または３つのタンパク質を異種発現する、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は固定される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４３】
細胞は成体の分化細胞である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４４】
細胞は線維芽細胞である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４５】
細胞は、ヒトの角膜の線維芽細胞である、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
細胞は、成体幹細胞、または、誘導多能性幹細胞である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４７】
細胞は、角膜縁上皮前駆細胞、角膜縁間質ニッチ細胞、臍の緒の幹細胞、羊膜幹細胞、または脂肪の幹細胞である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４８】
ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、請求項４６乃至４８のいずれかに記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、または、請求項４９乃至６１のいずれかに記載の単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体である、請求項１３９乃至１４７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１２年６月１１日に出願された米国特許出願第６１／６７０，５７１号の利益を主張し、該文献は全体として引用されることで本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（連邦政府の支援する研究または開発に関する報告）
本明細書に記載の作業に関する財政的援助は、米国メリーランド州ベテスダの国立眼学研究所、国立衛生研究所からの連邦政府の研究助成金ＲＯ１  ＥＹ０６８１９、Ｒ４４  ＥＹ０１７４９７、および、Ｒ４３  ＥＹ０２１０４５から一部提供された。
【０００３】
（ＥＦＳ−ウェブを介してテキストファイルとして提出された配列表の引用による取り込み）
本出願は配列表を包含しており、配列表は、ＥＦＳ−ＷｅｂによってＡＳＣＩＩフォーマットのコンピューターで読み取り可能なテキストファイルとして提出されており、本明細書で引用することで全体として組み込まれる。２０１３年７月８日に作成されたテキストファイルは、３４１５７−７３２−６０１ＳＥＱ．ｔｘｔと命名され、４６２ＫＢの大きさである。
【背景技術】
【０００４】
羊膜（ＡＭ）は、胎児を囲む羊水で満たされる無血管膜状の嚢である。ＡＭは、胎盤のように、受精卵が発達する間に形成される胚盤葉上層に由来する。ＡＭは羊膜腔で胎児を囲む最も内側の膜を形成する。胎盤の哺乳動物では、臍の緒（すなわち、臍帯）は発育段階の胎児を胎盤につなげている。臍の緒は羊膜（ＵＣＡＭ）とワルトンゼリーから構成される。羊膜は臍の緒の外側層を形成する。ＵＣＡＭはＵＣ内の液圧を調節するように機能する。ワルトンゼリーは、主にムコ多糖（ヒアルロン酸とコンドロイチン硫酸）から構成された、臍の緒の内部のゼラチン状の物質である。これはいくつかの繊維芽細胞とマクロファージも含んでいる。臍の緒は、ワルトンゼリー内に埋まっている２つの動脈（臍動脈）と１つの静脈（臍静脈）をさらに含む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書には、羊膜と臍の緒のような胎児の組織中のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を特定するための方法が記載されている。さらに、本明細書には、羊膜と臍の緒のような胎児の組織から天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を単離する方法が記載されている。さらに、本明細書には、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を生成するための方法が記載されている。さらに、本明細書には、本明細書で提供される天然で再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体本明細書で提供されたものの使用のための方法である。
【０００６】
本明細書には、特定の実施形態において、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を生成する方法が記載されている。いくつかの実施形態では、方法は、組織または細胞から調製された抽出物から天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体を単離する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体を生成する工程を含む。
【０００７】
本明細書には、特定の実施形態において、臍の緒または羊膜のような羊膜組織から天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体を分離する方法が記載されている。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は単離細胞から単離される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、培養細胞から単離される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、幹細胞から単離される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、臍の緒または羊膜のような組織から調製された抽出物の水溶性画分から単離される。いくつかの実施形態では、水溶性画分は等張塩溶液で抽出される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、臍の緒または羊膜のような組織から調製された抽出物の非水溶性画分から分離される。いくつかの実施形態では、非水溶性画分は、ＧｎＨＣｌで抽出される。
【０００８】
本明細書には、特定の実施形態において、生体外で再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）を生成する方法が記載されており、該方法は、（ａ）ＰＴＸ３とＨＭＷ  ＨＡの固定化した複合体（固定化したＰＴＸ３／ＨＡ）を形成するために、（ｉ）固形の支持体に固定化した高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）と、（ｉｉ）ペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）タンパク質を接触させる工程、および、（ｂ）固定化したｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を形成するために、重鎖１（ＨＣ１）を含むインターαインヒビター（ＩαＩ）タンパク質と、腫瘍壊死因子αで刺激した遺伝子６（ＴＳＧ−６）とに、固定化したＰＴＸ３／ＨＡを接触させる工程、を含む。いくつかの実施形態では、該方法の工程（ａ）と（ｂ）は、順番に連続して行われる。方法のいくつかの実施形態において、方法は、ペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）タンパク質、重鎖１（ＨＣ１）を含むインターαインヒビター（ＩαＩ）タンパク質、および、腫瘍壊死因子αで刺激した遺伝子６（ＴＳＧ−６）に、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）を同時に接触させる工程を含む。方法のいくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６は、ＨＡとのＩαＩ  ＨＣ１の共有結合を触媒する。いくつかの実施形態では、方法は、工程（ａ）の後で、かつ、工程（ｂ）を行う前に、結合していないＰＴＸ３タンパク質を取り除く工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、工程（ｂ）の後に、結合していないＴＳＧ−６を取り除く工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法で使用されるＰＴＸ３タンパク質は、細胞から単離した天然のＰＴＸ３タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒトの細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は羊膜細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は臍の緒の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は臍の緒からの羊膜細胞である。いくつかの実施形態において、羊膜細胞は羊膜の上皮細胞である。いくつかの実施形態では、羊膜細胞は臍の緒の上皮細胞である。いくつかの実施形態において、羊膜細胞は羊膜の間質細胞である。いくつかの実施形態では、羊膜細胞は臍の緒の間質細胞である。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３タンパク質は、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、方法で使用されるＰＴＸ３タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の配列を有するポリペプチド、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３で説明された配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、方法で使用されるＰＴＸ３タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３２−４５のいずれかで明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、その種変異体（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｖａｒｉａｎｔ）または対立遺伝子変異体（ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）を有する。いくつかの実施形態では、方法で使用されるＰＴＸ３タンパク質は多量体タンパク質である。いくつかの実施形態では、方法で使用されるＰＴＸ３タンパク質は、ホモ多量体（すなわち、２つ以上の同一の成分からなる多量体タンパク質）である。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３ホモ多量体は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、または八量体である。いくつかの実施形態において、ＰＴＸ３ホモ多量体は、八量体である。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３タンパク質は、修飾された多量体化ドメインまたは異種起源の多量体化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、方法で使用されるＴＳＧ−６タンパク質は、細胞から単離した天然のＴＳＧ−６タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒトの細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は羊膜細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は臍の緒の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は臍の緒からの羊膜細胞である。いくつかの実施形態において、羊膜細胞は羊膜の上皮細胞である。いくつかの実施形態では、羊膜細胞は臍の緒の上皮細胞である。いくつかの実施形態において、羊膜細胞は羊膜の間質細胞である。いくつかの実施形態では、羊膜細胞は臍の緒の間質細胞である。いくつかの実施形態において、ＴＳＧ−６タンパク質は、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記される配列を有するポリペプチド、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、方法で使用されるＴＳＧ−６タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−３１のいずれかで明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、その種変異体または対立遺伝子変異体を含む。いくつかの実施形態では、方法で使用されるＨＣ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７で明記される配列を有するポリペプチド、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７で明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ１の源として該方法で使用されるインターαインヒビター（ＩαＩ）タンパク質は、コンドロイチン硫酸鎖によって結合されたＨＣ２とビクニン（ｂｉｋｕｎｉｎ）も含んでいる。いくつかの実施形態では、ＨＣ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：４６−４７のいずれかで明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、その種変異体または対立遺伝子変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９で明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９で明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＨＣ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：４８−４９のいずれかで明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、その種変異体または対立遺伝子変異体を含む。いくつかの実施形態では、ビクニンは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ���：５３で明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３で明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるビクニンは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：５２−５３のいずれかで明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、その種変異体または対立遺伝子変異体を含む。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＩαＩタンパク質は、血液、血清、血漿、羊膜、絨毛膜、羊水、またはその組み合わせから単離される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＩαＩタンパク質は、血清から単離される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＩαＩタンパク質は、ヒト血清から単離される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＩαＩタンパク質は、哺乳動物の細胞によって生成される。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は羊膜細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は臍の緒の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は臍の緒からの羊膜細胞である。いくつかの実施形態において、羊膜細胞は羊膜の上皮細胞である。いくつかの実施形態では、羊膜細胞は臍の緒の上皮細胞である。いくつかの実施形態において、羊膜細胞は羊膜の間質細胞である。いくつかの実施形態では、羊膜細胞は臍の緒の間質細胞である。いくつかの実施形態では、ＩαＩおよびＴＳＧ−６のタンパク質は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、または、２０：１のモル比で接触する。いくつかの実施形態では、ＩαＩおよびＴＳＧ−６のタンパク質は、３：１のモル比で接触する。該方法のいくつかの実施形態において、ＨＭＷ  ＨＡの重量平均分子量は、約５００ｋＤａと約１０，０００ｋＤａの間、約８００ｋＤａと約８，５００ｋＤａの間、約１１００ｋＤａと約５，０００ｋＤａの間、または、約１４００ｋＤａと約３，５００ｋＤａの間である。該方法のいくつかの実施形態において、ＨＭＷ  ＨＡの重量平均分子量は３，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは、固形の支持体に対して直接結合によって固定化される。該方法のいくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは、固形の支持体に対して間接結合によって固定化される。該方法のいくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは、固形の支持体に対して共有結合によって固定化される。該方法のいくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは、固形の支持体に対して非共有結合によって固定化される。該方法のいくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは、切断可能なリンカーを介して固形の支持体に対して結合によって固定化される。いくつかの実施形態において、リンカーは、化学的に、または、酵素的に切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、該方法は、工程（ｂ）の後に、固形の支持体からｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の解離含む。いくつかの実施形態では、解離は、切断可能なリンカーの切断を含む。いくつかの実施形態では、方法は、分離したｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を精製する工程を含む。いくつかの実施形態では、精製は、アフィニティ精製、遠心分離、ろ過、クロマトグラフィー、またはその組み合わせを含む。該方法のいくつかの実施形態において、ＰＴＸ３、ＩαＩ  ＨＣ１、または、ＴＳＧ−６のポリペプチドは、アフィニティタグを含む。いくつかの実施形態では、アフィニティタグは、ヘマグルチニンタグ、ポリ−ヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）タグの中から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは、中間ポリペプチドにＨＭＷ  ＨＡを結合することによって固定化される。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドは、固形の支持体に共有結合される。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドに対するＨＭＷ  ＨＡの結合は非共有結合である。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドはＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）である。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドは、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、ＴＳＧ−６、ＣＤ４４、スタビリン（ｓｔａｂｉｌｉｎ）−１、スタビリン−２、または、ＨＡと結合するのに十分なこれらの一部の中から選択されたＨＡＢＰである。いくつかの実施形態において、中間ポリペプチドはバーシカンである。いくつかの実施形態において、中間ポリペプチドは、リンクモジュール（ｌｉｎｋ  ｍｏｄｕｌｅ）を含む。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドは、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、ＴＳＧ−６、ＣＤ４４、スタビリン−１、またはスタビリン−２のリンクモジュールを含む。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドは、バーシカンのリンクモジュールを含む。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：５４−９９のいずれかで明記されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、中間ポリペプチドは、ポリペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、該リンカーは固形の支持体に付く。いくつかの実施形態では、該方法は、工程（ｂ）の後に、中間ポリペプチドからのｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を解離する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチド
からのｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の解離は、複合体を解離剤に接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、解離剤は塩酸グアニジンまたは尿素である。いくつかの実施形態では、解離剤は約４Ｍ乃至約８Ｍの塩酸グアニジンである。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドまたはリンカーは、タンパク質切断配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の解離は、タンパク質切断配列で中間ポリペプチドまたはリンカーを切断する工程を含む。いくつかの実施形態では、切断はプロテアーゼにタンパク質切断配列を接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、フューリン、３Ｃプロテアーゼ、カスパーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、および、ＴＥＶプロテアーゼの中から選択される。
【０００９】
特定の実施形態において、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）を精製する方法が本明細書に記載されており、該方法は、固形の支持体に固定化したＰＴＸ３／ＨＡ複合体を、重鎖１（ＨＣ１）とＴＳＧ−６を含むインターαインヒビター（ＩαＩ）タンパク質に接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体は、ＰＴＸ３とＨＭＷ  ＨＡ（ＰＴＸ３／ＨＡ）の複合体を形成するのに有効な条件下で、ペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）タンパク質に高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）を接触させることによって生成され、ＨＭＷ  ＨＡは固形の支持体に固定される。いくつかの実施形態では、該方法は、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体をＩαＩとＴＳＧ−６に接触させる前に、結合していないＰＴＸ３タンパク質を取り除く工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、該方法は、結合していないＴＳＧ−６を取り除く工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３タンパク質は、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３で明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３で明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＰＴＸ３タンパク質は多量体タンパク質である。いくつかの実施形態では、方法で使用されるＰＴＸ３タンパク質はホモ多量体である。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３ホモ多量体は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、八量体である。いくつかの実施形態において、ＰＴＸ３ホモ多量体は、八量体である。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３は、修飾された多量体化ドメインまたは不均一な多量体化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＳＧ−６は、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７で明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７で明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＩαＩタンパク質はＨＣ２も含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９で明記される配列を有するポリペプチドを、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９で明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＩαＩタンパク質はビクニンも含む���いくつかの実施形態では、ビクニンは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３で明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３で明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＩαＩはまたコンドロイチン硫酸鎖も含む。いくつかの実施形態では、ＩαＩタンパク質は組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＩαＩタンパク質は、血液、血漿、血清、羊膜、絨毛膜、羊水、またはその組み合わせから単離される。いくつかの実施形態では、ＩαＩタンパク質は血清から単離される。いくつかの実施形態では、ＩαＩタンパク質はヒトの血清から単離される。いくつかの実施形態では、ＩαＩとＴＳＧ−６のタンパク質は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、または２０：１のモル比で接触する。いくつかの実施形態では、ＩαＩとＴＳＧ−６のタンパク質は３：１のモル比で接触する。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡの重量平均分子量は、約５００ｋＤａと約１０，０００ｋＤａの間、約８００ｋＤａと約８，５００ｋＤａの間、約１１００ｋＤａと約５，０００ｋＤａの間、または、約１４００ｋＤａと約３，５００ｋＤａの間である。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡの重量平均分子量は３，０００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは固形の支持体に直接結合によって固定される。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは固形の支持体に間接結合によって固定される。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは固形の支持体に対して共有結合によって固定される。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは固形の支持体に対して非共有結合によって固定される。いくつかの実施形態では、該方法は、固形の支持体からのｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を解離する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、該方法は、解離したｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を精製する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、精製は、アフィニティ精製、遠心分離、ろ過、クロマトグラフィー、またはその組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３、ＩαＩ  ＨＣ１、またはＴＳＧ−６のポリペプチドはアフィニティタグを含む。いくつかの実施形態では、アフィニティタグは、ヘマグルチニンタグ、ポリ−ヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）タグの中から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは中間ポリペプチドにＨＭＷ  ＨＡを結合させることによって固定される。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドは固形の支持体に共有結合される。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドに対するＨＭＷ  ＨＡの結合は非共有結合である。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドはＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）である。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドは、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、ＴＳＧ−６、ＣＤ４４、スタビ��ン−１、スタビリン−２、または、ＨＡと結合するのに十分なこれらの一部の中から選択されたＨＡＢＰである。いくつかの実施形態において、中間ポリペプチドはバーシカンである。いくつかの実施形態において、中間ポリペプチドは、リンクモジュールをさらに含む。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドは、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、ＴＳＧ−６、ＣＤ４４、スタビリン−１、またはスタビリン−２のリンクモジュールを含む。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドは、バーシカンのリンクモジュールを含む。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：５４−９９のいずれかで明記されたポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、中間ポリペプチドは、ポリペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、該リンカーは固形の支持体に付く。いくつかの実施形態では、該方法は、中間ポリペプチドからのｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を解離する工程を含む。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドからのｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の解離は、複合体を解離剤と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、解離剤は、塩酸グアニジンまたは尿素である。いくつかの実施形態では、解離剤は、約４Ｍ乃至約８Ｍの塩酸グアニジンである。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドまたはリンカーはタンパク質切断配列を含む。いくつかの実施形態では、解離は、タンパク質切断配列で中間ポリペプチドまたはリンカーを切断する工程を含む。いくつかの実施形態では、切断は、プロテアーゼにタンパク質切断配列を接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、フューリン、３Ｃプロテアーゼ、カスパーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、および、ＴＥＶプロテアーゼの中から選択される。
【００１０】
特定の実施形態において、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を生成するために本明細書で提供された方法のいずれかによって生成された、再構成されたＨＣ−ＨＡ（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体が本明細書に記載される。
【００１１】
特定の実施形態において、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３、およびＩαＩ  ＨＣ１を含む、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体が本明細書に記載され、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、マクロファージのＭ２極性化を促進する。特定の実施形態において、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３、およびＩαＩ  ＨＣ１を含む天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体が本明細書に記載され、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、マクロファージのＭ２極性化を促進する。特定の実施形態において、マクロファージのＭ２極性化を誘導する方法が本明細書に記載され、該方法は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３または単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体に、マクロファージを接触させる工程を含む。
【００１２】
特定の実施形態において、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３、およびＩαＩ  ＨＣ１を含む、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体が本明細書に記載され、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ中のＩＬ−１２ｐ４０の発現を減少させ、ＬＰＳで刺激したマクロファージによって発現されたＩＬ−１２ｐ４０の値は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下でＬＰＳで刺激したマクロファージによって発現されたＩＬ−１２ｐ４０の値と比較すると、ＬＰＳで刺激したマクロファージにｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体が接触した際の方が一層低い。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの値は減少する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０タンパク質の値は減少する。
【００１３】
特定の実施形態において、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３、およびＩαＩ  ＨＣ１を含む天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体が本明細書に記載され、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＬＰＳで刺激したマクロファージ中のＩＬ−１２ｐ４０の発現を減少させ、ＬＰＳで刺激したマクロファージによって発現されたＩＬ−１２ｐ４０の値は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下で、ＬＰＳで刺激したマクロファージによって発現されたＩＬ−１２ｐ４０の値と比較して、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体と接触する際の方がより低い。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの値は減少する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０タンパク質の値は減少する。
【００１４】
特定の実施形態において、ＬＰＳで刺激されたマクロファージによって発現されたＩＬ−１２ｐ４０の値を減少させる方法が本明細書で提供され、該方法は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に、ＬＰＳで刺激されたマクロファージを接触させる工程を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０  ｍＲＮＡの値は減少する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１２ｐ４０タンパク質の値は減少する。
【００１５】
特定の実施形態において、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３およびＩαＩ  ＨＣ１を含む、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体が本明細書に記載され、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体はＬＰＳで刺激されたマクロファージ中のＩＬ−１２ｐ７０タンパク質の発現を減少させ、ＬＰＳで刺激されたマクロファージによって発現されたＩＬ−１２ｐ７０タンパク質の量は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下で、ＬＰＳで刺激されたマクロファージによって発現されたＩＬ−１２ｐ７０タンパク質の量と比較すると、ＬＰＳで刺激されたマクロファージがｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体と接触した際の方が少ない。
【００１６】
特定の実施形態において、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３、およびＩαＩ  ＨＣ１を含む天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体が本明細書に記載され、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ中のＩＬ−１２ｐ７０タンパク質の発現を減少させ、ＬＰＳで刺激されたマクロファージによって発現されたＩＬ−１２ｐ７０タンパク質の量は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下で、ＬＰＳで刺激されたマクロファージによって発現されたＩＬ−１２ｐ７０タンパク質の量と比較すると、ＬＰＳで刺激されたマクロファージがｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に接触した際の方が少ない。
【００１７】
特定の実施形態において、ＬＰＳで刺激されたマクロファージによって発現されたＩＬ−１２ｐ７０タンパク質の値を下げる方法が本明細書に記載され、該方法は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３または単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に、ＬＰＳで刺激されたマクロファージを接触させる工程を含む。
【００１８】
特定の実施形態において、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３、およびＩαＩ  ＨＣ１を含む、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体が本明細書に記載され、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ中のＩＬ−２３の発現を減少させ、ＬＰＳで刺激されたマクロファージによって発現されたＩＬ−２３の値は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下で、ＬＰＳで刺激されたマクロファージによって発現されたＩＬ−２３の値と比較すると、ＬＰＳで刺激されたマクロファージがｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に接触する際の方が低い。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２３  ｍＲＮＡの値は減少する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２３タンパク質の値は減少する。
【００１９】
特定の実施形態において、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３、およびＩαＩ  ＨＣ１を含む天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体が本明細書に記載され、複合体は、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ中のＩＬ−２３の発現を減少させ、ＬＰＳで刺激されたマクロファージによって発現されたＩＬ−２３の値は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下で、ＬＰＳで刺激されたマクロファージによって発現されたＩＬ−２３の値と比較すると、ＬＰＳで刺激されたマクロファージがｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に接触する際の方が低い。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２３ｍＲＮＡの値は減少する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２３タンパク質の値は減少する。
【００２０】
特定の実施形態において、ＬＰＳで刺激されたマクロファージによって発現されたＩＬ−２３の値を下げる方法が本明細書に記載され、該方法は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３または単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に、ＬＰＳで刺激されたマクロファージを接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２３  ｍＲＮＡの値は減少する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２３タンパク質の値は減少する。
【００２１】
特定の実施形態において、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３、およびＩαＩ  ＨＣ１を含む、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体が本明細書に記載され、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ中のＩＬ−１０の発現を増加させ、ＬＰＳで刺激されたマクロファージによって発現されたＩＬ−１０の値は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下で、ＬＰＳで刺激されたマクロファージによって発現されたＩＬ−１０の値と比較すると、ＬＰＳで刺激されたマクロファージがｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に接触する際の方が高い。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１０  ｍＲＮＡの値が増加する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１０タンパク質の値が増加する。
【００２２】
特定の実施形態において、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３、およびＩαＩ  ＨＣ１を含む天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体が本明細書に記載され、複合体は、ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激されたマクロファージ中のＩＬ−１０の発現を増加させ、ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激されたマクロファージによって発現されたＩＬ−１０の量は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下で、ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激されたマクロファージによって発現されたＩＬ−１０の量と比較すると、ＬＰＳで刺激されたマクロファージがｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に接触する際の方が高い。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１０  ｍＲＮＡの値が増加する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１０タンパク質の値が増加する。
【００２３】
特定の実施形態において、ＬＰＳで刺激されたマクロファージによって発現されたＩＬ−１０の値を増加させる方法が本明細書に記載され、該方法は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３または単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に、ＬＰＳで刺激されたマクロファージを接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１０  ｍＲＮＡの値が増加する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１０タンパク質の値が増加する。
【００２４】
特定の実施形態において、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３、およびＩαＩ  ＨＣ１を含む、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体が本明細書に記載され、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＬＰＳで刺激された好中球のアポトーシスを促進するが、休止した好中球ではアポトーシスを促進しない。いくつかの実施形態では、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３、およびＩαＩ  ＨＣ１を含む、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体は、ＬＰＳで刺激された好中球のアポトーシスを促進し、ＬＰＳで刺激された好中球のサンプル中でアポトーシス性のＬＰＳで刺激された好中球の数は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下で、サンプル中でアポトーシス性のＬＰＳで刺激された好中球の数と比較すると、サンプルがｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に接触する際の方が多い。
【００２５】
特定の実施形態において、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３、およびＩαＩ  ＨＣ１を含む天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体が本明細書に記載され、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＬＰＳで刺激された好中球のアポトーシスを促進するが、休止した好中球ではアポトーシスを促進しない。いくつかの実施形態では、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３、およびＩαＩ  ＨＣ１を含むｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＬＰＳで刺激された好中球のアポトーシスを促進し、ＬＰＳで刺激された好中球のサンプル中でアポトーシス性のＬＰＳで刺激された好中球の数は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下で、サンプル中でアポトーシス性の、ＬＰＳで刺激された好中球の数と比較すると、サンプルがｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に接触する際の方が多い。
【００２６】
特定の実施形態において、ＬＰＳで刺激された好中球のアポトーシスを引き起こす方法が本明細書に記載され、該方法は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３または単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に、ＬＰＳで刺激された好中球を接触させる工程を含む。
【００２７】
特定の実施形態において、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３、およびＩαＩ  ＨＣ１を含む、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体が本明細書に記載され、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、アポトーシス性の好中球の貪食を促進し、アポトーシス性の好中球のサンプル中のＬＰＳで刺激されたマクロファージとＬＰＳで刺激されたマクロファージとによって貪食されるアポトーシス性の好中球の数は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下で、サンプル中のＬＰＳ刺激されたマクロファージによって貪食される好中球の数と比較すると、サンプルがｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に接触する際の方が多い。特定の実施形態において、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３、およびＩαＩ  ＨＣ１を含む、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体が本明細書に記載され、複合体はアポトーシス性の好中球の貪食を促進し、アポトーシス性の好中球のサンプル中の休止したマクロファージと、休止したマクロファージとによって貪食されるアポトーシス性の好中球の数は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下で、サンプル中の休止したマクロファージによって貪食される好中球の数と比較すると、サンプルがｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に接触する際の方が多い。
【００２８】
特定の実施形態において、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３、およびＩαＩ  ＨＣ１を含む天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体が本明細書に記載され、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、アポトーシス性の好中球の貪食を促進し、アポトーシス性の好中球のサンプル中のＬＰＳで刺激されたマクロファージとＬＰＳで刺激されたマクロファージとによって貪食されるアポトーシス性の好中球の数は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下で、サンプル中のＬＰＳ刺激されたマクロファージによって貪食される好中球の数と比較すると、サンプルがｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に接触する際の方が多い。特定の実施形態において、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３、およびＩαＩ  ＨＣ１を含む天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体が本明細書に記載され、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、アポトーシス性の好中球の貪食を促進し、アポトーシス性の好中球のサンプル中の休止したマクロファージとＬＰＳで刺激されたマクロファージとによって貪食されるアポトーシス性の好中球の数は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下で、サンプル中の休止したマクロファージによって貪食される好中球の数と比較すると、サンプルがｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に接触する際の方が多い。
【００２９】
特定の実施形態において、アポトーシス性の好中球の貪食を引き起こす方法が本明細書に記載され、該方法は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３または単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に、アポトーシス性の好中球と、ＬＰＳで刺激された、または、休止したマクロファージとを含むサンプルを接触させる工程を含む。
【００３０】
特定の実施形態において、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、ＰＴＸ３、およびＩαＩ  ＨＣ１を含む、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体が本明細書に記載され、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ヒトの臍の緒、ヒトの羊膜から単離した天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）、または、ヒトの臍の緒とヒトの羊膜の両方からのｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の組み合わせと少なくとも同じレベルに達するまでの、ＬＰＳで刺激されたマクロファージの結合を促進し、結合は、固形の支持体に固定されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体に、ＬＰＳで刺激されたマクロファージを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３はヒトの臍の緒から単離される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３はヒトの羊膜から単離される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、ヒトの臍の緒とヒトの羊膜の両方からのｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の組み合わせから単離される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体のＨＭＷ  ＨＡの重量平均分子量は、約５００ｋＤａと約１０，０００ｋＤａの間、約８００ｋＤａと約８，５００ｋＤａの間、約１１００ｋＤａと約５，０００ｋＤａの間、または、約１４００ｋＤａと約３，５００ｋＤａの間である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体のＨＭＷ  ＨＡの重量平均分子量は、約３，０００ｋＤａである。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体のＨＣ１は、ＨＡに共有結合される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体のＰＴＸ３タンパク質は、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体のＰＴＸ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３で明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３で明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＰＴＸ３タンパク質は多量体タンパク質である。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＰＴＸ３タンパク質はホモ多量体である。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３ホモ多量体は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、または八量体である。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３ホモ多量体は、三量体、四量体、または八量体である。いくつかの実施形態において、ＰＴＸ３ホモ多量体は八量体である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体のＩαＩ  ＨＣ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７で明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７で明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体のＩαＩ  ＨＣ１は組換えタンパク質である。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体はＴＳＧ−６を含む。いくつかの実施形態において、ＴＳＧ−６タンパク質は、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体のＰＴＸ３、ＩαＩ  ＨＣ１、またはＴＳＧ−６のポリペプチドは、アフィニティタグを含む。いくつかの実施形態では、アフィニティタグは、ヘマグルチニンタグ、ポリ−ヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）タグの中から選択される。
【００３７】
特定の実施形態において、本明細書に記載された、または、本明細書で提供される方法によって生成されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、溶液、懸濁液、粉末、軟膏、錠剤、カプセル、またはエアロゾルの形態である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、固体、架橋ゲル、またはリポソームの形態である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は架橋ヒアルロナンヒドロゲルの形態である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は天然のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、天然のポリマーは、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノゲン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、抗炎症剤、抗瘢痕剤（ａｎｔｉ−ｓｃａｒｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、抗腫瘍薬、化学療法剤、免疫抑制剤、細胞毒性薬、抗菌剤、またはその組み合わせをさらに含む。
【００３８】
特定の実施形態において、本明細書に記載される、または、薬物の製造のために本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用が、本明細書に記載されている。
【００３９】
特定の実施形態において、以下を含む組み合わせが本明細書に記載されている：（ａ）本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体；および、（ｂ）抗炎症剤、抗瘢痕剤、抗腫瘍薬、化学療法剤、免疫抑制剤、細胞毒性薬、抗菌剤、またはその組み合わせ。
【００４０】
特定の実施形態において、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物を投与する工程を含む治療法が、本明細書に記載されている。
【００４１】
特定の実施形態において、組織内の瘢痕形成または繊維症を予防するまたは逆行させる方法が本明細書に記載され、該方法は、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、必要としている被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、該方法は、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体に、組織を接触させる工程を含む。いくつかの実施形態において、瘢痕は、皮膚炎の瘢痕、ケロイド瘢痕、痙縮瘢痕、肥厚性瘢痕、ざ瘡に由来する瘢痕である。特定の実施形態において、瘢痕を減らすまたは防ぐために、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用が、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の投与は、組織内でのＴＧＦ−βシグナル伝達を減少させるまたは阻害することによって、瘢痕または繊維症を減少させるまたは防ぐ。
【００４２】
特定の実施形態において、被験体の炎症を防ぐまたは減少させる方法が本明細書に記載され、該方法は、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、該方法は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体に、炎症を起こした組織を接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、炎症は急性炎症または慢性炎症である。いくつかの実施形態では、被験体は炎症性の疾患を抱えている。いくつかの実施形態では、炎症性の疾患は、マクロファージ媒介性の炎症性疾患、Ｔｈ−１７−媒介性の免疫障害、または、Ｔ細胞媒介性の炎症性疾患である。いくつかの実施形態では、被験体は、自己免疫疾患、アレルギー、白血球欠損、感染症、移植片対宿主病、組織移植拒絶反応、またはその組み合わせを抱えている。いくつかの実施形態では、炎症性疾患は関節リウマチである。いくつかの実施形態において、炎症性疾患は目の炎症性疾患である。いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、結膜炎、角膜炎、眼瞼炎、眼瞼結膜炎、強膜炎、上強膜炎、ぶどう膜炎、網膜炎、または脈絡膜炎である。いくつかの実施形態では、急性炎症は、心筋梗塞、脳卒中、エンドトキシンショック、または敗血症によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、被験体はアテローム性動脈硬化を患っている。いくつかの実施形態では、被験体は癌を患っている。いくつかの実施形態では、被験体は固形腫瘍の炎症を抱えている。いくつかの実施形態では、被験体は、追加の抗炎症剤と併せて、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を投与される。いくつかの実施形態では、追加の抗炎症剤は、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＴＧＦ−β受容体遮断抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＴＮＦ受容体遮断抗体、抗ＩＬ１β抗体、抗ＩＬ１β受容体遮断抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ２受容体遮断抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ６受容体遮断抗体、抗ＩＬ１２抗体、抗ＩＬ１２受容体遮断抗体、抗ＩＬ１７抗体、抗ＩＬ１７受容体遮断抗体、抗ＩＬ２３抗体、または、抗ＩＬ２３受容体遮断抗体の中から選択される。いくつかの実施形態では、１型インターフェロンは、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βである。特定の実施形態において、炎症を減少させるまたは防ぐために、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用が、本明細書に記載されている。
【００４３】
特定の実施形態において、被験体の皮膚創傷または潰瘍を処置する方法が本明細書に記載され、該方法は、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、該方法は、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体に、皮膚創傷または潰瘍を接触させる工程を含む。特定の実施形態において、皮膚創傷または潰瘍を処置するために、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用が、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、皮膚創傷または潰瘍は、非治癒性の潰瘍である。
【００４４】
特定の実施形態において、被験体の骨形成を促進するまたは引き起こす方法が本明細書に記載され、該方法は、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、有効な量のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体またはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を、被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、被験体は、関節炎、骨粗鬆症、歯槽骨の劣化、パジェット病、または骨腫瘍を患っている。特定の実施形態において、被験体の骨形成を促進するまたは引き起こすために、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用が、本明細書に記載されている。
【００４５】
特定の実施形態において、被験体の異常な血管新生を防ぐまたは減少させる方法が本明細書に記載され、該方法は、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、被験体は、滲出型加齢黄斑変性（ｗＡＲＭＤ）または糖尿病性の増殖網膜症を患っている。いくつかの実施形態では、被験体は癌を患っている。いくつかの実施形態では、被験体は固形腫瘍を患っている。いくつかの実施形態では、被験体は、抗癌治療と組み合わせて、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を投与される。いくつかの実施形態では、抗癌療法は、抗腫瘍薬、細胞毒性薬、抗血管新生薬、化学療法剤の投与、または、放射線療法を含む。いくつかの実施形態では、抗癌療法は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体と連続的に、同時に、または断続的に施される。特定の実施形態において、血管新生を減少させるまたは防ぐために、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用が、本明細書に記載される。
【００４６】
特定の実施形態において、移植レシピエント内での移植拒絶反応を防ぐ方法が本明細書に記載され、該方法は、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、移植レシピエントに投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、該方法は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体に、移植片を接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、移植手順の前、移植手順の後、または移植手順中に、投与される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、免疫抑制剤と組み合わせて投与される。特定の実施形態において、移植レシピエント内での移植拒絶反応を防ぐために、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用が、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、移植片は角膜移植片である。
【００４７】
特定の実施形態において、被験体の幹細胞の拡張を引き起こす方法が本明細書に記載され、該方法は、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、該方法は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体に、幹細胞を接触させる工程を含む。特定の実施形態において、幹細胞の拡張を引き起こすために、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の使用が、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の投与は、ＴＧＦ−βシグナル伝達の抑制、および／または、ＢＭＰシグナル伝達経路のアップレギュレーションによって、幹細胞の拡張を引き起こす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の投与は、分化細胞を幹細胞（または、誘導前駆細胞、ｉＰＳＣ）に再プログラム化することによって、幹細胞の拡張を引き起こす。
【００４８】
特定の実施形態において、細胞治療のための、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用が、本明細書に記載されている。
【００４９】
特定の実施形態において、被験体の細胞治療の方法が本明細書に記載され、該方法は、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む組成物を、治療用細胞と組み合わせて、被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、治療用細胞およびｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、損傷を受けた組織に局所的に投与される。いくつかの実施形態では、治療用細胞およびｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、全身的に投与される。いくつかの実施形態では、治療用細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、治療用細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞治療は幹細胞の投与を含む。いくつかの実施形態では、幹細胞は間葉系幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は誘導前駆体幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞治療は、分化細胞の投与を含む。いくつかの実施形態では、治療用細胞はインスリン産生細胞である。いくつかの実施形態において、インスリン産生細胞は膵島細胞である。いくつかの実施形態では、被験体は１型糖尿病を患っている。
【００５０】
特定の実施形態において、被験体の細胞治療の方法が本明細書に記載され、該方法は、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、細胞送達装置に入れられた細胞と組み合わせて、被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、細胞はマイクロカプセルに入れられる。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、マイクロカプセルに付けられる。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは損傷を受けた組織に局所的に投与される。いくつかの実施形態では、治療用細胞およびｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、全身に投与される。いくつかの実施形態では、治療用細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、治療用細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞治療は幹細胞の投与を含む。いくつかの実施形態では、幹細胞は間葉系幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は誘導前駆体幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞治療は分化細胞の投与を含む。いくつかの実施形態では、治療用細胞はインスリン産生細胞である。いくつかの実施形態において、インスリン産生細胞は膵島細胞である。いくつかの実施形態では、被験体は１型糖尿病を患っている。
【００５１】
特定の実施形態において、被験体の傷みを防ぐまたは減らす方法が本明細書に記載され、該方法は、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、被験体に投与する工程を含み、痛みは、化学熱傷、重篤な細菌性角膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症、目の腫瘍の放射によって引き起こされる。特定の実施形態において、被験体の痛みを軽減するための、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用が、本明細書に記載されており、痛みは、化学熱傷、重篤な細菌性角膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症、目の腫瘍の放射によって引き起こされる。
【００５２】
特定の実施形態において、被験体の組織再生を引き起こすまたは促進する方法が本明細書に記載され、該方法は、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体に、被験体の損傷を受けた組織を接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、組織は、骨または歯ぐき、角膜の組織、または、結膜の組織である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、治療用細胞、複数の治療用細胞、または、組織移植片と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、組織移植片は同種移植片または自家移植片である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、組織ベースの治療と結合して投与される。特定の実施形態において、被験体内の組織再生を引き起こすまたは促進するために、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用が、本明細書に記載されている。
【００５３】
特定の実施形態において、被験体の繊維症を処置する方法が本明細書に記載され、該方法は、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、処置は瘢痕を阻害するまたは防ぐ。特定の実施形態において、被験体の繊維症を治療するために、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用が、本明細書に記載されている。
【００５４】
特定の実施形態において、被験体の肥満またはインスリン抵抗性を処置する方法が本明細書に記載され、該方法は、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、処置は、被験体のＭ１脂肪組織マクロファージの量を抑制するまたは減少させる。特定の実施形態において、被験体のＭ１脂肪組織マクロファージの量を抑制するまたは減少させる方法が本明細書に記載され、該方法は、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、被験体は、肥満またはインスリン抵抗性であると診断されている。特定の実施形態において、被験体の肥満またはインスリン抵抗性を処置するために、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用が、本明細書に記載されている。
【００５５】
特定の実施形態において、被験体の結膜弛緩症を処置する方法が本明細書に記載され、該方法は、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、被験体の結膜に接触させる工程を含む。特定の実施形態において、被験体の結膜弛緩症を処置するために、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の使用が、本明細書に記載されている。
【００５６】
特定の実施形態において、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｒｃＨＡ／ＰＴＸ３複合体またはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体と細胞を培養するのに適した基質を含む細胞培養液が、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態において、ｒｃＨＡ／ＰＴＸ３複合体またはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、基質に固定される。
【００５７】
特定の実施形態において、治療法が本明細書に記載され、被験体は、追加の治療薬と組み合わせて、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を投与される。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、インターフェロン、抗腫瘍壊死剤、インターロイキン１（ＩＬ−１）受容体アンタゴニスト、インターロイキン２（ＩＬ−２）受容体アンタゴニスト、インターロイキン６（ＩＬ−６）受容体アンタゴニスト、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）受容体アンタゴニスト、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）受容体アンタゴニスト、インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）受容体アンタゴニスト、細胞毒性薬、抗菌剤、インターロイキン、免疫調節剤、抗生物質、Ｔ細胞同時刺激遮断薬、障害改変性抗リューマチ剤、免疫抑制剤、抗リンパ球抗体、抗血管形成剤、化学療法剤、抗悪性腫瘍薬、抗代謝産物、Ａｋｔ阻害剤、ＩＧＦ−１阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ヘパラナーゼ阻害剤、リンホカイン阻害剤、サイトカイン阻害剤、ＩＫＫ阻害剤、Ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、抗アポトーシス経路阻害剤、アポトーシス経路アゴニスト、ＰＰＡＲアゴニスト、ＲＡＳの阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害剤、アミノペプチダーゼ阻害剤、ＳＨＩＰ活性化剤、および、これらの組み合わせから選ばれる。いくつかの実施形態において、抗菌剤は、抗ウイルス剤、抗菌剤、または、抗真菌剤である。
【００５８】
特定の実施形態において、治療法が本明細書に記載され、被験体は、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、有効な量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を投与され、被験体は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【００５９】
特定の実施形態において、治療法が本明細書に記載され、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、固体の表面に付けられる。いくつかの実施形態では、固体の表面は、ナノ粒子、ビーズ、マイクロカプセル、または、移植可能な医療装置の表面またはその一部である。
【００６０】
特定の実施形態において、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体でコーティングされた基質を含む医療装置である。いくつかの実施形態では、基質は、ステント、ジョイント、ねじ、ロッド、ピン、プレート、留め金、シャント、鉗子、クリップ、縫合糸、縫合糸アンカー、電極、カテーテル、リード線、移植片、包帯材、ペースメーカー、ペースメーカーの筐体、電気除細動器、電気除細動器の筐体、除細動器、除細動器の筐体、装具、耳のドレナージ管、眼の移植組織、整形外科装置、椎間板、骨の代用品、吻合装置、血管周囲用包装材料（ａ  ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ  ｗｒａｐ）、結腸瘻バッグ取り付け装置（ａ  ｃｏｌｏｓｔｏｍｙ  ｂａｇ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｄｅｖｉｃｅ）、止血バリア、血管移植片、血管支持部、組織接着剤、組織シーラント、組織スキャフォールド、および、腔内の装置の少なくとも１つを含む。
【００６１】
特定の実施形態において、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む装置が、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、表面はポリスチレン、ポリエチレン、シリカ、金属または重合体の表面である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、マイクロカプセルに付けられる。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、ナノ粒子に付けられる。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、ビーズ、チップ、スライド・ガラス、または、フィルタに取り付けられる。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、コンタクトレンズに付けられる。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、手術移植片または装具に取り付けられる。いくつかの実施形態では、移植組織片または装具は、人工関節、骨インプラント、縫合糸、またはステントである。いくつかの実施形態において、人工関節は、人工股関節、人工膝、人工の肩関節、または人工膝である。いくつかの実施形態では、ステントは、冠動脈ステント、尿管ステント、尿道ステント、前立腺ステント、食道ステント、または骨ステントである。
【００６２】
特定の実施形態において、患者に移植するのに適した構造を含む医療装置が本明細書に記載されており、該構造の表面または表面の一部は、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含んで付けられる。いくつかの実施形態では、結合は、該構造の表面または表面の一部に対する、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の共有結合または非共有結合を含む。いくつかの実施形態において、結合は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含有する組成物で、該構造の表面または表面の一部をコーティングすることを含む。いくつかの実施形態では、構造は、血管ステント、人工関節、縫合糸、または、マイクロカプセルである。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、細菌性バイオフィルムの形成を阻害する。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは治療用細胞を包含する。いくつかの実施形態では、治療用細胞は幹細胞である。
【００６３】
特定の実施形態において、マクロファージ活性を調節するための方法が本明細書に記載され、該方法は、ＩＬ−１２またはＩＬ−２３の発現を減少させるまたは阻害するが、Ｍ１からＭ２の表現型までの極性化マクロファージ中のＩＬ−１０の発現を促進するのに十分な量の、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体に、マクロファージを接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、マクロファージは炎症誘発性メディエーターで刺激された。いくつかの実施形態では、炎症誘発性メディエーターは、リポ多糖類（ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮγ）、または、これらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、被験体においてインビボのマクロファージを接触する。いくつかの実施形態では、被験体は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、該方法は生体外で行われる。特定の実施形態において、本明細書で提供されるマクロファージ活性を調節する方法によって調節されたマクロファージの投与を含む治療法が、本明細書に記載されている。
【００６４】
特定の実施形態において、本明細書に記載される、または、本明細書で提供される方法によって生成される、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、組成物を投与するための装置、および、随意に投与の説明書を含む、キットが本明細書に記載されている。
【００６５】
特定の実施形態において、（ａ）ＨＭＷ  ＨＡ（ＰＴＸ３／ＨＡ）にあらかじめ結合したＰＴＸ３の複合体、（ｂ）重鎖１（ＨＣ１）を含むインターαインヒビター（ＩαＩ）タンパク質、および、（ｃ）ＴＳＧ−６を含む、組み合わせまたは混合物が本明細書に記載されている。
【００６６】
特定の実施形態において、（ａ）ＨＣ−ＨＡに対してあらかじめ結合したＴＳＧ−６の複合体、および、（ｂ）ＰＴＸ３を含む、組み合わせまたは混合物が、本明細書に記載されている。
【００６７】
特定の実施形態において、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体を生体外で生成する方法が本明細書に記載され、該方法は、（ａ）ＴＳＧ−６にあらかじめ結合したｒｃＨＣ−ＨＡ複合体を形成するために、（ｉ）固形の支持体に固定された高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、（ｉｉ）重鎖１（ＨＣ１）を含むインターαインヒビター（ＩαＩ）タンパク質、および、（ｉｉｉ）ＴＳＧ−６を接触させる工程、および、（ｂ）ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を形成するために、ＴＳＧ−６にあらかじめ結合したｒｃＨＣ−ＨＡ複合体を、ペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）タンパク質に接触させる工程を含む。
【００６８】
特定の実施形態において、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）を生体外で生成する方法が本明細書に記載され、該方法は、固定化したｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を形成するために、（ｉ）固形の支持体に固定した高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）、（ｉｉ）ペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）タンパク質、（ｉｉｉ）重鎖１（ＨＣ１）を含むインターαインヒビター（ＩαＩ）タンパク質、および、（ｉｖ）腫瘍壊死因子αで刺激された遺伝子６（ＴＳＧ−６）を接触させる工程を含む。
【００６９】
特定の実施形態において、ＰＴＸ３に結合した固定されたＨＡを含む複合体が、本明細書に記載されている。
【００７０】
特定の実施形態において、生体外でＰＴＸ３に結合した固定されたＨＡを含む複合体を生成する方法が本明細書に記載され、該方法は、ＰＴＸ３とＨＭＷ  ＨＡ（ＰＴＸ３／ＨＡ）の複合体を形成するのに有効な状態下で、ＰＴＸ３タンパク質に、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）を接触させる工程を含み、ＨＭＷ  ＨＡは固形の支持体に固定される。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３タンパク質は細胞から単離した天然のＰＴＸ３タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒトの細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は羊膜細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は臍の緒の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は臍の緒から羊膜細胞である。いくつかの実施形態において、羊膜細胞は羊膜の上皮細胞である。いくつかの実施形態では、羊膜細胞は臍の緒の上皮細胞である。いくつかの実施形態において、羊膜細胞は羊膜の間質細胞である。いくつかの実施形態では、羊膜細胞は臍の緒の間質細胞である。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３タンパク質は組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＰＴＸ３タンパク質は多量体タンパク質である。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＰＴＸ３タンパク質はホモ多量体である。いくつかの実施形態において、ＰＴＸ３ホモ多量体は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、八量体である。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３ホモ多量体は、三量体、四量体、または八量体である。いくつかの実施形態において、ＰＴＸ３ホモ多量体は八量体である。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３は、修飾された多量体化ドメインまたは異種起源の多量体化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡの固定は、固形の支持体に対する非共有結合を含む。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡの固定は、中間ポリペプチドに対するＨＭＷ  ＨＡの結合を含む。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドは固形の支持体に共有結合される。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドに対するＨＭＷ  ＨＡの結合は非共有結合である。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドはＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）である。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドは、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、ＴＳＧ−６、ＣＤ４４、スタビリン−１、スタビリン−２、または、ＨＡを結合するのに十分なこれらの一部の中から選択されたＨＡＢＰである。いくつかの実施形態において、中間ポリペプチドはバーシカンである。いくつかの実施形態において、中間ポリペプチドはリンクモジュールを含む。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドは、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ��、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、ＴＳＧ−６、ＣＤ４４、スタビリン−１、または、スタビリン−２のリンクモジュールを含む。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドは、バーシカンのリンクモジュールを含む。いくつかの実施形態では、中間ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：５４−９９のいずれかで明記されるポリペプチドを含む。特定の実施形態において、前述の方法によって生成されたＰＴＸ３／ＨＡ複合体が、本明細書に記載されている。特定の実施形態において、前述の方法によって生成されたＰＴＸ３／ＨＡ複合体を含む医薬組成物が、本明細書に記載されている。特定の実施形態において、薬物の製造のためのＰＴＸ３／ＨＡ複合体の使用が、本明細書に記載されている。特定の実施形態において、瘢痕、炎症、血管新生、癌、糖尿病、肥満、または繊維症の予防または阻害のための、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体の投与を含む治療方法が本明細書に記載されている。
【００７１】
特定の実施形態において、細胞の多能性を誘導するまたは維持するための方法が本明細書に記載され、該方法は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を含む細胞を培養する工程を含み、それによって、細胞の多能性を誘導するまたは維持する。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｓｏｘ２、ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、および、ＫＬＦ４の中から選択されたタンパク質を異種発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｓｏｘ２、ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、および、ＫＬＦ４の中から選択された１つ、２つ、または３つのタンパク質を異種発現する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は固定される。いくつかの実施形態では、細胞は成体の分化細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は線維芽細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトの角膜の線維芽細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、胎生幹細胞、または誘導多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、角膜縁上皮前駆細胞、角膜縁間質ニッチ細胞（ｓｔｒｏｍａｌ  ｎｉｃｈｅ  ｃｅｌｌ）、臍の緒の幹細胞、羊膜幹細胞、または脂肪の幹細胞である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、羊膜のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、臍の緒のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体である。いくつかの実施形態では、方法は羊膜抽出物に超遠心分離を行うことにより、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を精製する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３抽出物（すなわち、可溶性のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）を生成するために、ＰＢＳ緩衝液中で調製された羊膜抽出物上で超遠心分離を行うことにより、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を精製する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３抽出物（すなわち、可溶性のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）を生成するために、ＧｎＨＣｌ緩衝液中で調製された羊膜抽出物で超遠心分離を行うことにより、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を精製する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は臍の緒の抽出物で超遠心分離を行うことにより、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を精製する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、臍の緒の抽出物は、臍の緒の羊膜、臍の緒の間質、ワルトンゼリー、または、この任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３抽出物（すなわち、可溶性のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）を生成するために、ＰＢＳ緩衝液中で調製された臍の緒の抽出物で超遠心分離を行うことにより、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を精製する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３抽出物（すなわち、可溶性のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）を生成するために、ＧｎＨＣｌ緩衝液中で調製された臍の緒の抽出物で超遠心分離を行うことにより、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を精製する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、２回、３回、または、４回の超遠心分離を行う工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、方��は、４回の超遠心分離を行う工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、ＰＴＸ３を含む。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、小ロイシン豊富なプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）を含む。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、ＰＴＸ３および小ロイシン豊富なプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）を含む。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なプロテオグリカンは、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、ＰＲＥＬＰ（プロリンアルギニン豊富な末端を有するロイシン豊富なタンパク質）、ケラトカン（ｋｅｒａｔｏｃａｎ）、オステオアドへリン（ｏｓｔｅｏａｄｈｅｒｉｎ）、エピピカン（ｅｐｉｐｙｃａｎ）、および、オステオグリシン（ｏｓｔｅｏｇｌｙｃｉｎ）の中から選択される。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なプロテオグリカンは、グリコサミノグリカンに共有結合する。いくつかの実施形態では、グリコサミノグリカンは硫酸ケラタンである。
【００７２】
前述の一般的な記載と以下の詳細な記載は、あくまで典型的かつ説明的なものに過ぎず、請求項に係る任意の主題を限定するものでないことに留意する。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１Ａ】羊膜抽出物（ＡＭＥ）からの天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体の精製と、タンパク質組成物およびＨＡの大きさの分析を例証する。（図１Ａ−Ｂ）ＣｓＣｌ／４ＭグアニジンＨＣｌの超遠心分離によって得られた画分中の全タンパク質とＨＡの濃度。
【図１Ｂ】羊膜抽出物（ＡＭＥ）からの天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体の精製と、タンパク質組成物およびＨＡの大きさの分析を例証する。（図１Ａ−Ｂ）ＣｓＣｌ／４ＭグアニジンＨＣｌの超遠心分離によって得られた画分中の全タンパク質とＨＡの濃度。
【図１Ｃ】羊膜抽出物（ＡＭＥ）からの天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体の精製と、タンパク質組成物およびＨＡの大きさの分析を例証する。（図１Ｃ）０．５％のアガロースゲル中のＳｔａｉｎｓ−ａｌｌ染色によって染色したＨＡ。ＮａＯＨまたはＮ＝１時間、２５°Ｃでの０．０５ＮのＮａＯＨによる処置。ＨＡａｓｅまたはＨ＝２時間、６０°Ｃでの２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＨＡａｓｅによる処置（図１Ｆ−Ｋ）。
【図１Ｄ】羊膜抽出物（ＡＭＥ）からの天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体の精製と、タンパク質組成物およびＨＡの大きさの分析を例証する。（図１Ｄ−Ｊ）ＨＣ１（図１ＤとＦ）、ＰＴＸ３（図１ＥとＧ）、ＨＣ２（図１Ｈ）、ＨＣ３（図１Ｉ）、ビクニン（図１Ｊ）、ＴＳＧ−６（図１Ｋ）、または、ＴＳＰ−１（図１Ｌ）に対する抗体を用いるウエスタンブロットによるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３中に存在するタンパク質の分析。ＮａＯＨまたはＮ＝１時間、２５°Ｃでの０．０５ＮのＮａＯＨによる処置。ＨＡａｓｅまたはＨ＝２時間、６０°Ｃでの２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＨＡａｓｅによる処置（図１Ｆ−Ｋ）。
【図１Ｅ】羊膜抽出物（ＡＭＥ）からの天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体の精製と、タンパク質組成物およびＨＡの大きさの分析を例証する。（図１Ｄ−Ｊ）ＨＣ１（図１ＤとＦ）、ＰＴＸ３（図１ＥとＧ）、ＨＣ２（図１Ｈ）、ＨＣ３（図１Ｉ）、ビクニン（図１Ｊ）、ＴＳＧ−６（図１Ｋ）、または、ＴＳＰ−１（図１Ｌ）に対する抗体を用いるウエスタンブロットによるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３中に存在するタンパク質の分析。ＮａＯＨまたはＮ＝１時間、２５°Ｃでの０．０５ＮのＮａＯＨによる処置。ＨＡａｓｅまたはＨ＝２時間、６０°Ｃでの２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＨＡａｓｅによる処置（図１Ｆ−Ｋ）。
【図１Ｆ】羊膜抽出物（ＡＭＥ）からの天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体の精製と、タンパク質組成物およびＨＡの大きさの分析を例証する。（図１Ｄ−Ｊ）ＨＣ１（図１ＤとＦ）、ＰＴＸ３（図１ＥとＧ）、ＨＣ２（図１Ｈ）、ＨＣ３（図１Ｉ）、ビクニン（図１Ｊ）、ＴＳＧ−６（図１Ｋ）、または、ＴＳＰ−１（図１Ｌ）に対する抗体を用いるウエスタンブロットによるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３中に存在するタンパク質の分析。ＮａＯＨまたはＮ＝１時間、２５°Ｃでの０．０５ＮのＮａＯＨによる処置。ＨＡａｓｅまたはＨ＝２時間、６０°Ｃでの２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＨＡａｓｅによる処置（図１Ｆ−Ｋ）。
【図１Ｇ】羊膜抽出物（ＡＭＥ）からの天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体の精製と、タンパク質組成物およびＨＡの大きさの分析を例証する。（図１Ｄ−Ｊ）ＨＣ１（図１ＤとＦ）、ＰＴＸ３（図１ＥとＧ）、ＨＣ２（図１Ｈ）、ＨＣ３（図１Ｉ）、ビクニン（図１Ｊ）、ＴＳＧ−６（図１Ｋ）、または、ＴＳＰ−１（図１Ｌ）に対する抗体を用いるウエスタンブロットによるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３中に存在するタンパク質の分析。ＮａＯＨまたはＮ＝１時間、２５°Ｃでの０．０５ＮのＮａＯＨによる処置。ＨＡａｓｅまたはＨ＝２時間、６０°Ｃでの２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＨＡａｓｅによる処置（図１Ｆ−Ｋ）。
【図１Ｈ】羊膜抽出物（ＡＭＥ）からの天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体の精製と、タンパク質組成物およびＨＡの大きさの分析を例証する。（図１Ｄ−Ｊ）ＨＣ１（図１ＤとＦ）、ＰＴＸ３（図１ＥとＧ）、ＨＣ２（図１Ｈ）、ＨＣ３（図１Ｉ）、ビクニン（図１Ｊ）、ＴＳＧ−６（図１Ｋ）、または、ＴＳＰ−１（図１Ｌ）に対する抗体を用いるウエスタンブロットによるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３中に存在するタンパク質の分析。ＮａＯＨまたはＮ＝１時間、２５°Ｃでの０．０５ＮのＮａＯＨによる処置。ＨＡａｓｅまたはＨ＝２時間、６０°Ｃでの２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＨＡａｓｅによる処置（図１Ｆ−Ｋ）。
【図１Ｉ】羊膜抽出物（ＡＭＥ）からの天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体の精製と、タンパク質組成物およびＨＡの大きさの分析を例証する。（図１Ｄ−Ｊ）ＨＣ１（図１ＤとＦ）、ＰＴＸ３（図１ＥとＧ）、ＨＣ２（図１Ｈ）、ＨＣ３（図１Ｉ）、ビクニン（図１Ｊ）、ＴＳＧ−６（図１Ｋ）、または、ＴＳＰ−１（図１Ｌ）に対する抗体を用いるウエスタンブロットによるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３中に存在するタンパク質の分析。ＮａＯＨまたはＮ＝１時間、２５°Ｃでの０．０５ＮのＮａＯＨによる処置。ＨＡａｓｅまたはＨ＝２時間、６０°Ｃでの２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＨＡａｓｅによる処置（図１Ｆ−Ｋ）。
【図１Ｊ】羊膜抽出物（ＡＭＥ）からの天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体の精製と、タンパク質組成物およびＨＡの大きさの分析を例証する。（図１Ｄ−Ｊ）ＨＣ１（図１ＤとＦ）、ＰＴＸ３（図１ＥとＧ）、ＨＣ２（図１Ｈ）、ＨＣ３（図１Ｉ）、ビクニン（図１Ｊ）、ＴＳＧ−６（図１Ｋ）、または、ＴＳＰ−１（図１Ｌ）に対する抗体を用いるウエスタンブロットによるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３中に存在するタンパク質の分析。ＮａＯＨまたはＮ＝１時間、２５°Ｃでの０．０５ＮのＮａＯＨによる処置。ＨＡａｓｅまたはＨ＝２時間、６０°Ｃでの２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＨＡａｓｅによる処置（図１Ｆ−Ｋ）。
【図１Ｋ】羊膜抽出物（ＡＭＥ）からの天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体の精製と、タンパク質組成物およびＨＡの大きさの分析を例証する。ＮａＯＨまたはＮ＝１時間、２５°Ｃでの０．０５ＮのＮａＯＨによる処置。ＨＡａｓｅまたはＨ＝２時間、６０°Ｃでの２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＨＡａｓｅによる処置（図１Ｆ−Ｋ）。
【図１Ｌ】羊膜抽出物（ＡＭＥ）からの天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体の精製と、タンパク質組成物およびＨＡの大きさの分析を例証する。
【図１Ｍ】羊膜抽出物（ＡＭＥ）からの天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体の精製と、タンパク質組成物およびＨＡの大きさの分析を例証する。ＩＧＦＢＰ１−３、ＰＦ４、または、ＴＩＭＰ−１を含む様々な抗原に対する抗体を使用するドット分析によって決定された相対的なタンパク量の棒グラフ（図１Ｍ）。
【図２Ａ】固定されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３に対するＬＰＳで刺激されたマクロファージの結合を媒介する、ＣＤ４４とＴＬＲ４の受容体を例証する。（図２Ａ）細胞の結合。ＲＡＷ２６４．７細胞（２．５ｘ１０５細胞／ｍｌの１００μｌ）を、固定したＨＡ（２μｇ／ウェル）またはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２μｇ／ウェル）（ｎ＝３）に播種し、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で刺激した。９０分のインキュベーション後、結合しなかった細胞を取り除き、結合した細胞をＣｙＱｕａｎｔアッセイによって数えた。スケールバーは１００μｍを表す。アステリスク（＊）は＜０．０５のｐ値を示す（ＨＡまたはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３  ｖｓ  ＰＢＳ対照（ｃｔｒｌ）またはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３  ｖｓ  ＨＡ）。
【図２Ｂ】固定されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３に対するＬＰＳで刺激されたマクロファージの結合を媒介する、ＣＤ４４とＴＬＲ４の受容体を例証する。（図２Ｂ）細胞生存率。ＬＰＳで刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞を、２４時間、固定したＰＢＳ対照、ＨＡ、またはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３で培養した（ｎ＝３）。細胞生存率はＭＴＴアッセイで測定した。これらの固定した基質上の細胞の細胞生存率で有意な差（全てのｐ値は＞０．０５）は観察されなかった。
【図２Ｃ】固定されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３に対するＬＰＳで刺激されたマクロファージの結合を媒介する、ＣＤ４４とＴＬＲ４の受容体を例証する。（図２Ｃ）  ＣＤ４４とＴＬＲ４の受容体は、固定したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３に対する、ＬＰＳで刺激されたマクロファージの結合の原因である。３０分間、氷の上で、アイソタイプ対照抗体またはＲＧＤ対照ペプチドに加えて、ＣＤ４４、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、インテグリンαｖ、β１、β２またはβ３、あるいは、ＲＧＤペプチドに対する遮断抗体を用いて、ＲＡＷ２６４．７細胞（２．５ｘ１０５／ｍｌ）をあらかじめインキュベートした（ｎ＝３）。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を加えた後に、細胞は９０分間インキュベートし、Ａに記載されたのと同じ方法で、細胞結合アッセイを行った。アステリスク（＊）は＜０．０５のｐ値を示す。
【図３】固定したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３による、Ｍ２表現型に向かうＬＰＳで刺激されたマクロファージの極性化を例証する。（Ａ）定量的ＰＣＲによって測定されたように、ＰＢＳ対照、または、固定されたＨＡあるいはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３に結合したマクロファージ中のＭ１（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０）またはＭ２（ＩＬ−１０、Ａｒｇ−１、ＬＩＧＨＴ、および、ＳＰＨＫ１）マーカーの相対的なｍＲＮＡ発現。（Ｂ）ＥＬＩＳＡによって測定されるような相対的なＴＮＦ−αタンパク質。（Ｃ）ＰＢＳ対照または固定されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３に結合したマクロファージ中のＭ１マーカーである、ＩＲＦ５の蛍光免疫染色による、ウエスタンブロット（左）およびｃｙｔｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ（右）。（Ｄ）固定したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３を用いたインキュベーション後の、休止したｆＭＬＰまたはＬＰＳで刺激された好中球のアポトーシス。アステリスク（＊）はｐ＜０．０５を示す。（Ｅ）休止したまたはＬＰＳで刺激されたマクロファージによるアポトーシス性の好中球の貪食。アステリスク（＊）はｐ＜０．０５を示す。
【図４】固定されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上でのＭ２マクロファージの極性化を維持する際にＣＤ４４の役割を例証する。（Ａ）ｑＰＣＲによって測定されるように、ＰＢＳで、または、ＣＤ４４、ＴＬＲ４、またはＣＤ４４／ＴＬＲ４に対する遮断抗体であらかじめインキュベートしたマクロファージの、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３に対する結合の後の、Ｍ１（ＩＬ−１２ｐ４０）とＭ２（ＩＬ−１０、ＬＩＧＨＴ、およびＳＰＨＫ１）マクロファージのマーカーの相対的なｍＲＮＡ発現。アステリスク（＊）は、同じ群内での０回の抗体処置（無）と比較して、ｐ＜０．０５を示す。（Ｂ）ＥＬＩＳＡによって測定されるようなＩＬ−１２およびＩＬ−１０タンパク質の量。アステリスク（＊）は、同じ群内での０回の抗体処置（無）と比較して、ｐ＜０．０５を示す。
【図５】ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（４番目）は細胞凝集を促進するが、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２番目）およびｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（４番目）は両方とも、ＩＦＮ−γ／ＬＰＳで刺激されたマクロファージ中のＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−２３のタンパク質の産生を抑制し、ＲＡＷ２６４．７細胞（２．５ｘ１０５／ｍｌ）を、固定化された基質（対照としてのＰＢＳ）上で培養し、４時間（Ａ）または２４時間（ＢとＣ）、ＩＦＮ−γ／ＬＰＳで刺激した。（Ａ）播種後４時間の細胞形態。あるいは、細胞を２４時間ＬＰＳで刺激し、細胞培養上清中のＩＬ−１０およびＩＬ−１２ｐ７０のタンパク質を、それぞれのＥＬＩＳＡ（ＢとＣ）によって測定した。ｐ値はＢとＣで示される。
【図６】９６ウェルのＣｏｖａＬｉｎｋ（商標）プレートの表面に対する、ＨＭＷ  ＨＡとｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の用量依存性のおよび共有的な結合を例証している。（Ａ）結合していないＨＭＷ  ＨＡとｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３を除去した後の、結合したＨＭＷ  ＨＡとｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３のＨＡ  ＥＬＩＳＡ。（Ｂ）ＨＭＷ  ＨＡとｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３からの結合した、および、結合していないＨＡのＨＡ  ＥＬＩＳＡ。
【図７】固定されたＨＡ（ｉＨＡ）に対するＴＳＧ−６の用量依存性の結合と、様々な解離剤および還元剤に対する耐性を例証している。（Ａ）ＴＳＧ−６  ＥＬＩＳＡによって測定されるようなｉＨＡに結合したＴＳＧ−６。（Ｂ）６ＭグアニジンＨＣｌ、８ＭグアニジンＨＣｌ、２％のＳＤＳ、１００ｍＭのＤＴＴ、または、２５ｍＭのＮａＯＨを用いた処置の後の、ＴＳＧ−６  ＥＬＩＳＡによって測定されるようなｉＨＡに結合したＴＳＧ−６。
【図８】固定化したＨＡ（ｉＨＡ）に対するＰＴＸ３の用量依存性の結合と、様々な解離剤および還元剤に対する耐性を例証している。（Ａ）ＰＴＸ３  ＥＬＩＳＡによって測定されるようなｉＨＡに結合したＰＴＸ３。（Ｂ）６ＭグアニジンＨＣｌ、８ＭグアニジンＨＣｌ、２％のＳＤＳ、１００ｍＭのＤＴＴ、または、２５ｍＭのＮａＯＨを用いた処置の後の、ＰＴＸ３  ＥＬＩＳＡによって測定されるようなｉＨＡに結合したＰＴＸ３。
【図９】ｉＨＡを結合するためのＴＳＧ−６とＰＴＸ３の間の競合または相乗作用の欠如を例証している。ＥＬＩＳＡによって測定されるような相対的な吸光度は、ｉＨＡを用いたそれぞれの因子のみのインキュベーション、または、ｉＨＡを用いた組み合わせたインキュベーションのために、結合したＴＳＧ−６またはＰＴＸ３について示されている。ｉＨＡに結合するＴＳＧ−６またはＰＴＸ３のいずれかについても、単独でも組み合わせても、統計的な有意性は見られなかった（Ｐ＞０．０５）。
【図１０】ＴＳＧ−６にあらかじめ結合したｉＨＡに対するＰＴＸ３結合の部分的な阻害と、ＰＴＸ３にあらかじめ結合したｉＨＡに対するＴＳＧ−６結合の阻害の欠如を例証している。図は、あらかじめ結合したＴＳＧ−６／ｉＨＡ（Ａ）、または、あらかじめ結合したＰＴＸ３／ｉＨＡ（Ｂ）に関して、ＴＳＧ−６またはＰＴＸ３のその後の結合のＴＳＧ−６およびＰＴＸ３のＥＬＩＳＡの結果を示している。Ｐ値は（Ａ）内で示され、統計的な有意性は（Ｂ）の群の中では見られなかった。
【図１１】ＰＢＳ（対照）、ＨＡ（ｉＨＡ）、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、ＴＳＧ−６／ｉＨＡ、または、ＰＴＸ３／ｉＨＡに対する、ＬＰＳで刺激されたＲＡＷ２６４．７マクロファージの結合を例証している。細胞はインキュベーションの２４時間後に撮影した。
【図１２Ａ】ＰＢＳ（対照）、ＨＡ（ｉＨＡ）、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、ＴＳＧ−６／ｉＨＡ、または、ＰＴＸ３／ｉＨＡ上でのインキュベーション後の、ＲＡＷ２６４．７マクロファージでの相対的な遺伝子発現を例証している。全ＲＮＡを単離し、ＩＬ−１２ｐ４０（図１２Ａ）とＩＬ−１０（図１２Ｄ）のｍＲＮＡ発現を定量的ＰＣＲによって測定した。アステリスク（＊）は対照と比較してｐ＜０．０５を示す。
【図１２Ｂ】ＰＢＳ（対照）、ＨＡ（ｉＨＡ）、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、ＴＳＧ−６／ｉＨＡ、または、ＰＴＸ３／ｉＨＡ上でのインキュベーション後の、ＲＡＷ２６４．７マクロファージでの相対的な遺伝子発現を例証している。代替的に、細胞を２４時間、ＬＰＳ（図１２ＢとＥ）またはＩＦＮ−γ／ＬＰＳ（図１２Ｃ）で刺激し、細胞培地中のＩＬ−１２ｐ７０（図１２Ｂ）、ＩＬ−２３（図１２Ｃ）、および、ＩＬ−１０（図１２Ｅ）のタンパク質発現を、それぞれのＥＬＩＳＡを用いて測定した。アステリスク（＊）は対照と比較してｐ＜０．０５を示す。
【図１２Ｃ】ＰＢＳ（対照）、ＨＡ（ｉＨＡ）、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、ＴＳＧ−６／ｉＨＡ、または、ＰＴＸ３／ｉＨＡ上でのインキュベーション後の、ＲＡＷ２６４．７マクロファージでの相対的な遺伝子発現を例証している。代替的に、細胞を２４時間、ＬＰＳ（図１２ＢとＥ）またはＩＦＮ−γ／ＬＰＳ（図１２Ｃ）で刺激し、細胞培地中のＩＬ−１２ｐ７０（図１２Ｂ）、ＩＬ−２３（図１２Ｃ）、および、ＩＬ−１０（図１２Ｅ）のタンパク質発現を、それぞれのＥＬＩＳＡを用いて測定した。アステリスク（＊）は対照と比較してｐ＜０．０５を示す。
【図１２Ｄ】ＰＢＳ（対照）、ＨＡ（ｉＨＡ）、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、ＴＳＧ−６／ｉＨＡ、または、ＰＴＸ３／ｉＨＡ上でのインキュベーション後の、ＲＡＷ２６４．７マクロファージでの相対的な遺伝子発現を例証している。全ＲＮＡを単離し、ＩＬ−１２ｐ４０（図１２Ａ）とＩＬ−１０（図１２Ｄ）のｍＲＮＡ発現を定量的ＰＣＲによって測定した。アステリスク（＊）は対照と比較してｐ＜０．０５を示す。
【図１２Ｅ】ＰＢＳ（対照）、ＨＡ（ｉＨＡ）、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、ＴＳＧ−６／ｉＨＡ、または、ＰＴＸ３／ｉＨＡ上でのインキュベーション後の、ＲＡＷ２６４．７マクロファージでの相対的な遺伝子発現を例証している。代替的に、細胞を２４時間、ＬＰＳ（図１２ＢとＥ）またはＩＦＮ−γ／ＬＰＳ（図１２Ｃ）で刺激し、細胞培地中のＩＬ−１２ｐ７０（図１２Ｂ）、ＩＬ−２３（図１２Ｃ）、および、ＩＬ−１０（図１２Ｅ）のタンパク質発現を、それぞれのＥＬＩＳＡを用いて測定した。アステリスク（＊）は対照と比較してｐ＜０．０５を示す。
【図１３Ａ】ＨＣ１とＨＣ２をＩαＩからｉＨＡまで移すための、溶液中のＴＳＧ−６の遊離（ｆｒｅｅ  ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）ｖｓＴＳＧ−６の結合の効率を例証している。（図１３Ａ、Ｂ）それぞれのＥＬＩＳＡによって測定されるような、ＴＳＧ−６とＩαＩをｉＨＡに同時にまたは逐次的に追加した後の、相対的な結合したＨＣ１（図１３Ａ）またはＩαＩ（図１３Ｂ）。アステリスク（＊）は、同時に、かつ、逐次的に加えられる際の、同じＴＳＧ−６濃度でのｐ＜０．０５を示す。
【図１３Ｂ】ＨＣ１とＨＣ２をＩαＩからｉＨＡまで移すための、溶液中のＴＳＧ−６の遊離ｖｓＴＳＧ−６の結合の効率を例証している。（図１３Ａ、Ｂ）それぞれのＥＬＩＳＡによって測定されるような、ＴＳＧ−６とＩαＩをｉＨＡに同時にまたは逐次的に追加した後の、相対的な結合したＨＣ１（図１３Ａ）またはＩαＩ（図１３Ｂ）。アステリスク（＊）は、同時に、かつ、逐次的に加えられる際の、同じＴＳＧ−６濃度でのｐ＜０．０５を示す。
【図１３Ｃ】ＨＣ１とＨＣ２をＩαＩからｉＨＡまで移すための、溶液中のＴＳＧ−６の遊離ｖｓＴＳＧ−６の結合の効率を例証している。（図１３Ｃ）ヒアルロニダーゼ（ＨＡａｓｅ）で消化され、抗−ＴＳＧ−６抗体で分析されたＡからのサンプルのウエスタンブロット。
【図１３Ｄ】ＨＣ１とＨＣ２をＩαＩからｉＨＡまで移すための、溶液中のＴＳＧ−６の遊離ｖｓＴＳＧ−６の結合の効率を例証している。（図１３Ｄ）ＥＬＩＳＡによって測定されるような、ｉＨＡを用いたＰＴＸ３とＩαＩの同時インキュベーション後の、ｉＨＡに結合した相対的なＨＣ１およびＰＴＸ３。
【図１４Ａ】ＰＴＸ３を用いた、または、用いない、ＩαＩとＴＳＧ−６の同時インキュベーション後に、溶液内で形成された複合体を例証している。（図１４Ａ−Ｄ）ＨＣ１（図１４Ａ）、ＨＣ２（図１４Ｂ）、ＴＳＧ−６（図１４Ｃ）、または、ビクニン（図１４Ｄ）に対する抗体を用いたウエスタンブロット。ＨＡａｓｅ＝ヒアルロニダーゼによる処置。
【図１４Ｂ】ＰＴＸ３を用いた、または、用いない、ＩαＩとＴＳＧ−６の同時インキュベーション後に、溶液内で形成された複合体を例証している。（図１４Ａ−Ｄ）ＨＣ１（図１４Ａ）、ＨＣ２（図１４Ｂ）、ＴＳＧ−６（図１４Ｃ）、または、ビクニン（図１４Ｄ）に対する抗体を用いたウエスタンブロット。ＨＡａｓｅ＝ヒアルロニダーゼによる処置。
【図１４Ｃ】ＰＴＸ３を用いた、または、用いない、ＩαＩとＴＳＧ−６の同時インキュベーション後に、溶液内で形成された複合体を例証している。（図１４Ａ−Ｄ）ＨＣ１（図１４Ａ）、ＨＣ２（図１４Ｂ）、ＴＳＧ−６（図１４Ｃ）、または、ビクニン（図１４Ｄ）に対する抗体を用いたウエスタンブロット。ＨＡａｓｅ＝ヒアルロニダーゼによる処置。
【図１４Ｄ】ＰＴＸ３を用いた、または、用いない、ＩαＩとＴＳＧ−６の同時インキュベーション後に、溶液内で形成された複合体を例証している。（図１４Ａ−Ｄ）ＨＣ１（図１４Ａ）、ＨＣ２（図１４Ｂ）、ＴＳＧ−６（図１４Ｃ）、または、ビクニン（図１４Ｄ）に対する抗体を用いたウエスタンブロット。ＨＡａｓｅ＝ヒアルロニダーゼによる処置。
【図１４Ｅ】ＰＴＸ３を用いた、または、用いない、ＩαＩとＴＳＧ−６の同時インキュベーション後に、溶液内で形成された複合体を例証している。（図１４Ｅ）ＩαＩとのＴＳＧ−６相互作用の実例。
【図１４Ｆ】ＰＴＸ３を用いた、または、用いない、ＩαＩとＴＳＧ−６の同時インキュベーション後に、溶液内で形成された複合体を例証している。（図１４Ｆ）ＰＴＸ３によるＨＣ２・ＴＳＧ−６形成の阻害の実例。
【図１４Ｇ】ＰＴＸ３を用いた、または、用いない、ＩαＩとＴＳＧ−６の同時インキュベーション後に、溶液内で形成された複合体を例証している。（図１４Ｇ）ＩαＩに対する抗体を用いたウエスタンブロット。
【図１５】ＰＴＸ３を用いた、または、用いない、ＩαＩとＴＳＧ−６の同時インキュベーション後に、ｉＨＡ上で形成された複合体を例証する。８ＭのＧｎＨＣｌとＰＢＳで洗浄後、結合したＨＣ１、ＴＳＧ−６、および、ＰＴＸ３を、それぞれのＥＬＩＳＡ（Ａ、Ｄ、Ｆ）で測定した。アステリスク（＊）は、１μｇ／ｍｌでのＰＴＸ３と比較して、ｐ＜０．０５を示している。複合体を再度、８ＭのＧｎＨＣｌとＰＢＳで洗浄し、結合した成分を２時間、１ｕｎｉｔ／ｍｌのヒアルロニダーゼで消化した。消化したサンプルを、ＨＣ１（Ｂ）、ＨＣ２（Ｃ）、ＴＳＧ−６（Ｅ）、および、ＰＴＸ３（Ｇ）に対する抗体を用いるウエスタンブロットによって分析した。
【図１６】ＴＳＧ−６を含むＩαＩの逐次的な追加と、その後のＰＴＸ３の追加後にｉＨＡ上に形成された複合体を例証する。結合したＨＣ１、ＴＳＧ−６、およびＰＴＸ３を、それぞれのＥＬＩＳＡ（Ａ、Ｄ、Ｆ）によって測定した。複合体を再度、８ＭのＧｎＨＣｌとＰＢＳで洗浄し、結合成分を２時間、１ｕｎｉｔ／ｍｌのヒアルロニダーゼで消化した。消化したサンプルを、ＨＣ１（Ｂ）、ＨＣ２（Ｃ）、ＴＳＧ−６（Ｅ）、ＰＴＸ３（Ｇ）に対する抗体を用いるウエスタンブロットによって分析した。
【図１７】ＰＴＸ３の逐次的な追加と、その後の、ＴＳＧ−６を含むＩαＩの追加後に、ｉＨＡ上で形成された複合体を例証する。結合したＨＣ１、ＴＳＧ−６、および、ＰＴＸ３を、それぞれのＥＬＩＳＡ（Ａ、Ｃ、Ｅ）によって測定した。複合体を再度、８ＭのＧｎＨＣｌとＰＢＳで洗浄し、結合成分を２時間１ｕｎｉｔ／ｍｌのヒアルロニダーゼで消化した。消化したサンプルを、ＰＴＸ３（Ｂ）、ＴＳＧ−６（Ｄ）、ＨＣ１（Ｆ）、および、ＨＣ２（Ｇ）に対する抗体を用いるウエスタンブロットによって分析した。
【図１８】ＰＢＳ（対照）、ＨＡ（ｉＨＡ）、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、（ＩαＩ／ＴＳＧ−６／ＰＴＸ３）／ｉＨＡ（ＩαＩ、ＴＳＧ−６、またはＰＴＸ３は、ｉＨＡに同時に結合する）、（ＩαＩ／ＴＳＧ−６）／ＰＴＸ３／ｉＨＡ（ＩαＩとＴＳＧ−６であらかじめインキュベートされたｉＨＡに対するＰＴＸ３の逐次的な追加）、あるいは、（ＰＴＸ３）／ＩαＩ／ＴＳＧ−６／ｉＨＡ（ＰＴＸ３であらかじめインキュベートされたｉＨＡに対するＩαＩとＴＳＧ−６の逐次的な追加）に対する、ＬＰＳで刺激されたＲＡＷ２６４．７マクロファージの結合を例証する。細胞はインキュベーションの２４時間後に撮影された。
【図１９Ａ】固定化した基質上で培養し、ＬＰＳで刺激した、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ中の遺伝子発現を例証する。全ＲＮＡを単離し、ＩＬ−１０とＩＬ−１２ｐ４０のｍＲＮＡの発現を、定量的ＰＣＲによって測定した（図１９ＡとＣ）。アステリスク（＊）はｐ＜０．０５を示す。
【図１９Ｂ】固定化した基質上で培養し、ＬＰＳで刺激した、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ中の遺伝子発現を例証する。細胞培養の上清中のＩＬ−１０とＩＬ−１２ｐ７０のタンパク質を、それぞれのＥＬＩＳＡによって測定した（図１９ＢとＤ）。アステリスク（＊）はｐ＜０．０５を示す。
【図１９Ｃ】固定化した基質上で培養し、ＬＰＳで刺激した、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ中の遺伝子発現を例証する。全ＲＮＡを単離し、ＩＬ−１０とＩＬ−１２ｐ４０のｍＲＮＡの発現を、定量的ＰＣＲによって測定した（図１９ＡとＣ）。アステリスク（＊）はｐ＜０．０５を示す。
【図１９Ｄ】固定化した基質上で培養し、ＬＰＳで刺激した、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ中の遺伝子発現を例証する。細胞培養の上清中のＩＬ−１０とＩＬ−１２ｐ７０のタンパク質を、それぞれのＥＬＩＳＡによって測定した（図１９ＢとＤ）。アステリスク（＊）はｐ＜０．０５を示す。
【図１９Ｅ】固定化した基質上で培養し、ＬＰＳで刺激した、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ中の遺伝子発現を例証する。（図１９Ｅ）ＩＬ−２３  ＥＬＩＳＡによって測定されるような、休止したＲＡＷ２６４．７細胞（無）の細胞培養上清中の、または、ＩＦＮ−γ（２００ｕｎｉｔ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）、ＩＦＮ−γ／ＬＰＳ、免疫複合体（ＬＰＳ／ＩＣ）を含むＬＰＳ、または、ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）の２４時間の刺激を受けた細胞培養上清注の、ＩＬ−２３タンパク質。アステリスク（＊）はｐ＜０．０５を示す。
【図１９Ｆ】固定化した基質上で培養し、ＬＰＳで刺激した、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ中の遺伝子発現を例証する。（図１９Ｆ）ＩＬ−２３  ＥＬＩＳＡによって測定されるような、固定化した基質上で培養し、および、ＩＦＮ−γ／ＬＰＳで２４時間刺激された、ＲＡＷ２６４．７細胞の細胞培養の上清中のＩＬ−２３。アステリスク（＊）はｐ＜０．０５を示す。
【図２０Ａ】ヒトの臍の緒（Ａ）または羊膜（Ｂ）内でのＨＡ、ＰＴＸ３、ＴＳＧ−６、ＨＣ、およびビクニンの免疫染色を例証する。ヒトの臍の緒の凍結切片を、ＨＡａｓｅ消化を伴うまたは伴わないビオチン化ＨＡＢＰで、および、ＰＴＸ３とＴＳＧ−６に対する抗体を用いて、ならびに、指示されたようなＩαＩとＰαＩ成分に対する鎖特異的な抗体で、調査した。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（青）で対比染色した。Ｅｐｉ、上皮。バーは１００μｍを表す。
【図２０Ｂ】ヒトの臍の緒（Ａ）または羊膜（Ｂ）内でのＨＡ、ＰＴＸ３、ＴＳＧ−６、ＨＣ、およびビクニンの免疫染色を例証する。ヒトの臍の緒の凍結切片を、ＨＡａｓｅ消化を伴うまたは伴わないビオチン化ＨＡＢＰで、および、ＰＴＸ３とＴＳＧ−６に対する抗体を用いて、ならびに、指示されたようなＩαＩとＰαＩ成分に対する鎖特異的な抗体で、調査した。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（青）で対比染色した。Ｅｐｉ、上皮。バーは１００μｍを表す。
【図２１】ＡＭ、ＣＨ、およびＵＣから連続的なＰＢＳとＧｎＨＣｌの抽出物中のＰＴＸ３のレベルの比較を例証している。Ａ、それぞれのレーンは、レーン２と３で２μｇのＨＡを、および、レーン４−１１で２０μｇの総タンパクを含有している。Ｂ、それぞれのレーンは、レーン３−１０に４０μｇの総タンパクを含有している。
【図２２】ＡＭ、ＣＨ、およびＵＣからの連続的なＰＢＳとＧｎＨＣｌの抽出物中のＨＣ１、ビクニン、およびＩαＩの比較を例証する。それぞれのレーンは、陽性対照（ｐｏｓ．ｃｔｒｌ）を除いて、ＡとＣに２０μｇの総タンパクを、ＢとＤ−Ｆに４０μｇの総タンパクを含有している。
【図２３】ＡＭとＵＣのＧｎＨＣｌ抽出物中のＴＳＧ−６の比較を例証する。それぞれのレーンは、陽性のＴＳＧ−６対照を除いて、４０μｇの総タンパクを含有している。
【図２４】１−４番目のＡＭ  ＨＣ・ＨＡ複合体中のＰＴＸ３（Ａ）、ＨＣ１（Ｂ）、ＨＣ２（Ｃ）、および、ＴＳＧ−６（Ｄ）のウエスタンブロット解析を例証する。それぞれのレーンは、陽性対照を除いて、４μｇのＨＡを含有している。
【図２５】ＡＭＥ、ＡＭ  ＧｎＨＣｌと、１−４番目のＨＣ−ＨＡ複合体中のＴＳＰ−１のウエスタンブロット解析を例証する。レーン３、４、１０、および１１のそれぞれのレーンは、３０μｇの総タンパクを含有している。レーン５−８および１２−１５のそれぞれのレーンは、４μｇのＨＡを含有している。
【図２６】４番目のＵＣ  ＨＣ−ＨＡ複合体中のＰＴＸ３（Ａ）、ＨＣ１（Ｂ）、ＨＣ２（Ｃ）、ＨＣ３（Ｄ）、および、ＴＳＧ−６（Ｅ）のウエスタンブロット解析を例証する。それぞれのレーンは、陽性対照を除いて、４μｇのＨＡを含有している。
【図２７】ＰＢＳとＧｎＨＣｌの抽出物から４番目のＨＣ・ＨＡ複合体におけるＨＣ１（Ａ）とＰＴＸ３（Ｂ）の比較を例証する。それぞれのレーンは、陽性対照を除いて、４μｇのＨＡを含有している。
【図２８】アガロースゲル中のＰＢＳとＧｎＨＣｌから４番目のＨＣ−ＨＡ複合体の比較を例証する。それぞれのレーンは、陽性のＨＡ対照を除いて、１５μｇのＨＡを含有している。
【図２９】ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡ、および、ＰＢＳ  ＨＣ−ＨＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのためのクーマシーブルー染色を例証している。Ａ．ＡＭ  ＰＢＳおよびＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡ。Ｂ．ＵＣ  ＰＢＳおよびＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡ。それぞれのレーンは３０μｇのＨＡを含有している。
【図３０】硫酸ケラタンとオステオアドへリンが、ＡＭ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡには存在するが、ＰＢＳ  ＨＣ−ＨＡには存在しなかったことを例証している。Ａ．クーマシーブルー染色。それぞれのレーンは３０μｇのＨＡを含有している。ＢおよびＣ．硫酸ケラタン（Ｂ）とオステオアドへリン（Ｃ）のためのウエスタンブロット。それぞれのレーンは４μｇのＨＡを含有している。Ｄ．ＡＭ中のケラチン硫酸塩のための免疫染色。
【図３１Ａ】ＣＢ染色またはウエスタンブロットを用いる（クーマシーブルー）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＡＭ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡの脱グリコシルおよび分析を例証する。図３１Ａ．クーマシーブルー染色。それぞれのレーンは、５μｇのＨＡを含有するレーン６を除いて、３０μｇのＨＡを含有している。
【図３１Ｂ】ＣＢ染色またはウエスタンブロットを用いる（クーマシーブルー）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＡＭ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡの脱グリコシルおよび分析を例証する。図３１Ｂ−Ｈ．オステオアドへリン（Ｂ）、デコリン（Ｃ、Ｄ）、バイグリカン（Ｅ、Ｆ）、硫酸ケラタン（Ｇ）、および、ＰＴＸ３（Ｈ）のためのウエスタンブロット。Ｈ：ヒアルロニダーゼ、Ｃ：コンドロイチナーゼ（Ｃａｂｃ）、Ｋ：ケラチナーゼ（硫酸ケラタンエンド−β−ガラクトシダーゼ）、Ｔ：ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）。それぞれのレーンは４μｇのＨＡを含有している。
【図３１Ｃ】ＣＢ染色またはウエスタンブロットを用いる（クーマシーブルー）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＡＭ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡの脱グリコシルおよび分析を例証する。図３１Ｂ−Ｈ．オステオアドへリン（Ｂ）、デコリン（Ｃ、Ｄ）、バイグリカン（Ｅ、Ｆ）、硫酸ケラタン（Ｇ）、および、ＰＴＸ３（Ｈ）のためのウエスタンブロット。Ｈ：ヒアルロニダーゼ、Ｃ：コンドロイチナーゼ（Ｃａｂｃ）、Ｋ：ケラチナーゼ（硫酸ケラタンエンド−β−ガラクトシダーゼ）、Ｔ：ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）。それぞれのレーンは４μｇのＨＡを含有している。
【図３１Ｄ】ＣＢ染色またはウエスタンブロットを用いる（クーマシーブルー）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＡＭ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡの脱グリコシルおよび分析を例証する。図３１Ｂ−Ｈ．オステオアドへリン（Ｂ）、デコリン（Ｃ、Ｄ）、バイグリカン（Ｅ、Ｆ）、硫酸ケラタン（Ｇ）、および、ＰＴＸ３（Ｈ）のためのウエスタンブロット。Ｈ：ヒアルロニダーゼ、Ｃ：コンドロイチナーゼ（Ｃａｂｃ）、Ｋ：ケラチナーゼ（硫酸ケラタンエンド−β−ガラクトシダーゼ）、Ｔ：ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）。それぞれのレーンは４μｇのＨＡを含有している。
【図３１Ｅ】ＣＢ染色またはウエスタンブロットを用いる（クーマシーブルー）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＡＭ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡの脱グリコシルおよび分析を例証する。図３１Ｂ−Ｈ．オステオアドへリン（Ｂ）、デコリン（Ｃ、Ｄ）、バイグリカン（Ｅ、Ｆ）、硫酸ケラタン（Ｇ）、および、ＰＴＸ３（Ｈ）のためのウエスタンブロット。Ｈ：ヒアルロニダーゼ、Ｃ：コンドロイチナーゼ（Ｃａｂｃ）、Ｋ：ケラチナーゼ（硫酸ケラタンエンド−β−ガラクトシダーゼ）、Ｔ：ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）。それぞれのレーンは４μｇのＨＡを含有している。
【図３１Ｆ】ＣＢ染色またはウエスタンブロットを用いる（クーマシーブルー）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＡＭ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡの脱グリコシルおよび分析を例証する。図３１Ｂ−Ｈ．オステオアドへリン（Ｂ）、デコリン（Ｃ、Ｄ）、バイグリカン（Ｅ、Ｆ）、硫酸ケラタン（Ｇ）、および、ＰＴＸ３（Ｈ）のためのウエスタンブロット。Ｈ：ヒアルロニダーゼ、Ｃ：コンドロイチナーゼ（Ｃａｂｃ）、Ｋ：ケラチナーゼ（硫酸ケラタンエンド−β−ガラクトシダーゼ）、Ｔ：ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）。それぞれのレーンは４μｇのＨＡを含有している。
【図３１Ｇ】ＣＢ染色またはウエスタンブロットを用いる（クーマシーブルー）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＡＭ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡの脱グリコシルおよび分析を例証する。図３１Ｂ−Ｈ．オステオアドへリン（Ｂ）、デコリン（Ｃ、Ｄ）、バイグリカン（Ｅ、Ｆ）、硫酸ケラタン（Ｇ）、および、ＰＴＸ３（Ｈ）のためのウエスタンブロット。Ｈ：ヒアルロニダーゼ、Ｃ：コンドロイチナーゼ（Ｃａｂｃ）、Ｋ：ケラチナーゼ（硫酸ケラタンエンド−β−ガラクトシダーゼ）、Ｔ：ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）。それぞれのレーンは４μｇのＨＡを含有している。
【図３１Ｈ】ＣＢ染色またはウエスタンブロットを用いる（クーマシーブルー）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＡＭ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡの脱グリコシルおよび分析を例証する。図３１Ｂ−Ｈ．オステオアドへリン（Ｂ）、デコリン（Ｃ、Ｄ）、バイグリカン（Ｅ、Ｆ）、硫酸ケラタン（Ｇ）、および、ＰＴＸ３（Ｈ）のためのウエスタンブロット。Ｈ：ヒアルロニダーゼ、Ｃ：コンドロイチナーゼ（Ｃａｂｃ）、Ｋ：ケラチナーゼ（硫酸ケラタンエンド−β−ガラクトシダーゼ）、Ｔ：ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）。それぞれのレーンは４μｇのＨＡを含有している。
【図３２Ａ】デコリンとバイグリカンは、ＵＣ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡに十分に存在するが、ＰＢＳ  ＨＣ−ＨＡには存在しないことを例証している。硫酸ケラタン、オステオアドへリン、およびビクニンは、ＵＣ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡには存在するが、硫酸ケラタンを除いて、ＰＢＳ  ＨＣ−ＨＡには存在していなかった。図３２Ａ．クーマシーブルー染色。それぞれのレーンは、５μｇのＨＡを含有するレーン６を除いて、３０μｇのＨＡを含有している。
【図３２Ｂ】デコリンとバイグリカンは、ＵＣ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡに十分に存在するが、ＰＢＳ  ＨＣ−ＨＡには存在しないことを例証している。硫酸ケラタン、オステオアドへリン、およびビクニンは、ＵＣ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡには存在するが、硫酸ケラタンを除いて、ＰＢＳ  ＨＣ−ＨＡには存在していなかった。図３２Ｂ−Ｇ．デコリン（Ｂ）、バイグリカン（Ｃ）、ビクニン（Ｄ）、ＰＴＸ３（Ｅ）、硫酸ケラタン（Ｆ）、および、オステオアドへリン（Ｇ）のためのウエスタンブロット。Ｈ：ヒアルロニダーゼ、Ｃ：コンドロイチナーゼ（Ｃａｂｃ）、Ｋ：ケラチナーゼ（硫酸ケラタンエンド−β−ガラクトシダーゼ）。それぞれのレーンは４μｇのＨＡを含有している。
【図３２Ｃ】デコリンとバイグリカンは、ＵＣ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡに十分に存在するが、ＰＢＳ  ＨＣ−ＨＡには存在しないことを例証している。硫酸ケラタン、オステオアドへリン、およびビクニンは、ＵＣ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡには存在するが、硫酸ケラタンを除いて、ＰＢＳ  ＨＣ−ＨＡには存在していなかった。図３２Ｂ−Ｇ．デコリン（Ｂ）、バイグリカン（Ｃ）、ビクニン（Ｄ）、ＰＴＸ３（Ｅ）、硫酸ケラタン（Ｆ）、および、オステオアドへリン（Ｇ）のためのウエスタンブロット。Ｈ：ヒアルロニダーゼ、Ｃ：コンドロイチナーゼ（Ｃａｂｃ）、Ｋ：ケラチナーゼ（硫酸ケラタンエンド−β−ガラクトシダーゼ）。それぞれのレーンは４μｇのＨＡを含有している。
【図３２Ｄ】デコリンとバイグリカンは、ＵＣ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡに十分に存在するが、ＰＢＳ  ＨＣ−ＨＡには存在しないことを例証している。硫酸ケラタン、オステオアドへリン、およびビクニンは、ＵＣ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡには存在するが、硫酸ケラタンを除いて、ＰＢＳ  ＨＣ−ＨＡには存在していなかった。図３２Ｂ−Ｇ．デコリン（Ｂ）、バイグリカン（Ｃ）、ビクニン（Ｄ）、ＰＴＸ３（Ｅ）、硫酸ケラタン（Ｆ）、および、オステオアドへリン（Ｇ）のためのウエスタンブロット。Ｈ：ヒアルロニダーゼ、Ｃ：コンドロイチナーゼ（Ｃａｂｃ）、Ｋ：ケラチナーゼ（硫酸ケラタンエンド−β−ガラクトシダーゼ）。それぞれのレーンは４μｇのＨＡを含有している。
【図３２Ｅ】デコリンとバイグリカンは、ＵＣ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡに十分に存在するが、ＰＢＳ  ＨＣ−ＨＡには存在しないことを例証している。硫酸ケラタン、オステオアドへリン、およびビクニンは、ＵＣ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡには存在するが、硫酸ケラタンを除いて、ＰＢＳ  ＨＣ−ＨＡには存在していなかった。図３２Ｂ−Ｇ．デコリン（Ｂ）、バイグリカン（Ｃ）、ビクニン（Ｄ）、ＰＴＸ３（Ｅ）、硫酸ケラタン（Ｆ）、および、オステオアドへリン（Ｇ）のためのウエスタンブロット。Ｈ：ヒアルロニダーゼ、Ｃ：コンドロイチナーゼ（Ｃａｂｃ）、Ｋ：ケラチナーゼ（硫酸ケラタンエンド−β−ガラクトシダーゼ）。それぞれのレーンは４μｇのＨＡを含有している。
【図３２Ｆ】デコリンとバイグリカンは、ＵＣ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡに十分に存在するが、ＰＢＳ  ＨＣ−ＨＡには存在しないことを例証している。硫酸ケラタン、オステオアドへリン、およびビクニンは、ＵＣ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡには存在するが、硫酸ケラタンを除いて、ＰＢＳ  ＨＣ−ＨＡには存在していなかった。図３２Ｂ−Ｇ．デコリン（Ｂ）、バイグリカン（Ｃ）、ビクニン（Ｄ）、ＰＴＸ３（Ｅ）、硫酸ケラタン（Ｆ）、および、オステオアドへリン（Ｇ）のためのウエスタンブロット。Ｈ：ヒアルロニダーゼ、Ｃ：コンドロイチナーゼ（Ｃａｂｃ）、Ｋ：ケラチナーゼ（硫酸ケラタンエンド−β−ガラクトシダーゼ）。それぞれのレーンは４μｇのＨＡを含有している。
【図３２Ｇ】デコリンとバイグリカンは、ＵＣ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡに十分に存在するが、ＰＢＳ  ＨＣ−ＨＡには存在しないことを例証している。硫酸ケラタン、オステオアドへリン、およびビクニンは、ＵＣ  ＧｎＨＣｌ  ＨＣ−ＨＡには存在するが、硫酸ケラタンを除いて、ＰＢＳ  ＨＣ−ＨＡには存在していなかった。図３２Ｂ−Ｇ．デコリン（Ｂ）、バイグリカン（Ｃ）、ビクニン（Ｄ）、ＰＴＸ３（Ｅ）、硫酸ケラタン（Ｆ）、および、オステオアドへリン（Ｇ）のためのウエスタンブロット。Ｈ：ヒアルロニダーゼ、Ｃ：コンドロイチナーゼ（Ｃａｂｃ）、Ｋ：ケラチナーゼ（硫酸ケラタンエンド−β−ガラクトシダーゼ）。それぞれのレーンは４μｇのＨＡを含有している。
【図３３】ヒトＡＭ中のＰＴＸ３の免疫局在性を例証する。抗ＰＴＸ３で、ＨＡａｓｅ消化を伴うまたは伴わないのビオチン化されたＨＡＢＰで、および、ＩαＩ成分に対する鎖特異的な抗体で、ヒト卵膜の凍結切片を調査した。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（青）で対比染色した。ＡＭ、羊膜；Ｅｐｉ、上皮；ＣＨ、絨毛膜。バー、１００μｍを表す。
【図３４】ＡＭ可溶性の抽出物と精製したＨＣ−ＨＡ複合体中のＰＴＸ３の存在を例証する。抗ＰＴＸ３（Ａ）と抗ＨＣ１（Ｂ）抗体を使用するウエスタンブロット、および、Ｓｔａｉｎｓ−ａｌｌ染色（Ｃ）で染色する前の０．５％のアガロースゲル電気泳動での分析を行う前に、精製したＰＴＸ３、ＡＭ抽出物（ＡＭＥ）、およびＡＭ  ＨＣ−ＨＡ複合体を、１時間２５°Ｃで５０ｍＭのＮａＯＨを用いてまたは用いずに、あるいは、１時間３７°Ｃでヒアルロニダーゼ（ＨＡａｓｅ）を用いてまたは用いずに、処置した。ＰＴＸ３種とその多量体の形態は、ＡＭ可溶性の抽出物と精製されたＨＣ−ＨＡ複合体で見られた。Ｍ、タンパク質ラダーマーカー。
【図３５】ＡＭＥＣとＡＭＳＣによる、ＰＴＸ３  ｍＲＮＡとタンパク質の発現を例証する。ＲＮＡとタンパク質を、ヒトの皮膚の繊維芽細胞（Ｓｋｉｎ  Ｆｉｂ．）と両方のＡＭＥＣおよびＡＭＳＣから抽出した。上清と細胞ライセート（Ｂ）中のＰＴＸ３  ｍＲＮＡ（Ａ）とタンパク質の発現を比較した。ＰＴＸ３  ｓｉＲＮＡトランスフェクションは、ＡＭＥＣとＡＭＳＣ（Ｃ）中のＰＴＸ３の発現を確認するために行われた。
【図３６】アガロースをオーバーレイした後に、ヒトの皮膚の繊維芽細胞（ＨＳＦ、Ａ）、ＡＭＳＣ（Ｂ）、およびＡＭＥＣ（Ｃ）の形態学的変化を例証する。ＨＳＦ、ＡＭＳＣ、およびＡＭＥＣは、５日間、３％アガロースオーバーレイを含むまたは含まない、血清を含まない、および、血清を含む両方の条件下で培養され、細胞形態学を撮影した。スケールバー、５０μｍ。
【図３７】アガロースオーバーレイが、ＨＳＦ、ＡＭＳＣ、およびＡＭＥＣの培養物による、培地へのＨＡの放出を減少させたことを例証している。血清を含まない、および、血清を含む両方の条件下で、アガロースオーバーレイを含むまたは含まない、ＨＳＦ、ＡＭＳＣ、およびＡＭＥＣからの培地において、ＨＡ濃度をＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。
【図３８】アガロースオーバーレイを含む細胞培養液中のＰＴＸ３、ＨＡ、およびＨＣ１の免疫局在性を例証する。ＨＳＦ、ＡＭＳＣ、およびＡＭＥＣを、ＴＮＦ処置を施したまたは施さないアガロースオーバーレイで培養し、ヒアルロナン（赤）、ＰＴＸ３（緑、Ａ−Ｆ；  赤、Ｊ−Ｌ）、およびＨＣ１（緑）（核は青）について調査した。ＨＡを含むＨＣ１の共局在（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）はすべての培養物において見られたが、ＨＡまたはＨＣ１を含むＰＴＸ３の共局在はＡＭＳＣとＡＭＥＣでしか見られなかった。スケールバー、５０μｍ。
【図３９】アガロースオーバーレイの下のＨＳＦではなく、ＡＭＳＣ中のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を例証する。アガロースを敷いたＨＳＦとＡＭＳＣの培養物からの細胞層のＧｎＨＣｌ抽出物を、ＮａＯＨ処置を施したまたは施していないＰＴＸ３のウエスタンブロットにかけた。Ｍ、タンパク質ラダーマーカー。
【図４０】生体外における固定化したＨＡ上でのＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の再構成を例証する。ｉＨＡ（〜１４μｇ／ｍｌ）、ＩαＩ（５μｇ／ｍｌ）、およびＴＳＧ−６（１２μｇ／ｍｌ）を、３７°Ｃで２時間、ＰＴＸ３（１、５、または２０μｇ／ｍｌ）を用いてまたは用いずに、同時にインキュベートした。連続して、ｉＨＡ（〜１４μｇ／ｍｌ）、ＩαＩ（１２μｇ／ｍｌ）、および、ＴＳＧ−６（１２μｇ／ｍｌ）を、３７°Ｃで２時間、反応緩衝液中でインキュベートし、その後、ＰＴＸ３（１、５、または２０μｇ／ｍｌ）を加え、３７°でさらに２時間インキュベートした。８ＭのＧｎＨＣｌとＰＢＳで洗浄した後に、結合成分を含むｉＨＡを、６０°Ｃで２時間、１ｕｎｉｔ／ｍｌのヒアルロニダーゼで消化した。サンプルを、ＩαＩ（Ａ）、ＴＳＧ−６（Ｂ）、およびＰＴＸ３（Ｃ）に対する抗体を用いて、ウエスタンブロットによって分析した。
【図４１】ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで２日間（Ａ）、あるいは、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで２日間±ＴＧＦ−β１で３日間（Ｂ）培養してＤ３に至るまでのヒトの角膜の繊維芽細胞の細胞形態学を例証する。
【図４２】可溶性のＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳ）がＴＧＦβ１を阻害するが、ＴＧＦβ３シグナル伝達を活性化し、その一方で、不溶性のＨＣ−ＨＡ（ＧｎＨＣｌ）が、血清を含まない条件下でＴＧＦβ１とＴＧＦβ３の両方のシグナル伝達を活性化し、さらにＴＧＦβ１刺激で増強されることをを例証している。
【図４３】可溶性のＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳ）と不溶性のＨＣ−ＨＡ（ＧｎＨＣｌ）の両方が、ＴＧＦβ１の曝露下で、ＴＧＦβＲ２とＴＧＦβＲ３の発現を阻害することを例証している。Ａ、ＴＧＦβＲ  ｍＲＮＡ発現。Ｂ、ＴＧＦβＲタンパク質発現。
【図４４】ＴＧＦβ１シグナル伝達のＨＣ−ＨＡ阻害による、ｐＳＭＡＤ２／３シグナル伝達の核移行の阻害を例証している。
【図４５】α平滑筋アクチン形成のＨＣ−ＨＡ阻害を例証する。
【図４６】ＢＭＰ６転写物が、ＨＡおよび可溶性の／不溶性のＨＣ−ＨＡによって活性化されたことを例証している。ＴＧＦβ１の追加は、プラスチック上のＢＭＰ６の転写物の発現を活性化するが、ＨＡと、可溶性および不溶性のＨＣ−ＨＡ上のＨＣＦ中のＢＭＰ４／６のｍＲＮＡ発現を劇的に活性化する。
【図４７】ＨＡではなくＨＣ−ＨＡが、ＴＧＦβ１を負荷したＨＣＦ中でＢＭＰＲ１Ａの転写物の発現を活性化し、その一方で、追加のＴＧＦβ１は、ＨＣＦ中でのＢＭＰＲ１ＢとＢＭＰＲ２ｍＲＮＡ発現を非特異的に活性化することを例証している。
【図４８】両方の可溶性のＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳ）と不溶性のＨＣ−ＨＡ（ＧｎＨＣｌ）が、ｐＳＭＡＤ１／５／８によってＢＭＰ４／６シグナル伝達を活性化することを例証している。
【図４９】ＳＭＡＤ／１／５／８の活性化が、その下流の遺伝子、ＤＮＡ結合１、３、および４（ＩＤ１、ＩＤ３、およびＩＤ４）の阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達の下流の標的のアップレギュレーションをもたらしたことを例証している。
【図５０】ＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳ）とＨＣ−ＨＡ（ＧｎＨＣｌ）は、ケラトカンのｍＲＮＡ発現をそれぞれ１４倍および１６倍促進し、これは追加のＴＧＦβ１によって著しいダウンレギュレートされたことを例証している。
【図５１】ＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳ）およびＨＣ−ＨＡ（ＧｎＨＣｌ）が、ケラトカンのタンパク質発現を促進することを例証している。
【図５２】ＨＣＦが、プラスチック上よりも４Ｘ  ＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳおよび不溶性のＨＣ−ＨＡ（ＧｎＨＣｌ）上で、および、細胞をＴＧＦβ１の追加で負荷した際に、より多くのＥＳＣマーカーを発現することを例証している。
【図５３】ＭＴＴによって測定されるようなＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の細胞生存率を例証する。
【図５４】アリザリンレッド染色によって測定されるようなＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のミネラル化を例証する。
【図５５】誘導の１３日目にＨＣ−ＨＡ（Ａ）またはＡＭＰ（Ｂ）で処置されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の形態を例証する。
【図５６】誘導の１３日目にＨＣ−ＨＡ（Ａ）またはＡＭＰ（Ｂ）で処置されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のアリザリンレッド染色を例証する。
【図５７】誘導の１３日目にＨＣ−ＨＡ（Ａ）またはＡＭＰ（Ｂ）で処置されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＡＲＳ染色の定量分析を例証する。
【図５８】誘導の１３日目にＨＣ−ＨＡ（Ａ）とＡＭＰ（Ｂ）で処置した細胞のＡＬＰ活性（ＩＵ／Ｌ）を例証する。
【図５９】３日目からの誘導後に、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞中の形態学的変化の位相差顕微鏡観察を例証する。（Ａ）非誘導細胞を７日間、αＭＥＭ  ｗ／１０％  ＦＢＳで培養した。（Ｂ）ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、播種の翌日（０日目）に平底の９６のウェルプレートで、コンフルエンスまで培養した。その後、細胞をアスコルビン酸とβ−グリセロリン酸で誘導した。
【図６０】１日目から７日目までＨＣ−ＨＡ（Ａ）またはＡＭＰ（Ｂ）で処置した誘導ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の形態学的変化の位相差顕微鏡観察を例証する。
【図６１】誘導の３日目から誘導したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の紡錘体の環形状の位相差顕微鏡観察を例証する。
【図６２】ＨＣ−ＨＡ（Ａ）とＡＭＰ（Ｂ）（０日目から６日目）で処置された、誘導したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の紡錘体の環形状の位相差顕微鏡観察を例証する。
【図６３】ＨＣ−ＨＡとＡＭＰで処置された、誘導したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＡＲＳ染色と、ＧｎＨＣｌによる抽出を例証する。
【図６４】酢酸と１０％の水酸化アンモニウムを用いる、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＡＲＳ抽出と定量化を例証する。酢酸処置を施したＡＲＳ抽出物を１０％の水酸化アンモニウムで中和し、その後、分光光度計（Ｂ）上で読むために、９６ウェルの底の透明なアッセイプレート（Ａ）に加えらた。＊は統計的有意性を表示する。
【図６５】ＧｎＨＣｌを用いる、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＡＲＳ抽出と定量化を例証する。ＧｎＨＣｌ処置を施したＡＲＳ抽出物を、分光光度計（Ｂ）上で読むために、９６ウェルの底の透明なアッセイプレートに加えた。＊は統計的有意性を表示する。
【図６６】１９日目（誘導の１８日目）にＨＣ−ＨＡで処置されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＡＲＳ染色（Ａ）および定量化（Ｂ）を例証する。ＡＲＳ染色は培養の１９日目（誘導の１８日目）に処置された。
【図６７】ＡＭＰで処置されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＡＲＳ染色（Ａ）および定量化（Ｂ）を例証する。ＡＲＳ染色は培養の１９日目（誘導の１８日目）に処置された。
【図６８】誘導の１４日目に誘導したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞で観察された環のような紡錘体を例証する。
【図６９】（Ａ）トランスウェルを用いずに、または、（Ｂ）トランスウェルを用いて培養された１４日間の誘導の後に、ＡＭＰで処置された誘導したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の細胞形態学の位相差顕微鏡観察を例証する。
【図７０】誘導の１４日目に誘導したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＡＲＳ染色を例証する。
【図７１】誘導の１４日目に誘導したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＡＲＳ染色の定量化を例証する。
【図７２】ＡＭＰで処置した、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＡＲＳ染色と定量化を例証する。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の（Ａ）位相差写真とＡＲＳ染色写真は、培養の２１日目（誘導の２０日目）に撮られた。（Ｂ）ＡＲＳ染色を、培養の２１日目（誘導の２０日目）に定量化した。＊の記号はｐ＜０．０５の統計的有意性を表示する。
【図７３】示された培地に加えられた共通因子を用いる、様々な前駆体の骨芽細胞への分化のマップを示す。
【図７４Ａ】ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＡＲＳ染色および定量化を例証する。（図７４Ａ）４日目から２１日目までのＨＵＶＥＣ、ｈＢＭＭＳＣｓ、および、ｈＡＭの間質の幹細胞のＡＲＳ染色を含むまたは含まない、位相差顕微鏡写真。
【図７４Ｂ】ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＡＲＳ染色および定量化を例証する。（図７４Ｂ）ＡＲＳ染色の定量化。＊記号は、陰性対照（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ）と比較して、ｐ＜０．０５の統計的有意性を表示する。
【図７５】ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の骨形成のタイムラインを例証する。
【図７６】ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＡＲＳ染色および定量化を例証する。（Ａ）ＡＭＰで処置されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の細胞形態学およびＡＲＳ染色（１日目、２日目、７日目、１０日目）。（Ｂ）ＡＭＰで処置されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＡＲＳ定量化（１日目、２日目、７日目、１０日目）。＊記号は、ｐ＜０．０５の統計的有意性を表示する。
【図７７】ＭＴＴアッセイによって細胞の生存率と拡張のタイムラインを例証する。（Ａ）１日目、２日目、および４日目に、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の生存率および代謝活性のＭＴＴアッセイ。＊記号は、１日目からｐ＜０．０５の統計的有意性を表示する。（Ｂ）１日目、２日目、および、１６日目のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞増殖のＢｒｄＵアッセイ。＊記号は１日目からｐ＜０．０５の統計的有意性を表示する。
【図７８Ａ−１】ＡＭＰ処置を施したまたは施していない分化誘導の後に検査された様々な遺伝子についてＱＰＣＲによるｍＲＮＡ発現を例証する。（図７８Ａ）ｈＭＳＣと（図７８Ｂ）ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の細胞発現。
【図７８Ａ−２】ＡＭＰ処置を施したまたは施していない分化誘導の後に検査された様々な遺伝子についてＱＰＣＲによるｍＲＮＡ発現を例証する。（図７８Ａ）ｈＭＳＣと（図７８Ｂ）ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の細胞発現。
【図７８Ｂ】ＡＭＰ処置を施したまたは施していない分化誘導の後に検査された様々な遺伝子についてＱＰＣＲによるｍＲＮＡ発現を例証する。（図７８Ａ）ｈＭＳＣと（図７８Ｂ）ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の細胞発現。
【図７９Ａ】ＡＲＳアッセイの位相差顕微鏡観察と定量化を例証する。試験の間（８日間）ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は鉱化して堆積した。その後、ＡＲＳを定性分析に使用した。（図７９Ａ）ＰＢＳ、ＨＡ、およびＨＣ−ＨＡを固定したＣｏｖａＬｉｎｋ−ＮＨの９６ウェルプレート。
【図７９Ｂ】ＡＲＳアッセイの位相差顕微鏡観察と定量化を例証する。試験の間（８日間）ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は鉱化して堆積した。その後、ＡＲＳを定性分析に使用した。（図７９Ｂ）陰性対照と、陽性対照としてＡＧＭ（誘導剤）およびＡＭＰを含む、従来の９６ウェルのプレート。
【図７９Ｃ】ＡＲＳアッセイの位相差顕微鏡観察と定量化を例証する。試験の間（８日間）ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は鉱化して堆積した。その後、ＡＲＳを定性分析に使用した。（図７９Ｃ）ＡＲＳアッセイの定量化。＊記号は１日目からｐ＜０．０５の統計的有意性を表示する。
【図８０Ａ】ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３処置を含むまたは含まない分化誘導後に検査した様々な遺伝子についてＱＰＣＲによるｍＲＮＡ発現を例証している。（図８０Ａ）１日目、７日目、１４日目の、骨形成と軟骨形成に関する主要な転写因子Ｒｕｎｘ２とＳｏｘ９。
【図８０Ｂ】ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３処置を含むまたは含まない分化誘導後に検査した様々な遺伝子についてＱＰＣＲによるｍＲＮＡ発現を例証している。（図８０Ｂ）１４日目の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）の発現。
【図８０Ｃ】ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３処置を含むまたは含まない分化誘導後に検査した様々な遺伝子についてＱＰＣＲによるｍＲＮＡ発現を例証している。（図８０Ｃ）７日目と１４日目に発現した、軟骨形成マーカーＣｏｌｌａｇｅｎ２（ＣＯＬ２）と、骨形成マーカーアルカリホスファターゼ（ＡＬＰＬ）。
【図８０Ｄ】ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３処置を含むまたは含まない分化誘導後に検査した様々な遺伝子についてＱＰＣＲによるｍＲＮＡ発現を例証している。（図８０Ｄ）１４日目に発現した異常発達マーカー・Ｃｏｌｌａｇｅｎ１０（ＣＯＬ１０）とＭＭＰ１３。
【図８０Ｅ】ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３処置を含むまたは含まない分化誘導後に検査した様々な遺伝子についてＱＰＣＲによるｍＲＮＡ発現を例証している。（図８０Ｅ）１４日目の骨形成マーカーＣｏｌｌａｇｅｎ１（ＣＯＬ１）、Ｏｓｔｅｒｉｘ（ＯＳＸ）、および、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）。
【図８１Ａ】１４日目のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（可溶性または不溶性の）処置を含むまたは含まない分化誘導後に、ＡＲＳアッセイの位相差顕微鏡観察（図８１Ａ）と定量化（図８１Ｂ）を例証する。
【図８１Ｂ】１４日目のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（可溶性または不溶性の）処置を含むまたは含まない分化誘導後に、ＡＲＳアッセイの位相差顕微鏡観察（図８１Ａ）と定量化（図８１Ｂ）を例証する。
【図８２】ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化と分化を例証する。異なる刺激下で、天然のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、または、Ｔｒｅｇに分化し、異なるサイトカインを分泌した。Ｔｈ１−型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２）は、炎症誘発性反応をもたらす傾向がある。
【図８３】細胞の増殖およびサイトカイン産生を測定する手順を例証する。脾細胞を、オバルブミン（ＯＶＡ）に特異的な遺伝子導入ＴＣＲを発現するＯＴ−ＩＩマウスから単離し、ＯＶＡで最大４日間刺激した。細胞増殖はＢｒｄＵ標識によって測定され、サイトカイン（ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２）の発現をそれぞれのＥＬＩＳＡによって測定した。
【図８４−１】ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３阻害を例証する。ＯｖａＴ細胞受容体の遺伝子導入マウスから単離した脾細胞を、４日間ＯＶＡ（０−１０μＭ）で刺激した。ＡＭ抽出物（ＡＭＥ、２５μｇ／ｍｌ）とｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２５μｇ／ｍｌ）を、ＯＶＡ濃度を増加させることによって引き起こされた活性化Ｔ細胞のクローン成長を阻害した（上）。ＨＡ、ＡＭＥ、またはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３で処置して、４日間ＣＦＳＥで標識した脾細胞の増殖を、フローサイトメトリーによって測定した。ＡＭＥとｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の両方は、用量依存的に細胞増殖を阻害した（真ん中）。
【図８４−２】ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３阻害を例証する。ＯｖａＴ細胞受容体の遺伝子導入マウスから単離した脾細胞を、４日間ＯＶＡ（０−１０μＭ）で刺激した。２５μｇ／ｍｌのｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、ＢｒｄＵで標識したＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を阻害した（下）（＊、対照と比較してｐ＜０．０５）。
【図８５】Ｔｈ１型サイトカインＩＦＮ−γとＩＬ−２のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３抑制を例証する。ＰＢＳ、２５μｇ／ｍｌのＨＡ、２５μｇ／ｍｌのＡＭＥ、または２５ｍｇ／ｍｌのｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３で処置した脾細胞を、４日間１０μＭのＯＶＡで刺激した。培養上清中のＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を、それぞれのＥＬＩＳＡによって測定した。ＡＭＥとｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の両方が、ＩＦＮ−γとＩＬ−２の産生を抑制した（＊  対照と比較して、ｐ＜０．０５）。
【図８６】（増強された緑色蛍光タンパク質、またはＥＧＦＰで標識した）マクロファージ流入のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３減少を例証する。ＬＰＳ（２μｇ／ｍｌの２μｌ）を、Ｍａｆｉａマウスの角膜実質に注入した。すぐに、５ｍｌのＰＢＳまたはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（１ｍｇ／ｍｌ）を、結膜下（ｓｕｂｊｕｎｃｔｉｖａｌ）組織を介して同じマウスからの１つの角膜のそれぞれの四分円（ｑｕａｒｄｒａｎｔ）に注入した。ＥＧＦＰ＋マクロファージの流入は、ＬＰＳ処置の後に１日目、２日目、３日目、および６日目に、インビボの生体顕微鏡検査を用いてモニターする（上）。あるいは、マウスの角膜を、ＬＰＳと同時に（事前処置（−）、または、ＬＰＳ処置（事前処理（＋）の３日前）、ＰＢＳまたはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３で処置した。ＬＰＳ処置後４日目に、角膜中の細胞をコラゲナーゼ消化によって単離し、ＦＡＣＳによってＥＧＦＰ−またはＥＧＦＰ＋（マクロファージ）に分類した（＊および＊＊、それぞれ対照と比較して、ｐ＜０．０５、および、ｐ＜０．０１）。
【図８７】Ｍ２表現型に向かうマクロファージのｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３極性化を例証する。ＬＰＳによって誘発されたマウスの角膜に浸潤したマクロファージ（ＥＧＦＰ＋）中のＭ２マーカー（Ａｒｇ−１およびＩＬ−１０）とＭ１マーカー（ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ３５）のｍＲＮＡ発現を、ｑＰＣＲによって定量化した（＊および＊＊、それぞれ対照と比較してｐ＜０．０５、および、ｐ＜０．０１）。
【図８８】角膜の同種移植片生着のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３改善を例証する。マウスの角膜の同種移植片生着は、１つの四分円の結膜下部位でのｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の注入（１０μｇ／度、２回／週、左上）によって著しく改善したが、４つの四分円の結膜下部位でのｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の注入（２０μｇ／度、２回／週、右上）によってさらに劇的に改善した。下、ＰＢＳ（手術後２１日目、左）の写真、または、角膜の同種移植片中のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３処置（手術後４０日目、右）。
【図８９−１】多くの慢性的な炎症性疾患につながるＴｈ１とＴｈ１７のリンパ球を活性化する、高レベルの炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、およびＩＬ２３など）を発現するための、マクロファージの古典的なＭ１活性化（例えば、ＬＰＳのようなＩＦＮ−γおよび／またはＴＬＲリガンドによって誘発された）を例証している。
【図８９−２】多くの慢性的な炎症性疾患につながるＴｈ１とＴｈ１７のリンパ球を活性化する、高レベルの炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、およびＩＬ２３など）を発現するための、マクロファージの古典的なＭ１活性化（例えば、ＬＰＳのようなＩＦＮ−γおよび／またはＴＬＲリガンドによって誘発された）を例証している。
【図９０】ＰＢＳ（対照）、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、またはＡＭＰの処置を用いて、マウスの角膜に対するＬＰＳによって誘発されたマクロファージ浸潤を例証する。両目に対するＬＰＳの基質内注入（５μｇ）を用いたＭａｆｉａマウス（マクロファージはＥＧＦＰ＋である）。ＯＳをＰＢＳで処置し、ＯＤをＨＣ−ＨＡ（２つの注入部位）（Ａ）、ＨＣ−ＨＡ（４つの注入部位）（Ｂ）、ＡＭＰ（２つの注入部位）（Ｃ）、（ＡＭＰ）（４つの注入部位）（Ｄ）のいずれかで処置し、それぞれの注入は５μｌであった。処置はＬＰＳ注入直後に１度きりであった。画像は、１日目、２日目、３日目、および６日目に撮影した。細胞は緑色蛍光の強度に基づいて数えた。
【図９１】ＰＢＳ（対照）、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、またはＡＭＰの処置または事前処置でマウスの角膜とそのサブタイプ（Ｍ１とＭ２）に対する、ＬＰＳによって誘発されたマクロファージ浸潤を例証する。Ｍａｆｉａマウスの事前処置と処置は、図８６に記載されるものと同じであった。４日目に、角膜ボタンを切除し、２時間３７°Ｃで、コラゲナーゼで消化した。ＥＧＦＰ−陽性／陰性細胞をＦＡＣＳによって分類した。ＥＧＦＰ陰性細胞に対するＥＧＦＰ陽性のマクロファージの比率を計算し、マクロファージ浸潤（Ａ）の程度を決定するために任意の単位として使用する。総ＲＮＡを、分類したＥＧＦＰ陽性のマクロファージから抽出し、ｃＤＮＡｓに変換した。Ａｒｇ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、および、ＩＬ−１２ｐ３５の発現を、定量的ＰＣＲ（Ｂ）によって測定する。
【図９２】注入部位の概略図。注入位置は円蓋のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３に近い結膜下になるか、あるいは、ＡＭＰは、マウスの実験のドライアイモデル中のＤＳによって引き起こされたＡＬＫＣを減らすことができる。
【図９３】血管新生を促進するために、ＩＧＦ１−ＨＩＦ１α−ＶＥＧＦシグナル伝達のＨＣ−ＨＡ活性化を例証する。細胞が休息状態にあるとき、ＨＣ−ＨＡは、ＩＧＦ１  ｍＲＮＡの２−６倍の増加と、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの２倍の増加を引き起こす。細胞がＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）に曝露されると、ＨＣ−ＨＡは、ＩＧＦ１  ｍＲＮＡの５−１２倍の増加とＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの５−９倍の増加を引き起こす。ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１．ＩＧＦ１、インスリン様成長因子１、ＨＩＦ１α、低酸素誘導因子因子１−α、ＶＥＧＦ、血管内皮細胞増殖因子。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
（特定の化学用語）
他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的な用語は、請求項に係る主題が属する当該分野の知識を有する者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。他に明記されない限り、本明細書の開示全体にわたって参照される特許、特許出願、公開された出願および出版物、ＧＥＮＢＡＮＫ配列、ウェブサイト、および、他の出版物はすべて、全体として引用されることで組み込まれる。本明細書の用語に複数の定義がある場合、この表題の定義が優先される。ＵＲＬまたは他のそのような識別子またはアドレスについて言及する場合、そのような識別子は変更可能であり、インターネット上の特定の情報は変動することがあるが、同等の情報は、インターネットの検索および／または適切なデータベースなどによって、知られており、容易に入手可能である。そのようなものについての言及は、そのような情報の利用可能性と好適な普及を証拠づけるものである。
【００７５】
本明細書で使用されているように、範囲と量は、「約（ａｂｏｕｔ）の」特定の値または範囲として表現することができる。「約」は正確な量も含んでいる。ゆえに、「約５μｇ」は「約５μｇ」も「５μｇ」も意味する。一般に、用語「約」は、実験誤差内にあると予想される量を含んでいる。
【００７６】
本明細書で使用されているように、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体は、複合体の成分分子の集合によって生体外で形成されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体である。ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３を組み立てるプロセスは、生物学的起源からの精製された天然のタンパク質または分子、組み換え方法によって生成された組換えタンパク質を用いる再構成、あるいは、生体外の合成による分子の合成を含んでいる。いくつかの例において、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の組立に使用される精製された天然タンパク質は、他のタンパク質（すなわち、多量体、多連鎖タンパク質、または、他の複合体）を含む複合体中のタンパク質である。いくつかの例において、ＰＴＸ３は、細胞からの多量体（例えば、ホモ多量体）として精製され、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の組立のために使用される。
【００７７】
本明細書で使用されているように、精製された天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体は、細胞、組織、または生体液などの生物学的起源から精製されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を指す。このような複合体は、被験体においてインビボで、あるいは、ヒトまたは他の動物を含む被験体からの細胞、組織、または生体液において生体外で、一般に組み立てられる。
【００７８】
本明細書で使用されているように、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体は、固定化したＨＡにＰＴＸ３を接触させることにより形成される中間の複合体を指す。本明細書で提供される方法において、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体は、ＨＡに対するＨＣ１の追加の前に生成されるものである。
【００７９】
本明細書で使用されているように、「ヒアルロナン」、「ヒアルロン酸」、または「ヒアルロン酸塩」（ＨＡ）は、Ｄグルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミン（Ｄ−グルクロノシル−Ｎ−アセチルグルコサミン）の反復二糖単位を含む、十分に非硫酸化型のリニアグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を指すために、交互に使用される。
【００８０】
本明細書で使用されているように、用語、「高分子量」または「ＨＭＷ」は、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）でのように、約５００キロダルトン（ｋＤａ）よりも大きな、例えば、約５００ｋＤａと約１０，０００ｋＤａの間、約８００ｋＤａと約８，５００ｋＤａの間、約１１００ｋＤａと約５，０００ｋＤａの間、または、約１４００ｋＤａと約３，５００ｋＤａの間の、重量平均分子量を有するＨＡを指すことを意図している。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは３０００ｋＤａ以上の重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは３０００ｋＤａの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは約３０００ｋＤａの重量平均分子量を備えたＨｅａｌｏｎ（登録商標）である。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは、約５００ｋＤａ乃至約１０，０００ｋＤａの間の分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは、約８００ｋＤａ乃至約８５００ｋＤａの間の分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは約３，０００ｋＤａの分子量を有する。
【００８１】
本明細書で使用されているように、用語、「低分子量」または「ＬＭＷ」は、低分子量ヒアルロナン（ＬＭＷ  ＨＡ）でのように、５００ｋＤａ未満、例えば、約４００ｋＤａ未満、約３００ｋＤａ未満、約２００ｋＤａ未満、約２００−３００ｋＤａ、または、約１−３００ｋＤａの重量平均分子量を有するＨＡを指すことを意図している。
【００８２】
本明細書で使用されているように、ペントラキシン３またはＰＴＸ３のタンパク質またはポリペプチドは、限定されないが、組み換え生成されたタンパク質、合成的に生成されたタンパク質、天然のＰＴＸ３タンパク質、および、細胞または組織から抽出されたＰＴＸ３タンパク質を含む、任意のＰＴＸ３タンパク質を指す。ＰＴＸ３は、限定されないが、自然にまたは人為的に生成された、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、四量体、八量体、および、他の多量体の形状を含む、ＰＴＸ３の多量体の形態（例えばホモ多量体）を含んでいる。
【００８３】
本明細書で使用されているように、腫瘍壊死因子である刺激遺伝子−６（ＴＳＧ−６）は、限定されないが、組み換え生成されたタンパク質、合成的に生成されたタンパク質、天然のＴＳＧ−６タンパク質、および、細胞または組織から抽出されたＴＳＧ−６タンパク質を含む、任意のＴＳＧ−６タンパク質またはポリぺプチドを指す。
【００８４】
本明細書で使用されているように、インターαインヒビター（ＩαＩ）は、軽鎖（すなわち、ビクニン）と、コンドロイチン硫酸鎖によって共有的に結合したＨＣ１またはＨＣ２の一方または両方の重鎖とで構成された、ＩαＩタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、ＩαＩの源は、血清からの、または、ＩαＩを生成する細胞、例えば、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインによる構成的な様式での刺激下での、肝細胞、羊膜の上皮または間質細胞、臍の緒の上皮または間質細胞からのものである。
【００８５】
本明細書で使用されているように「ヒアルロナン結合タンパク質」、「ＨＡ結合タンパク質」、または、「ＨＡＢＰ」は、ＨＡに特異的に結合する任意のタンパク質を指す。
【００８６】
本明細書で使用されているように、「リンクモジュール」は、ヒアルロナン結合ドメインを意味する。
【００８７】
本明細書で使用されているように、「生物活性」は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体のインビボの投与で生じる生理反応、あるいは、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含有する組成物または混合物のインビボ活性を指す。生物活性は、このように、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体、および、その組成物と混合物の治療効果と薬学的な活性を包含する。
【００８８】
本明細書で使用されているように、「被験体」、「個体」、および、「患者」との用語は、交互に使用される。これらの用語のいずれも、医療専門家（例えば、医者、看護師、医師助手、看護助手、ホスピスワーカー）の監督を必要とするものであるとは解釈されない。本明細書で用いられているように、被験体は、哺乳動物（例えば、ヒトまたはヒト以外の動物）と非哺乳動物を含む任意の動物である。本明細書で提供される方法と組成物の１つの実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００８９】
本明細書で用いられているように、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」との用語、および、他の文法的な同等物は、疾患または疾病の１以上の症状を緩和、軽減、または、寛解すること、疾患または疾病の１以上の追加の症状の出現、重篤性、または、頻度を軽減、予防、または減少させること、疾患または疾病の１以上の追加の症状の根底にある代謝の原因を改善または予防すること、疾患または疾病を抑制すること、例えば、疾患または疾病の進行を停止すること、疾患または疾病を緩和すること、疾患または疾病を退行させること、疾患または疾病により生じる状態を緩和すること、あるいは、疾患または疾病を予防的および／または治療的に抑制することを含む。非限定的な実施例では、予防的な利益について、本明細書で開示されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体または組成物は、特定の障害を進行させるか、特定の病気にかかりやすい危険のある個体に、あるいは、ある障害の生理的な症状の１つ以上を報告している個体に投与される。
【００９０】
本明細書で使用されているように、「胎盤」とは、母体の血液供給によって栄養分を摂取、廃棄物を排出し、およびガス交換を可能にするために、母体の子宮壁と発育中の胎児とをつなぐ臓器を指す。胎盤は３層からなる。胎児を包む最も内側の胎盤の層は羊膜と呼ばれる。尿膜は（胚の後腸に由来する）胎盤の中心の層であり、臍から始まる血管はこの膜を横断する。胎盤（絨毛膜）の最も外側の層は子宮内膜と接触する。絨毛膜と尿膜は絨毛尿膜を形成するために融合する。
【００９１】
本明細書で使用されているように、「絨毛膜」とは、胚外中胚葉と栄養芽層の２つの層によって形成された膜を指す。絨毛膜は２つの層：栄養芽層によって形成された外側と、壁側中胚葉によって形成された内側からなり、羊膜は後者に接している。栄養芽層は、立体細胞または角柱細胞の内部層、ラングハンスの栄養膜細胞層、および、細胞境界を欠いた豊富に核が形成された原形質の外層、合胞体栄養細胞から構成されている。無血管羊膜は絨毛膜の中間層に結合している。
【００９２】
本明細書で使用されているように、「羊膜絨毛膜」は、羊膜と絨毛膜を含む生成物を指す。いくつかの実施形態では、羊膜と絨毛膜は分離していない（すなわち、羊膜は、絨毛膜の中間層に自然に結合している）。いくつかの実施形態では、羊膜は絨毛膜から最初に分離し、その後、処理中に絨毛膜と結合する。
【００９３】
本明細書で使用されているように、「臍の緒」は、胎盤に発育中の胎児をつなぐ臓器を指す。臍の緒は、大部分がムコ多糖から作られたゼラチン状の物質であるワルトンゼリーからできている。臍の緒は、酸素を含んだ栄養の豊富な血液を胎児に運ぶ１つの静脈と、脱酸素化した栄養が足りない血液を取り除く２つの動脈を含んでいる。
【００９４】
本明細書で使用されているように、「胎盤の羊膜」（ＰＡＭ）とは、胎盤に由来する羊膜を指す。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは実質的に単離する。
【００９５】
本明細書で使用されているように、「臍の緒の羊膜」（ＵＣＡＭ）は、臍の緒に由来する羊膜を意味する。ＵＣＡＭは半透明の膜である。ＵＣＡＭには多くの層、上皮層、基底膜、緻密層、繊維芽細胞層、および、海綿層、を含む。ＵＣＡＭは血管または直接的な血液供給を欠いている。いくつかの実施形態において、ＵＣＡＭはワルトンゼリーを含む。いくつかの実施形態では、ＵＣＡＭは血管および／または動脈を含む。いくつかの実施形態では、ＵＣＡＭはワルトンゼリーと血管および／または動脈を含む。
【００９６】
本明細書で使用されているように、「精製された」および「単離した」との用語は、その天然の状態で通常それに伴う成分を実質的にまたは本質的に含まない材料（例えば、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体）を意味する。いくつかの実施形態では、「精製された」または「単離した」とは、その天然の状態で、通常それに伴う成分を約５０％以上含んでいない、例えば、その天然の状態で、通常それに伴う成分を約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％、含んでいない材料（例えば、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体）を意味する。
【００９７】
概観：ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３とｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体
ヒアルロナン（ＨＡ）は、ＧｌｃＵＡ−−β１，３−ＧｌｃＮＡｃ−β１，４−結合を介して、Ｄグルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄグルコサミンの反復二糖類サブユニット単位から構成された、十分に非硫酸化型のリニアグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）である。ＨＡはＨＡシンターゼ（例えば、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、およびＨＡＳ３）によって合成されて、細胞外マトリックスに堆積し、組織の構造の完全性に寄与するとともに、細胞表面受容体を含むタンパク質との相互作用によって多くの細胞のプロセスも制御する。ＨＡの分子量は一般に、約２００乃至約１０，０００ｋＤａまでの大きさに及ぶ。ＨＡの標準レベルは、Ｈｙａｌ１などのヒアルロニダーゼによるＨＡＳの酵素および異化反応によって、生合成のバランスを介して組織中で維持される。
【００９８】
一般に５００ｋＤａ以上の高分子量ＨＡ（ＨＭＷ  ＨＡ）は、目の軟骨と硝子体（体液）といった組織の細胞の休止と構造的な完全性を促し、瘢痕のない胎児の創傷治癒に関連付けられている。特定の例において、ＨＭＷ  ＨＡは、炎症誘発性メディエーターおよび血管形成の遺伝子発現を阻害する。
【００９９】
特定の病原性疾患において、ＨＭＷ  ＨＡは、（例えば、ヒアルロニダーゼまたは遊離基酸化によって）より小さなフラグメントとオリゴ糖に分解される。ＬＭＷ  ＨＡフラグメントは、炎症誘発性および血管新生促進の媒介物質の遺伝子発現を促すことによって、血管内皮細胞の増殖、遊走、コラーゲン合成、スプラウトの形成（ｓｐｒｏｕｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、およびラットの皮膚における血管形成、心筋梗塞、ならびに、クリオ損傷した（ｃｒｙｏ−ｉｎｊｕｒｅｄ）皮膚移植片モデルを刺激する。
【０１００】
ＨＡの生物学的機能は、ヒアルアドヘリン（ｈｙａｌａｄｈｅｒｉｎｓ）とも呼ばれる、ＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）とのＨＡの相互作用を媒介としている。このようなタンパク質は、限定されないが、腫瘍壊死因子α刺激遺伝子６（ＴＳＧ−６）、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ＬＹＶＥ−１、ＣＤ４４、および、インターαインヒビター（ＩαＩ）を含む。いくつかの例においては、ＨＡＢＰは、ＨＡに結合するリンクモジュールドメインを含む。ＴＳＧ−６、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ＬＹＶＥ−１、および、ＣＤ４４は、リンクモジュールを含有する典型的なＨＡＢＰである。
【０１０１】
ＩαＩは２つの重鎖（ＨＣ１とＨＣ２）を含み、その両方が、軽鎖（すなわち、ビクニン）に付くコンドロイチン硫酸鎖に対するエステル結合によって結合している。いくつかの例においては、ＨＡはＩαＩ重鎖に対する共有結合によって、ＩαＩのＨＣの１つまたは両方を含む共有結合複合体（以下に「ＨＣ−ＨＡ」）を形成する。特定の例では、ＩαＩは、血清中で見られるか、および／または、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインによる構成的な様式での刺激下で、ＩαＩを生成する細胞、例えば、肝細胞、羊膜の上皮または間質細胞、臍の緒の上皮または間質細胞から得られる。
【０１０２】
特定の例において、ＴＳＧ−６は、ＨＡに対するＩαＩのＨＣ１とＨＣ２の伝達を促進し、触媒し、および／または、ＨＡに対してＩαＩのＨＣ１とＨＣ２を伝達する。ＴＳＧ−６は固定化したＨＡ（ＴＳＧ−６・ＨＡ）を含む安定した複合体を形成し、ＨＣ−ＨＡ複合体を形成するためにＨＡへのＨＣ１とＨＣ２の伝達をもたらすとともに、該複合体からのＴＳＧ−６の放出をもたらす。ＴＳＧ−６の発現は、ＴＮＦ−αやインターロイキン１などの炎症性メディエーターによって、および、排卵や子宮頸部熟化などの炎症のようなプロセス中に、しばしば引き起こされる。
【０１０３】
羊膜（ＡＭ）は、成体の創傷治癒を調節して組織再生を促す。特定の例において、ＡＭは上皮化を促進するとともに、間質の炎症、血管新生および瘢痕を抑止する。ＡＭは、限定されないが、持続性の上皮欠損、深部角膜潰瘍、感染性角膜炎、症候性の水疱性角膜症、急性のスティーブンス・ジョンソン症候群／中毒性表皮壊死症（ＳＪＳ／ＴＥＮ）、角膜縁幹細胞欠陥、翼状片、瞼裂斑、結膜弛緩症、瞼球癒着、円蓋再構成（ｆｏｒｍｉｘ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、および、結膜の腫瘍を含む、角膜と結膜の表面の再構成を必要とする、眼の疾病の処置のための手術移植片または一時的な生物学的パッチとして成功裡に使用されてきた。
【０１０４】
ＡＭの無血管間質のマトリックスは多量のＨＡを包含しており、ＩαＩ（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８７（１５）：１２４３３−４４）を構造的に発現する。ＡＭでＨＭＷ  ＨＡはｎＨＣ−ＨＡ複合体を形成する（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８４（３０）：２０１３６−２０１４６）。提供される実施例において本明細書で示されるように、このｎＨＣ−ＨＡ複合体は、ペントラキシン  ３、ＰＴＸ３（図１）を含有しており、ゆえに、本明細書では「ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体」とも呼ばれる。ＡＭから抽出された天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＴＧＦ−βプロモーター活性の抑制、マクロファージ細胞死の促進、および、血管発達の抑制を示す。ＡＭのｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、このようにＡＭの抗炎症作用、抗瘢痕作用、および、血管新生抑制作用において、積極的な役割を担う。
【０１０５】
本明細書に記載されるように、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は臍の緒（ＵＣ）でも見られる。ＵＣ  ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＨＡ含有量と存在、および／または、小ロイシン豊富なプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）などのプロテオグリカンを含む複合体の様々な成分の相対存在量に関して、その生化学的組成において異なる。いくつかの実施形態では、ＳＬＲＰはデコリン、バイグリカン、および／または、オステオアドへリンである。本明細書に記載されるように、複合体は、硫酸ケラタンなどの特定の硫酸化型グリコサミノグリカンの存在に関して、含有量において異なる。加えて、本明細書に記載されるように、様々な抽出方法（例えば、ＰＢＳ対ＧｎＨＣｌ抽出）を使用してＡＭまたはＵＣから単離した複合体は、様々な生化学的組成と生物学的特性を備えた複合体を結果として生じた。特定の例では、臍の緒の組織からのＧｎＨＣｌ抽出によって不溶性の画分から単離した複合体は、改善された特徴を示すことが分かっている。
【０１０６】
ＰＴＸ３は、ＴＳＧ−６およびＩαＩ  ＨＣと直接相互に作用すると示された多量体タンパク質である。ＰＴＸ３は炎症性のレギュレーターに応じてアップレギュレートされ、卵成熟の間に卵丘（ｃｕｍｕｌｏｕｓ  ｏｏｐｈｏｒｏｕｓ）の細胞外マトリックス中のＨＡの組織化に重要な役割を果たすことが示されてきた。本明細書に実証されるように、ＰＴＸ３は、羊膜と臍の緒のｎＨＣ−ＨＡ複合体（すなわち、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）で見られ、Ｍ２マクロファージの極性化に重大な役割を果たす。
【０１０７】
Ｍ１マクロファージ、または、古典的に活性化された炎症誘発性のマクロファージは、インターフェロン（ＩＦＮ）単独によって、あるいは、リポ多糖類（ＬＰＳ）または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αと組み合わせて、誘発される。Ｍ１マクロファージは、典型的には、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）およびＩＬ−２３の高発現と、低レベルのＩＬ−１０を特徴とする。対照的に、Ｍ２マクロファージまたは「選択的活性化」マクロファージ」は、創傷治癒と組織再生の特性を示し、低いＩＬ−１２／ＩＬ−２３と高いＩＬ−１２、および、同じ比率のＩＬ−１０対ＩＬ−１０を特徴とする。特定の例においては、Ｍ２マクロファージはさらにＴＧＦ−βの高発現を備えている。
【０１０８】
本明細書で提供される実施例は、ＰＴＸ３が、解離剤に対する耐性によって証拠づけられるように、固定化したＨＡに直接結合することを実証している。ＰＴＸ３に結合したＨＡの生体外で再構成された複合体は、ＴＳＧ−６に対して結合したＨＡの生体外の再構成された複合体と比較すると、様々な特性を示すことが本明細書で実証されている。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体は、凝集せずにＬＰＳで刺激されたマクロファージの結合を促し、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ中でのＩＬ−１０の発現を誘導する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＰＴＸ３／ＨＡ複合体は、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体の不在下でのＩＬ−１０発現と比較して、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ中で、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％  ４０％  ４５％  ５０％  ５５％  ６０％  ６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、１００％、ＩＬ−１０の発現を増加させる。対照的に、いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６／ＨＡ複合体は、細胞の結合を減らし、ＬＰＳで刺激されたマクロファージの凝集を促し、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ中のＩＬ−１０の発現を誘導しない。加えて、いくつかの実施形態では、ＨＡにあらかじめ結合したＴＳＧ−６は、複合体に対するＰＴＸ３のその後の結合を阻害する。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６／ＨＡ複合体とＰＴＸ３／ＨＡ複合体の双方は、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ中のＩＬ−１２の発現を減少させた。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたＰＴＸ３／ＨＡ複合体またはＴＳＧ−６／ＨＡ複合体は、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体またはＴＳＧ−６／ＨＡ複合体の不在下でのＩＬ−１２発現と比較して、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ中でＩＬ−１２の発現を、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、１００％、減少させる、または、阻害する。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６／ＨＡ複合体およびＰＴＸ３／ＨＡ複合体の両方は、ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激されたマクロファージ中のＩＬ−２３の発現を増加させた。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたＰＴＸ３／ＨＡ複合体またはＴＳＧ−６／ＨＡ複合体は、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体またはＴＳＧ−６／ＨＡ複合体の不在下でのＩＬ−２３発現と比較して、ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激されたマクロファージ中で、ＩＬ−２３の発現を、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、１００％、減少させるまたは阻害する。
【０１０９】
加えて、生体外で再構成されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体が、ＩαＩの存在下でＴＳＧ−６にあらかじめ結合したＨＡを用いて、その後、ＰＴＸ３またはＰＴＸ３にあらかじめ結合したＨＡを加え、その後、ＩαＩを含むＴＳＧ−６を加えて形成されるかどうかに依存して、異なる生物活性を有することが、本明細書で実証されている。ＴＳＧ−６に対してあらかじめ結合したＨＡ、または、ＰＴＸ３に対してあらかじめ結合したＨＡを用いて形成されるｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の再構成のための典型的な方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６にあらかじめ結合した固定化ＨＡを用いて形成されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＬＰＳで刺激されたマクロファージの凝集を結果としてもたらす。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３に対してあらかじめ結合した固定化したＨＡを用いて形成されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、凝集せずにＬＰＳで刺激されたマクロファージの結合を促進する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３にあらかじめ結合した固定化したＨＡを用いて形成されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３のようなＭ１マクロファージマーカーの発現を阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３にあらかじめ結合した固定化したＨＡを用いて形成されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下でのＩＬ−１２発現と比較して、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ中のＩＬ−１２の発現を減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下でのＩＬ−１２発現と比較して、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ中でＩＬ−１２の発現を、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、１００％減少させるまたは阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３にあらかじめ結合した固定化したＨＡを用いて形成されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下でのＩＬ−１２発現と比較して、ＬＰＳ／ＩＦＮ−γで刺激されたマクロファージ中でＩＬ−２３の発現を減少させるまたは阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３にあらかじめ結合した固定化したＨＡを用いて形成されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の不在下でのＩＬ−２３発現と比較して、ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激されたマクロファージ中で、ＩＬ−２３の発現を、約５％１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、１００％、減少させるまたは阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３にあらかじめ結合した固定化したＨＡを用いて形成されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、羊膜から分離されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の活性を複製する。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６にあらかじめ結合した固定化したＨＡを用いて形成されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＩＬ−１２のようなＭ１マクロファージマーカーの発現を減少させるまたは阻害するが、ＩＬ−２３の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６にあらかじめ結合した固定化したＨＡを用いて形成されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＩＬ−１２の発現を減少させるまたは阻害する。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６にあらかじめ結合した固定化したＨＡを用いて形成されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＩＬ−２３の発現を増加させる。
【０１１２】
ＰＴＸ３にあらかじめ結合した固定化したＨＡを用いて、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を生成する方法とその使用が、本明細書で提供される。同様に、ＰＴＸ３にあらかじめ結合した固定化したＨＡの複合体とその使用も、本明細書で提供される。さらに、ＴＳＧ−６にあらかじめ結合した固定化したＨＡを用いて、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を生成する方法とその使用についても本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、限定されないが、炎症、自己免疫または免疫の拒絶反応につながる免疫反応、接着、瘢痕、血管新生、細胞または組織の回復を必要とする疾病、心筋梗塞と脳卒中を含む虚血による組織の再潅流障害、および、それによって引き起こされる症状の阻害、減少、予防、または、危険性の低下といった処置を含む、様々な疾患または疾病を処置するために投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、炎症を処置するために投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、瘢痕を処置するために投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、血管新生を処置するために投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、自己免疫または免疫の拒絶反応につながる免疫反応を処置するために投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、細胞粘着の阻害を必要とする疾病を処置するために投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、細胞または組織の再生を必要とする疾病を処置するために投与される。
【０１１３】
加えて、本明細書で提供される実施例は、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の能力が、未分化の状態で幹細胞を維持するだけでなく、ヒトの角膜の繊維芽細胞モデルにおいて若い前駆体に対して成体の分化した繊維芽細胞を誘導するということを実証する。ヒトの角膜の繊維芽細胞は、角膜実質細胞から外因性のＴＧＦの−β１の追加後に分化し、さらに分化して瘢痕を形成する筋線維芽細胞になる。本明細書で提供されるデータは、ＨＣ−ＨＡの存在下で細胞を培養することで、細胞がＴＧＦ−β１刺激下の筋線維芽細胞に分化するのを防いだことを実証している。ＴＧＦ−β１の不在下で、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ケラトカンとＣＤ３４を発現する角膜実質細胞へとヒトの角膜の繊維芽細胞を戻す。ＴＧＦ−β１のヒトの角膜の繊維芽細胞の存在下では、ケラトカン発現を欠くものの、Ｏｓｒ２、ＦＧＦ１０、およびＳｏｘ９などの多くの神経堤細胞マーカー、および、ｃ−ｍｙｃ、ＫＬＦ４、Ｎａｎｏｇ、ネスチン、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ−１、Ｓｏｘ−２、および、ＳＳＥＡ−４などの胚性幹細胞マーカーを発現する、より若い前駆体に再プログラムされる。
【０１１４】
転写因子Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、ｃ−Ｍｙｃ、および、ＫＬＦ４は、成人の分化細胞からの前駆体の幹細胞（ｉＰＳＣｓ）の誘導に重要な役割を果たすことが知られている。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、成人の分化細胞をｉＰＳＣに再プログラムするために使用される。いくつかの実施形態では、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、ｃ−Ｍｙｃ、および、ＫＬＦ４の１つ以上と組み合わせてＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を使用するｉＰＳＣｓの誘導は、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３のないこれらの４つの転写因子を使用する従来の方法よりもはるかに高い効率で行われる。いくつかの実施形態では、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の追加は、分化を防ぐためにＴＧＦ−βシグナル伝達をオフにすることによって、および、ｉＰＳＣｓのような若い前駆細胞への再プログラムを促すためにＢＭＰシグナル伝達をオンにすることによって、幹細胞誘導を促進する。いくつかの実施形態では、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の追加は、若い前駆体に細胞を再プログラムすることによる幹細胞の誘導および幹細胞マーカーの誘発を促進する。いくつかの実施形態では、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の追加は、生体外での拡張の間に幹細胞の特徴を維持するのを助け、したがってマウスの胚の繊維芽細胞でできた支持細胞層を使用する必要性がなくなる。ゆえに、いくつかの実施形態では、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、前記幹細胞治療の効能を促すために、ヒトの患者に生体外で拡大した幹細胞を送達するのを助けるべく、担体またはスキャフォールドとして使用される。
【０１１５】
（単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の生成方法）
本明細書では、単離した天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）を生成する方法が開示される。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、羊膜組織から単離している。いくつかの実施形態では、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、羊膜または臍の緒から単離される。いくつかの実施形態では、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、新鮮な、冷凍した、または、あらかじめ冷凍した胎盤の羊膜（ＰＡＭ）、新鮮な、冷凍した、または、あらかじめ冷凍した臍の緒の羊膜（ＵＣＡＭ）、新鮮な、冷凍した、または、あらかじめ冷凍した胎盤、新鮮な、冷凍した、または、あらかじめ冷凍した臍の緒、新鮮な、冷凍した、または、あらかじめ冷凍した絨毛膜、新鮮な、冷凍した、または、あらかじめ冷凍した羊膜の絨毛膜、あるいは、これらの任意の組み合わせから単離される。このような組織は、任意の哺乳動物、例えば、限定されないが、ヒト、ヒト以外の霊長類、雌ウシ、または、ブタなどから得ることができる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、任意の適切な方法によって精製される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、遠心分離（例えば、超遠心分離、勾配遠心分離）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、サイズ排除、および、ヒドロキシアパタイトのクロマトグラフィー）、ゲルろ過、または、差次的な溶解度、エタノール沈殿、あるいは、タンパク質の精製のために利用可能な他の技術によってによって精製される（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７；  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｓ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．  （ｅｄｓ．），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９９；  ａｎｄ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，  Ｍ．  Ｐ．，  Ｓｉｍｏｎ，  Ｍ．  Ｉ．，  Ａｂｅｌｓｏｎ，  Ｊ．  Ｎ．  （ｅｄｓ．），  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，  Ｖｏｌ  １８２），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９７，  ａｌｌ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｈｅｒｅｉｎ  ｂｙ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を参照のこと）。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、抽出物から単離される。いくつかの実施形態では、抽出物は羊膜の抽出物から調製される。いくつかの実施形態では、抽出物は臍の緒の抽出物から調製される。いくつかの実施形態では、臍の緒の抽出物は臍の緒の間質および／またはワルトンゼリーを含む。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、超遠心分離によって調製される抽出物に含まれる。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＣｓＣｌ／４−６ＭのグアニジンＨＣｌ勾配を使用する超遠心分離によって調製される抽出物に含まれる。いくつかの実施形態では、抽出物は、少なくとも２回の超遠心分離によって調製される。いくつかの実施形態では、抽出物は、２回を超える超遠心分離（すなわち、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３  ２ｎｄ）によって調製される。いくつかの実施形態では、抽出物は、少なくとも４回の超遠心分離（すなわち、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３  ４ｔｈ）によって調製される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、小ロイシン豊富なプロテオグリカンを含む。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＨＣ１、ＨＡ、ＰＴＸ３、および／または、小ロイシン豊富なプロテオグリカンを含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、超遠心分離は、等張液中での抽出によって調製された抽出物上で行われる。いくつかの実施形態において、等張液はＰＢＳである。例えば、いくつかの実施形態では、組織は、ＰＢＳ中で均質化されることで、均質化されたサンプルが生成される。均質化されたサンプルは、遠心分離によって可溶性部分と不溶性部分とに分離される。いくつかの実施形態では、超遠心分離はＰＢＳで抽出された組織の可溶性部分で行われる。そのような実施形態では、ＰＢＳで抽出された組織の超遠心分離によって精製されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３可溶性複合体と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ可溶性複合体は、小ロイシン豊富なプロテオグリカンを含む。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３可溶性複合体は、ＨＣ１、ＨＡ、ＰＴＸ３、および／または、小ロイシン豊富なプロテオグリカンを含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、超遠心分離は、羊膜および／または臍の緒の組織の直接的なグアニジンＨＣｌ抽出（例えば、４−６ＭのＧｎＨＣｌ）によって調製された抽出物で行われる。いくつかの実施形態では、ＧｎＨＣｌ抽出物組織は、その後、遠心分離機にかけられ、ＧｎＨＣｌ可溶性部分とＧｎＨＣｌ不溶性部分が生成される。いくつかの実施形態では、超遠心分離はＧｎＨＣｌ可溶性部分上で行われる。そのような実施形態では、グアニジンのＨＣｌで抽出された組織の超遠心分離によって精製されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３不溶性複合体と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡの不溶性の複合体は、小ロイシン豊富なプロテオグリカンを含む。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の不溶性複合体は、ＨＣ１、ＨＡ、ＰＴＸ３、および／または、小ロイシン豊富なプロテオグリカンを含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、超遠心分離は、ＰＢＳで抽出された組織の不溶性部分のさらなるグアニジンＨＣｌ抽出によって調製された抽出物上で行われる。例えば、いくつかの実施形態では、組織はＰＢＳ中で均質化されることで、均質化されたサンプルが生成される。その後、均質化されたサンプルは、遠心分離によって可溶性部分と不溶性部分とに分離される。不溶性部分は、グアニジンＨＣｌ（例えば４−６ＭのＧｎＨＣｌ）中で抽出され、遠心分離機にかけられることで、グアニジンＨＣｌの可溶性部分と不溶性部分とが生成される。いくつかの実施形態では、超遠心分離はグアニジンＨＣｌ可溶性部分で行われる。そのような実施形態では、グアニジンのＨＣｌで抽出された組織の超遠心分離によって精製されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３不溶性複合体と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡの不溶性複合体は、小ロイシン豊富なプロテオグリカンを含む。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の不溶性複合体は、ＨＣ１、ＨＡ、ＰＴＸ３、および／または、小ロイシン豊富なプロテオグリカンを含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３抽出物を精製する方法は、以下の工程を含む：（ａ）ＣｓＣｌ混合物を生成するために、１．３５ｇ／ｍｌの当初の密度でＣｓＣｌ／４−６ＭグアニジンＨＣｌにおいて単離した抽出物（例えば、本明細書に記載の可溶性または不溶性の方法によって調製される）を溶解させる工程、（ｂ）第１の精製された抽出物を生成するために、１５°Ｃで４８時間、１２５，０００倍のｇでＣｓＣｌ混合物を遠心分離機にかける工程、（ｃ）透析物を生成するために、第１の精製された抽出物を抽出し、それを蒸留水に対して透析する工程であって、それによって、ＣｓＣｌグアニジンＨＣｌを除去する、工程。いくつかの実施形態では、単離した抽出物を精製する方法は、さらに、（ｄ）第１の透析物／エタノール混合物を生成するために、１時間、０°Ｃで、透析物を、３容量の９５％（ｖ／ｖ）のエタノール含有１．３％（ｗ／ｖ）酢酸カリウムと混合する工程、（ｅ）第２の精製された抽出物を生成するために、１５，０００倍のｇで第１の透析物／エタノール混合物を遠心分離機にかける工程、および、（ｆ）第２の精製された抽出物を抽出する工程、を含む。いくつかの実施形態では、単離した抽出物を精製する方法は、さらに以下の工程を含む：（ｇ）第２の精製された抽出物／エタノール混合物を生成するために、第２の精製された抽出物をエタノール（例えば、７０％エタノール）で洗浄する工程、（ｈ）第３の精製された抽出物を生成するために、第２の精製された抽出物／エタノール混合物を遠心分離機にかける工程、および、（ｉ）第３の精製された抽出物を抽出する工程。いくつかの実施形態では、単離した抽出物を精製する方法は、さらに以下の工程を含む：（ｊ）第３の精製された抽出物／エタノール混合物を生成するために、第３の精製された抽出物をエタノール（例えば、７０％エタノール）で洗浄する工程、（ｋ）第４の精製された抽出物を生成するために、第３の精製された抽出物／エタノール混合物を遠心分離機にかける工程、および、（ｌ）第４の精製された抽出物を抽出する工程。いくつかの実施形態では、精製された抽出物は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。いくつかの実施形態では、抗ＨＣ１抗体、抗ＨＣ２抗体、または、その両方が生成され、定常的な支持体に付けられる。いくつかの実施形態では、未精製のＨＣ−ＨＡ複合体（すなわち移動相）は、支持体上を通過する。特定の例においては、ＨＣ−ＨＡの複合体は、（例えば、（ａ）抗ＨＣ１抗体とＨＣ１、（ｂ）抗ＨＣ２抗体とＨＣ２、（ｃ）抗ＰＴＸ抗体とＰＴＸ３、（ｄ）抗ＳＬＲＰ抗体とＳＬＲＰ、または、（ｅ）その任意の組み合わせ、の作用によって）抗体と結合する。いくつかの実施形態において、支持体が（例えばＰＢＳで）洗浄されることで、任意の結合していないまたは緩く結語した分子が除去される。いくつかの実施形態では、支持体は、支持体（例えば、１％のＳＤＳ、６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、または、８Ｍの尿素）からのｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の溶離を可能にする溶液で洗浄される。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、親和性クロマトグラフィーによって精製される。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＰは生成され、定常的な支持体に付けられる。いくつかの実施形態では、未精製のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（すなわち、移動相）は、支持体上を通過する。特定の例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＨＡＢＰに結合する。いくつかの実施形態において、支持体は（例えばＰＢＳで）洗浄されることで、任意の未結合のまたは緩く結合した分子が取り除かれる。いくつかの実施形態では、支持体は、支持体からのＨＣ−ＨＡ複合体の溶離を可能にする溶液で洗浄される。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＨＡＢＰ親和性クロマトグラフィー、および、抗ＨＣ１抗体、抗ＨＣ２抗体、抗ＰＴＸ３抗体、ＳＬＲＰまたはＳＬＲＰの組み合わせに対する抗体、あるいは、これらの抗体の任意の組み合わせを使用する免疫親和性のクロマトグラフィーの組み合わせによって精製される。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、１つ以上の抗体を用いて本明細書に記載されるように、不溶性の画分から精製される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、抗ＳＬＲＰ抗体を使用して、本明細書に記載されるように、不溶性の画分から精製される。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、本明細書に記載されるように、可溶性の画分から精製される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、抗ＰＴＸ３抗体を使用して、本明細書に記載されるように、可溶性の画分から精製される。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、小ロイシン豊富なプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）を含む。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型のＳＬＲＰを含む。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なプロテオグリカンは、デコリンおよびバイグリカンのようなＩ型ＳＬＲＰの中から選択される。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なプロテオグリカンは、フィブロモジュリン、ルミカン、ＰＲＥＬＰ（プロリンアルギニン豊富な末端を有するロイシン豊富なタンパク質）、ケラトカン、および、オステオアドへリンのようなＩＩ型ＳＬＲＰの中から選択される。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なプロテオグリカンは、エピピカンとオステオグリシンのようなＩＩＩ型ＳＬＲＰの中から選択される。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なプロテオグリカンは、ビクニン、デコリン、バイグリカン、および、オステオアドへリンの中から選択される。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なタンパク質は、グリコサミノグリカンを含む。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なプロテオグリカンは、硫酸ケラタンを含む。
【０１２９】
（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の生成方法）
ＳＬＲＰで、または、ＳＬＲＰなしで、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）を生成する方法が本明細書で開示される。同様に、そのような方法によって生成された成分のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体および中間の組み合わせが、本明細書で開示される。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を生成する方法は、（ａ）ＰＴＸ３／ＨＡ複合体を形成するために、適切な条件下で、固定化した高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）をペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）に接触させる工程、および、（ｂ）ＰＴＸ３／ＨＡ複合体を、ＩαＩと、腫瘍壊死因子に刺激された遺伝子−６（ＴＳＧ−６）とに接触させる工程を含む。そのような方法によって生成されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６は、ＨＡに対するインターαインヒビター（ＩαＩ）の重鎖１（ＨＣ１）の伝達を触媒する。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ１は、ＨＡとの共有結合を形成する。いくつかの実施形態では、該方法の工程（ａ）と（ｂ）は順番に連続して行われる。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を生成する方法は、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体をＩαＩおよびＴＳＧ−６に接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６は、ＨＡに対する、インターαインヒビター（ＩαＩ）の重鎖１（ＨＣ１）の伝達を触媒する。そのような方法によって生成されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ１は、ＨＡとの共有結合を形成する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３に結合したＨＡの複合体を生成する方法は、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体を形成する適切な条件下で、固定化した高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）を、ペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）に接触させる工程を含む。そのような方法によって生成されたＰＴＸ３／ＨＡ複合体が、本明細書で提供される。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を生成する方法は、（ａ）ＴＳＧ−６にあらかじめ結合したＨＣ−ＨＡ複合体を形成するために、ＩαＩとＴＳＧ−６を含む固定化した高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）を、ＨＡに接触させる工程、および、（ｂ）ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を形成する適切な条件下で、ＨＣ−ＨＡ複合体をペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）と接触させる工程を含む。そのような方法によって生成されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ１は、ＨＡとの共有結合を形成する。いくつかの実施形態では、該方法の工程（ａ）と（ｂ）は順番に連続して行われる。いくつかの実施形態では、該方法は、ＴＳＧ−６にあらかじめ結合したＨＣ−ＨＡ複合体をＰＴＸ３に接触させる工程を含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、該方法は、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体を形成するために適切な条件下で、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）をペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）にまず接触させる工程、その後、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体をＩαＩとＴＳＧ−６に接触させる工程を含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ＩαＩタンパク質とＴＳＧ−６タンパク質は、約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、または、２０：１（ＩαＩ：ＴＳＧ−６）のモル比で複合体に接触する。いくつかの実施形態において、ＩαＩ：ＴＳＧ−６の比率は、約１：１乃至約２０：１、例えば、約１：１乃至約１０：１、例えば、約１：１乃至約５：１、例えば、約１：１乃至約３：１の範囲である。いくつかの実施形態では、ＩαＩ：ＴＳＧ−６の比率は、３：１以上である。いくつかの実施形態では、ＩαＩ：ＴＳＧ−６の比率は、３：１である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、該方法の工程（ａ）と（ｂ）は順番に連続して行われる。いくつかの実施形態では、該方法は、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体をＩαＩとＴＳＧ−６に接触させる工程を含む。
【０１３７】
特定の例において、ＴＳＧ−６は、ＩαＩと相互に作用し、ＩαＩのＨＣ１とＨＣ２との共有結合の複合体（すなわち、ＨＣ１・ＴＳＧ−６およびＨＣ２・ＴＳＧ−６）を形成する。特定の例では、ＨＡの存在下で、ＨＣはｒｃＨＣ−ＨＡを形成するためにＨＡに移される。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６・ＨＣ１複合体は、ＨＡへのＨＣ１の伝達を触媒するために、あらかじめ結合したＰＴＸ３／ＨＡ複合体に加えられる。いくつかの実施形態では、該方法は、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体を形成するために適切な条件下で、固定した高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）をペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）にまず接触させる工程、その後、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体をＨＣ１・ＴＳＧ−６複合体と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ１・ＴＳＧ−６複合体およびＨＣ２・ＴＳＧ−６複合体の組み合わせは、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体に加えられる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、固定化したＨＭＷ  ＨＡにＰＴＸ３を接触させる工程は、少なくとも１０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、または、少なくとも２４時間以上、生じる。いくつかの実施形態では、固定化したＨＭＷ  ＨＡに対してＰＴＸ３を接触させる工程は、少なくとも２時間以上生じる。いくつかの実施形態では、固定化したＨＭＷ  ＨＡに対してＰＴＸ３を接触させる工程は、少なくとも２時間生じる。いくつかの実施形態では、固定化したＨＭＷ  ＨＡに対してＰＴＸ３を接触させる工程は、３７°Ｃで生じる。いくつかの実施形態では、固定化したＨＭＷ  ＨＡに対してＰＴＸ３を接触させる工程は、ＰＢＳ中の５ｍＭのＭｇＣｌ２で生じる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、ＩαＩおよびＴＳＧ−６を含むＰＴＸ３／ＨＡ複合体を、ＨＡに接触させる工程は、少なくとも１０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、または、少なくとも２４時間以上、生じる。いくつかの実施形態において、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体をＨＣ１・ＴＳＧ−６複合体および／またはＨＣ２・ＴＳＧ−６複合体に接触させる工程は、少なくとも１０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、または、少なくとも２４時間以上、生じる。いくつかの実施形態において、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体をＨＣ１・ＴＳＧ−６複合体および／またはＨＣ２・ＴＳＧ−６複合体に接触させる工程は、少なくとも２時間以上生じる。いくつかの実施形態において、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体をＨＣ１・ＴＳＧ−６複合体および／またはＨＣ２・ＴＳＧ−６複合体に接触させる工程は、少なくとも２時間生じる。いくつかの実施形態において、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体をＨＣ１・ＴＳＧ−６複合体および／またはＨＣ２・ＴＳＧ−６複合体に接触させる工程は、３７°Ｃで生じる。いくつかの実施形態において、ＰＴＸ３／ＨＡ複合体をＨＣ１・ＴＳＧ−６複合体および／またはＨＣ２・ＴＳＧ−６複合体に接触させる工程は、ＰＢＳ中の５ｍＭのＭｇＣｌ２で生じる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、該方法は、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を形成するために適切な条件下で、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）を、ペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）タンパク質、重鎖１（ＨＣ１）を含むインターαインヒビター（ＩαＩ）タンパク質、および、腫瘍壊死因子αで刺激された遺伝子６（ＴＳＧ−６）を、同時に接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡを、ＰＴＸ３、ＩαＩ、および、ＴＳＧ−６に接触させる工程は、少なくとも１０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、または、少なくとも２４時間以上、生じる。いくつかの実施形態において、ＨＭＷ  ＨＡを、ＰＴＸ３、ＩαＩ、および、ＴＳＧ−６に接触させる工程は、３７°Ｃで生じる。いくつかの実施形態において、ＨＭＷ  ＨＡを、ＰＴＸ３、ＩαＩ、および、ＴＳＧ−６に接触させる工程は、ＰＢＳ中５ｍＭのＭｇＣｌ２で生じる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、該方法は、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を形成するために、適切な条件下で、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）を、ペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）タンパク質、重鎖１（ＨＣ１）を含むインターαインヒビター（ＩαＩ）タンパク質、および、腫瘍壊死因子αで刺激された遺伝子６（ＴＳＧ−６）に、任意の順番で連続して接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡを、ＰＴＸ３、ＩαＩ、および、ＴＳＧ−６に接触させる工程は、少なくとも１０分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、または、少なくとも２４時間以上、生じる。いくつかの実施形態において、ＨＭＷ  ＨＡを、ＰＴＸ３、ＩαＩ、および、ＴＳＧ−６に接触させる工程は、３７°Ｃで生じる。いくつかの実施形態において、ＨＭＷ  ＨＡを、ＰＴＸ３、ＩαＩ、および、ＴＳＧ−６に接触させる工程は、ＰＢＳ中の５ｍＭのＭｇＣｌ２で生じる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の産生のための方法は、１つ以上の小ロイシン豊富なプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）の追加をさらに含む。いくつかの実施形態では、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を生成する方法は、（ａ）ＰＴＸ３／ＨＡ複合体を形成するために適切な条件下で、固定化した高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）をペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）に接触させる工程、（ｂ）ＰＴＸ３／ＨＡ複合体を、ＩαＩおよび腫瘍壊死因子で刺激された遺伝子−６（ＴＳＧ−６）に接触させる工程、（ｃ）ＰＴＸ３／ＨＡ複合体を１つ以上のＳＬＲＰＳに接触させる工程を含む。そのような方法によって生成されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６は、インターαインヒビター（ＩαＩ）の重鎖１（ＨＣ１）の、ＨＡへの伝達を触媒する。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ１は、ＨＡとの共有結合を形成する。いくつかの実施形態では、該方法の工程（ａ）、（ｂ）、および、、（ｃ）は、順番に連続して行われる。いくつかの実施形態では、該方法の工程（ａ）、（ｂ）、および、（ｃ）は、同時に行われる。いくつかの実施形態では、該方法の工程（ａ）が行われ、その後、該方法の工程（ｂ）と（ｃ）が順番に連続して行われる。いくつかの実施形態では、該方法の工程（ａ）が行われ、その後、該方法の工程（ｂ）と（ｃ）が同時に行われる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を生成する方法は、（ａ）ＴＳＧ−６にあらかじめ結合したＨＣ−ＨＡ複合体を形成するために、ＩαＩとＴＳＧ−６を含む固定化した高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷ  ＨＡ）を、ＨＡに接触させる工程、（ｂ）ＨＣ−ＨＡ複合体をペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）に接触させる工程、および、（ｃ）ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を形成するために、適切な条件下で、ＨＣ−ＨＡ複合体を、１つ以上のＳＬＲＰＳに接触させる工程を含む。そのような方法によって生成されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ１は、ＨＡとの共有結合を形成する。いくつかの実施形態では、該方法は、ＴＳＧ−６にあらかじめ結合したＨＣ−ＨＡ複合体を、ＰＴＸ３に接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、該方法の工程（ａ）、（ｂ）、および、（ｃ）は、順番に連続して行われる。いくつかの実施形態では、該方法の工程（ａ）、（ｂ）、および、（ｃ）は、同時に行われる。いくつかの実施形態では、該方法の工程（ａ）が行われ、その後、該方法の工程（ｂ）と（ｃ）が順番に連続して行われる。いくつかの実施形態では、該方法の工程（ａ）が行われ、その後、該方法の工程（ｂ）と（ｃ）が、同時に行われる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、ＳＬＲＰは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型のＳＬＲＰの中から選択される。いくつかの実施形態では、ＳＬＲＰは、デコリンおよびバイグリカンのような、Ｉ型のＳＬＲＰの中から選択される。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なプロテオグリカンは、フィブロモジュリン、ルミカン、ＰＲＥＬＰ（プロリンアルギニン豊富な末端を有するロイシン豊富なタンパク質）、ケラトカン、および、オステオアドへリンのようなＩＩ型のＳＬＲＰの中から選択される。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なプロテオグリカンは、エピピカンとオステオグリシンのようなＩＩＩ型のＳＬＲＰの中から選択される。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なプロテオグリカンは、ビクニン、デコリン、バイグリカン、および、オステオアドへリンの中から選択される。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なタンパク質は、グリコサミノグリカンを含む。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なプロテオグリカンは、硫酸ケラタンを含む。
【０１４５】
ＰＴＸ３
【０１４６】
いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＰＴＸ３は、細胞、または、複数の細胞（例えば組織抽出物）から単離される。ＰＴＸ３の発現に適している典型的な細胞は、限定されないが、動物細胞（限定されないが、哺乳動物の細胞、霊長類の細胞、ヒトの細胞、げっ歯類の細胞、昆虫の細胞、細菌、および、酵母菌を含む）、および、植物細胞（限定されないが、藻類、被子植物、裸子植物、シダ植物、および、コケ植物を含む）を含む。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＰＴＸ３は、ヒト細胞から単離される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＰＴＸ３は、ＰＴＸ３発現をアップレギュレートするために、１つ以上の炎症性サイトカインで刺激される細胞から単離される。いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインは、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αである。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＰＴＸ３は、羊膜細胞から単離される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＰＴＸ３は、臍の緒からの羊膜細胞から単離される。いくつかの実施形態では、羊膜細胞は、ＰＴＸ３発現をアップレギュレートするために、より多くの炎症性サイトカインで刺激される。いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインは、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αである。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＰＴＸ３は、臍の緒の細胞から単離される。いくつかの実施形態では、臍の緒の細胞は、ＰＴＸ３発現をアップレギュレートするために、より多くの炎症性サイトカインで刺激される。いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインはＩＬ−１またはＴＮＦ−αである。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＰＴＸ３は、羊膜の上皮細胞から単離される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＰＴＸ３は、臍の緒の上皮細胞から単離される。いくつかの実施形態では、羊膜の上皮細胞または臍の緒の上皮細胞は、ＰＴＸ３発現をアップレギュレートするために、より多くの炎症性サイトカインで刺激される。いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインはＩＬ−１またはＴＮＦ−αである。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＰＴＸ３は、羊膜の間質細胞から単離される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＰＴＸ３は、臍の緒の間質細胞から単離される。いくつかの実施形態では、羊膜の間質細胞または臍の緒の間質細胞は、ＰＴＸ３発現をアップレギュレートするために、より多くの炎症性サイトカインで刺激される。いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインは、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αである。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＰＴＸ３は、細胞から単離された天然のＰＴＸ３タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＰＴＸ３発現をアップレギュレートするために、より多くの炎症性サイトカインで刺激される。いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインは、ＩＬ−１またはＴＮＦ−αである。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３は組み換え技術によって調製される。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３は、組み換え発現ベクターから発現される。いくつかの実施形態では、核酸符号化ＰＴＸ３は、構成的プロモーターに動作可能に結合する。いくつかの実施形態では、核酸符号化ＰＴＸ３は、誘導性プロモーターに動作可能に結合する。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３は遺伝子導入動物で発現する。いくつかの実施形態において、ＰＴＸ３は組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３は細胞から単離した組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３は細胞を含まない抽出物中で生成された組換えタンパク質である。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３は、羊膜、臍の緒、臍の緒の羊膜、絨毛膜、羊水、または、これらの組み合わせから精製される。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３は羊膜細胞から精製される。いくつかの実施形態において、羊膜細胞は羊膜の上皮細胞である。いくつかの実施形態では、羊膜細胞は臍の緒の上皮細胞である。いくつかの実施形態において、羊膜細胞は羊膜の間質細胞である。いくつかの実施形態では、羊膜細胞は臍の緒の間質細胞である。いくつかの実施形態では、羊膜細胞は、ＰＴＸ３発現をアップレギュレートするために、より多くの炎症性サイトカイン刺激される。いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインはＩＬ−１またはＴＮＦ−αである。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３は、細胞、または、複数の細胞（例えば組織抽出物）から単離されない。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３で明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３で明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているその変異体を含む。典型的な変異体は、例えば、種変異体、対立遺伝子変異体、および、保存的および非保存的アミノ酸変異を含む変異体を含んでいる。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３は、ＨＡに結合するとともに、かつ、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の形成を促進するのに十分なＰＴＸ３のフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３は、ヒトＰＴＸ３のＧｌｕ１８からＳｅｒ２７７を含む。提供される方法で使用されるＰＴＸ３の変異体は、アミノ酸の置換（置換術）、欠失、または挿入である、アミノ酸修飾を含む変異体を含んでいる。いくつかの実施形態では、そのような修飾は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の１つ以上の治療特性（例えば、抗炎症、抗免疫、抗血管新生、抗瘢痕、抗接着、再生、または、本明細書に記載されるような他の治療活性）を改善するなどといった、ＰＴＸ３ポリペプチドの１つ以上の特性を改善する。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、ＰＴＸ３タンパク質は商用源から得られる。ＰＴＸ３のための典型的な商用源は、限定されないが、ＰＴＸ３（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．  １８２６−ＴＳ；  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ミネソタ州ミネアポリス）である。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＰＴＸ３タンパク質は、多量体タンパク質である。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＰＴＸ３タンパク質は、ホモ多量体である。いくつかの実施形態では、ホモ多量体は、二量体、三量体、四量体、六量体、五量体、または八量体である。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３ホモ多量体は、三量体、四量体、または八量体である。特定の実施形態において、ＰＴＸ３ホモ多量体は、八量体である。いくつかの実施形態では、多量体化ドメインは、ＰＴＸ３タンパク質の多量体化を改善するために修正される。いくつかの実施形態では、多量体化ドメインは、ＰＴＸ３に融合するとＰＴＸ３の多量体化を改善する、異種起源の多量体化ドメイン（例えば、Ｆｃ多量体化ドメインまたはロイシンジッパー）と取り替えられる。
【０１５８】
ＴＳＧ−６
【０１５９】
いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＴＳＧ−６は、細胞、または、複数の細胞（例えば組織抽出物）から単離される。ＴＳＧ−６の発現に適している典型的な細胞は、限定されないが、動物細胞（限定されないが、哺乳動物の細胞、霊長類の細胞、ヒトの細胞、げっ歯類の細胞、昆虫の細胞、細菌、および、酵母菌を含む）、および、植物細胞（限定されないが、藻類、被子植物、裸子植物、シダ植物、および、コケ植物を含む）を含む。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＴＳＧ−６は、ヒト細胞から単離される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＴＳＧ−６は、ＴＳＧ−６発現をアップレギュレートするために、１つ以上の炎症性サイトカインで刺激される細胞から単離される。いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインはＩＬ−１またはＴＮＦ−αである。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＴＳＧ−６は羊膜細胞から単離される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＴＳＧ−６は、臍の緒からの羊膜細胞から単離される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＴＳＧ−６は、ＴＳＧ−６発現をアップレギュレートするために、１つ以上の炎症性サイトカインで刺激される羊膜細胞から分離される。いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインはＩＬ−１またはＴＮＦ−αである。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＴＳＧ−６は臍の緒の細胞から単離される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＴＳＧ−６は、ＴＳＧ−６発現をアップレギュレートするために、１つ以上の炎症性サイトカインで刺激される臍の緒の細胞から単離される。いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインはＩＬ−１またはＴＮＦ−αである。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＴＳＧ−６は、羊膜の上皮細胞から単離される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＴＳＧ−６は、臍の緒の上皮細胞から単離される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＴＳＧ−６は、ＴＳＧ−６発現をアップレギュレートするために、１つ以上の炎症性サイトカインで刺激される羊膜の上皮細胞または臍の緒の上皮細胞から単離される。いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインはＩＬ−１またはＴＮＦ−αである。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＴＳＧ−６は、羊膜の間質細胞から単離される。いくつかの実施形態において、該方法で使用されるＴＳＧ−６は、臍の緒の間質細胞から単離される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＴＳＧ−６は、ＴＳＧ−６発現をアップレギュレートするために、１つ以上の炎症性サイトカインで刺激される羊膜の間質細胞または臍の緒の間質細胞から単離される。いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインはＩＬ−１またはＴＮＦ−αである。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＴＳＧ−６は、細胞から単離した天然のＴＳＧ−６タンパク質である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＴＳＧ−６発現をアップレギュレートするために、より多くの炎症性サイトカインで刺激される。いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインはＩＬ−１またはＴＮＦ−αである。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６は組み換え技術によって調製される。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６は組み換え発現ベクターから発現される。いくつかの実施形態では、核酸符号化ＴＳＧ−６は、構成的プロモーターに動作可能に結合する。いくつかの実施形態では、核酸符号化ＴＳＧ−６は、誘導性プロモーターに動作可能に結合する。いくつかの実施形態において、ＴＳＧ−６は、遺伝子導入動物で発現する。いくつかの実施形態において、ＴＳＧ−６は、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６は細胞から単離された組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６は細胞を含まない抽出物中で生成された組換えタンパク質である。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６は、羊膜、羊膜、絨毛膜、羊水、またはその組み合わせから精製される。いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３は羊膜細胞から精製される。いくつかの実施形態において、羊膜細胞は羊膜の上皮細胞である。いくつかの実施形態では、羊膜の上皮細胞は臍の緒の上皮細胞である。いくつかの実施形態において、羊膜細胞は羊膜の間質細胞である。いくつかの実施形態では、羊膜細胞は臍の緒の間質細胞である。いくつかの実施形態では、羊膜細胞は、ＴＳＧ−６発現をアップレギュレートするために、より多くの炎症性サイトカインで刺激される。いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインはＩＬ−１またはＴＮＦ−αである。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６は、細胞、または、複数の細胞（例えば組織抽出物）から単離されない。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６は、ＨＡに対する、ＩαＩのＨＣ１の伝達を促進するまたは触媒するのに十分なＴＳＧ−６のフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６は、ＴＳＧ−６のリンクモジュールを含む。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６は、ＴＳＧ−６のＬｅｕ２７７によってアミノ酸Ｔｒｐ１８を含む。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているその変異体を含む。典型的な変異体は、例えば、種変異体、対立遺伝子変異体、および、保存的および非保存的アミノ酸変異を含む変異体を含んでいる。ヒトＴＳＧ−６の天然の対立遺伝子変異体は、例えば、アミノ酸置換Ｑ１４４Ｒを包含するＴＳＧ−６を含んでいる。提供される方法で使用されるフラグメントを結合するＴＳＧ−６またはＨＡの変異体は、アミノ酸の置換（置換術）、欠失、または挿入であるアミノ酸修飾を含む変異体を含んでいる。いくつかの実施形態では、このような修飾は、ＴＳＧ−６ポリペプチドの１つ以上の特性を改善する（例えば、ＨＡに対するＩαＩのＨＣ１の伝達の改善、または、ＨＡに対するＩαＩのＨＣ１の伝達後のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３からのＴＳＧ−６ポリペプチドの放出の改善）。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６はアフィニティタグを含む。典型的なアフィニティタグは、限定されないが、ヘマグルチニンタグ、ポリ−ヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）タグを含む。そのようなアフィニティタグは精製で使用される技術では周知である。いくつかの実施形態では、そのようなアフィニティタグは、融合タンパク質として、または、化学的リンカーによって、ＴＳＧ−６ポリペプチドに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＳＧ−６はアフィニティタグを含み、結合していないＴＳＧ−６は、アフィニティ精製によって、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体から取り除かれる。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、ＴＳＧ−６タンパク質は商用源から得られる。ＴＳＧ−６のための典型的な商用源は、限定されないが、ＴＳＧ−６（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．  ２１０４−ＴＳ  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ミネソタ州ミネアポリス）である。
【０１７１】
ＩαＩ
【０１７２】
いくつかの実施形態において、ＩαＩはＨＣ１鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＩαＩはＨＣ１とＨＣ２の鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＩαＩはＨＣ１とビクニンを含む。いくつかの実施形態では、ＩαＩは、ＨＣ１とＨＣ２の鎖、および、ビクニンを含む。いくつかの実施形態では、ＩαＩは、コンドロイチン硫酸鎖によって結合した、ＨＣ１とＨＣ２の鎖、および、ビクニンを含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、ＩαＩは生体サンプルから単離される。いくつかの実施形態において、生体サンプルは哺乳動物からの生体サンプルがある。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。１つの実施形態において、生体サンプルは、血液、血清、血漿、肝臓、羊膜、絨毛膜、または、羊水のサンプルである。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、血液、血清、または、血漿のサンプルである。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血液サンプルである。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血清サンプルである。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血漿サンプルである。いくつかの実施形態では、ＩαＩはヒトの血液、血漿、または、血清から精製される。いくつかの実施形態では、ＩαＩはヒトの血清から単離される。いくつかの実施形態では、ＩαＩは血清からは単離されない。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＩαＩは、羊膜細胞中で生成される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＩαＩは、臍の緒の細胞中で生成される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＩαＩは、臍の緒からの羊膜細胞中で生成される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＩαＩは、羊膜の上皮細胞中で生成される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＩαＩは、臍の緒の上皮細胞中で生成される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＩαＩは、羊膜の間質細胞中で生成される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＩαＩは、臍の緒の間質細胞中で生成される。いくつかの実施形態では、該方法で使用されるＩαＩは、肝細胞中で生成される。いくつかの実施形態では、ＩαＩは組み換え技術によって調製される。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ１は、生体サンプルから単離される。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、哺乳動物からの生体サンプルである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血液、血清、血漿、肝臓、羊膜、絨毛膜、または、羊水のサンプルである。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、血液、血清、または血漿のサンプルである。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血液サンプルである。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血清サンプルである。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血漿サンプルである。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ１は、ヒトの血液、血漿、または血清から精製される。いくつかの実施形態では、ＩαＩはヒトの血清から単離される。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ１は、血清からは精製されない。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ１は、組み換え技術によって調製される。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ１は、肝細胞から精製される。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ１は、羊膜細胞から精製される。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ１は、羊膜の上皮細胞または臍の緒の上皮細胞から精製される。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ１は、羊膜の間質細胞または臍の緒の間質細胞から精製される。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、ＨＣ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７で明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７で明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ２は、生体サンプルから単離される。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、哺乳動物からの生体サンプルである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血液、血清、血漿、肝臓、羊膜、絨毛膜、または羊水のサンプルである。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、血液、血清、または血漿のサンプルである。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血液サンプルである。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血清サンプルである。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血漿サンプルである。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ２は、ヒトの血液、血漿、または血清から精製される。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ２は、ヒトの血清から単離される。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ２は、ヒトの血清から単離される。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ２は、血清からは単離されない。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ２は、組み換え技術によって調製される。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ２は、肝細胞から精製される。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ２は、羊膜細胞から精製される。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ２は、羊膜の上皮細胞または臍の緒の上皮細胞から精製される。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣ２は、羊膜の間質細胞または臍の緒の間質細胞から精製される。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ＨＣ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９で明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９で明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、ＩαＩはビクニンを含む。いくつかの実施形態では、ビクニンは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３で明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３で明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＩαＩはコンドロイチン硫酸鎖を含む。
【０１７９】
ＨＡ
【０１８０】
いくつかの実施形態では、ＨＡは細胞、組織、または流体サンプルから精製される。いくつかの実施形態では、ＨＡは、市販の供給元（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  ｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ，カリフォルニア州アーバイン（例えば、Ｈｅａｌｏｎ））から得られる。いくつかの実施形態では、ＨＡは粉末として市販の供給元から得られる。いくつかの実施形態では、ＨＡは細胞中で発現する。ＨＡの発現に適している典型的な細胞は、限定されないが、動物細胞（限定されないが、哺乳動物の細胞、霊長類の細胞、ヒトの細胞、げっ歯類の細胞、昆虫の細胞、細菌、および、酵母菌を含む）、および、植物細胞（限定されないが、藻類、被子植物、裸子植物、シダ植物、および、コケ植物を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡはヒトの細胞で発現する。いくつかの実施形態では、ＨＡは遺伝子導入動物で発現する。いくつかの実施形態では、ＨＡは、ヒアルロナン・シンターゼ（例えば、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、および、ＨＡＳ３）を発現する細胞から得られる。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＡシンターゼを発現する組み換え発現ベクターを包含している。特定の例においては、ＨＡシンターゼは、それが細胞膜を介して細胞外空間に押し出される際に、発生期の多糖類にグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンを繰り返し加えることによって、ヒアルロナンを延ばす。
【０１８１】
該方法で使用されるＨＡは、典型的に高分子量（ＨＭＷ）ＨＡである。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡの重量平均分子量は、約５００キロダルトン（ｋＤａ）よりも大きく、例えば、約５００ｋＤａと約１０，０００ｋＤａの間、約８００ｋＤａと約８，５００ｋＤａの間、約１１００ｋＤａと約５，０００ｋＤａの間、または、約１４００ｋＤａと約３，５００ｋＤａの間である。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡの重量平均分子量は、約３０００ｋＤａである。
【０１８２】
追加成分
【０１８３】
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加成分が加えられ、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を生成する。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を生成するために加えられる。いくつかの実施形態では、ＳＬＲＰは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型のＳＬＲＰである。いくつかの実施形態では、ＳＬＲＰは、デコリンおよびバイグリカンのようなＩ型ＳＬＲＰの中から選択される。いくつかの実施形態では、ＳＬＲＰは、フィブロモジュリン、ルミカン、ＰＲＥＬＰ（プロリンアルギニン豊富な末端を有するロイシン豊富なタンパク質）、ケラトカン、および、オステオアドへリンのようなＩＩ型ＳＬＲＰの中から選択される。いくつかの実施形態では、ＳＬＲＰは、エピピカンとオステオグリシンのようなＩＩＩ型ＳＬＲＰの中から選択される。いくつかの実施形態では、ＳＬＲＰは、ビクニン、デコリン、バイグリカン、および、オステオアドへリンの中から選択される。いくつかの実施形態において、ＳＬＲＰは、グリコサアミノグリカンを含む。いくつかの実施形態では、ＳＬＲＰは硫酸ケラタンを含む。
【０１８４】
ＨＡ固定化
【０１８５】
いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは任意の適切な方法によって固定化される。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは、固形の支持体、例えば、培養皿、ビーズ、カラム、または、例えば移植可能な医療装置またはその一部の表面といった他の適切な表面に、あるいは、本明細書に記載されるような移植可能な医療装置と実質的に結合させたまたは組み合わせた表面上に、固定される。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは、化学結合などによって、固形の支持体に直接固定される。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは、リンカーまたは中間タンパク質によって、固形の支持体に間接的に付けられる。アミノ基とチオール基の間で共有結合を形成し、かつ、チオール基をタンパク質に導入するために使用される多数のヘテロ二官能性の架橋試薬は、当業者に知られている。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは、固形の支持体に架橋することによって固形の支持体に直接固定される。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは、固形の支持体に架橋せずに、固形の支持体に直接固定される。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは、コーティング剤として固形の支持体に直接固定される。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは、Ｃｏｖａｌｉｎｋ（商標）−ＮＨ表面に固定される。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは、コーティング剤として固形の支持体に直接固定される。いくつかの実施形態では、ＨＭＷ  ＨＡは、４°Ｃで約１６時間Ｃｏｖａｌｉｎｋ（商標）−ＮＨ表面に固定される。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、該方法は、固形の支持体（すなわち、中間タンパク質のない）に対する直接結合によって、固体の表面にＨＭＷ  ＨＡを固定する工程を含む。いくつかの実施形態では、固形の支持体は、固定化したＨＡをＰＴＸ３に接触させる前に、結合していないＨＭＷ  ＨＡを取り除くために洗浄される。いくつかの実施形態では、固定化したＨＡをＰＴＸ３に接触させる前に、結合していないＨＭＷ  ＨＡを取り除くために、固形の支持体は８ＭのＧｎＨＣｌとＰＢＳの洗浄液で洗浄する。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、該方法は、中間タンパク質またはリンカーによって、固体の表面にＨＡを固定する工程を含む。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、中間タンパク質はＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）である。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＰは、（例えば、架橋、化学結合、または化学的リンカーによって）固形の支持体にまず結合する。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＰを含む固形の支持体は、その後、ＨＡに対するＨＡＢＰの結合によって、固形の支持体にＨＡを固定するために、ＨＡ（例えばＨＭＷ  ＨＡ）に接触する。いくつかの実施形態では、固形の支持体は、固定化したＨＭＷ  ＨＡをＰＴＸ３に接触させる前に、結合していないＨＭＷ  ＨＡを取り除くために洗浄される。いくつかの実施形態では、固定化したＨＡをＰＴＸ３に接触させる前に、結合していないＨＭＷ  ＨＡを取り除くために、固形の支持体は、８ＭのＧｎＨＣｌとＰＢＳの洗浄液で洗浄される。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、該方法は、固形の支持体へのペプチドリンカーの結合と、ペプチドリンカーへのＨＡの結合によって、固体の表面にＨＡを固定する工程を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、プロテアーゼ切断部位を含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、該方法は、限定されないが、ジスルフィド化学的リンカーなどの切断可能な化学的リンカーの結合によって、固体の表面にＨＡを固定する工程を含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、該方法で使用するのに選ばれたＨＡＢＰは、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の形成後に、ＨＡから解離されるＨＡＢＰである。いくつかの実施形態において、ＨＡＢＰは非特異的にＨＡに結合する。いくつかの実施形態では、該方法は、１つ以上の解離剤を用いて、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体をＨＡＢＰから解離する工程をさらに含む。非共有結合の相互作用を破壊するための解離剤（例えば、塩酸グアニジン、尿素、および、様々な洗剤（例えば、ＳＤＳ））は、当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、解離剤は尿素である。いくつかの実施形態では、解離剤は塩酸グアニジンである。いくつかの実施形態では、解離剤は、約４Ｍ乃至約８Ｍのグアニジン−ＨＣｌである。いくつかの実施形態では、解離剤は、約４Ｍ、約５Ｍ、約６Ｍ、約７Ｍ、約８Ｍのグアニジン−ＨＣｌである。いくつかの実施形態では、解離剤は、ｐＨ７．５のＰＢＳ中の、約４Ｍ乃至約８Ｍのグアニジン−ＨＣｌである。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、そのような解離剤は、中間ＨＡＢＰからｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を解離するために採用される。該方法で使用されるＨＡＢＰは、典型的には、ＨＡの結合親和性がｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の組立を可能にするほど十分に強力であるが、適切な解離剤を含むｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体から分離されるように、選択される。いくつかの実施形態では、解離剤は塩酸グアニジンである。
【０１９２】
本明細書で提供される該方法とともに使用される典型的なＨＡＢＰは、限定されないが、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、ＴＳＧ−６、ＣＤ４４、スタビリン−１、スタビリン−２、または、ＨＡを結合するのに十分なこれらの一部（例えば、これらのリンクモジュール）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＰは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：５４−９９のいずれかで明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：５４−９９のいずれかで明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＰはバーシカンである。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＰは組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＰは、組換え哺乳動物タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＰは、組換えヒトタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＰは、組み換え型のバーシカンタンパク質、または、ＨＡに結合するのに十分なその一部である。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＰは、組み換え型のアグリカンタンパク質、または、ＨＡに結合するのに十分なその一部である。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＰは、天然のＨＡＢＰ、または、ＨＡに結合するのに十分なその一部である。いくつかの実施形態では、天然のＨＡＢＰは、哺乳動物の組織または細胞から単離される。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＰは、ウシの鼻軟骨（例えば、アグリカンとリンクタンパク質のＨＡ結合領域を含む、ＳｅｉｋａｇａｋｕからのＨＡＢＰ）から単離される。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、ＨＡＢＰは、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、ＴＳＧ−６、ＣＤ４４、スタビリン−１、または、スタビリン−２のリンクモジュールを含む。いくつかの実施形態では、リンクモジュールを含むＨＡＢＰは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：５４−９９の結合ドメインのいずれかで明記される配列を有するポリペプチド、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：５４−９９の結合ドメインのいずれかで明記される配列を有するポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＰは、バーシカンのリンクモジュールを含む。いくつかの実施形態では、リンクモジュールを含むＨＡＢＰは、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、バーシカンのリンクモジュールを含むＨＡＢＰは、組換えタンパク質である。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、ＨＡＢＰのような中間タンパク質は、フューリン、３Ｃプロテアーゼ、カスパーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、または、ＴＥＶプロテアーゼのような部位に特異的なプロテアーゼによって認識されて加水分解される、タンパク質切断配列を包含している。そのような実施形態では、組み立てられたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、固定化した複合体を、特定の切断配列を切断するプロテアーゼに接触させることにより、固形の支持体から解放される。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体が精製される。いくつかの実施形態では、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、任意の適切な方法または方法の組み合わせによって精製される。下記に述べられる実施形態は、排他的になるように意図されたものではなく、単なる典型的なものである。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、サイズ排除、および、ヒドロキシアパタイトのクロマトグラフィー）、ゲルろ過、遠心分離（例えば、勾配遠心分離）または差次的な溶解度、エタノール沈殿、あるいは、タンパク質の精製のための他の利用可能な技術によって、精製される。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。いくつかの実施形態において、抗体は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の成分に対して生成され（例えば、抗ＨＣ１、抗ＰＴＸ、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の１つ以上のＳＬＲＰに対する抗体、例えば、抗ビクニン、抗デコリン、抗バイグリカン、または、抗オステオアドへリン）、固形の支持体に付けられる。いくつかの実施形態では、精製されていないｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（すなわち移動相）は、支持体上を通過する。特定の例では、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は抗体に結合する。いくつかの実施形態では、支持体は、任意の結合していない分子または緩く結合した分子を取り除くために、（例えばＰＢＳで）洗浄される。いくつかの実施形態では、支持体は、支持体からのｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の溶離を可能にする溶液で洗浄される（例えば、１％のＳＤＳ、６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、または、８Ｍの尿素）。いくつかの実施形態では、解離剤は、解離したｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体から取り除かれる。いくつかの実施形態では、解離剤は、限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外ろ過、または、ダイアフィルトレーションを含む方法によって、解離したｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体から取り除かれる。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、親和性クロマトグラフィーによって精製される。いくつかの実施形態では、ＨＡＢＰは、複合体を精製するべく、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体に結合するように採用され、および、定常的な支持体に貼付される。いくつかの実施形態では、精製されていないｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（すなわち移動相）は、支持体上を通過する。特定の例では、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＨＡＢＰに結合する。いくつかの実施形態において、支持体は、任意の結合していない、または、緩く結合した分子を取り除くために、（例えばＰＢＳで）洗浄される。いくつかの実施形態では、その後、支持体は、支持体からのｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の溶離を可能にする溶液（例えば解離剤）で洗浄される。いくつかの実施形態では、解離剤は、限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、分離、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過または、ダイアフィルトレーションを含む方法によって、解離したｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体から取り除かれる。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の１つ以上の成分に対する抗体を使用して、ＨＡＢＰ親和性クロマトグラフィーと免疫親和性クロマトグラフィーの組み合わせによって精製される。
【０２００】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の１つ以上の成分は、アフィニティタグ（例えば、アフィニティタグを含む、ＰＴＸ３またはＨＣ１の融合タンパク質）を含む。いくつかの実施形態においてｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の１つ以上の成分に組み込まれる典型的なアフィニティタグは、限定されないが、ヘマグルチニンタグ、ポリ・ヒスチジン、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、または、グルタチオン−Ｓ−転移酵素配列を含んでいる。いくつかの実施形態では、アフィニティタグのリガンドは、固形の支持体に結合する。いくつかの実施形態では、未精製のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、支持体上を通過する。特定の例では、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、リガンドに結合する。いくつかの実施形態において、支持体は、任意の結合していない、または、緩く結合した分子を取り除くために、（例えばＰＢＳで）洗浄される。いくつかの実施形態では、支持体は、支持体からの本明細書で開示されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の溶離を可能にする溶液で洗浄される。いくつかの実施形態では、溶離剤は、限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、分離、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過またはダイアフィルトレーションを含む方法によって、解離したｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体から取り除かれる。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、ＰＴＸ３、ＴＳＧ−６、および／またはＨＣ１は、標識と共役する。「標識」とは、標識したポリペプチドを生成するために、ポリペプチドと直接的または間接的に共役する、検知可能な化合物または組成物を指す。いくつかの実施形態では、標識はそれ自体で検知可能（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）であるか、または、酵素標識の場合には、検知可能な基質化合物組成物の化学変化を触媒する。非限定的な標識の例は、蛍光発生部分、色素、蛍光タグ、緑色蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼを含んでいる。
【０２０２】
（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３とｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の活性を評価する方法）
【０２０３】
本明細書で提供されるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３とｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の特性は、生体外とインビボの方法を含む任意の適切な方法によって、評価される。典型的な生体外の方法が本明細書で提供されており、限定されないが、固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体に対するマクロファージの結合を促進するために、マクロファージの凝集を阻害するまたは減少させるために、好中球のアポトーシス、アポトーシス性の好中球のマクロファージ貪食、および、刺激されたマクロファージのＭ２極性化を促進するために、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の能力を評価する細胞培養方法を含んでいる。いくつかの実施形態では、アッセイで使用されるマクロファージは、ＬＰＳまたはＩＦＮ−γへの曝露などによって、刺激される。いくつかの実施形態では、刺激されたマクロファージ中の遺伝子またはタンパク質の発現は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体との接触の後に評価される。ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の活性を評価するそのような方法では、適切な対照が比較のために使用される。いくつかの実施形態では、対照は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を用いた処置が欠けている（すなわち、陰性対照）。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の活性は、天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の活性と比較される。いくつかの実施形態において、天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は羊膜から単離される。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、処置されたマクロファージ中の遺伝子発現は、ＰＣＲ、ＲＴ  ＰＣＲ、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、免疫組織化学的検査、クロマトグラフィー、あるいは、タンパク質または核酸を検知する他の適切な方法によって評価される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ２３、ＬＩＧＨＴ、および、ＳＰＨＫ１の発現のレベルが評価される。
【０２０６】
本明細書で提供される  ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の活性を評価する典型的な生体外の方法は、限定されないが、様々な疾患および疾病の動物モデルを含む。様々な動物モデルが、限定されないが、虚血、再潅流障害、１型および２型の糖尿病、炎症性疾患、コラーゲン誘発性関節炎、関節リウマチ、コラーゲン誘発性関節炎およびミエリンペプチド誘発性の実験的アレルギー性脳脊髄炎などの抗原誘発性自己免疫疾患、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）／潰瘍性結腸炎、多発性硬化症、手術誘発性の変形性関節症および腎炎、乾癬、炎症性の皮膚疾患、ＬＰＳ誘発性のエンドトキシンショック、ＬＰＳ誘発性の肺損傷、アレルギー性鼻炎、肝臓損傷、慢性ストレス、喘息、および、様々な癌の異種移植片と同種移植片のモデルを含む、様々な炎症性疾患と自己免疫疾患の動物モデル（例えば、げっ歯類および霊長類のモデル）を含む、疾患と疾病の技術分野では入手可能であり、周知である。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、動物モデルは、慢性移植片対宿主病（ｃＧＶＨＤ）、ＨＳＶ１誘発性の壊死性の間質性角膜炎、または、ハイリスクの角膜移植などの炎症のげっ歯類モデルである。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の処置による炎症の減少は、Ｔ細胞の増殖と活性化、ならびに、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、および、ＴＮＦ−αなどの免疫サイトカインの産生を測定することにより評価される。いくつかの実施形態では、動物モデルは、エキシマー・レーザー支援レーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）などのげっ歯類モデルの瘢痕である。そのような動物モデルに使用される典型的な方法は、本明細書で提供される実施例において提供される。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、動物モデルは、炎症性および自己免疫性の疾患および障害の遺伝モデルであり、これは、該疾患または障害を引き起こす１つ以上の遺伝子変化を包含している。いくつかの実施形態では、このようなモデルは商用源から得られる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、特定の疾患または疾病の動物モデルに投与され、その疾患または疾病の１つ以上の症状を阻害するまたは減少させるｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の能力が評価される。
【０２０９】
（医薬組成物）
特定の実施形態において、本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を含む医薬組成物が本明細書で開示される。特定の実施形態において、本明細書で提供された方法によって生成されるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物が、本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、薬学用途に適した調製物にする処理を促進する賦形剤および助剤を含む、１つ以上の生理学的に許容可能な担体を使用する従来の方法で調剤される。適切な製剤は、選択される投与の経路に依存する。修復の技術、担体、および、賦形剤のいずれも、適切に、当該技術分野で理解されているように、使用することができる。
【０２１０】
特定の実施形態において、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物が、本明細書で開示されている。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、アジュバント、賦形剤、防腐剤、吸収を遅らせる薬剤、充填剤、結合剤、吸着剤、緩衝液、および／または、可溶化剤をさらに含む。本明細書で提供されるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を包含するように調剤された典型的な医薬組成物は、限定されないが、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、顆粒、粉末、軟膏、錠剤、カプセル、丸剤、またはエアロゾルを含んでいる。
【０２１１】
剤形
【０２１２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、水性懸濁液として投与される。いくつかの実施形態では、水性懸濁液は、水、リンゲル液、および／または、生理食塩液を含む。いくつかの実施形態では、水性懸濁液は、甘味料または香料添加剤、着色料または色素を、さらに、必要に応じて、希釈剤、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、または、その組み合わせと一緒に、乳化剤または懸濁化剤を含む。いくつかの実施形態では、水性懸濁液は懸濁化剤を含む。いくつかの実施形態では、水性懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、および／または、アラビアゴムを含む。いくつかの実施形態では、水性懸濁液は、分散剤または浸潤剤を含む。いくつかの実施形態では、水性懸濁液は、天然のリン脂質、例えば、レシチン、または、脂肪酸を含むアルキレンオキシドの縮合物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、または、長連鎖脂肪族アルコールを含むエチレンオキシドの縮合物、例えば、ヘプタデカエチレン−オキシセタノール（ｏｘｙｃｅｔａｎｏｌ）、または、脂肪酸由来、および、ポリオキシエチレンソルビトールモノクレアートなどのヘキシトール由来の部分エステルを含むエチレンオキシドの縮合物、または、脂肪酸に由来する、および、例えば、ポリエチレンソルビタンモノクレアートなどのヘキシトール無水物に由来する、部分エステルを含むエチレンオキシドの縮合物、を含む。いくつかの実施形態において、水性懸濁液は防腐剤を含む。いくつかの実施形態では、水性懸濁液は、エチル、または、ｎ−パラオキシ安息香酸プロピルを含む。いくつかの実施形態では、水性懸濁液は甘味剤を含む。いくつかの実施形態では、水性懸濁液は、ショ糖、サッカリン、またはアスパルテームを含む。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、油性懸濁液として投与される。いくつかの実施形態では、油性懸濁液は、植物油（例えば、落花生油、オリーブオイル、ごま油、またはココナッツ油）、または、鉱油（例えば、流動パラフィン）中の活性成分を懸濁することによって調剤される。いくつかの実施形態では、油性懸濁液は、増粘剤（例えば、蜜ろう、固形パラフィン、またはセチルアルコール）を含む。いくつかの実施形態では、油性懸濁液は、甘味剤（例えば上に明記したもの）を含む。いくつかの実施形態では、油性懸濁液は、酸化防止剤（例えば、ブチルヒドロキシアニソールまたはαトコフェロール）を含む。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、非経口注入（例えば、動脈内、心臓内、皮内、十二指腸内、髄内、筋肉内、骨内、腹腔内、鞘内、血管内、静脈内の、硝子体内、硬膜外、および／または、皮下を含む注入または点滴によって）のために調剤される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、無菌液、懸濁液、またはエマルジョンとして投与される。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、非経口投与のための製剤は、実施形態によっては、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、および／または、製剤を、意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでいる、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の水性および／または非水性（油性）の無菌の注入溶液、および／または、実施形態によっては、懸濁化剤および／またはを増粘剤含んでいる、水性および／または非水性の無菌の懸濁液を含む。いくつかの実施形態では、非経口投与のための製剤は、高濃度溶液の調製を可能にするために、本明細書で開示されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の溶解度を増加させる、適切な安定剤または薬剤を含んでいる。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、活性成分が油相に溶けた水中油型ミクロエマルジョンとして投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、脂肪油（例えば、ゴマ油または合成の脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド、またはリポソーム）に溶かされる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、ダイズ油および／またはレシチンの混合物で溶かされる。いくつかの実施形態では、油剤は、水とグリセロールの混合物に入れられ、処理されると、マイクロエマルジョンが形成される。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、非経口投与のために調剤された組成物は、単回ボーラスショットとして投与される。いくつかの実施形態では、非経口投与のために調剤された組成物は、連続的な静脈内送達装置（例えば、Ｄｅｌｔｅｃ  ＣＡＤＤ−ＰＬＵＳ（商標）ｍｏｄｅｌ  ５４００  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｐｕｍｐ）によって投与される。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、注入される製剤は、単位剤形、例えば、追加の防腐剤を含む、アンプルまたは複数回投与容器で提示される。いくつかの実施形態では、注入される製剤は、使用の直前に、無菌の液体担体、例えば、塩水または無菌の発熱物質を含まない水を追加することのみを必要として、粉末形態で、または、冷凍乾燥（凍結乾燥）状態で、貯蔵される。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、局所投与のために調剤される。局所製剤は、限定されないが、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、溶液、ペースト剤、ゲル、薄膜、スティック、リポソーム、ナノ粒子を含んでいる。いくつかの実施形態では、局所製剤は、パッチ、包帯、または創傷包帯を用いて投与される。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、固体、架橋ゲル、またはリポソームの形状の組成物として、調剤される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、不溶性の架橋ヒドロゲルとして調剤される。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、局所製剤は、ゲル化（または増粘）剤を含む。適切なゲル化剤としては、限定されないが、セルロース、セルロース誘導体、セルロースエーテル（例えば、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース）、グアーゴム、キサンタンゴム、ローカストビーンゴム、アルギン酸塩（例えば、アルギン酸）、ケイ酸塩、デンプン、トラガカント、カルボキシビニルポリマー、カラギーナン、パラフィン、ペトロラタム、アカシア（アラビアゴム）、寒天、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、アルギン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ヒバマタ（ｂｌａｄｄｅｒｗｒａｃｋ）、ベントナイト、カルボマー、カラゲーニン、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）、キサンタン、セルロース、微結晶性セルロース（ＭＣＣ）、セラトニア、ツノマタ属、デキストロース、ファーセレラン（ｆｕｒｃｅｌｌａｒａｎ）、ゼラチン、ガティ（ｇｈａｔｔｉ）ガム、グアーゴム、ヘクトライト（ｈｅｃｔｏｒｉｔｅ）、ラクトース、ショ糖、マルトデキストリン、マンニトール、ソルビトール、蜂蜜、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、ステルクリアガム（ｓｔｅｒｃｕｌｉａ  ｇｕｍ）、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ  ２００−４５００）、トラガカントゴム、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、エチルメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、オキシポリゼラチン、ペクチン、ポリゲリン、ポビドン、プロピレンカーボネート、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸コポリマー（ＰＶＭ／ＭＡ）、ポリ（メトキシエチルメタクリレート）、ポリ（メトキシエトキシエチルメタクリレート）、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシルメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）、二酸化ケイ素、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ：ポビドン）、または、その組み合わせが挙げられる。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される局所製剤は、皮膚軟化薬を含む。皮膚軟化薬としては、限定されないが、ヒマシ油エステルカカオバターエステル、ベニバナ油エステル、綿実油エステル、トウモロコシ油エステル、オリーブオイルエステル、たら肝油エステル、アーモンド油エステル、アボカド油エステル、パーム油エステル、ごま油エステル、スクアレンエステル、ククイオイル（ｋｉｋｕｉ  ｏｉｌ）エステル、大豆油エステル、アセチル化モノグリセリド、エトキシ化モノステアリン酸グリセリン、ラウリン酸ヘキシル、ラウリン酸イソヘキシル、パルミチン酸イソヘキシル、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸メチル、オレイン酸デシル（ｄｅｃｙｌｏｌｅａｔｅ）、オレイン酸イソデシル、ステアリン酸ヘキサデシル、ステアリン酸デシル、イソステアリン酸イソプロピル、イソステアリン酸メチル、アジピン酸ジイソプロピル、アジピン酸ジイソヘキシル、アジピン酸ジヘキシルデシル、セバシン酸ジイソプロピル、乳酸ラウリル、乳酸ミリスチル、および、乳酸セチル、ミリスチン酸オレイル、ステアリン酸オレイルおよびオレイン酸オレイル、ペラルゴン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、ヒドロキシステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リシノール酸、アラキン酸、ベヘン酸、エルカ酸、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、ヘキサデシルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ヒドロキシステアリルアルコール、オレイルアルコール、リシノレイル（ｒｉｃｉｎｏｌｅｙｌ）アルコール、ベヘニル（ｂｅｈｅｎｙｌ）アルコール、エルシル（ｅｒｕｃｙｌ）アルコール、２−オクチルドデカニルアルコール、ラノリンおよびラノリン誘導体、蜜ろう、鯨ろう、ミリスチン酸ミリスチル、ステアリン酸ステアリル、カルナウバワックス、カンデリラワックス、レシチン、および、コレステロールが挙げられる。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、１つ以上の天然のポリマーで調剤される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノゲン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸である天然のポリマーで調剤される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、天然のポリマーから調剤されたポリマーゲルで調剤される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、限定されないが、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノゲン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、および、その組み合わせなどの天然のポリマーから調剤されたポリマーゲルで調剤される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、架橋ポリマーで調剤される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、架橋していないポリマーで調剤される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、架橋していないポリマーと架橋ポリマーで調剤される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、架橋したヒアルロナンゲルで調剤される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、不溶性の架橋したＨＡヒドロゲルで調剤される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、架橋していないヒアルロナンゲルで調剤される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、コラーゲンマトリックスで調剤される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、フィブリンマトリックスで調剤される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、フィブリン／コラーゲンマトリックスで調剤される。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、目またはそれに関連する組織に投与するために調剤される。目への投与に適している製剤は、限定されないが、溶液、懸濁液（例えば、水性懸濁液）、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、リポソーム、ニオソーム（ｎｉｏｓｏｍｅｓ）、ファーマコソーム（ｐｈａｒｍａｃｏｓｏｍｅｓ）、ナノ粒子、または、この組み合わせを含んでいる。いくつかの実施形態では、目への局所性投与のための本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、噴霧、洗浄、または、その組み合わせで投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、注射可能なデボー製剤によって目に投与される。
【０２２５】
本明細書で使用されているように、「デボー製剤」は、目または関連する組織（例えば強膜）に（例えば、皮下に、筋肉内に、硝子体内に、または結膜下内に）移植される制御放出製剤である。いくつかの実施形態では、デボー製剤は、生分解性ポリマーで、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体のマイクロカプセル化されたマトリックス（マイクロカプセル化マトリックスとしても知られている）を形成することにより調剤される。いくつかの実施形態では、デボー製剤は、リポソームまたはマイクロエマルジョンで、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を捕捉することにより調剤される。
【０２２６】
目に投与される製剤は、眼に許容可能な張性を備えている。特定の例においては、涙液は、０．９％の塩化ナトリウム溶液と同等の等張性値を有している。いくつかの実施形態では、約０．６％乃至約１．８％の塩化ナトリウム等価からの等張性価値は、目への局所投与に適している。いくつかの実施形態では、本明細書で開示された目に投与される製剤は、約２００乃至約６００ｍＯｓｍ／Ｌのモル浸透圧濃度を有している。いくつかの実施形態では、本明細書で開示された目に投与される製剤は低浸透圧性であり、したがって、適切な張性範囲に到達するのに適切な追加を必要とする。張性を調節する眼に許容可能な物質としては、限定されないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、および、硫酸アンモニウムが挙げられる。
【０２２７】
目に投与される製剤は、眼に許容可能な透明性を備えている。眼に許容可能な清澄剤の例としては、限定されないが、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、またはその組み合わせが挙げられる。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、目に投与される製剤は、眼に許容可能な粘性エンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、粘性エンハンサーは、本明細書で開示された製剤が目に留まる時間を増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示示された製剤が目に留まる時間を増加させることは、大きな薬物吸収と効果をもたらす。粘膜付着性ポリマーの非限定的な例としては、カルボキシメチルセルロース、カルボマー（アクリル酸ポリマー）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリアクリルアミド、ポリカルボフィル、アクリル酸／アクリル酸ブチルコポリマー、アルギン酸ナトリウム、および、デキストランを含む。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、目に投与される製剤は、後眼部（例えば、網膜、脈絡膜、硝子体、および、視神経）に投与されるまたは送達される。例えば、いくつかの実施形態では、後眼部に送達するための本明細書で開示された目に投与される局所製剤は、可溶化剤、例えば、グルカン硫酸塩および／またはシクロデキストリンを含む。いくつかの実施形態で使用されるグルカン硫酸塩は、限定されないが、硫酸デキストラン、シクロデキストリン硫酸塩、および、β−１，３グルカン硫酸塩、その天然および誘導体の双方、または、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を包含している組織に一時的に結合するか、該組織で保持され、薬物の安定性および／または溶解性を改善し、および／または、本明細書で開示された目に投与される局所製剤の浸透と眼での吸収を改善する任意の化合物を含む。可溶化剤としていくつかの実施形態で使用されるシクロデキストリン誘導体は、限定されないが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチルβ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルγ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβ、シクロデキストリン、硫酸化型α−シクロデキストリン、硫酸化型β−シクロデキストリン、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンを含む。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、直腸または膣への投与のために調剤される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、坐薬として投与される。いくつかの実施形態では、直腸投与に適している組成物は、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、常温では固体であるが、直腸温では液体であり、したがって、直腸中で溶けて薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合することによって、調製される。いくつかの実施形態では、直腸投与に適している組成物は、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、カカオバター、グリセリンゼラチン、水素化した植物性油、様々な分子量のポリエチレングリコールの混合物、または、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステルと混合することにより調製されている。
【０２３１】
特定の実施形態では、本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、制御放出粒子、脂質複合体、リポソーム、ナノ粒子、微粒子、微小粒子、ナノカプセル、または、皮膚への局所的な送達を増強または促進する他の薬剤に、随意に組み込まれる。製剤の従来のマイクロカプセル化プロセスの一例は、米国特許番号３，７３７，３３７号に記載されており、これはこのような開示について参照により本明細書で組み込まれる。
【０２３２】
投与量
【０２３３】
投与された医薬組成物の量は、処置される個体にある程度は依存する。医薬組成物がヒト被験体に投与される例において、一日の投与量は、処方する医師によって決定され、投与量は一般に、個体の年齢、性別、食事、体重、全体的な健康および反応、個体の症状の重症度、処置されている詳細な疾患または疾病、処置されている疾患または疾病の重症度、投与時間、投与経路、組成物の性質、排泄速度、薬物の組み合わせ、および、処方する医師の裁量に応じて、変わる。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の投与量は、約０．００１乃至約１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の量は、約０．５乃至約５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の量は、約０．００１乃至約７ｇ／日である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の量は、約０．０１乃至約７ｇ／日である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の量は、約０．０２乃至約５ｇ／日である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の量は、約０．０５乃至約２．５ｇ／日である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の量は、約０．１乃至約１ｇ／日である。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、疾患または疾病の発症前後、または、その最中に、投与される。いくつかの実施形態では、併用療法は、疾患または疾病の発症前後、または、その最中に、施される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、疾患または疾病の発症前後、または、その最中に、併用療法で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３を含む組成物を投与するタイミングは変動する。ゆえに、いくつかの例において、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３ＨＡの複合体は、予防薬として使用され、疾患や疾病の発症を防ぐために、疾病や疾患を進行させる傾向のある被験体に継続的に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、症状の発症中に、または、症状の発症後できるだけすぐに、被験体に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の投与は、症状の発症の最初の４８時間以内に、好ましくは症状の発症の最初の４８時間以内、より好ましくは症状の発症の最初の６時間以内、最も好ましくは症状の発症の３時間以内に開始される。いくつかの実施形態では、最初の投与は、例えば、静脈注入、ボーラス注入、５分〜約５時間までの点滴、丸薬、カプセル剤、経皮パッチ、口腔送達、またはそれらの組み合わせなど、あらゆる経路を介して行われる。本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、疾患または疾病の発症が検知されるか疑われた後に実行可能となるやいなや、疾患の処置に必要な期間、例えば、約１ヶ月から約３ヶ月間、投与されるのが好ましい。いくつかの実施形態では、処置の期間は、それぞれの被検体ごとに変わり、その期間は既知の基準を用いて決定される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体、または、化合物を含む製剤は、少なくとも２週間、好ましくは約１ヶ月乃至約５年間、および、さらに好ましくは約１ヶ月乃至約３年間、投与される。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、毎日１回、単回投与で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、１日２回以上、複数回投与で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、毎日２回投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、毎日３回投与される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、毎日４回投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、毎日５回以上投与される。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、予防的処置および／または治療的処置のために投与される。治療的な用途では、いくつかの実施形態において、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、疾患または疾病の症状を直すか部分的に阻止するのに十分な量で、疾患または疾病に既に苦しんでいる個体に投与される。このような使用に有効な量は、疾患または疾病の重症度および経過、以前の治療、個体の健康状態、体重、および薬物への反応性、ならびに、処置を行う医師の判断に左右される。
【０２３８】
予防的な用途では、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、特定の障害の危険性がある個体に投与される。このような量は、「予防上有効な量または投与量”であると定義される。そのような用途では、正確な量は、個体の健康状態、体重、および、他の肉体的なパラメータによって変わる。
【０２３９】
個体の疾病が改善しない場合、医者の判断に基づき、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体が、長期的に、すなわち、個体の疾患または疾病の症状を寛解させるか、またはそうでなくとも制御するか、制限するために個体の寿命の間を含む長期間にわたって、投与される。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、個体の状態が改善した場合、医者の判断に基づき、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体が連続的に投与されるか、あるいは、投与されている薬物の容量が一時的に減られるか、あるいは、一定の期間にわたって一時的に停止される（すなわち「休薬期間」）。いくつかの実施形態では、休薬期間の長さは、ほんの一例ではあるが、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、３５日、５０日、７０日、１００日、１２０日、１５０日、１８０日、２００日、２５０日、２８０日、３００日、３２０日、３５０日、および、３６５日を含む、２日から１年までの間である。いくつかの実施形態では、休薬期間中の投与量の減少は、ほんの一例として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、１００％を含む、１０％〜１００％までである。
【０２４１】
ひとたび個体の状態が改善すると、必要に応じて維持用量が投与される。いくつかの実施形態では、その後、投与量もしくは投与頻度またはその両方が、症状に応じて、疾患、症状、または疾病の改善が維持される水準になるまで減らされる。いくつかの実施形態において、個体は、任意の症状の再発時に長期的な間欠的処置を必要とする。
【０２４２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、正確な投与量の単回投与に適した単位剤形である。単位剤形において、製剤は、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の適切な量を含む単位用量に分割される。単位用量は、製剤の離散量を含有するパッケージ形状である。非限定的な例は、包装された錠剤またはカプセル剤、および、バイアルまたはアンプル中の粉末である。いくつかの実施形態において、水性懸濁組成物は、単回用量用の再密閉できない容器に包装される。いくつかの実施形態では、複数回用量用の再密閉できる容器が使用され、この場合、組成物中に防腐剤を含めることが一般的である。いくつかの実施形態では、非経口注射用の製剤は単位剤形で提供され、これは、限定されないが、防腐剤を添えたアンプルまたは複数回投与用の容器を含む。
【０２４３】
本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体に適切な毎日の投与量は、例えば、体重当たり約０．０１〜２．５ｍｇ／ｋｇである。ヒトを含む（ただし、ヒトに限定されない）大型哺乳動物で表示される一日の投与量は、約０．５ｍｇから約１００ｍｇの幅であり、一日に４度（ただし、これに限定されない）の複数回投与で、または、持続放出形態で都合よく投与される。経口投与に適切な単位剤形は、約１ｍｇ−５０ｍｇの活性成分を含む。個々の処置レジメンに関する変数が大きいため、前述の範囲は単に示唆的なものでしかなく、これらの推奨値からのある程度の逸脱は珍しいわけではない。いくつかの実施形態では、上記のような投与量は、多くの変数に依存して変化するが、この変数とは、限定されないが、用いられるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の能力、治療される疾患または疾病、投与方法、個体の被験体の要件、治療される疾患または疾病の重篤度、および、実践者の判断を含む。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、このような処置レジメンの毒性および治療効果は、限定されないが、ＬＤ５０（個体群の５０％致死量）およびＥＤ５０（個体群の５０％における治療上有効な用量）の決定などを含む、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定される。いくつかの実施形態では、毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比率として表現される。高い治療指数を示すｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体が好ましい。いくつかの実施形態では、ヒトに使用する容量の範囲を策定する際に、細胞培養アッセイと動物研究から得られるデータを用いられる。本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の用量は、最小の毒性を備えたＥＤ５０を含む、一連の血中濃度内にあるのが好ましい。いくつかの実施形態では、用量は、採用される剤形と利用される投与経路に依存して、この範囲内で変化する。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の医薬組成物は、包装材料、疾患または疾病の予防および／または処置に有効な医薬組成物、および、医薬組成物が疾患または疾病を処置するために使用される使用されることを明記したラベルを包含している製品としてパッケージ化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は単位剤形でパッケージ化され、単回投与または複数回投与のための医薬組成物の量を包含している。いくつかの実施形態では、パッケージ化された組成物は、投与前に（例えば水または食塩水で）再構成される、医薬組成物の凍結乾燥粉末を包含している。
【０２４６】
医療装置と生体材料の組成物
【０２４７】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、表面上で直接組み立てられる、または移植可能な医療装置のためのコーティングとして調剤された。限定されないが、金属、重合体、セラミック、シリカ、および、複合物の表面などの表面に対するヒアルロナンの共有結合の方法は、当該技術で周知のものであり、いくつかの実施形態では、そのような表面上にｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を組立てるために本明細書で提供される方法とともに使用される（参照、例えば、米国特許第５，３５６，４３３；  ５，３３６，５１８、４，６１３，６６５、４，８１０，７８４、５，０３７，６７７、８，０９３，３６５）。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、移植可能な医療装置またはその一部の表面にで直接組み立てられる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供された方法に従って生成されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体が精製され、その後、移植可能な医療装置またはその一部の表面に直接取り付けられる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供された方法に従って生成されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体が精製され、その後、医療装置またはその一部に結合するためのコーティング剤として調剤される。いくつかの実施形態では、コーティング剤は、表面に直接塗られるか、または、あらかじめ処理されたまたはコーティングされた表面に適用され、前処理とコーティングは基質にコーティング剤を接着するのを助けることを意図している。いくつかの実施形態では、本明細書で提供された方法に従って生成されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体が精製され、その後、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の結合を促す物質でコーティングされた医療装置またはその一部に取り付けられる。例えば、いくつかの実施形態では、医療装置またはその一部は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体のヒアルロナンの共有結合のために、その表面上に官能基を供給する粘着ポリマーでコーティングされる。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、ポリマーコーティングに結合させるために、限定されないが、カルボジイミドなどのカップリング剤が使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、医療装置またはその一部に共有結合させるために、光固定化（ｐｈｏｔｏｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）が使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供された方法に従って生成されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、光化学的にまたは熱化学に反応基を含むスペーサ分子を使用して、医療装置またはその一部に取り付けられる。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含むコーティング製剤は、例えば、浸漬被覆によって基質に適用される。他の使用方法としては、限定されないが、噴霧、洗浄、蒸気蒸着、ブラシ、ローラー、カーテン、スピンコーティング、および、当該技術で既知の他の方法が挙げられる。
【０２４９】
典型的な移植可能な医療装置としては、限定されないが、人工関節、整形外科装置、骨インプラント、コンタクトレンズ、縫合糸、外科用ステープル、外科用クリップ、カテーテル、血管形成バルーン、センサー、外科用器具、電極、針、シリンジ、創傷排水管、シャント、尿道の挿入物、金属またはプラスチックの移植組織、心臓弁、人工器官、ラップバンド、人工弁輪、ガイドワイヤー、Ｋ−ワイヤー、または、Ｄｅｎｈａｍピン、ステント、ステントグラフト、血管グラフト、ペースメーカー、ペレット剤、ウェーハ、医療用チューブ、点滴スリーブ、移植可能な除細動器、神経刺激剤、グルコースセンサー、髄液シャント、移植可能な薬ポンプ、脊椎ケージ（ｓｐｉｎａｌ  ｃａｇｅ）、人工椎間板、眼の移植組織、人工内耳、乳房インプラント、髄核用の置換装置、耳チューブ、眼内レンズ、薬物送達システム、微小粒子、ナノ粒子、およびマイクロカプセルが挙げられる。
【０２５０】
特定の実施形態では、移植可能な医療装置は、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む、移植組織または装具である。特定の実施形態において、装具は人工関節である。いくつかの実施形態では、装具は、人工股関節、人工膝、人工の肩関節、人工の足首である。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、移植物はステントである。いくつかの実施形態では、移植物は、冠動脈ステント、尿管ステント、尿道ステント、前立腺ステント、骨ステント、または、食道ステントである。特定の実施形態では、移植物は、骨インプラントである、限定されないが、オッセオインテグレーテッドインプラントまたは頭蓋顔面の移植物（例えば、人工の耳、眼窩装具、鼻の装具）。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、被験体に対して、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を送達するために、微小粒子またはナノ粒子で直接組み立てられる（例えば、ＷＯ  ０３／０１５７５５とＵＳ２００４／０２４１２４８を参照）。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、本明細書に記載される、または、当該技術で知られている任意のそのような移植可能な医療装置の表面またはその一部に、取り付けられ、組み立てられ、または、コーティング剤として提供される。いくつかの実施形態において、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、移植後に、コーティング剤から周囲の組織に溶離する。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、幹細胞またはインスリン産生細胞などの生体材料の送達のために使用される、スキャフォールド、微小粒子、マイクロカプセル、または、マイクロキャリア上で直接組み立てられる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、マイクロカプセルに直接取り付けられるか、または、マイクロカプセル上で組み立てられる。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、マイクロカプセルを形成するために使用される材料と組み合わされるか、または、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を包含するマイクロカプセルが生成される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、マイクロカプセルの内面を覆うために使用される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、マイクロカプセルの外面を覆うために使用される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、マイクロカプセルの内面と外面を覆うために使用される。
【０２５５】
細胞をカプセル化するための典型的な材料としては、限定されないが、アガロース、アルギン酸塩、および、人工ポリマー、例えば、ポリ（ＮｉＰＡＡｍ−ｃｏ−ＡＡＣ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、および、ＰＥＧ  ジアクリレートやオリゴ（ポリ（エチレングリコール））フマレート（ｆｕｍｅｒａｔｅ）のようなＰＥＧ誘導体などの熱硬化性ヒドロゲルが挙げられる。幹細胞の培養とマイクロカプセル化の方法は、いくつかの実施形態では、当該技術分野で知られており、本明細書で提供されるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含むマイクロカプセルを生成するために使用される。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、細胞、複数の細胞、または、他の生体材料を包含している。いくつかの実施形態では、細胞は、限定されないが、間葉系幹細胞などの幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、限定されないが、インスリン産生細胞などの分化細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、自己細胞（すなわち、細胞のレシピエントからの、またはこれに由来する細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異型細胞（すなわち、細胞のレシピエントからではない、または、これに由来しない細胞）である。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、細胞、複数の細胞、または他の生体材料を包含しており、マイクロカプセルの内面は、本明細書で提供されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体でコーティングされる。いくつかの実施形態において、マイクロカプセルは、細胞、複数の細胞、または他の生体材料を包含しており、マイクロカプセルの外面は、本明細書で提供されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体でコーティングされる。いくつかの実施形態において、マイクロカプセルは、細胞、複数の細胞、または他の生体材料を包含しており、マイクロカプセルの外面と内面は、本明細書で提供されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体でコーティングされる。いくつかの実施形態においては、マイクロカプセルは、疾患または疾病を治療するために投与される。典型的な疾患および疾病と、マイクロカプセルを投与可能な処置の方法は、本明細書の他の場所に明記されており、限定されないが、炎症および免疫に関連する疾患を含んでいる。
【０２５７】
（処置方法）
特定の実施形態において、個体を処置する方法が本明細書で開示され、該方法は、本明細書に記載されるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を個体に投与する工程を含む。特定の実施形態において、個体を処置する方法が本明細書で開示され、該方法は、本明細書に記載された方法によって生成されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、個体に投与する工程を含む。以下は、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の投与を含む、非限定的な処置方法の例である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、下記の少なくとも１つを阻害するために使用される：瘢痕、炎症、自己免疫または免疫の拒絶反応につながる免疫反応、接着、血管形成、および、細胞または組織の再生を必要とする状態。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、創傷治癒を促すために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、幹細胞の拡張を促すために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、組織再生を促すために使用される。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、個体を処置する方法が本明細書で開示され、該方法は、任意の適切な方法によって、本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を個体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、個体を処置する方法が本明細書で開示され、該方法は、任意の適切な投与経路によって、本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を個体に投与する工程を含む。投与に適切な方法は、処置される疾患または状態に依存する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、処置の部位に局所的に投与される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、全身に投与される。本明細書で提供されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の投与のための典型的な方法は、限定されないが、非経口、腸内、皮下、経皮的、経皮的、皮内、静脈内、局所的、吸入、または、移植を含む。
【０２５９】
瘢痕
【０２６０】
特定の実施形態において、被験体の瘢痕を防ぐ、減らす、または、逆行させる方法が本明細書に記載され、該方法は、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む組成物を、被験体に投与する工程を含む。
【０２６１】
本明細書で使用されているように、「瘢痕化」は瘢痕の形成を指す。１つの態様では、瘢痕は、肥厚性瘢痕、ケロイド瘢痕、または、ざ瘡に由来する瘢痕である。本明細書で使用されているように、「瘢痕」は、コラーゲンの過剰生成に起因する線維組織の領域である。特定の例においては、創傷治癒は、損傷の部位への繊維芽細胞の移動を含む。特定の例においては、繊維芽細胞はコラーゲンを沈殿させる。特定の例においては、繊維芽細胞は創傷部位に過剰なコラーゲンを沈殿させ、瘢痕を結果として生じさせる。
【０２６２】
特定の例では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、ＴＧＦ−βシグナル伝達を防ぐか阻害する。特定の例においては、ＴＧＦ−βは、繊維増殖とコラーゲン沈着を刺激し、および、（プロテアーゼ阻害剤の合成をアップレギュレートすることによって）細胞外マトリックス分解を阻害することにより、細胞外マトリックスを制御する。特定の例においては、ＴＧＦ−βの発現を防ぐまたは阻害することにより、瘢痕の予防、または、瘢痕の強度の減少がもたらされる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の投与は、瘢痕を防ぐまたは減らす。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、筋線維芽細胞に分化する繊維芽細胞の能力を阻害するまたは防ぐ。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、分化した筋線維芽細胞を繊維芽細胞に戻す。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示された方法は、瘢痕の形成を防ぐか、減らすか、逆行させるために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示された方法は、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を、瘢痕化（例えば、皮膚炎瘢痕、ケロイド瘢痕、痙縮瘢痕、肥厚性瘢痕、または、ざ瘡により生じる瘢痕）をもたらす障害を抱えている個体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示された方法は、外傷の前後に、必要としている個体に、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示された方法は、手術の前後に、必要としている個体に、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を投与する工程を含む。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示された方法は、目または周囲の組織の瘢痕の形成を防ぐまたは減らすために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示された方法は、目または周辺組織の瘢痕をもたらす障害（例えば、末熟児網膜症）の個体に、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示された方法は、目または周囲の組織への外傷の前後に、必要としている個体に、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示された方法は、目または周囲の組織への手術の前後に、必要としている個体に、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を投与する工程を含む。
【０２６６】
炎症
【０２６７】
特定の実施形態において、被験体の炎症を防ぐまたは減少させる方法が本明細書に記載されており、該方法は、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む組成物を、被験体に投与する工程を含む。本明細書で使用されているように、「炎症」とは、感染または外傷（例えば、鈍力外傷、鋭的外傷、または外科手術）の部位に対する血漿および／または白血球（例えば、リンパ球、マクロファージ、顆粒球、および、好中球）の移動の結果として生じる生理反応を意味する。
【０２６８】
特定の例においては、白血球は、抗原との接触後に、サイトカインを分泌する。本明細書で使用されているように、「サイトカイン」は、シグナル伝達タンパク質または糖タンパク質である。特定の例では、サイトカインは、細胞の表面に受容体を結合する。特定の例においては、サイトカインは、感染部位に対する白血球の走化性を引き起こす。特定の例においては、白血球上の細胞表面受容体は、サイトカインの化学的勾配を検知する。特定の例では、白血球は感染部位に対する勾配を伴う。特定の例では、細胞表面受容体へのサイトカインの結合は、特定の遺伝子とそれらの転写因子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを結果としてもたらす。特定の例においては、遺伝子発現の変化は、サイトカインの産生、サイトカインの産生の増加、または、細胞表面受容体の提示の増加をもたらす。
【０２６９】
非限定的な例として、サイトカインは、インターロイキンＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２としても知られている）、および、ＴＮＦ−αを含んでいる。インターロイキン１は、２つのアイソフォーム：ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β中の本体にある。特定の例では、ＩＬ−１の存在は、内皮細胞上での接着因子の発現を増加させる。これは、次には、感染部位に対する白血球の血管外移動を可能にする。特定の例において、ＩＬ−８は、白血球の走化性を誘発する。特定の例においては、ＴＮＦ−αは、白血球の走化性を誘発する。特定の例においては、ＭＣＰ−１は、組織損傷と感染の部位に対して白血球を補充する。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、サイトカインの産生および／または活性を抑制する。特定の例においては、サイトカイン濃度の減少は、白血球の数、および／または、損傷部位への白血球の移動速度を減少させることによって、炎症を減らすまたは防ぐ。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、白血球（例えば、マクロファージ、好中球、またはリンパ球）のアポトーシスを引き起こす。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、活性化した白血球の数、または、白血球が活性化する速度を減少させる。特定の例において、白血球の濃度の減少は、損傷部位へ移動する細胞の数を減少させる（例えば、アポトーシスによるこのような細胞の死を促す）ことによって、炎症を減らすまたは防ぐ。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、炎症性の表現型（すなわち、Ｍ１表現型）へのマクロファージの極性化を阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、刺激されたマクロファージ中でＩＬ−１２またはＩＬ−２３の発現を減らすまたは阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、制御性のまたは創傷治癒のＭ２表現型への、刺激されたマクロファージの極性化を促す。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、被験体の炎症を阻害するまたは減らす。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、被験体の炎症反応によって引き起こされた組織損傷を抑制するまたは減らす。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、被験体の炎症を引き起こす疾病または疾患によって引き起こされた組織損傷を阻害するまたは減らす。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、炎症を抱える被験体に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、急性炎症を抱える被験体に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、慢性炎症を抱える被験体に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、炎症性障害を抱える被験体に投与される。いくつかの実施形態では、炎症性障害は、マクロファージ媒介性の炎症性障害である。いくつかの実施形態では、炎症性障害は、Ｔ細胞媒介性の炎症障害である。いくつかの実施形態では、炎症性障害は、Ｔｈ−１７媒介性の免疫障害である。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、急性の炎症反応を抱える被験体に投与される。いくつかの実施形態では、急性の炎症反応は、例えば、アレルギー、敗血症、エンドトキシンショックまたは虚血、例えば、限定されないが、心筋梗塞や脳卒中などによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、急性の炎症反応は、細菌感染、原虫感染、原虫感染、ウイルス感染、真菌感染、または、この組み合わせの結果である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、急性炎症を阻害するまたは減少させる。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、急性炎症により引き起こされた組織損傷を阻害するまたは減少させる。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、心筋梗塞と脳卒中を含む虚血による組織再潅流障害を阻害するまたは減らす。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、適応免疫によるリンパ球の活性化に関連付けられる慢性炎症を抱える被験体に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、Ｔｈ１反応を備える被験体に投与される。いくつかの実施形態において、Ｔｈ１反応は、生物学的移植の免疫拒絶反応につながる。いくつかの実施形態では、移植片は同種移植片である。いくつかの実施形態では、移植片は自己移植片である。いくつかの実施形態では、炎症性障害は、移植片対宿主病または組織移植拒絶反応である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、被験体の慢性炎症を阻害するまたは減少させる。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、炎症性障害に関連したＴｈ１７免疫反応に関連付けられる慢性炎症を抱える被験体に投与される。いくつかの実施形態では、炎症性障害は自己免疫疾患または白血球欠損である。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病；強直性脊椎炎；抗リン脂質抗体症候群；自己免疫性溶血性貧血；自己免疫性肝炎；自己免疫性内耳疾患；水疱性類天疱瘡；シャーガス病；慢性閉塞性肺疾患；セリアック病；皮膚筋炎；１型糖尿病；２型糖尿病；子宮内膜症；グッドパスチャー症候群；グレーブス病；ギラン・バレー症候群；橋本病；特発性血小板減少性紫斑病；間質性膀胱炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；メタボリック症候群、多発性硬化症；重症筋無力症；心筋炎、ナルコレプシー；肥満；尋常性天疱瘡；悪性貧血；多発性筋炎；原発性胆汁性肝硬変；関節リウマチ；統合失調症；強皮症；シェーグレン症候群；血管炎；白斑；ヴェーゲナー肉芽腫症；アレルギー性鼻炎；前立腺癌；非小細胞肺癌；卵巣癌；乳癌；黒色腫；胃癌；結腸直腸癌；膵癌；リンパ腫、鼻茸；消化器癌；潰瘍性大腸炎；クローン病；コラーゲン大腸炎；リンパ球性大腸炎；虚血性大腸炎；空置大腸炎（Ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ  ｃｏｌｉｔｉｓ）；ベーチェット症候群；感染性大腸炎；不確定大腸炎；炎症性の肝障害、虚血、心筋梗塞、脳卒中、エンドトキシンショック、敗血症性ショック；リウマチ性脊椎炎、強直性脊椎炎、痛風性関節炎、リウマチ性多発生筋痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、エイズ、認知症、喘息、成人呼吸窮迫症候群、気管支炎、嚢胞性線維症、急性白血球媒介性の肺損傷、遠位直腸炎（ｄｉｓｔａｌ  ｐｒｏｃｔｉｔｉｓ）、ヴェーゲナー肉芽腫症、結合組織炎、ぶどう膜炎、結膜炎、乾癬、湿疹、皮膚炎、平滑筋増殖障害、髄膜炎、帯状疱疹、脳炎、腎炎、結核、網膜炎、アトピー性皮膚炎、膵臓炎、歯周歯肉炎、凝固壊死、液化壊死、線維素壊死、新生内膜過形成、あるいは、これらの組み合わせである炎症性障害を抱える被験体に投与される。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、炎症性障害は目または周囲の組織の炎症性の障害である。いくつかの実施形態では、炎症性疾患は結膜炎である。特定の例においては、結膜炎はアレルゲンへの曝露に起因する。特定の例においては、結膜炎は細菌感染に起因する。いくつかの実施形態では、炎症性疾患は角膜炎である。本明細書で使用されているように、「角膜炎」とは角膜炎によって特徴付けられる障害である。いくつかの実施形態では、炎症性障害は、角結膜炎（すなわち、結膜炎と角膜炎の組み合わせ（すなわち、角膜の炎症））である。いくつかの実施形態では、炎症性障害は眼瞼炎である。本明細書で使用されているように、「眼瞼炎」とは、眼瞼辺縁の炎症によって特徴付けられた眼の障害である。いくつかの実施形態では、炎症性障害は、眼瞼結膜炎（すなわち、結膜炎と眼瞼炎の組み合わせ（すなわち眼瞼の炎症））である。いくつかの実施形態では、炎症性障害は強膜炎である。本明細書で使用されているように、「強膜炎」とは、強膜の炎症によって特徴付けられる障害である。いくつかの実施形態では、炎症性障害は上強膜炎である。本明細書で用いられているように、「上強膜炎」とは、充血や結膜浮腫によって特徴付けられた上強膜の炎症性障害である。いくつかの実施形態では、炎症性障害はブドウ膜炎である。本明細書で使用されているように、ブドウ膜炎は、ブドウ膜の炎症性び障害である。いくつかの実施形態では、障害は網膜炎である。本明細書で使用されているように、「網膜炎」とは網膜の炎症性の障害である。いくつかの実施形態では、障害は脈絡膜炎である。本明細書で用いられているように、「脈絡膜炎」とは、ブドウ膜、毛様体、および脈絡膜の炎症性の障害である。
【０２７９】
異常な血管新生
【０２８０】
特定の実施形態において、被験体の血管新生を防ぐまたは減少させる方法が本明細書で開示され、該方法は、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む組成物を、被験体に投与する工程を含む。本明細書で使用されているように、「血管新生」とは、新しい血管の形成のことを言う。特定の例において、血管新生は、腫瘍の成長と転移を促進する。さらに、特定の例において、異常な血管新生は、滲出型加齢黄斑変性（ｗＡＲＭＤ）と糖尿病性増殖網膜症の基盤である。特定の例では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、血管新生を防ぐまたは減らす。
【０２８１】
特定の例においては、ＶＥＧＦ受容体−２（ＶＥＧＦＲ−２）へのリガンドの結合は、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケードを開始させ、これは、血管透過性（ＮＯを生成するｅＮＯＳ）、増殖／生存（ｂＦＧＦ）、遊走（ＩＣＡＭ／ＶＣＡＭ／ＭＭＰ）、および、最後には成熟した血管への分化をさまざまに刺激する因子の産生を刺激する。特定の例においては、ＶＥＧＦＲ−２がそのリガンドに結合した後に、内皮細胞は、毛細管に似たチューブ構造を形成する。
【０２８２】
本明細書で使用されているように、「滲出型加齢黄斑変性」、「ｗＡＲＭＤ」、または「滲出型ＡＲＭＤ」は、脈絡膜からの血管の増殖によって特徴付けられる目の障害を意味する。特定の例においては、滲出型ＡＲＭＤは、黄斑よりも下での血液とタンパク質の漏出による、視力喪失を引き起こす。特定の例においては、これらの血管からの出血、漏出、および、瘢痕は、治療せずに放っておくと、光受容体への復元不能な損害と急速な視力喪失をもたらす。
【０２８３】
本明細書で使用されているように、「糖尿病性増殖性網膜症」は、血管壁の機能不全によって特徴付けられた目の障害を意味する。特定の例では、網膜中の酸素の欠乏は、網膜に沿った、および、硝子体液中の血管新生を引き起こす。特定の例では、新しい血管は出血し、視覚を曇らせ、網膜を破壊する。
【０２８４】
特定の例では、毛細管の増殖は腫瘍に栄養分を与えて、腫瘍を拡大させる。特定の例では、毛細管の増殖により、細胞廃棄物の迅速な除去が可能となり、腫瘍の成長を可能にする。特定の例において、血管新生は転移を促す。特定の例では、毛細管の増殖により、癌細胞が血管に入って、新しい部位で新しい腫瘍を確立することができる可能性が増える。
【０２８５】
いくつかの実施形態で、本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を使用して処置される典型的な癌型は、限定されないが、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、エイズ関連の癌、エイズ関連リンパ腫、肛門癌、星細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、類癌腫、癌、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、子宮頚部癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、脳室上衣細胞腫、食道癌、性腺外胚細胞腫瘍、目癌、眼球内黒色腫、目癌、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、胃腸間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍（頭蓋外）、胚細胞腫瘍（性腺外）、胚細胞腫瘍（卵巣）、栄養膜腫瘍、神経膠腫、ヘアリー・セル白血病、頭頚部癌、肝細胞性（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部と視覚路の神経膠腫、眼球内黒色腫、膵島細胞癌（内分泌膵）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、白血病（急性リンパ芽球性）、白血病（急性骨髄性）、白血病（慢性リンパ球性）、白血病（慢性骨髄性）、口唇癌と口腔癌、肝臓癌、肺癌（非小細胞）、肺癌（小細胞）、リンパ腫（皮膚のＴ細胞）、リンパ腫（非ホジキン）、骨／骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽腫、メラノーマ、メルケル細胞癌、中皮腫、原因不明の転移性頚部扁平上皮癌、多発性内分泌腺腹、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、骨髄性白血病、骨髄増殖性疾患、鼻腔癌および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽腫、口腔癌、口腔咽頭癌、骨の骨肉腫／悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、低悪性度卵巣腫瘍、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、クロム親和細胞腫、松果体芽腫およびテント上原始神経上皮腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（カポジ）、肉腫（子宮）、セザリー症候群、皮膚癌（非メラノーマ）、皮膚癌（メラノーマ）、皮膚癌（メルケル細胞）、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃（胃）癌、Ｔ細胞性リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、栄養膜腫瘍、妊娠性の尿道癌、子宮癌、子宮内膜の子宮肉腫、膣癌、視覚路と視床下部の神経膠腫、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、および、ウィルムス腫瘍が挙げられる。
【０２８６】
創傷治癒および組織再生
【０２８７】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を含む医薬組成物は、創傷被覆として使用されるか、または、創傷治癒を促すために使用される。いくつかの実施形態では、組織は損傷され、危険にさらされ、または、傷害（例えば、熱傷、外科的切開、感染、外傷、または毒素に由来する壊死の領域、裂傷）によって失われる。いくつかの実施形態では、組織は損傷され、危険にさらされ、または、熱傷により失われた。いくつかの実施形態では、組織は損傷され、危険にさらされ、または、創傷（例えば、切開、裂傷、摩耗）により失われた。いくつかの実施形態では、組織は損傷され、危険にさらされ、または、壊死により失われた。いくつかの実施形態では、組織は損傷され、危険にさらされ、または、潰瘍により失われた。
【０２８８】
熱傷
【０２８９】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、熱傷に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、第１度熱傷に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、第２度火傷に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、第３度熱傷に適用される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、熱傷に置かれる前に基質に適用される。
【０２９０】
創傷
【０２９１】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、皮膚の創傷（例えば、切開、裂傷、摩耗、潰瘍、穿刺、貫通）に適用される。いくつかの実施形態において、創傷は虚血性創傷である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、創傷に置かれる前に基質に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、創傷を処置する。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、臓器の切開（例えば、皮膚、脳、胃、腎臓、肝臓、腸、肺、膀胱、気管、食道、膣、尿管、および血管壁）に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、外科的切開に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、結腸切除の部位に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、胃切除の部位に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、胸の外科手術（例えば、乳房縮小手術、豊胸手術、および乳房切除術）の部位に適用される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、創傷に置かれる前に基質に適用される。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、皮膚の切開（例えば、上皮、真皮、および／または皮下組織の切開）の上の被覆として使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、痔疾の手術後に皮膚を修復または補充するために使用される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、創傷に置かれる前に基質に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、創傷を処置する。
【０２９４】
壊死
【０２９５】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、（例えば感染からの）壊死組織の領域一帯の保護移植片（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｒａｆｔ）として使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、壊死した皮膚の領域一帯の保護移植片に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、壊死組織の領域に置かれる。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、壊死組織に置かれる前に基質に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、壊死組織を処置する。
【０２９６】
潰瘍
【０２９７】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、潰瘍上の保護被覆として使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、潰瘍を処置する。いくつかの実施形態では、潰瘍は、糖尿病性足病変または下腿潰瘍のような糖尿病性潰瘍である。いくつかの実施形態において、潰瘍は虚血性創傷である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、潰瘍に置かれる前に基質に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、潰瘍を処置する。いくつかの実施形態では、潰瘍は非治癒性の潰瘍である。例えば、いくつかの実施形態では、非治癒性の潰瘍は、治療せずに約３−４週間存在した皮膚上の創傷または潰瘍である。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、潰瘍は、足潰瘍（例えば、糖尿病性足部潰瘍または動脈不全潰瘍）である。いくつかの実施形態では、足潰瘍の処置は、（ａ）創傷を（例えば、創傷を清拭して）準備することと、（ｂ）本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物を、創傷上に置くこと、を含む。いくつかの実施形態では、足潰瘍の治療は、（ａ）創傷を（例えば、創傷を清拭して）準備することと、（ｂ）本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物を、創傷上に置くことと、（ｃ）防護壁（例えば、Ｓｉｌｖｅｒｃｅｌｌのドレッシング材、ｍｅｔｉｐｅｌ、ガーゼ、または包帯）で医薬組成物を覆うこと、を含む。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、潰瘍に置かれる前に基質に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、潰瘍を処置する。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、潰瘍は静脈うっ血（ＶＳ）潰瘍である。いくつかの実施形態では、ＶＳ潰瘍の処置は、（ａ）創傷を（例えば、創傷を清拭して）準備することと、（ｂ）本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物を、創傷上に置くことを含む。いくつかの実施形態では、ＶＳ潰瘍の処置は、（ａ）創傷を（例えば、創傷を清拭して）準備することと、（ｂ）本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を含む医薬組成物を、創傷上に置くことと、（ｃ）防護壁（例えば、創傷ベール、抗菌ドレッシング、ガーゼ、または包帯）で医薬組成物を覆うことを含む。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、創傷に置かれる前に基質に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、潰瘍を処置する。
【０３００】
いくつかの実施形態では、潰瘍は角膜潰瘍（すなわち、潰瘍性角膜炎）である。いくつかの実施形態では、角膜潰瘍の処置は、（ａ）創傷を（例えば、創傷を清拭して）準備することと、（ｂ）本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物を、創傷上に置くことを含む。いくつかの実施形態では、角膜潰瘍の処置は、（ａ）創傷を（例えば、創傷を清拭して）準備することと、（ｂ）本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を含む医薬組成物を、創傷上に置くことと、（ｃ）防護壁（例えば、コンタクトレンズまたは包帯）で医薬組成物を覆うことを含む。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、創傷に置かれる前に基質に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、潰瘍を処置する。
【０３０１】
治療用細胞による治療
【０３０２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、細胞療法と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、治療用細胞とともに同時投与される。治療用細胞は、疾患または疾病の処置のための治療的性質を示す任意の細胞を含んでいる。いくつかの実施形態では、治療用細胞は１つ以上の治療用の遺伝子産物を異種発現する組み換え細胞である。いくつかの実施形態では、治療用細胞は移植される。いくつかの実施形態では、治療用細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、治療用細胞は、１つ以上の幹細胞マーカー（例えば、Ｏｃｔ−３／４  （Ｐｏｕ５ｆ１），  Ｓｏｘ２，  ｃ−Ｍｙｃ，  ａｎｄ  Ｋｌｆ４）を発現する細胞である。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、細胞療法は幹細胞の移植である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、移植の幹細胞の拡張と組織の再生を促すために投与される。いくつかの実施例において、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、幹細胞の移植によって引き起こされる炎症、瘢痕化、および、異常な血管新生を減少させるまたは阻害するために、使用される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、支持細胞層を置換することによって、生体外で拡張中に幹細胞の特徴を維持するために使用される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、分化細胞を幹細胞に再プログラム化するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、その後、被験体に移植するために、生体外で幹細胞を増殖して培養するべく使用される。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、幹細胞治療は胚性幹細胞の治療である。いくつかの実施形態では、幹細胞治療は成体幹細胞の治療である。いくつかの実施形態では、幹細胞治療は間葉系幹細胞の治療である。いくつかの実施形態では、幹細胞治療は、限定されないが、心疾患、癌、糖尿病、脊髄損傷、神経変性病、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、筋損傷またはジストロフィ、脳卒中、熱傷、肺疾患、網膜疾患、腎臓病、変形性関節症、および、関節リウマチなどの疾患または障害の処置のために施される。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、幹細胞は糖尿病を処置するために使用される。１型糖尿病は、膵臓のランゲルハンス島のインスリン分泌β細胞の自己免疫媒介性の破壊に起因する。２型糖尿病は、全身性のインスリン抵抗性と、膵臓のβ細胞によるインスリン分泌の減少に起因する。幹細胞はインスリン産生細胞に分化するように生体外で示されている（例えば、Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９７：１１３０７−１１３１２；  Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９）  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  ３０：２１４−２２７を参照）。したがって、いくつかの実施形態では、ＥＳＣとＡＳＣを含む幹細胞、および、部分的に分化した幹細胞などのその誘導体は、膵臓のβ細胞の再生のための幹細胞治療で使用される。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、治療のために使用される幹細胞または分化細胞は、マイクロカプセル装置にカプセル化される。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む。いくつかの実施形態において、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、マイクロカプセルに共有結合される。いくつかの実施形態において、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、マイクロカプセルの表面、例えば、内表面または外表面、あるいは、その両方で組み立てられる。いくつかの実施形態において、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、マイクロカプセルをコーティングするように調剤される。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、細胞への栄養分の通路がマイクロカプセルに至ることを可能にする孔を備え、および／または、カプセルに包まれた細胞によって分泌されたタンパク質と分子（例えば、インスリン）が、マイクロカプセルから流れ出ることを可能にする。いくつかの実施形態では、細胞は、まず、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でコーティングされたビーズなどのマイクロキャリア上で固定され、その後、マイクロカプセル内に封入される。例えば、幹細胞のような細胞のカプセル封入のための方法は、当該技術分野では知られており、例えば、Ｓｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６（８）：ｅ２３２１２に記載されている。いくつかの実施形態では、細胞のカプセル化のための任意の方法は、本明細書で提供された方法を用いて使用される。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、同種異系の治療用幹細胞（例えば、インスリン産生膵島細胞）は、インスリンの産生のためにマイクロカプセル装置に封入される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、幹細胞の拡張を促す。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、糖尿病の治療のために使用される幹細胞を含むマイクロカプセルに対する炎症反応を阻害するまたは減少させる。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、幹細胞を含むマイクロカプセルに対する炎症反応を阻害するまたは減少させる。
【０３０８】
軟組織の使用
【０３０９】
特定の実施形態において、レシピエントの損傷した、危険に晒された、または、失われている軟組織（例えば、腱）を、修復する、再構成する、置換する、または、補充するための、本明細書で開示されｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用が本明細書で開示されている。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、組織に直接適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、細胞または組織に基づいた治療と共に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、細胞、複数の細胞、または、組織と混合され、組織に基づいた治療の一部として投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、細胞、複数の細胞、または組織を覆うために使用され、組織に基づいた治療の一部として投与される。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、軟組織の切開にわたって被覆として使用される（例えば、眼瞼は、軟組織の異なる層の間に組織面を形成する）。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、その後、軟組織の切開にわたって被覆として使用される（例えば、眼瞼は、軟組織の異なる層の間に組織面を形成する）。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、軟組織の構造の（形成術的）支持体として使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、関節または腱の修復における接着を防ぐ。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、腱または関節の修復（回旋筋腱板修復、手の腱の修復など）で使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、腱または関節を強化するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、周囲の組織、腱または関節に、治癒しつつある腱が接着するのを防ぐために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、腱での瘢痕組織の形成を防ぐために使用される。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、後脛骨腱、腓骨腱、屈筋腱と伸筋腱、および、外側の足首の靭帯を含む、足と足首の小さな腱と靭帯を強化するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、四頭筋と膝を囲む膝蓋腱の第１次修復を強化するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、関節置換の骨移植のための骨膜パッチとして使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、全体的な関節修正手術の後に、不十分な殿部と膝のカプセル状組織を強化するために使用される。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、断裂した回旋筋腱板の修復で使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、回旋筋腱板の筋肉または腱（例えば、棘上筋腱）にわたるパッチとして使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、回旋筋腱板の筋肉または腱（例えば、棘上筋腱）を再構成するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、回旋筋腱板の筋肉または腱（例えば、棘上筋腱）を増強するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、回旋筋腱板の筋肉または腱（例えば、棘上筋腱）を強化するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、回旋筋腱板の筋肉または腱（例えば、棘上筋腱）に対する軟組織の接着を防ぐために使用される。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、歯肉の修復で使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、歯肉退縮の修復で使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、歯肉上のパッチとして使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、露出した歯根表面にわたるパッチとして使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、歯肉を再構成するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、歯肉を増強するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、歯肉を強化するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、歯肉に対する軟組織の接着を防ぐために使用される。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、筋膜の切開または断裂にわたる保護グラフトとして使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、筋膜中の構造（形成術的）支持体として用いられる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、筋膜の置換または補充として使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、ヘルニアを修復するために（例えば、筋膜を修復するために）使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、鼠径ヘルニアを修復するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、大腿ヘルニアを修復するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、臍ヘルニアを修復するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、瘢痕ヘルニアを修復するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、横隔膜ヘルニアを修復するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、クーパーヘルニア、上腹壁ヘルニア、裂孔ヘルニア、リトルヘルニア、腰ヘルニア、マイドルヘルニア、閉鎖孔ヘルニア、パンタロンヘルニア、傍食道型ヘルニア、臍傍ヘルニア、会陰ヘルニア、腹膜前ヘルニア、リクターヘルニア、滑脱ヘルニア、坐骨ヘルニア、半月状線ヘルニア（ｓｐｉｇｅｌｉａｎ  ｈｅｒｎｉａ）、スポーツヘルニア、ベルポーヘルニア、または、アミアンドヘルニアを修復するために使用される。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、脊椎円板のヘルニア形成を修復するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、脊椎円板の切開または断裂にわたる保護グラフトとして使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、線維輪の切開または断裂にわたる保護グラフトとして使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、脊椎円板の構造的（形成術的）な支持体として、使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、線維輪の構造的（形成術的）な支持体として、使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、脊椎円板の置換または補充として使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、脊椎円板の構造的（形成術的）な支持体として、使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、線維輪の置換または補充として使用される。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、脳、または、髄膜（すなわち、硬膜、軟膜、および／または、くも膜）のうちの１つ（またはすべて）の切開にわたって使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、髄膜（すなわち、硬膜、軟膜、および／または、くも膜）のうちの１つ（またはすべて）の構造的（形成術的）な支持体として、使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、髄膜（すなわち、硬膜、軟膜、および／または、くも膜）のうちの１つ（またはすべて）の代用品として使用される。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、肺または胸膜の切開にわたって使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、胸膜の構造的（形成術的）な支持体として、使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、胸膜の代用品として使用される。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、鼓膜の切開にわたって使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、鼓膜の構造的（形成術的）な支持体として使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、鼓膜の代用品として使用される。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、心臓または心膜中の切開にわたって保護グラフトとして使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、心膜の構造的（形成術的）な支持体として使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、心膜の代用品として使用される。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、腹膜中の切開にわたって保護グラフトとして使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、腹膜の構造的（形成術的）な支持体として使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、腹膜の代用品としてに使用される。
【０３２３】
眼科用途
【０３２４】
特定の実施形態において、レシピエントの損傷した、危険に晒された、または、失われつつある眼組織を、修復する、再構成する、置換する、または、補充するための、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物の使用が、本明細書で開示されている。
【０３２５】
緑内障の処置
【０３２６】
本明細書で使用されているように、「緑内障」とは、視神経中の視神経細胞の喪失によって特徴付けられる障害を意味する。特定の例において、緑内障は、前眼房（ＡＣ）中の眼内圧の増加に部分的にまたは完全に起因する。眼内圧は、目の毛様体突起の液体の房水の産生と、線維柱帯網を介した房水のドレナージとに依存して変化する。
【０３２７】
緑内障ドレナージ装置（ＧＤＤ）は、房水を排出する代替経路を提供することによって眼内圧を軽減するために、目に埋め込まれる医療装置である。被覆されていないままであれば、ＧＤＤチューブは腐食して、目を眼内の感染症にかかりやすくする。したがって、ＧＤＤチューブを被覆される必要がある。現在、ＧＤＤチューブを被覆するために使用されるパッチは、心膜、強膜、および角膜から作られる。これらのパッチは約４００−５５０ミクロンの厚さである。このような薄さのパッチは、結果として２年間で２５％溶けてしまい、シャントチューブを再度晒したままにする可能性がある。
【０３２８】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、ＧＤＤチューブを被覆するために使用される。いくつかの実施形態では、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、３００−６００ミクロンの厚さである。いくつかの実施形態では、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３または基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、２年で２５％も溶けない。
【０３２９】
眼潰瘍の処置
【０３３０】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、目の持続的な上皮の欠損および／または潰瘍を覆うために使用される。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、潰瘍の基底部は、手術用スポンジで清拭され、潰瘍の端に（例えば、上皮が完全に接着するようになる目の部分に）隣接している接着性に乏しい上皮は取り除かれる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、レシピエントの目に移される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、その後、埋められる縫合糸の結び目（例えば、結節された１０−０のナイロンの縫合糸、または、連続している１０−０のナイロンの縫合糸）によって、目に固定される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、フィブリン接着剤を用いることによって目に固定される。いくつかの実施形態では、保護層は、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体、あるいは、目（例えばコンタクトレンズ）全体に適用される。いくつかの実施形態では、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、さらに抗生物質（例えば、ネオマイシン、ポリミキシンｂ硫酸塩、および、デキサメタゾン）を含む。
【０３３２】
結膜、強膜、眼瞼、および、眼窩縁の表面の再構成
【０３３３】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、結膜、強膜、眼瞼、および、眼窩縁の表面の再構成に使用される。いくつかの実施形態では、結膜の表面に対する損傷は、瞼球癒着の溶解、腫瘍、病変、および／または、瘢痕組織の外科的摘出、エキシマー・レーザーによるレーザー屈折矯正角膜切除術および治療用の角膜切除、またはそれらの組み合わせに起因する。
【０３３４】
冠状動脈用途
【０３３５】
特定の実施形態において、レシピエントの損傷した、危険に晒された、または、失われつつある冠状動脈を、修復する、再構成する、置換する、または、補充するための、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物の使用が、本明細書で開示されている。
【０３３６】
虚血再灌流損傷の予防
【０３３７】
例えば心筋梗塞または脳卒中などの虚血によって引き起こされた急性急性炎症の結果として生じる組織損傷の阻害または減少のための、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物の使用が、本明細書で開示されている。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、限定されないが、心筋梗塞または脳卒中などの虚血性の疾病を抱える被験体に投与される。
【０３３８】
冠動脈バイパス術
【０３３９】
冠動脈バイパス術における本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物の使用が、本明細書で開示されている。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、アテローム性動脈硬化を特徴とする動脈の部分を迂回するために、冠動脈に移植される。
【０３４０】
心臓弁
【０３４１】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、心臓弁にわたって適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、心臓弁の構造的（形成術的）な支持体として使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、心臓弁の代替物として使用される。
【０３４２】
静脈および動脈
【０３４３】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、血管または動脈に適用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、血管または動脈の構造的（形成術的）な支持体として使用される。
【０３４４】
神経用途
【０３４５】
特定の実施形態において、レシピエントの損傷した、危険に晒された、または、失われつつある神経組織を、修復する、再構成する、置換する、または、補充するための、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物の使用が、本明細書で開示されている。
【０３４６】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、神経（例えば末梢神経）にわたって被覆として使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、神経移植片、神経移行術、または修復された神経にわたる被覆として、使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、神経（例えば末梢神経）中の切開にわたる被覆として、使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、神経（例えば末梢神経）の構造的（形成術的）な支持体として使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、神経修復における接着を防ぐ。
【０３４７】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、損傷した神経のための非収縮性の容器（ｅｎｃａｓｅｍｅｎｔ）として使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、瘢痕形成、カプセル化、慢性的な圧縮、神経の拘束（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）および神経絞扼を防ぐまたは最小限に抑える。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、神経腫形成を防ぐまたは最小限に抑える。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、神経修復の間に存在する内因性の成長因子（すなわち、神経成長因子）の移動を防ぐまたは最小限に抑える。
【０３４８】
脊髄用途
【０３４９】
特定の実施形態において、脊椎手術中の、本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を含む医薬組成物の使用が、本明細書で開示されている。
【０３５０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を含む医薬組成物は、椎弓切除中に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、脊椎手術（例えば、椎弓切除）の後に、硬膜外繊維症および／または瘢痕接着を減らすまたは防ぐために、使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、脊椎手術（例えば、椎弓切除）の後に、硬膜と重なった組織の間に注入される。いくつかの実施形態では、脊椎手術（例えば、椎弓切除）の後に、硬膜と重なる組織との間で本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物を注入することで、硬膜への繊維芽細胞の移動と硬膜上でのコラーゲン沈着を減らすまたは防ぐ。
【０３５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、脊椎手術（例えば椎弓切除）後に増殖性の瘢痕化の進行を低下させるまたは防ぐために、使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、手術後の（例えば、椎弓切除後の）硬膜外／硬膜上の／神経周囲の瘢痕の進行を低下させるまたは防ぐために、使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、脊椎手術（例えば、椎弓切除）後に、増殖性の瘢痕化の進行を低下させるまたは防ぐために、使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、椎弓切除後の膜の進行を低下させるまたは防ぐために使用される。
【０３５２】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３または本明細書に記載のｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を含む医薬組成物は、脊椎手術（例えば椎弓切除）後の硬膜外の圧縮または硬膜の係留の進行を低下させるまたは防ぐために、使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、脊椎手術（例えば椎弓切除）後の、係留された神経根の進行を低下させるまたは防ぐために、使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、脊椎手術（例えば椎弓切除）後の、くも膜炎の進行を低下させるまたは防ぐために、使用される。
【０３５３】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、小片に分けた（ｍｏｒｓｅｌｉｚｅｄ）骨組織をさらに含む。いくつかの実施形態では、小片に分けた骨組織を含む、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、脊椎固定術手順の間に使用される。いくつかの実施形態では、小片に分けた骨組織を含む、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、隣接する椎骨間に注入される。いくつかの実施形態では、２つの隣接する椎骨間に小片に分けた骨組織を含む、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物の注入は、椎骨の融合を促進する。
【０３５４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、硬膜中の切開にわたって保護グラフトとして使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、硬膜の構造的（形成術的）な支持体として使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、基質に適用され、基質／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、基質／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、硬膜の代替物として、使用される。
【０３５５】
ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の様々な用途
【０３５６】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、パッチまたは創傷ドレッシングに適用される。
【０３５７】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、皮膚の充填剤として使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、皮膚下の化粧紙に注入される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、顔のしわと加齢線（例えば、ほうれい線、ｍｅｌｏｍｅｎｔａｌ  ｆｏｌｄｓ、「カラスの足」、および、前頭部のしわ）の下に注入される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、口唇拡大術に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、唇に注入される。
【０３５８】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、関節炎（例えば、変形性関節症、関節リウマチ、化膿性関節炎、強直性脊椎炎、脊椎症）を処置するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、関節炎の関節（例えば膝）に注入される。
【０３５９】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、足の関節炎を処置するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、第１の中足指節（ＭＴＰ）関節（例えば、強剛母趾）の関節炎を処置するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、背側の唇切除術（ｄｏｒｓａｌ  ｃｈｅｉｌｅｃｔｏｍｙ）後にＭＴＰ関節に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物の投与は、強剛母趾または背側の唇切除術の手順に関連した１つ以上の有害な症状（例えば、瘢痕化、関節硬直、腫脹、炎症、および痛み）を減少させる。
【０３６０】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、骨棘に関連した１つ以上の症状（例えば、瘢痕、関節硬直、腫脹、炎症、および痛み）を処置するために使用される。
【０３６１】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、個体の骨吸収を阻害するために使用される。いくつかの実施形態では、個体は、関節炎、骨粗鬆症、歯槽骨の劣化、パジェット病、または、骨腫瘍を患っている。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、関節に注入される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、（例えば、創傷ドレッシングまたは包帯を使用することによって）骨と接触する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、骨ステント、骨インプラント、または人工骨（例えば、オッセオインテグレーテッドインプラント）をコーティングする。本明細書で使用されているように、「オッセオインテグレーテッドインプラント」は、骨芽細胞と支持する結合組織が移動する先の孔部を含む、３次元のインプラントを意味する。いくつかの実施形態では、骨ステントは骨の髄内管に挿入される。いくつかの実施形態では、骨ステントは足根洞に置かれる。いくつかの実施形態では、骨ステントは膝または関節に置かれた。いくつかの実施形態では、骨ステントは骨折箇所に置かれる。いくつかの実施形態では、骨ステントは拡張および収縮可能である。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、個体の骨形成を促進するまたは誘導するために使用される。いくつかの実施形態では、個体は、関節炎、骨粗鬆症、歯槽骨の劣化、パジェット病、または骨腫瘍を患っている。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、関節に注入される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、（例えば、創傷ドレッシングまたは包帯を用いることによって）骨と接触する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、骨ステント、骨インプラント、または人工骨（例えば、オッセオインテグレーテッドインプラント）をコーティングする。本明細書で使用されているように、「オッセオインテグレーテッドインプラント」は、骨芽細胞と支持する結合組織が移動する先の孔部を含む、３次元のインプラントを意味する。いくつかの実施形態では、骨ステントは骨の髄内管に挿入される。いくつかの実施形態では、骨ステントは足根洞に置かれる。いくつかの実施形態では、骨ステントは膝または関節に置かれた。いくつかの実施形態では、骨ステントは骨折個所に置かれる。いくつかの実施形態では、骨ステントは拡張および収縮可能である。
【０３６３】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、破骨細胞分化を阻害するために使用される。いくつかの実施形態では、個体は、関節炎、骨粗鬆症、歯槽骨の劣化、パジェット病、または骨腫瘍を患っている。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、関節に注入される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、（例えば、創傷ドレッシングまたは包帯を用いることによって）骨と接触する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、骨ステント、骨インプラント、または人工骨（例えば、オッセオインテグレーテッドインプラント）をコーティングする。本明細書で使用されているように、「オッセオインテグレーテッドインプラント」は、骨芽細胞と支持する結合組織が移動する先の孔部を含む、３次元のインプラントを意味する。いくつかの実施形態では、骨ステントは骨の髄内管に挿入される。いくつかの実施形態では、骨ステントは足根洞に置かれる。いくつかの実施形態では、骨ステントは膝または関節に置かれた。いくつかの実施形態では、骨ステントは骨折個所に置かれる。いくつかの実施形態では、骨ステントは拡張および収縮可能である。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、個体の骨芽細胞による鉱化作用を促すために使用される。いくつかの実施形態では、個体は、関節炎、骨粗鬆症、歯槽骨の劣化、パジェット病、または骨腫瘍を患っている。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、関節に注入される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、（例えば、創傷ドレッシングまたは包帯を用いることによって）骨と接触する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、骨ステント、骨インプラント、または人工骨（例えば、オッセオインテグレーテッドインプラント）をコーティングする。本明細書で使用されているように、「オッセオインテグレーテッドインプラント」は、骨芽細胞と支持する結合組織が移動する先の孔部を含む、３次元のインプラントを意味する。いくつかの実施形態では、骨ステントは骨の髄内管に挿入される。いくつかの実施形態では、骨ステントは足根洞に置かれる。いくつかの実施形態では、骨ステントは膝または関節に置かれた。いくつかの実施形態では、骨ステントは骨折個所に置かれる。いくつかの実施形態では、骨ステントは拡張および収縮可能である。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、個体の骨吸収と骨形成の平衡を保つために使用される。いくつかの実施形態では、個体は、関節炎、骨粗鬆症、歯槽骨の劣化、パジェット病、または骨腫瘍を患っている。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、関節に注入される。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、（例えば、創傷ドレッシングまたは包帯を用いることによって）骨と接触する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、骨ステント、骨インプラント、または人工骨（例えば、オッセオインテグレーテッドインプラント）をコーティングする。本明細書で使用されているように、「オッセオインテグレーテッドインプラント」は、骨芽細胞と支持する結合組織が移動する先の孔部を含む、３次元のインプラントを意味する。いくつかの実施形態では、骨ステントは骨の髄内管に挿入される。いくつかの実施形態では、骨ステントは足根洞に置かれる。いくつかの実施形態では、骨ステントは膝または関節に置かれた。いくつかの実施形態では、骨ステントは骨折個所に置かれる。いくつかの実施形態では、骨ステントは拡張および収縮可能である。
【０３６６】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、歯科矯正または歯周の状態を処置するために、使用される。いくつかの実施形態では、歯周の状態は、歯肉炎、歯肉退縮、または、歯周炎から選ばれる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、抗炎症剤として使用されるか、または、骨結合または治癒を促すために使用される。いくつかの実施形態では、インプラントの骨結合、抗炎症、および、治癒を促進するために、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、歯科インプラントと組み合わせて使用される。
【０３６７】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、嗄声または発声障害を処置する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、声帯を修復するため喉頭形成術のために注入されるべく使用される。
【０３６８】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む医薬組成物は、医療用移植組織（例えばステント）上でコーティングされる。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示された医療用の移植組織／ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、または、移植組織／ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、個体注入され、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、個体に部分的にまたは完全に放出される。いくつかの実施形態では、医療用の移植組織は、ステント（例えば骨ステントまたは冠状動脈ステント）である。いくつかの実施形態では、医療用の移植組織は骨ステントである。いくつかの実施形態では、医療用の移植組織は冠状動脈ステントである。
【０３６９】
組み合わせ
【０３７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、第２の治療薬と共に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、２つ以上の治療薬と共に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、１つ以上の治療薬と共に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上治療薬と共に使用される。
【０３７１】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体と第２の治療薬は、同じ剤形で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体と第２の治療薬は、個別の剤形で投与される。
【０３７２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体と第２の治療薬は、同時に（例えば、同時に、本質的に同時に、または同じ処置プロトコルで）投与される。
【０３７３】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体と第２の治療薬は、連続して投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、第２の治療薬の前後に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の第２の活性薬剤の投与間の時間は、医薬品の効能、可溶性、バイオアベイラビリティ、血漿半減期、および、動態プロファイルといった、それぞれの医薬品の特性に依存して、数分から数時間まで変動する。いくつかの実施形態では、標的分子濃度の日周期の変化は、最適な投与間隔を決定する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体と、第２の活性剤の投与間の時間は、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週、約２週、約３週、約１か月、あるいは、それよりも長い。
【０３７４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の同時投与は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を単独で投与する際に必要とされる投与量よりも少ない投与量のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体がが必要とされる。いくつかの実施形態では、第２の治療薬の同時投与は、第２の治療薬を単独で投与する際に必要とされる投与量よりも少ない投与量の第２の治療薬が必要とされる。併用療法レジメンで使用される薬物と他の薬剤の治療上有効な量を実験的に決定する方法は、当該技術分野では知られており、記載されている。例えば、メトロノミック投与の使用、すなわち、有毒な副作用を最小限に抑えるため、より頻繁により少ない投与量を提供することは、当該技術分野で広範囲に述べられている。併用療法は、個体の臨床管理を助けるために様々な時点で開始および停止する定期的処置もさらに含む。
【０３７５】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体と、１つ以上の追加の治療薬の併用療法が修正される。いくつかの実施形態では、併用療法は修正され、それによって、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の量は、第２の治療薬の量に対して増加する。いくつかの実施形態では、併用療法は修正され、それによって、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の量は、第２の治療薬の量に対して減少する。いくつかの実施形態では、併用療法は修正され、それによって、第２の治療薬の量は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の量に対して増加する。いくつかの実施形態では、併用療法は修正され、それによって、第２の治療薬の量は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の量に対して減少する。
【０３７６】
いくつかの実施形態では、第２の治療薬は、細胞毒性薬、抗菌剤、抗血管形成剤、化学療法剤、抗腫瘍薬、または、放射線療法から選ばれる。いくつかの実施形態では、第２の治療薬は、アルキル化剤、抗代謝産物、エピドフィロトキシン（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎｓ）、抗悪性腫瘍酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、プロカルバジン、ミトキサントロン、白金配位化合物、生体応答修飾物質および成長抑制剤、ホルモン／抗ホルモン治療薬、造血成長因子、アロマターゼ阻害薬、抗エストロゲン、抗アンドロゲン、コルチコステロイド、ゴナドレリン・アゴニスト、微小管活性薬剤、ニトロソウレア、脂質またはタンパク質キナーゼ標的薬剤、剤、免疫調節剤（ＩＭｉＤｓ）、タンパク質または脂質ホスファターゼ標的薬剤、抗血管新生薬、Ａｋｔ阻害剤、ＩＧＦ−Ｉ阻害剤、ＦＧＦ３修飾物質、ｍＴＯＲ阻害剤、Ｓｍａｃ模倣薬、ＨＤＡＣ阻害剤、細胞分化を引き起こす薬剤、ブラジキニン１受容体アンタゴニスト、アンジオテンシンＩＩアンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ヘパラナーゼ阻害剤、リンホカイン阻害剤、サイトカイン阻害剤、ＩＫＫ阻害剤、Ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、多標的キナーゼ阻害剤、ビスホスホネート、ラパマイシン誘導体、抗アポトーシス経路阻害剤、アポトーシス経路アゴニスト、ＰＰＡＲアゴニスト、ＲＡＲアゴニスト、ＲＡＳアイソフォームの阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害剤、アミノペプチダーゼ阻害剤、ＳＨＩＰ活性化剤−ＡＱＸ−ＭＮ１００、Ｈｕｍａｘ−ＣＤ２０（オファツムマブ）、ＣＤ２０アンタゴニスト、ＩＬ２−ジフテリア毒素融合物、または、および、これらの組み合わせから選ばれる。いくつかの実施形態において、抗菌剤は、抗ウイルス剤、抗菌剤、または、抗真菌剤である。非限定的な典型的な抗菌剤は、アミノグリコシド、ベータ・ラクタム、キノロンまたはフルオロキノロン、マクロライド、スルホンアミド、スルファメトキサゾール（ｓｕｌｆａｍｅｔｈａｘｏｚｏｌｅｓ）、テトラサイクリン、ストレプトグラミン、オキサゾリジノン（リネゾリドなど）、クリンダマイシン、リンコマイシン、リフォマイシン、グリコペプチド、ポリミキシン（ｐｏｌｙｍｘｉｎｓ）、リポ−ペプチド系抗生物質、同様に、薬理学的に許容可能なナトリウム塩、薬理学的に許容可能なカルシウム塩、薬理学的に許容可能なカリウム塩、脂質製剤、上記のものの誘導体および／またはアナログとして分類されたものを含んでいる。抗真菌薬の非限定的な典型的な分類としては、クロトリマゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、エコナゾール、ブトコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、テルコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾール、ボリコナゾール（ＵＫ１０９，４９６）、ポサコナゾール、ラブコナゾール、または、フルトリマゾールといった、イミダゾールまたはトリアゾール；アムホテリシンＢ、リポソームアムホテリシンＢ、ナタマイシン、ナイスタチン、および、ナイスタチン脂質製剤といったポリエン抗真菌薬；カスポファンギン、ミカファンギン、アニデュラファンギン（ａｎｉｄｕｌｆｕｎｇｉｎ）、シロファンギン（ｃｉｌｏｆｕｎｇｉｎ）などのエキノキャンディンを含む、細胞壁の活発な環式リポペプチド抗真菌剤；ＬＹ１２１０１９；ＬＹ３０３３６６；テルビナフィン（ｔｅｒｂｉｎａｆｍｅ）などの抗真菌剤のアリルアミン基が挙げられる。抗真菌薬のさらに別の非限定的な例としては、ナフチフィン、トルナフテート、メディオシディン（ｍｅｄｉｏｃｉｄｉｎ）、カンジシジン、トリコマイシン、ハマイシン、オーレファンギンン（ａｕｒｅｆｕｎｇｉｎ）、アスコシン、アイファッティン（ａｙｆａｔｔｉｎ）、アザコルチン（ａｚａｃｏｌｕｔｉｎ）、トリコマイシン、レボリン、ヘプタマイシン（ｈｅｐｔａｍｙｃｉｎ）、キャンディマイシン（ｃａｎｄｉｍｙｃｉｎ）、グリセオフルビン、ＢＦ−７９６、ＭＴＣＨ  ２４、ＢＴＧ−１３７５８６、プラジミシン（ｐｒａｄｉｍｉｃｉｎｓ）（ＭＮＳ  １８１８４）、ベナノマイシン（ｂｅｎａｎｏｍｉｃｉｎ）；アムビゾーム；ニッコマイシン  Ｚ；フルシトシン、または、ペリマイシンが挙げられる。抗ウイルス剤の非限定的な例としては、シドホビル、アマンタジン、リマンタジン、アシクロビル、ガンシクロビル、ペンシクロビル（ｐｅｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）、ファムシクロビル、ホスカーネット（ｆｏｓｃａｍｅｔ）、リバビリン、または、バラシクロビル（ｖａｌｃｙｃｌｏｖｉｒ）を含んでいる。いくつかの実施形態において、抗菌剤は、自然免疫ペプチドまたはタンパク質である。先天性のペプチドまたはタンパク質のいくつかの典型的なクラスは、トランスフェリン、ラクトフェリン、デフェンシン、ホスホリパーゼ、リゾチーム、カテリシジン、セルプロシジン（ｓｅｒｐｒｏｃｉｄｉｎｓ）、殺菌性透過性増加タンパク質、両親媒性のα螺旋形ペプチド、および、他の合成抗菌タンパク質である。いくつかの実施形態において、抗菌剤は防腐剤である。
【０３７７】
幾つかの実施形態では、第２の治療薬は、ＡＲＲＹ−７９７、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、アクチノマイシンＣ２、Ｃ３、Ｄ、およびＦ１、シクロホスファミド、メルファラン、エストラムスチン、マイタンシノール、リフォマイシン、ストレプトバリシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、エソルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシンＡ、Ａ２、および、Ｂ、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、９−アミノカンプトテシン、１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシン（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、９−ニトロカンプトテシン（ｎｉｔｒｏｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ボルテゾミブ、テモゾロミド、ＴＡＳ１０３、ＮＰＩ００５２、コンブレタスタチン、コンブレタスタチンＡ−２、コンブレタスタチンＡ−４、カリチアマイシン、ネオカルジノスタチン（ｎｅｏｃａｒｃｉｎｏｓｔａｔｉｎｓ）、エポチロンＡ  Ｂ、Ｃ、および、半合成の変異体、ハーセプチン、リツキサン、ＣＤ４０抗体、アスパラギナーゼ、インターロイキン、インターフェロン、ロイプロリドおよびペガスパルガーゼ、５−フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、プトラフル（ｐｔｏｒａｆｕｒ）、５’−デオキシフルオロウリジン（ｄｅｏｘｙｆｌｕｏｒｏｕｒｉｄｉｎｅ）、ＵＦＴ、ＭＩＴＣ、Ｓ−１カペシタビン、ジエチルスチルベストロール、タモキシフェン、トレミフェン（ｔｏｒｅｍｅｆｉｎｅ）、トルムデックス（ｔｏｌｍｕｄｅｘ）、チミタック（ｔｈｙｍｉｔａｑ）、フルタミド、フルオキシメステロン、ビカルタミド、フィナステリド、エストラジオール、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、デキサメタゾン、酢酸リュープロレリン、エストラムスチン、ドロロキシフェン、メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、アミノグルテチミド、テストラクトン、テストステロン、ジエチルスチルベストロール、ヒドロキシプロゲステロン、マイトマイシンＡ、Ｂ、およびＣ、ポルフィロマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、テトラプラチン、白金−ＤＡＣＨ、オルマプラチン、サリドマイド、レナリドミド、ＣＩ−９７３、テロメスタチン、ＣＨＩＲ２５８、Ｒａｄ  ００１、ＳＡＨＡ、チューバシン（Ｔｕｂａｃｉｎ）、１７−ＡＡＧ、ソラフェニブ、ＪＭ−２１６、ポドフィロトキシン、エピポドフィロトキシン、エトポシド、テニポシド、タルセバ、イレッサ、イマチニブ、ミルテホシン、ペリフォシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロ・メトトレキサート、６−メルカプトプリン、チオグアニン、アザッツオプリン（ａｚａｔｔｕｏｐｒｉｎｅ）、アロプリノール、クラドリビン、フルダラビン、ペントスタチン、２−クロロアデノシン（ｃｈｌｏｒｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、デオキシシチジン、サイトシンアラビノサイド、シタラビン、アザシチジン、５−アザシトシン、ゲムシタビン、５−アザシトシン・アラビノシッド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ロイロシン（ｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）、ロイロシジン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｉｎｅ）およびビンデシン、パクリタキ��ル、タキソテール（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、および／または、ドセタキセルから選ばれる。
【０３７８】
いくつかの実施形態では、第２の活性剤は、ナイアシン、フィブラート、スタチン、Ａｐｏ−Ａ１模倣ポリペプチド（例えば、ＤＦ−４、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ａｐｏＡ−Ｉの転写アップレギュレータ（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）、ＡＣＡＴ阻害剤、ＣＥＴＰ修飾薬、糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体アンタゴニスト、Ｐ２Ｙ１２受容体アンタゴニスト、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤、抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体アンタゴニスト、インターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体アンタゴニスト、インターロイキン−６（ＩＬ−６）受容体アンタゴニスト、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）受容体アンタゴニスト、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）受容体アンタゴニスト、インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）受容体アンタゴニスト、細胞毒性薬、抗菌剤、免疫調節剤、抗生物質、Ｔ細胞同時刺激遮断薬、障害を緩和する抗リューマチ剤、Ｂ細胞除去剤、免疫抑制剤、抗リンパ球抗体、アルキル化剤、抗代謝産物、植物アルカロイド、テルペノイド、トポイソメラーゼ阻害剤、抗腫瘍抗生物質、モノクローナル抗体、ホルモン療法（例えば、アロマターゼ阻害薬）、または、この組み合わせである。
【０３７９】
いくつかの実施形態では、第２の活性剤は、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＴＧＦ−β受容体遮断抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＴＮＦ受容体遮断抗体、抗ＩＬ１β抗体、抗ＩＬ１β受容体遮断抗体、抗ＩＬ−２抗体、抗ＩＬ−２受容体遮断抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−６受容体遮断抗体、抗ＩＬ−１２抗体、抗ＩＬ−１２受容体遮断抗体、抗ＩＬ−１７抗体、抗ＩＬ−１７受容体遮断抗体、抗ＩＬ−２３抗体、または、抗ＩＬ−２３受容体遮断抗体である。
【０３８０】
いくつかの実施形態において、第２の活性薬剤は、ナイアシン、ベザフィブラート、シプロフィブラート、クロフィブレート、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、ＤＦ４；（Ａｃ−Ｄ−Ｗ−Ｆ−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｅ−Ａ−Ｆ−ＮＨ２）ＤＦ５；ＲＶＸ‐２０８（Ｒｅｓｖｅｒｌｏｇｉｘ）；アバシミベ（ａｖａｓｉｍｉｂｅ）；パクチミベ（ｐａｃｔｉｍｉｂｅ）硫酸塩（ＣＳ−５０５）；ＣＩ−１０１１（２，６−ジイソプロピルフェニル［（（２、４，６−トリイソプロピルフェニル）アセチル］スルファメート））；ＣＩ−９７６（２，２−ジメチル−Ｎ−（２，４，６−トリメトキシフェニル）ドデカンアミド）；ＶＵＬＭ１４５７（１−（２，６−ジイソプロピル−フェニル）−３−［４−（４’−ニトロフェニルチオ）フェニル］尿素）；ＣＩ−９７６（２，２−ジメチル−Ｎ−（２，４，６−トリメトキシフェニル）ドデカンアミド）；Ｅ−５３２４（ｎ−ブチル−Ｎ’−（２−（３−（５−エチル−４−フェニル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）プロポキシ）−６−メチルフェニル）尿素）；ＨＬ−００４（Ｎ−（２，６−ジイソプロピルフェニル）テトラデシルチオアセトアミド）；ＫＹ−４５５（Ｎ−（４，６−ジメチル−１−ペンチルインドリン−７−イル）−２，２−ジメチルプロパンアミド）：ＦＹ−０８７（Ｎ−［２−［Ｎ’−ペンチル−（６，６−ジメチル−２，４−ヘプタジイニル）アミノ］エチル］−（２−メチル−１−ナフチル−チオ）アセトアミド）；
ＭＣＣ−１４７（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｐｈａｒｍａ）；Ｆ１２５１１（（Ｓ）−２’，３’，５’−トリメチル−４’−ヒドロキシ−アルファ−ドデシルチオアセトアニリド）；ＳＭＰ−５００（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＣＬ２７７０８２（２，４−ジフルオロ−フェニル−Ｎ［［４−（２，２−ジメチルプロピル）フェニル］メチル］−Ｎ−（ヘプチル）尿素）；Ｆ−１３９４（（１ｓ，２ｓ）−２−［３−（２，２−ジメチルプロピル）−３−ノニルウレイド（ｎｏｎｙｌｕｒｅｉｄｏ）］アミノシクロヘキサン−１−イル  ３−［Ｎ−（２，２，５，５−テトラメチル−１，３−ジオキサン−４−カルボニル）アミノ］プロピオネート）；ＣＰ−１１３８１８（Ｎ−（２，４−ビス（メチルチオ）−６−メチルピリジン−３−イル）−２−（ヘキシルチオ）デカン酸アミド）；ＹＭ−７５０；トルセトラピブ；アナセトラピブ（ａｎａｃｅｔｒａｐｉｄ）；ＪＴＴ−７０５（Ｊａｐａｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ／Ｒｏｃｈｅ）；アブシキシマブ；エプチフィバチド；チロフィバン；ロキシフィバン；バリアビリン（ｖａｒｉａｂｉｌｉｎ）；ＸＶ４５９（Ｎ（３）−（２−（３−（４−ホルムアミジノフェニル（ｆｏｒｍａｍｉｄｉｎｏｐｈｅｎｙｌ））イソキサゾリン−５−イル）アセチル）−Ｎ（２）−（１−ブチルオキシカルボニル）−２，３−ジアミノプロピオネート（ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）；ＳＲ  １２１５６６Ａ（３−［Ｎ−｛４−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］−１，３−チアゾール−２−イル｝−Ｎ−（１−カルボキシメチルピペリド−４−イル）アミノールプロピオン酸、トリヒドロクロリド）；ＦＫ４１９（（Ｓ）−２−アセチルアミノ−３−［（Ｒ）−［１−［３−（ピペリジン−４−イル）プロビオニル］ピペリジン−３−イルカルボニル］アミノ］プロピオン酸三水和物）；クロピドグレル；プラスグレル；カングレロール（ｃａｎｇｒｅｌｏｒ）；ＡＺＤ６１４０（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＭＲＳ  ２３９５（２，２−ジメチル−プロピオン酸３−（２−クロロ−６−メチルアミノプリン−９−イル）−（２−（２，２−ジメチル−プロピオニルオキシメチル）−プロピルエステル）；Ｂｘ  ６６７（Ｂｅｒｌｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；Ｂｘ  ０４８（Ｂｅｒｌｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ダラプラディブ（ＳＢ  ４８０８４８）；ＳＢ‐４３５４９５（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ＳＢ‐２２２６５７（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ＳＢ‐２５３５１４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；アレファセプト、エファリズマブ、メトトレキサート、アシトレチン、イソトレチノイン、ヒドロキシ尿素、ミコフェノール酸モフェチル、スルファサラジン、６−チオグアニン、ドボネックス、タクロネックス（Ｔａｃｌｏｎｅｘ）、ベタメタゾン、タザロテン、水酸化クロロキン、スルファサラジン、エタネルセプト、アダリムマブ、インフリキシマブ、アバタセプト、リツキシマブ、トラスツズマブ、抗ＣＤ４５モノクローナル抗体ＡＨＮ−１２、ヨウ素−１３１抗Ｂ１抗体（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐ．）、抗ＣＤ６６モノクローナル抗体ＢＷ  ２５０／１８３（ＮＣＩ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  Ｇｅｎｅ��ａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、抗ＣＤ４５モノクローナル抗体（ＮＣＩ，Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、抗体抗ａｎｂ３インテグリン（ＮＣＩ）、ＢＩＷ−８９６２（ＢｉｏＷａ  Ｉｎｃ．）、抗体ＢＣ８（ＮＣＩ）、抗体ｍｕＪ５９１（ＮＣＩ）、インジウム  Ｉｎ  １１１モノクローナル抗体ＭＮ−１４（ＮＣＩ）、イットリウムＹ  ９０モノクローナル抗体ＭＮ−１４（ＮＣＩ）、Ｆ１０５モノクローナル抗体（ＮＩＡＩＤ）、モノクローナル抗体ＲＡＶ１２（Ｒａｖｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＡＴ−１９２（ヒト抗−ＴＧＦ−Ｂｅｔａ１モノクローナル抗体，Ｇｅｎｚｙｍｅ）、抗体３Ｆ８（ＮＣＩ）、１７７Ｌｕ−Ｊ５９１（Ｗｅｉｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ＴＢ−４０３（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ））、アナキンラ、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、レフルノミド、ｄ−ペニシラミン、アミトリプチリンまたはノルトリプチリン、クロラムブシル、ナイトロジェンマスタード、プラステロン、ＬＪＰ  ３９４（ａｂｅｔｉｍｕｓｓｏｄｉｕｍ）、ＬＪＰ１０８２（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、エクリズマブ、ベリムマブ（ｂｅｌｉｂｕｍａｂ）、ｒｈｕＣＤ４０Ｌ（ＮＩＡＩＤ）、エプラツズマブ、シロリムス、タクロリムス、ピメクロリムス、サリドマイド、抗胸腺細胞グロブリン−ウマ（Ａｔｇａｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｕｐｊｏｈｎ）、抗胸腺細胞グロブリン−ウサギ（サイモグロブリン、Ｇｅｎｚｙｍｅ）、ムロモナブ−ＣＤ３（ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｒｐｈａｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リルゾール、クラドリビン、ナタリズマブ、インターフェロンベータ−１ｂ、インターフェロンベータ−１ａ、チザニジン、バクロフェン、メサラジン、アサコール、ペンタサ、メサラミン、バルサラジド、オルサラジン、６−メルカプトプリン、ＡＩＮ４５７（抗ＩＬ−１７モノクローナル抗体、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、テオフィリン、Ｄ２Ｅ７（Ｋｎｏｌｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのヒト抗ＴＮＦ  ｍＡｂ）、メポリズマブ（抗−ＩＬ−５抗体，ＳＢ  ２４０５６３）、カナキヌマブ（抗−ＩＬ−１ベータ抗体，ＮＩＡＭＳ）、抗−ＩＬ−２受容体抗体（ダクリズマブ、ＮＨＬＢＩ）、ＣＮＴＯ  ３２８（抗ＩＬ−６モノクローナル抗体，Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、ＡＣＺ８８５（完全にヒト抗インターロイキン−１ベータモノクローナル抗体，Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＣＮＴＯ１２７５（完全にヒト抗−ＩＬ−１２モノクローナル抗体，Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、（３Ｓ）−Ｎ−ヒドロキシ−４−（｛４−［（４−ヒドロキシ−２−ブチニル）オキシ］フェニル｝スルホニル）−２，２−ジメト−ｈｙｌ−３−チオモルホリンカルボキサミド（アプラタスタット（ａｐｒａｔａｓｔａｔ））、ゴリムマブ（ＣＮＴＯ  １４８）、オネルセプト（Ｏｎｅｒｃｅｐｔ）、ＢＧ９９２４（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、セルトリズマブペゴル（ＣＤＰ８７０，ＵＣＢ  Ｐｈａｒｍａ）、ＡＺＤ９０５６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＡＺＤ５０６９（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＡＺＤ９６６８（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＡＺＤ７９２８（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＡＺＤ２９１４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＡＺＤ６０６７（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＡＺＤ３３４２（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＡＺＤ８３０９（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、［（１Ｒ）−３−メチル−１−（｛（２Ｓ）−３−フェニル−２−［（ピラジン（ｐｙｒａｚｉｎ）−２−イルカルボニル）アミノ］プロパノイル｝アミノ）ブチル］ボロン酸（ボルテゾミブ）、ＡＭＧ−７１４（抗ＩＬ１５ヒトモノクローナル抗体、Ａｍｇｅｎ）、ＡＢＴ−８７４（抗ＩＬ−１２モノクローナル抗体，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ）、ＭＲＡ（トシリズマブ、抗ＩＬ−６受容体モノクローナル抗体，Ｃｈｕｇａｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ＣＡＴ−３５４（ヒト抗インターロイキン１３モノクローナル抗体，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、アスピリン、サリチル酸、ゲンチジン酸、サリチル酸コリンマグネシウム、サリチル酸コリン、サリチル酸コリンマグネシウム、サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウム、サリチル酸ナトリウム、ジフルニサル、カプロフェン、フェノプロフェン、フェノプロフェンカルシウム、フルロビプロフェン（ｆｌｕｒｏｂｉｐｒｏｆｅｎ）、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナブトン（ｎａｂｕｔｏｎｅ）、ケトロラク（ｋｅｔｏｌｏｒａｃ）、ケトロラクトロメタミン、ナプロキセン、オキサプロジン、ジクロフェナク、エトドラク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、ｍｅｃｌｏｆｅｎａｍａｔｅ、メクロフェナム酸ナトリウム（ｍｅｃｌｏｆｅｎａｍａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ）、メフェナム酸、ピロキシカム、メロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、エトリコキシブ、ルミラコキシブ、ＣＳ−５０２（Ｓａｎｋｙｏ）、ＪＴＥ−５２２（Ｊａｐａｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｉｎｃ．）、Ｌ−７４５，３３７（Ａｌｍｉｒａｌｌ）、ＮＳ３９８（Ｓｉｇｍａ）、ベタメタゾン（Ｃｅｌｅｓｔｏｎｅ）、プレドニゾン（Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ）、アルクロメタゾン、アルドステロン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、シクレソニド、クロベタゾール、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコート、デオキシコルチコステロン、デソニド、デスオキシメタゾン、デスオキシコルトン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、フルクロロロン、フルドロコルチゾン、フルドロキシコルチド、フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルチン、フルオコルトロン、フルオロメトロン、フルペロロン、フルプレドニデン、フルチカゾン、ホルモコータル、ホルモテロール、ハルシノニド、ハロメタゾン、ヒドロコルチゾン、アセポン酸ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ  ａｃｅｐｏｎａｔｅ）、ヒドロコルチゾンブテプレート（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ  ｂｕｔｅｐｒａｔｅ）、酪酸ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ  ｂｕｔｙｒａｔｅ）、ロテプレドノール、メドリゾン、メプレドニゾン、メ���ルプレドニソロン、メチルプレドニソロンアセポネート（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ  ａｃｅｐｏｎａｔｅ）、フランカルボン酸モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾン、リメキソロン、チキソコルトール、トリアムシノロン、ウロベタゾール；シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン；シクロホスファミド、クロラムブシル、ビンクリスチン；ビンブラスチン、ビノレルビン；ビンデシン、アザチオプリン；メルカプトプリン、フルダラビン；ペントスタチン、クラドリビン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）；フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）；サイトシンアラビノサイド；メトトレキサート、トリメトプリム；ピリメタミン；ペメトレキセド；パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、イリノテカン；トポテカン；アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン；バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎｅ）；イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎｅ）；エピルビシン；ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン；トラスツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、フィナステリド；ゴセレリン；アミノグルテチミド、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾール、エキセメスタン、４−アンドロステン−３，６，１７−トリオン（「６−オキソ」）；１，４，６−アンドロスタトリエン−３，１７−ジオン（ＡＴＤ）；ホルメスタン；テストラクトン、ファドロゾール；またはそれらの組み合わせである。
【０３８１】
いくつかの実施形態では、第２の治療薬は抗生物質である。いくつかの実施形態において、第２の治療薬は抗菌剤である。いくつかの実施形態では、第２の治療薬は、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、ロラカルベフ、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム、シラスタチン、メロペネム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファレキシン、セファクロール、セファマンドール、セホキシチン、セフプロジル（defprozil）、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、セフトビプロール、テイコプラニン、バンコマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スペクチノマイシン、アズトレオナム、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリン、ピペラシリン、チカルシリン（ｔｉｃａｒｃｉｌｌａｎ）、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、マフェナイド、プロントジル、スルファセタミド、スルファメチゾール、スルファニミリミド（ｓｕｌｆａｎｉｍｉｌｉｍｄｅ）、スルファサラジン（ｓｕｌｆｓａｌａｚｉｎｅ）、スルフイソキサゾール（ｓｕｌｆｓｉｏｘａｚｏｌｅ）、トリメトプリム、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン（ｏｘｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、テトラサイクリン、アルスフェナミン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、エタンブトール、ホスホマイシン、フシジン酸、フラゾリドン、イソニアジド、リネゾリド、メトロニダゾール、ムピロシン、ニトロフラントイン、プラテンシマイシン、ピラジンアミド、キヌプリスチン（ｑｕｉｎｕｓｐｒｉｓｔｉｎ）／ダルホプリスチン、リファンピン、チニダゾール、および、これらの組み合わを含む。
【０３８２】
いくつかの実施形態において、第２の治療薬剤は、抗ウイルス薬剤である。いくつかの実施形態では、第２の治療薬は、アシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、アバカビル、アシクロビル、アデホビル（ａｄｆｏｖｉｒ）、アマンタジン、アンプレナビル、アルビドール（ａｒｂｉｄｏｌ）、アタザナビル、アトリプラ（ａｒｔｉｐｌａ）、ブリブジン、シドホビル、コンビビル、エドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、ホミビルセン（ｆｏｍｖｉｒｓｅｎ）、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、ガンシクロビル、ガーダシル、イバシタビン、イムノビル（ｉｍｕｎｏｖｉｒ）、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インテグラーゼ阻害剤、インターフェロンＩ型（例えば、ＩＦＮαおよびＩＦＮβ）、インターフェロンＩＩ型、インターフェロンＩＩＩ型を含む、インターフェロン、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド（ｌｏｖｉｒｉｄｅ）、ＭＫ−０５１８、マラビロク、モロキシジン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネクサバール（ｎｅｘａｖｉｒ）、ヌクレオシドアナログ、オセルタミビル、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、テノホビル、テノホビル  ジソプロキシル（ｄｉｓｏｐｒｏｘｉｌ）、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バルガンシクロビル、ビクリビロック、ビダラビン、ビラミジン（ｖｉｒａｍｉｄｉｎｅ）、ザルシタビン、ザナミビル、ジドブジン、および、これの組み合わせである。
【０３８３】
いくつかの実施形態において、第２の治療薬は抗真菌薬である。いくつかの実施形態では、第２の治療薬は、アモロルフィン（ａｍｒｏｌｆｉｎｅ）、ブテナフィン（ｕｔｅｎａｆｉｎｅ）、ナフチフィン、テルビナフィン、フルシトシン、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ポサコナゾール、ラブコナゾール、ボリコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、ミコナゾール、オキシコナゾール、スルコナゾール、テルコナゾール、チオコナゾール、ニッコマイシンＺ、カスポファンギン、ミカファンギン、アニデュラファンギン、アンフォテリシンＢ、リポソームニスタチン（ｎｙｓｔａｓｔｉｎ）、ピマリシン、グリセオフルビン、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、トルナフテート、ウンデシレン酸、クリオキノール、および、これらの組み合わせである。
【０３８４】
いくつかの実施形態において、第２の治療薬は抗寄生虫薬である。いくつかの実施形態では、第２の治療薬は、アミトラズ、アモスカネート、アベルメクチン、カルバドックス、ジエチルカルバマジン（ｄｉｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｉｚｉｎｅ）、ジメトリダゾール、ジミナゼン、イベルメクチン、マクロフィラリサイド、マラチオン、ミタバン（ｍｉｔａｂａｎ）、オキサムニキン、ペルメトリン、プラジカンテル、パモ酸ピランテル（ｐｒａｎｔｅｌ  ｐａｍｏａｔｅ）、セラメクチン、スチボグルコン酸ナトリウム、チアベンダゾール、および、それらの組み合わせである。
【０３８５】
細胞と組織を用いた組み合わせ
【０３８６】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、細胞、複数の細胞、または、組織と同時投与される。
【０３８７】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、治療用細胞と同時投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、組織移植片と同時投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、幹細胞移植と同時投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、臓器移植と同時投与される。
【０３８８】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、組織移植と同時に（例えば、同時に、本質的に同時に、または、同じ処置プロトコルで）投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、組織移植の前後に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体と組織移植片の投与間の時間は、医薬品の効能、可溶性、バイオアベイラビリティ、血漿半減期、および、動態プロフィールのような、それぞれの医薬品の特性に依存して、数分から数時間までの範囲である。いくつかの実施形態では、標的分子濃度の日周期の変化は、最適な投与間隔を決定する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体と第２の活性剤の投与間の時間は、約１時間未満、１日未満、１週間未満、または、１か月未満である。
【０３８９】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、組織移植と免疫抑制剤で同時投与される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、組織移植およびカルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリンまたはタクロリムス）；ｍＴＯＲ阻害剤（シロリムス；エベロリムス）；抗増殖性薬の剤（アザチオプリンまたはミコフェノール酸）；コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロンまたはヒドロコルチゾン）；モノクローナル抗−ＩＬ−２Ｒα受容体抗体（例えば、バシリキシマブまたはダクリズマブ）；ポリクローナル抗Ｔ細胞、抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）または抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ））；またはそれらの組み合わせと同時投与される。
【０３９０】
いくつかの実施形態では、組織は、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体で覆われる。いくつかの実施形態では、複数の幹細胞は、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体で覆われる。いくつかの実施形態では、臓器は、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体で覆われる。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３で組織を覆うことまたは本明細書で開示されたｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体による組織の被覆は、宿主免疫系によって影響を受けるのを防ぐ。
【０３９１】
いくつかの実施形態では、器官、組織、または、複数の細胞は、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体と接触さする。いくつかの実施形態では、器官、組織、または、複数の細胞は、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む組成物と接触する。いくつかの実施形態では、組成物は約７．０〜約７．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、組成物はｐＨ７．４を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、カリウム、マグネシウム、および、ラフィノースを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、アデノシン、グルタチオン、アロプリノール、および、ヒドロキシエチルデンプンの少なくとも１つをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体で補われたＵＷ溶液である。
【０３９２】
いくつかの実施形態では、器官、組織、または、複数の細胞は、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体と、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、約３６時間、または、約４８時間、接触する。いくつかの実施形態では、接触は、組織および血管条件付け（例えば、周囲温度未満）を保護する温度で生じる。いくつかの実施形態では、条件付けは４°Ｃである。
【０３９３】
医療装置の組み合わせ
【０３９４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、医療装置で同時投与される。いくつかの実施形態では、医療装置またはその一部は、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体と接触する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、本明細書で別に記載される医療装置またはその一部を覆うために用いられる。いくつかの実施形態において、医療装置と組み合わせる、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の投与は、移植された医療装置に対する炎症反応を減少させ、阻害し、または、防ぐ。いくつかの実施形態において、医療装置と組み合わせる、本明細書で開示されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の投与は、移植される医療装置上の微生物の成長（すなわち、長期的なバイオフィルム感染症）によって生成する、感染性のバイオフィルムの形成を減少させ、阻害し、または、防ぐ。典型的なこのようなバイオフィルムは、限定されないが、黄色ブドウ球菌などの細菌によって生成される。
【０３９５】
製品とキット
【０３９６】
本明細書で提供される製品は、パッケージ材料を含む。医薬品をパッケージ化する際に使用される包装材料は、当業者に周知である。薬学的な包装材料の例としては、限定されないが、ブリスターパック、瓶、チューブ、吸入器（例えば、加圧した定量吸入器（ＭＤＩ）、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、噴霧器（例えば、ジェットまたは超音波噴霧器）、および、他の単回呼吸用液体システム）、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、瓶、および、選択された製剤と所望の投与および処置に適した任意の包装材料が挙げられる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、インプラント、カテーテル、人工関節、ステント、バルブ、ナノ粒子、またはマイクロカプセルなどの医療装置に組み込まれ、適用され、該装置上でコーティングされる。
【０３９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物または医薬配合物は、キットとして提供される。キットは、随意に、取扱説明書、装置、および、追加の試薬（例えば、組成物の希釈および／または凍結乾燥したタンパク質の再構成のための、滅菌水または食塩水）、ならびに、方法を実施するためのチューブ、容器、およびシリンジの構成要素、などの１以上の構成要素を含んでいる。典型的なキットは、本明細書で提供される医薬組成物また医薬配合物、および、随意に、使用説明書、被験体に医薬組成物または医薬配合物を投与するための装置、被験体のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を検知するための装置、被験体から得られたサンプルのｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を検知するための装置、および、被験体に追加の治療薬を投与するための装置を含む。
【０３９８】
キットは随意に使用説明書を含み得る。使用説明書は、典型的には、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体、および、随意に、キットに含まれる他の成分、および、被験体の適切な状態、適切な投与量、投薬レジメン、および、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を投与する適切な投与方法を含む、投与方法を記載した実体のある表現を含んでいる。いくつかの実施形態では、説明書は、処置時間の持続期間にわたって被験体をモニターするためのガイダンスを含んでいる。
【０３９９】
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の医薬組成物、および、診断用のアイテムも含んでいる。例えば、そのようなキットは、被験体の選択されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の濃度、量、または活性を測定するためのアイテムを含んでいる。
【０４００】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を被験体に投与するための装置を含んでいる。いくつかの実施形態では、被験体に薬物を投与するための当該技術で知られていた様々な装置のうちのいずれも、本明細書で提供されるキットに含まれている。典型的な装置としては、限定されないが、吸入器（例えば、加圧した定量吸入器（ＭＤＩ）、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、噴霧器（例えば、ジェットまたは超音波噴霧器）、および、他の単回呼吸用液体システム）、皮下針、静脈注射針、カテーテル、および、点眼器のような液体ディスペンサーを含んでいる。典型的に、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはキットのｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を投与するための装置は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の投与の所望の方法と適合する。
【０４０１】
幹細胞培養物の拡張
【０４０２】
特定の実施形態において、本明細書で提供されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む基質上の単離した幹細胞を増殖させる方法が本明細書で開示される。本明細書に記載されるように、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、幹細胞の凝集を促し、細胞の分化を防ぎ、および、幹細胞マーカーの発現を保存する。
【０４０３】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の拡張は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）マーカー（例えば、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２（ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２）、Ｒｅｘ１（Ｚｆｐ４２）、ＳＳＥＡ４（段階特異的な胚抗原−４）、ＭＹＣ／ｃ−Ｍｙｃ、および、ＫＬＦ４、周皮細胞マーカー（例えば、ＮＧ２（ニューロン神経膠の抗原２／コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４））、ＰＤＧＦＲ−β（血小板由来増殖因子受容体Ｂ）、および、α−ＳＭＡ（α−平滑筋アクチン）、ならびに、血管新生マーカー（例えば、ＣＤ１３３／２、ＦＬＫ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ２、Ｌｙ−７３）、ｖＷＦ（フォン・ヴィレブランド因子）、ＣＤ３４、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）、および、ＣＤ１４６の１つ以上の発現を保存する。いくつかの実施形態では、幹細胞マーカーの発現は、従来の方法、例えば、タンパク質発現分析（例えば、ウエスタンブロット、免疫蛍光検査、免疫組織化学検査、蛍光活性化細胞分類）、または、ｍＲＮＡ分析（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）あるいはノーザン）によって測定される。
【０４０４】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、培養細胞のＴＧＦ−βシグナル伝達を抑制する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、培養された幹細胞のＴＧＦ−βシグナル伝達を抑制する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達の抑制は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の不在下と比較して、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の存在下における、細胞中のｐＳＭＡＤ２／３シグナル伝達のようなＴＧＦ−β細胞シグナル伝達経路における、または、α平滑筋形成における、１つ以上のタンパク質またはマーカーの活性または発現の減少を指す。
【０４０５】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、培養細胞でＢＭＰシグナル伝達を引き起こす。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、培養された幹細胞でＢＭＰシグナル伝達を引き起こす。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達の抑制は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の不在下と比較して、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の存在下における、細胞中の、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、および、ｐＳＭＡＤ１／５／８などのＢＭＰシグナル伝達経路での１つ以上のタンパク質の活性または発現の増加を指す。
【０４０６】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、成体幹細胞である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、胎児の幹細胞である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、誘導多能性／前駆体幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
【０４０７】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、間葉系幹細胞である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、脂肪幹細胞（ＡＳＣ）である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、臍の緒の幹細胞である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、羊膜幹細胞である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、角膜縁ニッチ細胞または角膜縁上皮前駆細胞などの各膜縁細胞である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、内皮幹細胞である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、単離した幹細胞は骨髄幹細胞である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、神経幹細胞である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、内皮前駆細胞である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、骨格筋幹細胞である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、乳房幹細胞である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、腸の幹細胞である。
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、誘導多能性／前駆体幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、生体の分化したまたは部分的に分化した細胞に由来する、誘導多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、繊維芽細胞に由来する誘導多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、ヒトの角膜の繊維芽細胞に由来する誘導多能性幹細胞である。
【０４０８】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、胎盤組織または臍の緒の組織に由来する、胎児の組織である。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、羊膜に由来する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、脂肪組織に由来する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、角膜縁組織に由来する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、骨髄に由来する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、内皮組織に由来する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、角膜縁組織に由来する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、神経組織に由来する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、角膜縁組織に由来する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、骨格筋に由来する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、皮膚に由来する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、消化器系に由来する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、膵臓に由来する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、肝臓に由来する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、嗅粘膜に由来する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、生殖細胞集団に由来する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、血液に由来する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で培養された単離した幹細胞は、臍帯血に由来する。
【０４０９】
いくつかの実施形態では、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、羊膜または臍の緒から単離したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３である。いくつかの実施形態では、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、再構成されたＨＣ−ＨＡ複合体である。いくつかの実施形態では、ＨＡはＨＣに共有結合する。いくつかの実施形態では、ＩαＩのＨＣは重鎖１（ＨＣ１）である。いくつかの実施形態では、ＨＣ−ＨＡ複合体は、ペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）を含む。
【０４１０】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、小ロイシン豊富なプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）を含む。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型のＳＬＲＰを含む。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、ＰＴＸ３、および、小ロイシン豊富なプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）を含む。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なプロテオグリカンは、デコリンおよびバイグリカンのような、Ｉ型のＳＬＲＰの中から選択される。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なプロテオグリカンは、フィブロモジュリン、ルミカン、ＰＲＥＬＰ（プロリンアルギニン豊富な末端を有するロイシン豊富なタンパク質）、ケラトカン、および、オステオアドへリンのようなＩＩ型のＳＬＲＰの中から選択される。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なプロテオグリカンは、エピピカンとオステオグリシンのようなＩＩＩ型のＳＬＲＰの中から選択される。
【０４１１】
いくつかの実施形態では、単離した幹細胞は、固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３を含む基質上で増殖する。いくつかの実施形態では、固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、１つ以上の小ロイシン豊富なプロテオグリカン類（ＳＬＲＰ）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＬＲＰは、ビクニン、デコリン、バイグリカン、および、オステオアドへリンの中から選択される。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なタンパク質はグリコサミノグリカンを含む。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なプロテオグリカンは硫酸ケラタンを含む。
【０４１２】
いくつかの実施形態では、単離した幹細胞は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む培地で増殖する。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、１つ以上の小ロイシン豊富なプロテオグリカン類（ＳＬＲＰ）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＬＲＰは、ビクニン、デコリン、バイグリカン、および、オステオアドへリンの中から選択される。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なタンパク質はグリコサミノグリカンを含む。いくつかの実施形態では、小ロイシン豊富なプロテオグリカンは硫酸ケラタンを含む。いくつかの実施形態では、培地は、胚性幹細胞培地、修飾された胚性幹細胞培地、補充したホルモン上皮培地、および／または、その組み合わせである。いくつかの実施形態において、培地は、１またはそれ以上の増殖因子で補充される。いくつかの実施形態では、培地は、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、および／または、ＬＩＦで補充される。いくつかの実施形態では、培地は、Ｒｈｏ−に関連するキナーゼの阻害剤（ＲＯＣＫ阻害剤）で補充される。
【０４１３】
多能性の誘導と維持
【０４１４】
特定の実施形態において、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む基質上で、細胞の多能性を誘導する、または、幹細胞の多能性を維持する方法が、本明細書で開示されている。本明細書に記載されるように、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、幹細胞マーカー発現の維持を助け、幹細胞集団の連続的な通路一帯で細胞の分化を防ぐ。加えて、本明細書に記載されるように、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、分化したまたは一部分化した細胞集団で幹細胞の特性の誘導を促す。
【０４１５】
特定の実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、分化したまたは一部分化した細胞の多能性を促すまたは誘導する。特定の実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の不在下で培養された分化したまたは一部分化した細胞と比較して、分化したまたは一部分化した細胞の多能性を促すまたは誘導する。典型的な方法では、分化細胞または一部分化した細胞は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む基質上で培養され、それによって、多能性は細胞内で誘導される。
【０４１６】
特定の実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、幹細胞の多能性を促すまたは誘導する。特定の実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の不在下で培養された幹細胞と比較して、幹細胞の多能性を促すまたは誘導する。典型的な方法では、幹細胞は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む基質上で培養され、それによって、多能性は幹細胞内で維持される。典型的な方法では、幹細胞は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む基質上で培養され、それによって、多能性は幹細胞内で誘導される。
【０４１７】
タンパク質転写因子を用いる遺伝子の再プログラミングを用いて、胚性幹細胞と同等の多能性幹細胞は、ヒトの成人の皮膚組織から得られた。ｉＰＳＣ細胞は一般に、成人の繊維芽細胞のような非多能性細胞に、特定の幹細胞結合型の遺伝子を遺伝子導入することによって得られる。遺伝子導入は、一般に、多能性遺伝子が遺伝子発現のプロモーターに動作可能に結合しているレトロウイルスのようなウイルス・ベクターによって達成される。多能性幹細胞の産生にとって不可欠な４つの重要な多能性遺伝子は、Ｏｃｔ−３／４  （Ｐｏｕ５ｆ１），  Ｓｏｘ２，  ｃ−Ｍｙｃ，  ａｎｄ  Ｋｌｆ４である。他の遺伝子は誘導の効率を高めることができる。いくつかの研究では、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、および、Ｌｉｎ２８は、多能性を誘導するために使用されてきた。特定の例においては、３−４週間後に、少数のトランスフェクトされた細胞は、多能性幹細胞に形態学的に、かつ、生化学的に類似するようになり始め、形態学的選択、倍加時間、あるいは、レポーター遺伝子と抗生物質の選択によって、一般的に単離される。
【０４１８】
いくつかの実施形態では、本質的な転写因子ＯＣｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、および、Ｋｌｆ４の４つよりも少ない異種の発現を用いて、分化したまたは一部分化した細胞の多能性を誘導するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、多能性を誘導するための方法が提供され、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用は、異種遺伝子の導入により、ＯＣｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、および、Ｋｌｆ４の少なくとも１つを発現する分化したまたは一部分化した細胞の多能性の誘導を高める。いくつかの実施形態では、多能性を誘導するための方法が提供され、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用は、異種遺伝子の導入により、ＯＣｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、および、Ｋｌｆ４の中から選択された１つ、２つ、または、３つの因子を発現する分化したまたは一部分化した細胞の多能性の誘導を高める。いくつかの実施形態では、多能性を誘導するための方法が提供され、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用は、異種遺伝子の導入により、ＯＣｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）を発現する分化したまたは一部分化した細胞の多能性の誘導を高める。いくつかの実施形態では、多能性を誘導するための方法が提供され、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用は、異種遺伝子の導入により、Ｓｏｘ２を発現する分化したまたは一部分化した細胞の多能性の誘導を高める。いくつかの実施形態では、多能性を誘導するための方法が提供され、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用は、異種遺伝子の導入により、ｃ−Ｍｙｃを発現する分化したまたは一部分化した細胞の多能性の誘導を高める。いくつかの実施形態では、多能性を誘導するための方法が提供され、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の使用は、異種遺伝子の導入により、Ｋｌｆ４を発現する分化したまたは一部分化した細胞の多能性の誘導を高める。
【０４１９】
いくつかの実施形態では、分化したまたは一部分化した細胞は、Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、および、Ｋｌｆ４の１つ以上を発現するために形質導入され、および、形質導入された細胞は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む基質上で培養される。いくつかの実施形態では、分化したまたは一部分化した細胞は、Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、および、Ｋｌｆ４の少なくとも１つを発現するために形質導入され、および、形質導入された細胞は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む基質上で培養される。いくつかの実施形態では、分化したまたは一部分化した細胞は、Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、および、Ｋｌｆ４の１つ、２つ、または、３つを発現するために形質導入され、および、形質導入された細胞は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む基質上で培養される。いくつかの実施形態では、分化したまたは一部分化した細胞は、Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、および、Ｋｌｆ４を発現するために形質導入され、および、形質導入された細胞は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む基質上で培養される。いくつかの実施形態では、分化したまたは一部分化した細胞は、Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）を発現するために形質導入され、および、形質導入された細胞は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む基質上で培養される。いくつかの実施形態では、分化したまたは一部分化した細胞は、ＳＯＸ２を発現するために形質導入され、および、形質導入された細胞は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む基質上で培養される。いくつかの実施形態では、分化したまたは一部分化した細胞は、ｃ−Ｍｙｃを発現するために形質導入され、および、形質導入された細胞は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む基質上で培養される。いくつかの実施形態では、分化したまたは一部分化した細胞は、Ｋｌｆ４を発現するために形質導入され、および、形質導入された細胞は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体を含む基質上で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、Ｎａｎｏｇ、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、および、β−カテニンなどの１つ以上の追加の遺伝子を発現するために形質導入される。
【０４２０】
いくつかの実施形態では、分化したまたは一部分化した細胞は、Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、および、Ｋｌｆ４の１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子を含むウイルス・ベクターで形質導入される。いくつかの実施形態では、分化したまたは一部分化した細胞は、Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、および、Ｋｌｆ４の１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子を含む２以上のウイルス・ベクターで形質導入される。
【０４２１】
誘導、誘導多能性幹細胞の培養と維持、および、幹細胞マーカーの評価と様々な細胞系統の誘導を含む誘導幹細胞の多能性の評価のための様々な方法は、当外技術分野では周知であり、例えば、米国特許第７，６８２，８２８号、８，０４８，９９９号、８，２１１，６９７号、７，９５１，５９２号、および、米国特許公報第２００９／０１９１１５９号と２０１０／０００３７５号に述べられていた方法を含んでいる。
【０４２２】
いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の不在下で培養された形質導入された細胞と比較して、形質導入された細胞の多能性の誘導にかかる時間を減少させる。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の不在下で培養された複数の形質導入された細胞と比較して、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の不在下で培養された形質導入された細胞と比較して、形質導入された細胞の集団中において多能性が誘導された形質導入された細胞の割合を増加させる。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、形質導入された細胞における多能性の値を高める。いくつかの実施形態では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、形質導入された細胞の多能性の誘導に必要な異種の転写因子の数を減少させる。
【０４２３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、分化した細胞、幹細胞、またはｉＰＳＣのＴＧＦβ１シグナル伝達を阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、分化した細胞、幹細胞、またはｉＰＳＣのＳＭＡＤ２またはＳＭＡＤ３の核移行を阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、分化した細胞、幹細胞、またはｉＰＳＣのα平滑筋アクチン形成を阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、分化した細胞、幹細胞、またはｉＰＳＣのＢＭＰ４シグナル伝達を活性化する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、分化した細胞、幹細胞、またはｉＰＳＣのＢＭＰ６シグナル伝達を活性化する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、分化した細胞、幹細胞、またはｉＰＳＣの胚細胞マーカーの発現を誘導する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体は、分化した細胞、幹細胞、またはｉＰＳＣのｃ−ｍｙｃ、ＫＬＦ−４、Ｎａｎｏｇ、ネスチン、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ−１、Ｓｏｘ−２、および、ＳＳＥＡ−４の発現を誘導する。
【実施例】
【０４２４】
以下の実施例は説明目的のためだけに含まれたものにすぎず、請求される内容の範囲を制限することは意図していない。
実施例１．ヒトの羊膜抽出物（ＡＭＥ）からの天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ｈａ／ＰＴＸ３）複合体の精製
【０４２５】
羊膜抽出物（ＡＭＥ）とＡＭ粉末（ＡＭＰ）の調製
【０４２６】
Ｂｉｏ−ｔｉｓｓｕｅ（フロリダ州マイアミ）から入手した冷凍のヒトＡＭをＰＢＳで２−３回洗浄して、貯蔵培地を取り除いた。ＡＭＥを調製するために、ＡＭを無菌の５０ｍｌの遠心分離管に移し、５０００ｇで５分間、４°Ｃで遠心分離機にかけて余分な流体を取り除いた。ＡＭの重さを量り（〜１０ｍｇ／ｃｍ２）、１００ｍｍまたは１５０ｍｍの無菌のペトリ皿に移す。使い捨てのメスでに薄く切って小片にし、ＰＢＳ中でＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒ（オクラホマ州バートルズビルのＢｉｏｓｐｅｃＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ）で均質化する前に、２０分間、液体窒素容器の空気相で凍らせる。ホモジネートを３０分間４°Ｃで混合し、３０分間４８，０００のｇで遠心分離機にかけた。上清を集め、ＡＭＥと指定し、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の精製に使用するか、−８０°Ｃで保存した。
【０４２７】
凍結乾燥しＡＭ粉末（ＡＭＰ）を調製するために、−８０°Ｃの冷凍装置で凍らせたＡＭを、ベンチトップの凍結乾燥装置に移し、１６時間（Ｆｒｅｅｚｏｎｅ４．５，Ｌａｂｃｏｎｃｏ、ミズーリ州カンザス）凍結乾燥させた。その後、凍結乾燥させたＡＭを、Ｍｉｘｅｒ  Ｍｉｌｌ（Ｒｅｔｓｃｈ、ペンシルベニア州ニュータウン）によってそのマトリックス形状（ＡＭＰ）に微粒子化した。さらなる分析のために、ＡＭＰを−２０°Ｃ以下で保存した。
【０４２８】
天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体の精製
【０４２９】
ＡＭＥを１．３５ｇ／ｍｌの初期密度でＣｓＣｌ／４ＭグアニジンＨＣｌ混合物中に溶かし、１５°Ｃで４８時間、１２５，０００ｇで遠心分離機にかけた。合計１５の画分（０．８ｍｌ／画分）をそれぞれの管の上部と底部から採取した。それぞれの画分の総タンパク濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキットで測定した。それぞれの画分のヒアルロナン（ＨＡ）濃度を、Ｃｏｒｇｅｎｉｘ（コロラド州ウエストミンスター）のＥＬＩＳＡベースのＨＡ定量テストキットによって測定した（図１Ａ）。ＨＡを含むが検知可能なタンパク質を含まない画分＃８−１５をプールし、第２の超遠心分離に使用した。プールした画分（最初にＡＭと指定したもの）のサンプルを分析のために保存した。プールした画分を、１．４０ｇ／ｍｌの当初密度でＣｓＣｌ／４ＭグアニジンＨＣｌで調節し、遠心分離機にかけ、上に記載されているのと同じ方法で分画した（図１Ｂ）。ＨＡを含むが検知可能なタンパク質を含んでいなかった画分＃３−１５をプールし（第２のＡＭと呼ぶ）、蒸留水に対して透析を行い、ＣｓＣｌおよびグアニジンＨＣｌを取り除いた。ＡＭＰについて上記と同じ方法で透析物を凍結乾燥させた。代替的に、透析物を、１時間０°Ｃで、１．３％（ｗ／ｖ）の酢酸カリウムを含む９５％（ｖ／ｖ）のエタノールの３容量と混合した。１５，０００のｇの遠心分離の後、ペレットを７０％（ｖ／ｖ）のエタノールで洗浄し、再度、遠心分離機にかけた。ペレットを軽く空気乾燥させ、−８０°Ｃで保存した。粉末とペレットをｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体と呼んだ。
【０４３０】
いくつかの例において、プールしたサンプルを３または４回の超遠心分離にかけた。これらの超遠心分離において、画分＃７−１２だけをプールした。ＣｓＣｌ／４ＭグアニジンＨＣｌの当初の密度は１．４２ｇ／ｍｌである。３回または４回の超遠心分離の後、プールした画分＃７−１２を、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（第３）またはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（第４）と呼ぶ。
【０４３１】
１回目、２回目、３回目、または、４回目の超遠心分離の後のＡＭＥのプールした画分を、１時間２５°Ｃで０．０５ＮのＮａＯＨを用いてまたは用いずに、処理した。１回目、２回目、３回目、または、４回目の超遠心分離からプールした画分を、２時間６０°Ｃで２０ユニット／ｍｌのヒアルロニダーゼ（ＨＡａｓｅ）（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ｂｉｏｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，日本・東京）で消化した。
【０４３２】
その後、プールした画分からのサンプルと、ＮａＯＨおよびＨＡａｓｅで処理したサンプルを、０．５％のアガロースゲル上に置き、Ｓｔａｉｎｓ−ａｌｌ染色（図１Ｃ）による染色によって、または、ＩαＩ重鎖１（ＨＣ１）（図１Ｄと１Ｆ）、ペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）（図１Ｅと１Ｇ）、ＩαＩ重鎖２（ＨＣ２）（図１Ｈ）、ＩαＩ重鎖３（ＨＣ３）（図１Ｉ）、ビクニン（図１Ｊ）、ＴＮＦで刺激された遺伝子６（ＴＳＧ−６）（図１Ｋ）、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）（図１Ｌ）、または、ＩＧＦＢＰ  １−３およびＰＦ４（図１Ｍ）に対する抗体を使用するウエスタンブロットによって分析され、このうち、後者の２つは、ヒト血管新生アレイ（それぞれのアレイは５６の異なる血管新生タンパク質を含んでいる。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネソタ州ミネアポリス）を用いるタンパク質ドットアッセイを使用して分析された。簡潔に言えば、１．５ｍｌのヒトのＡＭ抽出物（２５μｇ／ｍｌ  ＨＡ）と精製されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２番目）（２５μｇ／ｍｌ  ＨＡ）を、４°Ｃで一晩、膜上にあらかじめコーティングした検出抗体とは別にインキュベートし、その後、第２の抗体を用いてインキュベートした。信号はＸ線膜に晒した化学発光の光で検知された。現像したＸ線フィルム上のアレイデータを、転送方式のスキャナーでフィルムをスキャンすることにより定量化し、アレイの画像ファイルを、ＩｍａｇｅＪ１．４６ソフトウェア（国立衛生研究所、メリーランド州ベテスダ）によって分析した。
【０４３３】
生化学的な特性評価によれば、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、ＩαＩとＰＴＸ３の重鎖１（ＨＣ１）に共有結合した高分子量ＨＡ（ＨＭＷ  ＨＡ）（図１Ｃ）からができている。ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３中のＨＣ１とＰＴＸ３の両方は、ヒアルロニダーゼ（ＨＡａｓｅ）またはＮａＯＨ（図１ＤＧ）の処置の後にのみ解放され、ＨＣ１が、報告されるように、エステル結合によってＨＡに結合していることを証明している。
【０４３４】
対照的に、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、ＨＣ２（図１Ｈ）、ＨＣ３（図１Ｉ、ＮａＯＨの処理の後にのみ検知される１２ｋＤａまでの帯域は非特異的である可能性が高い）、ビクニン（図１Ｊ）、ＴＳＧ−６（図１Ｋ）、および、ＴＳＰ−１（図１Ｌ）を含まない。インスリン様増殖因子結合タンパク質１−３（ＩＧＦＢＰ１−３）および血小板第４因子（ＰＦ４）は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２番目）でタンパク質ドットアッセイ（ＥＬＩＳＡに類似）によって検知され（図１Ｊ）、これらが依然としてｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（４番目）にあるかどうかは不明のままである。
【０４３５】
実施例２．共有結合による固定化したＨＡ（ｉＨＡ）の調製
【０４３６】
ＨＭＷ  ＨＡ（Ｈｅａｌｏｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ，カリフォルニア州サンタアナ）またはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２番目）からの一連のヒアルロナン（ＨＡ）量（０、０．２５、０．５、１．０、２．５、５、１０、および、２５μｇ／ウェル）を、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（０．１８４ｍｇ／ｍｌ）とＥＤＡＣ（０．１２３ｍｇ／ｍｌ）（両方ともイリノイ州ロックフォードのＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのものである）を含む結合溶液に加え、Ｃｏｖａｌｉｎｋ（登録商標）−ＮＨ  ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）で４°Ｃで１６時間インキュベートした。８Ｍのグアニジン−ＨＣｌ（ＧｎＨＣｌ）の３度洗浄した後、ＰＢＳで洗浄し、ＨＭＷ  ＨＡまたはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３からの結合したＨＡを、メーカーの説明書によってＣｏｒｇｅｎｉｘ（コロラド州ウエストミンスター州）からＨＡ  ＥＬＩＳＡによって定量的に測定した（図６Ａ）。ＡＭから精製されたＨＭＷ  ＨＡおよびｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、用量依存的であり、Ｃｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ  ９６のウェルの表面に共有結合する。結果として生じたｉＨＡまたは固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３を、８ＭのグアニジンＨＣｌによる洗浄剤に対する耐性を備えている。ＨＭＷ  ＨＡまたはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３のＨＡは、２μｇ／ウェルのＨＡ等価入力で最大に結合した（図６Ａ）。
【０４３７】
結合効率を測定するために、ＨＭＷ  ＨＡまたはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３からのからＨＡを、９６ウェルプレートのウェルごとのＣｏｖａｌｉｎｋ（登録商標）−ＮＨに結合し、ＨＭＷ  ＨＡまたはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３からの結合していないまたは結合したＨＡを、ＨＡ  ＥＬＩＳＡによって測定した（図６Ｂ）。ＨＭＷ  ＨＡまたはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３からの２μｇのＨＡを、Ｈ２Ｏ中のＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ（０．１８４ｍｇ／ｍｌ）とＥＤＡＣ（０．１２３ｍｇ／ｍｌ）［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド］を含む結合溶液に加え、Ｃｏｖａｌｉｎｋ（登録商標）−ＮＨ  ９６ウェルプレートで、４°Ｃで１６時間インキュベートした（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，イリノイ州ロックフォード）。洗浄溶液（プールした）中のウェルに結合したまたは結合していないＨＡは両方とも、メーカーの説明書に従ってＣｏｒｇｅｎｉｘ（コロラド州ウエストミンスター州）からのＨＡ  ＥＬＩＳＡによって測定した。結合したまたは結合していない状態のそれぞれのウェル中のＨＶの合計量は、結合の効率または結合していない割合を計算するために、入力されたＨＡ量（２μｇ／ウェル）によって分割される。平均結合効率は、ＨＭＷ  ＨＡに関して７０．５±１３．４％であり、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３に関して６９．０±５．７％であると測定された（図６Ｂ）。したがって、２μｇ／ウェルの入力ＨＡはおよそ１．４μｇのｉＨＡをもたらす。
実施例３．精製された天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ｈａ／ＰＴＸ３）複合体の活性
【０４３８】
固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３に対するＬＰＳで刺激されたマクロファージの結合
【０４３９】
ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ニューヨーク州グランドアイランド）中のＲＡＷ２６４．７細胞（２．５×１０５細胞／ｍｌの１００μｌ）［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ），バージニア州マナサス］を、固定化したＨＡ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ，カリフォルニア州サンタアナ、２μｇ／ウェル）、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２μｇ／ウェル）、または、ＰＢＳ対照を含む９６ウェルプレート中に播種し、リポ多糖類（ＬＰＳ）（１μｇ／ｍｌ）（ｎ＝３）で刺激した［ＬＰＳ−ＥＢ  Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ，  ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ］。Ｃｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ  ９６の表面上でのＨＡおよびｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の固定化は、上に記載されるのと同じように行われた。簡潔に言えば、Ｃｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨの９６ウェルプレートを２時間７０％のアルコールで殺菌し、蒸留水で３度洗浄し、９６ウェルプレート（ＰＢＳ対照ウェルはＨＡとｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３を除いてすべての試薬を含む）毎に２０μｇ／ｍｌのＨＡまたはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３を含む蒸留水中で、０．１８４ｍｇ／ｍｌのＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，イリノイ州ロックフォード）１００μｌと、０．１２３ｍｇ／ｍｌのＥＤＡＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，イリノイ州ロックフォード）と加えた。結合溶液を取り除く前に、プレートを４°Ｃで夜通しまたは２５°Ｃで２時間インキュベートし、２ＭのＮａＣｌと５０ｍＭ  のＭｇＳＯ４をを含有するＰＢＳで３度洗浄し、その後、ＰＢＳで３回洗浄した。９０分のインキュベーション後、結合しなかった細胞を取り除き、結合した細胞を撮影し、ＣｙＱｕａｎｔアッセイによって数えた（図２Ａ）。対照のウェルと比較して、固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３を含むウェルについて、ＬＰＳで刺激されたマクロファージの結合の３倍以上の増加が観察された。固定化したＨＡを含むウェルは、ＬＰＳで刺激されたマクロファージの結合を阻害した。
【０４４０】
その後、結合したＬＰＳで刺激されたマクロファージの細胞生存率を調べた。上に記載されたように、ＬＰＳで刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞（２．５×１０５細胞／ｍｌの１００μｌ）を、２４時間、固定化したＰＢＳ対照、ＨＡ、またはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上でＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ中でインキュベートした（ｎ＝３）。インキュベーション後、結合したマクロファージの細胞生存率をＭＴＴアッセイによって測定した。これらの固定化した基質上の細胞の細胞生存率に何ら有意差（すべてのｐ値＞０．０５）は観察されなかった（図２Ｂ）。
【０４４１】
その後、固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３に対するＬＰＳで刺激されたマクロファージの結合を阻害する遮断抗体とペプチドの能力を調べた。ＲＡＷ２６４．７細胞（２．５ｘ１０５細胞／ｍｌの濃度）を、３０分間、氷上で、アイソタイプ対照抗体［ラットＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）、マウスＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）、または、アルメニアンハムスターＩｇＧ（２０μｇ／ｍｌ）］、あるいは、ＲＧＤ対照ペプチド（１ｍｇ／ｍｌ）と一緒に、ＣＤ４４（１０μｇ／ｍｌ）、ＴＬＲ２（１０μｇ／ｍｌ）、ＴＬＲ４（１０μｇ／ｍｌ）、インテグリンαｖ（２０μｇ／ｍｌ）、β１（２０μｇ／ｍｌ）、β２（２０μｇ／ｍｌ）、または、β３（２０μｇ／ｍｌ）、または、ＲＧＤペプチド（ＳＤＧＲＧ、ＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＳ、すべて１ｍｇ／ｍｌ）に対する遮断抗体を含むＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ中で、あらかじめインキュベートした（ｎ＝３）。（ＣＤ４４とラットＩｇＧに対する抗体は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手し、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびマウスＩｇＧに対する抗体はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手し、インテグリンαｖ、β１、β２、β３、および、アルメニアンハムスターＩｇＧに対する抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手し、ＲＧＤペプチドはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から入手した）。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を加えた後に、固定化したＨＡ（２μｇ／ウェル）、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２μｇ／ウェル）、または、ＰＢＳ対照を含むプレートに細胞を播種し、９０分間インキュベートした（ｎ＝３）。インキュベーション後、結合しなかった細胞を取り除き、結合した細胞を撮影し、ＣｙＱｕａｎｔアッセイによって数えた（図２Ｃ）。その結果は、ＣＤ４４とＴＬＲ４に対する抗体が、ＬＰＳで刺激されたマクロファージの結合を著しく阻害したことを示しており、これらの受容体が固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３へのＬＰＳで刺激されたマクロファージの結合に関与することを実証している。
【０４４２】
ＬＰＳ刺激したマクロファージの極性化
固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３によるＭ１またはＭ２の表現型へのＬＰＳ刺激したマクロファージの極性化を、ＲＮＡおよびタンパク質の分析によってＭ１およびＭ２のマーカーをコード化する遺伝子の発現を決定することによって検査した。
【０４４３】
ＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ中でのＲＡＷ２６４．７細胞（１００μｌの２．５×１０５細胞／ｍｌ）を、固定化したＨＡ（２μｇ／ウェル）、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２μｇ／ウェル）またはＰＢＳ対照を含有している９６ウェルのプレートにおいて播種し、４時間（ｎ＝３）ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で刺激した。インキュベーション後に、非付着性細胞を取り除き、総ＲＮＡを付着性細胞から抽出した。Ｍ１マーカー（腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）（Ｍｍ００４４３２５８＿ｍ１）およびインターロイキン１２サブユニットｐ４０（ＩＬ−１２ｐ４０）（Ｍｍ００４３４１６５＿ｍ１））およびＭ２マーカー（インターロイキン１０）（ＩＬ−１０）（Ｍｍ００４３９６１４＿ｍ１）、アルギナーゼ−１（アルギニン−１）（Ｍｍ００４７５９８８＿ｍ１）、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＳＦ１４（Ｍｍ００４４４５６７＿ｍ１、およびスフィンゴシンキナーゼ−１（ＳＰＨＫ１）（Ｍｍ００４４８８４＿ｇ１））のｍＲＮＡ発現を、内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１）を用いて定量的リアルタイムＰＣＲによって測定した。リアルタイムＰＣＲを、７３００ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）上で行った。増幅プログラムは、９５℃での１０分の初期活性、その後の４０サイクルの９５℃での１５秒の変性、および６０℃での１分のアニーリングおよび伸展（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）から構成された。相対的な遺伝子発現データを、相対的なＣＴ方法（ΔΔＣＴ）によって分析した。すべてのアッセイを、３回繰り返して行い；結果を、内部標準としてＧＡＰＤＨによって正常化した。すべてのプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのものであった。対照と比較した、Ｍ２マーカーＩＬ−１０、Ａｒｇ−１、ＬＩＧＨＴ、およびＳＰＨＫ１の発現の著しい誘発を、ＨＡではなく、固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３に付着した細胞中で観察した（図３のＡ）。さらに、両方のＭ１マーカー、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２ｐ４０の発現は減少した。
【０４４４】
分泌されたＴＮＦ−αタンパク質の量を、上に記載されるような（ｎ＝３）、固定化したＨＡ（２μｇ／ウェル）、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２μｇ／ウェル）またはＰＢＳ対照を含有しているプレート上のＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ中で４時間、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）刺激で処置した細胞の培養上清において測定した。ＴＮＦ−αの量を、製造業者のプロトコル（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）に従ってＥＬＩＳＡにより測定した。
【０４４５】
減少した量のＴＮＦ−αを、ＰＢＳ対照と比較して、固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３を含有しているプレート上でインキュベートされた細胞の細胞培養上清において観察した（図３のＢ）。ＴＮＦ−αの量の変化は、固定化したＨＡプレート上で観察されなかった。
【０４４６】
ＩＲＦ−５の高い発現は、Ｍ１マクロファージの特徴である。ＩＲＦ−５は、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ３５およびＩＬ−２３ｐ１９をコード化する遺伝子の転写を直接活性化し、ＩＬ−１０をコード化する遺伝子を抑制する。ＩＲＦ−５タンパク質の発現および固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上のその細胞内局在（ｃｙｔｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を検査した。固定化した対照またはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で播種した細胞を、ＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ中で４時間または２４時間、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で刺激した。細胞可溶化物（２４時間のＬＰＳ刺激）中のＩＲＦ−５タンパク質の発現を、ウェスタンブロットによって検出した（図３のＣ、左）（一次抗体：アブカム（ａｂｃａｍ），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ；二次抗体、ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）。並列実験では、細胞（４時間のＬＰＳ刺激）を、抗ＩＲＦ−５抗体で固定して免疫染色した。ＩＲＦ−５の細胞内局在を、共焦点免疫蛍光顕微鏡検査法（ＬＳＭ ７００ 共焦点顕微鏡，Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（図３のＣ、右）によって検査した。固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、発現を減少させ、ＩＲＦ−５の核局在化を防いだ。これらの結果は、固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３によってＭ１表現型の抑制と一致している。
【０４４７】
活性化した好中球のアポトーシスおよびアポトーシス性好中球のマクロファージによる食作用
好中球を、製造業者の指示に従い、デキストラン密度［Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｐｏｌｙ（Ｒ）， Ｃｅｄａｒｌａｎｅ ＵＳＡ， Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ， ＮＣ］の遠心分離を使用して、正常ヒト末梢血から単離した。単離した好中球を、固定化したＨＡ（２μｇ／ウェル）、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２μｇ／ウェル）またはＰＢＳ対照上でＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）中の２×１０６細胞／ｍｌで播種し、２４時間（ｎ＝３）、ＰＢＳ（休止）、Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ）（１μＭ）（Ｓｉｇｍａ− Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）またはＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で処置した。好中球のアポトーシスを、製造業者のプロトコルに従って、細胞可溶化物中でＣｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ （Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）によって測定した。ＨＡではない、固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、休止する好中球ではなく、ｆＭＬＰまたはＬＰＳ活性の好中球のアポトーシスを促進する（図３のＤ）。
【０４４８】
その後、休止する又はＬＰＳ刺激したマクロファージによるアポトーシス性の好中球の食作用を検査した。ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０５細胞／ｍｌ）を、６日間（ｎ＝３）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）刺激なしで又は刺激とともに、固定化したＨＡ（２μｇ／ウェル）、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２μｇ／ウェル）またはＰＢＳ対照上のＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ中で培養した。その後、細胞培養培地を取り除き、（８時間、ロスコビチン（２０μＭ）（Ｓｉｇｍａ− Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を用いた単離した休止するヒト好中球の処置によって準備した）ＩＭＤＭ中の１００μｌのアポトーシス性の好中球の２×１０６細胞／ｍｌを、休止する又はＬＰＳ刺激のマクロファージを含有する各ウェルに加えた。３７℃の３０分間のインキュベーション後、各ウェルを、冷たいＰＢＳで３回洗浄し、（マクロファージおよび貪食した好中球を含む）細胞可溶化物を、マクロファージによる貪食した好中球を測定するＥＬＩＳＡアッセイによって、ヒトのミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を決定するために収集した。細胞可溶化物を、収集して、製造業者のプロトコルに従って、ヒトのミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）ＥＬＩＳＡアッセイ（ｎ＝４）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）にさらした。その後、ＭＰＯを、それぞれの細胞可溶化物中でＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）によって測定された総タンパク質で正常化し、食作用の指標として表わした。ＬＰＳ（ＬＰＳ）刺激のない休止細胞の食作用の指標を、この実験において１００％として定義した。ＨＡではない、固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、休止するマクロファージまたはＬＰＳ処置のマクロファージのいずれかによって、アポトーシス性の好中球の食作用を促進した（図３のＥ）。
【０４４９】
これらの結果は、固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２ｎｄ）が、活性化した好中球のアポトーシスおよびマクロファージによるアポトーシス性の好中球の食作用を増強することを実証している。
【０４５０】
固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３によるＭ２マクロファージの極性化に関係する受容体の分析
Ｍ２マクロファージ極性化における特定の受容体の関与を決定するために、受容体遮断抗体の存在または欠如下でのＭ１およびＭ２のマクロファージマーカーの定量的ｍＲＮＡ発現を行った。ＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ中のＲＡＷ２６４．７細胞（２．５×１０５細胞／ｍｌ）を、氷上で３０分間（ｎ＝３）、ＣＤ４４（１０μｇ／ｍｌ）、ＴＬＲ４（１０μｇ／ｍｌ）、またはＣＤ４４／ＴＬＲ４（各々１０μｇ／ｍｌで）に対するＰＢＳ（対照）または遮断抗体で予めインキュベートした。その後、細胞を、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で刺激し、固定化したＨＡ（２μｇ／ウェル）、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２μｇ／ウェル）またはＰＢＳ対照上で４時間３７℃でインキュベートした。総核酸を、総細胞から抽出した。Ｍ１マーカー（ＩＬ−１２ｐ４０）およびＭ２マーカー（ＩＬ−１０、ＬＩＧＨＴ、およびＳＰＨＫ１）の相対的なｍＲＮＡ発現を、上に記載されるような内在性コントロールとしてＧＡＰＤＨを用いて定量的ＰＣＲによって測定した（図４のＡ）。ＩＬ−１２ｐ４０の発現を無効にし、一方で、ＩＬ−１０、ＬＩＧＨＴおよびＳＰＨＫ１の発現を、ＨＡではなく、固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３によって促進した。この発現パターンは、ＴＬＲ４遮断抗体よりもＣＤ４４遮断抗体によってより阻害された。対照的に、固定化したＨＡによるＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１０の転写物の発現は、ＣＤ４４に対する遮断抗よりもＴＬＲ４に対する遮断抗体による影響をより受けた。
【０４５１】
ＩＬ−１２およびＩＬ−１０のタンパク質発現も測定した。細胞培養上清を、２４時間（４時間の代わり）（ｎ＝３）、上に記載されるように処置された、固定化したＨＡ（２μｇ／ウェル）、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２μｇ／ウェル）またはＰＢＳ対照上で培養された細胞から収集した。細胞培養上清中のＩＬ−１２またはＩＬ−１０のタンパク質の量を、製造業者のプロトコルに従って、ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）によって測定した（図４のＢ）。ＩＬ−１２タンパク質の発現が無効にされ、一方で、ＩＬ−１０タンパク質の発現は、固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３によって著しく促進される。この発現パターンは、ＣＤ４４に対する遮断抗体によって阻害される。対照的に、ＩＬ−１２タンパク質の発現は促進され、一方で、ＩＬ−１０の発現は、固定化したＨＡによって抑制され、発現パターンは、ＴＬＲ４に対する遮断抗体による影響をより受けた。
【０４５２】
ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２ｎｄ）およびｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（４ｔｈ）の複合体の比較
ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２ｎｄ）およびｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（４ｔｈ）の複合体を、マクロファージの細胞凝集を誘発する（不十分な細胞付着を示す）及び／又はＭ２マクロファージの極性化を促進する各複合体の能力を検査することによって比較した。ＲＡＷ２６４．７細胞（２．５×１０５細胞／ｍｌ）を、固定化したＨＡ（２、μｇ／ウェル）、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２、μｇ／ウェル）またはＰＢＳ対照上のＤＭＥＭ／１０％  のＦＢＳ中ので培養し、４時間または２４時間（ｎ＝３）、２００ユニット／ｍｌのＩＦＮ−γ／１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（その両方は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡからのもの）で刺激した。４時間後、細胞凝集を、光顕微鏡検査法によって検査し、撮影した（図５のＡ）。ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２ｎｄ）ではなく、固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（４ｔｈ）は、マクロファージの細胞凝集を促進し、これは、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（４ｔｈ）が、プレートへの細胞付着を促進せず、一方で、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２ｎｄ）が促進することを示している。
【０４５３】
２４時間後、サンプルを、細胞培養上清から得て、ＩＬ−１２ｐ４０タンパク質およびＩＬ−２３タンパク質の濃度を、製造業者のプロトコルに従って、それぞれのＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）によって測定した（図５のＢおよびＣ）。ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２ｎｄ）およびｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（４ｔｈ）の両方は、ＩＦＮ−γ／ＬＰＳ刺激したマクロファージにおいてＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−２３のタンパク質の産生を阻害する。
【０４５４】
実施例４：ＩαＩの欠如下での固定化したＨＡ（ｉＨＡ）に対するＴＳＧ−６およびＰＴＸ３のインビトロでの結合
ｉＨＡに対するＴＳＧ−６の結合
固定化したＨＡ（２μｇ／ウェルの投入量）を、上に記載されたように調製した。一連のヒトＴＳＧ−６（Ｃ端末１０Ｈｉｓタグを用いる、ヒトＴＳＧ−６のＬｅｕ２７７からＴｒｐ１８でのマウス骨髄腫細胞株ＮＳ０中の過剰発現、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃ Ｐ９８０６６； Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ， Ｃａｔ． Ｎｏ． ２１０４−ＴＳ）の濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）（１ウェル当たり、０、０．２４、１．２、６、１２、および２４μｇ／ｍｌ、１００μｌの容量）を、反応緩衝液（ＰＢＳ中に５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５）中で３７°Ｃで２時間ｉＨＡでインキュベートした。非結合ＴＳＧ−６を、８Ｍのグアニジン−ＨＣｌおよびＰＢＳの洗浄によって取り除いた。結合ＴＳＧ−６を、修正したＴＳＧ−６ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）によって測定した。ＴＳＧ−６がウェル中で連結されたｉＨＡに既に結合されていたため、予めコーティングしたＴＳＧ−６抗体によってサンプルをインキュベートする工程を省略した。続く工程は製造業者のプロトコルに従うものであった（図７のＡ）。ＴＳＧ−６は、ｉＨＡを用量依存的に結合し、ｉＨＡが約１．４μｇ（〜７０％の結合効率に基づく１ウェル当たり２μｇのＨＡ）であるときに、約６μｇ／ｍｌ（または０．１ｍｌの反応溶液中に０．６μｇ）でその最大の結合能力に達した。ＴＳＧ−６のＨＡに対するモル比は、ＴＳＧ−６が３５ｋＤａであること及びＨＡが〜３，０００ｋＤａであることに基づいて、約３７：１であった。
【０４５５】
その後、解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）に抵抗するＴＳＧ−６／ｉＨＡ複合体の能力を検査した。ｉＨＡ（２μｇ／ウェルの投入量）を、上に記載されるように調製した。
ＴＳＧ−６（１００μｌ中に６μｇ／ｍｌ）を、３７℃で２時間ｉＨＡでインキュベートした。非結合ＴＳＧ−６を、ＰＢＳ（対照として）による洗浄、あるいは異なる解離剤または還元剤：６ＭのグアニジンＨＣｌ／ＰＢＳ、８ＭのグアニジンＨＣｌ／ＰＢＳ、２％のＳＤＳ／ＰＢＳ、１００ｍＭのＤＴＴ／ＰＢＳ、および２５ｍＭのＮａＯＨ／Ｈ２Ｏによる洗浄によって取り除いた。結合ＴＳＧ−６を、上に記載されるような修正したＴＳＧ−６ ＥＬＩＳＡによって測定した（図７のＢ）。形成されたＴＳＧ−６／ｉＨＡ複合体は安定しており、様々な解離剤及び／又は還元剤による処置に耐性があった。すべての群間で統計的有意差は言及されなかった。
【０４５６】
ｉＨＡに対するＰＴＸ３の結合
固定化したＨＡ（２μｇ／ウェルの投入量）を、上に記載されるように調製した。一連のＰＴＸ３（Ｃ端末６Ｈｉｓタグを用いる、ヒトＰＴＸ３のＧｌｕ１８からＳｅｒ２７７でのマウス骨髄腫細胞株ＮＳ０中の過剰発現、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃ Ｐ２６０２２； Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）の濃縮物（１ウェル当たり、０、０．０４、０．２、１、５、および２５μｇ／ｍｌ、１００μｌの容量）を、反応緩衝液（ＰＢＳ中に５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５）中で３７°Ｃで２時間ｉＨＡでインキュベートした。非結合ＰＴＸ３を、８ＭのＧｎＨＣｌおよびＰＢＳでの洗浄によって取り除いた。結合ＰＴＸ３を、修正したＰＴＸ３ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）によって測定した。ＰＴＸ３がウェル中で連結されたｉＨＡに既に結合されていたため、予めコーティングしたＰＴＸ３抗体によってサンプルをインキュベートする工程を省略した。続く工程は製造業者のプロトコルに従うものであった（図８のＡ）。ＰＴＸ３は、ｉＨＡを用量依存的に結合し、ｉＨＡが約１．４μｇ（７０％の結合効率に基づく１ウェル当たり２μｇのＨＡ）であるときに、約５μｇ／ｍｌ（または０．１ｍｌの反応溶液中に０．５μｇ）でその最大の結合能力に達した。ＰＴＸ３のＨＡに対するモル比は、ＰＴＸ３が４５ｋＤａであること及びＨＡが〜３，０００ｋＤａであることに基づいて、約２４：１であった。
【０４５７】
その後、解離に抵抗するＰＴＸ３／ｉＨＡ複合体の能力を検査した。ｉＨＡ（２μｇ／ウェルの投入量）を、上に記載されるように調製した。ＰＴＸ３（１００μｌ中に５μｇ／ｍｌ）を、３７℃で２時間ｉＨＡでインキュベートした。非結合ＰＴＸ３を、ＰＢＳ（対照として）による洗浄、あるいは異なる解離剤または還元剤：６ＭのグアニジンＨＣｌ／ＰＢＳ、８ＭのグアニジンＨＣｌ／ＰＢＳ、２％のＳＤＳ／ＰＢＳ、１００ｍＭのＤＴＴ／ＰＢＳ、および２５ｍＭのＮａＯＨ／Ｈ２Ｏによる洗浄によって取り除いた。結合ＰＴＸ３を、上に記載されるような修正したＰＴＸ３ ＥＬＩＳＡによって測定した（図８のＢ）。形成されたＰＴＸ３／ｉＨＡ複合体は安定しており、様々な解離剤及び／又は還元剤による処置に耐性があった。すべての群間で統計的有意差は言及されなかった。
【０４５８】
ｉＨＡに対するＴＳＧ−６およびＰＴＸ３の同時結合
ｉＨＡ（２μｇ／ウェルの投入量）を、上に記載されるように調製した。６μｇ／ｍｌのＴＳＧ−６および５μｇ／ｍｌのＰＴＸ３（上に記載されるような最大の結合に対する濃縮物）を、ｉＨＡ単独で又は反応緩衝液（ＰＢＳ中に５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５）中に混合してインキュベートした。結合ＴＳＧ−６またはＰＴＸ３を、上に記載されるような、それぞれの修正したＥＬＩＳＡによって測定した。ＴＳＧ−６またはＰＴＸ３が単独で加えられたとき（ｐ＞０．０５）と比較して、両方のタンパク質がｉＨＡで同時にインキュベートされたときのＴＳＧ−６またはＰＴＸ３によるｉＨＡへの結合に対する競合や相乗作用はなかった。これらのデータは、ＴＳＧ−６およびＰＴＸ３に対するｉＨＡ上の結合部位が、異なっており、重なっていないかもしれないということを示した（図９）。
【０４５９】
ｉＨＡに対するＴＳＧ−６およびＰＴＸ３の逐次結合
予め結合したＴＳＧ−６またはＰＴＸ３が、ｉＨＡに対する他のタンパク質の結合を阻害するかどうかを決定するために、ｉＨＡに対するＴＳＧ−６およびＰＴＸ３の逐次付加を検査した。６μｇ／ｍｌのＴＳＧ−６または５μｇ／ｍｌのＰＴＸ３を、上に記載されるように準備された、ｉＨＡに予め結合させた。８ＭのＧｎＨＣｌおよびＰＢＳによる洗浄後、ＰＴＸ３（０、５または５μｇ／ｍｌ）またはＴＳＧ−６（０、１．２、または６μｇ／ｍｌ）の連続する濃縮物を、反応緩衝液（ＰＢＳ中に５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５）中で、それぞれ、予め結合したＴＳＧ−６／ｉＨＡまたは予め結合したＰＴＸ３／ｉＨＡによって続けてインキュベートした。続けて結合したＴＳＧ−６およびＰＴＸ３を、それぞれの修正したＥＬＩＳＡによって測定した。
【０４６０】
予め結合したＴＳＧ−６（６μｇ／ｍｌ）は、続くＰＴＸ３がｉＨＡに結合するのを部分的に防いだ（図１０のＡ）（続くＰＴＸ３を１μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌで加えたときに、それぞれ、ｐ＝０．０５および０．０１）（図５のＡ）。予め結合したＰＴＸ３（５μｇ／ｍｌ）は、ＴＳＧ−６がｉＨＡに結合することを妨害しなかった（続くＴＳＧ−６を１．２μｇ／ｍｌおよび６μｇ／ｍｌで加えたときに、それぞれ、ｐ＝０．５６および０．７４）（図１０のＢ）。これらのデータは、ｉＨＡが、続くＰＴＸ３結合を妨害するように、ＴＳＧ−６結合後に構造的に変化することを示している。
【０４６１】
実施例５：固定化したＴＳＧ−６／ｉＨＡおよびＰＴＸ３／ｉＨＡの複合体に対するＬＰＳ刺激したマクロファージの付着
Ｃｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ ９６ウェルを、上に記載されるように、ＰＢＳ（対照）、ＨＡ（ｉＨＡ）、または天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）と共有結合させた。その後、ＴＳＧ−６（６μｇ／ｍｌ）またはＰＴＸ３（５μｇ／ｍｌ）を、ｉＨＡに加えて結合させた。ＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ中のＲＡＷ２６４．７マクロファージ（１００μｌの１×１０５細胞／ｍｌ）を、各々が連結したウェルへと播種し、１μｇ／ｍｌのＬＰＳで処置した。２４時間のインキュベーション後、細胞形態を撮影した。
【０４６２】
マクロファージは、プラスチック制御（ｐｌａｓｔｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較したときに、ｉＨＡに不十分に付着した（すなわち、より多くの凝集した細胞を結果的にもたらす）。そのような付着は、ＴＳＧ−６／ｉＨＡによってさらに妨げられ、結果的に多くの数の及びより大きな細胞凝集をもたらす。対照的に、ＰＴＸ３／ｉＨＡは、細胞付着を促進し、結果的に固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３に示されるものと類似したパターンをもたらした（図１１）。
【０４６３】
実施例６：ＴＳＧ−６／ｉＨＡおよびＰＴＸ３／ｉＨＡの複合体によるＭ１およびＭ２のマーカーの調節
ＲＡＷ２６４．７細胞を、実施例５におけるように培養し、ＰＢＳ（対照）、固定化したＨＡ（ｉＨＡ）、ＴＳＧ−６／ｉＨＡ、ＰＴＸ３／ｉＨＡ、またはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で４時間、１μｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した。総ＲＮＡを、細胞から単離し、Ｍ２マーカーＩＬ−１０およびＭ１マーカーＩＬ−１２ｐ４０のｍＲＮＡ発現を、上に記載されるような定量的ＰＣＲによって測定さした（図１２Ａおよび図１２Ｄ）。あるいは、細胞を、２４時間、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（図１２Ｂおよび図１２Ｅ）またはＩＦＮ−γ／ＬＰＳ（図１２Ｃ）で刺激し、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、およびＩＬ−２３のタンパク質発現を、それぞれのＥＬＩＳＡを使用して、細胞培養培地中で測定した。
【０４６４】
ＩＬ−１２ｐ４０のｍＲＮＡ（ＩＬ−１２ｐ７０の２つのサブユニットの１つ）の発現は、対照（Ｃｔｒｌ）（ｐ＞０．０５）の発現と比較して、ｉＨＡ（なし（ｎｏｎｅ））上で著しく変化しなかった（図１２Ａ）。対照的に、ＩＬ−１２ｐ４０のｍＲＮＡは、ＴＳＧ−６／ｉＨＡ（ｐ＜０．０１）の上で著しくアップレギュレートされたが、ＰＴＸ３／ｉＨＡおよびｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｐ＜０．０５）上で著しくダウンレギュレートされた（図１２Ａ）。しかしながら、ＩＬ−１２ｐ７０タンパク質の発現は、対照またはｉＨＡ単独上で有意差（ｐ＞０．０５）なしで検出可能なだけであったが、ＴＳＧ−６／ｉＨＡ、ＰＴＸ３／ｉＨＡ、およびｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上では検出できない（図１２Ｂ）。ＩＬ−１２ｐ４０はまた、ＩＬ−２３のサブユニットとして機能する。ＩＬ−２３タンパク質の発現が、ＴＳＧ−６／ｉＨＡおよびＰＴＸ３／ｉＨＡ（ｐ＜０．０１）上で著しくアップレギュレートされたが、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｐ＜０．０５）上では検出できないことが観察された（図１２Ｃ）。これらのデータは、ＴＳＧ−６／ｉＨＡおよびＰＴＸ３／ｉＨＡの両方が、ＩＬ−２３ではなくＩＬ−１２を抑制するのに有効であることを示している。
【０４６５】
ＲＡＷ２６４．７細胞によるＩＬ−１０のｍＲＮＡの発現は、対照（ｐ＞０．０５）と比較して、ｉＨＡ単独上で著しく変化しなかったが、ＴＳＧ−６／ｉＨＡ、ＰＴＸ３／ｉＨＡ、およびｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｐ＜０．０５）上で著しくアップレギュレートされた（図１２Ｄ）。しかしながら、ＩＬ−１０タンパク質の発現は、固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｐ＜０．０５）（図１２Ｅ）の陽性対照に類似したＰＴＸ３／ｉＨＡの上で単に著しくアップレギュレートされる。これらのデータは、異なるパターンの細胞付着後に（実施例５）、結果として生じた細胞が異なる機能を示し、ＰＴＸ３／ｉＨＡが、ＴＳＧ−６／ｉＨＡよりもＩＬ−１０をアップレギュレートすることにより有効であることを示している。
【０４６６】
実施例７：ＩαＩから固定化したＨＡへのＨＣ１およびＨＣ２のインビトロでの移送
Ｃｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ ９６ウェルを、上に記載されているような、ＰＢＳ（対照）、ＨＡ（ｉＨＡ）、または天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）と共有結合させた。連続するＴＳＧ−６濃縮物（１００μｌ中に０、０．２４、１．２、６、１２μｇ／ｍｌ）を、反応緩衝液（ＰＢＳ中に５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５）中でｉＨＡによって個々にインキュベートした。（Ｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， ２９８−３０４に従ってヒト血漿から調製した）ヒトＩαＩ（５μｇ／ｍｌ）を、ＴＳＧ−６と同時に又は連続して（２時間後）加えた。結合ＨＣ１、ＨＣ２（ＨＣ１およびＨＣ２に対する抗体はアブカム，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡからのものであった）、またはＩαＩ（ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を、上に記載されるＴＳＧ−６およびＰＴＸ３のＥＬＩＳＡに類似したそれぞれの修正したＥＬＩＳＡによって測定した。
【０４６７】
データは、ＴＳＧ−６およびＩαＩが同時に加えられたときよりも、ＴＳＧ−６が、ＩαＩを続いて加えることでｉＨＡに予め結合されたときに、ｉＨＡに結合したＨＣ１（図１３Ａ）またはＩαＩ（図１３Ｂ）の量が、より高いＴＳＧ−６濃度（６および１２μｇ／ｍｌ）でより少ないことを示している。ＨＣ２は、サンプル中で検出されなかった（データは示されず）。結合ＨＡを消化し、ＨＡから結合タンパク質を放出するために、ウェルをヒアルロニダーゼでインキュベートし、これらのサンプルを、抗−ＴＳＧ−６抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）を用いて、ウェスタンブロットによって分析した；ｉＨＡに結合したＴＳＧ−６の量は、ＩαＩが続けて加えられたとき（すなわち、ＴＳＧ−６がｉＨＡに結合された後（図１３Ｃ））よりも、ＴＳＧ−６と同時に加えられたときにより少なかった。５μｇ／ｍｌのＰＴＸ３および５μｇ／ｍｌのＩαＩを、ｉＨＡで同時にインキュベートしたときに、ＩαＩではなくＰＴＸ３が、ｉＨＡに結合された（図１３Ｄ）。
【０４６８】
これらのデータは、溶液中で遊離した（ｆｒｅｅ）ＴＳＧ−６が、ｉＨＡに結合したＴＳＧ−６よりも、ＨＣ１をＩαＩからｉＨＡ上へと移送する際により効果的であることを示している（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。ＴＳＧ−６およびＩαＩがｉＨＡで同時にインキュベートされるとき（図１３Ｃ）よりも、ＴＳＧ−６がｉＨＡ単独に予め結合されるときに、より多くのＴＳＧ−６がｉＨＡに結合され、これは、ＴＳＧ−６を同時に加えた場合に、ＴＳＧ−６がｉＨＡに結合することをＩαＩが防ぎ、ＴＳＧ−６が、ｉＨＡよりもＩαＩに結合する際により高い親和性を有するかもしれないことを示している。
さらに、溶液中で遊離したまたはｉＨＡに結合したＴＳＧ−６は、ＨＣをＩαＩからｉＨＡに移送しない（図１３Ｄ）。
【０４６９】
実施例８：ＨＣ１・ＴＳＧ−６およびＨＣ２・ＴＳＧ−６の複合体の形成に対するＰＴＸ３の効果
ＩαＩ（４０μｇ／ｍｌ）およびＴＳＧ−６（６μｇ／ｍｌ）を、ＰＴＸ３（２０μｇ／ｍｌまたは１２０μｇ／ｍｌ）とともに又はそれなしで、３７℃で２時間、反応緩衝液（ＰＢＳ中に５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５）中でインキュベートしれた。反応サンプルを、ＨＣ１（図１４Ａ）、ＨＣ２（図１４Ｂ）、ＴＳＧ−６（図１４Ｃ）、ビクニン（アブカム、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）（図１４Ｄ）、およびＰＴＸ３（データは示されず）に対する抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。ＨＭＷ ＨＡのない溶液中で、ＴＳＧ−６は、ＨＣ１・ＴＳＧ−６およびＨＣ２・ＴＳＧ−６の複合体を形成し、ＨＭＷ ＩαＩ（図１４Ａおよび１４Ｂ）を生成する。ＨＭＷ ＩαＩの形成は、図１４Ｅで例証される。このデータは、ＨＣ１およびＨＣ２の両方が、溶液中のＴＳＧ−６によってＨＭＷ ＨＡに移送されることを示す。
【０４７０】
ＰＴＸ３の同時付加は、ＨＣ１・ＴＳＧ−６ではなく、ＨＣ２・ＴＳＧ−６の形成を用量依存的に阻害する（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。対照的に、ＨＣ２を含有しているＨＭＷ ＩαＩは増加されるが、ＨＣ１を含有しているＨＭＷ ＩαＩは減少される（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。ＴＳＧ−６は、ＰＴＸ３とともに又はそれなしで、ＨＭＷ ＨＡのない溶液中に加えられるときに、二量体を形成する（図１４Ｃ）。これらの結果は、１）ＩαＩ中のＨＣ１およびＨＣ２の両方が、ＴＳＧ−６の作用を介して、ＴＳＧ−６またはＨＭＷ ＩαＩのいずれかとの複合体を形成し；２）ＰＴＸ３が、ＴＳＧ−６によるＨＣ１およびＨＣ２の移送に関して上記のプロセスを別々に妨害することを示している。ＨＣ１またはＨＣ２の切断型はない。ＰＴＸ３によるＨＣ２・ＴＳＧ−６の阻害は、図１４Ｆで例証される。
【０４７１】
約４０ｋＤａおよび４５ｋＤａの、それぞれ、ビクニンのグリコシル化形態およびグリコシル化且つコンドロイチン硫酸結合した形態を、それぞれ、ＴＳＧ−６およびＰＴＸ３によって放出した（図１４Ｄ）。このデータは、ＴＳＧ−６およびＰＴＸ３の両方がＩαＩと相互作用することを示している、公表されたデータと一致しており、またＴＳＧ−６およびＰＴＸ３が、ＩαＩと別々に相互作用し、結果的にビクニンの異なる結果をもたらすことを示唆している。
【０４７２】
別々の実験において、ＨＭＷ ＨＡ（２５０μｇ／ｍｌ）、ＩαＩ（４０μｇ／ｍｌ）、およびＴＳＧ−６（６μｇ／ｍｌ）を、反応緩衝液（ＰＢＳ中に５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５）中のＰＴＸ３（１、２．５および５μｇ／ｍｌ）とともに又はそれなしで、３７°Ｃで２４時間溶液中でインキュベートした。反応サンプルを、ＩαＩに対する抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した（図１４Ｇ）。ＰＴＸ３なしではあるが、ＨＭＷ ＨＡを有する溶液中で、ＩαＩからのＨＣを、ＴＳＧ−６によってＨＭＷ ＨＡに完全に移送した。ＰＴＸ３の存在下で、ＴＳＧ−６媒介性のＨＣ移送は、用量依存的に阻害され、結果的にＬＭＷ中間物（〜１３０ｋＤａおよび恐らくＨＣ１−ＴＳＧ−６から成る）または未処理のプレ（ｐｒｅ）ＩαＩ（〜１３０ｋＤａ、未処理のＩαＩ）（２２０ｋＤａ）、およびＨＭＷ ＩαＩ（充填ウェル（ｌｏａｄｉｎｇ ｗｅｌｌｓ）内で保持された）の蓄積をもたらす（図１４Ｇ）。これらのデータは、ＰＴＸ３が、ＨＣ２−ＴＳＧ−６の形成をとりわけ防ぎ、結果的にＨＣ２移送および起こり得るＨＣ１移送の阻害をもたらす結果と一致している。
【０４７３】
実施例９：ＴＳＧ−６、ＰＴＸ３、およびＩαＩの同時付加による固定化したＨＡからのインビトロでの再構成したＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体の形成
固定化したＨＡ（各ウェルにおける１００μｌ中の〜１４μｇ／ｍｌまたは１．４μｇ）を、実施例３に記載されるように調製した。ＩαＩ（５μｇ／ｍｌ）およびＴＳＧ−６（１２μｇ／ｍｌ）を、反応緩衝液（ＰＢＳ中に５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５）中で３７℃で２時間、ＰＴＸ３（１、５または２０μｇ／ｍｌ）とともに又はそれなしで、ｉＨＡ上で同時にインキュベートした。８ＭのＧｎＨＣｌおよびＰＢＳでの洗浄後、結合したＨＣ１、ＴＳＧ−６、およびＰＴＸ３を、それぞれの修正したＥＬＩＳＡ（それぞれ、図１５のＡ、Ｄ、およびＦ）によって測定した。ウェルを、８ＭのＧｎＨＣｌおよびＰＢＳで再び洗浄し、結合成分を有するｉＨＡを、７５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０を用いて１０ｍＭの緩衝酢酸溶液中で６０℃で２時間、１ユニット／ｍｌのヒアルロニダーゼによって消化した。サンプルを、ＨＣ１（図１５のＢ）、ＨＣ２（図１５のＣ）、ＴＳＧ−６（図１５のＥ）、およびＰＴＸ３（図１５のＧ）に対する抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。
【０４７４】
ｉＨＡへのＴＳＧ−６、ＰＴＸ３およびＩαＩの同時付加は、結果的に、ＨＣ２ではなく、ＨＭＷ ＨＣ１を含有しているｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体、および切断されたＨＣ１およびＨＣ２をもたらした（図１５のＡ−Ｃ）。ＰＴＸ３は、複合体中でＨＭＷ ＨＣ１の量を用量依存的に減少した。データは、ＰＴＸ３が、ＴＳＧ−６によるＨＣ２へのＨＣ１およびＨＣ２の移送を用量依存的に妨害し（図１５のＡ−Ｃ）、結果的に、より少ないＨＣ１／切断されたＨＣ１および切断されたＨＣ２をもたらしたことを示している（図１５のＢおよびＣ）。ＴＳＧ−６モノマーは減少されたが、一方で、ＨＭＷ ＴＳＧ−６（ＰＴＸ３及び／又はＨＣによって多量体であるか複合体のいずれか）は変わらなかった（図１５のＤおよびＥ）。
【０４７５】
データはまた、ＰＴＸ３が、ＩαＩの存在下または欠如下で、ｉＨＡに結合されたＴＳＧ−６を妨害しないことを示している。公表されたデータは、より小さなＭＷ ＨＡが試験されるときに、ＴＳＧ−６が、ｉＨＡによって二量体を形成することを示唆している（Ｂａｒａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８６（２９）：２５６７５−８６）。本明細書に示されるデータは、ＴＳＧ−６が、ＩαＩの存在下でＨＭＷ ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体中で複合化されることを示している。遊離ＴＳＧ−６が、用量依存的な方法でＰＴＸ３によって減少されるため、ＰＴＸ３が、ＩαＩの存在下でＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体へのＴＳＧ−６の結合を促進することがさらに示される。この状況下で、大多数のＰＴＸ３は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３中で観察されたものに類似した、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体中の多量体として存在し、単量体、二量体または三量体の量は減少している（図１５のＦおよびＧ）。
【０４７６】
実施例１０：固定化したＨＡに対する、ＴＳＧ−６およびＩαＩによるインビトロで作られた再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体へのＰＴＸ３の逐次付加の効果
固定化したＨＡ（〜１４μｇ／ｍｌ）を、実施例３に記載されるように調製した。ＩαＩ（５μｇ／ｍｌ）およびＴＳＧ−６（１２μｇ／ｍｌ）を、３７℃で２時間、反応緩衝液（ＰＢＳ中に５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５）中のｉＨＡ上でインキュベートした。非結合のＩαＩおよびＴＳＧ−６を取り除いた後に、ＰＴＸ３（１、５または２０μｇ／ｍｌ）を有する又はそれなしでの反応緩衝液を、３７℃で２時間、予め結合したＨＣおよびＴＳＧ−６でインキュベートした。８ＭのＧｎＨＣｌおよびＰＢＳでの洗浄後、結合ＨＣ１、ＴＳＧ−６、およびＰＴＸ３を、それぞれのＥＬＩＳＡ（それぞれ、図１６のＡ、Ｄ、およびＦ）によって測定した。その後、ウェルを、８ＭのＧｎＨＣｌで再び洗浄した。その後、結合成分を有するＰＢＳ対照およびｉＨＡを、６０℃で２時間、１ユニット／ｍｌのヒアルロニダーゼによって消化した。サンプルを、ＨＣ１（図１６のＢ）、ＨＣ２（図１６のＣ）、ＴＳＧ−６（図１６のＥ）、ＰＴＸ３（図１６のＧ）に対する抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。
【０４７７】
ＴＳＧ−６およびＨＣがｉＨＡに予め結合された後に続いてＰＴＸ３が加えられるときに、ＰＴＸ３は、ＨＭＷ複合体へのＨＣ１移送を用量依存的に減少させる（インタクトな（ｉｎｔａｃｔ）ＨＣ１および切断されたＨＣ１の両方が減少される）が、複合体中の切断されたＨＣ２の量を増加させる。実施例７に示されるデータと一致して、結合ＴＳＧ−６は、ＴＳＧ−６ほどｉＨＡへのＨＣの移送に有効ではない。
【０４７８】
実施例８に示されるデータに類似して、ＰＴＸ３はまた、ＨＭＷ ＴＳＧ−６および単量体のＴＳＧ−６を用量依存的に減少させ（図１６のＤおよびＥ）、これは、ＰＴＸ３の続く追加が、予め結合したＴＳＧ−６を連続的に消耗させることを示している。
しかしながら、ＰＴＸ３は、ＴＳＧ−６／ＨＣ−ＨＡ複合体中にこれ以上組み込むことはできない（図１６のＦおよびＧ）。ｉＨＡ中の予め結合されたＴＳＧ−６はまた、ＰＴＸ３がｉＨＡに結合することを部分的に防ぐため（実施例４を参照）、この結果は、ＴＳＧ−６およびＩαＩによるｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の形成が、ｉＨＡへのＰＴＸ３結合が完全に除外される範囲で、ＴＳＧ−６／ｉＨＡとは構造上異なることを示している。
【０４７９】
実施例１１：固定化したＨＡ上の予め結合されたＰＴＸ３によるインビトロでの再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体の形成およびＴＳＧ−６およびＩαＩの逐次付加
固定化したＨＡ（〜１４μｇ／ｍｌ）を、実施例３に記載されるように調製した。ＰＴＸ３（５μｇ／ｍｌ）およびｉＨＡを、反応緩衝液（ＰＢＳ中に５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５）中の３７℃で２時間、反応緩衝液中でインキュベートした。非結合ＰＴＸ３を取り除いた後に、ＴＳＧ−６（６μｇ／ｍｌ）およびＩαＩ（５、２５および１２５μｇ／ｍｌ）を含有している反応緩衝液を、３７℃で２時間インキュベートした。８ＭのＧｎＨＣｌおよびＰＢＳでの洗浄後、結合ＨＣ１、ＴＳＧ−６、およびＰＴＸ３を、それぞれのＥＬＩＳＡ（それぞれ、図１７のＡ、Ｃ、およびＥ）によって測定した。その後、ウェルを、８ＭのＧｎＨＣｌで再び洗浄した。結合成分を有するＰＢＳまたはｉＨＡを、７５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０を用いて１０ｍＭの緩衝酢酸溶液中で６０℃で２時間、１ユニット／ｍｌのヒアルロニダーゼによって消化した。サンプルを、ＰＴＸ３（図１７のＢ）、ＴＳＧ−６（図１７のＤ）、ＨＣ１（図１７のＦ）およびＨＣ２（図１７のＧ）に対する抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。
【０４８０】
ＩαＩおよびＴＳＧ−６の存在下で、予め結合されたＰＴＸ３は、ＰＴＸ３に対するＥＬＩＳＡの免疫反応力および多量体のＰＴＸ３の量を用量依存的に増加させたが、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体中の単量体のＰＴＸ３の量を減少させた（図１７のＡおよびＢ）。このデータは、多量体のＰＴＸ３が、この抗体によって免疫反応力を促進することを示している。
【０４８１】
予め結合されたＰＴＸ３は、単量体のＴＳＧ−６を用量依存的に除外したが、一方で、ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体中のＴＳＧ−６を減少させた（図１７のＣおよびＤ）。ＩαＩのＴＳＧ−６に対するモル比が３：１であるときに、結合ＴＳＧ−６（単量体およびＨＭＷ形態の両方）の著しい減少が検出され、結合された多量体のＰＴＸ３も同様に最大限にされる。
【０４８２】
ＨＣ１ ＥＬＩＳＡデータ（図１７Ｅ）に基づく結合ＨＣ１の著しい変化はなかった。ＨＣ２の移送は、ＩαＩ濃度を増加させることによって用量依存的に増加された。
【０４８３】
実施例１２：固定化したＨＡ上の予め結合されたＰＴＸ３に対する予め結合されたＴＳＧ−６によってインビトロで形成された、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体間のマクロファージ細胞付着活性の比較
Ｃｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ ９６ウェルを、実施例３に記載されるように、ＰＢＳ（対照）、ＨＡ（ｉＨＡ）、またはｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３と共有結合させた。ＩαＩ（５μｇ／ｍｌ）、ＴＳＧ−６（６μｇ／ｍｌ）またはＰＴＸ３（５μｇ／ｍｌ）を、以下のように同時にまたは連続してｉＨＡに結合させた：（１）（ＩαＩ／ＴＳＧ−６／ＰＴＸ３）／ｉＨＡ：ＩαＩ、ＴＳＧ−６、およびＰＴＸ３を、反応緩衝液中で３７℃で２時間、ｉＨＡで同時にインキュベートした；（２）（ＩαＩ／ＴＳＧ−６）／ＰＴＸ３／ｉＨＡ：ＩαＩおよびＴＳＧ−６を、反応緩衝液中で３７℃で２時間ｉＨＡで最初にインキュベートした。非結合のＩαＩ／ＴＳＧ−６を取り除いた後、８ＭのＧｎＨＣｌおよびＰＢＳで洗浄し、ＰＴＸ３を加え、反応緩衝液中で３７℃で２時間インキュベートした；（３）（ＰＴＸ３）／ＩαＩ／ＴＳＧ−６／ｉＨＡ：ＰＴＸ３を、反応緩衝液中で３７℃で２時間、ｉＨＡで最初にインキュベートさした。非結合のＰＴＸ３を取り除いた後、８ＭのＧｎＨＣｌおよびＰＢＳで洗浄し、ＩαＩ／ＴＳＧ−６を加え、反応緩衝液中で３７℃で２時間インキュベートした。複合体の形成後、１００μｌのＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０５細胞／ｍｌ）を、各々が連結したウェルへと播種し、１μｇ／ｍｌのＬＰＳで処置した。２４時間のインキュベーション後、細胞形態を撮影した。
【０４８４】
マクロファージは、制御としてｉＨＡに不十分に付着した。
ＩαＩの存在下で、ｉＨＡ（（ＩαＩ／ＴＳＧ−６／ＰＴＸ３）／ｉＨＡまたは（ＩαＩ／ＴＳＧ−６）／ＰＴＸ３／ｉＨＡ）に対する同時に又は予め結合されたＴＳＧ−６は、細胞付着を阻害し、ＩαＩのない状態に類似した細胞凝集（図１８）を促進する（実施例５を参照）。対照的に、ｉＨＡ［（ＰＴＸ３）／ＩαＩ／ＴＳＧ−６／ｉＨＡ］に対する予め結合されたＰＴＸ３は、実施例５において示されるようなＩαＩのない予め結合されたＰＴＸ３に類似した細胞付着を促進する。後者は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の陽性対照に似ている（図１８）。
【０４８５】
実施例１３：固定化したＨＡ上の予め結合されたＰＴＸ３に対する予め結合されたＴＳＧ−６によってインビトロで形成された、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）複合体間のＭ１およびＭ２のマーカー発現の調整の比較
ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体上で培養されたマクロファージにおけるＩＬ−１０およびＩＬ−１２ｐ４０の発現
ＲＡＷ２６４．７細胞を、実施例１２に記載されるように、固定化した基質上でＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ中に培養し、４時間１μｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した。総ＲＮＡを単離した、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２ｐ４０ ｍＲＮＡの発現を、上に記載されるように定量的ＰＣＲによって測定した（図１９Ａおよび図１９Ｃ）。あるいは、細胞を、２４時間１μｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激し、細胞培養上清中のＩＬ−１０およびＩＬ−１２ｐ７０のタンパク質を、それぞれのＥＬＩＳＡによって測定した（図１９Ｂおよび図１９Ｄ）。
【０４８６】
ＰＢＳ対照と比較して、ＩＬ−１０ ｍＲＮＡの発現は、ｉＨＡ（ｐ＝０．５６）によっては著しく変化しなかったが、ｉＨＡ上のＴＳＧ−６、ＩαＩ、およびＰＴＸ３（図１９におけるＩαＩ／ＴＳＧ−６／ＰＴＸ３（ａ））（ｐ＝０．０００８）の同時付加によって形成された複合体上で著しくアップレギュレートされた。同様に、ＩＬ−１０ ｍＲＮＡの発現は、ＩαＩおよびＰＴＸ３（図１９におけるＩαＩ／ＴＳＧ−６／ＰＴＸ３（ｂ））（ｐ＝０．０４）の続く追加および陽性対照ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｐ＝０．００８）とともにｉＨＡに対する予め結合されたＴＳＧ−６によって形成された複合体上で著しくアップレギュレートされた。ＩＬ−１０ ｍＲＮＡの発現は、ＩαＩ／ＴＳＧ−６／ＰＴＸ３（ａ）（ｐ＝０．０４）よりｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３上で著しくより高かったが、ＩαＩ／ＴＳＧ−６／ＰＴＸ３（ｂ）（ｐ＝０．５５）上ほど著しく高くはなかった。対照的に、ＩＬ−１０ ｍＲＮＡの発現は、ｉＨＡに対する予め結合されたＰＴＸ３（図１９におけるＩαＩ／ＴＳＧ−６／ＰＴＸ３（ｃ））（ｐ＝０．７４）によって形成された複合体上で著しくアップレギュレートされなかった（図１９Ａ）。ＩＬ−１０タンパク質の発現は、ＥＬＩＳＡによって測定されるように、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｐ＝０．０３）によって単に著しくアップレギュレートされた（図１９Ｂ）。
【０４８７】
対照と比較して、ＩＬ−１２ｐ４０（ＩＬ−１２ｐ４０は、ＩＬ−１２ｐ７０の２つのサブユニットの１つであり、もう１つのサブユニットは、ＩＬ−１２ｐ３５である）ｍＲＮＡの発現は、ｉＨＡによって著しく変化しなかった（ｐ＝０．１）。対照的に、ＩＬ−１２ｐ４０ ｍＲＮＡの発現は、ｉＨＡ上のＴＳＧ−６、ＩαＩ、およびＰＴＸ３（図１９におけるＩαＩ／ＴＳＧ−６／ＰＴＸ３（ａ））（ｐ＝０．０５）の同時付加によって形成された複合体上で、およびｉＨＡに対する予め結合されたＴＳＧ−６（図１９におけるＩαＩ／ＴＳＧ−６／ＰＴＸ３（ｂ））（ｐ＝０．０４）によって形成された複合体の上で著しくアップレギュレートされた。対照的に、ＩＬ−１２ｐ４０ ｍＲＮＡの発現は、予め結合されたＰＴＸ３（図１９におけるＩαＩ／ＴＳＧ−６／ＰＴＸ３（ｃ））によって形成された複合体上で完全に無効にされ、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｐ＝０．０１）によって著しくダウンレギュレートされた。後者の２つの状態（ｐ＝０．０４）間に統計的有意差があった（図１９Ｃ）。対照と比較して、ＩＬ−１２ｐ７０タンパク質の発現は、ｉＨＡ（ｐ＝０．３２）によって著しく変化しなかったが、予め結合されたＰＴＸ３（ＩαＩ／ＴＳＧ−６／ＰＴＸ３（ｃ））（ｐ＝０．０３）によって形成された複合体上で著しくダウンレギュレートされた（図１９Ｄ）。対照的に、ＩＬ−１２ｐ７０タンパク質の発現は、ｉＨＡ上のＴＳＧ−６、ＩαＩ、およびＰＴＸ３（ＩαＩ／ＴＳＧ−６／ＰＴＸ３（ａ））の同時付加によって形成された複合体、予め結合されたＰＴＸ３（ＩαＩ／ＴＳＧ−６／ＰＴＸ３（ｃ））によって形成された複合体、およびｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（それぞれ、ｐ＝０．０５、０．０２、および０．０１）上で無効にされた。
【０４８８】
様々な刺激の存在下で培養されたマクロファージにおけるＩＬ−２３の発現
別々の実験において、休止するＲＡＷ２６４．７細胞（無）の細胞培養上清、または２４時間のＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ中のＩＦＮ−γ（２００ユニット／ｍｌ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）、ＩＦＮ−γ／ＬＰＳ、免疫複合体またはＩＣ（ＬＰＳ／ＩＣ）［ＩＣは、１５０μｇ／ｍｌのＩｇＧオプソニン化のＯＶＡ（ＩｇＧ−ＯＶＡ）を含有し、２５℃で３０分間、ＯＶＡ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）に対するウサギ抗ＯＶＡ ＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）の１０倍のモル過剰量を混合することによって作られた］を有するＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）、またはＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）の刺激による細胞培養上清中のＩＬ−２３タンパク質を測定した。細胞培養上清中のＩＬ−２３タンパク質を、製造業者のプロトコルに従って、ＩＬ−２３ ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）によって測定した（図１９Ｅ）。ＩＬ−２３タンパク質は、休止するＲＡＷ２６４．７細胞、およびＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）、免疫複合体を有するＬＰＳ（ＬＰＳ／ＩＣ）、またはＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）による４時間の刺激下での細胞の細胞培養上清において検出できなかったが、ＩＦＮ−γ（２００ユニット／ｍｌ）およびＩＦＮ−γ／ＬＰＳによる２４時間の刺激下で検知可能になった（図１９Ｅ）。
【０４８９】
ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体上で培養されたマクロファージにおけるＩＬ−２３の発現
別々の実験において、ＲＡＷ２６４．７細胞を、上に記載されるような固定化した基質上で培養し、２４時間ＩＦＮ−γ／ＬＰＳで刺激した。細胞培養上清中のＩＬ−２３を、上に記載されるようにＩＬ−２３ ＥＬＩＳＡによって測定した（図１９Ｆ）。
【０４９０】
対照と比較して、２４時間の２００ユニット／ｍｌのＩＦＮ−γ／１μｇ／ｍｌのＬＰＳの刺激によるＲＡＷ２６４．７細胞の細胞培養上清中のＩＬ−２３タンパク質は、ｉＨＡ（ｐ＝０．０２）によって著しく影響されなかったが、ｉＨＡ上のＴＳＧ−６、ＩαＩ、およびＰＴＸ３（ＩαＩ／ＴＳＧ−６／ＰＴＸ３（ａ））（ｐ＝０．００２）の同時付加によって形成された複合体、およびｉＨＡに対する予め結合されたＴＳＧ−６（ＩαＩ／ＴＳＧ−６／ＰＴＸ３（ｂ））（ｐ＝０．０００５）によって形成された複合体上で著しくアップレギュレートされた。対照的に、ＩＬ−２３タンパク質は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｐ＝０．０５）に類似した予め結合されたＰＴＸ３（ＩαＩ／ＴＳＧ−６／ＰＴＸ３（ｃ））（ｐ＝０．０５）によって形成された複合体上で完全に無効にされる（図１９Ｆ）。
【０４９１】
実施例１４：慢性移植片対宿主病の処置のためのＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の使用
同種異型の造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、血液悪性腫瘍のための治癒の可能性のある処置である。しかしながら、慢性移植片対宿主病（ｃＧＶＨＤ）は、主な合併症のままである。ＧＶＨＤは、４５−６０％でいくつかの眼症状発現を引き起こし、その中でも、眼乾燥は、同種異型のＨＳＣＴレシピエントのほぼ５０％で生じる、最も頻繁な合併症である。実際に、眼乾燥は、ｃＧＶＨＤの診断に対する特有な兆候および症状である。ｃＧＶＨＤを有する患者は、ｃＧＶＨＤに関連する初期の軽度の眼乾燥疾患またはＮＩＨのコンセンサス会議の分類に応じたいわゆる「ｃＧＶＨＤの示差的特徴」のいずれかを示す。
ＨＳＣＴ後の２つのタイプの眼乾燥が言及されている；１つは、眼乾燥の発症後すぐに生じる反射涙の減少を有する、重度の眼表面および涙機能の損傷を有し、一方で、もう１つは、正常な反射涙を有して軽度である。眼乾燥は、典型的に移植の６か月後に生じ、重症度は、ｃＧＶＨＤおよびマイボーム腺疾患の存在と関連していることが報告された。ｃＧＶＨＤ関連の重度の眼乾燥の発症は、軽度の眼乾燥の発症より早い。例えば、重度の眼乾燥は、ＨＳＣＴの６．８±２．５か月後に生じ、一方、軽度の眼乾燥は、ＨＳＣＴの１３．２±９．１か月後に生じる。２５人のＨＳＣＴ後の患者の５０の眼と１４人の年齢が一致した健康な対照の２８の眼との比較試験は、ＭＧ閉塞、減少した角膜知覚、角膜の感受性、増強された涙液蒸発速度、減少した結膜のＧＣＤ、増加した結膜の扁平上皮化生および炎症細胞が、眼乾燥の被験体のない正常な対照およびＨＳＣＴ後よりもｃＧＶＨＤ関連の眼乾燥においてより顕著であったことを示した。さらに、結膜の炎症細胞は、軽度の眼乾燥と比較して、重度の眼乾燥において著しくより多かった（Ｐ＜０．０３）。さらに、最も重度の眼乾燥患者は、全身性のｃＧＶＨＤを有していたが、軽度の眼乾燥患者の群においては、ほんの少しの患者しか全身性のｃＧＶＨＤを有さなかった。これらの結果は、ｃＧＶＨＤ関連の重度および軽度の眼乾燥疾患における異なる病理過程を示唆した。包括的な眼表面の変更が、ＨＳＣＴ後の患者において顕著であったため、患者がｃＧＶＨＤ関連の眼乾燥を有してしていたか否かにかかわらず、それらの結果は、炎症過程の程度がｃＧＶＨＤ関連の眼乾燥の結果における中心的な役割を有するようであることを示唆している。結膜のブラシ細胞診の検体は、眼乾燥の被験体のない正常な対照およびＨＳＣＴ後と比較して、ｃＧＶＨＤ関連の重度の眼乾燥および軽度の眼乾燥両方の患者における炎症細胞のかなりの増加を示した。その上、重度の眼乾燥の検体における炎症細胞の数は、軽度の眼乾燥の検体におけるよりも著しく多かった。さらに、多くの炎症性マーカーが、ｃＧＶＨＤ関連の眼乾燥患者から、結膜および涙腺の生検サンプル中に現れ、炎症が、ｃＧＶＨＤ関連の眼乾燥の病因に関係することが確認された。
【０４９２】
ｃＧＶＨＤ中の多くの瘢痕化の合併症をもたらす可能性のある１つの原因は、浸潤性ドナーリンパ球による慢性炎症によって放出されたサイトカインの結果としての結膜の基底上皮および涙腺筋上皮のＥＭＴによるものある。以前に、炎症および過度の繊維症が、慢性移植片対宿主病（ｃＧＶＨＤ）の顕著な組織学的特徴であることが認識されたが、これらの変化の根底にある機構は未知のままである。ｃＧＶＨＤは、強皮症に似た特徴を表わし、これは、皮膚病変における顕著な線維症、肺線維症、および慢性免疫不全症を示している。眼のｃＧＶＨＤの臨床像は、乾燥した、ゴロゴロした（ｇｒｉｔｔｙ）、または有痛性の眼、結膜下の線維性血管性組織の形成を含む瘢痕性結膜炎、および結膜線維症の特性である、強膜短縮の発症を含む。皮膚病変における硬化の特徴に加えて、口腔における粘膜萎縮、食道の上部から中部３分の１における狭窄または狭窄症、硬化症による関節の硬直または拘縮、および肺内の閉塞性気管支炎も一緒に、全身性のＧＶＨＤ媒介性の線維症の特性を示している。影響を受けた外分泌腺および粘膜における主な組織学的結果は、軽度のリンパ球浸潤に付随する、間質の著しい線維化および線維芽細胞の数の顕著な増加である。臨床的に、眼乾燥の重症度は、リンパ球浸潤の量よりもむしろ、線維性変化の程度に関連しており、これは、過度の細胞外マトリックスの蓄積が、主として、外分泌腺の機能不全に寄与することを示唆している。間質での線維芽細胞はまた、リンパ球に付着することによって、およびヒト白血球抗原クラスＩＩおよび副刺激分子を発現することによって、炎症において役割を果たす。これらの結果はとともに、線維芽細胞がｃＧＶＨＤの病因に重要な役割を果たすことを示唆している。さらに、ｃＧＶＨＤ患者の涙腺に蓄積された線維芽細胞が、キメラ状態であることを発見した。したがって、循環するドナー由来の前駆体から生じる線維芽細胞およびレシピエント由来の線維芽細胞は、相互作用するＴ細胞によってｃＧＶＨＤを有する患者における過度の線維症に関係し得る。Ｔ細胞浸潤の抑制による炎症の制御が、ｃＧＶＨＤにおけるそれほど瘢痕性でない合併症につながるかどうかは未知のままである。
【０４９３】
以前に、ドナー由来の線維芽細胞が、ヒトｃＧＶＨＤの組織サンプルにおいて免疫組織化学的検査およびＹ染色体蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の方法を組み合わせることによって検出された。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （（２００２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６８：３０８８−３０９８）によって確立されたｃＧＶＨＤのネズミモデルを使用すると、上記の結果が再現され得る。このモデルでは、涙液量は、移植の３週間後に減少し始める。涙腺管のまわりの初期の線維症および進行性の線維症は、早くて移植の３週間後に検出され、ヒトのサンプルに類似した方法で最大で８週間徐々に進行する。ＧＶＨＤおよび対照の群の両方で成功させるために、この実験を２０回以上行い、結果として、全体的な再現は、涙腺組織サンプルおよび涙液量の分析に基づいて、７０−８０％になる。
【０４９４】
典型的な移植試験では、７−８週齢の雄および雌のＢ１０．Ｄ２（Ｈ−２ｄ）およびＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ，Ｓａｎｋｙｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｔｄ）のマウスは、成熟したＴ細胞のソースとして加えられた脾臓細胞を使用して、それぞれ、ドナーおよびレシピエントとして使用される。簡潔に言うと、雌のレシピエントのマウスは、Ｇａｍｍａｃｅｌ １３７Ｃｓのソース（Ｊ． Ｌ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｓａｎ Ｆｅｒｎａｎｄｏ， ＣＡ）から７００ ｃＧｙを致死的に照射される。およそ６時間後に、それらは、尾静脈によって、ＲＰＭＩ １６４０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中に懸濁された雄ドナーの骨髄（１×１０６／マウス）および脾臓（２×１０６／マウス）の細胞を注入される。対照群（同遺伝子型ＢＭＴ）は、同数の雄のＢＡＬＢ／ｃ脾臓および骨髄の細胞を受け取る雌のＢＡＬＢ／ｃのレシピエントのマウスから成る。（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６８：３０８８−３０９８）。ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３処置に対して、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、骨髄移植の７、１４、２１および２８日後などに、骨髄移植後の所定時間に結膜下注射によって投与される。
【０４９５】
処置の効果は、限定されないが、Ｍａｌｌｏｒｙ染色を使用する涙腺線維症の測定、活性化された線維芽細胞のマーカーとしての、コラーゲン特異的分子シャペロンである、ＨＳＰ４７を使用する、フィールド（ｆｉｅｌｄ）当たりの活性化された線維芽細胞の数の測定、木綿糸の試験を使用する、ピロカルピン刺激下での涙液（ｌａｃｒｉｍａｌ ｔｅａｒ）の産生の測定、およびＲＴ−ＰＣＲを使用する、ＨＳＰ４７、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＴＧＦベータのような線維形成性サイトカインのレベルの決定を含む、アッセイを使用して評価される。
【０４９６】
ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体による処置が、結果として、マウスモデルにおける涙腺線維症の減少をもたらすと予期される。その後、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ｃＧＶＨＤによって引き起こされた眼乾燥の処置のために、ヒト被験体への結膜下注射によって臨床設定中に投与される。
【０４９７】
幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、分離された天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、臍帯組織から単離される。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、羊膜から単離される。幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。
【０４９８】
実施例１５：マウスモデルにおける炎症の処置のためのＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の使用
この例では、抗炎症効能は、ＨＳＶ−１壊死性の角膜実質性角膜炎のネズミモデルにおいて試験される。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｗｉｇａ（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た合計２４０匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（６−８週齢）は、２ｍｇのケタミンＨＣｌおよび４００ｎｇのメピバカインＨＣｌの腹腔内注射によって麻酔をかけられる。各マウスに対して、片目の中央の角膜は、外科用顕微鏡の下で、２７ゲージの針を使用して、８つの水平の引っかき傷および８つの垂直の引っかき傷を有する十字模様で引っ掻かれる。各々の損傷した角膜に、ＨＳＶ−１ウイルス（ＫＯＳ株）の１×１０５のプラーク形成単位を含有している５μｌの懸濁液が適用され、それらは、Ｖｅｒｏ細胞上で慣例的に繁殖され、−８０℃で保存され、および標準プラークアッセイによって定量化される。ＨＳＶ−１注入後の１４日目に、重度の潰瘍化する実質性角膜炎を進行させたマウスの角膜は、研究用に含まれ（約５０％の収率）、３つの群に細分化され、その各々は、４０の角膜（臨床検査に対してｎ＝６、組織学的検査に対してｎ＝５、免疫染色に対してｎ＝５、サイトカインＥＬＩＳＡに対してｎ＝６、ＴＵＮＥＬに対してｎ＝５、およびフローサイトメトリーに対してｎ＝１０、および摩耗／バックアップ（ｂａｃｋｕｐ）に対してｎ＝３）から成る。無感染の僚眼は、陰性対照群として使用される。陽性対照群は、眼瞼を閉じるために、２ １０−Ｏナイロン縫合を使用して瞼板縫合術を受ける。実験のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３群は、陽性対照と同じ瞼板縫合術を受け、精製されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を含有している組成物の局所適用を１日４回受ける。実験のＨＡ群は、同じ瞼板縫合術を受けるが、１日４回ＨＡ単独の組成物の局所適用を受ける。２日後に、瞼板縫合術は、すべての３つの群で除去される。手術用顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、各角膜の間質炎症の重症度は、０乃至４＋のスコアによって評価され、１＋は２５％未満、２＋は５０％未満、３＋は７５％未満、および４＋は７５％から１００％の間の、角膜血管新生、角膜浮腫、および角膜菲薄化のある角膜混濁を有している。ＣＯ２チャンバー（ｃｈａｍｂｅｒ）による安楽死に続く頸椎脱臼後に、各群からの５つの角膜は、ＣＤ１１ｂ（好中球およびマクロファージ）、Ｆ４／８０（マクロファージ）、Ｇｒ−１（ＰＭＮ）、およびＣＤ３（Ｔ細胞）に対する一次抗体を使用して、凍結切片の免疫染色にさらされ（方法（Ｍｅｔｈｏｄ）を参照）、各群からの別の５つの角膜は、ヘマトキシリン−エンジン染色およびＴＵＮＥＬ染色を受ける。さらに、各群からの６つの角膜から調製された角膜のホモジェネートは、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦαのレベルのＥＬＩＳＡ測定にさらされる。コラゲナーゼによって各群の１０の角膜から放出された細胞は、ＭＴＴアッセイによって生細胞を、およびＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＰＥ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によってアポトーシス細胞を定量するフローサイトメトリーのために調製される。
【０４９９】
５０％のマウス ＨＳＶ−１感染の角膜が、研究のために含められる接種後の２週間で、重度の角膜実質性角膜炎（炎症）、角膜浮腫、および角膜潰瘍を進行させると予期される。２日後に、無感染の角膜は正常なままであるが、一方で、対照群での感染した角膜は、瞼板縫合術が除去されるときに、同様の重度な炎症を維持する。対照群に類似して、実験のＨＡ群における角膜は、同様の重度な炎症を示す。対照的に、実験のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３群の角膜は、炎症の減少を示し、これは、ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０、Ｇｒ−１、およびＣＤ３に対する組織学的検査および免疫染色に基づく炎症性（ＰＭＮ／マクロファージ）および免疫（Ｔ細胞）の浸潤の大幅な減少、ＥＬＩＳＡに基づくＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αのような炎症性および免疫性のサイトカインの大幅な減少、および角膜組織におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞、および陽性対照群および実験のＨＡ群と比較されたときに角膜からコラゲナーゼによって放出される（Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ／７−ＡＡＤを使用するフローサイトメトリー）死（ＭＴＴ）細胞およびアポトーシス細胞の大幅な増加に関連し、それらによって具体化される。まとめると、これらのデータは、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体が、このネズミのＨＳＶ−１モデルにおいて臨床的な抗炎症効能を発揮するという観念を支持している。
【０５００】
幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法で使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、単離された天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、臍帯組織から単離される。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、羊膜から単離される。幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法で使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。
【０５０１】
実施例１６：ウサギモデルにおける瘢痕化の阻害のためのＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の使用
本実施例では、抗瘢痕化の効能が、エキシマーレーザー支援のレーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）のウサギモデルにおいて試験された。いずれかの性別の、２．５−３．０ｋｇの体重（ＢＷ）の合計３０羽のＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギが、使用され、以下の３つの群（各々ｎ＝１０）に細分化される：非ＰＲＫ対照群、ＰＲＫ ＨＡ群、およびＰＲＫ ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３群。ＰＲＫの前に及びすべてのＣＭＴＦ試験の間、ウサギは、５ｍｇ／ｋｇのＢＷキシラジンおよび３０ｍｇ／ｋｇのＢＷケタミンの筋肉内注射によって、および局所的に０．５％のテトラカインＨＣｌ点眼剤（Ｏｒｔｏｐｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｏｒｐ，，Ｆａｉｒｔｏｎ，ＮＪ）によって麻酔をかけられる。２つのＰＲＫ群について、各動物の片目の角膜上皮は、切除領域よりわずかに大きな領域で鈍いスパーテルで軽く削ることによって、手動で除去され、剥皮された間質は、通常生理食塩水で灌注され、および過剰流体は、セルローススポンジで軽く除去される。標準の６ｍｍの直径の、９．０ Ｄ ＰＲＫの近視矯正ＰＲＫは、１１８μｍの予測される理論的な間質の切除深さを達成するために、ＬａｄｄａｒＶｉｓｉｏｎ Ｅｘｃｉｍｅｒ Ｌａｓｅｒ （Ａｌｃｏｎ， Ｆｔ． Ｗｏｒｔｈ， ＴＸ）を使用して行なわれる。ＰＲＫの直後およびその後に、ＰＲＫ ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３基は、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を含有している組成物を適用され、一方で、ＰＲＫ ＨＡ基は、ＨＡ単独を含有している組成物を、１日４回、その後、合計３週間の両方で適用される。さらに、すべてのＰＲＫ処置された眼は、局所的な０．１％のナトリウムジクロフェナク（ＰＲＫ後に一滴）および０．３％の硫酸ゲンタマイシン（３日間毎日３回）を注入される。
【０５０２】
インビボでのＣＭＴＦが、２４Ｘ面接触の対物レンズを有する修正されたＴａｎｄｅｍ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ （Ｔａｎｄｅｍ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｒｅｓｔｏｎ， ＶＡ）を使用して、ＰＲＫ前に、およびその１、２、３、および４週間後、２か月後および４か月後に、すべての手術された眼（各群からｎ＝６）上で行われる。角膜形態の標準的な共焦点の検査後に、ビデオカメラ設定（ゲイン、キロボルト、および黒レベル）は、マニュアルに切り替えられ、研究の間に一定を保たれて、すべてのスキャンの直接の比較を可能にする。ＣＭＴＦは、全体の角膜にわたって、連続的な、Ｚ軸スキャンとして行われる。角膜、上皮、および間質の厚さは、すべての領域をカバーする領域で１０の連続するＣＭＴＦスキャンを行うことによって、中央の３ｍｍの領域内にマッピングされる。光剥離特性の中心に対応する最も薄い間質領域から得られたデータのみが、続く計算に使用される。画像強度の深さに基づくＣＭＴＦ特性は、ＣＭＴＦ録画から生じる。角膜の光反射率が、ＣＭＴＦ特性によって測定され、角膜薄濁の評価としてのμｍ＊ｐｉｘｅｌ強度として定義された任意の単位（Ｕ）で表わされる。
【０５０３】
間質線維性組織の存在を特定および測定するために、各群（対照群および処置群）からの３のＰＲＫ処置された動物は、以前に報告されたように、０．２Ｍの炭酸水素ナトリウム中に溶解された、０．５％の５−（４，６−ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）で生体染色される。２分の染色後に、眼は、局所用抗生物質の投与の前に、過剰な色素を除去するために徹底的に洗い流される。ＰＲＫの４か月後に、動物は、ナトリウムペントバルビタール（１２０ｍｇ／ｋｇのＢＷ）の静脈内注射によって安楽死させられる。安楽死後に、すべての角膜は、３分間、ｐＨ７．２のＰＢＳ中で２％のパラホルムアルデヒドの前眼房の灌流によってインサイツで固定され、切除され、新鮮な固定剤に入れられ、および４℃で保存した。組織は、その後、ＯＣＴに埋め込まれ、液体窒素中で急速凍結され、および凍結ミクロトームを使用して切断された。組織は、光剥離の中央および最も深い部分を特定するために連続的に階段状に切断（ｓｔｅｐｐｅｄ ｓｅｃｔｉｏｎ）され、ケラトカン、ＣＤ３４３４、ＦＩＴＣ結合したファロイジン、ＥＤ−Ａフィブロネクチン、Ｓ−１００Ａ４およびα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）に対する抗体を使用して、免疫染色にさらされることで、（ＣＭＴＦ光反射率による）角膜薄濁の変化を、角膜実質細胞から線維芽細胞または筋線維芽細胞までの表現型の変化と相互に関連付けられる。さらに、ＤＴＡＦで染色されるこれらの眼において、堆積される線維性組織の厚さは、基底上皮細胞と、元来の、損傷されていない角膜基質を表わすＤＴＡＦ染色された角膜組織との間の距離を決定することによって測定される。
【０５０４】
インビボでの共焦点顕微鏡検査法は、特徴的な、上皮、基底膜、間質および内皮の特徴を明らかにすることが予期され、これは、インビボでのＣＭＴＦ特性が、非ＰＲＫ対照の角膜に加えて、ＰＲＫを受ける角膜についても分析されるときに、経時的に強度および位置が変化する十分に定義されたピークと好適に相関する。公開されたデータによると、ＰＲＫ処置された角膜は、表在性の上皮、光切除された間質表面、スピンドル状の線維芽細胞の層、および内皮から生じる４つのピークを示すが、一方で、非ＰＲＫ対照の角膜は、ＰＲＫの１週間後に、表在性の上皮、基底膜、および内皮から生じる３つのピークを示す。ＰＲＫの１週間後に、２つの実験群間の差はそれほどないことが予期される。ＰＲＫの２週間後に、実験のＰＲＫ ＨＡ群は、スピンドル状の線維芽細胞の細胞移動の進行が原因で、光切除された間質表面に近い、増加するピークの強度を示す。しかしながら、（ピークの高さによる）再増殖する線維芽細胞の強度が、実験のＰＲＫ ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３群において非常に低下されることが予期される。ＰＲＫの３週間後から４か月後までの期間に、スピンドル状の線維芽細胞の層に対応するピークは、実験のＰＲＫ ＨＡ群において無細胞の前部間質の再増殖の完了が原因で、光切除された間質表面から生じるピークと合わさり、結果として、光切除された間質表面に対応するピークの反射率の劇的な増加をもたらす。対照的に、実験のＰＲＫ ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３群においては、反射率のそのような劇的な増加はない。そのような光反射率の差はまた、特定の角膜内の構造から生じるＣＭＴＦピークの領域を計算することによって定量され得る。実験のＰＲＫ ＨＡ群が、ＰＲＫ後の最初２乃至３週間以内に、反射率強度の相当な線形増加を示し、その後、反射率のゆっくりとした線形低下を示すと予期される。対照的に、両方の期間に、実験のＰＲＫ ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３群の反射率の大幅な減少があると予期される。まとめると、これらのＣＭＴＦデータは、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体が、無細胞の前部間質の再増殖中の、角膜実質細胞の活性化、移動および細胞動員の阻害作用を働かせることを支持しており、これは、なぜ角膜の光散乱（薄濁）が、以前に報告された抗ＴＧＦ−β抗体に類似して減少されるかを説明している。結果として、活性化された、移動する、間質内の創傷治癒の角膜実質細胞の細胞性および反射性はほとんどなく、新しい間質細胞外マトリックスの沈着もほとんどなく、および前部間質において正常な休止状態の角膜実質細胞集団がより速く確立される。この結論は、ＰＲＫ後の２乃至３週間の期間に、実験のＰＲＫ ＨＡ群と比較したときの、実験のＰＲＫ ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３群における、活性化された角膜実質細胞（ケラトカンを発現する細胞におけるＦ−アクチン）、線維芽細胞（Ｓ−１００Ａ４の細胞質染色、ＥＤ−Ａフィブロネクチンの細胞膜発現）、および筋線維芽細胞（Ｓ１００Ａ４の核発現およびα−ＳＭＡの細胞質発現）の著しい減少によって確証される。また、ＰＲＫ ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３群において、基底上皮細胞とＤＴＡＦ染色された角膜組織との間の距離の著しい減少があることが予期されるが、これは、ＰＲＫ ＨＡ群と比較したときに、線維���組織がかなり少ないことを示している。
【０５０５】
幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、単離された天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、臍帯組織から単離される。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、羊膜から単離される。幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。
【０５０６】
実施例１７：アテローム性動脈硬化の処置のためのＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の使用
本実施例では、本明細書に記載される方法によって生成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、アテローム性動脈硬化の処置のために投与される。
【０５０７】
アテローム性動脈硬化は、炎症細胞集団、特にマクロファージの関与を含む。マクロファージの表現型転換は、疾患進行中に観察される。アテローム性動脈硬化では、循環する単球は、ＣＣＲ２および内皮接着媒介性の機構を介して血管の内膜内および内膜下の脂肪性沈着物の蓄積の部位に動員される。到着後、これらの細胞は、活性化されるようになり、マクロファージへと分化する。その後、脂肪性沈着物は、炎症細胞、平滑筋細胞の継続的な動員、および細胞外マトリックスの産生とともにプラークへと成熟し始める。初期のアテローム性動脈硬化における初期の浸潤するマクロファージ集団は、不均質であるが、優性にＭ２様の表現型を有する。病変の進行および拡張と同時に、優性にＭ１の表現型への転換が、観察されている。この表現型への転換は、マクロファージによるプラーク内の過剰な酸化された低密度リポタンパク（ＬＤＬ）の食作用、および局所的なＴｈ１細胞によるＩＦＮ−γの産生が原因であり得、結果的に、泡沫細胞マクロファージの発達をもたらす。泡沫細胞マクロファージは、プラークを不安定にする炎症促進性メディエーターおよびＭＭＰの産生につながる、高度に活性化された表現型を示し、これは潜在的に、血栓塞栓症につながる。Ｍ２からＭ１への転換を防ぐ又は選択的にＭ１マクロファージを消耗する治療は、動脈硬化性プラークの安定のための臨床的有用性の治療である。
【０５０８】
本明細書に記載される方法によって生成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、アテローム性動脈硬化を有する被験体に投与される。ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、例えば、炎症の部位で又はその近くでの移植のために、ステントなどの、移植可能な医療機器をコーティングすべく利用される。ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体でのアテローム性動脈硬化の処置は、炎症を減少させ、血栓塞栓症を防ぐと予期される。
【０５０９】
幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、単離された天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、臍帯組織から単離される。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、羊膜から単離される。幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。
【０５１０】
実施例１８：肥満症およびインシュリン抵抗性の処置のためのＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の使用
本実施例では、本明細書に記載される方法によって生成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、肥満症およびインシュリン抵抗性の処置のために投与される。
【０５１１】
脂肪組織マクロファージ（ＡＴＭ）は、痩せた状態および肥満状態の脂肪組織の著しい割合の細胞成分を含む。正常ヒトでは、ＡＴＭは、組織の細胞構成成分の１０パーセントも占める。それに比べて、肥満の被験体では、その数字は４０％にも高まる。正常な、非肥満の被験体では、ＡＴＭは、増加したベースラインのＳＴＡＴ６およびＰＰＡＲ−γの発現によって特徴付けられた、極性化されたＭ２表現型を有する。これらの細胞は、栄養素代謝に重要且つ有益な役割を果たす。ＰＰＡＲ−γの欠乏は、害されたＭ２マクロファージ機能および食餌誘発性の炎症およびインスリン抵抗性に対する感受性につながる。
対照的に、肥満中に脂肪組織に蓄積するＡＴＭは、強く極性化された炎症促進性のＭ１表現型を有している。これらの細胞は、高レベルのＴＮＦα、ＩＬ−６、およびＩＬ−１βを生成し、それらのすべても、インスリン抵抗性の個体から脂肪組織の増加したレベルにおいて観察される。高レベルの炎症促進性のメディエーターは、内在するインスリン処理の（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）細胞の機能を局所的に低下させる。
【０５１２】
本明細書に記載される方法によって生成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、肥満症またはインシュリン抵抗性に苦しむ被験体に投与される。ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、例えば、処置のためのゲルの溶液として投与される。ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体での処置が、炎症促進性のＭ１表現型からＭ２表現型までの脂肪組織マクロファージ（ＡＴＭ）の表現型転換を促進し、正常なインスリン処理を回復させると予期される。
【０５１３】
幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、単離された天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、臍帯組織から単離される。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、羊膜から単離される。幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。
【０５１４】
実施例１９：１型糖尿病の処置のためのＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の使用
本実施例では、本明細書に記載される方法によって生成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、１型糖尿病の処置のために投与される。
【０５１５】
真性糖尿病１型（１型糖尿病、Ｔ１ＤＭ、ＩＤＤＭ、または以前では若年型糖尿病）は、膵臓のインスリンを分泌するベータ細胞の自己免疫性の破壊から結果的に生じる真性糖尿病の形態である。インスリンの続く欠如は、増加した血中および尿中のグルコースにつながる。典型的な症状は、多尿症（頻尿）、多飲症（口渇感増強）、過食（空腹感の増長）、および体重減少である。
【０５１６】
本明細書に記載される方法によって生成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体でコーティングされた自己由来または同種異型のインシュリンを分泌する細胞を含有しているマイクロカプセルの形態で、１型糖尿病に苦しむ被験体に投与される。マイクロカプセルは、例えば、注入によって、被験体に投与される。ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３でコーティングされたマイクロカプセルでの処置が、被験体において放出されるインスリンの分泌を可能にし、細胞治療またはマイクロカプセルに対する炎症反応を防ぐか、または減少させ、それによって、１型糖尿病およびその症状を軽減すると予期される。
【０５１７】
幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、単離された天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、臍帯組織から単離される。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、羊膜から単離される。幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。
【０５１８】
実施例２０：線維症の処置のためのＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の使用
本実施例では、本明細書に記載される方法によって生成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、線維症または線維性障害の処置のために投与される。
【０５１９】
特発性肺線維症（ＩＰＦ）、肝線維症および全身性硬化症などの、進行性の線維性疾患は、マクロファージによって厳密に調節される。「線維症促進性の」マクロファージは、Ｍ１特性を示し、線維芽細胞および筋線維芽細胞を直接活性化する、ＴＧＦβ１、ＰＤＧＦおよびインスリン様成長因子１を含む、様々なメディエーターを生成し、これは、ＥＣＭ沈着を制御する。線維症促進性のマクロファージはまた、ＭＭＰ、ＴＩＭＰ、およびＩＬ １βを生成する。ＩＬ−１βは、ＩＰＦの特徴に類似した特徴を有する線維性障害である、ブレオマイシン誘発性の肺線維症の重要な誘発因子である、ＩＬ １７を生成するように、ＴＨ１７細胞を刺激する。Ｍ２様のマクロファージによる、ＩＬ１０、ＲＥＬＭαおよびＡＲＧ１の生成は、線維症を抑える。
【０５２０】
本明細書に記載される方法によって生成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、線維症または線維性障害に苦しむ被験体に投与される。ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、例えば、溶液、ゲルとして、または移植可能な医療機器上のコーティングとして投与される。ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体での処置が、線繊維芽細胞および筋線維芽細胞のＭ１のマクロファージおよび活性化を減少させ、被験体の影響を受けた部位に存在するＭ２マクロファージの量を増加させると予期され、それによって、瘢痕化などの、線維症およびその症状を抑える。
【０５２１】
幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、単離された天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、臍帯組織から単離される。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、羊膜から単離される。幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。
【０５２２】
実施例２１：慢性炎症の処置のためのＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の使用
本実施例では、本明細書に記載される方法によって生成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、関節リウマチなどの、慢性炎症疾患の処置のために投与される。
【０５２３】
関節リウマチを含む、多くの自己免疫性疾患は、Ｆｃ受容体を活性化して、マスト細胞およびマクロファージの活性化および好中球浸潤を引き起こす、自己抗体に対する炎症反応を含む。これは、激しい局所的な炎症反応につながり、解消されないと、修復および破壊のサイクルによって時間をかけて組織損傷につながる。関節リウマチでは、ＣＳＦ１は、構成的に滑膜線維芽細胞によって生成され、組織を浸潤する単球およびマクロファージを動員する。さらに、局所的に生成されたＣＳＦ１は、ＲＡＮＫｌとともに、単球の破骨細胞への分化を誘発し、これは骨損失を引き起こす。
【０５２４】
本明細書に記載される方法によって生成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、関節リウマチなどの、慢性炎症疾患に苦しむ被験体に投与される。ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、例えば、溶液、ゲルとして、または移植可能な医療機器上のコーティングとして投与される。ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３での処置が、Ｍ１の炎症誘発性マクロファージを抑え、好中球アポプトーシスを誘発し、および破骨細胞の分化を阻害し、それによって、炎症性疾患およびその症状を処置すると予期される。
【０５２５】
幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、単離された天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、臍帯組織から単離される。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、羊膜から単離される。幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。
【０５２６】
実施例２２：急性炎症反応の処置のためのＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の使用
本実施例では、本明細書に記載される方法によって生成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、心筋梗塞、脳卒中または敗血症などの疾病によって引き起こされた急性炎症反応の処置のために投与される。本明細書に記載される方法によって生成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、心筋梗塞、脳卒中または敗血症などの疾病によって引き起こされた急性炎症反応を有する被験体に投与される。ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、例えば、静脈注射によって溶液として投与される。ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体が、Ｍ１の炎症性マクロファージの抑制によって、急性炎症によって引き起こされた損傷を減少させるか又は防ぐと予期される。
【０５２７】
幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、単離された天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、臍帯組織から単離される。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、羊膜から単離される。幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。
【０５２８】
実施例２３：癌の処置のためのＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の使用
本実施例では、本明細書に記載される方法によって生成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、癌の処置のために投与される。
【０５２９】
腫瘍の発達および進行における多量の炎症細胞の関与が観察され、これは、一般に「くすぶり型（ｓｍｏｌｄｅｒｉｎｇ）炎症」と記載される。これらの観察は、炎症細胞と、マクロファージ、特に癌との間の確立された関連性につながった。発癌遺伝子の発達が、結果的に、癌の特徴的な（ｈａｌｌｍａｒｋ）微小環境をもらしたと最初に考えられ、その中で、形質転換細胞は、組織発達を促進し、アポトーシスを防ぐとともに、細胞毒性免疫反応（「内因性の経路」と称される）を抑える、サイトカインおよびケモキネスを分泌する。腫瘍形成につながる別の経路が存在することが現在認識されている。この「外因性の経路」は、最初は、持続性の微生物感染、自己免疫性疾患、または未知の起原の他の病因から結果として生じる、慣性的な炎症促進性の環境を特徴とする。これらの場合での大量の炎症メディエーターの慣性的な生成は、腫瘍細胞の増殖および生存に、または正常細胞中の遺伝的不安定性の誘発につながり得、結果的に、発癌遺伝子の発現および免疫抑制性のサイトカインの生成をもたらす。したがって、初期の腫瘍発達は、多くの例において、極性化された炎症性の、Ｍ１様のマクロファージ環境を特徴とする。
【０５３０】
本明細書に記載される方法によって生成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、固形腫瘍癌を有する被験体に投与される。ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、例えば、局所的、注入、移植的な用途のために、溶液、ゲルとして、または移植可能な医療機器上のコーティングとして投与される。ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３が、Ｍ１マクロファージの極性化を抑えることができるため、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３での処置が、癌または後期の表現型へのその進行を阻害するか又は防ぐと予期される。
【０５３１】
幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、単離された天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、臍帯組織から単離される。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、羊膜から単離される。幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。
【０５３２】
実施例２４：非治癒性の皮膚の創傷または潰瘍の処置のためのＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の使用
本実施例では、本明細書に記載される方法によって生成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、非治癒性の皮膚の創傷または潰瘍の処置のために投与される。
【０５３３】
治癒なしで、約３乃至４週間の期間存在する非治癒性の皮膚の創傷または潰瘍は、非治癒性潰瘍と呼ばれる。非治癒性を一般に引き起こす疾患は、血管疾患、糖尿病、皮膚癌および幾つかの感染である。
【０５３４】
本明細書に記載される方法によって生成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、非治癒性の皮膚の創傷または潰瘍を有する被験体に投与される。ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、例えば、創傷または潰瘍の部位での処置のために、溶液、局所的にゲルとして、または皮下に投与される。ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３での処置が、創傷治癒および組織再生のマクロファージのＭ２表現型を促進することによって、創傷または潰瘍の治癒を促進すると予期される。
【０５３５】
幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、単離された天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、臍帯組織から単離される。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、羊膜から単離される。幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。
【０５３６】
実施例２５：高リスクの角膜移植の処置のためのＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の使用
本実施例では、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、高リスクの角膜移植の処置のために投与される。ＥＧＦＰ＋マクロファージが両眼に対してＬＰＳ（片目に５μｇ）とともに基質内に注入される、Ｍａｆｉａマウス。各眼において、ＯＳ（左眼（ｏｃｕｌｕｓ ｓｉｎｉｓｔｅｒ）；左目）は、ＰＢＳ（２つまたは４つの注射部位）で処置され、一方で、ＯＤ（右眼（ｏｃｕｌｕｓ ｄｅｘｔｅｒ）、右目）は、ＬＰＳ注入直後に、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２つまたは４つの注射部位；１つの注射部位当たり、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３を含有している１ｍｇ／ｍｌのＨＡ組成物５μｌ）で１回処置される。全体の角膜の画像は、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、および７日目に、インビボでの生体顕微鏡法によって得られる。ＥＧＦＰ陽性細胞は、ＥＧＦＰ浸潤のレベルを決定するために、緑色蛍光の強度に基づいて数えられる。角膜移植のマウスモデルでは、結膜下部位へのＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の注入は、ＰＢＳのビヒクル対照と比較したときに、炎症（すなわちマクロファージの浸潤）を減少させ、移植角膜の生存率を改善すると予期される。
【０５３７】
幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、単離された天然のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、臍帯組織から単離される。幾つかの例では、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、羊膜から単離される。幾つかの例では、本明細書に記載される処置の方法に使用されるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３）である。
【０５３８】
実施例２６：臍帯（ＵＣ）中のＨＡ、ＰＴＸ３、ＴＳＧ−６、ＨＣ１、ＨＣ２、ＨＣ３およびビクニンの分配（Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）
本実施例では、ＨＡ、ＰＴＸ３、ＴＳＧ−６、ＨＣ１、ＨＣ２、ＨＣ３およびビクニンのインビボでの分配を、免疫染色によって臍帯（ＵＣ）中で検出した。ＵＣの組織凍結切片を、ＨＡ、ＰＴＸ３、ＴＳＧ−６、およびＨＣおよびビクニンを含むＩαＩの様々な成分のための免疫染色にさらした。ＵＣは上皮の層から成り、間質は、羊膜下の層および３つの道管、すなわち、１つは静脈、２つは動脈（図２０ａ、１つの動脈管を有する、相）を含むワルトン膠様質から構成された。強力な陽性ＨＡ染色を、ＵＣ上皮、羊膜下の層およびワルトン膠様質において観察し、弱いＨＡ染色を、血管壁（図２０ａ、ＨＡ）において観察した。ＨＡａｓｅ消化により、ＨＡに対する特異的な染色に一致する、前述のＨＡ染色は消滅した（図２０ａ、ＨＡ（＋ＨＡａｓｅ））。
【０５３９】
ＰＴＸ３の強力な陽性免疫染色は、ワルトン膠様質中に存在し、弱いＰＴＸ３染色は、羊膜下の層および上皮（図２０ａ、ＰＴＸ３）中に存在した。ＨＡａｓｅ消化は、羊膜下の層および上皮（図示せず）においてＰＴＸ３染色を増強せず、これは、弱いＰＴＸ３染色が、ＨＡによるマスキング効果が原因ではないことを示唆している。陽性ＰＴＸ３染色をまた、動脈および静脈の血管壁ではなく、道管（図示せず）の内皮において観察した。
【０５４０】
ＴＳＧ−６およびビクニンの両方は、全体のＵＣにおいて存在し、ＴＳＧ−６は主に、細胞内および細胞の近くに存在し、およびより多くのＴＳＧ−６が、ワルトン膠様質と比較して上皮および羊膜下にあった。上皮および血管壁が、かすかなＨＣ１染色を有していたことを除いて、ＨＣ１は、ＨＡと類似した局在性を有していた。ＨＣ２およびＨＣ３のない染色に対する弱さ（Ｗｅａｋ）は、ＵＣの間質中ではなく上皮中に存在した。これらの結果は、ＵＣが、ＡＭと比較したときに、豊富なＨＡ、ＰＴＸ３、ＴＳＧ−６、ＨＣ１およびビクニン、および不均衡に、より少ないＨＣ２およびＨＣ３をもたらしたことを示した。ＵＣが、上述のタンパク質、およびＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を構成的に発現したことが決定された。
【０５４１】
さらに、ＰＴＸ３は、ＡＭで報告されたものとは異なる分散パターンでＵＣ中に存在した。より多くのＰＴＸ３が、ＵＣのワルトン膠様質に存在し、より少ないＰＴＸ３が、上皮および羊膜下に存在した。対照的に、より多くのＰＴＸ３が、上皮およびＡＭでの間質の緻密層にあった。ＵＣは、以下のマーカーにおいてＡＭに類似したパターンを有していた：より多くのＨＡが、ＵＣの全体の間質中にあり、ＵＣの上皮中にはほとんどなかった。これは、ＡＭでのＨＡの分散パターンにおいて類似していた。ＴＳＧ−６を、ＵＣの上皮および羊膜下の細胞において主に局所化し、ビクニンを、全体のＵＣにおいて発券した。
【０５４２】
実施例２７：ＡＭおよびＵＣから連続して得られたＰＢＳおよびＧｎＥの抽出物の比較
本実施例は、ＡＭからのＰＢＳ抽出後の不溶性部分が、任意のＰＴＸ３、ＴＳＧ−６およびＩαＩに加えて、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体もまだ含有していたか否かを決定づけた。ＰＴＸ３、ＴＳＧ−６およびＩαＩがあったかどうか確かめるために、タンパク質を、ＰＢＳ抽出後に４ＭのＧｎＨＣｌによってＡＭの不溶性部分から抽出した。さらに、これらの２つの異なる抽出物中のＰＴＸ３、ＴＳＧ−６、ＨＣおよびビクニンを検出するために、ＰＢＳを有するＵＣも、４ＭのＧｎＨＣｌによって連続して抽出した。
【０５４３】
Ｈｅ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８４：２０１３６−２０１４６）に記載される方法に従って、ＡＭ、ＣＨおよびＵＣを、ＡＭに対して１：１（ｇ／ｍｌ）またはＵＣに対して１：１．５（ｇ／ｍｌ）で、冷たいＰＢＳ中でブレンダーによって均質化し、１時間４℃で混合した。混合物を、３０分間４℃で４８，０００ｇでの遠心分離にかけた。ＰＢＳ抽出物の上清を、ＡＭＥ、ＣＨＥおよびＵＣＥとして、それぞれ指定した。さらに、ＵＣからのワルトン膠様質の混合物も、ＰＢＳによって抽出し、そのような抽出物を、ＵＪＥと名付けた。ＰＢＳ抽出後のＡＭ、ＣＨ、ＵＣおよびＵＣ膠様質混合物の不溶性のペレットを、２４時間４℃で、４ＭのＧｎＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．８、４ＭのＧｎＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）によってさらに抽出した。３０分４℃で、４８，０００ｇでの遠心分離後、上清を、収集し、それぞれ、ＡＭＧｎＥ、ＣＨＧｎＥ、ＵＣＧｎＥおよびＵＪＧｎＥと名付けた。各抽出物中のＨＡおよびタンパク質の濃度を、それぞれ、ＨＡ ＥＬＩＳＡおよびＢＣＡアッセイによって検出した。
【０５４４】
ＧｎＨＣｌは、ＰＢＳ抽出後に不溶性ペレットから豊富なＨＡおよびタンパク質をさらに抽出した。
【０５４５】
連続するＰＢＳおよびＧｎＨＣｌの抽出物中のＨＡおよびタンパク質の濃度を、表１に要約し、ここで、ＨＡ／タンパク質の比率も、２つの抽出物間で比較した。一般に、４ＭのＧｎＨＣｌは、ＰＢＳ抽出後に、ＡＭ、ＣＨ、ＵＣおよびＵＣ膠様質混合物の不溶性ペレットから豊富なタンパク質およびＨＡをさらに抽出した。ＧｎＨＣｌ緩衝剤は、不溶性ペレットからＰＢＳよりも多いタンパク質を抽出したが、より少ないＨＡを抽出した。しかしながら、ＵＣＧｎＥは、ＡＭＥおよびＣＨＥに類似した量のタンパク質およびＨＡをまだ含有していた。すなわち、ＵＣは、ＰＢＳおよびＧｎＨＣｌの抽出物の両方において、ＡＭおよびＣＨよりも多くのＨＡを含有していた。
【０５４６】
【表１】
2019178144.tif 000003
【０５４７】
単量体、二量体、およびＨＭＷ ＰＴＸ３は、ＡＭ細胞と比較して、ＵＣ細胞のＰＢＳ抽出物のより多い量で存在した。しかし、ＨＭＷ ＰＴＸ３は、ＡＭ細胞においてＧｎＨＣｌ抽出物のより多い量で存在した。
【０５４８】
抗ＰＴＸ３抗体によるＡＭＥの分析は、天然のＰＴＸ３単量体のサイズに対応する〜４５ｋＤａのバンド、および充填ウェルの底でＨＭＷバンドを明らかにした（図２１のＡ、レーン４）。ＮａＯＨ処置は、４５ｋＤａのバンドに影響を与えなかったが、ＨＭＷバンドを完全に除去し、結果的にＰＴＸ３のＨＭＷスミアをもたらし（図２１のＡ、レーン５）、これは、ＮａＯＨ処置によるＨＣ−ＨＡ複合体におけるＰＴＸ３の顕著な特徴であり、そこでは、単量体ＰＴＸ３ではなく、９０ｋＤの二量体を、ＮａＯＨ処置により、またはそれなしで検出した（図２１のＡ、レーン２および３）。ＰＴＸ３のＨＭＷスミアは、ＰＴＸ３とＨＣ−ＨＡとの間で形成された複合体を表わした。ＣＨＥは、ＰＴＸ３バンドの同じパターンを有したが、ＮａＯＨ処置後にＰＴＸ３のスミアはより少なく、これは、免疫染色の結果と一致していた。胎盤抽出物でも、ＣＨＥと同じ結果であった。顕著なことに、ＰＴＸ３は、ＵＣＥでの単量体を除いて、二量体およびＨＭＷスミアにより存在し、その強度は、ＮａＯＨ処置後にさらに増加した。ＡＭＥと同様に、ＵＣＥも、ＡＭＥよりも多い、ＨＭＷのスミアリングパターンを作り出した。これらの結果は、ＵＣＥが、ＡＭＥよりも多くのＰＴＸ３を含有し、一方で、ＣＨＥおよび胎盤抽出物が、ＰＴＸ３をほとんど含有していなかったことを示した。
【０５４９】
ＡＭＥ（図２１のＡ）と比較して、ＡＭＧｎＥは、強いＨＭＷ ＰＴＸ３スミア、弱い二量体、およびＰＴＸ３の単量体レベルを示し、ＨＭＷ ＰＴＸ３スミアの強度は、ＮａＯＨ処置後にさらに増加し（図２１のＢ、レーン３および４）、これは、ＡＭＧｎＥが、ＡＭＥよりも多いＨＭＷ ＰＴＸ３を含有していたことを示した。より多くのＰＴＸ３が、ＡＭの不水溶性部分に存在した。ＣＨＧｎＥは、ＮａＯＨによる処置の有無にかかわらず、ＨＭＷ ＰＴＸ３スミアでなく、充填ウェル中にＨＭＷバンドのみを有していた。ＰＴＸ３スミアの強度が、ＡＭＧｎＥにおける強度よりも少し弱かった（図２１のＢ、レーン３および４）ことを除いて、ＵＣＧｎＥおよびＵＪＧｎＥは、ＮａＯＨ処置によって又はそれなしで、ＡＭＧｎＥと同じＰＴＸ３のパターンを有していた。ＵＣＧｎＥ中のＰＴＸ３スミアの強度も、ＵＣＥ中の強度より低く、これは、ＵＣＧｎＥがＵＣＥより少ないＨＭＷ ＰＴＸ３を含有していたことを示し；すなわち、より多くのＰＴＸ３が、ＵＣの水溶性部分中に存在した。
【０５５０】
上述の結果は、ＡＭおよびＵＣの両方がＨＭＷ ＰＴＸ３を含有していたことを示した。ＡＭでは、より多くのＨＭＷ ＰＴＸ３が、不水溶性であり、ＰＢＳ抽出後にＧｎＨＣｌによって抽出され得るが、一方で、ＰＢＳによって主に抽出され得る、ＵＣ中のより多くのＨＭＷ ＰＴＸ３が水溶性であった。
【０５５１】
ＩαＩおよびＨＣ１の両方は、主にＡＭ ＰＢＳ抽出物中にあるが、ＵＣでは、ほとんどのＩαＩがＰＢＳ抽出物中にあり、一方で、ＨＣ１はＧｎＨＣｌ抽出物中にあるが、より多くのビクニンが、他の２つの抽出物と差がなく、ＵＣＥよりもＵＣＧｎＥ中に存在する。
【０５５２】
図２２は、８０ｋＤａのＨＣ１バンドが、ＵＣＥ以外のすべてのＰＢＳ抽出物中に存在し、ＡＭＧｎＥ以外のすべてのＧｎＥ抽出物中に存在したことを示す。このバンドは、ＧｎＥではなく、すべてのＰＢＳ抽出物中でＮａＯＨによって増加され、これは、ＡＭが、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８７：１２４３３−１２４４４に一致して、ＮａＯＨによって放出された、遊離した及び結合した水溶性のＨＣ１（すなわち、ＨＣ−ＨＡにおいてＨＡに、およびＩαＩにおいてビクニンに結合したエステル）の両方を含有していたことを示している。ＵＣは、ＮａＯＨによって放出された水溶性の結合された（ｂｏｕｎｄｅｄ）ＨＣｌを含有し、また、ＳＤＳおよび２−ＭＥによって分離されたが、ＮａＯＨによる影響を受けなかった不水溶性の細胞外成分に結合した、不水溶性の遊離したＨＣｌも含有していた。これは、ＵＣ中の強力な陽性のＨＣ１染色と一致していた。ＨＭＷ ＨＣ１バンドは、すべてのＰＢＳおよび充填ウェル中のＧｎＨＣｌ抽出物中に存在し、ＮａＯＨによって減少され、これが、ＨＣ−ＨＡ複合体であったことを示している。ＨＭＷ ＨＣ１バンドは、ＵＣＪＧｎＥよりもＵＣＧｎＥにおいてより弱く、これは、ワルトン膠様質が、より多くの不水溶性のＨＣ−ＨＡ複合体を含有していたことを示している。遊離したＩαＩを、すべてのＧｎＥ抽出物ではなく、すべてのＰＢＳ抽出物において発見し、これは、それが水溶性であったことを示唆している。しかしながら、遊離したＰαＩを、すべてのＰＢＳおよびＧｎＨＣｌの抽出物において発見し、これは、ＰαＩが、ＩαＩとは異なる作用を有していたことを示唆している。より多くのビクニンを、他の２つの抽出物に差がなく、ＵＣＥよりもＵＣＧｎＥにおいて発見し、これは、ほとんどのビクニンが、ＵＣにおいて他の水不溶性分子に結合し、これが特有の機能を示していたことを強調している。
【０５５３】
ＴＳＧ−６は、ＵＣ ＧｎＨＣｌ抽出物ではなく、ＡＭのＨＭＷ複合体中に存在した。
【０５５４】
図２３は、ＡＭＥ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８７：１２４３３−１２４４４）で報告された、３５ｋＤａのＴＳＧ−６バンドが、すべての他の抽出物ではなく、ＡＭＧｎＥ中に存在していたことを示し、これは、ＴＳＧ−６がＵＣのＧｎＥ中に存在しなかったことを示している。このバンドは、ＮａＯＨによる影響を受けず、これは、ＴＳＧ−６が、ＮａＯＨによって開裂され得るＨＭＷの種に結合されなかったことを確証している。しかしながら、ＨＭＷ ＴＳＧ−６バンドを、ＵＣＧｎＥおよびＵＪＧｎＥではなく、ＡＭＧｎＥおよびＣＨＧｎＥにおいて発見した。さらに、このバンドは、ＮａＯＨによって変更されず、これは、ＴＳＧ−６がＨＭＷの種に強く結合されたことを示している。ＴＳＧ−６は、ＧｎＥからの４Ｘ超遠心分離によって精製されたＨＣ−ＨＡにおいて検出されず、これは、ＴＳＧ−６が、不溶性マトリックス中にまだ結合されているが、超遠心分離中にＧｎＨＣｌによって分離可能であることを示唆している。
【０５５５】
要約すると、ＧｎＨＣｌは、ＰＢＳ抽出後に、ＡＭおよびＵＣの不溶性部分から豊富なＨＡおよびタンパク質をさらに抽出した。ＵＣは、ＰＢＳおよびＧｎＨＣｌの抽出物の両方において、ＡＭおよびＣＨよりも多くのＨＡを含有していた。ＨＭＷ ＰＴＸ３は、ＡＭ ＧｎＨＣｌ抽出物中でより高いレベルであり、ＵＣ ＰＢＳ抽出物中でより高いレベルであった。より多くのＨＭＷ ＰＴＸ３を、ＰＢＳ抽出後に不溶性部分において保持した。ＨＣ１は、ＵＣ ＧｎＨＣｌ抽出物ではなく、主にＡＭ ＰＢＳ抽出物中にあった。ＨＭＷ ＴＳＧ−６は、ＵＣＧｎＥおよびＵＪＧｎＥではなくＡＭＧｎＥ中にあり、これは、ＴＳＧ−６が、まだ不溶性マトリックス中に結合されており、超遠心分離中にＧｎＨＣｌによって分離可能であったことを示している。
【０５５６】
実施例２８：ＡＭおよびＵＣ ＰＢＳの抽出物からの４回の連続する超遠心分離によるＨＣ−ＨＡ複合体の精製、およびＨＣ−ＨＡ複合体中のＰＴＸ３、ＨＣ、ビクニン、およびＴＳＧ−６の存在の検出
本実施例では、ＨＣ−ＨＡ複合体を、４回の連続する超遠心分離によってＡＭＥおよびＵＣＥから精製し、ＨＣ、ビクニンおよびＴＳＧ−６に加えて、ＰＴＸ３の存在を、ウェスタンブロットによってＡＭおよびＵＣ ＨＣ−ＨＡの複合体中で検出した。
【０５５７】
４ｔｈ ＡＭ ＨＣ−ＨＡ複合体は、より多くのＨＭＷ ＰＴＸ３およびＨＣ１を含有しており、２ｎｄおよび３ｒｄのＨＣ−ＨＡ複合体より純粋であった。
【０５５８】
抗ＰＴＸ３抗体を用いて、１−４ｔｈのＡＭ ＨＣ−ＨＡのウェスタンブロット解析は、ＰＢＳ抽出物中で発見された単量体と比較して、９０ｋＤａのバンド（二量体）を示した。これは、二量体の状態が、超遠心分離によって４Ｍ ＧｎＨＣｌ中でさらなる抽出によって分解されたことを示し、これによって、１ｓｔ、２ｎｄ、３ｒｄおよび４ｔｈのＨＣ−ＨＡ複合体における上部のゲル上部（ｇｅｌ ｔｏｐ）のＨＭＷバンドを明らかにしている（図２４のａ）。精製されたＰＴＸ３対照と比較して、９０ｋＤａのバンドはＰＴＸ３二量体であって、高分子量バンドはＰＴＸ３を含有しているＨＣ−ＨＡ複合体であった。ＨＡａｓｅ処置後、９０ｋＤａのバンドは、すべてのＨＣ−ＨＡ複合体では変化しなかったが、ＨＭＷスミアのバンドは、３ｒｄおよび４ｔｈの画分で漠然と検出された。すなわち、１ｓｔから４ｔｈでは、ＨＭＷバンドは徐々に消滅し、スミアが徐々に出現し、これは、４ｔｈのＨＣ−ＨＡ複合体でより増強された。すべてのＨＣ−ＨＡ複合体中で４５ｋＤａのＰＴＸ３単量体バンドはなかった。その結果は、ＨＣ−ＨＡ複合体が、ＨＣ−ＨＡに結合することができるＰＴＸ３の多量体の形態を含み、超遠心分離の回数が増加するとともに、ＰＴＸ３を含有しているＨＣ−ＨＡ複合体がより精製されたことを示した。ＨＡａｓｅのある又はそれのないＨＣ−ＨＡ複合体中の９０ｋＤａのＰＴＸ３二量体の存在は以下を示した：１）ＨＣ−ＨＡ中に存在するＰＴＸ３二量体は、ＳＤＳおよび２−ＭＥによって分離され、２）ＨＭＷ ＰＴＸ３は、ＳＤＳおよび２−ＭＥに耐性があった。２ＭＥによる生成物であるＰＴＸ３二量体は、以下でさらに確証される（図２４のａ）。
【０５５９】
抗ＨＣ１抗体を用いて、８０ｋＤａのＨＣ１バンドを、４つのすべてのＨＣ−ＨＡ複合体から、初期の１ｓｔおよび２ｎｄの画分においてのみ検出した（図２４のｂ）。ＨＡａｓｅ処置後、ＨＣ１バンドは増強され、幾つかのより小さなバンドも、１ｓｔから３ｒｄのＨＣ−ＨＡ複合体中に現われた。その結果は、精製されたＨＣ−ＨＡ複合体が、遊離したＨＣを含有しておらず、ＨＣ−ＨＡがＨＣ１で作られていたことを示した。上述のＰＴＸ３ウェスタンブロットの結果に一致して、超遠心分離の回数が増加するとともに、ＨＣ−ＨＡ複合体は、より精製された。すべてのＨＣ−ＨＡ複合体において、ＨＣ２（図２４のｃ）、ＨＣ３、およびＴＳＧ−６（図２４のｄ）は発見されなかった。
【０５６０】
ＴＳＰ−１は、ＰＢＳ抽出物および１−４ｔｈのＨＣ−ＨＡ複合体ではなく、ＡＭ ＧｎＨＣｌ抽出物中にのみ存在した。
【０５６１】
トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）は、ＰＢＳ抽出物および１−４ｔｈのＨＣ−ＨＡ複合体ではなく、ＡＭ ＧｎＨＣｌ抽出物中で三量体として検出されただけであった（図２５）。ＨＡａｓｅ処置後、それはスミアとして現われ、これは、ＴＳＰ−１が、不溶性水であって、ＨＣ−ＨＡに強く結合されたことを示している。しかしながら、そのような不溶性マトリックス中のＨＣ−ＨＡへの結合は、ＧｎＨＣｌおよびＣｓＣｌによって分離され得る。
【０５６２】
４ｔｈ ＡＭ ＨＣ−ＨＡ複合体のように、４ｔｈ ＵＣ ＨＣ−ＨＡ複合体は、ＨＣ２、ＨＣ３、ビクニンおよびＴＳＧ−６ではなく、ＰＴＸ３およびＨＣ１を含有しており、２ＭＥの欠如によって、ＰＴＸ３二量体は生成されなかったが、ＨＣ１がもたらされた。
【０５６３】
抗ＰＴＸ３抗体を用いて、ＨＡａｓｅ処置による又はそれのない、４ｔｈ ＵＣ ＨＣ−ＨＡのウェスタンブロット解析は、４ｔｈ ＡＭ ＨＣ−ＨＡ複合体（図２６のａ、レーン３および４）中のＰＴＸ３バンドのパターンに類似した４ｔｈ ＵＣ ＨＣ−ＨＡ複合体（図２６のａ、レーン５および６）中のＰＴＸ３バンドのパターンを示した。サンプル緩衝剤が２−ＭＥを含有していなかったときに、９０ｋＤａのＰＴＸ３二量体は、ＨＡａｓｅのある又はそれなしで、ＵＣ ＨＣ−ＨＡ複合体中で消滅し（図２６のａ、レーン７および８）、これは、ＨＣ−ＨＡ複合体中の９０ｋＤａのＰＴＸ３二量体の出現が、サンプル緩衝剤中の２−ＭＥによるＨＣ−ＨＡに結合したＰＴＸ３の減少が原因であったことを示している。抗ＨＣ１抗体を用いて、高分子量のＨＣ−ＨＡバンドのみが、４ｔｈ ＡＭ ＨＣ−ＨＡ複合体（図２６のｂ、レーン４）中での検出と同様に、４ｔｈ ＵＣ ＨＣ−ＨＡ複合体（図２６のｂ、レーン６）中で検出された。ＨＡａｓｅ後、ＨＣ−ＨＡバンドは消滅し、ＨＣ１バンドは、４ｔｈ ＡＭ ＨＣ−ＨＡ複合体（レーン５）のように増加した（レーン７）が、その強度は、４ｔｈ ＡＭ ＨＣ−ＨＡ中におけるよりも少し弱かった。これは、ＨＣ１が、ＰＴＸ３とＳ−Ｓとの複合体を形成したことを示した。サンプル緩衝剤が２−ＭＥを含有していなかったときに、総称的なＨＣ１よりわずかに高いＭＷを有する強いバンドが現われ、これは、ＨＣ１が、Ｓ−Ｓを介してＰＴＸ３に連結されたことを示している。４ｔｈ ＡＭおよびＵＣ ＨＣ−ＨＡ複合体において、ＨＣ２、ＨＣ３（図２６のｃ）、ビクニン（図２６のｄ）およびＴＳＧ−６（図２６のｅ）は検出されなかった。
【０５６４】
実施例２９：４回の連続する超遠心分離による全体的なＡＭおよびＵＣ ＧｎＨＣｌ抽出物からのＨＣ−ＨＡ複合体の精製およびＰＢＳ抽出物の比較
本実施例は、より多くのＨＣ−ＨＡ複合体をＡＭおよびＵＣから得ることができ、ＨＣ−ＨＡ複合体が、ＰＴＸ３およびＨＣ−ＨＡのより合理的な構成を有し、およびそれが診療所においてより有効な治療上の役割を有していたことを決定づけた。ＡＭおよびＵＣを、６ＭのＧｎＨＣｌ緩衝剤（２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６ＭのＧｎＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのアミノカプロン酸、１０ｍＭのＮ‐エチルマレイミド、２ｍＭのＰＭＳＦ）によって抽出し：ＡＭおよびＵＣからのＧｎＨＣｌ抽出を、１：４（ｇ／ｍｌ）でＡＭおよびＵＣの粉末に６ＭのＧｎＨＣｌ緩衝剤を加えることによって行った。サンプルを、４℃で一晩混合し、３０分間４℃で、４８，０００ｇでの遠心分離にかけた。上清は、ＧｎＨＣｌ抽出物であった。４ｔｈ ＨＣ−ＨＡ複合体を、ＰＢＳ抽出物からの４ｔｈ ＨＣ−ＨＡの精製用の手順と同じ手順を使用して、ＡＭおよびＵＣ ＧｎＨＣｌの抽出から精製した。ＰＴＸ３、ＨＣ、ビクニン、ＴＳＧ−６および恐らく他のタンパク質を検査するために、ＨＣ−ＨＡ複合体の特徴づけを、ウェスタンブロッティングによって行った。ＨＣ−ＨＡのアガロースゲルを、ＨＡの内容物および分子量を見るために流した（ｒｕｎ）。
【０５６５】
ＧｎＨＣｌは、ＰＢＳよりもＡＭおよびＵＣから、より多くのＨＣ−ＨＡ複合体を抽出した。
【０５６６】
ＡＭおよびＵＣからのＧｎＨＣｌ抽出物を、ＡＭＥＧおよびＵＣＥＧと名付け、それらのＨＡおよびタンパク質の含有量を、それぞれ、ＢＣＡアッセイおよびＨＡ ＥＬＩＳＡによって検出した。４ｔｈ ＨＣ−ＨＡ複合体を、ＧｎＨＣｌ抽出から精製し、それらのＨＡおよびタンパク質の含有量を、同様に検出した。表２は、ＰＢＳおよびＧｎＨＣｌの抽出物の両方におけるタンパク質およびＨＡの内容物およびそれらの４ｔｈ ＨＣ−ＨＡ複合体を要約している。その結果は、ＡＭおよびＵＣ ＧｎＨＣｌの抽出物が、相対的なＰＢＳ抽出物と比較して、より多くのＨＡを含有し、より高いＨＡ／タンパク質の比率を有していることを示した。さらに、より多くのＨＣ−ＨＡ複合体を、ＧｎＨＣｌ抽出物から精製した。
【０５６７】
【表２】
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【０５６８】
ＡＭ ４ｔｈ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡ複合体は、ＨＡａｓｅまたはＮａＯＨの処置によって又はそれなしで、より多くのＨＣ１およびＨＭＷ ＰＴＸ３を含有していたが、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡよりは少なく、ＰＢＳおよびＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡの両方は、ＴＳＰ−１を含有していなかった。
【０５６９】
抗ＨＣ１抗体を用いて、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、充填ウェルに加えてＰＢＳ ＨＣ−ＨＡにおいてもＨＭＷバンドを示したが、ＨＡａｓｅ消化は、より弱いＨＣ１を放出しただけであった（図２７のａ、レーン６および７）。ＮａＯＨ処置はまた、ＨＡａｓｅによって放出されたものよりも、少し高いＭＷを有したより弱いＨＣ１バンドを放出し（図２７のａ、レーン８）、これは、ＮａＯＨ処置後のＰＢＳ ＨＣ−ＨＡにおいては見られなかった。これらの結果は、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡがＨＣ１を含有したが、その量がＰＢＳ ＨＣ−ＨＡより少なかったことを示している。同様に、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡとは違って、抗ＰＴＸ３抗体を用いて、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、ＨＡａｓｅ消化を有して又はそれなしで、重要なＨＭＷ ＰＴＸ３スミアを示さず、二量体ＰＴＸ３を示しただけであった（図２７のｂ、レーン６および７）。ＮａＯＨはまた、ＨＭＷおよび二量体ＰＴＸ３の出現を結果としてもたらした。これらの結果は、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡが、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡより少ないＨＭＷ ＰＴＸ３を含有していたことを示している。
【０５７０】
ＨＣ１ブロットと同様に、ＰＴＸ３のより高いＭＷ二量体は、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいてＨＡａｓｅよりもＮａＯＨの後に生じた。これらの結果は、ＮａＯＨが、ＨＣ１をＨＡに連結するエステル結合を放出し、ＰＴＸ３と結合し得ることを集合的に示した。ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡが、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡよりも多くのＨＡ内容物が有していたため、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡ複合体は、ＰＴＸ３またはＨＣ１によって結合されなかったＨＡを含有し、結果的に、精製された生成物中の実際のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の内容物の減少およびその中のより少ないＨＣ１およびＨＭＷ ＰＴＸ３をもたらした。ＴＳＰ−１は、抗ＴＳＰ−１によってＰＢＳ ＨＣ−ＨＡ中で検出されなかった。当然のことながら、ＴＳＰ−１も、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡ中で検出されなかった。ＧｎＨＣｌ抽出物が、ＴＳＰ−１を含有していたため、これらの結果は、ＴＳＰ−１が、超遠心分離によって分離し、そのためＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡ中に存在しなかったことを示した。
【０５７１】
アガロースゲルは、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡ中で豊富なＨＡを示した。
【０５７２】
ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡは、上部の充填ウェルからアガロースゲルの下部までの連続的なＨＡスミアを示し、ＨＡａｓｅは、ＨＡスミアを完全に無効にした（図２８、レーン３および４）。ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、充填ウェル中のバンド、および４，５７０ｋＤａの位置から始まりアガロースゲルの下部までの、ＨＡスミアを示した（図２８、レーン５）。
ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡ中のＨＡは、充填ウェルからＨＡスミアの開始までの間で休止したが、その強度は、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡにおけるよりも強かった。さらに、ＨＡａｓｅは、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいてＨＡスミアおよびＨＭＷ ＨＡバンドを完全には無効にしなかった（図２８、レーン６）。４ｔｈの超遠心分離後のＧｎＨＣｌ抽出からの上部画分（１−６の画分）もまた、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡの「下部画分」と同じＨＡスミアのパターンを示した（図２８、レーン７および８）。これらの結果は、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡが、（ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡよりも小さなＭＷを有する）より多くのＨＭＷ ＨＡを含有したが、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡのウェスタンブロットにおいてＨＭＷ ＰＴＸ３スミアの欠如に対応したＨＭＷ ＨＡスミアの一部分を欠いていたことを示した。これは、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡ中に存在した、欠けているＨＭＷ ＨＡスミアが、ＰＴＸ３およびＨＣ−ＨＡの交差結合によって少なくとも部分的に形成され、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡの充填ウェル中のＨＭＷ ＨＡが、ＰＴＸ３以外の成分によって複合化されたことを示した。
【０５７３】
ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、クーマシー青色染色によってＰＢＳ ＨＣ−ＨＡ中に発見されない幾つかのタンパク質を含有していた。
【０５７４】
図２９のＡは、上部の充填ウェル中のバンド、大きな１４０ｋＤａおよび幾つかの小さな７０ｋＤａ、ダブレット５５ｋＤａおよび２０ｋＤａのバンドが、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡおよびＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡの上部画分において存在したが、他のすべてのＰＢＳ ＨＣ−ＨＡでは存在しなかったことを示している。これは、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡが、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡ中に存在しなかった幾つかのタンパク質を含有していたことを示した。さらに、９０ｋＤａおよび２５ｋＤａのバンドも、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡの上部画分において視覚化された。ウェスタンブロットが、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡ中でＨＣ１を検出したため、ＨＣ１もまた、クーマシー青色染色によってＰＢＳ ＨＣ−ＨＡ中に存在したはずである。それがＰＢＳ ＨＣ−ＨＡ中に存在しなかった理由は、充填されたＨＣ−ＨＡが、過負荷によりゲルに入らなかったという事実が原因であった。１４０ｋＤａを、広帯バンドとして示したが、これは、それが砂糖部分を含有していたとことを示唆している。さらに、ＨＡａｓｅは、これらのバンドに影響を与えず、これは、これらの種がＳＤＳおよび２−ＭＥによって分離されたことを示している。
【０５７５】
ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡと比較して、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、上部の充填ウェル中のバンド、９０ｋＤａ、７０ｋＤａ、ダブレット５５ｋＤａ、３５ｋＤａおよび２０ｋＤａのバンドを示した（図２９のＢ、レーン４および５）。弱い１４０ｋＤａのバンドもその中に存在した。これらのバンドは、ＨＡａｓｅによる影響を受けなかった。さらに、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡの上部画分はまた、上部ウェルから、ＨＡａｓｅ処置後に減少した２００ｋＤａの部位までのスミアを示した。すべてのバンドは、ＵＣ ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡにおいて不在であった。これらの結果は、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡが、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡにおいて不在であった幾つかのタンパク質も含有し、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡが、それらが含有したタンパク質バンドに関するＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡとは異なっていたことを示した。
【０５７６】
上述の結果は、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡが、ＡＭおよびＵＣ両方からのＰＢＳ ＨＣ−ＨＡとは以下の点で異なっていたことを示した：（１）ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡが、（ウェスタンブロットからの）ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡよりも少ないＨＣ１およびＨＭＷ ＰＴＸ３を含有していた一方で、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡのように、ＴＳＧ−６、ＨＣ２およびＨＣ３もまた、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡ中に存在しなかった。（２）ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、より多くのＨＭＷ ＨＡを含有していたが、（アガロースゲルからの）ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡによって示されたウェスタンブロッティングにおいてＨＭＷ ＰＴＸ３スミアに対応した一片のＨＭＷ ＨＡを欠いていた。（３）ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、（クーマシーの青色染色ゲルからの）ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡにおいて発見されなかった、主としてＭＷ １４０ｋＤａを有する幾つかのタンパク質を含有していた。
【０５７７】
要約すると、ＧｎＨＣｌは、ＡＭおよびＵＣの組織からより多くのＨＡおよびタンパク質を抽出し、結果として、ＰＢＳ抽出と比較して、より高いＨＡ／タンパク質の比率をもたらした。（ＨＡ内容物に従う）より多くのＨＣ−ＨＡ複合体を、ＡＭおよびＵＣ両方のためにＧｎＨＣｌ抽出から精製した。ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、ＡＭおよびＵＣの両方のために、ＨＣ１およびＨＭＷ ＰＴＸ３を含有していたが、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡにおいてははるかに少なかった。ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡによって示されたウェスタンブロッティングにおいてＨＭＷ ＰＴＸ３スミアに対応したアガロースゲル中でＨＭＷ ＨＡスミアの種を欠いていた。ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡにおいて発見された幾つかのタンパク質を含有していた。
【０５７８】
実施例３０：ＡＭおよびＵＣから精製されたＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡ複合体中の未知のタンパク質バンドの同一性の決定
本実施例は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルを流した後に、脱グリコシルのある又はそれのない、ＡＭおよびＵＣからのＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡのＣＢ染色またはウェスタンブロット解析のいずれかによって、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいて未知のバンドの同一性を決定した。サンプルを、ＰＢＳおよびＧｎＨＣｌの抽出物両方からの凍結乾燥されたＡＭおよびＵＣの４ｘ ＨＣ−ＨＡ（３０μｇのＨＡを含有した）であった。凍結乾燥されたＨＣ−ＨＡを、３時間氷上で５０μｌのＴＦＭＳおよび２０μｌのアニソールでインキュベートし、１２５μｌのＮ−エチルモルホリンを有するＴＦＭＳで中和した。サンプルを、−２０Ｃで一晩または−８０Ｃで１時間、５−１０容量のアセトンで沈殿させた。サンプルを、遠心分離にかけ、乾燥したペレットを、電気泳動のためにＳＤＳサンプルの充填緩衝剤に溶解した。ケラチナーゼ（Ｅｎｄｏ−β−ガラクトシダーゼ）での酵素的脱グリコシル化を、ケラタン硫酸鎖およびＮ結合したオリゴ糖を除去するために行うか、あるいはコンドロイチナーゼ（Ｃａｂｃ）での酵素的脱グリコシル化を、コンドロイチン硫酸鎖を除去するために行った。ＨＣ−ＨＡ（３０μｇのＨＡを含有した）を、２時間３７Ｃで、ｐＨ５．８の、５０ｍＭの酢酸ナトリウム中で、０．１Ｕ／ｍｌのケラチナーゼでインキュベートするか、２時間３７ＣでＰＢＳ中で５Ｕ／ｍｌのＣａｂｃでインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルを、ＣＢ染色の試験のために流し、その後、ウェスタンブロット解析が続いた。
【０５７９】
ケラタン硫酸およびオステオアドへリンは、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡではなく、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡ中に存在した。
【０５８０】
ウェスタンブロット解析を行った。結果は、図３０のＢおよびＣで示される。抗ケラタン硫酸抗体でのウェスタンブロットは、ＨＡａｓｅ消化を有して又はそれなしで、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいて広域な７０ｋＤａ（６０−８０ｋＤａ）のバンドを示した（図３０のＢ、レーン６−８）が、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡにおいてはそうではなく、これは、この〜７０ｋＤのケラチン硫酸プロテオグリカンが、図３０Ｄで示される陽性の免疫染色の原因であったことを示した。この７０ｋＤのバンドは、クーマシー青色染色されたゲル（図３０Ａ）で示されたＨＡａｓｅ処置を有して又はそれなしで、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいて留意された同じバンドに対応した。
【０５８１】
この７０ｋＤのケラチン硫酸プロテオグリカンがＳＬＲＰであるかどうかをさらに決定するために、抗ルミカン、抗フィブロモジュリン、および抗オステオアドへリンの抗体を、ウェスタンブロットにおいて使用した。抗オステオアドへリン抗体は、ＨＡａｓｅ消化を有して又はそれなしで、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいて７０ｋＤのバンドではなく６０ｋＤのバンドを認識した（図３０のＣ、レーン６−８）が、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡにおいてはそうではなかった。ケラチン硫酸鎖を有するオステオアドへリンが、〜８０ｋＤの分子量を有する一方で、その非ケラチン硫酸タンパク質は、〜６０ｋＤである。６０ｋＤのサイズでのケラチン硫酸バンドが検出されたが、それは７０ｋＤの広域のサイズにおいてのみであり、これは、抗オステオアドへリンによって検出された６０ｋＤのバンドが、非ケラタン硫酸オステオアドへリンであったことを示した。ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、ＨＣ−ＨＡと密に結合した非ケラタン硫酸オステオアドへリンを含有し、６ＭのＧｎＨＣｌおよび塩化セシウムの存在下で４回の超遠心分離に耐性があった。しかし、それは、サンプル緩衝剤中でＳＤＳおよび２−ＭＥによって放出された。その結果はまた、７０ｋＤのケラチン硫酸塩プロテオグリカンが、オステオアドへリンではなかったことを示した。ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡで検出されたルミカンおよびフィブロモジュリンはなく、これは、８０ｋＤのプロテオグリカンが、ルミカンでもフィブロモジュリンでもないことを示した。
【０５８２】
ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡの脱グリコシル化および分析
ケラチナーゼを使用してすべてのグリカンを除去するために、およびコンドロイチナーゼを使用して特異的なグリカンを除去するために、ＨＣ−ＨＡを、ＴＦＭＳＡによって脱グリコシル化して、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいて１４０ｋＤおよび〜８０ｋＤのバンドに変化があったかどうかを確かめ、および〜８０ｋＤのケラチン硫酸プロテオグリカンが、ケラトカン、ＰＲＥＬＰまたはオステオグリカン（Ｏｓｔｅｏｇｌｙｃａｎ）であるかどうかを決定した。上述の脱グリコシル化の効果を確認する第一工程として、クーマシー青色染色を行った。
【０５８３】
図３１Ａでは、クーマシー青色（ＣＢ）に染色したゲル、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡ（図３１Ａ、レーン２）は、ゲルの上部において、ＨＭＷバンドと同様に、優性の１４０ｋＤａ、７０ｋＤａ、ダブレット５０ｋＤａ、２０ｋＤａおよび弱い３５ｋＤａのバンドの同じバンドも示した。Ｋ／Ｃ／Ｈは、大きな８０ｋＤａ、弱い１００ｋＤａ、および３０ｋＤａのバンドの出現をもたらすことを除いて、これらのバンドに大幅に影響を与えなかった（図３１Ａ、レーン３）。このパターンは、Ｃ／Ｋ／Ｈ下のＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡの上部画分から生じるパターンに類似していた（図３１Ａ、レーン６）。これらの結果は、１４０ｋＤａ、７０ｋＤａ、および５５ｋＤａのバンドが、非ケラタン硫酸化及び／又はコンドロイチン硫酸化されたものではなく、Ｃ／Ｋ／Ｈ後に大きな８０ｋＤａの種として放出されたＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいて他のケラタン硫酸化及び／又はコンドロイチン硫酸化されたタンパク質があったことを示した。ＴＦＭＳＡ処置は、２０ｋＤａのバンド以外の上述のすべてのバンドの消滅につながり、透明な新しい５０ｋＤａのバンドおよびＨＭＷスミアを生成した（図３１Ａ、レーン４）。ＴＦＭＳＡ／Ｈは、結果的に新しい２５ｋＤａのバンドをもたらスミアを消滅させたが、５０ｋＤａのバンドを変化させなかった（図３１Ａ、レーン５）。この結果は、１４０ｋＤａ、７０ｋＤａ、５５ｋＤａおよび８０ｋＤａのバンドが、異なる量のグリカンを有する５０ｋＤａの同じ種であったことを示した。
【０５８４】
５０ｋＤａのバンドが６０ｋＤａのオステオアドへリンから生じたかどうかを決定するために、ウェスタンブロット解析を、抗オステオアドへリン抗体を用いて行った。その結果は、図３１Ｃで示される結果と一致した、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおける６０ｋＤａの種を示した（図３１Ｂ、レーン４）。Ｃ／Ｋ／Ｈは、その分子量を変化させなかった（図３１Ｂ、レーン５および６）が、ＨＡａｓｅ（Ｔ／Ｈ）処置を有する又はそれのないＴＦＭＳＡは、それをより低い強度の５５ｋＤａの種へと完全に変化させた（図３１、レーン７および８）。Ｔ／Ｈを有するＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡの上部画分は、Ｔ／Ｈなしと比較して、より強いバンドを示したが、強度変更のないより小さなｍＷは示さなかった（図３１Ｂ、レーン９および１０）。これらの結果は、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡが、ケラタン硫酸およびコンドロイチン硫酸塩のない、オステオアドへリンを含有していたことをさらに確証した。ＴＦＭＳＡ処置後にオステオアドへリンのバンドの強度が減少した理由は、（１）タンパク質がＴＦＭＳＡによって分解された；（２）それが、ＴＦＭＳＡ処置後に放出された同じＭＷを有する他の大量のタンパク質によって遮断されたことが原因であった。オステオアドへリンは、処置なしではＰＢＳ ＨＣ−ＨＡにおいて検知不能であったが、ＴＦＭＳＡ／ＨＡａｓｅ処置後に、６０ｋＤａのダブレットのバンドが現れ、これは、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡが、ＨＡに密に結合された、微量のオステオアドへリンを含有していたことを示している。
【０５８５】
抗デコリン抗体でのウェスタンブロットは、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいて、非常に強力な広域の１４０ｋＤａの種（８０−１６０ｋＤａ）および弱いダブレット５０ｋＤａの種を示した（図３１Ｃ、レーン４；３１Ｄ、レーン４および５）が、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡにおいてはそうではなかった（図３１Ｃ、レーン２；３１Ｄ、レーン２および３）。広域な１４０ｋＤａの種が、１つのコンドロイチン硫酸またはデルマタン硫酸の鎖および異なる数のグリカンを有するデコリンに対応した一方で、ダブレット５０ｋＤａの種は、それほどグリコシル化しなかったデコリンに対応する傾向があった。ＨＡａｓｅは、デコリン種の影響を受けなかったため、ＳＤＳおよび２−ＭＥによって放出され得ることが示された。上述の考えは、７０ｋＤａの種を増加させた、Ｃ／Ｈ（図３１Ｃ、レーン５）、および同じ結果をもたらした、Ｃ／Ｈ／Ｋによって確証された（図３１Ｂ、レーン６）。故に、７０ｋＤａの種は、コンドロイチンのないデコリンであった。大きな広域の１４０ｋＤａの種が、Ｃ／ＨまたはＣ／Ｈ／Ｋのいずれによっても大幅に変化させられなかったため、この７０ｋＤａの種は少量の成分であった。ＴＦＭＳＡ処置は、広域な１４０ｋＤａの種を完全に消失させた一方で、脱グリコシル化されたデコリンのコアタンパク質に対応した大きな４３ｋＤａの種、および小さな９５ｋＤａ、８０ｋＤａおよび弱い３０ｋＤａの種を生じさせた（図３１Ｃ、レーン７）。ＴＦＭＳＡ／Ｈ処置は、すべてのこれらの種の強度が増強されたということを除いて、ＴＦＭＳＡ単独と同じ種のパターンを示し、これは、デコリンがＨＡに密に結合されたことを示している。ＴＦＭＳＡ／Ｈはまた、結果的に、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡからの弱い４３ｋＤａの種の放出につながり、これは、ＡＭ ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡが、ＨＡに密に結合された微量のデコリンも含有していたことを示している。ＴＦＭＳＡ／Ｈを有する又はそれのない、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡの上部画分は、後者よりも強い強度を有する下部画分と同じパターンを示し（図３１Ｃ、レーン９および１０）、これは、上部画分が豊富なデコリンも含有していたことを示した。上述の結果は、ＣＢ染色のゲルにおける大きな１４０ｋＤａ、７０ｋＤａ、およびダブレット５０ｋＤａの種が、ＣＳ、主として非ＣＳおよび非ＫＳを介して、デコリンによって形成されることを示した。
【０５８６】
デコリンとは異なり、抗ビグリカン抗体でのウェスタンブロットは、ＨＡａｓｅを有する又はそれのない、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡいおいて、４００ｋＤａでの１つの強力な領域を有するＨＭＷスミア、および弱い４５ｋＤａの種を示した（図３１Ｅ、レーン４；２Ｆ、レーン４および５）が、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡにおいてはそうではなかった（図３１Ｄ、レーン２；Ｆ、レーン２および３）。４５ｋＤａの種が、ビグリカンのコアタンパク質に対応した一方で、ＨＭＷスミアは、２つのコンドロイチン硫酸塩またはデルマタン硫酸の鎖を有するグリコシル化したビグリカンであった。ＨＡａｓｅは、４００ｋＤａを超えるＨＭＷスミアがより少ない４００ｋＤａの領域を増強し、これは、幾つかのビグリカンがＨＣ−ＨＡにも結合されたことを示した。Ｃ／ＨまたはＣ／Ｋ／Ｈは、ＨＭＷスミアおよび４５ｋＤａの種を大幅に変化させなかったが、恐らくコンドロイチンのないビグリカンであった７０ｋＤａの種を増加させた（図３１Ｅ、レーン５および６）。７０ｋＤａの種の量が非常に少なく、大きなＨＭＷスミアが、上述の処置によって大幅に変化しなかったため、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおけるほとんどのビグリカンは、ＣＳまたはＫＳに結合しなかった。ＴＦＭＳＡ処置は、ＨＭＷスミアを完全に消失させ、脱グリコシル化されたデコリンのコアタンパク質に対応した大きな４５ｋＤａの種、および弱い９５ｋＤａ、８０ｋＤａおよび３０ｋＤａの種を生じさせ（図３１Ｅ、レーン７）、これは、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおけるビグリカンの存在を示唆した。９５ｋＤａおよび８０ｋＤａの種が、部分的に脱グリコシル化されたビグリカンであった一方で、３０ｋＤａの種は、分解されたビグリカンであった。ＨＡａｓｅ処置と併用したＴＦＭＳＡ処置は、すべてのこれらの種の強度が増強されたということを除いて、ＴＦＭＳＡ単独と同じ種のパターンを示し、これは、ビグリカンがＨＡに密に結合されたことを示している。ＴＦＭＳＡ／ＨＡａｓｅを有する又はそれのない、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡの上部画分は、後者よりも強い強度を有する下部画分と同じパターンを示し（図３１Ｅ、レーン９および１０）、これは、上部画分が豊富なビグリカンも含有していたことを示した。抗ケラタン硫酸抗体でのウェスタンブロット解析は、分子の大きさを変更することなく、ケラチナーゼまたはコンドロイチナーゼの処置を有する又は有さない、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおける７０ｋＤａのケラタン硫酸化のタンパク質の存在を示し（図３１Ｇ）、これは、ケラチナーゼが、ケラタン硫酸を完全には除去しなかった、あるいはＫＳの量がこの種において微量であったことを示唆した。抗ＰＴＸ３抗体でのウェスタンブロットは、ＨＡａｓｅ単独の消化（図３１Ｇ、レーン４および５）を有する又は有さないものと比較して、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいてＫで示された及びＫ／Ｈでより多く示された増加したＨＭＷ ＰＴＸ３スミアを示した（図３１Ｈ、レーン６および８）。コンドロイチナーゼは、そのような効果はなく、これは、幾つかのＫＳを含有している種が、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいてＰＴＸ３に結合されたことを示した。同じ結果を、ケラチナーゼ消化を有する又は有さないＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡのウェスタンブロット解析からも得た（以下の図３２Ｇを参照）。ウェスタンブロットは、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいてビクニンに加えて、フィブロモジュリン、ルミカン、ケラトカン、ＰＲＥＬＰ、オステオグリシン、エピフィカン、ペリオスチンおよびＴＳＧ−６がなかったことを確証した。
【０５８７】
要約すると、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、ＨＣ−ＨＡに結合された豊富なデコリンおよびビグリカンを含有していたが、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡは、弱いデコリンを含有していただけでビグリカンを含有していなかった。ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡが、オステオアドへリンおよびケラタン硫酸を含有している種を含有していた一方で、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡは、そうではなかった。ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおける非常に少量のデコリンおよびビグリカンは、コンドロイチン硫酸鎖を含有していた。
【０５８８】
ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡの脱グリコシル化および分析は、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡではなく、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいてデコリンおよびビグリカンが豊富に存在していたことを示した。ケラタン硫酸、オステオアドへリンおよびビクニンも、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡ中に存在した。
【０５８９】
ＣＢ染色（図３２Ａ）は、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡ（図３２Ａ（レーン４））において上部の充填ウェル中で１６０ｋＤａ、９０ｋＤａ、７０ｋＤａ、ダブレット５０ｋＤａ、３５ｋＤａおよび２０ｋＤａのバンドの同じバンドを示した。大きな８０ｋＤａおよび弱い３０ｋＤａのバンドの出現を結果的にもたらすことを除いて、Ｃ／ＨまたはＣ／Ｈ／Ｋは、これらのバンドに大幅に影響を与えなかった（図３２Ａ、レーン５および６）。ＴＦＭＳＡ処置は、２０ｋＤａのバンド以外の上述のすべてのバンドを減少させたが、大きな５０ｋＤａバンド、小さな８０ｋＤａバンドおよびＨＭＷスミアを増加させた（図３２Ａ、レーン７）。ＴＦＭＳＡ／Ｈは、スミアおよび８０ｋＤａのバンドを消滅させたが、出現し、新しく形成された５０ｋＤａのバンドの強度を減少させた、弱い２５ｋＤａのバンドを結果的にもたらした（図３２Ａ、レーン８）。これらの結果は、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡから得られた結果と類似しており（図３１Ａ）、これは、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡが、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡと類似した構成を有していたことを示している。ＴＦＭＳＡ／Ｈを有する又は有さない、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡの上部画分は、下部画分と同じパターンを示し（図３２Ａ、レーン９および１０）、これは、それらが下部画分と同じ成分を有していたことを示した。脱グリコシル化のないＵＣ ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡは、充填ウェルにおいて及びその下でＨＭＷバンドを示し、同様に２０ｋＤａのバンドも示した。ＴＦＭＳＡ／Ｈは、ＨＭＷバンドを消失させたが、弱い８０ｋＤａおよび２５ｋＤａのバンド以外の５０ｋＤａバンドを主として増加させ、これは、ＵＣ ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡが、完全な脱グリコシル化およびＨＡ分解によって放出されただけの幾つかのグリコシル化したタンパク質を含有していたことを示唆している。
【０５９０】
抗デコリン抗体でのウェスタンブロット解析は、ＨＡａｓｅを有して又はそれなしで、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいて広域な１６０ｋＤａの種を示した（図３２Ｂ、レーン４および５）が、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡでは示さず（図３２Ｂ、レーン２および３）、これは、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡが、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡのように、デコリンを含有していたことを示している。その分子量は、異なるレベルのグリコシル化が原因で、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおける量とは異なっていた。ＨＡａｓｅは、１６０ｋＤａの種を大幅に減少させ、これは、それがＨＣ−ＨＡに結合されたことを示している。ＨＡａｓｅを有する又は有さないケラチナーゼはまた、１６０ｋＤａの種の強度も減少させ、これは、それが幾つかのＫＳを含有していたことを示している。顕著なことに、ＨＡａｓｅ消化を有する又は有さないＣは、１６０ｋＤａの種および上部ウェルの種の消滅につながったが、ＨＭＷスミアと同様に強い５０ｋＤａおよび９０ｋＤａの種を生じさせ、これは、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡ中のデコリンが、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡ中のデコリンと比較して、主としてコンドロイチン硫酸塩だったことを示ており、それらが含有していたンドロイチン硫酸鎖は少なかった。これらの結果は、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡがデコリンを含有し、ＵＣ中のデコリンが、（１）グリコシル化、（２）付けられるグリコサミノグリカンのタイプ、および（３）全体的な量においてＡＭとは異なっていたことをさらに確証した。
【０５９１】
抗ビグリカン抗体でのウェスタンブロットは、上部ウェルにおいて強いＨＭＷの種、４００ｋＤａの領域および１４０ｋＤａの領域でのＨＭＷスミア、およびＨＡａｓｅを有する又は有さないＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいて４５ｋＤａの種を示したが（図３１Ｃ、レーン４および５）、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡにおいてはそうではなかった（図３１Ｃ、レーン２および３）。ＨＡａｓｅは、ウェル中でＨＭＷの種に影響を与えることなく、４００ｋＤａの領域を増強し、これは、幾つかの種がＨＡに密に結合されたことを示唆している。ＨＡａｓｅを有する又は有さないケラチナーゼは、４５ｋＤａの種を減少させたことを除いて、上述の種を大幅に変化させず（図３２Ｃ、レーン６および８）、これは、４５ｋＤａの種がＫＳを含有したが、ほとんどの他のものはそうではなかったことを示唆している。コンドロイチナーゼ単独で、上部ウェルにおいてＨＭＷの種を無効にし、４００ｋＤａの領域の強度を減少させたが、それらの間のスミアで、強い広域な５０ｋＤａの種、１００ｋＤａの種および２８ｋＤａ種を増加させた（図３２Ｃ、レーン７）。コンドロイチナーゼ＋ＨＡａｓｅは、同じ結果を有し、全体のスミアはより増強され、２８ｋＤａの種は消滅した（図３２Ｃ、レーン９）。これらの結果は、デコリンに類似して、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡ中のビグリカンが、主として、コンドロイチン硫酸鎖をもたらすと示唆した。この結果は、コンドロイチンの硫酸化がより少ないＡＭ ＨＣ−ＨＡにおける結果とは異なる。また、ほとんどのビグリカンは、ＨＣ−ＨＡにおいてＨＭＷ複合体を形成し、幾つかはＨＣ−ＨＡに結合する。
【０５９２】
抗ビクニン抗体でのウェスタンブロットは、ＨＡａｓｅ消化を有する又は有さない、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおける広域の３５ｋＤａのバンドを示したが、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡにおいてはそうではなかった（図３２Ｄ、レーン４および５）。３５ｋＤａのバンドは、天然のビクニンのＭＷに対応する。ＨＡａｓｅを有する又は有さないケラチナーゼは、この３５ｋＤａのバンドを鋭くした（ｓｈａｒｐｅｎｄ）が、そのＭＷを変化させず（図３２Ｄ、レーン６および８）、一方で、ＨＡａｓｅ消化を有する又は有さないコンドロイチナーゼは、３５ｋＤａのビクニンを、２５ｋＤａのコアビクニンに変化させ（図３２Ｄ、レーン７および９）、これは、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおけるビクニンの存在、および報告されたように、ＣＳが含有されていたことをさらに確証している。ＨＭＷスミアがまた、コンドロイチナーゼ処置の後に形成されたため、ビクニンが、ＣＳを介してＨＣ−ＨＡに密に結合されることを示唆された。これらの結果は、ビクニンを含有していなかったＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡとは異なっていた。
【０５９３】
抗ＰＴＸ３抗体でのウェスタンブロットは、ＨＡａｓｅ消化のみによる又はそれなしのもの（図３２Ｅ、レーン４および５）と比較して、Ｈ、Ｋ、Ｃの後に、および特に、Ｋ／Ｈで、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおける増加したＨＭＷ ＰＴＸ３スミアを示した（図３２Ｅ、レーン６および８）。これらの結果は、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおけるＨＭＷ ＰＴＸ３の存在、およびＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおけるその強力な結合を確証した。さらに、そのような強力な結合は、ＫＳを含有している種の存在によってさらに助長され、その同一性は不明確なままである。（酵素的消化のない）我々の以前のデータが、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおけるＨＭＷ ＰＴＸ３の量を少なく見すぎていたかもしれないことも説明されている。
【０５９４】
抗ケラタン硫酸抗体でのウェスタンブロットは、ウェル中のＨＭＷの種およびＵＣ ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡにおける弱い５５ｋＤのバンドを示した。ＨＡａｓｅは、このバンドを変化させなかったが、６０ｋＤａのバンドをより明白にした（図３２Ｆ、レーン２および３）。しかしながら、１４０ｋＤのバンドは、ＨＡａｓｅ消化を有する又は有さない、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおける抗ケラタン硫酸抗体によって認識された（図３２Ｆ、レーン４および５）。ＨＡａｓｅ処置を有する又は有さないケラチナーゼは、１４０ｋＤａのバンドを消失させなかったが、主に３５ｋＤａのバンド、およびＰＢＳ ＨＣ−ＨＡに見られる６０ｋＤａおよび５５ｋＤａのバンドを含む、それらの間の幾つかの他のバンドを増加させた（図３２Ｆ、レーン６および８）。
【０５９５】
ＨＡａｓｅ処置を有する又は有さないコンドロイチナーゼはまた、１４０ｋＤａのバンドを消失させなかったが、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡに見られる６０ｋＤａおよび５５ｋＤａバンドと同様に、９０ｋＤａのバンドも増加させた（図３２Ｆ、レーン７および９）。コンドロイチナーゼ処置はまた、ＨＡａｓｅ処置後に減少したＨＭＷスミアの出現を結果的にもたらし、これは、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡが、ケラタン硫酸化のタンパク質以外の豊富なコンドロイチン硫酸化のタンパク質を含有していたことを示唆している。ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡ（１４０ｋＤａ）におけるケラタン硫酸化のタンパク質が、ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡ（〜８０ｋＤａ）におけるものとは異なるＭＷを有していたことは明らかであり、これは、鎖中の異なる量のグリカンが原因かもしれない。
【０５９６】
抗オステオアドへリン抗体を用いて、大きな６０ｋＤのバンドおよび弱い８０ｋＤのバンドが、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡではなく、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいて検出された（図３２Ｇ、レーン４）。これらの２つのバンドは、ケラチナーゼまたはコンドロイチナーゼまたはＨＡａｓｅによる明白な影響を受けなかった。８０ｋＤは、ケラチン硫酸化のオステオアドへリンであるはずであり、一方で、〜６０ｋＤは、非ケラチン硫酸化のオステオアドへリンであるはずである。その結果は、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡが、ケラチン硫酸化および非ケラチン硫酸化のオステオアドへリン両方を含有していたことを示唆した。
【０５９７】
要約すると、フィブロモジュリン、ルミカン、ケラトカン、ＰＲＥＬＰ、オステオグリシン、エピフィカン、ペリオスチンおよびＴＳＧ−６は、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいて検出されなかった。ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、デコリン、ビグリカン、オステオアドへリン、ケラタン硫酸およびビクニンを含有していた。ビグリカンおよびデコリンは、豊富にあったが、一方で、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡは、これらの種を豊富に含有していなかった。
【０５９８】
要約
ＡＭおよびＵＣのＰＢＳおよびＧｎＨＣｌの抽出両方から、４ｘ 超遠心分離によってＨＣ−ＨＡ複合体を精製した。ＧｎＥから精製されたＨＣ−ＨＡは、収率および化学構造においてＰＢＳ抽出から精製されたＨＣ−ＨＡとはかなり異なっていた（表１を参照）。量において、ＧｎＥから精製されたＨＣ−ＨＡは、ＰＢＳから精製されたものより多くのＨＡを含有していた。化学構造において：ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、より多くのＨＭＷ ＨＡ（ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡよりわずかに小さいＭＷ）を含有していたが、（アガロースゲルからの）ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡによって示されたウェスタンブロッティングにおいてＨＭＷ ＰＴＸ３スミアに対応した一片のＨＭＷ ＨＡを欠いていた。ＨＡａｓｅ消化を有して又は有さずに、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡよりも少ないＨＣ１およびＨＭＷ ＰＴＸ３を含有していたが、ケラチナーゼ＋ＨＡａｓｅの消化後、より多くのＰＴＸ３が、（ウェスタンブロットから）検出され、これは、ＨＭＷ ＰＴＸ３が、ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいてケラタン硫酸化のタンパク質に密に結合されたことを示唆している。ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡおよびＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡはいずれも、ＴＳＧ−６、ＨＣ２およびＨＣ３を含有していなかった。ビクニンは、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡ中に存在していたが、ＵＣ ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡ、およびＡＭ ＰＢＳおよびＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡの両方においてはそうではなかった。ＡＭ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、ＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡよりも比較的多く、豊富なデコリンを含有していた。ＡＭおよびＵＣ ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡの両方は、わずかな量のデコリンを含有していた。ＡＭおよびＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、特にＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいて、豊富なビグリカンを含有していた。ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡの中にはビグリカンは存在しなかった。ＡＭおよびＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、オステオアドへリンを含有していた。ＡＭおよびＵＣ ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡは、ビグリカン、ケラタン硫酸を含有している種、フィブロモジュリン、ルミカン、ケラトカン、ＰＲＥＬＰ、オステオグリシン、エピフィカン、ペリオスチン、およびオステオポンチン、ＴＳＰ−１を含有していなかった。ＡＭおよびＵＣ ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡにおいて、フィブロモジュリン、ルミカン、ケラトカン、ＰＲＥＬＰ、オステオグリシン、エピフィカン、ペリオスチンおよびオステオポンチン、ＴＳＰ−１、アスポリンはなかった。ＧｎＨＣｌ ＨＣ−ＨＡは、主として、（クーマシー青色染色のゲルからの）ＰＢＳ ＨＣ−ＨＡにおいて発見されなかったＭＷ ２００ ｋＤａ、８０ｋＤａ、および６０ｋＤａを有する、可視のタンパク質バンドを含有していた。
【０５９９】
【表３】
2019178144.tif 000005
【０６００】
【表４】
2019178144.tif 000006
【０６０１】
実施例３１：ヒト羊膜間質細胞によるＰＴＸ３の構成的な発現は、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の形成につながる。
本実施例では、ＡＭから精製されたＨＣ−ＨＡにおけるＰＴＸ３発現およびＡＭにおけるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の複合体の形成に対するその効果を検査した。
【０６０２】
実験手順
１．材料
塩酸グアニジン、塩化セシウム、ＥＤＴＡ、無水アルコール、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリス塩基、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、３−（Ｎ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンパルミチルアンモニオ）プロパンスルフォナート（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１６）、（４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフッ化物塩酸塩、アプロチニン、ベスタチン塩酸塩、Ｅ−６４、ロイペプチン、およびペプスタチンＡを含む）プロテアーゼ阻害剤の混合物、およびフッ化フェニルメタンスルホニルを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から得た。ストレプトマイセスヒアルロニダーゼ（ＨＡａｓｅ）およびビオチン化されたＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）は、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ｂｉｏｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）からのものであった。ダルベッコ変法イーグル培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２の栄養素混合物、ウシ胎児血清、ハンクス液、ゲンタマイシン、アムホテリシンＢおよびＲＩＰＡ緩衝剤を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）から購入した。Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ （３．５Ｋ ＭＷＣＯ）を、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ （Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ）からのものであった。ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔは、Ｐｉｅｒｃｅ （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）からのものであった。ＨＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔは、Ｃｏｒｇｅｎｉｘ （Ｗｅｓｔｍｉｎｓｔｅｒ， ＣＯ）からのものであった。４−１５％の勾配のアクリルアミドのｒｅａｄｙゲルおよびニトロセルロース膜は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ （Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）からのものであった。ＩαＩを、公開された方法（１，３８）に従って、我々の研究所でヒト血漿から調製した。ＰＴＸ３ ｍＡｂ（ＭＮＢ４）およびｐＡｂは、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ． （Ｐｌｙｍｏｕｔｈ， ＰＡ）からのものであった。組換え型のヒトＴＮＦ、組換え型のヒトＰｅｎｔｒａｘｉｎ ３／ＴＳＧ−１４およびヒト／マウスのＴＳＧ−６ ＭＡｂ（ＭＡＢ２１０４）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）からのものであった。全長ＩＴＩＨ１に対するマウス抗ヒトＩＴＩＨ１ポリクローナル抗体およびアミノ酸１２４−３２１に対するウサギ抗ヒトＩＴＩＨ２ポリクローナル抗体は、Ａｂｃａｍ Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）からのものであった。ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＲｅａｇｅｎｔおよびＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ＲＮＡの単離キットは、ＱＩＡＧＥＮ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からのものであった。内在性ヒトＰＴＸ３（ＡＣＡＣＵＵＧＡＧＡＣＵＡＡＵＧＡＡＡＧＡＧＡＧＡ）を標的とする、およびｓｉＲＮＡ対照オリゴヌクレオチド（スクランブルしたＲＮＡ）ｓｉＲＮＡを標的としないための、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴヌクレオチドは、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）からのものであった。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｉｎｇ（商標）Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔは、 ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ， Ｉｎｃ． （Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）からのものであった。超遠心機（ＬＭ８モデル、ＳＷ４１ローター）は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ． （Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， ＣＡ）からのものであった。
【０６０３】
２．細胞培養およびアガロースオーバーレイ
ヒト組織を、Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｌｓｉｎｋｉに従って処理した。新鮮なヒト胎盤を、Ｂａｐｔｉｓｔ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｏｕｔｈ Ｆｌｏｒｉｄａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによる認可（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｕｍｂｅｒ ０３−０２８）によって、Ｂａｐｔｉｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ （Ｍｉａｍｉ， ＦＬ）において選択的帝王切開で分娩した後の健康な母体から得た。主要なヒトＡＭの上皮のおよび間質の細胞（それぞれ、ＡＭＥＣおよびＡＭＳＣとして指定された）を、３７℃で５％のＣＯ２の加湿雰囲気下で、以前に記載されたように新鮮な胎盤から単離し（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． ２５： １９９５−２００５； Ｌｉ ｅｔ ａｔ． （２００８） Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２１５：６５７−６６４）、補足的なホルモンの上皮培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１、ｖ／ｖ）、５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、０．５％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、２ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、５μｇ／ｍｌのインスリン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、０．５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、０．１ｎＭのコレラ毒素、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１．２５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢから成る、ＳＨＥＭ）中で培養した（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５：１９９５−２００５； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７：５３７−５４８）。培地を、２日ごとに変更した。８０％のコンフルエンスでの細胞を、４８時間、０．５％のＦＢＳを含有しているＤＭＥＭ／Ｆ１２に切り替えて、細胞を休止させ、その後、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット解析にさらす前に、４時間または２４時間、２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦまたは２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βで処置した。アガロースオーバーレイの培養物に関して、ＡＭＥＣ、ＡＭＳＣおよびＨＳＦは、ＳＨＥＭ中の２ｘ１０４／ｃｍ２の密度で、１２ウェル（１ｘ１０５細胞／ウェル）および６ウェル（２ｘ１０５細胞／ウェル）のプレートにおいて播種される。培地は、１日目に、５％のＫｎｏｃｋＯｕｔ血清代替物および１ｍＭの２−ホスホ−Ｌ‐アスコルビン酸を含有している無血清ＳＨＥＭに変更され、さらに２日間インキュベートされる。培地の除去後、１ｍＭの２−ホスホ−Ｌ‐アスコルビン酸を有するＤＭＥＭ／Ｆ１２における３％のアガロース（低融点型、ＶＩＩ型、Ｓｉｇｍａ、Ａ９０４５）を、１ｍｌまたは０．５ｍｌでオーバーレイし、５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦとともに又はそれなしで、６または１２ウェルのプレートにつき、それぞれ、３ｍｌまたは１．５ｍｌの無血清ＳＨＥＭ培地を加える前に５−１０分間、室温で１ｍｍの厚さのゲル層を達成した。細胞を、５日目に培地変更の介入なしで採取した。
【０６０４】
３．ｓｉＲＮＡトランスフェクション
ＡＭＥＣおよびＡＭＳＣを、８０％のコンフルエンスまで６ウェルのプレート中のＳＨＥＭにおいて培養した。細胞を、４８時間０．５％のＦＢＳによってＤＭＥＭ／Ｆ１２に切り替え、１００ｎＭのＰＴＸ３ ｓｉＲＮＡまたはスクランブルされた（ｓｃ）核酸を用いてＰｅｐＭｕｔｅ（商標） ｓｉＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔでトランスフェクトした。４８時間後、細胞を採取し、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット解析にさらした。
【０６０５】
４．超遠心分離によるＡＭおよび無血清培養からのＨＣ−ＨＡ複合体の精製
ＨＣ−ＨＡ複合体を、以前に記載されたように、ＡＭおよび細胞培養から精製した（Ｈｅ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８４： ２０１３６−２０１４６； Ｙｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：５２４７−５２５７； Ｈｅ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ４９：４４６８−４４７５３２）。簡潔に言うと、Ｂｉｏ−ｔｉｓｓｕｅ， Ｉｎｃ． （Ｍｉａｍｉ， ＦＬ）から得た、凍結保存されたヒトＡＭを、小片へとスライスし、液体窒素中で凍結し、ＢｉｏＰｕｌｖｅｒｉｚｅｒによって微粉末へと粉砕した。粉末を、１：１（ｇ／ｍｌ）で冷たいリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝剤と混合した。混合物を、軽く撹拌しながら、１時間４℃で維持し、その後、４℃で３０分間、４８，０００ｇで遠心分離にかけた。その後、上清（ＡＭ抽出物として指定される）を、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのアミノカプロン酸、１０ｍＭのＮ−エチルマレイミド、および２ｍＭのＰＭＳＦを含有している、８ＭのグアニジンＨＣｌ／ＰＢＳ溶液（ｖ／ｖの１：１の割合で）と混合し、塩化セシウムとの、それぞれ、１．３５ｇ／ｍｌ（ＡＭ抽出物）または１．４０ｇ／ｍｌ（細胞抽出物）の密度に調節され、４８時間、１５℃、３５，０００ｒｐｍで等密度遠心法にさらした。結果として生じる密度勾配を、１２本のチューブに画分し（１ｍｌ／チューブ）、その中で、ＨＡおよびタンパク質の内容物を、それぞれ、ＨＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｅｓｔ ＫｉｔおよびＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して測定した。ほとんどのＨＡを含有していた、第１の超遠心分離からの画分を、貯蔵し、ＣｓＣｌの付加によって１．４０ｇ／ｍｌの密度にし、超遠心分離にかけ、上に記載されるのと同じ方法で画分した。ＨＡを含有していたが、検出可能なタンパク質を含有していなかった、第２の超遠心分離からの画分を、貯蔵し、ＣｓＣｌの付加によって１．４２ｇ／ｍｌの密度で、第３および第４の超遠心分離を継続した。第２および第４の超遠心分離からの画分を、蒸留水中で透析し、その後、１時間０℃で、１．３％（ｗ／ｖ）の酢酸カリウムを含有している３容量の９５％（ｖ／ｖ）のエタノールで２回沈殿させた。１５，０００ｇでの遠心分離後、ペレットを、簡単に空気乾燥し、−８０℃で保存し、それぞれ、剤はされたので、簡潔に飛行機で乾かされ、ＡＭの２ｎｄ ＨＣ−ＨＡおよび４ｔｈ ＨＣ−ＨＡとして指定した。
【０６０６】
５．免疫染色
アガロースオーバーレイを有する又は有さない、細胞培養物に加えてＡＭおよび絨毛膜切片（ｓｅｃｔｉｏｎ）を含有しているヒト胎児膜を、１５分間室温で、４％のパラホルムアルデヒドによって固定し、２０分間、ＰＢＳ中で０．２％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過性にした。１時間ＰＢＳ中で０．２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンによって遮断した後に、切片を、４℃で湿度室において一晩、ビオチン化されたＨＡＢＰ（ＨＡに対して、５μｇ／ｍｌ）、抗ＰＴＸ３、抗ＨＣ１または抗ＨＣ２の抗体（すべて、ブロッキング溶液中で１：２００に希釈された）でインキュベートした。ＰＢＳでの洗浄後、それらを、室温で１時間、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＨＡに対して、１：１００に希釈された）、またはそれぞれの二次抗体（すなわち、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の抗マウスＩｇＧ、またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５結合の抗ラットＩｇＧ）でインキュベートした。アイソタイプが一致した非特異的なＩｇＧ抗体を、対照として使用した。あるいは、切片を、固定前に、４時間３７℃で、５０Ｕ／ｍＬストレプトマイセスのＨＡａｓｅで処置した。核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２によって染色し、画像を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７００の共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して得た。
【０６０７】
６．リアルタイムＰＣＲ
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ＲＮＡ単離キットを使用して、細胞培養物から抽出した。ｃＤＮＡを、オリゴ（ｄＴ）プライマーにより、Ｃｌｏｎｅｄ ＡＭＷ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キットを使用して、１μｇの総ＲＮＡから逆転写した。第１ストランドのｃＤＮＡを、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ Ｆａｓｔ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘおよび特異的なＰＴＸ３プライマー（４６−４８）を使用して、ｑＰＣＲによって増幅した。グリセリンアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の遺伝子発現を、増幅された生成物の量を標準化するために使用した。
【０６０８】
７．ウェスタンブロット
培養上清を集め、細胞可溶化物を、冷たいＰＢＳで細胞を６回洗浄し、その後、軽く撹拌しながら４℃で３０分間１４，０００ｇで遠心分離にかけ、１時間４℃でＲＩＰＡ緩衝液中でインキュベートすることによって得た。培養上清および細胞可溶化物におけるタンパク質濃度を、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔで定量化した。サンプルを、２５℃で１時間、５０ｍＭのＮａＯＨ中でインキュベートするか、または０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ６．０）中に溶解し、２０ユニット/ｍｌのストレプトマイセスのＨＡａｓｅで又はそれなしで、１時間６０°Ｃでインキュベートした。その後、それらを、変性条件および還元条件下で、４−１５％（ｗ／ｖ）の勾配アクリルアミドのｒｅａｄｙゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、ニトロセルロース膜に移した。その後、膜を、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含有している、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５の、緩衝液中で、５％（ｗ／ｖ）の無脂肪牛乳で遮断し、その後、異なる一次抗体および続くそれぞれのＨＲＰ結合の二次抗体での連続するインキュベーションを行った。免疫反応性のタンパク質を、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｉｎｇ（商標） Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔによって視覚化した。
【０６０９】
結果
ＡＭの上皮および緻密な間質における陽性ＰＴＸ３染色。
抗ヒトＰＴＸ３抗体を使用する蛍光免疫染色を、上皮および無血管の間質の層からなる、新鮮なヒト胎児膜の断面上で行い、これは、緻密層および海綿層、および下位にある細胞が豊富な絨毛膜へとさらに細分化される（図３３、相）。陽性ＰＴＸ３染色は、上皮および緻密な間質の先端面において見られた。対照的に、ＰＴＸ３染色は、海綿状の間質および絨毛膜（図３３（ＰＴＸ３））において著しく減弱された。ＨＡａｓｅ消化は、後者においてＰＴＸ３染色を増強せず、これは、これらの２つの領域内の弱いＰＴＸ３染色が、マスキング効果が原因ではなかったことを示唆している。ビオチン化されたＨＡＢＰを使用して、強力な陽性ＨＡの免疫染色が、ＡＭ間質で見られ、比較的弱い染色が、ＡＭ上皮において見られた（図３３、ＨＡ）一方で、ＨＡの弱い染色が、ＡＭ間質の下位にある絨毛膜の上部層おいて見られたが、強い染色が絨毛膜の下部層で見られた。この染色は、組織切片がＨＡａｓｅによって予め消化されたときに消滅し（図３３、ＨＡ（＋ＨＡａｓｅ））、これは、ＨＡ染色が特異的であったことを示唆している。個々のＨＣの免疫染色はまた、ＡＭの上皮、間質細胞およびマトリックス、および絨毛膜において、陽性染色を明らかにした（図３３、ＨＣ１およびＨＣ２）。これらの結果は、主に緻密な間質および上皮において優性なＡＭ中のＰＴＸ３の存在を示唆した。
【０６１０】
ＡＭ可溶性の抽出物および精製されたＨＣ−ＨＡ複合体におけるＰＴＸ３の存在
ＡＭにおけるＰＴＸ３の存在をさらに調査するために、エステル結合を開裂する５０ｍＭのＮａＯＨの処置前後に、等張塩緩衝剤によって得られたＡＭ抽出物のウェスタンブロッティング分析を第１に行った。組換え型のＰＴＸ３は、４５ｋＤａ、９０ｋＤａ、１８０ｋＤａおよびＨＭＷの種として現われた（図３４、レーン２）。可溶性のＡＭ抽出物は、充填ウェル（主としてゲル化に入らない）の底部で、４５ｋＤａおよびＨＭＷの種を明らかにした（図３４、レーン３）。ＮａＯＨ処置は、４５ｋＤａの種に影響を与えなかったが、ＨＭＷの種を完全に除去し、結果的に、ＰＴＸ３のＨＭＷスミアをもたらした（図３４、レーン４）。これらの結果は、ＰＴＸ３が、ＡＭＥにおいて単量体およびＨＭＷ複合体として存在していたことを示唆した。後者が、ＨＣ−ＨＡ間のエステル共有結合を開裂することができるＮａＯＨによって、ＨＭＷスミアへと分離され得るため、充填ウェル中のＨＭＷ ＰＴＸ３を含有している種は、ＨＣ−ＨＡに結合するかもしれない。
【０６１１】
ＰＴＸ３がＡＭ ＨＣ−ＨＡ複合体に結合したかどうかをさらに確証するために、以前に報告されたように、２回および４回の連続する超遠心分離によって、ＡＭの可溶性の抽出物からＨＣ−ＨＡ複合体を精製し（Ｈｅ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８４：２０１３６−２０１４６．； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８７：１２４３３−１２４４４）、ＨＡａｓｅ消化を有して又はそれなしで、ウェスタンブロッティング解析を行った。可溶性のＡＭＥに見られた単量体とは対照的に、天然のＰＴＸ３二量体のサイズに対応する９０ｋＤａの種は、充填ウェルの底部で、ＨＭＷバンド以外のＡＭの２ｎｄおよび４ｔｈのＨＣ−ＨＡ複合体で示された（図３４、レーン５および７）。さらに、ＨＭＷスミアも、２ｎｄ ＨＣ−ＨＡにおいて弱く、４ｔｈ ＨＣ−ＨＡ複合体において強いことが分かった。ＨＡａｓｅ処置後、９０ｋＤａの二量体は、両方のＨＣ−ＨＡ複合体にとどまったが、ＨＭＷスミアは、４ｔｈ ＨＣ−ＨＡにおいて増強され、２ｎｄ ＨＣ−ＨＡにおいて増加され、ゲル上部におけるＨＭＷバンドの消失（図３４、レーン６および８）は、ＡＭＥで見られた結果に類似していた。ＨＡａｓｅを有する又は有さないＨＣ−ＨＡ複合体における９０ｋＤａのＰＴＸ３二量体の存在は、この９０ｋＤａの種（図示せず）の欠如を結果としてもたらす２−ＭＥの除去として２−ＭＥによって引き起こされたＨＣ−ＨＡからの分離によってもたらされることが分かった。これらの結果は、ＨＣ−ＨＡ複合体が、４回の超遠心分離にもかかわらず、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を形成するために、ＨＣ−ＨＡに結合されたＰＴＸ３を含有していたことを示唆した。
【０６１２】
抗ＨＣ１抗体でのウェスタンブロット解析は、ＨＡａｓｅ消化後に消滅した、充填ウェルの底部でのＨＭＷの種としてのＨＣ−ＨＡ複合体の存在（図３４、レーン１０−１３）、およびＨＡａｓｅ消化後にＨＣ−ＨＡ複合体から放出された、ＨＣ−ＨＡ複合体におけるＨＣ１の存在（図３４、レーン１１および１３）を示した。ＨＣ２およびＴＳＧ−６（図示せず）は検出されなかった。これらの結果は、ＡＭから精製されたＨＣ−ＨＡがＨＣ１を含有していただけであったことを集合的に確証した。また、２ｎｄ ＨＣ−ＨＡ複合体と４ｔｈ ＨＣ−ＨＡ複合体との間に主要な違いが見られ、すなわち、遊離した８０ｋＤａのＨＣ１バンドが、２ｎｄ ＨＣ−ＨＡ複合体においてのみ検出され、４ｔｈ ＨＣ−ＨＡ複合体では検出されず（図３４、レーン１１）、これは、後者が、遊離したＨＣ１を含有していなかったことを示唆している。４ｔｈ ＨＣ−ＨＡにおけるＨＡの存在を、上部の充填ウェルからゲルの下部までの連続的なＨＡスミアとして表示するアガロースゲル電気泳動法によって確証し、そのようなスミアリングは、ＨＡａｓｅ消化によって解消された。
【０６１３】
ＡＭＥＣおよびＡＭＳＣによるＰＴＸ３ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現
ＰＴＸ３が、ＡＭの上皮および間質細胞培養物によって合成されたと、その後断定した。報告されたように、これらの細胞を培養し（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５（８）：１９９５−２００５； Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２１５（３）：６５７−６４； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８７：１２４３３−１２４４４）、ＲＴ−ＰＣＲのために総ＲＮＡをおよびウェスタンブロット解析のためにタンパク質を抽出し、それらをヒト皮膚線維芽細胞（ＨＣＦ）と比較し、これは、ＴＮＦおよびＩＬ−１などの炎症促進性のサイトカインの刺激下でのみＰＴＸ３ ｍＲＮＡおよびタンパク質を発現すると報告された。予想通り、ｑＲＴ−ＰＣＲ結果は、ＰＴＸ３転写物の発現率が、休止するＨＳＦにおいて低かったが、ＴＮＦおよびＩＬ−１βによってアップレギュレートされたことを示した（図３５のＡ）。休止するＡＭＥＣおよびＡＭＳＣにおけるＰＴＸ３転写物の発現は低かったが、ＴＮＦまたはＩＬ−１βによって劇的に高められた（図３５のＡ）。ウェスタンブロット解析は、ＰＴＸ３タンパク質が、溶解物（４５ｋＤａ）において低く、休止するＨＳＦにおける培地中で検出不能であった（図３５のＢ、レーン２）が、ＴＮＦまたはＩＬ−１βの追加後に２４時間、培地ではなく溶解物中で検出されたことを確認した。対照的に、ＰＴＸ３タンパク質は、休止するＡＭＥＣにおいて検出可能であり、溶解物（４５ｋＤａ）および培地（４５ｋＤａおよび９０ｋＤａ）の両方においてＴＮＦまたはＩＬ−１ｂよって顕著に増加され（図３５のＢ、レーン５、６および７）、ＴＮＦは、ＩＬ−１ｂよりも有効であった。同じ結果が、ＡＭＳＣで示された（図３４のＢ、レーン８、９および１０）。これらのバンドがＴＮＦまたはＩＬ−１ｂの下の変化しなかったことが原因で、すべての細胞からの溶解物中の７５ｋＤａおよび１３５ｋＤａのバンドおよび培地中の５０ｋＤａのバンドが非特異的であったことを確認するために、ＰＴＸ３ ｓｉＲＮＡトランスフェクションを行い、溶解物中の４５ｋＤａの種および４５ｋＤａおよび９０ｋＤａの種の両方を実際にダウンレギュレートしたが、これらの非特異性のバンドではそうでなかった（図３５のＣ）。これらの結果は、ＰＴＸ３が、休止するＡＭ細胞によって、実際に合成および分泌され、炎症誘発性の刺激によってさらにアップレギュレートされたことを集合的に示唆した。
【０６１４】
ＡＭの間質細胞によるＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の生成
以前の研究は、ＨＣ−ＨＡ（すなわち、ＳＨＡＰ−ＨＡ）複合体が、ＦＢＳを補足された培地中の培養されたマウス経皮線維芽細胞の細胞層からを単離され得、単離されたＨＣ−ＨＡが、ＦＢＳから派生したＩαＩのＨＣ１およびＨＣ２の両方を含有していることを示した（Ｙｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：５２４７−５２５７； Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：２６７２５−２６７３０）。しかしながら、我々は、ＡＭ細胞が、その内因的に生成されたＩαＩを使用することによって、ＨＣ−ＨＡを生成すると報告した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８７：１２４３３−１２４４４）。ＡＭ細胞が、ＴＮＦおよびＩＬ−１によってさらに増加されたＰＴＸ３タンパク質を合成したため、我々は、それらが、ＰＴＸ３をも含有していたＨＣ−ＨＡを生成したかどうかを決定することを目指した。血清添加の条件下で、炎症促進性の刺激、例えばＴＮＦおよびＩＬ−１）下のみでＰＴＸ３を発現した、対照としてのＨＳＦを使用し（Ｙｏｎｅｄａ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：５２４７−５２５７； Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：２６７２５−２６７３０）（図３５）、ＴＮＦを有する又は有さない、無血清と血清添加の両方の条件下で培養された、ＡＭＥＣとＡＭＳＣを比較した。また、細胞単層上に３％のアガロースを重ね、なぜなら、この方法によって、分泌されたプロコラーゲンが、角膜実質細胞の培養物上の培地内よりもむしろ、細胞表面で又はその近くに捕捉されると分かったからである（Ｈａｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓａｒｃｈ． ８７：６０４−６１１； Ｅｔｈｅｒｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｍａｔｒｉｘ Ｂｏｉｌ． ２９：５１９−５２４）。
５日間のオーバーレイ後、ＨＳＦ、ＡＭＳＣおよびＡＭＥＣは、特に血清添加の条件下で、より緻密になった（図３６）。上皮の形態は、ＡＭＥＣにおいて、より異なった。
【０６１５】
その後、３％のアガロースオーバーレイが、ＨＡ ＥＬＩＳＡアッセイによる培養培地中でＨＡ濃度を測定することによって分泌されたＨＡを捕捉することにも有効であったかどうかを決定した。アガロースオーバーレイなしで、ＨＡレベルは、ＡＭＳＣおよびＡＭＥＣの両方の無血清培地において容易に検出可能であったが、ＨＳＦにおいてはそうではなかった。ＴＮＦは、すべての３つの細胞培養のＨＡレベルを著しく増加させた（図３７）。上述のパターンを、血清添加培地中でさらに促進した。アガロースオーバーレイは、すべての３つの培養物の中で、無血清および血清添加の両方の条件下で５０％を超えるＨＡレベルを還元した。これらの結果は、アガロースオーバーレイが、実際にＨＡレベルを培養培地へと還元したことを示唆した。
【０６１６】
分泌されたＨＡが、アガロースオーバーレイ後に細胞外マトリックス中に実際に捕捉されたのがいつなのかを決定するために、ＨＣ１およびＨＣ２に対する特異抗体、および２つの異なる抗ＰＴＸ３抗体、すなわちＭＮＢ４およびビオチン標識化されたｐＡｂである、それぞれ、ＰＴＸ３／ＨＡ、ＨＣ１／ＨＡ、およびビオチン標識化されたＨＡＢＰを有するＨＣ１／ＰＴＸ３のための二重免疫染色を行った。無血清条件で、陽性のＨＡ染色は、ＨＳＦにおける細胞周囲領域では示され、一方で、ＰＴＸ３染色は、陰性であった（図３８のＡ）。ＴＮＦ刺激によって、陽性のＰＴＸ３染色を、細胞質で観察し（図３８のＢ）、これは、ＨＳＦ中のＴＮＦによるＰＴＸ３の誘導可能な発現を確証している。ＴＮＦは、ＨＡ染色の強度を大幅に増加させなかったが、培養された腎臓近位の管状の上皮細胞で報告されたものに類似した、ケーブル様の構造（図３８のＧ）を誘発した（Ｓｅｌｂｉ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ． ７０： １２８７−１２９５）。ＰＴＸ３のＨＡとの共局在は観察されなかったが、これは、ＰＴＸ３が、ＴＮＦ刺激後にＨＳＦにおいてＨＡと結合していなかったことを示唆している。
対照的に、陽性のＨＡ染色は、細胞外マトリックスにおいてＨＡで共局在化されたため、細胞表面および細胞外マトリックス上の線維ネットワークとして休止するＡＭＳＣにおいて検出された（図３８のＣおよび６Ｋ）。ＴＮＦは、ＰＴＸ３染色の強度およびＨＡ原線維の量を増加させた（図３８のＤおよびＫ）。
【０６１７】
休止するＡＭＥＣにおいて、陽性のＨＡ染色は、幾らかの原線維性の出現のある細胞外空間でも発見されたが、それは、細胞が緻密でなかった散在性の領域でのみ発見された（図３８のＥおよびＬ）。ＰＴＸ３およびＨＡの共局在は、ＡＭＥＣでも観察された。ＴＮＦ処置は、ＰＴＸ３染色の強度およびＨＡ原線維の量をさらに増加させた（図３８のＦ）。これらの結果は、ＰＴＸ３がＡＭＳＣおよびＡＭＥＣによって構成的に発現されたこと及びその発現がＴＮＦによってさらに増加されたことをさらに確証した。弱い陽性のＨＣ１染色は、ＴＮＦ処置を有して（図３８のＧおよびＪ）または有さずに（図示せず）、幾つかのＨＳＦでのみ観察され、特にＨＡのケーブル様の構造（図３８のＧ）においてＨＡで共局在化された。しかしながら、我々は、ＨＣ１とＰＴＸ３との間の共局在に言及しなかった（図３８のＪ）。対照的に、強力な陽性のＨＣ１染色は、ＡＭＳＣにおいて示され、細胞膜上のＨＡで共局在化され（図３８のＨ）、細胞質においてＰＴＸ３で共局在化された（図３８のＫ）。ＡＭＥＣはまた、強力な陽性のＨＣ１染色、および細胞膜中のＨＡ（図３８のＩ）、および細胞質および細胞膜中のＰＴＸ３（図３８のＬ）での共局在を示した。まとめると、これらの結果は、ＨＡが豊富なマトリックスが、ＡＭＳＣ、ＡＭＥＣおよびＨＳＦにおいてアガロースオーバーレイによって効果的に捕捉され、無血清条件下で、ＡＭＳＣおよびＡＭＥＣにおいてのみＨＣ１およびＰＴＸ３の両方を含有していたことを示唆し、これは、そのようなＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体が、内因性のＩαＩによって合成されたことをさらに確証している。
【０６１８】
アガロースオーバーレイ下のＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体の形成をさらに確認するために、６ＭのＧｎＨＣｌによって細胞層を抽出し、ＮａＯＨ処置によって又はそれなしで、無血清および血清添加の両方の条件下で、ＡＭＳＣおよびＨＳＦの培養物においてウェスタンブロット解析を行った。無血清ＨＳＦは、ＴＮＦ刺激およびＮａＯＨ処置によって又はそれなしで、１７０ｋＤａおよび１４０ｋＤａの種を示したが、対照ＰＴＸ３に対応する４５ｋＤａの種を示さず、これは、これらの２つのバンドが特異的ではなかったことを示唆している（図３８のＤ、レーン２−５）。ＴＮＦでの血清添加ＨＳＦは、弱い１４０ｋＤａの種、および無血清ＨＳＦで見られたものに類似した幾つかの小さなＭＷの種を示した（図３９、レーン１１および１２）。対照的に、無血清のＡＭＳＣは、弱いＨＭＷ ＰＴＸ３スミア、９０ｋＤａおよび４５ｋＤａの種を示し（図３９、レーン６）、後者の２つは、それぞれ、ＰＴＸ３二量体および単量体に対応した（図３９、レーン２）。これらの結果は、ＡＭＥで見られた結果に類似していた（図３４）。無血清ＨＳＦで見られるのと同じ非特異的な１７０ｋＤａの種および幾つかの小さな分子種も観察された。ＮａＯＨ処置は、ＨＭＷ ＰＴＸ３スミアを増加させたが、ＰＴＸ３単量体および二量体（図３９、レーン７）および他の種に影響を与えなかった。ＴＮＦは、他の種と同様に、ＨＭＷ ＰＴＸ３スミア、ＰＴＸ３二量体および単量体も増加させた（図３９、レーン８および９）。ＴＮＦでの血清添加ＡＭＳＣは、強力なＨＭＷ ＰＴＸ３スミア、９０ｋＤａのＰＴＸ３二量体および４５ｋＤａのＰＴＸ３単量体を示した（図３９、レーン１３）。
ＮａＯＨ処置は、６０ｋＤａおよび５０ｋＤａでＨＭＷ ＰＴＸ３スミアおよび２つの種を大幅に増加させた（図３９、レーン１４）。ＮａＯＨが、ＨＣとＨＡとの間のエステル結合を壊し、ＨＣ−ＨＡの溶解につながったため、これらの結果は、ＨＭＷ ＰＴＸ３が、ＨＣ−ＨＡ複合体から放出されたことを示唆した。まとめると、上述の結果は、ＨＳＦではなくＡＭＳＣが、ＰＴＸ３を含有しているＨＣ−ＨＡ複合体を生成したことを示唆した。
【０６１９】
ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体（ｒｃＨＣ−ｈａ／ＰＴＸ３）のインビトロの再構成
ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体がどのように生成され得るかをさらに確証するために、我々は、ＨＡ、ＴＳＧ−６、ＩαＩおよびＰＴＸ３を用いて、インビトロでＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体を再構成したい。まず、プラスチック上でＨＡを固定化し、組換え型のＴＳＧ−６を加えることに成功し、ＩαＩの源として、ＩαＩまたは血清を精製した。ＴＳＧ−６が、固体面上で固定化されるＨＡに結合することによって、安定したＴＳＧ−６／ＨＡ複合体を形成することができ（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８０：１４４７６−８４）、遊離した及びＨＡ結合したＴＳＧ−６の両方が、ＨＣをＩαＩから固定化したＨＡへと移動させ、ＨＣ−ＨＡを形成することができる（Ｃｏｌｏｎ （２００９） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８４：２３２０−３１）と報告されている。抗ＩαＩ抗体を使用するウェスタンブロットは、予想通り、対照ｉＨＡ単独において種を検出しなかった（図４０のＡ、レーン２）。ＩαＩおよびＴＳＧ−６が、ｉＨＡに同時に加えられたときに、弱い２２０ｋＤａのＩαＩ、８５ｋＤａのＨＣ２、強力な〜８０ｋＤａのＨＣ１および５０ｋＤａの種が検出され（図４０のＡ、レーン３）、これは、ＨＣ１およびＨＣ２が両方とも、ＴＳＧ−６の存在下のｉＨＡに移動され、ＨＣ−ＨＡを形成したことを示唆している。ＨＣ２のバンド強度に対するＨＣ１のバンド強度の比較は、より多くのＨＣ１が、ＴＳＧ−６によってＨＣ２よりもｉＨＡに移動され、結果的に、先細りの５０ｋＤａの種をもたらしたことを示唆した。ＰＴＸ３が、ｉＨＡへのＩαＩおよびＴＳＧ−６と同時であったときに、ＩαＩの種の強度は減少したが、ＨＣ１強度は、ＰＴＸ３の用量依存的な方法で増加した（図４０のＡ、レーン４−６）一方で、ＨＣ２は、検知不能であり、これは、ＰＴＸ３が、ＴＳＧ−６によって触媒された固定化したＨＡへのＨＣ２ではなくＨＣ１の移動を優先的に促進したことを示唆している。ＰＴＸ３がＩαＩおよびＴＳＧ−６の同時の追加後に加えられたときに、ＩαＩまたはＨＣ２ではなく、ＨＣ１が検知され、ＨＣ１強度も、ＰＴＸ３の用量依存的な方法で増加され（図４０のＡ、レーン７−９）、これは、ＰＴＸ３が、固定化したＨＡへのＨＣ２ではなくＨＣ１の移動を促進したことを確証している。これらの結果は、ＰＴＸ３が、固定化したＨＡへの優位なＨＣ１の移動を一意に促進して、同時であろうが連続していようが、ＨＣ１−ＨＡ複合体を形成したことを示唆した。抗ＴＳＧ−６抗体を使用するウェスタンブロットは、３５ｋＤａのＴＳＧ−６単量体および７５ｋＤａの二量体の両方が、ｉＨＡ上のＩαＩおよびＴＳＧ−６の中央のＰＴＸ３の同時又は連続の付加によって形成されたｒｃＨＣ−ＨＡにおいて検出されたことを示した。ＴＳＧ−６バンドの強度が、ＰＴＸ３用量依存的に減少したため、固定化したＨＡに結合されたＴＳＧ−６が、ＰＴＸ３によってはじき出され（ｃｏｍｐｅｔｅｄ ｏｕｔ）得たことが示唆される（図４０Ｂ）。抗ＰＴＸ３抗体を使用するウェスタンブロットは、ＰＴＸ３がＩαＩおよびＴＳＧ−６を同時に加えられたときの、弱い四量体および二量体のバンドを有する充填ウェルにおける顕著なＨＭＷ ＰＴＸ３スミアを��し、それらの強度が、ＰＴＸ３の用量依存的な方法で増加したことを示した（図４０のＣおよびレーン４−６）。この結果は、ＰＴＸ３が、ｒｃＨＣ−ＨＡ複合体に優先的および強力に結合され、その中で、結合が、８ＭのＧｎＨＣｌ洗浄に耐性があったことを示唆した。対照的に、ＰＴＸ３が、ＩαＩおよびＴＳＧ−６の付加後に連続して加えられたときに、ＨＭＷ ＰＴＸ３および四量体および二量体の種（図４０のＣ、レーン７−９）を検出せず、これは、ＰＴＸ３と予め形成されたｒｃＨＣ−ＨＡ ＰＴＸ３との間の結合が、８ＭのＧｎＨＣｌ洗浄に対する耐性が強くなかったことを示唆している。故に、これらのインビトロの再構成実験は、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の形成を可能にするために、ＰＴＸ３が、インビボでのＨＡ、ＩαＩおよびＴＳＧ−６と同時に生成されなければならなかったことを示唆した。この解釈は、インビボの組織切片に加えてＡＭＳＣによって形成された細胞外マトリックスにおける、ＨＡ、ＨＣおよびＰＴＸ３の免疫共局在化によって支持された。
【０６２０】
実施例３３：ＴＧＦβ１シグナル伝達に対するＨＣ−ＨＡ複合体の効果
固定化したＨＣ−ＨＡは、ＴＧＦ−β１の発現をダウンレギュレートすることによってＴＧＦβ１シグナル伝達を阻害するが、ＴＧＦ−β３シグナル伝達をアップレギュレートする。ＴＧＦβ１シグナル伝達のそのような阻害は、ＧＦβＲＩＩおよびＴＧＦβＲＩＩＩのさらなる抑制が原因の、血清または外因性のＴＧＦ−β１の付加によるチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に抵抗し得る。したがって、固定化したＨＣ−ＨＡは、ＳＭＡＤ２／３シグナル伝達アルファ平滑筋形成の発現を阻害することによって、角膜の線維芽細胞の筋線維芽細胞分化を防ぐ。この作用はまた、角膜の線維芽細胞を角膜実質細胞に戻すのに十分強力である。ＨＣ−ＨＡ（不溶性（Ｉ））は、追加の小さなロイシンが豊富なタンパク質（ＳＬＲＰ）の構成においてＨＣ−ＨＡ（可溶性（Ｓ））とは異なり、ＢＭＰおよびそれらの受容体の発現をアップレギュレートすることによって、ＴＧＦβ１およびＢＭＰのシグナル伝達の発現を活性化し、それ故、凝集の形成を一緒にさらに促進する、ｐＳＭＡＤ１／５／８を活性化する。これらの作用は、角膜の線維芽細胞を神経冠前駆体にさらに脱分化することができる。
【０６２１】
本実施例では、外因性のＴＧＦβ１のチャレンジによる又はそれのない、ヒトの角膜の線維芽細胞におけるＴＧＦ−βシグナル伝達に対する固定化した可溶性および不溶性のＨＣ−ＨＡの効果を検査した。さらに、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達およびαＳＭＡ発現の抑制に対するＨＣ−ＨＡ複合体の効果を試験した。
【０６２２】
実験的および臨床的な研究は、凍結保存された羊膜（ＡＭ）による抗瘢痕化の治療上の作用を支持している。我々の研究は、重鎖ヒアルロナン複合体（ＨＣ−ＨＡ）が、ＡＭによって一意に生成され、ＡＭから精製され得、ヒトの角膜の線維芽細胞においてＴＧＦ−β１プロモーターの活性を抑制することを実証した。ＨＣ−ＨＡが、ＴＧＦ―β１ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を抑え、ＴＧＦ−βシグナル伝達を中和すると知られる、ＴＧＦ−β３ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を促進するかどうかは不明確であり、もしそうであっても、ＨＣ−ＨＡによるＴＧＦβシグナル伝達のそのような阻害が、ｐＳＭＡＤ２／３の核転位の抑制に変換されるかどうかも不明確である。
【０６２３】
マウス角膜実質細胞は、ＡＭの上で培養されれば、プラスチック上の無血清ＤＭＥＭ／ＩＴＳまたはＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳにおいて未分化の状態（ケラトカンを発現する）を維持することができる。１０％の血清または１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１を有する無血清ＤＭＥＭ／ＩＴＳにおける角膜実質細胞の処置は、Ｓｍａｄ２／３リン酸化および核局在化（３時間）およびα−ＳＭＡ発現（５日間）を誘発する。血清またはＴＧＦ−β１いずれかの処置によるＡＭに対する角膜実質細胞におけるＳｍａｄ２／３およびα−ＳＭＡの活性化が抑制される（Ｋａｗａｋｉｔａ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８０（２９）：２７０８５−９２）。我々の研究は、ＨＣ−ＨＡが、ヒトの角膜の線維芽細胞においてＴＧＦ−β１プロモーターの活性を抑制することを実証した。ｐＳｍａｄ２／３シグナル伝達およびα−ＳＭＡ形成が、ＨＣ−ＨＡによって抑制されることが予期された。
【０６２４】
ヒト角膜の線維芽細胞（または角膜輪部由来ニッチェ細胞（Ｌｉｍｂａｌ ｎｉｃｈｅ ｃｅｌｌｓ）、ｐ３）を、上に記載されるように、４８時間、固定化したＨＡ、可溶性のＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳ）（２Ｘまたは４Ｘ）または不溶性のＨＣ−ＨＡ（ＧｎＨＣｌ）（２Ｘまたは４Ｘ）によって又はそれなしで、プラスチック皿上で播種した。その後、細胞を、ｍＲＮＡの定量化およびＳＭＡＤ２／３シグナル伝達の決定のために採取される前に、２４時間ＴＧＦβ１で又はそれなしで処置した。ＴＧＦβ受容体のタンパク質の決定に関して、細胞を、タンパク質サンプルの収集前の４８時間、ＴＧＦ−β１で又はそれなしで処置することで、発現されたｍＲＮＡからのタンパク質発現のための時間を与えた。ＴＧＦ−β１ ＥＬＩＳＡに関して、細胞を、２４時間、ＴＧＦ−β１で又はそれなしで処置し、その後、２４時間（および４８時間）、新鮮な培地中で培養した。上清を、ＴＧＦ−β１ ＥＬＩＳＡのために収集した。ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３のＥＬＩＳＡに関して、細胞を、４８時間、ＴＧＦ−β１で又はそれなしで処置した。上清を、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３のＥＬＩＳＡのために収集した。位相コントラスト画像を、様々な培養物のために最大７２時間撮った。
【０６２５】
以下の実験を行った：
【０６２６】
１．リアルタイムＰＣＲによる、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、およびそれらの受容体のためのｍＲＮＡ半定量化は：ＴＧＦ−βファミリーおよびそれらの受容体のｍＲＮＡ転写物の発現の推定に使用した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲプロフィールは、９５℃で１０分間の最初の活性化、その後の９５℃での４０サイクルの１５秒間の変性、および６０℃での１分間のアニーリングおよび拡張から成った。
【０６２７】
２．免疫染色による、α−平滑筋形成およびＳＭＡＤ２／３シグナル伝達の決定を：標準的な免疫染色手順を使用して、α−平滑筋形成およびＳＭＡＤ２／３シグナル伝達をモニタリングするために行った。
【０６２８】
実験１および２のための実験群は次のとおりであった：
【０６２９】
【表５】
2019178144.tif 000007
【０６３０】
３．ウェスタンブロッティングによるＴＧＦβＲｓの定量化は：その対応する抗体を使用して、ＴＧＦβＲＩ、ＴＧＦβＲＩＩ、およびＴＧＦβＲＩＩＩのタンパク質濃度を定量するために使用した（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。充填配列は以下のとおりであった：
【０６３１】
【表６】
2019178144.tif 000008
【０６３２】
４．培地中のＴＧＦβｓの定量化用のＥＬＩＳＡ：Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓからのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２のＥＬＩＳＡ ＫｉｔｓおよびＮｏｒｖｕｓ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓからのＴＧＦ−β３ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔｓは、酸活性化された細胞培養上清、血清、血漿、および尿において、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β１３を測定するように設計された、固相ＥＬＩＳＡである。それらは、組換え型のヒトのＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３を含有しており、組換え型因子を正確に定量することが示された。天然のＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３を使用して得られた結果は、組換え型のキット基準を使用して得られた標準曲線と平行した線形曲線を示した。これらのキットを、培地中でＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３を決定するために使用した。実験４用の実験群は次のとおりであった：
【０６３３】
【表７】
2019178144.tif 000009
【０６３４】
結果
ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で播種されたＨＣＦは、不溶性ＨＣ−ＨＡ上でのみで７２時間ごとに凝集物を形成した（図４１）。そのような凝集は、ＤＭＥＭ／ＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／セレン）の培地中の２４時間の血清飢餓後も持続した。その後、細胞を、３つの異なる培養培地へと培養した：Ａ−４８時間のＤＭＥＭ／ＩＴ；Ｂ−２４時間のＤＭＥＭ／ＩＴ、２４時間のＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ；Ｃ−２４時間のＤＭＥＭ／ＩＴＳ、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１での２４時間のＤＭＥＭ／ＩＴＳ。ＨＣ−ＨＡ中で培養された細胞は、４Ｘ ＨＣ−ＨＡ（Ｇｎ）上で小さな凝集物を形成するが、他の培養条件では違った（図４１）。しかしながら、固定化した基質上のＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳにおける２時間の播種後に、対照中のＨＣＦだけがよく付着した。ＨＡ、ＨＣ−ＨＡ［ＨＣ−ＨＡ（４Ｘ、ＰＢＳ）および４Ｘ、ＧｎＨＣｌ］上の細胞は、すべて丸まっており、これは、それらが十分に付着されていなかったことを示している。７２時間のインキュベーション後、すべての細胞は、よく付着したが、固定化したＨＣ−ＨＡ上に細胞はほとんどなかった。これらの基質上の細胞の数は、ＨＣ−ＨＡ（４Ｘ、ＧｎＨＣｌ）上よりもＨＣ−ＨＡ（４Ｘ、ＰＢＳ）上でより多かった。ＨＣＦは、２４時間の培養後にＨＣ−ＨＡ（Ｇｎ）上で凝集物を形成し始め、７２時間の培養後に、より大きな凝集物に凝縮された。ＴＧＦβ１の刺激後、ＨＣ−ＨＡ（４Ｘ、ＰＢＳ；４Ｘ、Ｇｎ）上で培養されたＨＣＦの凝集を観察した。
【０６３５】
要約すると、ＨＣ−ＨＡ（Ｇｎ）は、ＴＧＦβ１のチャレンジで又はそれなしで、ＨＣＦの凝集を促進し、一方で、ＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳ）は、ＴＧＦβ１のチャレンジ下で、ＨＣＦの凝集を促進する。凝集の有意性は知られていない。
【０６３６】
ＤＭＥＭ／ＩＴＳでは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３の転写物の発現は、ＨＣ−ＨＡ（Ｇｎ）によって高められたが、ＴＧＦβ３転写物は、ＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳ）によって高められた（図４２）。予想通り、自己誘導では、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３のｍＲＮＡは、ＴＧＦβ１チャレンジによってプラスチック上で培養されたＨＣＦにおいて、それぞれ、４倍および２倍増加され、それに対応して、ＴＧＦβ１タンパク質は、６０ｐｇ／ｍｌから１０５ｐｇ／ｍｌまで増加した（ＴＧＦβ３タンパク質は、実験誤差のため、実験では検出されなかった）。無血清条件下では、可溶性の４Ｘ ＨＣ−ＨＡは、ＴＧＦβ１タンパク質の発現を減少させた。不溶性ＨＣ−ＨＡも、ＴＧＦβ１ ｍＲＮＡ発現のその促進にもかかわらず、分泌されたＴＧＦβ１を減少させたが、ＤＭＥＭ／ＩＴＳ中で培養された対照よりもまだ高かった。さらに、可溶性および不溶性両方のＨＣ−ＨＡによるＴＧＦβＲＩＩおよびＴＧＦβＲＩＩＩの顕著な抑制が観察された。結果的に、オートクリンＴＧＦβシグナル伝達は、可溶性または不溶性いずれかのＨＣ−ＨＡ上で培養されたＨＣＦにおいて抑制されたが、パラクリンＴＧＦβシグナル伝達は、不溶性ＨＣ−ＨＡ上で培養されたＨＣＦにおいて貯蔵される。さらに、可溶性および不溶性両方の４Ｘ ＨＣ−ＨＡは、ＴＧＦ−β１シグナル伝達を中和すると知られている、ＴＧＦβ１刺激によって又はそれなしで、無血清条件下でＴＧＦβ３ ｍＲＮＡ発現を３倍アップレギュレートした。ＴＧＦβ１による刺激下では、ＴＧＦβ３ ｍＲＮＡ発現は、ＨＣＦが、可溶性および不溶性のＨＣ−ＨＡ上で培養されたときに、それぞれ、５倍および８倍増加され、これは、可溶性および不溶性のＨＣ−ＨＡが、ＴＧＦβ３転写物の発現を強力に促進することを示している。これらの結果はまた、ＡＭから精製されたＨＣ−ＨＡが、ＴＧＦβ１シグナル伝達の抑制だけでなく、ＴＧＦβ３発現の著しいアップレギュレーションによっても、ＡＭの抗瘢痕化作用を促進することを示す。我々の結果から、ＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳおよびＧｎ）は、ｍＲＮＡおよびタンパク質両方のレベルでＴＧＦβ２発現に影響を与えないようである。要約すると、ＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳ）は、ＴＧＦβ１を阻害するが、ＴＧＦβ１によってチャレンジされたＨＣＦにおいてＴＧＦβ３シグナル伝達を活性化し、一方で、ＨＣ−ＨＡ（Ｇｎ）は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３両方のシグナル伝達を活性化する。
【０６３７】
プラスチックの対照では、ＴＧＦβＲＩＩ ｍＲＮＡは、ＴＧＦβチャレンジ下で８倍アップレギュレートされた（図４３）。ＴＧＦβＩＩおよびＴＧＦβＩＩＩの受容体ｍＲＮＡは、無血清条件下で、それぞれ、ＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳおよびＧｎ）によって２倍から８倍アップレギュレートされたが、ＴＧＦβ１チャレンジ下に完全に阻害された。同じ結果は、ＨＡについても言える。ＴＧＦβＲＩＩおよびＴＧＦβＲＩＩＩの対応するタンパク質発現は、ＨＣ−ＨＡ（それぞれ、ＰＢＳおよびＧｎ）上で培養されたＨＣＦが、ＴＧＦβによってチャレンジされたときに、それぞれ、３倍および３倍、また２倍および３倍ダウンレギュレートされた。この状況下では、これらのタンパク質発現は、ＨＡによって変化しなかった。そのようなダウンレギュレーションは、抗炎症性の機構およびＡＭによる抗瘢痕化の効果の部分的な説明となり得る。要約すると、ＨＣＦがＨＡおよびＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳおよびＧｎ）上で培養されたときに、ＴＧＦβＲ２およびＴＧＦβＲ３のｍＲＮＡ発現は増加した。
【０６３８】
免疫染色は、ＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳおよびＧｎ）が、ＴＧＦβ１チャレンジによって又はそれなしで、ＤＭＥＭ／ＩＴＳ両方においてｐＳＭＡＤ２／３の核転位を阻害したことを示した（図４４）。このような効果は、ＴＧＦβによってより明白であった。この結果は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβＲＩＩおよびＴＧＦβＲＩＩＩの抑制が、ＳＭＡＤ媒介性のシグナル伝達の抑制に変換されたことをさらに確証した。
【０６３９】
さらに、免疫染色の結果は、可溶性および不溶性両方のＨＣ−ＨＡが、阻害されることを示す、ＴＧＦβ１のチャレンジの後にα−ＳＭＡ形成を阻害したことを示しており、これは、可溶性および不溶性のＨＣ−ＨＡによるβ１シグナル伝達のこのような阻害が、ＴＧＦβ１の追加で又はそれなしで、筋線維芽細胞へのＨＣＦの分化を阻害することをさらに支持している（図４５）。
【０６４０】
要約すると、可溶性のＨＣ−ＨＡは、ＴＧＦ−β１をダウンレギュレートするが、ＴＧＦ−β３発現をアップレギュレートし、一方で、不溶性のＨＣ−ＨＡは、無血清およびＴＧＦβ１チャレンジの条件下で、ＨＣＦにおいてＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３両方の発現をアップレギュレートする。可溶性および不溶性両方のＨＣ−ＨＡが、ＴＧＦβＲＩＩおよびＴＧＦβＲＩＩＩ両方の発現をダウンレギュレートしたため、これらの変化は、結果的に、ｐＳＭＡＤ２／３の核転位の欠如およびアルファ平滑筋形成の抑制によって証拠づけられるように、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害をもたらした。
【０６４１】
実施例３４：ＢＭＰシグナル伝達に対するＨＣ−ＨＡ複合体の効果
本実施例では、ＢＭＰシグナル伝達に対する追加のＴＧＦ−β１による固定化したＨＣ−ＨＡの効果を検査した。ｐＳＭＡＤ１／５／８の活性化を介するＢＭＰシグナル伝達の活性化も決定した。
【０６４２】
ＢＭＰは、ＢＭＰ１−３、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ４−７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９−１５を含む、ＴＧＦβスーパーファミリーの亜群を構成する。ＢＭＰは、タイプＩＩ受容体（ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、またはＡＬＫ６）を結合し、これは、タイプＩ受容体を活性化して、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、およびＳｍａｄ８をリン酸化し、結果的に、ｐＳｍａｄ１／５／８の核転位をもたらした（Ｍａｓｓａｇｕｅ ２０００； Ｈｅｒｐｉｎ， ２００７で検討される）。どの具体的なＢＭＰおよびＢＭＰの受容体がＨＣＦ中に存在するかは明確ではなく、わかったとしても、ＴＧＦβシグナル伝達が抑制されるときに、ＢＭＰシグナル伝達が、ＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳおよびＧｎ）およびさらなるＴＧＦβ１によって活性化されるかどうかは明確ではなく、わかったとしても、ＢＭＰおよびＢＭＰの受容体のどの形態が、制御するＢＭＰシグナル伝達において主要な役割をはたすのか、およびＢＭＰシグナル伝達のそのような活性化が、ｐＳＭＡＤ１／５／８によるものであるのかどうかは不明確である。
【０６４３】
ヒトの角膜の線維芽細胞を、４８時間、固定化したＨＡまたはＨＣ−ＨＡ ＰＢＳ（４Ｘ）またはＨＣ−ＨＡ Ｇｎ（４Ｘ）によって又はそれらなしで、プラスチック上で播種し、その後、上に記載されるように、ｐＳＭＡＤ１／５／８のｍＲＮＡの定量化および決定のために２４時間、ＴＧＦβ１で又はそれなしで処置した。ＢＭＰ受容体のタンパク質の決定のために、細胞を、タンパク質サンプルの収集前の４８時間、ＴＧＦ−β１で又はそれなしで処置することで、タンパク質発現を可能にした。ＢＭＰ ＥＬＩＳＡに関して、細胞を、４８時間ＴＧＦ−β１で又はそれなしで処置した。上清を、ＢＭＰ ＥＬＩＳＡのために収集した。位相コントラスト画像を、様々な培養物のために最大７２時間撮った。
【０６４４】
以下の実験を、培養物上で行った：
【０６４５】
１．リアルタイムＰＣＲによるＢＭＰおよびその受容体のためのｍＲＮＡ半定量化は：ＢＭＰファミリーおよびそれらの受容体のｍＲＮＡ転写物の発現の推定に使用した。
【０６４６】
２．免疫染色による、α−平滑筋形成およびＳＭＡＤ１／５／８シグナル伝達の決定を：免疫染色によって、α−平滑筋形成およびＳＭＡＤ２／３シグナル伝達をモニタリングするために行った。
【０６４７】
実験１および２用の実験群は次のとおりであった：
【０６４８】
【表８】
2019178144.tif 000010
【０６４９】
３．ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１ＢおよびＢＭＰＲ２の抗体を使用する、ウェスタンブロッティングによるＢＭＰＲの定量化は：それぞれ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１ＢおよびＢＭＰＲ２のタンパク質濃度を定量するために使用した。充填配列は以下のとおりであった：
【０６５０】
【表９】
2019178144.tif 000011
【０６５１】
４．培地中のＢＭＰの定量化用のＥＬＩＳＡ：培地中のＢＭＰを決定するために、ＢＭＰ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。実験４用の実験群は次のとおりである：
【０６５２】
【表１０】
2019178144.tif 000012
【０６５３】
結果
休止状態下では、ＨＡおよびＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳ）およびＨＣ−ＨＡ（Ｇｎ）の両方は、ＢＭＰ６の転写物の発現を、それぞれ、７倍および４倍活性化する（図４６）。ＴＧＦβ１の存在下で、ＨＡおよびＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳ）およびＨＣ−ＨＡ（Ｇｎ）の両方は、ＨＣＦにおいて、それぞれ、ＢＭＰ４の転写物の発現を６倍、１１倍および６倍、およびＢＭＰ６のｍＲＮＡ発現を３０倍、３７倍および４６倍活性化し、これは、ＨＡおよび可溶性および不溶性両方のＨＣ−ＨＡが、ＢＭＰ４／６発現をアップレギュレートすることができる一方で、追加のＴＧＦβ１が、ＢＭＰ４およびＢＭＰ６のシグナル伝達をさらに劇的にアップレギュレートしたことを示している。ＢＭＰ７およびＢＭＰ９は検出されなかった。
【０６５４】
ＴＧＦβ１自体は、ＢＭＰＲ１Ａの転写物の発現を活性化しなかったが、ＨＡではない、ＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳ）およびＨＣ−ＨＡ（Ｇｎ）の両方は、ＴＧＦβ１の存在下で、ＢＭＰＲ１Ａの転写物の発現を、それぞれ、７倍および３倍活性化し、これは、ＢＭＰＲ１Ａが、ＨＣ−ＨＡ＋ＴＧＦβ１活性化のＢＭＰシグナル伝達において主要な役割を果たし得ることを示している（図４７）。さらに、ＴＧＦβ１は、ＢＭＰＲ１Ｂを３倍、およびＢＭＰＲ２を３倍活性化するが、ＨＡおよびＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳ）およびＨＣ−ＨＡ（Ｇｎ）の両方によって又はそれなしで、プラスチック上で４倍活性化し、これは、ＴＧＦβ１自体が、ＢＭＰＲ１ＢおよびＢＭＰＲ２のｍＲＮＡ発現を非特異的に活性化することを示している。ＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳ）またはＨＣ−ＨＡ（Ｇｎ）は、ＢＭＰＲ２の転写物の発現を４倍まで増強する。ＢＭＰ−ＢＭＰＲ１Ａが、ＳＭＡＤ１／５／８シグナル伝達を活性化すると予期される一方で、ＢＭＰ−ＢＭＰＲＩＩは、非ＳＭＡＤシグナル伝達を活性化すると予期される。
【０６５５】
免疫蛍光の結果は、使用される基質にもかかわらず、ＴＧＦβ１自体が、ＨＣＦにおいてｐＳＭＡＤ１／５／８の核転位を中程度に活性化することを示している（図４８）。ｐＳＭＡＤ１／５／８を有するより多くの核およびｐＳＭＡＤ１／５／８のはるかに強力な核染色によって証拠づけられるように、ＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳおよびＧｎ）は、ｐＳＭＡＤ１／５／８の核転位を介してＢＭＰ４／６シグナル伝達の活性化を強力に促進する。
【０６５６】
ＩＤ１は、ＳＭＡＤ１／５／８シグナル伝達によって調節された既知の下流の遺伝子である、転写因子の塩基性ＨＬＨファミリーのメンバーによってヘテロ二量体を形成することができる、ヘリックス・ループ・ヘリックス（ＨＬＨ）タンパク質である。我々の結果は、ＨＣＦがＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳ）およびＨＣ−ＨＡ（Ｇｎ）上で培養されたときに、それぞれ、ＳＭＡＤ１／５／８の活性化が、ＩＤ１ ｍＲＮＡの４倍および８倍のアップレギュレーションに結果的にもたらしたことを実証し、これは、ＨＣＦにおけるＳＭＡＤ１／５／８シグナル伝達が、ＨＣ−ＨＡ＋ＴＧＦβによって、実際に活性化されることを示している（図４９）。ＩＤ１が、ＤＮＡ結合活性を有さず、それ故、相互作用する塩基性ＨＬＨタンパク質のＤＮＡ結合および転写活性化の能力を阻害することができるため、我々は、ＩＤ１が、細胞の成長、老化および分化に重要な役割を果たすと予想する。
【０６５７】
実施例３５：筋線維芽細胞の分化に対するＨＣ−ＨＡ複合体の効果、および角膜実質細胞またはより若い前駆体へのト角膜の線維芽細胞の転換
角膜基質に埋め込まれた神経冠由来の細胞の特有の集合体である、角膜実質細胞は、角膜に特異的なケラトカンを含む、硫酸ケラタンを含有しているプロテオグリカンを発現する。ケラトカン（Ｋｅｒａ）は、成人の脊椎動物の眼中の角膜に特異的なケラタン硫酸プロテオグリカン（ＫＳＰＧ）である。それは、小さなロイシンが豊富なプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）の遺伝子ファミリーに属し、脊椎動物の角膜基質における細胞外のＫＳＰＧの主成分の１つである。角膜のＫＳＰＧは、マトリックス集合において中心的な役割を果たし、これは、角膜の透明度の要因である。ルミカンは、角膜のＫＳＰＧのおよそ半分を構成する。残りの角膜のケラタン硫酸のほとんどは、ケラトカンを変性する。成人の組織では、ケラトカンは、角膜基質に限定され、ケラトカン発現は、角膜実質細胞のための表現型マーカーと考えられる（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７８（２４）：２１６７２−７； Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８０（２７）：２５５４１−７）。プラスチック皿上で、ヒト、ウシ、およびウサギの角膜実質細胞は、血清添加培地中で培養されたときに、それらの特徴的な樹状形態およびケラトカン発現を失う（Ｅｓｐａｎａ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ． ４４ （１２）： ５１３６−４１ ； Ｅｓｐａｎａ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．４５（９）：２９８５−９１）。これらの露出した細胞は、ケラタン硫酸を含有しているプロテオグリカン、ケラトカンおよびＣＤ３４の発現をダウンレギュレートし、コンドロイチンデルマタン硫酸を含有しているプロテオグリカンおよびα−ＳＭＡの発現をアップレギュレートし、これは、これらの細胞が、より分化されるようになることを示している。
【０６５８】
以前の研究は、ヒト（Ｅｓｐａｎａ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ． ４４ （１２）： ５１３６−４１ ； Ｅｓｐａｎａ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．４５（９）：２９８５−９１）およびネズミ（Ｋａｗａｋｉｔａ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８０（２９）：２７０８５−９２）の角膜実質細胞が、ＴＧＦ−βがＳｍａｄシグナル経路のダウンレギュレーションによって血清添加培地中に加えられるときでさえ、ＡＭの間質表面上で培養されたときに、α−ＳＭＡ発現の筋線維芽細胞への分化なしで、それらの表現型を維持することができることを示した。羊膜間質は、培養物中のケラトカン発現を維持し、角膜実質細胞が、筋線維芽細胞へと分化するのを防ぐことができる（Ｋａｗａｋｉｔａ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８０（２９）：２７０８５−９２）。角膜実質細胞は、樹状形態を維持し、（１：２の分割で）少なくとも５継代の間、角膜基質に特異的なケラトカンを発現し続け、血清添加条件またはＴＧＦ−β１の付加の下で、α−ＳＭＡを発現しなかった（Ｅｓｐａｎａ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．４５（９）：２９８５−９１）。ネズミの角膜実質細胞はまた、それらの正常な表現型を失うことなく、少なくとも８継代の間、ＡＭ上に拡張され得、Ｓｍａｄ媒介性のＴＧＦ−βシグナル経路のその抑制は、ケラトカンを発現する表現型の維持において重要である（Ｋａｗａｋｉｔａ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８０（２９）：２７０８５−９２）。本実施例では、固定化したＨＣ−ＨＡが同じことをできるかどうかを検査し、できるのであれば、追加のＴＧＦβ１が、その結果に影響するかどうかを検査した。
【０６５９】
結果
ＨＡは、ケラトカン ｍＲＮＡの発現を４倍アップレギュレートした（図５０）。ヒト角膜の線維芽細胞を、固定化したＨＡで又はそれなしで、４８時間プラスチック上で播種し、２４時間血清なしで飢えさせ、その後、ｍＲＮＡ定量化およびＳＭＡＤ２／３シグナル伝達の決定のために採取される前に２４時間、ＴＧＦβ１で又はそれなしで処置した。ＴＧＦβ受容体のタンパク質の決定に関して、タンパク質発現がｍＲＮＡ発現に遅れているため、細胞を、タンパク質サンプルの収集前に４８時間、ＴＧＦ−β１で又はそれなしで処置した。ＴＧＦ−β１ ＥＬＩＳＡに関して、細胞を、２４時間、ＴＧＦ−β１で又はそれなしで処置し、その後、２４時間（および４８時間）新鮮な培地中で培養した。上清を、ＴＧＦ−β１ ＥＬＩＳＡのために収集した。ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３のＥＬＩＳＡに関して、細胞を、４８時間、ＴＧＦ−β１で又はそれなしで処置した。上清を、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３のＥＬＩＳＡのために収集した。予想通り、固定化したＨＣ−ＨＡは、ケラトカンのｍＲＮＡ発現を１４倍および１６倍促進し、これは、これらのＨＣＦが、ＴＧＦβ１なしでＨＣ−ＨＡ上で培養されたときに、はるかに若いことを示している。ＴＧＦβ１チャレンジ後、ケラトカンのｍＲＮＡ発現は、プラスチックおよびＨＡ上で劇的にダウンレギュレートされた。しかしながら、ケラトカン発現はそれでも、ＨＣ−ＨＡ（可溶性、ＰＢＳ）上で３倍に維持された。ケラトカンの発現は、ＨＣ−ＨＡ（不溶性、Ｇｎ）上で存在しなかった。我々は、ＨＣ−ＨＡ（Ｉ）上の結果として生じる表現型が、角膜実質細胞よりもさらに若いはずであると予想している。
【０６６０】
同様に、固定化したＨＣ−ＨＡ（Ｉ／Ｓ）は、ケラトカンのタンパク質レベルを８倍および１０倍促進し、これは、これらのＨＣＦが、ＨＣ−ＨＡ（Ｓ／Ｉ）上で培養されたときに、実際に角膜実質細胞に戻されたことを示している（図５１）。ＨＡ（ケラトカン ｍＲＮＡの４倍の増加）および４Ｘ ＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳ）（ケラトカン ｍＲＮＡの３倍の増加）を含む、試験された他の処置による、対応するケラトカンタンパク質の発現は見られず、これは、ケラトカン ｍＲＮＡのそのような中程度の増加が、ケラトカンの対応するタンパク質の発現を促進するのに十分ではなかったことを示している。
【０６６１】
実施例３６：ＨＣＦにおけるＥＳＣマーカー発現に対するＨＣ−ＨＡ複合体の効果
実施例３５は、ＨＣＦが、外因性のＴＧＦ−β１によるチャレンジ下で、筋線維芽細胞の分化を受けるのを防がれるだけでなく、外因性のＴＧＦ−β１によって又はそれなしで、ケラトカンの発現により角膜実質細胞に戻されたという強い証拠を示した。それ故、ＨＣＦが、特に固定化したＨＣ−ＨＡ（不溶性、ＧｎＨＣｌ）上で外因性のＴＧＦ−β１で播種されたときに、より若い前駆体へとさらに再プログラムされ得るかどうかを検査し、これは、ＴＧＦ−βシグナル伝達を抑制し、ＢＭＰシグナル伝達を促進するが、ケラトカン発現を止めると示された。血管新生前駆体において見られると我々が最近報告したように、ＥＳＣおよび内皮の前駆体および周細胞において見られる多くのマーカーの発現を検査した。ＨＣ−ＨＡによって調節されたこれらの条件下でのＨＣＦの再プログラミングの可能性をさらに調査するために、成人の分化した線維芽細胞をｉＰＳＣへと再プログラムする重要な役割を果たすと報告された、４つの重要な転写因子、すなわち、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫＬＦ４の発現を検査した。
【０６６２】
結果
遺伝子発現の検査を、実施例３５において上に記載されたＨＣＦ培養物上で行った。結果は、ＨＣＦが、プラスチック対照（ｐ＜０．０５、ｎ＝３）と比較して、外因性のＴＧＦ−β１によってチャレンジされたときでさえ、４Ｘ ＨＣ−ＨＡ上で、ｃＭＹＣ、ＫＬＦ−４、Ｎａｎｏｇ、ネスチン、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ−１、ＳＯＸ−２、およびＳＳＥＡ−４などの、より多くの（２乃至６倍）ＥＳＣマーカー、および２乃至４倍以上のＥＳＣマーカー発現したことを示した（図５２）。これらの結果は、ＨＣ−ＨＡ、特にＨＣ−ＨＡ（不溶性）が、ＨＣＦをより若い前駆体へと再プログラムすることができることを示唆している。
【０６６３】
実施例３７：溶液中のＨＣ−ＨＡは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の生存度および分化に影響を与えることによって骨形成を阻害する。
本実施例では、未分化のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の生存度および分化に対する溶液中のＨＣ−ＨＡ（可溶性画分）およびＨＡの効果を評価した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから確立された骨芽細胞の細胞株である。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、骨芽細胞および骨細胞に分化する能力を有し、インビトロで鉱化された骨組織を形成することが実証された。
【０６６４】
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、ビヒクル対照としてのＰＢＳによって、ＨＡ（１、５、２５、１００μｇ／ｍｌ）またはＨＣ−ＨＡ（１、５、および２５μｇ／ｍｌ）の様々な濃度で、完全培地（α−ＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）中で培養し、１．６×１０４細胞／ｍｌで９６ウェルで処置されたプラスチック細胞培養中に播種した。細胞の生存度を、ＭＴＴアッセイによって測定した。その結果は、５５０ｎｍでの吸収度が、２５μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡを除いて、すべての条件で、２４時間から４８時間まで増加したことを示し、これは、細胞増殖が、通常は、対照、１乃至１００μｇ／ｍｌのＨＡ、および１乃至５μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡにおいて進むことを示唆している（図５３）。
【０６６５】
次に、骨芽細胞へのＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の分化に対するＨＣ−ＨＡまたはＨＡの効果は検査した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、非誘発培地（１．６×１０５／ｍｌ）中で再懸濁し、９６ウェル中で播種し、コンフルエンスまでインキュベートした。非誘発培地を除去し、誘発培地１（０．２ｍＭのアスコルビン酸 ２−リン酸および１０ｍＭのグリセロール ２−リン酸塩を有する完全培地、インビトロの骨形成アッセイキットに対する製造業者の説明書、ｃａｔ＃ ＥＣＭ８１０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を加えた。１２日間の分化後、アリザリンレッド染色を、骨芽細胞の鉱化を測定し定量化するために使用した。その結果は、ＡＲが、対照において誘発培地によって実際に促進されたことを示した。事前の報告（Ｋａｗａｎｏ （２０１１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ． ４０５： ５７５−５８０）と一致して、２５μｇ／ｍｌのＨＡではなく、１００μｇ／ｍｌのＨＡが、対照と比較したときに、ＡＲ染色をさらに促進した。対照的に、ＡＲ染色は、５μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡ（ｐ＝０．１１）によっては減少されなかったが、２５μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡ（ｐ＝０．００００２）によって著しく減少された（図５４）。これらの結果は、誘発中のＨＣ−ＨＡ濃度の増加が、骨形成も減少させたことを示唆した。
【０６６６】
実施例３８：ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１モデル系を使用する、骨芽細胞の分化に対するＨＣ−ＨＡおよびＡＭＰのための用量依存的な反応。
以前の結果は、ＨＣ−ＨＡおよびＡＭＰが、ＲＡＮＫＬ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ＷＯ ２０１２／１４９４８６を参照）によって誘発されたＲＡＷ２６４．７細胞からの破骨細胞の分化を用量依存的に阻害することを示した。ＡＭＰ（羊膜粉末（Ａｍｎｉｏｔｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｗｄｅｒ））は、羊膜の凍結乾燥された及びその後微粉砕された形態である。本実施例では、骨形成のためのＨＣ−ＨＡおよびＡＭＰのＩＣ５０を測定し、破骨細胞形成のためのＩＣ５０と比較する。
【０６６７】
アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）アッセイおよびアリザリンレッド染色（ＡＲ−Ｓ）は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の分化を測定するために使用された２つのアッセイである。ＡＬＰは、骨芽細胞によって分泌され、長い間、骨芽細胞の活性のための広く認識された生化学的マーカーであり（Ｓａｂｏｋｂａｒ （１９９４） Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ． ２７（１）：５７−６７）、それ故、骨形成のための初期のマーカーとして機能する。アリザリンレッド（ＡＲ）色素は、カルシウムを用いてキレートを形成し、それ故、ＡＲ−Ｓは、鉱化を視覚化するために使用される。ＡＲＳ色素は、容易に抽出され得るため、鉱化の定量化にも転換され得る（Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２９： ７７−８４）。
【０６６８】
パートＡ
実験計画：
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１培養物
１０％のＦＢＳ、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有している、α−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｔ． ＃ ＩＣＭ８１０）の基本培地から成る、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ＫｉｔからのＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のモデル系を利用した。細胞を、５０，０００個の細胞／ｃｍ２で播種し、１００ｍＬの細胞培養皿において３７．０℃で９５％の空気および５％のＣＯ２中に培養し、コンフルエンス前に継代した。一旦十分な細胞数が得られると、細胞を、１ウェル当たり１００μＬ容量の基本培地（５２ウェル）で、９６ウェルの培養皿中で１．６ｘ１０５細胞／ｍｌで播種した。各濃縮を、ＡＬＰアッセイに対して２ウェルおよびＡＲ−Ｓ染色に対して２ウェルの、４ウェルで行った。細胞を、５％のＣＯ２の加湿空気中で３７℃で培養し、培地を、コンフルエンスまで４８−７２時間ごとに変更した。
【０６６９】
調査される投薬範囲は、骨芽細胞の分化で実行された予備データ（上記参照）、および破骨細胞の分化に対するＨＣ−ＨＡおよびＡＭＰのための用量−反応曲線からもたらされた。２５μｇ／ｍｌでのＨＣ−ＨＡが、骨芽細胞へのＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の増殖および分化を著しく阻害し、ＲＡＷ２６４．７細胞からの破骨細胞の分化を完全に阻害したため（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ＷＯ ２０１２／１４９４８６を参照）、それを最も高い濃度として選択した。５μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡが、５０％未満の阻害を示し、骨芽細胞の分化に対するＨＣ−ＨＡのＩＣ５０が、Ｐ−２１４におけるＩＣ５０よりも高いかもしれないことを、それが示唆しているため、０．１、０．５、１、５、１０、および２５μｇ／ｍｌの範囲のＨＣ−ＨＡ濃度を選択した。ＨＣ−ＨＡに関する予備データに基づいて、以下の濃度：１、５、２５、１２５、２５０μｇ／ｍｌでのＡＭＰを選択した。ＡＬＰ活性が、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞における分化の１２日目にピークに達するため（Ｍａｅｄａ （２００４） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９２：４５８＊４７１； Ｗａｎｇ， （２００８） Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ． ８７（７）：６５０−６５４）、誘発後の１２日目に骨形成を研究することを選択した。
【０６７０】
コンフルエンス後に、各ウェルからの媒体を、１００μＬのＯｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＃１と取り替えた。Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍは、０．２ｍＭのアスコルビン酸 ２−リン酸塩および１０ｍＭのβ−グリセリンリン酸を含有している（インビトロの骨形成アッセイキット、ｃａｔ＃ ＥＣＭ８１０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。ＡＭＰおよびＨＣ−ＨＡの１０μＬの使用液を、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＃１に加えた。ＰＢＳ中の、ＡＭＰ（ＡＭＰ−４； Ｌｏｔ ＃ＣＢ１０２９７１， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ＷＯ ２０１２／１４９４８６を参照）（５ｍｇ／ｍｌ）およびＨＣ−ＨＡ（Ｈｅ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８４（３０）： ２０１３６−２０１４６）（２５０μｇ／ｍｌ）の貯蔵溶液を作り、各々の実験濃度（ＨＣ−ＨＡに対して０．１、０．５、１、５、１０、および２５μｇ／ｍｌおよびＡＭＰに対して１、５、２５、１２５、２５０μｇ／ｍｌ）に対して、適切な培養培地（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＃１）にしたがって希釈した。培地を、３日ごとに変更した。
【０６７１】
分化の６日目に、培地を、アスコルビン酸、β−グリセリンリン酸、およびメラトニンを含有している、１００μＬの新鮮なＯｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＃２と交換する。ＡＭＰおよびＨＣ−ＨＡの１０μＬの使用液を、１００μＬのＯｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＃２（０．２ｍＭのアスコルビン酸 ２−リン酸塩、１０ｍＭのグリセロール ２−リン酸塩および５０ｎＭのメラトニン溶液、インビトロの骨形成アッセイキットに対する製造業者の説明書、ｃａｔ＃ ＥＣＭ８１０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へ加えて、培養ウェル中で最終的な実験濃度を得た。培地を、２−３日ごとに変更した。その後、サンプルを、製造業者の説明書に従って、ＡＬＰアッセイ（Ｈ−１５６）およびＡＲＳ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ａｓｓａｙによってアッセイした（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ， （Ｃａｔａｌｏｇ ＃ＥＣＭ８１０））。
【０６７２】
アリザリンレッドＳ染色
各ウェルからの培地を、細胞を妨害することなく、吸引した。細胞を、２００μＬのＰＢＳで１Ｘ洗浄した。細胞を、１００μＬの７０％のエタノールを加えて、１５分間Ｒ．Ｔ．でインキュベートすることによって固定した。その後、固定剤を除去し、細胞を、細胞単層を妨害することなく、過剰な蒸留水によって３Ｘ（各５分）で洗い流した。水を除去し、１００μＬ／ウェルのアリザリンレッド染色液を加えた。ウェルを、１時間Ｒ．Ｔ．でインキュベートした。過剰な色素を除去し、細胞を、脱イオン水で４Ｘ洗浄した（各洗浄による５分間の軽い揺れ（ｒｏｃｋｉｎｇ））。０．１−０．１５ｍＬの水を、各ウェルに加え、細胞が乾燥するのを防いだ。染色された細胞を、顕微鏡下で撮影した。
【０６７３】
その後、余分な水を、各ウェルから取り除いた。１００μＬの１０％の酢酸を、各ウェル加え、３０分間振とうさせながらインキュベートした。緩く付着した単層を、細胞スクレーパーによって慎重に除去し、細胞および酢酸を、１．５ｍＬの微小遠心管に移し、３０分間活発に攪拌した。サンプルを、１０分間８５℃まで加熱し、その後、５分間氷に移し、管を冷やした。管中のスラリーを、１５分間２０，０００ｘｇで遠心分離にかけた。４００μＬの上清を、取り除き、新しい１．５ｍＬの微小遠心管に移した。ｐＨを、１５０μＬの１０％の水酸化アンモニウムによって、４．１−４．５の範囲内に中和した。
１５０μＬの各サンプルを、透明な下部の９６ウェルのプレートに加え、ＯＤ４０５で読み取った。アリザリンレッド濃度対ＯＤ４０５のプロットを作成した。
【０６７４】
ＡＬＰアッセイ（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ： ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ ＡＬＰ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ， Ｃａｔ． ＃： ＤＡＬＰ−２５０）
各ウェル（９６ウェルのプレート）中の細胞を、ＰＢＳで洗浄し、Ｒ．Ｔ．で２０分間振とうすることによって、蒸留水中の１００μＬの０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で溶解した。２００μＬの蒸留水および２００μＬのＣａｌｉｂｒａｔｏｒ溶液（キットによって供給された）を、対照のための別々のウェルに移した。５０μＬのサンプルを、別々のウェルに移した。１５０μＬの使用液（２００μＬのアッセイ緩衝剤、５μＬのＭｇ酢酸塩（５ｍＭ）、２μＬのｐＮＰＰ液体基質（１０ｍＭ））を、サンプルウェルに加えた（最終的な反応容積は、２００μＬであった）。プレートを、短い間軽く叩いて混合した。ＯＤ４０５を、プレートリーダー上で０分および４分で読み取った。
【０６７５】
結果
位相差顕微鏡法
陰性対照は、１３日間の誘発（図５５）にわたって、六角形の形状を維持した。単層は、陽性対照よりも滑らかであり、これは、後者において、より多くの細胞または細胞のより多くの堆積が生じたことを示唆している。陽性対照中の細胞は、誘発が始まった後に、紡錘形状になった。時間が経てば経つほど、スピンドル状の環は、誘発の４日目ごろに、プラスチック培養物の（〜２−３ｍｍ離れた）縁に沿って発達した。
【０６７６】
０．１μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡから１０μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡまで、細胞単層は、陽性対照とは異ならず、これは、これらの濃度でのＨＣ−ＨＡが、誘発に悪い影響を与えなかったことを示唆している（図５５のＡ）。陽性対照のように、細胞も、紡錘形状に発達し、単層は、スピンドル状の環に発達した。しかしながら、２５μｇ／ｍｌで、細胞密度の劇的な減少および細胞形態の変化が、誘発の１３日目に観察された。
【０６７７】
２５μｇ／ｍｌを超える濃度で、ＡＭＰは、単層上に沈降した粒子状物質を堆積させた（図５５のＢ）。ＡＭＰ濃度が各々の培地変更後に補充されたため、単層の上部のＡＭＰの堆積は、誘発の期間にわたって増加した。細胞も、スピンドル環を有する紡錘形状を発達させたために、１２５μｇ／ｍｌより下のＡＭＰでの処置は、細胞形態学に影響を与えず、これは、ＡＭＰが、誘発に悪い影響を及ぼさなかったことを示唆している。１２５μｇ／ｍｌを超える濃度で、ＡＭＰの粒子密度は、スピンドル環の形成の目視観測を不明瞭にする程度まで増大した。しかしながら、細胞の密度および形態は、陽性対照のそれと変わらないままであり、これも、ＡＭＰが、誘発に悪い影響を及ぼさなかったことを確証している。
【０６７８】
アリザリンレッド染色
陰性対照は、淡いピンクを示す単層の部分を有する青灰色の背景色をもたらした。対照的に、陽性対照は、ローズピンク色の背景をもたらした（図５６）。
【０６７９】
０．１μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡは、可視性のスピンドル環の赤褐色の染色を有する赤さび色をもたらし、これは、陽性対照の色とは劇的に異なっていた（図５６のＡ）。この傾向は、１０μｇ／ｍｌで色のわずかな淡色化を有する０．５μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌまで続き、これは、鉱化が、０．１乃至５ｕｇ／ｍｌまで維持され、０から０．１ｕｇ／ｍｌの間の用量依存的な関連性があるかもしれないことを示唆している。２５μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡで、赤さび色の背景は消え、細胞間結合間で顕著な白色の間隙（ｇａｐｓ）を有する淡いパープルピンクに戻った。
【０６８０】
１μｇ／ｍｌから１２５μｇ／ｍｌでのＡＭＰは、０．１ｕｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡより淡く見えた、より淡い茶さび色（１μｇ／ｍｌ）からの用量依存的な変色をもたらし、これは、投薬反応がより緩やかであり、赤さび色の背景（５μｇ／ｍｌ＆２５μｇ／ｍｌ）、赤褐色（１２５μｇ／ｍｌ）になり、２５０μｇ／ｍｌで濃い赤褐色に劇的に増加したことを示唆している（図５６のＢ）。ＡＭＰの粒子状物質が、５μｇ／ｍｌを超えるＡＭＰによって処置された細胞単層の上部に見られ、粒径が、細胞自体よりも小さく、染色された背景色と一致するようであった。
【０６８１】
ＯＤ値の定量分析によって、０．１μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡ処置によるＡＲＳ染色は、統計的有意差（ｐ＜０．０５）を有して陽性対照から３ｘ増加した（図５７のＡ）。０．１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの濃度の幾らかの変化が観察され、これは、小さなサンプルサイズ（Ｎ＝２）に起因し得る。２５μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡ処置でのＯＤ値の劇的な減少を観察した。ＡＭＰに関して、１２５μｇ／ｍｌのＡＭＰでの処置は、陽性対照からの鉱化の量を２倍を超える量にし、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）（図５７のＢ）。陽性対照からのＯＤ値の少しの減少は、１μｇ／ｍｌのＡＭＰにおいて見られ、１μｇ／ｍｌから２５μｇ／ｍｌまで、ＯＤ値に少しの用量依存的な増加があった。ＯＤ４０５は、１２５μｇ／ｍｌと比較して、２５０μｇ／ｍｌのＡＭＰにおいて減少した。幾らかの変化は、小さなサンプルサイズ（Ｎ＝２）に起因し得る。
【０６８２】
ＡＬＰ染色
両方のＡＭ誘導体の群において、陰性対照は、陽性対照よりも５倍以上のＡＬＰ活性を示し、これは、陰性対照におけるサンプルの喪失から生じ得、サンプルサイズを縮小させた（図５８）。より小さなサンプルサイズは、陽性対照よりも陰性対照に対して８ｘ高い標準偏差値に寄与し、このはるかに大きな変化は、その増加に起因し得る。
【０６８３】
相当量のＨＣ−ＨＡでの誘発されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の処置は、陽性および陰性の対照と比較して、ＡＬＰ活性を減少させた（図５８のＡ）。ＡＬＰ活性は、ＡＬＰ活性が著しく低下した２５μｇ／ｍｌまで、異なる濃度群間で様々であった。実験群および陽性対照の各々における平均からの変化がほとんどなかったことを留意することは有益である。
【０６８４】
１μｇ／ｍｌで、ＡＬＰ活性は、陽性対照よりもほぼ４倍高かった（図５８のＢ）。この現象は、５μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌで遮断され、ＡＬＰ活性は、陽性対照からほぼ３ｘを減少した。１２５μｇ／ｍｌから２５０μｇ／ｍｌに濃度を増加させることで、ＡＬＰ活性は、１μｇ／ｍｌに近いレベルまで回復した。したがって、ＡＬＰ活性は、鉱化の量に一致していなかったようであった。
【０６８５】
結果の概要
陰性対照と比較して、陽性対照は、より多くの紡錘状細胞を示し、プラスチックウェルの縁のまわりで環を形成し（図５５のＡ）、アリザリン染色による変色（図５６のＡ）、およびＯＤ４０５の検出可能であるが有意でない変化（図５７のＡ）を示した。以前に、５ｘ１０４細胞／３５ｍｍのプラスチック皿で播種されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞はまた、４日目の後に層状の膠原細線維の形成、１８日目までに層状の原線維の形成、および２１日目の誘発までに結節状領域の形成を明らかにした。（Ｓｕｄｏ （１９８３） Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９６： １９１−１９８）。この事前の研究は、我々が観察したのと同じ環の形成を示さなかった。あるいは、それは、環を層状の膠原細線維として解釈したかもしれない。もしそうであれば、環領域は、鉱化を起こしやすいはずである。
【０６８６】
アリザリンレッド染色は、鉱化を示すために文献で深紅色として記載されている。鉱化および骨芽細胞の結節は、紅色で染色されると記載され、色の強度は、鉱化とともに増強した（Ｗａｎｇ， （２００６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． ２２（６）：１６９７−７０１； Ｚｈａｏ， ２００７）。ＡＲＳ染色は、４０５ｎｍで読に取られ、これは、可視スペクトル中のスミレ色に対応する。我々の結果とは異なり、公開されたデータからのＭＣ３Ｔ３−Ｅ１鉱化のＡＲＳ染色のカラー写真は、単層中で赤さび色または赤褐色を示さなかった。我々の結果におけるより濃い色は、公開された結果と比較して、より多くのＡＲＳ染色、およびそれ故、より多くの骨形成を示している。ＡＲＳの染色および定量化におけるＯＤ変化の量は、培養条件および細胞型に依存して様々であった。３０日間６ウェル（１０ｃｍ２／ウェル）中で培養されたヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、０．５乃至４のＯＤ４０５の増加を達成した（Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２９： ７７−８４）。２４ウェルのプレートで２８日間培養されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（α−ＭＥＭ、アスコルビン酸、α−グリセリンリン酸）は、０．６のＯＤを達成した。しかしながら、１６日目および２６日目のＯＤは、それぞれ、０．０５および０．２未満で、２８日目よりはるかに少なかった（Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ （２００６） Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｓｅｌ， Ｍａｓｔｅｒ Ｔｈｅｓｉｓ）。陽性対照中の劇的な変色の欠如は、ＡＬＰには最適であるがＡＲＳに対しては短すぎる、Ｄ１３の時間が原因かもしれない。
【０６８７】
０．１μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡはまた、「環の変化」（図５５のＡ）、色の明らかな増強（図５６のＡ）、および陽性対照（ｐ＜０．０５）よりも３Ｘ高いＯＤ値（図５７のＡ）を誘発し、これは、より少ない投与量でのＨＣ−ＨＡが、鉱化を促進し、用量−反応曲線が、０から０．１ｕｇ／ｍｌの間にあることを示唆している。
【０６８８】
０．５乃至１０μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡはまた、「環」を示し（図５５のＡ）、０．１ｕｇ／ｍｌと同じ色を維持し（図５６のＡ）、統計的有意差のないＯＤ４０５をもたらした。２５μｇ／ｍｌでのＨＣ−ＨＡは、細胞密度を減少させ、細胞形態学を変化させ、「環」を失い（図５５のＡ）、（陰性対照を類似した）変色をもたらさず（図５６のＡ）、および（陰性対照のような）取るに足りないＯＤ４０５を生成した。
【０６８９】
２５μｇ／ｍｌからのＡＭＰは、粒子状物質を残し（図５５のＢ）、１μｇ／ｍｌから、た、陽性の用量応答の関連性を有する色を増加させた（図５６のＢ）が、ＯＤ４０５は、１２５のμｇ／ｍｌのＡＭＰ（ｐ＜０．０５）まで統計的に有意でなかった増加を示し、その後、２５０μｇ／ｍｌで減少し、これは変色と一致していなかった。ＨＣ−ＨＡとは異なり、より高用量のＡＭＰは、細胞形態に有害作用をもたらさなかった。
【０６９０】
パートＢ
その後、アリザリンレッド染色法は、サンプルサイズを増加させ、ヒトＭＳＣのアリザリン染色および当該技術分野で既知の他の方法に使用される、Ｇｒｅｇｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  （（２００５）  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２９：  ７７−８４）による方法論を組み入れることによって改善された。Ｇｒｅｇｏｒｙ  ｅｔ  ａｌの方法、上に記載される我々の先の方法、および本実施例で概説される新しい方式の比較は、下記の表に提供される。以前の研究は、誘発下でのＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の分化が、３つの段階、すなわち、増殖（１〜９日目）、ＥＣＭ形成（９〜１６日目）、および鉱化（形成されたＥＣＭ中の鉱質沈着物（ｄｅｐｏｓｉｔ  ｍｉｎｅｒａｌｓ））（１６日目＋）へと細分化され得ることを示した。（Ｑｕａｒｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ． ７（６）：６８３−９２； Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ． （２０１０）  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ． ３１６（１４）：２２９１−３００）。異なる群からの研究を比較するために、コンフルエンスから始まる事象を０日目として設定することが重要であった。
【０６９１】
【表１１−１】
2019178144.tif 000013
【０６９２】
【表１１−２】
2019178144.tif 000014
【０６９３】
実験計画：
細胞を、パ−トＡおよび表５に記載されるように、分化培地中で培養且つ刺激した。分化培地を、１８日間３日ごとに変更した。０．１μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡおよび１２５μｇ／ｍｌのＡＭＰを、アッセイのために利用した。ＡＲＳアッセイを、表５に言及されるような変化とともにパ−トＡに記載されているように行った。
【０６９４】
結果
細胞形態および環の形成
非誘発性の細胞は、播種（図５９のＡ）後に水平な立方体形状を達成した。細胞の境界は、４日目に隆起した縁とともにより画定され、６日目に紡錘形状を発達させた細胞もあった。スピンドル細胞または多層は発達されなかった。
【０６９５】
１日目から３日目まで、細胞は立方体形状を維持し、単層は平らなままであった（図５９のＢ）。３日目までに、細胞の境界はより明確になりた、細胞の縁は隆起された。さらに、小さな円形細胞様の構造は、単層上で可視性であった（黒丸によって示される）。細胞形態は、紡錘状の細胞および多層で組織された細胞の出現によって４日目までに変化した。小さな円形細胞様の構造の出現は、６日目から７日目にわたって増加し続けた。
【０６９６】
ＨＣ−ＨＡによって処置された誘導細胞の細胞形態の変化は、陽性対照の変化を反映していた（図６０のＡ）。ＨＣ−ＨＡは、ＡＭＰのように単層上に粒子状物質を残さなかった。陽性対照のように、小さな円形細胞様の構造（黒丸で示される）が、３日目に現われ、７日目まで増加し続けた。
【０６９７】
ＡＭＰの粒子状物質（黒い矢印で示される）は、単層の上部に沈降し、真下の単層の観察を妨害した（図６０のＢ）。０日目および１日目にＡＭＰの粒子状物質を欠けている領域は、円形および立方体の形状を示した。２日目に、幾つかの紡錘状の細胞が、単層上に現われた。より小さなＡＭＰの粒子状物質から小さな円形細胞様の構造を特定し、識別することは難しく、これらの構造の発達は知られていないままである。５日目に、紡錘形状がスピンドル状の細胞を形成するため伸張する。６日目に、長いスピンドル細胞は、ＡＭＰの粒子状物質（黒丸で示される）とのウェブ状の相互作用を形成した。
【０６９８】
３日目に、紡錘状の細胞は、ウェルの縁の近く（縁から１−２ｍｍ）で発達した（図６１のＡ）。スピンドル細胞および環の形成は、４日目以降発達しなかった。細胞は、縁で互いに重なり、紡錘形状に成長するように見えた。０日目から２日目に、ウェルの縁に沿ったスピンドル状の細胞はなかった（図６１のＢ）。３日目に、環構成で堆積された同様の紡錘細胞が、縁で見られた。５日目から、これらの細胞は、縁から約２ｍｍの顕著な環として濃縮された（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）。６日目に、単層は、（白色→によって示される）縁の近くの特定領域に沿ったプラスチック表面からの分離を示す。
【０６９９】
細胞は、２日目まで、縁に沿って滑らかな且つ立方体のままであった（図６２のＡ）。紡錘状の細胞は、２日目に、縁の近くで発達した。その時に、縁の近くで可視性であった小さな円形細胞様の構造もあった。スピンドル状の細胞は、３日目に発達し、５日目までウェルの縁のまわりの環において厚化し続けた。プラスチックウェルからの単層の分離は、（白の矢印で示される）縁の近くの領域において６日目に観察された。紡錘状の細胞は、２日目にウェルの縁の近くに現われた（図６２のＢ）。スピンドル状の細胞は、３日目に（約１〜２ｍｍ離れて）縁から発達し、スピンドル状の細胞の環が、５日目までに形成された。プラスチックウェルからの単層の分離は、５日目に縁の近くの幾つかの領域において観察された。分離は６日目に継続したが、単層は、ＨＣ−ＨＡで処置された細胞および陽性対照細胞ほど分離しなかった。
【０７００】
ＡＲＳ染色および定量化
陰性対照の単層は、幾つかの領域（図６３）において淡いピンク色に染色された。陽性対照は、中心で淡いピンク色に染色されたが、スピンドル環の領域で明るい深紅色を示し、これは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞が、単層の残りよりも、環に鉱化を多量に堆積させることを示している。０．１μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡと陽性対照との間の中心の単層およびスピンドル環における染色の強度および色の両方は、同じであった。細胞の上部のＡＭＰの粒子状物質は、赤褐色に染色された。真下の細胞の目視観測は、染色された粒子状物質によって妨害されたが、開口部は、顕著な細胞単層の欠如を示し、陰性対照に類似して、淡いピンク色に染色される低密度細胞もあった。ＡＭＰで処置された細胞は、可視性のスピンドル環を示さず、ＡＲＳは、陽性対照に類似して、縁のまわりを深紅色に染色しなかった。
【０７０１】
ＧｎＨＣｌ処置は、細胞マトリックスを可溶性にし、深紅色のＡＲＳ色素を除去したが、陽性対照およびＨＣ−ＨＡで処置された細胞の両方において単層は無傷なままであった。ＧｎＨＣｌは、細胞タンパク質を消化し変性させ、細胞外マトリックスを残した。ＡＭＰの実験群では、ＡＭＰの粒子密度が減少したが、ほとんどの粒子状物質はウェルの底部に残ったままであった。長い培養時間によって、ＡＭＰの粒子状物質は、ＧｎＨＣｌによって溶解されなかったＥＣＭマトリックスとの密の相互作用を形成し得る。一度明るい赤褐色に染色された粒子状物質は、ＡＭＰが本来示す色のような薄茶色を示した。しかしながら、異なる１単層構造は観察されず；これは、ＡＭＰ間の間隙における細胞の単層の観察を支持した。細胞は、単層からＡＭＰの粒子状物質へと移動するかもしれず、それを分化および鉱化のためのスキャフォールドとして使用した。
【０７０２】
ＡＲＳ標準は、２ｍＭから３１．３μＭまで連続希釈による、深紅色からクリームピンク色までの進行を示した（図６４のＡ）。ＨＣ−ＨＡとＡＭＰでの処置サンプル間に顕著な変色があった。ＨＣ−ＨＡ処置された細胞抽出物は、明るいクリーム色を示し、一方で、ＡＭＰ処置された細胞抽出物は、淡いクリームピンク色を示した。陰性対照はまた、ＨＣ−ＨＡ処置された細胞と同じ色および色の強度のレベルを示したが、一方で、陽性対照は、ライターより淡い色を示し、ブランク（図示せず）に類似していた。ＯＤ４０５値は、先の実施例の値と同じ範囲内にとどまった（図６４のＢ）。陰性対照と比較して、陽性対照は、ＯＤの統計的に有意な２倍の減少を示した。ＨＣ−ＨＡ処置された（０．１μｇ／ｍｌ）細胞は、陽性対照よりもＯＤのわずかな増加を示したが、その違いは統計的に有意ではない。ＡＭＰ（１２５μｇ／ｍｌ）処置は、陽性対照と比較して、わずかにＯＤ値を減少させたが、この減少は統計的に有意ではなかった。
【０７０３】
ＡＲＳ標準は、２ｍＭから３１．３μＭまでの連続希釈による、深紅色からクリームピンク色までの進行を示した（図６５のＡ）。陰性対照の抽出物は、ブランク（図示せず）よりわずかに濃い淡いクリーム色を示した。陽性対照は、淡い金色を示し、その色は陰性対照より目に見えて濃かった。ＨＣ−ＨＡはまた、陽性対照と同じ強度で淡い金色を示した。ＡＭＰ処置された抽出物は、陽性およびＨＣ−ＨＡの両方の抽出群より濃いオレンジの金色を示した。ＯＤ４０５値は、約０．２５で最も高い範囲と同じ範囲内にとどまった（図６５のＢ）。陰性対照は、０に近い、取るに足りないＯＤ値を示した。陽性対照およびＨＣ−ＨＡ（０．１μｇ／ｍｌ）で処置された抽出物は、０．０５に近い平均ＯＤ値を示した。
ＡＭＰ処置された（１２５μｇ／ｍｌ）抽出物は、陽性およびＨＣ−ＨＡの両方の処置群からのＯＤ（Ｐ＝０．０３９）の統計的に有意な５倍の増加を示した。
【０７０４】
要約
細胞形態
αＭＥＭ ｗ／１０％のＦＢＳ中で培養されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、コンフルエンスまで成長し、立方体形状を発達させた。Ａｉｍ ＃１および＃２における結果のように、細胞は、アスコルビン酸、β−グリセリンリン酸、およびメラトニンの付加なしでは分化しなかった。誘発培地なしでは、スピンドル細胞およびスピンドル環は形成されなかった（図５９）。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、アスコルビン酸、β−グリセリンリン酸およびメラトニンによって分化へと誘発された。播種後、滑らかな単層が、立方体形状の細胞によって形成された。３日間の誘発後、細胞は、紡錘形状を達成した。５日目までに、細胞は、伸張し、スピンドル状になった。
【０７０５】
本実施例では、スピンドル環が、誘発の３日目に発達し、スピンドル状の細胞は、ウェルの壁から１〜２ｍｍ形成された。６日目に、ウェルの縁およびプラスチックの底部からの単層の分離が観察された（図６０）。小さな円形細胞様の構造が、２日目に単層上で発達し始め、６日目に数が増加した（図５９）。それらは、培地中に浮かず、単層の中に堅く付着され、主として細胞の境界の間に休止した。これらの構造は、マトリックス小胞（ＭＶ）が、軟骨および骨における初期のカルシウム沈着の部位に位置する、細胞外の、膜に包まれた（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｉｎｖｅｓｔｅｄ）粒子状物質であると表わしている。マトリックス小胞の合成は、によって、芽を出しかけて、分化する成長プレートの軟骨細胞および骨芽細胞の外部の原形質膜の特定領域からのベシクルの発芽および摘みによって生じる（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｃｕｒｒ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ Ｒｅｐ． ５（３）：２２２−６）。
【０７０６】
ＨＣ−ＨＡでの処置によって、分化によるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の細胞形態学的変化は変更されなかった（図６０）。紡錘状の細胞、スピンドル状の細胞およびスピンドル環の形成は、陽性対照の報告された時間的経過に従った（図６１）。ＡＭＰの粒子状物質は、以前の結果に類似して、細胞単層の上部に沈降した（図６０）。これによって、誘発による細胞単層および細胞形態の変更の十分な観察が妨げられた。しかしながら、ＡＭＰの粒子状物質が沈降しなかった開口部によって観察されたものもあった。ＨＣ−ＨＡとは異なり、ＡＭＰ処置は、細胞形態学的変化を促進し、幾つかの紡錘細胞は、誘発の２日目に１日早く可視性であった。ＡＭＰ処置された細胞は、ＨＣ−ＨＡ処置された細胞および陽性対照に類似して、スピンドル環を形成した（図６２）。しかしながら、単層は、他の２つの実験群よりも早く分離した（６日目の代わりに５日目）（図６２）。
【０７０７】
ＡＲ染色および定量化
ＡＲＳ染色は、以前に報告されたよりも劇的に異なる色を示した（図６６）。ＡＲＳは、陰性対照の細胞単層において灰青色の代わりに淡いピンク色を染色した。ＡＲＳ染色はまた、陽性対照およびＨＣ−ＨＡで処置された細胞における以前の結果から、茶さび色の代わりにスピンドル環において濃縮された明るい深紅色を示した。ＡＭＰの粒子状物質は、暗褐色の代わりに赤褐色で染色され、真下の細胞は、茶さび色の代わりに淡いピンク色に染色された。ＡＲＳ溶液の分解は、変色に寄与し得る。
【０７０８】
酢酸抽出後、単層には、著しい量の染色された色がまだ残っていたようであった。酢酸は、単層から完全にＡＲＳ染色を取り除くのに有効ではない。酢酸抽出によって、陽性対照（図６６）においてより多くのＡＲＳ染色の目視観測と一致した、陽性および陰性の対照（図６８）のＯＤ値間に統計的有意差があった。しかしながら、ＡＭＰ群の目視観測が、他の２つの群（図６７）よりもアッセイ抽出物中により多くの色を有しているにもかかわらず、酢酸抽出は、陽性とおよびＨＣ−ＨＡの群（図６６）と比較して、ＡＭＰのＯＤの統計的に有意な増加を示すのに有効ではなかった。ＡＭＰ粒子の堆積物によって、ＡＭＰ群からＡＲＳを取り除くことがより困難なっているのかもしれない。鉱石化されたマトリックスおよび細胞も、ＡＲＳの酢酸抽出を妨害するＡＭＰの粒子状物質との相互作用を有し得る。
【０７０９】
ＧｎＨＣｌは、酢酸処置よりも完全に細胞単層からＡＲＳを取り除いた（図６９）。さらに、色は、単層を除去するための細胞スクレーパーの使用なしで、ＧｎＨＣｌ溶液中で可溶性になった。両方の方法によって、粒子状物質は肉眼で見えないように残り、遠心分離による影響を受けなかったようである。ＧｎＨＣｌについて、これは、カルシウムおよび微粉末を形成する溶解されたマトリックスであり得る。これは、各サンプル中で繰り返す間の変化をもたらした。粒子状物質を除去するための６７０ｎｍでの読み取りは、ＧｎＨＣｌ抽出方法に対するこの問題を解決した。
【０７１０】
ＧｎＨＣｌ抽出は、陰性および陽性の対照間の定量可能な統計的有意差を確立することができず、これは、ＡＲＳ染色の目視観測と一致した（図７１）。ＧｎＨＣｌ抽出はまた、０．１μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡが、分化するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞において、さらなる鉱化を促進しなかったことを示し（図７１）、これは、酢酸抽出の結果と一致した。９６ウェル中のアッセイ抽出物の色を注視すると、陽性対照およびＨＣ−ＨＡのウェルでは、色または強度の差は示されなかった（図７０）。
【０７１１】
ＧｎＨＣｌ抽出は、１２５μｇ／ｍｌのＡＭＰが、陽性対照よりも分化するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞において、より多くの鉱化を促進したことを示した（図７１）。これは、単層のＡＲＳ染色（図６６）および９６ウェルのアッセイプレート中の抽出物の目視観測の両方に一致し（図７０）、ここで、ＡＭＰは、ＨＣ−ＨＡまたは陽性対照よりもはるかに深い黄橙色を示した。
【０７１２】
これらの結果から、ＧｎＨＣｌは、ＡＲＳ染色を単層からより完全に除去し、無傷なままで残すため、より好適な抽出法であり；単層をウェルからこすり落とす必要がないため、それほど技術的誤差はない。抽出物の色は、分光光度計の読み取りによって定量化され得る。
【０７１３】
パートＣ
上述の予備的研究は、小さなサンプルサイズおよびＡＲＳアッセイの不完全な発達が原因で、骨芽細胞分化上のＨＣ−ＨＡおよびＡＭＰのための用量−反応曲線に対する統計的に有意な結果を示さなかった。これは、０．１μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡが、鉱化を増強し得ることを示唆した。さらに、１０μｇ／ｍｌ乃至２５μｇ／ｍｌでのＨＣ−ＨＡは、細胞の生存率に影響を与え、鉱化を減少させるかもしれない。ＨＣ−ＨＡに対する用量曲線は、１０μｇ／ｍｌを超える濃度と同様に、０．１μｇ／ｍｌより下のより低い濃度も含むはずである。ＨＣ−ＨＡとは異なり、５μｇ／ｍｌ乃至１２５μｇ／ｍｌでのＡＭＰは、鉱化を促進し得る。この実験では、ＨＣ−ＨＡおよびＡＭＰの用量応答を、パートＢの方法を使用するので再試験した。この実験では、ＡＲＳ染色を、１５日目にアッセイするために使用し、染色且つ定量するための、１０％の酢酸を使用する修正されたプロトコルを利用した。
【０７１４】
実験計画
３Ｔ３−Ｅ１細胞に基づいてパートＢで示されるのと同じモデル系を、αＭＥＭ培地ｗ／１０％のＦＢＳにおいて９６ウェルプレート中で３ｘ１０４細胞／ｃｍ２／ウェルを播種することによって使用した。コンフルエンス後に、細胞を、アスコルビン酸、β−グリセリンリン酸、メラトニンの誘発培地を加えることによって分化するように誘発した。
各条件について、Ｎ＝３を試験した。コンフルエンス後に（０日目＝播種）、ＨＣ−ＨＡを、０．０２μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および２５μｇ／ｍｌで加え、一方で、ＡＭＰを、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、および１２５μｇ／ｍｌで加えた。ＡＲＳ染色のために、パートＢの修正された方法を使用した。
【０７１５】
結果
陰性対照のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、培養中に、スピンドル形状またはスピンドル環を発達させなかった（図６６のＡ）。単層の中心および周辺は、ベージュ色に染色された。陽性対照の細胞は、紡錘状およびスピンドル状の細胞を発達させ、培養する（４日目の誘発）Ｄ５のまわりにスピンドル環は出現した。ＡＲＳ染色は、中心に淡い栗色を示し、主として、濃い深紅色でスピンドル環において濃縮された。１．２５μｇ／ｍｌまでのＨＣ−ＨＡ濃度の増加は、細胞形態またはＡＲＳ染色の強度およびパターンに対する効果がなかった。２．５μｇ／ｍｌで、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のスピンドル環は分解し始め、ＡＲＳの色は、深紅色から赤褐色に変わった。２０μｇ／ｍｌによって、細胞は、その紡錘およびスピンドルの形状を失い；細胞の縁も、それほど画定されず、それほど隆起しなかった。細胞密度は減少し、単層は以前のように隆起されて出現しなかった。ＧｎＨＣｌは、ＡＲＳ色素を抽出することに成功し、ＯＤ４５０値の変動係数は、５％から１９％までの範囲であった。陽性対照は、統計的に有意な増加したＯＤ値を示した（図６６のＢ）。
【０７１６】
陰性対照のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、培養中に、スピンドル形状またはスピンドル環を発達させなかった（図６７のＡ）。単層の中心および周辺は、ベージュ色に染色された。陽性対照の細胞は、紡錘状およびスピンドル状の細胞を発達させ、培養する（４日目の誘発）Ｄ５のまわりにスピンドル環は出現した。ＡＲＳ染色は、単層の中心に淡い栗色を示した。ＡＭＰ処置によって、細胞単層の上部に沈降し、上向きの６２．５μｇ／ｍｌの濃度からの単層の観察を不明瞭にした、ＡＭＰの粒子状物質が残された。ＡＭＰのみで処置され、誘発のない、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、縁に沿ったスピンドル環を示さず、ＡＲＳ染色は、淡いピンク色の背景での濃い深紅色を示した。７．８μｇ／ｍｌから３１．２５μｇ／ｍｌまで、ＡＭＰの粒子状物質は、単層を完全には覆わず、細胞は、紡錘形状およびスピンドル形状を示した。縁に沿って、スピンドル環は見られなかった。ＡＲＳ染色は、淡い栗色に染色された中心の単層、およびスピンドル環に沿って陽性対照のように濃い深紅色に濃縮された色素を示した。ＧｎＨＣｌは、ＡＲＳ色素を抽出することに成功し、ＯＤ４５０値の変動係数は、３％から１０％までの範囲であった（６７のＢ）。
【０７１７】
結果の概要
細胞形態／ＡＲＳ染色
先の結果に類似して、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の分化は、立方体形状から、紡錘およびスピンドルの形状に変化する細胞から進行する。誘導時間が増加するとともに、スピンドル環が、ウェルの縁に沿って（〜２ｍｍ離れて）形成され、単層を時間とともに収縮する。陽性対照とは異なり、陰性対照は、スピンドル状の細胞やスピンドル環を決して発達させなかった。陰性対照の単層は、均一なベージュ色で染色されたが、陽性対照は、中心で淡い栗色／ピンク色を示し、スピンドル環で濃縮された濃い深紅色を示した。
【０７１８】
１０μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡで、細胞形態は、より低い濃度から変化し、より少ない細胞は、紡錘とおよびスピンドルの形状を示した。細胞密度は減少し、単層はそれほど隆起されなかったように見えた。２０μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡでは、細胞密度は劇的に減少し、スピンドル形状の細胞はほとんどなかった。単層は、陰性対照のように滑らかでなかったように見えた。両方の濃度に関して、これらの変化は、５日目の培養および誘発で始まると分かった。両方の濃度では、スピンドル環は、不十分に形成されたか、あるいは存在しなかった。ＨＣ−ＨＡ濃度の増加は、２．５μｇ／ｍｌおよびそれより上の濃度でスピンドル環の崩壊を引き起こした。
【０７１９】
すべてのＡＭＰ処置された細胞において、ＡＭＰの粒子状物質が沈降したまわりの領域は、濃い深紅色に染色された。ウェルの縁のまわりで、ＡＭＰの粒子状物質の開口部を通る単層を見られなかった。１２５μｇ／ｍｌのＡＭＰで処置された非誘発性のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１は、１２５μｇ／ｍｌのＡＭＰで処置された誘発性のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に類似した染色を示した。沈降したＡＭＰを有する細胞は、パッチ中で濃い深紅色で染色され、真下に染色された単層は観察されなかった。７．８μｇ／ｍｌから１５．６μｇ／ｍｌのＡＭＰで、細胞形態は可視性であった。細胞は、紡錘およびスピンドルの形状を示し、スピンドル環はウェルの縁に沿って形成された。ＡＲＳ染色は、中心に淡い栗色およびスピンドル環領域に濃い深紅色を有する陽性対照と類似していた。
【０７２０】
ＧｎＨＣｌ処置は、染色された単層からＡＲＳ色素を抽出することに成功した。抽出は、陰性対照から陽性対照までのＯＤ４５０の統計的に有意な（ｐ＜０．０１）２倍の増加を示した。ＨＣ−ＨＡ処置された細胞は、ＨＣ−ＨＡ濃度が増加するにつれ鉱化を減少する傾向を示した。１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌのＨＣ−ＨＡで、陽性対照からの鉱化の統計的に有意（ｐ＜０．０５）な減少があった。ＡＭＰは、分化するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の鉱化を用量依存的に増加させた。
【０７２１】
ＡＭＰで処置された非誘発性の細胞はまた、鉱化を示し、ＡＭＰは、陽性対照（ｐ＜０．０１）以上に鉱化を誘発且つ促進したようであった。また、１２５μｇ／ｍｌのＡＭＰで、非誘発性の細胞に対する処置は、誘発培地で培養された細胞（ｐ＜０．０５）以上の鉱化を示した。
【０７２２】
実施例３９骨芽細胞の分化に対するＡＭＰの効果
ＡＲＳ染色は、ＡＭＰによる染色の明らかな用量依存的増加を示し、１２５μｇ／ｍｌで鉱化の統計的に有意な増加を示したが、そのような変化が、ＡＭＰへのＡＲＳの非特異的結合によってもたらされるかどうかは不明瞭であった。ＡＭＰが、特に高用量でＨＣ−ＨＡとは異なって作用した、すなわち、鉱化作用を促進するが、それを阻害しなかったため、ＡＭＰの作用が、ＡＭＰとの細胞の直接的な接触に依存するかどうかについては除外することが重要であった。この問題は、ＨＣ−ＨＡが通り抜けるのに十分であるが、ＡＭＰの粒子状物質を排除するのに十分に小さい、３μｍの孔径を有するトランスウェルの使用によって対処された。この孔径を有する利用可能なトランスウェルのプレートが、２４ウェルのプレートに合うため、アッセイの培養条件は、それにしたがって変更された。１２５μｇ／ｍｌのＡＭＰの濃度を、アッセイのために使用した。
【０７２３】
実験計画：
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（Ｐ２での細胞；ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＲＬ−２５９３（商標））を、１ｘ１０５細胞／ｍｌの密度で、１２ウェルの水平で、透明な底部ウェル上に播種した。上で使用されるのと同じＡＭＰの貯蔵溶液（ＡＭＰ−４；Ｌｏｔ ＃ＣＢ１０２９７１）を、ＰＢＳ中で５ｍｇ／ｍｌとして調製した。トランスウェルのないウェルに関して、１７．５μＬのＡＭＰの貯蔵溶液を、０．７ｍｌの培養培地（基剤または誘発培地）中に加え、α−ＭＥＭ ｗ／１０％のＦＢＳ（誘発なし）または誘発培地＃１に続いて＃２（誘発あり）のいずれかにおいて、１２５μｇ／ｍｌのＡＭＰの濃度を達成した。トランスウェルを有するウェルに関して、１７．５μＬのＡＭＰの貯蔵溶液を、上に記載されるのと同じ方法で、トランスウェルの膜の中心へと直接加えた。培養培地（１０％のＦＢＳを有するα−ＭＥＭ；上に記載されるような誘発培地＃１および＃２）を、０日目の誘発後に３日ごとに変更した。細胞単層が、７０％のエタノールの代わりに４％のパラホルムアルデヒドで固定され、１時間の代わりに２時間染色されたことを除いて、ＡＲＳの染色および定量化の手順を、上に記載されるように行った。
【０７２４】
結果
すべての誘発細胞は、誘発の４日目に環の形成を発達させた（図６８）。環は、約２−３ｍｍ離れて、プラスチックウェルの縁のまわりで細胞の層から構成された。それらは、層において成長し、巻き付けられ、その後、単層は、多くのウェル中でプラスチックから分離された。誘発なしで、細胞は、培養期間の増加とともに、幾つかの紡錘形状と、主として六角形形状を維持し、単層は、誘発細胞と比較して、滑らかなままであった（図６９）。誘発は、細胞を紡錘形状にし、単層は隆起され、細胞間の境界は、より明確になった。誘発によって、４日目までに、スピンドル状の環は、培養皿の縁に沿って発達すると観察された。ＡＭＰでの処置は、細胞の生存率に影響を与えず；また環の形成にも影響を与えず、これは、ＡＭＰ誘発に悪影響を与えなかったことを示唆している。トランスウェルの付加は、細胞の成長または形態に影響を与えなかった。
【０７２５】
トランスウェルなしで、１２５μｇ／ｍｌでのＡＭＰによって、粒子状物質は細胞単層上に沈降してままであった（図６９のＡ）。誘発なしで、ＡＭＰ自体によって、細胞が、スピンドル形状を発達させ、環が生成されることはなく、それ故、これは、ＡＭＰ単独が、陰性対照に類似して、誘発を引き起こすには十分ではなかったことを示唆している。誘発によって、１２５μｇ／ｍｌのＡＭＰは、陽性対照のように細胞形態の変更をもたらし、これは、ＡＭＰ自体が、誘発に悪影響を与えなかったことを示唆している。トランスウェルによって、１２５のμｇ／ｍｌのＡＭＰは、取るに足りない粒子状物質を細胞単層上に残した（図６９のＢ）。誘発なしでは、ＡＭＰは、細胞の分化を誘発するのに十分ではなく、細胞は陰性対照を類似していた。誘発および１２５μｇ／ｍｌのＡＭＰによって、細胞は、紡錘状およびスピンドル状の形状を発達させ、１４日目まで陽性対照を類似しており、これも、ＡＭＰが誘発に悪影響を与えなかったことを示唆している。
【０７２６】
陰性対照は、単層中の淡いピンク色のパッチを有する暗灰色の背景色をもたらし、これは、先の実験における陰性対照の灰青色とは異なった（図７０）。誘発はないがトランスウェルによって、単層は、ＡＭＰで処置されるときでさえ、陰性対照に類似した、暗灰色の背景色で染色され、これは、ＡＭＰ自体が誘発をもたらさなかったことを示唆している。トランスウェルなしでは、陰性対照と比較して、背景色の顕著な減少を示す領域があり、これは、単層上に沈降されたＡＭＰの粒子状物質が、（＊＊によってマークされた）色を遮断し、ＡＭＰ自体が陽性の色を生成しなかったことを示しており、これはそれ故、鉱化を示唆している。
【０７２７】
陽性対照は、先の実験にける陽性対照からの深紅色より濃い、赤さび色に染色された環を有するローズピンクをもたらした。トランスウェルの付加は、陽性対照の色に影響を与えず、これは、トランスウェル自体が、誘発に影響を与えなかったことを確証している。ＡＭＰがあるがトランスウェルがないと、単層は、陽性対照よりも濃い赤さび色をもたらし、環はより濃く染色され、これは、ＡＭＰがさらなる陽性の誘発を働かせたことを示唆している。対照的に、トランスウェルによって、背景色の強度は、陽性対照のレベルに減少した一方で、環は同じ色を維持し、これは、トランスウェルが、誘発に対するＡＭＰの効果に対して悪影響を及ぼしたことを示唆している。
【０７２８】
定量化の結果は、統計的有意差をもたらすには十分ではなく、ＡＲＳ染色の視覚分析に一致しなかった（図７１）。しかしながら、全体的な傾向は、陽性対照が、陰性対照以上に鉱化を示すことを示唆した。さらに、トランスウェルが、ＡＭＰの存在および誘発に含まれたときにＯＤ４０５がより少ないことを示唆する傾向があった。
【０７２９】
結果の概要
恐らく皿のサイズがより大きかったため、環の形成を容易に観察した（図６９のＡ）。しかしながら、恐らく固定剤の変更が原因で、陰性対照用の背景色は、先の実験とは異なっていた。さらに、特に環領域において、陰性および陽性の対照の間に、より劇的な変色があった（図７０）。陽性対照中のトランスウェルの導入は、細胞形態（図６９のＢ）またはＡＲＳ染色の色（図７０）に影響を与えなかった。
【０７３０】
誘発がないと、トランスウェルのないＡＭＰは、陽性のＡＲＳ染色を明らかに遮断し（図７０）、トランスウェルのあるＡＭＰは、陰性対照と同じ色を示した。ＡＭＰは自体は、非特異的なＡＲＳをもたらさず、誘発をもたらさない。誘発によって、トランスウェルのないＡＭＰは、陽性対照よりも多い色をもたらした。対照的に、トランスウェルのあるＡＭＰは、陽性対照と同じ色をもたらすように見えた。
【０７３１】
先のＡＲＳの定量化結果は、陽性対照（ｐ＜０．０５）より３Ｘ多い鉱化を促進する１２５μｇ／ｍｌのＡＭＰを示した（図６７）が、図７１においてはそうでなかった。
【０７３２】
ＡＭＰで直接処置された細胞と、およびトランスウェルを介してＡＭＰで処置された細胞との間の細胞形態に違いはなかった（図６９のＡ、Ｂ）。両方の細胞群は、環の形成を発達させ、目視観測は、環状構造間の認知可能な違いを示さなかった。ＡＲＳ染色は、２つの実験群間の背景色の取るに足りない差を示した。しかしながら、ＡＭＰで直接処置された細胞は、より拡散した環の形成を示し、これは、ＡＭＰの粒子状物質からの散乱効果であり得る（図７０）。
【０７３３】
ＡＭＰは、鉱化に影響を与えるためにＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞との直接的な接触を必要としない。この実験から、ＡＭＰが鉱化を促進するかは不明確であるが、ＡＭＰは、細胞形態または細胞の生存度に影響を与えないと示された（図６９）。
【０７３４】
パートＢ
我々の結果は、成長および分化の１５日目の陽性対照と比較されたときに、１２５μｇ／ｍＬのＡＭＰが、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（図６５）の鉱化を著しく増加させたことを示した。ＡＭＰは、培地に直接送達され、ＡＭＰの粒子状物質は、細胞単層の上部に沈降し；それ故、Ａｉｍ １ＢにおけるＡＭＰの効果は、直接的な接触を必要とした。
【０７３５】
パートＡにおいて、ＡＭＰの効果が、分化するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞用のスキャフォールドとしての作用によるものであるか、または因子が、鉱化を促進するために粒子状物質から放出されるかどうかを調査した。しかしながら、１０％の酢酸を有するＡＲＳ染色の抽出物における小さなサンプルサイズおよび技術的誤差は、データに影響を及ぼし、統計的有意差は見られなかった。実験を、４ＭのグアニジンＨＣｌを使用して、実施例３８において発達された、ＡＲＳの染色および抽出の改善された技術的方法を使用して繰り返した。
【０７３６】
実験計画：
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、上に記載されるように、αＭＥＭ培地＋１０％のＦＢＳを用いて、２４ウェル中で、３ｘ１０４細胞／ｃｍ２／ウェルで播種した。コンフルエンス後に、細胞を、アスコルビン酸、β−グリセリンリン酸、メラトニンを加えることにより分化するように誘発した。各条件について、Ｎ＝３を試験した。０日目は細胞播種の日として見なされ、誘発が細胞コンフルエンス後に続いた。合計の誘発時間＝１５日。２つの実験群があった：ＡＭＰは誘発培地に直接加えられ、ＡＭＰはトランスウェルによって送達された。ＡＭＰの濃度を、１２５μｇ／ｍｌで以前と同じように維持した。陰性対照（誘発なし）を、ＡＭＰとともに又はそれなしで、しかし挿入物なしで加えた。上に記載されるように、ＡＲＳの染色および定量化を、誘発の１５日目に行った。
【０７３７】
結果
誘発培地なしで、陰性対照の細胞は、幾つかの紡錘形状を有する六角形形状を維持した（図７２のＡ）。スピンドル状の形状は観察されず、スピンドル環も周辺に沿って形成されなかった。ＡＲＳは、単層を淡いピンクに染色した。誘発によって、陽性対照の細胞は、スピンドル状の形状を達成した。細胞の境界はより顕著であり隆起され；スピンドル環が、ウェルの縁の近くの周辺に沿って形成された。単層の中心は、栗色で染色され、ＡＲＳ染色は、強い深紅色を有するスピンドル環において濃縮された。ＡＭＰでの処置によって直接、ＡＭＰの粒子状物質は、単層上に沈降し、細胞の形態を不明瞭にした。しかしながら、培養ウェルの縁の近くで、ＡＭＰの粒子状物質間の間隙は、両方の群における真下の顕著な単層の欠如を示した。ＡＭＰ処置単独と誘発を有するＡＭＰ処置との間の細胞形態に差はなかった。可視性の細胞は、形状がスピンドル状であった。陽性対照のようなスピンドル環は観察されなかった。ＡＲＳ染色は、中心に深紅色を示し、周辺に沿って赤茶色染色を示した。染色する色およびパターンは、誘発群と非誘発群との間で判別不能であった。トランスウェルを介するＡＭＰでの処置は、単層上のＡＭＰ粒子の沈降をもたらさなかった。細胞は、伸張し、スピンドル状になり、ウェルの縁に沿ってスピンドル環が形成された。陽性対照のように、単層の中心は、栗色に染色され、ＡＲＳ色素は、強い深紅色を有するスピンドル環において濃縮された。ＧｎＨＣｌは、ＡＲＳ色素の抽出に成功し、ＯＤ４５０値の変動係数は、２％から１５％までの範囲であった（図７２のＢ）。
【０７３８】
結果の概要
形態／ＡＲＳ染色
２１日間、α−ＭＥＭ ｗ／１０％のＦＢＳ中で培養された陰性対照は、縁に沿ったスピンドル状の細胞またはたスピンドル環を発達させなかった。ＡＡ、β―グリセロリン酸塩、およびメラトニン、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞による２０日間の誘発後の陽性対照は、ウェルの縁のまわりの、スピンドル状の細胞およびスピンドル環を発達させた（図７２）。細胞単層のＡＲＳの色および染色パターンは、陰性および陽性の対照間で異なっていた。陰性対照の単層は、陽性対照と同じくらいの量の色素を収集できず、均一な淡いピンク色を示した。陽性対照の単層の中心は、栗色に染色され、ＡＲＳ色素は、強い深紅色へとスピンドル環中で濃縮された（図７２）。
【０７３９】
培養培地中での直接的なＡＭＰでの処置は、ＡＭＰの粒子状物質の沈降が原因で、ＡＭＰおよび誘発群を有するＡＭＰにおける細胞単層の観察を不明瞭にした。しかしながら、ウェルの縁に沿ったスピンドル環は観察されず、縁に沿った幾つかの細胞は、スピンドル状の形態を示した。ＡＭＰの粒子状物質が通る開口部は、真下の単層の欠如を示した。ＡＲＳ染色は、ＡＭＰ単独の群と誘発群を有するＡＭＰとの間に色またはパターンの差がなかったことを示した。
【０７４０】
トランスウェルを介するＡＭＰでの処置は、単層の上部にＡＭＰの粒子状物質をもたらさなかった。細胞形態は、陽性対照に類似して、スピンドル状の細胞を有し、スピンドル環が成形された。ＡＲＳ染色の色およびパターンはまた、陽性対照と類似しており、背景の単層は、栗色に染色され、ＡＲＳ染色は、深紅色でスピンドル環において濃縮された。
【０７４１】
ＡＲ定量化
ＧｎＨＣｌは、単層からのＡＲＳ染色の抽出において必要であり、十分であった。対照を比較すると、陰性対照から陽性対照（ｐ＜０．０１）へのＯＤ４５０の統計的に有意な２倍の増加があった。また、陰性／陽性対照からＡＭＰ＋誘発へのＯＤの約６倍の増加があった。９６ウェルから２４ウェルへの表面積の６．５ｘ増加があり、これは、ＯＤの増加の原因となり得る。また、２０日目の培養でＡＲＳの染色および定量化を行ない、これによって、培養期間を２日伸ばし、鉱化も増加し得る。
【０７４２】
ＡＭＰ単独は、陰性および陽性の対照からのＯＤ４５０値の、それぞれ、統計的に有意な１０倍（ｐ＜０．０１）および３倍（ｐ＜０．０１）の増加を誘発した。したがって、ＡＭＰ単独は、分化の誘発および促進に十分であった。誘発を有するＡＭＰは、ＡＭＰ単独（ｐ＜０．０５）からのＯＤ４５０をわずかに減少させたが、陽性対照（ｐ＜０．０１）からのＯＤの３倍の増加を示した。誘発培地は、分化および鉱化を妨害した。
【０７４３】
誘発を有してトランスウェルを介して送達されたＡＭＰは、ＡＭＰより３倍低かったＯＤが、誘発（ｐ＜０．０１）によって直接送達されたことを示し、陽性対照（ｐ＜０．０５）よりわずかに低いＯＤを示した。ＡＭＰは、分化を促進するために直接的な接触を必要とする。直接的な接触なしで、ＡＭＰは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の鉱化を阻害する。
【０７４４】
実施例４０：ＭＳＣにおける骨形成の誘発に対するＡＭＰの効果
我々の結果は、ＡＭＰが、前骨芽細胞に接しているときにＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の分化を促進することを示した。しかしながら、ＡＭＰが、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）などの骨芽細胞系に対する、それほど分化しなかった及びそれほどコミット（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）しなかった細胞株の成長および分化にどれほど影響を与えるかは不明確であった。
【０７４５】
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、前骨芽細胞であり、単能性であるため、骨芽細胞へのその分化を押し進めるためのサプリメント（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）のみを必要とする。胚性幹細胞（ＥＳＣ）または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）などの、他の始原細胞株は、それほど分化されず、それぞれ、少能性および多能性である。したがって、人体の異なる領域に由来するＭＳＣに対するＡＭＰの効果を研究することによって、よりよく骨芽細胞の分化のプログラミングおよび関係する因子におけるＡＭＰの役割をよりよく理解することができる。この検査によって、ＡＭＰが影響を及ぼす細胞型がどれなのか、およびそれが異なる始原細胞における骨形成の誘発に対してどのような効果を有するのかの答えを絞ることができる。
【０７４６】
実験計画
以下の細胞株を使用した：ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）、ヒト骨髄細胞由来の間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ，Ｗｌａｋｅｒｆｉｅｌｄ，ＭＤ）、角膜輪部由来ニッチェ細胞（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｃｈ， Ｍｉａｍｉ， ＦＬ）、ヒト羊膜（ｈＡＭ）間質細胞（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｃｈ， Ｍｉａｍｉ， ＦＬ）、およびヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）。
【０７４７】
細胞を、９６ウェルのプラスチック培養皿中で、αＭＥＭ媒体＋１０％のＦＢＳ中の３ｘ１０４細胞／ｃｍ２／ウェルで播種した。コンフルエンス後に、細胞を、アスコルビン酸、β−グリセリンリン酸、およびメラトニン（ＡＧＭ）を加えることによって、骨芽細胞の分化を誘発させた。各条件について、Ｎ＝５を試験した。合計の誘発時間＝２０日。０日目は細胞播種の日として見なされ、誘発が細胞コンフルエンス後に続いた。各細胞型は、以下の３つの実験群を有した：陰性対照、陽性対照、およびＡＭＰ処置のみ。ＡＭＰ処置に対して、１２５μｇ／ｍｌのＡＭＰ濃度を使用した。培地（１００μＬ）を、２０日間の培養期間の間、３日ごとに変更した。（誘発または細胞のない）ＡＭＰを有する陰性対照を加えた。ＡＲＳの染色および定量化を、２０日目に上に記載されるように行った。その後、抽出物を４５０ｎｍで読み取った。
【０７４８】
結果
ＨＵＶＥＣ細胞は、４日目までに細胞成長の網状パターンを形成した（図７４Ａ）。しかしながら、細胞死があり、２１日目まで細胞の網の上部に死細胞が沈降していた。ほとんどのＨＵＶＥＣ細胞は、１０％のパラホルムアルデヒドで固定され得ず、ＡＲＳによって染色されたわずかな細胞が、暗褐色を示した。ＡＭＰが、ＨＵＶＥＣ細胞の上部に沈降し、細胞の網を覆ったが、ＡＭＰの粒子状物質は、ＡＲＳ染色後に、細胞によってプラスチックウェルから分離され；わずかな残りのＡＭＰの粒子状物質も、暗褐色に染色された。
【０７４９】
ｈＢＭ ＭＳＣは、誘発なしで、長い線維芽細胞の形状を維持した（図７４Ａ）。誘発によって、ＭＳＣは、４日目までに、より隆起された細胞の縁によって伸張された。１０日目までに、誘発されたＭＳＣは、スピンドル状の細胞を発達させ、細胞は、単層上で互いに、重なる層を発達させた。１７日目に、重なるスピンドル細胞は、ウェルの中心から約５ｍｍで密な環を形成した。ＡＲＳ染色は、非誘発性のＭＳＣ単層が、クリーム色に染色され、スピンドル環が、赤橙色に染色されたことを示した。ＡＭＰ処置されたＭＳＣは、単層を覆ったＡＭＰの粒子状物質を含有していた。時間とともに、単層は、ＡＭＰの粒子状物質の濃縮した領域の近くで収縮された。ＡＲＳ染色は、濃い赤褐色を示した。
【０７５０】
ｈＡＭの間質幹細胞は、誘発なしで、矩形形状を維持した（図７４Ａ）。４日目までに、誘発によって、細胞形態は変化し、細胞は、幾つかの発達する紡錘形状を有して伸張した。ＡＭＰの粒子状物質は、ＡＭＰ処置された間質細胞において、４日目までに、沈降し、単層の幾つかを覆った。４日目にＡＭＰの粒子状物質によって覆われなった細胞は、矩形形状であった。１７日目までに、ＡＭＰの粒子状物質によって覆われなった細胞は、陽性対照における誘発細胞に類似して伸張された。２１日目までに、ＡＭＰの粒子状物質は、ウェルを覆い、細胞形態を観察することができなかった。ＡＲＳ染色は、非誘発性の細胞がクリーム色に染色された一方で、誘発された細胞が淡いピンク色に染色されたことを示した。ＡＭＰ処置された細胞は、ＡＭＰ処置されたｈＢＭ ＭＳＣに類似して、濃い赤褐色に染色された。
【０７５１】
４Ｍ ＧｎＨＣｌと抽出物は、２％から１５％（図７４Ｂ）に及ばれたＯＤ４５０値内での変動係数をもたらした。
【０７５２】
結果の概要
結果は、誘発剤またはＡＭＰのいずれかによって、ＨＵＶＥＣの陰性対照において鉱化が示されなかったことを示した。ｈＢＭ ＭＳＣおよびｈＡＭの両方の間質幹細胞に関して、鉱化が、誘発剤によって促進され、これは、ＡＭＰによって促進されたものよりも少なかった。
【０７５３】
実施例４１：ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１分化中の鉱化および細胞増殖に対するＡＭＰの効果
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、成熟した骨芽細胞になる前に、以下の３つの主要な段階を受ける：増殖、マトリックス沈着／成熟、および鉱化（図７５）。我々の結果は、ＡＭＰが、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞において鉱化を促進することを示した。ＡＲＳ染色を考察すると、ＡＭＰで処置された細胞が、陽性および陰性の対照より濃く及び密に染色されたことを示す（図７２）。さらに、ＡＭＰの粒子状物質が単層を覆ったときに、ＡＭＰの粒子状物質の真下の単層が欠如していた（図７７）。１つの可能性として、ＡＭＰが、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞用のスキャフォールドとして作用しており、３Ｄマトリックス中のこの相互作用によって、細胞が成長し、鉱石化したことが挙げられる。したがって、ＡＭＰは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の増殖を増加させることによって鉱化を促進しているのかもしれない。
【０７５４】
実験計画
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、上に記載されるように、αＭＥＭ培地＋１０％のＦＢＳを用いて、２４ウェル中で３ｘ１０４細胞／ｃｍ２／ウェルで播種した。コンフルエンス後に、細胞を、アスコルビン酸、β−グリセリンリン酸、メラトニンを加えることによって分化を誘発させた。各条件について、Ｎ＝３が試験された。１日目は細胞播種の日として見なされ、誘発が細胞コンフルエンス後に続いた。合計の誘発時間＝２０日。４つの時間点をサンプリングした：１日目、２日目、７日目、１０日目、１３日目、２０日目。各時間点は、以下の４つの群を有した：陰性対照、陽性対照、ＡＭＰ処置のみ、ＡＭＰ＋（ｗ／誘発）。利用したＡＭＰ濃度は、１２５μｇ／ｍｌであった。
【０７５５】
ＭＴＴアッセイによって測定された増殖アッセイのために、培養期間は、増殖に対して９日であった。４つの時間点をサンプリングした：１日目、２日目、４日目、および９日目。各時間点は、以下の３つの群を有した：細胞のみ、ＡＭＰのみ、ＡＭＰ＋細胞。利用したＡＭＰ濃度は、１２５μｇ／ｍｌであった。
【０７５６】
結果
鉱化
１日目に、細胞を、２４時間播種し、誘発培地またはＡＭＰによっては処置しなかった（図７６）。細胞は、円形であり、単層上でより隆起したようである。ＡＲＳ染色は、淡いベージュ色を示し、鉱化がほとんどなかった。２日目に、誘発なしで、陰性対照の細胞は六角形になった。ＡＲＳは、単層を汚れた、淡い桃色に染色した。誘発によって、陽性対照の細胞は、鉱化がほとんどなく及び淡い桃色でのＡＲＳ染色を有する陰性対照と同一に見えた。ＡＭＰでの処置は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞形態を変化させ、紡錘形状の細胞およびスピンドル細胞が観察された。ＡＲＳ染色は、１日目から鉱化の増加を示したが、単層を淡いピンク色に染色した。しかしながら、ＡＭＰの粒子状物質が沈降した領域は、赤褐色に染色された。誘発を有するＡＭＰ処置はまた、幾つかの細胞形態を変化させた。紡錘形状の細胞が存在し、単層はまた、淡いピンク色に染色され、ＡＭＰの粒子状物質のまわりの領域は、赤茶色に染色された。７日目に、陰性対照の細胞は、より六角形に現れ、細胞の境界がより定義される。鉱化が増加し、単層は、淡いいベージュ色に染色された。陽性対照は、誘発によって、スピンドル形状の細胞およびスピンドル環を発達させた。ＡＲＳはまた、鉱化するにつれて、濃いピンク色を染色した。ＡＭＰおよび誘発を有するＡＭＰでの処置によって、ＡＭＰの粒子状物質が沈降し、細胞形態は見られなかった。個々の細胞の細胞単層は見られなかった。ＡＲＳは、ＡＭＰの粒子状物質のまわりの領域が赤褐色に染色され、単層が淡いピンク色に染色されたことを示した。ＧｎＨＣｌは、ＡＲＳ色素の抽出に成功し、ＯＤ４５０値の変動係数は、６％から１６％までの範囲であった。
【０７５７】
結果の概要
陰性対照のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、２日後にＡＲＳ染色の増加、およびそれ故、細胞培養が増加する鉱化を示す（図７６）。先の結果に類似して、誘発培地によって培養された陽性対照のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、７日目までに、細胞形態の変化を受け、紡錘形状の細胞およびスピンドル環を発達させた（図７６）。１日目のＡＭＰ処置後（Ｄ２）、誘発によって又はそれなしで、細胞形態の変化が見られた。細胞は、スピンドルになり、線維芽細胞さえ作られた（図７６のＡ）。この変化は、陰性または陽性の対照で観察されなかった。さらに、この変化は、少なくとも４日間の培養後に、誘発されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞で観察された（図７６のＡ）。
【０７５８】
ＡＭＰ処置された及び誘発を有してＡＭＰ処置された細胞は、ＡＲＳ定量化）によって示されるように、２日目までに、陽性対照からの鉱化の統計的に有意な増加を示した（図７６のＢ。単層は、淡いピンク色に染色されたが、ＡＭＰの粒子状物質が沈降した小さな領域は、鉱化の増加を示し、濃い赤褐色に染色された（図７６のＡ）。鉱化のこの増加は、培養期間にわたって継続した。
【０７５９】
誘発処置によるＡＭＰのみと比較したときに、ＡＭＰによる鉱化の促進に増加はなかった。
【０７６０】
増殖
決定するために、ＡＭＰが、細胞増殖の促進によって鉱化を促進したかどうかを決定するために、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、αＭＥＭ培地＋１０％のＦＢＳ中で、９６ウェル中の３ｘ１０４細胞／ｃｍ２／ウェルで播種した。コンフルエンス後に、ＡＭＰ群を、培地中で３日ごとに加えた、新鮮な１２５μｇ／ｍｌのＡＭＰによって処置した。ＭＴＴアッセイを、１、２および４日目に行い、ＢｒｄＵアッセイを、１、２および１６日目に行った。
【０７６１】
未処置のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞において、細胞の生存度は、１日目から４日目まで増加する（図７７のＡ）。ＡＭＰ処置された細胞では、細胞の生存度は、細胞のみの群の傾向に従って、２日目に減少し、その後、４日目に２倍を超えた。ＢｒｄＵアッセイは、細胞のみの群およびＡＭＰ処置された細胞群の両方において、１日目の後に細胞増殖の減少を示した（図７７のＢ）。細胞のみの群における細胞増殖は、２日目までに半分以上減少し、１６日目まで減少し続けた。ＡＭＰ処置された細胞では、細胞増殖は、１６日目までに統計的に有意な減少のみを示した。これらの結果は、ＡＭＰが、１６日間の培養期間の間に増殖を促進しなかったことを示唆している。
【０７６２】
結果の概要
細胞の生存度は、ＭＴＴアッセイによって示されるように、１日目から４日目までＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞で増加した。ＡＭＰ処置されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、１日目から２日目までの細胞の生存度の減少を示したが、未処置の細胞にように増加傾向が続いた。しかしながら、ＡＭＰ処置された細胞における４日目の細胞の生存度は、未処置のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の約半分であった。細胞増殖は、ＢｒｄＵによって測定されるように、１日目から１６日目までずっと減少した。ＡＭＰ処置された細胞とは異なり、未処置のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におうて、細胞増殖は、２日目までに半分以上減少した。１６日目までに、ＡＭＰ処置された及び未処置のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、同じレベルの細胞増殖を示した。
【０７６３】
実施例４２：ＡＭＰ処置されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１およびｈＢＭ ＭＳＣにおける骨形成の初期段階中に発現した遺伝子の特定。
ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＢＭＭＳＣｓ）は、多能性であり、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞などの、複数の組織タイプに分化することができる（Ｂｏｒｎ， ２０１２ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１３（１）：３１３−２１．）。インビボに移植されたときに、それらは、新しい骨を形成することができ、インビトロで、ｈＢＭ ＭＳＣは、β−グリセロリン酸塩、アスコルビン酸、ビタミンＤ３、および低用量のデキサメタゾン中の培養によって、骨形成に向けられる。ｈＢＭＭＳＣｓに対する骨形成は、ＥＣＭの具体的な転写因子、接着分子およびタンパク質を含む、骨芽細胞関連の遺伝子の発現によって調節される（Ｂｏｒｎ （２０１２） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１３（１）：３１３−２１；Ｖａｔｅｒ （２０１１） Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ． ７（２）：４６３−７７．）。成熟した骨芽細胞への進行は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の進行を反映し、細胞の拡大能力の損失、骨形成のマーカー発現の増加、およびＥＣＭの鉱化とともに生じる（Ｂｏｒｎ （２０１２） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１３（１）：３１３−２１）。最初に、細胞は、コラーゲンＩ（Ｃｏｌ Ｉ）の発現によってＥＣＭの合成を開始する。同時に、骨特異的なアルカリフォスファターゼ（ｂＡＬＰ）の発現は増加し、４日目までに、対照から誘発された細胞（６ｘ１０４細胞／６０ｍｍの培養皿）中のＡＬＰレベルの著しい増加を観察することができた（Ｂｏｒｎ （２０１２） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１３（１）：３１３−２１； Ｊａｉｓｗａｌ （１９９７） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６４：２９５−３１２）。分化が継続と、細胞は、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、オステオポンチン、オステオネクチンおよびオステオカルシンなどの、タンパク質を生成する。最終的に、ＥＣＭの鉱化は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞における骨形成のように、成熟した骨芽細胞を示す。
【０７６４】
本実施例では、遺伝子および転写因子は、３つの細胞株における骨形成の初期段階で発現され：ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞およびｈＢＭ ＭＳＣ細胞を決定した。我々の結果は、鉱化の統計的に著しい増加が、２日目までに（１日目の処置）、陽性対照と比較して、ＡＭＰ処置されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞で見ることができたことを示した。それ故、実験は、処置後に特定遺伝子に対するＡＭＰの効果を特定するために、骨形成の初期段階に焦点を置いた。
【０７６５】
実験計画
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１またはヒト骨髄ＭＳＣの細胞を、上に記載されるように、αＭＥＭ培地＋１０％のＦＢＳを用いて、２４ウェルのプレート中で３ｘ１０４細胞／ｃｍ２／ウェルで播種した。コンフルエンス後に、細胞を、アスコルビン酸およびβ−グリセリンリン酸を加えることによって分化を誘発させた。各時間点での各々のアッセイについて、Ｎ＝２を試験した。４つの時間点をサンプリングした：０日目（コンフルエンス後だが、誘発／処置の前）、１日目、４日目、および６日目。各時間点は、以下の３つの群を有した：陰性対照、陽性対照、ＡＭＰ処置のみ。使用されるＡＭＰ濃度は、１２５μｇ／ｍｌであった。
【０７６６】
結果
ｈＭＳＣ発現
ＡＭＰは、２４時間の培養期間内に、ＢＭＰ２およびＢＭＰ６の転写物の強い内因性の発現を誘発する（それぞれ、６０倍および５倍）（図７８Ａ）。ＢＭＰ２は、Ｄ１（１２０倍）でそのピークに達し、低下を示す前の４日目まで、高レベル（６０乃至１０倍）を維持した。対照的に、ＢＭＰ６は、４時間でピークに達し、その後、１日目から徐々に低下した。比較として、ＡＭＰは、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７およびＢＭＰ９の発現レベルを変化させなかった。それにもかかわらず、ＡＧは、４日目にのみＢＭＰ２およびＢＭＰ６の軽度のアップレギュレーション（１−２倍）および１日目の後にＢＭＰ４の顕著なアップレギュレーション（４−１０倍）を誘発した。比較として、ＡＧＭは、ＢＭＰ７およびＢＭＰ９の発現をいずれも変化させなかった。
【０７６７】
Ｒｕｎｘ２は、ＡＭＰに対して１日目でピークに達したが、ＡＧＭに対して２日目でピークに達した（図７８Ａ）。その後、両方の群は、徐々に低下し、その後、６日目に別のピークに達した。Ｒｕｎｘ２は、未熟な骨芽細胞への多能性の間葉細胞の分化を誘発し、これによって、未熟な骨の形成が進められる。さらに、Ｒｕｎｘ２は、骨芽細胞の分化の初期段階中に、主要な骨マトリックス遺伝子の発現を引き起こすが、Ｒｕｎｘ２は、成熟した骨芽細胞においてこれらの遺伝子発現の維持にとって不可欠ではない（Ｋｏｍｏｒｉ （２０１０） Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ． ６５８：４３−９）。
【０７６８】
ＡＬＰおよびＳｏｘ９の両方は、４日目にピークに達し、ＡＧＭによってアップレギュレートされたレベルは、ＡＭＰよりも低い（図７８Ａ）。この傾向は、ＡＬＰおよびＳｏｘ９が、Ｒｕｎｘ２の下流にあるという点で一致している。ＡＬＰは、骨形成の初期段階で発現され、カルシウムを溶液から出し結晶化させるアルカリ環境を作り出す。
【０７６９】
ＡＭＰは、４時間および４日目でピークに達したＶＥＧＦをアップレギュレートしたが、ＡＧＭは、４日目にのみＶＥＧＦをアップレギュレートした（図７８Ａ）。ＡＭＰは、ＣＸＣＲ４をアップレギュレートし、一方で、ＡＧＭは、１日目にＳＤＦ１をアップレギュレートし、前者に対して急速な低下があったが、後者に対してよりゆっくりとした低下があった。Ｋｏｒｔｅｓｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ． （（２００５） Ｂｌｏｏｄ． １０５（１０）：３７９３−８０１）は、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４の相互作用を妨害するように作用し得る環境要因に応じて増殖し分化することが必要とされるまで、ＳＤＦ−１が、その血管周囲のニッチ内で初期のコミットされていない（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）ＢＭＳＳＣの個体群を局所化するよう作用し得ることを示唆している。ＭＳＣの７つのプレコンディショニング実験では、ＣＸＣＲ４の発現は、通常、約２乃至４倍の増加であるが（Ｃｅｎｃｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ． （（２０１２） Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ． ９４（３）：４００−７）、ＡＭＰでの我々の結果は、１日目の後に６０倍の増加を示した。
【０７７０】
ＳＤＦ−１発現は、ＭＳＣのすべての群において非常に高かったが、図７８Ａではそうでなかったようである。ＳＤＦ−１は、サイクル２０あたりで見られたが、ＧＡＰＤＨは、サイクル１７あたりで見られた。文献から、間質細胞由来の因子−１が、始原細胞上の接着分子を活性化し、ＳＤＦ−１に対するｍＡｂが、造血前駆細胞の経血管内皮性の移動を阻害すると知られている（Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｌｏｏｄ ９３（１）：１４９−５６）。ＳＤＦ−１は、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ３４＋細胞を活性化し、それらの接着および経血管内皮性の移動につながる（Ｂｈａｋｔａ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｖａｓｃ Ｍｅｄ． ７：１９−２４．）。ＧＡＰＤＨ発現は、２日目から６日目まで、ＡＭＰ群において増加し、それ故、増殖が仮定される。この傾向は、他のサンプルで見られなかった。さらに、ＢＭＰ９は、（サイクル４０後に）検出不能であり、ＣＸＣＲ４は、サイクル３３あたりで検出され、ＶＥＧＦは、サイクル１９あたりで検出され、およびＳＯＸ−９は、サイクル２７ごろあたりで検出された。ＢＭＰ４はサイクル２８あたりで検出され、ＢＭＰ７は（サイクル４０後に）検出されず、ＢＭＰ２はサイクル２０あたりで検出され、Ｒｕｎｘ２はサイクル２５あたりで検出され、ＢＭＰ６はサイクル２７あたりで検出され、およびＡＬＰＬはサイクル２４あたりで検出された。
【０７７１】
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１発現
ＭＳＣは、骨前駆体が、さらに系列経路の下に既に押されているため、多能性であり、骨形成のみをもたらすはずであることが知られている。予想とは異なり、ＢＭＰ２発現は、特にヒトＭＳＣと比較して、マウス細胞においてかろうじて発現された（図７９）。ＢＭＰは、ヒトにおいて骨形成促進において有効でないことが示され、マウス細胞においても有効であるともいえない（Ｏｓｙｚｋａ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ． １７６（１−３）：１０９−１９． ， Ｓｋａｒｚｙｎｓｋａ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ． ５２（５）：４０８−１４）。ＢＭＰ−２の発現は、遺伝子アレイによって示されるように、ＭＣ３Ｔ３細胞において顕著ではない（Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １２： ６１−８３）。ヒト細胞と齧歯類細胞との間で見られる違いは、ヒト細胞におけるＳｍａｄ１とは異なり、齧歯類Ｓｍａｄ１が、骨形成中にＥＲＫリンカーのリン酸化を受けないことを示し得る。あるいは、齧歯類細胞におけるＳｍａｄ１活性は、ＥＲＫ媒介性のリンカーのリン酸化によって抑制されないかもしれない（Ｓｋａｒｚｙｎｓｋａ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ． ５２（５）：４０８−１４）。不十分な反応性のヒトＭＳＣにおけるＢＭＰ誘発性の骨形成は、ＥＲＫの調節（阻害）およびホスファチジルイノシトール ３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）の経路を必要とし；インスリン／ＩＧＦ−Ｉ活性化されたＰＩ３Ｋ／ＡＫＴの経路の阻害によって、ヒトＭＳＣの無血清培養中のＢＭＰ誘発性のアルカリフォスファターゼおよびオステオポンチンの発現は減少するが、ＳｍａｄｓのＢＭＰ活性化は増加する（Ｏｓｙｚｋａ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ． ２００５ （８）：３４２８−３７）。
【０７７２】
Ｒｕｎｘ２はまた、ｈＭＳＣと比較して、ＭＣ３Ｔ３細胞において異なると示された。２日目にＭＣ３Ｔ３細胞において遺伝子のアップレギュレーションをもたらす事例が明らかに存在する。ＡＧＭ群は、ＡＭＰ群の逆効果を有するようであり、これは、Ｐｉ３Ｋ、ＭＡＰＫの経路に関連し得る。Ｂｏｎｅ Ｓｉａｌｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＳＰ）としても知られている、Ｉｂｓｐは、２日目にＡＭＰにおいてアップレギュレートされるが、他の日には発現されない。陽性群では、ＢＳＰは、２日目の後に高度に発現される。
【０７７３】
オステオカルシン（ＯＣＮ）としても知られている、Ｂｇｌａｐ−ｒｓ１もまた、２日目にＡＭＰにおいてアップレギュレートされるが、他の日には発現されない。ＢＳＰと一致して、ＯＣは、２日目の後に陽性群において高度に発現される。これらの結果の分析を通して、ＢＳＰおよびＯＣＮは、成熟した骨芽細胞によって発現されると知られているため、アップレギュレートされる必要があると考えられる。Ｒｕｎｘ２は、ＭＣ３Ｔ３においてＣｏｌ１、ＢＳＰおよびＯＣＮの発現を調節すし、これは我々の結果と一致している。Ｒｕｎｘ２は、ＢＳＰおよびＯＣＮのように、２日目に増加し、他の日では発現されない。要約すると、ＡＭＰは、骨形成の遺伝子発現をダウンレギュレートするが、鉱化を促進する。
【０７７４】
実施例４３：ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１モデル系を使用する、鉱化に対するＡＭから精製されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の効果。
先の実験は、アスコルビン酸、β−グリセリンリン酸、およびメラトニン（ＡＧＭ）などの誘発剤とは関係なく、鉱化を促進するＡＭＰの特有の特性を明確に実証した。これらの実験では、ＡＭＰの効能を決定するために、ＡＧＭの存在下または不存在下で、ＡＭＰを、ネズミの骨芽細胞の始原細胞株（ＭＣ３Ｔ３）に加えた。ＧｎＨＣｌ抽出方法によるアリザリンレッド染色を、さらなる定量化のために、複数の時間点で使用した。ＡＭＰが、ＡＧＭとは関係なく鉱化を増強しただけでなく、より速い速度で鉱化を増強したと結論付けた。ＡＭＰのさらなる検査は、ＡＭＰによって示された骨誘発性の効果が、直接的な細胞の接触を必要とすることを示した。すなわち、ＡＭＰとの直接的な接触の下では、細胞は、ＡＧＭの導入なしで、鉱化を加速し増強するであろう。
【０７７５】
以前の研究は、誘発下のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の分化が、３つの段階、すなわち、増殖（１日目〜９日目）、ＥＣＭ形成（９日目〜１６日目）、および鉱化（形成されたＥＣＭ中の鉱質沈着物）（１６日目＋）へと細分化され得ることを示した（Ｑｕａｒｌｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ． ７（６）：６８３−９２．； Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ３１６（１４）：２２９１−３００）。しかしながら、我々の以前のＡｉｍ ４は、鉱化が、ＡＭＰを使用して、７〜１０日以内に容易に検出され得ることを示した。それ故、ＡＭから精製されたｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸＳが、鉱化を促進する要因であるかどうかを決定するために、８日目に我々のＡＲＳアッセイを行う。Ａｉｍ ４で見られるように、結果が注目すべきものであるため、８日目を選択し、培地は、０日目、３日目および６日目に取り替えられる必要があるだけである。
【０７７６】
ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３が、羊膜の既知の抗炎症性、抗血管新生、および抗瘢痕化の治療上の作用の要因であることは既に知られている。固定化したＨＣ−ＨＣ／ＰＴＸ３が、ＡＭＰの鉱化の促進に対する効果の要因であると仮定する。それがＨＡを含有しているため、推定上の効果が、ＨＡではなく、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３において一意に存在することを理確認するために、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３をＨＡと比較する。ヒアルロナン（ＨＡ）は、単一の繰り返し二糖単位から成る、硫酸化されていないグリコサミノグリカンである。それは、マトリックス集合および組織の水和を促進する、結合組織中の重要な成分である。Ｌｕｂｅｎ ｅｔ ａｌは、ＨＡが、再吸収部位から離れて、酵素の拡散に対する障壁として作用する、または破骨細胞の移動性を調節する、カルシウム結合剤として作用すると推測した。ＳｔｅｒｎおよびＲａｉｓｚは、「ヒアルロン酸が、骨再吸収に明白に関連するため、研究に最も適切であるように見える」と明言した。その吸湿性の性質によって、ＨＡは、それ自体の容量の１０，０００倍を占めることができる。したがって、ＨＡによって、増殖細胞は、阻害性の接触を避けることができる。ヒアルロン酸の合成は、有糸分裂に先行し、分裂する細胞をその基層から分離し、細胞移動を可能にする（Ｂａｌａｚｓ （２００１） Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８０： Ｒ４６６＊Ｒ４７２）。
【０７７７】
実験計画：
ネズミのＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（Ｃ−１３６）を、液体窒素フリーザーから取り出し、８０％のコンフルエンス〜１．５ｘ１０６細胞［４＊（３．１ｘ１０４）＊９＝１，１１６，０００細胞］まで３日ごとに変更された、αＭＥＭ培地（１００ｍｍの皿当たり１０ｍｌ）＋１０％のＦＢＳ中で、１００ｍｍの皿（５皿）上で成長させた。その後、細胞を、３．１ｘ１０４細胞／ｃｍ２／９６のプラスチックウェルで播種した。培地（９６ウェル当たり１００ｕｌ）を、２−３日ごとに、すなわち、０日目（水曜）、２日目（金曜）、および５日目（月曜）に交換し、培養を８日目に終了する。Ｎ＝４を、条件に従って試験した。
【０７７８】
群の概要は以下のとおりであった：
対照群：
陰性対照：従来の９６ウェルプレートではなし。
陽性対照１：従来の９６ウェルプレート上のＡＧＭ。
陽性対照２：３日ごとに従来の９６ウェルプレート上で１２５μｇ／ｍｌのＡＭＰを加えた。
実験群：
陰性対照：Ｃｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ ９６ウェルプレート
実験群１：３日ごとにＣｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ ９６ウェルプレートＡＧＭを加えた。
実験群２：２０μｇ／ｍｌのＨＡをＣｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ ９６ウェルプレート上に固定化した。
実験群３：２０μｇ／ｍｌのＨＡをＣｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ ９６ウェルプレート上に固定化し、３日ごとにＡＧＭを加えた（Ｈ−１２４）。
実験群４：２０μｇ／ｍｌのｎＨＣ−ＨＣ／ＰＴＸ３をＣｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ ９６ウェルプレート上に固定化した。
実験群５：
２０μｇ／ｍｌのｎＨＣ−ＨＣ／ＰＴＸ３をＣｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ ９６ウェルプレート上に固定化し、３日ごとにＡＧＭを加えた。
【０７７９】
ＡＧＭ群に関して：０日目および３日目に、骨形成誘発培地＃１（アスコルビン酸、β−グリセリンリン酸）を取り替えた。６日目に、骨形成誘発培地＃２（アスコルビン酸、β−グリセリンリン酸、メラトニン）を取り替えた。０日目に、０．２ｍｌの１０Ｘ誘発培地のみを作った。３日目および６日目に、新鮮な１０ｍｌの骨形成誘発培地を調製した。誘発培地用の説明書を、インビトロの骨形成アッセイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から得た。
【０７８０】
誘発培地＃１：９．８８ｍｌのαＭＥＭ培地＋１０％、２０μｌのアスコルビン酸 ２−リン酸 ５００Ｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｐａｒｔ． ２００４０１１）、１００μｌのグリセロール ２−リン酸 １００Ｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｐａｒｔ． ２００４０１１）。
【０７８１】
誘発培地＃２：９．８７ｍｌのαＭＥＭ培地＋１０％、２０μｌのアスコルビン酸 ２−リン酸 ５００Ｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｐａｒｔ． ２００４０１１）、１００μｌのグリセロール ２−リン酸 １００Ｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｐａｒｔ． ２００４０１１）、１０μｌのメラトニン ５０ｕＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｐａｒｔ． ２００４０１１）。５００ｕｌのｄＨ２０を、供給された６ｕｇのメラトニンに加える。
【０７８２】
ＡＲＳの染色および定量化を、上に記載されるように行った。写真を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＣＦＩ６０を使用して、１０Ｘで撮った。
【０７８３】
結果
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、８日間、異なるウェルプレート上で培養した。８日目に、位相コントラスト写真を、ウェルから撮り、それは以下で見られる（図７９Ａ、７９Ｂ）。陰性対照ウェルは、円形細胞を示し、ＡＲＳは非常に淡いピンク色を染色した。誘発培地を有するウェルは、はるかに明るい赤色を示し、スピンドル細胞は、ウェルの周辺上で見られた。ＡＲＳ染色は、外側周辺の環でより豊富に見られた。ＡＭＰでの処置は、ＡＲＳ処置後に深紅色を示し、細胞は、ＡＭＰがそれらの上に沈降したため、確認はかなり難しかった。（固定化したＨＣ−ＨＡ上に他の細胞型で凝集が見られたが）実験中に凝集は見られなかった。顕微鏡写真を、６、７および８日目に撮った。
【０７８４】
塩酸グアニジンの抽出方法を、８日目に使用し、ウェルプレートを一晩インキュベートした。肉眼で確認することは難しかったが、ＧｎＨＣｌは、ＡＲＳ色素を抽出することができ；すべてのウェルは、同じ淡いピンク／赤色を有するようであった。プレートリーダーが、４９０ｎｍまたはその近くで読み取る性能を有していなかったため、ＡＲＳ抽出を、４５０ｎｍで定量化した。結果は、図７９Ｃ見ることができる。＊記号は、ｐ＜０．０５の統計的有意差を示す。（＋はＡＧＭを有することを示し、−はＡＧＭがないことを示す）
【０７８５】
先の結果に一致して、ＡＭＰは、誘発剤を必要とすることなく、鉱化の促進に成功した。この実験は、８日間続いただけであったため、結果は、２０日間続いたＡｉｍ ４ほど注目すべくことではない。ＡＧＭで処置されたすべての条件は、それらの陰性対照の対照物からの鉱化の増加を示した。我々の結果はまた、固定化したｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸＳが、ＡＭＰでの鉱化を促進する要因でないことを示す。それ故、鉱化を促進しているＡＭＰの別の活性成分があるはずである。
【０７８６】
実施例４４：軟骨内骨化に対するＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ＰＢＳ）およびＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（Ｇｎ）の効果
骨形成および軟骨形成に対する主要な転写因子（それぞれ、Ｒｕｎｘ２およびＳｏｘ９）は、１４日間の培養期間にわたって、両方のＨＣ−ＨＡ条件下の細胞によって発現された。可溶性および不溶性の両方である、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、ＢＭＰ２の発現を促進することができ、骨誘発性の薬剤のないＢＭＰ６の程度まで、ＡＧＭ（すなわち、アスコルビン酸、グリセリンリン酸、メラトニン）が、市販で提供されている（以下を参照）。
【０７８７】
軟骨形成マーカー コラーゲン２は、ＡＧＭを必要とせずに、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ＰＢＳ）によって高度に発現された。ＡＧＭを加えたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（Ｇｎ）はまた、コラーゲン２をアップレギュレートすることができた。骨形成マーカー（ＢＳＰ、ＡＬＰＬ、Ｏｓｘ）を、１４日目にＨＣ−ＨＡ条件によってアップレギュレートし、それ故、軟骨から骨遺伝子型までの移行が確認された。
【０７８８】
実験計画：
培養条件：Ｌｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入したヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を、液体窒素フリーザーから取り出し、８０％のコンフルエンスまで３日ごとに変更された同じ培地中で、１００ｍｍの皿上で成長させた。細胞培養培地は、１０％のウシ胎児血清および抗生物質を含有しているαＭＥＭであった。培養培地（１００ｍｍの皿当たり１０ｍｌ）を、３日ごとに変更し、細胞は、上述の所望の細胞数に達するまで、８０％のコンフルエンスでサブ流路で処理された（ｓｕｂｐａｓｓａｇｅｄ）。実験のために、細胞を、骨誘発性の薬剤、アスコルビン酸 ２−リン酸塩、グリセロール ２−リン酸塩およびメラトニン（ＡＧＭ）によって又はそれらなしで、固定化したＨＡ、ＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳ）またはＨＣ−ＨＡ（Ｇｎ）上で、３．１ｘ１０４細胞／９６プラスチックウェルで播種した。加えたＡＧＭの終末濃度は、それぞれ、０．２ｍＭ、１０ｍＭおよび５０ｎＭであった。細胞が播種されたときに（０日目）、ＡＧＭを同時に加え、ｍＲＮＡを、１、７および１４日目に抽出した。遺伝子発現を定量化するために、ｑＰＣＲを行った。培地（９６ウェル当たり１００ｕｌ）を、３日ごとに取り替えた。
【０７８９】
実験群の概要は以下のとおりであった：
陰性対照：Ｃｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ ９６ウェルプレート
実験群１：３日ごとにＣｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ ９６ウェルプレートＡＧＭを加えた。
実験群２：２０μｇ／ｍｌのＨＡをＣｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ ９６ウェルプレート上に固定化した。
実験群３：２０μｇ／ｍｌのＨＡをＣｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ ９６ウェルプレート上に固定化し、３日ごとにＡＧＭを加えた。
実験群４：２０μｇ／ｍｌの４Ｘ ｎＨＣ−ＨＣ／ＰＴＸ３をＣｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ ９６ウェルプレート上に固定化した。
実験群５：２０μｇ／ｍｌの４Ｘ ｎＨＣ−ＨＣ／ＰＴＸ３をＣｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ ９６ウェルプレート上に固定化し、３日ごとにＡＧＭを加えた。
実験群６：２０μｇ／ｍｌの４Ｘ ｎＨＣ−ＨＣ／ＰＴＸ３（ＧｕＨＣｌ抽出）をＣｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ ９６ウェルプレート上に固定化した。
実験群７：２０μｇ／ｍｌの４Ｘ ｎＨＣ−ＨＣ／ＰＴＸ３（ＧｕＨＣｌ抽出）をＣｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ ９６ウェルプレート上に固定化し、３日ごとにＡＧＭを加えた。
【０７９０】
ＡＧＭ誘発群に関して：０日目および３日目に、骨形成誘発培地＃１（アスコルビン酸、グリセリンリン酸）を取り替えた。６日目に、骨形成誘発培地＃２（アスコルビン酸、グリセリンリン酸、メラトニン）を取り替える。０日目に、１０Ｘ誘発培地を作った。３日目および６日目に、新鮮な１０ｍｌの骨形成誘発培地を調製した。誘発培地の調製のための説明書を、インビトロの骨形成アッセイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から得た。
【０７９１】
誘発培地＃１：９．８８ｍｌのαＭＥＭ培地＋１０％、２０μｌのアスコルビン酸 ２−リン酸 ５００Ｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｐａｒｔ． ２００４０１１）、１００μｌのグリセロール ２−リン酸 １００Ｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｐａｒｔ． ２００４０１１）
【０７９２】
誘発培地＃２：９．８７ｍｌのαＭＥＭ培地＋１０％、２０μｌのアスコルビン酸 ２−リン酸 ５００Ｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｐａｒｔ． ２００４０１１）、１００μｌのグリセロール ２−リン酸 １００Ｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｐａｒｔ． ２００４０１１）、１０μｌのメラトニン ５０ｕＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｐａｒｔ． ２００４０１１）。５００ｕｌのｄＨ２０を、供給された６ｕｇのメラトニンに加える。
【０７９３】
ｍＲＮＡを、１、７および１４日目に細胞から抽出し、遺伝子発現を、ＱＰＣＲによって決定した（図８０Ａ−Ｅ）。以下の遺伝子をアッセイした：骨形成マーカー Ｒｕｎｘ２、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰＬ）、マーカーコラーゲン１（ＣＯＬ１）、Ｏｓｔｅｒｉｘ（ＯＳＸ）および骨サイアロプロテイン（ＢＳＰ）および軟骨形成マーカーＳｏｘ９およびコラーゲン２（ＣＯＬ２）、肥大性マーカー、コラーゲン１０（ＣＯＬ１０）およびＭＭＰ１３。
ＡＲＳの染色および定量化を、上に記載されるように、１４日目の培養物上で行った（図８１Ａ、８１Ｂ）。
【０７９４】
ＡＧＭは、プラスチック上でＢＭＰ４をアップレギュレートした。ＨＡは、ＢＭＰ４をアップレギュレートした（初期）が、ＢＭＰ６をダウンレギュレートし（後期）、ＢＭＰ２に影響を与えなかった（図８０Ｂ）。文献データは、ＨＡ自体がＢＭＰをアップレギュレートするとは示唆していない。しかしながら、ＡＧＭの付加は、ＢＭＰ２およびＢＭＰ６をアップレギュレートした。
【０７９５】
４Ｘの可溶性のＨＣ−ＨＡは、最初にＢＭＰ４をアップレギュレートしたが、ＢＭＰ４を後にダウンレギュレートし（ＨＡのように）、ＢＭＰ２を著しくアップレギュレートした（ＡＭＰのように、しかし一時的なＢＭＰ６なしで）（図８０Ｂ）。対照的に、ＡＧＭの追加は、ＢＭＰの発現パターンを変化させなかった。４Ｘの可溶性のＨＣ−ＨＡは、最初にＢＭＰ４をアップレギュレートしたが、ＢＭＰ４をダウンレギュレートし（後に）（ＨＡのように）、ＢＭＰ２を著しくアップレギュレートした（可溶性のＨＣＨＡのように）（図８０Ｂ）。［可溶性に一致］同様に、ＡＧＭの付加は、発現パターンを変化させなかった。
【０７９６】
我々の結果は、可溶性のＨＣ−ＨＡおよび不溶性のＨＣ−ＨＡが、軟骨内の機構によって、骨分化および鉱化を形成することができたことを示す。骨マーカー（Ｃｏｌ１、Ｏｓｘ、ＡＬＰ、およびＢＳＰ）の発現は、軟骨マーカー（Ｃｏｌ２）および肥大性マーカー（Ｃｏｌ１０、ＭＭＰ１３）の発現と同様に明白であった（図８０Ａ−Ｅ）。これらのＨＣ−ＨＡ条件間の違いは、可溶性のＨＣ−ＨＡが、遺伝子発現のより大きな振幅およびより顕著な骨結節（ＡＧＭがなくても）を促進することができるが、不溶性のＨＣ−ＨＡが、ＡＧＭを必要とするということである（データは示されず）。したがって、可溶性および不溶性の両方である、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、骨誘発性の薬剤 ＡＧＭなしで、ＢＭＰ２の発現を促進することができた。
【０７９７】
ＡＧＭのないＨＡはまた、軟骨形成マーカー（ＣＯＬ２）を示したが、ＡＲＳで定義された鉱化による骨形成の徴候、およびＡＬＰおよびＯＣのわずかな増加を示した。しかしながら、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ＰＢＳ）は、ＨＡよりも、骨マーカーのＡＬＰ、ＯｓｘおよびＢＳＰのより大きな軟骨形成発現およびより高い発現を有していた。しかし、これらの条件はどれも、著しい肥大性マーカーを発現しなかった。ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（Ｇｎ）は、２つの前述の条件よりも、ＡＬＰ、ＯＳＸおよびＢＳＰのはるかに大きな発現を発現した。肥大性マーカー ＭＭＰ１３も、軟骨形成マーカー ＣＯＬ２のわずかな発現と同様に発現された。
【０７９８】
ＨＡ＋ＡＧＭは、ＢＭＰ２、ＡＬＰ、Ｏｓｘ、ＢＳＰおよびＯＣの発現が増加すると骨形成を促進し、肥大性マーカー ＣＯＬ１０およびＭＭＰ１３を示す。しかしながら、ＨＡは、ＨＣ−ＨＡ群ほど、骨特異的なｍＲＮＡ発現および骨結節の形成をそれほどもたらさなかった。別の重要な違いは、ＨＡが、ＳＯＸ９をダウンレギュレートしたが、ＢＭＰ６発現を後に増加させたことであった。
【０７９９】
すべての前のデータは、不溶性のＨＣ−ＨＡが、骨の最も強力な誘発因子であり、より重要なことに、軟骨内の機構を誘発することを示している。
【０８００】
実施例４５．ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、炎症性および免疫性の反応を抑制し、ネズミの角膜の同種移植片生着を改善する。
実験的および臨床的な研究は、羊膜（ＡＭ）、ＡＭ抽出物、およびｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３［インター−α−トリプシンインヒビター（ＩαＩ）およびヒアルロナン（ＨＡ）の重鎖（ＨＣ）によって形成された共有結合型錯体］が、炎症促進性の反応を抑制することを示した。本実施例は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３／ＰＴＸ３が、Ｔ細胞応答を調節することができ、ネズミの角膜の同種移植片拒絶反応を減少させることができることを実証している。
【０８０１】
Ｔ細胞の活性化は、様々なサイトカインの増殖および生成によって評価され得る（図８２）。この例では、脾細胞は、オバルブミン（ＯＶＡ）に特異的なトランスジェニックＴＣＲを発現するＯＴ−ＩＩマウスから分離され、最大４日目までＯＶＡによって刺激された（図８３）。細胞増殖を、ＢｒｄＵ標識化によって測定し、サイトカイン（ＩＦＮｇおよびＩＬ−２）の発現を、それぞれのＥＬＩＳＡによって測定した。１ｍｇ／ｍｌでのＨＡではなくｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３は、２日目および４日目に、ＯＶＡペプチドを用いて、脾細胞中でＩＦＮ−γおよびＩＬ−２（図８５）の増殖（図８４）および生成を著しく抑制した（すべてのｐ＜０．０５）。さらに、角膜のＴ細胞を、ＬＰＳ注入によってインビボで活性化した。
【０８０２】
ＬＰＳの角膜内注入の前または間のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３による注入の部位、量および頻度の最適化を、Ｍａｆｉａマウスの角膜へのＥＧＦＰ陽性のマクロファージの流入によって決定した。注入レジメンを、すべての４つの四分円に対して、結膜下と円蓋との間の各注入で５μｌを与えることによってさらに最適化した。ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３処置後の４日目に、角膜を、１時間３７℃で、８２０ユニット／ｍｌのコラゲナーゼにより消化した。ＥＧＦＰ−およびＥＧＦＰ＋の細胞を、ＦＡＣＳによって単離した。ＬＰＳ注入の３日前のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の前処置は、ＬＰＳ侵襲性の角膜に対するＥＧＦＰ＋マクロファージの流入を著しく抑制した（９．１±０．３対１２．３±０．４、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３対ＰＢＳ、ｐ＝０．０２）（図８６）。重要なことに、たとえＥＧＦＰ＋マクロファージが、角膜に移動されたとしても、それらの幾つかは、Ａｒｇ−１およびＩＬ−１０の著しいアップレギュレーションではあるがＩＬ−１２（ｐ＜０．０５）のダウンレギュレーションによって示唆されるように、Ｍ２表現型へと極性化した（図８７）。Ａｒｇ−１、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のｍＲＮＡ発現を、ｑＰＣＲによって測定した。最終的に、同種異型の角膜移植を、レシピエントとして野生型のＢＡＬＢ／ｃマウス、およびドナーとしてＣ５７ＢＬ／６マウスを使用して行い、移植片の鮮明度（ｇｒａｆｔ ｃｌａｒｉｔｙ）によって採点されたその結果を、スリットランプの生体顕微鏡検法を使用して、週に２回測定した。分解なしで２つの連続するスコア≧３を受けた移植片は、拒絶されたと考えられた。ＰＢＳ対照と比較して、同種移植片拒絶反応は、週に１回、１つの四分円で、１０μｌのｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の注入で著しく抑制され（ｐ＜０．０５）、週に２回、４つの四分円で、５μｌでの注入によってさらに減少された（ｐ＜０．００２）（図８８）。
【０８０３】
これらの実験は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３が、ネズミの角膜の同種移植片拒絶反応を著しく抑制することを実証している。この作用の機構は、炎症促進性のマクロファージをダウンレギュレートする、およびＴ細胞免疫反応を抑制するｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の能力に寄与し得る。
【０８０４】
実施例４６：乾燥（Ｄｅｓｉｃｃａｔｉｎｇ）応力によってもたらされたマウスの眼乾燥のｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３およびＡＭＰによる処置
機能障害の涙症候群としても知られている、眼乾燥は、世界的に高い罹患率および際立った死亡率を有する一般的な眼表面の疾患である。それは、涙機能ユニット（ＬＦＵ；角膜、結膜、涙腺、およびマイボーム腺）の慣性的な自己反応性Ｔ細胞媒介性の炎症および機能不全によって特徴付けられた、自己免疫性ベースの炎症性疾患である。シェーグレン症候群（ＳＳ）は、単核細胞による唾液および涙腺の浸潤によって特徴付けられた、慢性的自己免疫疾患であり、実質組織の続発性損傷を引き起こす。
【０８０５】
ＳＳにおける乾性角結膜炎（ＫＣＳ）は、ＩＬ−１７およびインターフェロン（ＩＦＮ）−γを生成するＣＤ４＋Ｔ細胞を浸潤させることによって特徴付けられた、重度の及び潜在的に視界を脅かす眼表面の上皮性疾患である。Ｔ細胞の活性化を阻害する化合物（例えば、シクロスポリンＡ）は、動物およびヒトの両方において眼乾燥疾患を弱める。マクロファージは、（例えば、ＬＰＳなどの、ＩＦＮ−γ及び／又はＴＬＲリガンドによって）典型的なＭ１活性化を受けて、高レベルの炎症誘発性のサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、およびＩＬ２３など）を発現し得、これは、Ｔｈ１およびＴｈ１７のリンパ球（図８９）を活性化し、多くの慢性的炎症性疾患につながる。本実施例は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３およびＡＭＰの投与が、そのような疾病の処置に有用であり得ることを実証している。
【０８０６】
角膜へのマクロファージの浸潤は、各眼につき４つの注射部位で阻害される。
【０８０７】
ＭＡＦＩＡマウスは、ＥＧＦＰで標識化されると、マクロファージ流入のインビボのトラッキングを可能にする。ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはＡＭＰが、角膜に対するＬＰＳ誘発性のマクロファージ流入を防ぐかどうかを決定ために、これらのマウスを使用した（角膜炎に対するモデル）。ＬＰＳを、各注射部位に、５μｌ以下の適切な量で、結膜下と円蓋との間に注入した。ＭＡＦＩＡマウスの眼（マクロファージはＥＧＦＰ＋である）に、ＬＰＳ（１つの眼当たり５μｇ）を基質内注入した。各眼において、ＯＳをＰＢＳ（２つまたは４つの注射部位）で処置し、一方で、ＯＤを、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２つまたは４つの注射部位；１つの注射部位当たりｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３中に１ｍｇ／ｍｌのＨＡ、５μｌ）またはＡＭＰ（２つまたは４つの注射部位；１つの注射部位当たりＡＭＰ中に１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質、５μｌ）のいずれかで、１回処置した。その処置はＬＰＳ注入の直後であった。全体的な角膜の画像を、１日目、２日目、３日目および６日目に、インビボの生体内顕微鏡法によって撮った。ＥＧＦＰ陽性の細胞を、緑色蛍光の強度に基づいたので数えた。
【０８０８】
１日目に、ＥＧＦＰ陽性のマクロファージは、ＰＢＳ処置によるＬＰＳ注入の後に、ほとんどの角膜の周辺領域において検出される。ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはＡＭＰのいずれかでの処置は、角膜中のマクロファージを著しく増加または減少さることはなかった。
【０８０９】
２日目に、ＰＢＳ処置での角膜中のマクロファージは、１日目から著しく増加し（ｐ＜０．０５）、これは、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（２つおよび４つの注射部位、ｐ＜０．０５）、およびＡＭＰ（２つおよび４つの注射部位、ｐ＜０．０５）での処置でも同じであった。具体的には、より多くのマクロファージが、ＰＢＳ処置（ｐ＞０．０５）よりも、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の２回の注入によって処置された角膜において浸潤されたが、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（ｐ＞０．０５）の４回の注入によって処置された角膜においてはより少なかった。ＡＭＰ処置に関して、２回の注入では際立った効果がなかったが、４回の注入によって、マクロファージの浸潤はわずかに減少し、これは、各眼に対するｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはＡＭＰいずれかの４回の注入が、マクロファージの浸潤の減少に対する効果のために必要であることを示唆している。
【０８１０】
３日目に、マクロファージの浸潤は、ＰＢＳ、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、およびＡＭＰの処置によって継続した。
【０８１１】
ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の２回の注入、４回の注入、またはＡＭＰの２回の注入の処置による浸潤の阻害はなかった。ＡＭＰ（ｐ＜０．０５）の４回の注入での処置のみが、阻害につながることを示している。
【０８１２】
６日目に、マクロファージの浸潤は減少した。しかしながら、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはＡＭＰの処置は、対照と比較して、際立った阻害効果を有さなかった。
【０８１３】
これらのデータは、ＥＧＦＰ陽性のマクロファージが、１日目から３日目までＬＰＳ注入した角膜へと浸潤し続け、４日目または５日目にピークに達し、その後、６日目に低下することを示した。これは先の報告されたデータと一致している（図９０）。マクロファージの浸潤は、２日目に１つの眼当たりｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の４回の注入による処置によって、または２日目および３日目にＡＭＰの４回の注入による処置によって、わずかに阻害された。これは、ＡＭＰが、ＬＰＳによって引き出されたマクロファージの流入の遮断において、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３よりも優れた効能を有していることを示唆している。
【０８１４】
ＡＭＰでの前処置は、もしｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはＡＭＰのいずれかの注入が続くのであれば、追加の注入が原因である損傷によって刺激されたマクロファージ浸潤を著しく阻害する。
【０８１５】
各ＭＡＦＩＡマウスの左眼（ＯＳ）を、上に定義されるように、結膜下／円蓋の４つの部位で、ＰＢＳ（５μｌ）またはＡＭＰ（１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質、５μｌ）によって前処置した。各マウスの右眼（ＯＤ）は、未処置のままであった。３日後に、各眼に、角膜に対してＬＰＳ（５μｇ）を注入し、すぐに４つの部位でのＰＢＳ（５μｌ）、ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（１ｍｇ／ｍｌのＨＡ、５μｌ）、またはＡＭＰ（１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質、５μｌ）による処置が続いた。ＥＧＦＰ＋マクロファージの浸潤を、インビボの生体内顕微鏡法を使用して数え、これは、マクロファージ流入をマウスの角膜に還元することの有意性（Ｐ＞０．０５）を開示しなかった（データは示されず）。その後、インビボの蛍光顕微鏡法によって、この定量的方法の精度を調査した。
【０８１６】
浸潤したマクロファージをより正確に測定し、結果として生じるマクロファージ表現型（例えば、Ｍ１対Ｍ２）を検査するために、４日目に除去された角膜をコラゲナーゼ消化およびＦＡＣＳにさらすことによって、ＥＧＦＰ陽性のマクロファージを定量することにした。その後、マクロファージ浸潤の程度を評価するために、ＥＧＦＰ陽性のマクロファージを、比率としてＥＧＦＰ陰性の細胞によって標準化した。前処置のない群では、ＬＰＳ注入は、ＰＢＳの対照群においてマクロファージ浸潤をもたらした（図９１、Ａ、青色バー）。この浸潤は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（９．１±０．３対１２．３±０．４、ｐ＝０．０２）またはＡＭＰ（２．１±０．１対１２．３±０．４、ｐ＝０．０２）によって著しく阻害された。ＡＭＰ処置は、マクロファージ浸潤（ｐ＝０．０２）の阻害においてｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３処置よりも優れていた。
【０８１７】
前処置を有する群では、ＬＰＳ注入は、前処置なしと比較して、ＰＢＳの対照群において著しいマクロファージ浸潤を引き起こした（３７．２±１．３対１２．３±０．４、ｐ＝０．０１）（図９１、Ａ、赤色バー）。前処置中になされた４回の結膜下注射が、ＬＰＳによって後に処置される角膜に対するマクロファージ流入を増大させた、炎症を引き出した損傷を引き起こしたために、この違いが予期された。それにもかかわらず、この劇的な増加した浸潤は、ＡＭＰの前処置に続いて、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（８．２±０．３対３７．２±１．３、ｐ＝０．０２）またはＡＭＰ処置（２．３±０．１対３７．２±１．３、ｐ＝０．０２）のいずれかによって完全に阻害された。再び、ＡＭＰの前処置に続くＡＭＰ処置は、ＡＭＰの前処置に続くｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３処置よりも、マクロファージ浸潤を阻害することに優れていた（２．３±０．１対８．２±０．３、ｐ＝０．０２）。しかしながら、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはＡＭＰ（ｐ＞０．０５）に対して、ＡＭＰの前処置のない群とある群との間の阻害に有意差はなかった。ｑＰＣＲデータ（図９１、Ｂ）は、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３の前処置が、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ３５の場合にＭ１マーカーを減少させ、一方で、Ａｒｇ−１のＭ２マーカーを増加させたことを示している。ＡＭＰの処置および前処置は、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１２ｐ３５を著しく減少させるが、アルギニン−１およびＩＬ−１０を大幅に増加させる。すべてにおいて、ＡＭＰの前処置は、前処理の間のさらなる損傷によって刺激されたマクロファージ浸潤を完全に除去することができる。そのような効果は、ＬＰＳ注入と同時に、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはＡＭＰのいずれかの続く注入によって保持される。この利点は、４日後に顕著であり、ＡＭＰは、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３よりも強力である。
【０８１８】
ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３またはＡＭＰは、ネズミの実験的な眼乾燥モデルにおいてＤＳ誘発性のＡＬＫＣを減少させることができる。
【０８１９】
設計
種：Ｃ５７ＢＬ／６マウス
エンドポイント：角膜の上皮性関門機能（ＯＧＤ染色）
サンプルサイズ：１群当たり１５匹のマウス
群：２つの対照群および３つの処置群（ＰＢＳ、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、およびＡＭＰ）：１）非眼乾燥、未処置の対照（ＵＴ）― 別々の動物施設の部屋で保持される；２）実験的な眼乾燥、未処置の対照（ＥＤＥ）；３）ＰＢＳ；４）ｎＨＡ−ＨＣ／ＰＴＸ；５）ＡＭＰ。
【０８２０】
乾燥応力（Ｄ）
乾燥応力のモデルは、５日間（月曜−金曜）、環境的に管理された部屋で、涙分泌の薬理学的なコリン作用遮断および空気通風および低湿度への曝露によって作り出される。マウスは、ケージを通る気流を可能にするワイヤーメッシュと交換された側面を有する一般的なマウスケージから成る、特別に設計された穿孔されたケージに入れられる。各ケージは、一定の空気の流れの前に置かれる（電気ファン）。涙腺分泌は、５日間１日４回（８：３０ａｍ、１１：３０ａｍ、１：３０ｐｍ、４：３０ｐｍ）、スコポラミン（０．２ｍＬ中に０．５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の皮下投与によって阻害される。環境的に管理された部屋の湿度は、〜２５−３０％の相対湿度に維持され、これは、４つの持ち運び可能な除湿器および天井の１つの除湿器ユニットによって達成される。
【０８２１】
処置手順（５日間のプロトコル）
各実験中に、３つの対照が含まれている：
未処置の対照は、４０〜７０％の相対湿度下で、動物施設で保持される一群のマウスから成る。
これらのマウスは、決して、ＤＳにさらされたり、局所的処置を受けることはない。
眼乾燥の対照は、環境的な眼乾燥チャンバーに入れられるが処置を受けない、一群のマウスから成る。
ビヒクル対照は、ＤＳにさらされるがＰＢＳを受ける、一群のマウスから成る。
さらに、２つの実験群が含まれる：ｎＨＡ−ＨＣ／ＰＴＸ３およびＡＭＰ
【０８２２】
注入のために、ビヒクル対照としてのＰＢＳとともに、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（１ｍｇ／ｍｌのＨＭＷ ＨＡを含有している）およびＡＭＰ（１０ｍｇ／ｍｌの総タンパク質を含有している）を使用した。すべての溶液（ＰＢＳ、ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３、およびＡＭＰ）を、３０Ｇを有するツベルクリンシリンジに引き込んだ。注入位置は、円蓋（図９２）に近くの結膜下である。３、６、９、および１２時に１つの注入部位当たり５μｌでの４回の（４）注入を行った。拡散した溶液は、結膜の周辺全体を完全に覆い、閉眼、角膜表面の損傷または炎症を妨げた、最小の結膜または眼球の充血／腫張（もしあれば、１５分で消滅するはずである）を引き起こした。（すべての試薬に対して）１日目および３日目に合計２回、注入を行った。この注入プロトコルは表６に要約される。
【０８２３】
【表１２】
2019178144.tif 000015
【０８２４】
角膜染色の測定
５日目の朝に、マウスは、涙量の測定後に、スコポラミンの１回のＳ．Ｃ．投与を受けた。スコポラミン投与２時間後に、角膜染色を、７０ｋＤａの分子サイズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の結合した蛍光色素である、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｄｅｘｔｒａｎ （ＯＧＤ−４８８）を使用して行った。その手順は、安楽死の１分前の、ガラスの毛管ピペットを使用する、角膜上の０．５μｌのＯＧＤの滴下から成った。マウスを、イソフルラン麻酔ガスの吸引に続く、頸椎脱臼によって安楽死させた。その後、眼を２ｍｌのＢＳＳで洗い流した。余分な液体を、角膜に触れることなく、濾紙によって眼表面から慎重にふき取って乾かした（ｂｌｏｔｔｅｄ）。両眼のデジタル像を、１秒の曝露時間の中、ＣｏｏｌＳｎａｐ ＨＱ２の冷却ＣＣＤカメラを有するＮｉｋｏｎ ＳＭＺ−１５００の立体顕微鏡を使用して、４７０ｎｍの励起および４８８ｎｍの発光波長下で捕らえた。各動物からの両眼を評価した。中心角膜における固定された定関心領域（１ｍｍ直径の円）の蛍光強度を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓのソフトウェアを使用して、３枚のデジタル像において測定し、データは、データベース（Ｅｘｃｅｌ， Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）に保存される。結果を、階調の平均±標準偏差として表わした。３回の別々の実験からの結果を、群の統計的な比較のために平均化した。
【０８２５】
ヘルパーＴ細胞経路のメディエーターのレベルに対するｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３および凍結乾燥された羊膜粉末（ＡＭＰ）の効果を、５日間、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて作り出された実験的な眼乾燥（ＥＤＥ）モデルで比較した。Ｔｈ１（ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、およびＴ−Ｂｅｔ）、Ｔｈ−１７（ＩＬ−２３、ＩＬ−１７、ＲＯＲ−γｔ、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β１、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−９）、およびＴｈ２（ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＧＡＴＡ３）に関連する因子の発現を、リアルタイムＰＣＲによって以下の群における角膜上皮および結膜において測定した。
【０８２６】
統計分析。
統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０のソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｃ）を使用して行った。群間の全体的な違いを決定するために、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用し、その後ポストホックテスト（Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ）が続いた。非対合ｔ検定は、２つの実験群間の統計的な違いを評価するために使用される。
【０８２７】
実施例４７：
ＨＣ−ＨＡは、血管新生を促進するために、ＩＧＦ１−ＨＩＦ１α−ＶＥＧＦシグナル伝達を活性化し、これは、ヒト角膜の線維芽細胞中のＴＧＦβ１の付加によってさらに促進される。
【０８２８】
本実施例では、ヒト角膜の線維芽細胞中の血管新生マーカーの誘発に対するＨＣ−ＨＡ複合体の効果は検査した。
【０８２９】
ヒト角膜の線維芽細胞（９６ウェルプレート中に３０００細胞／ウェル）を、上に記載されるように、４８時間、固定化したＨＡ、可溶性のＨＣ−ＨＡ（ＰＢＳ）（４Ｘ）または不溶性のＨＣ−ＨＡ（ＧｎＨＣｌ）（４Ｘ）によって又はそれらなしで、またはＨＡなしで、プラスチック皿上で播種した。その後、細胞を、ＩＧＦ１、ＨＩＦ１αおよびＶＥＧＦのｍＲＮＡ定量化のために採取する前に、２４時間ＴＧＦβ１によって又はそれなしで処置した。実験分は次のとおりであった：
【０８３０】
【表１３】
2019178144.tif 000016
【０８３１】
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して逆転写した。各細胞成分のｃＤＮＡを、７０００ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、特異的なプライマープローブ混合物およびＤＮＡポリメラーゼを使用して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲプロフィールは、９５℃で１０分間の最初の活性化、その後の９５℃での４０サイクルの１５秒間の変性、および６０℃での１分間のアニーリングおよび拡張から成った。各ＰＣＲ生成物（ＩＧＦ１、ＨＩＦ１αおよびＶＥＧＦ）の同一性は、ＥＣ３ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ （ＢｉｏＩｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）に従い、２％のアガロースゲルを使用して、またその後のＰＣＲマーカーとともに臭化エチジウム染色によって、サイズの決定が確認された。
【０８３２】
細胞が休止する状態であったときに、ＨＣ−ＨＡは、ＩＧＦ１ ｍＲＮＡの２乃至６倍の増加、およびＶＥＧＦｍＲＮＡの２倍の増加を誘発した（図９２）。対照的に、細胞がＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）によってチャレンジされたときに、ＨＣ−ＨＡは、ＩＧＦ１ ｍＲＮＡの５乃至１２倍の増加、およびＶＥＧＦ ｍＲＮＡの５乃至９倍の増加を誘発した。ＶＥＧＦは、血管新生の主要な要因であることが実証され、これは、所与の網中の毛細管の数を増加させる。ＶＥＧＦ活性化は、ＩＧＦ１およびＨＩＦ１αなどの、上流の調節因子によって制御される。我々の結果は、ＨＣ−ＨＡが、血管新生を促進するために、ＩＧＦ１−ＨＩＦ１α−ＶＥＧＦ網を活性化することを実証しており、これは、ヒト角膜の線維芽細胞中のＴＧＦβ１の付加によってさらに促進される。
【０８３３】
好ましい実施形態が、本明細書に示され記載されているが、このような実施形態が、ほんの一例として提供されることは当業者に明白となるであろう。多数の変化、変更および置換がここで生じ得る。本明細書に記載される実施形態の様々な代替案が、記載される方法を実行する際に利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が、実施形態の範囲を定義するものであり、これらの特許請求の範囲及びそれらの同等物の範囲内の方法及び構造が、それによって包含されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図１Ｌ】
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【図１Ｍ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2019178144.tif 000039
【図１０】
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【図１１】
2019178144.tif 000041
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
2019178144.tif 000081
【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３１Ｅ】
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【図３１Ｆ】
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【図３１Ｇ】
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【図３１Ｈ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３２Ｆ】
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【図３２Ｇ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４Ａ】
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【図７４Ｂ】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８Ａ−１】
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【図７８Ａ−２】
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【図７８Ｂ】
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【図７９Ａ】
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【図７９Ｂ】
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【図７９Ｃ】
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【図８０Ａ】
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【図８０Ｂ】
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【図８０Ｃ】
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【図８０Ｄ】
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【図８０Ｅ】
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【図８１Ａ】
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【図８１Ｂ】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４−１】
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【図８４−２】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
2019178144.tif 000160
【図８８】
2019178144.tif 000161
【図８９−１】
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【図８９−２】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月25日(2019.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織再生を誘導または促進するための製剤の製造における、
再構成されたＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（「ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３」）複合体または、単離された天然型ＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３（「ｎＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３」）複合体、の使用。
【請求項２】
前記組織は、骨、歯ぐき、角膜の組織、皮膚、神経、軟組織、または結膜の組織である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記組織は、骨である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記組織は、歯ぐきである、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記組織は、角膜の組織である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記組織は、皮膚である、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記組織は、神経である、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記軟組織は、腱または関節である、請求項２に記載の使用。
【請求項９】
前記ｒｃＨＣ−ＨＡ／ＰＴＸ３複合体は、ヒアルロン酸（ＨＡ）、インターαインヒビター（ＩαＩ）タンパク質の重鎖１（ＨＣ１）、ＩαＩタンパク質の重鎖２（ＨＣ２）、およびペントラキシン  ３（ＰＴＸ３）を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記製剤は、注射、注入、吸入、移植または局所投与による投与に適している、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
前記製剤は、溶液、懸濁液、ゲル剤、粉末、軟膏剤、錠剤、カプセル、クリーム剤、ローション、ペースト、スティック、リポソーム、ニオソーム、ファーマコソーム、ミクロスフェア、ミクロ粒子、ナノ粒子、シロップ、顆粒、丸剤、エアロゾルまたはそれらの組み合わせの形態である、請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
前記製剤は、ヒアルロン酸、コラーゲン、フィブリン、フィブロネクチン、ラミニン、ケラチン、フィブリノーゲン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１に記載の使用。
【外国語明細書】
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