(57)【要約】【課題】タンパク質を利用した成形体であって、耐水性等の様々な機能性が有利に付与された成形体を得ること。【解決手段】タンパク質を含有する成形体前駆体と、タンパク質と反応して結合を形成可能な第一の反応性基を２つ以上有する第一の反応剤とを反応させて、中間体を得る第一の工程と、中間体と、第一の反応性基と反応して結合を形成可能な第二の反応性基を１つ有する第二の反応剤とを反応させて、成形体を得る第二の工程と、を備える、成形体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を含有する成形体前駆体と、前記タンパク質と反応して結合を形成可能な第一の反応性基を２つ以上有する第一の反応剤とを反応させて、中間体を得る第一の工程と、
前記中間体と、前記第一の反応性基と反応して結合を形成可能な第二の反応性基を１つ有する第二の反応剤とを反応させて、成形体を得る第二の工程と、
を備える、成形体の製造方法。
【請求項２】
前記第一の工程において、前記第一の反応剤の少なくとも一部が前記タンパク質を架橋し、且つ、前記第一の反応性基の少なくとも一部が前記中間体中に残存するように、前記タンパク質と前記第一の反応剤とを反応させる、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記第二の工程において、前記中間体中に残存する前記第一の反応性基と前記第二の反応性基とが反応して結合を形成するように、前記中間体と前記第二の反応剤とを反応させる、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記第一の反応性基が求電子性基であり、前記第二の反応性基が求核性基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記第一の反応性基がイソシアネート基であり、前記第二の反応性基がヒドロキシル基、アミノ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記第二の反応性基が、前記第二の反応性基と炭化水素基とからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記成形体が、ポリペプチド骨格、前記第一の反応剤の残基である第一の残基、及び、前記第二の反応剤の残基である第二の残基を、それぞれ複数有するタンパク質架橋体を含有し、
前記第一の残基の少なくとも一つが、前記ポリペプチド骨格を架橋しており、
前記第一の残基の少なくとも一つが、一端で前記ポリペプチド骨格と結合し、他端で前記第二の残基と結合している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
第一の工程の前に、前記第一の反応剤の一部と前記第二の反応剤の一部とを反応させて、前記第一の反応剤が有する前記第一の反応性基の一部と、前記第二の反応剤が有する前記第二の反応性基の一部とを反応させる前工程を備える、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
タンパク質架橋体を含有する成形体であって、
前記タンパク質架橋体が、ポリペプチド骨格と、タンパク質と反応して結合を形成可能な第一の反応性基を２つ以上有する第一の反応剤の残基である第一の残基と、前記第一の反応性基と反応して結合を形成可能な第二の反応性基を１つ有する第二の反応剤の残基である第二の残基と、をそれぞれ複数有し、
前記第一の残基の少なくとも一つが、前記ポリペプチド骨格を架橋しており、
前記第一の残基の少なくとも一つが、一端でポリペプチド骨格と結合し、他端で前記第二の残基と結合している、成形体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成形体及び成形体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境保全意識の高まりから、石油由来の材料の代替物質の検討が進められており、強度などの点でタンパク質がその候補として挙げられている。例えば、特許文献１には、動物繊維の集合体を圧縮成形して、応力−ひずみ特性等の機械的特性が高い動物繊維成形物を得る方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１７−１１０１３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、タンパク質を利用した成形体であって、耐水性等の様々な機能性が有利に付与された成形体及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一側面は、タンパク質を含有する成形体前駆体と、上記タンパク質と反応して結合を形成可能な第一の反応性基を２つ以上有する第一の反応剤とを反応させて、中間体を得る第一の工程と、上記中間体と、上記第一の反応性基と反応して結合を形成可能な第二の反応性基を１つ有する第二の反応剤とを反応させて、成形体を得る第二の工程と、を備える、成形体の製造方法に関する。
【０００６】
本発明の他の一側面は、タンパク質架橋体を含有する成形体であって、上記タンパク質架橋体が、ポリペプチド骨格と、タンパク質と反応して結合を形成可能な第一の反応性基を２つ以上有する第一の反応剤の残基である第一の残基と、上記第一の反応性基と反応して結合を形成可能な第二の反応性基を１つ有する第二の反応剤の残基である第二の残基と、をそれぞれ複数有し、上記第一の残基の少なくとも一つが、上記ポリペプチド骨格を架橋しており、上記第一の残基の少なくとも一つが、一端でポリペプチド骨格と結合し、他端で前記第二の残基と結合している、成形体に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、タンパク質を利用した成形体であって、耐水性等の様々な機能性が有利に付与された成形体及びその製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】改変フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。
【図２】天然由来のフィブロインのｚ／ｗ（％）の値の分布を示す図である。
【図３】天然由来のフィブロインのｘ／ｙ（％）の値の分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。ただし、本発明は下記実施形態に何ら限定されるものではない。
【００１０】
一実施形態に係る成形体の製造方法は、タンパク質を含有する成形体前駆体と、上記タンパク質と反応して結合を形成可能な第一の反応性基を２つ以上有する第一の反応剤とを反応させて、中間体を得る第一の工程と、中間体と、第一の反応性基と反応して結合を形成可能な第二の反応性基を１つ有する第二の反応剤とを反応させて、成形体を得る第二の工程と、を備える。
【００１１】
成形体前駆体が含有するタンパク質の種類は特に制限されず、例えば構造タンパク質であってよい。構造タンパク質とは、生体構造を形成するタンパク質又はそれに由来するタンパク質を示す。すなわち、構造タンパク質は、天然由来の構造タンパク質であってよく、天然由来の構造タンパク質のアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列の一部（例えば、当該アミノ酸配列の１０％以下）を改変した改変タンパク質であってもよい。
【００１２】
構造タンパク質としては、例えば、フィブロイン、コラ−ゲン、レシリン、エラスチン及びケラチン、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。フィブロインは、例えば、絹フィブロイン、クモ糸フィブロイン、及びホーネットシルクフィブロインからなる群より選択される１種以上であってよい。構造タンパク質は、絹フィブロイン、クモ糸フィブロイン又はこれらの組み合わせであってもよい。絹フィブロインとクモ糸フィブロインとを併用する場合、絹フィブロインの割合は、例えば、クモ糸フィブロイン１００質量部に対して、４０質量部以下、３０質量部以下、又は１０質量部以下であってよい。
【００１３】
フィブロインとしては、以下のような改変フィブロインを用いることもできる。改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。改変フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。
【００１４】
本明細書において「改変フィブロイン」とは、人為的に製造されたフィブロイン（人造フィブロイン）を意味する。改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインであってもよく、天然由来のフィブロインとアミノ酸配列と同一であるフィブロインであってもよい。本明細書における「天然由来のフィブロイン」もまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。
【００１５】
「改変フィブロイン」は、本実施形態で特定されるアミノ酸配列を有するものであれば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列をそのまま利用したものであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的に設計及び合成したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。
【００１６】
本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ１］ｍで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ１］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、式１中、（Ａ）ｎモチーフの、Ａはアラニン残基を示し、ｎは２〜２７の整数が好ましく、４〜２０、８〜２０、１０〜２０、４〜１６、８〜１６、１０〜１６の整数であって良く、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は４０％以上であれば良く、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する）であっても良い。ＲＥＰ１は１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０〜３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰ１は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。このようなフィブロインとしては、具体的には配列番号９で示されるアミノ酸配列（PRT410）を含むタンパク質をあげることができる。
【００１７】
改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列に対し、例えば、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行うことで得ることができる。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００１８】
天然由来のフィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質であり、具体的には、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。
【００１９】
昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ  ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ  Ｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ  ｓｉｍｉｌｌｉｍａ  ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
【００２０】
昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、ＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
【００２１】
クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
【００２２】
クモ類が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ−３（ａｄｆ−３）［Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ−４（ａｄｆ−４）［Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ  ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。
【００２３】
天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ  ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
【００２４】
改変フィブロインは、改変絹フィブロイン（カイコが産生する絹タンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、改変クモ糸フィブロイン（クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）であってもよい。それらのうちでも改変クモ糸フィブロインが、好適に用いられる。
【００２５】
改変フィブロインの具体的な例として、クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロイン、グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロイン、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン、グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインが挙げられる。
【００２６】
クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロインとしては、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロインは、式１中、ｎは３〜２０の整数が好ましく、４〜２０の整数がより好ましく、８〜２０の整数が更に好ましく、１０〜２０の整数が更により好ましく、４〜１６の整数が更によりまた好ましく、８〜１６の整数が特に好ましく、１０〜１６の整数が最も好ましい。クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロインは、式１中、ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の数は、１０〜２００残基であることが好ましく、１０〜１５０残基であることがより好ましく、２０〜１００残基であることが更に好ましく、２０〜７５残基であることが更により好ましい。クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して、４０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。
【００２７】
クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１４〜１６のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１４〜１６のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。
【００２８】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号１５に示されるアミノ酸配列は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号１６に示されるアミノ酸配列は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。
【００２９】
クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロインのより具体的な例として、（１−ｉ）配列番号１７で示されるアミノ酸配列、又は（１−ｉｉ）配列番号１７で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【００３０】
配列番号１７で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号１８）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１〜１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号１７で示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と同一である。
【００３１】
（１−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００３２】
グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。当該改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
【００３３】
グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、少なくとも１又は複数の当該モチーフ配列中の１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００３４】
グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインは、上述のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であってもよい。
【００３５】
グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の全ＲＥＰに含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが３０％以上、４０％以上、５０％以上又は５０．９％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
【００３６】
グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインは、ＧＧＸモチーフの１つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより。ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合を高めたものであることが好ましい。グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインは、ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることが更に好ましく、６％以下であることが更により好ましく、４％以下であることが更によりまた好ましく、２％以下であることが特に好ましい。ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合は、下記ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合（ｚ／ｗ）の算出方法と同様の方法で算出することができる。
【００３７】
ｚ／ｗの算出方法を更に詳細に説明する。まず、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのＲＥＰから、ＸＧＸからなるアミノ酸配列を抽出する。ＸＧＸを構成するアミノ酸残基の総数がｚである。例えば、ＸＧＸからなるアミノ酸配列が５０個抽出された場合（重複はなし）、ｚは５０×３＝１５０である。また、例えば、ＸＧＸＧＸからなるアミノ酸配列の場合のように２つのＸＧＸに含まれるＸ（中央のＸ）が存在する場合は、重複分を控除して計算する（ＸＧＸＧＸの場合は５アミノ酸残基である）。ｗは、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図１に示したドメイン配列の場合、ｗは４＋５０＋４＋１００＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝２３０である（最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフは除いている。）。次に、ｚをｗで除すことによって、ｚ／ｗ（％）を算出することができる。
【００３８】
ここで、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗについて説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、フィブロイン中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が６％以下である天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｚ／ｗを算出した。その結果を図２に示す。図２の横軸はｚ／ｗ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図２から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗは、いずれも５０．９％未満である（最も高いもので、５０．８６％）。
【００３９】
グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインにおいて、ｚ／ｗは、５０．９％以上であることが好ましく、５６．１％以上であることがより好ましく、５８．７％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、８０％以上であることが更によりまた好ましい。ｚ／ｗの上限に特に制限はないが、例えば、９５％以下であってもよい。
【００４０】
グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフにおける１つのグリシン残基を選択してもよいし、またｚ／ｗが５０．９％以上になるように置換してもよい。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記態様を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
【００４１】
上記の別のアミノ酸残基としては、グリシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限はないが、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、メチオニン（Ｍ）残基、プロリン（Ｐ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びトリプトファン（Ｗ）残基等の疎水性アミノ酸残基、グルタミン（Ｑ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、リシン（Ｋ）残基及びグルタミン酸（Ｅ）残基等の親水性アミノ酸残基が好ましく、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基及びグルタミン（Ｑ）残基がより好ましく、グルタミン（Ｑ）残基が更に好ましい。
【００４２】
グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインのより具体的な例として、（２−ｉ）配列番号３、配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列、又は（２−ｉｉ）配列番号３、配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【００４３】
（２−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号３で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、配列番号４で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号４の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号１２で示されるアミノ酸配列は、配列番号９で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端にＨｉｓタグが付加されたものである。
【００４４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）におけるｚ／ｗの値は、４６．８％である。配列番号３で示されるアミノ酸配列、配列番号４で示されるアミノ酸配列、配列番号１０で示されるアミノ酸配列、及び配列番号１２で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ５８．７％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。また、配列番号１、３、４、１０及び１２で示されるアミノ酸配列のギザ比率（後述する）１：１．８〜１１．３におけるｘ／ｙの値は、それぞれ１５．０％、１５．０％、９３．４％、９２．７％及び８９．３％である。
【００４５】
（２−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号３、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００４６】
（２−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号３、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【００４７】
（２−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号３、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
【００４８】
上述の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
【００４９】
タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）が挙げられる。
【００５０】
また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
【００５１】
さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。
【００５２】
さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。
【００５３】
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（２−ｉｉｉ）配列番号８、配列番号９、配列番号１１若しく配列番号１３で示されるアミノ酸配列、又は（２−ｉｖ）配列番号８、配列番号９、配列番号１１若しく配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【００５４】
配列番号６、７、８、９、１１及び１３で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３、４、１０及び１２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含む）を付加したものである。
【００５５】
（２−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号８、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００５６】
（２−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号８、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【００５７】
（２−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号８、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
【００５８】
上述の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
【００５９】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。当該改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
【００６０】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、天然由来のフィブロインから（Ａ）ｎモチーフを１０〜４０％欠失させたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００６１】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって１〜３つの（Ａ）ｎモチーフ毎に１つの（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００６２】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つ連続した（Ａ）ｎモチーフの欠失、及び１つの（Ａ）ｎモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００６３】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、そのドメイン配列が、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００６４】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
【００６５】
ｘ／ｙの算出方法を図１を参照しながら更に詳細に説明する。図１には、改変フィブロインからＮ末端配列及びＣ末端配列を除いたドメイン配列を示す。当該ドメイン配列は、Ｎ末端側（左側）から（Ａ）ｎモチーフ−第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第３のＲＥＰ（１０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフという配列を有する。
【００６６】
隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットは、重複がないように、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットが存在してもよい。図１には、パターン１（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第３のＲＥＰと第４のＲＥＰの比較）、パターン２（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン３（第２のＲＥＰと第３のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン４（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較）を示した。なお、これ以外にも選択方法は存在する。
【００６７】
次に各パターンについて、選択した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニット中の各ＲＥＰのアミノ酸残基数を比較する。比較は、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求めることによって行う。例えば、第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）と第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第１のＲＥＰを１としたとき、第２のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、１００／５０＝２である。同様に、第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）と第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第４のＲＥＰを１としたとき、第５のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、３０／２０＝１．５である。
【００６８】
図１中、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの組を実線で示した。以下このような比をギザ比率と呼ぶ。よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８未満又は１１．３超となる［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの組は破線で示した。
【００６９】
各パターンにおいて、実線で示した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの全てのアミノ酸残基数を足し合わせる（ＲＥＰのみではなく、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数もである。）。そして、足し合わせた合計値を比較して、当該合計値が最大となるパターンの合計値（合計値の最大値）をｘとする。図１に示した例では、パターン１の合計値が最大である。
【００７０】
次に、ｘをドメイン配列の総アミノ酸残基数ｙで除すことによって、ｘ／ｙ（％）を算出することができる。
【００７１】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインにおいて、ｘ／ｙは、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、６５％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、７５％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、例えば、１００％以下であってよい。ギザ比率が１：１．９〜１１．３の場合には、ｘ／ｙは８９．６％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．８〜３．４の場合には、ｘ／ｙは７７．１％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９〜８．４の場合には、ｘ／ｙは７５．９％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９〜４．１の場合には、ｘ／ｙは６４．２％以上であることが好ましい。
【００７２】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインが、ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフの少なくとも７つがアラニン残基のみで構成される改変フィブロインである場合、ｘ／ｙは、４６．４％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５５％以上であることが更に好ましく、６０％以上であることが更により好ましく、７０％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、１００％以下であればよい。
【００７３】
ここで、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙについて説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列で構成される天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｘ／ｙを算出した。ギザ比率が１：１．９〜４．１の場合の結果を図３に示す。
【００７４】
図３の横軸はｘ／ｙ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図３から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙは、いずれも６４．２％未満である（最も高いもので、６４．１４％）。
【００７５】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
【００７６】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインのより具体的な例として、（３−ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列、又は（３−ｉｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【００７７】
（３−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号２で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、配列番号４で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号４の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号１２で示されるアミノ酸配列は、配列番号１０で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端にＨｉｓタグが付加されたものである。
【００７８】
配列番号１で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）のギザ比率１：１．８〜１１．３におけるｘ／ｙの値は１５．０％である。配列番号２で示されるアミノ酸配列、及び配列番号４で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、いずれも９３．４％である。配列番号１０で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、９２．７％である。配列番号１２で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、８９．３％である。配列番号１、２、４、１０及び１２で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ４６．８％、５６．２％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。
【００７９】
（３−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号２、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００８０】
（３−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３−ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【００８１】
（３−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３（ギザ比率が１：１．８〜１１．３）となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
【００８２】
上述の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方に上述したタグ配列を含んでいてもよい。
【００８３】
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（３−ｉｉｉ）配列番号７、配列番号９、配列番号１１若しく配列番号１３で示されるアミノ酸配列、又は（２−ｉｖ）配列番号７、配列番号９、配列番号１１若しく配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【００８４】
配列番号６、７、８、９、１１及び１３で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３、４、１０及び１２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含む）を付加したものである。
【００８５】
（３−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００８６】
（３−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３−ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【００８７】
（３−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
【００８８】
上述の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
【００８９】
グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものである。当該改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。すなわち、上述した第１の実施形態に係る改変フィブロインと、第２の実施形態に係る改変フィブロインの特徴を併せ持つ改変フィブロインである。具体的な態様等は、第１及び第２の実施形態に係る改変フィブロインで説明したとおりである。
【００９０】
グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインのより具体的な例として、（４−ｉ）配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列、（４−ｉｉ）配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインの具体的な態様は上述のとおりである。
【００９１】
コラーゲン由来のタンパク質として、例えば、式２：［ＲＥＰ２］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式２中、ｐは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ２は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１９で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００９２】
レシリン由来のタンパク質として、例えば、式３：［ＲＥＰ３］ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ｑは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ−Ｊ−Ｊ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ４は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ  ６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００９３】
エラスチン由来のタンパク質として、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号２１で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００９４】
ケラチン由来のタンパク質として、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。具体的には、配列番号２２で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。
【００９５】
上述した構造タンパク質及び当該構造タンパク質に由来する改変構造タンパク質は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００９６】
＜タンパク質の製造方法＞
本実施形態に係るタンパク質は、例えば、当該タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
【００９７】
タンパク質をコードする核酸の製造方法は、特に制限されない。例えば、天然のフィブロインをコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングし、遺伝子工学的手法により改変する方法、又は、化学的に合成する方法によって、当該核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手したタンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製及び／又は確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を合成してもよい。
【００９８】
調節配列は、宿主における改変フィブロインの発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、改変フィブロインを発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
【００９９】
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、タンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
【０１００】
宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
【０１０１】
原核生物の宿主の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。
【０１０２】
原核生物を宿主とする場合、タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
【０１０３】
真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
【０１０４】
真核生物を宿主とする場合、改変フィブロインをコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
【０１０５】
発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
【０１０６】
タンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
【０１０７】
宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【０１０８】
炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
【０１０９】
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
【０１１０】
また、培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【０１１１】
発現させたタンパク質の単離、精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
【０１１２】
また、タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてタンパク質の不溶体を回収する。回収したタンパク質の不溶体はタンパク質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法によりタンパク質の精製標品を得ることができる。当該タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該タンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、その培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【０１１３】
成形体前駆体の形状は特に限定されず、例えば、フィルム、ファイバー、ゲル、フォーム（多孔質体）、板状、塊状等であってよい。フィルム状の成形体前駆体は、例えば、タンパク質及び溶媒を含有するタンパク質溶液の膜を形成し、形成された膜から溶媒を除去する方法により得られる。ファイバー状の成形体前駆体は、例えば、タンパク質及び溶媒を含有するタンパク質溶液を紡糸し、紡糸されたタンパク質溶液から溶媒を除去する方法により得られる。すなわち、本実施形態に係る成形体の製造方法は、第一の工程の前に、例えばタンパク質及び溶媒を含有するタンパク質溶液から成形体前駆体を成形する成形工程を更に備えていてもよい。
【０１１４】
成形工程において用いられる溶媒は、例えば極性溶媒であってよい。極性溶媒は、例えば、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）及びギ酸からなる群より選択される１種以上の溶媒を含んでいてよい。極性溶媒は、より高濃度の溶液を得る観点からは、ジメチルスルホキシド単独又はジメチルスルホキシドと水との混合溶媒であってよく、環境に対する悪影響を低減する観点からは水であってよい。
【０１１５】
タンパク質溶液におけるタンパク質の含有量は、タンパク質溶液の全質量を基準として、１５質量％以上、３０質量％以上、４０質量％以上又は５０質量%以上であってよい。タンパク質の含有量は、タンパク質溶液の製造効率の観点から、タンパク質溶液の全質量を基準として、７０質量％以下、６５質量％以下、又は６０質量％以下であってよい。
【０１１６】
タンパク質溶液は、タンパク質及び溶媒に加えて、１種又は２種以上の無機塩を更に含有していてもよい。無機塩は、例えば、以下に示すルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩が挙げられる。ルイス塩基は、例えば、オキソ酸イオン(硝酸イオン、過塩素酸イオン等)、金属オキソ酸イオン(過マンガン酸イオン等)、ハロゲン化物イオン、チオシアン酸イオン、シアン酸イオンなどであってよい。ルイス酸は、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン等の金属イオン、アンモニウムイオン等の多原子イオン、錯イオンなどであってよい。無機塩の具体例としては、塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、硝酸リチウム、過塩素酸リチウム、及びチオシアン酸リチウムのようなリチウム塩、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硝酸カルシウム、過塩素酸カルシウム、及びチオシアン酸カルシウムのようなカルシウム塩、塩化鉄、臭化鉄、ヨウ化鉄、硝酸鉄、過塩素酸鉄、及びチオシアン酸鉄のような鉄塩、並びに、塩化アルミニウム、臭化アルミニウム、ヨウ化アルミニウム、硝酸アルミニウム、過塩素酸アルミニウム、及びチオシアン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩、塩化カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、硝酸カリウム、過塩素酸カリウム、及びチオシアン酸カリウムのようなカリウム塩、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びチオシアン酸ナトリウムのようなナトリウム塩、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、硝酸亜鉛、過塩素酸亜鉛、及びチオシアン酸亜鉛のような亜鉛塩、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、硝酸マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、及びチオシアン酸マグネシウムのようなマグネシウム塩、塩化バリウム、臭化バリウム、ヨウ化バリウム、硝酸バリウム、過塩素酸バリウム、及びチオシアン酸バリウムのようなバリウム塩、塩化ストロンチウム、臭化ストロンチウム、ヨウ化ストロンチウム、硝酸ストロンチウム、過塩素酸ストロンチウム、及びチオシアン酸ストロンチウムのようなストロンチウム塩などが挙げられる。
【０１１７】
無機塩の含有量は、タンパク質の全量１００質量部に対して、１．０質量部以上、５．０質量部以上、９．０質量部以上、１５質量部以上又は２０．０質量部以上であってよい。無機塩の含有量は、タンパク質の全量１００質量部に対して、４０質量部以下、３５質量部以下又は３０質量部以下であってよい。
【０１１８】
タンパク質溶液は、必要に応じて、各種の添加剤を更に含有していてもよい。添加剤としては、例えば、可塑剤、レベリング剤、架橋剤、結晶核剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、着色剤、フィラー、及び合成樹脂が挙げられる。添加剤の含有量は、タンパク質の全量１００質量部に対して、５０質量部以下であってよい。
【０１１９】
ゲル状の成形前駆体は、例えば、国際公開第２０１４／１７５１７７号にフィブロイン由来タンパク質よりゲルを製造する方法が記載されており、基本的にこの方法によって得られる。また、フォーム状の成形前駆体は、フィブロイン由来タンパク質より多孔質体を製造する方法が国際公開第２０１４／１７５１７８号に記載されており、基本的にこの方法によって得られる。さらに、板状又は塊状の、例えばモールド成形体からなる成形前駆体は、例えば、国際公開第２０１７／０４７５０４号の明細書にフィブロイン由来タンパク質よりモールド成形体を製造する方法が記載されており、基本的にこの方法によって得られる。
【０１２０】
なお、フィブロイン由来タンパク質よりモールド成形体を製造する際には、例えば以下の操作が実施される。即ち、先ず、タンパク質を含む組成物（タンパク質のみ、或いは他の成分を含む）を加圧成形機の金型に導入した後、金型を加熱すると共に組成物に対して加圧する。所定の加圧下でタンパク質が所定の温度に達するまで加熱及び加圧を継続して、加熱加圧された組成物を得る。次いで、冷却器（例えばスポットクーラー）を用いて金型の温度を下降させ、組成物が所定の温度になったところで、内容物を取り出してモールド成形体を得る。加熱は、８０〜３００℃で行うことが好ましく、１００〜１８０℃がより好ましく、１００〜１３０℃が更に好ましい。加圧は、５ｋＮ以上で行うことが好ましく、１０ｋＮ以上がより好ましく、２０ｋＮ以上が更に好ましい。また、所定の加熱加圧条件に達した後、その条件での処理を続ける時間（保温条件）は、０〜１００分が好ましく、１〜５０分がより好ましく、５〜３０分が更に好ましい。
【０１２１】
第一の工程は、タンパク質を含有する成形体前駆体と第一の反応剤とを反応させる工程である。第一の反応剤は、タンパク質と反応して結合を形成可能な第一の反応性基を２つ以上有する多官能反応剤であり、第一の工程では、第一の反応剤によりタンパク質が架橋されてよい。
【０１２２】
タンパク質は、アミド基、ヒドロキシル基、フェノール性水酸基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、セレノール基、イミダゾリル基、インドリル基及びグアニジノ基からなる群より少なくとも一種の反応性官能基を有している。第一の反応剤が有する第一の反応性基は、上記反応性官能基と反応して結合を形成可能な基であってよい。
【０１２３】
第一の反応性基としては、求電子性基が好ましい。第一の反応性基が求電子性基であると、タンパク質の反応性官能基と付加反応によって容易に結合を形成できる。
【０１２４】
求電子性基である第一の反応性基としては、例えば、下記式（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ａ−３）、（Ａ−４）、（Ａ−５）又は（Ａ−６）で表される基が好ましい。なお、各式中の波線は、各基の結合手を示す。
【０１２５】
【化１】
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【０１２６】
式（Ａ−１）中、Ｘ１は酸素原子（Ｏ）又は硫黄原子（Ｓ）を示す。
【０１２７】
Ｘ１としては、酸素原子がより好ましい。
【０１２８】
式（Ａ−３）中、Ｘ２は脱離基を示す。脱離基は特に限定されず、タンパク質の反応性官能基による求核置換反応が可能な基であればよい。脱離基としては、例えば、ハロゲン原子（フッ素原子（Ｆ）、塩素原子（Ｃｌ）、臭素原子（Ｂｒ）、ヨウ素原子（Ｉ））、スルホン酸エステル基（−ＯＳＯ２Ｒ１）、カルボン酸エステル基（−ＯＣＯＲ２）、四級アンモニウム基（−ＮＲ３３）等が挙げられる。Ｒ１は、例えば、フッ素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン化アルキル基又はハロゲン化アリール基であってよい。Ｒ２は、例えば、アルキル基、アリール基、ハロゲン化アルキル基又はハロゲン化アリール基であってよい。Ｒ３は、例えば、アルキル基、アリール基、ハロゲン化アルキル基又はハロゲン化アリール基であってよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は置換基を有していてもよい。当該置換基としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アリール基、ハロゲン原子等が挙げられる。
【０１２９】
Ｘ２としては、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、エステル基及びスルホン酸エステル基がより好ましく、臭素原子、ヨウ素原子、スルホン酸エステル基が更に好ましい。Ｒ１としては、フッ素原子、アルキル基（特に、メチル基、エチル基、ベンジル基、アリル基）、パーフルオロオロアルキル基（特に、トリフルオロメチル基、ペンタフルオロエチル基）、アリール基（特に、フェニル基、トリル基、ナフチル基、フルオロフェニル基）等がより好ましい。Ｒ２としては、アルキル基（特に、メチル基、エチル基、ベンジル基、アリル基）、パーフルオロオロアルキル基（特に、トリフルオロメチル基、ペンタフルオロエチル基）、アリール基（特に、フェニル基、トリル基、ナフチル基、フルオロフェニル基）等がより好ましい。Ｒ３としては、アルキル基（特に、メチル基、エチル基、ベンジル基、アリル基）、アリール基（特に、フェニル基、トリル基、ナフチル基、フルオロフェニル基）等がより好ましい。
【０１３０】
式（Ａ−４）中、Ｘ３は酸素原子（Ｏ）、硫黄原子（Ｓ）、−ＮＲ４−で表される基、又は、−Ｃ（Ｒ５）２−で表される基を示す。Ｒ４は、例えば、水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン化アルキル基又はハロゲン化アリール基、アリールスルホニル基、アルキルスルホニル基、アシル基、カーバメート基であってよい。Ｒ５は、電子求引性基を示す。電子求引性基としては、例えば、カルボニル基、シアノ基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基等が挙げられる。２つのＲ５は互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ４及びＲ５は置換基を有していてもよい。当該置換基としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アリール基、ハロゲン原子等が挙げられる。
【０１３１】
Ｘ３としては、酸素原子がより好ましい。Ｒ４としては、アリールスルホニル基、アルキルスルホニル基、アシル基、カーバメート基等がより好ましい。
【０１３２】
式（Ａ−５）中、Ｘ４は酸素原子（Ｏ）又は硫黄原子（Ｓ）を示し、Ｙ１はハロゲン原子、ヒドロキシル基、−Ｒ６で表される基、−ＯＲ６で表される基、又は、−ＯＣＯＲ６で表される基を示す。Ｒ６は、例えば、アルキル基、アリール基、ハロゲン化アルキル基又はハロゲン化アリール基であってよい。Ｒ６は置換基を有していてもよい。当該置換基としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アリール基、ハロゲン原子等が挙げられる。
【０１３３】
Ｘ４としては、酸素原子がより好ましい。Ｙ１としては、ハロゲン原子、−ＯＲ６で表される基、又は、−ＯＣＯＲ６で表される基等がより好ましい。Ｒ６としては、アルキル基、アリール基等がより好ましい。
【０１３４】
式（Ａ−６）中、Ｘ５は酸素原子（Ｏ）又は硫黄原子（Ｓ）を示し、Ｙ２は酸素原子（Ｏ）、硫黄原子（Ｓ）又はＮＲ７で表される基を示す。Ｒ７は例えば、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アシル基、カーバメート基、アルキル基、アリール基、ハロゲン化アルキル基又はハロゲン化アリール基であってよい。Ｒ７は置換基を有していてもよい。当該置換基としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アリール基、ハロゲン原子等が挙げられる。
【０１３５】
Ｘ５としては、酸素原子がより好ましい。Ｙ２としては、酸素原子がより好ましい。Ｒ７としては、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アシル基、カーバメート基等がより好ましい。
【０１３６】
第一の反応剤は、第一の反応性基を２以上有する化合物であればよい。第一の反応剤が有する第一の反応性基の数は、特に限定されず、例えば２〜１００００であってよく、好ましくは２〜１０００である。
【０１３７】
第一の工程は、例えば、第一の反応剤を含有する第一の反応液と、成形体前駆体とを接触させて加熱することで実施してよい。
【０１３８】
第一の反応液は、無溶媒であってよく、溶媒を更に含有していてもよい。第一の反応液の溶媒は特に限定されず、例えば、第一の反応剤を溶解可能であり、且つ、タンパク質の反応性官能基と第一の反応性基との反応を阻害しないものであればよい。第一の反応性基が求電子性基である場合、第一の反応液の溶媒としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート等を好適に用いることができる。
【０１３９】
第一の工程における反応条件は特に限定されず、タンパク質の反応性官能基と第一の反応性基とが反応する条件であればよい。
【０１４０】
第一の工程では、第一の反応剤の少なくとも一部がタンパク質を架橋し、且つ、第一の反応性基の少なくとも一部が中間体中に残存することが好ましい。すなわち、第一の工程では、第一の反応剤により架橋されたタンパク質を含み、且つ、第一の反応性基を有する中間体が得られることが好ましい。
【０１４１】
例えば、第一の反応剤が第一の反応性基を２つ有する化合物であるとき、第一の反応剤の一部は、タンパク質を架橋（すなわち、第一の反応性基の両方がタンパク質と反応）していてよい。また、第一の反応性基の他の一部は、第一の反応性基の一方のみでタンパク質と反応していてよく、このとき、もう一方の第一の反応性基は未反応で、中間体中に残存していてよい。
【０１４２】
また、例えば、第一の反応剤が第一の反応性基を３つ以上有する化合物であるとき、第一の反応剤の一部は、全ての第一の反応性基でタンパク質を架橋（すなわち、第一の反応性基の全てがタンパク質と反応）していてよく、第一の反応剤の他の一部は、一部の第一の反応性基がタンパク質と反応し、他の一部の第一の反応性基が未反応で中間体中に残存していてもよい。
【０１４３】
第一の工程の反応は、第一の反応剤により、タンパク質の反応性官能基を起点として、架橋構造、又は、第一の反応性基を有する側鎖を形成する反応ということもできる。架橋構造及び側鎖の量は、反応に用いる第一の反応剤の量によって調節することができる。第一の反応剤の使用量を少なくすることで、側鎖が少なく、架橋構造が多く形成される傾向があり、第一の反応剤の使用路由を多くすることで、架橋構造が少なく、側鎖が多く形成される傾向がある。
【０１４４】
なお、架橋構造及び側鎖の量の調節は、例えば、第一の工程の実施に先立って、第一の反応剤が有する第一の反応性基の一部に、第二の反応剤が有する第二の反応性基を反応させる前工程を行うことによっても実現できる。このような前工程で用いる第二の反応剤の第一の反応剤に対する量等を適宜に調整することで、前工程で第二の反応性基と反応せずに残存する第一の反応性基の数をコントロールすることができる。それによって、第一の工程で、第一の反応性基のタンパク質との結合量を容易に調節することが可能となり、その結果として、タンパク質の架橋構造及び側鎖の量を容易にコントロールすることができるようになる。
【０１４５】
すなわち、本実施形態に係る製造方法は、第一の工程の前に、第一の反応剤の一部と第二の反応剤の一部とを反応させて、第一の反応剤が有する第一の反応性基の一部と、第二の反応剤が有する第二の反応性基の一部とを反応させる前工程を更に備えていてよい。
【０１４６】
架橋構造を多く形成することで、成形体の耐水性、機械的強度、耐熱性等が向上する傾向があり、側鎖を多く形成することで、成形体に付与される機能性（例えば、後述の質感）が向上する傾向がある。本実施形態では、所望の特性に応じて、架橋構造及び側鎖の割合を適宜調節してよい。なお、本明細書中、耐水性とは、例えば、水分との接触による収縮量を抑制可能な特性や、水分との接触後の乾燥時における収縮量を抑制可能な特性等を示す。
【０１４７】
第一の工程では、タンパク質と第一の反応剤との反応物を含む中間体が得られる。当該反応物中、タンパク質は第一の反応剤により架橋されており、未反応の第一の反応性基が残存していてよい。すなわち、上記反応物は、タンパク質に由来するポリペプチド骨格と、ポリペプチド骨格を架橋する架橋部と、ポリペプチド骨格に結合し、末端に第一の反応性基を有する側鎖部と、を含有していてよい。
【０１４８】
第二の工程は、第一の工程で得られた中間体と、第二の反応剤とを反応させる工程である。第二の反応剤は、第一の反応性基と反応して結合を形成可能な第二の反応性基を１つ有している。第二の工程は、中間体中に残存する第一の反応性基を、第二の反応剤と反応させる工程ということもできる。
【０１４９】
第二の反応剤が有する第二の反応性基は特に限定されず、第一の反応性基の種類に応じて適宜変更してよい。例えば、第一の反応性基が求電子性基である場合、第二の反応性基は求核性基であることが好ましい。
【０１５０】
求核性基である第二の反応性基としては、例えば、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、下記式（Ｂ−１）で表される基等が挙げられる。
【０１５１】
【化２】
2019183300.tif 000003
【０１５２】
式（Ｂ−１）中、Ｘ６は酸素原子（Ｏ）又は硫黄原子（Ｓ）を示す。
【０１５３】
式（Ｂ−１）で表される基としては、例えば、下記式（Ｂ−１−１）で表される基が挙げられる。
【０１５４】
【化３】
2019183300.tif 000004
【０１５５】
式（Ｂ−１−１）中、Ｙ３は一価の基を示す。Ｙ３は、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アルコキシ基、アルキルスルフィド基、アリールスルフィド基、１置換アミノ基、２置換アミノ基等であってよく、好ましくはアルキル基、アリール基、アルコキシ基、１置換アミノ基である。Ｙ３は置換基を有していてもよい。当該置換基としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アリール基、ハロゲン原子等が挙げられる。
【０１５６】
第二の反応剤は、第二の反応性基を１つ有する化合物であればよく、第二の工程の反応（第一の反応性基と第二の反応性基との反応）に不活性な機能性基を更に有していてよい。このような第二の反応剤によれば、中間体中の未反応の第一の反応性基を起点として、容易に成形体に機能性基を導入することができる。
【０１５７】
機能性基は特に限定されず、成形体に直接的に機能性を付与する基であってよく、成形体に更なる反応剤との反応性を付与する基であってもよい。
【０１５８】
機能性基としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等の炭化水素基；アリール基、複素環基等の環構造を有する基；保護基で保護された反応性基（ヒドロキシ基、アミノ基、チオール基等）；カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、エーテル結合（−Ｏ−）、アミド結合（＞ＮＣ（＝Ｏ）−）、ウレタン結合（＞ＮＣ（＝Ｏ）Ｏ−）、ウレア結合（＞Ｎ（Ｃ＝Ｏ）Ｎ＜）カーボネート結合（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−）等の構造を有する基；アルコキシシリル基、スルホニル基（−Ｓ（＝Ｏ）−）、カルボキシル基（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸基（−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＨ）、及び、第四級アンモニウム基等が挙げられる。
【０１５９】
例えば、機能性基がアルキル基であると、成形体の質感が向上する。このため、例えば、成形体が繊維状又は布状である場合、機能性基としてアルキル基を有する第二の反応剤を用いることで、質感に優れ、風合いの良い素材を得ることができる。
【０１６０】
従来のタンパク質素材は、架橋によって耐水性や強度の向上を図ると、素材の手触りが悪化して、人肌に触れる用途に使用しにくくなる場合があった。しかし、本実施形態によれば、架橋による耐水性及び機械的強度を維持しつつ、機能性基によって優れた質感及び風合いが得られ、人肌に触れる用途に好適に使用可能な素材を得ることができる。
機能性基の導入による。
【０１６１】
第二の工程は、例えば、第二の反応剤を含有する第二の反応液と、中間体とを接触させて加熱することで実施してよい。
【０１６２】
第二の反応液は、無溶媒であってよく、溶媒を更に含有していてもよい。第二の反応液の溶媒は特に限定されず、例えば、第二の反応剤を溶解可能であり、且つ、第一の反応性基と第二の反応性基との反応を阻害しないものであればよい。第一の反応性基が求電子性基、第二の反応性基が求核性基である場合、第二の反応液の溶媒としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート等を好適に用いることができる。
【０１６３】
第二の工程において、第二の反応剤の使用量は特に限定されない。第二の反応剤の使用量は、例えば、中間体中の第一の反応性基の量を超える量であってよい。
【０１６４】
第二の工程では、中間体中の第一の反応性基の一部又は全部が第二の反応性基と反応して消費される。成形体中には、可能な限り、第一の反応性基が残存しないことが望ましい。このため、本実施形態では、第一の反応性基の全部が第二の反応性基との反応又は他の副反応により消費されることが好ましい。
【０１６５】
第二の工程により、タンパク質架橋体を含有する成形体が得られる。ここで、本実施形態において、タンパク質架橋体は、タンパク質由来のポリペプチド骨格と、第一の反応剤の残基である第一の残基と、第二の反応剤の残基である第二の残基と、をそれぞれ複数有している。また、第一の残基の少なくとも一つは、ポリペプチド骨格を架橋している。また、第一の残基の少なくとも一つ（ポリペプチド骨格を架橋する第一の残基と同じでも異なっていてもよい。）は、一端でポリペプチド骨格と結合し、他端で第二の残基と結合している。
【０１６６】
本明細書中、第一の残基は、第一の反応剤から、第一の反応性基を除いた残りの構造を示す。また、第二の残基は、第二の反応剤から、第二の反応性基を除いた残りの構造を示す。
【０１６７】
ポリペプチド骨格と第一の残基とは、タンパク質の反応性官能基及び第一の反応性基の反応により形成される結合（例えば、反応性官能基がアミノ基、第一の反応性基がイソシアネート基の場合は、ウレア結合）によって結合している。また、第一の残基と第二の残基とは、第一の反応性基及び第二の反応性基の反応により形成される結合（例えば、第一の反応性基がイソシアネート基、第二の反応性基がヒドロキシル基の場合は、ウレタン結合）によって結合している。
【０１６８】
本実施形態に係る製造方法では、第一の反応剤によってタンパク質が架橋され、耐水性、機械的強度、耐熱性等に優れた成形体が得られる。また、本実施形態に係る製造方法では、中間体中に残存する第一の反応性基を起点として第二の反応剤により機能性基を付与できるため、様々な機能性を有する成形体を容易に得ることができる。
【０１６９】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
【実施例】
【０１７０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【０１７１】
（製造例１：成形体前駆体の製造）
〔（１）改変クモ糸フィブロイン（タンパク質）の製造〕
（改変クモ糸フィブロインをコードする核酸の合成、及び発現ベクターの構築）
配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する改変クモ糸フィブロイン（ＰＲＴ７９９）を設計した。
【０１７２】
配列番号１３で示されるアミノ酸配列は、配列番号９で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端にＨｉｓタグが付加されたアミノ酸配列に対し、Ｎ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含む）を付加したものである。
【０１７３】
設計した改変クモ糸フィブロインをコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト、終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。この核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
【０１７４】
（改変クモ糸フィブロインの発現）
得られたｐＥＴ−２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表１）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。
【０１７５】
【表１】
2019183300.tif 000005
【０１７６】
当該シード培養液を５００ｍｌの生産培地（下記表２）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。
【０１７７】
【表２】
2019183300.tif 000006
【０１７８】
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持しながら、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的とする改変フィブロインを発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とする改変フィブロインに相当するサイズのバンドの出現により、目的とする改変クモ糸フィブロインの発現を確認した。
【０１７９】
（改変クモ糸フィブロインの精製）
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ  グアニジン緩衝液（８Ｍ  グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ  リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収した。回収した凝集タンパク質から凍結乾燥機で水分を除き、目的とする改変フィブロインの凍結乾燥粉末を得た。
【０１８０】
得られた凍結乾燥粉末における目的とする改変クモ糸フィブロインの精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、いずれの改変クモ糸フィブロインも精製度は約８５％であった。
【０１８１】
〔（２）改変クモ糸フィブロイン繊維（改変タンパク質繊維）の製造〕
（ドープ液の調製）
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、上述のクモ糸フィブロイン（ＰＲＴ７９９）を濃度２４質量％となるよう添加した後、溶解促進剤としてＬｉＣｌを濃度４．０質量％となるように添加した。その後、シェーカーを使用して、クモ糸フィブロインを３時間かけて溶解させ、ＤＭＳＯ溶液を得た。得られたＤＭＳＯ溶液中のゴミと泡を取り除き、ドープ液とした。ドープ液の溶液粘度は９０℃において５０００ｃＰ（センチポアズ）であった。
【０１８２】
（紡糸）
上記のようにして得られたドープ液と公知の乾湿式紡糸装置とを用いて乾湿式紡糸を行って、クモ糸フィブロインからなるモノフィラメントを得た。なお、ここでは、乾湿式紡糸を下記の条件で行った。
凝固液（メタノール）の温度：５〜１０℃
延伸倍率：６倍
乾燥温度：８０℃
【０１８３】
上記のようにして得た改変クモ糸フィブロイン繊維を用いて公知の方法により紡績糸を製造し、この改変クモ糸フィブロイン繊維からなる紡績糸と公知の編機とを用いて、横編みにより５ｃｍ角の編地を編成した。なお、改変クモ糸フィブロイン繊維からなる紡績糸の番手は５８．１Ｎｍであり、編機のゲージ数は１８であった。
【０１８４】
（実施例１）
製造例１で得た試験サンプル（５ｃｍ角の編地）を、ヘキサンジイソアネート（ＨＤＩ）２０ｍＬ中に浸漬した。次いで、ＨＤＩが含浸した試験サンプルをアルミホイルに挟み、１３０℃で３０分加熱した。加熱後、試験サンプルを取り出し、ブタノール（ＢｕＯＨ）２０ｍｌ中に浸漬し、１００℃で２４０分反応させた。反応後の試験サンプルをＴＨＦで洗浄し、成形体を得た。
【０１８５】
（比較例１）
製造例１で得た試験サンプルを、比較例１の成形体として評価した。
【０１８６】
（比較例２）
製造例１で得た試験サンプルを、ヘキサンジイソアネート（ＨＤＩ）２０ｍＬ中に浸漬した。次いで、ＨＤＩが含浸した試験サンプルをアルミホイルに挟み、１３０℃で３０分加熱した。その後、試験サンプルをＴＨＦで洗浄して、比較例２の成形体を得た。
【０１８７】
実施例及び比較例の成形体について、以下の試験方法で耐水性及び質感を評価した。
【０１８８】
＜耐水性評価＞
成形体に鉛筆で３ｃｍ角の正方形を描き、評価サンプルとした。評価サンプルをＰａｎａｓｏｎｉｃ製洗濯機（Ｎａ−ＶＧ１１００Ｌ）の洗濯モード「お家クリーニング」で洗濯した。次いで、同じ洗濯機で１５分脱水し、１２０分自然乾燥させた。洗濯前後の正方形の縦横の長さをそれぞれ測定し、縦向及び横方向の収縮率を求めた。同じ試験を３回行い、３回の平均値を評価結果とした。結果を表３に示す。
【０１８９】
＜質感評価＞
成形体の肌触りを三段階で評価した。比較例１の成形体（処理前の成形体前駆体）の肌触りを基準（Ｂ）とし、それより風合いに優れる成形体をＡ、肌触りが荒く風合いに劣る成形体をＣとして評価した。結果を表３に示す。
【０１９０】
【表３】
2019183300.tif 000007
【図１】
2019183300.tif 000008
【図２】
2019183300.tif 000009
【図３】
2019183300.tif 000010
【配列表】
2019183300000001.app