(57)【要約】      （修正有）【課題】癌細胞を化学療法剤に向かって移動させることによって癌患者を治療する方法及び心筋梗塞患者を治療する方法の提供。【解決手段】化学療法剤に癌細胞を感作させる方法であって、該化学療法剤を必要とする被験体に、例えば、有効量の下記化合物を投与することを含む、方法。心筋梗塞を治療する方法であって、治療を必要とする被験体に、例えば、有効量の下記化合物を投与することを含む、方法。2019218383.tif 000021【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学療法剤に癌細胞を感作させる方法であって、該化学療法剤を必要とする被験体に有
効量の式（Ｉ）：
【化１】
2019218383.tif 000009
（式中、Ｒ１がＣ３〜２０シクロアルキルであり、各Ｒ２がＨ又はＣ１〜６アルキルであ
り、Ｌ１がＣ３〜２０ヘテロシクロアルキルであり、Ｌ２がＣ３〜２０シクロアルキルで
あり、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、及びｑが各々独立して０〜６である）の化合物を投与することを
含む、方法。
【請求項２】
前記癌細胞が乳癌細胞、肺癌細胞、及び前立腺癌細胞からなる群から選択される、請求
項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌細胞が急性骨髄性白血病細胞及び急性リンパ芽球性白血病細胞からなる群から選
択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｌ１が、
【化２】
2019218383.tif 000010
であり、Ｌ２がシクロヘキシレンであり、Ｒ１がシクロヘキシレン又は、
【化３】
2019218383.tif 000011
であり、Ｒ２がＨであり、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、及びｑが各々独立して０〜３である、請求項
１に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が以下の化合物：
【化４】
2019218383.tif 000012
の１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が、
【化５】
2019218383.tif 000013
である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｌ１が、
【化６】
2019218383.tif 000014
であり、Ｌ２がシクロヘキシレンであり、Ｒ１がシクロヘキシレン又は、
【化７】
2019218383.tif 000015
であり、Ｒ２がＨであり、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、及びｑが各々独立して０〜３である、請求項
２に記載の方法。
【請求項８】
心筋梗塞を治療する方法であって、治療を必要とする被験体に有効量の式（Ｉ）：
【化８】
2019218383.tif 000016
（式中、Ｒ１がＣ３〜２０シクロアルキルであり、各Ｒ２がＨ又はＣ１〜６アルキルであ
り、Ｌ１がＣ３〜２０ヘテロシクロアルキルであり、Ｌ２がＣ３〜２０シクロアルキルで
あり、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、及びｑが各々独立して０〜６である）の化合物を投与することを
含む、方法。
【請求項９】
Ｌ１が、
【化９】
2019218383.tif 000017
であり、Ｌ２がシクロヘキシレンであり、Ｒ１がシクロヘキシレン又は、
【化１０】
2019218383.tif 000018
であり、Ｒ２がＨであり、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、及びｑが各々独立して０〜３である、請求項
８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が以下の化合物：
【化１１】
2019218383.tif 000019
の１つである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、
【化１２】
2019218383.tif 000020
である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ケモカインは免疫応答又は炎症反応中の白血球の接着及び経内皮遊走を調節するサイト
カインファミリーの１つである（非特許文献１、非特許文献２）。ケモカインはまた、Ｔ
細胞及びＢ細胞のトラフィキング及びホーミングを調節することから、リンパ球産生系及
び造血系の発達に寄与している（非特許文献３）。
【０００２】
腫瘍を保護する微小環境は、化学療法剤の耐性における重大な因子として認識されつつ
ある。化学療法剤は癌細胞の成長を阻害する薬剤である。腫瘍細胞を保護する微小環境か
ら末梢血に腫瘍細胞を移動させ、腫瘍細胞を化学療法剤に更に近づけさせる作用剤を開発
する必要がある。
【０００３】
心筋梗塞（ＭＩ）後の生存患者において心不全はなおも大きな健康問題として存在する
。造血幹細胞、間葉系幹細胞、及び内皮前駆細胞の移動がＭＩ後の心機能の回復を促進す
ることが知られている。したがって、このような細胞を移動させることでＭＩ後の患者の
心機能を改善させる作用剤の開発も必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Mackay C.R., Nat. Immunol., 2001, 2:95
【非特許文献２】Olson et al., Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol., 2002, 283:R7
【非特許文献３】Ajuebor et al., Biochem. Pharmacol., 2002, 63:1191
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、或る特定の４−アミノ−ピリミジン化合物がＣＸＣＲ４を発現する細胞を末
梢循環に移動させることに効果的であるという発見に基づいている。
【０００６】
２つの態様において、本発明は、４−アミノ−ピリミジン化合物の１つ又は複数を用い
て、癌細胞を化学療法剤に向かって移動させることによって癌患者を治療する方法及び心
筋梗塞患者を治療する方法を特徴とする。それぞれの方法は、有効量の、以下に示す式（
Ｉ）：
【化１】
2019218383.tif 000002
の４−アミノピリミジン化合物を、治療を必要とする患者に投与することを含む。
【０００７】
この式中、Ｒ１はＣ３〜２０シクロアルキルであり、各Ｒ２はＨ又はＣ１〜６アルキル
であり、Ｌ１はＣ３〜２０ヘテロシクロアルキルであり、Ｌ２がＣ３〜２０シクロアルキ
ルであり、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、及びｑは各々独立して０〜６である。
【０００８】
式（Ｉ）に関して、上記の４−アミノ−ピリミジン化合物のサブセットは、Ｌ１は、
【化２】
2019218383.tif 000003
であり、Ｌ２はシクロヘキシレンであり、Ｒ１はシクロへキシレン又は、
【化３】
2019218383.tif 000004
であり、Ｒ２はＨであり、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、及びｑは各々独立して０〜３であるのもので
ある。
【０００９】
「アルキル」という用語は、−ＣＨ３又は分岐−Ｃ３Ｈ７等の飽和した直鎖又は分岐炭
化水素部分を指す。「シクロアルキル」という用語はシクロヘキシル、シクロヘキセン−
３−イル又はアダマンチル等の飽和した非芳香族単環式、二環式、三環式又は四環式炭化
水素部分を指す。「ヘテロシクロアルキル」という用語は、４−テトラヒドロピラニル又
は４−ピラニル等の１つ又は複数の環ヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ又はＳ）を有する飽和し
た非芳香族単環式、二環式、三環式又は四環式部分を指す。
【００１０】
本明細書で言及されるアルキル、シクロアルキル、及びヘテロシクロアルキルは、他に
指定のない限り、置換部分及び非置換部分の両方を含む。アルキル、シクロアルキル、及
びヘテロシクロアルキルの考え得る置換基は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アル
ケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロア
ルケニル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、
Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリール
オキシ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ２０ジアルキルアミノ、アリー
ルアミノ、ジアリールアミノ、ヒドロキシル、及びハロゲンを含むが、それらに限定され
ない。
【００１１】
上記の４−アミノ−ピリミジン化合物には化合物自体、並びに該当する場合にそれらの
塩、プロドラッグ及び溶媒和物が含まれる。塩は、例えばアニオンと４−アミノ−ピリミ
ジン化合物上の正電荷を有する基（例えばアミノ）との間で形成され得る。好適なアニオ
ンとしては、塩化物アニオン、臭化物アニオン、ヨウ化物アニオン、硫酸アニオン、硝酸
アニオン、リン酸アニオン、クエン酸アニオン、メタンスルホン酸アニオン、トリフルオ
ロ酢酸アニオン、酢酸アニオン、リンゴ酸アニオン、トシル酸アニオン、酒石酸アニオン
、フマル酸アニオン、グルタミン酸アニオン、グルクロン酸アニオン、乳酸アニオン、グ
ルタル酸アニオン及びマレイン酸アニオンが挙げられる。同様に、塩はカチオンと４−ア
ミノ−ピリミジン化合物上の負電荷を有する基（例えばカルボキシレート）との間でも形
成され得る。好適なカチオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウ
ムイオン、カルシウムイオン、及びテトラメチルアンモニウムイオン等のアンモニウムカ
チオンが挙げられる。４−アミノ−ピリミジン化合物には四級窒素原子を含有するこれら
の塩も含まれる。プロドラッグの例としては、被験体に投与した後に活性４−アミノ−ピ
リミジン化合物をもたらすことが可能なエステル及び他の薬学的に許容可能な誘導体が挙
げられる。溶媒和物は、活性４−アミノ−ピリミジン化合物と薬学的に許容可能な溶媒と
の間に形成される複合体を指す。薬学的に許容可能な溶媒の例としては、水、エタノール
、イソプロパノール、酢酸エチル、酢酸及びエタノールアミンが挙げられる。
【００１２】
「治療する」又は「治療」という用語は、治療効果をもたらす目的で、例えば上記の疾
患を治癒する、緩和する、変化させる、影響させる、又は改善するために、１つ又は複数
の４−アミノ−ピリミジン化合物を、治療を必要とする患者に投与することを指す。「有
効量」は、治療効果をもたらすために必要とされる活性化合物の量を指す。効果的な用量
は、当業者に認識されるように、治療する疾患のタイプ、投与経路、賦形剤の使用及び他
の治療処置を併用する可能性に応じて変化する。
【００１３】
癌は、或る一群の細胞が自律的増殖能、すなわち細胞の成長の急速な増大及び一部に腫
瘍転移を特徴とする異常な状態又は病態を有する疾患クラスの１つである。癌の例として
、乳癌細胞、肺癌、前立腺癌、急性骨髄性白血病、及び急性リンパ芽球性白血病が挙げら
れるが、それらに限定されない。
【００１４】
上記治療を必要とする被験体に有効量の上記の４−アミノ−ピリミジン化合物の１つ又
は複数と有効量の１つ又は複数の他の治療剤とを同時に投与することもできる。治療剤は
化学療法剤を含む。例えば、上記の４−アミノ−ピリミジン化合物と化学療法剤との組合
せを癌の治療に使用することができる。「同時に投与する」という用語は、２つ以上の活
性剤を同時に又は治療期間中の異なる時間に投与することを指す。同時に投与する例とし
て、２種以上の活性剤の固体又は液体の混合物を患者に適用させることが挙げられる。理
論に束縛されないが、癌（例えば、急性骨髄性白血病及び急性リンパ芽球性白血病）の治
療において、４−アミノ−ピリミジン化合物が「化学増感剤（chemosensitizer）」とし
て作用して癌細胞を骨髄から移動させると、化学療法剤がこれらの癌細胞を死滅させるこ
とにより治療効果が増強される。
【００１５】
心筋梗塞とは、通常心臓発作として知られているが、心臓の筋肉（心筋）に血液を送る
冠状動脈の１つが閉塞するために心臓の一部で酸素が枯渇したときに生じる医学的に緊急
な状態の１つである。
【００１６】
理論に束縛されないが、心筋梗塞の治療において、４−アミノ−ピリミジン化合物が内
皮前駆細胞、間葉系幹細胞、及び造血幹細胞を末梢循環に移動させ、炎症サイトカインの
産生を減少させ、抗炎症又は免疫修飾を生じる。
【００１７】
本発明の方法を実施するために、１つ又は複数の上記の４−アミノ−ピリミジン化合物
を有する組成物を非経口又は経口で投与することができる。本明細書において使用される
場合「非経口」という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内
、胸骨内、髄腔内、病変内、又は頭蓋内の注射、及び任意の好適な注入技法を指す。組成
物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、微粒子、又はナノ粒子の形
態とすることができる。また、組成物を活性成分の制御放出又は持続放出が実現するよう
配合することもできる。
【００１８】
滅菌注射用組成物は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒の溶液又は懸濁液
、例えば１，３−ブタンジオールの溶液であり得る。用いることができる許容可能なビヒ
クル及び溶媒にはマンニトール、水、リンガー液及び等張塩化ナトリウム溶液が含まれる
。加えて、固定油が溶媒又は懸濁媒として従来用いられている（例えば、合成モノグリセ
リド又はジグリセリド）。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体等の脂肪酸が、オリーブ
油又はヒマシ油等の天然の薬学的に許容可能な油、特にそれらのポリオキシエチル化物と
同様に注射剤の調製に有用である。これらの油溶液又は懸濁液は長鎖アルコール希釈剤若
しくは分散剤、カルボキシメチルセルロース又は同様の分散剤を含有していてもよい。Ｔ
ｗｅｅｎ若しくはＳｐａｎ等の他の一般に使用される界面活性剤、又は薬学的に許容可能
な固体、液体若しくは他の投与形態の製造に一般に使用される他の同様の乳化剤若しくは
バイオアベイラビリティ増強剤を配合目的で使用することもできる。
【００１９】
経口投与用の組成物はカプセル、錠剤、エマルション及び水性懸濁液、分散液並びに溶
液を含む任意の経口で許容可能な投与形態であり得る。錠剤の場合、一般に使用される担
体としてラクトース及びトウモロコシデンプンが挙げられる。ステアリン酸マグネシウム
等の滑沢剤も通例添加される。カプセル形態での経口投与については、有用な希釈剤とし
てラクトース及び乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。水性懸濁液又はエマルション
を経口で投与する場合、活性成分は乳化剤又は懸濁化剤と組み合わせて油相中に懸濁又は
溶解することができる。必要に応じて、或る特定の甘味料、香料又は着色料を添加するこ
とができる。
【００２０】
１つ又は複数の実施形態の詳細を、下記の発明を実施するための形態において説明する
。実施形態の他の特徴、目的及び利点が発明を実施するための形態及び特許請求の範囲か
ら明らかとなる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書に記載の方法は、４−アミノ−ピリミジン化合物を使用して癌又は心筋梗塞の
治療のためにＣＸＣＲ４を発現する細胞を末梢循環に移動させるものである。以下に化合
物１〜化合物５の例を示す：
【化４】
2019218383.tif 000005
【００２２】
上記の４−アミノ-ピリミジン化合物を当該技術分野において既知の方法により調製す
ることができる。
【００２３】
以下のスキームＩは、式（Ｉ）の或る特定の化合物を合成するための典型的な合成経路
を示す。２つのハロ基を含有する化合物Ａをアミノ化合物Ｂと反応させて化合物Ｃを得た
後、これをアルデヒドＤと反応させ、化合物Ｅを生成する。Ｂｏｃ保護の後、化合物Ｆを
得て、これを化合物Ｇと反応させ、化合物Ｈを得る。化合物Ｈをアルキル化した後、脱保
護及び加水分解を行い、化合物Ｉを介して化合物Ｊを生成した。
【化５】
2019218383.tif 000006
【００２４】
このように合成した化合物はカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー
又は再結晶化等の方法によって精製することができる。
【００２５】
上記方法において用いた中間体は、市販されているか又は当該技術分野において既知の
方法により調製することができるかのいずれかである。その方法はまた、最終的に化合物
を合成させるために、特に本明細書において記載の工程の前又は後のいずれかに好適な保
護基を付加又は除去する工程を更に含むことができる。さらに、所望の化合物を得るため
に、種々の合成工程を代替的な順列又は順序で行うことができる。該当の化合物を合成す
るのに有用な合成化学変換法及び保護基方法論（保護及び脱保護）は当該技術分野におい
て知られており、例えば、R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Pu
blishers (1989)、T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synth
esis, 2nd Ed., John Wiley and Sons (1991)、L. Fieser and M. Fieser, Fieser and F
ieser’s Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994)、及びL. Paqu
ette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (
1995)及びそれらの続版に記載されているものが挙げられる。
【００２６】
本明細書で言及される化合物は、非芳香族二重結合及び１つ又は複数の不斉中心を含有
し得る。このため、該化合物はラセミ体及びラセミ混合物、単一エナンチオマー、個々の
ジアステレオマー、ジアステレオマー混合物、並びにシス異性体又はトランス異性体とし
て生じる可能性がある。かかる異性体の全てが企図される。
【００２７】
以下の具体的な例は単なる例示として解釈され、いかなる形でも本開示の残りの部分を
限定するものではない。更に詳細に説明することなく、当業者は本明細書の説明に基づい
て本発明を最大限に利用することができると考えられる。本明細書に引用される全ての刊
行物は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
【００２８】
以下の実施例１〜５において化合物１〜５の調製を詳細に説明する。
【実施例】
【００２９】
実施例１：化合物１の調製
【化６】
2019218383.tif 000007
【００３０】
水（１０．０Ｌ）及び（Ｂｏｃ）２Ｏ（３．３３ｋｇ、１５．３ｍｏｌ）をトランス−
４−アミノメチル−シクロヘキサンカルボン酸（化合物１−Ｉ、２．０ｋｇ、１２．７ｍ
ｏｌ）及び重炭酸ナトリウム（２．６７ｋｇ、３１．８ｍｏｌ）の溶液に添加した。反応
混合物を雰囲気温度にて１８時間撹拌した。水性層を濃塩酸（２．９５Ｌ、ｐＨ＝２）で
酸性化した後、濾過した。得られた固体を回収し、水（１５Ｌ）で３回洗浄し、ホットボ
ックス（hot box）（６０℃）において乾燥させ、トランス−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ
カルボニルアミノ−メチル）−シクロ−ヘキサンカルボン酸（化合物１−ＩＩ、３．１７
ｋｇ、９７％）を白色固体として得た。Ｒｆ＝０．５８（ＥｔＯＡｃ）。ＬＣ−ＭＳ  ｍ
／ｅ  ２８０（Ｍ＋Ｎａ＋）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  ４．５
８（ｂｒｓ，１Ｈ）、２．９８（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）、２．２５（ｔｄ，Ｊ＝１
２，３．３Ｈｚ，１Ｈ）、２．０４（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，２Ｈ）、１．８３（ｄ，Ｊ
＝１１．１Ｈｚ，２Ｈ）、１．４４（ｓ，９Ｈ）、１．３５〜１．５０（ｍ，３Ｈ）、０
．８９〜１．０３（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  １８
１．３１、１５６．０８、７９．１２、４６．４１、４２．９９、３７．５７、２９．４
７、２８．２９、２７．９６。Ｍ．ｐ．１３４．８〜１３５．０℃。
【００３１】
化合物１−ＩＩ（１．０ｋｇ、３．８９ｍｏｌ）のＴＨＦ（５Ｌ）懸濁液を−１０℃に
て冷却し、トリエチルアミン（１．０７６Ｌ、７．７８ｍｏｌ）及びクロロギ酸エチル（
０．４４１Ｌ、４．４７ｍｏｌ）を−１０℃より低い温度にて添加した。反応混合物を雰
囲気温度にて３時間撹拌した。次いで、反応混合物を再度−１０℃にて冷却し、ＮＨ４Ｏ
Ｈ（３．６Ｌ、２３．３４ｍｏｌ）を−１０℃より低い温度にて添加した。反応混合物を
雰囲気温度にて１８時間撹拌し、濾過した。固体を回収し、水（１０Ｌ）で３回洗浄し、
ホットボックス（６０℃）において乾燥させ、トランス−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカル
ボニル−アミノ−メチル）−シクロヘキサンカルボン酸アミド（化合物１−ＩＩＩ、０．
８ｋｇ、８０％）を白色固体として得た。Ｒｆ＝０．２３（ＥｔＯＡｃ）。ＬＣ−ＭＳ  
ｍ／ｅ  ２７９，Ｍ＋Ｎａ＋。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）  δ  ６．６
３（ｂｒｓ，１Ｈ）、２．８９（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）、２．１６（ｔｄ，Ｊ＝１
２．２，３．３Ｈｚ，１Ｈ）、１．８０〜１．８９（ｍ，４Ｈ）、１．４３（ｓ，９Ｈ）
、１．３７〜１．５１（ｍ，３Ｈ）、０．９０〜１．０５（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ
（７５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）  δ  １８２．２６、１５８．８５、７９．９７、４７．６
５、４６．０２、３９．２８、３１．１１、３０．４１、２８．９３。Ｍ．ｐ．２２１．
６〜２２２．０℃。
【００３２】
化合物１−ＩＩＩ（１．２ｋｇ、４．６８ｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（８Ｌ）懸濁液を−
１０℃にて冷却し、トリエチルアミン（１．３Ｌ、９．３６ｍｏｌ）及び無水トリフルオ
ロ酢酸（０．７１７Ｌ、５．１６ｍｏｌ）を−１０℃より低い温度にて添加した。反応混
合物を３時間撹拌した。水（２．０Ｌ）を添加後、有機層を分離し、水（３．０Ｌ）で２
回洗浄した。次いで、有機層をシリカゲルに通し、濃縮した。得られた油を塩化メチレン
により結晶化させた。結晶をヘキサンで洗浄し、トランス−（４−シアノ−シクロヘキシ
ルメチル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物１−ＩＶ、０．９５ｋｇ、
８５％）を白色結晶として得た。Ｒｆ＝０．７８（ＥｔＯＡｃ）。ＬＣ−ＭＳ  ｍ／ｅ  
２６１，Ｍ＋Ｎａ＋。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  ４．５８（ｂｒ
ｓ，１Ｈ）、２．９６（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）、２．３６（ｔｄ，Ｊ＝１２，３．
３Ｈｚ，１Ｈ）、２．１２（ｄｄ，Ｊ＝１３．３，３．３Ｈｚ，２Ｈ）、１．８３（ｄｄ
，Ｊ＝１３．８，２．７Ｈｚ，２Ｈ）、１．４２（ｓ，９Ｈ）、１．４７〜１．６３（ｍ
，３Ｈ）、０．８８〜１．０２（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３
）  δ  １５５．９６、１２２．４１、７９．０９、４５．８９、３６．９２、２９．０
６、２８．８０、２８．２５、２８．００。Ｍ．ｐ．１００．４〜１００．６℃。
【００３３】
化合物１−ＩＶ（１．０ｋｇ、４．１９６ｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（８．０Ｌ）
と水（２．０Ｌ）との混合物に溶解させた。反応混合物に水酸化リチウム一水和物（０．
３１４ｋｇ、４．１９１）、ラネーニッケル（０．４ｋｇ、２．３３４ｍｏｌ）、及び１
０％パラジウム炭素（０．４６ｋｇ、０．２１６ｍｏｌ）を５０％懸濁水溶液として添加
した。反応混合物を水素雰囲気下において５０℃で２０時間撹拌した。触媒を濾過により
除去し、溶媒を真空において除去した後、水（１．０Ｌ）とＣＨ２Ｃｌ２（０．３Ｌ）と
の混合物を添加した。相を分離した後、有機相を水（１．０Ｌ）で洗浄、濃縮し、トラン
ス−（４−アミノメチル−シクロヘキシルメチル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエス
テル（化合物１−Ｖ、０．９７ｋｇ、９５％）を淡黄色濃化油として得た。Ｒｆ＝０．２
０（ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ＝９／１）。ＬＣ−ＭＳ  ｍ／ｅ  ２４３，Ｍ＋Ｈ＋。１Ｈ  
ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  ４．６７（ｂｒｓ，１Ｈ）、２．９３（ｔ，
Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）、２．４８（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）、１．７３〜１．７８
（ｍ，４Ｈ）、１．４０（ｓ，９Ｈ）、１．３５（ｂｒｓ，３Ｈ）、１．１９〜１．２１
（ｍ，１Ｈ）、０．７７〜０．９７（ｍ，４Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣ
ｌ３）  δ  １５５．８５、７８．３３、４８．２７、４６．３８、４０．８０、３８．
１９、２９．８７、２９．７６、２８．０７。
【００３４】
化合物１−Ｖ（８０６ｇ）及びＥｔ３Ｎ（１０１０ｇ、３当量）の１−ペンタノール（
２．７Ｌ）溶液を９０℃にて１５時間、化合物１−ＶＩ（５４０ｇ、１当量）で処理した
。ＴＬＣは、反応が完了したことを示した。
【００３５】
酢酸エチル（１．５Ｌ）を２５℃にて反応混合物に添加した。溶液を１時間撹拌した。
Ｅｔ３ＮＨＣｌ塩を濾過した。次いで、濾液を５０℃の真空により１．５Ｌ（元の容量の
１／６）に濃縮した。次いで、ジエチルエーテル（２．５Ｌ）を濃縮した溶液に添加し、
２５℃にて濾過後、所望の生成物１−ＶＩＩ（８４１ｇ、６８％の収率）を得た。
【００３６】
中間体１−ＶＩＩ（８４１ｇ）の溶液をＭｅＯＨ（８．１Ｌ）中の４Ｎ  ＨＣｌ／ジオ
キサン（２．７Ｌ）で処理し、２５℃にて１５時間撹拌した。ＴＬＣは反応が完了したこ
とを示した。混合物を５０℃の真空により１．５Ｌ（元の容量の１／７）に濃縮した。次
いで、ジエチルエーテル（５Ｌ）を溶液にゆっくり添加し、１−ＶＩＩＩのＨＣｌ塩（７
７４ｇ）を形成、濾過し、真空（１０ｔｏｒｒ未満）下において乾燥させた。中和のため
、Ｋ２ＣＯ３（２．５ｋｇ、８当量）を２５℃にて１−ＶＩＩＩのＨＣｌ塩のＭｅＯＨ（
１７Ｌ）溶液に添加した。混合物を同じ温度にて３時間撹拌し（ｐＨ１２超）、濾過した
（濾液中の１−ＶＩＩＩの推定量は５０４ｇである）。
【００３７】
アルデヒド１−ＩＸ（５８１ｇ、１−ＶＩＩの１モルに対して１．０当量）を０℃〜１
０℃にて１−ＶＩＩＩの濾液に添加した。反応物を０℃〜１０℃にて３時間撹拌した。Ｔ
ＬＣは、反応が完了したことを示した。次いで、ＮａＢＨ４（８１ｇ、１−ＶＩＩの１モ
ルに対して１．０当量）を１０℃未満にて添加し、溶液を１０℃〜１５℃にて１時間撹拌
した。溶液を濃縮し、残渣を得た後、これをＣＨ２Ｃｌ２（１５Ｌ）で処理した。混合物
をＨ２Ｏ（１．２Ｌ）で希釈した飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（３００ｍＬ）で洗浄した。ＣＨ
２Ｃｌ２相を濃縮し、残渣をシリカゲルのクロマトグラフィー（短カラム、他の構成要素
を除去するための移動相としてＥｔＯＡｃ；１−Ｘを回収するための移動相としてＭｅＯ
Ｈ／２８％  ＮＨ４ＯＨ＝９７／３）により精製し、粗製１−Ｘ（８４１ｇ）を得た。
【００３８】
次いで、Ｅｔ３Ｎ（１６７ｇ、１当量）及びＢｏｃ２Ｏ（３６０ｇ、１当量）を２５℃
にて１−Ｘ（８４１ｇ）のＣＨ２Ｃｌ２（８．４Ｌ）溶液に添加した。混合物を２５℃に
て１５時間撹拌した。ＴＬＣから明らかなように反応が完了後、溶液を濃縮し、ＥｔＯＡ
ｃ（５Ｌ）を、得られた残渣に添加した。溶液を低圧下において５０℃で３Ｌ（元の容量
の１／２）に濃縮した。次いで、ｎ−ヘキサン（３Ｌ）を濃縮した溶液に添加した。固体
生成物はシーディングにより５０℃で形成し、濾過及び蒸発後に所望の粗生成物１−ＸＩ
（６００ｇ、６０％の収率）を得た。
【００３９】
１−ペンタノール（３６０ｍＬ）中の化合物１−ＸＩ（１２０．０ｇ）及びピペラジン
（１−ＸＩＩ、５０．０ｇ、３当量）に２５℃にてＥｔ３Ｎ（６０．０ｇ、３．０当量）
を添加した。混合物を１２０℃にて８時間撹拌した。酢酸エチル（４８０ｍＬ）を２５℃
にて反応混合物に添加した。溶液を１時間撹拌した。Ｅｔ３ＮＨＣｌ塩を濾過し、溶液を
濃縮し、シリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ＝２：８）により精製し、１−ＸＩＩＩ（９
６ｇ）を７４％の収率で得た。
【００４０】
１−ＸＩＩＩ（１２０ｇ）のＭｅＯＨ（２．４Ｌ）溶液に２５℃にてビニルホスホン酸
ジエチル（１−ＸＩＶ、４５ｇ、１．５当量）を添加した。混合物を６５℃において２４
時間撹拌した。ＴＬＣ及びＨＰＬＣは、反応が完了したことを示した。溶液を濃縮し、シ
リカゲル（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２＝８／９２）により精製し、ＨＰＬＣにより生成物の
純度を分析した後、８７ｇの１−ＸＶ（５３％の収率、純度９８％超、各単一不純物質１
％未満）を得た。
【００４１】
２−ＩＩ（３００ｇ）のＣＨ２Ｃｌ２（１８００ｍＬ）溶液に、１０℃〜１５℃にて１
時間、ＴＭＳＢｒ（４５０ｇ、８当量）を添加した。混合物を２５℃にて１５時間撹拌し
た。溶液を濃縮し、真空下において４０℃でＴＭＳＢｒ及び溶媒を除去した。ＣＨ２Ｃｌ
２を混合物に添加し、残渣を溶解させた。ＴＭＳＢｒ及び溶媒を再度真空下において除去
し、真空下（１ｔｏｒｒ未満）において３時間乾燥させた後、３６０ｇの粗製固体を得た
。次いで、粗製固体を７．５ＬのＩＰＡ／ＭｅＯＨ（９／１）で洗浄し、濾過及び真空（
１ｔｏｒｒ未満）下において２５℃で３時間乾燥させた後に化合物３（２８０ｇ）を得た
。ＥｔＯＨによる結晶化により、化合物３の臭化水素酸塩（１９０ｇ）を得た。ＣＩ−Ｍ
Ｓ（Ｍ＋＋１）：５６７．０。
【００４２】
実施例２：化合物２の調製
化合物２をジエチル−１−ブロモプロピルホスホン酸をビニルホスホン酸ジエチルの代
わりに使用した以外は実施例１に記載のものと同様に調製した。
ＣＩ−ＭＳ（Ｍ＋＋１）：５８２．０
【００４３】
実施例３：化合物３の調製
化合物３を２，５−ジアザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプタンをピペラジンの代わりに
使用した以外は実施例１に記載のものと同様に調製した。
ＣＩ−ＭＳ（Ｍ＋＋１）：５７９．４
【００４４】
実施例４：化合物４の調製
【化７】
2019218383.tif 000008
【００４５】
中間体１−ＶＩＩを実施例１に記載の通りに調製した。
【００４６】
化合物シクロヘキシルメタンアミン（４−Ｉ、３．０ｇ）及びＢｏｃ２Ｏ（５．８ｇ）
のＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）溶液を２５℃にて１５時間、Ｅｔ３Ｎ（５．０ｍＬ）に添加
した。次いで、溶液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（
溶離液としてＥｔＯＡｃ及びヘキサンを使用）により精製し、４９％の収率で中間体４−
ＩＩ（６．５ｇ）を得た。
【００４７】
ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍｌ）中の中間体４−ＩＩ（３．０ｇ）及びＤＬ−１０−カンファ
ースルホン酸（４５０ｍｇ）に０℃にてアクロレイン（４−ＩＩＩ、２．７２ｇ）を添加
した。反応物を２５℃にて１５時間撹拌した。溶液を濃縮し、シリカゲルのクロマトグラ
フィー（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ＝４：１）により精製し、６３％の収率にて中間体４−ＩＶ
（２．４ｇ）を得た。
【００４８】
中間体１−ＶＩＩ（２．２ｇ）の溶液をＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中の４Ｎ  ＨＣｌ／ジオ
キサン（１０ｍＬ）で処理し、２５℃にて１５時間撹拌した。ＴＬＣは、反応が完了した
ことを示した。混合物を濃縮し、１−ＶＩＩＩのＨＣｌ塩を形成、濾過し、真空（１０ｔ
ｏｒｒ未満）下において乾燥させた。中和のため、Ｋ２ＣＯ３（１．５ｇ）を２５℃にて
１−ＶＩＩＩのＨＣｌ塩のＭｅＯＨ（２０ｍＬ）溶液に添加した。混合物を同じ温度にて
３時間撹拌し（ｐＨ１２超）、濾過した。
【００４９】
アルデヒド４−ＩＶ（１．８ｇ）を０℃〜１０℃にて濾液に添加した。混合物を０℃〜
１０℃にて３時間撹拌した。ＴＬＣは、反応が完了したことを示した。次いで、ＮａＢＨ
４（２２５ｍｇ）を１０℃未満にて添加し、溶液を１０℃〜１５℃にて１時間撹拌した。
溶液を濃縮し、残渣を得た後、これをＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）で処理した。混合物を飽
和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で洗浄した。ＣＨ２Ｃｌ２層を濃縮し、残渣をシリカゲルのクロマト
グラフィー（短カラム、他の構成要素を除去するための移動相としてＥｔＯＡｃ；４−Ｖ
を回収するための移動相としてＭｅＯＨ／２８％  ＮＨ４ＯＨ＝９７／３）により精製し
、粗製４−Ｖを得た。粗生成物を精製することなく次の工程に使用した。
【００５０】
Ｅｔ３Ｎ（８２０ｍｇ）及びＢｏｃ２Ｏ（４７０ｍｇ）を２５℃にて粗製４−ＶのＣＨ
２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液に添加した。混合物を２５℃にて１５時間撹拌した。ＴＬＣは
、反応が完了したことを示した。溶液を濃縮し、シリカゲルのクロマトグラフィー（Ｅｔ
ＯＡｃ／Ｈｅｘ＝１：１）により精製し、３５％の収率の中間体４−ＶＩ（１．３ｇ）を
得た。
【００５１】
１−ペンタノール（２６ｍＬ）中の化合物４−ＶＩ（１．３ｇ）及びピペラジン（１−
ＸＩＩ、１．０８ｇ）に２５℃にてＥｔ３Ｎ（１．２６ｇ）を添加した。混合物を１２０
℃にて８時間撹拌した。ＴＬＣは、反応が完了したことを示した。溶液を濃縮し、シリカ
ゲルのクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ＝３：７）により精製し、中間体４−
ＶＩＩ（１．０ｇ）を７６％の収率にて得た。
【００５２】
４−ＶＩＩ（１ｇ）のＭｅＯＨ（２０ｍＬ）溶液に、２５℃にてビニルホスホン酸ジエ
チル（１−ＸＩＶ、３６６ｍｇ、１．５当量）を添加した。混合物を６５℃において２４
時間撹拌した。ＴＬＣ及びＨＰＬＣは、反応が完了したことを示した。溶液を濃縮し、シ
リカゲル（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２＝８／９２）により精製し、３２％の収率にて４００
ｍｇの４−ＶＩＩＩを得た。
【００５３】
４−ＶＩＩＩ（３００ｍｇ）のＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）溶液に、１０℃〜１５℃にて１
時間ＴＭＳＢｒ（４３９ｍｇ、８当量）を添加した。混合物を２５℃にて１５時間撹拌し
た。溶液を濃縮し、真空下において４０℃でＴＭＳＢｒ及び溶媒を除去した。ＣＨ２Ｃｌ
２を混合物に添加し、残渣を溶解させた。ＴＭＳＢｒ及び溶媒を再度真空下において除去
し、粗製固体を得て、これをＩＰＡ／ＭｅＯＨ（９／１）で洗浄し、濾過及び真空（１ｔ
ｏｒｒ未満）下において２５℃で３時間乾燥させた後、化合物４を得た。ＥｔＯＨにおけ
る結晶化により、化合物４の臭化水素酸塩（１００ｍｇ）を得た。
ＣＩ−ＭＳ（Ｍ＋＋１）：５８１．４
【００５４】
実施例５：化合物５の調製
化合物５をｅｘｏ−２−アミノノルボルナンをシクロヘキシルメタンアミンの代わりに
使用した以外は実施例４に記載のものと同様に調製した。
ＣＩ−ＭＳ（Ｍ＋＋１）：５７９．４
【００５５】
実施例６：白血病移植マウスの治療における有効性
癌治療における４−アミノ−ピリミジン化合物のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を、白血病
移植マウス（白血病細胞を移植）を用いて評価した。
【００５６】
単核ヒト白血病細胞を、フィコール勾配遠心分離を用いて作製し、液体窒素において凍
結保存した。凍結した細胞を素早く解凍し、ＰＢＳで洗浄して凍結保存試薬を除去した。
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（中央研究院細胞與個體生物学研究所（Institute of Cellular 
and Organismic Biology, Academia Sinica））を６週齢〜８週齢にて２００センチグレ
イの全身照射により予め馴化させた。次いで、白血病細胞を予め馴化させたＮＯＤ／ＳＣ
ＩＤマウスに尾部静脈を介して移植した。得られた白血病芽球細胞、すなわちＴ細胞性急
性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）細胞及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞を脾臓か
ら採取し、以下に記載のように実験に使用した。
【００５７】
マウスの白血病細胞移植片及びマウス末梢血中のヒトＣＤ４５＋細胞の出現による播種
をモニタリングした（細胞移植の３週目以降に毎週サンプル採取した）。末梢血サンプル
を尾部静脈から採取し、赤血球細胞を塩化アンモニウムに溶解させ、リン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）＋２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）に再懸濁させた後、細胞染色を行った。血中
の単核細胞をフルオレセインイソチオシアネートコンジュゲート抗マウスＣＤ４５抗体（
Pharmingen）及びフィコエリスリンコンジュゲート抗ヒトＣＤ４５抗体（Pharmingen）を
用いて免疫染色し、アイソタイプ染色対照としてスペアアリコート（spare aliquot）を
１つ用いて免疫染色した。免疫染色後、細胞を洗浄し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳに懸濁させ、
ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences）を用いて分析した。細胞生存率のマーカー
として、これらの細胞にヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いた染色も行った。非生存細胞
をＰＩ取込み量に基づいてゲーティングし、それぞれのサンプル毎にアイソタイプを一致
させる調節を行い、これを使用してゲートセッティングを決定し、アイソタイプ染色対照
の細胞の少なくとも９９％を排除した。移植及び播種の割合は、移植後に白血病細胞が播
種した日数として既に確立されており、末梢血中のヒトＣＤ４５＋細胞の割合は少なくと
も１％に達していた。
【００５８】
ＡＭＬ治療におけるＡｒａ−Ｃ（抗癌化学療法剤）の有効性の強化
予め馴化させたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＡＭＬ細胞を静脈内注射した。１５日目に、
マウスに生理食塩水、Ａｒａ−ｃ（１００ｍｇ／ｋｇ）、又は化合物１（３０ｍｇ／ｋｇ
）＋Ａｒａ−ｃ（１００ｍｇ／ｋｇ）を処置した。１６日目に、マウスに第２の投薬処置
を行った。生理食塩水及び化合物１を静脈内注射し、Ａｒａ−Ｃを皮下注射した。化合物
１及びＡｒａ−Ｃを同時投与したマウスでは、化合物１注射の３０分後にＡｒａ−Ｃを注
射した。
【００５９】
これらの結果は、マウスに化合物１とＡｒａ−Ｃとの組合せを処置したとき、白血病マ
ウスの総生存時間はＡｒａ−Ｃのみを処置したマウスに比べ顕著に延長したことを示して
いる。さらに、ＡＭＬ注射後の５週目及び６週目のＣＤ４５＋細胞の割合は、Ａｒａ−Ｃ
のみを投与したマウスに比べ、化合物１とＡｒａ−Ｃとの組合せの処置を行ったマウスに
おいて顕著に減少した。つまり、化合物１はＡＭＬ治療におけるＡｒａ−ｃの有効性を大
幅に強化した。
【００６０】
Ｔ−ＡＬＬ治療におけるビンクリスチン（抗癌化学療法剤）の有効性の強化
予め馴化させたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＴ−ＡＬＬ細胞を静脈内注射した。１４日目
に、マウスに生理食塩水、ビンクリスチン（０．５ｍｇ／ｋｇ）、化合物１（５ｍｇ／ｋ
ｇ）＋ビンクリスチン（０．５ｍｇ／ｋｇ）、又は化合物１（２０ｍｇ／ｋｇ）＋ビンク
リスチンの注射を行った。２１日目及び２８日目に、マウスに第２及び第３の投薬処置を
それぞれ行った。生理食塩水及び化合物１を静脈内注射し、ビンクリスチンを腹腔内注射
した。化合物１及びビンクリスチンを同時投与したマウスでは、化合物１注射の１時間後
にビンクリスチンを注射した。
【００６１】
これらの結果は、各群の平均生存時間がそれぞれ４７±５．６日間、７３．６±７．１
日間、８５．４±１１．８日間、及び１１１．８±１２．２日間であることを示している
。言い換えれば、マウスに化合物１とビンクリスチンとの組合せを処置したとき、総生存
時間はビンクリスチン処置のみを行った群に比べ顕著に延長していた。
【００６２】
さらに、ビンクリスチン及び化合物１（５ｍｇ／ｋｇ）＋ビンクリスチンを処置したマ
ウスにおいて、８週間後まで末梢血中にＣＤ４５＋細胞は検出されず、また、化合物１（
２０ｍｇ／ｋｇ）＋ビンクリスチンを処置したマウスにおいて、１０週間後まで検出され
なかった。これらの結果は、化合物１及びビンクリスチンは上記期間中の血中のＣＤ４５
＋を効率よく排除することを示している。
【００６３】
要するに、化合物１はＴ−ＡＬＬ治療におけるビンクリスチンの有効性を大きく強化し
た。
【００６４】
ヒト白血病細胞（ＣＤ４５＋細胞）の移動
マウスに白血病細胞の移植後２１日目に化合物１（３０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した
。末梢血をベースライン、０．５時間、１時間、２時間、３時間、６時間、及び２４時間
に採取した。末梢血中のＣＤ４５＋細胞を、フローサイトメトリーを用いて測定した。
【００６５】
これらの結果は、末梢血中に循環するＣＤ４５＋細胞が化合物１の投与後０．５時間〜
１時間にてピークレベルに達したこと示し、化合物１が骨髄から末梢血に白血病細胞を効
果的に移動させたことを示している。
【００６６】
実施例７：ミニブタにおける心筋梗塞治療の有効性
心筋梗塞治療における４−アミノ−ピリミジン化合物の有効性を以下に記載の手順に従
い評価した。
【００６７】
ミニブタに冠状動脈閉塞を１５７±１７分間行い、心筋梗塞（ＭＩ）を誘発させた。各
動物にＭＩ後３日目に化合物１（２．８５ｍｇ／Ｋｇ）又は生理食塩水を静脈内注射した
。ＭＩ後７日目に、各動物に第２の投薬処置を行った。
【００６８】
全てのデータは、平均値±ＳＤとして表している。統計的分析をＰｒｉｓｍ  ５ソフト
ウェア（GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて行った。群間差
をマン−ホイットニー検定により評価した。０．０５未満のｐ値は統計的に有意であると
見なされた。複数回の測定は、２要因の分散分析（2-way analysis of variance：二元配
置分散分析）の後にペアワイズボンフェローニ補正法を用いた平均分離を用いて分析した
。
【００６９】
心機能及びリモデリングに対する化合物１の治療効果
化合物１の治療効果をＭＩ後３日目（治療前）及び１２週目にCardiovascular Researc
h, 2009, 81:482-490に記載の手順に従い、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて評価し
た。拡張末期容積（ＥＤＶ）及び収縮末期容積（ＥＳＶ）を容積時間曲線の最大値及び最
小値に対して評価した。これらの値を体表面積により正規化し、これらの値を使用してＬ
Ｖ駆出率（ＥＦ）をコンピュータ処理した。左心室（ＬＶ）の質量を拡張末期のＬＶ心外
膜容積とＬＶＥＤＶとの差としてコンピュータ処理し、心筋の密度（１．０５ｇ／ｍＬ）
を乗算した。
【００７０】
ＭＩ後１２週目に、ＥＤＶ及びＥＳＶは対照群及び化合物１処置群の両方において増加
した。対照群において、左心室の駆出率（ＬＶＥＦ）は、ベースラインの５４±８％から
ＭＩ後１２週目の４６±１０％に低下した（ｐ＝０．０１２５）。対照的に、化合物１処
置群は、ＬＶＥＦが保持されたことを示した（ベースラインの５０．７±４．９対ＭＩ後
１２週目の５０．７±４．３；ｐ＝０．３７２３）。２群間におけるＬＶＥＦのベースラ
インからの変化の差は統計的に有意であった（ｐ＝０．０２９）。ＬＶ収縮期の機能は十
分に保存されたが、ＭＩブタへの化合物１の処置においてＬＶ肥大が大幅に減弱しなかっ
たことには、ＬＶの質量がベースラインより増加したことが寄与していると考えられる。
【００７１】
これらの結果は、化合物１の処置によって心臓の構造変化に対して明らかな影響を与え
ることなく、ＭＩ後１２週目の心室機能不全を予防したことを示す。
【００７２】
心筋の生存率、梗塞サイズ、及び血管形成に対する化合物１の作用
化合物１の心筋生存率への作用について、ＭＩ後７日目（第２の投薬処置前）及び１２
週目にタリウム単一光子放射断層撮影（２０１Ｔｌ  ＳＰＥＣＴ）の安静時再分布シンチ
グラフィーを用いて評価した。ＳＰＥＣＴ画像はJournal Cardiovascular Imaging, 2007
, 23:757-765に記載のデュアルヘッドガンマカメラ（Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ、GE Medical S
ystems、米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）を用いて得られた。領域ＳＰＥＣＴを１
７セグメントモデル（米国心臓協会）及び欠損の重度及び範囲の半定量的スコア評価法を
用いて評価した。各セグメントを５点スコア評価法（０＝正常、１＝境界、２＝中等度、
３＝重度、及び４＝明らかなトレーサー取込みなし）においてトレーサーの取込みの重度
に基づきスコア評価した。続いてＳＲＳすなわち１７セグメントの安静時スコアの合計を
算出した。
【００７３】
ベースラインからＭＩ後１２週目までのＳＲＳの変化では、対照と化合物１処置群との
間に顕著な差はなかった。ＭＩ後１２週目にブタ心臓を回収したときに瘢痕体積を手動に
よるプラニメトリ法を用いて測定した。これらの結果から対照と化合物１処置群との間の
梗塞サイズに差はないことを確認している（６．４±２．１％対６．８±１．４％のＬＶ
質量）。さらに、化合物１による、梗塞した心筋周囲の血管密度の顕著な増大はなかった
（４９．６±１９．２／ｍｍ２対４３．５±１１．２／ｍｍ２）。
【００７４】
これらの結果から、化合物１が心臓の構造変化に対して明らかな影響を与えることなく
心臓収縮機能を改善することを更に確認している。
【００７５】
心筋及び全身の炎症に対する化合物１の作用
心筋の炎症を、ＭＩ後７日目及び１２週目の両方において梗塞領域のＴＮＦ−ａ、ＩＬ
−１３、及びＩＬ−６の遺伝子発現から決定した。ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１３、及びＩＬ−
６のレベルは対照群のものと比べ、ＭＩ後７日目の化合物１処置群において顕著に減少し
た。さらに、化合物１を処置したミニブタでは、ＭＩ後７日目でのＴＮＦ−ａ（３４９±
６０対１８６±４１ｐｇ／ｍＬ、ｎ＝６、ｐ＜０．００１）、ＩＬ−１３（４３６±８９
対１６３±５４、ｎ＝６、ｐ＜０．００１）、及びＩＬ−６（４０５±１０９対２０４±
５４ｐｇ／ｍＬ、ｎ＝６、ｐ＜０．０１）の血漿レベルが対照群より有意に低下していた
。さらに、化合物１を処置したミニブタのＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１３、及びＩＬ−６のレベ
ルは、ＭＩ後６週間〜１２週間の間で、対照群のものより顕著に低下した。
【００７６】
この結果は、化合物１により、炎症促進サイトカイン、すなわちＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１
３、及びＩＬ−６の心筋における発現が顕著に低下したことにより心機能が改善したこと
を示す。
【００７７】
造血幹細胞に対する化合物１の移動作用
ＭＩミニブタに生理食塩水又は化合物１（２．８５ｍｇ／Ｋｇ）を７２時間間隔で２回
静脈内注射した。末梢血（ＰＢ）をベースライン、０．５時間、１時間、２時間、３時間
、６時間、及び２４時間に採取した。白血球を密度勾配遠心分離法（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａ
ｑｕｅ、GE Healthcare Bio-Sciences AB）を用いて単離し、ＣＤ３４（ＹＳＴ０１；R&D
）、ＣＤ１３３（ＡＣ１３３；Miltenyi Biotec）、及びＣＤ２７１（ＭＥ２０．４；Mil
tenyl Biotec）に対する一次抗体で標識し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ装置（BD Bioscie
nce）及びＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて分析した。
ＰＢ内のＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、又はＣＤ２７１＋の事象頻度は、生存細胞に電気ゲ
ーティング（electronic gating）を行った後の全ての白血球のうちの陽性細胞の割合と
して表した。細胞１μｌ当たりの陽性細胞数は、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、又はＣＤ２
７１＋の事象頻度に総白血球数を乗算することにより算出した。化合物１の移動作用を評
価するため、ベースラインからの倍数増加を［（注射後の時点の事象）／（ベースライン
の事象）］として算出した。同様に、抗ＣＸＣＲ４（ａｂ２０７４；Abcam）を用いて、
移動したＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、及びＣＤ２７１＋細胞におけるＣＸＣＲ４
の共発現を確かめた。
【００７８】
対照群に比べ、化合物１は第１の注射の１時間〜６時間後の末梢循環中のＣＤ３４＋細
胞及びＣＤ１３３＋細胞をそれぞれ約４倍及び２．６５倍増加させた。化合物１は、第２
の注射後に、末梢血のＣＤ３４＋細胞を約５．１倍及びＣＤ１３３＋細胞を約５．８倍増
加させた。
【００７９】
これらの結果は、化合物１がＭＩ後のミニブタにおける血中幹細胞レベルを亢進させる
のに有効であったことを示す。
【００８０】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に対する化合物１の移動作用
ＭＩミニブタに、生理食塩水又は化合物１（２．８５ｍｇ／Ｋｇ）を７２時間間隔にて
２回静脈内注射した。ＰＢをベースライン、０．５時間、１時間、２時間、３時間、６時
間、及び２４時間に採取した。ＣＤ２７１＋細胞を免疫磁気により単離し、ＩＭａｇ（商
標）抗フィコエリスリン磁性粒子−ＤＭ（BD Bioscience）を用いて増大させた後、７５
ｍｍ２容のフラスコにおいてαＭＥＭ（Invitrogen）及び１０％ＦＢＳ（Invitrogen）か
らなるＭＳＣ培地を用いてインキュベーションし、２×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度を
得た。ＭＳＣ培地に、塩基性線維芽細胞成長因子及び上皮細胞成長因子（各１０ｎｇ／ｍ
ｌ；R&D Systems）を補充した。２４時間のインキュベーション後に、培地を３日毎に交
換した。ＭＳＣのコロニーをその習性において付着性、コロニー形成性、非食性、及び線
維芽球性として定義した（線維芽細胞コロニー形成単位：ＣＦＵＦと呼ぶ）。インキュベ
ーションの８日後に顕微鏡を用いてＭＳＣ−ＣＦＵＦの計数を行った。コロニー形成効率
（ＣＦＥ）を、播種した１０６個の細胞毎のコロニー数として定義した。増殖したＭＳＣ
−ＣＦＵＦの一方向混合リンパ球反応における同種反応を調節する能力及び表現型の特徴
の両方を評価した。
【００８１】
データは、化合物１が、第１及び第２の投薬処置の１時間〜３時間後に、ＰＢ中のＣＤ
２７１＋細胞をそれぞれ約４倍及び５．５倍増加させたことを示す。さらに、化合物１に
よって放出されたＣＤ２７１＋細胞の大部分がＣＸＣＲ４を発現した。さらに、ＣＦＥは
第１の投薬処置及び第２の投薬処置後にそれぞれ約１８倍（０．０５±０．０２から０．
９２±０．２５）及び約６倍（０．５５±０．２５から３．１８±０．３９）増加した（
ｐ＜０．０１）。結果は、化合物１がＣＸＣＲ４＋ＭＳＣ細胞を骨髄から末梢循環に移動
させることを示す。
【００８２】
内皮前駆細胞に対する化合物１の移動作用
ＢＡＬＢ／ｃマウス（BioLasco）に生理食塩水又は化合物１（６０ｍｇ／Ｋｇ）を静脈
内注射した。全血を１時間、２時間、３時間、６時間、１８時間、及び２４時間に採取し
た。内皮前駆細胞（ＣＤ１３３＋）を抗体表面染色及びフローサイトメトリー（Beckman 
Coulter、フロリダ州マイアミ）を用いて測定した。
【００８３】
データは、化合物１が単回注射後１時間〜３時間以内に血中ＣＤ１３３＋内皮前駆細胞
を５．２倍〜１０．７倍増加させたことを示す。結果は、化合物１が末梢血へのＣＤ１３
３＋内皮前駆細胞の移動を大きく亢進させることを示す。
【００８４】
他の実施形態
本明細書に開示される特徴の全てを任意の組合せで組み合わせてよい。本明細書に開示
されるそれぞれの特徴は、同じ目的、同等の目的又は類似の目的にかなう代替的な特徴に
よって置き換えることができる。このように、表現上特に記載が無い限り、開示されるそ
れぞれの特徴は、一連の包括的な同等の特徴又は類似の特徴の一例に過ぎない。
【００８５】
上記記載から、当業者は、本発明の必須の特性を容易に突きとめることができ、そして
その趣旨及び範囲から逸脱しなければ、それを様々な使用及び状況に適合させるために、
本発明の様々な変化及び変更を行うことが可能である。このように、他の実施形態も添付
の特許請求の範囲内である。
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月10日(2019.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋梗塞を治療するための組成物であって、式（Ｉ）：
【化１】
2019218383.tif 000022
（式中、Ｒ１がシクロヘキシルであり、各Ｒ２がＨであり、Ｌ１が
【化２】
2019218383.tif 000023
であり、Ｌ２がシクロヘキシレンであり、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、及びｑが各々独立して０〜３である）の化合物を含む、組成物。
【請求項２】
前記化合物が以下の化合物：
【化３】
2019218383.tif 000024
の１つである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記化合物が、
【化４】
2019218383.tif 000025
である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記化合物が、
【化５】
2019218383.tif 000026
である、請求項１又は２に記載の組成物。
【外国語明細書】
2019218383000001.pdf
2019218383000002.pdf
2019218383000003.pdf