(57)【要約】【課題】本発明は、ＴＲＰＶ４の活性を抑制し、過活動膀胱や過敏性腸症候群等の予防又は改善に有用な化合物を提供する。【解決手段】下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩。【化１】2019218308.tif 000029【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩。
【化１】
2019218308.tif 000022
〔式中、Ｘ及びＹはそれぞれ水素原子又はメチル基であり、Ｘがメチル基である場合Ｙは水素原子を示し、Ｘが水素原子である場合Ｙはメチル基を示す。〕
【請求項２】
下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制剤。
【化２】
2019218308.tif 000023
〔式中、Ｘ及びＹはそれぞれ水素原子又はメチル基であり、Ｘがメチル基である場合Ｙは水素原子を示し、Ｘが水素原子である場合Ｙはメチル基を示す。〕
【請求項３】
下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を有効成分とする過活動膀胱の予防又は改善剤。
【化３】
2019218308.tif 000024
〔式中、Ｘ及びＹはそれぞれ水素原子又はメチル基であり、Ｘがメチル基である場合Ｙは水素原子を示し、Ｘが水素原子である場合Ｙはメチル基を示す。〕
【請求項４】
下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善剤。
【化４】
2019218308.tif 000025
〔式中、Ｘ及びＹはそれぞれ水素原子又はメチル基であり、Ｘがメチル基である場合Ｙは水素原子を示し、Ｘが水素原子である場合Ｙはメチル基を示す。〕
【請求項５】
下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制用食品
【化５】
2019218308.tif 000026
〔式中、Ｘ及びＹはそれぞれ水素原子又はメチル基であり、Ｘがメチル基である場合Ｙは水素原子を示し、Ｘが水素原子である場合Ｙはメチル基を示す。〕
【請求項６】
下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を有効成分とする過活動膀胱の予防又は改善用食品。
【化６】
2019218308.tif 000027
〔式中、Ｘ及びＹはそれぞれ水素原子又はメチル基であり、Ｘがメチル基である場合Ｙは水素原子を示し、Ｘが水素原子である場合Ｙはメチル基を示す。〕
【請求項７】
下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善用食品。
【化７】
2019218308.tif 000028
〔式中、Ｘ及びＹはそれぞれ水素原子又はメチル基であり、Ｘがメチル基である場合Ｙは水素原子を示し、Ｘが水素原子である場合Ｙはメチル基を示す。〕
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過活動膀胱や過敏性腸症候群等の予防又は改善に有用な、ロズマリン酸誘導体又はその塩に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＲＰＶ４（Transient receptor potential cation channel subfamily V member 4）は、温度感受性ＴＲＰチャネルを構成するタンパク質の１つである。ＴＲＰＶ４は、腎、肺、膀胱、心臓、皮膚、脳、消化管など幅広い組織で発現しており、異なった幅広い生理的役割を果たしていると考えられている。
【０００３】
腎の遠位尿細管上皮細胞には特に強くＴＲＰＶ４が発現しており、ＴＲＰＶ４の作用により尿の浸透圧や流量が感知されることが示唆されている（非特許文献１）。また、ＴＲＰＶ４は膀胱の機能に関与することが報告されている（非特許文献２）。すなわち、膀胱内側の膀胱上皮細胞にはＴＲＰＶ４が存在し、尿が溜まって膀胱上皮細胞が伸展した場合に、ＴＲＰＶ４などにより構成されるＴＲＰＶチャネルを介して、細胞内にカルシウムが流入する。このカルシウムの流入によってＡＴＰが細胞から放出され、膀胱の膨らみが神経に伝わる。また、ＴＲＰＶ４が排尿間隔に及ぼす影響は、ＴＲＰチャネルを構成する他のタンパク質よりも大きいことが報告されている（非特許文献３）。
【０００４】
また、過敏性腸症候群（Irritable Bowel Syndrome：ＩＢＳ）は、細菌やウイルスの感染による腸炎や、潰瘍性大腸炎・大腸がん等の病気とは異なり、検査を行っても炎症や潰瘍といった器質的疾患が認められないにもかかわらず、下痢や便秘、腹痛、ガス過多による下腹部の張りなどの腹部不快感が生じる疾患である。ＩＢＳ患者ではＴＲＰＶ４アゴニストである多価不飽和脂肪酸の代謝産物（５，６−エポキシエイコサトリエン酸；５，６−ＥＥＴ）量が結腸で多いこと、当該５，６−ＥＥＴを含む結腸の破砕液をマウス結腸へ投与した場合に腸運動反応が増加して腸が過剰反応するが、この場合においてＴＲＰＶ４の発現を抑制すると当該過剰反応が抑制されることが報告されている（非特許文献４）。
【０００５】
したがって、ＴＲＰＶ４活性を阻害することにより、過活動膀胱や過敏性腸症候群を予防又は改善することが期待される。
【０００６】
一方、下記構造式で表される３’−Ｏ−メチル−ロズマリン酸（ｉ）、４’−Ｏ−メチル−ロズマリン酸（ｉｉ）、または３，３’−Ｏ−ジメチル−ロズマリン酸（ｉｉｉ）等の特定のロズマリン酸誘導体がシクロオキシゲナーゼ２の誘導抑制活性を有し、抗炎症作用があることが報告されている（特許文献２）。
【０００７】
【化１】
2019218308.tif 000002
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１４−２４８０９号公報
【特許文献２】特開２００５−１３９１３６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Tian  W.，Am．J．Physiol．Renal．Physiol.，2004，287，p．F17-F24
【非特許文献２】Nilius  B.，Physiol．Rev.，2007，87，p．165-217
【非特許文献３】Gevaert  T.，J．Clin．Invest.，2007，117，p．3453-3462
【非特許文献４】Nicolas Cenac et al., Gastroenterology 2015 149, 433-444
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＴＲＰＶ４の活性を抑制し、過活動膀胱や過敏性腸症候群等の予防又は改善に有用な化合物を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、ロズマリン酸誘導体について検討を行った結果、下記式（Ｉ）で示されるロズマリン酸誘導体が、優れたＴＲＰＶ４活性抑制作用を有し、過活動膀胱や過敏性腸症候群等の予防又は改善のために有用であることを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の１）〜７）に係るものである。
１）下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩。
２）下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制剤。
３）下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を有効成分とする過活動膀胱の予防又は改善剤。
４）下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善剤。
５）下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制用食品
６）下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を有効成分とする過活動膀胱の予防又は改善用食品。
７）下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善用食品。
【００１３】
【化２】
2019218308.tif 000003
【００１４】
〔式中、Ｘ及びＹはそれぞれ水素原子又はメチル基であり、Ｘがメチル基である場合Ｙは水素原子を示し、Ｘが水素原子である場合Ｙはメチル基を示す。〕
【発明の効果】
【００１５】
本発明のロズマリン酸誘導又はその塩は、ＴＲＰＶ４活性を効果的に抑制することができ、ＴＲＰＶ４チャネルが活性化されることによって生じる疾患、例えば過活動膀胱や過敏性腸症候群の予防又は改善に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体には、以下の３，４’−ジ−Ｏ−メチル−ロズマリン酸（５）及び４−Ｏ−メチル−ロズマリン酸（１３）の２化合物が包含される。当該化合物はこれまでに単離又は合成されたことがない、新規化合物である。なお、化合物（５）は（Ｅ）−３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−２−｛［３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）アクリロイル］オキシ｝プロピオン酸、化合物（１３）は（Ｅ）−３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−２−｛［３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリロイル］オキシ｝プロピオン酸と表記することもできる。
【００１７】
【化３】
2019218308.tif 000004
【００１８】
本発明のロズマリン酸誘導体には光学異性体が存在するが、いずれかの光学異性体であっても、光学異性体の混合物であってもよい。本発明ではＲ体又は光学異性体混合物が好ましい。
【００１９】
本発明の式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体の塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン等のアミン類との塩等を挙げることができる。
【００２０】
本発明の式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩は、未溶媒和型のみならず、水和物又は溶媒和物としても存在することができる。従って、本発明においては、その全ての結晶型及び水和若しくは溶媒和物を含むものである。溶媒和物の好ましい例としては、水和物、アルコール和物、アセトン和物などが挙げられる。
【００２１】
本発明の式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体は、例えば後記製造例に示すとおり、すなわち下記の反応スキームに従って合成することができる。
【００２２】
（１）３，４’−ジ−Ｏ−メチル−ロズマリン酸（５）の合成例
【００２３】
【化４】
2019218308.tif 000005
【００２４】
（２）４−Ｏ−メチル−ロズマリン酸（１３）の合成例
【００２５】
【化５】
2019218308.tif 000006
【００２６】
後記実施例で示すように式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体は、ＴＲＰＶ４活性を抑制する。すなわち、ＴＲＰＶ４刺激物質（ＴＲＰＶ４作動薬、アゴニスト）の存在下で、ＴＲＰＶ４遺伝子導入により、ＴＲＰＶ４が機能的に発現している形質転換細胞（ＴＲＰＶ４発現細胞）とジメチルロズマリン酸とを接触させた場合、ＴＲＰＶ４刺激物質による細胞内の陽イオン量の流入を抑制するという、ＴＲＰＶ４活性抑制作用を有する。
したがって、式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩は、ＴＲＰＶ４活性抑制剤となり、ＴＲＰＶ４活性抑制のため、或いはＴＲＰＶ４活性抑制剤を製造するために使用できる。
【００２７】
前述のとおり、ＴＲＰＶ４は、膀胱内側の膀胱上皮細胞に存在する。尿が溜まって膀胱上皮細胞が伸展した場合、ＴＲＰＶ４チャネルを介して細胞内にカルシウムが取り込まれ、これによってＡＴＰが細胞表面から放出され、膀胱の膨らみが神経に伝達される。したがって、ＴＲＰＶ４の活性を抑制することにより、過活動膀胱を予防又は改善することができる。また、過敏性腸症候群患者の結腸においては、多価不飽和脂肪酸の代謝産物ある５，６−ＥＥＴ（ＴＲＰＶ４アゴニスト）の量が多いこと、また当該５，６−ＥＥＴを含む結腸の破砕液をマウス結腸へ投与した場合に腸が過剰反応し、当該過剰反応はＴＲＰＶ４の発現を抑制することにより抑制されることが報告されている（前記非特許文献１）ことから、ＴＲＰＶ４活性を抑制することにより、過敏性腸症候群を予防又は改善することができる。
したがって、式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩は、過活動膀胱の予防又は改善剤、過敏性腸症候群の予防又は改善剤となり、過活動膀胱や過敏性腸症候群の予防又は改善のため、或いは過活動膀胱や過敏性腸症候群の予防又は改善剤を製造するために使用できる。
【００２８】
本発明において「ＴＲＰＶ４」とは、「Transient receptor potential cation channel subfamily V member 4」を意味する。ＴＲＰＶ４は、ヒトにおいてＴＲＰＶ４遺伝子によってコードされているタンパク質である。
また、「ＴＲＰＶ４の活性抑制」とは、受容体であるＴＲＰＶ４の活性を抑制することを指す。具体的には、ＴＲＰＶ４刺激物質がＴＲＰＶ４に結合することによって発現する活性、例えばイオン流束の調節能（例えば、細胞外から細胞内へのカルシウムイオン、ナトリウムイオンなどの陽イオンの輸送能など）、膜電位の調節能（例えば、電流の発生能など）を抑制又は阻害することを意味する。
【００２９】
本発明において、「過活動膀胱」とは尿意切迫感を必須とした症状症候群であり、通常頻尿や切迫性尿失禁を伴うものを指す。また、「過敏性腸症候群」とは、主として大腸の運動および分泌機能の異常で起こる疾患の総称であり、細菌やウイルスの感染による腸炎や、潰瘍性大腸炎・大腸がん等の病気とは異なり、検査では異常が見当たらないが下痢や便秘を繰り返す症状が続く場合に診断される疾患を意味する。
【００３０】
本発明において、ＴＲＰＶ４活性抑制のため、過活動膀胱或いは過敏性腸症候群の予防又は改善のための「使用」は、ヒトを含む動物への投与又は摂取であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
【００３１】
なお、本明細書において「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止若しくは遅延、又は個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。また、「改善」とは、疾患、症状若しくは状態の好転、疾患、症状若しくは状態の悪化の防止若しくは遅延、又は疾患、症状若しくは状態の進行の逆転、防止若しくは遅延をいう。
【００３２】
本発明のＴＲＰＶ４活性抑制剤、過活動膀胱若しくは過敏性腸症候群の予防又は改善剤は、ヒトを含む動物に摂取又は投与した場合に、ＴＲＰＶ４活性抑制効果、過活動膀胱或いは過敏性腸症候群の予防又は改善効果を発揮する医薬品、医薬部外品、サプリメント又は食品となり、或いはこれらへ配合するための素材又は製剤となり得る。
また、本発明の食品には、一般飲食品のほか、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品、機能性表示食品、サプリメントが包含される。
【００３３】
本発明の式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を含む上記医薬品（医薬部外品を含む）は、任意の投与形態で投与され得るが、経口投与が好ましい。投与に際しては、有効成分を経口投与、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。
【００３４】
このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００３５】
また、本発明の式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を配合した上記食品の形態は、清涼飲料水、茶系飲料、コーヒー飲料、果汁飲料、炭酸飲料、ゼリー、ウエハース、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品や栄養食等の各種食品の他、さらには、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、トローチ剤等の固形製剤）の栄養補給用組成物が挙げられる。なかでも、錠剤が好ましく、チュアブル錠がより好ましい。
種々の形態の食品を調製するには、本発明の式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００３６】
上記の医薬品（医薬部外品を含む）や食品中の本発明の式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、更に好ましくは１質量％以上であり、また、好ましくは１００質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、更に好ましくは７０質量％以下である。また、好ましくは０．０１〜１００質量％、より好ましくは０．１〜９０質量％、更に好ましくは１〜７０質量％である。
【００３７】
本発明の式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を医薬品や食品として、或いは医薬品や食品に配合して使用する場合のヒトへの投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人１人当たりの１日の投与量は、通常、式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩として、好ましくは０．１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上、更に好ましくは１０ｍｇ以上であり、また、好ましくは２０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下、更に好ましくは２００ｍｇ以下である。また、好ましくは０．１〜２０００ｍｇ、より好ましくは１〜５００ｍｇ、更に好ましくは１０〜２００ｍｇである。
また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数ヶ月間継続して投与することが好ましい。
【００３８】
投与又は摂取対象としては、ＴＲＰＶ４活性抑制、過活動膀胱、過敏性腸症候群の予防又は改善を必要とする若しくは希望するヒトを含む動物であれば特に限定されないが、過活動膀胱又は尿意切迫感及び切迫性尿失禁等の排尿障害などの症状を呈するヒト、ストレス等により下痢や便秘、腹痛、ガス過多による下腹部の張りなどの症状を呈するヒトへの投与又は摂取が有効である。
【００３９】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩。
＜２＞下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制剤。
＜３＞下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を有効成分とする過活動膀胱の予防又は改善剤。
＜４＞下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善剤。
＜５＞下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制用食品
＜６＞下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を有効成分とする過活動膀胱の予防又は改善用食品。
＜７＞下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善用食品。
【００４０】
＜８＞ＴＲＰＶ４活性抑制剤を製造するための、下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩の使用。
＜９＞過活動膀胱の予防又は改善剤を製造するための、下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩の使用。
＜１０＞過敏性腸症候群の予防又は改善剤を製造するための、下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩の使用。
＜１１＞ＴＲＰＶ４活性抑制用食品を製造するための、下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩の使用。
＜１２＞過活動膀胱の予防又は改善用食品を製造するための、下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩の使用。
＜１３＞過敏性腸症候群の予防又は改善用食品を製造するための、下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩の使用。
【００４１】
＜１４＞ＴＲＰＶ４活性抑制に使用するための、下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩。
＜１５＞過活動膀胱の予防又は改善に使用するための、下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩。
＜１６＞過敏性腸症候群の予防又は改善に使用するための、下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩。
【００４２】
＜１７＞ＴＲＰＶ４活性を抑制するための、下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩の非治療的使用。
＜１８＞過活動膀胱を予防又は改善するための、下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩の非治療的使用。
＜１９＞過敏性腸症候群を予防又は改善するための、下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩の非治療的使用。
【００４３】
＜２０＞下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するＴＲＰＶ４活性抑制方法。
＜２１＞下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する過活動膀胱の予防又は改善方法。
＜２２＞下記一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する過敏性腸症候群の予防又は改善方法。
【００４４】
＜２３＞＜２＞及び＜８＞のＴＲＰＶ４活性抑制剤、＜３＞及び＜９＞の過活動膀胱の予防又は改善剤、＜４＞及び＜１０＞の過敏性腸症候群の予防又は改善剤、＜５＞及び＜１１＞のＴＲＰＶ４活性抑制用食品、＜６＞及び＜１２＞の過活動膀胱の予防又は改善用食品、＜７＞及び＜１３＞の過敏性腸症候群の予防又は改善用食品における、前記有効成分の含有量は、総量中好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、更に好ましくは１質量％以上であり、また、好ましくは１００質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、更に好ましくは７０質量％以下であるか、又は好ましくは０．０１〜１００質量％、より好ましくは０．１〜９０質量％、更に好ましくは１〜７０質量％である。
【００４５】
＜２４＞＜１４＞〜＜２３＞において、成人１人当たりの１日の投与量は、一般式（Ｉ）で表されるロズマリン酸誘導体又はその塩として、好ましくは０．１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上、更に好ましくは１０ｍｇ以上であり、また、好ましくは２０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下、更に好ましくは２００ｍｇ以下であるか、又は好ましくは０．１〜２０００ｍｇ、より好ましくは１〜５００ｍｇ、更に好ましくは１０〜２００ｍｇである。
【００４６】
【化６】
2019218308.tif 000007
【００４７】
〔式中、Ｘ及びＹはそれぞれ水素原子又はメチル基であり、Ｘがメチル基である場合Ｙは水素原子を示し、Ｘが水素原子である場合Ｙはメチル基を示す。〕
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
製造例１  ３，４’−ジ−Ｏ−メチル−ロズマリン酸及び４−Ｏ−メチル−ロズマリン酸の合成
＜試薬＞
イソフェルラ酸、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）乳酸ナトリウム、イソバニリン、カフェ酸、Ｎ−アセチルグリシンは東京化成工業より、フェルラ酸、酢酸ナトリウムはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈより、臭化アリル、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、モルホリン、超脱水アセトン、超脱水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、超脱水テトラヒドロフラン、超脱水１，４−ジオキサン、超脱水ジクロロメタン、５５％水素化ナトリウム、テトラブチルアンモニウムヨージド（ＴＢＡＩ）、１-エチル-３-（３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）錯体［Ｐｄ（ＰＰｈ３）４］、８Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、無水硫酸ナトリウム、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルは富士フィルム和光純薬より、炭酸カリウム、ジクロロメタン、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、メタノール、クロロホルム、アセトン、濃塩酸、ギ酸、酢酸、水素化ホウ素ナトリウムは関東化学より、それぞれ購入して用いた。
【００４９】
１）（Ｅ）−３−［４−（アリルオキシ）−３−メトキシフェニル］アクリル酸アリル（１）の合成
【００５０】
【化７】
2019218308.tif 000008
【００５１】
アルゴン雰囲気下、イソフェルラ酸（１．５０ｇ、７．７２ｍｍｏｌ）に超脱水テトラヒドロフラン７ｍＬを加えた。さらに、５５％水素化ナトリウム（１．０１ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）、臭化アリル（１６．８ｍＬ、１３９ｍｍｏｌ）、ＴＢＡＩ（２８５ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を順次加え、７０℃加熱環流条件下、２４時間撹拌した。その後、反応系に８Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１６ｍＬおよびイオン交換水１００ｍＬを加え、クロロホルム １００ｍＬで３回抽出した。無水硫酸ナトリウムを用いて有機層を乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶出溶媒：ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（８５:１５，ｖ/ｖ））、目的物１．８８ｇ（８９％）を得た。
【００５２】
目的物の順相ＴＬＣ上のＲｆ＝［目的物スポットの移動距離］／［溶媒先端の移動距離］＝０．７１（ｎ−ヘキサン−酢酸エチル−酢酸、５０:５０:１，ｖ/ｖ/ｖ）
【００５３】
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）δ７．６４（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，１Ｈ），７．１１（ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．３０（ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，１Ｈ），６．０９（ｄｄｄ，Ｊ＝２２．６，１０．８，５．３Ｈｚ，１Ｈ），６．００（ｄｄｄ，Ｊ＝２２．７，１０．８，５．５Ｈｚ，１Ｈ），５．４０（ｄｄｄｄ，Ｊ＝３１．２，１７．１，２．８，１．７Ｈｚ，２Ｈ），５．３０（ｄｄｄｄ，Ｊ＝２７．０，１０．３，２．５，１．１Ｈｚ，２Ｈ），４．７１（ｄｔ，Ｊ＝５．５，１．３Ｈｚ，１Ｈ），４．６４（ｄｔ，Ｊ＝５．３，１．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ）.
【００５４】
２）（Ｅ）−３−［４−（アリルオキシ）−３−メトキシフェニル］アクリル酸（２）の合成
【００５５】
【化８】
2019218308.tif 000009
【００５６】
アルゴン雰囲気下、化合物（１）（１．８８ｇ、６．８６ｍｍｏｌ）に超脱水１，４−ジオキサン３４ｍＬおよび０．４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液３４ｍＬを加え、５０℃、７時間撹拌した。その後、反応系にイオン交換水１００ｍＬを加え、クロロホルム１００ｍＬで２回洗浄した。さらに、水層に１．５Ｎ塩酸水溶液を１０ｍＬ加えた後、クロロホルム１００ｍＬで３回抽出した。無水硫酸ナトリウムを用いて有機層を乾燥させた後、溶媒を減圧留去し、目的物１．４０ｇ（８４％）を得た。
【００５７】
目的物の順相ＴＬＣ上のＲｆ＝０．３０（ｎ−ヘキサン−酢酸エチル−酢酸、５０:５０:１，ｖ/ｖ/ｖ)
【００５８】
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）δ７．７１（ｄ，Ｊ＝１５.８Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｄｄ，Ｊ＝８．３，１．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．２９（ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，１Ｈ），６．０９（ｄｄｄ，Ｊ＝２２．６，１０．５，５．３Ｈｚ，１Ｈ），５．４４（ｄｄｄ，Ｊ＝１７．３，３．０，１．５Ｈｚ，１Ｈ），５．３３（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．５，２．６，１．１Ｈｚ，１Ｈ），４.６５（ｄｔ，Ｊ＝５．７，１．６Ｈｚ，２Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ）.
【００５９】
３）３−［４−（アリルオキシ）−３−メトキシフェニル］−２−ヒドロキシプロピオン酸アリル（３）の合成
【００６０】
【化９】
2019218308.tif 000010
【００６１】
アルゴン雰囲気下、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）乳酸ナトリウム（１．０ｇ、４．２７ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１．７７ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）に超脱水アセトン１２．６ｍＬを加えた。さらに、臭化アリル（５．４１ｍＬ、６４．１ｍｍｏｌ）を加え、６０℃加熱環流条件下、３日間撹拌した。その後、反応系に酢酸エチル１００ｍＬを加え、イオン交換水１００ｍＬで２回洗浄した。無水硫酸ナトリウムを用いて有機層を乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶出溶媒：ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（６０:４０，ｖ/ｖ））、目的物１．２１ｇ（９７％）を得た。
【００６２】
目的物の順相ＴＬＣ上のＲｆ＝０．６４（ｎ−ヘキサン−酢酸エチル−酢酸、５０:５０:１，ｖ/ｖ/ｖ）
【００６３】
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）δ６．８０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｄｄ，Ｊ＝７．９，１．９Ｈｚ，１Ｈ），６．１２−６．０６（ｍ，１Ｈ），６．０３−５．９６（ｍ，１Ｈ），５．４４−５．３６（ｍ，２Ｈ），５．３３−５．２６（ｍ，２Ｈ），５．２７（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．５，２．６，１．５Ｈｚ，１Ｈ），４．６６（ｄｔ，Ｊ＝６．０，１．３Ｈｚ，２Ｈ），４．５９（ｄｔ，Ｊ＝５．８，１．６Ｈｚ，２Ｈ），４．４５（ｄｄ，Ｊ＝６．２，４．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），３．０８（ｄｄ，Ｊ＝１３．８，４．７Ｈｚ，１Ｈ），２．９３（ｄｄ，Ｊ＝１４．１，６．６Ｈｚ，１Ｈ）.
【００６４】
４）３’，４−ジ−Ｏ−アリル−３，４’−ジ−Ｏ−メチル−ロズマリン酸メチル（４）の合成
【００６５】
【化１０】
2019218308.tif 000011
【００６６】
アルゴン雰囲気下、化合物（３）（６１．４ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）に超脱水ジクロロメタン１．０５ｍＬを加えた。さらに、化合物（２）（６６．４ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（７７．０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を順次加えた。反応系を−１０℃に冷却した後、ＤＣＣ（６５．０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を加え、室温下、２時間半撹拌した。その後、反応溶液を濾過し、濾過残渣をクロロホルム３ｍＬで洗浄した。濾液の溶媒を減圧留去し、得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶出溶媒：ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（５０:５０，ｖ/ｖ））、目的物１０６ｍｇ（７８％）を得た。
【００６７】
目的物の順相ＴＬＣ上のＲｆ＝０．６５（ｎ−ヘキサン−酢酸エチル−酢酸、５０:５０:１，ｖ/ｖ/ｖ）
【００６８】
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）δ７．６３（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｄｄ，Ｊ＝８．３，１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．７９（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），６．７８（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．９Ｈｚ，１Ｈ），６．３０（ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，１Ｈ），６．１２−６．０４（ｍ，２Ｈ），５．８６（ｄｄｄ，Ｊ＝２２．９，１０．４，５．８Ｈｚ，１Ｈ），５．４５−５．２２（ｍ，６Ｈ），４．６４（ｄｄ，Ｊ＝５．３，１．５Ｈｚ，２Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），３．１９（ｄｄ，Ｊ＝１４．５，４．７Ｈｚ，１Ｈ），３．１４（ｄｄ，Ｊ＝１４．３，８．３Ｈｚ，１Ｈ）.
【００６９】
５）３，４’−ジ−Ｏ−メチル−ロズマリン酸（５）の合成
【００７０】
【化１１】
2019218308.tif 000012
【００７１】
アルゴン雰囲気下、化合物（４）（４９．５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）に、超脱水テトラヒドロフラン２．５ｍＬ、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（５．７ｍｇ、５．０μｍｏｌ）、モルホリン（２５６μＬ、３．０ｍｍｏｌ）を順次加え、室温下、撹拌した。反応開始から１５分ごとに、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４を１１．４ｍｇ（９．９μｍｏｌ）ずつ添加し、計０．０９ｍｍｏｌを添加し、合計２時間半撹拌した。その後、反応系にイオン交換水４０ｍＬおよび１．５Ｎ塩酸水溶液２．９ｍＬを加え、酢酸エチル４０ｍＬで２回抽出した。無水硫酸ナトリウムを用いて有機層を乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶出溶媒：クロロホルム−メタノール（９６:４，ｖ/ｖ））、目的物１５.２ｍｇ（４０％）を得た。
【００７２】
目的物の順相ＴＬＣ上のＲｆ＝０．１９（クロロホルム−アセトン−ギ酸、７５:２０:５，ｖ/ｖ/ｖ）  
【００７３】
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ）δ７．５８（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０５（ｄｄ，Ｊ＝５．５，２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７４（ｄｄ，Ｊ＝５．４，１.６Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．３３（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，１Ｈ），５．２１（ｄｄ，Ｊ＝５．７，３．４Ｈｚ，１Ｈ），３.８９（ｓ，３Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），３．２０−３．０７（ｍ，１Ｈ），３．０７（ｄｄ，Ｊ＝９．６，８．９Ｈｚ，１Ｈ）．
【００７４】
１３Ｃ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ）δ１７２．５，１６６．７，１４９．１，１４６．４，１４５．８，１４５．７，１４４．３，１２７．９，１２７．２，１２１．８，１２１．７，１１４．５，１１４．２，１１３．０.１１１．９，１１０．５，６７．２，５５．６，５５．５，３６．８.
【００７５】
ＥＳＩ−ＭＳ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２０Ｈ１９Ｏ８−  ［Ｍ−Ｈ］−  ３８７．１;  ｆｏｕｎｄ  ３８７．０.
【００７６】
６）（Ｅ）−３−［３，４−ビス（アリルオキシ）フェニル］アクリル酸アリル（６）の合成
【００７７】
【化１２】
2019218308.tif 000013
【００７８】
カフェ酸（１．００ｇ、５．５５ｍｍｏｌ）に、超脱水アセトン１０ｍＬ、炭酸カリウム（２．３０ｍｇ、１６．６ｍｍｏｌ）、臭化アリル（４．０３ｇ、３３．３ｍｍｏｌ）を順次加え、５０℃、１２時間撹拌した。その後、イオン交換水３０ｍＬを加え、アセトンを減圧留去した。水層を酢酸エチル２０ｍＬで３回抽出した後、無水硫酸ナトリウムを用いて有機層を乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた目的物１．５０ｇ（ｃｒｕｄｅ）は、粗精製物のまま次の反応に用いた。
【００７９】
７）（Ｅ）−３−［３，４−ビス（アリルオキシ）フェニル］アクリル酸（７）の合成
【００８０】
【化１３】
2019218308.tif 000014
【００８１】
化合物（６）（１．５０ｇ、４．９９ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍＬに溶解した。さらに、水酸化ナトリウム（５９９ｍｇ、１４．９ｍｍｏｌ）を溶解したイオン交換水２ｍＬを加え、２５℃、３０分撹拌した。その後、１Ｎ塩酸水溶液２０ｍＬを加え、酢酸エチル２０ｍＬで３回抽出した。無水硫酸ナトリウムを用いて有機層を乾燥させた。得られた残渣にメチルｔｅｒｔ−ブチルメチルエ−テル５ｍＬを加え、２５℃、１時間撹拌し、濾過した。濾物をｔｅｒｔ−ブチルメチルエ−テル５ｍＬで３回洗浄し、目的物０．８０ｇ（６０％（２ｓｔｅｐｓ））を得た。
【００８２】
目的物の順相ＴＬＣ上のＲｆ＝０．５５（クロロホルム−メタノール−ギ酸、９５:５:１，ｖ/ｖ/ｖ）
【００８３】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ１２．２０（ｓ，１Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３３（ｓ，１Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．４２（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．０７−６．０２（ｍ，２Ｈ），５．４４（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），５．４３（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），５．２６（ｄ，Ｊ＝１０.４Ｈｚ，２Ｈ），４．６３−４．６０（ｍ，４Ｈ）.
【００８４】
８）（４Ｚ）−４−｛［３−（アセチルオキシ）−４−メトキシフェニル］メチレン｝−２−メチル−５（４Ｈ）−オキサゾロン（８）の合成
【００８５】
【化１４】
2019218308.tif 000015
【００８６】
イソバニリンを出発原料に用い、特許文献（ＫＲ２０１３０８７８７７）に記載の方法で合成し、目的物３２．５ｇ（８８％）を得た。
【００８７】
９）（Ｚ）−２−ヒドロキシ−３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）アクリル酸（９）の合成
【００８８】
【化１５】
2019218308.tif 000016
【００８９】
化合物（８）（５．０ｇ、２１．４ｍｍｏｌ）に超脱水１，４−ジオキサン６４ｍＬ、１Ｎ塩酸水溶液（６４ｍＬ）を加え、１０５℃、１３時間撹拌した。その後、反応系にイオン交換水１００ｍＬを加え、酢酸エチル１５０ｍＬで２回抽出した。無水硫酸ナトリウムを用いて有機層を乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣にクロロホルム ５０ｍＬを加え、残渣を懸濁させた。これを濾過し、濾物をクロロホルム１０ｍＬで２回洗浄した。得られた濾物を、メタノール７０ｍＬを用いて固液抽出した。回収した濾液の溶媒を減圧留去し、目的物１．４５ｇ（３２％）を得た。
【００９０】
目的物の順相ＴＬＣ上のＲｆ＝０．４２（クロロホルム−メタノール−ギ酸、７０:３０:１，ｖ/ｖ/ｖ）  
【００９１】
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ１２．９８（ｂｒ，１Ｈ），８．９６（ｂｒ，１Ｈ），８．９１（ｂｒ，１Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．２６（ｓ，１Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ）.
【００９２】
１０）３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）乳酸（１０）の合成
【００９３】
【化１６】
2019218308.tif 000017
【００９４】
化合物（９）（３００ｍｇ、１．４３ｍｍｏｌ）にメタノール０．８ｍＬ、イオン交換水２．４ｍＬを加えた。反応系を氷冷し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１．５ｍＬ）を加えてｐＨ  １０に調整した後、水素化ホウ素ナトリウム（８１ｍｇ、２．１５ｍｍｏｌ）を加えた。反応系を室温に戻し、１９時間撹拌した。その後、氷冷下、１．５Ｎ塩酸水溶液を滴下し、ｐＨ  ２に調整した。さらに、イオン交換水１００ｍＬを加え、酢酸エチル７０ｍＬで３回抽出した。無水硫酸ナトリウムを用いて有機層を乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣にメタノール１０ｍＬ、シリカゲル１．５ｇを加え、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶出溶媒：１％ギ酸含有クロロホルム−メタノール（９８:２，ｖ/ｖ））、目的物２２１ｍｇ（７３％）を得た。
【００９５】
目的物の順相ＴＬＣ上のＲｆ＝０．６３（クロロホルム−メタノール−ギ酸、７０:３０:１，ｖ/ｖ/ｖ）
【００９６】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ）δ６．８１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄｄ，Ｊ＝８．４，１．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２９（ｄｄｄ，Ｊ＝８．０，４．４，１．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），２．９８（ｄｄ，Ｊ＝１４．０，４．４Ｈｚ，１Ｈ），２．９８（ｄｄ，Ｊ＝１４．０，４．６Ｈｚ，１Ｈ）.
【００９７】
１１）３−（３−（アリルオキシ）−４−メトキシフェニル）−２−ヒドロキシプロピオン酸アリル（１１）の合成
【００９８】
【化１７】
2019218308.tif 000018
【００９９】
化合物（１０）（６６０ｍｇ、２．８２ｍｍｏｌ）を５０ｍＬナスフラスコにとり、超脱水ＤＭＦ１０ｍＬ、炭酸カリウム（７７９ｍｇ、５．６４ｍｍｏｌ）、臭化アリル（１．７０ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）を順次加え、５０℃、２時間撹拌した。その後、イオン交換水２０ｍＬを加え、酢酸エチル２０ｍＬで３回抽出した。回収した有機層をイオン交換水２０ｍＬで３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣に超脱水ＤＭＦ１０ｍＬを加えて溶解させた後、炭酸カリウム（７７９ｍｇ、５．６４ｍｍｏｌ）、臭化アリル（３４０ｍｇ、２．８２ｍｍｏｌ）を順次加え、５０℃、１０時間撹拌した。その後、イオン交換水２０ｍＬを加え、酢酸エチル２０ｍＬで３回抽出した。回収した有機層をイオン交換水２０ｍＬで３回洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた目的物５３０ｍｇ（ｃｒｕｄｅ）は、粗精製物のまま次の反応に用いた。
【０１００】
１２）３，３’，４’−トリ−Ｏ−アリル−４−Ｏ−メチル−ロズマリン酸アリル（１２）の合成
【０１０１】
【化１８】
2019218308.tif 000019
【０１０２】
化合物（１１）（６００ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ）と化合物（７）（５３４ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ）を超脱水ジクロロメタン５ｍＬに溶解し、ＤＭＡＰ（２５．０ｍｇ、２０５μｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（３９３ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃、１０時間撹拌した。その後、反応系を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１５ｍＬで３回洗浄し、１％クエン酸水溶液１５ｍＬで３回洗浄した。無水硫酸ナトリウムを用いて有機層を乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた目的物６００ｍｇ（ｃｒｕｄｅ）は、粗精製物のまま次の反応に用いた。
【０１０３】
１３）４−Ｏ−メチル−ロズマリン酸（１３）の合成
【０１０４】
【化１９】
2019218308.tif 000020
【０１０５】
化合物（１２）（６００ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を超脱水テトラヒドロフラン１０ｍＬに溶解し、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（３８９ｍｇ、３３６μｍｏｌ）、モルホリン（９７７ｍｇ、１１．２ｍｍｏｌ）を加え、２５℃、４時間撹拌した。その後、イオン交換水１００ｍＬを加え、１Ｎ塩酸水溶液を滴下してｐＨ  ５に調整した。さらに酢酸エチル３０ｍＬで３回抽出し、回収した有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３０ｍＬで３回洗浄した。回収した水層に１Ｎ塩酸水溶液を滴下してｐＨ  ５に調整し、酢酸エチル３０ｍＬで３回抽出した。すべての有機層を回収し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し（溶出溶媒：０．１％ギ酸水溶液−アセトニトリル（７５:２５，ｖ/ｖ））、目的物１００．５ｍｇ（２４％（２ｓｔｅｐｓ））を得た。
【０１０６】
目的物の順相ＴＬＣ上のＲｆ＝０．３９（クロロホルム−メタノール−ギ酸、９０:１０:１，ｖ/ｖ/ｖ）
【０１０７】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１３．１（ｓ，１Ｈ），９．６７（ｓ，１Ｈ），９．１８（ｓ，１Ｈ），８．９０（ｓ，１Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ），７．０３（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．０Ｈｚ１Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），６．２４（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），５．０５（ｄｄ，８．４，４．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．０３（ｄｄ，１４．４，４．４，１Ｈ），２.９４（ｄｄ，１４．０，８．４Ｈｚ，１Ｈ）．
【０１０８】
１３Ｃ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ）δ１７３．４，１６８．４，１４９．８，１４８．１，１４７．７，１４７．４，１４６.８，１３０．６，１２７．６，１２３．２，１２１．７，１１７．５，１１６．５，１１５．２，１１４．３，１１２．７，７４．５，５６．４，３７．９.
【０１０９】
ＥＳＩ−ＭＳ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１９Ｈ１８ＮａＯ８＋  ［Ｍ＋Ｎａ］＋  ３９７．１;  ｆｏｕｎｄ  ３９７．２.
【０１１０】
試験例１  ＴＲＰＶ４活性抑制作用の評価
（１）試薬
ヒト十二指腸由来細胞（Ｈｕｔｕ−８０細胞）、ヒト子宮頸癌由来細胞株（ＨｅＬａ細胞）はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔはロッシュより、ｐｃＤＮＡ３．１  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地はインビトロジェンより、ＴｒａｎｓＩＴ−ＨｅＬａＭＯＮＳＴＥＲ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ＫｉｔはＭｉｒｕｓより、ＤｅｔａｃｈｉｎはＧｅｎｌａｎｔｉｓより、９６ｗｅｌｌ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅはＮｕｎｃより、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｋｉｔ  ＩＩ  −  ｆｌｕｏ  ４はＤＯＪＩＮＤＯより、Ｈａｎｋｓ’ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、牛胎児血清はＧｉｂｃｏより、ＧＳＫ１０１６７９０ａはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈより、５ｘ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  Ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ  ｍｉｘｔｕｒｅ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはタカラバイオより、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅは富士フィルム和光純薬よりそれぞれ購入して用いた。
【０１１１】
（２）ヒトＴＲＰＶ４遺伝子発現ベクターの作製
Ｈｕｔｕ−８０細胞から抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡを鋳型にして、公開されているヒトＴＲＰＶ４遺伝子配列を参考に合成した、下記に示す塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて、下記の条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
【０１１２】
＜プライマーセット＞
フォワードプライマー；５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＴＴＣＣＡＧＣＧＡＡＧＧＣＣＣ−３’（配列番号１）
リバースプライマー；５’−ＣＴＡＧＡＧＣＧＧＧＧＣＧＴＣＡＴＣＡＧＴＣＣ−３’（配列番号２）
【０１１３】
＜ＰＣＲ条件＞
ａ）ＰＣＲ溶液組成
ｃＤＮＡ（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）                                    １５μＬ
５ｘ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  Ｂｕｆｆｅｒ                  １０μＬ
ｄＮＴＰｓ  ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ）                          ４μＬ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ          １μＬ
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）                          １μＬ
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）                          １μＬ
Ｗａｔｅｒ                                                      １８μＬ
ｂ）温度とサイクル条件
９５℃  ２ｍｉｎ
↓
９８℃  １０ｓｅｃ, ７０℃  ２ｍｉｎ, ３３ｃｙｃｌｅｓ
【０１１４】
得られたＰＣＲ産物を、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。精製したＰＣＲ産物と、ｐｃＤＮＡ３．１  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、ヒトＴＲＰＶ４遺伝子発現ベクターを作製した。
【０１１５】
（３）ヒトＴＲＰＶ４発現細胞の作製
１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて、ＨｅＬａ細胞の培養を行った。ＨｅＬａ細胞をＴ−７５細胞培養用フラスコに５×１０５ｃｅｌｌｓ／Ｆｌａｓｋで播種した。培養３日後、前記（２）で作製したヒトＴＲＰＶ４遺伝子発現用ベクター（８μｇ）をＴｒａｎｓＩＴ−ＨｅＬａＭＯＮＳＴＥＲ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて細胞にトランスフェクションし、１日培養した。
Ｄｅｔａｃｈｉｎで細胞をはがし９６ｗｅｌｌ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅに１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／９０μＬ／ｗｅｌｌの細胞密度で播き、さらに１日培養した。
【０１１６】
（４）細胞内カルシウムイオン流入率の測定
細胞内カルシウムイオン流入率の測定は、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｋｉｔ  ＩＩ  −  ｆｌｕｏ  ４を用いて行った。Ｆｌｕｏ４−ＡＭを含有したＬｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ及びＨａｎｋｓ’ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを１：１で混合した後、前記（３）で作製したヒトＴＲＰＶ４発現細胞に１８０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、３７℃で蛍光プレートリーダーＦＤＳＳ３０００（浜松ホトニクス）を用いて蛍光強度（励起波長：４８８ｎｍ、蛍光波長：５２４ｎｍ）を２秒毎に測定した。測定開始３０秒後にＴＲＰＶ４作動薬であるＧＳＫ１０１６７９０ａと検体として前記製造例で調製した４−Ｏ−メチル−ロズマリン酸または３，４’−ジ−Ｏ−メチル−ロズマリン酸溶液をそれぞれＨａｎｋｓ’ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎで希釈し、それらの混合溶液（添加直前に混合）を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３００秒まで２秒毎に蛍光強度変化を測定した。なお、ＧＳＫ１０１６７９０ａは終濃度３ｎＭとなるように添加した。
また、ＴＲＰＶ４活性抑制の陽性対照として、ＴＲＰＶ４の拮抗薬であるＨＣ０６７０４７を終濃度１０μＭで添加した。４−Ｏ−メチル−ロズマリン酸、３，４’−ジ−Ｏ−メチル−ロズマリン酸、ＧＳＫ１０１６７９０ａ、ＨＣ０６７０４７は、いずれもＤｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）に溶解して使用した。
検体のＴＲＰＶ４活性は、ＴＲＰＶ４作動薬であるＧＳＫ１０１６７９０ａの処理による細胞内カルシウムイオン流入率を１００％として、次式により算出した。
【０１１７】
（数１）
細胞内カルシウムイオン流入率（％）＝［（Ｆｍａｘ／Ｆ０）−（ＦｍａｘＣ２／Ｆ０Ｃ２）］／［（ＦｍａｘＣ１／Ｆ０Ｃ１）−（ＦｍａｘＣ２／Ｆ０Ｃ２）］×１００
【０１１８】
Ｆｍａｘ：測定開始０〜３００秒のＧＳＫ１０１６７９０ａと検体を添加したウェルの最高蛍光強度
ＦｍａｘＣ１：測定開始０〜３００秒のＧＳＫ１０１６７９０ａと溶媒を添加したウェルの最高蛍光強度
ＦｍａｘＣ２：測定開始０〜３００秒の溶媒のみを添加したウェルの最高蛍光強度
Ｆ０：測定開始直後のＦｍａｘと同じウェルの蛍光強度
Ｆ０Ｃ１：測定開始直後のＦｍａｘＣ１と同じウェルの蛍光強度
Ｆ０Ｃ２：測定開始直後の溶媒のみを添加したウェルの蛍光強度
【０１１９】
検体を添加した場合の細胞内カルシウムイオン流入率（各群ｎ＝３）を、ＧＳＫ１０１６７９０ａ＋溶媒（ＤＭＳＯ）添加時と比較しＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔを用いて検定した。４−Ｏ−メチル−ロズマリン酸または３，４’−ジ−Ｏ−メチル−ロズマリン酸を添加した場合の結果を表１に示す（表中、ＧＳＫ１０１６７９０ａ、４−Ｏ−メチル−ロズマリン酸、３，４’−ジ−Ｏ−メチル−ロズマリン酸は、それぞれＧＳＫ、４−Ｍｅ−ＲＡ、３，４’−ＤｉＭｅ−ＲＡと略記）。尚、結果は平均値（Ｍｅａｎ）±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）として表記した。
【０１２０】
【表１】
2019218308.tif 000021
【０１２１】
表１より、陽性対照であるＴＲＰＶ４の拮抗薬と同様、４−Ｏ−メチル−ロズマリン酸、３，４’−ジ−Ｏ−メチル−ロズマリン酸は濃度依存的にＴＲＰＶ４作動薬による細胞内へのカルシウムイオン流入を有意に低下させた。
【０１２２】
以上の結果から、４−Ｏ−メチル−ロズマリン酸又は３，４’−ジ−Ｏ−メチル−ロズマリン酸は、ＴＲＰＶ４の活性を抑制することを示している。さらに、ＴＲＰＶ４活性を抑制する作用を有する４−Ｏ−メチル−ロズマリン酸又は３，４’−ジ−Ｏ−メチル−ロズマリン酸は、過敏性腸症候群又は過活動膀胱の予防又は改善に有効であることを示している。
【配列表】
2019218308000001.app