(57)【要約】【課題】対象における肺腫瘍の存在を決定する方法を提供すること。【解決手段】対象における侵襲性肺腫瘍の存在を決定する方法も提供される。さらに、対象における肺腫瘍が顕在化するリスクを決定する方法が提供される。対象における侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクを決定する方法がさらに提供される。対象において肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスクを予測するための方法も提供される。肺がん処置の選択肢を確立する方法がさらに提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年１月５日に出願された米国仮出願第６１／９２３，７５８号および２０１４年１月１２日に出願された米国仮出願第６１／９２６，３２３号に対する優先権および利益を主張し、その両方の全体が参考として本願明細書に援用される。
【０００２】
本出願は、一般に、肺がんのリスクの診断および決定に関する。より詳細には、本出願は、肺腫瘍または侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクを決定するため、および肺腫瘍または侵襲性肺腫瘍の存在を決定するための、ｍｉＲＮＡの発現比率の使用を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
肺がんは、世界的に、がんによる死亡の主な原因である（Ｊｅｍａｌら、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ、６１巻：６９〜９頁、２０１１年）。現在、肺がんの大多数は処置の有効性が限られ、生存率が低い進行期に検出されている。肺がんを早い段階で検出することにより、死亡率が有意に低下する可能性がある。
観察に基づく対照アーム（ａｒｍ）を伴うが、サイズが限定されたヨーロッパのランダム化肺がんスクリーニング試験では、死亡率の低下はこれまでに実証されていないが（Ｉｎｆａｎｔｅら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １８０巻：４４５〜４５３頁、２００９年；Ｓａｇｈｉｒら、Ｔｈｏｒａｘ  ６７巻：２９６〜３０１頁、２０１２年；Ｐａｓｔｏｒｉｎｏら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  ２１巻：３０８〜３１５頁、２０１２年）、大規模なＮＣＩ−ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｕｎｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｔｒｉａｌ（ＮＳＬＴ）では、３０パックイヤー以上かつ喫煙をやめてから１５年以下の履歴を有する、高リスクの個体の低線量コンピュータ断層撮影法（ＬＤＣＴ）スクリーニングを用いて、年１回の胸部Ｘ線撮影法と比較して死亡率の２０％の低下が示された（Ａｂｅｒｌｅら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５巻：３９５〜４０９頁、２０１１年）。偽陽性率が高いこと、多数の高リスクの個体をスクリーニングする費用（ＵＳでは推定３．５百万ドル）、およびＬＤＣＴスクリーニングに付随する潜在的な害が臨床の場では依然として考慮すべき事項になっている（Ａｂｅｒｌｅら、２０１１年；Ｇｏｕｌａｒｔら、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃｏｍｐｒ  Ｃａｎｃ  Ｎｅｔｗ  １０巻：２６７〜２７５頁、２０１２年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊｅｍａｌら、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ、６１巻：６９〜９頁、２０１１年
【非特許文献２】Ｉｎｆａｎｔｅら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １８０巻：４４５〜４５３頁、２００９年
【非特許文献３】Ｓａｇｈｉｒら、Ｔｈｏｒａｘ  ６７巻：２９６〜３０１頁、２０１２年
【非特許文献４】Ｐａｓｔｏｒｉｎｏら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  ２１巻：３０８〜３１５頁、２０１２年
【非特許文献５】Ａｂｅｒｌｅら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５巻：３９５〜４０９頁、２０１１年
【非特許文献６】Ｇｏｕｌａｒｔら、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃｏｍｐｒ  Ｃａｎｃ  Ｎｅｔｗ  １０巻：２６７〜２７５頁、２０１２年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、肺がんの予測、予後判定および診断を改善するための追加的な方法体系が必要とされている。本発明は、その必要性に対処するものである。
【０００６】
本発明は、一部において、全体的な「肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスク」アッセイのための３レベルの分類子をもたらすために、アッセイ方法に循環ｍｉＲＮＡバイオマーカーを利用することができるという発見に基づく。
【０００７】
したがって、一部の実施形態では、対象における肺腫瘍の存在を決定する方法が提供される。方法は、
（ａ）対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超える場合には、当該比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超えない場合には、当該比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも９種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２７種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、９種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／１４０−５ｐ、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４０−５ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１３３ａ／１４２−３ｐ、１４０−５ｐ／１７、１４２−３ｐ／１４８ａ、１４２−３ｐ／１５ｂ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／２１、１４２−３ｐ／２２１、１４２−３ｐ／３０ｂ、もしくは３２０／６６０、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）肺腫瘍の存在を、（ｉ）ｍｉＲＮＡ対の発現比率のうちの少なくとも９種が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）９種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップとを含む。
【０００８】
別の実施形態によると、対象における侵襲性肺腫瘍の存在を決定する方法は、
（ａ）対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超える場合には、当該比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超えない場合には、当該比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも１４種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２８種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／１６、１０６／６６０、１６／１７、１６／３２０、１７／６６０、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、３２０／４５１、３２０／４８６−５ｐ、もしくは３２０／６６０、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）侵襲性肺腫瘍の存在を、（ｉ）ｍｉＲＮＡ対の発現比率のうちの少なくとも１４種が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップと
を含む。
【０００９】
さらに別の実施形態によると、対象における肺腫瘍が顕在化するリスクを決定する方法は、
（ａ）対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超える場合には、当該比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超えない場合には、当該比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも１０種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２７種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、１０種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
ｍｉＲＮＡ対が、１３３ａ／９２ａ、１５ｂ／２１、１５ｂ／３０ｂ、１５ｂ／３０ｃ、１６／１９７、もしくは２８−３ｐ／４５１、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）肺腫瘍が顕在化するリスクを、（ｉ）少なくとも１０種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）１０種未満のｍｉＲＮＡの発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップと
を含む。
【００１０】
他の実施形態によると、侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクを決定する方法は、
（ａ）対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超える場合には、当該比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超えない場合には、当該比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも１４種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２８種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１２６／２１、１２６／９２ａ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１９７／１９ｂ、１９７／６６０、もしくは２８−３ｐ／６６０、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクを、（ｉ）少なくとも１４種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップと
を含む。
【００１１】
他の実施形態では、対象において肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスクを予測するための方法は、
（ａ）上記の肺腫瘍の存在のシグネチャーを決定するステップと、
（ｂ）上記の侵襲性肺腫瘍の存在のシグネチャーを決定するステップと、
（ｃ）上記の肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーを決定するステップと、
（ｄ）上記の侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーを決定するステップと、
（ｅ）ステップ（ａ）〜（ｄ）のシグネチャーのいずれも陽性にカテゴリー化されない場合に、対象を、肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスクが低いとしてカテゴリー化するステップと、
（ｆ）少なくともステップ（ａ）の肺腫瘍の存在のシグネチャーが陽性であるか、ステップ（ｃ）の肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーが陽性であり、かつ、ステップ（ｂ）の侵襲性肺腫瘍の存在のシグネチャーとステップ（ｄ）の侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーがどちらも陰性である場合に、対象を、肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスクが中間であるとしてカテゴリー化するステップと、
（ｇ）少なくともステップ（ｂ）の侵襲性肺腫瘍の存在のシグネチャーが陽性であるか、またはステップ（ｄ）の侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーが陽性である場合に、対象を、肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスクが高いとしてカテゴリー化するステップと
を含む。
【００１２】
対象に対する処置の選択肢を確立する方法がさらに提供される。方法は、上記の方法のいずれかを使用して対象を検査するステップと、当該方法の結果に従って処置の選択肢を決定するステップとを含む。方法は、そのような処置を必要とする対象に対して処置を施行するステップをさらに含んでよい。
【００１３】
本開示は、その詳細な説明と併せて記載されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本開示の範囲を例示するものであり、限定するものではない。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【００１４】
本明細書で言及される特許および科学文献は、当業者が利用可能な知見を確立するものである。本明細書において引用されている米国特許および公開されたまたは公開されていない米国特許出願は全て、参照により組み込まれる。本明細書において引用されている公開された外国特許および特許出願は全て、これによって参照により組み込まれる。本明細書において引用されている受託番号によって示されるＧｅｎｂａｎｋおよびＮＣＢＩへの寄託は、これによって参照により組み込まれる。本明細書において引用されている他の公開された参考文献、文書、原稿および科学文献は全て、これによって参照により組み込まれる。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
対象における肺腫瘍の存在を決定する方法であって、
（ａ）前記対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）における前記ｍｉＲＮＡ対の前記発現比率がステップ（ｂ）における前記カットオフ値を超える場合には、前記比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）における前記ｍｉＲＮＡ対の前記発現比率がステップ（ｂ）における前記カットオフ値を超えない場合には、前記比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも９種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２７種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、９種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
前記ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／１４０−５ｐ、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４０−５ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１３３ａ／１４２−３ｐ、１４０−５ｐ／１７、１４２−３ｐ／１４８ａ、１４２−３ｐ／１５ｂ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／２１、１４２−３ｐ／２２１、１４２−３ｐ／３０ｂ、もしくは３２０／６６０、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）肺腫瘍の存在を、（ｉ）前記ｍｉＲＮＡ対の発現比率のうちの少なくとも９種が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）９種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／１４０−５ｐ、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４０−５ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１３３ａ／１４２−３ｐ、１４０−５ｐ／１７、１４２−３ｐ／１４８ａ、１４２−３ｐ／１５ｂ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／２１、１４２−３ｐ／２２１、１４２−３ｐ／３０ｂ、および３２０／６６０、またはその逆の比率を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１４０−５ｐ／２８−３ｐ、１４２−３ｐ／１４５、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、もしくは２８−３ｐ／６６０、またはその逆の比率をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１４０−５ｐ／２８−３ｐ、１４２−３ｐ／１４５、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、および２８−３ｐ／６６０、またはその逆の比率をさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目５）
対象における侵襲性肺腫瘍の存在を決定する方法であって、
（ａ）前記対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）における前記ｍｉＲＮＡ対の前記発現比率がステップ（ｂ）における前記カットオフ値を超える場合には、前記比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）における前記ｍｉＲＮＡ対の前記発現比率がステップ（ｂ）における前記カットオフ値を超えない場合には、前記比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも１４種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２８種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
前記ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／１６、１０６／６６０、１６／１７、１６／３２０、１７／６６０、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、３２０／４５１、３２０／４８６−５ｐ、もしくは３２０／６６０、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）侵襲性肺腫瘍の存在を、（ｉ）前記ｍｉＲＮＡ対の発現比率のうちの少なくとも１４種が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップと
を含む方法。
（項目６）
前記ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／１６、１０６／６６０、１６／１７、１６／３２０、１７／６６０、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、３２０／４５１、３２０／４８６−５ｐ、および３２０／６６０、またはその逆の比率を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／４５１、１０６ａ／４８６−５ｐ、１２６／４５１、１２６／４８６−５ｐ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１６／１９７、１７／４５１、１７／４８６−５ｐ、１９７／４５１、１９７／４８６−５ｐ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、１９ｂ／４８６−５ｐ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／４５１、もしくは２８−３ｐ／４８６−５ｐ、またはその逆の比率をさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／４５１、１０６ａ／４８６−５ｐ、１２６／４５１、１２６／４８６−５ｐ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１６／１９７、１７／４５１、１７／４８６−５ｐ、１９７／４５１、１９７／４８６−５ｐ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、１９ｂ／４８６−５ｐ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／４５１、もしくは２８−３ｐ／４８６−５ｐ、またはその逆の比率をさらに含む、項目６に記載の方法。
（項目９）
対象における肺腫瘍が顕在化するリスクを決定する方法であって、
（ａ）前記対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）における前記ｍｉＲＮＡ対の前記発現比率がステップ（ｂ）における前記カットオフ値を超える場合には、前記比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）における前記ｍｉＲＮＡ対の前記発現比率がステップ（ｂ）における前記カットオフ値を超えない場合には、前記比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも１０種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２７種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、１０種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
前記ｍｉＲＮＡ対が、１３３ａ／９２ａ、１５ｂ／２１、１５ｂ／３０ｂ、１５ｂ／３０ｃ、１６／１９７、もしくは２８−３ｐ／４５１、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）肺腫瘍が顕在化するリスクを、（ｉ）少なくとも１０種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）１０種未満のｍｉＲＮＡの発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップと
を含む方法。
（項目１０）
前記ｍｉＲＮＡ対が、１３３ａ／９２ａ、１５ｂ／２１、１５ｂ／３０ｂ、１５ｂ／３０ｃ、１６／１９７、および２８−３ｐ／４５１、またはその逆の比率を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ｍｉＲＮＡ対が、１０１／１４０−３ｐ、１０６ａ／４５１、１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１３３ａ／４５１、１３３ａ／６６０、１４０−３ｐ／６６０、１４２−３ｐ／１５ｂ、１５ｂ／４５１、１５ｂ／６６０、１７／４５１、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／１９ｂ、１９７／４５１、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／６６０、もしくは３２０／６６０、またはその逆の比率をさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記ｍｉＲＮＡ対が、１０１／１４０−３ｐ、１０６ａ／４５１、１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１３３ａ／４５１、１３３ａ／６６０、１４０−３ｐ／６６０、１４２−３ｐ／１５ｂ、１５ｂ／４５１、１５ｂ／６６０、１７／４５１、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／１９ｂ、１９７／４５１、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／６６０、および３２０／６６０、またはその逆の比率をさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
対象における侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクを決定する方法であって、
（ａ）前記対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）における前記ｍｉＲＮＡ対の前記発現比率がステップ（ｂ）における前記カットオフ値を超える場合には、前記比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）における前記ｍｉＲＮＡ対の前記発現比率がステップ（ｂ）における前記カットオフ値を超えない場合には、前記比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも１４種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２８種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
前記ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１２６／２１、１２６／９２ａ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１９７／１９ｂ、１９７／６６０、もしくは２８−３ｐ／６６０、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクを、（ｉ）少なくとも１４種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップと
を含む方法。
（項目１４）
前記ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１２６／２１、１２６／９２ａ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１９７／１９ｂ、１９７／６６０、および２８−３ｐ／６６０、またはその逆の比率を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／４５１、１２６／４５１、１４５／１９７、１７／４５１、１９７／２１、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、１９７／４５１、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、２１／２２１、２１／２８−３ｐ、２８−３ｐ／３０ｂ、２８−３ｐ／３０ｃ、２８−３ｐ／４５１、２８−３ｐ／９２ａ、３２０／４５１、もしくは３２０／９２ａ、またはその逆の比率をさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／４５１、１２６／４５１、１４５／１９７、１７／４５１、１９７／２１、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、１９７／４５１、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、２１／２２１、２１／２８−３ｐ、２８−３ｐ／３０ｂ、２８−３ｐ／３０ｃ、２８−３ｐ／４５１、２８−３ｐ／９２ａ、３２０／４５１、および３２０／９２ａ、またはその逆の比率をさらに含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
対象において肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスクを予測するための方法であって、
（ａ）項目１に記載の肺腫瘍の存在のシグネチャーを決定するステップと、
（ｂ）項目５に記載の侵襲性肺腫瘍の存在のシグネチャーを決定するステップと、
（ｃ）項目９に記載の肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーを決定するステップと、
（ｄ）項目１３に記載の侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーを決定するステップと、
（ｅ）ステップ（ａ）〜（ｄ）の前記シグネチャーのいずれも陽性にカテゴリー化されない場合に、前記対象を、肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスクが低いとしてカテゴリー化するステップと、
（ｆ）少なくともステップ（ａ）の肺腫瘍の存在のシグネチャーが陽性であるか、ステップ（ｃ）の肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーが陽性であり、かつステップ（ｂ）の侵襲性肺腫瘍の存在のシグネチャーとステップ（ｄ）の侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーがどちらも陰性である場合に、前記対象を、肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスクが中間であるとしてカテゴリー化するステップと、
（ｇ）少なくともステップ（ｂ）の侵襲性肺腫瘍の存在のシグネチャーが陽性であるか、またはステップ（ｄ）の侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーが陽性である場合に、前記対象を、肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスクが高いとしてカテゴリー化するステップと
を含む方法。
（項目１８）
前記カットオフ値を、前記複数の対照試料からの比率の平均値として決定する、項目１、５、９または１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記カットオフ値を、前記複数の対照試料からの比率の平均値＋／−１標準偏差として決定する、項目１、５、９または１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記カットオフ値を、複数の対照試料からの比率の中央値として決定する、項目１、５、９または１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記ｍｉＲＮＡ対の発現比率を、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して各ｍｉＲＮＡ対内の各ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡコピーを作製することによって決定する、項目１、５、９または１３に記載の方法。
（項目２２）
前記発現比率を、リアルタイムＰＣＲを使用してさらに決定する、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記発現比率を、ＴａｑＭａｎプローブを使用してさらに決定する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記生体試料が、生体液である、項目１、５、９または１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記生体液が、尿、血液、血漿または血清である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記生体液が、血漿または血清である、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記生体試料における溶血を決定し、検出可能な溶血が存在する場合には前記試料を前記方法に供さない、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
溶血を分光光度法で決定する、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
溶血を、溶血した試料中で上方制御される溶血関連ｍｉＲＮＡの発現レベルを分析することによって決定する、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記溶血関連ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−９２ａまたはｍｉＲ−１４０−３ｐのうちの複数を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記溶血関連ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−１６、およびｍｉＲ−９２ａである、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記溶血関連ｍｉＲＮＡの発現レベルを正規化するために、溶血した試料中で上方制御されない複数の正規化用ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するステップをさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
前記正規化用ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−３０ｂを含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
溶血を、
（ａ）前記試料中のｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−３０ｂのそれぞれと対になったｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−１６、およびｍｉＲ−９２ａのそれぞれからなる１６種のｍｉＲＮＡ対のそれぞれの発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記１６種の発現比率のそれぞれを、各発現比率について複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）前記１６種のｍｉＲＮＡ対のそれぞれについて、ステップ（ａ）における前記発現比率がステップ（ｂ）における前記カットオフ値を超える場合には、前記比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）における前記発現比率がステップ（ｂ）における前記カットオフ値を超えない場合には、前記比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）前記試料を、（ｉ）前記１６種の比率のうち８種またはそれ超が前記カットオフ値を超える場合には溶血を有するとして、または（ｉｉ）前記１６種の比率のうち８種未満が前記カットオフ値を超える場合には溶血を有さないとしてカテゴリー化するステップと
によってさらに決定する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
溶血を分光光度法でも決定する、項目２９に記載の方法。
（項目３６）
ｍｉＲＮＡ発現分析の前に、またはそれと同時に、前記対象を、ｍｉＲＮＡ発現の分析を含まないシステムを使用して肺がんについてスクリーニングするステップをさらに含む、項目１、５、９または１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記システムが、血液検査、Ｘ線、コンピュータ断層撮影法、陽電子放出断層撮影法、胸腔穿刺、気管支鏡検査、細針吸引、胸腔鏡検査、開胸術、縦隔鏡検査を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記システムが、低線量コンピュータ断層撮影法（ＬＤＣＴ）である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記対象由来の少なくとも２種の異なる生体試料に対して実施する、項目１、５、９または１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記少なくとも２種の異なる生体試料のうちの少なくとも１種が、前記対象が肺がんに対する処置を受けた後に前記対象から取得される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
存在またはリスクが陰性であることが決定された場合、またはリスクが低いことが決定された場合、前記対象に肺がんに対する処置を行わない、項目１、５、９、１３または１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
存在またはリスクが陽性であることが決定された場合、またはリスクが中間であるまたは高いことが決定された場合、前記対象に肺がんに対する処置を行う、項目１、５、９、１３または１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
対象に対する肺がん処置の選択肢を確立する方法であって、項目１、５、９、１３または１７のいずれか一項に記載の方法を使用して前記対象を検査するステップと、前記方法の結果に従って処置の選択肢を決定するステップとを含む方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例１、Ｔｈｅ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｉｃ  Ｉｔａｌｉａｎ  Ｌｕｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＭＩＬＤ）ｓｔｕｄｙ、２００５〜２０１２年におけるＳａｍｐｌｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔの特性を記載する図である。
【００１６】
【図２】図２は、全対象間の  ｍｉＲＮＡシグネチャー分類子（ＭＳＣ）に応じた血液試料採取の日からの３年生存を示すグラフおよび表である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一実施形態によると、本発明は、多数のｍｉＲＮＡ発現レベルの比率を利用して、（ａ）肺腫瘍が顕在化するリスク、（ｂ）侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスク、（ｃ）肺腫瘍の存在、（ｄ）侵襲性腫瘍の存在を決定するものであり、ステップ（ａ）〜（ｄ）において検出されたリスクを組み合わせると、肺腫瘍を有するまたはそれが発症する総合的なリスクが決定される。
【００１８】
本発明は、検出可能なレベルの溶血を有する試料を、例えば、ｍｉＲＮＡ溶血分類子を使用すること；２レベル（低、高）の分類子の代わりに３レベル（低、中間または高）の「疾患のリスク」分類子を使用すること；またはプールの代わりに単一の対象由来の対照血漿試料を使用することを含めることによって取り除くことを含み得る。対照プール内の変動性が高いことが原因で以前のアッセイの検証ステップでは排除されていた３種のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−１３３ａを含めることができる。
【００１９】
本発明の例示的な方法によると、「マイクロＲＮＡシグネチャー分類子」（ＭＳＣ）によりもたらされるスクリーニング感度は、ＭＳＣ単独では８７％、低線量コンピュータ断層撮影法（ＬＤＣＴ）スクリーニングと組み合わせると９８％である。したがって、ＭＳＣは別々で使用することもでき、ＬＤＣＴなどの他の方法と相乗的な手法において組み合わせて使用して、対象の大部分におけるＬＤＣＴのさらなるラウンドおよび不必要な浸潤性の診断的経過観察を回避することによって肺がんスクリーニングに関するＬＤＣＴの効果を改善することもできる。本出願において詳述されている通り、ＭＳＣ単独での予後判定能および診断能により、腫瘍の病期とは無関係に、ＭＳＣ内で測定されたｍｉＲＮＡは、単に腫瘍負荷量のアウトプットではなく、腫瘍の攻撃性に関連する病原の指標であることが実証される。
【００２０】
ＭＳＣの開発は、肺がん検出および予後不良との関連に関して最適なｍｉＲＮＡ比率のセットを選択するために、１００種の異なる血漿ｍｉＲＮＡの４，９５０種の比率をスクリーニングする偏りのないコンピュータによる手法に基づくものであった（Ｂｏｅｒｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８巻：３７１３〜３７１８頁、２０１１年）。これらのｍｉＲＮＡ比率は、腫瘍の異なる細胞成分および周囲の微小環境内のｍｉＲＮＡの競合するｍｉＲＮＡ調節の機構間の調節を反映する可能性がある。いかなる特定の理論にも縛られることなく、間質細胞は、肺微小環境の炎症、悪性形質転換に関連する標的遺伝子の調節に機能的に関与し得る、特定のｍｉＲＮＡの循環中への放出によって活性化し得る。
【００２１】
ＭＳＣでは、血漿由来のｍｉＲＮＡシグネチャーのロバストなアッセイを利用する。ＭＳＣは、悪性疾患の存在、今後の悪性腫瘍のリスクに関する診断能および肺がんと大きな大多数の良性のＬＤＣＴにより検出される肺小結節とを区別する能力を有する。ＭＳＣで利用することができる特定のシグネチャーは、本明細書に詳述されている。
「肺腫瘍の存在」シグネチャー
【００２２】
一部の実施形態では、対象における肺腫瘍の存在を決定する方法が提供される。方法は、
（ａ）対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超える場合には、当該比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超えない場合には、当該比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも９種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２７種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、９種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／１４０−５ｐ、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４０−５ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１３３ａ／１４２−３ｐ、１４０−５ｐ／１７、１４２−３ｐ／１４８ａ、１４２−３ｐ／１５ｂ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／２１、１４２−３ｐ／２２１、１４２−３ｐ／３０ｂ、もしくは３２０／６６０、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）肺腫瘍の存在を、（ｉ）ｍｉＲＮＡ対の発現比率のうちの少なくとも９種が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）９種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップとを含む。
【００２３】
一部の実施形態では、このアッセイのｍｉＲＮＡ対は、比率１０６ａ／１４０−５ｐ、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４０−５ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１３３ａ／１４２−３ｐ、１４０−５ｐ／１７、１４２−３ｐ／１４８ａ、１４２−３ｐ／１５ｂ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／２１、１４２−３ｐ／２２１、１４２−３ｐ／３０ｂ、および３２０／６６０のうちの２種超、３種超、４種超、５種超、６種超、７種超、８種超、９種超、１０種超、１１種超、１２種超、もしくは各々、またはその逆の比率を含む。
【００２４】
他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ対は、比率１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１４０−５ｐ／２８−３ｐ、１４２−３ｐ／１４５、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、もしくは２８−３ｐ／６６０、またはその逆の比率をさらに含んでよい。
【００２５】
さらに他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ対は、比率１０６ａ／１４０−５ｐ、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４０−５ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１３３ａ／１４２−３ｐ、１４０−５ｐ／１７、１４２−３ｐ／１４８ａ、１４２−３ｐ／１５ｂ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／２１、１４２−３ｐ／２２１、１４２−３ｐ／３０ｂ、３２０／６６０、１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１４０−５ｐ／２８−３ｐ、１４２−３ｐ／１４５、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、および２８−３ｐ／６６０のうちの少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、もしくは各々、またはその逆の比率を含む。これらの２７種の比率のうちの全てではないがいくつかを利用することにより、腫瘍の存在を正確に同定するアッセイがもたらされることが予測されることが当業者には理解されよう。
【００２６】
一部の実施形態では、本発明は、対象における肺腫瘍の存在を決定することにおいて有用な診断用試薬の製造における、２７種のｍｉＲＮＡ対のいずれかを検出するために有用な複数のプライマーまたはプローブの使用であって、検出は、
（ａ）対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超える場合には、当該比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超えない場合には、当該比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも９種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２７種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、９種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／１４０−５ｐ、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４０−５ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１３３ａ／１４２−３ｐ、１４０−５ｐ／１７、１４２−３ｐ／１４８ａ、１４２−３ｐ／１５ｂ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／２１、１４２−３ｐ／２２１、１４２−３ｐ／３０ｂ、もしくは３２０／６６０、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）肺腫瘍の存在を、（ｉ）ｍｉＲＮＡ対の発現比率のうちの少なくとも９種が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）９種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップとを含む、使用を提供する。
【００２７】
一部の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／１４０−５ｐ、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４０−５ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１３３ａ／１４２−３ｐ、１４０−５ｐ／１７、１４２−３ｐ／１４８ａ、１４２−３ｐ／１５ｂ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／２１、１４２−３ｐ／２２１、１４２−３ｐ／３０ｂ、および３２０／６６０のうちの２種超、３種超、４種超、５種超、６種超、７種超、８種超、９種超、１０種超、１１種超、１２種超、もしくは各々、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００２８】
他の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、さらに、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１４０−５ｐ／２８−３ｐ、１４２−３ｐ／１４５、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、もしくは２８−３ｐ／６６０、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００２９】
さらに他の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／１４０−５ｐ、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４０−５ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１３３ａ／１４２−３ｐ、１４０−５ｐ／１７、１４２−３ｐ／１４８ａ、１４２−３ｐ／１５ｂ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／２１、１４２−３ｐ／２２１、１４２−３ｐ／３０ｂ、３２０／６６０、１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１４０−５ｐ／２８−３ｐ、１４２−３ｐ／１４５、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、および２８−３ｐ／６６０のうちの少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、もしくは各々、またはその逆の比率を検出するために有用である。これらの２７種の比率のうちの全てではないがいくつかを利用することにより、腫瘍の存在を正確に同定するアッセイがもたらされることが予測されることが当業者には理解されよう。
【００３０】
一部の実施形態では、複数のプライマーおよびプローブ内の少なくとも１つのプライマーまたはプローブは、試料中のｍｉＲＮＡ対の少なくとも１つのｍｉＲＮＡに選択的に結合することが可能なものである。一部の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、試料中のｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／１４０−５ｐ、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４０−５ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１３３ａ／１４２−３ｐ、１４０−５ｐ／１７、１４２−３ｐ／１４８ａ、１４２−３ｐ／１５ｂ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／２１、１４２−３ｐ／２２１、１４２−３ｐ／３０ｂ、３２０／６６０、１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１４０−５ｐ／２８−３ｐ、１４２−３ｐ／１４５、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、および２８−３ｐ／６６０のうちの少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、または各々のうちの少なくとも１つのｍｉＲＮＡに選択的に結合することが可能なプライマーまたはプローブを少なくとも１つ含む。
【００３１】
一部の実施形態では、本発明は、対象における肺腫瘍の存在を決定するためのキットを提供する。キットは、診断用試薬の製造において２７種のｍｉＲＮＡ対のいずれかを検出するために有用な複数のプライマーまたはプローブ、および複数のプライマーまたはプローブを利用して対象における肺腫瘍の存在を決定するための説明書を含む。説明書は、
（ａ）対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超える場合には、当該比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超えない場合には、当該比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも９種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２７種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、９種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／１４０−５ｐ、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４０−５ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１３３ａ／１４２−３ｐ、１４０−５ｐ／１７、１４２−３ｐ／１４８ａ、１４２−３ｐ／１５ｂ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／２１、１４２−３ｐ／２２１、１４２−３ｐ／３０ｂ、もしくは３２０／６６０、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）肺腫瘍の存在を、（ｉ）ｍｉＲＮＡ対の発現比率のうちの少なくとも９種が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）９種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップとを含む。
【００３２】
一部の実施形態では、このキットで提供される複数のプライマーまたはプローブは、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／１４０−５ｐ、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４０−５ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１３３ａ／１４２−３ｐ、１４０−５ｐ／１７、１４２−３ｐ／１４８ａ、１４２−３ｐ／１５ｂ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／２１、１４２−３ｐ／２２１、１４２−３ｐ／３０ｂ、および３２０／６６０のうちの２種超、３種超、４種超、５種超、６種超、７種超、８種超、９種超、１０種超、１１種超、１２種超、もしくは各々、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００３３】
他の実施形態では、このキットで提供される複数のプライマーまたはプローブは、さらに、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１４０−５ｐ／２８−３ｐ、１４２−３ｐ／１４５、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、もしくは２８−３ｐ／６６０、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００３４】
さらに他の実施形態では、このキットで提供される複数のプライマーまたはプローブは、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／１４０−５ｐ、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４０−５ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１３３ａ／１４２−３ｐ、１４０−５ｐ／１７、１４２−３ｐ／１４８ａ、１４２−３ｐ／１５ｂ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／２１、１４２−３ｐ／２２１、１４２−３ｐ／３０ｂ、３２０／６６０、１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１４０−５ｐ／２８−３ｐ、１４２−３ｐ／１４５、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、および２８−３ｐ／６６０のうちの少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、もしくは各々、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００３５】
一部の実施形態では、このキットで提供される複数のプライマーおよびプローブ内の少なくとも１つのプライマーまたはプローブは、試料中のｍｉＲＮＡ対の少なくとも１つのｍｉＲＮＡに選択的に結合することが可能なものである。一部の実施形態では、このキットで提供される複数のプライマーまたはプローブは、試料中のｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／１４０−５ｐ、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４０−５ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１３３ａ／１４２−３ｐ、１４０−５ｐ／１７、１４２−３ｐ／１４８ａ、１４２−３ｐ／１５ｂ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／２１、１４２−３ｐ／２２１、１４２−３ｐ／３０ｂ、３２０／６６０、１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１４０−５ｐ／２８−３ｐ、１４２−３ｐ／１４５、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、および２８−３ｐ／６６０のうちの少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、または各々のうちの少なくとも１つのｍｉＲＮＡに選択的に結合することが可能なプライマーまたはプローブを少なくとも１つ含む。
「侵襲性肺腫瘍の存在」シグネチャー
【００３６】
他の実施形態では、対象における侵襲性肺腫瘍の存在を決定する方法が提供される。方法は、
（ａ）対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超える場合には、当該比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超えない場合には、当該比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも１４種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２８種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／１６、１０６／６６０、１６／１７、１６／３２０、１７／６６０、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、３２０／４５１、３２０／４８６−５ｐ、もしくは３２０／６６０、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）侵襲性肺腫瘍の存在を、（ｉ）ｍｉＲＮＡ対の発現比率のうちの少なくとも１４種が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップと
を含む。
【００３７】
一部の実施形態では、このアッセイのｍｉＲＮＡ対は、比率１０６ａ／１６、１０６／６６０、１６／１７、１６／３２０、１７／６６０、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、３２０／４５１、３２０／４８６−５ｐ、および３２０／６６０のうちの２種超、３種超、４種超、５種超、６種超、７種超、８種超、９種超、もしくは各々、またはその逆の比率を含む。
【００３８】
他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ対は、比率１０６ａ／４５１、１０６ａ／４８６−５ｐ、１２６／４５１、１２６／４８６−５ｐ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１６／１９７、１７／４５１、１７／４８６−５ｐ、１９７／４５１、１９７／４８６−５ｐ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、１９ｂ／４８６−５ｐ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／４５１、もしくは２８−３ｐ／４８６−５ｐ、またはその逆の比率をさらに含んでよい。
【００３９】
さらに他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ対は、比率１０６ａ／１６、１０６／６６０、１６／１７、１６／３２０、１７／６６０、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、３２０／４５１、３２０／４８６−５ｐ、３２０／６６０、１０６ａ／４５１、１０６ａ／４８６−５ｐ、１２６／４５１、１２６／４８６−５ｐ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１６／１９７、１７／４５１、１７／４８６−５ｐ、１９７／４５１、１９７／４８６−５ｐ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、１９ｂ／４８６−５ｐ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／４５１、または２８−３ｐ／４８６−５ｐのうちの少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、少なくとも２７種、もしくは各々、またはその逆の比率を含む。これらの２８種の比率のうちの全てではないがいくつかを利用することにより、侵襲性腫瘍の存在を正確に同定するアッセイがもたらされることが予測されることが当業者には理解されよう。
【００４０】
他の実施形態では、本発明は、対象における侵襲性肺腫瘍の存在を決定することにおいて有用な診断用試薬の製造における、２８種のｍｉＲＮＡ対のいずれかを検出するために有用な複数のプライマーまたはプローブの使用であって、検出は、
（ａ）対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超える場合には、当該比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超えない場合には、当該比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも１４種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２８種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／１６、１０６／６６０、１６／１７、１６／３２０、１７／６６０、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、３２０／４５１、３２０／４８６−５ｐ、もしくは３２０／６６０、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）侵襲性肺腫瘍の存在を、（ｉ）ｍｉＲＮＡ対の発現比率のうちの少なくとも１４種が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップと
を含む、使用を提供する。
【００４１】
一部の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／１６、１０６／６６０、１６／１７、１６／３２０、１７／６６０、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、３２０／４５１、３２０／４８６−５ｐ、および３２０／６６０のうちの２種超、３種超、４種超、５種超、６種超、７種超、８種超、９種超、もしくは各々、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００４２】
他の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、さらに、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／４５１、１０６ａ／４８６−５ｐ、１２６／４５１、１２６／４８６−５ｐ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１６／１９７、１７／４５１、１７／４８６−５ｐ、１９７／４５１、１９７／４８６−５ｐ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、１９ｂ／４８６−５ｐ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／４５１、もしくは２８−３ｐ／４８６−５ｐ、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００４３】
さらに他の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／１６、１０６／６６０、１６／１７、１６／３２０、１７／６６０、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、３２０／４５１、３２０／４８６−５ｐ、３２０／６６０、１０６ａ／４５１、１０６ａ／４８６−５ｐ、１２６／４５１、１２６／４８６−５ｐ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１６／１９７、１７／４５１、１７／４８６−５ｐ、１９７／４５１、１９７／４８６−５ｐ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、１９ｂ／４８６−５ｐ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／４５１、または２８−３ｐ／４８６−５ｐのうちの少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、少なくとも２７種、もしくは各々、またはその逆の比率を検出するために有用である。これらの２８種の比率のうちの全てではないがいくつかを利用することにより、侵襲性腫瘍の存在を正確に同定するアッセイがもたらされることが予測されることが当業者には理解されよう。
【００４４】
一部の実施形態では、複数のプライマーおよびプローブ内の少なくとも１つのプライマーまたはプローブは、試料中のｍｉＲＮＡ対の少なくとも１つのｍｉＲＮＡに選択的に結合することが可能なものである。一部の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、試料中のｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／１６、１０６／６６０、１６／１７、１６／３２０、１７／６６０、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、３２０／４５１、３２０／４８６−５ｐ、３２０／６６０、１０６ａ／４５１、１０６ａ／４８６−５ｐ、１２６／４５１、１２６／４８６−５ｐ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１６／１９７、１７／４５１、１７／４８６−５ｐ、１９７／４５１、１９７／４８６−５ｐ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、１９ｂ／４８６−５ｐ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／４５１、または２８−３ｐ／４８６−５ｐのうちの少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、少なくとも２７種、または各々のうちの少なくとも１つのｍｉＲＮＡに選択的に結合することが可能なプライマーまたはプローブを少なくとも１つ含む。
【００４５】
他の実施形態では、本発明は、対象における侵襲性肺腫瘍の存在を決定するためのキットを提供する。キットは、診断用試薬の製造において２８種のｍｉＲＮＡ対のいずれかを検出するために有用な複数のプライマーまたはプローブ、および複数のプライマーまたはプローブを利用して対象における侵襲性肺腫瘍の存在を決定するための説明書を含む。説明書は、
（ａ）対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超える場合には、当該比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超えない場合には、当該比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも１４種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２８種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／１６、１０６／６６０、１６／１７、１６／３２０、１７／６６０、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、３２０／４５１、３２０／４８６−５ｐ、もしくは３２０／６６０、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）侵襲性肺腫瘍の存在を、（ｉ）ｍｉＲＮＡ対の発現比率のうちの少なくとも１４種が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップと
を含む。
【００４６】
一部の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／１６、１０６／６６０、１６／１７、１６／３２０、１７／６６０、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、３２０／４５１、３２０／４８６−５ｐ、および３２０／６６０のうちの２種超、３種超、４種超、５種超、６種超、７種超、８種超、９種超、もしくは各々、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００４７】
他の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、さらに、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／４５１、１０６ａ／４８６−５ｐ、１２６／４５１、１２６／４８６−５ｐ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１６／１９７、１７／４５１、１７／４８６−５ｐ、１９７／４５１、１９７／４８６−５ｐ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、１９ｂ／４８６−５ｐ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／４５１、もしくは２８−３ｐ／４８６−５ｐ、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００４８】
さらに他の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／１６、１０６／６６０、１６／１７、１６／３２０、１７／６６０、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、３２０／４５１、３２０／４８６−５ｐ、３２０／６６０、１０６ａ／４５１、１０６ａ／４８６−５ｐ、１２６／４５１、１２６／４８６−５ｐ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１６／１９７、１７／４５１、１７／４８６−５ｐ、１９７／４５１、１９７／４８６−５ｐ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、１９ｂ／４８６−５ｐ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／４５１、または２８−３ｐ／４８６−５ｐのうちの少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、少なくとも２７種、もしくは各々、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００４９】
一部の実施形態では、このキットで提供される複数のプライマーおよびプローブ内の少なくとも１つのプライマーまたはプローブは、試料中のｍｉＲＮＡ対の少なくとも１つのｍｉＲＮＡに選択的に結合することが可能なものである。一部の実施形態では、このキットで提供される複数のプライマーまたはプローブは、試料中のｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／１６、１０６／６６０、１６／１７、１６／３２０、１７／６６０、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、３２０／４５１、３２０／４８６−５ｐ、３２０／６６０、１０６ａ／４５１、１０６ａ／４８６−５ｐ、１２６／４５１、１２６／４８６−５ｐ、１２６／６６０、１４０−５ｐ／１９７、１６／１９７、１７／４５１、１７／４８６−５ｐ、１９７／４５１、１９７／４８６−５ｐ、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、１９ｂ／４８６−５ｐ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／４５１、または２８−３ｐ／４８６−５ｐのうちの少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、少なくとも２７種、または各々のうちの少なくとも１つのｍｉＲＮＡに選択的に結合することが可能なプライマーまたはプローブを少なくとも１つ含む。
【００５０】
上記の２つの診断シグネチャー（「肺腫瘍の存在」および「侵襲性肺腫瘍の存在」）と共に、２つの予後判定シグネチャー、「肺腫瘍が顕在化するリスク」シグネチャー、および「侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスク」シグネチャーが提供される。これらの予後判定シグネチャーは、試料を取得した後の任意の期間内、例えば、３カ月、６カ月、１２カ月、１８カ月、２４カ月、３６カ月、またはこれらの期間外またはこれらの期間の間の任意の時間にリスクを決定するために利用することができる。
「肺腫瘍が顕在化するリスク」シグネチャー
【００５１】
したがって、さらなる実施形態では、対象における肺腫瘍が顕在化するリスクを決定する方法が提供される。方法は、
（ａ）対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超える場合には、当該比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超えない場合には、当該比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも１０種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２７種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、１０種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
ｍｉＲＮＡ対が、１３３ａ／９２ａ、１５ｂ／２１、１５ｂ／３０ｂ、１５ｂ／３０ｃ、１６／１９７、もしくは２８−３ｐ／４５１、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）肺腫瘍が顕在化するリスクを、（ｉ）少なくとも１０種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）１０種未満のｍｉＲＮＡの発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップと
を含む。
【００５２】
一部の実施形態では、このアッセイのｍｉＲＮＡ対は、比率１３３ａ／９２ａ、１５ｂ／２１、１５ｂ／３０ｂ、１５ｂ／３０ｃ、１６／１９７、および２８−３ｐ／４５１、またはその逆の比率のうちの２種超、３種超、４種超、５種超、または各々を含む。
【００５３】
他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ対は、比率１０１／１４０−３ｐ、１０６ａ／４５１、１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１３３ａ／４５１、１３３ａ／６６０、１４０−３ｐ／６６０、１４２−３ｐ／１５ｂ、１５ｂ／４５１、１５ｂ／６６０、１７／４５１、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／１９ｂ、１９７／４５１、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／６６０、もしくは３２０／６６０、またはその逆の比率をさらに含んでよい。
【００５４】
さらに他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ対は、比率１３３ａ／９２ａ、１５ｂ／２１、１５ｂ／３０ｂ、１５ｂ／３０ｃ、１６／１９７、２８−３ｐ／４５１、１０１／１４０−３ｐ、１０６ａ／４５１、１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１３３ａ／４５１、１３３ａ／６６０、１４０−３ｐ／６６０、１４２−３ｐ／１５ｂ、１５ｂ／４５１、１５ｂ／６６０、１７／４５１、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／１９ｂ、１９７／４５１、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／６６０、または３２０／６６０のうちの少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、もしくは各々、またはその逆の比率を含む。これらの２７種の比率のうちの全てではないがいくつかを利用することにより、肺腫瘍が顕在化するリスクを正確に同定するアッセイがもたらされることが予測されることが当業者には理解されよう。
【００５５】
一部の実施形態では、本発明は、対象における肺腫瘍が顕在化するリスクを決定することにおいて有用な診断用または予後判定用試薬の製造における、２７種のｍｉＲＮＡ対のいずれかを検出するために有用な複数のプライマーまたはプローブの使用であって、検出は、
（ａ）対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超える場合には、当該比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超えない場合には、当該比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも１０種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２７種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、１０種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
ｍｉＲＮＡ対が、１３３ａ／９２ａ、１５ｂ／２１、１５ｂ／３０ｂ、１５ｂ／３０ｃ、１６／１９７、もしくは２８−３ｐ／４５１、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）肺腫瘍が顕在化するリスクを、（ｉ）少なくとも１０種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）１０種未満のｍｉＲＮＡの発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップと
を含む、使用を提供する。
【００５６】
一部の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１３３ａ／９２ａ、１５ｂ／２１、１５ｂ／３０ｂ、１５ｂ／３０ｃ、１６／１９７、および２８−３ｐ／４５１のうちの２種超、３種超、４種超、５種超、もしくは各々、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００５７】
他の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、さらに、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０１／１４０−３ｐ、１０６ａ／４５１、１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１３３ａ／４５１、１３３ａ／６６０、１４０−３ｐ／６６０、１４２−３ｐ／１５ｂ、１５ｂ／４５１、１５ｂ／６６０、１７／４５１、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／１９ｂ、１９７／４５１、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／６６０、もしくは３２０／６６０、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００５８】
さらに他の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１３３ａ／９２ａ、１５ｂ／２１、１５ｂ／３０ｂ、１５ｂ／３０ｃ、１６／１９７、２８−３ｐ／４５１、１０１／１４０−３ｐ、１０６ａ／４５１、１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１３３ａ／４５１、１３３ａ／６６０、１４０−３ｐ／６６０、１４２−３ｐ／１５ｂ、１５ｂ／４５１、１５ｂ／６６０、１７／４５１、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／１９ｂ、１９７／４５１、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／６６０、または３２０／６６０のうちの少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、もしくは各々、またはその逆の比率を検出するために有用である。これらの２７種の比率のうちの全てではないがいくつかを利用することにより、肺腫瘍が顕在化するリスクを正確に同定するアッセイがもたらされることが予測されることが当業者には理解されよう。
【００５９】
一部の実施形態では、複数のプライマーおよびプローブ内の少なくとも１つのプライマーまたはプローブは、試料中のｍｉＲＮＡ対の少なくとも１つのｍｉＲＮＡに選択的に結合することが可能なものである。一部の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、試料中のｍｉＲＮＡ対の発現比率１３３ａ／９２ａ、１５ｂ／２１、１５ｂ／３０ｂ、１５ｂ／３０ｃ、１６／１９７、２８−３ｐ／４５１、１０１／１４０−３ｐ、１０６ａ／４５１、１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１３３ａ／４５１、１３３ａ／６６０、１４０−３ｐ／６６０、１４２−３ｐ／１５ｂ、１５ｂ／４５１、１５ｂ／６６０、１７／４５１、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／１９ｂ、１９７／４５１、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／６６０、または３２０／６６０のうちの少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、または各々のうちの少なくとも１つのｍｉＲＮＡに選択的に結合することが可能なプライマーまたはプローブを少なくとも１つ含む。
【００６０】
他の実施形態では、本発明は、対象における肺腫瘍が顕在化するリスクを決定するためのキットを提供する。キットは、診断用または予後判定用試薬の製造において２７種のｍｉＲＮＡ対のいずれかを検出するために有用な複数のプライマーまたはプローブ、および、複数のプライマーまたはプローブを利用して対象における肺腫瘍が顕在化するリスクを決定するための説明書を含む。説明書は、
（ａ）対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超える場合には、当該比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超えない場合には、当該比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも１０種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２７種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、１０種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
ｍｉＲＮＡ対が、１３３ａ／９２ａ、１５ｂ／２１、１５ｂ／３０ｂ、１５ｂ／３０ｃ、１６／１９７、もしくは２８−３ｐ／４５１、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）肺腫瘍が顕在化するリスクを、（ｉ）少なくとも１０種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）１０種未満のｍｉＲＮＡの発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップと
を含む。
【００６１】
一部の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１３３ａ／９２ａ、１５ｂ／２１、１５ｂ／３０ｂ、１５ｂ／３０ｃ、１６／１９７、および２８−３ｐ／４５１のうちの２種超、３種超、４種超、５種超、もしくは各々、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００６２】
他の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、さらに、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０１／１４０−３ｐ、１０６ａ／４５１、１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１３３ａ／４５１、１３３ａ／６６０、１４０−３ｐ／６６０、１４２−３ｐ／１５ｂ、１５ｂ／４５１、１５ｂ／６６０、１７／４５１、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／１９ｂ、１９７／４５１、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／６６０、もしくは３２０／６６０、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００６３】
さらに他の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１３３ａ／９２ａ、１５ｂ／２１、１５ｂ／３０ｂ、１５ｂ／３０ｃ、１６／１９７、２８−３ｐ／４５１、１０１／１４０−３ｐ、１０６ａ／４５１、１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１３３ａ／４５１、１３３ａ／６６０、１４０−３ｐ／６６０、１４２−３ｐ／１５ｂ、１５ｂ／４５１、１５ｂ／６６０、１７／４５１、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／１９ｂ、１９７／４５１、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／６６０、または３２０／６６０のうちの少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、もしくは各々、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００６４】
一部の実施形態では、このキットで提供される複数のプライマーおよびプローブ内の少なくとも１つのプライマーまたはプローブは、試料中のｍｉＲＮＡ対の少なくとも１つのｍｉＲＮＡに選択的に結合することが可能なものである。一部の実施形態では、このキットで提供される複数のプライマーまたはプローブは、試料中のｍｉＲＮＡ対の発現比率１３３ａ／９２ａ、１５ｂ／２１、１５ｂ／３０ｂ、１５ｂ／３０ｃ、１６／１９７、２８−３ｐ／４５１、１０１／１４０−３ｐ、１０６ａ／４５１、１０６ａ／６６０、１０６ａ／９２ａ、１２６／６６０、１３３ａ／４５１、１３３ａ／６６０、１４０−３ｐ／６６０、１４２−３ｐ／１５ｂ、１５ｂ／４５１、１５ｂ／６６０、１７／４５１、１７／６６０、１７／９２ａ、１９７／１９ｂ、１９７／４５１、１９７／６６０、１９７／９２ａ、１９ｂ／６６０、２８−３ｐ／６６０、または３２０／６６０のうちの少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、または各々のうちの少なくとも１つのｍｉＲＮＡに選択的に結合することが可能なプライマーまたはプローブを少なくとも１つ含む。
「侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスク」シグネチャー
【００６５】
対象における侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクを決定する方法も本発明で提供される。方法は、
（ａ）対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超える場合には、当該比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超えない場合には、当該比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも１４種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２８種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１２６／２１、１２６／９２ａ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１９７／１９ｂ、１９７／６６０、もしくは２８−３ｐ／６６０、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクを、（ｉ）少なくとも１４種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップと
を含む。
【００６６】
一部の実施形態では、このアッセイのｍｉＲＮＡ対は、比率１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１２６／２１、１２６／９２ａ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１９７／１９ｂ、１９７／６６０、および２８−３ｐ／６６０のうちの２種超、３種超、４種超、５種超、６種超、７種超、８種超、９種超、もしくは各々、またはその逆の比率を含む。
【００６７】
他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ対は、比率１０６ａ／４５１、１２６／４５１、１４５／１９７、１７／４５１、１９７／２１、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、１９７／４５１、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、２１／２２１、２１／２８−３ｐ、２８−３ｐ／３０ｂ、２８−３ｐ／３０ｃ、２８−３ｐ／４５１、２８−３ｐ／９２ａ、３２０／４５１、もしくは３２０／９２ａ、またはその逆の比率をさらに含んでよい。
【００６８】
さらに他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ対は、比率１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１２６／２１、１２６／９２ａ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１９７／１９ｂ、１９７／６６０、２８−３ｐ／６６０、１０６ａ／４５１、１２６／４５１、１４５／１９７、１７／４５１、１９７／２１、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、１９７／４５１、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、２１／２２１、２１／２８−３ｐ、２８−３ｐ／３０ｂ、２８−３ｐ／３０ｃ、２８−３ｐ／４５１、２８−３ｐ／９２ａ、３２０／４５１、および３２０／９２ａのうちの少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、少なくとも２７種、もしくは各々、またはその逆の比率を含む。これらの２８種の比率のうちの全てではないがいくつかを利用することにより、侵襲性腫瘍が顕在化するリスクを正確に同定するアッセイがもたらされることが予測されることが当業者には理解されよう。
【００６９】
一部の実施形態では、本発明は、対象における侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクを決定することにおいて有用な診断用または予後判定用試薬の製造における、２８種のｍｉＲＮＡ対のいずれかを検出するために有用な複数のプライマーまたはプローブの使用であって、検出は、
（ａ）対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超える場合には、当該比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超えない場合には、当該比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも１４種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２８種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１２６／２１、１２６／９２ａ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１９７／１９ｂ、１９７／６６０、もしくは２８−３ｐ／６６０、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクを、（ｉ）少なくとも１４種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップと
を含む、使用を提供する。
【００７０】
一部の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１２６／２１、１２６／９２ａ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１９７／１９ｂ、１９７／６６０、および２８−３ｐ／６６０のうちの２種超、３種超、４種超、５種超、６種超、７種超、８種超、９種超、もしくは各々、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００７１】
他の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、さらに、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／４５１、１２６／４５１、１４５／１９７、１７／４５１、１９７／２１、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、１９７／４５１、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、２１／２２１、２１／２８−３ｐ、２８−３ｐ／３０ｂ、２８−３ｐ／３０ｃ、２８−３ｐ／４５１、２８−３ｐ／９２ａ、３２０／４５１、もしくは３２０／９２ａ、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００７２】
さらに他の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１２６／２１、１２６／９２ａ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１９７／１９ｂ、１９７／６６０、２８−３ｐ／６６０、１０６ａ／４５１、１２６／４５１、１４５／１９７、１７／４５１、１９７／２１、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、１９７／４５１、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、２１／２２１、２１／２８−３ｐ、２８−３ｐ／３０ｂ、２８−３ｐ／３０ｃ、２８−３ｐ／４５１、２８−３ｐ／９２ａ、３２０／４５１、および３２０／９２ａのうちの少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、少なくとも２７種、もしくは各々、またはその逆の比率を検出するために有用である。これらの２８種の比率のうちの全てではないがいくつかを利用することにより、侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクを正確に同定するアッセイがもたらされることが予測されることが当業者には理解されよう。
【００７３】
他の実施形態では、本発明は、対象における侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクを決定するためのキットを提供する。キットは、診断用または予後判定用試薬の製造において２８種のｍｉＲＮＡ対のいずれかを検出するために有用な複数のプライマーまたはプローブ、および、複数のプライマーまたはプローブを利用して対象における侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクを決定するための説明書を含む。説明書は、
（ａ）対象由来の生体試料におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの発現比率を複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超える場合には、当該比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）におけるｍｉＲＮＡ対の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超えない場合には、当該比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）（１）少なくとも１４種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで、または（２）２８種のｍｉＲＮＡ対の発現比率を比較した後に、１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられるまで追加的なｍｉＲＮＡ対に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップであって、
ｍｉＲＮＡ対が、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１２６／２１、１２６／９２ａ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１９７／１９ｂ、１９７／６６０、もしくは２８−３ｐ／６６０、またはその逆の比率を含むステップと、
（ｅ）侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクを、（ｉ）少なくとも１４種のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陽性として、または（ｉｉ）１４種未満のｍｉＲＮＡ対の発現比率が陽性スコアに割り当てられた場合には陰性としてカテゴリー化するステップと
を含む。
【００７４】
一部の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１２６／２１、１２６／９２ａ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１９７／１９ｂ、１９７／６６０、および２８−３ｐ／６６０のうちの２種超、３種超、４種超、５種超、６種超、７種超、８種超、９種超、もしくは各々、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００７５】
他の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、さらに、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／４５１、１２６／４５１、１４５／１９７、１７／４５１、１９７／２１、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、１９７／４５１、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、２１／２２１、２１／２８−３ｐ、２８−３ｐ／３０ｂ、２８−３ｐ／３０ｃ、２８−３ｐ／４５１、２８−３ｐ／９２ａ、３２０／４５１、もしくは３２０／９２ａ、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００７６】
さらに他の実施形態では、複数のプライマーまたはプローブは、ｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１２６／２１、１２６／９２ａ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１９７／１９ｂ、１９７／６６０、２８−３ｐ／６６０、１０６ａ／４５１、１２６／４５１、１４５／１９７、１７／４５１、１９７／２１、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、１９７／４５１、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、２１／２２１、２１／２８−３ｐ、２８−３ｐ／３０ｂ、２８−３ｐ／３０ｃ、２８−３ｐ／４５１、２８−３ｐ／９２ａ、３２０／４５１、および３２０／９２ａのうちの少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、少なくとも２７種、もしくは各々、またはその逆の比率を検出するために有用である。
【００７７】
一部の実施形態では、このキットで提供される複数のプライマーおよびプローブ内の少なくとも１つのプライマーまたはプローブは、試料中のｍｉＲＮＡ対の少なくとも１つのｍｉＲＮＡに選択的に結合することが可能なものである。一部の実施形態では、このキットで提供される複数のプライマーまたはプローブは、試料中のｍｉＲＮＡ対の発現比率１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１２６／２１、１２６／９２ａ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／１９７、１４２−３ｐ／２８−３ｐ、１９７／１９ｂ、１９７／６６０、２８−３ｐ／６６０、１０６ａ／４５１、１２６／４５１、１４５／１９７、１７／４５１、１９７／２１、１９７／３０ｂ、１９７／３０ｃ、１９７／４５１、１９７／９２ａ、１９ｂ／４５１、２１／２２１、２１／２８−３ｐ、２８−３ｐ／３０ｂ、２８−３ｐ／３０ｃ、２８−３ｐ／４５１、２８−３ｐ／９２ａ、３２０／４５１、および３２０／９２ａのうちの少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種、少なくとも２５種、少なくとも２６種、少なくとも２７種、または各々のうちの少なくとも１つのｍｉＲＮＡに選択的に結合することが可能なプライマーまたはプローブを少なくとも１つ含む。
「肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスク」分類子
【００７８】
上記の４つの方法を組み合わせて、対象において肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスクを予測するための方法にすることができる。その方法は、
（ａ）上記の肺腫瘍の存在のシグネチャーを決定するステップと、
（ｂ）上記の侵襲性肺腫瘍の存在のシグネチャーを決定するステップと、
（ｃ）上記の肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーを決定するステップと、
（ｄ）上記の侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーを決定するステップと、
（ｅ）ステップ（ａ）〜（ｄ）のシグネチャーのいずれも陽性にカテゴリー化されない場合に、対象を、肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスクが低いとしてカテゴリー化するステップと、
（ｆ）少なくともステップ（ａ）の肺腫瘍の存在のシグネチャーが陽性であるか、ステップ（ｃ）の肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーが陽性であり、かつ、ステップ（ｂ）の侵襲性肺腫瘍の存在のシグネチャーとステップ（ｄ）の侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーがどちらも陰性である場合に、対象を、肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスクが中間であるとしてカテゴリー化するステップと、
（ｇ）少なくともステップ（ｂ）の侵襲性肺腫瘍の存在のシグネチャーが陽性であるか、ステップ（ｄ）の侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーが陽性である場合に、対象を、肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスクが高いとしてカテゴリー化するステップと
を含む。
【００７９】
上記の４つの使用を組み合わせて、対象において肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスクを予測するための使用にすることができる。その使用は、
（ａ）上記の肺腫瘍の存在のシグネチャーを決定することにおいて有用な診断用試薬の製造において、２７種のｍｉＲＮＡ対のいずれかを検出するために有用な複数のプライマーまたはプローブを使用するステップと、
（ｂ）上記の侵襲性肺腫瘍の存在のシグネチャーを決定することにおいて有用な診断用試薬の製造において２８種のｍｉＲＮＡ対のいずれかを検出するために有用な複数のプライマーまたはプローブを使用するステップと、
（ｃ）上記の肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーを決定することにおいて有用な診断用または予後判定用試薬の製造において２７種のｍｉＲＮＡ対のいずれかを検出するために有用な複数のプライマーまたはプローブを使用するステップと、
（ｄ）上記の侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーを決定することにおいて有用な診断用または予後判定用試薬の製造において２８種のｍｉＲＮＡ対のいずれかを検出するために有用な複数のプライマーまたはプローブを使用するステップと、
（ｅ）ステップ（ａ）〜（ｄ）のシグネチャーのいずれも陽性にカテゴリー化されない場合に、対象を、肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスクが低いとしてカテゴリー化するステップと、
（ｆ）少なくともステップ（ａ）の肺腫瘍の存在のシグネチャーが陽性であるか、ステップ（ｃ）の肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーが陽性であり、かつ、ステップ（ｂ）の侵襲性肺腫瘍の存在のシグネチャーとステップ（ｄ）の侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーがどちらも陰性である場合に、対象を、肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスクが中間であるとしてカテゴリー化するステップと、
（ｇ）少なくともステップ（ｂ）の侵襲性肺腫瘍の存在のシグネチャーが陽性であるか、ステップ（ｄ）の侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャーが陽性である場合に、対象を、肺腫瘍が発症するまたはそれを有するリスクが高いとしてカテゴリー化するステップと、
を含む。
【００８０】
Ａ．定義
「肺腫瘍」という用語は、本明細書で使用される場合、良性肺腫瘍または悪性肺腫瘍のいずれかであり得る。肺腫瘍は、１つまたは複数の肺の状態と関連するものであってよく、また、例えば肺小結節または肺腫瘤の形態をとるものであってよい。
【００８１】
「肺の状態」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば肺がんおよび種々の非がん性の状態を含めた、肺に関する疾患、事象、または健康状態の変化を指す。非がん性の肺の状態の例としては、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、良性肺腫瘍または細胞（例えば、過誤腫、線維腫、神経線維腫）の腫瘤、肉芽腫、サルコイドーシス、および細菌病原体によって引き起こされる感染（例えば、結核）または真菌病原体によって引き起こされる感染（例えば、ヒストプラスマ症）が挙げられる。ある特定の実施形態では、肺の状態は、Ｘ線検査による肺小結節の出現を伴う。
【００８２】
上記の方法は、任意の特定の肺がんの診断および／または予後判定を狭く限定するものではない。本明細書で使用される場合、「肺がん」とは、肺のがんを指すことが好ましいが、ヒトまたは他の哺乳動物の呼吸器系の任意の疾患または他の障害を含み得る。呼吸器の新生物疾患としては、例えば、小細胞細胞腫もしくは小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞癌もしくは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、腺癌、気管支肺胞癌（ＢＡＣ）、混合肺癌、悪性胸膜中皮腫、未分化大細胞癌、巨細胞癌、同時期性腫瘍（ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  ｔｕｍｏｒ）、大細胞神経内分泌癌、腺扁平上皮癌、未分化癌；ならびに、燕麦細胞がん、混合型小細胞／大細胞癌（ＬＣ）、大細胞癌、および複合型小細胞細胞腫を含めた小細胞細胞腫；ならびに、腺様嚢胞癌、過誤腫、粘液類上皮腫、定型カルチノイド肺腫瘍、非定型カルチノイド肺腫瘍、末梢カルチノイド肺腫瘍、中枢カルチノイド肺腫瘍、胸膜中皮腫、未分化肺癌および体の他の部分から肺に転移した二次がんなどの、肺の外側に由来するがん、または、現在公知であるまたは後に発見される任意の他の肺がんが挙げられる。肺がんは、任意の病期またはグレードのものであってよい。
【００８３】
「対象由来の生体試料」という用語は、本明細書で使用される場合、喫煙者、非喫煙者、元喫煙者、がん患者（例えば、処置後のがんの再発を診断および／またはモニタリングするため）、元がん患者などを含めた任意の対象由来の試料を指す。特定の実施形態では、生体試料の起源は、画像診断法に供しても試料採取時に肺腫瘍が示されない喫煙個体、特に、スパイラルＣＴスキャンに供しても５ｍｍを超える寸法の小結節が示されない喫煙個体である。
【００８４】
「生体試料」という用語は、本明細書で使用される場合、対象におけるｍｉＲＮＡプロファイルの正確な測定をもたらす任意の組織であり得る。一部の実施形態では、生体試料は、生体液である。ｍｉＲＮＡは基本的に全ての体液中に存在するので、これらの実施形態は任意の特定の体液に狭く限定されない（Ｗｅｂｅｒら、Ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｉｎ  １２  ｂｏｄｙ  ｆｌｕｉｄｓ、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５６巻：１７３３〜１７４１頁、２０１０年；Ｄｅ  Ｇｕｉｒｅら、Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ
４６巻：８４６〜８６０頁、２０１３年；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｄｏｒａｎｔｅｓら、Ｍｅｔｈ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１６５巻：８１〜８７頁、２０１４年も参照されたい）。有用な体液の例は、末梢血、血清、血漿、復水、尿、痰、唾液、気管支肺胞（ｂｒｏｎｃｈｅｏａｌｖｅｏｌａｒ）洗浄液、嚢胞液、胸膜液、腹腔液、リンパ液、膿、洞腔（ｓｉｎｕｓ  ｃａｖｉｔｙ）からの洗浄液、気管支肺吸引液、および骨髄穿刺液である。当業者は、過度な実験を伴わずに、任意の特定の体液が任意の特定の適用に対して有用であるかどうかを決定することができる。一部の実施形態では、体液は、血漿または血清である。一部の実施形態では、生体試料は、組織試料である。
【００８５】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」とは、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、複数の形態も含むものとする。さらに、「または（ｏｒ）」の使用は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を含むものとする。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「個体」、「対象」、「患者」または「それを必要とする対象」とは、腫瘍もしくは侵襲性腫瘍が発症するリスクを有する個体、または腫瘍もしくは侵襲性腫瘍を有する可能性があるもしくはそれを患っている可能性があるもしくはそれを有すると診断された個体である。これらの用語は、互換的に利用することができる。個体は、哺乳動物であることが好ましい。哺乳動物は、例えば、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、鳥類、マウス、ラット、家禽、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジまたはブタであってよい。哺乳動物はヒトであることが好ましい。
【００８７】
本明細書で使用される場合、複数のプライマーまたはプローブ内の「プライマー」または「プローブ」は、核酸分子である。プライマーまたはプローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡであってよい。プライマーまたはプローブは天然に存在するものであっても合成されたものであってもよい。プライマーまたはプローブは、少なくとも５核酸、少なくとも１０核酸、少なくとも１５核酸、少なくとも２０核酸、少なくとも２５核酸、少なくとも５０核酸、少なくとも７５核酸、少なくとも１００核酸の長さであってよい。複数のプライマーおよびプローブ内の少なくとも１つのプライマーまたはプローブは、試料中のｍｉＲＮＡ対の少なくとも１つのｍｉＲＮＡに選択的に結合することが可能なものであることが好ましい。複数のプライマーまたはプローブは、試料中の全てのｍｉＲＮＡ対発現割り当てのうちの少なくとも１つのｍｉＲＮＡに選択的に結合することが可能なプライマーまたはプローブを少なくとも１つ含むことが好ましい。「選択的に結合する」という用語は、プライマーまたはプローブが、試料中のｍｉＲＮＡ対の少なくとも１つのｍｉＲＮＡとの結合に対する親和性が高いことまたは試料中のｍｉＲＮＡ対の少なくとも１つのｍｉＲＮＡとの結合に対する親和性が他のあらゆるｍｉＲＮＡと比較して高いことを意味する。「プライマー」という用語は、当該核酸分子が、ＤＮＡ合成の開始点としての機能を果たすことが可能なものであることを意味する。すなわち、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーの３’末端から複製を開始することが可能である。
【００８８】
上記の方法のいずれかについて「ｍｉＲＮＡ対の発現比率」という用語は、本明細書で使用される場合、２種の特定のｍｉＲＮＡの発現レベルの比率である。本明細書に記載の任意の方法において明記されているｍｉＲＮＡ対のいずれかの比率は、明記されているものの逆の比率として算出できることが理解されるべきである。非限定的な例として、特定の方法に関してｍｉＲＮＡ対が「１０６ａ／１４０−５ｐ、１０６ａ／１４２−３ｐ、１２６／１４０−５ｐ、１２６／１４２−３ｐ、１３３ａ／１４２−３ｐ、１４０−５ｐ／１７、１４２−３ｐ／１４８ａ、１４２−３ｐ／１５ｂ、１４２−３ｐ／１７、１４２−３ｐ／２１、１４２−３ｐ／２２１、１４２−３ｐ／３０ｂ、および３２０／６６０、またはその逆の比率」である場合、これらのｍｉＲＮＡ対のうちの任意の１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種または１３種の発現比率は、逆の比率として算出することができ、その場合、カットオフ値を適宜調整する。
【００８９】
「カットオフ値」という用語は、本明細書で使用される場合、負の数または正の数であり得る。いくつかの比率を用いると、「カットオフ値を超える」発現比率は、大きさがカットオフ値よりも小さい値である。他の比率を用いると、「カットオフ値を超える」発現比率は、大きさがカットオフ値よりも大きい値である。例えば、表９を参照されたい。表９では、「＞」は、大きさがカットオフ値よりも大きい数がカットオフを超える比率を示すことを示し、「＜」は、大きさがカットオフ値よりも小さい数がカットオフ値を超える比率を示すことを示す。
【００９０】
この「カットオフ値を超える」の定義の下では、（ｉ）比率１３３ａ／９２ａについての−４．５０の値は、表９に列挙されている−４．１８のカットオフ値を超え、（ｉｉ）比率１７／４５１についての３．５０の値は、表９に列挙されている３．３３のカットオフ値を超え、（ｉｉｉ）比率１４２−３ｐ／１７についての−１．８０の値は、表９に列挙されている−１．９５のカットオフ値を超え、（ｉｖ）比率１６／１９７についての４．５０の値は、表９に列挙されている５．００のカットオフ値を超える。
【００９１】
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、任意の特定のｍｉＲＮＡ対の発現比率についてのカットオフ値は、複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定される。「複数の対照試料」という用語は、本明細書で使用される場合、任意の定義済みの集団、例えば、いかなるがんの病歴も有さない健康な対象、肺がんの病歴を有さない健康な対象、肺がんを有する対象、喫煙したことのない対象、喫煙していたがもう喫煙しない対象などに由来するものであってよい。好ましい実施形態では、複数の対照試料は健康な対象に由来し、カットオフ値は、複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率である。これらの実施形態の一部では、「平均」という用語は、本明細書で使用される場合、平均値または中央値であり得る。他の実施形態では、カットオフは、平均＋／−１標準偏差、または任意のより小さなまたはより大きな割合の標準偏差、例えば、＋／−１／２標準偏差、＋／−３／４標準偏差、＋／−１．５標準偏差、＋／−２標準偏差、または任意のより大きな、より小さな、または中間の割合の標準偏差である。
【００９２】
カットオフ値は、任意の対照集団由来の任意の複数の対照試料について、公知の方法を使用することによって、例えば、実施例に記載の通り訓練セットを使用することによって、過度な実験を伴わずに決定することができる。カットオフは、所望の感度（ＳＥ）、特異性（ＳＰ）、陽性的中率（ＰＰＶ）および陰性的中率（ＮＰＶ）が実現されるように確立する。
【００９３】
これらの診断方法（腫瘍の存在；侵襲性腫瘍の存在）および予後判定方法（腫瘍が顕在化するリスク；侵襲性腫瘍が顕在化するリスク）を評価するために、臨床の場ではカテゴリー化によって検査の結果を解釈する。方法の診断値または予後判定値は、そのＳＥ、ＳＰ、ＰＰＶおよびＮＰＶによって定義することができる。任意の検査方法により、真陽性（ＴＰ）、偽陰性（ＦＮ）、偽陽性（ＦＰ）、および真陰性（ＴＮ）が生じる。検査の「感度」は、疾患が存在するもしくは応答する、検査陽性の患者全ての百分率または（ＴＰ／ＴＰ＋ＦＮ）×１００％である。検査の「特異度」は、疾患を有さないもしくは応答しない、検査陰性の患者全ての百分率または（ＴＮ／ＦＰ＋ＴＮ）×１００％である。検査の「的中率」または「ＰＶ」は、値（陽性または陰性）が真の値である回数の尺度（％）であり、すなわち、真陽性である全ての検査陽性のパーセントが陽性的中率（ＰＶ＋）または（ＴＰ／ＴＰ＋ＦＰ）×１００％である。「陰性的中率」（ＰＶ）は、応答しない検査陰性の患者の百分率または（ＴＮ／ＦＮ＋ＴＮ）×１００％である。別の尺度である検査の「正確度」または「効率」は、検査の総数と比較した検査によって正確な答えがもたらされる回数の百分率または（ＴＰ＋ＴＮ／ＴＰ＋ＴＮ＋ＦＰ＋ＦＮ）×１００％である。「誤差率」は、応答すると予測されたが応答しなかった患者および応答すると予測されなかったが応答した患者または（ＦＰ＋ＦＮ／ＴＰ＋ＴＮ＋ＦＰ＋ＦＮ）×１００％から算出される。全体的な検査「特異度」は、集団における疾患変化の全体的な尤度、的中率が変化するにつれ検査の感度および特異度の正確度が変化しないことの尺度である。ＰＶは、所与の患者における疾患の有無または臨床応答の有無に関する医師の臨床的評価に伴って変化する。
【００９４】
任意の所与の検査に関して、ＴＰ、ＦＮ、ＦＰおよびＴＮは、当業者が過度な実験を伴わずに、例えば、予後判定的または診断的な決定を行うためにカットオフ値を調整すること、統計的有意性（例えば、Ｐ値）を調整すること；検査手順の正確度を調整することなどによって決定し、調整することができる。
【００９５】
Ｂ．方法
ｍｉＲＮＡの発現レベルは、当技術分野で公知の任意の手段によって決定することができる。一部の実施形態では、発現レベルを、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して各ｍｉＲＮＡ対内の各ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡコピーを作製することによって決定する。種々の実施形態では、発現比率を、リアルタイムＰＣＲを使用してさらに決定する。これらの方法の特定の実施形態では、発現比率を、ＴａｑＭａｎプローブを使用してさらに決定する。しかし、方法は、これらの実施形態に限定されず、ｍｉＲＮＡ発現レベルを決定するための、現在公知であるまたは後に発見される任意の適切な方法を使用して実施することができる。
【００９６】
本発明の方法の一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡを測定する前に増幅する。他の実施形態では、これらの核酸のレベルを増幅プロセス中に測定する。さらに他の方法では、核酸を測定する前に増幅しない。
【００９７】
成熟ｍｉＲＮＡ、前駆体ｍｉＲＮＡ、および一次ｍｉＲＮＡなどのｍｉＲＮＡの核酸配列を増幅するための多くの方法が存在する。適切な核酸の重合技法および増幅技法としては、逆転写（ＲＴ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ））、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応、多重ライゲーション可能プローブ増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｌｉｇａｔｅａｂｌｅ  ｐｒｏｂｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、インベーダー技術（ｉｎｖａｄｅｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ）、ローリングサークル増幅、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）、鎖置換増幅、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ＲＮＡ（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ）増幅、および当業者に公知の他の方法が挙げられる。ある特定の実施形態では、例えば、逆転写、その後にリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）など、１つ超の増幅方法を使用する。ＰＣＲ法およびｑ−ＰＣＲ法では、例えば、各標的配列に対してプライマーのセットを使用する。ある特定の実施形態では、プライマーの長さは、これだけに限定されないが、プライマー間の望ましいハイブリダイゼーション温度、標的核酸配列、および増幅される種々の標的核酸配列の複雑さを含めた多くの因子に左右される。ある特定の実施形態では、プライマーは、約１５〜約３５ヌクレオチドの長さである。他の実施形態では、プライマーは、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、または３５ヌクレオチドと等しいまたはそれ未満の長さである。追加的な実施形態では、プライマーは少なくとも３５ヌクレオチドの長さである。
【００９８】
さらなる態様では、フォワードプライマーは、ｍｉＲＮＡとアニーリングする配列を少なくとも１つ含んでよく、あるいは、追加的な５’非相補的領域を含んでよい。別の態様では、リバースプライマーは、逆転写されたｍｉＲＮＡの相補体にアニーリングするように設計することができる。リバースプライマーは、ｍｉＲＮＡ配列とは独立したものであってよく、同じリバースプライマーを使用して多数のｍｉＲＮＡバイオマーカーを増幅することができる。あるいは、リバースプライマーは、ｍｉＲＮＡバイオマーカーに特異的なものであってもよい。
【００９９】
ｑＲＴ−ＰＣＲ反応は、さらに、逆転写酵素とＤＮＡに基づく熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを両方含めることによって逆転写反応と組み合わせることができる。２種のポリメラーゼを使用する場合、アッセイの性能を最大にするために「ホットスタート」手法を使用することができる（米国特許第５，４１１，８７６号および同第５，９８５，６１９号）。例えば、重合効率を改善するために、逆転写酵素反応およびＰＣＲ反応の成分を、１つまたは複数の熱活性化法または化学的変質を使用して隔離することができる（米国特許第５，５５０，０４４号、同第５，４１３，９２４号、および同第６，４０３，３４１号）。
【０１００】
ある特定の実施形態では、増幅されたｍｉＲＮＡまたは増幅されなかったｍｉＲＮＡを検出するために、標識、色素、または標識されたプローブおよび／またはプライマーを使用する。当業者には、どの検出方法が適切であるかが、検出方法の感度および標的の存在量に基づいて認識されよう。検出方法の感度および標的の存在量に応じて、検出の前に増幅が必要な場合もあり、必要でない場合もある。ｍｉＲＮＡを増幅することが好ましい検出方法は当業者には認識されよう。
【０１０１】
プローブまたはプライマーは、ワトソンクリック塩基または修飾塩基を含んでよい。修飾塩基としては、これだけに限定されないが、例えば、米国特許第５，４３２，２７２号、同第５，９６５，３６４号、および同第６，００１，９８３号に記載されている、ＡＥＧＩＳ塩基（Ｅｒａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。ある特定の態様では、塩基は、天然のリン酸ジエステル結合または別の化学的連結によってつながっている。別の化学的連結としては、これだけに限定されないが、例えば、米国特許第７，０６０，８０９号に記載されているペプチド結合またはロックド核酸（ＬＮＡ）連結が挙げられる。
【０１０２】
さらなる態様では、増幅反応において存在するオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、時間に応じて産生される増幅産物の量をモニタリングするのに適している。ある特定の態様では、二本鎖特性に対して異なる一本鎖特性を有するプローブを使用して核酸を検出する。プローブとしては、これだけに限定されないが、５’−エキソヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標））プローブ（米国特許第５，５３８，８４８号を参照されたい）、ステムループ分子ビーコン（例えば、米国特許第６，１０３，４７６号および同第５，９２５，５１７号を参照されたい）、ステムレスまたは直鎖状ビーコン（例えば、ＷＯ９９２１８８１、米国特許第６，４８５，９０１号および同第６，６４９，３４９号を参照されたい）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子ビーコン（例えば、米国特許第６，３５５，４２１号および同第６，５９３，０９１号を参照されたい）、直鎖状ＰＮＡビーコン（例えば、米国特許第６，３２９，１４４号を参照されたい）、非ＦＲＥＴプローブ（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号を参照されたい）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（商標）／ＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒＢ（商標）プローブ（例えば、米国特許第６，５４８，２５０号を参照されたい）、ステムループおよび二重鎖Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）（例えば、米国特許第６，５８９，７４３号を参照されたい）、バルジループプローブ（例えば、米国特許第６，５９０，０９１号を参照されたい）、シュードノットプローブ（例えば、米国特許第６，５４８，２５０号を参照されたい）、サイクリコン（ｃｙｃｌｉｃｏｎ）（例えば、米国特許第６，３８３，７５２号を参照されたい）、ＭＧＢ  Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）ｐｒｏｂｅ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヘアピンプローブ（例えば、米国特許第６，５９６，４９０号を参照されたい）、ＰＮＡライトアッププローブ（ＰＮＡ  ｌｉｇｈｔ−ｕｐ  ｐｒｏｂｅ）、アンチプライマークエンチプローブ（ａｎｔｉｐｒｉｍｅｒ  ｑｕｅｎｃｈ  ｐｒｏｂｅ）（Ｌｉら、Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ５３巻：６２４〜６３３頁（２００６年））、自己組織化ナノ粒子プローブ、および、例えば米国特許第６，４８５，９０１号に記載されているフェロセン修飾されたプローブが挙げられる。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、増幅反応におけるプライマーの１つまたは複数は、標識を含む。またさらなる実施形態では、異なるプローブまたはプライマーは、互いを区別することができる検出可能な標識を含む。一部の実施形態では、プローブまたはプライマーなどの核酸を２つまたはそれ超の区別することができる標識で標識することができる。
【０１０４】
一部の実施形態では、マイクロアレイまたは別の支持体を使用してｍｉＲＮＡの濃度を測定する。
【０１０５】
「マイクロアレイ」は、それぞれが定義済みの領域を有し、例えば、これだけに限定されないが、ガラス、プラスチック、または合成膜などの固体支持体の表面上に形成された別個の領域の直線状または２次元または３次元の（および固相）アレイである。マイクロアレイ上の別個の領域の密度は、単一の固相支持体の表面上で検出される、固定化したポリヌクレオチドの総数によって決定され、例えば、少なくとも約５０／ｃｍ２、少なくとも約１００／ｃｍ２、または少なくとも約５００／ｃｍ２、約１，０００／ｃｍ２に至るまでまたはそれ超などである。アレイは、固定化したポリヌクレオチドを全部で約５００未満、約１０００未満、約１５００未満、約２０００未満、約２５００未満、約３０００未満、またはそれ超未満含有してよい。本明細書で使用される場合、ＤＮＡマイクロアレイは、試料から増幅またはクローニングされたポリヌクレオチドをハイブリダイズさせるために使用するチップまたは他の表面に配置されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブのアレイである。アレイ内のプローブの特定の群のそれぞれの位置は分かっているので、マイクロアレイ内の特定の位置への試料ポリヌクレオチドの結合に基づいて、試料ポリヌクレオチドの同一性を決定することができる。
【０１０６】
マイクロアレイの使用に対する代替として、ｍｉＲＮＡの発現を検出するための２次元の１つまたは複数の位置の配置または３次元配置を含めた、支持体上の任意のサイズのアレイを本開示の実施において使用することができる。
【０１０７】
一部の態様では、標識を１つまたは複数のプローブに付着させ、標識は、以下の性質のうちの１つまたは複数を有する：（ｉ）検出可能なシグナルをもたらす；（ｉｉ）第２の標識と相互作用して、第２の標識によってもたらされる検出可能なシグナル、例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を改変する；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション、例えば、二重鎖の形成を安定化する；および（ｉｖ）結合複合体または親和性のセット、例えば、親和性、抗体−抗原、イオン結合性錯体、ハプテン−リガンド（例えば、ビオチン−アビジン）のメンバーをもたらす。さらに他の態様では、標識の使用は、公知の標識、連結、連結基、試薬、反応条件、分析方法および精製方法を使用する多数の公知の技法の任意の１つを使用して実現することができる。
【０１０８】
ｍｉＲＮＡは、直接的な方法によっても間接的な方法によっても検出することができる。直接的な検出方法では、１つまたは複数のｍｉＲＮＡを、核酸分子に連結した検出可能な標識によって検出する。そのような方法では、ｍｉＲＮＡをプローブに結合させる前に標識することができる。したがって、結合を、プローブに結合した、標識したｍｉＲＮＡについてのスクリーニングによって検出する。プローブは、任意選択で、反応体積内でビーズに連結させる。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、核酸を、標識したプローブと直接結合させることによって検出し、その後にプローブを検出する。本発明の一実施形態では、増幅されたｍｉＲＮＡなどの核酸を、所望の核酸を捕捉するためのプローブとコンジュゲートしたＦＩｅｘＭＡＰ
Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用して検出する。いくつかの方法は、例えば、蛍光標識で修飾したポリヌクレオチドプローブを用いた検出または分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）検出を伴い得る。
【０１１０】
他の実施形態では、核酸を、間接的な検出方法によって検出する。例えば、ビオチン化したプローブを、ストレプトアビジンとコンジュゲートした色素と組み合わせて、結合した核酸を検出することができる。ストレプトアビジン分子が増幅されたｍｉＲＮＡ上のビオチン標識に結合し、結合したｍｉＲＮＡを、ストレプトアビジン分子に付着した色素分子を検出することによって検出する。一実施形態では、ストレプトアビジンとコンジュゲートした色素分子は、Ｐｈｙｃｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＲＯｚｙｍｅ）を含む。他のコンジュゲートした色素分子は当業者に公知である。
【０１１１】
標識としては、これだけに限定されないが、検出可能な蛍光シグナル、化学発光シグナル、または生物発光シグナルを生じさせるまたはクエンチする光放射性化合物、光散乱性化合物、および光吸収性化合物が挙げられる（例えば、Ｋｒｉｃｋａ，  Ｌ．、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９２年）およびＧａｒｍａｎ  Ａ．、Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７年）を参照されたい）。標識として有用な蛍光レポーター色素としては、これだけに限定されないが、フルオレセイン（例えば、米国特許第５，１８８，９３４号、同第６，００８，３７９号、および同第６，０２０，４８１号を参照されたい）、ローダミン（例えば、米国特許第５，３６６，８６０号、同第５，８４７，１６２号、同第５，９３６，０８７号、同第６，０５１，７１９号、および同第６，１９１，２７８号）、ベンゾフェノキサジン（例えば、米国特許第６，１４０，５００号を参照されたい）、ドナーとアクセプターの対を含むエネルギー移動蛍光色素（例えば、米国特許第５，８６３，７２７号；同第５，８００，９９６号；および同第５，９４５，５２６号を参照されたい）、およびシアニン（例えば、ＷＯ９７４５５３９を参照されたい）、リサミン、フィコエリトリン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＦｌｕｏｒＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＲＥＧ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ、Ｒｅｎｏｇｒａｐｈｉｎ、ＲＯＸ、ＳＹＰＲＯ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ、および／またはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ならびに検出可能なシグナルを生じさせることが可能な任意の他の蛍光部分が挙げられる。フルオレセイン色素の例としては、これだけに限定されないが、６−カルボキシフルオレセイン；２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン；および２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセインが挙げられる。ある特定の態様では、蛍光標識は、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ、６−カルボキシフルオレセイン（「ＦＡＭ」）、ＴＥＴ、ＲＯＸ、ＶＩＣＴＭ、およびＪＯＥから選択される。例えば、ある特定の実施形態では、標識は、異なる、スペクトル的に分解可能な波長で光を放射することが可能な異なるフルオロフォア（例えば、４種の色が異なるフルオロフォア）であり、ある特定のそのような標識したプローブは、当技術分野で公知であり、上記されており、また、米国特許第６，１４０，０５４号に記載されている。一部の実施形態では、レポーターフルオロフォアおよびクエンチャーフルオロフォアを含む二重標識蛍光プローブを使用する。フルオロフォアの対は、それらを容易に区別することができるように別個の発光スペクトルを有するものを選択することが理解されよう。
【０１１２】
またさらなる態様では、標識は、二重鎖のハイブリダイゼーションを増強する、安定化する、またはそれに影響を及ぼす機能を果たすハイブリダイゼーション安定化部分、例えば、インターカレーターおよびインターカレート色素（これだけに限定されないが、臭化エチジウムおよびＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎを含む）、副溝結合物質、および架橋官能基である（例えば、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎら編、「ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６年）を参照されたい）。
【０１１３】
さらなる態様では、オリゴヌクレオチドライゲーション（ＯＬＡ）法および標的核酸配列にハイブリダイズする区別可能なプローブを、結合していないプローブから分離することを可能にする方法を含めた、ハイブリダイゼーションおよび／またはライゲーションに依拠してｍｉＲＮＡを定量する方法を使用することができる。例として、米国特許出願公開第２００６／００７８８９４号に開示されているＨＡＲＰ様プローブを使用してｍｉＲＮＡの量を測定することができる。
【０１１４】
方法のさらなる実施形態では、ｍｉＲＮＡを定量するためにプローブライゲーション反応を使用することができる。マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）技法（Ｓｃｈｏｕｔｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０巻：ｅ５７頁（２００２年））では、標的核酸上で互いのすぐ隣にハイブリダイズするプローブの対が、標的核酸が存在するときにのみ互いとライゲーションする。一部の態様では、ＭＬＰＡプローブは隣接ＰＣＲプライマー結合部位を有する。ＭＬＰＡプローブは、ライゲーションしている場合にのみ、増幅することができ、したがって、ｍｉＲＮＡバイオマーカーを検出し、定量することが可能になる。
【０１１５】
Ｃ．溶血の検出
赤血球および血小板の溶血により、上記の方法に干渉し得るｍｉＲＮＡが放出される（Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６巻：ｅ２４１４５頁、２０１１年；Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ（Ｐｈｉｌａ）５巻：４９２〜４９７頁、２０１２年）。したがって、上記の方法の一部の実施形態では、生体試料における溶血を決定し、溶血が決定された場合には試料を方法に供さない。
【０１１６】
溶血は、対象試料において、当技術分野で公知の任意の手段によって決定することができる。一部の実施形態では、溶血を、例えば、異なる波長（４１４ｎｍ、５４１ｎｍ、５７６ｎｍ）における吸光度を測定して試料中の遊離のヘモグロビンの存在および量を同定することによって、分光光度法で決定する（Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒら、２０１１年）。
【０１１７】
他の実施形態では、溶血を、溶血した試料中で上方制御される溶血関連ｍｉＲＮＡの発現レベルを分析することによって決定する。これらの実施形態の一部では、溶血していない試料に対して溶血した試料では有意に上方制御されるｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−９２ａまたはｍｉＲ−１４０−３ｐのいずれかを利用する。これらの実施形態の種々の態様では、溶血関連ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−１６、およびｍｉＲ−９２ａである。
【０１１８】
さらなる実施形態では、溶血した試料において上方制御されない複数の正規化用ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定し、溶血関連ｍｉＲＮＡの発現レベルを正規化するために使用する。これらの正規化用ｍｉＲＮＡを溶血関連ｍｉＲＮＡとの比率で使用して、後者のｍｉＲＮＡの決定された発現レベルを正規化することができる。これらの実施形態の一部では、正規化用ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−３０ｂを含む。
【０１１９】
「溶血」シグネチャー
一部の実施形態では、溶血を、
（ａ）試料中のｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−３０ｂのそれぞれと対になったｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−１６、およびｍｉＲ−９２ａのそれぞれからなる１６種のｍｉＲＮＡ対のそれぞれの発現比率（すなわち、ｍｉＲ−４５１／ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−４５１／ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−４５１／ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−４５１／ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−４８６−５ｐ／ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−４８６−５ｐ／ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−４８６−５ｐ／ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−４８６−５ｐ／ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−１６／ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６／ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６／ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−１６／ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−９２ａ／ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−９２ａ／ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−９２ａ／ｍｉＲ−２２１、およびｍｉＲ−９２ａ／ｍｉＲ−３０ｂまたはその逆の比率）を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの１６種の発現比率のそれぞれを、各発現比率について複数の対照試料由来の複数の対応するｍｉＲＮＡ対の平均比率から決定されたカットオフ値と比較するステップと、
（ｃ）１６種のｍｉＲＮＡ対のそれぞれについて、ステップ（ａ）における発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超える場合には、当該比率に対して陽性スコアを割り当てるか、またはステップ（ａ）の発現比率がステップ（ｂ）におけるカットオフ値を超えない場合には、当該比率に対して非陽性スコアを割り当てるステップと、
（ｄ）試料を、（ｉ）１６種の比率のうち８種またはそれ超がカットオフ値を超える場合には溶血を有するとして、または（ｉｉ）１６種の比率のうち８種未満がカットオフ値を超える場合には溶血を有さないとしてカテゴリー化するステップと
によってさらに決定する。
【０１２０】
上記の診断アッセイおよび予後判定アッセイと同様に、この溶血アッセイのカットオフ値は対照集団に左右され、例えば、複数の溶血していない血清試料を対照試料として使用する場合のカットオフは、複数の溶血した血清試料を対照試料として使用する場合のカットオフとは異なる。実施例を参照されたい。さらに、カットオフは、例えば、所望のＳＥ値、ＳＰ値、ＰＰＶ値およびＮＰＶ値が実現されるように調整することができる。一部の実施形態では、溶血していない血清試料を対照試料として使用する場合、カットオフは、複数の対照試料の比率の平均（平均値または中央値）になる。任意選択で、このカットオフは、カットオフ値を決定するために使用した試料の間の変動性の差異を説明するために＋／−部分標準偏差を有する。
【０１２１】
種々の実施形態では、上記のｍｉＲＮＡ発現レベルを使用した溶血アッセイのいずれかを別の溶血アッセイ、例えば、Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒら、２０１１年に記載の分光光度アッセイと組み合わせもする。
【０１２２】
Ｄ．診断の組合せ
実施例において考察されている通り、実施例に記載されているＭＳＣシグネチャーを低線量コンピュータ断層撮影法（ＬＤＣＴ）と組み合わせることにより、ＬＤＣＴによって検出されなかった追加的ながんを検出することが可能になり、それにより、スクリーニング感度が、ＭＳＣ単独では８７％、ＬＤＣＴ単独では８４％から、ＬＤＣＴとＭＳＣを組み合わせた場合には９８％まで上昇する。ＬＤＣＴ以外のがんスクリーニングアッセイと組み合わせて、上記の診断方法および予後判定方法では、診断感度にも同様の改善が示されることが予測される。
【０１２３】
ＬＤＣＴスクリーニングおよび関連する経過観察手順の健康管理費用は著しいものである。米国における、ＬＤＣＴを広範に採用することが検討された最近の財政インパクトモデルから、ＬＤＣＴスクリーニングにより、７５％スクリーニング率で最大８１００件の早発性肺がんによる死亡が回避され、肺がんによる死亡を１件回避するための追加的なスクリーニング費用が２４０，０００ドルであることが示された（Ｇｏｕｌａｒｔら、２０１２年）。非侵襲的バイオマーカー検査を用いてＬＤＣＴスクリーニングを補完することで、下流の費用が縮小されることにより、ＬＤＣＴスクリーニングに登録される個体の数が増加し得る（Ｐｅｒｅｓ、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １０５巻：１〜２頁、２０１３年）。
【０１２４】
したがって、上記の診断的なまたは予後判定方法はいずれも、ｍｉＲＮＡ発現の分析を含まないシステムを使用した対象の肺がんについてのスクリーニングと組み合わせることができる。このシステムは、ｍｉＲＮＡ発現分析の前、それと同時に、またはその後に使用することができる。現在公知であるまたは後に発見される任意のシステムに、ＭＳＣを用いた追加的な分析による利点がもたらされることが予測される。そのようなシステムの非限定的な例としては、血液検査、Ｘ線、コンピュータ断層撮影法、陽電子放出断層撮影法、胸腔穿刺、気管支鏡検査、細針吸引、胸腔鏡検査、開胸術、または縦隔鏡検査が挙げられる。一部の実施形態では、システムは、低線量コンピュータ断層撮影法（ＬＤＣＴ）である。
【０１２５】
Ｅ．モニタリング
上記の方法はいずれも、対象を肺がんの存在および／または肺がんが発症するリスクについてモニタリングするために使用することができる。上記の方法のいずれかを、対象から違う時間に取得した少なくとも２種の異なる生体試料に対して実施すると対象がモニタリングされる。一部の実施形態では、少なくとも２種の異なる生体試料のうちの少なくとも１種は、対象が肺がんに対する処置を受けた後に対象から取得される。そのようなモニタリングにより、肺がんの再発または再発のリスクを評価する。
【０１２６】
Ｆ．処置
上記の方法を利用して、処置の選択肢を選択することができる。本明細書で使用される場合、「処置する（ｔｒｅａｔ）」という用語は、肺がんの徴候または症状の重症度を取り除くまたは軽減するために薬剤を投与することについて記載するものを意味する。その代わりに、またはそれに加えて、療法が多数の場所の少なくとも１つにおける障害に適用される場合には、多数の場所において起こり得る障害が処置される。
【０１２７】
一実施形態によると、上記の方法を利用して処置の選択肢を選択することができるというのは、腫瘍が発症するまたは腫瘍を有するリスクを予測するための方法の組合せにおいて存在またはリスクが陰性であることが決定された場合、またはリスクが低いことが決定された場合には対象に肺がんに対する処置を行わない場合である。別の実施形態では、方法の組合せにおいて存在またはリスクが陽性であることが決定された場合、または中間もしくは高いリスクが決定された場合には対象に肺がんに対する処置を行う。
【０１２８】
したがって、対象に対する肺がん処置の選択肢を確立する方法も本発明で提供される。方法は、上記の診断方法および／または予後判定方法を使用して対象を検査するステップと、方法の結果に従って処置の選択肢を決定するステップとを含む。方法は、それを必要とする対象に処置を施行するステップをさらに含んでよい。
【０１２９】
Ｇ．ｍｉＲＮＡ
全体として、２４種のｍｉＲＮＡにより、肺腫瘍の存在のシグネチャー（ＰＤ）、侵襲性肺腫瘍の存在のシグネチャー（ＰＡＤ）、肺腫瘍が顕在化するリスクのシグネチャー（ＲＤ）、および侵襲性肺腫瘍が顕在化するリスク（ＲＡＤ）のシグネチャーが構成される。表１に、各シグネチャーに存在し得るこれらの２４種のｍｉＲＮＡを列挙する。
【表１−１】
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【表１−２】
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【０１３０】
表２に、本発明の全ての態様において使用するためのｍｉＲＮＡの要約を提示する。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【０１３１】
以下の実施例は、特許請求された発明をよりよく例示するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。特定の材料について言及している場合には、それはただ単に例示を目的とするものであり、本発明を限定するものではない。当業者は、発明能力を発揮することなく、かつ本発明の範囲から逸脱することなく等価の手段または反応物を開発することができる。
【実施例】
【０１３２】
以下の実施例は、Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ  ＭＩＬＤ  Ｔｒｉａｌ  Ｓｔｕｄｙとも称されるコンピュータ断層撮影法肺がんスクリーニング内での、血漿に基づくマイクロＲＮＡシグネチャー分類子の臨床的な有用性に関する。ＬＤＣＴのランダム化Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ  Ｉｔａｌｉａｎ  Ｌｕｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＭＩＬＤ）臨床試験内の喫煙者の対象と、観察の喫煙者の対象から前向きに採取した試料において遡及的に評価した対象９３９名における、予め指定されたｍｉＲＮＡシグネチャー分類子（ＭＳＣ）アルゴリズムの診断能を決定するための検証試験（Ｐａｓｔｏｒｉｎｏら、２０１２年）からの結果が提供される。我々は、ＭＳＣが有意な診断能および予後判定能を有することを実証する。
【０１３３】
（実施例１）
方法
Ａ．試験集団。ランダム化前向き臨床試験であるＭｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ  Ｉｔａｌｉａｎ  Ｌｕｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＭＩＬＤ）試験が２００５年に開始され、Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｎａｚｉｏｎａｌｅ  ｄｅｉ  Ｔｕｍｏｒｉ  ｏｆ  Ｍｉｌａｎにおいて、現在の喫煙者または元喫煙者であり、少なくとも５０歳であり、ここ５年以内にがんの病歴を有さない４，０９９名が登録され、２，３７６名（５８％）がＬＤＣＴアームにランダム化され（１１９０名が１年に１回のＬＤＣＴ、１１８６名が２年に１回のＬＤＣＴ）、１，７２３名（４２％）が観察に基づくアームにランダム化された（Ｐａｓｔｏｒｉｎｏら、２０１２年）。試験の全志願者の登録時（ベースライン）および年に１回または２年に１回の呼び戻しのそれぞれの時点で、全血を、Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｎａｚｉｏｎａｌｅ  ｄｅｉ  Ｔｕｍｏｒｉ  ｏｆ  ＭｉｌａｎのＩｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄｓに従って記載の通り採取した（Ｂｏｅｒｉら、２０１１年）。
【０１３４】
この試験のために、試験に登録された肺がんを有さない個体の間で２００９年６月から２０１０年７月までに採取した１，０００の連続した血漿試料を使用して、ＭＳＣの特異度を決定した。まず、血漿試料を溶血についてアッセイして（以下を参照されたい）、赤血球ｍｉＲＮＡにより潜在的に汚染された患者由来の試料を取り除いた（Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒら、２０１１年；Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、２０１２年）。１０００の試料のうち１３０が、溶血が原因で評価できないものであった。残りの８７０の対象のうち、５９４（６８％）はＬＤＣＴアームに属し、２７６（３２％）は観察に基づくアームに属した。ＭＳＣの感度性能を決定するためのコホートを得るために、２０１２年９月までに診断されたほとんど全ての肺がんの患者由来の血漿試料を得た（Ｎ＝８５）。症例と対照を適合させる代わりに、大きな、選択されなかった一連の対象における陰性的中率（ＮＰＶ）を測定することを選び、これにより、対照の数および試験の力が著しく減少した。これらの８５名の患者のうち６９名について、評価可能な試料が少なくとも１つ採取された。患者全てについて、がん診断をもたらすＬＤＣＴ検査に最も近い試料を検討した。具体的には、５０名の患者に関して診断時の試料が入手可能であり、１９名の患者に関して疾患前の試料が入手可能であった（図１）。疾患前の試料は、肺がん検出の８〜３５カ月前に採取され、遅延時間の中央値は１８カ月であった。
【０１３５】
Ｂ．マイクロＲＮＡプロファイリング。全ＲＮＡを、血漿試料２００μｌからｍｉｒＶａｎａ  ＰＡＲＩＳＫｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｂｉｏｎ）を用いて抽出し、緩衝液５０μｌ中に溶出させた。ｍｉＲＮＡ発現を、溶出したＲＮＡ３μｌ中、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｏｏｌｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌを２４種のｍｉＲＮＡを２連でスポットした特注のマイクロフルイディクスカード（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に対して使用して決定した。各試料について、個々のｍｉＲＮＡのＣｔ’を、ＶｉｉＡ７  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、閾値０．１５および自動ベースラインを用いて決定した。ＭＳＣへのインプットのために、所定のｍｉＲＮＡ比率の２連の読み取りの平均を以前に記載されている通り算出した（Ｂｏｅｒｉら、２０１１年）。
【０１３６】
Ｃ．統計分析。個々の対象に関する臨床転帰を盲検化したＭＳＣリスクスコアを独立した研究センター、Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｍａｒｉｏ  Ｎｅｇｒｉ  ｏｆ  Ｍｉｌａｎに提出し、予め指定された統計分析計画の通りデータ分析を完了した。肺がんと診断された患者と疾患を有さない対象とを分類するためのＭＳＣの識別能を、全体的に、および試験のＬＤＣＴアームおよび観察に基づくアームの両方について評価するために、ＭＳＣの感度（ＳＥ）、特異度（ＳＰ）、陽性的中率（ＰＰＶ）および陰性的中率（ＮＰＶ）を計算した。診断能については、ＭＳＣ−低リスク群内にカテゴリー化された個体を、ＭＳＣ−中間またはＭＳＣ−高のいずれかにカテゴリー化された個体と比較した。２成分ＭＳＣおよびＬＤＣＴを組み合わせた使用に関しても、単一の陽性および二重の検査陽性を考慮して、ＳＥおよびＳＰを計算した。
【０１３７】
疾患発症の予測因子としてＭＳＣの時間依存性を説明するために、血液試料採取から肺がん診断までの種々の時間間隔（６カ月、１２カ月、１８カ月および２４カ月）について、Ｈｅａｇｅｒｔｙら、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ５６巻：３３７〜３４４頁（２０００年）およびＺｈｅｎｇおよびＨｅａｇｅｒｔｙ、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ６３巻：３３２〜３４１頁（２００７年）に記載されている方法体系を使用してＳＥ、ＳＰ、ＰＰＶおよびＮＰＶを算出した。
【０１３８】
ＭＳＣの予後判定能を決定するために、９３９名の対象全員の間でＭＳＣに従って、３つのリスク群全てを検査し、血液試料採取日からのカプランマイヤー推定量として生存曲線を得た。コックス比例ハザードモデルを使用し、年齢および性別に関してさらに調整したモデルも考慮して生存におけるＭＳＣの不均一性を推定し、高／中間ＭＳＣと低ＭＳＣの間のχ２１検定をコンピュータで行った。
【０１３９】
Ｄ．溶血の影響を受けている血漿試料の評価。赤血球（ＲＢＣ）または血小板などの血液細胞の溶血により、汚染ｍｉＲＮＡが放出されるので、溶血が存在する血漿試料はその後の分析から取り除いた（Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒら、２０１１年；Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、２０１２年）。２種の品質管理（ＱＣ）測定をこの評価のために使用した。第１に、ＲＮＡ抽出前の予備分析ステップにおいて、異なる波長（４１４ｎｍ、５４１ｎｍ、５７６ｎｍ）における吸光度を測定して試料中の遊離のヘモグロビンの存在および量を同定することによって分光光度分析を完了した（Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒら、２０１１年）。
【０１４０】
第２のＱＣステップを実行して、全ての試料についてｍｉＲＮＡシグネチャー分類子（ＭＳＣ；ｍｉｒ−４５１、４８６−５ｐ、１６、９２ａ）に含有される溶血関連ｍｉＲＮＡの発現レベルを分析することによって溶血のさらに大きな感度を得た。溶血関連ｍｉＲＮＡの発現レベルが全ての試料の全体的な平均値からの２標準偏差を超える血漿試料をその後の分析から排除した。検出可能な、分光光度法で測定された溶血を伴う試料もこの第２のＱＣステップにおいて排除した。分光光度法でまたは溶血関連ｍｉＲＮＡ分析によって測定した溶血の発生頻度または量に、がんと対照試料とで差異は観察されなかった。
【０１４１】
溶血によって放出される汚染ｍｉＲＮＡの潜在性に加えて、血漿中に示差的に発現するｍｉＲＮＡは、単に異なる血液細胞数を反映する可能性がある（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ、２０１２年）。この仮説を分析するために、好中球により発現されるｍｉＲＮＡとＲＢＣにより発現されるｍｉＲＮＡで構成されるｍｉＲＮＡ比率（同文献）を、本試験の肺がん患者２３名から全血球計算（ＣＢＣ）によって得られた好中球のレベルとＲＢＣのレベルの間の比率と比較した。表３において報告する通り、シグネチャー内に存在するｍｉＲＮＡ比率のいずれも、それぞれのＣＢＣ比率との有意な相関を有することは見いだされなかった。
表３．肺がん患者２３名における血漿ｍｉＲＮＡ比率と血液細胞数の相関。この表には、２３試料における好中球とＲＢＣのｍｉＲＮＡ比率および好中球数とＲＢＣ数のピアソン相関係数が示されている。統計的に有意な相関（両側ｐ値＜０．０５）が報告されている。
【表３】
2019122412.tif 000010
【０１４２】
溶血関連ｍｉＲＮＡの分析を伴う第２のＱＣステップでは、それに加えて、またはその代わりに、本明細書に記載のＭＳＣに含有されるｍｉＲＮＡを含む溶血ｍｉＲＮＡシグネチャーを利用することができる。
【０１４３】
ｉ．ｍｉＲＮＡシグネチャーを使用した溶血の検出：血漿採取
全血の試料を採取し、ＥＤＴＡを添加し、処理前１〜２時間以下にわたって室温で保管した。温度を下げての保管は、ｍｉＲＮＡの非特異的放出を導く可能性があるので回避するべきである。試料を４℃、およそ１２５０回ｇで１０分遠心分離して血漿を分離し、それを、リンパ球環（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｒｉｎｇ）に最も近い材料を回避しながら慎重に移した。血漿を同じ条件で再度遠心分離し、次いで、ペレット化した材料を回避しながら一定分量に分離し、それを１年またはそれ超に至るまで−８０℃で保管した。
【０１４４】
ｉｉ．溶血した試料と溶血していない試料におけるｍｉＲＮＡ発現レベル  溶血を検出するためのｍｉＲＮＡシグネチャーを開発するために、２４の血漿試料を溶血させた。溶血を目視検査によって評価した。溶血した試料を、特注のマイクロ流体カードを使用したｍｉＲＮＡのパネルを発現させるためにプロファイルした。溶血した試料におけるｍｉＲＮＡの発現を、疾患を有さない個体９８名由来の溶血していない（視覚的評価に基づいて）試料におけるｍｉＲＮＡの発現と比較した。
【０１４５】
４種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、およびｍｉＲ−９２ａ）をｍｉＲＮＡシグネチャーの開発に含めた。生のＣｔ値（発現レベルの尺度）を表４に示す。４種のｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−４８６−５ｐおよびｍｉＲ−９２ａは、ｍｉＲ−１４０−３ｐに加えて、溶血した試料において、溶血していない試料に対して有意に上方制御された（ｐ＜０．００１）。
【表４】
2019122412.tif 000011
【０１４６】
ｉｉｉ．溶血に関するシグネチャーにおけるｍｉＲＮＡ比率の生成
ｍｉＲＮＡ比率を使用して溶血した試料と溶血していない試料を識別するために、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで溶血させた血漿試料の段階希釈物を含有する正常な血漿試料をｍｉＲＮＡ発現レベルについて分析した。様々なｍｉＲＮＡの、表４に上方制御されることが示されている４種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、およびｍｉＲ−９２ａ）のそれぞれに対する比率を算出した。ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−２２１、およびｍｉＲ−３０ｂは、４種の上方制御されるｍｉＲＮＡとの比率が溶血と最も良好に相関するｍｉＲＮＡとして同定された（表５）。
【表５】
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【０１４７】
ベースラインｍｉＲＮＡ比率の平均値を、疾患を有さない個体９８名由来の溶血していない血漿試料から、次式、比率の平均値＋１．５ｓ．ｄ．（標準偏差）を使用して算出した。これらのベースライン比率を、溶血に関するｍｉＲＮＡシグネチャーの開発における１６種のｍｉＲＮＡ比率のそれぞれについてのカットオフとして設定した。
【０１４８】
ｉｖ．溶血を検出するための溶血ｍｉＲＮＡシグネチャーの使用
溶血ｍｉＲＮＡシグネチャーを使用して、血漿試料における溶血を検出することができる。表６に、８種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１２６、１５ｂ、３０ｂ、２２１、４５１、１６、４８６−５ｐおよび９２ａ）で構成される１６種の比率の一覧を示す。特に、４種のｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−１６およびｍｉＲ−９２ａは全て、溶血した試料において過剰発現した。この過剰発現を血漿試料における溶血の指標として使用することができる。さらに、表６に示されている１６種の比率のうち８種、またはそれ超がカットオフ値を超える場合、血漿試料は溶血について陽性である。
【表６】
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【０１４９】
ｖ．溶血を検出するための溶血ｍｉＲＮＡシグネチャーとヘモグロビン吸光度法の比較
ヘモグロビンは、波長４１４ｎｍの吸光度を有することが当技術分野で公知である。科学的実施および臨床的実施のどちらにおいても溶血を分析するために使用される１つの標準方法は、血漿試料中の遊離のヘモグロビンの、波長４１４ｎｍにおける分光学的測定である（吸光度閾値０．２を使用する）。本実験では、いくつかの試料（例えば、脂肪血症（ｌｉｐｅｍｉｃ）試料）における高バックグラウンドシグナルを克服するために、４１４ｎｍにおける吸光度を３７５ｎｍにおける吸光度に対して正規化した。４１４ｎｍにおける吸光度と３７５ｎｍにおける吸光度比率について１．４のカットオフを設定した。
【０１５０】
表５の最後の行に示されている通り、Ａ４１４ｎｍ／Ａ３７５ｎｍの値が１．４０を超える試料はｍｉＲＮＡシグネチャーに対応し、１６種のｍｉＲＮＡ比率のうち少なくとも８種がそれらのそれぞれのカットオフを超えた。これらの設定を使用して、２４の溶血した血漿試料と９８の溶血していない血漿試料（目視検査に基づく）を区別することにおけるｍｉＲＮＡシグネチャーの力を評価した。ｍｉＲＮＡシグネチャー法は、感度０．８８および特異度０．９３を示した。感度に関しては、溶血していると視覚的に評価された２４の試料が実際に溶血していたことが明白であった。
【０１５１】
視覚的に溶血している（赤色、オレンジ色または暗い黄色）６０の血漿試料および目視検査に基づいて溶血していない４３の血漿試料の選択で構成される独立したシリーズを使用して、溶血ｍｉＲＮＡシグネチャーと分光光度法を比較した。感度に関しては（表７）、最も溶血していた（赤色）試料５つは全て、どちらの方法によっても溶血について陽性と認識された。しかし、オレンジ色および暗い黄色の試料の評価では、ｍｉＲＮＡシグネチャー法がより感度が高かった（＞９０％、対して分光光度的方法は７６％）。
表７．６０の視覚的に溶血している血漿試料における溶血を評価するための分光光度計の結果とｍｉＲＮＡの結果の比較
【表７】
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【０１５２】
他方では、目視検査に基づいて溶血していなかった４３の血漿試料では（表８）、結果から、３つ（７％）の試料がどちらの方法を使用しても溶血について陽性であり、１つ（２％）の試料が分光光度的方法でのみ陽性であり、２つ（５％）の試料がｍｉＲＮＡシグネチャー法でのみ陽性であったことが示された。４０（９３％）の試料では２つの方法の間で溶血分類が一致した。どちらの方法でも陽性の３つの場合を除いて、分光光度的方法の特異度は９７．５％であり、ｍｉＲＮＡシグネチャー法の特異度は９５％であった。
表８．４３の溶血していない（目視検査に基づく）血漿試料における溶血を評価するための分光光度計の結果とｍｉＲＮＡの結果の比較
【表８】
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【０１５３】
Ｅ．ｍｉＲＮＡシグネチャー分類子（ＭＳＣ）アルゴリズム。ＭＳＣアルゴリズムは、本明細書において詳細に記載されている通りである。このアルゴリズムの開発のために、以前に記載されているＩＮＴ／ＩＥＯ肺がんスクリーニング試験（Ｂｏｅｒｉら、２０１１年）から診断前または診断時に前向きに採取した肺がん患者由来の試料の訓練セットにおいて、血漿中を（安定に）循環している１００種の異なるｍｉＲＮＡ４，９５０種の比率から開始して、２４種の異なるｍｉＲＮＡの異なる遺伝子発現比率を生成した。この試験において使用した予め指定されたＭＳＣアルゴリズムは、２つのやり方の以前の試験から改良したものであった。
【０１５４】
第１に、検出可能な溶血を伴う試料を元の訓練セットから取り除いた（Ｂｏｅｒｉら、２０１１年）。その刊行物の後に、研究者らにより、溶血が血漿および血清試料中のｍｉＲＮＡの正確な発現測定に影響を及ぼしたことが報告された。したがって、ＭＳＣについての最適な訓練セットを生成するために、元の訓練セット内の５つの試料を、分光光度分析による検出可能なヘモグロビンおよび溶血関連ｍｉＲＮＡレベルに起因して排除した（本明細書に記載の通り）。次いで、ｍｉＲＮＡ比率を最適な訓練セットにおいて使用して、疾患のリスク（ＲＤ）、疾患の存在（ＰＤ）、侵襲性疾患のリスク（ＲＡＤ）および侵襲性疾患の存在（ＰＡＤ；表９）についてのｍｉＲＮＡシグネチャーを開発した。
【表９】
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【０１５５】
第２のやり方では、ＭＳＣアルゴリズムの開発は、この試験では、８０％以上の特異度を得るために９３９の対象検証コホートを含まないＭＩＬＤ試験からの８４名の疾患を有さない個体の訓練セットからの血漿試料を使用して予め定義された比率カットオフ値を生成したという点で以前の試験とは異なる。
【０１５６】
プール（Ｂｏｅｒｉら、２０１１年において使用された）の代わりに単一の対象由来の血漿試料を使用することにより、訓練セットにおいて最初に同定された２４種のｍｉＲＮＡの全てを考慮し、正確なカットオフを生成することが可能になった。したがって、本試験では、前者の検証セットではその試験において使用した対照プール内の対象の間で変動性が高いことが原因で排除されたｍｉｒ−１０１、１４５および１３３ａを含めることができた。
【０１５７】
疾患に対する３レベルリスクのカテゴリー化（ＭＳＣ低、中間および高）を構築するために、訓練セットも使用して、陽性とみなす必要があるそれぞれのカットオフ値を超える最小数の比率を確立した：ＲＤに対して１０／２７、ＰＤに対して９／２７、ＲＡＤに対して１４／２８、ＰＡＤに対して１４／２８。次いで、３レベルＭＳＣを以下の通り定義した：低リスク（Ｌ）、ＲＤｎｅｇ  ∩  ＰＤｎｅｇ  ∩  ＲＡＤｎｅｇ  ∩  ＰＡＤｎｅｇの場合；中間リスク（Ｉ）、ＲＤｐｏｓ  Ｕ  ＰＤｐｏｓ  ∩  ＲＡＤｎｅｇ  ∩  ＰＡＤｎｅｇの場合；または高リスク（Ｈ）、ＲＡＤｐｏｓ  Ｕ  ＰＡＤｐｏｓの場合。次いで、これらの予め指定されたリスク群を使用して、ＭＩＬＤスクリーニング試験からの９３９名の対象の独立したセット内の診断能および予後判定能を検定した。
【０１５８】
Ｆ．対象の特性。肺がんの患者６９名および肺がんを有さない対象８７０名を含めた、ＭＩＬＤ試験に登録された、血漿試料が評価可能な対象９３９名の特性（２００５〜２０１２年；ＬＤＣＴ：Ｎ＝６５２；観察に基づく：Ｎ＝２８７）が年齢、性別、およびタバコ喫煙の状態、持続時間および１日当たりのタバコ数の数に従って示されている（表１０）。肺がん患者は、肺がんでない患者よりも年齢が上であり（ｐ＜０．０００１）、男性の割合が高かった（８１．２％対６３．３％；ｐ＝０．００２９）。喫煙の状態は、がんを有する群とがんを有さない群の間で有意に異ならなかったが、がんが発症した対象はより長い期間にわたって喫煙していた（ｐ＜０．０００１）。
表１０．肺がんを有する対象６９名および肺がんを有さない対象８７０名の年齢、性別、およびタバコ喫煙に応じた分布。Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｉｃ  Ｉｔａｌｉａｎ  Ｌｕｎｇ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＭＩＬＤ）試験、２００５〜２０１２年。
【表１０】
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【０１５９】
がん患者に関して、ランダム化から診断までの時間の中央値は２９カ月（範囲１〜８２）であり、血漿サンプリングから診断までの時間の中央値は２カ月（範囲０〜３５）であった。肺がんを有さない対象では、ランダム化から血漿サンプリングまでの時間の中央値は４４カ月（範囲０〜５８）であり、血漿サンプリングから最後の経過観察までの時間の中央値は２７カ月（範囲３〜４１）であった。
【０１６０】
（実施例２）
ＭＳＣの診断能および予後判定能
ＬＤＣＴアームおよび観察に基づくアームにわたって９３９名の対象から診断前または診断時に得た評価可能な血漿試料を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイを使用し、低リスク、中間リスクおよび高リスクのがん群の予め指定されたＭＳＣアルゴリズムを用いて分析した。９３９名の対象全てについて、肺がん出現、肺がんによる死亡、および腫瘍の病期に従ってＭＳＣリスク群を調査した（表１１）。ＭＳＣ中間および高には、肺がん患者６９名のうち６０名が正確に分類され、ＳＥ８７％、ＳＰ８１％、ＰＰＶ２７％およびＮＰＶ９９％であった。経過観察の間に死亡した肺がん患者１９名のうち、１８名はＭＳＣ検査で陽性であり、ＳＥ９５％、ＳＰ８１％、ＰＰＶ１０％およびＮＰＶ１００％であった。経過観察の間に肺がん以外の原因による死亡は観察されなかった。２つのアーム内でのＭＳＣの肺がん検出についての比較的診断能は同様であり、ＬＤＣＴアームおよび観察に基づくアームについて、それぞれＳＥ８８％、ＳＰ８０％、ＰＰＶ３１％、ＮＰＶ９９％およびＳＥ８２％、ＳＰ８３％、ＰＰＶ１６％、ＮＰＶ９９％であった。
表１１．肺がんを有する対象６９名および肺がんを有さない対象８７０名の肺がん分布率、肺がんによる死亡、および肺がん段階およびｍｉＲＮＡシグネチャー分類子（ＭＳＣ）に応じた分布、ならびに対応する感度（ＳＥ）、特異度（ＳＰ）、陽性的中率（ＰＰＶ）、および陰性的中率（ＮＰＶ）。Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｉｃ  Ｉｔａｌｉａｎ  Ｌｕｎｇ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＭＩＬＤ）試験、２００５〜２０１２年。
【表１１】
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【０１６１】
３つのＭＳＣリスク群全てにわたって、疾患による死亡の割合に有意な傾向が観察され、それぞれ低、中間および高に伴って肺がんによる死亡の割合が上昇した（ｐ＝０．０３３６）。ＭＳＣリスク群は、腫瘍の病期の変動（Ｉ、ＩＩ〜ＩＩＩまたはＩＶ；表１１）とは有意に関連しなかった（ｐ＝０．４０）。
【０１６２】
ＭＳＣリスク群と組織学的サブタイプの間（χ２＝１．６０、ｐ＝０．４４８５）、および腺癌と扁平上皮癌の間（χ２＝０．５５、ｐ＝０．７５９）に有意差は確認されなかった。ＭＳＣの診断能の時間依存性分析により示されたＳＥ、ＳＰ、ＰＰＶおよびＮＰＶの値は、血液サンプリングと肺がん診断の間隔が６カ月、１２カ月、１８カ月および２４カ月の時点で同様であった（表１２）。
表１２．ｍｉＲＮＡシグネチャー分類子（ＭＳＣ）の時間依存性分析、血液サンプリングから肺がん検出まで６カ月、１２カ月、１８カ月および２４カ月の時点で算出した感度（ＳＥ）、特異度（ＳＰ）、陽性的中率（ＰＰＶ）、および陰性的中率（ＮＰＶ）。
【表１２】
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【０１６３】
（実施例３）
ＬＤＣＴとＭＳＣの相補的診断能
分析をＬＤＣＴアーム内の総数６５２名の対象に制限することにより、ＬＤＣＴにより、肺がん対象５８名のうち４６名が同定され、肺小結節が検出されなかった２５１名の対象内で３名の患者が見逃され、９名の患者が、中間期がんが原因で見逃され、ＳＥは７９％であった（表１３）。「肺小結節がない」３例のがんは、非固形病変が１例、縦隔腺症が１例、および胸水が１例で構成された。予め指定されたＭＳＣの２成分リスク群（高および中間とみなすか低とみなすか）により、ＬＤＣＴにより検出されたがん４６例のうち４０例、中間期がん９例のうち８例、および「肺小結節がない」対象３名全てが同定された。
【０１６４】
表１３．対象９３９名の、ｍｉＲＮＡシグネチャー分類子（ＭＳＣ）および低線量コンピュータ断層撮影法（ＬＤＣＴ）による、ＬＤＣＴ（スクリーニングで検出された肺がんおよびスクリーニングで検出されたものではない肺がんを含む）および観察に基づくアームごとの分布。Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｉｃ  Ｉｔａｌｉａｎ  Ｌｕｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＭＩＬＤ）試験、２００５〜２０１２年。
【表１３】
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【０１６５】
ＬＤＣＴでは、非石灰化小結節＞５ｍｍの臨床的に使用可能なサブグループについてのＳＰは８１％であり、関連する偽陽性率は１９．４％（１１５／５９４）であった（表１３）。二重陽性（ＬＤＣＴおよびＭＳＣ）対象について検討したところ、偽陽性率が３．７％（２２／５９４）に低下し、同時にＳＥも低下した（４０／５８、６９％）。逆に、少なくとも１つの検査陽性（ＬＤＣＴまたはＭＳＣ）の対象を陽性とみなした場合、ＬＤＣＴとＭＳＣを組み合わせて使用することにより、５８症例のうち５７症例が同定され、ＳＥは９８％、ＳＰは６５％であった。他方では、ＭＳＣにより、観察に基づくアームにおいて生じた肺がん１１例中９例（８２％）が検出された（表１３）。
【０１６６】
（実施例４）
ＭＳＣリスク群と生存の関連性
分析を完了して、３つの所定のＭＳＣリスク群の、３年の経過観察で全対象から採取した血漿試料（Ｎ＝９３９）から全生存を予測する予後判定能を決定した。２年生存は、低ＭＳＣの対象については１００％、中間ＭＳＣについては９８％であり、高ＭＳＣについては８７％であり、一方、３年生存は、低、中間および高についてそれぞれ１００％、９７％および７７％であった（図２）。高／中間ＭＳＣとおよび低ＭＳＣの間の生存の差異は統計的に有意であった（χ２＝４９．５３、Ｐ＜０．０００１）。不均一性は、年齢および性別について調整した後になお有意であった（χ２＝１２．５７、Ｐ＝０．０００４）。
【０１６７】
（実施例５）
分析
感度が高いことと併せてＮＰＶが９９％であるという診断特性により、ＭＳＣが、臨床的に検証されたスクリーニング検査であることが示される。さらに、肺がん発症の予測因子としてのＭＳＣの診断能が時間依存性分析によって確認された。
【０１６８】
ＭＳＣにより、疾患による死亡の尤度が高い対象が同定された。２成分診断として、両方のアームにわたって９３９名の対象についての疾患による死亡に関してＭＳＣのＳＥは９５％であり、ＮＰＶは１００％であった。さらに、ＭＳＣリスク群は、対象９３９名のコホート全体について３年の時点での有意に異なる生存と関連した（低ＭＳＣ、中間ＭＳＣおよび高ＭＳＣについて、それぞれ１００％、９７％および７７％）。これらの所見により、血漿ｍｉＲＮＡにより悪性腫瘍と腫瘍の攻撃性の両方が同定されることが実証される。
【０１６９】
ＭＩＬＤを含めた３つの小規模のヨーロッパにおけるランダム化試験では、現在までに有意でない死亡率の低下が報告されている（Ｉｎｆａｎｔｅら、２００９年；Ｓａｇｈｉｒら、２０１２年；Ｐａｓｔｏｒｉｎｏら、２０１２年）。３ラウンドのＬＤＣＴによる年１回のスクリーニングと、胸部Ｘ線とに５３，４５４名が登録されたランダム化臨床スクリーニング試験であるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌｕｎｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｔｒｉａｌ（ＮＳＬＴ）により、肺がんによる死亡率の２０％の低下が実証された（Ａｂｅｒｌｅら、２０１１年）。３ラウンドのスクリーニング後に、対象の２４．２％が陽性として分類され、これらの９６．４％が偽陽性であり、１件の肺がんによる死亡を予防するために３２０名の対象をスクリーニングする必要があった。
【０１７０】
ＬＤＣＴスクリーニングの利益および損害を調査した全てのランダム化臨床試験のシステマティックレビューでは、平均小結節検出率は２０％であり、小結節の９０％が良性であった（Ｂａｃｈら、ＪＡＭＡ  ３０７巻：２４１８〜２４２９頁、２０１２年）。この試験では、ＭＳＣにより、ＬＤＣＴアームの６５２名の個体の中で７４％（４８５名）が低リスクに分類され、４７８名が真陰性であり、７名が偽陰性であった。ＭＳＣにより、ＬＤＣＴによって検出されなかった中間期がん９例のうち８例を同定することができた。したがって、ＭＳＣとＬＤＣＴの統合（少なくとも１つの検査陽性）により、スクリーニング感度が、ＭＳＣ単独では８７％、ＬＤＣＴ単独では８４％から、９８％（５７／５８）まで上昇し、偽陽性率は３５％になる。逆に、二重陽性対象（ＭＳＣ陽性かつＬＤＣＴ陽性）を検討すると、ＭＳＣとＬＤＣＴの統合により、ＬＤＣＴスクリーニングの偽陽性率が５分の１超低下する。具体的には、二重偽陽性ＭＳＣおよびＬＤＣＴの発生頻度は、ＬＤＣＴ単独での１９．７％（１１５／５９４）と比較してわずか３．７％（２２／５９４）であったが、ＳＥは６９％に低下した。
【０１７１】
したがって、ＭＳＣにより、偽陽性の結果を減少させることによりＬＤＣＴスクリーニングを補完することができ、また、診断アルゴリズムをより大きく標準化することが可能になり、それにより、健康管理費用が減少する。さらに、低ＭＳＣ対象の３年の時点での死亡がないことを考慮すると、低ＭＳＣ個体に対してＬＤＣＴではなくＭＳＣをさらに繰り返すことが提唱され得る。予め指定された血漿に基づくアッセイの本盲検化試験は、ＬＤＣＴスクリーニング試験内でバイオマーカーを試験する最も大きな試験を表すものであり、ＬＤＣＴをＭＳＣと組み合わせた場合の優れた診断能を実証するものである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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