(57)【要約】【課題】食物アレルギーの発症リスクを予測するための新たな検査方法及び該検査方法に用いられる試薬（プローブおよびプライマー）を提供する。【解決手段】上記課題はrs2071471、rs2395166、rs2670873若しくはrs77083409、又は前記SNPと連鎖不平衡にあるSNP（エビ成分に対するアレルギー）、rs2303444、rs3129860若しくはrs518636、又は前記SNPと連鎖不平衡にあるSNP（カニ成分に対するアレルギー）、rs11994717、又は前記SNPと連鎖不平衡にあるSNPのアリルプロファイルを解析することにより解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
rs2071471、rs2395166、rs2670873及びrs77083409から選択される１若しくは２以上のSNP又は前記SNPと連鎖不平衡にあるSNPのアリルプロファイルを決定し、得られたアリルプロファイルからエビの成分に対するアレルギーの発症リスクの予測を行うための検査方法。
【請求項２】
rs2071471、rs2395166、rs2670873及びrs77083409から選択される１又は２以上のSNPのアリルプロファイルを決定し、得られたアリルプロファイルからエビの成分に対するアレルギーの発症リスクの予測を行うための請求項１記載の検査方法。
【請求項３】
rs2071471の塩基がＴである場合、エビの成分に対するアレルギーの発症リスクが高いと予測することを含む請求項１又は２記載の検査方法。
【請求項４】
rs2395166の塩基がＣである場合、エビの成分に対するアレルギーの発症リスクが高いと予測することを含む請求項１又は２記載の検査方法。
【請求項５】
rs2670873の塩基がＣである場合、エビの成分に対するアレルギーの発症リスクが高いと予測することを含む請求項１又は２記載の検査方法。
【請求項６】
rs77083409の塩基がＡである場合、エビの成分に対するアレルギーの発症リスクが高いと予測することを含む請求項１又は２記載の検査方法。
【請求項７】
rs2303444、rs3129860及びrs518636から選択される１若しくは２以上のSNP又は前記SNPと連鎖不平衡にあるSNPのアリルプロファイルを決定し、得られたアリルプロファイルからカニの成分に対するアレルギーの発症リスクの予測を行うための検査方法。
【請求項８】
rs2303444、rs3129860及びrs518636から選択される１又は２以上の各SNPのアリルプロファイルを決定し、得られたアリルプロファイルからカニの成分に対するアレルギーの発症リスクの予測を行うための請求項７記載の検査方法。
【請求項９】
rs2303444の塩基がＣである場合、カニの成分に対するアレルギーの発症リスクが高いと予測することを含む請求項７又は８記載の検査方法。
【請求項１０】
rs3129860の塩基がＡである場合、カニの成分に対するアレルギーの発症リスクが高いと予測することを含む請求項７又は８記載の検査方法。
【請求項１１】
rs518636の塩基がＴである場合、カニの成分に対するアレルギーの発症リスクが高いと予測することを含む請求項７又は８記載の検査方法。
【請求項１２】
rs11994717又は前記SNPと連鎖不平衡にあるSNPのアリルプロファイルを決定し、得られたアリルプロファイルからソバの成分に対するアレルギーの発症リスクの予測を行うための検査方法。
【請求項１３】
rs11994717のアリルプロファイルを決定し、得られたアリルプロファイルからソバの成分に対するアレルギーの発症リスクの予測を行うための請求項１２記載の検査方法。
【請求項１４】
rs11994717の塩基がＡである場合、ソバの成分に対するアレルギーの発症リスクが高いと予測することを含む請求項１２又は１３記載の検査方法。
【請求項１５】
配列番号１乃至３及び８から選ばれる塩基配列において、６１番目の塩基を含む１５塩基以上の配列、又はその相補配列を有する、請求項１記載の検査方法に用いるためのプローブ。
【請求項１６】
配列番号４又は５の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１５塩基以上の配列、又はその相補配列を有する、請求項７記載の検査方法に用いるためのプローブ。
【請求項１７】
配列番号６の塩基配列において、塩基番号５６番目の塩基を含む１５塩基以上の配列、又はその相補配列を有する、請求項７記載の検査方法に用いるためのプローブ。
【請求項１８】
配列番号７の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１５塩基以上の配列、又はその相補配列を有する、請求項１２記載の検査方法に用いるためのプローブ。
【請求項１９】
配列番号１乃至３及び８から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる、請求項１記載の検査方法に用いるためのプライマー。
【請求項２０】
配列番号４又は５の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる、請求項７記載の検査方法に用いるためのプライマー。
【請求項２１】
配列番号６の塩基配列において、塩基番号５６番目の塩基を含む領域を増幅することのできる、請求項７記載の検査方法に用いるためのプライマー。
【請求項２２】
配列番号７の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる、請求項１２記載の検査方法に用いるためのプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は食物アレルギーの発症リスクを予測するための検査方法及び該検査方法に用いられる試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
食物アレルギーは、食物を摂取した後に抗原特異的な免疫反応により引き起こされる有害反応である。近年では食物アレルギーの患者は先進国を中心として増加しており、我が国では乳幼児の５〜１０％、小児の約５％、学童の約４．５％が食物アレルギーを有していると推定されている。
【０００３】
食物アレルギーの多くはＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）を介したものであり、該当食物の摂取後２時間以内にアレルギー反応が引き起こされる。食物アレルギーの診断では、血液検査や皮膚検査などによる食物アレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体の検出や照明が行われている。しかし、これらの検査は診断の補助的なものであり、採血や穿刺といった侵襲性の伴う検査である。最終的には食物除去試験や食物経口負荷試験によって食物アレルギーを診断するが、食物経口負荷試験はアナフィラキシーなどの有害な症状を引き起こす可能性がある。
【０００４】
食物アレルギーの危険因子には、家族歴、遺伝的な傾向、皮膚のバリア機能、出生時の季節などが考えられており、特にアトピー性皮膚炎の有無は重要な危険因子とされている。
【０００５】
近年、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）により、ピーナツアレルギーに関連する遺伝子座をゲノムワイド関連解析（Genome-wide association study: 以下単に「GWAS」ともいう。）により同定した例が報告されている（非特許文献１）。
【０００６】
しかし、日本人を中心とするアジア系人類に多く見られる食物アレルギー、特にエビ、カニ、ソバに含まれる成分に対するアレルギーについては報告がなく、従来の診断方法により発症リスクを判定していたため、侵襲性のある検査や重篤な全身症状を引き起こす可能性のある試験によって判定されていた。
【０００７】
本発明者等は、上記問題を解決すべく、日本人本土集団において、網羅的にゲノムワイド関連解析（GWAS）した結果、食物成分、特にエビ、カニ、ソバに含まれる成分に対するアレルギーの発症リスクをより精度よく予測しうる一塩基変異（SNP）を見出し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nat Commun. Author manuscript; available in PMC 2015 August 24.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、食物成分、特にエビ、カニ、ソバに含まれる成分に対するアレルギーの発症リスクをより精度よく予測する方法、及び該方法に用いられる検査用試薬、プローブおよびプライマーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の食物アレルギーの発症リスクを予測するためのマーカー、即ちrs2071471、rs2395166、rs2670873又はrs77083409を含む１又は２以上のオリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド（以下、単に「オリゴ（又はポリ）ヌクレオチド」という場合もある。）からなるマーカーを利用することで、エビの成分に対するアレルギーの発症リスクを予測することができる。また、rs2303444、rs3129860又はrs518636を含むオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドからなるマーカーを利用することで、カニの成分に対するアレルギーの発症リスクを予測することができる。さらに、rs11994717を含むオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドからなるマーカーを利用することで、ソバの成分に対するアレルギーの発症リスクを予測することができる。
【００１１】
具体的には、各マーカーに含まれるSNPのアリルプロファイルを解析することで、より確実に各成分に対するアレルギーの発症リスクを予測することができる。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］rs2071471、rs2395166、rs2670873及びrs77083409から選択される１若しくは２以上のSNP又は前記SNPと連鎖不平衡にあるSNPのアリルプロファイルを決定し、得られたアリルプロファイルからエビの成分に対するアレルギーの発症リスクの予測を行うための検査方法、
［２］rs2071471、rs2395166、rs2670873及びrs77083409から選択される１又は２以上のSNPのアリルプロファイルを決定し、得られたアリルプロファイルからエビの成分に対するアレルギーの発症リスクの予測を行うための［１］の検査方法、
［３］rs2071471の塩基がＴである場合、エビの成分に対するアレルギーの発症リスクが高いと予測することを含む［１］又は［２］記載の検査方法、
［４］rs2395166の塩基がＣである場合、エビの成分に対するアレルギーの発症リスクが高いと予測することを含む［１］又は［２］記載の検査方法、
［５］rs2670873の塩基がＣである場合、エビの成分に対するアレルギーの発症リスクが高いと予測することを含む［１］又は［２］記載の検査方法、
［６］rs77083409の塩基がＡである場合、エビの成分に対するアレルギーの発症リスクが高いと予測することを含む［１］又は［２］記載の検査方法、
［７］rs2303444、rs3129860及びrs518636から選択される１若しくは２以上のSNP又は前記SNPと連鎖不平衡にあるSNPのアリルプロファイルを決定し、得られたアリルプロファイルからカニの成分に対するアレルギーの発症リスクの予測を行うための検査方法、
［８］rs2303444、rs3129860及びrs518636から選択される１又は２以上の各SNPのアリルプロファイルを決定し、得られたアリルプロファイルからカニの成分に対するアレルギーの発症リスクの予測を行うための［７］記載の検査方法、
［９］rs2303444の塩基がＣである場合、カニの成分に対するアレルギーの発症リスクが高いと予測することを含む［７］又は［８］記載の検査方法、
［１０］rs3129860の塩基がＡである場合、カニの成分に対するアレルギーの発症リスクが高いと予測することを含む［７］又は［８］記載の検査方法、
［１１］rs518636の塩基がＴである場合、カニの成分に対するアレルギーの発症リスクが高いと予測することを含む［７］又は［８］記載の検査方法、
［１２］rs11994717又は前記SNPと連鎖不平衡にあるSNPのアリルプロファイルを決定し、得られたアリルプロファイルからソバの成分に対するアレルギーの発症リスクの予測を行うための検査方法、
［１３］rs11994717のアリルプロファイルを決定し、得られたアリルプロファイルからソバの成分に対するアレルギーの発症リスクの予測を行うための［１２］記載の検査方法、
［１４］rs11994717の塩基がＡである場合、ソバの成分に対するアレルギーの発症リスクが高いと予測することを含む［１２］又は［１３］記載の検査方法、
［１５］配列番号１乃至３及び８から選ばれる塩基配列において、６１番目の塩基を含む１５塩基以上の配列、又はその相補配列を有する、［１］記載の検査方法に用いるためのプローブ、
［１６］配列番号４又は５の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１５塩基以上の配列、又はその相補配列を有する、［７］記載の検査方法に用いるためのプローブ、
［１７］配列番号６の塩基配列において、塩基番号５６番目の塩基を含む１５塩基以上の配列、又はその相補配列を有する、［７］記載の検査方法に用いるためのプローブ、
［１８］配列番号７の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１５塩基以上の配列、又はその相補配列を有する、［１２］記載の検査方法に用いるためのプローブ、
［１９］配列番号１乃至３及び８から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる、［１］記載の検査方法に用いるためのプライマー、
［２０］配列番号４又は５の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる、［７］記載の検査方法に用いるためのプライマー、
［２１］配列番号６の塩基配列において、塩基番号５６番目の塩基を含む領域を増幅することのできる、［７］記載の検査方法に用いるためのプライマー、
［２２］配列番号７の塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる、［１２］記載の検査方法に用いるためのプライマー。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、正確かつ簡便にアレルギーの発症リスクを予測することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、「遺伝子」、「オリゴヌクレオチド」、及ひ゛「ポリヌクレオチド」とは、アデニン(Ａ)、グアニン(Ｇ)等のプリン塩基や、チミン(Ｔ)、ウラシル(Ｕ)、シトシン(Ｃ)等のピリミジン塩基やそれらの修飾塩基を構成要素として含むものであり、一本鎖又は二本鎖のDNA、一本鎖又は二本鎖のRNA、一本鎖DNAと一本鎖RNAからなるハイブリッド体、RNAとDNAが結合して一本鎖となったキメラ体のいずれか、又は複数を意味するものである。また、DNAには、cDNAも含まれる。
【００１５】
本明細書において、ハイブリダイズするオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドとは、目的のオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドに対して、完全に、又は部分的に相補的に結合しうるオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドをいう。例えば、本発明のマーカー群を構成するマーカーとしてのいずれかのオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドに対して、完全に、又は部分的に相補的に結合しうるオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドをいい、完全に相補的な配列、又は相補的な配列から１〜複数個の塩基が、置換、欠失、付加若しくは挿入された配列からなり、かつ結合可能な配列からなるオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドをいう。そのようなオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドは、プライマーやプローブとして使用することができる。
【００１６】
用語「連鎖不平衡」(LD)は、2つの隣接する多型遺伝子型間の統計学的相関を説明するために用いられる。一般的には、LDは、配偶子間にHardy-Weinberg平衡(統計的独立性)があると仮定して、2座位における無作為配偶子の対立遺伝子間の相関をさす。LDはLewontinの関連パラメーター(D')またはPearsonの相関係数(r)のいずれかにより定量化される(Devlin and Risch, 1995)。LD値が1である2つの座位は完全LDにあるといわれる。もう一方の極端な場合で、LD値が0である2つの座位は連鎖平衡にあると呼ばれる。連鎖不平衡は、ハプロタイプ頻度を推定するための期待値最大化アルゴリズム(EM)の適用に従って計算される(Slatkin and Excoffier, 1996)。隣接する遺伝子型/座位についての本発明に係るLD値は、0.1以上、好ましくは0.2以上、より好ましくは0.5以上、より好ましくは0.6以上、さらに好ましくは0.7以上、好ましくは0.8以上、さらに好ましくは0.9以上、理想的には約1.0を選択される。
【００１７】
「SNP」とは、一塩基多型のことであり、ヒトゲノム上の特定の位置に存在する塩基の多型を示す。「SNP」には、1塩基変異以外にも挿入や欠失による変異も含まれる。
【００１８】
「アリルプロファイル」とは、特定のSNPにおける個人の遺伝子型を示す。
【００１９】
アリルプロファイルの解析（ＳＮＰの解析）は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
１．本発明のプローブ
本発明は、食物アレルギーの発症リスクを検査するためのプローブを提供する。
【００２１】
本発明のプローブとしては、上記ＳＮＰ部位を含むオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドであって、本発明のマーカーとしてのいずれかのオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドに対するハイブリダイズの有無によってSNP部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。
【００２２】
本発明のプローブの塩基配列は、標的の塩基配列と、完全に相補対を形成する配列であるのが最も好ましいが、標的の塩基配列とハイブリダイズする程度に、１〜複数個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加及び／又は導入された配列であっても良い。また、キメラプローブも用いることができる。
【００２３】
具体的には、（１）配列番号１乃至３及び８から選ばれる塩基配列において、６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する、エビの成分に対するアレルギーの発症リスクの予測を行うための検査方法に用いるためのプローブ、（２）配列番号４または５から選ばれる塩基配列において、６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する、カニの成分に対するアレルギーの発症リスクの予測を行うための検査方法に用いるためのプローブ、（３）配列番号６の塩基配列の５６番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する、カニの成分に対するアレルギーの発症リスクの予測を行うための検査方法に用いるためのプローブ、（４）配列番号７の塩基配列において、６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する、ソバの成分に対するアレルギーの発症リスクの予測を行うための検査方法に用いるためのプローブが挙げられる。プローブの長さは検出の標的となるオリゴ（又はポリ）ヌクレオチドによって、様々で一概にはいえないが、好ましくは、１５〜３５塩基であり、より好ましくは２０〜３５塩基である。
【００２４】
２．本発明のプライマー
本発明は、食物アレルギーの発症リスクを検査するためのプライマーを提供する。
【００２５】
本発明のプライマーとしては、上記SNP部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマー、又は上記SNP部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１乃至５並びに７及び８から選ばれる塩基配列の６１番目の塩基、又は配列番号６の塩基配列の５６番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜３５塩基がより好ましく、２０〜３５塩基がさらに好ましい。
【００２６】
上記SNP部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは３０〜１００塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは３０〜１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーを用いることができる。ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが用いられる。
【００２７】
本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
【００２８】
３．本発明の検査方法
本発明の方法は、特定のSNPを分析し、該分析結果に基づいて食物成分、特にエビ、カニ、ソバに含まれる成分に対するアレルギー（単に食物アレルギーということもある）の発症リスクの予測を行うための検査方法である。すなわち、本発明において、「検査」とは食物アレルギーの発症リスクの検査を含む。本発明の方法は、SNPの分析結果を、食物アレルギーの発症リスクと関連付けることにより行われる。
【００２９】
本明細書において、rs番号はNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。
【００３０】
rs2071471はGenBank Accession No. NT_007592.15の32784645番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）の多型を意味し、この塩基がTである場合はエビ成分に対するアレルギーの発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、TT＞ＣＴ＞CCの順でエビ成分に対するアレルギーの発症リスクが高い。
【００３１】
rs2395166はGenBank Accession No. NT_007592.15の32388275番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）の多型を意味し、この塩基がCである場合はエビ成分に対するアレルギーの発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＣＣ＞ＣＴ＞ＴＴの順でエビ成分に対するアレルギーの発症リスクが高い。
【００３２】
rs2670873はGenBank Accession No. NT_008046.16の131328302番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）の多型を意味し、この塩基がCである場合はエビ成分に対するアレルギーの発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＣＣ＞ＣＴ＞ＴＴの順でエビ成分に対するアレルギーの発症リスクが高い。
【００３３】
rs77083409はGenBank Accession No. NT_011109.16の28180810番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／グアニン（Ｇ）の多型を意味し、この塩基がＡである場合はエビ成分に対するアレルギーの発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＡＡ＞ＡＧ＞ＧＧの順でエビ成分に対するアレルギーの発症リスクが高い。
【００３４】
rs2071471、rs2395166，rs2670873及びrs77083409について、SNP塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を配列番号１乃至３及び８に示した（配列番号８：rs2071471、配列番号１：rs2395166，配列番号２：rs2670873及び配列番号３：rs77083409）。６１番目の塩基が多型を有する。
【００３５】
rs2303444はGenBank Accession No. NT_008046.16の131226752番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）の多型を意味し、この塩基がＣである場合はカニ成分に対するアレルギーの発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＣＣ＞ＣＴ＞ＴＴの順でカニ成分に対するアレルギーの発症リスクが高い。
【００３６】
rs3129860はGenBank Accession No. NT_007592.15の32401079番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／グアニン（Ｇ）の多型を意味し、この塩基がＡである場合はカニ成分に対するアレルギーの発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＡＡ＞ＡＧ＞ＧＧの順でカニ成分に対するアレルギーの発症リスクが高い。
【００３７】
rs518636はGenBank Accession No. NT_008470.19の116363146番目の塩基におけるチミン（Ｔ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基がＴである場合はカニ成分に対するアレルギーの発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＴＴ＞ＴＣ＞ＣＣの順でカニ成分に対するアレルギーの発症リスクが高い。
【００３８】
rs2303444及びrs3129860について、SNP塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号４及び５に示した（配列番号４：rs2303444、配列番号５：rs3129860）。６１番目の塩基が多型を有する。
【００３９】
rs518636について、SNP塩基及びその５’側５５ｂｐ及び３’側６０ｂｐの領域を含む合計１１６ｂｐの長さの配列を、配列番号６に示した。５６番目の塩基が多型を有する。
【００４０】
rs11994717はGenBank Accession No. NT_008183.19の57160043番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／グアニン（Ｇ）の多型を意味し、この塩基がＡである場合はソバ成分に対するアレルギーの発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＡＡ＞ＡＧ＞ＧＧの順でソバ成分に対するアレルギーの発症リスクが高い。
rs11994717について、ＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、配列番号７に示した。６１番目の塩基が多型を有する。
【００４１】
rs2071471と連鎖不平衡にあるSNPとしては rs12207915（さらなる可能な例を表1に示す）rs2395166と連鎖不平衡にあるSNPとしては rs4335021（さらなる可能な例を表２に示す）、rs2670873と連鎖不平衡にあるSNPとしては rs2791344（さらなる可能な例を表３に示す）、rs77083409と連鎖不平衡にあるSNPとしては rs75479720（さらなる可能な例を表４に示す）、rs2303444と連鎖不平衡にあるSNPとしては rs74403851（さらなる可能な例を表５に示す）、rs3129860と連鎖不平衡にあるSNPとしては rs59642557（さらなる可能な例を表６に示す）、rs518636と連鎖不平衡にあるSNPとしては rs72763856（さらなる可能な例を表７に示す）、rs11994717と連鎖不平衡にあるSNPとしては rs13271434（さらなる可能な例を表８に示す）、があげられる。
【００４２】
SNP rs2071471にのための代用マーカーを表１に示した。このマーカーに対して0.05より高い r2 を有するマーカー上位 20 SNPs を選択した。相関 SNP の名称、rs2071471に対する r2 と D’ の値、および GRCh 37 における代用マーカーの位置を示した。
【００４３】
【表１】
2019033738.tif 000002
【００４４】
SNP rs2395166のための代用マーカーを表２に示した。このマーカーに対して0.05より高い r2 を有するマーカー上位 20 SNPs を選択した。相関 SNP の名称、rs2395166に対する r2 と D’ の値、および GRCh 37 における代用マーカーの位置を示した。
【００４５】
【表２】
2019033738.tif 000003
【００４６】
SNP rs2670873 のための代用マーカーを表３に示した。このマーカーに対して0.05より高い r2 を有するマーカー上位 20 SNPs を選択した。相関 SNP の名称、rs2670873 に対する r2 と D’ の値、および GRCh 37 における代用マーカーの位置を示した。
【００４７】
【表３】
2019033738.tif 000004
【００４８】
SNP rs77083409 のための代用マーカーを表４に示した。このマーカーに対して0.05より高い r2 を有するマーカー上位 20 SNPs を選択した。相関 SNP の名称、rs77083409 に対する r2 と D’ の値、および GRCh 37 における代用マーカーの位置を示した。
【００４９】
【表４】
2019033738.tif 000005
【００５０】
SNP rs2303444 のための代用マーカーを表５に示した。このマーカーに対して0.05より高い r2 を有するマーカー上位 20 SNPs を選択した。相関 SNP の名称、rs2303444 に対する r2 と D’ の値、および GRCh 37 における代用マーカーの位置を示した。
【００５１】
【表５】
2019033738.tif 000006
【００５２】
SNP rs3129860 のための代用マーカーを表６に示した。このマーカーに対して0.05より高い r2 を有するマーカー上位 20 SNPs を選択した。相関 SNP の名称、rs3129860 に対する r2 と D’ の値、および GRCh 37 における代用マーカーの位置を示した。
【００５３】
【表６】
2019033738.tif 000007
【００５４】
SNP rs518636 のための代用マーカーを表７に示した。このマーカーに対して0.05より高い r2 を有するマーカー上位 20 SNPs を選択した。相関 SNP の名称、rs518636 に対する r2 と D’ の値、および GRCh 37 における代用マーカーの位置を示した。
【００５５】
【表７】
2019033738.tif 000008
【００５６】
SNP rs11994717 のための代用マーカーを表８に示した。このマーカーに対して0.05より高い r2 を有するマーカー上位 20 SNPs を選択した。相関 SNP の名称、rs11994717 に対する r2 と D’ の値、および GRCh 37 における代用マーカーの位置を示した。
【００５７】
【表８】
2019033738.tif 000009
【００５８】
本発明においては、上記塩基に相当する塩基を解析する。「上記塩基に相当する塩基」とは、上記領域における該当塩基を意味する。すなわち、「上記塩基に相当する塩基を解析する」ことには、仮に人種の違いなどによって上記配列がSNP以外の位置で若干変化したとしても、上記領域における該当塩基を解析することが含まれる。
【００５９】
上記SNPの塩基の種類を調べ、得られた結果を上記のような基準に基づいて食物アレルギーと関連付けることにより、食物アレルギーを検査することができる。上記SNPは単独で解析されてもよいし、上記SNPの少なくとも１つを含む複数のSNP（SNPs）をまとめて解析（ハプロタイプ解析）してもよい。
【００６０】
ＳＮＰの解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。ＳＮＰの解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。
【００６１】
ＳＮＰの解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
シークエンス解析は通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側  数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス反応の前に、あらかじめＳＮＰ部位を含む断片をＰＣＲなどによって増幅しておくことが好ましい。
【００６３】
また、ＳＮＰの解析は、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、３’末端が各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号明細書）、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書）、ＩＣＡＮ法（特開２００２−２３３３７９号公報）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。
【００６４】
また、ＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法（Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、目的のＳＮＰを含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００６５】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００６６】
又はイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってＳＮＰがいずれの塩基であるかを調べることもで
きる。
【００６７】
このようにしてＳＮＰがいずれの塩基であるかを決定することで、食物アレルギーを検査するためのデータを得ることができる。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００６９】
食物アレルギー発症と関連する遺伝的変異を同定するために、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を行った。ＧＷＡＳとは、疾患等の表現型に関わる遺伝的変異を探索する遺伝統計学的手法である。例えば、ヒトゲノム全体を網羅するような数十万〜１００万ヶ所のＳＮＰｓを用いて、ある形質の平均値の分布において、多型の組み合わせ（ジェノタイプ）による差があるかどうかを統計的に検定することで、疾患と関連する遺伝的変異を見出すことができる。本実施例において、食物アレルギーを有するかどうかは、被験者に対するアンケート結果により判断した。
【００７０】
１．Genotypeデータの品質管理
１−１：Genotyping Platformの統合
本研究に用いたGenotypeデータはHumanCore-v12 Bead Chip（illumina）とHumanCore-v24 Bead Chip（illumina）の2つのアレイプラットフォームを使用した。両者のアレイプラットフォームに共通して搭載されている296,675 SNPsを抽出し、以降のデータ処理を行った。
【００７１】
１−２：性別の一致確認
Genotypeデータから性別を推定し、アンケート調査により取得した性別と合致しているかどうかを確認した。性別が一致しなかった52人のGenotypeデータを以降のデータ処理から取り除いた。
【００７２】
１−３：血縁関係の確認
PLINK（v1.9, https://www.cog-genomics.org/plink2, Purcell, Shaun, et al. "PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses." The American Journal of Human Genetics81.3 (2007): 559-575.）のペアワイズIBD推定を行って被験者間の血縁関係を推定した。血縁関係と推測される（p(Z0) < 0.05）89ペア・164人のGenotypeデータを以降のデータ処理から取り除いた。
【００７３】
１−４：SNPの品質管理
GWASを行うにあたって、コールレートが95％未満の被験者のGenotypeデータ、及びコールレートが90％未満のSNPs、マイナーアレル頻度が5％未満のSNPs、ハーディー・ワインベルグ平衡の適合度検定がp < 0.05のSNPsを削除した。また、以降の解析に用いるSNPsを常染色体上に位置するSNPsに限定した。
【００７４】
１−５：集団構造化解析
国際HapMap計画（Gibbs, Richard A., et al. "The international HapMap project." Nature 426.6968 (2003): 789-796.）が収集・公開している世界中の代表的な4集団（CEU、YRI、CHB、JPT）のGenotypeデータを取得し、本研究のGenotypeデータと共通して測定している163,708 SNPsのデータを統合した。統合したGenotypeデータの中から連鎖不均衡（LD）を用いてSNPsを絞込み、絞り込んだGenotypeデータを用いて主成分分析を行った。得られた上位2主成分をk-means法によりクラスタリングし、アジア系集団CHB、JPT）以外のクラスターに属している2人のGenotypeデータを以降の解析から除去した。
同様に国際HapMap計画のアジア系集団のGenotypeデータと本研究のGenotypeデータを統合・絞込み、主成分分析を行った。上位2主成分をk-means法でクラスタリングし、日本人本土集団と考えられるクラスターに属している11,409人を抽出した。この日本人本土集団に関して以降の解析を行った。
【００７５】
２．表現型の選定
Webを用いたアンケート調査により表現型を取得した。
【００７６】
２−１：食品アンケートに関するアンケートの品質管理
取得したアンケートからアンケート間の整合性を確認し、それぞれPre-Control、Pre-Caseと定義した。Pre-Control、Pre-Caseどちらの条件も満たさない被験者は、表現型をMissingとしてGWASからは除外した。
【００７７】
Pre-Controlの定義
X73「あなたは食品アレルギーになったことがありますか（持っていますか）」に「いいえ」と回答
X74.1〜X74.28「（はいの方のみ）何の商品アレルギーですか」にいずれも回答していない
X75,「（はいの方のみ）食品アレルギーに気づいたのはいつですか」に回答していない
X76「（はいの方のみ）いまでも食品アレルギーはありますか」に回答していない
X1080.5.1「食品アレルギー」に回答していない
【００７８】
Pre-Caseの定義
X73「あなたは食品アレルギーになったことがありますか（持っていますか）」に「はい」と回答
X74.1~X74.28「（はいの方のみ）何の食品アレルギーですか」に少なくとも1つ回答
X75,「（はいの方のみ）食品アレルギーに気づいたのはいつですか」に回答
X76「（はいの方のみ）いまでも食品アレルギーはありますか」に回答
X1080.5.1「食品アレルギー」に回答
【００７９】
２−２：Simple
それぞれの食品について既往歴の有無を表現型の基準とした
・Controlの選定基準
X74.1~X74.28の中の該当アンケートに回答していない
・Caseの選定基準
X74.1~X74.28の中の該当アンケートに回答
【００８０】
２−３：No-food allergy
食品アレルギーの既往歴が全くない被験者（= Pre-Control）をコントロールとした。
・Controlの選定基準
Pre-Control
・Caseの選定基準
Pre-Caseのうち、X74.1~X74.28の中の該当アンケートに回答
【００８１】
３．ゲノムワイド関連解析（GWAS）
上記のデータ処理により取得したGenotypeデータ及び表現型についてGWASを行った。Additive Modelを想定したロジスティック回帰によって表現型とSNPsとの関連解析を行った。共変数を含まない場合と、年齢・性別・BMI・喫煙暦及び集団構造化解析で行った上位2主成分を共変数とした場合をそれぞれ解析した。
【００８２】
結果
以下にCaseの人数が100人以上ある表現型のGWAS結果を食品成分ごとに示す。
【００８３】
Case、Control の選別方法 Simple におけるエビアレルギーの有無の人数、年齢、BMIについて表９に示した。Control と Case において、それぞれ男性の割合、年齢、BMIに違いがあるか Studentのt検定により検定を行ったP値を示した。
【００８４】
【表９】
2019033738.tif 000010
【００８５】
Case、Control の選別方法 No food allergy におけるエビアレルギーの有無の人数、年齢、BMIについて表１０に示す。Control と Case において、それぞれ男性の割合、年齢、BMIに違いがあるか Studentのt検定により検定を行ったP値を示した。
【００８６】
【表１０】
2019033738.tif 000011
【００８７】
Case、Control の選別方法 Simple および No food allergy におけるエビアレルギーの有無に対する GWAS 結果を表１１に示した。P値 < 1 × 10-5 を満たす SNPs において、連鎖 SNPsを除いた Top SNPs を示している。no covariates は、共変数を含まない場合を示し、 adjusted は、共変数を含む場合を示す。以下、列名の説明を示す。SNP: SNPのID、Chr: 染色体番号、Position: 位置、Allele: 塩基のペア (Effect Allele/Reference Allele)、OR: Effect Alleleのオッズ比、P: P値。
【００８８】
【表１１】
2019033738.tif 000012
【００８９】
Case、Control の選別方法 Simple におけるカニアレルギーの有無の人数、年齢、BMIについて表１２に示した。Control と Case において、それぞれ男性の割合、年齢、BMIに違いがあるか Studentのt検定により検定を行ったP値を示した。
【００９０】
【表１２】
2019033738.tif 000013
【００９１】
Case、Control の選別方法 No food allergy におけるカニアレルギーの有無の人数、年齢、BMIについて表１３に示した。Control と Case において、それぞれ男性の割合、年齢、BMIに違いがあるか Studentのt検定により検定を行ったP値を示した。
【００９２】
【表１３】
2019033738.tif 000014
【００９３】
Case、Control の選別方法 Simple および No food allergy におけるカニアレルギーの有無に対する GWAS 結果を表１４に示した。P値 < 1 × 10-5 を満たす SNPs において、連鎖 SNPsを除いた Top SNPs を示した。no covariates は、共変数を含まない場合を示し、 adjusted は、共変数を含む場合を示す。以下、列名の説明を示す。SNP: SNPのID、Chr: 染色体番号、Position: 位置、Allele: 塩基のペア (Effect Allele/Reference Allele)、OR: Effect Alleleのオッズ比、P: P値。
【００９４】
【表１４】
2019033738.tif 000015
【００９５】
Case、Control の選別方法 Simple におけるソバアレルギーの有無の人数、年齢、BMIについて表１５に示した。Control と Case において、それぞれ男性の割合、年齢、BMIに違いがあるか Studentのt検定により検定を行ったP値を示した。
【００９６】
【表１５】
2019033738.tif 000016
【００９７】
Case、Control の選別方法 No food allergy におけるソバアレルギーの有無の人数、年齢、BMIについて表１６に示した。Control と Case において、それぞれ男性の割合、年齢、BMIに違いがあるか Studentのt検定により検定を行ったP値を示した。
【００９８】
【表１６】
2019033738.tif 000017
【００９９】
Case、Control の選別方法 Simple および No food allergy におけるソバアレルギーの有無に対する GWAS 結果を表１７に示した。P値 < 1 × 10-5 を満たす SNPs において、連鎖 SNPsを除いた Top SNP を示した。no covariates は、共変数を含まない場合を示し、 adjusted は、共変数を含む場合を示す。以下、列名の説明を示す。SNP: SNPのID、Chr: 染色体番号、Position: 位置、Allele: 塩基のペア (Effect Allele/Reference Allele)、OR: Effect Alleleのオッズ比、P: P値。
【０１００】
【表１７】
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【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明の検査方法により食物アレルギーの発症リスクを簡便かつ正確に予測することができる。
【配列表】
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