(57)【要約】【課題】生体内への導入が容易で、毛包幹細胞の機能を維持することができる新たな因子を見出し、脱毛症を根本的にかつ効率的に予防及び／又は改善するための薬剤として提供すること。【解決手段】蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理されたオタネニンジンの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、毛包幹細胞の未分化状態維持剤、細胞外基質タンパク質の遺伝子の発現促進剤、脱毛症の予防及び／又は改善剤、ならびに毛髪用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理されたオタネニンジンの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、幹細胞の未分化状態維持剤。
【請求項２】
前記幹細胞が、毛包幹細胞である、請求項１に記載の幹細胞の未分化状態維持剤。
【請求項３】
蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理されたオタネニンジンの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、脱毛症の予防及び／又は改善剤。
【請求項４】
蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理されたオタネニンジンの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、細胞外基質タンパク質の遺伝子の発現促進剤。
【請求項５】
前記オタネニンジンが、乾燥又は生のオタネニンジンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の剤。
【請求項６】
請求項３に記載の脱毛症の予防及び／又は改善剤を含む、毛髪用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛包幹細胞の未分化状態維持剤及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、加齢、ストレス、紫外線等の様々な要因により、薄毛や脱毛といった毛髪のトラブルが増加している。毛髪は体表面を覆っており、皮膚の付属器官のひとつであり、毛髪の中でも頭髪は美容上極めて重要な要素である。よって、薄毛や脱毛は、心理面にもマイナスの影響を与え、生活の質（Quality of Life, QOL）を大きく低下させる要因となる（非特許文献１）。
【０００３】
毛髪は複数種の細胞からなる複雑な構造をとっているが、主にバルジ領域に存在する毛包幹細胞によって生み出されている。毛周期の休止期から成長期にかけて、このバルジ領域に存在する毛包幹細胞が、細胞分裂をすることで、毛母細胞が形成され、この毛母細胞から毛髪が形成される。
【０００４】
薄毛や脱毛の詳細なメカニズムは解明に至っていないが、最近の研究により、薄毛や脱毛などの症状は、毛包幹細胞が加齢によって老化し、自己複製能がなくなって、毛包の縮小が起こることや、毛包幹細胞が環境ストレス等によって長年ダメージを受け、機能低下や維持メカニズムが破綻することによって発生すると考えられている。また、近年では幹細胞の周囲の微細な環境（幹細胞ニッチ）に関しても研究が進められ、毛包組織周囲に存在する細胞外基質である１７型コラーゲンが毛包幹細胞の機能維持において重要であることも明らかとなった（非特許文献２）。また、毛乳頭細胞から産生されるＦＧＦ２やＦＧＦ７は、毛髪の再生と恒常性維持に関与していることが知られている（非特許文献３）。
【０００５】
よって、加齢等に伴う脱毛症状の改善のためには、毛髪の再生と恒常性維持を担っている毛包幹細胞の劣化を防ぎ、機能を回復させること、また、幹細胞の周囲の細胞外基質などの環境因子を正しく改善させることが重要であると考えられる。しかしながら、これまで報告されている上記因子は、生体内での制御や導入する手段が煩雑であるため日常的な使用が困難である。よって、これらに代わる新たな因子の解明が望まれる。
【０００６】
オタネニンジン（学名：Panax ginseng C.A.Mey）は、ウコギ科トチバニンジン属に属する多年草であり、生薬の人参（ニンジン）は、オタネニンジンの根を乾燥させたもので、サポニンのジンセノサイドなどを含み、強壮、鎮静、抗疲労、強心、利尿等の作用を有する漢方薬に用いられている。人参（ニンジン）はまた、単独で又は他の植物抽出物と組み合わせて、血糖降下作用（特許文献１）、アンジオテンシンII活性阻害作用（特許文献２）などがあることが報告されている。しかしながら、毛包幹細胞の未分化維持効果についてはこれまで何ら知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平６−２３７７３５号公報
【特許文献２】特開２０１３−１１９５３４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Sawant N et al., Androgenetic Alopecia: Quality-of-life and Associated Lifestyle Patterns, Int J Trichology. 2010 Jul;2(2):81-5
【非特許文献２】Matsumura H et al., Hair follicle aging is driven by transepidermal elimination of stem cells via COL17A1 proteolysis. Science. 2016 Feb 5;351(6273)
【非特許文献３】Rosenquist TA et al., Fibroblast growth factor signalling in the hair growth cycle:expression of the fibroblast growth factor receptor and ligand genes in the murine hair follicle. Dev Dyn. 1996 Apr;205(4):379-86.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上述した実情に鑑み、生体内への導入が容易で、毛包幹細胞の機能を維持することができる新たな因子を見出し、脱毛症を根本的にかつ効率的に予防及び／又は改善するための薬剤として提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、蒸気加熱処理後に加熱乾燥処理をするという前処理を行ってから抽出したオタネニンジンの抽出物が、毛包内バルジ領域に存在する毛包幹細胞の未分化状態を維持し、分化を抑制する作用を有すること、また、毛包幹細胞における細胞外基質タンパク質の遺伝子の発現促進作用を有することを見出した。よって、上記前処理を行ったオタネニンジンの抽出物は、毛髪を作り出す器官である毛包の供給源となる毛包幹細胞の減少又は枯渇を阻止できるとともに、毛包幹細胞周囲の細胞外環境を整えることができるので、脱毛症の根本的な予防及び／又は改善に有効である。本発明はかかる知見より完成されたものである。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理されたオタネニンジンの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、幹細胞の未分化状態維持剤。
（２）前記幹細胞が、毛包幹細胞である、（１）に記載の幹細胞の未分化状態維持剤。
（３）蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理されたオタネニンジンの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、脱毛症の予防及び／又は改善剤。
（４）蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理されたオタネニンジンの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、細胞外基質タンパク質の遺伝子の発現促進剤。
（５）前記オタネニンジンが、乾燥又は生のオタネニンジンである、（１）〜（４）のいずれかに記載の剤。
（６）（３）に記載の脱毛症の予防及び／又は改善剤を含む、毛髪用組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理されたオタネニンジンの抽出物を有効成分として含有する毛包幹細胞の未分化状態維持剤、脱毛症の予防及び／又は改善剤が提供される。蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理されたオタネニンジンの抽出物は、毛包幹細胞の減少又は枯渇を阻止でき、また、毛包幹細胞の増殖と維持に必要な毛包幹細胞周囲の細胞外環境を整えることができるので、脱毛症の根本的な予防及び／又は改善に有効である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の幹細胞の未分化状態維持剤は、蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理されたオタネニンジンを有効成分として含有する。本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤を、ヒトを含めた哺乳動物の幹細胞に適用することで、幹細胞の未分化状態を維持し、分化を抑制することができる。本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤を適用する幹細胞としては、本発明の目的に沿うものであれば特に限定されず、例えば胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）；骨髄、血液、皮膚（表皮、真皮、皮下組織）、脂肪、毛包、脳、神経、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉やその他の組織に存在する体性の幹細胞；遺伝子導入等により人工的に作製された幹細胞（人工多能性幹細胞：ｉＰＳ細胞）が挙げられるが、毛包の幹細胞に対してより効果を発揮する。本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤は、幹細胞の分化の方向性及び分化の過程等について同等の特性を持っていれば、全ての哺乳動物由来の幹細胞に応用が可能である。例えば、本発明に係る幹細胞の未分化状態維持剤は、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物の幹細胞に対して効果を発揮することができる。
【００１４】
本発明の好ましい態様によれば、幹細胞は毛包幹細胞であり、本発明の毛包幹細胞の未分化状態維持剤は、蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理されたオタネニンジンを有効成分として含有し、毛包幹細胞のニッチ（幹細胞の生態的適所）である毛包内バルジ領域の毛包幹細胞の未分化状態を維持し、分化を抑制できる。
【００１５】
本発明において「毛包幹細胞の未分化状態維持」とは、毛包内バルジ領域における毛包幹細胞の未分化性の維持と機能性の維持を意味する。
【００１６】
本発明において用いるオタネニンジン（学名：Panax ginseng C.A.Mey、別名：高麗人参、朝鮮人参、薬用人参）は、ウコギ科(Araliaceae)トチバニンジン属（Panax）に属する多年草で、生薬の「ニンジン」（和名：人参、学名：Ginseng Radix)の基原植物である。オタネニンジンの根を乾燥させたものが生薬として用いられているが、その製造方法の違いから、根の皮を剥ぎ、乾燥させた「白参」と、皮を付けたまま蒸して乾燥させた「紅参」に大別される。
【００１７】
本発明において、オタネニンジンは、その葉、茎、果実、果皮、花、花芽、種子、全草、根、根茎等の植物体の一部又は植物体全体、それらの混合物のいずれも用いることができるが、根が好ましく、根の側根部分がより好ましい。
【００１８】
本発明においてオタネニンジンは、乾燥オタネニンジン又は生のオタネニンジンのいずれも用いることができるが、乾燥オタネニンジンが好ましい。乾燥オタネニンジンの場合、水分含量が２０％以下、好ましくは１０％以下となるまで乾燥させたものが好ましい。水分含量は、日本薬局方の乾燥減量などの方法を用いて測定することができる。乾燥方法としては、植物体の乾燥方法として通常用いられ、水分含量が上記の範囲となる方法であれば特に限定はされないが、例えば、自然乾燥（風乾）、天日乾燥、通風乾燥、熱風乾燥、噴霧乾燥、減圧乾燥、真空乾燥等が挙げられる。
【００１９】
本発明において、上記の乾燥オタネニンジン又は生のオタネニンジンを抽出する前に、生薬の加工の際に行われる修治処理（蒸して乾かすという加工処理）に相当する蒸気加熱処理と加熱乾燥処理を行う。蒸気加熱処理は、熱水、飽和水蒸気、過熱蒸気、減圧（真空）蒸気等を熱媒体とし、高湿度雰囲気下、例えば、湿度８０％以上の雰囲気下で対象物を加熱する処理をいう。蒸気加熱は熱媒体を対象物に直接接触させることによって行ってもよく、または対象物を熱交換機を通じて間接的に加熱してもよい。また加熱は常圧下および加圧下のいずれで行ってもよい。蒸気加熱処理の条件としては、温度は、７０〜１８０℃が好ましく、１００〜１５０℃がより好ましい。時間は、温度によって異なるが、１〜１５時間が好ましく、２〜１０時間がより好ましく、２〜６時間がさらに好ましい。これらの温度及び時間の条件はあくまで例示であり、温度及び時間の相互の関係で適宜変更できる。また、本発明における蒸気加熱処理は、連続式またはバッチ式のスチーマー（蒸し機）やオートクレーブなどを用いて行えばよい。
【００２０】
蒸気加熱処理されたオタネニンジンは、水分を含んでいるため、加熱乾燥処理を行なう。加熱乾燥の温度としては、４０〜８５℃が好ましく、５０〜７０℃がより好ましい。乾燥方法としては、通風乾燥、熱風乾燥、マイクロ波乾燥等を用いることができる。乾燥時間（加熱時間）は、加熱温度、蒸気加熱処理後のオタネニンジンの水分含量、乾燥する総量によって異なり、特定はできないが、約６〜２４時間の範囲である。
【００２１】
上記のようにして蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理を施したオタネニンジンを抽出する。抽出方法は、特に限定されないが、水もしくは熱水、または水と有機溶媒の混合溶媒を用い、攪拌またはカラム抽出する方法により行うことができる。有機溶媒としては、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール類（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。なかでも、低級アルコール、液状多価アルコール等の極性溶媒が好ましく、エタノール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール等の水溶性有機溶媒がより好ましく、これらの一種又は二種以上を用いてもよい。特に好ましい抽出溶媒としては、水、または水−エタノール系の混合極性溶媒が挙げられる。溶媒の使用量については、特に限定はなく、例えば上記オタネニンジン（乾燥重量）に対し、１０倍以上、好ましくは２０倍以上であればよいが、抽出後に濃縮を行なったり、単離したりする場合の操作の便宜上１００倍以下であることが好ましい。また、抽出温度や時間は、用いる溶媒の種類によるが、例えば、１０〜１００℃、好ましくは３０〜９０℃で、３０分〜２４時間、好ましくは１〜１０時間を例示することができる。また、抽出物は、抽出した溶液のまま用いてもよいが、必要に応じて、その効果に影響のない範囲で、濃縮（有機溶媒、減圧濃縮、膜濃縮などによる濃縮）、希釈、濾過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理を行ってから用いてもよい。さらには、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いてもよい。
【００２２】
上記のようにして蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理されたオタネニンジンの抽出物（以下、「修治オタネニンジンの抽出物」と記載する場合もある）は、生体レベルで又は培養レベルで毛包幹細胞の分化を抑制し、未分化状態を維持させる作用を有するので、毛包幹細胞の未分化状態維持剤として使用できる。また、本発明の毛包幹細胞の未分化状態維持剤は、毛包幹細胞の分化抑制剤、毛包幹細胞の機能維持剤ともいうことができる。
【００２３】
修治オタネニンジンの抽出物は、毛包内バルジ領域の毛包幹細胞の分化抑制により、毛髪の元になる毛包幹細胞の減少又は枯渇を阻止できるとともに、毛包幹細胞における細胞外基質タンパク質の遺伝子発現を促進して毛包幹細胞周囲の細胞外環境を整えることができるので、脱毛症の予防及び／又は改善剤、細胞外基質タンパク質の遺伝子の発現促進剤の有効成分とすることができる。
【００２４】
本発明において、「脱毛症の予防及び／又は改善」には、脱毛や薄毛の発生の阻止、脱毛や薄毛の程度（本数や範囲）の改善、脱毛や薄毛の進行速度の低下、脱毛や薄毛に伴う毛髪の光沢や弾性の減少の抑制などが含まれる。また、脱毛症の予防及び／又は改善効果は、頭髪に直接な作用機序を示す場合と頭部における経皮的な作用機序を示す場合の両方を含む。
【００２５】
本発明において、脱毛症とは、例えば、加齢、疾患、紫外線や過労などの種々のストレスなどにより、毛髪の一部又は全部が抜けて、頭皮の一部又は全体が透けて見える症状をいう。脱毛症には、例えば、男性型脱毛症（ＡＧＡ）、びまん性脱毛症（ＦＡＧＡ）、円形脱毛症、老人性脱毛症、脂漏性脱毛症、粃糠性脱毛症、産後（分娩後）脱毛症、機械性（圧迫性若しくは牽引性）脱毛症、先天性脱毛症、火傷または外傷後の脱毛症、抗がん剤による薬剤性脱毛症、瘢痕性脱毛症（毛孔性扁平苔癬、紅斑性狼瘡、禿髪性毛包炎、頭部乳頭状皮膚炎等）、トリコチロマニア（抜毛症）などが含まれるが、これらに限定はされない。
【００２６】
また、本発明の脱毛症の予防及び／又は改善剤は、そのまま使用することも可能であるが、本発明の効果を損なわない範囲で適当な添加物等と混合し、医薬品、医薬部外品、化粧品などの組成物の形態とすることができる。なかでも、頭皮や毛髪に使用するのに適した製剤形態に製剤化した毛髪用組成物が好ましい。
【００２７】
毛髪用組成物は、皮膚外用組成物において通常使用されている各種の成分、添加剤、基剤等をその種類に応じて選択し、適宜配合し、当分野で公知の手法に従って製造することができる。配合する成分、添加剤、基材としては、例えば、希釈剤（精製水、エタノール等）、油脂類（オリーブ油、ヤシ油、月見草油、ホホバ油、ヒマシ油、硬化ヒマシ油等）、ロウ類（ラノリン、ミツロウ、カルナウバロウ等）、炭化水素類（流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、ワセリン等）、脂肪酸類（ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸等）、高級アルコール類（ミリスチルアルコール、セタノール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等）、エステル類（ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、トリオクタン酸グリセリン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ステアリン酸オクチル、ステアリン酸ステアリル等）、有機酸類（クエン酸、乳酸、α-ヒドロキシ酢酸、ピロリドンカルボン酸等）、糖類（マルチトール、ソルビトール、キシロビオース、N-アセチル-D-グルコサミン等）、界面活性剤、シリコーン油、保湿剤、増粘剤、紫外線吸収剤、金属イオン封鎖剤、清涼化剤、抗酸化剤、安定化剤、防腐剤、消炎剤、殺菌剤、香料、着色料等が挙げられる。
【００２８】
また、上記毛髪用組成物には、本発明の効果に悪影響を及ぼさない限り、育毛料・養毛料の成分として従来より知られている成分を含めてもよい。例えば、センブリエキス、柑橘類エキス等の植物抽出エキス、ビタミンＢ６、ビタミンＥ及びその誘導体、ビオチン等のビタミン類、パントテン酸及びその誘導体、グリチルリチン酸及びその誘導体、ニコチン酸エステル、セリン、メチオニン等のアミノ酸類、セフォランチン、塩化カプロニウム、ミノキシジル、ニコランジル、アセチルコリン誘導体、サイクロスポリン類、及びエストラジオール等の女性ホルモン剤等、ならびにこれらの混合物が挙げられる。
【００２９】
本発明において、毛髪用組成物は、頭皮や毛髪に使用するものを広く指し、頭皮や毛髪に適用可能なものであればいずれでもよく、剤型は特に問わない。例えば、液状、乳液状、クリーム状、ゲル状、ペースト状、スプレー状等のいずれであってもよい。具体的な製品形態としては、クリーム、ローション、乳剤、軟膏、ゲル、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアトリートメント、ヘアコンディショナー、スカルプトリートメント、ヘアスプレー、ヘアパック、ヘアエッセンス、ヘアトニック、ヘアリキッド、ヘアムースなどが挙げられる。
【００３０】
これらの製品形態をとる毛髪用組成物中の修治オタネニンジンの抽出物の含有量は、形態に応じて異なるので特定することはできないが、一般に、当該組成物の総重量に対し、０．０００１〜２０重量％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．００１〜１０重量％（ｗ／ｗ）である。修治オタネニンジンの添加の方法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。
【００３１】
「細胞外基質（細胞外マトリクス）」とは、細胞の外側（細胞間）に存在する線維状や網目状の構造体をいい、細胞の形態保持や機能（増殖、分化、移動等）の制御に重要な役割を果たしている。本発明において「細胞外基質タンパク質」とは、細胞外基質を構成するタンパク質をいい、コラーゲン、フィブリリン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、テネイシン、エンタクチン、プロテオグリカン（デコリン、バーシカン、パールカン、アグリカン等）などが含まれ、より具体的には、皮膚基底膜や皮膚付属器官（毛包、汗腺、皮脂腺など）基底膜を構成するVII型コラーゲン（COL7A1）、XVII型コラーゲン（COL17A1）、ラミニン332（LAMA3,LAMB3,LAMC2)、ラミニン511（LAMA5,LAMB1,LAMC1）、デコリン等が挙げられる。
【００３２】
修治オタネニンジンの抽出物はまた、毛包幹細胞の未分化状態を維持させるための培地添加剤として利用できる。当該培地添加剤を添加した培地で培養した毛包幹細胞は、未分化性を保持しつつ、一定期間生存可能である。細胞の未分化状態維持期間は、培養目的、基礎培地の種類、培養温度などに応じて、適宜変更することができる。例えば、培地に修治オタネニンジンの抽出物を添加して通常の培養条件にて培養した場合、少なくとも１週間以上、好ましくは少なくとも２週間以上、さらに好ましくは少なくとも１ヶ月以上は、毛包幹細胞の未分化状態を維持することができる。よって、本発明はまた、毛包幹細胞を、修治オタネニンジンの抽出物を添加した培地内で培養する工程を含む、毛包幹細胞の未分化状態維持方法を提供するものである。当該方法は、例えば、毛包幹細胞の維持及び分化のメカニズム、薄毛及び／又は脱毛発生のメカニズム、抗脱毛剤の作用機序の解明に利用できる。
【００３３】
毛包幹細胞の培養に用いる培地は、修治オタネニンジンの抽出物を添加する以外は、従来の上皮系細胞の培養に一般に用いられる基礎培地を用いることができる。例えば、毛包幹細胞の生存及び増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、脂肪酸）を含む基本培地、例えば、Dulbecco's Modified Eagle Medium(D-MEM)、Minimum Essential Medium(MEM)、RPMI1640、Basal Medium Eagle(BME)、Ham's F12、Ham's F12K(Kaighn's modified of Ham’s F12)、Dulbecco's Modified  Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12(D-MEM/F-12)、Glasgow  Minimum Essential Medium(Glasgow MEM)、ハンクス液(Hank's balanced salt solution)、MCDB153培地等が挙げられる。また、培地に、増殖因子[上皮細胞増殖因子(EGF)、コレラトキシン、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、白血球遊走阻止因子(LIF)、Stem Cell Factor(SCF)等]、ホルモン（インスリン、ヒドロコルチゾン等）を添加することが好ましい。さらに、必要に応じて、培地は、腫瘍壊死因子（TNF）、ビタミン類、インターロイキン類、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメント、抗生物質等を含有してもよい。
【００３４】
また、上記の成分以外には、０．１〜２０％（ｖ／ｖ）の含有率でウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）、血清または血清代替物が培地に含まれることが好ましい。血清または血清代替物は、公知のものであればいずれのものも用いることができる。例えば、血清としては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＦＣＳ）などが挙げられ、血清代替物としては、ＫＳＲなどが挙げられる。しかしながら、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。
【００３５】
上皮系細胞の培養に必要な成分（例えば、インスリン、ヒドロコルチゾン、上皮細胞増殖因子等）を含む上皮系細胞用培地は市販されており、これらの市販品の培地を用いてもよい。例えば、Keratinocyte-SFM培地(Thermo Fisher Scientific社製）、Humedia-KG2培地（KURABO社）、CnT-PR培地（CellnTec社）、MCDB153培地（Sigma社製）、正常ヒトケラチノサイト用無血清培地（DSファーマバイオメディカル社製）等を用いることができる。
【００３６】
毛包幹細胞の培養に用いる培養器は、毛包幹細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、シャーレ、ディッシュ、マルチウェルプレート（例えば、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、９６ウェル）、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バッグ、ローラーボトルなどが挙げられる。培養器の材質としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属等が挙げられる。
【００３７】
培養器は、細胞非接着性であっても接着性であってもよく、目的に応じて適宜選択される。細胞接着性の培養器は、細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス等による細胞支持用基質などでコーティング処理したものを用いてもよい。細胞支持用基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどが挙げられる。
【００３８】
毛包幹細胞培養に使用される培地に対する修治オタネニンジンの抽出物の添加濃度は、上述の本発明に係る毛包幹細胞の未分化状態維持剤におけるオタネニンジンの抽出物の含有量に準じて適宜決定することができるが、修治オタネニンジンの抽出物の量に換算して、例えば１０〜１００００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００〜５０００μｇ／ｍＬの濃度が挙げられる。また、幹細胞の培養期間中、修治オタネニンジンの抽出物を、定期的に培地に添加してもよい。
【００３９】
毛包幹細胞の培養条件は、幹細胞の培養に用いられる通常の条件に従えばよく、特別な制御は必要ではない。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０〜４０℃、好ましくは３６〜３７℃である。ＣＯ２ガス濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。なお、培地の交換は２〜３日に１回行うことが好ましく、毎日行うことがより好ましい。前記培養条件は、幹細胞が生存及び増殖可能な範囲で適宜変動させて設定することもできる。
【００４０】
毛包幹細胞の未分化状態維持は、例えば、本発明に係る毛包幹細胞の未分化状態維持剤の非存在下で培養した毛包幹細胞と比較して、本発明に係る毛包幹細胞の未分化状態維持剤の存在下で培養した該幹細胞において幹細胞未分化マーカー遺伝子の発現レベルがｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで培養開始時の発現レベルと同程度のレベルに有意に維持されているか否かで評価することができる。毛包幹細胞未分化マーカー遺伝子としては、例えばKRT15（Keratin, type I cytoskeletal 15)等が挙げられる。
【００４１】
毛包幹細胞未分化マーカー遺伝子発現レベルの測定方法としては、ｍＲＮＡレベルでは、例えば毛包幹細胞未分化マーカー遺伝子に特異的なプライマーやプローブを用いたＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲやノーザンブロッティング等の方法が挙げられ、また、タンパク質レベルでは、例えば毛包幹細胞未分化マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的な抗体を用いたＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング等の免疫学的方法が挙げられる。
【００４２】
発現レベルの測定の結果、培養開始時（１００％未分化状態）の毛包幹細胞における毛包幹細胞未分化マーカー遺伝子の発現レベルと本発明の毛包幹細胞の未分化状態維持剤の存在下で所定時間培養後の毛包幹細胞における毛包幹細胞未分化マーカー遺伝子の発現レベルとの相対比が、本発明の毛包幹細胞の未分化状態維持剤の非存在下で培養した場合の同相対比（コントロール）よりも大きい場合に毛包幹細胞の未分化状態を維持できたと判定することができる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４４】
[実施例１] オタネニンジンの抽出物の製造例
オタネニンジンの抽出物を以下のとおり製造した。製造例２−ａ〜２−ｅは、蒸気加熱の温度を変更する以外は、製造例２と同様にして行った。
【００４５】
（製造例１）生オタネニンジンの根（蒸気加熱：１０５℃、加熱乾燥：５０℃）の熱水抽出物の調製
収穫後の生のオタネニンジン（水分量８０％）を１０５℃で８時間蒸した後、５０℃で乾燥させた（日本薬局方の「紅参」に適合）。このオタネニンジンの乾燥物４０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、蒸気加熱処理（１０５℃）された生オタネニンジンの根の熱水抽出物１７．５ｇ得た。
【００４６】
（製造例２）乾燥オタネニンジンの根（蒸気加熱：１０５℃、加熱乾燥：５０℃）の熱水抽出物の調製
乾燥したオタネニンジンの根（水分量９％）を１０５℃で８時間蒸した後、５０℃で乾燥させた。このオタネニンジンの乾燥物４０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して蒸気加熱処理（１０５℃）された乾燥オタネニンジンの根の熱水抽出物１８．７ｇ得た。
【００４７】
（製造例３）乾燥オタネニンジンの根（蒸気加熱：１０５℃、加熱乾燥：７０℃）の５０％エタノール抽出物の調製
乾燥したオタネニンジンの根（水分量９％）を１０５℃で８時間蒸した後、７０℃で乾燥させた。このオタネニンジンの乾燥物１００ｇに精製水５００ｍＬ及びエタノール５００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、蒸気加熱処理（１０５℃）された乾燥オタネニンジンの根の５０％エタノール抽出物４３ｇ得た。
【００４８】
（製造例４）乾燥オタネニンジンの葉及び茎（蒸気加熱：１００℃、加熱乾燥：６０℃）の１，３−ブチレングリコール抽出物の調製
乾燥したオタネニンジンの葉及び茎（水分量１０％）を１００℃で４時間蒸した後、６０℃で乾燥させた。このオタネニンジンの乾燥物２０ｇに１，３−ブチレングリコール２００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、蒸気加熱処理（１００℃）された乾燥オタネニンジンの葉及び茎の１，３−ブチレングリコール抽出物１４１ｇ得た。
【００４９】
（比較製造例１）生オタネニンジンの根（蒸気加熱処理なし）の熱水抽出物の調製
収穫後の生のオタネニンジンの根を６５℃で乾燥させたもの４０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してオタネニンジンの根の熱水抽出物を１２．５ｇ得た。
【００５０】
（比較製造例２）生オタネニンジンの根（蒸気加熱処理なし）の５０％エタノール抽出物の調製
収穫後の生のオタネニンジンの根を６５℃で乾燥させたもの１００ｇに精製水５００ｍＬ及びエタノール５００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、オタネニンジンの根の５０％エタノール抽出物を１５．１ｇ得た。
【００５１】
（製造例２−ａ）乾燥オタネニンジンの根（蒸気加熱：７０℃、加熱乾燥：５０℃）の熱水抽出物の調製
乾燥したオタネニンジンの根（水分量９％）を７０℃で８時間蒸した後、５０℃で乾燥させた。このオタネニンジンの乾燥物４０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して蒸気加熱処理（７０℃）された乾燥オタネニンジンの根の熱水抽出物１７．２ｇ得た。
【００５２】
（製造例２−ｂ）乾燥オタネニンジンの根（蒸気加熱：１００℃、加熱乾燥：５０℃）の熱水抽出物の調製
乾燥したオタネニンジンの根（水分量９％）を１００℃で８時間蒸した後、５０℃で乾燥させた。このオタネニンジンの乾燥物４０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して蒸気加熱処理（１００℃）された乾燥オタネニンジンの根の熱水抽出物１８．１ｇ得た。
【００５３】
（製造例２−ｃ）乾燥オタネニンジンの根（蒸気加熱：１２１℃、加熱乾燥：５０℃）の熱水抽出物の調製
乾燥したオタネニンジンの根（水分量７％）を１２１℃で８時間蒸した後、５０℃で乾燥させた。このオタネニンジンの乾燥物４０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して蒸気加熱処理（１２１℃）された乾燥オタネニンジンの根の熱水抽出物１７．６ｇ得た。
【００５４】
（製造例２−ｄ）乾燥オタネニンジンの根（蒸気加熱：１５０℃、加熱乾燥：５０℃）の熱水抽出物の調製
乾燥したオタネニンジンの根（水分量９％）を１５０℃で８時間蒸した後、５０℃で乾燥させた。このオタネニンジンの乾燥物４０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して蒸気加熱処理（１５０℃）された乾燥オタネニンジンの根の熱水抽出物１９．０ｇ得た。
【００５５】
（製造例２−ｅ）乾燥オタネニンジンの根（蒸気加熱：１８０℃、加熱乾燥：５０℃）の熱水抽出物の調製
乾燥したオタネニンジンの根（水分量９％）を１８０℃で８時間蒸した後、５０℃で乾燥させた。このオタネニンジンの乾燥物４０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して蒸気加熱処理（１８０℃）された乾燥オタネニンジンの根の熱水抽出物１８．６ｇ得た。
【００５６】
［実施例２］オタネニンジンの抽出物の毛包幹細胞に対する未分化状態維持効果及び細胞外基質遺伝子の発現促進効果の評価
実施例１において製造したオタネニンジンの各抽出物を用いて毛包幹細胞に対する未分化性維持状態効果及び細胞外基質タンパク質の遺伝子（以下、「細胞外基質遺伝子」という）の発現促進効果の評価を行った。
【００５７】
（実験例１）毛包幹細胞に対する未分化状態維持効果の評価
（１）ヒト毛包幹細胞の培養
ヒトの毛髪を毛抜きで採取し、メス等を用いて毛包組織のバルジ領域を含む組織を回収した。PBS(-)にて洗浄した後、トリプシン(BD Biosciences社製)処理を行った。その後、セルストレイナー(FALCON社製)を用いて、細胞を単離し、回収した。回収した細胞を培養プレートに播種し、KG2培地(KURABO社製)を用いてコンフルエントになるまで維持した。コンフルエントになった細胞を回収し、同培養プレートに再び播種し、その後生着し、増殖している細胞を毛包幹細胞として以下の試験に用いた。
【００５８】
（２）オタネニンジンの抽出物を添加した際の毛包幹細胞の未分化性の評価
毛包幹細胞にオタネニンジンの抽出物を作用させ、オタネニンジンの抽出物が毛包幹細胞の未分化性にどのように関わっているかを評価した。未分化性は、KG2培地(KURABO社製)にて培養した毛包幹細胞を24ウェルの培養プレートに1×10４個ずつ播種し、オタネニンジンの抽出物（製造例１〜４、製造例２−ａ〜２−ｅ、比較製造例１〜２）を最終濃度が100 μg/mlとなるように添加して培養し、オタネニンジンの抽出物の添加48時間後の毛包幹細胞を回収し、毛包幹細胞の未分化性をKRT15（Keratin, type I cytoskeletal 15)の遺伝子発現量を指標に解析した。
【００５９】
KRT15の遺伝子発現解析は次の通り行った。オタネニンジンの抽出物添加後の毛包幹細胞をPBS(-)にて2回洗浄した後、Trizol Reagent(Invitrogen社製)によって該細胞からRNAを抽出した。2-STEPリアルタイムPCRキット(Applied Biosystems社製)を用いて、抽出したRNAをcDNAに逆転写した後、ABI7300(Applied Biosystems社製)により、下記プライマーセットを用いてリアルタイムPCR(95℃:15秒間、60℃:30秒間、40cycles)を実施し、KRT15の遺伝子発現量を測定した。その他の操作は定められた方法に従って実施した。
【００６０】
KRT15（毛包幹細胞未分化マーカー）用プライマーセット：
5'- GATGCTGCTTGACATAAAGACACG-3' (配列番号１)
5'- ACCTGTCCATCCACTGACTCTTC-3' (配列番号２)
18srRNA(内部標準)用プライマーセット：
5'-CCGAGCCGCCTGGATAC-3' (配列番号３）
5'-CAGTTCCGAAAACCAACAAAATAGA-3'(配列番号４）
【００６１】
毛包幹細胞の未分化状態維持効果は、オタネニンジンの抽出物を添加せずに培養した毛包幹細胞におけるKRT15のmRNAの発現量を内部標準である18s ribosomal RNA（18srRNA）の発現量に対する割合として算出したKRT15遺伝子相対発現量(KRT15遺伝子発現量/18srRNA遺伝子発現量)の値を1とし、これに対し、オタネニンジンの抽出物を添加して培養した毛包幹細胞におけるKRT15の遺伝子相対発現量の値を算出し、評価した。結果を以下の表１及び表２に示す。
【００６２】
【表１】
2019094268.tif 000002
【００６３】
【表２】
2019094268.tif 000003
【００６４】
表１に示すように、蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理を行ったオタネニンジンの抽出物（製造例１〜４）を添加した培地で培養した毛包幹細胞では、蒸気加熱処理を行っていないオタネニンジンの抽出物（比較製造例１〜２）に比べて、未分化マーカーKRT15の発現が著しく上昇し、優れた毛包幹細胞の未分化維持効果を有することが示された。また、蒸気加熱処理前に乾燥させたオタネニンジン（製造例２〜４）を用いたほうが、生のオタネニンジン（製造例１）を用いるよりも当該効果が高かった。また、表２に示すように、蒸気加熱処理の温度が１００〜１５０℃の範囲で、特に毛包幹細胞の未分化維持効果が顕著であった（製造例２−ｂ、２−ｃ、２−ｄ）。
【００６５】
（実験例２）オタネニンジン抽出物の細胞外基質遺伝子の発現促進効果
（１）ヒト毛包幹細胞の培養
ヒトの毛髪を毛抜きで採取し、メス等を用いて毛包組織のバルジ領域を含む組織を回収した。PBS(-)にて洗浄した後、トリプシン(BD Biosciences社製)処理を行った。その後、セルストレイナー(FALCON社製)を用いて、細胞を単離し、回収した。回収した細胞を培養プレートに播種し、KG2培地(KURABO社製)を用いてコンフルエントになるまで維持した。コンフルエントになった細胞を回収し、培養プレートに再び播種し、その後生着し、増殖している細胞を毛包幹細胞として以下の試験に用いた。
【００６６】
（２）オタネニンジン抽出物を添加した際の細胞外基質遺伝子の発現量の評価
毛包幹細胞にオタネニンジンの抽出物を作用させ、オタネニンジンの抽出物が毛包幹細胞における細胞外基質遺伝子の発現にどのように関わっているかを評価した。
【００６７】
試験は次の通り行った。毛包幹細胞に対してオタネニンジンの抽出物（製造例１〜４、比較製造例１〜２）を最終濃度が100 μg/mlとなるように添加した。オタネニンジンの抽出物を添加して、48時間後の細胞を回収し、毛包幹細胞の細胞外基質遺伝子発現量をCOL7A1, COL17A1, LAMA3, LAMB3, LAMC2, LAMA5, LAMB1, LAMC1, DCNの遺伝子発現量を指標として解析した。
【００６８】
遺伝子発現解析は次の通り行った。オタネニンジンの抽出物添加後の毛包幹細胞をPBS(-)にて2回洗浄した後、Trizol Reagent(Invitrogen社製)によって細胞からRNAを抽出した。2-STEPリアルタイムPCRキット(Applied Biosystems社製)を用いて、抽出したRNAをcDNAに逆転写した後、ABI7300(Applied Biosystems社製)により、リアルタイムPCR(95℃:15秒間、60℃:30秒間、40cycles)を実施し、COL7A1, COL17A1, LAMA3, LAMB3, LAMC2, LAMA5, LAMB1, LAMC1, DCNの遺伝子発現量を測定した。その他の操作は定められた方法に従って実施した。
【００６９】
COL7A1用プライマーセット：
5'-CACTGGAGCCACAGCTTACA-3' (配列番号５)
5'-GCTGACTCCACCTTCGAGAC-3' (配列番号６)
COL17A1用プライマーセット：
5'-TCCTGTCCAACTCAGAAACC-3' (配列番号７)
5'-ACCTGGATCACCTTTGTCAC-3' (配列番号８)
LAMA3用プライマーセット：
5'-AACCAAAAAGTGCTCGGAAGAC-3' (配列番号９)
5'-TCAGTAGGTGGTAAGCCCAAATC-3' (配列番号１０)
LAMB3用プライマーセット：
5'-GGGAGACCCCCACATTCAA-3' (配列番号１１)
5'-GCTGTGTGTTCTGCCGTTCTT-3' (配列番号１２)
LAMC2用プライマーセット：
5'-GGATGAGAATCCTGACATTGAGTGT-3' (配列番号１３)
5'-GTCGTGCGGATCGTTGTAGA-3' (配列番号１４)
LAMA5用プライマーセット：
5'-CAGCACTGCACTAGAAGAGG-3' (配列番号１５)
5'-CTTGCTTGTCTCGTCTGTGTC-3' (配列番号１６)
LAMB1用プライマーセット：
5'-ATCCCAAAGTTCTCAAGTCCT-3' (配列番号１７)
5'-GTCCATTACATTTACATCTGCCAC-3' (配列番号１８)
LAMC1用プライマーセット：
5'-CTTCTGTCTGTACAAACGCTG-3' (配列番号１９)
5'-CCATCCTCATCAATCTGAAAGG-3' (配列番号２０)
DCN用プライマーセット：
5'-TTCTGCCCACCTGGACACA-3' (配列番号２１)
5'-GACCGGGTTGCTGAAAAGAC-3' (配列番号２２)
18srRNA(内部標準)用プライマーセット：
5'-CCGAGCCGCCTGGATAC-3' (配列番号３）
5'-CAGTTCCGAAAACCAACAAAATAGA-3'(配列番号４）
【００７０】
細胞外基質遺伝子（以下、「標的遺伝子」という）の発現は、オタネニンジンの抽出物を添加せずに培養した毛包幹細胞における各標的遺伝子のmRNAの発現量を内部標準である18s ribosomal RNA（18srRNA）の発現量に対する割合として算出した標的遺伝子相対発現量(標的遺伝子発現量/18srRNA遺伝子発現量)の値を1とし、これに対し、オタネニンジンの抽出物を添加して培養した毛包幹細胞の各標的遺伝子相対発現量の値を算出し、評価した。結果を以下の表３に示す。
【００７１】
【表３】
2019094268.tif 000004
【００７２】
表３に示すように、蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理を行ったオタネニンジンの抽出物（製造例１〜４）を添加した培地で培養した毛包幹細胞では、蒸気加熱処理を行っていないオタネニンジンの抽出物（比較製造例１〜２）に比べて、COL7A1, COL17A1, LAMA3, LAMB3, LAMC2, LAMA5, LAMB1, LAMC1, DCNの発現量が高く、優れた細胞外基質遺伝子の発現促進効果が示された。また、蒸気加熱処理前に乾燥させたオタネニンジン（製造例２〜４）を用いたほうが、生のオタネニンジン（製造例１）を用いるよりも当該効果が高かった。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明は、脱毛症の予防及び／又は改善を目的とした医薬品、医薬部外品、又は化粧品の製造分野において利用できる。
【配列表】
2019094268000001.app