(57)【要約】【課題】各種製品の原料として有用な高分子の水溶性ケラチン断片の提供。【解決手段】ケラチンを含む基質をＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼで加水分解することを含む、ケラチン断片の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケラチンを含む基質をＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼで加水分解することを含む、ケラチン断片の製造方法。
【請求項２】
前記ケラチンを含む基質を、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを含有する酵素組成物で加水分解することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼがβ−リティックメタロプロテアーゼ、ＬａｓＡタンパク質、及びアエロモナス・ハイドロフィラプロテイナーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ケラチン断片の分子量が２５，０００〜５０，０００である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記ケラチン断片が水溶性である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記ケラチン断片がロッド領域を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記ケラチンを含む基質が、動物の毛、爪、皮膚、角、蹄、鱗、上皮細胞及び羽毛、それらの加工物、ならびにそれらから分離したケラチン画分からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記基質に含まれるケラチンが水溶性ケラチンである、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記基質に含まれるケラチンが水不溶性又は難溶性ケラチンである、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記ケラチンを含む基質がケラチン１０を含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記加水分解で得られたケラチン断片を回収することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記加水分解の後、酵素反応を停止させる処理を行わない、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを有効成分とするケラチン断片化剤。
【請求項１４】
前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを含有する酵素組成物を有効成分とする、請求項１３記載のケラチン断片化剤。
【請求項１５】
前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼがβ−リティックメタロプロテアーゼ、ＬａｓＡタンパク質、及びアエロモナス・ハイドロフィラプロテイナーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１３又は１４記載のケラチン断片化剤。
【請求項１６】
前記断片化ケラチンの分子量が２５，０００〜５０，０００である、請求項１３〜１５のいずれか１項記載のケラチン断片化剤。
【請求項１７】
前記断片化ケラチンが水溶性である、請求項１３〜１６のいずれか１項記載のケラチン断片化剤。
【請求項１８】
前記断片化ケラチンがロッド領域を有する、請求項１３〜１７のいずれか１項記載のケラチン断片化剤。
【請求項１９】
前記ケラチンが水溶性ケラチンである、請求項１３〜１８のいずれか１項記載のケラチン断片化剤。
【請求項２０】
前記ケラチンが水不溶性又は難溶性ケラチンである、請求項１３〜１８のいずれか１項記載のケラチン断片化剤。
【請求項２１】
前記ケラチンがケラチン１０である、請求項１３〜１８のいずれか１項記載のケラチン断片化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケラチン断片の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケラチンは、動物の毛、爪、皮膚などを構成しているタンパク質である。従来、ケラチンは、飼料や肥料、界面活性剤、フィルム、繊維、化粧品、医療品等の各種製品の素材、及び研究対象として注目され、利用されている。天然のケラチンは、架橋構造を備えた難溶性の高分子物質である。そのため、従来のケラチンの工業的利用においては、可溶化又は低分子化したケラチンを素材として利用している。可溶化又は低分子化ケラチンは、一般に、天然のケラチンを酸、アルカリ、酵素などで加水分解することや、ケラチンのジスルフィド結合をチオール基に還元開裂して還元ケラチンを生成することなどによってケラチンを可溶化することで製造される。
【０００３】
特許文献１には、還元ケラチンをトリプシン等のタンパク質分解酵素で制限的に加水分解することで製造された、平均分子量３，０００〜３０，０００、アミノ酸１００残基当りシステインを４〜１６個有するケラチン断片が開示されている。該ケラチン断片が、フィルム、繊維等に加工した場合に好適な強度を持ち、架橋可能なチオール基を有し、かつ人体への毒性、刺激性も少ないことから、フィルム、繊維の材料や化粧品基材等として好適であることも開示されている。
【０００４】
特許文献２には、ケラチンのα−へリックス領域にエピトープを持つ抗体との免疫反応のため、ケラチンタンパク質を、α−へリックス領域、又は該エピトープ領域を有するそのフラグメントへと可溶化することが記載されている。該手順においては、ケラチンの可溶化に尿素及びキモトリプシン等のプロテアーゼが用いられるが、可溶化フラグメントにエピトープが維持されるように、タンパク質分解条件の至適化や、適切なタイミングでの分解反応停止が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平６−１１６３００号公報
【特許文献２】特開平２−６７５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、飼料や肥料、界面活性剤、フィルム、繊維、化粧品、医療品等の各種製品の原料及び研究試料として有用な高分子ケラチン断片を製造するための、ケラチン断片の製造方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼによるケラチンの加水分解により、α−へリックス領域（ロッド領域）が維持された高分子の水溶性ケラチン断片が生成されることを見出した。また本発明者らは、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼによるケラチン分解反応では、時間が経ってもケラチンが小さい断片に分解されてしまうことがないので、酵素反応を停止させなくとも、ロッド領域が維持された高分子の水溶性ケラチン断片を得ることができることを見出した。
【０００８】
したがって、本発明は、ケラチンを含む基質をＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼで加水分解することを含む、ケラチン断片の製造方法を提供する。
また本発明は、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを有効成分とするケラチン断片化剤を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、各種製品の素材及び研究試料として有用なロッド領域を有する高分子の水溶性ケラチン断片を製造することができる。Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、ケラチン水溶性画分及び水不溶性又は難溶性画分のいずれからでもケラチン断片を生成することができるので、本発明によれば、天然のケラチン資源を効率よく利用することができる。またＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、ケラチンをある程度よりも小さいサイズには断片化しないため、本発明によれば、酵素反応を停止させる工程を経なくとも、高分子のケラチン断片を得ることができる。したがって本発明によれば、工業的利用に有用な高分子ケラチン断片を効率よくかつ簡便に製造することが可能になる。
【００１０】
さらに、本発明の方法で得られるケラチン断片は、水溶性であり、かつロッド領域を有し、抗ケラチン抗体のエピトープを保持している。そのため、本発明のケラチン断片は、抗体やＵＶ等を用いた各種方法での定量や解析が可能である。さらに、本発明の方法で得られるケラチン断片は、主にロッド領域を有しているため、ケラチンのロッド領域、又はヘッドもしくはテイル領域の機能を明らかにするための研究サンプルとして使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】襟袖汚れから抽出したケラチン溶液のウェスタンブロッティングによる検出像。
【図２】トリプシン又はＢＬＰ処理したケラチン溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像。
【図３】襟袖汚れとＢＬＰとの反応液の上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像。
【図４】踵角質から抽出したケラチン溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像とウェスタンブロッティングによる検出像。
【図５】Ｍ２３ファミリーの酵素で処理したケラチン溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像。
【図６】ＢＬＰ処理したケラチン溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像。
【図７】酵素処理した角質不溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像。
【図８】ケラチン１０のアミノ酸配列。太字は実施例５の質量分析で同定されたペプチド配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一態様において、本発明は、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを用いたケラチン断片の製造方法を提供する。
【００１３】
ケラチンは、動物の毛、爪、皮膚などを構成しているタンパク質である。ケラチン分子の中央部にはα−へリックス領域（ロッド領域）が存在し、またＮ及びＣ末端部には非へリックス構造をとるヘッド及びテイル領域がそれぞれ存在する。表皮性のケラチンはヘッド及びテイル領域にグリシンやセリンを多く含む（蛋白質核酸酵素  ３８（１６）１９９３，ｐ２７１１−２７２２）。このケラチンのヘッド及びテイル領域のようなグリシンを多く含む領域はｆｌｅｘｉｂｌｅな構造をとり、さらに疎水性であることが報告されている（Ｋｏｒｇｅ．ＢＰ  ｅｔ．ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｖｏｌ．８９，１９９２，ｐ９１０−９１４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｋｉｎ  Ｔｈｅ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ，１９９３，ｐ１６４）。一方、ケラチンのロッド領域は、ｆｌｅｘｉｂｌｅで疎水性のヘッド及びテイル領域を含む全長ケラチンと比べて、構造的により安定であり、かつ親水性が高いと考えられる。
【００１４】
Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼとは、ＭＥＲＯＰＳデータベース[ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ]に記載されるタンパク質分解酵素ファミリーにおいて、Ｍ２３ファミリーに属するメタロプロテアーゼのサブファミリーである、Ｍ２３Ａサブファミリーに属するプロテアーゼをいう。ＭＥＲＯＰＳデータベースでは、酵素を以下の論文に記載の方法に基づいてファミリーまたはサブファミリーにまで分類している：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９９９，２７：３２５−３３１、Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ，２００１，１３４：９５−１０２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２０１６，４４：Ｄ３４３−Ｄ３５０。ＭＥＲＯＰＳデータベースのリリース１１．０においては、Ｍ２３Ａサブファミリーには、β−リティックメタロプロテアーゼ（beta-lytic metallopeptidase；ＢＬＰ）（MEROPS ID：M23.001）、Staphylolysinとも呼ばれるＬａｓＡタンパク質（Las A protein；ＬＡＳ）（MEROPS ID：M23.002）、及びMername-AA291 peptidaseとも呼ばれるアエロモナス・ハイドロフィラプロテイナーゼ（Aeromonas hydrophila proteinase；ＡｈＰ）（MEROPS ID：M23.003）の３つのプロテアーゼがＨｏｌｏｔｙｐｅとして存在している。
【００１５】
好ましくは、本明細書におけるＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼとは、β−リティックメタロプロテアーゼ（ＢＬＰ）、ＬａｓＡタンパク質（ＬａｓＡ又はＬＡＳ）、及びアエロモナス・ハイドロフィラプロテイナーゼ（ＡｈＰ）からなる群より選択される少なくとも１種をいう。本発明において、ＢＬＰ、ＬＡＳ及びＡｈＰは、いずれか１種が使用されてもよく、いずれか２種又は３種の組み合わせで使用されてもよい。好ましくは、本発明において使用されるＭ２３ＡサブファミリープロテアーゼはＢＬＰを含み、より好ましくはＢＬＰである。
【００１６】
β−リティックメタロプロテアーゼ（ＢＬＰ）、ＬａｓＡタンパク質（ＬａｓＡ又はＬＡＳ）、アエロモナス・ハイドロフィラプロテイナーゼ（ＡｈＰ）は、ペプチド配列中のグリシン−グリシン結合の分解活性を有する酵素である。ＢＬＰの好ましい例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。ＢＬＰの別の例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であって、好ましくは配列番号２で示されるアミノ酸配列のＨ２２、Ｄ３６、Ｈ１２１及びＨ１２３に相当するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン−グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。ＬＡＳの好ましい例としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。ＬＡＳの別の例としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であって、好ましくは配列番号４で示されるアミノ酸配列のＨ２３、Ｄ３６、Ｈ１２０及びＨ１２２に相当するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン−グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。ＡｈＰの好ましい例としては、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。ＡｈＰの別の例としては、配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であって、好ましくは配列番号６で示されるアミノ酸配列のＨ２１、Ｄ３４、Ｈ１１８及びＨ１２０に相当するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン−グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００１７】
本明細書において、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に関する「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、なお好ましくは９８％以上、さらになお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【００１８】
本明細書において、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の同一性は、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−４１）によって計算することができる。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより算出できる。
【００１９】
本明細書において、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）とを、各アミノ酸配列またはヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基またはヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ  ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２およびＣｌｕｓｔａｌ  ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。
【００２０】
上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置に対応する位置にアラインされた目的配列のアミノ酸残基又はヌクレオチドの位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。目的配列上の該「相当する位置」のアミノ酸残基が参照配列とで同じであるとき、それは参照配列のアミノ酸残基に「相当するアミノ酸残基」とみなされる。例えば、目的配列上で、配列番号２のアミノ酸配列のＨ２２に相当する位置のアミノ酸残基がＨであれば、それは、配列番号２のアミノ酸配列のＨ２２に相当するアミノ酸残基である。
【００２１】
上記に挙げたＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、それを含有する微生物又はその培養物から抽出又は調製することができる。例えば、ＢＬＰは、Lysobacter sp. (NBRC 12725又はNBRC 12726)、Achromobacter lyticus M497-1、Lysobacter sp. IB-9374、Lysobacter gummosus DSMZ 6980等、又はその培養物から抽出又は調製することができ、ＬＡＳは、Pseudomonas aeruginosa PA01、Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145、Pseudomonas aeruginosa FRD1等、又はその培養物から抽出又は調製することができ、ＡｈＰは、Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila ATCC 7966、Aeromonas hydrophila (Chester) Stanier (ATCC 51307)等、又はその培養物から抽出又は調製することができる。上記微生物は公的微生物保存機関より購入することができる。当該Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを含有する微生物は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。かくして得られた微生物又は培養液から、一般的な方法によって酵素の採取、調製を行い、さらに凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化等により必要な酵素形態を得ることができる。例えば、培養物からの酵素の回収及び調製は、遠心分離又はろ過による組換え微生物の分離、上清又はろ液中の酵素の、硫酸アンモニウム等の塩を加えることによる沈殿又はエタノール等の有機溶媒を加えることによる沈殿、限外ろ過膜等を用いた濃縮や脱塩、イオン交換又はゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた精製、などの通常の方法を用いて行うことができる。
【００２２】
あるいは、当該Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、上述したアミノ酸配列を利用して、化学合成又は生物学的手法により製造することができる。例えば、アミノ酸配列に基づき化学合成したＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼ遺伝子を発現するように形質転換した微生物を培養し、微生物又は培養物から目的の酵素を調製することで、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを得ることができる。そのような形質転換微生物としては、例えば、制御領域と作動可能に連結されたＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼ遺伝子を、宿主細胞のゲノム中若しくはプラスミド中に導入して得られた微生物、適切な位置に目的遺伝子が組み込まれた発現ベクターを導入した微生物、などが挙げられる。
【００２３】
本明細書において、目的遺伝子と制御領域とを「作動可能に連結する」とは、制御領域による遺伝子発現を制御する機能が目的遺伝子に作用するように、ＤＮＡ上で制御領域と目的遺伝子とを配置することをいう。目的遺伝子と制御領域を作動可能に連結する方法としては、当該制御領域の下流に当該目的遺伝子を連結する方法が挙げられる。
【００２４】
本明細書において、遺伝子の「制御領域」とは、該領域の下流の遺伝子の細胞内における発現を制御する機能を有し、好ましくは、下流遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する領域である。具体的には、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼが相互作用して当該遺伝子の転写を制御する機能を有する領域と定義され得る。好ましくは、本明細書における遺伝子の制御領域とは、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流２００〜６００ヌクレオチド程度の領域をいう。制御領域は、遺伝子の転写開始制御領域及び／又は翻訳開始制御領域、あるいは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域を含む。転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列に相当する部位である（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．，Ｄａｌｇａｒｎｏ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９７４，７１：１３４２−１３４６）。
【００２５】
Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ遺伝子を含む発現ベクターは、該遺伝子を安定に保持でき、宿主微生物内で複製維持が可能であり、かつ該Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを安定に発現させることができるベクターに、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ遺伝子を組込むことで作製することができる。かかるベクターとしては、大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４（Ｓｕｍｉｔｏｍｏら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｅｍ．，１９９５，５９：２１７２−２１７５）あるいはｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）等が挙げられる。
【００２６】
宿主微生物の形質転換は、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。宿主微生物としては、特に制限されないが、Bacillus属（例えば枯草菌）等のグラム陽性菌、大腸菌等のグラム陰性菌、Streptomyces属、Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カビ）等の真菌などが挙げられる。好ましい宿主は、該宿主に導入するＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼ遺伝子の由来菌と同種もしくは同属の微生物、大腸菌、又はバチルス属細菌であり、より好ましくはバチルス属細菌である。さらに、導入したＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼ以外のプロテアーゼの生産が少ないバチルス属細菌が好ましい。好ましい例としては、枯草菌のａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡから選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株、より好ましくは、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡの８個の遺伝子を欠失した８重欠失株が挙げられる。
【００２７】
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。かくして得られた微生物又は培養物から、一般的な方法によって酵素の採取、調製を行い、さらに凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化等により必要な酵素形態を得ることができる。例えば、培養物からの酵素の回収及び調製は、遠心分離又はろ過による組換え微生物の分離、上清又は濾液中の酵素の、硫酸アンモニウム等の塩を加えることによる沈殿又はエタノール等の有機溶媒を加えることによる沈殿、限外ろ過膜等を用いた濃縮や脱塩、イオン交換又はゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた精製、などの通常の方法を用いて行うことができる。
【００２８】
あるいは、当該Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、それを含む酵素組成物等から調製することができる。例えば、ＢＬＰは、アクロモペプチダーゼから調製することができる。アクロモペプチダーゼは、Lysobacter enzymogenes由来の溶菌酵素であり、ＢＬＰを含有する。アクロモペプチダーゼは、和光純薬工業（株）等から市販されている。
【００２９】
本発明のケラチン断片の製造方法においては、ケラチンを含む基質を、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼで加水分解する。
【００３０】
本発明の方法に用いられるケラチンを含む基質の原料には、ケラチンを含有する任意の物質を使用することができる。ケラチンを含有する物質の例としては、動物の毛、爪、皮膚、角、蹄、鱗、羽毛、上皮細胞等の天然のケラチン含有物質が挙げられ、好ましくは、鶏などの鳥類の羽毛、及び牛毛、馬毛、ヤギ毛、羊毛、アルパカ、モヘア、アンゴラ、カシミヤ等の獣毛、ヒト皮膚やその剥離物、獣皮、などが挙げられる。このうち、より好ましい例としてはヒト皮膚やその剥離物、及び獣皮が挙げられ、さらに好ましい例としてはヒト由来の皮膚や垢、豚皮、シープスキン、ラムスキン、ゴートスキン、ディアスキン、ホースハイド、コードバン等が挙げられる。ケラチンを含有する物質の別の例としては、上記天然のケラチン含有物質の加工品、例えば、羽毛布団、羊毛布団、ムートン、毛織物、皮革製品、及びダウンジャケット、セーター等の衣類、などが挙げられる。本発明の方法に用いられるケラチンを含む基質の原料としては、上述したケラチンを含有する物質のいずれか１種又は２種以上を用いることができる。ただし、当該ケラチンを含む基質の原料は、これらに限定されない。
【００３１】
当該ケラチンを含有する物質は、そのまま、あるいは必要に応じて適宜粉砕もしくは微粉化、脱脂処理、又は活性剤や変性剤による可溶化処理をして、本発明の方法におけるケラチンを含む基質として用いることができる。あるいは、該ケラチンを含有する物質から分離したケラチン画分を、本発明の方法におけるケラチンを含む基質として用いてもよい。ケラチンを含有する物質からケラチン画分を分離するには、例えば、ケラチンを含有する物質を粉砕もしくは微粉化、脱脂処理、又は活性剤や変性剤による可溶化処理した後、ろ過、クロマトグラフィー、溶媒抽出、凍結乾燥、塩析やＴＣＡ沈殿、アセトン沈殿などのタンパク質沈殿法などにより分離すればよい。本発明の方法でケラチンを含む基質として使用されるケラチン画分は、水溶性画分であっても、水不溶性又は難溶性画分であってもよい。好ましくは、該ケラチン画分は、グリシンリッチ領域を含むケラチンを含む画分であり、より好ましくは、ケラチン１０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＿ＡＡＨ３４６９７、配列番号２６）又はそのグリシンリッチ領域とロッド領域とを有する断片を含む画分である。
【００３２】
本明細書において、グリシンリッチ領域とは、分子量２５，０００以上のタンパク質中の任意の連続した２０アミノ酸からなる領域において、グリシンが少なくとも２以上連続した配列（−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−）を有し、かつグリシンを１０以上有する領域をいう。
【００３３】
あるいは、当該ケラチンを含有する物質を還元して得られた還元ケラチンを、ケラチンを含む基質として用いてもよい。還元ケラチンは、上記ケラチンを含有する物質から公知の手法（例えば、特許文献１記載の手法）に従って調製することができる。例えば、ケラチンを含有する物質を、蛋白質変成剤の存在下又は蛋白質変成剤と界面活性剤の存在下で、還元剤で還元し、不溶物を除去した後、得られた水溶液から塩析、透析等により還元ケラチンを調製することができる。還元剤としては、ケラチンのジスルフィド結合を還元してチオール基に変換する作用をするものであればよく、例えば、２−メルカプトエタノール、チオグリコール酸、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトールなどのチオール化合物；トリプロピルホスフィン、トリブチルホスフィンなどの有機リン化合物；亜硫酸水素ナトリウムなどの還元能力を持つ無機化合物、などが挙げられる。蛋白質変成剤としては、尿素、チオ尿素などが挙げられる。
【００３４】
本発明の方法において、当該ケラチンを含む基質の加水分解に用いられるＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、好ましくは、ＢＬＰ、ＬＡＳ及びＡｈＰからなる群より選択される少なくとも１種である。より好ましくは、本発明で用いられるＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、ＢＬＰである。
【００３５】
当該ケラチンを含む基質の加水分解には、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを含有する酵素組成物を使用することもできる。好ましくは、当該酵素組成物は、ＢＬＰ、ＬＡＳ及びＡｈＰからなる群より選択される少なくとも１種を含有する。より好ましくは、当該酵素組成物はＢＬＰを含有する。
【００３６】
当該加水分解反応の反応液における当該ケラチンを含む基質の含有量は、好ましくは０．００１〜５０質量％、より好ましくは０．０１〜２０質量％、さらに好ましくは０．０１〜５質量％である。
【００３７】
当該加水分解反応の反応液におけるＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの量は、好ましくは０．０００００１〜１０質量％、より好ましくは０．０００１〜１質量％、さらに好ましくは０．００１〜０．１質量％である。
【００３８】
当該Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼによる当該ケラチンを含む基質の加水分解反応の温度条件は、好ましくは０〜９０℃、より好ましくは２０〜５０℃である。また、該加水分解反応の時間は、好ましくは１分以上、より好ましくは３０分以上である。後述の実施例に示すとおり、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、長時間反応させてもケラチンをある程度よりも小さいサイズには断片化しない。したがって、本発明の方法では、加水分解反応の時間の上限を制限する必要はない。経済性の観点からは、該加水分解反応の時間は、１〜３０００分が好ましく、１〜６００分がより好ましく、１〜６０分がさらに好ましく、３０〜６０分がなお好ましい。
【００３９】
当該加水分解により、ケラチン断片が生成される。生成されたケラチン断片は、反応液から任意の手法で回収することができる。好ましい実施形態において、本発明のケラチン断片の製造方法は、該加水分解で得られたケラチン断片を回収することをさらに含む。反応液からケラチン断片を回収する手法としては、一般的なポリペプチドの単離又は精製のための手法、例えば、ろ過、遠心、濃縮、精密ろ過、限外ろ過、クロマトグラフィー等による分離、凍結乾燥、塩析やＴＣＡ沈殿、アセトン沈殿等のタンパク質沈殿法、などを用いることができる。
【００４０】
上述したとおり、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼはケラチンをある程度よりも小さいサイズには断片化しない。そのため、本発明のケラチン断片の製造方法においては、当該ケラチンを含む基質のＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼによる加水分解の後、酵素反応を停止させる処理を行わなくともよい。しかし、本発明の方法においては、該加水分解の後に酵素反応を停止させる処理を行うことも可能である。該酵素反応を停止させる処理としては、例えば、反応液への反応停止剤（例えば１，１０−フェナントロリン、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等の還元剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤）の添加や反応液の加熱による酵素の失活、及び反応液からの酵素の除去が挙げられる。反応液から酵素を除去する手法としては、予め酵素を担体に固定化し、この担体に固定化された酵素を用いて基質の加水分解反応を行い、反応後に反応液から担体ごと酵素を除去する方法が挙げられる。
【００４１】
本発明の方法により生成されたケラチン断片は、分子量が好ましくは約２５，０００〜５０，０００、より好ましくは約３７，０００〜５０，０００である。本明細書において、タンパク質又はポリペプチドの「分子量」は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって計算することができる。好ましい分子量測定の手順を以下に記載する：試料溶液を５０ｍＭジチオトレイトールを含む２×Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒと等量混合し、１００℃で５分間加熱することで泳動サンプルを調製する。この泳動サンプルをＡｎｙ  ｋＤTMミニプロティアン（登録商標）ＴＧＸTMプレキャストゲル及び電気泳動用バッファー（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、０．１％（ｗ/ｖ）ＳＤＳ、ｐＨ８．３）を用いて電気泳動する。このとき分子量マーカーにはプレシジョン  Ｐｌｕｓ  プロテインTM２色スタンダードを使用する。泳動後のゲルはＣＢＢ染色又はルビー染色する。分子量マーカーの分子量と移動度から作成できる検量線の式に、目的タンパク質又はポリペプチドの移動度を代入することで得られる値を、該目的タンパク質又はポリペプチドの分子量とする。ここでサンプルの移動度（Ｒｆ値）は、該サンプルを流したレーンにおける、ゲルの上端（又はサンプルをアプライした位置）から先行色素（ブロモフェノールブルー）までの距離を１としたときの、該ゲルの上端（又はサンプルをアプライした位置）から該サンプルのバンドまでの距離の相対値とする。
【００４２】
本発明の方法により生成されたケラチン断片は、水溶性である。そのため、親水性可溶化剤や変性剤を使用せずに可溶性状態で回収できる。したがって、本発明の方法により生成されたケラチン断片は、可溶化剤や変性剤を含むと解析が困難な方法（例えば動的光散乱法、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル測定による解析、吸光度の測定による解析）での解析が可能である。
【００４３】
本発明の方法により生成されたケラチン断片は、ロッド領域を有する。好ましくは、本発明の方法により生成されたケラチン断片は、主にロッド領域からなる。本発明の方法により生成されたケラチン断片に含まれるロッド領域の例としては、配列番号２６のアミノ酸番号１５７〜４５０で示されるアミノ酸配列からなる領域が挙げられる。本発明の方法により生成されるケラチン断片の例としては、配列番号２６のアミノ酸番号１５７〜４５０で示されるアミノ酸配列を含み、かつ分子量が約３７，０００〜５０，０００であるケラチン断片が挙げられる。ケラチンのロッド領域は、抗ケラチン抗体のエピトープとして使用されているため（特許文献２参照）、ロッド領域を有する本発明のケラチン断片は、抗体を用いた解析に有用である。また、主にロッド領域からなる本発明のケラチン断片は、構造的により安定であるため、Ｘ線を用いた解析、例えばＸ線結晶構造解析に有用である。従来のケラチンのＸ線解析では、全長ケラチン結晶中の配向が不完全なため、精度の高いデータを得ることが困難であった（高分子，５３，（２），２００４，ｐ７４−７８）。このように、本発明の方法により生成されたケラチン断片は、ケラチンの解析のためのツールとして有用である。
【００４４】
以上のとおり、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを用いてケラチン断片を製造することができる。言い換えると、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、ケラチン断片化のための有効成分として使用することができる。したがって、さらなる態様において、本発明は、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを含有するケラチン断片化剤を提供する。さらなる態様において、本発明は、ケラチン断片化剤の製造のためのＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの使用を提供する。さらなる態様において、本発明は、ケラチン断片化のためのＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの使用を提供する。さらなる態様において、本発明は、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを含有する、ケラチン断片化用キットを提供する。
【００４５】
上記の本発明のさらなる態様において、当該ケラチン断片化は、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼによるケラチンを含む基質の加水分解によって達成される。該ケラチンを含む基質の種類、加水分解反応に用いられる該基質及び酵素の量、ならびに加水分解反応の条件は、上述した本発明のケラチン断片の製造方法の場合と同様である。上記の本発明のさらなる態様において、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、好ましくはＢＬＰ、ＬＡＳ及びＡｈＰからなる群より選択される少なくとも１種であり、より好ましくはＢＬＰである。あるいは、ケラチン断片化のために、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを含有する酵素組成物を使用することもできる。上記の本発明のさらなる態様において、該ケラチン断片化により、分子量が好ましくは約２５，０００〜５０，０００、より好ましくは約３７，０００〜５０，０００の、高分子の水溶性ケラチン断片が生成される。当該ケラチン断片は、ロッド領域を有し、好ましくは主にロッド領域からなる。当該ケラチン断片の例としては、配列番号２６のアミノ酸番号１５７〜４５０で示されるアミノ酸配列を含み、かつ分子量が約３７，０００〜５０，０００であるケラチン断片が挙げられる。
【００４６】
本発明のケラチン断片化用キットは、必要に応じて、ケラチンを含む基質の加水分解のための反応液に含まれ得る他の試薬、溶媒等をさらに含有していてもよい。該キット中のＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、該反応液用の試薬又は溶媒等と混合されたプレミックスの形態であってもよい。
【００４７】
本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００４８】
〔１〕ケラチンを含む基質をＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼで加水分解することを含む、ケラチン断片の製造方法。
〔２〕好ましくは、前記ケラチンを含む基質を、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを含有する酵素組成物で加水分解することを含む、〔１〕記載の方法。
〔３〕好ましくは、前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼがβ−リティックメタロプロテアーゼ、ＬａｓＡタンパク質、及びアエロモナス・ハイドロフィラプロテイナーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記ケラチン断片の分子量が好ましくは２５，０００〜５０，０００、より好ましくは３７，０００〜５０，０００である、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕好ましくは、前記ケラチン断片が水溶性である、〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕前記ケラチン断片が、
好ましくはロッド領域を有し、
より好ましくは、配列番号２６の１５７〜４５０番アミノ酸で示されるアミノ酸配列を含む、
〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載の方法。
〔７〕好ましくは、前記ケラチンを含む基質が、動物の毛、爪、皮膚、角、蹄、鱗、上皮細胞及び羽毛、それらの加工物、ならびにそれらから分離したケラチン画分からなる群より選択される少なくとも１種である、〔１〕〜〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕好ましくは、前記基質に含まれるケラチンが水溶性ケラチンである、〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕好ましくは、前記基質に含まれるケラチンが水不溶性又は難溶性ケラチンである、〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔１０〕前記ケラチンを含む基質が、好ましくはケラチン１〜２０のいずれかを含み、より好ましくはケラチン１０を含む、〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔１１〕好ましくは、前記加水分解で得られたケラチン断片を回収することをさらに含む、〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項記載の方法。
〔１２〕好ましくは、前記加水分解の後、酵素反応を停止させる処理を行わない、〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項記載の方法。
【００４９】
〔１３〕Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを有効成分とするケラチン断片化剤。
〔１４〕好ましくは、前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを含有する酵素組成物を有効成分とする、〔１３〕記載のケラチン断片化剤。
〔１５〕好ましくは、前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼがβ−リティックメタロプロテアーゼ、ＬａｓＡタンパク質、及びアエロモナス・ハイドロフィラプロテイナーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、〔１３〕又は〔１４〕記載のケラチン断片化剤。
〔１６〕前記断片化ケラチンの分子量が好ましくは２５，０００〜５０，０００、より好ましくは３７，０００〜５０，０００である、〔１３〕〜〔１５〕のいずれか１項記載のケラチン断片化剤。
〔１７〕好ましくは、前記断片化ケラチンが水溶性である、〔１３〕〜〔１６〕のいずれか１項記載のケラチン断片化剤。
〔１８〕前記断片化ケラチンが、
好ましくはロッド領域を有し、
より好ましくは、配列番号２６の１５７〜４５０番アミノ酸で示されるアミノ酸配列を含む、
〔１３〕〜〔１７〕のいずれか１項記載のケラチン断片化剤。
〔１９〕好ましくは、前記ケラチンが水溶性ケラチンである、〔１３〕〜〔１８〕のいずれか１項記載のケラチン断片化剤。
〔２０〕好ましくは、前記ケラチンが水不溶性又は難溶性ケラチンである、〔１３〕〜〔１８〕のいずれか１項記載のケラチン断片化剤。
〔２１〕前記ケラチンが、好ましくはケラチン１〜２０のいずれかを含み、より好ましくはケラチン１０である、〔１３〕〜〔１８〕のいずれか１項記載のケラチン断片化剤。
【００５０】
〔２２〕配列番号２６のアミノ酸番号１５７〜４５０で示されるアミノ酸配列を含み、かつ分子量が３７，０００〜５０，０００であるケラチン断片。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５２】
本実施例で使用したプライマーの一覧を表１に示す。
【００５３】
【表１】
2019122301.tif 000002
【００５４】
参考例１  プロテアーゼの調製
（１）ＢＬＰを含む培養上清の調製
（１−１）発現ベクターの作製
ＢＬＰ遺伝子（配列番号１）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＢＬＰ／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＢＬＰ／ｐＵＣ５７を鋳型としてプライマーペアＢＬＰ＿Ｓ２３７ｓｉｇｎａｌ＿Ｆ／ＢＬＰ＿Ｓ２３７ｓｉｇｎａｌ＿Ｒ（配列番号９及び１０）及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用してＰＣＲ反応を行った。ＷＯ２００６／０６８１４８  Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーペアｖｅｃｔｏｒ−Ｆ／ｖｅｃｔｏｒ−ｓｉｇ−Ｒ（配列番号１１及び１２）を使用して、同様にＰＣＲ反応を行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理を行った。続いてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。
【００５５】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応液を用いてＥＣＯＳTMＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５  α（ニッポンジーン、３１０−０６２３６）を形質転換した。形質転換処理した細胞をアンピシリンを含有するＬＢプレートに塗抹し、３７℃で一晩培養した。プレート上に形成したコロニーをアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌して、一晩培養した後、菌体を回収してＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してプラスミド（ＢＬＰ／ｐＨＹ）を抽出した。抽出したＢＬＰ／ｐＨＹを鋳型としてプライマーペアΔＳ２３７Ｎ＿ｆｗ／ΔＳ２３７Ｎ＿ｒｖ（配列番号１３及び１４）を用いてＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０８  Ｐｒｅｍｉｕｍ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換した。形質転換処理した細胞をアンピシリンを含有するＬＢプレートに塗抹し、３７℃で一晩培養した。プレート上に形成したコロニーをアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌して、一晩培養した後、菌体を回収してＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してプラスミド（ＢＬＰ２／ｐＨＹ）を抽出した。
【００５６】
（１−２）酵素産生形質転換株の作製
１ｍＬのＬＢ培地に枯草菌１６８株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８株：Ｎａｔｕｒｅ，３９０，１９９７，ｐ．２４９）を植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩振盪培養した。１ｍＬの新たなＬＢ培地にこの培養液を１０μＬ植菌して３７℃、２００ｒｐｍで３時間培養した。この培養液を遠心分離してペレットを回収した。ペレットに４ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（ＳＩＧＭＡ）を含むＳＭＭＰ［０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｍｅｄｉｕｍ  ３（Ｄｉｆｃｏ）］を５００μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次に遠心分離によりペレットを回収し、４００μＬのＳＭＭＰに懸濁した。懸濁液１３μＬ、（１−１）で得たプラスミドＢＬＰ２／ｐＨＹ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、３４．２ｎｇ／μＬ）２μＬ、ＳＭＭＰ２０μＬを混合し、さらに１００μＬの４０％ＰＥＧを加え攪拌し、さらにＳＭＭＰを３５０μＬ加えた後、３０℃で１時間振盪した。この液２００μＬをテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、ＳＩＧＭＡ）を含むＤＭ３再生寒天培地［０．８％寒天（和光純薬）、０．５％コハク酸２ナトリウム６水塩、０．５％カザミノ酸テクニカル（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水塩、０．０１％牛血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ）、０．５％カルボキメチルセルロース、０．００５％トリパンブルー（Ｍｅｒｃｋ）及びアミノ酸混液（トリプトファン、リジン、メチオニン各１０μｇ／ｍＬ）；％は（ｗ／ｖ）％］に塗抹して３０℃で３日間インキュベートし、形成したコロニーを取得した。
【００５７】
（１−３）形質転換株培養による酵素製造
ＬＢ培地に終濃度１５ｐｐｍとなるようにテトラサイクリンを添加した。この培地５ｍＬに（１−２）で得た枯草菌形質転換体コロニーを植菌した後、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。翌日この培養液４００μＬを２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン、６ｐｐｍ硫酸亜鉛七水和物；％は（ｗ／ｖ）％）２０ｍＬに植菌し、３２℃、２３０ｒｐｍで２日間培養した後、菌体から産生された酵素を含む培養上清を遠心分離により回収した。
【００５８】
（２）ＬａｓＡを含む培養上清の調製
ＬａｓＡ遺伝子（配列番号３）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＬａｓＡ／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＬａｓＡ／ｐＵＣ５７を鋳型とし、プライマーペアＬａｓＡ＿Ｆ／ＬａｓＡ＿ＣＲ（配列番号１５及び１６）を使用して、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）のプロトコルに従いＰＣＲ反応を行った。ＷＯ２００６／０６８１４８  Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーペアｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｆ／ｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｒ＿ＮＥＷ（配列番号１７及び１８）を使用して、同様にＰＣＲ反応を行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理を行った。続いてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うことでプラスミド（ＬａｓＡ／ｐＨＹ）溶液を得た。
【００５９】
得られたプラスミド（ＬａｓＡ／ｐＨＹ）溶液を用いて、上記（１−２）と同様の手順で枯草菌ｐｒｓＡ遺伝子発現強化株（特開２００７−４９９８６号公報の実施例１において作製されたｐｒｓＡ−Ｋｃ株）の形質転換を行い、枯草菌形質転換体コロニーを取得した。２×Ｌ液体培地に終濃度１５ｐｐｍとなるようにテトラサイクリンを添加した。この培地５ｍＬに枯草菌形質転換体コロニーを植菌した後、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。培養液からペレットを回収し、ペレットからプラスミドＬａｓＡ／ｐＨＹを抽出した。抽出したプラスミドＬａｓＡ／ｐＨＹを鋳型として、プライマーペアＬａｓＡ＿Ｃｈｉｓ＿ｎ＿Ｆ／ＬａｓＡ＿Ｃｈｉｓ＿ｎ＿Ｒ（配列番号１９及び２０）、ならびにＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用して、ＰＣＲ反応、Ｄｐｎ  Ｉによるプラスミドの消化、及びライゲーションを行い、プラスミド（ＬａｓＡ２／ｐＨＹ）を得た。
【００６０】
得られたプラスミド（ＬａｓＡ２／ｐＨＹ）を使用して、上記（１−２）と同様の方法で形質転換を行った。このとき宿主として枯草菌ｐｒｓＡ遺伝子発現強化株（特開２００７−４９９８６号公報の実施例１において作製されたｐｒｓＡ−Ｋｃ株）を使用した。次いで、得られた形質転換株を（１−３）と同様の手順で培養し、菌体から産生された酵素を含む培養上清を回収した。
【００６１】
（３）ＡｈＰを含む培養上清の調製
ＡｈＰ遺伝子（配列番号５）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＡｈＰ／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＡｈＰ／ｐＵＣ５７を鋳型とし、プライマーペア２Ｆ／２Ｒ＿ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃｈｉｓ（配列番号２１及び２２）を使用して、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）のプロトコルに従いＰＣＲ反応を行った。ＷＯ２００６／０６８１４８  Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーペアｖｅｃｔｏｒ−Ｆ／ｖｅｃｔｏｒ−Ｒ（配列番号１１及び２３）を使用して、同様にＰＣＲ反応を行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理を行った。続いてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うことでプラスミド（ＡｈＰ／ｐＨＹ）溶液を得た。
【００６２】
得られたプラスミド（ＡｈＰ／ｐＨＹ）を使用して、上記（１−２）と同様の方法で形質転換を行った。このとき宿主として枯草菌１６８株を使用した。次いで、得られた形質転換株を（１−３）と同様の手順で培養し、菌体から産生された酵素を含む培養上清を回収した。
【００６３】
（４）ＡＬＥ−１を含む培養上清の調製
Ｍ２３ＢサブファミリープロテアーゼであるALE-1 glycylglycine endopeptidase（ＡＬＥ−１）（MEROPS ID：M23.012；配列番号８）を調製した。ＡＬＥ１遺伝子（配列番号７）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＡＬＥ１／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＡＬＥ１／ｐＵＣ５７を鋳型とし、プライマーペアｐＨＹ−ｌｉｋｅ６−ｊｕｓｔ−Ｆ／ｐＨＹ−ｌｉｋｅ６−ｊｕｓｔ−ＣＨｉｓＲ（配列番号２４及び２５）及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用してＰＣＲ反応を行った。ＷＯ２００６／０６８１４８  Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーペアｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｆ／ｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｒ＿ＮＥＷ（配列番号１７及び１８）を使用して、同様にＰＣＲ反応を行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理を行った。続いてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うことでプラスミド（ＡＬＥ１／ｐＨＹ）溶液を得た。
【００６４】
得られたプラスミド（ＡＬＥ１／ｐＨＹ）を使用して、上記（１−２）と同様の方法で枯草菌１６８株の形質転換を行い、枯草菌形質転換体コロニーを取得した。２×Ｌ液体培地に終濃度１５ｐｐｍとなるようにテトラサイクリンを添加した。この培地５ｍＬに枯草菌形質転換体コロニーを植菌した後、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。培養液からペレットを回収し、ペレットからプラスミドＡＬＥ１／ｐＨＹを抽出した。抽出したプラスミド（ＡＬＥ１／ｐＨＹ）を使用して、上記（１−２）と同様の方法で形質転換を行った。このとき宿主として枯草菌Ｄｐｒ９株（特開２００６−１７４７０７号公報の実施例１〜５において作製されたＫａｏ９株）を使用した。得られた形質転換株を（１−３）と同様の手順で培養し、菌体から産生された酵素を含む培養上清を回収した。
【００６５】
（５）培養上清からのプロテアーゼの調製
（１）〜（４）で得た培養上清から目的のプロテアーゼを調製した。培養上清をアミコンウルトラ  分画分子量１０Ｋ（メルクミリポア）を用いてＢｕｆｆｅｒＡでバッファー交換した。バッファー交換後の液から、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ（ＧＥヘルスケア）を用いて酵素を調製した。まず該バッファー交換で得られた液をカラム１に通し、次いでＢｕｆｆｅｒＢを使用してカラム１の吸着成分を溶出させた。溶出分画のうちＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧ（参考例５）の分解活性が認められる分画液を回収した。続いて、回収した分画液を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌの溶液で平衡化したカラム２を用いてＳｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙにかけ、ＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧの分解活性が認められる分画液を回収した。回収した分画液をアミコンウルトラ  分画分子量１０Ｋを用いて２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液でバッファー交換し、目的のプロテアーゼを含む酵素溶液を得た。各培養上清に使用したＢｕｆｆｅｒＡ、ＢｕｆｆｅｒＢ、カラム１、及びカラム２は、表２のとおりとした。
【００６６】
【表２】
2019122301.tif 000003
【００６７】
参考例２  酵素溶液の濃度測定
酵素溶液の濃度測定にはＤＣプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。タンパク質量算出のための標準液にはＢＳＡ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＷＡＫＯ）を用いた。
【００６８】
参考例３  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
５０ｍＭジチオトレイトール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む２×Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１６１−０７３７）と試料溶液を等量混合し、１００℃で５分間加熱することで泳動サンプルを調製した。この泳動サンプルをＡｎｙ  ｋＤTMミニプロティアン（登録商標）ＴＧＸTMプレキャストゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）及び１０倍希釈した１０×トリス／グリシン／ＳＤＳ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１６１０７３２）を用いて電気泳動した。分子量マーカーにはプレシジョン  Ｐｌｕｓ  プロテインTM２色スタンダード（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１６１−０３７４）を使用した。泳動後のゲルはＣＢＢ染色又はルビー染色した。ＣＢＢ染色にはＢｉｏ−Ｓａｆｅ  ＣＢＢ  Ｇ−２５０ステイン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１６１−０７８６）を使用した。ルビー染色にはＯｎｅ−ｓｔｅｐ  Ｒｕｂｙ（ＡＰＲＯ  ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＳＰ−４０４０）を使用した。分子量マーカーの分子量と移動度から作成できる検量線の式に、目的タンパク質又はポリペプチドの移動度を代入することで得られた値を、該目的タンパク質又はポリペプチドの分子量とした。サンプルの移動度（Ｒｆ値）は、該サンプルを流したレーンにおける、ゲルの上端（サンプルをアプライした位置）から先行色素（ブロモフェノールブルー）までの距離を１としたときの、該ゲルの上端から該サンプルのバンドまでの距離の相対値として計測した。
【００６９】
参考例４  ケラチンサンプルの調製
（１）襟袖汚れ付着布の回収
ワイシャツの襟の領域に布（組成：ポリエステル６５％、綿３５％）を縫い合わせたものを準備した。このシャツを成人男性に３日間にわたって日中に着用させることで襟袖汚れ付着布を回収した。
【００７０】
（２）ケラチン溶液の調製
（１）で得られた襟袖汚れ付着布を細断し、５０ｍＭジチオトレイトール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む２×Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１６１−０７３７）に浸漬して、１００℃で１０分間加熱した後、遠心分離し、上清を回収した。この上清を用いて、参考例３に記載の手順でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（ただしさらなる２×Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒの添加と加熱、及び染色は行っていない）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを脱イオン水中で振とうした後、マーカーを目安に分子量７５，０００〜１００，０００の領域のゲルを切り出した。切り出したゲルは薬さじで砕いた後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で一晩振とうした。振とう後の溶液はアトプレップＭＦ（ＡＴＴＯ、３５２１３７０）を用いてゲルを除去した。ゲル除去後の溶液を、アミコンウルトラ  分画分子量１０Ｋ（メルクミリポア）を用いて濃縮し、ケラチン溶液を得た。得られたケラチン溶液のタンパク質濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ２８０で測定したところ、０．１４ｍｇ／ｍＬであった。
【００７１】
（３）ケラチン画分の評価
（２）で得られたケラチン溶液に含まれるケラチン画分を、抗ケラチン抗体によるウェスタンブロッティングで評価した。ウェスタンブロッティングでは、ケラチン溶液を参考例３に記載の手順でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（未染色）にかけた後、ゲルをトランスブロットＴｕｒｂｏTMシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とトランスブロットＴｕｒｂｏTMミニ  ＰＶＤＦ転写パック（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１７０−４１５６）を用いてＰＶＤＦ膜へ転写した。抗体反応にはＩｂｉｎｄ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。１次抗体としてＫＲＴ１０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｍ０１），ｃｌｏｎｅ  １Ｈ６（Ａｂｎｏｖａ）、２次抗体としてＳｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ（Ｈ＋Ｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃３２４３０）、検出試薬としてＥＣＬ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア）を使用した。ウェスタンブロッティングの結果、（２）で調製したケラチン溶液がケラチン１０を含むことが確認された（図１）。
【００７２】
参考例５  酵素活性の測定
基質として、蛍光基Ｎｍａと消光基Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）の間がペンタグリシンであるＦＲＥＴ基質[以下ＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧ]（ピーエイチジャパンにて受注生産）を用いた。ここでＮｍａとは２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイル（Ｎｍａ）を指す。またＬｙｓ（Ｄｎｐ）とは２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）をリシン（Ｌｙｓ）の側鎖に有するものを指す。９６穴のアッセイプレート（ＡＧＣテクノグラス、３８８１−０９６）に参考例１（５）で得た酵素溶液（酵素、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を１９０μＬ添加し、さらにＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧ溶液（１ｍＭ  ＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を１０μＬ添加して反応液を調製した。ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて温度３０℃、励起波長３４０ｎｍ、測定波長４４０ｎｍにて反応液の蛍光強度を経時で測定した。同じ反応条件で、酵素溶液の代わりに２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５液、ＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧの代わりにジメチルスルホキシドで溶かしたＦＲＥＴＳ−２５−ＳＴＤ１（ペプチド研究所、３７２０−ｖ）を用いた反応液の蛍光強度を測定し、検量線を作成した。１ユニット（Ｕ）の活性は、１分間あたりに、１ｎｍｏｌのＦＲＥＴＳ−２５−ＳＴＤ１による蛍光強度に相当する蛍光強度の変化を示すのに必要な酵素量とした。
【００７３】
実施例１  トリプシンとＢＬＰによるケラチンの分解
参考例４で調製したケラチン溶液３０μＬに酵素溶液を１μＬ添加した。酵素は、トリプシン（ＳＩＧＭＡ、Ｔ１４２６−１００ＭＧ）又は参考例１で調製したＢＬＰを使用した。酵素の終濃度は２μｇ／ｍＬに調整した。反応液を３０℃で３時間静置した後、参考例３に記載の手順でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ルビー染色）を行った。
【００７４】
結果を図２に示す。トリプシンを添加したサンプルでは、ケラチン由来のバンドが消失していた。トリプシン分解されたケラチン断片のバンドが検出されなかったのは、トリプシンによりケラチンが様々な分子量の断片へと分解されたことで検出限界以下となったためか、断片が低分子化したためにゲルの外へと流出したためであると考えられた。一方、ＢＬＰを添加したサンプルでは、分子量３７，０００マーカーと分子量５０，０００マーカーの間にケラチン断片のバンドが検出された。
【００７５】
実施例２  襟袖汚れ付着布からのケラチン断片の調製
参考例４（１）で得た襟袖汚れ付着布３枚を１００ｍＬの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）に浸漬した。ここに終濃度が３μｇ／ｍＬとなるように参考例１で調製したＢＬＰを添加した後、マグネチックスターラーで３時間撹拌した。この溶液を遠心分離（８，０００Ｇ、１５分）にかけて上清を回収した。回収後の溶液をアミコンウルトラ  分画分子量１０Ｋ（メルクミリポア）にて４０倍濃縮した後、遠心分離（１０，０００Ｇ、１０分）して上清を回収した。この上清を用いて参考例３に記載の手順でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）を行った。
【００７６】
結果を図３に示す。ＢＬＰを添加したサンプルから、実施例１と同様に、分子量３７，０００マーカーと分子量５０，０００マーカーの間にバンドが検出された。これは、汚れ付着布に含まれていた水溶性又は不溶性ケラチン、及び角質細胞に存在するタンパク質と複合体を形成したケラチン等からＢＬＰにより生成されたケラチン断片であると考えられた。すなわち、生体から採取したケラチン含有サンプルから、予め変性剤や活性剤の添加、及び加熱などの操作を行わなくとも、ＢＬＰにより水溶性のケラチン断片を生成できることが示された。
【００７７】
実施例３  酵素によるケラチン分解活性の評価
（１）ケラチン溶液の調製
参考例１で調製した各種酵素のケラチン分解活性を調べた。ヒトの踵から、ベルベットスムーズ電動角質リムーバー  ダイヤモンド（レキットベンキーザー）を使用して角質を削り出した。踵角質５ｍｇに対し、１ｍＬの可溶化液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２％ＳＤＳ、２５ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、１００℃で１０分間加熱した後、遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を、Ｍｉｎｉ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｋｉｔ  ８ｋＤａ  ｃｕｔ−ｏｆｆ  ２ｍＬ（ＧＥヘルスケア、＃８０−６４８４−３２）を用いて、透析バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％ＳＤＳ）に対して一晩透析し、ケラチン溶液を得た。
【００７８】
（２）ケラチン画分の評価
得られたケラチン溶液を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２０倍希釈して、参考例３〜４と同様の手順に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）とウェスタンブロッティングにより評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングによる評価の結果、踵角質から調製したケラチン溶液がケラチン１０を含むことが確認された（図４）。図４では複数のバンドが検出されたが、これらは単量体のケラチン１０の他に、複合体化したケラチン１０、修飾されたケラチン１０、ケラチン１及び他の種類のケラチン等であると考えられた。
【００７９】
（３）酵素によるケラチン分解
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２０倍希釈したケラチン溶液３０μＬに対し、酵素溶液を１μＬ添加した。酵素としては、参考例１で調製したＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ及びＡＬＥ−１、ならびにＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ（Ｗａｋｏ、＃１２０−０４３１３）を使用した。酵素の終濃度は、ＢＬＰが１μｇ／ｍＬ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＡＬＥ−１及びＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎが１０μｇ／ｍＬとなるように調整した。反応液を３０℃で１５時間静置した後、参考例３の手順に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）にて評価した。
【００８０】
結果を図５に示す。Ｍ２３Ａサブファミリーの酵素であるＢＬＰ、ＬａｓＡ又はＡｈＰを添加した溶液では、分子量３７，０００マーカーと分子量５０，０００マーカーの間にバンドが検出され、これらの酵素がケラチンを分解したことが示された。一方で、Ｍ２３Ｂサブファミリーの酵素であるＡＬＥ−１又はＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎを添加した溶液ではケラチンの分解が見られなかった。すなわち、Ｍ２３ファミリーのなかでもＭ２３Ａサブファミリーの酵素のみがケラチンを分解することが示された。
【００８１】
実施例４  ＢＬＰのケラチン分解能の評価
実施例３と同様の手順で調製したケラチン溶液１００μＬに対し、参考例１で調製したＢＬＰ（１００μｇ酵素／ｍＬ）を１μＬ添加した。得られた溶液を２つに分け、それぞれを３０℃で８時間静置した。その後、一方の溶液は、２５ｍＭジチオトレイトール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）入りの２×Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１６１−０７３７）と等量混合した後、１００℃で５分間加熱して反応を停止させた。もう一方の溶液は、さらに同じＢＬＰ（１００μｇ酵素／ｍＬ）を１μＬ添加し、３０℃で１５時間静置した。静置後のサンプルは２５ｍＭジチオトレイトール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）入りの２×Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１６１−０７３７）と等量混合した後、１００℃で５分間加熱して反応を停止させた。それぞれの反応液を、参考例３の手順に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色、ただし、さらなる２×Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒの添加と加熱は行っていない）にて評価した。
【００８２】
結果を図６に示す。ＢＬＰ添加により溶液中のケラチンの分子量が低下した。ＢＬＰ添加８時間後と１５時間後の溶液ではいずれも、分子量３７，０００マーカーと分子量５０，０００マーカーの間にケラチン断片のバンドが検出された。一方、ＢＬＰ添加８時間後と１５時間後の溶液でケラチン断片の分子量は変化していなかった。これらのことから、ＢＬＰがケラチン分解活性を有すること、及び分子量３７，０００〜５０，０００の間に位置するケラチン断片のさらなる分解がＢＬＰによって進行しないことが示唆された。
【００８３】
実施例５  Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼによる角質細胞由来不溶性画分のケラチンの可溶化
テープ（ニチバン、ＣＴ−２４）を２ｃｍ使用して、テープストリッピングによりヒトの首から角質を取得した。この角質に可溶化液（１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２％ＳＤＳ、２５ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、１００℃で１０分加熱した後、遠心分離し、上清を除去して沈殿物を得た。沈殿物に対して該可溶化液の添加、加熱、遠心分離の操作をさらに２回行うことで、角質細胞由来の不溶性画分を得た。得られた不溶性画分に２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を４０μＬ添加し、さらに酵素溶液を１μＬ添加した。酵素としては、参考例１で調製したＢＬＰ、ＬａｓＡ、及びＡｈＰを使用した。酵素の終濃度は、ＢＬＰは１μｇ／ｍＬ、ＬａｓＡ及びＡｈＰは１０μｇ／ｍＬに調整した。反応液を３０℃で１５時間静置した後、参考例３の手順に従って、上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ルビー染色）を行った。
【００８４】
結果を図７に示す。ＢＬＰ、ＬａｓＡ及びＡｈＰを添加した溶液では、いずれも分子量３７，０００マーカーと分子量５０，０００マーカーの間にバンドが検出され、これらの酵素が角質の不溶性画分中のケラチンをケラチン断片へと分解したことが示された。
【００８５】
図７に示すとおり、ＢＬＰ添加溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥで、分子量３７，０００マーカーと分子量５０，０００マーカーの間に２つのバンドが検出された。このうち低分子側のバンドの質量分析を行った。質量分析には株式会社リバネスのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓを用いた。この質量分析サービスではタンパク質の消化にトリプシンを使用した。質量分析の結果、低分子側のバンドに含まれるタンパク質はケラチン１０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＿ＡＡＨ３４６９７）の断片であることが判明した。また、図８に示すように、質量分析で同定されたペプチド配列（太字）は、いずれもケラチン１０のアミノ酸配列（配列番号２６）のアミノ酸番号１５７から４５０の間に存在する領域に対応していた。Ｋｅｒａｔｉｎ，  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  １０［ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ＿Ｐ１３６４５］に公開されている情報によると、ケラチン１０は、そのアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜１４５がヘッド領域、アミノ酸番号１４６〜４５６がロッド領域、アミノ酸番号４５７〜５８４がテイル領域である。したがって、本実施例で得られたケラチン断片がケラチン１０のロッド領域を含むことが示された。
以上より、ＢＬＰ及び他のＭ２３Ａサブファミリーの酵素が、ケラチン１０のアミノ酸配列（配列番号２６）の１〜１５６番アミノ酸領域、又は４５１〜５８４番アミノ酸領域を切断することで、角質不溶性画分中に含まれるケラチン１０のロッド領域を含む断片を生成することが判明した。
【００８６】
以上、本発明の実施形態を説明したが、これらが、本発明を、説明した特定の実施形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内にある様々な他の変更及び修正は当業者には明白である。本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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