(57)【要約】      （修正有）【課題】治療を必要としている対象におけるアルツハイマー病を予防および／または治療するための方法の提供。【解決手段】対象に対して有効量のクルクミン誘導体、ＴＭＬ−６、および任意には薬学的に許容可能な担体または賦形剤を投与するステップを含む方法の開示。アポリポタンパク質Ｅの発現を増大させること、ベータアミロイドのクリアランスを促進すること、アミロイド前駆体タンパク質合成を阻害すること、および／または脳領域内の炎症を阻害することを目的とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要としている対象におけるアルツハイマー病を予防および／または治療するための方法において、前記対象に対して有効量の下記式、
【化１】
2019218334.tif 000018
のＴＭＬ−６、またはＴＭＬ−６の薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、同位体置換体もしくはプロドラッグ、および任意には薬学的に許容可能な担体または賦形剤を投与するステップを含む方法。
【請求項２】
アポリポタンパク質Ｅの発現を増大させること、ベータアミロイドのクリアランスを促進すること、アミロイド前駆体タンパク質合成を阻害すること、および／または脳領域内の炎症を阻害することを目的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アポリポタンパク質Ｅの発現を増大させること、ベータアミロイドのクリアランスを促進すること、アミロイド前駆体タンパク質合成を阻害すること、および脳領域内の炎症を阻害することを目的とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
脳領域が海馬または他の前頭領域を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
アポリポタンパク質Ｅの発現を増大させ、ベータアミロイドのクリアランスを促進し、アミロイド前駆体タンパク質合成を阻害し、かつ／または脳領域内の炎症を阻害することのできる候補化合物を同定する方法において、ＡｐｏＥプロモーター領域のＡＰ−２またはＰＰＡＲα／ＲＸＲα結合部位と候補化合物を接触させるステップおよびＡｐｏＥプロモーター領域のＡＰ−２またはＰＰＡＲα／ＲＸＲα結合部位に候補化合物が結合したか否かを決定するステップを含む方法であって、該結合は、候補化合物がアポリポタンパク質Ｅの発現を増大し、ベータアミロイドのクリアランスを促進させ、アミロイド前駆体タンパク質合成を阻害し、かつ／または脳領域内の炎症を阻害し得ることを標示している方法。
【請求項６】
ＡｐｏＥプロモーター領域のＡＰ−２結合部位が、転写開始部位から数えておおよそ−１５４〜＋４５の位置にある、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＡｐｏＥプロモーター領域のＡＰ−２結合部位が、前記転写開始部位から数えておおよそ−１２０〜−１１１および−８６〜−７６の位置にある、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ＡｐｏＥプロモーター領域のＰＰＡＲα／ＲＸＲα結合部位が、転写開始部位から数えておおよそ−１２５〜−１１４および−８４〜−７３の位置にある、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
候補化合物が、ＡｐｏＥプロモーター領域によって作動的にカップリングされたレポーター遺伝子の発現を増強するか否かを決定するステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
候補化合物がクルクミン誘導体である、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クルクミン誘導体の使用に関する。より具体的には、本発明は、アルツハイマー病を予防および／または治療する上でのクルクミン誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
クルクミンは、インドおよびアジアの他の場所で天然に成長する多年草のショウガ科に属する、ウコンとして総称的に知られているＣｕｒｃｕｍｉｎ  ｌｏｎｇａの主要構成要素である。ウコンの根茎は、黄色の粉末へと圧砕され、その後東南アジアにおいてカレーなどのインド風料理の中で使用される。ウコン抽出物の主要構成要素は、クルクミノイドと名付けられ、これは約７５％のクルクミン（ジフェルロイルメタン）、１５％のデメトキシクルクミンおよび１０％のビスデメトキシクルクミンを含有する［Ｈａｔｃｈｅｒ  Ｈ、Ｐｌａｎａｌｐ  Ｒ、Ｃｈｏ  Ｊ、Ｔｏｒｔｉ  ＦＭ、Ｔｏｒｔｉ  ＳＶ：Ｃｕｒｃｕｍｉｎ：ｆｒｏｍ  ａｎｃｉｅｎｔ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｔｏ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ２００８、６５（１１）：１６３１〜１６５２］。近年の研究では同様に、ウコンの活性成分がクルクミンであることが示されている［Ａｇｇａｒｗａｌ  ＢＢ、Ｈａｒｉｋｕｍａｒ  ＫＢ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｕｒｃｕｍｉｎ、ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ、ａｇａｉｎｓｔ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ、ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ、ｐｕｌｍｏｎａｒｙ、ｍｅｔａｂｏｌｉｃ、ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９、４１（１）：４０〜５９］。新たに出現した証拠は、クルクミンが、癌［Ｄａｒｖｅｓｈ  ＡＳ、Ａｇｇａｒｗａｌ  ＢＢ、Ｂｉｓｈａｙｅｅ  Ａ：Ｃｕｒｃｕｍｉｎ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１２、１３（１）：２１８〜２２８］、心臓血管疾患［Ｊａｇｔａｐ  Ｓ、Ｍｅｇａｎａｔｈａｎ  Ｋ、Ｗａｇｈ  Ｖ、Ｗｉｎｋｌｅｒ  Ｊ、Ｈｅｓｃｈｅｌｅｒ  Ｊ、Ｓａｃｈｉｎｉｄｉｓ  Ａ：Ｃｈｅｍｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ、ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ａｎｄ  ｃｕｒｃｕｍｉｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００９、１６（１２）：１４５１〜１４６２］、肥満［Ａｌａｐｐａｔ  Ｌ、Ａｗａｄ  ＡＢ：Ｃｕｒｃｕｍｉｎ  ａｎｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｎｕｔｒ  Ｒｅｖ  ２０１０、６８（１２）：７２９〜７３８］、肝疾患［Ｅｌ−Ａｇａｍｙ  ＤＳ：Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｕｒｃｕｍｉｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ  ｏｎ  ａｆｌａｔｏｘｉｎ  Ｂ（ｌ）−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ａｒｃｈ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２０１０、８４（５）：３８９〜３９６］、炎症性疾患［Ｃｈａｎｄｒａｎ  Ｂ、Ｇｏｅｌ  Ａ：Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ、ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ  ｔｏ  ａｓｓｅｓｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｃｕｒｃｕｍｉｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１２、２６（１１）：１７１９〜１７２５］および老化［Ｐａｌｌａｕｆ  Ｋ、Ｒｉｍｂａｃｈ  Ｇ：Ａｕｔｏｐｈａｇｙ、ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ  ａｎｄ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｇｅｉｎｇ．Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ  ２０１３、１２（１）：２３７〜２５２］などの多種多様な疾患に対して、多数の分子標的を通して有効であることを示している［Ｔａｙｌｏｒ  ＲＡ、Ｌｅｏｎａｒｄ  ＭＣ：Ｃｕｒｃｕｍｉｎ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｌｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  Ｒｅｖ  ２０１１、１６（２）：１５２〜１５６、２２；Ｓｈｅｈｚａｄ  Ａ、Ｒｅｈｍａｎ  Ｇ、Ｌｅｅ  ＹＳ：Ｃｕｒｃｕｍｉｎ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ  ２０１３、３９（１）：６９〜７７］。
【０００３】
ウコン抽出物の３つの主要構成要素、クルクミン（ジフェルロイルメタン）、デメトキシクルクミンおよびビスデメトキシクルクミンが同定され、クルクミノイドと命名されている［Ｈａｔｃｈｅｒ  Ｈ、Ｐｌａｎａｌｐ  Ｒ、Ｃｈｏ  Ｊ、Ｔｏｒｔｉ  ＦＭ、Ｔｏｒｔｉ  ＳＶ：Ｃｕｒｃｕｍｉｎ：ｆｒｏｍ  ａｎｃｉｅｎｔ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｔｏ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ２００８、６５（１１）：１６３１〜１６５２］。クルクミンの効果は、一連の疫学的調査、動物実験および細胞株研究により示唆されてきたものの、クルクミンの低い生物学的利用能および急速な代謝が、ヒトの疾患のためのクルクミンの治療開発を妨げてきた［Ｊａｇｅｒ  Ｒ、Ｌｏｗｅｒｙ  ＲＰ、Ｃａｌｖａｎｅｓｅ  ＡＶ、Ｊｏｙ  ＪＭ、Ｐｕｒｐｕｒａ  Ｍ、Ｗｉｌｓｏｎ  ＪＭ：Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｕｒｃｕｍｉｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｎｕｔｒ  Ｊ  ２０１４、１３：１１］。
【０００４】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、寿命の延長に起因して世界中で有病率が増加している進行性の神経変性疾患である。ＡＤを患う個体の総数は、２０３０年までにおおよそ７４７０万人にまで増加し［Iｊａｏｐｏ  ＥＯ：Ｄｅｍｅｎｔｉａ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｇｉｔａｔｉｏｎ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｉｓｋｓ  ａｎｄ  ｂｅｎｅｆｉｔｓ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２０１７、７（１０）：ｅｌ２５０］、医療費は、２０５０年までに年間１兆ドルに上るものと推測されている［Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ａ：２０１５  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  ｆｉｇｕｒｅｓ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ＆  ｄｅｍｅｎｔｉａ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ２０１５、１１（３）：３３２〜３８４］。過去数十年で１００回を超える試験が行なわれてきたものの、ＡＤの複雑な病因の理解が不充分であり、かつ標的個体群を選択するためのバイオマーカーまたは信頼できる診断テストが欠如していることを主たる理由として、市販に至ることが期待される作用物質の数はわずかである。したがって、特に軽度認知障害またはＡＤの早期段階における認知機能の進行性の低下を減速、停止または逆行させるため、ＡＤ患者のための治療薬を開発する緊急の需要が存在する。現在ＦＤＡにより認可されているＡＤ治療薬は、コリンエステラーゼ阻害物質およびＮＭＤＡアンタゴニストであるが、これらは、非特異的に作用し、高い副作用を伴って症候を軽減することしかできない。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、クルクミン誘導体ＴＭＬ−６が、ＡＰＯＥプロモーター内でのＰＰＡＲαおよびＲＸＲα応答要素を通してＡｐｏＥの発現を調節することによってアルツハイマー病を治療および／または予防できる、ということを初めて実証している。
【０００６】
本開示は、治療を必要としている対象におけるアルツハイマー病を予防および／または治療するための方法において、前記対象に対して有効量の下記式、
【化１】
2019218334.tif 000002
のＴＭＬ−６、またはＴＭＬ−６の薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、同位体置換体もしくはプロドラッグ、および任意には薬学的に許容可能な担体または賦形剤を投与するステップを含む方法を提供することにある。
【０００７】
一実施形態において、アルツハイマー病は、治療を必要としている対象において、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の発現を調節すること、ベーターアミロイド（Ａβ）のクリアランスを促進すること、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）合成を阻害すること、および／または脳領域内の炎症を阻害することによって治療および／または予防される。
【０００８】
本開示は同様に、ＡｐｏＥの発現を増大させ、Ａβのクリアランスを促進し、ＡＰＰ合成を阻害し、かつ／または脳領域内の炎症を阻害することのできる候補化合物を同定する方法において、ＡｐｏＥプロモーター領域のＡＰ−２またはＰＰＡＲα／ＲＸＲα結合部位と候補化合物を接触させるステップおよびＡｐｏＥプロモーター領域のＡＰ−２またはＰＰＡＲα／ＲＸＲα結合部位に候補化合物が結合したか否かを決定するステップを含む方法であって、該結合は、候補化合物がＡｐｏＥの発現を増大し、Ａβのクリアランスを促進させ、ＡＰＰ合成を阻害し、かつ／または脳領域内の炎症を阻害し得ることを標示している、方法をも提供する。
【０００９】
本開示は、以下の節で詳細に説明される。本発明の他の特徴、目的および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲中に見い出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＴＭＬ−６がＡＰＰおよびホスホ−ＮＦ−κＢの発現を抑制し、Ｈｕｈ７細胞株内でのＡｐｏＥ発現を増大させることを示している。Ｈｕｈ７細胞は、異なる用量のクルクミンおよびＴＭＬ−６で２４時間処理された。アルツハイマー関連タンパク質、例えばＡＰＰ、ＡｐｏＥおよび炎症性バイオマーカーリン酸化ＮＦκＢを検査するために、ウエスタンブロット法が使用された。
【図２】ＴＭＬ−６が、Ｎ２ａ／ＡＰＰｓｗｅ安定細胞株内でのＡβの産生を抑制することを示している。Ｎ２Ａ細胞株中のＡＰＰスウェーデン突然変異体（Ｎ２ａ／ＡＰＰｓｗｅ）の安定した過剰発現は、異なる用量のクルクミンおよびＴＭＬ−６で処理された。２４時間のインキュベーションの後、培地中のＡβ４０、Ａβ４２およびＡβ４２／４０比のレベルは、Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ＢｅｔａＭａｒｋ  Ｂｅｔａ−Ａｍｙｌｏｉｄ  ｘ−４０およびｘ−４２  ＥＬＩＳＡキットによって検査された。
【図３】ＡｐｏＥのプロモーター活性が、ＡｐｏＥプロモーター領域上の−１５４〜＋４５の間のＰＰＡＲα／ＲＸＲαおよびＡＰ−２結合部位の転写調節を通して、ＴＭＬ−６によって調節されることを示している。（Ａ）ＡｐｏＥプロモーター構成体の全長（−１０６１／＋４５）および連続欠失変異体上の潜在的結合部位の概略的表現である。潜在的結合部位はＪＡＳＰＡＲデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｊａｓｐａｒ２０１６．ｇｅｎｅｒｅｇ．ｎｅｔ／）によって予測された。（Ｂ）転写因子結合部位の略語およびスコアは、ＡｐｏＥプロモーターの予測結果に基づいて示されている。（Ｃ）Ｈｕｈ−７細胞は、異なる長さのＡｐｏＥプロモーターおよびｐＲＬ−ＴＫプラスミドで過渡的に同時トランスフェクトされた。従来のクルクミンまたはＴＭＬ−６を用いたインキュベーションの後、細胞溶解物のルシフェラーゼレポーター活性が測定された。（Ｄ）上の図版は、ＡｐｏＥプロモーター上の−１５４と＋４５の間のＰＰＡＲα／ＲＸＲαおよびＡＰ−２の推定結合部位を示す。ＡＰ２結合部位は、−１５４／＋４５ＡｐｏＥプロモーター領域の−１２０〜−１１１および−８６〜−７６にあり、ＰＰＡＲα／ＲＸＲα結合部位は−１２５〜−１１４および−８４〜−７３にある。２つの点線四角の囲みは、それぞれＡｐｏＥプロモーター上のＰＰＡＲα／ＲＸＲαおよびＡＰ−２の遠位および近位結合部位を示す。下の図版は、部位特異的突然変異誘発によるＰＰＡＲα／ＲＸＲαおよびＡＰ−２結合部位の突然変異を表わしている。（Ｅ）Ｈｕｈ−７細胞は、ＡｐｏＥプロモーターおよびｐＲＬ−ＴＫプラスミドの突然変異体と同時トランスフェクトされた。ＴＭＬ−６を用いた２４時間のインキュベーションの後、細胞溶解物のルシフェラーゼレポーター活性が測定された。（Ｆ）ＡｐｏＥプロモーターの突然変異体形態（−１５４／＋４５ＭｄｅｌＡＰ２）は、Ｈｕｈ７細胞内にｓｉＰＰＡＲαおよび／またはｓｉＲＸＲαと同時トランスフェクトされた。ＴＭＬ−６を用いた２４時間のインキュベーションの後、細胞溶解物のルシフェラーゼレポーター活性が測定された。結果は、レニラルシフェラーゼ活性を用いた正規化の後、ＲＬＵの折り畳み構造として提示されている。平均±ＳＤは、３つの独立した実験から導出されている。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＮＳ：有意でない（対応あるｔ−検定）。
【図４】ＴＭＬ−６が三重遺伝子突然変異体ＡＤ（３ｘＴｇＡＤ）トランスジェニックマウスの脳内のＡβレベルを低減させることを示す。ＴＭＬ−６は、３ｘＴｇＡＤトランスジェニックマウスの脳内のＡβレベルを有意に低減させる。生後６ヵ月の３ｘＴｇ−ＡＤマウスに、４ヵ月間、クルクミンと１５０ｍｇ／ｋｇのＴＭＬ−６を給餌した。マウスの脳切片は、Ａβ免疫蛍光染色によって検査された。
【図５】ＴＭＬ−６が、３ｘＴｇＡＤトランスジェニックマウス体内で炎症性バイオマーカーＩｂａ−１を削減することを示す。クルクミン誘導体−ＴＭＬ−６は、ＡＤトランスジェニックマウス体内で炎症性バイオマーカーＩｂａ１を削減する。生後６ヵ月の３ｘＴｇ−ＡＤマウスに、クルクミンおよびＴＭＬ−６（１５０ｍｇ／ｋｇ）を給餌した。４ヵ月間給餌した後、３ｘＴｇＡＤトランスジェニックマウスの体内で、Ｉｂａ−１免疫蛍光染色によってＩｂａ−１の炎症性バイオマーカーを検出し分析した。
【図６】アルツハイマー病の治療におけるＴＭＬ−６の作用機序を示す。クルクミン誘導体−ＴＭＬ−６治療は、（１）ＡＰＰからのＡβの産生を阻害し；（２）神経細胞内のＡβの分泌を抑制し；（３）星状膠細胞内で、ＡＰＯＥの転写を活性化しＡβのクリアランスを増強し；（４）ミクログリア細胞内で、ＮＦ−κＢのリン酸化を阻害しＡＤ脳内の炎症を低下させることによって、抗炎症効果を達成することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は、治療を必要としている対象におけるアルツハイマー病を予防および／または治療するための方法において、前記対象に対して有効量の下記式、
【化２】
2019218334.tif 000003
のＴＭＬ−６、またはＴＭＬ−６の薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、同位体置換体もしくはプロドラッグ、および任意には薬学的に許容可能な担体または賦形剤を投与するステップを含む方法を提供する。
【００１２】
本開示は同様に、治療を必要としている対象における、ＡｐｏＥの発現を調節し、Ａβのクリアランスを促進し、ＡＰＰ合成を阻害し、および／または脳領域内の炎症を阻害するための方法において、前記対象に対して有効量のＴＭＬ−６、またはＴＭＬ−６の薬学的に許容可能な誘導体、および任意には薬学的に許容可能な担体または賦形剤を投与するステップを含む方法も提供している。
【００１３】
本発明は、本発明のさまざまな実施形態についての以下の詳細な説明、実施例および化学図および表とそれらに関連する説明を参照することによって、さらに容易に理解することができるものである。特許請求の範囲によって別段の具体的指示のないかぎり、本発明は、特定の調製方法、担体または調合、あるいは局所、経口または非経口投与のために意図された製品または組成物への本発明の化合物の特定の調合様式に限定されず、当該技術分野の当業者であれば充分認識しているようにこのような事柄は当然のことながら変動し得る、ということを理解すべきである。同様に、本明細書中で使用されている用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図したものではないということも理解すべきである。
【００１４】
本開示にしたがって使用される下記の用語は、別段の指示の無いかぎり、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００１５】
本明細書中で使用される「薬学的に許容可能な誘導体」なる用語は、本発明の化合物から修飾されているものの、本発明の化合物のものと同じかまたはそれ以上の特性および効能を有する化合物を意味する。好ましくは、薬学的に許容可能な誘導体は、本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、同位体置換体もしくはプロドラッグである。
【００１６】
本発明のＴＭＬ−６は、溶媒和物または水和物としても存在し得る。したがって、これらの化合物は、例えば、水和水、または母液溶媒の分子の一つ、一定数もしくは任意のフラクションと結晶化し得る。このような化合物の溶媒和物および水和物は、本発明の範囲内に含まれる。
【００１７】
「任意の」または「任意には」なる用語は、後続して説明される事象または状況が発生してもしなくてもよいこと、およびその説明には、前記事象または状況が発生する事例および発生しない事例を含むことを意味している。例えば、「任意には作用物質を含む」なる言い回しは、その作用物質が存在してもしなくてもよいということを意味している。
【００１８】
明細書および添付の特許請求の範囲で使用されているように、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」なる単数形態には、文脈が明らかに別段の規定を示しているのでないかぎり、複数の指示対象を含む。したがって、文脈から別段の要求がないかぎり、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含むものとする。
【００１９】
本明細書中で使用される「対象」なる用語は、あらゆる動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを意味する。対象の例としては、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌおよびネコが含まれる。
【００２０】
本明細書中で提供されている「有効量の」活性成分なる用語は、所望の機能の所望の調節を提供するのに充分な量の成分を意味する。以下で指摘するように、必要とされる正確な量は、対象の病状、体調、年令、性別、種および体重、組成物の特異的同一性および調合などに応じて、対象毎に変動するものである。最適な治療応答を誘発するために、投薬計画を調整してもよい。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与してもよいし、あるいは治療状況の緊急要件が指示する通りに、用量を比例して削減することも可能である。したがって、正確な「有効量」を規定することは可能ではない。しかしながら、当業者であれば、日常の実験のみを用いて、適切な有効量を決定することが可能である。
【００２１】
本明細書中で使用される「治療する」または「治療」なる用語は、このような用語があてはまる障害、疾患または身体条件、またはこのような傷害、疾患または身体条件の１つ以上の症候群を逆行させるか、緩和するか、その進行を阻害するかまたはそれらを改善することを意味する。
【００２２】
本明細書中で使用される「担体」または「賦形剤」なる用語は、それ自体治療薬ではないものの、治療薬を対象に送出するための担体および／または希釈剤および／またはアジュバントまたはビヒクルとして使用されるか、あるいは取扱いまたは保管特性を改善するかまたは経口投与に好適なカプセルまたは錠剤などの個別の物品への一用量単位の組成物の形成を可能にするかもしくは容易にするために調合に添加されるあらゆる物質を意味する。好適な担体または賦形剤は、医薬調合物または食品の製造技術の当業者にとって周知である。担体または賦形剤としては、例示を目的として非限定的に、緩衝液、希釈剤、崩壊剤、結合剤、粘着剤、湿潤剤、ポリマー、潤滑剤、流動促進剤、悪味または悪臭を隠すかまたは弱めるために添加される物質、香味料、着色料、香料および組成物の外観を改善するために添加される物質が含まれ得る。許容可能な担体または賦形剤としては、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、重炭酸塩緩衝液、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、炭酸マグネシウム、タルク、ゼラチン、アカシアゴム、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、デキストリン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、デンプン、ゼラチン、セルロース系材料（例えばアルカン酸のセルロースエステルおよびセルロースアルキルエステルなど）、低融点ワックスココアバター、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば血清アルブミン）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、塩化ナトリウムまたは他の塩、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、グリセロールまたは粉末、ポリマー（例えばポリビニル−ピロリドン、ポリビニルアルコールおよびポリエチレングリコール）、ならびに他の薬学的に許容可能な材料が含まれる。担体は、治療薬の薬理活性を損なってはならず、治療量の作用物質を送出するのに充分な用量で投与された場合に非毒性でなければならない。
【００２３】
アルツハイマー病は、２つの病理学的特徴、すなわち細胞外老人斑および細胞内の神経原線維のもつれの存在を特徴とする進行性神経変性疾患である。老人斑は、線維状凝集体形態のβ−アミロイドで構成されていることが発見されており、正常な脳機能を破壊させ得る［Ｌｏｒｅｎｚｏ  Ａ、Ｙａｎｋｎｅｒ  ＢＡ：Ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｆｉｂｒｉｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃｏｎｇｏ  ｒｅｄ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９４、９１（２５）：１２２４３〜１２２４７］。細胞内の神経原線維のもつれは、主としてタウタンパク質で構成されていることが後に分かっている。コリンエステラーゼ阻害物質およびＮＭＤＡアンタゴニストのいくつかの薬剤が、ＡＤ患者の治療のために利用可能であるが、効果は満足のいくものではない。これらの薬剤は、疾病を治癒する代りに患者の症候を改善することを目的としている。
【００２４】
ＡＤの病因を説明するためのいくつかの仮説が存在する。アミロイド仮説は、Ａβがまず蓄積し、血流によって充分速く除去され得ず、したがって老化のプロセス中で細胞外に不溶性のアミロイド斑を形成する、と提案する。Ａβの蓄積はその後、神経系細胞の内部でタウタンパク質の沈着を引き起こす［Ｄｉｃｋｓｏｎ  ＤＷ：Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｃａｕｓｅ  ｏｒ  ｅｆｆｅｃｔ？  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００４、１１４（１）：２３〜２７］。対合した酵素β−セクレターゼとγ−セクレターゼによる開裂を通してアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からタンパク質分解処理によりＡβペプチドが生成され、Ａβ４０およびＡβ４２の産生を導き、これらがアミノイド生成プロセスを開始させ、次に凝集して斑を形成する。
【００２５】
Ａβとタウタンパク質以外に、最近の研究により、アポリポタンパク質Ｅ（Ａｐｏ  Ｅ）も同様にＡβクリアランスの異化において重要な役割を果たすことが報告されている。Ａｐｏ  Ｅは、脳内において優勢なコレステロールおよび脂質担体であり［Ｗｉｌｄｓｍｉｔｈ  ＫＲ、Ｈｏｌｌｅｙ  Ｍ、Ｓａｖａｇｅ  ＪＣ、Ｓｋｅｒｒｅｔｔ  Ｒ、Ｌａｎｄｒｅｔｈ  ＧＥ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ２０１３、５（４）：３３］、また、Ａｐｏ  Ｅの機能不全は、Ａβ異化の破壊を結果としてもたらし得る。ＡＤ患者において、ＣＳＦおよび血漿中のＡｐｏ  Ｅレベルは、健康な個体に比べて低い傾向がある［Ｈｅｓｓｅ  Ｃ、Ｌａｒｓｓｏｎ  Ｈ、Ｆｒｅｄｍａｎ  Ｐ、Ｍｉｎｔｈｏｎ  Ｌ、Ａｎｄｒｅａｓｅｎ  Ｎ、Ｄａｖｉｄｓｓｏｎ  Ｐ、Ｂｌｅｎｎｏｗ  Ｋ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ（ａｐｏＥ）  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  ２０００、２５（４）：５１１−５１７；Ｇｕｐｔａ  ＶＢ、Ｌａｗｓ  ＳＭ、Ｖｉｌｌｅｍａｇｎｅ  ＶＬ、Ａｍｅｓ  Ｄ、Ｂｕｓｈ  ＡＩ、Ｅｌｌｉｓ  ＫＡ、Ｌｕｉ  ＪＫ、Ｍａｓｔｅｒｓ  Ｃ、Ｒｏｗｅ  ＣＣ、Ｓｚｏｅｋｅ  Ｃら：Ｐｌａｓｍａ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｉｓｋ：ｔｈｅ  ＡＩＢＬ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａｇｉｎｇ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２０１１、７６（１２）：１０９１〜１０９８；Ｂａｎｎｉｎｇ  ＬＣＰ、Ｒａｍａｋｅｒｓ  ＩＨＧＢ、Ｄｅｃｋｅｒｓ  Ｋ、Ｖｅｒｈｅｙ  ＦＲＪ、Ａａｌｔｅｎ  Ｐ：Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ａｎｄ  ａｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｉｎ  ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｍｅｎｔｉａ：Ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｂｉｏｂｅｈａｖ  Ｒｅｖ．  ２０１９  ９６：３０２〜３１５］。Ｃｒａｍｅｒらは、ＡＤトランスジェニックマウスにおけるＲＸＲアゴニストベキサロテンの治療が数時間以内で可溶性Ａβのクリアランスの増強を結果としてもたらし、ＡｐｏＥ−依存性を有することを報告し［Ｃｒａｍｅｒ  ＰＥ、Ｃｉｒｒｉｔｏ  ＪＲ、Ｗｅｓｓｏｎ  ＤＷ、Ｌｅｅ  ＣＹ、Ｋａｒｌｏ  ＪＣ、Ｚｉｎｎ  ＡＥ、Ｃａｓａｌｉ  ＢＴ、Ｒｅｓｔｉｖｏ  ＪＬ、Ｇｏｅｂｅｌ  ＷＤ、Ｊａｍｅｓ  ＭＪら：ＡｐｏＥ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｃｌｅａｒ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎ  ＡＤ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２、３３５（６０７５）：１５０３〜１５０６］、ＡＤの病因におけるＡｐｏＥの重要な役割およびＡＤにおけるＡｐｏＥを標的とした開発についての潜在的可能性を示唆した。
【００２６】
ＡＤの病因は、特に疾病の後期段階において脳機能をさらに劣化させる神経損傷およびミクログリア細胞の活性化の結果としてもたらされる炎症によって、さらに複雑化されている。炎症の削減が脳の機能を改善する。過去１０年間に、Ａβに対する抗体またはセクレターゼ阻害物質などの単一部位を標的としたいくつかの薬剤が、恐らくはＡＤの複雑な病因に起因して失敗であることが明らかになった［Ｋｕｍａｒ  Ｄ、Ｇａｎｅｓｈｐｕｒｋａｒ  Ａ、Ｋｕｍａｒ  Ｄ、Ｍｏｄｉ  Ｇ、Ｇｕｐｔａ  ＳＫ、Ｓｉｎｇｈ  ＳＫ  Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｌｏｎｇ  ｒｏａｄ  ａｈｅａｄ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１８  Ｍａｒ  ２５；１４８：４３６〜４５２；  ｖａｎ  Ｄｙｃｋ  ＣＨ：Ａｎｔｉ−Ａｍｙｌｏｉｄ−β  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｐｉｔｆａｌｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｉｓｅ．Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２０１８  １５；８３（４）：３１１〜３１９］。したがって、ＡＤの病因の多数の経路を標的とした薬剤の開発が、来たる将来において最も望ましい。
【００２７】
本開示は、クルクミンまたはその誘導体ＴＭＬ−６がインビトロでＡＰＰ合成を阻害し、Ａβ合成を阻害し、ＮＦκＢを阻害し、ＡｐｏＥをアップレギュレートすることができるということを実証する。本開示は、ＡｐｏＥのアップレギュレーションにおけるクルクミン誘導体を初めて実証しようとするものである。３つの突然変異体遺伝子（ＡＰＰ、タウ、ＰＳＥＮ）を宿したＡＤトランスジェニックマウスにおいて、クルクミン誘導体ＴＭＬ−６は、ミクログリア活性化バイオマーカー、Ｉｂａ−１の発現により査定される通り、脳のＡβレベルの削減および脳の炎症の阻害におけるクルクミンよりも有意に優れた活性を明らかにし、従来のクルクミンよりも優れたクルクミン誘導体ＴＭＬ−６の生物学的利用能を証明した。したがって、ＡＤの病因における多数の経路を標的にするクルクミン誘導体ＡＭＬ＃６は、ＡＤのための治療薬である。
【００２８】
好ましくは、Ｉｂａ−１バイオマーカーの発現により査定される脳領域内の炎症の阻害は、好ましくは、海馬または他の前頭領域を含む脳領域内での炎症の阻害である。
【００２９】
本発明は、治療を必要としている対象におけるＡｐｏＥ関連疾患を予防および／または治療するための方法において、前記対象に対して有効量のＴＭＬ−６および任意には薬学的に許容可能な担体または賦形剤を投与するステップを含む方法を提供する。
【００３０】
アポリポタンパク質Ｅは、ヒトの体内の脂質代謝に関与する主要なタンパク質の１つであり、２９９個のアミノ酸で構成されている。この脂質結合タンパク質は、トリグリセリド富有リポタンパク質の異化処理にとって不可欠のものである。ＡｐｏＥは、肝臓および脳内で産生され、末梢組織内でコレステロール代謝を仲介する。中枢神経系において、ＡｐｏＥは主として星状膠細胞により産生され、ＡｐｏＥ受容体を介してコレステロールをニューロンまで輸送する［Ｌｉｕ  ＣＣ、Ｌｉｕ  ＣＣ、Ｋａｎｅｋｉｙｏ  Ｔ、Ｘｕ  Ｈ、Ｂｕ  Ｇ：Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｒｉｓｋ、ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２０１３、９（２）：１０６〜１１８］。したがってＡｐｏＥは、リポタンパク質代謝におけるその生物学的機能で知られており、心臓血管疾患の病因に関与している。ＡｐｏＥの欠乏は、カイロミクロン、ＶＬＤＬおよびＬＤＬ残余物のクリアランスの低下に起因する血漿コレステロールおよびトリグリセリドの増大を伴う家族性異常βリポタンパク血症を結果としてもたらし得る［ｄｅ  Ｋｎｉｊｆｆ  Ｐ、Ｊａｎｓｅｎ  Ｈ、Ｌｉｅ  ＫＩ、Ｈａｖｅｋｅｓ  ＬＭ：Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｐｓｉｌｏｎ  ４  ａｎｄ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｌａｎｃｅｔ  １９９２、３４０（８８３１）：１３５１］。近年、ＡｐｏＥが、リポタンパク質輸送に関連するプロセスだけでなくＡＤなどのヒト疾患に結び付けられるプロセスという多くの生物学的プロセスにおいて研究されてきた［Ｗａｋｕｄａ  Ｈ、Ｕｃｈｉｄａ  Ｓ、Ｉｋｅｄａ  Ｍ、Ｔａｂｕｃｈｉ  Ｍ、Ａｋａｈｏｓｈｉ  Ｙ、Ｓｈｉｎｏｚｕｋａ  Ｋ、Ｙａｍａｄａ  Ｓ：Ｉｓ  ｈｙｐｅｒｕｒｉｃｅｍｉａ  ａ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ？  Ｕｒｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  ２０１４、３７（１２）：１８６６〜１８７１；Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ＪＲ：Ｕｎｒａｖｅｌｉｎｇ  ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ（ｄｙｓｂｅｔａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ）、ｓｌｏｗｌｙ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２００９、１７（５）：５４１〜５４２］。ＡｐｏＥは、カルシウムイオンレベルの上昇および機械的損傷の後のアポトーシスと結び付けられてきた［Ｊｉａｎｇ  Ｌ、Ｚｈｏｎｇ  Ｊ、Ｄｏｕ  Ｘ、Ｃｈｅｎｇ  Ｃ、Ｈｕａｎｇ  Ｚ、Ｓｕｎ  Ｘ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＡｐｏＥ  ｏｎ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１５、３０１：３７５〜３８３］。単球によるＡｐｏＥの分泌は、炎症性サイトカインによってダウンレギュレートされ、ＴＧＦ−βによってアップレギュレートされる［Ｂｒａｅｓｃｈ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｓ、Ｐａｕｌｉｅ  Ｓ、Ｓｍｅｄｍａｎ  Ｃ、Ｍｉａ  Ｓ、Ｋｕｍａｇａｉ−Ｂｒａｅｓｃｈ  Ｍ：ＡｐｏＥ  ｐｒｏｄｕｃ��ｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１３、８（１１）：ｅ７９９０８］。高脂肪食を給餌したＡｐｏＥ欠損マウス（ＡｐｏＥ−／−）は、冠動脈内のアテローム性動脈硬化症の加速を示した［Ｌｅｅ  ＨＲ、Ｊｕｎ  ＨＫ、Ｃｈｏｉ  ＢＫ：  Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ  ＢｓｐＡ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ＡｐｏＥ（−／−）  ｍｉｃｅ．Ｏｒａｌ  Ｄｉｓ  ２０１４、２０（８）：８０３〜８０８］。したがって、ＡｐｏＥを標的化することで、アテローム性動脈硬化症およびＡＤなどのヒト疾患のＡｐｏＥ欠損に対する治療可能性を得ることがある。
【００３１】
ＡｐｏＥは、Ａβクリアランスの異化における極めて重要な役割を果たし［Ｗｉｌｄｓｍｉｔｈ  ＫＲ、Ｈｏｌｌｅｙ  Ｍ、Ｓａｖａｇｅ  ＪＣ、  Ｓｋｅｒｒｅｔｔ  Ｒ、  Ｌａｎｄｒｅｔｈ  ＧＥ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ２０１３、５（４）：３３］、かつＡｐｏＥの異常調節は、Ａβ異化の破壊を結果としてもたらし、Ａβ沈着の増大を導く場合がある。近年、Ｃｒａｍｅｒらは、トランスジェニックマウスにおけるＲＸＲアゴニストベキサロテンによる治療が、ＡｐｏＥ依存性であるＡＤ欠損の逆転を伴う可溶性Ａβのクリアランスの増強を結果としてもたらすことを報告している［Ｃｒａｍｅｒ  ＰＥ、Ｃｉｒｒｉｔｏ  ＪＲ、Ｗｅｓｓｏｎ  ＤＷ、Ｌｅｅ  ＣＹ、Ｋａｒｌｏ  ＪＣ、Ｚｉｎｎ  ＡＥ、Ｃａｓａｌｉ  ＢＴ、Ｒｅｓｔｉｖｏ  ＪＬ、Ｇｏｅｂｅｌ  ＷＤ、Ｊａｍｅｓ  ＭＪら：ＡｐｏＥ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｃｌｅａｒ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎ  ＡＤ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２、３３５（６０７５）：１５０３〜１５０６］。この結果は、ＡｐｏＥがＡβ異化に関与し、ＡＤの病因に密に関係することを示している。したがって、ＡＰＯＥ遺伝子型全てにおけるＡｐｏＥの発現を増大させることで、ＡＤの進行を予防するまたは遅延させ得る。
【００３２】
本発明は、クルクミンおよびＴＭＬ−６によるＡｐｏＥのアップレギュレーションを実証し、ＡｐｏＥプロモーターに対するクルクミンおよびその誘導体の転写効果をさらに明確にする。−１５４と＋４５の間のＡｐｏＥのプロモーター領域は、クルクミン、リポソームクルクミンおよびＴＭＬ−６による転写因子の結合および活性化の重要なシス作用エレメントを含む。ＡｐｏＥプロモーターの予測にしたがって、我々はＰＰＡＲα／ＲＸＲαおよびＡＰ２がこの領域内の潜在的な応答エレメントであることを確認した。したがって、クルクミンおよびＴＭＬ−６は、ＰＰＡＲαおよびＲＸＲαを通してＡｐｏＥの発現を転写活性化でき、潜在的に、アルツハイマー病などのＡｐｏＥ関連ヒト疾患のための治療薬を提供する可能性がある。
【００３３】
本発明は、ＡｐｏＥの発現を増大させ、Ａβクリアランスを促進し、ＡＰＰ合成を阻害し、かつ／または脳領域内の炎症を阻害することのできる候補化合物を同定する方法において、ＡｐｏＥプロモーター領域のＡＰ−２またはＰＰＡＲα／ＲＸＲα結合部位と候補化合物を接触させるステップおよびＡｐｏＥプロモーター領域のＡＰ−２またはＰＰＡＲα／ＲＸＲα結合部位に候補化合物が結合したか否かを決定するステップを含む方法であって、結合は、アポリポタンパク質Ｅの発現を増大させ得る候補化合物が、ベータアミロイドのクリアランスを促進させ、アミロイド前駆体タンパク質合成を阻害し、かつ／または脳領域内の炎症を阻害し得ることを標示している、方法をも提供する。
【００３４】
好ましくは、ＡｐｏＥプロモーター領域のＡＰ−２結合部位は転写開始部位から数えておおよそ−１２０〜−１１１および−８６〜−７６の位置にある。
【００３５】
好ましくは、ＡｐｏＥプロモーター領域のＰＰＡＲα／ＲＸＲα結合部位は転写開始部位から数えておおよそ−１２５〜−１１４および−８４〜−７３の位置にある。
【００３６】
本発明の1つの好ましい実施形態において、方法はさらに、候補化合物がＡｐｏＥプロモーター領域によって作動可能にカップリングされたレポーター遺伝子の発現を増強するか否かを決定するステップを含む。
【００３７】
好ましくは、レポーター遺伝子はルシフェラーゼを含むが、これに限定されない。
【００３８】
好ましくは、候補化合物はクルクミン誘導体である。
【００３９】
以下の実施例は、本発明を実施するにあたり当業者の一助となるように提供されるものである。
【００４０】
材料と方法
細胞培養および化学物質
ヒト肝細胞癌Ｈｕｈ−７細胞株を、ヒューマンサイエンス研究資源バンク（ＪＣＲＢ０４０３；日本国大阪）から入手し、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ）で補足されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。細胞を、５％ＣＯ２のインキュベータ（Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｒｉｅｔｔａ、ＯＨ、ＵＳＡ）の加湿雰囲気中で３７℃で培養した。実験の前日に一晩、６ｃｍまたは１０ｃｍの２４ウェルの皿に細胞を播種した。翌日、細胞をクルクミン（Ｓｉｇｍａ）およびＴＭＬ−６で処置した。各化合物の作業濃度は、表中に示されている。濃縮原液は、５ｍｇ／ｍｌ（クルクミン）および１０ｍＭ（ＴＭＬ−６）で調製された。
【００４１】
細胞溶解およびウエスタンブロット法
細胞にクルクミンおよびその誘導体を播種し２４時間処理した後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害物質（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で補足した１００μＬのＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）で溶解した。細胞溶解物を、１５分間４℃１４０００ｒｐｍでの遠心分離によりさらに洗浄した。ＢｒａｄＦｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてタンパク質濃度を決定した。ウエスタンブロット分析のために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に２０μｇの各試料を調製し、１０分間９５℃で変性させた。全溶解物からの調製試料を投入して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％または１０％）により分離し、その後、半乾燥転送細胞（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によりＰＶＤＦ膜（細孔サイズ０．４５μｍ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に転送した。ＰＢＳ−Ｔ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中の５％のスキムミルクで遮断した後、膜を一晩４℃で１／１０００の希釈度で一次抗体とハイブリッド形成させた。翌日、膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄し、その後、必要に応じて１時間室温で、１／５０００の希釈度でＨＲＰ−共役抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体（ＤＡＫＯ）と共にインキュベートした。最後に、化学発光ＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて現像した後に、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｍａｇｅｒ  ６００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）で画像を捕捉した。この研究で使用した一次抗体は、抗ＡＰＰ、抗ｐＮＦκＢ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）、抗ＡｐｏＥ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、抗ＰＰＡＲγ、抗ＲＸＲα、および抗ＲＸＲβ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）であった。
【００４２】
ＡｐｏＥプロモーターの構築、連続欠失および部位特異的突然変異誘発
ヒトＡＰＯＥ遺伝子のプロモーター領域は、同定され公開されている［Ｓｈｅｎ  Ｌ、Ｌｉｕ  ＣＣ、Ａｎ  ＣＹ、Ｊｉ  ＨＦ：Ｈｏｗ  ｄｏｅｓ  ｃｕｒｃｕｍｉｎ  ｗｏｒｋ  ｗｉｔｈ  ｐｏｏｒ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ？  Ｃｌｕｅｓ  ｆｒｏｍ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ２０１６、６：２０８７２］。我々は、−１０６１〜＋４５のＡｐｏＥプロモーター領域を２段階で構築した。逆方向プライマー
【化３】
2019218334.tif 000004
と対合された順方向プライマー
【化４】
2019218334.tif 000005
によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて第１のフラグメントを増幅させ、Ｋｐｎ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩ制限部位を使用することで、ｐＧＬ３  ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）に連結した。逆方向プライマー
【化５】
2019218334.tif 000006
と対合された順方向プライマー
【化６】
2019218334.tif 000007
によるＰＣＲを用いて第２のフラグメントを増幅させ、Ｂｇ１  ＩＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位を使用することでｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結した。ＡｐｏＥプロモーターの連続欠失突然変異体、−７０５／＋４５、−４５６／＋４５、−３４４／＋４５、−２４７／＋４５、−１５４／＋４５および−３２／＋４５を、ＰＣＲを用いて、かつ全長ＡｐｏＥプロモーター（−１０６１／＋４５）に基づいて増幅させた。生成されたフラグメントをＫｐｎ  ＩおよびＸｂａ  Ｉによって消化し、その後、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内に挿入した。ＡｐｏＥプロモーターの欠失突然変異体を生成するためには、異なる長さ用にプロモーターを増幅するべくプライマーを使用した。順方向プライマーは
【化７】
2019218334.tif 000008
であり、プロモーターの標的領域を増幅するため、これらを逆方向プライマー
【化８】
2019218334.tif 000009
と対合させた。ＡｐｏＥプロモーター上のＰＰＡＲおよび／またはＡＰ−２の結合部位を破壊させるために、我々は、点突然変異方法を行ない、使用した対合プライマーは、以下の通りであった：
【化９】
2019218334.tif 000010
と
【化１０】
2019218334.tif 000011
の対合、
【化１１】
2019218334.tif 000012
と
【化１２】
2019218334.tif 000013
の対合、
【化１３】
2019218334.tif 000014
と
【化１４】
2019218334.tif 000015
の対合、
【化１５】
2019218334.tif 000016
と
【化１６】
2019218334.tif 000017
の対合。ＡｐｏＥプロモーター内でＰＰＡＲまたはＡＰ−２結合部位の突然変異体を増幅させるためのＰＣＲ反応用鋳型として、ｐＧＬ３−１５４／＋４５−ＡｐｏＥ−Ｌｕｃを使用した。ＰＣＲ産物をＤｐｎ  Ｉで消化し、ＴＯＰ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）内に形質転換させた。プラスミドのＬＢ平板固定および抽出の後、制限酵素消化により、陽性コロニーを確認した。配列決定によって、全てのプロモーター構成体を確認した。
【００４３】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
２４ウェルの培養プレート内にＨｕｈ−７細胞を播種し、その後、ｐＲＬ−ＴＫレニラルシフェラーゼレポーターを用いてｐＧＬ３−ＡｐｏＥ−Ｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ）の連続欠失で同時トランスフェクトした。一晩インキュベートした後、トランスフェクトした細胞を従来のクルクミンおよびＴＭＬ−６でさらに２４時間処理した。Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼレポーターアッセイを行なった。ホタルシフェラーゼおよびレニラルシフェラーゼの両方の活性について細胞溶解物をアッセイした。照度計（ＧＬＯＭＡＸ  Ｍｕｌｔｉ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を測定した。対照として各溶解物中のレニラルシフェラーゼ活性を用いてトランスフェクション効率についてホタルルシフェラーゼ活性を正規化した。ＲＬＵは、３つの独立した実験の平均プラス標準偏差として表現される。
【００４４】
ＡＤトランスジェニックマウスおよび細胞株
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｎｇ  Ｋｕｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮＣＫＵ）の実験動物センターにおいて、アルツハイマー病のモデルとしての３重−トランスジェニックマウス（３ｘＴｇ−ＡＤ、ＡＰＰ  Ｓｗｅｄｉｓｈ、ＭＡＰＴ  Ｐ３０１Ｌ、およびＰＳＥＮ１  Ｍ１４６Ｖ）を飼育した［Ｏｄｄｏ  Ｓ、Ｃａｃｃａｍｏ  Ａ、Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ＪＤ、Ｍｕｒｐｈｙ  ＭＰ、Ｇｏｌｄｅ  ＴＥ、Ｋａｙｅｄ  Ｒ、Ｍｅｔｈｅｒａｔｅ  Ｒ、Ｍａｔｔｓｏｎ  ＭＰ、Ａｋｂａｒｉ  Ｙ、ＬａＦｅｒｌａ  ＦＭ：Ｔｒｉｐｌｅ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｑｕｅｓ  ａｎｄ  ｔａｎｇｌｅｓ：ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｂｅｔａ  ａｎｄ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｎ  ２００３、３９（３）：４０９〜４２１］。マウスの実験的取扱い手順は、ＮＣＫＵのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）のガイドラインに準じていた。１２時間の明暗サイクルに維持した室内にマウスを収容し、不断給餌した。動物実験では、生後１６ヵ月の３ｘＴｇ−ＡＤマウスを使用した。これらのマウスは斑およびもつれの病理を発生させた。早くも６ヵ月目には進行性沈着としてのＡβ沈着が出現した。
【００４５】
免疫蛍光染色
１０％の抱水クロラール（４００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を用いてマウスを麻酔し安楽死させ、その後、０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で経心腔的灌流を行なった。４％のＰＦＡ中で２日間、脳を事後定着させ、４℃で３０％のスクロースを用いて脱水した。水和させた脳を、最適切断温度化合物（ＯＣＴ、Ｌｅｉｃａ）を用いて包埋し、−３０℃で急速冷凍した。１６μｍの厚みでブロックを切片化した。薄片を−２０℃で貯蔵した。免疫蛍光染色の前に、切片を５分間、低温ＰＢＳ中に浸した。５分間、１００℃で、０．０１Ｍのクエン酸を用いて抗原回復を行なった。その後、ＰＢＳＴ中に０．１％のトリトンＸ−１００（ｓｉｇｍａ）を含有する５％の正常なロバ血清（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）で切片を遮断した。一次抗体Ｉｂａ１（Ｗａｋｏ、１：４００）およびＡβ（Ｃｏｖａｎｃｅ、１：１００）を１時間、室温で使用した。それぞれ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８共役抗ウサギ抗体（Ｉｂａ１用、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：３００）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４共役抗マウス抗体（ＧＦＡＰ用、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：３００）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８共役抗マウス抗体（Ａβ用、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：３００）を使用した。Ｔｉｓｓｕｒｅ  ＦＡＸＳ顕微鏡システムによって画像を捕捉し、ＴｉｓｓｕｅＱｕｅｓｔソフトウェアモジュール（ＴｉｓｓｕｅＧｎｏｓｔｉｃ、Ｖｉｅｎｎｅ  Ａｕｓｔｒｉａ）により陽性シグナルを定量化した。
【００４６】
アミロイドβの酵素結合免疫吸着アッセイ
ＬＥＧＥＮＧ  ＭＡＸ（商標）β−Ａｍｙｌｏｉｄ  ｘ−４０およびＸ−４２  ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）により、可溶性Ａβ４０およびＡβ４２の細胞外レベルを決定した。安定して過剰発現するＡＰＰ  Ｓｗｅｄｉｓｈ突然変異（ＡＰＰｓｗｅ）を有するＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞株を、Ｎ２Ａ／ＡＰＰｓｗｅ細胞株として設計した（Ｙｕ−Ｍｉｎ’ｓ  ＬａｂのＫｕｏ教授の好意により移植）。６ｃｍの皿に、８×１０５のＮ２Ａ／ＡＰＰｓｗｅ細胞を播種した。一晩インキュベートした後、細胞を２４時間、クルクミンまたはＴＭＬ−６で処理した。ＤＭＥＭ培地中で希釈されたクルクミンおよびＴＭＬ−６の作業濃度は、図２に示されている通りである。培養上清を収集し、５分間４℃で１５００×ｇで遠心分離して細胞を除去した。さまざまな処理の培養上清のＡβレベルを、メーカーの器具設定にしたがってアッセイした。試料はＯＤ６２０で検出され、Ａβレベルの計算は、Ａβ４０およびＡβ４２の標準曲線にそれぞれ基づいていた。
【００４７】
統計分析
従来のクルクミンとクルクミン誘導体（ＡＳＣ化合物）の間のルシフェラーゼレポーターアッセイによるＡｐｏＥプロモーターの異なる長さの有意性、およびクルクミンおよびＴＭＬ−６での処理の後のＰＰＡＲおよびＡＰ２上の部位特異的突然変異誘発を、２方向ＡＮＯＶＡ（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）によって決定した。従来のクルクミンおよびＡＳＣ化合物での処理後のＡｐｏＥプロモーターの連続欠失突然変異体の有意性、およびｓｉＲＮＡノックダウン実験を、対応のあるｔ検定によって決定した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。データは、標準偏差（ＳＤ）エラーバーを伴う平均を表わす。
【００４８】
結果
複数の重要なバイオマーカーのタンパク質発現レベルを検査するために、Ｈｕｈ−７細胞を従来のクルクミンおよびＴＭＬ−６で２４時間処理し、その後、ウエスタンブロット法で分析した。我々の結果は、ＡＰＰおよびホスホ−ＮＦ−κＢのタンパク質発現レベルが、ＴＭＬ−６での２４時間の処理後に用量依存的に低下することを示した。その一方で、Ａｐｏ  Ｅのタンパク質発現レベルは、ＴＭＬ６処理において有意に増大した（図１）。この実験においては、陽性対照として、従来のクルクミンを使用した。これらの結果は、ＴＭＬ−６がＮＦκＢタンパク質のリン酸化を抑制することによって、炎症応答を阻害することを表わしている。ＡＰＰの発現も同様にＴＭＬ−６によって抑制される。反対に、ＡｐｏＥのタンパク質レベルは、ＴＭＬ−６での処理の後、増大した。
【００４９】
Ａβ産生がＴＭＬ−６により影響されたか否かを検査するために、安定した細胞株Ｎ２ａ／ＡＰＰｓｗｅを、従来のクルクミン、ＴＭＬ−６で２４時間のインキュベーションの間、処理した。ＥＬＩＳＡを使用することによって、培地中の分泌されたＡβを検査した。これらのデータは、ＴＭＬ−６が、Ａβ４０、Ａβ４２およびＡβ４２／４０の産生を有意に抑制するものの、クルクミン中では抑制しないということを示している（図２）。
【００５０】
ＡｐｏＥプロモーターの全長（−１０６１／＋４５）および連続欠失を、図３Ａに示した。ＪＡＳＰＡＲオープンアクセスデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｊａｓｐａｒ２０１６．ｇｅｎｅｒｅｇ．ｎｅｔ／）によって、ＡｐｏＥプロモーター上の転写結合部位を予測した。予測に基づいて、我々は−１０６１〜＋４５の間のＡｐｏＥプロモーター領域の連続欠失突然変異体をｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクター（図３Ｂ）へと構築し、その後、ルシフェラーゼレポーターアッセイでプロモーター活性を分析した。ＡｐｏＥプロモーターのルシフェラーゼ活性は、従来のクルクミンおよびＴＭＬ−６での処理の後、５’末端から３’末端までの領域を連続切断として漸進的に増大する（図３Ｃ）。これらの結果は、ＡｐｏＥプロモーター上の−１５０〜＋４５の間の領域が、ＡｐｏＥ遺伝子転写活性のための正の調節要素として存在することを実証している。
【００５１】
予測されたＡＰ−２の転写因子結合部位は、図３Ｄに示されているように、−１５４〜＋４５の間のＡｐｏＥプロモーター上にＰＰＡＲα／ＲＸＲαと重複して位置設定されていた。より具体的には、−１２５〜−１１４および−８４〜−７３にある２つのＰＰＡＲα／ＲＸＲα結合部位と重複する−１２０〜−１１１および−８６〜−７６にあるＡｐｏＥプロモーター領域の２つのＡＰ２結合部位が、図３Ｄの上の図版に示されている。したがって、−１５４〜＋４５の間のＡｐｏＥプロモーターの部分欠失を伴うＰＰＡＲα／ＲＸＲαおよびＡＰ−２結合配列の破壊が、部位特異的突然変異誘発によって実施された（図３Ｄの下の図版）。例えば、ＧＣＣＴモチーフ（ＰＰＡＲα／ＲＸＲαの部分結合モチーフ）が欠失させられＡＰ２結合モチーフ全体が保存されている突然変異体構成体Ｒ１ｄｅｌＰＰＡＲを通して、遠位重複ＰＰＡＲα／ＲＸＲαおよびＡＰ−２結合部位を設計した。その一方で、Ｒ１ｄｅｌＡＰ２の突然変異体構成体については、ＡＰ２結合部位は部分的に破壊され、ＰＰＡＲ結合部位は保存された。ＡｐｏＥプロモーター活性は、ＴＭＬ−６によるＡｐｏＥ転写活性化の原因であった近位ＰＰＡＲα／ＲＸＲαおよびＡＰ２結合部位（ＭｄｅｌＡＰ２およびＭｄｅｌＰＰＡＲ）の破壊によって有意に抑制された（図３Ｅ）。したがって、−８６〜−７６（ＡＰ−２）および−８４〜−７３（ＰＰＡＲα／ＲＸＲα）における近位ＡＰ２およびＰＰＡＲα／ＲＸＲα結合部位が、ＴＭＬ−６によるＡｐｏＥ転写活性化にとって極めて重要である。
【００５２】
ＴＭＬ−６によるＡｐｏＥプロモーター転写活性化についてのＰＰＡＲαの役割を解明する目的で、我々は、ＴＭＬ−６に応答したＡｐｏＥの転写調節を検査するためにｓｉＲＮＡノックダウン実験においてＡｐｏＥ−１５４／＋４５のＭｄｅｌＡＰ２（近位ＡＰ２結合部位は破壊されていた）突然変異構成体を選択した。我々のデータは、ＴＭＬ−６での処理の後、−１５４から＋４５までの野生型ＡｐｏＥプロモーター領域に比べて、ＡｐｏＥ−１５４ＭｄｅｌＡＰ２／＋４５突然変異体のプロモーター活性が抑制されたことを示している（図３Ｆ）。その上、ＡｐｏＥプロモーターの活性は、ＰＰＡＲα、ＲＸＲαおよびＡＰ２がノックダウンされた時点で最低である。その上で、我々のデータは、ＰＰＡＲαのノックダウンが、ＡｐｏＥプロモーターのＡＰ２破壊の効果を有意に抑制することを表わしている（図３Ｆ）。
【００５３】
ＡＤの治療薬としてのＴＭＬ−６の効率を検査するために、生後６ヵ月の３ｘＴｇＡＤトランスジェニックマウスに、１５０ｍｇ／ｋｇの投薬量で４ヵ月間、クルクミンおよびその誘導体ＴＭＬ−６を給餌した。Ａβレベルは、Ａβ免疫蛍光染色によって検査されるように、ＴＭＬ−６で処理された３ｘＴｇＡＤトランスジェニックマウスの脳内で有意に減少している（図４）。
【００５４】
脳の炎症がＴＭＬ−６により抑制されたか否かを検査するため、我々は、クルクミンおよびＴＭＬ−６での給餌後の、ミクログリア活性化の炎症性バイオマーカーであるＩｂａ−１の発現を検査した。データは、ＴＭＬ−６を給餌後のＡＤトランスジェニックマウス内でＴＭＬ−６が、３重ＡＤマウス実験におけるクルクミンと比べて、Ｉｂａ−１の発現を有意に阻害することを示した（図５）。
【００５５】
総合すれば、ＴＭＬ−６の作用機序は、図６で提案され示されている。クルクミン誘導体ＴＭＬ−６処理が、ＡＰＰの合成およびＡＰＰからのＡβ産生を阻害し、これによりＡβの分泌を抑制することができる。したがって、ＡＰＯＥの転写活性化は、星状膠細胞内のＡβのクリアランスを増強し得る。インビトロで、クルクミンおよびＴＭＬ−６は、ＮＦκＢのリン酸化を阻害することによって達成される抗炎症効果を有し、これは、ミクログリア活性化バイオマーカーであるＩｂａ−１の発現により査定される通り、脳領域内の炎症の低下と一致する（図５）。
【００５６】
本発明は、上述の具体的実施形態と併せて説明されてきたが、当業者には、これらの実施形態の多くの変形形態およびその修正および変更は明白である。このような変形形態、修正および変更は全て、本発明の範囲内に入るものとみなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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