(57)【要約】【課題】トリペプチドからなるＡＣＥ阻害剤、前記ＡＣＥ阻害剤を含有する食品、飲料およびサプリメントを提供する。【解決手段】Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、およびこれらの塩からなる群から選択される１以上のトリペプチドを含む、ＡＣＥ阻害剤である。このＡＣＥ阻害剤は、食品や飲料に混合して摂取することができ、サプリメントとして利用することもできる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、およびこれらの塩からなる群から選択される１以上のトリペプチドを含む、アンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項２】
請求項１記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含む食品。
【請求項３】
請求項１記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含む飲料。
【請求項４】
請求項１記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含むサプリメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリペプチドを含むアンジオテンシン変換酵素阻害剤、食品、飲料、およびサプリメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
アンジオテンシンＩは肝臓で合成されたアンジオテンシノーゲンが酵素レニンにより分解されて生じる１０アミノ酸のポリペプチドであり、さらにアンジオテンシン変換酵素（angiotensin-converting enzyme：以下ＡＣＥとも称する）の作用によりＣ末端からジペプチドが切り出されることでアンジオテンシンＩＩに変換される。アンジオテンシンＩには血圧を上昇させる効果は無いが、アンジオテンシンＩＩは血管平滑筋を収縮させ、副腎皮質からアルドステロンを分泌させることにより血圧を上昇させる昇圧効果がある。したがってＡＣＥの作用を阻害し、昇圧作用のあるアンジオテンシンＩＩの生成を抑制すると血圧を下げることができる。また、ＡＣＥは血圧降下作用を持つブラジキニンを分解して不活性化するため、この経路からもＡＣＥ阻害による効果が期待できる。塩分や酒類の過剰摂取、喫煙習慣、ストレスなどで高血圧者数が増加している現在、カプトプリルなど種々のＡＣＥ阻害薬が高血圧治療薬として利用されており、近年では様々なタンパク質由来ペプチドのＡＣＥ阻害作用にも注目が集まっている。
【０００３】
例えば、小腸粗酵素による消化で得られた鶏胸肉エキス酵素処理物由来のＡＣＥ阻害活性を持つペプチドであって、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、またはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙで表されるペプチドがある（特許文献１）。上記アミノ酸配列の１以上のプロリン（Ｐｒｏ）をヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）に置換してもよく、これによりＡＣＥ阻害活性が増加するという。これは、ヒトＡＣＥの活性中心の１０８９番目にはヒスチジンが存在し、これによってアルカリ性側で酵素活性が高くなると推定し、Ｐｒｏの水酸化により活性部位の環境を酸性にすることでＡＣＥ阻害活性を高めるというものである。
【０００４】
また、鶏又は豚由来コラーゲンのプロテアーゼ分解物もある（特許文献２）。ＡＣＥ阻害作用・血管保全作用を有するペプチドとして、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙが記載されている。血圧上昇抑制作用を有するアミノ酸数８以上のペプチドである。
【０００５】
また、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを含有し、アミノ酸残基数が３〜１０のペプチドを有効成分とするＡＣＥ阻害剤もある（特許文献３）。前記ペプチドは、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、及びＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏからなる群より選択される１種又は２種以上のペプチドである。これらペプチドは、獣乳の全乳、脱脂乳、カゼイン等の乳タンパク質成分；とうもろこし、コーンタンパク、小麦、小麦タンパク、大豆、脱脂大豆、大豆タンパク等を酵素加水分解処理する方法、または通常の有機化学的合成法等によって製造することができるという。更に、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを構成成分とするペプチドを含む食品素材を乳酸菌により発酵処理して製造することもできるという。実施例では、脱脂粉乳を乳酸菌などで発酵し、発酵物を精製してＶａｌ：Ｐｒｏ＝１．００：２．０８であり、Ｎ末端の配列がＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏのペプチドを得ている。このペプチドのＡＣＥ阻害活性をヒプリルヒスチジルロイシンを基質として吸光度法で評価したところ、ＩＣ５０は１４μＭであったという。
【０００６】
更に、Ｉｌｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−ＡｒｇおよびＶａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列からなるペプチド（塩）を有効成分とする、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤もある（特許文献４）。コラーゲンやゼラチンをプロテアーゼ処理、醗酵処理して得たペプチドである。Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡｒｇのＩＣ５０は４６０μｍｏｌ／Ｌであり、Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙは２１０μｍｏｌ／Ｌであるという。
【０００７】
また、獣乳カゼインを所定の酵素群を用いて分解してなるＡＣＥ阻害剤であって、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ、Ａｒｇ−Ｐｒｏ、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ及びＴｙｒ−ＰｒｏなどのＸａａ−Ｐｒｏ配列を有するジペプチドとＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ及びＶａｌ−Ｐｒｏ−ＰｒｏなどのＸａａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ配列を有するトリペプチドからなるＡＣＥ阻害剤もある（特許文献５）。プロリンを含むジペプチドとトリペプチドとを混合して使用する点に特徴がある。
【０００８】
一方、鶏コラーゲン加水分解物を経口摂取した後に血中で検出されるＨｙｐ含有ペプチドについてＡＣＥ阻害効果を評価し、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｈｙｐ、Ｐｈｅ−Ｈｙｐ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−ＧｌｙなどがＡＣＥ阻害活性を有するとの報告がある（非特許文献１）。ジペプチドやトリペプチドが、単に栄養成分としてのみ使用されるものでないことを示唆するものである。なお、Ａｌａ−Ｈｙｐ−ＧｌｙのＡＣＥ阻害活性のＩＣ５０は、０．７１１ｍｍｏｌ／Ｌと記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第３９４３４５９号公報
【特許文献２】国際公開２００７／１０８５５４号
【特許文献３】特許第２７８２１４２号公報
【特許文献４】特開２００３−２８４５５１号公報
【特許文献５】特開２０１１−１０２３２７号公報
【特許文献６】国際公開２０１４／０１７４７４号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】岩井浩二等、”鶏コラーゲン加水分解物摂取後のヒト血中ペプチドの動態とＡＣＥ阻害作用”、日本食品化学工学会誌、第５６巻、第６号、ｐ３２６−３３０、（２００９）
【非特許文献２】Taga Y, et al., ”Efficient absorption of X-hydroxyproline (Hyp)-Gly after oral administration of a novel gelatin hydrolysate prepared using ginger protease”, J. Agric. Food Chem., (2016) 64(14):2962-2970
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
コラーゲンは、バクテリアコラゲナーゼで分解されるとその基質特異性によってＮ末端がグリシン（Ｇｌｙ）のペプチドを多く生成する。また、特許文献１、特許文献２記載のペプチドはコラーゲンを複数のプロテアーゼで分解したものであり、いずれもＮ末端がＧｌｙであり、かつアミノ酸数８以上のペプチドである。一方、特許文献４に記載されるように、コラーゲンの分解方法によってはＮ末端がＧｌｙ以外のペプチドが生成する。更に多くのＡＣＥ阻害剤を開発すべく、Ｎ末端がＧｌｙ以外のペプチドや、ＡＣＥ阻害活性の高いペプチドの検索が望まれる。
【００１２】
特許文献３〜５、非特許文献１に記載されるように、トリペプチドには高いＡＣＥ阻害活性が期待される。コラーゲンは−（Ｇｌｙ−アミノ酸Ｘ−アミノ酸Ｙ）ｎ−（Ｙに位置するＰｒｏはほとんどがＨｙｐへと水酸化される）で示される繰り返しアミノ酸配列から構成されているため、コラーゲンから生成されうるトリペプチドとしては、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ、Ｙ−Ｇｌｙ−Ｘ、およびＸ−Ｙ−Ｇｌｙが考えられる。コラーゲンからのＹ−Ｇｌｙ−Ｘ型トリペプチドの製造はこれまで達成されていないが、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ型トリペプチドはバクテリアコラゲナーゼを使用することで効率的に生成することが出来る。また、コラーゲンやゼラチンにショウガ根茎由来酵素を添加してＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを製造する方法がある（特許文献６）。この方法によれば、特許文献４のように複数工程でコラーゲンを分解することなく、ショウガ根茎由来酵素を添加して一段階でＮ末端がＧｌｙ以外のトリペプチドを製造することができ、安定供給が可能である。したがって、安定供給可能なペプチドであって、よりＡＣＥ阻害活性に優れるトリペプチドを含むＡＣＥ阻害剤の開発が希求される。
【００１３】
また、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ型トリペプチドはその高いプロテアーゼ耐性により、経口摂取後に他の食物タンパク質由来ペプチドに比べ非常に高濃度で血中へと移行する（非特許文献２）。したがって、実際に体内においてＡＣＥ阻害作用を発揮することが期待され、このような血中移行率に優れるペプチドであって、よりＡＣＥ阻害活性に優れるトリペプチドを含むＡＣＥ阻害剤の開発が希求される。
【００１４】
更に、トリペプチドがコラーゲン由来であれば安全性が高く、サプリメント等として利用することもできる。このようなＡＣＥ阻害活性を有するＡＣＥ阻害剤やサプリメントの開発が希求される。
【００１５】
上記現状に鑑み、本発明は、トリペプチドからなるＡＣＥ阻害剤を提供することを目的とする。
【００１６】
また本発明は、前記ＡＣＥ阻害剤を含む食品、飲料、サプリメントを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者等は、コラーゲン由来のトリペプチドについて詳細に検討した結果、Ｎ末端およびＣ末端のアミノ酸残基が同一でも、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がＰｒｏかＨｙｐかによってＡＣＥ阻害活性が著しく異なること、およびＣ末端がＧｌｙであり、Ｎ末端がイソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、またはバリン（Ｖａｌ）であるトリペプチドは、特にＡＣＥ阻害活性が高いことを見出し、本発明を完成させた。
【００１８】
すなわち本発明は、Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、およびこれらの塩からなる群から選択される１以上のトリペプチドを含む、ＡＣＥ阻害剤を提供するものである。
【００１９】
また本発明は、前記ＡＣＥ阻害剤を含む食品を提供するものである。
【００２０】
また本発明は、前記ＡＣＥ阻害剤を含む飲料を提供するものである。
【００２１】
また本発明は、前記ＡＣＥ阻害剤を含むサプリメントを提供するものである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、トリペプチドからなるＡＣＥ阻害剤等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例において、Ｖａｌ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（ＶＯＧ）のＡＣＥ阻害曲線を示す図である。
【図２】実施例において、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（ＶＰＧ）のＡＣＥ阻害曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の第１は、Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、およびこれらの塩からなる群から選択される１以上のトリペプチドを含む、ＡＣＥ阻害剤である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
（１）トリペプチド
本発明のＡＣＥ阻害剤を構成するトリペプチドは、Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、またはこれらの塩である。Ｃ末端がＧｌｙであるトリペプチドのＡＣＥ阻害活性を評価したところ、Ｎ末端から２番目のアミノ酸残基がＨｙｐの場合にはＰｒｏの場合よりもＡＣＥ阻害活性が著しく高いことが判明した。例えば、後記する実施例に示すように、Ｎ末端がＡｌａの場合、Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＧｌｙのＩＣ５０は９８５．７μＭであるが、Ａｌａ−Ｈｙｐ−ＧｌｙのＩＣ５０は１５９．２μＭと、ＡＣＥ阻害活性が６倍も相違した。特に、Ｎ末端がＶａｌの場合は約９倍、Ｌｅｕの場合は約９０倍もＡＣＥ阻害活性が高い。非特許文献１では、Ｈｉｐ−ＨＬ（ヒプリルヒスチジルロイシン）を用いてＡｌａ−Ｈｙｐ−ＧｌｙのＡＣＥ阻害活性を測定し、そのＩＣ５０を７１１μＭと記載している。そこで、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを陽性対照として種々トリペプチドのＡＣＥ阻害活性を評価したところ、前記Ｎ末端がＶａｌやＬｅｕ、ＩｌｅであるトリペプチドがＡｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙに比べて１０〜４０倍ものＡＣＥ阻害活性を有することが判明した。これら３つのＮ末端アミノ酸は全て脂肪族かつ疎水性度の高いアミノ酸であり、その性質がＡＣＥ阻害活性に寄与していると考えられる。本発明では、Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙおよびこれらの塩の中から選択される１種のトリペプチドを使用する場合であってもよく、２種以上を混合して使用する場合であってもよい。
【００２６】
本発明で使用するトリペプチドの塩としては、製剤学上許容されうる酸付加塩および塩基付加塩等が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸との塩；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸等の有機酸との塩等が挙げられる。また、製剤学上許容されうる塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム、エタノールアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン等のアミン類との塩等がある。トリペプチドの製造方法やＡＣＥ阻害剤の製剤方法、その他に応じて適宜選択することができる。
【００２７】
本発明で使用するトリペプチドは、コラーゲンやゼラチン、その他エラスチンなどのＨｙｐを含有するタンパク質をタンパク質分解酵素で加水分解して製造することができる。また、化学合成によって製造するものであってもよい。好ましくは、安定供給できる点で、入手容易なコラーゲンやゼラチンなどを酵素分解する方法である。コラーゲンは、真皮、靱帯、腱、骨、軟骨などを構成するタンパク質のひとつであり、ゼラチンはコラーゲンの熱変性・分解物である。コラーゲンとしては、ウシ、ブタ、ニワトリ、魚類、その他、何れの動物種であってもよい。
【００２８】
本発明で使用するトリペプチドはいずれもＣ末端がＧｌｙであり、Ｎ末端から２番目のアミノ酸残基がＨｙｐである。従来、コラーゲン分解に一般的に使用されるクロストリジウム由来コラゲナーゼを使用してコラーゲンを分解した場合、Ｃ末端がＧｌｙのトリペプチドの生産率は極めて低い。一方、例えば、特許文献６記載の方法に準じてゼラチン溶液にショウガ根茎由来酵素と共にＳＨ基含有還元剤を添加して分解すると、前記トリペプチドを含むペプチド組成物を得ることができ、これを精製すれば所定のトリペプチドを単離することができる。使用するゼラチン溶液としては、前記コラーゲンを熱変性して得たゼラチンの溶液を好適に用いることができる。
【００２９】
（２）ＡＣＥ阻害剤
本発明のＡＣＥ阻害剤は、Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、およびこれらの塩のいずれか１以上のトリペプチドを含む。例えば、前記した特許文献６記載の方法に準じて、Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、およびこれらの塩を含むペプチド組成物を調製し、このペプチド組成物をそのままＡＣＥ阻害剤として使用することができる。一方、単離したＩｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、およびこれらの塩のいずれか１以上、または前記ペプチド組成物に更に、賦形剤、希釈剤、乳化分散剤、矯味剤、矯臭剤などを添加してＡＣＥ阻害剤としてもよい。このような賦形剤や希釈剤として、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ラクトースなどを例示することができる。これらは、ＡＣＥ阻害活性を損なわない範囲で適宜混合することができる。なお、ＡＣＥ阻害剤として投与する場合の投与量は、被投与者の血圧の程度、患者の年齢、体重、または投与方法などに応じて適宜調整することができる。好ましくは０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００３０】
ＡＣＥ阻害剤の剤型にも限定はなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、粉剤等の経口剤などの形態とすることができる。
【００３１】
本発明では、前記ＡＣＥ阻害剤を食品や飲料に添加することもできる。高血圧などの生活習慣病は、食習慣との関わりが指摘されている。前記ＡＣＥ阻害剤を含む食品や飲料を、機能性食品・飲料、特定保健用食品・飲料、美容健康食品・飲料、栄養補助食品・飲料などとすることができる。食品としては、キャンディー、ゼリーなどの菓子類、かまぼこ、ソーセージなどの練り製品、チーズ、バターなどの乳製品その他がある。また、飲料としては、オレンジ、グレープなどの果汁飲料、ヨーグルト飲料その他がある。
【００３２】
前記ＡＣＥ阻害剤は、血圧降下を目的としたサプリメントとして利用することもできる。Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、およびこれらの塩のいずれか１以上のトリペプチドを含むサプリメントを摂取することで、高血圧を予防し、または改善することができる。
【実施例】
【００３３】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【００３４】
（１）ＡＣＥ阻害率の測定方法
０．３５ｍＵのブタ腎臓由来ＡＣＥ（シグマアルドリッチ社製）を含む７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）２７５μｌに被検物質の水溶液２５μｌを加え全量３００μｌとした後、予め３７℃、１０分間加温した。同じ緩衝液に溶解し、同様に３７℃としたＨｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（ＨＨＬ；株式会社ペプチド研究所社製）溶液（０．７μｍｏｌ／ｍｌ）５０μｌをこれに添加し反応を開始した。反応開始後５分、１０分、２０分および３０分時点で反応液７０μｌを取り、反応停止液（内部標準として４ｎｇ／ｍｌのＮ−ｂｅｎｚｏｙｌ−ｄ５−ｇｌｙｃｉｎｅ（ｄ５Ｈｉｐ；ＣＤＮ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ社製）を含む１％ギ酸溶液）７０μｌと混合して反応を停止し、ＬＣ／ＭＳ測定用サンプルとした。同様に、被検物質無添加の対照サンプルを調製した。ＡＣＥの作用によりＨＨＬから遊離したＨｉｐおよび内部標準として添加したｄ５Ｈｉｐを下記ＬＣ／ＭＳ測定条件で測定した後、ｄ５Ｈｉｐで補正して定量したＨｉｐ量を反応時間に対してプロットし、Ｈｉｐの生成曲線を求めた。同曲線から１分間あたりのＨｉｐ生成量を算出してＡＣＥ活性とした。検量線は０．５〜５０ｎｇ／ｍｌのＨｉｐ（シグマアルドリッチ社製）溶液を７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）で調製後、７０μｌを取り、反応液と同様７０μｌの反応停止液を混合して調製した。被検物質を含まない対照の活性と被検物質を加えたサンプルの活性を比較し、以下の式により阻害率を算出した。
阻害率（％）＝１００×（対照の活性−サンプルの活性）／対照の活性
【００３５】
（２）ＩＣ５０値の測定方法
ＩＣ５０値（対照の活性を５０％阻害するのに要する被検物質量）は、縦軸に阻害率、横軸に被検物質濃度をプロットして阻害曲線の式を求めた後、５０％阻害に対応する被検物質の濃度を算出して求めた。
【００３６】
（３）ＬＣ／ＭＳ測定条件
高速液体クロマトグラフ：1200Series(アジレント・テクノロジー株式会社製)、
質量分析装置：3200 QTRAP(株式会社エービー・サイエックス社製)、
分析カラム：Ascentis Express C18 5μm, 2.1mmi.d.×150mm(SUPLECO社製)、
カラム温度：２５℃
移動相：Ａ液；０．１％ギ酸、Ｂ液；１００％アセトニトリル、
グラジエント条件：
０〜２分：Ａ液１００％、
２〜６分：Ａ液１００〜３０％；Ｂ液０〜７０％、
６〜８分：Ａ液１０％；Ｂ液９０％、
８〜１０分：Ａ液１００％、
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、
イオン化：ＥＳＩ、ポジティブ、
分析モード：Multiple Reaction Monitoring(MRM)モード、
イオンスプレー電圧：５．５ｋＶ、
イオンソース温度：５００℃
【００３７】
（製造例１）
ｐＨ４．０の０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファーにウシ由来ゼラチンを溶解して２質量％溶液を調製し、この溶液にショウガ根茎をアセトン中で粉砕して作製したショウガ粉末をウシ由来ゼラチンに対して質量換算で１／１０倍量、ジチオスレイトール（和光純薬工業株式会社製）を最終濃度２ｍＭとなるように加え、５０℃で振盪、攪拌しながら１６ｈ反応させた。反応終了後静置し、上清を回収してペプチド溶液を得た。得られたペプチド溶液を下記ＬＣ／ＭＳ測定条件で測定した。結果を表１に示す。コラーゲンをショウガ根茎由来酵素で分解することで、Ｖａｌ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（ＶＯＧ）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（ＶＰＧ）、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（ＡＯＧ）、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（ＡＰＧ）、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（ＬＯＧ）、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（ＬＰＧ）、およびＩｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（ＩＯＧ）が生成されることが確認された。
【００３８】
ＬＣ／ＭＳ測定条件
高速液体クロマトグラフ：1200Series(アジレント・テクノロジー株式会社製)、
質量分析装置：3200 QTRAP(株式会社エービー・サイエックス社製)、
分析カラム：Ascentis Express F5 5μm, 4.6mmi.d.×250mm(SUPELCO社製)、
カラム温度：４０℃
移動相：Ａ液；０．１％ギ酸、Ｂ液；１００％アセトニトリル、
グラジエント条件：
０〜７．５分：Ａ液１００％、
７．５〜２０分：Ａ液１００〜１０％；Ｂ液０〜９０％、
２０〜２５分：Ａ液１０％；Ｂ液９０％、
２５〜３０分：Ａ液１００％、
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ、
イオン化：ＥＳＩ、ポジティブ、
分析モード：MRMモード、
イオンスプレー電圧：３ｋＶ、
イオンソース温度：５００℃
【００３９】
（実施例１〜３、比較例１〜４）
製造例１でショウガ粉末によるコラーゲンの分解により生成が確認されたトリペプチドについて、Ａｎｙｇｅｎ社のカスタム合成サービスにより化学合成（ＶＯＧ、ＶＰＧ、ＡＯＧ、ＬＯＧ、ＬＰＧおよびＩＯＧ）、またはＢａｃｈｅｍ社より市販品を購入（ＡＰＧ）し、上記測定法にてそのＡＣＥ阻害活性を測定した。結果を表２に示す。
【００４０】
表２に示すように、トリペプチドについて、Ｎ末端から２番目のアミノ酸残基がＰｒｏまたはＨｙｐであり、Ｃ末端がＧｌｙの３組のトリペプチドついてＡＣＥ阻害活性を評価したところ、実施例１と比較例１、比較例２と比較例３、実施例２と比較例４の組み合わせに示すように、いずれもＰｒｏよりもＨｙｐの場合にＩＣ５０が低値となり、ＡＣＥ阻害活性に優れた。図１にＶＯＧのＡＣＥ阻害曲線を示し、図２にＶＰＧのＡＣＥ阻害曲線を示す。
比較例２のＡＯＧは非特許文献１に開示され、そのＩＣ５０は７１１μＭと記載されている。ＡＯＧを陽性対照として、製造例１で生成の確認された種々のトリペプチドを本願のＡＣＥ阻害活性の測定方法によって測定したところ、ＶＯＧ（実施例１）、ＬＯＧ（実施例２）、およびＩＯＧ（実施例３）は、ＡＯＧ（比較例２）より極めて高いＡＣＥ阻害活性を有することが判明した。
【００４１】
【表１】
2019094271.tif 000002
【００４２】
【表２】
2019094271.tif 000003
【図１】
2019094271.tif 000004
【図２】
2019094271.tif 000005