(57)【要約】      （修正有）【課題】慢性腎疾患患者に対する、改善され、より標的化された再生医療治療選択を提供する。【解決手段】初代腎細胞及び生物活性のある細胞群（たとえば、ＨＵＶＥＣ細胞等の内皮細胞群）の混合物を含有するオルガノイドが開示され、及び、当該オルガノイドを用いて、その必要のある対象を治療する方法が開示される。さらに、当該単離腎細胞（尿細管及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生腎細胞群を含有しても良い）、及び／または、当該内皮細胞群は、自己、同種、同系、もしくは異種を起源とする、またはそれらの組み合わせのものであっても良い。さらに、当該オルガノイドを用いて、必要のある対象を治療する方法が開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種腎細胞群及び生物活性のある細胞群を含有するオルガノイドの形成方法であって、前記異種腎細胞群及び生物活性のある細胞群を、ｉ）２Ｄ培養；ｉｉ）３Ｄ培養：ＣＯＬ（Ｉ）ゲル；ｉｉｉ）３Ｄ培養：マトリゲル；ｉｖ）３Ｄ培養：スピナー、次いで、ＣＯＬ（Ｉ）／マトリゲル；及び、ｖ）３Ｄ培養：ＣＯＬ（ＩＶ）ゲル、からなる群から選択される培養システム中で培養すること、を含む前記方法。
【請求項２】
前記異種腎細胞群が、生物活性のある腎細胞群を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記異種腎細胞群が、尿細管細胞の富化群を含有するＢ２細胞群を含有し、及び、ここで、前記異種腎細胞群が、Ｂ１細胞群を枯渇している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記異種腎細胞群はさらに、Ｂ５細胞群を枯渇している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記異種腎細胞群が、Ｂ２、Ｂ２／Ｂ３、Ｂ２／Ｂ４、及び、Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４から選択される細胞群を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記異種腎細胞群は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記生物活性のある細胞群は、内皮細胞群である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記内皮細胞群は、細胞株である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記内皮細胞群は、ＨＵＶＥＣ細胞を含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞群は、異種、同系、同種、自己、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記異種腎細胞群及び前記生物活性のある細胞群は、第一の期間の間は別々に培養され、第二の期間の間に、混合され、及び培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第二の期間は、少なくとも２４時間である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第二の期間は、２４時間〜７２時間である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記腎細胞群及び生物活性のある細胞群は、１：１の比率である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記腎細胞群及び生物活性のある細胞群は、増殖培地中に懸濁される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法に従い作製されたオルガノイド。
【請求項１７】
異種腎細胞群及び生物活性のある細胞群を含有するオルガノイド。
【請求項１８】
前記生物活性のある細胞群は、内皮細胞群である、請求項１７に記載のオルガノイド。
【請求項１９】
前記異種腎細胞群は、尿細管細胞の富化群を含有するＢ２細胞群を含有し、ここで、前記異種腎細胞群は、Ｂ１細胞群を枯渇している、請求項１８に記載のオルガノイド。
【請求項２０】
前記異種腎細胞群はさらに、Ｂ５細胞群を枯渇している、請求項１９に記載のオルガノイド。
【請求項２１】
前記異種腎細胞群は、Ｂ２／Ｂ３、Ｂ２／Ｂ４、及び、Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４から選択される細胞群を含有する、請求項１７に記載のオルガノイド。
【請求項２２】
前記異種腎細胞群は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞を含有する、請求項１７に記載のオルガノイド。
【請求項２３】
前記内皮細胞群は、細胞株である、請求項１８に記載のオルガノイド。
【請求項２４】
前記内皮細胞群は、ＨＵＶＥＣ細胞を含有する、請求項１８に記載のオルガノイド。
【請求項２５】
少なくとも１つのオルガノイド、及び、液体培地を含有する注射可能な製剤。
【請求項２６】
前記液体培地が、細胞増殖培地、ＤＰＢＳ、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項２５に記載の製剤。
【請求項２７】
前記液体培地が、ＤＰＢＳである、請求項２６に記載の製剤。
【請求項２８】
前記オルガノイドが、前記液体培地中に懸濁されている、請求項２５に記載の製剤。
【請求項２９】
オルガノイド、及び、
（ｉ）約８℃以下で実質的に固形状態、及び、
（ｉｉ）およそ気温以上で実質的に液体状態、
を維持する温度感受性細胞安定化バイオマテリアルを含有する注射可能な製剤。
【請求項３０】
前記オルガノイドは、生物活性のある腎細胞を含有する、請求項２９に記載の製剤。
【請求項３１】
前記オルガノイドはさらにＨＵＶＥＣを含有する、請求項３０に記載の製剤。
【請求項３２】
前記生物活性のある細胞は、実質的に、細胞安定化バイオマテリアルの体積全体に均一に分散されている、請求項２９に記載の製剤。
【請求項３３】
前記バイオマテリアルは、約８℃〜約気温以上では、固形−液体の遷移状態を有する、請求項２９に記載の製剤。
【請求項３４】
前記実質的に固形状態とは、ゲル状態である、請求項２９に記載の製剤。
【請求項３５】
前記細胞安定化バイオマテリアルは、ハイドロゲルを含有する、請求項２９に記載の製剤。
【請求項３６】
前記ハイドロゲルは、ゼラチンを含有する、請求項３５に記載の製剤。
【請求項３７】
前記ゼラチンは、約０．５％〜約１％（ｗ／ｖ）で、製剤中に存在する、請求項３６に記載の製剤。
【請求項３８】
前記ゼラチンは、約０．７５％（ｗ／ｖ）で、製剤中に存在する、請求項３６に記載の製剤。
【請求項３９】
異種腎細胞群及び生物活性のある細胞群を含有するオルガノイドを少なくとも１つ投与することを含む、必要のある対象における腎疾患の治療方法。
【請求項４０】
前記生物活性のある細胞群は、内皮細胞群である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記異種腎細胞群は、尿細管細胞の富化群を含有するＢ２細胞群を含有し、ここで、前記異種腎細胞群は、Ｂ１細胞群を枯渇している、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記異種腎細胞群はさらにＢ５細胞群を枯渇している、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記異種腎細胞群は、Ｂ２、Ｂ２／Ｂ３、Ｂ２／Ｂ４、及び、Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４から選択される細胞群を含有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記異種腎細胞群は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞を含有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記内皮細胞群は、細胞株である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記内皮細胞群は、ＨＵＶＥＣ細胞を含有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
請求項２５〜３８のいずれか１項に記載の注射可能な製剤を投与することを含む、必要のある対象における腎疾患の治療方法。
【請求項４８】
前記対象は、哺乳類である、請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記哺乳類は、ヒトである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記対象は、腎疾患を有している、請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の方法
【請求項５１】
以下の基準のうちのいずれか１つにおける改善が認められる、請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の方法：
貧血（Ｈｃｔ、Ｈｇｂ、ＲＢＣ）、炎症（ＷＢＣ）、尿濃縮（ｓｐＧｒａｖ）及び高窒素血症（ＢＵＮ）。
【請求項５２】
腎疾患の前記治療のための医薬の製造における、オルガノイドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択された生物活性のある初代腎細胞及び、さらに生物活性のある細胞群の混合物、ならびに、その必要のある対象を治療する方法を目的とするものである。本発明はさらに、尿細管細胞及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生腎細胞群を含有する単離腎細胞を含有するオルガノイド、必要のある対象に当該オルガノイドを用いて治療を行う方法を目的とする。
【背景技術】
【０００２】
米国において、１９００万人を超える人々が慢性腎疾患（ＣＫＤ）に罹患しており、それらは多くの場合、肥満、糖尿病及び高血圧を含む代謝性疾患の結果である。データを検証したところ、比率の増加は、高血圧及び非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）に続発する腎不全の発症によるものであることが明らかとなり（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｒｅｎａｌ  Ｄａｔａ  Ｓｙｓｔｅｍ：  Ｃｏｓｔｓ  ｏｆ  ＣＫＤ  ａｎｄ  ＥＳＲＤ．ｅｄ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００７  ｐｐ  ２２３−２３８）、そしてこの２つの疾患はまた、世界中で上昇傾向にある。肥満、高血圧、及び不十分な血糖コントロールは全て、腎損傷の独立したリスク因子であり、糸球体病変及び尿細管病変を発生させ、蛋白尿、及び、他の検出可能な腎濾過機能の全身的な変化を生じさせることが示されている（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｕｒｏｌ，２６：２９５−３００，２００８；Ａｍａｎｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１３：１９５８−６６，１９９８）。進行ステージ１〜３のＣＫＤ患者は、根本的な疾患状態（複数含む）をコントロールすることを目的に、ライフスタイルを変化させ、薬理学的介入を行うことにより管理される一方で、ステージ４〜５の患者は、透析及び薬物レジメン（通常、抗高血圧剤、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）、鉄及びビタミンＤの補給を含む）により管理される。Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｒｅｎａｌ  Ｄａｔａ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  （ＵＳＲＤＳ）によると、平均的な末期腎不全（ＥＳＲＤ）患者は、注射用赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）、ビタミンＤサプリメント、及び鉄サプリメントのために、ひと月で６００＄超を費やしている（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｒｅｎａｌ  Ｄａｔａ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｃｏｓｔｓ  ｏｆ  ＣＫＤ  ａｎｄ  ＥＳＲＤ．ｅｄ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００７  ｐｐ  ２２３−２３８）。透析の年平均コスト（６５，４０５＄）と併せると、１人の患者の維持にかかるヘルスケアコストは、７２，０００＄／年超となり（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｒｅｎａｌ  Ｄａｔａ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｃｏｓｔｓ  ｏｆ  ＣＫＤ  ａｎｄ  ＥＳＲＤ．ｅｄ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００７  ｐｐ  ２２３−２３８）、さらにこの数字は標準的な手段のコストのみを反映したものであり、他の合併症、緊急時の処置、または、たとえば、透析アクセスのための代用血管の設置等の補助的な処置は含まれていない。２００５年におけるＣＤＫ及びＥＳＲＤに対する複合的な医療コストは、トータルで６２０億ドルにもなり、その年にかかった全ての医療コストの１９％を占める（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｒｅｎａｌ  Ｄａｔａ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｃｏｓｔｓ  ｏｆ  ＣＫＤ  ａｎｄ  ＥＳＲＤ．ｅｄ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００７  ｐｐ  ２２３−２３８）。腎臓移植は、透析を回避するための先制手段として、または、透析ではもう十分に疾患状態を管理できない場合のステージ４〜５の患者に対する有効な選択肢ではあるが、全腎臓移植が有効な米国におけるステージ５のＣＫＤの患者数（＞４００，０００）は、常に、利用可能な適切なドナー腎臓の数（約１６，０００）を遥かに超えている（Ｐｏｗｅ，ＮＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ，５３：Ｓ３７−４５，２００９）。ゆえに、透析への依存を遅延させ、または依存度を低下させ、ドナー腎臓の不足による穴を埋めるための新たな治療パラダイムが必要とされている。
【０００３】
進行性の腎疾患は、最初の病害（たとえば、高血圧）があり、次いで、その障害に対し十分に腎臓が応答できないことの組み合わせにより生じる。そのような応答としては、炎症促進性及び線維化促進性のサイトカイン及び成長因子の産生が挙げられる。それゆえ、ＣＫＤの進行を遅らせるための１つの戦略は、炎症及び線維化反応を改善すること、ならびに、腎組織の修復、及び／または、再生を介して腎臓の変性を軽減もしくは元に戻すことである。
【０００４】
慢性腎不全は、ヒトならびに一部の家畜動物において広く存在している。腎不全の患者は、腎機能の喪失（尿毒症）だけではなく、骨髄が赤血球造成を介した十分な数の赤血球（ＲＢＣ）を産生できなくなることによる、貧血も発症する。赤血球のホメオスタシスは、腎臓に存在する特殊化した間質性線維芽細胞によるエリスロポエチン（ＥＰＯ）の産生と、標的とされた骨髄の赤芽球前駆細胞が、ＥＰＯに反応して多くのＲＢＣを産生する能力の両方に依存している。腎不全による貧血は、腎臓におけるＥＰＯ産生の減少と、骨髄のＥＰＯの作用に対する尿毒性因子の負の作用の両方によるものである。
【０００５】
これまでの慢性腎不全の治療に対する臨床研究としては、透析、腎濾過及び尿素産生の回復のための腎移植、ならびに、赤血球集団を回復させるためのＥＰＯアナログまたは組換えＥＰＯの全身性送達が挙げられる。透析により、中〜後期ステージの腎不全患者に対して生存利益がもたらされたが、生活の質に関する著しい課題も生じている。腎移植は、腎不全の後期ステージの患者に対する、非常に望ましい（そして、多くの場合は唯一の）選択肢であるが、高品質のドナー腎臓の供給は、腎不全の患者に必要とされる数にまったく追いついていない。貧血を治療するための組換えＥＰＯを用いたボーラス投与は、現在、重篤な下流健康リスクと関連付けられており、ＦＤＡから当該薬剤に対し枠組み付き（ブラックボックス）の警告が出されており、この患者群に対して、赤血球ホメオスタシスを回復させるための別の治療法を調査する必要性が生じている。前臨床研究により、遺伝子治療法を用いて作製されたＥＰＯ産生細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性及び安全性が検証されている。これら研究により、ＥＰＯ産生細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ送達することにより、赤血球生成を一過性に刺激し、ＲＢＣ数を増加させることが可能であることが示されている。しかしながら、現在のところ、これら方法のいずれも、赤血球ホメオスタシスの制御、または長期間のｉｎ  ｖｉｖｏ機能性をもたらすには至っていない。結果として、ＨＣＴ及びＲＢＣの数がしばしば正常値を超えて増加し、それにより、真性赤血球増加症及び他の合併症が生じている。治療関連性があり、組換えＥＰＯの送達を超えるような利益をもたらすＥＰＯ産生細胞の送達によって、ＨＣＴのみを増加させ、そして赤血球のホメオスタシスもまた回復させなければならない。しかしそれらは本来、正と負の両方の制御メカニズムである。ＥＰＯ欠損性貧血は腎不全患者に普遍的ではあるが、他の疾患状態（心不全、多臓器不全、及び他の慢性疾患を含む）の結果として発症する可能性もあることに注意しなくてはならない。
【０００６】
再生医療技術により、慢性腎疾患（ＣＫＤ）に対する次世代の治療選択が提示されることとなった。ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８及びＩｌａｇａｎらのＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７において、尿細管及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生腎細胞群を含有する生物活性のある単離腎細胞が開示され、及び、同細胞を単離し、培養する方法、ならびに、必要のある対象を、当該細胞群を用いて治療する方法が開示されている。
【０００７】
必要のある対象に対する、改善され、より標的化された再生医療治療選択が必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本明細書において、オルガノイド、その製造方法、及び使用方法が開示される。
【０００９】
本明細書に開示されるオルガノイドにより、スキャホールドを用いることなく、必要のある対象に対して治療利益がもたらされる。
【００１０】
１つの態様において、異種腎細胞群及び生物活性のある細胞群を含有するオルガノイドを形成する方法が開示される。１つの実施形態において、当該方法は、異種腎細胞群及び生物活性のある細胞群を、ｉ）２Ｄ培養；ｉｉ）３Ｄ培養：ＣＯＬ（Ｉ）ゲル；ｉｉｉ）３Ｄ培養：マトリゲル；ｉｖ）３Ｄ培養：スピナー（ｓｐｉｎｎｅｒｓ）、次いで、ＣＯＬ（Ｉ）／マトリゲル；及び、ｖ）３Ｄ培養：ＣＯＬ（ＩＶ）ゲル、からなる群から選択される培養システム中で培養することを含有する。一部の実施形態において、異種腎細胞群は、生物活性のある腎細胞群を含有する。ある実施形態において、異種腎細胞群は、富化尿細管細胞群を含有するＢ２細胞群を含有し、ここで、当該異種腎細胞群は、Ｂ１細胞群及び／またはＢ５細胞群またはその組み合わせを枯渇している。一部の実施形態において、異種腎細胞群は、Ｂ２、Ｂ２／Ｂ３、Ｂ２／Ｂ４、及び、Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４から選択される細胞群を含有する。複数の実施形態において、異種腎細胞群は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞を含有する。
【００１１】
他の実施形態において、生物活性のある細胞群は、内皮細胞群である。ある実施形態において、内皮細胞群は、細部株である。一部の実施形態において、内皮細胞群は、ヒト臍帯由来である。一部の実施形態において、生物活性のある細胞群は、内皮前駆細胞を含有する。一部の実施形態において、生物活性のある細胞群は、間葉系幹細胞を含有する。一部の実施形態において、内皮細胞群は、成人を源とするものである。一部の実施形態において、細胞群は、異種、同系、同種、自己、及びそれらの組み合わせから選択される。
【００１２】
他の実施形態において、異種腎細胞群及び生物活性のある細胞群は、第一の期間の間は別々に培養され、第二の期間の間に、混合され、及び培養される。ある実施形態において、腎細胞群及び生物活性のある細胞群は、１：１の比率で混合される。最も多い実施形態において、腎細胞群及び生物活性のある細胞群は、増殖培地中で混合される、たとえば、懸濁される。一部の実施形態において、第二の期間は、２４〜７２時間、好ましくは、２４時間である。
【００１３】
他の態様において、オルガノイドが開示される。一部の実施形態において、オルガノイドは、本明細書に開示される方法に従い作製される。全ての実施形態において、オルガノイドは、異種腎細胞群及び生物活性のある細胞群を含有する。一部の実施形態において、生物活性のある細胞群は、内皮細胞群である。一部の実施形態において、内皮細胞群は、細胞株である。ある実施形態において、内皮細胞群は、ＨＵＶＥＣ細胞を含有する。
【００１４】
一部の実施形態において、異種腎細胞群は、尿細管細胞富化群を含有するＢ２細胞群を含有し、ここで、当該異種腎細胞群は、Ｂ１細胞群を枯渇している。ある実施形態において、異種腎細胞群はさらに、Ｂ５細胞群を枯渇している。選択された実施形態において、異種腎細胞群は、Ｂ２、Ｂ２／Ｂ３、Ｂ２／Ｂ４、及び、Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４から選択される細胞群を含有する。一部の実施形態において、異種腎細胞群は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞を含有する。
【００１５】
さらなる態様において、オルガノイドを少なくとも１つ、及び液体培地を含有する注射可能な製剤が開示される。１つの実施形態において、液体培地は、細胞増殖培地、ＤＰＢＳ及びそれらの組み合わせから選択される。他の実施形態において、オルガノイドは、液体培地中に懸濁される。
【００１６】
第二の実施形態において、当該注射可能な製剤には、オルガノイド、ならびに、（ｉ）約８℃以下で実質的に固形状態、及び、（ｉｉ）およそ気温以上で実質的に液体状態、を維持する温度感受性細胞安定化バイオマテリアルが含有される。他の１つの実施形態において、生物活性のある細胞は、本明細書に開示される腎細胞を含有する。他の実施形態において、生物活性のある細胞は、実質的に、細胞安定化バイオマテリアルの体積全体に均一に分散されている。他の実施形態において、バイオマテリアルは、約８℃〜気温以上では、固形−液体の遷移状態を有する。１つの実施形態において、実質的に固形状態とは、ゲル状態である。他の実施形態において、細胞安定化バイオマテリアルは、ハイドロゲルを含有する。他の１つの実施形態において、ハイドロゲルは、ゼラチンを含有する。他の実施形態において、ゼラチンは、約０．５％〜約１％（ｗ／ｖ）で、製剤中に存在する。１つの実施形態において、ゼラチンは、約０．７５％（ｗ／ｖ）で、製剤中に存在する。
【００１７】
ある態様において、異種腎細胞群及び生物活性のある細胞群を含有するオルガノイドを少なくとも１つ投与することを含む、必要のある対象において腎疾患を治療する方法が開示される。一部の実施形態において、生物活性のある細胞群は、内皮細胞群である。ある実施形態において、内皮細胞群は、細胞株である。１つの実施形態において、内皮細胞群は、ＨＵＶＥＣ細胞を含有する。
【００１８】
多くの実施形態において、異種腎細胞群は、富化尿細管群を含有するＢ２細胞群を含有し、ここで、当該異種腎細胞群は、Ｂ１細胞群を枯渇している。選択された実施形態において、異種腎細胞群はさらに、Ｂ５細胞群を枯渇している。一部の実施形態において、異種腎細胞群は、Ｂ２、Ｂ２／Ｂ３、Ｂ２／Ｂ４、及び、Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４から選択される細胞群を含有する。最も多い実施形態において、異種腎細胞群は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞を含有する。
【００１９】
ある実施形態においては、本明細書に開示される注射可能な製剤を投与することを含む、必要のある対象において腎疾患を治療する方法。全ての実施形態において、対象は、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、及び霊長類から選択される哺乳類である。特定の実施形態において、哺乳類はヒトである。全ての実施形態において、対象は、腎疾患を有している。複数の実施形態において、以下の測定基準のうちのいずれか１つにおける改善が認められる：貧血（Ｈｃｔ、Ｈｇｂ、ＲＢＣ）、炎症（ＷＢＣ）、尿濃縮（ｓｐＧｒａｖ）及び高窒素血症（ＢＵＮ）。
【００２０】
他の態様においては、腎疾患の前記治療のための医薬の製造における、オルガノイドの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】フィブロネクチンでコートされたプレート上における、初代ＺＳＦ１細胞の細胞培養形態を示す。Ａ．５ｘの拡大率で観察された、未分画のソート前ｐ０；Ｂ．５ｘの拡大率で観察されたｐ１  ＣＤ３１＋；Ｃ．ＫＧＭ中、フィブロネクチン処置されたフラスコ上で、２１％Ｏ２で増殖した、０継代の最後での初代培養未分画腎細胞；Ｄ．Ｍｉｌｔｅｎｙｉマイクロビーズ選択由来の陰性フロースルー（ＣＤ３１−）；及び、Ｅ．ＥＧＭ２が十分に補充された培地中で、フィブロネクチンでコートされたフラスコ上で増殖した１回目の継代の最後で選択された９０％ＣＤ３１＋細胞。
【図２】５ｘで観察された、ヒト細胞培養の形態を示す。Ａ．ＫＧＭ中、ＴＣ処置されたフラスコ上、２１％Ｏ２で増殖した、ｐ０の最後での未分画腎細胞；Ｂ．ＫＧＭ中、ＴＣ処置されたフラスコ上、２％Ｏ２Ｏ／Ｎに曝されながら増殖した、０継代の最後での未分画腎細胞；Ｃ．ＥＧＭ２が十分に補充された培地中で、フィブロネクチンでコートされたフラスコ上、０継代の最後での未分画腎細胞；Ｄ．十分に補充されたＥＧＭ２培地中で、フィブロネクチンでコートされたフラスコ上で増殖した１継代の最後でのＣＤ３１＋陽性選択細胞。
【図３】培養期間の間、選択された試料における陽性ＣＤ３１内皮細胞のパーセンテージを示すＦＡＣＳ分析を示す。未分画（ＵＮＦＸ）内皮の組成は、ｐ０で＜３％であり、フィブロネクチン上に置かれ、ＥＧＭ２培地中で培養されたｐ１で、約１５倍に富化された。
【図３−１】系統追跡実験のためのＢｉｇｅｎｅｉｃ  Ｃｒｅ／ｌｏｘＰレポーターを示す。Ａ．Ｓｉｘ２−Ｃｒｅ  ｘ  Ｒ２６ｔｄ  Ｔｏｍａｔｏ  Ｒｅｄは、上皮細胞（壁細胞、近位尿細管細胞、及び遠位尿細管細胞）、とクロストレースするが、間質または集合尿細管とはしない。Ｂ．非標識対照。Ｃ．ｐ１培養からのＳｉｘ−２陽性（３日間、酸素正常培養を行い、次いで、１日低酸素培養を行った）。
【図４】ＳＲＣオルガノイド形成に用いられたスピナーフラスコ（Ａ）及び、回転器上の低結合プレート（Ｂ）を示す。
【図５】サイズの均一性を示す、Ａ．ラット、及びＢ．ヒトＳＲＣの位相差イメージング（１０ｘ）を示す。Ｃ．汎カドヘリン表現型（緑）、核（青）を発現しているオルガノイド（２０ｘ）。
【図６】３ＤコラーゲンＩ／ＩＶゲル内で培養されたヒトオルガノイドを示す。Ａ．オルガノイド管形成を示す低拡大の位相差イメージング（白で囲まれた部分）。Ｂ．残余オルガノイドと共に、高拡大での位相差イメージング（白で囲まれた部分）。Ｃ．ＧＧＴ−１表現型発現（緑）、核（青）。Ｄ．２０ｘ拡大での、ＣＫ１８発現（緑）、核（青）。
【図７】膜色素標識オルガノイドを示す。Ａ．１００ｘ拡大での、ＤｉＬ（赤）で標識されたＳＲＣのみ。Ｂ．オルガノイドと、ＤｉＬ（赤）で標識されたＳＲＣ、ＤｉＯ（緑）で標識されたＨｕＶＥＣ（ｘ１００拡大）。
【図８】自己形成オルガノイドのＣｏｌＩ／ＩＶゲルにおける、３Ｄ尿細管形成アッセイを示す。パネルＡ、Ｂ及びＣにおいて、ＳＲＣ群（赤）及び内皮細胞（緑）の両方の存在を示す。重ね合わせると、群は黄色に見える。核染色（青）、（２０ｘ拡大）。
【図９】注入前の、ＳＰＩＯローダミン標識オルガノイド（赤）を示す。
【図１０】移植後のオルガノイド保持の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を示す。緑は細胞。注入後、Ａ．２４時間、Ｂ．４８時間。
【図１１】細胞保持及び生体内分布を示す、移植オルガノイドのプルシアンブルー染色を示す（低拡大と高拡大）。Ａ．移植２４時間後の移植左腎。Ｂ．移植４８時間後の移植左腎。
【図１２】本明細書に開示されるオルガノイドを投与されたラット腎臓における、ヒト細胞のＨＬＡ１染色を示す写真のパネルである。Ａ．正常なヒト腎臓；Ｂ．ラットの腎臓におけるヒト腎細胞。Ｃ．未処置の腎摘出されたラットの腎臓。Ｄ．ＮＫＯ処置（低倍率顕微鏡）。Ｅ．ＮＫＯ処置（高倍率顕微鏡）。Ｆ．第二のＮＫＯ処置動物。パネルＡとＢは、正常なヒト腎組織の染色（茶色）ならびに、げっ歯類の腎臓へ急速に送達されたヒト腎細胞の染色（緑の矢印）を示す。おそらくタンパク質性円柱の「粘性」の性質により、バックグラウンド染色は、未処置疾患ラット腎臓実験の終了時に損傷尿細管を示した（パネルＣ及びＦにおいて、黄色い矢印により示される）。この染色は通常、明るい色であるが、時折、暗い色となり、細胞よりも小さいサイズになる。パネルＤ、Ｅ及びＦは、暗染色細胞特定のためのスクリーニングに用いられた低拡大図、及び、ＨＬＡ１染色細胞（緑の矢印）の確認のための高拡大図を示す。
【００２２】
特許または特許出願は、カラーの図を少なくとも１つ含有している。カラー図面（複数含む）を伴う本特許または本特許公開のコピーは、要求し、必要な料金を支払うことで、当局から提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
多くの細胞型によって、腎実質内の機能単位であるネフロンを作り上げる。正常及び罹患した動物とヒトから、治療的に生物活性のある腎細胞を単離する技術は近年になり確立された１〜３。これら実験で用いられた方法は、浮遊密度勾配遠心を用いた、罹患した組織生検内にある腎細胞の混合物の単離によったものである。
【００２４】
本発明の１つの態様は、様々なネフロン単位またはニッチの、選択された個々の細胞群の単離、同定及び増殖に関するものであり、それにより、新規で複合的な富化細胞型を、選択混合物として組み合わせることが可能となる。本発明の新規選択混合物により、腎疾患の臨床的及び病態生理学的原則に関連した特定の構造的及び機能的欠損の標的化の改善がもたらされる。ネフロンを作り上げる複合的な個々の細胞型の単離及び富化、ならびに選択混合物として組み合わせることにより、特定の腎疾患コホートの標的化治療の改善が可能となる。
【００２５】
たとえば、血管内皮、尿細管及び集合尿細管の上皮、間質細胞、糸球体細胞、間葉系幹細胞等の細胞型を、単離、同定し、ｅｘ−ｖｉｖｏで増殖させることができる。各細胞型には、サブ培養のための固有の方法及び培地処方が必要とされる一方で、それらを選択された組み合わせまたは混合物にオルガノイドクラスターとして戻し、特定の急性及び／または慢性腎疾患患者症候群／コホート８と関連した、根本的な腎組織／細胞の欠陥に対するデリバリーの強化、及び治療の改善が可能である。
【００２６】
本発明から、腎尿細管上皮と内皮細胞の規定の比率を用いた、血管系疾患（たとえば、高血圧、微小血管症性貧血等）と関連した腎機能障害の治療法が予期される。選択された培養システム及び磁気ソーティングを用いた、内在腎内皮細胞の単離、特徴解析及び増殖を行うことにより、前もって特徴解析された、特定の割合の精製腎内皮細胞（ＳＲＣ＋）を有する選択再生腎上皮細胞（ＳＲＣ）群２，４の富化が可能となる。本発明のＳＲＣ＋細胞群は、前述の、及び本明細書に開示される、選択腎細胞（ＳＲＣまたはＢＲＣ）、及び、さらに生物活性のある細胞群（限定されないが、内皮細胞、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞及び／または脂肪由来前駆細胞を含む）を含む。１つの実施形態において、さらに生物活性のある細胞群は、腎臓起源である。他の実施形態において、さらに生物活性のある細胞群は、腎臓起源ではない。
【００２７】
本発明の１つの態様は、選択された、もしくは生物活性のある腎細胞（ＳＲＣまたはＢＲＣ）またはＳＲＣ＋細胞群の異種混合物または分画を含有する、及び／または、から形成されるオルガノイド、それらを単離及び培養する方法、ならびに、本明細書に開示されるオルガノイドを用いた治療方法を目的とする。ＳＲＣまたはＳＲＣ＋群をオルガノイドとして、腎臓へと方向性を持って送達することにより、細胞保持が改善され、それにより、全体的な治療転帰の改善がもたらされることが予期される。本発明はまた、ＳＲＣ＋細胞群を用いた治療方法を目的とする。
【００２８】
定義
他で定義されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者により普遍的に理解されているものと同じ意味を有する。Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒ  Ｌａｎｚａ，Ｒ  Ｌａｎｇｅｒ，＆  Ｊ  Ｖａｃａｎｔｉ），２００７において、本明細書に用いられている用語のうちの多くに関する全体的なガイドラインが当業者に開示されている。当業者であれば、本明細書に開示されているものと類似した、または均等な多くの方法及び物質を認識し、及び、本発明の実施に用いることができることを認識するであろう。本発明は、決して開示される方法及び物質を限定しない。
【００２９】
本明細書において、「細胞群」という用語は、適切な組織源（通常は、哺乳類）から直接的に単離することにより得た多くの細胞を指す。単離細胞群は、引き続き、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されても良い。当業者であれば、本発明で用いるための細胞群を単離及び培養するための様々な方法を認識し、及び、本発明における使用に適した細胞群の様々な細胞数を認識するであろう。細胞群は、腎臓由来の未分画な異種細胞群であっても良い。たとえば、異種細胞群は、腎生検から単離されたものでも、または全腎組織から単離されたものでも良い。あるいは、異種細胞群は、腎生検または全腎組織から確立された、哺乳類細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養由来であっても良い。未分画の異種細胞群はまた、非富化細胞群とも呼称されても良い。
【００３０】
「自然の腎臓」という用語とは、生きた対象の腎臓を意味する。対象は、健康でも不健康でも良い。不健康な対象は、腎疾患を有していても良い。
【００３１】
「再生効果」という用語は、自然の腎臓に利益をもたらす効果を意味する。当該効果としては、限定されないが、損傷の程度を自然の腎臓にまで減少させること、または、自然の腎臓の機能の改善、回復、または安定化が挙げられる。腎損傷は、線維化、炎症、糸球体肥大等の形態であっても良く、及び、対象の腎疾患に関するものであっても良い。
【００３２】
本明細書において、「再生能」または「再生活性の潜在性」という用語は、生物活性のある細胞群及び／または本明細書に開示される混合物を含有するオルガノイドの、再生効果をもたらす潜在性を指す。
【００３３】
本明細書において、「混合物」という用語は、未分画の異種細胞群から誘導された単離された富化細胞群の２以上の組み合わせを指す。ある実施態様においては、本発明の細胞群は、腎細胞群である。
【００３４】
「富化された」細胞群または調製物とは、開始腎細胞群（たとえば、未分画の異種細胞群）から誘導された細胞群を指し、当該開始細胞群におけるその細胞型の割合よりも大きい割合の特定の細胞型を含有している。たとえば、開始腎細胞群は、対象の第一、第二、第三、第四、第五等の細胞群が富化されていても良い。本明細書において、「細胞群」、「細胞調製物」、及び「細胞プロトタイプ」という用語は、相互交換可能に用いられる。
【００３５】
１つの態様において、本明細書における「富化された」細胞群という用語は、開始腎細胞群（たとえば、腎生検または培養哺乳類腎細胞由来の細胞懸濁液）由来の細胞群を指し、当該開始群におけるＥＰＯを産生することができる細胞の割合よりも高い割合のＥＰＯ産生可能細胞を含有している。たとえば、「Ｂ４」という用語は、開始群と比較して高い割合のＥＰＯ産生細胞、糸球体細胞、及び血管細胞を含有している開始腎細胞群由来の細胞群である。本発明の細胞群は、１以上の細胞型に対して付加されていても良く、及び、１以上の他の細胞型を枯渇していても良い。たとえば、富化ＥＰＯ産生細胞群は、非富化細胞群（すなわち、当該富化細胞群が誘導された開始細胞群）における間質線維芽細胞及び尿細管細胞と比較して、間質線維芽細胞を富化され、尿細管細胞及び集合尿細管上皮細胞を枯渇していても良い。ＥＰＯ富化、または「Ｂ４」群を引用している全ての実施態様において、当該富化細胞群は、酸素制御された様式においてＥＰＯを産生することができる細胞（内因性天然型ＥＰＯ遺伝子からの、酸素調整可能なＥＰＯ発現により示される）を含有する異種細胞群である。
【００３６】
他の態様において、特定の細胞型（たとえば、血管細胞、糸球体細胞または内分泌細胞）を、開始群における当該細胞型の割合よりも高い割合で含有する富化細胞群は、健康な個体または対象から誘導された開始腎細胞群と比較して、１以上の特定の細胞型（たとえば、血管細胞、糸球体細胞、または内分泌細胞）を枯渇、または不足していても良い。たとえば、１つの態様における「Ｂ４´」または「Ｂ４プライム」という用語は、健常な個体と比較して、開始検体の疾患状態に依存して、１以上の細胞型（たとえば、血管、糸球体または内分泌）を枯渇、または不足している開始腎細胞群由来の細胞群である。１つの実施形態において、「Ｂ４´」細胞群は、慢性腎疾患を有する対象に由来する。１つの実施形態において、Ｂ４´細胞群は、巣状分節上糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を有する対象由来である。他の実施形態において、Ｂ４´細胞群は、自己免疫性糸球体腎炎を有する対象由来である。他の態様において、Ｂ４´は、全ての細胞型（たとえば、血管細胞、糸球体細胞、または内分泌細胞）を含有する開始細胞群から誘導された細胞群であり、後に、１以上の細胞型（たとえば、血管細胞、糸球体細胞または内分泌細胞）を枯渇する、または不足する。さらに他の態様において、Ｂ４´は、全ての細胞型（たとえば、血管細胞、糸球体細胞、または内分泌細胞）を含有する開始細胞群由来の細胞群であり、後に、１以上の特定の細胞型（たとえば、血管細胞、糸球体細胞、または内分泌細胞）が富化される。たとえば、１つの実施形態において、Ｂ４´細胞群は、血管細胞が富化されているが、糸球体細胞及び／または内分泌細胞が枯渇されていても良い。他の実施形態において、Ｂ４´細胞群は、糸球体細胞が富化されているが、血管細胞及び／または内分泌細胞が枯渇されていても良い。他の実施形態において、Ｂ４´細胞群は、内分泌細胞が富化されているが、血管細胞／糸球体細胞が枯渇されていても良い。他の実施形態において、Ｂ４´細胞群は、血管細胞と内分泌細胞が富化されているが、糸球体細胞が枯渇されていても良い。好ましい実施形態において、単独、または他の富化細胞群（たとえば、Ｂ２及び／またはＢ３）と混合されたＢ４´細胞群は、治療特性を保持している。たとえば、Ｂ４´細胞群は、本明細書において、実施例（たとえば、実施例７〜９）に開示されている。
【００３７】
他の態様において、富化細胞群とはまた、開始群における、何らかのＥＰＯ産生細胞を伴う、血管マーカー、糸球体マーカー及び近位尿細管マーカーの１つ以上を発現している細胞の割合よりも高い、何らかのＥＰＯ産生細胞を伴う、血管マーカー、糸球体マーカー、近位尿細管マーカーを１つ以上発現している細胞を一定の割合で含有している、上述の開始腎細胞群由来の細胞群を指しても良い。たとえば、「Ｂ３」という用語は、開始群と比較して、高い割合の近位尿細管細胞ならびに血管細胞及び糸球体細胞を含有する開始腎細胞群由来の細胞群を指す。１つの実施形態において、Ｂ３細胞群は、開始群と比較して高い割合の近位尿細管細胞を含有するが、Ｂ２細胞群と比較して近位尿細管細胞の割合は低い。他の実施形態において、Ｂ３細胞群は、開始群と比較して、大きな割合の、何らかのＥＰＯ産生細胞を伴う血管マーカー及び糸球体細胞マーカーを含有するが、Ｂ４細胞群と比較して、何らかのＥＰＯ産生細胞を伴う血管細胞マーカー及び糸球体細胞マーカーの割合は低い。
【００３８】
他の態様において、富化細胞群はまた、開始群において尿細管細胞マーカーを１つ以上発現している細胞の割合よりも高く、尿細管細胞マーカーを１つ以上発現している一定割合の細胞を含有する、上述の開始腎細胞群由来の細胞群を指しても良い。たとえば、「Ｂ２」という用語は、開始群と比較して、高い割合の尿細管細胞を含有する開始腎細胞群由来の細胞群を指す。さらに、尿細管細胞マーカーを１つ以上発現している細胞を富化した細胞群（またはＢ２）は、集合尿細管システム由来のいくらかの上皮細胞を含有しても良い。尿細管細胞マーカーを１つ以上発現している細胞に対する細胞群（またはＢ２）は比較的ＥＰＯ産生細胞、糸球体細胞及び血管細胞を枯渇しているが、当該富化群は、開始群と比較し、低い割合のこれら細胞（ＥＰＯ産生細胞、糸球体細胞及び血管細胞）を含有しても良い。概して、枯渇前の異種細胞群に含有されていた細胞型（複数含む）の比率と比較して、枯渇異種細胞群は少ない比率の細胞型（複数含む）を含有するように、当該異種細胞群は、１つ以上の細胞型を枯渇される。枯渇されうる細胞型は、任意の腎細胞型である。たとえば、ある実施形態において、枯渇されうる細胞型としては、＜約１．０４５ｇ／ｍｌの密度を有する集合尿細管及び尿細管システムの大きな粒度の細胞（Ｂ１と呼称される）が挙げられる。他のある実施形態においては、枯渇されうる細胞型としては、＞約１．０９５ｇ／ｍｌの密度を有する、低い粒度と活性の細胞残渣及び小細胞（Ｂ５と呼称される）が挙げられる。一部の実施形態において、尿細管細胞を富化した細胞群は、比較的、以下の全てを枯渇している：「Ｂ１」、「Ｂ５」、酸素調整可能なＥＰＯ発現細胞、糸球体細胞、及び血管細胞。
【００３９】
本明細書において用いられる「低酸素」培養条件という用語は、大気酸素レベル（約２１％）で細胞が培養される標準的な培養条件と比較して、培養システム中の利用可能な酸素レベルが減少している状態に細胞が供される培養条件を指す。非低酸素条件は、本明細書において、通常、または、正常酸素培養条件と呼称される。
【００４０】
本明細書において、「酸素調整可能な」という用語は、細胞が利用可能な酸素の量に基づいて、遺伝子発現を（上または下に）調節する細胞の能力を指す。「低酸素誘導性」とは、（誘導前の酸素圧、または開始酸素圧にかかわらず）酸素圧の減少に反応して遺伝子発現を上方制御することを指す。
【００４１】
「スフェロイド」という用語は、単層としての増殖とは対照的に、３Ｄ増殖を可能とするよう培養された細胞の凝集体またはアセンブリを指す。「スフェロイド」という用語は、当該凝集体が幾何学的な球状であることを意味しないことに注意されたい。凝集体は、きちんと確立された形態を有するよう高度に組織化されても良く、または、組織化されていない塊であっても良い；単一の細胞型を含有しても良く、または２以上の細胞型を含有しても良い。細胞は、主に分離下部であっても良く、または永久細胞株であっても良く、または当該２つの組み合わせであっても良い。本定義には、オルガノイド及び器官型培養物が含まれる。
【００４２】
本明細書において、「オルガノイド」という用語は、自然状態の器官に存在している細胞の自己組織化、構造、及びシグナル伝達相互作用の態様が再現されている細胞の異種３Ｄ凝集を指す。「オルガノイド」という用語には、スフェロイドまたは細胞培養懸濁液から形成された細胞塊が含まれる。
【００４３】
本明細書において「バイオマテリアル」という用語は、生きた組織への導入に適した天然または合成の生体適合性のある物質を指す。天然型バイオマテリアルは、生きているシステムにより作製された物質である。合成バイオマテリアルは、生きているシステムにより作製されていない物質である。本明細書に開示されるバイオマテリアルは、天然型または合成の生体適合性物質の組み合わせであっても良い。本明細書において、バイオマテリアルとしては、限定されないが、たとえば、ポリマーマトリクス及びスキャホールドが挙げられる。当分野の当業者であれば、バイオマテリアル（複数含む）は、たとえば、液体ハイドロゲル懸濁液、多孔質発泡体等の様々な形態で構成されても良く、及び、天然または合成生体適合性物質を１つ以上含有しても良い。
【００４４】
「構築物」という用語は、１つ以上の合成または天然生体適合性物質から構成されているスキャホールドまたはマトリクス内、または表面上に置かれた１つ以上の細胞群を指す。当該１つ以上の細胞群は、１つ以上の合成または天然生体適合性ポリマー、タンパク質、またはペプチドから構成されているバイオマテリアルでコートされ、上に置かれ、組み込まれ、付着され、播種され、または封入されても良い。当該１つ以上の細胞群は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでバイオマテリアルまたはスキャホールドまたはマトリクスと組み合わされても良い。概して、スキャホールド／バイオマテリアルを形成するために用いられる１以上の生体適合性物質は、その上に置かれる細胞群のうちの少なくとも１つの、多細胞性の３次元組織化の形成を指示し、促進し、または可能とするよう選択される。当該構築物を作製するために用いられる１以上のバイオマテリアルはまた、内因性宿主組織を有する構築物または構築物の細胞成分の分散及び／または組込みを指示、促進または可能とするよう選択されても良く、または、構築物または構築物の細胞成分の生存、生着、寛容または機能的遂行を指示、促進または可能とするよう選択されても良い。
【００４５】
「マーカー」または「バイオマーカー」という用語は通常、ＤＮＡ、ＲＮＡ，タンパク質、炭水化物または糖脂質をベースとした分子マーカーを指し、培養細胞群において、それらの発現または存在は、標準的な方法（または本明細書に開示される方法）により検出されることができ、当該培養細胞群における１以上の細胞が、特定の細胞型であることと一致している。マーカーは、細胞により発現されるポリペプチドであっても良く、または、たとえば遺伝子、制限酵素認識部位等の染色体上の識別可能な物理的位置であっても良く、または、天然細胞により発現されるポリペプチドをコードする核酸（たとえば、ｍＲＮＡ）であっても良い。マーカーは、「遺伝子発現マーカー」と呼称される遺伝子の発現領域であっても良く、または、コードしている機能が不明なＤＮＡの何らかのセグメントであっても良い。バイオマーカーは、細胞誘導性（たとえば、分泌された）産物であっても良い。
【００４６】
「特異的に発現された遺伝子」、「特異的遺伝子発現」という用語、及びそれらの類義語は、相互交換可能に用いられ、それら発現は、第二の細胞または細胞群におけるその発現と比較して、第一の細胞または細胞群において高いレベル、または低いレベルにまで活性化される遺伝子を指す。当該用語にはまた、その発現が、第一または第二の培養中の細胞の継代の間に、経時的に異なるステージで、高いレベルまたは低いレベルまで活性化される遺伝子が含まれる。また、特異的に発現される遺伝子は、核酸レベルまたはタンパク質レベルで活性化または阻害されても良く、または、別のスプライシングが行われ、異なるポリペプチド産物が生じても良い。その差は、たとえばｍＲＮＡレベルにおける変化、表面発現における変化、ポリペプチド分泌の変化またはポリペプチド分配の変化により明らかとなっても良い。特異的遺伝子発現としては、２以上の遺伝子またはその遺伝子産物間の発現比較、または、２以上の遺伝子またはその遺伝子産物管の発現比率の比較、または、同じ遺伝子の２つの異なるプロセッシング産物の比較が挙げられても良く、それらは第一の細胞と第二の細胞の間で異なっている。特異的発現は、遺伝子またはその発現産物の、たとえば第一の細胞と第二の細胞の間の一時的発現または細胞発現のパターンにおける、定量的ならびに定性的な差の両方が含まれる。本発明の目的に関しては、「特異的遺伝子発現」は、第一の細胞と第二の細胞における所与の遺伝子の発現の間に差がある場合に存在するとみなされる。マーカーの特異的発現は、投与（第二の細胞）を受けた後の患者由来の細胞における発現と比較して、細胞群、混合物または構築物（第一の細胞）の投与を受ける前の患者由来の細胞においてであっても良い。
【００４７】
「阻害する」、「下方制御する」、「低発現させる」、及び「減少させる」という用語は相互交換可能に用いられ、１以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、または、ＲＮＡ分子もしくは同等のＲＮＡ分子のレベル、または、１以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性が、１以上の対象（たとえば、１以上の陽性対照及び／または陰性対照）と比較して減少していることを意味する。低発現は、投与後の患者由来の細胞と比較して、細胞群、混合物または構築物の投与を受ける前の患者由来の細胞におけるものであっても良い。
【００４８】
「上方制御」、または「過剰発現」という用語は、１以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、またはＲＮＡ分子もしくは同等のＲＮＡ分子のレベル、または１以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性が、１以上の対象（たとえば、１以上の陽性対照及び／または陰性対照）と比較して上昇していることを意味する。過剰発現は、投与前の患者由来の細胞と比較して、細胞群、混合物または構築物の投与を受けた後の患者由来の細胞におけるものであっても良い。
【００４９】
本明細書において、「貧血」という用語は、対象のＥＰＯ産生細胞による機能的なＥＰＯタンパク質の産生が不適切であることによる、ならびに／または、全身循環へのＥＰＯタンパク質放出が不適切であることによる、ならびに／または、ＥＰＯタンパク質に応答する骨髄における赤芽球の不能による、赤血球数及び／またはヘモグロビンレベルの不足を指す。貧血を有する対象は、赤血球のホメオスタシスを維持することができない。概して、貧血は、腎機能の減少または喪失（たとえば、慢性腎不全）で発生し、相対ＥＰＯ欠乏と関連した貧血、うっ血性心不全と関連した貧血、たとえば化学療法または抗ウイルス治療（たとえば、ＡＺＴ）等の骨髄抑制性治療に関連した貧血、非骨髄癌と関連した貧血、ウイルス（たとえばＨＩＶ）感染と関連した貧血、ならびに、自己免疫性疾患（たとえば、リュウマチ性関節炎）、肝疾患及び多臓器不全等の慢性疾患の貧血がある。
【００５０】
「ＥＰＯ欠乏」という用語は、エリスロポエチン受容体アゴニスト（たとえば、組換えＥＰＯまたはＥＰＯアナログ）を用いて治療することができる任意の状態または疾患を指し、貧血が含まれる。
【００５１】
本明細書において、「臓器関連疾患」という用語は、臓器がその機能を発揮する能力を失う急性または慢性の臓器不全の任意のステージまたは程度と関連した疾患を指す。
【００５２】
本明細書において、「腎疾患」という用語は、血液を濾過し、血液から過剰な液体、電解質及び老廃物を排出する機能を行う腎臓の能力が失われた急性または慢性の腎不全の任意のステージまたは程度に関連した疾患を指す。また、腎疾患としては、たとえば貧血（エリスロポエチン欠乏）及びミネラルの不均衡（ビタミンＤ欠乏）等の内分泌機能障害が挙げられる。腎疾患は、腎臓に起源があっても良く、または、様々な状態（限定されないが、心不全、高血圧、糖尿病、自己免疫性疾患または肝疾患が挙げられる）に続発するものであっても良い。腎疾患は、腎臓の急性損傷後に発症した慢性腎不全の状態であっても良い。たとえば、虚血及び／または毒物に曝されたことにより腎臓に障害が発生し、それによって急性腎損傷となり；急性腎損傷の後の回復が不完全であるために慢性腎不全を発症することもある。
【００５３】
「処置」という用語は、腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏、尿細管輸送の欠如、または糸球体濾過の欠如に対する治療的処置及び予防または防止的手段の両方を指し、その目的は、標的とした疾患の回復、防止または減速（減少）ことである。治療を必要とする対象としては、既に腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏、尿細管輸送の欠如、または糸球体濾過の欠如を有するもの、ならびに、腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏、尿細管輸送の欠落、もしくは糸球体濾過の欠如を有する傾向があるもの、または、腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏、尿細管輸送の欠落、もしくは糸球体濾過の欠如が予防されるもの、が挙げられる。本明細書において、「処置」という用語は、腎機能の安定化及び／または改善が含まれる。
【００５４】
「対象」という用語は、任意の１人のヒト対象（腎疾患、貧血またはＥＰＯ欠如の兆候、症状または他の指標を１つ以上経験している、または経験していた処置の適格者、患者）を意味する。そのような対象としては、限定されないが、腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠如（原因は問わない）と新たに診断された、もしくは既に診断されていた者、及び、再発、ぶり返しを新たに経験している者、または、そのリスクがある者が挙げられる。対象は、腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠如に対して既に処置を受けていても良く、または受けていなくても良い。
【００５５】
「患者」という用語は、処置が望まれる任意の１つの動物、より好ましくは哺乳類（たとえば、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、及び非ヒト霊長類等の非ヒト動物を含む）を指す。最も好ましくは、本明細書において、患者はヒトである。
【００５６】
「試料（サンプル）」または「患者試料（サンプル）」または「生物学的試料（サンプル）」という用語は、通常、対象もしくは患者、体液、体組織、細胞株、組織培養物、または他の源から得られた任意の生物学的試料を意味する。当該用語は、たとえば腎生検等の組織生検を含む。当該用語は、たとえば培養哺乳類腎細胞等の培養細胞を含む。組織生検及び培養細胞を哺乳類から得るための方法は当分野に公知である。もし「試料」という用語が単独で用いられた場合、それは、「試料」が「生物学的試料」または「患者試料」（すなわち、当該用語は相互交換可能に用いられる）であることを意味している。
【００５７】
「検証試料」という用語は、本発明の方法により処置された対象由来の試料を指す。検証試料は、限定されないが、血液、精液、血清、尿、骨髄、粘膜、組織等の、哺乳類対象の様々な源由来のものであっても良い。
【００５８】
「対照」または「対照試料」という用語は、陰性結果または陽性結果が予期され、検証試料における結果との相互関係の証明を補助する陽性対照または陰性対照を指す。本発明に適した対照としては、限定されないが、正常な赤血球ホメオスタシスに特徴的な指標を示すことが知られている試料、貧血に特徴的な指標を示すことが知られている試料、貧血ではないことが分かっている対象から得た試料、及び、貧血であることが判明している対象から得た試料が挙げられる。本発明方法における使用に適したさらなる対照としては、限定されないが、赤血球産生を調節することが知られている薬剤（たとえば、組換えＥＰＯまたはＥＰＯアナログ）で処置された対象から得た試料が挙げられる。さらに、対照は、本発明方法により処置される前の対象から得た試料であっても良い。適切な対照としてはさらに、任意の型またはステージの腎疾患を有していることが判明している対象から得た検証試料、任意の型またはステージの腎疾患を有していないことが判明している対象由来の試料であっても良い。対照は、正常で健康な、対応対照であっても良い。当業者であれば、本発明における使用に適した他の対照を認識しうるであろう。
【００５９】
「再生の予後診断」、「再生予後診断」、または「再生に関する予後診断」は通常、本明細書に開示される細胞群、混合物もしくは構築物の投与または移植により推定される再生経過または転帰に関する予測または予想を指す。再生予後診断に関しては、予測または予想は、以下のうちの１つ以上により情報が与えられるものであっても良い：移植または投与後の機能性器官（たとえば腎臓）の改善、移植または投与後の機能性腎臓の発生、移植または投与後の腎臓機能または能力の改善の発現、及び、移植または投与後の自然状態の腎臓による、あるマーカーの発現。
【００６０】
「再生された器官」とは、本明細書に開示される細胞群、混合物もしくは構築物の移植または投与後の、自然状態にある器官を指す。再生された器官は、様々な指標（限定されないが、自然器官の機能または能力の発現、自然器官の機能または能力の改善、及び、自然器官のあるマーカーの発現が挙げられる）により特徴付けられる。当業者であれば、再生器官の特徴付けに適しうる他の指標を認識するであろう。
【００６１】
「再生された腎臓」とは、本明細書に開示される細胞群、混合物もしくは構築物の移植または投与後の、自然状態にある腎臓を指す。再生された腎臓は、様々な指標（限定されないが、自然腎臓の機能または能力の発現、自然腎臓の機能または能力の改善、及び、自然腎臓のあるマーカーの発現が挙げられる）により特徴付けられる。当業者であれば、再生腎臓の特徴付けに適しうる他の指標を認識するであろう。
【００６２】
ＳＲＣ＋細胞群
本発明により、急性または慢性の腎疾患の処置における使用のための、特定の生物活性のある成分または細胞型が富化され、ならびに／または、不活性もしくは望ましくない成分または細胞型及びさらには生物活性のある細胞群（限定されないが、内皮細胞、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来前駆細胞が挙げられる）が枯渇した、単離異種腎細胞群を含有する細胞群が開示される。特定の生物活性のある成分または細胞型が富化され、及び／または、特定の不活性もしくは望ましくない成分または細胞型が枯渇された単離異種腎細胞群は、本明細書に開示される任意の細胞群を含有しても良い。１つの実施形態において、当該さらなる生物活性のある成分（たとえば、内皮細胞、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来前駆細胞）は、特定の生物活性のある成分もしくは細胞型が富化され、及び／または、特定の不活性もしくは望ましくない成分または細胞型が枯渇した単離異種腎細胞群と混合される。本発明の他の態様において、本明細書に開示されるＳＲＣ＋細胞群の製造方法が開示される。当該細胞群を含有する当該さらなる生物活性のある成分（たとえば、内皮細胞、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来前駆細胞）は、細胞または組織の欠如を改善するために十分な任意の割合で存在しても良い。
【００６３】
本発明の細胞群は、１以上のさらなる生物活性のある成分（限定されないが、たとえば、当該細胞群を含有する、内皮細胞、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来前駆細胞）を含有しても良い。ある実施形態において、当該細胞群は、２つのさらなる生物活性のある成分を含有する。ある実施形態において、当該細胞群は、３つのさらなる生物活性のある成分を含有する。ある実施形態において、当該細胞群は、４つのさらなる生物活性のある成分を含有する。ある実施形態において、当該細胞群は、５つのさらなる生物活性のある成分を含有する。ある実施形態において、当該細胞群は、６つのさらなる生物活性のある成分を含有する。ある実施形態において、当該細胞群は、７つのさらなる生物活性のある成分を含有する。ある実施形態において、当該細胞群は、８つのさらなる生物活性のある成分を含有する。ある実施形態において、当該細胞群は、９つのさらなる生物活性のある成分を含有する。ある実施形態において、当該細胞群は、１０つのさらなる生物活性のある成分を含有する。
【００６４】
１つの実施形態において、さらなる生物活性のある成分は、上皮細胞である。１つの実施形態において、上皮細胞は、近位尿細管上皮細胞である。他の実施形態において、上皮細胞は、遠位尿細管上皮細胞である。他の実施形態において、上皮細胞は、壁上皮細胞である。
【００６５】
他の実施形態において、さらなる生物活性のある成分は、上皮細胞である。１つの実施形態において、上皮細胞は、静脈内皮細胞である。１つの実施形態において、上皮細胞は、動脈内皮細胞である。１つの実施形態において、上皮細胞は、毛細管内皮細胞である。１つの実施形態において、上皮細胞は、リンパ内皮細胞である。
【００６６】
他の実施形態において、さらなる生物活性のある成分は、集合尿細管細胞である。さらに他の実施形態において、さらなる生物活性のある成分は、平滑筋細胞である。他の実施形態において、さらなる生物活性のある成分は、間葉系幹細胞である。他の実施形態において、さらなる生物活性のある成分は、内皮細胞系列、間葉系細胞系列、上皮細胞系列、または造血細胞系列の前駆細胞である。他の実施形態において、さらなる生物活性のある成分は、内胚葉系、外胚葉系、または間葉系起源の前駆細胞である。ある実施形態において、さらなる生物活性のある成分は、任意の起源または由来の幹細胞（限定されないが、胚性（ＥＳ）幹細胞及び人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞が挙げられる）である。一部の実施形態において、さらなる生物活性のある成分は、任意の起源または由来の幹細胞（限定されないが、胚性（ＥＳ）幹細胞及び人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞が挙げられる）の派生物であり、ここで、当該派生物は、小分子及び／もしくはタンパク質及び／もしくは核酸分子の規定の組み合わせまたはカクテルにより幹細胞から分化指示されることにより作製されても良い。１つの実施形態において、さらなる生物活性のある成分は、内皮系、間葉系、上皮系または造血系の系列の前駆細胞の派生物であり、ここで、当該派生物は、小分子及び／もしくはタンパク質及び／もしくは核酸分子の規定の組み合わせまたはカクテルにより幹細胞から分化指示されることにより作製されても良い。１つの実施形態において、さらなる生物活性のある成分は、内胚葉系、外胚葉系、間葉系起源の前駆細胞の派生物であり、ここで、当該派生物は、小分子及び／もしくはタンパク質及び／もしくは核酸分子の規定の組み合わせまたはカクテルにより幹細胞から分化指示されることにより作製されても良い。１つの実施形態において、さらなる生物活性のある成分は、任意の系列または派生物が遺伝子操作された細胞である。
【００６７】
さらに他の実施形態において、さらなる生物活性のある成分は、間質細胞である。１つの実施形態において、間質細胞は、支持線維芽細胞である。他の実施形態において、間質細胞は、分化した皮質エリスロポエチン産生線維芽細胞である。
【００６８】
１つの実施形態において、さらなる生物活性のある成分は、対象に対して自己である源由来である。他の１つの実施形態において、さらなる生物活性のある成分は、対象に対して同種である源由来である。ある実施形態において、さらなる生物活性のある成分は、対象に対して自己である源由来であり、そのさらなる生物活性のある成分は、対象に対して同種である源由来である、さらなる生物活性のある成分との混合物である。
【００６９】
本発明のある態様において、本明細書に開示される細胞群及び／またはオルガノイド及び／またはバイオマテリアルの指示送達により腎臓の大部分及び腎臓の機能性の標的化再生のための方法が開示される。本発明の他の態様においてさらに、本明細書に開示される細胞群及び／またはオルガノイド及び／またはバイオマテリアルの投与により急性または慢性の腎疾患を有する患者における、腎機能の防御及び／または回復のための方法が開示される。
【００７０】
治療用オルガノイド
本発明によりさらに、本明細書に開示される生物活性のある成分（たとえば、Ｂ２、Ｂ４及びＢ３であり、不活性または望ましくない成分（たとえば、Ｂ１及びＢ５）を枯渇しており、急性及び／または慢性腎疾患の処置における使用のために、単独、または混合される）を含有する、及び／または、から形成されるオルガノイドが開示される。１つの態様において、本発明により、１以上の細胞型（たとえば、血管、内分泌または内皮）が枯渇または欠如している、特定の亜分画（Ｂ４）（すなわち、Ｂ４´であり、単独で、または他の生物活性のある亜分画（たとえば、Ｂ２及び／またはＢ３）と混合された際に、治療特性（たとえば腎機能の安定化及び／または改善及び／または再生）を保持している）を含有する、及び／または、から形成されるオルガノイドが開示される。好ましい実施形態において、生物活性のある細胞群は、Ｂ２である。ある実施形態において、Ｂ２細胞群は、Ｂ４またはＢ４´と混合される。他の実施形態において、Ｂ２細胞群は、Ｂ３と混合される。他の実施形態において、Ｂ２細胞群は、Ｂ３及びＢ４の両方、または、Ｂ３及び／またはＢ４の特定の細胞性成分と混合される。全ての実施形態において、本発明のオルガノイドは、ｅｘ  ｖｉｖｏで形成及び培養される。全ての実施形態において、オルガノイドはさらに、さらなる生物活性のある細胞群（限定されないが、内皮細胞、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来前駆細胞が挙げられる）を含有し、及び／または、から形成されても良い。１つの実施形態において、さらなる生物活性のある細胞群（限定されないが、内皮細胞、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来前駆細胞が挙げられる）は、特定の生物活性成分または細胞型が富化された、及び／または、不活性もしくは望ましくない成分または細胞型が枯渇した、単離異種腎細胞群と混合される。
【００７１】
１つの実施形態において、本発明のオルガノイドは、Ｂ２細胞群を含有し、または、から形成され、ここで、当該Ｂ２細胞群は、尿細管細胞の富化群を含有する。他の実施形態において、当該異種腎細胞群はさらに、Ｂ４細胞群を含有する。さらに他の実施形態において、当該異種腎細胞群はさらに、Ｂ３群を含有する。さらに他の実施形態において、当該異種腎細胞群はさらに、Ｂ５群を含有する。
【００７２】
ある実施形態において、細胞群は、Ｂ２細胞群を含有し、ここで、当該Ｂ２細胞群は、尿細管細胞の富化群を含有し、及び、Ｂ１細胞群、及び／または、Ｂ５細胞群を枯渇している。
【００７３】
他の態様において、本発明により、単独または混合されて、不活性または望ましくない成分（たとえば、Ｂ１及びＢ５）を枯渇している、本発明の生物活性のある成分（たとえば、Ｂ２、Ｂ４及びＢ３）を含有する、及び／または、から形成されるオルガノイドを形成する方法が開示される。１つの態様において、本発明により、１以上の細胞型（たとえば、血管、内分泌または内皮）が枯渇または不足している、特定の亜分画（Ｂ４）（すなわち、Ｂ４´であり、単独で、または他の生物活性のある亜分画（たとえば、Ｂ２及び／またはＢ３）と混合された際に、治療特性（たとえば腎機能の安定化及び／または改善及び／または再生）を保持している）を含有する、及び／または、から形成されるオルガノイドが開示される。好ましい実施形態において、生物活性のある細胞群は、Ｂ２である。ある実施形態において、Ｂ２細胞群は、Ｂ４またはＢ４´と混合される。他の実施形態において、Ｂ２細胞群は、Ｂ３と混合される。他の実施形態において、Ｂ２細胞群は、Ｂ３及びＢ４の両方、または、Ｂ３及び／またはＢ４の特定の細胞性成分と混合される。
【００７４】
１つの実施形態において、本発明のオルガノイドは、Ｂ２細胞群を含有し、または、から形成され、ここで、当該Ｂ２細胞群は、尿細管細胞の富化群を含有する。他の実施形態において、当該異種腎細胞群はさらに、Ｂ４細胞群を含有する。さらに他の実施形態において、当該異種腎細胞群はさらに、Ｂ３群を含有する。さらに他の実施形態において、当該異種腎細胞群はさらに、Ｂ５群を含有する。
【００７５】
ある実施形態において、細胞群は、Ｂ２細胞群を含有し、ここで、当該Ｂ２細胞群は、尿細管細胞の富化群を含有し、及び、Ｂ１細胞群、及び／または、Ｂ５細胞群を枯渇している。
【００７６】
他の態様において、本発明により、本明細書に開示される生物活性のある細胞群及び／または混合物を用いた、オルガノイドを形成する方法が開示される。３Ｄ  ＣＯＬ（Ｉ）ゲルを用いた、初代腎細胞群から管を作製する一般的な方法は当分野に公知であり、たとえば、Ｊｏｒａｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９  Ｆｅｂ；４７（２）：１２９−３３に記載されている。全ての実施形態において、本発明のオルガノイドは、ｅｘ  ｖｉｖｏで形成及び培養される。
【００７７】
一部の実施形態において、本明細書に開示される生物活性のある細胞群及び／または混合物からのオルガノイド及び管の形成は、たとえば、限定されないが、以下の培養方法またはシステムを用いて誘導されても良い：ｉ）２Ｄ培養；ｉｉ）３Ｄ培養：ＣＯＬ（Ｉ）ゲル；ｉｉｉ）３Ｄ培養：マトリゲル；ｉｖ）３Ｄ培養：スピナー、次いで、ＣＯＬ（Ｉ）／マトリゲル；及び、ｖ）３Ｄ培養：ＣＯＬ（ＩＶ）ゲル。ＮＫＡからオルガノイド及び管を形成する具体的な例は、以下の実施例２及び４に開示される。
【００７８】
１つの実施形態において、本明細書に開示される生物活性のある細胞調製物及び／または混合物から形成されるオルガノイドは、２Ｄ培養で誘導されても良い。１つの実施形態において、本明細書に開示される生物活性のある細胞調製物及び／または混合物は、標準的な２Ｄプラスチック製品上に播種される。１つの実施形態において、細胞は、約５０００細胞／ｃｍ２の密度で播種される。細胞は、適切な培地（たとえば、腎細胞完全増殖培地）（ＲＣＧＭ）に播種されても良い。概して、細胞群は、約３〜４日毎に定期的に培地を交換しながら、約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日以上の間、コンフルエンスを過ぎて増殖されても良い。１つの実施形態において、細胞は、スフェロイド構造（すなわち、オルガノイド）及び管へと、約７〜約１５日の間に、自発的な自己組織化を示す。
【００７９】
他の実施形態において、本明細書に開示される生物活性のある細胞調製物及び／または混合物から形成されたオルガノイドは、３Ｄ培養で誘導されても良い。１つの実施形態において、オルガノイドは、天然または合成起源のバイオマテリアルスキャホールドと共に本発明の細胞群を用いて作製される。１つの実施形態において、本明細書に開示される製剤化された生物活性のある細胞調製物及び／または混合物は、コラーゲン（Ｉ）ゲル、コラーゲン（ＩＶ）ゲル、マトリゲル、または前述のこれらの任意の混合物（Ｇｕｉｍａｒａｅｓ−Ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ０：１−９を参照のこと）へ組み込まれても良い。液体ゲルは、中性ｐＨとされても良く、本明細書に開示される生物活性のある細胞調製物及び／または混合物は、約５００〜２５００細胞／ｕｌで混合されても良い。１つの実施形態においては、約１０００細胞／ｕｌが混合される。細胞／ゲル混合物は、たとえば、約２００〜約４００ｕｌ／ウェルの２４ウェルプレートのウェルへと分注され、数時間、３７℃で凝固されても良い。次いで、細胞培養培地を添加し、培地を定期的に交換しながら、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０日間、成熟するまで培養させても良い。１つの実施形態において、菅構造のネットワークは、本明細書に開示される生物活性のある細胞調製物及び／または混合物により、ゲルマトリクス全体に格子構造及び環状形態として組織化される。
【００８０】
他の実施形態において、オルガノイドは、スピナーフラスコまたは低結合プラスチック製品中で、本明細書に開示される生物活性のある細胞調製物及び／または混合物の懸濁培養液により、形成されても良い。１つの実施形態において、約８０ｒｐｍ、最大で４日間、スピナーフラスコの培地中で細胞が培養されても良い。次いで、スフェロイドがさらに約７、約８、約９、または約１０日間、たとえばマトリゲルコートプレート上で培養されても良い。１つの実施形態において、本明細書に開示される生物活性のある細胞調製物及び／または混合物から形成されたスフェロイドは、培養スフェロイドから新たに伸びた環状構造により示されるように、管形成の潜在力を示す。
【００８１】
細胞群
本発明のＳＲＣ＋細胞群及び／またはオルガノイドは、腎疾患の処置における使用のため（すなわち、腎機能の安定化及び／または改善及び／または再生をもたらすために）に、特定の生物活性のある成分または細胞型を富化した、及び／または、特定の不活性な、もしくは望ましくない成分または細胞型を枯渇させた、単離異種腎細胞群、及びその混合物を含有し、及び／または、から形成されても良い（ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＵＳ２０１１−０１１７１６２及びＩｌａｇａｎらのＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７に既に開示されている。参照により、その全内容が本明細書に援用される）。オルガノイドは、健常な個人と比較して細胞成分を欠いているが、治療特性を保持している（すなわち、腎機能の安定化及び／または改善及び／または再生をもたらす）単離腎細胞分画を含有しても良い。本明細書に開示される細胞群、細胞分画及び／または混合物は、健常な個人、腎疾患を有する個人、または、本明細書に開示される対象から誘導されても良い。
【００８２】
生物活性のある細胞群
本発明から、必要のある対象の標的器官または組織へと投与される、生物活性のある細胞群を含有する、治療用オルガノイド及びＳＲＣ＋細胞群が予期される。通常、生物活性のある細胞群は、対象への投与に対する治療特性を潜在的に有する細胞群を指す。たとえば、必要のある対象への投与で、生物活性のある腎細胞群を含有するオルガノイドは、対象の腎機能の安定化及び／または改善及び／または再生をもたらすことができる。治療特性に、再生効果が含まれても良い。
【００８３】
生物活性のある細胞群としては、限定されないが、たとえば胚性幹細胞、羊膜幹細胞、成体幹細胞（たとえば、造血幹細胞、乳腺幹細胞、腸管幹細胞、間葉系幹細胞、胎盤幹細胞、肺幹細胞、骨髄幹細胞、血液幹細胞、臍帯幹細胞、内皮幹細胞、歯髄幹細胞、脂肪幹細胞、神経幹細胞、嗅神経幹細胞、神経堤幹細胞、精巣幹細胞等）等の幹細胞（たとえば多能性、多分化能、２以上の分化能、または単分化能等）、人工多能性幹細胞；遺伝子操作された細胞；ならびに、任意の身体の源から誘導された細胞群または組織片が挙げられる。生物活性のある細胞群は、単離、富化、精製、同種または異種の性質であっても良い。当業者であれば、本発明のオルガノイドの作製における使用に適した他の生物活性のある細胞群を認識するであろう。
【００８４】
１つの実施形態において、細胞の源は、意図される標的器官または組織と同じである。たとえば、腎細胞は、当該腎臓へ投与されるオルガノイドを作製するために、当該腎臓から調達されても良い。他の実施形態において、細胞の源は、意図される標的器官または組織と同じではない。たとえば、エリスロポエチン発現細胞は、当該腎臓へ投与されるオルガノイドを作製するために、腎脂肪から調達されても良い。
【００８５】
１つの態様において、本発明により、生物活性のある成分を富化され、不活性な、または望ましくない成分を枯渇された、異種腎細胞群のある亜分画を含有するオルガノイドが開示され、それにより、開始群よりも優れた治療転帰及び再生結果がもたらされる。たとえば、本明細書に開示される生物活性のある腎細胞（たとえば、Ｂ２、Ｂ４及びＢ３）は、不活性な、または望ましくない成分（たとえば、Ｂ１及びＢ５）が枯渇され、単独または混合されており、腎機能を安定化及び／または改善及び／または再生させるために用いられるオルガノイドを作製するために用いることができる。
【００８６】
他の態様において、オルガノイドは、特定の亜分画、Ｂ４（１以上の細胞型（たとえば、血管、内分泌または内皮）を枯渇または欠如している、すなわちＢ４´であり、単独で、または他の生物活性のある亜分画（たとえば、Ｂ２及び／またはＢ３）と混合された際に、治療特性（たとえば、腎機能の安定化及び／または改善及び／または再生）を保持している）を含有する。好ましい実施形態において、生物活性のある細胞群は、Ｂ２である。ある実施形態において、Ｂ２細胞群は、Ｂ４またはＢ４´と混合される。他の実施形態において、Ｂ２細胞群は、Ｂ３と混合される。他の実施形態において、Ｂ２細胞群は、Ｂ３及びＢ４の両方、または、Ｂ３及び／またはＢ４の特定の細胞性成分と混合される。
【００８７】
Ｂ２細胞群は、以下の１つ以上からなる群から選択される尿細管細胞マーカーの発現により特徴付けられる：メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３  ２５−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送レギュレーター４（Ｆｘｙｄ４）、溶質担体ファミリー９（ナトリウム／水素交換）、メンバー４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ３ファミリー、メンバーＢ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＡ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、及び、カルパイン−８（Ｃａｐｎ８）、及び集合尿細管マーカーアクアポリン−４（Ａｑｐ４）。Ｂ２は、Ｂ３及び／またはＢ４よりも大きく、粒状であり、それゆえに、約１．０４５ｇ／ｍｌ〜約１．０６３ｇ／ｍｌ（げっ歯類）、約１．０４５ｇ／ｍｌ〜１．０５２ｇ／ｍｌ（ヒト）、及び約１．０４５ｇ／ｍｌ〜約１．０５８ｇ／ｍｌ（イヌ科）の浮遊密度を有している。
【００８８】
Ｂ３細胞群は、何らかのＥＰＯ産生細胞を伴う、血管、糸球体及び近位尿細管マーカーの発現により特徴付けられ、Ｂ２及びＢ４と比較して、中間のサイズと粒度であり、ゆえに、約１．０６３ｇ／ｍｌ〜約１．０７３ｇ／ｍｌ（げっ歯類）、約１．０５２ｇ／ｍｌ〜約１．０６３ｇ／ｍｌ（ヒト）、及び約１．０５８ｇ／ｍｌ〜約１．０６３ｇ／ｍｌ（イヌ科）の浮遊密度を有している。Ｂ３は、以下の１つ以上からなる群から選択されるマーカーの発現により特徴付けられる：アクアポリン７（Ａｑｐ７）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送レギュレーター２（Ｆｘｙｄ２）、溶質担体ファミリー１７（リン酸ナトリウム）、メンバー３（Ｓｌｃ１７ａ３）、溶質担体ファミリー３、メンバー１（Ｓｌｃ３ａ１）、クラウジン２（Ｃｌｄｎ２）、ナプシンＡアスパラギン酸ペプチダーゼ（Ｎａｐｓａ）、溶質担体ファミリー２（グルコース促進トランスポーター）、メンバー２（Ｓｌｃ２ａ２）、アラニル（膜）アミノペプチダーゼ（Ａｎｐｅｐ）、膜貫通タンパク質２７（Ｔｍｅｍ２７）、アシル−ＣｏＡ合成酵素中鎖ファミリーメンバー２（Ａｃｓｍ２）、グルタチオンペルオキシダーゼ３（Ｇｐｘ３）、フルクトース−１，６−バイホスファターゼ１（Ｆｂｐ１）、及び、アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ２（Ａｇｘｔ２）。Ｂ３はまた、血管発現マーカーである、血小板内皮細胞付着分子（Ｐｅｃａｍ）及び、糸球体発現マーカーであるポドシン（Ｐｏｄｎ）により特徴付けられる。
【００８９】
Ｂ４細胞群は、以下の１つ以上を含有する血管マーカーセットの発現により特徴付けられる：ＰＥＣＡＭ、ＶＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａ、ＣＤ３１、ＣＤ１４６；以下の１つ以上を含有する糸球体マーカーセット：ポドシン（Ｐｏｄｎ）、及びネフリン（Ｎｅｐｈ）；及び、未分画（ＵＮＦＸ）と比較して、酸素調整可能なＥＰＯ富化群、Ｂ２及びＢ３。Ｂ４はまた、以下のマーカーの１つ以上の発現により特徴付けられる：ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４（Ｃｘｃｒ４）、エンドセリン受容体Ｂ型（Ｅｄｎｒｂ）、コラーゲン、Ｖ型、α２（Ｃｏｌ５ａ２）、カドヘリン５（Ｃｄｈ５）、プラスミノーゲン活性化因子、組織（Ｐｌａｔ）、アンギオポエチン２（Ａｎｇｐｔ２）、キナーゼ挿入ドメインタンパク質受容体（Ｋｄｒ）、分泌型タンパク質、酸性、システインリッチ（オステオネクチン）（Ｓｐａｒｃ）、セルグリシン（Ｓｒｇｎ）、ＴＩＭＰメタロペプチダーゼインヒビター３（Ｔｉｍｐ３）、Ｗｉｌｍｓ腫瘍１（Ｗｔ１）、ウィングレス型ＭＭＴＶ結合部位ファミリー、メンバー４（Ｗｎｔ４）、Ｇタンパク質シグナル伝達４のレギュレーター（Ｒｇｓ４）、血小板内皮細胞付着分子（Ｐｅｃａｍ）、及び、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）。Ｂ４はまた、Ｂ２またはＢ３のいずれかと比較して、小さく、粒度が低いことにより特徴付けられ、浮遊密度は、約１．０７３ｇ／ｍｌ〜約１．０９１ｇ／ｍｌ（げっ歯類）、約１．０６３ｇ／ｍｌ〜約１．０９１ｇ／ｍＬ（ヒト及びイヌ科）である。
【００９０】
Ｂ４´細胞群は、約１．０６３ｇ／ｍｌ〜約１．０９１ｇ／ｍＬの浮遊密度を有し、以下のマーカーの１つ以上を発現していると定義される：ＰＥＣＡＭ、ｖＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａ、ポドシン、ネフリン、ＥＰＯ、ＣＫ７、ＣＫ８／１８／１９。１つの実施形態において、Ｂ４´細胞群は、以下の１つ以上を含有する血管マーカーセットの発現により特徴付けられる：ＰＥＣＡＭ、ｖＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａ、ＣＤ３１、ＣＤ１４６。他の実施形態において、Ｂ４´細胞群は、内分泌マーカーＥＰＯの発現により特徴付けられる。１つの実施形態において、Ｂ４´細胞群は、以下の１つ以上を含有する糸球体マーカーの発現により特徴付けられる：ポドシン（Ｐｏｄｎ）、及びネフリン（Ｎｅｐｈ）。ある実施形態において、Ｂ４´細胞群は、以下の１つ以上を含有する血管マーカーセットの発現により特徴付けられ：ＰＥＣＡＭ、ｖＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａ、及び、内分泌マーカーＥＰＯの発現により特徴付けられる。他の実施形態において、Ｂ４´細胞群はまた、Ｂ２またはＢ３のいずれかと比較して、小さく、粒度が低いことにより特徴付けられ、浮遊密度は、約１．０７３ｇ／ｍｌ〜約１．０９１ｇ／ｍｌ（げっ歯類）、約１．０６３ｇ／ｍｌ〜約１．０９１ｇ／ｍＬ（ヒト及びイヌ科）である。
【００９１】
１つの態様において、本発明により、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有する、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞、血管細胞、及び糸球体細胞のうち少なくとも１つを含有する、単離されたヒト腎細胞の富化Ｂ４´群を含有するオルガノイドが開示される。１つの実施形態において、Ｂ４´細胞群は、血管マーカーの発現により特徴付けられる。ある実施形態において、Ｂ４´細胞群は、糸球体マーカーの発現により特徴付けられない。一部の実施形態において、Ｂ４´細胞群は、酸素調整可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現を行うことができる。
【００９２】
１つの実施形態において、本発明のオルガノイドは、Ｂ４´細胞群を含有するが、１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する尿細管細胞を含有するＢ２細胞群を含有しない。他の実施形態において、Ｂ４´細胞群含有オルガノイドは、＜１．０４５ｇ／ｍｌの密度を有する集合尿細管及び尿細管システムの大きな粒度の細胞を含有するＢ１細胞群を含有しない。さらに他の実施形態において、Ｂ４´細胞群オルガノイドは、細胞残渣及び、＞１．０９１ｇ／ｍｌの密度を伴う低粒度及び低活性の小細胞を含有するＢ５細胞群を含有しない。
【００９３】
１つの実施形態において、Ｂ４´細胞群含有オルガノイドは、１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する尿細管細胞を含有するＢ２細胞群；＜１．０４５ｇ／ｍｌの密度を有する集合尿細管及び尿細管システムの大きな粒度の細胞を含有するＢ１細胞群；ならびに、細胞残渣及び、＞１．０９１ｇ／ｍｌの密度を有する低粒度及び低活性の小細胞を含有するＢ５細胞群、を含有しない。一部の実施形態において、Ｂ４´細胞群は、腎疾患を有する対象由来であっても良い。
【００９４】
１つの態様において、本発明により、第一の細胞群であるＢ２（１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する、単離された、富化尿細管細胞群を含有する）、及び、第二の細胞群であるＢ４´（約１．０６３ｇ／ｍｌ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有する、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞及び血管細胞を含有するが、糸球体細胞を枯渇している）を含有するヒト腎細胞の混合物を含有するオルガノイドが開示され、ここで、当該混合物は、＜１．０４５ｇ／ｍｌの密度を有する集合尿細管及び尿細管システムの大きな粒度の細胞を含有するＢ１細胞群を含有せず、または、細胞残渣及び、＞１．０９１ｇ／ｍｌの密度を有する低粒度及び低活性の小細胞を含有するＢ５細胞群を含有しない。ある実施形態において、Ｂ４´細胞群は、血管マーカーの発現により特徴付けられる。１つの実施形態において、Ｂ４´細胞群は、糸球体マーカーの発現により特徴付けられない。ある実施形態において、Ｂ２はさらに、集合尿細管上皮細胞を含有する。１つの実施形態において、オルガノイドは、受容体介在性アルブミン取り込みを行うことができる、細胞の混合物を含有、または、から形成されている。他の実施形態において、当該細胞の混合物は、酸素調整可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現を行うことができる。１つの実施形態において、当該混合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、高分子量種のヒアルロン酸（ＨＡ）を産生することができる、及び／または、産生を刺激することができる、ＨＡＳ−２発現細胞を含有する。全ての実施形態において、第一の細胞群及び第二の細胞群は、腎組織または培養腎細胞由来であっても良い（Ｂａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｐｉｄｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１１，１０：１７１）。
【００９５】
１つの実施形態において、オルガノイドは、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達を行うことで、再生刺激をもたらすことができる混合物を含有する。他の実施形態において、混合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達を行うことで、糸球体濾過、尿細管再吸収、尿産生及び／または内分泌機能の衰退を減少させることができ、安定化させることができ、または改善することができる。１つの実施形態において、Ｂ４´細胞群は、腎疾患を有する対象由来である。
【００９６】
１つの態様において、本発明により、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有する、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞、血管細胞及び糸球体細胞のうち少なくとも１つを含有する、単離されたヒト腎細胞富化Ｂ４´群を含有するオルガノイドが開示される。１つの実施形態において、Ｂ４´細胞群は、血管マーカーの発現により特徴付けられる。ある実施形態において、Ｂ４´細胞群は、糸球体マーカーの発現により特徴付けられない。発現されない糸球体マーカーは、ポドシンであっても良い（実施例１０を参照のこと）。一部の実施形態において、Ｂ４´細胞群は、酸素調整可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）の発現を行うことができる。
【００９７】
１つの実施形態において、Ｂ４´細胞群含有オルガノイドは、１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する、尿細管細胞を含有するＢ２細胞群を含有しない。他の実施形態において、Ｂ４´細胞群オルガノイドは、＜１．０４５ｇ／ｍｌの密度を有する集合尿細管及び尿細管システムの大きな粒度の細胞を含有するＢ１細胞群を含有しない。さらに他の実施形態において、Ｂ４´細胞群オルガノイドは、細胞残渣及び、＞１．０９１ｇ／ｍｌの密度を有する低粒度及び低活性の小細胞を含有するＢ５細胞群を含有しない。
【００９８】
１つの実施形態において、Ｂ４´細胞群含有オルガノイドは、１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する、尿細管細胞を含有するＢ２細胞群；＜１．０４５ｇ／ｍｌの密度を有する集合尿細管及び尿細管システムの大きな粒度の細胞を含有するＢ１細胞群；ならびに、細胞残渣及び、＞１．０９１ｇ／ｍｌの密度を有する低粒度及び低活性の小細胞を含有するＢ５細胞群、を含有しない。一部の実施形態において、Ｂ４´細胞群は、腎疾患を有する対象由来であっても良い。
【００９９】
１つの態様において、本発明により、第一の細胞群であるＢ２（１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する、単離された、富化尿細管細胞群を含有する）、及び、第二の細胞群であるＢ４´（約１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有する、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞及び血管細胞を含有するが、糸球体細胞を枯渇している）を含有するヒト腎細胞の混合物を含有するオルガノイドが開示され、ここで、当該混合物は、＜１．０４５ｇ／ｍｌの密度を有する集合尿細管及び尿細管システムの大きな粒度の細胞を含有するＢ１細胞群を含有せず、または、細胞残渣及び、＞１．０９１ｇ／ｍｌの密度を有する低粒度及び低活性の小細胞を含有するＢ５細胞群を含有しない。ある実施形態において、Ｂ４´細胞群は、血管マーカーの発現により特徴付けられる。１つの実施形態において、Ｂ４´細胞群は、糸球体マーカーの発現により特徴付けられない。ある実施形態において、Ｂ２はさらに、集合尿細管上皮細胞を含有する。１つの実施形態において、当該細胞の混合物は、受容体介在性アルブミン取り込みを行うことができる。他の実施形態において、当該細胞の混合物は、酸素調整可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現を行うことができる。１つの実施形態において、当該混合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、高分子量種のヒアルロン酸（ＨＡ）を産生することができる、及び／または、産生を刺激することができる、ＨＡＳ−２発現細胞を含有する。全ての実施形態において、第一の細胞群及び第二の細胞群は、腎組織または培養腎細胞由来であっても良い。
【０１００】
他の態様において、本発明により、細胞分画または富化細胞群の組み合わせ（たとえば、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４（またはＢ４´）、及びＢ５）を含有する異種腎細胞群を含有するオルガノイドが開示される。１つの実施形態において、当該組み合わせは、約１．０４５ｇ／ｍｌ〜約１．０９１ｇ／ｍｌの浮遊密度を有する。他の１つの実施形態において、当該組み合わせは、約１．０４５ｇ／ｍｌ未満〜約１．０９９ｇ／ｍｌまたは約１．１００ｇ／ｍｌの浮遊密度を有する。他の実施形態において、当該組み合わせは、たとえば、遠心による密度勾配での分離により測定される浮遊密度を有している。さらに他の実施形態において、細胞分画の組み合わせは、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４（またはＢ４´）を含有し、Ｂ１及び／またはＢ５を枯渇する。一部の実施形態において、細胞分画の組み合わせは、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４（またはＢ４´）及びＢ５を含有するが、Ｂ１を枯渇する。Ｂ２、Ｂ３及びＢ４（またはＢ４´）細胞分画の組み合わせを含有するオルガノイドの製造を行う前に、Ｂ１及び／またはＢ５を枯渇した時点で、当該組み合わせを引き続きｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養しても良い。
【０１０１】
本発明の発明者らは、驚くことに、Ｂ１が枯渇したＢ２、Ｂ３、Ｂ４及びＢ５の組み合わせをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより、Ｂ５が枯渇することを見出した。１つの実施形態において、Ｂ５は、少なくとも１、２、３、４または５回の継代の後で枯渇する。他の１つの実施形態において、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４及びＢ５の細胞分画の組み合わせを本明細書に開示される条件下で継代することにより、当該継代細胞群の約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または約０．５％未満の割合でＢ５を有する継代細胞群がもたらされる。
【０１０２】
他の実施形態において、Ｂ４´は、細胞分画の組み合わせの一部である。他の１つの実施形態において、Ｂ５を欠落させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養は、低酸素条件下である。
【０１０３】
１つの実施形態において、オルガノイドは、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達で再生刺激を与えることができる混合物を含有する。他の実施形態において、当該混合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達を行うことで、糸球体濾過、尿細管再吸収、尿産生及び／または内分泌機能の衰退を減少させることができ、安定化させることができ、または改善することができる。１つの実施形態において、Ｂ４´細胞群は、腎疾患を有する対象由来である。
【０１０４】
好ましい実施形態において、オルガノイドは、Ｂ３及び／またはＢ４と組み合わせてＢ２を含有する混合物を含有、及び／または、から形成される。他の好ましい実施形態において、当該混合物は、Ｂ３及び／またはＢ４´と組み合わせてＢ２を含有する。他の好ましい実施形態において、当該混合物は、（ｉ）Ｂ３及び／またはＢ４と組み合わせたＢ２；または、（ｉｉ）Ｂ３及び／またはＢ４´と組み合わせたＢ２、からなる、または、から本質的になる。
【０１０５】
Ｂ４´細胞群を含有する混合物は、健康ではない対象から得たＢ２及び／またはＢ３細胞群を含有しても良い。当該健康ではない対象は、Ｂ４´分画を得た対象と同じ対象であっても良い。Ｂ４´細胞群とは対照的に、健康ではない対象から得たＢ２及びＢ３細胞群は、健康な個体から得た開始腎細胞群と比較して、通常、１つ以上の特定の細胞型を欠如していない。
【０１０６】
ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８に記述されるように、Ｂ２及びＢ４細胞群は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、Ｂ２細胞群においてより特異的に富化されたマーカーであるヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）の作用により、高分子量種のヒアルロン酸（ＨＡ）を産生することができることが判明している。５／６ＮｘモデルにおけるＢ２を用いた処置により、線維症が減少することと同時に、ｉｎ  ｖｉｖｏでＨＡＳ２が強発現することが示されており、当該処置組織内において高分子量ＨＡが産生されていることが予測されている。特に、未処置の５／６Ｎｘモデルは、わずかなＨＡＳ−２しか検出されず、高分子量ＨＡの産生もほとんどなく、線維症を発症した。学説に拘束されることは望まないが、主にＢ２（及び、ある程度はＢ４）により産生されるこの抗炎症性高分子量種ＨＡが、細胞調製物と相乗的に腎線維症の減少に作用し、腎臓再生の補助となったと仮定されている。従って、本発明には、ヒアルロン酸を含有するバイオマテリアルと併せて本明細書に開示される生物活性のある腎細胞を含有するオルガノイドが含まれる。また、本発明により、移植細胞による直接的な産生または産生刺激を介した、再生刺激性のバイオマテリアル成分の提供が予期される。
【０１０７】
１つの態様において、本発明により、必要のある対象の腎疾患、貧血、及び／または、ＥＰＯ欠乏症の処置における使用のための、単離された、異種ＥＰＯ産生腎細胞群を含有する、及び／または、から作製されるオルガノイドが開示される。１つの実施形態において、当該細胞群は、腎生検由来である。他の実施形態において、当該細胞群は、全腎組織由来である。他の１つの実施形態において、当該細胞群は、腎生検または全腎組織から確立された哺乳類腎細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物由来である。全ての実施形態において、これら群は、未分画の細胞群（本明細書において、非富化細胞群とも呼称される）である。
【０１０８】
他の態様において、本発明により、開始細胞群または最初の細胞群におけるＥＰＯ産生細胞の比率と比較して、富化亜群におけるＥＰＯ産生細胞の比率が高くなるよう、さらに富化されたエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生腎細胞の単離群を含有するオルガノイド、及び／または、から作製されたオルガノイドが開示される。１つの実施形態において、富化ＥＰＯ産生細胞分画は、富化されていない最初の群に含有されていた間質線維芽細胞及び尿細管細胞と比較して、高い割合の間質線維芽細胞と低い割合の尿細管細胞を含有している。ある実施形態において、富化ＥＰＯ産生細胞分画は、付加されていない最初の群に含有されていた糸球体細胞、血管細胞、及び集合尿細管細胞と比較して、高い割合の糸球体細胞及び血管細胞、ならびに、低い割合の集合尿細管細胞を含有している。当該実施形態において、これらの群は、本明細書において、「Ｂ４」細胞群と呼称される。
【０１０９】
他の態様において、本発明により、１以上の追加の腎細胞群と混合されたＥＰＯ産生腎細胞群を含有するオルガノイド、及び／または、から作製されるオルガノイドが開示される。１つの実施形態において、ＥＰＯ産生細胞群は、ＥＰＯ産生細胞が富化された第一の細胞群（たとえば、Ｂ４）である。他の実施形態において、当該ＥＰＯ産生細胞群は、ＥＰＯ産生細胞が富化されていない第一の細胞群（たとえば、Ｂ２）である。他の実施形態において、第一の細胞群は、第二の腎細胞群と混合される。一部の実施形態において、第二の細胞群は尿細管細胞が富化され、それらは、尿細管細胞の表現型の存在により示されうる。他の実施形態において、尿細管細胞の表現型は、１つの尿細管細胞マーカーの存在により示されても良い。他の実施形態において、尿細管細胞の表現型は、１以上の尿細管細胞マーカーの存在により示されても良い。尿細管細胞のマーカーとしては、限定されないが、メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３  ２５−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送レギュレーター４（Ｆｘｙｄ４）、溶質担体ファミリー９（ナトリウム／水素交換）、メンバー４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ３ファミリー、メンバーＢ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＡ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、及び、カルパイン−８（Ｃａｐｎ８）が挙げられる。他の実施形態において、第一の細胞群は、限定されないが、間質由来細胞、尿細管細胞、集合尿細管由来細胞、糸球体由来細胞、及び／または、血液もしくは血管系に由来する細胞、を含む、数種の腎細胞型のうち少なくとも１つと混合される。
【０１１０】
本発明のオルガノイドは、Ｂ２及び／またはＢ３との混合の形態で、または、富化細胞群の形態（たとえば、Ｂ２＋Ｂ３＋Ｂ４／Ｂ４´）で、Ｂ４またはＢ４´を含有するＥＰＯ産生腎細胞群を含有、または、から形成されても良い。
【０１１１】
１つの態様において、オルガノイドは、培養システムの酸素圧の減少によってＥＰＯの発現が誘導されるよう、ＥＰＯ発現及び酸素に対する生体反応性により特徴付けられるＥＰＯ産生腎細胞群を含有する、及び／または、から作製される。１つの実施形態においてＥＰＯ産生細胞群は、ＥＰＯ産生細胞を富化されている。１つの実施形態において、培養システム中の細胞が利用可能な酸素のレベルが低下した状態に細胞が供される条件下で細胞群が培養された際に、通常の大気の利用可能酸素レベル（約２１％）で培養された細胞群と比較して、ＥＰＯ発現が誘導される。１つの実施形態において、低酸素条件下で培養されたＥＰＯ産生細胞は、通常の酸素条件で培養されたＥＰＯ産生細胞と比較して、高いレベルのＥＰＯを発現する。通常、利用可能な酸素レベルが低い状態で細胞を培養すること（低酸素培養条件とも呼称される）は、通常の大気の利用可能な酸素レベル（正常または通常酸素培養条件とも呼称される）で細胞を培養することと比較して、酸素レベルが低下していることを意味する。１つの実施形態において、低酸素細胞培養条件は、約１％未満の酸素、約２％未満の酸素、約３％未満の酸素、約４％未満の酸素、または約５％未満の酸素で細胞を培養することを含む。他の実施形態において、正常または通常酸素培養条件は、約１０％酸素、約１２％酸素、約１３％酸素、約１４％酸素、約１５％酸素、約１６％酸素、約１７％酸素、約１８％酸素、約１９％酸素、約２０％酸素、または約２１％酸素で細胞を培養することを含む。
【０１１２】
他の１つの実施形態において、ＥＰＯの誘導またはＥＰＯ発現の増加が行われ、及び、それらは利用可能な酸素が約５％未満の状態で細胞を培養し、大気（約２１％）酸素で培養された細胞のＥＰＯ発現レベルと比較することにより観察することができる。他の実施形態において、細胞培養が大気酸素状態（約２１％）で何らかの期間、行われる第一の培養フェーズと、利用可能な酸素レベルを低下させ、利用可能な酸素が約５％未満の状態で同細胞を培養する第二の培養フェーズを含む方法によってＥＰＯを発現することができる細胞の培養において、ＥＰＯの誘導が得られる。他の実施形態において、低酸素状態に反応性のＥＰＯ発現は、ＨＩＦ１αにより制御される。当業者であれば、当分野に公知の他の酸素操作培養条件が、本明細書に開示される細胞に対して行われうることを認識するであろう。
【０１１３】
１つの態様において、オルガノイドは、かん流条件に対して生体反応性（たとえば、ＥＰＯ発現）であることにより特徴付けられるＥＰＯ産生哺乳類細胞の富化群を含有、及び／または、から形成される。１つの実施形態において、かん流条件には、一過性、断続的、または継続的な液体の流れ（かん流）が含まれる。１つの実施形態において、ＥＰＯ発現は、細胞が培養されている培地を、当該流れを介して細胞に動力が伝わるような様式で、断続的もしくは継続的に循環または攪拌させた場合に、機械的に誘導される。１つの実施形態において、３次元構造が形成されるようなフレームワーク及び／または空間をもたらす物質中、または物質上で、一過性、断続的または継続的な液流に供された細胞を、３次元構造として当該細胞が存在するような様式で、培養する。１つの実施形態において、当該細胞を、多孔性ビーズ上で培養し、振動プラットホーム、軌道プラットホーム、またはスピナーフラスコを用いて、断続的または継続的な液流に供する。他の実施形態においては、当該細胞は３次元スキャホールド上で培養され、ならびに、当該スキャホールドが固定され、及び、液流が直接当該スキャホールドを通る、または横切るデバイスへと、置かれる。当業者であれば、当分野に公知の他のかん流培養条件を、本明細書に開示される細胞に対して用いうることを認識するであろう。
【０１１４】
不活性細胞群
本明細書において、本発明は、生物活性のある成分を富化し、不活性な、または望ましくない成分を枯渇させた異種腎細胞群のある亜分画を含有するオルガノイド、及び／または、から形成されたオルガノイドによって、開始群よりも優れた治療転帰及び再生結果がもたらされるという驚きの発見に部分的に基づいている。好ましい実施形態において、本発明に開示されるオルガノイドは、Ｂ１及び／またはＢ５細胞群を枯渇された細胞群を含有している。たとえば、以下はＢ１及び／またはＢ５を枯渇しても良い：Ｂ２、Ｂ３及びＢ４（またはＢ４´）のうち２以上の混合物；Ｂ２、Ｂ３及びＢ４（またはＢ４´）を富化した細胞群。
【０１１５】
Ｂ１細胞群は、集合尿細管及び尿細管システムの大きな顆粒細胞を含有しており、当該群の当該細胞は、約１．０４５ｇ／ｍ未満の浮遊密度を有している。Ｂ５細胞群は、細胞残渣ならびに、約１．０９１ｇ／ｍｌ超の浮遊密度を有する、低粒度及び低活性の小細胞から構成されている。
【０１１６】
細胞群の単離及び培養方法
１つの態様において、本発明のＳＲＣ＋細胞群及び／またはオルガノイドは、腎組織から単離、及び／または、培養された細胞群を含有、及び／または、から形成される。本明細書において、腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏症、尿細管輸送障害、及び糸球体濾過障害の処置を含む、治療用途のためのオルガノイド中に含有される富化細胞群等の腎細胞成分を分離及び単離する方法が開示される。１つの実施形態において、細胞群は、消化されたばかりの、すなわち、機械的または酵素的に消化されたばかりの腎組織から単離され、または、哺乳類腎細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ異種培養物から単離される。本発明のＳＲＣ＋細胞群を含有する、さらなる生物活性のある細胞群を単離する方法を、実施例に詳述する。
【０１１７】
オルガノイドは、Ｂ４（Ｂ４´を含む）ならびに、Ｂ２及び／またはＢ３分画の両方中の分配及び組成を富化させるための密度勾配分離を行う前に、低酸素条件下で培養された腎細胞の異種混合物を含有、及び／または、から形成されても良い。罹患した腎臓及び罹患していない腎臓の両方から単離された腎細胞において、Ｂ２からＢ４の、酸素依存性細胞の富化が認められる。学説に拘束されることは望まないが、これは、以下の現象の１つ以上によるものである可能性がある：１）低酸素培養期間中の、特定の細胞成分の選択的生存、死亡、または増殖；２）低酸素培養に反応して細胞の粒度及び／またはサイズが変化し、それにより、浮遊密度の変化と、それに続く、密度勾配分離中の位置の変化が生じる；及び、３）低酸素培養期間に反応して細胞遺伝子／タンパク質発現が変化し、それにより、所与の勾配分画内の細胞の異なる特性がもたらされた。ゆえに、１つの実施形態において、オルガノイドは、低酸素抵抗性である、尿細管細胞が富化された細胞群（たとえば、Ｂ２）を含有、及び／または、から形成される。
【０１１８】
本発明の細胞群を分離及び単離するための技術例としては、対象群に含有されている異なる細胞型の異なる比重に基づいた密度勾配での分離が挙げられる。所与の細胞型の比重は、細胞内の粒度の程度、細胞内の水の量、及び他の因子により影響を受けることがある。１つの態様において、本発明により、複数の種（限定されないが、ヒト、イヌ科、及びげっ歯類を含む）にわたる、本発明の細胞調製物（たとえば、Ｂ２及びＢ４（Ｂ４´を含む））の単離のための最適な勾配条件が開示される。好ましい実施形態において、密度勾配を用いて、異種腎細胞群由来の尿細管細胞分画（すなわち、Ｂ２細胞群）の新規富化群を得る。１つの実施形態において、密度勾配を用いて、異種腎細胞群由来のＥＰＯ産生細胞分画（すなわち、Ｂ４細胞群）の新規富化群を得る。他の実施形態において、密度勾配を用いて、腎臓の尿細管細胞、糸球体細胞、及び内皮細胞の富化亜群を得る。１つの実施形態において、ＥＰＯ産生細胞及び尿細管細胞の両方が、赤血球及び細胞残渣から分離される。１つの実施形態において、ＥＰＯ産生細胞、糸球体細胞、及び血管細胞は、他の細胞型から分離され、ならびに、赤血球細胞及び細胞残渣から分離され、一方で、尿細管細胞及び集合尿細管細胞の亜群も併せて、他の細胞型ならびに赤血球及び細胞残渣から分離される。他の１つの実施形態において、内分泌細胞、糸球体細胞、及び／または、血管細胞は、他の細胞型ならびに赤血球及び細胞残渣から分離され、一方で、尿細管細胞及び集合尿細管細胞の亜群も併せて、他の細胞型ならびに赤血球及び細胞残渣から分離される。
【０１１９】
１つの態様において、本発明のオルガノイドは、以下に記述されるある重要な特性に基づき、ＯＰＴＩＰＲＥＰ（登録商標）（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）密度勾配培地（水に溶解させた６０％非イオン性ヨウ化化合物イオジキサノールを含有）を部分的に用いて作製された細胞群を含有、及び／または、から形成される。しかしながら、当業者であれば、本発明の細胞群の単離のために必要な特性を有する任意の密度勾配または他の手段（たとえば、当分野に公知の細胞表面マーカーを用いた免疫学的分離等）を本発明に従い用いても良いことを認識するであろう。また、当業者であれば、密度勾配（サイズ及び粒度）を介した細胞亜群分離に寄与する同じ細胞特性を活用して、フローサイトメトリーを介した細胞亜群への分離が可能であることを認識するであろう（フォワードスキャッター＝フローサイトメトリーを介したサイズの反映、及び、サイドスキャッター＝粒度の反映）。重要なことは、密度勾配培地は、対象の特定の細胞に対し、毒性を低くすることである。密度勾配培地は対象の特定の細胞に対し毒性を低くしなければならないため、本発明からは、勾配培地の使用が、対象細胞の選択プロセスにおいて重要な役割を果たすことが予期される。学説に拘束されることは望まないが、イオジキサノールを含有する勾配から回収された本発明の細胞群は、イオジキサノール抵抗性であり、ローディング工程と回収工程の間で細胞の喪失が相当量あることから、勾配条件下でイオジキサノールに曝すことにより、ある細胞が排除されていることが示唆される。イオジキサノール勾配後に特定のバンドに現れる細胞は、イオジキサノール及び／または密度勾配の露出の何らかの有害作用に対し、抵抗性である。従って、本明細書に開示されるオルガノイドのための細胞群の単離及び／または選択において、軽度から中程度の腎毒性である追加の造影剤を用いることがまた予期される。さらに、密度勾配培地はまた、ヒト血漿中のタンパク質に結合してはならず、または、対象細胞の重要な機能に悪影響を与えてはならない。
【０１２０】
他の態様において、本発明により、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて腎細胞型を富化及び／または枯渇させた細胞群を含有するオルガノイド、及び／または、から形成されたオルガノイドが開示される。１つの実施形態において、腎細胞型は、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）またはその均等物を用いて富化及び／または枯渇されても良い。
【０１２１】
他の態様において、オルガノイドは、磁性細胞ソーティングを用いて腎細胞型を富化及び／または枯渇させた細胞群を含有、及び／または、から形成される。１つの実施形態において、腎細胞型は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）またはその均等物を用いて富化、及び／または、枯渇されていても良い。
【０１２２】
他の態様において、オルガノイドは、３次元培養に供された腎細胞群を含有、及び／または、から形成されても良い。１つの態様において、細胞群を培養する方法は、継続的なかん流を介するものである。１つの実施形態において、３次元培養及び継続的なかん流を介して培養された細胞群は、静的培養された細胞群と比較し、高い細胞充実度及び相互接続性を示す。他の実施形態において、３次元培養及び継続的なかん流を介して培養された細胞群は、当該細胞群を静的に培養した場合と比較し、高いＥＰＯの発現、ならびに、たとえばｅ−カドヘリン等の腎尿細管関連遺伝子の高い発現を示す。さらに他の実施形態において、継続的なかん流を介して培養された細胞群は、静的に培養された細胞群と比較して、高いレベルのグルコース消費及びグルタミン消費を示す。
【０１２３】
本明細書に開示されるように、本発明のオルガノイドのための細胞群を製造する方法において、低酸素条件を用いても良い。しかし、細胞群の製造方法は、低酸素条件の工程無しで用いられても良い。１つの実施形態においては、正常酸素条件を用いても良い。
【０１２４】
当業者であれば、当分野に公知の他の単離及び培養方法を、本明細書に開示される細胞に用いても良いことを認識するであろう。
【０１２５】
バイオマテリアル
Ｂｅｒｔｒａｍらの米国特許公開２００７０２７６５０７に開示されるように、ポリマーマトリクスまたはスキャホールドを、任意の数の全体的なシステム制限、形状制限、または空間的制限を満たすために所望される任意の数の構造へと成形しても良い。１つの実施形態において、本発明のマトリクスまたはスキャホールドは、３次元構造であってもよく、及び、器官構造または組織構造の大きさ及び形状に合わせるために成形されても良い。たとえば、腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏、尿細管輸送障害、または糸球体濾過障害の処置に対するポリマースキャホールドの使用において、３次元（３−Ｄ）マトリクスを用いても良い。様々な異なる形状の３−Ｄスキャホールドを用いても良い。当然ながら、ポリマーマトリクスは、異なるサイズの患者に合わせるために、異なるサイズ及び形状に成形されても良い。また、ポリマーマトリクスは、患者の特別のニーズに対応するために他の方法で成形されても良い。他の実施形態において、ポリマーマトリクスまたはスキャホールドは、生体適合性の多孔性ポリマースキャホールドであっても良い。当該スキャホールドは、様々な合成物質または天然物質（限定されないが、オープンセルポリ乳酸（ＯＰＬＡ（登録商標））、セルロースエーテル、セルロース、セルロースエステル、フッ素化ポリエチレン、フェノール、ポリ−４−メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアクリレート、ポリベンゾキサゾール、ポリカルボネート、ポリシアノアリールエーテル、ポリエステル、ポリエステルカルボネート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリフルオロオレフィン、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾール、ポリフェニレンオキシド、ポリフェニレンスルフィド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、ポリビニル、ポリビニリデンフッ化物、再生セルロース、シリコーン、尿素−ホルムアルデヒド、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、グリコサミノグリカン、絹、エラスチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、アガロース、またはそれらのコポリマーもしくは物理的混合物が挙げられる）から形成されても良い。スキャホールドの構造は、液体ハイドロゲル懸濁液から、柔らかい多孔性スキャホールド、硬い形状維持多孔性スキャホールドに及んでも良い。
【０１２６】
スキャホールドは、任意のバイオマテリアルの形状（限定されないが、希釈剤、細胞担体、マイクロビーズ、マテリアル断片、合成物（限定されないが、ＰＧＡ、ＰＬＧＡ、ＰＬＬＡ、ＯＰＬＡ、エレクトロスパンナノファイバーが挙げられる）のスキャホールド、及び合成物（限定されないが、ＰＧＡ、ＰＬＧＡ、ＰＬＬＡ、ＯＰＬＡ、エレクトロスパンナノファイバーが挙げられる）の発泡体、が挙げられる）から構成されていても良い。
【０１２７】
ハイドロゲルは、様々なポリマー物質から形成されても良く、及び、様々なバイオメディカル応用において有用である。ハイドロゲルは、親水性ポリマーの３次元ネットワークとして物理的に特徴付けられることができる。ハイドロゲルのタイプに応じて、それらは、各割合の水を含有するが、水に完全には溶解しない。高含水量にもかかわらず、ハイドロゲルは、その親水性残基の存在により、かなりの量の液体にさらに結合することができる。ハイドロゲルはそのゲル状構造を変えることなく、かなり膨らむことができる。ハイドロゲルの基本的な物理的特性は、用いられたポリマーの特性及び製品の特殊な追加備品に応じて、具体的に改変することができる。
【０１２８】
好ましくは、ハイドロゲルは、生物学的に不活性であり、哺乳類組織との生理学的な適合性を有する、生物由来の原料、合成物質由来の原料、または、それらの組み合わせであるポリマーから作製される。ハイドロゲルの原料は、好ましくは、炎症反応を誘導しないものである。ハイドロゲル形成に用いることができる他の原料の例としては、（ａ）改変アルギン酸塩、（ｂ）一価カチオンに曝すことによりゲル化する多糖（たとえば、ジェランガム及びカラギーナン）、（ｃ）非常に粘性のある液体または揺変性であり、構造のゆっくりとした変化により経時的にゲルを形成する多糖（たとえば、ヒアルロン酸）、及び、（ｄ）ポリマーハイドロゲル前駆物質（たとえば、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマー及びタンパク質）、が挙げられる。米国特許第６，２２４，８９３  Ｂ１号において、様々なポリマーに関する細かな説明、及び本発明によるハイドロゲルの作製に適したポリマーの化学的特性が記載されている。
【０１２９】
スキャホールドの特性またはバイオマテリアルの特性により、細胞が付着することができ、及び、スキャホールドマテリアルまたはバイオマテリアルと相互作用することができ、ならびに／または、細胞がトラップされることができる多孔性の空間がもたらされうる。１つの実施形態において、本発明の多孔性スキャホールドまたはバイオマテリアルにより、細胞の１以上の群または混合物が、多孔性スキャホールドとして構成されたバイオマテリアル上に（細胞の付着により）、及び／またはスキャホールドの孔内に（たとえば、細胞がトラップされることにより）付加または沈着することが可能となる。他の実施形態において、スキャホールドまたはバイオマテリアルにより、当該スキャホールド内の細胞：細胞、及び／または、細胞：バイオマテリアルの相互作用が可能となり、または促進され、本明細書に開示される構築物が形成される。
【０１３０】
１つの実施形態において、本発明に従い用いられるバイオマテリアルは、ハイドロゲルの形態のヒアルロン酸（ＨＡ）から構成され、５．１ｋＤＡから＞２ｘ１０６ｋＤａのサイズ範囲のＨＡ分子を含有する。他の実施形態において、本発明に従い用いられるバイオマテリアルは、多孔性発泡体の形態のヒアルロン酸から構成され、５．１ｋＤＡから＞２ｘ１０６ｋＤａのサイズ範囲のＨＡ分子を含有する。さらに他の実施形態において、本発明に従い用いられるバイオマテリアルは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）ベースの発泡体から構成され、オープンセルの構造を有し、約５０ミクロン〜約３００ミクロンの多孔サイズを有している。さらに他の実施形態において、特定の細胞群、好ましくは、Ｂ２のみならずＢ４により、特に腎内移植の後に、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）を介した高分子量ヒアルロン酸の合成が直接もたらされる、及び／または、合成が刺激される。
【０１３１】
本明細書に開示されるバイオマテリアルはまた、ある外部条件（たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）に反応するよう設計または適合されても良い。１つの実施形態において、バイオマテリアルは、温度感受性である（たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれか）。他の実施形態において、バイオマテリアルは、酵素分解への露出に応答するよう適合されている（たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれか）。外部条件に対するバイオマテリアルの反応は、本明細書に開示されるように微調整することができる。開示されるオルガノイドの温度感受性は、当該オルガノイド中のバイオマテリアルの割合を調節することにより変えることができる。あるいは、バイオマテリアルを化学的に架橋し、酵素分解に対しより抵抗性であるようにしても良い。たとえば、カルボジイミド架橋物質を用いて、ゼラチンビーズを化学的に架橋し、それによって、内因性酵素に対する感受性を低下させても良い。
【０１３２】
１つの態様において、バイオマテリアルによる外部条件に対する反応は、バイオマテリアルの構造完全性の喪失に関与する。酵素分解に対する温度感受性及び抵抗性は上記に提示されているが、異なるバイオマテリアルにおいて、マテリアルの完全性を喪失させる他のメカニズムも存在する。これらメカニズムとしては、限定されないが、熱力学的（たとえば、融解、拡散（たとえば、バイオマテリアルから周辺組織へのイオン性架橋物質の拡散等）等の相転移）、化学的、酵素的、ｐＨ（たとえば、ｐＨ感受性リポソーム）、超音波、及び光解離性（光浸透性）のものが挙げられる。バイオマテリアルがその構造完全性を失う正確なメカニズムは変化するが、通常、当該メカニズムは、移植の時点で、または移植の後に発生する。
【０１３３】
当業者であれば、当分野に公知の、他のタイプの合成マテリアルまたは天然マテリアルを用いて、本明細書に開示されるスキャホールドを形成しうることを認識するであろう。
【０１３４】
１つの態様において、本発明により、上述のスキャホールドまたはバイオマテリアルから作製される本明細書に開示される構築物が開示される。
【０１３５】
構築物
１つの態様において、本発明により、必要のある対象における腎疾患、貧血またはＥＰＯ欠乏症を処置するための、本明細書に開示される細胞群の１つ以上を有する移植可能な構築物を含有するオルガノイドが開示される。１つの実施形態において、当該構築物は、生体適合性のある物質またはバイオマテリアルである、１以上の合成生体適合性物質または天然生体適合性物質及び、本明細書に開示される１以上の細胞群または細胞の混合物（付着及び／またはトラップされることにより、当該スキャホールドの表面に置かれ、または、埋め込まれている）から構成されるスキャホールドまたはマトリクスから作製される。ある実施形態において、当該構築物は、バイオマテリアル及び、当該バイオマテリアルの構成要素（複数含む）を用いてコートされ、上に置かれ、中に置かれ、付着され、中にトラップされ、中に埋め込まれ、播種され、または組み合わされた、本明細書に開示される１以上の細胞群または細胞の混合物から作製される。本明細書に開示される任意の細胞群（富化細胞群またはその混合物を含む）は、構築物を形成するためのマトリクスと組み合わせて用いられても良い。
【０１３６】
他の実施形態において、当該構築物の配置された細胞群または細胞成分は、酸素調整可能なＥＰＯ産生細胞が富化された第一の腎細胞群である。他の実施形態において、第一の腎細胞群は、酸素調整可能なＥＰＯ産生細胞に加えて、糸球体細胞及び血管細胞を含有している。１つの実施形態において、第一の腎細胞群は、Ｂ４´細胞群である。他の１つの実施形態において、当該構築物の配置された細胞群または細胞成分（複数含む）は、第一の富化腎細胞群及び第二の腎細胞群の両方を含有する。一部の実施形態において、第二の細胞群は、酸素調整可能なＥＰＯ産生細胞を富化されていない。他の実施形態において、第二の細胞群は、腎尿細管細胞を富化されている。他の実施形態において、第二の細胞群は、腎尿細管細胞を富化され、及び、集合尿細管上皮細胞を含有している。他の実施形態において、腎尿細管細胞は、１以上の尿細管細胞マーカー（限定されないが、メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３  ２５−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送レギュレーター４（Ｆｘｙｄ４）、溶質担体ファミリー９（ナトリウム／水素交換）、メンバー４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ３ファミリー、メンバーＢ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＡ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、及び、カルパイン−８（Ｃａｐｎ８）が挙げられうる）の発現により特徴付けられる。
【０１３７】
１つの実施形態において、本発明の構築物を形成するために、バイオマテリアルまたはスキャホールド上に配置された細胞群、または、バイオマテリアルまたはスキャホールドと組み合わされた細胞群は、たとえば自己の源等の様々な源由来である。非自己源（限定されないが、同種または同系（自家または同系）の源が挙げられる）もまた使用に適している。
【０１３８】
当業者であれば、構築物を形成するためにバイオマテリアルに配置するための適切な方法、またはバイオマテリアルと細胞群を組み合わせるための適切な方法が数種あることを認識するであろう。
【０１３９】
１つの態様において、本発明の構築物は、本明細書に開示される使用方法における使用に適している。１つの実施形態において、構築物は、任意の病因の腎疾患、貧血、または任意の病因のＥＰＯ欠乏症の治療を必要とする対象への投与に適している。他の実施形態において、構築物は、赤血球系ホメオスタシスの改善または回復の必要がある対象への投与に適している。他の実施形態において、構築物は、腎機能改善の必要がある対象への投与に適している。
【０１４０】
さらに他の態様において、本発明により、以下を含有する、腎機能改善の必要がある対象への移植のための構築物が開示される：ａ）生体適合性のある合成ポリマーまたは天然タンパク質もしくはペプチドを１つ以上含有するバイオマテリアル；及び、ｂ）第一の細胞群であるＢ２（単離された尿細管細胞富化群を含有し、１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する）及び第二の細胞群であるＢ４´（エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞及び血管細胞を含有するが、糸球体細胞を枯渇し、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有する）を含有し、当該バイオマテリアルでコートされ、当該バイオマテリアル上に配置され、当該バイオマテリアル中に配置され、当該バイオマテリアル中にトラップされ、当該バイオマテリアル中に懸濁され、当該バイオマテリアル中に埋め込まれ、及び／または、当該バイオマテリアルと混合される、腎疾患を有する対象由来の哺乳類腎細胞の混合物。ある実施形態において、当該混合物は、＜１．０４５ｇ／ｍｌの密度を有する集合尿細管及び尿細管システムの大きな顆粒細胞を含有するＢ１細胞群、または、細胞残渣ならびに、＞１．０９１ｇ／ｍｌの密度を有する低粒度及び低活性の小細胞を含有するＢ５細胞群を含有しない。
【０１４１】
１つの実施形態において、構築物は、血管マーカーの発現により特徴付けられるＢ４´細胞群を含有する。一部の実施形態において、Ｂ４´細胞群は、糸球体マーカーの発現により特徴付けられない。ある実施形態において、当該混合物は、酸素調整可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現を行うことができない。全ての実施形態において、当該混合物は、哺乳類腎組織または培養腎細胞由来であっても良い。
【０１４２】
１つの実施形態において、構築物は、当該混合物のトラップ及び／または付着に適した３次元（３−Ｄ）多孔性バイオマテリアルとして構成されたバイオマテリアルを含有する。他の実施形態において、構築物は、哺乳類細胞の埋め込み、付着、懸濁またはコーティングに適した液体、または反液体ゲルとして構成されたバイオマテリアルを含有する。さらに他の実施形態において、構築物は、主にハイドロゲルの形態の高分子量種のヒアルロン酸（ＨＡ）から構成されるバイオマテリアルを含有する。他の実施形態において、構築物は、主に多孔性発泡体の形態の高分子量種のヒアルロン酸から構成されるバイオマテリアルを含有する。さらに他の実施形態において、構築物は、約５０ミクロン〜約３００ミクロンの孔を有するポリ乳酸ベースの発泡体から構成されるバイオマテリアルを含有する。さらに他の実施形態において、構築物は、腎機能を改善する必要がある対象に対して自己である、腎試料由来でありうる１以上の細胞群を含有する。ある実施形態において、試料は、腎生検である。一部の実施形態において、対象は、腎疾患を有している。さらに他の実施形態において、細胞群は、非自己の腎試料由来である。１つの実施形態において、構築物により、赤血球系のホメオスタシスがもたらされる。
【０１４３】
使用方法
１つの態様において、本発明により、本明細書に開示される腎細胞群及び腎細胞の混合物を含有する、及び／もしくは、から形成される、ＳＲＣ＋細胞群ならびに／またはオルガノイドを用いた、必要のある対象における腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏症の処置のための方法が開示される。１つの実施形態において、当該方法には、ＥＰＯ産生細胞が富化された第一の腎細胞群を含有する、及び／または、から形成されたオルガノイド（複数含む）を対象に投与することを含む。他の実施形態において、第一の細胞群は、ＥＰＯ産生細胞、糸球体細胞及び血管細胞が富化されている。他の実施形態において、オルガノイド（複数含む）はさらに、１以上の追加の腎細胞群を含有しても良く、及び／または、から形成されても良い。１つの実施形態において、追加の細胞群は、ＥＰＯ産生細胞が富化されていない第二の細胞群である。他の実施形態において、追加の細胞群は、ＥＰＯ産生細胞、糸球体細胞、または血管細胞が富化されていない第二の細胞群である。他の実施形態において、オルガノイド（複数含む）はまた、本明細書に開示される疾患または障害の処置のための、本明細書に開示される移植可能な構築物を形成するためのバイオマテリアル中に配置され、バイオマテリアル上に配置され、バイオマテリアル中に埋め込まれ、バイオマテリアルでコートされ、またはバイオマテリアル中にトラップされる腎細胞群または腎細胞混合物を含有する、及び／または、から形成される。１つの実施形態において、オルガノイドは、単独で、または、他の細胞もしくはバイオマテリアル（たとえば、ハイドロゲル、多孔性スキャホールド、または天然ペプチドもしくはタンパク質、または合成ペプチドもしくはタンパク質）と組み合わせて用いられ、急性疾患状態または慢性疾患状態の再生を刺激する。
【０１４４】
他の態様において、本発明の方法により、対象における腎疾患、貧血またはＥＰＯ欠乏症の効果的な治療が、赤血球生成及び／または腎機能の様々な指標を通して認められうる。１つの実施形態において、赤血球系ホメオスタシスの指標として、限定されないが、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、ヘモグロビン（ＨＢ）、平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）、赤血球数（ＲＢＣ）、網状赤血球数、網状赤血球％、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、及び赤血球分布幅（ＲＤＷ）が挙げられる。他の１つの実施形態において、腎機能の指標としては、限定されないが、血清アルブミン、アルブミンとグロブリンの比率（Ａ／Ｇ比）、血清リン、血清ナトリウム、腎臓のサイズ（超音波で測定可能）、血清カルシウム、リン：カルシウムの比、血清カリウム、蛋白尿、尿クレアチニン、血清クレアチニン、血液窒素尿素（ＢＵＮ）、コレステロールレベル、トリグリセリドレベル及び糸球体濾過率（ＧＦＲ）が挙げられる。さらに、一般的な良好健康状態のいくつかの指標として、限定されないが、体重の増減、生存率、血圧（平均全身血圧、拡張期血圧、または収縮期血圧）、及び身体持久力能が挙げられる。
【０１４５】
他の実施形態において、ＳＲＣ＋細胞群または生物活性のある腎細胞オルガノイドを用いた有効的な治療は、腎機能の１つ以上の指標の安定化により証明される。腎機能の安定化は、本発明方法により処置されていない対象における同じ指標と比較して、本発明方法により処置された対象における指標の変化を観察することにより示される。あるいは、腎機能の安定化は、処置前の同じ対象における同じ指標と比較し、本発明方法により処置された対象における指標の変化の観察を行うことにより示されても良い。第一の指標における変化は、値の増加または減少であっても良い。１つの実施形態において、本発明により開示される処置は、対象における血液尿素窒素（ＢＵＮ）レベルの安定化が含まれても良く、本発明方法による処置を受けていない、同じ疾患状態を有する対象と比較して、対象に認められるＢＵＮレベルは、低い。他の１つの実施形態において、処置には、対象における血清クレアチニンレベルの安定化が含まれても良く、本発明方法による処置を受けていない、同じ疾患状態を有する対象と比較して、対象に認められる血清クレアチニンレベルは低い。他の実施形態において、処置には、対象におけるヘマトクリット（ＨＣＴ）レベルの安定化が含まれても良く、本発明方法による処置を受けていない、同じ疾患状態を有する対象と比較して、対象に認められるＨＣＴレベルは高い。他の実施形態において、処置には、対象における赤血球（ＲＢＣ）レベルの安定化が含まれても良く、本発明方法による処置を受けていない、同じ疾患状態を有する対象と比較して、対象に認められるＲＢＣレベルは高い。当業者であれば、本明細書に開示される、または当分野に公知の、１つ以上の追加の指標を測定し、対象における腎疾患の効果的処置を決定しても良いことを認識するであろう。
【０１４６】
投与方法及び投与経路
本発明のＳＲＣ＋細胞群及び／または生物活性のある細胞オルガノイドは、単独で、または他の生物活性のある成分と組み合わせて投与されても良い。ＳＲＣ＋細胞群及び／またはオルガノイドは、組織を再生するための、固形器官内部への組込み型再生医療用成分の注入または移植に適している。
【０１４７】
１つの態様において、本発明により、必要のある対象に本明細書に開示される生物活性のある細胞オルガノイド（複数含む）を送達する方法が開示される。１つの実施形態において、生物活性のある細胞の源は、自己または同種、同系（自家または同系）、及びそれらの任意の組み合わせであっても良い。源が自己ではない場合、当該方法は、免疫抑制剤の投与を含んでも良い。適切な免疫抑制剤としては、限定されないが、アザチオプリン、シクロホスファミド、ミゾリビン、シクロスポリン、タクロリムス水和物、クロラムブシル、ロベンザリット二ナトリウム、オーラノフィン、アルプロスタジル、グスペリムス塩酸塩、バイオシンソルブ、ムロモナブ（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）、アレファセプト、ペントスタチン、ダクリズマブ、シロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、レフロノミド、バシリキシマブ、ドルナーゼα、ビンダリド（ｂｉｎｄａｒｉｄ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、ピメクロリムス（ｐｉｍｅｃｒｏｌｉｍｕｓ）、イロデカキン（ｉｌｏｄｅｃａｋｉｎ）、セデリズマブ、エファリズマブ、エベロリムス、アニスペリムス（ａｎｉｓｐｅｒｉｍｕｓ）、ガビリモマブ（ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ）、ファラリモマブ（ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ）、クロファラビン（ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ）、ラパマイシン、シプリズマブ（ｓｉｐｌｉｚｕｍａｂ）、柴苓湯（ｓａｉｒｅｉｔｏ）、ＬＤＰ−０３、ＣＤ４、ＳＲ−４３５５１、ＳＫ＆Ｆ−１０６６１５、ＩＤＥＣ−１１４、ＩＤＥＣ−１３１、ＦＴＹ−７２０、ＴＳＫ−２０４、ＬＦ−０８０２９９、Ａ−８６２８１、Ａ−８０２７１５、ＧＶＨ−３１３、ＨＭＲ−１２７９、ＺＤ−７３４９、ＩＰＬ−４２３３２３、ＣＢＰ−１０１１、ＭＴ−１３４５、ＣＮＩ−１４９３、ＣＢＰ−２０１１、Ｊ−６９５、ＬＪＰ−９２０、Ｌ−７３２５３１、ＡＢＸ−ＲＢ２、ＡＰ−１９０３、ＩＤＰＳ、ＢＭＳ−２０５８２０、ＢＭＳ−２２４８１８、ＣＴＬＡ４−１ｇ、ＥＲ−４９８９０、ＥＲ−３８９２５、ＩＳＡｔｘ−２４７、ＲＤＰ−５８、ＰＮＵ−１５６８０４、ＬＪＰ−１０８２、ＴＭＣ−９５Ａ、ＴＶ−４７１０、ＰＴＲ−２６２−ＭＧ、及びＡＧＩ−１０９６が挙げられる（米国特許第７，５６３，８２２号を参照のこと）。当業者であれば、他の適切な免疫抑制剤を認識するであろう。
【０１４８】
本発明の治療方法には、本明細書に開示されるＳＲＣ＋細胞群及び／またはオルガノイドの送達が含まれる。１つの実施形態において、目的とする利益を受ける部位へと細胞を直接投与することが望ましい。
【０１４９】
本明細書を考慮し、対象にオルガノイドを投与する様々な手段が当業者には明らかであろう。そのような方法としては、限定されないが、実質内注射、被膜下設置、経尿道カテーテル法、及び腎動脈内カテーテル法が挙げられる。
【０１５０】
細胞を、対象への注射または移植による導入を容易にする送達用デバイスまたはビヒクル中に挿入しても良い。ある実施形態において、送達用ビヒクルは天然材料を含有しても良い。ある他の実施形態において、送達用ビヒクルは、合成原料を含有しても良い。１つの実施形態において、送達用ビヒクルにより、器官構造を模倣する構造、または器官構造に適切にフィットする構造がもたらされる。他の実施形態において、送達用ビヒクルは、液体様の性質である。そのような送達用ビヒクルとしては、細胞及び液体をレシピエント対象の身体に注入するためのチューブ（たとえば、カテーテル）が挙げられる。好ましい実施形態において、当該チューブはさらに、本発明の細胞が所望される位置で対象へと導入されるための針（たとえば、シリンジ）を有している。一部の実施形態において、哺乳類の腎臓由来の細胞群は、カテーテルを介した血管投与用に処方される（「カテーテル」という用語には、血管への物質送達のための任意の様々なチューブ様のシステムが含まれる）。あるいは、当該細胞は、バイオマテリアルまたはスキャホールド内、または、バイオマテリアルまたはスキャホールド（限定されないが、繊維製品（たとえば、織物、ニット、紐、メッシュ、及び非織物）、有孔フィルム、スポンジ及び発泡体、ならびにビーズ（たとえば固形ビーズまたは多孔ビーズ）、マイクロ粒子、ナノ粒子等（たとえば、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ−Ｓゼラチンビーズ、Ｓｉｇｍａ））上に挿入されても良い。細胞は、様々な異なる形態で送達用に調製されても良い。たとえば、細胞は、溶液またはゲル中に懸濁されても良い。細胞を、薬学的に受容可能な担体または希釈剤（本発明の細胞はその中で活性を維持している）と混合しても良い。薬学的に受容可能な担体及び希釈剤としては、生理食塩水、水性緩衝溶液、溶媒及び／または分散媒が挙げられる。そのような担体及び希釈剤の使用は、当分野に公知である。溶液は、好ましくは滅菌及び液状であり、及び、多くの場合等張である。好ましくは、溶液は、製造及び保存の条件下で安定であり、及び、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等の使用を介して、細菌及び真菌等の微生物の汚染から保護されている。当業者であれば、本発明の細胞群及びその混合物の送達に用いられる送達用ビヒクルは、上述の特性の組み合わせを含有しても良いことを認識するであろう。
【０１５１】
たとえば、単独、またはＢ４´及び／またはＢ３と混合されたＢ２細胞群等の単離腎細胞群（複数含む）を含有するオルガノイド、及び／または、から形成されるオルガノイドの投与様式としては、限定されないが、実質内注射、被膜下設置、または腎動脈が挙げられる。本発明に従い用いられる、さらなる投与様式としては、直接開腹を介した、直接腹腔鏡を介した、経腹壁の、または経皮の単回注射または頻回注射が挙げられる。本発明に従い用いられる、さらに他の追加の投与様式としては、たとえば、逆行注入及び尿管腎盂注入が挙げられる。投与の外科的手段としては、たとえば、限定されないが、部分腎摘出と構築物移植、部分腎摘出、部分腎盂摘出、網±腹膜を用いた血管新生、多焦点生検注射、円錐またはピラミッド状〜円柱状、及び腎極様置換等の一工程法、ならびに、たとえば、置換用のオルガノイド内部バイオリアクター等を含む二工程法が挙げられる。１つの実施形態において、細胞混合物を含有するオルガノイド及び／または細胞混合物から形成されるオルガノイドは、同時に同経路から送達される。他の実施形態において、各オルガノイドは、本明細書に開示される方法の１以上により、同時に、または時間制御された様式のいずれかで、特定の位置へ、または特定の技法を用いて別々に送達される。
【０１５２】
ヒトにおける適切な細胞またはオルガノイドの移植量は、たとえばＥＰＯ産生等のオルガノイドの活性、または、臨床実験で行われた用量実験からの外挿のいずれかに関連した既存情報から決定されても良い。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養及びｉｎ  ｖｉｖｏ動物実験から、オルガノイドの量が数値化され、移植物質の適切な投与量を算出する際に用いることができる。さらに、状況に応じて追加の移植を行うか、または、移植物質を減少させるかを決定するために、患者をモニターしても良い。
【０１５３】
本発明の細胞群及びその混合物を含有するオルガノイド、及び／または、から形成されるオルガノイドに、１以上の他の成分（選択細胞外マトリクス成分（たとえば、当分野公知の１以上の型のコラーゲンまたはヒアルロン酸）、増殖因子、及び／または、サイトカイン（限定されないが、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、ＦＧＦ、ＩＧＦが挙げられる）、血小板富化血漿、及び薬物が挙げられる）を追加しても良い。
【０１５４】
当業者であれば、本明細書に開示されるオルガノイドに適した様々な投与方法を認識するであろう。
【０１５５】
製品及びキット
本発明にはさらに、本発明のポリマーマトリクス及びスキャホールドを含有するキット、及び関連物質、ならびに／または、培養培地及び使用説明書を含有するキットが含まれる。使用説明書には、たとえば、本発明のＳＲＣ＋細胞群またはオルガノイドの形成における細胞培養、及び／または、ＳＲＣ＋細胞群またはオルガノイドの投与に関する説明が含まれても良い。１つの実施形態において、本発明により、本明細書に開示されるスキャホールド及び説明書を含有するキットが開示される。さらに他の実施形態において、当該キットは、マーカー発現の検出のための剤、当該剤の使用のための試薬、及び使用説明書を含有する。このキットは、本明細書に開示されるオルガノイド（複数含む）の移植または投与後の、対象における自然腎の再生予後決定の目的のために使用されても良い。当該キットはまた、本明細書に開示されるオルガノイド（複数含む）の生体治療有効性の測定のために用いられても良い。
【０１５６】
本発明の他の実施形態は、必要のある対象の治療に有用な生物活性のある細胞を含有するオルガノイド、及び／または、から形成されるオルガノイドを含有する製品である。当該製品は、容器と、当該容器上に、もしくは当該容器に添付されたラベルまたは添付文書を含有する。適切な容器としては、たとえば、瓶、バイアル、シリンジ等が挙げられる。容器は、様々な物質（たとえば、ガラスまたはプラスチック）から形成されても良い。容器は、疾患の治療に有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポート（たとえば、当該容器は、注射針で穴を開けることが可能なストッパーを有するバイアルまたは溶液バッグであっても良い）を有していても良い。ラベルまたは添付文書は、オルガノイドが、特定の疾患の治療に用いられることを示している。ラベルまたは添付文書はさらに、患者へのオルガノイドの投与に関する説明書を含有しうる。本明細書に開示される併用療法を含む製品及びキットもまた予期される。添付文書は、適応症、用法、用量、投与法、禁忌、及び／または、当該治療用製品の使用に関する警告に関する情報を含む、治療用製品の市販品に習慣的に含有される説明に言及している。１つの実施形態において、添付文書は、オルガノイド（複数含む）が、たとえば腎疾患または腎障害等の疾患または障害の治療に用いられることを示している。さらに、市場及びユーザー視点から望ましい他の物質（他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む）を含んでも良い。また、様々な目的（たとえば、再生転帰の分析等）に有用なキットが提示される。本明細書に開示される、尿由来の小胞及び／またはその内容物（たとえば、核酸（たとえば、ｍｉＲＮＡ）、小胞、エキソソーム等）に対する検出剤を含有するキットも開示されうる。検出剤としては、限定されないが、所望される標的のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出のための核酸プライマー及びプローブ、ならびに、抗体が挙げられる。製品と同様に、キットは、容器及び、当該容器上に、もしくは当該容器に添付されたラベルまたは添付文書を含有する。容器は、少なくとも１つの検出剤を含有する組成物を保持する。たとえば、希釈剤及び緩衝剤または対照検出剤等を含有する追加の容器が含まれても良い。ラベルまたは添付文書は、当該組成物に関する説明ならびに、意図されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ、予測、または診断用途に対する説明を提示する。
【０１５７】
以下の実施例は、解説の目的のためにのみ提示するものであり、決して本発明範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１５８】
実施例１  選択腎細胞＋（ＳＲＣ＋）細胞群の単離：腎生検からの内皮細胞の単離
以下の方法において、従前に適合されたコラゲナーゼ／ディスパーゼ消化プロトコール２、３、５を用いた、酵素消化後の内皮細胞の単離例を提示する。この方法を、罹患ＺＳＦ１ラット腎臓及び、透析を受けている高血圧症のヒトＥＳＲＤ患者から得た腎生検に適用する。
【０１５９】
内皮細胞（ＥＣ）、脈管系、及びリンパ系の由来
下記に開示されるように、腎細胞単離のための標準的な操作手順を用いて消化された腎臓（複数含む）を、１００μｍのＳｔｅｒｉｆｌｉｐフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過する。残った細胞懸濁液を、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭを用いて中性化し、次いで、５分間、３００ｘｇで遠心することにより洗浄する。１００μｍフィルターを通して回収された細胞ペレットを、十分に補充されたＥＭＧ−２増殖培地（Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁し、２５Ｋ／ｃｍ２の細胞密度で、フィブロネクチンをコートしたディッシュ上に播種する。培養を３日毎に行う。ＥＣ培養が８０〜９０％コンフルエントに達したとき、トリプシン処理を行い、計数する。トリプシン処理された細胞を、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）一次抗体を用いて標識し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ抗ＣＤ３１マイクロビーズを用いて陽性選択を行った。ＣＤ３１＋ソートされた細胞を洗浄、計数し、十分に補充されたＥＧＭ−２培地中に１０Ｋ／ｃｍ２の密度で播種する。内皮細胞の形態は、２４時間後に明白となり、これら細胞は、複数回の継代を介して増殖させることができる。脈管系及び／またはリンパ系の組成を、系統特異的抗体（たとえば、ＶＥＧＦ−３は毛細血管；ＬＹＶＥ１はリンパ系）を用いて分析しても良く；Ｍｉｌｔｅｎｙｉマイクロビーズ選択法を用いた、同じ細胞表面表現型マーカーにより、特定の内皮細胞亜群をさらに選択／ソートすることもできる。
【０１６０】
増殖及び精製後、ＮＫＡ  ＳＲＣの内皮細胞成分を、通常（＜２％）よりも大きな割合（＞３０％）へと富化することができる（浮遊密度分画化を通して観察される）。１つの実施形態において、活性のあるＮＫＡの生物成分または組成を制御するために、精製ＥＣを、移植の前に、選択頻度（たとえば、６０％Ｂ２−Ｂ４＋４０％ＥＣ）で、浮遊密度勾配分画由来の上述のＢ２及び／またはＢ２−Ｂ３−Ｂ４分画と混合させても良い。
【０１６１】
磁性マイクロビーズを用いた内皮細胞ソーティング
ＥＧＭ２培地中、フィブロネクチンコートされたフラスコから回収された細胞を、ＥＭＧ２培地ｗ／ｏサプリメント中、０．４μｇ／１００万個の細胞／１００μｌの濃度で、マウス抗ヒトＣＤ３１の一次抗体を用いて、４℃で２０分間、染色する。２０分後、細胞を洗浄し、１２ｍｌのＥＧＭ２培地ｗ／ｏサプリメントと２００μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ１中に再懸濁する。Ｍｉｌｔｅｎｙｉマイクロビーズを添加し、さらに２０分間、４℃で遮光しながらインキュベートする。２０分後、細胞を、遠心（５分、３００ｘｇ）を介して２回洗浄し、１２ｍｌ（１０００万個の細胞／ｍｌ）中に再懸濁し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ自動ＭＡＣＳ機器（センシティブモードプログラムで、二重陽性選択）を用いて精製する。
【０１６２】
図１に開示される例において、内皮細胞は、初代ＺＳＦ１細胞から選択された（ＣＤ３１＋選択）。このプロセスから回収された３６０万個の細胞を計数し、２つのＴ１７５フィブロネクチンコートフラスコ上に、１０Ｋ／ｃｍ２の濃度でサブ培養を行った。細胞を、２１％Ｏ２で４日間培養し、８５％コンフルエントで回収した。この選択と培養期間の後、細胞を計数し、９５０万個の細胞を回収した。ＦＡＣＳによる表現型分析のために回収されたサンプルは、ＣＤ３１に対して約９０％陽性であった（図１Ｅ、右のＦＡＣＳパネル）。
【０１６３】
ヒトＣＫＤ内皮細胞の単離、特徴解析及び増殖
ヒト腎細胞の培養：
ヒト腎細胞（ドナーに関する情報は、表１の下を参照）は、下記に開示されるように、ヒト腎初代細胞の酵素的単離及び培養に関する標準的な操作手順を用いて単離した。簡潔に述べると、細胞を単離し、標準的なＫＧＭのＴ／Ｃ処置フラスコ、または、ＥＧＭ２を十分に補充した培地のフィブロネクチンコートフラスコのいずれかで、２５Ｋ／ｃｍ２で培養した。細胞を、２１％酸素環境下で３日間増殖させ、次いで、培地を交換し、Ｏ／Ｎ曝露のために培養物を２％酸素環境下へと移した。４日後、細胞を画像撮影し、培養形態を分析した（図２Ａ）。次いで、それらを回収し、標準的な方法を用いて計数した（ＨＫ０２７バッチレコードを参照）。サンプルを採取し、染色して、ＣＤ３１＋内皮細胞の割合を測定した（図２）。内皮細胞を、マウス抗ヒトＣＤ３１の一次抗体（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いてソートした。次いで、ＣＤ３１＋細胞を１０Ｋ／ｃｍ２の密度で再度フィブロネクチンコートフラスコ上に播種し、さらに４日間培養した（図２、細胞培養形態）。次いで、細胞を計数し、サンプルを採取して、マウス抗ヒトＣＤ３１  一次抗体とＦＡＣＳ分析を用いて陽性内皮細胞の割合を測定した（図３）。
2019122381.tif 000003
【０１６４】
結論として、フィブロネクチン上での罹患ＺＳＦ１細胞の最初の培養により、９％のＣＤ３１＋培養物が得られた（ＴＣ処置からは＜２％）。ｐ１では、フィブロネクチン上でサブ培養された９％ＣＤ３１＋分画から、約９０％のＣＤ３１＋細胞が得られ、ｐ０からｐ１にかけて、ほぼ３倍に増殖した。Ｔ／Ｃ処置またはフィブロネクチンコートフラスコのいずれか上で最初に培養されたヒトＣＫＤ細胞からは、おおよそ同じ割合のＣＤ３１陽性細胞（２．７％に対し、２．１％）が得られた。示されるように、陽性選択されたＣＤ３１陽性細胞を、十分に補充されたＥＧＭ２培地中、フィブロネクチンコートフラスコ上でサブ培養し、ＣＤ３１陽性細胞の割合を１回の継代後に１３倍にまで増加させる（２．７％から３５．５％）ことは可能である。
【０１６５】
ＳＲＣ＋細胞群の単離：さらに生物活性のある細胞型単離の例：
Ａ．腎上皮：
浮遊密度勾配を介して単離された分画における様々な上皮細胞コンパートメント（壁細胞、近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞、遠位尿細管細胞）の発現評価が進行中である。より具体的には、系統追跡実験により、Ｓｉｘ２＋上皮細胞単離の直接及び選択的な立証がなされ；ネフロン上皮コンパートメントに特異的なマーカーでＳｉｘ２を共標識すること（表２〜３を参照）により、細胞特異的な検出が確認される（表４を参照）。表４において、ｐ０  ＺＳＦ１培養（混合分画Ｂ２−Ｂ３−Ｂ４）を近位、遠位、及び集合尿細管の細胞型の混合物として特徴解析する上皮マーカーの限定パネルを提示する。表２〜４に列記されるものと同じ細胞表面検出抗体を用いた、上述の培養選択（磁性ソーティングと併せた培養条件）を介したこれら特異的上皮細胞コンパートメントの富化が予期される。
【０１６６】
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【０１６７】
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二次抗体は、Ａｌｅｘａ  ６４７分子プローブヤギ抗マウスＩｇＧ、ヤギ抗ウサギＩｇＧ、及びロバ抗ヤギＩｇＧ、ストレプトアビジンＡ６４７。１ｕｇ／ｍｌ／１ｘ１０６細胞を用いて、ＳＯＰに従い染色。
【０１６８】
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【０１６９】
Ｂ．糸球体由来細胞（壁上皮及び有足細胞）：
骨盤の解剖学的除外により、糸球体分画の単離が改善される。下記に記述される、腎消化のための標準的な操作手順を用いて、細胞を単離し、１００μｍのＳｔｅｒｉ−ｆｌｉｐフィルター（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ）を介して濾過し、１００μｍを超える大きさの細胞粒子／塊（糸球体分画を含有する）を、さらに２０分間、再消化する。消化された分画を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で中和し、遠心により洗浄する（３００ｘｇ、５分）。再懸濁された細胞ペレットを、ＶＲＡＤＤ培地６（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１ｕＭ  Ａｌｌ  Ｔｒａｎｓ  Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、０．１ｕｍのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０〜１００ｎＭのビタミンＤ（有足細胞培養を促進するための１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）、または、たとえば、（５０：５０  ＤＭＥＭ／ＫＳＦＭ）等のＦＢＳ無しで十分に補充された、壁上皮細胞に適した血清フリー培地中で、１型コラーゲンでコートされたＴ／Ｃプレート上で培養する。細胞を、２５Ｋ／ｃｍ２の密度で播種し、細胞増殖が現れるまでサブ培養する。増殖細胞を、増殖させ、及び、１継代目で、Ｍｉｌｔｅｎｙｉマイクロビーズに結合した一次抗体（ＰＥＣ特異的マーカー（たとえば、限定されないが、Ｃｌａｕｄｉｎ−１）または前駆体特異的マーカー（たとえば、ＣＤ１４６、ＣＤ１１７、ＳＯＸ２、Ｏｃｔ  ４Ａ、ＣＤ２４、ＣＤ１３３）、またはメサンギウム特異的マーカー（たとえば、限定されないが、平滑筋アクチン、ビメンチン、ミオカルジン、カルビンジン）または糸球体毛細管内皮細胞（たとえば、ＶＥＦＧ３またはＣＤ３１またはＬＩＶＥ１）のいずれかを用いる）を用いてソートする。最適な細胞産生量で採取し、及び、通常の頻度よりも高い割合でＢ２成分と混合すると、高割合の糸球体由来細胞を、糸球体疾患に罹患している患者に適用することができる。
【０１７０】
Ｃ．集合尿細管上皮：
腎臓の皮質領域と髄質領域を解剖学的に切除することにより、骨盤内、または骨盤近くに位置する細胞の単離が改善される。下記に記述されるように、げっ歯類、イヌ科、及びヒトの初代腎細胞を単離、増殖及び採取するための標準的な操作手順は、集合尿細管上皮細胞の単離及び増殖に従うものである。初代培養腎細胞の亜群を分画化するための標準的な操作手順は、細胞分画Ｂ１の集合尿細管の細胞を富化するものであり、以下に記述される。これら細胞は、最も高い割合で集合尿細管上皮細胞を含有している（たとえば、アクアポリン２及びＤｏｌｉｃｈｏｓ  Ｂｉｆｌｏｒｕｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＤＢＡ）等のマーカーに基づく）。あるいは、Ｄｒ．Ｂｅｎ  Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓから得た乳頭／髄質間集合尿細管（ＩＭＣＤ）培養プロトコールを適用した（ＥＧＦを補充したＲＥＧＭ培地；未公開データ）。これら方法のいずれにおいても、集合尿細管上皮を富化された細胞分画を、通常よりも高い頻度でＢ２成分と組み合わせて用いることができ、または、標準的なＫＧＭまたは均等物を用いて増殖させ、尿濃縮と関連した疾患原因を標的とするために用いることができ、及び、腎盂の異常、及び／または、腎盂の疾患（たとえば、水腎症、血管−尿管閉塞）に適用しうる活性のある生物成分をより良く具体化しうる。
【０１７１】
実施例２  ＳＲＣ及びＳＲＣ＋群由来のオルガノイドの生成及び特徴解析
自己形成オルガノイド／スフェロイド形成
オルガノイドは、初代腎培養、増殖、及びＳＲＣを単離するための浮遊密度勾配遠心の後に生成された（以下に記述される、ＮＫＡ生成のための標準的な操作手順）。簡潔に述べると、ＳＲＣを、１００ｍｌの腎細胞増殖培地に、［１ｘ１０６細胞／ｍｌ］の濃度で、スピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、磁気攪拌機（８０ｒｐｍに設定）上で２４〜４８時間、再懸濁した（図４）。細胞オルガノイド／スフェロイドは、５０〜１２５μＭのサイズ範囲の細胞塊からなる。オルガノイド当たりの細胞数は、細胞型、及びスピナーフラスコ培養前のサイズによって変化しうる。オルガノイド／スフェロイドは、ラット及びヒトＳＲＣの両方から生成され、尿細管上皮の表現型を表した（図５）。
【０１７２】
オルガノイドの機能及び管形成
管を形成するＳＲＣの能力を適用して、ＮＫＡの潜在能力を評価しても良い。このアッセイを、３Ｄの１型コラーゲン／４型コラーゲンゼラチンの５０：５０混合物中で培養したＳＲＣオルガノイドに行った。培養オルガノイドに免疫蛍光染色を行うと、得られた管は、上皮表現型を発現し続ける（図６）。
【０１７３】
オルガノイドに加える
他の細胞型の組み合わせを適用する際の自己形成スフェロイドを形成するＳＲＣ活性の優位性が明らかとなる。管形成は、血管成分または幹細胞成分を添加することで増強されうる。オルガノイド形成期間中に、ＳＲＣ群を有する培養液中に選択細胞群を添加することにより、再生転帰の間に活性化される重要な細胞シグナル伝達経路を繰り返しながら、機能性ユニットが形成されうる。そのような細胞−細胞相互作用としては、限定されないが、器官形成中に軸となることが知られている、上皮−間葉系シグナル伝達事象が挙げられる（Ｂａｓｕ  ＆  Ｌｕｄｌｏｗ  ２０１２，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｋｉｄｎｅｙ−ｌｅｖｅｒａｇｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｒｔｈ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ｃ  ９６：３０−３８を参照のこと）。標準的な手順を用いてＳＲＣが生成される一方で、内皮細胞株（ＨｕＶＥＣ）は、オルガノイド（＋）の組み合わせの例として用いられた。８０００万個のＳＲＣを、膜色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＤｉＬ赤色標識）を用いて標識し、そして、１００ｍｌのＲＣＧＭ培地中、１２５ｍｌのスピナーフラスコ中の、異なる膜色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＤｉＯ緑色標識）で標識された２０００万個のＨｕＶＥＣに、４８時間、８０ｒｐｍにて、添加した（図７）。ＳＲＣオルガノイド群単独もまた、対照として開始させた。オルガノイドが形成された時点で、管形成アッセイを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ＣｏｌＩ／ＩＶ  ３Ｄゲル内で設定し、潜在的な同時血管新生を伴う、または伴わない管形成活性を確認した（図８）。
【０１７４】
実施例３  腎疾患のげっ歯類モデルにおける、ＳＲＣオルガノイドの特徴解析／生体分布
４８時間にわたる、ＳＰＩＯ標識オルガノイドの細胞保持及び生体分布を評価するＺＳＦ１急性実験。６匹の４０＋週齢のＺＳＦ１ラットに、２．５ｘ１０６  ＳＰＩＯローダミン標識細胞（およそ２５０００の自己形成オルガノイド（ＰＢＳに溶解）を表す）を、５０ｘ１０６／ｍｌの濃度で、左尾極において、実質へと注射した（図９）。３匹の動物を、移植後、２４〜４８時間の間隔で回収した。腎臓を、細胞保持及び生体分布に関して、ＭＲＩにより評価し、プルシアンブルー染色及びＨ＆Ｅ染色法を用いて組織学的に評価した（図１０と１１）。
【０１７５】
結果
オルガノイドは、容易に標識及び標的化送達を追跡することができた。尿細管または糸球体コンパートメントにおいて、形態学的変化は観察されず、オルガノイド処置は耐容性良好であった。上皮細胞（プルシアンブルーにより陽性染色）の多焦点塊が、注入後２４時間で、左腎の腎皮質（尿細管内／尿細管間）にしばしば観察され、４８時間後には少なくなった。
【０１７６】
実施例４  オルガノイド由来のＳＲＣ＋及びＳＲＣ／ＳＲＣ＋の治療有効性を示すためのｉｎ  ｖｉｖｏ実験：ＣＫＤ（５／６腎摘出術）免疫不全げっ歯類実験
ヒト由来ＳＲＣ＋ＳＲＣ／ＳＲＣ＋オルガノイドを、免疫不全げっ歯類（ＮＩＨＲＮＵ（ヌード）ラット；無胸腺ラット）の、５／６腎摘出の慢性腎疾患モデルを用いて治療有効性に関して評価した。疾患状態の確率、治療介入モダリティ、及び治療応答の臨床評価は、従前に開示されている（Ｇｅｎｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｒｅｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  １９６：３７４−８４）。
【０１７７】
細胞単離及び選択：
ヒト腎細胞を単離し、Ｐｒｅｓｎｅｌｌ（２０１１）に開示されるように生検から増殖させた。細胞をサブ培養し、２回継代した後、凍結保存緩衝液（８０％ＨＴＳ／１０％ＤＭＳＯ／１０％ＦＢＳ）において、２０ｘ１０６細胞／ｍｌ／バイアルの濃度で、−１℃／分の凍結速度で−８０℃まで温度を下げて凍結保存し、次いで、長期保管のための液体窒素フリーザーに移した。凍結保存の後、細胞を急速に３７℃まで溶解させ、回復と活性について、標準的なトリパンブルー排除法を用いて評価した。次いで、細胞を３０００細胞／ｃｍ２で組織培養管に播種し、酸素正常状態（２１％Ｏ２／５％ＣＯ２／３７℃）で４日間、腎細胞増殖培地中で培養した。４日後、培養培地を交換し、培養物を、低酸素環境下（２％Ｏ２／５％ＣＯ２／３７℃）で一晩インキュベートし、次いで、細胞を回収して、密度勾配分離によりＳＲＣを選別した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）培養物（Ｌｏｎｚａ  ２３８９、ＣＡＴ＃  ＣＣ２５１７）を、凍結保存後の早期継代から、ＥＧＭ２が十分に補充された培地で３回継代するまで増殖させた。細胞を回収し、活性を、標準的なトリパンブルー排除法を用いて評価した。
【０１７８】
オルガノイド形成：
オルガノイド培養は、１）ヒトＳＲＣ及びＨＵＶＥＣを、それぞれの培地中に２ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、２）各細胞調製物２５ｍｌ（５０ｘ１０６細胞／ｍｌ）の等量を１２５ｍｌのスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）へと混合させることにより確立させた。混合培養に対し、各培地２５ｍｌをフラスコに添加し、１００ｍｌ中、最終細胞濃度は１ｘ１０６細胞／ｍｌとした。フラスコをインキュベーター内の磁気攪拌機に置き、８０ＲＰＭの早さ、２４時間培養した。
【０１７９】
試験物質：
オルガノイドの投与量は、ラット腎臓当たり、およそ（２〜５ｘ１０６細胞／５０μｌ）が投与されるように調整された。オルガノイドの数は、輸送の間に生じる損失のために、より多い量のＤＰＢＳ  ０．５ｍｌ中で、上述の濃度に調整された。余剰管を補充分として送付した。ＦＥＤＥＸを介し、４〜８℃でＣＲＥＤＯ  ｃｕｂｅ  ｓｈｉｐｐｅｒを用いて、２本の０．５ｍｌマイクロ遠心管中で、投与物を移植施設へと送付した。
【０１８０】
試験物品の送付：
残った左腎は、左わき腹の切開により得た。送付する前に、穏やかに管底をタッピングまたはフリッキングすることによりオルガノイドを再懸濁した（ボルテックスは行わない）。オルガノイドを、１８Ｇの丸い先端の針を用いてシリンジ内に吸引した。次いで、送付のために針を２３Ｇの切断針に変えた。標的化送達は、５０μＬを腎臓の皮髄境界領域に注入することにより行われた。未処置対照動物には処置せず、何も手順を行わなかった。
【０１８１】
ＲＫＭモデルの手順：
オスのＮＩＨＲＮＵラット（８〜１２週齢、体重は平均でおよそ２００ｇ）に、以下のように２工程の腎摘出術を行った。各個々の動物に対し、右腎を摘出し、重量を計測し、１週間回復させた後、左腎の頭頂及び尾極から組織を切除し、重量を計測した。実験を開始する前に、２〜３週間の回復と馴化を行った。馴化期間の後、血液と尿を連続して２週間、採取し、分析した。次のサンプリングは、その後の２週間毎に行われた。全てのラットに、市販の餌を与え、水は不断で与えた。
【０１８２】
動物は腎摘出術後モニターされ、尿タンパク質／尿タンパク質クレアチニン（ＵＰＣ）の増加が認められ、腎摘出１２週後にヒトオルガノイドで処置された。以下の表５に本実験の概要を示す。
2019122381.tif 000007
測定項目：体重（ｇ）は、隔週ベースで記録された。血清生化学的評価、血液学的評価は、隔週ベースで、実験期間の間行われた。尿検査は隔週で行われた。予定通りの剖検の場合には、実験動物に対し肉眼的病理所見を作成し、残った腎臓を切除及び固定し、残りの動物身体をホルマリン固定した。全ての動物及び組織を必要に応じて採取し、重さを計測し、測定し、組織学的処理のために調製した。腎臓の組織学的評価に用いられる方法を行った。ＫＭＲは、腎質量の減少である。
【０１８３】
結果：
ヒトＮＫＯの有効性が、無胸腺ラットの腎不全モデルで示された。
【０１８４】
ＲＫＭモデルの概要
無胸腺ＫＭＲモデルでの疾患進行は、従前に報告されている腎摘出モデルと一致しており、ＣＫＤ関連後遺症（腎タンパク質処置、高窒素血症、高コレステロール血症、貧血及び尿毒症の発現を含む）があった。得られた疾患状態に関するＮＩＨＲＮＵ腎摘出モデルの転帰は、質量減少の間は、摘出された腎組織の量に影響を受けており、本明細書において使用された動物は、臨床病理モニタリングと末端組織学的評価に基づき、ゆっくりとした早期ステージの疾患状態の進行を示した。
【０１８５】
生存中の臨床病理所見に対する、ＮＫＯプロタイプの効果
腎機能に関連した臨床病理学的測定結果を処置前に検証し、対の形式として、実験終了前に記録された測定結果と比較した。以下の表に要約されるように、この比較から、未処置の対照動物において、４か月にわたる実験中に、疾患が進行するにつれ変化が認められた。有意の差は、ＢＵＮ、Ｈｃｔ、Ｈｇｂ、ＲＢＣ、ＷＢＣ、ｓＣｈｏｌ、ｓＰｒｏｔ、ｓＡｌｂ、ｕＰｒｏ、ＵＰＣ、及びｓｐＧｒａｖの対比較で記録された。これらマーカーにおける変化は、早期ステージのＣＫＤの典型であり、急性高窒素血症、終末期の尿細管濾過／濃縮の消失及びリン酸塩血症にはまだ至っていない腎機能低下の指標である。ＮＫＯで処置された動物においては、未処置対照動物の転帰を基に予測されるように、ＢＵＮ、Ｈｃｔ、Ｈｇｂ、ＲＢＣ、ＷＢＣ、及びｓｐＧｒａｖの変化は有意ではなかった（以下の表６を参照）。
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【０１８６】
モデル由来の腎臓の組織学的概要
組織学的検査により、対照動物は、中程度にまで進行し、最終的に殺処分されるまでに、腎症を発症したことが示された。
【０１８７】
通常、中程度の重篤度である、萎縮、拡張、及びタンパク質性の円柱を伴う損傷関連の所見は主に尿細管で発見された。尿細管の好塩基化及び線維化はしばしば最小であり、間質性の炎症は通常、最小か存在しない。糸球体の変化は、最小の重篤度であった。
【０１８８】
皮膜の線維化／炎症は通常、最小の重篤度のみであり、ほとんど炎症性細胞の浸潤がなかった；無胸腺ヌードラットにおいては不完全な免疫システムであることから、反応が消失した可能性がある。バッチ１の動物においては、石化とリンパ球浸潤の発生率と重篤度は低かった。まれに限局性の石化が観察された（実験用ラットには通常である）。
【０１８９】
未処置群とＮＫＯ処置群の間に有意差は記録されなかった。
2019122381.tif 000011
【０１９０】
生存率に対するＮＫＯの効果
全ての動物（５９％ＫＭＲ）が、実験終了時（Ｔｘ後１１９日、及び腎摘出後２０４日）まで生存したため、ＮＫＯ処置による明らかな生存率に関する利益は検出されなかった。
【０１９１】
ＥＯＳで染色法を用いて検出されたヒトＮＫＯの生着
このモデルにはヒト産物の異種移植が可能であるため、ヒト細胞を識別する抗体の使用を介した、ラット腎臓内でのヒト細胞の追跡が可能であった。ＲＫＭラット腎臓のバックグラウンド内のヒトＨＬＡ１染色により、処置の４か月後に細胞を識別した（図１２参照）。ヒト細胞の生着と一致しているとみなされた染色の同定は、二人の独立した検閲者によって確認された。各動物に対して染色された４つの切片のうちの１つにおいて、通常１または２の細胞が識別され、尿細管へと組み込まれていたが、１つの塊は間質内にあると識別された。
【０１９２】
結論：
オルガノイド（ＮＫＯ）送達により緩和された重要な変化は、対照動物において腎疾患の進行に関連したものであり、及び、疾患モデルへの同系／自己ＮＫＡ送達により影響を受けた測定項目を含有していた。
影響を受けた測定項目は、疾患モデルへの同系／自己ＮＫＡ送達で観察されたもの（貧血（Ｈｃｔ、Ｈｇｂ、ＲＢＣ）、炎症（ＷＢＣ）、尿濃縮（ｓｐＧｒａｖ）及び、場合によって、高窒素血症（ＢＵＮ）の測定項目）と一致していた。
非常に小数のヒト細胞が、ＮＫＯプロタイプで処置を行ったおよそ４か月後に検出された。
ヌードラットの腎摘出（平均で５９％ＫＭＲ）により、早期ステージ及び慢性進行状態の腎不全の状態がもたらされた（貧血、蛋白尿、脂質異常症、及び場合によって早期ステージの高窒素血症の指標により特徴付けられる）。
全ての動物が、実験終了まで生存した。
ヒトオルガノイドをＲＫＭモデルへと送達させるために用いられた手順は、耐容性良好であった。
【０１９３】
実施例５  生体反応性腎細胞の単離及び特徴解析
成獣のオスブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）における、貧血を伴う特発性進行性慢性腎疾患（ＣＫＤ）の症例により、年齢を適合させた正常ブタ腎組織との直接比較を用いた細胞組成の評価及び特徴解析のための、新鮮な罹患腎組織がもたらされた。採取時点での腎組織の組織学的評価により、重篤なびまん性慢性間質性線維化及び多発性線維化を伴う半月体形成性糸球体腎炎により特徴付けられる腎疾患が確認された。臨床化学的検査により、高窒素血症（血中尿素窒素及び血清クレアチニンの上昇）及び、中程度の貧血（ヘマトクリットの中程度の低下及びヘモグロビンレベルの低下）が確認された。細胞を罹患腎組織及び正常腎組織の両方から単離、増殖及び特徴解析を行った。ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８の図１に示されるように、Ｇｏｍｏｒｉ'ｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色により、正常腎組織と比較し、罹患腎組織において線維化が顕著に認められる（矢印により示されている青色染色）。キュビリン（ｃｕｂｕｌｉｎ）：メガリン（ｍｅｇａｌｉｎ）を発現し、受容体介在性アルブミン移送を行うことができる機能性尿細管細胞は、正常及び罹患腎組織の両方から増殖していた。エリスロポエチン（ＥＰＯ）発現細胞もまた、培養中に存在しており、複数回の継代及び凍結／融解サイクルを通して維持された。さらに、分子学的分析により、正常及び罹患組織由来のＥＰＯ発現細胞が、ＥＰＯ及び他の低酸素制御遺伝子標的（ｖＥＧＦを含む）のＨＩＦ１α駆動性の誘導を伴うｉｎ  ｖｉｔｒｏ低酸素状態に反応したことが確認された。コラゲナーゼ＋ディスパーゼを用いた酵素消化を介して、細胞をブタ腎組織から単離し、及び、１回の機械的消化及び移植片培養を行うことにより、別の実験においてもまた単離した。２回継代した時点で、移植片由来細胞培養（ｅｐｏ発現細胞を含有）を、大気状態（２１％）及び変動低酸素状態（＜５％）培養条件の両方に供し、低酸素状態に曝すことで、ＥＰＯ遺伝子発現がアップレギュレートされるかどうかを測定した。げっ歯類培養で示したように（実施例３を参照）、正常なブタは、ＥＰＯ遺伝子の酸素依存性の発現及び制御を呈した。驚いたことに、ＣＫＤブタは尿毒症状態／貧血状態であるにもかかわらず（ヘマトクリット＜３４、クレアチニン＞９．０）、ＥＰＯ発現細胞は、組織から容易に単離及び増殖し、ＥＰＯ遺伝子の発現は低酸素制御された状態を維持していた（ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８の図２に示される。その全体で参照により本明細書に援用される）。ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８（その全体で参照により本明細書に援用される）の図３に示されるように、増殖培養中の細胞は、尿細管様構造への自己組織化能力を示した。ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８（その全体で参照により本明細書に援用される）の図４に示されるように、培養中の機能性尿細管細胞の存在（３継代目）は、培養細胞による、受容体介在性のＦＩＴＣ結合アルブミンの取り込みが観察されたことにより確認された。緑色のドット（薄白の矢印により示されている）は、尿細管細胞特異的受容体（メガリン及びキュビリン）により介在される、フルオレセイン結合アルブミンのエンドサイトーシスを表し、このことから、機能性尿細管細胞によるタンパク質の再吸収が示唆される。青色染色（薄白矢印により示される）は、Ｈｏｅｓｃｈｔ染色された核である。まとめると、これらのデータから、ブタの腎組織（たとえＣＫＤに罹患し重度に弱っている腎組織であっても）から機能性尿細管及び内分泌細胞を単離、増殖させることができることが示される。さらに、これらの結果から、自己細胞をベースとした、ＣＫＤ治療のための治療用製品の利点が支持される。
【０１９４】
さらに、正常な成人ヒト腎組織からＥＰＯ産生細胞が酵素的に単離された（実施例１に上述）。ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８（その全体で参照により本明細書に援用される）の図５に示されるように、単離を行うことによって、当初組織においてよりも、単離した後に、相対的により多くのＥＰＯの発現がもたらされた。ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８（その全体で参照により本明細書に援用される）の図６に示されるように、ＥＰＯ遺伝子の発現を維持させたまま、ヒトＥＰＯ産生細胞を培養中に維持することが可能である。平らな組織培養処置プラスチック上または、何らかの細胞外マトリクス（たとえば、フィブロネクチンまたはコラーゲン）でコートされたプラスチック上で、ヒト細胞を培養／増殖させ、及び、それら全てで、経時的にＥＰＯ発現を支持することが判明した。
【０１９５】
実施例６  特定の生物活性のある腎細胞の単離と富化
腎細胞単離：簡潔に述べると、１０のバッチ、２週齢のオスのＬｅｗｉｓラットの腎臓を、供給業者（Ｈｉｌｌｔｏｐ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｉｎｃ．）から購入し、Ｖｉａｓｐａｎ保存培地中、約４℃で一晩輸送した。本明細書に開示される全ての工程は、滅菌性を保つために生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）中にて行われた。腎臓をＨａｎｋ'ｓ平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で３回洗浄し、Ｖｉａｓｐａｎ保存培地を洗い流した。３回の洗浄の後、残った腎臓被膜を、残りの間質組織と共に除去した。大腎杯もまた、マイクロ切開技術を用いて除去した。次いで、滅菌外科用メスを用いて腎臓を細かくスラリーへと分割した。次いで、スラリーを５０ｍｌのコニカル遠心管へと移し、重量を計測した。少しのサンプルをＲＮＡのために採取し、ＲＮＡｓｅフリーの滅菌１．５ｍｌマイクロ遠心管へと入れ、液体窒素中で急速冷凍した。凍結した時点で、分析を行うまで−８０℃の冷凍庫へと移した。１０の幼齢動物の腎臓の組織重量はおよそ１ｇであった。バッチ重量に基づき、消化培地を調整し、組織１ｇ当たり、２０ｍｌの消化培地とした。この手順のための消化緩衝液は、ＨＢＳＳに溶解した４ユニットのディスパーゼ１（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈ）、３００ユニット／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）と５ｍＭのＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）を含有した。
【０１９６】
前もって温めておいた消化緩衝液の適量をチューブに加え、次いで、封をし、３７℃のインキュベーター中の振とう器に、２０分間置いた。この最初の消化工程により、多くの赤血球細胞が取り除かれ、残った組織の消化が促進される。２０分後、チューブを取り出して、ＢＳＣ中に置いた。組織をチューブの底に沈ませ、次いで、上清を除去した。次いで、残った組織に、開始量と同じ量の新鮮な消化緩衝液を加えた。再度、チューブを、３７℃のインキュベーター中の振とう器上に、さらに３０分間置いた。
【０１９７】
３０分後、消化混合物を、７０μｍのセルストレイナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を通して等量の中和緩衝液（ＤＭＥＭ  ｗ／１０％ＦＢＳ）へとピペッティングし、消化反応を止めた。次いで、細胞懸濁液を３００ｘｇ、５分間遠心することにより洗浄した。遠心後、次いで、ペレットを２０ｍｌのＫＳＦＭ培地に再懸濁し、細胞計数及びトリパンブルー排除を用いた活性評価のためのサンプルを得た。細胞数を算出し、１００万個の細胞ＲＮＡのために採取し、ＰＢＳで洗浄し、液体窒素中で急速冷凍した。残った細胞懸濁液をＫＳＦＭ培地で５０ｍｌとし、再度、３００ｘｇ、５分間遠心することにより洗浄した。洗浄後、細胞ペレットを、１５００万個の細胞／ＫＳＦＭ  １ｍｌの濃度で再懸濁した。
【０１９８】
腎細胞懸濁液５ｍｌを、次いで、１５ｍｌのコニカル遠心管（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に入れた５ｍｌの３０％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）へと加え、６回転倒混和することにより混合した。これにより、１５％（ｗ／ｖ）のＯｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）の最終混合物が形成された。転倒混和後、チューブに注意深く１ｍＬのＰＢＳを重ねた。チューブを８００ｘｇで１５分間、ブレーキをかけずに遠心した。遠心後、チューブを取り出し、細胞バンドが、混合物勾配の一番上に形成された。また、赤血球、死細胞、及び、いくらかの小さい少量の顆粒細胞、いくらかのｅｐｏ産生細胞、いくらかの尿細管細胞、及びいくらかの内皮細胞を含有するペレットも形成された。バンドを、ピペットを用いて注意深く取り除き、もう１つの１５ｍｌコニカル管へと移した。勾配培地を吸引により取り除き、ペレットを１ｍｌのＫＳＦＭに再懸濁することにより回収した。次いでバンド細胞及びペレット細胞を再度混合し、ＫＳＦＭを用いて採取バンド量の少なくとも３希釈に再懸濁し、３００ｘｇで５分間遠心することにより洗浄した。洗浄後、細胞を２０ｍｌのＫＳＦＭに再懸濁し、細胞計数のためのサンプルを採取した。トリパンブルー排除を用いて細胞数を算出した後、１００万個の細胞をＲＮＡサンプルのために採取し、ＰＢＳで洗浄し、液体窒素中で急速冷凍した。
【０１９９】
密度勾配分離を用いて、特定の生物活性のある腎細胞の活性及び培養パフォーマンスを増強させるためのプレ培養「クリーンアップ」
培養のための清浄で、増殖可能な細胞群を得るために、細胞懸濁液を「腎細胞単離」で上述されたように作製した。任意選択の工程として、及び、最初の調製物を清浄化する手段として、滅菌東宝緩衝液中で懸濁された、最大で１００万個のトータル細胞を、６０％（ｗ／ｖ）イオジキサノールのストックから室温で調製した等量の３０％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）と１：１で完全に混合し（最終的に１５％ｗ／ｖ  Ｏｐｔｉｐｒｅｐ溶液となる）、６回転倒混和することにより完全に混合させた。混合した後、１ｍｌのＰＢＳ緩衝液を混合細胞懸濁液の上に注意深く重ねた。次いで、勾配チューブを注意深く遠心管に入れ、適切なバランスを取った。勾配チューブを、８００ｘｇで、１５分間、２５℃にてブレーキをかけずに遠心した。清浄化された細胞群（増殖能があり、機能性の集合尿細管細胞、尿細管細胞、内分泌細胞、糸球体細胞及び血管細胞を含有する）を、６％〜８％（ｗ／ｖ）のＯｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）（１．０２５〜１．０４５ｇ／ｍＬの密度に相当）で分割させた。他の細胞及び残渣は、チューブの底に沈殿した。
【０２００】
腎細胞培養：
混合細胞バンド及びペレットを、次いで、組織培養処置三重フラスコ（ＮｕｎｃＴ５００）またはその均等物に、抗生物質／抗真菌物質を有する、ＤＭＥＭ（高グルコース）／ＫＳＦＭ（５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２．５μｇ  ＥＧＦ、２５ｍｇ  ＢＰＥ、１Ｘ  ＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／セレナイトナトリウム培地補充物））の５０：５０の混合物１５０ｍｌ中、３０，０００細胞／ｃｍ２の細胞濃度で播種した。細胞を、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター（細胞に２１％の大気酸素レベルを供給する）で２〜３日間培養した。２日後、培地を交換し、培養物を、ＣＯ２／窒素ガスのマルチガス加湿インキュベーター（Ｓａｎｙｏ）により供給される２％酸素レベル環境下に、２４時間置いた。２４時間のインキュベート後、細胞を６０ｍｌの１ｘＰＢＳで洗浄し、次いで、４０ｍｌの０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて回収した。回収した時点で、細胞懸濁液を、等量のＫＳＦＭ（１０％ＦＢＳ含有）を用いて中和した。次いで、細胞を３００ｘｇで１０分間遠心することにより洗浄した。洗浄後、細胞を２０ｍｌのＫＳＦＭに再懸濁し、５０ｍｌのコニカルチューブに移し、細胞計数のためのサンプルを採取した。トリパンブルー排除法を用いて活性のある細胞を計数した時点で、１００万個の細胞を、ＲＮＡサンプルのために採取し、ＰＢＳで洗浄し、液体窒素中で急速冷凍した。細胞を再度ＰＢＳで洗浄し、３００ｘｇ、５分間遠心することにより回収した。洗浄した細胞ペレットを、３７５０万個の細胞／ｍｌの濃度でＫＳＦＭに再懸濁した。
【０２０１】
密度段階勾配分離を用いた、特定の生物活性のある腎細胞の富化：
培養した腎細胞（主に腎尿細管細胞から構成されるが、他の細胞群（集合尿細管、糸球体、血管及び内分泌系）も小数含有する）を、イオジキサノール（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）の複数の濃度ｗ／ｖから作製された密度段階勾配を用いて、その構成要素亜群に分離した。培養物を、採取と勾配への適用の前に低酸素環境下に２４時間置いた。段階づけられた勾配は、１５ｍｌの滅菌コニカルチューブ中に、互いに上に４つの異なる密度の培地を重ねることにより作製された（最も高い密度を有する溶液を底に置き、最も低い密度の溶液を一番上に重ねる）。細胞を段階勾配の一番上に置き、遠心することにより、サイズと粒度に基づき、複数のバンドへと群が分割される。
【０２０２】
簡潔に述べると、７、１１、１３及び１６％のＯｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）（６０％ｗ／ｖイオジキサノール）の密度を、ＫＦＳＭ培地を希釈物質として用いて作製した。たとえば、５０ｍｌの７％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）に対しては、５．８３ｍｌの６０％（ｗ／ｖ）イオジキサノールのストックを、４４．１７ｍｌのＫＳＦＭ培地に添加し、転倒混和により良く混合した。滅菌キャピラリーチューブに連結された滅菌Ｌ／Ｓ１６Ｔｙｇｏｎ管を有するぜん動ポンプ（Ｍａｓｔｅｒ  Ｆｌｅｘ  Ｌ／Ｓ）を、２ｍｌ／分の流速に設定し、４つの溶液各々を２ｍＬ、１５ｍＬの滅菌コニカルチューブへロードした（１６％溶液から開始し、１３％溶液、１１％溶液、７％溶液と続く）。最終的に、７５００万個の培養ラット腎細胞を含有する細胞懸濁液２ｍＬ（「腎細胞培養」に上述されるように作製された懸濁液）が、段階勾配の上にロードされた。重要なことは、ポンプが勾配溶液をチューブへと運び始めるとともに、勾配の各層の間に適切なインターフェースが形成されるよう、液体がチューブの側面に４５°の角度でゆっくりと流れ落ちるように注意することである。細胞と共にロードされた段階勾配を、次いで、８００ｘｇで２０分間、ブレーキをかけずに遠心した。遠心後、各インターフェースを乱さないようにチューブを注意深く取り出した。５つの異なる細胞分画（４つのバンドと１つのペレット）（Ｂ１〜Ｂ４、＋ペレット）（図２６、左のコニカルチューブを参照）を得た。各分画を、滅菌ディスポーザブル球ピペットまたは５ｍｌのピペットのいずれかを用いて集め、表現型及び機能性を特徴解析した（ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８、実施例１０を参照のこと）。単離後すぐにラット腎細胞懸濁液を段階勾配分画に供した場合、尿細管細胞が富化された分画（及び、集合尿細管由来の細胞をいくらか含有する）は、１．０６２〜１．０８８ｇ／ｍＬの間の密度に分離する。対照的に、密度勾配分離が、ｅｘ  ｖｉｖｏ培養の後に行われた場合、尿細管細胞が富化された分画（及び、集合尿細管由来の細胞をいくらか含有する）は、１．０５１〜１．０６２ｇ／ｍＬの間の密度に分離する。同様に、単離後すぐにラット腎臓細胞懸濁液が段階勾配分画に供された場合、ｅｐｏ産生細胞、糸球体有足細胞、及び血管細胞（「Ｂ４」）が富化された分画は、１．０２５〜１．０３５ｇ／ｍＬの間の密度に分離する。対照的に、密度勾配分離がｅｘ  ｖｉｖｏ培養の後に行われた場合、ｅｐｏ産生細胞、糸球体有足細胞、及び血管細胞（「Ｂ４」）が富化された分画は、１．０７３〜１．０９１ｇ／ｍＬの間の密度に分離した。重要なことは、「Ｂ２」及び「Ｂ４」分画の両方への細胞の培養後分配は、回収及び段階勾配手順の前に、低酸素培養環境（低酸素とは、＜２１％（大気）酸素レベルとして定義される）へ培養物を、（約１時間〜約２４時間）露出することにより増強される（バンド分配に対する低酸素効果に関するさらなる詳細は、実施例７に示す）。
【０２０３】
各バンドを、３ｘ量のＫＳＦＭで希釈し、良く混合し、３００ｘｇで５分間、遠心することにより洗浄した。ペレットを、２ｍｌのＫＳＦＭに再懸濁し、活性のある細胞をトリパンブルー排除法及びヘマサイトメーターを用いて計数した。１００万個の細胞をＲＮＡサンプルのために集め、ＰＢＳ中で洗浄し、液体窒素中で急速凍結した。Ｂ２及びＢ４由来の細胞は、尿毒症及び貧血のメスラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで、２工程の５／６腎摘出術により作製）への移植実験のために用いた。Ｂ４の特性は、定量リアルタイムＰＣＲにより確認した（エリスロポエチン及びｖＥＧＦの酸素制御発現、糸球体マーカー（ネフリン、ポドシン）の発現、ならびに血管マーカー（ＰＥＣＡＭ）の発現を含む）。「Ｂ２」分画の表現型は、Ｅカドヘリン、Ｎカドヘリン及びアクアポリン２の発現を介して確認した。ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８、図４９ａ及び４９ｂを参照のこと。
【０２０４】
ゆえに、段階勾配法を用いることにより、小数のｅｐｏ産生細胞群（Ｂ４）の富化が可能になるのみならず、機能性尿細管細胞（Ｂ２）の相対的富化分画を作製する手段ともなる（ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８、図５０と５１を参照のこと）。また、段階勾配戦略により、ＥＰＯ産生細胞及び尿細管細胞を、赤血球、細胞残渣、及び他の望ましくない影響を有する可能性がある細胞型（たとえば、大きな細胞塊、及びあるタイプの免疫細胞）から分離することが可能となる。
【０２０５】
段階勾配法には、細胞成分を良く分離するために、用いられる特定の密度に調製する必要が生じうる。勾配を調製するための好ましい方法には、１）連続的な密度勾配（勾配の底辺で高い密度（たとえば、１６〜２１％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）であり、勾配の一番上で比較的低い密度（たとえば、５〜１０％）である）を流すこと、を含む。連続勾配は、標準的な方法（Ａｘｉｓ  Ｓｈｉｅｌｄ）に従い、任意の標準的な密度勾配溶液（フィコール、パーコール、スクロース、イオジキサノール）を用いて調製することができる。対象の細胞を、連続勾配上にロードし、ブレーキをかけずに８００ｘｇで２０分間、遠心する。サイズと粒度が似た細胞は、勾配中に一緒に分離される傾向があり、勾配中の相対位置を計測することができ、その位置での溶液の比重もまた計測される。ゆえに、その後、特定の細胞群を、特定の条件下で密度勾配を横断するそれら能力に基づいて単離することに焦点を置いた既定の段階勾配を作製することができる。不健康な組織と健康な組織で細胞を単離する場合、または、異なる種類の細胞から特定の細胞を単離する場合には、そのような最適化が必要となりうる。たとえば、ラットで同定された特定のＢ２及びＢ４の亜群を他種細胞から単離できるようにするために、イヌ科及びヒトの腎細胞培養の両方で最適化を行った。げっ歯類Ｂ２とＢ４亜群の単離に最適な勾配は、７％、１１％、１３％及び１６％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（ｗ／ｖ）からなる。イヌ科Ｂ２とＢ４亜群の単離に最適な勾配は、７％、１０％、１１％及び１６％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（ｗ／ｖ）からなる。ヒトＢ２とＢ４亜群の単離に最適な勾配は、７％、９％、１１％及び１６％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（ｗ／ｖ）からなる。培養されたげっ歯類腎細胞、イヌ科腎細胞、及びヒト腎細胞からのＢ２及びＢ４の局在化のための密度範囲を、表８に提示する。
2019122381.tif 000012
【０２０６】
実施例７  勾配前の低酸素培養は、バンド分布、組成、及び遺伝子発現に影響を与える。
プロトタイプＢ２及びＢ４の分布及び組成に対する酸素条件の影響を測定するために、異なる種由来の新しい腎細胞調製物を、勾配工程の前に、異なる酸素条件に曝した。げっ歯類の新しい腎増殖（ＮＫＡ）細胞調製物（ＲＫ０６９）は、上述の標準的なラット細胞単離及び培養開始のための手順を用いて確立された。全てのフラスコは、２１％（大気）酸素条件下で、２〜３日間培養された。培地を交換し、次いで、フラスコの半分を、酸素制御されたインキュベーター（２％酸素に設定）へと移し、残ったフラスコは２１％酸素条件にさらに２４時間維持された。次いで、上述の標準的な酵素による回収手順を用いて、各設定条件から細胞を回収した。段階勾配は、標準的な手順に従い調製され、「正常酸素」（２１％酸素）及び「低酸素」（２％酸素）培養は別々に回収され、同じ段階勾配に一緒に適用した（図２７）。４つのバンドとペレットが両方の条件下において生成されたが、勾配全体の細胞分布は２１％と２％の酸素培養バッチで異なっていた（表３）。具体的には、Ｂ２の収量は低酸素条件で増加し、Ｂ３で減少した。さらに、Ｂ４特異的遺伝子（たとえば、エリスロポエチン）の発現は、低酸素培養細胞から作製された勾配で増強されていた（ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８、図７３）。
【０２０７】
イヌ科のＮＫＡ細胞調製物（ＤＫ００８）は、上述のイヌ細胞の単離と培養の標準的な手順を用いて確立された（げっ歯類の単離及び培養手順と類似である）。全てのフラスコは、４日間、２１％（大気）酸素条件下で培養され、次いで、フラスコのサブセットが低酸素（２％）に２４時間移された一方で、もう一方のフラスコサブセットは２１％に維持された。続いて、フラスコの各セットを回収し、同じ段階勾配に供した（図２８）。ラットの結果（実施例６）と同じように、低酸素培養されたイヌの細胞は勾配全体に分配されており、大気酸素条件下で培養されたイヌの細胞とは異なっていた（表９）。Ｂ２の収量も、勾配前に低酸素に曝されると増加し、同時に、Ｂ３への分布は減少した。
2019122381.tif 000013
【０２０８】
上述のデータから、勾配前に低酸素に曝すことで、Ｂ２の組成、ならびに、特定の特異化細胞（エリスロポエチン産生細胞、血管細胞、及び糸球体細胞）のＢ４への分配が増強されることが示された。ゆえに、低酸素培養の後に上述の密度勾配分離を行うことは、種を越えて、「Ｂ２」及び「Ｂ４」細胞群を生成するのに有効な方法である。
【０２０９】
実施例８  ヒトの腎臓からの尿細管／糸球体細胞の単離
本明細書に開示される酵素単離方法により、正常なヒト腎組織から尿細管及び糸球体細胞を単離し、増殖させた。上述の勾配法により、尿細管細胞分画をｅｘ  ｖｉｖｏ及び培養後に富化した。ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８、図６８（その全体で参照により本明細書に援用される）に示されるように、表現型の特性は、単離中及び増殖中に維持されていた。尿細管細胞の機能（標識アルブミンの取り込みにより評価された）もまた、繰り返しの継代と凍結保存の後に維持されていた。ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８、図６９（その全体で参照により本明細書に援用される）において、尿細管富化群及び尿細管欠落群が３Ｄ動的培養で培養された場合、尿細管マーカー（カドヘリン）発現の著しい増加が、尿細管富化群で現れた。このことにより、細胞が３Ｄ動的環境下で培養された際に最初の富化を超えて尿細管細胞の富化が、維持され得たことが確認される。実施例７に上述される、同じ腎細胞培養群を、フローサイトメトリー分析に供し、フォワードスキャッターとサイドスキャッターを検証した。この小さく、粒度の小さいＥＰＯ産生細胞群は識別可能であり（８．１５％）、フローサイトメーターのソーティング能力を用いて、当該小さく、粒度の小さい群の陽性選択を介して、分離された（ＰｒｅｓｎｅｌｌらのＷＯ／２０１０／０５６３２８、図７０（その全体で参照により本明細書に援用される））。
【０２１０】
実施例９  自己免疫性糸球体腎炎患者試料から単離された腎細胞の未分画混合物の特徴解析
自己免疫性糸球体腎炎患者の試料から、腎細胞の未分画混合物を上述のように単離した。腎組織から単離及び増殖された腎細胞の特定の亜群の、偏りのない遺伝子型組成を測定するために、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴＰＣＲ）分析（Ｂｒｕｎｓｋｉｌｌら、上記、２００８）を行って、細胞亜分画の間で、異なる細胞型に特異的な、及び、経路特異的な遺伝子発現パターンを特定した。ＩｌａｇａｎらのＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７の表６．１に示されるように、ＨＫ２０は、自己免疫性糸球体腎炎患者の試料である。ＩｌａｇａｎらのＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７の表６．２に示されるように、ＨＫ２０から生成された細胞は、糸球体細胞を欠いている（ｑＲＴＰＣＲにより測定）。
【０２１１】
実施例１１  蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いた、活性のある腎細胞型の富化／枯渇
蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、単離初代腎組織から、１以上の単離腎細胞を富化させても良く、及び／または、１以上の特定の腎細胞型を、枯渇させても良い。
【０２１２】
試薬：
７０％エタノール；洗浄緩衝液（ＰＢＳ）；５０：５０腎細胞培地（５０％ＤＭＥＭ高グルコース）：５０％角化細胞−ＳＦＭ；トリパンブルー０．４％；標的腎細胞群に対する一次抗体（たとえば、腎内皮細胞に対するＣＤ３１、及び、腎糸球体細胞に対するネフリン）。対応するアイソタイプ特異的蛍光二次抗体；染色緩衝液（ＰＢＳに溶解した０．０５％ＢＳＡ）
【０２１３】
手順：
生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）を清浄化するための標準的な手順を行った後、初代単離物、または培養細胞のいずれか由来の腎細胞の単一細胞懸濁液を、Ｔ５００Ｔ／Ｃ処置フラスコから得て、腎細胞培地に再懸濁し、氷上に置いても良い。次いで、細胞数と活性を、トリパンブルー排除法を用いて測定する。たとえば、異種群由来の糸球体細胞または内皮細胞等の腎細胞富化／枯渇に関しては、少なくとも７０％の活性を有する１０〜５０ｘ１０６生細胞が得られる。次いで、異種腎細胞群を、標的細胞型に特異的な一次抗体で染色する（開始濃度は１μｇ／０．１ｍｌ（染色緩衝液）／１ｘ１０６細胞（もし必要であれば力価））。標的抗体は、結合されていても（たとえばＣＤ３１  ＰＥ（腎内皮細胞に特異的））、または、結合されていなくても良い（たとえばネフリン（腎糸球体細胞に特異的））。
【０２１４】
次いで、細胞を、遮光しながら４℃、氷上にて３０分間染色する。インキュベーション３０分後、細胞を３００ｘｇで５分間遠心することにより洗浄する。次いで、ペレットを、ＰＢＳまたは染色緩衝液のいずれか（結合アイソタイプ特異的二次抗体が必要かどうかに依存する）にて再懸濁する。もし細胞を、蛍光色素結合一次抗体を用いて標識する場合、細胞を、１０ｘ１０７細胞当たり２ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳ  ａｒｉａまたは均等のセルソーターへと進める。もし細胞が蛍光色素結合抗体で標識されない場合は、細胞を、アイソタイプ特異的蛍光色素結合二次抗体を用いて標識する（開始濃度は、１ｕｇ／０．１ｍｌ／１ｘ１０６細胞）。
【０２１５】
次いで、細胞を３０分間、氷上４℃で、遮光しながら染色する。３０分間のインキュベーションの後、細胞を３００ｘｇで５分間遠心することにより洗浄する。遠心後、ペレットを、５ｘ１０６／ｍｌ（ＰＢＳ）の濃度でＰＢＳ中に再懸濁し、次いで、４ｍｌ／１２ｘ７５ｍｍを、滅菌チューブに移す。
【０２１６】
ＦＡＣｓ  Ａｒｉａは、メーカーの説明書（ＢＤ  ＦＡＣｓ  Ａｒｉａユーザーマニュアル）に従い、生細胞滅菌ソーティング用に調整される。サンプルチューブをＦＡＣｓ  Ａｒｉａへロードし、取得（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）が開始された後で、ＰＭＴ電圧を調製する。ゲートを引き、特定の波長による蛍光強度を用いて、腎臓の特定の細胞型を選択する。他のゲートは、陰性群を選択するために引く。所望されるゲートを引き、陽性標的群と陰性群を囲った時点で、細胞を、メーカーの説明書を用いてソートする。
【０２１７】
陽性標的群は、１つの１５ｍｌコニカルチューブに集め、陰性群は、他の１５ｍｌコニカルチューブに集める（チューブは腎細胞培地１ｍｌで満たされている）。集めた後、各チューブのサンプルを、フローサイトメトリーにより分析し、純度を測定する。
【０２１８】
集められた細胞を、３００ｘｇで５分間、遠心により洗浄し、ペレットを、さらなる分析と実験のために、腎細胞培地中に再懸濁する。
【０２１９】
実施例１２  磁気細胞ソーティングを用いた腎細胞型の富化／枯渇
１以上の単離腎細胞を富化しても良く、及び／または、１以上の特定の腎細胞型を、単離初代腎組織から枯渇させても良い。
【０２２０】
試薬：
７０％エタノール、洗浄緩衝液（ＰＢＳ）、５０：５０腎細胞培地（５０％ＤＭＥＭ高グルコース）：５０％角化細胞−ＳＦＭ、トリパンブルー０．４％、泳動緩衝液（ＰＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＢＳＡ）、リンス緩衝液（ＰＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）、クリーニング溶液（７０％ｖ／ｖエタノール）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＦＣＲブロッキング試薬、Ｍｉｌｔｅｎｙｉマイクロビーズ（ＩｇＧアイソタイプ、標的抗体（たとえばＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）またはネフリン）または二次抗体のいずれかに特異的）。
【０２２１】
手順：
生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）を清浄化するための標準的な手順を行った後、初代単離物、または培養物のいずれか由来の腎細胞の単一細胞懸濁液を得て、腎細胞培地に再懸濁する。細胞数と活性を、トリパンブルー排除法を用いて測定する。たとえば、異種群由来の糸球体細胞または内皮細胞等の腎細胞富化／枯渇に関しては、少なくとも７０％の活性を有する少なくとも１０ｘ１０６〜４ｘ１０９生細胞が得られる。
【０２２２】
最も良い富化／枯渇法のための分離法は、対象の標的細胞に基づいて決定される。１０％未満の標的頻度の富化に対しては（たとえば、ネフリン抗体を用いた糸球体細胞）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ａｕｔｏＭＡＣＳ、またはその均等物、機器プログラムのＰＯＳＳＥＬＤＳ（センシティブモードの二重陽性選択）が用いられる。１０％を超える標的頻度の枯渇に対しては、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ａｕｔｏＭＡＣＳ、またはその均等物、機器プログラムのＤＥＰＬＥＴＥＳ（センシティブモードの枯渇）が用いられる。
【０２２３】
生細胞は、たとえば糸球体細胞に対するネフリンｒｂポリクローナル抗体等の標的特異的一次抗体を用いて、１５ｍｌのコニカル遠心管中、１μｇ／１０ｘ１０６細胞／０．１ｍｌＰＢＳ（０．０５％ＢＳＡを含有）を添加し、次いで、４℃で１５分間インキュベーションを行うことにより標識される。
【０２２４】
標識した後、１０ｘ１０７細胞当たり１〜２ｍｌの緩衝液を加え、次いで、３００ｘｇで５分間、遠心を行うことにより細胞を洗浄し、結合していない一次抗体を除去する。洗浄後、アイソタイプ特異的二次抗体（たとえば、ニワトリ抗ウサギＰＥ（１ｕｇ／１０ｘ１０６／０．１ｍｌ  ＰＢＳ（０．０５％ＢＳＡ含有）））を加え、次いで、４℃で１５分間、インキュベーションを行う。
【０２２５】
インキュベーションの後、１０ｘ１０７細胞当たり１〜２ｍｌの緩衝液を加え、次いで、３００ｘｇで５分間、遠心を行うことにより細胞を洗浄し、結合していない二次抗体を除去する。上清を除去し、細胞ペレットを、１０ｘ１０７総細胞当たり６０μｌの緩衝液中に再懸濁し、次いで、１０ｘ１０７総細胞当たり２０μｌのＦＣＲブロッキング試薬を加え、それを良く混合する。
【０２２６】
２０μｌの直接ＭＡＣＳマイクロビーズ（たとえば、抗ＰＥマイクロビーズ）を加え、混合し、次いで、４℃で１５分間インキュベートする。
【０２２７】
インキュベーションの後、細胞を１０〜２０ｘ量の標識緩衝液を加え、３００ｘｇで５分間、細胞懸濁液を遠心することにより洗浄し、５００μｌ〜２ｍｌ緩衝液／１０ｘ１０８細胞で細胞ペレットを再懸濁する。
【０２２８】
メーカーの説明書に従い、ａｕｔｏＭＡＣＳシステムを清浄化し、ａｕｔｏＭＡＣＳを用いた磁気細胞分離に備えて準備する。新たな滅菌採取チューブを出口ポート（ｏｕｔｌｅｔ  ｐｏｒｔｓ）の下に置く。ａｕｔｏＭＡＣＳ細胞分離プログラムを選択する。選択に関しては、ＰＯＳＳＥＬＤＳプログラムを選択する。枯渇に関しては、ＤＥＰＬＥＴＥＳプログラムを選択する。
【０２２９】
標識細胞を取り込みポート（ｕｐｔａｋｅ  ｐｏｒｔｓ）に挿入し、プログラムをスタートさせる。
【０２３０】
細胞選択または枯渇の後、試料を集め、使用するまで氷上に置く。枯渇資料または選択試料の純度は、フローサイトメトリーにより確認する。
【０２３１】
実施例１３  治療可能性のある細胞を正常組織及び慢性腎疾患組織から単離し、増殖させることが可能である。
本実験の目的は、高含量分析（ＨＣＡ）を介してヒトＮＫＡ細胞の機能的特徴を測定することである。高含量イメージング（ＨＣＩ）により、多数の試料の、複数の細胞内事象の２以上の蛍光プローブを用いた（マルチプレックス）同時イメージングがもたらされる。高含量分析（ＨＣＡ）により、高含量イメージングで捕捉された複数の細胞パラメーターの同時定量的測定がもたらされる。簡潔に述べると、未分画（ＵＮＦＸ）培養を生成し（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂら、上記、２００８）、標準的な生検法を用いて進行した慢性腎疾患（ＣＫＤ）を有する５人のヒト腎臓、及び非ＣＫＤの３人のヒト腎臓から採取されたコア生検から、独立して維持される。ｅｘ  ｖｉｖｏでＵＮＦＸを２回継代した後、細胞を回収し、密度勾配法（実施例２に記述）に供し、亜分画（Ｂ２、Ｂ３及び／またはＢ４亜分画を含有）を生成する。
【０２３２】
ヒト腎組織は、非ＣＫＤヒトドナー及びＣＫＤヒトドナーから得られた（ＩｌａｇａｎらのＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７の表１０．１に要約）。ＩｌａｇａｎらのＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７の図４に、ＨＫ１７及びＨＫ１９サンプルの組織病理学的特徴が示されている。全ての非ＣＫＤ（３／３）及びＣＫＤ（５／５）腎臓からｅｘ  ｖｉｖｏ培養が確立された。対象領域（ＲＯＩ）を規定するヒトＮＫＡ細胞におけるアルブミン輸送の高含量分析（ＨＣＡ）は、ＩｌａｇａｎらのＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７の図５に示す（ヒトＮＫＡ細胞におけるアルブミン輸送のＨＣＡ）。非ＣＫＤ及びＣＫＤの腎臓から誘導されたＮＫＡ細胞におけるアルブミン輸送の定量比較は、ＩｌａｇａｎらのＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７の図６に示されている。
【０２３３】
ＩｌａｇａｎらのＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７の図６に示されているように、ＣＫＤ由来ＮＫＡ培養においてアルブミン輸送は損なわれていない。尿細管細胞富化Ｂ２亜分画と尿細管細胞枯渇Ｂ４亜分画とのマーカー発現の比較分析は、ＩｌａｇａｎらのＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７の図７（ＣＫ８／１８／１９）に示されている。
【０２３４】
尿細管細胞富化Ｂ２亜分画と尿細管細胞枯渇Ｂ４亜分画とのアルブミン輸送の機能性比較分析は、ＩｌａｇａｎらのＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６３４７の図８に示されている。Ｂ２亜分画は、近位尿細管細胞が富化されているために、アルブミン輸送機能の増加を示す。
【０２３５】
アルブミン取り込み：
２４ウェルのＩＶ型コラーゲンプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ（商標））でコンフルエントまで増殖した細胞の培養培地を、１ｘ抗真菌物質／抗生物質と２ｍＭグルタミンを含有する、フェノールレッドフリー、血清フリー、低グルコースＤＭＥＭ（ｐｒ−／ｓ−／Ｉｇ  ＤＭＥＭ）と１８〜２４時間置き換えた。分析を行う直前に、細胞を洗浄し、ｐｒ−／ｓ−／ｌｇ  ＤＭＥＭ＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、及び１ｍＭ  ＭｇＣｌ２と３０分間インキュベートした。細胞を、２５μｇ／ｍＬローダミン結合ウシアルブミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に３０分間曝し、氷冷ＰＢＳを用いて洗浄し、エンドサイトーシスを停止させ、ただちに２％パラホルムアルデヒド（２５μｇ／ｍＬのヘキスト核色素を含有）を用いて固定した。阻害実験に対しては、１μＭの受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）（Ｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ  ＧＡ）をアルブミン添加の１０分前に添加した。顕微鏡イメージングと分析を、ＢＤ  Ｐａｔｈｗａｙ（商標）８５５  Ｈｉｇｈ−Ｃｏｎｔｅｎｔ  ＢｉｏＩｍａｇｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて行った（Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０  Ｎｏｖ；２９９（５）：Ｆ１０２６−３９．Ｅｐｕｂ  Ｓｅｐ  ８，２０１０を参照のこと）。
【０２３６】
結論として、ＨＣＡによって細胞レベルのデータが得られ、他のアッセイ（すなわち、遺伝子発現またはタンパク質発現）では検出できない群動態を明らかとすることができる。アルブミン輸送機能を測定するための定量可能なｅｘ  ｖｉｖｏ  ＨＣＡアッセイ（ＨＣＡ−ＡＴ）を用いて、ヒトＮＫＡプロトタイプの成分としてのヒト腎尿細管細胞を特徴解析することができる。ＨＣＡにより行うことが可能な細胞機能の比較評価によって、ヒトＣＫＤ腎から誘導されたＮＫＡ培養物中に、アルブミン輸送を行う細胞が保持されていたことが明らかとなった。また、ＮＫＡ培養物中の特定の亜分画（Ｂ２及びＢ４）が、表現型及び機能においてはっきりと区別可能であり、Ｂ２は、アルブミン輸送活性が増強した尿細管細胞富化分画を表していた。ヒトＣＫＤ由来のＢ２細胞亜群は、ｉｎ  ｖｉｖｏで有効性を示されたげっ歯類Ｂ２細胞（上述）と表現型的に、及び機能的に類似している。
【０２３７】
参照文献
１．  Ｋｅｌｌｅｙ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｒａ−ｒｅｎａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ  Ｒｅｎａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｄｓ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＺＳＦＩ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ．２０１１  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＤＡ）Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．（２０１１）
２．  Ｋｅｌｌｅｙ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｕｂｕｌａｒ  ｃｅｌｌ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｋｉｄｎｅｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９９，Ｆ１０２６−１０３９．
３．  Ｐｒｅｓｎｅｌｌ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｒｏｄｅｎｔ，Ｃａｎｉｎｅ，ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｄ  Ｋｉｄｎｅｙｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７：２６１−２７３．
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８．  Ｂａｓｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｒｇａｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｐｅｒｉ−ｏｒｇａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ：ｋｉｄｎｅｙ．Ｌｉｐｉｄｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｉｓ  １０，１７１．
９．  Ｘｉｎａｒｉｓ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｎａｌ  ｏｒｇａｎｏｉｄｓ  ｆｏｒｍｅｄ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２３，１−１２．（２０１２）．
１０．  Ｂｕｚｈｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ  Ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ  Ｔｕｂｕｌａｒ  Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ  Ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｕｂｕｌｏｇｅｎｉｃ  Ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｋｉｄｅｎｙ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ，（２０１１）．
１１．  Ｂｒｏｗｎ，ＳＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｒｅｎａｌ  ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｄｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｒｅｎａｌ  ｍａｓｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．５：１７６８−７４（１９９５）．
１２．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｒｅｎａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｈｉｇｈ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｄｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ７５％  ｎｅｐｈｒｅｃｔｏｍｙ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．２９：５１１−９（１９８６）．
１３．  Ｕｒｉｅ，Ｂ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔａｔｕｓ，ｒｅｎａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ  ｎｅｐｈｒｅｃｔｏｍｙ  ｉｎ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｏｎｏｒｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ．２３０：１６５３−６（２００７）．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３−１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月28日(2019.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2019122381000001.pdf