(57)【要約】【課題】本発明に至る研究から、驚いたことに、水中油型乳剤中に低酸化魚油及びジュースを含む組成物は、炎症及び/又は根本原因が炎症である疾患の治療に使用できることが見出された。以下に詳しく述べる試験から、魚油及びジュースを含む本発明の組成物で治療すると、その後に炎症過程が遅くなり、炎症反応後の修復が改善されることが示されている。【解決手段】本発明は、炎症及び/又は根本原因が炎症である疾患の治療/消散における、水中油型乳剤中に低totox値の魚油及びジュースを含む組成物の使用を提供する。本発明は、アセチルサリチル酸並びに/又はその誘導体及び/若しくは類似体を含む前記組成物を更に包含する。更に、本発明は、本発明の組成物と、炎症性疾患又は根本原因が炎症である疾患を治療するための治療剤とを組み合わせた使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症及び/又は根本原因が炎症である疾患の治療に使用するための、水中油型乳剤中に魚油とジュースとの組み合わせを含む組成物であって、前記魚油が、20未満のtotox値及び魚油の総質量に対して10質量%超のオメガ-3含有率を有する魚油から選択され、乳剤を安定化させるために適切な乳化剤が使用される、組成物。
【請求項２】
前記炎症又は疾患/状態が、上気道感染症(URTI)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、軽度認知機能障害(MCI)を含めたアルツハイマー病(AD)、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)並びに過体重及び肥満の群、又はそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記疾患が、喘息、嚢胞性線維症、脳卒中、糖尿病、脳震盪を含めた外傷性脳障害、術後認知低下、冠状動脈疾患及び関節リウマチの群、又はそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
魚油のtotox値が、10未満である、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
魚油の含有率が、組成物の全質量に対して約0.5から15質量%である、請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
ジュースの含有率が、組成物の全質量に対して約20〜95質量%である、請求項1に記載の組成物。
【請求項７】
前記ジュースが、適切な高いレベルの抗酸化物質を有する果物及び液果から選択される、請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
ジュースが、ザクロ、アンズ、グレープフルーツ、オレンジ、クランベリー、バラの実、パイナップル、ブラックチョークベリー、クワの実、クラウドベリー、アセロラ、ラズベリー、スイカ、モモ、ブドウ、チェリー、ジャンボラン、リンゴ、マンゴー、セイヨウナシ、アロニア、パッションフルーツ及びキーウィの群から選択される、請求項6又は7に記載の組成物。
【請求項９】
前記乳化剤が、乳固形分、ホエータンパク質、カラスムギタンパク質及びエンドウ豆タンパク質の群から選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項１０】
ペクチンを更に含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１１】
甘味料、香味料、抗酸化物質及び防腐剤を更に含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１２】
投与する場合、EPA及びDHAが約300mg/日から約5000mg/日の範囲内、好ましくは約3000mg/日、より好ましくは約2000mg/日、最も好ましくは約1100mg/日の投与量である、請求項1に記載の組成物。
【請求項１３】
飲用可能であるか、又はカプセル若しくは粉末の形態である、請求項13に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項1に記載の組成物と、炎症性疾患又は根本原因が炎症である疾患を治療するための治療剤とを組み合わせた使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症及び/又は根本原因が炎症である疾患の治療/消散における、水中油型乳剤中に低totox値の魚油及びジュースを含む組成物の使用を提供する。本発明は、アセチルサリチル酸並びに/又はその誘導体及び/若しくは類似体を含む前記組成物を更に包含する。更に、本発明は、本発明の組成物と、炎症性疾患又は根本原因が炎症である疾患を治療するための治療剤とを組み合わせた使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
オメガ-3(n-3)脂肪酸は、炎症が根本原因である疾患及び状態に関連する可能性がある種々の抗炎症及び免疫調節効果を有する。炎症は、体の自己防衛における試みであり、その目的は、有害な刺激を取り除いて治癒過程を開始することである。炎症は、急性炎症と慢性炎症に分類することができ、急性炎症は、急速に始まり、すぐに重篤になる。急性炎症の例は、例えば、急性気管支炎又は急性虫垂炎であり得る。慢性炎症は、例えば、原因物質の排除の失敗、自己抗原に対する自己免疫性応答、又は低い強度が持続する慢性の刺激であり得る。しかし、慢性炎症は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、癌、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病(AD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)等のような重篤な疾患に発展する可能性がある。
【０００３】
オメガ-3脂肪酸は、あらゆる段階において生命に必須であり、これは誕生前でも当てはまる。それらは、体内のすべての細胞の膜の必須な構成単位であり、適正な細胞膜を維持するためにそれらの存在が必要である。それらは、ほとんどの生物学的機能の制御にも寄与する。
【０００４】
長鎖オメガ-3多価不飽和脂肪酸(PUFA)を最も豊富に含む食事供給源は、魚油由来のものである。脂肪酸は食事性脂肪の構成単位であり、実質的にトリグリセリドの形で貯蔵されている。しかし、体はこれらの脂肪酸を産生することができず、食物源又は栄養補助食品から得なければならない。3種の脂肪酸、すなわちα-リノレン酸(ALA)、エイコサペンタエン酸(EPA)及びドコサヘキサエン酸(DHA)が、オメガ-3ファミリーを構成している。ALAは、例えば、クルミ、ある種のマメ及びオリーブ油に見出される。EPA及びDHAは、魚油を含めた魚及び栄養補助食品に見出される。
【０００５】
レゾルビン及びプロテクチンは、EPA及びDHAから誘導される酸素化代謝産物であり、炎症反応に必要とされなくなったときの炎症細胞の除去及び組織の修復に寄与する分子機序の一部である。アスピリンで処理すると、EPA及びDHAから強力な抗炎症シグナルを伝達するレゾルビンへの転化率が高まることが示されている。それらが効果を発揮する機序については未だに議論があるところであるが、前記の酸素化代謝産物は、ナノモル及びピコモルの範囲の濃度であっても強力な抗炎症及び免疫制御効果を有するので、それらは恐らく重要な役割を果たしていると思われる。組織が正常に戻ると、レゾルビン及びプロテクチンは、リポキシン及びマレシンとして更なる酸素化代謝産物と一緒に、白血球及び細胞残屑の除去を通して炎症の消散を促進する。
【０００６】
ボストンのBrigham and Women's Hospitalでの最近の研究から、オメガ-3は、実際に、元の脂肪酸それ自体より10,000倍強力な化合物に転化することが明らかになった。これらの化合物にはレゾルビンが含まれ、これは、体内の炎症反応の終息させるのを助ける。
【０００７】
WO 2007/064222は、水中油型乳剤中に低酸化魚油及びジュースを含む組成物を開示している。しかし、炎症の治療及び/又は消散については開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO 2007/064222
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Cedarbaum JM. The ALSFRS-R: a revised ALS functional rating scale that incorporates assessments of respiratory function. BDNF ALS Study Group (Phase III). J Neurol Sci 1999年; 169: 13〜21
【非特許文献２】Int J of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 2010年:5 217〜222; Tumor necrosis factor-alpha levels in healthy smokers and nonsmokers
【非特許文献３】Saris H.ら、Biochem Pharmacol 2010年3月1日;79(5(:698〜701 ; IL-8 production by macrophages is synergistically enhanced when cigarette smoke is combined with TNF-alpha
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【非特許文献４４】Gleesonら、2011年、Daily probiotic's (Lactobacillus casei Shirota) reduction of infection incidence in athletes. Int J Sport Nutr Exerc Metab 21、55〜64
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明に至る研究から、驚いたことに、水中油型乳剤中に低酸化魚油及びジュースを含む組成物は、炎症及び/又は根本原因が炎症である疾患の治療に使用できることが見出された。以下に詳しく述べる試験から、魚油及びジュースを含む本発明の組成物で治療すると、その後に炎症過程が遅くなり、炎症反応後の修復が改善されることが示されている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、炎症及び/又は根本原因が炎症である疾患の治療に使用するための、水中油型乳剤中に魚油とジュースとの組み合わせを含む組成物であって、前記魚油が、20未満のtotox値及び魚油の総質量に対して10質量%超のオメガ-3含有率を有する魚油から選択され、乳剤を安定化させるために適切な乳化剤が使用される、組成物を包含する。
【００１２】
本発明は更に、炎症及び/又は根本原因が炎症である疾患の治療に使用するための、水中油型乳剤中の魚油とジュースとの組み合わせ、並びに投与量当たり20mgから200mgの範囲内のアセチルサリチル酸及び/又はその誘導体を含む組成物であって、前記魚油が、20未満のtotox値及び魚油の総質量に対して10質量%超のオメガ-3含有率を有する魚油から選択され、乳剤を安定化させるために適切な乳化剤が使用される、組成物に関する。
【００１３】
本発明は更に、本発明の組成物と、炎症性疾患又は根本原因が炎症である疾患を治療するための治療剤とを併用する使用に関する。
【００１４】
好ましい実施形態は、従属請求項及び発明を実施するための形態に記述される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】本発明の組成物[Smartfish(登録商標)]の使用がALSベースラインの炎症性メディエーター転写に及ぼす効果を示す図である。左隅及び右隅の数字は、それぞれ上方制御及び下方制御された炎症性遺伝子の数を示している。これらには、炎症性サイトカインIL1、IL6等、及びケモカインCXCL3、CCL2等が含まれる。4倍より多く上方制御されることが観察されたmRNAレベルはすべて三角が付いた円で示され、4倍より多く下方制御されるものは塗りつぶされた円として示される。
【図１Ｂ】本発明の組成物[Smartfish(登録商標)]の使用がALSベースラインの炎症性メディエーター転写に及ぼす効果を示す図である。左隅及び右隅の数字は、それぞれ上方制御及び下方制御された炎症性遺伝子の数を示している。これらには、炎症性サイトカインIL1、IL6等、及びケモカインCXCL3、CCL2等が含まれる。4倍より多く上方制御されることが観察されたmRNAレベルはすべて三角が付いた円で示され、4倍より多く下方制御されるものは塗りつぶされた円として示される。
【図２】応答者における本発明の組成物及びプラセボの補給に対する代謝応答を示す図である。
【図３】本発明の組成物及びプラセボの補給に応答するデルタLDLコレステロール及びデルタTAGの値(mmol/L)の変化を示す図である。
【図４】本発明の組成物(Smartfish)が16週間の介入期間の間にURTI(上気道感染症)を患う患者に及ぼす効果を比較して示す図である。Smartfishを補給されないURTI患者は、対照群としての役割を果たした。上のパネルは、各群の患者当たりのURTIの症状発現の平均数を示す図である。下のパネルは、各群の症状の総日数を示す図である。
【図５】ELISAによって解析された、LPS刺激マクロファージからの炎症誘発性サイトカインTNF-αの分泌に及ぼす本発明の組成物(Smartfish)及び良質の魚油の効果を示す図である。
【図６】ELISAによる、LPS刺激マクロファージからの炎症誘発性サイトカインIL-6の分泌に及ぼす本発明の組成物(Smartfish)及び良質の魚油の効果を示す図である。
【図７】対照培地、本発明の組成物(Smartfish)又は良質の魚油を添加した培地で培養されたLPS刺激マクロファージでのtnfα及びnfκbの遺伝子発現を示す図である。
【図８】対照培地、本発明の組成物(Smartfish)又は良質の魚油を添加した培地で培養されたLPS刺激マクロファージでのIL8の遺伝子発現を示す図である。
【図９】対照培地、本発明の組成物(Smartfish)又は良質の魚油を添加した培地で培養されたLPS刺激マクロファージでのbax及びgpxの遺伝子発現を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の目的は、炎症及び/又は根本原因が炎症である疾患/状態の治療における、魚油及びジュースを含む組成物の使用を提供することである。該組成物及び該組成物の調製については、本発明者自身の特許である、WO 2007/064222に記載されている。
【００１７】
本発明で使用される組成物は、オメガ-3から誘導される脂質メディエーターが驚くほど効果的に送達され、体内の抗炎症過程に利用されるという点で、高い生物学的利用能を有するオメガ-3供給源であることが、以下の試験で示されている。
【００１８】
本発明では、炎症及び根本原因が炎症である様々な疾患/状態の治療における組成物の使用が試験される。前記炎症又は疾患/状態とは、ALS(筋萎縮性側索硬化症)、MCI(軽度認知機能障害)を含めたAD(アルツハイマー病)、COPD(慢性閉塞性肺疾患)、URTI(上気道感染症)並びに過体重及び肥満である。
【００１９】
本発明の組成物で治療しようとする疾患/状態の更なる例は、喘息、嚢胞性線維症、関節リウマチ、術後認知低下、脳卒中、冠状動脈疾患、糖尿病及び代謝欠陥(metabolic frailty)である。
【００２０】
炎症性腸疾患、外傷性脳障害(脳震盪)、脳卒中からの回復、悪液質及び筋肉減少症においても、該組成物が有益であり得ると考えられる状態として挙げられるべきである。
【００２１】
これらの疾患に共通した特徴は、根本に炎症、特に慢性炎症があることである。
【００２２】
以下に、様々な試験と結果の一部を提示する。
【００２３】
1. ALS(筋萎縮性側索硬化症)
本試験の目的は、11人のALS患者におけるin vivoでの末梢血単核球中のベースラインの炎症性遺伝子転写及びトシリズマブ(tozilizumab)[Actemra(登録商標)]の効果を調査することであり、またFRS-Rスコア(機能評価尺度)を比較して療法の前後の能力障害を測定することであった。Fialaら(公表予定)。患者は、自由に栄養補助食品を摂った。3人の患者は、本発明で使用する組成物を摂った。転写の結果を、実施例1に、ALSFRS-Rスコア(筋萎縮性側索硬化症機能評価尺度)からの結果と共に提示する。
【００２４】
ALSは不治の疾患であり、新たな治療手法が緊急に必要とされている。ALS患者では、脊髄及び末梢血における炎症が明らかに示されている。炎症は、カスパーゼ1、インターロイキン1(IL1)、IL6及びケモカインのシグナル伝達を通して、凝集したスーパーオキシドジスムターゼ1(SOD 1)がマクロファージを活性化させることによって引き起こされる。
【００２５】
11人のALS患者の末梢血単核球におけるin vivoでのベースラインの炎症性遺伝子転写及びトシリズマブ[Actemra(登録商標)](サイトカインアンタゴニスト)の点滴の効果を試験した(トシリズマブは、慢性のリウマチ様障害の主要な機序であるインターロイキン-6(IL6)の広範囲なシグナル伝達を阻害する)。
【００２６】
試験中の患者はALSFRS-Rのスコアを自己申告した。筋萎縮性側索硬化症機能評価尺度(ALSFRS-R)は、運動ニューロン疾患を有する患者の能力障害を評価する、0から48までのスコアである。それは、Cedarbaumとその共同研究者によって開発された[Cedarbaum JM. The ALSFRS-R: a revised ALS functional rating scale that incorporates assessments of respiratory function. BDNF ALS Study Group (Phase III). J Neurol Sci 1999年; 169: 13〜21]。12の質問があり、日常活動及び患者がどの程度の補助を必要としているかを問うものもあれば、特定の症状を問うものもある。
【００２７】
結論として、本発明の組成物を使用することによって、炎症性mRNAの発現が下がり、ALSの進行の遅延が示される(FRS-Rスコアの低下によって測定される)と思われる。
【００２８】
更なる詳細については、実施例1並びに図1A及び図1Bを参照されたい。
【００２９】
2. ALS患者由来のマクロファージについての試験
本試験は、本発明の試験1の追跡試験である。その目的は、ALS患者及び対照由来の細胞試料における抗炎症メディエーターの産生を試験することである。
【００３０】
ALS患者及び対照由来のマクロファージ試料が試験される。試験は、例えば、RvD1、RvD2、RvE1、RvE2、7Mar1、PGE2、LXA4、18-HEPE、17-HDOH等のメディエーターの試験を含む。
【００３１】
3. COPDを有する患者での試験
本試験の目的は、重篤な(入院する程の)増悪に苦しむCOPDの患者における本発明の組成物の潜在的利益を確認すること、気道及び全身性炎症のバイオマーカーに及ぼす本発明の効果を判定すること、並びに最終的に肺リハビリテーションを受けている患者の運動能力の向上に及ぼす本発明の組成物の効果を決定することである。
【００３２】
COPDは、吸入されたガス及び粒子状物質に対する異常な炎症反応によって引き起こされる、高度に蔓延している疾患である。それは進行性の状態であり、気道及び肺胞腔に影響を及ぼす肺の病変の発症によって顕在化し、その病変は生活の質及び機能的動作を制限する恐れのある症状となる。吸入される刺激物質は通常タバコの煙であるが、職業性粉塵及び環境汚染が可変的に関与している。炎症は特定の炎症パターンによって特徴付けられ、ここで鍵となる炎症細胞は、マクロファージ、CD8+、Tリンパ球及び好中球である。
【００３３】
近年の研究から、COPDは肺以外の臓器にも影響を及ぼし、幾つもの全身症状を引き起こすことが確認されてきた。現在の治療戦略は、現在の標準的ケアである吸入療法を使用して、肺を標的とすることである。COPD患者の詳細な臨床試験から、個体の多くに栄養不良の徴候が現れており、食事が貧弱であることが多く、筋機能が損なわれていることが確認されてきた。これにより、栄養状態を経口栄養補助食品で増強する戦略が開発され、現在、それが低BMIの又は体重減少の病歴がある患者に示されている。
【００３４】
カロリー又はタンパク質の摂取量を単純に増大させるという追加的な治療上の利益をもたらす可能性のある栄養豊富な経口栄養補助食品の開発は、これらの患者の治療にとりわけ重要な分野である。その理由は、そうした患者は、恐らく呼吸筋の活動が増大したために必要なエネルギーが増加していることが多く、同時に咀嚼と嚥下が両方とも障害されている可能性があるためである。しかし、体重減少は重要な負の要因であることから、COPDの予防及び管理には食事及び栄養が重要な要因であり得る(Schoolsら)ことが、以前に示唆されている。試験に参加した患者は45〜80歳であり、確定診断を得ている。治験期間は最長6か月である。
【００３５】
更なる詳細については、実施例2を参照されたい。
【００３６】
4. COPD 2
本試験は上の試験番号3の追跡試験であり、COPDの状態を模した細胞試験を含み、ここでは、マクロファージ及び他の細胞の炎症マーカーを試験する。本試験の目的は、細胞における炎症に及ぼす本発明の組成物の効果を比較することであり、ここでは、前記細胞を本発明の組成物、又はオメガ-3を含有する別の組成物に供した。
【００３７】
炎症マーカー、とりわけTNF-α及びIL-8の変化は、COPDと関連性が高いことが示唆されている。(Int J of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 2010年:5 217〜222; Tumor necrosis factor-alpha levels in healthy smokers and nonsmokers)、及びSaris H.ら、Biochem Pharmacol 2010年3月1日;79(5(:698〜701 ; IL-8 production by macrophages is synergistically enhanced when cigarette smoke is combined with TNF-alphaを参照されたい。
【００３８】
5.  組成物の使用が周術期の神経認知アウトカムに及ぼす効果
このプロジェクトの目的は、整形外科手術の患者に通常影響を及ぼす、認知機能及び疼痛を含めた大手術後の術後アウトカムに、オメガ-3必須脂肪酸の補給が(内在性レゾルビンの産生を増大させる手段として)及ぼす影響を試験することである。
【００３９】
作業仮説は次の通りである。すなわち、本発明の組成物を手術前に予防的に4週間毎日補給すると、1)術後の認知低下が予防又は改善される; 2)慢性及び急性の術後痛の徴候が緩和される; 3)整形外科の大手術後に組織/骨の治癒が向上する。現状技術の神経心理学検査を使用して行う。
【００４０】
探求を目的として、本発明者らは、4週間毎日のSmartFish 1100(登録商標)(本発明の組成物)がどれほどオメガ-3指数(血中のAA:EPA、オメガ-6:オメガ-3)及びレゾルビンの産生に影響を及ぼすのかを理解するために、健康なボランティアに及ぼすオメガ-3補給の効果を検査する。概して、本試験は、オメガ-3必須脂肪酸によって高められたレゾルビン産生と周術期アウトカム(認知、疼痛、治癒)との関係を探求する。
【００４１】
手術及び重症疾患によって認知機能障害に至ることが多く、それには現在のところ依然として有効な予防的治療がない。急性認知機能障害(せん妄)は、一般的な入院後の患者の14〜24%に起こり、亜急性及び苦痛緩和状況又は集中治療室(ICU)への入院後では70%の度合いにも達すると推定され、とりわけ高齢の患者の中に見られることが多い(1)。手術後の認知機能の経過(cognitive trajectory)及びせん妄は、術後最初の1年間で更に悪化して、学習及び記憶、集中力、推理、抽象思考、言語理解、社会的統合、方向を含めた複数の領域で長期化した障害に至る可能性があり、永続的な認知症に寄与する可能性がある。認知機能の回復の障害は、急性であれ長く持続するものであれ、1年間の死亡率の増加、機能低下にも関連し、医療費への相当な負担となる。
【００４２】
本発明者らは以前に、ヒトにおける認知機能障害に至ることが多い整形外科手術のマウスモデルを使用して、神経炎症及び手術により誘発される認知低下を発症する背後にある、鍵となる全身性炎症の役割を決定した。最近、本発明者らは、整形外科手術後のマウスでの、術後の神経炎症及び認知低下の制御におけるレゾルビンの新規な役割について初めて報告した。
【００４３】
レゾルビン及びプロテクチンは、自己限定性の炎症の消散の間に、n-3脂肪酸であるエイコサペンタエン酸(EPA)及びドコサヘキサエン酸(DHA)から生成される局所的な脂質メディエーターのファミリーである。Serhanらは、多価不飽和脂肪酸から誘導されるこうした強力な抗炎症の特殊化炎症収束脂質メディエーター(specialized proresolving lipid mediator)(SPM)について初めて記載した。これらには、アラキドン酸から誘導されるリポキシン、長鎖n-3脂肪酸であるエイコサペンタエン酸(EPA)から誘導されるEシリーズのレゾルビン、並びにすべてn-3脂肪酸ドコサヘキサエン酸(DHA)から誘導される、Dシリーズのレゾルビン、プロテクチン/ニューロプロテクチン及びマレシンが含まれる。幾つもの前臨床疾患モデル、例えば、中でも虚血再灌流障害後の腎損傷、実験的大腸炎、微生物による敗血症、脳卒中から保護するレゾルビンの役割には、山のような証拠がある。(RvD1は、齧歯動物モデルでは、炎症痛及び術後痛を低減させる抗侵害受容性作用物質としても、いずれにも関与してきた。最近、RvD1と17RエピマーであるAT-RvD1の両方が健康なドナーの末梢血中に確認されたが、周術期状況におけるSPMの役割及び手術の予後の悪化のバイオマーカーとしてのSPMの役割について評価した研究はまだない。
【００４４】
更なる詳細に関しては、実施例3を参照されたい。
【００４５】
6.  嚢胞性線維症の試験
本試験の目的は、脂肪酸、すなわち本発明の組成物の長期の補給が嚢胞性線維症を有する患者の臨床状態に及ぼす影響を調査することである。
【００４６】
50年以上前から、嚢胞性線維症(CF)を有する患者は必須脂肪酸であるリノール酸(LA)のレベルが低いことが周知であり、また長鎖多価不飽和脂肪酸(LCPUFA)であるDHAが血漿及び組織中で減少していることも周知である(Kuo PT、Huang NN、Bassett DR.、J Pediatr 1962年;60:394〜403; Underwood BA、Denning CR、Navab M.、Ann NY AcadSci 1972年;203:237〜47)。1975年過ぎに、新生児の膵臓機能がイントラリピドの投与後に回復したときに[Elliott RB、Robinson PG.、Arch Dis Child. 1975年1月;50(1):76〜8]、数回の短期の治験が行われ、成長[Kusoffsky Eら、JPGN 1983年;2(3):434〜8; Steinkamp G.ら、JPGN 2000;34:418〜23; Maqbool Aら、JPGN 2008; 47: 635〜44]及び肺機能[Lloyd-Still JDら、ActaPediatr 1996年;85: 1426〜32; Lai HJら、Pediatrics. 2009年2月; 123(2):714〜22]にわずかな効果を及ぼすことが示された。オメガ-6とオメガ-3脂肪酸を組み合わせた最近の試験から、オメガ-3脂肪酸だけを補給したときと比較して幾つかのパラメータに顕著な向上が示されたが、この場合、臨床的利点は得られなかった[Oliveira Gら、tic Arch Bronconeum. 2010;46(2):70〜77 Oliver C、Jahnke N、Cochrane Database SystRev. 2011年8月10日;(8):CD002201; Alicandro Gら、Prostagland Leurkotr Ess Fatty Acids 2013年; 88: 163〜9]。遺伝子が確認される前に行われた長期の小規模対照試験では、腎臓及び肝臓のパラメータに向上が認められた(Strandvik B. Acta Paediatr Scand 363 : 58〜65、1989年; Strandvik B. Ann Nestle 2006年; 64: 131〜40)。CFを有するスウェーデンの患者の比較的大きい患者コホートでは、オメガ-6に富む油及びイントラリピドでの非常に長期であるが非対照の治療によって、成長、骨塩量、肺機能、肺の増悪の低減、及び低臨床感染状態に関して、他の国際センターと比較して並外れて良好な臨床状態となった(Strandvik B., Ann Nestle 2006年; 64: 131〜40)。しかし、長期の対照試験が不足しているので、恐らく、若年齢からの高い身体活動のような他の治療法がスウェーデンの患者の良好な臨床状態に大きな重要性を持っていたと思われる。本試験には、2種の重度の突然変異(例えば、dF508、394delTT)を引き起こすCF及び膵不全を有する50人の患者が含まれていた。患者は、通常通りのPERT及びビタミンの治療並びに肺の症状及び感染症のための治療を続けた。患者を無作為に振り分け、LA(900mg)及び本発明の組成物(DHA 400mg、EPA 200mg)又は高オレイン酸のヒマワリ油(1.5g)を含む果汁を毎日12か月間与えられる。無作為化はジェネレータによって為され、25mlの果汁だけが番号付けされるので、患者のみならず介護者も補給物の種類から情報を与えられることはない。
【００４７】
更なる詳細については、実施例4を参照されたい。
【００４８】
7.  ベースラインの代謝タイプにより応答が予測される過体重及び肥満の青年において、本発明による組成物はインスリン感受性を選択的に向上させる
本試験の目的は、本発明の組成物が14〜18歳の小児においてインスリン感受性を向上させるかどうかを調査することであった。
【００４９】
食事摂取が変化したことによって、高脂肪、高エネルギーで、微量栄養素が希薄な食事を消費する小児が増えている(IUNA、2008)。アイルランドの青年の56%超が35%超のエネルギーを食事性脂肪から得ており、3人に1人の青年が果物を全く消費していない(IUNA、2008)。この様式の食事摂取は健康的な食事のガイドラインから外れており、こうしたバランスの悪い栄養素の摂取が、これらの若年者集団における過体重及び肥満の有病率の増加に拍車をかけている[Jennings A、Welch A、van Sluiis EM、Griffin SJ、Cassidy A(2011年) Diet Quality is independently associated with weight status in children aged 9-10 years. J Nutr. 141(3):453〜9]。
【００５０】
新たに出現した肥満及び糖尿病のモデルは、亜急性慢性炎症及びインスリン抵抗性によって特徴付けられる[Hu FB、Meigs JB、Li TY、Rifai N、Manson JE. Inflammatory markers and risk of developing type 2 diabetes in women. Diabetes 2004年;53 :693〜700。Irish Universities Nutrition Alliance (IUNA). 2008年. National Teen's Food Survey]。機序的データから、炎症を起こした脂肪組織では免疫細胞の湿潤が増大しており、その免疫細胞が炎症誘発性サイトカインを生じることが示されている[Weisberg, S.P.ら、Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. J Clin Invest、2003年。112(12): 1796〜808頁; Nishimura, S.ら、CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nat Med、2009年. 15(8): 914〜20頁]。
【００５１】
これらのサイトカインは、次に、インスリンシグナル伝達経路の必須成分を下方制御することによって、インスリン感受性を妨害する[McGillicuddy FC、ChiquoineEH、Hinkle CC、Kim RJ、Shan R、Roche HM、Smyth EM及びReilly MP(2009年) IFNγ attenuates insulin signalling, lipid storage and differentiation in human adipocytes via activation of the JAK/STAT pathway. J Biol Chem. 284(46):31936〜44]。小児期の肥満が世界中で増加しつつある一方で、炎症誘発性状態の影響、並びにそれによりメタボリック症候群及び糖尿病が予測されることは、若年期では比較的知られていない。
【００５２】
小児期の肥満は早いペースで増加しているので、過体重及び肥満の小児に見られる亜急性慢性炎症を減少させる、非薬理学的療法の役割を確立することが重要である。以前の試験から、成人では、食事介入によって肥満に伴う慢性の炎症状態を減弱できることが説明されている[Bakker GC、van Erk MJ、Pellis L、Wopereis S、Rubingh CM、Cnubben NH、Koositra T、van Ommen B、Hendriks HF. An anti-inflammatory dietary mix modulates inflammation and oxidative and metabolic stress in overweight men: a nutrigenomics approach. Am J Clin Nutr 2010年4月;91(4): 1044〜59]。
【００５３】
幾つかの食物は、抗炎症性があることが知られている栄養素を含有する[Puglisi MJ、Fernandez ML. Modulation of C-reactive protein, tumor necrosis factor-alpha, and adiponectin by diet, exercise, and weight loss. J Nutr. 2008年12月; 138(12):2293〜6]。そのような食物として、魚、並びに果物及び野菜が挙げられる。
【００５４】
本試験の結果は、本発明の組成物のインスリン増感効果に関する不均一性を明示している。非応答者とBMIが同様であるにもかかわらず、インスリン抵抗性で脂質代謝異常という代謝タイプの応答者は、栄養による抗炎症手法の影響が強かった。これにより、個別化された栄養補給という状況の中で効力を最適化する可能性があることが説明される。更なる詳細については、実施例5を参照されたい。
【００５５】
8.  糖尿病及び冠状動脈疾患についての試験
本試験の目的は、2型糖尿病及び冠状動脈疾患を有する患者における凝固、血小板活性化、炎症及び酸化ストレスのバイオマーカーの向上に、オメガ-3多価不飽和脂肪酸(PUFA)が関与しているのかどうかを調査することである。
【００５６】
2型糖尿病及び冠状動脈疾患を有する患者は、心血管イベントを起こす危険性が増大している。糖尿病患者の罹病及び死亡原因として冠状動脈疾患が最も多い。冠状動脈疾患における高血糖の有害な影響に関与する幾つかの機序が想定されてきた。すなわち、酸化ストレスの強化、血液の凝固及び血小板の活性化、炎症の刺激、及び内皮細胞機能障害である。これらはすべて、2型糖尿病にも報告されてきた[Undas A、Ariens RA.、Arterioscler Thromb Vase Biol. 2011年8月11日.(電子出版が印刷に先行) PubMed PMID: 21836064; Undas Aら、J Thromb Haemost. 2011年4月;9(4): 870〜3. doi: 10.1111/j.1538〜7836. 2011.04198.x. PubMed PMID: 21251200; Undas Aら、Blood. 2009年11月5日; 114(19):4272〜8. 電子出版2009年8月18日. PubMed PMID: 19690336]。更に、本発明者らは、高血糖が、糖尿病患者だけでなくin vitro条件下においても、トロンビン生成の増大及び血小板の活性化、不利に変化したフィブリン塊の性質、及び繊維素溶解の低減と結び付いていることを明示した。
【００５７】
本発明者らは、最近、経皮的冠動脈形成術の後にn-3 PUFAをアスピリンとクロピドグレルとの組み合わせに追加すると、クロピドグレルに対する血小板の応答が有意に助長されることも明示した[(Celinska-Lowenhoff Mら、kow. Thromb Haemost. 2011年8月; 106(2):379〜81. 電子出版2011年6月9日. PubMed PMID: 21655678]。
【００５８】
更に、本発明者らは、経皮的冠動脈形成術を受けた冠状動脈疾患患者における標準的療法にn-3 PUFAを追加すると、トロンビンの形成、酸化ストレスが有意に減少し、フィブリン塊の性質が有利に変化することを証明した[Gajos Gら、(OMEGA-PCI clot). Arterioscler Thromb Vase Biol. 2011年7月;31(7): 1696〜702. 電子出版2011年5月26日. PubMed PMID: 21617138]。
【００５９】
n-3 PUFAについてのこうした性質は、冠状動脈疾患及び付随する糖尿病を有する患者にとりわけ有益であり得ると思われる。
【００６０】
更なる詳細については実施例6を参照されたい。
【００６１】
9.  運動誘発性喘息;呼吸生理学及び炎症についての試験
本試験の目的は、吸入誘発試験後の呼気一酸化窒素を調べることである。参加者は、運動の前後に200mlのNutrifriend(登録商標)(本発明の組成物)を1日に2回(1日当たり4gのDHA/EPA)を摂る。対照群は、1日に2回、試験群と同じ時間に飲料を与えられる。
【００６２】
10.  運動者集団においてURTI(上気道感染症)に及ぼす効果についての試験
本試験の目的は、本発明の組成物(以降、Smartfishジュース又は単にSmartfish)の食事摂取が運動者集団におけるURTIの発生率に及ぼす効果を調査することである。
【００６３】
運動がURTIの発生率に及ぼす効果は、運動競技者及び娯楽として運動する人だけでなく、免疫系が損なわれているために既に危険性のある特定の集団(例えば、高齢者)を考慮する上でも重要である。
【００６４】
その結果から、Smartfishで治療した群では、患者当たりのURTIの症状発現数が低減する傾向、及び症状の総日数が有意に低減する傾向が示された。
【００６５】
よって、その結果から、本発明の組成物は上気道感染症の治療に使用できることが示される。
【００６６】
更なる詳細については、実施例7を参照されたい。
【００６７】
11. LPS刺激マクロファージに及ぼす免疫調節効果
本試験の目的は、本発明の組成物(以降、Smartfishジュース又は単にSmartfish)が、LPSで処理したマクロファージ細胞培養物における炎症過程にプラス効果を及ぼすかどうかを調査すること、及びSmartfishジュースの効果を良質な魚油のそれと比較することである。
【００６８】
本試験から、Smartfishジュースは、LPSで刺激されたヒトマクロファージからの炎症誘発性サイトカインTNF-αの分泌を低減させることが明示された。更に、LPSで刺激されたヒトマクロファージにおいて、Smartfishジュースは炎症及びストレス応答に関与する遺伝子(tnf-α、IL8、nfkb、gpx及びbax)の発現を低減させることが明示された。Smartfishジュースの効果は、対照である同様の良質の油より有意に良好であった。
【００６９】
更なる詳細については実施例8を参照されたい。
【００７０】
12. AD患者由来のマクロファージ中のレゾルビンレベル
本試験の目的は、抗炎症メディエーターであるレゾルビンD1の産生を調べ、本発明の組成物(以降、Smartfishとする)が、アルツハイマー病を患う患者に由来する細胞試料においてレゾルビンD1の量を増加させる能力があるのかどうかを試験することであった。
【００７１】
前に述べたように、レゾルビンは、EPA及びDHAから誘導される酸素化代謝産物であり、ナノモル及びピコモルの範囲の濃度であっても強力な抗炎症作用及び免疫制御作用を有する。
【００７２】
本試験の結果から、本発明の組成物は、マクロファージ中のレゾルビンレベルを増加させるのに有意に寄与していることが明らかに示された。
【００７３】
更なる詳細については実施例9を参照されたい。
【００７４】
上述の試験の主な焦点は、炎症及び/又は炎症が根本原因である疾患の治療における本発明で使用される組成物の驚くべき有益な影響を明らかにすることである。
【００７５】
これらの試験からの結果により、炎症過程が改変され、炎症反応後の修復が向上することが示される。したがって、本発明の組成物は、栄養を補助するものであるという目的、及び治癒過程に重要なオメガ-3代謝産物を供給することを通して炎症後のバランスを修復するのに活性な疾患修飾性栄養素であるという目的を果たすので、本発明の組成物の使用は、慢性炎症を被る患者に有益であると思われる。
【００７６】
本発明に使用される組成物は、水産物の乳剤として高い安定性を有することが示されており、低酸化が可能であり、壊されやすい栄養素をそのまま強力な状態で保持するので、吸収が増大し、生物学的利用能が高くなる。
【００７７】
該組成物は、
a)医療及び/又は栄養的効果を得るのに十分な濃度の、低totox値の脂肪酸、とりわけオメガ-3脂肪酸、並びに
b)天然に存在する抗酸化物質を含有するジュース;
c)乳化剤
を含む。
【００７８】
組成物の様々な態様がWO 2007/064222に記載されているが、本発明ではその組成物を更に改変したものを用いてもよい。
【００７９】
組成物中の魚油は、望ましくない味及び魚の後味をもたらすことが多い。本発明で使用するための組成物には、例えば味の良い飲料であるという利点があり、それは、味の変化及び食欲減退を感じる患者に重要な必要条件であり得る。
【００８０】
したがって、本発明の一態様は、炎症及び/又は根本原因が炎症である疾患の治療における、水中油型乳剤中に魚油とジュースとの組み合わせを含む組成物の使用であって、前記魚油が、20未満のtotox値及び魚油の総質量に対して10質量%超のオメガ-3含有率を有する魚油から選択され、乳剤を安定化させるために適切な乳化剤が使用される、組成物の使用に関する。
【００８１】
本発明の組成物の使用は、任意の炎症又は根本原因が炎症である疾患の治療に有益であり得る。
【００８２】
本発明では、炎症及び根本原因が炎症である様々な疾患/状態の治療における該組成物の使用を試験する。前記炎症又は疾患/状態は、ALS(筋萎縮性側索硬化症)、MCI(軽度認知機能障害)を含めたAD(アルツハイマー病)、COPD(慢性閉塞性肺疾患)、URTI(上気道感染症)並びに過体重及び肥満である。
【００８３】
別の実施形態では、本発明の組成物は、喘息、嚢胞性線維症、関節リウマチ、術後認知低下、脳卒中、冠状動脈疾患、糖尿病及び代謝欠陥の群、又はそれらの任意の組み合わせから選択される疾患の治療に使用することができる。
【００８４】
炎症性腸疾患、外傷性脳障害(脳震盪)、脳卒中からの回復、悪液質及び筋肉減少症においても、該組成物が有益であり得ると考えられる状態として挙げられるべきである。
【００８５】
魚油は、適正な品質、すなわち酸化のレベルが低くなければならない任意の魚油調製物から選択されてもよい。適正な品質のものであるために、totox値として与えられる酸化レベル[過酸化物価(PV)の2倍にアニシジン価(AV)を加える]は、20未満であるべきである。好ましい実施形態では、totox値は10未満であってもよい。そのような適正な品質の魚油は、通常、極めて弱い魚の匂い及び味を有する透明な油である。
【００８６】
オメガ-3脂肪酸の含有率は、魚油調製物が異なれば大きく異なる。オメガ-3脂肪酸の含有率は高いことが好ましい。好ましい実施形態によれば、本発明の組成物に使用される魚油中のオメガ-3脂肪酸の含有率は、魚油の質量に対して少なくとも10質量%、好ましくは少なくとも16質量%、又は最も好ましくは30質量%超であるべきである。
【００８７】
本発明の好ましい一実施形態は、魚油の含有率が組成物の全質量に対して質量で約0.5%〜15%、より好ましくは2%〜7%の範囲内、最も好ましくは約2%〜5%である組成物を提供する。
【００８８】
本発明の更なる実施形態では、ジュースの含有率は、組成物の全質量に対して約20〜95質量%である。ジュースは、適切な高いレベルの抗酸化物質を有する果物及び/又は液果から選択されてもよい。果物は、酸化剤として機能する金属イオンを最低限レベル有することが更に好ましい。
【００８９】
好ましいジュースは、ザクロ、アンズ、グレープフルーツ、オレンジ、クランベリー、バラの実、パイナップル、ブラックチョークベリー、クワの実、クラウドベリー、アセロラ、ラズベリー、スイカ、モモ、ブドウ、チェリー、ジャンボラン、リンゴ、マンゴー、セイヨウナシ、アロニア、パッションフルーツ、レモン及びキーウィの群から選択されてもよい。更に、ジュースは、ビートの根、ニンジン、リンゴンベリー(コケモモ)、グアバ(quava)、クロイチゴ、又は青物、例えば、ケール、ホウレンソウ、セロリ、パセリ若しくはキュウリから選択されてもよい。しかし、魚油の酸化を安定化させるのに適切な任意のジュースが使用されてもよい。濃縮ジュース及びジュースピューレに水を添加することによってジュースを調製して、すぐに使用できる通常のジュースを得てもよい。ジュースは、絞った新鮮なジュースであってもよい。
【００９０】
更に、本発明によって使用される組成物は、ヨーグルト粉末又は他の粉末、例えば、ヘンプミルク粉末、アーモンドミルク粉末若しくはカラス麦ミルク粉末を含んでもよい。そのような添加物を添加することによって、組成物はとろみが増し、魅力的な粘度となる。添加する量は、組成物の全質量に対して5〜10質量%の範囲内であってもよい。
【００９１】
一実施形態では、組成物はミルク成分を何も含まない。
【００９２】
組成物は、ビタミン類、好ましくはビタミンDが更に追加されてもよい。一例として、ビタミンDの量は、単位用量である200ml当たり1μgから2000μg、好ましくは単位用量である200ml当たり5μgから50μg、最も好ましくは単位用量である200ml当たり10μgから20μgである。葉酸を含めたビタミンBも添加されてもよい。セレン及び亜鉛のようなミネラルも添加されてもよい。
【００９３】
魚油及びジュースを含む水中油型乳剤を安定化させるために、適切な乳化剤が使用される。適切な乳化剤は、乳固形分、ホエータンパク質、カラスムギタンパク質及びエンドウ豆タンパク質の群から選択されてもよい。乳化剤は、例えば、Grindsted又はLacprodanであってもよいが、任意の適切な乳化剤が用いられてもよい。更に、本発明は増粘剤を含んでもよく、それは好ましくはペクチンであってもよく、好ましくはカラスムギ由来の、より好ましくは果物由来の、例えば柑橘類由来のペクチンであってもよい。
【００９４】
本発明の更なる好ましい実施形態では、組成物は、甘味料、香味料、抗酸化物質、及び防腐剤を含んでもよい。好ましい防腐剤及び甘味料はそれぞれ、ソルビン酸カリウム及びキシリトールであってもよい。
【００９５】
本発明による好ましい抗酸化物質は、トコフェロールである。
【００９６】
一実施形態では、該組成物には、天然に存在しない追加的な抗酸化物質が何も添加されない。
【００９７】
本発明の更に好ましい実施形態では、該組成物は、投与する場合、EPA及びDHAが約300mg/日から約5000mg/日の範囲内、好ましくは約3000mg/日、より好ましくは約2000mg/日、最も好ましくは約1100mg/日の投与量であるものでもよい。治療的な効果を達成するために、投与量を低くしても、更に高くしてもよい。組成物は、50〜300mlの容積の範囲内、好ましくは100ml、より好ましくは200mlの飲料として投与されてもよい。本発明の組成物を必要とする人は、1日に1つ又は複数の単位用量の飲料を飲んでもよい。体重等は投与量の算出に使用されるべきパラメータとなると見込まれるので、投与量は個人毎に異なっていてもよい。
【００９８】
本発明の好ましい実施形態では、該組成物は、飲用可能であってもよいし、カプセル若しくは粉末の形態であってもよい。
【００９９】
更なる実施形態では、本発明の組成物は、補助療法として使用されてもよく、又は特定の疾患若しくは障害を治療するために使用される他の治療剤、例えば、問題とする炎症性疾患若しくは根本原因が炎症である疾患を治療するために使用される従来の薬物と組み合わせて使用されてもよい。
【０１００】
用語「組み合わせて」とは、本発明の組成物と他の治療剤とが、治療効果を生じるような量で、治療効果を生じるような投与回数に分けて投与されることを意味する。本発明の組成物及び他の治療剤は、根本原因が炎症である疾患の炎症の治療に使用するために、同時に投与されても、逐次投与されてもよい。本発明の組成物及び他の治療剤は、別々の製剤の形でもよいし、組み合わせ製剤と共に製剤化されてもよい。「他の治療剤」には放射線療法が含まれる。
【０１０１】
組成物の様々な態様がWO 2007/064222に記載されているが、本発明では組成物を更に改変したものを用いてもよい。よって、本発明の一態様は、アセチルサリチル酸並びに/又はその誘導体及び/若しくはその類似体を含む前記組成物、並びに炎症及び/若しくは根本原因が炎症である疾患の治療に使用するための前記組成物の使用に関する。
【０１０２】
最近、アスピリンがレゾルビンの産生を引き起こすのを助けることが示され、また更に、アスピリンは、異なる経路を通して、より長く作用する形態のレゾルビンD3の産生を引き起こすことが報告された。これらのレゾルビンは、有害な状態、例えば、炎症性の肺疾患、心臓疾患及び関節炎の根本にある炎症を止める又は消散させる。
【０１０３】
一実施形態では、前記炎症及び/又は根本原因が炎症である疾患は、ALS(筋萎縮性側索硬化症)、MCI(軽度認知機能障害)を含めたAD(アルツハイマー病)、COPD(慢性閉塞性肺疾患)、URTI(上気道感染症)並びに過体重及び肥満である。
【０１０４】
別の実施形態では、本発明の組成物は、喘息、嚢胞性線維症、関節リウマチ、術後認知低下、脳卒中、冠状動脈疾患、糖尿病及び代謝欠陥の群、又はそれらの任意の組み合わせから選択される疾患の治療に使用することができる。
【０１０５】
炎症性腸疾患、外傷性脳障害(脳震盪)、脳卒中からの回復、悪液質及び筋肉減少症においても、該組成物が有益であり得ると考えられる状態として挙げられるべきである。
【０１０６】
したがって、本発明のある態様は、水中油型乳剤中の魚油とジュースとの組み合わせ、並びに投与量当たり20mgから200mgの範囲内のアセチルサリチル酸及び/又はその誘導体を含む組成物であって、前記魚油が、20未満のtotox値及び魚油の総質量に対して10質量%超のオメガ-3含有率を有する魚油から選択され、乳剤を安定化させるために適切な乳化剤が使用される、組成物の使用に関する。
【０１０７】
魚油は、適正な品質、すなわち酸化のレベルが低くなければならない任意の魚油調製物から選択されてもよい。適正な品質のものであるために、totox値として与えられる酸化レベル[過酸化物価(PV)の2倍にアニシジン価(AV)を加える]は、20未満であるべきである。好ましい実施形態では、totox値は10未満であってもよい。そのような適正な品質の魚油は、通常、極めて弱い魚の匂い及び味を有する透明な油である。
【０１０８】
オメガ-3脂肪酸の含有率は、魚油調製物が異なれば大きく異なる。オメガ-3脂肪酸の含有率は高いことが好ましい。好ましい実施形態によれば、本発明の組成物に使用される魚油中のオメガ-3脂肪酸の含有率は、魚油の質量に対して少なくとも10質量%、好ましくは少なくとも16質量%、又は最も好ましくは30質量%超であるべきである。
【０１０９】
本発明の好ましい一実施形態は、魚油の含有率が組成物の全質量に対して質量で約0.5%〜15%、より好ましくは2%〜7%の範囲内、最も好ましくは約2%〜5%である、組成物を提供する。
【０１１０】
本発明の一実施形態では、アセチルサリチル酸の含有率は、20から2000mg/投与量、好ましくは50から1000mg/投与量、より好ましくは80から500mg/投与量の範囲内であってもよい。それより低い又は高い用量であっても好ましい場合がある。
【０１１１】
本発明の更なる実施形態では、ジュースの含有率は、組成物の全質量に対して約20〜95質量%である。ジュースは、適切な高いレベルの抗酸化物質を有する果物及び/又は液果から選択されてもよい。果物は、酸化剤として機能する金属イオンを最低限レベル有することが更に好ましい。
【０１１２】
好ましいジュースは、ザクロ、アンズ、グレープフルーツ、オレンジ、クランベリー、バラの実、パイナップル、ブラックチョークベリー、クワの実、クラウドベリー、アセロラ、ラズベリー、スイカ、モモ、ブドウ、チェリー、ジャンボラン、リンゴ、マンゴー、セイヨウナシ、アロニア、パッションフルーツ、レモン及びキーウィから選択されてもよい。更に、ジュースは、ビートの根、ニンジン、リンゴンベリー(コケモモ)、グアバ、クロイチゴ、又は青物、例えば、ケール、ホウレンソウ、セロリ、パセリ若しくはキュウリの群から選択されてもよい。しかし、魚油の酸化を安定化させるのに適切な任意のジュースが使用されてもよい。濃縮ジュース及びジュースピューレに水を添加することによってジュースを調製して、すぐに使用できる通常のジュースを得てもよい。ジュースは、絞った新鮮なジュースであってもよい。
【０１１３】
更に、本発明によって使用される組成物は、ヨーグルト粉末又は他の粉末、例えば、ヘンプミルク粉末、アーモンドミルク粉末若しくはカラス麦ミルク粉末を含んでもよい。そのような添加物を添加することによって、組成物はとろみが増し、魅力的な粘度となる。添加される量は、組成物の全質量に対して5〜10質量%の範囲内であってもよい。
【０１１４】
一実施形態では、組成物はミルク成分を何も含まない。
【０１１５】
組成物は、ビタミン類、好ましくはビタミンDが更に追加されてもよい。一例として、ビタミンDの量は、単位用量である200ml当たり1μgから2000μg、好ましくは単位用量である200ml当たり5μgから50μg、最も好ましくは単位用量である200ml当たり10μgから20μgである。葉酸を含めたビタミンBも添加されてもよい。セレン及び亜鉛のようなミネラルも添加されてもよい。
【０１１６】
魚油及びジュースを含む水中油型乳剤を安定化させるために、適切な乳化剤が使用される。適切な乳化剤は、乳固形分、ホエータンパク質、カラスムギタンパク質及びエンドウ豆タンパク質の群から選択されてもよい。乳化剤は、例えば、Grindsted又はLacprodanであってもよいが、任意の適切な乳化剤が用いられてもよい。更に、本発明は増粘剤を含んでもよく、それは好ましくはペクチンであってもよく、好ましくはカラスムギ由来の、より好ましくは果物由来の、例えば柑橘類由来のペクチンであってもよい。
【０１１７】
本発明の更なる好ましい実施形態では、組成物は、甘味料、香味料、抗酸化物質、及び防腐剤を含んでもよい。好ましい防腐剤及び甘味料はそれぞれ、ソルビン酸カリウム及びキシリトールであってもよい。
【０１１８】
本発明による好ましい抗酸化物質は、トコフェロールである。
【０１１９】
一実施形態では、該組成物には、天然に存在しない追加的な抗酸化物質が何も添加されない。
【０１２０】
本発明の更に好ましい実施形態では、該組成物は、投与する場合、EPA及びDHAが約300mg/日から約5000mg/日の範囲内、好ましくは約3000mg/日、より好ましくは約2000mg/日、最も好ましくは約1100mg/日の投与量であるものでもよい。治療的な効果を達成するために、投与量を低くしても、更に高くしてもよい。組成物は、50〜300mlの容積の範囲内、好ましくは100ml、より好ましくは200mlの飲料として投与されてもよい。本発明の組成物を必要とする人は、1日に1つ又は複数の単位用量の飲料を飲んでもよい。体重等は投与量の算出に使用されるべきパラメータとなると見込まれるので、投与量は個人毎に異なっていてもよい。
【０１２１】
本発明の好ましい実施形態では、該組成物は、飲用可能であってもよいし、カプセル若しくは粉末の形態であってもよい。
【実施例】
【０１２２】
(実施例1)
ALS
10人のALS患者の末梢血単核球(peripheral blood nuclear cell)(PBMS)は、同年齢の対照とベースラインで比較すると、炎症性遺伝子の上方制御(1群)又は下方制御(2群)を示した。ベースラインでは、2分の1のALS被験者は炎症が強く活性化し(1群)(8種の遺伝子が4倍より多く上方制御され、対照に対してP<0.05)、残りの半分は(2群)弱く活性化していた(2群)。すべての患者は、MMP1、CCL7、CCL13及びCCL24の4倍より多い上方制御を示した。1群の患者にトシリズマブを点滴すると、炎症性遺伝子が下方制御され、一方2群の患者ではこれらの遺伝子が上方制御された。
【０１２３】
1群のALS患者の末梢血単核球中では、サイトカイン[インターロイキン-1β(IL1β)、IL6、TNFα]及びケモカイン(CCL3、CCL20、CXCL2、CXCL3、CXCL5)の炎症性遺伝子が高く上方制御されているので、末梢血には炎症が存在する。
【０１２４】
本発明の組成物を与えられた患者のうち2人は、炎症性遺伝子の強い下方制御を示した。
【０１２５】
前記患者のうち1人は、6種の遺伝子が上方制御され、26種の遺伝子が下方制御された。1群のベースラインでは、11種の遺伝子が上方制御され、21種が下方制御されていた。対照では、10種の遺伝子が上方制御され、24種の遺伝子が下方制御されていた(図1A)。前記患者のうち2人目は、4種の遺伝子が上方制御され、28種の遺伝子が下方制御された。1群のベースラインでは、8種の遺伝子が上方制御され、13種の遺伝子が下方制御されていた(図1B)。
【０１２６】
結論として、本発明の組成物を使用することによって、炎症性mRNAの発現が低下しつつあると思われる。
【０１２７】
Table 1(表1)において、Actemra(登録商標)療法前の1群(高炎症)及び2群(低炎症)の全患者のFRS-Rスコアの比較によれば、1群における1月当たりの低下(0.59から2.6の範囲)の方が、2群(0.3から0.7の範囲)より大きいことが示される。5人の患者を[Actemra(登録商標)]で、1番は8か月、2番は2か月、6番は4か月、7番は5か月、11番は4か月間治療した[Table 1(表1)]。3人の患者は、1月当たりのFRS-R失点の大幅な減弱を示し、1番:失点2.6から失点0.4点、6番:失点0.7点から1点増加、11番:失点3.5から失点0.5を示した。前記の3人の患者は、本発明の組成物を与えられた患者であった。結論として、組成物の使用がALSの進行を遅延化させている(FRS-Rスコアの低下によって測定される)と思われる。
【０１２８】
【表１】
2019094348.tif 000002
【０１２９】
(実施例2)
COPD
試験デザインは、無作為化プラセボ対照臨床試験である。試験対象集団は、COPDの増悪という一次診断で入院した、早期のリハビリテーション計画に適格な被験者である。20人の被験者がおり、各治療群に10人である。患者は40〜80歳である。患者は本発明の組成物を与えられる。
【０１３０】
選択基準を以下に示す:
1. COPDという確定診断及びCOPDの増悪という入院時一次診断でUHSに入院した、45〜80歳の患者。
2. 本試験への参加について自由意思による文書同意が得られた者。
3. すべての試験手順に参加可能な被験者。
【０１３１】
除外基準を以下に示す:
1. 経口栄養補助食品又はプラセボを摂取することができない患者。
2. 栄養補助食品又はプラセボのいずれかの成分に不耐性があることがわかっている患者。
3. 入院中に挿管及び補助換気又は非侵襲的補助換気を必要とする患者。
4. 経口栄養補助食品を既に与えられている患者。
5. 長期的に経口副腎皮質ステロイド剤を服用している又は他の全身的な免疫抑制薬物療法を受けている患者。
6. 活性な癌の診断、制御不良の真性糖尿病、制御不良の心臓の状態(不整脈、心不全及び狭心症が含まれる)、結核、認知症を含めた、治験責任医師が試験結果に混乱を与えることとなると判断する併存症を有する被験者。
7. 治験責任医師の判断において、本試験に参加するのに臨床的に適切でないと見なされるいずれかの被験者。
【０１３２】
評価方法を以下に示す:
1) 症状の臨床指標、生理学的変数及び関連する有害事象。
2) 血液、呼気及び痰について行われる臨床検査評価(重症度、免疫応答及びバイオマーカーに関する)。
3) 肺機能並びに機能状態及び体組成の測定値の変化。
4) 毎日の呼吸器症状の日誌。
【０１３３】
統計的方法:
人工統計学:記述的統計を提供する。
有害事象:記載する。
治療群とプラセボ群の間のアウトカムの相違のMITT解析。
【０１３４】
(実施例3)
周術期の神経認知アウトカム
試験デザイン:
無作為化プラセボ対照デザインには、局部又は全身麻酔下で待機的人工股関節全置換を受ける患者が含まれる。
検出力分析。
整形外科手術が予定される、危険性のある高齢の65歳過ぎの患者(男性及び女性)が、口頭及び書面にて説明に基づく同意を得た後に本試験に含まれる。患者を無作為に振り分け、SmartFish(登録商標)(オメガ-3補給群)又はプラセボ対照飲料を手術前に4週間飲用させる。
選択基準:
1. 65歳過ぎの男性及び女性の患者。米国麻酔学会術前状態I〜II
2. 人工股関節全置換
3. 同意を得ていること
【０１３５】
除外基準:
1. 患者の治験への参加拒否
2. 継続中の喫煙/ニコチンの使用
3. 生活に支障を来すほどの精神神経障害(MMSEスコア≦24、認知症、アルツハイマー、パーキンソン、統合失調症、精神の抑うつの診断)又は相当な認知低下の他の徴候
4. 神経学的後遺症を有する脳卒中の病歴
5. 局部麻酔が予定される外科手術
6. 重篤な心臓及び/又腎臓及び/又は肝臓の機能障害
7. 凝固障害
8. 終末期の慢性疾患
9. 非ステロイド系抗炎症剤(NSAID)を使用中の患者
10 B-グルコース>15mmol/Lの制御不良の真性糖尿病での入院
11. 非協力的又は法的無能力と推定される
12. 術前又は術後後期のB-ヘモグロビン<90g/L
13. BMI値が>25又は<18.5
14. 食物アレルギー、乳糖不耐症又は飲料中に存在する他の成分に対する不耐症
【０１３６】
被験者の中断:
試験の被験者には、予定されている試験の評価への参加を、理由を述べることなくいつでも永続的に中断する自由があり、又は彼らの法的代理人が試験の被験者の永続的な中断を行うこともできる。試験の被験者は、何らかの医学的理由のために治験責任医師によって彼らの試験への参加の中断が推奨される場合も、永続的に本試験への参加を中断することができる。中断するすべての理由は、参加者の症例報告書に記録される。
【０１３７】
試験デザインの概要:
手術のおよそ4週間前に、同意が得られた被験者をコンピュータが作成するコードを使用して無作為に振り分け、SmartFish(登録商標)(本発明の組成物)又はプラセボ対照飲料を与える。以下についての情報を収集する:
1. 患者背景(体重、身長、BMI)及び平常のバイタルサインの記録(例えば、血圧、脈拍数)。
2. 静脈血サンプリング(炎症のバイオマーカー、ex-vivo全血検査及びオメガ-3指数用に総容積10mlの静脈血)。
3. 術前の認知検査バッテリー(test batter)(ISPOCDプロトコルに従う、Moller JTら、Lancet 1998年を参照されたい)。
4. NPSに沿った疼痛
【０１３８】
手術前に、患者は術前病棟(preoperative unit)に入院して、以下を受ける:
1. 体重、及び平常のバイタルサインの記録
2. 静脈血サンプリング(炎症のバイオマーカー、ex-vivo全血検査及びオメガ-3指数用に総容積10mlの静脈血)
3. 術前の認知検査バッテリー(ISPOCDプロトコルに従う)
4. 疼痛NPS(累積的な疼痛評価)
【０１３９】
手術当日に、研究群のメンバーを再び電子症例報告書に適用して、外科手術前、手術中、手術後の標準的なバイタルサインを記録する。血液を、手術中に埋込体を挿入するときに5ml、手術終了時に5ml収集して、炎症のバイオマーカーを測定する。手術後24時間まで尿を収集する。次いで患者は術後病棟に移され、そこで、VASに沿った疼痛及びPONVのスコア化を含む、追加的なバイタルサインを記録する。術後痛は、手術後最初の72時間の間に、NPSを1日2回、すなわち朝及び夕方に記録することによって評価する。24時間毎に、静注及び経口のパラセタモール(mg/24時間)、非ステロイド系抗炎症化合物(mg/24時間)及びオピオイド(mg/24時間、経口のオピオイド等価物への変換後)の総消費量を両方の試験群で記録する。72時間後に、毎日のNPS(朝及び夕方)並びにNSIAD(mg/24時間)及びオピオイド(mg/24時間、経口のオピオイド等価物への変換後)の消費量の測定値を、自己投与した患者への問診票によって収集する。
【０１４０】
術後1日目から3日目まで、睡眠日誌、疼痛及びPONVスコアを含む、関連するバイタルサインを継続して記録をする。
手術から1週間後(又は可能な限り近く)に、以下を記録するために患者を術前病棟に戻す:
1. 平常のバイタルサイン、及び術後のヘモグロビンレベル>90g/Lを保証するためのB-ヘモグロビンの解析(除外基準に関して上記を参照されたい)
2. 静脈血サンプリング(炎症のバイオマーカー及びオメガ-3指数用に総容積10mlの静脈血)
3. 術前の認知検査バッテリー(ISPOCDプロトコルに従う)
【０１４１】
手術から3か月(およそ90日)後に、以下を記録するために患者を術前病棟に戻す:
1. 平常のバイタルサイン、及び術後のヘモグロビンレベル>90g/Lを保証するためのB-ヘモグロビンの解析(除外基準に関して上記を参照されたい)
2. 静脈血サンプリング(炎症のバイオマーカー、ex-vivo全血検査、オメガ-3指数用に総容積10ml、及び炎症性バイオマーカーの遺伝子解析用に追加的に10mlの静脈血)
3. 術前の認知検査バッテリー(ISPOCDプロトコルに従う)
【０１４２】
試験プロトコルのその後のすべての部分で、バイタルサインデータ、認知検査結果、臨床検査並びに関係する疼痛、PONV及び睡眠衛生についての情報は、更なる解析のために電子症例報告書に記録され、コンピュータに保持される。
【０１４３】
(実施例4)
嚢胞性線維症
説明に基づく同意を得た後で、2種の重度の突然変異(例えば、dF508、394delTT)を引き起こすCF及び膵不全を有する50人の患者が含まれる。除外基準は、妊娠、移植及び6〜7歳未満の年齢となろう(カプセルの大きさ及び肺機能検査のため)。患者は、通常通りPERT及びビタミンの治療並びに肺の症状及び感染症のための治療を続ける。
患者を無作為に振り分け、果汁(本発明の組成物)及びLA(900mg)及びω3-LCPUFA(DHA 400mg、EPA 200mg)を含む本発明の組成物、又は果汁及びオリーブ油(1.5g)を毎日12か月間与える。無作為化はジェネレータによって為され、200mlのジュースだけが番号付けされるので、患者のみならず介護者も補給物の種類から情報を与えられることはない。
【０１４４】
方法:
食事摂取頻度調査票を含めて、食物の登録(24時間思い出し法)を治療の開始時と終了時に行う。脂肪酸に関する通常の食事に変化が起こっていないことを管理するために追加の24時間思い出し法を6か月目に行う。
【０１４５】
試験の開始時及び終了時に年1回のCF患者の検診を行うので、8-イソプロスタン(脂質過酸化を調べるため)を解析するための尿の試料以外は追加調査をする必要はない。血漿サイトカイン及び平常の感染症パラメータ(WBC、CRP、IgG、IL-6、Il-8)のチェック及び肝臓機能検査(ASAT、ALAT、γGT、PK)及び腎臓検査(尿素、クレアチニン)を開始及び終了時に行う。NO及びFEV1を含めた肺の検査も年1回の検診に含まれる。すべての患者で感染症増悪の回数を1年前の同じ時期と比較する。
【０１４６】
アウトカム:
主要アウトカム:成長(体重、身長、BMI、皮下脂肪、MMAC)。
副次アウトカム:感染症及び抗生物質での治療の回数。感染症のパラメータ。
【０１４７】
(実施例5)
過体重及び肥満
本発明による組成物は、過体重及び肥満の青年においてインスリン感受性を選択的に向上させ、ここでは、ベースラインの代謝タイプが応答を予測する。
【０１４８】
序文:
栄養による抗炎症手法は、肥満により誘発されるインスリン抵抗性を減弱させることができる。しかし、臨床試験からの結果は完全に一致しておらず、被験者間、特に若年の高い危険性のコホート内の被験者間の変動性の決定要因について更に焦点を合わせることが必要となる。ベースラインの代謝タイプが、応答者と非応答者をある程度区別する可能性がある。
【０１４９】
試験方法:
本発明の組成物の代謝的効果を、過体重及び肥満の青年(n=58;平均値±SD、年齢15.9±1.6歳;BMI 32.1±6.5kg/m2)において、8週間の無作為化、クロスオーバー、プラセボ対照介入によって決定した。HOMA-IR(恒常性モデル評価;インスリン抵抗性を定量化するためのモデル)において10%より大きい向上を明示した被験者を応答者として分類した。
【０１５０】
結果:
本発明の組成物は抗炎症性栄養補給として作用し、40%の被験者でHOMA-IRを低減させた(応答者;栄養補助食品-32.05±18.02%対プラセボ13.13±54.09%、p=0.004)。応答する被験者は治療前に、非応答者と比較して同様のBMIであるにもかかわらず増加したHOMA-IR、総コレステロール及びLDLコレステロールによって特徴付けられる有害な代謝タイプであることが明示された(それぞれ、p=0.001、p=0.029、p=0.024、p=0.236)。逐次重回帰分析から、ベースラインのHOMA-IR及びLDL:HDL比が、抗炎症補給に対するHOMA-IR応答の、独立した有意な予測変数として確認された(R2=0.432、p<0.001)。進行中の解析により、応答差の分子的根拠が定まりつつある。
【０１５１】
結論:これらの結果は、本発明の組成物のインスリン増感効果に関する不均一性を明示している。非応答者とBMIが同様であるにもかかわらず、インスリン抵抗性で脂質代謝異常という代謝タイプの応答者は、栄養による抗炎症手法の影響が強かった。これにより、個別化された栄養補給という状況の中で効力を最適化する可能性があることが説明される。
【０１５２】
以下のTable 2(表2)は、過体重及び肥満の青年における本発明の組成物及びプラセボの補給前後の炎症マーカーを示す(n=23)。
【０１５３】
【表２】
2019094348.tif 000003
【０１５４】
以下のTable 3(表3)は、過体重及び肥満の少年におけるベースラインでの人体測定上の特性及び生化学的特性、及び本発明の組成物を8週間補給した後の、プラセボ補給と比較したそれらの特性を示す(n=23)。
【０１５５】
【表３】
2019094348.tif 000004
【０１５６】
以下のTable 4(表4)は、本発明の組成物の補給に対する応答者及び非応答者のベースライン特性を示す。
【０１５７】
【表４】
2019094348.tif 000005
【０１５８】
図2及び図3も参照されたい。
【０１５９】
(実施例6)
糖尿病及び冠状動脈疾患
本試験は、前方視的、単一施設、二重盲検、プラセボ対照、無作為化試験である。
【０１６０】
糖尿病及び冠状動脈疾患を有する患者を、1000mgのエイコサペンタエン酸及び1000mgのドコサヘキサエン酸を臨床栄養組成物中に含む本発明の組成物(n-30)又はプラセボ(n-30)に無作為に振り分け、本発明の組成物又はプラセボを3〜6か月与える(資金に応じて決まる)。血球数の基本的パラメータ(RBC、WBC、Hgb及び血小板)、炎症及び腎臓のマーカーを評価する。
【０１６１】
特定の凝固検査の幾つかを2回、すなわち試験の開始時及び治療期間終了時に測定する。計画しているのは、フィブリン生成試験、トロンビン-抗トロンビン(TAT)複合体の血漿レベル、プロトロンビンフラグメント1.2、血漿フィブリン塊透過性(Ks)及び8-イソプロスタグランジンF2α(8-イソ-PGF2α、酸化ストレスマーカー)である。バイオマーカーの詳細な一覧についてはTable 5(表5)を参照されたい(最終的な一覧は資金に応じて決まる)。血管及び内皮機能は、上腕動脈の流量依存性拡張(FMD)及び充血によるずり応力(HSS)検査によって評価する。
【０１６２】
【表５】
2019094348.tif 000006
【０１６３】
(実施例7)
運動者集団におけるURTI(上気道感染症)に及ぼす効果の試験
試験の背景
開業医を訪れる主因の1つは、咳、風邪、耳感染症、咽頭炎及び喉頭炎等の上気道感染症(URTI)である(Graham、1990年、The epidemiology of acute respiratory tract infections in children and adults: a global perspective. Epidemiologic Reviews 12、149〜178)。更に、1人の成人は、平均して年2回から5回風邪にかかることが明示されており(Heathら、1992年、Exercise and upper respiratory tract infections.Is there a relationship? Sports Med 14、353〜365)、それにより、社会経済的費用、例えば、労働損失日数及びこれらの病気の医療費における社会経済的費用はかなりのものとなる。したがって、URTIの危険性を低減させることが知られる、いかなる機序についてもよく理解し、それによって関連する社会経済的な負担を緩和することは必要不可欠である。
【０１６４】
運動が健康に有益であることは定説であり、現在の勧告には、すべての成人は30分の運動を週に5日継続して行うべきであることが示されている(Haskellら、2007年、Physical activity and public health: updated recommendation for adults from the American College of Sports Medicine and the American Heart Association. Med Sci Sports Exerc 39、1423〜1434)。最近では、健康を向上させるには強度の強い運動の方が低い/中程度の強度の運動よりも有効であるという仮説を支持する証拠が次々と出てきている(Babrajら、2009年、Infectious episodes in runners before and after the Los Angeles Marathon. J Sports Med Phys Fitness 30、316〜328)。しかし、取り組む運動の量及び強度が増大すると、URTIの危険性の増大等の、ある有害な結果が生じることもある。実際に、2つの疫学的試験から、持久力運動を一回激しく行った後に回復した運動者は、運動しなかった対照と比較して、URTIの発生率が運動後に2倍になったことが示された(Peters及びBateman、1983年、Ultramarathon running and upper respiratory tract infections. An epidemiological survey. S.Afr.MedJ 64、582〜584; Niemanら、1990年、Infectious episodes in runners before and after the Los Angeles Marathon. J Sports Med Phys Fitness 30、316〜328)。更なる調査によって、広範な運動及びスポーツの後に同様の結果が見出されている。
【０１６５】
運動がURTIの発生率に及ぼす効果は、運動競技者及び娯楽として運動する人だけでなく、免疫系が損なわれているために既に危険性のある特定の集団(例えば、高齢者)を考慮する上でも重要である(総説に関しては、Mazzeo、1994年、The influence of exercise and aging on immune function. Med Sci Sports Exerc 26、586〜592を参照されたい)。老化過程には、高齢者集団において致死的な細菌及びウイルス感染症の発生率の増加の部分的な原因となっていると思われる、免疫機能の減少が含まれる(Woodsら、2002年、Can exercise training improve immune function in the aged? Ann N Y.Acad Sci 959、117〜127)。老化は、慢性の軽度の炎症にも関連することが多く、それは、機能の制約に密接に相関する炎症性サイトカイン及び急性期タンパク質レベルの増加によって示される(Brinkleyら、2009年、Chronic Inflammation Is Associated With Low Physical Function in Older Adults Across Multiple Comorbidities. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences 64A、455〜461)。そのような機能的変化を克服する又は低減させるために、高齢者集団は、身体活動に参加して、筋機能を向上させ、疾患発症を好転させることを奨励される。その一方で、そのような運動は、若年の人々と比較して免疫機能にかなりの減弱を明らかに示す高齢の被験者には有害にもなり得ると考えられる(Bruunsgaard及びPedersen、2000年、Special feature for the Olympics: effects of exercise on the immune system: effects of exercise on the immune system in the elderly population. Immunol Cell Biol 78、523〜531)。したがって、広範な集団において運動後に免疫機能を向上させるために用いることができる何らかの考えられる戦略を特定し、彼らが定期的な運動の利益を受けながら、URTIの危険性を低減させることができるようにすることが必要不可欠である。
【０１６６】
免疫機能を高めるために用いることができる、考えられる1つの方法は、必須脂肪酸の栄養摂取量を変更することである。n-3多価不飽和脂肪酸(PUFA)、すなわちエイコサペンタエン酸(EPA)及びドコサヘキサエン酸(DHA)は、両方とも魚油に見出され、in vitroで免疫調節効果を有することが見出されている。更に、本発明者らが行った最近の試験において、本発明者らは、魚油の消費がナチュラルキラー(NK)細胞の活性及び末梢血単核球(PBMC)のIL-2の産生を高めることができることを見出した(Grayら、2012年. Fish oil supplementation augments post-exercise immune function in young males. 近刊のBrain, Behavior, and Immunity。)。しかし、これらの免疫の変化がURTIの発生率に何らかの効果を有するのかどうかは明らかではない。
【０１６７】
治験の目標及び目的
現在のプロジェクトの目的は、運動者集団におけるURTIの発生率に及ぼす本発明の組成物(以降、Smartfishジュース又は単にSmartfish)の食事摂取の効果を調査することである。
【０１６８】
治験デザイン
参加者
18〜45歳の60人の健康なボランティア(男性及び女性)を本試験に募集する。参加者は、地元の陸上/スポーツクラブに連絡することによって募集する。彼らは、毎週少なくとも3時間の中程度から高強度のトレーニングに参加する。参加者は、心血管、代謝又は血液障害の病歴があれば除外され、それは、事前のスクリーニング用健康問診票によって決定される。参加者に、試験期間中はいかなる栄養補助食品も控えるように依頼する。
【０１６９】
実験前手順
補給前の唾液試料を得る。これは、予め秤量した小さいチューブに参加者が3分間受動的に流涎するものである。次いで、唾液の流量を算出できるようにこのチューブを再び秤量する。
【０１７０】
実験プロトコル
16週間の試験の間、参加者を対照群又はSmartfish群のいずれかに無作為に振り分ける(性別を合わせる)。Smartfish群は、2種の果汁をベースとした飲料として本発明の組成物を毎日消費するが、その飲料は、飲料当たり0.5gのEPA及び0.5gのDHAを含有し、EPA/DHAを合わせて1日当たり合計2gを含有する。プラセボ群には、EPA及びDHAを抜いた同じ飲料を与える。プラセボ飲料と魚油飲料は両方ともSmartfish AS社によって提供される。
【０１７１】
無作為化は、乱数表を生成する独立した第三者によって行われる。16週間の期間中、このような方式で自分の食事を補足するように参加者に依頼する。
【０１７２】
この期間中、国際標準化身体活動質問票(IPAQ: https://sites.google.com/site/theipaq/)を使用して1週間単位の自分の身体活動の度合いを記録するように参加者に依頼する。1日単位でウィスコンシン上気道症状調査(WURSS)すべてに記入し、あらゆる風邪/咳等のために服用したあらゆる市販又は処方薬を記録することも参加者に依頼する。切手が貼られ、住所が書かれた封筒を参加者に与え、参加者は、その封筒と一緒にこれらの記入用紙を1週間単位で送り返すが、電子的手段によってこれらに記入する選択肢もある。
【０１７３】
試料の解析
唾液のIgA及びリゾチームを測定して、唾液の抗菌状態の指標を得る。その理由は、これらのマーカーとURTIの発生率の間には相関関係があるからである(例えば、Niemanら、2006年. Relationship between salivary IgA secretion and upper respiratory tract infection following a 160-km race. J Sports Med Phys Fitness 46、158〜162。)。この解析は、市販のELISAキットを使用して行われる。
【０１７４】
統計値
これは事前の予備試験であるため、正式な検出力の算出は行っていない。本発明者らは、URTIの発生率を低減させるための食事介入を考慮して、同様の研究に使用される被験者の数を含むように試験を設計した(Gleesonら、2011年、Daily probiotic's (Lactobacillus casei Shirota) reduction of infection incidence in athletes. Int J Sport Nutr Exerc Metab 21、55〜64。)。
【０１７５】
データは、繰り返しのある二元配置分散分析法、及び必要に応じて対t-検定によって解析する。
【０１７６】
結果
図4は、対照及びSmartfish群におけるURTI(上気道感染症)を患う患者からの、16週間の介入期間の結果を示している。有意差はないが、図4の上のパネルに概要を示す通りに、Smartfishで治療した群では、患者当たりのURTIの症状発現数が低減する傾向がある。更に、Smartfish群には、対照群と比較して症状の総日数の有意な(P<0.05)低減がある。
【０１７７】
よって、この結果から、本発明の組成物を上気道感染症の治療に使用できることが明らかに示される。
【０１７８】
本試験は進行中であり、更なるデータを入手できるのは後の段階となる。
【０１７９】
(実施例8)
LPS刺激マクロファージに及ぼす免疫調節効果
背景
本試験の目的は、本発明の組成物(以降、Smartfishジュース又は単にSmartfishとする)が炎症過程にプラス効果を及ぼすかどうかを検査すること、及びSmartfishジュースの効果を良質な魚油のそれと比較することである。
【０１８０】
マクロファージは、免疫応答の制御及び炎症の発症に重要である。組織及び培養物中で、マクロファージは単球から分化する。これらの細胞によって多くの異なる化学物質が産生され(サイトカイン、酵素、補体タンパク質、及び制御因子が含まれる)、これらの細胞は他の免疫細胞の刺激も行う。LPSはグラム陰性細菌の外膜の重要な成分であり、マクロファージ及び内皮細胞において炎症性サイトカイン[腫瘍壊死因子α(TNFα)及びインターロイキン6(IL-6)等]の発現を誘発する。ヒトの単球をLPSで刺激すると、IκBキナーゼ(IKK)-NF-κBシグナル伝達経路及び3つのマイトジェン活性化タンパク質キナーゼシグナル伝達経路(ERK1及び2、JNK並びにp38)を含めた、多くの細胞内シグナル伝達経路を活性化することが示されている(Guhaら、2001年)。これらのシグナル伝達経路はNF-κB(p50/p65)及びAP-1(c-Fos/c-Jun)等の転写因子を活性化し、これらは、炎症性メディエーターの多くの遺伝子の誘発を連係させる。幾つかの炎症性サイトカインは酸化ストレスによって誘発され、他のサイトカインの放出を誘発し、酸化ストレスを増大させることとなる。これにより、サイトカインは慢性炎症及び他の免疫応答において重要となる。
【０１８１】
培養物中のマクロファージにLPSを添加すると炎症反応が開始するので、それは炎症反応に及ぼすSmartfishジュースの効果を検査するのに良いモデル系である。
【０１８２】
材料及び方法
細胞培養
細胞をCO2 5%の加湿インキュベーター中37℃で維持した。細胞培養液はすべてInvitrogen社(Invitrogen社、カールズバッド、CA、米国)から得た。通常懸濁液中で増殖するTHP-1細胞は、アメリカ培養細胞系統保存機関[Manasas、VA、米国]から得た。THP-1細胞を、10% FCS、0.05mMの2-メルカプトエタノール、2mmol/lのL-グルタミン、100U/mLのペニシリン及び100μg/mLのストレプトマイシンを含有するRPMI 1640培地中で培養した。細胞を1週間に3回継代培養した。マクロファージ様表現型への分化は、12ウェル培養プレート中のTHP-1細胞(ウェル当たり1mLの細胞懸濁液は、106細胞/mLを有する)を100ng/mLのホルボール12-ミリスタート13-アセタート(PMA、Sigma-Aldrich社)で72時間処理することによって実現した。粘着性の分化細胞を、予め温めた培地(上の通りのRPMIであるが、メルカプトエタノールを含まない)で2回洗浄し、48時間休ませた後に実験を開始した。
【０１８３】
分化THP-1細胞の単一培養物を、示した濃度のSmartfish、良質な1812魚油又は血清-DMSO対照で24時間刺激し、その後0.5ng/mlのLPS[大腸菌(E.coli)055:B5]を添加した。6時間インキュベートした後に上清を収集した。
【０１８４】
Smartfishジュース(Nutrifriend 2000 [2500mg  オメガ-3、2000mg EPA/DHA])及び良質の1812魚油(20未満のTOTOX)を、EPA及びDHAに関して同じ濃度で細胞に添加した。魚油中のEPA及びDHAの濃度は、Smartfish中の濃度より19.6倍高かった。よって、0.5mg/mlの魚油及び9.8mg/mlのSmartfishを、血清及びDMSOを有する乳剤として細胞に添加した。
【０１８５】
実験は、4回繰り返して二重で実行した。
【０１８６】
ELISA
細胞培養物上清中のIL-6及びTNF-αの濃度を、酵素免疫検定法(ELISA)を使用して決定した。コーティング用緩衝液(0.1M炭酸塩/炭酸水素塩緩衝液、pH 9.6)中に懸濁させたモノクローナルマウス抗ヒトIL-6又はTNF-α抗体(BD Bioscience Pharmingen社、サンディエゴ、CA、米国)をMaxiSorp(商標)ELISAプレート(Nunc社、ロスキレ、デンマーク)に添加し、一晩4℃でインキュベートした。プレートを0.01% Tween-20を含有するPBSで3回洗浄し、PBS中5% BSAと共に1時間室温でインキュベートすることによって非特異的結合部位をブロックした。PBS-Tweenで5回洗浄した後、使用強度(working strength)の高性能ELISA(HPE)緩衝液、Sanquin社(アムステルダム、オランダ)製、で希釈した試料及びヒト組換えIL-6又はTNF-α標準物質(BD Bioscience Pharmingen社)をプレートに添加し、次いでそれを室温で1.5時間インキュベートし、その後PBS-Tweenで5回洗浄した。次いで、プレートを、HPE緩衝液中のビオチン化マウス抗ヒトIL-6又はTNF-αモノクローナル抗体(BD Bioscience Pharmingen社)と共に1時間インキュベートした。更なる洗浄ステップの後、HPE緩衝液中ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(BD Bioscience Pharmingen社)を添加し、室温で30分間インキュベートした。次いで、洗浄毎に30秒おいてプレートを5回洗浄した。H2O2を含有する0.05Mリン酸塩-クエン酸塩-緩衝液中3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(Sigma-Aldrich社)を添加した後、発色した。10分後、1N H2SO4の添加によって反応を中止し、Spectrostar Nanoプレートリーダー(BMG LABTECH社、オッフェンブルグ、ドイツ)を使用して450nmでの吸光度を測定した。
【０１８７】
遺伝子発現
RNeasy Plusミニキット(Qiagen社、バレンシア、CA、米国)を使用して、RNAを単離した。RNAの濃度及び純度は、NanoDrop 1000分光光度計(NanoDrop Technologies社、米国)を使用して評価した。Taqman逆転写酵素試薬(Applied Biosystems社、フォスターシティ、CA、米国)を使用して、cDNAを20μLの反応容積中の300ngのRNAから作製した。cDNAの合成は、次のの条件下、すなわち、25℃で10分間、48℃で60分間、及び95℃で5分間、PCR機中で実行した。qPCR用の反応ミックスは、4μlの希釈済み(1:10)cDNA、1μlのフォワード及びリバースプライマー[最終濃度0.5μΜ;Table 6(表6)]、及び5μlのSYBR Green-I Master (Roche Applied Science社、ドイツ)から構成されていた。プライマーの効率を評価するための各プライマー対の検量線が含まれていた。すべての試料を並行して解析し、cDNAの代わりに水を用いた、テンプレートを含まない対照をプライマー対毎に実行した。qPCR反応は、LightCycler480(Roche Diagnostics Gmbh社、ドイツ)で、次の条件下:95℃で5分間のプレインキュベーション、95℃で15秒間及び60℃で1分間を45サイクル有する増幅、95℃で5秒間及び65℃で1分間の融解曲線、40℃で10秒間の冷却、で実行した。相対的な遺伝子発現レベルを、ΔΔCt法(Pfaffl 2001年)に従い、ef1aを参照遺伝子として使用して算出した。
【０１８８】
【表６】
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【０１８９】
結果及び考察
サイトカインの分泌
Smartfish及び良質の魚油が炎症誘発性サイトカインTNF-α及びIL-6の分泌に及ぼす効果をELISAで解析した。Smartfish及び良質の魚油は、TNF-αの基礎分泌に有意な効果を及ぼさなかった(図5)。LPSを添加して炎症反応を刺激すると、対照細胞においてTNF-αの分泌が11pg/mlから2500pg/mlと有意に増加した。良質の魚油を添加すると、LPSに誘発されるTNF-αの分泌が対照と比較して有意に減少した。興味深いことに、Smartfishを添加すると、LPSに誘発されるTNF-α分泌に、良質の魚油より更に強い低減効果を及ぼし、TNF-α分泌を基礎分泌に相当するレベルまで低減させた。
【０１９０】
IL-6から得られた分泌プロファイルは、TNF-αから得られたプロファイルとは異なっていた(図6)。Smartfishは、基礎分泌とLPSに誘発されるIL-6の分泌の両方を、対照及び良質の油と比較して有意に増加させた一方で、良質の魚油は、LPSに誘発されるIL-6の分泌に対照と比較して有意な効果を及ぼさなかった。同一の良質の魚油は、以前にTHP-1由来のマクロファージにおいてLPSに誘発されるIL-6の分泌を低減させた。この不一致の理由は明らかではない。しかし、IL-6は、炎症誘発性と抗炎症性サイトカインの両方として作用することができる。抗炎症性サイトカインとして、IL-6にはTNF-αを阻害する効果がある。よって、この実験において、IL-6は抗炎症性サイトカインとして作用した可能性があり、これは、LPSに誘発されるTNF-αの分泌に関して見られた阻害効果と一致している。
【０１９１】
遺伝子発現
Smartfishジュースと共に培養されたLPS誘発マクロファージは、対照細胞及び良質の魚油を添加した培地中で培養された細胞と比較して、tnfα、nfκb、及びIL8のような炎症誘発性マーカーの遺伝子発現が下方制御されたことが示された(図7及び図8)。Smartfishジュース中で培養された細胞は、対照細胞及び良質の魚油中で培養された細胞よりbax(アポトーシスに関与する)の遺伝子発現レベルが低く、gpx(酸化ストレス応答に関与する)の遺伝子発現が低くなる傾向があることも示された(図9)。
【０１９２】
これらの試験から、Smartfishジュースは、ヒトマクロファージからの炎症誘発性サイトカインTNF-αの分泌を低減させることが明示された。更に、Smartfishジュースは、ヒトマクロファージにおいて炎症及びストレス応答に関与する遺伝子(tnf-α、IL18、nfκb、gpx及びbax)の発現を低減させることが明示された。Smartfishジュースの効果は、Smartfishジュースに使用されるものと同様に良質な単なる魚油よりも有意に良好であった。
【０１９３】
よって、驚いたことに、水中油型乳剤中に魚油とジュースとの組み合わせを含む本発明の組成物は、炎症の治療に有用であること、更に、Smartfishジュースに含有される魚油と同様の品質の、対照である良質な魚油は、同程度の炎症のパラメータのプラス効果を見せないことが示された。
【０１９４】
特に、TNF-αの分泌が減少し、IL-8の遺伝子発現が下方制御されることが示された。前記炎症マーカーの変化はCOPDと関連性が高いことが示唆されている。Int J of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 2010年:5 217〜222; Tumor necrosis factor-alpha levels in healthy smokers and nonsmokers及びSaris H.ら、Biochem Pharmacol 2010年、3月1日;79(5(:698〜701 ; IL-8 production by macrophages is synergistically enhanced when cigarette smoke is combined with TNF-alphaを参照されたい。
【０１９５】
(実施例９)
AD患者由来のマクロファージにおけるレゾルビンレベル
本試験の目的は、抗炎症メディエーターであるレゾルビンD1の産生を調べ、本発明の組成物(以降、Smartfishとする)が、アルツハイマー病を患う患者に由来する細胞試料においてレゾルビンD1の量を増加させる能力があるのかどうかを試験することであった。
【０１９６】
前に述べたように、レゾルビンは、EPA及びDHAから誘導される酸素化代謝産物であり、ナノモル及びピコモルの範囲の濃度であっても強力な抗炎症作用及び免疫制御作用を有する。
【０１９７】
よって、本発明の組成物が、ADを患う患者から単離されたマクロファージにおけるレゾルビンのレベルに何らかの影響を及ぼすかどうかを見ることは非常に興味深い。
【０１９８】
本試験に使用する本発明の組成物は、Nutrifriend 2000という商品名で製造される、2000mgのEPA/DHAを含有する果汁ベースの飲料である。この飲料はSmartfish AS社によって製造され、以降Smartfishとする。
【０１９９】
材料及び方法
Smartfishを補給される患者は、果汁ベースの飲料を1日1杯消費する(すなわち、2000mgのEPA/DHA)。AD患者由来のマクロファージは、少なくとも3か月のSmartfish補給の前後で検査した。
【０２００】
In vitroでのSmartfishを用いた刺激
AD患者由来のマクロファージを末梢血単核球(PBMC)から細胞培養で調製し、それは10%の自己血清を有するIMDM培地中で10〜15日間培養することによって行った。マクロファージが分化したとき、それを1:100に希釈したSmartfishを用いて又は用いずに一晩処理し、メタノール中に回収し、窒素を使用する蒸発によってメタノールを除去した。
【０２０１】
レゾルビンD1を、Resolvin D1 EIAキット500380番(Cayman社)によって検査した。
レゾルビンは、EPA及びDHAから誘導される酸素化代謝産物であり、炎症反応に必要とされなくなったときの炎症細胞の除去及び組織の修復に寄与する分子機序の一部である。
【０２０２】
結果
Smartfish補給前のAD患者のマクロファージ中のRvD1のレベルは、上で概要を示す通りにin vitroでSmartfishを用いて刺激すると、有意に増加した。以下のTable 7(表7)で述べる通りに、RvD1レベルは、患者JBでは8pgから13.6pgに、患者AMでは37.4pgから75.9pgに増加した。よって、Smartfishを飲用していないAD患者由来のマクロファージを、in vitroにおいてSmartfishで刺激した後に、RvD1のレベルは2倍に増加することが観察された。
【０２０３】
同様の分析を、1日1杯のSmartfishを毎日補給した後に患者JBで行った。RvD1レベルは、in vitroで刺激していないマクロファージにおいて、8pgから21.3pgに増加した。in vitroで更に刺激すれば、RvD1のレベルは21.3pgから28.6pgに適度に増加した。
【０２０４】
【表７】
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【０２０５】
本試験の結果によって、本発明の組成物は、ADを患う患者由来のマクロファージにおけるレゾルビンレベルの増加に、in vivoとin vitroのいずれにおいても有意に寄与することが明らかに示された。
【０２０６】
試験は進行中であり、よって更なる結果を入手できるのはこの先のこととなる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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