(57)【要約】【課題】ペプチドの血中滞留性を増強させる手段を提供する。【解決手段】リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成することにより、ペプチドの血中滞留性を増強する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させる工程を含む、ペプチドの血中滞留性を増強させる方法。
【請求項２】
リンカーが、下記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）のいずれかに示される構造を有する、請求項１に記載の方法。
−Ａ１−    （Ｌ１）
（式中、Ａ１は炭素数１以上のアルキレン基を表す。）
−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−    （Ｌ２）
（式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１は任意の結合を表す。）
−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｙ２−Ａ３−    （Ｌ３）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して任意の結合を表す。）
−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｐｈ−Ａ３−    （Ｌ４）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｐｈはフェニレン基を表す。）
−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−ｃＨｅｘ−Ａ３−    （Ｌ５）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、ｃＨｅｘはシクロヘキシレン基を表す。）
【請求項３】
リンカーが、下記一般式（Ｌ６）〜（Ｌ１０）のいずれかに示される構造を有する、請求項１に記載の方法。
Ｚ１−Ａ１−    （Ｌ６）
（式中、Ａ１は炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｚ１は任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−    （Ｌ７）
（式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｙ２−Ａ３−    （Ｌ８）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｐｈ−Ａ３−    （Ｌ９）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表し、Ｐｈはフェニレン基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−ｃＨｅｘ−Ａ３−    （Ｌ１０）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表し、ｃＨｅｘはシクロヘキシレン基を表す。）
【請求項４】
リンカーが、下記一般式（Ｌ１１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造を有する、請求項１に記載の方法。
Ｚ１−Ａ１−Ｚ２    （Ｌ１１）
（式中、Ａ１は炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｚ２    （Ｌ１２）
（式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｙ２−Ａ３−Ｚ２    （Ｌ１３）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して任意の結合を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｐｈ−Ａ３−Ｚ２    （Ｌ１４）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表し、Ｐｈはフェニレン基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−ｃＨｅｘ−Ａ３−Ｚ２    （Ｌ１５）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表し、ｃＨｅｘはシクロヘキシレン基を表す。）
【請求項５】
Ｙ１及びＹ２が、それぞれ独立して下記一般式（Ｙ１）〜（Ｙ１２）のいずれかに示される構造を有する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
−Ｎ＝ＣＨ−    （Ｙ１）
−ＣＨ＝Ｎ−    （Ｙ２）
−ＮＨ−ＣＨ２−    （Ｙ３）
―ＣＨ２−ＮＨ−    （Ｙ４）
−ＮＨ−ＣＯ−    （Ｙ５）
−ＣＯ−ＮＨ−    （Ｙ６）
−Ｓ−    （Ｙ７）
−Ｓ−Ｓ−    （Ｙ８）
−ＣＯ−ＣＨ２−Ｓ−    （Ｙ９）
−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−    （Ｙ１０）
−Ｓｕｃ−Ｓ−    （Ｙ１１）
（式中、Ｓｕｃは１，３−ピロリジン−２，５−ジオン基を表す。）
−Ｓ−Ｓｕｃ−    （Ｙ１２）
（式中、Ｓｕｃは１，３−ピロリジン−２，５−ジオン基を表す。）
【請求項６】
Ｚ１及びＺ２が、それぞれ独立して下記一般式（Ｚ１）〜（Ｚ７）のいずれかに示される構造を有する、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
−ＮＨ２    （Ｚ１）
−ＳＨ    （Ｚ２）
−ＣＨＯ    （Ｚ３）
−ＣＯ−ＣＨ２−Ｘ    （Ｚ４）
（式中、Ｘは任意のハロゲン原子を表す。）
−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ    （Ｚ５）
−Ｍａｌ    （Ｚ６）
（式中、ＭａｌはＮ−マレイミド基を表す。）
−ＣＯ−Ｏ−Ｓｕ    （Ｚ７）
（式中、ＳｕはＮ−スクシンイミジル基又は３−スルホ−Ｎ−スクシンイミジル基を表す。）
【請求項７】
ペプチドが、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるペプチドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（Ａ）下記（ａ）に示されるＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列を含むペプチド。
（ａ）ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（ＧＬＰ−１（７−３７））
（Ｂ）下記（ｂ１）〜（ｂ３）からなる群より選択されるＧＬＰ−１（７−３７）のアナログのアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ１）ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＣ（ＧＬＰ−１Ｃ）
（ｂ２）ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＲＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（ＧＬＰ−１ＲＫ）
（ｂ３）ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＣ（ＧＬＰ−１ｏｒｉＣ）
（Ｃ）前記（ａ）および（ｂ１）〜（ｂ３）のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、血糖抑制作用を有する、ペプチド。
（Ｄ）前記（ａ）および（ｂ１）〜（ｂ３）のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、血糖抑制作用を有する、ペプチド。
【請求項８】
ペプチドが、下記（Ａ）に示されるペプチド及び下記（Ｂ）に示されるペプチドを含むペプチド多量体であって、血糖抑制作用を有するペプチド多量体である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
（Ａ）下記（ａ１）に示されるインスリンＡ鎖のアミノ酸配列を含むペプチド、又は下記（ａ２）若しくは（ａ３）に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ａ１）ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
（ａ２）前記（ａ１）に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
（ａ３）前記（ａ１）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
（Ｂ）下記（ｂ１）に示されるインスリンＢ鎖のアミノ酸配列を含むペプチド、又は下記（ｂ２）若しくは（ｂ３）に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ１）ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ
（ｂ２）前記（ｂ１）に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
（ｂ３）前記（ｂ１）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を行う工程を含む、血中滞留性が増強されたペプチドの製造方法。
【請求項１０】
Ｚ１−Ｌ−Ｇで示される構造を有する、グリコサミノグリカンの誘導体。
（式中、Ｚ１は任意の官能基を表し、Ｌはリンカーを表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
【請求項１１】
請求項１０に記載の誘導体を含有する、ペプチドの血中滞留性を増強するための増強剤。
【請求項１２】
Ｐ−Ｌ−Ｇで示される構造を有する、グリコサミノグリカンとペプチドの複合体。
（式中、Ｐはペプチドを表し、Ｌはリンカーを表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
【請求項１３】
請求項１２に記載の複合体を含有する、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１２に記載の複合体を含有する、ペプチド製剤。
【請求項１５】
炭素数が１以上のアルキレン基を含む構造を有するリンカーであって、これを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させてペプチドの血中滞留性を増強するために用いられるリンカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドの血中滞留性を増強させる技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリコサミノグリカンは糖鎖の１種であり、アミノ糖を含む二糖が繰り返し重合した構造を骨格として有する直鎖状の多糖である。コンドロイチンとヘパロサンは、どちらもグリコサミノグリカンの１種である。コンドロイチンは、グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）とＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）からなる二糖が繰り返し重合した構造［→４）−β−ＧｌｃＵＡ−（１→３）−β−ＧａｌＮＡｃ−（１→］を骨格とする多糖である。ヘパロサンは、グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）とＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からなる二糖が繰り返し重合した構造［→４）−β−ＧｌｃＵＡ−（１→４）−α−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］を骨格とする多糖である。
【０００３】
特許文献１には、「コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンおよび／またはコンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンをタンパク質に結合させて複合体を形成させることにより、当該タンパク質の血中滞留性を著しく増強できること」が記載されている。
【０００４】
特許文献２には、「ヘパロサンと薬剤の複合体」が記載されている。当該文献は、「薬剤の薬物動態（血中半減期等）を改善する技術を提供すること」を課題としている。ここで当該文献には、「ヘパロサンと薬剤は、リンカーを介して結合していてもよい」と記載されている。また当該文献においては、「リンカーは任意の鎖長であってよい」と記載されている。
【０００５】
特許文献３には、「少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチド」が記載されている。当該文献は、「ＧＬＰ−１と比べて、血中安定性が増大しており、さらに好ましくは、高い血糖値抑制活性を示す、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを提供すること」を課題としている。ここで当該文献には、「糖鎖とアミノ酸とは、リンカーを介して結合していてもよい」と記載されている。また当該文献においては、「リンカーを介さない場合とリンカーを介する場合とで、糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドの血糖値上昇抑制活性に大きな違いはみられない」と記載されている。
【０００６】
特許文献１には、コンドロイチンとタンパク質を結合させるための手段としてリンカーを用いることについての開示や示唆がない。また、特許文献２にはヘパロサンと薬剤を、特許文献３には糖鎖とＧＬＰ−１ペプチドを、それぞれ結合させるための手段としてリンカーを用いる態様が開示されているが、リンカーの構造によって血中滞留性が変化し得ることについての開示も示唆もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０４６６０２号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１５／０１１８１８５号明細書
【特許文献３】国際公開第２００９／１５３９６０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ペプチドの血中滞留性を増強させる技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
特許文献１〜３より明らかなように、当技術分野においてリンカーは、糖鎖と薬剤（ペプチド等）を結合させるための手段の一つとして使用可能であると認識されるにとどまっていた。すなわち、当業者はグリコサミノグリカンを用いてペプチドの血中滞留性を増強させるためにはリンカーを用いることが好ましいとの着想を有しておらず、当技術分野においては、糖鎖とペプチドを結合するために用いるリンカーの構造がペプチドの血中滞留性に影響するとは認識されていなかった。
【００１０】
本発明者らは、ペプチドの血中滞留性を増強させる手段についての検討を鋭意行った。その結果、本発明者らは、リンカーを介してコンドロイチンやヘパロサン等のグリコサミノグリカンとペプチドを結合させることにより、ペプチドの血中滞留性を増強できることを見出した。また、本発明者らは、特に、特定の構造を有するリンカーを採用することにより、ペプチドの血中滞留性を顕著に増強できることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１１】
前記課題は、以下の態様を包含する本発明によって解決される。
［Ａ１］
リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させる工程を含む、ペプチドの血中滞留性を増強させる方法。
［Ａ２］
リンカーが、下記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ａ１］に記載の方法。
−Ａ１−    （Ｌ１）
（式中、Ａ１は炭素数１以上のアルキレン基を表す。）
−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−    （Ｌ２）
（式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１は任意の結合を表す。）
−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｙ２−Ａ３−    （Ｌ３）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して任意の結合を表す。）
−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｐｈ−Ａ３−    （Ｌ４）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｐｈはフェニレン基を表す。）
−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−ｃＨｅｘ−Ａ３−    （Ｌ５）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、ｃＨｅｘはシクロヘキシレン基を表す。）
［Ａ３］
リンカーが、下記一般式（Ｌ６）〜（Ｌ１０）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ａ１］に記載の方法。
Ｚ１−Ａ１−    （Ｌ６）
（式中、Ａ１は炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｚ１は任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−    （Ｌ７）
（式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｙ２−Ａ３−    （Ｌ８）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、
Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｐｈ−Ａ３−    （Ｌ９）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表し、Ｐｈはフェニレン基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−ｃＨｅｘ−Ａ３−    （Ｌ１０）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表し、ｃＨｅｘはシクロヘキシレン基を表す。）
［Ａ４］
リンカーが、下記一般式（Ｌ１１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ａ１］に記載の方法。
Ｚ１−Ａ１−Ｚ２    （Ｌ１１）
（式中、Ａ１は炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｚ２    （Ｌ１２）
（式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｙ２−Ａ３−Ｚ２    （Ｌ１３）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して任意の結合を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｐｈ−Ａ３−Ｚ２    （Ｌ１４）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表し、Ｐｈはフェニレン基を表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−ｃＨｅｘ−Ａ３−Ｚ２    （Ｌ１５）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して任意の官能基を表し、ｃＨｅｘはシクロヘキシレン基を表す。）
［Ａ５］
Ｙ１及びＹ２が、それぞれ独立して下記一般式（Ｙ１）〜（Ｙ１２）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ａ２］〜［Ａ４］のいずれかに記載の方法。
−Ｎ＝ＣＨ−    （Ｙ１）
−ＣＨ＝Ｎ−    （Ｙ２）
−ＮＨ−ＣＨ２−    （Ｙ３）
―ＣＨ２−ＮＨ−    （Ｙ４）
−ＮＨ−ＣＯ−    （Ｙ５）
−ＣＯ−ＮＨ−    （Ｙ６）
−Ｓ−    （Ｙ７）
−Ｓ−Ｓ−    （Ｙ８）
−ＣＯ−ＣＨ２−Ｓ−    （Ｙ９）
−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−    （Ｙ１０）
−Ｓｕｃ−Ｓ−    （Ｙ１１）
（式中、Ｓｕｃは１，３−ピロリジン−２，５−ジオン基を表す。）
−Ｓ−Ｓｕｃ−    （Ｙ１２）
（式中、Ｓｕｃは１，３−ピロリジン−２，５−ジオン基を表す。）
［Ａ６］
Ｚ１及びＺ２が、それぞれ独立して下記一般式（Ｚ１）〜（Ｚ７）のいずれかに示され
る構造を有する、前記［Ａ３］〜［Ａ５］のいずれかに記載の方法。
−ＮＨ２    （Ｚ１）
−ＳＨ    （Ｚ２）
−ＣＨＯ    （Ｚ３）
−ＣＯ−ＣＨ２−Ｘ    （Ｚ４）
（式中、Ｘは任意のハロゲン原子を表す。）
−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ    （Ｚ５）
−Ｍａｌ    （Ｚ６）
（式中、ＭａｌはＮ−マレイミド基を表す。）
−ＣＯ−Ｏ−Ｓｕ    （Ｚ７）
（式中、ＳｕはＮ−スクシンイミジル基又は３−スルホ−Ｎ−スクシンイミジル基を表す。）
［Ａ７］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーとペプチドのアミノ酸残基との結合である、前記［Ａ１］〜［Ａ６］のいずれかに記載の方法。
［Ａ８］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーとペプチドのリジン残基、システイン残基、Ｎ末端のアミノ酸残基、及び／又はＣ末端のアミノ酸残基との結合である、前記［Ａ１］〜［Ａ６］のいずれかに記載の方法。
［Ａ９］
リンカーとペプチドのリジン残基との結合が、リンカーとペプチドのリジン残基のε−アミノ基との結合である、前記［Ａ８］に記載の方法。
［Ａ１０］
リンカーとペプチドのシステイン残基との結合が、リンカーとペプチドのシステイン残基のチオール基との結合である、前記［Ａ８］に記載の方法。
［Ａ１１］
リンカーとペプチドのＮ末端のアミノ酸残基との結合が、リンカーとペプチドのＮ末端のアミノ酸残基のα−アミノ基との結合である、前記［Ａ８］に記載の方法。
［Ａ１２］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーの官能基Ｚ１とペプチドの官能基の反応により形成される結合である、前記［Ａ３］〜［Ａ１１］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１３］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの糖残基との結合である、前記［Ａ１］〜［Ａ１２］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１４］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの還元末端の糖残基との結合である、前記［Ａ１］〜［Ａ１２］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１５］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの還元末端の糖残基の１位の炭素原子との結合である、前記［Ａ１］〜［Ａ１２］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１６］
糖残基が、グルコサミン残基、ガラクトサミン残基、又はグルクロン酸残基である、前記［Ａ１３］〜［Ａ１５］のいずれかに記載の方法。
［Ａ１７］
グルコサミン残基が、Ｎ−アセチルグルコサミン残基である、前記［Ａ１６］に記載の方法。
［Ａ１８］
ガラクトサミン残基が、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基である、前記［Ａ１６］に記載の方法。
［Ａ１９］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーの官能基Ｚ２とグリコサミノグリカンの官能基の反応により形成される結合である、前記［Ａ４］〜［Ａ１８］のいずれかに記載の方法。
［Ａ２０］
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン及び／又はヘパロサンである、前記［Ａ１］〜［Ａ１９］のいずれかに記載の方法。
［Ａ２１］
リンカーとペプチドの結合およびリンカーとグリコサミノグリカンの結合が、共有結合である、前記［Ａ１］〜［Ａ２０］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ１］
ペプチドが、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるペプチドである、前記［Ａ１］〜［Ａ２１］のいずれかに記載の方法。
（Ａ）下記（ａ）に示されるＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列を含むペプチド。
（ａ）ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（ＧＬＰ−１（７−３７））
（Ｂ）下記（ｂ１）〜（ｂ３）からなる群より選択されるＧＬＰ−１（７−３７）のアナログのアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ１）ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＣ（ＧＬＰ−１Ｃ）
（ｂ２）ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＲＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（ＧＬＰ−１ＲＫ）
（ｂ３）ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＣ（ＧＬＰ−１ｏｒｉＣ）
（Ｃ）前記（ａ）および（ｂ１）〜（ｂ３）のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、血糖抑制作用を有する、ペプチド。
（Ｄ）前記（ａ）および（ｂ１）〜（ｂ３）のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、血糖抑制作用を有する、ペプチド。
［Ｂ２］
リンカーが、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造を有するリンカーであり、式中、Ａ１が炭素数８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４のアルキレン基である、前記［Ｂ１］に記載の方法。
［Ｂ３］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーと前記［Ｂ１］における（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示されるペプチドの２６位のリジン残基、３４位のリジン残基、３７位のシステイン残基、及び／又はＣ末端のアミノ酸残基との結合である、前記［Ｂ１］又は［Ｂ２］に記載の方法。
［Ｃ１］
ペプチドが、下記（Ａ）に示されるペプチド及び下記（Ｂ）に示されるペプチドを含むペプチド多量体であって、血糖抑制作用を有するペプチド多量体である、前記［Ａ１］〜［Ａ２１］のいずれかに記載の方法。
（Ａ）下記（ａ１）に示されるインスリンＡ鎖のアミノ酸配列を含むペプチド、又は下記（ａ２）若しくは（ａ３）に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ａ１）ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
（ａ２）前記（ａ１）に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
（ａ３）前記（ａ１）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
（Ｂ）下記（ｂ１）に示されるインスリンＢ鎖のアミノ酸配列を含むペプチド、又は下記
（ｂ２）若しくは（ｂ３）に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ１）ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ
（ｂ２）前記（ｂ１）に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
（ｂ３）前記（ｂ１）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
［Ｃ２］
リンカーが、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造を有するリンカーであり、式中、Ａ１が炭素数１、２、３、４、５、又は６のアルキレン基である、前記［Ｃ１］に記載の方法。
［Ｃ３］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーと前記［Ｃ１］における（Ｂ）に示されるペプチドの２９位のリジン残基、及び／又は前記［Ｃ１］における（Ａ）に示されるペプチドのＮ末端のアミノ酸残基である、前記［Ｃ１］又は［Ｃ２］に記載の方法。
［Ｃ４］
ペプチド多量体が、前記［Ｃ１］における（Ａ）に示されるペプチド及び前記［Ｃ１］における（Ｂ）に示されるペプチドからなるペプチド二量体であって、血糖抑制作用を有するペプチド二量体である、前記［Ｃ１］〜［Ｃ３］のいずれかに記載の方法。
［Ｄ１］
前記［Ａ１］〜［Ａ２１］、［Ｂ１］〜［Ｂ３］、又は［Ｃ１］〜［Ｃ４］のいずれかに記載の方法を行う工程を含む、血中滞留性が増強されたペプチドの製造方法。
［Ｄ２］
前記［Ｂ１］〜［Ｂ３］のいずれかに記載の方法を行う工程を含む、血中滞留性が増強されたＧＬＰ−１誘導体の製造方法。
［Ｄ３］
前記［Ｃ１］〜［Ｃ４］のいずれかに記載の方法を行う工程を含む、血中滞留性が増強されたインスリン誘導体の製造方法。
［Ｅ１］
Ｚ１−Ｌ−Ｇで示される構造を有する、グリコサミノグリカンの誘導体。
（式中、Ｚ１は任意の官能基を表し、Ｌはリンカーを表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
［Ｅ２］
Ｌが、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｅ１］に記載の誘導体。
［Ｅ３］
Ｚ１−Ｌが、前記一般式（Ｌ６）〜（Ｌ１０）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｅ１］に記載の誘導体。
［Ｅ４］
Ｚ１−Ｌ−Ｇが、下記一般式（Ｌ１６）〜（Ｌ２０）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｅ１］に記載の誘導体。
Ｚ１−Ａ１−Ｇ    （Ｌ１６）
（式中、Ａ１は炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｚ１は任意の官能基を表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｇ    （Ｌ１７）
（式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｙ２−Ａ３−Ｇ    （Ｌ１８）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｐｈ−Ａ３−Ｇ    （Ｌ１９）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表し、Ｐｈはフェニレン基を表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
Ｚ１−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−ｃＨｅｘ−Ａ３−Ｇ    （Ｌ２０）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｚ１は任意の官能基を表し、ｃＨｅｘはシクロヘキシレン基を表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
［Ｅ５］
Ｙ１及びＹ２が、それぞれ独立して前記一般式（Ｙ１）〜（Ｙ１２）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｅ２］〜［Ｅ４］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ６］
Ｚ１が、前記一般式（Ｚ１）〜（Ｚ７）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｅ１］〜［Ｅ５］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ７］
リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させ、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させて、ペプチドの血中滞留性を増強させるために用いられる、前記［Ｅ１］〜［Ｅ６］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ８］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーとペプチドのアミノ酸残基との結合である、前記［Ｅ７］に記載の誘導体。
［Ｅ９］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーとペプチドのリジン残基、システイン残基、Ｎ末端のアミノ酸残基、及び／又はＣ末端のアミノ酸残基との結合である、前記［Ｅ７］に記載の誘導体。
［Ｅ１０］
リンカーとペプチドのリジン残基との結合が、リンカーとペプチドのリジン残基のε−アミノ基との結合である、前記［Ｅ９］に記載の誘導体。
［Ｅ１１］
リンカーとペプチドのシステイン残基との結合が、リンカーとペプチドのシステイン残基のチオール基との結合である、前記［Ｅ９］に記載の誘導体。
［Ｅ１２］
リンカーとペプチドのＮ末端のアミノ酸残基との結合が、リンカーとペプチドのＮ末端のアミノ酸残基のα−アミノ基との結合である、前記［Ｅ９］に記載の誘導体。
［Ｅ１３］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーの官能基Ｚ１とペプチドの官能基の反応により形成される結合である、前記［Ｅ７］〜［Ｅ１２］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ１４］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの糖残基との結合である、前記［Ｅ１］〜［Ｅ１３］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ１５］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの還元末端の糖残基との結合である、前記［Ｅ１］〜［Ｅ１３］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ１６］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの還元末端の糖残基の１位の炭素原子との結合である、前記［Ｅ１］〜［Ｅ１３］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ１７］
糖残基が、グルコサミン残基、ガラクトサミン残基、又はグルクロン酸残基である、前記［Ｅ１４］〜［Ｅ１６］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ１８］
グルコサミン残基が、Ｎ−アセチルグルコサミン残基である、前記［Ｅ１７］に記載の誘導体。
［Ｅ１９］
ガラクトサミン残基が、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基である、前記［Ｅ１７］に記載の誘導体。
［Ｅ２０］
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン及び／又はヘパロサンである、前記［Ｅ１］〜［Ｅ１９］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ２１］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、共有結合である、前記［Ｅ１］〜［Ｅ２０］のいずれかに記載のグリコサミノグリカンの誘導体。
［Ｅ２２］
リンカーとペプチドの結合が、共有結合である、前記［Ｅ７］〜［Ｅ２１］のいずれかに記載のグリコサミノグリカンの誘導体。
［Ｅ２３］
前記［Ａ１］〜［Ａ２１］、［Ｂ１］〜［Ｂ３］、［Ｃ１］〜［Ｃ４］、又は［Ｄ１］〜［Ｄ３］のいずれかに記載の方法を行うために用いられる、前記［Ｅ１］〜［Ｅ２２］のいずれかに記載の誘導体。
［Ｅ２４］
前記［Ｅ１］〜［Ｅ２３］のいずれかに記載の誘導体を含有する、ペプチドの血中滞留性を増強するための増強剤。
［Ｆ１］
Ｐ−Ｌ−Ｇで示される構造を有する、グリコサミノグリカンとペプチドの複合体。
（式中、Ｐはペプチドを表し、Ｌはリンカーを表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
［Ｆ２］
Ｌが、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｆ１］に記載の複合体。
［Ｆ３］
Ｐ−Ｌが、下記一般式（Ｌ２１）〜（Ｌ２５）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｆ１］に記載の複合体。
Ｐ−Ａ１−    （Ｌ２１）
（式中、Ａ１は炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｐはペプチドを表す。）
Ｐ−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−    （Ｌ２２）
（式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｐはペプチドを表す。）
Ｐ−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｙ２−Ａ３−    （Ｌ２３）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して任意の結合を表し、Ｐはペプチドを表す。）
Ｐ−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｐｈ−Ａ３−    （Ｌ２４）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｐｈはフェニレン基を表し、Ｐはペプチドを表す。）
Ｐ−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−ｃＨｅｘ−Ａ３−    （Ｌ２５）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、ｃＨｅｘはシクロヘキシレン基を表し、Ｐはペプチドを表す。）
［Ｆ４］
Ｐ−Ｌ−Ｇが、下記一般式（Ｌ２６）〜（Ｌ３０）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｆ１］に記載の複合体。
Ｐ−Ａ１−Ｇ    （Ｌ２６）
（式中、Ａ１は炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｐはペプチドを表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
Ｐ−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｇ    （Ｌ２７）
（式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｐはペプチドを表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
Ｐ−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｙ２−Ａ３−Ｇ    （Ｌ２８）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立して任意の結合を表し、Ｐはペプチドを表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
Ｐ−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−Ｐｈ−Ａ３−Ｇ    （Ｌ２９）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｐはペプチドを表し、Ｐｈはフェニレン基を表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
Ｐ−Ａ１−Ｙ１−Ａ２−ｃＨｅｘ−Ａ３−Ｇ    （Ｌ３０）
（式中、Ａ１、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して炭素数１以上のアルキレン基を表し、Ａ２及びＡ３はそれぞれ独立して存在してもしなくてもよく、Ｙ１は任意の結合を表し、Ｐはペプチドを表し、ｃＨｅｘはシクロヘキシレン基を表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）
［Ｆ５］
Ｙ１及びＹ２が、それぞれ独立して前記一般式（Ｙ１）〜（Ｙ１２）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｆ２］〜［Ｆ４］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ６］
ペプチドそのものと比較して血中滞留性が増強されている、前記［Ｆ１］〜［Ｆ５］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ７］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーとペプチドのアミノ酸残基との結合である、前記［Ｆ１］〜［Ｆ６］
のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ８］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーとペプチドのリジン残基、システイン残基、Ｎ末端のアミノ酸残基、及び／又はＣ末端のアミノ酸残基との結合である、前記［Ｆ１］〜［Ｆ６］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ９］
リンカーとペプチドのリジン残基との結合が、リンカーとペプチドのリジン残基のε−アミノ基との結合である、前記［Ｆ８］に記載の複合体。
［Ｆ１０］
リンカーとペプチドのシステイン残基との結合が、リンカーとペプチドのシステイン残基のチオール基との結合である、前記［Ｆ８］に記載の複合体。
［Ｆ１１］
リンカーとペプチドのＮ末端のアミノ酸残基との結合が、リンカーとペプチドのＮ末端のアミノ酸残基のα−アミノ基との結合である、前記［Ｆ８］に記載の複合体。
［Ｆ１２］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの糖残基との結合である、前記［Ｆ１］〜［Ｆ１１］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ１３］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの還元末
端の糖残基との結合である、前記［Ｆ１］〜［Ｆ１１］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ１４］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの還元末端の糖残基の１位の炭素原子との結合である、前記［Ｆ１］〜［Ｆ１１］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ１５］
糖残基が、グルコサミン残基、ガラクトサミン残基、又はグルクロン酸残基である、前記［Ｆ１２］〜［Ｆ１４］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ１６］
グルコサミン残基が、Ｎ−アセチルグルコサミン残基である、前記［Ｆ１５］に記載の複合体。
［Ｆ１７］
ガラクトサミン残基が、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基である、前記［Ｆ１５］に記載の複合体。
［Ｆ１８］
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン及び／又はヘパロサンである、前記［Ｆ１］〜［Ｆ１７］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ１９］
リンカーとペプチドの結合およびリンカーとグリコサミノグリカンの結合が、共有結合である、前記［Ｆ１］〜［Ｆ１８］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ２０］
グリコサミノグリカンとペプチドの複合体が、前記［Ｄ１］〜［Ｄ３］のいずれかに記載の方法を行うことにより得られる複合体である、前記［Ｆ１］〜［Ｆ１９］のいずれかに記載の複合体。
［Ｆ２１］
前記［Ｆ１］〜［Ｆ２０］のいずれかに記載の複合体を含有する、医薬組成物。
［Ｆ２２］
前記［Ｆ１］〜［Ｆ２０］のいずれかに記載の複合体を含有する、ペプチド製剤。
［Ｇ１］
ペプチドが、前記［Ｂ１］における（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるペプチドである、前記［Ｆ１］〜［Ｆ２０］のいずれかに記載の複合体。
［Ｇ２］
前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）または（Ｌ２１）〜（Ｌ３０）のいずれかに示される構造において、Ａ１が炭素数８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４のアルキレン基である、前記［Ｇ１］に記載の複合体。
［Ｇ３］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーと前記［Ｂ１］における（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示されるペプチドの２６位のリジン残基、３４位のリジン残基、３７位のシステイン残基、及び／又はＣ末端のアミノ酸残基との結合である、前記［Ｇ１］又は［Ｇ２］に記載の複合体。
［Ｇ４］
前記［Ｇ１］〜［Ｇ３］のいずれかに記載の複合体を含有する、医薬組成物。
［Ｇ５］
前記［Ｇ１］〜［Ｇ３］のいずれかに記載の複合体を含有する、ペプチド製剤。
［Ｇ６］
前記［Ｇ１］〜［Ｇ３］のいずれかに記載の複合体を含有する、ＧＬＰ−１製剤。
［Ｈ１］
ペプチドが、前記［Ｃ１］における（Ａ）に示されるペプチド及び前記［Ｃ１］における（Ｂ）に示されるペプチドを含むペプチド多量体であって、血糖抑制作用を有するペプチド多量体である、前記［Ｆ１］〜［Ｆ２０］のいずれかに記載の複合体。
［Ｈ２］
リンカーが、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）または（Ｌ２１）〜（Ｌ３０）のいずれかに示される構造を有するリンカーであり、式中、Ａ１が炭素数１、２、３、４、５、又は６のアルキレン基である、前記［Ｈ１］に記載の複合体。
［Ｈ３］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーと前記［Ｃ１］における（Ｂ）に示されるペプチドの２９位のリジン残基、及び／又は前記［Ｃ１］における（Ａ）に示されるペプチドのＮ末端のアミノ酸残基との結合である、前記［Ｈ１］又は［Ｈ２］に記載の複合体。
［Ｈ４］
ペプチド多量体が、前記［Ｃ１］における（Ａ）に示されるペプチド及び前記［Ｃ１］における（Ｂ）に示されるペプチドからなるペプチド二量体であって、血糖抑制作用を有するペプチド二量体である、前記［Ｈ１］〜［Ｈ３］のいずれかに記載の複合体。
［Ｈ５］
前記［Ｈ１］〜［Ｈ４］のいずれかに記載の複合体を含有する、医薬組成物。
［Ｈ６］
前記［Ｈ１］〜［Ｈ４］のいずれかに記載の複合体を含有する、ペプチド製剤。
［Ｈ７］
前記［Ｈ１］〜［Ｈ４］のいずれかに記載の複合体を含有する、インスリン製剤。
［Ｉ１］
炭素数が１以上のアルキレン基を含む構造を有するリンカーであって、これを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させてペプチドの血中滞留性を増強するために用いられるリンカー。
［Ｉ２］
リンカーが、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造を有するリンカーである、前記［Ｉ１］に記載のリンカー。
［Ｉ３］
Ｙ１及びＹ２が、それぞれ独立して前記一般式（Ｙ１）〜（Ｙ１２）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｉ２］に記載のリンカー。
［Ｉ４］
Ｚ１が、前記一般式（Ｚ１）〜（Ｚ７）のいずれかに示される構造を有する、前記［Ｉ２］又は［Ｉ３］に記載のリンカー。
［Ｉ５］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーとペプチドのアミノ酸残基との結合である、前記［Ｉ１］〜［Ｉ４］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ６］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーとペプチドのリジン残基、システイン残基、Ｎ末端のアミノ酸残基、及び／又はＣ末端のアミノ酸残基との結合である、前記［Ｉ１］〜［Ｉ５］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ７］
リンカーとペプチドのリジン残基との結合が、リンカーとペプチドのリジン残基のε−アミノ基との結合である、前記［Ｉ１］〜［Ｉ６］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ８］
リンカーとペプチドのシステイン残基との結合が、リンカーとペプチドのシステイン残基のチオール基との結合である、前記［Ｉ１］〜［Ｉ７］のいずれかに記載のリンカー。［Ｉ９］
リンカーとペプチドのＮ末端のアミノ酸残基との結合が、リンカーとペプチドのＮ末端のアミノ酸残基のα−アミノ基との結合である、前記［Ｉ１］〜［Ｉ８］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ１０］
リンカーとペプチドの結合が、リンカーの官能基Ｚ１とペプチドの官能基の反応により
形成される結合である、前記［Ｉ２］〜［Ｉ９］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ１１］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの糖残基との結合である、前記［Ｉ１］〜［Ｉ１０］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ１２］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの還元末端の糖残基との結合である、前記［Ｉ１］〜［Ｉ１１］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ１３］
リンカーとグリコサミノグリカンの結合が、リンカーとグリコサミノグリカンの還元末端の糖残基の１位の炭素原子との結合である、前記［Ｉ１］〜［Ｉ１２］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ１４］
糖残基が、グルコサミン残基、ガラクトサミン残基、又はグルクロン酸残基である、前記［Ｉ１１］〜［Ｉ１３］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ１５］
グルコサミン残基が、Ｎ−アセチルグルコサミン残基である、前記［Ｉ１４］に記載のリンカー。
［Ｉ１６］
ガラクトサミン残基が、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基である、前記［Ｉ１４］に記載のリンカー。
［Ｉ１７］
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン及び／又はヘパロサンである、前記［Ｉ１］〜［Ｉ１６］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ１８］
リンカーとペプチドの結合およびリンカーとグリコサミノグリカンの結合が、共有結合である、前記［Ｉ１］〜［Ｉ１７］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ１９］
前記［Ａ１］〜［Ａ２１］、［Ｂ１］〜［Ｂ３］、［Ｃ１］〜［Ｃ４］、又は［Ｄ１］〜［Ｄ３］のいずれかに記載の方法を行うために用いられる、前記［Ｉ１］〜［Ｉ１８］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ２０］
前記［Ｅ１］〜［Ｅ２３］のいずれかに記載の誘導体を製造するために用いられる、前記［Ｉ１］〜［Ｉ１８］のいずれかに記載のリンカー。
［Ｉ２１］
前記［Ｆ１］〜［Ｆ２０］、［Ｇ１］〜［Ｇ３］、又は［Ｈ１］〜［Ｈ４］のいずれかに記載の複合体を製造するために用いられる、前記［Ｉ１］〜［Ｉ１８］のいずれかに記載のリンカー。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ペプチドの血中滞留性を増強することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】コンドロイチンとＧＬＰ−１を含む複合体のマウスにおける血中濃度の推移を示す図である。
【図２】コンドロイチンとＧＬＰ−１を含む複合体のマウスにおける血中濃度の推移を示す図である。
【図３】コンドロイチンとＧＬＰ−１を含む複合体のマウスにおける薬効持続性を示す図である。
【図４】コンドロイチンとＧＬＰ−１を含む複合体のマウスにおける薬効持続性を示す図である。
【図５】ヘパロサンとＧＬＰ−１を含む複合体のマウスにおける血中濃度の推移を示す図である。
【図６】ヘパロサンとＧＬＰ−１を含む複合体のマウスまたはラットにおける血中濃度の推移の比較を示す図である。
【図７】ヘパロサンとＧＬＰ−１を含む複合体のマウスにおける薬効持続性を示す図である。
【図８】コンドロイチンとインスリンを含む複合体のマウスにおける血中濃度の推移を示す図である。
【図９】コンドロイチンとインスリンを含む複合体のマウスにおける血中濃度の推移を示す図である。
【図１０】コンドロイチンとインスリンを含む複合体のマウスにおける血中濃度の推移を示す図である。
【図１１】コンドロイチンとインスリンを含む複合体のマウスにおける薬効持続性を示す図である。
【図１２】ヘパロサンとインスリンを含む複合体のマウスにおける血中濃度の推移を示す図である。
【図１３】ヘパロサンとインスリンを含む複合体のラットにおける血中濃度の推移を示す図である。
【図１４】ヘパロサンとインスリンを含む複合体のマウスにおける薬効持続性を示す図である。
【図１５】ヘパロサンとインスリンを含む複合体のラットにおける薬効持続性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において「或る対象物（例えば、複合体、誘導体、リンカー、官能基、および結合）が或る構成要素（例えば、構造、官能基、および結合）を有する」という表現は、特記しない限り、当該対象物が当該構成要素を含むことを意味し、当該対象物が当該構成要素からなる場合も包含する。
【００１５】
本発明においては、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させることにより、ペプチドの血中滞留性を増強することができる。本発明においては、具体的には、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させることにより、ペプチドの血中滞留性を増強することができる。すなわち、本発明においては、当該複合体を形成させることにより、ペプチドそのもの（当該複合体を形成していないペプチド）と比較して、ペプチドの血中滞留性を増強することができる。言い換えると、当該複合体においては、ペプチドそのもの（当該複合体を形成していないペプチド）と比較して、増強されたペプチドの血中滞留性が得られる。
【００１６】
本発明において「グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体」は、グリコサミノグリカンと、当該グリコサミノグリカンに結合したリンカーと、当該リンカーに結合したペプチドとを含む複合体を意味する。言い換えると、本発明において「グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体」は、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドが結合した構造を有する複合体を意味する。グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体は、一態様において、グリコサミノグリカンと、当該グリコサミノグリカンに結合したリンカーと、当該リンカーに結合したペプチドからなる複合体であってよく、言い換えると、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドが結合した構造からなる複合体であってよい。また、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体は、ペプチドそのもの（当該複合体を形成していないペプチド）と比較して血中滞留性が増強されたペプチドの複合体でもある。グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体は、具体的には、後述する「
本発明の複合体」であってよい。
【００１７】
本発明において「血中滞留性」は、血中持続性または血中安定性に言い換えることができる。また、本発明において「増強」は、付与、改善、または向上に言い換えることができる。よって、本発明において「血中滞留性の増強」は、血中滞留性の付与、血中滞留性の改善、血中滞留性の向上、血中持続性の増強、血中安定性の増強等に言い換えることができる。また、本発明において「ペプチドの血中滞留性の増強」は、血中におけるペプチドの活性維持等に言い換えることができる。さらに、本発明において「血中滞留性」は、「薬効持続性」または「血中滞留性および薬効持続性」に言い換えることができる。
【００１８】
血中滞留性は、例えば、血中半減期として測定することができる。本発明において「ペプチドの血中滞留性の増強」は、好ましくは、例えば、ペプチドの血中半減期（すなわちグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体の血中半減期）が１時間以上、３時間以上、６時間以上、９時間以上、１２時間以上、１５時間以上、１８時間以上、２４時間以上、または３０時間以上となることを意味してよい。本発明において「ペプチドの血中滞留性の増強」は、ペプチドの血中半減期（すなわちグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体の血中半減期）が、好ましくは１５時間以上、１８時間以上、２４時間以上、または３０時間以上、より好ましくは２４時間以上または３０時間以上、さらに好ましくは３０時間以上となることを意味してよい。
【００１９】
本発明において「ペプチドの薬効持続性の増強」は、好ましくは、例えば、ヒト等の動物においてペプチドが薬効を示す期間が１２時間以上、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、または７日以上となることを意味してよい。
【００２０】
本発明においてリンカーを介したグリコサミノグリカンとペプチドの結合は、ペプチドの血中滞留性を増強させるために行われてもよいし、ペプチドの薬効持続性を増強させるために行われてもよいし、ペプチドの血中滞留性および薬効持続性を増強させるために行われてもよい。
【００２１】
＜１＞本発明の増強方法
本発明の増強方法は、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させる工程を含む、ペプチドの血中滞留性を増強させる方法である。当該工程を「結合工程」ともいう。本発明の増強方法は、具体的には、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させる工程を含む、ペプチドの血中滞留性を増強させる方法である。すなわち、結合工程は、具体的には、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させる工程である。
【００２２】
結合工程の実施態様は、上記複合体の構成要素（例えば、グリコサミノグリカン、リンカー、およびペプチド）の構成等の諸条件に応じて適宜設定できる。結合工程においては、１つの結合（１箇所の結合）のみを形成させてもよく、複数の結合（複数箇所の結合）を形成させてもよい。結合工程において複数の結合を形成させる場合、それら複数の結合の形成は、同時に行われてもよいし、別々に行われてもよい。例えば、結合工程において、グリコサミノグリカン、リンカー、およびペプチドの結合を形成させる場合、それらの結合の形成は同時に行われてもよいし、別々に行われてもよい。これらの構成要素は、予め一部が結合していてもよい。例えば、結合工程に供されるグリコサミノグリカンおよびペプチドは、いずれも、リンカーを有していてもよく、有していなくてもよい。リンカーを有するグリコサミノグリカンおよびリンカーを有するペプチドとしては、それぞれ、予めリンカーを結合させたグリコサミノグリカンおよび予めリンカーを結合させたペプチドが挙げられる。例えば、リンカーを有するグリコサミノグリカンとして、具体的には、後
述する「本発明のグリコサミノグリカン誘導体」が挙げられる。すなわち、例えば、結合工程においては、（Ａ）リンカーを有するグリコサミノグリカンとペプチドを結合させる工程が行われてもよいし、（Ｂ）リンカーを有するペプチドとグリコサミノグリカンを結合させる工程が行われてもよい。また、例えば、結合工程においては、（Ｃ）リンカーを有するグリコサミノグリカンとリンカーを有するペプチドを結合させる工程が行われてもよい。（Ｃ）の場合、リンカー同士の結合（すなわち、グリコサミノグリカンが有するリンカーとペプチドが有するリンカーとの結合）により、完全長のリンカーが形成され得る。よって、（Ｃ）の場合、特に、グリコサミノグリカンおよびペプチドがそれぞれ有するリンカーを「リンカーの一部」ともいう。結合工程は、予めグリコサミノグリカンとリンカーを結合させる工程、予めペプチドとリンカーを結合させる工程、またはそれらの工程の両方を含んでいてもよい。すなわち、例えば、結合工程においては、（Ａ１）グリコサミノグリカンとリンカーを結合させる工程が行われた後にペプチドを結合させる工程が行われてもよいし、（Ｂ１）リンカーとペプチドを結合させる工程が行われた後にグリコサミノグリカンを結合させる工程が行われてもよい。また、例えば、結合工程においては、（Ｃ１）グリコサミノグリカンとペプチドにそれぞれリンカーの一部を結合させる工程が行われた後に、結果物を結合させる（リンカーの一部を結合させたグリコサミノグリカンとリンカーの一部を結合させたペプチドとを結合させる）工程が行われてもよい。
【００２３】
これらの構成要素間の結合は、例えば、これらの構成要素を適当な反応系において共存させることにより形成できる。反応条件は、これらの構成要素間の結合の形成が可能な条件である限り、特に制限されない。反応条件は、これら構成要素の構成やこれら構成要素間の結合様式等の諸条件に応じて適宜設定できる。なお、後述するグリコサミノグリカンまたはペプチドとリンカーとの結合様式についての記載は、リンカーを有するグリコサミノグリカンとリンカーを有するペプチドを結合させる場合のリンカー同士の結合様式にも準用できる。反応条件としては、例えば、結合に用いられる官能基間の公知の反応条件が挙げられる。反応条件として、具体的には、例えば、実施例の反応条件が挙げられる。
【００２４】
形成された複合体は、適宜、回収することができる。すなわち、本発明の増強方法は、さらに、形成された複合体を回収する工程を含んでいてもよい。当該工程を「回収工程」ともいう。複合体の回収は、例えば、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により実施することができる。
【００２５】
本発明の増強方法によれば、ペプチドの血中滞留性を増強することができる。
【００２６】
＜２＞本発明の製造方法
本発明の製造方法は、本発明の増強方法を行う工程を含む（すなわち、本発明の増強方法において行われる工程を含む）、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体の製造方法であり、血中滞留性が増強されたペプチドの製造方法である。すなわち、本発明の製造方法は、上述した結合工程を含む。また、本発明の製造方法は、さらに、上述した回収工程を含んでいてもよい。本発明の製造方法によれば、ペプチドそのもの（当該複合体を形成していないペプチド）と比較して血中滞留性が増強されたペプチドを提供することができる。
【００２７】
＜３＞本発明のグリコサミノグリカン誘導体
本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、グリコサミノグリカンと、当該グリコサミノグリカンに結合したリンカーとを含む、グリコサミノグリカンの誘導体である。言い換えると、本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、グリコサミノグリカンとリンカーが結合した構造を有する、グリコサミノグリカンの誘導体である。具体的には、本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、Ｚ１−Ｌ−Ｇ（Ｚ１は任意の官能基を表し、Ｌはリンカーを表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）で示される構造を有する、グリコサミノグリカ
ンの誘導体であってよい。本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、一態様において、グリコサミノグリカンとリンカーが結合した構造からなる（例えば、Ｚ１−Ｌ−Ｇで示される構造からなる）グリコサミノグリカンの誘導体であってよい。
【００２８】
本発明のグリコサミノグリカン誘導体において、リンカー（例えば、上記一般式におけるＬ）としては、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）のいずれかに示される構造を有するものが例示される。また、本発明のグリコサミノグリカン誘導体において、上記一般式におけるＺ１−Ｌとしては、前記一般式（Ｌ６）〜（Ｌ１０）のいずれかに示される構造を有するものが例示される。本発明のグリコサミノグリカン誘導体（例えば、上記一般式におけるＺ１−Ｌ−Ｇ）としては、具体的には、前記一般式（Ｌ１６）〜（Ｌ２０）のいずれかに示される構造を有するものが例示される。前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ１０）および（Ｌ１６）〜（Ｌ２０）において、Ｙ１およびＹ２は、例えば、それぞれ独立して、前記一般式（Ｙ１）〜（Ｙ１２）のいずれかに示される構造（すなわち結合）を有するものであってよい。また、前記一般式（Ｌ６）〜（Ｌ１０）および（Ｌ１６）〜（Ｌ２０）において、Ｚ１は、例えば、前記一般式（Ｚ１）〜（Ｚ７）のいずれかに示される構造（すなわち官能基）を有するものであってよい。
【００２９】
本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、例えば、グリコサミノグリカンとリンカーを結合することにより製造することができる。グリコサミノグリカンとリンカーを結合することは、本発明の増強方法において記載したように行うことができる。
【００３０】
本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、例えば、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を製造するために用いることができる。具体的には、本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、例えば、本発明の増強方法または本発明の製造方法を実施するために用いることができる。より具体的には、本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、例えば、本発明のグリコサミノグリカン誘導体が有するリンカーの官能基（例えば、前記Ｚ１−Ｌ−Ｇで示される一般式においてＺ１で示される官能基）とペプチドが有する官能基を結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させるために用いることができる。本発明のグリコサミノグリカン誘導体との結合に用いられるペプチドは、リンカーを有していてもよい。ペプチドがリンカーを有する場合、本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、例えば、本発明のグリコサミノグリカン誘導体が有するリンカーの官能基とペプチドが有するリンカーの官能基を結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させるために用いることができる。本発明のグリコサミノグリカン誘導体を用いてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させることにより、当該ペプチドの血中滞留性を増強することができる。
【００３１】
＜４＞本発明の増強剤
本発明の増強剤は、本発明のグリコサミノグリカン誘導体を有効成分として含有する、ペプチドの血中滞留性の増強剤（ペプチドの血中滞留性を増強するための増強剤）である。本発明の増強剤は、本発明のグリコサミノグリカン誘導体からなるものであってもよく、その他の成分をさらに含有するものであってもよい。「その他の成分」は、本発明の増強剤の利用態様に応じて許容可能なものであれば特に制限されない。「その他の成分」としては、例えば、本発明の効果を損なわず、かつ保存安定性を向上させる成分が挙げられる。また、本発明の増強剤は、任意の剤形で製剤化されていてよい。本発明の増強剤の剤形は、本発明の増強剤の利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。本発明の増強剤の製剤化は、例えば、公知の手法により行われてよい。
【００３２】
本発明の増強剤における本発明のグリコサミノグリカン誘導体の濃度は、本発明の増強剤を用いてペプチドの血中滞留性を増強することが可能である限り、特に制限されない。本発明の増強剤における本発明のグリコサミノグリカン誘導体の濃度は、本発明の増強剤
の剤型、ペプチドの種類、所望する血中滞留性等の諸条件に応じて適宜設定できる。本発明の増強剤における本発明のグリコサミノグリカン誘導体の濃度は、例えば、０．００１〜１００％（ｗ／ｗ）であってよい。本発明の増強剤は、例えば、そのまま、あるいは適宜、水、生理食塩水、緩衝液、有機溶媒等の溶媒を用いて希釈、分散、または溶解し、用いられてよい。
【００３３】
本発明の増強剤は、例えば、ペプチドの血中滞留性を増強するために用いることができる。具体的には、本発明の増強剤は、例えば、本発明の増強方法または本発明の製造方法を実施するために用いることができる。より具体的には、本発明の増強剤は、例えば、これに含有される本発明のグリコサミノグリカン誘導体が有するリンカーの官能基（例えば、前記Ｚ１−Ｌ−Ｇで示される一般式においてＺ１で示される官能基）とペプチドが有する官能基を結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させるために用いることができる。本発明のグリコサミノグリカン誘導体との結合に用いられるペプチドは、リンカーを有していてもよい。ペプチドがリンカーを有する場合、本発明の増強剤は、例えば、これに含有される本発明のグリコサミノグリカン誘導体が有するリンカーの官能基とペプチドが有するリンカーの官能基を結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させるために用いることができる。本発明の増強剤を用いてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させることにより、当該ペプチドの血中滞留性を増強することができる。
【００３４】
＜５＞本発明の複合体
本発明の複合体は、グリコサミノグリカンと、当該グリコサミノグリカンに結合したリンカーと、当該リンカーに結合したペプチドとを含む複合体である。言い換えると、本発明の複合体は、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドが結合した構造を有する、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体である。具体的には、本発明の複合体は、Ｐ−Ｌ−Ｇ（Ｐはペプチドを表し、Ｌはリンカーを表し、Ｇはグリコサミノグリカンを表す。）で示される構造を有する、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体であってよい。本発明の複合体は、一態様において、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドが結合した構造からなる（例えば、Ｐ−Ｌ−Ｇで示される構造からなる）グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体であってよい。本発明の複合体は、ペプチドそのもの（当該複合体を形成していないペプチド）と比較して血中滞留性が増強されたペプチドの複合体でもある。
【００３５】
本発明の複合体において、上記一般式におけるＬとしては、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）のいずれかに示される構造が例示される。また、本発明の複合体において、上記一般式におけるＰ−Ｌとしては、前記一般式（Ｌ２１）〜（Ｌ２５）のいずれかに示される構造が例示される。
【００３６】
本発明の複合体としては、具体的には、前記一般式（Ｌ２６）〜（Ｌ３０）のいずれかに示される構造が例示される。前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）および（Ｌ２１）〜（Ｌ３０）において、Ｙ１およびＹ２は、例えば、それぞれ独立して前記一般式（Ｙ１）〜（Ｙ１２）のいずれかに示される構造（すなわち結合）を有するものであってよい。
【００３７】
本発明の複合体は、例えば、リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合することにより製造することができる。リンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合することは、本発明の増強方法において記載したように行うことができる。本発明の複合体は、具体的には、例えば、本発明の増強方法または本発明の製造方法により製造することができる。
【００３８】
本発明の複合体は、本発明の複合体そのものとして提供されてもよいし、その他の成分
を含有する態様で提供されてもよい。「その他の成分」は、本発明の複合体の利用態様に応じて許容可能なものであれば特に制限されない。「その他の成分」としては、例えば、本発明の効果を損なわず、かつ薬理学的に許容される成分が挙げられる。また、本発明の複合体は、任意の剤形で製剤化されていてよい。本発明の複合体の剤形は、本発明の複合体の利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。本発明の複合体の製剤化は、例えば、公知の手法により行われてよい。
【００３９】
本発明の複合体は、例えば、これを含有する医薬組成物（以下、「本発明の医薬」ともいう。）またはペプチド製剤（以下、「本発明の製剤」ともいう。）として提供されてもよい。本発明の医薬または本発明の製剤は、例えば、ヒト等の動物における疾患の治療用であってよい。疾患としては、ペプチドの投与対象となる疾患が挙げられる。疾患としては、生活習慣病が挙げられる。生活習慣病としては、脂質異常症、高血圧、糖尿病、肥満が挙げられる。生活習慣病としては、特に、糖尿病が挙げられる。本発明の医薬または本発明の製剤における本発明の複合体の濃度は、ヒト等の動物の治療等の用途に応じた有効な量を含有している限り、特に制限されない。本発明の医薬または本発明の製剤における本発明の複合体の濃度は、それらの剤型、ペプチドの種類、治療の対象となる疾患の種類、所望する血中滞留性等の諸条件に応じて適宜設定できる。本発明の医薬または本発明の製剤における本発明の複合体の濃度は、例えば、０．００１〜１００％（ｗ／ｗ）であってよい。本発明の医薬または本発明の製剤は、例えば、そのまま経口剤や注射剤として用いられてもよいし、輸液に混合して用いられてもよい。
【００４０】
＜６＞本発明におけるリンカー
本発明において「リンカー」は、２つまたはそれ以上の官能基を有する分子（クロスリンカー）であって、これを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させるために用いることが可能な分子を意味する単語として使用される。本発明においてリンカーは、これを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させてグリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体を形成させることにより、当該ペプチドの血中滞留性を増強させることが可能な分子である限り、特に制限されない。本発明においてリンカーの構造は、これを介してグリコサミノグリカンと結合させるペプチドの種類等の諸条件に応じて適宜設定することができる。
【００４１】
本発明においてリンカーは、例えば、アルキレン基を有するリンカーであってよく、言い換えると、アルキレン基を含む構造を有するリンカーであってよい。本発明においてリンカーは、具体的には、例えば、炭素数が１以上のアルキレン基を含む構造を有するリンカーであって、これを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させてペプチドの血中滞留性を増強するために用いられるリンカーであってよい。本発明においてリンカーは、アルキレン基を１つのみ有するリンカーであってもよく、２つまたはそれ以上有するリンカーであってもよい。
【００４２】
本発明においてアルキレン基は、特に制限されない。本発明においてアルキレン基は、側鎖を有しない直鎖アルキレン基であってもよく、側鎖を有する直鎖アルキレン基であってもよく、側鎖を有しないシクロアルキレン基であってもよく、側鎖を有するシクロアルキレン基であってもよい。本発明においてアルキレン基は、側鎖を有しない直鎖アルキレン基または側鎖を有しないシクロアルキレン基であることが好ましく、側鎖を有しない直鎖アルキレン基であることがより好ましい。本発明においてアルキレン基は、飽和アルキレン基であってもよく、不飽和アルキレン基であってもよい。本発明においてアルキレン基は、飽和アルキレン基であることが好ましい。
【００４３】
本発明においてアルキレン基は、鎖中にヘテロ原子を有しないアルキレン基であってもよく、鎖中にヘテロ原子を有するアルキレン基であってもよい。本発明において「ヘテロ
原子」は、水素及び炭素以外の原子を意味する。ヘテロ原子としては、窒素、酸素、硫黄が例示される。「鎖中にヘテロ原子を有するアルキレン基」とは、アルキレン基を構成する炭素原子の少なくとも１つがヘテロ原子で置換された構造からなるアルキレン基を意味する。アルキレン基に含まれるヘテロ原子は、１つであってもよく、２つまたはそれ以上であってもよい。アルキレン基に含まれるヘテロ原子の種類は、１種であってもよく、２種またはそれ以上であってもよい。本発明においてアルキレン基は、鎖中にヘテロ原子を有しないアルキレン基であることが好ましい。
【００４４】
本発明においてアルキレン基は、置換基を有しないアルキレン基であってもよく、置換基を有するアルキレン基であってもよい。本発明において「置換基」は、水素及び炭素以外の原子または原子団を意味する。「置換基を有するアルキレン基」とは、アルキレン基を構成する水素原子の少なくとも１つが置換基で置換された構造からなるアルキレン基を意味する。アルキレン基に含まれる置換基は、１つであってもよく、２つまたはそれ以上であってもよい。アルキレン基に含まれる置換基の種類は、１種であってもよく、２種またはそれ以上であってもよい。本発明においてアルキレン基は、置換基を有しないアルキレン基であることが好ましい。
【００４５】
本発明においてアルキレン基が有する炭素原子の数は、特に制限されない。当該炭素原子の数は、例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、または１２以上であってよい。当該炭素原子の数は、例えば、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、または３以下であってよい。当該炭素原子の数は、例えば、それらの矛盾しない組み合わせの範囲であってよい。当該炭素原子の数は、例えば、１〜１６、１〜１２、１〜８、１〜４、１〜３、１〜２、２〜３、２〜４、４〜１４、８〜１４、８〜１３、８〜１２、９〜１３、９〜１２、９〜１１、１０〜１２、または１０〜１１であってよい。当該炭素原子の数は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６であってよい。当該アルキレン基が鎖中にヘテロ原子を有するアルキレン基である場合、上記例示した炭素原子の数は、炭素原子とヘテロ原子の総数を意味する。
【００４６】
本発明においてリンカーは、具体的には、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ５）のいずれかに示される構造を有するリンカーであってよい。本発明においてリンカーは、より具体的には、前記一般式（Ｌ６）〜（Ｌ１０）のいずれかに示される構造を有するリンカーであってよい。本発明におけるリンカーは、さらに具体的には、前記一般式（Ｌ１１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造を有するリンカーであってよい。本発明においてリンカーは、一態様において、前記一般式（Ｌ１１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造からなるリンカーであってもよい。
【００４７】
前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ１５）においてＡ１、Ａ２、及びＡ３は、それぞれ独立して、上記のようなアルキレン基であってよい。
【００４８】
なお、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ１５）における各構成要素についての記載は、他の一般式（例えば、前記一般式（Ｌ１６）〜（Ｌ３０））におけるそれらに該当する構成要素にも準用できる。以下、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ１５）に加えて、他の一般式における各構成要素についてもまとめて記載する場合がある。
【００４９】
前記一般式（Ｌ４）、（Ｌ９）、（Ｌ１４）、（Ｌ１９）、（Ｌ２４）、または（Ｌ２９）においてフェニレン基は、１，２−フェニレン基、１，３−フェニレン基、１，４−フェニレン基のいずれであってもよいが、１，３−フェニレン基または１，４−フェニレン基であることが好ましく、１，４−フェニレン基であることがより好ましい。
【００５０】
前記一般式（Ｌ５）、（Ｌ１０）、（Ｌ１５）、（Ｌ２０）、（Ｌ２５）、または（Ｌ３０）においてシクロヘキシレン基は、１，２−シクロヘキシレン基、１，３−シクロヘキシレン基、１，４−シクロヘキシレン基のいずれであってもよいが、１，３−シクロヘキシレン基または１，４−シクロヘキシレン基であることが好ましく、１，４−シクロヘキシレン基であることがより好ましい。当該ヘキシレン基は、シス体であってもよく、トランス体であってもよい。
【００５１】
前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ３０）において、Ｙ１およびＹ２は、例えば、それぞれ独立して、前記一般式（Ｙ１）〜（Ｙ１２）のいずれかに示される構造（すなわち結合）を有するものであってよい。
【００５２】
前記一般式（Ｙ１１）に示される結合は、具体的には、下記構造式（Ｙ１３）に示される結合である。
【００５３】
【化１】
2019218265.tif 000003
【００５４】
前記一般式（Ｙ１２）に示される結合は、具体的には、下記構造式（Ｙ１４）に示される結合である。
【００５５】
【化２】
2019218265.tif 000004
【００５６】
前記一般式（Ｌ６）〜（Ｌ２０）において、Ｚ１及びＺ２は、例えば、それぞれ独立して、前記一般式（Ｚ１）〜（Ｚ７）のいずれかに示される構造（すなわち官能基）を有するものであってよい。
【００５７】
前記一般式（Ｚ４）において、Ｘとしては、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）が例示される。前記一般式（Ｚ４）において、Ｘは臭素（Ｂｒ）またはヨウ素（Ｉ）であることが好ましく、臭素（Ｂｒ）であることがより好ましい。
【００５８】
前記一般式（Ｚ６）に示される官能基は、具体的には、下記構造式（Ｚ８）に示される官能基である。
【００５９】
【化３】
2019218265.tif 000005
【００６０】
前記一般式（Ｚ７）に示される官能基は、具体的には、下記構造式（Ｚ９）に示される官能基である。
【００６１】
【化４】
2019218265.tif 000006
（式中、Ｒ１は水素、又はＳＯ３Ｒ２を表し、Ｒ２は水素、又は任意のアルカリ金属原子を表す。）
【００６２】
上記構造式（Ｚ９）において、アルカリ金属原子としては、リチウム（Ｌｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）が例示される。上記構造式（Ｚ９）において、アルカリ金属原子は、ナトリウム（Ｎａ）であることが好ましい。
【００６３】
本発明においてリンカーは、例えば、下記構造式（Ｘ１）〜（Ｘ２６）のいずれかに示されるリンカーあってよい。また、本発明においてリンカーは、例えば、下記構造式（Ｘ１）〜（Ｘ２６）に示される構造の組み合わせからなるリンカーであってもよい。組み合わせは、下記構造式（Ｘ１）〜（Ｘ２６）から選択される単一の構造の２つまたはそれ以上の組み合わせであってもよく、下記構造式（Ｘ１）〜（Ｘ２６）から選択される２種またはそれ以上の構造の組み合わせであってもよく、それらのさらなる組み合わせであってもよい。組み合わせとして、具体的には、例えば、実施例に記載の組み合わせが挙げられる。
【００６４】
【化５】
2019218265.tif 000007
【００６５】
【化６】
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【００６６】
【化７】
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【００６７】
【化８】
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【００６８】
【化９】
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【００６９】
【化１０】
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【００７０】
【化１１】
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【００７１】
【化１２】
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【００７２】
【化１３】
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【００７３】
【化１４】
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【００７４】
【化１５】
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【００７５】
【化１６】
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【００７６】
【化１７】
2019218265.tif 000019
【００７７】
【化１８】
2019218265.tif 000020
【００７８】
【化１９】
2019218265.tif 000021
【００７９】
【化２０】
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【００８０】
【化２１】
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【００８１】
【化２２】
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【００８２】
【化２３】
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【００８３】
【化２４】
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【００８４】
【化２５】
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【００８５】
【化２６】
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【００８６】
【化２７】
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【００８７】
【化２８】
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【００８８】
【化２９】
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【００８９】
【化３０】
2019218265.tif 000032
【００９０】
本発明においてリンカーは、３つまたはそれ以上の官能基を有していてもよい。本発明において３つまたはそれ以上の官能基を有するリンカーを用いた場合、例えば、２つまたはそれ以上および／または２種またはそれ以上のグリコサミノグリカンを含む複合体を得ることができる。また、本発明において３つまたはそれ以上の官能基を有するリンカーを用いた場合、例えば、２つまたはそれ以上および／または２種またはそれ以上のペプチドを含む複合体を得ることができる。
【００９１】
上述したリンカーにおける官能基（例えば、Ｚ１、Ｚ２、（Ｚ１）〜（Ｚ９）、およびリンカーの構造式中のそれらに該当する部位）は、グリコサミノグリカンまたはペプチドとの結合（例えば、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体の形成）前のリンカーにおける官能基を示す。当該官能基は、グリコサミノグリカンまたはペプチドとの結合に用いられ得る。よって、当該官能基は、グリコサミノグリカンまたはペプチドとの結合後には存在しなくてもよい。すなわち、用いられる構成要素間の結合様式に応じて、当該末端官能基の一部または全部が、形成された結合により置換され得る。
【００９２】
本発明においてリンカーは、完全長のリンカーとして提供され用いられてもよく、そうでなくてもよい。例えば、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体の形成の際に、完全長のリンカーが形成されてもよい。具体的には、例えば、リンカーを有するグリコサミノグリカンとリンカーを有するペプチドを結合させる場合、リンカー同士の結合（すなわち、グリコサミノグリカンが有するリンカーとペプチドが有するリンカーとの結合）により、完全長のリンカーが形成され得る。また、例えば、グリコサミノグリカンまたはペプチドが有するリンカーに別のリンカーを逐次結合させる（リンカーを伸長させる）ことにより、完全長のリンカーが形成されてもよい。具体的には、例えば、グリコサミノグリカンまたはペプチドにリンカーの一部を導入し、さらにリンカーの残部が導入されることにより、完全長のリンカーが形成され得る。すなわち、例えば、上述したリンカーにおける結合（例えば、Ｙ１、Ｙ２、（Ｙ１）〜（Ｙ１４）、およびリンカーの構造式中のそれらに該当する部位）は、いずれも、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体の形成前からリンカー中に存在していてもよく、グリコサミノグリカンとペプチドを含む複合体の形成の際に形成されてもよい。
【００９３】
本発明におけるリンカーとしては、１種のリンカーのみが用いられてもよく、２種またはそれ以上のリンカーが用いられてもよい。
【００９４】
本発明において用いられるリンカーは、例えば、化学合成により製造することができる。化学合成による製造は、公知の方法により行うことができる。また、本発明において用いられるリンカーは、例えば、各種試薬メーカー（Thermo scientific社、東京化成工業
社、同仁化学社等）から市販品として、または合成を委託して入手することができる。
【００９５】
本発明におけるリンカーを介してグリコサミノグリカンとペプチドを結合させることにより、ペプチドの血中滞留性を増強することができる。特に、特定の構造を有するリンカーを採用することにより、当該ペプチドの血中滞留性を顕著に増強することができる。
【００９６】
＜７＞本発明におけるグリコサミノグリカン
本発明において用いられるグリコサミノグリカンは、ペプチドの血中滞留性を増強させる作用を有するグリコサミノグリカンである限り、特に制限されない。本発明において用いられるグリコサミノグリカンは、具体的には、リンカーを介してペプチドと複合体を形成することによりペプチドの血中滞留性を増強させることが可能なグリコサミノグリカンである限り、特に制限されない。
【００９７】
本発明においてグリコサミノグリカンは、硫酸基を実質的に有しないグリコサミノグリカンであることが好ましく、硫酸基を有しないグリコサミノグリカンであることがより好ましい。また、本発明においてグリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸を除くグリコサミノグリカンであることが好ましい。特に、本発明においてグリコサミノグリカンは、コンドロイチンまたはヘパロサンであることが好ましく、コンドロイチンであることがより好ましい。
【００９８】
本発明においてグリコサミノグリカンは、側鎖を有していてもよく、有していなくても
よい。側鎖を有するグリコサミノグリカンは、側鎖（アルキル基等）を導入したグリコサミノグリカンであってよい。側鎖を有しないグリコサミノグリカンは、本来的に側鎖を有しないグリコサミノグリカン（側鎖を有しない形態で生産されたグリコサミノグリカン）であってもよく、側鎖を除去して得られたグリコサミノグリカンであってもよい。側鎖の除去は、例えば、公知の方法により行うことができる。側鎖の除去は、例えば、酸加水分解反応により行うことができる（Lidholt K, Fjelstad M., J Biol Chem. 1997 Jan 31; 272(5): 2682-7.）。本発明においてグリコサミノグリカンは、側鎖を実質的に有しない
グリコサミノグリカンであることが好ましく、側鎖を有しないグリコサミノグリカンであることがより好ましく、本来的に側鎖を有しないグリコサミノグリカンであることがさらに好ましい。
【００９９】
「硫酸基を実質的に有しないグリコサミノグリカン」とは、ペプチドの血中滞留性を増強させる程度が、比較対象を用いた場合と比較して全くあるいはほとんど変化（増加または低下）しない程度の硫酸基しか有しないグリコサミノグリカンを意味し、硫酸基を全く有しないグリコサミノグリカンも包含する。硫酸基を実質的に有しないグリコサミノグリカンについての「比較対象」とは、硫酸基を有しないグリコサミノグリカンであって、硫酸基の有無を除き、当該「硫酸基を実質的に有しないグリコサミノグリカン」と同一の構造からなるグリコサミノグリカンを意味する。また、「側鎖を実質的に有しないグリコサミノグリカン」とは、ペプチドの血中滞留性を増強させる程度が、比較対象を用いた場合と比較して全くあるいはほとんど変化（増加または低下）しない程度の側鎖しか有しないグリコサミノグリカンを意味し、側鎖を全く有しないグリコサミノグリカンも包含する。側鎖を実質的に有しないグリコサミノグリカンについての「比較対象」とは、側鎖を有しないグリコサミノグリカンであって、側鎖の有無を除き、当該「側鎖を実質的に有しないグリコサミノグリカン」と同一の構造からなるグリコサミノグリカンを意味する。
【０１００】
「ペプチドの血中滞留性を増強させる程度がほとんど変化しない」とは、具体的には、同一のリンカーを介して同一のペプチドと複合体を形成した際のペプチドの血中半減期または薬効時間（すなわち当該複合体の血中半減期または薬効時間）で比較した場合に、例えば、２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、または１％以下の変化しか起こらないことを意味してよく、全く変化が認められない場合も包含する。すなわち、例えば、硫酸基を実質的に有しないグリコサミノグリカンについての「ペプチドの血中滞留性を増強させる程度がほとんど変化しない」とは、リンカーを介してペプチドと比較対象を結合させて複合体を形成した場合のペプチドの血中半減期または薬効時間がｎ時間である場合に、同リンカーを介して同ペプチドと硫酸基を実質的に有しないグリコサミノグリカンを結合させて複合体を形成した場合のペプチドの血中半減期または薬効時間が、０．８ｎ時間〜１．２ｎ時間、０．９ｎ時間〜１．１ｎ時間、０．９５ｎ時間〜１．０５ｎ時間、０．９８ｎ時間〜１．０２ｎ時間、または０．９９ｎ時間〜１．０１ｎ時間であることを意味してよい。
【０１０１】
「硫酸基を実質的に有しないグリコサミノグリカン」とは、具体的には、硫黄含量が０％〜１％、０％〜０．５％、または０％〜０．１％であるグリコサミノグリカンを意味してよい。硫黄含量は、グリコサミノグリカンが有する硫黄原子の量（グリコサミノグリカンが有する硫黄原子の数と硫黄の原子量を乗じた値）をグリコサミノグリカンの分子量で除して算出される値を百分率換算した値（グリコサミノグリカンを構成する原子の総重量に対する硫黄原子の総重量を重量パーセント濃度（ｗ／ｗ）で示した値）として定義される。硫黄含量は、例えば、公知の手法により測定することができる。硫黄含量は、例えば、酸素フラスコ燃焼法により測定することができる。
【０１０２】
「側鎖を実質的に有しないグリコサミノグリカン」とは、具体的には、グリコサミノグリカンの骨格を構成する糖残基の総数に対する側鎖を有する糖残基の総数の比率が０％〜
２０％、０％〜１０％、０％〜５％、０％〜２％、０％〜１％、０％〜０．５％、または０％〜０．１％であるグリコサミノグリカンを意味してよい。糖残基の総数は、例えば、公知の手法により測定することができる。糖残基の総数は、例えば、グリコサミノグリカンを酸加水分解して得られる単糖やオリゴ糖をゲルろ過等のクロマトグラフィーに供して測定することができる。
【０１０３】
本発明においてグリコサミノグリカンの分子量は、リンカーを介してペプチドと複合体を形成することによりペプチドの血中滞留性を増強させることが可能である限り、特に制限されない。本発明においてグリコサミノグリカンの分子量は、重量平均分子量として、１０ｋＤａ（１×１０４）超であることが好ましい。本発明においてグリコサミノグリカンの分子量は、重量平均分子量として、例えば、１×１０４超、２×１０４以上、または３×１０４以上であってもよく、５×１０６以下、１×１０６以下、５×１０５以下、２×１０５以下、または１×１０５以下であってもよく、それらの組み合わせの範囲であってもよい。本発明においてグリコサミノグリカンの分子量は、重量平均分子量として、例えば、１×１０４超５×１０６以下、１×１０４超１×１０６以下、１×１０４超５×１０５以下、１×１０４超２×１０５以下、２×１０４以上２×１０５以下、３×１０４以上２×１０５以下、１×１０４超１×１０５以下、２×１０４以上１×１０５以下、３×１０４以上１×１０５以下であってよい。ここにいう重量平均分子量は、ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定される重量平均分子量を意味する。グリコサミノグリカンの分子量は、例えば、参考例２に記載の方法により測定することができる。
【０１０４】
本発明においてグリコサミノグリカンは、微生物によって生産されたグリコサミノグリカン（以下、「微生物由来グリコサミノグリカン」ともいう。）または酵素によって合成されたグリコサミノグリカン（以下、「酵素合成グリコサミノグリカン」ともいう。）であることが好ましい。「微生物由来グリコサミノグリカン」は、具体的には、グリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物により生産されたグリコサミノグリカンである。また、「酵素合成グリコサミノグリカン」は、具体的には、in vitroまたは無細胞系でグリコサミノグリカンの合成酵素によって合成されたグリコサミノグリカンである。グリコサミノグリカンの合成酵素としては、コンドロイチン合成酵素やヘパロサン合成酵素が挙げられる。グリコサミノグリカンの合成酵素としては、１種の酵素のみが用いられてもよく、２種またはそれ以上の酵素が用いられてもよい。
【０１０５】
＜微生物由来グリコサミノグリカンの製造＞
「グリコサミノグリカンを生産する能力」とは、例えば、グリコサミノグリカンそのもの（側鎖を有しないグリコサミノグリカン）を生産する能力であってもよく、側鎖を有するグリコサミノグリカンを生産する能力であってもよい。側鎖としては、フルクトース等の糖残基が挙げられる。側鎖を有するグリコサミノグリカンとしては、具体的には、フルクトース残基を側鎖として有するコンドロイチンであるＫ４多糖（フルクトシル化コンドロイチン）が挙げられる。Ｋ４多糖としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ４株が生産するＫ４多糖が挙げられる。本発明においては、Ｋ４多糖をそのままグリコサミノグリカンとして用いてもよいし、フルクトース残基を脱離（脱フルクトシル化）して得られる脱フルクトシル化Ｋ４多糖をグリコサミノグリカンとして用いてもよい。
【０１０６】
「グリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物」は、例えば、細胞内にグリコサミノグリカンを生産する微生物であってもよく、培地中にグリコサミノグリカンを生産する微生物であってもよく、菌体表層（例えば、細胞膜上や細胞壁上）にグリコサミノグリカンを生産する微生物であってもよい。菌体表層にグリコサミノグリカンを生産する微生物としては、莢膜多糖としてグリコサミノグリカンを生産する微生物が挙げられる。
【０１０７】
「グリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物」において、微生物の種類は特
に制限されない。微生物としては、例えば、細菌や酵母が挙げられる。微生物としては、グリコサミノグリカンの生産性や取扱いの容易性などの点から、細菌が好ましい。
【０１０８】
細菌の種類は特に限定されない。細菌としては、文献（特表２０１０−５２４４３１号公報）に開示されているグルコノアセトバクター・ハンセニー（Gluconacetobacter hansenii）やグルコノアセトバクター・キシリナス（Gluconacetobacter xylinus）等のグル
コノアセトバクター属細菌、リゾビウム・メフロティ（Rhizobium meffloti）等のリゾビウム属細菌、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）等のアセトバクター
属細菌、エルヴィニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）等のエルヴィニア属細菌、
チオバチルス・フェロキシダンス（Thiobacillus ferrooxidans）等のチオバチルス属細
菌、ザイレラ・ファスチジオーサ（Xylella fastidiosa）等のザイレラ属細菌、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）等のシノリゾビウム属細菌、ロドコッカス・ロドクラス（Rhodococcus rhodochrous）等のロドコッカス属細菌、クレブシエラ・
アエロゲネス（Klebsiella aerogenes）等のクレブシエラ属細菌、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等のエンテロバクター属細菌、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌が例示される。また、細菌としては、文献（特表２０１３−５２０９９５号公報）に開示されているシュードモナス（Pseudomonas）属細菌、キサントモナス（Xanthomonas）属細菌、メチロモナス（Methylomonas）属細菌、アシネトバクター（Acinetobacter）属細菌、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属
細菌などの非病原性生物も例示できる。また、細菌としては、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）も挙げられる。
【０１０９】
細菌としては、グリコサミノグリカンの生産性や、汎用性、取扱いの容易性などの点で、エシェリヒア（Escherichia）属に属する細菌が好ましい。なかでも、特に汎用されて
おり取扱いが容易な、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が好ましい。エシェリヒア・コリとしては、例えば、W3110株（ATCC 27325）やMG1655株（ATCC 47076）等のエシ
ェリヒア・コリK-12株；NCDC U1-41株（ATCC 23502）等のエシェリヒア・コリＫ４株；NCDC Bi 8337-41株（ATCC 23506）等のエシェリヒア・コリＫ５株；BL21株等のエシェリヒ
ア・コリＢ株；およびそれらの派生株が挙げられる。これらの株は、例えば、American Type Culture Collection（ATCC）（P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108 United States of America）やThe International Escherichia and Klebsiella Centre (WHO), Statens Serum Institut（Building 37K, Room 125c Artillerivej 5 DK-2300 Copenhagen S Denmark）のカタログ又はホームページから入手可能である。
【０１１０】
「グリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物」は、本来的にグリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物であってもよく、グリコサミノグリカンを生産する能力を有するように改変された微生物であってもよい。
【０１１１】
「本来的にグリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物」としては、例えば、コンドロイチンを生産する微生物であるエシェリヒア・コリＫ４株やパスツレラ・ムルトシダ  タイプＦが挙げられる。エシェリヒア・コリＫ４株は、フルクトース残基を側鎖として有するコンドロイチン（Ｋ４多糖）を生産する。本発明においては、エシェリヒア・コリＫ４株がそのまま「グリコサミノグリカン（コンドロイチン）を生産する能力を有する微生物」として用いられてもよいし、生産するコンドロイチン（Ｋ４多糖）がフルクトース残基を側鎖として有しないように改変されたエシェリヒア・コリＫ４株が「グリコサミノグリカン（コンドロイチン）を生産する能力を有する微生物」として用いられてもよい。そのようなエシェリヒア・コリＫ４株の改変株は、例えば、エシェリヒア・コリＫ４株のkfoE遺伝子を不活性化して得ることができる。エシェリヒア・コリＫ４株のkfoE遺伝子の不活性化は、例えば、公知の文献（特表２０１３−５３１９９５号公報）に記載された方法を参照して行うことができる。また、「本来的にグリコサミノグリカンを生産する
能力を有する微生物」としては、例えば、ヘパロサンを生産する微生物であるエシェリヒア・コリＫ５株、エシェリヒア・コリＮｉｓｓｌｅ１９１７株、パスツレラ・ムルトシダ
タイプＤも挙げられる。
【０１１２】
「グリコサミノグリカンを生産する能力を有するように改変された微生物」は、例えば、上述した細菌等の微生物にグリコサミノグリカンを生産する能力を付与することにより取得できる。「グリコサミノグリカンを生産する能力の付与」は、例えば、グリコサミノグリカンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を微生物に発現可能に導入することにより行うことができる。
【０１１３】
グリコサミノグリカンが側鎖を有するグリコサミノグリカンである場合、グリコサミノグリカンを生産する能力の付与は、例えば、グリコサミノグリカンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を、グリコサミノグリカンに側鎖を付加する能力を有する微生物に発現可能に導入することにより行うことができる。「グリコサミノグリカンに側鎖を付加する能力を有する微生物」は、例えば、グリコサミノグリカンへの側鎖の付加に関与するタンパク質をコードする遺伝子を有する微生物である。「グリコサミノグリカンに側鎖を付加する能力を有する微生物」は、当該遺伝子を本来的に有する微生物であってもよく、当該遺伝子を発現可能に導入した微生物であってもよい。
【０１１４】
グリコサミノグリカンが側鎖を有しないグリコサミノグリカンである場合、グリコサミノグリカンを生産する能力の付与は、例えば、グリコサミノグリカンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を、グリコサミノグリカンに側鎖を付加する能力を有しない微生物に発現可能に導入することにより行うことができる。「グリコサミノグリカンに側鎖を付加する能力を有しない微生物」は、例えば、グリコサミノグリカンへの側鎖の付加に関与するタンパク質をコードする遺伝子を有しない微生物である。「グリコサミノグリカンに側鎖を付加する能力を有しない微生物」は、当該遺伝子を本来的に有しない微生物であってもよく、当該遺伝子を欠失または不活性化させた微生物であってもよい。
【０１１５】
「グリコサミノグリカンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子」としては、例えば、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子としてkfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT, pmCS遺伝子が挙げられる。kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子が挙げられる。pmCS遺伝子としては、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来のpmCS遺伝子が挙
げられる。
【０１１６】
また、「グリコサミノグリカンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子」としては、例えば、ヘパロサンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子としてkfiA, kfiB, kfiC, kfiD, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT, pmHS遺伝子が挙げられる。kfiA, kfiB, kfiC, kfiD, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ５株由来のkfiA, kfiB, kfiC, kfiD, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子が挙げられる。pmHS遺伝子としては、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来のpmHS遺伝子が挙げられる。
【０１１７】
「グリコサミノグリカンへの側鎖の付加に関与するタンパク質をコードする遺伝子」としては、kfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子が挙げられる。kfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子が挙げられる。
【０１１８】
上述した遺伝子の塩基配列、及びこれらの遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等の公用データベースから取得できる。遺伝子の導入は、例えば、同遺伝子を搭載したベクターを微生物に導入することや、同遺伝子を微生物の染色体上に導入することにより達成できる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。本発明においては、１種の遺伝子を導入してもよく、２種またはそれ以上の遺伝子を導入してもよい。
【０１１９】
導入する遺伝子は、用いる微生物の種類等に応じて適宜選択できる。例えば、エシェリヒア・コリＫ５株は、ヘパロサンを生産する能力を有し、コンドロイチンを生産する能力を有しないが、kfoAおよびkfoC遺伝子を導入することにより、エシェリヒア・コリＫ５株にコンドロイチンを生産する能力を付与することができる。また、例えば、エシェリヒア・コリK-12株は、コンドロイチンを生産する能力を有しないが、kfo遺伝子群（kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG）およびkps遺伝子群（kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT）を導入することにより、エシェリヒア・コリK-12株にコンドロイチンを生産する能力を付与することができる。さらに、例えば、エシェリヒア・コリK-12株は、ヘパロサンを生産する能力を有しないが、kfi遺伝子群（kfiA, kfiB, kfiC, kfiD）およびkps遺伝子群（kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT）を導入することにより、エシェリヒア・コリK-12株にヘパロサンを生産する能力を付与することができる。
【０１２０】
これらのグリコサミノグリカンを生産する能力を付与された株により、例えば、グリコサミノグリカンを莢膜多糖として生産させることができる。本発明において使用されるグリコサミノグリカンは、莢膜多糖として生産されたグリコサミノグリカンそのものであってもよく、水酸化ナトリウム等の塩基または塩酸等の酸と接触させて処理した後のグリコサミノグリカンであってもよい。
【０１２１】
また、グリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物は、グリコサミノグリカンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子の内、その微生物が本来的に有するタンパク質をコードする遺伝子の発現が増強されるように改変されていてもよい。例えば、エシェリヒア・コリＫ４株に、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を導入してもよい。また、例えば、エシェリヒア・コリＫ５株に、kfoAおよびkfoC遺伝子に加えて、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする他の遺伝子をさらに導入してもよい。さらに、例えば、エシェリヒア・コリＫ５株に、ヘパロサンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を導入してもよい。
【０１２２】
なお、「微生物が本来的に有するタンパク質をコードする遺伝子」は、当該微生物由来の遺伝子であってもよく、当該微生物以外の生物由来の遺伝子であってもよい。すなわち、例えば、エシェリヒア・コリＫ４株に、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードするエシェリヒア・コリＫ４株由来の遺伝子を導入してもよく、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードするエシェリヒア・コリＫ４株以外の生物由来の遺伝子を導入してもよい。また、例えば、エシェリヒア・コリＫ５株に、ヘパロサンの生産に関与するタンパク質をコードするエシェリヒア・コリＫ５株由来の遺伝子を導入してもよく、ヘパロサンの生産に関与するタンパク質をコードするエシェリヒア・コリＫ５株以外の生物由来の遺伝子を導入してもよい。
【０１２３】
コンドロイチンを生産する能力を有する微生物としては、例えば、文献（特表２０１０−５２４４３１号公報、または特表２０１３−５２０９９５号公報）に開示されているコンドロイチンを生産する能力を有する細菌が挙げられる。
【０１２４】
コンドロイチンを生産する能力を有する微生物としては、文献（特表２０１０−５２４４３１号公報）に記載されている「エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA遺伝子とkfoC遺
伝子が共に導入されたエシェリヒア・コリ」を好ましく例示することができる。また、コンドロイチンを生産する能力が側鎖を有しないコンドロイチンを生産する能力である場合は、コンドロイチンを生産する能力を有する微生物としては、「エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA遺伝子とkfoC遺伝子が共に導入された、kfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子から選択される１〜３または全ての遺伝子を有しないエシェリヒア・コリ」を好ましく例示することができる。そのようなエシェリヒア・コリとしては、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA遺伝子とkfoC遺伝子が共に導入されたエシェリヒア・コリＫ５株を好ましく例示することができる。エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA遺伝子やkfoC遺伝子の導入は、例えば、文献（特表２０１０−５２４４３１号公報）に記載された方法で行うことができる。
【０１２５】
また、コンドロイチンを生産する能力を有する微生物としては、文献（特表２０１３−５２０９９５号公報）に記載されている「エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子及びシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のxylS遺伝子が導入されたエシェリヒア・コリ」も好ましく例示することができる。また、コンドロイチンを生産する能力が側鎖を有しないコンドロイチンを生産する能力である場合は、コンドロイチンを生産する能力を有する微生物としては、「エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子及びシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のxylS遺伝子が導入された、kfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子から選択される１〜３または全ての遺伝子を有しないエシェリヒア・コリ」も好ましく例示することができる。そのようなエシェリヒア・コリとしては、例えば、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG遺伝子を各４コピー、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子を各１コピー、及びシュードモナス・プチダ由来のxylS遺伝子を１コピー導入したエシェリヒア・コリが好ましい。なかでも、これらの遺伝子が導入されたエシェリヒア・コリK-12株が好ましい。エシェリヒア・コリK-12株としては、エシェリヒア・コリK-12 W3110株を好ましく例示することができる。エシェリヒア・コリK-12 W3110株にこれらの遺伝子が導入された細菌株は、文献（特表２０１３−５２０９９５号公報）において「MSC702株」として開示されている。これらの遺伝子の導入は、例えば、文献（特表２０１３−５２０９９５号公報）に記載された方法で行うことができる。
【０１２６】
なお、グリコサミノグリカンを生産する能力の付与等のために微生物の改変に使用される遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記に例示したような公知の遺伝子に限られず、例えば、そのバリアントであってもよい。微生物の改変に使用される遺伝子は、例えば、公知の遺伝子の塩基配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、且つ、元の機能が維持されたタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、微生物の改変に使用される遺伝子は、例えば、公知のタンパク質のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、且つ、元の機能が維持されたタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、「相同性」とは、「同一性」を意味してよい。また、微生物の改変に使用される遺伝子は、例えば、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１箇所にまとまって若しくは数箇所に分散して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、元の機能が維持されたタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。「１又は数個」とは、例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個であってよい。
【０１２７】
アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加は、タンパク質の機能が正常に維持され
る保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性ア
ミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間
で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には
、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAsp
への置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn
、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile
又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。
【０１２８】
微生物の改変に使用される遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドン（同じアミノ酸をコードする別のコドン）に置換したものであってもよい。例えば、微生物の改変に使用される遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度（宿主が発現するタンパク質をコードする核酸においてコドンとして使用される頻度）に応じて最適なコドンを有するように改変されていてもよい。
【０１２９】
「微生物由来グリコサミノグリカン」は、例えば、上記に例示したようなグリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物を培養することで生産できる。培養条件は、グリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物が生育でき、グリコサミノグリカンの生産が可能な条件ある限り、特に制限されない。グリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物は、例えば、細菌や酵母等の微生物を培養する通常の条件で培養することができる。培養条件としては、例えば、文献（特開２００８−２９５４５０号公報、特表２０１０−５２４４３１号公報、または特表２０１３−５２０９９５号公報）に記載されている培養条件を参照できる。
【０１３０】
微生物由来グリコサミノグリカンは、公知の方法により培養物から単離し精製することができる。微生物由来グリコサミノグリカンは、例えば、エタノール等の溶媒を利用して沈殿させて回収することができる。また、微生物由来グリコサミノグリカンは、この沈殿物を溶解した後に再度沈殿させる操作を繰り返すことや、陰イオン交換その他のクロマトグラフィーに供すること等によってさらに精製してもよい。
【０１３１】
＜酵素合成グリコサミノグリカンの製造＞
「グリコサミノグリカンの合成酵素」とは、グリコサミノグリカンの骨格を構成する二種類の糖残基を糖鎖の非還元末端に交互に付加し、グリコサミノグリカン鎖を伸長する反応を触媒するタンパク質をいう。グリコサミノグリカンの合成酵素は、二種類の糖残基の付加を単独で触媒するタンパク質であってもよく、どちらか一方の糖残基の付加を触媒するタンパク質ともう一方の糖残基の付加を触媒するタンパク質の組み合わせであってもよい。すなわち、グリコサミノグリカンの合成酵素は、ポリメラーゼであってもよく、糖転移酵素であってもよい。ポリメラーゼとしては、コンドロイチンポリメラーゼやヘパロサンポリメラーゼが挙げられる。糖転移酵素としては、Ｎ−アセチルガラクトサミン（GalNAc）転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）転移酵素、グルクロン酸（GlcUA）
転移酵素が挙げられる。コンドロイチンポリメラーゼは、GalNAc残基の付加およびGlcUA
残基の付加の両方を単独で触媒するタンパク質である。また、ヘパロサンポリメラーゼは、GlcNAc残基の付加およびGlcUA残基の付加の両方を単独で触媒するタンパク質である。
【０１３２】
コンドロイチンポリメラーゼとしては、kfoC遺伝子にコードされるKfoCタンパク質やpmCS遺伝子にコードされるPmCSタンパク質が挙げられる。kfoC遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoC遺伝子が挙げられる。pmCS遺伝子としては、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来のpmCS遺伝子が挙げられる。また、ヘパロサンポ
リメラーゼとしては、pmHS遺伝子にコードされるPmHSタンパク質が挙げられる。pmHS遺伝子としては、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来のpmHS遺伝子が挙
げられる。
【０１３３】
GlcNAc転移酵素としては、kfiA遺伝子にコードされるKfiAタンパク質が挙げられる。kfiA遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ５株由来のkfiA遺伝子が挙げられる。また、GlcUA転移酵素としては、kfiC遺伝子にコードされるKfiCタンパク質が挙げられる。kfiC遺
伝子としては、エシェリヒア・コリＫ５株由来のkfiC遺伝子が挙げられる。KfiAタンパク質とKfiCタンパク質は、複合体を形成してヘパロサンポリメラーゼとして機能する。
【０１３４】
グリコサミノグリカンの合成酵素としては、例えば、微生物由来のグリコサミノグリカンの合成酵素が好ましい。微生物由来のグリコサミノグリカンの合成酵素としては、具体的には、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoC遺伝子にコードされるKfoCタンパク質（K4CP）、エシェリヒア・コリＫ５株由来のkfiA遺伝子にコードされるKfiAタンパク質、エシェリヒア・コリＫ５株由来のkfiC遺伝子にコードされるKfiCタンパク質、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）のpmCS遺伝子にコードされるPmCSタンパク質、パス
ツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）のpmHS遺伝子にコードされるPmHSタンパ
ク質等の微生物が本来的に有するグリコサミノグリカンの合成酵素が好ましく例示される。これらの中で、グリコサミノグリカンの合成酵素は、KfoCタンパク質（K4CP）、KfiAタンパク質、またはKfiCタンパク質であることが好ましい。
【０１３５】
グリコサミノグリカンの合成酵素は、グリコサミノグリカンの合成酵素からなるものであってもよく、その他の成分をさらに含有するものであってもよい。グリコサミノグリカンの合成酵素としては、グリコサミノグリカンの合成酵素を産生する微生物の培養物、当該培養物から分離した培養上清、当該培養物から分離した菌体、当該菌体の処理物、およびそれらから分離したグリコサミノグリカンの合成酵素が挙げられる。グリコサミノグリカンの合成酵素は、所望の程度に精製されていてよい。グリコサミノグリカンの合成酵素を産生する微生物は、本来的にグリコサミノグリカンの合成酵素を産生する微生物であってもよく、グリコサミノグリカンの合成酵素を産生するように改変された微生物であってもよい。グリコサミノグリカンの合成酵素を産生するように改変された微生物は、例えば、グリコサミノグリカンの合成酵素をコードする遺伝子を微生物に発現可能に導入することにより取得できる。遺伝子の導入は、例えば、同遺伝子を搭載したベクターを微生物に導入することや、同遺伝子を微生物の染色体上に導入することにより達成できる。
【０１３６】
グリコサミノグリカンの合成酵素をコードする遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記に例示したような公知の遺伝子に限られず、例えば、そのバリアントであってもよい。グリコサミノグリカンの合成酵素をコードする遺伝子のバリアントについては、上述したグリコサミノグリカンを生産する能力の付与等のために微生物の改変に使用される遺伝子のバリアントに関する記載を準用できる。
【０１３７】
「酵素合成グリコサミノグリカン」は、例えば、上記に例示したようなグリコサミノグリカンの合成酵素を、糖供与体および糖受容体と、適当な反応系において共存させることにより合成できる。反応条件は、グリコサミノグリカンの合成が可能な条件である限り、特に制限されない。反応条件は、グリコサミノグリカンの合成酵素の由来や態様、グリコサミノグリカンの所望の重合度等の諸条件に応じて適宜設定できる。反応条件としては、
例えば、文献（特許第４１０１５４８号公報）または（特許第５０８１６２９号公報）に記載の条件を参照できる。
【０１３８】
「糖供与体」とは、グリコサミノグリカンの合成酵素によるグリコサミノグリカンの合成反応において糖残基を供与する分子をいう。糖供与体の種類は、グリコサミノグリカンの合成反応に利用可能である限り、特に限定されない。糖供与体としては、アミノ糖の供与体やウロン酸の供与体が挙げられる。糖供与体として、具体的には、GalNAc供与体、GlcNAc供与体、GlcUA供与体が挙げられる。また、糖供与体としては、糖ヌクレオチドが挙
げられる。
【０１３９】
「GalNAc供与体」とは、グリコサミノグリカンの合成酵素によるグリコサミノグリカンの合成反応においてGalNAc残基を供給する分子をいう。GalNAc供与体の種類は、グリコサミノグリカンの合成反応に利用可能である限り、特に限定されない。GalNAc供与体としては、GalNAcヌクレオチドが挙げられる。GalNAcヌクレオチドとしては、UDP-GalNAc（ウリジン５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルガラクトサミン）が挙げられる。
【０１４０】
「GlcNAc供与体」とは、グリコサミノグリカンの合成酵素によるグリコサミノグリカンの合成反応においてGlcNAc残基を供給する分子をいう。GlcNAc供与体の種類は、グリコサミノグリカンの合成反応に利用可能である限り、特に限定されない。GlcNAc供与体としては、GlcNAcヌクレオチドが挙げられる。GlcNAcヌクレオチドとしては、UDP-GlcNAc（ウリジン５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン）が挙げられる。
【０１４１】
「GlcUA供与体」とは、グリコサミノグリカンの合成酵素によるグリコサミノグリカン
の合成反応においてGlcUA残基を供給する分子をいう。GlcUA供与体の種類は、グリコサミノグリカンの合成反応に利用可能である限り、特に限定されない。GlcUA供与体としては
、GlcUAヌクレオチドが挙げられる。GlcUAヌクレオチドとしては、UDP-GlcUA（ウリジン
５’−ジホスホ−グルクロン酸）が挙げられる。
【０１４２】
糖供与体は、市販品であってもよく、適宜製造して取得したものであってもよい。糖供与体は、例えば、公知の手法により調製することができる。
【０１４３】
UDP-GlcUAは、例えば、UDP-Glcデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.22）を用い、UDP-Glc（ウリジン５’−ジホスホ−グルコース）を酸化して得ることができる。よって、例えば、UDP-Glcデヒドロゲナーゼを用いることにより、UDP-GlcをGlcUA供与体として用いることが
できる。UDP-Glcデヒドロゲナーゼとしては、kfoF遺伝子にコードされるKfoFタンパク質
、kfiD遺伝子にコードされるKfiDタンパク質が挙げられる。kfoF遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoF遺伝子が挙げられる。kfiD遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ５株由来のkfiD遺伝子が挙げられる。
【０１４４】
UDP-GalNAcは、例えば、UDP-Glc-4-エピメラーゼ（EC 5.1.3.2）またはUDP-GlcNAc-4-
エピメラーゼ（EC 5.1.3.7）を用い、UDP-GlcNAcを異性化して得ることができる。よって、例えば、UDP-Glc-4-エピメラーゼまたはUDP-GlcNAc-4-エピメラーゼを用いることによ
り、UDP-GlcNAcをGalNAc供与体として用いることができる。UDP-Glc-4-エピメラーゼとしては、kfoA遺伝子にコードされるKfoAタンパク質が挙げられる。kfoA遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA遺伝子が挙げられる。
【０１４５】
UDP-GlcNAcは、例えば、UDP-Gal-4-エピメラーゼ（EC 5.1.3.2）またはUDP-GalNAc-4-
エピメラーゼ（EC 5.1.3.7）を用い、UDP-GalNAcを異性化して得ることができる。よって、例えば、UDP-Gal-4-エピメラーゼまたはUDP-GalNAc-4-エピメラーゼを用いることによ
り、UDP-GalNAcをGlcNAc供与体として用いることができる。UDP-Gal-4-エピメラーゼとし
ては、kfoA遺伝子にコードされるKfoAタンパク質が挙げられる。kfoA遺伝子としては、エシェリヒア・コリK4株由来のkfoA遺伝子が挙げられる。
【０１４６】
よって、本発明においては、例えば、UDP-Glc-4-エピメラーゼおよび／もしくはUDP-GlcNAc-4-エピメラーゼならびに／またはUDP-Glcデヒドロゲナーゼを用いることにより、UDP-GlcNAcおよび／またはUDP-GlcをそれぞれGalNAc供与体および／またはGlcUA供与体としてコンドロイチンの合成に用いることができる。また、本発明においては、例えば、UDP-Gal-4-エピメラーゼおよび／もしくはUDP-GalNAc-4-エピメラーゼならびに／またはUDP-Glcデヒドロゲナーゼを用いることにより、UDP-GalNAcおよび／またはUDP-GlcをそれぞれGlcNAc供与体および／またはGlcUA供与体としてヘパロサンの合成に用いることができる。
【０１４７】
「糖受容体」とは、グリコサミノグリカンの合成酵素によるグリコサミノグリカンの合成反応において、その非還元末端にGlcUA残基、GalNAc残基、またはGlcNAc残基が付加さ
れることによりグリコサミノグリカン鎖の伸長が開始される糖鎖（アクセプター）をいう。
【０１４８】
糖受容体としては、下記一般式（１）、（２）、または（３）で示される糖鎖が挙げられる。
ＧｌｃＵＡ−Ｒ１    （１）
ＧａｌＮＡｃ−Ｒ２    （２）
ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ３    （３）
（各式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ任意の基を表す。）
【０１４９】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３としては、水酸基や１またはそれ以上の残基数の糖鎖が挙げられる。Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３がそれぞれ糖鎖である場合、各式中、「−」はグリコシド結合を表す。糖鎖としては、グリコサミノグリカン鎖が挙げられる。グリコサミノグリカン鎖としては、コンドロイチン鎖、ヘパロサン鎖、ヒアルロン酸鎖が挙げられる。コンドロイチン鎖としては、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンや微生物由来コンドロイチンが挙げられる。ヘパロサン鎖としては、微生物由来ヘパロサンが挙げられる。また、糖鎖としては、これら糖鎖の誘導体も挙げられる。「糖鎖の誘導体」とは、原子、官能基、化合物等の構成要素が導入、置換、および／または除去された糖鎖をいう。糖鎖の誘導体としては、硫酸化された糖鎖や任意の糖が付加された糖鎖が挙げられる。すなわち、酵素合成グリコサミノグリカンの糖受容体部分は、本発明におけるグリコサミノグリカンの好適な態様に該当する構造を有していてもよいし、本発明におけるグリコサミノグリカンの好適な態様に該当しない構造を有していてもよい。
【０１５０】
一般式（１）において、Ｒ１がＧａｌＮＡｃやＧｌｃＮＡｃ等の糖残基を含み、非還元末端のＧｌｃＵＡ残基がＲ１の当該糖残基と結合している場合、その結合はβ−１，３−グリコシド結合またはβ−１，４−グリコシド結合であることが好ましく、β−１，３−グリコシド結合であることがより好ましい。
【０１５１】
一般式（２）において、Ｒ２がＧｌｃＵＡ等の糖残基を含み、非還元末端のＧａｌＮＡｃ残基がＲ２の当該糖残基と結合している場合、その結合はβ−１，４−グリコシド結合であることが好ましい。
【０１５２】
一般式（３）において、Ｒ３がＧｌｃＵＡ等の糖残基を含み、非還元末端のＧｌｃＮＡｃ残基がＲ３の当該糖残基と結合している場合、その結合はα−１，４−グリコシド結合、またはβ−１，４−グリコシド結合であることが好ましく、α−１，４−グリコシド結合であることがより好ましい。
【０１５３】
糖受容体の糖鎖の残基数（糖受容体の長さ）は、グリコサミノグリカン鎖が伸長される限り、特に制限されない。糖受容体の糖鎖の残基数は、例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、または１０以上であってよく、６以上であるのが好ましい。糖受容体の糖鎖の残基数は、例えば、５０以下、４０以下、３０以下、または２０以下であってよい。糖受容体の糖鎖の残基数は、例えば、それらの組み合わせの範囲であってよい。
【０１５４】
糖受容体としては、コンドロイチン鎖またはヘパロサン鎖が好ましい。コンドロイチン鎖は微生物由来コンドロイチンであることが好ましい。ヘパロサン鎖は微生物由来ヘパロサンであることが好ましい。糖受容体としては、具体的には、例えば、６残基以上のコンドロイチン鎖またはヘパロサン鎖を好適に用いることができる。
【０１５５】
糖受容体は、市販品であってもよく、適宜製造して取得したものであってもよい。糖受容体は、例えば、公知の手法により調製することができる。
【０１５６】
グリコサミノグリカンの伸長は、溶液中に界面活性剤を共存させた状態で行われてよい。また、グリコサミノグリカンの伸長は、溶液中に有機溶媒を共存させた状態で行われてよい。界面活性剤や有機溶媒としては、文献（特許第５０８１６２９号公報）に記載されたものが挙げられる。
【０１５７】
酵素合成グリコサミノグリカンの調製時における反応温度は、例えば、１０〜５０℃、２０〜４０℃、または２５〜３７℃であってよい。また、酵素合成グリコサミノグリカンの調製時における反応時間は、例えば、１時間〜７日間、６〜４８時間、または１２〜２４時間であってよい。
【０１５８】
上記のように反応を行うことにより、酵素合成グリコサミノグリカンを調製することができる。酵素合成グリコサミノグリカンは、上述した微生物由来グリコサミノグリカンと同様にして、単離および精製することができる。
【０１５９】
このようにして得られる「酵素合成グリコサミノグリカン」は、グリコサミノグリカンを生産する能力を有する微生物が細胞内で行う反応を、微生物の培養以外の方法、例えば、in vitroまたは無細胞系で再現して得られるグリコサミノグリカンである。すなわち、「酵素合成グリコサミノグリカン」は「微生物由来グリコサミノグリカン」と実質的に同一の反応を経て得られるグリコサミノグリカンである。よって、両者は血中滞留性等において同質のグリコサミノグリカンである。
【０１６０】
グリコサミノグリカンとしては、１種のグリコサミノグリカンのみが用いられてもよく、２種またはそれ以上のグリコサミノグリカンが用いられてもよい。
【０１６１】
＜８＞本発明におけるペプチド
本発明においてペプチドは、血中滞留性の増強を所望するペプチドである限り、特に限定されない。ペプチドは、単量体（monomer）あってもよく、二量体等の多量体（multimer）であってもよい。ペプチドは、医薬として用いられるペプチドであってもよく、試薬
として用いられるペプチドであってもよく、動物試験に用いられるペプチドであってもよい。
【０１６２】
本発明においてペプチドの分子量は、リンカーを介してグリコサミノグリカンと複合体を形成することにより血中滞留性が増強されることが可能である限り、特に制限されない。本発明においてペプチドの分子量は、例えば、１０ｋＤａ（１×１０４）以下であってよい。本発明においてペプチドの分子量は、例えば、１×１０４以下、９×１０３以下、
８×１０３以下、７×１０３以下、６×１０３以下、または５×１０３以下であってよい。本発明においてペプチドの分子量は、例えば、１×１０３以上、２×１０３以上、または３×１０３以上であってよい。本発明においてペプチドの分子量は、例えば、それらの組み合わせの範囲であってよい。本発明においてペプチドの分子量は、例えば、１×１０３〜１×１０４、１×１０３〜８×１０３、１×１０３〜６×１０３、１×１０３〜５×１０３、２×１０３〜１×１０４、２×１０３〜８×１０３、２×１０３〜６×１０３、２×１０３〜５×１０３、３×１０３〜１×１０４、３×１０３〜８×１０３、３×１０３〜６×１０３、または３×１０３〜５×１０３であってよい。
【０１６３】
本発明においてペプチドを構成するアミノ酸残基の数（ペプチドの長さ）は、リンカーを介してグリコサミノグリカンと複合体を形成することにより血中滞留性が増強されることが可能である限り、特に制限されない。本発明においてペプチドを構成するアミノ酸残基の数は、例えば、１００残基以下、９０残基以下、８０残基以下、７０残基以下、６０残基以下、５０残基以下であってよい。本発明においてペプチドを構成するアミノ酸残基の数は、例えば、１０残基以上、２０残基以上、３０残基以上であってよい。本発明においてペプチドを構成するアミノ酸残基の数は、例えば、それらの組み合わせの範囲であってよい。本発明においてペプチドを構成するアミノ酸残基の数は、例えば、１０残基〜１００残基、１０残基〜８０残基、１０残基〜６０残基、１０残基〜５０残基、２０残基〜１００残基、２０残基〜８０残基、２０残基〜６０残基、２０残基〜５０残基、３０残基〜１００残基、３０残基〜８０残基、３０残基〜６０残基、または３０残基〜５０残基であってよい。
【０１６４】
本発明においてペプチドは、疾患の治療のために長期に亘って薬効を維持することが重要なペプチドであることが好ましい。そのようなペプチドとしては、生活習慣病の治療のために投与されるペプチドが挙げられる。生活習慣病としては、脂質異常症、高血圧、糖尿病、肥満が挙げられる。本発明におけるペプチドは、糖尿病の治療のために投与されるペプチドであることが好ましい。また、本発明におけるペプチドは、血糖抑制作用を有するペプチドであることが好ましい。本発明におけるペプチドとしては、具体的には、ＧＬＰ−１、インスリンが挙げられる。
【０１６５】
ＧＬＰ−１としては、ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列を含むペプチドおよびＧＬＰ−１（７−３７）のアナログのアミノ酸配列を含むペプチド、並びにそれらのバリアントを例示することができる。
【０１６６】
バリアントについては、グリコサミノグリカンを生産する能力の付与等のために微生物の改変に使用される遺伝子のバリアントについての記載を準用できる。すなわち、ＧＬＰ−１のバリアントは、例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）またはＧＬＰ−１（７−３７）のアナログのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、血糖抑制作用を有する、ペプチドであってよい。「１又は数個」とは、上述したとおりであるが、特にペプチドについては、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜７個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、または１〜２個を意味してもよい。また、ＧＬＰ−１のバリアントは、例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）またはＧＬＰ−１（７−３７）のアナログのアミノ酸配列に対し、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸を含み、血糖抑制作用を有する、ペプチドであってもよい。
【０１６７】
ＧＬＰ−１として、具体的には、下記（Ａ）〜（Ｄ）に示されるペプチドを例示することができる。すなわち、本発明においてペプチドは、具体的には、例えば、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるペプチドであってよい。
（Ａ）下記（ａ）に示されるＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列を含むペプチド。
（ａ）ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（ＧＬＰ−１（７−３７）；配列番号１）
（Ｂ）下記（ｂ１）〜（ｂ３）からなる群より選択されるＧＬＰ−１（７−３７）のアナログのアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ１）ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＣ（ＧＬＰ−１Ｃ；配列番号２）
（ｂ２）ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＲＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（ＧＬＰ−１ＲＫ；配列番号３）
（ｂ３）ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＣ（ＧＬＰ−１ｏｒｉＣ；配列番号４）
（Ｃ）前記（ａ）および（ｂ１）〜（ｂ３）のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、血糖抑制作用を有する、ペプチド。
（Ｄ）前記（ａ）および（ｂ１）〜（ｂ３）のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、血糖抑制作用を有する、ペプチド。
【０１６８】
上記ＧＬＰ−１のバリアントにおいて、改変（例えば、置換、欠失、挿入、及び／又は付加）されるアミノ酸残基は、リンカーを結合させるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基であってよい。
【０１６９】
ＧＬＰ−１アナログのアミノ酸配列としては、上記（ｂ１）〜（ｂ３）に例示したアミノ酸配列に加えて、文献（ＵＳ８９５７０２１）に記載されたアミノ酸配列も例示することができる。
【０１７０】
ＧＬＰ−１等のペプチドに結合させるリンカーについては、上述した通りである。ＧＬＰ−１（例えば、上記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示されるペプチド）に結合させるリンカーは、例えば、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造を有するリンカーであってよい。式中、Ａ１は、好ましくは、８〜１４、８〜１３、８〜１２、９〜１３、９〜１２、９〜１１、１０〜１２、または１０〜１１のアルキレン基であってよい。具体的には、式中、Ａ１は、炭素数８、９、１０、１１、１２、１３、または１４のアルキレン基であることが好ましく、炭素数９、１０、１１、または１２のアルキレン基であることがより好ましく、炭素数１０または１１のアルキレン基であることがさらに好ましく、炭素数１１のアルキレン基であることが特に好ましい。
【０１７１】
ＧＬＰ−１等のペプチドとリンカーの結合様式については、後述する通りである。リンカーは、例えば、ペプチドのアミノ酸残基と結合させることができる。ＧＬＰ−１においてリンカーを結合させるアミノ酸残基は、Ｎ末端のアミノ酸残基から好ましくは１５残基以上、より好ましくは２０残基以上、さらに好ましくは２５残基以上、特に好ましくは３０残基以上Ｃ末端側に存在するアミノ酸残基であってよい。また、ＧＬＰ−１においてリンカーを結合させるアミノ酸残基は、Ｃ末端の近傍に存在するアミノ酸残基であることが好ましく、Ｃ末端のアミノ酸残基であることがより好ましい。ここにいう「Ｃ末端の近傍に存在するアミノ酸残基」とは、Ｃ末端から好ましくは１５残基以内、より好ましくは１２残基以内、さらに好ましくは８残基以内、特に好ましくは４残基以内に存在するアミノ酸残基である。
【０１７２】
ＧＬＰ−１においてリンカーを結合させるアミノ酸残基は、リジン（Ｋ）残基、システイン（Ｃ）残基、および／またはＣ末端のアミノ酸残基であることが好ましい。リンカーを結合させるアミノ酸残基がリジン残基である場合は、リジン残基のε−アミノ基とリンカーを結合させることが好ましい。リンカーを結合させるアミノ酸残基がシステイン残基
である場合は、システイン残基のチオール基とリンカーを結合させることが好ましい。
【０１７３】
ＧＬＰ−１（７−３７）において、Ｎ末端のアミノ酸残基は７位のヒスチジン残基である。よって、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１Ｃ、およびＧＬＰ−１ｏｒｉＣにおいてリジン残基は２６位と３４位に存在し、ＧＬＰ−１ＲＫにおいてリジン残基は３４位に存在する。また、ＧＬＰ−１ＣおよびＧＬＰ−１ｏｒｉＣにおいてシステイン残基は３７位に存在する。
【０１７４】
ＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列を含むペプチドやＧＬＰ−１（７−３７）のアナログのアミノ酸配列を含むペプチド等）においてリンカーを結合させるアミノ酸残基は、具体的には、２６位のリジン残基、３４位のリジン残基、または３７位のシステイン残基であることが好ましく、３４位のリジン残基または３７位のシステイン残基であることがより好ましく、３７位のシステイン残基であることがさらに好ましい。なお、ここに記載のアミノ酸残基の位置は、（ａ）および（ｂ１）〜（ｂ３）のいずれかに示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の位置を基準とした相対的な位置を示す。よって、ここに記載のアミノ酸残基の絶対的な位置は、アミノ酸残基の欠失、挿入、及び／又は付加によって前後し得る。任意のＧＬＰ−１のアミノ酸配列におけるここに記載のアミノ酸残基の絶対的な位置は、例えば、当該任意のＧＬＰ−１のアミノ酸配列と（ａ）および（ｂ１）〜（ｂ３）のいずれかに示されるアミノ酸配列とのアラインメントにより同定できる。
【０１７５】
ＧＬＰ−１においてリンカーを結合させるアミノ酸残基の数（グリコサミノグリカンを導入するアミノ酸残基の数）は、１つであってもよく、２つまたはそれ以上であってもよい。ＧＬＰ−１においてリンカーを結合させるアミノ酸残基の数は、１つであることが好ましい。
【０１７６】
インスリンとしては、Ａ鎖及びＢ鎖を含み、血糖抑制作用を有するペプチド多量体が挙げられる。Ａ鎖としては、インスリンＡ鎖及びそのバリアントを例示することができる。Ｂ鎖としては、インスリンＢ鎖及びそのバリアントを例示することができる。
【０１７７】
バリアントについては、ＧＬＰ−１のバリアントについての記載を準用できる。すなわち、インスリンＡ鎖及びＢ鎖のバリアントは、例えば、それぞれ、インスリンＡ鎖及びＢ鎖のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むペプチドであってよい。また、インスリンＡ鎖及びＢ鎖のバリアントは、例えば、それぞれ、インスリンＡ鎖及びＢ鎖のアミノ酸配列に対し、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであってもよい。
【０１７８】
インスリンとして、具体的には、下記（Ａ）に示されるペプチド及び下記（Ｂ）に示されるペプチドを含み、血糖抑制作用を有するペプチド多量体を例示することができる。すなわち、本発明においてペプチドは、具体的には、例えば、下記（Ａ）に示されるペプチド及び下記（Ｂ）に示されるペプチドを含み、血糖抑制作用を有するペプチド多量体であってよい。
（Ａ）下記（ａ１）に示されるインスリンＡ鎖のアミノ酸配列を含むペプチド、又は下記（ａ２）若しくは（ａ３）に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ａ１）ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号５）
（ａ２）前記（ａ１）に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
（ａ３）前記（ａ１）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するア
ミノ酸配列。
（Ｂ）下記（ｂ１）に示されるインスリンＢ鎖のアミノ酸配列を含むペプチド、又は下記（ｂ２）若しくは（ｂ３）に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ１）ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号６）
（ｂ２）前記（ｂ１）に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
（ｂ３）前記（ｂ１）に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【０１７９】
上記バリアントにおいて、改変（例えば、置換、欠失、挿入、及び／又は付加）されるアミノ酸残基は、リンカーを結合させるアミノ酸残基を除く他のアミノ酸残基であってよい。
【０１８０】
インスリン等のペプチドに結合させるリンカーについては、上述した通りである。インスリン（例えば、上記のペプチド多量体）に結合させるリンカーは、例えば、前記一般式（Ｌ１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造を有するリンカーであってよい。式中、Ａ１は、好ましくは、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜４、または２〜３であってよい。具体的には、式中、Ａ１は、炭素数１、２、３、４、５、または６のアルキレン基であることが好ましく、炭素数１、２、３、または４のアルキレン基であることがより好ましく、炭素数１または２のアルキレン基であることがさらに好ましく、炭素数２のアルキレン基であることが特に好ましい。
【０１８１】
インスリン等のペプチドとリンカーの結合様式については、後述する通りである。リンカーは、例えば、ペプチドのアミノ酸残基と結合させることができる。インスリンにおいてリンカーを結合させるアミノ酸残基は、リジン（Ｋ）残基またはＮ末端のアミノ酸残基であることが好ましい。リンカーを結合させるアミノ酸残基がリジン残基である場合は、リジン残基のε−アミノ基とリンカーを結合させることが好ましい。リンカーを結合させるアミノ酸残基がＮ末端のアミノ酸残基である場合は、Ｎ末端のα−アミノ基とリンカーを結合させることが好ましい。
【０１８２】
インスリンにおいてリンカーを結合させるアミノ酸残基は、具体的には、インスリンＡ鎖（例えば、上記（Ａ）に示されるペプチド）のＮ末端のアミノ酸残基、インスリンＢ鎖（例えば、上記（Ｂ）に示されるペプチド）のＮ末端のアミノ酸残基、またはインスリンＢ鎖の２９位のリジン残基であることが好ましく、インスリンＡ鎖のＮ末端のアミノ酸残基、またはインスリンＢ鎖の２９位のリジン残基であることがより好ましく、インスリンＡ鎖のＮ末端のアミノ酸残基であることがさらに好ましい。なお、「インスリンＢ鎖の２９位のリジン残基」の位置は、（ｂ１）に示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の位置を基準とした相対的な位置を示す。よって、当該アミノ酸残基の絶対的な位置は、アミノ酸残基の欠失、挿入、及び／又は付加によって前後し得る。任意のインスリンＢ鎖のアミノ酸配列における当該アミノ酸残基の絶対的な位置は、例えば、当該任意のインスリンＢ鎖のアミノ酸配列と（ｂ１）に示されるアミノ酸配列とのアラインメントにより同定できる。
【０１８３】
インスリンは、一態様において、Ａ鎖及びＢ鎖からなるペプチド二量体（例えば、上記（Ａ）に示されるペプチドおよび上記（Ｂ）に示されるペプチドからなるペプチド二量体）であってよい。
【０１８４】
インスリンにおいてＡ鎖は、６位のシステイン残基と１１位のシステイン残基がジスルフィド結合を形成していることが好ましい。また、インスリンにおいてＡ鎖とＢ鎖は、Ａ
鎖の７位のシステイン残基とＢ鎖の７位のシステイン残基およびＡ鎖の２０位のシステイン残基とＢ鎖の１９位のシステイン残基がジスルフィド結合を形成していることが好ましい。
【０１８５】
上記のペプチドの説明において、「アミノ酸配列を含む」という表現は、「アミノ酸配列からなる」場合を包含する。
【０１８６】
ペプチドとしては、１種のペプチドのみが用いられてもよく、２種またはそれ以上のペプチドが用いられてもよい。
【０１８７】
ペプチドは、例えば、化学合成により、当該ペプチドを産生する生物からの回収により、または当該ペプチドをコードする遺伝子の発現により、製造することができる。また、ペプチドは、例えば、各種試薬メーカー（ペプチド研究所社、北海道システムサイエンス社、スクラム社等）から市販品として、または合成を委託して入手することができる。
【０１８８】
＜９＞本発明におけるグリコサミノグリカンとリンカーの結合様式
本発明においてグリコサミノグリカンとリンカーの結合様式は、両者が結合した状態を維持することが可能な様式である限り、特に制限されない。本発明においてグリコサミノグリカンとリンカーを結合させる方法としては、例えば、グリコサミノグリカンにリンカーを導入する公知の方法を用いることができる。本発明においてグリコサミノグリカンとリンカーの結合様式は、結合状態の安定性の点から、共有結合であることが好ましい。
【０１８９】
リンカーは、例えば、グリコサミノグリカンの糖残基と結合させることができる。本発明においてリンカーを結合させるグリコサミノグリカンの糖残基は、還元末端の糖残基であることが好ましい。本発明においてリンカーとグリコサミノグリカンの結合は、リンカーとグリコサミノグリカンの還元末端の糖残基の１位の炭素原子との結合であることが好ましい。還元末端の糖残基は、グルコサミン残基、ガラクトサミン残基、またはグルクロン酸残基であることが好ましい。グルコサミン残基は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基であることが好ましい。ガラクトサミン残基は、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基であることが好ましい。
【０１９０】
本発明においてリンカーとグリコサミノグリカンの結合は、リンカーの官能基とグリコサミノグリカンの官能基の反応により形成される結合であってよい。本発明においてリンカーとグリコサミノグリカンの結合は、前記一般式（Ｌ１１）〜（Ｌ１５）のいずれかに示される構造を有するリンカーの官能基Ｚ２とグリコサミノグリカンの官能基の反応により形成される結合であることが好ましい。リンカーは、具体的には、例えば、グリコサミノグリカンのアルデヒド基および／またはアミノ基と結合させることができる。当該グリコサミノグリカンの官能基は、アルデヒド基であることが好ましい。
【０１９１】
グリコサミノグリカンとリンカーの結合は、例えば、アルデヒド基とアミノ基の結合により行うことができる。よって、グリコサミノグリカンとリンカーの結合は、具体的には、例えば、グリコサミノグリカンが有するアルデヒド基とリンカーが有するアミノ基の結合、またはグリコサミノグリカンが有するアミノ基とリンカーが有するアルデヒド基との結合により行うことができる。
【０１９２】
「グリコサミノグリカンが有するアルデヒド基」は、グリコサミノグリカンが還元末端に本来的に有するアルデヒド基であってもよく、人為的に導入されたアルデヒド基であってもよい。「人為的に導入されたアルデヒド基」とは、グリコサミノグリカンを化学反応に供することで導入されるアルデヒド基であることを意味する。例えば、グリコサミノグリカンを過ハロゲン酸と共存させる処理を行うことにより、還元末端ＧａｌＮＡｃ残基の
Ｃ４−Ｃ５結合、還元末端ＧｌｃＵＡ残基のＣ２−Ｃ３結合、還元末端ＧｌｃＵＡ残基のＣ５−Ｃ６結合、および／または還元末端以外のＧｌｃＵＡ残基のＣ２−Ｃ３結合を切断して、グリコサミノグリカンにアルデヒド基を人為的に導入することができる。ここにいう過ハロゲン酸としては、過ヨウ素酸が挙げられる。「グリコサミノグリカンが有するアルデヒド基」は、グリコサミノグリカンが還元末端に本来的に有するアルデヒド基であることが好ましい。
【０１９３】
「グリコサミノグリカンが有するアミノ基」は、グリコサミノグリカンがアミノ糖残基に本来的に有するアミノ基であってもよく、人為的に導入されたアミノ基であってもよい。「本来的に有するアミノ基」とは、グリコサミノグリカンのＧａｌＮＡｃ残基またはＧｌｃＮＡｃ残基の２位のアミノ基であることを意味する。当該アミノ基がアセチル化されている場合は、例えば、酸もしくは塩基またはヒドラジンと接触させる処理に供して脱アセチル化することにより、当該アミノ基をリンカーとの結合のために用いることができる。また、「人為的に導入されたアミノ基」とは、グリコサミノグリカンを化学反応に供することで導入されるアミノ基であることを意味する。例えば、グリコサミノグリカンをアミンと共存させる処理を行うことにより、グリコサミノグリカンの糖残基のアルデヒド基とのシッフ塩基を形成させて、グリコサミノグリカンにアミノ基を導入することができる。また、「人為的に導入されたアミノ基を有するグリコサミノグリカン」は、このようにして形成されるシッフ塩基を還元したグリコサミノグリカンであってもよい。ここにいうアミンとしては、アンモニア、アンモニウム塩（塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等）、ジアミン（エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン等のポリメチレンジアミン等）が挙げられる。
【０１９４】
リンカーが結合するグリコサミノグリカンの糖残基は、還元末端の糖残基であることが好ましい。また、リンカーが結合するグリコサミノグリカンの部位は、グリコサミノグリカンが還元末端に本来的に有するアルデヒド基であることが好ましい。
【０１９５】
本発明において、グリコサミノグリカンとリンカーの結合は、一態様において、下記構造式（Ｇ１）〜（Ｇ３）のいずれかに示される構造（すなわち結合）を有するものであってよい。
【０１９６】
【化３１】
2019218265.tif 000033
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して水素又は任意の基を表し、Ｌ’はリンカーのうちグリコサミノグリカン鎖と結合しているアミノ基を除く残余の部分を表し、Ｇ’はグリコサミノグリカン鎖のうち還元末端のガラクトサミン残基を除く残余の部分を表す。）
【０１９７】
上記構造式（Ｇ１）において、Ｒ１は水素、硫酸基、又はアセチル基であることが好ましく、水素又はアセチル基であることがより好ましく、アセチル基であることがさらに好ましい。上記構造式（Ｇ１）において、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して水素又は硫酸基であることが好ましく、水素であることがより好ましい。上記構造式（Ｇ１）において、Ｇ’はコンドロイチン鎖であることが好ましい。
【０１９８】
【化３２】
2019218265.tif 000034
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して水素又は任意の基を表し、Ｌ’はリンカーのうちグリコサミノグリカン鎖と結合しているアミノ基を除く残余の部分を表し、Ｇ’はグリコサミノグリカン鎖のうち還元末端のグルコサミン残基を除く残余の部分を表す。）
【０１９９】
上記構造式（Ｇ２）において、Ｒ１は水素、硫酸基、又はアセチル基であることが好ましく、水素又はアセチル基であることがより好ましく、アセチル基であることがさらに好ましい。上記構造式（Ｇ２）において、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して水素又は硫酸基であることが好ましく、水素であることがより好ましい。上記構造式（Ｇ２）において、Ｇ’はヘパロサン鎖であることが好ましい。
【０２００】
【化３３】
2019218265.tif 000035
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して水素又は任意の基を表し、Ｌ’はリンカーのうちグリコサミノグリカン鎖と結合しているアミノ基を除く残余の部分を表し、Ｇ’はグリコサミノグリカン鎖のうち還元末端のグルクロン酸残基を除く残余の部分を表す。）
【０２０１】
上記構造式（Ｇ３）において、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、それぞれ独立して水素又は硫酸基であることが好ましく、水素であることがより好ましい。上記構造式（Ｇ３）において、Ｒ４は水素、任意のアルカリ金属原子、又は任意のアルカリ土類金属原子であることが好ましく、水素又は任意のアルカリ金属原子であることがより好ましく、任意のアルカリ金属原子であることが好ましい。上記構造式（Ｇ３）において、Ｒ４としては、ナトリウム原子（Ｎａ）やカリウム原子（Ｋ）が例示される。上記構造式（Ｇ３）において、Ｇ’はコンドロイチン鎖またはヘパロサン鎖であることが好ましい。
【０２０２】
リンカーとグリコサミノグリカンは、１箇所のみで結合していてもよく、２またはそれ以上の箇所で結合していてもよい。１分子のリンカーに対し、１分子のグリコサミノグリカンのみが結合していてもよく、２分子またはそれ以上および／または２種またはそれ以上のグリコサミノグリカンが結合していてもよい。１分子のグリコサミノグリカンに対し、１分子のリンカーのみが結合していてもよく、２分子またはそれ以上および／または２種またはそれ以上のリンカーが結合していてもよい。
【０２０３】
＜１０＞本発明におけるリンカーとペプチドの結合様式
本発明においてリンカーとペプチドの結合様式は、両者が結合した状態を維持することが可能な様式である限り、特に制限されない。本発明においてリンカーとペプチドを結合させる方法としては、例えば、リンカーをペプチドに導入する公知の方法を用いることができる。本発明においてリンカーとペプチドの結合様式は、結合状態の安定性の点から、
共有結合であることが好ましい。
【０２０４】
リンカーは、例えば、ペプチドのアミノ酸残基と結合させることができる。本発明においてリンカーを結合させるペプチドのアミノ酸残基は、例えば、アミノ基を有するアミノ酸残基（アルギニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、リジン残基等）、チオール基を有するアミノ酸残基（システイン残基、メチオニン残基、ホモシステイン残基等）、Ｃ末端のアミノ酸残基、および／またはＮ末端のアミノ酸残基であってよい。本発明においてリンカーを結合させるペプチドのアミノ酸残基は、リジン（Ｋ）残基、システイン（Ｃ）残基、Ｃ末端のアミノ酸残基、および／またはＮ末端のアミノ酸残基であることが好ましい。
【０２０５】
本発明においてリンカーとペプチドの結合は、リンカーの官能基とペプチドの官能基の反応により形成される結合であってよい。本発明においてリンカーとペプチドの結合は、前記一般式（Ｌ６）〜（Ｌ２０）のいずれかに示される構造を有するリンカーの官能基Ｚ１とペプチドの官能基の反応により形成される結合であることが好ましい。リンカーは、具体的には、例えば、ペプチドのアミノ基および／またはチオール基と結合させることができる。リンカーを結合させるアミノ酸残基がリジン残基である場合は、リジン残基のε−アミノ基とリンカーを結合させることが好ましい。リンカーを結合させるアミノ酸残基がシステイン残基である場合は、システイン残基のチオール基とリンカーを結合させることが好ましい。リンカーを結合させるアミノ酸残基がＮ末端のアミノ酸残基である場合は、Ｎ末端のα−アミノ基とリンカーを結合させることが好ましい。
【０２０６】
「リンカーとペプチドの結合」は、例えば、マレイミド基またはハロアセチル基とチオール基の結合により行うことができる。よって、リンカーとペプチドの結合は、具体的には、例えば、リンカーが有するマレイミド基またはハロアセチル基とペプチドが有するチオール基の結合により行うことができる。
【０２０７】
「ペプチドが有するチオール基」は、ペプチドが本来的に有するチオール基であってもよく、人為的に導入されたチオール基であってもよい。「人為的に導入されたチオール基」とは、ペプチドを化学反応に供することで導入されるチオール基であることを意味する。「ペプチドが有するチオール基」は、ペプチドが本来的に有するチオール基（システイン、メチオニン、ホモシステイン等が本来的に有するチオール基）であることが好ましい。
【０２０８】
リンカーが結合するペプチドのアミノ酸残基は、本来的にチオール基を有するアミノ酸残基（システイン残基、メチオニン残基、ホモシステイン残基等）であることが好ましい。これらの中でリンカーが結合するペプチドのアミノ酸残基は、システイン（Ｃ）残基であることがより好ましい。
【０２０９】
また、「リンカーとペプチドの結合」は、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基またはアルデヒド基とアミノ基の結合により行うことができる。よって、リンカーとペプチドの結合は、具体的には、例えば、リンカーが有するＮＨＳ基またはアルデヒド基とペプチドが有するアミノ基の結合により行うことができる。
【０２１０】
「ペプチドが有するアミノ基」は、ペプチドが本来的に有するアミノ基であってもよく、人為的に導入されたアミノ基であってもよい。「人為的に導入されたアミノ基」とは、ペプチドを化学反応に供することで導入されるアミノ基であることを意味する。「ペプチドが有するアミノ基」は、ペプチドが本来的に有するアミノ基（アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン等が本来的に有するε−アミノ基、またはペプチドのＮ末端に存在するα−アミノ基）であることが好ましい。
【０２１１】
リンカーが結合するペプチドのアミノ酸残基は、本来的にアミノ基を有するアミノ酸残基（アルギニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、リジン残基等）、および／またはペプチドのＮ末端のアミノ酸残基であることが好ましい。これらの中でリンカーが結合するペプチドのアミノ酸残基は、リジン（Ｋ）および／またはペプチドのＮ末端のアミノ酸残基であることがより好ましい。
【０２１２】
リンカーとペプチドの結合様式は、特に具体的には、本発明におけるペプチド（例えば、ＧＬＰ−１およびインスリン）に関連して説明した通りであってよい。
【０２１３】
本発明において、リンカーとペプチドの結合は、一態様において、下記（Ｐ１）〜（Ｐ３）のいずれかに示される構造（すなわち結合）を有するものであってよい。
【０２１４】
【化３４】
2019218265.tif 000036
（式中、Ｌ’はリンカーのうちシステイン残基等のアミノ酸残基のチオール基と結合しているマレイミド基を除く残余の部分を表し、Ｐｎ及びＰｃは存在しても存在しなくてもよく、但しＰｎ及びＰｃは同時に存在しないことはなく、Ｐｎはペプチドのうちリンカーが結合したシステイン残基等のアミノ酸残基よりＮ末端側の残余の部分を表し、Ｐｃはペプチドのうちリンカーが結合したシステイン残基等のアミノ酸残基よりＣ末端側の残余の部分を表す。）
【０２１５】
【化３５】
2019218265.tif 000037
（式中、Ｌ’はリンカーのうちシステイン残基等のアミノ酸残基のチオール基と結合しているハロアセチル基のハロゲン原子を除く残余の部分を表し、Ｐｎ及びＰｃは存在しても存在しなくてもよく、但しＰｎ及びＰｃは同時に存在しないことはなく、Ｐｎはペプチドのうちリンカーが結合したシステイン残基等のアミノ酸残基よりＮ末端側の残余の部分を表し、Ｐｃはペプチドのうちリンカーが結合したシステイン残基等のアミノ酸残基よりＣ末端側の残余の部分を表す。）
【０２１６】
【化３６】
2019218265.tif 000038
（式中、Ｌ’はリンカーのうちＮＨＳ基を除く残余の部分を表し、Ｐｎ及びＰｃは存在しても存在しなくてもよく、但しＰｎ及びＰｃは同時に存在しないことはなく、Ｐｎはペプチドのうちリンカーが結合したリジン残基等のアミノ酸残基よりＮ末端側の残余の部分
を表し、Ｐｃはペプチドのうちリンカーが結合したリジン残基等のアミノ酸残基よりＣ末端側の残余の部分を表す。）
【０２１７】
本発明において、リンカーとペプチドの結合がリンカーとシステイン残基との結合である場合、その結合様式は前記一般式（Ｐ１）に示される結合様式であることが好ましい。本発明において、リンカーとペプチドの結合がリンカーとリジン残基との結合である場合、その結合様式は前記一般式（Ｐ３）に示される結合様式であることが好ましい。
【０２１８】
リンカーとペプチドは、１箇所のみで結合していてもよく、２またはそれ以上の箇所で結合していてもよい。１分子のリンカーに対し、１分子のペプチドのみが結合していてもよく、２分子またはそれ以上および／または２種またはそれ以上のペプチドが結合していてもよい。１分子のペプチドに対し、１分子のリンカーのみが結合していてもよく、２分子またはそれ以上および／または２種またはそれ以上のリンカーが結合していてもよい。例えば、リンカーを結合させるペプチドのアミノ酸残基は、１残基であってもよく、２残基またはそれ以上であってもよい。また、リンカーは、同一のアミノ酸残基に２つまたはそれ以上導入されてもよい。
【０２１９】
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
【実施例】
【０２２０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例の内容のみに限定されるものではない。
【０２２１】
＜実施例１＞コンドロイチンの調製
コンドロイチン（以下、「ＣＨ」ともいう。）は、文献（国際公開第２０１１／１０９４３８号）に記載の方法に従ってエシェリヒア・コリMSC702株を培養し、培養上清から精製して調製した。エシェリヒア・コリMSC702株は、同文献に記載の方法に基づき、エシェリヒア・コリK-12 W3110株（ATCC 27325）に、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG遺伝子を各４コピー、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS、kpsM、kpsT遺伝子を各１コピー、及びシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のxylS遺伝子を１コピー導入して構築した。
【０２２２】
＜実施例２＞ヘパロサンの調製
ヘパロサン（以下、「ＨＰＮ」ともいう。）は、公知の文献（特開２００４−０１８８４０号公報）に記載の方法に従ってエシェリヒア・コリＫ５株（Serotype O10:K5(L):H4,
ATCC 23506）を培養し、培養上清から精製して調製した。
【０２２３】
＜参考例１＞分子量の調整
前記実施例１で得られたコンドロイチンまたは前記実施例２で得られたヘパロサンを１ｇ／Ｌとなるように蒸留水に溶解した。この溶液に終濃度で０．５Ｍとなるように塩酸を添加し、６０℃で１０分間〜５時間撹拌した。この溶液に水酸化ナトリウムを添加して中和し、透析により脱塩した後、凍結乾燥させた。続いて、当該コンドロイチンまたは当該ヘパロサンを１２．５ｍｇ／ｍＬになるように１０％メタノール／５０ｍＭ炭酸ナトリウムに溶解した後、ヘキソサミン残基（ＧａｌＮＡｃ残基またはＧｌｃＮＡｃ残基）の数に対して４モル当量の無水酢酸を添加して室温で１時間撹拌した。この溶液に酢酸ナトリウムを終濃度３％（ｗ／ｖ）となるように添加し、続いて１．６倍容の９９．５％（ｖ／ｖ）エタノールと混合した後、室温に一晩静置して得られる沈殿物を回収した。このようにして得られた沈殿物を含水エタノールで洗浄し、その後に乾燥させた。このようにして所
望の分子量を有するコンドロイチンおよびヘパロサンを得た。以下、ｎ×１０３の分子量を有するコンドロイチンおよびヘパロサンを、それぞれ、「ＣＨｎ」および「ＨＰＮｎ」ともいう。すなわち、例えば、「ＣＨ１０」とは、分子量１０ｋＤａのコンドロイチンを示す。
【０２２４】
＜参考例２＞分子量の測定
本実施例に記載したコンドロイチンまたはヘパロサンの分子量は、以下の条件に従ったゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量である。
【０２２５】
分子量の測定は、カラムとしてUltrahydrogel Linear（内径：7.8mm×長さ：300mm、Waters社製）を用い、カラム温度を４０℃に設定して行った。移動相には０．２Ｍ  ＮａＣｌを用い、流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎとした。検出は示差屈折率検出器により行い、１ｍｇ／ｍＬに溶解した試料を１００μＬアプライして得られるピークの保持時間から較正曲線を用いて分子量を算出した。標準物質としてプルラン（昭和電工社製）を用いた測定を行い、マークホーインク補正を行って較正曲線を作成した。マークホーインク補正は、ＨＰＬＣシステム（島津製作所社製）に付属のソフトウェアを用いて行った。
【０２２６】
＜実施例３＞本実施例で使用するリンカー
本実施例では、前記構造式（Ｘ１）〜（Ｘ２６）に示されるリンカーを使用した。これらのリンカーは、下記の通りに入手した。
（１）AMAS（Ｘ１）およびSulfo-SMPB（Ｘ２４）は、Thermo scientific社から入手した
。
（２）BMPS（Ｘ２）、SBA（Ｘ１０）、SIA（Ｘ１２）、SPDP（Ｘ１４）、HDA（Ｘ１８）
、BAMB（Ｘ２２）、およびBAMC（Ｘ２６）は、東京化成工業社から入手した。
（３）Sulfo-GMBS（Ｘ３）、Sulfo-EMCS（Ｘ４）、Sulfo-HMCS（Ｘ５）、Sulfo-KMUS（Ｘ６）、DTBSU（Ｘ１５）、AHT（Ｘ１９）、およびAUDT（Ｘ２０）は、同仁化学研究所から入手した。
（４）Sulfo-LMDS（Ｘ７）は、アミノドデカン酸のアミノ基をマレイミド化した後、カルボキシ基に対してsulfo-NHS（N-hydroxysulfosuccinimide）を導入して調製した。
（５）Sulfo-NMTS（Ｘ８）は、１４−アミノテトラデカン酸のカルボキシ基に対してsulfo-NHSを導入して調製した。１４−アミノテトラデカン酸は、フタルイミドと１−ブロモ
−１２−ドデカノールを光延反応でＮ−（１２−ドデシル）フタルイミドとした後、マロン酸エステルと反応させ、酸加水分解とそれにつづく脱炭酸反応により１４−フタルイミドテトラデカン酸とし、フタルイミドを分解して調製した。
（６）Sulfo-OMHS（Ｘ９）は、１６−ブロモヘキサデカン酸とアジ化ナトリウムを反応させて１６−アジドヘキサデカン酸とした後、接触還元でアジド基をアミノ基に変換して１６−アミノヘキサデカン酸とした。その後、カルボキシ基に対してsulfo-NHSを導入して
調製した。
（７）Sulfo-SBAX（Ｘ１１）は、SBA（Ｘ１０）のＮＨＳ基とアミノドデカン酸のアミノ
基を反応させて１２−[（２−ブロモアセチル）アミノ]ドデカン酸を調製した後、カルボキシ基に対してsulfo-NHSを導入して調製した。
（８）SIAX（Ｘ１３）は、Molecular BioScience社から入手した。
（９）EDA（Ｘ１６）、AET（Ｘ１７）、およびDDDA（Ｘ２１）は、和光純薬工業社から入手した。
（１０）Sulfo-MBS（Ｘ２３）、およびSulfo-SMCC（Ｘ２５）は、ProtoChem社より入手した。
【０２２７】
＜実施例４＞還元末端にアミノ基を導入したグリコサミノグリカンの調製
グリコサミノグリカン（以下、「ＧＡＧ」ともいう。）の還元末端へのアミノ基の導入は、ジアミノリンカー（EDA、HDA、DDDA、BAMB、またはBAMC）、アンモニア、またはアン
モニウム塩を用い、還元的アミノ化反応により行った。還元末端にアミノ基を導入したグリコサミノグリカンの誘導体を、以下、総称して「ＧＡＧ−ＮＨ２」ともいう。
【０２２８】
（１）還元末端にＥＤＡを導入したＣＨ１０（ＣＨ１０−ＥＤＡ）の調製
２００ｍｇのＣＨ１０に２８．５ｍＬのＥＤＡ溶液（３２ｍＬの注射用水（ＷＦＩ）と１ｍＬのＥＤＡを混合した後、５Ｍ  ＨＣｌを添加してｐＨ７．３に調整した水溶液、以下同じ）を添加して２時間撹拌した。その後、ＥＤＡ溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液（１８ｍＬのＷＦＩに９００ｍｇのＮａＢＨ３ＣＮを溶解させた溶液、以下同じ）を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。この溶液に終濃度で３％（ｗ／ｖ）となるように酢酸ナトリウムを添加して３０分間撹拌し、終濃度で７５％（ｖ／ｖ）となるようにエタノールを添加して３０分間撹拌した後、この溶液を遠心して上清を除去した。このようにして得た沈殿物をＷＦＩに溶解した後、陽イオン交換カラム（Diaion PK220（三菱化学社製）、直径：17mm×長さ：170mm）を素通りさせた。回収した溶液をＮａＯＨで中和し、
透析により脱塩した後、凍結乾燥した。このようにして１５４ｍｇのＣＨ１０−ＥＤＡを得た。
【０２２９】
（２）還元末端にＥＤＡを導入したＣＨ２０（ＣＨ２０−ＥＤＡ）の調製
８２．９ｍｇのＣＨ２０に５．２ｍＬのＥＤＡ溶液を添加して１．５時間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして７３．０ｍｇのＣＨ２０−ＥＤＡを得た。
【０２３０】
（３）還元末端にＥＤＡを導入したＣＨ３０（ＣＨ３０−ＥＤＡ）の調製
８２．６ｍｇのＣＨ３０に３．５ｍＬのＥＤＡ溶液を添加して１．５時間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして７８．７ｍｇのＣＨ３０−ＥＤＡを得た。
【０２３１】
（４）還元末端にＥＤＡを導入したＣＨ４０（ＣＨ４０−ＥＤＡ）の調製
２００ｍｇのＣＨ４０に３．３３ｍＬのＷＦＩと６．６６ｍＬのＥＤＡ希釈液（３２ｍＬのＷＦＩと１ｍＬのＥＤＡを混合した溶液、以下同じ）を添加して３０分間撹拌した後、４７２μＬの５Ｍ  ＨＣｌを添加して３０分間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして１６７ｍｇのＣＨ４０−ＥＤＡを得た。
【０２３２】
（５）還元末端にＥＤＡを導入したＣＨ７０（ＣＨ７０−ＥＤＡ）の調製
１ｇのＣＨ７０に８．３５ｍＬのＷＦＩと１６．７ｍＬのＥＤＡ希釈液を添加して３０分間撹拌した後、２．２５ｍＬの５Ｍ  ＨＣｌを添加して４０分間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして７７７ｍｇのＣＨ７０−ＥＤＡを得た。
【０２３３】
（６）還元末端にＥＤＡを導入したＣＨ９０（ＣＨ９０−ＥＤＡ）の調製
３００ｍｇのＣＨ９０に１．９ｍＬのＷＦＩと３．８ｍＬのＥＤＡ希釈液を添加して３０分間撹拌した後、５４０μＬの５Ｍ  ＨＣｌを添加して１５分間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして２７６ｍｇのＣＨ９０−ＥＤＡを得た。
【０２３４】
（７）還元末端にＥＤＡを導入したＣＨ１４０（ＣＨ１４０−ＥＤＡ）の調製
３００ｍｇのＣＨ１４０に１．６４ｍＬのＷＦＩと３．２８ｍＬのＥＤＡ希釈液を添加して４０分間撹拌した後、４５０μＬの５Ｍ  ＨＣｌを添加して３０分間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして２８２ｍｇのＣＨ１４０−ＥＤＡを得た。
【０２３５】
（８）還元末端にＥＤＡを導入したＨＰＮ５０（ＨＰＮ５０−ＥＤＡ）の調製
３０ｍｇのＨＰＮ５０に０．５ｍＬのＷＦＩと１．０ｍＬのＥＤＡ希釈液を添加して３
０分間撹拌した後、７１μＬの５Ｍ  ＨＣｌを添加して３０分間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして２９．５ｍｇのＨＰＮ５０−ＥＤＡを得た。
【０２３６】
（９）還元末端にＨＤＡを導入したＣＨ７０（ＣＨ７０−ＨＤＡ）の調製
３０２ｍｇのＣＨ７０に２．５ｍＬのＷＦＩと５．０ｍＬのＨＤＡ溶液（６．５５ｍＬのＷＦＩに２０５ｍｇのＨＤＡを溶解させた後、５Ｍ  ＨＣｌを添加してｐＨ８．６に調整した溶液）を添加して１時間撹拌した。その後、ＨＤＡ溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして２５２ｍｇのＣＨ７０−ＨＤＡを得た。
【０２３７】
（１０）還元末端にＨＤＡを導入したＣＨ１４０（ＣＨ１４０−ＨＤＡ）の調製
３０５ｍｇのＣＨ１４０に１．６４ｍＬのＷＦＩと３．２８ｍＬのＨＤＡ水溶液（３．８４ｍＬのＷＦＩに１２０ｍｇのＨＤＡを溶解させた溶液）を添加して４０分間撹拌した後、４５０μＬの５Ｍ  ＨＣｌを添加して３０分間撹拌した。その後、ＨＤＡ水溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、上記（９）と同じ操作を行った。このようにして２７６ｍｇのＣＨ１４０−ＨＤＡを得た。
【０２３８】
（１１）還元末端にＤＤＤＡを導入したＣＨ９０（ＣＨ９０−ＤＤＤＡ）の調製
２００ｍｇのＣＨ９０に１．２７ｍＬのＷＦＩと２．５４ｍＬのＤＤＤＡ溶液（５．０ｍＬの５０％エタノールに２００ｍｇのＤＤＤＡを溶解させた溶液）を添加して２５分間撹拌した後、３６０μＬの５Ｍ  ＨＣｌを添加して７５分間撹拌した。その後、ＤＤＤＡ溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして１７１ｍｇのＣＨ９０−ＤＤＤＡを得た。
【０２３９】
（１２）還元末端にＢＡＭＢを導入したＣＨ７０（ＣＨ７０−ＢＡＭＢ）の調製
２０４ｍｇのＣＨ７０に１．７１ｍＬのＷＦＩと３．４１ｍＬのＢＡＭＢ溶液（４．８ｍＬのＷＦＩに１５０ｍｇのＢＡＭＢを溶解させた後、５Ｍ  ＨＣｌを添加してｐＨ８．４に調整した溶液、以下同じ）を添加して４０分間撹拌した。その後、ＢＡＭＢ溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして１３５ｍｇのＣＨ７０−ＢＡＭＢを得た。
【０２４０】
（１３）還元末端にＢＡＭＢを導入したＣＨ１４０（ＣＨ１４０−ＢＡＭＢ）の調製
３００ｍｇのＣＨ１４０に１．６４ｍＬのＷＦＩと３．２７ｍＬのＢＡＭＢ溶液を添加して６０分間撹拌した。以後、上記（１２）と同じ操作を行った。このようにして２５８ｍｇのＣＨ１４０−ＢＡＭＢを得た。
【０２４１】
（１４）還元末端にＢＡＭＣを導入したＣＨ７０（ＣＨ７０−ＢＡＭＣ）の調製
３０３ｍｇのＣＨ７０に２．５ｍＬのＷＦＩと５．０ｍＬのＢＡＭＣ溶液（８．８４ｍＬのＷＦＩに２７６ｍｇのＢＡＭＣを溶解させた後、５Ｍ  ＨＣｌを添加してｐＨ８．１に調整した溶液、以下同じ）を添加して１時間撹拌した。その後、ＢＡＭＣ溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして２４２ｍｇのＣＨ７０−ＢＡＭＣを得た。
【０２４２】
（１５）還元末端にＢＡＭＣを導入したＣＨ１４０（ＣＨ１４０−ＢＡＭＣ）の調製
３００ｍｇのＣＨ１４０に１．６４ｍＬのＷＦＩと３．２７ｍＬのＢＡＭＣ溶液を添加して１時間撹拌した。以後、上記（１４）と同じ操作を行った。このようにして２５９ｍｇのＣＨ１４０−ＢＡＭＣを得た。
【０２４３】
（１６）還元末端にアミノ基を導入したＣＨ７０（ＣＨ７０−ＮＨ２）の調製
３０７ｍｇのＣＨ７０に２．５ｍＬのＷＦＩと５．０ｍＬのＮＨ４ＨＣＯ３水溶液（６．４ｍＬのＷＦＩに４００ｍｇのＮＨ４ＨＣＯ３を溶解させた溶液、以下同じ）を添加して２０分間撹拌した後、６８９μＬの５Ｍ  ＨＣｌを添加して３５分間撹拌した。その後、ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして２３６ｍｇのＣＨ７０−ＮＨ２を得た。
【０２４４】
（１７）還元末端にアミノ基を導入したＣＨ１４０（ＣＨ１４０−ＮＨ２）の調製（１）
２０ｍｇのＣＨ１４０に１０９μＬのＷＦＩと２１８μＬのＮＨ４ＨＣＯ３水溶液を添加して１５分間撹拌した後、３０μＬの５Ｍ  ＨＣｌを添加して２０分間撹拌した。以後、上記（１６）と同じ操作を行った。このようにして２１．１ｍｇのＣＨ１４０−ＮＨ２を得た。
【０２４５】
（１８）還元末端にアミノ基を導入したＣＨ１４０（ＣＨ１４０−ＮＨ２）の調製（２）
２０ｍｇのＣＨ１４０に１０９μＬのＷＦＩと１０９μＬのアンモニア希釈液（０．３ｍＬのＷＦＩと０．１ｍＬの２８％アンモニア水を混合した溶液）を添加して１時間撹拌した後、３０μＬの５Ｍ  ＨＣｌを添加して４５分間撹拌した。その後、アンモニア希釈液と等量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、上記（１６）と同じ操作を行った。このようにして２１．１ｍｇのＣＨ１４０−ＮＨ２を得た。
【０２４６】
＜実施例５＞還元末端にチオール基を導入したグリコサミノグリカンの調製
グリコサミノグリカンの還元末端へのチオール基の導入は、二価性架橋試薬（AET、AHT、AUDT、SPDP、またはDTBSU）を用いて行った。還元末端にチオール基を導入したグリコ
サミノグリカンの誘導体を、以下、総称して「ＧＡＧ−ＳＨ」ともいう。
【０２４７】
（１）還元末端にＡＥＴを導入したＣＨ７０（ＣＨ７０−ＡＥＴ）の調製
５０ｍｇのＣＨ７０に０．４２ｍＬのＡＥＴ溶液（３ｍＬのＷＦＩに１１７ｍｇのＡＥＴを溶解させた溶液、以下同じ）を添加して３０分間撹拌した。その後、ＡＥＴ溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、前記実施例４（１）と同じ操作を行った。このようにして３８ｍｇのＣＨ７０−ＡＥＴを得た。
【０２４８】
（２）還元末端にＡＥＴを導入したＣＨ９０（ＣＨ９０−ＡＥＴ）の調製
１００ｍｇのＣＨ９０に０．８４ｍＬのＡＥＴ溶液を添加して３０分間撹拌した。以後、上記（１）と同じ操作を行った。このようにして１０３ｍｇのＣＨ９０−ＡＥＴを得た。
【０２４９】
（３）還元末端にＡＨＴを導入したＣＨ４０（ＣＨ４０−ＡＨＴ）の調製
５１３ｍｇのＣＨ４０に１１．５ｍＬのＡＨＴ溶液（１２．９ｍＬのＷＦＩに５０５ｍｇのＡＨＴを溶解させた溶液、以下同じ）を添加して３０分間撹拌した。その後、ＡＨＴ溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、前記実施例４（１）と同じ操作を行った。このようにして４４７ｍｇのＣＨ４０−ＡＨＴを得た。
【０２５０】
（４）還元末端にＡＨＴを導入したＣＨ７０（ＣＨ７０−ＡＨＴ）の調製
５０ｍｇのＣＨ７０に０．４２ｍＬのＡＨＴ溶液を添加して３０分間撹拌した。以後、上記（３）と同じ操作を行った。このようにして３０ｍｇのＣＨ７０−ＡＨＴを得た。
【０２５１】
（５）還元末端にＡＨＴを導入したＣＨ９０（ＣＨ９０−ＡＨＴ）の調製
１００ｍｇのＣＨ９０に０．８４ｍＬのＡＨＴ溶液を添加して３０分間撹拌した。以後、上記（３）と同じ操作を行った。このようにして９３．２ｍｇのＣＨ９０−ＡＨＴを得
た。
【０２５２】
（６）還元末端にＡＵＤＴを導入したＣＨ９０（ＣＨ９０−ＡＵＤＴ）の調製
５０ｍｇのＣＨ９０に０．５ｍＬのＡＵＤＴ溶液（０．６８ｍＬの５０％エタノールに３７．４ｍｇのＡＵＤＴを溶解させた溶液）を添加して３０分間撹拌した。その後、ＡＵＤＴ溶液の１／２容量のＮａＢＨ３ＣＮ水溶液を混合し、４２℃で１６時間撹拌した。以後、前記実施例４（１）と同じ操作を行った。このようにして５０ｍｇのＣＨ９０−ＡＵＤＴを得た。
【０２５３】
（７）還元末端にＳＰＤＰを導入したグリコサミノグリカンの調製
３０ｍｇのＧＡＧ−ＮＨ２（CH70-NH2、CH30-EDA、CH40-EDA、CH70-EDA、HPN50-EDA、CH70-HDA、CH30-DDDA、CH90-DDDA、CH70-BAMB、またはCH70-BAMC）を５０％Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ）７５０μＬに溶解した後、０．５Ｍ  Ｂｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．３）９０μＬと２０ｍＭ  ＳＰＤＰ溶液１５０μＬを添加して反応溶液を調製し、遮光して室温で１時間撹拌した。続いて４ｍｇのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加して室温で１時間撹拌し、ピリジルジチオ基をチオール基に還元してpropanoyl-SH基（−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＳＨ）を生成させた。その後、反応溶液５００μＬと０．１Ｍギ酸アンモニウム１ｍＬを混合した溶液を脱塩カラム（Hi Trap Desalting G-25、ＧＥヘルスケア社製）（３５ｍＬ）にアプライした。移動相として０．１Ｍギ酸アンモニウムを用い、グリコサミノグリカンを含む溶出画分を回収した後、凍結乾燥した。このようにして、還元末端にチオール基を導入したグリコサミノグリカン（CH70-NH2-propanoyl-SH、CH30-EDA-propanoyl-SH、CH40-EDA-propanoyl-SH、CH70-EDA-propanoyl-SH、HPN50-EDA-propanoyl-SH、CH70-HDA-propanoyl-SH、CH70-BAMB-propanoyl-SH、CH70-BAMC-propanoyl-SH、CH30-DDDA-propanoyl-SH、およびCH90-DDDA-propanoyl-SH）を得た。
【０２５４】
（８）還元末端にＤＴＢＳＵを導入したＣＨ７０の調製
１００ｍｇのCH70-EDAを５０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２．５ｍＬに溶解した後、０．５Ｍ  Ｂｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．３）０．３ｍＬとジチオスレイトール（ＤＴＴ）２９ｍｇを添加して反応溶液を調製し、遮光して室温で１時間撹拌した。続いて７ｍＭ  ＤＴＢＳＵ溶液０．６ｍＬとＤＭＦ  ２ｍＬを添加して室温で２時間撹拌し、ジチオ基をチオール基に還元してundecanoyl-SH基（−ＣＯ−（ＣＨ２）１０−
ＳＨ）を生成させた。その後、反応溶液と蒸留水２ｍＬを混合した溶液を等分し、それぞれ０．１Ｍギ酸アンモニウム０．７５ｍＬと混合した。この溶液を遠心（２０，０００×ｇ、１０分間）し、上清を回収した。回収した上清を脱塩カラム（Hi Trap Desalting G-25）（３５ｍＬ）にアプライした。移動相として０．１Ｍギ酸アンモニウムを用い、グリコサミノグリカンを含む溶出画分を回収した後、凍結乾燥した。このようにして、還元末端にチオール基を導入したコンドロイチン（CH70-EDA-undecanoyl-SH）を得た。
【０２５５】
＜実施例６＞還元末端にマレイミド基を導入したグリコサミノグリカンの調製
グリコサミノグリカンの還元末端へのマレイミド基の導入は、二価性架橋試薬（AMAS、BMPS、Sulfo-GMBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-HMCS、Sulfo-KMUS、Sulfo-LMDS、Sulfo-NMTS、Sulfo-OMHS、Sulfo-SMCC、Sulfo-MBS、またはSulfo-SMPB）を用いて行った。二価性架橋試
薬は、ＤＭＦに溶解した溶液（以下「二価性架橋試薬溶液」という。）を用いた。還元末端にマレイミド基を導入したグリコサミノグリカンの誘導体を、以下、総称して「ＧＡＧ−Ｍａｌ」ともいう。
【０２５６】
２０ｍｇのＧＡＧ−ＮＨ２（CH70-NH2、CH10-EDA、CH20-EDA、CH30-EDA、CH40-EDA、CH70-EDA、CH90-EDA、CH140-EDA、HPN50-EDA、CH70-HDA、CH140-HDA、CH90-DDDA、CH70-BAMB、CH140-BAMB、CH70-BAMC、またはCH140-BAMC）を５０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５００μＬに溶解した後、０．５Ｍ  Ｂｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．３）
６０μＬと１０ｍＭ二価性架橋試薬溶液１２０μＬを添加して反応溶液を調製し、遮光して室温で１時間撹拌した。その後、反応溶液３４０μＬと０．１Ｍギ酸アンモニウム１．２５ｍＬを混合した溶液を脱塩カラム（Hi Trap Desalting G-25）（３５ｍＬ）にアプライした。移動相として０．１Ｍギ酸アンモニウムを用い、グリコサミノグリカンを含む溶出画分を回収した後、凍結乾燥した。このようにして、還元末端にマレイミド基を導入したグリコサミノグリカン（CH70-NH2-BMPS、CH70-NH2-KMUS、CH10-EDA-KMUS、CH20-EDA-KMUS、CH30-EDA-KMUS、CH40-EDA-BMPS、CH40-EDA-KMUS、CH40-EDA-NMTS、CH40-EDA-OMHS、CH70-EDA-AMAS、CH70-EDA-BMPS、CH70-EDA-GMBS、CH70-EDA-EMCS、CH70-EDA-HMCS、CH70-EDA-KMUS、CH70-EDA-LMDS、CH70-EDA-SMCC、CH70-EDA-MBS、CH70-EDA-SMPB、CH90-EDA-KMUS、CH90-EDA-LMDS、CH140-EDA-AMAS、CH140-EDA-GMBS、CH140-EDA-EMCS、CH140-EDA-HMCS、CH140-EDA-KMUS、CH140-EDA-LMDS、HPN50-EDA-BMPS、HPN50-EDA-LMDS、CH70-HDA-GMBS
、CH70-HDA-EMCS、CH70-HDA-HMCS、CH70-HDA-KMUS、CH140-HDA-BMPS、CH140-HDA-KMUS、CH90-DDDA-BMPS、CH90-DDDA-EMCS、CH70-BAMB-AMAS、CH70-BAMB-GMBS、CH70-BAMB-EMCS、CH70-BAMB-HMCS、CH70-BAMB-KMUS、CH70-BAMB-LMDS、CH70-BAMB-SMCC、CH70-BAMB-MBS、CH70-BAMB-SMPB、CH140-BAMB-AMAS、CH140-BAMB-BMPS、CH140-BAMB-EMCS、CH140-BAMB-HMCS、CH140-BAMB-KMUS、CH140-BAMB-LMDS、CH70-BAMC-GMBS、CH70-BAMC-EMCS、CH70-BAMC-HMCS、CH70-BAMC-KMUS、CH70-BAMC-LMDS、CH140-BAMC-BMPS、CH140-BAMC-KMUS、およびCH140-BAMC-LMDS）を得た。
【０２５７】
＜実施例７＞還元末端にハロアセチル基を導入したグリコサミノグリカンの調製
グリコサミノグリカンの還元末端へのハロアセチル基の導入は、二価性架橋試薬（SBA
、Sulfo-SBAX、SIA、SIAX）を用いて行った。還元末端にハロアセチル基を導入したグリ
コサミノグリカンの誘導体を、以下、総称して「ＧＡＧ−Ｈａｌ」ともいう。
【０２５８】
ＧＡＧ−ＮＨ２としてCH70-NH2、CH70-EDA、CH140-EDA、CH90-DDDA、CH70-BAMB、また
はCH140-BAMCを用い、上記二価性架橋試薬を用いて、前記実施例６と同じ操作を行った。このようにして、還元末端にハロアセチル基を導入したグリコサミノグリカン（CH70-NH2-SBA、CH70-NH2-SBAX、CH70-EDA-SBA、CH70-EDA-SBAX、CH70-EDA-SIA、CH140-EDA-SBA、CH140-EDA-SIAX、CH90-DDDA-SBA、CH90-DDDA-SIAX、CH70-BAMB-SBAX、およびCH140-BAMC-SBA）を得た。
【０２５９】
＜実施例８＞本実施例で使用するペプチド
本実施例では、ペプチドとして、下記のＧＬＰ−１ペプチドおよびインスリンを使用した。これらのペプチドは、下記の通りに入手した。
・ＧＬＰ−１Ｃ（配列番号２）；北海道システムサイエンス社またはスクラム社から入手した。
・ＧＬＰ−１ＲＫ（配列番号３）；スクラム社から入手した。
・ＧＬＰ−１ｏｒｉＣ（配列番号４）；スクラム社から入手した。
・インスリン（配列番号５、配列番号６）；サーモフィッシャーサイエンティフィック社から入手した。
【０２６０】
＜実施例９＞リジン残基にマレイミド基を有するリンカーを導入したＧＬＰ−１ＲＫ誘導体の調製
ＧＬＰ−１ＲＫ水溶液（０．６μｍｏｌ（２ｍｇ）のＧＬＰ−１ＲＫを０．６ｍＬのＷＦＩに溶解して１ｍＭに調整した溶液）に４．１μＬの０．７２Ｎトリエチルアミン、１００ｍＭ二価性架橋試薬溶液（sulfo-EMCSにおいては１２μＬ（２当量）、BMPS、sulfo-HMCS、およびsulfo-KMUSにおいては１５μＬ（２．５当量）または１８μＬ（３当量）、sulfo-LMDS、SBA、およびSPDPにおいては２１μＬ（３．５当量））を添加して反応溶液
を調製し、室温で１〜２時間撹拌した。その後、この反応溶液と１．２ｍＬの０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／８０％アセトニトリル、４．８ｍＬの０．１％  ＴＦＡを順
に混合して遠心（２０，０００×ｇ、１０分間）し、上清を逆相カラム（Capcell Pak、
内径：10mm×全長：250mm、資生堂社製）にアプライした。移動相には溶媒Ａ（０．１％
ＴＦＡ）と溶媒Ｂ（０．１％  ＴＦＡ／８０％  ＭｅＣＮ）を用いた。溶離はリニアグラジエントにより行い、分析開始から５分後までの間は溶媒Ｂの割合を３０％で維持し、５分後から３０分後までの間に溶媒Ｂの割合を３０％から７０％に変化させた。流速は４ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とした。二価性架橋試薬とＧＬＰ−１ＲＫの複合体を含む溶出画分を回収した後、凍結乾燥した。このようにして、ＧＬＰ−１ＲＫ誘導体（マレイミド基を有するリンカーをリジン残基に結合させた構造を有する、ＧＬＰ−１ＲＫの誘導体）を得た。
【０２６１】
＜実施例１０＞マレイミド基を有するリンカーを導入したインスリン誘導体の調製
インスリン溶液（インスリンをＤＭＳＯに溶解して１ｍＭに調整した溶液）４００μＬに２００μＬの４ｍＭトリエチルアミン、１０ｍＭ二価性架橋試薬溶液（BMPS、EMCS、Sulfo-EMCS、またはKMUSを５０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた溶液）４０〜６０μＬを添加して反応溶液を調製し、室温で１時間撹拌した。続いて、この溶液と０．１％  ＴＦＡを混合して全量を８〜１０ｍＬとした後に遠心（２０，０００×ｇ、１０分間）し、上清を逆相カラム（Capcell Pak、内径：20mm×全長：250mm、資生堂社製）にアプライした。移動相には溶媒Ａ（０．１％  ＴＦＡ）と溶媒Ｂ（０．１％  ＴＦＡ／８０％  ＭｅＣＮ）を用いた。溶離はリニアグラジエントにより行った。二価性架橋試薬としてBMPSを用いた場合は、分析開始後または１分後からの２０分間で溶媒Ｂの割合を４０％から４５％に変化させた。二価性架橋試薬としてEMCSまたはSulfo-EMCSを用いた場合は、分析開始後または１分後からの２５分間で溶媒Ｂの割合を４２％から４８．２％に変化させた。二価性架橋試薬としてKMUSを用いた場合は、分析開始後からの２０分間で溶媒Ｂの割合を４０％から８０％に変化させた。流速は８ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とした。このようにしてインスリンＡ鎖のα−アミノ基（Ｎ末のアミノ基）にリンカーが導入されたインスリン誘導体、インスリンＢ鎖のε−アミノ基（リジン残基のアミノ基）にリンカーが導入されたインスリン誘導体、それらの両方にリンカーが導入されたインスリン誘導体をそれぞれ分取して回収した後、凍結乾燥した。このようにして、インスリン誘導体（マレイミド基を有するリンカーを導入した、インスリンの誘導体）を得た。
【０２６２】
＜実施例１１＞グリコサミノグリカンとＧＬＰ−１を含む複合体のアゴニスト活性の測定
以下の実施例においては、グリコサミノグリカンとＧＬＰ−１を含む複合体（以下、「ＧＡＧ／ＧＬＰ−１複合体」ともいう。）を調製し、以下の手順でそのアゴニスト活性を測定した。
【０２６３】
すなわち、ＧＡＧ／ＧＬＰ−１複合体のアゴニスト活性は、RIN-m5F細胞（ATCC CRL-11605）を用い、細胞内のcAMP濃度を指標として測定した。RIN-m5F細胞は、American Type Culture Collection（ATCC）から入手した。細胞内のcAMP濃度はcAMP-Glo Max Assay kit（プロメガ社製）を用いて測定した。
【０２６４】
RIN-m5F細胞を９６ウェルプレートに４×１０４cells/wellとなるように播種した。温
度３７℃かつＣＯ２濃度５％の条件下（以下、「培養条件下」ともいう）で１６時間静置して細胞をプレートに接着させた後、培地を血清不含培地に交換した。培養条件下で６時間静置した後、培地を０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ（3-isobutyl-1-methylxanthine）／０．１
ｍＭ  Ｒｏ−２０−１７２４を含有する血清不含培地に交換し、更に培養条件下で１５分間静置した。各ウェルに被験物質（０．０６ｎＭ〜６００ｎＭに調製したＧＡＧ／ＧＬＰ−１複合体の溶液）を２０μＬ添加し、培養条件下で１０分間静置した後、各ウェルにcAMP Detection Solutionを１０μＬ添加し、室温に２０分間静置した。その後、各ウェル
にKinase-Glo Reagentを５０μＬ添加し、室温に１０分間静置した後、マルチプレートリ
ーダー（2030 ARVO X5、パーキンエルマー社製）を用いて発光強度を測定した。
【０２６５】
各濃度の被験物質を添加した場合の発光強度の値からブランク（溶媒のみを添加した場合の発光強度）の値を減じて算出した測定値に基づき、解析用ソフトウェア（Origin ver.9.1、OriginLab Corporation社製）を用いて、Ｘ軸を被験物質の濃度、Ｙ軸を測定値と
したドットプロットからシグモイド曲線を作成した。このシグモイド曲線を４−パラメーターロジスティック曲線に回帰してＥＣ５０（ｎＭ）を算出した。
【０２６６】
＜実施例１２＞グリコサミノグリカンとインスリンを含む複合体のアゴニスト活性の測定
以下の実施例においては、グリコサミノグリカンとインスリンを含む複合体（以下、「ＧＡＧ／インスリン複合体」ともいう。）を調製し、以下の手順でそのアゴニスト活性を測定した。
【０２６７】
すなわち、ＧＡＧ／インスリン複合体のアゴニスト活性は、3T3-L1 MBX細胞（ATCC CRL-3242）を用い、細胞内に取り込まれた［1-14C］2-deoxy-D-glucose（2-DG）の放射活性
を指標として測定した。3T3-L1 MBX細胞はAmerican Type Culture Collection （ATCC）
から、［1-14C］2-DGは日本アイソトープ協会から、それぞれ入手した。
【０２６８】
3T3-L1 MBX細胞を９６ウェルプレートに２×１０４cells/wellとなるように播種した。培養条件下で４日間静置培養した後、培地を分化培地Ａ（１０％  ＦＢＳ、１μｇ／ｍＬ
ヒト組換えインスリン（アニマルフリー）、０．５ｍＭ  イソブチルメチルキサンチン、０．４μｇ／ｍＬ  デキサメタゾン、２μＭ  ロシグリタゾンを含むように調製したDMEM high glucose（ギブコ社製）培地）に交換した。さらに培養条件下で２日間または３
日間静置培養した後、培地を分化培地Ｂ（１０％  ＦＢＳ、１μｇ／ｍＬ  ヒト組換えインスリン（アニマルフリー）を含むように調製したDMEM high glucose培地）に交換した
。さらに培養条件下で２日間または３日間静置培養した後、培地を血清含有培地（１０％
ＦＢＳを含むように調製した、DMEM high glucose培地）に交換した。以後、培養条件
下で７日間〜２１日間静置培養した。このようにして得た細胞を以後の試験に用いた。
【０２６９】
培地を血清不含培地に交換し、培養条件下で一晩静置した後、培地を被験物質含有溶液（０．００１〜１００００ｎＭのＧＡＧ／インスリン複合体、０．３％  ＢＳＡを含むように調製したDMEM培地）１００μＬに置換した。培養条件下で１時間静置した後、０．１ｍＭ（５μＣｉ／ｍＬ）の［1-14C］2-DGを２０μＬ添加し、培養条件下で３０分間静置
した。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．２Ｎ  ＮａＯＨを１００μＬ添加し、３７℃で３０分間静置した。ピペッティングにより懸濁した溶液をバイアルに回収し、エコシンチＸＲ（桑和貿易社製）を３ｍＬ添加して混合した後、液体シンチレーションカウンター（Tri-Carb 2910、パーキンエルマー社製）を用いて放射活性を測定した。
【０２７０】
解析用ソフトウェア（Origin ver.9.1）を用いて、Ｘ軸を被験物質の濃度、Ｙ軸を１分間あたりの放射線計測回数（ｃｐｍ）としたドットプロットからシグモイド曲線を作成した。このシグモイド曲線を４−パラメーターロジスティック曲線に回帰してＥＣ５０（ｎＭ）を算出した。
【０２７１】
＜実施例１３＞ＧＡＧ／ＧＬＰ−１複合体の血中半減期の測定
以下の実施例においては、ＧＡＧ／ＧＬＰ−１複合体を調製し、以下の手順でその血中半減期を測定した。
【０２７２】
すなわち、被験物質（ＧＡＧ／ＧＬＰ−１複合体）を３００ｎｍｏｌ／ｋｇ（ＧＬＰ−１の重量として１ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウス（１群につき３匹）に尾静脈注射した。投与後０〜１４４時間の各時点で採血し、回収した血液を遠心分離して血漿を得
た。
【０２７３】
ＧＡＧ／ＧＬＰ−１複合体の血中半減期（Ｔ１／２）は、血漿中の活性型ＧＬＰ−１の濃度を測定し、これを指標として算出した。当該濃度の測定にはGlucagon-Like Peptide-1 (Active) ELISA Kit（Merck Millipore社製）を用い、キットに添付のプロトコールに
従った操作を行って測定を実施した。血中半減期の算出にはPhoenix WinNonlin（サター
ラ合同会社）を用い、各個体の最終測定時点から３時点以上の測定データについてモデル非依存的解析を行って算出した。
【０２７４】
＜実施例１４＞ＧＡＧ／インスリン複合体の血中半減期の測定
以下の実施例においては、ＧＡＧ／インスリン複合体を調製し、以下の手順でその血中半減期を測定した。
【０２７５】
すなわち、被験物質（ＧＡＧ／インスリン複合体）を３４０ｎｍｏｌ／ｋｇ（インスリンの重量として２ｍｇ／ｋｇ）または１００ｎｍｏｌ／ｋｇ（インスリンの重量として０．５８ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウス（１群につき３匹）に尾静脈注射した。投与後０〜４８時間の各時点で採血し、回収した血液を遠心分離して血清を得た。
【０２７６】
ＧＡＧ／インスリン複合体の血中半減期（Ｔ１／２）は、血清中のインスリン濃度を測定し、これを指標として算出した。当該濃度の測定はサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。測定プレートとしてはYK060 Insulin ELISAキット（矢内原研究所製）に添付され
たプレートを用いた。測定対象がＣＨ／インスリンである場合は、検出用プローブとしてはビオチン標識ヒアルロン酸結合タンパク質（生化学工業社製）を、標識試薬としてはＨＲＰ標識ストレプトアビジンを、それぞれ用いた。測定対象がＨＰＮ／インスリンである場合は、検出用プローブとして抗ヘパロサン抗体（ＮＡＨ４６、生化学工業社製）を、標識試薬としてはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＭ＋ＩｇＧ＋ＩｇＡ（Ｈ＋Ｌ）抗体（メルクミリポア社製）を、それぞれ用いた。血中半減期の算出にはPhoenix WinNonlinを用い、各個
体の最終測定時点から３時点以上の測定データについてモデル非依存的解析を行って算出した。
【０２７７】
＜実施例１５＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（１）
２０ｍｇのＣＨ−Ｍａｌ（CH40-EDA-BMPS、CH40-EDA-KMUS、CH40-EDA-NMTS、CH40-EDA-OMHS、CH70-EDA-AMAS、CH70-EDA-BMPS、CH70-EDA-GMBS、CH70-EDA-EMCS、CH70-EDA-HMCS
、CH70-EDA-KMUS、CH70-EDA-LMDS、CH140-EDA-AMAS、CH140-EDA-GMBS、CH140-EDA-EMCS、CH140-EDA-HMCS、CH140-EDA-KMUS、またはCH140-EDA-LMDS）を蒸留水６５０μＬに溶解した後、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）３２５μＬ、０．５Ｍ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．９）８１μＬ、ＧＬＰ−１Ｃ溶液（ＧＬＰ−１Ｃを１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＦに溶解した溶液）８１μＬを添加して反応溶液を調製し、遮光して室温で一晩（１６時間）撹拌した。その後、この反応溶液と０．１％  ＴＦＡ  ７ｍＬを混合して遠心（２０，０００×ｇ、１０分間）し、上清を逆相カラム（DAISOGEL SP-120-5-ODS-BP、内径：20mm×全長：250mm、大阪ソーダ社製）にアプライした。移動相には溶媒Ａ（０．１％  ＴＦ
Ａ）と溶媒Ｂ（０．１％  ＴＦＡ／８０％  ＭｅＣＮ）を用いた。溶離はリニアグラジエントにより行い、分析開始から３０分後までの間に溶媒Ｂの割合を１０％から６０％に変化させた。流速は８ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とした。ＣＨとＧＬＰ−１Ｃの複合体を含む溶出画分（保持時間２０分〜３０分のピーク画分）を回収した後、凍結乾燥した。このようにして、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体（リンカーを介してコンドロイチンをＣ末端のシステイン残基に結合させた構造を有する、コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体）を得た。
【０２７８】
上記により得たＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）を実施例１１に記載の方法に従って、また血中半減期（Ｔ１／２）を実施例１３に記載の方法に従って、それぞれ算出した。結果を表１に示す。
【０２７９】
【表１】
2019218265.tif 000039
【０２８０】
表１において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ１）に示される結合様式である。
【０２８１】
表１に示されるとおり、上記の一般式で示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体において、Ｌ２が（ＣＨ２）１０、（ＣＨ２）１１、または（ＣＨ２）１３で表されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体は、いずれも２０時間以上の血中半減期を有していた。これに対し、Ｌ２が（ＣＨ２）７で表されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の血中半減期は１０時間以下、Ｌ２が（ＣＨ２）１５で表されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の血中半減期は約１４時間であった。なお、ＧＬＰ−１そのものの血中半減期は２〜６分であることが知られている。
【０２８２】
＜参考例３＞コンドロイチンを有しないＧＬＰ−１Ｃ誘導体の調製、当該誘導体の活性と血中滞留性の測定
前記実施例で確認された血中滞留性の増強効果がリンカーのみでも奏される効果であるのかを確認するため、リンカーのみを有するＧＬＰ−１Ｃ誘導体を調製し、当該誘導体の活性と血中滞留性を測定した。
【０２８３】
１．３ｍｇのＧＬＰ−１Ｃを蒸留水３００μＬに溶解した後、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）２００μＬと１０ｍＭアルキル化試薬溶液（マレイミド基を有するＣ１６またはＣ１４のアルキル誘導体）１３０μＬを添加し、遮光して室温で４時間撹拌した。その後、この反応溶液１０５μＬ、溶媒Ｂ（０．１％  ＴＦＡ／８０％  ＭｅＣＮ）２００μＬ、溶媒Ａ（０．１％  ＴＦＡ）７００μＬを混合して遠心（２０，０００×ｇ、１０分間）し
、上清を逆相カラム（CAPCELLPAK、内径：10mm×全長：250mm、資生堂社製）にアプライ
した。移動相には溶媒Ａと溶媒Ｂを用いた。溶離はリニアグラジエントにより行い、分析開始から３０分後までの間に溶媒Ｂの割合を３０％から７０％に変化させた。流速は４ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とした。ＧＬＰ−１Ｃの誘導体を含む溶出画分を回収した後、凍結乾燥した。このようにして、ＧＬＰ−１Ｃ誘導体（リンカーのみをＣ末端のシステイン残基に結合させた構造を有する、ＧＬＰ−１Ｃの誘導体）を得た。
【０２８４】
上記により得たＧＬＰ−１Ｃ誘導体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）を実施例１１に記載の方法に従って算出した。その結果、Ｃ１６アルキルを導入したＧＬＰ−１Ｃ誘導体のＥＣ５０は３３．６ｎＭ、Ｃ１４アルキルを導入したＧＬＰ−１誘導体のＥＣ５０は９．２ｎＭであった。また、当該ＧＬＰ−１誘導体はどちらもマウスにおいて静脈投与２４時間後の血漿において検出限界以下であったため、血中半減期（Ｔ１／２）の算出はできなかった。すなわち、リンカーのみを有する（グリコサミノグリカンを有しない）ＧＬＰ−１はグリコサミノグリカンを有するＧＬＰ−１と比較して、極めて短い血中半減期（Ｔ１／２）を有することが示された。よって、前記実施例で確認された血中滞留性の増強効果はリンカーのみによって奏される効果ではなく、コンドロイチン等のグリコサミノグリカンとの組合せにによって奏される効果であることが示された。
【０２８５】
＜実施例１６＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（２）
ＣＨ−ＭａｌとしてCH10-EDA-KMUS、CH20-EDA-KMUS、CH30-EDA-KMUS、CH40-EDA-KMUS、CH70-EDA-KMUS、またはCH140-EDA-KMUSを用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ
／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表２に示す。
【０２８６】
【表２】
2019218265.tif 000040
【０２８７】
表２において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ１）に示される結合様式である。
【０２８８】
表２に示されるとおり、上記の一般式で示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体において、ＣＨの分子量が１０ｋＤａの場合は、当該分子量が２０ｋＤａ以上の場合と比較して血中滞留性がやや劣ることが示された。一方、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体において、ＣＨの分子量が２０ｋＤａ以上の場合は、いずれの複合体も１９時間以上の血中半減期を有しており、良好な血中滞留性を示した。また、ＣＨの分子量が３０ｋＤａ〜７０ｋＤａの場合は、いずれの複合体も２１時間以上の血中半減期を有しており、より良好な血中滞留性を示した。さらに、ＣＨの分子量が３０ｋＤａの場合は、２４時間以上の血中半減期を有して
おり、特に良好な血中滞留性を示した。
【０２８９】
＜実施例１７＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（３）
ＣＨ−ＭａｌとしてCH70-NH2-BMPSまたはCH70-NH2-KMUSを用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表３に示す。
【０２９０】
【表３】
2019218265.tif 000041
【０２９１】
表３において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｙ−Ｌ−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｙは表中に示される結合を表し、Ｌは表中に示される構造を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｙ間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ１）に示される結合様式である。
【０２９２】
表３に示されるとおり、上記の一般式で示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体において、Ｌが（ＣＨ２）１０で表されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体は、２０時間以上の血中半減期を有していた。よって、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の血中滞留時間は、前記実施例１５においてＣＨとリンカーＬ２を結合するために用いられたリンカーＬ１の有無には依存せず、Ｌ２の構造、すなわちペプチドに結合させたリンカーの構造、に依存することが示唆された。
【０２９３】
＜実施例１８＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（４）
ＣＨ−ＭａｌとしてCH70-HDA-GMBS、CH70-HDA-EMCS、CH70-HDA-HMCS、CH70-HDA-KMUS、CH140-HDA-BMPS、CH140-HDA-KMUS、CH90-DDDA-BMPS、またはCH90-DDDA-EMCSを用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表４に示す。
【０２９４】
【表４】
2019218265.tif 000042
【０２９５】
表４において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ１）に示される結合様式である。
【０２９６】
表４に示されるとおり、上記の一般式で示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体において、Ｌ２が（ＣＨ２）１０で表されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体は、いずれも２０時間以上の血中半減期を示した。よって、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の血中滞留時間は、前記実施例１５においてＣＨとリンカーＬ２を結合するために用いられたリンカーＬ１の構造には依存せず、Ｌ２の構造、すなわちペプチドに結合させたリンカーの構造、に依存することが示された。
【０２９７】
＜実施例１９＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（５）
ＣＨ−ＭａｌとしてCH70-BAMB-AMAS、CH70-BAMB-GMBS、CH70-BAMB-EMCS、CH70-BAMB-HMCS、CH70-BAMB-KMUS、CH70-BAMB-LMDS、CH140-BAMB-AMAS、CH140-BAMB-BMPS、CH140-BAMB-EMCS、CH140-BAMB-HMCS、CH140-BAMB-KMUS、またはCH140-BAMB-LMDSを用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表５に示す。
【０２９８】
【表５】
2019218265.tif 000043
【０２９９】
表５において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造（Ｐｈは１，４−フェニレン基を表す。）を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ１）に示される結合様式である。
【０３００】
表５に示されるとおり、上記の一般式で示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体において、Ｌ２が（ＣＨ２）１０または（ＣＨ２）１１で表されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体は、い
ずれも２０時間以上の血中半減期を示した。よって、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の血中滞留時間は、前記実施例１５においてＣＨとリンカーＬ２を結合するために用いられたリンカーＬ１の構造には依存せず、Ｌ２の構造、すなわちペプチドに結合させたリンカーの構造、に依存することが改めて示された。
【０３０１】
＜実施例２０＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（６）
ＣＨ−ＭａｌとしてCH70-BAMC-GMBS、CH70-BAMC-EMCS、CH70-BAMC-HMCS、CH70-BAMC-KMUS、CH70-BAMC-LMDS、CH140-BAMC-BMPS、CH140-BAMC-KMUS、またはCH140-BAMC-LMDSを用
いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表６に示す。
【０３０２】
【表６】
2019218265.tif 000044
【０３０３】
表６において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造（ｃＨｅｘは１，４−シクロヘキシレン基を表す。）を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ１）に示される結合様式である。
【０３０４】
表６に示されるとおり、上記の一般式で示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体において、Ｌ１がＣＨ２−ｃＨｅｘ−ＣＨ２で表され、Ｌ２が（ＣＨ２）１０または（ＣＨ２）１１で表されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体は、いずれも３０時間を超える血中半減期を有していた。よって、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の血中滞留時間は、前記実施例１５においてＣＨとリンカーＬ２を結合するために用いられたリンカーＬ１の構造がシクロヘキシレン基を含んでいる場合は、特に顕著に血中滞留性を増強できることが示された。
【０３０５】
＜実施例２１＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（７）
ＣＨ−ＭａｌとしてCH70-EDA-SMCC、CH70-EDA-MBS、CH70-EDA-SMPB、またはCH90-EDA-LMDSを用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、なら
びに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表７に示す。
【０３０６】
【表７】
2019218265.tif 000045
【０３０７】
表７において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造（ｍＰｈは１，３−フェニレン基を、ｐＰｈは１，４−フェニレン基を、それぞれ表す。）を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ１）に示される結合様式である。
【０３０８】
＜実施例２２＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（８）
ＣＨ−Ｍａｌに代えてＣＨ−Ｈａｌ（CH70-NH2-SBA）を用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表８に示す。
【０３０９】
【表８】
2019218265.tif 000046
【０３１０】
表８において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造は一般式「Ｇ−Ｙ−Ｌ−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｙは表中に示される結合を表し、Ｌは表中に示される構造を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｙ間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ２）に示される結合様式である。
【０３１１】
＜実施例２３＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（９）
ＣＨ−ＨａｌとしてCH70-NH2-SBAXを用いて前記実施例２２と同じ操作を行い、ＣＨ／
ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表９に示す。
【０３１２】
【表９】
2019218265.tif 000047
【０３１３】
表９において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造は一般式「Ｇ−Ｙ１−Ｌ１−Ｙ２−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンド
ロイチンを表し、Ｙ１およびＹ２はそれぞれ表中に示される結合を表し、Ｌ１およびＬ２は表中に示される構造を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｙ間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ２）に示される結合様式である。
【０３１４】
＜実施例２４＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（１０）
ＣＨ−ＨａｌとしてCH90-DDDA-SBA、CH140-BAMC-SBA、CH70-EDA-SIA、またはCH140-EDA-SBAを用いて前記実施例２２と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表１０に示す。
【０３１５】
【表１０】
2019218265.tif 000048
【０３１６】
表１０において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造（ｃＨｅｘは１，４−シクロヘキシレン基を表す。）を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ２）に示される結合様式である。
【０３１７】
＜実施例２５＞コンドロイチンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（１１）
ＣＨ−ＨａｌとしてCH90-DDDA-SIAX、CH70-BAMB-SBAX、CH70-EDA-SBAX、またはCH140-EDA-SIAXを用いて前記実施例２２と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、
ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表１１に示す。
【０３１８】
【表１１】
2019218265.tif 000049
【０３１９】
表１１において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ１−Ｌ２−Ｙ２−Ｌ３−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれ表中に示される構造（Ｐｈは１，４−フェニレン基を表す。）を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ３−Ｐ
間の結合様式は前記構造式（Ｐ２）に示される結合様式である。
【０３２０】
＜実施例２６＞コンドロイチンとＧＬＰ−１ＲＫの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（１）
ＣＨ−Ｍａｌに代えてＣＨ−ＳＨ（CH70-NH2-propanoyl-SH）を、ＧＬＰ−１Ｃに代え
てＧＬＰ−１ＲＫ誘導体（ＥＭＣＳ／ＧＬＰ−１ＲＫまたはＫＭＵＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ）を用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表１２に示す。
【０３２１】
【表１２】
2019218265.tif 000050
【０３２２】
表１２において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙは表中に示される結合（Ｓ−Ｓｕｃは前記構造式（Ｙ１４）に示される結合様式を表す。）を表し、ＰはＧＬＰ−１ＲＫを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ３）に示される結合様式である。
【０３２３】
＜実施例２７＞コンドロイチンとＧＬＰ−１ＲＫの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（２）
ＣＨ−ＳＨとしてCH30-EDA-propanoyl-SH、CH40-EDA-propanoyl-SH、CH70-EDA-propanoyl-SH、またはCH70-EDA-undecanoyl-SHを、ＧＬＰ−１ＲＫ誘導体としてＢＭＰＳ／ＧＬ
Ｐ−１ＲＫ、ＥＭＣＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ、ＫＭＵＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ、またはＬＭＤＳ／ＧＬＰ−１ＲＫを用いて前記実施例２６と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表１３に示す。
【０３２４】
【表１３】
2019218265.tif 000051
【０３２５】
表１３において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ１−Ｌ２−Ｙ２−Ｌ３−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれ表中に示される構造
を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ表中に示される結合（Ｓ−Ｓｕｃは前記構造式（Ｙ１４）に示される結合様式を表す。）を表し、ＰはＧＬＰ−１ＲＫを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ３）に示される結合様式である。
【０３２６】
＜実施例２８＞コンドロイチンとＧＬＰ−１ＲＫの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（３）
ＣＨ−ＳＨとしてCH70-BAMB-propanoyl-SH、CH70-BAMC-propanoyl-SH、CH70-HDA-propanoyl-SH、CH30-DDDA-propanoyl-SH、またはCH90-DDDA-propanoyl-SHを、ＧＬＰ−１ＲＫ
誘導体としてＢＭＰＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ、ＥＭＣＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ、ＨＭＣＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ、ＫＭＵＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ、またはＬＭＤＳ／ＧＬＰ−１ＲＫを用いて前記実施例２６と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表１４に示す。
【０３２７】
【表１４】
2019218265.tif 000052
【０３２８】
表１４において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ１−Ｌ２−Ｙ２−Ｌ３−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれ表中に示される構造（ｐＰｈは１，４−フェニレン基を、ｃＨｅｘは１，４−シクロヘキシレン基を、それぞれ表す。）を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ表中に示される結合（Ｓ−Ｓｕｃは前記構造式（Ｙ１４）に示される結合様式を表す。）を表し、ＰはＧＬＰ−１ＲＫを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ３）に示される結合様式である。
【０３２９】
＜実施例２９＞コンドロイチンとＧＬＰ−１ＲＫの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（４）
ＣＨ−ＳＨとしてCH90-AET、CH70-AHT、CH90-AHT、またはCH90-AUDTを、ＧＬＰ−１Ｒ
Ｋ誘導体としてＢＭＰＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ、ＥＭＣＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ、ＫＭＵＳ／ＧＬＰ−１ＲＫ、またはＬＭＤＳ／ＧＬＰ−１ＲＫを用いて前記実施例２６と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表１５に示す。
【０３３０】
【表１５】
2019218265.tif 000053
【０３３１】
表１５において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙは表中に示される結合（Ｓ−Ｓｕｃは前記構造式（Ｙ１４）に示される結合様式を表す。）を表し、ＰはＧＬＰ−１ＲＫを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ３）に示される結合様式である。
【０３３２】
＜実施例３０＞コンドロイチンとＧＬＰ−１ＲＫの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（５）
ＣＨ−ＭａｌとしてCH70-EDA-BMPS、またはCH70-EDA-KMUSを、ＧＬＰ−１Ｃに代えてＧＬＰ−１ＲＫ誘導体（ｐｒｏｐａｎｏｙｌ−ＳＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ）を用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性および血中半減期の算出を行った。結果を表１６に示す。
【０３３３】
【表１６】
2019218265.tif 000054
【０３３４】
表１６において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ１−Ｌ２−Ｙ２−Ｌ３−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ表中に示される結合（Ｓｕｃ−Ｓは前記構造式（Ｙ１３）に示される結合様式を表す。）を表し、ＰはＧＬＰ−１ＲＫを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ３）に示される結合様式である。
【０３３５】
＜実施例３１＞コンドロイチンとＧＬＰ−１ＲＫの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（６）
ＣＨ−ＳＨとしてCH70-EDA-propanoyl-SHまたはCH90-DDDA-propanoyl-SHを、ＧＬＰ−
１ＲＫ誘導体としてＳＢＡ／ＧＬＰ−１ＲＫを用いて前記実施例２６と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）
および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表１７に示す。
【０３３６】
【表１７】
2019218265.tif 000055
【０３３７】
表１７において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ１−Ｌ２−Ｙ２−Ｌ３−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１ＲＫを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ３）に示される結合様式である。
【０３３８】
＜実施例３２＞コンドロイチンとＧＬＰ−１ＲＫの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（７）
ＣＨ−ＳＨとしてCH90-AUDTを、ＧＬＰ−１ＲＫ誘導体としてＳＢＡ／ＧＬＰ−１ＲＫ
を用いて前記実施例２６と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表１８に示す。
【０３３９】
【表１８】
2019218265.tif 000056
【０３４０】
表１８において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１ＲＫ複合体の構造は一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１ＲＫを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ３）に示される結合様式である。
【０３４１】
＜実施例３３＞コンドロイチンとＧＬＰ−１ＯｒｉＣの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定
ＣＨ−ＭａｌとしてCH140-EDA-KMUSを、ＧＬＰ−１Ｃに代えてＧＬＰ−１ＯｒｉＣを用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＣＨ／ＧＬＰ−１ＯｒｉＣ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表１９に示す。
【０３４２】
【表１９】
2019218265.tif 000057
【０３４３】
表１９において表中のＩＤで示されるＣＨ／ＧＬＰ−１ＯｒｉＣ複合体の構造は一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１ＯｒｉＣを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ１）に示される結合様式である。
【０３４４】
＜実施例３４＞ヘパロサンとＧＬＰ−１Ｃの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定
ＣＨ−Ｍａｌに代えてＨＰＮ−Ｍａｌ（HPN50-EDA-BMPSまたはHPN50-EDA-LMDS）を用いて前記実施例１５と同じ操作を行い、ＨＰＮ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表２０に示す。
【０３４５】
【表２０】
2019218265.tif 000058
【０３４６】
表２０において表中のＩＤで示されるＨＰＮ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するヘパロサンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙは表中に示される結合を表し、ＰはＧＬＰ−１Ｃを表す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ２）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式であり、Ｌ２−Ｐ間の結合様式は前記構造式（Ｐ１）に示される結合様式である。
【０３４７】
表２０に示されるとおり、上記の一般式で示されるＨＰＮ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体において、Ｌ２が（ＣＨ２）１１で表されるＨＰＮ／ＧＬＰ−１Ｃ複合体は、約３４時間もの血中半減期を有していた。よって、本発明において血中滞留性の増強に使用することができるグリコサミノグリカンは、コンドロイチンには限定されず、ヘパロサンも使用可能であることが示された。
【０３４８】
＜実施例３５＞コンドロイチンとインスリンの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（１）
インスリン誘導体を６ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＦに溶解し、これに０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を終濃度５０ｍＭとなるように添加した。この溶液に４０ｍｇ／ｍＬのＣＨ−ＳＨ（CH90-EDA-propanoyl-SH、またはCH90-AET）の水溶液を当該溶液
の１０倍容、ＤＭＦをＣＨ−ＳＨ水溶液の１／２容量、それぞれ添加した後、遮光して室温で１６時間撹拌した。その後、この溶液に０．１％  ＴＦＡを全量が６〜１０ｍとなるように混合して遠心（２０，０００×ｇ、１０分間）し、その上清を逆相カラム（DAISOGEL SP-120-5-ODS-BP、内径：20mm×全長：250mm、大阪ソーダ社製、またはSHISEIDO CAPCELL PAK C18、内径：20mm×全長：250mm、資生堂社製）にアプライした。移動相には溶媒Ａ（０．１％  ＴＦＡ）と溶媒Ｂ（０．１％  ＴＦＡ／８０％  ＭｅＣＮ）を用いた。溶離はリニアグラジエントにより行い、分析開始５分後から３５分後までの間に溶媒Ｂの割合を１０％から８０％に変化させた。流速は８ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃とした。ＣＨとインスリンの複合体を含む溶出画分（保持時間２０分〜３０分のピーク画分）を回収した後、凍結乾燥した。このようにして、ＣＨ／インスリン複合体（リンカーを介し
てコンドロイチンをインスリンＡ鎖のＮ末端のアミノ酸残基および／またはインスリンＢ鎖のリジン残基に結合させた構造を有する、コンドロイチンとインスリンの複合体）を得た。このようにして得たＣＨ／インスリン複合体を逆相カラムにアプライして分取し、インスリンＡ鎖にのみコンドロイチンを有するＣＨ／インスリン複合体、インスリンＢ鎖にのみコンドロイチンを有するＣＨ／インスリン複合体、インスリンＡ鎖およびインスリンＢ鎖にコンドロイチンを有するＣＨ／インスリン複合体をそれぞれ得た。
【０３４９】
上記により得たＣＨ／インスリン複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）を実施例１２に記載の方法に従って、また血中半減期（Ｔ１／２）を実施例１４に記載の方法に従って、それぞれ算出した。結果を表２１に示す。
【０３５０】
【表２１】
2019218265.tif 000059
【０３５１】
表２１において表中のＩＤで示されるＣＨ／インスリン複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ１−Ｌ２−Ｙ２−Ｌ３−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ表中に示される結合（Ｓ−Ｓｕｃは前記構造式（Ｙ１４）に示される結合様式を表す。）を表し、Ｐはインスリンを表し、部位αはコンドロイチンがリンカーを介してインスリンＡ鎖のα−アミノ基（Ｎ末端のアミノ基）に結合していることを示し、部位εはコンドロイチンがリンカーを介してインスリンＢ鎖のε−アミノ基（リジン残基のアミノ基）に結合していることを示し、部位α／εはコンドロイチンがリンカーを介してインスリンＡ鎖のα−アミノ基（Ｎ末端のアミノ基）とインスリンＢ鎖のε−アミノ基（リジン残基のアミノ基）の両方に結合していることを示す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式である。
【０３５２】
＜実施例３６＞コンドロイチンとインスリンの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定（２）
ＣＨ−ＳＨとしてCH90-AETを用いて前記実施例３５と同じ操作を行い、ＣＨ／インスリン複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表２２に示す。
【０３５３】
【表２２】
2019218265.tif 000060
【０３５４】
表２２において表中のＩＤで示されるＣＨ／インスリン複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ−Ｌ２−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するコンドロイチンを表し、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙはそれぞれ表中に示される結合（Ｓ−Ｓｕｃは前記構造式（Ｙ１４）に示される結合様式を表す。）を表し、Ｐはインスリンを表し、部位αはコンドロイチンがリンカーを介してインスリンＡ鎖のα−アミノ基（Ｎ末端のアミノ基）に結合していることを示し、部位α／εはコンドロイチンがリンカーを介してインスリンＡ鎖のα−アミノ基（Ｎ末端のアミノ基）とインスリンＢ鎖のε−アミノ基（リジン残基のアミノ基）の両方に結合していることを示す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式である。
【０３５５】
＜実施例３７＞ヘパロサンとインスリンの複合体の調製、当該複合体の活性と血中滞留性の測定
ＣＨ−ＮＨＳに代えてＨＰＮ−ＳＨ（HPN50-EDA-propanoyl-SH）を用いて前記実施例３５と同じ操作を行い、ＨＰＮ／インスリン複合体の調製、ならびに当該複合体のアゴニスト活性（ＥＣ５０）および血中半減期（Ｔ１／２）の算出を行った。結果を表２３に示す。
【０３５６】
【表２３】
2019218265.tif 000061
【０３５７】
表２３において表中のＩＤで示されるＣＨ／インスリン複合体の構造はいずれも一般式「Ｇ−Ｌ１−Ｙ１−Ｌ２−Ｙ２−Ｌ３−Ｐ」で示され、式中、Ｇは表中に示される分子量を有するヘパロサンを表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれ表中に示される構造を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ表中に示される結合（Ｓ−Ｓｕｃは前記構造式（Ｙ１４）に示される結合様式を表す。）を表し、Ｐはインスリンを表し、部位αはヘパロサンがリンカーを介してインスリンＡ鎖のα−アミノ基（Ｎ末端のアミノ基）に結合していることを示し、部位εはヘパロサンがリンカーを介してインスリンＢ鎖のε−アミノ基（リジン残基のアミノ基）に結合していることを示し、部位α／εはヘパロサンがリンカーを介してインスリンＡ鎖のα−アミノ基（Ｎ末端のアミノ基）とインスリンＢ鎖のε−アミノ基（リジン残基のアミノ基）の両方に結合していることを示す。また、前記一般式において、Ｇ−Ｌ１間の結合様式は前記構造式（Ｇ１）に示される結合様式または前記構造式（Ｇ３）に示される結合様式である。
【０３５８】
＜実施例３８＞ＣＨ／ＧＬＰ−１複合体のマウスにおける血中濃度の推移（１）
被験物質（GLP27-4（実施例１５）、GLP28-5（実施例２０）、またはリラグルチド（Novo Nordisk社製））を１００ｎｍｏｌ／ｋｇ（ＧＬＰ−１の重量として０．３４ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウスに皮下注射した。投与後０〜１４４時間の各時点で採血し、回収した血液を遠心分離して血漿を得た。血漿中の活性型ＧＬＰ−１濃度の測定にはGlucagon-Like Peptide-1 (Active) ELISA Kitを用い、キットに添付のプロトコールに従った操作を行って当該濃度を測定した。結果を図１に示す。
【０３５９】
図１に示されるとおり、ＣＨ／ＧＬＰ−１複合体は持効型ＧＬＰ−１製剤であるリラグルチドよりも有意に良好な血中滞留性を示した。
【０３６０】
＜実施例３９＞ＣＨ／ＧＬＰ−１複合体のマウスにおける血中濃度の推移（２）
被験物質（GLP40-1（実施例２１））を３００ｎｍｏｌ／ｋｇ（ＧＬＰ−１の重量とし
て１ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウスに尾静脈注射（iv）または皮下注射（sc）した。以後、前記実施例３８と同じ操作を行った。結果を図２に示す。
【０３６１】
図２に示されるとおり、ＣＨ／ＧＬＰ−１複合体は投与方法（静脈注射または皮下注射）には依存せず、同様の濃度推移を示した。
【０３６２】
＜実施例４０＞ＣＨ／ＧＬＰ−１複合体のマウスにおける薬効持続性（１）
被験物質（GLP30-1（実施例２９）、GLP27-4（実施例１５）、GLP28-5（実施例２０）
、またはリラグルチド）を１００ｎｍｏｌ／ｋｇ（ＧＬＰ−１の重量として０．３４ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウスに皮下注射した。投与後２４〜９６時間の各時点でグルコースを１ｇ／ｋｇの用量で腹腔内に負荷し、グルコース負荷後の血糖値変化を継時的に測定した。血糖値の測定には簡易型自己血糖測定器（ライフチェック、エーザイ社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って測定を実施した。グルコース負荷０分後、１５分後、３０分後、および６０分後の血糖値から血糖値推移曲線を作成し、当該曲線の下面積（AUC0-60）を算出して、各被験物質の血糖上昇抑制効果を比較した。結果を
図３に示す。
【０３６３】
図３に示されるとおり、ＣＨ／ＧＬＰ−１複合体はリラグルチドを上回る薬効持続性を示した。
【０３６４】
＜実施例４１＞ＣＨ／ＧＬＰ−１複合体のマウスにおける薬効持続性（２）
被験物質（GLP40-1（実施例２１）またはリラグルチド）を３００ｎｍｏｌ／ｋｇ（Ｇ
ＬＰ−１の重量として１ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウスに皮下注射した。投与後９６〜１６８時間の各時点でグルコースを１ｇ／ｋｇの用量で腹腔内に負荷し、グルコース負荷後の血糖値変化を継時的に測定した。以後、前記実施例４０と同じ操作を行った。結果を図４に示す。
【０３６５】
図４に示されるとおり、ＣＨ／ＧＬＰ−１複合体はリラグルチドを上回る薬効持続性を示した。
【０３６６】
＜実施例４２＞ＨＰＮ／ＧＬＰ−１複合体のマウスにおける血中濃度の推移
被験物質（GLP42-1またはGLP42-2（いずれも実施例３４））を３００ｎｍｏｌ／ｋｇ（ＧＬＰ−１の重量として１ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウスに尾静脈注射（iv）または皮下注射（sc）した。以後、前記実施例３８と同じ操作を行った。結果を図５に示す。
【０３６７】
図５に示されるとおり、ＨＰＮ／ＧＬＰ−１複合体はＣＨ／ＧＬＰ−１複合体と同様、投与方法（静脈注射または皮下注射）には依存せず、同様の濃度推移を示した。
【０３６８】
＜実施例４３＞ＨＰＮ／ＧＬＰ−１複合体のマウスまたはラットにおける血中濃度の推移
被験物質（GLP42-1（実施例３４））を３００ｎｍｏｌ／ｋｇ（ＧＬＰ−１の重量とし
て１ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウスまたは雄のＦ３４４ラットに尾静脈注射した。以後、前記実施例３８と同じ操作を行った。結果を図６に示す。
【０３６９】
図６に示されるとおり、ＨＰＮ／ＧＬＰ−１複合体はマウスとラットにおいて同様の濃
度推移を示した。
【０３７０】
＜実施例４４＞ＨＰＮ／ＧＬＰ−１複合体のマウスにおける薬効持続性
被験物質（GLP42-2（実施例３４）またはリラグルチド）を３００ｎｍｏｌ／ｋｇ（Ｇ
ＬＰ−１の重量として１ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウスに皮下注射した。投与後７２〜１６８時間の各時点でグルコースを１ｇ／ｋｇの用量で腹腔内に負荷し、グルコース負荷後の血糖値変化を継時的に測定した。以後、前記実施例４０と同じ操作を行った。結果を図７に示す。
【０３７１】
図７に示されるとおり、ＣＨ／ＧＬＰ−１複合体と同様に、ＨＰＮ／ＧＬＰ−１複合体はリラグルチドを上回る薬効持続性を示した。
【０３７２】
＜実施例４５＞ＣＨ／インスリン複合体のマウスにおける血中濃度の推移（１）
被験物質（Ins3-1、Ins3-2、またはIns3-3（いずれも実施例３５））を３４０ｎｍｏｌ／ｋｇ（インスリンの重量として２ｍｇ／ｋｇ）の用量で雄のＩＣＲマウスに尾静脈注射（iv）または皮下注射（sc）した。投与後０〜４９時間の各時点で採血し、回収した血液を遠心分離して血清を得た。血清中のインスリン濃度は実施例１４に記載の方法に従って測定した。結果を図８に示す。
【０３７３】
＜実施例４６＞ＣＨ／インスリン複合体のマウスにおける血中濃度の推移（２）
被験物質としてIns4-1、Ins4-2、またはIns4-3（いずれも実施例３５）を用い、投与後０〜４８時間の各時点で採血したことの他は、前記実施例４５と同じ操作を行った。結果を図９に示す。
【０３７４】
＜実施例４７＞ＣＨ／インスリン複合体のマウスにおける血中濃度の推移（３）
被験物質としてIns5-1、Ins5-2、またはIns5-3（いずれも実施例３５）を用い、前記実施例４６と同じ操作を行った。結果を図１０に示す。
【０３７５】
図８〜図１０に示されるとおり、ＣＨ／インスリン複合体はＣＨ／ＧＬＰ−１複合体と同様、投与方法（静脈注射または皮下注射）には依存せず、同様の濃度推移を示した。
【０３７６】
＜実施例４８＞ＣＨ／インスリン複合体のマウスにおける薬効持続性
ストレプトゾトシンを２００ｍｇ／ｋｇの用量で雄のＩＣＲマウスに尾静脈注射し、糖尿病を惹起した。被験物質（Ins4-1、Ins5-2、Ins4-3（いずれも実施例３５）、デグルデク（Novo Nordisk社製）、またはグラルギン（Eli Lilly and Company社製））を１００
ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で雄のＩＣＲマウスに皮下注射した。投与後２〜２４時間の各時点で血糖値を測定した。血糖値の測定には簡易型自己血糖測定器（ライフチェック）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って測定を実施した。結果を図１１に示す。
【０３７７】
図１１に示されるとおり、ＣＨ／インスリン複合体は持効型インスリン製剤であるデグルデクやグラルギンと同等以上の薬効持続性を示した。
【０３７８】
＜実施例４９＞ＨＰＮ／インスリン複合体のマウスにおける血中濃度の推移
被験物質（Ins7-1、Ins7-2、Ins7-3、Ins6-1、Ins6-2、またはIns6-3（いずれも実施例３７））を１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で雄のＩＣＲマウスに尾静脈注射した。投与後０〜４８時間の各時点で採血し、回収した血液を遠心分離して血清を得た。以後、前記実施例４５と同じ操作を行った。結果を図１２に示す。
【０３７９】
＜実施例５０＞ＨＰＮ／インスリン複合体のラットにおける血中濃度の推移
被験物質（Ins7-1（実施例３７））を９０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で雄のＦ３４４ラット
に尾静脈注射または皮下注射した。以後、前記実施例４５と同じ操作を行った。結果を図１３に示す。
【０３８０】
＜実施例５１＞ＨＰＮ／インスリン複合体のマウスにおける薬効持続性
ストレプトゾトシンを２００ｍｇ／ｋｇの用量で雄のＩＣＲマウスに尾静脈注射し、糖尿病を惹起した。被験物質（Ins7-1、Ins7-2、Ins7-3（いずれも実施例３７）、デグルデク、またはグラルギン）を１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で雄のＩＣＲマウスに皮下注射した。以後、前記実施例４８と同じ操作を行った。結果を図１４に示す。
【０３８１】
図１４に示されるとおり、ＨＰＮ／インスリン複合体は持効型インスリン製剤であるデグルデクやグラルギンと同等以上の薬効持続性を示した。
【０３８２】
＜実施例５２＞ＨＰＮ／インスリン複合体のラットにおける薬効持続性
被験物質（Ins7-1（実施例３７）、デグルデク、またはグラルギン）を１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で雄のＦ３４４ラットに皮下注射した。以後、前記実施例４８と同じ操作を行った。結果を図１５に示す。
【０３８３】
図１５に示されるとおり、ＨＰＮ／インスリン複合体は、ラットにおいてもデグルデクやグラルギンと同等の薬効持続性を示した。
【産業上の利用可能性】
【０３８４】
本発明によれば、ペプチドの血中滞留性を増強することができる。よって、本発明によれば、例えば、ペプチドを有効成分とする医薬や製剤の効果を長期間持続させることができる。したがって、本発明は臨床においても研究においても極めて有用である。
【図１】
2019218265.tif 000062
【図２】
2019218265.tif 000063
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019218265.tif 000068
【図８】
2019218265.tif 000069
【図９】
2019218265.tif 000070
【図１０】
2019218265.tif 000071
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2019218265.tif 000074
【図１４】
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【図１５】
2019218265.tif 000076
【配列表】
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