(57)【要約】【課題】生物学的ペースメーカーの生成のための方法および組成物を提供すること。【解決手段】一部の実施形態において、方法は、非ペースメーカー細胞を１つ以上の転写因子と接触させることと（インビボまたはインビトロで）、その細胞においてペースメーカーの機能性を誘導することと、を含む。本出願のいくつかの実施形態は、概して、ペースメーカー細胞（例えば、規則的、律動的な電気活動を有する心臓細胞）の生成のための方法および組成物に関する。具体的には、本発明の一部の実施形態は、転写因子を使用してペースメーカー細胞を生成するための遺伝子および細胞治療方法（および付随する組成物）に関する。【選択図】図２Ｃ
2019218394.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年１１月９日出願の米国仮特許出願第６１／５５７，８１２号の利益を主張するものであり、その開示は参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本出願のいくつかの実施形態は、概して、ペースメーカー細胞（例えば、規則的、律動的な電気活動を有する心臓細胞）の生成のための方法および組成物に関する。具体的には、本発明の一部の実施形態は、転写因子を使用してペースメーカー細胞を生成するための遺伝子および細胞治療方法（および付随する組成物）に関する。
関連技術の説明
【０００３】
心発生の間、心筋細胞は、心室、心房、またはペースメーカー特性のいずれかを示すように特殊化される。心臓の主要なペースメーカー領域である洞房結節（ＳＡＮ）は、ＳＡＮにおいて収縮を開始するように機能する１０，０００個未満のペースメーカー細胞を含む高度に特殊化した構造である。これらのＳＡＮ収縮は、次いで、残りの興奮性心臓組織に伝播し、心拍をもたらす。興奮性心臓組織の不規則性および／またはペースメーカー細胞の不規則性は、心臓調律の異常を引き起こし得る。多くの心臓の異常は、典型的に、心拍不整、頻脈（心拍数が高すぎる場合）、または徐脈（心拍数が遅すぎる場合）に関与する。これらの異常は、まとめて不整脈として知られている。
【０００４】
心不整脈の現在の治療法は、典型的に、薬物療法、アブレーション、電子ペースメーカー装置、またはそれらの組み合わせを利用する。しかしながら、これらの治療法のそれぞれの実用性は、限定的であり、ばらつきのある成功を有した。抗不整脈薬剤が広く処方され、使用されているが、これらはある特定の患者集団に有害な全身性副作用をもたらし得る。さらに、多くの薬物は、新たな不整脈性現象を誘発する傾向があり、これは病的状態の増加を引き起こし得る。不整脈の一部の治療において、高周波アブレーションが使用される。アブレーションは、不整脈の維持の原因として識別されるか、または不整脈の維持に対して極めて重要である、組織の永続的な除去に関与する。この方法は、房室結節リエントリー性頻拍、副伝導路の頻脈、および心房粗動の治療において、いくつかの成功が見られたが、他の不整脈においては、限定的な成功しか見られなかった。例えば、カテーテルアブレーションは、心房細動（ＡＦ）または心室頻脈（ＶＴ）等のより複雑なケースの治療において、あまり成功しない。その上、カテーテルアブレーションは、徐脈の治療において有用ではない。電子ペースメーカー装置は、心拍数を維持するか、または頻脈を終えるためのショックを送達することができる。しかしながら、高価な装置、ならびに肺虚脱、出血、細菌感染症、およびリード／ジェネレーター障害、または他の種類の機能不全等の合併症が、技術の限界を示す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
心臓ペーシングの機能障害および不整脈の従来の治療法に関連する限界を踏まえて、心不整脈（単純および複雑な両方の種類）を治療する、心不全（電子ペースメーカーの心臓再同期用途などにおいて）を治療する、および／または電動ペースメーカーの必要性を補う、もしくは除去するように心臓ペーシングおよび調律を調節するために使用され得る代替的方法および組成物の必要性が存在する。
【０００６】
現在、生物学的ペースメーカーは、典型的に、変異イオンチャネルタンパク質を転写するヌクレオチドの遺伝子送達を通して、その効果を誘発する。対照的に、本発明のいくつかの実施形態は、直接的な体細胞から体細胞へのリプログラミング（例えば、非ペースメーカー細胞がペースメーカー細胞にリプログラムされるか、または機能不全のペースメーカー細胞が機能的ペースメーカー細胞にリプログラムされる）を可能にする１つ以上の転写因子をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達を通して操作される。このため、いくつかの実施形態において、ペースメーカー細胞は、イオンチャネルタンパク質の誘導される変質発現を伴わずに生成される。さらなる実施形態は、幹細胞、または一部の実施形態においては、心筋細胞もしくは幹細胞および心筋細胞の組み合わせを、インビトロの生物学的ペースメーカー細胞に変換させ（例えば、本明細書に開示される１つ以上の転写因子の投与によって）、その後の変換された細胞の植え込みが続くことに関与する。このため、転写因子またはそれらの転写因子によって変換される細胞の送達は、様々な心臓調律の異常を治療する、および／または従来の治療法の必要性を減らすもしくは除去する。
【０００７】
このため、いくつかの実施形態において、対象の心臓組織の電気活動を修正するために、転写因子を使用して生物学的ペースメーカーを生成するための方法が提供され、方法は、異常な電気活動を示す心臓組織を有する対象を識別することであって、対象が静止細胞を含む心臓組織を有し、静止細胞が心筋細胞および幹細胞のうちの１つ以上を含み、静止細胞が自発的で反復的な電気活動を示さない、識別することと、処置細胞を生成するために１つ以上の転写因子を静止細胞に投与することであって、処置細胞が自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって、対象の心臓組織の電気活動を修正する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、異常な心臓の電気活動は、心不整脈によるものである。しかしながら、心臓の電気活動、シグナル伝達、または機能における他の異常は、本明細書に開示される方法を用いて対処され得る。例えば、いくつかの実施形態において、対象は、洞不全症候群、洞性徐脈、頻脈徐脈症候群、心房細動、房室ブロック、変時不全、ＱＴ延長症候群、および心不全からなる群から選択される状態に苦しむ。
【０００９】
いくつかの実施形態において、投与は、インビトロで生じ、方法は、処置細胞を対象に投与することをさらに含む。しかしながら、有利に、本明細書に開示される方法は、投与をインビボで生じさせる。
【００１０】
幹細胞の集団を得ることと、インビトロで幹細胞を培養することであって、培養された幹細胞が自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を含む、培養することと、変換された細胞を生成するために、１つ以上の転写因子を前記静止細胞に送達することであって、変換された細胞が自発的で反復的な電気活動を示す、送達することと、を含み、それによって、幹細胞を、生物学的ペースメーカーを生成することができる細胞に変換する、幹細胞の集団を転写因子の使用を通して生物学的ペースメーカーの生成に適した細胞に変換する方法もまた提供される。
【００１１】
心不整脈を患っている対象を識別することであって、対象が静止細胞を含む心臓組織を有し、静止細胞が心筋細胞および幹細胞のうちの１つ以上を含み、静止細胞が自発的で反復的な電気活動を示さない、識別することと、処置細胞を生成するためにＴｂｘ１８、Ｓｈｏｘ−２、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、それらの機能的断片、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を静止細胞に投与することであって、処置細胞が自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって、心不整脈を治療する、転写因子を使用して心不整脈を治療する方法がさらに提供される。
【００１２】
心不整脈を患っている対象を識別することと、変換された幹細胞の集団を得ることであって、変換の前に、幹細胞が自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を含み、自発的で反復的な電気活動を示す変換された細胞を生成するために、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ−２、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、それらの機能的断片、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上が、静止細胞に投与された、得ることと、変換された細胞を対象に投与することであって、投与される変換された細胞を対象の心臓組織に移植し、自発的で反復的な電気活動を示し続ける、投与することと、を含み、それによって生物学的ペースメーカーを生成し、心不整脈を治療する、転写因子を使用して生物学的ペースメーカーを生成することによって心不整脈を治療する方法がまた提供される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、１つ以上の転写因子は、胚の洞房結節発生の制御因子であり、および／または洞房結節細胞への新規細胞分化を促進する。いくつかの実施形態において、１つ以上の転写因子は、発生の間に静脈洞を定義する。いくつかの実施形態において、１つ以上の転写因子は、静脈洞におけるＮｋｘ２．５の負の制御因子である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、１つ以上の転写因子は、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ−２、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、それらの機能的断片、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、１つ以上の転写因子は、Ｔｂｘ−１８を含む。いくつかの実施形態において、Ｔｂｘ１８（または、他のＴｂｏｘ因子）を使用して、自発的な電気活動を生成するための筋細胞をもたらす。いくつかの実施形態において、１つ以上の転写因子は、Ｓｈｏｘ−２を含む。一部の実施形態において、Ｓｈｏｘ−２を使用して、幹細胞を自発的な電気活動を生成する細胞に変換する。しかしながら、さらなる実施形態において、任意に、Ｓｈｏｘ−２を使用して、筋細胞をペースメーカー細胞に変換してもよく、および／またはＴｂｘ１８を使用して、幹細胞をペースメーカー細胞に変換してもよい。
【００１５】
いくつかの実施形態において、転写因子の投与は、インビボであり、心尖部、ヒス束の右脚、ヒス束の左脚、プルキンエ線維、心室間中隔、右心室自由壁、左心室自由壁、ＳＡ結節、ＡＶ結節からなる群から選択される部位に対してである。いくつかの実施形態において、投与部位は、右心室を介して、右心房を介して、または心臓に直接アクセスすることによって、アクセスされる。いくつかの実施形態において、直接的なアクセスは、マップ誘導カテーテル注入システムによって、蛍光透視誘導によって、Ｘ線誘導によって、心エコー誘導によって、磁気共鳴映像法を介する誘導によって、またはそれらの組み合わせによって達成される。各特定の対象は、症状または他の関連する医療課題を示してもよく、それは、最適な投与経路を決定する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、転写因子の投与は、標的組織に１つ以上の転写因子をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ送達系を送達することによって、達成される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ送達系は、ウイルスベクターを含む。実施形態によって、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ＨＪＶ、ＨＩＶ、および／またはＨＳＶ等の種々のウイルスベクターが使用される。１つを超える転写因子が投与される実施形態において、転写因子は、任意に異なるウイルスベクターにパックされてもよい。あるいは、一部の実施形態において、複数の転写因子が、単一のウイルスベクターにパッケージ化されてもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態において、しかしながら、ＤＮＡ送達系は、非ウイルスベクターを含む。実施形態によって、例えば、リポソームベクター、カチオンポリマー、および／またはＤＮＡ結合ポリマー等の種々の非ウイルスベクターが使用され得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ送達系は、裸のＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、免疫抑制であるか、またはさもなければ不十分な免疫機能を有する患者が、非ウイルス送達系から利益を得てもよい。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ペースメーカー細胞のように機能することに加え、処置細胞は、自然のペースメーカー細胞と類似のものである特徴を示す。しかしながら、ある一部のこれらの特徴は、ペースメーカー細胞としての処置細胞機能を有するために存在する必要がない。いくつかの実施形態において、処置細胞は、天然のＳＡＮ細胞の長さ／幅形態に実質的に類似する長さ／幅形態を示す。いくつかの実施形態において、この長さ／幅比は、少なくとも約１０である。いくつかの実施形態において、処置細胞は、自発的な細胞内Ｃａ＋＋変動の増加を示す。いくつかの実施形態において、自発的で反復的な電気活動は、β−アドレナリン刺激に応答して増加する。いくつかの実施形態において、変換された細胞は、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）または骨格αアクチン（αＳｋＡ）を発現しない。
【００１９】
いくつかの実施形態において、対象は、心臓組織の電気活動を修正する電子ペースメーカーを有し、それは、一部の患者において対象内に植え込まれ得る。いくつかの実施形態において、生物学的ペースメーカーの生成は、電子ペースメーカーの機能を補う（例えば、電子ペースメーカーの作業負荷を、生物学的ペースメーカーの生成によって減少する）。いくつかの実施形態において、ペースメーカー細胞の生成は、置換、または代替の電子ペースメーカーが対象内に植え込まれ得るまでの一時的なブリッジとして役立つ。いくつかの実施形態において、しかしながら、生物学的ペースメーカーの生成は、電子ペースメーカーを機能的に置き換える。いくつかの実施形態において、この機能的置換は、電子ペースメーカーの短期、中期、長期、およびさらには永続的な停止（または、外植）を可能にする。
【００２０】
いくつかの実施形態において、心不整脈を患っている対象を識別することであって、対象が静止細胞を含む心臓組織を有し、静止細胞が心筋細胞および幹細胞のうちの１つ以上を含み、静止細胞が自発的で反復的な電気活動を示さない、識別することと、処置細胞を生成するために１つ以上の転写因子を静止細胞に投与することであって、処置細胞が自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって心不整脈を治療する、心不整脈を治療するために転写因子を使用して生物学的ペースメーカーを生成する方法がまた提供される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、対象は哺乳類であり、いくつかの実施形態においては、ヒトである。いくつかの実施形態において、ペースメーカー細胞に変換される幹細胞は、胚性幹細胞であるが、さらなる実施形態において、それらは、成体幹細胞、誘導幹細胞、または常在幹細胞である。
【００２２】
本明細書に開示される方法に従って、ペースメーカー細胞に変換される細胞を得ることと、変換された細胞を心臓の電気活動の機能障害を患っている対象に投与することであって、変換された細胞が自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって心臓の電気活動の機能障害を治療する、心臓の電気活動の機能障害を治療する方法がまた本明細書に提供される。
【００２３】
いくつかの実施形態において、心臓の電気活動の機能障害は、心不整脈を含む。いくつかの実施形態において、方法は、投与の前に変換された細胞を単離することをさらに含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、自発的で反復的な電気活動は、ペースメーカー細胞の正常活動の約６５％〜約１００％の範囲である。いくつかの実施形態において、転写因子の投与は、対象の心臓の調律に変化をもたらす。いくつかの実施形態において、心臓の変化した調律は、正常な心拍数の約２５％〜約３５％の範囲内の新たな心拍数に対応する。
【００２５】
Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ−２、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、それらの機能的断片、またはそれらの組み合わせをコードするウイルスベクター、および真核生物プロモーターを含む、ＤＮＡ送達系を含む、生物学的ペースメーカーの生成のための組成物がさらに提供される。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、配列中に以下の操作可能に連結される成分、第１の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、第１のｌｏｘＰ部位、パッケージング部位（ψ、ｐｓｉ）、サイトメガロウイルスプロモーター、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、またはそれらの組み合わせをコードする配列、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ポリアデニル化シグナル（Ａｎ）、第２のｌｏｘＰ部位、アデノウイルス初期領域２および初期領域４遺伝子をコードする配列、および第２の逆方向反復配列（ＩＴＲ）をさらに含む。
【００２７】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、幹細胞が、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ−２、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、それらの機能的断片、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される１つ以上の転写因子と接触しており、１つ以上の転写因子が、細胞の前記自発的で反復的な電気活動の増加を誘導し、細胞の自発的で反復的な電気活動の増加が、細胞の異所性収縮を生成することができ、幹細胞が、生物学的ペースメーカー機能を必要とする対象への投与に適している、複数の幹細胞を含む、生物学的ペースメーカーの生成のための細胞集団に関する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、幹細胞は、胚性幹細胞、非胚性幹細胞、骨髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、誘導多能性幹細胞、および心臓幹細胞からなる群から選択される。
【００２９】
自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を自発的で反復的な電気活動を示すペースメーカー細胞に変換するための、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ−２、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、それらの機能的断片、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の転写因子の使用がまた本明細書に提供される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を含む心臓組織を有する対象を識別することと、処置細胞を生成するために１つ以上の転写因子を静止細胞に投与することであって、処置細胞が自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって心不整脈を治療する、転写因子を使用して生物学的ペースメーカーを生成するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、対象は、以前に心不整脈を患っていた。
【００３１】
いくつかの実施形態において、静止細胞を含む心臓組織を有する対象を識別することであって、その対象が心不整脈を患っており、静止細胞が自発的で反復的な電気活動を示さない、識別することと、処置細胞を生成するために、静止細胞にＴｂｘ１８および／またはＳｈｏｘ２（またはそれらの断片）のうちの１つ以上を投与することであって、処置細胞が自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって心不整脈を治療する、心不整脈を治療するための方法がまた提供される。
【００３２】
いくつかの実施形態において、静止細胞は、心筋細胞を含む。他の実施形態において、静止細胞は、幹細胞を含む。なおさらなる実施形態において、静止細胞は、機能不全洞房結節細胞（例えば、正常に機能するペースメーカー細胞に対して速すぎるまたは遅すぎる水準でシグナルする洞房結節細胞）を含む。他の実施形態において、静止細胞は、心臓で発見される他の細胞および／または心臓では発見されない他の体細胞を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、幹細胞の集団を生物学的ペースメーカーの生成に適した細胞に変換する方法がまた提供され、方法は、幹細胞の集団を得ることと、インビトロで幹細胞を培養することであって、培養された幹細胞が自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を含む、培養することと、変換された細胞を生成するために１つ以上の転写因子を静止細胞に投与することと、を含む。いくつかの実施形態において、変換された細胞は、自発的で反復的な電気活動を示し、このため、インビボで生物学的ペースメーカーを生成することができる。いくつかの実施形態において、幹細胞は、心臓幹細胞を含む。いくつかの実施形態において、インビトロ変換は、心筋細胞、心臓で発見される他の細胞、および／または心臓では発見されない他の体細胞上で実施され得る。
【００３４】
いくつかの実施形態において、転写因子を使用して生物学的ペースメーカーを生成することによって心不整脈を治療する方法がまた提供され、方法は、心不整脈を患っている対象を識別することと、変換された幹細胞の集団を得ることであって、変換の前に、幹細胞が自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を含み、変換された細胞を生成するために、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ−２（またはそれらの断片）のうちの１つ以上が静止細胞に投与され、変換された細胞が自発的で反復的な電気活動を示す、得ることと、変換された細胞を対象に投与することであって、変換された細胞を対象の心臓組織に移植し、自発的で反復的な電気活動を示し続ける、投与することと、を含み、それによって、生物学的ペースメーカーを生成し、心不整脈を治療する。いくつかの実施形態において、変換された細胞は、対象への投与の前に、単離される、精製される、選択される、またはさもなければ、濃縮される。上記で考察されるように、いくつかの実施形態において、幹細胞の代わりに、または幹細胞と併せて、他の静止細胞の種類が、ペースメーカー細胞に変換される。いくつかの実施形態において、インビトロで自発的で反復的な電気活動を示す細胞に変換される細胞には、心筋細胞が挙げられる。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、哺乳類対象を治療するために哺乳類幹細胞を利用する。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。
【００３６】
いくつかの実施形態において、１つ以上の転写因子は、胚の洞房結節発生の制御因子である。いくつかの実施形態において、１つ以上の転写因子は、洞房結節細胞への新規細胞分化を促進する。なおさらなる実施形態において、１つ以上の転写因子は、胚の洞房結節発生を制御するだけではなく、洞房結節細胞への前駆細胞の新規細胞分化を促進する。さらなる実施形態において、１つ以上の転写因子は、そのような発生または分化経路上に、正または負の制御入力を提供する。いくつかの実施形態において、１つ以上の転写因子は、心臓の発生の間に、静脈洞を定義する。一部の実施形態において、１つ以上の転写因子は、静脈洞（または発生する心臓の他の領域）におけるＮｋｘ２．５の負の制御因子である。例えば、１つ以上の転写因子は、Ｎｋｘ２．５シグナル伝達が含まれる経路を負に制御し得る。さらに、もう１つの転写因子は、（ＲＮＡまたはタンパク質レベルのいずれかで）Ｎｋｘ２．５の発現を負に制御し得る。その上、１つ以上の転写因子は、Ｎｋｘ２．５、またはそこに関連するシグナル伝達経路を間接的に制御し得る（例えば、１つ以上の転写因子は、その後、Ｎｋｘ２．５を負に制御し得る経路を制御する）。
【００３７】
いくつかの実施形態において、１つ以上の転写因子は、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５の変異体は、単独で、または組み合わせて使用される。一部の実施形態において、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５の機能的断片は、単独で、または組み合わせのいずれかで使用される。さらなる実施形態において、これらの転写因子の関連するファミリーメンバーがまた、使用される。一部の実施形態において、ヒト転写因子が使用され、一方他の実施形態においては、異なる種からの相同体が使用される（ヒト転写因子（複数可）の代わりに、またはそれと併せてのいずれかで）。さらなる実施形態において、生物学的ペースメーカーの生成または幹細胞の変換において１つ以上の転写因子の効果を強化するために、１つ以上の転写因子の前に、それと同時に、またはその後に、さらなる転写因子、タンパク質、生物学的分子、または薬理剤が投与される。一部の実施形態において、生成される生物学的ペースメーカーが、対象中で完全な機能効果を可能にする短期のブリッジを提供するために、例えば、心不整脈を治療するために使用される従来の薬理剤が、１つ以上の転写因子と同時に投与される。いくつかの実施形態において、１つ以上の転写因子は、Ｔｂｘ１８を含み、一方一部の実施形態において、１つ以上の転写因子は、Ｓｈｏｘ−２を含む。なおさらなる実施形態において、Ｔｂｘ１８およびＳｈｏｘ２は、両方使用される。しかしながら、一部の実施形態において、これら２つの転写因子は、（一部の実施形態において、任意に重複する）別々の時間枠で投与される。加えて、Ｔｂｘ１８およびＳｈｏｘ２は、一部の実施形態において別々に投与される（例えば、異なる送達系が使用される）。いくつかの実施形態において、１つの転写因子の機能的断片は、１つ（またはそれ以上）の完全長の転写因子と併せて使用される。なおさらなる実施形態において、転写因子の機能的断片の組み合わせが使用される。
【００３８】
一部の実施形態において、１つ以上の転写因子の投与は、１つ以上の転写因子をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ送達系の投与を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ送達系は、ウイルスベクターを含む。実施形態によって、変数の中でもとりわけ、送達される転写因子（複数可）、ポリヌクレオチド（複数可）の大きさ、投与経路、および患者の一般的な健康状態に基づいて、様々な異なるウイルスベクターが使用される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ＨＪＶ、ＨＩＶ、およびＨＳＶからなる群から選択される。上記で考察されるように、ある特定の実施形態において、単一を超える転写因子が、投与される。一部の実施形態において、送達される転写因子のそれぞれは、同じ種類のウイルスに送達される。一部の実施形態において、しかしながら、第１の転写因子は、第１の種類のウイルスに送達され、一方第２の転写因子は、第２の種類のウイルスにおいて送達される。このように、転写因子のそれぞれの所望の発現プロファイルは、選択されるウイルスの特徴に基づいて生成され得る（例えば、ウイルスの感染からウイルスによって輸送される導入遺伝子の発現までの時間）。例えば、ある特定のウイルスは、他のウイルスと比較してそれらが達するポリヌクレオチドの長期発現を提供する。なお他の実施形態において、１つを超えるウイルスベクターを使用して単一の転写因子を送達することができる。
【００３９】
あるいは、いくつかの実施形態において、ＤＮＡ送達系は、非ウイルスベクターを含む。一部の実施形態において、非ウイルスベクターは、リポソームベクター、カチオンポリマー、および／またはＤＮＡ結合ポリマーから選択される。さらなる実施形態において、１つ以上の転写因子をコードする裸のＤＮＡが送達される。１つを超える転写因子が投与されるなおさらなる実施形態において、ウイルスおよび非ウイルス送達系の組み合わせが使用されてもよい。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、自発的で反復的な電気活動を示す細胞の生成をもたらす。一部の実施形態において、自発的で反復的な電気活動は、健常なペースメーカー細胞の正常活動の約５０％〜約１００％の間である。一部の実施形態において、生物学的ペースメーカーは、生成される細胞が、健常なペースメーカー細胞の正常活動の約５％〜約５０％の間である自発的で反復的な電気活動を示す場合であっても、生成され得る。このため、本明細書に開示される方法は、生成される細胞が、健常なペースメーカー細胞の正常活動の約５％〜約１５％、約１５％〜約２５％、約２５％〜約３５％、約３５％〜約４５％、約４５％〜約５５％、約５５％〜約６５％、約６５％〜約７５％、約７５％〜約８５％、約８５％〜約９５％、または約９５％〜約１００％の間の自発的で反復的な電気活動を示す場合、生物学的ペースメーカーの生成に適している。いくつかの実施形態において、生成される細胞は、健常なペースメーカー細胞の正常活動の１００％を超える自発的で反復的な電気活動を示す。
【００４１】
標的細胞の電気活動の変化に加えて、いくつかの実施形態において、１つ以上の転写因子（または生物学的ペースメーカー細胞に変換される細胞）の投与は、心臓の調律におけるその後の変化をもたらす。いくつかの実施形態において、結果として得られる心臓調律は、（特定の患者の年齢および健康歴を考慮して）正常な心臓調律の約５％〜約１５％、約１５％〜約２５％、約２５％〜約３５％、約３５％〜約４５％、約４５％〜約５５％、約５５％〜約６５％、約６５％〜約７５％、約７５％〜約８５％、約８５％〜約９５％、または約９５％〜約１００％内である。いくつかの実施形態において、１００％を超える心臓調律の上昇が達成される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、１つ以上の転写因子（または、生物学的ペースメーカー細胞へ変換される細胞）の投与は、植え込み電子ペースメーカーを有する対象に対するものである。一部の実施形態において、設定された投与による生物学的ペースメーカーの生成が、対象の植え込み電子ペースメーカーへの依存を低減する。一部の実施形態において、生物学的ペースメーカーの生成は、電子ペースメーカーのすべてまたは一部が、置換えられる間（例えば、電子ペースメーカーの一部が感染される場合）、ブリッジ治療を提供するためである。なおさらなる実施形態において、生物学的ペースメーカーの生成は、植え込み電子ペースメーカーの必要性を除去し、したがって、植え込み電子ペースメーカーは、対象から永久的に取り除かれ得る。さらなる実施形態において、電子ペースメーカーは、電子ペースメーカーへの依存が低減されるように、１つ以上の転写因子（または変換された生物学的ペースメーカー細胞）の投与と併せて植え込まれ得る。
【００４３】
複数の投与経路が、実施形態によって、任意に使用され得る。種々の因子は、本明細書に開示される方法を使用して、機能不全のペースメーカー細胞を再機能させる場合、１つ以上の転写因子が投与されるべき場合、または変換された細胞が投与されるべき場合、健常組織が生物学的ペースメーカーを生成することができる場所を含むが、これらに限定されない、何の標的部位が使用されるかを決定する。一部の実施形態において、投与は、心尖部内にである。一部の実施形態において、投与は、心室間中隔に対してである。一部の実施形態において、投与は、右心室自由壁に対してである。一部の実施形態において、投与は、左心室自由壁に対してである。一部の実施形態において、投与は、右心室を介してである。一部の実施形態において、投与は、右心房を介してである。いくつかのそのような実施形態において、右側のアプローチは、有利に、塞栓症および／または脳卒中の危険性を減少させる。一部の実施形態において、投与は、同時または異なる時間のいずれかで、上記経路の２つ以上を介して行われる。
【００４４】
上記で考察されるように、一部の実施形態において、本明細書に開示される方法を使用して、存在するペースメーカー細胞または心臓伝導系内の細胞の機能を（部分的にまたは完全にのいずれかで）回復する。一部の実施形態において、投与は、ヒス束の右脚または左脚に対してである。一部の実施形態において、投与は、プルキンエ線維に対してである。なおさらなる実施形態において、投与は、ＳＡ結節に対して、および／またはＡＶ結節に対してである。
【００４５】
変換された細胞が送達されるある特定の実施形態において、静脈内投与が使用される。一部の実施形態において、冠動脈内投与が使用される。
【００４６】
状況次第で、一部の実施形態において、（１つ以上の転写因子の、または変換された生物学的ペースメーカー細胞の）投与は、心臓に直接アクセスすることによって行われる（例えば、電子ペースメーカーを除去する間に注入）。一部の実施形態において、カテーテルが、投与に使用される。一部の実施形態において、カテーテルは、マップ誘導カテーテル注入システムを含む。一部の実施形態において、蛍光透視誘導を使用して、カテーテル（または他の投与システム）を心臓内の標的組織に導く。一部の実施形態において、Ｘ線誘導が使用される。さらなる実施形態において、心エコー誘導が使用され、ある特定の実施形態において、同様に磁気共鳴映像法が使用される。一部の実施形態において、上記モードの誘導媒体（ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｖｅｈｉｃｌｅ）の２つ以上が、同時にまたは投与中の異なる時間に使用される。
【００４７】
上記で開示される方法に加えて、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、またはそれらの組み合わせをコードするウイルスベクター、および真核生物プロモーターを含む、ＤＮＡ送達系を含む、生物学的ペースメーカーの生成のための組成物がまた本明細書に提供される。１つの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであるが、しかしながら、上記で考察されるように、実施形態によって、様々な異なるウイルスベクターもまた使用され得る。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、配列中に以下の操作可能に連結される成分、第１の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、第１のｌｏｘＰ部位、パッケージング部位（ψ、ｐｓｉ）、サイトメガロウイルスプロモーター、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、またはそれらの組み合わせをコードする配列、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ポリアデニル化シグナル（Ａｎ）、第２のｌｏｘＰ部位、アデノウイルス初期領域２および初期領域４遺伝子をコードする配列、および第２の逆方向反復配列（ＩＴＲ）をさらに含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、投与されるウイルス構築物の用量は、ウイルスに関する学問（ｖｉｒａｌ  ａｒｔｓ）において、確立した測定単位であるプラーク形成単位に基づく。一部の実施形態において、約１×１０８〜１×１０１０ｐｆｕ（体積で５０〜２００マイクロリットルの範囲）の用量が、使用される。生物学的ペースメーカー細胞に変換される細胞の送達に関しては、細胞の用量は、１×１０５〜１×１０８細胞の範囲にわたる。（他の要因の中でもとりわけ）対象の心不整脈の重症度、電子ペースメーカーの有無、および／または対象の心臓の大きさによって、より高いまたはより低い用量が使用され得る。
【００４９】
幹細胞がＴｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される１つ以上の転写因子と接触しており、１つ以上の転写因子が細胞の自発的で反復的な電気活動の増加を誘導し、細胞の自発的で反復的な電気活動の増加が自発的で反復的な異所性収縮を生成し、幹細胞が生物学的ペースメーカー機能を必要とする対象への投与に適している、複数の幹細胞を含む、生物学的ペースメーカーの生成のための細胞集団がまた本明細書に提供される。
【００５０】
いくつかの実施形態において、幹細胞は、胚性幹細胞、非胚性幹細胞、骨髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、誘導多能性幹細胞、および心臓幹細胞からなる群から選択される。１つの実施形態において、細胞集団は、生物学的ペースメーカーの表現型を有する細胞に変換されている収集された成人心臓幹細胞を含む。
【００５１】
自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を自発的で反復的な電気活動を示すペースメーカー細胞に変換するための、Ｔｂｘ１８およびＳｈｏｘ２からなる群から選択される１つ以上の転写因子の使用がまた本明細書に提供される。
一つの実施形態において、本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
対象の心臓組織の電気活動を修正するための転写因子を使用して、生物学的ペースメーカーを生成する方法であって、
異常な電気活動を示す心臓組織を有する対象を識別することであって、
前記対象が、静止細胞を含む心臓組織を有し、
前記静止細胞が、心筋細胞および幹細胞のうちの１つ以上を含み、
前記静止細胞が、自発的で反復的な電気活動を示さない、識別することと、
処置細胞を生成するために、前記静止細胞に１つ以上の転写因子を投与することであって、
前記処置細胞が、自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって、前記対象の前記心臓組織の電気活動を修正する、方法。
（項目２）
前記対象が、洞不全症候群、洞性徐脈、頻脈徐脈症候群、心房細動、房室ブロック、変時不全、ＱＴ延長症候群、および心不全から成る群から選択される状態に苦しむ、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記異常な心臓の電気活動が、心不整脈によるものである、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記投与が、インビトロで生じ、前記方法が、前記対象に前記処置細胞を投与することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記投与が、インビボで生じる、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記１つ以上の転写因子が、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ−２、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、それらの機能的断片、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記１つ以上の転写因子が、Ｔｂｘ−１８を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記１つ以上の転写因子が、Ｓｈｏｘ−２を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記投与が、心尖部、ヒス束の右脚、ヒス束の左脚、プルキンエ線維、心室間中隔、右心室自由壁、左心室自由壁、ＳＡ結節、ＡＶ結節から成る群から選択される部位に対してである、項目５〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記投与部位が、右心室を介してアクセスされる、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記投与部位が、右心房を介してアクセスされる、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記投与部位が、心臓に直接アクセスすることによってアクセスされる、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記アクセスすることが、マップ誘導カテーテル注入システムによって達成される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記アクセスすることが、蛍光透視誘導によって達成される、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記アクセスすることが、Ｘ線誘導によって達成される、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記アクセスすることが、心エコー誘導によって達成される、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
前記アクセスすることが、磁気共鳴映像法を介する誘導によって達成される、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
前記投与が、前記１つ以上の転写因子をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ送達系を送達することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記ＤＮＡ送達系が、ウイルスベクターを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ＨＪＶ、ＨＩＶ、およびＨＳＶから成る群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ＤＮＡ送達系が、非ウイルスベクターを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記非ウイルスベクターが、リポソームベクター、カチオンポリマー、および／またはＤＮＡ結合ポリマーのうちの１つ以上である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ＤＮＡ送達系が、裸のＤＮＡを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
前記処置細胞が、天然のＳＡＮ細胞の長さ／幅形態に実質的に類似する長さ／幅形態を示す、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記処置細胞が、少なくとも約１０の長さ／幅比を有する、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記処置細胞が、自発的な細胞内Ｃａ２＋変動の増加を示す、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記自発的で反復的な電気活動が、β−アドレナリン刺激に応答して増加する、項目１に記載の方法。
（項目２８）
変換された細胞が、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）または骨格αアクチン（αＳｋＡ）を発現しない、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記対象が、前記心臓組織の前記電気活動を修正する電子ペースメーカーを有する、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記生物学的ペースメーカーの前記生成が、前記電子ペースメーカーの機能を補う、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記生物学的ペースメーカーの前記生成が、前記電子ペースメーカーを機能的に置き換える、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
心不整脈を治療するための転写因子を使用して生物学的ペースメーカーを生成する方法であって、
心不整脈を患っている対象を識別することであって、
前記対象が、静止細胞を含む心臓組織を有し、
前記静止細胞が、心筋細胞および幹細胞のうちの１つ以上を含み、
前記静止細胞が、自発的で反復的な電気活動を示さない、識別することと、
処置細胞を生成するために、前記静止細胞に１つ以上の転写因子を投与することであって、
前記処置細胞が、自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって、前記心不整脈を治療する、方法。
（項目３３）
転写因子の使用を通して幹細胞の集団を生物学的ペースメーカーの生成に適した細胞に変換する方法であって、
幹細胞の集団を得ることと、
インビトロで前記幹細胞を培養することであって、
前記培養された幹細胞が、自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を含む、培養することと、
変換された細胞を生成するために、１つ以上の転写因子を前記静止細胞に送達することであって、
前記変換された細胞が、自発的で反復的な電気活動を示す、送達することと、を含み、それによって、前記幹細胞を、生物学的ペースメーカーを生成することができる細胞に変換する、方法。
（項目３４）
前記１つ以上の転写因子が、胚の洞房結節発生の制御因子であり、および／または洞房結節細胞への新規細胞分化を促進する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記１つ以上の転写因子が、発生の間に静脈洞を定義する、項目３３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記１つ以上の転写因子が、前記静脈洞においてＮｋｘ２．５の負の制御因子である、項目３３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記１つ以上の転写因子が、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ−２、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、それらの機能的断片、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、項目３３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記１つ以上の転写因子が、Ｔｂｘ１８を含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記１つ以上の転写因子が、Ｓｈｏｘ−２を含む、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記送達が、前記静止細胞に前記１つ以上の転写因子をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ送達系を送達することを含む、項目３３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記ＤＮＡ送達系が、ウイルスベクターを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ＨＪＶ、ＨＩＶ、およびＨＳＶから成る群から選択される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記ＤＮＡ送達系が、非ウイルスベクターを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４４）
前記非ウイルスベクターが、リポソームベクター、カチオンポリマー、および／またはＤＮＡ結合ポリマーのうちの１つ以上である、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記ＤＮＡ送達系が、裸のＤＮＡを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４６）
前記対象および／または前記幹細胞が、哺乳類である、項目３３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
心臓の電気活動の機能障害を治療する方法であって、
項目３３〜４７のいずれか一項に記載の方法に従って、変換された細胞を得ることと、
前記変換された細胞を心臓の電気活動の機能障害を患っている対象に投与することであって、前記変換された細胞が、自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって、心臓の電気活動の前記機能障害を治療する、方法。
（項目４９）
心臓の電気活動の前記機能障害が、心不整脈を含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記投与の前に前記変換された細胞を単離することをさらに含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記自発的で反復的な電気活動が、ペースメーカー細胞の正常活動の約６５％〜約１００％の範囲内である、項目４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記投与が、心臓の調律に変化をもたらす、項目４８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
心臓の前記変化した調律が、正常な心拍数の約２５％〜約３５％の範囲内の新たな心拍数に対応する、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記投与が、植え込みペースメーカーを有する対象に対するものである、項目４８〜５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記投与が、前記対象の前記植え込みペースメーカーへの依存を低減する、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記低減された依存が、前記植え込みペースメーカーの外植または置換を可能にするのに十分である、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記投与が、心尖部内にである、項目４８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記投与が、ヒス束の右脚に対してである、項目４８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記投与が、ヒス束の左脚に対してである、項目４８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記投与が、プルキンエ線維に対してである、項目４８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記投与が、心室間中隔に対してである、項目４８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記投与が、右心室自由壁に対してである、項目４８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記投与が、左心室自由壁に対してである、項目４８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記投与が、ＳＡ結節に対してである、項目４８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記投与が、ＡＶ結節に対してである、項目４８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記投与が、右心室を介してである、項目４８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記投与が、右心房を介してである、項目４８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記投与が、心臓に直接アクセスすることによって行われる、項目４８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記アクセスすることが、マップ誘導カテーテル注入システム、蛍光透視誘導、Ｘ線誘導、心エコー誘導、および磁気共鳴映像法を介する誘導のうちの１つ以上の使用によって促進される、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記生物学的ペースメーカーの生成のための組成物であって、
Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ−２、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、それらの機能的断片、またはそれらの組み合わせをコードするウイルスベクターと、
真核生物プロモーターと、を含む、ＤＮＡ送達系を含む、組成物。
（項目７１）
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、項目７０に記載の組成物。
（項目７２）
前記アデノウイルスベクターが、配列中に以下の操作可能に連結される成分、
第１の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、
第１のｌｏｘＰ部位、
パッケージング部位（ψ、ｐｓｉ）、
サイトメガロウイルスプロモーター、
Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、またはそれらの組み合わせをコードする配列、
配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、
ポリアデニル化シグナル（Ａｎ）、
第２のｌｏｘＰ部位、
前記アデノウイルス初期領域２および初期領域４遺伝子をコードする配列、および
第２の逆方向反復配列（ＩＴＲ）をさらに含む、項目７１に記載の組成物。
（項目７３）
前記生物学的ペースメーカーの生成のための細胞集団であって、
幹細胞が、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ−２、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、それらの機能的断片、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される１つ以上の転写因子と接触しており、
前記１つ以上の転写因子が、前記細胞の前記自発的で反復的な電気活動の増加を誘導し、
前記細胞の前記自発的で反復的な電気活動の前記増加が、前記細胞の異所性収縮を生成することができ、
前記幹細胞が、生物学的ペースメーカー機能を必要とする対象への投与に適している、複数の幹細胞を含む、細胞集団。
（項目７４）
前記幹細胞が、胚性幹細胞、非胚性幹細胞、骨髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、誘導多能性幹細胞、および心臓幹細胞から成る群から選択される、項目７３に記載の細胞集団。
（項目７５）
自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を自発的で反復的な電気活動を示すペースメーカー細胞に変換するための、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ−２、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、それらの機能的断片、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される１つ以上の転写因子の使用。
（項目７６）
転写因子を使用して心不整脈を治療する方法であって、
心不整脈を患っている対象を識別することであって、
前記対象が、静止細胞を含む心臓組織を有し、
前記静止細胞が、心筋細胞および幹細胞のうちの１つ以上を含み、
前記静止細胞が、自発的で反復的な電気活動を示さない、識別することと、
処置細胞を生成するために、前記静止細胞にＴｂｘ１８、Ｓｈｏｘ−２、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、それらの機能的断片、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を投与することであって、
前記処置細胞が、自発的で反復的な電気活動を示す、投与することと、を含み、それによって、前記心不整脈を治療する、方法。
（項目７７）
転写因子を使用して生物学的ペースメーカーを生成することによって心不整脈を治療する方法であって、
心不整脈を患っている対象を識別することと、
変換された幹細胞の集団を得ることであって、
前記変換の前に、前記幹細胞が、自発的で反復的な電気活動を示さない静止細胞を含み、
自発的で反復的な電気活動を示す変換された細胞を生成するために、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ−２、Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、それらの機能的断片、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上が、前記静止細胞に投与された、得ることと、
前記変換された細胞を前記対象に投与することであって、前記投与される変換された細胞を前記対象の前記心臓組織に移植し、自発的で反復的な電気活動を示し続ける、投与することと、を含み、それによって生物学的ペースメーカーを生成し、前記心不整脈を治療する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１Ａ】新生（１Ａ）および成体（１Ｂ）ラットの心臓のＳＡＮ細胞の免疫組織化学を示す。ＳＡＮは、ＨＣＮ４共染色によって境界を画定され、周囲の心房から分離される。スケールバー：５０μｍ。
【図１Ｂ】新生（１Ａ）および成体（１Ｂ）ラットの心臓のＳＡＮ細胞の免疫組織化学を示す。ＳＡＮは、ＨＣＮ４共染色によって境界を画定され、周囲の心房から分離される。スケールバー：５０μｍ。
【図２Ａ】新生ラットの心室筋細胞（ＮＲＶＭ）へのＴｂｘ１８形質導入の効果を示す。図２Ａは、自発的に拍動するＮＲＶＭ培養の数の著しい増加を示す。各「ｎ」は、２４ウェルプレートの１ウェルを表す。図２Ｂは、ＧＦＰ−（２Ｂ左）およびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（２Ｂ右）からの代表的な活動電位（ＡＰ）記録を示す。図２Ｃは、最大拡張期電位（左）、自動能の指標（中央）、および自発的変動（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ−ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ）Ｃａ２＋トランジェントの全細胞数（右）が要約されることを示す。図２Ｄは、左に代表的なＩＫ１密度の未加工記録を、および右に−１４０ｍＶでの要約されたＩＫ１密度を示す。図２Ｅは、ＧＦＰ−（左）またはＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（中央）におけるＨＣＮ４免疫染色（ＨＣＮ４−白色、核−青色）を示す。要約データが、右に示される。図２Ｆ（左）は、Ｔｂｘ１８形質導入が、ＨＣＮ４を発現するＮＶＲＭの数の３．８倍の増加をもたらすことを示し、一方２Ｆ（右）は、Ｔｂｘ１８−ＮＶＲＭにおけるＨＣＮ４タンパク質レベルの１．４倍の増加を示す。図２Ｇは、Ｔｂｘ１８−形質導入細胞が、ウサギのＳＡＮ細胞において報告されるものと一致する密度（−１４０ｍＶで−５．２±１．３ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝３）で、Ｉｆを示したことを示す。図２Ｈおよび２Ｉは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭに正規化されるＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（左）およびＬＶ正規化されるＳＡＮ（右）と比較して、選択される遺伝子の関連するｍＲＮＡレベルの変化を示す。ＳＡＮおよびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。
【図２Ｂ】新生ラットの心室筋細胞（ＮＲＶＭ）へのＴｂｘ１８形質導入の効果を示す。図２Ａは、自発的に拍動するＮＲＶＭ培養の数の著しい増加を示す。各「ｎ」は、２４ウェルプレートの１ウェルを表す。図２Ｂは、ＧＦＰ−（２Ｂ左）およびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（２Ｂ右）からの代表的な活動電位（ＡＰ）記録を示す。図２Ｃは、最大拡張期電位（左）、自動能の指標（中央）、および自発的変動（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ−ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ）Ｃａ２＋トランジェントの全細胞数（右）が要約されることを示す。図２Ｄは、左に代表的なＩＫ１密度の未加工記録を、および右に−１４０ｍＶでの要約されたＩＫ１密度を示す。図２Ｅは、ＧＦＰ−（左）またはＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（中央）におけるＨＣＮ４免疫染色（ＨＣＮ４−白色、核−青色）を示す。要約データが、右に示される。図２Ｆ（左）は、Ｔｂｘ１８形質導入が、ＨＣＮ４を発現するＮＶＲＭの数の３．８倍の増加をもたらすことを示し、一方２Ｆ（右）は、Ｔｂｘ１８−ＮＶＲＭにおけるＨＣＮ４タンパク質レベルの１．４倍の増加を示す。図２Ｇは、Ｔｂｘ１８−形質導入細胞が、ウサギのＳＡＮ細胞において報告されるものと一致する密度（−１４０ｍＶで−５．２±１．３ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝３）で、Ｉｆを示したことを示す。図２Ｈおよび２Ｉは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭに正規化されるＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（左）およびＬＶ正規化されるＳＡＮ（右）と比較して、選択される遺伝子の関連するｍＲＮＡレベルの変化を示す。ＳＡＮおよびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。
【図２Ｃ】新生ラットの心室筋細胞（ＮＲＶＭ）へのＴｂｘ１８形質導入の効果を示す。図２Ａは、自発的に拍動するＮＲＶＭ培養の数の著しい増加を示す。各「ｎ」は、２４ウェルプレートの１ウェルを表す。図２Ｂは、ＧＦＰ−（２Ｂ左）およびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（２Ｂ右）からの代表的な活動電位（ＡＰ）記録を示す。図２Ｃは、最大拡張期電位（左）、自動能の指標（中央）、および自発的変動（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ−ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ）Ｃａ２＋トランジェントの全細胞数（右）が要約されることを示す。図２Ｄは、左に代表的なＩＫ１密度の未加工記録を、および右に−１４０ｍＶでの要約されたＩＫ１密度を示す。図２Ｅは、ＧＦＰ−（左）またはＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（中央）におけるＨＣＮ４免疫染色（ＨＣＮ４−白色、核−青色）を示す。要約データが、右に示される。図２Ｆ（左）は、Ｔｂｘ１８形質導入が、ＨＣＮ４を発現するＮＶＲＭの数の３．８倍の増加をもたらすことを示し、一方２Ｆ（右）は、Ｔｂｘ１８−ＮＶＲＭにおけるＨＣＮ４タンパク質レベルの１．４倍の増加を示す。図２Ｇは、Ｔｂｘ１８−形質導入細胞が、ウサギのＳＡＮ細胞において報告されるものと一致する密度（−１４０ｍＶで−５．２±１．３ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝３）で、Ｉｆを示したことを示す。図２Ｈおよび２Ｉは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭに正規化されるＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（左）およびＬＶ正規化されるＳＡＮ（右）と比較して、選択される遺伝子の関連するｍＲＮＡレベルの変化を示す。ＳＡＮおよびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。
【図２Ｄ】新生ラットの心室筋細胞（ＮＲＶＭ）へのＴｂｘ１８形質導入の効果を示す。図２Ａは、自発的に拍動するＮＲＶＭ培養の数の著しい増加を示す。各「ｎ」は、２４ウェルプレートの１ウェルを表す。図２Ｂは、ＧＦＰ−（２Ｂ左）およびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（２Ｂ右）からの代表的な活動電位（ＡＰ）記録を示す。図２Ｃは、最大拡張期電位（左）、自動能の指標（中央）、および自発的変動（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ−ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ）Ｃａ２＋トランジェントの全細胞数（右）が要約されることを示す。図２Ｄは、左に代表的なＩＫ１密度の未加工記録を、および右に−１４０ｍＶでの要約されたＩＫ１密度を示す。図２Ｅは、ＧＦＰ−（左）またはＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（中央）におけるＨＣＮ４免疫染色（ＨＣＮ４−白色、核−青色）を示す。要約データが、右に示される。図２Ｆ（左）は、Ｔｂｘ１８形質導入が、ＨＣＮ４を発現するＮＶＲＭの数の３．８倍の増加をもたらすことを示し、一方２Ｆ（右）は、Ｔｂｘ１８−ＮＶＲＭにおけるＨＣＮ４タンパク質レベルの１．４倍の増加を示す。図２Ｇは、Ｔｂｘ１８−形質導入細胞が、ウサギのＳＡＮ細胞において報告されるものと一致する密度（−１４０ｍＶで−５．２±１．３ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝３）で、Ｉｆを示したことを示す。図２Ｈおよび２Ｉは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭに正規化されるＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（左）およびＬＶ正規化されるＳＡＮ（右）と比較して、選択される遺伝子の関連するｍＲＮＡレベルの変化を示す。ＳＡＮおよびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。
【図２Ｅ】新生ラットの心室筋細胞（ＮＲＶＭ）へのＴｂｘ１８形質導入の効果を示す。図２Ａは、自発的に拍動するＮＲＶＭ培養の数の著しい増加を示す。各「ｎ」は、２４ウェルプレートの１ウェルを表す。図２Ｂは、ＧＦＰ−（２Ｂ左）およびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（２Ｂ右）からの代表的な活動電位（ＡＰ）記録を示す。図２Ｃは、最大拡張期電位（左）、自動能の指標（中央）、および自発的変動（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ−ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ）Ｃａ２＋トランジェントの全細胞数（右）が要約されることを示す。図２Ｄは、左に代表的なＩＫ１密度の未加工記録を、および右に−１４０ｍＶでの要約されたＩＫ１密度を示す。図２Ｅは、ＧＦＰ−（左）またはＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（中央）におけるＨＣＮ４免疫染色（ＨＣＮ４−白色、核−青色）を示す。要約データが、右に示される。図２Ｆ（左）は、Ｔｂｘ１８形質導入が、ＨＣＮ４を発現するＮＶＲＭの数の３．８倍の増加をもたらすことを示し、一方２Ｆ（右）は、Ｔｂｘ１８−ＮＶＲＭにおけるＨＣＮ４タンパク質レベルの１．４倍の増加を示す。図２Ｇは、Ｔｂｘ１８−形質導入細胞が、ウサギのＳＡＮ細胞において報告されるものと一致する密度（−１４０ｍＶで−５．２±１．３ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝３）で、Ｉｆを示したことを示す。図２Ｈおよび２Ｉは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭに正規化されるＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（左）およびＬＶ正規化されるＳＡＮ（右）と比較して、選択される遺伝子の関連するｍＲＮＡレベルの変化を示す。ＳＡＮおよびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。
【図２Ｆ】新生ラットの心室筋細胞（ＮＲＶＭ）へのＴｂｘ１８形質導入の効果を示す。図２Ａは、自発的に拍動するＮＲＶＭ培養の数の著しい増加を示す。各「ｎ」は、２４ウェルプレートの１ウェルを表す。図２Ｂは、ＧＦＰ−（２Ｂ左）およびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（２Ｂ右）からの代表的な活動電位（ＡＰ）記録を示す。図２Ｃは、最大拡張期電位（左）、自動能の指標（中央）、および自発的変動（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ−ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ）Ｃａ２＋トランジェントの全細胞数（右）が要約されることを示す。図２Ｄは、左に代表的なＩＫ１密度の未加工記録を、および右に−１４０ｍＶでの要約されたＩＫ１密度を示す。図２Ｅは、ＧＦＰ−（左）またはＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（中央）におけるＨＣＮ４免疫染色（ＨＣＮ４−白色、核−青色）を示す。要約データが、右に示される。図２Ｆ（左）は、Ｔｂｘ１８形質導入が、ＨＣＮ４を発現するＮＶＲＭの数の３．８倍の増加をもたらすことを示し、一方２Ｆ（右）は、Ｔｂｘ１８−ＮＶＲＭにおけるＨＣＮ４タンパク質レベルの１．４倍の増加を示す。図２Ｇは、Ｔｂｘ１８−形質導入細胞が、ウサギのＳＡＮ細胞において報告されるものと一致する密度（−１４０ｍＶで−５．２±１．３ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝３）で、Ｉｆを示したことを示す。図２Ｈおよび２Ｉは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭに正規化されるＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（左）およびＬＶ正規化されるＳＡＮ（右）と比較して、選択される遺伝子の関連するｍＲＮＡレベルの変化を示す。ＳＡＮおよびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。
【図２Ｇ】新生ラットの心室筋細胞（ＮＲＶＭ）へのＴｂｘ１８形質導入の効果を示す。図２Ａは、自発的に拍動するＮＲＶＭ培養の数の著しい増加を示す。各「ｎ」は、２４ウェルプレートの１ウェルを表す。図２Ｂは、ＧＦＰ−（２Ｂ左）およびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（２Ｂ右）からの代表的な活動電位（ＡＰ）記録を示す。図２Ｃは、最大拡張期電位（左）、自動能の指標（中央）、および自発的変動（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ−ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ）Ｃａ２＋トランジェントの全細胞数（右）が要約されることを示す。図２Ｄは、左に代表的なＩＫ１密度の未加工記録を、および右に−１４０ｍＶでの要約されたＩＫ１密度を示す。図２Ｅは、ＧＦＰ−（左）またはＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（中央）におけるＨＣＮ４免疫染色（ＨＣＮ４−白色、核−青色）を示す。要約データが、右に示される。図２Ｆ（左）は、Ｔｂｘ１８形質導入が、ＨＣＮ４を発現するＮＶＲＭの数の３．８倍の増加をもたらすことを示し、一方２Ｆ（右）は、Ｔｂｘ１８−ＮＶＲＭにおけるＨＣＮ４タンパク質レベルの１．４倍の増加を示す。図２Ｇは、Ｔｂｘ１８−形質導入細胞が、ウサギのＳＡＮ細胞において報告されるものと一致する密度（−１４０ｍＶで−５．２±１．３ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝３）で、Ｉｆを示したことを示す。図２Ｈおよび２Ｉは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭに正規化されるＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（左）およびＬＶ正規化されるＳＡＮ（右）と比較して、選択される遺伝子の関連するｍＲＮＡレベルの変化を示す。ＳＡＮおよびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。
【図２Ｈ】新生ラットの心室筋細胞（ＮＲＶＭ）へのＴｂｘ１８形質導入の効果を示す。図２Ａは、自発的に拍動するＮＲＶＭ培養の数の著しい増加を示す。各「ｎ」は、２４ウェルプレートの１ウェルを表す。図２Ｂは、ＧＦＰ−（２Ｂ左）およびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（２Ｂ右）からの代表的な活動電位（ＡＰ）記録を示す。図２Ｃは、最大拡張期電位（左）、自動能の指標（中央）、および自発的変動（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ−ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ）Ｃａ２＋トランジェントの全細胞数（右）が要約されることを示す。図２Ｄは、左に代表的なＩＫ１密度の未加工記録を、および右に−１４０ｍＶでの要約されたＩＫ１密度を示す。図２Ｅは、ＧＦＰ−（左）またはＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（中央）におけるＨＣＮ４免疫染色（ＨＣＮ４−白色、核−青色）を示す。要約データが、右に示される。図２Ｆ（左）は、Ｔｂｘ１８形質導入が、ＨＣＮ４を発現するＮＶＲＭの数の３．８倍の増加をもたらすことを示し、一方２Ｆ（右）は、Ｔｂｘ１８−ＮＶＲＭにおけるＨＣＮ４タンパク質レベルの１．４倍の増加を示す。図２Ｇは、Ｔｂｘ１８−形質導入細胞が、ウサギのＳＡＮ細胞において報告されるものと一致する密度（−１４０ｍＶで−５．２±１．３ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝３）で、Ｉｆを示したことを示す。図２Ｈおよび２Ｉは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭに正規化されるＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（左）およびＬＶ正規化されるＳＡＮ（右）と比較して、選択される遺伝子の関連するｍＲＮＡレベルの変化を示す。ＳＡＮおよびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。
【図２Ｉ】新生ラットの心室筋細胞（ＮＲＶＭ）へのＴｂｘ１８形質導入の効果を示す。図２Ａは、自発的に拍動するＮＲＶＭ培養の数の著しい増加を示す。各「ｎ」は、２４ウェルプレートの１ウェルを表す。図２Ｂは、ＧＦＰ−（２Ｂ左）およびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（２Ｂ右）からの代表的な活動電位（ＡＰ）記録を示す。図２Ｃは、最大拡張期電位（左）、自動能の指標（中央）、および自発的変動（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ−ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ）Ｃａ２＋トランジェントの全細胞数（右）が要約されることを示す。図２Ｄは、左に代表的なＩＫ１密度の未加工記録を、および右に−１４０ｍＶでの要約されたＩＫ１密度を示す。図２Ｅは、ＧＦＰ−（左）またはＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（中央）におけるＨＣＮ４免疫染色（ＨＣＮ４−白色、核−青色）を示す。要約データが、右に示される。図２Ｆ（左）は、Ｔｂｘ１８形質導入が、ＨＣＮ４を発現するＮＶＲＭの数の３．８倍の増加をもたらすことを示し、一方２Ｆ（右）は、Ｔｂｘ１８−ＮＶＲＭにおけるＨＣＮ４タンパク質レベルの１．４倍の増加を示す。図２Ｇは、Ｔｂｘ１８−形質導入細胞が、ウサギのＳＡＮ細胞において報告されるものと一致する密度（−１４０ｍＶで−５．２±１．３ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝３）で、Ｉｆを示したことを示す。図２Ｈおよび２Ｉは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭに正規化されるＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（左）およびＬＶ正規化されるＳＡＮ（右）と比較して、選択される遺伝子の関連するｍＲＮＡレベルの変化を示す。ＳＡＮおよびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。
【図３Ａ】ＮＲＶＭにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのＴｂｘ１８発現の効果を示す。図３Ａは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの線走査共焦点イメージングが、天然のＳＡＮペースメーカー中で観察されるＬＣＲを再現する、各全細胞Ｃａ２＋トランジェント（１０個の細胞からｎ＝８）に先立つ局所的Ｃａ２＋放出現象（ＬＣＲ）を解像したことを示す。図３Ｂは、対照細胞中のＬＣＲを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図３Ｃは、ＬＣＲが、サイクル長の７２±１％の平均期間を有したことを示す。図３Ｄは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいてカフェイン（２０ｍＭ）誘発性Ｃａ２＋トランジェントの２．３倍の増加を示すＣａ２＋濃度の変化の空間平均されたｄＦ／Ｆ０プロットを示す。図３Ｅは、自発的なＣａ２＋トランジェントが、対照におけるわずか１２±２％の抑制と比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＲｙＲ遮断薬であるリアノジン（１０μＭ）による灌流上で４７±６％抑制されることを示す。図３Ｆは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのＳＡＮに類似している全ＰＬＢレベルの減少およびリン酸化ＰＬＢ（ｓｅ１６）の増加を示したことを示す。図３Ｇは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＳＥＲＣＡ２Ａ、ＮＣＸＩ、およびＲｙＲのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連ｐ−ＰＬＢ（Ｓｅｒ１６）レベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて６５倍高く（図３Ｆ、左パネル）、心室心筋内のものと比較して、ＳＡＮにおいて見られるｐＰＬＮの増大を模倣した（図３Ｆ、右パネル）。ウサギのＳＡＮ対左心室における所見と一致して、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＮＣＸｌ、およびリアノジン受容体（ＲｙＲ）のタンパク質レベルにおける差異は、Ｔｈｘ１８−とＧＦＰ−ＮＲＶＭ（図３Ｇ）との間において検出されなかった。図３Ｈは、ＧＦＰ−ＮＶＲＭ（白バー）およびＴｂｘ１８−ＮＶＲＭ（斜線格子柄のバー）の細胞内ｃＡＭＰレベルに関するデータを示す。細胞内ｃＡＭＰレベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて著しく高く、これは、ウサギのＳＡＮと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図３Ｉは、ＧＦＰ−またはＴｂｘ１８ＮＶＲＭにおけるＣａ２＋トランジェントに関するデータを示す。ＰＫＡ阻害剤（ＰＫＩ、１５μＭ）の適用は、Ｔｂｘ−ＮＲＶＭにおける自発的な全細胞のＣａ２＋トランジェントの休止を引き起こしたが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭ上では効果がなかった。図３Ｊは、最大半量の持続時間での全幅（ＦＷＨＤ、左パネル）、および最大半量の幅での全持続時間（ＦＤＨＷ、左パネル）として測定された、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭからのＬＣＲが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭからの自発的なＣａ２＋放出現象よりも長く、広いことを示す。Ｃａ２＋シグナルの振幅（Ｆ／Ｆｏの任意の単位で測定される、右パネル）は、２つのグループ間に類似している。
【図３Ｂ】ＮＲＶＭにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのＴｂｘ１８発現の効果を示す。図３Ａは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの線走査共焦点イメージングが、天然のＳＡＮペースメーカー中で観察されるＬＣＲを再現する、各全細胞Ｃａ２＋トランジェント（１０個の細胞からｎ＝８）に先立つ局所的Ｃａ２＋放出現象（ＬＣＲ）を解像したことを示す。図３Ｂは、対照細胞中のＬＣＲを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図３Ｃは、ＬＣＲが、サイクル長の７２±１％の平均期間を有したことを示す。図３Ｄは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいてカフェイン（２０ｍＭ）誘発性Ｃａ２＋トランジェントの２．３倍の増加を示すＣａ２＋濃度の変化の空間平均されたｄＦ／Ｆ０プロットを示す。図３Ｅは、自発的なＣａ２＋トランジェントが、対照におけるわずか１２±２％の抑制と比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＲｙＲ遮断薬であるリアノジン（１０μＭ）による灌流上で４７±６％抑制されることを示す。図３Ｆは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのＳＡＮに類似している全ＰＬＢレベルの減少およびリン酸化ＰＬＢ（ｓｅ１６）の増加を示したことを示す。図３Ｇは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＳＥＲＣＡ２Ａ、ＮＣＸＩ、およびＲｙＲのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連ｐ−ＰＬＢ（Ｓｅｒ１６）レベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて６５倍高く（図３Ｆ、左パネル）、心室心筋内のものと比較して、ＳＡＮにおいて見られるｐＰＬＮの増大を模倣した（図３Ｆ、右パネル）。ウサギのＳＡＮ対左心室における所見と一致して、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＮＣＸｌ、およびリアノジン受容体（ＲｙＲ）のタンパク質レベルにおける差異は、Ｔｈｘ１８−とＧＦＰ−ＮＲＶＭ（図３Ｇ）との間において検出されなかった。図３Ｈは、ＧＦＰ−ＮＶＲＭ（白バー）およびＴｂｘ１８−ＮＶＲＭ（斜線格子柄のバー）の細胞内ｃＡＭＰレベルに関するデータを示す。細胞内ｃＡＭＰレベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて著しく高く、これは、ウサギのＳＡＮと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図３Ｉは、ＧＦＰ−またはＴｂｘ１８ＮＶＲＭにおけるＣａ２＋トランジェントに関するデータを示す。ＰＫＡ阻害剤（ＰＫＩ、１５μＭ）の適用は、Ｔｂｘ−ＮＲＶＭにおける自発的な全細胞のＣａ２＋トランジェントの休止を引き起こしたが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭ上では効果がなかった。図３Ｊは、最大半量の持続時間での全幅（ＦＷＨＤ、左パネル）、および最大半量の幅での全持続時間（ＦＤＨＷ、左パネル）として測定された、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭからのＬＣＲが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭからの自発的なＣａ２＋放出現象よりも長く、広いことを示す。Ｃａ２＋シグナルの振幅（Ｆ／Ｆｏの任意の単位で測定される、右パネル）は、２つのグループ間に類似している。
【図３Ｃ】ＮＲＶＭにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのＴｂｘ１８発現の効果を示す。図３Ａは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの線走査共焦点イメージングが、天然のＳＡＮペースメーカー中で観察されるＬＣＲを再現する、各全細胞Ｃａ２＋トランジェント（１０個の細胞からｎ＝８）に先立つ局所的Ｃａ２＋放出現象（ＬＣＲ）を解像したことを示す。図３Ｂは、対照細胞中のＬＣＲを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図３Ｃは、ＬＣＲが、サイクル長の７２±１％の平均期間を有したことを示す。図３Ｄは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいてカフェイン（２０ｍＭ）誘発性Ｃａ２＋トランジェントの２．３倍の増加を示すＣａ２＋濃度の変化の空間平均されたｄＦ／Ｆ０プロットを示す。図３Ｅは、自発的なＣａ２＋トランジェントが、対照におけるわずか１２±２％の抑制と比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＲｙＲ遮断薬であるリアノジン（１０μＭ）による灌流上で４７±６％抑制されることを示す。図３Ｆは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのＳＡＮに類似している全ＰＬＢレベルの減少およびリン酸化ＰＬＢ（ｓｅ１６）の増加を示したことを示す。図３Ｇは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＳＥＲＣＡ２Ａ、ＮＣＸＩ、およびＲｙＲのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連ｐ−ＰＬＢ（Ｓｅｒ１６）レベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて６５倍高く（図３Ｆ、左パネル）、心室心筋内のものと比較して、ＳＡＮにおいて見られるｐＰＬＮの増大を模倣した（図３Ｆ、右パネル）。ウサギのＳＡＮ対左心室における所見と一致して、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＮＣＸｌ、およびリアノジン受容体（ＲｙＲ）のタンパク質レベルにおける差異は、Ｔｈｘ１８−とＧＦＰ−ＮＲＶＭ（図３Ｇ）との間において検出されなかった。図３Ｈは、ＧＦＰ−ＮＶＲＭ（白バー）およびＴｂｘ１８−ＮＶＲＭ（斜線格子柄のバー）の細胞内ｃＡＭＰレベルに関するデータを示す。細胞内ｃＡＭＰレベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて著しく高く、これは、ウサギのＳＡＮと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図３Ｉは、ＧＦＰ−またはＴｂｘ１８ＮＶＲＭにおけるＣａ２＋トランジェントに関するデータを示す。ＰＫＡ阻害剤（ＰＫＩ、１５μＭ）の適用は、Ｔｂｘ−ＮＲＶＭにおける自発的な全細胞のＣａ２＋トランジェントの休止を引き起こしたが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭ上では効果がなかった。図３Ｊは、最大半量の持続時間での全幅（ＦＷＨＤ、左パネル）、および最大半量の幅での全持続時間（ＦＤＨＷ、左パネル）として測定された、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭからのＬＣＲが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭからの自発的なＣａ２＋放出現象よりも長く、広いことを示す。Ｃａ２＋シグナルの振幅（Ｆ／Ｆｏの任意の単位で測定される、右パネル）は、２つのグループ間に類似している。
【図３Ｄ】ＮＲＶＭにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのＴｂｘ１８発現の効果を示す。図３Ａは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの線走査共焦点イメージングが、天然のＳＡＮペースメーカー中で観察されるＬＣＲを再現する、各全細胞Ｃａ２＋トランジェント（１０個の細胞からｎ＝８）に先立つ局所的Ｃａ２＋放出現象（ＬＣＲ）を解像したことを示す。図３Ｂは、対照細胞中のＬＣＲを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図３Ｃは、ＬＣＲが、サイクル長の７２±１％の平均期間を有したことを示す。図３Ｄは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいてカフェイン（２０ｍＭ）誘発性Ｃａ２＋トランジェントの２．３倍の増加を示すＣａ２＋濃度の変化の空間平均されたｄＦ／Ｆ０プロットを示す。図３Ｅは、自発的なＣａ２＋トランジェントが、対照におけるわずか１２±２％の抑制と比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＲｙＲ遮断薬であるリアノジン（１０μＭ）による灌流上で４７±６％抑制されることを示す。図３Ｆは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのＳＡＮに類似している全ＰＬＢレベルの減少およびリン酸化ＰＬＢ（ｓｅ１６）の増加を示したことを示す。図３Ｇは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＳＥＲＣＡ２Ａ、ＮＣＸＩ、およびＲｙＲのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連ｐ−ＰＬＢ（Ｓｅｒ１６）レベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて６５倍高く（図３Ｆ、左パネル）、心室心筋内のものと比較して、ＳＡＮにおいて見られるｐＰＬＮの増大を模倣した（図３Ｆ、右パネル）。ウサギのＳＡＮ対左心室における所見と一致して、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＮＣＸｌ、およびリアノジン受容体（ＲｙＲ）のタンパク質レベルにおける差異は、Ｔｈｘ１８−とＧＦＰ−ＮＲＶＭ（図３Ｇ）との間において検出されなかった。図３Ｈは、ＧＦＰ−ＮＶＲＭ（白バー）およびＴｂｘ１８−ＮＶＲＭ（斜線格子柄のバー）の細胞内ｃＡＭＰレベルに関するデータを示す。細胞内ｃＡＭＰレベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて著しく高く、これは、ウサギのＳＡＮと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図３Ｉは、ＧＦＰ−またはＴｂｘ１８ＮＶＲＭにおけるＣａ２＋トランジェントに関するデータを示す。ＰＫＡ阻害剤（ＰＫＩ、１５μＭ）の適用は、Ｔｂｘ−ＮＲＶＭにおける自発的な全細胞のＣａ２＋トランジェントの休止を引き起こしたが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭ上では効果がなかった。図３Ｊは、最大半量の持続時間での全幅（ＦＷＨＤ、左パネル）、および最大半量の幅での全持続時間（ＦＤＨＷ、左パネル）として測定された、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭからのＬＣＲが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭからの自発的なＣａ２＋放出現象よりも長く、広いことを示す。Ｃａ２＋シグナルの振幅（Ｆ／Ｆｏの任意の単位で測定される、右パネル）は、２つのグループ間に類似している。
【図３Ｅ】ＮＲＶＭにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのＴｂｘ１８発現の効果を示す。図３Ａは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの線走査共焦点イメージングが、天然のＳＡＮペースメーカー中で観察されるＬＣＲを再現する、各全細胞Ｃａ２＋トランジェント（１０個の細胞からｎ＝８）に先立つ局所的Ｃａ２＋放出現象（ＬＣＲ）を解像したことを示す。図３Ｂは、対照細胞中のＬＣＲを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図３Ｃは、ＬＣＲが、サイクル長の７２±１％の平均期間を有したことを示す。図３Ｄは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいてカフェイン（２０ｍＭ）誘発性Ｃａ２＋トランジェントの２．３倍の増加を示すＣａ２＋濃度の変化の空間平均されたｄＦ／Ｆ０プロットを示す。図３Ｅは、自発的なＣａ２＋トランジェントが、対照におけるわずか１２±２％の抑制と比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＲｙＲ遮断薬であるリアノジン（１０μＭ）による灌流上で４７±６％抑制されることを示す。図３Ｆは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのＳＡＮに類似している全ＰＬＢレベルの減少およびリン酸化ＰＬＢ（ｓｅ１６）の増加を示したことを示す。図３Ｇは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＳＥＲＣＡ２Ａ、ＮＣＸＩ、およびＲｙＲのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連ｐ−ＰＬＢ（Ｓｅｒ１６）レベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて６５倍高く（図３Ｆ、左パネル）、心室心筋内のものと比較して、ＳＡＮにおいて見られるｐＰＬＮの増大を模倣した（図３Ｆ、右パネル）。ウサギのＳＡＮ対左心室における所見と一致して、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＮＣＸｌ、およびリアノジン受容体（ＲｙＲ）のタンパク質レベルにおける差異は、Ｔｈｘ１８−とＧＦＰ−ＮＲＶＭ（図３Ｇ）との間において検出されなかった。図３Ｈは、ＧＦＰ−ＮＶＲＭ（白バー）およびＴｂｘ１８−ＮＶＲＭ（斜線格子柄のバー）の細胞内ｃＡＭＰレベルに関するデータを示す。細胞内ｃＡＭＰレベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて著しく高く、これは、ウサギのＳＡＮと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図３Ｉは、ＧＦＰ−またはＴｂｘ１８ＮＶＲＭにおけるＣａ２＋トランジェントに関するデータを示す。ＰＫＡ阻害剤（ＰＫＩ、１５μＭ）の適用は、Ｔｂｘ−ＮＲＶＭにおける自発的な全細胞のＣａ２＋トランジェントの休止を引き起こしたが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭ上では効果がなかった。図３Ｊは、最大半量の持続時間での全幅（ＦＷＨＤ、左パネル）、および最大半量の幅での全持続時間（ＦＤＨＷ、左パネル）として測定された、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭからのＬＣＲが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭからの自発的なＣａ２＋放出現象よりも長く、広いことを示す。Ｃａ２＋シグナルの振幅（Ｆ／Ｆｏの任意の単位で測定される、右パネル）は、２つのグループ間に類似している。
【図３Ｆ】ＮＲＶＭにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのＴｂｘ１８発現の効果を示す。図３Ａは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの線走査共焦点イメージングが、天然のＳＡＮペースメーカー中で観察されるＬＣＲを再現する、各全細胞Ｃａ２＋トランジェント（１０個の細胞からｎ＝８）に先立つ局所的Ｃａ２＋放出現象（ＬＣＲ）を解像したことを示す。図３Ｂは、対照細胞中のＬＣＲを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図３Ｃは、ＬＣＲが、サイクル長の７２±１％の平均期間を有したことを示す。図３Ｄは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいてカフェイン（２０ｍＭ）誘発性Ｃａ２＋トランジェントの２．３倍の増加を示すＣａ２＋濃度の変化の空間平均されたｄＦ／Ｆ０プロットを示す。図３Ｅは、自発的なＣａ２＋トランジェントが、対照におけるわずか１２±２％の抑制と比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＲｙＲ遮断薬であるリアノジン（１０μＭ）による灌流上で４７±６％抑制されることを示す。図３Ｆは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのＳＡＮに類似している全ＰＬＢレベルの減少およびリン酸化ＰＬＢ（ｓｅ１６）の増加を示したことを示す。図３Ｇは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＳＥＲＣＡ２Ａ、ＮＣＸＩ、およびＲｙＲのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連ｐ−ＰＬＢ（Ｓｅｒ１６）レベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて６５倍高く（図３Ｆ、左パネル）、心室心筋内のものと比較して、ＳＡＮにおいて見られるｐＰＬＮの増大を模倣した（図３Ｆ、右パネル）。ウサギのＳＡＮ対左心室における所見と一致して、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＮＣＸｌ、およびリアノジン受容体（ＲｙＲ）のタンパク質レベルにおける差異は、Ｔｈｘ１８−とＧＦＰ−ＮＲＶＭ（図３Ｇ）との間において検出されなかった。図３Ｈは、ＧＦＰ−ＮＶＲＭ（白バー）およびＴｂｘ１８−ＮＶＲＭ（斜線格子柄のバー）の細胞内ｃＡＭＰレベルに関するデータを示す。細胞内ｃＡＭＰレベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて著しく高く、これは、ウサギのＳＡＮと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図３Ｉは、ＧＦＰ−またはＴｂｘ１８ＮＶＲＭにおけるＣａ２＋トランジェントに関するデータを示す。ＰＫＡ阻害剤（ＰＫＩ、１５μＭ）の適用は、Ｔｂｘ−ＮＲＶＭにおける自発的な全細胞のＣａ２＋トランジェントの休止を引き起こしたが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭ上では効果がなかった。図３Ｊは、最大半量の持続時間での全幅（ＦＷＨＤ、左パネル）、および最大半量の幅での全持続時間（ＦＤＨＷ、左パネル）として測定された、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭからのＬＣＲが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭからの自発的なＣａ２＋放出現象よりも長く、広いことを示す。Ｃａ２＋シグナルの振幅（Ｆ／Ｆｏの任意の単位で測定される、右パネル）は、２つのグループ間に類似している。
【図３Ｇ】ＮＲＶＭにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのＴｂｘ１８発現の効果を示す。図３Ａは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの線走査共焦点イメージングが、天然のＳＡＮペースメーカー中で観察されるＬＣＲを再現する、各全細胞Ｃａ２＋トランジェント（１０個の細胞からｎ＝８）に先立つ局所的Ｃａ２＋放出現象（ＬＣＲ）を解像したことを示す。図３Ｂは、対照細胞中のＬＣＲを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図３Ｃは、ＬＣＲが、サイクル長の７２±１％の平均期間を有したことを示す。図３Ｄは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいてカフェイン（２０ｍＭ）誘発性Ｃａ２＋トランジェントの２．３倍の増加を示すＣａ２＋濃度の変化の空間平均されたｄＦ／Ｆ０プロットを示す。図３Ｅは、自発的なＣａ２＋トランジェントが、対照におけるわずか１２±２％の抑制と比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＲｙＲ遮断薬であるリアノジン（１０μＭ）による灌流上で４７±６％抑制されることを示す。図３Ｆは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのＳＡＮに類似している全ＰＬＢレベルの減少およびリン酸化ＰＬＢ（ｓｅ１６）の増加を示したことを示す。図３Ｇは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＳＥＲＣＡ２Ａ、ＮＣＸＩ、およびＲｙＲのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連ｐ−ＰＬＢ（Ｓｅｒ１６）レベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて６５倍高く（図３Ｆ、左パネル）、心室心筋内のものと比較して、ＳＡＮにおいて見られるｐＰＬＮの増大を模倣した（図３Ｆ、右パネル）。ウサギのＳＡＮ対左心室における所見と一致して、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＮＣＸｌ、およびリアノジン受容体（ＲｙＲ）のタンパク質レベルにおける差異は、Ｔｈｘ１８−とＧＦＰ−ＮＲＶＭ（図３Ｇ）との間において検出されなかった。図３Ｈは、ＧＦＰ−ＮＶＲＭ（白バー）およびＴｂｘ１８−ＮＶＲＭ（斜線格子柄のバー）の細胞内ｃＡＭＰレベルに関するデータを示す。細胞内ｃＡＭＰレベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて著しく高く、これは、ウサギのＳＡＮと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図３Ｉは、ＧＦＰ−またはＴｂｘ１８ＮＶＲＭにおけるＣａ２＋トランジェントに関するデータを示す。ＰＫＡ阻害剤（ＰＫＩ、１５μＭ）の適用は、Ｔｂｘ−ＮＲＶＭにおける自発的な全細胞のＣａ２＋トランジェントの休止を引き起こしたが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭ上では効果がなかった。図３Ｊは、最大半量の持続時間での全幅（ＦＷＨＤ、左パネル）、および最大半量の幅での全持続時間（ＦＤＨＷ、左パネル）として測定された、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭからのＬＣＲが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭからの自発的なＣａ２＋放出現象よりも長く、広いことを示す。Ｃａ２＋シグナルの振幅（Ｆ／Ｆｏの任意の単位で測定される、右パネル）は、２つのグループ間に類似している。
【図３Ｈ】ＮＲＶＭにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのＴｂｘ１８発現の効果を示す。図３Ａは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの線走査共焦点イメージングが、天然のＳＡＮペースメーカー中で観察されるＬＣＲを再現する、各全細胞Ｃａ２＋トランジェント（１０個の細胞からｎ＝８）に先立つ局所的Ｃａ２＋放出現象（ＬＣＲ）を解像したことを示す。図３Ｂは、対照細胞中のＬＣＲを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図３Ｃは、ＬＣＲが、サイクル長の７２±１％の平均期間を有したことを示す。図３Ｄは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいてカフェイン（２０ｍＭ）誘発性Ｃａ２＋トランジェントの２．３倍の増加を示すＣａ２＋濃度の変化の空間平均されたｄＦ／Ｆ０プロットを示す。図３Ｅは、自発的なＣａ２＋トランジェントが、対照におけるわずか１２±２％の抑制と比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＲｙＲ遮断薬であるリアノジン（１０μＭ）による灌流上で４７±６％抑制されることを示す。図３Ｆは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのＳＡＮに類似している全ＰＬＢレベルの減少およびリン酸化ＰＬＢ（ｓｅ１６）の増加を示したことを示す。図３Ｇは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＳＥＲＣＡ２Ａ、ＮＣＸＩ、およびＲｙＲのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連ｐ−ＰＬＢ（Ｓｅｒ１６）レベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて６５倍高く（図３Ｆ、左パネル）、心室心筋内のものと比較して、ＳＡＮにおいて見られるｐＰＬＮの増大を模倣した（図３Ｆ、右パネル）。ウサギのＳＡＮ対左心室における所見と一致して、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＮＣＸｌ、およびリアノジン受容体（ＲｙＲ）のタンパク質レベルにおける差異は、Ｔｈｘ１８−とＧＦＰ−ＮＲＶＭ（図３Ｇ）との間において検出されなかった。図３Ｈは、ＧＦＰ−ＮＶＲＭ（白バー）およびＴｂｘ１８−ＮＶＲＭ（斜線格子柄のバー）の細胞内ｃＡＭＰレベルに関するデータを示す。細胞内ｃＡＭＰレベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて著しく高く、これは、ウサギのＳＡＮと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図３Ｉは、ＧＦＰ−またはＴｂｘ１８ＮＶＲＭにおけるＣａ２＋トランジェントに関するデータを示す。ＰＫＡ阻害剤（ＰＫＩ、１５μＭ）の適用は、Ｔｂｘ−ＮＲＶＭにおける自発的な全細胞のＣａ２＋トランジェントの休止を引き起こしたが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭ上では効果がなかった。図３Ｊは、最大半量の持続時間での全幅（ＦＷＨＤ、左パネル）、および最大半量の幅での全持続時間（ＦＤＨＷ、左パネル）として測定された、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭからのＬＣＲが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭからの自発的なＣａ２＋放出現象よりも長く、広いことを示す。Ｃａ２＋シグナルの振幅（Ｆ／Ｆｏの任意の単位で測定される、右パネル）は、２つのグループ間に類似している。
【図３Ｉ】ＮＲＶＭにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのＴｂｘ１８発現の効果を示す。図３Ａは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの線走査共焦点イメージングが、天然のＳＡＮペースメーカー中で観察されるＬＣＲを再現する、各全細胞Ｃａ２＋トランジェント（１０個の細胞からｎ＝８）に先立つ局所的Ｃａ２＋放出現象（ＬＣＲ）を解像したことを示す。図３Ｂは、対照細胞中のＬＣＲを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図３Ｃは、ＬＣＲが、サイクル長の７２±１％の平均期間を有したことを示す。図３Ｄは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいてカフェイン（２０ｍＭ）誘発性Ｃａ２＋トランジェントの２．３倍の増加を示すＣａ２＋濃度の変化の空間平均されたｄＦ／Ｆ０プロットを示す。図３Ｅは、自発的なＣａ２＋トランジェントが、対照におけるわずか１２±２％の抑制と比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＲｙＲ遮断薬であるリアノジン（１０μＭ）による灌流上で４７±６％抑制されることを示す。図３Ｆは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのＳＡＮに類似している全ＰＬＢレベルの減少およびリン酸化ＰＬＢ（ｓｅ１６）の増加を示したことを示す。図３Ｇは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＳＥＲＣＡ２Ａ、ＮＣＸＩ、およびＲｙＲのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連ｐ−ＰＬＢ（Ｓｅｒ１６）レベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて６５倍高く（図３Ｆ、左パネル）、心室心筋内のものと比較して、ＳＡＮにおいて見られるｐＰＬＮの増大を模倣した（図３Ｆ、右パネル）。ウサギのＳＡＮ対左心室における所見と一致して、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＮＣＸｌ、およびリアノジン受容体（ＲｙＲ）のタンパク質レベルにおける差異は、Ｔｈｘ１８−とＧＦＰ−ＮＲＶＭ（図３Ｇ）との間において検出されなかった。図３Ｈは、ＧＦＰ−ＮＶＲＭ（白バー）およびＴｂｘ１８−ＮＶＲＭ（斜線格子柄のバー）の細胞内ｃＡＭＰレベルに関するデータを示す。細胞内ｃＡＭＰレベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて著しく高く、これは、ウサギのＳＡＮと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図３Ｉは、ＧＦＰ−またはＴｂｘ１８ＮＶＲＭにおけるＣａ２＋トランジェントに関するデータを示す。ＰＫＡ阻害剤（ＰＫＩ、１５μＭ）の適用は、Ｔｂｘ−ＮＲＶＭにおける自発的な全細胞のＣａ２＋トランジェントの休止を引き起こしたが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭ上では効果がなかった。図３Ｊは、最大半量の持続時間での全幅（ＦＷＨＤ、左パネル）、および最大半量の幅での全持続時間（ＦＤＨＷ、左パネル）として測定された、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭからのＬＣＲが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭからの自発的なＣａ２＋放出現象よりも長く、広いことを示す。Ｃａ２＋シグナルの振幅（Ｆ／Ｆｏの任意の単位で測定される、右パネル）は、２つのグループ間に類似している。
【図３Ｊ】ＮＲＶＭにおける心臓のカルシウムシグナリングの種々の点上でのＴｂｘ１８発現の効果を示す。図３Ａは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの線走査共焦点イメージングが、天然のＳＡＮペースメーカー中で観察されるＬＣＲを再現する、各全細胞Ｃａ２＋トランジェント（１０個の細胞からｎ＝８）に先立つ局所的Ｃａ２＋放出現象（ＬＣＲ）を解像したことを示す。図３Ｂは、対照細胞中のＬＣＲを示す。時折ランダムに分布したスパークが観察された。図３Ｃは、ＬＣＲが、サイクル長の７２±１％の平均期間を有したことを示す。図３Ｄは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいてカフェイン（２０ｍＭ）誘発性Ｃａ２＋トランジェントの２．３倍の増加を示すＣａ２＋濃度の変化の空間平均されたｄＦ／Ｆ０プロットを示す。図３Ｅは、自発的なＣａ２＋トランジェントが、対照におけるわずか１２±２％の抑制と比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＲｙＲ遮断薬であるリアノジン（１０μＭ）による灌流上で４７±６％抑制されることを示す。図３Ｆは、ウエスタンブロット実験が、成体ラットのＳＡＮに類似している全ＰＬＢレベルの減少およびリン酸化ＰＬＢ（ｓｅ１６）の増加を示したことを示す。図３Ｇは、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＳＥＲＣＡ２Ａ、ＮＣＸＩ、およびＲｙＲのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかったことを示す。関連ｐ−ＰＬＢ（Ｓｅｒ１６）レベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて６５倍高く（図３Ｆ、左パネル）、心室心筋内のものと比較して、ＳＡＮにおいて見られるｐＰＬＮの増大を模倣した（図３Ｆ、右パネル）。ウサギのＳＡＮ対左心室における所見と一致して、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＮＣＸｌ、およびリアノジン受容体（ＲｙＲ）のタンパク質レベルにおける差異は、Ｔｈｘ１８−とＧＦＰ−ＮＲＶＭ（図３Ｇ）との間において検出されなかった。図３Ｈは、ＧＦＰ−ＮＶＲＭ（白バー）およびＴｂｘ１８−ＮＶＲＭ（斜線格子柄のバー）の細胞内ｃＡＭＰレベルに関するデータを示す。細胞内ｃＡＭＰレベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて著しく高く、これは、ウサギのＳＡＮと心室心筋との比較の間に存在することが知られている増加を模倣する。図３Ｉは、ＧＦＰ−またはＴｂｘ１８ＮＶＲＭにおけるＣａ２＋トランジェントに関するデータを示す。ＰＫＡ阻害剤（ＰＫＩ、１５μＭ）の適用は、Ｔｂｘ−ＮＲＶＭにおける自発的な全細胞のＣａ２＋トランジェントの休止を引き起こしたが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭ上では効果がなかった。図３Ｊは、最大半量の持続時間での全幅（ＦＷＨＤ、左パネル）、および最大半量の幅での全持続時間（ＦＤＨＷ、左パネル）として測定された、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭからのＬＣＲが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭからの自発的なＣａ２＋放出現象よりも長く、広いことを示す。Ｃａ２＋シグナルの振幅（Ｆ／Ｆｏの任意の単位で測定される、右パネル）は、２つのグループ間に類似している。
【図４Ａ】Ｔｂｘ−１８形質導入後の種々の心臓タンパク質の発現、機能、およびチャネル発現に関するデータを示す。図４Ａは、ＨＣＮ４発現（上段、中央）によって境界を画定される新生ラットのＳＡＮを示し、それは、より弱く、不定形の筋節α−アクチニン（α−ＳＡ）発現（上段パネル）を示す。下段左：上段左内の囲まれた範囲の拡大画像。図４Ｂは、対照と比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの膜容量において細胞範囲の２８％の減少および３３％の減少（それぞれ、左および右）を示す。図４Ｃ：Ｈ３Ｋ２７上のトリメチル化レベル（左）は、対照に正規化されるＨＣＮ４プロモーター上のその抑圧的な後成的圧力を解放する一方、Ｔｂｘ１８が、Ｃｘ４３、Ｋｉｒ２．１、およびα−ＳＡプロモーターの不活性を増加したことを示す。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３レベル（右）は、Ｃｘ４３、Ｋｉｒ２．１、およびａ−ＳＡの転写的活性プロモーター領域が、Ｔｂｘ１８発現に応じて減少した一方、活性ＨＣＮ４プロモーター領域の割合が、Ｔｂｘ１８発現に応じて増加したことを示す。
【図４Ｂ】Ｔｂｘ−１８形質導入後の種々の心臓タンパク質の発現、機能、およびチャネル発現に関するデータを示す。図４Ａは、ＨＣＮ４発現（上段、中央）によって境界を画定される新生ラットのＳＡＮを示し、それは、より弱く、不定形の筋節α−アクチニン（α−ＳＡ）発現（上段パネル）を示す。下段左：上段左内の囲まれた範囲の拡大画像。図４Ｂは、対照と比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの膜容量において細胞範囲の２８％の減少および３３％の減少（それぞれ、左および右）を示す。図４Ｃ：Ｈ３Ｋ２７上のトリメチル化レベル（左）は、対照に正規化されるＨＣＮ４プロモーター上のその抑圧的な後成的圧力を解放する一方、Ｔｂｘ１８が、Ｃｘ４３、Ｋｉｒ２．１、およびα−ＳＡプロモーターの不活性を増加したことを示す。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３レベル（右）は、Ｃｘ４３、Ｋｉｒ２．１、およびａ−ＳＡの転写的活性プロモーター領域が、Ｔｂｘ１８発現に応じて減少した一方、活性ＨＣＮ４プロモーター領域の割合が、Ｔｂｘ１８発現に応じて増加したことを示す。
【図４Ｃ】Ｔｂｘ−１８形質導入後の種々の心臓タンパク質の発現、機能、およびチャネル発現に関するデータを示す。図４Ａは、ＨＣＮ４発現（上段、中央）によって境界を画定される新生ラットのＳＡＮを示し、それは、より弱く、不定形の筋節α−アクチニン（α−ＳＡ）発現（上段パネル）を示す。下段左：上段左内の囲まれた範囲の拡大画像。図４Ｂは、対照と比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの膜容量において細胞範囲の２８％の減少および３３％の減少（それぞれ、左および右）を示す。図４Ｃ：Ｈ３Ｋ２７上のトリメチル化レベル（左）は、対照に正規化されるＨＣＮ４プロモーター上のその抑圧的な後成的圧力を解放する一方、Ｔｂｘ１８が、Ｃｘ４３、Ｋｉｒ２．１、およびα−ＳＡプロモーターの不活性を増加したことを示す。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３レベル（右）は、Ｃｘ４３、Ｋｉｒ２．１、およびａ−ＳＡの転写的活性プロモーター領域が、Ｔｂｘ１８発現に応じて減少した一方、活性ＨＣＮ４プロモーター領域の割合が、Ｔｂｘ１８発現に応じて増加したことを示す。
【図５Ａ】胎児心臓特有の遺伝子および細胞マーカーの研究を示す。データは、胎生／胎児状態への脱分化ではなく、Ｔｂｘ１８に誘導される特異的再操作を支持する。図５Ａ〜５Ｂは、エンドセリン−Ｉ（１００ｎＭ）を用いた２４時間の刺激によって誘導されるＮＲＶＭ中の心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の発現を示す。ＧＦＰは効果がなかった（Ａ、下段パネル）が、一方ＡＮＰ発現は、Ｔｂｘ１８発現によって抑制された（Ｂ、下段パネル）。図５Ｃは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭ中の骨格αアクチン（αＳｋＡ）の発現を示す。図５Ｄは、ホスホヒストン３（Ｈ３Ｐ、有糸分裂的活性細胞マーカー）の発現ならびにＥｄＵ（ＢｒｄＵの類似体、有糸分裂および新生ＤＮＡ合成のマーカー）のＧＦＰ−およびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭへの取り込みを示す（ｎ＝３）。免疫組織化学データが、上段パネルに、要約データが、対応する下段パネルに示される。発現およびこれらのマーカーのＴｂｘ１８−およびＧＦＰ−ＮＲＶＭ中への取り込みは同等であり、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭは、胎生／胎児状態に脱分化しなかったという結論を支持する。図５Ｅおよび５Ｇは、クロマチンリモデリングに関する８４個の遺伝子の発現の比較において、Ｔｂｘ１８−とＧＦＰ−ＮＲＶＭとの間のごくわずかな全体的な差異の存在を示す。図５Ｆおよび５Ｈは、ｉＰＳ細胞とそれらの親の線維芽細胞との間の類似の比較を示す。
【図５Ｂ】胎児心臓特有の遺伝子および細胞マーカーの研究を示す。データは、胎生／胎児状態への脱分化ではなく、Ｔｂｘ１８に誘導される特異的再操作を支持する。図５Ａ〜５Ｂは、エンドセリン−Ｉ（１００ｎＭ）を用いた２４時間の刺激によって誘導されるＮＲＶＭ中の心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の発現を示す。ＧＦＰは効果がなかった（Ａ、下段パネル）が、一方ＡＮＰ発現は、Ｔｂｘ１８発現によって抑制された（Ｂ、下段パネル）。図５Ｃは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭ中の骨格αアクチン（αＳｋＡ）の発現を示す。図５Ｄは、ホスホヒストン３（Ｈ３Ｐ、有糸分裂的活性細胞マーカー）の発現ならびにＥｄＵ（ＢｒｄＵの類似体、有糸分裂および新生ＤＮＡ合成のマーカー）のＧＦＰ−およびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭへの取り込みを示す（ｎ＝３）。免疫組織化学データが、上段パネルに、要約データが、対応する下段パネルに示される。発現およびこれらのマーカーのＴｂｘ１８−およびＧＦＰ−ＮＲＶＭ中への取り込みは同等であり、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭは、胎生／胎児状態に脱分化しなかったという結論を支持する。図５Ｅおよび５Ｇは、クロマチンリモデリングに関する８４個の遺伝子の発現の比較において、Ｔｂｘ１８−とＧＦＰ−ＮＲＶＭとの間のごくわずかな全体的な差異の存在を示す。図５Ｆおよび５Ｈは、ｉＰＳ細胞とそれらの親の線維芽細胞との間の類似の比較を示す。
【図５Ｃ】胎児心臓特有の遺伝子および細胞マーカーの研究を示す。データは、胎生／胎児状態への脱分化ではなく、Ｔｂｘ１８に誘導される特異的再操作を支持する。図５Ａ〜５Ｂは、エンドセリン−Ｉ（１００ｎＭ）を用いた２４時間の刺激によって誘導されるＮＲＶＭ中の心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の発現を示す。ＧＦＰは効果がなかった（Ａ、下段パネル）が、一方ＡＮＰ発現は、Ｔｂｘ１８発現によって抑制された（Ｂ、下段パネル）。図５Ｃは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭ中の骨格αアクチン（αＳｋＡ）の発現を示す。図５Ｄは、ホスホヒストン３（Ｈ３Ｐ、有糸分裂的活性細胞マーカー）の発現ならびにＥｄＵ（ＢｒｄＵの類似体、有糸分裂および新生ＤＮＡ合成のマーカー）のＧＦＰ−およびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭへの取り込みを示す（ｎ＝３）。免疫組織化学データが、上段パネルに、要約データが、対応する下段パネルに示される。発現およびこれらのマーカーのＴｂｘ１８−およびＧＦＰ−ＮＲＶＭ中への取り込みは同等であり、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭは、胎生／胎児状態に脱分化しなかったという結論を支持する。図５Ｅおよび５Ｇは、クロマチンリモデリングに関する８４個の遺伝子の発現の比較において、Ｔｂｘ１８−とＧＦＰ−ＮＲＶＭとの間のごくわずかな全体的な差異の存在を示す。図５Ｆおよび５Ｈは、ｉＰＳ細胞とそれらの親の線維芽細胞との間の類似の比較を示す。
【図５Ｄ】胎児心臓特有の遺伝子および細胞マーカーの研究を示す。データは、胎生／胎児状態への脱分化ではなく、Ｔｂｘ１８に誘導される特異的再操作を支持する。図５Ａ〜５Ｂは、エンドセリン−Ｉ（１００ｎＭ）を用いた２４時間の刺激によって誘導されるＮＲＶＭ中の心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の発現を示す。ＧＦＰは効果がなかった（Ａ、下段パネル）が、一方ＡＮＰ発現は、Ｔｂｘ１８発現によって抑制された（Ｂ、下段パネル）。図５Ｃは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭ中の骨格αアクチン（αＳｋＡ）の発現を示す。図５Ｄは、ホスホヒストン３（Ｈ３Ｐ、有糸分裂的活性細胞マーカー）の発現ならびにＥｄＵ（ＢｒｄＵの類似体、有糸分裂および新生ＤＮＡ合成のマーカー）のＧＦＰ−およびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭへの取り込みを示す（ｎ＝３）。免疫組織化学データが、上段パネルに、要約データが、対応する下段パネルに示される。発現およびこれらのマーカーのＴｂｘ１８−およびＧＦＰ−ＮＲＶＭ中への取り込みは同等であり、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭは、胎生／胎児状態に脱分化しなかったという結論を支持する。図５Ｅおよび５Ｇは、クロマチンリモデリングに関する８４個の遺伝子の発現の比較において、Ｔｂｘ１８−とＧＦＰ−ＮＲＶＭとの間のごくわずかな全体的な差異の存在を示す。図５Ｆおよび５Ｈは、ｉＰＳ細胞とそれらの親の線維芽細胞との間の類似の比較を示す。
【図５Ｅ】胎児心臓特有の遺伝子および細胞マーカーの研究を示す。データは、胎生／胎児状態への脱分化ではなく、Ｔｂｘ１８に誘導される特異的再操作を支持する。図５Ａ〜５Ｂは、エンドセリン−Ｉ（１００ｎＭ）を用いた２４時間の刺激によって誘導されるＮＲＶＭ中の心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の発現を示す。ＧＦＰは効果がなかった（Ａ、下段パネル）が、一方ＡＮＰ発現は、Ｔｂｘ１８発現によって抑制された（Ｂ、下段パネル）。図５Ｃは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭ中の骨格αアクチン（αＳｋＡ）の発現を示す。図５Ｄは、ホスホヒストン３（Ｈ３Ｐ、有糸分裂的活性細胞マーカー）の発現ならびにＥｄＵ（ＢｒｄＵの類似体、有糸分裂および新生ＤＮＡ合成のマーカー）のＧＦＰ−およびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭへの取り込みを示す（ｎ＝３）。免疫組織化学データが、上段パネルに、要約データが、対応する下段パネルに示される。発現およびこれらのマーカーのＴｂｘ１８−およびＧＦＰ−ＮＲＶＭ中への取り込みは同等であり、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭは、胎生／胎児状態に脱分化しなかったという結論を支持する。図５Ｅおよび５Ｇは、クロマチンリモデリングに関する８４個の遺伝子の発現の比較において、Ｔｂｘ１８−とＧＦＰ−ＮＲＶＭとの間のごくわずかな全体的な差異の存在を示す。図５Ｆおよび５Ｈは、ｉＰＳ細胞とそれらの親の線維芽細胞との間の類似の比較を示す。
【図５Ｆ】胎児心臓特有の遺伝子および細胞マーカーの研究を示す。データは、胎生／胎児状態への脱分化ではなく、Ｔｂｘ１８に誘導される特異的再操作を支持する。図５Ａ〜５Ｂは、エンドセリン−Ｉ（１００ｎＭ）を用いた２４時間の刺激によって誘導されるＮＲＶＭ中の心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の発現を示す。ＧＦＰは効果がなかった（Ａ、下段パネル）が、一方ＡＮＰ発現は、Ｔｂｘ１８発現によって抑制された（Ｂ、下段パネル）。図５Ｃは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭ中の骨格αアクチン（αＳｋＡ）の発現を示す。図５Ｄは、ホスホヒストン３（Ｈ３Ｐ、有糸分裂的活性細胞マーカー）の発現ならびにＥｄＵ（ＢｒｄＵの類似体、有糸分裂および新生ＤＮＡ合成のマーカー）のＧＦＰ−およびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭへの取り込みを示す（ｎ＝３）。免疫組織化学データが、上段パネルに、要約データが、対応する下段パネルに示される。発現およびこれらのマーカーのＴｂｘ１８−およびＧＦＰ−ＮＲＶＭ中への取り込みは同等であり、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭは、胎生／胎児状態に脱分化しなかったという結論を支持する。図５Ｅおよび５Ｇは、クロマチンリモデリングに関する８４個の遺伝子の発現の比較において、Ｔｂｘ１８−とＧＦＰ−ＮＲＶＭとの間のごくわずかな全体的な差異の存在を示す。図５Ｆおよび５Ｈは、ｉＰＳ細胞とそれらの親の線維芽細胞との間の類似の比較を示す。
【図５Ｇ】胎児心臓特有の遺伝子および細胞マーカーの研究を示す。データは、胎生／胎児状態への脱分化ではなく、Ｔｂｘ１８に誘導される特異的再操作を支持する。図５Ａ〜５Ｂは、エンドセリン−Ｉ（１００ｎＭ）を用いた２４時間の刺激によって誘導されるＮＲＶＭ中の心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の発現を示す。ＧＦＰは効果がなかった（Ａ、下段パネル）が、一方ＡＮＰ発現は、Ｔｂｘ１８発現によって抑制された（Ｂ、下段パネル）。図５Ｃは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭ中の骨格αアクチン（αＳｋＡ）の発現を示す。図５Ｄは、ホスホヒストン３（Ｈ３Ｐ、有糸分裂的活性細胞マーカー）の発現ならびにＥｄＵ（ＢｒｄＵの類似体、有糸分裂および新生ＤＮＡ合成のマーカー）のＧＦＰ−およびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭへの取り込みを示す（ｎ＝３）。免疫組織化学データが、上段パネルに、要約データが、対応する下段パネルに示される。発現およびこれらのマーカーのＴｂｘ１８−およびＧＦＰ−ＮＲＶＭ中への取り込みは同等であり、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭは、胎生／胎児状態に脱分化しなかったという結論を支持する。図５Ｅおよび５Ｇは、クロマチンリモデリングに関する８４個の遺伝子の発現の比較において、Ｔｂｘ１８−とＧＦＰ−ＮＲＶＭとの間のごくわずかな全体的な差異の存在を示す。図５Ｆおよび５Ｈは、ｉＰＳ細胞とそれらの親の線維芽細胞との間の類似の比較を示す。
【図５Ｈ】胎児心臓特有の遺伝子および細胞マーカーの研究を示す。データは、胎生／胎児状態への脱分化ではなく、Ｔｂｘ１８に誘導される特異的再操作を支持する。図５Ａ〜５Ｂは、エンドセリン−Ｉ（１００ｎＭ）を用いた２４時間の刺激によって誘導されるＮＲＶＭ中の心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の発現を示す。ＧＦＰは効果がなかった（Ａ、下段パネル）が、一方ＡＮＰ発現は、Ｔｂｘ１８発現によって抑制された（Ｂ、下段パネル）。図５Ｃは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭ中の骨格αアクチン（αＳｋＡ）の発現を示す。図５Ｄは、ホスホヒストン３（Ｈ３Ｐ、有糸分裂的活性細胞マーカー）の発現ならびにＥｄＵ（ＢｒｄＵの類似体、有糸分裂および新生ＤＮＡ合成のマーカー）のＧＦＰ−およびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭへの取り込みを示す（ｎ＝３）。免疫組織化学データが、上段パネルに、要約データが、対応する下段パネルに示される。発現およびこれらのマーカーのＴｂｘ１８−およびＧＦＰ−ＮＲＶＭ中への取り込みは同等であり、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭは、胎生／胎児状態に脱分化しなかったという結論を支持する。図５Ｅおよび５Ｇは、クロマチンリモデリングに関する８４個の遺伝子の発現の比較において、Ｔｂｘ１８−とＧＦＰ−ＮＲＶＭとの間のごくわずかな全体的な差異の存在を示す。図５Ｆおよび５Ｈは、ｉＰＳ細胞とそれらの親の線維芽細胞との間の類似の比較を示す。
【図６Ａ】心室異所性拍動に関するデータを示す。図６Ａは、インビボでモルモットの心臓の心尖部におけるＴｂｘ１８の局所的発現が、ＧＦＰ（左パネル）と比較して異所性の心室拍動（右パネル）を引き起こしたことを示す。図６Ｂは、遺伝子送達後３〜５日間のＴｂｘ１８−注入動物における異所性心室拍動の速度が、対照よりも著しく速いことを示す。
【図６Ｂ】心室異所性拍動に関するデータを示す。図６Ａは、インビボでモルモットの心臓の心尖部におけるＴｂｘ１８の局所的発現が、ＧＦＰ（左パネル）と比較して異所性の心室拍動（右パネル）を引き起こしたことを示す。図６Ｂは、遺伝子送達後３〜５日間のＴｂｘ１８−注入動物における異所性心室拍動の速度が、対照よりも著しく速いことを示す。
【図７Ａ】インビボでのモルモットの心臓の心尖部におけるＴｂｘ１８（７Ａ）の局所的発現が、（ＧＦＰ対照（７Ｂ）と比較して）異所性心室拍動を引き起こしたことを示す。これらのデータはまた、ＴＢＸ１８動物（７Ｃ）およびＧＦＰ対照（７Ｄ）からのＥＫＧ記録においても表される。
【図７Ｂ】インビボでのモルモットの心臓の心尖部におけるＴｂｘ１８（７Ａ）の局所的発現が、（ＧＦＰ対照（７Ｂ）と比較して）異所性心室拍動を引き起こしたことを示す。これらのデータはまた、ＴＢＸ１８動物（７Ｃ）およびＧＦＰ対照（７Ｄ）からのＥＫＧ記録においても表される。
【図７Ｃ】インビボでのモルモットの心臓の心尖部におけるＴｂｘ１８（７Ａ）の局所的発現が、（ＧＦＰ対照（７Ｂ）と比較して）異所性心室拍動を引き起こしたことを示す。これらのデータはまた、ＴＢＸ１８動物（７Ｃ）およびＧＦＰ対照（７Ｄ）からのＥＫＧ記録においても表される。
【図７Ｄ】インビボでのモルモットの心臓の心尖部におけるＴｂｘ１８（７Ａ）の局所的発現が、（ＧＦＰ対照（７Ｂ）と比較して）異所性心室拍動を引き起こしたことを示す。これらのデータはまた、ＴＢＸ１８動物（７Ｃ）およびＧＦＰ対照（７Ｄ）からのＥＫＧ記録においても表される。
【図８】単一の筋細胞が注入の５日間後に単離されるＴｂｘ１８−注入成体モルモットの心臓を示す。誘導ＳＡＮペースメーカー細胞は、Ｔｂｘ１８体細胞リプログラミングによって作成される（下の右パネル）。
【図９Ａ】Ｔｂｘ１８を形質導入された心室筋細胞およびＧＦＰを形質導入された心室筋細胞（ＶＭ）の種々の特徴を示す。図９Ａは、Ｔｂｘ１８を形質導入された誘導ＳＡＮ（ｉＳＡＮ）細胞（ＧＦＰ−陽性細胞、上段写真）対天然の細胞（下段）を示す。図９Ｂは、Ｔｂｘ１８−ＶＭおよびＧＦＰ−ＶＭと比較したＳＡＮ筋細胞を示す。上のパネルは、明視野画像であり、下の視野は、蛍光画像である。α−ＳＡに対する免疫染色は、天然のＳＡＮ筋細胞のものに類似しているＴｂｘ１８−ＶＭ中の無秩序な筋原線維構造を明らかにした。図９Ｃは、新たに単離された、生ＳＡＮ筋細胞、Ｔｂｘ１８−ＶＭ（ＧＦＰ発現によって報告される）、およびＧＦＰ−ＶＭ（上段パネル）、ならびに免疫染色された固定筋細胞（下段パネル）の代表的な明視野画像を示す。図９Ｄは、新たに単離された生筋細胞からの細胞の形状および大きさの測定として、筋細胞の長さ／幅比および全細胞容量の分析を示す。Ｔｂｘ１８−ＶＭは、ＧＦＰ−ＶＭ（Ｔｂｘ１８−ＶＭに対してｎ＝５３、ならびにＧＦＢ−ＶＭおよび非形質導入ＶＭに対して８０、ｐ＜０．０１）と比較してより小さい大きさで、紡錘状であるが、天然のＳＡＮ筋細胞（ｎ＝２４）と類似している。図９Ｅは、穿孔処理パッチの電流固定技術を使用して、新たに単離される単一のＴｂｘ１８−ＶＭ（ｎ＝５、中央のパネル）から記録された自発的な活動電位を示す。これらのデータは、Ｔｂｘ１８が、天然のＳＡＮ筋細胞（左パネル）と類似の顕著な拡張期脱分極を有する力強く、律動的なＡＰを表すことを示す。同じ記録が、Ｔｂｘ１８−ＶＭおよび天然のＳＡＮ筋細胞において顕著な拡張期脱分極を示すため、下段パネルに拡張される。右パネルは、安定した静止膜電位を表示し、電気刺激に応じてのみ単一の活動電位を発火するＧＦＰ−ＶＭを示す。図９Ｆは、Ｔｂｘ１８−ＶＭ（ｎ＝５）の活動電位パラメータが、ＧＦＰ−ＶＭ（ｎ＝６）よりも天然のＳＡＮ筋細胞（ｎ＝６）に近かったことを示す。図９Ｇは、天然のＳＡＮ筋細胞、１週間のＧＦＰ−ＶＭ、およびウイルスなしの対照と比較して、１週間、３週間、および６週間のＴｂｘ１８−ＶＭの長さ／幅比を示す。
【図９Ｂ】Ｔｂｘ１８を形質導入された心室筋細胞およびＧＦＰを形質導入された心室筋細胞（ＶＭ）の種々の特徴を示す。図９Ａは、Ｔｂｘ１８を形質導入された誘導ＳＡＮ（ｉＳＡＮ）細胞（ＧＦＰ−陽性細胞、上段写真）対天然の細胞（下段）を示す。図９Ｂは、Ｔｂｘ１８−ＶＭおよびＧＦＰ−ＶＭと比較したＳＡＮ筋細胞を示す。上のパネルは、明視野画像であり、下の視野は、蛍光画像である。α−ＳＡに対する免疫染色は、天然のＳＡＮ筋細胞のものに類似しているＴｂｘ１８−ＶＭ中の無秩序な筋原線維構造を明らかにした。図９Ｃは、新たに単離された、生ＳＡＮ筋細胞、Ｔｂｘ１８−ＶＭ（ＧＦＰ発現によって報告される）、およびＧＦＰ−ＶＭ（上段パネル）、ならびに免疫染色された固定筋細胞（下段パネル）の代表的な明視野画像を示す。図９Ｄは、新たに単離された生筋細胞からの細胞の形状および大きさの測定として、筋細胞の長さ／幅比および全細胞容量の分析を示す。Ｔｂｘ１８−ＶＭは、ＧＦＰ−ＶＭ（Ｔｂｘ１８−ＶＭに対してｎ＝５３、ならびにＧＦＢ−ＶＭおよび非形質導入ＶＭに対して８０、ｐ＜０．０１）と比較してより小さい大きさで、紡錘状であるが、天然のＳＡＮ筋細胞（ｎ＝２４）と類似している。図９Ｅは、穿孔処理パッチの電流固定技術を使用して、新たに単離される単一のＴｂｘ１８−ＶＭ（ｎ＝５、中央のパネル）から記録された自発的な活動電位を示す。これらのデータは、Ｔｂｘ１８が、天然のＳＡＮ筋細胞（左パネル）と類似の顕著な拡張期脱分極を有する力強く、律動的なＡＰを表すことを示す。同じ記録が、Ｔｂｘ１８−ＶＭおよび天然のＳＡＮ筋細胞において顕著な拡張期脱分極を示すため、下段パネルに拡張される。右パネルは、安定した静止膜電位を表示し、電気刺激に応じてのみ単一の活動電位を発火するＧＦＰ−ＶＭを示す。図９Ｆは、Ｔｂｘ１８−ＶＭ（ｎ＝５）の活動電位パラメータが、ＧＦＰ−ＶＭ（ｎ＝６）よりも天然のＳＡＮ筋細胞（ｎ＝６）に近かったことを示す。図９Ｇは、天然のＳＡＮ筋細胞、１週間のＧＦＰ−ＶＭ、およびウイルスなしの対照と比較して、１週間、３週間、および６週間のＴｂｘ１８−ＶＭの長さ／幅比を示す。
【図９Ｃ】Ｔｂｘ１８を形質導入された心室筋細胞およびＧＦＰを形質導入された心室筋細胞（ＶＭ）の種々の特徴を示す。図９Ａは、Ｔｂｘ１８を形質導入された誘導ＳＡＮ（ｉＳＡＮ）細胞（ＧＦＰ−陽性細胞、上段写真）対天然の細胞（下段）を示す。図９Ｂは、Ｔｂｘ１８−ＶＭおよびＧＦＰ−ＶＭと比較したＳＡＮ筋細胞を示す。上のパネルは、明視野画像であり、下の視野は、蛍光画像である。α−ＳＡに対する免疫染色は、天然のＳＡＮ筋細胞のものに類似しているＴｂｘ１８−ＶＭ中の無秩序な筋原線維構造を明らかにした。図９Ｃは、新たに単離された、生ＳＡＮ筋細胞、Ｔｂｘ１８−ＶＭ（ＧＦＰ発現によって報告される）、およびＧＦＰ−ＶＭ（上段パネル）、ならびに免疫染色された固定筋細胞（下段パネル）の代表的な明視野画像を示す。図９Ｄは、新たに単離された生筋細胞からの細胞の形状および大きさの測定として、筋細胞の長さ／幅比および全細胞容量の分析を示す。Ｔｂｘ１８−ＶＭは、ＧＦＰ−ＶＭ（Ｔｂｘ１８−ＶＭに対してｎ＝５３、ならびにＧＦＢ−ＶＭおよび非形質導入ＶＭに対して８０、ｐ＜０．０１）と比較してより小さい大きさで、紡錘状であるが、天然のＳＡＮ筋細胞（ｎ＝２４）と類似している。図９Ｅは、穿孔処理パッチの電流固定技術を使用して、新たに単離される単一のＴｂｘ１８−ＶＭ（ｎ＝５、中央のパネル）から記録された自発的な活動電位を示す。これらのデータは、Ｔｂｘ１８が、天然のＳＡＮ筋細胞（左パネル）と類似の顕著な拡張期脱分極を有する力強く、律動的なＡＰを表すことを示す。同じ記録が、Ｔｂｘ１８−ＶＭおよび天然のＳＡＮ筋細胞において顕著な拡張期脱分極を示すため、下段パネルに拡張される。右パネルは、安定した静止膜電位を表示し、電気刺激に応じてのみ単一の活動電位を発火するＧＦＰ−ＶＭを示す。図９Ｆは、Ｔｂｘ１８−ＶＭ（ｎ＝５）の活動電位パラメータが、ＧＦＰ−ＶＭ（ｎ＝６）よりも天然のＳＡＮ筋細胞（ｎ＝６）に近かったことを示す。図９Ｇは、天然のＳＡＮ筋細胞、１週間のＧＦＰ−ＶＭ、およびウイルスなしの対照と比較して、１週間、３週間、および６週間のＴｂｘ１８−ＶＭの長さ／幅比を示す。
【図９Ｄ】Ｔｂｘ１８を形質導入された心室筋細胞およびＧＦＰを形質導入された心室筋細胞（ＶＭ）の種々の特徴を示す。図９Ａは、Ｔｂｘ１８を形質導入された誘導ＳＡＮ（ｉＳＡＮ）細胞（ＧＦＰ−陽性細胞、上段写真）対天然の細胞（下段）を示す。図９Ｂは、Ｔｂｘ１８−ＶＭおよびＧＦＰ−ＶＭと比較したＳＡＮ筋細胞を示す。上のパネルは、明視野画像であり、下の視野は、蛍光画像である。α−ＳＡに対する免疫染色は、天然のＳＡＮ筋細胞のものに類似しているＴｂｘ１８−ＶＭ中の無秩序な筋原線維構造を明らかにした。図９Ｃは、新たに単離された、生ＳＡＮ筋細胞、Ｔｂｘ１８−ＶＭ（ＧＦＰ発現によって報告される）、およびＧＦＰ−ＶＭ（上段パネル）、ならびに免疫染色された固定筋細胞（下段パネル）の代表的な明視野画像を示す。図９Ｄは、新たに単離された生筋細胞からの細胞の形状および大きさの測定として、筋細胞の長さ／幅比および全細胞容量の分析を示す。Ｔｂｘ１８−ＶＭは、ＧＦＰ−ＶＭ（Ｔｂｘ１８−ＶＭに対してｎ＝５３、ならびにＧＦＢ−ＶＭおよび非形質導入ＶＭに対して８０、ｐ＜０．０１）と比較してより小さい大きさで、紡錘状であるが、天然のＳＡＮ筋細胞（ｎ＝２４）と類似している。図９Ｅは、穿孔処理パッチの電流固定技術を使用して、新たに単離される単一のＴｂｘ１８−ＶＭ（ｎ＝５、中央のパネル）から記録された自発的な活動電位を示す。これらのデータは、Ｔｂｘ１８が、天然のＳＡＮ筋細胞（左パネル）と類似の顕著な拡張期脱分極を有する力強く、律動的なＡＰを表すことを示す。同じ記録が、Ｔｂｘ１８−ＶＭおよび天然のＳＡＮ筋細胞において顕著な拡張期脱分極を示すため、下段パネルに拡張される。右パネルは、安定した静止膜電位を表示し、電気刺激に応じてのみ単一の活動電位を発火するＧＦＰ−ＶＭを示す。図９Ｆは、Ｔｂｘ１８−ＶＭ（ｎ＝５）の活動電位パラメータが、ＧＦＰ−ＶＭ（ｎ＝６）よりも天然のＳＡＮ筋細胞（ｎ＝６）に近かったことを示す。図９Ｇは、天然のＳＡＮ筋細胞、１週間のＧＦＰ−ＶＭ、およびウイルスなしの対照と比較して、１週間、３週間、および６週間のＴｂｘ１８−ＶＭの長さ／幅比を示す。
【図９Ｅ】Ｔｂｘ１８を形質導入された心室筋細胞およびＧＦＰを形質導入された心室筋細胞（ＶＭ）の種々の特徴を示す。図９Ａは、Ｔｂｘ１８を形質導入された誘導ＳＡＮ（ｉＳＡＮ）細胞（ＧＦＰ−陽性細胞、上段写真）対天然の細胞（下段）を示す。図９Ｂは、Ｔｂｘ１８−ＶＭおよびＧＦＰ−ＶＭと比較したＳＡＮ筋細胞を示す。上のパネルは、明視野画像であり、下の視野は、蛍光画像である。α−ＳＡに対する免疫染色は、天然のＳＡＮ筋細胞のものに類似しているＴｂｘ１８−ＶＭ中の無秩序な筋原線維構造を明らかにした。図９Ｃは、新たに単離された、生ＳＡＮ筋細胞、Ｔｂｘ１８−ＶＭ（ＧＦＰ発現によって報告される）、およびＧＦＰ−ＶＭ（上段パネル）、ならびに免疫染色された固定筋細胞（下段パネル）の代表的な明視野画像を示す。図９Ｄは、新たに単離された生筋細胞からの細胞の形状および大きさの測定として、筋細胞の長さ／幅比および全細胞容量の分析を示す。Ｔｂｘ１８−ＶＭは、ＧＦＰ−ＶＭ（Ｔｂｘ１８−ＶＭに対してｎ＝５３、ならびにＧＦＢ−ＶＭおよび非形質導入ＶＭに対して８０、ｐ＜０．０１）と比較してより小さい大きさで、紡錘状であるが、天然のＳＡＮ筋細胞（ｎ＝２４）と類似している。図９Ｅは、穿孔処理パッチの電流固定技術を使用して、新たに単離される単一のＴｂｘ１８−ＶＭ（ｎ＝５、中央のパネル）から記録された自発的な活動電位を示す。これらのデータは、Ｔｂｘ１８が、天然のＳＡＮ筋細胞（左パネル）と類似の顕著な拡張期脱分極を有する力強く、律動的なＡＰを表すことを示す。同じ記録が、Ｔｂｘ１８−ＶＭおよび天然のＳＡＮ筋細胞において顕著な拡張期脱分極を示すため、下段パネルに拡張される。右パネルは、安定した静止膜電位を表示し、電気刺激に応じてのみ単一の活動電位を発火するＧＦＰ−ＶＭを示す。図９Ｆは、Ｔｂｘ１８−ＶＭ（ｎ＝５）の活動電位パラメータが、ＧＦＰ−ＶＭ（ｎ＝６）よりも天然のＳＡＮ筋細胞（ｎ＝６）に近かったことを示す。図９Ｇは、天然のＳＡＮ筋細胞、１週間のＧＦＰ−ＶＭ、およびウイルスなしの対照と比較して、１週間、３週間、および６週間のＴｂｘ１８−ＶＭの長さ／幅比を示す。
【図９Ｆ】Ｔｂｘ１８を形質導入された心室筋細胞およびＧＦＰを形質導入された心室筋細胞（ＶＭ）の種々の特徴を示す。図９Ａは、Ｔｂｘ１８を形質導入された誘導ＳＡＮ（ｉＳＡＮ）細胞（ＧＦＰ−陽性細胞、上段写真）対天然の細胞（下段）を示す。図９Ｂは、Ｔｂｘ１８−ＶＭおよびＧＦＰ−ＶＭと比較したＳＡＮ筋細胞を示す。上のパネルは、明視野画像であり、下の視野は、蛍光画像である。α−ＳＡに対する免疫染色は、天然のＳＡＮ筋細胞のものに類似しているＴｂｘ１８−ＶＭ中の無秩序な筋原線維構造を明らかにした。図９Ｃは、新たに単離された、生ＳＡＮ筋細胞、Ｔｂｘ１８−ＶＭ（ＧＦＰ発現によって報告される）、およびＧＦＰ−ＶＭ（上段パネル）、ならびに免疫染色された固定筋細胞（下段パネル）の代表的な明視野画像を示す。図９Ｄは、新たに単離された生筋細胞からの細胞の形状および大きさの測定として、筋細胞の長さ／幅比および全細胞容量の分析を示す。Ｔｂｘ１８−ＶＭは、ＧＦＰ−ＶＭ（Ｔｂｘ１８−ＶＭに対してｎ＝５３、ならびにＧＦＢ−ＶＭおよび非形質導入ＶＭに対して８０、ｐ＜０．０１）と比較してより小さい大きさで、紡錘状であるが、天然のＳＡＮ筋細胞（ｎ＝２４）と類似している。図９Ｅは、穿孔処理パッチの電流固定技術を使用して、新たに単離される単一のＴｂｘ１８−ＶＭ（ｎ＝５、中央のパネル）から記録された自発的な活動電位を示す。これらのデータは、Ｔｂｘ１８が、天然のＳＡＮ筋細胞（左パネル）と類似の顕著な拡張期脱分極を有する力強く、律動的なＡＰを表すことを示す。同じ記録が、Ｔｂｘ１８−ＶＭおよび天然のＳＡＮ筋細胞において顕著な拡張期脱分極を示すため、下段パネルに拡張される。右パネルは、安定した静止膜電位を表示し、電気刺激に応じてのみ単一の活動電位を発火するＧＦＰ−ＶＭを示す。図９Ｆは、Ｔｂｘ１８−ＶＭ（ｎ＝５）の活動電位パラメータが、ＧＦＰ−ＶＭ（ｎ＝６）よりも天然のＳＡＮ筋細胞（ｎ＝６）に近かったことを示す。図９Ｇは、天然のＳＡＮ筋細胞、１週間のＧＦＰ−ＶＭ、およびウイルスなしの対照と比較して、１週間、３週間、および６週間のＴｂｘ１８−ＶＭの長さ／幅比を示す。
【図９Ｇ】Ｔｂｘ１８を形質導入された心室筋細胞およびＧＦＰを形質導入された心室筋細胞（ＶＭ）の種々の特徴を示す。図９Ａは、Ｔｂｘ１８を形質導入された誘導ＳＡＮ（ｉＳＡＮ）細胞（ＧＦＰ−陽性細胞、上段写真）対天然の細胞（下段）を示す。図９Ｂは、Ｔｂｘ１８−ＶＭおよびＧＦＰ−ＶＭと比較したＳＡＮ筋細胞を示す。上のパネルは、明視野画像であり、下の視野は、蛍光画像である。α−ＳＡに対する免疫染色は、天然のＳＡＮ筋細胞のものに類似しているＴｂｘ１８−ＶＭ中の無秩序な筋原線維構造を明らかにした。図９Ｃは、新たに単離された、生ＳＡＮ筋細胞、Ｔｂｘ１８−ＶＭ（ＧＦＰ発現によって報告される）、およびＧＦＰ−ＶＭ（上段パネル）、ならびに免疫染色された固定筋細胞（下段パネル）の代表的な明視野画像を示す。図９Ｄは、新たに単離された生筋細胞からの細胞の形状および大きさの測定として、筋細胞の長さ／幅比および全細胞容量の分析を示す。Ｔｂｘ１８−ＶＭは、ＧＦＰ−ＶＭ（Ｔｂｘ１８−ＶＭに対してｎ＝５３、ならびにＧＦＢ−ＶＭおよび非形質導入ＶＭに対して８０、ｐ＜０．０１）と比較してより小さい大きさで、紡錘状であるが、天然のＳＡＮ筋細胞（ｎ＝２４）と類似している。図９Ｅは、穿孔処理パッチの電流固定技術を使用して、新たに単離される単一のＴｂｘ１８−ＶＭ（ｎ＝５、中央のパネル）から記録された自発的な活動電位を示す。これらのデータは、Ｔｂｘ１８が、天然のＳＡＮ筋細胞（左パネル）と類似の顕著な拡張期脱分極を有する力強く、律動的なＡＰを表すことを示す。同じ記録が、Ｔｂｘ１８−ＶＭおよび天然のＳＡＮ筋細胞において顕著な拡張期脱分極を示すため、下段パネルに拡張される。右パネルは、安定した静止膜電位を表示し、電気刺激に応じてのみ単一の活動電位を発火するＧＦＰ−ＶＭを示す。図９Ｆは、Ｔｂｘ１８−ＶＭ（ｎ＝５）の活動電位パラメータが、ＧＦＰ−ＶＭ（ｎ＝６）よりも天然のＳＡＮ筋細胞（ｎ＝６）に近かったことを示す。図９Ｇは、天然のＳＡＮ筋細胞、１週間のＧＦＰ−ＶＭ、およびウイルスなしの対照と比較して、１週間、３週間、および６週間のＴｂｘ１８−ＶＭの長さ／幅比を示す。
【図１０Ａ】Ｔｂｘ−１８形質導入細胞の幹細胞性に関するデータを示す。図１０Ａおよび１０Ｂは、それぞれ、Ｔｂｘ１８−ＮＶＲＭ対ＧＦＰ−ＮＶＲＭ、およびｉＰＳ細胞対親の線維芽細胞（Ｆｉｂｓ）の散布図を示す。散布図は、対照と比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの幹細胞性に関する転写レベルに対して識別可能な変化がないことを示す。図１０Ｃおよび１０Ｄは、幹細胞の識別、増殖、および分化に関する８４個の遺伝子転写物のＲＴ−ＰＣＲ配列を示す。
【図１０Ｂ】Ｔｂｘ−１８形質導入細胞の幹細胞性に関するデータを示す。図１０Ａおよび１０Ｂは、それぞれ、Ｔｂｘ１８−ＮＶＲＭ対ＧＦＰ−ＮＶＲＭ、およびｉＰＳ細胞対親の線維芽細胞（Ｆｉｂｓ）の散布図を示す。散布図は、対照と比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの幹細胞性に関する転写レベルに対して識別可能な変化がないことを示す。図１０Ｃおよび１０Ｄは、幹細胞の識別、増殖、および分化に関する８４個の遺伝子転写物のＲＴ−ＰＣＲ配列を示す。
【図１０Ｃ】Ｔｂｘ−１８形質導入細胞の幹細胞性に関するデータを示す。図１０Ａおよび１０Ｂは、それぞれ、Ｔｂｘ１８−ＮＶＲＭ対ＧＦＰ−ＮＶＲＭ、およびｉＰＳ細胞対親の線維芽細胞（Ｆｉｂｓ）の散布図を示す。散布図は、対照と比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの幹細胞性に関する転写レベルに対して識別可能な変化がないことを示す。図１０Ｃおよび１０Ｄは、幹細胞の識別、増殖、および分化に関する８４個の遺伝子転写物のＲＴ−ＰＣＲ配列を示す。
【図１０Ｄ】Ｔｂｘ−１８形質導入細胞の幹細胞性に関するデータを示す。図１０Ａおよび１０Ｂは、それぞれ、Ｔｂｘ１８−ＮＶＲＭ対ＧＦＰ−ＮＶＲＭ、およびｉＰＳ細胞対親の線維芽細胞（Ｆｉｂｓ）の散布図を示す。散布図は、対照と比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの幹細胞性に関する転写レベルに対して識別可能な変化がないことを示す。図１０Ｃおよび１０Ｄは、幹細胞の識別、増殖、および分化に関する８４個の遺伝子転写物のＲＴ−ＰＣＲ配列を示す。
【図１１Ａ】胚様体（ＥＢ）の増殖に由来する細胞の概略図を示す。
【図１１Ｂ】胚様体（ＥＢ）ＥＢ増殖の概略図を示す。３日目に、吊るされたＥＢを懸濁液中で培養した。６日目に、ＥＢを組織培養プレート中に蒔いた。
【図１２Ａ】ＥＢの増殖中の対照マウスの胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）に対するＴｂｘ１８（Ａ）およびＴｂｘ３（Ｂ）の内因性発現を示す。
【図１２Ｂ】ＥＢの増殖中の対照マウスの胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）に対するＴｂｘ１８（Ａ）およびＴｂｘ３（Ｂ）の内因性発現を示す。
【図１３Ａ】Ｓｈｏｘ２を用いた細胞の治療予定を示す。Ｓｈｏｘ２遺伝子を運搬するベクターを用いた治療は、（この一般手順において）３日目に、次いで、６日目に２回生じる。
【図１３Ｂ】形質導入後の異なる時点における内因性Ｓｈｏｘ２のｍＲＮＡ発現を示す。
【図１４Ａ】ＧＦＰでのみ処置された対照に対するＳｈｏｘ２を形質導入された拍動ＥＢのパーセンテージを示す。
【図１４Ｂ】拍動ＥＢあたりの拍動のフォーカスの数を示す。
【図１５Ａ】ＧＦＰで処置された細胞に対するＳｈｏｘ２発現因子で処置された細胞のＨＣＮ４のｍＲＮＡ発現の増加を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａにおける対応する時点のウエスタンブロット分析を示す。
【図１６】ＧＦＰ対照（Ａ）と比較してＳｈｏｘ２を形質導入されたｍＥＳＣ由来心筋細胞（Ｂ）中のトロポニンＩとＨＣＮ４の同時発現を示す。
【図１７Ａ】６＋７日目（形質導入後）のＳｈｏｘ２形質導入細胞対ＧＦＰ対照中のＮＣＸ１のｍＲＮＡ（Ａ）およびタンパク質レベル（Ｂ）を示す。
【図１７Ｂ】６＋７日目（形質導入後）のＳｈｏｘ２形質導入細胞対ＧＦＰ対照中のＮＣＸ１のｍＲＮＡ（Ａ）およびタンパク質レベル（Ｂ）を示す。
【図１８Ａ】６＋１４日目（形質導入後）のＳｈｏｘ２形質導入細胞対ＧＦＰ対照中のＮＣＸ１のｍＲＮＡ（Ａ）およびタンパク質レベル（Ｂ）を示す。
【図１８Ｂ】６＋１４日目（形質導入後）のＳｈｏｘ２形質導入細胞対ＧＦＰ対照中のＮＣＸ１のｍＲＮＡ（Ａ）およびタンパク質レベル（Ｂ）を示す。
【図１９Ａ】６＋１４日目（形質導入後）のＳｈｏｘ２形質導入細胞対ＧＦＰ対照中のＣｘ４５のｍＲＮＡ（Ａ）およびタンパク質レベル（Ｂ）を示す。
【図１９Ｂ】６＋１４日目（形質導入後）のＳｈｏｘ２形質導入細胞対ＧＦＰ対照中のＣｘ４５のｍＲＮＡ（Ａ）およびタンパク質レベル（Ｂ）を示す。
【図２０Ａ】６＋１４日目（形質導入後）のＳｈｏｘ２形質導入細胞対ＧＦＰ対照中のＣｘ４３のｍＲＮＡ（Ａ）およびタンパク質レベル（Ｂ）を示す。
【図２０Ｂ】６＋１４日目（形質導入後）のＳｈｏｘ２形質導入細胞対ＧＦＰ対照中のＣｘ４３のｍＲＮＡ（Ａ）およびタンパク質レベル（Ｂ）を示す。
【図２１Ａ】Ｓｈｏｘ２形質導入細胞対ＧＦＰ対照中のＣｘ４３のｍＲＮＡ倍率変化を示す。
【図２１Ｂ】Ｓｈｏｘ２形質導入細胞対ＧＦＰ対照中のＣｘ４５のｍＲＮＡ倍率変化を示す。
【図２２】Ｓｈｏｘ２を形質導入されたｍＥＳＣ由来心筋細胞におけるＨＣＮ４およびＣｘ４５発現を示す。
【図２３Ａ】内因性マウスＳｈｏｘ２のｍＲＮＡが、外因性Ｓｈｏｘ２を用いたＥＳＣ由来心筋細胞の形質導入に関して上方制御されることを示す。
【図２３Ｂ】内因性ヒトＳｈｏｘ２のｍＲＮＡが、外因性Ｓｈｏｘ２を用いたＥＳＣ由来心筋細胞の形質導入に関して上方制御されることを示す。
【図２４Ａ】ヒドロキシメチルビランシンターゼ（ＨＭＢＳ）に対するＴｂｘ１８のｍＲＮＡレベルを示す。
【図２４Ｂ】ＨＭＢＳに対するＴｂｘ３のｍＲＮＡレベルを示す。
【図２５Ａ】自律神経制御（ａｕｔｏｎｏｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に応答する新規の自動能を示す。図２５Ａは、６ウェル多電極アレイ（ＭＥＡ、左パネル）の配置図およびそのようなウェル上で単層として培養されるＮＲＶＭの代表的な画像を示す。図２５Ｂは、対照におけるものと比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおける著しく速いベースラインの変時性を示すＭＥＡから記録された平均発火頻度を示す。Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの発火頻度は、１μＭのイソプロテレノール（ＩＳＯ）を含有するもので基本培地を変えることによるβ−アドレナリン刺激に応じて著しく増加した。その後の１μＭのアセチルコリン（ＡＣｈ）を用いたコリン作動薬負荷は、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの発火頻度を著しく遅くした。対照的に、ＧＦＰ−ＮＲＶＭの変時性は、自律神経入力にほとんど応答しなかった。図２５Ｃは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭを蒔いた６ウェルＭＥＡの電極からの代表的な未加工記録を示す。図２５Ｄは、β−アドレナリン受容体およびＭ２ムスカリン受容体の強い発現を示すＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（ＧＦＰ＋細胞）上の免疫染色を示す。図２５Ｅおよび２５Ｆは、インビボで心尖部にＴｂｘ１８を注入された無処置の灌流された心臓の心電図記録を示す。以下で考察されるように、実施形態によって、他の部位の投与が使用される。注入後７日間、心臓は、ＡＶ接合部領域で、収集され、灌流され、冷凍アブレーションされた（ｃｒｙｏａｂｌａｔｅｄ）。異所性拍動（図２５Ｅ、左パネル）の極性および形態は、導入遺伝子注入の部位における電極ペースの拍動のもの（図２５Ｅ、右パネル）と同じである。対照的に、ほとんどの対照の心臓（７／１０）は、心尖部における電極ペースの拍動のもの（図２５Ｆ、右パネル）と極性および形態が反対である狭いＱＲＳの接合部性補充調律（図２５Ｆ、左パネル）を示した。図２５Ｇは、灌流液（通常のタイロード液）をβ−アドレナリン刺激のための１μＭのイソプロテレノールを含有するもの、次いで、コリン作動性抑制のための１μＭのアセチルコリンを含有するものに変更することによって評価されるＴｂｘ１８−注入心臓の自律神経入力への変時性反応を示す。
【図２５Ｂ】自律神経制御（ａｕｔｏｎｏｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に応答する新規の自動能を示す。図２５Ａは、６ウェル多電極アレイ（ＭＥＡ、左パネル）の配置図およびそのようなウェル上で単層として培養されるＮＲＶＭの代表的な画像を示す。図２５Ｂは、対照におけるものと比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおける著しく速いベースラインの変時性を示すＭＥＡから記録された平均発火頻度を示す。Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの発火頻度は、１μＭのイソプロテレノール（ＩＳＯ）を含有するもので基本培地を変えることによるβ−アドレナリン刺激に応じて著しく増加した。その後の１μＭのアセチルコリン（ＡＣｈ）を用いたコリン作動薬負荷は、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの発火頻度を著しく遅くした。対照的に、ＧＦＰ−ＮＲＶＭの変時性は、自律神経入力にほとんど応答しなかった。図２５Ｃは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭを蒔いた６ウェルＭＥＡの電極からの代表的な未加工記録を示す。図２５Ｄは、β−アドレナリン受容体およびＭ２ムスカリン受容体の強い発現を示すＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（ＧＦＰ＋細胞）上の免疫染色を示す。図２５Ｅおよび２５Ｆは、インビボで心尖部にＴｂｘ１８を注入された無処置の灌流された心臓の心電図記録を示す。以下で考察されるように、実施形態によって、他の部位の投与が使用される。注入後７日間、心臓は、ＡＶ接合部領域で、収集され、灌流され、冷凍アブレーションされた（ｃｒｙｏａｂｌａｔｅｄ）。異所性拍動（図２５Ｅ、左パネル）の極性および形態は、導入遺伝子注入の部位における電極ペースの拍動のもの（図２５Ｅ、右パネル）と同じである。対照的に、ほとんどの対照の心臓（７／１０）は、心尖部における電極ペースの拍動のもの（図２５Ｆ、右パネル）と極性および形態が反対である狭いＱＲＳの接合部性補充調律（図２５Ｆ、左パネル）を示した。図２５Ｇは、灌流液（通常のタイロード液）をβ−アドレナリン刺激のための１μＭのイソプロテレノールを含有するもの、次いで、コリン作動性抑制のための１μＭのアセチルコリンを含有するものに変更することによって評価されるＴｂｘ１８−注入心臓の自律神経入力への変時性反応を示す。
【図２５Ｃ】自律神経制御（ａｕｔｏｎｏｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に応答する新規の自動能を示す。図２５Ａは、６ウェル多電極アレイ（ＭＥＡ、左パネル）の配置図およびそのようなウェル上で単層として培養されるＮＲＶＭの代表的な画像を示す。図２５Ｂは、対照におけるものと比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおける著しく速いベースラインの変時性を示すＭＥＡから記録された平均発火頻度を示す。Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの発火頻度は、１μＭのイソプロテレノール（ＩＳＯ）を含有するもので基本培地を変えることによるβ−アドレナリン刺激に応じて著しく増加した。その後の１μＭのアセチルコリン（ＡＣｈ）を用いたコリン作動薬負荷は、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの発火頻度を著しく遅くした。対照的に、ＧＦＰ−ＮＲＶＭの変時性は、自律神経入力にほとんど応答しなかった。図２５Ｃは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭを蒔いた６ウェルＭＥＡの電極からの代表的な未加工記録を示す。図２５Ｄは、β−アドレナリン受容体およびＭ２ムスカリン受容体の強い発現を示すＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（ＧＦＰ＋細胞）上の免疫染色を示す。図２５Ｅおよび２５Ｆは、インビボで心尖部にＴｂｘ１８を注入された無処置の灌流された心臓の心電図記録を示す。以下で考察されるように、実施形態によって、他の部位の投与が使用される。注入後７日間、心臓は、ＡＶ接合部領域で、収集され、灌流され、冷凍アブレーションされた（ｃｒｙｏａｂｌａｔｅｄ）。異所性拍動（図２５Ｅ、左パネル）の極性および形態は、導入遺伝子注入の部位における電極ペースの拍動のもの（図２５Ｅ、右パネル）と同じである。対照的に、ほとんどの対照の心臓（７／１０）は、心尖部における電極ペースの拍動のもの（図２５Ｆ、右パネル）と極性および形態が反対である狭いＱＲＳの接合部性補充調律（図２５Ｆ、左パネル）を示した。図２５Ｇは、灌流液（通常のタイロード液）をβ−アドレナリン刺激のための１μＭのイソプロテレノールを含有するもの、次いで、コリン作動性抑制のための１μＭのアセチルコリンを含有するものに変更することによって評価されるＴｂｘ１８−注入心臓の自律神経入力への変時性反応を示す。
【図２５Ｄ】自律神経制御（ａｕｔｏｎｏｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に応答する新規の自動能を示す。図２５Ａは、６ウェル多電極アレイ（ＭＥＡ、左パネル）の配置図およびそのようなウェル上で単層として培養されるＮＲＶＭの代表的な画像を示す。図２５Ｂは、対照におけるものと比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおける著しく速いベースラインの変時性を示すＭＥＡから記録された平均発火頻度を示す。Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの発火頻度は、１μＭのイソプロテレノール（ＩＳＯ）を含有するもので基本培地を変えることによるβ−アドレナリン刺激に応じて著しく増加した。その後の１μＭのアセチルコリン（ＡＣｈ）を用いたコリン作動薬負荷は、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの発火頻度を著しく遅くした。対照的に、ＧＦＰ−ＮＲＶＭの変時性は、自律神経入力にほとんど応答しなかった。図２５Ｃは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭを蒔いた６ウェルＭＥＡの電極からの代表的な未加工記録を示す。図２５Ｄは、β−アドレナリン受容体およびＭ２ムスカリン受容体の強い発現を示すＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（ＧＦＰ＋細胞）上の免疫染色を示す。図２５Ｅおよび２５Ｆは、インビボで心尖部にＴｂｘ１８を注入された無処置の灌流された心臓の心電図記録を示す。以下で考察されるように、実施形態によって、他の部位の投与が使用される。注入後７日間、心臓は、ＡＶ接合部領域で、収集され、灌流され、冷凍アブレーションされた（ｃｒｙｏａｂｌａｔｅｄ）。異所性拍動（図２５Ｅ、左パネル）の極性および形態は、導入遺伝子注入の部位における電極ペースの拍動のもの（図２５Ｅ、右パネル）と同じである。対照的に、ほとんどの対照の心臓（７／１０）は、心尖部における電極ペースの拍動のもの（図２５Ｆ、右パネル）と極性および形態が反対である狭いＱＲＳの接合部性補充調律（図２５Ｆ、左パネル）を示した。図２５Ｇは、灌流液（通常のタイロード液）をβ−アドレナリン刺激のための１μＭのイソプロテレノールを含有するもの、次いで、コリン作動性抑制のための１μＭのアセチルコリンを含有するものに変更することによって評価されるＴｂｘ１８−注入心臓の自律神経入力への変時性反応を示す。
【図２５Ｅ】自律神経制御（ａｕｔｏｎｏｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に応答する新規の自動能を示す。図２５Ａは、６ウェル多電極アレイ（ＭＥＡ、左パネル）の配置図およびそのようなウェル上で単層として培養されるＮＲＶＭの代表的な画像を示す。図２５Ｂは、対照におけるものと比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおける著しく速いベースラインの変時性を示すＭＥＡから記録された平均発火頻度を示す。Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの発火頻度は、１μＭのイソプロテレノール（ＩＳＯ）を含有するもので基本培地を変えることによるβ−アドレナリン刺激に応じて著しく増加した。その後の１μＭのアセチルコリン（ＡＣｈ）を用いたコリン作動薬負荷は、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの発火頻度を著しく遅くした。対照的に、ＧＦＰ−ＮＲＶＭの変時性は、自律神経入力にほとんど応答しなかった。図２５Ｃは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭを蒔いた６ウェルＭＥＡの電極からの代表的な未加工記録を示す。図２５Ｄは、β−アドレナリン受容体およびＭ２ムスカリン受容体の強い発現を示すＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（ＧＦＰ＋細胞）上の免疫染色を示す。図２５Ｅおよび２５Ｆは、インビボで心尖部にＴｂｘ１８を注入された無処置の灌流された心臓の心電図記録を示す。以下で考察されるように、実施形態によって、他の部位の投与が使用される。注入後７日間、心臓は、ＡＶ接合部領域で、収集され、灌流され、冷凍アブレーションされた（ｃｒｙｏａｂｌａｔｅｄ）。異所性拍動（図２５Ｅ、左パネル）の極性および形態は、導入遺伝子注入の部位における電極ペースの拍動のもの（図２５Ｅ、右パネル）と同じである。対照的に、ほとんどの対照の心臓（７／１０）は、心尖部における電極ペースの拍動のもの（図２５Ｆ、右パネル）と極性および形態が反対である狭いＱＲＳの接合部性補充調律（図２５Ｆ、左パネル）を示した。図２５Ｇは、灌流液（通常のタイロード液）をβ−アドレナリン刺激のための１μＭのイソプロテレノールを含有するもの、次いで、コリン作動性抑制のための１μＭのアセチルコリンを含有するものに変更することによって評価されるＴｂｘ１８−注入心臓の自律神経入力への変時性反応を示す。
【図２５Ｆ】自律神経制御（ａｕｔｏｎｏｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に応答する新規の自動能を示す。図２５Ａは、６ウェル多電極アレイ（ＭＥＡ、左パネル）の配置図およびそのようなウェル上で単層として培養されるＮＲＶＭの代表的な画像を示す。図２５Ｂは、対照におけるものと比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおける著しく速いベースラインの変時性を示すＭＥＡから記録された平均発火頻度を示す。Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの発火頻度は、１μＭのイソプロテレノール（ＩＳＯ）を含有するもので基本培地を変えることによるβ−アドレナリン刺激に応じて著しく増加した。その後の１μＭのアセチルコリン（ＡＣｈ）を用いたコリン作動薬負荷は、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの発火頻度を著しく遅くした。対照的に、ＧＦＰ−ＮＲＶＭの変時性は、自律神経入力にほとんど応答しなかった。図２５Ｃは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭを蒔いた６ウェルＭＥＡの電極からの代表的な未加工記録を示す。図２５Ｄは、β−アドレナリン受容体およびＭ２ムスカリン受容体の強い発現を示すＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（ＧＦＰ＋細胞）上の免疫染色を示す。図２５Ｅおよび２５Ｆは、インビボで心尖部にＴｂｘ１８を注入された無処置の灌流された心臓の心電図記録を示す。以下で考察されるように、実施形態によって、他の部位の投与が使用される。注入後７日間、心臓は、ＡＶ接合部領域で、収集され、灌流され、冷凍アブレーションされた（ｃｒｙｏａｂｌａｔｅｄ）。異所性拍動（図２５Ｅ、左パネル）の極性および形態は、導入遺伝子注入の部位における電極ペースの拍動のもの（図２５Ｅ、右パネル）と同じである。対照的に、ほとんどの対照の心臓（７／１０）は、心尖部における電極ペースの拍動のもの（図２５Ｆ、右パネル）と極性および形態が反対である狭いＱＲＳの接合部性補充調律（図２５Ｆ、左パネル）を示した。図２５Ｇは、灌流液（通常のタイロード液）をβ−アドレナリン刺激のための１μＭのイソプロテレノールを含有するもの、次いで、コリン作動性抑制のための１μＭのアセチルコリンを含有するものに変更することによって評価されるＴｂｘ１８−注入心臓の自律神経入力への変時性反応を示す。
【図２５Ｇ】自律神経制御（ａｕｔｏｎｏｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に応答する新規の自動能を示す。図２５Ａは、６ウェル多電極アレイ（ＭＥＡ、左パネル）の配置図およびそのようなウェル上で単層として培養されるＮＲＶＭの代表的な画像を示す。図２５Ｂは、対照におけるものと比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおける著しく速いベースラインの変時性を示すＭＥＡから記録された平均発火頻度を示す。Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの発火頻度は、１μＭのイソプロテレノール（ＩＳＯ）を含有するもので基本培地を変えることによるβ−アドレナリン刺激に応じて著しく増加した。その後の１μＭのアセチルコリン（ＡＣｈ）を用いたコリン作動薬負荷は、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの発火頻度を著しく遅くした。対照的に、ＧＦＰ−ＮＲＶＭの変時性は、自律神経入力にほとんど応答しなかった。図２５Ｃは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭを蒔いた６ウェルＭＥＡの電極からの代表的な未加工記録を示す。図２５Ｄは、β−アドレナリン受容体およびＭ２ムスカリン受容体の強い発現を示すＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（ＧＦＰ＋細胞）上の免疫染色を示す。図２５Ｅおよび２５Ｆは、インビボで心尖部にＴｂｘ１８を注入された無処置の灌流された心臓の心電図記録を示す。以下で考察されるように、実施形態によって、他の部位の投与が使用される。注入後７日間、心臓は、ＡＶ接合部領域で、収集され、灌流され、冷凍アブレーションされた（ｃｒｙｏａｂｌａｔｅｄ）。異所性拍動（図２５Ｅ、左パネル）の極性および形態は、導入遺伝子注入の部位における電極ペースの拍動のもの（図２５Ｅ、右パネル）と同じである。対照的に、ほとんどの対照の心臓（７／１０）は、心尖部における電極ペースの拍動のもの（図２５Ｆ、右パネル）と極性および形態が反対である狭いＱＲＳの接合部性補充調律（図２５Ｆ、左パネル）を示した。図２５Ｇは、灌流液（通常のタイロード液）をβ−アドレナリン刺激のための１μＭのイソプロテレノールを含有するもの、次いで、コリン作動性抑制のための１μＭのアセチルコリンを含有するものに変更することによって評価されるＴｂｘ１８−注入心臓の自律神経入力への変時性反応を示す。
【図２６Ａ】長期のＴｂｘ１８−ＶＭの単細胞、定量ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。データは、Ｔｂｘ１８発現が衰退した後であっても、持続性自動能を示す。図２６Ａは、ＲＴ−ｑＰＣＲによって単細胞転写検出の感受性を検証するために、インビボでの遺伝子導入後３日間アッセイされたＴｂｘ１８−形質導入心室筋細胞を示す。データは、Ｔｂｘ１８転写レベルが、超低（ＧＡＰＤＨの２．６％、細胞１）から超高（ＧＡＰＤＨの１６８％、細胞８）までの広い範囲にわたって正確に検出されたことを示す。図２６Ｂは、インビボでの遺伝子導入後６〜８週間のモルモットから新たに単離されたＶＭの結果であるＲＴ−ｑＰＣＲを示し、自発的な拍動細胞中のＴｂｘ１８の転写レベルが、小さい（細胞１および２）または取るに足らない（細胞３および４）もののいずれかであったことを示す。強いＧＦＰシグナルを有するＴｂｘ１８−Ｖｍ（細胞５）は、Ｔｂｘ１８のより大きい相対量を示した。図２６Ｃは、陰性対照を示す（ＧＦＰを単独で発現するＶＭが、Ｔｂｘ１８に対してアッセイされた）。
【図２６Ｂ】長期のＴｂｘ１８−ＶＭの単細胞、定量ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。データは、Ｔｂｘ１８発現が衰退した後であっても、持続性自動能を示す。図２６Ａは、ＲＴ−ｑＰＣＲによって単細胞転写検出の感受性を検証するために、インビボでの遺伝子導入後３日間アッセイされたＴｂｘ１８−形質導入心室筋細胞を示す。データは、Ｔｂｘ１８転写レベルが、超低（ＧＡＰＤＨの２．６％、細胞１）から超高（ＧＡＰＤＨの１６８％、細胞８）までの広い範囲にわたって正確に検出されたことを示す。図２６Ｂは、インビボでの遺伝子導入後６〜８週間のモルモットから新たに単離されたＶＭの結果であるＲＴ−ｑＰＣＲを示し、自発的な拍動細胞中のＴｂｘ１８の転写レベルが、小さい（細胞１および２）または取るに足らない（細胞３および４）もののいずれかであったことを示す。強いＧＦＰシグナルを有するＴｂｘ１８−Ｖｍ（細胞５）は、Ｔｂｘ１８のより大きい相対量を示した。図２６Ｃは、陰性対照を示す（ＧＦＰを単独で発現するＶＭが、Ｔｂｘ１８に対してアッセイされた）。
【図２６Ｃ】長期のＴｂｘ１８−ＶＭの単細胞、定量ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。データは、Ｔｂｘ１８発現が衰退した後であっても、持続性自動能を示す。図２６Ａは、ＲＴ−ｑＰＣＲによって単細胞転写検出の感受性を検証するために、インビボでの遺伝子導入後３日間アッセイされたＴｂｘ１８−形質導入心室筋細胞を示す。データは、Ｔｂｘ１８転写レベルが、超低（ＧＡＰＤＨの２．６％、細胞１）から超高（ＧＡＰＤＨの１６８％、細胞８）までの広い範囲にわたって正確に検出されたことを示す。図２６Ｂは、インビボでの遺伝子導入後６〜８週間のモルモットから新たに単離されたＶＭの結果であるＲＴ−ｑＰＣＲを示し、自発的な拍動細胞中のＴｂｘ１８の転写レベルが、小さい（細胞１および２）または取るに足らない（細胞３および４）もののいずれかであったことを示す。強いＧＦＰシグナルを有するＴｂｘ１８−Ｖｍ（細胞５）は、Ｔｂｘ１８のより大きい相対量を示した。図２６Ｃは、陰性対照を示す（ＧＦＰを単独で発現するＶＭが、Ｔｂｘ１８に対してアッセイされた）。
【図２７Ａ】注入領域において強く、局所的なＴｂｘ１８形質導入を示すＴｂｘ１８−注入モルモット心臓からの組織学的切片を示す。
【図２７Ｂ】注入領域において強く、局所的なＴｂｘ１８形質導入を示すＴｂｘ１８−注入モルモット心臓からの組織学的切片を示す。
【図２８Ａ】エクスビボでの無処置の全心臓ＥＣＧ記録におけるリードの配置を示す。心臓は、３６℃で酸素化したタイロード液を用いて、６０ｍｍＨｇの大動脈を介して逆行性灌流された。灌流された心臓は、温かいタイロード液が充填された、シルガード（ｓｙｌｇａｒｄ）で被覆されたプレートに配置された。ＥＣＧリードは、リードＩおよびＩＩを記録するために適切な部位に配置された。
【図２８Ｂ】エクスビボでの無処置の全心臓ＥＣＧ記録におけるリードの配置を示す。心臓は、３６℃で酸素化したタイロード液を用いて、６０ｍｍＨｇの大動脈を介して逆行性灌流された。灌流された心臓は、温かいタイロード液が充填された、シルガード（ｓｙｌｇａｒｄ）で被覆されたプレートに配置された。ＥＣＧリードは、リードＩおよびＩＩを記録するために適切な部位に配置された。
【図２９Ａ】遺伝子導入３〜４週間後のＴｂｘ１８−注入心臓の心電図を示す。図２９Ａは、１６５±１４ｂｐｍ（ｎ＝３／３）での異所性の固有心室調律を示す。図２９Ｂは、Ｔｂｘ１８注入部位からの生物学的ペーシングと一致する心電図を示す。図２９Ｃは、短期のＴｂｘ１８−注入心臓（図２５Ｇ）に類似した手法における自律神経制御に応答した心臓を示す。
【図２９Ｂ】遺伝子導入３〜４週間後のＴｂｘ１８−注入心臓の心電図を示す。図２９Ａは、１６５±１４ｂｐｍ（ｎ＝３／３）での異所性の固有心室調律を示す。図２９Ｂは、Ｔｂｘ１８注入部位からの生物学的ペーシングと一致する心電図を示す。図２９Ｃは、短期のＴｂｘ１８−注入心臓（図２５Ｇ）に類似した手法における自律神経制御に応答した心臓を示す。
【図２９Ｃ】遺伝子導入３〜４週間後のＴｂｘ１８−注入心臓の心電図を示す。図２９Ａは、１６５±１４ｂｐｍ（ｎ＝３／３）での異所性の固有心室調律を示す。図２９Ｂは、Ｔｂｘ１８注入部位からの生物学的ペーシングと一致する心電図を示す。図２９Ｃは、短期のＴｂｘ１８−注入心臓（図２５Ｇ）に類似した手法における自律神経制御に応答した心臓を示す。
【図３０Ａ】個々の筋細胞におけるＴｂｘ１８のｍＲＮＡレベルを検査するためのリアルタイムＰＣＲの結果を示す。３つのプライマーセットのそれぞれに対する標準曲線は、入力ＤＮＡテンプレートの段階希釈を用いて構築され、匹敵する増幅効率が検証された（曲線勾配：−３．３２〜−３．６４）。ヒトＴｂｘ１８、モルモットＧＡＰＤＨ、およびモルモットＴｎｎＴ２の関連ｍＲＮＡレベルは、各プライマーセットに対する標準曲線の勾配を用いたＣｔ値の外挿によって得られた。各細胞中のＴｂｘ１８のｍＲＮＡ量を、次いで、ＧＡＰＤＨまたはＴｎｎＴ２レベルに正規化した。
【図３０Ｂ】個々の筋細胞におけるＴｂｘ１８のｍＲＮＡレベルを検査するためのリアルタイムＰＣＲの結果を示す。３つのプライマーセットのそれぞれに対する標準曲線は、入力ＤＮＡテンプレートの段階希釈を用いて構築され、匹敵する増幅効率が検証された（曲線勾配：−３．３２〜−３．６４）。ヒトＴｂｘ１８、モルモットＧＡＰＤＨ、およびモルモットＴｎｎＴ２の関連ｍＲＮＡレベルは、各プライマーセットに対する標準曲線の勾配を用いたＣｔ値の外挿によって得られた。各細胞中のＴｂｘ１８のｍＲＮＡ量を、次いで、ＧＡＰＤＨまたはＴｎｎＴ２レベルに正規化した。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
背景技術
興奮性組織の異常
心不整脈は、心臓内における異常な電気活動が来たされる、一連の不均一な状態の１つである。不整脈の結果として、心拍数が、速すぎる、遅すぎることがあり、および／または規則的もしくは不規則であり得る。心臓の正常な電気活動は、心臓の右心房、より具体的には、洞結節（洞房結節、ＳＡ結節、および／またはＳＡＮとも称される）から起こる電気インパルスから生じる。このインパルスは、両心房の収縮を誘導する。インパルスは、次いで、房室（またはＡＶ）結節を通して、ならびにヒス束およびプルキンエ線維を介する両心室を通して、通過する。その結果が、心筋の同調収縮、およびしたがって、血流である。正常な成人の心拍数は、１分間に６０〜８０拍動の範囲であるが、小児における安静時心拍数は、典型的にずっと速い。
【００５４】
徐脈（６０ｂｐｍ未満の心拍数）は、可能性がある複数の病因、すなわち、洞結節（洞性徐脈）からの緩徐なシグナル、洞結節の正常活動の休止（洞停止）、または心房から心室への電気インパルスの妨害（ＡＶブロック）を有する。頻脈（１００ｂｐｍを超える安静時心拍数）は、単なる動悸（対象が彼らの心拍動の異常を認識するようになる）を引き起こすことがあり、単純に、例えば、運動または身体的ストレスの間の洞結節の交感神経系刺激（洞性頻脈として知られる）の結果であり得る。洞性頻脈ではない頻脈は、正常な心周期に加えて、異常なインパルスに起因し得る。異常なインパルスは、自動能、リエントリー、または撃発活動の３つの機構のうちの１つによって始まり得る。
【００５５】
ある特定の心臓組織は、それら自ら電気インパルスを開始することができ、それは自動能として知られている。通常、そのような自動細胞は、心臓の伝導系（ＳＡ結節、ＡＶ結節、ヒス束、およびプルキンエ線維）内に位置する。洞房結節は、残りの心臓よりも高い自動能（より速いペースメーカー）を有する心房内の単一の特殊化された位置であり、したがって、通常、心拍数の設定および各心拍の開始に関与する。
【００５６】
リエントリー性不整脈は、電気インパルスが、心房から心室に伝播するよりもむしろ、心臓の小さな領域を通して反回性に循環するときに生じる。例えば、損傷した、または疾患の心臓組織によって、伝導が心臓の一部の範囲において異常に遅い場合、インパルス伝播時間は変化し、ある特定のインパルスは、完全に新しいインパルスとして潜在的に処理され得る。そのようなばらばらのインパルス伝播は、持続した異常な回路調律（ｃｉｒｃｕｉｔ  ｒｈｙｔｈｍ）を生成することがあり、それは、心房粗動、ほとんどの発作性上室性頻脈、および危険な心室頻脈の原因となる。
【００５７】
心臓の全体の腔が、複数のリエントリー回路を有する場合、腔は、滑らかに収縮し、血液を送達するというよりもむしろ、細動および無秩序な電気刺激によって震えていると考えられる。滑らかで持続した血液の欠如および無秩序な収縮は、心原性ショック、効果的な血液循環の休止、および突発性の心臓死をもたらし得る。細動は、心房（心房細動）または心室（心室細動）に影響することがあり、心室細動は、切迫した命に関わるものである。
興奮性組織の異常のための従来の治療
【００５８】
従来の不整脈治療には、薬物治療、電子ペースメーカー、植え込み型心臓除細動器（ＩＣＤ）、アブレーション、およびそれらの組み合わせが挙げられる。これらの従来の治療が、種々の種類の心不整脈の治療に従来から使用されてきたが、これらの手法は、いくつかの欠点を有する。植え込みペースメーカーおよびＩＣＤは、装置の植え込み、機能不全、または機器感染から合併症を生じ得る。薬物治療は、一部の患者において許容し難い場合があり、治療中、さらなる不整脈を誘導する可能性を有する。このため、心臓の収縮力および／またはコンダクタンスを調節する薬物治療および植え込み型装置の代わりとなる、または補足する必要性が存在する。
【００５９】
本明細書に開示されるものとは異なる生物学的ペースメーカーを生成する種々の手法が存在し、いくつかのかかる方法は、イオンチャネルまたはイオンチャネルのサブユニットの心臓細胞への送達を用いる。特に、ドミナントネガティブなイオンチャネル（またはそれらのサブユニット）が、研究されてきた。概して、心臓細胞中のドミナントネガティブなイオンチャネルの発現の結果として、細胞膜を横切るイオン電流が変化し、それによって、これらの細胞中でペースメーカーのような発火をもたらす。このような方法は、概して、ある特定のイオンの伝導に対する細胞の能力を変化させることによって処置細胞の機能を効果的に操作する遺伝子の送達を利用する。言い換えると、そのような手法は、典型的に、既存の細胞を採り、その機能を変化するために、その既存の構造（例えば、イオンチャネル）を増強するか、または変化させる。
【００６０】
対照的に、本発明のいくつかの実施形態は、生物学的ペースメーカー細胞になるようにリプログラムされる静止細胞をもたらす。本発明のいくつかの実施形態は、静止細胞のリプログラミングが、細胞構造中に自然に存在しない遺伝子配列を用いて細胞を治療するよりもむしろ、細胞をそれらの自然状態に変換するため、特に有利である。例えば、いくつかの実施形態は、（例えば、イオンチャネルを用いるのではなく）転写因子を用いた静止細胞のリプログラミングが、リプログラムされる細胞中に誘導される異常の危険性を低減するため、有利である。一部の実施形態において、転写因子は、嵩張らず（例えば、より小さい遺伝子配列が使用され得る）、それは、ロジスティックな合併症を低減し、さらなる送達の選択肢をもたらす。本発明の一部の実施形態は、細胞を自然の（または天然の）ペースメーカー状態に変換するため、特に有益であり、その細胞は、適切なペースメーカー調律の生成および維持において成功する可能性が高く、他の手法によって生じ得る副作用（例えば、治療自体による不整脈の誘発）の低減された可能性を有する。さらに、本発明のいくつかの実施形態は、細胞を自然のペースメーカー状態へ変換することが、自然に定義され、そのため、平衡された頻度で細胞が作動することを可能にするため、それらが、所望の効果の「微調整」の必要性（例えば、特定の結果を達成するために増加された用量または数の治療を必要とする）を低減するという点において、有益である。結果として、本方法のいくつかの実施形態は、心臓内に新たなペースメーカーを生成するための十分な数の細胞の変換を達成するために、組成物のより少ない投与（または用量）を必要とする。このため、いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、患者に対して低侵襲性であってもよく、より少ない投与手順を必要とし、それによって患者に対するより少ない危険性を示し、治療自体による罹患（病的状態）を低下させる。
【００６１】
さらに、本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態は、それらが、既存の心臓細胞の複雑な機能単位（例えば、イオンチャネル）の（「非天然の」配列による）修正を必要とせず、それどころか、細胞のペースメーカー状態への変換が、機能的内因性ペースメーカーチャネルの完全な補体の生成をもたらすという点において有利である。既存のチャネルの修正への低減された必要性は、有害な結果を生じる可能性を低減する（例えば、チャネルの誤形成、または予測されたよりも大きいもしくは小さい機能への衝撃を生成するチャネルの形成）。
【００６２】
加えて、いくつかの実施形態は、細胞が外因的に操作される単流を有するよりもむしろ、本明細書の方法によってペースメーカーに変換される細胞が、完全に機能的に均衡したイオン電流（およびしたがって電気活動）の補体を有するため、細胞中の不均衡な電気活動による望ましくない副作用の危険性を有利に低減する。
【００６３】
本明細書に開示されるように、（発生の完了後、発現が低減される）ペースメーカー細胞の早期の自然発生に関与する転写因子の送達は、非ペースメーカー細胞をペースメーカー細胞に予想外にリプログラムすることができる。これらの手法は、心臓細胞の一般的な見解は、それらが最終的に分化する（例えば、一旦収縮性細胞になると、常に収縮性細胞）というものであるため、予想外である。しかしながら、本方法のいくつかの実施形態は、それらのイオンチャネルの直接的外因性変化を伴わずに、これらの細胞のリプログラミングを可能にする。このため、非ペースメーカー細胞の機能単位（イオンチャネル）を操作するよりもむしろ、本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態は、細胞の機能的運命（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆａｔｅ）および機能同一性をペースメーカー細胞に変化させる。したがって、本明細書に開示される方法および組成物のいくつかの実施形態は、そのような従来の薬物治療、アブレーション、または人工ペースメーカーの必要性を減らす、または除去するリプログラムされる生物学的ペースメーカーの生成をもたらす。
生物学的ペースメーカーを生成するための転写因子
【００６４】
転写因子に基づく生物学的ペースメーカーの使用は、従来の不整脈治療の必要性を低減するか、および／または除去する。いくつかの実施形態では、生物学的ペースメーカーの生成を使用して、徐脈または他の不整脈に対する従来の治療を補う。いくつかの実施形態では、生物学的ペースメーカーの生成は、従来の治療への依存を低減する（例えば、患者はそこから引き離される）。いくつかの実施形態において、心不整脈は、対象が治療されていない、または非生物学的治療（例えば、医薬品または電子ペースメーカー治療）を用いて治療される場合には不可能である正常なまたは実質的に正常な調律で心臓を動作させる生物学的ペースメーカーの生成によって治療される。いくつかの実施形態において、生物学的ペースメーカーの生成は、ブリッジ治療（例えば、移植を必要とするのに十分な心臓の損傷を有する患者のためのもの）として使用される。
【００６５】
いくつかの実施形態において、生物学的ペースメーカーの生成は、細胞への転写因子の伝達によって（伝達は、例えば、本明細書に開示される転写因子のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを送達するために使用される遺伝子送達技術の使用を通して生じ得る）、静止心臓細胞のペースメーカー細胞への変換を誘導することを含む。本明細書で使用される場合、用語「静止心臓細胞」は、その通常の意味を与えるものとし、また、発火頻度を示さない、ほとんど示さない、もしくは不適当な発火頻度である心臓細胞および／または自発的に活性しない心臓細胞を指すものとする。静止心臓細胞の識別は、一部の実施形態において、標的とされる細胞型に左右されることが理解されるべきである。例えば、心室および／または心房心筋は、通常、ペースメーカー細胞によって生成される電気信号に応答し、このため、典型的に、正常なペースメーカー細胞と比較して低い自発的発火頻度を有する。このため、発火頻度がほとんどない心室および／または心房心筋静止細胞を標的とする場合、一部の実施形態において、正常なペースメーカー細胞と比較して、約２０％未満、約１５％未満、もしくは約１０％未満の自発的な発火を有する細胞を含む。あるいは、本明細書に開示されるある特定の実施形態は、心臓の伝導系の機能不全領域（または複数の領域）を標的とする。例えば、いくつかの実施形態では、例えば、洞不全症候群において、洞房結節の機能不全領域が標的である。さらなる実施形態では、例えば、ＡＶブロックを有する患者において、房室（ＡＶ）結節が標的とされる。なおさらなる実施形態において、心臓の二次伝導経路（例えば、ヒス−プルキンエ系および／またはヒス束）が、標的とされる。通常、自発的で反復的な電気活動を示すそのような組織において、静止細胞は、心臓のその領域における正常な細胞と比較して減少された頻度で発火するものであり、減少された頻度は、適切な心臓の発火頻度および／または心拍出量を維持するのに不十分である。このため、静止細胞は、一部の実施形態において、心臓の電気活動の動作に関与する場合、心血管系にわたって適切な血流を維持するのに不十分な電気的発火のレベルそれを行う細胞（例えば、血行力学的に持続不可能な頻度で発火する細胞）として認識される。
【００６６】
いくつかの実施形態において、生物学的ペースメーカーの生成は、インビボでの心臓組織への転写因子の送達によって生じ、静止心筋細胞、内因性心臓幹細胞、またはそれらの組み合わせのペースメーカー細胞への変換をもたらす。いくつかの実施形態において、生物学的ペースメーカーの生成は、インビトロでの転写因子の送達によって実施され、培養された体細胞、心筋細胞、幹細胞（胚性、誘導多能性、多能性、複能性、単能性、および／または成体幹細胞を含む）、またはそれらの組み合わせのペースメーカー細胞への変換をもたらす。いくつかの実施形態において、これらの生成されるペースメーカー細胞は、その後、心臓調律の異常を治療するためにインビボで植え込まれ得る。
【００６７】
いくつかの実施形態において、体細胞、心筋細胞、および／または幹細胞のペースメーカー細胞への変換は、胚の洞房結節（ＳＡＮ）発生の制御因子である転写因子を使用して実現される。胚のＳＡＮ発生の制御因子である潜在的転写因子には、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、Ｔｂｘ３、および／またはＴｂｘ５が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔｂｘ１８は、頭部範囲の胚のＳＡＮ発生に必要とされる転写因子であるが、以下でより詳細に考察されるように、典型的に、出生によって検出不能となり、成人期において検出不能なままである（図１）。Ｓｈｏｘ２は、静脈洞におけるＮｋｘ２．５の負の制御因子である。このタンパク質は、組織分化にとって極めて重要である。さらに、Ｓｈｏｘ２欠乏性マウスおよびゼブラフィッシュ胚は、徐脈を呈する。Ｔｂｘ３は、欠乏性または異所性の発現のいずれかから生じる発生エラーを有するＳＡＮ特殊分化の強力な制御因子である。ホルト・オーラム症候群においてその投薬量と異常な心臓形態形成の逆相関を示すＴｂｘ５は、Ｓｈｏｘ２およびＴｂｘ３の正の制御因子である。
【００６８】
上述のように、生物学的ペースメーカー生成のいくつかの実施形態は、インビボ治療に基づく。いくつかの実施形態において、Ｓｈｏｘ２、Ｔｂｘ１８、またはそれらの組み合わせは、非ペースメーカー体細胞、心筋細胞、内因性幹細胞、またはその３つの組み合わせにおいて異所性のペースメーカー活動を誘導するように、インビボで送達される。いくつかの実施形態において、ＳＡＮを制御する転写因子（または心臓の発生に関係するが、ＳＡＮ制御に特異的ではない転写因子）の他の組み合わせが、Ｓｈｏｘ２およびＴｂｘ１８もしくは個々のＳｈｏｘ２およびＴｂｘ１８を伴ってまたは伴わずに、インビボで細胞をペースメーカー細胞に変換するために使用されてもよい。それらの他の転写因子には、Ｔｂｘ３およびＴｂｘ５が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔｂｘ３、Ｔｂｘ５、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、およびそれらの変異体の配列は、それぞれ、添付物Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに示される。
【００６９】
いくつかの実施形態において、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、またはＴｂｘ−１８およびＳｈｏｘ２の組み合わせは、インビトロで心筋細胞または幹細胞に送達され、それは、以下で考察されるように、培養されるペースメーカー細胞を産生する。これらの細胞は、その後、生物学的ペースメーカー生成のための細胞治療として患者に投与され得る。いくつかの実施形態において、投与は、対象の心臓への細胞の直接投与を含む（例えば、注入）。本明細書に開示される他の投与経路が使用される。例えば、一部の実施形態において、カテーテルベースの投与が用いられる。さらなる実施形態において、生成されるペースメーカー細胞は、心臓内の標的部位で細胞保持を補助する、基質、移植片、または他の生体材料の中に取り込まれる。インビトロで生物学的ペースメーカーの生成に使用される細胞は、一部の実施形態において、それらが移植される患者の健常な組織から収集される（例えば、誘導ペースメーカー細胞の自家移植片）。次いで、これらの細胞は、インビトロで転写因子によってペースメーカー細胞に変換されることができ、不整脈の治療のために同じ患者に再挿入され得る。他の実施形態において、誘導ペースメーカー細胞の同種移植片が実施される（例えば、細胞は、第１の対象から収集され、インビトロで培養され、本明細書に開示される転写因子のうちの１つ以上と接触させ、次いで、第２の対象に移植される）。いくつかの実施形態において、インビトロで細胞をペースメーカー細胞に変換するために、他のＳＡＮ制御転写因子またはそのような転写因子の組み合わせが使用される（例えば、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、および／またはＴｂｘ−１８＋Ｓｈｏｘ２に加えて、またはその代わりの転写因子）。それらの他の転写因子には、Ｔｂｘ３およびＴｂｘ５が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本明細書に開示される方法を用いて治療され得る興奮性組織の異常を有する患者には、哺乳動物、および特にヒトが挙げられる。患者には、本明細書に開示される心臓状態、または心臓活動、伝導率、調律等に影響することが当分野で知られている他の状態のうちの１つ以上を患っているか、または診断されるものが挙げられる。
遺伝子送達ベクター
【００７１】
リプログラミング心筋細胞は、本明細書に開示されるいくつかの実施形態において、外因性遺伝物質を体細胞、心筋細胞、幹細胞、またはそれらの組み合わせに送達する手段として遺伝子送達を使用して、達成される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドが、核酸送達系において投与される。いくつかの実施形態において、核酸送達系は、ポリヌクレオチドに結び付けられる非ウイルスベクターを含む。そのような非ウイルスベクターの例には、ポリヌクレオチド単独（例えば、裸のＤＮＡ）または好適なタンパク質、ポリサッカライド、もしくは脂質製剤と組み合わせたポリヌクレオチドが挙げられる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、核酸送達系は、アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルパー依存型アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、またはセンダイウイルスリポソーム（ＨＶＪ）複合体が挙げられるが、これらに限定されない１つ以上のウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスおよび／またはＡＡＶの種々の血清型がまた使用される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、真核生物プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが使用される。組織特異的プロモーターを含む他のプロモーターが、当分野に置いて確立しており、ある特定の実施形態において、使用され得る。さらなるベクターには、モロニーマウス白血病ウイルスおよびＨＩＶベースのウイルス等のレトロウイルスベクターが挙げられる。１つの実施形態において、ＨＩＶベースのウイルスベクターは、少なくとも２つのベクターを含み、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子はＨＩＶゲノム由来であり、ｅｎｖ遺伝子は別のウイルス由来である。一部の実施形態において、オルソポックスもしくはトリポックスベクター等のポックスベクター、単純ヘルペスＩウイルス（ＨＳＶ）ベクター等のヘルペスウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない、ＤＮＡウイルスベクターが使用される。
【００７３】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、１つ以上の転写因子をコードするもの）が、細胞（幹細胞、心筋細胞、および／または体細胞）をペースメーカー細胞に変換するために、インビボおよび／またはインビトロで投与される。一部の実施形態において、転写因子の機能的断片をコードするポリヌクレオチドが、全転写因子に加えて、またはその代わりに送達される。本明細書で使用される場合、用語「断片」、「機能的断片」、または類似の用語は、それらの通常の意味を与えるものとし、対応する完全長アミノ酸配列（またはその配列をコードするポリヌクレオチド）の機能の少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を有するアミノ酸配列（またはその配列をコードするポリヌクレオチド）の一部を指すものとする。そのような断片の機能性を検出および定量化する方法は、当分野において確立されている。
送達方法
【００７４】
いくつかの実施形態において、心臓の電気活動を調節するための本明細書に開示される組成物（転写因子または細胞である）の投与は、（例えば、電子ペースメーカーの植え込みまたは外植中の）直接的な心臓注入を介するものである。一部の実施形態において、全身注入が使用される。一部の実施形態において、冠内注入が使用される。なおさらなる実施形態において、カテーテル指向性（ｃａｔｈｅｔｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）投与が使用される。一部の実施形態において、組成物を局所的に投与するために、マップ誘導カテーテルシステム（例えば、ＮＯＧＡ（登録商標））が使用される。一部の実施形態において、他のマッピングまたは誘導技術が使用される。例えば、いくつかの実施形態において、蛍光透視ベースの誘導が使用される。一部の実施形態において、エレクトロアナトミカル（Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｔｏｍｉｃａｌ）誘導がまた使用される。一部の実施形態において、心臓内電位図による、特異的構造のマッピング（ヒス束、束の右または左部分、プルキンエ線維等が挙げられるが、これらに限定されない）がまた使用される。さらに、一部の実施形態において、カテーテル、針、または他の送達装置（複数可）の所望の標的位置への送達を誘導するために、Ｘ線または磁気カテーテルがまた使用される。
【００７５】
いくつかの実施形態において、局所的送達手法は、活性生物学的ペースメーカーを生成する時間を有利に減少させる。一部の実施形態において、本明細書に開示されるいくつかの構成物の組織特異的（または細胞型特異的）送達は、その構成物が内因性組織の発現プロファイルに基づく生物学的ペースメーカーの生成の促進に特に適しているという点において有利である。一部のそのような実施形態において、転写因子の組み合わせが同じ標的部位に送達される一方、他の実施形態において、個々の構成が別個の標的部位に送達され、全体の効果は、生物学的ペースメーカーの生成をもたらす。
【００７６】
いくつかの実施形態において、形質導入は、心尖部への局所的注入によって達成される。いくつかの実施形態において、形質導入は、左心室の心尖部への局所的注入によって達成される。いくつかの実施形態において、脳卒中または他の塞栓症の危険性を低減するために、右側（例えば、心房、または心室のいずれかの心臓の右側）のアプローチが使用される。しかしながら、いくつかの実施形態において、左側のアプローチが使用される。いくつかの実施形態において、上部からヒス束またはＡＶ結節にアクセスするために、注入カテーテルは、（右心室ではなく）右心房を介して導入される。いくつかの実施形態において、動脈アクセスを必要とすることなく注入カテーテルを左心房または左心室に導入するために、経中隔カテーテル法が使用され、それによって、脳卒中の危険性を低減する。なおさらなる実施形態において、注入カテーテルの導入は、本明細書に開示されるような生物学的製剤を心室の種々の標的に注入するためのバルサルバ洞を介した心静脈を経由したものである。そのようなアプローチは、心臓再同期治療においてペースメーカーリードの配置のために使用されるものと類似している。
【００７７】
このため、いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物は、１つ以上の転写因子（または事前に転写因子と接触させた細胞）を、右心房、右心室、ＳＡ結節、ＡＶ結節、ヒス束、ならびに／または束の左脚および右脚のいずれかに送達するために使用され得る。さらに、いくつかの実施形態において、冠静脈洞およびその静脈枝のカニューレ挿入を通して、複数の左心室部位への送達が達成される。有利に、好ましくない冠静脈解剖所見を有する患者において、いくつかの実施形態において、動脈アクセスを必要とすることなく左側の構造に直接アクセスすることを可能にする経中隔穿刺を通して右側から、左側へのアクセスが達成される。
【００７８】
いくつかの実施形態において、追加の方法が使用され、心臓組織の毛細血管透過性を増加するための化合物の投与を含む。好適な血管透過性薬剤（遺伝子導入ベクターの投与前に、その間に、またはその後に投与される）は、約５００マイクロモル濃度未満のカルシウムを有する溶液：物質Ｐ、ヒスタミン、アセチルコリン、アデノシンヌクレオチド、アラキドン酸、ブラジキニン、エンドセリン、エンドトキシン、インターロイキン２、ニトログリセリン、一酸化窒素、ニトロプルシド、ロイコトリエン、酸素ラジカル、ホスホリパーゼ、血小板活性化因子、プロタミン、セロトニン、腫瘍壊死因子、血管内皮増殖因子、毒液、血管作用性アミン、または一酸化窒素合成阻害剤、セロトニン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）もしくは機能性ＶＥＧＦ断片を含む。
組織上の生物学的ペースメーカーの効果
【００７９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される転写因子（またはインビトロでそれらの転写因子と接触させた細胞）の投与は、そのような信号に先に応答したが、それらを生成しなかった細胞中で、自発的で反復的な電気信号を誘導するか、またはさもなければ、それを生成させる。例えば、発火頻度をほとんど示さなかった、または示さなかった処置された心筋細胞（例えば、約４０％〜約３０％、約３０％〜約２０％、約２０％〜約１０％、または約１０％〜約０％、またはそれらの範囲に重複する自動能の指標）に関して、投与前の細胞と比較して、投与後、発火頻度または電気信号出力の増加した回数を示す（例えば、約５％〜約１５％、約１５％〜約２５％、約２５％〜約３５％、約３５％〜約４５％、約４５％〜約５５％、約５５％〜約６５％、約６５％〜約７５％、約７５％〜約８５％、約８５％〜約９５％、約９５％〜約１００％以上の自動能の指標）。
【００８０】
本明細書に開示される方法によって、結果として得られる心臓収縮の変化および／または変換されるペースメーカー細胞の電気的特性は、いくつかの実施形態において、心臓調律を調節する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法および組成物は、臨床的に所望の心拍数の約２５％以内、約２０％以内、約１５％以内、約１０％以内、約５％以内、約２％以内、または約１％以内の心拍数を実現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法および組成物を使用して、心臓に関係する失神（例えば、ストークス・アダムス失神）、持続性洞性徐脈等の洞結節機能の異常、Ｓ−Ａウェンケバッハを呈する洞房（Ｓ−Ａ）ブロック、完全なＳ−Ａブロックもしくは洞停止、および高度房室ブロック、または徐脈頻脈症候群もしくは他の徐脈関連状態等の疾病または疾患を患っているか、またはそれらの影響を受けやすい対象を治療する。いくつかの実施形態において、植え込みペースメーカーの機能を上昇するか、または鈍化するための調節が使用される（例えば、植え込みペースメーカーが、それ自体で提供することができない所望の心拍数を達成するために）。
転写因子の投与の結果としての細胞の変化
【００８１】
いくつかの実施形態において、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、またはそれらの組み合わせの投与は、上記で考察された自発的で反復的な電気信号の生成に加えて、またはそれとは別に、接触した細胞にいくつかの生理学的変化を生じる。一部の実施形態において、これらの生理学的変化は、最初にインビトロで見られたとしても、インビボでも検出可能であり、それらは、生物学的ペースメーカー生成の有効性の追加のマーカーとして機能し得る（例えば、それらがペースメーカー細胞の特徴または特質として認識される）。一部の実施形態において、１つ以上の転写因子の投与は、対照と比較して、自発的に拍動する単層培養の増加したパーセンテージをもたらす。いくつかの実施形態において、自発的な拍動の存在または量は、移植する前に機能性に関して培養を選別するために、またはインビトロのペースメーカー細胞の生成におけるそれらの有用性のための転写因子の他の組み合わせを評価するために、使用される。一部の実施形態において、１つ以上の転写因子の投与は、投与される心筋細胞の自発的な細胞内Ｃａ２＋変動をもたらす。一部の実施形態において、１つ以上の転写因子の投与は、段階的第４相脱分極をもたらす。一部の実施形態において、本明細書に開示される１つ以上の転写因子の送達は、細胞内のＨＣＮ４の発現を増加または減少する。カルシウムフラックスが、心臓の電気的シグナル伝達の主要成分であり、ＨＣＮ４発現が、ペースメーカー細胞機能において重要であるため、これらのエンドポイントの変化は、一部の実施形態において、誘導される生物学的ペースメーカー細胞において、よりＳＡＮのような挙動に対応する。一部の実施形態において、１つ以上の転写因子の投与は、筋細胞膜下の自発的な局所的Ｃａ２＋放出現象の調節をもたらす。一部の実施形態において、１つ以上の転写因子の投与は、細胞内ｃＡＭＰレベルの調節をもたらす。このため、上記の種類の転写因子のうちの１つ以上の投与の結果として、心臓の電気活動が調節され、興奮性心臓組織の異常が治療され得る。
【００８２】
いくつかの実施形態において、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、またはそれらの組み合わせの投与は、自発的で反復的な電気信号の生成に加えて、またはそれとは別に、接触した細胞の新たな表現型の細胞をもたらす。一部の実施形態において、１つ以上の転写因子の投与は、形質導入細胞において、無秩序な著しく低い筋節α−アクチン発現をもたらし、それはペースメーカー細胞を示している。一部の実施形態において、１つ以上の転写因子の投与は、細胞の大きさの変化をもたらす。一部の実施形態において、１つ以上の転写因子の投与は、クロマチン状態の変化をもたらす。一部の実施形態において、１つ以上の転写因子の投与は、クロマチン修正をもたらし、以下の遺伝子、Ｃｘ４３、Ｋｉｒ２．１、Ａｃｔｃ２、およびＨＣＮ４のうちの１つ以上のより低いもしくはより高い発現または活性を生じる。これらの表現型の変化は、自然のＳＡＮ細胞のものに酷似しており、これらの転写因子のうちの１つ以上の投与の結果として、いくつかの実施形態において、生物学的ペースメーカー細胞の生成を評価するための追加の手法として使用され得る。
【００８３】
いくつかの実施形態において、１つ以上の転写因子の心臓への投与は、標的化されるペースメーカー活性の生成をもたらす遺伝子注入の部位から高頻度の異所性心室拍動をもたらす。一部の実施形態において、１つ以上の転写因子の投与は、細胞および新規のペースメーカー活性において遺伝子関連の後成的変化をもたらす。このペースメーカー活性は、一部の実施形態において、体細胞のリプログラミングの結果であり、前駆体状態への脱分化によるものではない。体細胞から体細胞への分化転換は、形質導入細胞からの腫瘍の脅威を低下させる（例えば、奇形腫形成を低減させる）。他の実施形態において、しかしながら、１つ以上の転写因子の投与は、前駆体状態への脱分化をもたらし得る。ある特定のそのような実施形態において、ペースメーカー細胞への分化は、本明細書に開示される転写因子のうちの１つ以上を使用して誘導される。そのような方法を使用して、生物学的ペースメーカー細胞は、多種多様な細胞から、安全に、効率的に作られることができる。
【実施例】
【００８４】
以下に提供される実施例は、本発明の実施形態の非限定的なものとして意図される。
方法：
ＮＲＶＭの異種形質導入
【００８５】
Ｃ末端ｍｙｃ／ＦＬＡＧタグを有するヒトＴｂｘ１８遺伝子をＦｓｅＩおよびＳａｌＩによる消化によってｐＣＭＶ６−Ｔｂｘ１８（Ｏｒｉｇｅｎｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から切除した。Ｔｂｘ１８遺伝子を、次いで、所望のレポーター遺伝子であるｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ消化レンチウイルス発現ベクターにサブクローン化し、これにより、ｐＬＶ−Ｔｂｘ１８−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎ１（約１０．１ｋｂ）ベクターを生成した。ＺｓＧｒｅｅｎｌを、通常使用されるＧＦＰとの、その類似のスペクトル特徴のため、Ｔｂｘ１８−形質導入心筋細胞に対してレポータータンパク質として使用した。このため、本開示全体を通して、用語ＺｓＧｒｅｅｎｌおよびＧＦＰは、同様の意味で用いられる。組換え標的遺伝子を、次いで、ゲートウェイ適応ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用するゲートウェイ組換えクローン化によってアデノウイルスベクター主鎖に導入した。所望のアデノウイルス発現構成物、ｐＡｄ−ＣＭＶ−ＴＢＸ１８−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（約３９．８ｋｂ）を生成するために、ＬＲ組換え反応をエントリークローンと目的ベクター（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴ（約３６．７ｋｂ）との間で実施した。陽性の構成物をＤＮＡ配列決定によって正確な標的遺伝子を有するように検証した（Ｌａｒａｇｅｎ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）。
電気生理学
【００８６】
全細胞電気生理の記録を以下に記載されるように実施した。Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により、２０ｋＨｚのサンプリングレートおよび５ｋＨｚでの低域ベッセルフィルターで、標準的な微小電極ホールセルパッチクランプ技術を用いて実験を行った。実験はすべて室温で実施した。ＮａＣｌ  １３８、ＫＣｌ  ５、ＣａＣｌ２  ２、グルコース１０、ＭｇＣｌ２  ０．５、およびＨＥＰＥＳ  １０（ｍｍｏｌ／Ｌ）を含有する、ｐＨ  ７．４の通常のタイロード液で細胞を洗浄した。マイクロピペット電極溶液は、Ｋ−グルタミン酸１３０、ＫＣｌ  ９、ＮａＣｌ  ８、ＭｇＣｌ２  ０．５、ＨＥＰＥＳ  １０、ＥＧＴＡ  ２、およびＭｇ−ＡＴＰ  ５（ｍｍｏｌ／Ｌ）；ｐＨ  ７．２で構成された。内部記録溶液で満たした場合、微小電極は２〜４ＭΩの先端抵抗を有した。２．５秒のエピソード間の間隔で、電位−クランプ実験を実施した。活動電位は、ＧＦＰ−ＮＲＶＭ上で短い脱分極電流パルス（２〜３ｍｓ、５００〜８００ｐＡ）によって開始されるか、またはＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ上でＩ＝０モードで記録されるかのいずれかであった。測定された液体接合部電位（−ｍＶ）に関するデータを収集した。キセノンアークランプを用いて、４８８／５３０ｎｍ（励起／放出）でＧＦＰ蛍光を見た。
アデノウイルスの構成および精製
【００８７】
２９３Ａ細胞に遺伝子導入する前に逆方向末端反復を露出するために、上記で考察される発現構成をＰａｃＩで消化し、その後の導入遺伝子発現の発現に使用するためのアデノウイルスのストックを産生した。アデノウイルスをプラーク精製し、増幅し、アデノピュア（Ａｄｅｎｏｐｕｒｅ）キット（Ｐｕｒｅｓｙｎ，Ｉｎｃ）を使用してアフィニティーカラム精製し、−８０℃で保管した。
筋細胞の単離および形質導入
【００８８】
生後１〜２日の子ラットからＮＲＶＭを単離し、確立した培養方法を使用して単層として培養した。房室結節細胞の汚染を最小化するために、心臓の下３分の１のみ（心尖部から正中）を切除した。一部の実施形態において、内因性ペースメーカー細胞を選択的に除去する、下部３分の１、中央３分の１、およびこれらの部分の組み合わせを含む心臓の他の部分、または全心臓（もしくはそれらの部分）を使用する、一部の実施形態において、非ペースメーカー組織）を得るために、生検（例えば、誘導生検）を使用する。細胞単離の１日後、Ａｄ−Ｔｂｘ１８−ＩＲＥＳ−ＧＦＰまたはＡｄ−ＧＦＰのいずれかでＮＲＶＭの単層を形質導入し（対照ベクター；ｍｏｉ＝１〜１０）、２〜５日間培養された。非特異的な胚性転写因子関連効果を制御するために、心臓腔の分化に極めて重要であると知られているＴｂｘ２０を用いた。
ＳＡ筋細胞の単離
【００８９】
成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットからＳＡ結節筋細胞を単離した。動物は、イソフルランで麻酔をかけられた。心臓を素早く除去し、心室から心房を分離し、１４０  ＮａＣｌ、５．４  ＫＣｌ、１．２  ＫＨ２ＰＯ４、５  ＨＥＰＥＳ、５．５５  グルコース、１  ＭｇＣｌ２、１．８  ＣａＣｌ２（ｍＭ）（ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整される）から成るタイロード液中で洞房結節領域を解剖した。分界稜、心房中隔、ならびに上および下大静脈の境界でラットの洞房結節領域を画定した。
胚性幹細胞の形質導入
【００９０】
マウスの胚性幹細胞にＳｈｏｘ２または対照遺伝子を発現するアデノウイルスベクターを遺伝子導入した。確立された胚様体法を使用して分化した。統合データは、すべての報告された差異において、ｎ≧３およびｐ＜０．０５である。
細胞内カルシウム記録および分析
【００９１】
細胞内Ｃａ２＋変動の測定において、２ｘ１０６ＮＲＶＭを３５ｍｍのガラス底培養皿（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｕｌｔｕｒｅｗａｒｅ）または２２ｍｍのフィブロネクチンをコートしたカバーガラスに蒔き、形質導入し、形質導入後４日間分析した。細胞に１８分間Ｒｈｏｄ２−ＡＭ（２μｍｏｌ／Ｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）をロードし、次いで１度洗浄し、その後、２ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムを含む通常のタイロード液中に配置した。Ａｄ−Ｔｂｘ１８ＩＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰおよびＡｄ−ＧＦＰ形質導入ＮＲＶＭからカルシウムトランジェントを３７℃で記録した。倒立共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ｎｉｋｏｎ）またはＬｅｉｃａ  ＳＰ５共焦点顕微鏡上で画像を得た。Ｕｌｔｒａｖｉｅｗ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）およびＩｍａｇｅＪを使用して、オフライン分析を実施した。個々の細胞の信号を平均することによって単一のＮＲＶＭを通した共焦点ライン走査画像から、全細胞Ｃａ２＋トランジェントを得た。Ｃａ２＋トランジェントは、バックグラウンド除去され、正規化された蛍光（Ｆ／Ｆ０）として示される。２−Ｄ共焦点Ｃａ２＋イメージングに関して、全体の細胞を通る信号を平均することによって、カルシウムトランジェントを得た。
免疫染色
【００９２】
アデノウイルス形質導入後４日の、新生ラットの洞房結節およびＮＲＶＭの凍結切片を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．１％のトリトンＸ１００で透過処理し、次いで、適切な一次抗体：筋節α−アクチニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ａ５０４４；１：８００）、ＡＮＰ（ＡｂＣａｍ；ａｂ−１４３４８；１：１０００）、ＨＣＮ４（Ａｂｃａｍ；ａｂ８５０２３；１：５００）、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−結合型二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でインキュベートした。
免疫ブロット
【００９３】
Ｃｘ４３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃ６２１９；１：１０００）、ＰＬＮ（Ａｌｏｍｏｎｅ；Ａ０１０−１４：１：５０００）、ｐ−ＰＬＢ（Ａｌｏｍｏｎｅ；Ａ０１０−１２：１：５０００）、ＨＣＮ４（ＡｂＣａｍ；ａｂ８５０２３；１：５００）に対して特異的な抗体を使用して、ウエスタンブロットを実施した。簡潔に、Ａｄ−Ｔｂｘ１８、Ａｄ−ＧＦＰ形質導入ＮＲＶＭ、ラットのＳＡＮ、および左心室を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を含有するＲＩＰ  Ａ緩衝液中でホモジナイズした。ＢＣＡアッセイによってタンパク質含有量を数量化し、細胞ライセート（レーンあたり１５μｇ）を１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流し、ＰＶＤＦ膜上に移した。次いで、移された膜を４℃で一晩、一次抗体でインキュベートし、ペルオキシダーゼ結合型二次抗体での１時間のインキュベーションが続く。化学発光（ＥＣＬウエスタンブロッティング分析システム、Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって免疫活性を検出した。モノクローナル抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ａｂｅａｍ；ａｂ９４８２；１：１００００）または抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ａ３８４８：１：２５０００）で膜を再検出することによって、ゲルの同等のタンパク質負荷を評価した。
インビボ遺伝子導入
【００９４】
モルモットの左心室心尖部にアデノウイルスを注入した。成体雌性モルモット（体重  ２５０〜３００ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に４％のイソフルランで麻酔をかけ、挿管し、１．５％〜２％のイソフルランを供給する気化器を伴う人工呼吸器の上に置いた。外側開胸後、３０ゲージの針を左心室の自由壁心尖部に挿入した。１ｘ１０９プラーク形成単位のＡｄ−Ｔｂｘ１８−ＩＲＥＳ−ＧＦＰまたはＡｄ−ＧＦＰ（対照群）を含有する１００μｌのアデノウイルスを左心室心尖部に注入した。上記で考察されるように、一部の実施形態において、他の送達経路が使用される。
インビボおよびエクスビボ心電計（ＥＣＧ）
【００９５】
全身麻酔（２％のイソフルラン、９８％のＯ２）下でのＥＣＧ記録の前に動物の洞調律を緩徐にするために、頸静脈を介してメタコリン（生理食塩水中の体重１ｋｇあたり０．１〜０．５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を送達した。２ｋＨｚで２リードのデジタルＥＣＧシステム（リードＩおよびリード３、ＢＩＯＰＡＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｏｌｅｔａ，ＣＡ）を使用してＥＣＧを記録し、Ａｃｑｋｎｏｗｌｅｇｅ３．７．３ソフトウェア（ＢＩＯＰＡＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｏｌｅｔａ，ＣＡ）を使用してアイントホーフェンの三角形によってリード２をオフラインで算出した。すべての動物において、完全な心臓ブロックが達成されるまでメタコリンを投与した。心臓ブロックは、１００ｂｐｍ未満の動物の洞調律の減少を伴った。Ｔｂｘ１８注入モルモットのほとんどにおいて、洞調律が１００ｂｐｍに達する前に、異所性の心室調律が明らかになった（図３Ｄ、右パネル）。対照的に、対照動物は、洞調律が１００ｂｐｍ未満に導かれる場合であっても、そのような異所性の心室拍動の証拠がないことを示した（図３Ｄ、左パネル）。図３Ｄは、Ｔｂｘ１８注入動物と比較してとても遅い補充速度（ｅｓｃａｐｅ  ｒａｔｅ）であっても、対照動物中の任意の異所性の心室調律の欠如を強調する。
【００９６】
エクスビボでの無処置の全心臓ＥＣＧ記録のため、３６℃で酸素化したタイロード液を用いて６０ｍｍＨｇの大動脈を介して心臓を逆行性灌流した。灌流された心臓を、温かいタイロード液が充填された、シルガードで被覆されたプレートに配置した。リードＩおよびＩＩを記録するために適切な部位にＥＣＧリードを配置した（図２８）。２０分間の平衡化時間の後、液体Ｎ２が充填されたｃｒｙｏｇｕｎ（Ｂｒｙｍｉｌｌ  Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，ＣＴ）で房室結節の領域を切断した。隔離されたパルス刺激装置（Ｍｏｄｅｌ  ２１００，Ａ−Ｍ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂｏｒｇ，ＷＡ）に接続された白金電極を用いて、導入遺伝子注入の部位（前側の左心室心尖部）で、２００ｍｓ間隔で電極ペーシングを実施した。
遺伝子配列のＲＴ−ＰＣＲ
【００９７】
ラットの洞房結節、左心室、ならびにＴｂｘ１８およびＧＦＰ形質導入ＮＲＶＭ（形質導入後４日）を収集し、ｍＲＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ  ｍＲＮＡ単離キット）。ＲＴ２第１ストランドキット（ＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ｍＲＮＡサンプルを第１ストランドｃＤＮＡに変換した。次いで、ｃＤＮＡテンプレートをＲＴ２  ｑＰＣＲマスターミックスと混合し、その混合物を事前に分配される遺伝子特異的プライマーセットを含む、同じプレートの各ウェルに分注した。７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上でＰＣＲを実施し、遺伝子の相対的発現を算出した。
ｃＡＭＰアッセイ
【００９８】
Ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  Ｅｌｉｓａアッセイキット（カタログ番号ＳＴＡ−５０１；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＩＮＣ）を使用して、Ａｄ−Ｔｂｘ１８またはＡｄ−ＧＦＰを形質導入されたＮＲＶＭにおけるｃＡＭＰレベルを判定した。簡潔に、ヤギ抗ウサギ抗体被覆プレート（Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｐｌａｔｅ）の９６ウェルプレートに、５０μｌのＴｂｘ１８およびＧＦＰ−ＮＲＶＭ細胞ライセートを添加した。２５μｌの希釈されたペルオキシダーゼ  ｃＡＭＰトレーサー複合体を各被験ウェルに添加した。次いで、各被験ウェルに５０μｌの希釈されたウサギ抗ｃＡＭＰポリクローナル抗体を添加し、振盪しながら室温で３０分間プレートをインキュベートした。洗浄後、各ウェルに１００μｌの化学発光試薬を添加した。オービタルシェーカー上での室温で５分間のインキュベーション後、各マイクロウェルの発光に対してプレートをプレートルミノメーター上で読み取った。光放出（ＲＬＵ）の測定は、サンプル中のｃＡＭＰの量の算出を可能にし、それは次いで、サンプルの比較のためにβ−アクチンに正規化された。
溶液
【００９９】
ＮａＣｌ  １４０、ＫＣｌ  ５．４、ＣａＣｌ２  １．５、ＭｇＣｌ２  １．５、グルコース  １０、およびＨｅｐｅｓ  ５（ｍｍ）；（ｐＨはＮａＯＨで７．３８に調整される）を含有するタイロード液。リアノジンおよびタンパク質キナーゼＩ（ＰＫＩ）をＴｏｃｒｉｓ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、カフェインをＳｉｇｍａから購入した。Ｒｈｏｄ−２／ＡＭをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
クロマチン免疫沈降
【０１００】
室温で８分間、１０％のホルムアルデヒドを用いたウイルスベクター形質導入の後２〜４日に、Ｔｂｘ１８またはＧＦＰのいずれかを形質導入されたＮＲＶＭを固定した。各２０秒間の１０回のパルスで、各パルス間に氷上で３０秒静止するソニケーターを使用して、細胞を剪断した。製造業者の手順書に従って、ＣｈＩＰ−ＩＴ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓクロマチン免疫沈降キット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してクロマチン免疫沈降を実施した。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３の一次抗体をＡｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆから購入した。
クロマチン免疫沈降後のｑＰＣＲ
【０１０１】
既にラット中でｑＰＣＲを検証された遺伝子特異型（Ｃｘ４３、Ｋｉｒ２．１、α−ＳＡ、ＨＣＮ４）プライマーをＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。各遺伝子に関して、転写開始部位の−２ｋｂ（上流）、−ｌｋｂ、および＋ｌｋｂ（下流）に対応する３セットのプライマーを用いた。３つのタイルからのΔＣｔ値をデータ分析のために各実験から平均化した。
単細胞の定量的リアルタイムＰＣＲ
【０１０２】
広開口のパッチピペットを用いてＰＢＳ中で単一の筋細胞を収集し、ドライアイス上に配置し、次いで、−８０℃で保管した。製造業者の取扱説明書に従って、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ−ｔｏ−ＣＴ（商標）キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、定量的リアルタイムＰＣＲによって個々の筋細胞中のＴｂｘ１８のｍＲＮＡレベルを検査した。簡潔に、室温で５分間、単細胞を細胞溶解液およびＤＮａｓｅＩで処置した。ＳｕｐｅｒｓＳｃｒｉｐｔ  ＲＴおよびＶＩＬＯ  ＲＴの混合物の添加後、２５℃で１０分間、４２℃で６０分間、および８５℃で５分間逆転写を実施した。ＰｒｅＡｍｐ混合物ならびにヒトＴｂｘ１８（アッセイＩＤ：Ｈｓ０１３８５４５７＿ｍ１）、モルモットＧＡＰＤＨ（アッセイＩＤ：Ｃｐ０３７５５７４２＿ｇ１）、およびモルモットＴｎｎＴ２（アッセイＩＤ：Ｃｐ０４１８２３５７＿ｇ１）のプライマーを含有する０．２ｘＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイの添加により、前置増幅を９５℃で１５秒間および６０℃で４分間の１４サイクル実施した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって、カスタムプライマーを合成した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステムを使用して、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを用いたリアルタイムＰＣＲに前置増幅生成物（１：２０希釈）を使用した。３つのプライマーセットのそれぞれに対する標準曲線は、入力ＤＮＡテンプレートの段階希釈を用いて構築され（図３０）、匹敵する増幅効率が検証された（曲線勾配：−３．３２〜−３．６４）。Ｔｂｘ１８、ＧＡＰＤＨ、およびＴｎｎＴ２の関連ｍＲＮＡレベルは、各プライマーセットに対する標準曲線の勾配を用いたＣｔ値の外挿によって得られた。各細胞中のＴｂｘ１８のｍＲＮＡ発現を、次いで、ＧＡＰＤＨまたはＴｎｎＴ２レベルに正規化した。
統計分析
【０１０３】
平均値、標準偏差、および平均値の標準誤差（ＳＥＭ）に関してデータを分析した。この作業における定量的な数値は、平均値±ＳＥＭを表す。独立ｔ検定を使用して、データセットを統計学的に評価した。別途示されない限り、ｐ＜０．０５は、有意であると見なされた。
実施例１−ＮＶＲＭへの遺伝子送達によって作成されたペースメーカー細胞
【０１０４】
上記で考察されるように、興奮性組織の異常によって引き起こされる心不整脈の現在の治療法は、主として薬物療法、高周波アブレーション、植え込み型装置、および他のそのような関連する手法を用いる。これらの方法は、不整脈の一部の形態の治療に有用であるが、制限を有する（上記で考察されるように）。生物学的ペースメーカーは、従来のペースメーカーの使用に優る利点を提供し、従来のペースメーカーの代わりに、または組み合わせて使用することができる。現在の研究は、生物学的ペースメーカーの生成のための薬剤を誘導する転写因子の使用を評価した。
【０１０５】
転写因子の心臓細胞への形質導入が生物学的ペースメーカーを生成することを示すために、バイシストロニックアデノウイルスベクターにおいて選択された転写因子の特異な異種の形質導入を新たに単離されるＮＲＶＭにおいて実施した。最初のスクリーンとして、形質導入３６〜４８時間後の自発的に拍動する培養の数を分析した。Ｔｂｘ１８遺伝子導入したＮＲＶＭ（Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭ）は、対照および選別される他の転写因子と比較して、自発的に拍動する単層培養の増加したパーセンテージを示した（群あたり最低５つの異なる細胞単離、図２Ａ）。培養の２日間を超えて、ＴｂｘによるＣｘ４３（しかしＣｘ４５またはＣｘ４０ではない）の下方制御から予想されるように、複数の自発的に拍動するフォーカスが、個々のＴｂｘ−ＮＲＶＭ単層内で観察された。したがって、心室の心筋細胞をペースメーカー細胞に変換するための候補としてＴｂｘを選択した。このため、いくつかの実施形態において、Ｔｂｘ１８を使用して、生物学的ペースメーカーを作る。しかしながら、いくつかの実施形態において、現在の実験において選別されるもののうちの１つ以上を含む他の転写因子が使用される。いくつかの実施形態において、２つ以上の転写因子の組み合わせが使用される。いくつかの実施形態において、これらの結果を達成するために、Ｔｂｘ１８と組み合わせてＳｈｏｘ２が使用される。いくつかの実施形態において、以下の転写因子、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、Ｔｂｘ３、およびＴｂｘ５のうちの１つ以上が、使用するために選択される。
【０１０６】
単層として培養される場合、ＮＲＶＭは自発的なシンシチウム収縮（ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）を示すが、そのような現象は、比較的少ない数の自律的に拍動する細胞によって動かされる。図２Ｂは、代表的な活動電位（ＡＰ）記録を示す。所与の細胞が、隣接する細胞と物理的に接触する可能性がないように、約４ＮＲＶＭ／ｍｍ２の密度で低密度に蒔かれるとき、刺激に応じてのみ単一の活動電位を発火する対照（ＧＦＰ）心室筋細胞の大多数は、静止状態であった（９個中７個）（図２Ｂ，左）。Ｔｂｘ１８発現は、電気的な表現型をＳＡＮ細胞のものに形質転換した。ほとんどのＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（９個中７個）は、自律的および自発的に拍動する（図２Ｂ、右）。いくつかの実施形態において、Ｓｈｏｘ２が、Ｔｂｘ１８の代わりに、またはそれと併せて使用され得ることが理解されよう。いくつかの実施形態において、以下の転写因子、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、Ｔｂｘ３、およびＴｂｘ５のうちの１つ以上が、使用するために選択される。Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭは、顕著な段階的第４相脱分極を有する自発的なＡＰを示した。段階的第４相脱分極は、ＳＡＮペースメーカー細胞中の自動能の根底にあり、Ｔｂｘ−ＮＲＶＭ（図２Ｂ）において顕著である。この自律的拍動の増加および段階的脱分極は、これらの細胞が自然の洞房結節細胞と一致する方法で機能することを示し、これはＴｂｘ１８（単独または他の転写因子と組み合わせて）がペースメーカー細胞を生成することを示唆する。一部の実施形態において、同様の機能が幹細胞において検出され、それによって、その細胞が、生物学的ペースメーカーの生成および不整脈の治療において有用であることを示す。
【０１０７】
ＧＦＰ−ＮＲＶＭ（ｎ＝５、図２Ｃ、左）における−７３±６ｍＶの静止膜電位（ＲＭＰ）と比べて、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおける−４７±１０ｍＶ（ｎ＝６）の最大拡張期電位（ＭＤＰ）が脱分極された。これは、Ｔｂｘ−１８形質導入細胞が、ペースメーカー細胞がそうであると予期されるように、対照細胞よりもより頻繁に発火することを示唆する。ＧＦＰおよびＴｂｘ１８群は、提示されるデータ全体を通して、それぞれ白および斜交平行模様のバーによって示される。本明細書で使用される場合、用語「自動能の指標」は、その通常の意味を与えるものとし、また、対照（ｌ３±４％ｂｐｍ、図２Ｃ、中央）と比較してＴｂｘ−ＮＲＶＭ（７０±１６％ｂｐｍ）においてはるかに大きかった、それらの細胞における活動電位（ＡＰ）変動の頻度を乗じる自律的に拍動する細胞のパーセンテージとして定義されるものとする。図２Ｃの中央に示されるように、自動能は、ＧＦＰ対照に比べて約６０％増加した。一部の実施形態において、自動能の指標における増加は、正常なペースメーカー細胞の自動能と比較して、５％〜約１５％、約１５％〜約２５％、約２５％〜約３５％、約３５％〜約４５％、約４５％〜約５５％、約５５％〜約６５％、約６５％〜約７５％、約７５％〜約８５％、約８５％〜約９５％、約９５％〜約１００％、およびそれらの重複する範囲である。自発的なＣａ２＋変動を有する細胞の数もまた、対照と比べて増加した（図２Ｃ、右）。自発的な細胞内Ｃａ２＋変動を示すＴｂｘ１８−ＮＲＶＭの数は、対照に比べて約６倍高かった（図２Ｃ、右）。Ｃａ２＋が、ペースメーカー細胞の活動電位の生成に必須であるため、これらのデータはまた、細胞のＴｂｘ１８（単独または他の転写因子との組み合わせ）の形質導入が、ペースメーカー細胞の生成に成功裏に使用され得ることを示す。
【０１０８】
拡張期電位、自動能、およびＣａ２＋変動の変化は、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおけるＩＫ１密度の７８％減少によって補完された（図２Ｄ）。左：−１４０〜−２０ｍＶのランププロトコルによって誘発された代表的なＩＫ１の未加工記録を示す。−１４０ｍＶで要約されたＩＫ１密度が、２Ｄの右に示される。いくつかの実施形態において、ＩＫ１密度の減少は、約５％〜約１５％、約１５％〜約２５％、約２５％〜約３５％、約３５％〜約４５％、約４５％〜約５５％、約５５％〜約６５％、約６５％〜約７５％、約７５％〜約８５％、約８５％〜約９５％、約９５％〜約１００％、およびそれらの重複する範囲である。ＩＫ１密度の減少はまた、形質導入細胞が非処置細胞（例えば、非ペースメーカー細胞）と比較してより高い頻度で発火することを示す。この発火の増加は、これらの形質導入細胞が、ペースメーカー細胞として機能することを示す。このため、これらの細胞を生成するために使用される方法、または幹細胞からペースメーカー細胞を生成するために使用される方法が、心不整脈、または妨害される心臓細胞の発火頻度に関連する他の疾患の治療において使用され得る。
【０１０９】
ＨＣＮ４は、ＳＡＮ中のペースメーカー活性に寄与する過分極活性化電流Ｉｆの分子相関物である。Ｔｂｘ１８の形質導入は、ＨＣＮ４を発現する細胞の数の３．８倍の増加をもたらした（図２Ｅ）。ＧＦＰまたはＴｂｘ１８−ＮＲＶＭのＨＣＮ４免疫染色画像（ＨＣＮ４−白、核−青）は、それぞれ、左および中央に示される。スケールバー：２００μｍ。右パネル：ＧＦＰまたはＴｂｘ１８−形質導入細胞あたりのパーセントＨＣＮ４−陽性細胞の要約。Ｔｂｘ１８発現はまた、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおけるＨＣＮ４タンパク質レベルの１．４倍の増加（図２Ｆ）をもたらした。そのような細胞はまた、ウサギのＳＡＮ細胞において報告されるものと一致する密度（−１４０ｍＶで−５．２±１．３ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝３）でＩｆ（図２Ｇ）を示した。ウエスタンブロットは、成体ラットのＳＡＮ（右）において観察されるレベルのＨＣＮ４に匹敵する、対照（左）と比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいてより高いＨＣＮ４タンパク質レベルを示す。Ｃａ２＋サイクリング事象は、自動能を生成する筋細胞膜のイオン電流を補完し、それと共役する。電位およびカルシウム依存性機構の選択される成分の転写レベルの比較は、ここで陽性対照として使用される天然のＳＡＮと心室心筋との間でそれらを綿密に再現する、Ｔｂｘ１８対ＧＦＰ−ＮＲＶＭにおける差異を明らかにした（図２Ｈ）。ＧＦＰ−ＮＲＶＭに正規化されたＴｂｘ１８−ＮＲＶＭと（左）、ＬＶに正規化されたＳＡＮ（右）とを比較する、選択される遺伝子の関連ｍＲＮＡレベルの変化。ＳＡＮおよびＴｂｘ１８−ＮＲＶＭは、類似のパターンの正規化される転写レベルを示す。このため、いくつかの実施形態において、Ｔｂｘ１８はまた、生物学的ペースメーカー形成に関連する遺伝子およびタンパク質発現の変化を誘発する。
【０１１０】
図２Ｂは、Ｔｂｘ１８細胞が、（緩徐な脱分極を伴う）天然のＳＡＮ細胞のものと同様の方法において、さらに発火する可能性が高かったことを示す。図２Ｃが、Ｔｂｘ１８細胞が、自動能のより高い指標（中央）およびより自発的なＣａ２＋の全細胞変動（左）をもたらすより低い拡張期電位（中央）を有することを示す。図２Ｄは、Ｔｂｘ１８細胞の電流密度が、より短い再分極時間、およびこのため、発火のより大きな可能性を有することを示す。これらのデータは共に、一部の実施形態において、Ｔｂｘ１８が、細胞の電気特性を変化させ、それらをＳＡＮのようにしたことを示す。これらの結果のそれぞれは、生体心臓に植え込まれるか、またはその中に生成されるとき、これらの細胞が自動的に発火するより高い可能性を示す。このため、いくつかの実施形態において、これらの誘導ペースメーカー細胞は、拍動することができ、心不整脈または異常な心臓調律に関連する他の疾患を治療するために、心臓調律を調節することができる。
【０１１１】
膜限局性の電気生理経路は歩調取りに寄与するが、ＳＡＮ細胞は、細かく組織化された特徴的な細胞内Ｃａ２＋サイクリング事象によって、律動的に発火するように誘起される。筋細胞膜下の、自発的な局所的Ｃａ２＋放出現象（ＬＣＲ）は、洞房結節細胞における自動能の特質である。後期拡張期中、ＬＣＲは、Ｎａ＋−Ｃａ２＋交換体電流（ＩＮＣＸ）を作動し、それは次いで、第４相脱分極の対数期に寄与する。それらのＣａ２＋サイクリングプロファイルを特徴付けるために、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭ上でＬＣＲ測定を実施した。
【０１１２】
後期拡張期中、ＬＣＲは、Ｎａ＋−Ｃａ２＋交換体電流（ＩＮＣＸ）を作動し、それは次いで、第４相脱分極の対数期に寄与する。Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの線走査共焦点イメージングが、天然のＳＡＮペースメーカー中で観察されるＬＣＲを再現する、各全細胞Ｃａ２＋トランジェント（図３Ａ、ｎ＝１０個の細胞中８個）に先立つＬＣＲを解像した。形質導入後４日で、Ｒｈｏｄ２／ＡＭをロードされたＴｂｘ１８−ＮＲＶＭ（図３Ａ）およびＧＦＰ−ＮＲＶＭ（図３Ｂ）における［Ｃａ２＋］ｉの変化の代表的な共焦点線走査画像は、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭ中でのみ全細胞Ｃａ２＋トランジェントに先立つＬＣＲを示すが、時折、Ｃａ２＋スパークがＧＦＰ−ＮＲＶＭ中で検出され得る。ＬＣＲ期間は、Ｃａ２＋トランジェントの開始からその後のＬＣＲの初めまでの間の期間として定義される。サイクル長は、全細胞Ｃａ２＋トランジェントの開始からその後のＣａ２＋トランジェントの開始までの間の期間として定義される。ＬＣＲは、サイクル長の７２±１％の平均期間をもつ周期性を示した（図３Ｃ）。このため、Ｔｂｘ１８は、単独でまたは他の転写因子とともに、心筋細胞をペースメーカーのようなＣａ２＋活性を有する細胞に機能的に変換する。
【０１１３】
Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおけるＬＣＲは、３４３±８ｍｓの平均期間で生じ、全細胞Ｃａ２＋トランジェントサイクル長の７２±１％であった（４７４±７ｍｓ、図３Ｄ）。一部の実施形態において、ＬＣＲは、全細胞Ｃａ２＋トランジェントサイクル長の約５％〜約１５％、約１５％〜約２５％、約２５％〜約３５％、約３５％〜約４５％、約４５％〜約５５％、約５５％〜約６５％、約６５％〜約７５％、約７５％〜約８５％、約８５％〜約９５％、約９５％〜約１００％であり、およびそれらの重複する範囲で生じる。［Ｃａ２＋］ｉにおける変化の空間平均されたＦ／Ｆ０プロットは、対照と比較してＴｂｘ−ＮＲＶＭにおいてカフェイン（２０ｍＭ）誘導性Ｃａ２＋トランジェントの２．３倍の増加を示した。対照的に、ＬＣＲは、対照細胞中（ｎ、１２個の細胞中約１２個、図３Ｄ）では検出されなかったが、時折ランダムに分布したスパークが観察された（例えば、図３Ｂ）。筋小胞体（ＳＲ）中のより大きいＣａ２＋ストアは、自動能を促進する可能性がある。カフェイン誘発性Ｃａ２＋トランジェントの振幅は、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて２．３倍大きかった（図３Ｄ）。
【０１１４】
ウエスタンブロット実験は、成体ラットのＳＡＮに類似している全ＰＬＢレベルの減少およびリン酸化ＰＬＢ（ｓｅ１６）の増加を示した（図３Ｆ）。対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＳＥＲＣＡ２Ａ、ＮＣＸＩ、およびＲｙＲのタンパク質レベルにおける変化が観察されなかった（図３Ｇ）。Ｃａ２＋遊離チャネル遮断薬であるリアノジン（１０μＭ）は、自発的なＣａ２＋トランジェントの比率をＴｂｘ−ＮＲＶＭにおいて４７±６％抑制したが、対照においては、わずかｌ２±２％であった（図３Ｅ）。これらの結果は、Ｔｂｘ１８（単独または他の転写因子と組み合わせて）の形質導入が、いくつかの実施形態において、生物学的ペースメーカーを生成するために使用され得るか、または一部の実施形態において、生体ペースメーカーとして機能するように、その後植え込まれ得る細胞を生成するために使用され得ることを示す。
【０１１５】
ホスホランバン（ＰＬＮ）は、その非リン酸化状態において、筋小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼ２ａ（ＳＥＲＣＡ２ａ）を阻害し、それによって、内部ストアによるＣａ２＋の再取り込みを抑制する。そのような阻害は、タンパク質のリン酸化（Ｐ−ＰＬＢ）に応じて軽減される。関連ｐ−ＰＬＢ（Ｓｅｒ１６）レベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ−ＮＲＶＭにおいて６５倍高く（図３Ｆ、左パネル）、心室心筋内のものと比較して、ＳＡＮにおいて見られるｐＰＬＮの増大を模倣した（図３Ｆ、右パネル）。一方、ウサギ洞房結節対左心室における所見と一致して、ＳＥＲＣＡ２ａ、ＮＣＸｌ、およびリアノジン受容体（ＲｙＲ）のタンパク質レベルにおける差異は、Ｔｈｘ−とＧＦＰ−ＮＲＶＭとの間において検出されなかった（図３Ｇ）。細胞内ｃＡＭＰレベルは、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて１．７倍高く（図３Ｈ）、当分野で既知の心室心筋と比較して、ウサギのＳＡＮにおいて観察されるより高い［ｃＡＭＰ］ｉを再現した。ＰＫＡ阻害剤（ＰＫＩ、１５μＭ）の適用は、Ｔｂｘ−ＮＲＶＭにおける自発的な全細胞Ｃａ２＋トランジェントの休止をもたらしたが、ＧＦＰ−ＮＲＶＭ（図３Ｉ）上で効果はなかった。このため、ＮＲＶＭにおけるＴｂｘ１８発現は、洞房結節ペースメーカー細胞の主要特徴を再現する主要Ｃａ２＋サイクリング成分の変化を生成し、それによって、いくつかの実施形態において、細胞のＴｂｘ１８（実施形態によって、単独または他の転写因子と組み合わせて）の形質導入が、心不整脈を治療するための治療法において使用されることを可能にした。
リプログラムされた細胞の表現型の変化
【０１１６】
電気生理学的変化に加えて、細胞のリプログラミングは、ペースメーカー組織における細胞構造の主要特徴を再現する。天然の洞房結節ペースメーカー細胞は、それらの形態において特徴的であり、機能している心筋細胞よりも小さく、秩序のない筋原線維を示す。Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭが表現型の変化を有するかどうかを試験するために、細胞の形態を研究した。
【０１１７】
新生ラットの心臓の切片は、心臓筋節α−アクチニン（α−ＳＡ）発現が、隣接する右心房と比較して、洞房結節でより顕著に低く、無秩序であることを示す（ＲＡ、図４Ａ、上部左および下部左）。Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭは、筋原線維の組織崩壊およびａ−ＳＡの弱い発現（図４Ａ、下部右）を伴うそれらの形態において、天然の洞房結節細胞に似ていた。ＨＣＮ４発現（上部中央）によって境界を画定される新生ラットの洞房結節は、より弱く、不定形の筋節α−アクチニン（α−ＳＡ）発現（上部パネル）を示す。下段左：上段左内の囲まれた領域の拡大画像。パターンは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて、ＧＦＰ−ＮＲＶＭと比較して、正確に再現される（それぞれ、下部右および中央）。スケールバー：３０μｍ。データは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおけるα−ＳＡ転写レベルの観察される下方制御によって実証される（図２Ｈ）。２つの補完的方法によって測定される細胞の大きさは、対照ＮＲＶＭにおけるものよりもＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて２８−３３％小さく（図４Ｂ）、機能している心筋細胞と比較してより小さい大きさのＳＡＮ細胞を再現する。このため、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭは、構造的（形態学）ならびに機能的（電気生理学）リプログラミングの両方を経た。
【０１１８】
洞房結節様表現型への変化がＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおける洞房結節様クロマチン状態に関連するかどうかを次いで研究した。ヒストン３（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）におけるリジン２７のトリメチル化は、遺伝子発現抑制のためのポリコーム群タンパク質の動員を促進するヘテロクロマチンマークである。反対に、リジン４（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）のトリメチル化は、遺伝子転写的活性をマークする。４つの遺伝子、Ｃｘ４３、Ｋｉｒ２．１、Ａｃｔｃ２、およびＨＣＮ４のプロモーター領域中のヒストン修正プロファイルを次いで研究した。Ｔｂｘ１８は、洞房結節頭部範囲の胚発生に必要とされる転写因子である。Ｓｈｏｘ２は、静脈洞におけるＮｋｘ２．５の負の制御因子である（上記で考察されるように）。Ｔｂｘ３は、欠乏性または異所性の発現のいずれかから生じる発生エラーを有する洞房結節特殊分化の強力な制御因子である。Ｔｂｘ５は、Ｓｈｏｘ２およびＴｂｘ３の正の制御因子である。これらの遺伝子は、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおける関連分子および機能的変化を示す。Ｈ３Ｋ２７上のトリメチル化レベルは、対照に正規化されるＨＣＮ４プロモーター上のその抑圧的な後成的圧力を解放する一方、Ｔｂｘ１８が、Ｃｘ４３、Ｋｉｒ２．１、およびａ−ＳＡプロモーターの不活性を増加したことを示す。ｑＰＣＲが続くクロマチン免疫沈降によってこれらの結果を測定した。一方、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（図４Ｃ右）レベルは、Ｃｘ４３、Ｋｉｒ２．１、およびａ−ＳＡの転写的活性プロモーター領域が、Ｔｂｘ１８発現に応じて減少した一方、活性ＨＣＮ４プロモーター領域の割合が、Ｔｂｘ１８発現に応じて増加したことを示す。Ｃｘ４３、Ｋｉｒ２．１、およびＡｃｔｃ２は、対照と比較してＴｂｘ１８−ＮＲＶＭにおいて後成的に不活性になった（より高いＨ３Ｋ２７ｍｅ３およびより低いＨ３Ｋ４ｍｅ３）（図４Ｃ）。結果として、これらのデータは、Ｔｂｘ１８発現が、Ｃｘ４３、Ｋｉｒ２．１、およびａ−ＳＡ発現のうちの１つ以上を低減し得る一方、ＨＣＮ４が上方制御され得ることを示唆する。ＨＣＮ４が反復信号に関与するので、これらのデータは生物学的ペースメーカーの形成と一致する。さらに、クロマチンヒストン修正は、トランジェント機能的再操作ではなく、恒久的な後成的リプログラミングと一致する。
【０１１９】
図５において、ＮＲＶＭにおける心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の発現は、血管収縮剤であるエンドセリン−Ｉ（１００ｎＭ）を用いた２４時間の刺激によって誘導された。しかしながら、誘導されるＡＮＰ発現は、Ｔｂｘ１８発現によって抑制されたが（５Ｂ、下部パネル）、ＧＦＰには効果がなかった（５Ａ、下部パネル）。スケールバー：２０μｍ。これらの表現型の変化のそれぞれは、Ｔｂｘ１８−形質導入細胞が、処置されない心筋細胞よりも洞房結節のように見えることを示す。これは、構造的ならびに生理学的である細胞のリプログラミングを反映し、このため、洞房結節細胞に類似する生物学的ペースメーカー細胞を生成する。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、Ｃｘ４３、Ｋｉｒ２．１、およびＡｃｔｃ２のうちの少なくとも１つは、静止細胞と比較してｉＳＡＮ細胞において後成的に不活性になり得る。いくつかの実施形態において、ｉＳＡＮ細胞における筋節α−アクチニンの発現は、静止細胞と比較して弱いことがある。さらに、いくつかの実施形態において、ｉＳＡＮ細胞は、筋原線維の組織崩壊を示し得る。そのような変化のうちの１つだけが生じ得るか、または実施形態によって、それらの組み合わせが生じ得るが、しかしながら、上述のそれぞれは、洞房結節様表現型に対する細胞の変化と一致する。さらに、いくつかの実施形態において、ペースメーカー細胞は、イオンチャネルタンパク質の誘導される変質発現を伴わずに生成され、その遺伝子導入は、上記のデータに反し得る（例えば、少なくとも部分的にｉＳＡＮ形成に寄与するＫｉｒ２．１の減少は、Ｋｉｒ２．１チャネルの遺伝子導入によって潜在的に相殺される可能性がある）。
実施例２：生物学的ペースメーカーを誘導する転写因子のインビボでの適用
【０１２１】
前の実施例は、インビトロでの遺伝子／タンパク質の発現および機能における変化を誘導するＴｂｘ１８の能力を確立した。このため、インビボで成体心室筋細胞をペースメーカー細胞にリプログラミングする可能性をまた研究した。Ｔｂｘ１８をコードするアデノウイルスベクターを直接および局所的にモルモットの心臓の心尖部に注入した。一部の実施形態において、注入は、心臓の他の範囲に対してであり、一度にいくつかの範囲であることもある。モルモットは、心血管研究における使用に認められたモデルであり、データは、ヒトを含む他の哺乳動物に容易に推定され得ることが理解されるべきである。一部の実施形態において、Ｔｂｘ１８アデノウイルスベクターの投与は、ヒトの心臓を含む種々の哺乳類の心臓上で実施される。
【０１２２】
モルモットの心臓への注入後２〜４日で、注入の部位から生じるペースメーカーのような信号に関して心臓を調べた。洞調律の徐脈化に際し、ペースメーカー機能を示し得る７つの対照（ＧＦＰ注入）動物のどれも広範囲の複雑な補充調律を示さなかった（図６Ａ左）。同じ条件下で、７匹のＴｂｘ１８−注入動物のうち５匹は、４０±２１ｂｐｍの速さで高頻度の異所性の心室拍動（リードＩＩにおいて負極性をもつ幅広いＱＲＳ複合、図７Ａ）を示した（図６Ｂ）。Ｔｂｘ１８−注入動物における異所性の心室拍動の速度は、遺伝子送達後３〜５日で、対照よりも著しく速くなった（図６Ｂ）。一部の実施形態において、ペースメーカー細胞の拍動数は、健常なペースメーカー細胞の正常な拍動数の約５％〜約１５％、約１５％〜約２５％、約２５％〜約３５％、約３５％〜約４５％、約４５％〜約５５％、約５５％〜約６５％、約６５％〜約７５％、約７５％〜約８５％、約８５％〜約９５％、約９５％〜約１００％、およびそれらの重複する範囲である。この拍動は、正常な心臓の約５％〜約１５％、約１５％〜約２５％、約２５％〜約３５％、約３５％〜約４５％、約４５％〜約５５％、約５５％〜約６５％、約６５％〜約７５％、約７５％〜約８５％、約８５％〜約９５％、約９５％〜約１００％、またはそれらの重複する範囲のヒトを含む哺乳動物の新たな心拍数に対応する。心電図のベクター分析は、異所性拍動が、遺伝子注入の部位（心尖部）において生じ、ベースに対して伝播したことを明らかにした（図６Ａ、右）。対照的に、対照中に見られるまれな補充拍動は、注入部位からは生じなかった。それらは狭く、房室接合部から心尖部に対して伝播された（図６Ａ、左）。このため、インビボでの心室のＴｂｘ１８形質導入は、異所性のペースメーカー活性を誘導し、それは、Ｔｂｘ１８が興奮性組織の異常の治療に使用され得ることを示す。いくつかの実施形態において、Ｓｈｏｘ２は、Ｔｂｘ１８の代わりに、またはそれと併せて使用されてもよい。いくつかの実施形態において、以下の転写因子、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、Ｔｂｘ３、およびＴｂｘ５のうちの１つ以上が、使用するために選択される。いくつかの実施形態において、幹細胞、前駆体細胞、体細胞、および／または心筋細胞は、上記の転写因子に関する遺伝子を遺伝子導入され得ることが理解されよう。次いで、ペースメーカー活性の生成を検証した後、これらの細胞は、興奮性組織の異常を治療するためにインビボで植え込まれ得る。
形態学的変化
【０１２３】
成体モルモットの心室においてＴｂｘ１８を発現することと、Ｔｂｘ１８−形質導入心室筋細胞（Ｔｂｘ１８−ＶＭ）の特性を、ＧＦＰ−形質導入心室筋細胞（対照として、対照−ＶＭ）および天然のＳＡＮ細胞の特性と比較することによってリプログラミングのフィデリティーを試験した。Ｔｂｘ１８およびＧＦＰ、またはＧＦＰ単独を同時発現するアデノウイルスをモルモットの心臓の心尖部内に直接注入した（４×１０７ｃｆｕ／心臓）。注入５日後、心臓を収集し、遺伝子注入部位から心筋細胞を単離した。
【０１２４】
天然の洞房結節細胞は、非形質導入心室筋細胞よりも小さく、痩せている。長さ／幅（ＬｔＷ）比は、それぞれ、１４．７±１．５（ｎ＝２４）および７．６±０．７（ｎ＝９、ｐ＜０．０５）と同等。新たに単離される対照−心室筋細胞は、それらの天然の形状（ＬｔＷ＝７．４±０．９、ｎ＝４を有する）を維持し、対照的に、Ｔｂｘ１８−心室筋細胞は、対照−心室筋細胞よりも痩せており（ＬｔＷ＝１６．０±１．０、ｎ＝１２、ｐ＜０．０５）、しばしば紡錘状であり、ＳＡＮ細胞の形態学的特質を再現した。対照−心室筋細胞は、−７６ｍＶで安定した静止電位を有し、電気刺激にのみ応じて活動電位を誘発した。対照的に、Ｔｂｘ１８−ＶＭは、拡張期脱分極（最大拡張期電位＝−５９ｍＶ）を示し、２６ｂｐｍで自発的な活動電位を発火した。このため、Ｔｂｘ１８形質導入細胞は、よりペースメーカー細胞のように機能する。細胞の大きさの測定である全細胞容量は、Ｔｂｘ１８−心室筋細胞において対照−心室筋細胞に対してより小さかった（それぞれ、４０．８±３．６対１１９±１６ｐＦ）。Ｔｂｘ１８−ＶＭの電気生理学的および形態学的特徴は、概して、天然のＳＡＮ細胞のもの似ていた（図８および９）。これらのデータは、インビボでの心室におけるＴｂｘ１８の体細胞遺伝子導入は、本物のＳＡＮ細胞の主要な表現型特性を正確に再現する誘導ＳＡＮ（ｉＳＡＮ）細胞を産生したことを示す。インサイツリプログラミングは、効果的および迅速（わずか５日間）であり、電子装置の代替物として生物学的ペースメーカーを作る新規の手法を提供した。データは、いくつかの実施形態においてｉＳＡＮ細胞が、非形質導入心室筋細胞よりも大きい長さ／幅比を有することを示す。いくつかの実施形態において、このＬｔＷ比は、約２、約４、約６、約８、または約１０よりも大きい。いくつかの他の実施形態において、このＬｔＷ比は、１５とほぼ同等である。なおさらなる実施形態において、比率は、約１０〜約１２、約１２〜約１４、約１４〜約１６、約１６〜約２０の範囲であるか、またはより大きい。いくつかの実施形態において、ｉＳＡＮ細胞の他の表現型特徴は、天然のペースメーカー細胞のものと似ている（例えば、非形質導入心室細胞よりも密接である）。
実施例３：脱分化の代わりの体細胞から体細胞への形質転換の試験
【０１２５】
Ｔｂｘ１８は、心臓発生における複能性前駆体のマーカーであり、腫瘍に関連付けられている。多能性幹細胞（胚性または誘導性）は、ペースメーカー細胞に自発的に分化することが知られている。したがって、腫瘍による懸念を減少するために、Ｔｂｘ１８形質導入が、培養された心筋細胞内で生じることが知られている脱分化を促進することによって生じ得る多能性／腫瘍性状態を介してペースメーカー細胞を産生しなかったことを確実にするように試験を実施した。しかしながら、本明細書で示されるデータは、Ｔｂｘ１８−ＶＭのＳＡＮ様形態が、非特異的な回帰を示していないことを示す。例えば、成体ＶＭの脱分化は、長方向の「長方形のような（ｂｒｉｃｋｌｉｋｅ）」形状を失い、それらの新生カウンターパートと類似のやや円形になったが、細くはならない。さらに、Ｔｂｘ１８が、胎児状態への復帰変異ではなく特異的再操作を誘導することが、以下に示される。第１に、脱分化は、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）および骨格αアクチン（αＳｋＡ）を含む、胎児心臓の遺伝子特徴の再発現を伴う。Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭ（ｉＳＡＮ細胞）において、ＡＮＰまたはαＳｋＡのいずれも再発現されず、実際、ＡＮＰ発現は強く抑制された（それぞれ、図５Ｃおよび５Ａ、Ｂ）。第２に、脱分化は、前駆体状態に近い形質導入筋細胞をもたらし、Ｎｋｘ２−５等の早期心室転写因子の発現を強化することができる。代わりに、Ｔｂｘ１８は、Ｎｋｘ２−５の転写レベルを低減し（図２Ｉ）、成熟ペースメーカー細胞への変換と一致するが、胎児状態への復帰変異ではない。第３に、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの新規の自動能が、胎生／胎児状態への脱分化の結果である場合、それらの細胞の増殖性指標は、増加することが予期される。これは、胚性心室が、誕生後に急落する能力である過形成によって成長するためである。それどころか、ホスホヒストン３（Ｈ３Ｐ、有糸分裂的活性細胞マーカー）の発現ならびにＥｄＵ（ＢｒｄＵの類似体、有糸分裂および新生ＤＮＡ合成のマーカー）の取り込みは、Ｔｂｘ１８−およびＧＦＰ−ＮＲＶＭにおいて同程度であった（ｎ＝３、図５Ｄ）。最終的に、胚状態への復帰変異は、広範な後成的変化を必要とすることが予期され得る。クロマチンリモデリングに関する８４個の遺伝子の研究は、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭおよびＧＦＰ−ＮＲＶＭとの間のごくわずかな全体的な差異を識別した（図５Ｅ−Ｈ）。さらに、幹細胞性に関する８４個の遺伝子の発現の研究は、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭが、形質導入後２〜４日間、幹細胞性因子の識別可能な増加を伴わずに分化されたままであったことを検証した（図１０Ａ）。これらの発見は、それらの親の皮膚線維芽細胞と比べて、誘導多能性幹細胞にみられる増加した幹細胞性および減少した分化を明確に対比させた（図１０Ｂ）。特異遺伝子関連の後成的変化（図４Ｃ）を踏まえて、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおける新規のペースメーカー活性は、前駆体状態への脱分化を伴わずに、直接の体細胞リプログラミングから起こることが結論づけられた。−特異遺伝子の倍率変化は、Ｔｂｘ１８（ＧＦＰに対して）およびｉＰＳＣ（親の線維芽細胞に対して）に関して、それぞれ、図１０Ｃおよび図１０Ｄにおいてバーグラフで表される。いくつかの実施形態において、Ｓｈｏｘ２が、Ｔｂｘ１８の代わりに、またはそれと組み合わせて使用され得ることが理解されよう。いくつかの実施形態において、以下の転写因子、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、Ｔｂｘ３、およびＴｂｘ５のうちの１つ以上が、分化転換を達成するための使用に選択される。
【０１２６】
これらのデータから、いくつかの実施形態において、静止細胞が胎生／胎児状態への最初に分化転換を伴わずにｉＳＡＮ細胞へ分化転換することが理解されるべきである。このため、いくつかの実施形態において、脱分化を伴わない静止細胞からｉＳＡＮ細胞への変換と一致して、ｉＳＡＮ細胞は、天然のＳＡＮ細胞のものと類似の形態を示し得る。同様に、いくつかの実施形態において、ＡＮＰおよびαＳｋＡの発現は、ｉＳＡＮ細胞において抑制される。加えて、いくつかの実施形態において、ｉＳＡＮ細胞は、成熟した天然のペースメーカー細胞と類似のＮｋｘ２．５の転写レベルを示し得る。いくつかの実施形態において、ｉＳＡＮ細胞は、いかなる識別可能な幹細胞性因子の増加も伴わずに分化されたままである。いくつかの実施形態において、この分化転換が、インビトロで生じ得る一方、他の実施形態においてこの分化転換は、インビボで生じ得る。いくつかの実施形態において、静止細胞は、哺乳類であり、静止細胞がヒトであるいくつかの実施形態を含む。実施例４：Ｓｈｏｘ２を使用する胚性幹細胞のペースメーカー表現型への分化
【０１２７】
胚性幹細胞は、心房、心室、およびペースメーカー特性を用いて、心筋細胞の不均一集合体に自発的に分化することができる。このため、胚性幹細胞が、ランダムな心発生からドミナントなペースメーカー表現型に傾き得るかどうかを試験する実験を実施した。Ｓｈｏｘ２は、洞房結節におけるペースメーカー細胞のパターン形成に不可欠な胚性転写因子である。Ｓｈｏｘ２の過剰発現を使用して、胚性幹細胞の発生プログラムをペースメーカー筋細胞に対して、傾斜させ、ドミナントにした。いくつかの実施形態において、Ｔｂｘ１８が、Ｓｈｏｘ２の代わりに、またはそれと組み合わせて使用され得ることが理解されよう。いくつかの実施形態において、以下の転写因子、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、Ｔｂｘ３、およびＴｂｘ５のうちの１つ以上が、使用のために選択され得る。
結果：
【０１２８】
ＭＥＦフィーダー層上でマウス胚性幹細胞を培養した。確立された懸滴培養方法を使用して、胚様体形成を培養した。３日目に、胚様体の培養を実施した。６日目に、組織培養プレート上での胚様体のプレーティングを実施した（図１１）。
【０１２９】
転写因子ＲＮＡの内因性レベルをいくつかの時点において測定した。図１２に示されるように、Ｔｂｘ１８のＲＮＡの内因性レベルは、胚様体の形成に応じてはっきりと増加し、胚様体のプレーティング後に均一となった。内因性Ｔｂｘ３のＲＮＡは、しかしながら、マウスの胚性幹細胞に対して減少した。図１３は、Ｓｈｏｘ２発現ベクターの投与を示す。１３Ｂのグラフに示されるように、対照マウスの胚性幹細胞に対するｍＲＮＡのレベルは、Ｓｈｏｘ２−ベクターの第３の投与後に対照マウスの胚性幹細胞よりも高いレベルに上昇した。
【０１３０】
胚性幹細胞におけるＳｈｏｘ２のトランジェント過剰発現は、自発的に拍動する胚様体の量を対照（９±６％）と比較して８倍（８０±２７％）増加した（図１４Ａ）。各拍動する胚様体内で、対照（胚様体あたり１．０±０．６）と比較して、Ｓｈｏｘ２−胚様体内で２倍の拍動するフォーカス（胚様体あたり２．１±０．８）が見られた（図１４Ｂ）。Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換体（ＮＣＸ１）およびＨＣＮ４は、ペースメーカーの電気生理学において重要である。図１５に示されるように、ＨＣＮ４タンパク質レベルは、Ｓｈｏｘ２−胚様体内の細胞表面発現の増大によって、すべての分化ステージで上方制御された。図１６の共焦点イメージングも、ＧＦＰ対照細胞に対するＨＣＮ４発現の増加を示す。ＮＣＸｌタンパク質レベルは、分化の早期および後期ステージにおいて、対照と比較してＳｈｏｘ２−胚様体内で６倍を超えて増加した（図１７）。このレベルは下がり始め、Ｓｈｏｘ２遺伝子の最後の投与から１４日後には、ＮＣＸ１は対照よりも１．４倍高かった。活動電位は、コネキシン（Ｃｘ）４５によって主に伝播されるが、心房／心室心筋において反映される洞房結節におけるＣｘ４３はそうではなく、Ｓｈｏｘ２過剰発現は、Ｃｘ４５の転写物（約１．５倍）およびタンパク質（約３倍）レベルの増加をもたらした。対照的に、Ｃｘ４３転写物およびタンパク質レベルは、Ｓｈｏｘ２−胚様体において、対照と比較してそれぞれ３３±５％および３０±１０％低減された（図２０）。Ｃｘ４３転写物におけるこの減少は、実験の１４日間において対照よりも低いままであった（図２１Ａ）。対照的に、Ｃｘ４５は、Ｓｈｏｘ２ベクターの投与から７日後の減少を伴い、１４日まで対照に対して増加されたままであった（図２１Ｂ）。ＨＣＮ４発現およびＣｘ４５の増加されたレベルはまた、形質導入された細胞の共焦点イメージングから明らかである（図２２）。遺伝子導入後のＳｈｏｘ２発現は、対照ＨＭＢＳおよびＧＦＰ遺伝子導入細胞に対して上昇したレベルのままであった（図２３）。ｈＳｈｏｘ２のｍＲＮＡは、Ｓｈｏｘ２遺伝子の形質導入後、最終的に対照細胞のレベルを下回るまで減少した。ＨＭＢＳに対するＴｂｘ１８およびＴｂｘ３のｍＲＮＡレベルは、図２４に示される。これらのデータは、外因性Ｓｈｏｘ２は、様々な遺伝子における発現の変化を生じた内因性Ｓｈｏｘ２の増加を誘導したことを示唆し、それはペースメーカー生成を提案する。例えば、ＨＣＮ４は、ペースメーカー機能およびその上方制御にとって重要であるとして知られており、形質導入細胞は、これらの細胞が、ｉ）Ｓｈｏｘ２によってペースメーカーの特徴を持つ、および／またはｉｉ）それ自体が生物学的ペースメーカー細胞（例えば、移植される細胞）として有用であり得ることを示す。さらに、活動電位の伝播の主な原因となるＣｘ４５の上方制御は、これらのＳｈｏｘ２−形質導入幹細胞がそれらの分化においてペースメーカー系列に対して傾ったことを示す。そのように、これらのデータは、Ｓｈｏｘ２（ここで試験されるように単独、または他の転写因子、例えばＴｂｘ１８と組み合わせて）が、インビボおよび／またはインビトロでの生物学的ペースメーカー細胞の生成に有用であることを示す。
【０１３１】
Ｓｈｏｘ２の過剰発現は、胚性幹細胞分化をよりペースメーカー細胞に対して著しく傾かせ、ＮＣＸ１、ＨＣＮ４、Ｃｘ４５の発現を増加し、およびＣｘ４３を下方制御した。これらの特徴すべては、ＳＡ結節細胞生物学の特質である。いくつかの実施形態において、以下の転写因子、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、Ｔｂｘ３、およびＴｂｘ５のうちの１つ以上が、胚性幹細胞の分化において使用するために選択される。さらに、本明細書に開示される転写因子のうちの１つ以上を接触するとき、複能性および／または他の多能性幹細胞の使用がまた、洞房結節細胞生物学および／またはペースメーカー機能の特質を提供することが理解されよう。データは、多能性細胞から生物学的ペースメーカーを発生させる新規のおよび効率的なプラットフォームを提供する。
実施例５：新規の自動能は、インビトロでおよび無処置の灌流された心臓において自律神経制御に応答する
【０１３２】
ＳＡＮペースメーカー細胞は、変化した発火頻度で自律神経入力に応答する。ｉＳＡＮ細胞におけるアドレナリンおよびムスカリン応答を評価するために、自発的に拍動する細胞からの細胞外電界の電位を記録するようにＴｂｘ１８−およびＧＦＰ−ＮＲＶＭを多電極アレイ（ＭＥＡ）上に蒔いた（図２５Ａ）。（１μＭのイソプロテレノールを用いた）β−アドレナリン刺激は、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭの発火頻度を１０１±３０ｂｐｍから１８３±４４ｂｐｍに増加した（ｎ＝１２、ｐ＜０．０５）。その後のコリン作動薬であるアセチルコリン（１μＭ）への曝露は、速度を６９±３３ｂｐｍに抑制した（ｎ＝１２、ｐ＜０．０５、図２５Ｂ、Ｃ）。対照的に、ＧＦＰ−ＮＲＶＭは、イソプロテレノールまたはアセチルコリンのいずれかによってほとんど変化しない非常に緩徐な自発的な拍動数を示した（図２５Ｂ、Ｃ）。免疫染色は、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭにおけるβ−アドレナリン受容体およびムスカリン受容体２型の顕著な発現を確信させた（図２５Ｄ）。このため、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭは、アドレナリンおよびムスカリン刺激に適切に応答した。
【０１３３】
無処置の心臓における誘導生物学的ペースメーカーの自律神経制御を研究するために、電子ペースメーカーの配置における一般的な指標である房室（ＡＶ）ブロックの疾病モデルを作成した。エクスビボで灌流された拍動する心臓の心電図記録（図２８）は、１５４±６ｂｐｍの速度で、８個のＴｂｘ１８−注入心臓中８個において異所性の心室拍動を明らかにした。異所性拍動の極性および形態は、異所性拍動の起点をＴｂｘ１８形質導入の部位に関連づける、導入遺伝子注入の位置において、電極ペースの拍動のものと同一であった（図２５Ｅ）。反対に、ほとんどの対照の心臓は、１２０±７ｂｐｍの平均速度で、心室の反対の端部において生じる狭いＱＲＳの接合部性補充調律を示した（ｎ＝７／１０）（図２５Ｆ）。Ｔｂｘ１８−注入心臓は、自律神経制御によく応答した。コリン作動性抑制が続くβ−アドレナリン刺激は、それぞれ心拍数を、２３５±１９ｂｐｍに増加し、次いで１５０±２３ｂｐｍに減少させた（ｎ＝７、図２５Ｇ）。まとめると、データは、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭ細胞がインビトロでおよび正常な変時性を有する無処置の心臓における自律神経制御に応答することを示す。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、Ｓｈｏｘ２が、Ｔｂｘ１８の代わりに、またはそれと組み合わせて使用され得ることが理解されるべきである。いくつかの実施形態において、以下の転写因子、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、Ｔｂｘ３、およびＴｂｘ５のうちの１つ以上が、使用のために選択され得る。いくつかの実施形態において、ｉＳＡＮ細胞は、異所性の心室拍動を生成し得る。いくつかの実施形態において、Ｔｂｘ１８−ＮＲＶＭ細胞（ｉＳＡＮ細胞）は、自然のＳＡＮ細胞と実質的に同様の方法において異所性拍動のペーシングを変化させる自律神経制御に応答し得る。このため、いくつかの実施形態において、ｉＳＡＮ細胞は、インビボでのβ−アドレナリン刺激およびコリン作動性抑制等の自律神経制御に応答する。いくつかの他の実施形態において、インビトロで静止細胞から変換されるｉＳＡＮ細胞は、自律神経制御に応答することができる。いくつかの実施形態において、ｉＳＡＮ細胞は、自律神経制御によって制御された調律で、異所性拍動を生成し得る。ｉＳＡＮ細胞が自律神経制御に応答するいくつかの実施形態において、ｉＳＡＮ細胞は、不整脈を患っている患者における心不整脈を治療するように機能することができることが理解されるべきである。いくつかの実施形態において、自律神経制御に応答するｉＳＡＮ細胞は、患者の電子ペースメーカー装置を置き換えるか、またはそれを補うことができる。実施例６：誘導ペースメーカー表現型は、Ｔｂｘ１８転写の継続する発現に左右されない
【０１３５】
リプログラムされる細胞は、持続した転写因子発現を伴わずに変化されるままである。ＳＡＮ表現型の持続性を研究するために、インビボでの最初の遺伝子導入から６〜８週間後Ｔｂｘ１８−ＶＭを単離し、Ｔｂｘ１８の転写レベルを単細胞の定量的なＲＴ−ＰＣＲによって数量化した。Ｔｂｘ１８転写は、インビボでの遺伝子導入からちょうど３日後に単離されたＴｂｘ１８−ＶＭにおいて広い動的な検出範囲を示した（図２６Ａ、下部パネル）。ＳＡＮ様ペースメーカー細胞への変換の耐久性を検査するために、インビボでの遺伝子導入から６〜８週間後に単離された５個の自発的に拍動する心室筋細胞（１１４±１０ｂｐｍ、生細胞ビデオ記録またはホールセルパッチクランプによって識別される）を検査した。Ｔｂｘ１８、心臓のトロポニンＴ（ＴｎＴ２、心筋細胞のアイデンティティを検証するため）、およびＧＡＰＤＨを検出するように、ＰＣＲプライマーセットを設計した。５個の自発的に拍動する筋細胞中４個におけるＴｂｘ１８転写のレベルは、ＧＦＰ単体を発現する心室筋細胞中の負の対照レベル（図２６Ｃ）に近い、取るに足らないものであった（図２６Ｂ、細胞１、２、３、および４、下部パネル）。判断基準として細胞の長さ／幅（Ｌ／Ｗ）比をとり、最初の遺伝子導入後６週間まで、ＳＡＮ様Ｔｂｘ１８−ＶＭ（ｉＳＡＮ細胞）のパーセンテージを検査した。有意な比率のｉＳＡＮ細胞が持続するが、パーセンテージは経時的に低下する傾向にある（図９Ｃ）。いくつかの実施形態において、それによって、ｉＳＡＮ細胞の投与による持続性の好ましい効果（例えば、心不整脈を治療する）が、投与後、延長された期間において持続する。例えば、いくつかの実施形態において、その効果は、投与後約２〜約４週間、約３〜約５週間、約４〜約６週間、約５〜約７週間、約６〜約８週間、およびそれらの重複する範囲において持続する。いくつかの実施形態において、実施形態によって、より長い期間の持続が、認められる。
【０１３６】
灌流された無処置の心臓ＡＶブロックモデルを使用して、形質導入の最初の数日間を過ぎる誘導ペースメーカー表現型の持続を検査した。遺伝子導入後３〜４週間、Ｔｂｘ１８−注入心臓は、１６５±１４ｂｐｍ（ｎ＝３／３、図２９Ａ）で異所性の固有心室調律を示し、Ｔｂｘ１８注入部位からの生物学的ペーシングと一致する心電図を有する（図２９Ｂ）。さらに、これらの心臓は、短期のＴｂｘ１８−注入心臓（図２５Ｇ）に類似の手法における自律神経制御に応答した（図２９Ｃ）。まとめると、データは、ＳＡＮ様細胞が、外因性Ｔｂｘ１８発現が衰退した後であってもペースメーカー機能を維持し、本物のリプログラミングを示していることを示す。
【０１３７】
このデータから、いくつかの実施形態において、ｉＳＡＮ細胞は、静止細胞からペースメーカー様細胞への変換後、Ｔｂｘ１８を発現し続けないことが理解されるべきである。このため、いくつかの実施形態において、Ｔｂｘ１８の静止細胞への単一の投与は、静止細胞をｉＳＡＮ細胞に変換し、ｉＳＡＮ細胞が、例えｉＳＡＮ細胞中でＴｂｘ１８発現が衰退する場合であっても、インビボで少なくとも６〜８週間それらのペースメーカー機能を維持するのに十分であり得ることが理解されるべきである。一部の実施形態において、変換されるｉＳＡＮ細胞がペースメーカー機能を維持する間のこの期間は、６週間未満であり得る。一部の実施形態において、この期間は、８週間超であり得る。一部の実施形態において、Ｔｂｘ１８転写物の１つを超える投与が、静止細胞に投与され得る。さらに、いくつかの実施形態において、Ｓｈｏｘ２は、Ｔｂｘ１８の代わりに、またはそれと組み合わせて使用され得ることが理解されるべきである。いくつかの実施形態において、以下の転写因子、Ｔｂｘ１８、Ｓｈｏｘ２、Ｔｂｘ３、およびＴｂｘ５のうちの１つ以上ならびに／もしくは機能的断片またはそれらの組み合わせが使用のために選択され得る。一部の実施形態において、転写因子または複数の転写因子の投与が、インビトロで生じ得る。いくつかの実施形態において、ｉＳＡＮ細胞におけるＴｂｘ１８の発現が衰退した後に、異所性の調律を生成するｉＳＡＮ細胞の能力は、ｉＳＡＮ細胞が、心不整脈を有する対象における電子ペースメーカーを置き換えるか、もしくは補う、またはその対象におけるその心不整脈を治療するように作用するのに好適であり得ることを示すことが理解されるべきである。
【０１３８】
本発明の実施形態は、ある特定の好ましい実施形態および実施例に関連して開示されてきたが、本発明は、具体的に開示された実施形態を超えて、他の代替の実施形態および／または本発明ならびにそれらの明らかな修正および均等物の使用まで拡大解釈されることが当業者によって理解される。加えて、本発明の多数の変形が示され、詳細に説明されたが、本発明の範囲内である他の修正が、本開示に基づいて当業者には容易に明らかである。実施形態の特定の特徴および態様の種々の組み合わせまたは部分的組合せが、本発明のうちの１つ以上の範囲において行われてもよいことがまた企図される。さらに、一実施形態と関連する本明細書の開示の任意の特定の特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）、態様、方法、特性、特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）、品質、特質、要素等は、本明細書に示されるすべての他の実施形態において使用され得る。したがって、開示される実施形態の種々の特徴および態様は、開示される発明の様々な様式を形成するために互いに組み合わせられるか、または置き換えられ得ることを理解されたい。本明細書に開示される実施形態のすべてに関して、その方法のステップは、連続して実施されることを必要としない。このため、本明細書で開示される本発明の範囲は、上記で説明された特定の開示された実施形態によって制限されるべきではないことが意図される。
【０１３９】
配列番号第１−ヒトＴ−ｂｏｘ３（ＴＢＸ３）、転写変異体１、ｍＲＮＡ
受入番号−ＮＭ＿００５９９６．３
ＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＣＴＣＧＣＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＣＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＣＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧＴＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＴＴＡＧＧＡＡＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＴＴＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＣＡＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＡＴＴＧＡＡＡＣＣＧＡＧＡＣＡＣＣＣＴＣＣＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＧＣＧＡＡＣＧＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＴＴＣＡＡＧＴＴＴＴＧＡＴＡＧＣＧＣＴＧＧＴＡＧＡＡＧＧＧＧＧＴＴＴＡＡＡＴＣＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＣＴＴＴＴＴＣＣＧＣＴＣＴＣＴＣＧＣＴＣＣＣＴＧＴＴＡＡＡＧＣＣＧＧＧＴＣＴＡＧＣＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＡＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＧＴＡＡＡＡＡＧＴＣＴＴＣＴＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＧＣＡＡＣＡＡＡＡＧＡＣＣＴＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＴＴＣＣＴＧＧＧＡＣＧＣＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＡＧＣＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＣＧＣＧＡＧＴＣＧＡＧＡＣＣＣＴＧＣＴＣＧＣＴＣＣＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＡＣＧＴＴＣＡＧＧＡＧＣＧＧＣＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＣＧＣＡＡＧＧＣＡＣＡＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＣＣＣＧＣＧＣＧＡＣＴＡＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＴＴＴＴＴＣＧＣＣＴＴＧＣＣＣＴＣＴＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＴＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＡＡＡＡＧＡＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴＴＧＡＡＧＴＧＣＡＴＴＡＧＴＴＧＴＧＡＴＴＴＣＴＧＣＣＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＧＡＡＴＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＧＡＣＴＴＧＴＣＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＡＴＧＡＧＡＧＡＴＣＣＧＧＴＣＡＴＴＣＣＴＧＧＧＡＣＡＡＧＣＡＴＧＧＣＣＴＡＣＣＡＴＣＣＧＴＴＣＣＴＡＣＣＴＣＡＣＣＧＧＧＣＧＣＣＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＴＧＡＧＣＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＴＣＡＣＣＡＧＣＣＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＣＣＣＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＡＡＣＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＴＣＴＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＧＡＴＣＡＴＧＧＡＴＣＡＡＴＴＧＧＴＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＣＧＣＡＴＣＴＧＡＧＧＣＣＴＴＴＧＡＡＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＡＡＡＧＡＡＣＴＴＴＧＧＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＣＡＡＧＣＧＧＧＧＣＡＣＣＧＡＧＡＴＧＧＴＣＡＴＴＡＣＣＡＡＧＴＣＧＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡＴＧＴＴＴＣＣＴＣＣＡＴＴＴＡＡＡＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＡＡＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＴＴＧＡＴＧＧＡＣＡＴＴＡＴＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＧＴＣＧＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＴＴＣＴＣＧＧＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧＴＡＡＧＧＣＣＧＡＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＣＣＡＡＡＧＡＧＧＡＴＧＴＡＣＡＴＴＣＡＣＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＧＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＡＣＡＧＴＧＧＡＴＧＴＣＣＡＡＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＴＴＣＣＡＣＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣＴＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＴＴＴＣＡＧＡＣＡＡＡＣＡＴＧＧＡＴＴＴＡＣＴＡＴＡＴＴＧＡＡＣＴＣＣＡＴＧＣＡＣＡＡＡＴＡＣＣＡＧＣＣＣＣＧＧＴＴＣＣＡＣＡＴＴＧＴＡＡＧＡＧＣＣＡＡＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＡＡＡＣＴＣＣＣＴＴＡＴＡＧＴＡＣＡＴＴＴＣＧＧＡＣＡＴＡＣＴＴＧＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＡＣＴＧＣＡＴＡＣＣＡＧＡＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＡＣＣＣＡＧＴＴＡＡＡＡＡＴＡＧＡＣＡＡＣＡＡＣＣＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＡＣＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＣＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＴＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＡＴＧＡＧＧＧＴＧＴＴＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＣＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＣＴＴＴＣＡＡＣＴＧＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＴＧＴＡＧＧＧＡＣＡＴＣＧＡＡＣＣＴＣＡＡＡＧＡＴＴＴＡＴＧＴＣＣＣＡＧＣＧＡＧＧＧＴＧＡＧＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＧＣＡＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＴＧＧＣＣＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＴＣＧＧＡＧＧＡＧＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＡＣＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＣＡＡＧＧＣＴＣＡＣＣＴＴＴＴＣＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＧＡＣＡＧＣＧＧＧＣＧＧＣＴＧＧＡＣＡＡＡＧＣＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＴＣＡＣＧＣＣＡＴＡＧＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＴＣＧＴＣＣＡＧＣＡＣＴＣＧＣＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＣＧＧＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＧＡＧＣＣＣＧＧＴＴＣＧＣＧＡＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＣＣＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＴＣＣＣＧＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＴＴＣＧＣＧＣＣＧＣＴＣＡＣＧＧＴＧＣＡＧＡＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＣＡＣＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＧＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＴＧＧＣＧＧＧＣＣＡＡＣＡＧＴＴＣＴＴＣＡＡＣＧＧＧＣＡＣＣＣＧＣＴＣＴＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧＧＧＧＧＣＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＡＴＧＧＧＴＣＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＡＣＧＧＴＴＴＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＣＡＣＣＧＧＴＧＴＣＴＣＧＧＧＣＣＴＧＧＡＴＴＣＣＡＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＴＧＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＣＣＧＣＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＣＴＴＴＣＧＧＡＡＧＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＡＴＧＧＣＣＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＴＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＣＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＴＧＡＡＣＡＣＣＡＴＧＣＧＣＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＧＣＴＡＣＡＧＣＣＣＣＴＡＣＴＣＣＡＴＣＣＣＧＧＴＧＣＣＧＧＴＣＣＣＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＴＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＧＧＣＡＡＡＧＴＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＣＴＣＧＧＧＣＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＡＣＡＧＣＣＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＧＣＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＣＣＣＡＡＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＣＧＧＴＴＧＧＴＴＡＧＣＧＧＣＴＴＧＧＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＧＡＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＣＧＣＧＴＣＣＣＣＧＴＡＧＡＣＣＣＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＣＧＴＣＴＴＴＴＣＡＴＴＣＣＡＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＣＧＴＧＣＡＣＴＴＴＧＴＣＧＧＡＴＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＣＣＡＣＧＧＧＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＧＴＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＣＣＣＧＧＡＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＧＧＣＧＴＧＧＴＴＴＡＴＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＡＧＡＡＡＣＧＴＣＧＧＴＴＧＣＡＴＴＧＡＧＣＴＡＣＴＧＧＧＧＧＴＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＡＣＡＴＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＧＣＡＡＣＴＴＣＣＡＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＣＣＣＴＣＡＧＴＧＣＧＧＡＴＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＴＣＣＴＴＣＡＣＴＧＴＧＴＣＡＡＧＴＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＧＧＧＡＣＡＡＧＴＧＡＡＣＡＣＡＴＴＡＡＣＡＴＧＡＴＴＣＴＧＴＴＴＧＴＧＣＡＧＡＴＴＡＡＡＡＡＣＴＴＴＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＧＣＡＴＴＡＴＣＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴＡＡＡＴＴＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＴＴＧＴＴＴＧＧＧＧＡＧＧＧＡＡＧＴＣＣＣＴＡＣＣＡＴＣＣＴＴＧＴＴＴＡＧＴＣＴＡＴＡＴＴＡＡＧＡＡＡＡＴＣＴＧＴＧＴＣＴＴＴＴＴＡＡＴＡＴＴＣＴＴＧＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＣＡＴＧＴＣＣＡＣＡＧＴＡＡＴＧＴＡＴＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＣＧＣＴＴＧＣＴＴＴＴＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＴＡＴＡＧＣＣＣＣＣＴＡＣＣＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＴＣＣＴＴＴＧＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＡＧＴＧＡＣＣＣＡＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＴＧＧＧＣＡＡＡＡＣＡＣＡＴＡＡＡＡＴＧＡＡＴＴＴＡＴＴＡＴＡＴＣＴＡＡＧＣＴＣＴＧＴＡＧＣＡＧＧＡＴＴＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＴＴＴＧＡＣＡＧＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＧＣＡＡＴＡＡＣＡＡＧＧＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＧＡＡＧＴＧＡＧＡＣＴＡＴＴＡＧＡＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＡＴＧＴＡＡＴＴＡＴＴＴＧＡＴＡＡＣＴＣＴＴＧＴＡＡＡＴＡＧＧＴＧＧＡＡＴＡＴＧＡＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＡＡＴＴＡＡＡＣＴＴＴＡＡＴＴＴＡＴＴＧＡＣＡＴＴＧＴＡＣＡＴＡＧＣＴＣＴＧＴＧＴＡＡＡＴＡＧＡＡＴＴＧＣＡＡＣＴＧＴＣＡＧＧＴＴＴＴＧＴＧＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＡＧＴＴＧＧＧＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＧＣＴＧＴＴＡＡＣＡＣＴＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＣＴＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＴＡＣＣＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＡＴＧＴＣＣＡＡＡＡＧＴＧＧＧＧＧＡＡＡＧＴＧＣＴＡＴＴＴＣＣＴＡＴＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡＡＴＴＧＧＧＧＡＡＧＧＡＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＡＡＴＴＣＣＴＴＡＡＡＡＴＡＴＡＡＣＴＧＡＧＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＴＴＧＣＴＡＧＴＣＴＣＴＧＡＴＴＴＣＣＴＣＡＡＡＡＣＧＡＡＧＴＧＧＡＡＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＴＧＴＣＡＧＴＡＴＣＧＧＴＧＴＴＴＴＧＡＡＴＴＧＧＴＧＣＣＴＧＣＣＴＡＴＡＧＡＧＡＴＡＴＡＴＴＣＡＣＡＧＴＴＣＡＡＡＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＡＧＡＴＧＧＴＴＴＡＡＡＧＡＣＡＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＧＴＴＡＴＡＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＴＴＴＧＧＴＴＴＴＣＴＧＴＡＴＴＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＴＣＴＴＴＡＡＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＡＡＡＴＴＴＣＡＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＡＴＴＧＡＡＡＴＧＴＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
【０１４０】
配列番号第２−ヒトＴ−ｂｏｘ３（ＴＢＸ３）、転写変異体２、ｍＲＮＡ
受入番号−ＮＭ＿０１６５６９．３｜
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配列番号第３−ヒトＴ−ｂｏｘ５（ＴＢＸ５）、転写変異体１、ｍＲＮＡ
受入番号−ＮＭ＿０００１９２．３
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【０１４２】
配列番号第４−ヒトＴ−ｂｏｘ５（ＴＢＸ５）、転写変異体２、ｍＲＮＡ
受入番号−ＮＭ＿０８０７１８．１
ＡＴＧＧＣＣＧＡＣＧＣＡＧＡＣＧＡＧＧＧＣＴＴＴＧＧＣＣＴＧＧＣＧＣＡＣＡＣＧＣＣＴＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＡＡＡＡＧＡＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＧＡＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＧＡＧＣＧＣＧＣＴＣＧＧＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＡＡＧＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＣＣＣＣＧＣＡＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＧＧＡＡＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＴＣＴＣＣＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＡＡＡＡＴＴＣＣＡＣＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＡＴＣＡＴＡＡＣＣＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＧＡＴＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＴＡＣＡＡＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＧＧＧＣＣＴＴＡＡＴＣＣＣＡＡＡＡＣＧＡＡＧＴＡＣＡＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＴＡＣＣＴＧＣＣＧＡＣＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＣＡＡＡＴＴＣＧＣＡＧＡＴＡＡＴＡＡＡＴＧＧＴＣＴＧＴＧＡＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴＧＴＡＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＧＧＣＧＣＡＴＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＧＣＴＣＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧＡＡＡＣＴＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＣＡＴＴＴＧＧＧＣＡＴＡＴＴＡＴＴＣＴＡＡＡＴＴＣＣＡＴＧＣＡＣＡＡＡＴＡＣＣＡＧＣＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＣＡＴＣＧＴＧＡＡＡＧＣＧＧＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＴＧＧＡＴＴＴＧＧＣＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＣＡＧＣＧＴＴＣＴＧＣＡＣＴＣＡＣＧＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＣＧＴＴＴＡＴＡＧＣＡＧＴＧＡＣＴＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＡＴＣＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＧＡＴＴＧＡＧＡＡＴＡＡＴＣＣＣＴＴＴＧＣＣＡＡＡＧＧＡＴＴＴＣＧＧＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＣＡＧＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＴＧＣＡＡＡＧＴＡＡＡＧＡＡＴＡＴＣＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＧＴＧＡＧＧＣＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＣＴＣＣＡＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＴＴＴＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＴＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＡＴＡＣＣＡＧＴＧＴＧＡＧＡＡＴＧＧＴＧＴＴＴＣＣＧＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＣＣＣＡＴＡＣＣＣＡＣＴＧＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＡＴＡＧＣＣＡＡＡＴＴＴＡＣＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧＴＧＡＧＴＧＴＧＡＴＣＡＣＣＣＣＴＧＧＴＣＡＡＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＡＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＧＧＴＧＡ
【０１４３】
配列番号第５−ヒトＴ−ｂｏｘ５（ＴＢＸ５）、転写変異体３、ｍＲＮＡ
受入番号−ＮＭ＿０８０７１７．２｜
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【０１４４】
配列番号第６−ヒトＴ−ｂｏｘ５（ＴＢＸ５）、転写変異体４、ｍＲＮＡ
受入番号−ＮＭ＿１８１４８６．１
ＴＴＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴＧＡＧＡＧＡＧＡＣＴＧＡＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＧＡＡＴＣＣＧＧＧＡＡＣＴＴＴＡＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＧＡＡＡＧＧＡＣＴＴＣＧＡＣＣＡＴＴＣＡＣＴＧＧＧＣＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＧＴＧＴＡＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＧＧＧＧＣＡＣＴＧＡＧＡＴＴＡＴＡＴＧＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＧＡＧＧＣＴＡＴＴＴＴＧＴＧＴＴＣＴＴＴＧＧＣＧＣＴＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＣＧＣＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＣＣＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧＧＴＡＧＧＴＧＣＧＣＣＣＴＡＧＴＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＣＣＧＣＴＡＴＴＣＴＧＧＧＴＡＡＧＣＡＧＴＡＡＡＣＣＣＣＧＣＡＴＡＡＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣＧＣＣＴＣＡＣＣＧＣＣＧＧＣＴＴＣＣＣＴＧＣＴＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＴＧＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＡＡＣＧＡＧＡＧＣＡＧＡＡＣＣＴＴＧＣＧＣＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＧＣＡＧＡＣＧＡＧＧＧＣＴＴＴＧＧＣＣＴＧＧＣＧＣＡＣＡＣＧＣＣＴＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＡＡＡＡＧＡＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＧＡＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＧＡＧＣＧＣＧＣＴＣＧＧＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣＡＡＧＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＣＣＣＣＧＣＡＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＧＧＡＡＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＴＣＴＣＣＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＡＡＡＡＴＴＣＣＡＣＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＡＴＣＡＴＡＡＣＣＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＧＡＴＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＴＡＣＡＡＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＧＧＧＣＣＴＴＡＡＴＣＣＣＡＡＡＡＣＧＡＡＧＴＡＣＡＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＴＡＣＣＴＧＣＣＧＡＣＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＣＡＡＡＴＴＣＧＣＡＧＡＴＡＡＴＡＡＡＴＧＧＴＣＴＧＴＧＡＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴＧＴＡＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＧＧＣＧＣＡＴＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＧＣＴＣＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧＡＡＡＣＴＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＣＡＴＴＴＧＧＧＣＡＴＡＴＴＡＴＴＣＴＡＡＡＴＴＣＣＡＴＧＣＡＣＡＡＡＴＡＣＣＡＧＣＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＣＡＴＣＧＴＧＡＡＡＧＣＧＧＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＴＧＧＡＴＴＴＧＧＣＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＣＡＧＣＧＴＴＣＴＧＣＡＣＴＣＡＣＧＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＣＧＴＴＴＡＴＡＧＣＡＧＴＧＡＣＴＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＡＴＣＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＧＡＴＴＧＡＧＡＡＴＡＡＴＣＣＣＴＴＴＧＣＣＡＡＡＧＧＡＴＴＴＣＧＧＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＣＡＣＡＧＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＴＧＣＡＡＡＧＴＡＡＡＧＡＡＴＡＴＣＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＧＴＧＡＧＧＣＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＣＴＣＣＡＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＴＴＴＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＴＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＡＴＡＣＣＡＧＴＧＴＧＡＧＡＡＴＧＧＴＧＴＴＴＣＣＧＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＣＣＣＡＴＡＣＣＣＡＣＴＧＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＡＴＡＧＣＣＡＡＡＴＴＴＡＣＣＡＴＴＧＴＡＣＣＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＴＧＴＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＡＣＣＡＴＣＣＣＴＡＴＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＴＣＡＣＣＣＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＴＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＣＴＣＴＡＧＣＴＡＴＣＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＧＴＧＣＣＴＣＣＴＡＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＴＣＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＴＡＴＧＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣＧＡＧＣＣＴＧＴＧＣＣＣＡＧＣＣＴＡＧＡＧＧＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＡＣＧＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＴＧＣＣＴＴＣＣＴＡＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＣＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＧＣＴＡＣＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＣＡＣＣＴＣＧＧＧＧＣＣＣＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＴＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＡＴＧＴＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＣＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＴＧＴＧＧＧＣＣＴＣＡＧＡＣＴＧＧＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＴＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＣＴＡＣＴＣＴＣＡＴＧＧＣＧＴＧＣＣＡＡＧＧＡＣＴＣＴＡＴＣＣＣＣＴＣＡＴＣＡＧＴＡＣＣＡＣＴＣＴＧＴＧＣＡＣＧＧＡＧＴＴＧＧＣＡＴＧＧＴＧＣＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＣＧＡＣＡＡＴＡＧＣＴＡＡＡＧＴＧＡＧＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＴＴＴＣＣＴＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＣＡＧＴＡＧＣＣＡＡＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡＣＧＧＡＣＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＡＴＴＴＣＡＣＣＣＡＡＴＧＴＴＣＡＣＡＴＣＴＧＣＡＣＴＣＡＡＧＧＴＣＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＡＴＣＡＧＴＡＧＣＴＴＧＡＡＡＣＣＡＣＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＧＡＴＧＡＧＴＣＣＣＡＣＣＣＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＡＴＣＡＡＣＣＡＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＧＣＴＡＣＴＣＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＡＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＧＧＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＧＣＣＴＣＡＴＴＧＡＧＴＧＴＴＴＴＴＣＣＣＴＡＧＴＧＣＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＧＴＴＡＡＴＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＴＴＡＴＡＴＡＡＴＡＡＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＡＡＴＧＧＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＴＴＡＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＴＣＴＧＡＧＧＣＡＡＧＴＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＡＴＡＴＧＴＡＣＴＴＧＣＧＧＧＡＴＴＣＣＣＴＴＣＡＡＧＴＡＡＡＣＣＡＴＣＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＴＣＡＣＧＴＴＴＣＣＣＣＴＴＧＡＣＴＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＣＣＴＡＣＣＴＣＴＧＣＣＡＴＧＴＧＡＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＡＡＧＣＣＴＣＴＧＴＡＴＧＴＣＣＣＣＡＴＴＴＧＣＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＴＣＣＴＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＡＴＣＡＣＧＴＧＣＴＣＡＧＴＴＴＴＧＣＣＴＣＴＡＣＴＴＡＣＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡＴＡＡＣＡＣＴＧＡＣＧＣＴＣＣＣＴＧＧＣＡＴＣＣＴＡＴＣＴＴＡＴＴＣＡＧＣＣＣＴＡＣＣＡＴＣＴＴＧＣＣＡＧＣＴＣＴＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＴＧＴＣＧＣＴＡＡＡＡＣＧＴＧＧＣＣＴＡＴＡＧＣＴＴＣＣＣＴＴＣＣＧＧＡＡＡＧＣＴＴＧＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＴＡＡＡＡＡＧＣＣＣＣＣＧＴＴＴＡＣＡＴＧＴＡＧＧＣＡＧＧＡＣＴＧＴＧＡＴＡＡＣＡＧＴＧＣＡＡＧＣＴＣＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＡＧＡＧＴＴＧＴＧＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＡＡＣＣＴＴＣＣＡＡＡＣＣＴＣＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＧＣＡＡＡＡＴＧＣＡＣＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＡＡＧＡＣＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡＡＴＧＡＴＡＴＣＴＣＧＣＣＡＡＡＧＡＡＡＣＣＡＣＧＣＣＣＡＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＡＡＣＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＣＴＧＡＡＡＧＣＣＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＧＴＧＴＧＴＡＡＧＴＡＡＡＧＴＧＴＴＡＴＧＧＴＡＧＧＧＴＴＣＴＴＣＡＧＡＴＧＴＡＡＴＡＴＴＴＴＡＣＴＧＧＴＡＣＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＡＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＴＡＡＧＴＡＡＴＡＡＣＡＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＡＴＡＧＧＡＧＣＴＧＧＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＴＴＧＡＴＡＣＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＴＴＴＧＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＣＧＡＡＴＧＴＧＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＧＡＴＴＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡＡＣＡＧＡＣＣＣＴＡＡＴＡＡＡＧＡＧＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＧＡＴＧＴＧＡＧＧＣＴＧＡＧＴＧＴＧＴＴＴＡＡＧＴＡＣＧＴＧＡＧＡＧＡＧＴＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＴＴＧＴＡＡＧＴＧＡＧＴＧＴＣＣＣＴＡＴＧＣＧＡＴＴＡＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＣＧＴＴＧＣＴＡＡＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＡＴＴＡＡＧＴＡＣＴＣＧＴＧＣＣＴＴＡＴＡＴＴＴＧＴＧＴＧＣＣＡＡＴＴＡＡＴＧＣＣＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＣＡＴＧＴＧＣＴＴＡＡＡＣＡＡＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
【０１４５】
配列番号第７−ヒトＴ−ｂｏｘ１８（ＴＢＸ１８）、ｍＲＮＡ
受入番号−ＮＭ＿００１０８０５０８．１
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【０１４６】
配列番号第８−ヒト低身長ホメオボックス２（ＳＨＯＸ２）、転写変異体１、ｍＲＮＡ
受入番号−ＮＭ＿００３０３０．４
ＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＡＧＴＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧＡＧＣＧＧＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＧＧＴＴＧＡＧＣＧＣＣＧＧＧＣＴＧＡＣＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＡＴＧＧＡＡＧＡＡＣＴＴＡＣＧＧＣＧＴＴＣＧＴＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＴＴＴＧＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＧＡＴＣＡＣＧＴＡＣＣＧＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＧＣＣＧＣＴＧＣＧＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＧＡＣＣＧＧＣＴＧＣＡＣＣＧＡＧＧＣＧＧＧＣＣＧＣＧＡＣＧＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＴＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＣＴＣＴＣＣＣＧＴＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＧＡＡＧＣＡＧＧＧＡＧＣＣＧＧＧＣＡＧＣＣＣＧＣＧＡＣＴＧＡＣＧＧＡＧＧＧＴＡＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＡＡＣＧＡＡＡＧＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＧＣＴＡＣＧＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＣＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＴＴＴＣＧＧＴＴＴＣＴＴＧＴＧＴＣＣＣＣＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＡＴＣＧＣＡＡＡＧＡＧＧＡＴＧＣＧＡＡＡＧＧＧＡＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＧＣＣＡＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＧＡＡＧＴＣＧＧＡＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＧＡＡＣＡＡＣＴＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＴＴＴＴＧＡＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＴＡＴＣＣＣＧＡＣＧＣＣＴＴＣＡＴＧＣＧＡＧＡＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡＧＣＧＡＣＴＧＧＧＣＣＴＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＣＧＡＧＴＧＣＡＧＧＴＴＴＧＧＴＴＴＣＡＡＡＡＴＣＧＡＡＧＡＧＣＴＡＡＡＴＧＴＡＧＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＡＡＡＧＧＴＧＴＴＣＴＣＡＴＡＧＧＧＧＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＴＴＴＧＡＡＧＣＴＴＧＴＡＧＡＧＴＣＧＣＡＣＣＴＴＡＴＧＴＣＡＡＣＧＴＡＧＧＴＧＣＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＴＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＴＡＧＴＣＡＴＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＣＧＣＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＣＴＧＴＧＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＴＣＣＧＣＡＣＣＴＧＧＣＣＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＣＣＴＡＣＡＴＧＡＴＧＴＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＣＴＴＣＧＧＡＣＴＧＣＣＧＣＴＣＧＣＣＡＣＧＣＴＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＴＣＧＧＣＴＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＴＡＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＴＣＧＣＣＧＡＴＣＴＣＡＧＡＣＴＧＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＡＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＧＣＣＣＴＧＧＧＴＣＴＧＴＧＡＣＧＣＣＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＴＧＴＣＧＣＧＣＣＴＧＴＣＣＣＧＣＧＧＣＡＣＴＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＧＣＣＣＴＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＧＴＴＡＣＣＣＣＴＴＴＧＡＧＡＣＣＴＣＧＧＧＡＧＣＣＧＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＴＣＡＣＴＧＡＣＣＡＴＣＣＣＴＣＧＴＣＣＣＣＴＡＴＣＧＣＡＴＣＴＴＧＧＡＣＴＣＧＧＡＡＡＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＣＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＧＡＴＣＴＣＡＣＧＡＧＧＣＡＣＧＣＡＧＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＴＣＣＴＧＣＣＣＧＴＴＴＴＣＣＴＡＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＴＡＧＡＡＴＴＧＧＧＴＴＴＴＧＴＡＧＧＡＧＣＧＧＧＴＴＴＧＧＧＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＣＣＧＣＧＧＡＧＴＴＴＧＧＣＴＣＡＣＣＧＣＡＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＴＴＧＣＡＴＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＧＴＴＡＡＣＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＴＣＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＣＧＧＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＧＡＡＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴＡＡＣＴＧＣＴＡＴＴＴＧＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＣＣＡＡＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＡＡＧＴＡＴＴＴＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＡＡＡＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＧＡＣＴＧＧＧＧＧＧＡＧＴＴＡＣＣＡＡＣＴＴＡＡＡＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＧＣＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＣＴＴＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＴＡＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＴＧＣＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＴＴＣＡＣＡＧＧＴＴＴＴＧＡＡＡＣＴＧＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＣＧＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＡＡＣＡＣＧＡＧＡＡＡＴＴＴＧＡＴＧＡＧＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＴＴＧＡＡＴＣＡＧＡＴＧＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＴＡＴＴＡＡＡＡＣＧＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＴＡＴＴＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＣＡＣＡＧＡＣＡＡＴＧＡＴＴＴＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣＴＧＴＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴＡＡＡＴＴＣＣＧＧＴＴＴＧＣＡＴＧＴＴＡＣＴＴＧＴＡＴＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＣＴＴＡＴＣＴＣＣＣＡＴＧＣＡＣＴＣＡＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＡＴＣＴＴＣＡＣＴＡＴＧＡＡＡＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＡＡＡＧＴＡＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＣＡＴＡＴＡＴＴＴＧＣＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＴＧＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＴＣＡＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＡＣＴＣＡＴＴＧＴＣＣＴＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＡＡＴＡＴＧＴＧＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＡＡＡＴＧＡＡＡＴＡＡＴＧＡＡＧＧＴＡＣＡＧＣＧＣＣＴＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＣＡＣＡＧＴＡＧＧＣＧＣＴＣＡＡＴＣＡＧＴＡＴＴＡＧＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＴＣＣＣＣＴＴＴＴＣＴＴＧＴＧＴＴＣＣＴＴＣＴＴＧＴＴＧＧＴＴＴＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＴＡＴＴＴＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＴＡＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＴＣＴＡＴＣＣＣＧＴＣＡＡＡＴＴＣＡＣＣＴＴＡＡＡＴＡＡＣＡＣＣＣＡＧＣＴＡＧＡＴＡＣＡＧＧＣＡＣＴＡＧＧＴＴＴＧＴＧＴＡＡＧＡＴＡＴＧＴＴＧＡＴＡＣＡＣＡＣＧＡＡＣＡＡＡＧＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＧＣＡＴＴＴＴＡＴＣＴＣＡＣＡＡＡＧＧＴＧＴＡＴＣＴＡＴＴＣＡＡＧＴＡＡＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＧＣＴＡＴＴＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＴＡＣＣＴＴＧＧＡＣＴＡＡＧＣＣＡＧＴＣＴＧＴＡＴＣＣＣＡＡＴＴＣＧＣＴＡＧＣＡＡＧＣＣＴＡＡＧＴＴＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＣＣＴＴＣＴＡＡＴＴＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＡＣＴＧＡＡＣＴＴＴＧＧＴＡＴＧＣＧＧＴＴＧＡＧＣＴＴＴＧＴＡＡＣＴＡＴＴＴＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＡＣＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＧＴＡＴＴＡＡＧＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＴＴＡＴＣＴＣＡＴＧＡＣＧＴＧＴＴＧＴＣＡＧＴＡＣＡＡＡＡＴＧＴＧＴＣＧＣＣＴＣＣＡＡＴＴＣＴＧＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＡＡＧＴＧＣＣＡＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＴＧＡＡＧＡＣＡＣＴＴＴＧＣＧＡＴＣＡＡＴＴＧＡＡＴＧＡＡＡＡＴＡＴＣＧＴＴＴＣＡＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
【０１４７】
配列番号第９−ヒト低身長ホメオボックス２（ＳＨＯＸ２）、転写変異体２、ｍＲＮＡ
受入番号−ＮＭ＿００６８８４．３
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【０１４８】
配列番号第１０−ヒト低身長ホメオボックス２（ＳＨＯＸ２）、転写変異体３、ｍＲＮＡ受入番号−ＮＭ＿００１１６３６７８．１
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【図２Ａ】
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【図２Ｉ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｉ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２５Ｆ】
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【図２５Ｇ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【配列表】
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