(57)【要約】【課題】  大量の細胞が培養可能であり、且つ、細胞を低侵襲に回収することが可能な、温度応答性重合体ブロックを含むブロック共重合体がコートされたビーズおよびその製造方法を提供すること。【解決手段】  下記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のブロックを含むブロック共重合体コートしたビーズにより前記課題を解決する。（Ａ）ＨＬＢ値（グリフィン法）が７以上２０以下の範囲にある重合体ブロック。（Ｂ）ＨＬＢ値（グリフィン法）が０以上７未満の範囲にある重合体ブロック。（Ｃ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体ブロック。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のブロックを含むブロック共重合体が、ビーズにコートされていることを特徴とするブロック共重合体コートビーズ。
（Ａ）ＨＬＢ値（グリフィン法）が７．０以上２０．０以下の範囲にある重合体ブロック。
（Ｂ）ＨＬＢ値（グリフィン法）が０．０以上７．０未満の範囲にある重合体ブロック。
（Ｃ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体ブロック。
【請求項２】
ビーズの直径が２０μｍ〜１０００μｍであることを特徴とする請求項１に記載のブロック共重合体コートビーズ。
【請求項３】
ビーズの材質が合成高分子材料であることを特徴とする請求項１または２に記載のブロック共重合体コートビーズ。
【請求項４】
以下の工程（１）と（２）を含む、請求項１から３のいずれかに記載のブロック共重合体コートビーズの製造方法。
（１）請求項１に記載の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のブロックを含むブロック共重合体を含む表面処理剤を製造する工程、
（２）工程（１）で製造した表面処理剤とビーズを接触させて、ビーズにブロック共重合体をコートする工程。
【請求項５】
４０℃以上に加熱した状態でビーズにブロック共重合体をコートすることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
減圧下でビーズにブロック共重合体をコートすることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１から３のいずれか１項に記載のブロック共重合体コートビーズを用い、請求項１に記載の温度応答性重合体ブロックのＬＣＳＴより高い温度で細胞を前記ブロック共重合体コートビーズ上で培養し、細胞増殖後に温度をＬＣＳＴより低くして増殖細胞を前記ブロック共重合体コートビーズから剥離することを特徴とする細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温度応答性重合体ブロックを含むブロック共重合体がコートされたビーズおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞は、あらゆる系統の細胞へと分化できる多能性を有していることから、再生医療や細胞医療の確立に向け研究が進められている。一方で、培地や増殖因子などの消耗品のコスト低減が課題になっており、安価で安定な細胞供給システムが求められる。一般的にヒト細胞を含め多くの動物細胞は足場依存性があり、細胞を増殖する際は足場が必要である。コスト低減に当たり、単位培地量当たりの細胞増殖が高くなる足場の設計を行う必要があった。これを解決するため、合成高分子や多糖などの天然高分子を原料としたビーズから構成されるマイクロキャリアが開発されている。マイクロキャリアを細胞懸濁液入りの容器に投入し培養することで、細胞は容器表面だけでなくマイクロキャリア表面にも接着し増殖し、単位培地量当たりの細胞増殖を高めることができる。
【０００３】
一方、増殖後の細胞は足場から剥離して回収する必要がある。細胞は、細胞が産出した接着性タンパク質により足場に接着しており、一般的に、足場に接着した細胞を剥離して回収するには、トリプシンなどのタンパク質分解酵素が用いられる。しかしながら、トリプシンなどのタンパク質分解酵素は接着性タンパク質を分解するのと同時に、細胞固有の表面タンパク質も分解するため、細胞にダメージを与える点が課題であった。
【０００４】
こうした課題を解決するために、例えば特許文献１には、クロロメチル化されたポリスチレンビーズに３２℃で水和力が変化する温度応答性ポリマーを固定したマイクロキャリアを用いて細胞を培養することで、３７℃では細胞増殖が見られ、２０℃に冷却することでタンパク質分解酵素を用いることなく細胞をマイクロキャリアから剥離して回収する方法が開示されている。
【０００５】
しかしながら、特許文献１記載のマイクロキャリアは、クロロメチル化されたポリスチレンビーズを用いているが、未反応のクロロメチル基が存在するため、細胞に悪影響を与える懸念があった。また温度応答性ポリマーを固定したマイクロキャリアを用いた細胞の冷却剥離では、マイクロキャリアが培地中に懸濁して存在するため、事前に冷却した培地での培地交換が難しく、冷所で冷却する必要があるが、培地の熱容量の高さから、十分に冷却するまでに２０分を超える時間が必要であり、必ずしも低侵襲な細胞回収ができなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１３−５９３１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、温度応答性重合体ブロックを含むブロック共重合体がコートされたビーズおよびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、以上の点を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、ＨＬＢ値（グリフィン法）が７以上２０以下の範囲にある重合体ブロック、ＨＬＢ値（グリフィン法）が０以上７未満の範囲にある重合体ブロックおよび水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体ブロックを含むブロック共重合体がコートされたビーズを用いることにより、大量の細胞が培養可能であり、且つ、温度を変化させることにより細胞を低侵襲に回収することが可能であることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は以下の態様を包含する。
＜１＞  下記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のブロックを含むブロック共重合体が、ビーズにコートされていることを特徴とするブロック共重合体コートビーズ。
（Ａ）ＨＬＢ値（グリフィン法）が７．０以上２０．０以下の範囲にある重合体ブロック。
（Ｂ）ＨＬＢ値（グリフィン法）が０．０以上７．０未満の範囲にある重合体ブロック。
（Ｃ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体ブロック。
＜２＞  ビーズの直径が２０μｍ〜１０００μｍであることを特徴とする＜１＞に記載のブロック共重合体コートビーズ。
＜３＞  ビーズの材質が合成高分子材料であることを特徴とする＜１＞または＜２＞に記載のブロック共重合体コートビーズ。
＜４＞  以下の工程（１）と（２）を含む、＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のブロック共重合体コートビーズの製造方法。
（１）＜１＞に記載の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のブロックを含むブロック共重合体を含む表面処理剤を製造する工程、
（２）工程（１）で製造した表面処理剤とビーズを接触させて、ビーズにブロック共重合体をコートする工程。
＜５＞  ４０℃以上に加熱した状態でビーズにブロック共重合体をコートすることを特徴とする＜４＞に記載の製造方法。
＜６＞  減圧下でビーズにブロック共重合体をコートすることを特徴とする＜４＞に記載の製造方法。
＜７＞  ＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のブロック共重合体コートビーズを用い、＜１＞に記載の温度応答性重合体ブロックのＬＣＳＴより高い温度で細胞を前記ブロック共重合体コートビーズ上で培養し、細胞増殖後に温度をＬＣＳＴより低くして増殖細胞を前記ブロック共重合体コートビーズから剥離することを特徴とする細胞培養方法。
【発明の効果】
【０００９】
ＨＬＢ値が特定の範囲にある２種類の重合体ブロック（Ａ）および（Ｂ）と、温度応答性重合体ブロック（Ｃ）を含むブロック共重合体は、ビーズの材質や形状によらずビーズにコートすることが可能である。前述のブロック（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を含むブロック共重合体がコートされたビーズは、細胞増殖後に温度をＬＣＳＴより低くすることにより、ブロック共重合体コートがコートされたビーズ上で増殖した細胞を、ビーズから速やかに剥離することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明のブロック共重合体コートビーズに用いるブロック共重合体は、以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のブロックを含むブロック共重合体である。
（Ａ）ＨＬＢ値（グリフィン法）が７.０以上２０．０以下の範囲にある重合体ブロック。
（Ｂ）ＨＬＢ値（グリフィン法）が０．０以上７．０未満の範囲にある重合体ブロック。
（Ｃ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体ブロック。
【００１２】
以下に本発明のブロック共重合体コートビーズに用いるブロック共重合体に含まれるブロック（Ａ）、ブロック（Ｂ）およびブロック（Ｃ）の詳細を説明する。なお、「重合体」とは、「共重合体」（ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）および「単独重合体」（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ）を含む。即ち、ブロック（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の各々を構成する繰り返し単位は、それぞれ１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。
【００１３】
本明細書において、ＨＬＢ値（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  Ｂａｌａｎｃｅ：ＨＬＢ）とは、Ｗ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，  １，  ３１１（１９４９）．に記載の、水と油への親和性の程度を表す値であり、０から２０までの値を取り、０に近いほど疎水性が高く、２０に近いほど親水性が高くなる。計算式によりＨＬＢ値を算出方法として、アトラス法、グリフィン法、デイビス法、川上法があるが、本明細書においては、グリフィン法により算出した値を使用し、本発明のブロック共重合体を構成する各ブロックの繰り返し単位中の親水部の式量と繰り返し単位の総式量を元に、下記の計算式により算出した。
【００１４】
ＨＬＢ値＝２０×（繰り返し単位中の親水部の式量）÷（繰り返し単位の総式量）
前述の、各ブロックの繰り返し単位中の親水部の定義として、スルホン部（−ＳＯ３−）、ホスホノ基部（−ＰＯ３−）、カルボキシル基部（−ＣＯＯＨ）、エステル部（−ＣＯＯ−）、アミド部（−ＣＯＮＨ−）、イミド部（−ＣＯＮ−）、アルデヒド基部（−ＣＨＯ）、カルボニル基部（−ＣＯ−）、ヒドロキシル基部（−ＯＨ）、アミノ基部（−ＮＨ２）、アセチル基部（−ＣＯＣＨ３）、エチレンアミン部（−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ−）、エチレンオキシ部（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、アンモニウムイオン、ハロゲン化物イオン、酢酸イオンを例示することができる。
【００１５】
繰り返し単位中の親水部の算出では、親水部を構成する原子が、他の親水部を構成する原子として重複してはならない。繰り返し単位中のＨＬＢ値の算出例を以下に記載した。例えば、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート（分子量：１５７．１１）の場合、親水部は、エステル部が１部およびエチレンアミン部が１部であり、親水部の分子量は８６．０７であるから、ＨＬＢ値は１１．０である。ｎ−ブチルメタクリレート（分子量：１４２．２０）の場合、親水部は、エステル部が１部であり、親水部の分子量は４４．０１であるから、ＨＬＢ値は６．２である。
【００１６】
さらに、本発明のブロック共重合体を構成する各ブロックが、異なるモノマー（モノマー１、モノマー２・・・）からなる共重合体である場合は、それぞれのモノマーが重合して生成する繰り返し単位の共重合体中の比率（ｍｏｌ％）を分析し、下記の計算式で算出することができる。
【００１７】
ＨＬＢ値＝ＨＬＢ値１×比率１＋ＨＬＢ値２×比率２＋・・・・
ここで、ＨＬＢ値１はモノマー１が重合して生成する重合体のＨＬＢ値であり、組成１はモノマー１が重合して生成する繰り返し単位の共重合体中の比率（ｍｏｌ％）であり、ＨＬＢ値２はモノマー２が重合して生成する重合体のＨＬＢ値であり、組成２はモノマー２が重合して生成する繰り返し単位の共重合体中の比率（ｍｏｌ％）である。
【００１８】
ＨＬＢ値の取扱いは、小数点以下第２位を四捨五入して表示される小数点以下第１位までの数字から７以上か未満かを判断する。
【００１９】
本発明のブロック共重合体コートビーズに用いるブロック共重合体に含まれるブロック（Ａ）は、ＨＬＢ値（グリフィン法）が７．０以上２０．０以下の範囲にあるブロックであり、本発明のブロック共重合体コートビーズ上で増殖した細胞を剥離するために必要な冷却時間を短縮する点で、８．０以上２０．０以下であることが好ましい。ブロック（Ａ）を構成する繰り返し単位は、ＨＬＢ値が７．０以上２０．０以下であれば特に制限はなく、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリエチレングリコールメタクリレート、２−メトキシエチルアクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレート、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（３−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（３−メタクリロイルアミノプロピル）（４−スルホナトブチル）アミニウムまたはジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−スルホナトエチル）アミニウム、２−ジメチルアミノメチル（メタ）アクリレート、２−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチル［（メタ）アクリルアミドメチル］アミン、ジメチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミンをモノマーとして重合して生成する繰り返し単位や、２−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、３−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、ジメチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミン、ジメチル［３−（メタ）アクリルアミドプロピル］アミンをモノマーとして重合して生成する繰り返し単位と、炭素数１〜４のハロゲン化アルキル、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、１，２−ブチレンオキシド、２−クロロエチルメチルエーテルとを反応させて生成する繰り返し単位を例示することができる。これらの繰り返し単位の中では、細胞接着性を制御できる点および細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリエチレングリコールメタクリレート、２−メトキシエチルアクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレート、２−ジメチルアミノメチル（メタ）アクリレート、２−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチル［（メタ）アクリルアミドメチル］アミン、ジメチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミンをモノマーとして重合して生成する繰り返し単位であることが好ましい。また、ブロック（Ａ）はＨＬＢ値が７．０以上２０．０以下であれば、１種類の繰り返し単位から成っていてもよく、２種類以上の繰り返し単位から成っていてもよい。
【００２０】
本発明のブロック共重合体コートビーズに用いるブロック共重合体に含まれるブロック（Ｂ）は、ＨＬＢ値（グリフィン法）が０．０以上７．０未満の範囲にあるブロックであり、ビーズにコートした際に安定な膜を得る点で、０以上６以下であることが好ましい。ブロック（Ｂ）を構成する繰り返し単位は、ＨＬＢ値が０．０以上７．０未満であれば特に制限はなく、スチレン、１−ビニルナフタレン、２−ビニルナフタレン、９−ビニルアントラセン、１−ビニルピレンをモノマーとして重合して生成する繰り返し単位や、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−プロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリレート化合物をモノマーとして重合して生成する繰り返し単位を例示することができる。これらの繰り返し単位の中では、ビーズにコートした際に安定な膜を得る点で、スチレンをモノマーとして重合して生成する繰り返し単位や、ｎ−プロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリレート化合物をモノマーとして重合して生成する繰り返し単位であることが好ましい。また、ブロック（Ｂ）はＨＬＢ値が０．０以上７．０未満であれば、１種類の繰り返し単位から成っていてもよく、２種類以上の繰り返し単位から成っていてもよい。  本明細書において、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ；Ｌｏｗｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）とは、この温度よりも低い温度では高分子が水に溶解するが、この温度よりも高い温度では高分子が不溶化あるいは難溶化し、相分離する温度である。
本発明のブロック共重合体コートビーズに用いるブロック共重合体に含まれるブロック（Ｃ）は、水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体ブロックである。本発明のブロック共重合体コートビーズを用いて細胞を培養する場合、体温である３７℃付近で細胞接着性を付与すると共に、温度降下で細胞を剥離し回収するため、ブロック（Ｃ）のＬＣＳＴは１０℃〜４０℃の範囲にあることが好ましく、２０℃〜３５℃の範囲にあることがより好ましい。ＬＣＳＴが０℃未満あるいは５０℃以上では、細胞にダメージを与えるため、低侵襲な細胞剥離が困難となる。
ブロック（Ｃ）を構成する繰り返し単位は、ＬＣＳＴが０℃〜５０℃の範囲であれば特に制限はなく、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝約４４℃）、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝約３５℃）、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝約３５℃）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝約３２℃）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝約３２℃）、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（ＬＣＳＴ＝約２８℃）、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝約２８℃）、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝約２２℃）、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝約２２℃）、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ＝約２０℃）をモノマーとして重合して生成する繰り返し単位を例示することができる。これらの繰り返し単位の中では、温度降下による細胞剥離性が良好である点で、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミドをモノマーとして重合して生成する繰り返し単位であることが好ましい。また、ブロック（Ａ）はＬＣＳＴが０℃〜５０℃の範囲であれば、１種類の繰り返し単位から成っていてもよく、２種類以上の繰り返し単位から成っていてもよい。
【００２１】
本発明のブロック共重合体コートビーズに用いるブロック共重合体を構成するブロック（Ａ）、ブロック（Ｂ）およびブロック（Ｃ）の構成比は、それぞれ１ｍｏｌ％〜９０ｍｏｌ％であれば特に制限はないが、温度降下による細胞剥離性が良好である点で、ブロック（Ｃ）の比率は３０ｍｏｌ％〜９０ｍｏｌ％であることが好ましい。ブロック（Ｂ）の比率が１０ｍｏｌ％未満の場合、前記ブロック共重合体のビーズへの接着性が低下し、温度降下時にブロック共重合体が培地中に溶出する。
【００２２】
本発明のブロック共重合体コートビーズに用いるブロック共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）に特に制限はないが、３，０００〜１，０００，０００が好ましい。Ｍｎが３，０００未満の場合はビーズから溶出した際に細胞に取り込まれてしまい、細胞に悪影響を及ぼす懸念がある。Ｍｎが１，０００，０００を越える場合は溶液粘度が高くなり、ビーズへのコートが困難になる。
【００２３】
本発明のブロック共重合体コートビーズに用いるブロック共重合体を構成するブロック（Ａ）、ブロック（Ｂ）、ブロック（Ｃ）の配列順は特に制限はなく、（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）、（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）、（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）からなる、および／または含む配列を例示できる。また、前記ブロック共重合体は、各ブロック（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）を２回以上含んでいてもよく、各ブロックはランダムに配列されていてもよい。例えば、（Ａ）−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）、（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）なども許容される。これらブロック共重合体の配列順の中では、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮する点で、（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）であることが好ましい。
【００２４】
本発明のブロック共重合体コートビーズに用いるブロック共重合体を構成する各ブロックは、異なる種類のモノマーとのブロック共重合が行える点で、リビングカチオン重合やリビングアニオン重合やリビングラジカル重合などのリビング重合により製造されることが好ましい。これらのリビング重合の中では、重合反応の制御が容易である点でリビングラジカル重合を用いることが好ましく、例えば、株式会社エヌ・ティー・エス発行、“ラジカル重合ハンドブック”、ｐ．１６１〜２２５（２０１０）に記載のリビングラジカル重合技術を用いて製造することがより好ましい。リビングラジカル重合技術としては、原子移動ラジカル重合法（ＡＴＲＰ）、可逆的付加開裂連鎖移動重合法（ＲＡＦＴ）、ニトロキシドを介した重合法（ＮＭＰ）などを例示することができるが、これらの中では、汎用性が高く、細胞毒性を示す金属を使用しなくてもよい点でＲＡＦＴ重合により製造することが好ましい。
【００２５】
本発明に用いるビーズの形状は特に限定はないが、機械的強度やブロック共重合体のコート性に優れる点で、球状であることが好ましい。ビーズの直径は、ビーズ表面で細胞を培養することから、一般的な細胞よりも大きいことが好ましい。一方、ビーズの直径が大きすぎると撹拌を伴う細胞培養時にビーズが沈降することから、ビーズの直径は２０〜１０００μｍが好ましく、２０μｍ〜４００μｍであることがより好ましい。
【００２６】
本発明に用いるビーズの素材は特に制限はないが、好ましい素材としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアルキル（メタ）アクリレート、ポリアルキル（メタ）アクリルアミド、ポリエステル、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、またはそれらの共重合体の樹脂などの合成高分子、デキストラン、セルロースなどの植物由来高分子、あるいは木片やセラミックスを例示できる。ビーズの比重が培養液の比重に近く設計でき、撹拌を伴う細胞培養時にビーズの沈降を抑制できる点で、ポリスチレン、ポリアルキル（メタ）アクリレート、ポリアルキル（メタ）アクリルアミド、ポリエステル、ポリウレタンなどの合成高分子製ビーズが好ましく、ポリスチレン製ビーズがより好ましい。なおビーズの素材は１種類でもよく、２種類以上の素材を含んでいてもよい。
【００２７】
本発明のブロック共重合体コートビーズは、以下の工程（１）から（３）を含む工程からなる方法により製造することができる。
（１）本発明における（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のブロックを含むブロック共重合体を含む表面処理剤を製造する工程、
（２）工程（１）で製造した表面処理剤とビーズを接触させて、ビーズにブロック共重合体をコートする工程。
【００２８】
本発明における表面処理剤は、本発明における（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のブロックを含むブロック共重合体を含んでいれば特に制限はなく、例えば、前記ブロック共重合体を溶解することができる溶媒を含むものであってもよい。前記ブロック共重合体を溶解することができる溶媒は、ブロック共重合体をコートするビーズを溶解或いは変形させたりしない溶媒であれば特に制限はなく、ビーズがポリスチレン製の場合、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどを例示することができる。また表面処理剤中の前記ブロック共重合体の濃度に特に制限はないが、表面処理剤のコートムラの発生を低減できることから好ましくは０．０１ｗｔ％〜１０ｗｔ％、より好ましくは０．０１ｗｔ％〜１ｗｔ％である。
【００２９】
本発明におけるブロック共重合体を含む表面処理剤をビーズにコートする方法に特に制限はないが、ビーズを表面処理剤に含浸させた後、乾燥させることでコートできる含浸法を例示できる。さらに、温度応答性重合体ブロックを含むブロック共重合体は、自己組織化で特異な構造をとることが知られており、コート時の温度で構造が変化し温度応答性の発現に影響しうることから、室温変化の影響を除外し、安定な温度応答性を発現するため、コート時の温度は、４０℃以上である必要がある。
【００３０】
前記コート方法では、本発明におけるブロック共重合体のコート量の調整が容易になることから、表面処理剤中のブロック共重合体を全量コートすることが好ましい。例えば、ビーズと表面処理剤をフラスコに適量加え、ロータリーエバポレーターにフラスコをセットし、減圧しながら溶媒を除去することで、ブロック共重合体をビーズにコートする方法を例示できる。尚、ビーズの単位面積当たりにコートしたブロック共重合体の量は、下式から算出することができる。
【００３１】
単位面積当たりのブロック共重合体コート量（μｇ／ｃｍ２）＝（投入したブロック共重合体の量（μｇ）−フラスコの重量増加量（μｇ））／（ビーズの表面積（ｃｍ２／ｇ）×ビーズの重量（ｇ））
本発明におけるブロック共重合体のビーズへのコート量は特に制限はなく、例えば、０．５μｇ／ｃｍ２〜１０００μｇ／ｃｍ２を例示できる。コート量のばらつきを抑える点で、好ましくは０．５μｇ／ｃｍ２〜１００μｇ／ｃｍ２である。
【００３２】
本発明のブロック共重合体コートビーズを用いた細胞培養では、ブロック（Ｃ）のＬＣＳＴより高い温度で細胞をビーズ上で培養し、細胞増殖後に温度をブロック（Ｃ）のＬＣＳＴより低くして増殖細胞をビーズから剥離することを特徴とする。本発明のブロック共重合体ビーズを用いて細胞を培養する方法に特に制限はなく、例えば、培地が入った細胞培養用容器に本発明のブロック共重合体コートビーズを加え、細胞を播種後、静置、連続的に撹拌、あるいは一定時間攪拌或いは振盪することにより細胞を培養できる。冷却して細胞を本発明のブロック共重合体コートビーズから剥離する際の冷却方法に特に制限はなく、冷所で冷却しても良いし、冷却した培地で培地交換しても良い。また細胞を効率的に剥離するため、培養基材を軽く叩いたり、揺らしたり、あるいはピペッティングを併用しても良い。
【００３３】
本発明のブロック共重合体コートビーズを用いて培養される細胞としては、細胞を剥離するために冷却する前のブロック共重合体コートビーズ表面に接着して増殖する細胞であれば特に制限はなく、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞、ヒト肺由来線維芽細胞、ヒト皮膚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞、マウス結合組織Ｌ９２９細胞、ヒト胎児腎臓由来細胞ＨＥＫ２９３細胞、ヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞等の種々の培養細胞株や、生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン細胞、グリア細胞、線維芽細胞、生体の代謝に関与する肝実質細胞、肝非実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々の組織に存在する幹細胞、さらにはそれらから分化誘導した細胞等を例示することができる。
【実施例】
【００３４】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。
【００３５】
＜モノマー転化率およびブロック共重合体組成の解析＞
核磁気共鳴測定装置（日本電子製、商品名ＪＮＭ−ＥＣＺ４００Ｓ／Ｌ１）を用いたプロトン核磁気共鳴分光（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル分析より求めた。
【００３６】
＜ブロック共重合体の分子量、分子量分布解析＞
重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ装置は東ソー（株）製  ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣを用い、カラムは東ソー製  ＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＡＷＭ−Ｈを２本用い、カラム温度を４０℃に設定し、溶離液は１０ｍＭトリフルオロ酢酸ナトリウムを含む１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールまたは１０ｍＭ臭化リチウムを含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いて測定した。測定試料は１．０ｍｇ／ｍＬで調製して測定した。分子量の検量線は、分子量既知のポリメタクリル酸メチル（ポリマーラボラトリーズ製）を用いた。
【００３７】
実施例１
［ブロック共重合体の調製］
１００ｍＬラウンドボトムフラスコに、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート１．５７ｇ（１０ｍｍｏｌ）、４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド９１．７ｍｇ（２２３μｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１０ｍＬに溶解した。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で２４時間反応させた。反応後の２−ジメチルアミノエチルメタクリレートのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、さらにフラスコにｎ−ブチルメタクリレート５．０４ｇ（３５ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）、１，４−ジオキサン１０ｍＬを加えた。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で４８時間反応させた。反応後のｎ−ブチルメタクリレートのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、さらにフラスコにＮ−イソプロピルアクリルアミド５．１４ｇ（４５ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）、１，４−ジオキサン１０ｍＬを加えた。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で７２時間反応させた。反応後のＮ−イソプロピルアクリルアミドのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、反応液を５００ｍＬの水に滴下し、淡黄色沈殿を得た。回収した淡黄色沈殿をクロロホルム１００ｍＬに溶解し、無水硫酸マグネシウムを加え３０分撹拌した。無水硫酸マグネシウムを濾過で除き、クロロホルム溶液をロータリーエバポレーターで２０ｍＬの溶液になるまで減圧濃縮した。濃縮したクロロホルム溶液を３００ｍＬのヘキサンに滴下し、白色沈殿を得た。回収した白色沈殿を減圧乾燥することで、ブロック（Ａ）として２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体（ＨＬＢ値＝１０．９）、ブロック（Ｂ）としてｎ−ブチルメタクリレート重合体（ＨＬＢ値＝６．２）、ブロック（Ｃ）としてＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体（ＬＣＳＴ＝約３２℃）からなるブロック共重合体を調製した。
［表面処理剤の調製］
先述のブロック共重合体２０ｍｇをエタノール１９．９９８ｇに溶解し、ブロック共重合体の０．１ｗｔ％表面処理剤を調製した。
［表面処理剤のビーズへのコート］
ナス型フラスコに直径２００μｍのポリスチレンビーズ１０ｇと先述の表面処理剤２０ｇを加えた。ロータリーエバポレーターを用い、４０℃で撹拌しながら減圧することで、溶媒を完全に除去し、表面処理剤をビーズにコートした。重量測定から、コート量は５μｇ／ｃｍ２であった。
［細胞培養評価］
ＡＧＣテクノグラス製のφ３５ｍｍＩＷＡＫＩ無処理ディッシュに、先述のブロック共重合体コートビーズを５ｍｇ加え、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ロンザ社、ＰＴ−２５０１）１０＾５個を播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。培地はロンザ社ＰＴ−３００１キットを３ｍＬ用いた。培養１日後、ビーズ表面への細胞接着を確認した。培養６日後、ビーズと培地を新しいＩＷＡＫＩ無処理ディッシュに移し、１５℃で１０分間冷却したところ、細胞がビーズから剥離した。冷却剥離した細胞の数は血球計算盤で計測した。さらにビーズと培地を１５ｃｃ遠沈管に移し、遠心加速度１００Ｇの遠心機で３分処理したのち、アスピレーターで培地を除き、リン酸緩衝液で洗浄した。１ｃｃのトリプシンＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃、ＣＯ２濃度５％で５分間静置し、残りの細胞をビーズから剥離した。剥離した細胞の数は血球計算盤で計測した。ビーズに接着していた細胞の内、冷却で剥離した細胞の割合は９０％であった。
【００３８】
実施例２
［ブロック共重合体の調製］
１００ｍＬラウンドボトムフラスコに、２−ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド１．５６ｇ（１０ｍｍｏｌ）、４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド９１．７ｍｇ（２２３μｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１０ｍＬに溶解した。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で２４時間反応させた。反応後の２−ジメチルアミノエチルメタクリレートのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、さらにフラスコにｎ−ブチルメタクリレート５．０４ｇ（３５ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）、１，４−ジオキサン１０ｍＬを加えた。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で４８時間反応させた。反応後のｎ−ブチルメタクリレートのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、さらにフラスコにＮ−イソプロピルアクリルアミド５．１４ｇ（４５ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）、１，４−ジオキサン１０ｍＬを加えた。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で７２時間反応させた。反応後のＮ−イソプロピルアクリルアミドのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、反応液を５００ｍＬの水に滴下し、淡黄色沈殿を得た。回収した淡黄色沈殿をクロロホルム１００ｍＬに溶解し、無水硫酸マグネシウムを加え３０分撹拌した。無水硫酸マグネシウムを濾過で除き、クロロホルム溶液をロータリーエバポレーターで２０ｍＬの溶液になるまで減圧濃縮した。濃縮したクロロホルム溶液を３００ｍＬのヘキサンに滴下し、白色沈殿を得た。回収した白色沈殿を減圧乾燥することで、ブロック（Ａ）として２−ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド重合体（ＨＬＢ値＝１０．０）、ブロック（Ｂ）としてｎ−ブチルメタクリレート重合体（ＨＬＢ値＝６．２）、ブロック（Ｃ）としてＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体（ＬＣＳＴ＝約３２℃）からなるブロック共重合体を調製した。
［表面処理剤の調製］
上記で調製したブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１の［表面処理剤の調製］と同様の方法で表面処理剤を調製した。
［表面処理剤のビーズへのコート］
上記で調製した表面処理剤を用いたこと以外は実施例１の［表面処理剤のビーズへのコート］と同様の方法で表面処理剤をビーズにコートした。重量測定から、コート量は５μｇ／ｃｍ２であった。
［細胞培養評価］
先述のブロック共重合体コートビーズを用いたこと以外は実施例１の［細胞培養評価］と同様の方法で行った。培養１日後、ビーズ表面への細胞接着を確認した。培養６日後の評価では、ビーズに接着していた細胞の内、冷却で剥離した細胞の割合は８５％であった。
【００３９】
実施例３
［ブロック共重合体の調製］
１００ｍＬラウンドボトムフラスコに、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート１．５７ｇ（１０ｍｍｏｌ）、４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド９１．７ｍｇ（２２３μｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１０ｍＬに溶解した。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で２４時間反応させた。反応後の２−ジメチルアミノエチルメタクリレートのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、さらにフラスコにｎ−ヘキシルメタクリレート５．９６ｇ（３５ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）、１，４−ジオキサン１０ｍＬを加えた。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で４８時間反応させた。反応後のｎ−ブチルメタクリレートのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、さらにフラスコにＮ−イソプロピルアクリルアミド５．１４ｇ（４５ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）、１，４−ジオキサン１０ｍＬを加えた。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で７２時間反応させた。反応後のＮ−イソプロピルアクリルアミドのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、反応液を５００ｍＬの水に滴下し、淡黄色沈殿を得た。回収した淡黄色沈殿をクロロホルム１００ｍＬに溶解し、無水硫酸マグネシウムを加え３０分撹拌した。無水硫酸マグネシウムを濾過で除き、クロロホルム溶液をロータリーエバポレーターで２０ｍＬの溶液になるまで減圧濃縮した。濃縮したクロロホルム溶液を３００ｍＬのヘキサンに滴下し、白色沈殿を得た。回収した白色沈殿を減圧乾燥することで、ブロック（Ａ）として２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体（ＨＬＢ値＝１０．９）、ブロック（Ｂ）としてｎ−ヘキシルメタクリレート重合体（ＨＬＢ値＝５．２）、ブロック（Ｃ）としてＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体（ＬＣＳＴ＝約３２℃）からなるブロック共重合体を調製した。
［表面処理剤の調製］
上記で調製したブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１の［表面処理剤の調製］と同様の方法で表面処理剤を調製した。
［表面処理剤のビーズへのコート］
上記で調製した表面処理剤を用いたこと以外は実施例１の［表面処理剤のビーズへのコート］と同様の方法で表面処理剤をビーズにコートした。重量測定から、コート量は５μｇ／ｃｍ２であった。
［細胞培養評価］
先述のブロック共重合体コートビーズを用いたこと以外は実施例１の［細胞培養評価］と同様の方法で行った。培養１日後、ビーズ表面への細胞接着を確認した。培養６日後の評価では、ビーズに接着していた細胞の内、冷却で剥離した細胞の割合は７６％であった。
【００４０】
実施例４
［ブロック共重合体の調製］
１００ｍＬラウンドボトムフラスコに、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート１．５７ｇ（１０ｍｍｏｌ）、４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド９１．７ｍｇ（２２３μｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１０ｍＬに溶解した。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で２４時間反応させた。反応後の２−ジメチルアミノエチルメタクリレートのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、さらにフラスコにｎ−ブチルメタクリレート５．０４ｇ（３５ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）、１，４−ジオキサン１０ｍＬを加えた。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で４８時間反応させた。反応後のｎ−ブチルメタクリレートのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、さらにフラスコにＮ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド５．７２ｇ（４５ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）、１，４−ジオキサン１０ｍＬを加えた。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で７２時間反応させた。反応後のＮ，Ｎ−ジエチルアクリルアミドのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、反応液を５００ｍＬの水に滴下し、淡黄色沈殿を得た。回収した淡黄色沈殿をクロロホルム１００ｍＬに溶解し、無水硫酸マグネシウムを加え３０分撹拌した。無水硫酸マグネシウムを濾過で除き、クロロホルム溶液をロータリーエバポレーターで２０ｍＬの溶液になるまで減圧濃縮した。濃縮したクロロホルム溶液を３００ｍＬのヘキサンに滴下し、白色沈殿を得た。回収した白色沈殿を減圧乾燥することで、ブロック（Ａ）として２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体（ＨＬＢ値＝１０．９）、ブロック（Ｂ）としてｎ−ブチルメタクリレート重合体（ＨＬＢ値＝６．２）、ブロック（Ｃ）としてＮ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド重合体（ＬＣＳＴ＝約３２℃）からなるブロック共重合体を調製した。
［表面処理剤の調製］
上記で調製したブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１の［表面処理剤の調製］と同様の方法で表面処理剤を調製した。
［表面処理剤のビーズへのコート］
上記で調製した表面処理剤を用いたこと以外は実施例１の［表面処理剤のビーズへのコート］と同様の方法で表面処理剤をビーズにコートした。重量測定から、コート量は５μｇ／ｃｍ２であった。
［細胞培養評価］
先述のブロック共重合体コートビーズを用いたこと以外は実施例１の［細胞培養評価］と同様の方法で行った。培養１日後、ビーズ表面への細胞接着を確認した。培養６日後の評価では、ビーズに接着していた細胞の内、冷却で剥離した細胞の割合は７３％であった。
【００４１】
実施例５
［ブロック共重合体の調製］
１００ｍＬラウンドボトムフラスコに、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート０．９４ｇ（６ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート０．５７ｇ（４ｍｍｏｌ）４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド９１．７ｍｇ（２２３μｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１０ｍＬに溶解した。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で２４時間反応させた。反応後の２−ジメチルアミノエチルメタクリレートのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、さらにフラスコに２−ジメチルアミノエチルメタクリレート０．６３ｇ（４ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート４．４１ｇ（３１ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）、１，４−ジオキサン１０ｍＬを加えた。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で４８時間反応させた。反応後のｎ−ブチルメタクリレートのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、さらにフラスコにＮ−イソプロピルアクリルアミド５．１４ｇ（４５ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）、１，４−ジオキサン１０ｍＬを加えた。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で７２時間反応させた。反応後のＮ−イソプロピルアクリルアミドのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、反応液を５００ｍＬの水に滴下し、淡黄色沈殿を得た。回収した淡黄色沈殿をクロロホルム１００ｍＬに溶解し、無水硫酸マグネシウムを加え３０分撹拌した。無水硫酸マグネシウムを濾過で除き、クロロホルム溶液をロータリーエバポレーターで２０ｍＬの溶液になるまで減圧濃縮した。濃縮したクロロホルム溶液を３００ｍＬのヘキサンに滴下し、白色沈殿を得た。回収した白色沈殿を減圧乾燥することで、ブロック（Ａ）として２−ジメチルアミノエチルメタクリレート−ｎ−ブチルメタクリレート共重合体（モル比６／４、ＨＬＢ値＝９．０）、ブロック（Ｂ）として２−ジメチルアミノエチルメタクリレート−ｎ−ブチルメタクリレート共重合体（モル比４／３１、ＨＬＢ値＝６．７）、ブロック（Ｃ）としてＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体（ＬＣＳＴ＝約３２℃）からなるブロック共重合体を調製した。
［表面処理剤の調製］
上記で調製したブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１の［表面処理剤の調製］と同様の方法で表面処理剤を調製した。
［表面処理剤のビーズへのコート］
上記で調製した表面処理剤を用いたこと以外は実施例１の［表面処理剤のビーズへのコート］と同様の方法で表面処理剤をビーズにコートした。重量測定から、コート量は５μｇ／ｃｍ２であった。
［細胞培養評価］
先述のブロック共重合体コートビーズを用いたこと以外は実施例１の［細胞培養評価］と同様の方法で行った。培養１日後、ビーズ表面への細胞接着を確認した。培養６日後の評価では、ビーズに接着していた細胞の内、冷却で剥離した細胞の割合は７３％であった。
【００４２】
実施例６
［ブロック共重合体の調製］
実施例１と同じブロック共重合体を調製した。
［表面処理剤の調製］
実施例１と同じ表面処理剤を調製した。
［表面処理剤のビーズへのコート］
ナス型フラスコに直径３５０μｍのポリスチレンビーズ１０ｇと先述の表面処理剤２０ｇを加えた。ロータリーエバポレーターを用い、４０℃で撹拌しながら減圧することで、表面処理剤をビーズにコートした。重量測定から、コート量は９μｇ／ｃｍ２であった。
［細胞培養評価］
先述のブロック共重合体コートビーズを用いたこと以外は実施例１と同様の方法で行った。培養１日後、ビーズ表面への細胞接着を確認した。さらに冷却剥離検討の結果、ビーズに接着していた細胞の内、冷却で剥離した細胞の割合は８４％であった。
【００４３】
実施例７
［温度応答性ブロック共重合体の調製］
実施例１と同じブロック共重合体を調製した。
［表面処理剤の調製］
実施例１と同じ表面処理剤を調製した。
［表面処理剤のビーズへのコート］
ナス型フラスコに直径１００μｍのポリスチレンビーズ１０ｇと先述の表面処理剤２０ｇを加えた。ロータリーエバポレーターを用い、４０℃で撹拌しながら減圧することで、表面処理剤をビーズにコートした。重量測定から、コート量は２μｇ／ｃｍ２であった。
［細胞培養評価］
先述のブロック共重合体コートビーズを用いたこと以外は実施例１と同様の方法で行った。培養１日後、ビーズ表面への細胞接着を確認した。さらに冷却剥離検討の結果、ビーズに接着していた細胞の内、冷却で剥離した細胞の割合は７１％であった。
【００４４】
実施例８
［ブロック共重合体の調製］
実施例１と同じブロック共重合体を調製した。
［表面処理剤の調製］
実施例１と同じ表面処理剤を調製した。
［表面処理剤のビーズへのコート］
ナス型フラスコに直径２００μｍのポリメチルメタクリレートビーズ１０ｇと先述の表面処理剤２０ｇを加えた。ロータリーエバポレーターを用い、４０℃で撹拌しながら減圧することで、表面処理剤をビーズにコートした。重量測定から、コート量は５μｇ／ｃｍ２であった。
［細胞培養評価］
先述のブロック共重合体コートビーズを用いたこと以外は実施例１と同様の方法で行った。培養１日後、ビーズ表面への細胞接着を確認した。さらに冷却剥離検討の結果、ビーズに接着していた細胞の内、冷却で剥離した細胞の割合は８０％であった。
【００４５】
比較例１
［ブロック共重合体の調製］
１００ｍＬラウンドボトムフラスコに、ｎ−ブチルメタクリレート５．０４ｇ（３５ｍｍｏｌ）、４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド９１．７ｍｇ（２２３μｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１０ｍＬに溶解した。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で４８時間反応させた。反応後のｎ−ブチルメタクリレートのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、さらにフラスコにＮ−イソプロピルアクリルアミド５．１４ｇ（４５ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）、１，４−ジオキサン１０ｍＬを加えた。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で７２時間反応させた。反応後のＮ−イソプロピルアクリルアミドのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、反応液を５００ｍＬの水に滴下し、淡黄色沈殿を得た。回収した淡黄色沈殿をクロロホルム１００ｍＬに溶解し、無水硫酸マグネシウムを加え３０分撹拌した。無水硫酸マグネシウムを濾過で除き、クロロホルム溶液をロータリーエバポレーターで２０ｍＬの溶液になるまで減圧濃縮した。濃縮したクロロホルム溶液を３００ｍＬのヘキサンに滴下し、白色沈殿を得た。回収した白色沈殿を減圧乾燥することで、ブロック（Ｂ）としてｎ−ブチルメタクリレート重合体（ＨＬＢ値＝６．２）、ブロック（Ｃ）としてＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体（ＬＣＳＴ＝約３２℃）からなるブロック（Ａ）を含まないブロック共重合体を調製した。
［表面処理剤の調製］
上記で調製したブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１の［表面処理剤の調製］と同様の方法で表面処理剤を調製した。
［表面処理剤のビーズへのコート］
上記で調製した表面処理剤を用いたこと以外は実施例１の［表面処理剤のビーズへのコート］と同様の方法で表面処理剤をビーズにコートした。重量測定から、コート量は５μｇ／ｃｍ２であった。
［細胞培養評価］
先述のブロック共重合体コートビーズを用いたこと以外は実施例１と同様の方法で行った。培養１日後、ビーズ表面への細胞接着を確認した。さらに冷却剥離検討の結果、ビーズに接着していた細胞の内、冷却で剥離した細胞の割合は１０％であった。
【００４６】
比較例２
［ブロック共重合体の調製］
１００ｍＬラウンドボトムフラスコに、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート１．５７ｇ（１０ｍｍｏｌ）、４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド９１．７ｍｇ（２２３μｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１０ｍＬに溶解した。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で２４時間反応させた。反応後のｎ−ブチルメタクリレートのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、さらにフラスコにＮ−イソプロピルアクリルアミド５．１４ｇ（４５ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）、１，４−ジオキサン１０ｍＬを加えた。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で７２時間反応させた。反応後のＮ−イソプロピルアクリルアミドのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、反応液を５００ｍＬの５０℃の水に滴下し、淡黄色沈殿を得た。回収した淡黄色沈殿をクロロホルム１００ｍＬに溶解し、無水硫酸マグネシウムを加え３０分撹拌した。無水硫酸マグネシウムを濾過で除き、クロロホルム溶液をロータリーエバポレーターで２０ｍＬの溶液になるまで減圧濃縮した。濃縮したクロロホルム溶液を３００ｍＬのヘキサンに滴下し、白色沈殿を得た。回収した白色沈殿を減圧乾燥することで、ブロック（Ａ）として２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体（ＨＬＢ値＝１０．９）、ブロック（Ｃ）としてＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体（ＬＣＳＴ＝約３２℃）からなるブロック（Ｂ）を含まないブロック共重合体を調製した。
［表面処理剤の調製］
上記で調製したブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１の［表面処理剤の調製］と同様の方法で表面処理剤を調製した。
［表面処理剤のビーズへのコート］
上記で調製した表面処理剤を用いたこと以外は実施例１の［表面処理剤のビーズへのコート］と同様の方法で表面処理剤をビーズにコートした。重量測定から、コート量は５μｇ／ｃｍ２であった。
［細胞培養評価］
先述のブロック共重合体コートビーズを用いたこと以外は実施例１と同様の方法で行った。培養１日後、ビーズ表面への細胞接着は見られなかった。
【００４７】
比較例３
［ブロック共重合体の調製］
１００ｍＬラウンドボトムフラスコに、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート１．５７ｇ（１０ｍｍｏｌ）、４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド９１．７ｍｇ（２２３μｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１０ｍＬに溶解した。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で２４時間反応させた。反応後の２−ジメチルアミノエチルメタクリレートのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、さらにフラスコにｎ−ブチルメタクリレート５．０４ｇ（３５ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル３．７ｍｇ（２２μｍｏｌ）、１，４−ジオキサン１０ｍＬを加えた。アルゴンガスでバブリングを２０分行った後、フラスコに栓をし、６５℃で４８時間反応させた。反応後のｎ−ブチルメタクリレートのモノマー転化率は９９％であった。反応液を室温まで冷却後、反応液を５００ｍＬのヘキサンに滴下し、白色沈殿を得た。回収した白色沈殿を減圧乾燥することで、ブロック（Ａ）として２−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体（ＨＬＢ値＝１０．９）、ブロック（Ｂ）としてｎ−ブチルメタクリレート重合体（ＨＬＢ値＝６．２）からなるブロック共重合体を調製した。
［表面処理剤の調製］
上記で調製したブロック共重合体を用いたこと以外は実施例１の［表面処理剤の調製］と同様の方法で表面処理剤を調製した。
［表面処理剤のビーズへのコート］
上記で調製した表面処理剤を用いたこと以外は実施例１の［表面処理剤のビーズへのコート］と同様の方法で表面処理剤をビーズにコートした。重量測定から、コート量は５μｇ／ｃｍ２であった。
［細胞培養評価］
先述のブロック共重合体コートビーズを用いたこと以外は実施例１と同様の方法で行った。培養１日後、ビーズ表面への細胞接着を確認した。さらに冷却剥離検討の結果、ビーズに接着していた細胞の内、冷却で剥離した細胞の割合は１％であった。
【００４８】
【表１】
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