(57)【要約】【課題】抗血栓性材料の簡便な抗血栓性評価方法を提供することを目的とする。【解決手段】抗血栓性材料の抗血栓性評価方法であって、基材と、前記基材上に形成された前記抗血栓性材料からなる抗血栓性材料層と、を有する抗血栓性部材の、前記抗血栓性材料層表面に血液を流通させる工程（１）；前記抗血栓性材料層表面から前記血液を除去する工程（２）；及び前記抗血栓性材料層表面に、血液凝固剤を含む血液を接触させる工程（３）；を有する抗血栓性評価方法。【選択図】図１
2019122734.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗血栓性材料の抗血栓性評価方法であって、
基材と、前記基材上に形成された前記抗血栓性材料からなる抗血栓性材料層と、を有する抗血栓性部材の、前記抗血栓性材料層表面に血液を流通させる工程（１）、
前記抗血栓性材料層表面から前記血液を除去する工程（２）、及び
前記抗血栓性材料層表面に、血液凝固剤を含む血液を接触させる工程（３）、
を有する、抗血栓性評価方法。
【請求項２】
前記抗血栓性部材は、管状基材と、前記管状基材の内面上に形成された抗血栓性材料からなる抗血栓性材料層と、を有する、請求項１に記載の抗血栓性評価方法。
【請求項３】
直列に配列された複数の前記抗血栓性部材を用いる、請求項１又は２に記載の抗血栓性評価方法。
【請求項４】
前記血液凝固剤は、硫酸プロタミン及び塩化カルシウムのうちの少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗血栓性評価方法。
【請求項５】
前記基材は、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート及びポリ塩化ビニルからなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗血栓性評価方法。
【請求項６】
前記抗血栓性材料は、下記式（Ｉ）：
【化１】
2019122734.tif 000006
式中、Ｒ３は、水素原子又はメチル基を表し、Ｒ１は、炭素数１〜４のアルキレン基を表し、Ｒ２は、炭素数１〜４のアルキル基を表す；
で示されるアルコキシアルキル（メタ）アクリレート由来の構成単位を有する抗血栓性高分子化合物を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗血栓性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗血栓性材料の抗血栓性評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多孔質膜を使用した中空糸膜型人工肺（以下、単に「人工肺」とも称する）は、心臓疾患の開心術時における体外循環装置や循環補助用人工心肺装置として、一般に広く使用されている。膜型人工肺は主に中空糸膜を用い、その中空糸膜を介して血液のガス交換を行うものである。人工肺への血液の灌流方式として、中空糸膜の内側に血液を流し、中空糸膜の外側にガスを流す内部灌流方式と、逆に血液を中空糸膜の外側へ流し、ガスを中空糸膜の内側へ流す外部灌流方式とがある。
【０００３】
中空糸膜型人工肺は、中空糸膜の内表面又は外表面が血液と触れるため、血液と接触する中空糸膜の内表面又は外表面が血小板系の粘着（付着）や活性化に影響を与える虞がある。特に、中空糸膜の外表面が血液と触れる外部灌流型人工肺は、血液の流れに乱れを発生させるため、血小板系の粘着（付着）や活性化に影響を与えやすい。
【０００４】
このような課題を考慮して、アルコキシアルキル（メタ）アクリレートの血小板系の粘着や活性化の抑制・防止効果を利用して、従来、アルコキシアルキル（メタ）アクリレートを抗血栓性材料として外部灌流型人工肺用中空糸膜にコーティングに使用していた。例えば、特許文献１では、中空糸膜の外面又は外面層を、水、メタノール及びエタノールの混合溶媒にアルコキシアルキル（メタ）アクリレートを主成分としてなる高分子を溶解してなるコート液でコーティングした後、乾燥させることが記載されている。
【０００５】
近年、従来の人工呼吸管理では生命維持が難しい急性の重症呼吸不全患者に対して、体外式膜型人工肺（Ｅｘｔｒａｃｏｒｐｏｒｅａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ：ＥＣＭＯ）を適応することが有効であるとの報告がなされている。開心術時の人工肺の使用時間は５〜６時間であるのに対し、ＥＣＭＯによる平均管理日数は１０〜１４日（全身性炎症反応症候群や他の臓器不全を合併している場合には３０日程度）であることから、ＥＣＭＯに用いられる人工肺は長期間にわたる抗血栓性が求められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−１１４０５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来、人工肺に用いられる抗血栓性材料の抗血栓性を評価する方法として、評価対象である抗血栓性材料を中空糸膜の内表面又は外表面（血液流路側の表面）にコーティングした人工肺を製造し、当該人工肺に血液を長期間流通させた後で、血栓の有無を確認していた。
【０００８】
しかしながら、複数の抗血栓性材料の抗血栓性を評価する場合において、従来の評価方法は煩雑であるため、より簡便な評価方法が求められていた。
【０００９】
そこで、本発明は、抗血栓性材料の簡便な抗血栓性評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記の問題を解決すべく、鋭意研究を行った。その結果、血栓が形成される一つの要因として、抗血栓性材料の表面に血液由来の変性タンパク質（特に、血小板系の粘着性物質）等の目視できない粘着性物質が付着すること、そして、当該粘着性物質に血液凝固剤を含む血液を接触させて粘着性物質の有無を可視化することにより、上記課題を解決できることを知得し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、上記目的は、抗血栓性材料の抗血栓性評価方法であって、基材と、前記基材上に形成された前記抗血栓性材料からなる抗血栓性材料層と、を有する抗血栓性部材の、前記抗血栓性材料層表面に血液を流通させる工程（１）；前記抗血栓性材料層表面から前記血液を除去する工程（２）；及び前記抗血栓性材料層表面に、血液凝固剤を含む血液を接触させる工程（３）；を有する抗血栓性評価方法によって達成できる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、抗血栓性材料の抗血栓性を簡便に評価することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一形態に係る抗血栓性材料の抗血栓性評価方法を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態を説明するが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきものであり、以下の実施形態に限定されない。なお、本明細書中の数値範囲「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上Ｂ以下」を意味する。また、「Ａ及び／又はＢ」とは、「Ａ又はＢのいずれか一方」又は「Ａ及びＢの両方」を意味する。また、本明細書中の各種物性は、特記しない限り、後述する実施例に記載の方法により測定した値を意味する。
【００１５】
本発明の一形態は、抗血栓性材料の抗血栓性評価方法（以下、単に「評価方法」とも称する）であって、基材と、前記基材上に形成された前記抗血栓性材料からなる抗血栓性材料層と、を有する抗血栓性部材の、前記抗血栓性材料層表面に血液を流通させる工程（１）；前記抗血栓性材料層表面から前記血液を除去する工程（２）；及び前記抗血栓性材料層表面に、血液凝固剤を含む血液を接触させる工程（３）；を有する抗血栓性評価方法である。
【００１６】
以下、添付した図面を参照しながら、本発明の実施形態を説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
【００１７】
図１は、本発明の一形態に係る抗血栓性材料の抗血栓性評価方法を説明するための図である。（ａ）に示すように、本形態の評価方法で使用される抗血栓性部材１０は、基材１１と、基材１１上に形成された抗血栓性材料からなる抗血栓性材料層１２とを有する。
【００１８】
工程（１）では、（ａ）に示す抗血栓性材料層１２の表面に血液（図示せず）を流通させる。抗血栓性材料の抗血栓性が低い（血栓を生じやすい）場合、血液の流通時間が長くなるに連れて、（ｂ）に示すように抗血栓性材料層１２の表面に血液由来の変性タンパク質等の粘着性物質２０が付着する。この場合、工程（２）において、抗血栓性材料層１２の表面から血液を除去した後であっても、粘着性物質２０は抗血栓性材料層１２の表面に残存したままとなる。一方、抗血栓性材料の抗血栓性が高い（血栓を生じにくい）場合、血液の流通時間が長くなっても粘着性物質２０は抗血栓性材料層１２の表面に付着せず、（ａ）に示す状態のままとなる。なお、粘着性物質２０は目視できないため、工程（１）及び工程（２）を経た後であっても、抗血栓性材料層１２の表面に粘着性物質２０が付着しているのか（（ｂ）に示す状態であるのか）、付着していないのか（（ａ）に示す状態であるのか）を確認することはできない。つまり、工程（１）及び工程（２）を経た段階では、抗血栓性材料の抗血栓性を目視により評価することはできない。
【００１９】
その後、工程（３）において、抗血栓性材料層１２の表面に、血液凝固剤を含む血液を接触させる。血液凝固剤を含む血液は、抗血栓性材料層１２の表面で凝固し、（ｃ）に示すように凝固血液３０となる。凝固血液３０を除去すると、抗血栓性材料層１２の表面に粘着性物質２０が存在する場合、凝固血液３０の一部が粘着性物質２０の表面に付着したままとなり、血栓性付着物３０ａとして残存する。血栓性付着物３０ａは目視により確認することができるため、血栓性付着物３０ａの有無を確認することにより、抗血栓性材料層１２の表面に粘着性物質２０が付着しているか否かを間接的に確認することができる。
【００２０】
本発明者の検討によると、長期間にわたる抗血栓性が求められる系内での血栓の形成には、粘着性物質２０が抗血栓性材料層１２の表面に付着する段階と、その後、粘着性物質２０上に血栓性付着物３０ａが付着し成長して血栓が形成される段階と、の２つの段階があると推測される。この推測に基づくと、粘着性物質２０の抗血栓性材料層１２の表面への付着しやすさ（つまり、抗血栓性材料層１２の粘着性物質２０に対する親和性）が、血栓のできやすさを左右していると考えられる。本形態の評価方法では、抗血栓性材料層１２の表面に付着した目視できない粘着性物質２０に、人為的に血栓性付着物３０ａを付着させて可視化することにより、粘着性物質２０の有無を確認し、これによりさらに抗血栓性材料層１２の粘着性物質２０への親和性の高低を評価することによって、抗血栓性材料の抗血栓性を評価しているのである。
【００２１】
本形態の評価方法は、従来の人工肺を用いた評価方法と比較して、以下の３つの効果を有する。
【００２２】
第１の効果は、従来の評価方法と比べて簡便に評価できる点である。従来は、抗血栓性材料を血液流路側の表面にコーティングした人工肺を製造した後、体外循環装置を構成し、血液を長期間循環させることにより評価を行っていた。よって、複数の抗血栓性材料の抗血栓性を評価する場合、評価対象となる抗血栓性材料毎に人工肺を製造し、体外循環装置を構成する必要があり、評価には多くの時間やコストが掛かっていた。本形態の評価方法によると、基材上に抗血栓性材料からなる抗血栓性材料層を形成した抗血栓性部材を用いて評価を行う。複数の抗血栓性材料を評価する場合であっても、抗血栓性部材の製造は容易であるし、複数の抗血栓性部材を１つの体外循環装置に組み込むことも可能であるため、従来の評価方法よりも格段に簡便に評価することができる。
【００２３】
第２の効果は、長期間にわたる抗血栓性をより厳密に評価できる点である。従来の人工肺を用いた方法では、抗血栓性材料をコーティングした人工肺に血液を長期間流通させた後で、血栓の有無を目視により確認することにより抗血栓性を評価していた。この場合、血栓が形成されて初めて抗血栓性が低いということが判別できるようになるため、血栓が形成される前の段階では、抗血栓性材料の表面に粘着性物質が付着することによって血栓性付着物が付着しやすく変化していたとしても、これを感知することができなかった。本形態の評価方法によると、目視できない粘着性物質に人為的に血栓性付着物を付着させて可視化するため、血栓が形成される前の段階においても、抗血栓性を評価することができる。本形態の評価方法によると従来は長時間を要しなければ判別できなかった抗血栓性の評価がより短時間で評価できるようになったとも言えるし、従来は感知し得なかった僅かな抗血栓性の違いを判別できるようになったとも言える。
【００２４】
第３の効果は、抗血栓性材料そのものの抗血栓性をより正確に評価できる点である。血栓のできやすさは、抗血栓性材料の抗血栓性以外の要因、例えば、人工肺の形状（血液が滞留する部分があるか否か）や、抗血栓性材料の密着性（コーティングの剥がれやすさ）などにも影響される。従来の人工肺を用いた評価方法では、これらの様々な要因を加味した状態で評価を行っていたため、抗血栓性材料そのものの抗血栓性を正確に評価することが難しかった。本形態の評価方法は、形状や材質を単純化した基材上に抗血栓性材料からなる抗血栓性材料層を形成した抗血栓性部材を用いて評価を行うことができるため、形状や材質による影響を排除した状態で抗血栓性材料そのものの抗血栓性をより正確に評価することが可能となる。
【００２５】
以下、本形態の評価方法について、工程毎に説明する。
【００２６】
工程（１）
工程（１）では、基材と、前記基材上に形成された前記抗血栓性材料からなる抗血栓性材料層と、を有する抗血栓性部材の、前記抗血栓性材料層表面に血液を流通させる。これにより、評価対象である抗血栓性材料の抗血栓性が低い場合、抗血栓性材料層表面に粘着性物質が付着しうる。
【００２７】
抗血栓性部材は、基材上に抗血栓性材料層が形成されてなる。
【００２８】
基材は、評価対象である抗血栓性材料をこの上に塗布し、抗血栓性材料層を形成するために用いられる。つまり、抗血栓性材料層の支持体としての機能を有する。
【００２９】
基材の材質は、特に制限されないが、抗血栓性材料との密着性が高い材料であることが好ましい。具体的には、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル等が挙げられる。これらの材料は、１種のみが単独で用いられてもよいし、２種以上が組み合わされて用いられてもよい。
【００３０】
基材の形状は、特に制限されないが、抗血栓性に影響を与えにくい単純な形状であることが好ましい。具体的には、シート状、管状、糸状等が挙げられる。なかでも、血液を流通させるのが容易な、管状の基材であることが好ましい。
【００３１】
基材のサイズは、特に制限されないが、操作性や流通させる血液の使用量の観点から、抗血栓性材料層の表面積が好ましくは９〜２３ｃｍ２、より好ましくは１０〜２０ｃｍ２となるような基材を用いることが好ましい。また、管状基材を用いる場合は、流通させる血液の使用量や、血栓性付着物の付着状態の観察しやすさの観点から、内径が好ましくは４〜１２ｍｍ、より好ましくは６〜１０ｍｍであることが好ましい。
【００３２】
抗血栓性材料層は、評価対象である抗血栓性材料からなる。
【００３３】
抗血栓性材料は、特に制限されないが、抗血栓性高分子化合物を含むことが好ましい。抗血栓性高分子化合物としては、具体的には、下記式（Ｉ）： 
【００３４】
【化１】
2019122734.tif 000003
【００３５】
式中、Ｒ３は、水素原子又はメチル基を表し、Ｒ１は、炭素数１〜４のアルキレン基を表し、Ｒ２は、炭素数１〜４のアルキル基を表す；
で示されるアルコキシアルキル（メタ）アクリレート由来の構成単位を有する抗血栓性高分子化合物が挙げられる。上記式（Ｉ）で示される構成単位を有する化合物は、抗血栓性生体適合性（血小板の粘着／付着の抑制・防止効果、及び血小板の活性化の抑制・防止効果）、特に血小板の粘着／付着の抑制・防止効果に優れる。
【００３６】
なお、本明細書において、「（メタ）アクリレート」は「アクリレート及び／又はメタクリレート」を意味する。すなわち、「アルコキシアルキル（メタ）アクリレート」は、アルコキシアルキルアクリレートのみ、アルコキシアルキルメタクリレートのみ、ならびにアルコキシアルキルアクリレート及びアルコキシアルキルメタクリレートすべての場合を包含する。
【００３７】
上記式（Ｉ）において、Ｒ１は、炭素数１〜４のアルキレン基を表す。ここで、炭素数１〜４のアルキレン基としては、特に制限されず、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、プロピレン基の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基がある。これらのうち、エチレン基、プロピレン基が好ましく、抗血栓性及び生体適合性のさらなる向上効果を考慮すると、エチレン基が特に好ましい。Ｒ２は、炭素数１〜４のアルキル基を表す。ここで、炭素数１〜４のアルキル基としては、特に制限されず、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基の直鎖又は分岐鎖のアルキル基がある。これらのうち、メチル基、エチル基が好ましく、抗血栓性及び生体適合性のさらなる向上効果を考慮すると、メチル基が特に好ましい。Ｒ３は、水素原子又はメチル基を表す。なお、本発明に係る抗血栓性高分子化合物が２種以上のアルコキシアルキル（メタ）アクリレート由来の構成単位を有する場合には、各構成単位は、同一であってもあるいは異なるものであってもよい。
【００３８】
アルコキシアルキル（メタ）アクリレートとしては、具体的には、メトキシメチルアクリレート、メトキシエチルアクリレート、メトキシプロピルアクリレート、エトキシメチルアクリレート、エトキシエチルアクリレート、エトキシプロピルアクリレート、エトキシブチルアクリレート、プロポキシメチルアクリレート、ブトキシエチルアクリレート、メトキシブチルアクリレート、メトキシメチルメタクリレート、メトキシエチルメタクリレート、エトキシメチルメタクリレート、エトキシエチルメタクリレート、プロポキシメチルメタクリレート、ブトキシエチルメタクリレート等が挙げられる。これらのうち、抗血栓性及び生体適合性のさらなる向上効果の観点から、メトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシブチルアクリレートが好ましく、メトキシエチルアクリレート（ＭＥＡ）が特に好ましい。すなわち、本発明に係る抗血栓性高分子化合物がポリメトキシエチルアクリレート（ＰＭＥＡ）であることが好ましい。上記アルコキシアルキル（メタ）アクリレートは、単独で使用されてもあるいは２種以上を混合して使用してもよい。
【００３９】
本発明に係る抗血栓性高分子化合物は、アルコキシアルキル（メタ）アクリレート由来の構成単位を有していると好ましく、アルコキシアルキル（メタ）アクリレート由来の構成単位の１種もしくは２種以上から構成される重合体（単独重合体）であっても又は１種もしくは２種以上のアルコキシアルキル（メタ）アクリレート由来の構成単位及び当該アルコキシアルキル（メタ）アクリレートと共重合し得る１種もしくは２種以上の単量体由来の構成単位（他の構成単位）から構成される重合体（共重合体）であってもよい。なお、本発明に係る抗血栓性高分子化合物が２種以上の構成単位から構成される場合には、高分子（共重合体）の構造は特に制限されず、ランダム共重合体、交互共重合体、周期的共重合体、ブロック共重合体のいずれであってもよい。また、重合体の末端は特に制限されず、使用される原料の種類によって適宜規定されるが、通常、水素原子である。
【００４０】
ここで、本発明に係る抗血栓性高分子化合物がアルコキシアルキル（メタ）アクリレート由来の構成単位に加えて他の構成単位を有する場合の、アルコキシアルキル（メタ）アクリレートと共重合し得る単量体（共重合性単量体）としては、特に制限されない。例えば、メチルアクリレート、エチルアクリレート、プロピルアクリレート、ブチルアクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、プロピルメタクリレート、ブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ヘキシルアクリレート、ヘキシルメタクリレート、イソボルニルメタクリレート、エチレン、プロピレン、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、アミノメチルアクリレート、アミノエチルアクリレート、アミノイソプロピルアクリレート、ジアミノメチルアクリレート、ジアミノエチルアクリレート、ジアミノブチルアクリレート、メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルメタクリルアミド、アミノメチルメタクリレート、アミノエチルメタクリレート、ジアミノメチルメタクリレート、ジアミノエチルメタクリレート等が挙げられる。これらのうち、共重合性単量体としては、分子内にヒドロキシル基やカチオン性基を有しないものが好ましい。共重合体は、ランダム共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体のいずれでもよく、ラジカル重合やイオン重合、マクロマーを利用した重合等の公知の方法により合成することができる。ここで、共重合体の全構成単位中、共重合性単量体に由来する構成単位の割合は、特に制限されないが、抗血栓性及び生体適合性などを考慮すると、共重合性単量体に由来する構成単位（他の構成単位）が、共重合体の全構成単位中、０モル％を超えて５０モル％以下であることが好ましい。５０モル％を超えると、アルコキシアルキル（メタ）アクリレートによる効果が低下してしまう可能性がある。
【００４１】
ここで、抗血栓性高分子化合物の重量平均分子量は特に制限されないが、好ましくは８０，０００以上８００，０００未満であると好ましく、２００，０００を超えて８００，０００未満であるとより好ましく、２１０，０００〜６００，０００であるとさらに好ましく、２２０，０００〜５００，０００であると特に好ましく、２３０，０００〜４５０，０００であると最も好ましい。
【００４２】
本明細書において、「重量平均分子量」は、標準物質としてポリスチレンを、移動相としてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）をそれぞれ使用するゲル浸透クロマトグラフィー（Ｇｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＧＰＣ）により測定した値を採用するものとする。具体的には、分析対象となるポリマーをＴＨＦに溶解し１０ｍｇ／ｍｌの溶液を調製する。このように調製されたポリマー溶液について、株式会社島津製作所製ＧＰＣシステムＬＣ−２０にＳｈｏｄｅｘ社製ＧＰＣカラムＬＦ−８０４を取付け、移動相としてＴＨＦを流し、標準物質としてポリスチレンを用いて、分析対象となるポリマーのＧＰＣを測定する。標準ポリスチレンで較正曲線を作製した後、この曲線に基づいて分析対象となるポリマーの重量平均分子量を算出する。
【００４３】
抗血栓性高分子化合物の分子量を大きくすることによって、抗血栓性材料層に含まれる、分子量が比較的小さい高分子の含有量を低減でき、その結果、比較的分子量が小さい高分子が、血液中へ溶出することを抑制・防止するという効果も得られると推測される。したがって、抗血栓性高分子化合物の重量平均分子量が上記範囲に含まれる場合には、抗血栓性材料層（特に低分子量の高分子）の血液中への溶出をさらに有効に抑制・防止できる。また、抗血栓性及び生体適合性の点からも好ましい。また、本明細書において、「低分子量の高分子」とは、重量平均分子量が６０，０００未満の高分子を意味する。なお、重量平均分子量の測定方法は、上記の通りである。
【００４４】
上記式（Ｉ）で示されるアルコキシアルキル（メタ）アクリレート由来の構成単位を含む抗血栓性高分子化合物は、公知の方法によって製造できる。具体的には、下記式（ＩＩ）：
【００４５】
【化２】
2019122734.tif 000004
【００４６】
で示されるアルコキシアルキル（メタ）アクリレート、及び必要に応じて添加される上記アルコキシアルキル（メタ）アクリレートと共重合し得る単量体（共重合性単量体）の１種又は２種以上とを重合溶媒中で重合開始剤と共に攪拌して、単量体溶液を調製し、上記単量体溶液を加熱することにより、アルコキシアルキル（メタ）アクリレート、又はアルコキシアルキル（メタ）アクリレート及び必要に応じて添加される共重合性単量体を（共）重合させる方法が好ましく使用される。なお、上記式（ＩＩ）において、置換基Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、上記式（Ｉ）の定義と同様であるため、ここでは説明を省略する。
【００４７】
上記単量体溶液の調製で使用できる重合溶媒は、用いられる上記式（ＩＩ）のアルコキシアルキル（メタ）アクリレート及び必要に応じて添加される共重合性単量体を溶解できるものであれば特に制限されない。例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等のアルコール、ポリエチレングリコール類などの水性溶媒；トルエン、キシレン、テトラリン等の芳香族系溶媒；及びクロロホルム、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン、トリクロロベンゼン等のハロゲン系溶媒などが挙げられる。これらのうち、アルコキシアルキル（メタ）アクリレートの溶解しやすさ、上記したような重量平均分子量を有する高分子の得やすさなどを考慮すると、メタノールが好ましい。
【００４８】
単量体溶液中の単量体濃度は、特に制限されないが、濃度を比較的高く設定することによって、得られる抗血栓性高分子化合物の重量平均分子量を大きくすることができる。このため、上記したような重量平均分子量を有する高分子の得やすさなどを考慮すると、単量体溶液中の単量体濃度は、好ましくは５０質量％未満であり、より好ましくは１５質量％以上５０質量％未満である。さらに、単量体溶液中の単量体濃度は、より好ましくは２０質量％以上４８質量％以下であり、特に好ましくは２５質量％以上４５質量％以下である。なお、上記単量体濃度は、単量体を２種以上使用する場合には、これらの単量体の合計濃度を意味する。
【００４９】
重合開始剤は特に制限されず、公知のものを使用すればよい。好ましくは、重合安定性に優れる点で、ラジカル重合開始剤であり、具体的には、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩；過酸化水素、ｔ−ブチルパーオキシド、メチルエチルケトンパーオキシド等の過酸化物；アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロリド、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジスルフェートジハイドレート、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロリド、２，２’−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン）］ハイドレート、３−ヒドロキシ−１，１−ジメチルブチルパーオキシネオデカノエート、α−クミルパーオキシネオデカノエート、１，１，３，３−テトラブチルパーオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルパーオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルパーオキシネオヘプタノエート、ｔ−ブチルパーオキシピバレート、ｔ−アミルパーオキシネオデカノエート、ｔ−アミルパーオキシピバレート、ジ（２−エチルヘキシル）パーオキシジカーボネート、ジ（セカンダリーブチル）パーオキシジカーボネート、アゾビスシアノ吉草酸等のアゾ化合物が挙げられる。また、例えば、上記ラジカル重合開始剤に、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、アスコルビン酸等の還元剤を組み合わせてレドックス系開始剤として用いてもよい。重合開始剤の配合量は、単量体（アルコキシアルキル（メタ）アクリレート及び必要に応じて添加される共重合性単量体；以下、同様）の合計量に対して、０．０００１〜１モル％が好ましく、０．００１〜０．８モル％であるとより好ましく、０．０１〜０．５モル％であると特に好ましい。又は、重合開始剤の配合量は、１００質量部の単量体（複数種の単量体を用いる場合は、その全体）に対して、好ましくは０．００５〜２質量部であり、より好ましくは０．０５〜０．５質量部である。このような重合開始剤の配合量であれば、所望の重量平均分子量を有する高分子がより効率よく製造できる。
【００５０】
上記重合開始剤は、単量体及び重合溶媒とそのまま混合されてもよいが、予め他の溶媒に溶解した溶液の形態で単量体及び重合溶媒とそのまま混合されてもよい。後者の場合、他の溶媒としては、重合開始剤を溶解できるものであれば特に制限されないが、上記重合溶媒と同様の溶媒が例示できる。また、他の溶媒は、上記重合溶媒と同じであっても又は異なってもよいが、重合の制御のしやすさなどを考慮すると、上記重合溶媒と同じ溶媒であることが好ましい。また、この場合の他の溶媒における重合開始剤の濃度は、特に制限されないが、混合のしやすさなどを考慮すると、重合開始剤の添加量が、他の溶媒１００質量部に対して、好ましくは０．１〜１０質量部、より好ましくは０．１５〜５質量部、さらにより好ましくは０．２〜１．８質量部である。
【００５１】
次に、上記単量体溶液を加熱することにより、アルコキシアルキル（メタ）アクリレート又はアルコキシアルキル（メタ）アクリレート及び他の単量体を（共）重合する。ここで、重合方法は、例えば、ラジカル重合、アニオン重合、カチオン重合などの公知の重合方法が採用でき、好ましくは製造が容易なラジカル重合を使用する。
【００５２】
重合条件は、上記単量体（アルコキシアルキル（メタ）アクリレート又はアルコキシアルキル（メタ）アクリレート及び共重合性単量体）が重合できる条件であれば特に制限されない。具体的には、重合温度は、好ましくは３０〜６０℃であり、より好ましくは４０〜５５℃である。また、重合時間は、好ましくは１〜２４時間であり、好ましくは３〜１２時間である。かような条件であれば、上記したような高分子量の重合体がより効率的に製造できる。また、重合工程におけるゲル化を有効に抑制・防止すると共に、高い製造効率を達成できる。
【００５３】
また、必要に応じて、連鎖移動剤、重合速度調整剤、界面活性剤、及びその他の添加剤を、重合の際に適宜使用してもよい。
【００５４】
重合反応を行う雰囲気は特に制限されるものではなく、大気雰囲気下、窒素ガスやアルゴンガス等の不活性ガス雰囲気等で行うこともできる。また、重合反応中は、反応液を攪拌してもよい。
【００５５】
重合後の重合体は、再沈澱法、透析法、限外濾過法、抽出法など一般的な精製法により精製することができる。上記の中でも、再沈殿法による精製を行うと好ましい。このとき、再沈殿を行うために用いる貧溶媒としては、エタノールを用いると好ましい。
【００５６】
精製後の重合体は、凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥、又は加熱乾燥等、任意の方法によって乾燥することもできるが、重合体の物性に与える影響が小さいという観点から、凍結乾燥又は減圧乾燥が好ましい。
【００５７】
抗血栓性材料層を基材上に形成する方法は、特に制限されないが、一例としては、抗血栓性材料を含む塗布液を調製し、これを基材上に塗布する方法が挙げられる。
【００５８】
塗布液に含まれる溶媒は、抗血栓性材料を溶解又は分散できるものであれば特に制限されないが、例えば、水（純水、イオン交換水又は蒸留水）、メタノール、アセトンなどが挙げられる。これらの溶媒は、１種のみが単独で用いられてもよいし、２種以上が組み合わされて用いられてもよい。
【００５９】
塗布液中の抗血栓性材料の濃度は、特に制限されないが、抗血栓性材料をムラなく均一に塗布する観点から、好ましくは０．１〜５質量％であり、より好ましくは０．５〜３質量％である。
【００６０】
基材上に塗布液を塗布する方法としては、例えば、充填、ディップコート（浸漬法）等が挙げられる。塗布液を塗布した後、溶媒を乾燥させることにより、基材上に抗血栓性材料層が形成された抗血栓性部材が得られる。
【００６１】
なお、抗血栓性材料層は、基材の血液と接触する面側の全体に形成されることが好ましい。基材表面が露出した部分が存在すると、当該露出部分に粘着性物質及び血栓性付着物が付着するため、正確な評価を行うことが困難となるためである。例えば、管状基材を用いる場合は、管状基材の内面上に抗血栓性材料層を形成した抗血栓性部材を作製し、当該抗血栓性部材の中空部に血液を流通させることが好ましい。すなわち、本発明の好ましい一形態において、抗血栓性部材は、管状基材と、前記管状基材の内面上に形成された抗血栓性材料からなる抗血栓性材料層と、を有する。
【００６２】
次に、抗血栓性部材の抗血栓性材料層表面に血液を流通させる方法について説明する。
【００６３】
工程（１）において流通させる血液は、哺乳類から採取した新鮮血であることが好ましい。具体的には、ブタ新鮮血、ヒツジ新鮮血、ウシ新鮮血等が挙げられる。当該新鮮血は、ヘパリン、クエン酸ナトリウム等で抗凝固処理されたものであることが好ましい。
【００６４】
上記血液を抗血栓性部材の抗血栓性材料層表面に流通させる。ここで、本明細書において「流通」とは、抗血栓性材料層表面において血流を再現するために血液を所定の速度で流すことを意味する。この際の血液の流速は、抗血栓性材料層表面において、好ましくは１５〜７０ｍｍ／秒、より好ましくは２０〜４０ｍｍ／秒となるように調整される。また、血液を流通させる際の血液の温度は、好ましくは３０〜３９℃、より好ましくは３４〜３８℃である。なお、血液を流通させるための装置としては、遠心ポンプ、ローラーポンプ等が挙げられる。
【００６５】
血液を流通させる期間は、抗血栓性材料の抗血栓性を評価するのに必要な期間であれば特に制限されないが、好ましくは１０〜３０日間、より好ましくは１４〜２８日間である。１０日間以上であると、抗血栓性材料層表面に粘着性物質が付着するか否かを評価するのに十分な期間が確保される。一方、３０日間以下であると、実験の効率化、費用削減の観点から好ましい。
【００６６】
なお、特に管状基材の内面上に抗血栓性材料層を有する抗血栓性部材を用いる場合、１つの血液循環回路内に複数の抗血栓性部材を組み込むことが容易なため、１回の評価期間で、複数の抗血栓性材料の抗血栓性を評価することができる。すなわち、本発明の好ましい一形態によると、直列に配列された複数の前記抗血栓性部材を用いる、抗血栓性評価方法が提供される。なお、１回の評価期間で評価する抗血栓性部材は、特に制限されないが、好ましくは２以上であり、より好ましくは２〜１０であり、さらに好ましくは３〜７である。この際、各抗血栓性部材の抗血栓性材料層を構成する抗血栓性材料の種類は、互いに異なってもよいし、同じであってもよいが、より多くの種類の抗血栓性材料を短期間にスクリーニングできることから、抗血栓性材料の種類は、互いに異なることが好ましい。また、基材の種類（材質）、抗血栓材料層の厚さ、抗血栓性材料層の塗布方法等が異なる抗血栓性部材を作製し、これらの抗血栓性を評価する際にも、本評価方法は適している。
【００６７】
工程（２）
次に、工程（２）において、抗血栓性材料層表面から血液を除去する。これにより、後述の工程（３）において、血液凝固剤を含む血液と、場合によって抗血栓性材料層表面に形成されている粘着性物質と、を接触させることが可能となる。
【００６８】
血液を除去する方法は、抗血栓性材料層表面の性状を変化させない方法であれば特に制限されず、例えば、抗血栓性材料層表面を生理食塩水で洗浄する方法等が挙げられる。
【００６９】
工程（３）
次に、工程（３）において、抗血栓性材料層表面に、血液凝固剤を含む血液を接触させる。これにより、評価対象である抗血栓性材料の抗血栓性が低い場合、抗血栓性材料層表面に付着している目視できない粘着性物質に血栓性付着物が付着し、可視化される。
【００７０】
工程（３）において抗血栓性材料層に接触させる血液は、血液凝固剤を必須に含むこと以外は、工程（１）で用いた血液と同様の血液を用いることができる。より詳しくは、哺乳類から採取した新鮮血であることが好ましく、具体的には、ブタ新鮮血、ヒツジ新鮮血、ウシ新鮮血等が挙げられる。当該新鮮血は、ヘパリン、クエン酸ナトリウム等で抗凝固処理されたものであることが好ましい。この際、工程（１）で用いた血液と同一個体から採取した血液を用いることが好ましく、工程（１）で用いた血液と同一個体から採取し、かつ、同一の抗凝固処理がなされた血液を用いることがより好ましい。このような血液を用いることにより異個体の血液が混合されることによる影響を排除できる。
【００７１】
血液凝固剤は、上記血液を凝固させることが可能なものであれば、特に制限されない。具体的には、硫酸プロタミン、塩化カルシウム等が挙げられる。これらの血液凝固材は１種のみが単独で用いられてもよいし、２種以上が組み合わされて用いられてもよい。
【００７２】
工程（３）において用いられる血液凝固剤を含む血液は、抗血栓性材料層に接触させた後、所定の時間内に凝固するように調整されたものであることが好ましい。具体的には、活性化凝固時間（ＡＣＴ）が、好ましくは２２０秒以下、より好ましくは１５０〜２２０秒に調整された血液を用いる。なお、本明細書において、活性化凝固時間（ＡＣＴ）は、血液凝固計  ヘモクロン  レスポンス（アクリバ  ダイアグノスティックス社製）により測定された値を採用する。
【００７３】
抗血栓性材料層表面に粘着性物質が存在する場合は、抗血栓性材料層表面に血液凝固剤を含む血液を接触させて当該血液を凝固させることにより、粘着性物質に血栓性付着物が付着する。その後、凝固血液を洗浄等により除去することにより、粘着性物質表面に付着した血栓性付着物を目視により確認することができる。そして、血栓性付着物の有無や付着している血栓性付着物の量から、評価対象である抗血栓性材料の抗血栓性を評価することができる。
【００７４】
なお、凝固血液を抗血栓性材料層表面に接触させる方法としては、例えば、充填、ディップコート（浸漬法）等が挙げられる。接触時間は、特に制限されないが、血液凝固を十分に行わせる観点から、好ましくは３０〜１８０分間であり、より好ましくは５０〜１００分間である。また、接触させる際の血液凝固剤を含む血液の温度は、好ましくは２０〜３８℃、より好ましくは２５〜３５℃である。
【実施例】
【００７５】
以下、本発明を実施例及び比較例を用いてさらに具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されない。なお、特記しない限り、各操作は室温（２５℃）／相対湿度４０〜５０％ＲＨの条件で行われた。また、特記しない限り、「％」及び「部」は、それぞれ、「質量％」及び「質量部」を意味する。
【００７６】
＜抗血栓性高分子化合物の調製＞
［製造例１］ＭＥＡ重合体（ポリメトキシエチルアクリレート（ＰＭＥＡ））
メトキシエチルアクリレート（ＭＥＡ）１５ｇ（０．１１５ｍｏｌ）を、３０ｇのメタノールに溶解し、四口フラスコに入れ、５０℃でＮ２バブリングを１時間行い、ＭＥＡメタノール溶液を調製した。その後、２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−７０、和光純薬工業株式会社製、１０時間半減期温度：３０℃）０．０１５ｇを５ｇのメタノールに溶解した開始剤溶液を、ＭＥＡメタノール溶液に加えて重合反応液（単量体濃度：３０質量％）を調製した。重合反応液を窒素ガス雰囲気下にて５０℃で５時間攪拌した。反応後の重合反応液をエタノールに滴下し、析出した重合体を回収した。なお、回収した重合体の重量平均分子量は、３２０，０００であった。
【００７７】
［製造例２］ＭＥＡ−ＢＭＡ共重合体（ＭＥＡ：ＢＭＡ＝７５：２５（モル比））
メトキシエチルアクリレート（ＭＥＡ）３０ｇ（０．２３ｍｏｌ）及びブチルメタクリレート（ＢＭＡ）１０ｇ（０．０７ｍｏｌ）を、７５ｇのメタノールに溶解し、四口フラスコに入れ、５０℃でＮ２バブリングを１時間行い、ＭＥＡ及びＢＭＡを含むメタノール溶液を調製した。その後、２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−７０、和光純薬工業株式会社製、１０時間半減期温度：３０℃）０．０４ｇを５ｇのメタノールに溶解した開始剤溶液を、ＭＥＡ及びＢＭＡを含むメタノール溶液に加えて重合反応液（単量体濃度：３０質量％）を調製した。重合反応液を窒素ガス雰囲気下にて５０℃で５時間攪拌した。反応後の重合反応液をエタノールに滴下し、析出した重合体を回収した。なお、回収した重合体の重量平均分子量は、２８０，０００であった。
【００７８】
［製造例３］ＭＥＡ−ＩＢＭＡ共重合体（ＭＥＡ：ＩＢＭＡ＝９０：１０（モル比））
メトキシエチルアクリレート（ＭＥＡ）２５ｇ（０．１９ｍｏｌ）及びイソボルニルメタクリレート（ＩＢＭＡ）５ｇ（０．０２ｍｏｌ）を、６５ｇのトルエンに溶解し、四口フラスコに入れ、５０℃でＮ２バブリングを１時間行い、ＭＥＡ及びＩＢＭＡを含むトルエン溶液を調製した。その後、２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−７０、和光純薬工業株式会社製、１０時間半減期温度：３０℃）０．０３ｇを５ｇのトルエンに溶解した開始剤溶液を、ＭＥＡ及びＩＢＭＡを含むメタノール溶液に加えて重合反応液（重合反応液の単量体含量：３０重量％）を調製した。重合反応液を窒素ガス雰囲気下にて５０℃で５時間攪拌した。反応後の重合反応液をエタノールに滴下し、析出した重合体を回収した。なお、回収した重合体の重量平均分子量は、２７０，０００であった。
【００７９】
［製造例４］ＭＥＡ−ＩＢＭＡ共重合体（ＭＥＡ：ＩＢＭＡ＝７５：２５（モル比））
メトキシエチルアクリレート（ＭＥＡ）１８ｇ（０．１４ｍｏｌ）及びイソボルニルメタクリレート（ＩＢＭＡ）１０ｇ（０．０４ｍｏｌ）を、６５ｇのトルエンに溶解し、四口フラスコに入れ、５０℃でＮ２バブリングを１時間行い、ＭＥＡ及びＩＢＭＡを含むトルエン溶液を調製した。その後、２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−７０、和光純薬工業株式会社製、１０時間半減期温度：３０℃）０．０３ｇを５ｇのトルエンに溶解した開始剤溶液を、ＭＥＡ及びＩＢＭＡを含むメタノール溶液に加えて重合反応液（重合反応液の単量体含量：３０重量％）を調製した。重合反応液を窒素ガス雰囲気下にて５０℃で５時間攪拌した。反応後の重合反応液をエタノールに滴下し、析出した重合体を回収した。なお、回収した重合体の重量平均分子量は、２４０，０００であった。
【００８０】
＜抗血栓性部材の作製＞
製造例１〜４で得た重合体（抗血栓性高分子化合物）を０．５ｇ秤量し、各々をガラス製サンプル瓶に入れ、メタノールを加えて５０ｇとし、１質量％重合体溶液を調製した。内径９．５ｍｍ、長さ６ｃｍの管状のポリカーボネート製ストレートコネクター（基材）を重合体溶液中に１０秒間ディップしたのち、引上げ、室温で２４時間以上乾燥させることにより、抗血栓性部材１〜４をそれぞれ作製した。また、重合体（抗血栓性高分子化合物）をコートしていない基材をブランクとした。
【００８１】
＜血栓付着性試験（血液循環前）＞
ヘパリン抗凝固ブタ新鮮血に硫酸プロタミンを添加し、活性化凝固時間（ＡＣＴ）を２００秒未満に調整した。当該血液を抗血栓性部材１〜４の中空部にそれぞれ充填し、６０分間静置した。中空部の凝固血液を生理食塩水で洗浄し、抗血栓性部材の内表面における血栓性付着物の有無を観察した。目視にて点状、線状又は塊状の血栓が確認できた場合は、血栓付着有り（×）とし、確認できなかった場合を血栓付着無し（○）とした。また、重合体（抗血栓性高分子化合物）をコートしていない基材のみをブランクとして、同様に血栓付着性試験を行った。結果を下記表１に示す。
【００８２】
＜血栓付着性試験（本発明の抗血栓性評価方法）＞
抗血栓性部材１〜４を血液循環回路内に直列に配置し、１４日間又は２８日間、中空部に同一個体から採取したヘパリン抗凝固ブタ新鮮血（３７℃）を３３ｍｍ／秒の速度で循環させた（工程（１））。その後、抗血栓性部材１〜４を取り出し、中空部を生理食塩水で洗浄した（工程（２））。一方で同一個体から採取したヘパリン抗凝固ブタ新鮮血に硫酸プロタミンを添加し、活性化凝固時間（ＡＣＴ）を２００秒未満に調整した。当該血液（２５℃）を洗浄後の抗血栓性部材１〜４の中空部にそれぞれ充填し、６０分間静置した。中空部の凝固血液を生理食塩水で洗浄し、抗血栓性部材の内表面における血栓性付着物の有無を観察した。目視にて点状、線状又は塊状の血栓が確認できた場合は、血栓付着有り（×）とし、確認できなかった場合を血栓付着無し（○）とした。また、重合体（抗血栓性高分子化合物）をコートしていない基材のみをブランクとして、同様に血栓付着性試験を行った。結果を下記表１に示す。
【００８３】
【表１】
2019122734.tif 000005
【００８４】
表１の結果より、本発明の抗血栓性評価方法によると、抗血栓性材料層表面に血液を長期間流通させることにより生じる、粘着性物質の有無を、血栓性付着物の有無により評価することができることが示された。粘着性物質が付着しにくい抗血栓性材料は、粘着性物質との親和性が低いと考えられることから、当該抗血栓性材料は抗血栓性に優れると判断される。
【符号の説明】
【００８５】
１０  抗血栓性部材、
１１  基材、
１２  抗血栓性材料層、
２０  粘着性物質、
３０  凝固血液、
３０ａ  血栓性付着物。
【図１】
2019122734.tif 000007