(57)【要約】【課題】グルコースからミオ−イノシトールを製造することができる形質転換枯草菌および当該形質転換枯草菌を用いたミオ−イノシトールの製造方法を提供すること。【解決手段】ミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子を保有し、ｐｂｕＥ遺伝子を欠損する、形質転換枯草菌が開示される。ミオ−イノシトールの製造方法が開示され、この方法は、グルコースを含有する培地において、上記形質転換枯草菌を培養する工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子を保有し、かつｐｂｕＥ遺伝子を欠損する、形質転換枯草菌。
【請求項２】
さらに、ミオ−イノシトール−２−デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を欠損する、請求項１に記載の形質転換枯草菌。
【請求項３】
さらに、さらに、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ、シロイノソースイソメラーゼ、ミオ−イノシトール−２−デヒドロゲナーゼ、イノシトール代謝系遺伝子群のリプレッサータンパク質、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素、２−デオキシ−５−ケトグルコン酸イソメラーゼ、２−デオキシ−５−ケトグルコン酸キナーゼ、３，５／４トリヒドロキシ−１，２−ジオン加水分解酵素、および２−デオキシ−５−ケトグルコン酸−６−リン酸アルドラーゼからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を欠損する、請求項１または２に記載の形質転換枯草菌。
【請求項４】
ミオ−イノシトールの製造方法であって、
グルコースを含有する培地において、請求項１から３のいずれかに記載の形質転換枯草菌を培養する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミオ−イノシトールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イノシトールは、シクロヘキサンの各炭素上の水素原子が１つずつヒドロキシ基に置き換わった構造（１，２，３，４，５，６−シクロヘキサンヘキサオール）を持つ、シクリトールの１種である。ヒドロキシ基の結合方向の違いによって、９種類の立体異性体があり、ミオ−イノシトール（myo-inositol：ＭＩ）、Ｄ−キロ−イノシトール（D-chiro-inositol：ＤＣＩ）およびシロ−イノシトール（scyllo-inositol：ＳＩ）などが含まれる。
【０００３】
ミオ−イノシトールは、水溶性ビタミン様作用物質であり、ヒト体内で生合成され、広く動植物中に存在し、通常、食品を通じて接種される。ミオ−イノシトールには、例えば、コレステロール低下作用、脂質代謝作用、パニック症候群の治療効果や、体内時計の調整機能が期待されている。ミオ−イノシトールは、医薬品の添加剤、食品およびその添加剤（健康食品、サプリメントを含む）、化粧品等の成分として利用されている。特に高脂血症の予防または治療への利用が期待されている。Ｄ−キロ−イノシトールは、血糖値を調節するインスリンに似た機能があり、また、糖尿病や多嚢胞性卵巣症候群の治療物質として着目されている。シロ−イノシトールは、アルツハイマー病の治療薬、家畜のタンパク質凝集性疾患（例えばプリオン病）予防のための飼料、生理活性物質の合成原料、液晶化合物の合成原料としての用途が期待されている。
【０００４】
例えば、枯草菌（バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis））において、ミオ−イノシトール、Ｄ−キロ−イノシトールおよびシロ−イノシトールの間の変換反応経路が知られている（特許文献１ならびに非特許文献１および２）。よって、ミオ−イノシトールはそれ自体が有用な物質であるだけでなく、Ｄ−キロ−イノシトールおよびシロ−イノシトールの製造のための原料ともなる。
【０００５】
枯草菌を利用したミオ−イノシトールからのシロ−イノシトールの製造に関して、種々の方法が記載されている（特許文献１ならびに非特許文献１および２）。
【０００６】
他方、ミオ−イノシトールは、グルコースからグルコース−６−リン酸およびミオ−イノシトール−１−リン酸を経て、酵素媒介反応にて生産される。
【０００７】
枯草菌等の原核微生物の多くは、上記生産反応系に関与する酵素の１つであるミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素を有しておらず、このような微生物を用いてグルコースからこれらのイノシトールを生産することが困難である。このため、原核微生物について、遺伝子組換えにより、グルコースからイノシトールの生産を可能にする微生物を作出する試みがなされている。例えば、ミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノホスファターゼ遺伝子、ミオ−イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を保有するよう形質転換した大腸菌によって、グルコースからシロ−イノシトールを生産したこと（特許文献２）；ならびにミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素遺伝子およびイノシトールモノホスファターゼ遺伝子を保有するよう形質転換した大腸菌によって、グルコースからミオ−イノシトールを生産したこと（特許文献３）ことが報告されている。
【０００８】
しかし、枯草菌において、グルコースからミオ−イノシトールを生産した例は未だ報告されておらず、新たな生産反応系の構築が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０５０２３１号
【特許文献２】国際公開第２０１３／１１５０１２号
【特許文献３】特開２０１４−１７６３９０号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Microbial Cell Factories 2013, 12:124
【非特許文献２】Microbial Cell Factories 2017, 16:67
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、グルコースからミオ−イノシトールを製造することができる形質転換枯草菌および当該形質転換枯草菌を用いたミオ−イノシトールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子を保有し、かつｐｂｕＥ遺伝子を欠損する、形質転換枯草菌を提供する。
【００１３】
１つの実施形態では、上記枯草菌は、さらに、ミオ−イノシトール−２−デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を欠損する。
【００１４】
さらなる実施形態では、上記枯草菌は、さらに、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ、シロイノソースイソメラーゼ、ミオ−イノシトール−２−デヒドロゲナーゼ、イノシトール代謝系遺伝子群のリプレッサータンパク質、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素、２−デオキシ−５−ケトグルコン酸イソメラーゼ、２−デオキシ−５−ケトグルコン酸キナーゼ、３，５／４トリヒドロキシ−１，２−ジオン加水分解酵素、および２−デオキシ−５−ケトグルコン酸−６−リン酸アルドラーゼからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を欠損する。
【００１５】
本発明は、ミオ−イノシトールの製造方法であって、この方法は、
グルコースを含有する培地において、上記形質転換枯草菌を培養する工程を含む。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、枯草菌を用いて、グルコースからミオ−イノシトールを製造することができる。これにより、ミオ−イノシトールを生産するための新たな反応系が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ａｍｙ：：ＰｒｐｓＯ−ｉｎｏ１ΔｉｏｌＧ（上）およびａｍｙ：：ＰｒｐｓＯ−ｉｎｏ１ΔｉｏｌＧΔｐｂｕＥ（中）の形質転換枯草菌細胞をそれぞれ１２０時間培養した後の培地のＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトグラムである。
【図２】ａｍｙ：：ＰｒｐｓＯ−ｉｎｏ１ΔｉｏｌＧΔｐｂｕＥの形質転換枯草菌細胞を１２０時間培養した期間におけるミオ−イノシトールの生産量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子を保有し、かつｐｂｕＥ遺伝子を欠損する、形質転換枯草菌を提供する。本明細書においては、「枯草菌」を枯草菌細胞ともいう。
【００１９】
本明細書において、枯草菌細胞に関して「遺伝子を保有する」とは、その遺伝子を細胞が含み、かつ当該遺伝子がコードするタンパク質を発現する能力を発揮し得る状態にあることをいう。例えば、その遺伝子が存在しない野生型の細胞に、当該遺伝子を導入することにより、「遺伝子を保有する」形質転換細胞を作製することができる。「遺伝子を保有する」形質転換細胞とは、元の細胞が既に有する遺伝子の発現量を増大させるように改変することもさらに包含し得る。
【００２０】
本明細書において、枯草菌細胞に関して「遺伝子を欠損する」とは、対象の遺伝子が欠失されている、該遺伝子に変異が導入されている、または該遺伝子が破壊されていることのいずれをも包含する。細胞が「遺伝子を欠損する」ことにより、例えば、遺伝子を欠損していない細胞（例えば、野生型細胞）と比べて、対象遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が低下もしくは消失する、タンパク質の量が低減する、またはタンパク質が発現されない。例えば、このような遺伝子の欠損は、天然に生じたものであってもよいし、人為的に改変されたものであってもよい。人為的な改変により形質転換細胞を作製し得る。
【００２１】
グルコースからのミオ−イノシトールの生産における反応経路を以下に示す。以下の三段階の反応が存在する：
（１）グルコース等の糖を基質とするホスホトランスフェラーゼ（例えば、グルコースホスホトランスフェラーゼ）の媒介により、グルコースからグルコース−６−リン酸に変換され；
（２）ミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素の媒介により、グルコース−６−リン酸からミオ−イノシトール−１−リン酸に変換され；そして
（３）イノシトールモノホスファターゼの媒介により、ミオ−イノシトール−１−リン酸からミオ−イノシトールに変換される。
【００２２】
【化１】
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【００２３】
本発明の枯草菌は、ミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子を保有する。枯草菌は野生型細胞では通常、ミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子を保有していない。ミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子を保有するように、当該遺伝子を枯草菌に導入し得る。なお、枯草菌は上記（１）の反応系は元来備えている。枯草菌は、上記（３）のイノシトールモノホスファターゼについて、内在性遺伝子（例えば、ｙｋｔＣ（別名「ｓｕｈＢ」）（配列情報として、SWISS-PROT:Q45499、KEGG：BSU14670またはNCBI-GeneID：935986、NCBI-ProteinID：NP_389350）を保有し得る。
【００２４】
ミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子は、枯草菌で実質的にミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素活性を発現し得る限り、任意の遺伝子が用いられ得る。例えば、結核菌（Mycobacterium tuberculosis UT205）由来の遺伝子ｉｎｏ１を用いることができ、その配列等の情報は、KEGG：UDA_0046c（データベースhttp://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?mtd:UDA_0046c）またはNCBI-ProteinID：CCE35588より入手可能である。さらに、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae（strain ATCC 204508/S288c））由来の遺伝子ＩＮＯ１（配列情報として、UniProtKB：P11986）およびアルファルファ根粒菌（Sinorhizobium meliloti（strain SM11））由来の遺伝子SM11_pD1362（配列情報として、UniProtKB：F7XIG1）などもまた用いられ得る。なお、ミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素は、「イノシトール−３−リン酸合成酵素」とも称され得る。ミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子は、上記以外の他の生物に由来するものであっても、または人工的に合成したものであってもよい。
【００２５】
形質転換細胞内で実質的なイノシトール−１−リン酸合成酵素活性を発現できるものであれば、ミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子は、自然界で発生し得る変異または人工的に導入された変異、あるいは人工的な改変を有していてもよい。
【００２６】
１つの実施形態として、イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子によりコードされるタンパク質は、イノシトール−１−リン酸合成酵素活性を有する限り、天然のアミノ酸配列（例えば、上記公開されたアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸配列）において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる変異タンパク質であってもよく、この遺伝子は、そのような変異タンパク質をコードするものであってもよい。そのようなアミノ酸の変異（例えば、欠失、置換もしくは付加）は、いずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、１または数個であるが、その所望の機能または効果を実質的に有する限り特に限定されず、そのタンパク質の大きさにも依存し得る。変異の総数は、例えば、１個以上１０個以下、１個以上５個以下、１個以上４個以下、１個以上３個以下、または１個以上２個以下であるが、これらに限定されない。また、変異の総数は、例えば、以下に説明する配列同一性を満たす範囲内であり得る。
【００２７】
他の実施形態としては、イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子は、上記天然のアミノ酸配列と、例えば、ＢＬＡＳＴ（J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)）やＦＡＳＴＡ（Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)）等の解析ソフトを用いて計算したときに、例えば、７４％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有し、かつイノシトール−１−リン酸合成酵素を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
【００２８】
さらに他の実施形態として、イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子は、本明細書に記載されるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを含むものでもよい。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、公開されたデータベースに記載の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部のＤＮＡ断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。より具体的には、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌの存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）の中、６５℃でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡが挙げられる。ハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rd Ed,, Cold Spring Harbor Laboratory（2001）に記載されている方法などの周知の方法で行うことができる。温度が高いほど、または塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり、より相同性（配列同一性）の高いポリヌクレオチドを単離できる。
【００２９】
さらに他の実施形態として、イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子は、本明細書に記載されるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列と、上記解析ソフトを用いて計算したときに、例えば、７０％以上、７５％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつイノシトール−１−リン酸合成酵素活性を実質的に有するタンパク質をコードするものであってもよい。
【００３０】
さらに他の実施形態として、イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子は、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって変更された塩基配列を有する遺伝子も包含する。所定のアミノ酸配列（例えば、上記公開されたアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸配列）をコードする遺伝子の塩基配列は、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって、タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく、所定のアミノ酸配列をコードする塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の塩基に置換することもできる。遺伝子は、宿主のコドン頻度を考慮して最適化した配列に基づいて、人工的に合成して得ることもできる。例えば、以下の実施例で使用した配列番号２の塩基配列（３９位〜１１４５位；コードされるアミノ酸配列を配列番号３に示す）は、結核菌由来イノシトール−１−リン酸合成酵素遺伝子ｉｎｏ１を枯草菌のコドン頻度を考慮して最適化した配列である。
【００３１】
このような遺伝子は、例えば、開示されるまたは公知の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、各種生物から抽出したＤＮＡ、各種ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリー等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、上記ライブラリーなどに由来する核酸を鋳型とし、本発明で発現または発現しようとする酵素をコードする遺伝子の一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいは遺伝子は、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
【００３２】
また、遺伝子は、例えば、開示されるまたは公知のアミノ酸の配列をコードするＤＮＡを、慣用の突然変異誘発法、部位特異的変異法、エラープローンＰＣＲを用いた分子進化的手法等によって改変することによって取得することができる。このような手法としては、Kunkel法または Gapped duplex法等の公知手法またはこれに準ずる方法が挙げられ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K（タカラバイオ株式会社製）やMutant-G（タカラバイオ株式会社製）)などを用いて、あるいは、タカラバイオ株式会社のLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットを用いて変異が導入される。
【００３３】
イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子を含む発現カセットを構築し得る。この発現カセットにおいては、イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子の上流（当該遺伝子の５’領域）にプロモーターが作動可能に連結され得る。プロモーターとしては、枯草菌で機能する任意のプロモーターが用いられ得る。例えば、ｒｐｓＯのプロモーター（配列番号２の塩基配列の１〜３８位）、ｙｂｆＫのプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。発現カセットにおいて、イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子の下流（当該遺伝子の３’領域）に、さらにターミネーターが作動可能に連結され得る。ターミネーターとしては、枯草菌で機能する任意のターミネーター（例えば、ｔｕｆＡターミネーター（配列番号２の塩基配列の１１４６位〜１２１９位））が用いられ得る。さらに、発現カセットには、形質転換細胞の選択を可能とするマーカー遺伝子（例えば、下述するような薬剤耐性遺伝子）を適当な配置で含めることができる。発現カセットは、枯草菌への導入のために、染色体の任意の位置に挿入される形態であっても、あるいは染色体とは独立に複製維持されるベクター（例えば、プラスミドベクター）に組み込んでもよい。
【００３４】
遺伝子またはＤＮＡの合成および連結（結合）は、当業者が通常用い得る技術で行われ得る。各構成要素の結合については、例えば、ＰＣＲ法により適当な制限酵素の認識配列を付与された各構成要素のＤＮＡをその制限酵素で切断し、リガーゼなどを用いて連結することができる。
【００３５】
上記発現カセットの枯草菌の細胞への導入のために、例えば、相同組み換え法、ファージ・トランスダクション法などが用いられる。相同組換え法では、例えば、薬剤耐性遺伝子（例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子など）を含む発現カセットを導入した後、相当する薬剤で選抜し、生存する細胞を得る方法である。枯草菌細胞への導入後、発現カセットは、染色体の任意の位置に挿入されていても、あるいは染色体とは独立に複製維持されるベクター（例えば、プラスミドベクター）にあってもよく、例えば、望むべき部分に発現カセットが挿入されたことをＰＣＲなどの機器を用いて確認することによって、目的の細胞を得ることができる。
【００３６】
発現カセットを挿入する宿主としての枯草菌細胞は、野生型細胞（本来、イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードする遺伝子を保有していない枯草菌細胞）が用いられ得る。あるいは、栄養要求性変異株、薬剤耐性変異株であってもよく、変異に関する各種マーカー遺伝子を有するように既に形質転換されていてもよい。さらに、下述するような「遺伝子を欠損する」細胞を宿主に用いてもよい。
【００３７】
本発明の枯草菌は、ｐｂｕＥ遺伝子を欠損する。ｐｂｕＥ遺伝子は、枯草菌においてプリンヌクレオシドの細胞外排出を担う機能を有するものとして命名されたタンパク質ＰｂｕＢ（Purine Efflux Pump）をコードする（配列情報として、KEGG：BSU05800またはNCBI-GeneID：937996、NCBI-ProteinID：NP_388461）。上記（２）の反応経路において、イノシトール−１−リン酸合成酵素活性はＮＡＤ＋／ＮＡＤＨに依存し、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨはプリンヌクレオシドの派生物である。
【００３８】
遺伝子欠損の手段として、例えば、遺伝子の人為的な欠失（削除）、変異の導入、または破壊もしくは不活性化が挙げられる。そのための遺伝子操作として、例えば、ファージ・トランスダクション法、相同組み換え法、プラスミドベクター挿入法などが利用され得る。プラスミドベクター挿入法（環状のプラスミドＤＮＡが１箇所の相同組み換えにより染色体ＤＮＡの特定箇所に挿入される）を用いた枯草菌における標的遺伝子の不活性化は、例えば、Microbiology 1998，144：3097-3104に記載された方法に準じて行われ得る。相同組み換えによる目的遺伝子の削除は、例えば、Genes Genet. Syst. 2009，84:315-318に記載された方法に準じて行われ得る。相同組み換えを利用した方法として、遺伝子破壊のために遺伝子ノックアウトや、変異の導入のために遺伝子ノックインなども用いられ得る。相同組み換えにより取り込ませるＤＮＡ断片に予め薬剤耐性遺伝子を含ませることにより、相当する薬剤で生存細胞を選抜することで、相同組み換えが生じた形質転換細胞を得ることができる。さらに、例えば、相同組み換えの目的領域の配列をＰＣＲなどの機器を用いて確認することによっても、目的の形質転換細胞を得ることができる。
【００３９】
１つの実施形態では、本発明の枯草菌は、さらにミオ−イノシトール−２−デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を欠損する。ミオ−イノシトール−２−デヒドロゲナーゼは、イノシトール代謝系遺伝子群（ｉｏｌ群）の１つ、ｉｏｌＧ遺伝子によりコードされるミオ−イノシトール代謝の初発酵素である。ミオ−イノシトール−２−デヒドロゲナーゼは、ミオ−イノシトール（ＭＩ）を、ＮＡＤ＋依存の反応により、２−ケト−ミオ−イノシトール（2-keto-myo-inositol：２ＫＭＩ）（「シロ−イノソース」とも称する）に変換する。またミオ−イノシトール−２−デヒドロゲナーゼは、Ｄ−キロ−イノシトール（D-chiro-inositol：ＤＣＩ）を１−ケト−Ｄ−キロ−イノシトール（1-keto-D-chiro-inositol：１ＫＤＣＩ）へ変換する反応も触媒する。
【００４０】
別の実施形態では、本発明の枯草菌は、さらに、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ（ｉｏｌＥ）、シロイノソースイソメラーゼ（ｉｏｌＩ）、ミオ−イノシトール−２−デヒドロゲナーゼ（ｉｏｌＸ）、イノシトール代謝系遺伝子群のリプレッサータンパク質（ｉｏｌＲ）、メチルマロン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ｉｏｌＡ）、２−デオキシ−５−ケトグルコン酸イソメラーゼ（ｉｏｌＢ）、２−デオキシ−５−ケトグルコン酸キナーゼ（ｉｏｌＣ）、３，５／４トリヒドロキシ−１，２−ジオン加水分解酵素（ｉｏｌＤ）および２−デオキシ−５−ケトグルコン酸−６−リン酸アルドラーゼ（ｉｏｌＪ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を欠損する。上記の酵素またはタンパク質は、ｉｏｌＧ遺伝子と同様、イノシトール代謝系遺伝子群（ｉｏｌ群）の遺伝子によりコードされ、代謝系に関与する。本発明の枯草菌は、上記のタンパク質の少なくとも１つ、好ましくは２つ以上、より好ましくは全部のタンパク質をコードする遺伝子を欠損する。本発明の枯草菌は、さらに、イノシトールトランスポーター（ｉｏｌＦ）、機能未同定のイノシトール代謝関連酵素（ｉｏｌＨ）などをコードする遺伝子も欠損していてもよい。上記の全部のタンパク質をコードする遺伝子を欠損する枯草菌は、例えば、非特許文献１に記載された枯草菌ＭＹＩ０４である。ＭＹＩ０４は、ｉｏｌＡＢＣＤＥＦＨＩＪのオペロン、ｉｏｌＸおよびｉｏｌＲを欠損する（非特許文献１）。
【００４１】
本発明の枯草菌は、上記ｉｏｌ群遺伝子について、好ましくは、少なくともｉｏｌＧを欠損する。
【００４２】
本発明はさらに、ミオ−イノシトールの製造方法を提供する。ミオ−イノシトールの製造方法は、グルコースを含有する培地において、本発明の形質転換枯草菌を培養する工程を含む。この製造方法は、培養工程で得られた培養ろ液から枯草菌細胞を除去する工程と、当該細胞を除去した培養ろ液からミオ−イノシトールを単離する工程もまた含み得る。
【００４３】
「グルコースを含有する培地」とは、グルコース以外の糖を含有する培地であってもよい。例えば、本発明の形質転換枯草菌の培養の間に、グルコースを構成糖とする分子量がより大きな多糖が酵素等により分解されて生じたグルコースを含有するものであってもよい。
【００４４】
培地は、グルコースを含有する以外は、組成は、特に制限はない。原料であるグルコースに加えて、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含有する培地であればよく、合成培地または天然培地のいずれも使用できる。培養液（液体培地）が好ましい。
【００４５】
培地は、例えば、以下のように配合されたものが用いられ得る（配合量の「％」はいずれも「％（ｗ／ｖ）」である）：グルコースを０．１％〜４０％、好ましくは、１％〜３０％、より好ましくは、１％〜１０％；炭素源の全体量を０．１％〜２０％、好ましくは、０．３％〜５％；および窒素源の全体量を０．０１％〜５％、好ましくは、０．５％〜２％。炭素源として、例えば、リンゴ酸、グリセロール、シュークロース、マルトース、澱粉などの少なくとも１つが用いられ得る。窒素源としては、ソイトン、カザミノ酸、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムあるいは尿素等などの少なくとも１つが用いられ得る。
【００４６】
その他、必要に応じて、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン、モリブデンイオン、リン酸イオン、硫酸イオンなどのイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加してもよい。無機塩類の添加量は、当業者が任意に決定することができる。
【００４７】
培養液中の水素イオン濃度は特に調整する必要はないが、好ましくは、ｐＨ５〜１０、より好ましくは、ｐＨ６〜９である。
【００４８】
培養条件として、培養温度は、例えば、１２℃〜４５℃、好ましくは、１５℃〜３７℃であり、培養は好気培養であり得、例えば、培養液を振とうしたり、培養液に空気あるいは酸素ガスを吹き込むなどし得る。培養期間は、ミオ−イノシトールが最大または、必要量の蓄積量を示すまで行えばよく、例えば、１〜７日、好ましくは、１〜５日である。
【００４９】
培養後の培養液には、枯草菌細胞およびミオ−イノシトールが含まれる。例えば、培養液からミオ−イノシトールを採取する方法は、通常の水溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用することができる。すなわち、培養液から菌体を除去した後、培養上清液を活性炭やイオン交換樹脂等で処理することにより、ミオ−イノシトール以外の不純物をほとんど除くことができる。その後、再結晶等の方法を用いることにより、目的物質を単離することができる。培養後に回収した枯草菌細胞は、再度新規な培養に供することもできる。
【００５０】
具体的には、例えば、ミオ−イノシトールが蓄積した培養上清液を、望ましくない成分の除去の目的で強酸性陽イオン交換樹脂、例えばデュオライト（登録商標）Ｃ−２０（Ｈ＋型）を充填したカラムに通過させ通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液および洗浄液を合併する。こうして得られた溶液を強塩基性陰イオン交換樹脂、例えばデュオライト（登録商標）Ａ１１６（ＯＨ−型）を充填したカラムに通過させ通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液および洗浄液を合併して、ミオ−イノシトールを含みそれ以外の不純物をほとんど含まない水溶液を取得する。この水溶液を濃縮して得られたミオ−イノシトールの濃厚溶液に、エタノールの適当量を加え、室温または低温で一晩放置すると、純粋なミオ−イノシトールの結晶を晶出できる。さらに、カラム操作を行なう際に、脱色を目的として、活性炭を充填したカラムを使用することもできる。
【００５１】
本発明においては、上記形質転換枯草菌に対し、特許文献１ならびに非特許文献１および２などに記載されるいずれかの方法を用いて、ミオ−イノシトールからシロ−イノシトールを生産することができるように改変してもよい。
【００５２】
本発明の形質転換枯草菌は、グルコースからミオ−イノシトールを製造するために用いられる。これにより、それ自体医薬品、食品、化粧品などの材料として有用なミオ−イノシトール自体を安定供給するための手段が提供される。ミオ−イノシトールは、シロ−イノシトールまたはＤ−キロ−イノシトールの製造のための原料としても用いられ得る。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例により本発明を詳述する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５４】
（実施例１：形質転換枯草菌細胞の作製）
非特許文献１に記載された枯草菌ＭＹＩ０４のｉｏｌＧ遺伝子を以下の方法で削除した。
【００５５】
本方法は、Genes Genet. Syst. 2009，84:315-318に記載された方法に準じた。
【００５６】
まず、ＭＹＩ０４染色体ＤＮＡより、ｉｏｌＧ遺伝子の下流に存在するｙｘｄＪ遺伝子領域を、一対のオリゴＤＮＡプライマーＡＦ（配列番号４）およびＡＲ（配列番号５）を用いるＰＣＲ増幅によって取得した（ＤＮＡ断片Ａと称する）。同じく、ＭＹＩ０４染色体ＤＮＡより、ｉｏｌＧ遺伝子の上流に存在するｉｏｌＳ  ＤｉｏｌＲ遺伝子領域を、一対のオリゴＤＮＡプライマーＢＦ（配列番号６）およびＢＲ（配列番号７）を用いるＰＣＲ増幅によって取得した（ＤＮＡ断片Ｂと称する）。また、ＭＹＩ０４染色体ＤＮＡより、ｉｏｌＧ遺伝子領域を、一対のオリゴＤＮＡプライマーＣＦ（配列番号８）およびＣＲ（配列番号９）を用いるＰＣＲ増幅によって取得した（ＤＮＡ断片Ｃと称する）。さらに、Genes Genet. Syst. 2009，84:315-318に記載された枯草菌ＴＭＯ３１１染色体ＤＮＡより、ｍａｚＦカセット領域を、一対のオリゴＤＮＡプライマーｍａｚＦＦ（配列番号１０）とｍａｚＦＲ（配列番号１１）を用いるＰＣＲ増幅によって取得した（ＤＮＡ断片Ｄと称する）。
【００５７】
こうして準備した４種のＤＮＡ断片であるＡ、Ｂ、ＤそしてＣをこの順にリコンビナントＰＣＲによって連結した。ｍａｚＦカセット内にはカナマイシン耐性遺伝子が含まれており、このリコンビナントＰＣＲ  ＤＮＡをＭＹＩ０４の自然形質転換能力によって取り込ませると、ＤＮＡ断片ＡならびにＣに相当する領域において相同組み換えが起こる。これにより、リコンビナントＰＣＲ  ＤＮＡ全体が染色体に取り込まれた組み換え体をカナマイシン耐性の獲得により選択した。
【００５８】
この組み換え体の染色体にはＤＮＡ断片Ｂに相当する領域が２か所に重複して存在しており、この領域間では一定頻度で同一染色体内の相同組み換えが生じる。そして、このような同一染色体内の相同組み換えの結果、重複するＤＮＡ断片Ｂ領域に挟まれるＤＮＡ断片Ｃ（ｉｏｌＧ遺伝子領域）ならびにＤ（ｍａｚＦカセット領域）を含む染色体ＤＮＡは切り出されて消失する。ｍａｚＦカセットにはＩＰＴＧで誘導されるトキシン遺伝子であるｍａｚＦが含まれており、上記の染色体の切り出しが生じなかった細胞はＩＰＴＧ存在下で死滅する。加えて、この染色体の切り出しによってはｍａｚＦカセットも失われるため、細胞はカナマイシンへの抵抗性も同時に失う。
【００５９】
従って、上記組み換え体を一定期間培養した後にＩＰＴＧを含む培地に移して生育するものを選抜し、かつそのような細胞のカナマイシンへの感受性に加えて当該染色体領域の塩基配列を確認して、ＭＹＩ０４のｉｏｌＧ遺伝子を削除したΔｉｏｌＧを取得した。
【００６０】
上記ΔｉｏｌＧへ結核菌のミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素遺伝子を以下の方法で導入した。
【００６１】
結核菌のミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素遺伝子（ｉｎｏ１）を、データベースにある情報（http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?mtd:UDA_0046c）より、配列番号１のアミノ酸配列を与える合成ＤＮＡとして作製した。合成ＤＮＡは、枯草菌での翻訳に適するようにコドンを調整し、そしてｒｐｓＯ  Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列とｔｕｆＡターミネーターとをそれぞれ人工的に５’領域と３’領域に付加した。この合成ＤＮＡの塩基配列を配列番号２、そしてコードされたアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００６２】
非特許文献１に記載された枯草菌ＫＵ１０６染色体から、ａｍｙＥ座のＣ末端領域、クロラムフェニコール耐性遺伝子およびｒｐｓＯ遺伝子プロモーターを含む染色体ＤＮＡ領域を、一対のオリゴＤＮＡプライマーａ０１１（配列番号１２）およびａ６５０（配列番号１３）を用いるＰＣＲ増幅によって取得した（ＤＮＡ断片Ｅと称する）。また、上記の結核菌のミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素遺伝子を与える合成ＤＮＡを、オリゴＤＮＡプライマーａ６５１（配列番号１４）およびａ６５２（配列番号１５）を用いてＰＣＲにより増幅した（ＤＮＡ断片Ｆと称する）。さらに、ＫＵ１０６染色体より、ａｍｙＥ遺伝子座のＮ末端領域を含む領域を、プライマーａ０１４（配列番号１６）およびａ０１５（配列番号１７）を用いてＰＣＲにより増幅した（ＤＮＡ断片Ｇと称する）。
【００６３】
そして、これらの３つのＤＮＡ断片Ｅ、ＦおよびＧをこの順にリコンビナントＰＣＲによって連結したＤＮＡを用いて、自然形質転換能力によってΔｉｏｌＧへ取り込ませてクロラムフェニコール耐性に形質転換した。これによって、ΔｉｏｌＧのａｍｙＥ座にはクロラムフェニコール耐性遺伝子とともに結核菌のミオ−イノシトール−１−リン酸合成酵素遺伝子がｒｐｓＯプロモーターにより転写発現するように取り込まれ、その正確な取り込みを塩基配列で確認してａｍｙ：：ＰｒｐｓＯ−ｉｎｏ１ΔｉｏｌＧを得た。
【００６４】
さらに、上記ａｍｙ：：ＰｒｐｓＯ−ｉｎｏ１ΔｉｏｌＧのｐｂｕＥ遺伝子を、以下の方法で破壊した。本方法は、Microbiology 1998，144：3097-3104に記載された方法に準じた。
【００６５】
ナショナルバイオリソースプロジェクトによって国立遺伝学研究所原核生物遺伝研究室にて管理される枯草菌変異株バンクより入手した枯草菌変異株ＹＤＨＬｄ（ｐｂｕＥ遺伝子破壊株：https://shigen.nig.ac.jp/bsub/resource/strainGeneDisrupted/detail/2185;jsessionid=BCB7B4AF23FB68E7667ABF98AA9AA57A）の染色体ＤＮＡを用いてａｍｙ：：ＰｒｐｓＯ−ｉｎｏ１ΔｉｏｌＧをエリスロマイシン耐性となるように形質転換した。これによって、この細胞のｐｂｕＥ遺伝子はエリスロマイシン耐性遺伝子カセットの挿入によって分断、不活性化される。この結果得られた細胞をａｍｙ：：ＰｒｐｓＯ−ｉｎｏ１ΔｉｏｌＧΔｐｂｕＥとした。
【００６６】
（実施例２：形質転換枯草菌の培養後の培地中のイノシトールの検出）
枯草菌はLysogeny Broth（ＬＢ）培地中で、１８０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で一晩前培養した（必要に応じて抗生物質を添加した）。
【００６７】
イノシトール生物変換のためには、０．５％（ｗ／ｖ）バクトイーストエキストラクト（Becton、Dickinson and Co.、Sparks、MD、USA）、２％（ｗ／ｖ）グルコース、および２％バクトソイトン（Becton、Dickinson and Co.）よりなる生物変換培地を使用した。１００ｍＬ容の三角フラスコに入れた２０ｍＬの生物変換培地に、枯草菌の前培養液を６００ｎｍで濁度０．１を与えるように接種し、１８０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で保温培養した。
【００６８】
上述の通りに、グルコースの存在下でａｍｙ：：ＰｒｐｓＯ−ｉｎｏ１ΔｉｏｌＧ株およびａｍｙ：：ＰｒｐｓＯ−ｉｎｏ１ΔｉｏｌＧΔｐｂｕＥ株を生物変換培地（グルコース添加培地）で１２０時間培養した。
【００６９】
培養後、遠心分離によってまず細胞を培地から除去し、さらにAmicon Ultra-0.5mL 3K Centrifugal Filter（Millipore、Billerica、MA、USA）によるろ過で固形物を完全に排除した。こうして得られた液を、COSMOSIL Sugar-Dカラム（４．６×２５０ｍｍ）（ナカライテスク、京都）を用いて、２８℃に保温された２ｍＬ毎分流量のアセトニトリル／水（８０／２０）を移動相とする高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（LaChrom Elite：HITACHI High Technologies、Tokyo、Japan）にかけて示差屈折率検出器によって分析した。標準物質であるミオ−イノシトールとシロ−イノシトールを同条件の高速液体クロマトグラフィーにかけた場合の流出保持時間を指標として立体異性体を同定し、また示差屈折率のピーク面積より濃度を算出した。
【００７０】
図１は、ａｍｙ：：ＰｒｐｓＯ−ｉｎｏ１ΔｉｏｌＧ（上）およびａｍｙ：：ＰｒｐｓＯ−ｉｎｏ１ΔｉｏｌＧΔｐｂｕＥ（中）の形質転換枯草菌細胞をそれぞれグルコース添加培地で１２０時間培養した後の培地のＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトグラムである。図１には、標準物質であるミオ−イノシトールとシロ−イノシトールのピークを示すクロマトグラム（下）を併せて示す。生物変換培地での培養１２０時間後、ａｍｙ：：ＰｒｐｓＯ−ｉｎｏ１ΔｉｏｌＧ株ではミオ−イノシトールの生産は確認できなかったが、ａｍｙ：：ＰｒｐｓＯ−ｉｎｏ１ΔｉｏｌＧΔｐｂｕＥ株においてミオ−イノシトールの生産が認められた。
【００７１】
（実施例３：形質転換枯草菌の培養によるミオ−イノシトールの製造）
実施例２に記載の通り生物変換培地（グルコース添加培地）でａｍｙ：：ＰｒｐｓＯ−ｉｎｏ１ΔｉｏｌＧΔｐｂｕＥ株を培養し、培養開始から２４時間後、４８時間後、および１２０時間後のミオ−イノシトール量をＨＰＬＣによって分析して測定した。
【００７２】
図２は、ａｍｙ：：ＰｒｐｓＯ−ｉｎｏ１ΔｉｏｌＧΔｐｂｕＥの形質転換枯草菌細胞をグルコース添加培地で１２０時間培養した期間におけるミオ−イノシトールの生産量を示すグラフである。横軸は培養時間（単位：時間）を示し、縦軸はミオ−イノシトールの生産量（単位：％（ｗ／ｖ））を示す。ａｍｙ：：ＰｒｐｓＯ−ｉｎｏ１ΔｉｏｌＧΔｐｂｕＥ株の１２０時間培養後のミオ−イノシトールの生産量は０．０１％（ｗ／ｖ）であり、２％グルコースからの変換効率は０．５％であった。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明は、ミオ−イノシトールの工業的生産に利用できる。さらに、医薬品、食品および化粧品の製造のための原料供給のために有用である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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