(57)【要約】【課題】糸状真菌細胞の選択的オートファジー系が、部分的又は完全に不活性化された改変糸状真菌細胞、前記遺伝子改変糸状真菌細胞を作製する方法、及び前記改変糸状真菌細胞において目的の生物由来物質を生産する方法が開示される。【解決手段】破壊又は欠失したａｔｇ１１活性を有する、遺伝子改変糸状真菌細胞、前記遺伝子改変糸状真菌細胞を作製する方法、及び前記改変糸状真菌細胞において目的の生物由来物質を生産する方法も開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状真菌細胞の選択的オートファジー系の成分の破壊又は欠失を含む、糸状真菌宿主細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の糸状真菌細胞であって、前記細胞が、目的の異種ポリペプチドをコード化するヌクレオチドの配列と、前記糸状真菌細胞において前記異種ポリペプチドを産生するのに好適な遺伝子エレメントとを含む、発現ベクターを含む、糸状真菌細胞。
【請求項３】
前記目的の異種ポリペプチドが、酵素である、請求項２に記載の糸状真菌細胞。
【請求項４】
前記糸状真菌細胞のａｔｇ１１活性の完全又は部分的不活性化を含む糸状真菌細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の糸状真菌細胞であって、前記細胞が、目的の異種ポリペプチドをコード化するヌクレオチドの配列と、前記糸状真菌細胞において前記異種ポリペプチドを産生するのに好適な遺伝子エレメントとを含む、発現ベクターを含む、糸状真菌細胞。
【請求項６】
前記目的の異種ポリペプチドが、酵素である、請求項５に記載の糸状真菌細胞。
【請求項７】
前記目的の異種ポリペプチドが、以下：ペプチダーゼ（カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、プロテアーゼ）、アミラーゼ（例えば、α−アミラーゼ又はグルコアミラーゼ）、カルボヒドラーゼ、プルラナーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、エンドグルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、及びキシラナーゼからなる群から選択される酵素である、請求項５に記載の糸状真菌細胞。
【請求項８】
前記目的の異種ポリペプチドが、グルコアミラーゼである、請求項５に記載の糸状真菌細胞。
【請求項９】
前記目的の異種ポリペプチドが、アミラーゼである、請求項５に記載の糸状真菌細胞。
【請求項１０】
前記糸状真菌細胞が、以下：アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）属、ミセリオフトーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）属、及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の糸状真菌細胞。
【請求項１１】
前記糸状真菌細胞が、以下：アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）フザリウム・レティキュラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブチヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコセキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、及びトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）の細胞から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の糸状真菌細胞。
【請求項１２】
前記糸状真菌細胞が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の糸状真菌細胞。
【請求項１３】
前記糸状真菌細胞が、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）又はアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の細胞である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の糸状真菌細胞。
【請求項１４】
前記破壊又は欠失が、前記ａｔｇ１１遺伝子の上流又は下流調節配列の欠失又は破壊を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の糸状真菌細胞。
【請求項１５】
前記破壊又は欠失が、前記ａｔｇ１１遺伝子の欠失又は破壊を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の糸状真菌細胞。
【請求項１６】
前記破壊又は欠失が、前記ａｔｇ１１遺伝子の欠失を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の糸状真菌細胞。
【請求項１７】
前記糸状真菌細胞が、前記糸状真菌宿主細胞におけるｈａｃ１  ＵＰＲ調節タンパク質の存在を増大させるような改変をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の糸状真菌細胞。
【請求項１８】
前記糸状真菌細胞が、前記糸状真菌宿主細胞におけるｉｒｅ１  ＵＰＲ調節タンパク質の存在を増大させるような改変をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の糸状真菌細胞。
【請求項１９】
目的の異種ポリペプチドを生産する方法であって、目的の異種ポリペプチドの発現を誘導するのに好都合な条件下で、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の糸状真菌細胞を培養するステップを含む方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞培地から前記目的のポリペプチドを回収するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、コンピュータで読み取り可能な形態の配列表を含む。該コンピュータで読み取り可能な形態は、参照により本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
本発明は、改変された糸状真菌細胞、及びこのような改変糸状真菌細胞を用いて、ポリペプチド（例えば、酵素）などの生物由来化合物を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
オートファジーは、細胞質成分及びオルガネラが液胞／リソソームを用いて消化される、真核細胞における系である。オートファジーは、飢餓の最中、並びに増殖及び発生、さらにはその他の様々なイベントにおいて養分循環に関連していた。オートファジーの機構は複雑で、ａｔｇ１、ａｔｇ２、ａｔｇ３、ａｔｇ４、ａｔｇ５、ａｔｇ６、ａｔｇ７、ａｔｇ８、ａｔｇ９、ａｔｇ１０、ａｔｇ１１、ａｔｇ１２、ａｔｇ１３、ａｔｇ１４、ａｔｇ１５、ａｔｇ１６、ａｔｇ１７、ａｔｇ１８、ａｔｇ１９、ａｔｇ２０、ａｔｇ２１、ａｔｇ２２、ａｔｇ２３、ａｔｇ２４、ａｔｇ２５、ａｔｇ２６、ａｔｇ２７、ａｔｇ２８、ａｔｇ２９、ａｔｇ３０、及びａｔｇ３１遺伝子と称する３０超のオートファジー遺伝子の相互作用を含み得る。
【０００４】
オートファジー遺伝子及びオートファジー遺伝子の多くの役割について、酵母及び糸状真菌などの多数の真核細胞において研究されている。Ｍａｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ，”Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４６（２００９），１−８；Ａｓｋｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｌｉｎｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｍｅｔａｌ  Ｉｏｎ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ，”Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ，Ｄｅｃ．２００７，２４３７−２４４７；Ｋｉｔａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｙｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＴＧ８  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｅ  Ａｏａｔｇ８  ａｎｄ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ，”Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ，Ａｕｇ．２００６，１３２８−１３３６；Ｋｉｔａｍｏｔｏ  Ｋ．＆  Ｋｉｋｕｍａ  Ｔ．，“Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｂｙ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｏａｔｇ１３，Ａｏａｔｇ４，ａｎｄ  Ａｏａｔｇ１５  ｇｅｎｅｓ，”ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  ３１６（２０１１）６１−６９；Ｋｌｉｏｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ａｔｇ１  Ｋｉｎａｓｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｉｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｔｏ  Ｉｎｉｔｉａｔｅ  Ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ  Ｖｅｓｉｃｌｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１９，Ｆｅｂ．２００８，６６８−６８１；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｌｅｉ，“Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  β−Ｌａｃｔａｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ，”Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７７，Ｎｏ．４，Ｆｅｂ．２０１１，１４１３−１４２２；Ｋｌｉｏｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ａｃｔｉｎ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  Ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  Ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，ｂｕｔ  Ｎｏｔ  Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，ｉｎ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１６，Ｄｅｃ．２００５，５８４３−５８６５；Ｋｌｉｏｎｓｋｙ  Ｄ．Ｊ．＆  Ｃｈｅｏｎｇ  Ｈ．，“Ｄｕａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ａｔｇ１  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＡＳ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，”Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，４：５，Ｊｕｌｙ  ２００８，７２４−７２６；Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“ＡＴＧ���，ａｎｄ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ，ｉｎｈｉｂｉｔ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ，”ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．４，（２００７），３６０−３６５；Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｔｇ１／ＵＬＫ１  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２２：１３２−１３９（２０１０）；Ｋｉｔａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｏａｔｇ１  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｖｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ，”（２０１２）；Ｋｌｉｏｎｓｋｙ  Ｄ．＆  Ｙｏｒｉｍｉｔｓｕ  Ｔ．，“Ａｔｇ１１  Ｌｉｎｋｓ  Ｃａｒｇｏ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｖｅｓｉｃｌｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ｔｏ  Ｖａｃｕｌｏｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１６，Ａｐｒｉｌ  ２００５，１５９３０１６０５；及びＫ．Ｓｕｚｕｋｉ，“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｂｕｄｄｉｎｇ  ｙｅａｓｔ，”Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２０１３）２０，４３−４８。
【０００５】
しかし、オートファジー系及びオートファジー遺伝子の完全な役割は、十分に解明されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、糸状真菌細胞の選択的オートファジー系が、部分的又は完全に不活性化された遺伝子改変糸状真菌宿主細胞、及びそのような改変宿主細胞におけるポリペプチドの生産に関する。糸状真菌細胞の選択的オートファジー系の不活性化によって、目的のポリペプチドなど、目的の生物由来物質の発現収量が増加する。特定の実施形態では、本発明は、部分的又は完全に不活性化された遺伝子改変糸状真菌宿主細胞を提供し、ここで、前記改変糸状真菌宿主細胞は、目的のポリペプチド（例えば、酵素）をコード化する遺伝子などの目的の生物由来物質をコードする遺伝子で形質転換されている。糸状真菌細胞における選択的オートファジー系の活性化は、糸状真菌細胞の選択的オートファジー経路に関与する１つ又は複数の遺伝子／タンパク質（ａｔｇ遺伝子／タンパク質）を欠失又は破壊することによって、例えば、糸状真菌細胞に存在する内在性ａｔｇ１１活性を欠失させる、破壊する、又はサイレンシングする、並びに／あるいは、糸状真菌細胞の選択的オートファジー経路におけるａｔｇ１１活性と直接若しくは間接的に関与する１つ又は複数の遺伝子／タンパク質を欠失又は破壊することなどによって、達成することができる。
【０００７】
本発明は、糸状真菌細胞のａｔｇ１１活性が、例えば、該糸状真菌細胞に存在する内在性ａｔｇ１１遺伝子の発現を欠失又は破壊することにより、欠失、破壊又はサイレンシングされた遺伝子改変糸状真菌宿主細胞に関する。糸状真菌宿主細胞のａｔｇ１１活性の欠失、破壊又はサイレンシングは、目的の生物由来物質、例えば、目的のポリペプチドの発現収率の増加をもたらす。特定の実施形態において、本発明は、欠失又は破壊又はサイレンシングされたａｔｇ１１遺伝子を含む改変糸状真菌宿主細胞を提供し、この糸状真菌宿主細胞は、目的の生物由来物質をコード化する遺伝子、例えば、目的のポリペプチド（例えば、酵素）をコード化する遺伝子で形質転換されている。
【０００８】
本発明はまた、真菌細胞のａｔｇ１１活性が欠失、破壊又はサイレンシングされた改変糸状真菌宿主細胞を生産する方法も提供する。具体的実施形態では、本発明は、糸状真菌宿主細胞を生産する方法であって、該糸状真菌細胞のａｔｇ１１遺伝子を欠失させるか、又は破壊するステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、目的の生物由来物質、例えば、目的のポリペプチドをコードする発現ベクターで糸状真菌細胞を形質転換するステップを含む、糸状真菌宿主細胞を生産する方法であって、前記糸状真菌細胞は、ａｔｇ１１遺伝子の欠失若しくは破壊若しくはサイレンシングを含むように改変されているか、又はそのようにさらに改変される、方法を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、真菌細胞のａｔｇ１１活性が欠失又は破壊されている改変糸状真菌宿主細胞を用いて、目的の生物由来化合物を生産する方法も提供し、これは、目的のポリペプチドの組換え生産を含む。特定の実施形態では、本発明は、目的のポリペプチドをコード化する遺伝子を含む糸状真菌細胞を培養するステップを含み、ここで、前記糸状真菌細胞のａｔｇ１１遺伝子は、欠失又は破壊されている。培養は、目的の異種ポリペプチドの発現を誘導するのに好都合な条件下で行い、目的の異種ポリペプチドは、１つ以上の用途で用いるために、培地から回収してもよいし、あるいは、目的のポリペプチドを含有する培地又は発酵ブロスを１つ以上の用途に用いてもよい。
【００１０】
本発明の宿主細胞及び方法を適用して、目的とする任意の生物由来物質を生産することができる。特定の実施形態では、改変糸状真菌宿主細胞及び方法を適用して、目的のポリペプチド、例えば、ホルモン、酵素、受容体若しくはそれらの部分、抗体若しくはその部分、又はリポータなどを生産する。本発明の具体的実施形態は、本発明の改変糸状真菌宿主細胞及び方法を、目的の酵素を組換えにより生産するのに使用することに関する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
Ａｔｇ１１：「ａｔｇ１１」という用語は、選択的オートファジーに関与するアダプタータンパク質であると考えられるオートファジー関連タンパク質を指す。ａｔｇ１１タンパク質及びコード化核酸配列の例は、当分野では公知であり、例えば、配列番号１に示す核酸配列によりコード化される配列番号２のアミノ酸を有するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｇｅｒｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｔｇ１１タンパク質がある。その他のａｔｇ１１タンパク質及び遺伝子も特定決定されており、例えば、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）及びアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）などが挙げられる。ａｔｇ１１遺伝子及びタンパク質は、真菌細胞において構造的かつ機能的に類似であるため、その他のａｔｇ１１遺伝子及びタンパク質（ａｔｇ１１遺伝子及びタンパク質相同体）は、常用の分子生物学的方法を用いて、他の真菌宿主において同定することができる。また、当業者であれば、ａｔｇ１１配列の変異は様々な細胞系で起こり得るが、それはタンパク質の機能を改変するものではないことを理解されよう。
【００１２】
生物由来物質：「生物由来物質」という用語は、糸状真菌宿主細胞に産生される目的とする任意の産物を指す。生物由来物質は、選択的オートファジー経路の部分的又は完全な不活性化、例えば、ａｔｇ１１の欠失若しくは破壊などにより、直接その収量が増加する発現産物、又は選択的オートファジー経路の不活性化、例えば、ａｔｇ１１活性の欠失若しくは破壊などにより、直接増大する発現産物の作用から作出される産物であってもよい。
【００１３】
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という用語は、真核又は原核細胞から得られた成熟型の、スプライス済みｍＲＮＡ分子から逆転写により調製することができるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡに存在し得るイントロン配列を欠失している。最初の一次ＲＮＡ転写物は、成熟型の、スプライス済みｍＲＮＡとして生成される前に、スプライシングを含む一連のステップを通してプロセッシングされるｍＲＮＡの前駆体である。
【００１４】
コード配列：「コード配列」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接規定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームにより決定され、ＡＴＧ、ＧＴＧ、又はＴＴＧなどの開始コドンで始まり、ＴＡＡ、ＴＡＧ、又はＴＧＡなどの停止コドンで終わる。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はその組み合わせであってもよい。
【００１５】
制御配列：「制御配列」という用語は、成熟型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対してネイティブ（すなわち、同じ遺伝子由来）又は外来（すなわち、異なる遺伝子由来）でも、あるいは、互いにネイティブ又は外来であってもよい。このような制御配列として、限定はしないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネータなどが挙げられる。最低でも、制御配列は、プロモータ、並びに転写及び翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、制御配列と、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域との連結を容易にする特定の制限部位を導入する目的で、リンカーを備える。「制御配列」という用語は、本明細書において、ポリペプチドの発現に必要であるか、又は有利な全ての構成要素を包含するように定義される。
【００１６】
制御配列は、適切なプロモータ配列、すなわち、核酸配列の発現のために宿主細胞により認識される核酸配列であってよい。プロモータ配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモータは、最適な宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であってよく、例えば、突然変異体、短縮型、及びハイブリッドプロモータを含み、また、宿主細胞に対して相同的又は異種いずれかの細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られるものであってもよい。
【００１７】
糸状真菌宿主細胞において核酸構築物の転写を指令するのに好適なプロモータの例としては、以下：アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）又はアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ、フザリウム・オキスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開９６／００７８７号パンフレット）、並びにＮＡ２−ｔｐｉプロモータ（アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来のプロモータのハイブリッド）の遺伝子から得られるプロモータ；並びにこれらの突然変異体、短縮型、及びハイブリッドプロモータがある。
【００１８】
制御配列はまた、好適な転写終結配列、すなわち、転写を終了するために宿主細胞によって認識される配列であってもよい。終結配列は、ポリペプチドをコード化する核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞において機能性である任意のターミネータを本発明で使用することができる。
【００１９】
糸状真菌宿主細胞の好ましいターミネータは、以下：アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニレートシンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、及びフザリウム・オキスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【００２０】
制御配列はまた、好適なリーダー配列、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である。リーダー配列は、ポリペプチドをコード化する核酸配列の５’末端に作動可能に結合される。最適な宿主細胞において機能性である任意のリーダー配列、例えば、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ及びアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子を本発明で使用することができる。Ｍｃｋｎｉｇｈｔ  Ｇ．Ｌ．，Ｏ’Ｈａｒａ  Ｐ．Ｊ．，Ｐａｒｋｅｒ  Ｍ．Ｌ．，“Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒｏｎｓ”，Ｃｅｌｌ  ４６：１４３−１４７（１９８６））。
【００２１】
制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち、核酸配列の３’末端に作動可能に結合し、転写されるとき、ポリアデノシン残基を転写されたｍＲＮＡに付加するためのシグナルとして宿主細胞によって認識される配列である。最適な宿主細胞において機能性である任意のポリアデニル化配列を本発明で使用することができる。例として、以下：アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニレートシンターゼ、フザリウム・オキスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ、及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼの遺伝子のポリアデニル化配列が挙げられる。
【００２２】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に結合したアミノ酸配列をコード化し、コード化されたポリペプチドを細胞の分泌経路に向かわせる、シグナルペプチドコード領域であってもよい。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されたポリペプチドをコード化するコード領域のセグメントを有する翻訳リーディングフレームに天然に連結している、シグナルペプチドコード領域を本質的に含んでいてもよい。あるいは、コード領域の５’末端は、コード配列に対して外来のシグナルペプチドコード領域を含んでいてもよい。コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然に含んでいない場合には、外来のシグナルペプチドコード領域が必要となる場合がある。あるいは、ポリペプチドの分泌を増強するために、外来のシグナルペプチドコード領域で、天然のシグナルペプチドコード領域を単に置換してもよい。しかし、発現されたポリペプチドを最適な宿主細胞の分泌経路に向かわせる任意のシグナルペプチドコード領域を、本発明で使用してもよい。
【００２３】
糸状真菌宿主細胞の有効なシグナルペプチドコード領域は、以下：アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、及びフミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼの遺伝子から得るシグナルペプチドコード領域である。
【００２４】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であってもよい。結果として得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（あるいは、場合によってはチモーゲン）として知られる。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒作用又は自己触媒開裂によって成熟した活性ポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード領域は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α因子、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼ、及びミセリオフトーラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）の遺伝子から得ることができる。
【００２５】
シグナルペプチドとプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合には、プロペプチド領域をポリペプチドのアミノ末端の次に配置し、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の次に配置する。
【００２６】
欠失した、又は破壊された：「欠失した、又は破壊された」（及び「欠失又は破壊」）という用語は、評価対象の遺伝子又はタンパク質に対する改変を含まない同じ種の宿主細胞に対して、改変された宿主細胞におけるタンパク質機能又は活性の排除若しくは低減を指す。ａｔｇ１１タンパク質（又は選択的オートファジー経路の他の成分）のタンパク質機能又は活性の低減は、それが真菌宿主でのタンパク質の収量増大を可能にすれば、十分である。ａｔｇ１１タンパク質機能若しくは活性（又は選択的オートファジー経路の他の成分）の欠失又は破壊は、以下：１）発現を制御する上流又は下流調節配列（例えば、ａｔｇ１１遺伝子又はａｔｇ１１遺伝子相同体）の欠失又は破壊、並びに２）ある遺伝子（例えば、ａｔｇ１１遺伝子タンパク質をコードする遺伝子）を非機能性にするような該遺伝子の突然変異（ここで、「突然変異」は、コード化タンパク質が、活性又は機能を有することができないようにする、該遺伝子への欠失、置換、挿入若しくは付加を含む）によって得ることができる。
【００２７】
発現：「発現」という用語は、限定はしないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含む、ポリペプチドの生産に関与するあらゆるステップを包含する。
【００２８】
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含み、その発現をもたらす制御配列に作動可能に連結される直鎖又は環状ＤＮＡ分子を意味する。
【００２９】
糸状真菌：「糸状真菌」（又は「糸状菌」）という用語は、あらゆる糸状真菌宿主細胞を指し、亜門：真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及び卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の全ての糸状形態を包含する（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、前掲、に記載されている通り）。糸状真菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複雑な多糖類から構成される菌糸体細胞壁により特徴づけられる。栄養成長は菌糸の伸長によって行われ、炭素異化は偏性好気性である。対照的に、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母による栄養成長は、単細胞の葉状体の出芽によって行われ、炭素異化は発酵的であると考えられる。好ましい実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、限定はしないが、以下の種：アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）属、ミセリオフトーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）属、又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の細胞である。一実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、又はアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）である。別の実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レティキュラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブチヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコセキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、又はフザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）の細胞である。別の実施形態では、糸状真菌宿主細胞は、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）の細胞である。
【００３０】
異種：目的のポリペプチドは、目的の糸状真菌宿主細胞に対してネイティブ又は異種のいずれであってもよい。「異種ポリペプチド」という用語は、本明細書において、真菌細胞に対してネイティブではないポリペプチド、ネイティブ配列を変更するように改変が施されたネイティブポリペプチド、又は組換えＤＮＡ技術による真菌細胞の操作の結果、発現が、量的に変更されたネイティブポリペプチドとして定義される。目的のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドを産生することができる、多細胞生物及び微生物、例えば、細菌及び真菌などの任意の生物を起源とするものであってよい。
【００３１】
相同体：「相同体」という用語は、参照配列と共通の構造及び機能類似性を有する遺伝子又はタンパク質配列を指す。用語「相同体」は、共通の祖先からの進化のために構造的に類似する、異なる種の配列であるオルソログ、及び同じゲノム内の類似配列であるパラログの両方を包含する。
【００３２】
不活性化：「不活性化した」（又は「不活性化」）という用語は、評価対象の遺伝子又はタンパク質に対する改変を含まない同じ種の宿主細胞に対して、改変された宿主細胞における活性の部分的若しくは完全な排除を指す。
【００３３】
収量の増加：「収量の増加」という用語は、改変（例えば、ａｔｇ１１遺伝子若しくはタンパク質、又は評価対象のその他の遺伝子若しくはタンパク質に対する）を含まない同じ種の宿主細胞に対して、改変された真菌細胞が、目的のポリペプチドを産生する能力の増大を意味する。本発明によれば、上記細胞は、改変を含まない同じ種の宿主細胞と比較して、同じ時間量で、より多くの目的のポリペプチドを産生する。
【００３４】
導入：「導入」という用語は、ベクターが染色体組み込み体又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、ポリペプチドをコード化する核酸配列を含むベクターを真菌細胞に導入することを意味する。組み込みは、一般に、核酸配列が、細胞内に安定して維持される可能性がより高いため、有利であると考えられている。染色体へのベクターの組み込みは、相同的組換え、非相同的組換え、又は転位によって行われる。宿主細胞のゲノムへの組み込みの場合、ベクターは、相同的若しくは非相同的組換えによるゲノムへのベクターの安定な組み込みのために、ポリペプチドをコード化する核酸配列又は該ベクターの他の任意のエレメントを利用してもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞のゲノムへの、相同的組換えによる組み込みを指令する追加の核酸配列を含有してもよい。上記の追加核酸配列は、染色体における正確な場所で、宿主細胞ゲノムにベクターを組み込むことを可能にする。正確な場所での組み込みの可能性を増大するため、組み込みエレメントは、相同的組換えの確率を高めるために、対応する標的配列と高度に相同性である、１００〜１，５００塩基対、好ましくは４００〜１，５００塩基対、最も好ましくは８００〜１，５００塩基対など、十分な数の核酸を含有するのが好ましい。組み込みエレメントは、宿主細胞のゲノム内の標的配列と相同性である任意の配列であってもよい。これらの核酸配列は、宿主細胞のゲノム内の標的配列と相同性である任意の配列であってもよいし、さらに、組み込みエレメントは、非コード化又はコード化配列であってもよい。自律複製の場合、ベクターは、宿主細胞でベクターが自律的に複製できるようにする複製起点をさらに含んでもよい。組換え発現ベクターを構築するために、前述したエレメントを連結するのに用いる手順は、当業者には周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，前掲参照）。
【００３５】
核酸構築物：「核酸構築物」という用語は、本明細書において、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又は天然には存在しない様式で組み合わせ、並置した核酸のセグメントを含むように改変された、一本鎖若しくは二本鎖いずれかの核酸分子として定義する。「核酸構築物」という用語は、核酸構築物が、コード配列の発現に必要な全ての制御配列を含む場合、用語「発現カセット」と同義語である。「コード配列」という用語は、本明細書に定義するように、ｍＲＮＡに転写され、本発明の転写活性化因子に翻訳される配列である。コード配列の境界は、一般に、ｍＲＮＡの５’末端のＡＴＧ開始コドン及びｍＲＮＡの３’末端のオープンリーディングフレームのすぐ下流に位置する転写終結配列によって決定される。コード配列は、限定はしないが、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び組換え核酸配列を含んでよい。
【００３６】
目的のポリペプチド：「目的のポリペプチド」という用語は、本明細書において、特定の長さのコード化産物を指し、従って、ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質を包含する。ポリペプチドが天然に分泌されない場合、当分野では公知の技術に従い、シグナル配列を有するように、タンパク質をコード化する核酸配列を改変してもよい。分泌されるポリペプチドは、天然に発現されるが、本発明によって、より多くの量が発現される内在性ポリペプチドであってよいし、あるいは、ポリペプチドは、異種であってもよい。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、異種である。従って、ポリペプチドは、細胞に対してネイティブであってもよいが、例えば、目的のポリペプチドをコード化する核酸を含有する自己複製ベクターを用いた形質転換によって生産される。あるいは、組換え体は、ポリペプチドの１つ又は複数の追加コピーを組換え技術によりゲノムに組み込んだものであってもよい。ある実施形態では、目的のタンパク質では、以下：ペプチダーゼ（カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、プロテアーゼ）、アミラーゼ（例えば、α−アミラーゼ又はグルコアミラーゼ）、カルボヒドラーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、エンドグルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、及びキシラナーゼからなる群から選択される。別の実施形態では、目的のタンパク質は、以下：ワクチン、サイトカイン、受容体、抗体、ホルモン、及び増殖因子などの因子からなる群から選択される。好ましい実施形態では、目的のポリペプチドは、細胞外分泌される。
【００３７】
目的のポリペプチドをコード化する核酸配列は、原核、真核、又は他の供給源から得てもよい。本発明の目的のために、所与の供給源に関して、本明細書で用いられる「〜から得られる」という用語は、ポリペプチドが、その供給源から、又はその供給源由来の遺伝子を挿入した細胞により産生されることを意味する。
【００３８】
目的のポリペプチドをコード化する核酸配列を単離、又はクローニングするのに用いる技術は、当分野では公知であり、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、又はそれらの組み合わせを含む。このようなゲノムＤＮＡからの核酸配列のクローニングは、例えば、公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用により実施することができる。例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。クローニング手順は、ポリペプチドをコード化する核酸配列を含む所望の核酸断片の切除及び単離、ベクター分子への該断片の挿入、突然変異真菌細胞（ここで、核酸配列の複数のコピー若しくはクローンが複製される）への該組換えベクターの組み込みを含み得る。核酸配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、又はこれらのいずれかの組み合わせであってよい。
【００３９】
組換え発現ベクター：「組換え発現ベクター」という用語は、組み換えＤＮＡ手順に好都合に付すことができ、ポリペプチドをコード化する核酸配列の発現をもたらし得る任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であってよい。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される真菌宿主細胞と該ベクターの適合性に応じて変わり得る。ベクターは、線状又は閉じた環状プラスミドであってもよい。ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在し、その複製は染色体複製、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体であるベクターであってよい。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を包含していてもよい。あるいは、ベクターは、糸状真菌細胞に導入されるときにゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるベクターであってもよい。さらに、ベクター系は、真菌細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを共に含む単一のベクター若しくはプラスミド、又は２つ以上のベクター若しくはプラスミド、又はトランスポゾンであってもよい。
【００４０】
好ましくは、ベクターは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする、１つ又は複数の選択マーカを含有する。選択マーカは、遺伝子であり、その産物は、殺生物剤又はウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体への原栄養性等を提供する。糸状真菌細胞で使用するための選択マーカは、限定はしないが、以下：ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニレートシンターゼ）、並びにその他の種に由来する同等物を含む群から選択することができる。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属細胞での使用に好適なのは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）のａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子、並びにストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子である。ベクターは、好ましくは、宿主細胞ゲノムへのベクターの安定な組み込み、又は細胞のゲノムとは独立した細胞中のベクターの自律複製を可能にするエレメントを含有する。
【００４１】
真菌細胞への発現ベクター又は核酸構築物の導入は、それ自体公知の方法で、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生から成る方法を含んでもよい。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属細胞の形質転換に好適な手順は、欧州特許第２３８  ０２３号明細書及びＹｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４に記載されている。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種を形質転換する好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ  ７８：１４７−１５６又は国際公開第９６／００７８７号パンフレットに記載されている。
【００４２】
組換え核酸：「組換え核酸」という用語は、一般に、ポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼによる核酸の操作により、天然には通常存在しない形態に、最初にｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された核酸を意味する。一般に、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はｍＲＮＡを指し、遺伝子又は遺伝子断片を含む。従って、直鎖状の単離された核酸、又は通常結合していないＤＮＡ分子を連結することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成した発現ベクターは、いずれも、本発明が目的とする組換え体とみなされる。いったん組換え核酸が作製され、宿主細胞又は生物に再導入されると、これは、非組換え的に、すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作ではなく、宿主細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞機序を用いて複製するが、このような核酸は、いったん組換えにより生産されたら、その後非組換え的に複製しても、やはり本発明が目的とする組換え体とみなされる。
【００４３】
組換えタンパク質：「組換えタンパク質」という用語は、組換え技術を用いて、すなわち、上に示したような組換え核酸の発現を通して作製されるタンパク質である。一般に、タンパク質及びペプチド又はポリペプチドという用語は、本明細書において、置換え可能に用いることができる。組換えタンパク質は、少なくとも１つ又は複数の特徴によって、天然に存在するタンパク質から識別される。例えば、野生型宿主では通常結合していたタンパク質及び化合物の一部又は全部からタンパク質を単離するか、又は精製してよく、従って、上記タンパク質は、実質的に純粋であり得る。例えば、単離タンパク質は、天然の状態では通常結合している材料の少なくとも一部又は全部を伴わず、好ましくは、所与のサンプル中の全タンパク質の少なくとも約０．５重量％、より好ましくは、少なくとも約５重量％を占める。実質的に純粋なタンパク質は、全タンパク質の少なくとも約７５重量％を含み、少なくとも約８０重量％が好ましく、少なくとも約９０重量％が特に好ましい。一実施形態では、この定義は、その宿主細胞以外からのタンパク質の生産、又は組換え核酸により生産されるタンパク質を含む。あるいは、タンパク質は、増大した濃度レベルでタンパク質が生成されるように、誘導プロモータ又は高度発現プロモータの使用により、通常認められるより有意に高い濃度で生成することができる。あるいは、タンパク質は、以下に説明するように、エピトープタグの付加又はアミノ酸置換、挿入及び欠失のような、天然に存在しない形態であってもよい。
【００４４】
組換え細胞：「組換え細胞」という用語は、概して、組換え核酸又はポリペプチド（タンパク質）を含有するように操作された細胞を指す。これらの細胞への遺伝子の輸送は、例えば、これらの生物について記載されている従来の形質転換方法を用いて達成することができる。哺乳動物細胞宿主系トランスフェクションの一般的態様は、米国特許第４，３９９，２１６号明細書に記載されている。酵母への形質転換は、典型的に、Ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１３０：９４６（１９７７）及びＨｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７６：３８２９（１９７９）の方法に従い実施する。しかし、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどの、ＤＮＡを細胞に導入する他の方法。哺乳動物細胞を形質転換するための様々な技術については、Ｋｅｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５２７−５３７（１９９０）及びＭａｎｓｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照されたい。
【００４５】
ＵＰＲ調節タンパク質をコード化する核酸（例えば、ｃＤＮＡ、コード又はゲノムＤＮＡ）を複製可能なベクターに挿入してもよい。様々なベクターが一般に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態であってよい。適切な核酸配列を、様々な手順によりベクターに挿入することができる。一般に、当分野では公知の技術を用いて、ＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼに挿入する。ベクター成分は、一般に、限定はしないが、１つ又は複数のシグナル配列、複製起点、１つ又は複数のマーカ遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモータ、及び転写終結配列を含む。これらの成分の１つ又は複数を含む好適なベクターの構築には、当業者に周知である標準的連結技術を使用する。
【００４６】
選択マーカ：「選択マーカ」という用語は、本明細書において、その産物が、殺生物剤又はウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体への原栄養性等を提供する遺伝子として定義され、これは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする。糸状真菌宿主細胞で使用するための選択マーカとして、限定はしないが、以下：ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニレートシンターゼ）、並びにその同等物が挙げられる。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属細胞での使用に好適なのは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）のａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子、並びにストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子である。また、これら選択マーカの機能性誘導体も本発明において有利であり、特に、低減した活性又は低減した安定性を有するために、選択物質の濃度を増加することなく、発現ベクターのより高いコピー数の選択を可能にする機能性誘導体が有利である。
【００４７】
選択オートファジー：「選択オートファジー」という用語は、糸状真菌細胞のａｔｇ１１活性に依存するオートファジー系を指す。
【００４８】
配列同一性：２つのアミノ酸配列同士又は２つのヌクレオチド配列同士の関連性は、パラメータ「配列同一性」によって表される。本発明の目的のため、２つのアミノ酸配列同士の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）（好ましくはバージョン５．０．０以降）のＮｅｅｄｌｅプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて決定する。用いるパラメータは、ギャップオープンペナルティー：１０、ギャップ伸張ペナルティー：０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力は、同一性の割合（％）として用いられ、次のように計算される：
（同一残基×１００）／（アライメント長−アライメントにおける合計ギャップ数）
【００４９】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列同士の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，前掲）（好ましくはバージョン５．０．０以降）のＮｅｅｄｌｅプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，前掲）を用いて決定する。用いるパラメータは、ギャップオープンペナルティー：１０、ギャップ伸長ペナルティー：０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力は、同一性の割合（％）として用いられ、次のように計算される：
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アライメント長−アライメントにおける合計ギャップ数）
【００５０】
本発明は、糸状真菌細胞の選択的オートファジー系が、部分的又は完全に不活性化されている遺伝子改変糸状真菌宿主細胞、そのような遺伝子改変糸状真菌細胞を作製する方法、及びそのような改変糸状真菌細胞において目的の生物由来物質を生産する方法を提供する。
【００５１】
糸状真菌細胞の選択的オートファジー系は、選択的オートファジー経路における特定の遺伝子／タンパク質の欠失又は破壊によって（部分的又は完全に）不活性化させることができる。特定の実施形態では、糸状真菌細胞における選択的オートファジー系の不活性化は、糸状真菌細胞に存在する内在性ａｔｇ１１活性を欠失させるか、又は破壊することによって達成することができる。別の実施形態では、糸状真菌細胞における選択的オートファジー系の不活性化は、糸状真菌細胞の選択的オートファジー経路においてａｔｇ１１活性と直接又は間接的に関与する糸状真菌細胞の選択的オートファジー経路の１つ又は複数の遺伝子／タンパク質を欠失させるか、又は破壊することによって達成することができる。
【００５２】
本発明は、破壊又は欠失したａｔｇ１１活性を含む遺伝子改変糸状真菌宿主細胞、そのような遺伝子改変糸状真菌細胞を作製する方法、及びそのような改変糸状真菌細胞において目的の生物由来物質を生産する方法を提供する。
【００５３】
本発明によれば、内在性ａｔｇ１１遺伝子を破壊するか、又は欠失させて、その結果、ａｔｇ１１活性を有するポリペプチドを全く産生しないか、その産生が低減した改変糸状真菌細胞を得ることによって、改変糸状真菌細胞を取得する。作出されたａｔｇ１１欠失突然変異型細胞は、相同性若しくは異種ポリペプチド又は一次若しくは二次代謝物などの相同性及び／又は異種発現産物を発現させるための宿主細胞として特に有用である。従って、本発明はさらに、相同性又は異種産物を生産する方法であって、（ａ）産物の生産に好都合な条件下で改変真菌細胞を培養するステップ；及び（ｂ）産物を回収するステップを含む方法にも関する。
【００５４】
ａｔｇ１１活性が低減した株の構築は、細胞におけるａｔｇ１１ポリペプチドの発現に必要な核酸配列の修飾又は不活性化により、好都合に達成することができる。修飾又は不活性化しようとする核酸配列は、例えば、ａｔｇ１１活性を発揮するのに不可欠なポリペプチド又はその一部をコード化する核酸配列、例えば、配列番号１の核酸配列若しくはその一部、又は該核酸配列のコード配列からのポリペプチドの発現に必要な調節機能を有し得る核酸配列であってよい。こうした調節若しくは制御配列の例として、プロモータ配列、又はその機能性部分、すなわち、ポリペプチドの発現に作用するのに十分な部分が挙げられる。考えられる修飾のための他の制御配列は、このセクションに詳しく記載する。
【００５５】
核酸配列の修飾又は不活性化は、細胞を突然変異誘発に付し、ａｔｇ１１活性が低減又は排除された細胞を選択又はスクリーニングすることによって実施することができる。突然変異誘発（特異的又はランダムのいずれでもよい）は、例えば、好適な物理的若しくは化学的突然変異誘発因子の使用、好適なオリゴヌクレオチドの使用によるか、又はＰＣＲによる突然変異誘発にＤＮＡ配列を付すことによって実施してよい。さらに、突然変異誘発は、これらの突然変異誘発因子の任意の組み合わせを用いて実施することもできる。
【００５６】
本発明の目的に好適な物理的又は化学的突然変異誘発因子の例としては、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、硝酸、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、重硫酸ナトリウム、ギ酸、及びヌクレオチド類似体が挙げられる。こうした因子を用いる場合、突然変異誘発は、典型的に、突然変異誘発させようとする細胞を、好適な条件下、最適な突然変異誘発因子の存在下でインキュベートした後、ａｔｇ１１活性又は生産の低減を示す細胞を選択することにより実施する。
【００５７】
真菌細胞のａｔｇ１１活性の生産の改変又は不活性化は、特に、該ポリペプチド又はその転写若しくは翻訳に必要な調節エレメントをコードする核酸配列における１つ又は複数のヌクレオチドの導入、置換、若しくは除去によって達成することができる。例えば、停止コドンの導入、開始コドンの除去、若しくはオープンリーディングフレームの変化をもたらすように、ヌクレオチドを挿入又は除去してよい。こうした改変又は不活性化は、当分野では公知の方法に従い、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲによる突然変異誘発によって達成することができる。原則として、改変はｉｎ  ｖｉｖｏ、すなわち、改変しようとする核酸配列に対して直接実施することもできるが、以下に例示するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで改変を実施するのが好ましい。
【００５８】
ａｔｇ１１活性を排除又は低減する好都合な方法の一例は、遺伝子置換又は遺伝子分断の技術に基づくものである。例えば、遺伝子分断法では、目的の内在性遺伝子又は遺伝子断片に対応する核酸配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏで突然変異させることにより、欠損核酸配列を作製し、次にこれを宿主細胞に形質転換することにより、欠損遺伝子を作製する。相同的組換えにより、欠損核酸配列が内在性遺伝子又は遺伝子断片に代わる。欠損遺伝子又は遺伝子断片がマーカをコード化することも望ましく、このマーカは、ポリペプチドをコード化する遺伝子が修飾又は破壊された形質転換体の選択に用いることができる。標的遺伝子を欠失させる、又は破壊するための方法は、例えば、以下により記載されている：Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ（１９８５．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１７１４−１７２１）；国際公開第９０／００１９２号パンフレット；Ｍａｙ，Ｇ．（１９９２．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ．Ｊ．Ｒ．Ｋｉｎｇｈｏｒｎ  ａｎｄ  Ｇ．Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｉｅ  ａｃａｄｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，ｐｐ．１−２５）；及びＴｕｒｎｅｒ，Ｇ．（１９９４．Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｓ．Ｄ．Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｋｉｎｇｈｏｒｎ，ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ｐｐ．６４１−６６５）。
【００５９】
あるいは、核酸配列の改変又は不活性化は、ａｔｇ１１ポリペプチドコード化配列と相補的なヌクレオチド配列を用い、確立されたアンチセンス技術により実施することができる。アンチセンス技術及びその応用については、例えば、米国特許第５，１９０，９３１号明細書に記載されている。
【００６０】
ａｔｇ１１活性の改変のための前記方法を、選択的オートファジー経路の他の成分を改変するのに適用してもよい。
【００６１】
本発明はさらに、親細胞の改変真菌細胞にも関し、この細胞は、ａｔｇ１１タンパク質をコード化する核酸配列若しくはその制御配列の破壊又は欠失を含み、これによって、親細胞により、ａｔｇ１１タンパク質の産生が低減した突然変異細胞が得られる。遺伝子改変により、真菌宿主細胞が、ａｔｇ１１活性を全く含まないか、あるいは、低減したａｔｇ１１活性を有するように、例えば、宿主細胞により発現されるａｔｇ１１活性のレベルが、個別に約５０％超、好ましくは約８５％超、約９０％超、約９５％超、約９８％超、または約９９％超低減されるように、糸状真菌宿主細胞のａｔｇ１１活性は欠失しているか、又は破壊されている。ａｔｇ１１活性の有効な欠失又は破壊は、改変真菌宿主細胞が、目的の生物由来物質、例えば、目的のポリペプチドの収量を増加したかどうかを測定することによって評価することができる。
【００６２】
一態様において、本発明は、目的の異種ポリペプチドをコード化する核酸配列を含む糸状真菌宿主細胞において、目的のポリペプチドを生産する方法を提供し、本方法は、ａｔｇ１１欠失宿主細胞に、目的のポリペプチドをコード化する核酸配列を導入するステップ、好適な増殖培地で宿主細胞を培養するステップ、続いて、タンパク質産物を回収するステップを含む。宿主細胞は、要望される目的のポリペプチドの発現に必要な構造及び調節遺伝子領域を含む。こうした構造及び調節領域の性質は、該当するポリペプチド及び宿主細胞に大きく依存する。本発明の宿主細胞の遺伝子設計は、宿主細胞の形質転換又はトランスフェクションのための標準的組換えＤＮＡ技術を用いて、当業者により達成され得る（例えば、中でもＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）。好ましくは、宿主細胞は、適切なクローニング用ビヒクル、すなわち要望されるタンパク質産物をコード化するＤＮＡ断片を含むプラスミド又はベクターの導入のための当分野では公知の方法により改変する。クローニング用ビヒクルは、自律的に複製するプラスミドとして宿主細胞に導入してもよいし、又は染色体に組み込んでもよい。好ましくは、クローニング用ビヒクルは、１つ又は複数の適切な調節領域に作動可能に連結した１つ又は複数の構造領域を含む。
【００６３】
本発明の実施形態では、例えば、ａｔｇ１１活性の欠失又は破壊により、（部分的若しくは完全に）不活性化した選択的オートファジー経路を含む糸状真菌宿主細胞は、１つ又は複数の内在性プロテアーゼの発現が低減されているか、又は完全に排除されたプロテアーゼ欠失又はプロテアーゼ欠損株であってもよい。特定の実施形態では、親株は、国際公開第００／３９３２２号パンフレット、実施例１に記載のプロテアーゼ欠失アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）株ＢＥＣｈ２であってもよく、これは、国際公開第９８／１２３００号パンフレット、実施例１に記載のＪａＬ２２８にも関連する。この株は、アルカリプロテアーゼＡｌｐと中性メタロプロテアーゼＮｐｌを欠失している。他の修飾は、ＰｅｐＣと称するスブチリシンタイプのセリンプロテアーゼの破壊又は欠失を含んでもよく、任意選択で、カルシウム依存性、中性、セリンプロテアーゼ、ＫｅｘＢを欠失している。
【００６４】
本発明の一実施形態では、生物由来物質（例えば、目的のポリペプチド）の発現及び／又は分泌を増大するように、真菌宿主細胞に他の改変を施すことが望ましい場合もある。例えば、目的のポリペプチドの分泌を増大するのに有益な真菌細胞中の他のタンパク質の存在を増大するように、宿主細胞を改変してもよい。本発明の具体的実施形態では、糸状真菌宿主細胞中のＵＰＲ調節タンパク質の存在を増大するように、糸状真菌宿主細胞を改変する。別の実施形態では、糸状真菌宿主細胞中のｈａｃ１  ＵＰＲ調節タンパク質（スプライス済み（例えば、ｈａｃＡｉ）及び非スプライスバージョンを含む）及び／又はｉｒｅ１  ＵＰＲ調節タンパク質の存在を増大するように、糸状真菌宿主細胞を改変する。例えば、以下を参照されたい：Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，ＩＲＥ１−  ａｎｄ  ＨＡＣ１−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｆｏｌｄｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４９（３）：５９１−６０６，２００３；Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  Ｕｎｆｏｌｄｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，”Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．３９１−４０４，Ｎｏｖ．１９９６；Ｃｌａｒｋｅ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  Ｕｎｆｏｌｄｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  Ｉｒｅ１Ｐ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈ．Ｓｕｐｐｌ．，Ｎｏ．１９Ｂ，ｐ．２０９，１９９５；Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＡＣ１−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ．，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７（４）：１１４９−６１，２００３；及びＡｒｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＨａｃＡ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  ｂｉｐＡ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  Ｓｔｒａｉｎｓ  Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＰｒｏｔｅｉｎｓＡｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００６  Ｊａｎｕａｒｙ；７２（１）：９５３−９５５。
【００６５】
本発明の改変糸状真菌宿主細胞は、改変糸状真菌宿主細胞が、ａｔｇ１１活性の欠失又は破壊を含み、しかも、目的のポリペプチドを含む発現ベクターで形質転換されている、異種ポリペプチドの発現にとりわけ有用である。破壊又は欠失したａｔｇ１１活性と、目的の異種ポリペプチドをコード化する核酸配列とを含む糸状真菌宿主細胞を培養して、目的のポリペプチドを生産することができる。用いる培養ブロス又は培地は、本発明の宿主細胞を培養するのに好適な任意の慣用培地であってよく、従来技術の原則に従って調製することができる。培地は、炭素及び窒素源、並びに他の無機塩を含有するのが好ましい。例えば、最少又は複合培地などの好適な培地は、供給業者から入手可能であり、あるいは、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｍｄ．，ＵＳＡ．１９７０により公開されたＴｈｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓのような公開レシピに従って調製することもできる。
【００６６】
発酵に好適なｐＨは、多くの場合、使用する宿主細胞の性質、増殖培地の組成、目的のポリペプチドの安定性などの要因に依存し得る。そのため、本発明の宿主細胞は、任意のｐＨで実施する任意の発酵工程を用いて培養してよいが、発酵工程のｐＨは、宿主細胞の酸性及び／又は中性プロテアーゼ活性が、ほぼ排除されるか、又は少なくとも有意に低減するようなものであることが有利である。従って、国際公開第９０／００１９２号パンフレットに記載のようなアスパラギン酸プロテアーゼ活性の除去は、発酵ｐＨを上昇させることによっても達成し得るが、これは、アルカリ性ｐＨ範囲で培養した宿主細胞からの要望されるタンパク質の収量に、それ以外の有利な作用を一切もたらさない。
【００６７】
発酵工程のｐＨが、５〜１１、例えば、６〜１０．５、７〜１０、又は８〜９．５の範囲内であれば、ｐＨ範囲が７を超える酸性プロテアーゼ、例えば、アスパラギン酸及びセリンプロテアーゼ、並びに中性プロテアーゼの活性は低減されるか、又はブロックされる。
【００６８】
アルカリ発酵条件下で生産される酵素の例としては、エンドグルカナーゼ、フィターゼ及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼが挙げられる。しかし、アルカリｐＨ範囲は、非修飾宿主細胞におけるアルカリプロテアーゼ活性を支持し、これは、潜在的に目的のポリペプチド産物の分解も引き起こし得る。その結果、このような場合、アルカリプロテアーゼをコード化する遺伝子の不活性化は、特に有利である。本発明のアルカリプロテアーゼ遺伝子の不活性化は、酸性、中性及びアルカリプロテアーゼ活性が、種によって変動するため、特定の細胞については特に有利である。
【００６９】
培養後、目的とする要望されるポリペプチドを、培養ブロスからのタンパク質単離及び精製の慣用的方法で回収するか、又は培養ブロスを用途に直接用いてもよい。十分に確立された精製手順は、遠心分離又は濾過により培地から細胞を分離するステップ、硫酸アンモニウムなどの塩を用いて、培地のタンパク質性成分を沈殿させるステップ、並びにイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー方法を含む。
【００７０】
本発明の特定の実施形態では、ａｔｇ１１活性の破壊又は欠失を適用して、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞を生産する。本発明のこの態様は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞の内在性ａｔｇ１１タンパク質活性の破壊又は欠失をさらに含む、目的の異種ポリペプチドをコード化する核酸配列を含むアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞を提供する。別の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、配列番号１に示す核酸配列によってコード化された、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するａｔｇ１１タンパク質の破壊又は欠失を含む。
【００７１】
また別の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、配列番号２と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列同一性を有するａｔｇ１１タンパク質の破壊又は欠失を含む。また別の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、配列番号２と少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列同一性を有するａｔｇ１１タンパク質の破壊又は欠失を含む。また別の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、配列番号２と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列同一性を有するａｔｇ１１タンパク質の破壊又は欠失を含む。また別の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列同一性を有するａｔｇ１１タンパク質の破壊又は欠失を含む。また別の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列同一性を有するａｔｇ１１タンパク質の破壊又は欠失を含む。また別の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列同一性を有するａｔｇ１１タンパク質の破壊又は欠失を含む。また別の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、配列番号２と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列同一性を有するａｔｇ１１タンパク質の破壊又は欠失を含む。また別の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、配列番号２と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列同一性を有するａｔｇ１１タンパク質の破壊又は欠失を含む。
【００７２】
また別の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、配列番号１と少なくとも５０％同一である配列同一性を有するａｔｇ１１遺伝子の破壊又は欠失を含む。また別の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、配列番号１と少なくとも６０％同一である配列同一性を有するａｔｇ１１遺伝子の破壊又は欠失を含む。また別の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、配列番号１と少なくとも７０％同一である配列同一性を有するａｔｇ１１遺伝子の破壊又は欠失を含む。また別の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、配列番号１と少なくとも８０％同一である配列同一性を有するａｔｇ１１遺伝子の破壊又は欠失を含む。また別の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、配列番号１と少なくとも９０％同一である配列同一性を有するａｔｇ１１遺伝子の破壊又は欠失を含む。また別の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、配列番号１と少なくとも９５％同一である配列同一性を有するａｔｇ１１遺伝子の破壊又は欠失を含む。また別の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、配列番号１と少なくとも９８％同一である配列同一性を有するａｔｇ１１遺伝子の破壊又は欠失を含む。また別の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、配列番号１と少なくとも９９％同一である配列同一性を有するａｔｇ１１遺伝子の破壊又は欠失を含む。
【００７３】
特定の実施形態では、ａｔｇ１１活性の破壊又は欠失を適用して、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）宿主細胞において異種酵素を生産する。本発明のこの態様は、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）宿主細胞の内在性ａｔｇ１１タンパク質の破壊又は欠失をさらに含む、目的の異種ポリペプチドをコード化する核酸配列を含むアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）宿主細胞を提供する。
【００７４】
また別の実施形態では、ａｔｇ１１活性の破壊又は欠失を適用して、例えば、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）細胞などのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属宿主細胞において異種酵素を生産する。本発明のこの態様は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属宿主細胞の内在性ａｔｇ１１タンパク質の破壊又は欠失をさらに含む目的の異種ポリペプチドをコード化する核酸配列を含むトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属宿主細胞を提供する。
【００７５】
改変された糸状真菌細胞（例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）若しくはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属宿主細胞）において生産され得る目的の異種ポリペプチドとしては、酵素、例えば、以下：ペプチダーゼ（カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、プロテアーゼ）、アミラーゼ（例えば、α−アミラーゼ又はグルコアミラーゼ）、プルラナーゼカルボヒドラーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、エンド−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーセ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、及びキシラナーゼから成る群から選択される酵素などが挙げられる。
【００７６】
特定の実施形態では、酵素は、α−アミラーゼである。別の特定の実施形態では、酵素は、グルコアミラーゼである。別の特定の実施形態では、酵素は、フィターゼである。
【００７７】
ａｔｇ１１遺伝子の破壊又は欠失によって、ａｔｇ１１遺伝子の破壊又は欠失を含まない同一宿主と比較して、同じ時間量で、目的のポリペプチドの収量を増加する。
【００７８】
当業者が、本明細書をより明瞭に理解し、かつ実施することができるように、以下の調製物及び実施例を記載する。これらは、本発明の範囲及び／又は精神を限定するものとしてではなく、あくまで本発明を例示し、それらを代表するものとみなすべきである。
【００７９】
材料及び方法
別に指摘のない限り、ＤＮＡ操作及び形質転換は、以下に記載されているような分子生物学の標準的方法を用いて実施した：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ，Ｓ．Ｍ．（ｅｄｓ．）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ”．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９０。
【００８０】
購入した材料（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びキット）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５−α（Ｔｏｙｏｂｏ）をプラスミド構築及び増幅に用いる。増幅したプラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で回収する。連結は、ＤＮＡ連結キット（Ｔａｋａｒａ）又はＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で実施する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Ｅｘｐａｎｄ  ＴＭ  ＰＣＲシステム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて実施する。ＰＣＲ断片の精製及びアガロースゲルからのＤＮＡ断片の抽出のために、ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いる。
【００８１】
プラスミド
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ♯２１２２０６）
アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモータ（Ｐｇｐｄ）及びアスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリプトファンシンターゼターミネータ（ＴｔｒｐＣ）により駆動される、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｐｙｒＧ遺伝子及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）を保有するｐＨＵｄａ８０１が、国際公開第２０１２／１６００９３号パンフレットの実施例４に記載されている。
【００８２】
目的のアミログルコシダーゼを保有するｐＰＥ００１は、欧州特許第１２１９１号明細書に記載されている。
【００８３】
酵素遺伝子の発現のベクター用のプラスミドｐＲｉｋａ１４７は、国際公開第２０１２／１６００９３号パンフレットの実施例９に記載されている。
【００８４】
遺伝子
Ａｔｇ１１（ＤＳＭゲノムデータベースＩＤ；Ａｎ０２ｇ０７３８０）
【００８５】
微生物株
表現型：ｐｙｒＧ−表現型／ウリジン栄養要求性を有するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）発現宿主細胞を用いた。
【００８６】
ＭＳＳは、７０ｇのスクロース、１００ｇのダイズ粉末、３滴のプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）消泡剤、及び１リットルまでの脱イオン水から構成され、ｐＨは６．０に調整した。
【００８７】
ＭＵ１は、２６０ｇのマルトデキストリン、３ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、６ｇのＫ２ＳＯ４、５ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｍｌのＡＭＧ金属溶液、３滴のプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）消泡剤、及び１リットルまでの脱イオン水から構成され、ｐＨは４．５に調整した。
【００８８】
ＡＭＧ金属溶液は、０．３ｇのクエン酸・Ｈ２Ｏ、０．６８ｇのＺｎＣｌ２、０．２５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０２４ｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．３９ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３５６ｇのＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ及び１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【００８９】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の形質転換
親アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞の形質転換は、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｔｒｐＣ  ｐｌａｓｍｉｄ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９８４  Ｍａｒ；８１（５）：１４７０−４に記載されているように、糸状真菌での形質転換のための公知の一般的方法を用いて、以下のように達成した。
【００９０】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞株は、該宿主細胞がｐｙｒＧ欠失突然変異体である場合、１０ｍＭウリジンを補充した１００ｍｌのＹＰＧ培地に接種し、３２℃、８０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。ペレットを回収し、０．６Ｍ  ＫＣｌで洗浄した後、ｍｌ当たり２０ｍｇの最終濃度で、市販のβ−グルカナーゼ製剤（ＧＬＵＣＡＮＥＸ（商標），Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有する２０ｍｌの０．６Ｍ  ＫＣｌに再懸濁させた。プロトプラストが形成されるまで、懸濁液を３２℃、８０ｒｐｍでインキュベートしてから、ＳＴＣバッファーで２回洗浄した。血球計数器でプロトプラストを係数した後、２．５×１０7プロトプラスト／ｍｌの最終濃度まで、ＳＴＣ：ＳＴＰＣ：ＤＭＳＯの８：２：０．１溶液で調節した。約４μｇのプラスミドＤＮＡを１００μｌのプロトプラスト懸濁液に添加し、穏やかに混合した後、３０分氷上でインキュベートした。１ｍｌのＳＰＴＣを添加し、プロトプラスト懸濁液を３７℃で２０分インキュベートした。１Ｍスクロースなどの浸透性安定剤と、低融点アガロースとを含有する５０℃の浸透性上層アガロースを１０ｍｌ添加した後、混合物を、浸透性安定剤含有の最少培地（例えば、窒素源として３ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムを補充したＣＯＶＥ  １９６６に記載の最少培地）に注ぎ込み、プレートを３２℃で５日間インキュベートした。
【００９１】
培地の成分は、以下の通りである；
ＹＰＧ培地は、１５ｇのグルコース、４ｇの酵母エキス、１ｇのＫ２ＨＰＯ４、０．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び１リットルまでの脱イオン水から構成された（ｐＨ５．７）。
【００９２】
ＣＯＶＥ微量金属溶液は、０．０４ｇのＮａＢ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、０．４ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．２ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．７ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．８ｇのＮａ２ＭｏＯ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【００９３】
５０×ＣＯＶＥＡ塩溶液は、２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、７６ｇのＫＨ２ＰＯ４、５０ｍｌのＣＯＶＥ微量金属溶液、及び１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【００９４】
ＣＯＶＥ培地は、３４２．３ｇのスクロース、２０ｍｌの５０×ＣＯＶＥ塩溶液、１０ｍｌの１Ｍアセトアミド、１０ｍｌの１．５Ｍ  ＣｓＣｌ２、及び２５ｇのノーブル（Ｎｏｂｌｅ）寒天、及び１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【００９５】
ＣＯＶＥ−Ｎ（ｔｆ）は、３４２．３ｇのスクロース、３ｇのＮａＮＯ３、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、３０ｇのノーブル（Ｎｏｂｌｅ）寒天、及び１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【００９６】
ＣＯＶＥ−Ｎ上層アガロースは、３４２．３ｇのスクロース、３ｇのＮａＮＯ３、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、１０ｇの低融点アガロース、及び１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【００９７】
ＣＯＶＥ−Ｎは、３０ｇのスクロース、３ｇのＮａＮＯ３、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、３０ｇのノーブル（Ｎｏｂｌｅ）寒天、及び１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【００９８】
ＳＴＣバッファーは、０．８Ｍソルビトール、２５ｍＭトリスｐＨ８、及び２５ｍＭ  ＣａＣｌ２から構成された。
【００９９】
ＳＴＰＣバッファーは、ＳＴＣバッファー中の４０％ＰＥＧ４０００から構成された。
【０１００】
Ｄ．Ｊ．Ｃｏｖｅ，“Ｔｈｅ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉｔｒａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｕｓ  Ａｓｐｇｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｎｉｄｕａｌａｎｓ，”Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｃａ  ＡＣＴＡ，（１９６６）５１−５６。
【０１０１】
ＰＣＲ増幅
５×ＰＣＲバッファー（ＭｇＣｌ2を含む）                 ２０μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス                            １０μｌ
フォワードプライマー（１００μＭ）                      １μｌ
リバースプライマー（１００μＭ）                        １μｌ
エキスパンドハイフィデリティ（Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）                                      １μｌ
鋳型ＤＮＡ（５０〜１００ｎｇ／μｌ）                    １μｌ
蒸留水                                                  １００μｌまで
【０１０２】
【表１】
2019122386.tif 000002
【０１０３】
グルコアミラーゼ生産のための実験室規模タンク培養
発酵は、フェドバッチ発酵として実施した（Ｈ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｔｃｈ，ｃｈｅｍｏｓｔａｔ  ａｎｄ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ａｎ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｍａｒ；５３（３）：２７２−７，２０００）。選択した株を液体培地中に前培養した後、増殖した菌糸体をタンクに移し、酵素生産のためにさらに培養する。培養は、グルコース及びアンモニウムを供給しながら、しかし、酵素生産を阻止するような過剰投与はせずに、３４Ｃ、ｐＨ４．５で７日間実施した。酵素アッセイのために遠心分離後培養上清を用いた。
【０１０４】
サザンハイブリダイゼーション
選択した形質転換体の菌糸体を１００ｍｌのＹＰＧ培地中で一晩の培養物から採取し、蒸留水ですすぎ、乾燥させた後、−８０℃で凍結した。粉砕した菌糸体をプロテイナーゼＫ及びＲＮａｓｅＡと一緒に６５℃で１時間インキュベートした。２回のフェノール／ＣＨＣｌ３抽出によりゲノムＤＮＡを回収した後、ＥｔＯＨ沈殿させ、蒸留水で再懸濁させた。製造業者の指示に従い、ＰＣＲ  ＤＩＧプローブ合成キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ  ＩＮ）を用いて、非放射性プローブを合成した。製造業者の指示に従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、ＤＩＧ標識プローブをゲル精製した。
【０１０５】
５マイクログラムのゲノムＤＮＡを適切な制限酵素で１６時間消化した（総量４０μｌ、４Ｕ酵素／μｌＤＮＡ）後、０．８％アガロースゲル上に流し込んだ。０．２Ｍ  ＨＣｌを用いた処理によりＤＮＡをゲル中に断片化し、変性させ（０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）、中和した（１Ｍトリス、ｐＨ７．５；１．５Ｍ  ＮａＣｌ）後、２０×ＳＳＣ中でＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。ＤＮＡを上記の膜にＵＶ架橋させ、２０ｍｌのＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で４２℃にて１時間プレハイブリダイズした。変性したプローブをＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂバッファーに直接添加し、４２℃で一晩のハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後の洗浄（２×ＳＳＣ中室温で５分を２回、０．１×ＳＳＣ中６８℃で１５分を２回）に続いて、製造業者のプロトコルに従って、ＤＩＧ検出システム及びＣＰＤ−Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた化学発光検出を実施した。標準マーカには、ＤＩＧ標識ＤＮＡ分子量マーカ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ）ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。
【０１０６】
グルコアミラーゼ活性
ＡｍｙｌｏＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ単位（ＡＧＵ）でグルコアミラーゼ活性を測定した。ＡＧＵは、３７℃、ｐＨ４．３、基質：マルトース２３．２ｍＭ、バッファー：酢酸塩０．１Ｍ、反応時間５分の標準的条件下で毎分１マイクロモルのマルトースとハイブリダイズする酵素の量として定義される。自動分析装置を用いてもよい。存在する全てのα−Ｄ−グルコースがβ−Ｄ−グルコースに転化するように、ムタロターゼをグルコースデヒドロゲナーゼ試薬に添加した。グルコースデヒドロゲナーゼは、前述した反応において、β−Ｄ−グルコースと特異的に反応し、ＮＡＤＨを形成するが、これは、元のグルコース濃度の尺度として、光度計を用いて３４０ｎｍで決定される。
【０１０７】
アミノグリコシダーゼインキュベーション：
基質：                              マルトース２３．２ｍＭ
バッファー：                        酢酸塩０．１Ｍ
ｐＨ：                              ４．３０±０．０５
インキュベーション温度：            ３７℃±１
反応時間：                          ５分
酵素作用範囲：                      ０．５〜４．０  ＡＧＵ／ｍＬ
【０１０８】
発色反応：
ＧｌｕｃＤＨ：                      ４３０Ｕ／Ｌ
ムタロターゼ：                      ９Ｕ／Ｌ
ＮＡＤ：                            ０．２１ｍＭ
バッファー：                        リン酸塩０．１２Ｍ；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ
ｐＨ：                              ７．６０±０．０５
インキュベーション温度：            ３７℃±１
反応時間：                          ５分
波長：                              ３４０ｎｍ
【０１０９】
実施例１：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）におけるａｔｇ１１遺伝子の破壊
ａｔｇ１１遺伝子破壊プラスミドｐＨＵｄａ１４９３の構築
ＸｂａＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位をそれぞれ導入する次のプライマー３ａｔｇ１１Ｆ及び３ａｔｇ１１Ｒを、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ゲノムＤＮＡデータベースＡｎ０２ｇ０７３８０のヌクレオチド配列情報に基づいて、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｔｇ１１遺伝子のａｔｇ１１開始コドンから＋２６８００〜＋４７７０の位置で３’フランキング領域を単離するためにデザインされた。
３ａｔｇ１１Ｆ：ａｃｔａｇｔｔｃｔａｇａｇｔｔｇａｇａｃａｔｔｇｇｃｔｃｇｔ（配列番号３）
３ａｔｇ１１Ｒ：ｇａａｔｔｃｇｃｔａｇｃｃｇｔｃｃａｇａｇａｃｃｔａｇｇｇ（配列番号４）
【０１１０】
３ａｔｇ１１Ｆ及び３ａｔｇ１１Ｒのプライマーペアを用いて、鋳型としてのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株のゲノムＤＮＡのＰＣＲ反応を実施した。反応産物を１．０％アガロースゲル上で単離し、２．０ｋｂ産物バンドをゲルから切除した。２．０ｋｂ増幅ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化し、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化したｐＨＵｄａ８０１に連結することにより、ｐＨＵｄａ１４９２を作出した。
【０１１１】
ＮｏｔＩ部位及びＳｐｅＩ部位をそれぞれ導入する次のプライマー５ａｔｇ１１Ｆ及び５ａｔｇ１１Ｒを、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ゲノムＤＮＡデータベースＡｎ０２ｇ０７３８０のヌクレオチド配列情報に基づいて、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｔｇ１１遺伝子のａｔｇ開始コドンから−１９７０〜−１０の位置で５’フランキング領域を単離するように設計した。
５ａｔｇ１１Ｆ：ｇｃｇｇｃｃｇｃｇｇｔｃｇｇｃｇｔｔｃｇａａｇｇ（配列番号５）
５ａｔｇ１１Ｒ：ｔａｃｔａｇｔｇｇｇｇｇｔａｔｃｇａａｇｔｃｔｔｃｇｇｇｇｃ（配列番号６）
【０１１２】
５ａｔｇ１１Ｆ及び５ａｔｇ１１Ｒのプライマーペアを用いて、鋳型としてのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株のゲノムＤＮＡのＰＣＲ反応を実施した。反応産物を１．０％アガロースゲル上で単離し、２．０ｋｂ産物バンドをゲルから切除した。２．０ｋｂ増幅ＤＮＡ断片をＮｏｔＩ及びＳｐｅＩで消化し、ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩで消化したｐＨＵｄａ１４９２に連結することにより、ｐＨＵｄａ１４９３を作出した。
【０１１３】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）親株におけるａｔｇ１１遺伝子の破壊
Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｔｒｐＣ  ｐｌａｓｍｉｄ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９８４  Ｍａｒ；８１（５）：１４７０−４）に記載されているように、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）形質転換の標準的方法を用いて、ｐＨＵｄａ１４９３をアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）親株に導入した。ランダムに選択した形質転換体を、２．５μＭの５−フルオロ−２−デオキシウリジン（ＦｄＵ）、すなわち、ｐＨＵｄａ１４９３を保有する単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）を発現する細胞を死滅させる薬剤を含む最少培地プレートに接種した。２．５μＭのＦｄＵを含むこのようなプレート上でよく増殖する株を精製し、ａｔｇ１１遺伝子が正しく破壊されたどうかを確認するために、サザンブロッティング分析に付した。
【０１１４】
非放射性プローブを作製するための次のプライマーのセットを用いて、以下に記載する選択された形質転換体を分析した。これにより、３’ａｔｇ１１フランキング領域用のプローブ；フォワードプライマー：ｔｇｇｃｔｃｇｔｃａｇｔｃｔｇａａｇａ、リバースプライマー：ｔａｃａｃｇｃｔｔｇａｃｇａｃｃｇｃｇｔを作製する。
【０１１５】
選択された形質転換体から抽出したゲノムＤＮＡをＳｐｅＩにより消化した。正しい遺伝子破壊イベントによって、ＳｐｅＩ消化による１２．７ｋｂのサイズでのハイブリダイズシグナルは、前述したプローブ済みの５．９ｋｂへとシフトした。正しい組込みイベントが為された株の中から、株Ｈｕｄａ１４９３を選択した。
【０１１６】
実施例２：目的の遺伝子を含有するａｔｇ１１欠失組換え宿主細胞の生産
グルコアミラーゼ（ＡＭＧ）発現プラスミドｐＨＵｄａ１４７９の構築
プライマーＰＥ００１−Ｆ及びＰＥ００１−ＲをそれぞれＢａｍ  ＨＩ部位及びＰｍｌ  Ｉ部位に導入し、グルコアミラーゼ変異遺伝子を単離するように設計した。
ＰＥ００１−Ｆ：
ｃｇｇａｔｃｃａｃｃａｔｇｃｇｔｃｔｃａｃｔｃｔａｔｔａｔｃ（配列番号７）
ＰＥ００１−Ｒ：
ａｃｃａｃｇｔｇｔｃａａａａｃｔｇｃｃａｃａｃｇｔｃｇｔ（配列番号８）
【０１１７】
ＰＥ００１１Ｆ及びＰＥ００１Ｒのプライマーペアを用いて、鋳型としてのプラスミドｐＰＥ００１とのＰＣＲ反応を実施した。反応産物を１．０％アガロースゲル上で単離し、１．９ｋｂ産物バンドをゲルから切除した。１．９ｋｂ増幅ＤＮＡ断片をＢａｍ  ＨＩ及びＰｍｌＩで消化し、ＢａｍＨＩ及びＰｍｌＩで消化したｐＲｉｋａ１４７に連結することにより、ｐＨＵｄａ１４７９を作出した。
【０１１８】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）転写因子ｈａｃＡ発現プラスミド発現プラスミドｐＨＵｄａ１２９２の構築
文献（Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｈａｃＡ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ，ａｎｄ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｔｓ  ｏｗｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｍｕｌｄｅｒ  ＨＪ，Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ  Ｍ，Ｐｅｎｔｔｉｌａ  Ｍ，Ｍａｄｒｉｄ  ＳＭ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００４  Ｍａｒ；２７１（２）：１３０−４０．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｊａｎ  １７．）からの転写因子ｈａｃＡに関する配列情報に基づき、次のプライマーを作製した。
ｈａｃＡ１：ｔｔｔｇｃｔａｇｃｃｇａｃｇｇｇｇａｔｇｃｔｔｔｔｔｇｃ（配列番号９）
ｈａｃＡ２：ｃｔｔｃｃａｔｃａｔｇｇｔｇｇａｔｃｃｔｔｃａａｇｃｇｔｇａｃａｇ（配列番号１０）
ｈａｃＡ３：ｃｔｇｔｃａｃｇｃｔｔｇａａｇｇａｔｃｃａｃｃａｔｇａｔｇｇａａｇ（配列番号１１）
ｈａｃＡ４：ｃｃａｇｃｇａｃｇｇａｃａｃｔｇｃａｇｇａｔｇｔｔｇｔｇｔｃ（配列番号１２）
ｈａｃＡ５：ｇａｃａｃａａｃａｔｃｃｔｇｃａｇｔｇｔｃｃｇｔｃｇｃｔｇｇ（配列番号１３）
ｈａｃＡ６：ｔｔｃａｃｇｔｇａｔａａａａｔｔａｔａａｇｇａｔｔ（配列番号１４）
【０１１９】
ｈａｃＡ１及び２、ｈａｃＡ３及び４、並びにｈａｃＡ５及び６のプライマーペアを用いて、鋳型としてのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のゲノムＤＮＡとのＰＣＲ反応を実施した。反応産物を１．０％アガロースゲル上で単離して、１．３、０．７及び０．７ｋｂ産物バンドをゲルから切除した。これら３つの断片を混合し、ｈａｃＡ１及び６のプライマーペアを用いた２回目のＰＣＲ反応のために使用した。反応産物を１．０％アガロースゲル上で単離し、２．７ｋｂ産物バンドをゲルから切除した。２．７ｋｂ増幅ＤＮＡ断片をＮｈｅＩ及びＰｍｌＩで消化し、ＮｈｅＩ及びＰｍｌＩで消化したｐＲｉｋａ１４７に連結することにより、ｐＨＵｄａ１２９２を作出した。
【０１２０】
ｈｕｄａ１４９３のｐｙｒＧ遺伝子レスキュー
ｈｕｄａ１４９３のａｔｇ１１遺伝子座に導入したｐｙｒＧ遺伝子を以下のようにレスキューした。株ｈｕｄａ１４９３を、１０ｍＭウリジン及び１ｇ／Ｌの５−フルオロト酸（５−ＦＯＡ）を含有する最少培地にいったん接種した。ｐｙｒＧ遺伝子を欠失させた株を５−ＦＯＡの存在下で増殖させた；上記遺伝子を保持する株は、５−ＦＯＡを５−フルオロ−ＵＭＰ、すなわち毒性中間体に変換するであろう。急速に増殖したコロニーを単離した。単離した株をｈｕｄａ１４９３−３と名付けた。
【０１２１】
ａｔｇ１１遺伝子破壊株ｈｕｄａ１４９３−３におけるＡＭＧ及びｈａｃＡの共発現
ＡＭＧ及びｈａｃＡの改変された遺伝子コピーを有する株を作出するために、ｐＨＵｄａ１２９２及びｐＨＵｄａ１４７９を用いて、競合的遺伝子交換を実施した。
【０１２２】
ｐＨＵｄａ１２９２及びｐｈｕｄａ１４７９をアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株ｈｕｄａ１４９３−３及びその親株に同時導入した。形質転換体を、１％Ｄ−キシロース及び１０μｇ／ｍｌの５−フルオロシトシン（５ＦＣ）で補充した標準培地から選択した。ランダムに選択した形質転換体を、１０μｇ／ｍｌの５−フルオロシトシン（５ＦＣ）で補充した最少培地プレートに接種した。十分に増殖した株を精製した後、サザンブロッティング分析に付して、ｐｈｕｄａ１４７９のＡＭＧ遺伝子及びｐＨＵｄａ１２９２のｈａｃＡ遺伝子が、ＮＡ１、ＮＡ２、ＳＰ２８８又はＰＡＹ遺伝子座に正しく導入されたかどうかを確認した。
【０１２３】
非放射性プローブを作製するための次のプライマーセットを用いて、選択された形質転換体を分析した。
ＡＭＧコード領域については：
フォワードプライマー：ｔｔａｔａｃａｔｇｇａｃｔｃｇｔｇａｃｔ（配列番号１５）
リバースプライマー：ａｇａａｔｃａｃａｇｇｃａｔｃｇｃａｇｇ（配列番号１６）
ｈａｃＡコード領域については：
フォワードプライマー：ａｇａａｇａｇａａａｇｔｃａｔｇｇｇｇｃ（配列番号１７）
リバースプライマー：ａｇｇｇｃａｃｔｔｃｃｔｔｃｔｃｃｔｔｃ（配列番号１８）
【０１２４】
選択された形質転換体から抽出したゲノムＤＮＡをＳｐｅＩ及びＰｍｌＩにより消化した後、ＡＭＧコード領域でプローブした。正しい遺伝子導入イベントによって、ＳｐｅＩ及びＰｍｌＩ消化による６．９ｋｂ（ＮＡ１）、３．６ｋｂ（ＳＰ２８８）、４．９ｋｂ（ＮＡ２）及び５．８ｋｂ（ＰＡＹ）のサイズでのハイブリダイズシグナルは、前述のようにプローブ済みであるのが観測された。
【０１２５】
選択された形質転換体から抽出したゲノムＤＮＡをＳｐｈＩにより消化した後、ｈａｃＡコード領域でプローブした。正しい遺伝子導入イベントによって、ＳｐｈＩ消化による８．６ｋｂ（ＮＡ１）、４．２ｋｂ（ＳＰ２８８）、５．３ｋｂ（ＮＡ２）、３．９ｋｂ（ＰＡＹ）及び２．２ｋｂ（天然遺伝子）のサイズでのハイブリダイズシグナルが、前述のようにプローブ済みであるのが観測された。
【０１２６】
ＮＡ１及びＳＥ２８８遺伝子座にｐＨＵｄａ１４７９のＡＭＧ遺伝子を有し、ＮＡ２及びＰＡＹ遺伝子座にｐＨＵｄａ１２９２のｈａｃＡ遺伝子を有する３つの形質転換体をｈｕｄａ１４９３−３及び親株の両方から選択した。
【０１２７】
実施例３：酵素生産に対するａｔｇ１１遺伝子破壊の影響
２つの遺伝子座にＡＭＧ遺伝子を、また２つの遺伝子座に別のｈａｃＡ遺伝子を導入する、親由来の３つの株及びｈｕｄａ１４９３−３由来の他の３つの株を実験室サイズのタンクで発酵させ、前述した方法に従いその酵素活性（ＡＧＵ活性）を測定した；結果を以下の表に示す。
【０１２８】
【表２】
2019122386.tif 000003
【配列表】
2019122386000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月4日(2019.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状真菌細胞のａｔｇ１１活性の完全な不活性化を含む糸状真菌細胞であって、前記細胞が、目的の異種酵素をコードするヌクレオチドの配列と、前記糸状真菌細胞における前記異種酵素を生産するのに適したコントロール配列とを含む発現ベクターを含む、前記細胞。
【請求項２】
前記目的の異種酵素が、ペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、プルラナーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、エンドグルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、及びキシラナーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の糸状真菌細胞。
【請求項３】
ペプチダーゼが、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、及びプロテアーゼからなる群から選ばれるペプチダーゼである、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
前記目的の異種酵素が、グルコアミラーゼである、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
前記目的の異種酵素が、アミラーゼである、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
前記糸状真菌細胞が、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）属、ミセリオフトーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）属、及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の糸状真菌細胞。
【請求項７】
前記糸状真菌が、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）フザリウム・レティキュラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブチヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコセキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、及びトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）の細胞から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の糸状真菌細胞。
【請求項８】
前記糸状真菌細胞が、アスペルギルス細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の糸状真菌細胞。
【請求項９】
前記糸状真菌細胞が、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）又はアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
前記ａｔｇ１１遺伝子の上流又は下流調節配列の欠失又は破壊を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
前記ａｔｇ１１遺伝子の欠失又は破壊を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
前記ａｔｇ１１遺伝子の欠失を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
前記糸状真菌細胞が、糸状真菌宿主細胞のhac1 UPR調節タンパク質の存在を増大させるような改変をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記糸状真菌細胞が、糸状真菌宿主細胞のire1 UPR調節タンパク質の存在を増大させるような改変を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５】
目的の異種ポリペプチドを生産する方法であって、目的の異種ポリペプチドの発現を誘導するのに好都合な条件下で、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞を培養するステップを含む方法。
【請求項１６】
宿主細胞培地から前記目的のポリペプチドを回収するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【外国語明細書】
2019122386000001.pdf