(57)【要約】【課題】安全性が担保された食物由来の化合物を使用した、治療予防効果に優れたアルツハイマー病の治療予防剤を提供する。【解決手段】第１の有効成分としてのフェルラ酸（ＦＡ）及びその薬理的に許容された塩からなる群から選択された少なくとも一種の化合物と、第２の有効成分としての没食子酸エピガロカテキン（ＥＧ）及びその薬理的に許容される塩からなる群から選択された少なくとも一種の化合物とを組み合わせ、ＦＡとＥＧとを併用投与するアルツハイマー病の治療予防剤であって、上記第１の有効成分と上記第２の有効成分との質量比が、上記第１の有効成分の質量をフェルラ酸の質量に換算し、上記第２の有効成分の質量を没食子酸エピガロカテキンの質量に換算して、１：１０〜１０：１の範囲であることを特徴とするアルツハイマー病の治療予防剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の有効成分としてのフェルラ酸及びその薬理的に許容された塩からなる群から選択された少なくとも一種の化合物と、
第２の有効成分としての没食子酸エピガロカテキン及びその薬理的に許容される塩からなる群から選択された少なくとも一種の化合物と
を組み合わせてなるアルツハイマー病の治療予防剤であって、
前記第１の有効成分と前記第２の有効成分との質量比が、前記第１の有効成分の質量をフェルラ酸の質量に換算し、前記第２の有効成分の質量を没食子酸エピガロカテキンの質量に換算して、１：１０〜１０：１の範囲であることを特徴とするアルツハイマー病の治療予防剤。
【請求項２】
前記第１の有効成分と前記第２の有効成分との両方を含む合剤である、請求項１に記載のアルツハイマー病の治療予防剤。
【請求項３】
前記第１の有効成分を含む治療予防剤と、前記第２の有効成分を含む治療予防剤と、からなるキットである、請求項１に記載のアルツハイマー病の治療予防剤。
【請求項４】
健康食品として経口投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアルツハイマー病の治療予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の治療予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
超高齢化社会を迎えつつある現在、医療機関を受診する認知症患者の数は急激に増加しており、２０１５年の世界アルツハイマー報告によると、２０１５年に全世界で４，６８０万人の認知症患者が生存し、２０５０年までに１億３，１５０万人に増加すると予想されている。この数値は２０年ごとに約２倍になる数値であり、認知症が世界規模で危機をもたらす疾患であると警告されている。このため、認知症に対する効果的な治療法と予防法とを確立することが急務となっている。
【０００３】
認知症の原因の最も多くを占めるアルツハイマー病は、認知機能の低下や精神神経機能の低下をきたす神経変性疾患であり、症状の重症度が増すと、摂食、着替え、意思疎通などが困難となり、最終的には寝たきりとなる。また、症状経過の途中で、被害妄想、幻覚、暴言、暴力などの周辺症状が起こり、介護時の問題となっている。アルツハイマー病の病態発生の原因として、アミロイド前駆体タンパク質の代謝異常に伴う脳内アミロイドβタンパク質（以下、アミロイド前駆体タンパク質を「ＡＰＰ」と表し、アミロイドβタンパク質を「Ａβ」と表す。）の凝集・沈着亢進（アミロイドカスケード仮説）、タウタンパク質の過剰リン酸化（タウ仮説）、グリア細胞・サイトカインサイクルの異常亢進（神経炎症性仮説）、活性酸素種の増加（フリーラジカル仮説）、アセチルコリン合成の低下（コリン性仮説）などが挙げられているが、結論には至っていない。
【０００４】
図４は、アルツハイマー病の発症・病態進行に関わる原因物質の１つとされているＡβの産生経路を示している。ＡβはＩ型膜貫通タンパク質であるＡＰＰからの段階的な酵素切断により産生される。第一段階として、ＡＰＰの細胞外領域がβ−セクレターゼにより酵素切断される。この切断により、Ｃ末端断片（β−ＣＴＦ，Ｃ９９：１２ｋＤａ）と可溶性のＮ末端断片（ｓＡＰＰ−β：〜１００ｋＤａ）が産生される。続いて、細胞膜に取り残されたβ−ＣＴＦの膜貫通領域でのγ−セクレターゼの複数回の酵素切断（ε，γそしてζ切断）により、Ｎ末端断片として４０アミノ酸ほどのＡβが産生される。産生されたＡβは、可溶性のモノマーからオリゴマータイプに移行する。オリゴマータイプのＡβは、シナプス毒性があり、行動・認知機能障害との関連性が強く示唆されている。最終的に、Ａβは、組織に沈着してβ-アミロイドタンパク質斑（老人斑）を形成するようになる。Ａβには、最終的な酵素切断により４０アミノ酸或いは４２アミノ酸で構成されるサブタイプが存在する。Ａβは、生理的条件下では、主として神経細胞の細胞膜に存在するＡＰＰから恒常的に低レベルで産生されている。脳内に沈着したＡβの一部はグリア細胞に取り込まれる。また、血液脳脊髄関門のクリアランスシステムを介して、脳内から脳脊髄液中或いは血清中に排除される。しかし、アルツハイマー病の患者脳では、これらのＡβの産生の亢進あるいは排除システムの障害により、脳内のＡβが増加して組織への沈着が進行する。
【０００５】
Ａβに着目したアルツハイマー病の治療法として、Ａβの凝集・沈着を抑制する方法、分解を促進する方法、神経毒性を軽減する方法、産生を軽減する方法、及び脳内から抹消血液への排出を促進する方法などが試されてきた（非特許文献１（Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１４，４６９（２００９））参照）。しかし、精力的な開発努力にも関わらず、医療機関で処方可能な新薬は２００３年以降生まれていない。この原因は、第Ｉ〜ＩＩＩ相の臨床試験において、前臨床試験で確認されなかった被験薬の毒性が発現したことや、前臨床試験の結果と同様の有効性が得られなかったことによるところが大きい。このような状況下で、安全性が担保されている食物由来の化合物の中から脳内Ａβの産生・沈着に影響する物質を探索することが重要であると考えられており、これまでにいくつかの化合物の使用が提案されている。
【０００６】
このうち、フェルラ酸（トランス−４−ヒドロキシ−３−メトキシ桂皮酸）は、人が摂取する食物の中に存在する最も豊富なフェノール化合物の一種であり、米、小麦、大麦等の穀類、トマト、ニンジン等の野菜、パイナップル、オレンジ等の果物に多く認められる化合物である。この化合物が、活性酸素除去作用、抗酸化作用、抗炎症作用を含む多様な生理活性を有する他、Ａβの凝集・沈着を抑制する作用を有することが知られている。非特許文献２（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，８，ｅ５５７７４（２０１３））は、アルツハイマー病の病態モデルマウスに対するフェルラ酸の投与により、マウスの過活動、物体認識障害等の行動学的障害が有意に改善されると共に、脳実質及び脳血管のＡβの沈着及びオリゴマーを含む種々のＡβ種の存在量が有意に減少し、フェルラ酸のβ−セクレターゼを標的としてアミロイド産生系を抑制する効果により、アルツハイマー病の病態を改善する有効性と安全性とが確認されたことを報告している。また、特許文献１（特表２００２−５４１１９４号公報）は、フェルラ酸を予め投与したマウスにおいて脳室内へのＡβの投与による記憶減少が効果的に防止されたことを報告している。さらに、フェルガード（登録商標）の名称で、フェルラ酸を有効成分の一種として含む健康食品が販売されている（非特許文献３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｏｖｉａ．ｃｏ．ｊｐ／ｉｎｆｏ／）参照）。
【０００７】
また、没食子酸エピガロカテキン（［（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル］３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート）は、植物の中で特に緑茶に最も豊富に含まれているカテキンの一種である。この化合物は多彩な生理活性作用を有し、強力な抗酸化作用及び抗炎症作用により癌を含む多くの疾患に対して治療効果を示すとの報告がある他、この化合物がＡβの凝集・沈着を抑制する作用を有することが知られている。非特許文献４（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２５，８８０７（２００５））は、アルツハイマー病の病態モデルマウスに対する没食子酸エピガロカテキンの投与により、Ａβ種の存在量及び老人斑が有意に減少し、没食子酸エピガロカテキンのα−セクレターゼを標的としてアミロイド非産生系を亢進する効果により、アルツハイマー病の病態を改善する有効性と安全性とが確認されたことを報告している。また、特許文献２（特開平１０−２４５３４２号公報）は、没食子酸エピガロカテキンを含む培地で培養したラット胎児脳の海馬神経細胞にＡβを添加して培養し、海馬神経細胞の生存率を測定した結果、没食子酸エピガロカテキンによりＡβによる神経細胞毒性が効果的に低減されたことを報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００２−５４１１９４号公報
【特許文献２】特開平１０−２４５３４２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１４，４６９（２００９）
【非特許文献２】ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，８，ｅ５５７７４（２０１３）
【非特許文献３】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｏｖｉａ．ｃｏ．ｊｐ／ｉｎｆｏ／
【非特許文献４】Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２５，８８０７（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したように、食物由来の化合物の使用は安全性が担保されている点で安心であるが、現在までに提案された化合物のアルツハイマー病の治療予防効果は必ずしも満足のいくものではなく、治療予防効果の向上が常に要請されている。
【００１１】
そこで、本発明の目的は、上述の要請に答えることができる、安全性が担保された食物由来の化合物を使用した、治療予防効果に優れたアルツハイマー病の治療予防剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明者らは、β−セクレターゼを標的としてアミロイド産生系を抑制する効果を有するフェルラ酸と、α−セクレターゼを標的としてアミロイド非産生系を亢進する効果を有する没食子酸エピガロカテキンとを、所定の比率で組み合わせることにより、アルツハイマー病の治療予防効果が格段に向上し、アルツハイマー病が発病していない状態に到るまでの治療効果が期待されることを発見し、発明を完成させた。
【００１３】
したがって、本発明は、第１の有効成分としてのフェルラ酸及びその薬理的に許容された塩からなる群から選択された少なくとも一種の化合物と、第２の有効成分としての没食子酸エピガロカテキン及びその薬理的に許容される塩からなる群から選択された少なくとも一種の化合物とを組み合わせてなるアルツハイマー病の治療予防剤であって、上記第１の有効成分と上記第２の有効成分との質量比が、上記第１の有効成分の質量をフェルラ酸の質量に換算し、上記第２の有効成分の質量を没食子酸エピガロカテキンの質量に換算して、１：１０〜１０：１の範囲であることを特徴とするアルツハイマー病の治療予防剤に関する。本発明では、上記第１の有効成分と上記第２の有効成分との質量比を求める際に、フェルラ酸或いは没食子酸エピガロカテキンが塩を構成している場合には、これらの塩の質量を同モルのフェルラ酸或いは没食子酸エピガロカテキンの質量に換算して、質量比を算出する。
【００１４】
β−セクレターゼを標的としてアミロイド産生系を抑制する効果を有する化合物と、α−セクレターゼを標的としてアミロイド非産生系を亢進する効果を有する化合物と、の異なる作用機序を有する化合物の併用効果に関する知見はこれらでのところ得られておらず、上記第１の有効成分と上記第２の有効成分との併用効果を予測することはできなかった。また、フェルガード（登録商標）の中に酸化防止剤として没食子酸エピガロカテキンを含む緑茶抽出物を配合したものが存在するが、フェルラ酸に対する没食子酸エピガロカテキンの割合は数％以下であり、併用効果を確認可能な量ではない。本発明における上記第１の有効成分と上記第２の有効成分との質量比は、上記第１の有効成分の質量をフェルラ酸の質量に換算し、上記第２の有効成分の質量を没食子酸エピガロカテキンの質量に換算して、１：１０〜１０：１の範囲であるが、好ましくは２：１０〜１０：２の範囲であり、より好ましくは５：１０〜１０：５の範囲であり、特に好ましくは８：１０〜１０：８の範囲である。
【００１５】
本発明のアルツハイマー病の治療予防剤を製剤化する場合には、上記第１の有効成分と上記第２の有効成分との両方を含む合剤の形態であっても良く、上記第１の有効成分を含む治療予防剤と、上記第２の有効成分を含む治療予防剤と、からなるキットの形態であっても良い。合剤及びキットを構成する各治療予防剤には、本発明の効果に悪影響を及ぼさない限りにおいて、第１の有効成分及び第２の有効成分以外の成分が含まれていても良い。キットの形態である場合には、投与される順番に制限はなく、いずれの治療予防剤が先に投与されても良い。
【００１６】
上記キットを構成する各治療予防剤の成分を合計すると、フェルラ酸及びその薬理的に許容された塩からなる群から選択された少なくとも一種の化合物と没食子酸エピガロカテキン及びその薬理的に許容される塩からなる群から選択された少なくとも一種の化合物との質量比は、上述したようにフェルラ酸及び没食子酸エピガロカテキンに換算して、１：１０〜１０：１、好ましくは２：１０〜１０：２、より好ましくは５：１０〜１０：５、特に好ましくは８：１０〜１０：８の範囲である。本発明はまた、このようなキットを構成するための、フェルラ酸及びその薬理的に許容された塩からなる群から選択された少なくとも一種の化合物を有効成分として含むアルツハイマー病の治療予防剤、及び、没食子酸エピガロカテキン及びその薬理的に許容される塩からなる群から選択された少なくとも一種の化合物を有効成分として含むアルツハイマー病の治療予防剤に関する。
【００１７】
本発明のアルツハイマー病の治療予防剤は、経口及び非経口のいずれの形態でも投与することができ、医薬品、医薬部外品、健康食品（サプリメントを含む。）等の形態で投与することができる。安全性が担保された食物由来の化合物を使用しているため、多量を継続的に投与することができ、簡便さの点から健康食品として経口投与されるのが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のアルツハイマー病の治療予防剤によると、アルツハイマー病の治療予防効果が格段に向上し、アルツハイマー病が発病していない状態に到るまでの治療効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】アルツハイマー病の病態モデルマウス及び野生型マウスに、フェルラ酸、没食子酸エピガロカテキン、及び両者を投与したときの、エピソード記憶の指標としての認識頻度の変化を評価した結果を示した図であり、（Ａ）はトレーニングフェーズの試験における認識頻度を、（Ｂ）はリテンションフェーズの試験における認識頻度を、それぞれ示している。
【図２】アルツハイマー病の病態モデルマウス及び野生型マウスに、フェルラ酸、没食子酸エピガロカテキン、及び両者を投与したときの、Ｙ−迷路試験の結果を示した図であり、（Ａ）は各迷路への総進入回数を、（Ｂ）は自発的交替行動率を、それぞれ示している。
【図３】アルツハイマー病の病態モデルマウスに、フェルラ酸、没食子酸エピガロカテキン、及び両者を投与した後の大脳組織片におけるＡβの存在量を評価した結果を示した図であり、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれ、Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）溶液可溶画分、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液可溶画分、及び塩酸グアニジン溶液可溶画分におけるＡβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）の量を測定した結果を示しており、（Ｄ）はＳＤＳ溶液可溶画分におけるＡβオリゴマーの量を測定した結果を示している。
【図４】アミロイドβタンパク質の産生経路を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のアルツハイマー病の治療予防剤は、β−セクレターゼを標的としてアミロイド産生系を抑制する効果を有する第１の有効成分としてのフェルラ酸及びその薬理的に許容された塩からなる群から選択された少なくとも一種の化合物と、α−セクレターゼを標的としてアミロイド非産生系を亢進する効果を有する第２の有効成分としての没食子酸エピガロカテキン及びその薬理的に許容される塩からなる群から選択された少なくとも一種の化合物と、を所定の質量比で組み合わせてなる。この併用投与により、アルツハイマー病の治療予防効果が格段に向上し、アルツハイマー病が発病していない状態に到るまでの治療効果が期待される。
【００２１】
フェルラ酸は、これを含む植物、例えば、米、小麦、大麦等の穀類、トマト、ニンジン等の野菜、パイナップル、オレンジ等の果物から抽出することができ、米から抽出するのが好ましい。この他、フェルラ酸を化学合成により得ることもでき、商業的に入手することもできる。本発明では、植物からの抽出方法としては、公知の抽出方法を特に限定なく使用することができるが、例えば、米糠より得られる米糠油を精製する過程で生じる米糠ピッチをアルカリ加水分解し、溶剤抽出してフェルラ酸の粗結晶を得、この粗結晶を精製する方法を挙げることができる。化学合成によってフェルラ酸を得る方法としては、例えば、バニリン（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンズアルデヒド）とマロン酸とをピペリジン存在下ピリジン中で縮合脱炭酸させる方法を挙げることができる。
【００２２】
フェルラ酸は、塩とすることにより水溶性を向上させ、生理学的有効性を増大させることができる。フェルラ酸の塩としては、薬理的に許容される塩であれば特に限定がなく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、アルギニン塩、リジン塩等の塩基性アミノ酸塩、モノエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩等のアミン塩が挙げられる。特にアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩が好ましい。
【００２３】
なお、フェルラ酸及びその塩は、薬理的に許容される溶媒和物、例えば、水やアルコール類の溶媒和物の形態で存在しても良い。また、フェルラ酸は、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、好ましくはγ−シクロデキストリンとの包接化合物の形態で存在しても良い。
【００２４】
没食子酸エピガロカテキンは、例えば、緑茶葉の抽出液から、高速液体クロマトグラフィー、合成吸着剤クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びゲルろ過等の手法により単離することができ、商業的に入手することもできる。本発明では、緑茶葉からの抽出方法として、公知の抽出方法を特に限定なく使用することができるが、例えば、緑茶葉から熱水、メタノール水溶液、エタノール水溶液或いはアセトン水溶液で抽出し、得られた抽出液を有機溶媒に転溶した後濃縮する方法が挙げられる。
【００２５】
没食子酸エピガロカテキンは、薬理的に許容される塩の形態であっても良い。塩としては、例えば、アルカリ金属（ナトリウム、カリウム等）の塩及びアルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウム等）の塩が挙げられる。また、没食子酸エピガロカテキン又はその塩は、薬理的に許容される溶媒和物、例えば、水やアルコール類の溶媒和物の形態で存在しても良い。
【００２６】
本発明のアルツハイマー病の治療予防剤では、上記第１の有効成分と上記第２の有効成分とが、１：１０〜１０：１、好ましくは２：１０〜１０：２、より好ましくは５：１０〜１０：５、特に好ましくは８：１０〜１０：８の質量比で組み合わせられている。上記第１の有効成分と上記第２の有効成分との併用投与により、アルツハイマー病の治療予防効果が格段に向上し、以下の実施例に示すように、アルツハイマー病が発病していない状態に到るまでの治療効果が期待される。
【００２７】
本発明のアルツハイマー病の治療予防剤は、経口及び非経口のいずれの形態でも投与することができ、医薬品、医薬部外品、健康食品（サプリメントを含む。）等の形態で投与することができる。安全性が担保された食物由来の化合物を使用しているため、多量を継続的に投与することができる。簡便さの点からサプリメントとして経口投与されるのが好ましい。
【００２８】
製剤化する場合には、上記第１の有効成分と上記第２の有効成分との両方を含む合剤の形態であっても良く、上記第１の有効成分を含む治療予防剤と、上記第２の有効成分を含む治療予防剤と、からなるキットの形態であっても良い。キットの形態である場合には、投与される順番に制限はなく、いずれの治療予防剤が先に投与されても良く、各治療予防剤が連続的に投与されても良く時間を空けて投与されても良い。
【００２９】
合剤の場合も、キットを構成する各治療予防剤の場合も、使用目的に応じて、カプセル剤、チュアブル剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与用製剤、又は、注射剤、点滴剤、坐剤等の非経口投与用製剤の形態に製剤化することができる。キットの形態の場合には、各治療予防剤の剤型は同一であっても異なっていてもよい。
【００３０】
これらの製剤の製造において、上記第１の有効成分及び／又は上記第２の有効成分が、通常、使用目的に応じて選択される薬理的に許容される賦形剤、即ち、デキストリン、ラクトース等の固体賦形剤、水、塩水、グリセリン等の液体賦形剤と混合され、所定形状に剤型化される。これらの製剤には、本発明の効果に悪影響を与えない限り、他の成分、例えば、ビタミンＣ、ビタミンＥ等のビタミン類、鉄、亜鉛等のミネラル類、イチョウ葉エキス、ドコサヘキサエン酸等の機能性成分の他、結合剤、増粘剤、潤滑剤、香料、甘味料、緩衝剤、保存剤、抗菌剤等の慣用の添加物が含まれていても良い。
【００３１】
さらに、本発明のアルツハイマー病の治療予防剤は、ミネラルウェーター、清涼飲料水等の飲料、チーズ、ヨーグルト等の乳製品、ゼリー、ビスケット、キャンディー等の菓子類等の、各種飲食品に配合することもできる。  
【００３２】
本発明のアルツハイマー病の治療予防剤の投与量は、アルツハイマー病患者の症状、年齢、体重等や、投与形態、投与回数、他剤の併用等に応じて適宜決定することができるが、経口投与の場合には、成人１日あたり、上記第１の有効成分と上記第２の有効成分との合計量が、上述したようにフェルラ酸及び没食子酸エピガロカテキンに換算して、一般的には２０〜１０００ｍｇ、好ましくは１００〜７００ｍｇ、特に好ましくは２００〜５００ｍｇの範囲である。但し、上記第１の有効成分の投与量と、上記第２の有効成分の投与量とは、フェルラ酸及び没食子酸エピガロカテキンに換算して、１：１０〜１０：１、好ましくは２：１０〜１０：２、より好ましくは５：１０〜１０：５、特に好ましくは８：１０〜１０：８の質量比になるように選択されなければならない。
【００３３】
上述したキットを構成する各治療予防剤もまた、本発明におけるアルツハイマー病の治療予防剤として提供される。但し、これらの治療予防剤は、フェルラ酸及び没食子酸エピガロカテキンに換算して、１：１０〜１０：１、好ましくは２：１０〜１０：２、より好ましくは５：１０〜１０：５、特に好ましくは８：１０〜１０：８の範囲の質量比が確保されるように、別の治療予防剤と併用されなければならない。
【実施例】
【００３４】
本発明を以下の実施例を用いて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。なお、以下の実施例において、アルツハイマー病の病態モデルマウスとしてのヒトＡＰＰとプレセネリンの突然変異遺伝子を導入した遺伝子改変マウスを「ＰＳＡＰＰマウス」と表し、野生型マウスを「ＷＴマウス」と表し、フェルラ酸を「ＦＡ」と表し、没食子酸エピガロカテキンを「ＥＧ」と表し、フェルラ酸と没食子酸エピガロカテキンとの併用投与を「ＦＡＥＧ」と表す。また、ＦＡＥＧを投与されたＰＳＡＰＰマウスを「ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウス」と表し、ＥＧを投与されたＰＳＡＰＰマウスを「ＰＳＡＰＰ−ＥＧマウス」と表し、ＦＡを投与されたＰＳＡＰＰマウスを「ＰＳＡＰＰ−ＦＡマウス」と表し、ＥＧ及びＦＡを含まない蒸留水を与えられたＰＳＡＰＰマウスを「ＰＳＡＰＰ−Ｖマウス」と表す。さらに、ＦＡＥＧを投与されたＷＴマウスを「ＷＴ−ＦＡＥＧマウス」と表し、ＥＧを投与されたＷＴマウスを「ＷＴ−ＥＧマウス」と表し、ＦＡを投与されたＷＴマウスを「ＷＴ−ＦＡマウス」と表し、ＥＧ及びＦＡを含まない蒸留水を与えられたＷＴマウスを「ＷＴ−Ｖマウス」と表す。
【００３５】
（１）実験手順
（ａ）動物・投与群・飼育環境
雄性ＰＳＡＰＰマウス［Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＡＰＰｓｗｅ，ＰＳＥＮ１ｄＥ９）８５Ｄｂｏ／Ｍｍｊａｘ  ｍｉｃｅ［ｂｅａｒｉｎｇ  ＡＰＰ  “Ｓｗｅｄｉｓｈ”  ＡＰＰＫ５９５Ｎ／Ｍ５９６Ｌ（ＡＰＰｓｗｅ）ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  １（ＰＳ１）ｅｘｏｎ  ９  ｄｅｌｅｔｅｄ（ＰＳ１△Ｅ９）  ｍｕｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ］は、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から入手した。雄性ＰＳＡＰＰマウスを雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配し、この交配により雌性・雄性Ｆ１のＰＳＡＰＰマウス及びＷＴマウスを得た。実験に使用した全てのマウスの遺伝的背景は同系統のものを使用した。
【００３６】
ＦＡ及びＥＧは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）より入手し、蒸留水で溶解した。１２ヶ月齢のＷＴマウス及び行動・認知機能障害と脳アミロイド症を発症しているＰＳＡＰＰマウスに、胃ゾンデを用いて、ＦＡ（３０ｍｇ／ｋｇ（換算したヒト６０ｋｇ成人の投与量は１８０ｍｇ／ｄａｙ））、ＥＧ（３０ｍｇ／ｋｇ）、ＦＡＥＧ（ＦＡ３０ｍｇ／ｋｇ＋ＥＧ３０ｍｇ／ｋｇ）及び蒸留水を、１日１回３ヶ月間連続経口投与した。ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウス、ＰＳＡＰＰ−ＥＧマウス、ＰＳＡＰＰ−ＦＡマウス、及びＰＳＡＰＰ−Ｖマウスとして、各８匹（雄４匹，雌４匹）の合計３２匹を使用した。また、ＷＴ−ＦＡＥＧマウス、ＷＴ−ＥＧマウス、ＷＴ−ＦＡマウス、及びＷＴ−Ｖマウスとして、各８匹（雄４匹，雌４匹）の合計３２匹を使用した。各マウスを、特定病原体未感染（ＳＰＦ）区域で、１２時間／１２時間の明暗の照明サイクルの環境下で、餌と水とを自由摂取させて飼育した。
【００３７】
（ｂ）行動学的解析
新規物体認識及び記憶維持を評価するために、各薬剤又は蒸留水を投与されたマウスを４時間個別ケージに入れ、２種類の異なった形状の物体Ａ，Ｂを同時に１０分間ケージに入れた。最初の５分間に、マウスの鼻先が物体Ａ，Ｂに対して２ｃｍあるいはそれ以内に近づいた回数を、物体Ａ，Ｂを探索した回数（興味を持ったと評価される回数）として、それぞれＮＡ及びＮＢとして数え、エピソード記憶の指標としての認識頻度ＲＡＢ（％）を、
ＲＡＢ（％）＝ＮＢ／（ＮＡ＋ＮＢ）×１００
に従って算出した（トレーニングフェーズ）。２４時間後に、記憶維持を見るために、物体Ｂを別の形状の物体Ｃに換えて、５分間同様に各物体を探索した回数をそれぞれＮＡ及びＮＣとして数え、エピソード記憶の指標としての認識頻度ＲＡＣ（％）を、
ＲＡＣ（％）＝ＮＣ／（ＮＡ＋ＮＣ）×１００
に従って算出した（リテンションフェーズ）。
【００３８】
続いて、Ｙ−迷路への総進入回数及び自発的交換行動により、探索活動及び空間作業記憶を評価するため、光沢の無い灰色のアクリル製の放射状・対称性迷路で構成されたＹ−迷路（迷路の長さ４０ｃｍ，幅４ｃｍ，迷路壁の高さ４０ｃｍ）の１つの迷路にマウスを置き、各迷路への進入軌跡を記録（各迷路をＡ，Ｂ，Ｃと番号付けし、迷路に進入した軌跡をＡＢＣＣＡＢＢＣＡＡＣＡＢＡＣ・・・として記録）すると共に、各迷路への総進入回数を８分間記録した。自発的交替行動率Ａ（％）の算出は、自発的交替行動数（３回連続で異なる迷路のルートを選択した場合の回数）Ａ１及び各迷路への総進入回数Ａ２を用いて
Ａ（％）＝Ａ１／（Ａ２−２）×１００
に従って算出した。
【００３９】
（ｃ）Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ解析
３ヶ月経口投与後の１５ヶ月齢の時点で、ペントバルビタールナトリウム塩（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与により深麻酔下に安楽死した。ＥＬＩＳＡ解析のために、右側大脳半球を秤量して−８０℃にて凍結保存した。大脳組織片を、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）溶液にて、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてホモジェナイズし、４℃及び１８，８００Ｇの条件下で６０分間遠心分離し、上清をＴＢＳ溶液可溶画分として採取した。残ったペレットを、同様のプロテアーゼインヒビターカクテルを含む２％ＳＤＳ溶液にて、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＬＴを用いてホモジェナイズし、４℃及び１８，８００Ｇの条件下で６０分間遠心分離し、上清をＳＤＳ溶液可溶画分として採取した。さらに、残ったペレットを、５Ｍ塩酸グアニジン溶液にて、氷上で３０分間攪拌して溶解し、４℃及び１８，８００Ｇの条件下で６０分間遠心分離し、上清を塩酸グアニジン溶液可溶画分として採取した。Ａβ１−４０とＡβ１−４２の存在量は、ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔｓ（Ａβ１−４０：カタログ番号２７７１８、Ａβ１−４２：カタログ番号２７７１２，ＩＢＬ，Ｇｕｎｍａ，Ｊａｐａｎ）を用いて個別に測定した。ＳＤＳ溶液可溶画分におけるＡβオリゴマーの存在量は、Ａβ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（カタログ番号２７７２５，ＩＢＬ）を用いて測定した。全てのサンプルの測定値は検量線の線形範囲内を示した。
【００４０】
（ｄ）統計学的方法
全てのデータは、平均値±標準誤差で表した。各群間を多重比較する場合には、一元配置分散分析法（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を用い、群間比較のｐｏｓｔ  ｈｏｃテストとしてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法あるいはＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  Ｔ３法を用いた。どちらの分析結果を選択するかは、等分散性検定の結果により、ｐ＞０．０５の場合はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法の結果を、ｐ＜０．０５の場合はＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  Ｔ３法の結果をそれぞれ選択した。全ての統計解析の結果は、ｐ＜０．０５で有意差ありとした。統計解析は、ＳＰＳＳ，ｒｅｌｅａｓｅ  １９．０（ＩＢＭ，Ａｒｍｏｎｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて行った。
【００４１】
（２）結果
（ａ）行動・認知機能障害の改善効果
アルツハイマー病では、様々な行動・認知機能障害を発生し、病態進行により家庭・社会生活を行うことが困難となる。薬剤を評価する上で、行動・認知機能障害への有効性を評価することが重要である。新規物体認識及び記憶維持を評価する試験は、マウスの好奇心を利用した試験である。ケージに２つの異なる物体を入れると、通常マウスは両方の物体を気にして吻部を接触させる行動を示す。物体を覚えさせ、２４時間後に物体の一方を入れ替えた時の反応を観察する。新しい物体への探索行動の増減を測定し、記憶学習（新規物体認識能）の指標とする。
【００４２】
図１（Ａ）に結果を示すトレーニングフェーズの試験において、全ての８群は類似した認識頻度（ＲＡＢ：５０．３−５２．０％）を示した。しかし、図１（Ｂ）に結果を示すリテンションフェーズの試験において、ＰＳＡＰＰ−Ｖマウスは、前日の物体の記憶が乏しく、新しい物体に気づかないことから、同じ様に両方の物体に吻部を接触させる行動をとり、新規物体認識能の低下を示したが、ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウス、ＰＳＡＰＰ−ＥＧマウス及びＰＳＡＰＰ−ＦＡマウスは、入れ替えられた物体を新しい物体として認識し、新しい方の物体に吻部を接触させる行動を多くとり、新規物体認識能の改善を示した。
【００４３】
即ち、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡとｐｏｓｔ  ｈｏｃ解析の結果、ＰＳＡＰＰ−Ｖマウス群の認識頻度ＲＡＣは他の７群の認識頻度ＲＡＣに対して統計学的有意差（＊ｐ＜０．０５）を示し、ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウス、ＰＳＡＰＰ−ＥＧマウス及びＰＳＡＰＰ−ＦＡマウス（ＲＡＣ：６０．８−７１．６％）は、ＰＳＡＰＰ−Ｖマウス（ＲＡＣ：５０．０％）と比較して、有意に増加した新規物体認識頻度を示した。さらに、ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウス群は、ＰＳＡＰＰ−ＥＧマウス群及びＰＳＡＰＰ−ＦＡマウス群に対して有意に増加した新規物体認識頻度を示し（＋ｐ＜０．０５）、ＦＡとＥＧとの併用投与により相乗的な改善効果が認められた。ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウス群の認識頻度（ＲＡＣ：７１．６％）は、他の４群のＷＴマウス群の認識頻度（ＲＡＣ：７１．０−７１．５％）と統計的有意差が見られなかった（ｐ＞０．０５）。このことは、ＦＡＥＧの併用投与が、ＡＰＰ突然変異を発現しているＰＳＡＰＰマウスにおける新規物体認識障害を完全に改善したことを示している。
【００４４】
次にＹ−迷路試験の結果を示す。本来マウスは、Ｙ−迷路のルート選択をする際、直前に選択したルートとは異なるルートを選ぶ性質がある。Ａ・Ｂ・Ｃの３本の異なるルートを持つＹ−迷路にマウスを入れた場合、最初にＡを選択すると、次の行動は他のＢあるいはＣのルートを取る。Ｙ−迷路試験は、この性質を利用した探索活動性と短期記憶（空間作業記憶）を評価する試験である。この試験で、３回連続で異なるルートを選択した場合を「自発的交替行動」とした。記憶障害が発症すると、同じルートを何回も選ぶ傾向が高くなり、結果として自発的交替行動が低下する。
【００４５】
ＰＳＡＰＰ−Ｖマウスでは、過活動性を反映するＹ−迷路への総進入回数が増加し、短期記憶（空間作業記憶）障害を反映して自発的交替行動が低下した。一方、ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウス、ＰＳＡＰＰ−ＥＧマウス及びＰＳＡＰＰ−ＦＡマウスでは、過活動性が沈静化し（Ｙ−迷路への総進入回数の減少）、短期記憶（空間作業記憶）障害も改善した。
【００４６】
即ち、図２（Ａ）に示すように、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡとｐｏｓｔ  ｈｏｃ解析の結果、ＰＳＡＰＰ−Ｖマウス群は他の７群と比較してＹ−迷路への総進入回数の有意な増加を示した（＊ｐ＜０．０５。総進入回数は、ＰＳＡＰＰ−Ｖマウス群では４８．３回、ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウス群では２９．０回、ＰＳＡＰＰ−ＥＧマウス群では３９．０回、ＰＳＡＰＰ−ＦＡマウス群では３８．４回、ＷＴ−Ｖマウス群では２８．３回、ＷＴ−ＦＡＥＧマウス群では２９．８回、ＷＴ−ＥＧマウス群では２８．４回、ＷＴ−ＦＡマウス群では２８．５回）。興味深いことに、ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウス群では、ＰＳＡＰＰ−ＥＧマウス群及びＰＳＡＰＰ−ＦＡマウス群と比較して、過活動性が有意に低下して安定化し（＋ｐ＜０．０５）、ＦＡとＥＧとの併用投与により相乗的な改善効果が認められた。このＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウス群のデータは、他の４群のＷＴマウス群のデータと比べて有意差がないまでに低下していた。このことは、ＦＡＥＧの併用投与が、ＰＳＡＰＰマウスで増加していた探索活動性を完全に安定化させたことを示している。
【００４７】
ＰＳＡＰＰ−Ｖマウスは、５０％以下の低い自発的交替行動率を示し、短期記憶（空間作業記憶）の障害を持っていた。ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡとｐｏｓｔ  ｈｏｃ解析の結果、ＰＳＡＰＰ−Ｖマウス群は他の7群と比較して自発的交替行動率の有意な低下を示した（＊ｐ＜０．０５。自発的交替行動率は、ＰＳＡＰＰ−Ｖマウス群では４１．５％、ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウス群では６７．５％、ＰＳＡＰＰ−ＥＧマウス群では５４．１％、ＰＳＡＰＰ−ＦＡマウス群では５２．５％、ＷＴ−Ｖマウス群では６７．３％、ＷＴ−ＦＡＥＧマウス群では６９．９％、ＷＴ−ＥＧマウス群では６８．９％、ＷＴ−ＦＡマウス群では６６．２％）。重要なことに、ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウス群では、ＰＳＡＰＰ−ＥＧマウス群及びＰＳＡＰＰ−ＦＡマウス群と比較して、自発的交替行動率が有意に増加し（++ｐ＜０．０１）、ＦＡとＥＧとの併用投与により相乗的な改善効果が認められた。このＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウス群のデータは、他の４群のＷＴマウス群のデータと比べて有意差がないまでに増加していた。このことはＦＡＥＧの併用投与が、ＰＳＡＰＰマウスで障害されていた短期記憶（空間作業記憶）の低下を完全に改善したことを示している。
【００４８】
興味深いことに、ＦＡＥＧの併用投与、ＦＡ或いはＥＧの単独投与は、何れの試験結果においても、ＷＴマウスの行動・認知機能の亢進には影響しなかった。
【００４９】
（ｂ）Ａβの産生・蓄積の抑制効果
Ａβはアルツハイマー病の発症・病態進行に関わる原因物質の１つとされている。従って、薬剤を評価する上で、Ａβの産生・蓄積の抑制効果を見ることが重要である。
【００５０】
図３（Ａ）に示すＴＢＳ溶液可溶画分の解析では、ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウス、ＰＳＡＰＰ−ＥＧマウス及びＰＳＡＰＰ−ＦＡマウスは、Ａβ１−４０レベル（減少率は各投与群５８．５，３４．０，２８．５％）およびＡβ１−４２レベル（減少率は各投与群５５．８，４２．２，４４．０％）の有意な減少を示した（＊ｐ＜０．０５）。さらに、ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウスでは、ＰＳＡＰＰ−ＥＧマウス及びＰＳＡＰＰ−ＦＡマウスと比較して、Ａβ１−４０レベルが相乗的に有意に減少した（+ｐ＜０．０５）。図３（Ｂ）に示すＳＤＳ溶液可溶画分の解析では、ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウス、ＰＳＡＰＰ−ＥＧマウス及びＰＳＡＰＰ−ＦＡマウスは、Ａβ１−４０レベル（減少率は各投与群６１．１，３２．４，３６．２％）およびＡβ１−４２レベル（減少率は各投与群３７．６，３５．５，３０．３％）の有意な減少を示した（＊＊Ｐ＜０．０１）。さらに、ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウスでは、ＰＳＡＰＰ−ＥＧマウス及びＰＳＡＰＰ−ＦＡマウスと比較して、Ａβ１−４０レベルが相乗的に有意に減少した（＋ｐ＜０．０５）。
【００５１】
図３（Ｃ）に示す塩酸グアニジン溶液可溶画分の解析では、ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウス、ＰＳＡＰＰ−ＥＧマウス及びＰＳＡＰＰ−ＦＡマウスは、Ａβ１−４０レベル（減少率は各投与群５５．９，３４．６，３２．５％）およびＡβ１−４２レベル（減少率は各投与群５８．０，３３．５，３０．０％）の有意な減少を示した（＊＊＊ｐ＜０．００１）。さらに、ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウスでは、ＰＳＡＰＰ−ＥＧマウス及びＰＳＡＰＰ−ＦＡマウスと比較して、Ａβ１−４０レベルが相乗的に有意に減少し（＋ｐ＜０．０５）、Ａβ１−４２レベルも相乗的に有意に減少した（＋＋ｐ＜０．０１）。また、ＳＤＳ溶液可溶画分に関しては、Ａβオリゴマーの解析も行った。興味深いことに、図３（Ｄ）に示すように、ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウス、ＰＳＡＰＰ−ＥＧマウス及びＰＳＡＰＰ−ＦＡマウスは、Ａβオリゴマーレベル（減少率は各投与群５９．７，３２．７，２９．２％）の有意な減少も示した（＊ｐ＜０．０５）。さらに、ＰＳＡＰＰ−ＦＡＥＧマウスでは、ＰＳＡＰＰ−ＥＧマウス及びＰＳＡＰＰ−ＦＡマウスと比較して、Ａβオリゴマーレベルが相乗的に有意に減少した（＋ｐ＜０．０５）。
【００５２】
したがって、ＦＡＥＧの併用投与により、Ａβの産生・蓄積が相乗的に抑制されることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明により、安全性が担保され且つ治療予防効果に優れたアルツハイマー病の治療予防剤が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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