(57)【要約】【課題】抗原特異的免疫細胞治療の実用化を実現するため、簡便性と安全性を兼ね備え、しかも低コストで効率よく大量に抗原特異的免疫細胞を好適に調製可能とする。【解決手段】細胞培養部となる凹部４が容器内壁面の一面に複数個凹設された培養容器１を用いて、凹部４に細胞を沈降させて目的細胞を調製する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血単核球と、抗原特異的ペプチド又は形質転換用ウイルスとの共培養により、抗原特異的免疫細胞を調製する細胞調製方法であって、
細胞培養部となる凹部が容器内壁面の一面に複数個凹設された培養容器を用いて、前記凹部に細胞を沈降させて目的細胞を調製することを特徴とする細胞調製方法。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｅ）の操作をいずれか一つ、又は二以上併用して行い、抗原特異的免疫細胞の増殖を促す請求項１に記載の細胞調製方法。
（ａ）抗原特異的ペプチドを追加する
（ｂ）抗ＣＤ３抗体を加える
（ｃ）抗ＰＤ−１抗体を加える
（ｄ）免疫チェックポイント分子、制御性Ｔ細胞の発現・代謝経路を阻害する又はＨＬＡ分子の発現を向上させる低分子阻害剤を添加する
（ｅ）免疫受容体を介して免疫を活性化する物質を加える
【請求項３】
請求項１又は２に記載の細胞調製方法に用いられる細胞培養容器であって、
ガス透過性を有するプラスチックフィルムからなる容器本体と注入出用ポートとを備え、
前記容器本体は、周辺部がシールされた膨出形状を有し、
前記容器本体の底面に、細胞培養部となる開口直径１．５ｍｍ以上の椀状凹部を複数設けたことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項４】
前記プラスチックフィルムの酸素透過度が、３０００ｍＬ／（ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）以上である請求項３に記載の細胞培養容器。
【請求項５】
前記椀状凹部は、開口面積よりも底部の面積が小さくなっている請求項３又は４に記載の細胞調製方法。
【請求項６】
前記椀状凹部は、断面Ｕ字形状である請求項５に記載の細胞調製方法。
【請求項７】
前記椀状凹部の直径ｒに対する深さｄの比ｄ／ｒが０．０５〜１である請求項３〜６のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、ウイルスや細菌、或いは、癌及びその他の免疫疾患に対して特異的な免疫応答を担っている免疫細胞を効率良く調製することができる細胞調製方法、及びそれに用いる細胞培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトの免疫系の解明が進むにつれて、免疫反応を利用して癌やウイルス感染症等の疾患を治療、予防する免疫療法への関心が高まってきている。特に、ウイルス特異的抗原、腫瘍特異的抗原が発見されて以来、新たな抗ウイルス、抗がん治療法として抗原特異的免疫療法の研究が進み、世界各国で臨床試験が行われている。そのなかで、自家又は他家同種抗原特異的免疫細胞及び抗原特異的遺伝子改変免疫細胞を用いた免疫細胞療法は、造血細胞移植後の日和見感染症、リンパ腫、メラノーマ、鼻咽頭癌、血液がん、自己免疫などの疾患に対して効果的な臨床データが蓄積されつつある。
【０００３】
抗原特異的免疫細胞療法は、最も進展の速い医療技術として、ここ二十数年の間、腫瘍浸潤細胞を用いたＴＩＬ療法、細胞傷害性Ｔ細胞を用いたＣＴＬ療法、ペルパーＴ細胞を用いたＨＴＬ療法、遺伝子改変免疫細胞を用いたＣＡＲ−Ｔ、ＣＡＲ−ＮＫ療法やＴＣＲ−Ｔ療法などが開発され、臨床試行されている。
【０００４】
従来のＬＡＫ療法、ＣＩＫ療法などをはじめとするいわゆる非特異的免疫細胞療法と異なり、抗原特異的免疫細胞療法のコア技術は、特異的な免疫応答を担っている免疫細胞のみを体外で効率良く誘導させ、又は形質転換させ、十分量に増殖させることにある。
【０００５】
例えば、ＣＴＬ療法やＨＴＬ療法では、患者から採取した患者自身の末梢血単核球から、抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）やヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）を誘導し、増殖させてから患者に輸注する。それを用いた多くの臨床試験では、患者に輸注する細胞数は、１回あたり1×１０７個以上が理想的である。このため、例えば、抗原特異的免疫細胞の存在比率が１０％の場合には、培養終了時の総細胞数は、少なくとも１×１０８個（数億個）以上が必要となる。そして、採血対象者の負担を軽減するために、一度の操作でより多くの抗原特異的免疫細胞を誘導し、増殖することが求められている。
【０００６】
しかし、末梢血には、抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）やヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）が、末梢血単核球画分の百分の一程度以下というごく僅かな頻度でしか存在せず、それを体外において大量に調製することは非常に困難である。
【０００７】
さらに、これらの抗原特異的免疫細胞の存在頻度は、個体別、抗原種類別、アリル別による偏りが認められる。例えば、造血幹細胞移植後の日和見感染症における治療標的の一つであるウイルス抗原ＨＣＭＶを例示する。アジア人に多いＨＬＡ-Ａ２４拘束性ＨＣＭＶ特異的ＣＴＬが末梢血中に含まれる数は、欧米人に多いＨＬＡ-Ａ２拘束性ＨＣＭＶ特異的ＣＴＬのそれに比べると百分の一程度である。これは、ＨＬＡ-Ａ２４拘束性ＨＣＭＶ特異的ＣＴＬの体外での誘導、増殖が困難であることの理由のひとつと考えられる。そのため、ＨＬＡ-Ａ２拘束性以外の特異的ＣＴＬについては、臨床応用に向けた体外での調製方法に関する報告はほとんどなされていない。
【０００８】
アジア圏では、平均寿命の延伸により、さらにウイルス感染者や癌患者が増加すると予想されおり、免疫細胞療法は、これまで以上に治療対象となるＨＬＡ型を多くすることが求められている。効率的かつ汎用的に抗原特異的免疫細胞を調製できないことは、臨床試験及び事業化に移行する際の律速ファクターになっている。
【０００９】
これまでに数多くの研究がなされたにもかかわらず、報告されている抗原特異的免疫細胞の調製方法は、以下に掲げた問題があるため、事業として応用されるまでには至っていない。
（１）抗原特異的免疫細胞を誘導させるために、例えば、抗原特異的ＣＴＬの場合、抗原提示細胞の調製を必要とする。抗原提示細胞としては、樹状細胞が使われることが多いが、樹状細胞の調製は煩雑で費用が嵩む。
（２）誘導した抗原特異的ＣＴＬをさらに増殖させる場合に、抗原提示細胞が使われる（非特許文献１参照）。そのため、上記（１）と同様の問題が生じる。また、増殖において使用する抗原提示細胞を調製するため、再度ドナーから採血する必要がある。さらに、増殖時には、誘導時に比べて多数の抗原提示細胞が必要となることからドナーにかかる負担が大きい。
（３）誘導した抗原特異的ＣＴＬをさらに増殖させる別の手段として、ＯＫＴ３やレクチンによる非特異的な刺激を用いることがある。しかし、この方法では、相対的に抗原特異的ＣＴＬ以外の細胞が増殖しやすいため効率性に欠ける。また、比較的に効率の良い増殖法としてＲＥＭ法が知られている。ＲＥＭ法は、大量の末梢血単核球と、ＥＢＶ−ＬＣＬを必要とすることから、ウイルスの混入といった大きな問題があるため、事業化において現実的な方法ではない。
【００１０】
このような状況の下に、本発明者らは、抗原特異的免疫細胞、特に、抗原特異的ＣＴＬによる細胞治療の実用化を実現するため、抗原提示細胞を調製することなく、末梢血単核球と抗原特異的ペプチド及び刺激物質とを共培養することで、迅速かつ簡便に、末梢血単核球から抗原特異的免疫細胞を誘導することができる調製方法を提案している。
【００１１】
また、これまで行われている抗原特異的免疫細胞の培養法は、複雑なステップを経るため、２４穴平面プレート（非特許文献２参照）、平板フラスコ（非特許文献３参照）、撹拌式培養槽（非特許文献４参照）などの開放系培養容器に頼らざるを得ない。
【００１２】
開放系培養容器を用いた際に、未解決の問題点が多く存在する。例えば、比較的効率の良い調製法としてＥＢＶ−ＬＣＬを用いた培養法を例として挙げる。この培養方法は、具体的には、ＥＢＶ−ＬＣＬ細胞を抗原ペプチドでパルスした後、Ｘ線(４０Ｇｙ)照射で不活化処理する。その後、採集した１×１０６個の末梢血単核球と４０：１の比率で混合し、２４穴平面プレートに播種する。その際、一穴あたり、最大２ｍＬの培地を添加する。細胞培養の期間中、ＥＢＶ−ＬＣＬ細胞による再刺激が必要になる際、又は培地が枯渇するたびに、何度も細胞を遠心回収し新鮮な培地に再懸濁し播種する必要がある。
【００１３】
抗原特異的免疫細胞の生育期、特に、増殖後期において、総細胞中の抗原特異的免疫細胞の割合が、誘導前期と比較してダイナミックに変化するため、必須栄養分及びサイトカインを適切な量でタイムリーにコントロールしなければならない。
【００１４】
そのため、開放系での培養は、頻繁に培地交換の作業が不可欠で、外部からの細菌、ウイルスなどの混入を防ぐため、細胞加工施設内で行う必要があり、莫大な設備費、管理費を要する。
【００１５】
通常、２４穴平面プレートで最終的に得られる細胞数は、１×１０７個以下である。複数枚のプレートでスケールアップしなければ、治療用に十分量な細胞数が得られない。さらに、平面プレートや平板フラスコのような培養容器は、容積の限界があり、細胞の大量調製には非常に不向きである。
【００１６】
さらに、平面プレートや平板フラスコのような通気性をもたないプラスチック培養容器では根本的に克服できない問題点がある。それは、効率的なガス交換と安定的な緩衝能の維持を同時に調整できないことである。これまでの研究報告では、抗原特異的免疫細胞の培養には、培地のガス交換率（Ｏ２／ＣＯ２）とｐＨ条件を厳密にコントロールすることが重要であることが明らかになっている（非特許文献５参照）。ガス交換を十分に確保するために、経験上１ｍＬ体積の培地に１ｃｍ２以上の表面積を保たなければならない。すなわち、細胞を覆う培地が浅いほど、ガス交換率が良い。その反面、細胞の代謝廃棄物である乳酸、二酸化炭素などの蓄積により、細胞を覆う培地が浅いほど、栄養分の供与能とｐＨ緩衝能が劣る傾向がある。このジレンマは平面プレートや平板フラスコのような通気性をもたないプラスチック培養容器では、とうてい克服できない。
【００１７】
一方で、ガス交換率を向上させるために、撹拌式培養槽が考案されている。しかし、撹拌子によって生じたずり応力が細胞にダメージを与えやすく、結果的に死細胞率を上昇させ、汎用的な培養容器にはならない。
【００１８】
また、上記の開放系培養容器のいくつかの問題点を解決しようとするために、近年、ＬＡＫ療法、ＣＩＫ療法などの非特異的免疫細胞の培養では、平面培養バッグを用いた閉鎖系培養システムが使われ始めている。しかし、このような平面培養バッグは抗原特異的免疫細胞に使用する場合、低い誘導効率および高い死細胞率が問題となる。
【００１９】
平面培養バッグのフィルム素材は非常に柔らかく、培養容器が傾斜して置かれた場合や、静置した際に生じるフィルムの歪み、さらには、周囲環境やインキュベータ由来の僅かな振動等により、収容物中の細胞が容器の一部や周縁付近に集中し、細胞同士が物理的に衝突することによる損傷と液相内の細胞密度が不均一になることにより、細胞の増殖を低下させる原因となっている。
また、仕切りを設けるなどして周縁付近に集中しないようにすることも可能ではあるが、各区域内での細胞は分散したり、集中したりコントロールすることは不可能であり、結果として、抗原特異的免疫細胞を効率良く誘導することは難しかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Foster AE, Gottlieb DJ, Marangolo M, Bartlett A, Li YC, Barton GW,Romagnoli JA, Bradstock KF. Rapid, large-scale generation of highly pure cytomegalovirus-specific cytotoxic T cells for adoptive immunotherapy., J Hematother Stem Cell Res. 2003 Feb;12(1):93-105.
【非特許文献２】Leen AM, Christin A, Myers GD, Liu H, Cruz CR, Hanley PJ, Kennedy-Nasser AA, Leung KS, Gee AP, Krance RA, Brenner MK, Heslop HE, Rooney CM, Bollard CM. Cytotoxic T lymphocyte therapy with donor T cells prevents and treats adenovirus and Epstein-Barr virus infections after haploidentical and matched unrelated stem cell transplantation.,Blood. 2009 Nov 5;114(19):4283-92.
【非特許文献３】Hanley PJ, Lam S, Shpall EJ, Bollard CM. Expanding cytotoxic T lymphocytes from umbilical cord blood that target cytomegalovirus, Epstein-Barr virus, and adenovirus.,J Vis Exp. 2012 May 7;(63):e3627.
【非特許文献４】Bohnenkamp H, Hilbert U, Noll T. Bioprocess development for the cultivation of human T-lymphocytes in a clinical scale.,Cytotechnology. 2002 Jan;38(1-3):135-45.
【非特許文献５】Nakagawa Y, Negishi Y, Shimizu M, Takahashi M, Ichikawa M, Takahashi H. Effects of extracellular pH and hypoxia on the function and development of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes.,Immunol Lett. 2015 Oct;167(2):72-86.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであり、抗原特異的免疫細胞治療の実用化を実現するため、簡便性と安全性を兼ね備え、しかも低コストで効率よく大量に抗原特異的免疫細胞を好適に調製可能な細胞調製方法、及びそれに用いる細胞培養容器の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明に係る細胞調製方法は、末梢血単核球と、抗原特異的ペプチド又は形質転換用ウイルスとの共培養により、抗原特異的免疫細胞を調製する細胞調製方法であって、細胞培養部となる凹部が容器内壁面の一面に複数個凹設された培養容器を用いて、前記凹部に細胞を沈降させて目的細胞を調製する方法としてある。
【００２３】
また、本発明に係る細胞培養容器は、上記の細胞調製方法に用いられる細胞培養容器であって、ガス透過性を有するプラスチックフィルムからなる容器本体と注入出用ポート３とを備え、前記容器本体は、周辺部がシールされた膨出形状を有し、前記容器本体の底面に、細胞培養部となる開口直径１．５ｍｍ以上の椀状凹部を複数設けた構成としてある。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の細胞調製方法によれば、煩雑な作業を要することなく、簡便な操作で目的細胞を調製できる。また、調製に要する時間も非常に短くなる。
【００２５】
また、本発明の細胞培養容器によれば、全ての培養工程を閉鎖系で行うことが可能となる。これによって、安全性の向上がもたらされる。高い安全性が確保できることによって、必要な設備のレベルが低下し、コンタミネーションのリスクを低減できる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の実施形態に係る細胞培養容器の概略を示す説明図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は側面図、（ｃ）は底面図である。
【図２】実施例の評価例において細胞の沈降状態を示す顕微鏡像である。
【図３】実施例の評価例の誘導工程において総生細胞数の変化を示すグラフである。
【図４】実施例の評価例の誘導工程においてＨＣＭＶ特異的ＣＴＬの陽性率を示す染色像及びＣＴＬ細胞数を示すグラフである。
【図５】実施例の評価例の誘導工程及び増殖工程において総生細胞数の変化を示すグラフである。
【図６】実施例の評価例の増殖工程においてＨＣＭＶ特異的ＣＴＬの陽性率を示す染色像及びＣＴＬ細胞数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の好ましい実施形態について、図面を参照しつつ説明する。
【００２８】
［培養容器］
図１に示す細胞培養容器１は、ガス透過性を有するプラスチックフィルムからなる容器本体２と、培地や細胞などが流通可能な管状の部材からなる注入出用ポート３とを備えている。
【００２９】
また、容器本体２は、周辺部がシールされて枕状に膨らんだ膨出形状を有しており、容器本体２の底面２ｂには、細胞培養部となる開口直径ｒが１．５ｍｍ以上の椀状凹部４が複数設けられている。他方、容器本体２の天面２ａは、平坦面とされている。
【００３０】
容器本体２の底面２ｂに形成される椀状凹部４は、その底部に細胞が集まり易くなるように、断面Ｕ字形状に形成するのが好ましいが、これに限定されない。底部に細胞が集まり易くなるように、その開口面積よりも底部の面積が小さくなる縮径構造であればよく、具体的には、断面Ｕ字形状の他、断面半円型、断面Ｖ字型、さい頭逆円錐状であってもよい。
【００３１】
さらに、容器本体２内における細胞の移動を抑止して、培養中の細胞が、一つの椀状凹部４に留まるようにするために、椀状凹部４の深さｄは、椀状凹部４の直径ｒに対する深さｄの比ｄ／ｒが０．０５〜１であるのが好ましい。
【００３２】
また、椀状凹部４の配列は、底面２ｂに占める椀状凹部４の占有面積ができるだけ大きくなるように、図示するような千鳥状とするのが好ましいが、必要に応じて格子状に配列してもよい。
【００３３】
また、容器本体２の大きさは特に限定されないが、例えば、縦５０〜５００ｍｍ、横５０〜５００ｍｍとするのが好ましい。
【００３４】
このような細胞培養容器１は、例えば、次のようにして製造することができる。
まず、容器本体２の天面２ａとなる天面側プラスチックフィルムと、容器本体２の底面２ｂとなる底面側プラスチックフィルムとを用意する。底面側プラスチックフィルムは、その周辺部を残して膨出するように成形するとともに、膨出させた部位に椀状凹部４を成形する。これらは、一般的な真空成形や圧空成形などによって形成することが可能であり、金型などを適宜調整することで、膨出形状や椀状凹部４の形状が所望の形状となるように成形することができる。
【００３５】
次に、上記のように成形された底面側プラスチックフィルムと、天面側プラスチックフィルムとを重ね合せるとともに、所定の位置に注入出用ポート３を形成する管状の部材を挟んで周辺部を熱融着によりシールし、必要に応じて周辺部をトリミングする。これにより、図１に示すような細胞培養容器１を製造することができる。
【００３６】
容器本体２を形成するプラスチックフィルムのガス透過性は、ＪＩＳ  Ｋ  ７１２６のガス透過度試験方法に準拠して、試験温度３７℃で測定した酸素の透過度が、３０００ｍｌ／（ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）以上であるのが好ましく、６０００ｍｌ／（ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）以上であるのがより好ましい。
また、当該プラスチックフィルムは、一部又は全部が透明性を有しているのが好ましい。このようにすることで、容器内から細胞を取り出さなくても、随時、外部からの目視観察又は顕微鏡観察により、細胞培養の進行状況や細胞の状態などを確認することができる。
【００３７】
容器本体２を形成するプラスチックフィルムに用いる材料としては、所望のガス透過性を有していれば特に限定されない。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリエステル、シリコーン系エラストマー、ポリスチレン系エラストマー、テトラフルオロエチレン−ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）などの熱可塑性樹脂が挙げられる。また、シリコーンを用いることも可能である。これらは単層で用いても、同種又は異種の材料を積層して用いてもよいが、周辺部をシールする際の熱融着性を考慮すると、シーラント層として機能する層を有しているのが好ましい。
【００３８】
また、可撓性を有しながらも、椀状凹部４が潰れたりしない適度の形状保持性を有するように、容器本体２を形成するのに用いるプラスチックフィルムの厚みは、３０〜２００μｍであるのが好ましい。
【００３９】
また、注入出用ポート３は、培地や細胞などが流通可能な管状の部材からなるのは前述した通りである。注入出用ポート３を形成する管状の部材は、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレン系エラストマー、ＦＥＰなどの熱可塑性樹脂を用いて、射出成形、押出成形などにより、所定の形状に成形することができるが、注入出用ポート３の具体的な形態は、特に限定されない。注射針による注入が可能となるように、例えば、ゴムなどの弾性体からなる注入口を有するポートとしてもよく、ルアーロックタイプのポートとしてもよい。
【００４０】
また、注入出用ポート３は、末梢血単核球などの細胞の注入にも使用され、また、調製された抗原特異的免疫細胞などの目的細胞の注出にも使用される。図示する例では、注入出用ポート３を一つとしているが、操作ミスに対応すべく複数のポートを備えるようにしてもよい。この場合、それぞれのポートにキャップを備えることで、コンタミネーションを防止するとともに、かかるキャップの色や形状などを異ならせることによって識別可能として、より確実に操作ミスを防止できるようにすることができる。
【００４１】
このような細胞培養容器１により、例えば、末梢血単核球から抗原特異的免疫細胞を誘導したり、形質転換したりして、目的細胞を調製するには、注入出用ポート３に接続された液送チューブを介して閉鎖系を維持しつつ、患者の末梢血から分離した末梢血単核球又はその他の細胞、患者のＨＬＡ型に応じて調製された抗原特異的ペプチド、刺激物質、及び所定の培地などを所定の配合比で容器本体２に注入する。
【００４２】
容器本体２に注入された末梢血単核球と抗原特異的ペプチドは、培地中を沈降して各椀状凹部４に区分けされて、それぞれの底部に集まり、容器内での移動が抑制される。これにより、細胞同士が密着した状態で、末梢血単核球と抗原特異的ペプチドとを共培養することができ、非常に低頻度の抗原特異的免疫細胞に対して、効果的な抗原提示を実現し、効率よく抗原特異的免疫細胞を誘導することが可能になる。
【００４３】
また、各椀状凹部４をほぼ同一の形状とすることで、椀状凹部４毎にほぼ均一な細胞密度とすることができる。そして、細胞培養容器１が傾斜して置かれた場合や、静置した際に生じるフィルムの歪み、さらには、周囲環境やインキュベータ由来の僅かな振動等によっても、椀状凹部４に集まった細胞は、他の椀状凹部４に移動することなく、各椀状凹部４内で一定の凝集を形成することが可能となる。これにより、細胞密度を効率良く誘導可能な状態に保つことができ、密集による増殖率の低下や分散による誘導効率の低下を招くことなく細胞を誘導・増殖することが可能となる。その結果、均質な細胞増殖を実現でき、死細胞の低減や誘導効率向上に効果を発揮する。
【００４４】
また、容器本体２の天面２ａは平面状であり、可撓性を利用して天面２ａを押し下げて椀状凹部４の底部に接触させることで、各椀状凹部４に沈降している細胞を容易に再懸濁させることができる。これにより、椀状凹部４毎の細胞密度に偏りが生じてしまっても、各椀状凹部４に細胞をほぼ均等に分散させることができる。
【００４５】
また、増殖した細胞の回収時には、例えば、容器を反転させて傾斜させることにより、容易に注入出用ポート３から内容液を排出できるため、２４穴平面プレートのプラスチック容器を用いた場合のような、ピペットを用いて、細胞をウェル毎に注入し、回収するといった手間の掛かる作業を省くことができる。さらに、閉鎖系を維持した状態で細胞の充填や増殖した細胞の回収ができるため、細菌などの微生物や、マイコプラズマやウイルス等のコンタミネーションを低減することができる。したがって、体内に輸注又は埋設し、或いは、損傷部に貼付する細胞の培養をより好適に行うことができる。
【００４６】
そして、容器本体２は、ガス透過性を有するプラスチックフィルムからなるため、閉鎖系を構築しても、培養中の細胞に十分な量の酸素を供給できる。
【００４７】
以上のように、本実施形態の細胞培養容器１によれば、全ての培養工程を閉鎖系で行うことが可能となる。これによって、安全性の向上がもたらされる。高い安全性が確保できることによって、必要な設備のレベルが低下し、コンタミネーションのリスクを低減できる。さらに、プラスチックフィルムを用いて容器本体２を形成しているため、その容量を大きくしても軽量であり、嵩張ることもないので、大量の細胞培養に適しており、容器本体２には、予め十分な量の培地を注入しておくことができる。
【００４８】
［細胞調製方法］
次に、上記した細胞培養容器１を用いた本発明の細胞調製方法の一実施形態について、説明する。
【００４９】
本発明が対象とする細胞は、抗原特異的ペプチド及び刺激物質との共培養により抗原特異的免疫細胞を誘導できる細胞、ウイルス溶液との共培養により抗原特異的遺伝子改変免疫細胞に形質転換できる細胞である。特に、末梢血単核球細胞に好適である。
【００５０】
まず、細胞培養容器１に、注入出用ポート３から培地と細胞、及び抗原特異的ペプチド又は形質転換用ウイルス溶液を注入し、培地中を沈降する細胞等が各椀状凹部４の底部に集まるようにする。このとき、培地は、椀状凹部４だけでなく、容器本体２の底面２ｂを覆う程度に注入する。
【００５１】
培地としては、液体培地を使用し、細胞の種類に応じて適宜選択する。抗原特異的免疫細胞の培養に適した培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＵＬＢＥＣＣＯ‘ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）、Ｘ−ＶＩＶＯ(Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製)、ＡＬｙＳ５０５Ｎ(細胞科学研究所社製)、ＫＢＭシリーズリンパ球培養培地（コージンバイオ社製）等）に、ＩＬ−２等を添加することによって、サイトカイン含有培地を調製することができる。血清、血漿、血清アルブミン、抗生物質、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ等も添加することにしてもよい。ＩＬ−２としては、組換えヒトＩＬ−２（例えば、Ｃｈｉｒｏｎ社が提供するＰＲＯＬＥＵＫＩＮや、塩野義製薬社が提供するテセロイキン）を用いることが好ましい。ＩＬ−２の含量は例えば１０〜１，０００ＩＵ／ｍＬである。
【００５２】
抗原特異的ペプチドとしては、ウイルス（サイトメガロウイルス、エプスタインバールウイルス、アデノウイルス等）、腫瘍抗原（ＷＴ１、ｈＴＥＲＴ、ＭＮ／ＣＡ９、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ６、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＵＭ１、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ２、ＣＥＡ、ＰＳＡ等）のＨＬＡ結合ペプチドを例示することができる。通常は１種類の抗原特異的ペプチドのみが用いられるが、二種類以上の抗原特異的ペプチドの使用を妨げるものではない。
形質転換用ウイルスとしては、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイル スベクター、レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、ＨＳＶベクターなどのウイルスベクターが使用できる。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。
【００５３】
各椀状凹部４に播種する細胞数は、椀状凹部４の大きさにもよるが、細胞密度１×１０４〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度とすることが好ましい。１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ未満では、細胞同士が出会う確率が低くなるので、誘導効率が低いからである。一方、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを越えると、細胞死の割合が増加するので、細胞の増殖効率が低下するからである。
【００５４】
（１）抗原特異的免疫細胞の誘導工程
前記の操作の後、抗原特異的免疫細胞の培養に適した条件（典型的には、３７℃、５％ＣＯ２）に設定したインキュベータ内へ細胞培養容器１を移す。所定時間（例えば、１〜４日）経過後、インキュベータから細胞培養容器１を取り出し、注入出用ポート３からサイトカイン含有培地を注入する。インキュベータ内に戻して所定時間（例えば、２〜７日）培養した後、注入出用ポート３からサイトカイン含有培地を再び細胞培養容器１に注入する。その後、インキュベータ内での培養を継続する。新しい培地を入れた状態で細胞培養容器１を回転することにより、再懸濁で細胞密度を整えつつ、培養してもよい。このようにして、容器を変えることなく培地追加を行なうことができる。
【００５５】
（２）抗原特異的免疫細胞の増殖工程
細胞培養中の細胞培養容器１から少量の細胞を採取し、後述の抗原特異的免疫細胞の定量手法を用いて、抗原特異的免疫細胞の頻度および量を測定する。その後、増殖工程に移る。
この工程では、誘導された抗原特異的免疫細胞を増殖させ、抗原特異的免疫細胞を大量に調製する。前記の誘導工程で抗原特異的免疫細胞の陽性率が十分に得られた場合、継続して、抗原特異的免疫細胞の培養に適した条件（典型的には、３７℃、５％ＣＯ２）に設定したインキュベータ内で培養する。
所定時間（例えば、１〜４日）経過後、インキュベータから細胞培養容器１を取り出し、注入出用ポート３から増殖用培地を細胞培養容器１に注入する。インキュベータ内に戻して所定時間（例えば、２〜７日）培養した後、注入出用ポート３から増殖用培地を再び注入する。その後、インキュベータ内での培養を継続する。この後、細胞の回収操作に移る。増殖用培地の注入操作を行ってから次の増殖用培地の注入操作を行うまでの間隔は、例えば、１〜６日である。１回目の注入操作と２回目の注入操作の間隔を３日とし、２回目の注入操作と３回目の注入操作の間隔を２日としてもよく、ここでの間隔を必ずしも統一する必要はない。
【００５６】
増殖用培地は、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、又はＩＬ−１５、或いはこれら両方を含有する。ＩＬ−２の含量は、例えば、１０〜１，０００ＩＵ／ｍＬである。他方、ＩＬ−１５の含量は、例えば、１０〜１００ｎｇ／ｍＬである。
【００５７】
前記の誘導工程で、抗原特異的免疫細胞の陽性率が比較的低い場合には、抗原特異的免疫細胞の増殖を促すために、下記（ａ）〜（ｅ）の操作をいずれか一つ、又は二以上併用して行ってから、増殖工程に移るようにしてもよい。
【００５８】
（ａ）抗原特異的ペプチドを追加する。
抗原特異的ペプチドをさらに追加することによって、細胞表面刺激因子の発現が促進される。これにより、その後の増殖工程において、誘導された抗原特異的免疫細胞の増殖速度が速くなり、高効率で増殖させることができる。追加による培地中の抗原特異的ペプチドの量は、例えば、０．０１〜１００μｇ／ｍＬである。
【００５９】
（ｂ）抗ＣＤ３抗体を加える。
抗ＣＤ３抗体を加えることによって、細胞表面に副刺激因子の発現が促進される。これにより、その後の増殖工程において、誘導された抗原特異的免疫細胞の増殖速度が速くなり、高効率で増殖させることができる。
使用する抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３分子又はその一部を用いた免疫学的手法により調製することができる。市販の抗ＣＤ３抗体を用いることもできる。市販の抗ＣＤ３抗体の例はＯＫＴ−３抗体（ヤンセンファーマ社製）である。安全性の点から薬事承認を受けているＯＫＴ−３抗体を用いることが好ましい。
なお、抗ＣＤ３抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。但し、特異性や効率の点を考慮すれば、モノクローナル抗体である抗ＣＤ３抗体を用いることが好ましい。二種類以上の抗ＣＤ３抗体を併用することも可能である。培地中の抗ＣＤ３抗体の量は、例えば、０．０１〜１０μｇ／ｍＬである。
【００６０】
（ｃ）抗ＰＤ−１抗体を加える。
抗ＰＤ−１抗体を加えることによって、抗原特異的免疫細胞の増殖を阻害する免疫チェックポイントＰＤ−1分子をブロックすることができ、誘導された抗原特異的免疫細胞を高効率で増殖させることができる。
使用する抗ＰＤ−1抗体は、ＰＤ−1分子又はその一部を用いた免疫学的手法により調製することができる。市販の抗ＰＤ−1抗体を用いることもできる。
市販の抗ＰＤ−1抗体の例は、ニボルマブ（小野薬品工業社製）である。安全性の点から薬事承認を受けている抗ＰＤ−1抗体を用いることが好ましい。
なお、抗ＰＤ−1抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。但し、特異性や効率の点を考慮すれば、モノクローナル抗体である抗ＰＤ−1抗体を用いることが好ましい。二種類以上の抗ＰＤ−1抗体を併用することも可能である。培地中の抗ＰＤ−1抗体の量は、例えば、０．０１〜１０μｇ／ｍＬである。
また、抗原特異的免疫細胞の増殖を阻害する免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−1以外に、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＨＴ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ等が多数存在する。それらの分子に対する抗体を用いて、同様に培地に添加することができる。二種類以上の抗免疫チェックポイント分子抗体を併用することも可能である。
【００６１】
（ｄ）免疫チェックポイント分子や制御性Ｔ細胞（Ｔｒeｇ）の発現・代謝経路を阻害する又はＨＬＡ分子の発現を向上させる低分子阻害剤を添加する。
免疫チェックポイント分子の発現を阻害する物質としては、例えば、ＰＤ−Ｌ１の発現を抑制するセリンプロテアーゼ阻害剤であるＮａｆａｍｏｓｔａｔ Ｍｅｓｙｌａｔｅなどの低分子化合物が挙げられる。Ｔｒeｇの発現を抑制する物質としては、例えば、ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔｒｅｇｓ (ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３ｈｉｇｈＣＤ４５ＲＡｌｏｗ)細胞のみを阻害するＬｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ低分子化合物、又はＴｒeｇ様細胞を阻害するインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ阻害剤であるＩＮＣＢ０２４３６０低分子化合物等が挙げられる。ＨＬＡ分子の発現を向上させる物質としては、ＭＡＰＫ阻害剤であるＬａｐａｔｉｎｉｂ Ｄｉｔｏｓｙｌａｔｅ等が挙げられる。前記の低分子化合物のいずれか一種又は複数を増殖培地に添加しておくことが好ましい。培地中の低分子化合物の量は、例えば、１ｐＭ〜１μＭである。
【００６２】
（ｅ）Toll-like receptor（ＴＬＲ）やRIG-I-like receptorなどの免疫受容体を介して免疫を活性化する物質を加える。
免疫賦活成分としては、免疫賦活性を有するキノコ成分（抽出物及び原末等）、海藻（メカブ及びモズク等） 成分（抽出物及び原末等）などが挙げられる。これらは１種のみを用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
また、病原体の構成成分やそれを模倣した物質、いわゆるＩｍｍｕｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ（免疫刺激物質）として、リポタンパク質（ＴＬＲ１のリガンド）、ペプチドグリカン（ＴＬＲ２のリガンド）、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ） （Ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ−ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）を代表とするｄｓＲＮＡ（ＴＬＲ３のリガンド）、リポ多糖体（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）（ＴＬＲ４のリガンド）、ｓｓＲＮＡ（ＴＬＲ７のリガンド）、Ｃｐ ＧＤＮＡ（ＴＬＲ９のリガンド）などが挙げられる。
免疫賦活成分は自然免疫系の調節だけでなく，獲得免疫系の始動と制御においても重要である。ＴＬＲはＴ細胞そのものに発現され、Ｔ細胞の機能を直接的に制御する能力を備えている。例えば，ＣＤ８陽性Ｔ細胞はＴＬＲ２を発現しており、抗原とＴＬＲ２リガンドの共刺激によって細胞増殖や細胞生存性を直接的に増強し、樹状細胞由来の間接的な共刺激の必要性を低下させるのに役立つ。またＴＬＲ リガンド（特にＴＬＲ３、ＴＬＲ７やＴＬＲ９）で刺激することにより、外来性抗原のＭＨＣクラスＩによる「クロスプレゼンテーション」能力が増加させられ、抗原特異的にＣＤ８陽性Ｔ細胞を細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）へ効果的に分化させることができる。
【００６３】
（３）抗原特異的免疫細胞の回収工程
細胞培養中の細胞培養容器１から少量の細胞を採取し、後述の抗原特異的免疫細胞の定量手法を用いて、抗原特異的免疫細胞の頻度および量を測定する。その後、回収工程に移る。
【００６４】
回収操作には、細胞培養容器１の注入出用ポート３が用いられる。すなわち、注入出用ポート３から、増殖した抗原特異的免疫細胞を移出する。細胞を移出した後、遠心処理による細胞の洗浄工程を組み込むことにしてもよい。このような洗浄工程を繰り返すことにしてもよい（例えば、２〜４回）。
【００６５】
（４）抗原特異的免疫細胞の定量
本発明の細胞調製方法を適用して抗原特異的免疫細胞を調製する各工程において、抗原特異的免疫細胞の量の変動を知ることは、工程期間の調整、終了可否の判断、培地添加の間隔等を決定する上で非常に重要である。
臨床治療用を目的とする抗原特異的免疫細胞を定量的に測定する事は、その効果成分を測定することと同じ意味である。さらに、本発明の細胞調製方法を適用して調製された抗原特異的免疫細胞を用いて提供される最終的な製剤の有効成分量を測定する品質検定においても重要である。抗原特異的免疫細胞の定量は、以下の３つの方法によって行うことができる。
【００６６】
・定量方法１（ＭＨＣ−多量体法等）
抗原特異的免疫細胞の誘導に用いた抗原特異的ペプチドと同一のプペプチドを使用して製造したＭＨＣ−モノマー及び／又はＭＨＣ−多量体（以下、ＭＨＣ−多量体等とも総称する）を用いて、調製中または調製した抗原特異的免疫細胞を定量することができる。定量は、例えば、次のようにして実施することができる。
細胞培養液から採取した試料を、適当な濃度のＭＨＣ−多量体等と反応させる。当該ＭＨＣ−多量体等と結合した抗原特異的免疫細胞は、標識色素により染色されるので、フローサイトメーター、顕微鏡等を用いてカウントする。ＭＨＣ−多量体等と反応させるときに、ＭＨＣ−多量体等と異なる色素で標識された抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体等を反応させることで、抗原特異的免疫細胞の細胞サブセットも同時に判定できる。
【００６７】
・定量方法２
採取した細胞を抗原特異的ペプチドで刺激することによって、抗原特異的免疫細胞が産生するＩＦＮγ（インターフェロンガンマ）、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子アルファ）、インターロイキン等のサイトカイン及び／又はケモカインを定量する方法である。以下にＩＦＮγを例にとり具体的に示す。
【００６８】
２−１）サイトカイン定量による方法１（細胞内ＩＦＮγ産生細胞定量法）
採取した細胞を適当な培地に、約２×１０６／ｍＬの細胞濃度で浮遊させ、抗原特異的ペプチドを加える。さらに、細胞内タンパク質輸送阻止剤（例えば、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ、Ｍｏｎｅｎｓｉｎ等）を加え、５％ＣＯ２恒温槽にて３７℃で５〜１６時間培養する。培養後、Ｔ細胞マーカー抗体（抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体）、又は、ＭＨＣ−多量体等と反応させ、細胞を固定後、膜透過処理を行い、色素標識抗ＩＦＮγ抗体を反応させる。フローサイトメーター等を用いて解析し、全細胞中、Ｔ細胞中、又はＭＨＣ−多量体等陽性細胞中のＩＦＮγ陽性細胞率を定量する。
【００６９】
２−２）サイトカイン定量による方法２（エリスポットアッセイ）
抗ＩＦＮγ抗体を固相化した９６ウェルＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＨＡプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に採取した細胞をまく。その後、抗原特異的ペプチドを各ウェルに入れ、５％ＣＯ２恒温槽にて３７℃で２０時間培養する。翌日、プレートを洗浄し、抗ＩＦＮγ抗体、ペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体の順で反応させる。さらに、ペルオキシダーゼの基質を加え、発色によりＩＦＮγスポットを可視化し、実体顕微鏡かＥＬＩＳＰＯＴアナライザー（Ｃ．Ｔ．Ｌ．社製）を用いてカウントすることで定量する。
【００７０】
２−３）サイトカイン定量による方法３（培養上清中に分泌されたＩＦＮγを定量する方法）
調製した細胞試料を適当な培地に、約２×１０６／ｍＬの細胞濃度で浮遊させ、抗原特異的ペプチドを加える。５％ＣＯ２恒温槽にて３７℃で２４〜４８時間培養する。培養後、培養上清に含まれるＩＦＮγ濃度を市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄシステムズ社のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮγ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を使用して定量する。
【００７１】
・定量方法３
細胞表面タンパク質特異抗体を用いて定量を行う。抗原特異的ペプチドを特異的に認識する抗原特異的免疫細胞は、当該ペプチドとの結合により刺激され、細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ６３、ＣＤ６９等）の発現が増強することが報告されている。したがって、抗原特異的ペプチド等で刺激した細胞と細胞表面タンパク質を特異的に認識する標識抗体を混合することで、抗原特異的免疫細胞は標識抗体と結合し、標識色素により染色される。染色された抗原特異的免疫細胞は、フローサイトメーター、顕微鏡等を用いてカウントし、定量することができる。さらに、標識抗体と異なる色素で標識された抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体等を加えることで、抗原特異的免疫細胞の細胞サブセットも同時に判定できる。
【００７２】
以上説明したように、本発明の細胞培養容器は、末梢血単核球と抗原特異的ペプチドを混合培養して、末梢血単核球から抗原特異的免疫細胞を誘導し、増殖するために用いる細胞培養容器として好適に利用できる。また、目的とする抗原特異的免疫細胞の調製に要する時間は、当然ながら治療目的や患者の状態などに影響を受けるものの、本発明の細胞調製方法によれば、単離した末梢血単核球より概ね１４日〜一ヶ月程度で治療に必要量の抗原特異的免疫細胞の調製が可能となる。
また、本発明の細胞培養容器は、末梢血単核球と特定のウイルスを共培養して、末梢血単核球から遺伝子改変免疫細胞を産出及び増殖するために用いる培養容器としても利用できる。
【実施例】
【００７３】
以下、具体的な実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７４】
［実施例１］
ガス透過性を有するプラスチックフィルム（東洋製罐グループホールディングス（株）製：細胞培養バッグ「ＣＣＢ−ｓｔ」に使用されるポリエチレン系特殊多層フィルムと同一素材）を用いて、図１に示す細胞培養容器１と同様の培養容器を製造した。
容器本体２の底部２ｂに形成する椀状凹部４は、直径ｒ６ｍｍ、深さｄ３ｍｍ（ｄ／ｒ＝０．５）の球冠状とし、底面２ｂに占める占有面積が６４％となるように９６個の椀状凹部４を形成した。
【００７５】
［実施例２］
椀状凹部４の直径ｒを３ｍｍ、深さｄを１ｍｍ（ｄ／ｒ＝０．３３）とし、底面２ｂに占める占有面積が５１％となるように３３０個の椀状凹部４を形成した以外は実施例１と同様にして培養容器を製造した。
【００７６】
［比較例１］
容器本体２の底部２ｂに椀状凹部４を形成せずに、底部２ｂを天面２ａと同様の平坦面とした以外は実施例１と同様にして培養容器を製造した。
【００７７】
［評価例］
実施例１、実施例２、比較例１のそれぞれの培養容器を用いて、以下の工程によってＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＭＶ ｐｐ６５抗原特異的ＣＴＬを調製した。
【００７８】
（１）抗原特異的ＣＴＬ誘導工程
（ａ）末梢血単核球の単離
ＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人より末梢血を、ヘパリンを少量加えた注射筒を用いて２０ｍＬ採取し、フィコール比重遠心分離法にて末梢血単核球を単離した（３×１０７個）。
【００７９】
（ｂ）血漿の採取
末梢血単核球を単離する際、血漿を採取し、５６℃、２０分間、加熱処理した後、２５００rpmで１０分間遠心処理した。
【００８０】
（ｃ）ＲＰＭＩ１６４０培地への末梢血単核球の懸濁
誘導培地（０．０１％ヒト血清アルブミン及び１０μｇ／ｍＬゲンタシン含有のＨｅｐｅｓ緩衝ＲＰＭＩ１６４０培地）を用いて末梢血単核球を洗浄した後、誘導培地を１２ｍＬ採取し、末梢血単核球と懸濁させた。さらに、自己血漿を３ｍＬ加えた。続いて終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＨＣＭＶ特異的ＣＴＬペプチドＱＹＤ(配列：ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ、医学生物学研究所社製)を添加し、十分に混合した（細胞密度：２×１０６／ｍＬ）。
【００８１】
（ｄ）ＣＴＬの誘導
誘導培地に懸濁した末梢血単核球を三等分し、ルアーロックシリンジを用いて５ｍＬずつ、注入出用ポートより実施例１、実施例２、比較例１のそれぞれの培養容器に注入した。その後、３７℃、５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベータ内に移した（培養開始）。
【００８２】
インキュベータ内にしばらく静置してから、デジタルカメラを搭載した顕微鏡システムにより細胞の画像を取得し、実施例１、実施例２の培養容器中の細胞の沈降状態を確認した。顕微鏡は倒立型蛍光位相差顕微鏡ＢＺ−Ｘ７００（キーエンス社製）を使用した。倍率は、４倍、４０倍レンズを使用した。その結果を図２に示す。
【００８３】
図２では、注入された細胞が細胞培養部となる椀状凹部の断面Ｕ字形状の底部中心に沈降していることがわかった。断面Ｕ字形状の底中心部に比較的高密度の細胞が集まっているのに対して、それ以外の域では、細胞がほとんど確認できない。このように、容器本体内の細胞が複数の椀状凹部へ区分けされて、容器壁の延在方向への移動が抑制されるとともに、細胞は断面Ｕ字形状の底中心部に沈降し、細胞同士を密着させながら培養することができ、非常に低頻度の抗原特異的免疫細胞に対して、効率よく抗原特異的免疫細胞を誘導できる環境を整えた。
【００８４】
培養開始２日後に培養容器を取り出した。次に、ＩＬ−２含有誘導培地１ｍＬ（ＩＬ−２含量：３００ＩＵ／ｍＬ）を注入出用ポートより培養容器に注入した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で５日間培養した後、ＩＬ−２含有誘導培地１ｍＬ（ＩＬ−２含量：５０ＩＵ／ｍＬ）を注入出用ポートより培養容器に注入した。以上の操作によって、培養開始から７日（但し、末梢血単核球及び血漿の調製に要する時間を除く）という短時間で抗原特異的ＣＴＬを誘導した。
【００８５】
誘導７日後に、それぞれの培養容器の注入出用ポートより、一定数の細胞を取り出して、その一部は血球計数盤を用いて、総細胞数をカウントした。もう一部は、ＰＥ標識ＨＣＭＶ特異的ＭＨＣテトラマーとＰＣ５標識ＣＤ８抗体を反応させて、フローサイトメーターを用いてＨＣＭＶ特異的ＣＴＬの誘導率を測定した。具体的には、適量の細胞数に対して１０μＬのＰＥ標識ＭＨＣ−テトラマー試薬（医学生物学研究所社製）と、２０μＬのＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）標識Ｔ細胞表面抗体ＣＤ８（ベックマン・コールター社製）を加えた。その後、穏やかに混合し２〜８℃で６０分間または、室温にて３０分間静置した。１．５ｍＬのＰＢＳを加え攪拌後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄みを吸引廃棄後、細胞を４００μＬのＰＢＳに再懸濁した。この際、死細胞による非特異的な蛍光を除外するために、７−ＡＡＤ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ（死細胞検出試薬、医学生物学研究所社製）を加えた。２４時間以内にフローサイトメーターにて解析した。その結果を図３及び図４に示す。
【００８６】
図３では、細胞懸濁液とトリパンブルー染色液を１：４で混和し、速やかに血球計算盤より細胞数を測定した。その結果、比較例１の培養容器で得られた生細胞数は１．０４×１０７個であったのに対して、実施例１と実施例２の培養容器で得られた生細胞数はそれぞれ、１．１８２×１０７個、１．２０×１０７個であった。椀状凹部を設けた実施例１と実施例２の培養容器では、平底タイプの比較例１の培養容器で培養した場合より、生細胞が多く得られた。また、椀状凹部の数が多いほど、生細胞数が多い傾向が見られた。
【００８７】
一方、抗原特異的ＣＴＬを定量した結果を図４に示す。図４の左段において、ドットプロット展開図中の数字は、展開図を四分割した領域を、ＵＬ（左上）、ＵＲ（右上）、ＬＬ（左下）、ＬＲ（右下）と表記した場合、（ＵＲ＋ＬＲ）分のＵＲの百分率を示す。Ｘ軸にＣＤ８、Ｙ軸にＭＨＣ−テトラマー混合試薬に対する蛍光強度をｌｏｇスケールで示したドットプロット展開図で示す。
図４に示した結果から明らかな通り、比較例１の培養容器で誘導したＨＣＭＶ特異的ＣＴＬは０．１３％の陽性率であったが、実施例１の培養容器で誘導したＨＣＭＶ特異的ＣＴＬは０．５４％の陽性率で、実施例２で１．１３％の陽性率が検出された。
【００８８】
また、図４の右段では、ＣＴＬの細胞数を算出した。培養開始から７日後までに誘導されたＣＴＬの細胞数は三種類の培養容器でそれぞれ、４．１６×１０５個（比較例１）、７．１０×１０５個（実施例１）、１０．８０×１０５個（実施例２）であった。比較例１の培養容器に対して、実施例１の培養容器では１．７倍、実施例２の培養容器では２．６倍のＣＴＬ細胞が得られた。同一ドナーの末梢血単核球からの誘導実験であるにも関わらず、図４に示された実施例のテトラマー陽性細胞の頻度及びＣＴＬの細胞数が比較例１より高いのがわかった。このことから、断面Ｕ字形状の椀状凹部が、抗原特異的ＣＴＬの誘導に効果的であることが明らかである。
【００８９】
（２）抗原特異的ＣＴＬ増殖工程
前記の抗原特異的免疫細胞の誘導工程で抗原特異的免疫細胞の陽性率が十分に得られ、継続して、そのまま免疫細胞の培養に適した条件（典型的には、３７℃、５％ＣＯ２）に設定したインキュベータ内で培養する（増殖培養開始）。その後、培養（２日間）、注入出用ポートから増殖用培地の注入の順序で行った。その後、インキュベータ内での培養を継続する。以上の操作により、工程（１）及び（２）における培養開始から１４日という短時間で抗原特異的ＣＴＬを調製した。得られた細胞を細胞計数およびフローサイトメトリー解析に供した。その結果を図５及び図６に示す。
【００９０】
図５で示したように、培養開始から１４日目で得られた総生細胞数はそれぞれ、２．９９×１０５個（比較例１）、３．１７×１０５個（実施例１）、３．３２×１０５個（実施例２）であった。総生細胞数に顕著な差が示さないものの、図６に示した通り、ＣＴＬ細胞数はそれぞれ、８．９７×１０５個（比較例１）、２９．５１×１０５個（実施例１）、５２．１５×１０５個（実施例２）であり、大きく異なっていることがわかった。比較例１の培養容器に対して、実施例１の培養容器では約３．３倍、実施例２の培養容器では約５．８倍のＣＴＬ細胞が得られた。また、図６の左段のフローサイトメトリー解析結果の比較から、ＣＴＬの陽性率は、比較例１の培養容器に対して、実施例１の培養容器では約１５．７倍、実施例２の培養容器では約１７．８倍であったことがわかった。従来の培養より、高純度のＣＴＬ細胞が得られた。
【００９１】
すなわち、工程（１）及び（２）における培養開始から１４日（但し、ＰＢＭＣ及び血漿の調製に要する時間を除く）という短時間にも拘わらず高純度かつ大量に抗原特異的ＣＴＬの調製に成功した。
【００９２】
（３）抗原特異的ＣＴＬ回収工程
抗原特異的ＣＴＬを調製した後の回収操作の一例を示す。まず、培養容器の注入出用ポートを利用して内容物（すなわち、抗原特異的ＣＴＬ）を適切な容器に分注する。次に、遠心分離した後、上清（培養液）を廃棄し、凍結保存液（８％ヒト血清アルブミン加ＣＰ−１：極東製薬工業（株)製等）を注入して細胞を懸濁する。続いて細胞懸濁液を適切な凍結保存用容器に移出し、凍結保存する（例えば−１３０〜−１５０℃）。そして、使用時には融解し、細胞を洗浄した後、輸注用バッグを用いて患者へ細胞を輸注する。
【００９３】
以上、本発明について、好ましい実施形態を示して説明したが、本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲で種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
【００９４】
例えば、前述した実施形態では、容器本体２は長方形状とされており、その短辺側の一辺に注入出用ポート３を備えているが、これに限定されない。容器本体２の形状は、正方形状、楕円形状、円形状などとする場合もあり、必要に応じて種々の形状とすることができる。注入出用ポート３を備える位置も適宜変更可能である。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明は、特に、細胞の誘導効率及び細胞の増殖速度を高めて、短期間で細胞を大量に得ることを必要とする分野、再生医療用細胞の培養などに利用することができる。
【符号の説明】
【００９６】
１          培養容器
２          容器本体
２ｂ          底面
３          注入出用ポート
４          椀状凹部
【図１】
2019122261.tif 000003
【図２】
2019122261.tif 000004
【図３】
2019122261.tif 000005
【図４】
2019122261.tif 000006
【図５】
2019122261.tif 000007
【図６】
2019122261.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成29年4月10日(2017.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
（ｃ）ＲＰＭＩ１６４０培地への末梢血単核球の懸濁
誘導培地（０．０１％ヒト血清アルブミン及び１０μｇ／ｍＬゲンタシン含有のＨｅｐｅｓ緩衝ＲＰＭＩ１６４０培地）を用いて末梢血単核球を洗浄した後、誘導培地を１２ｍＬ採取し、末梢血単核球と懸濁させた。さらに、自己血漿を３ｍＬ加えた。続いて終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＨＣＭＶ特異的ＣＴＬペプチドＱＹＤ(配列番号１：ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ、医学生物学研究所社製)を添加し、十分に混合した（細胞密度：２×１０６／ｍＬ）。