(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｃｒｙタンパク質をバチルス属細菌の菌体内で高生産するための方法の提供。【解決手段】Ｃｒｙタンパク質をコードする遺伝子とσＡ依存性プロモーター又はσＨ依存性プロモーターを含む制御領域とが作動可能に連結して組み込まれてなる発現プラスミドでバチルス属細菌を形質転換し、当該形質転換細胞を培養することを含むＣｒｙタンパク質又はそれを含有する培養産物の製造方法であって、前記発現プラスミドが、特定の配列で示されるアミノ酸配列からなる複製タンパク質又はこれとアミノ酸配列において８０％以上の同一性を有し、且つ複製開始に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドである、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｒｙタンパク質をコードする遺伝子とσＡ依存性プロモーター又はσＨ依存性プロモーターを含む制御領域とが作動可能に連結して組み込まれてなる発現プラスミドでバチルス属細菌を形質転換し、当該形質転換細胞を培養することを含むＣｒｙタンパク質又はそれを含有する培養産物の製造方法であって、前記発現プラスミドが、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる複製タンパク質又はこれとアミノ酸配列において８０％以上の同一性を有し、且つ複製開始に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドである、方法。
【請求項２】
σＡ依存性プロモーター又はσＨ依存性プロモーターを含む制御領域が、Ｃｒｙタンパク質をコードする遺伝子の起源微生物における当該遺伝子の制御領域とは異なる請求項１記載の方法。
【請求項３】
σＡ依存性プロモーターを含む制御領域が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
σＨ依存性プロモーターを含む制御領域が、ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域である請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域が、当該セルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域及び翻訳開始領域である請求項３記載の方法。
【請求項６】
ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域が、当該ｓｐｏＶＧ遺伝子遺伝子の転写開始制御領域及び翻訳開始領域である請求項４記載の方法。
【請求項７】
バチルス属細菌が、枯草菌、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）又はバチルス・ブレビス（Bacillus brevis）である請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
バチルス属細菌が、枯草菌、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）である請求項１〜６のいずれか１項記載の方法
【請求項９】
バチルス属細菌が、枯草菌である請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
枯草菌が、枯草菌１６８株である請求項７〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
枯草菌が、ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌株である請求項７〜１０記載の方法。
【請求項１２】
枯草菌が、ＭＧＢ８７４株である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
枯草菌が、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡから選択される遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株である請求項７〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
枯草菌が、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡの各遺伝子の全てを欠失又は不活性化させた枯草菌株である請求項７〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
枯草菌が、ｓｉｇＥ、ｓｉｇＦ、ｓｉｇＧから選ばれる遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株である請求項７〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
枯草菌が、ｓｉｇＥ、ｓｉｇＦから選ばれる遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株である請求項７〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
枯草菌が、ｓｉｇＦ遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株である請求項７〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
枯草菌が、枯草菌ＭＧＢ８７４株に対して、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化されている枯草菌変異株である請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
Ｃｒｙタンパク質が、Ｃｒｙ５Ｂである請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
Ｃｒｙタンパク質が、Ｃｒｙ５Ｂtである請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
Ｃｒｙタンパク質が、Ｃｒｙ４Ａａ、Ｃｒｙ４Ｂａ及びＣｒｙ１１Ａａから選ばれる殺蚊タンパク質である請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
バチルス属細菌内でＣｒｙタンパク質を発現するための発現プラスミドであって、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる複製タンパク質又はこれとアミノ酸配列において８０％以上の同一性を有し、且つ複製開始に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、Ｃｒｙタンパク質をコードする遺伝子とσＡ依存性プロモーター又はσＨ依存性プロモーターを含む制御領域とが作動可能に連結されてなる、発現プラスミド。
【請求項２３】
σＡ依存性プロモーター又はσＨ依存性プロモーターを含む制御領域が、Ｃｒｙタンパク質をコードする遺伝子の起源微生物における当該遺伝子の制御領域とは異なる請求項２２記載の発現プラスミド。
【請求項２４】
σＡ依存性プロモーターを含む制御領域が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域を含む請求項２２又は２３記載の発現プラスミド。
【請求項２５】
σＨ依存性プロモーターを含む制御領域が、ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域を含む請求項求項２２又は２３記載の発現プラスミド。
【請求項２６】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域が、当該遺伝子の転写開始制御領域及び翻訳開始領域である請求項２４記載の発現プラスミド。
【請求項２７】
ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域が、当該遺伝子の転写開始制御領域及び翻訳開始領域である請求項２５記載の発現プラスミド。
【請求項２８】
Ｃｒｙタンパク質が、Ｃｒｙ５Ｂである請求項２２〜２７のいずれか１項記載の発現プラスミド。
【請求項２９】
Ｃｒｙタンパク質が、Ｃｒｙ５Ｂtである請求項２２〜２７のいずれか１項記載の発現プラスミド。
【請求項３０】
Ｃｒｙタンパク質が、Ｃｒｙ４Ａａ、Ｃｒｙ４Ｂａ及びＣｒｙ１１Ａａから選ばれる殺蚊タンパク質である請求項２２〜２７のいずれか１項記載の発現プラスミド。
【請求項３１】
請求項２２〜３０のいずれか１項記載の発現プラスミドを含有するバチルス属細菌。
【請求項３２】
枯草菌、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）又はバチルス・ブレビス（Bacillus brevis）である、請求項３１記載のバチルス属細菌。
【請求項３３】
枯草菌である、請求項３１又は３２記載のバチルス属細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバチルス属細菌を用いたＣｒｙタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、大腸菌を用いて、その菌体内にてタンパク質を大量発現させるとインクルージョンボディ(inclusion body、封入体)と呼ばれる不溶で不活性な凝集体（変性タンパク質）として回収されることが多く、タンパク質が生物活性を回復するためには、凝集体の可溶化及び活性化（リフォールディング）の操作が必要となる（非特許文献１）。それでも活性型のタンパク質が得られない場合はインクルージョンボディを形成しないように、発現量を調節することが行われる（非特許文献２、３）。その他、異種タンパク質を菌体内にて生産させる場合は、異種タンパク質の宿主への影響等々より、プロモーターの発現やプラスミドコピー数を調整する必要もある（非特許文献２、３）。
【０００３】
一方、菌体外タンパク質の発現においては、インクルージョンボディの形成や宿主内の該タンパク質濃度の影響を考慮する必要性が少なく、従来、高発現プロモーターと高コピー数プラスミドを組み合わせた高発現化やプロモーターの抑制を解除する検討 (特許文献１)等が行われてきた。また、このような菌体外タンパク質の生産に適する宿主として、バチルス属細菌、特に、枯草菌が優れていることも報告されている（非特許文献４、５）。さらに、枯草菌は特に安全性が高い微生物として認識されている点においても、宿主として有利である。
【０００４】
バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）は、各種殺虫性結晶タンパク質（ｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ、以下「Ｃｒｙタンパク質」と称する）を生産し、生物農薬として使用されている微生物である（非特許文献６）。一般に、バチルス・チューリンゲンシスが有するＣｒｙタンパク質遺伝子（ｃｒｙ遺伝子）をコードするプラスミドは、シータ型複製を行う低コピー数の巨大なプラスミドであるのに対して、枯草菌における複製に機能する配列番号９で示される複製タンパク質（ＲｅｐＢ）をコードするプラスミドの様にローリングサークル型の複製を行うプラスミドは、一般に高コピー数であることが知られ、前述したシータ型複製を行う低コピー数プラスミドと異なる（非特許文献７）。斯かるバチルス・チューリンゲンシスを用いて、そのプラスミド上のＣｒｙタンパク質遺伝子（ｃｒｙ遺伝子）から当該Ｃｒｙタンパク質を菌体内生産する場合においては、ｃｒｙ遺伝子のコピー数は飽和に達しており、コピー数の増加により生産量が増加しないことが示唆されている（非特許文献６）。また、高コピー数プラスミドへｃｒｙ遺伝子をクローニングすると生理的平衡が崩れ、胞子形成が阻害されることも観察されている（非特許文献６）。また、Ｃｒｙタンパク質の結晶構造の形成や可溶性には、２次構造や付加的な構成成分などの様々な因子が関係していることが示唆されており（非特許文献６）、単純なｃｒｙ遺伝子発現の増加により当該タンパク質を高生産できるとは云えないと考えられていた。例えば、バチルス・チューリンゲンシス由来のＣｒｙ５Ｂタンパク質をバチルス・ズブチリス  ＰＹ７９にて発現させた場合に、バチルス・チューリンゲンシスの該タンパク質の生産性７５ｍｇ／Ｌに対して、バチルス・ズブチリス  ＰＹ７９での生産性は１０ｍｇ／Ｌに過ぎないことが報告されている（非特許文献８、特許文献２）。また、ラクトコッカス・ラクティスにて、高コピー数プラスミドを用いて高発現プロモーターの制御下でＣｒｙ５Ｂタンパク質遺伝子を発現させた場合に、バチルス・チューリンゲンシスの該タンパク質の生産性はウエスタンブロットレベルしか検出できないことも報告されている（非特許文献９）。
【０００５】
斯様に、一般的に菌体外タンパク質の発現向上のために検討されてきた手法が、菌体内タンパク質の生産に適用可能であるとは云えず、特にＣｒｙタンパク質を高発現するための効率な手法は見出されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際特許公開第２０１１／０４９２２７号
【特許文献２】国際特許公開第２０１６／００７３５５号
【特許文献３】国際特許公開第２０１７／１２３９４６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Singh A, Upadhyay V, Upadhyay AK, Singh SM, Panda AK (2015) Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process. Microb Cell Fact.;25:14-41.
【非特許文献２】東端 啓貴 (2013) 大腸菌を宿主とした異種タンパク質高発現のイロハ. 生物工学, 91, 96-100
【非特許文献３】CHUMANN, Wolfgang  and  FERREIRA, Luis Carlos S.(2004) Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Genet. Mol. Biol. [online].,27(3), 442-453.
【非特許文献４】Gomes AR, Byregowda SM, Veeregowda BM, Balamurugan V (2016). An overview of heterologous expression host systems for the production of recombinant proteins. Adv. Anim. Vet. Sci. 4(7): 346-356.
【非特許文献５】Ferrer-Miralles and Villaverde (2013). Bacterial cell factories for recombinant proteinproduction; expanding the catalogue. Microbial Cell Factories, 12:113
【非特許文献６】HERVE´ A. et al. How Does Bacillus thuringiensis Produce SO Much Insecticidal Crystal Protein?, J. of Bacteriology 1995, 177(21), 6027-6032
【非特許文献７】Deng C, Peng Q, Song F, Lereclus D (2014) Regulation of cry gene expression in Bacillus thuringiensis. Toxins. 6:2194-2209
【非特許文献８】Yan Hu et al. Bacillus subtilis Strain Engineered for Treatment of Soil-Transmitted Helminth Diseases, Applied and Environmental Microbiology 2013, 79(18) :5527-5532
【非特許文献９】Durmaz E. et al. Intracellular and Extracellular Expression of Bacillus thuringiensis Crystal Protein Cry5B in Lactococcus lactis for Use as an Anthelminthic, Applied and Environmental Microbiology 2016, 82(4) :1286-1294
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、Ｃｒｙタンパク質をバチルス属細菌の菌体内で高生産するための方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、バチルス属細菌、好ましくは、枯草菌によるＣｒｙタンパク質の菌体内生産について検討したところ、意外にも菌体外タンパク質の生産に用いられる特定の高発現プラスミドを用いることにより、菌体内に著量のＣｒｙタンパク質が生産され、当該タンパク質は野生型と同程度の活性を有することを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の１）〜２）を提供するものである。
１）Ｃｒｙタンパク質をコードする遺伝子とσＡ依存性プロモーター又はσＨ依存性プロモーターを含む制御領域とが作動可能に連結して組み込まれてなる発現プラスミドでバチルス属細菌を形質転換し、当該形質転換細胞を培養することを含むＣｒｙタンパク質又はそれを含有する培養産物の製造方法であって、前記発現プラスミドが、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる複製タンパク質又はこれとアミノ酸配列において８０％以上の同一性を有し、且つ複製開始に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドである、方法。
２）バチルス属細菌内でＣｒｙタンパク質を発現するための発現プラスミドであって、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる複製タンパク質又はこれとアミノ酸配列において８０％以上の同一性を有し、且つ複製開始に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、Ｃｒｙタンパク質をコードする遺伝子とσＡ依存性プロモーター又はσＨ依存性プロモーターを含む制御領域とが作動可能に連結されてなる発現プラスミド。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、バチルス属細菌、好ましくは、枯草菌（Bacillus subtilis）を用いたＣｒｙタンパク質の高発現系が提供され、これを用いることにより、Ｃｒｙタンパク質又はそれを含有する培養産物を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−Ａ】Ｃｒｙ５Ｂ発現プラスミド（ｐＰｓＳｃｒｙ５ＢとｐＰｓＳｃｒｙ５Ｂｔ）の構築。矢印はプライマーの位置と方向を示し、矢印の上あるいは下にプライマーの名称を付した。
【図１−Ｂ】Ｃｒｙ５Ｂ発現プラスミド（ｐＰｓｃｒｙ５ＢとｐＰｓｃｒｙ５Ｂｔ）の構築。矢印はプライマーの位置と方向を示し、矢印の上あるいは下にプライマーの名称を付した。
【図１−Ｃ】Ｃｒｙ５Ｂ発現プラスミド（ｐＰｖｃｒｙ５ＢとｐＰｖｃｒｙ５Ｂｔ）の構築。矢印はプライマーの位置と方向を示し、矢印の上あるいは下にプライマーの名称を付した。
【図１−Ｄ】Ｃｒｙ５Ｂ発現プラスミド（ｐＰｖＳｃｒｙ５ＢとｐＰｖＳｃｒｙ５Ｂｔ）の構築。矢印はプライマーの位置と方向を示し、矢印の上あるいは下にプライマーの名称を付した。
【図２】分泌シグナルを持つプラスミドによるＣｒｙ５ＢとＣｒｙ５Ｂｔの発現。
【図３】分泌シグナルを持たないプラスミドによるＣｒｙ５Ｂ発現。
【図４−Ａ】枯草菌変異株を用いたＣｒｙ５Ｂ発現（１）。
【図４−Ｂ】枯草菌変異株を用いたＣｒｙ５Ｂ発現（２）。
【図５】Ｌ１  ｇｒｏｗｔｈ  アッセイにおける線虫の写真。
【図６】線虫の面積。コントロールの面積が１００％としたときの各Ｃｒｙ５Ｂタンパク濃度における値。
【図７】分泌シグナルを持たないプラスミドによるＣｒｙ５Ｂｔ発現。
【図８】殺蚊タンパク質発現プラスミド（ｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ４Ａａ、ｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ４Ｂａ、ｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ１１Ａａ、ｐＨＹ−Ｐｖｃｒｙ４Ａａ、ｐＨＹ−Ｐｖｃｒｙ４Ｂａ、ｐＨＹ−Ｐｖｃｒｙ１１Ａａ）。
【図９】殺蚊タンパク質の発現。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｌｉｐｍａｎ，ＤＪ．，Ｐｅａｒｓｏｎ．ＷＲ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１，１９８５）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１４】
本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列におけるアミノ酸又は塩基の欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」とは、例えば、１〜１２個、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜４個であり得る。また本明細書において、アミノ酸又は塩基の「付加」には、配列の一末端及び両末端への１〜数個のアミノ酸の又は塩基の付加が含まれる。
【００１５】
本明細書において、ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな条件下」としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の条件が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件であり得る。
【００１６】
本明細書において、遺伝子の上流及び下流とは、それぞれ、対象として捉えている遺伝子又は領域の５’側及び３’側に続く領域を示す。別途定義されない限り、遺伝子の上流及び下流とは、それぞれ遺伝子の翻訳開始点からの上流領域及び遺伝子の下流領域には限定されない。
【００１７】
本明細書において、転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列に相当する部位である（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．，Ｄａｌｇａｒｎｏ，Ｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７１，１３４２−１３４６，１９７４）。
【００１８】
本発明において、Ｃｒｙタンパク質は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が産生する結晶性殺虫タンパク質を意味する。Ｃｒｙタンパク質は、タンパク質の１次構造より、Ｃｒｙ１からＣｒｙ７５までのクラスに分類されており（Microbiology and Molecular Biology Reviews(1998) 62, 807-813. Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins, http://www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/.(２０１７年１２月7日）、各クラスは配列類似性の程度によりさらにサブクラスに分類されている。例えば、Ｃｒｙ１クラスに属するものは１００種以上存在する。主要なＣｒｙタンパク質を、以下の表１−１〜１−３に示す。なお、該表に示すアクセス番号はＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．である。
【００１９】
【表１−１】
2019122270.tif 000002
【００２０】
【表１−２】
2019122270.tif 000003
【００２１】
【表１−３】
2019122270.tif 000004
【００２２】
このうち、本発明の方法は、Ｃｒｙ１Ａタンパク質、Ｃｒｙ１Ｆタンパク質、Ｃｒｙ２Ａタンパク質、Ｃｒｙ３４Ａタンパク質、Ｃｒｙ３５Ａタンパク質、Ｃｒｙ３Ａタンパク質、Ｃｒｙ３Ｂタンパク質、Ｃｒｙ２１タンパク質、Ｃｒｙ１４Ａタンパク質、Ｃｒｙ６Ａタンパク質、Ｃｒｙ１３タンパク質、Ｃｒｙ５Ｂタンパク質、Ｃｒｙ４Ａａタンパク質、Ｃｒｙ４Ｂａタンパク質、Ｃｒｙ１１Ａａタンパク質の製造に、より好適であり、Ｃｒｙ５Ｂタンパク質Ｃｒｙ４Ａａタンパク質、Ｃｒｙ４Ｂａタンパク質、Ｃｒｙ１１Ａａタンパク質の製造に、より好適である。
Ｃｒｙ５Ｂタンパク質は、土壌伝播蠕虫症に対して有効であることが知られている殺線虫タンパク質である（Cappello M et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103:15154-15159, Hu Y et al. PLoS Negl. Trop. Dis. 4:e614）。Ｃｒｙ５Ｂのアミノ酸配列の例としては、配列表の配列番号２で示され、当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号１で示される。
【００２３】
Ｃｒｙ４Ａａタンパク質、Ｃｒｙ４Ｂａタンパク質及びＣｒｙ１１Ａａタンパク質は、蚊に対して殺虫活性を有するタンパク質として知られている（FEMS Microbiol Lett 266 (2007) 163-169, Mhalakshmi A at al. Advances Microbiol. 2 (2012) 216-226）。
Ｃｒｙ４Ａａのアミノ酸配列の例としては、配列表の配列番号４で示され、当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号３で示される。
Ｃｒｙ４Ｂａのアミノ酸配列の例としては、配列表の配列番号６で示され、当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号５で示される。
Ｃｒｙ１１Ａａのアミノ酸配列の例としては、配列表の配列番号８で示され、当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号７で示される。
【００２４】
斯かる天然のタンパク質の中には生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）等の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在などに起因して１から数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。
よって、本発明のＣｒｙタンパク質には、表１に示されるＣｒｙタンパク質の他に当該タンパク質を構成するアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸残基が付加又は置換、或いは１ないし数個のアミノ酸残基が欠失したものであって、同様の殺虫活性を有する、当該Ｃｒｙタンパク質の変異体も包含される。
【００２５】
例えば、Ｃｒｙ５Ｂタンパク質、Ｃｒｙ４Ａａタンパク質、タンパク質Ｃｒｙ４Ｂａ、Ｃｒｙ１１Ａａタンパク質であれば、以下の（Ａ）〜（Ｃ）が包含される。
（Ａ）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ殺虫活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ殺虫活性を有するタンパク質
【００２６】
本発明のＣｒｙタンパク質をコードする遺伝子（ｃｒｙ遺伝子とも称する）は、その類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成ＤＮＡの何れでもよく、またゲノムＤＮＡクローン、ｃＤＮＡクローンの何れでもよい。
【００２７】
本発明のｃｒｙ遺伝子は典型的には、上記表１で示す各ｃｒｙ遺伝子を指すが、天然の遺伝子の中には、生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）等の違いに起因する少数の変異やよく似たアイソザイムの存在に起因する少数の変異が存在することは当業者に周知である。従って、本発明のｃｒｙ遺伝子は、表１で示される遺伝子のみに限定されるわけではなく、上記のＣｒｙタンパク質をコードする全ての遺伝子が包含される。
【００２８】
例えば、ｃｒｙ５Ｂ遺伝子、ｃｒｙ４Ａａ遺伝子、ｃｒｙ４Ｂａ遺伝子、ｃｒｙ１１Ａａ遺伝子であれば、以下の（ａ）〜（ｆ）が包含される。
（ａ）配列番号１、３、５又は７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、３、５又は７に示すヌクレオチド配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ殺虫活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１、３、５又は７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ殺虫活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号２、４、６又は８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ殺虫活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ殺虫活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００２９】
本発明において、Ｃｒｙタンパク質又はそれを含有する培養産物は、前述したｃｒｙ遺伝子とσＡ依存性プロモーター又はσＨ依存性プロモーターを含む制御領域とを作動可能に連結して発現プラスミドに組み込み、当該プラスミドでバチルス属細菌を形質転換し、当該形質転換細胞を培養することにより製造され、発現プラスミドとして、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる複製タンパク質又はこれとアミノ酸配列において８０％以上の同一性を有し、且つ複製開始に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドが用いられる。
【００３０】
複製タンパク質（Ｒｅｐ）は、プラスミドの複製開始に働くイニシエータータンパク質であるが、本発明で用いられるプラスミドは、枯草菌における複製に必要な配列番号９で示される複製タンパク質を包含する。例えば、配列番号９で示される複製タンパク質は、ｐＡＭα１に存在する。ｐＡＭα１の複製タンパク質は２種類存在するが、本発明において用いられる複製タンパク質は、配列番号９で示されるアミノ酸からなるタンパク質（ＲｅｐＢ）である。また、当該タンパク質とアミノ酸配列において８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、且つ複製開始に関与するタンパク質も当該タンパク質と同様に用いることができる。斯かるプラスミド複製タンパク質としては、例えば、配列番号９で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものが包含される。例えば、特許第５３６１４８４号に記載の変異タンパク質、すなわち、配列番号９で示されるアミノ酸配列において、（ａ）４８位、（ｂ）２６２位、（ｃ）１４９位及び（ｄ）１９８位から選ばれる１以上のアミノ酸残基が特定のアミノ酸残基に置換してなるタンパク質が挙げられる。
【００３１】
上記プラスミドには、複製タンパク質をコードするポリヌクレオチドの他に、複製開始に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド等が含まれる。また、当該プラスミドには、これらの他に、薬剤耐性遺伝子、マルチクローニングサイト等を適宜含むことができる。
【００３２】
本発明において用いられる好適なプラスミドとしては、例えばｐＨＹ３００ＰＬＫ、特許第５３６１４８４号に記載のプラスミド等が挙げられる。
ｐＨＹ３００ＰＬＫは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  とＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの両方へＤＮＡを形質転換できるシャトルベクターで、Ｅ．ｃｏｌｉのプラスミドｐＡＣＹＣ１７７とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓのプラスミドｐＡＭα１由来のＤＮＡより構築され、ｐＡＭα１の複製領域にはＲｅｐＢが含まれる。
【００３３】
当該プラスミドに、目的のＣｒｙタンパク質をコードする遺伝子と、σＡ因子依存性プロモーター又はσＨ因子依存性プロモーターを含む制御領域とが作動可能に連結され、Ｃｒｙタンパク質を枯草菌の菌体内に生産させ得る組換えプラスミド（発現ベクター）が構築される。
ここで、「制御領域と作動可能に連結された遺伝子」とは、当該制御領域による制御の下に発現し得るように配置されている遺伝子をいう。
ここで、プロモーターとは、所定の遺伝子におけるコーディング領域の上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼが相互作用して当該遺伝子の転写を制御する機能を有する領域と定義される。より具体的には、プロモーターとは、所定の遺伝子におけるコーディング領域の上流２００〜６００塩基程度の領域を意味する。
また、プロモーターを含む制御領域としては、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が挙げられる。当該制御領域は、好ましくは、宿主内における下流の遺伝子の発現を高める機能を有し、より好ましくは、下流遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する。
【００３４】
σＡ因子依存性プロモーター及びσＨ因子依存性プロモーターは、胞子形成微生物において、胞子形成期におけるスポアコートタンパク沈着期より前において働くプロモーターである。
σＡ依存性プロモーター又はσＨ依存性プロモーターを含む制御領域が、Ｃｒｙタンパク質をコードする遺伝子の起源微生物における当該遺伝子の制御領域とは異なる制御領域、から選択されることが好ましい。
σＡ因子依存性プロモーターとしては、特に限定されないが、枯草菌ファージＳＰ０１プロモーター（Proc. Natl. Acd. Sci. USA. (1984) 81:439-443.）、ｖｅｇ遺伝子、ａｍｙＥ（アミラーゼ）遺伝子、ａｐｒＥ（ズブチリシン）遺伝子及びＳ２３７（Ｓ２３７セルラーゼ、特開２０００−２１００８１号公報）遺伝子のプロモーターを挙げることができる。σＨ因子依存性プロモーターとしては、特に限定されないが、ｃｉｔＧ遺伝子、ｓｐｏＶＳ遺伝子及びｓｐｏＶＧ（Proc. Natl. Acd. Sci. USA. (1986) 83:9438-9442.）遺伝子のプロモーターが挙げられる。
本発明においては、σＡ因子依存性プロモーターとしてはＢａｃｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子のプロモーターがより好ましく、σＨ因子依存性プロモーターとしては枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）のｓｐｏＶＧ遺伝子（ＢＧ１０１１２）のプロモーターがより好ましい。
【００３５】
σＡ因子依存性プロモーターを含む制御領域としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域が好適に挙げられる。当該制御領域は、具体的には当該セルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域及び翻訳開始領域であり（配列番号１０）、好ましくは配列番号１０で示される塩基配列、または当該塩基配列に対して８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列、或いは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列である。上記配列番号１０で示される塩基配列に対して８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列とは、上記同一性を有しており、且つσＡ因子依存性プロモーターとして遺伝子の転写に関わる機能、および、翻訳に関わる機能を保持している配列を意味する。また、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、σＡ因子依存性プロモーターとして遺伝子の転写に関わる機能、および、翻訳に関わる機能を保持している配列を意味する。このうち、より好ましいσＡ因子依存性プロモーターとして、配列番号１１で示される塩基配列からなるプロモーターが挙げられる。当該プロモーターは上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域においてＣｒｅ様配列が削除された配列からなり（特開２０１１−１０３８７５号公報）、配列番号１０で示される塩基配列に対して９５％の配列同一性を有するプロモーターである。
ここで、「σＡ因子依存性プロモーターとして機能する」とは、ＲＮＡポリメラーゼであるσＡ因子によって特異的に転写制御されることを意味する。この特異性は、評価対象となるポリヌクレオチドの下流にレポーター遺伝子を結合し、σＡ因子存在下及び不存在下でのレポーター遺伝子の発現を観察することによって評価することができる。
【００３６】
また、σＨ因子依存性プロモーターを含む制御領域としては、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）のｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域が好適に挙げられる。当該制御領域は、具体的には当該ｓｐｏＶＧ遺伝子（ＢＧ１０１１２）の転写開始制御領域及び翻訳開始領域であり（配列番号１２）、好ましくは配列番号１２で示される塩基配列、または当該塩基配列に対して８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列、或いは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列である。上記配列番号１２で示される塩基配列に対して８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列とは、上記同一性を有しており、且つσＨ因子依存性プロモーターとして遺伝子の転写に関わる機能、および、翻訳に関わる機能を保持している配列を意味する 。また、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、σＨ因子依存性プロモーターとして遺伝子の転写に関わる機能、および、翻訳に関わる機能を保持している配列を意味する。ここで、「σＨ因子依存性プロモーターとして機能する」とは、ＲＮＡポリメラーゼであるσＨ因子によって特異的に転写制御されることを意味する。この特異性は、評価対象となるポリヌクレオチドの下流にレポーター遺伝子を結合し、σＨ因子存在下及び不存在下でのレポーター遺伝子の発現を観察することによって評価することができる。
【００３７】
上記ｃｒｙ遺伝子、及び上記制御領域を含むプラスミドへの挿入は、当該分野における通常の方法に従って行うことができる。例えば、上記ｃｒｙ遺伝子、及び制御領域の断片をＰＣＲ等によって増幅し、これらの断片を制限酵素法等によってプラスミドに挿入し、連結すればよい。あるいは、上記遺伝子及び制御領域の断片を予め連結した断片を作製し、これをプラスミドに挿入してもよい。その際、プラスミド上において、上流から制御領域断片、ｃｒｙ遺伝子の断片の順で連結されているようにする。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、タカラバイオ製等）を用いることもできる。
【００３８】
構築されたプラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．７４（１９８９）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００３９】
上記発現プラスミドを導入する宿主細胞としては、バチルス属細菌、好ましくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）又はバチルス・ブレビス（Bacillus brevis）が使用されるが、これは野生型のものでも変異を施したものでもよい。バチルス属に属する微生物としては、具体的には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｏｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ  （Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ、  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｕｓ  ｌｉｑｕｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ等を挙げることができる。なお、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓはＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属に分類されて、株によってＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓあるいはＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ等と記載される場合があり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属に分類されてＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａと記載される場合があり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｏｍｏｐｈｉｌｕｓはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に分類されてＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｏｍｏｐｈｉｌｕｓと記載される場合がある。しかしながら本明細書においては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ、及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｏｍｏｐｈｉｌｕｓは、共にＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌として定義する。すなわち、本発明において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物といった場合、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓと記載される微生物、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａと記載される微生物及びＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｏｍｏｐｈｉｌｕｓと記載される微生物を含む意味として解釈する。なお、上記バチルス属に属する微生物は各微生物保存機関より購入可能である。
野生型のバチルス属細菌としては、例えば枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）が挙げられ、枯草菌変異株としては、Ｃｒｙタンパク質の製造に適するものであれば特に限定されないが、例えば枯草菌野生株のゲノム上に生存、増殖やタンパク質生産にとって不必要な領域が欠失した枯草菌株、特定のプロテアーゼ遺伝子が欠失した枯草菌株、胞子形成期特異的なσ因子遺伝子が欠失した枯草菌株、或いはこれらの変異を組み合わせた枯草菌株等が挙げられる。
【００４０】
ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株は、枯草菌野生株（例えば、枯草菌１６８株）のゲノムと比べて、そのゲノム中の大領域が欠失したゲノムを有するものであり、例えば特許４９５５３５８号に記載の変異株が挙げられる。例えば、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される領域の１以上が欠失した枯草菌変異株が挙げられ、好ましくは、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域の全てを欠失している枯草菌ＭＧＢ８７４株が挙げられる。当該ＭＧＢ８７４株は国立遺伝学研究所ＮＢＲＰ（ナショナルバイオリソースプロジェクト）より分譲可能となっている（http://www.shigen.nig.ac.jp/bsub/kaoListAction.do）さらに、ＭＧＢ８７４株の変異株として、例えば特開２０１７−７９６３９号に記載の、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４ａｂｒＢ＊  ΔｋｉｎＡ）が挙げられる。
【００４１】
特定のプロテアーゼ遺伝子が欠失した枯草菌株としては、例えば特許４４８５３４１号に記載の、枯草菌のａｐｒＸ遺伝子と、枯草菌のａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡから選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌、好ましくは、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡの９個の遺伝子を欠失した９重欠失株（Ｄｐｒ９株）が挙げられる。
【００４２】
また、胞子形成期特異的なσ因子遺伝子が欠失した枯草菌株としては特許４３３６０８２号に記載の、ｓｉｇＦ、ｓｉｇＧ、及び、ｓｉｇＥから選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化した枯草菌株、好ましくはｓｉｇＥ欠失株（ΔｓｉｇＥ株）、ｓｉｇＦ欠失株（ΔｓｉｇＦ株）、より好ましくは、ｓｉｇＦ欠失株（ΔｓｉｇＦ株）が挙げられる。
Ｃｒｙタンパク質の生産の点から、上記ＭＧＢ８７４株に対してｓｉｇＦを欠失させたＭＧＢ８７４ΔｓｉｇＦ変異株、及び上記Ｄｐｒ９株に対してｓｉｇＦを欠失させたＤｐｒ９ΔｓｉｇＦ変異株を用いるのより好ましい。
【００４３】
本発明のＣｒｙタンパク質は、上記の如く調製された発現ベクターを含む形質転換枯草菌を栄養培地で培養することによって発現（生産）することができる。栄養培地は、枯草菌（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、通気撹拌条件、培地のｐＨ及び培養時間等は、本発明のタンパク質が大量に生産されるように適宜選択される。
【００４４】
本発明のＣｒｙタンパク質を含む上記培養により得られる培養物は、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば濃度が１０Ｍ〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液（ｐＨ５．０〜９．０の範囲が望ましい）や水に懸濁することで得られる。さらに、公知の細胞破砕法、例えばリゾチーム、凍結融解、超音波処理、フレンチプレス、ビーズ破砕等を適宜組み合わせることにより細胞を破壊し、遠心分離によりＣｒｙタンパク質を回収することもできる。また、上記培養物を、カルバクロールなどの殺菌効果のある物質を加えてインキュベーションすることにより殺菌処理することもできる（特許文献３）。  
【００４５】
回収されたＣｒｙタンパク質は、ショ糖密度勾配法、再結晶法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、Ｃｒｙタンパク質に対するポリクローナル抗体等をリガンドとしたアフィニテイーカラム等を利用して適宜精製することができる。
【００４６】
上述した実施形態に関し、本発明においてはさらに以下の態様が開示される。
＜１＞Ｃｒｙタンパク質をコードする遺伝子とσＡ依存性プロモーター又はσＨ依存性プロモーターを含む制御領域とが作動可能に連結して組み込まれてなる発現プラスミドでバチルス属細菌を形質転換し、当該形質転換細胞を培養することを含むＣｒｙタンパク質又はそれを含有する培養産物の製造方法であって、前記発現プラスミドが、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる複製タンパク質又はこれとアミノ酸配列において８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、且つ複製開始に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドである、方法。
＜２＞σＡ依存性プロモーター又はσＨ依存性プロモーターを含む制御領域が、Ｃｒｙタンパク質をコードする遺伝子の起源微生物における当該遺伝子の制御領域とは異なる＜１＞の方法。
＜３＞σＡ依存性プロモーター又はσＨ依存性プロモーターを含む制御領域が、ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域である＜１＞又は＜２＞の方法。
＜４＞Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域が、当該遺伝子の転写開始制御領域及び翻訳開始領域である＜３＞の方法。
＜５＞バチルス属細菌が、枯草菌、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）又はバチルス・ブレビス（Bacillus brevis）である＜１＞〜＜４＞のいずれかの方法。
＜６＞バチルス属細菌が、枯草菌である＜１＞〜＜４＞のいずれかの方法。
＜７＞枯草菌が、枯草菌１６８株である＜６＞の方法。
＜８＞枯草菌が、ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌株である＜６＞又は＜７＞の方法。
＜９＞枯草菌が、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡの各遺伝子の全てを欠失又は不活性化させた枯草菌株である＜６＞〜＜８＞のいずれかの方法。
＜１０＞枯草菌が、ｓｉｇＥ、ｓｉｇＦ、ｓｉｇＧから選ばれる遺伝子を欠損させた枯草菌株である＜６＞〜＜８＞のいずれかの方法。
＜１１＞枯草菌が、ｓｉｇＥ、ｓｉｇＦから選ばれる遺伝子を欠損させた枯草菌株である＜６＞〜＜８＞のいずれかの方法。
＜１２＞枯草菌が、ｓｉｇＦ遺伝子を欠損させた枯草菌株である＜６＞〜＜８＞のいずれかの方法。
＜１３＞枯草菌が、枯草菌１６８株、ＭＧＢ８７４株及びＤｐｒ９株から選ばれる枯草菌株又はこれに対してｓｉｇＦ遺伝子を欠損させた枯草菌株である＜１２＞の方法。
＜１４＞枯草菌が、枯草菌ＭＧＢ８７４株に対して、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化されている枯草菌変異株である＜６＞〜＜８＞のいずれかの方法。
＜１５＞Ｃｒｙタンパク質が、Ｃｒｙ５Ｂである＜１＞〜＜１４＞のいずれかの方法。
＜１６＞Ｃｒｙタンパク質が、Ｃｒｙ５Ｂtである＜１＞〜＜１４＞のいずれかの方法。
＜１７＞Ｃｒｙタンパク質が、Ｃｒｙ４Ａａ、Ｃｒｙ４Ｂａ及びＣｒｙ１１Ａａから選ばれる殺蚊タンパク質である＜１＞〜＜１４＞のいずれかの方法。
【００４７】
＜１８＞バチルス属細菌内でＣｒｙタンパク質を発現するための発現プラスミドであって、配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる複製タンパク質又はこれとアミノ酸配列において８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、且つ複製開始に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、Ｃｒｙタンパク質をコードする遺伝子とσＡ依存性プロモーター又はσＨ依存性プロモーターを含む制御領域とが作動可能に連結されてなる、発現プラスミド。
＜１９＞σＡ依存性プロモーター又はσＨ依存性プロモーターを含む制御領域が、Ｃｒｙタンパク質をコードする遺伝子の起源微生物における当該遺伝子の制御領域とは異なる＜１８＞の発現プラスミド。
＜２０＞σＡ依存性プロモーター又はσＨ依存性プロモーターを含む制御領域が、ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域を含む＜１８＞又＜１９＞の発現プラスミド。
＜２１＞Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域が、当該遺伝子の転写開始制御領域及び翻訳開始領域である＜２０＞の発現プラスミド。
＜２２＞Ｃｒｙタンパク質が、Ｃｒｙ５Ｂである＜１８＞〜＜２１＞のいずれか１項記載の発現プラスミド。
＜２３＞Ｃｒｙタンパク質が、Ｃｒｙ５Ｂtである＜１８＞〜＜２１＞のいずれか１項記載の発現プラスミド。
＜２４＞Ｃｒｙタンパク質が、Ｃｒｙ４Ａａ、Ｃｒｙ４Ｂａ及びＣｒｙ１１Ａａから選ばれる殺蚊タンパク質である＜１８＞〜＜２１＞のいずれか１項記載の発現プラスミド。
【００４８】
＜２５＞＜１８＞〜＜２４＞のいずれか１項記載の発現プラスミドを導入したバチルス属細菌。
＜２６＞＜２５＞のバチルス属細菌が、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）又はバチルス・ブレビス（Bacillus brevis）である。
＜２７＞＜２６＞の枯草菌が、枯草菌１６８株である。
＜２８＞＜２６＞又は＜２７＞の枯草菌がｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌株である。
＜２９＞＜２６＞〜＜２８＞のいずれか１項記載の枯草菌がｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域が欠失したゲノムを有する枯草菌株である。
＜３０＞＜２６＞〜＜２９＞のいずれか１項記載の枯草菌が、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡから選択される１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株である。
＜３１＞＜２６＞〜＜３０＞のいずれか１項記載の枯草菌が、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡ遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株である。
＜３２＞＜２６＞〜＜３１＞のいずれか１項記載の枯草菌が、ｓｉｇＥ、ｓｉｇＦ、ｓｉｇＧから選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株である。
＜３３＞＜２６＞〜＜３２＞のいずれか１項記載の枯草菌が、ｓｉｇＦ遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株である。
＜３４＞＜２６＞〜＜３３＞のいずれか１項記載の枯草菌が、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化されている枯草菌である。
【００４９】
＜３５＞σＡ依存性プロモーター含む制御領域が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域である、＜１８＞〜＜３４＞のいずれか１項記載の発現プラスミド又は枯草菌。
＜３６＞Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域が配列番号１０で示される塩基配列に対して８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有しており、且つσＡ因子依存性プロモーターとして遺伝子の転写に関わる機能、および、翻訳に関わる機能を保持している配列である、＜３５＞記載の発現プラスミド又は枯草菌。
＜３７＞σＨ因子依存性プロモーターを含む制御領が、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）のｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域である、＜１８＞〜＜３４＞のいずれか１項記載の発現プラスミド又は枯草菌。
＜３８＞ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域が、配列番号１２で示される塩基配列に対して８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つσＨ因子依存性プロモーターとして遺伝子の転写に関わる機能、および、翻訳に関わる機能を保持している配列である、＜３７＞の発現プラスミド又は枯草菌。
【実施例】
【００５０】
実施例１  Ｃｒｙ５Ｂタンパク質を含む培養物の製造
１．人工遺伝子の合成
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ＹＢＴ−１５１８由来の殺虫タンパク質遺伝子ｃｒｙ５Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００５９３５．１、配列番号１）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（アメリカ）により人工合成した。合成した遺伝子の３７３８  ｂｐはｐＵＣ５７のＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩサイトにクローニングし、ｐＵＣ５７−ｃｒｙ５Ｂを得た。
【００５１】
２．発現プラスミドの構築
全ての発現プラスミドの構築において、ベクターとしてｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）、およびターミネターとしてＳ２３７セルラーゼ遺伝子由来配列を用いた。プロモーターはＳ２３７セルラーゼ遺伝子［Hakamada et al, Biosci. Biotechnol. Biochem.,  64 (2000), 2281-2289］あるいは枯草菌１６８株のｓｐｏＶＧ遺伝子由来、シグナル配列はＳ２３７セルラーゼ由来あるいは無し、ｃｒｙ５Ｂ遺伝子は全長（ｃｒｙ５Ｂ）あるいは短縮型（ｃｒｙ５Ｂｔ）の組み合わせで、８種のプラスミドの作製を行った（図１−Ａ〜Ｄ）。ｃｒｙ５Ｂ遺伝子の全長（３７３８ｂｐ）は、配列番号１で示されるが、塩基番号２０９５−３７３８番の塩基配列は線虫の腸内において分解される領域で、塩基番号１−２０９４番の塩基配列は分解された後の活性化Ｃｒｙｓｔａｌ  ｔｏｘｉｎをコードする配列［Hui et al,  2012, Biochemistry, vol 11, p 9911-21］であり、全長型は全配列（１−３７３８番）、短縮型は塩基番号１−２０９４番の配列である。
【００５２】
構築方法はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  ＥｃｏＤｒｙTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉtのプロトコールに従った。各プラスミドの作製過程は図１−Ａ〜Ｄに示した。
【００５３】
２．１  ｐＰｓＳｃｒｙ５ＢとｐＰｓＳｃｒｙ５Ｂｔの構築
表２に示すｖｅｃｔ＋ｐｓＦとｖｅｃｔ＋ｔＲのプライマーセットを用いて、ｐＨＹＳ２３７  ＤＮＡを鋳型にＳ２３７のプロモーター、シグナル及びターミネター領域を含むベクターを増幅した。次に、ｐＵＣ５７−ｃｒｙ５Ｂ  ＤＮＡを鋳型にｃｒｙ５ＢｐｓｓＦとｃｒｙ５ＢｔＲ（あるいはＴ２３７−ｃｒｙ５ＢａｔＲＮ）のプライマーセットを用いてｃｒｙ５Ｂ遺伝子全長（あるいは短縮型）のインサートをＰＣＲで増幅した。続いて、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  ＥｃｏＤｒｙTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてベクターとインサートを連結した後、大腸菌ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ）に形質転換した。テトラサイクリン耐性により選抜した形質転換体をコロニーＰＣＲにより確認し、ｐＰｓＳｃｒｙ５Ｂ（あるいはｐＰｓＳｃｒｙ５Ｂｔ）と命名した（図１−Ａ）。抽出したプラスミドについて、さらにＰＣＲ確認、また、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩとＸｂａＩを用いてプラスミドの消化パターンの確認を行った。
【００５４】
【表２】
2019122270.tif 000005
【００５５】
２．２  ｐＰｓｃｒｙ５ＢとｐＰｓｃｒｙ５Ｂｔの構築
表２に示すｖｅｃｔ＋ｐＦとｖｅｃｔ＋ｔＲのプライマーセットを用いて、ｐＨＹＳ２３７  ＤＮＡを鋳型にＳ２３７のプロモーター、及びターミネター領域を含むベクターを増幅した。次に、ｐＵＣ５７−ｃｒｙ５Ｂ  ＤＮＡを鋳型にｃｒｙ５ＢｐＦとｃｒｙ５ＢｔＲ（あるいはＴ２３７−ｃｒｙ５ＢａｔＲＮ）のプライマーセットを用いてｃｒｙ５Ｂ遺伝子全長（あるいは短縮型）のインサートをＰＣＲで増幅した。続いて、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  ＥｃｏＤｒｙTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてベクターとインサートを連結した後、大腸菌ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ）に形質転換した。テトラサイクリン耐性により選抜した形質転換体をコロニーＰＣＲにより確認し、ｐＰｓｃｒｙ５Ｂ（あるいはｐＰｓｃｒｙ５Ｂｔ）と命名した（図１−Ｂ）。抽出したプラスミドについて、さらにＰＣＲ確認、また、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩとＸｂａＩを用いてプラスミドの消化パターンの確認を行った。
【００５６】
２．３  ｐＰｖｃｒｙ５ＢとｐＰｖｃｒｙ５Ｂｔの構築
表２に示すｖｅｃｔＲとｖｅｃｔ＋ｔＲのプライマーセットを用いて、ｐＨＹＳ２３７  ＤＮＡを鋳型にＳ２３７のターミネター領域を含むベクターを増幅した。次に、ｐＵＣ５７−ｃｒｙ５Ｂ  ＤＮＡを鋳型にｃｒｙ５ＢａＦとｃｒｙ５ＢｔＲ（あるいはＴ２３７−ｃｒｙ５ＢａｔＲＮ）のプライマーセットを用いてｃｒｙ５Ｂ遺伝子全長（あるいは短縮型）のインサートをＰＣＲで増幅した。また、Ｖｅｃｔ−ＰｖｇＦとｃｒｙ５Ｂａ−ＰｖｇＲのプライマーセットを用いて、枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡを鋳型にｓｐｏＶＧ遺伝子のプロモーター領域を２つ目のインサートとして増幅した。続いて、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  ＥｃｏＤｒｙTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてベクターと２つのインサートを連結した後、大腸菌ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ）に形質転換した。テトラサイクリン耐性により選抜した形質転換体をコロニーＰＣＲにより確認し、ｐＰｖｃｒｙ５Ｂ（あるいはｐＰｖｃｒｙ５Ｂｔ）と命名した（図１−Ｃ）。抽出したプラスミドについて、さらにＰＣＲ確認、また、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩとＸｂａＩを用いてプラスミドの消化パターンの確認を行った。
【００５７】
２．４  ｐＰｖＳｃｒｙ５ＢとｐＰｖＳｃｒｙ５Ｂｔの構築
表２に示すｖｅｃｔＲとｖｅｃｔ＋ｔＲのプライマーセットを用いて、ｐＨＹＳ２３７  ＤＮＡを鋳型にＳ２３７のターミネター領域を含むベクターを増幅した。次に、ｐＰｓＳｃｒｙ５Ｂ  ＤＮＡを鋳型にＳ２３７Ｆとｃｒｙ５ＢｔＲ（あるいはＴ２３７−ｃｒｙ５ＢａｔＲＮ）のプライマーセットを用いてＳ２３７のシグナル配列が連結したｃｒｙ５Ｂ遺伝子全長（あるいは短縮型）のインサートをＰＣＲで増幅した。また、Ｖｅｃｔ−ＰｖｇＦとＳ２３７−ＰｖｇＲのプライマーセットを用いて、枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡを鋳型にｓｐｏＶＧ遺伝子のプロモーター領域を２つ目のインサートとして増幅した。続いて、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  ＥｃｏＤｒｙTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてベクターと２つのインサートを連結した後、大腸菌ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ）に形質転換した。テトラサイクリン耐性により選抜した形質転換体をコロニーＰＣＲにより確認し、ｐＰｖＳｃｒｙ５Ｂ（あるいはｐＰｖＳｃｒｙ５Ｂｔ）と命名した（図１−Ｄ）。抽出したプラスミドについて、さらにＰＣＲ確認、また、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩとＸｂａＩを用いてプラスミドの消化パターンの確認を行った。
【００５８】
３．プラスミドのシーケンス確認
構築した８種のプラスミドについてシーケンス確認を行った。シーケンスの鋳型をＰＣＲにより調製し、全長ｃｒｙ５Ｂの４種のプラスミドは、表２示したｆｒａｇ１−Ｆとｆｒａｇ１−Ｒまたは  ｆｒａｇ２−Ｆとｆｒａｇ２−Ｒのプライマーを用いてそれぞれ５’側と３’側の断片を調製した。短縮型ｃｒｙ５Ｂの４種のプラスミドは、表２示したｆｒａｇ１−Ｆとｆｒａｇ２−Ｒのプライマーを用いて断片の調製を行った。それらのＰＣＲ産物について表２に示したＳＥＱ−Ｐ１〜ＳＥＱ−Ｐ１０の１０個のプライマーを用いたシーケンス解析を行った。解析の結果、すべてのプラスミドについて、変異がなかったことから、全てのプラスミドが設計通りに構築できたことが確認された。
【００５９】
４．分泌シグナルを持つプラスミドによる枯草菌野生株でのＣｒｙ５Ｂタンパク質、および、短縮型Ｃｒｙ５Ｂ（Ｃｒｙ５Ｂｔ）タンパク質の発現
構築した４種の分泌シグナルを持つプラスミド（図１−Ａ、Ｄ）を、トリプトファン栄養要求性を解除した枯草菌１６８株（１６８Ｔ株）（特開２０１７−７９６４０号公報）に形質転換し、得られた形質転換体をテトラサイクリン含有２ｘＬ／ｍａｌ培地（バクトトリプトン２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１．０％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム１．０％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン五水和物（和光純薬工業株式会社製）０．０００７５％（ｗ／ｖ）、マルトース一水和物（和光純薬工業株式会社製）７．５％（ｗ／ｖ）、テトラサイクリン塩酸塩０．００１５％（ｗ／ｖ））で３日間、３０℃、２５０ｒｐｍ振盪培養した。培養液１ｍＬを１５０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離し、培養上清と細胞に分けた。調製した培養上清のＣｒｙ５Ｂの発現についてＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認を行った結果、Ｃｒｙ５Ｂのバンドが認められなかった（図２）。
【００６０】
５．分泌シグナルを持たないプラスミドによる枯草菌野生株でのＣｒｙ５Ｂタンパク質の発現
構築した分泌シグナルを持たないプラスミド（図１−Ｂ、Ｃ）のうち、Ｃｒｙ５Ｂタンパク質を発現するための２種類のプラスミド＜５＞、＜６＞（図３）を、トリプトファン栄養要求性を解除した枯草菌１６８株（１６８Ｔ株）に形質転換し、得られた形質転換体を、２ｘＬ／ｍａｌ培地で３日間、３０℃、２５０ｒｐｍ振盪培養した。培養液１ｍＬを１５０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離し、培養上清と細胞に分けた。細胞ペレットは１ｘＰＢＳを用いて洗浄した後、１ｍＬ  １ｘＰＢＳに懸濁し、１ｍｇ／ｍＬリゾチームを添加して、３７℃で１ｈｒ保温した。続いて、ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ（Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ）を用いて、３０秒ｘ２０回ソニケーションにより細胞破砕を行った後に、１５０００ｒｐｍ、４℃で３０分遠心分離し、上清を捨てて沈殿を１ｍＬ  １ｘＰＢＳに懸濁し、細胞破砕液とした。調製した細胞破砕液のＣｒｙ５Ｂの発現についてＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認を行った結果、ｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ５Ｂ（＜５＞）およびｐＨＹ−Ｐｖｃｒｙ５Ｂ（＜６＞）による高発現が確認された。ｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ５ＢとｐＨＹ−Ｐｖｃｒｙ５Ｂは全長型の１４０ｋＤで、いずれも推定サイズと一致した（図３）。
【００６１】
６．枯草菌変異株でのＣｒｙ５Ｂタンパク質の発現（１）
枯草菌野生株ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４株；特許４９５５３５８）、プロテアーゼの９重欠失株（Ｄｐｒ９株；特許４４８５３４１）、ｓｉｇＦ欠失株（ΔｓｉｇＦ株；特許４３３６０８２）、ＭＧＢ８７４ΔｓｉｇＦ株、Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ株を宿主にそれぞれｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ５Ｂの形質転換を行った。ＭＧＢ８７４ΔｓｉｇＦ株とＤｐｒ９ΔｓｉｇＦ株、ＭＧＢ８７４ａｂｒＢ*ΔｋｉｎＡ株(特開２０１７−７９６３９号公報)は、ΔｓｉｇＦ株の構築と同様な方法で、ＭＧＢ８７４とＤｐｒ９株をベースにそれぞれｓｉｇＦを削除することにより作成した。上記４と同様に２ｘＬ／ｍａｌ培地で培養し、調製した細胞破砕液のＣｒｙ５Ｂ発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。その結果、野生株の１６８Ｔ株に比べ、ＭＧＢ８７４株、Ｄｐｒ９株、ｓｉｇＦ欠失株、ＭＧＢ８７４ΔｓｉｇＦ株、Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ株で発現したＣｒｙ５Ｂのバンドが明らかに太いことが分かった（図４−Ａ）。
【００６２】
７．枯草菌変異株でのＣｒｙ５Ｂタンパク質の発現（２）
ｓｉｇＥ欠失株（ΔｓｉｇＥ株；特許４３３６０８２）を宿主にｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ５Ｂの形質転換を行った。上記４と同様に、２ｘＬ／ｍａｌ培地で培養し、調製した細胞破砕液のＣｒｙ５Ｂ発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。その結果、ｓｉｇＥ欠失株においてもＣｒｙ５Ｂのバンドが明らかに太いことが分かった（図４−Ｂ）。
【００６３】
８．バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）でのＣｒｙ５Ｂタンパク質の発現
Ｃｒｙ５Ｂタンパク質を発現するためのプラスミドｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ５Ｂを、プロトプラスト法によってBacillus megaterium ATCC 14581株（以下14581株）に導入した。得られた組換え株を実施例１の５と同様に、２ｘＬ／ｍａｌ培地で培養し、調製した細胞破砕液のＣｒｙ５Ｂ発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。その結果、ｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ５Ｂを導入した形質転換体において、Ｃｒｙ５Ｂの太いバンドを確認した。
【００６４】
９．発現したＣｒｙ５Ｂタンパク質の定量
米国国立衛生研究所（National Institute of Health, NIH）が開発した画像ソフトＩｍａｇｅＪ（http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のバンドの定量を行った。標準タンパク質としてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（和光純薬工業株式会社製）およびｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ５Ｂ形質転換体で発現したＣｒｙ５ＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、Bio-SafeTM Coomassie （BIO-RAD）で1時間振盪しながら染色した。イオン交換水にて脱色後、ゲルの撮影を行った。ＩｍａｇｅＪを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥの画像に対して各バンドの輝度を解析し、ＢＳＡの検量線を作成した。この検量線からＣｒｙ５Ｂタンパク質量を計算した（表３、表４、表５）。表３に示すように、枯草菌野生株でのＣｒｙ５Ｂ生産性が１．１ｇ／Ｌであり、組換え生産の文献値（７５ｍｇ／Ｌ）より１５倍高いことが分かった。ＭＧＢ８７４ΔｓｉｇＦ株を用いることにより生産性が更に２倍以上向上した。
【００６５】
【表３】
2019122270.tif 000006
【００６６】
【表４】
2019122270.tif 000007
【００６７】
【表５】
2019122270.tif 000008
【００６８】
１０．Ｃｒｙ５Ｂの活性評価
１０．１  抱卵成虫の調製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＯＰ５０−１）溶液（１ｇ湿重／６ｍＬ  Ｓ培地）７５０μＬ，ストレプトマイシン（１ｍｇ／ｍＬ）溶液１００μＬ、Ｌ１幼虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）１０００頭を含んだ液をＮＧＭプレートに滴下し、これを２０℃のインキュベーター内で３〜４日培養し、抱卵成虫を得た。
【００６９】
１０．２  第一期（Ｌ１））幼虫の調製
線虫を培養しておいたＮＧＭプレート（表６）をＳ  ｂａｓａｌで３回ほど洗い、全て１５ｍＬ遠心管に移した。上澄みを捨て、沈殿している線虫を１．５ｍＬエッペンチューブに移した。しばらく放置した後，１ｍＬまで上澄みを除き，そこへ４Ｍ  ＮａＯＨ  ２５０μＬ，次亜塩素酸ナトリウム溶液（Ｗａｋｏ）２５０μＬを加え，軽く撹拌した。３分静置した後、卓上ミニ遠心分離機で３０秒程度スピンダウンを行った。沈殿物を残して上澄みを取り除き、１．５ｍＬまでＳ  ｂａｓａｌを加え、軽く撹拌した後３０秒程度スピンダウンを行った。この操作を３回繰り返した。これにより得られた卵の沈殿全量を３５ｍｍ径シャーレに移し、２０℃で約２４時間培養し、ふ化した第一期幼虫（Ｌ１幼虫）を得た。
【００７０】
１０．３  Ｌ１  ｇｒｏｗｔｈ  アッセイ
Ｂｉｓｃｈｏｆらの方法（Methods in Molecular Biology, vol. 331, pp139-154, C. elegans: Methods and applications, Edited by: K. Strange, Humana Press）に従い、Ｌ１  ｇｒｏｗｔｈアッセイを行った。４８穴平底プレートを用い、各ウェルに１ｇ／３５ｍＬの大腸菌溶液を２０μＬ、１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを２０μＬ、Ｌ１幼虫１０匹、枯草菌で発現したＣｒｙ５Ｂタンパク質を適量、Ｓ培地（表７）で総量を２００μＬに調整した。Ｃｒｙ５Ｂのタンパク質量は１．２５、２．５、５μｇ／ｍＬを使用した。コントロールはベクター（ｐＨＹ３００ＰＬＫ）を導入した枯草菌を使用した。２０℃で３日間培養した後、各ウェルの線虫の様子をカメラで撮影した（図５）。撮影した画像をＩｍａｇｅ  Ｊを用いて、線虫の輪郭を書き、面積を計算した。その結果を図６に示した。Ｃｒｙ５Ｂを使用することにより、線虫の生育が顕著に抑制され、コントロールに比べ１．２５μｇ／ｍＬの濃度でも生育が約８０％抑制された。この結果から、枯草菌で発現したＣｒｙ５Ｂが線虫に対する毒性を有することを証明した。
【００７１】
・培地成分
（１）ＮＧＭ：
【００７２】
【表６】
2019122270.tif 000009
【００７３】
（２）Ｓ  ｂａｓａｌ：０．１Ｍ  ＮａＣｌ，０．０５Ｍ  ＫＨＰＯ４（ｐＨ６．０）
【００７４】
（３）Ｓ培地：
【００７５】
【表７】
2019122270.tif 000010
【００７６】
１１．分泌シグナルを持たないプラスミドによる枯草菌野生株での短縮型Ｃｒｙ５Ｂ（Ｃｒｙ５Ｂｔ）タンパク質の発現
分泌シグナルを持たない短縮型Ｃｒｙ５Ｂ（Ｃｒｙ５Ｂｔ）のプラスミドｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ５Ｂｔ＜７＞を、トリプトファン栄養要求性を解除した枯草菌１６８株（１６８Ｔ株）に形質転換し、得られた形質転換体を２ｘＬ／ｍａｌ培地で３日間、３０℃、２５０ｒｐｍ振盪培養した。培養液１ｍＬを１５０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離し、培養上清と細胞に分けた。細胞ペレットは１ｘＰＢＳを用いて洗浄した後、１ｍＬ  １ｘＰＢＳに懸濁し、１ｍｇ／ｍＬリゾチームを添加して、３７℃で１ｈｒ保温した。続いて、Ｂｉｏｒｕｐｔｅｒ（Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ）を用いて、３０秒ｘ２０回ソニケーションにより細胞破砕を行った後に、１５０００ｒｐｍ、４℃で３０分遠心分離し、上清を捨てて沈殿を１ｍＬ  １ｘＰＢＳに懸濁し、細胞破砕液とした。調製した細胞破砕液のＣｒｙ５Ｂｔの発現についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図７）。その結果、ｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ５Ｂｔによる高発現が確認された。蛋白質バンドのサイズは７９ｋＤであり、短縮型Ｃｒｙ５Ｂの推定サイズと一致した。
【００７７】
実施例２  殺蚊タンパク質（Ｃｒｙ４Ａａ、Ｃｒｙ４Ｂａ、Ｃｒｙ１１Ａａ）の製造
１．人工遺伝子の合成  
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ由来の殺虫タンパク質遺伝子ｃｒｙ４Ａａ（ＧｅｎＢａｎｋ：  ＹＰ＿００１５７３８３３、配列番号３）、ｃｒｙ４Ｂａ（ＧｅｎＢａｎｋ：  ＮＣ＿０１００７６、配列番号５）およびｃｒｙ１１Ａａ（ＧｅｎＢａｎｋ：  ＮＣ＿０１００７６、配列番号７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（アメリカ）により人工合成した。合成した遺伝子はｐＵＣ５７のＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩサイトにクローニングし、それぞれｐＵＣ５７−ｃｒｙ４Ａａ、ｐＵＣ５７−ｃｒｙ４ＢａとｐＵＣ５７−ｃｒｙ１１Ａａのプラスミドを得た。
【００７８】
２．発現プラスミドの構築
全ての発現プラスミドの構築において、ベクターとしてｐＨＹ３００ＰＬＫ、およびターミネターとしてＳ２３７セルラーゼ遺伝子由来配列を用いた。プロモーターは当研究室で実績のあるＳ２３７セルラーゼ遺伝子［Hakamada et al, Biosci. Biotechnol. Biochem., 64 (2000), 2281-2289］あるいは枯草菌１６８株のｓｐｏＶＧ遺伝子由来、ｃｒｙ４Ａａ、ｃｒｙ４Ｂａ、ｃｒｙ１１Ａａの３つの遺伝子との組み合わせで、図８に示した６種のプラスミドの作製を行った。ｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ４Ａａ、ｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ４Ｂａ、ｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ４ＡａはＳ２３７セルラーゼ遺伝子のプロモーター、ｐＨＹ−Ｐｖｃｒｙ４Ａａ、ｐＨＹ−Ｐｖｃｒｙ４Ｂａ、ｐＨＹ−Ｐｖｃｒｙ４Ａａは枯草菌１６８株のｓｐｏＶＧ遺伝子のプロモーターを使用した。構築方法はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ(R)  ＨＤ  ＥｃｏＤｒｙTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔのプロトコールに従った。
【００７９】
２．１  ｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ４Ａａ、ｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ４ＢａとｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ１１Ａａの構築
表８に示すｖｅｃｔ＋ｐＦとｖｅｃｔ＋ｔＲのプライマーセットを用いて、ｐＨＹＳ２３７  ＤＮＡを鋳型にＳ２３７のプロモーター、及びターミネター領域を含むベクターを増幅した。次に、ｐＵＣ５７−ｃｒｙ４Ａａ  ＤＮＡを鋳型にｃｒｙ４ＡＦＰＳとｃｒｙ４ＡＲＴのプライマーセットを用いてｃｒｙ４Ａａ遺伝子のインサートをＰＣＲで増幅した。続いて、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  ＥｃｏＤｒｙTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてベクターとインサートを連結した後、大腸菌ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ）に形質転換した。テトラサイクリン耐性により選抜した形質転換体をコロニーＰＣＲにより確認し、ｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ４Ａａと命名した。抽出したプラスミドについて、さらにＰＣＲ確認、また、制限酵素を用いてプラスミドの消化パターンの確認を行った。
上記と同様に、ｐＵＣ５７−ｃｒｙ４Ｂａ  ＤＮＡを鋳型にｃｒｙ４ＢＦＰＳとｃｒｙ４ＢＲＴのプライマーセットを用いてｃｒｙ４Ｂａ遺伝子、ｐＵＣ５７−ｃｒｙ１１Ａａ  ＤＮＡを鋳型にｃｒｙ１１ＡＦＰＳとｃｒｙ１１ＡＲＴのプライマーセットを用いてｃｒｙ１１Ａａ遺伝子のインサートをそれぞれＰＣＲで増幅し、ｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ４ＢａとｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ１１Ａａの構築を行った。
【００８０】
【表８】
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【００８１】
２．２  ｐＨＹ−Ｐｖｃｒｙ４Ａａ、ｐＨＹ−Ｐｖｃｒｙ４Ｂａ、ｐＨＹ−Ｐｖｃｒｙ１１Ａａの構築
表８に示すｖｅｃｔ＋ｐｖｇＦとｖｅｃｔ＋ｔＲのプライマーセットを用いて、ｐＨＹ−Ｐｓｃｒｙ５Ｂ（Ｃｒｙ５Ｂの実施例参考）を鋳型にｓｐｏＶＧ遺伝子のプロモーター、及びＳ２３７セルラーゼ遺伝子のターミネター領域を含むベクターを増幅した。次に、ｐＵＣ５７−ｃｒｙ４Ａａ  ＤＮＡを鋳型にｃｒｙ４ＡＦＰＶとｃｒｙ４ＡＲＴのプライマーセットを用いてｃｒｙ４Ａａ遺伝子のインサートをＰＣＲで増幅した。続いて、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  ＥｃｏＤｒｙTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてベクターとインサートを連結した後、大腸菌ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ）に形質転換した。テトラサイクリン耐性により選抜した形質転換体をコロニーＰＣＲにより確認し、ｐＨＹ−Ｐｖｃｒｙ４Ａａと命名した。抽出したプラスミドについて、さらにＰＣＲ確認、また、制限酵素を用いてプラスミドの消化パターンの確認を行った。
【００８２】
上記と同様に、ｐＵＣ５７−ｃｒｙ４Ｂａ  ＤＮＡを鋳型にｃｒｙ４ＢＦＰＶとｃｒｙ４ＢＲＴのプライマーセットを用いてｃｒｙ４Ｂａ遺伝子、ｐＵＣ５７−ｃｒｙ１１Ａａ  ＤＮＡを鋳型にｃｒｙ１１ＡＦＰＶとｃｒｙ１１ＡＲＴのプライマーセットを用いてｃｒｙ１１Ａａ遺伝子のインサートをそれぞれＰＣＲで増幅し、ｐＨＹ−Ｐｖｃｒｙ４ＢａとｐＨＹ−Ｐｖｃｒｙ１１Ａａの構築を行った。
【００８３】
３．枯草菌での殺蚊タンパク質の発現
構築した６種のプラスミド（図８）をトリプトファン栄養要求性を解除した枯草菌１６８株（１６８Ｔ株）に形質転換し、得られた形質転換体を２ｘＬ／ｍａｌ培地で３日間、３０℃、２５０ｒｐｍ振盪培養した。培養液１ｍＬを１５０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離し、培養上清と細胞に分けた。細胞ペレットは１ｘＰＢＳを用いて洗浄した後、１ｍＬ  １ｘＰＢＳに懸濁し、１ｍｇ／ｍＬリゾチームを添加して、３７℃で１ｈｒ保温した。続いて、Ｂｉｏｒｕｐｔｅｒ（Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ）を用いて、３０秒ｘ２０回ソニケーションにより細胞破砕を行った後に、１５０００ｒｐｍ、４℃で３０分遠心分離し、上清を捨てて沈殿を１ｍＬ  １ｘＰＢＳに懸濁し、細胞破砕液とした。調製した細胞破砕液中のタンパク質の発現についてＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認を行った。結果は図９に示したように、すべてのプラスミドにおいて、高発現が認められた。
【００８４】
４．発現した殺蚊タンパク質の定量
米国国立衛生研究所（National Institute of Health, NIH）が開発した画像ソフトＩｍａｇｅＪ（http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のバンドの定量を行った。標準タンパク質としてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用した。ＩｍａｇｅＪを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥの画像に対して各バンドの輝度を解析し、ＢＳＡの検量線を作成した。この検量線から各殺蚊タンパク質の量を計算した。表９に示すように、０．６−０．７ｇ／Ｌの生産性が確認された。
【００８５】
【表９】
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【００８６】
５．殺蚊タンパク質の活性評価
５．１  ボウフラの調製
ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）は住化テクノサービス株式会社より購入した卵を孵化させたものを使用した。プラスチックパンに水を１ｃｍ程度張り、卵が産みつけられているろ紙を入れた。毎日孵化後のボウフラ用餌として熱帯魚用のエサ（テトラミンベビー）を与えた。孵化後５日目のボウフラを活性評価に用いた。
【００８７】
５．２  殺蚊活性評価
Ｌｅｅｔａｃｈｅｗａらの方法（BMB reports, 47 (2014), 546-551）に従い、枯草菌で発現したＣｒｙ４Ａａ、Ｃｒｙ４ＢａとＣｒｙ１１Ａａの殺蚊活性評価を行った。２４穴平底プレートを用い、各ウェルに５日齢ボウフラ１０匹、殺蚊タンパク質濃度は５０μｇ／ｍＬ、水で総量を１ｍＬに調整した。２５℃で２４ｈ放置した後、死滅したボウフラの数を数え、死亡率を算出した。その結果は表１０に示した。対照の死亡率が０％に対して、Ｃｒｙ４Ａａ、Ｃｒｙ４Ｂａ、Ｃｒｙ１１Ａａはそれぞれ９３．３％、９３．３％と７６．７％を示した。この結果から、枯草菌で発現した殺蚊タンパク質は高い殺蚊効果が認められた。
【００８８】
【表１０】
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【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図１−Ｃ】
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【図１−Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４−Ａ】
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【図４−Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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