(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト免疫疾患および病原体感染症のモデル作製に有用である、ヒトＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子改変マウスの提供。【解決手段】ヒトＭ−ＣＳＦタンパク質をコードし、かつマウスＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーターに機能的に連結されている核酸配列を含む、ヒト化Ｍ−ＣＳＦマウス。Ｒａｇ２における２個のヌル変異；ＩＬ２ｒｇにおける２個のヌル変異；マウスＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーターに機能的に連結されたヒトＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする核酸配列、および、ヒト造血細胞を含む、ヒト造血系のマウスモデル。【選択図】図２Ａ
2019122397.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトM-CSFタンパク質をコードし、かつマウスM-CSF遺伝子のプロモーターに機能的に連結されている核酸配列を含む、ヒト化M-CSFマウス。
【請求項２】
前記核酸配列を2コピー含む、請求項1記載のヒト化M-CSFマウス。
【請求項３】
前記核酸配列が、マウスM-CSF座で内因性のマウスM-CSFプロモーターに機能的に連結されている、請求項1記載のヒト化M-CSFマウス。
【請求項４】
少なくとも1つのマウスM-CSF対立遺伝子においてヌル変異を含む、請求項1記載のヒト化M-CSFマウス。
【請求項５】
ヌル変異がマウスM-CSFエキソン2〜9の欠失である、請求項4記載のヒト化M-CSFマウス。
【請求項６】
Rag2に関してホモ接合ヌルである、請求項1記載のヒト化M-CSFマウス。
【請求項７】
IL2rgに関してホモ接合ヌルである、請求項6記載のヒト化M-CSFマウス。
【請求項８】
ヒト細胞を含む、請求項1記載のヒト化M-CSFマウス。
【請求項９】
前記ヒト細胞が造血細胞である、請求項8記載のヒト化M-CSFマウス。
【請求項１０】
ヒト病原体による感染症を含む、請求項9記載のヒト化M-CSFマウス。
【請求項１１】
Rag2における2個のヌル変異；
IL2rgにおける2個のヌル変異；
マウスM-CSF遺伝子のプロモーターに機能的に連結された、ヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列；および
ヒト造血細胞
を含む、ヒト造血系のマウスモデル。
【請求項１２】
前記核酸配列が、マウスM-CSF座で内因性のマウスM-CSFプロモーターに機能的に連結されている、請求項11記載のマウスモデル。
【請求項１３】
マウスM-CSFに関してヌル欠失を含む、請求項11記載のマウスモデル。
【請求項１４】
a．野生型マウスにおけるマウスM-CSFの発現と同等のレベルで、骨髄、脾臓、血液、肝臓、脳、肺、精巣、および腎臓においてヒトM-CSFを発現すること；
b．hM-CSFを発現しない細胞生着マウスにおけるhCD14+CD33+より2倍から6倍高い脾臓のhCD14+CD33+細胞の出現率を示すこと；
c．hM-CSFを発現しない細胞生着マウスにおけるhCD14+CD33+より2倍から8倍高い末梢血のhCD14+CD33+細胞の出現率を示すこと；
d．約15％から約40％のhCD14+CD33+単球／マクロファージ系列細胞の血中レベルを示すこと；
e．約20週齢で約5％から約15％のhCD14+CD33+単球／マクロファージ系列細胞の血中レベルを示すこと；
f．ヒトM-CSFを欠如しているマウスより肝臓においてhCD14+CD33+細胞のパーセンテージに関して約1.5倍から約6倍大きい、LPS注射に対する反応を示すこと；
g．LPS注射後約48時間で脾臓においてhCD14+CD33+hCD45+細胞の産生の増強を示し、ここで、増強が、hM-CSFを欠如している細胞生着マウスに対して約2倍から約5倍である、こと；
h．LPSに反応して血清中ヒトIL-6の産生の増強を示し、ここで、LPS注射後約6時間でのhIL-6のレベルが、hM-CSFを欠如している細胞生着マウスに対して約2倍から約5倍増強される、こと；
i．hM-CSF遺伝子を欠如している細胞生着マウスよりhTNFαに関して約2倍から3倍高い、LPS刺激時の単球および／またはマクロファージによるインビトロ分泌を示すこと；
j．hM-CSF遺伝子を欠如している細胞生着マウスよりhIL-6に関して約2倍から4倍高い、LPS刺激時の単球および／またはマクロファージによるインビトロ分泌を示すこと；
k．hM-CSF遺伝子を欠如している細胞生着マウスよりhIFNαに関して約3倍から6倍高い、poly I:C刺激時の単球および／またはマクロファージによるインビトロ分泌を示すこと；
ｌ．hM-CSF遺伝子を欠如している細胞生着マウスよりhIFNβに関して約2倍から3倍高い、poly I:C刺激時の単球および／またはマクロファージによるインビトロ分泌を示すこと；
m．hM-CSF遺伝子を欠如している遺伝子改変細胞生着マウスと比較して増強された貪食を示すこと；
n．hM-CSF遺伝子を欠如している遺伝子改変細胞生着マウスと比較してMip3βに反応してインビトロで増強された走化性を示すこと；ならびに
o．LPS刺激に反応した共刺激分子のインビトロでのアップレギュレーションを示し、ここで、共刺激分子がヒトCD40、ヒトCD80、ヒトCD86、ヒトHLA-DRおよびそれらの組み合わせから選択される、こと
から選択される1つまたは複数の特徴を示す、請求項11記載のマウスモデル。
【請求項１５】
マウスが、前記特徴の2つまたはそれより多くを示す、請求項14記載のマウスモデル。
【請求項１６】
マウスが、前記特徴の3つまたはそれより多くを示す、請求項14記載のマウスモデル。
【請求項１７】
Rag2における2個のヌル変異；
IL2RGにおける2個のヌル変異；
マウスM-CSF遺伝子のプロモーターに機能的に連結された、ヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列；
ヒト造血細胞；および
ヒト病原体による感染症
を含む、ヒト病原体のマウスモデル。
【請求項１８】
前記病原体がウイルス、真菌、および細菌から選択される、請求項17記載のマウスモデル。
【請求項１９】
前記細菌がマイコバクテリウム（mycobacterium）または腸内細菌である、請求項18記載のマウスモデル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒトM-CSFタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子改変マウス、およびヒト造血細胞の生着を支持するさらなる改変を含むマウスに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ヒト疾患を調べるための動物モデルの開発により、癌を含むいくつかの疾患の基礎となる機序の理解は有意に前進した。今日まで、動物モデル、特にマウスは、薬物および治療選択肢の有効性および効能の評価のための優れた候補であることが証明されている。ヒトの生物学および疾患を研究するためにこれらの代用モデルを利用することは、十分に正当化することができるが（ヒトにおける実験的治療の実施に対する倫理的および技術的制約により）、マウスのデータをヒトに外挿する場合には限度がありうることが研究により強調されている（Mestas J, Hughes CC. (2004) Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172:2731-2738（非特許文献1））。
【０００３】
これらの問題を克服するために、ヒト化マウスモデルの開発に関しては長年にわたって関心が寄せられている。いくつかのグループによる集中的な研究は、マウスにおいてヒトの生物学および疾患を研究することが実現可能であるという証明に成功している。レシピエントが機能的および有効な免疫系を有すると、移植されたヒト起源の組織／細胞の消失が起こることから、T、B、およびNK細胞等の適応免疫系の細胞を欠如している遺伝子変異体を用いることは、ヒト化マウスモデルの成功に有意に貢献している。したがって、ヒト化マウスモデルの最も有効な候補には、組み換え活性化遺伝子（RAG）、共通γ鎖（γC、「インターロイキン2受容体γ」またはIL2rgとしても知られる）、β2ミクログロブリン（B2M）、およびパーフォリン1（Prf1）を含む遺伝子を欠如しているNOD-SCIDおよびBalb/c系統が挙げられる（Shultz LD, et al. (2007) Humanized mice in translational biomedical research, Nat. Rev. Immunol. 7:118-130（非特許文献2））。過去数十年間のいくつかの研究により、末梢血白血球、胎児肝細胞、胎児骨、胎児胸腺、胎児リンパ節、血管形成皮膚、動脈セグメント、および動員されたまたは臍帯血造血幹細胞（HSC）を含むいくつかのタイプのヒト組織を、ある種のヒト化マウスに移植することが実現可能であることが証明されている（Macchiarini F., et al. (2005) Humanized mice: are we there yet? J. Exp. Med. 202:1307-1311（非特許文献3））。これらのマウスにおけるヒト細胞から得られたデータがヒトの系の生理学を反映しうることから、このアプローチは、より良好なモデル系を提供すると考えられる。当技術分野における研究の主要な道筋は、ヒト起源の完全な造血系および機能的免疫系を有するマウスを作製することである。ヒトTリンパ球、Bリンパ球、NK細胞、および樹状細胞（DC）を有する免疫無防備状態のマウスの作製に関しては有意な進歩が認められるが、当技術分野にはなおもいくつかの難題が存在し、その1つは、ヒト化マウスの骨髄分化が不良であることである。
【０００４】
興味深いことに、ヒト化マウスにおいて、造血幹細胞（HSC）からヒトT細胞、B細胞、NK細胞、および樹状細胞（DC）を作製することは大きく進歩している。個々の造血区画に加えて、これらのマウスにヒトHSCを注入することによって、胸腺および脾臓等のリンパ系臓器の再構成が起こった。それにもかかわらず、骨髄細胞、特に顆粒球、マクロファージ、赤血球、および巨核球の出現率は非常に低く、これは、おそらくこれらのマウスにおけるヒトHSCからの骨髄造血が無効であることによる結果である（Shultz et al. (2007)（非特許文献2）; Macchiarini et al. (2005)（非特許文献3））。血液系が正常に機能するためには骨髄起源の細胞（赤血球および巨核球等の）が肝要であり、しかも適応免疫系の発達にとって顆粒球およびマクロファージが不可欠であるという事実を考慮すると、有効なヒト骨髄造血を有するヒト化マウスの作製は、極めて重要である。
【０００５】
したがって、ヒトHSCの生着により骨髄造血を改善させることができる遺伝子改変マウスが当技術分野において必要である（Manz MG. Human-hemato-lymphoid-system mice: opportunities and challenges. Immunity. 2007 May;26(5):537-41（非特許文献4））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Mestas J, Hughes CC. (2004) Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172:2731-2738
【非特許文献２】Shultz LD, et al. (2007) Humanized mice in translational biomedical research, Nat. Rev. Immunol. 7:118-130
【非特許文献３】Macchiarini F., et al. (2005) Humanized mice: are we there yet? J. Exp. Med. 202:1307-1311
【非特許文献４】Manz MG. Human-hemato-lymphoid-system mice: opportunities and challenges. Immunity. 2007 May;26(5):537-41
【発明の概要】
【０００７】
概要
ヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子改変マウスを提供する。同様に、ヒト造血細胞等のヒト細胞が生着しているヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子改変マウス、およびそのような生着マウスを作製する方法を提供する。これらのマウスは、ヒト免疫疾患および病原体感染症のモデルの作製；たとえば健康な状態または疾患状態で造血細胞の発達および／または活性を調整する物質に関するインビボスクリーニング；造血細胞に対して毒性である物質に関するインビボスクリーニング；造血細胞に対する毒性物質の毒性効果を防ぐ、緩和する、または逆転させる物質に関するインビボスクリーニング；疾患の治療に対する個体の反応性を予測するための個体のヒト造血細胞のインビボスクリーニング等の多数の応用において有用である。
【０００８】
本発明のいくつかの局面において、ヒトM-CSFタンパク質をコードし、かつマウスM-CSF構造遺伝子座の5'で、調節配列、たとえばマウスM-CSFプロモーター、5'UTR等に機能的に連結された核酸配列を含むヒト化M-CSFマウスが提供される。いくつかの態様において、マウスは前記核酸配列を2コピー含む。いくつかの態様において、核酸配列は、マウスM-CSF座内のマウスゲノムに存在する。いくつかの態様において、核酸配列は、マウスM-CSF座で内因性のマウスM-CSFプロモーターに機能的に連結しており、すなわちマウスはM-CSFh/mマウスである。いくつかの態様において、マウスは、その核酸配列がマウスM-CSF座内のマウスゲノムに存在する2つの対立遺伝子を含む。いくつかの態様において、両方の対立遺伝子の核酸配列は、マウスM-CSF座で内因性のマウスM-CSFプロモーターに機能的に連結しており、すなわちマウスはM-CSFh/hマウスである。いくつかの態様において、ヒト化M-CSFマウスは、少なくとも1つのマウスM-CSF対立遺伝子でヌル変異を含む。いくつかの態様において、ヒト化M-CSFマウスは、両方のマウスM-CSF対立遺伝子においてヌル変異を含む。いくつかのそのような態様において、ヌル変異は、マウスM-CSFエキソン2〜9の欠失である。
【０００９】
いくつかの態様において、マウスは、骨髄、脾臓、血液、肝臓、脳、肺、精巣、および腎臓においてヒトM-CSFを発現する。いくつかの態様において、発現されるヒトM-CSFの量は、野生型マウスにおいて発現されるマウスM-CSFの量と実質的に同じである。いくつかの態様において、ヒト化M-CSFマウスの骨髄間葉間質細胞は、野生型マウス骨髄間葉間質細胞によって発現されるマウスM-CSFの量と実質的に同じである量のヒトM-CSFを発現する。いくつかの態様において、ヒト化M-CSFマウスは、血液および／または組織においてM-CSFの生理的濃度を示す。いくつかの態様において、マウスは、マウスM-CSFおよびヒトM-CSFの両方を発現する。他の態様において、マウスによって発現される唯一のM-CSFは、ヒトM-CSFである。
【００１０】
いくつかの態様において、マウスは、生着したヒト造血幹細胞をヒト単球、ヒトマクロファージ、およびヒト破骨細胞へと分化させるために十分なヒトM-CSFを分泌する。いくつかの態様において、マウスは、ヒト造血幹細胞のマウスへの生着によって生じたヒト単球からのヒトマクロファージの発達を刺激するために有効な量のM-CSFを分泌する。いくつかの態様において、マウスは、ヒト造血幹細胞を生着させたマウスにおいて、ヒト造血幹細胞の単芽球への発達、単芽球のヒト前単球への発達、ヒト前単球のヒト単球への発達、およびヒト単球のヒトマクロファージへの発達を刺激するために有効な量のM-CSFを分泌する。いくつかの態様において、マウスにおいて分泌されるヒトM-CSFの有効量は、対応する結果を得るために野生型マウスによって分泌されるマウスM-CSFの量と実質的に同じ量（たとえば、マウス単球からのマウスマクロファージの発達を刺激するために有効な量のマウスM-CSF）である。
【００１１】
いくつかの態様において、遺伝子改変マウスにおけるヒトM-CSFの転写および翻訳制御は、内因性のマウスM-CSF遺伝子の改変を有しないマウスにおけるマウスM-CSFの転写および翻訳制御と同一であるか、または実質的に同一である。
【００１２】
いくつかの態様において、ヒト化M-CSFマウスにおけるヒトM-CSFの生理的濃度は、マウスM-CSF遺伝子を有するがヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸を欠如している野生型マウスにおいてマウスM-CSFを分泌する同じ細胞タイプからのヒトM-CSFの分泌に由来する。言い換えれば、1つまたは複数のM-CSFイソ型が、正常な組織特異的および発達パターンで発現される。
【００１３】
いくつかの態様において、マウスは、プロテオグリカンM-CSF、糖タンパク質M-CSF、および細胞表面M-CSF、ならびにそれらの組み合わせから選択されるヒトM-CSFイソ型を発現する。1つの態様において、マウスは、前記イソ型の少なくとも2つを正常な組織特異的および発達パターンで発現する。特定の態様において、マウスは、ヒトプロテオグリカンCSF-1およびヒト糖タンパク質M-CSFおよびヒト細胞表面M-CSFを発現する。
【００１４】
いくつかの態様において、マウスは、胸腺T細胞由来マクロファージではないヒトマクロファージを含む。いくつかの態様において、マウスは、マウスにおいて発現されたヒトM-CSFによって刺激されたM-CSF依存的ポドソーム形成を示すヒトマクロファージを含む。
【００１５】
いくつかの態様において、マウスは、Rag2に関してホモ接合ヌルである。いくつかの態様において、マウスはIL2rgに関してホモ接合ヌルである。いくつかの態様において、マウスはRag2およびIL2rgに関してホモ接合ヌルである。いくつかの態様において、マウスはヒト細胞を含む。いくつかの態様において、ヒト細胞は造血細胞である。
【００１６】
本発明のいくつかの局面において、Rag2に関する2つのヌル対立遺伝子、IL2rgに関する2つのヌル対立遺伝子、マウスM-CSF遺伝子のプロモーターに機能的に連結したヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列、およびヒト造血細胞を含む、ヒト免疫系のマウスモデルを提供する。言い換えれば、マウスは、細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスであり、hM-CSFとは、マウスがヒトM-CSF遺伝子をコードする核酸を少なくとも1つ含むことを意味する。いくつかの態様において、細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSF マウスは、これらの遺伝子改変を含むBALB/c系統のマウスである。いくつかの態様において、マウスは他の遺伝子改変も同様に含む。
【００１７】
いくつかの態様において、約12週齢の細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスは、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しないヒト造血細胞を含むマウスと比較して、骨髄、脾臓、および末梢血において、ヒトCD14+CD33+（hCD14+CD33+）細胞の出現率の増加を示す。特定の態様において、マウスM-CSFのみを発現するマウスと比較した骨髄のhCD14+CD33+細胞の増加は、約5倍から約15倍であり、1つの態様において、約12倍から約14倍である。特定の態様において、マウスM-CSFのみを発現するヒト造血細胞を含むマウスと比較した脾臓のhCD14+CD33+細胞の増加は、約2倍から約6倍であり、1つの態様において、約5倍から約6倍である。特定の態様において、マウスM-CSFのみを発現するヒト造血細胞を含むマウスと比較した末梢血のhCD14+CD33+細胞の増加は、約2倍から約8倍であり、1つの態様において、約5倍から約7倍である。
【００１８】
いくつかの態様において、約12週齢の細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSF マウスが示すhCD14+CD33+単球／マクロファージ系列細胞の血中レベルは、約15％から約40％の血中レベルであり、1つの態様において、約30％のレベルを示す。1つの態様において、約16週齢の遺伝子改変細胞生着マウスが示すhCD14+CD33+単球／マクロファージ系列細胞の血中レベルは、約15％から約30％であり、1つの態様において約22％のレベルを示す。1つの態様において、約20週齢の遺伝子改変細胞生着マウスが示すhCD14+CD33+単球／マクロファージ系列細胞の血中レベルは、約5％から約15％であり、1つの態様において約10％のレベルを示す。1つの態様において、約20週齢の遺伝子改変細胞生着マウスは、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しない細胞生着マウスの血中レベルより約4倍から8倍高いhCD14+CD33+単球／マクロファージ系列細胞の血中レベルを示し、1つの態様において約6倍高いレベルを示す。
【００１９】
いくつかの態様において、約12週齢の細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスは、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しない細胞生着マウスより、肝臓において約1.5倍から約6倍高いレベルのhCD14+CD33+CD45+細胞を示す。1つの態様において、約12週齢の遺伝子改変細胞生着マウスは、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しない細胞生着マウスより肺において約1.5倍から約10倍高いレベルのhCD14+CD33+CD45+細胞を示す。1つの態様において、約12週齢の遺伝子改変細胞生着マウスは、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しない細胞生着マウスより腹膜または皮膚において約2倍から約3倍高いレベルのヒトhCD14+CD33+CD45+細胞を示す。
【００２０】
いくつかの態様において、細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスは、ヒトM-CSFを欠如しているマウスより肝臓におけるhCD14+CD33+細胞のパーセンテージに関して約1.5倍から約6倍大きい、LPS注射に対する反応を示し、1つの態様において、約2倍から約4倍大きい反応を示す。肺においてhCD14+CD33+細胞に関するLPS反応は、約1.5倍から10倍であり、1つの態様において、約2倍から3倍である。皮膚においてhCD14+CD33+に関するLPS反応は、約2倍から約5倍であり、1つの態様において約3倍から約4倍である。腹膜において、hCD14+CD33+に関するLPS反応は、約2倍から約5倍であり、1つの態様において、約3倍から約4倍である。
【００２１】
いくつかの態様において、細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスは、LPS刺激に反応して増強された炎症誘発性サイトカイン反応を示し、hM-CSF遺伝子を欠如している遺伝子改変細胞生着マウスと比較した増強は、炎症誘発性サイトカインに対して反応性である細胞タイプの活性化および／または分化レベルに関して約2倍から少なくとも約5倍である。
【００２２】
いくつかの態様において、細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスは、LPS注射後約48時間で脾臓においてhCD14+CD33+hCD45+細胞の産生の増強を示し、増強は、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しない細胞生着マウスと比較して約2倍から約5倍であり、1つの態様において4倍から約5倍である。
【００２３】
いくつかの態様において、細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスは、LPSに反応して血清中ヒトIL-6の産生の増強を示し、LPS注射後約6時間でのhIL-6のレベルは、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しない細胞生着マウスと比較して約2倍から約5倍増強され、1つの態様において約3倍から約4倍増強される。
【００２４】
いくつかの態様において、細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスは、LPSに反応して血清中ヒトTNFαの産生の増強を示し、LPS注射後約6時間でのhTNFαのレベルは、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しない細胞生着マウスと比較して約2倍から約4倍増強され、1つの態様において約2倍から約3倍増強される。
【００２５】
いくつかの態様において、細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスから単離された単球および／またはマクロファージは、LPS刺激によって、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しない細胞生着マウスより、hTNFαに関して約2倍から3倍高いインビトロ分泌を示す。
【００２６】
いくつかの態様において、細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスから単離された単球および／またはマクロファージは、LPS刺激によって、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しない細胞生着マウスより、hIL-6に関して約2倍から4倍高いインビトロ分泌を示す。
【００２７】
いくつかの態様において、細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスから単離された単球および／またはマクロファージは、poly I:C刺激によって、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しない細胞生着マウスより、hIFNαに関して約3倍から6倍高いインビトロ分泌を示す。
【００２８】
いくつかの態様において、細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスから単離された単球および／またはマクロファージは、poly I:C刺激によって、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しない細胞生着マウスより、hIFNβに関して約2倍から3倍高いインビトロ分泌を示す。
【００２９】
いくつかの態様において、細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスから単離されたヒト単球および／またはマクロファージは、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しない細胞生着マウスと比較して貪食の増強を示す。1つの態様において、増強は、標識細菌の37℃で60分間の取り込みによって測定した場合に、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しない細胞生着マウスからのヒト細胞と比較して、約2倍の貪食率である。1つの態様において、上記のように測定した貪食率は、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しない細胞生着マウスからのヒト細胞の貪食率の2倍またはそれ以上であり、たとえば2倍、3倍、または4倍もしくはそれ以上である。
【００３０】
いくつかの態様において、細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスから単離されたヒト単球および／またはマクロファージは、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しない細胞生着マウスと比較してインビトロでMip3βに反応した走化性の増強を示す。1つの態様において、増強は、Mip3β曝露後30分または60分での遊走細胞数によって測定した場合に、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しない細胞生着マウスからのヒト単球および／またはマクロファージと比較して、約1.5倍から3倍、またはそれ以上であり、たとえば約1.5倍、2倍、3倍、4倍またはそれ以上である。
【００３１】
いくつかの態様において、細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFhマウスから単離されたヒト単球および／またはマクロファージは、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しない細胞生着マウスより、poly I:C刺激によって、hIFNαに関して約3から6倍高いインビトロ分泌を示す。
【００３２】
いくつかの態様において、細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスから単離されたヒト単球および／またはマクロファージは、LPS刺激に反応して共刺激分子のインビトロでのアップレギュレーションを示す。1つの態様において、共刺激分子は、ヒトCD40、ヒトCD80、ヒトCD86、ヒトHLA-DR、およびそれらの組み合わせから選択される。
【００３３】
本発明のいくつかの局面において、遺伝子改変細胞生着マウスが提供され、当該マウスは、ヒト造血細胞の生着を含み、Rag2-/-IL2rg-/-であり、マウスM-CSFに関するヌル対立遺伝子を含み、および内因性のM-CSF座でヒトM-CSFをコードする核酸配列を含み、当該マウスは、マウスM-CSFを発現するがヒトM-CSFを発現しないマウスと比較してヒト骨髄細胞の増強または数の増加を示す。
【００３４】
いくつかの態様において、増強は、骨髄、脾臓、および末梢血から選択されるマウスの部分においてhCD14+CD33+細胞数の少なくとも倍増を含む。特定の態様において、増強は、hCD14+CD33+細胞の3倍増加を含む。別の態様において、増強は、hCD14+CD33+細胞数の4倍から5倍増加またはそれ以上を含む。
【００３５】
いくつかの態様において、増強は、皮膚および腹膜から選択されるマウスの区画においてhCD14+CD33+hCD45+細胞数の2倍から3倍の増加を含む。
【００３６】
いくつかの態様において、増強は、肝臓および肺から選択されるマウスの区画においてhCD14+CD33+hCD45+細胞数の1.5倍から10倍増加を含む。
【００３７】
いくつかの態様において、増強は、LPS刺激後約48時間でhCD14+CD33+hCD45+脾細胞数の4倍から5倍増加を含む。
【００３８】
いくつかの態様において、増強は、LPS刺激による血清中hIL-6またはLPS刺激による血清中hTNFαの2倍から4倍増加を含む。
【００３９】
いくつかの態様において、増強は、hCD14+CD33+細胞のヒトMIP3βによって刺激されたインビトロ遊走の2倍から3倍増加を含む。
【００４０】
本発明のいくつかの局面において、Rag2に関する2つのヌル対立遺伝子、IL2rgに関する2つのヌル対立遺伝子、マウスM-CSF遺伝子のプロモーターに機能的に連結したヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列、ヒト造血細胞、およびヒト病原体による感染症を含む、ヒト病原体のマウスモデルが提供される。言い換えれば、マウスは、ヒト病原体に感染している細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスである。いくつかの態様において、病原体はウイルス、真菌、または細菌である。いくつかの態様において、ウイルスは、ヒトまたはブタまたはトリインフルエンザウイルスである。いくつかの態様において、細菌は、マイコバクテリウム（mycobacterium）、たとえばヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis（M. tuberculosis））である。いくつかの態様において、細菌は、腸内細菌、たとえばチフス菌（Salmonella typhi（S. typhi））である。
【００４１】
本発明のいくつかの局面において、マウスM-CSF遺伝子のプロモーターに機能的に連結されたヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列を含む、多能性、人工多能性、または全能性マウス細胞が提供される。1つの態様において、マウス細胞はマウスES細胞である。
【００４２】
本発明のいくつかの局面において、マウスM-CSF遺伝子のプロモーターに機能的に連結されたヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列を含むマウス胚が提供される。
【００４３】
本発明のいくつかの局面において、マウスM-CSF遺伝子を標的とするターゲティング構築物が提供され、構築物は、（a）（i）マウスM-CSFタンパク質をコードするヌクレオチド配列、または（ii）マウスM-CSFタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、のいずれかの上流および下流のヌクレオチド配列と相補的または実質的に相補的である上流および下流のターゲティングアーム；（b）ヒトM-CSFタンパク質もしくはその断片をコードするヒト核酸配列、またはヒトM-CSFタンパク質もしくはその断片の相補体をコードするヌクレオチド配列；ならびに（c）マーカーおよび／または選択カセットを含む。
【００４４】
本発明のいくつかの局面において、本明細書において記述されるマウスからのヒト免疫細胞が提供される。1つの態様において、ヒト免疫細胞は、ヒト単球およびヒトマクロファージから選択される。1つの態様において、ヒト免疫細胞は、ヒトNK細胞、ヒトB細胞、およびヒトT細胞から選択される。
【００４５】
本発明のいくつかの局面において、本明細書において記述されるマウスからのヒトヌクレオチド配列によってコードされる抗体が提供される。1つの態様において、抗体は、IgA、IgD、IgE、IgM、またはIgGアイソタイプ抗体から選択される。
【００４６】
本発明のいくつかの局面において、本発明に従う細胞生着ヒト化M-CSFマウスから得られる、ヒト免疫グロブリン配列をコードするヌクレオチド配列が提供される。1つの態様において、ヌクレオチド配列は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のヒト可変領域またはその断片をコードする。1つの態様において、ヌクレオチド配列は、ヒトTCR可変領域またはその断片をコードする。
【００４７】
本発明のいくつかの局面において、生物活性ヒトM-CSFを発現するヒト化M-CSFマウスを作製する方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、マウス多能性幹細胞、たとえばES細胞またはiPS細胞に、ヒトM-CSFタンパク質のコード配列またはその断片を含む核酸配列を接触させる段階、および該核酸配列のマウスゲノムへの組み込みを促進する条件で多能性幹細胞を培養する段階；ヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列を含むマウスES細胞からマウスを作製する段階；ならびにマウスがヒトM-CSF遺伝子からヒトM-CSFを発現させるために十分な条件でマウスを維持する段階を含む。いくつかの態様において、核酸配列は、ゲノムに無作為に組み入れられる。他の態様において、核酸配列は、標的座に組み入れられる。いくつかのそのような態様において、標的座は、内因性のマウスM-CSF座であり、たとえばヒトM-CSFタンパク質のコード配列を含む核酸配列は、内因性のマウスM-CSF座と相同である配列に隣接して、核酸配列は、相同組み換えによって内因性のマウスM-CSF座に組み入れられる。いくつかの態様において、マウスは、Rag2に関してホモ接合ヌルである。他の態様において、マウスは、IL2rgに関してホモ接合ヌルである。いくつかの態様において、マウスはRag2およびIL2rgに関してホモ接合ヌルであり、すなわちマウスはRag2-/-IL2rg-/-である。
【００４８】
本発明のいくつかの局面において、ヒト造血系を含むヒト化M-CSFマウスを作製する方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、ヒト化M-CSFマウス、たとえばRag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスまたは致死下量の放射線を照射したhM-CSFマウスに、ヒト造血前駆細胞を含む細胞集団を移植する段階を含む。いくつかの態様において、ヒト造血前駆細胞はCD34+細胞である。いくつかの態様において、ヒト造血前駆細胞はCD133+である。いくつかの態様において、ヒト造血前駆細胞は、多能性幹細胞、たとえばES細胞またはiPS細胞である。いくつかの態様において、ヒト造血前駆細胞を含む細胞集団の起源は胎児肝臓である。いくつかの態様において、細胞の起源は骨髄である。いくつかの態様において、細胞の起源は末梢血である。いくつかの態様において、細胞の起源はインビトロ細胞集団である。
【００４９】
本発明のいくつかの局面において、ヒト病原体に感染したマウスを作製する方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、ヒト造血細胞を含むヒト化M-CSF、たとえば細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスまたは致死下量の放射線を照射した細胞生着マウスを、ヒト病原体に曝露する段階、およびヒト病原体がマウスに感染するために十分な条件でマウスを維持する段階を含む。いくつかの態様において、ヒト病原体は、本明細書において記述される遺伝子改変の1つまたは複数を欠如しているマウスには感染しないヒト病原体である。いくつかの態様において、ヒト病原体は、本明細書において記述される遺伝子改変の1つまたは複数を欠如しているマウスにおいて病原性ではないヒト病原体である。
【００５０】
本発明のいくつかの局面において、本明細書において先に記述したおよび本明細書において他所で記述した生物活性ヒトM-CSFを発現するヒト化M-CSFマウスを作製する段階を含む、マウスにおいて生物活性ヒトM-CSFを作製する方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、マウスの血液、たとえば血清または組織から生物活性ヒトM-CSFを精製する段階を含む。いくつかの態様において、方法は、生物活性ヒトM-CSFを発現する細胞をマウスから得る段階、細胞が生物活性ヒトM-CSFを発現および分泌するために十分な条件で細胞を培養する段階、および分泌された生物活性ヒトM-CSFを単離する段階を含む。本発明のこの局面において、マウスは他のいかなる遺伝子改変も有する必要はないこと、およびマウスはある種のヒト免疫細胞の調製物を作製するために有用であることに注意されたい。そのため、本発明のいくつかの局面において、トランスジェニックマウスから得られた単離された生物活性ヒトM-CSFが提供される。
【００５１】
本発明のいくつかの局面において、ヒト造血細胞を生着させたヒト化M-CSFマウスを免疫刺激剤に曝露する段階、マウスにおいてヒト単球またはマクロファージを活性化させる段階、およびマウスからヒト単球またはヒトマクロファージを単離する段階を含む、マウスにおいて活性化ヒト単球または活性化ヒトマクロファージを作製する方法が提供され、活性化単球または活性化マクロファージの画分は、ヒト化M-CSFマウスではない細胞生着マウス、すなわちヒトM-CSF遺伝子を欠如しているマウスから得られる画分より約2倍から5倍高い。いくつかの態様において、免疫刺激剤はエンドトキシンである。特定の態様において、エンドトキシンはLPSである。
【００５２】
本発明のいくつかの局面において、ヒト造血細胞機能を調整する活性に関して候補物質をスクリーニングする方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、ヒト造血細胞を生着させたヒト化M-CSFマウス、たとえば細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウス、または致死下量の放射線を照射した細胞生着hM-CSFマウスに、候補物質を接触させる段階、および候補物質に接触させたマウスモデルにおける造血細胞の機能を、候補物質に接触していないマウスモデルにおける造血細胞の機能と比較する段階を含み、候補物質に接触させたマウスにおける造血細胞の機能が調整されれば、候補物質が造血細胞機能を調整することを示している。
【００５３】
本発明のいくつかの局面において、細胞生着ヒト化M-CSFマウス、たとえば細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウス、または致死下量の放射線を照射した細胞生着hM-CSFマウスを、マウスにおいて感染症を生じさせるために必要な病原体の量であるヒト病原体の有効量に曝露する段階；病原体をマウスに感染させる段階；物質の存在下で感染症のパラメータを経時的に測定する段階；およびその測定値を、物質に曝露していない細胞生着ヒト化M-CSFマウスからの測定値と比較する段階を含む、ヒト病原体に及ぼす物質の効果を決定する方法が提供される。いくつかの態様において、物質は、たとえば保護効果を決定するために、マウスをヒト病原体に曝露する前に提供される。いくつかの態様において、物質は、たとえば保護または治療効果を決定するために、マウスをヒト病原体に曝露するのと同時に提供される。いくつかの態様において、物質は、たとえば治療効果を決定するために、マウスをヒト病原体に曝露した後に提供される。いくつかの態様において、ヒト病原体に曝露されたマウスは、病原体に曝露されたヒトの感染症のモデルとなる細胞性および／または液性免疫応答を開始する。いくつかの態様において、ヒト病原体は、本明細書において記述される遺伝子改変の1つまたは複数を欠如しているマウスには感染しない病原体である。いくつかの態様において、ヒト病原体は、野生型マウスに感染する病原体であるが、感染後の野生型マウスは、病原体に反応してヒトが開始する免疫応答のモデルとはならない。いくつかの態様において、ウイルスはヒトまたはブタまたはトリインフルエンザウイルスである。いくつかの態様において、細菌は、マイコバクテリウム、たとえばヒト型結核菌である。いくつかの態様において、細菌は腸内細菌、たとえばチフス菌である。いくつかの態様において、マウスは、ヒト病原体の既知の感染単位数に曝露され、感染症のパラメータは、マウスの体液または組織中のヒト病原体の感染単位数である。いくつかの態様において、感染症のパラメータは、マウスの体液中の力価である。いくつかの態様において、感染症のパラメータは、肉芽腫の形成である。いくつかのそのような態様において、肉芽腫は肺肉芽腫である。いくつかのそのような態様において、肉芽腫は十分に明確な肉芽腫である。
【００５４】
本発明のいくつかの局面において、細胞生着ヒト化M-CSFマウス、たとえば細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウス、または致死下量の放射線を照射した細胞生着hM-CSFマウスを、マウスにおいて細胞性および／または液性応答を促進するために必要な抗原量であるヒト病原体抗原の有効量に曝露する段階；細胞性および／または液性応答を発生させる段階；物質の存在下で細胞性および／または液性応答のパラメータを経時的に測定する段階；ならびにその測定値を、物質に曝露されていない細胞生着ヒト化M-CSFマウスの測定値と比較する段階を含む、ヒト病原体に及ぼす物質の効果を決定する方法が提供される。いくつかの態様において、物質は、たとえば物質の保護効果を決定するために、マウスをヒト病原体の抗原に曝露する前に提供される。いくつかの態様において、物質は、たとえば物質の保護効果または治療効果を決定するために、マウスをヒト病原体の抗原に曝露するのと同時に提供される。いくつかの態様において、物質は、たとえば物質の治療効果を決定するために、マウスをヒト病原体の抗原に曝露した後に提供される。いくつかの態様において、ヒト病原体に曝露されたマウスは、病原体に曝露されたヒトの感染症のモデルとなる細胞性および／または液性免疫応答を開始する。
【００５５】
いくつかの態様において、抗原は、本明細書において記述される遺伝子改変の1つまたは複数を欠如しているマウスには感染しないヒト病原体に由来する。他の態様において、抗原は、野生型マウスに感染するヒト病原体に由来するが、感染後の野生型マウスは、病原体に反応してヒトが開始する免疫応答のモデルではない。いくつかの態様において、病原体はウイルス、真菌、または細菌である。いくつかの態様において、ウイルスはヒトまたはブタまたはトリインフルエンザウイルスである。いくつかの態様において、細菌はマイコバクテリウム、たとえばヒト型結核菌である。いくつかの態様において、細菌は腸内細菌、たとえばチフス菌である。
【００５６】
本発明のいくつかの局面において、ヒト造血細胞に対する毒性に関して候補物質をスクリーニングする方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、ヒト造血細胞を生着させたヒト化M-CSFマウス、たとえば細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスに候補物質を接触させる段階；および候補物質を接触させたマウスにおける造血細胞の生存率および／または機能を、候補物質を接触させていないヒト造血細胞を生着させたヒト化M-CSFマウスにおける造血細胞の生存率および／または機能と比較する段階を含み、候補物質を接触させたマウスにおける造血細胞の生存率および／または機能が減少すれば、候補物質が造血細胞に対して毒性であることを示している。
【００５７】
本発明のいくつかの局面において、ヒト造血細胞を毒性物質から保護する能力、ヒト造血細胞に対する毒性物質の効果を軽減する能力、またはヒト造血細胞に対する毒性物質の効果を逆転させる能力に関して候補物質をスクリーニングする方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、ヒト造血細胞を生着させたヒト化M-CSFマウス、たとえば細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウス、または致死下量の放射線を照射した細胞生着hM-CSFマウスに、毒性物質を接触させる段階；マウスに候補物質を接触させる段階；および候補物質を接触させたマウスにおける造血細胞の生存率および／または機能を、候補物質に接触させていないヒト造血細胞を生着させたヒト化M-CSFマウスにおける造血細胞の生存率および／または機能と比較する段階を含み、候補物質を接触させたマウスモデルにおいて造血細胞の生存率および／または機能が増強されれば、候補物質が、毒性物質から造血細胞を保護することを示している。
【００５８】
本発明のいくつかの局面において、治療物質による処置に対する個体の反応性を予測する方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、個体からのヒト造血細胞を生着させたヒト化M-CSFマウス、たとえば細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウス、または致死下量の放射線を照射した細胞生着hM-CSFマウスに治療物質を接触させる段階、および候補物質を接触させたマウスモデルにおける造血細胞の生存率および／または機能を、候補物質に接触させなかったヒト造血細胞を生着させたヒト化M-CSFマウスにおける造血細胞の生存率および／または機能と比較する段階を含み、候補物質を接触させたマウスにおける造血細胞の生存率および／または機能が調整されれば、個体が治療物質による処置に対して反応を有することを示している。
[本発明1001]
ヒトM-CSFタンパク質をコードし、かつマウスM-CSF遺伝子のプロモーターに機能的に連結されている核酸配列を含む、ヒト化M-CSFマウス。
[本発明1002]
前記核酸配列を2コピー含む、本発明1001のヒト化M-CSFマウス。
[本発明1003]
前記核酸配列が、マウスM-CSF座で内因性のマウスM-CSFプロモーターに機能的に連結されている、本発明1001のヒト化M-CSFマウス。
[本発明1004]
少なくとも1つのマウスM-CSF対立遺伝子においてヌル変異を含む、本発明1001のヒト化M-CSFマウス。
[本発明1005]
ヌル変異がマウスM-CSFエキソン2〜9の欠失である、本発明1004のヒト化M-CSFマウス。
[本発明1006]
Rag2に関してホモ接合ヌルである、本発明1001のヒト化M-CSFマウス。
[本発明1007]
IL2rgに関してホモ接合ヌルである、本発明1006のヒト化M-CSFマウス。
[本発明1008]
ヒト細胞を含む、本発明1001のヒト化M-CSFマウス。
[本発明1009]
前記ヒト細胞が造血細胞である、本発明1008のヒト化M-CSFマウス。
[本発明1010]
ヒト病原体による感染症を含む、本発明1009のヒト化M-CSFマウス。
[本発明1011]
Rag2における2個のヌル変異；
IL2rgにおける2個のヌル変異；
マウスM-CSF遺伝子のプロモーターに機能的に連結された、ヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列；および
ヒト造血細胞
を含む、ヒト造血系のマウスモデル。
[本発明1012]
前記核酸配列が、マウスM-CSF座で内因性のマウスM-CSFプロモーターに機能的に連結されている、本発明1011のマウスモデル。
[本発明1013]
マウスM-CSFに関してヌル欠失を含む、本発明1011のマウスモデル。
[本発明1014]
a．野生型マウスにおけるマウスM-CSFの発現と同等のレベルで、骨髄、脾臓、血液、肝臓、脳、肺、精巣、および腎臓においてヒトM-CSFを発現すること；
b．hM-CSFを発現しない細胞生着マウスにおけるhCD14+CD33+より2倍から6倍高い脾臓のhCD14+CD33+細胞の出現率を示すこと；
c．hM-CSFを発現しない細胞生着マウスにおけるhCD14+CD33+より2倍から8倍高い末梢血のhCD14+CD33+細胞の出現率を示すこと；
d．約15％から約40％のhCD14+CD33+単球／マクロファージ系列細胞の血中レベルを示すこと；
e．約20週齢で約5％から約15％のhCD14+CD33+単球／マクロファージ系列細胞の血中レベルを示すこと；
f．ヒトM-CSFを欠如しているマウスより肝臓においてhCD14+CD33+細胞のパーセンテージに関して約1.5倍から約6倍大きい、LPS注射に対する反応を示すこと；
g．LPS注射後約48時間で脾臓においてhCD14+CD33+hCD45+細胞の産生の増強を示し、ここで、増強が、hM-CSFを欠如している細胞生着マウスに対して約2倍から約5倍である、こと；
h．LPSに反応して血清中ヒトIL-6の産生の増強を示し、ここで、LPS注射後約6時間でのhIL-6のレベルが、hM-CSFを欠如している細胞生着マウスに対して約2倍から約5倍増強される、こと；
i．hM-CSF遺伝子を欠如している細胞生着マウスよりhTNFαに関して約2倍から3倍高い、LPS刺激時の単球および／またはマクロファージによるインビトロ分泌を示すこと；
j．hM-CSF遺伝子を欠如している細胞生着マウスよりhIL-6に関して約2倍から4倍高い、LPS刺激時の単球および／またはマクロファージによるインビトロ分泌を示すこと；
k．hM-CSF遺伝子を欠如している細胞生着マウスよりhIFNαに関して約3倍から6倍高い、poly I:C刺激時の単球および／またはマクロファージによるインビトロ分泌を示すこと；
ｌ．hM-CSF遺伝子を欠如している細胞生着マウスよりhIFNβに関して約2倍から3倍高い、poly I:C刺激時の単球および／またはマクロファージによるインビトロ分泌を示すこと；
m．hM-CSF遺伝子を欠如している遺伝子改変細胞生着マウスと比較して増強された貪食を示すこと；
n．hM-CSF遺伝子を欠如している遺伝子改変細胞生着マウスと比較してMip3βに反応してインビトロで増強された走化性を示すこと；ならびに
o．LPS刺激に反応した共刺激分子のインビトロでのアップレギュレーションを示し、ここで、共刺激分子がヒトCD40、ヒトCD80、ヒトCD86、ヒトHLA-DRおよびそれらの組み合わせから選択される、こと
から選択される1つまたは複数の特徴を示す、本発明1011のマウスモデル。
[本発明1015]
マウスが、前記特徴の2つまたはそれより多くを示す、本発明1014のマウスモデル。
[本発明1016]
マウスが、前記特徴の3つまたはそれより多くを示す、本発明1014のマウスモデル。
[本発明1017]
Rag2における2個のヌル変異；
IL2RGにおける2個のヌル変異；
マウスM-CSF遺伝子のプロモーターに機能的に連結された、ヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列；
ヒト造血細胞；および
ヒト病原体による感染症
を含む、ヒト病原体のマウスモデル。
[本発明1018]
前記病原体がウイルス、真菌、および細菌から選択される、本発明1017のマウスモデル。
[本発明1019]
前記細菌がマイコバクテリウム（mycobacterium）または腸内細菌である、本発明1018のマウスモデル。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１Ａ】骨髄間葉間質細胞に関して、以下を図解する：M-CSFの発現；M-CSFm/mおよびM-CSFh/hから表記の臓器を単離して、RNAを抽出して、マウスM-CSF（上）、またはヒトM-CSF（中央）特異的プライマーのいずれかを用いて、逆転写（RT）-PCR分析を行った；HPRTレベル（下）をcDNA投入量に関する対照として用いた；データは2回の独立した実験の代表である。
【図１Ｂ】骨髄間葉間質細胞に関して、以下を図解する：M-CSFh/mから表記の臓器を単離して、RNAを抽出し、マウスM-CSF（上）またはヒトM-CSF（下）特異的プライマーのいずれかを用いてRT-PCR分析を行った。マウス肝臓またはヒト胎児肝臓のいずれかから抽出されたRNAをそれぞれ、マウスおよびヒトプライマー対に関する陽性対照として、RTなし、および鋳型なしのPCR反応を陰性対照とした。データは2回の独立した実験の代表である。
【図１Ｃ】骨髄間葉間質細胞に関して、以下を図解する：M-CSFm/m、M-CSFm/h、およびM-CSFh/hマウスからの骨関連間質細胞を単離して、インビトロで10日間培養して、細胞を溶解し、RNAを抽出して、マウスM-CSF（白）またはヒトM-CSF（黒）特異的プライマーのいずれかを用いてリアルタイムPCR分析を行った。1試料当たり2個ずつ測定した平均値を示す；誤差のバーは±SEMを示し；cDNA投入量を、HPRT（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）発現レベルに従って標準化した；データは2回の独立した実験の代表である。
【図１Ｄ】骨髄間葉間質細胞に関して、以下を図解する：M-CSFm/m、M-CSFm/h、およびM-CSFh/hマウスからの骨関連間質細胞を単離して、インビトロで10日間培養した；細胞培養上清を採取して、分泌されたマウス（白）およびヒト（黒）M-CSFレベルを、種特異的M-CSF ELISAキットを用いて定量した；1試料当たり3個ずつ測定した平均値を示す；誤差のバーは±SEMを示す；データは2回の独立した実験の代表である。
【図１Ｅ】骨髄間葉間質細胞に関して、以下を図解する：M-CSFm/m、M-CSFh/m、およびM-CSFh/hマウスから血液を採取して、ヒトおよびマウスM-CSFの血清レベルをELISAによって定量した。1試料当たり3個ずつ測定した平均値を示す。誤差のバーは、±SEMを示す。
【図２Ａ】M-CSFm/m、M-CSFm/h、およびM-CSFh/hマウスの骨髄（BM）細胞の絶対数を、動物（2つの脛骨および腓骨）当たりの平均値として図解する；各群は4週齢のn＝5匹のマウスを含む；誤差のバーは、±SEMを示す；データは3回の独立した実験の代表である。
【図２Ｂ】Gr1およびCD11b抗体によって染色したM-CSFm/m、M-CSFm/h、およびM-CSFh/hマウスのBM（上）、脾臓（中央）、および末梢血（PB）の染色された単細胞浮遊液のフローサイトメトリー分析を図解する。
【図２Ｃ】F4/80およびCD11b抗体によって染色したM-CSFm/m、M-CSFm/h、およびM-CSFh/hマウスのBM（上）、および脾臓（中央）の染色された単細胞浮遊液のフローサイトメトリー分析を図解する。
【図２Ｄ】単離して、組み換え型マウスM-CSF（左）またはヒトM-CSF（右）のいずれかの存在下で7日間培養したBM細胞のフローサイトメトリー分析を図解する；細胞をF4/80およびCD11b抗体によって染色した。
【図２Ｅ】単離して、組み換え型マウスM-CSF（黒）またはヒトM-CSF（白）のいずれかの存在下で7日間培養したBM細胞のフローサイトメトリー分析を図解する；細胞を表記の表面マーカーによって染色した。
【図３Ａ】ヒトCD34+細胞を生着させたM-CSFm/m、M-CSFm/h、およびM-CSFh/hマウスのBM（上）、脾臓（中央）、および末梢血（PB）の単細胞浮遊液のフローサイトメトリー分析を図解する；染色はCD45、CD14、およびCD33ヒト抗体によって行う；ヒトCD45+である細胞を予めゲーティングして、CD14およびCD33発現に基づいて識別した。
【図３Ｂ】BM（上）、脾臓（中央）および末梢血（PB）のヒトCD45+CD14+CD33+細胞の相対出現率を図解する；BM細胞の絶対数を動物（2つの脛骨および腓骨）当たりの平均値として決定して、末梢血の絶対数を血液量1 ml当たりで決定した；各群は、n＝20匹のマウスを含む；各記号は個々のマウスを表し、水平のバーは平均値を示し；データは5回の独立した実験の代表である。
【図３Ｃ】BM（上）、脾臓（中央）および末梢血（PB）のヒトCD45+CD14+CD33+細胞の絶対出現率を図解する；BM細胞の絶対数を動物（2つの脛骨および腓骨）当たりの平均値として決定して、末梢血の絶対数を血液量1 ml当たりで決定した；各群はn＝20匹のマウスを含む；各記号は個々のマウスを表し、水平のバーは平均値を示し；データは5回の独立した実験の代表である。
【図４Ａ】ヒトCD34+細胞を生着させて、移植後12、16、および20週目に採血を行ったM-CSFm/m、M-CSFm/h、およびM-CSFh/hマウスの染色細胞のフローサイトメトリー分析を図解する；細胞をCD45、CD14、およびCD33ヒト抗体によって染色した。ヒトCD45+である細胞を予めゲーティングして、CD14およびCD33発現に基づいて識別した。
【図４Ｂ】ヒトCD45+CD14+CD33+細胞の相対出現率を図解する；各群はn＝10匹のマウスを含む；各記号は個々のマウスを表し、水平のバーは平均値を示す；データは3回の独立した実験の代表である。
【図５】ヒトCD34+細胞を生着させて、移植後12週目にマウスを屠殺してPBSによって還流したM-CSFm/m、M-CSFm/h、およびM-CSFh/hマウスのフローサイトメトリーの結果の分析を図解する；肝臓（A）、肺（B）および皮膚（C）を採取して、単細胞浮遊液を調製した；腹腔細胞（D）を、PBSを用いた吸引によって採取して；細胞をヒトCD45、CD14、およびCD33抗体によって染色して、フローサイトメトリーによって分析した；各記号は個々のマウスを表し、水平のバーは平均値を示し；データは3回の独立した実験の代表である。
【図６Ａ】LPS刺激の結果を図解する。M-CSFm/mおよびM-CSFm/hマウスにヒトCD34+細胞を生着させて、移植後12週目にLPSをi.p.注射して、48時間後にマウスを屠殺して、脾臓におけるヒトCD45+CD14+CD33+細胞の出現率を決定した；PBS注射マウスを対照とした；各記号は個々のマウスを表し、水平のバーは、平均値を示す。
【図６Ｂ】LPS刺激の結果を図解する。M-CSFm/mおよびM-CSFm/hマウスにヒトCD34+細胞を生着させて、移植後12週目にLPSをi.p.注射した。6時間後、マウスから採血して、ヒト（右）およびマウス（左）IL-6およびTNFαの血清中レベルをELISAによって定量した。PBS注射マウスを対照とした；1試料当たり3個ずつ測定した平均値を示し、誤差のバーは±SEMを示す。
【図６Ｃ】LPS刺激の結果を図解する。M-CSFm/mおよびM-CSFm/hマウスにヒトCD34+細胞を生着させて、移植後12週目にLPSをi.p.注射した。6時間後、マウスから採血して、ヒト（右）およびマウス（左）IL-6およびTNFαの血清中レベルをELISAによって定量した。PBS注射マウスを対照とした；1試料当たり3個ずつ測定した平均値を示し、誤差のバーは±SEMを示す。
【図７Ａ】図7A（hTNFα）は、LPS刺激後に単球／マクロファージがインビトロで炎症誘発性サイトカインを分泌する能力を図解する。ヒトCD34+細胞を生着させたM-CSFm/mおよびM-CSFh/hマウスの脾臓のヒトCD45+CD14+CD33+細胞を、移植後12週目に単離した；胎児肝臓から得たヒトCD45+CD14+CD33+細胞を対照とした；細胞をインビトロでLPSによって24時間または48時間刺激して、細胞培養上清を採取し、ヒトTNFα（A）およびIL-6（B）レベルをELISAによって定量した。1試料当たり3個ずつ測定した平均値を示す；誤差のバーは±SEMを示す。
【図７Ｂ】図7B（hIL-6）は、LPS刺激後に単球／マクロファージがインビトロで炎症誘発性サイトカインを分泌する能力を図解する。ヒトCD34+細胞を生着させたM-CSFm/mおよびM-CSFh/hマウスの脾臓のヒトCD45+CD14+CD33+細胞を、移植後12週目に単離した；胎児肝臓から得たヒトCD45+CD14+CD33+細胞を対照とした；細胞をインビトロでLPSによって24時間または48時間刺激して、細胞培養上清を採取し、ヒトTNFα（A）およびIL-6（B）レベルをELISAによって定量した。1試料当たり3個ずつ測定した平均値を示す；誤差のバーは±SEMを示す。
【図７Ｃ】poly I:C刺激に反応したインターフェロン-αおよび-βmRNAのレベルを図解する。ヒトCD45+CD14+CD33+細胞をpoly I:Cによって6時間または12時間刺激して、IFNα（左）およびIFNβ（右）mRNAレベルをリアルタイムPCRによって定量した；1試料当たり2個ずつ測定した平均値を示す；誤差のバーは、±SEMを示す。
【図７Ｄ】細胞生着マウスからの細胞の貪食、遊走、および活性化特性を図解する。ヒトCD45+CD14+CD33+細胞をヒト化マウスから単離して、FITC標識細菌と共に37℃で30分または60分間インキュベートして、フローサイトメトリーによって測定した；氷中でFITC標識細菌と共にインキュベートした細胞を対照とした。白色のヒストグラムはM-CSFm/mマウスの細胞を表し、点付きのヒストグラムはM-CSFh/hマウスの細胞を表し、および黒色のヒストグラムは、ヒト胎児肝臓の細胞を表す。
【図７Ｅ】MIP3βに反応した細胞の走化性を図解する。M-CSFm/mマウス、M-CSFh/hマウス、およびヒト胎児肝臓から単離したヒトCD45+CD14+CD33+細胞を上部のウェルに入れて、MIP3βを含む培地を下部のウェルに入れた；細胞を30分または60分間インキュベートして、上部のウェルから下部のウェルへと遊走した細胞数を計算してプロットした。1試料当たり2個ずつ測定した平均値を示す；誤差のバーは±SEMを示す。
【図７Ｆ】インビトロLPS刺激後のhCD40、hCD80、hCD86、およびhHLA-DRのアップレギュレーションに基づく、細胞生着マウスからのヒト単球／マクロファージの活性化の増強を図解する。M-CSFm/mマウス、M-CSFh/hマウス、およびヒト胎児肝臓から単離したヒトCD45+CD14+CD33+細胞をLPSの存在下または非存在下で培養した；刺激後24時間目に、細胞を表記の表面マーカーによって染色して、フローサイトメトリーによって測定した。白色のヒストグラムはM-CSFm/mマウスの細胞を表し、点付きのヒストグラムはM-CSFh/hマウスの細胞を表し、および黒色のヒストグラムは、ヒト胎児肝臓の細胞を表す。
【図８】エキソン1〜9の相対位置を示すマウスM-CSF座、およびヒトM-CSF遺伝子と共に最終標的対立遺伝子の概略図を提供する。
【図９】図9A〜Bは、M-CSFm/m、M-CSFh/m、およびM-CSFh/hマウスにおけるHSC区画および骨髄前駆細胞区画の出現率を図解する。M-CSFm/m、M-CSFm/h、およびM-CSFh/hマウスのBM細胞を、lineage、c-Kit、Sca1、CD150、CD48、CD16/32、およびCD34抗体によって染色して、フローサイトメトリーによって分析した。（A）Lineage-細胞（上）をゲーティングして、Sca1およびc-Kit発現（中央）に基づいて識別した。Lineage-Sca1+c-Kit+（LSK）細胞をゲーティングして、CD150およびCD48発現（下）に基づいてさらに識別した。（B）Lineage-細胞を予めゲーティングして、Sca1およびc-Kit発現（上）に基づいて識別した。Lineage-c-Kit+Sca1-細胞をゲーティングして、CD16/32およびCD34発現に基づいてさらに識別した。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
詳細な説明
本発明の方法および組成物を説明する前に、記述される特定の方法または組成物は当然変化しうることから、本発明は、それらに限定されないと理解すべきである。同様に、本明細書において用いられる用語は、特定の態様を説明する目的に限られ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることから、制限的であると意図されないと理解すべきである。
【００６１】
それ以外であると定義している場合を除き、本明細書において用いられる全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において記述される方法および材料と類似または同等のいかなる方法および材料も、本発明の実践または試験において用いることができるが、特定の方法および材料をここに記述する。本明細書において言及した刊行物は全て、刊行物が引用される内容に関連して方法および／または材料を開示および記述するために、参照により本明細書に組み入れられる。矛盾がある場合には、本開示が、組み入れられた刊行物のいかなる開示にも取って代わると理解される。
【００６２】
本開示を読むことによって当業者に明らかであるように、本明細書において記述され図解される個々の態様の各々は、他のいくつかの態様のいずれかの特色から容易に分離されうるまたは特色と容易に組み合わせられうる別個の成分および特色を有し、それらも本発明の範囲または精神に含まれる。引用されたいかなる方法も、引用された事象の順序で、または論理的に可能である任意の他の順序で行うことができる。
【００６３】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その」は、本文がそれ以外であることを明らかに示している場合を除き、複数形を含む。このように、たとえば、「1つの細胞」という言及は、そのような細胞の複数を含み、「ペプチド」という言及は、当業者に公知である1つまたは複数のペプチドおよびその同等物、たとえばポリペプチド等に対する言及等を含む。
【００６４】
本明細書において考察された刊行物は、本出願の提出日以前に単にその開示がなされたために提供される。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明に基づいてそのような刊行物の日付を早める権利がないと自認したととるべきではない。
【００６５】
ヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子改変マウスが提供される。同様に、ヒト造血細胞等のヒト細胞が生着しているヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子改変マウス、およびそのような細胞生着マウスを作製する方法が提供される。これらのマウスは、ヒトの免疫疾患および病原体感染症のモデル作製；たとえば健康な状態または疾患状態で造血細胞の発達および／または活性を調整する物質に関するインビボスクリーニング；造血細胞に対して毒性である物質に関するインビボスクリーニング；造血細胞に及ぼす毒性物質の毒性効果を防ぐ、軽減する、または逆転させる物質に関するインビボスクリーニング；疾患治療に対する個体の反応性を予測するために個体からのヒト造血細胞のインビボスクリーニング等の、多数の応用において有用である。
【００６６】
ヒト化M-CSFマウス
本発明のいくつかの局面において、ヒト化M-CSFマウスが提供される。ヒト化M-CSFマウスまたは「hM-CSFマウス」とは、ヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列を含むマウスを意味する。ヒトM-CSFタンパク質とは、ヒトM-CSFであるタンパク質、またはヒトM-CSFと実質的に同一である、たとえばヒトM-CSFと80％もしくはそれ以上同一である、85％もしくはそれ以上同一である、90％もしくはそれ以上同一である、または95％もしくはそれ以上同一である、たとえばヒトM-CSFと97％、98％、または99％同一であるタンパク質を意味する。それゆえ、ヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列は、ヒトM-CSFタンパク質、すなわちヒトM-CSFまたはヒトM-CSFと実質的に同一であるタンパク質のコード配列を含むポリヌクレオチドである。M-CSF（同様にCSF-1、「コロニー刺激因子1」としても知られる）は、マクロファージの産生、分化、および機能を制御するサイトカインである。ヒトM-CSFのポリペプチド配列およびヒトM-CSFをコードする核酸配列は、Genbankアクセッション番号NM_000757.5（変種1）、NM_172210.2（変種2）、およびNM_172212.2（変種4）において見いだされうる。ヒトM-CSFタンパク質をコードするゲノム座は、ヒトゲノムにおいて1番染色体；NC_000001 .10（110453233-110472355）において見いだされうる。タンパク質配列は、この座でエキソン1から8によってコードされるが、エキソン9は、非翻訳配列を含む。そのため、ヒトM-CSFのコード配列を含む核酸配列は、ヒトM-CSF遺伝子のエキソン1〜8の1つまたは複数を含む。いくつかの例において、核酸配列はまた、ヒトM-CSFのゲノム座の局面、たとえばイントロン、3'および／または5'非翻訳配列（UTR）を含む。いくつかの例において、核酸配列は、ヒトM-CSFゲノム座の全領域を含む。いくつかの例において、核酸配列は、ヒトM-CSFゲノム座のエキソン2から非コードエキソン9の633ヌクレオチド下流までを含む。
【００６７】
本出願のヒト化M-CSFマウスにおいて、ヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列は、マウスM-CSF遺伝子の1つまたは複数の調節配列に機能的に連結されている。マウスM-CSF調節配列は、マウスM-CSF発現を調節するマウスM-CSFゲノム座の配列、たとえば5'調節配列、たとえばM-CSFプロモーター、M-CSF 5'非翻訳領域（UTR）等；3'調節配列、たとえば3' UTR；およびエンハンサー等である。マウスM-CSFは、3番染色体上の約107,543,966〜107,563,387番目の位置に存在し、マウスM-CSFコード配列は、Genbankアクセッション番号NM_007778.4（イソ型1）、NM_001113529.1（イソ型2）、およびNM_001113530.1（イソ型3）において見いだされうる。マウスM-CSFの調節配列は、当技術分野において明確に定義されており、インシリコ法を用いて、たとえばワールドワイドウェブ上のgenome.ucsc.eduでのUCSCゲノムブラウザにおいて上記のGenbankアクセッション番号を参照することによって、または以下に記述され、および当技術分野において記述される実験法によって、たとえばその開示が参照により本明細書に組み入れられる、Abboud et al. (2003) Analysis of the Mouse CSF-1 Gene Promoter in a Transgenic Mouse Model. J. Histochemistry and Cytochemistry 51 (7):941-949に記述される実験法によって、容易に同定されうる。いくつかの例において、たとえばヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列がマウスM-CSFゲノム座に存在する場合、ヒトCSFコード配列に機能的に連結する調節配列は、マウスゲノムに対して内因性であるかまたは本来であり、すなわち、それらはヒト核酸配列を組み入れる以前からマウスゲノムに存在した。
【００６８】
いくつかの例において、ヒト化M-CSFマウスは、ヒトM-CSFタンパク質またはその断片をコードするヒト核酸配列、すなわち「ヒトM-CSF核酸配列」または「ヒトM-CSF配列」のゲノムへのランダム組み込み、または挿入によって作製される。典型的に、そのような態様において、ヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列のゲノムでの位置は不明である。他の例において、ヒト化M-CSFマウスは、たとえば相同組み換えによる、ヒトM-CSF核酸配列のゲノムへの標的化組み込みまたは挿入によって作製される。相同組み換えにおいて、ポリヌクレオチドは、宿主ゲノム材料、たとえばゲノム材料の50塩基対（bp）もしくはそれ以上、100 bpもしくはそれ以上、200 bpもしくはそれ以上、500 bpもしくはそれ以上、1 kBもしくはそれ以上、2 kBもしくはそれ以上、5 kBもしくはそれ以上、10 kBもしくはそれ以上、15 kBもしくはそれ以上、20 kBもしくはそれ以上、または50 kBもしくはそれ以上を標的座から同時に除去しながら、標的座の宿主ゲノムに挿入される。そのため、たとえばヒトM-CSF核酸配列をマウスM-CSF座へと標的化することによって作製されたヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列を含むヒト化M-CSFマウスにおいて、ヒトM-CSF核酸配列は、M-CSF座でマウス配列、たとえばエキソンおよび／またはイントロンのいくつかまたは全てを交換しうる。いくつかのそのような例において、ヒトM-CSF核酸配列は、ヒトM-CSF配列の発現が、マウスM-CSF座で、本来のまたは内因性の調節配列によって調節されるように、マウスM-CSF座に組み入れられる。言い換えれば、ヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列が機能的に連結されている調節配列は、マウスM-CSF座での本来のM-CSF調節配列である。
【００６９】
いくつかの例において、ヒトM-CSF配列の組み込みは、ヒトM-CSF配列が組み入れられる遺伝子の転写に影響を及ぼさない。たとえば、ヒトM-CSF配列がインテインとしてコード配列に組み入れられる場合、またはヒトM-CSF配列が2Aペプチドを含む場合、ヒトM-CSF配列は、ヒトM-CSF配列が組み入れられた遺伝子と同時に転写および翻訳されるであろう。他の例において、ヒトM-CSF配列の組み込みは、ヒトM-CSF配列が組み入れられる遺伝子の転写を中断する。たとえば、相同組み換えによってヒトM-CSF配列が組み入れられると、ヒトM-CSF配列がその代わりに転写されるように、組み込み座でのコード配列のいくつかまたは全てが除去されうる。いくつかのそのような例において、ヒトM-CSF配列の組み込みは、ヌル変異を作製し、そのためヌル対立遺伝子を作製する。ヌル対立遺伝子は、その遺伝子の正常な機能を完全に欠如している遺伝子の変異体コピーである。これは、分子レベルで遺伝子産物（タンパク質、RNA）が完全に存在しないか、または非機能的遺伝子産物が発現された結果でありうる。表現型レベルでは、ヌル対立遺伝子は、座全体の欠失と識別することができない。
【００７０】
いくつかの例において、ヒト化M-CSFマウスは、ヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列1コピーを含む。たとえば、マウスは、核酸配列に関してヘテロ接合でありうる。言い換えれば、座における1つの対立遺伝子は核酸配列を含むが、他の対立遺伝子は内因性の対立遺伝子であろう。たとえば、先に考察したように、いくつかの例において、ヒトM-CSF核酸配列は、それがマウスM-CSFに関してヌル対立遺伝子を作製するように、マウスM-CSF座に組み入れられる。いくつかのそのような態様において、ヒト化M-CSFマウスは、コードする核酸配列に関してヘテロ接合でありえて、すなわちヒト化M-CSFマウスは、マウスM-CSFに関する1つのヌル対立遺伝子（核酸配列を含む対立遺伝子）と1つの内因性のM-CSF対立遺伝子（野生型またはそれ以外）とを含む。言い換えれば、マウスは、M-CSFh/mマウスであり、ここで「h」はヒト配列を含む対立遺伝子を表し、「m」は内因性の対立遺伝子を表す。他の例において、ヒト化M-CSFは、ヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸配列を2コピー含む。たとえば、マウスは核酸配列に関してホモ接合でありえて、すなわち二倍体ゲノムにおける座の両方の対立遺伝子が核酸配列を含み、すなわちヒト化M-CSFマウスは、マウスM-CSFに関して2つのヌル対立遺伝子（核酸配列を含む対立遺伝子）を含む。言い換えれば、マウスはM-CSFh/hマウスである。
【００７１】
特に、ヒト化M-CSFマウス、たとえば上記のマウス等の、たとえばM-CSFh/hおよびM-CSFh/mマウスは、マクロファージおよび単球、ならびにマクロファージ系列の細胞から発達する組織、たとえば骨、の正常なまたは野生型の発達および機能を示す。たとえば、ヒト化マウスは、正常な歯および骨特性を示すと共に正常な骨髄含有量、骨髄、脾臓および末梢血における骨髄細胞出現率、ならびに骨髄および脾臓におけるマクロファージ出現率を示す。
【００７２】
いくつかの例において、ヒト化M-CSFマウスは、他の遺伝子改変を含む。たとえば、ヒト化M-CSFマウスは、Rag2遺伝子（「組み換え活性化遺伝子2」、このコード配列はGenbankアクセッション番号1.NM_009020.3において見いだされうる）に関して少なくとも1つのヌル対立遺伝子を含みうる。いくつかの態様において、ヒト化M-CSFマウスは、Rag2に関して2つのヌル対立遺伝子を含む。言い換えれば、ヒト化M-CSFマウスは、Rag2に関してホモ接合ヌルである。もう1つの例として、ヒト化M-CSFマウスは、IL2rg遺伝子（「インターロイキン2受容体、γ」、共通γ鎖またはγCとしても知られ、そのコード配列はGenbankアクセッション番号1.NM_013563.3において見いだされうる）に関して少なくとも1つのヌル対立遺伝子を含む。いくつかの態様において、ヒト化M-CSFマウスは、IL2rgに関して2つのヌル対立遺伝子を含む。言い換えれば、ヒト化M-CSFマウスは、IL2rgに関してホモ接合ヌルである。いくつかの態様において、マウスは、Rag2およびIL2rgの両方に関するヌル対立遺伝子を含み、すなわちマウスはRag2-/-IL2RG-/-である。他の遺伝子改変も同様に企図される。たとえば、ヒト化M-CSFマウスは、造血細胞および免疫系の発達および／または機能に関連する他の遺伝子において改変、たとえば1つまたは他のマウス遺伝子と、ヒトオルトログをコードする核酸配列との交換を含みうる。さらにもしくはまたは、ヒト化M-CSFマウスは、他の細胞および組織の発達および／または機能に関連する遺伝子、たとえばヒトの障害もしくは疾患に関連する遺伝子、またはマウスにおいて改変されるとヒトの障害および疾患のマウスモデルを提供する遺伝子において改変を含みうる。
【００７３】
本発明のいくつかの局面において、ヒト化M-CSFマウス、たとえばRag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスまたは致死下量の放射線を照射したhM-CSFマウスは、細胞が生着している、または細胞を移植されている。細胞は、分裂細胞または分裂後細胞でありえて、多能性幹細胞、たとえばES細胞、iPS細胞、および胚幹細胞、ならびに体細胞、たとえば線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、血管内皮細胞、腸管細胞、およびその他、ならびにそれらの系列拘束前駆細胞および前駆体等の関心対象の細胞を含みうる。特定の関心対象の細胞集団には、ヒト化M-CSFマウスの造血系に貢献するまたは造血系を再構成する造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団、たとえば末梢血白血球、胎児肝細胞、胎児骨、胎児胸腺、胎児リンパ節、血管形成皮膚、動脈セグメント、および精製造血幹細胞、たとえば動員されたHSC、または臍帯血HSCが挙げられる。細胞は、任意の哺乳動物種、たとえばマウス、齧歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、霊長類、ヒト等に由来しうる。細胞は確立された細胞株に由来しうる、または細胞は初代培養細胞であってもよく、「初代培養細胞」、「初代培養細胞株」、および「初代培養物」は、本明細書において、対象に由来しており、インビトロで制限された回数の継代、すなわち培養物の分割で生育させた細胞および細胞培養物を意味するために互換的に用いられる。たとえば、初代培養物は、0回、1回、2回、4回、5回、10回、または15回継代されていてもよいが、クライシス段階を経験するほどの回数は継代されていない培養物である。典型的に、本発明の初代培養細胞株は、インビトロで10回より少ない継代で維持される。
【００７４】
細胞が初代培養細胞である場合、それらは、任意の都合のよい方法によって個体から採取されうる。たとえば、細胞、たとえば血球、たとえば白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離等によって採取されうる。もう1つの例として、細胞、たとえば皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸管、胃組織等は生検によって採取されうる。採取した細胞の分散液または懸濁液に関して適切な溶液が用いられうる。そのような溶液は一般的に、緩衝塩類溶液、たとえば生理食塩液、PBS、ハンクス緩衝塩類溶液等であり、都合よくは、低濃度、一般的に5〜25 mMの許容される緩衝液と共に、ウシ胎児血清または他の天然に存在する因子が添加されるであろう。都合のよい緩衝液には、HEPES、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等が挙げられる。
【００７５】
いくつかの例において、不均一な細胞集団は、ヒト化マウスに移植されるであろう。他の例において、特定の細胞タイプ、たとえば前駆細胞、たとえば造血前駆細胞に関して濃縮された細胞集団が、ヒト化マウスに生着するであろう。関心対象の細胞集団の濃縮は、任意の都合のよい分離技術によって行われうる。たとえば、関心対象細胞は、培養法によって濃縮されうる。そのような培養法において、他の細胞集団に対して1つの細胞集団の生存および／または増殖を促進する特定の増殖因子および栄養素が、典型的に培養物に添加される。生存および／または増殖に影響を及ぼす他の培養条件には、接着または非接着基質上での生育、特定の長さの期間での培養等が挙げられる。そのような培養条件は当技術分野において周知である。もう1つの例として、関心対象細胞は、アフィニティ分離技術による当初の集団からの関心対象細胞の分離によって濃縮されうる。アフィニティ分離のための技術には、アフィニティ試薬によってコーティングした磁気ビーズを用いる磁気分離、アフィニティクロマトグラフィー、固相マトリクス、たとえばプレートに付着させたアフィニティ試薬による「パンニング」、アフィニティ試薬に結合させたまたはアフィニティ試薬と共に用いられる細胞障害剤、たとえば補体および細胞毒素、または他の簡便な技術が挙げられる。正確な分離を提供する技術には、多数のカラーチャンネル、低角鈍角光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネル等の様々な精巧度を有することができる蛍光活性化セルソーターが挙げられる。細胞は、死細胞に関連する色素（たとえば、ヨウ化プロピジウム）を用いることによって死細胞に対して選択されうる。関心対象細胞の生存率に不当に有害でない任意の技術が用いられうる。
【００７６】
たとえば、アフィニティ分離技術を用いて、移植のための関心対象細胞ではない細胞は、関心対象細胞において発現されないマーカーを特異的に認識して選択的に結合するアフィニティ試薬を集団に接触させることによって、集団から枯渇されうる。たとえば、造血前駆細胞の集団を濃縮するために、成熟造血細胞マーカーを発現する細胞を枯渇させてもよい。さらにもしくはまたは、造血前駆細胞に関連するマーカー、たとえばCD34、CD133等を特異的に認識して選択的に結合するアフィニティ試薬を集団に接触させることを用いて、陽性選択および分離を行ってもよい。「選択的に結合する」とは、分子が、関心対象の標的に選択的に結合する、または他の分子より標的に対してより大きいアフィニティで結合することを意味する。たとえば、抗体は、特異的であるエピトープを含む分子には結合するが、無関係なエピトープには結合しない。いくつかの態様において、アフィニティ試薬は、抗体、すなわちCD34、CD133等に対して特異的な抗体でありうる。いくつかの態様において、アフィニティ試薬は、CD34、CD133等に関する特異的受容体またはリガンド、たとえばペプチドリガンドおよび受容体、エフェクターおよび受容体分子、CD34、CD133等に対して特異的なT細胞受容体等でありうる。いくつかの態様において、関心対象マーカーに対して特異的な多数のアフィニティ試薬が用いられうる。
【００７７】
アフィニティ試薬として有用である抗体およびT細胞受容体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよく、トランスジェニック動物、免疫した動物、不死化ヒトまたは動物B細胞、抗体またはT細胞受容体をコードするDNAベクターをトランスフェクトした細胞等によって産生されうる。抗体の調製の詳細および特異的結合メンバーとして用いるためのその適切性は当業者に周知である。特に重要であるのは、アフィニティ試薬としての標識抗体の使用である。都合よくは、これらの抗体は分離のために用いるために標識に結合される。標識には、直接分離を可能にする磁気ビーズ；支持体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンによって除去することができるビオチン；蛍光活性化セルソーターと共に用いることができる蛍光色素；または特定の細胞タイプの分離を容易にするその他の標識が挙げられる。有用な蛍光色素には、フィコビリタンパク質、たとえばフィコエリスリンおよびアロフィコシアニン、フルオレセイン、およびテキサスレッドが挙げられる。しばしば、各々の抗体は、各マーカーに関して独立したソーティングが可能となるように、異なる蛍光色素によって標識される。
【００７８】
最初の細胞集団をアフィニティ試薬に接触させて、利用できる細胞表面抗原に結合させるために十分な期間インキュベートする。インキュベーションは通常、少なくとも約5分であり、通常約60分未満であろう。抗体の不足によって分離効率が制限されないように、反応混合物中に十分な濃度の抗体を有することが望ましい。適切な濃度は滴定によって決定されるが、典型的に細胞浮遊液の体積に対して約1：50（すなわち、抗体1に対して反応体積50）、約1：100、約1：150、約1：200、約1：250、約1：500、約1：1000、約1：2000、または約1：5000である抗体の希釈であろう。細胞を浮遊させる培地は、細胞の生存を維持する任意の培地であろう。好ましい培地は、0.1から0.5％BSAまたは1〜4％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩液である。しばしばウシ胎児血清、BSA、HSA、ヤギ血清等が添加される、ダルベッコ改変イーグル培地（dMEM）、ハンクス緩衝塩類溶液（HBSS）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（dPBS）、RPMI、イスコブ培地、5mM EDTAを有するPBS等を含む様々な培地が市販されており、細胞の性質に応じて用いられうる。
【００７９】
アフィニティ試薬によって標識された接触させた集団における細胞を、任意の都合のよいアフィニティ分離技術、たとえば先に記述した技術または当技術分野において公知の技術によって選択する。分離後、分離した細胞は、通常、採取管の底に血清のクッションを入れた、細胞の生存率を維持する任意の適切な培地中に採取されうる。しばしばウシ胎児血清が添加される、dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、イスコブ培地等を含む様々な培地が市販されており、細胞の性質に従って用いられうる。
【００８０】
関心対象細胞タイプ、たとえば造血細胞に関して高度に濃縮された組成物は、このようにして得られる。細胞は、細胞組成物の約70％、約75％、約80％、約85％、約90％またはそれ以上、濃縮細胞組成物の約95％またはそれ以上であり、好ましくは濃縮細胞組成物の約95％またはそれ以上であろう。言い換えれば、組成物は、関心対象細胞の実質的に純粋な組成物であろう。
【００８１】
ヒト化M-CSFマウスに移植される細胞は、それらが不均一な細胞集団であれ、濃縮された細胞集団であれ、直ちに移植してもよい。または、細胞を、液体窒素温度で凍結して、長期間保存してもよく、融解し再利用することができる。そのような場合、細胞は通常、10％DMSO、50％血清、40％緩衝培地、またはそのような凍結温度で細胞を保存するために当技術分野において一般的に用いられる他のいくつかのそのような溶液中で凍結されて、凍結した培養細胞を融解するために当技術分野において一般的に公知の様式で融解される。さらにもしくはまたは、細胞は、様々な培養条件でインビトロで培養されうる。培養培地は、液体であってもよく、またはたとえば寒天、メチルセルロース等を含む半固体であってもよい。細胞集団は、通常、ウシ胎児血清（約5〜10％）、L-グルタミン、チオール、特に2-メルカプトエタノール、および抗生物質、たとえばペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した、イスコブ改変DMEMまたはRPMI 1640等の適切な栄養培地に都合よく浮遊させてもよい。培養物は、それに対して細胞が反応する増殖因子を含みうる。本明細書において定義される増殖因子は、膜貫通受容体に対する特異的効果を通して、培養物または無傷の組織において細胞の生存、生育、および／または分化を促進することができる分子である。増殖因子には、ポリペプチドおよび非ポリペプチド因子が挙げられる。
【００８２】
細胞は、たとえば選択可能なもしくは追跡可能なマーカーを提供するために、細胞における遺伝子欠損を誘導するために（たとえば、疾患のモデリングのために）、遺伝子欠損を修復するために、または細胞において遺伝子を異所発現させる等のために（たとえば、そのような改変が疾患の経過に影響を及ぼすか否かを決定するために）、ヒト化M-CSFマウスに移植される前に遺伝子改変されうる。細胞は、適したベクターによるトランスフェクションまたは形質導入、相同組み換え、または細胞が関心対象遺伝子を発現するように他の適切な技術、または望ましくない遺伝子の発現を遮断するためにアンチセンスmRNA、siRNA、またはリボザイムによって遺伝子改変されうる。核酸を標的細胞に導入するために、様々な技術が当技術分野において公知である。遺伝子改変細胞を有することを証明するために、様々な技術が用いられうる。細胞のゲノムを、制限酵素によって消化して、増幅してまたは増幅せずに用いてもよい。ポリメラーゼ連鎖反応；ゲル電気泳動；制限酵素分析；サザン、ノザン、およびウェスタンブロット；シークエンシング；またはその他を全て用いてもよい。本出願において開示されるこれらおよび他の目的に関する分子細胞生化学における一般的な方法は、その開示が参照により本明細書に組み入れられる、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001 ); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); and Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)等の標準的なテキストにおいて見いだすことができる。本開示において言及された遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、およびキットは、BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich、およびClonTech等の販売元から入手可能である。
【００８３】
細胞は、たとえば肝臓内注射、尾静脈注射、後眼窩注射およびその他を含む任意の都合のよい方法によってヒト化M-CSFマウスに移植されうる。典型的に、多能性または前駆細胞約0.5×105〜2×106個が移植され、たとえば細胞約1×105個〜1×106個、または細胞約2×105個〜5×105個が移植される。いくつかの例において、マウスは、ヒト細胞を移植する前に、致死下量の放射線を照射される。言い換えれば、マウスは、たとえば以下の実施例の章に記述されるように、および当技術分野において周知であるように、致死下量の放射線に曝露される。次に、細胞生着ヒト化M-CSFマウスを、生着細胞によって免疫系が十分に再構築されるように、実験動物飼育条件で少なくとも1週間、たとえば1週間もしくはそれ以上、または2週間もしくはそれ以上、時に4週間もしくはそれ以上、およびいくつかの例において、6週間もしくはそれ以上維持する。
【００８４】
以下の実施例の章で証明されるように、ヒト化M-CSFマウスは、この目的のために開発されている他のマウス系統および他のM-CSFトランスジェニックマウスと比較して、ヒト造血細胞を生着させて維持する能力が有意に増加していることを証明する。たとえば、ヒト胎児肝臓由来造血幹細胞および前駆細胞（CD34+）を新生仔マウスに肝臓内移入すると、骨髄、脾臓、末梢血、肺、肝臓、および腹腔においてヒト単球／マクロファージのより効率的な分化および増強された出現率が得られる。ヒトCD14+CD33+細胞の有意な比率が16〜20週目で観察される。具体的に、造血細胞を生着させたヒト化M-CSFマウスは、以下の特徴の1つまたは複数、いくつかの例において2つまたはそれ以上、いくつかの例において3つまたはそれ以上、いくつかの例において4つまたはそれ以上、いくつかの例において以下の特徴の全てを証明する：マウスは、骨髄、脾臓、血液、肝臓、脳、肺、精巣、および腎臓においてヒトM-CSFを、野生型マウスにおけるマウスM-CSFの発現と同等のレベルで発現し；hM-CSFを発現しない細胞生着マウスにおけるhCD14+CD33+より2倍から6倍高い脾臓のhCD14+CD33+細胞出現率を示し；hM-CSFを発現しない細胞生着マウスにおけるhCD14+CD33+より2倍から8倍高い末梢血のhCD14+CD33+細胞出現率を示し；hCD14+CD33+単球／マクロファージ系列細胞の約15％から約40％の血中レベルを示し；約20週齢でhCD14+CD33+単球／マクロファージ系列細胞の約5から約15％の血中レベルを示し；ヒトM-CSFを欠如しているマウスより肝臓においてhCD14+CD33+細胞のパーセンテージに関して約1.5倍から約6倍大きいLPS注射反応を示し； hM-CSFを欠如している細胞生着マウスと比較して、LPS注射後約48時間で脾臓において約2倍から約5倍であるhCD14+CD33+hCD45+細胞の産生の増強を示し；LPSに反応して血清中ヒトIL-6の産生の増強を示し、LPS注射後約6時間でのhIL-6レベルは、hM-CSFを欠如している細胞生着マウスに対して約2倍から約5倍増強され；hM-CSF遺伝子を欠如している細胞生着マウスより、LPS刺激時にhTNFαに関して約2倍から約3倍高い単球および／またはマクロファージによるインビトロ分泌を示し；hM-CSF遺伝子を欠如している細胞生着マウスより、LPS刺激時にhIL-6に関して約2倍から4倍高い単球および／またはマクロファージによるインビトロ分泌を示し; hM-CSF遺伝子を欠如している細胞生着マウスより、poly I:C刺激時にhIFNαに関して約3倍から6倍高い単球および／またはマクロファージによるインビトロ分泌を示し; hM-CSF遺伝子を欠如している細胞生着マウスより、poly I:C刺激時にhIFNβに関して約2倍から3倍高い単球および／またはマクロファージによるインビトロ分泌を示し;hM-CSF遺伝子を欠如している遺伝子改変細胞生着マウスと比較して増強された貪食を示し；hM-CSF遺伝子を欠如している遺伝子改変細胞生着マウスと比較してMip3βに反応してインビトロで走化性の増強を示し；ならびにLPS刺激に反応して、ヒトCD40、ヒトCD80、ヒトCD86、ヒトHLA-DR、およびそれらの組み合わせから選択される共刺激分子のインビトロでのアップレギュレーションを示す。
【００８５】
有用性
ヒト化M-CSFマウスおよびヒト造血細胞を生着させたヒト化M-CSFマウス、たとえば細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウス、および任意で他の遺伝子改変を有するマウスは、多くの応用において有用である。たとえば、これらのマウスは、ヒト免疫疾患およびヒト病原体のモデルを作製するために有用な系を提供する。たとえば、対象マウスは、初期ヒト造血細胞、たとえばヒト造血幹細胞または前駆細胞を起源とするヒト造血細胞悪性疾患のモデルを作製するために有用である。もう1つの例として、対象マウスは、通常はマウスに感染しないヒト病原体、たとえばウイルス、真菌、および細菌を研究するために有用である。
【００８６】
通常はマウスに感染しないヒト病原体の1つのそのような例は、チフス熱の原因物質であるチフス菌である。チフス熱は、米国での年間約400例を含めて、世界中で、主に発展途上国において2100万人を超える人々に罹患している。チフス熱は、薬物アモキシシリン、アンピシリン、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、コトリモキサゾール、エルタペネム、イミペネム、フルオロキノロン（たとえば、シプロフロキサシン、ガチフロキサシン、オフロキサシン）、ストレプトマイシン、スルファジアジン、スルファメトキサゾール、テトラサイクリン、およびその併用によって処置されている。再発性の感染症が一般的であり、これらは抗生物質治療による疾患管理を制限する。さらに、多剤耐性も同様にチフス菌感染症では頻発している。
【００８７】
新しい治療、新しいワクチン、ならびに治療薬およびワクチンの効能を試験する新しい方法が必要である。たとえばチフス菌が感染することができるマウスは、新しい治療薬および新しいワクチンを同定するために有用であろう。新しい治療薬および新しいワクチンは、たとえば推定の抗チフス剤による処置に反応するマウス（血液または所定の組織における）におけるチフス菌の量を決定することによって、またはマウスに推定のワクチンを接種した後にチフス菌の感染投与量に曝露することによって、およびワクチンを接種していないがチフス菌に感染している対照と比較して、推定のワクチンの接種による感染性のいかなる変化も観察することによって、そのようなマウスにおいて試験することができるであろう。
【００８８】
ヒト造血細胞を生着させたヒト化M-CSFマウス、たとえばRag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスは、ヒト病原体、すなわち、ヒトに感染する病原体；ヒト病原体による感染症に対するヒト免疫系の応答；およびヒト病原体による感染症からの保護および／または感染症の処置における物質の有効性、を研究するために有用である。病原体はウイルス、真菌、細菌等でありうる。ウイルス病原体の非制限的な例には、ヒトまたはブタまたはトリインフルエンザウイルスが挙げられる。細菌病原体の非制限的な例には、マイコバクテリウム、たとえばヒト型結核菌、および腸内細菌、たとえばチフス菌が挙げられる。
【００８９】
たとえば、細胞生着ヒト化M-CSFマウスは、チフス菌感染症の非ヒト動物モデルとして有用である。対照的に、野生型マウス、および他の公知の免疫無防備状態のマウス（たとえば、RAG1/RAG2遺伝子ノックアウトマウス）には、チフス菌は感染することができない。先に考察したように、本明細書において記述される細胞生着ヒトM-CSFマウスは、ヒトM-CSFタンパク質を含まない細胞生着マウスと比較してヒト細胞の増強された生着を示す。この増強は、増殖性のチフス菌感染症を維持するために十分であり、すなわちチフス菌は、マウスにおいて増殖することができ、すなわち感染マウスはその細胞の1つまたは複数においてチフス菌を保有して増殖させることができる。特定の態様において、マウスは、チフス菌の初回導入または感染量の曝露後、チフス菌を少なくとも1週間、10日間、2週間、3週間、または4週間増殖させることができる。言い換えれば、マウスは、チフス菌に対する感染量の曝露後、その血液中、または少なくとも1つの組織において、少なくとも1週間、10日間、2週間、3週間、または4週間、チフス菌の力価またはレベルを維持することができる。チフス菌をマウスに感染させる、および感染症を評価する方法の例は、たとえばその開示が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2011/0200982号において見いだされうる。
【００９０】
もう1つの例として、細胞生着ヒト化M-CSFマウス、たとえば細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスは、ヒト型結核菌による感染症の非ヒト動物モデルとして有用である。ヒトM-CSFタンパク質をコードする核酸を含むマウスにおけるヒト造血細胞の生着の増強は、増殖性の結核菌感染症を維持するために十分であり、すなわち、ヒト型結核菌は、マウスにおいて増殖することができ、すなわち、感染マウスは、その細胞の1つまたは複数においてヒト型結核菌を保有して増殖させることができる。そのようないくつかの態様において、マウスは、ヒト病原性マイコバクテリウムに対する抗マイコバクテリウム免疫応答を開始し、応答は、ヒト免疫細胞によって媒介され、ヒト免疫細胞を含む肉芽腫の形成を含む。いくつかのそのような態様において、肉芽腫は、肺肉芽腫である。いくつかのそのような態様において、肉芽腫は、十分に明確な肉芽腫である。結核菌をマウスに感染させる方法および感染症を評価する方法の例は、たとえば、その開示が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2011/0200982号において見いだされうる。
【００９１】
ヒトM-CSFを発現するマウス、およびいくつかの例においてたとえば本明細書において記述される1つもしくは複数の他の遺伝子改変を発現するマウスには感染しないヒト病原体の他の例、または野生型マウスに感染するヒト病原体（感染後の野生型マウスは、その病原体に反応してヒトが開始する免疫応答のモデルにはならない）の他の例は、当業者に周知であろう。
【００９２】
病原体感染症のそのようなマウスモデルは、たとえばヒト感染症の進行をよりよく理解するために研究において有用である。そのようなマウス感染症モデルはまた、たとえば感染症から保護するまたは感染症を処置する候補物質を同定するために、新薬開発において有用である。
【００９３】
ヒト造血細胞を生着させたヒト化M-CSFマウスは、インビボで他の所望の活性に関して同様に候補物質をスクリーニングするために、たとえば健康な状態または疾患状態で、たとえば新規治療薬を同定するためおよび／または免疫系の発達および機能に関する分子基礎のよりよい理解を得るために、造血細胞の発達および／または活性、たとえばB細胞、T細胞、NK細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、抗塩基球等の活性を調整する（すなわち促進または抑制する）ことができる物質；造血細胞、たとえばB細胞、T細胞、NK細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、抗塩基球等およびその前駆細胞に対して毒性である物質；ならびに造血細胞、たとえばB細胞、T細胞、NK細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、抗塩基球等およびその前駆細胞に及ぼす毒性物質の毒性効果を防ぐ、軽減する、または逆転させる物質等をスクリーニングするために有用な系を提供する。なおもう1つの例として、本明細書において記述される遺伝子改変マウスは、たとえばある物質に対する個体の反応性を予測するために、その物質、たとえば治療物質に対する個体の免疫系の反応性をスクリーニングするためのインビボプラットフォームを提供することによって、疾患治療に対する個体の反応性を予測するために有用な系を提供する。
【００９４】
生物活性物質のスクリーニングアッセイにおいて、ヒト化M-CSFマウス、たとえばヒト造血細胞が生着して、およびいくつかの例においてヒト病原体に感染しているRag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウス、またはヒト化M-CSFマウスに生着させる細胞に、関心対象の候補物質を接触させて、1つまたは複数の出力パラメータをモニターすることにより候補物質の効果を評価する。これらの出力パラメータは、細胞の生存率、たとえば造血細胞の総数または特定の造血細胞タイプの細胞数、またはアポトーシス状態の細胞数、たとえばDNA断片化の量、細胞の空胞形成量、細胞表面上のホスファチジルセリンの量、および当技術分野において周知の方法によるその他の反映でありうる。またはもしくはさらに、出力パラメータは細胞の分化能、たとえば分化した細胞および分化した細胞タイプの比率の反映でありうる。またはもしくはさらに、出力パラメータは、細胞の機能、たとえば細胞によって産生されたサイトカインおよびケモカイン、細胞のホーミング能およびチャレンジ部位への浸潤能、細胞がインビトロまたはインビボで他の細胞の活性を調整する、すなわち促進または抑制する能力等の反映でありうる。他の出力パラメータは、動物における病原体感染症の程度、たとえばマウスにおける病原体の力価、マウスにおける肉芽腫の存在等の反映でありうる。
【００９５】
パラメータは、細胞の定量可能な成分、特に望ましくはハイスループットシステムで正確に測定することができる成分である。パラメータは、細胞表面決定基、受容体、タンパク質またはそのコンフォメーショナルもしくは翻訳後修飾、脂質、炭水化物、有機または無機分子、核酸、たとえばmRNA、DNA等、またはそのような細胞成分に由来する部分、またはそれらの組み合わせを含む任意の細胞成分または細胞産物でありうる。ほとんどのパラメータは定量的読み出しを提供するが、いくつかの例において、半定量的または定性的結果が許容可能であろう。読み出しは、決定された1つの値を含みうる、または平均値、中央値、もしくは分散等を含みうる。特徴的に、多数の同じアッセイからの各パラメータについて、パラメータ読み出し値の範囲が得られるであろう。変動が予想され、試験パラメータの組の各々に関する値の範囲は、1つの値を提供するために用いられる一般的な統計法と共に標準的な統計法を用いて得られるであろう。
【００９６】
スクリーニングするための関心対象候補物質には、非常に多くの化学クラス、主に有機金属分子を含みうる有機分子、無機分子、遺伝子配列、ワクチン、抗生物質、または抗生物質特性を有することが疑われる他の物質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、ヒトにおいて用いるための薬剤として承認されている物質等を包含する公知のおよび未知の化合物が挙げられる。本発明の重要な局面は、毒性試験を含む候補薬を評価することおよびその他である。
【００９７】
候補物質は、構造的相互作用、特に水素結合にとって必要な官能基を含む有機分子を含み、典型的に、少なくとも1つのアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基を含み、しばしば官能化学基の少なくとも2つを含む。候補物質はしばしば、1つまたは複数の上記の官能基によって置換された、環状炭素または複素環構造および／または芳香族または多価芳香族構造を含む。候補物質はまた、ペプチド、ポリヌクレオチド、糖質、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、その誘導体、構造アナログ、または組み合わせ等を含む生体分子において見いだされる。薬理学的に活性な薬物、遺伝的に活性な分子等が含まれる。関心対象化合物には、化学療法剤、ホルモンまたはホルモンアンタゴニスト等が挙げられる。本発明にとって適した薬剤の例は、"The Pharmacological Basis of Therapeutics," Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996), Ninth editionに記述される薬剤である。同様に毒素、ならびに生物および化学兵器物質も含まれ、たとえばSomani, S. M. (Ed.), "Chemical Warfare Agents," Academic Press, New York, 1992)を参照されたい。
【００９８】
スクリーニングするための関心対象の候補物質にはまた、核酸、たとえばsiRNA、shRNA、アンチセンス分子、もしくはmiRNAをコードする核酸、またはポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。核酸を標的細胞に移入するために有用な多くのベクターが利用可能である。ベクターは、エピソームとして、たとえばプラスミド、ミニサークルDNA、サイトメガロウイルス、アデノウイルス等のウイルス由来ベクターとして維持されうるか、またはベクターは相同組み換えもしくはランダム組み込みを通して、たとえばMMLV、HIV-1、ALV等のレトロウイルス由来ベクターを通して、標的細胞ゲノムに組み入れられうる。ベクターは、対象細胞に直接提供されうる。言い換えれば、ベクターが細胞に取り込まれるように、関心対象核酸を含むベクターを多能性細胞に接触させる。
【００９９】
電気穿孔、塩化カルシウムトランスフェクション、およびリポフェクション等の、細胞、たとえば培養細胞またはマウスにおける細胞に核酸ベクターを接触させる方法は、当技術分野において周知である。または関心対象核酸は、ウイルスを介して細胞に提供されうる。言い換えれば、細胞は関心対象核酸を含むウイルス粒子に接触する。レトロウイルス、たとえばレンチウイルスは本発明の方法にとって特に適している。一般的に用いられるレトロウイルスベクターは、「欠損型」であり、すなわち増殖性感染症にとって必要なウイルスタンパク質を産生することができない。むしろ、ベクターの複製は、パッケージング細胞株における生育を必要とする。関心対象の核酸を含むウイルス粒子を作製するために、核酸を含むレトロウイルス核酸を、パッケージング細胞株によってウイルスカプシドにパッケージングする。異なるパッケージング細胞株は、カプシドに組み入れられる異なるエンベロープタンパク質を提供し、このエンベロープタンパク質は細胞に関するウイルス粒子の特異性を決定する。エンベロープタンパク質は、少なくとも3つのタイプ、すなわち同種指向性、両指向性、および異種指向性のタンパク質である。同種指向性エンベロープタンパク質をパッケージングされたレトロウイルス、たとえばMMLVは、ほとんどのマウスおよびラット細胞タイプに感染することができ、BOSC23（Pear et al. (1993) P.N.A.S. 90:8392-8396）等の同種指向性パッケージング細胞株を用いることによって作製される。両指向性エンベロープタンパク質、たとえば4070A（Danos et al、前記）を有するレトロウイルスは、ヒト、イヌ、およびマウスを含むほとんどの哺乳動物細胞タイプに感染することができ、PA12（Miller et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437）；PA317（Miller et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902）；GRIP（Danos et al. (1988) PNAS 85:6460-6464）等の両指向性パッケージング細胞株を用いることによって作製される。異種指向性エンベロープタンパク質、たとえばAKR envをパッケージングされたレトロウイルスは、マウス細胞を除くほとんどの哺乳動物細胞タイプに感染することができる。関心対象細胞、いくつかの例において、細胞生着細胞、いくつかの例において、宿主、すなわちヒト化M-CSFの細胞が、パッケージされたウイルス粒子の確実に標的となるように、適切なパッケージング細胞株が用いられうる。
【０１００】
対象細胞に関心対象核酸を提供するために用いられるベクターは、典型的に、関心対象核酸の発現を駆動するための、すなわち転写活性化のための適したプロモーターを含むであろう。これには、汎在的に作用するプロモーター、たとえばCMV-bアクチンプロモーター、または特定の細胞集団において活性であるプロモーター、もしくはテトラサイクリン等の薬物の存在に反応するプロモーター等の誘導型プロモーターが挙げられうる。転写活性化とは、転写が標的細胞における基礎レベルより少なくとも約10倍、少なくとも約100倍、より通常、少なくとも約1000倍増加すると意図される。さらに、リプログラミング因子を対象細胞に提供するために用いられるベクターは、たとえばCre/Lox等のリコンビナーゼ系を用いて後に除去されなければならない遺伝子、またはヘルペスウイルス、TK、bcl-xs等の選択的毒性を許容する遺伝子を含めることによって、それらを発現する細胞を破壊させる遺伝子を含みうる。
【０１０１】
スクリーニングのための関心対象の候補物質はまたポリペプチドを含む。そのようなポリペプチドを、任意で、産物の溶解度を増加させるポリペプチドドメインに融合させてもよい。ドメインは、定義されたプロテアーゼ切断部位、たとえばTEVプロテアーゼによって切断されるTEV配列を通してポリペプチドに連結されうる。リンカーはまた、たとえば1から10個のグリシン残基の1つまたは複数のフレキシブル配列を含みうる。いくつかの態様において、融合タンパク質の切断は、産物の溶解度を維持する緩衝液において、たとえば0.5から2 M尿素の存在下、溶解度を増加させるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、およびその他の存在下で行われる。関心対象ドメインには、エンドソーム溶解ドメイン、たとえばインフルエンザHAドメイン、および産生を助ける他のポリペプチド、たとえばIF2ドメイン、GSTドメイン、GRPEドメイン、およびその他が挙げられる。さらにもしくはまたは、そのようなポリペプチドは、安定性が改善されるように製剤化されうる。たとえば、ペプチドをPEG化してもよく、ポリエチレンオキシ基は、血流における寿命の増加を提供する。ポリペプチドを、さらなる機能性を提供するために、たとえばインビボ安定性を増加させるために、もう1つのポリペプチドに融合させてもよい。一般的にそのような融合パートナーは、安定な血漿タンパク質であり、これは、たとえば融合体として存在すると、ポリペプチドのインビボ血漿中半減期を延長させる可能性があり、特にそのような安定な血漿タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインである。ほとんどの場合において、安定な血漿タンパク質は通常、多量体型で見いだされ、たとえば免疫グロブリンまたはリポタンパク質は、同じまたは異なるポリペプチド鎖が通常ジスルフィド結合および／または非共有結合して、構築された多重鎖ポリペプチドを形成するが、ポリペプチドを含む本発明の融合体も同様に、安定な血漿タンパク質前駆体と実質的に同じ構造を有する多量体として産生され、用いられるであろう。これらの多量体は、それらが含むポリペプチド物質に関して均一であるか、または1つより多くのポリペプチド物質を含みうる。
【０１０２】
候補ポリペプチド物質は、真核細胞から産生されてもよく、または原核細胞によって産生されてもよい。物質は、アンフォールディング、たとえば熱変性、DTT還元等によってさらに加工されてもよく、当技術分野において公知の方法を用いてさらにリフォールディングされうる。一次配列を変化させない関心対象の修飾には、ポリペプチドの化学的誘導体化、たとえばアシル化、アセチル化、カルボキシル化、アミド化等が挙げられる。同様に、グリコシル化の修飾、たとえばその合成およびプロセシングの際にまたはさらなるプロセシング段階において、ポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによって；たとえば哺乳動物グリコシル化または脱グリコシル化酵素等のグリコシル化に影響を及ぼす酵素にポリペプチドを曝露することによって作製される修飾も含まれる。同様に、リン酸化アミノ酸残基、たとえばホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニンを有する配列も包含される。ポリペプチドは、タンパク質分解に対するその抵抗性を改善するために、または溶解特性を最適にするために、またはポリペプチドを治療物質としてより適するようにするために、通常の分子生物学技術および合成化学を用いて修飾されうる。そのようなポリペプチドのアナログは、天然に存在するL-アミノ酸以外の残基、たとえばD-アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸を含むアナログを含む。D-アミノ酸を、アミノ酸残基のいくつかまたは全ての代わりに置換してもよい。
【０１０３】
候補ポリペプチド物質は、当技術分野において公知の通常の方法を用いてインビトロ合成によって調製されうる。様々な市販の合成装置、たとえばApplied Biosystems, Inc.、Beckman等の自動シンセサイザーが利用可能である。シンセサイザーを用いることによって、天然に存在するアミノ酸を非天然アミノ酸に置換してもよい。特定の配列および調製様式は、簡便さ、費用、必要な純度、およびその他によって決定されるであろう。または、候補ポリペプチド物質を、通常の組み換え体合成法に従って単離および精製してもよい。発現宿主の溶解物を調製して、溶解物をHPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、または他の精製技術を用いて精製してもよい。たいていの場合、用いられる組成物は、産物の調製およびその精製法に関連する混入物質に関連して、所望の産物の少なくとも20重量％、より通常少なくとも約75重量％、好ましくは少なくとも約95重量％、および治療目的の場合、通常少なくとも約99.5重量％を含むであろう。通常、パーセンテージは総タンパク質に基づくであろう。
【０１０４】
いくつかの例において、スクリーニングされる候補ポリペプチド物質は抗体である。「抗体」または「抗体部分」という用語は、エピトープに適合してこれを認識する特異的形状を有する任意のポリペプチド鎖含有分子構造を含むと意図され、1つまたは複数の非共有結合相互作用は分子構造とエピトープとの複合体を安定化させる。所定の構造およびその特異的エピトープの特異的または選択的適合は時に、「鍵穴と鍵」の適合と呼ばれる。原型となる抗体分子は、免疫グロブリンであり、全ての起源、たとえばヒト、齧歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、他の哺乳動物、ニワトリ、他の鳥類等からの全てのタイプの免疫グロブリン、IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等は、「抗体」であると考えられる。本発明において用いられる抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかでありうる。抗体は典型的に、細胞が培養される培地に提供される。
【０１０５】
候補物質は、合成または天然化合物のライブラリを含む広く多様な起源から得られうる。たとえば、無作為化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む生体分子を含む広く多様な有機化合物のランダム合成および定方向合成のために多数の手段が利用可能である。または、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形での天然化合物のライブラリが入手可能であるか、または容易に産生される。さらに、天然または合成により産生されたライブラリおよび化合物は、通常の化学、物理的および生化学手段を通して容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリを産生するために用いられうる。構造アナログを産生するために、公知の薬理物質を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等の定方向またはランダム化学修飾に供してもよい。
【０１０６】
候補物質は、時に物質を含まない試料と共に、物質を少なくとも1つおよび通常複数の試料に投与することによって生物活性に関してスクリーニングされる。物質に反応したパラメータの変化を測定して、たとえば物質の存在下および非存在下で、他の物質について得られた参照培養物と比較すること等によって結果を評価する。毒性物質の効果を防止、軽減、または逆転させる候補物質を同定するためにスクリーニングを行う場合、スクリーニングは、典型的に毒性物質の存在下で行われ、毒性物質は、結果を決定するために最も適切な時点で添加される。たとえば、候補物質の保護／予防能を試験する場合、候補物質は、毒性物質の前、候補物質と同時、または候補物質による処置後に添加されうる。もう1つの例として、毒性物質の効果を候補物質が逆転させる能力を試験する場合、候補物質は、候補物質による処置後に添加されうる。先に言及したように、いくつかの例において、試料は、細胞が生着しているヒト化M-CSFマウスであり、すなわち候補物質は細胞が生着しているヒト化M-CSFマウスに提供される。いくつかの例において、試料は生着させるべき細胞であり、すなわち候補物質は移植前に提供される。
【０１０７】
候補物質をマウスに直接投与する場合、物質は、ペプチド、低分子、および核酸のマウスへの投与に関して当技術分野において周知の多数の任意の方法によって投与されうる。たとえば物質は、経口、粘膜、表面、皮内、または注射、たとえば腹腔内、皮下、筋肉内、静脈内、または頭蓋内注射、およびその他によって投与されうる。物質は、緩衝液中で投与されうるか、または物質は、たとえば適切な薬学的に許容される媒体と混合することによって、多様な任意の製剤に組み入れられうる。「薬学的に許容される媒体」は、ヒト等の哺乳動物において用いるために、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認された、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識される薬局方に記載された媒体でありうる。「媒体」という用語は、それと共に本発明の化合物を哺乳動物に投与するために製剤化する希釈剤、補助剤、賦形剤、または担体を意味する。そのような薬学的媒体は、脂質、たとえばリポソーム、たとえばリポソームデンドリマー；落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油、およびその他等の、石油、動物、植物、または合成起源の油、食塩水を含む、水および油等の液体；アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素およびその他でありうる。さらに、補助剤、安定化剤、濃化剤、潤滑剤、および着色剤を用いてもよい。薬学的組成物は、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル、ミクロスフェア、およびエアロゾル等の固体、半固体、液体、またはガス様剤形の調製物に製剤化されうる。物質は、投与後に全身性でありうるか、または限局的投与、壁内投与を用いる、もしくは植え込み部位で活性用量を保持するように作用するインプラントを用いることによる局所性でありうる。活性物質は、即時活性となるよう製剤化されてもよく、または徐放性となるよう製剤化されてもよい。いくつかの病態に関して、特に中枢神経系の病態の場合、血液-脳関門（BBB）を通過するように物質を製剤化する必要がありうる。血液脳関門（BBB）を通して薬物を送達する1つの戦略は、マンニトールもしくはロイコトリエン等の浸透圧手段による、または生化学的に、ブラジキニン等の血管活性物質を用いることによるBBBの妨害を伴う。BBB妨害物質は、組成物が血管内注射によって投与される場合、物質と同時に投与することができる。BBBを通り抜ける他の戦略は、カベオリン-1媒介トランスサイトーシス、グルコースおよびアミノ酸担体等の担体媒介輸送体、インスリンまたはトランスフェリンに関する受容体媒介トランスサイトーシス、およびp-糖タンパク質等の能動排出輸送体を含む内因性の輸送体系を用いることを伴いうる。能動輸送部分はまた、血管の内皮壁を通しての輸送を容易にするために本発明において用いられる治療化合物にコンジュゲートされうる。または、BBBを回避する物質の薬物送達は、局所送達によって、たとえばOmmayaリザーバー（たとえば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,222,982号および第5385582号を参照されたい）を通しての、たとえば髄腔内送達によって；ボーラス注射、たとえばシリンジによる、たとえば硝子体内または頭蓋内注射によって；持続的注入、たとえば対流によるカニューレ挿管によ��て（たとえば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第20070254842号を参照されたい）；または物質が可逆的に固定されているデバイスを植え込むことによって（たとえば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第20080081064号および第20090196903号を参照されたい）行われうる。
【０１０８】
物質が移植前に細胞に提供される場合、物質は、都合よくは、溶液でまたは容易に可溶性の剤形で培養細胞の培地に添加される。物質は、フロースルーシステムで、流れとして、間欠的もしくは連続的にされうるか、または化合物のボーラスを、それ以外は静的な溶液に1回または漸増して添加する。フロースルーシステムでは、2つの液体が用いられ、1つは生理的に中性の溶液であり、他方は試験化合物を添加した同じ溶液である。第一の液体が細胞の上を通過した後に、第二の液体が通過する。１溶液法では、試験化合物のボーラスを細胞周囲の培地の容量に添加する。培養培地の成分の全体的な濃度は、ボーラスの添加によって、またはフロースルー法における2つの溶液のあいだで有意に変化してはならない。
【０１０９】
様々な濃度に対して異なる反応を得るために、異なる物質濃度に関して、複数のアッセイを同時に行ってもよい。当技術分野において公知であるように、物質の有効濃度を決定する段階は、典型的に、1：10または他の対数尺度の希釈により生じる濃度範囲を用いる。濃度は、必要であれば第二のシリーズの希釈によってさらに精密にされうる。典型的に、これらの濃度の1つは、陰性対照として役立ち、すなわち物質のゼロ濃度もしくは検出レベル未満、または表現型の検出可能な変化を生じない物質の濃度もしくはそれ未満である。
【０１１０】
ヒト化M-CSFマウスにおける細胞の候補物質に対する反応の分析は、物質による処置後任意の時間で行われうる。たとえば、細胞を、候補物質との接触後1、2、または3日目に分析してもよく、時に4、5、または6日目、時に8、9、または10日目、時に14日目、時に21日目、時に28日目、時に1ヶ月またはそれ以上、たとえば2ヶ月、4ヶ月、6ヶ月目、またはそれ以上で分析してもよい。いくつかの態様において、分析は多数の時点での分析を含む。分析のための時点の選択は、当業者に容易に理解されるように、行われる分析のタイプに基づくであろう。
【０１１１】
特に分析は免疫細胞の細胞に関することから、分析は、細胞の生存率、細胞増殖、細胞同一性、細胞形態学、および細胞機能を測定するために、本明細書において記述されるまたは当技術分野において公知の任意のパラメータを測定する段階を含みうる。たとえば、フローサイトメトリーを用いて、造血細胞の総数または特定の造血細胞タイプの細胞数を決定してもよい。細胞のアポトーシス状態を決定するために、組織化学または免疫組織化学を行ってもよく、たとえばDNAの断片化を測定するためのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識（TUNEL）、または細胞表面上でのホスファチジルセリンに対するアネキシンV結合を検出するための免疫組織化学を行ってもよい。フローサイトメトリーはまた、分化した細胞および分化した細胞タイプの比率を評価するために、たとえば物質の存在下での造血細胞の分化能を決定するために用いられうる。たとえば生着細胞の機能を評価するために、細胞生着ヒト化M-CSFマウスにおいて発現されたサイトカイン、ケモカイン、免疫グロブリン等のレベルを決定するために、ELISA、ウェスタンブロットおよびノザンブロットを行ってもよい。免疫細胞の機能を試験するためのインビボアッセイと共に糖尿病、自己免疫疾患、移植片対宿主病、AMD等の関心対象の特定の疾患または障害に関連するアッセイも同様に行ってもよい。たとえば、その開示が参照により本明細書に組み入れられる、Current Protocols in Immunology (Richard Coico, ed. John Wiley & Sons, Inc. 2012)およびImmunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997)を参照されたい。
【０１１２】
そのためたとえば、細胞生着ヒト化M-CSFマウス、たとえば細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスを、マウスにおいて感染症を生じるために必要な病原体の量であるヒト病原体の有効量に曝露する段階；病原体をマウスに感染させる段階；物質の存在下で経時的に感染症のパラメータを測定する段階；およびその測定を、物質に曝露されていない細胞生着ヒト化M-CSFマウスからの測定と比較する段階を含む、ヒト病原体に及ぼす物質の効果を決定するための方法が提供される。物質は、1回投与後、または選択された期間に対して物質の2回もしくはそれより多くの投与後に少なくとも半数のマウスの血液または組織において物質の量を低減させれば、抗病原体剤、たとえば抗チフス剤であると決定される。
【０１１３】
もう1つの例として、関心対象の病原体単離体または株が薬物耐性、たとえば多剤耐性であるか否かを決定するための方法が提供される。これらの方法において、細胞生着ヒト化M-CSFマウス、たとえば細胞生着Rag2-/-IL2rg-/-hM-CSFマウスは、マウスにおいて感染症を生じるために必要な病原体の量である関心対象のヒト病原体単離体または株の有効量に曝露される；病原体をマウスに感染させる；感染症のパラメータ、たとえばマウスの血液または組織における関心対象の単離体もしくは株の力価、関心対象の単離体もしくは株がマウスにおいて感染症を維持する能力、または関心対象の単離体もしくは株が薬物の投与後のある時点でマウスにおいて増殖する能力を、薬物の存在下で測定する；およびその測定を、物質に曝露されていない病原体を感染させた細胞生着ヒト化M-CSFマウスからの測定と比較する。関心対象の薬物の例には、アモキシシリン、アンピシリン、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、コトリモキサゾール、エルタペネム、イミペネム、フルオロキノロン（たとえば、シプロフロキサシン、ガチフロキサシン、オフロキサシン）、ストレプトマイシン、スルファジアジン、スルファメトキサゾール、テトラサイクリン、およびその併用が挙げられる。特定の態様において、薬物または薬物の併用の投与は、関心対象の単離体または株に対して感染症を生じる曝露後少なくとも1週間、10日、2週間、3週間、または4週間目である。
【０１１４】
対象マウスの使用に関する他の例は、本明細書において他所で提供される。本開示において記述される遺伝子改変細胞生着マウスのさらなる応用は、本開示を読むことによって当業者に明らかとなるであろう。
【０１１５】
試薬、装置、およびキット
同様に、上記の方法の1つまたは複数を実践するための試薬、装置、およびキットが提供される。その対象試薬、装置、およびキットは、極めて多様でありうる。
【０１１６】
いくつかの態様において、試薬またはキットは、記述の方法において用いるための1つまたは複数の物質を含むであろう。たとえば、キットはヒト化M-CSFマウスを含みうる。キットは、ヒト化M-CSFマウスを繁殖させるための試薬、たとえばプライマー、およびいくつかの例において、ヒト化M-CSFマウスを遺伝子タイピングするための試薬を含みうる。キットは、ヒト化M-CSFマウスに移植するためのヒト造血細胞もしくはヒト造血前駆細胞の濃縮集団、またはヒト化M-CSFマウスに移植するために、造血細胞集団もしくは濃縮された造血細胞集団をヒトから調製するための試薬を含みうる。他の試薬には、たとえば候補物質の存在下／非存在下で造血細胞の生存率および／または機能を決定するための試薬、たとえば異なるタイプの造血細胞によって発現されるマーカーに対して特異的な1つもしくは複数の抗体、または特定のサイトカイン、ケモカイン等を検出するための試薬が挙げられうる。他の試薬には、培養培地、培養補助剤、マトリクス組成物およびその他が挙げられうる。
【０１１７】
上記の構成要素に加えて、対象キットは、対象方法を実践するための説明書をさらに含むであろう。これらの説明書は、多様な形状で対象キットに存在してもよく、その1つまたは複数はキットに存在しうる。これらの説明書の1つの形状は、適した媒体または基体上に印刷された情報として、たとえば情報が印刷されている1枚または複数枚の紙として、キットの包装において、添付文書等として、存在しうる。なおもう1つの手段は、その中に情報が記録されているコンピューター読み取り可能な媒体、たとえばディスケット、CD等であろう。存在しうるなおもう1つの手段は、離れた場所で情報にアクセスするためにインターネットを介して用いられうるウェブサイトアドレスである。任意の都合のよい手段がキットに存在しうる。
【実施例】
【０１１８】
以下の実施例は、本発明を作製および使用する方法に関する完全な開示および説明を当業者に提供するために述べられ、本発明者らが本発明として見なす範囲を制限しないと意図され、また以下の実験が行われた全てまたは唯一の実験を表すのではないと意図される。用いた数字（たとえば、量、温度等）に関しては正確を期するように努力しているが、いくつかの実験誤差および偏差があることは考慮されるべきである。それ以外であると示している場合を除き、分量は重量での分量であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
【０１１９】
コロニー刺激因子-1（CSF-1）またはマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）は、造血を促進することが発見された初期のサイトカインの1つである。造血系において、M-CSFは、共通の骨髄前駆細胞（CMP）段階から始まって骨髄前駆細胞に特異的に、および単球／マクロファージ系列へのCMPの分化にとって都合がよいように作用すると考えられる（Sherr, C.J. et al. (1988) Macrophage colony-stimulating factor, CSF-1, and its proto-oncogene- encoded receptor, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 53 Pt 1 :521-530）。さらに、M-CSFは、マクロファージの生存、接着、および運動性にとっても必要である（Pixley, F.J., and Stanley, E.R. (2004) CSF-1 regulation of the wandering macrophage: complexity in action, Trends Cell Biol. 14:628-638; Socolovsky, M. et al. (1998) Cytokines in hematopoiesis: specificity and redundancy in receptor function, Adv. Protein Chem. 52:141-198; Stanley, E.R. et al. (1997) Biology and action of colony-stimulating factor-1, Mol. Reprod. Dev. 1997;46:4-10）。骨髄の分化におけるその重要な役割の他に、M-CSFは、破骨細胞の分化にとって、雌性生殖管の細胞の分化、生存、および増殖にとって、ならびに胎盤の形成にとって肝要である（Pixley et al. (2004); Socolovsky et al. (1998); Stanley et al. (1997)）。M-CSFは、線維芽細胞、骨髄（BM）間質細胞、活性化T細胞およびマクロファージ、ならびに分泌上皮細胞を含む多様な細胞によって産生される。M-CSFはM-CSF受容体（Fms；CD115）を通してシグナルを伝達し、M-CSFによるその受容体のライゲーションにより、Fmsのチロシンリン酸化が起こり、その後Grb2、Shc、Sos1、およびp85等のいくつかの宿主細胞タンパク質のリン酸化が起こる（Pixley et al. (2004); Stanley et al. (1997); Rohrschneider, L.R. et al. (1997) Growth and differentiation signals regulated by the M- CSF receptor, Mol. Reprod. Dev. 46:96-103; Yeung, Y.G. and Stanley, E.R. (2003) Proteomic approaches to the analysis of early events in colony-stimulating factor-1 signal transduction, Mol. Cell. Proteomics 2:1143-1155）。
【０１２０】
本発明者らは、ヒト化マウスにおけるヒト骨髄分化の欠損が、骨髄分化を促進する特異的シグナルの欠如による可能性があるという仮説を立てた。これを確認するために、本発明者らは、適切な組織から生理的レベルでヒトM-CSFを分泌するようにヒト化マウスの新規世代を操作した。これらのヒト化M-CSFマウスの分析により、ヒトM-CSFが正常に発現されることが定性的および定量的に明らかとなった。ヒトCD34+細胞を生着させたヒト化M-CSFマウスの分析により、様々な組織におけるヒト単球／マクロファージの出現率の増加が示された。さらに、これらのマウスから得られたヒト単球／マクロファージは、増強された機能的特性を示した。
【０１２１】
本明細書において記述されるヒト化M-CSFマウスは、ヒト骨髄細胞の出現率および機能の増強を示す。ヒトM-CSFを、組み換え活性化遺伝子2（Rag2；Genbankアクセッション番号1.NM_009020.3）およびγ鎖（γc、同様に「インターロイキン2受容体、γ鎖」、またはIL2RGとしても知られる；Genbankアクセッション番号 1.NM_013563.3）を欠損するBalb/cマウス（Rag2-/-γc-/-マウス）のマウスM-CSF座に挿入すると、これらのマウスにおいて定性的にしかも定量的にヒトM-CSFの忠実な発現が起こった。ヒト化M-CSF（M-CSFh/h）の新生仔においてヒト胎児肝臓由来造血幹細胞および前駆細胞（CD34+）を肝臓内移入すると、骨髄、脾臓、および末梢血においてヒト単球／マクロファージのより効率的な分化および出現率の増加が起こった。さらに、M-CSFh/hマウスは、移植後20週間であってもヒト単球／マクロファージの分化を持続的に支持する能力を示した。その上、M-CSFh/hマウスは、対照の非改変マウスとは異なり、肝臓および肺を含む様々な組織内に常在ヒト単球／マクロファージを含む。ヒト化M-CSFマウスから得られたヒト単球／マクロファージはまた、遊走、貪食、活性化、およびLPSに対する反応等の機能的特性の増強を示す。
【０１２２】
実施例1：細胞調製、分析法、およびアッセイ
CD34+細胞の単離および移植。ヒト胎児肝臓試料を、Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NYのヒト胎児肝臓組織貯蔵所からおよびAdvance Biosciences Resources, Inc., Alameda, CAから得た。ヒト組織を伴う実験は全て、エール大学ヒト治験委員会の承認を受けて行った。
【０１２３】
ヒトCD34+細胞を単離するために、胎児肝臓組織をPBSによって1回すすぎ、小片に切断して、コラゲナーゼD（100 ng/mL）によって37℃で45分間処置した。単細胞浮遊液を調製して、密度勾配遠心分離（リンパ球分離培地、MP biomedicals）を用いて単核球を単離した。細胞を抗ヒトCD34マイクロビーズによって処置した後、MACS（商標）技術（Miltenyi Biotech）によってCD34+細胞を単離した。
【０１２４】
移植する場合、新生仔（生後1日）に致死下量の放射線を4時間あけて2回の線量（2×150 cGy）を照射して、精製ヒトCD34+細胞1×105個から2×105個をPBS 20μL中で22ゲージ針（Hamilton Company, Reno, NV）を用いて肝臓に注射した。
【０１２５】
間葉間質細胞（MSC）の単離および培養
マウスの長骨を単離して、BM細胞を押し出した。骨を小片に切断して、コラゲナーゼDおよびP（25 ng/mL）の混合物によって37℃で45分間消化した。浮遊細胞を単離して、MSC培養培地（Stem Cell Technologies）の存在下で平板培養した。培養2週間後、CD45+Sca1+CD90+細胞を単離して培養した。
【０１２６】
抗体およびフローサイトメトリー
単細胞浮遊液をFACS CaliburまたはLSRIIおよびCELLQUEST（商標）ソフトウェア、FACS DIVA（商標）ソフトウェア（BD Biosciences, San Jose, CA）、またはFLOWJO（商標）ソフトウェア（Tree Star, Inc., Ashland, OR）をそれぞれ用いて、フローサイトメトリーによって分析した。定義された亜集団の細胞のソーティングは、FACS ARIA（商標）セルソーター（BD Biosciences, San Jose, CA）を用いて行った。
【０１２７】
以下のヒト抗体を試験に用いた：CD11 b、CD14、CD33、CD34、CD38、CD40、CD45、CD80、CD86、CD90、およびHLA-DR。
【０１２８】
以下のマウス抗体を本試験に用いた：CD11 b、CD40、CD45、CD80、CD86、F4/80、Gr1、H2Kd、およびIAd。
【０１２９】
細胞培養
マウスマクロファージの分化に関して、BM細胞を、10％FCSおよび必要な補助物質（2 mM L-グルタミン、1％ペニシリン-ストレプトマイシン、および1 mM非必須アミノ酸）を添加したDMEMの存在下で6ウェルプレートにおいて平板培養した。細胞を、組み換え型マウスM-CSF（10 ng/mL）または組み換え型ヒトM-CSF（10 ng/mL）のいずれかによって7日間処置した。細胞培養上清を3日毎に採取して、培養物を新鮮な培地およびサイトカインに交換した。
【０１３０】
活性化、貪食、および遊走等のヒトマクロファージ試験に関して、脾臓のCD45+CD14+CD33+細胞2×105個をソーティングして、15％ヒトAB血清および必要な補助物質（2 mM L-グルタミン、1％ペニシリン-ストレプトマイシン、および1 mM非必須アミノ酸）を添加したDMEMにおいてインビトロで培養した。
【０１３１】
活性化、貪食、および遊走アッセイ
インビボでのLPS刺激に関して、マウスにLPS（100 ng/g体重）をi.p.注射した。インビトロでのLPS刺激に関して、LPS（10 ng/mL）を細胞に添加して、1日または2日培養した。インビトロでのpoly I:C刺激に関して、細胞をpoly I:C（10μg/mL）の存在下で6時間または12時間培養した。
【０１３２】
貪食アッセイは、市販のVYBRANT（商標）貪食アッセイキット（Invitrogen）を用いて製造元の説明書に従って行った。
【０１３３】
市販のQCM（商標）走化性細胞遊走アッセイキット（Millipore）を用いて、製造元の説明書に従って遊走アッセイを行った。
【０１３４】
RNA抽出およびリアルタイムPCR
総RNAを市販のキットシステム（RNEASY（商標）ミニキット、Qiagen）を用いて単離した。オリゴdTプライマーを用いてcDNAを合成し、逆転写酵素（Roche）によって伸長させた。PCR反応は、7500リアルタイムPCRシステムおよびPower SYBR（商標）Green PCRマスターミックス（Applied Biosystems）を用いて製造元の説明書に従って、以下の遺伝子特異的プライマー対を用いて 1試料当たり2個ずつ行った：ヒトCSF1（センス：
2019122397.tif 000003
およびアンチセンス：
2019122397.tif 000004
、マウスcsf1（センス：
2019122397.tif 000005
およびアンチセンス：
2019122397.tif 000006
、ヒトIFNa（センス：
2019122397.tif 000007
およびアンチセンス：
2019122397.tif 000008
、ヒトIFNb（センス：
2019122397.tif 000009
およびアンチセンス：
2019122397.tif 000010
、マウスhprtプライマー（センス：
2019122397.tif 000011
およびアンチセンス：
2019122397.tif 000012
、ならびにヒトHPRTプライマー（センス：
2019122397.tif 000013
およびアンチセンス：
2019122397.tif 000014
）。通常のPCRに関して、標的細胞のDNAを、市販のキット（DNEASY（商標）血液および組織キット、Qiagen）を用いて抽出して、遺伝子特異的プライマー対を用いてPCR分析を行った。
【０１３５】
ELISA
サイトカイン定量試験に関して、血清または細胞培養上清のいずれかを採取して、市販のヒトIL6およびヒトTNF ELISAキット（Ray Biotech, Inc., GA）を用いて製造元の説明書に従ってELISAに供した。
【０１３６】
組織学
固形臓器を4％PFA中で固定した。固定した臓器をパラフィン（Blue RiBbon; Surgipath Medical Industries）に包埋した。ブロックを切片にして、5μm切片をH&E染色によって染色した後、ルーチンの方法によってカバーガラスを載せた。切片はいかなる培地も加えずに維持した。Zeiss Axio Imager、A1顕微鏡（2倍および10倍の対物レンズ）、AxioCam MRc5カメラ、およびAxioVision 4.7.1イメージングソフトウェア（Carl Zeiss Microimaging LLC）を用いて、デジタル光学顕微鏡画像を室温で記録した。
【０１３７】
統計分析
データは平均値±SEMとして表記する。統計学的有意性は、両側のStudent t検定を用いて評価した。P値＞0.05は、有意ではないと見なされ、P値＜0.05は*で表記した。
【０１３８】
実施例2：細胞生着のための遺伝子改変マウス
ヒトM-CSFノックイン戦略
1回のターゲティング段階でマウスM-CSF核酸配列をヒトM-CSF核酸配列（VELOCIGENE（登録商標）、対立遺伝子識別番号5093）に交換するためのターゲティング構築物を、既に記述されたように（Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat. Biotechnol. 21 :652-659）、VELOCIGENE（登録商標）技術を用いて構築した。マウスおよびヒトM-CSF DNAをそれぞれ、細菌人工染色体（BAC）RPCI-23、クローン373B18およびBAC RPCI-11、クローン101 M23から得た。簡単に説明すると、エキソン2から非コードエキソン9の633 nt下流まで伸長する17.5 kbヒトM-CSF配列に隣接するマウスM-CSF上流および下流相同性アーム、およびfloxed薬物選択カセットを含む、ギャップ修復クローニングによって作製された線状化ターゲティング構築物を、市販のV17 ES細胞株（BALB/c×129F1）から作製したRAG2+/-γc-/-マウス胚幹（ES）細胞に電気穿孔した。M-CSF遺伝子のヘテロ接合欠失を有するマウスES細胞を、マウスCsf1遺伝子のイントロン2（TUFプライマー、
2019122397.tif 000015
；TUPプローブ、
2019122397.tif 000016
；TURプライマー、
2019122397.tif 000017
および3'隣接配列（TDFプライマー、
2019122397.tif 000018
；TDPプローブ、
2019122397.tif 000019
；TDRプライマー、
2019122397.tif 000020
）における配列を認識する2つのTaqMan qPCRアッセイによるLoss-of-Alleleスクリーニングによって同定した。マウス遺伝子とヒトCSF1遺伝子との同時の交換を、CSF1のイントロン2における配列（フォワードプライマー、
2019122397.tif 000021
；プローブ、
2019122397.tif 000022
；リバースプライマー、
2019122397.tif 000023
）の1コピー、およびネオマイシン耐性（neor）カセット（フォワードプライマー、
2019122397.tif 000024
；プローブ、
2019122397.tif 000025
；リバースプライマー、
2019122397.tif 000026
）の1コピーを検出するGain-of Allele TaqManアッセイによって確認した；図8を参照されたい。CSF1配列を認識するqPCRアッセイは、マウスゲノムからのDNAを増幅しない。同じアッセイを用いて、標的化ES細胞に由来するマウスの遺伝子型を確認した。薬物選択カセットのCreによる切除を、neor TaqManアッセイによって確認した。全てのプライマー-プローブセットは、Biosearch Technologiesによって供給された。プローブは、その5'末端で6-カルボキシ-フルオレセイン（FAM）およびその3'末端でBHQ-1によって標識された。
【０１３９】
正確に標的化されたES細胞に、薬物選択カセットを除去するために一過性のCre発現ベクターをさらに電気穿孔した。薬物カセットを有しない標的化ES細胞クローンを、VELOCIMOUSE（登録商標）法（Poueymirou et al. (2007)）によって8細胞期マウス胚に導入した。ヒト化M-CSF遺伝子（VG5093）を有するVELOCIMICE（登録商標）（ドナーES細胞に完全に由来するF0マウス）を、修正を加えた対立遺伝子アッセイを用いて（Valenzuela et al.(2003））、マウス対立遺伝子の喪失およびヒト対立遺伝子の獲得に関する遺伝子タイピングによって同定した。
【０１４０】
マウスの維持
Balb/c Rag2-/-γc-/-M-CSFm/m、Balb/c Rag2-/-γc-/-M-CSFh/m、およびBalb/c Rag2-/-γc-/-M-CSFh/hマウスを、エール大学の動物飼育施設において特異的病原体を含まない条件下で維持した。マウスの実験は全て、エール大学の学内動物飼育使用委員会によって承認された。
【０１４１】
ヒト化M-CSFマウスの作製
マウスにおけるヒトM-CSFの生理的発現によって、ヒト化マウスにおいてヒトマクロファージの分化の改善が起こるか否かを確認するために、Balb/c Rag2-/-γc-/-マウスをヒトM-CSFを発現するように操作した。Rag2-/-γc-/-欠損を有するBalb/c系統は、マウスにおけるヒト免疫系の研究に関して成功したモデル系として役立つ（Traggiai E et al. (2004) Development of a human adaptive immune system in cord blood cell- transplanted mice, Science 304:104-107）。これらのマウスにおけるヒトM-CSFの生理的レベルを超える発現を回避するために、マウスM-CSFコード配列をヒト相対物に交換する戦略を採用した。一段階ターゲティングにおいてM-CSFオープンリーディングフレームの大部分をヒトM-CSFコード配列（VELOCIGENE（登録商標）対立遺伝子識別番号5093）に交換するための構築物（図8）を、既に記述されたようにVELOCIGENE（登録商標）技術を用いて構築した（Valenzuela et al.(2003)）。注意すべきことに、プロモーターおよびマウスの他の調節エレメント（5' UTR等の）は、このベクターにおいて保存された。線状化ターゲティングベクターを、Balb/c×129 Rag2+/-γc-/-胚幹細胞に電気穿孔した。正確に標的化されたES細胞に、薬物選択カセットを除去するために一過性のCre発現ベクターをさらに電気穿孔した。薬物カセットを有しない標的化ES細胞クローンを、VELOCIMOUSE（登録商標）法によって8細胞期マウス胚に導入した（Poueymirou et al. (2007)）。ヒト化M-CSF遺伝子（VG 5093）を有するVELOCIMICE（登録商標）（ドナーES細胞に完全に由来するF0マウス）を、修正を加えた対立遺伝子アッセイを用いて、マウス対立遺伝子の喪失およびヒト対立遺伝子の獲得に関して遺伝子タイピングすることによって同定した（Valenzuela et al.(2003)）。子孫の連続的異種交配を通して、Balb/c Rag2-/-γc-/-マウスキメラマウス、ならびにマウスおよびヒトM-CSF（M-CSFm/h、ヘテロ接合ノックイン）、およびヒトM-CSFのみ（M-CSFh/h、ホモ接合ノックイン）を有するジャームライントランスミットマウスを作製した。
【０１４２】
ヒト化M-CSFマウスの特徴付け
ヒト化M-CSFマウスにおけるヒトM-CSFの発現を評価した。M-CSFm/mまたはM-CSFh/hマウスのいずれかからの臓器を採取して、種特異的であるプライマーを用いて、マウスおよびヒトM-CSF mRNA発現に関して分析した。図1Aおよび1Bに示されるように、M-CSFは、BM、脾臓、血液、肝臓、脳、肺、精巣、および腎臓を含む分析された臓器の大部分において発現される。しかし、胸腺および皮膚は、M-CSFの検出可能な発現を示さなかった。注目すべきことに、マウスおよびヒトM-CSFの発現パターンはそれぞれ、M-CSFm/mおよびM-CSFh/hマウスのあいだで同等であった。次に、M-CSFm/m、M-CSFm/h、およびM-CSFh/hマウスにおけるマウスおよびヒトM-CSFの発現レベルを定量した。骨髄間葉間質細胞（MSC）を単離して、M-CSF mRNAの発現レベルを、リアルタイムPCRを用いて定量し（図1C）、M-CSFタンパク質（分泌型）を、ELISAを用いて定量した（図1D）。M-CSFm/mマウスは、マウスM-CSFのみを発現したが、M-CSFm/hマウスはマウスおよびヒトM-CSFの両方を発現し、ならびにM-CSFh/hマウスは、ヒトM-CSFのみを発現した。ヒトM-CSFの発現レベルは、マウスM-CSFと同等であった。これらのデータと一致して、血清中のCSF-1の分析から、m/m、h/m、およびh/hマウスにおけるCSF-1タンパク質の発現レベルが同等であることが判明した（図1E）。ヘミ接合性によって、遺伝子およびタンパク質発現レベルの減少は起こらず、遺伝子-用量レベルが、このサイトカインにとって制限的ではないように思われることを示している。
【０１４３】
マウスM-CSFをヒトM-CSFと交換することによって、特に骨および造血に対して有害な効果が起こるか否かを調べるために、M-CSFh/hマウスを様々な週齢で分析した。M-CSFシグナル伝達が欠損しているマウス（Csf1op/opおよびCsf1r-/-）は、歯の出現不全および骨欠損を示すことが、初期の研究から報告されている（Dai, X.M. et al. (2002) Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects, Blood 99:111-120; Felix, R. et al. (1990) Macrophage colony stimulating factor restores in vivo bone resorption in the op/op osteopetrotic mouse, Endocrinology 127:2592-2594; Wiktor-Jedrzejczak, W. et al. (1990) Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse, Proc. Natl Acad. Sci. USA 87:4828- 4832; Yoshida, H. et al. (1990) The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene, Nature 345:442-444）。対照的に、M-CSFh/hマウスは、正常な歯および骨特性を明らかにした。さらに、Csf1op/opおよびCsf1r-/-とは異なり、BMの総細胞含有量（図2A）、BM、脾臓（SP）および末梢血（PB）における骨髄細胞の出現率（図2B）、ならびにBMおよびSPにおけるマクロファージの出現率（図2C）は、M-CSFm/m、M-CSFh/m、およびM-CSFh/hマウスにおいて同等であった。この知見と一致して、HSC区画の出現率（長期HSC、短期HSC、および多能性前駆細胞を含む）および骨髄前駆細胞区画（一般的骨髄前駆細胞、顆粒球単球前駆細胞、および巨核球赤血球前駆細胞を含む）は、M-CSFm/m、M-CSFh/m、およびM-CSFh/hマウスにおいて同等であった（図9）。
【０１４４】
M-CSFh/hマウスにおいて造血および骨発達が正常であることに関して可能性がある説明は、ヒトM-CSFがマウス細胞と交叉反応性である可能性がある点である。このことを確認するために、M-CSFm/mから総BM細胞を単離して、組み換え型マウスM-CSFまたは組み換え型ヒトM-CSFのいずれかの存在下で培養した。サイトカインの非存在下で培養したBM細胞は生存できなかったが、ヒトまたはマウスM-CSFのいずれかの存在下で培養した細胞は、同等のインビトロ分化レベルを示した（図2D）。共刺激分子およびMHCの発現に関するこれらのインビトロ分化マクロファージの分析により、ヒトまたはマウスM-CSFのいずれかの存在下でこれらの分子のレベルが同等であることが示された（図2E）。本発明者らの知見と一貫して、これまでの研究から、ヒトM-CSFはマウス標的細胞において活性であるが、マウスM-CSFはヒト細胞とは交叉反応性でないことが報告された（Sieff, C.A. (1987) Hematopoietic growth factors, J. Clin. Invest. 79:1549-1557）。
【０１４５】
実施例3：ヒト化M-CSFマウスにおけるヒト単球／マクロファージの分化
M-CSFヒト化の影響を評価するために、致死下量の放射線を照射した新生仔Rag2-/-γc-/-M-CSFm/m、Rag2-/-γc-/-M-CSFh/m、およびRag2-/-γc-/-M-CSFh/hの肝臓内（i.h.）に精製ヒト胎児肝CD34+細胞〜2×105個を移植した。次に移植後8週目にレシピエントから採血して、ドナー（ヒトCD45発現に基づく）起源の細胞を確認した。移植後12週目で、レシピエントを屠殺して、そのBM、SP、およびPBを採取した。分析から、M-CSFm/mマウスと比較して、M-CSFh/mマウスおよびM-CSFh/hマウスの両方のBM、SP、およびPBにおいてCD14+CD33+単球／マクロファージ系列細胞の相対出現率および絶対出現率の増強が明らかとなった（図3A〜C）。M-CSFh/mマウスは、CD14+CD33+細胞の出現率の増加を示したが、CD14+CD33+細胞の最大の出現率は、M-CSFh/hマウスにおいて見いだされた。興味深いことに、この増加に加えて、CD14+CD33+細胞の出現率は、M-CSFh/mおよびM-CSFh/hマウスのBM、SP、およびPBにおいても増加した（図3A）。
【０１４６】
ヒトM-CSFノックインマウスが持続的なヒト骨髄形成を支持するか否かを分析するために、移植後12、16、および20週目にレシピエントを分析した。ヒトCD14+CD33+単球／マクロファージ系列細胞は、M-CSFm/mマウスにおいて16週目ではわずかに低減され、移植後20週目では大きく低減されたが、M-CSFh/mおよびM-CSFh/hマウスの両方において16および20週目でヒトCD14+CD33+細胞の有意な比率が観察された。それにもかかわらず、ヒトCD14+CD33+細胞の最大出現率はM-CSFh/hマウスにおいて認められた（図4Aおよび4B）。
【０１４７】
次に、ヒト化M-CSFマウスがヒト組織マクロファージの効率的な分化を支持するか否かを評価した。この目的に関して、M-CSFm/m、M-CSFm/h、およびM-CSFh/hマウスにPBSを還流して、その臓器（肝臓、肺、および皮膚を含む）を採取した。腹腔内をPBSで洗うことによって腹膜の細胞を得た。単細胞浮遊液を調製して、ヒトCD14+CD33+細胞の出現率を計算した。予想されたようにヒトCD14+CD33+細胞の出現率は、M-CSFm/hおよびM-CSFh/hマウスの両方において、肝臓、肺、および腹膜において有意に増加した。しかし、皮膚外植片の分析から、M-CSFm/mおよびM-CSFm/hマウスのあいだでヒトCD14+CD33+細胞の出現率が同等であることが判明したが、これらの細胞の有意な増加がM-CSFh/hマウスの皮膚外植片において観察された（図5）。併せて考慮すると、これらのデータは、マウスにおけるヒトM-CSFの発現が、ヒトHSCの骨髄／マクロファージ系列の分化を改善することを示唆している。
【０１４８】
実施例4：ヒト化M-CSFマウスにおけるヒト単球／マクロファージの機能
ヒト化M-CSFマウスにおけるヒトCD14+CD33+単球／マクロファージが通常に機能するか否かを調べるために、インビボおよびインビトロ機能試験を行った。致死下量の放射線を照射したM-CSFm/mおよびM-CSFm/h仔に胎児肝臓CD34+細胞を注射して、移植後12週目でドナー由来の造血を評価して、レシピエントマウスにLPSまたはPBSのいずれかを注射した。LPS注射の2日後、レシピエントを、脾臓におけるヒトCD14+CD33+細胞の出現率に関して分析した。LPS注射は、M-CSFm/mマウスにおいて単球／マクロファージ系列細胞の中等度の増加を誘導したが、PBS注射群と比較して、LPSを注射したM-CSFm/hマウスは、脾臓においてヒトCD14+CD33+細胞の数倍の増加を示した（図6A）。次に、これらの細胞がインビボでLPS刺激に反応して炎症誘発性サイトカインを産生できるか否かを調べた。
【０１４９】
ヒトCD34+細胞を生着させたM-CSFm/mおよびM-CSFm/hマウスにLPSを注射した。注射後6時間目に、マウスから採血して、ヒトおよびマウスIL6およびTNFαの血清レベルをELISAによって決定した。ヒト化M-CSFマウスにおける単球／マクロファージの出現率の増加と一致して、ヒトIL6およびTNFαレベルの上昇がM-CSFm/hマウスにおいて検出された。これらのサイトカインの基礎レベルは、M-CSFm/hマウスではより高かったが、LPS刺激によって、血清中のヒトIL6およびTNFαレベルの増強が起こった（図6Bおよび6C）。次に、インビトロで単球／マクロファージ（ヒト化M-CSFマウスから得られた）が炎症誘発性サイトカインを分泌する能力を分析した。ヒトCD34+細胞による再構成の12週間後、ヒトCD14+CD33+細胞を、M-CSFm/mまたはM-CSFh/hマウスのいずれかの脾臓から単離して、インビトロでLPSによって24時間または48時間刺激した。細胞培養上清におけるIL-6およびTNFαサイトカインレベルをELISAによって評価した。インビボデータと一致して、M-CSFh/hマウスから精製されたCD14+CD33+細胞は、LPSに反応してこれらのサイトカインの増強されたレベルを分泌した（図7Aおよび7B）。同様に、ヒト化M-CSFマウスから単離されたヒトCD14+CD33+細胞は、poly I:C刺激に反応して、増強されたインターフェロン-αおよびインターフェロン-βmRNAレベルを発現した（図7C）。最後に、ヒト化M-CSFマウスから得られたヒト単球／マクロファージの貪食、遊走、および活性化特性を分析した。ヒトCD34+再構成M-CSFh/hマウスから精製されたヒトCD14+CD33+細胞は、増加した貪食特性を示し（図7D）、ケモカインMip3βに反応して増強された走化性を示した（図7E）。予想されたように、M-CSFh/hマウスから得たヒト単球／マクロファージは、インビトロでLPS刺激に反応して、CD40、CD80、およびCD86，ならびにHLA-DRを含む共刺激分子のアップレギュレーションに基づいて評価した場合に、活性化特性の増強を示した（図7F）。全体として、ヒト化マウスにおいてヒトM-CSFの存在下で分化したヒト単球／マクロファージは、増強された機能的特性を示す。
【０１５０】
完全に再構成された機能的なヒト起源の造血／免疫系を有するマウスの作製は、当技術分野において非常に難題であった。今日まで3つのマウス系統（NOD-scidγc-/-、[NSG]、NOD/Shi-scidγc-/-[NOG]、およびBalb/c-Rag2-/-γc-/-）が開発されている。これらの系統の各々によって与えられる利点にもかかわらず、ヒトの造血は、これらのマウスにおいて不完全である。
【０１５１】
この主要な技術的難題を克服するために、マウスCSF-1遺伝子をそのヒト相対物と交換した。これによって、ヒト造血幹細胞および前駆細胞によって再構成されたマウスにおいて効率的なヒトマクロファージ分化が起こった。ヒト化CSF-1マウスの分析により、BM、脾臓、および末梢血においてヒト単球／マクロファージの効率的な分化が示された。その上、ヒトマクロファージは、これらのマウスにおいて肺および肝臓を含むいくつかの異なる組織において検出され、このことは、ヒト化マウスにおけるCSF-1の存在がヒト組織マクロファージの分化を促進するために十分であることを示した。さらに、CSF1m/mおよびCSF1h/hマウスから単離されたヒト単球／マクロファージを含む本明細書において記述される機能的試験から、CSF1h/hマウスの細胞が、貪食、遊走、活性化、およびサイトカイン分泌等の機能を行うことに関してより良好であることが示された。これらの知見に基づいて、ヒトCSF-1の存在下で分化する単球／マクロファージはより良好に機能すると推論されうる。
【０１５２】
VELOCIGENE（登録商標）遺伝子操作技術を用いて、ヒトCSF-1を発現するBalb/c-Rag2-/-γc-/-マウスの新規系統を作製した。したがって、マウスCSF-1コード領域は、マウスcsf1遺伝子のプロモーター等の調節エレメントを乱すことなくヒト相対物に交換された。これによって、マウス調節エレメントとヒトCSF-1コード領域とを含むキメラ遺伝子が得られた。これらのマウスの発現試験から、このキメラ遺伝子が定性的および定量的に忠実に発現されることが示された。
【０１５３】
マウスマクロファージの分化におけるCSF-1の役割は、十分に確立されている。CSF-1（Csf1op/op）またはその受容体（Csf1r-/-）のいずれかを欠損するマウスは、マクロファージおよび破骨細胞出現率の重度の低減、大理石病、歯の発生不全、神経系、雄性および雌性受精能、真皮および滑膜を含む様々な組織の発達欠損を示す。これらの試験は、マウスにおけるCSF-1の役割に対して非常に重要な洞察を提供しているが、ヒトの造血におけるCSF-1の重要性はなおもほとんどわかっていないままである。この点において、本明細書において記述されるマウスは、ヒトの造血におけるサイトカインの生理学および機能ならびに造血細胞機能の理解を改善することができることから、貴重なツールとして役立つであろう。さらに、このマウスは、疾患のモデルとして用いられ、ヒトの免疫系に及ぼす物質の効果を調べるために用いられうる。このマウスモデルは、いくつかのヒトの障害および疾患の病理生理学の理解および処置において貴重なツールである。
【０１５４】
前述は、本発明の原理を単に説明している。当業者は、本明細書において明白に記述または示されていないが本発明の原理を具体化する様々な変化を考案することができ、それらも本発明の精神および範囲に含まれると認識されるであろう。さらに、本明細書において引用した全ての実施例および条件付き言語は、本発明の原理、および当技術分野をさらに推進するために本発明者らが貢献する概念を読者が理解するのを助けることを主に意図しており、そのような具体的に引用された実施例および条件に対する制限ではないと解釈される。その上、本発明の原理、局面および態様を引用する本明細書における全ての声明と共にその特異的実施例は、その構造的および機能的同等物の両方を包含すると意図される。さらに、そのような同等物は、現在公知の同等物と将来開発される同等物の両方、すなわち構造によらず、同じ機能を行う、開発された任意の要素を含むと意図される。それゆえ、本発明の範囲は、本明細書において示され、記述される例示的な態様に限定されないと意図される。むしろ、本発明の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。
【図１Ａ】
2019122397.tif 000027
【図１Ｂ】
2019122397.tif 000028
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2019122397.tif 000033
【図２Ｃ】
2019122397.tif 000034
【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
2019122397.tif 000037
【図３Ｂ】
2019122397.tif 000038
【図３Ｃ】
2019122397.tif 000039
【図４Ａ】
2019122397.tif 000040
【図４Ｂ】
2019122397.tif 000041
【図５】
2019122397.tif 000042
【図６Ａ】
2019122397.tif 000043
【図６Ｂ】
2019122397.tif 000044
【図６Ｃ】
2019122397.tif 000045
【図７Ａ】
2019122397.tif 000046
【図７Ｂ】
2019122397.tif 000047
【図７Ｃ】
2019122397.tif 000048
【図７Ｄ】
2019122397.tif 000049
【図７Ｅ】
2019122397.tif 000050
【図７Ｆ】
2019122397.tif 000051
【図８】
2019122397.tif 000052
【図９】
2019122397.tif 000053
【配列表】
2019122397000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月23日(2019.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)ヒト造血細胞を生着させた第1のヒト化M-CSFマウスに候補物質を接触させる段階；および
(b)該物質を接触させた第1のヒト化M-CSFマウスにおけるヒト造血細胞の生存率および／または機能を、該物質を接触させていないヒト造血細胞を生着させた第2のヒト化M-CSFマウスにおけるヒト造血細胞の生存率および／または機能と比較する段階
を含み、
該第1および第2のヒト化M-CSFマウスがそれぞれ、
ヒト化M-CSFマウスのゲノムに組み込まれた、ヒトM-CSFタンパク質をコードしかつマウスM-CSF座でマウスM-CSF遺伝子の内因性プロモーターに機能的に連結されている核酸配列を含み、かつ
Rag2遺伝子ノックアウトおよびIL2rg遺伝子ノックアウトを含むかまたはNOD-scidγc-/-マウス、NOD/Shi-scidγc-/-マウス、およびBalb/c Rag2-/-γc-/-マウスからなる群より選択され、
該第1および第2のヒト化M-CSFマウスがそれぞれ、該核酸配列によってコードされるM-CSF RNAを骨髄、脾臓、血液、肝臓、脳、肺、精巣、および腎臓において発現し、かつ
候補物質を接触させた該第1のマウスにおける造血細胞の生存率および／または機能の減少により、該候補物質が造血細胞に対して毒性であることが示される、
ヒト造血細胞に対する毒性に関して候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項２】
前記第1および第2のヒト化M-CSFマウスがそれぞれ、前記核酸配列を2コピー含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記第1および第2のヒト化M-CSFマウスがそれぞれ、少なくとも1つのマウスM-CSF対立遺伝子において同じヌル変異を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌル変異が、マウスM-CSFエキソン2〜9の欠失である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記第1および第2のヒト化M-CSFマウスがそれぞれ、少なくとも1つのマウスM-CSF対立遺伝子において同じヌル変異を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記ヌル変異が、マウスM-CSFエキソン2〜9の欠失である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
(a)ヒト造血細胞を生着させた第1のヒト化M-CSFマウスに毒性物質を接触させる段階；
(b)ヒト造血細胞を生着させた第2のヒト化M-CSFマウスに毒性物質を接触させる段階；
(c)該第1のヒト化M-CSFマウスに候補物質を接触させる段階；および
(d)該候補物質を接触させた第1のヒト化M-CSFマウスにおけるヒト造血細胞の生存率および／または機能を、該候補物質を接触させていない第2のヒト化M-CSFマウスにおけるヒト造血細胞の生存率および／または機能と比較する段階
を含み、
該第1および第2のヒト化M-CSFマウスがそれぞれ、
ヒト化M-CSFマウスのゲノムに組み込まれた、ヒトM-CSFタンパク質をコードしかつマウスM-CSF座でマウスM-CSF遺伝子の内因性プロモーターに機能的に連結されている核酸配列を含み、かつ
Rag2遺伝子ノックアウトおよびIL2rg遺伝子ノックアウトを含むかまたはNOD-scidγc-/-マウス、NOD/Shi-scidγc-/-マウス、およびBalb/c Rag2-/-γc-/-マウスからなる群より選択され、
該第1および第2のヒト化M-CSFマウスがそれぞれ、該核酸配列によってコードされるM-CSF RNAを骨髄、脾臓、血液、肝臓、脳、肺、精巣、および腎臓において発現し、かつ
候補物質を接触させた該第1のマウスにおける造血細胞の生存率および／または機能の増強により、該候補物質が、造血細胞を毒性物質から保護するか、ヒト造血細胞に対する毒性物質の効果を軽減するか、またはヒト造血細胞に対する毒性物質の効果を逆転させることが示される、
ヒト造血細胞を毒性物質から保護する能力に関して候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】
前記第1および第2のヒト化M-CSFマウスがそれぞれ、前記核酸配列を2コピー含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記第1および第2のヒト化M-CSFマウスがそれぞれ、少なくとも1つのマウスM-CSF対立遺伝子において同じヌル変異を含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヌル変異が、マウスM-CSFエキソン2〜9の欠失である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記第1および第2のヒト化M-CSFマウスがそれぞれ、少なくとも1つのマウスM-CSF対立遺伝子において同じヌル変異を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌル変異が、マウスM-CSFエキソン2〜9の欠失である、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記第1のマウスと毒性物質との接触が、該第1のマウスと候補物質との接触の後に起こる、請求項7〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第1のマウスと毒性物質との接触が、該第1のマウスと候補物質との接触の前に起こる、請求項7〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第1のマウスと毒性物質との接触が、該第1のマウスと候補物質との接触と同時に起こる、請求項7〜12のいずれか一項に記載の方法。