(57)【要約】      （修正有）【課題】再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化又は再生するための方法の提供。【解決手段】再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、ａ）該材料に、２材料容積以上の溶出バッファーを通過させる工程であって、該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．９である、工程、ｂ）約１０分間から約３０分間までの範囲の時間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持する工程、ｃ）該材料に、約２材料容積以上の溶出バッファーを通過させる工程、及び、ｄ）該材料に、約２材料容積以上の再生バッファーを通過させる工程であって、該再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である、工程を含む、方法。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、
ａ）該材料に、２材料容積以上の溶出バッファーを通過させる工程であって、該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．９である、工程、
ｂ）約１０分間から約３０分間までの範囲の時間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｃ）該材料に、約２材料容積以上の溶出バッファーを通過させる工程、及び
ｄ）該材料に、約２材料容積以上の再生バッファーを通過させる工程であって、該再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である、工程
を含む、方法。
【請求項２】
再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、
ａ）該材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．９である、工程、
ｂ）約３０分間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｃ）該材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、及び
ｄ）該材料に、約４材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、該再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である、工程
を含む、方法。
【請求項３】
再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、
ａ）該材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．９である、工程、
ｂ）約３０分間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｃ）該材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、及び
ｄ）該材料に、約２．５材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、該再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である、工程、
ｅ）約３０分間にわたって、再生バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｆ）該材料に、約２．５材料容積の再生バッファーを通過させる工程
を含む、方法。
【請求項４】
再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、
ａ）該材料に、約２材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程であって、該平衡化バッファーは、約２５ｍＭのトリス及び約２５ｍＭのＮａＣｌを含み、約ｐＨ７．１である、工程、
ｂ）約３０分間にわたって、平衡化バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｃ）該材料に、約２材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程、
ｄ）該材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．８である、工程、
ｅ）約３０分間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｆ）該材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、
ｇ）該材料に、約２材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、該再生バッファーは、０．１ＮのＮａＯＨを含み、ｐＨ１３である、工程、
ｈ）約３０分間にわたって、再生バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｉ）該材料に、約２材料容積の再生バッファーを通過させる工程
を含む、方法。
【請求項５】
再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、
ａ）該材料に、約４材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程であって、該平衡化バッファーは、約２５ｍＭのトリス及び約２５ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨ７．１である、工程、
ｂ）６サイクルの、
ｉ）該材料に、約３材料容積の溶出バッファーを通過させること、ここで該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．８である；
ｉｉ）約１０分間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持すること；
ｉｉｉ）該材料に、約１材料容積の溶出バッファーを通過させること；
ｉｖ）該材料に、約３材料容積の再生バッファーを通過させること、ここで該再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である；
ｖ）約１０分間にわたって、再生バッファー中で該材料を静的に保持すること；
ｖｉ）該材料に、約１材料容積の再生バッファーを通過させること
を含む工程を実施する工程
を含む、方法。
【請求項６】
再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、６サイクルの、
ａ）該材料に、約３材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．８である、工程、
ｂ）約１５分間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｃ）該材料に、約１材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、
ｄ）該材料に、約３材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、該再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である、工程、
ｅ）約１５分間にわたって、再生バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｆ）該材料に、約１材料容積の再生バッファーを通過させる工程、
ｇ）該材料に、約３材料容積の貯蔵バッファーを通過させる工程であって、該貯蔵バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約２％のベンジルアルコールを含み、約ｐＨ５．０である、工程、
ｅ）約１５分間にわたって、貯蔵バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｆ）該材料に、約１材料容積の貯蔵バッファーを通過させる工程
を含む、方法。
【請求項７】
クロマトグラフィー材料が、クロマトグラフィーカラム中に存在する、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
クロマトグラフィー材料が、アフィニティー材料である、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
アフィニティー材料が、プロテインＡアフィニティー材料である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
プロテインＡアフィニティー材料が、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ材料、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ材料又はＭＡｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ材料である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
クロマトグラフィー材料が、ポリペプチドの大規模産生のために使用される、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、
ａ）該材料に、約３材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程であって、該平衡化バッファーは、約４０ｍＭの酢酸ナトリウムを含み、約ｐＨ５．５である、工程、
ｂ）該材料に、約２材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程、
ｃ）約１０分間にわたって、約０．５ＮのＮａＯＨ中で該材料を静的に保持する工程、
ｄ）該材料に、約１材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程、及び
ｅ）約１０分間にわたって、約０．５ＮのＮａＯＨ中で該材料を静的に保持する工程、
ｆ）該材料に、約１材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程
を含む、方法。
【請求項１３】
クロマトグラフィー材料が、クロマトグラフィーカラム中に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
クロマトグラフィー材料が、イオン交換材料である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
イオン交換材料が、陽イオン交換材料である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
陽イオン交換材料が、ＰＯＲＯＳ  ＨＳ５０材料である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
クロマトグラフィー材料が、抗体の大規模産生のために使用される、請求項１２から１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、
ａ）該材料に、約３材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程であって、該平衡化バッファーは、約５０ｍＭのトリス、８５ｍＭの酢酸ナトリウムを含み、約ｐＨ８．８及び約８．６ｍＳ／ｃｍである、工程、
ｂ）該材料に、約２材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程、
ｃ）約１０分間にわたって、約０．５ＮのＮａＯＨ中で該材料を静的に保持する工程、
ｄ）該材料に、約１材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程、及び
ｅ）約１０分間にわたって、約０．５ＮのＮａＯＨ中で該材料を静的に保持する工程、
ｆ）該材料に、約１材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程
を含む、方法。
【請求項１９】
クロマトグラフィー材料が、クロマトグラフィーカラム中に存在する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
クロマトグラフィー材料が、イオン交換材料である、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
イオン交換材料が、陰イオン交換材料である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
陰イオン交換材料が、ＱＳＦＦ材料である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
クロマトグラフィー材料が、抗体の大規模産生のために使用される、請求項１８から２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
バッファーが、材料を、約３０材料容積／時間、約２０材料容積／時間又は約１５材料容積／時間で通過する、請求項１から２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
バッファーが、材料を、ダウンフロー方向又はアップフロー方向で通過する、請求項１から２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
クロマトグラフィー材料を浄化した後にモック溶出を実行することによって、クロマトグラフィー材料の浄化が測定される、請求項１から２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
モック溶出の溶出剤が＜０．２５ｍｇ／ｍＬの総タンパク質、＜１ｐｐｍのＩｇＧ断片、＜１ｐｐｍの浸出されたプロテインＡ、＜１μｇ／ｍＬのＣＺＥ  ＬＩＦ、＜１ｐｐｍのＣＨＯＰ及び＜１ｐｇ／ｍＬのＣＨＯ  ＤＮＡのうち１又は複数を含むことが、多産物使用に関して材料の有効な浄化の指標である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
クロマトグラフィー材料が、アルカリ中で安定である、請求項１から２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
クロマトグラフィー材料が、ポリペプチドを精製するために使用される、請求項１から２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
クロマトグラフィー材料が第１のポリペプチドの精製後に浄化され、浄化の後、該クロマトグラフィー材料が第２のポリペプチドを精製するために使用される、請求項１から２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ポリペプチドが、抗体又はイムノアドヘシンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ポリペプチドがイムノアドヘシンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ポリペプチドが抗体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
モノクローナル抗体が、ＩｇＧモノクローナル抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抗体が、抗原結合性断片である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
抗原結合性断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、ジ−ｓｃＦｖ、ビ−ｓｃＦｖ、タンデム（ジ、トリ）−ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｄＡｂ、三機能性抗体、ＢｉＴＥ、ダイアボディ又はトリアボディである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ポリペプチドが、酵素、ホルモン、融合タンパク質、Ｆｃ含有タンパク質、イムノコンジュゲート、サイトカイン又はインターロイキンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
第１のポリペプチドが、第１の抗体又は第１のイムノアドヘシンであり、第２のポリペプチドが、第２の抗体又は第２のイムノアドヘシンである、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願とのクロスリファレンス
本出願は、その全内容が本明細書に参照により援用される、２０１３年９月５日出願の米国仮特許出願第６１／８７４３０５号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、クロマトグラフィーのための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、医学及び診断学において使用される（Albrecht, H.等, Drugs Today 2009, 45:199-211; Takimoto, C. H.; Principles of Oncologic Pharmacotherapy Calvo, E. In Cancer Management:A Multidisciplinary Approach Medical, Surgical & Radiation Oncolog, 第11版; Pazdur, R.; Wagman, L. D.; Camphausen, K.A.; Hoskins, W.J., 編 CMP Healthcare Media LLC: Lawrence, KS, USA, 2008）。産業的に、組換えｍＡｂは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの生細胞において生体産生される（Fahrner, R. L.等, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2001, 18:301-327）。産生された後、目的のｍＡｂは、その産生に使用された細胞成分及び培地成分から単離しなくてはならない。この精製プロセスは、２つの主要な工程（ａ）一次単離プロセスと、その後の（ｂ）最終精製プロセス、を有する。この一次ｍＡｂ単離プロセスは、目的のｍＡｂのために細胞を回収した後に始まる。ｍＡｂが回収された後、産物プールは、目的のｍＡｂ並びにｍＡｂ産生プロセスの間に存在し得る細胞成分（培地成分、タンパク質、ＤＮＡ）及びウイルスを含む。例示的単離プロセスの第１のクロマトグラフィー工程において、この産物プールは、プロテインＡアフィニティーカラムを介して実行される（工程１）。プロテインＡアフィニティー工程の目的は、培地成分、細胞デブリ及び推定ウイルスを除去することである。工程１の後、ｍＡｂを含む産物プールは、イオン交換カラムでさらに精製される（ＩＥＸ、工程２）。工程２は、凝集物及びＤＮＡなどのさらなる夾雑物を除去するように機能する。ＩＥＸクロマトグラフィー後、一次単離プロセスの最後の工程は、ウイルス低減フィルターを使用してウイルスを除去するための工程を含む（工程３）。典型的には、工程３の後、ｍＡｂの最終精製が、任意の残留ＣＨＯタンパク質（ＣＨＯＰ）を除去するために、第２のイオン交換工程（工程４）を用いて実施される。最終精製後、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ、工程５）が、精製されたｍＡｂをその最終製剤バッファーへと製剤化するために、低分子を除去し、ｍＡｂを濃縮し、バッファーを交換するために実施される。この後に、ｍＡｂプールの無菌状態を確実にする、バルク濾過工程が続く（工程６）。
【０００４】
産業的ｍＡｂ精製におけるプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、効率的であり、スケーラブルであり、再現性があることから一般的によく使用される（Affinity Chromatography Principles and Methods, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden, 2002, 2012年7月13日にアクセスされたgelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-us/18102229におけるワールドワイドウェブを参照のこと; Fahrner, R.L.等, Bioprocess Eng. 1999, 22:287）。しかし、プロテインＡ樹脂のコストは、顕著であり、ＭＡｂ製造における原材料コストのかなりの部分を構成する（Fahrner, R. L.等, Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 30, 121-128; Kelley, B., Biotechnol. Prog. 2007, 23:995-1008）。この出費は、単一の充填プロテインＡカラムがその潜在的寿命の１０％しか使用されていない（パイロットプラントにおいて及び臨床産生の間に）ような樹脂の使用不足によって、さらに深刻になる。これらのコストを低減させるために、複数の異なるｍＡｂ産物についてのプロテインＡ樹脂の再使用が望ましい。複数の産物についてのプロテインＡ樹脂の再使用は、一般的な慣行ではないが、それは、再使用が、前の実行からだけでなく、以前に精製された産物からも、タンパク質キャリーオーバーを生じ得るからである。従って、効率的な浄化プロセスが、再使用を可能にする。かかるプロセスは、金、空間及び時間を節約するだけでなく、環境にも優しい。さらに、時間の節約は、合成される全ての新たなｍＡｂのためにカラムを再充填することの回避から得られる。プロテインＡ樹脂を再使用することは、消耗、貯蔵又は出荷されるプロテインＡ樹脂が少なくなるので、環境汚染がより少なくなる。典型的なＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ樹脂は、最大２５０サイクル（回）使用できることに留意のこと（Fahrner, R. L. Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 30, 121-128; Kelley, B., Biotechnol. Prog. 2007, 23:995-1008; MabSelect（商標）Sure resin; Application note 28-9872096 AA; Lifetime performance study of MabSelect（商標） Sure LX during repeated cleaning-in-place; GE Healthcare, Piscataway, NJ. 2011年2月。gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1314807262343/litdoc28987296AA_20110831222625.pdfにおけるワールドワイドウェブを参照のこと）。しかし、典型的な臨床実行又は毒物学実行のためのパイロットプラント規模では、プロテインＡカラムは、合計３−４回の実行（１８−３０サイクル）でのみ使用され、概ね２２０−２３２サイクルを無駄にしている（Fahrner, R. L.等, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2001, 18:301-327）。本明細書に記載するように、実験室規模及びパイロット規模での複数のＣＨＯ産物についてのＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ樹脂カラムなどのクロマトグラフィーカラムの再使用が可能になり、最適化された。前の精製からのｍＡｂキャリーオーバーのレベルを、許容されるレベルまで低減させるために、ｍＡｂ精製実行間で使用される改善されたプロテインＡ樹脂浄化手順が、開発され、検証された。これは、以下：（ａ）同じプロテインＡ樹脂を使用する前の精製からそれに続く精製への、浄化前タンパク質キャリーオーバー（存在する場合）の量の定量化、及び（ｂ）わずかなタンパク質キャリーオーバーでかつ安全性の懸念なしに複数の産物が同じプロテインＡ樹脂で精製できるように、使用の前又は後にプロテインＡアフィニティー樹脂を浄化す���方法の同定に取り組むことによって達成された。
【０００５】
特許出願及び刊行物を含む本明細書で引用される全ての参考文献は、その全内容が本明細書に参照により援用される。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、再使用のために、クロマトグラフィー樹脂などのクロマトグラフィー材料を浄化又は再生するための方法を提供する。クロマトグラフィー材料は、同じ産物又は異なる産物との使用のために、浄化及び／又は再生され得る。
【０００７】
一部の態様では、本発明は、再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法を提供し、この方法は、ａ）この材料に、２材料容積以上の溶出バッファーを通過させる工程であって、この溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．９である、工程、ｂ）約１０分間から約３０分間までの範囲の時間にわたって、溶出バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｃ）この材料に、約２材料容積以上の溶出バッファーを通過させる工程、及びｄ）この材料に、約２材料容積以上の再生バッファーを通過させる工程であって、この再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である、工程を含む。
【０００８】
一部の態様では、本発明は、再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法を提供し、この方法は、ａ）この材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、この溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．９である、工程、ｂ）約３０分間にわたって、溶出バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｃ）この材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、及びｄ）この材料に、約４材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、この再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である、工程を含む。
【０００９】
一部の態様では、本発明は、再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法を提供し、この方法は、ａ）この材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、この溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．９である、工程、ｂ）約３０分間にわたって、溶出バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｃ）この材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、及びｄ）この材料に、約２．５材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、この再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である、工程、ｅ）約３０分間にわたって、再生バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｆ）この材料に、約２．５材料容積の再生バッファーを通過させる工程を含む。
【００１０】
一部の態様では、本発明は、再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法を提供し、この方法は、ａ）この材料に、約２材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程であって、この平衡化バッファーは、約２５ｍＭのトリス及び約２５ｍＭのＮａＣｌを含み、約ｐＨ７．１である、工程、ｂ）約３０分間にわたって、平衡化バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｃ）この材料に、約２材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程、ｄ）この材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、この溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．８である、工程、ｅ）約３０分間にわたって、溶出バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｆ）この材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、ｇ）この材料に、約２材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、この再生バッファーは、０．１ＮのＮａＯＨを含み、ｐＨ１３である、工程、ｈ）約３０分間にわたって、再生バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｉ）この材料に、約２材料容積の再生バッファーを通過させる工程を含む。
【００１１】
一部の態様では、本発明は、再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法を提供し、この方法は、ａ）この材料に、約４材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程であって、この再平衡化バッファーは、約２５ｍＭのトリス及び約２５ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨ７．１である、工程、ｂ）６サイクルの、ｉ）この材料に、約３材料容積の溶出バッファーを通過させること、ここでこの溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．８である；ｉｉ）約１０分間にわたって、溶出バッファー中でこの材料を静的に保持すること；ｉｉｉ）この材料に、約１材料容積の溶出バッファーを通過させること；ｉｖ）この材料に、約３材料容積の再生バッファーを通過させること、ここでこの再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である；ｖ）約１０分間にわたって、再生バッファー中でこの材料を静的に保持すること；ｖｉ）この材料に、約１材料容積の再生バッファーを通過させること、を含む工程を実施する工程を含む。
【００１２】
一部の態様では、本発明は、再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法を提供し、この方法は、ａ）この材料に、約３材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、この溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．８である、工程、ｂ）約１５分間にわたって、溶出バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｃ）この材料に、約１材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、ｄ）この材料に、約３材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、この再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である、工程、ｅ）約１５分間にわたって、再生バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｆ）この材料に、約１材料容積の再生バッファーを通過させる工程、ｇ）この材料に、約３材料容積の貯蔵バッファーを通過させる工程であって、この貯蔵バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約２％のベンジルアルコールを含み、約ｐＨ５．０である、工程、ｅ）約１５分間にわたって、貯蔵バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｆ）この材料に、約１材料容積の貯蔵バッファーを通過させる工程を含む。
【００１３】
上記態様の一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、クロマトグラフィーカラム中に存在する。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、アフィニティー材料である。さらなる実施態様では、このアフィニティー材料は、プロテインＡアフィニティー材料、例えば、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ材料、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ材料又はＭＡｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ材料であるが、これらに限定されない。上記態様の一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、ポリペプチドの大規模産生のために使用される。
【００１４】
一部の態様では、本発明は、再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法を提供し、この方法は、ａ）この材料に、約３材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程であって、この平衡化バッファーは、約４０ｍＭの酢酸ナトリウムを含み、約ｐＨ５．５である、工程、ｂ）この材料に、約２材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程、ｃ）約１０分間にわたって、約０．５ＮのＮａＯＨ中でこの材料を静的に保持する工程、ｄ）この材料に、約１材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程、及びｅ）約１０分間にわたって、約０．５ＮのＮａＯＨ中でこの材料を静的に保持する工程、ｆ）この材料に、約１材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程を含む。
【００１５】
上記態様の一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、クロマトグラフィーカラム中に存在する。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、イオン交換材料である。一部の実施態様では、このイオン交換材料は、陽イオン交換材料、例えば、ＰＯＲＯＳ  ＨＳ５０材料である。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、抗体の大規模産生のために使用される。
【００１６】
一部の態様では、本発明は、再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法を提供し、この方法は、ａ）この材料に、約３材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程であって、この平衡化バッファーは、約５０ｍＭのトリス、８５ｍＭの酢酸ナトリウムを含み、約ｐＨ８．８及び約８．６ｍＳ／ｃｍである、工程、ｂ）この材料に、約２材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程、ｃ）約１０分間にわたって、約０．５ＮのＮａＯＨ中でこの材料を静的に保持する工程、ｄ）この材料に、約１材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程、及びｅ）約１０分間にわたって、約０．５ＮのＮａＯＨ中でこの材料を静的に保持する工程、ｆ）この材料に、約１材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程を含む。
【００１７】
上記態様の一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、クロマトグラフィーカラム中に存在する。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、イオン交換材料である。一部の実施態様では、このイオン交換材料は、陰イオン交換材料、例えば、ＱＳＦＦ材料である。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、抗体の大規模産生のために使用される。
【００１８】
上記態様のいずれかの一部の実施態様では、これらのバッファーは、この材料を、約３０材料容積／時間、約２０材料容積／時間又は約１５材料容積／時間で通過する。一部の実施態様では、このバッファーは、この材料を、ダウンフロー方向又はアップフロー方向で通過する。一部の実施態様では、クロマトグラフィー材料を浄化した後にモック溶出（模擬溶出、ｍｏｃｋ  ｅｌｕｔｉｏｎ）を実行することによって、クロマトグラフィー材料の浄化が測定される。一部の実施態様では、モック溶出の溶出剤が＜０．２５ｍｇ／ｍＬの総タンパク質、＜１ｐｐｍのＩｇＧ断片、＜１ｐｐｍの浸出されたプロテインＡ、＜１μｇ／ｍＬのＣＺＥ  ＬＩＦ、＜１ｐｐｍのＣＨＯＰ及び＜１ｐｇ／ｍＬのＣＨＯ  ＤＮＡのうち１又は複数を含むことが、多産物使用に関してこの材料の有効な浄化の指標である。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、アルカリ中で安定である。
【００１９】
上記態様のいずれかの一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、ポリペプチドを精製するために使用される。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は第１のポリペプチドの精製後に浄化され、浄化の後、このクロマトグラフィー材料は第２のポリペプチドを精製するために使用される。一部の実施態様では、このポリペプチドは、抗体又はイムノアドヘシンである。一部の実施態様では、この抗体は、モノクローナル抗体である。さらなる実施態様では、このモノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である。さらなる実施態様では、このモノクローナル抗体は、ＩｇＧモノクローナル抗体である。一部の実施態様では、この抗体は、抗原結合性断片である。一部の実施態様では、この抗原結合性断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、ジ−ｓｃＦｖ、ビ−ｓｃＦｖ、タンデム（ジ、トリ）−ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｄＡｂ、三機能性抗体、ＢｉＴＥ、ダイアボディ又はトリアボディである。他の実施態様では、ポリペプチドは、酵素、ホルモン、融合タンパク質、Ｆｃ含有タンパク質、イムノコンジュゲート、サイトカイン又はインターロイキンである。一部の実施態様では、この第１のポリペプチドは、第１の抗体又は第１のイムノアドヘシンであり、第２のポリペプチドは、第２の抗体又は第２のイムノアドヘシンである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】さらなる樹脂浄化なしの、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅカラム上での、ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢ及びｍＡｂＣの順次的な実験室規模精製からの溶出試料サイクルの関数としての、総タンパク質キャリーオーバー（インタクトなＩｇＧ＋Ｆｃ断片）のプロットを示す図である。説明文：ｍＡｂＢ溶出におけるｍＡｂＡキャリーオーバー（黒色及び灰色）、ｍＡｂＣ溶出におけるｍＡｂＢキャリーオーバー（灰色）及びｍＡｂＣ溶出におけるｍＡｂＡキャリーオーバー（黒色）。
【図２】溶出バッファー（０．１５Ｍの酢酸）又は再生バッファー（０．１ＮのＮａＯＨ）ＣＶ洗浄の関数としての、初期浄化サイクルにおいて見られたタンパク質除去を示す図である。矢印は、３０分間の静的保持を指す。３０分間の静的保持後にカラムから洗浄除去されたタンパク質の量において５倍の増加が存在すること、及び再生バッファーによる静的保持後にタンパク質が検出されなかったことに留意のこと。説明文：方法４（表２）：黒色；方法５（表２）：黒色及び灰色。
【図３】方法６（黒色バー、表２）及び方法７（検出されたものなし、表２）を使用する浄化の後の、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅカラムで実施した「モック実行」後に検出されたインタクトなＩｇＧタンパク質を示す図である。３回の「モック実行」を、方法７（表２）を使用して実施し、結果は再現性があった。
【図４】９４ｎｇ／ｍＬのモック溶出試料について方法７の浄化手順（表２）に従う、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅカラムの浄化後の、「モック溶出」のキャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）解析により、ｍＡｂが９０％を超えて完全にインタクトであったことが明らかになったことを示す図である。
【図５】方法７の浄化手順（表２）を使用するＡｋｔａクロマトグラムを示す図である。「モック溶出」のクロマトグラムは、溶出バッファー（０．１５Ｍの酢酸）から再生バッファー（０．１ＮのＮａＯＨ）へのシフトが６サイクルの各々について行われる際のＵＶ強度におけるスパイクで実証される、カラムの効率的な浄化を示唆する。青色の線＝ＵＶ２８０ｎｍ、赤色の線＝ｐＨ、マゼンタの線＝伝導率。
【図６】タンパク質キャリーオーバーを決定するための、「モック実行」前の、最適化された浄化手順（エントリー７、表２）を使用した、ｍＡｂＡの実験室規模精製についての結果を示す図である。Ａ．溶出バッファーサイクル洗浄の関数としてのタンパク質キャリーオーバー（ｎｇ／ｍｇタンパク質）；Ｂ．再生バッファーサイクル洗浄の関数としてのタンパク質キャリーオーバー（ｎｇ／ｍｇタンパク質）；Ｃ．「モック実行」中の段階の関数としてのタンパク質キャリーオーバー（ｎｇ／ｍｇタンパク質）。インタクトなＩｇＧは黒色で示され、Ｆｃ断片は灰色で示される。
【図７】貯蔵バッファー（１００ｍＭの酢酸ナトリウム及び２％のベンジルアルコール（ｐＨ５））を用いた、方法８、表２中に概略を示した条件に従う浄化サイクルの関数としての、総タンパク質キャリーオーバーのプロットを示す図である。説明文：溶出サイクル（黒色及び灰色）、再生サイクル（灰色）、貯蔵バッファーサイクル（黒色）。
【図８】ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅカラムでのｍＡｂＺの３．２３Ｌのパイロット規模精製と、その後の最適化された６サイクルの浄化手順（エントリー７、表２）によるカラム洗浄からの試料の関数としての、タンパク質キャリーオーバーのプロットを示す図である。インタクトなＩｇＧは黒色で示され、Ｆｃ断片は灰色で示される。
【図９】１５分間の静的保持時間（Ａ）及び「モック実行」（Ｂ）を使用する最適化された浄化プロトコールの模式的概略を示す図である。平衡化バッファーは、２５ｍＭのトリス、２５ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．１）である。溶出バッファーは、０．１５Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ２．９）である。再生バッファーは、０．１ＮのＮａＯＨ（ｐＨ１３）である。
【図１０】タンパク質キャリーオーバーを決定するための、「モック実行」前の、浄化手順（図９）を使用した、ｍＡｂＣの実験室規模精製についての結果を示す図である。Ａ．溶出バッファーサイクル洗浄の関数としてのタンパク質キャリーオーバー（ｎｇ／ｍｇタンパク質）；Ｂ．再生バッファーサイクル洗浄の関数としてのタンパク質キャリーオーバー（ｎｇ／ｍｇタンパク質）；Ｃ．「モック実行」中の段階の関数としてのタンパク質キャリーオーバー（ｎｇ／ｍｇタンパク質）。
【図１１】ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅカラムの最適化された浄化プロトコール（図９）の異なる段階において採取した１０％トリス−ＨＣｌゲルを示す図である。試料は、ｍＡｂＣの精製後に採取した。再生試料は濃縮され（２５倍）、レーン２、４、６、８、１０及び１２は、１５分間の静的保持後の試料を含む。
【図１２】タンパク質キャリーオーバーを決定するための、「モック実行」前の、最適化された浄化手順（エントリー７、表２）を使用した、ｍＡｂＣのパイロット規模のカラム（３Ｌ）精製についての結果を示す図である。Ａ．溶出バッファーサイクル洗浄の関数としてのタンパク質キャリーオーバー（ｎｇ／ｍｇタンパク質）；Ｂ．再生バッファーサイクル洗浄の関数としてのタンパク質キャリーオーバー（ｎｇ／ｍｇタンパク質）。インタクトなＩｇＧは黒色で示され、Ｆｃ断片は灰色で示される。
【図１３】陽イオン交換カラム（ＰＯＲＯＳ）及び陰イオン交換カラム（ＱＳＦＦ）のモック溶出後に検出されたインタクトなＩｇＧキャリーオーバーの結果を示す図である。ＭＡｂＡ又はＭＡｂＢは、以前にロードされており、カラムから溶出されている。
【図１４】図１４Ａは、定置浄化手順の前及び後の陽イオン交換カラム（ＰＯＲＯＳ）及び陰イオン交換カラム（ＱＳＦＦ）のモック溶出後に検出されたインタクトなＩｇＧキャリーオーバーの結果を示す図である。ＭＡｂＡは、以前にロードされており、カラムから溶出されている。図１４Ｂは、定置浄化手順の前及び後の陽イオン交換カラム（ＰＯＲＯＳ）及び陰イオン交換カラム（ＱＳＦＦ）のモック溶出後に検出されたインタクトなＩｇＧキャリーオーバーの結果を示す図である。ＭＡｂＢは、以前にロードされており、カラムから溶出されている。
【図１５】浄化プロトコールの選択された工程の最後において、ＰＯＲＯＳカラム又はＱＳＦＦカラムから溶出したインタクトなＩｇＧ（ＭＡｂＣ）の量を示す図である。
【図１６】パイロット規模のカラムでの浄化プロトコールの異なる工程におけるＭＡｂＤキャリーオーバーを示す図である。
【図１７】異なる洗浄条件の関数としての、インタクトなヒトＩｇＧキャリーオーバーのプロットを示す図である。
【図１８】ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）ｖＡカラムでの異なるバッファー溶液によるＣＶ洗浄（樹脂浄化の試み）の関数としての、タンパク質キャリーオーバーのプロットを示す図である。説明文：６ＭグアニジンＨＣｌ：マゼンタ）；１９％エタノール：赤色；２ＭアルギニンＨＣｌ：茶色；２０％ヘキシレングリコール（hexene glycol）：灰色；８Ｍ尿素／１Ｍ  ＮａＣｌ：橙色；平衡化バッファー：青色；１％ｖ／ｖリン酸：黄色；０．１Ｍのイミダゾール／１９％エタノール：黒色；０．１Ｍ酢酸：緑色；２Ｍリン酸カリウム：青緑色。
【図１９】０．１Ｍ酢酸の浄化溶液の５つの逐次的なモック実行を示すクロマトグラムである。
【図２０】種々の浄化溶液を用いた逐次的なモック実行後のキャリーオーバーを示すチャートである。
【図２１】浄化溶液、６Ｍグアニジン塩酸塩、２Ｍアルギニン塩酸塩又は２０％ヘキシレングリコールを用いた逐次的なモック実行後のキャリーオーバーを示すチャートである。
【図２２】カラム浄化なしの産物溶出のクロマトグラムを示す図である（上のパネル）。各画分中のキャリーオーバーは、下のパネルに示される。
【図２３】パルス浄化全体にわたる産物溶出を示す図である。
【図２４】パルス浄化あり又はなしの逐次的なモック実行にわたるキャリーオーバーを示すグラフである。
【図２５】ダウンフロー条件又はアップフロー条件のいずれかを使用した逐次的なモック実行にわたるキャリーオーバーを示すグラフである。
【図２６】パルス浄化全体にわたる産物溶出のクロマトグラムを示す図である。黒色の線は、ダウンフロー条件を示し、灰色の線は、アップフロー条件を示し、明るい灰色は、ｐＨを示す。
【図２７】３０ＣＶ／時間及び１５ＣＶ／時間の流速での逐次的なモック実行にわたるキャリーオーバーを示す図である。
【図２８】平衡化バッファー又は再生バッファーによる単一の静的保持を用いた逐次的なモック実行にわたるキャリーオーバーを示す図である。通常パルスは、静的保持なしの試料を示す。
【図２９】平衡化バッファーによる複数の静的保持を用いた逐次的なモック実行にわたるキャリーオーバーを示す図である。通常パルスは、静的保持なしの試料を示す。
【図３０】パルス浄化全体にわたる産物溶出のクロマトグラムを示す図である。黒色の線は、３０ＣＶ／時間の条件を示し、灰色の線は、１５ＣＶ／時間の条件を示し、明るい灰色は、ｐＨを示す。
【図３１】静的保持を用いた、パルス浄化全体にわたる産物溶出のクロマトグラムを示す図である。黒色の線は、通常パルスを示し、中間の灰色の線は、平衡化バッファー保持条件を示し、暗い灰色は、再生バッファー保持条件を示し、明るい灰色の線は、ｐＨを示す。
【図３２】単一又は複数の静的保持を用いた、パルス浄化全体にわたる産物溶出のクロマトグラムを示す図である。黒色の線は、通常パルスを示し、中間の灰色の線は、１×平衡化バッファー保持条件を示し、暗い灰色は、４×平衡化バッファー保持条件を示し、明るい灰色の線は、ｐＨを示す。
【図３３】パルス浄化条件下でのキャリーオーバーに対する低減されたサイクル持続時間の影響を示す図である。
【図３４】低減されたサイクル持続時間を用いた、パルス浄化全体にわたる産物溶出のクロマトグラムを示す図である。黒色の線は、ＩｇＧを示し、明るい灰色の線は、ｐＨを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
再使用のために、クロマトグラフィー樹脂などのクロマトグラフィー材料を浄化又は再生するための方法が、本明細書で提供される。クロマトグラフィー再使用は、クロマトグラフィー材料が、同じ産物又は異なる産物との使用のために浄化及び／又は再生される、切り替え手順である。本発明の方法は、大規模、例えば、製造規模のクロマトグラフィー材料の再生のために使用され得る。樹脂、例えば、プロテインＡ樹脂が、複数の産物のために再使用される場合に、顕著なコスト節約が達成され得る。一部の実施態様では、この浄化手順は、引き続く精製試料中への、インタクトなタンパク質、例えば、ＩｇＧの、１ｐｐｍ未満のキャリーオーバーを生じる。一部の実施態様では、この低いタンパク質キャリーオーバーは、安全域中のそのセットの１０３分の１のタンパク質キャリーオーバーであり、同じ樹脂が、複数の産物を精製するために使用され得ることを実証する。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、クロマトグラフィーカラム中に存在する。
【００２２】
Ｉ．定義
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、本明細書で相互交換可能に使用されて、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。このポリマーは、直鎖又は分岐鎖であり得、修飾されたアミノ酸を含み得、非アミノ酸によって中断され得る。これらの用語は、天然に修飾されているか、あるいは介入、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識化成分とのコンジュゲーションによって修飾されている、アミノ酸ポリマーもまた包含する。アミノ酸の１又は複数のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、並びに当該技術分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドなどもまた、この定義内に含まれる。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書で使用する場合、抗体を具体的に包含する。
【００２３】
「精製された」ポリペプチド（例えば、抗体又はイムノアドヘシン）とは、そのポリペプチドが、そのポリペプチドがその天然の環境中に存在するとき並びに／又は実験室条件下で最初に合成及び／若しくは増幅されたときよりも純粋な形態で存在するように、純度において増加されていることを意味する。純度は、相対的用語であり、絶対的純度を必ずしも意味しない。
【００２４】
目的の抗原、例えば、腫瘍関連ポリペプチド抗原標的を「結合する」ポリペプチドは、そのポリペプチドが、抗原を発現する細胞又は組織を標的化することにおいて診断剤及び／又は治療剤として有用であり、他のポリペプチドと顕著に交差反応しないように、十分な親和性で抗原に結合するポリペプチドである。かかる実施態様では、「非標的」ポリペプチドに対するこのポリペプチドの結合の程度は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）解析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）によって決定されるように、その特定の標的ポリペプチドに対するこのポリペプチドの結合の約１０％未満である。
【００２５】
標的分子に対するポリペプチドの結合に関して、用語「特異的結合」又は、特定のポリペプチド若しくは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」若しくはそれら「に対して特異的」であるとは、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に、結合活性を有さない類似の構造の分子であるコントロール分子の結合と比較して、分子の結合を決定することによって、測定され得る。例えば、特異的結合は、標的と類似したコントロール分子、例えば、過剰量の非標識化標的との競合によって、決定され得る。この場合、特異的結合は、プローブに対する標識された標的の結合が、過剰量の標識されていない標的によって競合的に阻害される場合に示される。
【００２６】
用語「抗体」は、本明細書では、最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及びそれらが所望の生物活性を示す限りにおいて抗体断片を、カバーする。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書では、抗体と相互交換可能に使用される。
【００２７】
抗体は、免疫グロブリンフォールドに全て基づく変動する構造を有する、天然に存在する免疫グロブリン分子である。例えば、ＩｇＧ抗体は、機能性抗体を形成するようにジスルフィド結合した２つの「重」鎖及び２つの「軽」鎖を有する。各重鎖及び軽鎖自体は、「定常」（Ｃ）領域及び「可変」（Ｖ）領域を含む。Ｖ領域は、抗体の抗原結合特異性を決定するが、Ｃ領域は、免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用における構造的支持及び機能を提供する。抗体又は抗体の抗原結合性断片の抗原結合特異性は、抗体が特定の抗原に特異的に結合する能力である。
【００２８】
抗体の抗原結合特異性は、Ｖ領域の構造特徴によって決定される。可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸のスパンにわたって均等に分布するわけではない。その代り、Ｖ領域は、各々９−１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極度の可変性のより短い領域によって分離された、１５−３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチからなる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々、ループ接続を形成し、一部の例ではβ−シート構造の一部を形成する３つの超可変領域（「ＨＶＲ」）によって接続された、大部分はβ−シート立体配置を採る、４つのＦＲを含む。各鎖中の超可変領域は、これらのＦＲによってごく近接して一緒に保持され、他方の鎖由来の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)を参照のこと）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接は関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与などの、種々のエフェクター機能を示す。
【００２９】
各Ｖ領域は、典型的には、３つの超可変領域、例えば、その各々が「超可変ループ」を含む相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、及び４つのフレームワーク領域を含む。従って、抗体結合部位、特定の所望の抗原に実質的な親和性で結合するために必要とされる最小の構造単位は、典型的には、３つのＣＤＲ、及び、適切なコンフォメーションでＣＤＲを保持及び提示するための、それらの間に散在された、少なくとも３つ、好ましくは４つのフレームワーク領域を含む。古典的な四鎖抗体は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインによって協働して規定される抗原結合部位を有する。特定の抗体、例えば、ラクダ抗体及びサメ抗体は、軽鎖を欠き、重鎖のみによって形成される結合部位に依存する。ＶＨとＶＬとの間での協働の非存在下で重鎖又は軽鎖単独によって結合部位が形成される、単一ドメイン操作免疫グロブリンが、調製され得る。
【００３０】
用語「可変」とは、可変ドメインの特定の部分が、抗体の間で配列において広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性において使用されるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均等に分布するわけではない。可変性は、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方において、超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々、ループ接続を形成し、一部の例ではβ−シート構造の一部を形成する３つの超可変領域によって接続された、大部分はβ−シート立体配置を採る、４つのＦＲを含む。各鎖中の超可変領域は、これらのＦＲによってごく近接して一緒に保持され、他方の鎖由来の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照のこと）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接は関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与などの、種々のエフェクター機能を示す。
【００３１】
用語「超可変領域」とは、本明細書で使用する場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。この超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、ＶＬ中のおよそ約残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）並びにＶＨ中のおよそ約３１−３５Ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）並びに／又は「超可変ループ」由来のアミノ酸残基（例えば、ＶＬ中の残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）並びにＶＨ中の２６−３２（Ｈ１）、５２Ａ−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）（Chothia及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）を含み得る。
【００３２】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で規定される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００３３】
「抗体断片」は、好ましくはその抗原結合領域を含む、インタクトな抗体の一部分を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、直鎖状抗体（例えば、米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)）；ワンアームド抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ、単鎖抗体分子；抗体断片から形成された多重特異性抗体（例えば、Ｄｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−ＣＨ３、（ｓｃＦＶ）４−Ｆｃ、ジ−ｓｃＦｖ、ビ−ｓｃＦｖ又はタンデム（ジ、トリ）−ｓｃＦｖが含まれるがこれらに限定されない）；及び二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（engagers）（ＢｉＴＥ）が含まれる。
【００３４】
抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合性断片、及びその名称が容易に結晶化するその能力を反映している残存「Ｆｃ」断片を生じる。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋することがなおも可能である、Ｆ（ａｂ’）２断片を生じる。
【００３５】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、緊密な非共有結合的会合での、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなる。この立体配置では、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面上の抗原結合部位を規定する。集合的に、これら６つの超可変領域が、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）であっても、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識し結合する能力を有する。
【００３６】
Ｆａｂ断片もまた、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（一又は複数）が少なくとも１つの遊離チオール基を保有するＦａｂ’についての、本明細書での命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学カップリングもまた公知である。
【００３７】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる型のうちの１つに割り当てられる。
【００３８】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、抗体は、異なるクラスに割り当てられ得る。５つの主要なクラスのインタクトな抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２へとさらに分割され得る。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元立体配置は、周知である。
【００３９】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖中に存在する。一部の実施態様では、このＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合にとって望ましい構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
【００４０】
用語「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖中に、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインとペアリングさせられて、２つの抗原結合性部位を創出する。ダイアボディは、例えば、欧州４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８（１９９３）に、より完全に記載されている。
【００４１】
用語「多重特異性抗体」は、最も広い意味で使用され、ポリエピトープ特異性を有する抗体を具体的にカバーする。かかる多重特異性抗体には、ＶＨＶＬ単位がポリエピトープ特異性を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体、各ＶＨＶＬ単位が異なるエピトープに結合する、２以上のＶＬドメイン及びＶＨドメインを有する抗体、各単一可変ドメインが異なるエピトープに結合する、２以上の単一可変ドメインを有する抗体、完全長抗体、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、三機能性抗体、共有結合的に又は非共有結合的に結合された抗体断片が含まれるが、これらに限定されない。「ポリエピトープ特異性」とは、同じ又は異なる標的（一又は複数）上の２以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。「単一特異性」とは、１つのエピトープだけに結合する能力を指す。一実施態様によれば、多重特異性抗体は、５μＭから０．００１ｐＭ、３μＭから０．００１ｐＭ、１μＭから０．００１ｐＭ、０．５μＭから０．００１ｐＭ又は０．１μＭから０．００１ｐＭの親和性で各エピトープに結合するＩｇＧ抗体である。
【００４２】
表現「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「単一可変ドメイン（ＳＶＤ）抗体」は、一般に、単一可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）が抗原結合を付与できる抗体を指す。言い換えると、この単一可変ドメインは、標的抗原を認識するために、別の可変ドメインと相互作用する必要がない。単一ドメイン抗体の例には、ラクダ科（ラマ及びラクダ）及び軟骨魚類（例えば、コモリザメ）から誘導されるもの、並びにヒト抗体及びマウス抗体から組換え方法により誘導されるものが含まれる（Nature (1989) 341:544-546；Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56；Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003):21:484-490；国際公開第２００５／０３５５７２号；国際公開第０３／０３５６９４号；Febs Lett (1994) 339:285-290；国際公開第００／２９００４号；国際公開第０２／０５１８７０号）。
【００４３】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用する場合、実質的に均一な抗体の集団から取得された抗体を指し、即ち、集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生の間に生じ得る可能な変異体を除き、同一である及び／又は同じエピトープを結合し、かかる変異体は、一般には、微量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンが夾雑していないという点で、有利である。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から取得されるとして抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。例えば、本明細書に提供される方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製され得るか、又は組換えＤＮＡ方法によって作製され得る（例えば、米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００４４】
本明細書のモノクローナル抗体には、具体的には、それらが所望の生物活性を示す限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が、特定の種から誘導される又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配意と同一又は相同であり、鎖（一又は複数）の残部が、別の種から誘導される又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配意と同一又は相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びにかかる抗体の断片が含まれる（米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)）。本明細書の目的のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザル）及びヒト定常領域配列から誘導される可変ドメイン抗原結合配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる（米国特許第５６９３７８０号）。
【００４５】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘導される最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類の超可変領域由来の残基によって置き換えられた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに精緻化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループと対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、上記ＦＲ置換（一又は複数）を除いて、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。このヒト化抗体はまた、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものを含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
【００４６】
本明細書の目的のために、「インタクトな抗体」は、重鎖及び軽鎖可変ドメイン並びにＦｃ領域を含む抗体である。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であり得る。好ましくは、インタクトな抗体は、１又は複数のエフェクター機能を有する。
【００４７】
「天然抗体」は、通常、２つの同一な軽（Ｌ）鎖及び２つの同一な重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有結合的ジスルフィド結合によって重鎖に結合されるが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変動する。各重鎖及び軽鎖はまた、一定の間隔を開けた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一方の末端において、可変ドメイン（ＶＨ）とその後のいくつかの定常ドメインとを有する。各軽鎖は、一方の末端において可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他方の末端において定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインとアラインされ、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインとアラインされる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の接触面を形成すると考えられる。
【００４８】
「ネイキッド抗体」は、細胞傷害性部分又は放射標識などの異種分子にコンジュゲートされていない抗体（本明細書で規定される）である。
【００４９】
一部の実施態様では、抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰属する生物活性を指し、抗体アイソタイプによって変動する。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体の下方調節が含まれる。
【００５０】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）が、標的細胞上の結合した抗体を認識し、標的細胞の溶解を引き続いて引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）のｐ４６４の表３にまとめられる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５５００３６２号又は米国特許第５８２１３３７号に記載されるものなどのインビトロＡＤＣＣアッセイが、実施され得る。かかるアッセイのために有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又はさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるものなどの動物モデルにおいて、評価され得る。
【００５１】
「ヒトエフェクター細胞」は、１又は複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実施する白血球である。一部の実施態様では、これらの細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実施する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球が含まれ、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。
【００５２】
用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述するために使用される。一部の実施態様では、このＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体を結合するものであり（ガンマ受容体）、これには、対立遺伝子変異体及びこれらの受容体の選択的スプライシング形態を含む、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、これらは、その細胞質ドメインにおいて主に異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に、免疫受容体チロシン−ベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)を参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ等、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；並びにｄｅ  Ｈａａｓ等、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）に概説がある。将来同定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書で用語「ＦｃＲ」に包含される。この用語はまた、胎児への母系ＩｇＧの移行を担う新生児受容体ＦｃＲｎを含む（Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim等, J. Immunol. 24:249 (1994)）。
【００５３】
用語「順次的」とは、クロマトグラフィーに関して本明細書で使用する場合、第１のクロマトグラフィーとその後の第２のクロマトグラフィーとを有することを指す。さらなる工程が、第１のクロマトグラフィーと第２のクロマトグラフィーとの間に含まれ得る。
【００５４】
用語「連続的」とは、クロマトグラフィーに関して本明細書で使用する場合、直接又は２つのクロマトグラフィー材料間の連続的フローを可能にするいくつかの他の機構を介して接続された第１のクロマトグラフィー材料及び第２のクロマトグラフィー材料を有することを指す。
【００５５】
用語「単離された」とは、本明細書で使用する場合、典型的にはそれと共に天然に見出される又は産生される成分の少なくとも一部から分離された分子を指す。例えば、ポリペプチドは、それが産生された細胞の成分の少なくとも一部から分離される場合、「単離された」と言われる。ポリペプチドが発現後に細胞によって分泌される場合、そのポリペプチドを産生した細胞からそのポリペプチドを含む上清を物理的に分離することは、そのポリペプチドを「単離する」とみなされる。同様に、ポリヌクレオチドは、典型的にそれが天然に見出されるより大きいポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドの場合、例えば、ゲノムＤＮＡ又はミトコンドリアＤＮＡなど）の一部でない場合、又は例えばＲＮＡポリヌクレオチドの場合にはそれが産生された細胞の成分の少なくとも一部から分離される場合、「単離された」と言われる。従って、宿主細胞の内側のベクター中に含まれるＤＮＡポリヌクレオチドは、「単離された」と言われる場合もある。
【００５６】
「一日曝露許容量（ＡＤＥ）」は、本明細書で使用する場合、個体が寿命にわたってこの用量又はより低い用量に曝露される場合に、有害健康事象又は望ましくない生理的影響を引き起こす可能性が低い、物質特異的用量である（Teschner, W.等, Vox Sang. 2007, 92:42-55; 食品医薬品局, HHS. Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. Rockville, MD. 2005年7月、ワールドワイドウェブ上の、2012年8月7日にアクセスされたgoogle.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0CE8QFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.fda.gov%2Fdownloads%2FDrugs%2F...%2FGuidances%2FUCM078932.pdf&ei=f4QhUJv4K9Ov6gGQ-4DgAg&usg=AFQjCNFbTE75U0nDbFpfdpxK85uWXT8frgに記載;European Medicines Agency. Impurities: Residual Solvents, Note for Guidance on Impurities: Residual Solvents (CPMP/ICH/283/95). London, UK、1997年9月、ワールドワイドウェブ上の、2012年8月7日にアクセスされたema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/regulation/general/general_content_000431.jsp&mid=WC0b01ac0580029593に記載）。ＡＤＥに加えて、ＩｇＧについての「推定一日摂取量（ＥＤＩ）」は、１用量当たり投与されるＩｇＧの量に基づいて決定される。
【００５７】
「夾雑物」とは、所望のポリペプチド産物とは異なる材料を指す。夾雑物としては、これらに限定されないが、以下：宿主細胞材料、例えば、ＣＨＯＰ；浸出されたプロテインＡ；核酸；所望のポリペプチドの変異体、断片、凝集物又は誘導体；別のポリペプチド；エンドトキシン；ウイルス夾雑物；細胞培養培地成分などが挙げられる。一部の例では、この夾雑物は、これらに限定されないが、例えば、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、昆虫細胞、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、トリ細胞、真菌細胞などの細胞由来の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）であり得る。
【００５８】
本明細書に記載される値又はパラメーターの「約」への言及は、その値又はパラメーター自体に対するバリエーションを含む（及び記述する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。
【００５９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その（the）」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形の指示対象を含む。本明細書に記載される本発明の態様及びバリエーションは、態様及びバリエーション「からなる」並びに／又は態様及びバリエーション「から本質的になる」を含むことが理解される。
【００６０】
ＩＩ．カラム浄化の方法
（Ａ）クロマトグラフィー
本発明は、再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化又は再生するための方法を提供する。一部の実施態様では、これらのクロマトグラフィー材料は、大規模、例えば、ポリペプチド産物の製造規模の産生のために使用される。
【００６１】
一部の実施態様では、この方法は、ａ）この材料に、約２材料容積以上の溶出バッファーを通過させる工程であって、この溶出バッファーは、約ｐＨ２．９の約０．１５Ｍの酢酸を含む、工程、ｂ）約１０分間から約３０分間までの範囲の時間にわたって、溶出バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｃ）この材料に、約２材料容積以上の溶出バッファーを通過させる工程、及びｄ）この材料に、約２材料容積以上の再生バッファーを通過させる工程であって、この再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨ、ｐＨ１３である、工程を含む。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、クロマトグラフィーカラム中に存在する。一部の実施態様では、このクロマトグラフィーカラムは、大規模、例えば、抗体産物などのポリペプチド産物の製造規模の産生のために使用される。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、プロテインＡクロマトグラフィー材料である。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、複数の抗体産物を精製するために使用される。一部の実施態様では、浄化する方法の後のキャリーオーバーは、＜０．２５ｍｇ／ｍＬの総タンパク質、＜１ｐｐｍのＩｇＧ断片、＜１ｐｐｍの浸出されたプロテインＡ、＜１μｇ／ｍＬのＣＺＥ  ＬＩＦ、＜１ｐｐｍのＣＨＯＰ及び＜１ｐｇ／ｍＬのＣＨＯ  ＤＮＡのうち１又は複数を含む。
【００６２】
一部の実施態様では、この方法は、ａ）この材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、この溶出バッファーは、約ｐＨ２．９の約０．１５Ｍの酢酸を含む、工程、ｂ）約３０分間にわたって、溶出バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｃ）この材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、及びｄ）この材料に、約４材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、この再生バッファーは、約ｐＨ１３の約０．１ＮのＮａＯＨである、工程を含む。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、クロマトグラフィーカラム中に存在する。一部の実施態様では、このクロマトグラフィーカラムは、大規模、例えば、抗体産物などのポリペプチド産物の製造規模の産生のために使用される。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、プロテインＡクロマトグラフィー材料である。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、複数の抗体産物を精製するために使用される。一部の実施態様では、浄化する方法の後のキャリーオーバーは、＜０．２５ｍｇ／ｍＬの総タンパク質、＜１ｐｐｍのＩｇＧ断片、＜１ｐｐｍの浸出されたプロテインＡ、＜１μｇ／ｍＬのＣＺＥ  ＬＩＦ、＜１ｐｐｍのＣＨＯＰ及び＜１ｐｇ／ｍＬのＣＨＯ  ＤＮＡのうち１又は複数を含む。
【００６３】
一部の実施態様では、この方法は、ａ）この材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、この溶出バッファーは、約ｐＨ２．９の約０．１５Ｍの酢酸を含む、工程、ｂ）約３０分間にわたって、溶出バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｃ）この材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、ｄ）この材料に、約２．５材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、この再生バッファーは、約ｐＨ１３の約０．１ＮのＮａＯＨである、工程、ｅ）約３０分間にわたって、再生バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｆ）この材料に、約２．５材料容積の再生バッファーを通過させる工程を含む。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、クロマトグラフィーカラム中に存在する。一部の実施態様では、このクロマトグラフィーカラムは、大規模、例えば、抗体産物などのポリペプチド産物の製造規模の産生のために使用される。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、プロテインＡクロマトグラフィー材料である。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、複数の抗体産物を精製するために使用される。一部の実施態様では、浄化する方法の後のキャリーオーバーは、＜０．２５ｍｇ／ｍＬの総タンパク質、＜１ｐｐｍのＩｇＧ断片、＜１ｐｐｍの浸出されたプロテインＡ、＜１μｇ／ｍＬのＣＺＥ  ＬＩＦ、＜１ｐｐｍのＣＨＯＰ及び＜１ｐｇ／ｍＬのＣＨＯ  ＤＮＡのうち１又は複数を含む。
【００６４】
一部の実施態様では、この方法は、ａ）この材料に、約２材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程であって、この平衡化バッファーは、約ｐＨ７．１の、約２５ｍＭのトリス、約２５ｍＭのＮａＣｌを含む、工程、ｂ）約３０分間にわたって、平衡化バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｃ）この材料に、約２材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程、ｄ）この材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、この溶出バッファーは、約ｐＨ２．８の約０．１５Ｍの酢酸である、工程、ｅ）約３０分間にわたって、溶出バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｆ）この材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、ｇ）この材料に、約２材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、この再生バッファーは、ｐＨ１３の約０．１ＮのＮａＯＨである、工程、ｈ）約３０分間にわたって、再生バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｉ）この材料に、約２材料容積の再生バッファーを通過させる工程を含む。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、クロマトグラフィーカラム中に存在する。一部の実施態様では、このクロマトグラフィーカラムは、大規模、例えば、抗体産物などのポリペプチド産物の製造規模の産生のために使用される。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、プロテインＡクロマトグラフィー材料である。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、複数の抗体産物を精製するために使用される。一部の実施態様では、浄化する方法の後のキャリーオーバーは、＜０．２５ｍｇ／ｍＬの総タンパク質、＜１ｐｐｍのＩｇＧ断片、＜１ｐｐｍの浸出されたプロテインＡ、＜１μｇ／ｍＬのＣＺＥ  ＬＩＦ、＜１ｐｐｍのＣＨＯＰ及び＜１ｐｇ／ｍＬのＣＨＯ  ＤＮＡのうち１又は複数を含む。
【００６５】
一部の実施態様では、この方法は、ａ）この材料に、約４材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程であって、この平衡化バッファーは、約ｐＨ７．１の、約２５ｍＭのトリス、約２５ｍＭのＮａＣｌを含む、工程、ｂ）６サイクルの、ｉ）この材料に、約３材料容積の溶出バッファーを通過させること、ここでこの溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸、ｐＨ２．８である；ｉｉ）約１０分間にわたって、溶出バッファー中でこの材料を静的に保持すること；ｉｉｉ）この材料に、約１材料容積の溶出バッファーを通過させること；ｉｖ）この材料に、約３材料容積の再生バッファーを通過させること、ここでこの再生バッファーは、約ｐＨ１３の約０．１ＮのＮａＯＨである；ｖ）約１０分間にわたって、再生バッファー中でこの材料を静的に保持すること；ｖｉ）この材料に、約１材料容積の再生バッファーを通過させること、を含む工程を実施する工程を含む。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、クロマトグラフィーカラム中に存在する。一部の実施態様では、このクロマトグラフィーカラムは、大規模、例えば、抗体産物などのポリペプチド産物の製造規模の産生のために使用される。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、プロテインＡクロマトグラフィー材料である。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、複数の抗体産物を精製するために使用される。一部の実施態様では、浄化する方法の後のキャリーオーバーは、＜０．２５ｍｇ／ｍＬの総タンパク質、＜１ｐｐｍのＩｇＧ断片、＜１ｐｐｍの浸出されたプロテインＡ、＜１μｇ／ｍＬのＣＺＥ  ＬＩＦ、＜１ｐｐｍのＣＨＯＰ及び＜１ｐｇ／ｍＬのＣＨＯ  ＤＮＡのうち１又は複数を含む。
【００６６】
一部の実施態様では、この方法は、６サイクルの、ａ）この材料に、約３材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、この溶出バッファーは、約ｐＨ２．８の約０．１５Ｍの酢酸である、工程、ｂ）約１５分間にわたって、溶出バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｃ）この材料に、約１材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、ｄ）この材料に、約３材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、この再生バッファーは、約ｐＨ１３の約０．１ＮのＮａＯＨである、工程、ｅ）約１５分間にわたって、再生バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｆ）この材料に、約１材料容積の再生バッファーを通過させる工程、ｇ）この材料に、約３材料容積の貯蔵バッファーを通過させる工程であって、この貯蔵バッファーは、約ｐＨ５．０の、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約２％のベンジルアルコールである、工程、ｅ）約１５分間にわたって、貯蔵バッファー中でこの材料を静的に保持する工程、ｆ）この材料に、約１材料容積の貯蔵バッファーを通過させる工程を含む。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、クロマトグラフィーカラム中に存在する。一部の実施態様では、このクロマトグラフィーカラムは、大規模、例えば、抗体産物などのポリペプチド産物の製造規模の産生のために使用される。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、プロテインＡクロマトグラフィー材料である。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、複数の抗体産物を精製するために使用される。一部の実施態様では、浄化する方法の後のキャリーオーバーは、＜０．２５ｍｇ／ｍＬの総タンパク質、＜１ｐｐｍのＩｇＧ断片、＜１ｐｐｍの浸出されたプロテインＡ、＜１μｇ／ｍＬのＣＺＥ  ＬＩＦ、＜１ｐｐｍのＣＨＯＰ及び＜１ｐｇ／ｍＬのＣＨＯ  ＤＮＡのうち１又は複数を含む。
【００６７】
本発明の一部の態様では、このクロマトグラフィー材料は、アフィニティークロマトグラフィー材料である。アフィニティークロマトグラフィー材料の例には、プロテインＡ又はプロテインＧで誘導体化されたクロマトグラフィー材料が含まれるがこれらに限定されない。アフィニティークロマトグラフィー材料の例には、Ｐｒｏｓｅｐ−ＶＡ、Ｐｒｏｓｅｐ−ＶＡ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ、Ｔｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ及びＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ  ＬＸが含まれるがこれらに限定されない。上記の一部の実施態様では、このアフィニティークロマトグラフィー材料は、アフィニティークロマトグラフィー材料である。上記の一部の実施態様では、このアフィニティークロマトグラフィー材料は、アフィニティークロマトグラフィー膜である。一部の実施態様では、このアフィニティークロマトグラフィー材料は、プロテインＧクロマトグラフィー材料である。一部の実施態様では、このクロマトグラフィーカラムは、大規模、例えば、抗体産物などのポリペプチド産物の製造規模の産生のために使用される。
【００６８】
一部の態様では、本発明は、再使用のためにイオン交換クロマトグラフィー材料を浄化する方法を提供する。一部の実施態様では、この方法は、ａ）この材料に、約３材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程であって、この平衡化バッファーは、約ｐＨ７．１の、約２５ｍＭのトリス、約２５ｍＭのＮａＣｌを含む、工程、ｂ）この材料に、約２材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程、ｃ）約１０分間にわたって、約０．５ＮのＮａＯＨ中でこの材料を静的に保持する工程、ｄ）この材料に、約１材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程、ｅ）約１０分間にわたって、約０．５ＮのＮａＯＨ中でこの材料を静的に保持する工程、及びｆ）この材料に、約１材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程を含む。一部の実施態様では、このイオン交換材料は、クロマトグラフィーカラム中に存在する。一部の実施態様では、このクロマトグラフィーカラムは、大規模、例えば、抗体産物などのポリペプチド産物の製造規模の産生のために使用される。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、複数の抗体産物を精製するために使用される。一部の実施態様では、浄化する方法の後のキャリーオーバーは、＜０．２５ｍｇ／ｍＬの総タンパク質、＜１ｐｐｍのＩｇＧ断片、＜１ｐｐｍの浸出されたプロテインＡ、＜１μｇ／ｍＬのＣＺＥ  ＬＩＦ、＜１ｐｐｍのＣＨＯＰ及び＜１ｐｇ／ｍＬのＣＨＯ  ＤＮＡのうち１又は複数を含む。
【００６９】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、イオン交換クロマトグラフィー材料、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー材料又は陽イオン交換クロマトグラフィー材料である。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、陰イオン交換材料である。一部の実施態様では、この陰イオン交換材料は、クロマトグラフィーカラム中に存在する。一部の実施態様では、この陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、正に荷電した固体相であり、この固体相を越えて又は通って通過した水溶液中の陰イオンとの交換のための遊離陰イオンを有する。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、この陰イオン交換材料は、膜、モノリス又は樹脂であり得る。一実施態様では、この陰イオン交換材料は、樹脂であり得る。一部の実施態様では、この陰イオン交換材料は、一級アミン、二級アミン、三級アミン又は四級アンモニウムイオン官能基、ポリアミン官能基又はジエチルアミノエチル官能基を含み得る。上記の一部の実施態様では、この陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、陰イオン交換クロマトグラフィー材料である。上記の一部の実施態様では、この陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、陰イオン交換クロマトグラフィー膜である。一部の実施態様では、この陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、大規模、例えば、抗体産物などのポリペプチド産物の製造規模の産生のために使用される。
【００７０】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、陽イオン交換材料である。一部の実施態様では、この陽イオン交換材料は、クロマトグラフィーカラム中に存在する。一部の実施態様では、この陽イオン交換材料は、負に荷電した固体相であり、この固体相を越えて又は通って通過した水溶液中の陽イオンとの交換のための遊離陽イオンを有する。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、この陽イオン交換材料は、膜、モノリス又は樹脂であり得る。一部の実施態様では、この陽イオン交換材料は、樹脂であり得る。この陽イオン交換材料は、例えば、スルホネート、カルボン酸、カルボキシメチルスルホン酸、スルホイソブチル、スルホエチル、カルボキシル、スルホプロピル、スルホニル、スルホキシエチル又はオルトホスフェートであるがこれらに限定されない、カルボン酸官能基又はスルホン酸官能基を含み得る。上記の一部の実施態様では、この陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、陽イオン交換クロマトグラフィー材料である。上記の一部の実施態様では、この陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、陽イオン交換クロマトグラフィー膜である。本発明の一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、陽イオン交換クロマトグラフィー材料ではない。一部の実施態様では、この陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、大規模、例えば、抗体産物などのポリペプチド産物の製造規模の産生のために使用される。
【００７１】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、このイオン交換材料は、従来のクロマトグラフィー材料又は対流クロマトグラフィー材料を利用し得る。これらの従来のクロマトグラフィー材料には、例えば、潅流性材料（例えば、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）樹脂）及び拡散性材料（例えば、架橋アガロース樹脂）が含まれる。一部の実施態様では、このポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）樹脂は、Ｐｏｒｏｓ樹脂であり得る。一部の実施態様では、この架橋アガロース樹脂は、スルホプロピル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（「ＳＰＳＦＦ」）樹脂であり得る。対流クロマトグラフィー材料は、膜（例えば、ポリエーテルスルホン）又はモノリス材料（例えば、架橋ポリマー）であり得る。このポリエーテルスルホン膜は、Ｍｕｓｔａｎｇであり得る。架橋ポリマーモノリス材料は、架橋ポリ（グリシジルメタクリレート−ｃｏ−エチレンジメタクリレート）であり得る。
【００７２】
陰イオン交換材料の例は、当該技術分野で公知であり、これには、Ｐｏｒｏｓ  ＨＱ  ５０、Ｐｏｒｏｓ  ＰＩ  ５０、Ｐｏｒｏｓ  Ｄ、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ及びＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅが含まれるがこれらに限定されない。
【００７３】
陽イオン交換材料の例は、当該技術分野で公知であり、これには、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｓ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ、ＳＯ３  Ｍｏｎｏｌｉｔｈ、Ｓ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ、Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ、Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ５０、Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ２０、ＳＰＳＦＦ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ（ＳＰＸＬ）、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ  Ｓ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｓｅ  ＨｉＣａｐ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＯ３又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＣＯＯが含まれるがこれらに限定されない。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、この陽イオン交換材料は、Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ５０である。一部の実施態様では、このＰｏｒｏｓ  ＨＳ樹脂は、Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ  ５０μｍ粒子又はＰｏｒｏｓ  ＨＳ  ２０μｍ粒子であり得る。
【００７４】
ミックスモード
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、以下の機能性のうち１又は複数が可能な官能基を含むミックスモード材料である：陰イオン交換、陽イオン交換、水素結合及び疎水性相互作用。一部の実施態様では、このミックスモード材料は、陰イオン交換及び疎水性相互作用が可能な官能基を含む。この混合様式材料は、配位子としてのＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン、４−メルカプト−エチル−ピリジン、ヘキシルアミン若しくはフェニルプロピルアミンを含み得、又は架橋ポリアリルアミンを含み得る。ミックスモード材料の例には、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ樹脂、ＱＭＡ樹脂、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ樹脂、ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂、ＨＥＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂、ＰＰＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂、又はＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ膜若しくはＳａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣが含まれる。一部の実施態様では、このミックスモード材料は、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ樹脂である。上記の一部の実施態様では、このミックスモード材料は、ミックスモードクロマトグラフィー材料である。上記の一部の実施態様では、このミックスモード材料は、ミックスモードクロマトグラフィーカラムである。上記の一部の実施態様では、このミックスモード材料は、ミックスモード膜である。一部の実施態様では、このミックスモードクロマトグラフィーカラムは、大規模、例えば、製造規模のクロマトグラフィーカラムである。
【００７５】
本発明の一部の態様では、このクロマトグラフィー材料は、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料である。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、疎水性に従って生体分子を分離する液体クロマトグラフィー技術である。ＨＩＣクロマトグラフィー材料の例には、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ｈｅｘｙｌ  ６５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒ  ｂｕｔｙｌ  ６５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ｐｈｅｎｙｌ  ６５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ｅｔｈｅｒ  ６５０、Ｓｏｕｒｃｅ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉ−Ｔｒａｐ、Ｏｃｔｙｌ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ及びＰｈｅｎｙｌ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅが含まれるがこれらに限定されない。上記の一部の実施態様では、このＨＩＣクロマトグラフィー材料は、ＨＩＣクロマトグラフィーカラムである。上記の一部の実施態様では、このＨＩＣクロマトグラフィー材料は、ＨＩＣクロマトグラフィー膜である。一部の実施態様では、このＨＩＣクロマトグラフィーカラムは、大規模、例えば、製造規模のクロマトグラフィーカラムである。
【００７６】
本発明の一部の態様では、このクロマトグラフィー材料は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）クロマトグラフィー材料である。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー材料の例には、ＨＡ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌ及びＣＨＴヒドロキシアパタイトが含まれるがこれらに限定されない。上記の一部の実施態様では、このＨＡＰクロマトグラフィー材料は、ＨＡＰクロマトグラフィーカラムである。上記の一部の実施態様では、このＨＡＰクロマトグラフィー材料は、ＨＡＰクロマトグラフィー膜である。一部の実施態様では、このＨＡＰクロマトグラフィーカラムは、大規模、例えば、製造規模のクロマトグラフィーカラムである。
【００７７】
一部の実施態様では、本発明は、アルカリ安定なクロマトグラフィー材料、例えば、アルカリ安定なクロマトグラフィーカラムを浄化又は再生するための方法を提供する。
【００７８】
本発明は、本発明の方法での使用のためのバッファーを提供する。溶出バッファーは、一般に、クロマトグラフィー材料から、材料、例えば、所望の材料、又は夾雑物などの望ましくない材料を除去するために、使用される。溶出バッファーの例には、約ｐＨ２．８−２．９の約０．１５Ｍの酢酸が含まれるがこれに限定されない。再生バッファーは、一般に、クロマトグラフィー手順後にカラムを再チャージするために使用される。例えば、陰イオンクロマトグラフィーのための再生バッファーは、約ｐＨ１３の約０．１ＮのＮａＯＨであり得る。平衡化バッファーは、試料と同じ条件（塩濃度、ｐＨなど）下にクロマトグラフィー材料を置くために使用され得る。平衡化バッファーの非限定的な例は、約ｐＨ７．１の、約２５ｍＭのトリス及び約２５ｍＭのＮａＣｌである。貯蔵バッファーは、一般に、使用していないときに、例えば、夾雑を防止するためのマイクロコードと共に、クロマトグラフィー材料を維持するために使用される。貯蔵バッファーの非限定的な例は、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約２％ベンジルアルコール及び約ｐＨ５．０である。
【００７９】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、流速は、約５０材料容積／時間、約４０材料容積／時間又は約３０材料容積／時間のいずれか未満である。この流速は、約５材料容積／時間と約５０材料容積／時間との間、約１０材料容積／時間と約４０材料容積／時間との間、又は約１８材料容積／時間と約３６材料容積／時間との間のいずれかであり得る。一部の実施態様では、この流速は、約９材料容積／時間、約１８材料容積／時間、約２５材料容積／時間、約３０材料容積／時間、約３６材料容積／時間又は約４０材料容積／時間のいずれかである。
【００８０】
一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、クロマトグラフィーカラム中に存在する。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、この流速は、約５０カラム容積（ＣＶ）／時間、約４０ＣＶ／時間又は約３０ＣＶ／時間のいずれか未満である。この流速は、約５ＣＶ／時間と約５０ＣＶ／時間との間、約１０ＣＶ／時間と約４０ＣＶ／時間との間又は約１８ＣＶ／時間と約３６ＣＶ／時間との間のいずれかであり得る。一部の実施態様では、この流速は、約９ＣＶ／時間、約１８ＣＶ／時間、約２５ＣＶ／時間、約３０ＣＶ／時間、約３６ＣＶ／時間又は約４０ＣＶ／時間のいずれかである。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、この流速は、約１００ｃｍ／時間、約７５ｃｍ／時間又は約５０ｃｍ／時間のいずれか未満である。この流速は、約２５ｃｍ／時間と約１５０ｃｍ／時間との間、約２５ｃｍ／時間と約１００ｃｍ／時間との間、約５０ｃｍ／時間と約１００ｃｍ／時間との間又は約６５ｃｍ／時間と約８５ｃｍ／時間との間のいずれかであり得る。
【００８１】
床高さは、使用されるクロマトグラフィー材料の高さである。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、この床高さは、約３ｃｍ、約１０ｃｍ又は約１５ｃｍのいずれかよりも大きい。この床高さは、約３ｃｍと約３５ｃｍとの間、約５ｃｍと約１５ｃｍとの間、約３ｃｍと約１０ｃｍとの間又は約５ｃｍと約８ｃｍとの間のいずれかであり得る。一部の実施態様では、この床高さは、約３ｃｍ、約５ｃｍ、約１０ｃｍ、約１５ｃｍ、約２０ｃｍ、約２５ｃｍ又は約３０ｃｍのいずれかである。一部の実施態様では、床高さは、ロード中のポリペプチド又は夾雑物の量に基づいて決定される。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、大規模、例えば、ポリペプチドの製造規模の産生のために使用されるカラム中に存在する。一部の実施態様では、この製造規模のクロマトグラフィー材料は、約１０ｃｍ、約１５ｃｍ、約２０ｃｍ、約２５ｃｍ又は約３０ｃｍのいずれかの床高さを有する。
【００８２】
床直径は、使用されるクロマトグラフィー材料の直径である。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、この床直径は、約８０ｃｍ、約１００ｃｍ又は約１２０ｃｍのいずれかよりも大きい。一部の実施態様では、この床直径は、約５０ｃｍ、約６０ｃｍ、約７０ｃｍ、約８０ｃｍ、約９０ｃｍ、約１００ｃｍ、約１１０ｃｍ、約１２０ｃｍ、約１３０ｃｍ、約１４０ｃｍ、約１５０ｃｍ、約１６０ｃｍ、約１７０ｃｍ、約１８０ｃｍ、約１９０又は約２００ｃｍのいずれかである。一部の実施態様では、床直径は、ロード中のポリペプチド又は夾雑物の量に基づいて決定される。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、大規模、例えば、ポリペプチドの製造規模の産生のために使用されるカラム中に存在する。一部の実施態様では、この製造規模のクロマトグラフィー材料は、約５０ｃｍ、約６０ｃｍ、約７０ｃｍ、約８０ｃｍ、約９０ｃｍ、約１００ｃｍ、約１１０ｃｍ、約１２０ｃｍ、約１３０ｃｍ、約１４０ｃｍ、約１５０ｃｍ、約１６０ｃｍ、約１７０ｃｍ、約１８０ｃｍ、約１９０又は約２００ｃｍのいずれかの床直径を有する。
【００８３】
一部の実施態様では、このクロマトグラフィーは、約１ｍＬ、約２ｍＬ、約３ｍＬ、約４ｍＬ、約５ｍＬ、約６ｍＬ、約７ｍＬ、約８ｍＬ、約９ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、約２５ｍＬ、約３０ｍＬ、約４０ｍＬ、約５０ｍＬ、約７５ｍＬ、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、約１０Ｌ、約２５Ｌ、約５０Ｌ、約１００Ｌ、約２００Ｌ、約３００Ｌ、約４００Ｌ、約５００Ｌ、約６００Ｌ、約７００Ｌ、約８００Ｌ、約９００Ｌ又は約１０００Ｌよりも大きい容積を有する容器の材料中に存在する。一部の実施態様では、この容器は、大規模プロテインＡカラムなど、１４ｃｍの床高さ及び８０ｃｍの床容積を有する。一部の実施態様では、この容器は、大規模陰イオン交換カラムなど、１９ｃｍの床高さ及び１００ｃｍの床容積を有する。一部の実施態様では、この容器は、大規模陽イオン交換カラムなど、３０ｃｍの床高さ及び１２０ｃｍの床容積を有する。
【００８４】
ロードは、本明細書で使用する場合、クロマトグラフィー材料上にロードされる組成物である。一部の実施態様では、このロードは、異なるポリペプチドを単離するために以前に使用されたクロマトグラフィー材料上にロードされるポリペプチドである。ローディングバッファーは、クロマトグラフィー材料上に目的の産物を含む組成物をロードするために使用されるバッファーである。このクロマトグラフィー材料は、精製される組成物をロードする前に、平衡化バッファーで平衡化され得る。一部の例では、洗浄バッファーが、クロマトグラフィー材料上に組成物をロードした後、かつ固体相からの目的のポリペプチドの溶出前に、使用される。しかし、ポリペプチドなどの目的の産物の一部は、洗浄バッファー（例えば、フロースルーモードと類似した）によって、クロマトグラフィー材料から除去され得る。
【００８５】
溶出は、本明細書で使用する場合、クロマトグラフィー材料からの、産物、例えば、ポリペプチドの除去である。本発明の一部の実施態様では、この溶出は、タンパク質が最後の浄化手順に引き続いてロードされなかったクロマトグラフィー材料に溶出手順が適用される、「モック溶出」である。本発明の一部の実施態様では、このモック溶出手順は、本明細書に記載される浄化手順のいずれか１つの後に、クロマトグラフィー材料に適用される。一部の実施態様では、このモック溶出は、実際の産生実行の間にキャリーオーバー材料（例えば、夾雑物）が存在し得るかどうかを決定するための試みにおいて材料に適用される、タンパク質を溶出するために使用される溶出を模倣する。モック溶出は、浄化手順の有効性を評価するための手段として使用され得る。
【００８６】
溶出バッファーは、クロマトグラフィー材料から目的のポリペプチド又は他の産物を溶出するために使用されるバッファーである。多くの場合、溶出バッファーは、ロードバッファーとは異なる物理的特性を有する。例えば、この溶出バッファーは、ロードバッファーとは異なる伝導率又はロードバッファーとは異なるｐＨを有し得る。一部の実施態様では、この溶出バッファーは、ロードバッファーよりも低い伝導率を有する。一部の実施態様では、この溶出バッファーは、ロードバッファーよりも高い伝導率を有する。一部の実施態様では、この溶出バッファーは、ロードバッファーよりも低いｐＨを有する。一部の実施態様では、この溶出バッファーは、ロードバッファーよりも高いｐＨを有する。一部の実施態様では、この溶出バッファーは、ロードバッファーとは異なる伝導率及び異なるｐＨを有する。この溶出バッファーは、より高い若しくはより低い伝導率又はより高い若しくはより低いｐＨの任意の組み合わせを有し得る。
【００８７】
伝導率とは、水溶液が２つの電極間で電流を伝導する能力を指す。溶液中では、電流は、イオン輸送によって流れる。従って、水溶液中に存在する漸増量のイオンでは、この溶液は、より高い伝導率を有する。伝導率についての尺度の基本的単位は、シーメンス（又はｍｈｏ）、ｍｈｏ（ｍＳ／ｃｍ）であり、伝導率メーター、例えば、Ｏｒｉｏｎ伝導率メーターの種々のモデルを使用して、測定され得る。電解伝導率は、溶液中のイオンが電流を流す能力であるので、溶液の伝導率は、その中のイオンの濃度を変化させることによって変更され得る。例えば、溶液中のバッファリング剤の濃度及び／又は塩（例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム若しくは塩化カリウム）の濃度は、所望の伝導率を達成するために変更され得る。好ましくは、種々のバッファーの塩濃度は、所望の伝導率を達成するために修飾される。
【００８８】
（Ｂ）夾雑物
本発明は、製造規模などの大規模での使用のためのクロマトグラフィー材料の再使用のための方法を提供する。この方法は、複数のポリペプチド産物のためのクロマトグラフィー材料の複数回の使用を提供する。例えば、本発明の方法を使用して、第１の抗体が、クロマトグラフィー材料上で産業的規模で精製され得、その後、本明細書に記載されるクロマトグラフィー材料を浄化／再生する方法が続き、次いでその後、第２の抗体産物の産業的規模の精製が続き得る。一部の実施態様では、本発明の方法は、クロマトグラフィー材料を使用して精製された前の産物の「キャリーオーバー」を低減させるために使用される。一部の実施態様では、このキャリーオーバー夾雑物には、抗体全体、ＩｇＧ断片、Ｆｃ及びＦｃ断片が含まれるがこれらに限定されない。
【００８９】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、この少なくとも１つの夾雑物は、宿主細胞材料、例えば、ＣＨＯＰ；浸出されたプロテインＡ；核酸；所望のポリペプチドの変異体、断片、凝集物又は誘導体；別のポリペプチド；エンドトキシン；ウイルス夾雑物；細胞培養培地成分、カルボキシペプチターゼＢ、ゲンタマイシンなどのうちいずれか１又は複数である。一部の例では、この夾雑物は、これらに限定されないが、例えば、細菌細胞、例えば、大腸菌細胞、昆虫細胞、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、トリ細胞、真菌細胞などの細胞由来の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）であり得る。
【００９０】
浸出されたプロテインＡは、それが結合した固体相から脱離又は洗浄されたプロテインＡである。例えば、浸出されたプロテインＡは、プロテインＡクロマトグラフィー材料から浸出され得る。プロテインＡの量は、例えば、ＥＬＩＳＡによって測定され得る。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、浸出されたプロテインＡの量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％又は約９０％のいずれかよりも大きく、低減される。浸出されたプロテインＡの量は、約１０％と約９９％との間、約３０％と約９５％との間、約３０％と約９９％との間、約５０％と約９５％との間、約５０％と約９９％との間、約７５％と約９９％との間又は約８５％と約９９％との間のいずれか、低減され得る。一部の実施態様では、浸出されたプロテインＡの量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は約９５％のいずれか、低減される。一部の実施態様では、この低減は、精製工程（一又は複数）から回収された組成物中の浸出されたプロテインＡの量を、精製工程（一又は複数）前の組成物中の浸出されたプロテインＡの量と比較することによって決定される。
【００９１】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、ポリペプチドが産生された細胞由来のタンパク質である。例えば、ＣＨＯＰは、宿主細胞由来のタンパク質、即ち、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質である。ＣＨＯＰの量は、酵素結合免疫吸着法（「ＥＬＩＳＡ」）又はＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（「ＭＳＯ」）によって測定され得る。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、溶出液中のＨＣＰ（例えば、ＣＨＯＰ）の量は、モック溶出において最小である。一部の実施態様では、モック溶出からの溶出液中の宿主細胞タンパク質のレベルは、浄化する方法あり及びなしで、又は浄化する方法の前及び後に、比較される。
【００９２】
宿主細胞ＤＮＡなどのＤＮＡを測定する方法は、当該技術分野で公知であり、実施例のセクションに記載されている。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、ＤＮＡの量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％又は約９０％のいずれかよりも多く、低減される。ＤＮＡの量は、約１０％と約９９％との間、約３０％と約９５％との間、約３０％と約９９％との間、約５０％と約９５％との間、約５０％と約９９％との間、約７５％と約９９％との間又は約８５％と約９９％との間のいずれか、低減され得る。ＤＮＡの量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又は約９９％のいずれか、低減され得る。一部の実施態様では、この低減は、精製工程（一又は複数）から回収された組成物中のＤＮＡの量を、精製工程（一又は複数）前の組成物中のＤＮＡの量と比較することによって決定される。
【００９３】
断片ポリペプチドは、低分子量（ＬＭＷ）タンパク質であり得る。一部の実施態様では、断片化されたポリペプチドは、目的のポリペプチドの断片である。ＬＭＷタンパク質の例には、Ｆａｂ（断片抗原結合）、Ｆｃ（断片、結晶化可能）領域若しくは両方の組み合わせ、又は目的の抗体の任意のランダムな断片化された一部が含まれるがこれらに限定されない。断片化されたタンパク質（例えば、ＬＭＷタンパク質）を測定する方法は、当該技術分野で公知であり、実施例のセクションに記載されている。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、ＬＭＷタンパク質の量は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は約９５％のいずれかよりも多く、低減される。ＬＭＷタンパク質の量は、約１０％と約９９％との間、約３０％と約９５％との間、約３０％と約９９％との間、約５０％と約９５％との間、約５０％と約９９％との間、約７５％と約９９％との間又は約８５％と約９９％との間のいずれか、低減され得る。ＬＭＷタンパク質の量は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は約９５％のいずれか、低減され得る。一部の実施態様では、この低減は、精製工程（一又は複数）から回収された組成物中の断片化されたタンパク質（例えば、ＬＭＷタンパク質）の量を、精製工程（一又は複数）前の組成物中の断片化されたタンパク質（例えば、ＬＭＷタンパク質）の量と比較することによって決定される。
【００９４】
凝集したポリペプチドは、高分子量（ＨＭＷ）タンパク質であり得る。一部の実施態様では、この凝集したポリペプチドは、目的のポリペプチドの多量体である。このＨＭＷタンパク質は、目的のポリペプチドの、ダイマー、最大で８×のモノマー又はそれより多くであり得る。凝集したタンパク質（例えば、ＨＭＷタンパク質）を測定する方法は、当該技術分野で公知である。一部の実施態様では、モック溶出中のＨＭＷのレベルは、最低限、例えば、約５ｐｐｍ未満、約４ｐｐｍ未満、約３ｐｐｍ未満、約２ｐｐｍ未満又は約１ｐｐｍ未満である。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、この凝集したタンパク質の量は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は約９５％のいずれかよりも多く、低減される。凝集したタンパク質の量は、約１０％と約９９％との間、約３０％と約９５％との間、約３０％と約９９％との間、約５０％と約９５％との間、約５０％と約９９％との間、約７５％と約９９％との間又は約８５％と約９９％との間のいずれか、低減され得る。凝集したタンパク質の量は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は約９５％のいずれか、低減され得る。一部の実施態様では、この低減は、精製工程（一又は複数）から回収された組成物中の凝集したタンパク質（例えば、ＨＭＷタンパク質）の量を、精製工程（一又は複数）前の組成物中の凝集したタンパク質（例えば、ＨＭＷタンパク質）の量と比較することによって決定される。
【００９５】
細胞培養培地成分とは、細胞培養培地中に存在する成分を指す。細胞培養培地は、細胞を回収する時点の細胞培養培地であり得る。一部の実施態様では、この細胞培養培地成分は、ゲンタマイシンである。ゲンタマイシンの量は、ＥＬＩＳＡによって測定され得る。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、細胞培養培地成分の量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％又は約９０％のいずれかよりも多く、低減される。細胞培養培地成分の量は、約１０％と約９９％との間、約３０％と約９５％との間、約３０％と約９９％との間、約５０％と約９５％との間、約５０％と約９９％との間、約７５％と約９９％との間又は約８５％と約９９％との間のいずれか、低減され得る。一部の実施態様では、細胞培養培地成分の量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又は約９８％のいずれか、低減される。一部の実施態様では、この低減は、精製工程（一又は複数）から回収された組成物中の細胞培養培地成分の量を、精製工程（一又は複数）前の組成物中の細胞培養培地成分の量と比較することによって決定される。
【００９６】
（Ｃ）夾雑物を検出するための方法
本発明は、再使用可能なクロマトグラフィー材料の浄化の効率を評価するための方法を提供する。例えば、ポリペプチドが以前にロードされ、少なくとも１回溶出されたクロマトグラフィー材料が、上記本発明の方法の１つによって浄化される。次いで、モック溶出が、さらなるポリペプチドが浄化手順後にその材料上にロードされていない材料上で実行される。このモック溶出は、その材料上に以前にロードされたポリペプチドに対して使用された溶出手順に従い得る、又は溶出手順は、浄化手順後に精製されるポリペプチドのための溶出手順に従い得る。一部の実施態様では、モックローディングが、モック溶出の前に、材料上で実行される。モックローディングは、そのポリペプチドがローディングに含まれていないことを除いて、この材料上にポリペプチドをロードするために、同じ手順を使用する。一部の実施態様では、モック溶出からの溶出剤は、１又は複数の画分において収集される。一部の実施態様では、モック溶出からの溶出剤は、単一の画分において収集される。一部の実施態様では、溶出剤、又は溶出剤の試料は、クロマトグラフィー材料の前のローディングからのキャリーオーバーポリペプチド、ＩｇＧ断片、浸出されたプロテインＡ、ＣＨＯＰ及びＣＨＯ  ＤＮＡを含む夾雑物について解析される。
【００９７】
ポリペプチドの定量化
抗体などのポリペプチドの濃度は、ＵＶ−可視分光光度計（８４５３モデルＧ１１０３Ａ；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）又はＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００モデルＮＤ−１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して、２８０ｎｍ及び３２０ｎｍにおける吸光度を介して決定され得る。再使用可能なクロマトグラフィー材料上に以前にロードされたポリペプチド又は本発明の方法によって浄化された材料上にロードされたポリペプチド以外の種（即ち、不純物）は、ＵＶ吸光度に対する認識できる影響を有するには、濃度が低すぎる場合がある。必要に応じて、試料は、０．１−１．０の吸光度単位の範囲で、適切な非妨害性希釈剤を用いて希釈され得る。試料調製及びＵＶ測定は、２重で実施され、平均値が記録される。ＭＡｂ吸収係数は、１．４２／ｍｇ・ｍｌ・ｃｍから１．６４５／ｍｇ・ｍｌ・ｃｍまでの範囲であり得る。
【００９８】
総タンパク質は、キャピラリーゾーン電気泳動／レーザー誘起蛍光検出アッセイによって決定され得る。
【００９９】
ＩｇＧ検出
インタクトなヒトＩｇＧ及びヒトＩｇＧ断片は、インタクトなヒトＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡ又はＩｇＧ断片特異的ＥＬＩＳＡを使用して検出され得る。ヒトＦｃは、ヒトＦｃ特異的ＥＬＩＳＡを使用して検出され得る。
【０１００】
ＣＨＯ宿主細胞タンパク質（ＣＨＯＰ）の定量化
ＥＬＩＳＡは、ＣＨＯＰと呼ばれる宿主細胞タンパク質のレベルを定量化するために使用され得る。抗ＣＨＯＰ抗体が、マイクロタイタープレートウェル上に固定化される。ＣＨＯＰを含む試料、標準及びコントロールの希釈が、ウェル中でインキュベートされ、その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされた抗ＣＨＯＰ抗体と共にインキュベートされる。ＨＲＰ酵素活性は、ｏ−フェニレンジアミンを用いて検出され得、ＣＨＯＰは、マイクロタイタープレートリーダーにおいて４９０ｎｍで吸光度を読み取ることによって定量化される。サンドイッチＥＬＩＳＡの原理に基づくと、ペルオキシダーゼの濃度は、ＣＨＯＰ濃度と対応する。ＥＬＩＳＡについてのアッセイ範囲は、典型的には、アッセイ内可変性＜１０％で、５−３２０ｎｇ／ｍｌである。ＣＨＯＰ値は、ｎｇ／ｍｌの単位で報告され得る。あるいは、ＣＨＯＰ値は、ＭＡｂ濃度によって除算され得、結果は、ＰＰＭ（百万分率；例えば、ＣＨＯＰのｎｇ／ＭＡｂのｍｇ）で報告され得る。ＣＨＯＰ  ＥＬＩＳＡは、試料中の総ＣＨＯＰレベルを定量化するために使用され得るが、個々のタンパク質の濃度は定量化しない。
【０１０１】
ＣＨＯ  ＤＮＡの定量化
産物試料中のＣＨＯ  ＤＮＡは、リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ）を使用して定量化され得る。試料及びコントロール由来のＤＮＡが、ＱｉａｇｅｎのＶｉｒｕｓ  Ｂｉｏｒｏｂｏｔキットを使用して最初に抽出され得る。抽出された試料、コントロール及び標準ＤＮＡは、ＡＢＩの配列検出システムと共に９６ウェルプレートにおいてＰＣＲプライマー及びプローブを使用するＴａｑＭａｎリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供される。これらのプライマーは、チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ゲノム中の反復ＤＮＡ配列の１１０塩基対セグメントによって規定される。このプローブは、５’末端において蛍光性レポーター色素で、３’末端においてクエンチャー色素で、標識される。プローブがインタクトである場合、レポーターの発光スペクトルは、クエンチャーによって抑制される。ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性は、このプローブを加水分解し、レポートを放出し、これが、蛍光発光における増加を生じる。配列検出器は、ＤＮＡ増幅の間に連続的に測定される蛍光発光における増加に正比例する、増幅された産物を定量化する。ＤＮＡが閾値（ＣＴ）を越えて増幅したときのサイクル数が、検量線について計算される。１ｐｇ／ｍＬ−１０，０００ｐｇ／ｍＬの範囲の検量線が生成され得、これが、試料中のＤＮＡを定量化するために使用される。
【０１０２】
浸出されたプロテインＡの定量化
プロテインＡプール中の浸出されたプロテイン−Ａのレベルは、サンドイッチプロテイン−Ａ  ＥＬＩＳＡによって決定され得る。ニワトリ抗ブドウ球菌プロテインＡ抗体が、マイクロタイタープレートウェル上に固定化される。試料処理手順は、試料希釈、及びサンドイッチＥＬＩＳＡ上で試料を実行する前の事前処理工程としてマイクロ波支援加熱を使用したプロテインＡ／ＩｇＧ複合体の解離を含み得る。プロテインＡは、試料中に存在する場合、コートされた抗体に結合し得る。結合したプロテインＡは、ホースラディッシュペルオキシダーゼがコンジュゲートされた抗タンパク質抗体を使用して検出される。ホースラディッシュペルオキシダーゼの酵素活性は、比色分析シグナルを生じる２成分ＴＭＢ基質溶液を用いて定量化される。
【０１０３】
ＩＩＩ．ポリペプチド
本発明の方法は、複数のポリペプチドの精製において使用されるクロマトグラフィー材料を浄化するために使用され得る。一部の実施態様では、このクロマトグラフィー材料は、大規模、例えば、抗体又はその断片などのポリペプチドの製造規模の産生において使用される。一部の実施態様では、クロマトグラフィー材料は、第１の抗体などの第１のポリペプチドの精製において使用され、次いで、この材料は、本発明の方法によって浄化され、次いで、このクロマトグラフィー材料は、第２の抗体などの第２のポリペプチドを精製するために使用され得る。一部の実施態様では、この浄化は有効であり、その結果、第２の精製されたポリペプチドを含む調製物が、第１のポリペプチドを本質的に含まない。一部の実施態様では、第２の精製されたポリペプチド（例えば、第２の抗体）を含む調製物は、１ｐｐｍ未満の第１のポリペプチド（例えば、第１の抗体）を含む。一部の実施態様では、この第２の精製されたポリペプチドは、１ｐｐｍ未満、２ｐｐｍ未満、３ｐｐｍ未満、４ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、４０ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満又は１００ｐｐｍ未満のいずれか１つの第１のポリペプチドを含む。
【０１０４】
一部の実施態様では、本発明の方法は、治療ポリペプチドを精製するために使用されるクロマトグラフィー材料を再使用するために使用される。一部の実施態様では、このポリペプチドは、アンタゴニストである。一部の実施態様では、このポリペプチドは、アゴニストである。一部の実施態様では、このポリペプチドは、抗体である。一部の実施態様では、このポリペプチドは、エピトープでタグ化されている。一部の実施態様では、このポリペプチドは、生物活性及び／又は免疫活性を保持する。一部の実施態様では、このポリペプチドは、アンタゴニストである。一部の実施態様では、このポリペプチドは、補体依存性細胞傷害を開始させる。一部の実施態様では、このポリペプチドは、抗体又はイムノアドヘシンである。
【０１０５】
一部の実施態様では、このポリペプチド、第１のポリペプチド及び／又は第２のポリペプチドは、約５，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン、約２５，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン、約７５，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約１２５，０００ダルトン又は約１５０，０００ダルトンのいずれかよりも大きい分子量を有する。このポリペプチドは、約５０，０００ダルトンから約２００，０００ダルトン又は約１００，０００ダルトンから約２００，０００ダルトンのいずれかの間の分子量を有し得る。あるいは、本明細書での使用のためのこのポリペプチドは、約１２０，０００ダルトン又は約２５，０００ダルトンの分子量を有し得る。
【０１０６】
ｐＩは、等電点であり、特定の分子又は表面が正味の電荷を有さないｐＨである。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、ポリペプチド、例えば、第１のポリペプチド及び／又は第２のポリペプチドのｐＩは、約６から約１０、約７から約９又は約８から約９のいずれかの間であり得る。一部の実施態様では、このポリペプチドは、約６、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５又は約１０のいずれかのｐＩを有する。
【０１０７】
本明細書に記載される方法によって浄化された再使用可能なクロマトグラフィー材料を使用して精製されるポリペプチドは、一般に、組換え技術を使用して産生される。組換えタンパク質を産生するための方法は、例えば、本明細書に参照により援用される米国特許第５５３４６１５号及び米国特許第４８１６５６７号に記載されている。一部の実施態様では、目的のタンパク質は、ＣＨＯ細胞において産生される（例えば、国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと）。組換え技術を使用する場合、これらのポリペプチドは、細胞内で産生され得、細胞周辺腔において産生され得、又は培地中に直接分泌され得る。
【０１０８】
本明細書に記載される方法によって浄化された再使用可能なクロマトグラフィー材料を使用して精製されるポリペプチドは、培養培地又は宿主細胞溶解物から回収され得る。ポリペプチドの発現において使用される細胞は、種々の物理的又は化学的手段、例えば、凍結−解凍サイクリング、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤によって破壊され得る。ポリペプチドが細胞内で産生される場合、第１の工程として、宿主細胞又は溶解された断片のいずれかの粒状デブリが、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）は、大腸菌の細胞周辺腔に分泌されるポリポリペプチドを単離するための手順を記載している。簡潔に述べると、細胞ペーストが、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分間にわたって解凍される。細胞デブリは、遠心分離によって除去され得る。ポリペプチドが培地中に分泌される場合、かかる発現系由来の上清は、一般に、市販のポリペプチド濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して、最初に濃縮される。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が、タンパク質分解を阻害するために上述の工程のいずれかにおいて含められ得、抗生物質が、偶発性夾雑物の増殖を防止するために含められ得る。
【０１０９】
本明細書に記載される方法によって浄化された再使用可能なクロマトグラフィー材料を使用して精製され得るポリペプチドの例には、免疫グロブリン、イムノアドヘシン、抗体、酵素、ホルモン、融合タンパク質、Ｆｃ含有タンパク質、イムノコンジュゲート、サイトカイン及びインターロイキンが含まれるがこれらに限定されない。ポリペプチドの例には、哺乳動物タンパク質、例えば、レニンなど；ホルモン；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子及びフォン・ヴィルブランド因子；抗凝固因子、例えば、プロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血性増殖因子；腫瘍壊死因子−アルファ及び−ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；リラクシンＡ鎖；リラクシンＢ鎖；プロリラクシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；酵素；微生物タンパク、例えば、ベータ−ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ−４；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は増殖因子に対する受容体；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５若しくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５若しくはＮＴ−６）、又は神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−ｂ；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子、例えば、ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−アルファ、及びＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４又はＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−ベータ；インスリン様増殖因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；サイトカイン；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；融合ポリペプチド、即ち、２以上の異種ポリペプチド又はそれらの断片上に含まれ、組換え核酸によってコードされるポリペプチド；Ｆｃ含有ポリペプチド、例えば、第２のポリペプチドに融合した免疫グロブリンＦｃ領域又はその断片を含む融合タンパク質；イムノコンジュゲート；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロン−アルファ、−ベータ及び−ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；制御タンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えば、ＣＡ１２５（卵巣癌抗原）又はＨＥＲ２、ＨＥＲ３若しくはＨＥＲ４受容体；イムノアドヘシン；並びに、上に列挙したタンパク質のいずれかの断片及び／又は変異体、並びに、例えば上に列挙したタンパク質のいずれかを含むタンパク質に結合する抗体断片を含む抗体が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１０】
（Ａ）抗体
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、本明細書に記載される方法によって浄化された再使用可能なクロマトグラフィー材料を使用して精製され得るポリペプチド、例えば、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド又は任意の引き続くポリペプチドは、抗体である。
【０１１１】
抗体に対する分子標的には、例えば以下であるがこれらに限定されないＣＤタンパク質及びそれらのリガンドが含まれる：（ｉ）ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）及びＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）；（ｉｉ）ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー、例えば、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４受容体；（ｉｉｉ）細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、及びそれらのアルファサブユニット又はベータサブユニットのいずれかを含む、αｖ／β３インテグリン（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）；（ｉｖ）増殖因子、例えば、ＶＥＧＦ；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ−ｍｅｔ、組織因子、β７など；並びに（ｖ）細胞表面及び膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載されるもの。
【０１１２】
他の例示的抗体には、抗エストロゲン受容体抗体、抗プロゲステロン受容体抗体、抗ｐ５３抗体、抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗カテプシンＤ抗体、抗Ｂｃｌ−２抗体、抗Ｅ−カドヘリン抗体、抗ＣＡ１２５抗体、抗ＣＡ１５−３抗体、抗ＣＡ１９−９抗体、抗ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体、抗Ｐ−糖タンパク質抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗網膜芽細胞腫タンパク質抗体、抗ｒａｓ癌タンパク質抗体、抗Ｌｅｗｉｓ  Ｘ抗体、抗Ｋｉ−６７抗体、抗ＰＣＮＡ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ７抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ９／ｐ２４抗体、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３５抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４１抗体、抗ＬＣＡ／ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ１００抗体、抗ＣＤ９５／Ｆａｓ抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ユビキチン抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ｃ−ｍｙｃ抗体、抗サイトケラチン抗体、抗ビメンチン抗体、抗ＨＰＶタンパク質抗体、抗カッパ軽鎖抗体、抗ラムダ軽鎖抗体、抗メラノソーム抗体、抗前立腺特異的抗原抗体、抗Ｓ−１００抗体、抗ｔａｕ抗原抗体、抗フィブリン抗体、抗ケラチン抗体及び抗Ｔｎ−抗原抗体から選択されるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１３】
（ｉ）ポリクローナル抗体
一部の実施態様では、これらの抗体は、ポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、好ましくは、適切な抗原及びアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射によって、動物において惹起される。適切な抗原を、免疫化される種において免疫原性であるポリペプチド、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン又はダイズトリプシン阻害因子に、二官能性剤又は誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ、ここで、Ｒ及びＲ１は、異なるアルキル基である、を使用してコンジュゲートすることが、有用であり得る。
【０１１４】
動物は、例えば、１００μｇ又は５μｇのポリペプチド又はコンジュゲート（それぞれ、ウサギ又はマウスについて）を、３容積の完全フロイントアジュバントと組み合わせ、複数の部位において溶液を皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート又は誘導体に対して免疫化される。１カ月後、動物は、完全フロイントアジュバント中のペプチド又はコンジュゲートの元の量の１／５から１／１０で、複数の部位における皮下注射によってブーストされる。７から１４日後、動物から採血し、血清が、抗体力価についてアッセイされる。動物は、力価がプラトーになるまでブーストされる。一部の実施態様では、この動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なるポリペプチドに及び／又は異なる架橋試薬を介してコンジュゲートされたコンジュゲートによって、ブーストされる。コンジュゲートは、ポリペプチド融合物として組換え細胞培養においても作製され得る。また、凝集剤、例えばミョウバンが、免疫応答を増強するために適切に使用される。
【０１１５】
（ｉｉ）モノクローナル抗体
一部の実施態様では、本発明の方法によって浄化された再使用可能なクロマトグラフィー材料上で精製される抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から取得され、即ち、集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生の間に生じる可能な変異体を除き、同一である及び／又は同じエピトープを結合し、かかる変異体は、一般には、微量で存在する。従って、修飾語句「モノクローナル」は、別々の又はポリクローナル抗体の混合物ではないとして、抗体の特徴を示す。
【０１１６】
例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法を使用して作製され得るか、又は組換えＤＮＡ方法によって作製され得る（米国特許第４８１６５６７号）。
【０１１７】
ハイブリドーマ方法では、マウス又は他の適切な宿主動物、例えば、ハムスターが、免疫化に使用されるポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生する又は産生することが可能であるリンパ球を惹起するために、本明細書に記載のように免疫化される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。次いで、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコールなどの適切な融剤を使用して骨髄腫細胞と融合される（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。
【０１１８】
こうして調製されたハイブリドーマ細胞は、融合していない親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１又は複数の物質を好ましくは含む適切な培養培地に播種され、増殖される。例えば、これらの親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。
【０１１９】
一部の実施態様では、これらの骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性である骨髄腫細胞である。これらのうち、一部の実施態様では、骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍、並びにアメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞から誘導される骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【０１２０】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。一部の実施態様では、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法又はインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって、決定される。
【０１２１】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ解析によって決定され得る。
【０１２２】
所望の特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、それらのクローンは、限界希釈法手順によってサブクローニングされ得、標準的な方法によって増殖され得る（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。この目的のために適切な培養培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、これらのハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖され得る。
【０１２３】
これらのサブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、ポリペプチドＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水液又は血清から適切に分離される。
【０１２４】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離及び配列決定される。一部の実施態様では、これらのハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの供給源として機能する。単離された後、このＤＮＡは、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得るために、そうでなければ免疫グロブリンポリペプチドを産生しない宿主細胞、例えば、大腸菌細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞中に次いでトランスフェクトされる発現ベクター中に配置され得る。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現についての概説記事には、Ｓｋｅｒｒａ等、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６−２６２（１９９３）及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．、１３０：１５１−１８８（１９９２）が含まれる。
【０１２５】
さらなる一実施態様では、抗体又は抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載される技術を使用して生成される抗体ファージライブラリーから単離され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）は、ファージライブラリーを使用する、それぞれマウス抗体及びヒト抗体の単離を記載している。引き続く刊行物は、鎖シャッフリング（Marks等, Bio/Technology 10:779-783 (1992)）、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組換え（Waterhouse等, Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)）による、高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生を記載している。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替法である。
【０１２６】
ＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって（米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)）、又は免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全て若しくは一部を共有結合的に連結することによって、修飾され得る。
【０１２７】
典型的には、かかる非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインを置換し、又はかかる非免疫グロブリンポリペプチドは、ある抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位及び異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を創出するために、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインを置換する。
【０１２８】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施態様では、この抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭである。一部の実施態様では、この抗体は、ＩｇＧモノクローナル抗体である。
【０１２９】
（ｉｉｉ）ヒト化抗体
一部の実施態様では、この抗体は、ヒト化抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野で記載されている。一部の実施態様では、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源由来の、その中に導入された１又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と言われる場合が多く、これらは、典型的には、「移入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、超可変領域配列でヒト抗体の対応する配列を置き換えることによって、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者（Jones等, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science 239:1534-1536 (1988)）の方法に従って、本質的には実施され得る。従って、かかる「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４８１６５６７号）、ここで、実質的に、インタクトなヒト可変ドメイン未満が、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、一部の超可変領域残基及びおそらくは一部のＦＲ残基が、げっ歯類抗体中の類似の部位由来の残基によって置換される、ヒト抗体である。
【０１３０】
ヒト化抗体を作製する際に使用される軽鎖及び重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」方法によれば、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、げっ歯類のものと最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として受容される（Sims等, J. Immunol. 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol. 196:901 (1987)）。別の方法は、軽鎖又は重鎖可変領域の特定の下位群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用され得る（Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol. 151:2623 (1993)）。
【０１３１】
抗体が、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物特性の保持を伴ってヒト化されることが、さらに重要である。この目標を達成するために、これらの方法の一部の実施態様では、ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列の３次元モデルを使用した、親配列及び種々の概念的ヒト化産物の解析のプロセスによって調製される。３次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能な３次元コンフォメーション構造を図示しディスプレイするコンピュータープログラムが利用可能である。これらのディスプレイの検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性の高い役割の解析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の解析を可能にする。この方法で、ＦＲ残基は、所望の抗体特性、例えば、標的抗原（一又は複数）に対する増加した親和性が達成されるように、レシピエント配列及び移入配列から選択され得、組み合わされ得る。一般に、超可変領域の残基は、直接的かつ最も実質的に、抗原結合に影響を与えることに関与する。
【０１３２】
（ｖ）ヒト抗体
一部の実施態様では、この抗体は、ヒト抗体である。ヒト化に対する代替法として、ヒト抗体が生成され得る。例えば、免疫化の際に、内因性の免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全レパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが、ここで可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性の抗体産生の完全な阻害を生じることが記載されている。かかる生殖細胞系変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移行は、抗原曝露の際にヒト抗体の産生を生じる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ等、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３（１９９３）；並びに米国特許第５５９１６６９号；米国特許第５５８９３６９号；及び米国特許第５５４５８０７号を参照のこと。
【０１３３】
あるいは、ファージディスプレイテクノロジー（McCafferty等, Nature 348:552-553 (1990)）は、免疫化されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産生するために使用され得る。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、線状バクテリオファージ、例えば、Ｍ１３又はｆｄのメジャー又はマイナーコートポリペプチド遺伝子のいずれか中に、インフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能性抗体断片としてディスプレイされる。線状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能的特性に基づく選択もまた、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択を生じる。従って、ファージは、Ｂ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは、種々の形式で実施され得る；それらの概説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．及びＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）を参照のこと。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源が、ファージディスプレイのために使用され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化されたマウスの脾臓から誘導されるＶ遺伝子の小さいランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫化されていないヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーが構築され得、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体が、Ｍａｒｋｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）又はＧｒｉｆｆｉｔｈ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載された技術に本質的に従って、単離され得る。米国特許第５５６５３３２号及び米国特許第５５７３９０５号もまた参照のこと。
【０１３４】
ヒト抗体は、インビトロで活性化されたＢ細胞によっても生成され得る（米国特許第５５６７６１０号及び米国特許第５２２９２７５号を参照のこと）。
【０１３５】
（ｖ）抗体断片
一部の実施態様では、この抗体は、抗体断片である。種々の技術が、抗体断片の産生のために開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して誘導された（例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science 229:81 (1985)を参照のこと）。しかし、これらの断片は、ここで、組換え宿主細胞によって直接的に産生され得る。例えば、これらの抗体断片は、上で議論した抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片が、大腸菌から直接回収され得、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成するために化学的にカップリングされ得る（Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)）。別の手法によれば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体断片の産生のための他の技術は、熟練の施術者に明らかである。他の実施態様では、選択された抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。抗体断片はまた、例えば米国特許第５６４１８７０号などに記載されるような、「直鎖状抗体」であり得る。かかる直鎖状抗体断片は、単一特異性又は二重特異性であり得る。
【０１３６】
一部の実施態様では、本発明に記載される抗体の断片が提供される。一部の実施態様では、この抗体断片は、抗原結合性断片である。一部の実施態様では、この抗原結合性断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ及びダイアボディからなる群より選択される。
【０１３７】
（ｖｉ）二重特異性抗体
一部の実施態様では、この抗体は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得る。あるいは、二重特異性抗体の結合アームは、細胞防御の焦点を細胞に合わさせるように、白血球上のトリガー分子、例えば、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２若しくはＣＤ３）、又はＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームと組み合わされ得る。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製され得る。
【０１３８】
二重特異性抗体を作製するための方法は、当該技術分野で公知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づき、これら２つの鎖は、異なる特異性を有する（Millstein等, Nature 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな取り合わせに起因して、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生し、これらのうち１つだけが、正しい二重特異性構造を有する。アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常行われる正しい分子の精製は、むしろ扱いにくく、産物収量は低い。類似の手順は、国際公開第９３／０８８２９号及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０１３９】
異なる手法によれば、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインが、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。一部の実施態様では、この融合は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。一部の実施態様では、軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合物の少なくとも１つにおいて存在する。免疫グロブリン重鎖融合物、及び所望の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクター中に挿入され、適切な宿主生物中にコトランスフェクトされる。これは、構築において使用される３つのポリペプチド鎖の不均等な比率が最適な収量を提供する場合の実施態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合を調整することにおける大きな順応性を提供する。しかし、等しい比率での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収量を生じる場合又は比率に特定の有意性がない場合、１つの発現ベクター中に２つ又は３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
【０１４０】
この手法の一部の実施態様では、これらの二重特異性抗体は、一方のアーム中の第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアーム中のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）から構成される。この非対称構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離を促進することが見出されたが、それは、二重特異性分子の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在が、分離の容易な方法を提供するからである。この手法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を生成することのさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１４１】
米国特許第５７３１１６８号に記載される別の手法によれば、抗体分子の対間の接触面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の百分率を最大化するために操作され得る。一部の実施態様では、この接触面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の接触面由来の１又は複数の小さいアミノ酸側鎖が、より大きい側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えられる。大きい側鎖（一又は複数）に対して同一又は類似のサイズの代償的「腔」が、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）で置き換えることによって、第２の抗体分子の接触面上に創出される。これは、ホモ二量体などの他の望ましくない最終産物を超えて、ヘテロ二量体の収量を増加させるための機構を提供する。
【０１４２】
二重特異性抗体には、架橋抗体又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方は、アビジンにカップリングされ得、他方は、ビオチンにカップリングされ得る。かかる抗体は、例えば、望ましくない細胞へと免疫系細胞を標的化するため（米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のため（国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号及び欧州０３０８９号）に提唱されてきた。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の従来の架橋方法を使用して作製され得る。適切な架橋結合剤は、当該技術分野で周知であり、いくつかの架橋技術と共に、米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
【０１４３】
抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技術もまた、文献中に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がＦ（ａｂ’）２断片を生成するためにタンパク質分解性に切断される手順を記載している。これらの断片は、隣接ジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止するために、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。次いで、生成されたＦａｂ’断片は、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうち一方が、メルカプトエチルアミンによる還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、等モル量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて、二重特異性抗体を形成する。提供される二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０１４４】
組換え細胞培養物から直接二重特異性抗体断片を作製及び単離するための種々の技術もまた、記載されてきた。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生されてきた。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓタンパク質及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合によって、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。これらの抗体ホモ二量体は、モノマーを形成するために、ヒンジ領域において還元され、次いで、抗体ヘテロ二量体を形成するために再酸化された。この方法は、抗体ホモ二量体の産生のためにも利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）によって記載される「ダイアボディ」テクノロジーは、二重特異性抗体断片を作製するための代替的機構を提供してきた。これらの断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つの断片のＶＨドメイン及びＶＬドメインは、別の断片の相補的なＶＬドメイン及びＶＨドメインとペアリングするようにさせられ、それによって、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略もまた、報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０１４５】
２つよりも多い結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１４６】
（ｖｉｉ）多価抗体
一部の実施態様では、これらの抗体は、多価抗体である。多価抗体は、この抗体が結合する抗原を発現する細胞によって、二価抗体よりも速く内部移行（及び／又は異化）され得る。本明細書で提供される抗体は、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に産生され得る、３つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体（ＩｇＭクラスのもの以外）（例えば、四価抗体）であり得る。この多価抗体は、１つの二量体化ドメイン及び３つ以上の抗原結合部位を含み得る。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域若しくはヒンジ領域を含む（又はＦｃ領域若しくはヒンジ領域からなる）。このシナリオでは、抗体は、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域に対してアミノ末端に３つ以上の抗原結合部位とを含む。本明細書の好ましい多価抗体は、３つから約８つであるが、好ましくは４つの抗原結合部位を含む（又はそれらからなる）。この多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（及び好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、ここで、このポリペプチド鎖（一又は複数）は、２以上の可変ドメインを含む。例えば、このポリペプチド鎖（一又は複数）は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含み得、ここで、ＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２は、アミノ酸又はポリペプチドを示し、ｎは、０又は１である。例えば、このポリペプチド鎖（一又は複数）は、ＶＨ−ＣＨ１−可動性リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖又はＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含み得る。本明細書の多価抗体は、好ましくは、少なくとも２つの（及び好ましくは４つの）軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含む。本明細書の多価抗体は、例えば、約２つから約８つまでの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含み得る。本明細書で企図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意選択的に、ＣＬドメインをさらに含む。
【０１４７】
一部の実施態様では、この抗体は、多重特異性抗体である。多重特異性抗体の例には、ＶＨＶＬ単位がポリエピトープ特異性を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体、各ＶＨＶＬ単位が異なるエピトープに結合する、２以上のＶＬドメイン及びＶＨドメインを有する抗体、各単一可変ドメインが異なるエピトープに結合する、２以上の単一可変ドメインを有する抗体、完全長抗体、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、三機能性抗体、共有結合的に又は非共有結合的に結合した抗体断片が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施態様では、この抗体は、ポリエピトープ特異性、例えば、同じ又は異なる標的（一又は複数）上の２以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を有する。一部の実施態様では、これらの抗体は、１つのエピトープのみに結合する抗体など、単一特異性である。一実施態様によれば、この多重特異性抗体は、５μＭから０．００１ｐＭ、３μＭから０．００１ｐＭ、１μＭから０．００１ｐＭ、０．５μＭから０．００１ｐＭ又は０．１μＭから０．００１ｐＭの親和性で各エピトープに結合するＩｇＧ抗体である。
【０１４８】
（ｖｉｉｉ）他の抗体修飾
例えば、抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強するために、エフェクター機能に関して、本明細書に提供される抗体を修飾することが望まれ得る。これは、抗体のＦｃ領域において１又は複数のアミノ酸置換を導入することによって達成され得る。あるいは又はさらに、システイン残基（一又は複数）が、Ｆｃ領域において導入され得、それによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にする。こうして生成されたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能並びに／又は増加した補体媒介性細胞殺傷及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎ等、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるように、ヘテロ二官能性クロスリンカーを使用しても、調製され得る。あるいは、二重Ｆｃ領域を有する抗体が操作され得、それによって、増強された補体媒介性溶解及びＡＤＣＣ能を有し得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０１４９】
抗体の血清半減期を増加させるために、アミノ酸変更が、その全内容が本明細書に参照により援用される米国特許出願公開第２００６／００６７９３０号に記載されるように、抗体において行われ得る。
【０１５０】
（Ｂ）ポリペプチド変異体及び修飾
本明細書に記載される抗体を含むポリペプチドのアミノ酸配列修飾（一又は複数）が、本明細書に記載される方法によって浄化される再使用可能なクロマトグラフィー材料において使用され得る。
【０１５１】
（ｉ）変異体ポリペプチド
「ポリペプチド変異体」とは、シグナルペプチドを有する又は有さない、ポリペプチドの完全長天然配列、シグナルペプチドを欠くポリペプチド配列、ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する、本明細書で定義されるポリペプチド、好ましくは活性ポリペプチドを意味する。かかるポリペプチド変異体には、例えば、１又は複数のアミノ酸残基が完全長天然アミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端において付加又は欠失されるポリペプチドが含まれる。通常、ＴＡＴポリペプチド変異体は、シグナルペプチドを有する又は有さず、完全長天然配列ポリペプチド配列、シグナルペプチドを欠くポリペプチド配列、ポリペプチドの細胞外ドメインと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％のいずれかのアミノ酸配列同一性を有する。任意選択的に、変異体ポリペプチドは、天然ポリペプチド配列と比較して、１つ以下の保存的アミノ酸置換、あるいは、天然ポリペプチド配列と比較して、約２以下、約３以下、約４以下、約５以下、約６以下、約７以下、約８以下、約９以下又は約１０以下の保存的アミノ酸置換を有する。
【０１５２】
この変異体ポリペプチドは、例えば、完全長天然ポリペプチドと比較した場合、Ｎ末端若しくはＣ末端において切除され得、又は内部残基を欠き得る。特定の変異体ポリペプチドは、所望の生物活性にとって重要でないアミノ酸残基を欠き得る。切除、欠失及び挿入を有するこれらの変異体ポリペプチドは、いくつかの従来の技術のいずれかによって調製され得る。所望の変異体ポリペプチドは、化学合成され得る。別の適切な技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、所望の変異体ポリペプチドをコードする核酸断片を単離及び増幅することが関与する。核酸断片の所望の断片を規定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおいて５’プライマー及び３’プライマーにおいて使用される。好ましくは、変異体ポリペプチドは、本明細書に開示される天然ポリペプチドと、少なくとも１つの生物活性及び／又は免疫活性を共有する。
【０１５３】
アミノ酸配列挿入には、１残基から、１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さ範囲の、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体又は細胞傷害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、酵素、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの、抗体のＮ末端又はＣ末端への融合物が含まれる。
【０１５４】
例えば、ポリペプチドの結合親和性及び／又は他の生物特性を改善することが望ましい場合がある。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、抗体核酸中に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、又はペプチド合成によって、調製される。かかる修飾には、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列内の残基からの欠失及び／又は残基中への挿入及び／又は残基の置換が含まれる。最終コンストラクトが所望の特性を有する限りにおいて、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに達するために行われる。アミノ酸変化はまた、ポリペプチド（例えば、抗体）の翻訳後プロセスを変更し得る、例えば、グリコシル化部位の数又は位置を変化させる。
【０１５５】
どのアミノ酸残基が、所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失され得るかを決定することにおけるガイダンスは、このポリペプチドの配列を相同な公知のポリペプチド分子の配列と比較し、高い相同性の領域において作製されるアミノ酸配列変化の数を最小化することによって、見出され得る。
【０１５６】
突然変異誘発にとって好ましい位置であるポリペプチド（例えば、抗体）の特定の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）に記載されるように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、残基又は標的残基の群が同定され（例えば、荷電残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ）、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を与えるために、中性又は負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）によって置き換えられる。次いで、置換に対する機能的感受性を実証するアミノ酸位置が、置換の部位において、又は置換の部位の代わりに、さらなる又は他の変異体を導入することによって、精緻化される。従って、アミノ酸配列差異を導入するための部位は、予め決定されるが、突然変異自体の性質は、予め決定される必要はない。例えば、所与の部位における突然変異の性能を解析するために、ａｌａスキャニング又はランダム突然変異誘発が、標的コドン又は領域において実施され、発現された抗体変異体は、所望の活性についてスクリーニングされる。
【０１５７】
別の型の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基によって置き換えられた、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換突然変異誘発のために最も目的とされる部位には、超可変領域が含まれるが、ＦＲ変更もまた企図される。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しの下に、以下の表１に示される。かかる置換が生物活性における変化を生じる場合、表１中で「例示的置換」と称され、又はアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載されるような、より実質的な変化が導入され得、産物がスクリーニングされ得る。
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【０１５８】
ポリペプチドの生物特性における実質的修飾は、（ａ）置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造を、例えば、シート又はらせんコンフォメーションとして維持すること、（ｂ）標的部位における分子の電荷若しくは疎水性を維持すること、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持することに対するそれらの影響が顕著に異なる置換を選択することによって、達成される。アミノ酸は、それらの側鎖の特定における類似性に従ってグループ分けされ得る（A. L. Lehninger, Biochemistry 第2版, pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)中）：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
【０１５９】
あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられ得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１６０】
非保存的置換は、これらのクラスのうち１つのメンバーを別のクラスに交換することを必要とする。
【０１６１】
抗体の適切なコンフォメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基もまた、分子の酸化安定性を改善するため、及び異常な架橋を防止するために、一般にはセリンで置換され得る。逆に、システイン結合（一又は複数）が、その安定性を改善するために、ポリペプチドに付加され得る（特に、抗体が、Ｆｖ断片などの抗体断片である場合）。
【０１６２】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体）の１又は複数の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる開発のために選択される得られた変異体（一又は複数）は、それらが生成される親抗体と比較して、改善された生物特性を有する。かかる置換変異体を生成するための簡便な方法には、ファージディスプレイを使用する親和性成熟が関与する。簡潔に述べると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６−７個の部位）が、各部位において全ての可能なアミノ酸置換を生成するために変異される。こうして生成された抗体変異体は、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として、線状ファージ粒子から一価の様式でディスプレイされる。次いで、ファージディスプレイされた変異体は、本明細書に開示されるように、それらの生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発が、抗原結合に顕著に寄与する超可変領域残基を同定するために実施され得る。あるいは、又はさらに、抗体と標的との間の接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を解析することが有益であり得る。かかる接触残基及び隣接残基は、本明細書で詳述される技術に従う置換のための候補である。かかる変異体が生成されると、変異体のパネルが、本明細書に記載されるようにスクリーニングに供され、１又は複数の適切なアッセイにおいて優れた特性を有する抗体が、さらなる開発のために選択され得る。
【０１６３】
ポリペプチドの別の型のアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。このポリペプチドは、非アミノ酸部分を含み得る。例えば、このポリペプチドは、グリコシル化され得る。かかるグリコシル化は、宿主細胞若しくは宿主生物におけるポリペプチドの発現の間に天然に生じ得、又はヒトの介入から生じる意図的な修飾であり得る。変更するとは、ポリペプチド中に見出される１若しくは複数の炭水化物部分を欠失すること、及び／又はポリペプチド中に存在しない１若しくは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【０１６４】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合のいずれかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を創出する。Ｏ結合グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの、糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースのうちの１つの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンもまた使用され得る。
【０１６５】
ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が、上記トリペプチド配列のうち１又は複数を含むように、アミノ酸配列を変更することによって、簡便には達成される（Ｎ結合グリコシル化部位について）。この変更は、元の抗体の配列への、１若しくは複数のセリン若しくはスレオニン残基の付加、又は１若しくは複数のセリン若しくはスレオニン残基による置換によっても、行われ得る（Ｏ結合グリコシル化部位について）。
【０１６６】
ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的若しくは酵素的に、又はグリコシル化のための標的として機能するアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異的置換によって、達成され得る。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、種々のエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。
【０１６７】
他の修飾には、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へのグルタミニル及びアスパラギニル残基の脱アミド、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化、Ｎ末端アミンのアセチル化、並びに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１６８】
（ｉｉ）キメラポリペプチド
本明細書に記載されるポリペプチドは、別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合されたポリペプチドを含むキメラ分子を形成するための方法において、修飾され得る。一部の実施態様では、キメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとの、ポリペプチドの融合を含む。このエピトープタグは、一般に、ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端に配置される。ポリペプチドのかかるエピトープタグ化形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出され得る。また、エピトープタグの提供は、ポリペプチドが、このエピトープタグに結合する抗タグ抗体又は別の型のアフィニティーマトリックスを使用するアフィニティー精製によって容易に精製されることを可能にする。
【０１６９】
代替的な一実施態様では、このキメラ分子は、免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域とのポリペプチドの融合を含み得る。二価形態のキメラ分子は、「イムノアドヘシン」と呼ばれる。
【０１７０】
本明細書で使用する場合、用語「イムノアドヘシン」は、異種ポリペプチドの結合特異性を免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせる抗体様分子を指定する。構造的には、これらのイムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち、「異種」である）所望の結合特異性を有するアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部分は、典型的には、受容体又はリガンドの結合部位を少なくとも含む、近接するアミノ酸配列である。イムノアドヘシン中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３若しくはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから取得され得る。
【０１７１】
これらのＩｇ融合物は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、可溶型（膜貫通ドメインが欠失又は不活化されている）形態のポリペプチドの置換を含む。特に好ましい一実施態様では、この免疫グロブリン融合物は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。
【０１７２】
（ｉｉｉ）ポリペプチドコンジュゲート
ポリペプチド製剤における使用のためのポリペプチドは、細胞傷害性剤、例えば、化学療法剤、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位体（即ち、放射性コンジュゲート）にコンジュゲートされ得る。
【０１７３】
かかるコンジュゲートの生成において有用な化学療法剤が使用され得る。さらに、使用され得る酵素的に活性な毒素及びそれらの断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン及びトリコテセンが含まれる。種々の放射性核種が、放射性コンジュゲートされたポリペプチドの産生のために利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。ポリペプチドと細胞傷害性剤とのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド（glutareldehyde））、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製される。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製され得る。炭素−１４標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、ポリペプチドへの放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的キレート剤である。
【０１７４】
ポリペプチドと、カリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコテセン（trichothene）及びＣＣ１０６５、並びに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体などの１又は複数の低分子毒素とのコンジュゲートもまた、本明細書で企図される。
【０１７５】
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、東アフリカの灌木メイテナス・セラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａ）から最初に単離された。引き続いて、特定の微生物もまた、メイタンシノイド、例えば、メイタンシノール及びＣ−３メイタンシノールエステルを産生することが発見された。合成メイタンシノール並びにその誘導体及びアナログもまた企図される。例えば、米国特許第５２０８０２０号に開示されるものを含む、ポリペプチド−メイタンシノイドコンジュゲートを作製するための当該技術分野で公知の多数の結合基が存在する。この結合基には、上で同定した特許に開示されるような、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基又はエステラーゼ不安定性基が含まれ、ジスルフィド基及びチオエーテル基が好ましい。
【０１７６】
リンカーが、結合の型に依存して、種々の位置においてメイタンシノイド分子に結合され得る。例えば、エステル結合は、従来のカップリング技術を使用して、ヒドロキシル基との反応によって形成され得る。この反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位において生じ得る。好ましい一実施態様では、この結合は、メイタンシノール又はメイタンシノールアナログのＣ−３位において形成される。
【０１７７】
目的の別のコンジュゲートは、１又は複数のカリケアマイシン分子にコンジュゲートされたポリペプチドを含む。カリケアマイシンファミリーの抗生物質は、ピコモル以下の濃度において二本鎖ＤＮＡ中断を生じることが可能である。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、例えば、米国特許第５７１２３７４号を参照のこと。使用され得るカリケアマイシンの構造的アナログには、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθ１Ｉが含まれるがこれらに限定されない。抗体がコンジュゲートされ得る別の抗腫瘍薬は、抗葉酸であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡの両方が、細胞内の作用部位を有し、原形質膜を容易には通過しない。従って、ポリペプチド（例えば、抗体）媒介性の内部移行を介したこれらの薬剤の細胞取り込みは、それらの細胞傷害性効果を大いに増強する。
【０１７８】
本明細書に記載されるポリペプチドにコンジュゲートされ得る他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾシン（streptozoicin）、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル、集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラミシンが含まれる。
【０１７９】
一部の実施態様では、このポリペプチドは、ポリペプチドと、核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えば、デオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）との間でコンジュゲートされ得る。
【０１８０】
なお別の実施態様では、このポリペプチド（例えば、抗体）は、腫瘍の事前標的化における利用のために「受容体」（ストレプトアビジンなど）にコンジュゲートされ得、このポリペプチド受容体コンジュゲートは、患者に投与され、その後、洗浄剤を使用して循環から未結合のコンジュゲートが除去され、次いで、細胞傷害性剤（例えば、放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートされた「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【０１８１】
一部の実施態様では、このポリペプチドは、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤）を活性抗癌薬に変換するプロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートされ得る。このイムノコンジュゲートの酵素成分には、プロドラッグをそのより活性な細胞傷害性形態に変換するような方法でプロドラッグに作用することが可能な任意の酵素が含まれる。
【０１８２】
有用な酵素には、ホスフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用なアルカリホスファターゼ；サルフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬、５−フルオロウラシルに変換するために有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用なプロテアーゼ、例えば、セラチア属（ｓｅｒｒａｔｉａ）プロテアーゼ、サーモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチターゼ及びカテプシン（例えば、カテプシンＢ及びＬ）；Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラッグを変換するために有用なＤ−アラニルカルボキシペプチターゼ；グリコシル化されたプロドラッグを遊離薬物に変換するために有用な炭水化物切断酵素、例えば、β−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ；β−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するために有用なβ−ラクタマーゼ；並びにそれらのアミン窒素においてそれぞれフェノキシアセチル基又はフェニルアセチル基で誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するために有用なペニシリンアミダーゼ、例えば、ペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれるがこれらに限定されない。あるいは、当該技術分野で「アブザイム」としても公知の、酵素活性を有する抗体が、プロドラッグを遊離活性薬物に変換するために使用され得る。
【０１８３】
（ｉｖ）その他
ポリペプチドの別の型の共有結合的修飾は、種々の非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールの共重合体のうちの１つに、ポリペプチドを結合させることを含む。このポリペプチドはまた、例えば、コアセルベーション技術によって若しくは接触面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）中に、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中に、又はマクロエマルジョン中に、捕捉され得る。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．編（１９９０）に開示されている。
【０１８４】
ＩＶ．製剤及び方法における使用のためにポリペプチドを取得する
本明細書に記載される方法によって浄化された再使用可能なクロマトグラフィー材料を使用して精製されるポリペプチドは、組換え方法を含む当該技術分野で周知の方法を使用して取得され得る。以下のセクションは、これらの方法に関するガイダンスを提供する。
【０１８５】
（Ａ）ポリヌクレオチド
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、本明細書で相互交換可能に使用される場合、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。
【０１８６】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチドｍＲＮＡを有する及び検出可能なレベルでそれを発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーが含まれるがこれに限定されない任意の供給源から取得され得る。従って、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、簡便には、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから取得され得る。ポリペプチドコード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから、又は公知の合成手順（例えば、自動化された核酸合成）によっても、取得され得る。
【０１８７】
例えば、このポリヌクレオチドは、免疫グロブリン分子鎖全体、例えば、軽鎖又は重鎖をコードし得る。完全重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）だけでなく重鎖定常領域（ＣＨ）もまた含み、これは典型的には、３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３；並びに「ヒンジ」領域を含む。一部の情況では、定常領域の存在が望ましい。
【０１８８】
このポリヌクレオチドによってコードされ得る他のポリペプチドには、抗原結合性抗体断片、例えば、単一ドメイン抗体（「ｄＡｂ」）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２並びに「ミニボディ」が含まれる。ミニボディは（典型的には）、ＣＨ１及びＣＫ又はＣＬドメインが切除された二価抗体断片である。ミニボディは従来の抗体よりも小さいので、臨床的／診断的使用においてより良い組織透過を達成するはずであるが、二価であるので、ｄＡｂなどの一価の抗体断片よりも高い結合親和性を保持するはずである。従って、文脈が他を示さない限り、用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、抗体分子全体だけでなく、上で議論した型の抗原結合性抗体断片もまた包含する。好ましくは、コードされたポリペプチド中に存在する各フレームワーク領域は、対応するヒトアクセプターフレームワークと比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。従って、例えば、これらのフレームワーク領域は、アクセプターフレームワーク領域と比較して、合計で、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のアミノ酸置換を含み得る。
【０１８９】
適切に、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、単離及び／又は精製され得る。一部の実施態様では、これらのポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。
【０１９０】
用語「単離されたポリヌクレオチド」は、その分子が、その通常の若しくは天然の環境から除去若しくは分離されている、又はその通常の若しくは天然の環境中にその分子が存在しないような方法で産生されたことを示す意図である。一部の実施態様では、これらのポリヌクレオチドは、精製されたポリヌクレオチドである。精製されたという用語は、少なくとも一部の夾雑する分子又は物質が除去されていることを示す意図である。
【０１９１】
適切に、これらのポリヌクレオチドは、実質的に精製されており、その結果、関連のポリヌクレオチドは、組成物中に存在する支配的な（即ち、最も豊富な）ポリヌクレオチドを構成する。
【０１９２】
（Ｂ）ポリヌクレオチドの発現
以下の説明は、ポリペプチドコード化ポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換又はトランスフェクトされた細胞を培養することによるポリペプチドの産生に主に関する。当然、当該技術分野で周知である代替的方法がポリペプチドを調製するために使用され得ることが企図される。例えば、適切なアミノ酸配列又はその部分は、固相技術を使用する直接的ペプチド合成によって産生され得る（例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)を参照のこと）。インビトロタンパク質合成は、手動技術を使用して、又は自動化によって、実施され得る。自動化された合成は、製造者の指示を使用して、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）を使用して達成され得る。ポリペプチド種々の部分が、別々に化学合成され得、所望のポリペプチドを産生するために、化学的方法又は酵素的方法を使用して組み合わされ得る。
【０１９３】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ポリペプチドの産生のために発現ベクター（一又は複数）中に挿入される。用語「制御配列」とは、特定の宿主生物における動作可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。制御配列には、プロモーター（例えば、天然に関連する又は異種のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント及び転写終結配列が含まれるがこれらに限定されない。
【０１９４】
ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチド配列と機能的に関連するように配置される場合、「動作可能に連結される」。例えば、プレ配列若しくは分泌リーダーについての核酸は、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドについての核酸に動作可能に連結される；プロモーター若しくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合、コード配列に動作可能に連結される；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置付けられる場合、コード配列に動作可能に連結される。一般に、「動作可能に連結された」とは、結合されている核酸配列が近接すること、及び分泌リーダーの場合、近接しかつ読み取り相（reading phase）にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、近接している必要はない。結合は、簡便な制限部位におけるライゲーションによって達成される。かかる部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、従来の実務に従って使用される。
【０１９５】
抗体について、軽鎖及び重鎖は、同じ又は異なる発現ベクターにおいて、クローニングされ得る。免疫グロブリン鎖をコードする核酸セグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター（一又は複数）において、制御配列に動作可能に連結される。
【０１９６】
ポリヌクレオチド配列（例えば、可変重鎖及び／又は可変軽鎖コード配列並びに任意選択的発現制御配列）を含むベクターは、細胞宿主の型に依存して変動する周知の方法によって、宿主細胞中に移行され得る。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核細胞について一般に使用されるが、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、微粒子銃又はウイルスベースのトランスフェクションは、他の細胞宿主について使用され得る（一般には、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 第2版, 1989を参照のこと）。哺乳動物細胞を形質転換するために使用される他の方法には、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション及びマイクロインジェクションの使用が含まれる。トランスジェニック動物の産生について、導入遺伝子は、受精した卵母細胞中にマイクロインジェクションされ得る、又は胚性幹細胞のゲノム中に取り込まれ得、かかる細胞の核は、除核された卵母細胞中に移行され得る。
【０１９７】
（Ｃ）ベクター
用語「ベクター」には、発現ベクター及び形質転換ベクター及びシャトルベクターが含まれる。
【０１９８】
用語「発現ベクター」とは、インビボ又はインビトロでの発現が可能なコンストラクトを意味する。
【０１９９】
用語「形質転換ベクター」とは、１つの実体から別の実体−これらは、その種のものであってもよく、又は異なる種のものであってもよい−へと移行されることが可能なコンストラクトを意味する。このコンストラクトが、１つの種から別の種−例えば、大腸菌プラスミドから細菌、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）へと移行されることが可能である場合、この形質転換ベクターは、時折、「シャトルベクター」と呼ばれる。この形質転換ベクターは、大腸菌プラスミドからアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）へ、植物へと移行されることが可能なコンストラクトでさえあり得る。
【０２００】
ベクターは、ポリペプチドの発現を提供するために、以下に記載される適切な宿主細胞中に形質転換され得る。種々のベクターが、公に入手可能である。このベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子又はファージの形態であり得る。適切な核酸配列が、種々の手順によってベクター中に挿入され得る。一般に、ＤＮＡは、当該技術分野で公知の技術を使用して、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（一又は複数）中に挿入される。これらの成分のうち１又は複数を含む適切なベクターの構築は、当業者に公知の標準的なライゲーション技術を使用する。
【０２０１】
これらのベクターは、例えば、複製開始点、任意選択的に、このポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、及び任意選択的に、このプロモーターの制御因子が提供された、プラスミド、ウイルス又はファージベクターであり得る。ベクターは、当該技術分野で周知である１又は複数の選択マーカー遺伝子を含み得る。
【０２０２】
これらの発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡの一体的な一部としてのいずれかで、宿主生物中で複製可能である。
【０２０３】
（Ｄ）宿主細胞
宿主細胞は、例えば、細菌、酵母若しくは他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞であり得る。
【０２０４】
遺伝子操作されたトランスジェニック多細胞宿主生物が、ポリペプチドを産生するために使用され得る。この生物体は、例えば、トランスジェニック哺乳動物生物（例えば、トランスジェニックヤギ又はマウス系統）であり得る。
【０２０５】
適切な原核生物には、真正細菌、例えば、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、大腸菌などの腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）が含まれるがこれらに限定されない。大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ  ５３，６３５）などの種々の大腸菌株が、公に利用可能である。他の適切な原核生物宿主細胞には、腸内細菌科、例えば、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば、大腸菌、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウイニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えば、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属、例えば、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）及びシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）並びに桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、バチルス・リケニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えば、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。これらの例は、限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、１つの特に好ましい宿主又は親宿主であるが、それは、これが、組換えポリヌクレオチド産物発酵のための一般的な宿主株だからである。好ましくは、この宿主細胞は、最少量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、宿主にとって内因性のポリペプチドをコードする遺伝子において遺伝子突然変異をもたらすように修飾され得、かかる宿主の例には、完全遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎ’を有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）；完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎ’を有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失突然変異を有する株３７Ｄ６である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；並びに変異体周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株が含まれる。あるいは、クローニングのインビトロ方法、例えば、ＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が、適切である。
【０２０６】
これらの原核生物宿主では、宿主細胞と適合性の発現制御配列（例えば、複製開始点）を典型的に含む発現ベクターを作製することができる。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、又はファージラムダ由来のプロモーター系などの、いくつかの種々の周知のプロモーターが存在する。これらのプロモーターは、典型的には、任意選択的にオペレーター配列と共に、発現を制御し、転写及び翻訳を開始及び完了するために、リボソーム結合部位配列などを有する。
【０２０７】
真核微生物が、発現のために使用され得る。真核微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、一般的に使用される下等真核宿主微生物である。他には、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、例えば、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４）、クルイベロミセス・フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、クルイベロミセス・ブルガリカス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、クルイベロミセス・ウィッカーハミー（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、クルイベロミセス・ワルティ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、クルイベロミセス・ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、クルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びクルイベロミセス・マルシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）など；ヤロウィア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ  ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・レーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シュワニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えば、シュワニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；並びに糸状菌、例えば、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）など、及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びクロアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）が含まれる。メチロトローフ酵母が、本明細書で適切であり、これには、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ属、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）及びロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）からなる属より選択されるメタノール上での増殖が可能な酵母が含まれるがこれらに限定されない。サッカロミセス属が好ましい酵母宿主であり、適切なベクターは、所望により、発現制御配列（例えば、プロモーター）、複製開始点、終結配列などを有する。典型的なプロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及び他の解糖酵素が含まれる。誘導性酵母プロモーターには、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムＣ、並びにマルトース及びガラクトース利用を担う酵素由来のプロモーターが含まれる。
【０２０８】
微生物に加えて、哺乳動物組織細胞培養物もまた、本明細書に記載されるポリペプチドを発現及び産生するために使用され得、一部の例では好ましい（Winnacker, From Genes to Clones VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)を参照のこと）。一部の実施態様について、真核細胞が好ましい可能性があるが、それは、異種ポリペプチド（例えば、インタクトな免疫グロブリン）を分泌することが可能ないくつかの適切な宿主細胞株が、当該技術分野で開発されているからであり、それには、ＣＨＯ細胞株、種々のＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくは、骨髄腫細胞株、又は形質転換されたＢ細胞若しくはハイブリドーマが含まれる。一部の実施態様では、この哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【０２０９】
一部の実施態様では、この宿主細胞は、脊椎動物宿主細胞である。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓株（懸濁培養における増殖のためにサブクローニングされた２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ又はＣＨＯ−ＤＰ−１２株）；マウスセルトリ細胞；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；ｂｕｆｆａｌｏラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝がん株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２１０】
Ｖ．例示的実施態様
一部の実施態様では、本発明は、以下を提供する：
【０２１１】
１．再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、ａ）該材料に、２材料容積以上の溶出バッファーを通過させる工程であって、該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．９である、工程、ｂ）約１０分間から約３０分間までの範囲の時間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持する工程、ｃ）該材料に、約２材料容積以上の溶出バッファーを通過させる工程、及びｄ）該材料に、約２材料容積以上の再生バッファーを通過させる工程であって、該再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である、工程を含む、方法。
【０２１２】
２．再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、ａ）該材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．９である、工程、ｂ）約３０分間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持する工程、ｃ）該材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、及びｄ）該材料に、約４材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、該再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である、工程を含む、方法。
【０２１３】
３．再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、ａ）該材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．９である、工程、ｂ）約３０分間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持する工程、ｃ）該材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、及びｄ）該材料に、約２．５材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、該再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である、工程、ｅ）約３０分間にわたって、再生バッファー中で該材料を静的に保持する工程、ｆ）該材料に、約２．５材料容積の再生バッファーを通過させる工程を含む、方法。
【０２１４】
４．再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、ａ）該材料に、約２材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程であって、該平衡化バッファーは、約２５ｍＭのトリス及び約２５ｍＭのＮａＣｌを含み、約ｐＨ７．１である、工程、ｂ）約３０分間にわたって、平衡化バッファー中で該材料を静的に保持する工程、ｃ）該材料に、約２材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程、ｄ）該材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．８である、工程、ｅ）約３０分間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持する工程、ｆ）該材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、ｇ）該材料に、約２材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、該再生バッファーは、０．１ＮのＮａＯＨを含み、ｐＨ１３である、工程、ｈ）約３０分間にわたって、再生バッファー中で該材料を静的に保持する工程、ｉ）該材料に、約２材料容積の再生バッファーを通過させる工程を含む、方法。
【０２１５】
５．再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、ａ）該材料に、約４材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程であって、該再平衡化バッファーは、約２５ｍＭのトリス及び約２５ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨ７．１である、工程、ｂ）６サイクルの、ｉ）該材料に、約３材料容積の溶出バッファーを通過させること、ここで該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．８である；ｉｉ）約１０分間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持すること；ｉｉｉ）該材料に、約１材料容積の溶出バッファーを通過させること；ｉｖ）該材料に、約３材料容積の再生バッファーを通過させること、ここで該再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である；ｖ）約１０分間にわたって、再生バッファー中で該材料を静的に保持すること；ｖｉ）該材料に、約１材料容積の再生バッファーを通過させること
を含む工程を実施する工程を含む、方法。
【０２１６】
６．再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、６サイクルの、ａ）該材料に、約３材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．８である、工程、ｂ）約１５分間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持する工程、ｃ）該材料に、約１材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、ｄ）該材料に、約３材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、該再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である、工程、ｅ）約１５分間にわたって、再生バッファー中で該材料を静的に保持する工程、ｆ）該材料に、約１材料容積の再生バッファーを通過させる工程、ｇ）該材料に、約３材料容積の貯蔵バッファーを通過させる工程であって、該貯蔵バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約２％のベンジルアルコールを含み、約ｐＨ５．０である、工程、ｅ）約１５分間にわたって、貯蔵バッファー中で該材料を静的に保持する工程、ｆ）該材料に、約１材料容積の貯蔵バッファーを通過させる工程を含む、方法。
【０２１７】
７．前記クロマトグラフィー材料が、クロマトグラフィーカラム中に存在する、実施態様１から６の何れか一項に記載の方法。
【０２１８】
８．前記クロマトグラフィー材料が、アフィニティー材料である、実施態様１から７の何れか一項に記載の方法。
【０２１９】
９．前記アフィニティー材料が、プロテインＡアフィニティー材料である、実施態様８に記載の方法。
【０２２０】
１０．前記プロテインＡアフィニティー材料が、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ材料、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ材料又はＭＡｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ材料である、実施態様９に記載の方法。
【０２２１】
１１．前記クロマトグラフィー材料が、ポリペプチドの大規模産生のために使用される、実施態様１から１０の何れか一項に記載の方法。
【０２２２】
１２．再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、ａ）該材料に、約３材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程であって、該平衡化バッファーは、約４０ｍＭの酢酸ナトリウムを含み、約ｐＨ５．５である、工程、ｂ）該材料に、約２材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程、ｃ）約１０分間にわたって、約０．５ＮのＮａＯＨ中で該材料を静的に保持する工程、ｄ）該材料に、約１材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程、及びｅ）約１０分間にわたって、約０．５ＮのＮａＯＨ中で該材料を静的に保持する工程、ｆ）該材料に、約１材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程を含む、方法。
【０２２３】
１３．前記クロマトグラフィー材料が、クロマトグラフィーカラム中に存在する、実施態様１２に記載の方法。
【０２２４】
１４．前記クロマトグラフィー材料が、イオン交換材料である、実施態様１２又は１３に記載の方法。
【０２２５】
１５．前記イオン交換材料が、陽イオン交換材料である、実施態様１４に記載の方法。
【０２２６】
１６．前記陽イオン交換材料が、ＰＯＲＯＳ  ＨＳ５０材料である、実施態様１５に記載の方法。
【０２２７】
１７．前記クロマトグラフィー材料が、抗体の大規模産生のために使用される、実施態様１２から１６の何れか一項に記載の方法。
【０２２８】
１８．再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、ａ）該材料に、約３材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程であって、該平衡化バッファーは、約５０ｍＭのトリス、８５ｍＭの酢酸ナトリウムを含み、約ｐＨ８．８及び約８．６ｍＳ／ｃｍである、工程、ｂ）該材料に、約２材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程、ｃ）約１０分間にわたって、約０．５ＮのＮａＯＨ中で該材料を静的に保持する工程、ｄ）該材料に、約１材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程、及びｅ）約１０分間にわたって、約０．５ＮのＮａＯＨ中で該材料を静的に保持する工程、ｆ）該材料に、約１材料容積の約０．５ＮのＮａＯＨを通過させる工程を含む、方法。
【０２２９】
１９．前記クロマトグラフィー材料が、クロマトグラフィーカラム中に存在する、実施態様１８に記載の方法。
【０２３０】
２０．前記クロマトグラフィー材料が、イオン交換材料である、実施態様１８又は１９に記載の方法。
【０２３１】
２１．前記イオン交換材料が、陰イオン交換材料である、実施態様２０に記載の方法。
【０２３２】
２２．前記陰イオン交換材料が、ＱＳＦＦ材料である、実施態様２１に記載の方法。
【０２３３】
２３．前記クロマトグラフィー材料が、抗体の大規模産生のために使用される、実施態様１８から２２の何れか一項に記載の方法。
【０２３４】
２４．前記バッファーが、前記材料を、約３０材料容積／時間、約２０材料容積／時間又は約１５材料容積／時間で通過する、実施態様１から２３の何れか一項に記載の方法。
【０２３５】
２５．前記バッファーが、前記材料を、ダウンフロー方向又はアップフロー方向で通過する、実施態様１から２４の何れか一項に記載の方法。
【０２３６】
２６．前記クロマトグラフィー材料を浄化した後にモック溶出を実行することによって、前記クロマトグラフィー材料の浄化が測定される、実施態様１から２５の何れか一項に記載の方法。
【０２３７】
２７．前記モック溶出の溶出剤が＜０．２５ｍｇ／ｍＬの総タンパク質、＜１ｐｐｍのＩｇＧ断片、＜１ｐｐｍの浸出されたプロテインＡ、＜１μｇ／ｍＬのＣＺＥ  ＬＩＦ、＜１ｐｐｍのＣＨＯＰ及び＜１ｐｇ／ｍＬのＣＨＯ  ＤＮＡのうち１又は複数を含むことが、多産物使用に関して前記材料の有効な浄化の指標である、実施態様２６に記載の方法。
【０２３８】
２８．前記クロマトグラフィー材料が、アルカリ中で安定である、実施態様１から２７の何れか一項に記載の方法。
【０２３９】
２９．前記クロマトグラフィー材料が、ポリペプチドを精製するために使用される、実施態様１から２８の何れか一項に記載の方法。
【０２４０】
３０．前記クロマトグラフィー材料が第１のポリペプチドの精製後に浄化され、浄化の後、該クロマトグラフィー材料が２のポリペプチドを精製するために使用される、実施態様１から２９の何れか一項に記載の方法。
【０２４１】
３１．前記ポリペプチドが、抗体又はイムノアドヘシンである、実施態様３０に記載の方法。
【０２４２】
３２．前記ポリペプチドがイムノアドヘシンである、実施態様３１に記載の方法。
【０２４３】
３３．前記ポリペプチドが抗体である、実施態様３１に記載の方法。
【０２４４】
３４．前記抗体が、モノクローナル抗体である、実施態様３３に記載の方法。
【０２４５】
３５．前記モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、実施態様３４に記載の方法。
【０２４６】
３６．前記モノクローナル抗体が、ＩｇＧモノクローナル抗体である、実施態様３５に記載の方法。
【０２４７】
３７．前記抗体が、抗原結合性断片である、実施態様３６に記載の方法。
【０２４８】
３８．前記抗原結合性断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、ジ−ｓｃＦｖ、ビ−ｓｃＦｖ、タンデム（ジ、トリ）−ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｄＡｂ、三機能性抗体、ＢｉＴＥ、ダイアボディ又はトリアボディである、実施態様３７に記載の方法。
【０２４９】
３９．前記ポリペプチドが、酵素、ホルモン、融合タンパク質、Ｆｃ含有タンパク質、イムノコンジュゲート、サイトカイン又はインターロイキンである、実施態様３８に記載の方法。
【０２５０】
４０．前記第１のポリペプチドが、第１の抗体又は第１のイムノアドヘシンであり、前記第２のポリペプチドが、第２の抗体又は第２のイムノアドヘシンである、実施態様３０に記載の方法。
【０２５１】
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わされ得る。本明細書に開示される各特徴は、同じ、等価な又は類似の目的を果たす代替的特徴によって置き換えられ得る。従って、明示的に特記しない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の等価な又は類似の特徴の一例に過ぎない。
【０２５２】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的な実施例によって示される。本明細書中の全ての参考文献の開示は、本明細書に参照により明示的に援用される。
【実施例】
【０２５３】
以下の実施例は、純粋に本発明の例示であることを意図し、従って、本発明を限定すると決してみなすべきではない。以下の実施例及び詳細な説明は、例示として提供されるのであって、限定としてではない。
【０２５４】
実施例１
タンパク質キャリーオーバー
この実施例は、試料から試料へのタンパク質キャリーオーバーを定量化する試みを記載する。浄化前試験実行を、標準的プロテインＡアフィニティー材料（０．６６×２０ｃｍ）を使用して実験室規模で実施した。このプロセスは、ロードサイクルを平衡化バッファーでシミュレートしたこと以外、標準的精製手順に従って実行したので、この実行を「モック実行」と呼んだ。典型的プロテインＡプロセスにより、溶出プールを収集し、解析して、タンパク質の存在を決定した。この解析により、２０−３０ｐｐｍのタンパク質キャリーオーバーが、任意のさらなるカラム浄化の非存在下で「モック溶出」において存在したことが明らかになった。結果を２回目の実行で確認した。
【０２５５】
安全なキャリーオーバーレベルを決定するために、リスク評価を実施して、ｍＡｂにおける許容される免疫グロブリン（ＩｇＧ）及びタンパク質キャリーオーバーレベルを決定し、ＩｇＧについての物質特異的一日曝露許容量（ＡＤＥ）を計算した。ＡＤＥとＥＤＩとの比較は、「最悪の」ｘ倍安全域を生じる（例えば、OCTAGAM（登録商標）；Product Approval Information Summary Basis of Approval OCTAGAM（登録商標）5%。ワールドワイドウェブ上の、2012年8月7日にアクセスされたfda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ApprovedProducts/LicensedProductsBLAs/FractionatedPlasmaProducts/ucm064955.pdfに記載された、OCTAPHARMA Pharmazeutika: Vienna, Austria. 2002年8月を参照のこと）。この「最悪の」安全域は、前の試料から入った最も高い値のＩｇＧキャリーオーバーであり、この値は、１０μｇ  ｍＡｂ  Ａ／ｍｌ  ｍＡｂ  Ｂ又は１０００ｐｐｍに設定される。このとき、ｍＡｂ  Ａは、キャリーオーバーされたｍＡｂであり、ｍＡｂ  Ｂは、目的の所望のｍＡｂである（Teschner, W.等, Vox Sang. 2007, 92:42-55; 食品医薬品局, HHS. Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. Rockville, MD. 2005年7月、ワールドワイドウェブ上の、2012年8月7日にアクセスされたgoogle.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0CE8QFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.fda.gov%2Fdownloads%2FDrugs%2F...%2FGuidances%2FUCM078932.pdf&ei=f4QhUJv4K9Ov6gGQ-4DgAg&usg=AFQjCNFbTE75U0nDbFpfdpxK85uWXT8frgに記載; European Medicines Agency. Impurities: Residual Solvents, Note for Guidance on Impurities: Residual Solvents (CPMP/ICH/283/95). London, UK 1997年9月、ワールドワイドウェブ上の、2012年8月7日にアクセスされたema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/regulation/general/general_content_000431.jsp&mid=WC0b01ac0580029593に記載; OCTAGAM（登録商標）; Product Approval Information Summary Basis of Approval OCTAGAM（登録商標）5%. OCTAPHARMA Pharmazeutika: Vienna, Austria. 2002年8月、ワールドワイドウェブ上の、2012年8月7日にアクセスされたfda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ApprovedProducts/LicensedProductsBLAs/FractionatedPlasmaProducts/ucm064955.pdfに記載）。
【０２５６】
材料及び方法
設備
ＡＫＴＡエクスプローラー１００システム：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）の標準的ＡＫＴＡエクスプローラー１００クロマトグラフィーシステムを、実験に使用した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡ媒体を充填した０．６６ｃｍ直径×２０ｃｍ床高さカラム（Ｏｍｎｉｆｉｔ）を、システム評価に使用した。このシステムを、ＵＮＩＣＯＲＮソフトウェア（ｖ５．１１）を使用して制御した。アフィニティー樹脂：ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を、このプロジェクトにおいて選択された樹脂として使用したが、それは、これが、剛性ハイフローアガロースマトリックス及びアルカリ安定化プロテインＡ由来リガンドから構成されているからである。このリガンドは、定置浄化（ＣＩＰ）プロトコールにおいて使用されるアルカリ条件下で従来のプロテインＡベースの媒体よりも高い安定性を提供する。浄化は、プロセスの倹約を助け得る水酸化ナトリウムなどのコスト効率の高い試薬を用いて実施され得る。
【０２５７】
標準的精製手順（「モック溶出」）。プロテインＡサイクルを、以下のパラメーターを使用して実行した：（ａ）３０ｇ／Ｌ樹脂のロード能力で、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ樹脂、（ｂ）回収された細胞培養液（ＨＣＣＦ）を、０．６６×２０ｃｍカラム上に１５℃（１２−１８℃）でロードした（全ての他の相は室温）、（ｃ）プールのｐＨを、１．５Ｍトリス塩基の添加によってｐＨ５．０に調整した。使用したバッファーは、バッチプロセスに使用したバッファーと類似であった。カラムを、２５ｍＭのトリス及び２５ｍＭの塩化ナトリウムで平衡化し、０．４Ｍのリン酸カリウムで洗浄し、０．１Ｎの酢酸（ｐＨ２．９）で溶出させ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅについて０．１Ｎの水酸化ナトリウムで再生させた（Fahrner, R. L.等, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2001, 18:301-327；Fahrner, R. L.等, Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 30:121-128；B. Kelley, Biotechnol. Prog. 2007, 23:995-1008；Trexlar-Schmidt, M.等, Biopharm. Intl. March 2, 2009）。
【０２５８】
バッファー
以下のバッファーを使用した：
溶出バッファー：０．１５Ｍの酢酸、ｐＨ２．９
再生バッファー：０．１ＭのＮａＯＨ、ｐＨ１３
平衡化バッファー：２５ｍＭのトリス、２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１
貯蔵バッファー：１００ｍＭの酢酸ナトリウム、２％ベンジルアルコール、ｐＨ５．０
【０２５９】
浄化戦略。
浄化手順を、２０ＣＶ／時間の流速で実施する。この浄化手順は、２つの因子（ａ）ｐＨサイクリング及び（ｂ）静的保持時間に基づいて開発した。
【０２６０】
さらなる浄化なしの「モック実行」において得られた浄化前キャリーオーバー結果（２０−３０ｐｐｍ）は、リスク評価によって設定した１０００ｐｐｍの確立された安全性限界を十分に下回った。しかし、臨床的製造のための限界は１０００ｐｐｍよりも低いので、慎重すぎるほど慎重になることを決定した。このプロジェクトの目的は、臨床的製造に移行することができる浄化手順を開発することであった；従って、キャリーオーバーを１ｐｐｍ未満まで最小化するための浄化手順を同定した。注意深い最適化の後、最適な浄化戦略は、（ａ）静的保持及び（ｂ）ｐＨサイクリングに基づいた。浄化プロセスにおける静的保持手順の追加は、追加のバッファーを使用することなく、追加の滞留時間を可能にした。増加した滞留時間は、物質移動を助ける可能性が高く、カラム上の任意の残留タンパク質をバッファー中に抽出するように効率的に機能する。ｐＨサイクリングと呼ばれる、酸性バッファーと塩基性バッファーとの間の交互変化は、タンパク質抽出を増強し、従って、カラムを効率的に洗浄する。最適な浄化条件は、溶出バッファー及び再生バッファーとして既に使用されたバッファーを含んだ。「溶出バッファー」は、０．１５ＭのＡｃＯＨ（ｐＨ２．９）であり、浄化のための「再生バッファー」は、０．１ＮのＮａＯＨ（ｐＨ１３）であった。バッファーの選択は、そのそれぞれの特性に基づいた。例えば、「溶出バッファー」（０．１５ＭのＡｃＯＨ、ｐＨ２．９）を使用して、結合したＩｇＧをプロテインＡ樹脂から洗浄した。水酸化ナトリウムは、タンパク質の変性及び小さい断片への切断によって、タンパク質及び核酸（産生プロセスの全ての成分）を可溶化する。さらに、水酸化ナトリウムは、エンドトキシンを破壊し、樹脂を再生させる。これらの条件のいずれも、樹脂と不適合性でなく、社内ｍＡｂの精製のために既に使用されなかったので、それらの使用は、経済的でもあった。
【０２６１】
樹脂選択
大きい作業ｐＨ範囲（ｐＨ３−１２）を有するので、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅプロテインＡアフィニティー樹脂を最適化のために選択したが、これは、結合能の喪失なしに、塩基性条件下で安定である。従って、この樹脂は、浄化のための現行の溶出（０．１５ＭのＡｃＯＨ）バッファー及び再生（０．１ＮのＮａＯＨ）バッファーと適合性であった。
【０２６２】
他の樹脂、例えば、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）ｖＡは、以前に調査された。簡潔に述べると、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）ｖＡカラムを浄化するために、いくつかの異なる浄化剤を調査した。しかし、条件の大部分は、類似の性能を示した。標準的精製手順において概要を述べたような、種々のバッファーのスクリーニングとその後の逐次的な「モック実行」とは、試料から試料へのタンパク質キャリーオーバーの減少を生じた。増加した溶出流速もまた、カラムを効率的に浄化した。この研究の主要な知見は、静的保持及びｐＨサイクリングが、試験した他の変数と比較して、タンパク質キャリーオーバーの低減により顕著に寄与したことであった。浄化手順の一部は、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）ｖＡ上でのタンパク質キャリーオーバーを低減させたが、この低減は、パイロット規模又はより大きい規模でのその使用を保証するには十分でなかった。それにもかかわらず、ｐＨサイクリング及び静的保持実験からの結果は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ樹脂での浄化手順の最適化において有用であると証明された。
【０２６３】
解析方法
ＨＣＣＦの抗体濃度を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）で２．１×３０ｃｍ  ＰＯＲＯＳカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して決定した。バッファーＡ（１００ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．３）、バッファーＢ（２％酢酸、１００ｍＭグリシン）及びバッファーＣ（０．１Ｍリン酸、２０％ＣＡＮ（２０％アセトニトリル））を使用し、総実行時間は４．５分間であった。精製されたプール中のタンパク質濃度を、２８０ｎｍでＡｇｉｌｅｎｔ  ８４５３（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）分光光度計を使用して測定した。多産物酵素結合免疫吸着法を、ＣＨＯＰ及び浸出されたＰｒｏＡの解析に使用した。ＴａｑＭａｎポリメラーゼ連鎖反応を、ＣＨＯ  ＤＮＡ解析に使用した。総タンパク質を、キャピラリーゾーン電気泳動／レーザー誘起蛍光検出（ＣＺＥ−ＬＩＦ）アッセイを使用して測定した。インタクトな抗体及び断片化された抗体部分を、一般的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥを、１８％トリス−ＨＣｌゲル上で実施した。
【０２６４】
浄化なしのタンパク質キャリーオーバーの定量化
ｍＡｂキャリーオーバーの決定のための実験プロトコールは、以下の通りである：第１に、１８ロードサイクルのｍＡｂを、３０ｇ／ＬでプロテインＡアフィニティーカラム（０．６６×２０ｃｍ、容積＝６．８ｍＬ）上にロードし、試料を溶出させた。プロテインＡアフィニティーカラムを、表２に概要を述べたカラム浄化手順の１つに従って、引き続いて浄化した。浄化後、「モック実行」を実施した。タンパク質又は不純物のキャリーオーバーのレベルを決定するために、解析的試料を、特定の時点において「モック実行」の間に、又はカラム洗浄手順の間に、採取した。収集した解析的試料を、ｐＨ５−５．５に調整し（１．５Ｍトリス塩基バッファー）、次いで、洗剤（０．１％ポリソルベート、０．０５％アジ化ナトリウム）で処理して、タンパク質表面接着（これは偽陰性結果を生じるので）を防止した。
【０２６５】
第１の実験において、溶出プール中のキャリーオーバーを、間欠性の浄化なしにＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅプロテインＡカラム上で順次的に精製された３つの異なるｍＡｂ（ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢ及びｍＡｂＣ）について最初に決定した。３回の精製サイクルを、プロテインＡアフィニティーカラム（０．６６×２０ｃｍ、容積＝６．８ｍＬ）上に３０ｇ／Ｌでロードし、結果を（図１）に示す。データは、溶出の関数として、前の実行からキャリーオーバーされたインタクトなＩｇＧタンパク質の量（ｎｇキャリーオーバー／ｍｇ産物）としてグラフ化される。間欠性の浄化なしのグラフによれば、３回のロードサイクルの最も高いキャリーオーバーは、３０−４０ｐｐｍであった（図１）。これらの結果は、明らかに、タンパク質キャリーオーバーを１ｐｐｍ未満に留めるためには、さらなる浄化サイクルがカラムをリサイクルするために必要とされることを示した。
【０２６６】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ浄化手順（ＣＰ）の最適化
バッファー消費及び浄化時間を低減させることによって浄化手順を単純化するための試みにおいて、バッファー及び実行時間の異なる組み合わせを調査した（表２、エントリー１−３）。キャリーオーバーのレベルは、１ｐｐｍの限界より下には決して下がらなかったので、より厳格な浄化手順が、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅカラム上での実験室規模のリサイクルのために同定される必要があることが明らかであった。より厳格な浄化条件は、静的保持の追加を含み、このとき、カラムは、バッファー中で規定された期間にわたって保持し、ゼロフローで実行した（表２、エントリー４−５）。静的保持は、バッファーでフラッシングするよりも、樹脂からより多くのタンパク質を効率的に洗浄除去したことが見出された。静的保持は、溶出バッファー静的保持の後にカラムから洗浄除去されたインタクトなＩｇＧの量を効率的に５倍増加させ、インタクトなＩｇＧは、再生バッファー静的保持後には検出されなかった（図２）。さらに、キャリーオーバーの量は、「モック溶出」において、エントリー４について１０ｐｐｍ未満のインタクトなＩｇＧまで顕著に低減され（表２）、１ｐｐｍ未満のインタクトなＩｇＧが、エントリー５についてキャリーオーバーされる（表２）。
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2019094334.tif 000005
【０２６７】
エントリー６−７で調査した、静的保持時間と共に浄化の回数の増加（表２）。明らかに、さらなる浄化サイクルを伴う静的保持時間は、全ての他の以前に調査した条件よりも、樹脂をより効率的に浄化した。その結果、「モック実行」を実施した後、エントリー６について３ｐｐｍ未満のキャリーオーバー（表２）及びエントリー７について０．３ｐｐｍ未満のキャリーオーバー（表２）が検出された（表２、図３）。ｐＨサイクルの増加は、鋭いｐＨ変遷の間に、より多くのタンパク質を溶出させた。しかし、０．１ＮのＮａＯＨでの凝集時間は、樹脂結合能にとって有害であり得る長い静的保持と共に、サイクルの数を増加させることによって増加される。タンパク質の大部分は、３０分間及び１０分間の両方の静的保持時間について１回目のサイクル（図３）の後に溶出されるので、追加の静的保持時間は、限定的なさらなる利益を有した。しかし、増加したサイクルを伴うより短い静的保持時間が、より長い保持時間よりも好ましかった。ＥＬＩＳＡアッセイに加えて、キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム解析（ＣＥ−ＳＤＳ）を実施して、浄化サイクルを介した断片クリアランスを確実にした。９４ｎｇ／ｍＬの「モック溶出」試料についてエントリー７で概要を述べた手順（表２）を使用したＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅカラムの浄化後の「モック溶出」のＣＥ−ＳＤＳ解析により、単離されたｍＡｂが９０％を超えて完全にインタクトであったことが明らかになった（図４）。
【０２６８】
エントリー７の浄化手順（表２）を使用する「概念実証」として、「モック溶出」のＡｋｔａクロマトグラム（精製実行の間に生成された）は、カラムの効率的な浄化が、溶出バッファー（０．１５Ｍの酢酸）から再生バッファー（０．１ＮのＮａＯＨ）へのシフトが行われたときに達成されたことを示唆した。これは、６サイクルの各々についてのこのｐＨサイクリングの間のＵＶ強度における一連のスパイクによって明らかであった（図５）。まとめると、ｐＨサイクリング及び静的保持は、理想的な浄化手順を提供する。
【０２６９】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ  Ｏｍｎｉｆｉｔカラム（０．６６×２０ｃｍ、容積＝６．７ｍＬ、３０ｇ／Ｌにおいて１８サイクルのＨＣＣＦ）上でのｍＡｂＡの精製のための実験室規模の最適化された浄化手順（エントリー７、表２）の拡大縮小は、実際に、タンパク質キャリーオーバーを最小化した（図６）。これらの結果は、明らかに、６サイクルの溶出バッファー（０．１５Ｍの酢酸）を使用してカラムを浄化した後、顕著に少ないインタクトなＩｇＧ又はＦｃ断片が、各サイクル後に検出され、その結果、サイクル６までに、５ｐｐｍ未満が検出されたことを実証している（図６）。同様に、さらに少ないインタクトなＩｇＧ及びＦｃ断片（＜１０ｐｐｍ）が、再生バッファー（０．１ＭのＮａＯＨ、図６）による６サイクルの洗浄の各々の後に検出された。さらに、「モック溶出」を実施したとき（事前溶出、事前再生及び事前平衡化後）までに、１ｐｐｍ未満のタンパク質キャリーオーバーが、「モック溶出」試料において検出された（図６）。
【０２７０】
浄化手順の最適化の過程の間に、少量のタンパク質が、貯蔵バッファー（１００ｍＭの酢酸ナトリウム、２％ベンジルアルコール、ｐＨ５．０）中での貯蔵の期間後に、カラムから外れた。この観察は、おそらく貯蔵バッファーが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ樹脂のための効率的な浄化バッファーとしても機能し得ることを示唆した。しかし、貯蔵バッファーによる間欠性のカラム浄化後の引き続く「モック実行」は、以前に最適化された条件（エントリー８、表２；図７）よりも効率的なカラム浄化を生じなかった。さらに、プロセスにおけるこの浄化バッファーの追加は、さらなる利益なしに、全体的プロセスをより長くした。従って、既存の最適化された浄化手順を用いて進行することを決定した。
【０２７１】
次いで、最適化された浄化手順（エントリー７、表２）を、目的のｍＡｂへとこの手順を拡張する前の最終試験として、ｍＡｂＺの精製のためにパイロット規模で遂行した（１４×２０、容積＝３．２３Ｌ）。これらの結果は、各浄化後に検出された漸減するインタクトなＩｇＧ及びＦｃで予測されたように有望であり、その結果、１ｐｐｍ未満のタンパク質キャリーオーバーが、「モック実行」の「モック溶出」において検出された。この特定のパイロット実行を、９回の精製サイクルで以前に使用されたＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅカラム上でｍＡｂＺと共に実施した（図８）。
【０２７２】
この浄化手順はとても有効であったので、合計５つのパイロット規模のカラムを、遂行後に浄化した。浸出されたプロテインＡ（浸出されたプロテインＡアッセイ）、（Zhu-Shimoni, J.等, J Immunol. Methods. 2009, 341:59-67）他のタンパク質（ＣＺＥ  ＬＩＦ−総タンパク質、アッセイ；D. Michels、（出版準備中）、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質（ＣＨＯＰアッセイ；Fahrner, R. L.等, Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 30:121-128）及びＤＮＡ（ＣＨＯ  ＤＮＡアッセイ；ＣＨＯ  ＤＮＡ解析に使用したＴａｑＭａｎポリメラーゼ連鎖反応）、抗体のＦｃ断片（ヒトＦｃ  ＥＬＩＳＡ；インタクトな抗体及び断片化された抗体部分を、一般的な社内開発したサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した）及び総抗体（インタクトなヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ；インタクトな抗体及び断片化された抗体部分を、一般的な社内開発したサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した）などの他の不純物の量を決定するための、これら全てのパイロット規模の試料のさらなる解析もまた実施して、このプロセスがパイロット規模で同様に機能したことを検証した（表３）。予測されるように、全ての検出された不純物は、許容される限界を十分に下回っており、この浄化手順は、ｍＡｂの精製に使用され得る（エントリー６、表３）。
2019094334.tif 000006
【０２７３】
結果
以前に最適化された延長された浄化条件（エントリー７、表２）を、さらなる研究のためにわずかに修飾し、１０分間の静的保持時間の代わりに、１５分間の静的保持時間を取り込んだ（図８）。樹脂を浄化するプロセス全体は、２０カラム容積（ＣＶ）／時間の流速で４．５時間かかり、これを６サイクル（６回）にわたって実行した。これらの条件は、カラムを効率的に洗浄するために、溶出バッファーと再生バッファーとの間でのｐＨサイクリング及び静的保持を含んだ。簡潔に述べると、この手順は図９に詳述される。プロセス全体は、樹脂を徹底的に浄化するために、合計６サイクル実行される。最後に、この樹脂を、平衡化バッファー（３ＣＶ）で洗浄し、その後、貯蔵バッファー（５ＣＶ、貯蔵バッファー）中で貯蔵した。樹脂浄化を効率的にモニタリングするために、試料を、１５分間の保持時間の後に収集して、各サイクルにおけるキャリーオーバーを解析し、どれだけ多くのタンパク質が各工程及び各サイクルにおいて樹脂から除去されたかを決定した（図９）。
【０２７４】
樹脂を浄化した後、「モック実行」を実施して、タンパク質キャリーオーバーを検証した（図９）。この「モック溶出」を収集し、アッセイして、キャリーオーバーの量及び他の不純物の存在を決定した（Zhu-Shimoni, J.等, J Immunol. Methods. 2009, 341:59-67; Fahrner, R. L.等, Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 30:121-128）。総タンパク質を、キャピラリーゾーン電気泳動／レーザー誘起蛍光検出（ＣＺＥ−ＬＩＦ）アッセイを使用して測定した（D. Michaels等、出版準備中）。ＴａｑＭａｎポリメラーゼ連鎖反応を、ＣＨＯ  ＤＮＡ解析のために使用した。インタクトな抗体及び断片化された抗体部分を、一般的なサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した。これらの他の不純物には、宿主細胞成分、タンパク質、ウイルス又はＤＮＡが含まれる。これらのアッセイには、ＥＬＩＳＡを使用するインタクトなヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）についての試験、別のＥＬＩＳＡにおけるヒトＦｃ断片についての試験、キャピラリーゾーン電気泳動／レーザー誘起蛍光検出アッセイ（ＣＺＥ／ＬＩＦ）を使用する任意の他のタンパク質についての試験、ＣＨＯＰアッセイにおけるチャイニーズハムスター卵巣タンパク質についての試験（Fahrner, R. L.等, Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 30:121-128）、及び浸出されたプロテインＡアッセイ（Zhu-Shimoni, J.等, J Immunol. Methods. 2009, 341:59-67）が含まれる。「インタクトなヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ」及び「ヒトＦｃ  ＥＬＩＳＡ」では、カラム上の抗体全体又は抗体断片の量が定量化される；ここで、前者は、断片抗原結合領域（Ｆａｂ）及び断片結晶化可能（Ｆｃ）領域の両方に結合し、後者は、ヒトＦｃ領域のみに結合する。ＣＺＥ−ＬＩＦアッセイは、試料中のタンパク質の総量を定量化することによって、これらの結果を確認できる。最後に、プロテインＡは、実行の間又は苛酷な浄化の間に樹脂から浸出でき、結合能に負の影響を与えることが公知であり、従って、浸出されたプロテインＡの量を決定することは重要である（Fahrner, R. L.等, Biotechnol. Appl. Biochem. 1999, 30:121-128; Kelley, B., Biotechnol. Prog. 2007, 23995-1008; D. Michaels, 出版準備中; Fahrner, R. L.等, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2001, 18:301-327）。
【０２７５】
浄化手順の効率を試験するために、目的のｍＡｂ、ｍＡｂＣを、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００を用いて、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅカラム（０．６６×２０ｃｍ、容積＝６．８ｍＬ）上で実験室規模で精製した（２．２に記載したとおり）。数回の浄化サイクルの間及びその後のタンパク質キャリーオーバーを測定したところ、結果は、タンパク質キャリーオーバーが各浄化サイクル後に減少したことを実証した（図１０）。引き続く「モック実行」におけるｍＡｂＣのインタクトなＩｇＧタンパク質及びＦｃ断片キャリーオーバーは、溶出バッファーによる１回目のサイクルにおける２５ｎｇ／ｍｇのインタクトなＩｇＧ及び３５ｎｇ／ｍｇのＦｃ断片から、溶出バッファーによる６回目のサイクルの後に、両方について５ｎｇ／ｍｇ未満まで減少した（図１０）。再生（溶出の後）の間及び後に、６回目のサイクルまでカラムから洗浄除去された、顕著により多くのインタクトなＩｇＧ及びＦｃ断片は、レベルが５ｎｇ／ｍｇ未満のキャリーオーバーまで累積的に減少するところまで達した。キャリーオーバーを試験するために、「モック実行」（浄化サイクル全体の後の実行）を実施し、さらなるＩｇＧ及びＦｃ断片を、事前再生においてカラムから洗浄除去し、「モック溶出」プロセスが開始するとき（このとき、第２のｍＡｂは、再使用プロセスにおいて外れると予測される）までに、１ｐｐｍ未満のＩｇＧ及びＦｃ断片が検出された（図１０）。まとめると、これらの結果は、これらの条件が有効な浄化条件であること、及び前の実行からキャリーオーバーされたタンパク質の総量が、この浄化手順を使用した後に樹脂を再使用した場合、１ｐｐｍ未満であることを確認する。
【０２７６】
１回のサイクル洗浄につきどの型のタンパク質断片が存在するかについてのより良い発想を得るために、各サイクル由来の試料を、１０％トリス−ＨＣｌゲル上で泳動した（ｍＡｂＣ）（図１１）（Trexlar-Schmidt, M.等, Biopharm. Intl.2009年3月2日）。サイクル１からサイクル６まで、より少ないタンパク質が、連続するサイクルそれぞれにおいて観察された（各レーンにおいて減少したバンド強度、図１１）。さらに、静的保持サイクル由来の試料を含むレーンは、サイクル１−６の間よりも濃縮され、より多くのタンパク質が、各静的保持サイクルの後に除去された。これらの結果は、延長された滞留時間が、カラムから残留タンパク質を除去するのを助けることを実証している。
【０２７７】
この最適化された浄化プロセスを、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅカラム（１３．８×２０、容積＝３Ｌ）上でのパイロット規模でのｍＡｂＸの精製に拡張した。それらの結果は、実験室規模で以前に見られた結果（図６）と類似していた。実験室規模の実行で見られたように、タンパク質不純物は、初期浄化段階において樹脂から除去され、それらの全体的濃度は、６回目のサイクルに達するまで、各溶出サイクル及び再生サイクルの後に減少する（図１２）。樹脂再生の間に、カラムから最初に洗浄除去されたタンパク質の量は、６回目のサイクルの後よりもかなり多く、その結果、６回目の再生サイクルに達するときまでに、１ｐｐｍ未満のタンパク質不純物が検出される（図１２）。
【０２７８】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅカラム（２０×２０、容積＝６．２８Ｌ）上でのｍＡｂＹの精製及び上記浄化プロトコールを用いた引き続くカラム浄化（図９）、その後の「モック実行」は、モック溶出における６回目の再生サイクル後に、１ｐｐｍ未満の浸出されたプロテインＡ、０．２５ｍｇ／ｍＬ（定量化の限界）未満のＣＺＥ−ＬＩＦ、０．５ｐｐｍ未満のＣＨＯＰ及び１．０ｐｇ／ｍＬ未満のＣＨＯ  ＤＮＡを生じた（表４）。全ての不純物は、歴史的データと匹敵し、許容される限界内であった。
2019094334.tif 000007
【０２７９】
最適化された浄化プロトコール（図９）の頑強性の最終試験において、１５３回の多産物ロードサイクルを以前に受けた６．２８ＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ樹脂を使用して、目的のｍＡｂを精製した。以前に使用した樹脂から「モック実行」中へのキャリーオーバー（エントリー１、表５）を、他の異なる３つのＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ樹脂から観察されたキャリーオーバーと比較した。これらの結果を、表５で概要を述べる。簡潔に述べると、古いＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ大規模多産物樹脂（エントリー１及び２、表５）は、新たなｍＡｂ特異的（多産物ではない）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ樹脂（エントリー３、表５）及び新たなｍＡｂ特異的実験室規模ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ樹脂（エントリー４、表５）と匹敵して挙動した。これらの結果によれば、全てのプロテインＡ樹脂は、匹敵するＣＨＯＰ、百分率凝集物及び浸出されたプロテインＡ（ｎｇ／ｍｇ）で、９０％よりも高い収量でｍＡｂを提供した。まとめると、多産物樹脂は、産物不純物プロファイル又は工程収量に対して負の影響を有さない。パイロット規模及び実験室規模の結果もまた、匹敵する（エントリー４、表５）。
【０２８０】
示された作業に加えて、いくつかのより多くのｍＡｂが、この手順を使用して浄化された多産物樹脂上で精製されている。これらの結果は、全て、非常に類似し再現性があり、総タンパク質レベルは０．２５ｐｐｍ（アッセイ検出限界）を下回った（表６）。これらの結果は、最適化された浄化手順が、多産物ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅプロテインＡ樹脂を浄化、再生、再使用及びリサイクルするための効率的で再現性のある頑強な方法であることを示唆している。間欠性のプロテインＡ樹脂浄化のためのＭＳＳＣＣＰ浄化手順の使用は、タンパク質キャリーオーバーを、確立された安全域を十分に下回るまで低減させる。
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【０２８１】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅプロテインＡ樹脂が、産物純度に対する影響及び又は樹脂結合能の喪失なしに、多産物精製に使用されるのを可能にする、高度に有効なＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ浄化方法が開発された。実験室並びにパイロット規模の実験からのデータは、６サイクルの、０．１５Ｍの酢酸（溶出バッファー）及び０．１Ｎの水酸化ナトリウム（再生バッファー）洗浄並びに１５分間の保持時間を含む浄化プロトコールが、この１回目のｍＡｂ浄化工程における５ｐｐｍ未満のタンパク質キャリーオーバーまで、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ樹脂を浄化することを示唆している。このプロセスは、パイロット規模で多産物プロテインＡ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ）上で首尾よく遂行され、この戦略の有用性のさらなる信用を与えた。
2019094334.tif 000009
【０２８２】
実施例２
多産物使用についてのイオン交換カラムの評価
研究を実施して、類似の浄化プロセスがイオン交換クロマトグラフィーのために開発できるかどうかを決定した。ＰｒｏＡプール由来のＭＡｂＡ及びＭＡｂＢを、陽イオン交換カラム（ＰＯＲＯＳ）又は陰イオン交換カラム（ＱＳＦＦ）上にロードした。通常の溶出後、カラムを、「モック溶出」に供した。画分を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅアッセイを使用して、ＭＡｂＡ及び／又はＭａｂＢの存在について解析し、検出限界は０．８２ｎｇ／ｍＬであった。図１３で見られるように、モック溶出結果は、これらのカラムのさらなる浄化の必要性を示した。
【０２８３】
以下の定置浄化（ＣＩＰ）手順を試験した。
Ｉ．    ３ＣＶの平衡化バッファー
ＩＩ．  ２ＣＶの０．５ＮのＮａＯＨ
１０分間の静的保持
ＩＩＩ．１ＣＶの０．５ＮのＮａＯＨ
１０分間の静的保持
ＩＶ．  １ＣＶの０．５ＮのＮａＯＨ
Ｖ．    浄化後モック実行
【０２８４】
試料を、低濃度の洗剤（０．１％ポリソルベート２０、０．０５％アジ化ナトリウム）で条件付けて、コンテナの壁に試料が固着することを防止した。試料を、カラム上にロードする前に、中性ｐＨに調整した。ＭＡｂＡ及びＭＡｂＢを、陽イオン交換カラム（ＰＯＲＯＳ）又は陰イオン交換カラム（ＱＳＦＦ）上にロードした。通常の溶出後、カラムを、上記プロトコールを使用して浄化した。第２のセットのカラムに、ＭＡｂＡ又はＭＡｂＢをロードしたが、溶出後、これらのカラムは、上記プロトコールを使用して浄化しなかった。次いで、全てのカラムを、「モック溶出」に供した。モック溶出液を、インタクトなＩｇＧの存在について解析し、ＥＬＩＳＡによって解析した。
【０２８５】
図１４に示すように、この浄化方法は、ＰＯＲＯＳカラムにおいてＭＡｂＡのタンパク質キャリーオーバーを顕著に低減させ（パネルＡ）、ＱＳＦＦカラムにおいてＭＡｂＢのタンパク質キャリーオーバーを顕著に低減させた（パネルＢ）。ＱＳＦＦカラムでは、ＣＩＰ工程なしであってもＭＡｂＡキャリーオーバーはほとんど見られず（パネルＡ）、ＰＯＲＯＳカラムでは、ＣＩＰ工程なしであってもＭＡｂＢキャリーオーバーはほとんど見られなかった（パネルＢ）。
【０２８６】
第３の抗体ＭＡｂＣを、ＰＯＲＯＳカラム及びＱＳＦＦカラムに適用し、浄化プロトコールの選択された工程の最後にカラムから溶出するインタクトなＩｇＧの量を測定したところ（図１５）、その結果、ＣＩＰサイクルの最後までに、タンパク質キャリーオーバーの量は、０．１ｐｐｍ未満であった。モック溶出プールにおけるタンパク質キャリーオーバーもまた、０．１ｐｐｍ未満であった。
【０２８７】
浄化プロトコールが大規模なイオン交換クロマトグラフィーカラムに対して有効であるかどうかを決定するために、この浄化プロトコールを、ＭＡｂＤが以前にロードされたパイロット規模のカラムに対して実施した。これらのカラムは、７．２２Ｌ  ＰＯＲＯＳ  ＨＳ５０カラム及び１．５７Ｌ  ＱＳＦＦカラムであった。ＭＡｂＤのローディング及び溶出の後、これらのカラムを、浄化することなしにモック平衡化し、次いで、モック溶出した。次いで、これらのカラムを、上記ＣＩＰプロトコールに従って浄化し、その後、さらなるモック平衡化及びモック溶出を行った。各工程由来の試料を取り出し、上記のようにインタクトなＩｇＧについて解析した。結果を図１６に示す。ＰＯＲＯＳ  ＨＳ５０カラム及びＱＳＦＦカラムの両方について、タンパク質キャリーオーバーは、約０．１ｐｐｍ未満であった。
【０２８８】
実施例３
多産物使用についてのＰｒｏＳｅｐ  Ａカラムの評価
異なる浄化溶液を、どの溶液が産物キャリーオーバーを低減させるにあたり最も有効であるかを評価するために、小規模で評価した。酸、カオトロープ、塩及び有機溶媒を含む、いくつかの異なるカテゴリーの溶液を試験した。この研究は、一般的なプロセス条件を最良に模倣するために、標準的プロテインＡ抗体プロセスに従うように設計したが、実際のプロセシング条件は、使用される特定の産物に依存して異なり得る。
【０２８９】
流れを、浄化サイクルを除く全てのプロセスについて、カラムを介してダウンフロー方向に方向付けた。浄化サイクルを通じて、流れを、最良の浄化シナリオを創出することを望んで、カラムを介して上方向に方向付けた。原料は、ローディングサイクルの間、下方向でカラムを介して方向付けられるので、プロテインＡカラムの上部は、理論的にはほとんどが詰まる。浄化サイクルの流れを上方向に方向付けることによって、カラムの上部に積みあがったキャリーオーバー及び他の不純物が、溶出する前に、カラム長全体を横切る必要はないというのが理論である。この研究の時点で、アップフローがカラムを浄化するにあたってダウンフローよりも有益であるかどうかは、明らかでなかった。このセクションの目的のために、全ての実験はアップフローを使用することにおいて一貫しているので、比較は、この知見にもかかわらず、異なる浄化溶液間でなおもなされ得る。
【０２９０】
材料及び方法
プロテインＡクロマトグラフィープロセシング
プロテインＡクロマトグラフィーを、ＡＫＴＡエクスプローラー１００クロマトグラフィー系（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＵｎｉｃｏｒｎ  ５．１０制御ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。ＰｒｏＳｅｐ  Ａ樹脂を、ＰｒｏＳｅｐ  ｖＡ樹脂の代わりに使用した。２つの樹脂の性能は、等価であることが以前に示されている。この樹脂を、０．６６ｃｍ直径のＯｍｎｉｆｉｔガラスカラム中に、１４ｃｍの床高さまで充填した。ナイーブ樹脂を、全ての実行のために充填した。全ての実験を、室温（２０−３０℃）で実施した。ｍＡｂ１及びｍＡｂ２の回収された細胞培養液（ＨＣＣＦ）を使用した。標準的なプロテインＡ抗体プロセスを、３０ＣＶ／時間の流速、１４ｇ／Ｌ樹脂のロード能力、及び２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度に基づいて０．５ＯＤから２ＣＶの最終容積までのプーリングで維持した。
【０２９１】
溶出及び再生の事前サイクルの後に、平衡化、抗体ロード、３回の洗浄、溶出／プーリング及び再生からなるローディングサイクルを行った。９回のローディングサイクルを、順次的に実行して、カラムを十分に詰まらせた。再生、平衡化、１０ＣＶの試験される浄化剤及び再生の延長からなる浄化サイクルが後に続いた。この浄化サイクルを、１０ＣＶ／時間のより緩徐な流速を使用して、アップフロー方向で実行した。１ＣＶの画分を、浄化溶液ブロックを通じて収集した。次いで、このカラムを、一連のモック実行（キャリーオーバーサイクル）を実行する前に貯蔵して、産物キャリーオーバーを評価した。事前サイクル、通常のローディングサイクル及び貯蔵からなる完全性チェックがモック実行の後に続いて、タンパク質収量が減少しなかったことを確実にした。各実験を２重で実施した。
【０２９２】
モック実行は、ロード相以外の各プロセス工程の通常の相が後に続く実行として規定され、このロード相の間は、カラム上にロードされるタンパク質は存在しない。その代り、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が、タンパク質を含む通常のロードプールの容積、ｐＨ及び伝導率をシミュレートするために、カラム上にロードされる（モックロード）。キャリーオーバー試料プール（モックプール）を、通常のタンパク質溶出プールを収集したのと同じ出発容積で、モック実行から収集した。
【０２９３】
全体的プロセスの流れを以下にまとめる：
事前サイクル
溶出                  ３ＣＶ
再生                  ３ＣＶ
ローディングサイクル（×９）
平衡化                ４ＣＶ
ＨＣＣＦによるロード  １４ｇ／Ｌ
洗浄１                ３ＣＶ
洗浄２                ３ＣＶ
洗浄３                ３ＣＶ
溶出／プール          ３ＣＶ
再生                  ３ＣＶ
浄化サイクル
再生                  ７ＣＶ
平衡化                ５ＣＶ
浄化剤                １０ＣＶ
再生                  １０ＣＶ
貯蔵                      ５ＣＶ
事前サイクル
モック実行
ローディングサイクル（ＰＢＳロード）
完全性チェック
ローディングサイクル（ＨＣＣＦロード）
貯蔵
【０２９４】
バッファー成分を表７に示す。
2019094334.tif 000010
【０２９５】
浄化剤の組成を表８に示す。
2019094334.tif 000011
【０２９６】
プロテインＡプールの事後プロセシング
溶出の３時間以内に、浄化画分及びキャリーオーバープールを、０．１％ポリソルベート２０及び０．０５％アジ化ナトリウムの最終濃度になるように、ポリソルベート２０及びアジ化ナトリウムで条件付けた。ポリソルベート２０は、低レベルのタンパク質が試料コンテナ壁上に吸着するのを防止する洗剤であり、アジ化ナトリウムは、細菌増殖を阻害を防止する防腐剤である。プロテインＡプール（タンパク質及びモックの両方）を、ｐＨ５．０に調整し、浄化画分を、１．５Ｍトリス塩基を使用してｐＨ５．０−７．０の間に調整した。全ての試料を、産物（インタクトなＩｇＧ）について解析するまで、４℃で貯蔵した。
【０２９７】
分析論
タンパク質プール濃縮が、２８０ｎｍの吸光度においてＵＶ分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を使用して見出された。浄化及びモックプール試料を２重又は３重のいずれかで提出し、インタクトなヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡを使用して産物について解析した。
【０２９８】
インタクトなヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡからの結果を、以下の計算を使用して、キャリーオーバー値に変換した：
2019094334.tif 000012
【０２９９】
最悪のキャリーオーバーを表すために、各実験のタンパク質プール試料由来の最も低い産物濃度を、キャリーオーバーの計算に使用した（表９）。
2019094334.tif 000013
【０３００】
結果
浄化溶液スクリーニングからのキャリーオーバー結果を図１７にまとめる。比較のために、２つの実行を実施し、このとき、プロセシング工程の全てが同じであったが、浄化サイクルは実施しなかった。浄化されていないカラムと比較した場合、浄化溶液に曝露させたカラムの全てが、キャリーオーバーの顕著な低減を示した。平均キャリーオーバーは、浄化サイクルに曝露されていないカラムと比較して、６５−９３％の間減少した。
【０３０１】
タンパク質は通常、平衡化バッファーに曝露された場合にはプロテインＡカラムから溶出しないので、平衡化バッファーを、浄化溶液についてのネガティブコントロールとして含めた。しかし、この平衡化バッファーは、キャリーオーバーを低減させることにおいて他の溶液のいずれかと全く同様に機能した。これは、カラムを通じたバッファーのさらなるフロースルーが、実際の溶液組成に関わらず、キャリーオーバーを除去することを助けたことを示唆した。
【０３０２】
実行間の高い可変性が、異なる浄化溶液の多くについて見られた。この可変性は、実験を通じた２つの異なる原料の使用に一部起因し得る。ＭＡｂ１  ＨＣＣＦを、以下の試料の各々からの２つの実行のうち１つのために使用した：浄化なし、平衡化バッファー、６ＭグアニジンＨＣｌ、１％ｖ／ｖリン酸、１９％エタノール、０．１Ｍイミダゾール／１９％エタノール；ｍＡｂ２  ＨＣＣＦを、全ての他の実行に使用した。限定的な原料の入手可能性は、実行の全てを通じた一貫した原料の使用を妨げた。しかし、２Ｍリン酸カリウム試料が、両方の実行のためのｍＡｂ２  ＨＣＣＦの使用にもかかわらず高い可変性を示したので（５６．５％ＲＳＤ）、見られた可変性の全てを、一貫しない原料が説明するわけではない可能性がある。
【０３０３】
さらなるロードサイクルを、各実行のキャリーオーバーサイクル後に実施して、浄化後のカラムの性能を評価した。産物収量は、浄化剤への曝露の前にロードサイクルの間に取得された収量と一致した（結果示さず）。
【０３０４】
画分を、浄化において現れる抗体の量を評価するために、浄化サイクルの浄化剤ブロックにわたって収集した（図１８）。浄化剤の一部は、タンパク質に対して変性効果を有していた可能性があるので、これらの結果を使用して、絶対量を見出すのではなく、傾向を確立した。浄化剤の全てが、１０ＣＶ内に十分に入る、低い、ほぼ一定のレベルまで安定化された抗体量を放出した。対照的に、モックサイクルの間に溶出したキャリーオーバーは、かなり高い濃度のままであった。タンパク質分解が予測されなかった平衡化バッファーなどのバッファーを用いても、より高いレベルのキャリーオーバーが、浄化から放出された低いレベルの抗体にもかかわらず、観察された。これらの知見は、この浄化手順が使用される場合、浄化持続時間の単なる低減又は延長が、キャリーオーバーレベルに顕著に影響を与えるわけではないことを示唆している。
【０３０５】
いくつかの逐次的なモック実行を、試験した各溶液について浄化サイクル後に実施した。０．１Ｍ酢酸浄化の５回の逐次的なモック実行からのＵＶ２８０ｎｍシグナルを、図１９においてクロマトグラム中に重ねて示す。実施した全ての逐次的なモック実行で、プーリング領域における鋭いピークは、徐々に減少した。各逐次的サイクルでのキャリーオーバーのこの減少は、この特定のカラムに限定されなかった。図２０に見られ得るように、同じ傾向が、スクリーニングしたほぼ全ての浄化溶液で生じた。カラムに対して浄化を行わなかった場合であっても、キャリーオーバーは、各追加のモック実行を実施して、顕著に減少した。図２１では、６ＭグアニジンＨＣｌ試料は、２回目のキャリーオーバーからのデータを欠いているが、同じ傾向が見られた。２０％ヘキシレングリコール試料は、最大５回目のキャリーオーバーまで、同様に同じ傾向を示した。５回目のキャリーオーバーの高い値が、実際のキャリーオーバー又は試料採取における人為的ミスを反映するかどうかは、決定していない。
【０３０６】
各逐次的なモック実行によるキャリーオーバーにおける減少は、キャリーオーバーが、スクリーニングされているものなどのより特定化された浄化剤の代わりに標準的なプロテインＡバッファーを使用して、低減され得ることを示唆した。より少ない調製時間が、バッファーの計量のために必要とされ、より少ない不確実性がカラムに対する化学物質の影響に関して存在するので、既存のバッファーの使用は、精製パイロットプラントにおけるこれらの浄化手順のより容易な遂行になる。
【０３０７】
より重要なことに、これらの結果はまた、プロテインＡカラムのための代替的浄化手順としてのモック実行バッファーのパルシングを示唆した。キャリーオーバーは、０．１Ｍの酢酸又は１％ｖ／ｖリン酸への連続的曝露からよりも、逐次的なモック実行からより多く低減されたので、モック実行の間の低ｐＨの溶出バッファー及び再生バッファーは、改善された浄化を完全には説明できない。その代り、モック実行の間の高いｐＨから低いｐＨへの遷移がキャリーオーバーの低減を担った可能性がある。
【０３０８】
図２１は、２ＭアルギニンＨＣｌ試料が、キャリーオーバー低減傾向に従わなかったことを示している。Ａｋｔａシステムへの電源供給は中断されており、３回目のモック実行の後及びおそらくはその間にバッファー中でカラムが保持された。延長された持続時間のバッファー曝露後の増加したキャリーオーバーは、単一のキャリーオーバー結果が、どのくらいのタンパク質がカラム上に残存するかを完全には示さない可能性があることを示した。最初の結果でカラムが「浄化」されたと示唆された後であっても、さらなるキャリーオーバー溶出の可能性は、重大な障害を提示する。
【０３０９】
ＰｒｏＳｅｐ  Ａを充填したプロテインＡカラムにおいてキャリーオーバーを低減させる適切な浄化戦略を同定するために、１０種の異なる浄化剤をスクリーニングした。これらの浄化溶液の全てが、キャリーオーバーの低減を助けた；しかし、可変性の問題に起因して、これらの薬剤の大部分は、類似の性能を示した。逐次的なモック実行からの解析したキャリーオーバープールは、各さらなるモック実行を実施すると、減少したキャリーオーバーの傾向を示した。
【０３１０】
実施例４
高いｐＨから低いｐＨのバッファーへのパルス振動
研究を実施して、産物キャリーオーバーを低減させる手段として、モック実行バッファーのパルス振動を調査した。基本的戦略を同定した後、最適化を、より大きい小規模カラムを使用して実施した。最適化パラメーターは、流れの方向性、流速及び静的浸漬の解析を含んだ。
【０３１１】
材料及び方法
産物溶出の予備的解析
プロテインＡクロマトグラフィーを、１５℃でロードしたｍＡｂ３  ＨＣＣＦを使用して、実施例２に記載した方法に従って実施した。９回のローディングサイクルを実施し、その後、貯蔵、事前サイクル及び２回のモック実行を実施した。浄化は実施しなかった。以前に記載したように、１ＣＶの画分を、モック実行の各々にわたって収集し、トリス塩基、ポリソルベート２０及びアジ化ナトリウムで条件付けた。画分を、インタクトなヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによって解析した。
【０３１２】
ｐＨパルス振動及び最適化
全ての実験を、１．６ｃｍ直径カラム上でｍＡｂ３  ＨＣＣＦを使用して実施した。床高さは１４ｃｍのままであった。９回のローディングサイクルを実施し、その後、３ＣＶの平衡化バッファー及び３ＣＶの再生バッファーからなる浄化サイクルを実施した。１０回の浄化サイクルを実施し、その後、貯蔵、事前サイクル、及び一連のモック実行を実施した。１ＣＶの画分を、浄化プロセス全体にわたって収集した。以前に記載したように、浄化画分及びモックプールを条件付けし、解析した。
【０３１３】
初期設定の浄化手順を、１０サイクルにわたって３０ＣＶ／時間でダウンフロー方向で実行した。最適化研究には、流れ方向及び流速の修飾、静的浸漬条件の試験、並びに浄化持続時間の低減が関与した。流れ方向の最適化のために、浄化サイクルを、アップフロー方向で実行した。流速の最適化のために、浄化サイクルを、１５ＣＶ／時間の流速で実行した。静的浸漬を、平衡化バッファー中又は再生バッファー中のいずれかで、４回目の浄化サイクルの間にカラムを３時間保持することによって試験した。静的浸漬の最適化のために、このカラムを、１０回の浄化サイクルのうち４回の間に、平衡化バッファー中で３時間保持した。浄化持続時間の最適化のために、浄化サイクルを、２ＣＶの平衡化バッファー及び２ＣＶの再生バッファーへと低減させた。さらに、平衡化バッファー中での静的浸漬を、１０回の浄化サイクルのうち５回について実施した。最適化パラメーターを表１０にまとめる。
2019094334.tif 000014
【０３１４】
結果
画分を、詰まったカラムの最初の２回のモック実行サイクルにわたって収集して、モック実行サイクルの間のいつ、産物が実際に溶出するかを調査した。クロマトグラム及びキャリーオーバーの結果を図２２に示す。産物の大部分は、平衡化バッファーを溶出バッファーによって置き換えた、高いｐＨから低いｐＨへの遷移の時点で溶出した。産物は、再生バッファーが溶出バッファーを置き換えた、次のｐＨ低下の時点で、より低い程度まで溶出した。これらの観察は、２回目のキャリーオーバーサイクルで反復された。キャリーオーバー結果により、低いｐＨでカラムを保持するだけでは、カラムが効率的に浄化されないことが確認された。唯一の要求が低いｐＨである場合、２回目のキャリーオーバーサイクルの間のピークは、より小さかったはずであり、より多くのタンパク質が、１回目のキャリーオーバーサイクルの溶出及び再生ブロック全体の間に外れたはずである。
【０３１５】
ｐＨ低下からの溶出と２回目のモック実行の間のさらなる溶出との比較は、潜在的浄化戦略としての高いｐＨから低いｐＨへのパルスを強力に支持した。タンパク質溶出は、３ＣＶ以内の溶出バッファーでピークを迎えたので、バッファー持続時間を、高いｐＨ及び低いｐＨのバッファーの各々について、３ＣＶに設定した。平衡化バッファー（ｐＨ７．１）を、高いｐＨのバッファーとして選択し、再生バッファー（ｐＨ１．７）を、低いｐＨのバッファーとして選択した。
【０３１６】
ｐＨパルス振動
１０回のパルス振動サイクルの平衡化バッファー及び再生バッファーを通じた産物溶出を、図２３に示す。カラムからのＩｇＧ溶出のピークは、浄化の高いｐＨから低いｐＨへの遷移毎に存在した。各引き続くサイクルで、溶出するタンパク質の量は減少した。
【０３１７】
数回の逐次的なモック実行を、パルス浄化後に実施した。５回の逐次的なモック実行からのキャリーオーバー量を、図２４に示す。比較のために、浄化されていないカラムからの逐次的なキャリーオーバーもまた示される。１０サイクルのｐＨパルス浄化は、４８４ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物から６８ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物まで、カラムからのキャリーオーバーの８６％の低減を生じた。浄化はキャリーオーバーの顕著な低減を生じたが、さらなるモック実行は、キャリーオーバーをなおも生じた。最適化が、キャリーオーバーをさらに低減させるために必要であった。
【０３１８】
パルス浄化の最適化
浄化サイクルの間のカラムを通じたバッファーのアップフロー及びダウンフローを比較した。５回の逐次的なモック実行についてのキャリーオーバーを、図２５に示す。アップフローは、ダウンフローと比較した場合、初期キャリーオーバーにおける５４％の増加を生じた（１０５ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物対６８ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物）。全ての引き続くキャリーオーバーが、キャリーオーバーにおける増加を同様に示した。ポリソルベート２０及びアジ化ナトリウムは、誤って、試料に添加されなかったので、４回目のモック実行の間のキャリーオーバーは、無効であった。図２６は、アップフローカラム及びダウンフローカラムの両方についての、浄化持続時間全体を通じた産物溶出を示す。アップフローは、より多くのモック実行キャリーオーバーを生じたが、カラムをより徹底的に効率的に浄化する１０回の浄化サイクルを通じてカラムからより多くのタンパク質が溶出することを引き起こした。顕著な量のタンパク質が最後の浄化サイクルの間にカラムからなおも溶出していたので、アップフロー実行は、ほぼ間違いなく、キャリーオーバーとして溶出している産物のより多くを除去するために、より多くのサイクルで延長され得る。
【０３１９】
モック実行キャリーオーバーレベルに対する、浄化の間のバッファー流速の影響を、図２７に示す。３０ＣＶ／時間から１５ＣＶ／時間まで流速を半分に低減させることで、初期キャリーオーバーをほぼ５０％（６８ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物から３５ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物まで）低減させた。より緩徐な流速は、キャリーオーバーを効率的に半分にカットしたが、浄化時間の倍加が不利益であった。
【０３２０】
浄化サイクルの間のバッファー中でのカラムの静的浸漬からの結果を、図２８に示す。このカラムを、平衡化バッファー又は再生バッファー中のいずれかで３時間保持し、複数のキャリーオーバーを評価した。平衡化バッファー中でのカラムの浸漬は、再生バッファー中でのカラムの浸漬よりも優れていた（１９ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物対２８ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物）。両方の静的浸漬は、カラムの通常パルス浄化からの６８ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物に対する、注目すべき改善であった。流速の低減に伴って、増加した浄化時間の不利益を、キャリーオーバー低減の利益と比較検討する必要があった。
【０３２１】
バッファー中でのカラムの静的浸漬を、平衡化バッファー中での単一回の３時間保持を、複数回の３時間保持と比較することによって、さらに評価した。カラムを、１０回のパルス振動サイクルのうちの４回について静的浸漬中に保持し、キャリーオーバーについて評価した（図２９）。複数回の静的浸漬を用いると、キャリーオーバーは、１９ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物から８ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物へと低下した。
【０３２２】
最適化実行の各々について浄化サイクルを通じて収集した画分を、最適な浄化持続時間を決定するために、産物溶出について評価した（図２３、２６、３０−３２）。浄化サイクルの大部分は、第３ＣＶの平衡化バッファー及び再生バッファーの両方の間に、ほとんど又は全く産物溶出を示さなかった。結果として、各浄化サイクルの持続時間を、２ＣＶの平衡化バッファー及び２ＣＶの再生バッファーに低減させた。浄化持続時間のこの低減は、より少ないバッファー及びより短い浄化時間になった；しかし、産物キャリーオーバーは、同じままか、わずかに増加するかのいずれかである。より小さいバッファー容積を維持しながらキャリーオーバーをさらに低減させるために、静的浸漬の回数を、４から５に増加させた。図３３は、これらの変化が、７．８ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物から６．７ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物まで、キャリーオーバーをわずかに低減させたことを示している。カラム浄化を通じた産物溶出を、図３４に示す。１０回目の浄化サイクルの最後までに、５．０ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物が、再生バッファーの最後のカラム容積で溶出した。
【０３２３】
実施例５
浄化の大規模性能。
最適化研究の間に同定された最も有望なｐＨパルス浄化手順を、以前に使用したパイロット規模のカラムに適用した。この研究のためのカラムを、分子、寸法、及び前のタンパク質接触の回数に基づいて選択した。Ｐｈａｒｍａｃｉａスキッドだけが自動的なポーズ持続時間を可能にしたので、２Ｌ／分のスキッドの流速上限を越えないカラムを選択した。
【０３２４】
材料及び方法
以前に使用したｍＡｂ４及びｍＡｂ５プロテインＡカラムを、パイロットプラントのコールドルーム貯蔵から取得した。このｍＡｂ４カラムは、直径が２０ｃｍで１３．５ｃｍの床高さがあり、２８サイクルにわたって以前に使用されたものである。Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓスキッド１５３８（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を浄化に使用し、スキッド１０５０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をモック実行に使用した。このｍＡｂ５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｄｅｘ）は、直径が１４ｃｍで１５ｃｍの床高さがあり、２０サイクルにわたって以前に使用されたものである。Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓスキッド１０７６（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、全てのｍＡｂ５プロセスに使用した。
【０３２５】
２ＣＶの平衡化バッファー及び２ＣＶの再生バッファーからなる１０回の浄化サイクルを実施した。このカラムを、３時間の平衡化バッファー静的浸漬中で、１０回のパルス振動サイクルのうち５回について保持した。浄化の後に、カラムの貯蔵、スキッドの衛生化、及びモック実行を行った。ｍＡｂ５カラムについて、このカラムなしのさらなるモック実行の直後に衛生化を行い、系キャリーオーバーについての値を取得した。
【０３２６】
モック実行パラメーターは、各特定の分子のプロテインＡプロセシングにおいて以前に使用したパラメーターに基づいた。ｍＡｂ５カラムについて、洗浄３工程を、典型的なｍＡｂ５プロテインＡクロマトグラフィーにつき、４ＣＶに拡張した。モック実行パラメーター及び参照のために使用した元の実行のまとめを、表１１に列挙する。
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【０３２７】
産物キャリーオーバーを表１２に示す。浄化した後、ａＩＧＦ１Ｒカラムは、４８．２ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物のキャリーオーバーを有したが、ａｎｔｉＡｂｅｔａカラムは、８．６ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物のキャリーオーバーを有した。以前の研究は、キャリーオーバー値が、増加したタンパク質接触と共に増加することを示している。ｍＡｂ４カラムを、ｍＡｂ５カラムよりも８回多いタンパク質接触サイクルに曝露させたが、増加した回数の接触単独は、キャリーオーバー値における大きい不同性を説明するのに顕著に十分でない可能性がある。
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【０３２８】
最終浄化サイクルの最後までに、産物は、両方のカラムについて浄化バッファーと共になおも溶出していた。小規模最適化の間に観察された最終浄化ＣＶからの５．０ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物と比較して、パイロット規模での産物溶出は、予測したよりも高かった（それぞれａＩＧＦ１Ｒカラム及びａｎｔｉＡｂｅｔａカラムについて、１２．７ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物及び６２．９ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物）。
【０３２９】
系キャリーオーバーを、スキッド衛生化後に所定の位置にカラムなしでモック実行を実施することによって解析した。系キャリーオーバーは、Ｐｒｏｓｅｐ  Ａ樹脂にではなくスキッドに起因するキャリーオーバーの量を示す。スキッドの浄化手順及び衛生化は、全ての系キャリーオーバーを排除したはずだが、０．９７ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物が、ｍＡｂ５実行の間に系モックプールにおいてなおも検出された。これらの結果は、キャリーオーバーへの系の寄与が最小であることを示すが、スキッド自体のさらなる浄化が、１つの実行から次の実行まで産物のキャリーオーバーが絶対的に存在しないことを確実にするために、必要とされ得る。
【０３３０】
小規模最適化の間に使用される浄化手順の、パイロット規模への適用は、顕著な可変性でより高いキャリーオーバーレベルを生じた。産物は、小規模においても同様に以前に観察されたものよりも高いレベルで、浄化サイクルの最後を通じて溶出し続けた。この系は、カラムが所定の位置に存在しない場合であっても、小さいレベルのキャリーオーバーに寄与することが見出された。
【０３３１】
高いｐＨから低いｐＨへのバッファーのパルス振動は、小規模においてキャリーオーバーを低減させる有効な手段であることが見出された。１．６ｃｍ直径のカラムを使用すると、キャリーオーバーは、６．７ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物に低減された。しかし、前のパイロット実行の間に使用された実際のカラムへの浄化手順の適用は、４８．２ｎｇ  ＩｇＧ／ｍｇ産物で、これまでに測定された最も高い値で、かなり高いキャリーオーバー値を生じた。キャリーオーバーレベルは、カラムの使用法における差異に起因してカラム間で幾分異なることが予測されるが、完成した浄化手順は、任意の所与のカラムの詳細に関わらず、キャリーオーバーを遍在的に排除する必要がある。さらに、長期カラム性能及び最小キャリーオーバー検出限界などのさらなるパラメーターを評価することが重要である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月24日(2019.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、
ａ）該材料に、２材料容積以上の溶出バッファーを通過させる工程であって、該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．９である、工程、
ｂ）約１０分間から約３０分間までの範囲の時間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｃ）該材料に、約２材料容積以上の溶出バッファーを通過させる工程、及び
ｄ）該材料に、約２材料容積以上の再生バッファーを通過させる工程であって、該再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である、工程
を含む、方法。
【請求項２】
再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、
ａ）該材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．９である、工程、
ｂ）約３０分間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｃ）該材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、及び
ｄ）該材料に、約４材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、該再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である、工程
を含む、方法。
【請求項３】
再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、
ａ）該材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．９である、工程、
ｂ）約３０分間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｃ）該材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、及び
ｄ）該材料に、約２．５材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、該再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である、工程、
ｅ）約３０分間にわたって、再生バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｆ）該材料に、約２．５材料容積の再生バッファーを通過させる工程
を含む、方法。
【請求項４】
再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、
ａ）該材料に、約２材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程であって、該平衡化バッファーは、約２５ｍＭのトリス及び約２５ｍＭのＮａＣｌを含み、約ｐＨ７．１である、工程、
ｂ）約３０分間にわたって、平衡化バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｃ）該材料に、約２材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程、
ｄ）該材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．８である、工程、
ｅ）約３０分間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｆ）該材料に、約２材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、
ｇ）該材料に、約２材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、該再生バッファーは、０．１ＮのＮａＯＨを含み、ｐＨ１３である、工程、
ｈ）約３０分間にわたって、再生バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｉ）該材料に、約２材料容積の再生バッファーを通過させる工程
を含む、方法。
【請求項５】
再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、
ａ）該材料に、約４材料容積の平衡化バッファーを通過させる工程であって、該平衡化バッファーは、約２５ｍＭのトリス及び約２５ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨ７．１である、工程、
ｂ）６サイクルの、
ｉ）該材料に、約３材料容積の溶出バッファーを通過させること、ここで該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．８である；
ｉｉ）約１０分間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持すること；
ｉｉｉ）該材料に、約１材料容積の溶出バッファーを通過させること；
ｉｖ）該材料に、約３材料容積の再生バッファーを通過させること、ここで該再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である；
ｖ）約１０分間にわたって、再生バッファー中で該材料を静的に保持すること；
ｖｉ）該材料に、約１材料容積の再生バッファーを通過させること
を含む工程を実施する工程
を含む、方法。
【請求項６】
再使用のためにクロマトグラフィー材料を浄化する方法であって、６サイクルの、
ａ）該材料に、約３材料容積の溶出バッファーを通過させる工程であって、該溶出バッファーは、約０．１５Ｍの酢酸を含み、約ｐＨ２．８である、工程、
ｂ）約１５分間にわたって、溶出バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｃ）該材料に、約１材料容積の溶出バッファーを通過させる工程、
ｄ）該材料に、約３材料容積の再生バッファーを通過させる工程であって、該再生バッファーは、約０．１ＮのＮａＯＨを含み、約ｐＨ１３である、工程、
ｅ）約１５分間にわたって、再生バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｆ）該材料に、約１材料容積の再生バッファーを通過させる工程、
ｇ）該材料に、約３材料容積の貯蔵バッファーを通過させる工程であって、該貯蔵バッファーは、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約２％のベンジルアルコールを含み、約ｐＨ５．０である、工程、
ｅ）約１５分間にわたって、貯蔵バッファー中で該材料を静的に保持する工程、
ｆ）該材料に、約１材料容積の貯蔵バッファーを通過させる工程
を含む、方法。
【請求項７】
クロマトグラフィー材料が、
ａ）クロマトグラフィーカラム中にある；及び／又は
ｂ）ポリペプチドの大規模産生のために使用される、
請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
クロマトグラフィー材料が、
ａ）アフィニティー材料；又は
ｂ）プロテインＡアフィニティー材料；又は
ｃ）ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ材料、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ材料又はＭＡｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ材料
である、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【外国語明細書】
2019094334000001.pdf