(57)【要約】【課題】菌根性茸の子実体を発生させることができる簡便な菌根性茸類の種菌調製方法及び接種方法を提供する。【解決手段】本発明の菌根性茸類の種菌調製方法は、（１）菌根性茸類の菌糸体破砕物と、菌根性茸類の菌糸体の成長に必要な栄養分を含まない無菌の担体との混合物を調製する工程と、（２）栄養分を含む固体栄養培地を、栄養分と水分は透過するが菌糸体及び担体は透過しない多孔質膜で覆う工程と、（３）混合物を多孔質膜上に配置して、菌根性茸類の菌糸体を培養して種菌を得る工程と、（４）種菌と固体栄養培地とを多孔質膜の上下で分離する工程とを含む方法である。また、本発明の菌根性茸類の接種方法は、本発明の菌根性茸類の種菌調製方法により調製された種菌を使用する方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）菌根性茸類の菌糸体破砕物と、菌根性茸類の菌糸体の成長に必要な栄養分を含まない無菌の担体との混合物を調製する工程と、
（２）栄養分を含む固体栄養培地を、栄養分と水分は透過するが菌糸体及び担体は透過しない多孔質膜で覆う工程と、
（３）混合物を多孔質膜上に配置して、菌根性茸類の菌糸体を培養して種菌を得る工程と、
（４）種菌と固体栄養培地とを多孔質膜の上下で分離する工程と、
を含む菌根性茸類の種菌調製方法。
【請求項２】
菌根性茸類が、バカマツタケである請求項１に記載の菌根性茸類の種菌調製方法。
【請求項３】
多孔質膜が、セロハンシートである請求項１に記載の菌根性茸類の種菌調製方法。
【請求項４】
請求項１から請求項３の何れかに記載の方法で調製された菌根性茸類の種菌を使用する菌根性茸類の接種方法。
【請求項５】
（１）請求項１から請求項３の何れかに記載の方法で調製された菌根性茸類の種菌と、宿主植物とを準備する工程と、
（２）菌根性茸類の種菌と宿主植物の根部とを接触させ、これらを透水膜で覆って密着させ、宿主植物・種菌複合体を製作する工程と、
（３）宿主植物・種菌複合体を接種場所に接種する工程と、
を含む請求項４に記載の菌根性茸類の接種方法。
【請求項６】
宿主植物・種菌複合体を製作する際に使用する透水膜が、セロハンシートである請求項５に記載の菌根性茸類の接種方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菌根性茸類の種菌調製方法及び接種方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
菌根性茸類は、マツ科、ブナ科、カバノキ科などの樹木根と共生（菌根形成）して生活する。そのため、菌根性茸が発生しない林地において、茸子実体を発生させるには、菌根性茸の種菌を林地等に接種して、樹木根と菌根形成させる必要がある。
【０００３】
林地等に接種する種菌を人工的に調整する場合は、目的となる菌根性茸の菌糸を何らかの担体に蔓延させ、固形の培養物として調製する必要がある。液体培養した菌糸体では、目的の位置に設置するのが困難なためである。
【０００４】
さて、茸の菌糸が成長するには、窒素、リン酸、カリウム、その他微量ミネラル成分、ビタミンのほかに、ブドウ糖などのエネルギー源となる有機物が必要である。そのため、林地接種に使用する種菌の調製には、これら有機物等を鉱物質の担体にしみこませたものを一般的に使用する。
【０００５】
しかし、菌糸体が担体全体に蔓延して種菌が完成した段階でも、培地含まれる有機物はそのかなりの部分が消費されずに残存している。そのため、種菌を土壌等に埋設した場合、土壌中の成長が旺盛な糸状菌やバクテリアが、残存した有機物を利用して目的とした菌根菌の菌糸体を駆逐してしまう。これによって、ホンシメジなど菌糸の成長が旺盛な一部の菌根性茸を除き、培養した種菌を林地に接種しても、宿主植物と菌根共生を成して、茸の子実体を発生させることができなかった。
【０００６】
林地等に接種したのちの土着の微生物対策としては、従来から、様々な方法が考え出されている。具体的には、培地担体に菌根菌の生育を阻害しない程度の殺菌剤を混和して、種菌を調製する方法（特許文献１を参照。）、水不透性シートを使用して接種部位を野外の条件から物理的に隔離する方法（特許文献２を参照。）、飢餓培養により担体中の有機物を低減する方法（特許文献３を参照。）などが考え出されている。ただ、いずれの方法も目的とする茸の子実体は発生できていなかった。
【０００７】
また、高糖濃度の寒天培地と低糖濃度の担体を接して配置して培養することによって、低糖濃度の担体に菌根性茸の菌糸体を蔓延させる方法が考えられている（特許文献４を参照。）。ただ、この方法は、特別な培養容器を作製することが必要なうえ、寒天培地まで菌糸が延伸し、接種前の寒天培地と担体との分離作業が煩雑となるので、簡易に実施することができなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０００−９２９８３号
【特許文献２】特開２００５−５２０８８号
【特許文献３】特許第３６９６５７９号
【特許文献４】特許第３９５６１３９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、菌根性茸の子実体を発生させることができる簡便な菌根性茸類の種菌調製方法及び接種方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者は、鋭意検討の結果、糖類やアミノ酸、ビタミン類、無機塩類、水分などはセロハンシート等の多孔質膜を透過できるが、菌根性茸の菌糸体は多孔質膜を通過できないことに着目し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明の請求項１に記載の菌根性茸類の種菌調製方法は、（１）菌根性茸類の菌糸体破砕物と、菌根性茸類の菌糸体の成長に必要な栄養分を含まない無菌の担体との混合物を調製する工程と、（２）栄養分を含む固体栄養培地を、栄養分と水分は透過するが菌糸体及び担体は透過しない多孔質膜で覆う工程と、（３）混合物を多孔質膜上に配置して、菌根性茸類の菌糸体を培養して種菌を得る工程と、（４）種菌と固体栄養培地とを多孔質膜の上下で分離する工程とを含む方法である。
【００１２】
また、本発明の請求項２に記載の菌根性茸類の種菌調製方法は、請求項１に記載の方法であって、菌根性茸類がバカマツタケの方法である。さらに、本発明の請求項３に記載の菌根性茸類の種菌調製方法は、請求項１に記載の方法であって、多孔質膜がセロハンシートの方法である。
【００１３】
また、請求項４に記載の菌根性茸類の接種方法は、請求項１から請求項３の何れかに記載の方法で調製された菌根性茸類の種菌を使用する方法である。
【００１４】
さらに、請求項５に記載の菌根性茸類の接種方法は、請求項４に記載の方法であって、（１）請求項１から請求項３の何れかに記載の方法で調製された菌根性茸類の種菌と、宿主植物とを準備する工程と、（２）菌根性茸類の種菌と宿主植物の根部とを接触させ、これらを透水膜で覆って密着させ、宿主植物・種菌複合体を製作する工程と、（３）宿主植物・種菌複合体を接種場所に接種する工程とを含む方法である。
【００１５】
加えて、請求項６に記載の菌根性茸類の接種方法は、請求項５に記載の方法であって、
宿主植物・種菌複合体を製作する際に使用する透水膜がセロハンシートの方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の菌根性茸の種菌調製方法及び接種方法は、菌根性茸をより簡便に栽培できる。そのため、本発明の種菌調製方法及び接種方法によって、バカマツタケ等の菌根性茸の栽培が新規産業として確立でき、山村地域の経済発展に大きく貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の菌根性茸類の種菌調製方法の概要を示す説明図である。
【図２】図２は、本発明の菌根性菌類の接種方法の概要を示す説明図である。
【図３】図３は、本発明の林地接種用種菌の外観を示す代用写真である。
【図４】図４は、本発明の林地接種用種菌と固体培地とが容易に分離できることを示す代用写真である。
【図５】図５は、取り木苗の根が種菌に侵入して種菌の周囲にシロ状の構造が形成されていることを示す代用写真である。
【図６】図６は、苗木・種菌複合体の外観を示す代用写真である。
【図７】図７は、苗木・種菌複合体を接種した位置からシロ状構造が広がっていることを示す代用写真である。
【図８】図８は、発生したバカマツタケの子実体の代用写真である。
【図９】図９は、シロ状構造の表面にバカマツタケのシロに特有の菌糸膜が発生していることを示す代用写真である。なお、（ａ）はシロ状構造の一部を示す代用写真であり、（ｂ）は（ａ）を拡大した代用写真である。
【図１０】図１０は、菌糸膜にバカマツタケに特有の厚壁胞子が存在することを示す代用写真である。なお、（ａ）は厚壁胞子の一部を示す代用写真であり、（ｂ）は（ａ）を拡大した代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、菌根性茸類の種菌調製方法及びこれを使用する菌根性菌類の接種方法である。そこで、その詳細について以下に説明する
【００１９】
１．菌根性茸類の種菌調製方法
本発明の菌根性茸類の種菌調製方法は、図１に示すように、（１）混合工程、（２）培地準備工程、（３）培養工程、（４）取出分離工程を含む方法である。そこで、図１に基づいて、これらの工程について以下に説明する。
【００２０】
（１）混合工程
混合工程は、菌根性茸類の菌糸体破砕物１と担体２との混合物３を調製する工程である。ここで、菌根性茸類とは、生きた樹木の根と共生関係を保ちながら生育する茸類のことである。具体的には、アミタケ、ハツタケ、コウタケ、アイシメジ、ホンシメジ、マツタケ、バカマツタケなどが挙げられる。
【００２１】
また、菌糸体破砕物１とは、液体培地及び固体培地等で培養された菌糸体を、その再生能力を損なわない公知の方法、例えばミキサーやブレンダー、超音波破砕機などを使用して破砕したものであり、液体又は固体の何でもよく、培養に使用された培地を含んでいてもよい。
【００２２】
さらに、担体２は、菌根性茸類の菌糸体を生育するための栄養分を含まず、無菌の公知の担体であれば特に限定することなく使用できる。具体的には、バーミキュライト、パーライト、土、砂、ピートモス、パルプ等が挙げられ、これらは単独又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００２３】
菌糸体破砕物１と担体２とを混合方法は、菌糸体の再生能力が失われず、混合物３に雑菌が生じない公知の方法であれば特に限定することなく、使用できる。具体的には、滅菌した薬匙、撹拌機等を利用して撹拌することが挙げられる。なお、菌糸体破砕物１と担体２と混合割合は、菌糸体破砕物１と担体２の種類や含まれる固形分の量に応じて自由に設定できる。
【００２４】
（２）培地準備工程
培地準備工程は、調製用容器４中に、多孔質膜５によって覆われた固体栄養培地６を製作する工程である。ここで、調製用容器４は菌根性茸類の菌糸体の培養に使用できる公知の容器であれば特に限定することなく使用できる。具体的には、プラスチック製の使い捨て容器等が挙げられるが、これに限定されるわけではない。
【００２５】
多孔質膜５は、菌根性茸類の菌糸体の生育に必要な栄養分と水分は透過させるが、菌糸体破砕物１の菌糸及び担体２は透過しない公知の多孔質膜であれば特に限定することなく使用できる。具体的には、セロハン、コロジオン膜、膀胱膜、卵殻膜、アセチルセルロース膜、ポリアクリロニトリル膜、テフロン（登録商標）膜、ポリエステル系ポリマーアロイ膜あるいはポリスルホン膜などの半透膜のシートや、ろ過滅菌に用いられるメンブレンフィルターが利用できる。中でも、生分解性を有し、安価であることからセロハンシートが好ましい。また、合成繊維を使用する場合には、環境への影響を考えて、生分解性を有するもの（ポリ乳酸など）が好ましい。
【００２６】
固体栄養培地６は、菌根性茸類の菌糸体の生育に必要な栄養分を含む液体培地を、ゲル化剤によって固体化した培地である。ここで、菌根性茸類の菌糸体の生育に必要な栄養分としては、菌根性茸類の菌糸体の培養に使用されている公知の成分であれば特に限定することなく使用できる。具体的には、菌根性茸類の種類や菌株に応じて、各種糖類、アミノ酸類、蛋白質類、塩類、ビタミン類等が挙げられるが、これに限定されるわけではない。
【００２７】
また、ゲル化剤としては、菌根性茸類の菌糸体の固体培養に使用されている公知のゲル化剤であれば特に限定することなく使用できる。具体的には、寒天、ゲルライト、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム、マンナン、ペクチン、ゼラチンなどが挙げられる。中でも、安価なことから寒天が好ましい。
【００２８】
固体栄養培地６は、公知の手段によって調製用容器４の中に製作する。具体的には、ゲル化剤を含む液体培地を滅菌したのち、固化する前に調製用容器４に注ぎ入れる方法、又は、ゲル化剤と液体培地の混合物を調製用容器４の中に入れ、調製用容器４ごと滅菌する方法等が挙げられる。固体栄養培地６を多孔質膜５で覆う方法としては、公知の方法であれば特に限定することなく使用できる。具体的には、固体栄養培地６の上から、滅菌した多孔質膜５を滅菌したピンセットなどで被せる方法が挙げられる。
【００２９】
（３）培養工程
培養工程は、（１）混合工程で調製した混合物３を、（２）培地準備工程で製作した多孔質膜５の上に配置して、培養する工程である。混合物３を多孔質膜５の上に配置する方法としては、公知の方法、例えば、混合物３を滅菌した薬匙等で配置する方法が挙げられる。配置される混合物３の量は、調製用容器４に収納される範囲であれば特に限定する必要はないが、一般的に、混合物３に加える菌糸体破砕物１の量が多ければ多いほど、培養時間を短縮できる。
【００３０】
混合物３の培養は、公知の菌根性茸類の菌糸体の培養方法であれば、特に限定することなく使用できる。具体的には、混合物３が配置された調製用容器を培養室、孵卵器等に入れて、培養する方法が挙げられる。なお、培養条件は、菌根性茸類の菌糸体の培養する際の培養条件、具体的には温度20〜22℃、相対湿度約60%、暗黒下での培養等が挙げられる。
【００３１】
（４）取出分離工程
取出分離工程は、混合物３が成長してなる種菌１０を調製用容器４から取出して固体栄養培地６と分離する工程である。具体的には、（ａ）調製用容器４の蓋を開けて、固体栄養６と調製用容器４の横壁と間にスパティラ等を差し込んで切り出し、両者が合体した状態で取出したのち、多孔質膜５を使用して両者を分離する方法、（ｂ）調製用容器４を破壊して、種菌１０と固体栄養培地６とが合体した状態で取出し、多孔質膜５を使用して両者を分離する方法、（ｃ）調製用容器４の蓋を開けて容器の開口部を下に向け、開口部を板などに打ち付けてその振動により、両者が合体した状態で取出したのち、多孔質膜５を使用して両者を分離する方法、（ｄ）調製用容器４の蓋を開けて、多孔質膜５の対向する辺や角をピンセットなどで引っ張って、種菌１０だけを取出す方法等が挙げられる。このように、種菌１０と固体栄養培地６とは多孔質膜５によって分離されているため、両者は容易に分離できる。
【００３２】
２．菌根性菌類の接種方法
本発明の菌根性茸類の接種方法としては、公知の菌根性茸類の接種方法であれば特に限定することなく使用できる。具体的には、（ａ）種菌をゲルなどに包埋して、これをアカマツ、コナラ、クヌギ等の宿主植物の生根の成長部分に配置する方法、（ｂ）種菌と微細粒子からなる鉱物質とを順次充填した容器に、宿主植物の根の先端を挿入する方法、（ｃ）殺菌剤を含んだ培養液をバーミキュライト等の支持体に添加した培地で種菌をさらに培養して、雑菌に強い種菌を作り、これを宿主植物の根に接種する方法、（ｄ）宿主植物の取り木苗に種菌を付着させ、これを土壌に植え付ける方法、（ｅ）宿主植物の取り木苗と種菌とを透水膜で密着させて複合体を製作し、この複合体を土壌に植え付ける方法等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。これらのうち、発明者らの研究から、菌根の成長性や接種作業の生産性の高さ等が確認されている（ｅ）について、図２に基づいて、以下に説明する。
【００３３】
本発明の菌根性菌類の接種方法の一例は、図２に示すように、（１）準備工程、（２）被覆工程、（３）接種工程を含む方法である。そこで、これらの工程について以下に説明する。
【００３４】
（１）準備工程
準備工程は、図２（１）に示すように、種菌１０、取り木苗（宿主植物）１１、透水膜１２を準備する工程である。ここで、種菌１０は本発明の種菌の調製方法によって調製されたものである。また、透水膜１２は、前記多孔質膜５に加えて、和紙や木綿布など、生分解性で透水性があり、林地の土壌と物理的に遮断できる素材であれば特に限定することなく使用できる。中でも、生分解性を有し、安価であることからセロハンシートが好ましい。
【００３５】
また、取り木苗（宿主植物）１１は、取り木法によって得られた苗のことである。ここで、取り木とは、植物の無性繁殖法の一種であり、宿主植物の枝に剥皮等の発根処理を施し、水ゴケなどを巻くことによって、発根処理を行った部位に新しく発根させて苗木を得る方法である。取り木法には、圧条法、盛土法、高取り木法などいくつかの種類がある。これらの、中でも、苗木が地面に接することなく、無菌根苗を容易に得ることができるため、高取り木法が好ましい。
【００３６】
なお、宿主植物の根部分が無菌根状態となるのであれば、取り木法以外の方法で製作された宿主植物を使用してもかまわない。具体的には、２〜３年生程度の実生苗の菌根部分を全て切除し殺菌土壌などで養成して菌根がしていない根を出させる方法、水耕栽培により無菌根の苗を養成する方法などが挙げられる。また、宿主植物は、苗だけでなく、成木であっても構わない。
【００３７】
（２）被覆工程
被覆工程は、取り木苗１１の下部にある根部と種菌１０とを接触させ、透水膜１２でこれらを覆ったのち、透水膜１２の上下端を取り木苗１１に巻きつけて密着させ、苗木・種菌複合体（宿主植物・種菌複合体）２０を製作する工程である。
【００３８】
（３）接種工程
接種工程は、移植ゴテなどを使用する公知の方法によって、苗木・種菌複合体２０を林地、植木鉢などの接種場所に植え込む工程である。接種場所は、苗木以外にも共生できるように、他の宿主植物が生育している林地などが好ましい。なお、接種に際して、苗木の根の周りに抗ウイルス剤、抗菌剤、動物忌避剤、栄養分等を合わせて撒いてもよく、苗木の葉や幹にこれらを散布してもよい。
【００３９】
苗木・種菌複合体２０は、その外周が透水膜１２によって覆われているので、その外部から栄養分と水分は取り込めるが、林地に生息する他のカビ類などの微生物、トビムシやキノコバエなどの昆虫の幼虫、ミミズ等はしばらくの間その中に入ってこられない。そのため、微生物、昆虫及び小動物等の影響を受けることが少なく、種菌は菌根を成長させることができる。また、苗木・種菌複合体２０は、その外周を透水膜１２で被覆するだけで製作でき、そのまま保存しても分離せず、そのまま植え込めば接種できるので、作業性が高い。
【００４０】
以下、この発明について実施例に基づいてより詳細に説明する。なお、この発明の特許請求の範囲は、以下の実施例によって如何なる意味においても制限されない。
【実施例１】
【００４１】
１．菌糸体の調製
林地接種用種菌のもとになる菌糸体は、次のようにして調製した。まず、奈良県森林技術センターで保有しているバカマツタケ菌株を、20〜22℃、相対湿度約60%の培養室で、固体栄養培地に接種して伸長させた。菌糸が伸長した固体栄養培地の一部を切り出して、約４ヶ月間液体培地で同様に培養した。この培養液を撹拌機（ペンシルミキサー（登録商標）、アズワン株式会社）で約30〜60秒間破砕し、破砕液10mlを新しい液体培地に植え継ぎ、同様にして液体培養した。植え継ぎして約１ヶ月後に菌糸の成長が肉眼で確認できた。３〜６ヶ月後に植え継ぎ、これを種菌調製用の菌糸体として使用した。
【００４２】
なお、固体栄養培地は、表１に示す液体培地に寒天を15g/1Lとなるように加えた培地を滅菌したのち、シャーレで固形化したものを使用した。また、液体培地は、表１に示す培地50mlを容量100mlの三角フラスコ入れて滅菌したものを使用した。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
２.林地接種用種菌の調製
前記１で調製した菌糸体を使用して、林地接種用種菌を調製した。具体的には、以下の手順で調製した。
【００４５】
（１）調製用容器の製作及び担体の調製
前記１で使用した固体栄養培地70mlを、底面60×60mm、上面65×65mm、高さ95mmのポリカーボネート製角型容器に分注して、121℃で15分間滅菌した。培地が固形化したのち、滅菌したセロハンシート（多孔質膜）をピンセットで固体培地の上面に敷いて、調製用容器を製作した。なお、比較のため、セロハンシートを敷かない調製用容器も製作した。また、バーミキュライト細粒70g及び蒸留水160mlを1Lのガラスビーカーに入れ、その上部をアルミ箔で覆ったのち、121℃で60分間滅菌して室温まで冷し、無菌の担体を調製した。
【００４６】
（２）菌糸体破砕物と担体の混合
前記１で調製した菌糸体を、撹拌機で約30〜60秒間破砕して菌糸体破砕液を調製した。液体培地を含む菌糸体破砕液と無菌の担体とを滅菌した薬匙で均一になるよう混合し、（１）で製作した調製用容器に取り分けた。この際、混合物の厚さが1cm程度になるように取り分けたので、8つの調製用容器を使用した。
【００４７】
（３）林地接種用種菌の調製
混合物を含む調製用容器を20〜22℃、相対湿度約60%の培養室で培養すると、菌糸体は約１ヶ月後に担体内で成長し始め、約２ヶ月後に担体全体を覆った。さらに、３ヶ月又は４ヶ月後まで培養して、これを林地接種用種菌とした。林地接種用種菌の外観を図３に示す。また、林地接種用種菌と固体培地はセロハンシートで仕切られているため、林地接種用種菌と固体培地は、図４に示すように、容易に分離できた。なお、セロハンシートによる仕切りがない場合、種菌と寒天培地が固着し、両者を容易に分離できなかった。
【００４８】
３.林地接種１
約４ヶ月間培養した林地接種用種菌と、別途用意したウバメガシの取り木苗とを使用して、４月に奈良県内にあるコナラ林で林地接種し、その効果を調べた。具体的には、以下の手順で調べた。
【００４９】
ウバメガシの枝の外側を剥いで、剥いた部位を水ゴケで覆い発根させ、ウバメガシ取り木苗を得た。そして、林内のコナラの根がありそうな場所に、取り木苗と種菌を植えるための穴を掘った。この穴に取り木苗を入れ、取り木苗の根に接するように林地接種用種菌を配置した。そして、穴を掘った時の土で穴を埋め戻した。
【００５０】
約１５ヶ月経過した翌年の7月に取り木苗を掘り取って観察した。その結果、図５に示すように、取り木苗の根が種菌に侵入して種菌の周囲にシロ状の構造が形成されていることが、観察できた。このシロ状構造の菌根の一部を光学顕微鏡で観察したところ、付着した菌糸にバカマツタケ特有の厚壁胞子が確認できた。ただ、バカマツタケの子実体は発生していなかった。
【００５１】
４．林地接種２
約３ヶ月間培養した林地接種用種菌と、別途用意したウバメガシの取り木苗とを使用して、１１月に奈良県内にあるコナラ林で林地接種し、その効果を調べた。具体的には、以下の手順で調べた。
【００５２】
ウバメガシの枝の外側を剥いで、剥いた部位を水ゴケで覆い発根させ、ウバメガシ取り木苗を得た。この取り木苗の根系部を覆う水ゴケと種菌とを接触させ、セロハンシートで包み込んだ。セロハンシートの上下端をそれぞれ取り木苗に巻きつけ、取り木苗の根と種菌が密着した苗木・種菌複合体を製作した。苗木・種菌複合体の外観を図６に示す。
【００５３】
林内のコナラの根がありそうな場所に、苗木・種菌複合体を植えるための穴を掘った。この穴に苗木・種菌複合体（宿主植物・種菌複合体）を入れ、穴を掘った時の土で穴を埋め戻した。
【００５４】
約１１ヶ月経過した翌年１０月に苗木・種菌複合体の周囲を観察した。その結果、図７に示すように、接種した位置からシロ状構造が広がっていることが観察された。このシロ状構造の大きさは、斜面方向が90cmで水平方向が90cmであった。そして、シロの一部には、図８に示すように、バカマツタケの子実体も発生していた。
【００５５】
また、シロ状構造の表面には、図９に示すように、バカマツタケのシロに特有の菌糸膜が観察された。さらに、この菌糸膜には、図１０に示すように、バカマツタケに特有の厚壁胞子が多数確認された。なお、DNA分析でも、シロ状構造においてバカマツタケのDNAが検出された。
【００５６】
なお、接種した取り木苗の地上部は枯死していた。ただ、根系部を掘り出して観察すると、種菌が接した場所には菌根形成された跡が残っており、シロは種菌が配置された方向から伸長していた。
【符号の説明】
【００５７】
１    菌糸体破砕物
２    滅菌した担体
３    混合物
４    調製用容器
５    セロハンシート（多孔質膜）
６    固体栄養培地
１０    種菌
１１    取り木苗（宿主植物）
１２    セロハンシート（透水膜）
２０    苗木・種菌複合体（宿主植物・種菌複合体）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2019122346.tif 000007
【図５】
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【図６】
2019122346.tif 000009
【図７】
2019122346.tif 000010
【図８】
2019122346.tif 000011
【図９】
2019122346.tif 000012
【図１０】
2019122346.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月31日(2019.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）菌根性茸類の菌糸体破砕物と、菌根性茸類の菌糸体の成長に必要な栄養分を含まない無菌の担体との混合物を調製する工程と、
（２）栄養分を含む固体栄養培地を、栄養分と水分は透過するが菌糸体及び担体は透過しない多孔質膜で覆う工程と、
（３）前記混合物を前記多孔質膜上に配置して、菌根性茸類の菌糸体を培養して種菌を得る工程と、
（４）前記種菌と前記固体栄養培地とを前記多孔質膜の上下で分離する工程と、
を含む菌根性茸類の種菌調製方法。
【請求項２】
前記菌根性茸類が、バカマツタケである請求項１に記載の菌根性茸類の種菌調製方法。
【請求項３】
前記多孔質膜が、セロハンシートである請求項１に記載の菌根性茸類の種菌調製方法。
【請求項４】
請求項１から請求項３の何れかに記載の方法で調製された菌根性茸類の種菌を使用する菌根性茸類の接種方法。
【請求項５】
（１）請求項１から請求項３の何れかに記載の方法で調製された菌根性茸類の種菌と、宿主植物とを準備する工程と、
（２）前記種菌と前記宿主植物の根部とを接触させ、これらを透水膜で覆って密着させ、宿主植物・種菌複合体を製作する工程と、
（３）前記宿主植物・種菌複合体を接種場所に接種する工程と、
を含む請求項４に記載の菌根性茸類の接種方法。
【請求項６】
前記宿主植物・種菌複合体を製作する際に使用する前記透水膜が、セロハンシートである請求項５に記載の菌根性茸類の接種方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
すなわち、本発明の請求項１に記載の菌根性茸類の種菌調製方法は、（１）菌根性茸類の菌糸体破砕物と、菌根性茸類の菌糸体の成長に必要な栄養分を含まない無菌の担体との混合物を調製する工程と、（２）栄養分を含む固体栄養培地を、栄養分と水分は透過するが菌糸体及び担体は透過しない多孔質膜で覆う工程と、（３）前記混合物を前記多孔質膜上に配置して、菌根性茸類の菌糸体を培養して種菌を得る工程と、（４）前記種菌と前記固体栄養培地とを前記多孔質膜の上下で分離する工程とを含む方法である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
また、本発明の請求項２に記載の菌根性茸類の種菌調製方法は、請求項１に記載の方法であって、前記菌根性茸類がバカマツタケの方法である。さらに、本発明の請求項３に記載の菌根性茸類の種菌調製方法は、請求項１に記載の方法であって、前記多孔質膜がセロハンシートの方法である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
さらに、請求項５に記載の菌根性茸類の接種方法は、請求項４に記載の方法であって、（１）請求項１から請求項３の何れかに記載の方法で調製された菌根性茸類の種菌と、宿主植物とを準備する工程と、（２）前記種菌と前記宿主植物の根部とを接触させ、これらを透水膜で覆って密着させ、宿主植物・種菌複合体を製作する工程と、（３）前記宿主植物・種菌複合体を接種場所に接種する工程とを含む方法である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
加えて、請求項６に記載の菌根性茸類の接種方法は、請求項５に記載の方法であって、前記宿主植物・種菌複合体を製作する際に使用する前記透水膜がセロハンシートの方法である。