(57)【要約】【課題】ファブリー病治療に有用な細胞医薬の提供。【解決手段】配列番号４に示されるアミノ酸配列を基準として第171番目のセリンがグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、かつ第174番目のアラニンがロイシン、バリン、又はイソロイシンに置換された、α−ガラクトシダーゼ（GLA）活性を有する改変型α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ（NAGA）成熟タンパク質部分、及びそのN末端に連結した分泌シグナルペプチドからなるポリペプチドをコードする遺伝子を有する、幹細胞、並びに当該細胞又はその分化誘導細胞を含むファブリー病治療薬。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４に示されるアミノ酸配列を基準として第171番目のセリンがグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、かつ第174番目のアラニンがロイシン、バリン、又はイソロイシンに置換された、α−ガラクトシダーゼ（GLA）活性を有する改変型α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ（NAGA）成熟タンパク質部分、及びそのN末端に連結した分泌シグナルペプチドからなるポリペプチドをコードする遺伝子を有する、幹細胞。
【請求項２】
前記第171番目のセリンがグルタミン酸に置換され、前記第174番目のアラニンがロイシンに置換された、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記分泌シグナルペプチドが配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
前記改変型NAGA成熟タンパク質部分が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６】
前記遺伝子をゲノム中に有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７】
前記遺伝子をゲノム中にホモで有する、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記遺伝子を細胞質中に有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９】
人工多能性幹細胞（iPS細胞）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞又はその分化誘導細胞を含む、ファブリー病治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ファブリー病治療用の細胞医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ファブリー病はリソソーム病の一種であり、X染色体上に存在するα−ガラクトシダーゼA（GLA）遺伝子の異常によってGLA活性が顕著に低下又は欠損することで引き起こされる。GLAはα−ガラクトシル基を認識し、糖タンパク質や糖脂質から切り離すことにより、糖タンパク質や糖脂質の分解を担っている。ファブリー病は、GLA活性の顕著な低下又は欠損により、グロボトリアオシルセラミドを始めとする糖脂質がリソソームで正常に分解されずに血管内皮細胞、平滑筋細胞、神経節細胞などに蓄積し、皮膚、循環器、神経、消化器、腎臓などを含む全身に悪影響をもたらす難病である。
【０００３】
ファブリー病の主な治療法として、酵素補充療法が行われている。酵素補充療法では、培養細胞を用いて産生されたGLAを精製し、それを点滴静注により患者に投与する。しかし、酵素補充療法は定期的かつ一生涯の精製GLA投与を必要とするため、膨大な費用が必要となる。しかも、GLAタンパク質を欠損している患者にGLA製剤を投与すると、患者の免疫系がGLAを異物と認識し抗GLA抗体を産生してしまい、アレルギー性副反応が見られたり、酵素補充療法に対する治療抵抗性が誘導されたりする例が散見される。こうした場合にはGLA製剤の治療効果は減少してしまう。
【０００４】
特許文献１及び特許文献２は、この問題を解決するため、ヒトGLAとアミノ酸配列で75%の相同性を有するヒトα-N-アセチルガラクトサミニダーゼ（NAGA）の基質認識部位において第188番目のアミノ酸及び第191番目のアミノ酸の置換を導入し、GLA活性を有する改変型NAGAを作製したことを開示している。野生型NAGAは、α-N-アセチルガラクトサミンを認識して糖タンパク質や糖脂質から切断するが、α−ガラクトシル基を有するグロボトリアオシルセラミドは切断しない。しかし、特許文献１に開示された改変型NAGAは、導入したアミノ酸置換変異により、GLAと同一の基質認識部位を有することとなり、GLAと同様にα−ガラクトシル基を認識・切断する活性を獲得したことから、グロボトリアオシルセラミドなどの糖脂質等を分解することができる。一方で、当該改変型NAGAは、基質認識部位以外は野生型NAGAと同じ抗原性を保持している。ファブリー病患者はGLAタンパク質を欠損していてもNAGAタンパク質は有しているため、この改変型NAGAはGLA活性を持つにもかかわらず、ファブリー病患者の免疫系で排除されず、治療抵抗性の誘導を抑制できる。そのため特許文献１に開示された改変型NAGAの精製タンパク質は、ファブリー病の酵素補充療法に有用と考えられている。しかしこの改変型NAGAの精製タンパク質を用いた場合でも、従来のGLAの酵素補充療法と同様に高頻度の投与や高額の製造コストが必要となる。患者にとってより利用しやすいファブリー病治療薬の開発が望まれている。
【０００５】
ところで、体細胞に初期化因子を導入して初期化することにより作製される人工多能性幹細胞（iPS細胞）が知られている。初期化因子としては当初、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycの4因子の組み合わせが使用されたが（特許文献３）、現在では様々な初期化因子の組み合わせを用いた体細胞の初期化が報告されている。体細胞の初期化においては特にOct3/4の重要性が明らかになっており、Oct3/4単独の導入による体細胞の初期化も報告されている（非特許文献１）。様々な組織又は細胞へのiPS細胞の分化誘導法の研究が進められている。同様に、胚性幹細胞（ES細胞）や体性幹細胞（間葉系幹細胞、心臓幹細胞、腸上皮幹細胞など）を含む様々な幹細胞やその分化誘導法の研究も数多く行われている。しかし、細胞医薬としての幹細胞の利用についてはまだ十分な知見が得られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００７／０５８３８１号
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００８／１４３３５４号
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２００７／０６９６６６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kim J.B. et al., Nature. (2009) 461(7264):649-653
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ファブリー病治療に有用な細胞医薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、改変型NAGAを発現及び分泌する幹細胞がファブリー病治療に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］配列番号４に示されるアミノ酸配列を基準として第171番目のセリンがグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、かつ第174番目のアラニンがロイシン、バリン、又はイソロイシンに置換された、α−ガラクトシダーゼ（GLA）活性を有する改変型α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ（NAGA）成熟タンパク質部分、及びそのN末端に連結した分泌シグナルペプチドからなるポリペプチドをコードする遺伝子を有する、幹細胞。
［２］前記第171番目のセリンがグルタミン酸に置換され、前記第174番目のアラニンがロイシンに置換された、上記［１］に記載の細胞。
［３］前記分泌シグナルペプチドが配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる、上記［１］又は［２］に記載の細胞。
［４］前記改変型NAGA成熟タンパク質部分が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞。
［５］前記ポリペプチドが、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の細胞。
［６］前記遺伝子をゲノム中に有する、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞。
［７］前記遺伝子をゲノム中にホモで有する、上記［６］に記載の細胞。
［８］前記遺伝子を細胞質中に有する、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞。
［９］人工多能性幹細胞（iPS細胞）である、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の細胞。
［１０］上記［１］〜［９］のいずれかに記載の細胞又はその分化誘導細胞を含む、ファブリー病治療薬。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ファブリー病治療に有用なGLA活性を対象者に持続的に供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、iPS細胞形質転換体を培養した培地（培養上清）（図１Ａ）、及びその細胞内（図１Ｂ）のGLA活性の測定値を示すグラフである。GLA Het #5は、GLA遺伝子をゲノム中にヘテロで有するiPS細胞クローン、GLA Homo #17はGLA遺伝子をホモで有するiPS細胞クローンである。mNAGA Het #2、及びmNAGA Het #10は、改変型NAGA遺伝子をゲノム中にヘテロで有するiPS細胞クローン、mNAGA Homo #14、及びmNAGA Homo #33は、改変型NAGA遺伝子をホモで有するiPS細胞である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明は、NAGAの抗原性を保持しながらGLA活性を有する改変型NAGAタンパク質を発現する幹細胞、及びそれを用いたファブリー病治療薬に関する。そのような幹細胞は、改変型NAGAタンパク質をコードする遺伝子（改変型NAGA遺伝子）を有する。改変型NAGA遺伝子は、外来性のものであってよいが、それに限定されない。
【００１５】
改変型NAGAについての詳細は特許文献１及び２に開示されている。特許文献１及び２に記載されているとおり、NAGAとGLAの立体構造はよく類似しており、それらの立体構造を重ね合わせて比較することにより、触媒部位及び基質結合部位において立体構造上対応する位置に存在し基質の結合に関与する１４のアミノ酸残基が抽出されるが、そのうち１２のアミノ酸残基が同一であり、２つのアミノ酸残基が異なる。改変型NAGAでは、GLAと異なるその２つのアミノ酸残基のうちの１つであるセリン（Ser；配列番号２に示されるNAGAのアミノ酸配列の第188番目、及び配列番号４に示されるNAGA成熟タンパク質のアミノ酸配列の第171番目のアミノ酸）が、GLAの立体構造上それと対応する位置に存在するグルタミン酸（Glu；配列番号１４に示されるアミノ酸配列の第203番目のアミノ酸）又はそれと同様にGLAの基質との結合を可能にするアミノ酸アスパラギン酸（Asp）に置換されている。さらに改変型NAGAでは、GLAと異なる上記２つのアミノ酸残基のうちのもう１つであるアラニン（Ala；配列番号２に示されるNAGAのアミノ酸配列の第191番目、及び配列番号４に示されるNAGA成熟タンパク質のアミノ酸配列の第174番目のアミノ酸）が、GLAの立体構造上それと対応する位置に存在するロイシン（Leu；配列番号１４に示されるアミノ酸配列の第206番目のアミノ酸）又はそれと同様にGLAの基質との結合を可能にするアミノ酸バリン（Val）若しくはイソロイシン（Ile）に置換されている。特許文献１及び２は、これらの置換により、NAGAの抗原性を保持しながらGLA活性を有するタンパク質（改変型NAGA）が得られることを開示している。
【００１６】
具体的には、本発明は、配列番号４に示されるアミノ酸配列（非改変型NAGA成熟タンパク質）を基準として第171番目のセリンがグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、かつ第174番目のアラニンがロイシン、バリン、又はイソロイシンに置換された、GLA活性を有する改変型NAGA成熟タンパク質部分、及びそのN末端に連結した分泌シグナルペプチドからなるポリペプチドをコードする遺伝子（改変型NAGA遺伝子）を有する、幹細胞に関する。特に好ましい実施形態では、改変型NAGA成熟タンパク質部分において、その第171番目のセリンがグルタミン酸に置換され、第174番目のアラニンがロイシンに置換される。
【００１７】
本発明に関して、「配列番号４に示されるアミノ酸配列を基準として第171番目のセリン」という表現は、配列番号４中で第171番目に位置するセリン、又は配列番号４の第171番目に位置するセリンに相当する他のタンパク質（ポリペプチド）のアミノ酸配列中のセリンを指す。配列番号４に示されるアミノ酸配列を、その配列と相同性（例えばおよそ70％以上の配列同一性）を有するタンパク質Ｘ（例えば、配列番号４とは異なるアミノ酸配列を有するNAGAバリアント）のアミノ酸配列とアラインメントしたときに、配列番号４の第171番目に位置するセリンに対してアラインメントされるタンパク質Ｘ中のセリンは、タンパク質Ｘ中でそのセリンが第171番目に位置するか否かにかかわらず、「配列番号４に示されるアミノ酸配列を基準として第171番目のセリン」である。同様に「配列番号４に示されるアミノ酸配列を基準として第174番目のアラニン」という表現は、配列番号４中で第174番目に位置するアラニン、又は配列番号４の第174番目に位置するアラニンに相当する他のタンパク質（ポリペプチド）のアミノ酸配列中のアラニンを指し、その表現は上記と同様の方法で解釈される。他の配列番号、他のアミノ酸若しくは塩基番号、及び他のアミノ酸に同様の表現で言及する場合も同様に解釈される。
【００１８】
なお本発明において「成熟タンパク質部分」とは、翻訳後プロセシングによるシグナルペプチドの切断で生成されるタンパク質（成熟タンパク質）に相当するポリペプチド領域を指す。また「分泌シグナルペプチド」とは、細胞外へのタンパク質の分泌（輸送）を誘導するシグナルペプチドを指す。
【００１９】
NAGA遺伝子（非改変型NAGA遺伝子）の典型的な塩基配列を配列番号１に、それによってコードされるNAGA（非改変型NAGA）のアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号２の第1番目〜第17番目はNAGAの天然シグナルペプチド（配列番号６）であり、配列番号２の第18番目のアミノ酸から成熟タンパク質部分が開始する。すなわち、配列番号４に示されるアミノ酸配列は、配列番号２の第18番目〜第411番目のアミノ酸配列に相当する。配列番号４の第171番目のアミノ酸は配列番号２の第188番目のアミノ酸であり、配列番号４の第174番目のアミノ酸は配列番号２の第191番目のアミノ酸である。配列番号３に示される塩基配列は、配列番号１の塩基配列のうち、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする部分である。配列番号５に示される塩基配列は、配列番号１の塩基配列のうち、配列番号２の第1番目〜第17番目のアミノ酸配列（シグナルペプチド；配列番号６）をコードする部分である。
【００２０】
本発明において改変型NAGA成熟タンパク質（又は改変型NAGA成熟タンパク質部分）は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるものであってもよいし、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上、例えば９９．４％以上又は９９．７％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGLA活性を有するものであってもよい。本発明において改変型NAGA成熟タンパク質（又は改変型NAGA成熟タンパク質部分）はまた、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１又は複数個（例えば、２、３、４、又は５個）のアミノ酸の欠失、置換、付加を有するアミノ酸配列からなり、かつGLA活性を有するものであってもよい。なお「改変型NAGA成熟タンパク質部分がGLA活性を有する」とは、その改変型NAGA成熟タンパク質部分が成熟タンパク質として生成された場合にGLA活性を有することを意味する。配列番号１０に示されるアミノ酸配列（改変型NAGA成熟タンパク質部分）は、例えば、配列番号９に示される塩基配列によりコードされる。
【００２１】
但し本発明で用いる改変型NAGA成熟タンパク質（又は改変型NAGA成熟タンパク質部分）は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を基準として第171番目のアミノ酸のGlu又はAspへの置換、及び第174番目のアミノ酸のLeu、Val又はIleへの置換を有する。さらに、改変型NAGA成熟タンパク質（又は改変型NAGA成熟タンパク質部分）は、NAGAとGLAの触媒部位及び基質結合部位において立体構造上対応する位置に存在し基質の結合に関与する、GLAと同一のアミノ酸を有するNAGA中の１２のアミノ酸残基を保持する。その１２のアミノ酸残基は、配列番号４に示されるアミノ酸配列の第16番目のトリプトファン（Trp）、第61番目のアスパラギン酸（Asp）、第62番目のアスパラギン酸（Asp）、第102番目のチロシン（Tyr）、第110番目のシステイン（Cys）、第137番目のリシン（Lys）、第139番目のアスパラギン酸（Asp）［触媒残基］、第141番目のシステイン（Cys）、第175番目のチロシン（Tyr）、第196番目のアルギニン（Arg）、第200番目のアスパラギン酸（Asp）［触媒残基］、及び第235番目のアスパラギン酸（Asp）である。なおこれらのアミノ酸は、配列番号１０においても同じ位置に存在する。本発明で用いる改変型NAGA成熟タンパク質は、NAGAの抗原性を保持しており、好ましくは配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるNAGAの成熟タンパク質（配列番号４）の抗原性を保持している。そのため、改変型NAGA成熟タンパク質は、ファブリー病患者に投与されても基本的には異物として認識されない。また、本発明で用いる改変型NAGA成熟タンパク質（又は改変型NAGA成熟タンパク質部分）は、配列番号４又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列の第171番目のアミノ酸及び第174番目のアミノ酸を除き、投与対象者の内在性NAGAのアミノ酸配列と同一であることが好ましい。改変型NAGA成熟タンパク質は、GLA活性を有し、GLAと同様にα-ガラクトシル基を認識し切断することができ、ファブリー病患者で蓄積が認められるグロボトリアオシルセラミド等の物質を分解することができる。
【００２２】
本発明においては、分泌シグナルペプチドが改変型NAGA成熟タンパク質部分のN末端に連結している。幹細胞の細胞外へ分泌することができる限り、任意の分泌シグナルペプチドを用いることができる。好ましい実施形態では、分泌シグナルペプチドは、幹細胞、例えばiPS細胞、ES細胞、又はいずれかの体性幹細胞において細胞外へのタンパク質分泌に適した分泌シグナルペプチドであってよい。一実施形態では、分泌シグナルペプチドは、分泌型酵素（例えば、リソソーム酵素）由来のシグナルペプチドであってよく、例えば、GLA由来のシグナルペプチド（GLAシグナルペプチド）であってよい。GLAシグナルペプチドの好ましい例は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。GLAシグナルペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上の配列同一性を有し、かつ分泌シグナル活性を有するものであってもよい。「分泌シグナル活性」とは、タンパク質のN末端に存在する場合にシグナルペプチドとして機能し、細胞外へのタンパク質分泌を誘導できることを意味する。あるいは分泌シグナルペプチドは、IL-2シグナルペプチドであってもよい。配列番号１２に示されるアミノ酸配列は、配列番号８及び１４の第1番目〜第31番目のアミノ酸配列に相当し、例えば、配列番号１１に示される塩基配列によってコードされる。
【００２３】
上記のような改変型NAGA成熟タンパク質部分、及びそのN末端に連結した分泌シグナルペプチドからなるポリペプチドは、例えば、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むものであってよい。配列番号８に示されるアミノ酸配列は、例えば、配列番号７に示される塩基配列によってコードされる。
【００２４】
本発明では、上記の改変型NAGAを幹細胞で発現させる。典型的には、改変型NAGA遺伝子を幹細胞にプロモーターの制御下で導入し、改変型NAGAを幹細胞で発現させることができる。
【００２５】
本発明で用いる改変型NAGA遺伝子は、上記の改変型NAGA成熟タンパク質部分、及びそのN末端に連結した分泌シグナルペプチドからなるポリペプチドをコードする。本発明で用いる改変型NAGA遺伝子は、改変型NAGA成熟タンパク質部分をコードする塩基配列と、その5'側にインフレーム（in frame）で連結した分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列とを含んでもよい。好ましい実施形態では、本発明で用いる改変型NAGA遺伝子は、配列番号７に示される塩基配列を含む。改変型NAGA遺伝子の塩基配列は、導入する幹細胞の由来生物種に合わせてコドン最適化されていてもよい。本発明において「遺伝子」は、主にDNAを指すが、RNA、RNA/DNAハイブリッド、又は人工塩基を含む核酸であってもよい。
【００２６】
本発明で用いる幹細胞は、多能性幹細胞又は単能性幹細胞であってよい。本発明で用いる幹細胞は、以下に限定するものではないが、体性幹細胞、胚性幹細胞（ES細胞）、又は人工多能性幹細胞（iPS細胞）であってよい。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、腸上皮幹細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい実施形態では、幹細胞はiPS細胞である。
【００２７】
本発明で用いる幹細胞は、ヒト、ゴリラ等の霊長類、マウス、ラット、モルモットなどのげっ歯類、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、イヌ、ネコ等の任意の哺乳動物に由来するものであってよい。本発明に係る幹細胞は、健康な哺乳動物個体、例えば健康なヒト個体に由来することが好ましい。本発明に係る幹細胞は、それを投与する対象者と同じヒト白血球抗原（HLA）型を（より好ましくはホモで）有するヒトの細胞（例えば体細胞）に由来するものであってよい。本発明で用いる幹細胞は、それを投与する対象者と同じ人種のヒトの細胞に由来してもよく、また、それを投与する対象者自身又はその血縁者の細胞に由来するものであってもよい。
【００２８】
iPS細胞は、初期化因子を導入及び／又は発現誘導・促進することにより体細胞を初期化（リプログラミング）して得られる多能性幹細胞である。本発明において用いる初期化因子は初期化因子遺伝子であっても初期化因子タンパク質であってもよい。本発明では任意のiPS細胞を用いることができる。典型的には、iPS細胞は、１つ又はそれ以上（例えば２〜４つ）の初期化因子（初期化因子遺伝子）を体細胞にゲノム中に導入するか又はエピソーマルベクターの形態で導入することにより作製されるが、他の方法、例えば、薬剤により内在性初期化因子の発現を促進することにより作製してもよい。
【００２９】
iPS細胞の作製（細胞の初期化）は、所定の初期化因子の発現に基づく。初期化因子は、好ましくはOctファミリーメンバーを含む。初期化因子の組み合わせは、Octファミリーメンバーと、Klfファミリーメンバー及びSoxファミリーメンバーからなる群から選択される少なくとも１つとを含んでもよい。一実施形態では、初期化因子の組み合わせは、Octファミリーメンバー、Klfファミリーメンバー、及びSoxファミリーメンバーを含むが、これらに限定されない。Octファミリーメンバーとして、例えば、Oct3/4（Oct3又はOct4とも称される）が挙げられる。Klfファミリーメンバーとして、例えば、Klf1、Klf2、Klf4、及びKlf5が挙げられる。Soxファミリーメンバーとして、例えば、Sox1、Sox2、Sox3、Sox15、及びSox17が挙げられる。初期化因子の組み合わせは、上記のような初期化因子に加えて、他の初期化因子を含んでもよく、例えば、Mycファミリーメンバー（例えば、c-Myc、L-Myc、N-Myc、c-Mycの変異遺伝子であるT58A）、Sallファミリーメンバー（例えば、Sall1、Sall4）、Linファミリーメンバー（例えば、Lin28）、Glisファミリーメンバー（例えば、Glis1）、Nanogファミリーメンバー（例えば、Nanog）等から選択される少なくとも１つを含んでもよい。一実施形態では、初期化因子は、Oct3/4及びSox2；Oct3/4及びKlf4；Oct3/4、Sox2、及びKlf4；Oct3/4、Sox2、Klf4、及びL-Myc；Oct3/4、Sox2、Klf4、及びc-Myc；Oct3/4、Sox2、c-Myc、及びLin28Aのいずれかの組み合わせを含み得る。なお、初期化される体細胞において、発現対象の初期化因子の一部が既に発現している場合には、その初期化因子は導入する初期化因子から除いてもよいし、除かなくてもよい。すなわち体細胞に導入する初期化因子は、上記の初期化因子又はその組み合わせの一部又は全部であり得るが、少なくともOctファミリーメンバー（好ましくはOct3/4）を含むことが好ましい。iPS細胞の一例として、WTC11細胞（GM25256）が挙げられるが、これに限定されない。例えば、市販の又は寄託機関から分譲される様々なiPS細胞を当業者であれば容易に入手することができるし、また公知の方法に従って上述のように初期化因子を体細胞に導入することによりiPS細胞を任意の体細胞から作製することもできる。
【００３０】
一実施形態では、本発明に係る幹細胞は、改変型NAGA遺伝子をゲノム中に有する。この実施形態では、幹細胞は、改変型NAGA遺伝子をゲノム中でホモ（ホモ接合）又はヘテロ（ヘテロ接合）で有するものであってよい。別の実施形態では、本発明に係る幹細胞は、改変型NAGA遺伝子をエピソーマル（染色体外）に、すなわち細胞質中に有する。この実施形態では、改変型NAGA遺伝子は、宿主細胞の染色体（ゲノム）に組み込まれることなく、エピソーマルベクターの形態で幹細胞の細胞質中で維持され得る。エピソーマルベクターは、宿主細胞ゲノムへの導入遺伝子の組込みを引き起こすことなく染色体外で自律複製して維持され、細胞分裂後は娘細胞に分配されるベクターである。本発明において「エピソーマルベクターの形態で」とは、エピソーマルベクター中に目的の遺伝子が、通常は発現誘導可能な状態で、組み込まれていることを意味し、その場合、エピソーマルベクター中、プロモーター、ターミネーター、ポリアデニル化シグナル、プロセシングシグナル等の発現制御配列の制御下に目的の遺伝子が組み込まれていることが好ましい。
【００３１】
本発明に係る幹細胞は、改変型NAGA遺伝子を、細胞機能を損なわない任意のゲノム内部位に有するものであってよい。好ましい一実施形態では、本発明に係る幹細胞は、改変型NAGA遺伝子をセーフ・ハーバー遺伝子座（セーフ・ハーバー部位）に有する。セーフ・ハーバー遺伝子座は宿主細胞や宿主動物等に対して有害な効果をもたらすことなく遺伝子導入が可能な遺伝子座を指す。セーフ・ハーバー遺伝子座としては、AAVS1（AAV integration site 1）遺伝子座、CCR5遺伝子座、アルブミン遺伝子座、HRPT遺伝子座、GTP結合タンパク質10遺伝子座、β-アクチン遺伝子座、H11遺伝子座などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
幹細胞への改変型NAGA遺伝子の導入は常法により行うことができる。好ましい実施形態では、改変型NAGA遺伝子の導入は、TALEN（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ；TALE-ヌクレアーゼ）、Znフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、CRISPR-Cas9等を用いたゲノム編集技術により行うことができる。一般的なゲノム編集技術では、導入すべき遺伝子又は変異領域を含むターゲティングベクターを用い、ヌクレアーゼ等による部位特異的DNA切断後の相同組換え修復（homology direct repair：HDR）を利用して宿主細胞中の特定のゲノム部位に外来性DNAを挿入することができる。但しゲノム編集技術はその方法に限定されるわけではない。ゲノム編集技術を用いた幹細胞への改変型NAGA遺伝子の導入は、市販のゲノム編集用キット、酵素、ベクター等を用いて行うこともできる。あるいは、改変型NAGA遺伝子は、改変型NAGA遺伝子を発現ベクター中に組み込んだ後、その発現ベクターを幹細胞に常法により導入してもよい。発現ベクターの幹細胞への導入は、リポフェクション法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール（PEG）法、マイクロインジェクション法などの、動物細胞用に用いられる任意の形質転換技術により行うことができる。
【００３３】
本発明に係る幹細胞において、改変型NAGA遺伝子はプロモーターの制御下に導入される。プロモーターは、例えば、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は時期特異的プロモーターであってもよく、構成性プロモーターがより好ましい。プロモーターはセーフ・ハーバー遺伝子座等の導入部位周辺（例えば導入部位の上流）に天然に存在するプロモーターであってもよいし、改変型NAGA遺伝子と共に導入する外来性プロモーターであってもよい。外来性プロモーターの例としては、例えば、CAGプロモーター、EF1αプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター等が挙げられる。本発明に係る幹細胞において、改変型NAGA遺伝子はまた、ターミネーター、ポリアデニル化シグナル、プロセシングシグナル等の発現制御配列の制御下に導入されることも好ましい。そのような発現制御配列は導入部位周辺（例えば導入部位の下流）に天然に存在するものであってもよいし、改変型NAGA遺伝子と共に導入する外来性のものであってもよい。
【００３４】
好ましい一実施形態では、本発明に係る幹細胞は、改変型NAGA遺伝子を有するとともに、内在性GLAタンパク質を欠損している。幹細胞の内在性GLAタンパク質の欠損は、常法により引き起こすことができ、例えばゲノム編集技術を用いて当該遺伝子をノックアウトしてもよい。「内在性GLAタンパク質の欠損」は、本発明においては、GLAタンパク質が発現されないことを意味し、例えば、GLA遺伝子全体の欠落、及び発現不能（転写又は翻訳不能）をもたらすGLA遺伝子の部分的欠落又は変異が挙げられる。
【００３５】
改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞は、幹細胞に利用可能な任意の培地で培養することができる。培地としては、例えば、mTeSRTM1培地（STEMCELL Technologies）やEssential 8TM培地（Thermo Fisher Scientific）が挙げられるが、これらに限定されない。培地には、Rock阻害剤（例えば、Y-27632）を添加してもよい。
【００３６】
本発明における改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞は、改変型NAGA遺伝子を発現し、活性のある改変型NAGA成熟タンパク質を産生することができる。本発明に係る改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞は、改変型NAGA成熟タンパク質を産生し、細胞内に含むだけでなく、細胞外に分泌することができる。当該幹細胞は、改変型NAGA成熟タンパク質を細胞外に持続的に供給することができるため、改変型NAGA成熟タンパク質の供給源として有利に用いることができる。
【００３７】
したがって本発明における改変型NAGA遺伝子を有し改変型NAGA成熟タンパク質を産生する幹細胞は、細胞内及び培地中のGLA活性をもたらすことができる。本発明における改変型NAGA成熟タンパク質、又はそれを産生する幹細胞のもたらすGLA活性は、常法により測定することができ、例えば、MU-α-ガラクトピラノシドを基質として一定時間にわたり反応させた後、グリシン緩衝液の添加により反応を停止させ、その反応産物である遊離4-メチルウンベリフェロンを励起波長355 nm、蛍光波長460 nmで検出することにより測定することができる。
【００３８】
本発明における改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞は、様々な分化誘導条件下で任意の細胞又は組織に分化させることができる。様々な分化誘導条件に適した各種分化誘導培地が公知であり、また市販されている。本発明における改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞から分化誘導した細胞（分化誘導細胞）は、任意の細胞型であってよいが、ファブリー病の症状が現れやすい細胞、あるいはファブリー病において糖脂質等の蓄積が認められる細胞であることが好ましい。分化誘導細胞は、組織の形態であってもよい。分化誘導細胞は、外胚葉、中胚葉、又は内胚葉細胞であってよい。本発明における改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞からは、例えば、血管細胞（血管内皮細胞、血管平滑筋細胞など）、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、神経細胞、神経節細胞、網膜色素上皮細胞、腎臓細胞、腸細胞、皮膚細胞など、又はそれらの前駆細胞等の様々な細胞の分化を誘導し、その細胞を用いた組織を構築することができる。本発明における改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞の分化誘導細胞も、上記の改変型NAGA成熟タンパク質を産生し、細胞内に含むだけでなく、細胞外に分泌することができる。
【００３９】
したがって本発明における改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞又はその分化誘導細胞は、GLA活性を補充するための医薬として用いることができる。本発明は、改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞又はその分化誘導細胞を含む細胞医薬を提供する。本発明において細胞医薬とは、外から生細胞を投与してその細胞機能を体内で発揮させることに基づく治療／予防法のための、その生細胞を含む医薬を指す。
【００４０】
本発明に係る改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞又はその分化誘導細胞を含む医薬は、医薬組成物であってよい。本発明に係る改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞又はその分化誘導細胞を含む医薬は、有効成分としてのその細胞に加えて、細胞機能を損なわない限り、製薬上許容される添加剤（医薬品添加剤）をさらに含んでもよい。そのような添加剤としては、賦形剤、担体、安定剤、保存剤、緩衝剤、pH調節剤、懸濁化剤、着香剤、着色剤、粘稠剤等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に係る医薬はまた、培地由来成分を含んでもよい。
【００４１】
本発明に係る改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞又はその分化誘導細胞を含む医薬は、細胞医薬に適した任意の剤形であってよい。本発明に係る医薬は、改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞又はその分化誘導細胞を個々の細胞のまま含んでもよいし、あるいはシート状、管状、層状、固相結合体等の任意の形状で含んでもよい。本発明に係る医薬は、改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞又はその分化誘導細胞をタンパク質透過性マイクロデバイスなどの体内移植用デバイスに封入したものであってもよい。但し本発明に係る医薬は、改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞又はその分化誘導細胞を生細胞として含む。
【００４２】
本発明に係る改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞又はその分化誘導細胞及びそれを含む医薬は、GLA活性を補充することができるため、ファブリー病治療薬として用いることができる。したがって本発明は、本発明に係る改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞又はその分化誘導細胞を含むファブリー病治療薬も提供する。ファブリー病はリソソーム病の一種であり、X染色体上に存在するGLA遺伝子の異常に起因する。本発明に係る改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞又はその分化誘導細胞及びそれを含む医薬は、改変型NAGA成熟タンパク質のin vivo産生により、GLA活性を持続的に（好ましくは、生体内にその細胞が存在する限り永続的に）供給することができる。ファブリー病治療に用いられている従来の酵素補充療法では、一部の患者は野生型GLAを生来有していないために投与されたGLAに対する免疫反応が生じ、酵素補充療法に対する治療抵抗性が誘導されるという問題があるが、改変型NAGAは患者が有するNAGAと同等の抗原性を有するため、治療抵抗性の誘導を回避することができる。
【００４３】
本発明に係る改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞若しくはその分化誘導細胞及びそれを含む医薬は、GLA活性を補充する必要性を有する対象者（例えばヒト患者）、典型的にはファブリー病に罹患している又はファブリー病の素因を有する対象者に投与することができる。「ファブリー病に罹患している」とは、X染色体上の少なくとも１つのアレルのGLA遺伝子に異常があり、ファブリー病の１つ以上の症状（以下に限定するものではないが、典型的には、四肢疼痛、聴力低下、めまい、角膜混濁、アンジオケラトーマ、低・無汗症、胃腸障害、腎不全やタンパク尿などの腎機能障害、心不全などの心機能障害、頭痛、及び脳血管障害等）を有しているか、又はGLA活性の顕著な低下又は欠損による糖脂質等（グロボトリアオシルセラミド、グロボトリアオシルスフィンゴシンなど）の細胞内蓄積が認められることを意味する。「ファブリー病の素因を有する」とは、ファブリー病の症状が明確には現れていないものの、X染色体上に存在する少なくとも１つのアレルのGLA遺伝子に異常を有していることを意味する。ファブリー病は古典型のファブリー病であってもよいし、遅発型ファブリー病であってもよい。対象者は男性であっても女性であってもよいが、男性が特に好適である。男性はX染色体を１つしか有しないため、GLA遺伝子の異常により正常なGLAタンパク質を有しないヘミ接合体となるためである。なお対象者はNAGAを欠損していないことが好ましい。
【００４４】
本発明に係る改変型NAGA遺伝子を有し、かつ内在性GLAタンパク質を欠損している幹細胞又はその分化誘導細胞及びそれを含む医薬（例えば、ファブリー病治療薬）は、細胞から供給されたGLAに対する免疫反応の惹起を予防することができ、それはアレルギー症状の発現を予防又は低減する上で有用である。このような幹細胞又はその分化誘導細胞及びそれを含む医薬は男性の対象者のために特に有用である。
【００４５】
本発明に係る改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞若しくはその分化誘導細胞又はそれを含む医薬をそのような対象者に有効量で投与することにより、対象者の体内のGLA活性を補充し、GLA活性低下による糖脂質等の蓄積を抑制し、ファブリー病を治療することができる。「ファブリー病の治療」とは、糖脂質等の蓄積やファブリー病の症状の低減（軽減）又は消失だけでなく、それらの悪化を阻止又は遅延させることを含む。対象者への本発明に係る改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞若しくはその分化誘導細胞又はそれを含む医薬の投与は、様々な投与経路を用いて行うことができるが、直接移植（細胞シートの貼り付け、埋め込みなど）、骨髄移植、静脈内又は動脈内投与、筋肉内投与などの非経口経路で行うことが好ましい。
【００４６】
本発明に係る改変型NAGA遺伝子を有する幹細胞若しくはその分化誘導細胞又はそれを含む医薬の投与量は、投与対象者の年齢及び体重、投与経路、投与回数等を考慮しながら、当業者の裁量によって適宜設定することができる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４８】
１．ヒトiPS細胞の培養
ヒト野生型iPS細胞としては、エピソーマルベクターを用いたリプログラミング法でOct3/4、Sox2、L-Myc、及びKlf4を導入して樹立された、健康な男性の皮膚由来のWTC11（Kreitzer F.R., et. al., Am. J. Stem Cells (2013) 2(2):119-131；Miyaoka Y., et al., Nat. Methods. (2014) 11(3):291-293）を使用した。マトリゲルでコーティングしたプラスチックディッシュ上で、mTeSRTM1培地（STEMCELL Technologies）又はEssential 8TM培地（Thermo Fisher Scientific）中でWTC11の培養を行った。培地は毎日交換し、細胞密度が低い状態ではRock阻害剤であるY-27632を10 μMで培地に添加した。細胞のディッシュからの剥離には、細胞剥離液AccutaseTM（Innovative Cell Technologies）を用いた。
【００４９】
２．ターゲティングベクターの構築
プラスミドAAV-CAGGS-EGFP（Addgene#: 22212）中のEGFP（改良型緑色蛍光タンパク質） cDNAを改変型NAGA cDNA（配列番号７）に置換し、ベクターAAV-CAGGS-ModNAGAを作製した。AAV-CAGGS-EGFPは、CAGプロモーター下でEGFPを発現させるカセットを宿主ゲノムのAAVS1部位（DeKelver R.C., et al., Genome Res. (2010) 20:1133-1142）にノックインするためのターゲティングベクターである。改変型NAGA cDNA（配列番号７）は、N末端のGLAシグナルペプチド配列（配列番号１２）とそれに連結した改変型NAGA成熟タンパク質配列（配列番号１０）からなるポリペプチド（配列番号８）をコードする。改変型NAGA成熟タンパク質は、野生型NAGA（配列番号２）の成熟タンパク質（配列番号４）の抗原性を保持しつつ、GLA（α-ガラクトシダーゼA；配列番号１４）と同様の触媒活性（GLA活性）を有する。コントロールとして、プラスミドAAV-CAGGS-EGFP中のEGFP cDNAをGLA cDNA（配列番号１３）に置換したベクター（AAV-CAGGS-GLA）も作製した。
【００５０】
３．トランスフェクション及びピューロマイシン選択
2 x 106個のWTC11細胞に、AAVS1部位を標的とするTALEN発現ベクター１組（2 μgずつ）と、AAV-CAGGS-ModNAGA又はAAV-CAGGS-GLA（5 μg）とを、P3 Primary Cell KitとNucleofectorTM 4d（Lonza）のDS-138プログラムを用いてトランスフェクションした。AAVS1部位を標的とするTALEN発現ベクターの詳細については、Mandegar, et al., Cell Stem Cell. (2016) 18(4):541-553に記載されている。簡潔に説明すると、AAVS1部位を標的とするTALEN発現ベクターは、Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0（Addgene Kit # 1000000024）を用いて、遺伝子挿入を行う直近の配列である5'-CCCCTCCACCCCACAG-3'（配列番号１５）と5'-TTTCTGTCACCAATCC-3'（配列番号１６）を認識するRVD（repeat variable diresidues）を持つTALEN１組を設計し、発現ベクター中に構築したものを用いた。
【００５１】
トランスフェクションした細胞をマトリゲルでコーティングした96ウェルプレートに播種し、３日後に培地を0.5 μg/mlのピューロマイシンを加えた新鮮培地に交換し、ピューロマイシン耐性の細胞を選択した。選択された細胞からゲノムDNAを抽出し、それを鋳型として、野生型AAVS1部位を増幅するプライマーと、ドナーベクター配列と内在性ゲノムDNAの境界部分を増幅するプライマーを用いたPCRを行うことにより、ターゲティングされていない野生型アリルと正しくターゲティングされたアリルをそれぞれ検出した。これにより、改変型NAGA、又はGLAをCAGプロモーター下でヘテロ又はホモでAAVS1部位にノックインしたiPS細胞の樹立を確認した。用いたプライマーは、以下のとおりであり、Mandegar, et al., Cell Stem Cell. (2016) 18(4):541-553にも記載されている。
【００５２】
野生型AAVS1部位を増幅するプライマー対（PCR産物サイズ  254 bp）：
フォワードプライマー：5'-CGGTTAATGTGGCTCTGGTT-3'（配列番号１７）
リバースプライマー  ：5'-AGGATCCTCTCTGGCTCCAT-3'（配列番号１８）
ドナーベクター配列と内在性ゲノムDNAの境界部分を増幅するプライマー対（PCR産物サイズ  1068 bp）：
フォワードプライマー：5'-CTGCCGTCTCTCTCCTGAGT-3'（配列番号１９）
リバースプライマー  ：5'-GTGGGCTTGTACTCGGTCAT-3'（配列番号２０）
【００５３】
４．細胞内と培地中のGLA活性の測定
ターゲティングを行う前の野生型WTC11、並びに上記のようにして作製した改変型NAGAをヘテロ又はホモでAAVS1部位にノックインしたWTC11細胞、及びGLAをヘテロ又はホモでAAVS1部位にノックインしたWTC11細胞を、マトリゲルでコーティングされた12ウェルプレート中の1ウェルに播いた。その細胞をEssential 8TM培地（Thermo Fisher Scientific）中で37℃で培養し、細胞が各ウェルで完全にコンフルエントになってから培地を新鮮培地に交換した。48時間後に培地を1.5 mlチューブに移し、5000 rpmで3分間遠心した後、上清を回収し、同様の遠心を繰り返した。2回目の遠心の後に回収した培地を-80℃で冷凍保存し、後述の測定試料として用いた。
【００５４】
AccutaseTMの添加により細胞を剥離後、1.5 mlチューブに移して5000 rpmで3分間遠心し、上清を除去し、PBSを1 ml加えて細胞を懸濁することによる洗浄を2回繰り返した。2回目の遠心の後に、上清を完全に取り除き細胞ペレットを-80℃で冷凍保存した。冷凍保存した細胞に、プロテアーゼ阻害剤cOmpleteTM Mini（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）を含む20 mM MES緩衝液（pH 6.0）を加え、超音波処理した。得られた細胞ホモジネート溶液を、12,000 rpmにて4℃で5分間遠心し、上清を回収し、測定試料とした。
【００５５】
GLAの酵素活性測定は、MU-α-ガラクトピラノシド（Calbiochem, LaJolla, CA）を基質として行った。5 mM MU-α-ガラクトピラノシド、及び117 mM N-アセチル-D-ガラクトサミン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO；α-N-アセチルガラクトサミニダーゼを阻害するために添加）を0.1 M クエン酸リン酸緩衝液（pH 4.6）に溶解した溶液を基質溶液とした。1.5 mlチューブに入れた40 μl 基質溶液に10 μlの測定試料（上記で調製した培地又は細胞ホモジネート溶液）を添加し、37℃で30分間反応させた。酵素反応後、反応液に0.2 M グリシン緩衝液（pH 10.7）を計1000 μlになるように添加し、反応を停止させた。酵素反応により遊離した4-メチルウンベリフェロンをプレートリーダーWallac 1420 ARVO MX Multilabel Counter（Perkin Elmer, Waltham, MA）を用いて、励起波長355 nm、蛍光波長460 nmで測定した。
【００５６】
５．タンパク質定量
牛血清アルブミンの濃度を基準として、Micro BCA法（Micro BCATM Protein Assay Reagent Kit: Thermo Fisher）によりタンパク質の定量を行った。測定においては、測定試料をMilliQ水で希釈した後に、等量のMicro BCATM試薬を添加し、60℃で1時間反応させた。反応液を室温まで冷却し、OD560で測定した。
【００５７】
６．細胞内及び培地中のGLA活性
得られた測定結果を図１に示す。GLAをヘテロ又はホモにAAVS1部位に有するiPS細胞（GLA Het #5、GLA Homo #17）では、野生型のiPS細胞（WT）と比較して、培地（培養上清）中（図１Ａ）と、細胞内（図１Ｂ）の両方でGLA活性の顕著な増大が認められた。
【００５８】
同様に、改変型NAGAをヘテロ又はホモにAAVS1部位に有するiPS細胞（mNAGA Het #2、mNAGA Het #10、mNAGA Homo #14、mNAGA Homo #33）でも、野生型のiPS細胞（WT）と比較して、培地（培養上清）中（図１Ａ）と細胞内（図１Ｂ）の両方でGLA活性の顕著な増大が認められた。
【００５９】
これらの結果は、改変型NAGAを発現するiPS細胞が、活性を有する改変型NAGAを生産し細胞内に蓄積するとともに、改変型NAGAを活性を保ったまま細胞外に分泌し、それによりiPS細胞内及びiPS細胞外においてGLA活性をもたらすことを示す。そのことは、このiPS細胞の移植が、GLA活性の補充を必要とするファブリー病の治療に有効であることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、ファブリー病患者のGLA活性補充に有効な医薬を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００６１】
配列番号１：NAGA cDNA
配列番号２：NAGA
配列番号３：成熟NAGAコード配列
配列番号４：成熟NAGA
配列番号５：NAGAシグナルペプチドコード配列
配列番号６：NAGAシグナルペプチド
配列番号７：改変型NAGA cDNA
配列番号８：改変型NAGA
配列番号９：改変型NAGA成熟タンパク質コード配列
配列番号１０：改変型NAGA成熟タンパク質
配列番号１１：GLAシグナルペプチドコード配列
配列番号１２：GLAシグナルペプチド
配列番号１３：GLA cDNA
配列番号１４：GLA
配列番号１５〜２０：プライマー
【図１】
2019122339.tif 000003
【配列表】
2019122339000001.app