(57)【要約】【課題】固定化したナノ粒子の観察に対しても適用可能な、新規なナノ粒子判別方法を提供する。【解決手段】暗視野観察下で輝点として観察可能なナノ粒子の判別方法であって、ナノ粒子を含む試料を暗視野観察下で観察し、カラーの観察画像を得る工程、観察画像を色分解して、各色成分の情報を含む輝点の色情報を取得する工程、および色情報から、観察画像中の輝点がナノ粒子の輝点であるか否かを判別する工程を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
暗視野観察下で輝点として観察可能なナノ粒子の判別方法であって、
ナノ粒子を含む試料を暗視野観察下で観察し、カラーの観察画像を得る工程、
上記観察画像を色分解して、各色成分の情報を含む輝点の色情報を取得する工程、および
上記色情報から、上記観察画像中の輝点がナノ粒子の輝点であるか否かを判別する工程を含むことを特徴とするナノ粒子の判別方法。
【請求項２】
上記試料は、生じる輝点の色が互いに異なる２種類以上の上記ナノ粒子を含んでいることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子の判別方法。
【請求項３】
上記観察画像を得る工程では、上記試料中の上記ナノ粒子を基板に固定化して観察を行うことを特徴とする請求項１または２に記載のナノ粒子の判別方法。
【請求項４】
上記観察画像を得る工程では、上記試料中の上記ナノ粒子を基板に固定化せずに観察を行うことを特徴とする請求項１または２に記載のナノ粒子の判別方法。
【請求項５】
上記試料には、上記ナノ粒子として金ナノ粒子モノマーが含まれていることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載のナノ粒子の判別方法。
【請求項６】
上記判別する工程では、上記観察画像中の上記輝点が上記ナノ粒子、上記ナノ粒子の凝集体および不純物のいずれであるかを判別することを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載のナノ粒子の判別方法。
【請求項７】
上記観察画像の色分解は、上記観察画像をＲＧＢに色分解することを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載のナノ粒子の判別方法。
【請求項８】
上記判別する工程では、予め取得した判別情報に基づき、上記観察画像中の輝点がナノ粒子の輝点であるか否かを判別することを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載のナノ粒子の判別方法。
【請求項９】
上記判別情報は、上記色情報と上記輝点の帰属との相関関係を機械学習した、上記輝点の分類モデルであることを特徴とする請求項８に記載のナノ粒子の判別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はナノ粒子を判別する方法に関し、より詳細には、暗視野下で、ナノ粒子を特異的に判別する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
暗視野顕微鏡下で金ナノ粒子を観察すると、強い表面プラズモン共鳴の光散乱によって明るい輝点として観察することが可能である。この暗視野下での強い光散乱を利用した分子検出方法が数多く提案されている。
【０００３】
例えば、非特許文献１には、ＤＮＡ修飾金ナノ粒子と磁気微粒子とを用いたＤＮＡ測定系を構築したことが示されている。この測定系は、まずＤＮＡ修飾金コロイド、ストレプトアビジン修飾磁気微粒子、およびビオチン修飾プローブ存在下に、測定対象のＤＮＡを添加し、測定対象ＤＮＡを介した磁気微粒子と金ナノ粒子の複合体を形成させる。次に、磁力を用いて集磁し、非吸着成分の洗浄を行う。その後、ＤＮＡ間の会合を解離させることで、磁気微粒子と金ナノ粒子との複合体を分離し、金ナノ粒子を上清中に得る。上清中に存在する金ナノ粒子の個数は測定対象ＤＮＡ濃度と相関するので、暗視野顕微鏡観察により、粒子の輝点をカウントすることで、対象ＤＮＡ濃度を測定している。
【０００４】
また、非特許文献２では、抗アミロイドペプチド抗体修飾金ナノ粒子を用いて、アミロイドフィブリルを検出することが示されている。この測定系では、アミロイドモノマーと結合した金ナノ粒子（モノマーで存在する）、およびアミロイドフィブリルと結合した金ナノ粒子（凝集体として存在する）を暗視野顕微鏡観察によりイメージングする。得られた観測画像にあるスポットのピクセル値平均を輝度として算出し、ヒストグラムを作成し、ナノ粒子凝集を評価することで、アミロイドフィブリルを高感度で検出している。
【０００５】
これらの分子検出方法は金ナノ粒子の強い散乱光を利用したものである。しかしながら暗視野顕微鏡の視野に不純物が存在すると、金ナノ粒子と同様な輝点として観測される場合があり、測定に影響を及ぼすことがある。これに対し特許文献１では、負に帯電する金ナノ粒子がガラス基板に付着せず、液中で不規則なブラウン運動を行うことを利用して不純物と金ナノ粒子とを判別する技術が開示されている。具体的には、画像データ取得の際の露光時間を長くすると、不純物はガラス基板上に固定化されているため露光時間に比例して輝度が増すが、金ナノ粒子は固定化されていないため、ブラウン運動の軌跡として画像データが得られることを利用し判別を行っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−２２９１０３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１６，８８，４１８８
【非特許文献２】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．，２０１６，３２，３０７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１に記載の方法は、暗視野下でナノ粒子と不純物とを判別する有用な方法ではあるが、基板上に固定化されたナノ粒子の観察への適応は困難である。例えば、非特許文献１及び非特許文献２に示された方法では、粒子の輝度を増加し、鮮明な画像データを得るために、アミノ基修飾ガラスを用いてナノ粒子を固定化している。そのため、これらの方法に特許文献１に記載の方法を用いることはできない。
【０００９】
そこで、本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、固定化したナノ粒子の観察に対しても適用可能な、新規なナノ粒子判別方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係るナノ粒子の判別方法は、上記課題を解決するために、暗視野観察下で輝点として観察可能なナノ粒子の判別方法であって、ナノ粒子を含む試料を暗視野観察下で観察し、カラーの観察画像を得る工程、上記観察画像を色分解して、各色成分の情報を含む輝点の色情報を取得する工程、および上記色情報から、上記観察画像中の輝点がナノ粒子の輝点であるか否かを判別する工程を含むものである。
【００１１】
また、本発明に係るナノ粒子の判別方法の一態様においては、上記試料は、生じる輝点の色が互いに異なる２種類以上の上記ナノ粒子を含んでいる。
【００１２】
また、本発明に係るナノ粒子の判別方法の一態様においては、上記観察画像を得る工程では、上記試料中の上記ナノ粒子を基板に固定化して観察を行う。
【００１３】
また、本発明に係るナノ粒子の判別方法の一態様においては、上記観察画像を得る工程では、上記試料中の上記ナノ粒子を基板に固定化せずに観察を行う。
【００１４】
また、本発明に係るナノ粒子の判別方法の一態様においては、上記試料には、上記ナノ粒子として金ナノ粒子モノマーが含まれている。
【００１５】
また、本発明に係るナノ粒子の判別方法の一態様においては、上記判別する工程では、上記観察画像中の上記輝点が上記ナノ粒子、上記ナノ粒子の凝集体および不純物のいずれであるかを判別する。
【００１６】
また、本発明に係るナノ粒子の判別方法の一態様においては、上記観察画像の色分解は、上記観察画像をＲＧＢに色分解する。
【００１７】
また、本発明に係るナノ粒子の判別方法の一態様においては、上記判別する工程では、予め取得した判別情報に基づき、上記観察画像中の輝点がナノ粒子の輝点であるか否かを判別する。
【００１８】
また、本発明に係るナノ粒子の判別方法の一態様においては、上記判別情報は、上記色情報と上記輝点の帰属との相関関係を機械学習した、上記輝点の分類モデルである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のナノ粒子の判別方法によれば、色情報に基づき輝点の帰属の判別を行うため、ナノ粒子が基板に固定化されている試料に対しても適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の実施形態に係る判別方法における、３次元プロットを作成するまでのスキームを示した図である。
【図２】実施例４でのＲＧＢ３次元プロットを示す図である。
【図３】実施例７でのＲＧＢ３次元プロットを示す図である。
【図４】実施例８の（３）におけるＤＬＳによる粒径分布を示す図である。
【図５】実施例８の（５）におけるＲＧＢ３次元プロットを示す図である。
【図６】実施例８の（６）におけるＲＧＢ３次元プロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明に係るナノ粒子の判別方法は、ナノ粒子を含む試料を暗視野観察下で観察し、カラーの観察画像を得る工程、得られた観察画像を色分解して、輝点の色情報を取得する工程、および得られた色情報から、輝点がナノ粒子の輝点であるか否かを判別する工程を含むものである。以下、本発明に係るナノ粒子の判別方法の一実施形態について説明する。
【００２２】
〔ナノ粒子〕
本実施形態で判別対象となるナノ粒子は、暗視野観察下で輝点として観察可能な粒子である。暗視野観察下で輝点として観察可能であれば、本実施形態に適用されるナノ粒子は特に制限されず、例えば、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、金ナノロッド、金ナノアーチン、金ナノ粒子凝集体などの同種粒子の凝集体、銀ナノ粒子−金ナノアーチンダイマーなどの異種粒子の凝集体および量子ドットなどが例示できる。
【００２３】
また、ナノ粒子の粒子径も特に制限されないが、１０ｎｍ〜１μｍの粒子径であることが好ましく、２０ｎｍ〜１００ｎｍの粒子径であることがさらに好ましい。なお、本明細書において粒子径とは、球状の粒子においては直径であり、ナノロッドなどの棒状の粒子の場合には長軸方向の長さである。
【００２４】
ナノ粒子の材質は、ナノ粒子が暗視野下で特徴的な輝点として観測可能となるものであれば、特に制限されない。しかしながら、輝度の大きさの観点で、可視から近赤外の波長帯にプラズモン共鳴特性を有する金属が好ましい。
【００２５】
また、上述の特許文献１に記載の方法では、金ナノ粒子モノマーと金ナノ粒子凝集体、または金ナノ粒子と銀ナノ粒子等、複数のナノ粒子が同じ溶液中に存在する場合、その判別は困難である。しかしながら、本実施形態の判別方法によれば、生じる輝点の色の異なる粒子を用いることにより、暗視野観察下で２つ以上の異なる粒子を区別して判別することができる。すなわち、暗視野観察下で２つ以上の異なる粒子を判別する場合には、生じる輝点の色の異なる粒子を用いることが好ましい。例えば第一のナノ粒子として金ナノ粒子モノマー（粒子径４０ｎｍ、暗視野観察下で緑色の輝点）および第二のナノ粒子として金ナノ粒子凝集体（暗視野観察下で黄色の輝点）を用いる組み合わせ、または、第一のナノ粒子として金ナノ粒子モノマー（粒子径４０ｎｍ、暗視野観察下で緑色の輝点）および第二のナノ粒子として銀ナノ粒子モノマー（粒径６０ｎｍ、暗視野観察下で青色の輝点）を用いる組み合わせなどを例示できる。
【００２６】
本実施形態の判別方法は、ナノ粒子の輝点を不純物の輝点と区別するものである。本明細書において不純物とは、暗視野観察時に観察される目的以外の物質であり、特に限定されない。不純物としては、例えば、ガラス基板上に存在し、暗視野観察下で輝点を生じるガラス粉およびほこり等が挙げられる。また、ナノ粒子を含む検体試料を測定対象とする場合には、暗視野観察時に輝点を生じる生体物質が不純物として挙げられる。
【００２７】
〔暗視野観察〕
本実施形態における暗視野観察は、試料に斜めから光を当て、試料からの散乱光および反射光等のみを観察する、従来公知の暗視野観察手法であればよい。照明法も透過型、および落射型のどちらでもよく、利用者が適宜選択すればよい。
【００２８】
暗視野観察下で生じる輝点を画像解析するために、観察画像をカラー画像として取得する。観察画像を取得するための撮像装置は、カラー画像として撮像可能な限り特に制限はない。なお、試料中のナノ粒子を固定化せずに観察を行う場合には、シャッタースピードの速い撮像装置を用いることが好ましい。
【００２９】
ナノ粒子の暗視野観察のために、ナノ粒子を含む液状試料を基板上に展開する。基板は、例えば、スライドガラスおよびガラスシャーレなどを例示できる。基板の材質は、液状試料が展開できる限り特に制限はなく、ソーダガラス、石英ガラス、アクリル樹脂およびポリカーボネート等の材料を例示できる。
【００３０】
本実施形態における暗視野観察では、ナノ粒子を基板上に固定化してもよい。ナノ粒子を基板上に固定化することにより、取得される観察画像の鮮明さを向上させることができる。これにより、観察画像を利用した本実施形態の判別方法による精度を向上させることができる。ナノ粒子を基板上に固定化する方法としては、ナノ粒子と基板表面との相互作用を利用した手法が挙げられるがこれに限定されない。例えば、ナノ粒子として金ナノ粒子を用いる場合、基板表面をアミノ基で修飾することにより、負に帯電した金ナノ粒子との静電的な相互作用により、金ナノ粒子を基板上に固定化することができる。あるいは、ナノ粒子を含む試料中の塩濃度を上昇させ、基板としてスライドガラスを用いることにより、ナノ粒子を基板上に固定化することができる。
【００３１】
このように、本実施形態の判別方法によれば、ナノ粒子が基板上に固定化された状態の試料に対してもナノ粒子の判別が可能である。しかしながらナノ粒子の固定化は必須の工程ではない。なお、ナノ粒子の基板上への固定化を行わない場合には、ナノ粒子のブラウン運動による影響を抑えるために、シャッタースピードの速いカメラ（撮像装置）を用いて観察画像を取得することが好ましい。なお、本明細書において「シャッタースピードが速い」とは、露光時間が短いために素早く画像が出力される場合のほか、複数画像を取得してそれを合成するような処理（例えば、ピクセルシフトマルチ撮影）を行わないためにより素早く画像を出力できる場合も意図している。あるいは、ナノ粒子を含む試料に増粘剤を添加することにより、ナノ粒子のブラウン運動を物理的に抑えてもよい。あるいは、シャッタースピードの速いカメラを用いること、および試料に増粘剤を添加することを併用してもよい。
【００３２】
増粘剤は、対象となる試料に応じて、観察を阻害しないような増粘剤を適宜選択すればよい。増粘剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、キトサンおよびペクチン等を挙げることができる。
【００３３】
〔輝点の解析〕
次に、取得した観察画像を用いた輝点の解析手法について説明する。図１は、以下に説明する輝点の解析手法の一態様におけるスキームを示した図である。
【００３４】
（輝点の色分解）
本実施形態における判別方法では、暗視野観察により得られたカラーの観察画像を複数の色成分に色分解して、各色成分の情報を含む輝点の色情報を取得し、当該色情報に基づき解析を行う。以下では、暗視野観察により得られたカラーの観察画像をＲＧＢに色分解し、各輝点のＲＧＢ値に基づき解析を行う場合を例に説明する。
【００３５】
まず暗視野観察で得られたカラーの観察画像を８−ｂｉｔグレースケールに画像変換する。グレースケール画像において輝点を識別し、輝点として識別された領域を対象領域（ＲＯＩ）と決定する。輝点の識別は、例えば、後述の実施例で示す画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ）を用いる場合には、閾値３０−２５５、サイズ３０−１００００、および真円度０．３−１．０という条件を満たすものを画像処理の段階で輝点として識別すればよい。次いで、対象となるカラーの観察画像をＲ成分、Ｇ成分およびＢ成分それぞれの成分画像に分割し、各色成分画像について全てのＲＯＩで強度測定を行う。ＲＯＩにおける各色成分の強度（Ｒ値、Ｇ値およびＢ値）を、輝点の色情報とする。すなわち、本実施形態における輝点の色情報は、ＲＧＢ値からなる３変量データである。
【００３６】
（輝点の判別）
色情報に基づき輝点を判別するための一態様として、得られた輝点の色情報を、ＲＧＢ値の３変量データとして３次元プロットする。３次元プロットすることにより、帰属が異なることによる輝点の相違を、視覚的に認識できるようになる。なお、本明細書において帰属とは、輝点がナノ粒子、ナノ粒子凝集体および不純物の何れに由来するものであるか、またナノ粒子の種類が複数ある場合に、どのナノ粒子に由来するものであるかを示すものである。
【００３７】
例えば、ナノ粒子が金ナノ粒子モノマーである場合、輝点の色は緑色であり、ＲＧＢに色分解するとＧの値が最も大きい。すなわち、ＲおよびＢに比較してＧの値が大きな位置にプロットされている輝点は、金ナノ粒子モノマーの輝点であると認識できる。一方で不純物に由来する輝点は白色であり、ＲＧＢに色分解するとＲＧＢの値はいずれも同程度である。すなわち、ＲＧＢの値がいずれも同程度であるような位置にプロットされている輝点は、不純物であると認識できる。このようにＲＧＢの３次元プロットを行うことでナノ粒子が視覚的に判別可能となる。
【００３８】
３次元プロットを行うことでナノ粒子を視覚的に判別することが可能となるが、より正確な判別を行うためには、あるいはより簡便に判別を行うためには、予め取得した判別情報に基づいて判別することが好ましい。ここで、判別情報とは、帰属が明らかな輝点の色情報を収集し、収集された色情報を用いることにより導きだされた基準、モデル、アルゴリズムおよびプログラム等であり、観察により得られた輝点の色情報に当該判別情報を適用し、当該輝点の帰属が何であるかを結論づけるものである。
【００３９】
（機械学習的手法）
同じ種類のナノ粒子であっても、各ナノ粒子の輝点のＲＧＢ値にはバラツキがある。また、異なる種類のナノ粒子または不純物であっても、目的とするナノ粒子と輝点の色が近い場合がある。そのため、精度よく判別を行うには、人の視覚による判別では限界がある。そのため、帰属の判別にあたっては、上述の判別情報として、ＲＧＢ値を入力データとして、帰属の判定結果を出力するソフトウェア（コンピュータプログラム）を用いることが好ましい。特に、機械学習結果に基づいて帰属を自動で判別するソフトウェア（分類モデル）を上述の判別情報として用いることが、判定精度の観点から望ましい。判別に利用可能なソフトウェア（アルゴリズム）は、特に限定されないが、例えば、教師あり学習済みのニューラルネットワーク、あるいは教師あり学習済みのサポートベクターマシン等を利用することもできる。
【００４０】
例えば、ＲＧＢ値である入力データから、金ナノ粒子モノマー、金ナノ粒子凝集体および不純物の何れであるかの判別結果を上記ソフトウェアに出力させることができる。この場合、予め、金ナノ粒子モノマーを用いて金ナノ粒子モノマーの色情報を取得し、金ナノ粒子凝集体を用いて金ナノ粒子凝集体の色情報を取得し、不純物（例えば、生体試料および土壌サンプル等）を用いて不純物の色情報を取得しておく。そして、このようにして得られた帰属が既知の色情報を学習データとして用いて上記ソフトウェアの機械学習を行い、同じく帰属が既知の色情報をテストデータとして用いて機械学習の精度を確認する、という処理を繰り返し行う。これにより、当該ソフトウェアによる所望の判定精度での判定が可能な状態となる。
【００４１】
このようなソフトウェアの一つの例としては、統計分析フリーソフトのＲ（Ｒ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ  ＣＯＲＥ  ＴＥＡＭ  （２００５）．  Ｒ：  Ａ  ＬＡＮＧＵＡＧＥ
ＡＮＤ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ    ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．  Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ．ＩＳＢＮ    ３−９０００５１−０７−０，  ＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ．）が挙げられる。
【００４２】
機械学習を用いた判別手法を採用することにより、ナノ粒子の帰属をより精度良く判別できるようになる。
【００４３】
以上説明したように、暗視野下でナノ粒子の観察を行う際、共存する不純物の存在によりナノ粒子の判別が困難になることがある。本実施形態の判別方法によれば、カラーの観察画像を色分解するというアプローチを採用したことで、従来適用が困難であった観察対象においても適用可能となる。また、暗視野観察でのナノ粒子の分析として分光器を用いる手法が知られているが、本実施形態の判別方法によれば、カラー画像を色分解するというアプローチを採用したことで、分光器などの高価な機器を用いることなく簡便にナノ粒子の判別が可能である。また、容易にナノ粒子の判別が可能であるため、ナノ粒子の輝点と不純物の輝点とを識別することでナノ粒子のみに着目でき、ナノ粒子を用いる種々の検出方法において、その正確性を上げることができる。さらには、本実施形態の判別方法においては、全ての解析操作を自動化することが可能である。そのため、人力による観察および分光器を用いた方法に比べ、所要時間を大幅に短縮することが可能となる。
【００４４】
さらに、本実施形態の判別方法によれば、暗視野下で観察される輝点の色の違いを利用して、第一のナノ粒子と、それとは異なる第二のナノ粒子とを判別することが可能となる。また、各輝点のＲＧＢ値と輝点の帰属（例えば、金ナノ粒子モノマー、金ナノ粒子凝集体および不純物）との相関関係を所定のソフトウェアに機械学習させることで、ナノ粒子の自動検出システムを設計することも可能となる。これにより、不純物を含む試料であっても、暗視野観察下で、ナノ粒子をより迅速かつ正確に検出することが可能となる。
【００４５】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００４６】
〔実施例１．アミノ基導入スライドガラスの作製〕
スライドガラス（松浪ガラス社製、Ｓ１１１１）を超純水および７０％エタノールで洗浄し、乾燥させた。次に１％ＡＰＴＥＳ（（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ、超純水希釈）をスライドガラスに塗布し、室温で３０分静置した後、超純水で洗浄した。これを乾燥させアミノ基導入スライドガラスを得た。
【００４７】
〔実施例２．金ナノ粒子モノマー、金ナノ粒子凝集体および不純物の暗視野下での撮影〕
（１）金ナノ粒子モノマーの撮影
４０ｎｍの金ナノ粒子（ＢＢＩ社製、１５０ｐＭ）を超純水で５ｐＭに希釈し、試料を調製した。試料３．５μＬを実施例１で作製したアミノ基導入スライドガラスに滴下し、その上からカバーガラスを被せ、カバーガラスの四辺にトップコートを塗ることで密閉し、プレパラートを作製した。
【００４８】
作製したプレパラートを暗視野下で油浸観察した。観察装置には顕微鏡（ＢＸ５３、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）、ＣＣＤカメラ（カラー、ＤＰ７３、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）、対物レンズ（ＵｐｌａｎＦＬＮ６０×、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用いた。観察条件は露光時間２００ｍｓ、ＩＳＯ２００、光学フィルターなしで行った。以上の条件で焦点を合わせ、観察位置の異なる６枚の観察像を撮影（４８００×３６００，ピクセルマルチ撮影）した。
【００４９】
（２）金ナノ粒子凝集体の撮影
４０ｎｍの金ナノ粒子（ＢＢＩ社製、１５０ｐＭ）を超純水で１０ｐＭに希釈した。これに同量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え１０分間静置したものを試料として用いたこと以外は、上記（１）に記載の方法を用いてプレパラートを作製し、観察像撮影を行った。
【００５０】
（３）不純物の撮影
試料としてフィルター（ＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ  ０．２２μｍ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理した土壌サンプルまたは血清（１００倍希釈、未フィルター）を用いたこと以外は、上記（１）に記載の方法でプレパラートを観察し、観察像撮影を行った。
【００５１】
〔実施例３．画像処理〕
画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  ｖｏｌ１１，ｉｓｓｕｅ７，ｐｐ．３６−４２，２００４）を用いて、以下の方法で画像処理を行った。
【００５２】
（１）グレースケール変換、輝点解析およびＲＯＩ保存
対象画像をグレースケールに変換し、輝点解析および輝点の領域情報（ＲＯＩ）の取得を行った。輝点解析のパラメーターは閾値３０−２５５、サイズ３０−１００００、真円度０．３−１．０で行った。
【００５３】
（２）ＲＧＢへの分割、および各画像におけるＲＯＩでの輝点解析
ＲＧＢで構成されている対象の画像を、Ｒ成分の画像、Ｇ成分の画像およびＢ成分の画像の３つの画像に分割した。各画像について上記（１）で取得したＲＯＩで輝点解析を行い、Ｒ、ＧおよびＢの各画像におけるＲＯＩの強度を取得した。取得した各ＲＯＩの強度を、各輝点のＲ、ＧおよびＢそれぞれの強度とした。これを、以降の解析データとして用いた。
【００５４】
〔実施例４．Ｒを用いたデータ処理〕
実施例３で得た解析データの処理は、統計分析フリーソフトのＲ（Ｒ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ  ＣＯＲＥ  ＴＥＡＭ  （２００５）．  Ｒ：  Ａ  ＬＡＮＧＵＡＧＥ  ＡＮＤ
ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ    ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．
Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ．ＩＳＢＮ    ３−９０００５１−０７−０，  ＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ．）を用いて行った。
【００５５】
具体的には、解析データをテキストファイルとして出力し、各輝点とそのＲＧＢ値とを対応させた表を作成した。各輝点のＲＧＢ値を３次元プロットすることで、輝点のＲＧＢ値の分布を可視化した。実施例３および実施例４の解析スキームは、図１に示した通りである。可視化したＲＧＢ値の３次元プロットを異なる角度から観察した結果を、図２の（ａ）〜（ｃ）に示す。図２においては、異なる濃淡のプロットとして、金ナノ粒子モノマー、金ナノ粒子凝集体および不純物を区別して示している。濃淡の最も薄いプロットが金ナノ粒子モノマーの輝点のプロットであり、濃淡の最も濃いプロットが不純物の輝点のプロットである（特に、図２の（ｃ）参照）。図２の３次元プロットにおいて、Ｒ値、Ｇ値およびＢ値に対応する軸を、図中の符号を付した矢印で示している。
【００５６】
図２の（ａ）〜（ｃ）から明らかなように、金ナノ粒子モノマー、金ナノ粒子凝集体および不純物の輝点は、ＲＧＢ値の３次元プロットにおいてそれぞれ異なる分布を示した。したがって、金ナノ粒子モノマー、金ナノ粒子凝集体および不純物の輝点をそれぞれ色分解することで、金ナノ粒子モノマー、金ナノ粒子凝集体および不純物を判別できることが確認された。
【００５７】
〔実施例５．機械学習を利用した輝点の帰属〕
観察対象の輝点がどのナノ粒子または不純物に対応するか決定するための基準を設けることにより、帰属の判別が容易となる。しかしながら、図２の３次元プロットに示されるような、各輝点のプロットが線形分離できない場合には、人の手で基準を規定することが困難である。そこで、機械学習を利用した輝点の帰属の判別方法を採用した。
【００５８】
実施例２および３で得られた、金ナノ粒子モノマー、金ナノ粒子凝集体および不純物のいずれの帰属であるか明らかな輝点のＲＧＢ値情報を、その帰属と合わせて機械学習のトレーニングデータセットとした。このデータセットを乱数で２分割して、一方を学習データ、他方をテストデータとした。機械学習による、輝点の帰属を判定するための分類モデルの作製は統計分析フリーソフトのＲを用いて行った。分割したどの学習データを用いた機械学習であっても、テストデータを金ナノ粒子モノマー、金ナノ粒子凝集体または不純物へ分類することが可能であり、その正答率は９８．８％であった。
【００５９】
〔実施例６．測定間誤差の評価〕
測定間のＲＧＢ値のズレおよびバラつきが機械学習による帰属結果に与える影響を評価するため、同一試料について複数回測定し、測定による誤差を確認した。
【００６０】
金ナノ粒子モノマー試料を用い、実施例２に記載の方法に従いプレパラートを作製し、暗視野顕微鏡下で画像撮影を行った。このとき、ステージ位置（ＸＹ方向）を固定したまま、対物レンズおよびコンデンサーレンズ（Ｚ方向）のみを動かし、撮影を行う工程を６回繰り返した。具体的には、画像撮影を行った後、対物レンズおよびコンデンサーレンズを動かしピントを外した後、再度ピントを調整し、もう一度撮影を行うという工程を繰り返し、６枚の撮影画像を取得した。ナノ粒子の帰属の判定は実施例５において使用したトレーニングセット全てのデータを学習データとして用いた機械学習済の統計分析フリーソフトのＲにより行った。６枚の画像データの解析結果を表１に示す。
【００６１】
【表１】
2019215314.tif 000003
【００６２】
６回計測した際の凝集割合の標準偏差は０．０００４３７であった。この結果から測定間の誤差は小さく測定間のズレおよびバラつきが機械学習の結果に与える影響は少ないことが示唆された。
【００６３】
以上の結果から、本発明の方法により、色分解によりナノ粒子を判別できることが確認された。
【００６４】
〔実施例７．浮遊した金ナノ粒子の観察および帰属〕
浮遊した金ナノ粒子の観察を行うため、増粘剤としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を用いて、金ナノ粒子の運動を抑えて速いシャッタースピードで撮影を行った。
【００６５】
（１）金ナノ粒子モノマーの撮影
４０ｎｍの金ナノ粒子（ＢＢＩ社製、１５０ｐＭ）を超純水により１０ｐＭに希釈し、そこに同量の１．０％ＣＭＣを添加し、試料を調製した。試料３．５μＬをスライドガラス（松浪ガラス社製、Ｓ１１１１、アミノ基未導入）に滴下し、その上からカバーガラスを被せ、カバーガラスの四辺にトップコートを塗ることで密閉し、モノマー試料のプレパラートを作製した。
【００６６】
作製したプレパラートを暗視野下で油浸観察した。観察装置には顕微鏡（ＢＸ５３、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）、ＣＣＤカメラ（カラー、ＤＰ７３、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）、対物レンズ（ＵｐｌａｎＦＬＮ６０×、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用い、観察条件は露光時間２００ｍｓ、ＩＳＯ２００、光学フィルターなしで行った。以上の条件で焦点を合わせ、６枚の観察像を撮影（１６００×１２００，通常撮影）した。
【００６７】
（２）金ナノ粒子凝集体の撮影
４０ｎｍの金ナノ粒子（ＢＢＩ社製、１５０ｐＭ）を超純水により２０ｐＭに希釈し、これに同量のＰＢＳを加え１０分静置した。その後、１：１の容量で１．０％ＣＭＣを添加することで試料を調製した。試料３．５μＬをスライドガラス（松浪ガラス社製、Ｓ１１１１、アミノ基未導入）に滴下し、その上からカバーガラスを被せ、カバーガラスの四辺にトップコートを塗ることで密閉し、凝集体試料のプレパラートを作製した。
【００６８】
作製したプレパラートの観察は上記（１）に記載の方法で行った。
【００６９】
（３）不純物試料の撮影
土壌サンプル（フィルター済）を１：１の容量で１．０％ＣＭＣと混合することで試料を調製した。試料３．５μＬをスライドガラス（松浪ガラス社製、Ｓ１１１１、アミノ基未導入）に滴下し、その上からカバーガラスを被せ、カバーガラスの四辺にトップコートを塗ることで密閉し、不純物試料のプレパラートを作製した。
【００７０】
作製したプレパラートの観察は上記（１）に記載の方法で行った。
【００７１】
（４）輝点解析
上記（１）〜（３）の撮影で得られた画像を実施例３および実施例４に記載の方法を用いてデータ処理を行い、ＲＧＢ値の３次元プロットを行った。ＩｍａｇｅＪによる輝点解析のパラメーターは、閾値３０−２５５、サイズ５−２００、真円度０．３−１．０で行った。また可視化したＲＧＢ値の３次元プロットを異なる角度から観察した結果を図３の（ａ）〜（ｃ）に示す。図３においては、実施例４と同様の異なる濃淡のプロットとして、金ナノ粒子モノマー、金ナノ粒子凝集体および不純物を区別して示している。図３の（ａ）〜（ｃ）から明らかなように、金ナノ粒子の固定化を行わずに撮影を行った場合にも、固定化を行った場合と同様に、金ナノ粒子モノマー、金ナノ粒子凝集体および不純物の輝点は、ＲＧＢ値の３次元プロットにおいてそれぞれ異なる分布を示すことが確認された。
【００７２】
機械学習による輝点の帰属判定のため、（１）〜（３）で帰属が明らかな輝点のＲＧＢ情報を帰属と合わせて学習データとした。１個抜き交差検証を用いた学習データの正確性評価を行った結果、平均正答率は９９．５９％であった。以上のように、基板に固定化されていない浮遊した金ナノ粒子の観察においても、本発明の方法の一態様によりナノ粒子を判別可能であることが確認された。
【００７３】
〔実施例８．銀ナノ粒子、金ナノアーチンおよびそのダイマーの判別〕
銀ナノ粒子、金ナノアーチン、および銀ナノ粒子−金ナノアーチンダイマーを以下の方法で作製し、その判別を行った。
【００７４】
（１）抗ＢＳＡウサギ抗体修飾銀ナノ粒子の作製
４０ｎｍの銀ナノ粒子（ＢＢＩ社製）５０μＬと０．１２５ｍｇ／ｍＬに調整したスタンダードＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）１μＬとを混合し、室温で３０分間静置した。この混合液に抗ＢＳＡウサギポリクローナル抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製  ２０μｇ／ｍＬ、５０μＬ）を添加し、室温でさらに２時間静置した。その後１％ＢＳＡ溶液（１００μＬ）および超純水（８００μＬ）を添加し、混合した。８０００ｒｐｍで１０分の遠心操作を行うことで上清とナノ粒子とを分離し、回収したナノ粒子を０．１×ＰＢＳ緩衝液５０μＬに分散することで、抗ＢＳＡ抗体修飾銀ナノ粒子溶液を得た。
【００７５】
（２）抗ウサギ抗体修飾金ナノアーチンの作製
抗ウサギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社製）２μＬを５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）１８μＬで希釈し、８０ｎｍ金ナノアーチン（Ｃｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）２００μＬに添加して室温で３０分間静置した。その後、１％ＢＳＡ溶液８０μＬを添加して撹拌し、１５分静置した。この混合液を遠心操作（８０００ｒｐｍで１０分）して上清とナノアーチンとを分離し、抗ウサギ抗体修飾金ナノアーチンを得た。回収した修飾金ナノアーチンを５００μＬの超純水に分散し、同様の遠心操作を２回行うことで、過剰の抗ウサギポリクローナル抗体を除去した。得られたナノアーチンを２００μＬの超純水に分散することで、抗ウサギ抗体修飾金ナノアーチン溶液を得た。
【００７６】
（３）作製ナノ粒子の確認
上記（１）および（２）で作製した修飾ナノ粒子について、動的光散乱法（ＤＬＳ）を利用した粒径分布測定により評価を行い、目的タンパクの修飾を確認した。結果を図４に示す。図４の（Ａ）ではＢＳＡ修飾銀ナノ粒子に抗ＢＳＡウサギポリクローナル抗体を修飾する前後、図４の（Ｂ）では金ナノアーチンに抗ウサギポリクローナル抗体を修飾する前後の結果を示す。どちらの場合も抗体の修飾により粒径分布が正の方向にシフトしたことから、目的タンパクが修飾されたことが示唆された。
【００７７】
（４）ナノ粒子の暗視野観察
上記（１）および（２）で作製した修飾ナノ粒子、ならびにその混合試料を暗視野下で観察した。混合試料としては、（１）の溶液５μＬと（２）の溶液５μＬとを混合し、３時間静置したものを用いた。観察用プレパラートの作製は実施例２に記載の方法で行った。作製したプレパラートを暗視野下で油浸観察した。観察装置には顕微鏡（ＢＸ５３、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）、ＣＣＤカメラ（カラー、ＤＰ７３、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）、および対物レンズ（ＵｐｌａｎＦＬＮ６０×、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用い、観察条件は露光時間１０ｓｅｃ、ＩＳＯ１００、および４８００×３６００ピクセルシフトで撮影した。混合試料において、銀ナノ粒子および金ナノアーチンのいずれとも異なる色（ピンク〜紫色）の輝点が観察された。
【００７８】
（５）銀ナノ粒子−金ナノアーチンダイマーの像の予測
上記（１）および（２）で作製した修飾ナノ粒子をそれぞれ暗視野観察し、観察されたそれぞれ１０個の輝点を３０×３０ｐｉｘｅｌで抽出した。次いで（１）の修飾ナノ粒子の輝点と、（２）の修飾ナノ粒子との輝点を重ね合わせたｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｄｉｍｅｒ像を得た。詳細には、（１）の修飾ナノ粒子の１０個の各輝点と、（２）の修飾ナノ粒子の１０個の各輝点との全ての組み合わせ（１０×１０）について重ね合わせを行い、計１００個のｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｄｉｍｅｒ像を得た。ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｄｉｍｅｒは、（１）の修飾ナノ粒子と（２）の修飾ナノ粒子とでダイマーを形成した際に観察されると推測される像を意図したものである。抽出した各１０個の輝点と、ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｄｉｍｅｒ像をＲＧＢ値の３次元プロットにより可視化した（図５）。結果、図５の（ａ）に示されるように、銀ナノ粒子のクラスター、金ナノアーチンのクラスターおよびｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｄｉｍｅｒ像のクラスターの３つのクラスターに分かれることが確認された。また、ダイマーとして観察される輝点のＲＧＢ値の３次元プロットは図５の（ａ）〜（ｃ）に示す位置であることが推測された。
【００７９】
（６）混合試料のＲＧＢ３次元プロット
上記（４）で観察した各暗視野像を実施例３および４に示した方法で処理し、上記（５）のｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｄｉｍｅｒも含めてＲＧＢ３次元プロットした結果を図６に示す。図６の（ａ）〜（ｃ）に示されるように、銀ナノ粒子および金ナノアーチン由来のプロットとは明らかに異なるプロットが混合試料中に確認され、そのプロットはｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｄｉｍｅｒのプロットと十分近い位置であった。以上の結果から混合試料中に銀ナノ粒子と金ナノアーチンとのダイマーが存在することが示唆された。また、図６の（ａ）〜（ｃ）に示すように、色分解によって、銀ナノ粒子、金ナノアーチンおよび銀ナノ粒子−金ナノアーチンダイマーを判別可能であることが確認された。なお、図６に示すプロット中、銀ナノ粒子のクラスターには、混合試料中にモノマーとして存在する修飾銀ナノ粒子の輝点も含まれている。同様に、図６に示すプロット中、金ナノアーチンのクラスターには、混合試料中にモノマーとして存在する修飾金ナノアーチンの輝点も含まれている。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明は、暗視野下でナノ粒子を観察する技術を用いる分野に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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