(57)【要約】【課題】本発明の目的は、生体組織内（特に、骨格筋内）でオートファジー活性を向上させることができるオートファジー活性向上剤を提供することである。【解決手段】β-クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルは、オートファジー活性を向上させる作用があり、特に、骨格筋内でオートファジー活性を向上でき、加齢による骨格筋量の低下を抑制でき、骨格筋の老化抑制に有効である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルを含む、オートファジー活性向上剤。
【請求項２】
前記β−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルがかんきつ類由来である、請求項１に記載のオートファジー活性向上剤。
【請求項３】
筋肉組織におけるオートファジー活性の向上のために使用される、請求項１又は２に記載のオートファジー活性向上剤。
【請求項４】
前記筋肉組織が骨格筋である、請求項３に記載のオートファジー活性向上剤。
【請求項５】
前記骨格筋が、長趾伸筋、腓腹筋、足底筋、及び／又はヒラメ筋である、請求項４に記載のオートファジー活性向上剤。
【請求項６】
筋肉機能の低下抑制及び／又は筋肉量及び筋力の維持・低下抑制のために使用される、請求項１〜５のいずれかに記載のオートファジー活性向上剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のオートファジー活性向上剤を含む、オートファジー活性向上用の飲食品。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載のオートファジー活性向上剤を含む、オートファジー活性向上用の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オートファジー活性向上剤に関する。より具体的には、本発明は、生体組織内（特に、骨格筋内）でオートファジー活性を向上させることができるオートファジー活性向上剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
オートファジーは、タンパク質を含む細胞質成分やミトコンドリア等の細胞内オルガネラなどの細胞質内の一部を分解するシステムの総称である。オートファジーは、飢餓条件下でタンパク質を分解してアミノ酸を供給する機能等があり、正常な生体機能を維持する上で重要な役割を担っている。
【０００３】
オートファジーは、マクロオートファジー、ミクロオートファジー、シャペロン介在性オートファジーに分類される。ミクロオートファジーは、リソソームや液胞膜が直接的に取り囲んで分解する過程であり、シャペロン介在性のオートファジーでは分解されるべきタンパク質がリソソーム膜上に存在する通過装置を介して直接リソソーム内へと運ばれる。これら3つの中ではマクロオートファジーが主要であり、単にオートファジーと呼ばれることが多い。本明細書では、マクロオートファジーを単にオートファジーと表記する。
【０００４】
オートファジーは、Beclin-1、autophagy related 14 (Atg14)、p150、phosphoinositide 3-kinase (PI3 Kinase)が複合体を形成することにより隔離膜の形成が開始される。autophagy related 16 like 1 (Atg16L1)、autophagy related 12 (Atg12)、及びAtg5が複合体を形成し、light chain 3 (LC3-I)がAtg7の働きにより活性型のLC3-IIになることで隔離膜が伸長形成される。細胞内のタンパク質を選択的、非選択的に包み込むことでオートファゴソームを形成し、オートファゴソームがリソソームと融合することでオートファゴリソソームとなる。リソソーム内の分解酵素によりオートファゴリソソーム内のタンパク質は分解される。この時、オートファゴソームの内側に包み込まれたp62もリソソームの分解酵素により分解される。つまり、オートファジー活性が低下すると、オートリソソーム内のp62が蓄積する。オートファゴソームは非選択的に細胞内タンパク質を分解するが、アダプタータンパク質となるp62が選択的にユビキチン化されたタンパク質をオートファジーへと導くことで選択的にタンパク質を分解する経路もある。
【０００５】
オートファジー活性は加齢により低下することが知られており、高齢者において、正常な生体機能を維持するには、加齢によるオートファジー活性の低下を抑制することが有効であると考えられている。特に、近年、骨格筋等の筋肉組織に障害を持つ高齢者や筋肉機能が低下している高齢者の増加が社会問題となっており、日常の食生活において、筋肉組織内のオートファジー活性の低下を抑制できる飲食品を摂取することができれば、高齢者の寝たきりを防ぎ、自立した健康的な生活の継続に有効になると考えられている。
【０００６】
そこで、従来、オートファジー活性を向上させる成分について種々検討が行われている。例えば、特許文献１には、ウロリチンには、オートファジーを刺激する作用があることが開示されている。また、特許文献２には、梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物又は梅肉エキスの中和処理物には、高いオートファジー誘導作用があることが開示されている。しかしながら、β-クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルが、オートファジー活性に及ぼす影響については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１５−５２３３６２号公報
【特許文献２】特開２００７−１４３４５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、生体組織内特に、骨格筋内でオートファジー活性を向上させることができるオートファジー活性向上剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、β-クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルには、オートファジー活性を向上させる作用があることを見出した。特に、β-クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルには、骨格筋内でオートファジー活性を向上でき、加齢による骨格筋量の低下を抑制でき、骨格筋の老化抑制に有効であることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  β−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルを含む、オートファジー活性向上剤。
項２．  前記β−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルがかんきつ類由来である、項１に記載のオートファジー活性向上剤。
項３．  筋肉組織におけるオートファジー活性の向上のために使用される、項１又は２に記載のオートファジー活性向上剤。
項４．  前記筋肉組織が骨格筋である、項３に記載のオートファジー活性向上剤。
項５．  前記骨格筋が、長趾伸筋、腓腹筋、足底筋、及び／又はヒラメ筋である、項４に記載のオートファジー活性向上剤。
項６．  筋肉機能の低下抑制及び／又は筋肉量及び筋力の維持・低下抑制のために使用される、項１〜５のいずれかに記載のオートファジー活性向上剤。
項７．  項１〜６のいずれかに記載のオートファジー活性向上剤を含む、オートファジー活性向上用の飲食品。
項８．  項１〜６のいずれかに記載のオートファジー活性向上剤を含む、オートファジー活性向上用の医薬品。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のオートファジー活性向上剤は、生体内のオートファジー活性を向上できるので、例えば、加齢によるオートファジー活性の低下の抑制等に有効である。特に、本発明のオートファジー活性向上剤は、骨格筋内のオートファジー活性の向上に卓効を示すので、加齢による筋肉機能の低下を抑制する上で好適に使用される。
【００１２】
また、本発明のオートファジー活性向上剤は、食経験がある天然素材に含まれる成分を使用しており、飲食品の形態で摂取できるので、安全且つ負担の少ない手法で、前記所望の効果を有効に享受させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】C2C12細胞から分化させた筋管細胞をβ-クリプトキサンチン（10 μM、25 μM、50 μM）存在下で培養し、オートファジーマーカータンパク質の発現量をウエスタンブロット法により測定した結果を示す図である。
【図２】老化促進マウスSAMP1(コントロール群とβ-クリプトキサンチン群)及びコントロールマウスSAMR1について、13週齢から30週齢までの体重を測定した結果、及び20週齢から30週齢までの飼料の摂食量を示す図である。
【図３】老化促進マウスSAMP1(コントロール群とβ-クリプトキサンチン群)及びコントロールマウスSAMR1について、30週齢時に体重と、長趾伸筋、腓腹筋、足底筋、及びヒラメ筋の各重量を測定した結果を示す図である。
【図４】老化促進マウスSAMP1(コントロール群とβ-クリプトキサンチン群)及びコントロールマウスSAMR1について、30週齢時のヒラメ筋の筋線維の断面積の分布を測定した結果を示す図である。
【図５】老化促進マウスSAMP1(コントロール群とβ-クリプトキサンチン群)及びコントロールマウスSAMR1について、30週齢時のヒラメ筋におけるユビキチン化タンパク質の発現量をウエスタンブロット法により測定した結果を示す図である。
【図６】老化促進マウスSAMP1(コントロール群とβ-クリプトキサンチン群)及びコントロールマウスSAMR1について、30週齢時のヒラメ筋におけるオートファジーマーカータンパク質の発現量をウエスタンブロット法により測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のオートファジー活性向上剤は、β-クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルを含むことを特徴とする。以下、本発明のオートファジー活性向上剤について詳述する。
【００１５】
［β-クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステル］
本発明のオートファジー活性向上剤では、オートファジー活性を向上させる成分として、β-クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルを使用する。
【００１６】
β−クリプトキサンチンについては、その異性体のタイプについては、特に制限されず、オールトランス型又はシス型のいずれであってもよい。
【００１７】
β−クリプトキサンチンの脂肪酸エステルにおいて、エステル体を構成する脂肪酸については、特に制限されないが、例えば、炭素数８〜３２好ましくは１０〜２４の飽和又は不飽和脂肪酸が挙げられる。当該脂肪酸としては、具体的には、ラウリン酸（Ｃ１２）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸（Ｃ１８）が挙げられる。これらのクリプトキサンチンの脂肪酸エステルは、温州みかんに含まれており、β−クリプトキサンチンの脂肪酸エステルとして、温州みかん由来のものが好適に使用される。また、β−クリプトキサンチンの配糖体における糖成分の種類については特に制限されず、グルコース、マンノース、ガラクトース等の単糖類；スクロース、ラクトースやトレハロース等の二糖類；三糖類以上のオリゴ糖等が挙げられる。これらのβ−クリプトキサンチンの脂肪酸エステルは、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００１８】
本発明のオートファジー活性向上剤は、β−クリプトキサンチン及びその脂肪酸エステルの中から１種を選択して使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。β−クリプトキサンチン及びその脂肪酸エステルの中でも、好ましくはβ−クリプトキサンチンが挙げられる。
【００１９】
本発明で使用されるβ−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルの由来については、特に制限されず、天然素材（植物由来や動物由来）又は微生物から抽出されたものであってもよく、また化学合成や酵素合成等によって得られたものであってもよい。安全性、製造コストの低減等の観点から、天然素材由来のβ−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルを使用することが好ましい。
【００２０】
β−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルが含まれる動植物としては、例えば、玄米、とうもろこし等の穀類；さつまいも、さといも、やまいも等のいも類とその加工物；あずき、いんげんまめ、えんどうまめ、ささげ、そらまめ、だいず、ひよこまめ、べにばないんげん、らいまめ、りょくとう、レンズまめ等の豆類；アーモンド、あさ、えごま、カシューナッツ、かや、銀杏、栗、くるみ、ココナッツ、ゴマ、しい、すいか、とち、はす、ひし、ピスタチオ、ひまわり、ブラジルナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、まつ、落花生等の種実類；アーティチョーク、あさつき、明日葉、アスパラガス、うど、おおさかしろな、丘ひじき、おくら、カブ、かぼちゃ、からしな、カリフラワー、かんぴょう、菊、キャベツ、きゅうり、ぎょうじゃにんにく、京菜、キノコ類、キンサイ、クレソン、くわい、ケール、コールラビ、こごみ、ごぼう、小松菜、ザーサイ、さんとうさい、ししとうがらし、しそ、じゅうろくささげ、春菊、じゅんさい、しょうが、しろうり、ずいき、すぐきな、ズッキーニ、せり、セロリー、ぜんまい、タアサイ、だいこん類、たいさい、高菜、タケノコ、たまねぎ類、たらのめ、チコリー、チンゲンサイ、つうし、つるな、つるむらさき、つわぶき、唐辛子、冬瓜、トマト類、トレビス、とんぶり、ながさきはくさい、なす類、なずな、にがうり、にら、ニンジン、にんにく、ねぎ、野沢菜、のびる、白菜類、パクチョイ、バジル、パセリ、はつかだいこん、はやとうり、ビート、ピーマン類、ひのな、ひろしまな、ふき類、ふだんそう、ブロッコリー、ほうれん草、ホースラディッシュ、まこも、みずかけな、三つ葉、みょうが、むかご、めたで、もやし類、モロヘイヤ、やまごぼう、ゆりね、ようさい、よめな、よもぎ、らっきょう、リーキ、ルバーブ、レタス類、れんこん、わけぎ、わさび、わらび等の野菜類；アセロラ、アボカド、杏、イチゴ、イチジク、いよかん、梅、温州みかん、オリーブ、オレンジ、オロブランコ、柿、かぼす、かりん、キウイフルーツ、キワノ、キンカン、グァバ、グズベリー、ぐみ、グレープフルーツ、ごれんし、サクランボ、さんぼうかん、シイクワシャ―、すいか、すだち、すもも、だいだい、タンゴール、ダンゼロ、チェリモヤ、ドリアン、夏みかん、なつめ、なつめやし、パインアップル、ハスカップ、はっさく、パッションフルーツ、バナナ、パパイア、ひゅうがなつ、びわ、ブルーベリー、ぶんたん、ホワイトサポテ、ポンカン、まくわうり、マルメロ、マンゴー、メロン、もも、やまもも、ゆず、ラズベリー、りんご、レモン等の果実類；あおさ、あおのり、あまのり、あらめ、いわのり、えごのり、おごのり、かわのり、くびれつた、昆布類、すいぜんじのり、天草、とさかのり、ひじき、ひとえぐさ、ふのり、まつも、むかでのり、もずく類、わかめ類等の海藻類；いかなご、いわな、うなぎ、キャビア、こち、さけ・ます類、ししゃも、たら類、どじょう、はぜ、ぼら、まぐろ、わかさぎ等の魚類；あげまき、あさり、あわび、いあたやがい、牡蠣、さざえ、しじみ、たにし、つぶ、とこぶし、トップシェル、ばいがい、ばかがい、ハマグリ類、帆立貝、ほっきがい、もがい等の貝類；えび類、かに類等の甲殻類；いか類、た���類等の頭足類；うに、おきあみ、くらげ、しゃこ、なまこ、ほや等のその他海産物；いのしし、いのぶた、うさぎ、牛、馬、鯨、鹿、豚、めんよう、ヤギ、あいがも、鳥肉類等の肉類；うこっけい卵、うずら卵、鶏卵、ピータン等の卵類；牛乳等の乳類や加工品等が挙げられる。
【００２１】
これらの動植物の中でも、β−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルの原料として、好ましくはかんきつ類が挙げられる。かんきつ類としては、ミカン科などに属する植物を挙げられ、より具体的には、温州みかん、イヨカン、夏みかん、オレンジ、カボス、カワバタ、キシュウミカン、清見、キンカン、グレープフルーツ、ゲッキツ、三宝柑、シイクワサー、ジャバラ、スウィーティー、スダチ、ダイダイ、タチバナ、デコポン、ナツダイダイ、ハッサク、ネーブルオレンジ、バレンシアオレンジ、晩白柚、ヒュウガナツ、ブンタン、ポンカン、マンダリンオレンジ、ヤツシロ、ユズ、ライム、レモン、カラタチ（これらと同等又は類似の品種のものも含む）等が挙げられる。これらのかんきつ類の中でも、とりわけ温州みかんは、生産量が多く、β−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルの含有量も高いことから、β−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルの原料として好適である。
【００２２】
β−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルの産生能を有する微生物としては、例えば、デュナリエラ、ヘマトコッカス等の藻類；ファフィア（Phaffia）属、ロドトルーラ（Rhodotorula）属等に属する酵母；パラコッカス（Paracoccus）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、ブレバンディモナス（Brevundimonas）属、エリスロバクター（Erythrobacter）属等に属する細菌等が挙げられる。これらの中でも、β−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルの産生能力の観点から、好ましくは、パラコッカス属、スフィンゴモナス属、ブレバンディモナス属、エリスロバクター属に属する細菌が挙げられる。パラコッカス属に属する細菌としては、具体的には、パラコッカス・カロティニファシエンス（Paracoccus carotinifaciens）、パラコッカス・マークシイ（Paracoccus marcusii）、パラコッカス・ヘウンデンシス（Paracoccus haeundaensis）、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Paracoccus zeaxanthinifaciens）、好ましくはパラコッカス・カロティニファシエンスが挙げられる。また、パラコッカス属に属する細菌の具体的な菌株の例として、パラコッカス・カロティニファシエンスE-396株（FERM BP-4283）、パラコッカス属細菌A-581-1株（FERM BP-4671）、これらの変異株が挙げられる。
【００２３】
本発明において、天然素材又は微生物由来のβ−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルを使用する場合、当該β−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルは、他の天然素材又は微生物由来成分が除去されて精製されたものであってもよいが、β−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステル以外の天然素材又は微生物由来成分が含まれていてもよい。例えば、本発明で使用されるβ−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルは、β−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルを含む前記植物の加工物の状態であってもよく、また前記植物原料からクリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルを抽出した抽出物の状態であってもよい。
【００２４】
クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルを含む前記植物の加工物としては、具体的には、前記植物を搾汁した残渣、当該残渣の酵素処理物、これらの乾燥物等が例示される。
【００２５】
前記残渣は、前記植物の果実をインライン搾汁機、チョッパーヘルパー搾汁機、ブラウン搾汁機等により搾汁した後、パドル型又はスクリュー型のフィニシャー等でろ過又は篩別、或いは遠心分離を行うことによって得ることができる。
【００２６】
また、前記酵素処理物は、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、キシラーゼ、プロテアーゼ、ペプチターゼ、リパーゼ、マレーションエンザイム（細胞壁崩壊酵素）等の酵素を前記残渣に作用させることにより得ることができる。当該酵素処理物は、温州みかんからジュースを絞った後の残渣に多量に含まれる食物繊維を水に可溶化・除去することにより残渣を減容でき、相対的にクリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルの濃度を高めることが可能であるため、本発明において好適に使用される。
【００２７】
前記残渣及び酵素処理物は、水洗処理（水での洗浄処理）に供されたものであってもよい。前記残渣及び乾燥物を水洗処理に供することにより、残渣及びその酵素処理物中に存在する酸や糖等の水溶性不純物を除去し、クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルの濃度を高めることができる。更に、前記残渣及び酵素処理物は、クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルの濃度を高めるために、固液分離により水分が減じられたものであってもよい。
【００２８】
また、前記乾燥物は、前記残渣又は酵素処理物を、熱風乾燥、凍結乾燥、マイクロ波乾燥、遠赤外線加熱乾燥等の乾燥処理に供することにより得ることができる。当該乾燥物は、水分が除去されることにより、前記残渣又は酵素処理物中のクリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルの濃度が高められているため、本発明において好適に使用される。
【００２９】
斯して得られる前記植物の加工物は、粉末化、懸濁液化等の処理に供して所望の形状に調整してもよい。
【００３０】
クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルを含む前記植物の抽出物としては、例えば、前記植物の果実、前記植物を搾汁した残渣、当該残渣の酵素処理物、これらの乾燥物等を抽出原料として用いて、溶媒抽出、超臨界抽出等の抽出処理に供することにより得ることができる。
【００３１】
前記抽出原料の内、前記植物の果実については、果実そのままであってもよいが、果実をすり潰し、破砕、粉砕、加熱、脱水、乾燥等の物理的処理に供したものであってもよい。また、前記抽出原料として使用される残渣及びその酵素処理物は、クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルを含む前記植物の加工物として使用される残渣及びその酵素処理物と同様である。
【００３２】
前記溶媒抽出は、前記抽出原料を抽出溶媒に静置又は撹拌しながら浸漬することにより行われる。前記溶媒抽出に使用される抽出溶媒としては、クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルを抽出可能な溶媒であることを限度として特に制限されず、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、ペンタン等の脂肪族炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ピリジン類等の有機溶媒が挙げられる。これらの抽出溶媒は１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中でも、アルコール類、特にエタノールは、クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルの抽出効率が高く、前記抽出溶媒として好適である。また、クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルの抽出効率を高めるために、必要に応じて、水、酵素、界面活性剤等の添加物を抽出溶媒中に添加してもよい。
【００３３】
また、前記超臨界抽出は、前記抽出原料を、超臨界二酸化炭素等の超臨界流体と接触させることにより行われる。
【００３４】
斯して得られた抽出物は、必要に応じて、更に濃縮、乾燥、脱塩、活性炭処理、再結晶法、分配精製、カラムクロマトグラフィー等の精製処理に供することにより、不純物類を取り除いてもよい。これらの処理は、同一処理を複数回繰り返して実施してもよく、２以上の異なる処理を組み合わせて実施してもよい。また、得られた抽出物は、更に粉末化や乳化等の処理に供して、所望の形状に調整してもよい。
【００３５】
［添加成分］
本発明のオートファジー活性向上剤は、β-クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステル以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、剤型、適用形態等に応じて、他の添加成分を含有していてもよい。本発明のオートファジー活性向上剤に使用できる添加成分としては、例えば、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤、甘味料、賦形剤等が挙げられる。これらの添加成分は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの添加成分の含有量については、使用する添加成分の種類や、本発明のオートファジー活性向上剤が適用される製品の剤型等に応じて適宜設定される。
【００３６】
［剤型・適用形態］
本発明のオートファジー活性向上剤が使用される製品の剤型については、特に制限されず、固体状、半固体状、又は液体状のいずれであってもよく、オートファジー活性向上剤の適用方法等に応じて適宜設定すればよい。
【００３７】
本発明のオートファジー活性向上剤の適用形態については、特に制限されないが、例えば、経口、経皮、経腸、経粘膜、経静脈、経動脈、皮下、筋肉内等の任意の適用形態で使用できるが、オートファジー活性の向上効果をより一層有効に奏させるという観点から、好ましくは、経口適用が挙げられる。
【００３８】
［使用対象となる製品］
本発明のオートファジー活性向上剤が使用される製品の種類については、特に制限されないが、例えば、飲食品、医薬品、化粧料、飼料、ペットフード等が挙げられる。
【００３９】
例えば、本発明のオートファジー活性向上剤を飲食品に使用する場合、本発明のオートファジー活性向上剤を、そのまま又は他の食品素材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような飲食品としては、一般の飲食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品等が挙げられる。これらの飲食品の形態として、特に制限されないが、具体的には、パン類、麺類等の主菜；チーズ、ハム、ウィンナー、魚介加工品等の副菜；果汁飲料、炭酸飲料、乳飲料等の飲料；クッキー、ケーキ、ゼリー、プリン、キャンディー、ヨーグルト等の嗜好品；カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤）、錠剤、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、リポソーム製剤、栄養ドリンク等のサプリメント等が例示される。これらの飲食品の中でも、好ましくはサプリメント、より好ましくはカプセル剤が挙げられる。当該飲食品は、オートファジー活性向上用の飲食品として使用することができる。
【００４０】
本発明のオートファジー活性向上剤の飲食品への配合量については、特に制限されず、配合される飲食品の種類、期待される効果等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、β-クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルの配合量として０．０００１〜５０質量％、好ましくは０．００１〜５０質量％、更に好ましくは０．０１〜５０質量％が挙げられる。
【００４１】
例えば、本発明のオートファジー活性向上剤を医薬品に使用する場合、本発明のオートファジー活性向上剤を、そのまま又は他の添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような医薬品の形態としては、特に制限されないが、具体的には、錠剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、シロップ剤等の内服用医薬品；乳液剤、懸濁液剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、噴霧剤、貼付剤、パップ剤、リニメント剤、エアゾール剤、軟膏剤、パック剤、吸入剤、坐剤等の外用医薬品；注射剤等が挙げられる。当該医薬品は、オートファジー活性向上用の医薬品として使用することができる。
【００４２】
本発明のオートファジー活性向上剤の医薬品への配合量については、特に制限されず、医薬品の剤型、対象者の年齢等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、β-クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルの配合量として、０．０００１〜５０質量％、好ましくは０．００１〜５０質量％、更に好ましくは０．０１〜５０質量％が挙げられる。
【００４３】
例えば、本発明のオートファジー活性向上剤を化粧料に使用する場合、本発明のオートファジー活性向上剤を香粧学的に許容される基材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような化粧料の形態としては、特に制限されないが、具体的には、クリーム剤、乳液、化粧水（ローション）、パック、洗浄剤、メーキャップ化粧料、頭皮・毛髪用品、オイル、リップ、口紅、ファンデーション、アイライナー、頬紅、マスカラ、アイシャドー、マニキュア・ペディキュア（及び除去剤）、シャンプー、リンス、ヘアトリートメント、パーマネント剤、染毛料、ひげ剃り剤、石けん（ハンドソープ、ボディソープ、洗顔料）等が挙げられる。当該化粧料は、オートファジー活性向上用の化粧料として使用することができる。
【００４４】
本発明のオートファジー活性向上剤の化粧料への配合量については、特に制限されず、化粧料の形態、期待される効果等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、β-クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルの配合量として、０．０００００１〜１０質量％、好ましくは０．００００１〜１０質量％、更に好ましくは０．０００１〜１０質量％が挙げられる。
【００４５】
例えば、本発明のオートファジー活性向上剤を飼料又はペットフードに使用する場合、本発明のオートファジー活性向上剤を単独で又は他の飼料成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。飼料又はペットフードに使用される飼料成分としては、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦等の穀類；ふすま、米ぬか等のぬか類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の粕類；脱脂粉乳、ホエー、魚粉、骨粉等の動物性飼料類；ビール酵母等の酵母類；リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等のカルシウム類；ビタミン類；油脂類；アミノ酸類；糖類等が挙げられる。当該飼料又はペットフードは、オートファジー活性向上用の飼料又はペットフードとして使用することができる。
【００４６】
本発明のオートファジー活性向上剤の飼料又はペットフードへの配合量については、特に制限されず、給餌対象となる動物の種類、飼料又はペットフードの形態等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、β-クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルの配合量として、０．００００１〜１０質量％、好ましくは０．０００１〜１０質量％、更に好ましくは０．００１〜１０質量％が挙げられる。
【００４７】
［適用量］
本発明のオートファジー活性向上剤の適用量については、使用される製品の種類、用途、期待される効果、適用形態等に応じて適宜設定すればよい。例えば、経口適用される場合であれば、β−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルの成人１日当たりの摂取又は投与量が０．０００１〜１００ｇ、好ましくは０．００１〜１０ｇ、更に好ましくは０．０１ｇ〜１ｇとなるように設定すればよい。また、例えば、経皮適用される場合であれば、β−クリプトキサンチン及び／又はその脂肪酸エステルの１日当たりの皮膚への適用量が０．００００１〜１０００μｇ／ｃｍ2、好ましくは０．００１〜５００μｇ／ｃｍ2、更に好ましくは０．０１〜１００μｇ／ｃｍ2となるように設定すればよい。
【００４８】
［用途］
本発明のオートファジー活性向上剤は、生体内でオートファジーマーカータンパク質であるBeclin-1、p62、及びLC3の発現量を低減させ、オートファジー（マクロオートファジー）活性を向上させるので、生体組織内でオートファジー活性を向上させる用途に使用される。特に、本発明のオートファジー活性向上剤は、加齢によるオートファジー活性の低下の抑制、加齢によって低下したオートファジー活性の改善又は回復等の目的で好適に使用される。
【００４９】
本発明のオートファジー活性向上剤において、オートファジー活性を向上させる生体組織については、特に制限されないが、好ましくは筋肉組織が挙げられる。筋肉組織の中でも、長趾伸筋、腓腹筋、足底筋、ヒラメ筋等の骨格筋は、本発明のオートファジー活性向上剤によってオートファジー活性の向上効果が顕著に認められるため、オートファジー活性を向上させる生体組織として特に好適である。
【００５０】
また、本発明のオートファジー活性向上剤は、筋肉組織（特に、骨格筋）におけるオートファジー活性を向上させることにより、筋肉量の増大又は筋肉量の低下抑制が可能になるので、筋肉機能の低下抑制、筋肉量及び筋力の維持・低下抑制、筋肉の老化抑制等の目的で好適に使用され、とえりわけ、加齢による筋肉量・筋力の低下抑制、加齢によって低下した筋肉量・筋力の増大等の目的で特に好適に使用される。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５２】
１．実験方法
（１）細胞培養法
（１−１）培地組成
使用した培地の組成を以下に示す。なお、培地はフィルター滅菌した後に使用した。
[DMEM(10％ FBS、+P/S)]
1 g/l DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium-low glucose）（low glucose）、10％ 牛胎児血清(FBS)、100 units/ml ペニシリンGナトリウム、100 μg/ml ストレプトマイシン、及び0.1 g/l 炭酸水素ナトリウム。
[DMEM（2% HS、+P/S）]
1 g/l DMEM （low glucose）、2 % 馬血清（HS）、100 units/ml ペニシリンGナトリウム、100 μg/ml ストレプトマイシン、及び0.1 g/l炭酸水素ナトリウム。
【００５３】
（１−２）C2C12細胞培養法
マウス由来筋芽細胞株C2C12細胞(European Collection of Authenticated Cell Cultures, Salisbury, England)の培養はDMEM (10％FBS、+P/S) を用いた。ディッシュはNEST培養細胞ディッシュ(SANPLATEC Co.Ltd、Osaka、Japan)を用いた。培養は95％Air、5％CO2、37℃のインキュベーター内で行った。細胞はPhosphate-buffered saline （Ca2+ , Mg2+ -free） （137 mM Sodium chloride, 2.68 mM Potassium chloride, 8.1 mM Disodium hydrogenphosphate 12-water, 1.47 mM Potassium dihydrogenphosphate）(PBS(-))で洗浄し、0.25％ トリプシンと0.02％ エチレンジアミン四酢酸(EDTA)で処理することで細胞を剥がし、新鮮な培地に懸濁することによって継代を行った。細胞は飽和状態の40％に達した時点で1/8量を継代した。
【００５４】
β-クリプトキサンチン（富士フィルム和光純薬株式会社製）は、ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、50 mMに調整したものを適宜DMSOで希釈し、添加したときの培地のDMSOが0.1％になるように添加した。またコントロールとして培地中で0.1％になるようにDMSOを添加した。
【００５５】
（１−３）C2C12細胞の筋管細胞への分化誘導法
DMEM（10％ FBS、+P/S）を用いて飽和状態の90〜100％に達したC2C12細胞をDMEM（2％HS、+P/S）で培養し、2日ごとに新鮮培地に交換することで分化誘導を行った。
【００５６】
（１−４）筋管細胞におけるβ-クリプトキサンチンの影響についての検討方法
C2C12細胞では分化誘導6日目にβ-クリプトキサンチン(10、25、50 μM）存在下で48時間培養し、細胞を回収した。
【００５７】
（２）動物実験法
（２−１）飼育条件
すべての動物は、飼育の環境条件として室温を23±2℃に、照明時間を12時間提示照明（8:00〜20：00）に設定し、床敷きチップ（CLEA Japan Inc.）を敷いたプラスチックゲージで飼育した。飼料は自由摂食させ、飼料水は自由摂水させた。飼料は、CLEA Rodent Diet CE-2（CLEA Japan Inc.）又はAIN-93M精製飼料（CLEA Japan Inc.）を与えた。
【００５８】
（２−２）老化促進モデルマウスSAMP1に及ぼすβ-クリプトキサンチンの効果
老化促進マウスSAMP1（senescence-accelerated-prone mouse 1）(13週齢、雄性)とそのコントロールマウスSAMR1(senescence-accelerated-resistant mouse 1)(13週齢、雄性)は、Japan SLC, Inc.(Shizuoka, Japan)より購入した。予備飼育から実験終了までの期間を通して室温23±2℃、湿度60±10％に、照明時間12時間提示照明(8:00〜20：00)の条件で飼育し、水は自由摂水させた。飼料は、予備飼育中はCLEA Rodent Diet CE-2を、その後はAIN-93M精製飼料を自由摂食させた。7週間の予備飼育の後、SAMP1を2群に分け、下記（３−３）に示すVehicleとβ-クリプトキサンチンミセルを10週間投与した。30週齢時にイソフルラン投与下で屠殺し、各臓器を摘出した。摘出後の各臓器はすぐに重量を測定し、ヒラメ筋は解剖直後に-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)用のサンプル調製を行い、その他は解析を行うまで-80℃で凍結保存した。
【００５９】
（２−３）Vehicle及びβ-クリプトキサンチンミセルの調製法
それぞれの成分の終濃度が以下の通りになるようにミセルを調製した。
・12 mM   タウロコール酸ナトリウム
・1.25 mM  リゾホスファチジルコリン(卵黄由来)
・7.5 mM   オレイン酸
・2.5 mM   モノオレイン
・4.65 mM  β-クリプトキサンチン（Vehicleはβ-クリプトキサンチンを含まない）
・残部     精製水
【００６０】
（２−４）Vehicle及びβ-クリプトキサンチンミセルの投与法
マウス用経口ゾンデ(φ0.9×L 50 mm)を用いて、マウス1匹につき前記Vehicle、β-クリプトキサンチンミセルをそれぞれ200 μl経口投与した。投与は15時〜18時の時間帯に行った。
【００６１】
（３）ウエスタンブロット法
（３−１）細胞回収、サンプル調製
35 mm dishで培養した細胞をPBS(-)で2回洗浄し、セルスクレーパーで細胞を回収し、チューブに移した後、250 g、3分間遠心分離後PBS(-)を完全に取り除いた。細胞溶解液70 μlで懸濁後、氷冷しながら超音波分散機（Handy Sonic UR-21P、TOMY SEIKO CO., LTD.、TOKYO、Japan）（Power 3）を用いて5秒間のソニックを3回行った後、20000 g、15分、4℃で遠心分離後、上清を回収し、タンパク質量を測定した。タンパク質量はBradfordの方法に従い、牛血清アルブミンを標準タンパク質として行ったタンパク質濃度を細胞溶解液で調整して濃度を統一した。2×ローディングバッファー(200 mM Tris-HCl, pH 6.8, 4% ドデシル硫酸ナトリウム, 20% グリセロール, 0.002% ブロモフェノールブルー, 10% 2-メルカプとエタノール)を等量加え、98℃で3分間加熱し、電気泳動用試料とした。
【００６２】
（３−２）組織サンプル調製
マウスのヒラメ筋1本につき細胞溶解液70 μl中でハサミを用いてミンスし、ペッスルを用いてホモジナイズした。氷冷しながら超音波洗浄機 (Handy Sonic UR-21P, TOMY SEIKO CO. LTD., TOKYO, Japan) (Power 3) を用いて5秒間のソニックを3回行った後、20000 ｇ、15分、4℃で遠心分離後、上清を回収し、タンパク質量を定量した。タンパク質量はBradfordの方法に従い、牛血清アルブミンを標準タンパク質として行ったタンパク質濃度を細胞溶解液で調整して濃度を統一した。2×ローディングバッファーを等量加え、98℃で3分間加熱し、電気泳動用試料とした。
【００６３】
（３−３）SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）
SDS-PAGEは、Laemmli（Laemmli UK. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.）の方法に従って行った。分離ゲルは9〜15 ％（分離ゲルのアクリルアミドの濃度は目的のタンパク質の分子量によって使い分けた）、濃縮ゲルは5 ％とし、25 mM トリス、192 mM グリシン、0.1 % SDSを電気泳動緩衝液とした。分子量のマーカーにはTakara Bio Inc. (Shigma、Japan) より購入したProtein Molecular Weight Marker（Broad）を用いた泳動の際、ミニゲル1枚当たり20 mA、ワイドゲル1枚当たり30 mAの電流を流した。
【００６４】
（３−４）ウエスタンブロット法（セミドライ式）
SDS-PAGE終了後、メタノールで平衡化し、ブロッティングバッファー(48 mM トリス, 39 mM グリシン)に浸潤させて前処理した。ポリフッ化ビニリデン（PVDF）メンブレンに、ブロッティング装置を用いて、PVDFメンブレン1 cm2当たり1.5 mAで1時間エレクトロトランスファーを行った。トランスファー後、PVDFメンブレンを、6% スキムミルクを含むTBS(-)(10 mM Tris-HCｌ, pH 7.5, 150 mM 塩化ナトリウム)で１時間ブロッキングを行った。一次抗体（ウサギ抗GAPDHポリクローナル抗体、ウサギ抗Beclin-1ポリクローナル抗体、ウサギ抗p62ポリクローナル抗体、ウサギ抗LC3モノクローナル抗体、ウサギ抗GAPDHポリクローナル抗体、ヤギ抗MuRf1ポリクローナル抗体、ウサギ抗Ubiquitin抗体）を0.05% チメロサール、及び6% スキムミルクを含むTBS(-)又はCan get signal (TOYOBO Co. Ltd.)で希釈し、抗原抗体反応を4℃のインキュベーター内で一晩行った。その後TBS(-)で3分間、3回洗浄し、それぞれの一次抗体に結合するHRP標識二次抗体を0.05% チメロサール、6% スキムミルクを含むTBS(-)で希釈し、1時間反応させた。その後、PVDFメンブレンをTBS(-)で3分間、3回洗浄し、ImmmobilonTM Western Chemiluminescent HRP Substrateに1分間浸透し、LAS-4000 (Fujifilm、Tokyo、Japan）により検出を行った。
【００６５】
（４）筋断面積測定
包埋皿（クリオモルド1号Sakura Finetek Japan Co. Ltd.、Tokyo、Japan）に凍結包埋剤であるSCEM（SECTION-LAB Co. Ltd、Hiroshima、Japan）を入れ、線維方向に垂直に切断し半分にしたヒラメ筋を線維方向にまっすぐになるように埋めた。液体窒素で冷やしたイソペンタンを用いて包埋皿を凍結した。O.C.T Compound （Sakura Finetek Japan Co. Ltd.、Tokyo、Japan）を用いて試料ホルダーに包埋したサンプルを取り付け、-20℃に冷却したクライオスタット（Leica CM1850）（Leica Microsystems Gmbh、Weltzlar, Germany）を用いて10 μmの厚さで切断し、1時間室温で乾燥させた。乾燥させたスライドガラスを10% 中性ホルマリンで固定後、0.1 Mリン酸緩衝液で洗浄した。10% 標準血清を含む0.1 M リン酸緩衝液でインキュベート後、Laminin抗体を含む5% 標準血清と0.3% Triton X-100を含む0.1 M リン酸緩衝液で２時間室温にてインキュベートした。次いで、0.1 Mリン酸緩衝液で洗浄後、Alexa Fluor 488を添加した5% 標準血清と0.1% Triton X-100を含む0.1M リン酸緩衝液でインキュベートした。0.1M リン酸緩衝液で洗浄後、カバーガラスを重ねて封入し、蛍光顕微鏡で観察し、得られた蛍光画像をImage J (version 1.44p; National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) を用いて解析した。
【００６６】
（５）統計処理
統計処理はJMP statistical software version 8.0.1（SAS Institute、Cary、NC、USA）を用いてStudent's-testにより評価し、p<0.05を有意差ありとした。
【００６７】
２．実験結果
（１）C2C12筋管細胞に及ぼすβ-クリプトキサンチンのオートファジーへの影響
β-クリプトキサンチンが骨格筋のオートファジーに及ぼす影響を検討するため、C2C12細胞を分化培地で６日間培養し、筋管細胞へ分化させた後、10 μM、25 μM、50 μMのβ-クリプトキサンチン存在下で更に48時間培養した。細胞を回収し、ウエスタンブロット法によりオートファジーマーカータンパク質であるBeclin-1、p62、及びLC3の発現レベルを評価した。
【００６８】
結果を図１に示す。図１において、（A）にはウエスタンブロットによりオートファジーマーカータンパク質を検出した像を示し、(B)には各タンパク質量をImage Jで定量化し、GADPHにより補正してVehichleを１とした相対値を算出した結果を示す。
【００６９】
Beclin-1は、β-クリプトキサンチン10 μM、25 μM、及び50 μMにより、p62はβ-クリプトキサンチン50 μMによりタンパク質レベルが有意に減少していた。このp62の発現量の低下は、フコキサンチンによってオートファジーが活性化される場合に認められるp62の発現変化と同じ傾向であり（Hou LL, et al., Acta Pharmacol. Sin. 34, 1403-1410. 2013）、β-クリプトキサンチンはC2C12筋管細胞のオートファジーを活性化していることの証左といえる。また、Beclin-1とp62の蓄積が減少していることから、β-クリプトキサンチンによりオートファゴソームとリソソームとの融合によるオートリソソームの分解が進んだと考えられる。また、LC3は、LC3-I及びLC3-II共に、β-クリプトキサンチン50 μMにより減少傾向を示した。なお、LC3-II/LC3-Iはβ-クリプトキサンチンによる影響は認められなかった。以上の結果よりβ-クリプトキサンチンはオートファジーを活性化することが明らかとなった。
【００７０】
（２）老化促進マウスに及ぼすβ-クリプトキサンチンの影響
加齢性筋萎縮によりオートファジー活性が低下している状態でβ-クリプトキサンチンがオートファジーに作用するのかを検討した。
【００７１】
具体的には、加齢性筋萎縮の実験で用いられるモデルマウスである老化促進マウスSAMP1の骨格筋のオートファジーに及ぼすβ-クリプトキサンチンの影響を検討した。SAMP1及びSAMR1を13週齢から20週齢まで予備飼育させ、20週齢目にSAMP1を2群 (コントロール群とβ-クリプトキサンチン群)に分け、前述したVehicleとβ-クリプトキサンチンミセルを10週間投与した。予備飼育の間はCLEA Rodent Diet CE-2を自由摂食させ、20週齢から30週齢時にはAIN-93M精製飼料を自由摂食させた。
【００７２】
13週齢から30週齢まで7日に1回体重を測定した結果を図２の(A)に示し、20週齢から30週齢のAIN-93M精製飼料の摂食量を測定した結果を図２の(B)に示す。この結果、各週齢時において体重・摂食量の群間による差は無かった。
【００７３】
（２−１）組織重量比の比較
30週齢時に摘出した長趾伸筋、腓腹筋、足底筋、及びヒラメ筋の重量と体重を測定し、重量比（組織重量/体重）を求めた。結果を図３に示す。図３において、重量比はSAMP1のコントロール群を1とした相対値により示した。なお、図３において、結果は平均値±SD (SAMR1はn=8、SAMP1のコントロール群はn=10、SAMP1のβ-クリプトキサンチン群はn=9)で示している。
【００７４】
この結果、SAMP1のβ-クリプトキサンチン群では、SAMP1のコントロール群に比べて、長趾伸筋、腓腹筋、足底筋、及びヒラメ筋の重量が増加する傾向が認められた。
【００７５】
（２−２）老化促進マウスのヒラメ筋の筋線維の断面積の比較
ヒラメ筋の筋線維のサイズに及ぼすβ-クリプトキサンチンの影響を評価した。30週齢時に摘出したヒラメ筋における筋線維の筋断面積をLamininで染色して定量した結果を図４に示す。筋線維の断面積の度数分布はSAMP1のコントロール群に比べてSAMR1群では大きいサイズ側に移動した。また筋線維の断面積の度数分布はSAMP1のコントロール群に比べてSAMP1のβ-クリプトキサンチン群では大きいサイズ側に移動した。これらの結果はβ-クリプトキサンチン摂取によりSAMP1の筋線維のサイズが大きくなることを示した。
【００７６】
（２−３）老化促進マウスの骨格筋に及ぼすβ-クリプトキサンチンのタンパク質分解系への影響
加齢性筋萎縮時のタンパク質分解系へのβ-クリプトキサンチンの作用を検討するため、ウエスタンブロット法により30週齢のSAMP1(コントロール群、β-クリプトキサンチン群)及びSAMR1のヒラメ筋におけるユビキチン化タンパク質の発現レベルを評価した。結果を図５に示す。図５において、（A）にはウエスタンブロットによりユビキチン化タンパク質を検出した像を示し、(B)にはユビキチン化タンパク質量をImage Jで定量化し、GADPHにより補正してSAMP1のコントロール群を１とした相対値を算出した結果を示す。
【００７７】
その結果、ユビキチン化タンパク質の発現がSAMR1と比べてSAMP1のコントロール群で増加していたが、SAMP1のβ-クリプトキサンチン群ではその増加が有意に抑制されていることが確認された。老化によりユビキチン化タンパク質が増加することが報告されていることから(Rajasekaran MR. et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. Dec 1;313(6):G581-G588, 2017)、本結果から、β-クリプトキサンチンは、ユビキチン化タンパク質の発現を抑制し、骨格筋の老化抑制に寄与し得ることが明らかとなった。
【００７８】
（２−４）老化促進マウスの骨格筋に及ぼすβ-クリプトキサンチンのオートファジーへの影響
加齢性筋萎縮時のオートファジーへのβ-クリプトキサンチンの影響を検討するため、ウエスタンブロット法により30週齢のSAMP1(コントロール群、β-クリプトキサンチン群)及びSAMR1のヒラメ筋におけるオートファジーマーカータンパク質(Beclin-1、p62、及びLC3)の発現量を測定した。結果を図６に示す。図６において、オートファジーマーカータンパク質をImage Jで定量化し、GADPHにより補正してSAMP1のコントロール群を１とした相対値を算出した結果を示す。
【００７９】
その結果、Beclin-1及びp62は、SAMR1と比べ、SAMP1のコントロール群で増加していたが、SAMP1のβ-クリプトキサンチン群では発現上昇が有意に抑えられた。LC3はLC3-I及びLC3-II共に、SAMR1と比べ、SAMPのコントロール群で発現が増加傾向を示したが、SAMP1のβ-クリプトキサンチン群では、その発現増加が抑えられていた。また、LC3-II/LC3-Iは、群間に差が見られなかった。
【００８０】
また、SAMR1とSAMP1のコントロール群とを比較すると、Beclin-1及びp62の発現が増加しており、更にLC3-IIが増加傾向にあることから、SAMP1のコントロール群では、老化によりリソソームの分解酵素でのオートファゴソーム内容物の分解が減少し、Beclin-1やp62が蓄積したと考えられる。また、SAMP1のコントロール群では、LC3-Iが増加していることより、LC3-IからLC3-IIへの変換の活性が低下していると考えられる。老化により、LC3-IからLC3-IIへ変換する酵素であるAtg7の活性が低下することが報告されている（小倉裕司（2010）身体運動に伴う筋オートファジー関連タンパク質の変化とその加齢による影響 上原記念生命科学財団研究報告集, 24）。また脂肪では老化によりオートファゴソーム形成能が低下することが報告されており、老化によりオートファジー活性が低下するといわれている（江崎淳二、上野隆（2011）日老医誌 48 : 606-612）。これらの結果より、本実験のSAMP1のコントロール群でも、老化によりオートファジー活性が低下していることが確認された。
【００８１】
SAMP1のコントロール群とSAMP1のβ-クリプトキサンチン群を比較すると、Beclin-1、p62、及びLC3-IIの発現が減少しているため、β-クリプトキサンチンによりリソソーム内の分解酵素によるオートファゴソーム内容物の分解が活性化され、Beclin-1、p62、及びLC3-IIの分解が進んだと考えられる。以上の結果から、老化促進モデルにおいて、β-クリプトキサンチンによりオートファジー活性低下が抑制されることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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