(57)【要約】【課題】本開示は、例えば１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることにより１つ以上のヒト細胞においてテロメア長を増加させるための方法、及び／又は１つ以上のヒト細胞のゲノム安定性を向上させるための方法に関する。【解決手段】例えばＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と対象中の１つ以上のヒト細胞を接触させることにより、又は必要な対象にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによりテロメア延長を必要とする対象を処置する方法、ゲノム異常及び／又は染色体異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法、１つ以上のヒト細胞を若返らせる方法、組織又は器官を若返らせる方法、及び若返りを必要とする対象を若返らせる方法も提供される。【選択図】図１６
2019122398.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のヒト細胞においてテロメア長を増加させる方法であって、前記ヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることを含み、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長が誘導される、前記方法。
【請求項２】
テロメア延長を必要とする対象を処置する方法であって、前記対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることを含み、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長を誘導する、前記方法。
【請求項３】
テロメア延長を必要とする対象を処置する方法であって、
（ｉ）前記対象よりテロメア延長を必要とする１つ以上のヒト細胞を単離すること、
（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長を誘導すること、及び
（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与すること
を含む、前記方法。
【請求項４】
テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、治療を必要とする対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することを含み、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長を誘導してテロメア異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療する、前記方法。
【請求項５】
テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、
（ｉ）テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象より１つ以上のヒト細胞を単離すること、
（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長を誘導すること、及び
（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与してテロメア異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療すること
を含む、前記方法。
【請求項６】
染色体異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、治療を必要とする対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することを含み、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において前記染色体異常の修正を誘導して染色体異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療する、前記方法。
【請求項７】
染色体異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、
（ｉ）染色体異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象より１つ以上のヒト細胞を単離すること、
（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において前記染色体異常の修正を誘導すること、及び
（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与して染色体異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療すること
を含む、前記方法。
【請求項８】
核型異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、治療を必要とする対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することを含み、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において前記核型異常の修正を誘導して核型異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療する、前記方法。
【請求項９】
核型異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、
（ｉ）核型異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象より１つ以上のヒト細胞を単離すること、
（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において前記核型異常の修正を誘導すること、及び
（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与して核型異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療すること
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記核型異常が染色体ヌリソミー、染色体モノソミー、染色体トリソミー、染色体テトラソミー、及び染色体ペンタソミーからなる群より選択される、請求項８又は請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核型異常が２１番染色体トリソミー、１６番染色体トリソミー、１８番染色体トリソミー、１３番染色体トリソミー、Ｘ染色体モノソミー、ＸＸＸ異数性、ＸＸＹ異数性、ＸＹＹ異数性、及び１ｐ３６領域重複からなる群より選択される、請求項８又は請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
核型異常に関連する前記疾患又は健康状態が１７番染色体（ｐ１１．２ｐ１１．２）領域重複症候群、ペリツェウス・メルツバッハー病、２２番染色体（ｑ１１．２ｑ１１．２）領域重複症候群、ネコ眼症候群、ネコなき症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン、ウィリアムス・ボイレン症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、遺伝性圧脆弱性ニューロパチー、スミス・マゲニス症候群、神経線維腫症、アラジール症候群、口蓋心臓顔面症候群、ディジョージ症候群、ステロイドスルファターゼ欠損、カルマン症候群、線型皮膚欠陥症の小眼症、副腎低形成、グリセロールキナーゼ欠損、ペリツェウス・メルツバッハー病、Ｙ染色体上の精巣決定因子、無精子症（ａ因子）、無精子症（ｂ因子）、無精子症（ｃ因子）、及び１ｐ３６領域欠失からなる群より選択される、請求項８又は請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患又は健康状態がテロメア短縮疾患、骨髄機能不全症候群、加齢性テロメア短縮疾患又は障害、及び早期老化疾患又は障害からなる群より選択される１つ以上の疾患又は健康状態である、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記疾患又は健康状態が先天性角化不全症、ホイエラール・レイダーソン症候群、レーヴェース症候群、コーツプラス症候群、特発性肺性線維症、肝硬変、膵臓線維症、アルツハイマー病、及び骨関節炎からなる群より選択されるテロメア短縮疾患である、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記疾患又は健康状態がファンコーニ貧血、無巨核球性血小板減少症、再生不良性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化不全症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、ピアソン症候群、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、血小板減少症、及び骨髄異型性症候群からなる群より選択される骨髄機能不全症候群である、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患又は健康状態がウェルナー症候群、ブルーム症候群、ハッチソン・ギルフォード早老症候群、コケイン症候群、色素性乾皮症、毛細管拡張性運動失調症、ロスモンド・トムソン症候群、硫黄欠乏性毛髪発育異常症、ジュバーグ・マルシジ症候群、及びダウン症からなる群より選択される加齢性テロメア短縮疾患又は障害、早期老化疾患又は障害、又はそれらの両方である、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾患又は健康状態が免疫不全、自己免疫疾患、自己免疫障害、慢性潰瘍、アテローム性硬化症、癌、神経損傷、変性障害、神経変性障害、創傷治癒、筋肉修復、心筋修復、軟骨置換、関節炎、骨関節炎、歯科再生、盲目症、網膜色素上皮細胞の増殖性の減退に起因する加齢性盲目症、難聴、骨髄機能不全、骨髄移植、糖尿病、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、遺伝病、遺伝子変異、及びＤＮＡ損傷からなる群より選択される１つ以上の疾患又は健康状態である、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記疾患又は健康状態が心臓の癌（例えば、血管肉腫、繊維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘液腫、横紋筋腫、繊維腫、脂肪腫及び奇形腫）；肺癌（例えば、気管支原性癌（鱗状細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞上皮（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫）；胃腸管癌（例えば、食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）；胃癌（上皮癌、リンパ腫、平滑筋肉腫）；膵臓癌（膵管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）；小腸癌（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経繊維腫、繊維腫）；大腸癌（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；泌尿生殖路癌（例えば、腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍、腎芽腫、リンパ腫、白血病）；膀胱癌及び尿道癌（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）；前立腺癌（腺癌、肉腫）；精巣癌（精上皮腫、奇形腫、胎生期癌、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、繊維腫、繊維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫）；肝臓癌（例えば、肝癌（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫）；骨癌（例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、繊維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液繊維腫、類骨骨腫及び巨細胞腫）；神経系癌（例えば、頭骨（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫、松果体腫、多形神経膠芽腫、希突起神経膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄（神経繊維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫））；婦人科癌（例えば、子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、腫瘍前子宮頸部異形成症）、卵巣（卵巣癌、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、類内膜性腫瘍、ブレナー腫瘍、明細胞癌、非分類癌、顆粒膜／莢膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、陰門（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、繊維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫、胎児型横紋筋肉腫、卵管（癌））；血液癌（例えば、血液（骨髄性白血病（急性及び慢性）、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異型性症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫））；皮膚癌（例えば、悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、黒子、異型性母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚繊維腫、ケロイド、乾癬）；及び副腎癌（例えば、神経芽細胞腫）からなる群より選択される癌である、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記疾患又は健康状態が甲状腺炎、グッドパスチャー病、リウマチ性関節炎、若年性少関節炎、コラーゲン誘発関節炎、アジュバント誘発関節炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性胃萎縮、尋常性天疱瘡、乾癬、尋常性白斑、１型糖尿病、非肥満糖尿病、重症筋無力症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性唾液腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性血小板減少性紫斑症、アジソン病、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、自己免疫性溶血性貧血、及び悪性貧血からなる群より選択される自己免疫疾患である、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患又は健康状態が副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、アルコール中毒症、アレキサンダー病、アルパーズ病、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症、ルー・ゲーリッグ病、毛細管拡張性運動失調症、バッテン病、シュピールマイヤー・フォクト・シェーグレン・バッテン病、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、カナバン病、脳性麻痺、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病、脊髄小脳失調症３型、多系統委縮症、多発性硬化症、ナルコレプシー、ニーマンピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、亜急性連合性脊髄変性症併発性悪性貧血、シュピールマイヤー・フォクト・シェーグレン・バッテン病、バッテン病、脊髄小脳失調症、脊髄性筋委縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、及び中毒性脳症からなる群より選択される神経変性疾患である、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
癌を治療する方法であって、治療を必要とする対象中の１つ以上の癌細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することを含み、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上の癌細胞の増殖を抑制することで前記癌を治療する、前記方法。
【請求項２２】
癌患者における化学療法に対する応答性を改善する方法であって、応答性の改善を必要とする対象に前記対象中の１つ以上の癌幹細胞における内在性ＺＳＣＡＮ４の発現を低下させる薬剤を投与することを含み、内在性ＺＳＣＡＮ４の発現低下によって前記１つ以上の癌幹細胞における１つ以上の化学療法剤に対する抵抗性を低下させ、又は除去し、それによって前記対象において前記１つ以上の化学療法剤に対する応答性を改善する、前記方法。
【請求項２３】
内在性ＺＳＣＡＮ４の発現を低下させる前記薬剤がＺＳＣＡＮ４に特異的なｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が心臓の癌（例えば、血管肉腫、繊維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘液腫、横紋筋腫、繊維腫、脂肪腫及び奇形腫）；肺癌（例えば、気管支原性癌（鱗状細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞上皮（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫）；胃腸管癌（例えば、食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）；胃癌（上皮癌、リンパ腫、平滑筋肉腫）；膵臓癌（膵管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）；小腸癌（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経繊維腫、繊維腫）；大腸癌（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；泌尿生殖路癌（例えば、腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍、腎芽腫、リンパ腫、白血病）；膀胱癌及び尿道癌（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）；前立腺癌（腺癌、肉腫）；精巣癌（精上皮腫、奇形腫、胎生期癌、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、繊維腫、繊維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫）；肝臓癌（例えば、肝癌（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫）；骨癌（例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、繊維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液繊維腫、類骨骨腫及び巨細胞腫）；神経系癌（例えば、頭骨（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫、松果体腫、多形神経膠芽腫、希突起神経膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄（神経繊維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫））；婦人科癌（例えば、子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、腫瘍前子宮頸部異形成症）、卵巣（卵巣癌、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、類内膜性腫瘍、ブレナー腫瘍、明細胞癌、非分類癌、顆粒膜／莢膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、陰門（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、繊維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫、胎児型横紋筋肉腫、卵管（癌））；血液癌（例えば、血液（骨髄性白血病（急性及び慢性）、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異型性症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫））；皮膚癌（例えば、悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、黒子、異型性母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚繊維腫、ケロイド、乾癬）；及び副腎癌（例えば、神経芽細胞腫）からなる群より選択される、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
１つ以上のヒト細胞のゲノム安定性を向上させる方法であって、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることを含み、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてゲノム安定性が向上する、前記方法。
【請求項２６】
１つ以上のヒト細胞のＤＮＡ修復能を向上させる方法であって、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることを含み、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞におけるＤＮＡ修復能が向上する、前記方法。
【請求項２７】
１つ以上のヒト細胞を若返らせる方法であって、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることを含み、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞が若返る、前記方法。
【請求項２８】
皮膚を若返らせる方法、アトピー性皮膚炎を治療する方法、及び／又は皮膚損傷を治療する方法であって、それらを必要とする対象の皮膚にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を局所投与することを含む、前記方法。
【請求項２９】
脱毛を治療する方法であって、治療を必要とする対象の頭皮にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を局所投与することを含む、前記方法。
【請求項３０】
白髪化を防止する方法、白髪化を治療する方法、又は両方の方法であって、それらを必要とする対象の１つ以上の毛包にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項３１】
角膜を若返らせる方法であって、角膜の若返りを必要とする対象の角膜にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項３２】
ドライアイを治療する方法であって、治療を必要とする対象の角膜にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項３３】
特発性肺性線維症を治療する方法であって、治療を必要とする対象の肺にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項３４】
アテローム性硬化症、冠動脈疾患、又はそれらの両方を治療する方法であって、治療を必要とする対象の血流にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項３５】
１つ以上のヒト細胞において１種類以上の遺伝毒性物質に対する抵抗性を提供する方法であって、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることを含み、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において１種類以上の遺伝毒性物質に対する抵抗性が上昇する、前記方法。
【請求項３６】
前記遺伝毒性物質がマイトマイシンＣ又はシスプラチンである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記１つ以上のヒト細胞がヒト成体細胞である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つ以上のヒト細胞が成体幹細胞、組織幹細胞、始原細胞、又は人工多能性幹細胞である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つ以上のヒト細胞が造血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、神経幹細胞、及び生殖幹細胞からなる群より選択される１つ以上の成体幹細胞、組織幹細胞、又は始原細胞である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つ以上のヒト細胞が体細胞、成熟細胞、又は分化細胞である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記１つ以上のヒト細胞が表皮細胞、線維芽細胞、リンパ球、肝細胞、上皮細胞、筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、心筋細胞、膵臓β細胞、ケラチノサイト、赤血球、末梢血液細胞、神経細胞、星状細胞、生殖細胞、精細胞、及び卵母細胞からなる群より選択される１つ以上の体細胞、成熟細胞、又は分化細胞である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
１つ以上のヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞においてヒト胚性幹細胞様ＤＮＡメチル化パターンを誘導するための方法であって、前記１つ以上のヒトｉＰＳ細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒトｉＰＳ細胞を接触させることを含み、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒトｉＰＳ細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒトｉＰＳ細胞においてヒト胚性幹細胞様ＤＮＡメチル化パターンが誘導される、前記方法。
【請求項４３】
１つ以上のヒト卵母細胞を若返らせる方法であって、前記１つ以上のヒト卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト卵母細胞を接触させることを含み、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト卵母細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト卵母細胞が若返る、前記方法。
【請求項４４】
１つ以上のヒト卵母細胞のゲノム安定性を向上させる方法であって、前記１つ以上のヒト卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト卵母細胞を接触させることを含み、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト卵母細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト卵母細胞におけるゲノム安定性が向上する、前記方法。
【請求項４５】
１つ以上のヒト卵母細胞において１つ以上の核型異常を修正する方法であって、前記１つ以上のヒト卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト卵母細胞を接触させることを含み、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト卵母細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト卵母細胞において前記１つ以上の核型異常の修正が誘導される、前記方法。
【請求項４６】
前記１つ以上のヒト卵母細胞がＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる前記薬剤との接触前に対象から単離される、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
Ｚｓｃａｎ４の発現を上昇させる前記薬剤との接触後に前記１つ以上のヒト卵母細胞が体外受精を受ける、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
１つ以上のヒト受精卵母細胞のゲノム安定性を向上させるインビトロ方法であって、前記１つ以上のヒト受精卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト受精卵母細胞を接触させることを含み、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト受精卵母細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト受精卵母細胞においてゲノム安定性が向上する、前記方法。
【請求項４９】
１つ以上のヒト受精卵母細胞における１つ以上の核型異常を修正するインビトロ方法であって、前記１つ以上のヒト受精卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト受精卵母細胞を接触させることを含み、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト受精卵母細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト受精卵母細胞において前記１つ以上の核型異常の修正が誘導される、前記方法。
【請求項５０】
前記１つ以上のヒト受精卵母細胞が体外受精によって受精した、請求項４８又は請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
受精させられる前に前記１つ以上のヒト卵母細胞が対象から単離された、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記１つ以上の受精卵母細胞が１細胞期と胚盤胞期の間の胚である、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、
（ｉ）テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象よりヒト骨髄細胞を単離すること、
（ｉｉ）前記ヒト骨髄細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記ヒト骨髄細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記ヒト骨髄細胞においてテロメア延長を誘導すること、及び
（ｉｉｉ）前記接触済みヒト骨髄細胞を前記対象に移植してテロメア異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療すること
を含む、前記方法。
【請求項５４】
染色体異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、
（ｉ）染色体異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象よりヒト骨髄細胞を単離すること、
（ｉｉ）前記ヒト骨髄細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記ヒト骨髄細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記ヒト骨髄細胞において前記染色体異常の修正を誘導すること、及び
（ｉｉｉ）前記接触済みヒト骨髄細胞を前記対象に移植して染色体異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療すること
を含む、前記方法。
【請求項５５】
前記疾患又は健康状態がテロメア短縮疾患、骨髄機能不全症候群、加齢性テロメア短縮疾患又は障害、及び早期老化疾患又は障害からなる群より選択される１つ以上の疾患又は健康状態である、請求項５３又は請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記疾患又は健康状態が先天性角化不全症、ホイエラール・レイダーソン症候群、レーヴェース症候群、コーツプラス症候群、特発性肺性線維症、肝硬変、膵臓線維症、アルツハイマー病、及び骨関節炎からなる群より選択されるテロメア短縮疾患である、請求項５３又は請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記疾患又は健康状態がファンコーニ貧血、無巨核球性血小板減少症、再生不良性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化不全症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、ピアソン症候群、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、血小板減少症、及び骨髄異型性症候群からなる群より選択される骨髄機能不全症候群である、請求項５３又は請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記疾患又は健康状態がウェルナー症候群、ブルーム症候群、ハッチソン・ギルフォード早老症候群、コケイン症候群、色素性乾皮症、毛細管拡張性運動失調症、ロスモンド・トムソン症候群、硫黄欠乏性毛髪発育異常症、ジュバーグ・マルシジ症候群、及びダウン症からなる群より選択される加齢性テロメア短縮疾患又は疾患、早期老化疾患又は疾患、又はそれらの両方である、請求項５３又は請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
対象内の組織又は器官を若返らせる方法であって、組織又は器官の若返りを必要とする対象に前記組織又は器官においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することを含み、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記組織又は器官を若返らせる、前記方法。
【請求項６０】
若返りを必要とする対象を若返らせる方法であって、前記対象にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することを含み、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記対象を若返らせる、前記方法。
【請求項６１】
１つ以上のヒト細胞の寿命を延長する方法であって、前記対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることを含み、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞の寿命が延長される、前記方法。
【請求項６２】
対象内の組織又は器官の寿命を延長する方法であって、組織又は器官の寿命の延長を必要とする対象に前記組織又は器官においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することを含み、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記組織又は器官の寿命を延長する、前記方法。
【請求項６３】
対象の寿命を延長する方法であって、寿命の延長を必要とする対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することを含み、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞の寿命を延長し、それによって前記対象の寿命を延長する、前記方法。
【請求項６４】
寿命の延長を必要とする対象の寿命を延長する方法であって、
（ｉ）前記対象より１つ以上のヒト細胞を単離すること、
（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞の寿命を延長すること、及び
（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与して前記対象の寿命を延長すること
を含む、前記方法。
【請求項６５】
１つ以上のヒト細胞において１つ以上のＺｓｃａｎ４誘導性作用を測定するための方法であって、
（ｉ）１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させること、
（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルを測定すること、及び
（ｉｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルを前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルと比較し、前記１つ以上のヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルの上昇によって前記１つ以上のヒト細胞における１つ以上のＺｓｃａｎ４誘導性作用の存在を示すこと
を含む、前記方法。
【請求項６６】
前記Ｚｓｃａｎ４の発現上昇が一時的なものである、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記薬剤がＺｓｃａｎ４発現を約１時間〜約２３時間にわたって上昇させる、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記薬剤がＺｓｃａｎ４発現を約１日〜約１０日にわたって上昇させる、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記薬剤が内在性Ｚｓｃａｎ４と直接的に相互作用してＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする単離核酸分子である、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記単離核酸分子が合成ｍＲＮＡである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記単離核酸分子がベクターを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ウイルスベクターがパラミクソウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はアデノウイルスベクターである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ベクターがプラスミドベクターである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
前記ベクターがプロモーターに機能的に結合しているＺｓｃａｎ４をコードする、請求項７２〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記Ｚｓｃａｎ４がＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質である、請求項７０〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記Ｚｓｃａｎ４がＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質である、請求項７０〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質が少なくとも１つのジンクフィンガードメインの欠失を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記Ｚｓｃａｎ４がマウスＺｓｃａｎ４、ヒトＺＳＣＡＮ４、又はそれらのホモログである、請求項７０〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記Ｚｓｃａｎ４がＺｓｃａｎ４ａ、Ｚｓｃａｎ４ｂ、Ｚｓｃａｎ４ｃ、Ｚｓｃａｎ４ｄ、Ｚｓｃａｎ４ｅ、及びＺｓｃａｎ４ｆからなる群より選択される、請求項７０〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記単離核酸分子が配列番号１〜１０及び２１〜３０からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項７０〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記Ｚｓｃａｎ４がヒトＺＳＣＡＮ４である、請求項７０〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記単離核酸分子が配列番号７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項７０〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記薬剤がＺｓｃａｎ４タンパク質である、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質が細胞透過性ペプチドに融合されている、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記細胞透過性ペプチドがタンパク質導入ドメインを含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記細胞透過性ペプチドがポリアルギニンペプチドタグを含む、請求項９０又は請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質がナノ粒子内に封入される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質がマウスＺｓｃａｎ４タンパク質、ヒトＺＳＣＡＮ４タンパク質、又はそれらのホモログである、請求項８９〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質がＺｓｃａｎ４ａタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｂタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｃタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｄタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｅタンパク質、及びＺｓｃａｎ４ｆタンパク質からなる群より選択される、請求項８９〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質が配列番号１１〜２０及び３１〜４０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８９〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質がヒトＺＳＣＡＮ４タンパク質である、請求項８９〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質が配列番号１７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８９〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質がＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質である、請求項８９〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質がＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質である、請求項８９〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質がマウスＺｓｃａｎ４タンパク質、ヒトＺＳＣＡＮ４タンパク質、又はそれらのホモログを含み、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質が少なくとも１つのジンクフィンガードメインの欠失を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質がＺｓｃａｎ４ａタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｂタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｃタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｄタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｅタンパク質、及びＺｓｃａｎ４ｆタンパク質からなる群より選択されるＺｓｃａｎ４タンパク質を含み、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質が少なくとも１つのジンクフィンガードメインの欠失を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質がヒトＺＳＣＡＮ４タンパク質を含み、前記ＺＳＣＡＮ４タンパク質が少なくとも１つのジンクフィンガードメインの欠失を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
前記薬剤がレチノイド又は酸化ストレスを誘発する薬剤である、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は２０１３年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／８００６６８番の利益を請求するものであり、その仮特許出願の全体を参照によりここに援用する。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表の提出
次のＡＳＣＩＩテキストファイルの提出物であるコンピューター読み込み可能形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：６９９４４２０００８４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、登録日：２０１４年３月１１日、サイズ：１０４ＫＢ）の内容全体が参照によって本明細書に援用される。
【０００３】
技術分野
本開示は、例えば１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることにより１つ以上のヒト細胞においてテロメア長を増加させるための方法、及び／又は１つ以上のヒト細胞のゲノム安定性を向上させるための方法に関する。本開示は、例えばＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と対象中の１つ以上のヒト細胞を接触させることにより、又は必要な対象にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによりテロメア延長を必要とする対象を処置する方法、ゲノム異常及び／又は染色体異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法、１つ以上のヒト細胞を若返らせる方法、組織又は器官を若返らせる方法、及び若返りを必要とする対象を若返らせる方法をさらに提供する。
【背景技術】
【０００４】
背景
テロメアは、各染色体の末端にキャップをし、且つ、各細胞周期において絶え間ない分解から各染色体の末端を守ることによって染色体完全性を確保及び保障するタンパク質が付随している反復ＤＮＡ配列である。テロメア短縮はゲノム不安定性に寄与することによって癌を引き起こすこともあり得（Ｒａｙｎａｕｄら、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ誌、第６６巻：９９〜１１７頁、２００８年）、老化及び細胞老化と関連付けられている（Ｙａｎｇ、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ誌、第１２２巻：２１１〜２１８頁、２００８年）。テロメアは正常な老化の経過の中で徐々に短くなることが充分に立証されている。各回のＤＮＡ複製に付き最大で２００塩基対のテロメアＤＮＡが失われることが報告されている。例えば、ヒト新生児では末梢血リンパ球は各染色体の両端におよそ１０ｋｂのテロメアＤＮＡを有し、７０歳までにおよそ６ｋｂにまで徐々に短くなる。環境要因と生活習慣要因がテロメア短縮を加速し得ることもわかっている。そのようなテロメア短縮は加齢性の細胞衰微と関連していると考えられる。テロメア短縮によって細胞分裂の回数が限定され、それによって究極的にはヒトの寿命が限定されることになるとも考えられる。ヒトは様々な長さのテロメアを有して生まれてくることもわかっている。例えば、およそ８ｋｂのテロメアから始まるヒトもいれば、およそ１２ｋｂのテロメアから始まるヒトもいる。よって、より短いテロメアを有するヒトはより長いテロメアを有するヒトよりも早い年齢である特定の加齢性の病的状態を発症しやすい場合があり得る。そのような病的状態には、例えば、免疫不全、慢性潰瘍、アテローム性硬化症、網膜色素上皮細胞の増殖性の減退に起因する加齢性盲目症、及び癌が含まれる。
【０００５】
また、テロメア短縮と関連することもある様々な疾患及び障害が存在する（Ａｒｍａｎｉｏｓ及びＢｌａｃｋｂｕｒｎ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ誌、２０１２年１０月、第１３巻（第１０号）：６９３〜７０４頁）。テロメア短縮を引き起こし得る遺伝病の例には先天性角化不全症、ホイエラール・レイダーソン症候群、レーヴェース症候群、及びコーツプラス症候群が挙げられる。さらに、特発性肺性線維症（ＩＰＦ）のかなりの割合がテロメア短縮によって引き起こされることが近年示された。同様に、幾つかの肝硬変と膵臓線維症がテロメア短縮によって引き起こされ得る。そのような病的状態の有病率を考慮すると、テロメア短縮が原因の疾患はこれまでに考えられていたよりも一般的であるように見える。
【０００６】
テロメア短縮に関連する疾患の別の例はファンコーニ貧血である。ファンコーニ貧血は希少性常染色体劣性疾患である。ファンコーニ貧血は進行性汎血球減少症と癌感受性を特徴とする遺伝性骨髄機能不全症候群である（Ｂｏｇｌｉｏｌｏら、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ誌、２００２年１１月；第１７巻（第６号）：５２９〜３８頁）。ファンコーニ貧血患者は加速されたテロメア短縮を示すことが報告されている（Ｌｅｔｅｕｒｔｅら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．誌、１９９９年；Ｂａｌｌら、Ｂｌｏｏｄ誌、１９９８年；Ｈａｎｓｏｎら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．誌、２００１年；及びＣａｌｌeｎら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ誌、２００２年２月１５日；第１１巻（第４号）：４３９〜４４頁）。
【０００７】
これらの様々なテロメア短縮関連疾患及び障害を治療する１つの有望な方法は短くなったテロメアを長くするためにテロメラーゼを使用することである。テロメラーゼはテロメア伸長維持に関与することが知られている主要な酵素として特定された。テロメラーゼは胚性幹細胞では活性を有するが、体細胞などの非胚性細胞（すなわち、成体細胞）ではテロメラーゼは通常は発現していない。したがって、成体細胞におけるテロメラーゼの再活性化又はテロメラーゼの強制発現がテロメア長を増加させるために用いられ得る。しかしながら、テロメラーゼの使用に関する１つの潜在的な問題は、テロメラーゼの連続的発現が多くの場合に腫瘍形成及び癌性形質転換と関連していることである。よって、テロメラーゼの発現はテロメア短縮に関連する疾患又は健康状態を患う患者においてテロメア長を増加させるには理想的な方法ではない。
【０００８】
テロメアを長くする別の有望な方法は、最近発見されたテロメア長を増加させる可能性がある漢方薬草の成分（ＴＡ−６５）を使用することである（Ｈａｒｌｅｙら、Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ誌、第１４巻：４５〜５６頁、２０１１年）。しかしながら、この薬草がテロメアを効果的に長くすることができることは充分に立証されていない。また、この薬草の使用はテロメア延長を必要とする患者を治療するために薬品の長期連続投与を必要とする。
【０００９】
さらに、Ｚｓｃａｎ４（ジンクフィンガー及びＳＣＡＮドメイン含有タンパク質４）はマウス胚性幹細胞におけるゲノム安定性と正常核型の維持に必要であり、マウス胚及び胚性幹細胞において発現することが近年示された（Ｆａｌｃｏら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ誌、第３０７巻：５３９〜５５０頁、２００７年；Ｚａｌｚｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ誌、第４６４巻：８５８〜８６３頁、２０１０年；ＰＣＴ出願国際公開第２００８／１１８９５７号、国際公開第２０１１／０２８８０号、国際公開第２０１２／１０３２３５号、国際公開第２０１２／１２９３４２号、国際公開第２０１２／１５８５６１号、及び国際公開第２０１２１５８５６４号、及び米国特許出願公開第２０１０／０１０５０４３号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１２９１６１号明細書、及び米国特許出願公開第２０１２／０１５６３０５号明細書）。マウス胚性幹細胞におけるＺｓｃａｎ４発現がテロメア伸長と関連することも示されている（Ｚａｌｚｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ誌、第４６４巻：８５８〜８６３頁、２０１０年；ＰＣＴ出願国際公開第２０１１／０２８８０号、国際公開第２０１２／１２９３４２号、及び国際公開第２０１２１５８５６４号；及び米国特許出願公開第２０１２／０１５６３０５号明細書）。ヒトゲノムもＺＳＣＡＮ４遺伝子を含むことが示されている一方で、Ｆａｌｃｏら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ誌、第３０７巻：５３９〜５５０頁、２００７年；Ｚａｌｚｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ誌、第４６４巻：８５８〜８６３頁、２０１０年；ＰＣＴ出願国際公開第２００８／１１８９５７号、国際公開第２０１１／０２８８０号、国際公開第２０１２／１０３２３５号、国際公開第２０１２／１２９３４２号、国際公開第２０１２／１５８５６１号、及び国際公開第２０１２１５８５６４号、又は米国特許出願公開第２０１０／０１０５０４３号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１２９１６１号明細書、及び米国特許出願公開第２０１２／０１５６３０５号明細書の中で、Ｚｓｃａｎ４発現によってマウス胚細胞内で生じるのと同じ作用が、ヒト細胞において生じることを証明する実験的裏付けを提供しているものはない。マウスゲノムは６種類のＺｓｃａｎ４遺伝子と３種類のＺｓｃａｎ４偽遺伝子を含み、一方でヒトゲノムは１種類のＺＳＣＡＮ４遺伝子を含むだけである（ＰＣＴ出願国際公開第２００８／１１８９５７号）ので、ヒトＺＳＣＡＮ４がマウスＺｓｃａｎ４と同じ機能を有するかは特に不明瞭である。また、テロメア短縮に関連する疾患及び健康状態に関与している体細胞などのヒト細胞におけるＺＳＣＡＮ４発現が、マウス胚性幹細胞について示されているものと同じ作用を有するか不明である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上より、テロメア短縮とゲノム異常に関連する疾患又は健康状態を治療するためにヒト細胞においてテロメア長を増加させ、ゲノム異常及び／又は染色体異常を修正するための改善型アプローチの必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の必要性に対応するため、本開示は、細胞内でＺｓｃａｎ４（ジンクフィンガー及びＳＣＡＮドメイン含有タンパク質４）の発現を上昇させる薬剤とヒト細胞を接触させることによりテロメア長を増加させる新規方法、ヒト細胞において染色体及び／又はゲノムの安定性を向上させる新規方法、ヒト細胞において染色体及び／又は核型の異常（例えば、２１番染色体トリソミー）を修正する新規方法、及び／又はヒト細胞を若返らせる新規方法を提供する。本明細書において使用される場合、「Ｚｓｃａｎ４」という用語はＺｓｃａｎ４ポリペプチド、及びマウスとヒトをはじめとするあらゆる種に由来するＺｓｃａｎ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、遺伝子を指す。本明細書において使用される場合、「ＺＳＣＡＮ４」という用語はヒトＺｓｃａｎ４ポリペプチド及びＺｓｃａｎ４ポリペプチドをコードするヒトポリヌクレオチド、例えば、遺伝子を特異的に指す。
【００１２】
本開示は、テロメア異常、染色体異常及び／又は核型異常に関連する疾患又は健康状態を治療する新規方法、ヒト卵母細胞、ヒト受精卵母細胞、及びヒト着床前胚においてゲノム安定性を向上させ、且つ、核型異常を修正する新規方法、組織又は器官を若返らせる新規方法、及び／又は若返りを必要とする対象を若返らせる新規方法であって、それらを必要とする対象にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによる前記方法も提供する。幾つかの実施形態では前記ヒト細胞はヒト成体細胞（すなわち、非胚性細胞）である。
【００１３】
また、本開示はヒト細胞、例えば、線維芽細胞におけるＺｓｃａｎ４発現によってわずか２日後にはそれらの細胞においてテロメア長が急激及び劇的に増加するという驚くべき発見に少なくとも部分的に基づいている。とりわけ、下の実施例８において開示されるように、ヒト線維芽細胞におけるＺｓｃａｎ４発現によって３日以内にテロメア長が約４０％増加した。さらに、ファンコーニ貧血を有する患者より単離されたヒト線維芽細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現によって３日以内にテロメア長が約１６０％増加した。驚くべきことに、ダウン症患者より単離された線維芽細胞集団におけるＺｓｃａｎ４発現によって２１番染色体トリソミーを有するその集団中の細胞のパーセンテージを劇的に低下させることもできた。とりわけ、下の実施例１５において開示されるように、ダウン症患者より単離された線維芽細胞集団におけるＺｓｃａｎ４発現によってそれらの細胞のおよそ５５％において２１番染色体トリソミー異常を修正することができた。
【００１４】
Ｚｓｃａｎ４発現によってヒト細胞においてテロメア長を増加させることができると以前には決して示されていないと考えられることを考慮すると、本明細書において開示される結果は特に驚くべきことである。本明細書において開示される結果は予想されてもいない。Ｚｓｃａｎ４発現がマウス胚性幹（ＥＳ）細胞においてテロメア長を増加させることはこれまでに示されていたが、ヒト細胞におけるＺｓｃａｎ４発現もテロメア長を増加させることはヒトＺＳＣＡＮ４とマウスＺｓｃａｎ４との間の差ばかりではなく、ヒト細胞の生物学とマウス細胞の生物学との間の差、並びにＥＳ細胞と成体細胞などの非ＥＳ細胞との間の差のためにも予想されなかった。ヒトゲノムとマウスゲノムの転写調節要素は大きく異なることがこれまでに示されたことを考慮すると、このことは特に妥当である。ヒトとマウスの両方で保存された機能を有する転写因子であってもかなりの程度の種特異的結合事象嗜好を示すこと（Ｏｄｏｍら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ誌、第６巻：３９頁、２００７年）を考慮すると、このことは非常に印象的である。
【００１５】
有利なことに、Ｚｓｃａｎ４発現を増加させる薬剤、例えば、Ｚｓｃａｎ４をコードする核酸分子の活用を用いて若返りによって、及び／又は卵母細胞、受精卵母細胞、又は着床前胚におけるゲノム異常及び／又は染色体異常、例えば、異数性の修正によって高齢の女性において体外受精（ＩＶＦ）の成功率を上昇させることができ、妊娠の成功を増加させることができる。さらに、Ｚｓｃａｎ４発現を増加させる薬剤、例えば、Ｚｓｃａｎ４をコードする核酸分子の活用を用いてテロメア短縮に関連する疾患又は健康状態、例えば、ファンコーニ貧血によって冒されている患者の細胞内のテロメア長を増加させることによって前記疾患又は健康状態を患っているその患者を治療することができる。さらに、Ｚｓｃａｎ４発現を増加させる薬剤、例えば、Ｚｓｃａｎ４をコードする核酸分子を使用してテロメア短縮が原因で老化した細胞、組織、器官及び個体におけるテロメア長を増加させることによって個体内の細胞、個体内の組織、又は個体内の器官を若返らせることもでき、又は個体を若返らせることもできる。
【００１６】
以上より、本開示のある特定の態様は、１つ以上のヒト細胞においてテロメア長を増加させる方法であって、前記ヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長が誘導される前記方法に関する。
【００１７】
本開示の他の態様は、テロメア延長を必要とする対象を処置する方法であって、前記対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることによる方法であり、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長を誘導する前記方法に関する。
【００１８】
本開示の他の態様は、テロメア延長を必要とする対象を処置する方法であって、（ｉ）前記対象よりテロメア延長を必要とする１つ以上のヒト細胞を単離すること、（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長を誘導すること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与することによる前記方法に関する。
【００１９】
本開示の他の態様は、テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、治療を必要とする対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することによる方法であり、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長を誘導してテロメア異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療する前記方法に関する。
【００２０】
本開示の他の態様は、テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、（ｉ）テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象より１つ以上のヒト細胞を単離すること、（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長を誘導すること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与してテロメア異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療することによる前記方法に関する。
【００２１】
本開示の他の態様は、染色体異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、治療を必要とする対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することによる方法であり、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において前記染色体異常の修正を誘導して染色体異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療する前記方法に関する。
【００２２】
本開示の他の態様は、染色体異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、（ｉ）染色体異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象より１つ以上のヒト細胞を単離すること、（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において前記染色体異常の修正を誘導すること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与して染色体異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療することによる前記方法に関する。
【００２３】
本開示の他の態様は、核型異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、治療を必要とする対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することによる方法であり、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において前記核型異常の修正を誘導して核型異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療する前記方法に関する。
【００２４】
本開示の他の態様は、核型異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、（ｉ）核型異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象より１つ以上のヒト細胞を単離すること、（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において前記核型異常の修正を誘導すること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与して核型異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療することによる前記方法に関する。
【００２５】
前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記核型異常は染色体ヌリソミー、染色体モノソミー、染色体トリソミー、染色体テトラソミー、及び染色体ペンタソミーから選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記核型異常は２１番染色体トリソミー、１６番染色体トリソミー、１８番染色体トリソミー、１３番染色体トリソミー、Ｘ染色体モノソミー、ＸＸＸ異数性、ＸＸＹ異数性、ＸＹＹ異数性、及び１ｐ３６領域重複から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、核型異常に関連する前記疾患又は健康状態は１７番染色体（ｐ１１．２ｐ１１．２）領域重複症候群、ペリツェウス・メルツバッハー病、２２番染色体（ｑ１１．２ｑ１１．２）領域重複症候群、ネコ眼症候群、ネコなき症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン、ウィリアムス・ボイレン症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、遺伝性圧脆弱性ニューロパチー、スミス・マゲニス症候群、神経線維腫症、アラジール症候群、口蓋心臓顔面症候群、ディジョージ症候群、ステロイドスルファターゼ欠損、カルマン症候群、線型皮膚欠陥症の小眼症、副腎低形成、グリセロールキナーゼ欠損、ペリツェウス・メルツバッハー病、Ｙ染色体上の精巣決定因子、無精子症（ａ因子）、無精子症（ｂ因子）、無精子症（ｃ因子）、及び１ｐ３６領域欠失から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態はテロメア短縮疾患、骨髄機能不全症候群、加齢性テロメア短縮疾患又は障害、及び早期老化疾患又は障害から選択される１つ以上の疾患又は健康状態である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態は先天性角化不全症、ホイエラール・レイダーソン症候群、レーヴェース症候群、コーツプラス症候群、特発性肺性線維症、肝硬変、膵臓線維症、アルツハイマー病、及び骨関節炎から選択されるテロメア短縮疾患である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態はファンコーニ貧血、無巨核球性血小板減少症、再生不良性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化不全症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、ピアソン症候群、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、血小板減少症、及び骨髄異型性症候群から選択される骨髄機能不全症候群である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態はウェルナー症候群、ブルーム症候群、ハッチソン・ギルフォード早老症候群、コケイン症候群、色素性乾皮症、毛細管拡張性運動失調症、ロスモンド・トムソン症候群、硫黄欠乏性毛髪発育異常症、ジュバーグ・マルシジ症候群、及びダウン症から選択される加齢性テロメア短縮疾患又は障害、早期老化疾患又は障害、又はそれらの両方である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態は免疫不全、自己免疫疾患、自己免疫障害、慢性潰瘍、アテローム性硬化症、癌、神経損傷、変性障害、神経変性障害、創傷治癒、筋肉修復、心筋修復、軟骨置換、関節炎、骨関節炎、歯科再生、盲目症、網膜色素上皮細胞の増殖性の減退に起因する加齢性盲目症、難聴、骨髄機能不全、骨髄移植、糖尿病、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、遺伝病、遺伝子変異、及びＤＮＡ損傷から選択される１つ以上の疾患又は健康状態である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態は心臓の癌（例えば、血管肉腫、繊維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘液腫、横紋筋腫、繊維腫、脂肪腫及び奇形腫）；肺癌（例えば、気管支原性癌（鱗状細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞上皮（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫）；胃腸管癌（例えば、食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）；胃癌（上皮癌、リンパ腫、平滑筋肉腫）；膵臓癌（膵管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）；小腸癌（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経繊維腫、繊維腫）；大腸癌（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；泌尿生殖路癌（例えば、腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍、腎芽腫、リンパ腫、白血病）；膀胱癌及び尿道癌（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）；前立腺癌（腺癌、肉腫）；精巣癌（精上皮腫、奇形腫、胎生期癌、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、繊維腫、繊維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫）；肝臓癌（例えば、肝癌（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫）；骨癌（例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、繊維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液繊維腫、類骨骨腫及び巨細胞腫）；神経系癌（例えば、頭骨（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫、松果体腫、多形神経膠芽腫、希突起神経膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄（神経繊維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫））；婦人科癌（例えば、子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、腫瘍前子宮頸部異形成症）、卵巣（卵巣癌、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、類内膜性腫瘍、ブレナー腫瘍、明細胞癌、非分類癌、顆粒膜／莢膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、陰門（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、繊維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫、胎児型横紋筋肉腫、卵管（癌））；血液癌（例えば、血液（骨髄性白血病（急性及び慢性）、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異型性症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫））；皮膚癌（例えば、悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、黒子、異型性母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚繊維腫、ケロイド、乾癬）；及び副腎癌（例えば、神経芽細胞腫）から選択される癌である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態は甲状腺炎、グッドパスチャー病、リウマチ性関節炎、若年性少関節炎、コラーゲン誘発関節炎、アジュバント誘発関節炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性胃萎縮、尋常性天疱瘡、乾癬、尋常性白斑、１型糖尿病、非肥満糖尿病、重症筋無力症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性唾液腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性血小板減少性紫斑症、アジソン病、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、自己免疫性溶血性貧血、及び悪性貧血から選択される自己免疫疾患である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態は副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、アルコール中毒症、アレキサンダー病、アルパーズ病、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症、ルー・ゲーリッグ病、毛細管拡張性運動失調症、バッテン病、シュピールマイヤー・フォクト・シェーグレン・バッテン病、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、カナバン病、脳性麻痺、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病、脊髄小脳失調症３型、多系統委縮症、多発性硬化症、ナルコレプシー、ニーマンピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、亜急性連合性脊髄変性症併発性悪性貧血、シュピールマイヤー・フォクト・シェーグレン・バッテン病、バッテン病、脊髄小脳失調症、脊髄性筋委縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、及び中毒性脳症から選択される神経変性疾患である。
【００２６】
本開示の他の態様は、癌を治療する方法であって、治療を必要とする対象中の１つ以上の癌細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することによる方法であり、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上の癌細胞の増殖を抑制することで前記癌を治療する前記方法に関する。本開示の他の態様は、癌患者における化学療法に対する応答性を改善する方法であって、応答性の改善を必要とする対象に前記対象中の１つ以上の癌幹細胞における内在性ＺＳＣＡＮ４の発現を低下させる薬剤を投与することによる方法であり、内在性ＺＳＣＡＮ４の発現低下によって前記１つ以上の癌幹細胞における１つ以上の化学療法剤に対する抵抗性を低下させ、又は除去し、それによって前記対象において前記１つ以上の化学療法剤に対する応答性を改善する前記方法に関する。幾つかの実施形態では内在性ＺＳＣＡＮ４の発現を低下させる前記薬剤はＺＳＣＡＮ４に特異的なｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである。幾つかの実施形態では前記癌は心臓の癌（例えば、血管肉腫、繊維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘液腫、横紋筋腫、繊維腫、脂肪腫及び奇形腫）；肺癌（例えば、気管支原性癌（鱗状細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞上皮（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫）；胃腸管癌（例えば、食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）；胃癌（上皮癌、リンパ腫、平滑筋肉腫）；膵臓癌（膵管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）；小腸癌（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経繊維腫、繊維腫）；大腸癌（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；泌尿生殖路癌（例えば、腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍、腎芽腫、リンパ腫、白血病）；膀胱癌及び尿道癌（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）；前立腺癌（腺癌、肉腫）；精巣癌（精上皮腫、奇形腫、胎生期癌、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、繊維腫、繊維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫）；肝臓癌（例えば、肝癌（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫）；骨癌（例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、繊維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液繊維腫、類骨骨腫及び巨細胞腫）；神経系癌（例えば、頭骨（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫、松果体腫、多形神経膠芽腫、希突起神経膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄（神経繊維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫））；婦人科癌（例えば、子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、腫瘍前子宮頸部異形成症）、卵巣（卵巣癌、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、類内膜性腫瘍、ブレナー腫瘍、明細胞癌、非分類癌、顆粒膜／莢膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、陰門（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、繊維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫、胎児型横紋筋肉腫、卵管（癌））；血液癌（例えば、血液（骨髄性白血病（急性及び慢性）、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異型性症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫））；皮膚癌（例えば、悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、黒子、異型性母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚繊維腫、ケロイド、乾癬）；及び副腎癌（例えば、神経芽細胞腫）から選択される。
【００２７】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト細胞のゲノム安定性を向上させる方法であって、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてゲノム安定性が向上する前記方法に関する。
【００２８】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト細胞のＤＮＡ修復能を向上させる方法であって、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞におけるＤＮＡ修復能が向上する前記方法に関する。
【００２９】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト細胞を若返らせる方法であって、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞が若返る前記方法に関する。
【００３０】
本開示の他の態様は、皮膚を若返らせる方法、アトピー性皮膚炎を治療する方法、及び／又は皮膚損傷を治療する方法であって、それらを必要とする対象の皮膚にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を局所投与することによる前記方法に関する。
【００３１】
本開示の他の態様は、脱毛を治療する方法であって、治療を必要とする対象の頭皮にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を局所投与することによる前記方法に関する。
【００３２】
本開示の他の態様は、白髪化を防止する方法、白髪化を治療する方法、又は両方の方法であって、それらを必要とする対象の１つ以上の毛包にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによる前記方法に関する。
【００３３】
本開示の他の態様は、角膜を若返らせる方法であって、角膜の若返りを必要とする対象の角膜にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによる前記方法に関する。
【００３４】
本開示の他の態様は、ドライアイを治療する方法であって、治療を必要とする対象の角膜にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによる前記方法に関する。
【００３５】
本開示の他の態様は、特発性肺性線維症を治療する方法であって、治療を必要とする対象の肺にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによる前記方法に関する。
【００３６】
本開示の他の態様は、アテローム性硬化症、冠動脈疾患、又はそれらの両方を治療する方法であって、治療を必要とする対象の血流にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによる前記方法に関する。
【００３７】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト細胞において１種類以上の遺伝毒性物質に対する抵抗性を提供する方法であって、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において１種類以上の遺伝毒性物質に対する抵抗性が上昇する前記方法に関する。幾つかの実施形態では前記遺伝毒性物質はマイトマイシンＣ又はシスプラチンである。
【００３８】
前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記１つ以上のヒト細胞はヒト成体細胞である。幾つかの実施形態では前記１つ以上のヒト細胞は成体幹細胞、組織幹細胞、始原細胞、又は人工多能性幹細胞である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記１つ以上のヒト細胞は造血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、神経幹細胞、及び生殖幹細胞から選択される１つ以上の成体幹細胞、組織幹細胞、又は始原細胞である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記１つ以上のヒト細胞は体細胞、成熟細胞、又は分化細胞である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記１つ以上のヒト細胞は体細胞、成熟細胞、又は分化細胞である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記１つ以上のヒト細胞は表皮細胞、線維芽細胞、リンパ球、肝細胞、上皮細胞、筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、心筋細胞、膵臓β細胞、ケラチノサイト、赤血球、末梢血液細胞、神経細胞、星状細胞、生殖細胞、精細胞、及び卵母細胞から選択される１つ以上の体細胞、成熟細胞、又は分化細胞である。
【００３９】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞においてヒト胚性幹細胞様ＤＮＡメチル化パターンを誘導するための方法であって、前記１つ以上のヒトｉＰＳ細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒトｉＰＳ細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒトｉＰＳ細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒトｉＰＳ細胞においてヒト胚性幹細胞様ＤＮＡメチル化パターンが誘導される前記方法に関する。
【００４０】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト卵母細胞を若返らせる方法であって、前記１つ以上のヒト卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト卵母細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト卵母細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト卵母細胞が若返る前記方法に関する。
【００４１】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト卵母細胞のゲノム安定性を向上させる方法であって、前記１つ以上のヒト卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト卵母細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト卵母細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト卵母細胞におけるゲノム安定性が向上する前記方法に関する。本開示の他の態様は、１つ以上のヒト卵母細胞において１つ以上の核型異常を修正する方法であって、前記１つ以上のヒト卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト卵母細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト卵母細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト卵母細胞において前記１つ以上の核型異常の修正が誘導される前記方法に関する。幾つかの実施形態では前記１つ以上のヒト卵母細胞はＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる前記薬剤との接触前に対象から単離される。幾つかの実施形態では前記１つ以上のヒト卵母細胞はＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる前記薬剤との接触後に体外受精を受ける。
【００４２】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト受精卵母細胞のゲノム安定性を向上させるインビトロ方法であって、前記１つ以上のヒト受精卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト受精卵母細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト受精卵母細胞胚と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト受精卵母細胞においてゲノム安定性が向上する前記方法に関する。本開示の他の態様は、１つ以上のヒト受精卵母細胞における１つ以上の核型異常を修正するインビトロ方法であって、前記１つ以上のヒト受精卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト受精卵母細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト受精卵母細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト受精卵母細胞において前記１つ以上の核型異常の修正が誘導される前記方法に関する。幾つかの実施形態では前記１つ以上のヒト受精卵母細胞は体外受精によって受精した。幾つかの実施形態では前記１つ以上のヒト卵母細胞は受精させられる前に対象から単離された。幾つかの実施形態では前記１つ以上の受精卵母細胞は１細胞期と胚盤胞期の間の胚である。
【００４３】
本開示の他の態様は、テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、（ｉ）テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象よりヒト骨髄細胞を単離すること、（ｉｉ）前記ヒト骨髄細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記ヒト骨髄細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記ヒト骨髄細胞においてテロメア延長を誘導すること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みヒト骨髄細胞を前記対象に移植してテロメア異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療することによる前記方法に関する。
【００４４】
本開示の他の態様は、染色体異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、（ｉ）染色体異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象よりヒト骨髄細胞を単離すること、（ｉｉ）前記ヒト骨髄細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記ヒト骨髄細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記ヒト骨髄細胞において前記染色体異常の修正を誘導すること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みヒト骨髄細胞を前記対象に移植して染色体異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療することによる前記方法に関する。
【００４５】
前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態はテロメア短縮疾患、骨髄機能不全症候群、加齢性テロメア短縮疾患又は障害、及び早期老化疾患又は障害から選択される１つ以上の疾患又は健康状態である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態は先天性角化不全症、ホイエラール・レイダーソン症候群、レーヴェース症候群、コーツプラス症候群、特発性肺性線維症、肝硬変、膵臓線維症、アルツハイマー病、及び骨関節炎から選択されるテロメア短縮疾患である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態はファンコーニ貧血、無巨核球性血小板減少症、再生不良性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化不全症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、ピアソン症候群、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、血小板減少症、及び骨髄異型性症候群から選択される骨髄機能不全症候群である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態はウェルナー症候群、ブルーム症候群、ハッチソン・ギルフォード早老症候群、コケイン症候群、色素性乾皮症、毛細管拡張性運動失調症、ロスモンド・トムソン症候群、硫黄欠乏性毛髪発育異常症、ジュバーグ・マルシジ症候群、及びダウン症から選択される加齢性テロメア短縮疾患又は疾患、早期老化疾患又は疾患、又はそれらの両方である。
【００４６】
本開示の他の態様は、対象内の組織又は器官を若返らせる方法であって、組織又は器官の若返りを必要とする対象に前記組織又は器官においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによる方法であり、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記組織又は器官を若返らせる前記方法に関する。
【００４７】
本開示の他の態様は、若返りを必要とする対象を若返らせる方法であって、前記対象にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによる方法であり、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記対象を若返らせる前記方法に関する。
【００４８】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト細胞の寿命を延長する方法であって、前記対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞の寿命が延長される、前記方法に関する。
【００４９】
本開示の他の態様は、対象内の組織又は器官の寿命を延長する方法であって、組織又は器官の寿命の延長を必要とする対象に前記組織又は器官においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによる方法であり、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記組織又は器官の寿命を延長する前記方法に関する。
【００５０】
本開示の他の態様は、対象の寿命を延長する方法であって、寿命の延長を必要とする対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することによる方法であり、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞の寿命を延長し、それによって前記対象の寿命を延長する前記方法に関する。
【００５１】
本開示の他の態様は、対象の寿命を延長する方法であって、（ｉ）前記対象より１つ以上のヒト細胞を単離すること、（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞の寿命を延長すること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与して前記対象の寿命を延長することによる前記方法に関する。
【００５２】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト細胞において１つ以上のＺｓｃａｎ４誘導性作用を測定するための方法であって、（ｉ）１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させること、（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルを測定すること、及び（ｉｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルを前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルと比較し、前記１つ以上のヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルの上昇によって前記１つ以上のヒト細胞における１つ以上のＺｓｃａｎ４誘導性作用の存在を示すことによる前記方法に関する。
【００５３】
前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４の発現上昇は一時的なものである。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記薬剤はＺｓｃａｎ４発現を約１時間から約２３時間にわたって上昇させる。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記薬剤はＺｓｃａｎ４発現を約１日から約１０日にわたって上昇させる。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記薬剤は内在性Ｚｓｃａｎ４と直接的に相互作用してＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記薬剤はＺｓｃａｎ４をコードする単離核酸分子である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記単離核酸分子は合成ｍＲＮＡである。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記単離核酸分子はベクターを含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記ベクターはウイルスベクターである。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記ウイルスベクターはパラミクソウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクターである。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記ウイルスベクターはパラミクソウイルスベクターである。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記パラミクソウイルスベクターはセンダイウイルスベクターである。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記ベクターはプラスミドベクターである。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記ベクターはプロモーターに機能的に結合しているＺｓｃａｎ４をコードする。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記プロモーターは構成的プロモーターである。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記プロモーターは誘導性プロモーターである。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４はＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４はＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は少なくとも１つのジンクフィンガードメインの欠失を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４はマウスＺｓｃａｎ４、ヒトＺＳＣＡＮ４、又はそれらのホモログである。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４はＺｓｃａｎ４ａ、Ｚｓｃａｎ４ｂ、Ｚｓｃａｎ４ｃ、Ｚｓｃａｎ４ｄ、Ｚｓｃａｎ４ｅ、及びＺｓｃａｎ４ｆから選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記単離核酸分子は配列番号１〜１０及び２１〜３０から選択されるヌクレオチド配列に��して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４はヒトＺＳＣＡＮ４である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記単離核酸分子は配列番号７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記薬剤はＺｓｃａｎ４タンパク質である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質は細胞透過性ペプチドに融合されている。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記細胞透過性ペプチドはタンパク質導入ドメインを含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記細胞透過性ペプチドはポリアルギニンペプチドタグを含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質はナノ粒子内に封入される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質はマウスＺｓｃａｎ４タンパク質、ヒトＺＳＣＡＮ４タンパク質、又はそれらのホモログである。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質はＺｓｃａｎ４ａタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｂタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｃタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｄタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｅタンパク質、及びＺｓｃａｎ４ｆタンパク質から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質は配列番号１１〜２０及び３１〜４０から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質はヒトＺＳＣＡＮ４タンパク質である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質は配列��号１７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質はＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質はＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質はマウスＺｓｃａｎ４タンパク質、ヒトＺＳＣＡＮ４タンパク質、又はそれらのホモログを含み、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質は少なくとも１つのジンクフィンガードメインの欠失を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質はＺｓｃａｎ４ａタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｂタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｃタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｄタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｅタンパク質、及びＺｓｃａｎ４ｆタンパク質から選択されるＺｓｃａｎ４タンパク質を含み、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質は少なくとも１つのジンクフィンガードメインの欠失を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質はヒトＺＳＣＡＮ４タンパク質を含み、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質は少なくとも１つのジンクフィンガードメインの欠失を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記薬剤はレチノイド、酸化ストレスを誘発する薬剤、又はそれらの両方である。
【００５４】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト細胞においてテロメア長を増加させる方法であって、前記ヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長が誘導される前記方法に関する。
【００５５】
本開示の他の態様は、テロメア延長を必要とする対象を処置する方法であって、前記対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長を誘導する前記方法に関する。
【００５６】
本開示の他の態様は、テロメア延長を必要とする対象を処置する方法であって、（ｉ）前記対象よりテロメア延長を必要とする１つ以上のヒト細胞を単離すること、（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤であって、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長を誘導する前記薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与することによる前記方法に関する。
【００５７】
本開示の他の態様は、テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、治療を必要とする対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長を誘導してテロメア異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療する前記方法に関する。
【００５８】
本開示の他の態様は、テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、（ｉ）テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象より１つ以上のヒト細胞を単離すること、（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤であって、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長を誘導する前記薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与してテロメア異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療することによる前記方法に関する。
【００５９】
本開示の他の態様は、染色体異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、治療を必要とする対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において前記染色体異常の修正を誘導して染色体異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療する前記方法に関する。
【００６０】
本開示の他の態様は、染色体異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、（ｉ）染色体異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象より１つ以上のヒト細胞を単離すること、（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤であって、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において前記染色体異常の修正を誘導する前記薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与して染色体異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療することによる前記方法に関する。
【００６１】
本開示の他の態様は、核型異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、治療を必要とする対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において前記核型異常の修正を誘導して核型異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療する前記方法に関する。
【００６２】
本開示の他の態様は、核型異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、（ｉ）核型異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象より１つ以上のヒト細胞を単離すること、（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤であって、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞における前記核型異常の修正を誘導する前記薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与して核型異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療することによる前記方法に関する。
【００６３】
前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記核型異常は染色体ヌリソミー、染色体モノソミー、染色体トリソミー、染色体テトラソミー、及び染色体ペンタソミーから選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記核型異常は２１番染色体トリソミー、１６番染色体トリソミー、１８番染色体トリソミー、１３番染色体トリソミー、Ｘ染色体モノソミー、ＸＸＸ異数性、ＸＸＹ異数性、ＸＹＹ異数性、及び１ｐ３６領域重複から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、核型異常に関連する前記疾患又は健康状態は１７番染色体（ｐ１１．２ｐ１１．２）領域重複症候群、ペリツェウス・メルツバッハー病、２２番染色体（ｑ１１．２ｑ１１．２）領域重複症候群、ネコ眼症候群、ネコなき症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン、ウィリアムス・ボイレン症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、遺伝性圧脆弱性ニューロパチー、スミス・マゲニス症候群、神経線維腫症、アラジール症候群、口蓋心臓顔面症候群、ディジョージ症候群、ステロイドスルファターゼ欠損、カルマン症候群、線型皮膚欠陥症の小眼症、副腎低形成、グリセロールキナーゼ欠損、ペリツェウス・メルツバッハー病、Ｙ染色体上の精巣決定因子、無精子症（ａ因子）、無精子症（ｂ因子）、無精子症（ｃ因子）、及び１ｐ３６領域欠失から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態はテロメア短縮疾患、骨髄機能不全症候群、加齢性テロメア短縮疾患又は障害、及び早期老化疾患又は障害から選択される１つ以上の疾患又は健康状態である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態は先天性角化不全症、ホイエラール・レイダーソン症候群、レーヴェース症候群、コーツプラス症候群、特発性肺性線維症、肝硬変、膵臓線維症、アルツハイマー病、及び骨関節炎から選択されるテロメア短縮疾患である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態はファンコーニ貧血、無巨核球性血小板減少症、再生不良性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化不全症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、ピアソン症候群、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、血小板減少症、及び骨髄異型性症候群から選択される骨髄機能不全症候群である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態はウェルナー症候群、ブルーム症候群、ハッチソン・ギルフォード早老症候群、コケイン症候群、色素性乾皮症、毛細管拡張性運動失調症、ロスモンド・トムソン症候群、硫黄欠乏性毛髪発育異常症、ジュバーグ・マルシジ症候群、及びダウン症から選択される加齢性テロメア短縮疾患又は障害、早期老化疾患又は障害、又はそれらの両方である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態は免疫不全、自己免疫疾患、自己免疫障害、慢性潰瘍、アテローム性硬化症、癌、神経損傷、変性障害、神経変性障害、創傷治癒、筋肉修復、心筋修復、軟骨置換、関節炎、骨関節炎、歯科再生、盲目症、網膜色素上皮細胞の増殖性の減退に起因する加齢性盲目症、難聴、骨髄機能不全、骨髄移植、糖尿病、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、遺伝病、遺伝子変異、及びＤＮＡ損傷から選択される１つ以上の疾患又は健康状態である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態は心臓の癌（例えば、血管肉腫、繊維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘液腫、横紋筋腫、繊維腫、脂肪腫及び奇形腫）；肺癌（例えば、気管支原性癌（鱗状細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞上皮（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫）；胃腸管癌（例えば、食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）；胃癌（上皮癌、リンパ腫、平滑筋肉腫）；膵臓癌（膵管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）；小腸癌（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経繊維腫、繊維腫）；大腸癌（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；泌尿生殖路癌（例えば、腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍、腎芽腫、リンパ腫、白血病）；膀胱癌及び尿道癌（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）；前立腺癌（腺癌、肉腫）；精巣癌（精上皮腫、奇形腫、胎生期癌、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、繊維腫、繊維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫）；肝臓癌（例えば、肝癌（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫）；骨癌（例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、繊維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液繊維腫、類骨骨腫及び巨細胞腫）；神経系癌（例えば、頭骨（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫、松果体腫、多形神経膠芽腫、希突起神経膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄（神経繊維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫））；婦人科癌（例えば、子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、腫瘍前子宮頸部異形成症）、卵巣（卵巣癌、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、類内膜性腫瘍、ブレナー腫瘍、明細胞癌、非分類癌、顆粒膜／莢膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、陰門（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、繊維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫、胎児型横紋筋肉腫、卵管（癌））；血液癌（例えば、血液（骨髄性白血病（急性及び慢性）、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異型性症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫））；皮膚癌（例えば、悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、黒子、異型性母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚繊維腫、ケロイド、乾癬）；及び副腎癌（例えば、神経芽細胞腫）から選択される癌である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態は甲状腺炎、グッドパスチャー病、リウマチ性関節炎、若年性少関節炎、コラーゲン誘発関節炎、アジュバント誘発関節炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性胃萎縮、尋常性天疱瘡、乾癬、尋常性白斑、１型糖尿病、非肥満糖尿病、重症筋無力症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性唾液腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性血小板減少性紫斑症、アジソン病、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、自己免疫性溶血性貧血、及び悪性貧血から選択される自己免疫疾患である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態は副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、アルコール中毒症、アレキサンダー病、アルパーズ病、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症、ルー・ゲーリッグ病、毛細管拡張性運動失調症、バッテン病、シュピールマイヤー・フォクト・シェーグレン・バッテン病、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、カナバン病、脳性麻痺、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病、脊髄小脳失調症３型、多系統委縮症、多発性硬化症、ナルコレプシー、ニーマンピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、亜急性連合性脊髄変性症併発性悪性貧血、シュピールマイヤー・フォクト・シェーグレン・バッテン病、バッテン病、脊髄小脳失調症、脊髄性筋委縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、及び中毒性脳症から選択される神経変性疾患である。
【００６４】
本開示の他の態様は、癌を治療する方法であって、治療を必要とする対象中の１つ以上の癌細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上の癌細胞の増殖を抑制することで前記癌を治療する前記方法に関する。本開示の他の態様は、癌患者における化学療法に対する応答性を改善する方法であって、応答性の改善を必要とする対象に前記対象中の１つ以上の癌幹細胞における内在性ＺＳＣＡＮ４の発現を低下させる薬剤を投与することによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、内在性ＺＳＣＡＮ４の発現低下によって前記１つ以上の癌幹細胞における１つ以上の化学療法剤に対する抵抗性を低下させ、又は除去し、それによって前記対象において前記１つ以上の化学療法剤に対する応答性を改善する前記方法に関する。幾つかの実施形態では内在性ＺＳＣＡＮ４の発現を低下させる前記薬剤はＺＳＣＡＮ４に特異的なｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである。幾つかの実施形態では前記癌は心臓の癌（例えば、血管肉腫、繊維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘液腫、横紋筋腫、繊維腫、脂肪腫及び奇形腫）；肺癌（例えば、気管支原性癌（鱗状細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞上皮（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫）；胃腸管癌（例えば、食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）；胃癌（上皮癌、リンパ腫、平滑筋肉腫）；膵臓癌（膵管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）；小腸癌（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経繊維腫、繊維腫）；大腸癌（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；泌尿生殖路癌（例えば、腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍、腎芽腫、リンパ腫、白血病）；膀胱癌及び尿道癌（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）；前立腺癌（腺癌、肉腫）；精巣癌（精上皮腫、奇形腫、胎生期癌、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、繊維腫、繊維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫）；肝臓癌（例えば、肝癌（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫）；骨癌（例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、繊維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液繊維腫、類骨骨腫及び巨細胞腫）；神経系癌（例えば、頭骨（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫、松果体腫、多形神経膠芽腫、希突起神経膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄（神経繊維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫））；婦人科癌（例えば、子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、腫瘍前子宮頸部異形成症）、卵巣（卵巣癌、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、類内膜性腫瘍、ブレナー腫瘍、明細胞癌、非分類癌、顆粒膜／莢膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、陰門（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、繊維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫、胎児型横紋筋肉腫、卵管（癌））；血液癌（例えば、血液（骨髄性白血病（急性及び慢性）、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異型性症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫））；皮膚癌（例えば、悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、黒子、異型性母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚繊維腫、ケロイド、乾癬）；及び副腎癌（例えば、神経芽細胞腫）から選択される。
【００６５】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト細胞のゲノム安定性を向上させる方法であって、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてゲノム安定性が向上する前記方法に関する。
【００６６】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト細胞のＤＮＡ修復能を向上させる方法であって、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞におけるＤＮＡ修復能が向上する前記方法に関する。
【００６７】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト細胞を若返らせる方法であって、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞が若返る前記方法に関する。
【００６８】
本開示の他の態様は、皮膚を若返らせる方法、アトピー性皮膚炎を治療する方法、及び／又は皮膚損傷を治療する方法であって、それらを必要とする対象の皮膚にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を局所投与することによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターである前記方法に関する。
【００６９】
本開示の他の態様は、脱毛を治療する方法であって、治療を必要とする対象の頭皮にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を局所投与することによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターである前記方法に関する。
【００７０】
本開示の他の態様は、白髪化を防止する方法、白髪化を治療する方法、又は両方の方法であって、それらを必要とする対象の１つ以上の毛包にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターである前記方法に関する。
【００７１】
本開示の他の態様は、角膜を若返らせる方法であって、角膜の若返りを必要とする対象の角膜にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターである前記方法に関する。
【００７２】
本開示の他の態様は、ドライアイを治療する方法であって、治療を必要とする対象の角膜にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターである前記方法に関する。
【００７３】
本開示の他の態様は、特発性肺性線維症を治療する方法であって、治療を必要とする対象の肺にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターである前記方法に関する。
【００７４】
本開示の他の態様は、アテローム性硬化症、冠動脈疾患、又はそれらの両方を治療する方法であって、治療を必要とする対象の血流にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターである前記方法に関する。
【００７５】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト細胞において１種類以上の遺伝毒性物質に対する抵抗性を提供する方法であって、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において１種類以上の遺伝毒性物質に対する抵抗性が上昇する前記方法に関する。幾つかの実施形態では前記遺伝毒性物質はマイトマイシンＣ又はシスプラチンである。
【００７６】
前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記１つ以上のヒト細胞はヒト成体細胞である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記１つ以上のヒト細胞は成体幹細胞、組織幹細胞、始原細胞、又は人工多能性幹細胞である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記１つ以上のヒト細胞は造血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、神経幹細胞、及び生殖幹細胞から選択される１つ以上の成体幹細胞、組織幹細胞、又は始原細胞である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記１つ以上のヒト細胞は体細胞、成熟細胞、又は分化細胞である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記１つ以上のヒト細胞は体細胞、成熟細胞、又は分化細胞である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記１つ以上のヒト細胞は表皮細胞、線維芽細胞、リンパ球、肝細胞、上皮細胞、筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、心筋細胞、膵臓β細胞、ケラチノサイト、赤血球、末梢血液細胞、神経細胞、星状細胞、生殖細胞、精細胞、及び卵母細胞から選択される１つ以上の体細胞、成熟細胞、又は分化細胞である。
【００７７】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞においてヒト胚性幹細胞様ＤＮＡメチル化パターンを誘導するための方法であって、前記１つ以上のヒトｉＰＳ細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒトｉＰＳ細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒトｉＰＳ細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒトｉＰＳ細胞においてヒト胚性幹細胞様ＤＮＡメチル化パターンが誘導される前記方法に関する。
【００７８】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト卵母細胞を若返らせる方法であって、前記１つ以上のヒト卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト卵母細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト卵母細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト卵母細胞が若返る前記方法に関する。
【００７９】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト卵母細胞のゲノム安定性を向上させる方法であって、前記１つ以上のヒト卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト卵母細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト卵母細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト卵母細胞におけるゲノム安定性が向上する前記方法に関する。本開示の他の態様は、１つ以上のヒト卵母細胞において１つ以上の核型異常を修正する方法であって、前記１つ以上のヒト卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト卵母細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト卵母細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト卵母細胞において前記１つ以上の核型異常の修正が誘導される前記方法に関する。幾つかの実施形態では前記１つ以上のヒト卵母細胞はＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる前記薬剤との接触前に対象から単離される。幾つかの実施形態では前記１つ以上のヒト卵母細胞はＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる前記薬剤との接触後に体外受精を受ける。
【００８０】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト受精卵母細胞のゲノム安定性を向上させるインビトロ方法であって、前記１つ以上のヒト受精卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト受精卵母細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト受精卵母細胞胚と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト受精卵母細胞においてゲノム安定性が向上する前記方法に関する。本開示の他の態様は、１つ以上のヒト受精卵母細胞における１つ以上の核型異常を修正するインビトロ方法であって、前記１つ以上のヒト受精卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト受精卵母細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト受精卵母細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト受精卵母細胞において前記１つ以上の核型異常の修正が誘導される前記方法に関する。幾つかの実施形態では前記１つ以上のヒト受精卵母細胞は体外受精によって受精した。幾つかの実施形態では前記１つ以上のヒト卵母細胞は受精させられる前に対象から単離された。幾つかの実施形態では前記１つ以上の受精卵母細胞は１細胞期と胚盤胞期の間の胚である。
【００８１】
本開示の他の態様は、テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、（ｉ）テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象よりヒト骨髄細胞を単離すること、（ｉｉ）前記ヒト骨髄細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤であって、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記ヒト骨髄細胞においてテロメア延長を誘導する前記薬剤と前記ヒト骨髄細胞を接触させること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みヒト骨髄細胞を前記対象に移植してテロメア異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療することによる前記方法に関する。
【００８２】
本開示の他の態様は、染色体異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、（ｉ）染色体異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象よりヒト骨髄細胞を単離すること、（ｉｉ）前記ヒト骨髄細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤であって、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記ヒト骨髄細胞において前記染色体異常の修正を誘導する前記薬剤と前記ヒト骨髄細胞を接触させること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みヒト骨髄細胞を前記対象に移植して染色体異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療することによる前記方法に関する。
【００８３】
前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態はテロメア短縮疾患、骨髄機能不全症候群、加齢性テロメア短縮疾患又は障害、及び早期老化疾患又は障害から選択される１つ以上の疾患又は健康状態である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態は先天性角化不全症、ホイエラール・レイダーソン症候群、レーヴェース症候群、コーツプラス症候群、特発性肺性線維症、肝硬変、膵臓線維症、アルツハイマー病、及び骨関節炎から選択されるテロメア短縮疾患である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態はファンコーニ貧血、無巨核球性血小板減少症、再生不良性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化不全症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、ピアソン症候群、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、血小板減少症、及び骨髄異型性症候群から選択される骨髄機能不全症候群である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記疾患又は健康状態はウェルナー症候群、ブルーム症候群、ハッチソン・ギルフォード早老症候群、コケイン症候群、色素性乾皮症、毛細管拡張性運動失調症、ロスモンド・トムソン症候群、硫黄欠乏性毛髪発育異常症、ジュバーグ・マルシジ症候群、及びダウン症から選択される加齢性テロメア短縮疾患又は疾患、早期老化疾患又は疾患、又はそれらの両方である。
【００８４】
本開示の他の態様は、対象内の組織又は器官を若返らせる方法であって、組織又は器官の若返りを必要とする対象に前記組織又は器官においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記組織又は器官を若返らせる前記方法に関する。
【００８５】
本開示の他の態様は、若返りを必要とする対象を若返らせる方法であって、前記対象にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記対象を若返らせる前記方法に関する。
【００８６】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト細胞の寿命を延長する方法であって、前記対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞の寿命が延長される、前記方法に関する。
【００８７】
本開示の他の態様は、対象内の組織又は器官の寿命を延長する方法であって、組織又は器官の寿命の延長を必要とする対象に前記組織又は器官においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記組織又は器官の寿命を延長する前記方法に関する。
【００８８】
本開示の他の態様は、対象の寿命を延長する方法であって、寿命の延長を必要とする対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することによる方法であり、前記薬剤がＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞の寿命を延長し、それによって前記対象の寿命を延長する前記方法に関する。
【００８９】
本開示の他の態様は、対象の寿命を延長する方法であって、（ｉ）前記対象より１つ以上のヒト細胞を単離すること、（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤であって、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターであり、且つ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞の寿命を延長する前記薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与して前記対象の寿命を延長することによる前記方法に関する。
【００９０】
本開示の他の態様は、１つ以上のヒト細胞において１つ以上のＺｓｃａｎ４誘導性作用を測定するための方法であって、（ｉ）１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤であって、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ分子、又はＺｓｃａｎ４をコードするウイルスベクター、好ましくはセンダイウイルスベクターである前記薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させること、（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルを測定すること、及び（ｉｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルを前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルと比較し、前記１つ以上のヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルの上昇によって前記１つ以上のヒト細胞における１つ以上のＺｓｃａｎ４誘導性作用の存在を示すことによる前記方法に関する。
【００９１】
前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４の発現上昇は一時的なものである。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記薬剤はＺｓｃａｎ４発現を約１時間から約２３時間にわたって上昇させる。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記薬剤はＺｓｃａｎ４発現を約１日から約１０日にわたって上昇させる。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記薬剤は内在性Ｚｓｃａｎ４と直接的に相互作用してＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記ベクターはプロモーターに機能的に結合しているＺｓｃａｎ４をコードする。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記プロモーターは構成的プロモーターである。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記プロモーターは誘導性プロモーターである。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４はＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４はＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は少なくとも１つのジンクフィンガードメインの欠失を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４はマウスＺｓｃａｎ４、ヒトＺＳＣＡＮ４、又はそれらのホモログである。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４はＺｓｃａｎ４ａ、Ｚｓｃａｎ４ｂ、Ｚｓｃａｎ４ｃ、Ｚｓｃａｎ４ｄ、Ｚｓｃａｎ４ｅ、及びＺｓｃａｎ４ｆから選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記単離核酸分子は配列番号１〜１０及び２１〜３０から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４はヒトＺＳＣＡＮ４である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記単離核酸分子は配列番号７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。前述の実施形態��いずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記薬剤はＺｓｃａｎ４タンパク質である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質は細胞透過性ペプチドに融合されている。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記細胞透過性ペプチドはタンパク質導入ドメインを含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記細胞透過性ペプチドはポリアルギニンペプチドタグを含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質はナノ粒子内に封入される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質はマウスＺｓｃａｎ４タンパク質、ヒトＺＳＣＡＮ４タンパク質、又はそれらのホモログである。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質はＺｓｃａｎ４ａタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｂタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｃタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｄタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｅタンパク質、及びＺｓｃａｎ４ｆタンパク質から選択される。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質は配列番号１１〜２０及び３１〜４０から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質はヒトＺＳＣＡＮ４タンパク質である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質は配列番号１７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質はＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質はＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質である。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質はマウスＺｓｃａｎ４タンパク質、ヒトＺＳＣＡＮ４タンパク質、又はそれらのホモログを含み、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質は少なくとも１つのジンクフィンガードメインの欠失を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形���では、前記Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質はＺｓｃａｎ４ａタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｂタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｃタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｄタンパク質、Ｚｓｃａｎ４ｅタンパク質、及びＺｓｃａｎ４ｆタンパク質から選択されるＺｓｃａｎ４タンパク質を含み、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質は少なくとも１つのジンクフィンガードメインの欠失を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質はヒトＺＳＣＡＮ４タンパク質を含み、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質は少なくとも１つのジンクフィンガードメインの欠失を含む。前述の実施形態のいずれかと組み合わせてよい幾つかの実施形態では、前記薬剤はレチノイド、酸化ストレスを誘発する薬剤、又はそれらの両方である。
【００９２】
本開示の前述及び他の課題及び特徴は、添付図面に関連して続く次の詳細な説明からさらに明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、ｈＺＳＣＡＮ４−ｍＲＮＡで形質移入されたマウスＥＳ細胞における染色体異常の修正を示す図である。図１Ａは、実験手順を示している。図１Ｂは、ｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡで形質移入された正倍数体マウスＥＳ細胞のパーセントを示している。
【図２】図２は、ｍＺｓｃａｎ４又はｈＺＳＣＡＮ４を発現するセンダイウイルスベクターを感染させたマウスＥＳ細胞における染色体異常の修正を示す図である。図２Ａは、ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４又はＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４を感染させた正倍数体マウスＥＳ細胞のパーセントを示している。図２Ｂは、ＳｅＶｍＺＥＲＴ２又はＳｅＶｈＺＥＲＴ２を感染させた正倍数体マウスＥＳ細胞のパーセントを示している。
【図３】図３は、ｍＺｓｃａｎ４又はｈＺＳＣＡＮ４を発現する温度感受性センダイウイルスベクターを感染させたマウスＥＳ細胞における染色体異常の修正を示す図である。図３Ａは、ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４−ＴＳ１５又はＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５を感染させ、続いて３５℃で３日間培養された正倍数体マウスＥＳ細胞のパーセントを示している。図３Ｂは、ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４−ＴＳ１５又はＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５を感染させ、続いて３５℃で６日間培養された正倍数体マウスＥＳ細胞のパーセントを示している。図３Ｃは、ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４−ＴＳ１５又はＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５を感染させ、続いて３５℃で３日間培養され、その後に３７℃で３日間培養された正倍数体マウスＥＳ細胞のパーセントを示している。
【図４】図４は、マウスＥＳ細胞に対するＺｓｃａｎ４生物製剤の効果を示す図である。図４Ａは、ｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡを用いるマウスＥＳ細胞の形質移入の効果を示している。図４Ｂは、Ｚｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターによるマウスＥＳ細胞の感染の効果を示している。図４Ｃは、ｍＺｓｃａｎ４又はｈＺＳＣＡＮ４を発現する温度感受性センダイウイルスベクターによるマウスＥＳ細胞の感染の効果を示している。
【図５】図５は、ヒトｉＰＳ細胞に対するＺｓｃａｎ４生物製剤の効果を示す図である。図５Ａは、Ｚｓｃａｎ４  ｍＲＮＡを用いるヒトｉＰＳ細胞の形質移入の効果を示している。図５Ｂは、Ｚｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターによるヒトｉＰＳ細胞の感染の効果を示している。図５Ｃは、ｍＺｓｃａｎ４又はｈＺＳＣＡＮ４を発現する温度感受性センダイウイルスベクターによるヒトｉＰＳ細胞の感染の効果を示している。
【図６】図６は、ｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡ又はＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入されたＤＫＣ患者由来ヒト線維芽細胞の増殖アッセイの結果を示す図である。
【図７】図７Ａは、ＳｅＶｈＺＳｃａｎ４を感染させたＤＫＣ患者由来ヒト線維芽細胞の増殖アッセイの結果を示す図である。図７Ｂは、ＳｅＶｈＺＳｃａｎ４を感染させたＤＫＣ患者由来ヒト線維芽細胞の細胞形態を表す顕微鏡写真を示す図である。
【図８】図８Ａは、実験手順を示す図である。図８Ｂは、ｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡ又はＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入されたＤＫＣ患者由来ヒト線維芽細胞のテロメア長アッセイの結果を示す図である。
【図９】図９は、ｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡ又はＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入されたウェルナー症候群（ＷＳ）患者の線維芽細胞の増殖アッセイの結果を示す図である。
【図１０】図１０は、Ｚｓｃａｎ４を使用する例となる治療スキームを示す図である。
【図１１】図１１は、ヒトＺＳＣＡＮ４の過剰発現が正常なヒト成体線維芽細胞においてテロメア長を増加させることを表す棒グラフを示す図である。「Ｎ」は複製実験の回数を表す。
【図１２】図１２は、ヒトＺＳＣＡＮ４の過剰発現がファンコーニ貧血相補群Ａを有する患者より単離されたヒト線維芽細胞においてテロメア長を増加させることを表す棒グラフを示す図である。「Ｎ」は複製実験の回数を表す。
【図１３】図１３は、ｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡ、ｍＺｓｃａｎ４  ｍＲＮＡ、又はＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入されたヒト成体皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）の増殖アッセイの結果を示す図である。図１３Ａは、ｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡ又はＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入され、およそ５０日間培養されたＨＤＦａ細胞の増殖アッセイの結果を示している。図１３Ｂは、ｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡ又はＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入され、およそ３０日間培養されたＨＤＦａ細胞の増殖アッセイの結果を示している。図１３Ｃは、ｍＺｓｃａｎ４  ｍＲＮＡ、ｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡ、又はＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入され、およそ２０日間培養されたＨＤＦａ細胞の増殖アッセイの結果を示している。
【図１４】図１４は、マウスＺｓｃａｎ４又はヒトＺＳＣＡＮ４を発現する温度感受性センダイウイルスベクターを感染させたヒト間葉系幹（ＭＳ）細胞におけるテロメア長の延長の結果を示す図である。
【図１５】図１５は、分化細胞と組織幹細胞に対するＺｓｃａｎ４生物製剤の効果を示す図である。
【図１６】図１６は、ｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡで形質移入されたダウン症患者の線維芽細胞（ＤＳ細胞）に由来する２１番染色体の倍数性の数を示す図である。図１６Ａは、ＦＩＳＨ分析の典型的な結果を示している。３つのドットは２１番染色体トリソミーを示しており、２つのドットは正常な二倍体の２１番染色体を示している。図１６Ｂは、ｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡで１回形質移入されたＤＳ細胞を示している。図１６Ｃは、ｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡで２回形質移入されたＤＳ細胞を示している。図において「ｎ」は調査した細胞核の数を表している。
【図１７】図１７Ａは、実験手順を示す図である。図１７Ｂは、ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５を１回感染させ、続いてＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４を２回感染させたダウン症患者の線維芽細胞（ＤＳ細胞）に由来する２１番染色体の倍数性を示す図である。図１７Ｃは、ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５を１回感染させ、続いてＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４を４回感染させたダウン症患者の線維芽細胞（ＤＳ細胞）に由来する２１番染色体の倍数性を示す図である。
【図１８】図１８は、マウスＺｓｃａｎ４又はヒトＺＳＣＡＮ４を使用する若返りのための、及び／又はヒト卵母細胞、ヒト受精卵母細胞、及びヒト着床前胚における染色体異常の修正のための例となる治療スキームを示す図である。
【図１９】図１９は、ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４−ＴＳ１５又はＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５のどちらかを感染させたＨＣＴ１１６癌細胞の細胞増殖の抑制を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
詳細な説明
概観
上で考察されたように、マウス胚性幹細胞におけるマウスＺｓｃａｎ４の発現がテロメア伸長と関連することがこれまでに示されている。マウスゲノムが６種類のＺｓｃａｎ４遺伝子と３種類のＺｓｃａｎ４偽遺伝子を含み、一方でヒトゲノムが１種類のＺｓｃａｎ４遺伝子を含むだけであることを考慮すると、当業者はマウス細胞におけるＺｓｃａｎ４発現の結果からヒト細胞における結果を推定することはできなかっただろう。しかしながら、下の実施例８において開示されるように、申請者は完全に分化したヒト成体線維芽細胞におけるヒトＺＳＣＡＮ４の発現によってそれらの線維芽細胞においてテロメア長が約４０％増加することを初めて示した。また、申請者はファンコーニ貧血を有する患者より単離されたヒト線維芽細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現によってそれらの線維芽細胞においてテロメア長が約１６０％増加することを示した。Ｚｓｃａｎ４発現はファンコーニ貧血を有する患者より単離されたヒト線維芽細胞においてテロメア長を増加させるのにそれだけで充分であることが示されたので、これらの結果は驚くべきことにＺｓｃａｎ４はテロメア伸長の下流作用因子というよりもむしろ上流エフェクターであることを示している。したがって、細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現活性化又は発現上昇はファンコーニ貧血又は他のあらゆるテロメア短縮に関連する疾患又は健康状態の有効な治療法であり得る。さらに、下の実施例１５において開示されるように、申請者はＺｓｃａｎ４発現がゲノム安定性を単に促進するだけではないことも初めて示した。２１番染色体トリソミーを有するヒト線維芽細胞集団におけるＺｓｃａｎ４発現によってそれらの細胞のおよそ５５％において２１番染色体トリソミー異常の修正が誘導される。よって、Ｚｓｃａｎ４の発現活性化又は発現上昇を用いて細胞内の異数性を治療することができ、並びに、若返りによって、及び／又は卵母細胞及び受精卵母細胞における染色体異常、例えば、異数性の修正によって高齢の女性において体外受精（ＩＶＦ）の成功率を上昇させることができ、妊娠の成功を増加させることができる。
【００９５】
以上より、本開示の方法は概してテロメア長を増加させるため、及び／又はゲノム安定性を向上させるためにヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現（例えば、Ｚｓｃａｎ４タンパク質発現）を上昇させることに関する。本開示の様々な態様は１つ以上のヒト細胞におけるテロメア長の増加、テロメア延長を必要とする対象の処置、テロメア異常に関連する疾患又は健康状態の治療、染色体異常に関連する疾患又は健康状態の治療、１つ以上のヒト細胞のゲノム安定性の向上、１つ以上のヒト細胞の若返り、対象内の組織又は器官の若返り、及び若返りを必要とする対象の若返りに関する。
【００９６】
１つの態様では本開示は、１つ以上のヒト細胞においてテロメア長を増加させる方法であって、前記ヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることを含み、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長が誘導される前記方法に関する。
【００９７】
別の態様では本開示は、テロメア延長を必要とする対象を処置する方法であって、前記対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることを含み、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長を誘導する前記方法に関する。
【００９８】
別の態様では本開示は、テロメア延長を必要とする対象を処置する方法であって、（ｉ）前記対象よりテロメア延長を必要とする１つ以上のヒト細胞を単離すること、（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長を誘導すること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与することを含む前記方法に関する。
【００９９】
別の態様では本開示は、テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、治療を必要とする対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することを含み、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長を誘導してテロメア異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療する前記方法に関する。
【０１００】
別の態様では本開示は、テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、（ｉ）テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象より１つ以上のヒト細胞を単離すること、（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長を誘導すること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与してテロメア異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療することを含む前記方法に関する。
【０１０１】
別の態様では本開示は、染色体異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、治療を必要とする対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することによる方法であり、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において前記染色体異常の修正を誘導して染色体異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療する前記方法に関する。
【０１０２】
別の態様では本開示は、染色体異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、（ｉ）染色体異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象より１つ以上のヒト細胞を単離すること、（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において前記染色体異常の修正を誘導すること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与して染色体異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療することによる前記方法に関する。
【０１０３】
別の態様では本開示は、核型異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、治療を必要とする対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することによる方法であり、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において前記核型異常の修正を誘導して核型異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療する前記方法に関する。
【０１０４】
別の態様では本開示は、核型異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、（ｉ）核型異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象より１つ以上のヒト細胞を単離すること、（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において前記核型異常の修正を誘導すること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与して核型異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療することによる前記方法に関する。
【０１０５】
別の態様では本開示は、癌を治療する方法であって、治療を必要とする対象中の１つ以上の癌細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することによる方法であり、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上の癌細胞の増殖を抑制することで前記癌を治療する前記方法に関する。
【０１０６】
別の態様では本開示は、癌患者における化学療法に対する応答性を改善する方法であって、応答性の改善を必要とする対象に前記対象中の１つ以上の癌幹細胞における内在性ＺＳＣＡＮ４の発現を低下させる薬剤を投与することによる方法であり、内在性ＺＳＣＡＮ４の発現低下によって前記１つ以上の癌幹細胞における１つ以上の化学療法剤に対する抵抗性を低下させ、又は除去し、それによって前記対象において前記１つ以上の化学療法剤に対する応答性を改善する前記方法に関する。
【０１０７】
別の態様では本開示は、１つ以上のヒト細胞のゲノム安定性を向上させる方法であって、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることを含み、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてゲノム安定性が向上する前記方法に関する。
【０１０８】
別の態様では本開示は、１つ以上のヒト細胞のＤＮＡ修復能を向上させる方法であって、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞におけるＤＮＡ修復能が向上する前記方法に関する。
【０１０９】
別の態様では本開示は、１つ以上のヒト細胞を若返らせる方法であって、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることを含み、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞が若返る前記方法に関する。
【０１１０】
別の態様では本開示は、１つ以上のヒト細胞において１種類以上の遺伝毒性物質に対する抵抗性を提供する方法であって、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞において１種類以上の遺伝毒性物質に対する抵抗性が上昇する前記方法に関する。
【０１１１】
別の態様では本開示は、１つ以上のヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞においてヒト胚性幹細胞様ＤＮＡメチル化パターンを誘導するための方法であって、前記１つ以上のヒトｉＰＳ細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒトｉＰＳ細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒトｉＰＳ細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒトｉＰＳ細胞においてヒト胚性幹細胞様ＤＮＡメチル化パターンが誘導される前記方法に関する。
【０１１２】
別の態様では本開示は、１つ以上のヒト卵母細胞を若返らせる方法であって、前記１つ以上のヒト卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト卵母細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト卵母細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト卵母細胞が若返る前記方法に関する。
【０１１３】
別の態様では本開示は、１つ以上のヒト卵母細胞のゲノム安定性を向上させる方法であって、前記１つ以上のヒト卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト卵母細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト卵母細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト卵母細胞におけるゲノム安定性が向上する前記方法に関する。
【０１１４】
別の態様では本開示は、１つ以上のヒト卵母細胞において１つ以上の核型異常を修正する方法であって、前記１つ以上のヒト卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト卵母細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト卵母細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト卵母細胞において前記１つ以上の核型異常の修正が誘導される前記方法に関する。
【０１１５】
別の態様では本開示は、１つ以上のヒト受精卵母細胞のゲノム安定性を向上させるインビトロ方法であって、前記１つ以上のヒト受精卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト受精卵母細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト受精卵母細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト受精卵母細胞においてゲノム安定性が向上する前記方法に関する。
【０１１６】
別の態様では本開示は、１つ以上のヒト受精卵母細胞における１つ以上の核型異常を修正するインビトロ方法であって、前記１つ以上のヒト受精卵母細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト受精卵母細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト受精卵母細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト受精卵母細胞において前記１つ以上の核型異常の修正が誘導される前記方法に関する。
【０１１７】
別の態様では本開示は、テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、（ｉ）テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象よりヒト骨髄細胞を単離すること、（ｉｉ）前記ヒト骨髄細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記ヒト骨髄細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記ヒト骨髄細胞においてテロメア延長を誘導すること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みヒト骨髄細胞を前記対象に移植してテロメア異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療することを含む前記方法に関する。
【０１１８】
別の態様では本開示は、染色体異常に関連する疾患又は健康状態を治療する方法であって、（ｉ）染色体異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象よりヒト骨髄細胞を単離すること、（ｉｉ）前記ヒト骨髄細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記ヒト骨髄細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記ヒト骨髄細胞において前記染色体異常の修正を誘導すること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みヒト骨髄細胞を前記対象に移植して染色体異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療することを含む前記方法に関する。
【０１１９】
別の態様では本開示は、対象内の組織又は器官を若返らせる方法であって、組織又は器官の若返りを必要とする対象に前記組織又は器官においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することを含み、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記組織又は器官を若返らせる前記方法に関する。
【０１２０】
別の態様では本開示は、若返りを必要とする対象を若返らせる方法であって、前記対象にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することを含み、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記対象を若返らせる前記方法に関する。
【０１２１】
別の態様では本開示は、１つ以上のヒト細胞の寿命を延長する方法であって、前記対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることによる方法であり、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較するとＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞の寿命が延長される、前記方法に関する。
【０１２２】
別の態様では本開示は、対象内の組織又は器官の寿命を延長する方法であって、組織又は器官の寿命の延長を必要とする対象に前記組織又は器官においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与することによる方法であり、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記組織又は器官の寿命を延長する前記方法に関する。
【０１２３】
別の態様では本開示は、対象の寿命を延長する方法であって、寿命の延長を必要とする対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与することによる方法であり、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞の寿命を延長し、それによって前記対象の寿命を延長する前記方法に関する。
【０１２４】
別の態様では本開示は、対象の寿命を延長する方法であって、（ｉ）前記対象より１つ以上のヒト細胞を単離すること、（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞の寿命を延長すること、及び（ｉｉｉ）前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与して前記対象の寿命を延長することによる前記方法に関する。
【０１２５】
別の態様では本開示は、１つ以上のヒト細胞において１つ以上のＺｓｃａｎ４誘導性作用を測定するための方法であって、（ｉ）１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させること、（ｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルを測定すること、及び（ｉｉｉ）前記１つ以上のヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルを前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルと比較し、前記１つ以上のヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルの上昇によって前記１つ以上のヒト細胞における１つ以上のＺｓｃａｎ４誘導性作用の存在を示すことによる前記方法に関する。
【０１２６】
Ｚｓｃａｎ４
ジンクフィンガー及びＳＣＡＮドメイン含有４ (Zinc finger and SCAN domain containing 4)（Ｚｓｃａｎ４）遺伝子は２細胞期特異的発現及びＥＳ細胞特異的発現を示すものとしてこれまでに特定された一群の遺伝子を表す（ＰＣＴ出願国際公開第２００８／１１８９５７号）。Ｚｓｃａｎ４遺伝子は、大規模ｃＤＮＡシーケンシングプロジェクト（Ｋｏら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ誌、第１２７巻：１７３７〜１７４９頁、２０００年；Ｓｈａｒｏｖら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ誌、第１巻：Ｅ７４、２００３年）とＤＮＡマイクロアレイ分析（Ｈａｍａｔａｎｉら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ誌、第６巻：１１７〜１３１頁、２００４年）を用いるマウス胚の全ての着床前期の発現プロファイリングによって特定された。マウスでは「Ｚｓｃａｎ４」という用語は３種類の偽遺伝子（Ｚｓｃａｎ４−ｐｓ１、Ｚｓｃａｎ４−ｐｓ２及びＺｓｃａｎ４−ｐｓ３）と６種類の発現遺伝子（Ｚｓｃａｎ４ａ、Ｚｓｃａｎ４ｂ、Ｚｓｃａｎ４ｃ、Ｚｓｃａｎ４ｄ、Ｚｓｃａｎ４ｅ及びＺｓｃａｎ４ｆ）を含む一団の遺伝子を指す。それらの６種類のパラログの中でＺｓｃａｎ４ｃ、Ｚｓｃａｎ４ｄ、及びＺｓｃａｎ４ｆのオープンリーディングフレームは、タンパク質間相互作用に介在すると予測されているＳＣＡＮドメイン並びにそれらのパラログの転写因子としての潜在的役割を示唆する４つのジンクフィンガードメインをコードしている。マウスと対照的にヒトゲノムはたった１コピーのＺｓｃａｎ４を含む。Ｚｓｃａｎ４はＺｓｃａｎ４ポリペプチドを指すことができ、Ｚｓｃａｎ４はそれらのＺｓｃａｎ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指すことができる。
【０１２７】
Ｚｓｃａｎ４（ジンクフィンガー及びスキャンドメイン含有タンパク質４）は、マウスでは２細胞期胚とＥＳ細胞に特異的に発現し（Ｆａｌｃｏら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ第３０７巻：５３９〜５５０頁、２００７年）、ＥＳ細胞におけるゲノム安定性と正常核型の維持に必要である（Ｚａｌｚｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ誌、第４６４巻：８５８〜８６３頁、２０１０年）ことが近年示された。未分化ＥＳ細胞のうちのわずかな割合（約１％から約５％）だけが所与の期間にＺｓｃａｎ４を発現するが（Ｆａｌｃｏら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ第３０７巻：５３９〜５５０頁、２００７年）、基本的に培養されているＥＳ細胞の全てが９回の継代以内に一時的なＺｓｃａｎ４+状態を経験する（Ｚａｌｚｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ誌、第４６４巻：８５８〜８６３頁、２０１０年）。Ｚｓｃａｎ４が短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）介在性抑制を受けると、約８継代後にＥＳ細胞は大規模な核型劣化を経験する。マウスＥＳ細胞のＺｓｃａｎ４+状態がテロメア延長と関連することも先行研究によって示されている（Ｚａｌｚｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ誌、第４６４巻：８５８〜８６３頁、２０１０年）。ＥＳ細胞は培養中にそれらの細胞のゲノム完全性を維持する最も高い能力を有するが、ＥＳ細胞であっても長期培養中には徐々にそれらの細胞の発生能を失うことも広く認識されている。テロメアは真核生物染色体の末端である、染色体の複製と安定性に関与する特別な構造体を指すことができる。テロメアは短いＤＮＡ配列の特定の方向の多数の反復を含む。テロメア機能は染色体末端の保護を含み、それによって染色体が連結して終わることがなく、（テロメラーゼによる）染色体の最末端の複製を可能にする。染色体の末端部のテロメアＤＮＡの反復回数は年齢と共に減少する。
【０１２８】
マウスＥＳ細胞における３日間のマウスＺｓｃａｎ４の強制発現によってテロメアの平均長がおよそ４０ｋｂという標準的な長さからおよそ６６ｋｂにまで増加することもこれまでに示されている（Ｚａｌｚｍａｎら、２０１０）。このことはＺｓｃａｎ４だけでテロメア長を効率的及び急激に増加させることができることを示している。しかしながら、Ｚｓｃａｎ４が成体幹細胞及び体細胞などのヒト非胚性細胞でテロメア長を増加させることができるかは不明である。
【０１２９】
ヒト細胞
本開示のある特定の態様は１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現（例えば、Ｚｓｃａｎ４タンパク質発現）を増加させる薬剤を利用することによる、限定されないが、ヒト成体細胞をはじめとする１つ以上のヒト細胞におけるテロメア長の増加に関する。ある特定の実施形態では前記１つ以上のヒト細胞はテロメア延長を必要とする対象、又はテロメア異常に関連する疾患又は健康状態を患っている対象、又はテロメア異常に関連する疾患又は健康状態を有していると診断された対象の中の細胞である。
【０１３０】
様々なヒト細胞が本明細書に記載される方法において有用である。本明細書において開示されるように、「ヒト細胞」という用語は胚発生中及び胚発生後にヒトの身体に見出されるあらゆる細胞、例えば、ヒト胚細胞、幹細胞、多能性細胞、分化細胞、成熟細胞、体細胞、及び成体細胞を指す。幾つかの実施形態では本開示のヒト細胞はヒト成体細胞である。本明細書において開示されるように、「ヒト成体細胞」という用語は胚発生後にヒトの身体に見出されるあらゆる細胞（すなわち、非胚細胞）を指す。本開示のヒト細胞には、限定されないが、精細胞、卵母細胞、受精卵母細胞（すなわち、接合子）、胚細胞、成熟細胞、分化細胞、体細胞、始原細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、成体幹細胞、体性幹細胞、及び組織幹細胞が含まれる。成体幹細胞は体性幹細胞又は組織幹細胞としても知られており、胚発生後の身体に見出される未分化細胞を指すことができ、細胞分裂によって増殖して死細胞を補充し、且つ、損傷組織を再生する。始原細胞は特定の種類の細胞又は細胞系譜に分化する少能性細胞又は単能性細胞を指すことができる。始原細胞は幹細胞に類似しているがさらに分化しており、且つ、限られた自己複製を示す。例となる成体幹細胞、組織幹細胞、及び／又は始原細胞には、限定されないが、造血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、神経幹細胞、腸管幹細胞、皮膚幹細胞、及び生殖細胞（例えば、精細胞及び卵母細胞）が含まれ得る。
【０１３１】
ヒト細胞は、限定されないが、体細胞、成熟細胞、及び分化細胞を含んでもよい。体細胞は、限定されないが、生殖細胞、組織幹細胞、始原細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、及び分化細胞をはじめとする身体のあらゆる細胞を指すことができる。例となる体細胞、成熟細胞、及び／又は分化細胞には、限定されないが、表皮細胞、線維芽細胞、リンパ球、肝細胞、上皮細胞、筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、心筋細胞、膵臓β細胞、ケラチノサイト、赤血球、末梢血液細胞、骨髄細胞、神経細胞、星状細胞、及び生殖細胞が含まれ得る。生殖細胞は有性生殖を行う生物の配偶子（すなわち、卵と精子）を生じる細胞を指すことができる。ある特定の実施形態では生殖細胞には、限定されないが、卵母細胞及び精細胞が含まれる。幾つかの実施形態では本開示の体細胞、成熟細胞、及び／又は分化細胞は、限定されないが、着床前胚も含む。
【０１３２】
Ｚｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤
本開示のある特定の態様はヒト細胞においてテロメア長を増加させるための前記ヒト細胞におけるＺｓｃａｎ４発現（例えば、Ｚｓｃａｎ４タンパク質発現）を増加させる薬剤の利用に関する。薬剤はあらゆる核酸分子、タンパク質、化合物、小分子、有機化合物、無機化合物、又は目的の他の分子を指すことができる。幾つかの実施形態ではその薬剤は、内在性Ｚｓｃａｎ４遺伝子（あらゆる上流調節性配列又は下流調節性配列を含む）との直接的相互作用又はＺｓｃａｎ４発現の誘導を引き起こす遺伝子及び／又はタンパク質との相互作用のどちらかによってＺｓｃａｎ４の発現を上昇させるあらゆる薬剤である。幾つかの実施形態ではその薬剤は、限定されないが、合成ｍＲＮＡ及び、限定されないが、センダイウイルスベクターなどのウイルスベクターをはじめとする発現ベクターを含むＺｓｃａｎ４をコードする核酸分子であり得る。他の実施形態ではその薬剤は、Ｚｓｃａｎ４タンパク質又はＺｓｃａｎ４−ΔＣなどのＺｓｃａｎ４タンパク質の機能部分を含むポリペプチドであり得る。幾つかの実施形態ではその薬剤はレチノイド、又は酸化ストレスを誘発する薬剤であり得る。
【０１３３】
幾つかの実施形態ではヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現（例えば、Ｚｓｃａｎ４タンパク質発現）を上昇させる本開示の薬剤はＺｓｃａｎ４発現を一時的に上昇させる。例えば、ヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる本開示の薬剤はＺｓｃａｎ４発現を約１時間から約２３時間にわたって（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、又は約２３時間にわたって）、又は約１日から約１０日にわたって（例えば、約１日間、約１．２５日間、約１．５日間、約１．７５日間、約２日間、約２．２５日間、約２．５日間、約２．７５日間、約３日間、約３．２５日間、約３．５日間、約３．７５日間、約４日間、約４．２５日間、約４．５日間、約４．７５日間、約５日間、約６．２５日間、約６．５日間、約６．７５日間、約７日間、約７．２５日間、約７．５日間、約７．７５日間、約８日間、約８．２５日間、約８．５日間、約８．７５日間、約９日間、約９．２５日間、約９．５日間、約９．７５日間、又は約１０日間にわたって）上昇させることができる。
【０１３４】
幾つかの実施形態ではヒト細胞における上昇したＺｓｃａｎ４発現（例えば、Ｚｓｃａｎ４タンパク質発現）の開示される有益な効果はＺｓｃａｎ４発現の反復的一時的上昇によって増強され得る。よって、ある特定の実施形態ではヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現（例えば、Ｚｓｃａｎ４タンパク質発現）を上昇させる本開示の薬剤は、４時間毎、８時間毎、１２時間毎、１６時間毎、２４時間毎、３２時間毎、４０時間毎、４８時間毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、１週間毎、２週間毎、３週間毎、４週間毎、１か月毎、２か月毎、３か月毎、４か月毎、６か月毎、７か月毎、８か月毎、９か月毎、１０か月毎、１１か月毎、１年毎、２年毎、３年毎、４年毎、５年毎、６年毎、７年毎、８年毎、９年毎、１０年毎、１１年毎、１２年毎、１３年毎、１４年毎、１５年毎、１６年毎、１７年毎、１８年毎、１９年毎、２０年毎、２１年毎、２２年毎、２３年毎、２４年毎、２５年毎、２６年毎、２７年毎、２８年毎、２９年毎、３０年毎、３５年毎、４０年毎、４５年毎、又は５０年毎の間隔でヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を反復的に上昇させるために使用され得る。
【０１３５】
本明細書において開示されるように、ヒト細胞は概してＺＳＣＡＮタンパク質をあまり発現しない。したがって、Ｚｓｃａｎ４発現を上昇させる本開示の薬剤は処理細胞におけるＺｓｃａｎ４タンパク質発現を上昇させる。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４発現を上昇させる本開示の薬剤を用いるヒト細胞の処理によってＺｓｃａｎ４タンパク質発現が少なくとも１．５倍から少なくとも１，０００，０００倍上昇し得る。
【０１３６】
以上より、ある特定の実施形態ではヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる本開示の薬剤は例えば前記薬剤と接触していないヒト細胞におけるＺｓｃａｎ４タンパク質発現と比べてＺｓｃａｎ４タンパク質発現を少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．１５倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．２５倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．３５倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．４５倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．５５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６．０倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７．０倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８．０倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９．０倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも２，０００倍、少なくとも３，０００倍、少なくとも４，０００倍、少なくとも５，０００倍、少なくとも６，０００倍、少なくとも７，０００倍、少なくとも８，０００倍、少なくとも９，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも２５，０００倍、少なくとも５０，０００倍、少なくとも７５，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも１２５，０００倍、少なくとも１５０，０００倍、少なくとも１７５，０００倍、少なくとも２００，０００倍、少なくとも２２５，０００倍、少なくとも２５０，０００倍、少なくとも２７５，０００倍、少なくとも３００，０００倍、少なくとも３２５，０００倍、少なくとも３５０，０００倍、少なくとも３７５，０００倍、少なくとも４００，０００倍、少なくとも４２５，０００倍、少なくとも４５０，０００倍、少なくとも４７５，０００倍、少なくとも５００，０００倍、少なくとも５２５，０００倍、少なくとも５５０，０００倍、少なくとも５７５，０００倍、少なくとも６００，０００倍、少なくとも６２５，０００倍、少なくとも６５０，０００倍、少なくとも６７５，０００倍、少なくとも７００，０００倍、少なくとも７２５，０００倍、少なくとも７５０，０００倍、少なくとも７７５，０００倍、少なくとも８００，０００倍、少なくとも８２５，０００倍、少なくとも８５０，０００倍、少なくとも８７５，０００倍、少なくとも９００，０００倍、少なくとも９２５，０００倍、少なくとも９５０，０００倍、少なくとも９７５，０００倍、又は少なくとも１，０００，０００倍上昇させる。
【０１３７】
細胞中のＺｓｃａｎ４タンパク質発現を測定するための、又は細胞あたりのタンパク質数（すなわち、タンパク質化学量論）を定量するための当技術分野において知られており、且つ、本明細書において開示されるあらゆる方法を用いることができる。幾つかの実施形態では前記薬剤で処置された細胞集団又は対象の全ての細胞がその薬剤によって影響を受けるわけではない。例えば、前記薬剤がＺｓｃａｎ４を発現するウイルスベクターである実施形態では、そのウイルスベクターは処理細胞集団又は処置対象の全ての細胞に感染しなくてもよい。したがって、Ｚｓｃａｎ４タンパク質発現の「上昇倍率」は、本明細書において使用される場合、前記薬剤によって影響を受けている処理細胞集団又は処置対象の細胞におけるＺｓｃａｎ４タンパク質発現上昇の平均を指す。例えば、前記薬剤がウイルスベクターである実施形態では、Ｚｓｃａｎ４タンパク質発現の上昇倍率は処理細胞集団又は処置対象の感染細胞におけるＺｓｃａｎ４タンパク質発現上昇の平均を指すことができる。
【０１３８】
Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチド
幾つかの実施形態では、Ｚｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤は、Ｚｓｃａｎ４タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子である。ポリヌクレオチドはあらゆる長さの核酸配列（例えば、直鎖状配列）を指すことができる。したがって、ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドを含み、且つ、染色体中に見出される遺伝子配列も含む。オリゴヌクレオチドは本来のホスホジエステル結合によって結合した複数の連結ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは６ヌクレオチドと３００ヌクレオチドの間の長さのポリヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド類似体はオリゴヌクレオチドと同様に機能するが、非天然部分を有する部分を指す。例えば、オリゴヌクレオチド類似体は非天然部分、変化した糖部分又は糖間結合、例えば、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを含み得る。天然ポリヌクレオチドの機能類似体はＲＮＡ又はＤＮＡに結合することができ、且つ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子を含む。
【０１３９】
Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドをコードする核酸分子をＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド又はＺｓｃａｎ４核酸分子と呼ぶ。これらのポリヌクレオチドはＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、及びｍＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列を含み、それらの配列はＺｓｃａｎ４をコードする。Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドをコードする全てのポリヌクレオチドもゲノム安定性又はテロメア長を調節する能力などの認められているＺｓｃａｎ４活性を有するポリペプチドをコードする限り本明細書に含まれることが理解される。ゲノム安定性は、ＤＮＡを忠実に複製し、且つ、ＤＮＡ複製機構の完全性を維持する細胞の能力を指すことができる。長いテロメアは細胞老化に対する緩衝を提供し、且つ、ゲノム安定性と全体的な細胞健常性を概ね示すと考えられる。染色体安定性（例えば、突然変異がほとんど無いこと、染色体再構成が無いこと、又は染色体数の変化が無いこと）もゲノム安定性と関連する。ゲノム安定性の喪失は癌、神経障害及び早期老化と関連する。ゲノム不安定性の兆候は突然変異率の上昇、大規模染色体再構成、染色体数の変化、及びテロメア短縮を含む。
【０１４０】
Ｚｓｃａｎ４核酸配列はこれまでに当技術分野において記載されている（例えば、その開示が参照により本明細書に援用される国際公開第２００８／１１８９５７号；Ｆａｌｃｏら、Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．誌、第３０７巻（第２号）：５３９〜５５０頁、２００７年；及びＣａｒｔｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．  Ｐａｔｔｅｒｎｓ．誌、第８巻（第３号）：１８１〜１９８頁、２００８年を参照のこと）。Ｚｓｃａｎ４核酸は、限定されないが、２細胞胚期特異的発現又はＥＳ細胞特異的発現を示すマウスＺｓｃａｎ４遺伝子のグループ（Ｚｓｃａｎ４ａ、Ｚｓｃａｎ４ｂ、Ｚｓｃａｎ４ｃ、Ｚｓｃａｎ４ｄ、Ｚｓｃａｎ４ｅ及びＺｓｃａｎ４ｆを含む）のいずれか１つ、ヒトＺＳＣＡＮ４オルソログ、又は他のあらゆる種のＺｓｃａｎ４オルソログを含み得る。
【０１４１】
本明細書において開示されるように、マウスＺｓｃａｎ４ａ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１に示されており、マウスＺｓｃａｎ４ｂ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号２に示されており、マウスＺｓｃａｎ４ｃ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３に示されており、マウスＺｓｃａｎ４ｄ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号４に示されており、マウスＺｓｃａｎ４ｅ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号５に示されており、マウスＺｓｃａｎ４ｆ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号６に示されている。さらに、ヒトＺＳＣＡＮ４遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号７に示されている。
【０１４２】
イヌＺｓｃａｎ４（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＸＭ．ｓｕｂ．−−５４１３７０．２及びＸＭ．ｓｕｂ．−−８４８５５７．１；配列番号８）、ウシＺｓｃａｎ４（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＸＭ．ｓｕｂ．−−００１７８９２５０．１；配列番号９）、ウマＺｓｃａｎ４（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＸＭ．ｓｕｂ．−−００１４９３９４４．１；配列番号１０）、ゴリラＺｓｃａｎ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ａ１ＹＥＱ９のヌクレオチド配列；配列番号２１）、ボノボＺｓｃａｎ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ａ１ＹＦＸ５のヌクレオチド配列；配列番号２２）、ボルネオオランウータンＺｓｃａｎ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ａ２Ｔ７Ｇ６のヌクレオチド配列；配列番号２３）、スマトラオランウータン（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ｈ２Ｐ０Ｅ３のヌクレオチド配列；配列番号２４）、パンダＺｓｃａｎ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ｇ１ＬＥ２９のヌクレオチド配列；配列番号２５）、ブタＺｓｃａｎ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ｆ１ＳＣＱ２のヌクレオチド配列；配列番号２６）、キタホオジロテナガザルＺｓｃａｎ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ｇ１ＲＪＤ４のヌクレオチド配列；配列番号２７）、アカゲザルＺｓｃａｎ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ｆ７ＧＨ５５のヌクレオチド配列；配列番号２８）、モルモットＺｓｃａｎ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ｈ０Ｖ５Ｅ８のヌクレオチド配列；配列番号２９）、及びジュウサンセンジリス（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ｉ３Ｎ７Ｔ３のヌクレオチド配列；配列番号３０）を含む他の種に由来するＺｓｃａｎ４核酸配列が公開されている。２００９年８月１１日のＧｅｎＢａｎｋデータベースに現れるところの上記のＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号の各々が参照により本明細書に援用される。２０１３年３月１５日のＵｎｉＰｒｏｔデータベースに現れるところの上記のＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号の各々が参照により本明細書に援用される。
【０１４３】
特定の例では、Ｚｓｃａｎ４は、マウスＺｓｃａｎ４ｃ又はヒトＺＳＣＡＮ４である。Ｚｓｃａｎ４核酸は、限定されないが、ゲノム安定性を向上させることができる、及び／又はテロメア長を増加させることができるＺｓｃａｎ４ポリペプチドをコードするＺｓｃａｎ４核酸、又はそれらの核酸のホモログを含み得る。
【０１４４】
当業者は分子的技術を使用してＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドの断片及び変異体を容易に調製することができる。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドの断片はＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドの少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１５００、又は少なくとも２０００の連続的核酸を含む。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４の断片は目的の細胞で発現すると、限定されないが、ゲノム安定性の向上及び／又はテロメア長の増加などのＺｓｃａｎ４の機能を付与する断片である。
【０１４５】
Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチド配列のわずかな改変により、本明細書に記載される対照的非改変型ポリヌクレオチドと比較すると実質的に同等の活性を有するペプチドが発現し得る。そのような改変は部位特異的突然変異形成による場合のように計画的であり得、又は自然発生的であり得る。これらの改変によって作り出されるポリヌクレオチドの全てが本明細書に含まれる。
【０１４６】
Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチドは、ベクターに、自律複製型のプラスミド又はウイルスに、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれている組換えＤＮＡ、又は他の配列から独立して別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ）として存在する組換えＤＮＡを含み得る。それらのヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はどちらかのヌクレオチドの修飾型であり得る。その用語は一本鎖型及び二本鎖型のＤＮＡを含む。組換え核酸又は組換えポリペプチドは天然で生じたものではない配列を有するもの、又は他の場合であれば分かれている２つの配列断片の人工的な結合によって作成される配列を有するものである。この人工的な結合は多くの場合に化学合成によって、又は核酸単離断片の人工的な操作、例えば、遺伝子操作技術によって達成される。
【０１４７】
幾つかの実施形態では本明細書に記載されるＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドのいずれかの縮重変異体を本開示の方法において使用してよい。縮重変異体は、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドなどのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、遺伝暗号の結果として縮重している配列を含むポリヌクレオチドを指すことができる。２０種類の天然アミノ酸が存在し、それらのアミノ酸のほとんどが１種類より多くのコドンによって指定される。したがって、全ての縮重ヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が変わっていない限り、含まれる。
【０１４８】
Ｚｓｃａｎ４コード配列を異種性プロモーターに機能的に連結してそのＺｓｃａｎ４コード核酸配列の転写を行わせることができる。プロモーターは核酸の転写を行わせる核酸制御配列を指すことができる。プロモーターは転写開始部位の近傍に必須核酸配列を含む。プロモーターは遠位エンハンサー配列又は遠位リプレッサー配列を含んでもよい。構成的プロモーターは、絶えず活性型であり、且つ、外部シグナル又は外部分子による調節の対象ではないプロモーターである。対照的に、誘導性プロモーターの活性は外部シグナル又は外部分子（例えば、転写因子）によって調節される。第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係状態で配置されているときにその第１の核酸配列はその第２の核酸配列に機能的に結合している。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を与える場合にそのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合している。通常、機能的に結合している核酸配列は連続的であり、２つのタンパク質コード領域を結合することが必要な場合には同じリーディングフレームにある。異種性ポリペプチド又は異種性ポリヌクレオチドは異なる起源又は種に由来するポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。プロモーターは転写開始部位の近傍にある必須核酸配列を含み、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合はＴＡＴＡ配列を含む。プロモーターは転写開始部位から数千塩基対もの位置にあり得る遠位エンハンサー配列又は遠位リプレッサー配列を含んでもよい。一例では、前記プロモーターは構成的プロモーター、例えば、ＣＡＧプロモーター（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ誌、第１０８巻（第２号）：１９３〜９頁、１９９１年）又はホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである。幾つかの実施形態では前記プロモーターはテトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｍａｓｕｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．誌、第３３巻：ｅ４３、２００５年）などの誘導性プロモーターである。Ｚｓｃａｎ４発現を行わせるために使用され得る他の例となるプロモーターにはｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ｔａｃシステム、ｔｒｃシステム、ラムダファージの主要オペレーター領域及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、ＳＶ４０の初期プロモーター及び後期プロモーター；ポリオーマウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス及びシミアンウイルス由来のプロモーター；３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酵母酸ホスファターゼのプロモーター、及び酵母α交配因子のプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４本来のプロモーターが使用される。本開示のＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドは構成的プロモーター、誘導性プロモーター、又は本明細書に記載される他のあらゆる適切なプロモーター、又は当業者によって容易に認識される他の適切なプロモーターの制御下にあり得る。
【０１４９】
２つ以上の核酸配列、又は２つ以上のアミノ酸配列の間の同一性／類似性はそれらの配列の間の同一性又は類似性の見地から表される。配列同一性をパーセンテージ同一性の見地から測定することができ、そのパーセンテージが高いほどそれらの配列が同一である。配列類似性を（保存的アミノ酸置換を考慮する）パーセンテージ類似性の見地から測定することができ、そのパーセンテージが高いほどそれらの配列が類似している。核酸配列又はアミノ酸配列のホモログ又はオルソログは標準的方法を用いて整列させられると比較的に高い程度の配列同一性／類似性を有する。それらのオルソロガスなタンパク質又はｃＤＮＡがより遠い類縁関係の種（例えば、ヒト配列とエレガンス線虫配列）と比較してより近い類縁関係の種（例えば、ヒト配列とマウス配列）に由来する場合にこの相同性はより有意である。
【０１５０】
２つ以上の配列（例えば、核酸配列又はアミノ酸配列）という文脈の中の「同一である」又はパーセント「同一性」という用語は同一である２つ以上の配列又は亜配列を指すことができる。２つの配列が後続の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、又は手作業のアラインメントと目視検査によって評価される場合に比較ウィンドウ又は指定領域にわたる最大の対応性を求めてそれらの配列が比較及び整列させられるとき、それらの２つの配列が同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドの指定されたパーセンテージ（すなわち、指定領域にわたる、又は、指定されていないときは配列全体にわたる２９％の同一性、所望により３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性）を有する場合にそれらの２つの配列は実質的に同一である。
【０１５１】
配列比較のために典型的には１つの配列が基準配列の役を務め、その基準配列に対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用するときは試験配列と基準配列をコンピューターに入力し、亜配列座標を指定し、必要であれば配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。初期プログラムパラメーターを使用することができ、又は代替パラメーターを指定することができる。その後に配列比較アルゴリズムがプログラムパラメーターに基づいて基準配列と比べた試験配列のパーセント配列同一性を計算する。同一性について２つの配列を比較するときにはそれらの配列が連続的である必要はないが、全体のパーセント同一性を低下させることになるペナルティーがあらゆるギャップに付随する。ｂｌａｓｔｐについて、初期パラメーターはギャップ・オープニングペナルティー＝１１とギャップ・エクステンションペナルティー＝１である。ｂｌａｓｔｎについて、初期パラメーターはギャップ・オープニングペナルティー＝５とギャップ・エクステンションペナルティー＝２である。
【０１５２】
比較ウィンドウは、限定されないが、２０から６００まで、一般的には約５０から約２００まで、より一般的には約１００から約１５０までをはじめとする連続的位置数のいずれか１つのセグメントに対する照合を含んでよく、その比較ウィンドウ内で配列と基準配列の２つの配列を最適な状態に整列させた後に同じ連続的位置数のその基準配列に対してその配列を比較することができる。比較のための配列アラインメント方法が当技術分野においてよく知られている。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（１９８１年）によって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ誌、第４８巻（第３号）：４４３〜４５３頁の相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ誌、第８５巻（第８号）：２４４４〜２４４８頁の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズム（ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、ジェネティクス・コンピューター・グループ、５７５サイエンスドライブ、マディソン、ウィスコンシン州）のコンピューター化実行によって、又は手作業のアラインメントと目視検査［例えば、Ｂｒｅｎｔら、（２００３年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社（Ｒｉｎｇｂｏｕ編）を参照のこと］によって実施され得る。
【０１５３】
パーセント配列同一性と配列類似性の決定に適切なアルゴリズムの２つの例はＢＬＡＳＴアルゴリズムとＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それらのアルゴリズムはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ誌、第２５号（第１７号）：３３８９〜３４０２頁、及びＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ誌、第２１５巻（第３号）４０３〜４１０頁に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは米国国立バイオテクノロジー情報センターによって公開されている。このアルゴリズムは、クエリ配列内の短いワード長Ｗであって、データベース配列内の同じ長さのワードと整列させるとある正の値の閾値スコアＴと一致するか、又はＴを満たすワード長Ｗを特定することによって高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を最初に特定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上掲）。これらの初期隣接ワードヒットはそれらの初期隣接ワードヒットを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するための種としての役を務める。それらのワードヒットは累積アラインメント・スコアが増加し得る限りそれぞれの配列に沿って両方向に延ばされる。累積スコアはヌクレオチド配列についてパラメーターＭ（一致残基対に対するリワード・スコア；常に０より上である）とパラメーターＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティー・スコア；常に０より下である）を使用して計算される。アミノ酸配列については累積スコアを計算するためにスコアリング・マトリックスを使用する。各方向でのワードヒットの延伸は累積アラインメント・スコアが累積アラインメント・スコアの最大達成値から量Ｘだけ下落するときに、１つ以上の負のスコア形成残基アラインメントの蓄積のために累積スコアが０又はそれより下になるときに、又はどちらかの配列の末端に達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、及びＸはアラインメントの感度と速度を決定する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは３のワード長と１０の期待値（Ｅ）、及び５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリックス［Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、（１９９２年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ誌、第８９巻（第２２号）：１０９１５〜１０９１９頁を参照のこと］アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を初期設定として使用する。ヌクレオチド配列について、ＢＬＡＳＴＮプログラムは１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を初期設定として使用する。
【０１５４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列の間の類似性の統計分析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、（１９９３年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ誌、第９０巻（第１２号）：５８７３〜５８７７頁を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小合計確度（Ｐ（Ｎ））であり、それは２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の間での一致が偶然に発生する確率の指標を提供する。例えば、基準核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確度が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合にその核酸はその基準配列に類似していると見なされる。
【０１５５】
２つの核酸分子が近縁であるという１つの指標は、それらの２つの分子がストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズすることである。高い程度の同一性を示さない核酸配列がそれにもかかわらず遺伝暗号の縮重性のために同一又は類似の（保存的）アミノ酸配列をコードすることがあり得る。全てが実質的に同一のタンパク質をコードする複数の核酸分子を作製するためにこの縮重性を使用して核酸配列を変化させることができる。２つの核酸配列が実質的に同一であるという代わりの（及び、必ずしも重複しない）指標は、第１の核酸がコードするポリペプチドが第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。
【０１５６】
また、２つの核酸配列が実質的に同一であるという１つの指標は、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドに対して作製された抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、そのポリペプチドはその第２のポリペプチドと実質的に同一であることが典型的である。
【０１５７】
本開示の様々な態様は単離物質、例えば、単離核酸、又は合成ｍＲＮＡ分子に関する。単離核酸は他の核酸配列から、及びその核酸が天然に生じている生物の細胞から、すなわち、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡから実質的に分離又は精製されている。したがって、「単離された」という用語は標準的核酸精製方法によって精製された核酸を包含する。その用語は宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸並びに化学的に合成された核酸も包含する。同様に、単離タンパク質はそのタンパク質が天然に生じている生物の細胞の他のタンパク質から実質的に分離又は精製されており、宿主細胞における組換え発現によって調製されたタンパク質並びに化学的に合成されたタンパク質を包含する。同様に、単離細胞は他の細胞種から実質的に分離されている。
【０１５８】
以上より、ある特定の実施形態では本開示のポリヌクレオチドは遺伝暗号の結果として縮重している配列を含む。２０種類の天然アミノ酸が存在し、それらのアミノ酸のほとんどが１種類より多くのコドンによって指定される。したがって、全ての縮重ヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列によってコードされるＺｓｃａｎ４ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変わっていない限り、含まれる。Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチドは本明細書において開示されるようにＺｓｃａｎ４ポリペプチドをコードする。Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドをコードする例となるポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号１〜１０及び２１〜３０のいずれか１つに由来するヌクレオチド配列を含み得る。さらに、ヒトＺＳＣＡＮ４の非ヒトホモログは、そのような非ヒトＺｓｃａｎ４ホモログの発現が一時的であり、したがって、ヒト対象において有害免疫原性反応を引き起こさないので、本開示の方法のいずれとも合致してヒト対象においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させるために使用され得る。
【０１５９】
幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４ポリペプチドをコードするＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドはヒトＺＳＣＡＮ４ポリヌクレオチド又はそのホモログである。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４ポリペプチドをコードするＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドはマウスＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド又はそのホモログである。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４ポリペプチドをコードするＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドはＺｓｃａｎ４ａポリヌクレオチド、Ｚｓｃａｎ４ｂポリヌクレオチド、Ｚｓｃａｎ４ｃポリヌクレオチド、Ｚｓｃａｎ４ｄポリヌクレオチド、Ｚｓｃａｎ４ｅポリヌクレオチド、又はＺｓｃａｎ４ｆポリヌクレオチドである。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４ポリペプチドをコードするＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドはイヌＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド、ウシＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド、ウマＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド、又はそれらのホモログである。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４ポリペプチドをコードするＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドは配列番号１〜１０及び２１〜３０のいずれか１つに由来するヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０１６０】
ある特定の実施形態ではＺｓｃａｎ４ポリペプチドをコードするＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドはヒトＺＳＣＡＮ４ポリヌクレオチド又はそのホモログである。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４ポリペプチドをコードするＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドは配列番号７のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０１６１】
Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチドをヒト細胞に導入する方法
幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドはヒト細胞に導入される。細胞への核酸分子又はタンパク質の導入はその核酸分子又はタンパク質をその細胞に送達するためのあらゆる手段を包含する。例えば、核酸分子は細胞に形質移入、形質導入、又は電気穿孔導入され得る。細胞へのタンパク質の送達は、例えば、そのタンパク質の細胞透過性ペプチド、例えば、タンパク質導入ドメインを有するペプチド（例えば、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ）、又はポリアルギニンペプチドタグ（Ｆｕｃｈｓ及びＲａｉｎｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第１４巻：１５３８〜１５４４頁、２００５年）との融合によって達成され得る。タンパク質導入ドメインは、古典的なエンドサイトーシスと無関係の機序によってより大きな分子（タンパク質、核酸分子等）の細胞への侵入を促進する陽イオン性小ペプチドを指すことができる。ポリアルギニンペプチドタグはより大きな分子（タンパク質及び核酸分子等）の細胞への送達を容易にするアルギニン残基から構成される短鎖ペプチド（概ね７〜１１残基）を指すことができる（例えば、Ｆｕｃｈｓ及びＲａｉｎｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第１４巻：１５３８〜１５４４頁、２００５年を参照のこと）。
【０１６２】
ヒト細胞へのＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドの導入はウイルスベクター（組込み型又は非組込み型ウイルスベクター）又はプラスミドベクターの使用、Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチドをコードするｍＲＮＡ分子の送達、又はＺｓｃａｎ４タンパク質の直接送達を伴い得る。これらの方法のそれぞれは当技術分野において記載されており、したがって、当業者の能力の範囲内である。ヒト細胞にＺｓｃａｎ４を送達するために用いられ得る各方法の簡単な概要が本明細書において提供される。ベクターは宿主細胞に導入され、それによって形質転換された宿主細胞を産生する核酸分子を指すことができる。ベクターは宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列、例えば、複製起点（ＤＮＡ合成の開始に関わるＤＮＡ配列）を含んでよい。例えば、発現ベクターは挿入された遺伝子又は複数の遺伝子の転写及び翻訳を可能にする必須の調節性配列を含む。ベクターは１つ以上の選択マーカー遺伝子及び当技術分野において知られている他の遺伝配列を含んでもよい。ベクターは、例えば、ウイルスベクター及びプラスミドベクターを含み得る。
【０１６３】
Ｚｓｃａｎ４プロモーター配列及び発現ベクター
異種性ポリペプチドをコードする核酸配列（レポーター遺伝子等）に対して機能的に結合したＺｓｃａｎ４プロモーター配列を含む発現ベクターが、Ｚｓｃａｎ４を発現する細胞を特定するために使用され得る。レポーター遺伝子の発現を検出する方法はレポーター遺伝子の種類に応じて様々であり、且つ、当技術分野においてよく知られている。例えば、蛍光性レポーターが使用されるとき、発現の検出はＦＡＣＳ又は蛍光顕微鏡法によって達成され得る。Ｚｓｃａｎ４を発現するヒト細胞の特定は、限定されないが、Ｚｓｃａｎ４に特異的な抗体を使用する方法、又はインサイチュハイブリダイゼーションによる方法をはじめとする代替的方法によって達成され得る。
【０１６４】
幾つかの実施形態では異種性核酸配列（レポーター分子等）は（例えば、ベクター内の）Ｚｓｃａｎ４プロモーターの制御下で発現する。Ｚｓｃａｎ４プロモーターは本明細書に記載される内在性Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチドの発現を調節するプロモーター配列であり得る。Ｚｓｃａｎ４プロモーターの特定は優に当技術分野の、及び本開示に関連する当業者の能力の範囲内である。適切なエンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の直前の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル、及び終止コドンをはじめとする他の発現制御配列をＺｓｃａｎ４プロモーターと共に発現ベクター内に含めることができる。通常、そのプロモーターは異種性核酸配列の転写を行わせるのに充分な最小配列を少なくとも含む。幾つかの実施形態ではその異種性核酸配列はレポーター分子をコードする。
【０１６５】
幾つかの実施形態では異種性核酸配列（レポーター分子等）は例えば相同組換えによって対象のゲノムＤＮＡに組み込まれる。例えば、内在性Ｚｓｃａｎ４と同じ様にＧＦＰが発現するようにＧＦＰのコード配列をＺｓｃａｎ４のコード領域に挿入することができ、又はＺｓｃａｎ４のコード領域と置き換えることができる。相同組換えによる遺伝子「ノックイン」法が当技術分野においてよく知られている。
【０１６６】
異種性核酸配列によってコードされる異種性タンパク質は通常は、従来の分子生物学的手法を使用して特定され得るマーカー、酵素、蛍光性タンパク質、細胞に抗生物質抵抗性を付与するポリペプチド、又は抗原などのレポーター分子である。レポーター分子は、目的の細胞又は細胞集団、例えば、ヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤と接触したヒト細胞を特定するために使用され得る。幾つかの実施形態では前記異種性タンパク質は蛍光性マーカー（緑色蛍光タンパク質、又はその変異体、例えば、Ｅｍｅｒａｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）等）、抗原マーカー（ヒト成長ホルモン、ヒトインスリン、ヒトＨＬＡ抗原等）、細胞表面マーカー（ＣＤ４又はあらゆる細胞表面受容体等）、又は酵素マーカー（ｌａｃＺ、アルカリホスファターゼ等）である。レポーター遺伝子の発現は細胞がＺｓｃａｎ４を発現していることを示す。レポーター遺伝子の発現を検出する方法はレポーター遺伝子の種類に応じて様々であり、且つ、当技術分野においてよく知られている。例えば、蛍光性レポーターが使用されるとき、発現の検出はＦＡＣＳ又は蛍光顕微鏡法によって達成され得る。
【０１６７】
発現ベクターは典型的には複製起点並びに形質転換細胞の表現型による選択を可能にする特定の遺伝子、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子を含む。本明細書における使用に適切なベクターが当技術分野においてよく知られており、ウイルスベクター及びプラスミドベクター（本明細書に記載されるベクター等）を含む。幾つかの実施形態ではエンハンサーがＺｓｃａｎ４プロモーターの上流に位置するが、エンハンサー配列は通常はベクター上のどこに位置していてもよく、それでも増強効果を有することができる。しかしながら、活性の上昇量は概して距離と共に減少する。さらに、２コピー以上のエンハンサー配列を相次いで機能的に結合してさらに高いプロモーター活性の上昇をもたらすことができる。
【０１６８】
Ｚｓｃａｎ４プロモーターを含む発現ベクターが、宿主細胞、例えば、ヒト細胞等に形質移入するために使用され得る。宿主において発現及び複製可能である生物学的に機能的なウイルスＤＮＡベクター及びプラスミドＤＮＡベクターが当技術分野において知られており、且つ、目的のあらゆる細胞に形質移入するために使用され得る。宿主細胞は、中でベクターが増殖することができ、且つ、そのベクターのＤＮＡが発現する細胞を指すことができる。その用語はその対象宿主細胞のあらゆる子孫細胞も含む。複製中に生じる突然変異が存在する場合があり得るので、全ての子孫細胞が親細胞と同一でなくてもよいことが理解される。しかしながら、「宿主細胞」という用語が使用されるとき、そのような子孫細胞が含まれる。
【０１６９】
形質移入細胞はＺｓｃａｎ４プロモーター配列を含むＤＮＡ分子などの核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）が導入されている宿主細胞（又は、先祖細胞に導入されている宿主細胞）を指すことができる。形質移入過程又は形質移入は核酸を細胞又は組織に導入する過程を指すことができる。形質移入は、限定されないが、リポソーム介在性形質移入、電気穿孔法及び注入などの多数の方法のうちのいずれか１つによって達成され得る。組換え核酸分子による宿主細胞の形質移入は当業者によく知られている従来の技法によって実行され得る。形質移入はリポソーム介在性形質移入、電気穿孔法、注入、又は細胞へ核酸分子を導入するための他のあらゆる適切な技法を含み得る。
【０１７０】
ウイルスベクター
幾つかの実施形態では本開示の方法において使用されるベクターはウイルスベクターである。様々なウイルスベクターが当技術分野において知られており、且つ、本明細書に記載されている。
【０１７１】
本開示の方法においてパラミクソウイルスを使用することができる。パラミクソウイルスベクターには、限定されないが、パラミクソウイルスに由来し、且つ、ヒト細胞などの宿主細胞へのＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドなどの遺伝子移入に使用されるベクター（又はキャリアー）が含まれ得る。パラミクソウイルスベクターは感染性を有するリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）又はウイルス粒子であり得る。感染性は、パラミクソウイルスベクターの細胞接着・膜融合能力によってそのベクターに含まれる遺伝子をそのベクターが接着している細胞に移入するそのパラミクソウイルスベクターの能力を指すことができる。パラミクソウイルスベクターは複製能を有してよく、又は複製能を持たない欠損ベクターであってもよい。複製能は、パラミクソウイルスベクターが感染した宿主細胞において感染性ウイルス粒子を複製及び産生するそのウイルスベクターの能力を指すことができる（例えば、米国特許出願公開第２００４／０００５２９６号明細書を参照のこと）。
【０１７２】
パラミクソウイルスはパラミクソウイルス科のウイルス又はその派生物である。パラミクソウイルスには、限定されないが、センダイウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、呼吸系発疹ウイルス、牛疫ウイルス、ジステンパーウイルス、サルパラインフルエンザウイルス（ＳＶ５）、並びにＩ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型ヒトパラインフルエンザウイルスなどのパラミクソウイルス科に属するウイルスが含まれ得る。本明細書において使用されるウイルスベクターはパラミクソウイルス属のウイルス又はその派生物に基づき得る。本明細書において使用されるウイルスベクターは、限定されないが、Ｉ型ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩ−Ｖ−１）、ＩＩＩ型ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ−３）、ＩＩＩ型ウシパラインフルエンザウイルス（ＢＰＩＶ−３）、センダイウイルス（「Ｉ型マウスパラインフルエンザウイルス」とも呼ばれる）、又はｘ型サルパラインフルエンザウイルス（ＳＰＩＶ−１０）を含む様々なパラミクソウイルスに基づき得る。これらのウイルスは天然型株、野生型株、突然変異株、研究室継代株、又は人工的に構築された株であり得る。例えば、ＤＩ粒子（Ｗｉｌｌｅｎｂｒｉｎｋ  Ｗ．及びＮｅｕｂｅｒｔ  Ｗ．Ｊ．、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．誌、１９９４年、第６８巻、８４１３〜８４１７頁）及び合成オリゴヌクレオチドなどの不完全ウイルスも本明細書において使用されるパラミクソウイルスウイルスベクターを作製するための材料として利用され得る（例えば、米国特許出願公開第２００４／０００５２９６号明細書を参照のこと）。
【０１７３】
パラミクソウイルスのタンパク質をコードする遺伝子にはＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子、及びＬ遺伝子が含まれる。ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子、及びＬ遺伝子はそれぞれヌクレオキャプシドタンパク質、リンタンパク質、マトリックスタンパク質、融合タンパク質、赤血球凝集素ノイラミニダーゼ、及びラージタンパク質をコードする遺伝子である。ＮＰ遺伝子はＮ遺伝子として表されてもよい。前述のパラミクソウイルスタンパク質は当技術分野においてよく知られている。例えば、パラミクソウイルス科のレスピロウイルスとして分類される、例えば、センダイウイルスの各遺伝子のヌクレオチド配列データベースにおける受け入れ番号は、ＮＰ遺伝子についてはＭ２９３４３、Ｍ３０２０２、Ｍ３０２０３、Ｍ３０２０４、Ｍ５１３３１、Ｍ５５５６５、Ｍ６９０４６、及びＸ１７２１８であり、Ｐ遺伝子についてはＭ３０２０２、Ｍ３０２０３、Ｍ３０２０４、Ｍ５５５６５、Ｍ６９０４６、Ｘ００５８３、Ｘ１７００７、及びＸ１７００８であり、Ｍ遺伝子についてはＤ１１４４６、Ｋ０２７４２、Ｍ３０２０２、Ｍ３０２０３、Ｍ３０２０４、Ｍ６９０４６、Ｕ３１９５６、Ｘ００５８４、及びＸ５３０５６であり、Ｆ遺伝子についてはＤ００１５２、Ｄ１１４４６、Ｄ１７３３４、Ｄ１７３３５、Ｍ３０２０２、Ｍ３０２０３、Ｍ３０２０４、Ｍ６９０４６、Ｘ００１５２、及びＸ０２１３１であり、ＨＮ遺伝子についてはＤ２６４７５、Ｍ１２３９７、Ｍ３０２０２、Ｍ３０２０３、Ｍ３０２０４、Ｍ６９０４６、Ｘ００５８６、Ｘ０２８０８、及びＸ５６１３１であり、Ｌ遺伝子についてはＤ０００５３、Ｍ３０２０２、Ｍ３０２０３、Ｍ３０２０４、Ｍ６９０４０、Ｘ００５８７、及びＸ５８８８６である（例えば、米国特許出願公開第２００４／０００５２９６号明細書を参照のこと）。本明細書において使用されるセンダイウイルス系ベクターなどのパラミクソウイルス系ベクターは内在性ウイルスタンパク質の欠失などの改変を含み得ることに留意されたい。
【０１７４】
パラミクソウイルス系ウイルスベクターは宿主細胞における核酸の有用な発現である。パラミクソウイルスベクターはヒトでは病原性ではないので、パラミクソウイルスベクターが安全性の点でヒト遺伝子治療の臨床試験において好適に利用されることが示唆され得る。大半の事例においてプラスミドＤＮＡ又は同種のものを介した外来性遺伝子の発現のためには導入されたＤＮＡが細胞核に輸送されなければならないこと、又は細胞核膜が除去されなければならないことが高効率の遺伝子移入における主要な障害である。しかしながら、センダイウイルスの場合ではウイルスが複製すると細胞質内の細胞性チューブリンとそのウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（Ｌタンパク質）の両方によって外来性遺伝子の発現が行われる。このことは、センダイウイルスが宿主細胞の染色体と相互作用せず、そのことによって癌発生及び細胞の不死化などの危険性が回避されることを示唆している。さらに、センダイウイルスはげっ歯類では病原性であり、肺炎を引き起こすことが知られているが、ヒトでは病原性ではなく、このことは野生型センダイウイルスの鼻腔内投与が非ヒト霊長類では害にならないことを示す研究（Ｈｕｒｗｉｔｚ  Ｊ．Ｌ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ誌、１９９７年、第１５巻、５３３〜５４０頁）によって裏付けされている。これらの特徴はセンダイウイルスベクターをヒトの治療において利用することができることを示唆しており、さらに、センダイウイルスベクターはヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤とのヒト細胞の接触に特に使用される有望なツールであり得るという考えを支持する（例えば、米国特許出願公開第２００４／０００５２９６号明細書を参照のこと）。よって、ある特定の実施形態では前記ウイルスベクターはセンダイウイルスベクターである。幾つかの実施形態では前記センダイベクターは温度感受性センダイベクターである。例えば、ＴＳ１５温度感受性センダイベクターは３５℃において機能的であるが、３７℃で培養されると不活化され得る（例えば、Ｂａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ誌、２０１１年；第１０８巻（第３４号）：１４２３４〜１４２３９頁を参照のこと）。その他の温度感受性センダイベクターの例には、限定されないが、３２℃、３５℃、及び３７Ｃでは機能的であるが、３８℃又は３９℃で培養されると不活化され得るＴＳ７センダイベクター及びＴＳ１３センダイベクターが挙げられる（例えば、Ｂａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ誌、２０１１年；第１０８巻（第３４号）：１４２３４〜１４２３９頁を参照のこと）。当技術分野において知られている他のあらゆる変異体センダイベクターも本開示のＺｓｃａｎ４を発現させるために使用され得る。
【０１７５】
さらに、レトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）系ベクター）を本明細書において使用してもよい（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ誌、第１２６巻：６６３〜６６６頁、２００６年；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ誌、第３１巻：８６１〜８７２頁、２００７年；Ｏｋｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ誌、３１３〜３１７頁、２００７年；Ｐａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ誌、第４５１巻：１４１〜１４６頁；米国特許出願公開第２００９／００４７２６３号明細書を参照のこと）。レンチウイルス系ベクターを利用する研究（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ誌、第２巻：１５１〜１５９頁、２００８年；Ｗｅｒｎｉｇら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ誌、第２６巻：９１６〜９２４頁、２００８年；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第３２２巻：９４５〜９４９頁、２００８年）により、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができ、それによって細胞形質導入率を改善することができるというこれらのベクターの利点が示された。加えて、レンチウイルスはウイルス指向性を拡張するためにシュードタイプされ得る。例えば、水胞性口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶｇ）によるシュードタイピングは広範囲の細胞種の感染を可能にする（Ｌａｉら、Ｊ  Ａｓｓｉｓｔ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｇｅｎｅｔ誌、第２８巻（第４号）：２９１〜３０１頁、２０１１年）。レンチウイルスはタンパク質の構成的発現と誘導性発現の両方も可能にする。薬物誘導性レンチウイルス発現システムの例はＨｏｃｋｍｅｙｅｒら（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ誌、第３巻：３４６〜３５３頁、２００８年）及びＷｅｒｎｉｇら（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ誌、第２６巻：９１６〜９２４頁、２００８年）によって記載されている。
【０１７６】
レンチウイルスにはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２等）、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス及びサル免疫不全ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。他のレトロウイルスにはヒトＴリンパ好性ウイルス、サルＴリンパ好性ウイルス、マウス白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス及びネコ白血病ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターを作製する方法及びそれらのベクターの使用法は当技術分野においてよく記載されている（例えば、米国特許第７２１１２４７号明細書、第６９７９５６８号明細書、第７１９８７８４号明細書、第６７８３９７７号明細書、及び第４９８０２８９号明細書を参照のこと）。
【０１７７】
非組込み型ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクターもタンパク質をコードする核酸分子を細胞へ送達するために使用されている。例えば、アデノウイルスベクターは細胞内でエピソームのままであり、マウス線維芽細胞及び肝細胞へタンパク質を送達するためにうまく使用されている（Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第３２２巻：９４５〜９４９頁、２００８年）。
【０１７８】
幾つかの実施形態ではＳＶ４０の、又はラウス肉腫ウイルスのロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）のプロモーター領域及びエンハンサー領域並びにＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナル及びスプライシングシグナルを含有するベクター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＢｅｒｇ、１９８１年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ誌、第７８巻：２０７２〜６頁；Ｇｏｒｍａｎら、１９８２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ誌、第７８巻：６７７７〜８１頁）が使用される。幾つかの実施形態では前記ベクターは、アデノウイルスベクター、例えば、米国特許第４７９７３６８号明細書（Ｃａｒｔｅｒら）及びＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．誌、第６２巻：１９６３〜７３頁、１９８８年）記載されるもの、及び４型ＡＡＶ（Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．誌、第７１巻：６８２３〜３３頁、１９９７年）及び５型ＡＡＶ（Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．誌、第７３巻：１３０９〜１９頁、１９９９年）などのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、又はレトロウイルスベクター（モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス等、並びにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥白血症ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳癌ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）などのウイルスベクターである。ワクシニアウイルス（Ｍｏｓｓら、１９８７、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．誌、第５巻：３０５〜２４頁）、ウシパピローマウイルス（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．誌、第１３９巻：６４２〜５４頁）又はエプスタイン・バール・ウイルスなどのヘルペスウイルス群のメンバー（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅら、１９８８、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．誌、第８巻：２８３７〜４７頁）を含む他のウイルス形質移入システムを利用してもよい。加えて、ベクターは、それらのベクターの（及びしたがってＺｓｃａｎ４核酸の）安定した長期発現を示す形質移入細胞の選択を可能にする抗生物質選択マーカー（ネオマイシン、ハイグロマイシン又はミコフェノール酸等）を含んでよい。
【０１７９】
前記ベクターは、パピローマ（Ｓａｒｖｅｒら、１９８１年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．誌、第１巻：４８６頁）又はエプスタイン・バール（Ｓｕｇｄｅｎら、１９８５年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．誌、第５巻：４１０頁）などのウイルスの調節性配列を使用することによってエピソーム性自由複製実体として細胞内で維持され得る。あるいは、ゲノムＤＮＡに前記ベクターを組み込んだ細胞株を作製することもできる。これらの種類の細胞株の両方が絶えず遺伝子産物を産生する。当業者は高レベルの遺伝子産物を産生することができる細胞株を作製するためにベクターのコピー数を（及びしたがってｃＤＮＡのコピー数も）増幅させた細胞株を作製することもできる。
【０１８０】
プラスミドベクター
幾つかの例では、例えば宿主細胞ゲノムへの組込みを回避するために非ウイルスベクターを使用することが望ましい。したがって、１種類以上のプラスミドベクターを使用してＺｓｃａｎ４コードポリヌクレオチドをヒト細胞に送達することができる。プラスミドベクターはエピソームとして維持され、概して短期間の遺伝子発現を示す（Ｌａｉら、Ｊ  Ａｓｓｉｓｔ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｇｅｎｅｔ誌、第２８巻（第４号）：２９１〜３０１頁、２０１１年）。一例として、Ｏｋｉｔａら（Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第３２２巻：９４９〜９５３頁、２００８年）は体細胞におけるタンパク質の発現用のＣＡＧプロモーターを含有するｐＣＸプラスミドの使用について記載している。
【０１８１】
エピソーム性プラスミドベクターはＺｓｃａｎ４コードポリヌクレオチドをヒト細胞へ導入するための追加の選択肢である。エピソーム性プラスミドベクターはそれらのベクター自身を染色体外配列として自律的に複製することができ、したがって、標的細胞において長期の遺伝子発現を示す。エプスタイン・バール・ウイルスに由来するエピソーム性プラスミドベクター（ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１）がヒト体細胞においてタンパク質を発現させるために使用されている（Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第３２４巻：７９７〜８０１頁、２００９年）。
【０１８２】
適切なベクターの選択は優に当業者の能力の範囲内である。発現ベクターは通常は複製起点、プロモーターを含み、所望により形質転換細胞の表現型による選択を可能にする特定の遺伝子（例えば、抗生物質抵抗性カセット）を含む。通常、発現ベクターはプロモーターを含む。そのプロモーターは誘導性又は構成的であり得る。そのプロモーターは組織特異的でもあり得る。例となるプロモーターにはＣＡＧプロモーター、チミジンキナーゼプロモーター（ＴＫ）、メタロチオネインＩ、ポリヘドロン、神経細胞特異的エノラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、βアクチン、ＣＭＶ最初期プロモーター、又は他のプロモーターが含まれる。所望によりエンハンサー配列も含まれ、エンハンサー配列は概してベクター上のどこに位置していてもよく、それでも遺伝子発現に対する増強効果を有することができる。
【０１８３】
プラスミドベクターはあらゆる適切な方法を用いてヒト細胞に導入され得る。幾つかの実施形態では前記ベクターは陽イオン性高分子脂質を使用する形質移入によって細胞に送達される。特定の例では、形質移入試薬はリポフェクタミン（商標）又は類似の試薬である。他の例ではヌクレオフェクション形質移入技術（Ａｍａｘａ、ケルン、ドイツ）を使用して送達が達成される。この技術は宿主細胞核へ直接的にＤＮＡを導入するＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）送達装置を使用する電気穿孔技法に基づいている（Ｌａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ誌、第２２巻：５３１〜５４３頁、２００４年）。さらに別の例では形質移入試薬はポリβ−アミノエステルを含む。
【０１８４】
ヒト細胞又は他の哺乳類細胞へのＤＮＡの移入は従来の技法である。例えば、単離Ｚｓｃａｎ４核酸配列（例えば、裸ＤＮＡとして、又は発現ベクターの一部として）は、例えば、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎｄｅｒ  Ｅｂ、１９７３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ誌、第５２巻：４６６頁）又はリン酸ストロンチウム（Ｂｒａｓｈら、１９８７年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．誌、第７巻：２０１３頁）による沈殿、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎら、１９８２年、ＥＭＢＯ  Ｊ．誌、第１巻：８４１頁）、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ誌、第８４巻：７４１３頁）、ＤＥＡＥデクストラン（ＭｃＣｕｔｈａｎら、１９６８年、Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．誌、第４１巻：３５１頁）、顕微注入（Ｍｕｅｌｌｅｒら、１９７８年、Ｃｅｌｌ誌、第１５巻：５７９頁）、プロトプラスト融合（Ｓｃｈａｆｎｅｒ、１９８０年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ誌、第７７巻：２１６３〜７頁）、又はペレット銃（Ｋｌｅｉｎら、１９８７年、Ｎａｔｕｒｅ誌、第３２７巻：７０頁）によって受容細胞に導入され得る。
【０１８５】
切除戦略
ゲノムの組込み部位からの外来性ポリヌクレオチドの切除が望ましい場合があり得る。ＣｒｅｌｏｘＰ組換えとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポジションの２種類の切除系方法がこれまでに説明されている。Ｓｏｌｄｎｅｒら（Ｃｅｌｌ誌、第１３６巻：９６４〜９７７頁、２００９年）はＣｒｅ−ｌｏｘシステムの使用法について記載している。この戦略は、リプログラミング因子の発現を引き起こすＤｏｘ誘導性最小ＣＭＶプロモーターを含むレンチウイルスベクターの３’ＬＴＲにｌｏｘＰ部位を配置することを含んだ。プロフイルス複製中にｌｏｘＰは５’ＬＴＲに複製され、その結果、２つのｌｏｘＰ部位によって挟み込まれたリプログラミング因子のゲノム組込が生じた。Ｃｒｅリコンビネースの一時的発現によってｌｏｘＰで挟み込まれたリプログラミング因子の切除が生じた。
【０１８６】
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンは細胞ゲノム中に外来性ＤＮＡのどのような残留物も残すことなくそのトランスポゾン自身を切除することができる（Ｅｌｉｃｋら、Ｇｅｎｅｔｉｃａ誌、第９８巻：３３〜４１頁、１９９６年；Ｆｒａｓｅｒら、Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ誌、第５巻：１４１〜１５１頁、１９９６年）。この方法を使用して、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの５’末端リピートと３’末端リピートの間に位置する２Ａペプチドリンカーで連結された遺伝子を担持するポリシストロン性構築物の送達により、ヒト細胞において２種類を越えるタンパク質を産生することに成功している。トランスポゼースが発現すると組み込まれたリプログラミング遺伝子の正確な切除が観察される（Ｋａｊｉら、Ｎａｔｕｒｅ誌、第４５８巻：７７１〜７７５頁、２００９年；Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ誌、第１０５巻：９２９０〜９２９５頁、２００８年；Ｙｕｓａら、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ誌、第６巻：３６３〜３６９頁、２００９年）。
【０１８７】
ｍＲＮＡ
ヒト細胞へＺｓｃａｎ４を導入するための別の戦略はＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡの送達によるものである。細胞へ特定のタンパク質をコードする合成ｍＲＮＡを形質移入することによってそのタンパク質を効率的に産生させることができることが示されている（Ｗａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ誌、第７巻（第５号）：６１８〜６３０頁、２０１０年）。Ｗａｒｒｅｎらによる研究ではそのｍＲＮＡは自然抗ウイルス応答を克服するために修飾された。ｍＲＮＡは細胞内で急速に分解されるので、この方法の一時性を補うために最大で数週間にわたってｍＲＮＡの形質移入を一日に１回反復して実施した。この特定の特徴は、所望の効果（すなわち、テロメアの延長とゲノム安定性の向上）を達成するために短時間（例えば、数時間から数日の程度）だけ発現が必要とされるＺｓｃａｎ４にとっては有利であり得る。ある特定の実施形態ではＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡはウイルスエンベロープ内に封入される。好ましくはそのウイルスエンベロープ外被は細胞表面受容体を認識するエンベロープタンパク質を含み、したがって、細胞への合成Ｚｓｃａｎ４  ｍＲＮＡの送達効率を上昇させる。ある特定の実施形態ではＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡはウイルスエンベロープタンパク質で被覆されたナノ粒子又はリポソーム内に封入される。当技術分野において知られているあらゆる適切なウイルスエンベロープを使用することができる。幾つかの実施形態ではそのウイルスエンベロープはセンダイウイルスエンベロープである。ウイルスエンベロープ又はウイルスエンベロープタンパク質内に合成ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドを封入する方法が当技術分野においてよく知られている。
【０１８８】
Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチドを含む細胞
本明細書に記載されるＺｓｃａｎ４核酸分子又はＺｓｃａｎ４含有ベクターを含む単離細胞が本明細書においてさらに提供される。幾つかの実施形態ではその細胞はヒト細胞である。そのヒト細胞の起源はあらゆる適切な種に由来し得る。そのヒト細胞は本明細書に記載されるあらゆる種類のヒト細胞を含み得る。
【０１８９】
Ｚｓｃａｎ４ポリペプチド
ある特定の実施形態ではＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤はＺｓｃａｎ４ポリペプチドである。ポリペプチドは単量体がアミド結合によって連結されているアミノ酸残基である高分子を指すことができる。それらのアミノ酸がα−アミノ酸であるとき、Ｌ−光学異性体又はＤ−光学異性体のどちらかを使用することができ、Ｌ−異性体が好ましい。「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語はあらゆるアミノ酸配列を包含し、且つ、糖タンパク質などの修飾型配列を内包するものとする。「ポリペプチド」という用語は具体的には天然タンパク質並びに組換え的又は合成的に産生されるタンパク質を含むものとする。
【０１９０】
様々なＺｓｃａｎ４ポリペプチドが当技術分野において知られており、且つ、本明細書に記載される方法において使用され得る。当業者は、Ｚｓｃａｎ４活性、例えば、細胞内でテロメア長を増加させ、且つ／又はゲノム安定性を向上させる能力を保持する本明細書に記載される様々なＺｓｃａｎ４ポリペプチドが本明細書に記載される方法において使用され得ることを理解する。
【０１９１】
例となるＺｓｃａｎ４ポリペプチドが本明細書において提供される。例えば、マウスＺｓｃａｎ４ａポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１１に示されており、マウスＺｓｃａｎ４ｂポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１２に示されており、マウスＺｓｃａｎ４ｃポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１３に示されており、マウスＺｓｃａｎ４ｄポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１４に示されており、マウスＺｓｃａｎ４ｅポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１５に示されており、マウスＺｓｃａｎ４ｆポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１６に示されている。さらに、ヒトＺＳＣＡＮ４ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１７に示されている。
【０１９２】
イヌＺｓｃａｎ４（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＸＰ．ｓｕｂ．−−５４１３７０．２及びＸＰ．ｓｕｂ．−−８５３６５０．１；配列番号１８）、ウシＺｓｃａｎ４（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＸＰ．ｓｕｂ．−−００１７８９３０２．１；配列番号１９）、ウマＺｓｃａｎ４（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＸＰ．ｓｕｂ．−−００１４９３９９４．１；配列番号２０）、ゴリラＺｓｃａｎ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ａ１ＹＥＱ９；配列番号３１）、ボノボＺｓｃａｎ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ａ１ＹＦＸ５のヌクレオチド配列；配列番号３２）、ボルネオオランウータンＺｓｃａｎ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ａ２Ｔ７Ｇ６；配列番号３３）、スマトラオランウータンＺｓｃａｎ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ｈ２Ｐ０Ｅ３；配列番号３４）、パンダＺｓｃａｎ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ｇ１ＬＥ２９；配列番号３５）、ブタＺｓｃａｎ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ｆ１ＳＣＱ２；配列番号３６）、キタホオジロテナガザルＺｓｃａｎ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ｇ１ＲＪＤ４；配列番号３７）、アカゲザルＺｓｃａｎ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ｆ７ＧＨ５５；配列番号３８）、モルモットＺｓｃａｎ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ｈ０Ｖ５Ｅ８；配列番号３９）、及びジュウサンセンジリス（ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ｉ３Ｎ７Ｔ３；配列番号４０）を含む様々な他の種に由来するＺｓｃａｎ４アミノ酸配列が公開されている。２００９年８月１１日のＧｅｎＢａｎｋデータベースに現れるところの上記のＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号の各々が参照により本明細書に援用される。２０１３年３月１５日のＵｎｉＰｒｏｔデータベースに現れるところの上記のＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号の各々が参照により本明細書に援用される。
【０１９３】
幾つかの実施形態では前記Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドはヒトＺＳＣＡＮ４ポリペプチド、又はそのホモログ若しくはオルソログである。幾つかの実施形態では前記Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドはマウスＺｓｃａｎ４ポリペプチド又はそのホモログ若しくはオルソログである。幾つかの実施形態では前記Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドはＺｓｃａｎ４ａポリペプチド、Ｚｓｃａｎ４ｂポリペプチド、Ｚｓｃａｎ４ｃポリペプチド、Ｚｓｃａｎ４ｄポリペプチド、Ｚｓｃａｎ４ｅポリペプチド、又はＺｓｃａｎ４ｆポリペプチドである。幾つかの実施形態では前記Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドはイヌＺｓｃａｎ４ポリペプチド、又はそのホモログ若しくはオルソログである。幾つかの実施形態では前記Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドはウシＺｓｃａｎ４ポリペプチド、又はそのホモログ若しくはオルソログである。幾つかの実施形態では前記Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドはウマＺｓｃａｎ４ポリペプチド、又はそのホモログ若しくはオルソログである。幾つかの実施形態では前記Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドは配列番号１１〜２０及び３１〜４０のいずれか１つに由来するアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１９４】
幾つかの実施形態では前記Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドはヒトＺＳＣＡＮ４ポリペプチド又はそのホモログ若しくはオルソログである。幾つかの実施形態では前記Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドは配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１９５】
当業者は分子的技術を使用してＺｓｃａｎ４ポリペプチドの断片及び変異体を容易に調製することができる。ポリペプチド断片は少なくとも１つの有用なエピトープを示すポリペプチドの一部を指すことができる。「ポリペプチドの機能性断片」という用語は、Ｚｓｃａｎ４などのポリペプチドの活性を保持する全てのポリペプチド断片を指す。例えば、生物学的機能性断片は、抗体分子に結合可能なエピトープと同じ位に小さいポリペプチド断片から細胞増殖又は分化への作用をはじめとする細胞内での表現型変更の特徴的誘導又はプログラミングに関与可能である大ポリペプチドまで、様々な大きさであり得る。エピトープは抗原との接触に応答して生じた免疫グロブリンに結合することができるポリペプチドの領域である。したがって、Ｚｓｃａｎ４の生物活性を含む小ペプチド、又はＺｓｃａｎ４の保存的変異体はそれ故に有用なものとして含まれる。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４ポリペプチドの断片はＺｓｃａｎ４ポリペプチドの少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０又は少なくとも５００の連続的アミノ酸を含む。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４の断片は目的の細胞に移入されると、限定されないが、ゲノム安定性の向上及び／又はテロメア長の増加などのＺｓｃａｎ４の機能を付与する断片である。
【０１９６】
Ｚｓｃａｎ４ポリペプチド一次アミノ酸配列のわずかな改変により、本明細書に記載される対照的非改変型ポリペプチドと比較すると実質的に同等の活性を有するペプチドが生じ得る。そのような改変は部位特異的突然変異形成による場合のように計画的であり得、又は自然発生的であり得る。これらの改変によって作り出されるポリヌペプチドの全てが本明細書に含まれる。
【０１９７】
当業者はＺｓｃａｎ４ポリペプチドと目的の第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を容易に作製することができる。所望によりＺｓｃａｎ４ポリペプチドと目的の第２のポリペプチドとの間にリンカーを含めることができる。融合タンパク質にはＺｓｃａｎ４ポリペプチドとマーカータンパク質を含むポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。幾つかの実施形態ではそのマーカータンパク質を使用してＺｓｃａｎ４ポリペプチドを特定又は精製することができる。例となる融合タンパク質には、限定されないが、緑色蛍光タンパク質、６ヒスチジン残基、又はｍｙｃとＺｓｃａｎ４ポリペプチドが含まれる。
【０１９８】
当業者は、本開示の方法に有用なＺｓｃａｎ４のそのような変異体、断片、及び融合体がＺｓｃａｎ４活性（例えば、ヒト細胞においてゲノム安定性を向上させる能力、及びテロメア長を増加させる能力、又は両方）を保持するものであることを理解する。
【０１９９】
本開示の様々な態様は実質的に精製されたポリペプチドに関する。実質的に精製されたポリペプチドは、他のタンパク質、脂質、炭水化物又はそのポリペプチドが自然状態で結合している他の物質が実質的に存在しないポリペプチドを指すことができる。１つの実施形態ではそのポリペプチドには他のタンパク質、脂質、炭水化物又はそのポリペプチドが自然状態で結合している他の物質が少なくとも５０％、例えば、少なくとも８０％存在していない。別の実施形態ではそのポリペプチドには他のタンパク質、脂質、炭水化物又はそのポリペプチドが自然状態で結合している他の物質が少なくとも９０％存在していない。さらに別の実施形態ではそのポリペプチドには他のタンパク質、脂質、炭水化物又はそのポリペプチドが自然状態で結合している他の物質が少なくとも９５％存在していない。
【０２００】
本開示のポリペプチド、例えば、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドはそのポリペプチドを構成するアミノ酸の保存的置換を含んでもよい。保存的置換により、１つのアミノ酸がサイズ、疎水性等について類似している別のアミノ酸によって置き換えられる。保存的置換の例が下に示されている。
【０２０１】
【表１】
2019122398.tif 000003
【０２０２】
コードされるタンパク質の機能的同一性及び免疫学的同一性を保存するために、保存的であってもそうでないにしても、アミノ酸の変更を引き起こすｃＤＮＡ配列の変化は最小限にされるべきである。したがって、幾つかの非限定的な例では、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドは多くても２か所、多くても５か所、多くても１０か所、多くても２０か所、又は多くても５０か所の保存的置換を含む。そのタンパク質の免疫学的同一性は、そのタンパク質が抗体によって認識されるかどうか判定することで評価され得る。そのような抗体によって認識される変異体は免疫学的に保存されている。どのようなｃＤＮＡ配列変異体でもコードされるポリペプチドにわずかに２０か所のアミノ酸置換、好ましくは１０か所よりも少ないアミノ酸置換を導入することが好ましい。
【０２０３】
ある特定の実施形態では本開示のＺｓｃａｎ４ポリペプチドはウイルスエンベロープ内に封入される。好ましくはそのウイルスエンベロープ外被は細胞表面受容体を認識するエンベロープタンパク質を含み、したがって、細胞へのＺｓｃａｎ４ポリペプチドの送達効率を上昇させる。ある特定の実施形態ではＺｓｃａｎ４ポリペプチドはウイルスエンベロープタンパク質で被覆されたナノ粒子又はリポソーム内に封入される。当技術分野において知られているあらゆる適切なウイルスエンベロープを使用することができる。幾つかの実施形態ではそのウイルスエンベロープはセンダイウイルスエンベロープである。ウイルスエンベロープ又はウイルスエンベロープタンパク質内にポリペプチドを封入する方法が当技術分野においてよく知られている。
【０２０４】
Ｚｓｃａｎ４ポリペプチドを含む細胞
本明細書に記載されるＺｓｃａｎ４ポリペプチドを含む単離細胞が本明細書においてさらに提供される。幾つかの実施形態ではその細胞はヒト細胞である。そのヒト細胞の起源はあらゆる適切な種に由来し得る。そのヒト細胞は本明細書に記載されるあらゆる種類のヒト細胞を含み得る。
【０２０５】
改変型Ｚｓｃａｎ４を含む組成物、ベクター及び細胞
改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質であって、そのタンパク質の活性が調節可能（すなわち、誘導可能又は抑制可能）であるように改変されたタンパク質をコードする単離核酸分子が本明細書において提供される。例えば、そのＺｓｃａｎ４タンパク質は誘導性の受容体又はリガンド結合ドメインを含む融合タンパク質であり得る。当技術分野において知られているあらゆる誘導性の受容体及び／又はリガンド結合ドメインを使用することができる。幾つかの実施形態ではその誘導性の受容体及び／又はリガンド結合ドメインは、限定されないが、エストロゲン受容体（ＥＲ）；タモキシフェン又はタモキシフェンの代謝物である４−ヒドロキシ−タモキシフェン（４ＯＨＴ）に感受性を有する変異型エストロゲン受容体、例えば、ＥＲＴ又はＥＲＴ２；ミフェプリストン（ＭＩＦＥＰＲＥＸ）に対して感受性を有するグルココルチコイド受容体であるグルココルチコイド受容体（ＧＲ）；薬剤調節可能リガンド結合ドメイン；及びステロイド誘導性受容体、例えば、エクダイソン誘導性受容体を含み得る。
【０２０６】
ある特定の実施形態では本開示の単離核酸分子は、融合タンパク質であって、ＥＲＴ２タンパク質に融合したＺｓｃａｎ４タンパク質を含む融合タンパク質をコードする。ＥＲＴ２はヒトエストロゲン受容体の変異型のリガンド結合ドメインである。ＥＲＴ２は生理的濃度ではその天然のリガンド（１７β−エストラジオール）に結合しないが、ナノモル濃度のタモキシフェン又はタモキシフェンの代謝物である４−ヒドロキシ−タモキシフェン（４ＯＨＴ）に対して高い感度を有する（Ｆｅｉｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ誌、第２３７巻（第３号）：７５２〜７５７頁、１９９７年）。融合タンパク質は２つの異なる（異種性）タンパク質の少なくとも一部を含むタンパク質を指すことができる。幾つかの例ではそのようなタンパク質は、２つの異なる（異種性）タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列から設計された核酸配列の発現によって生成される。融合タンパク質を生成するため、それらの核酸配列は同じリーディングフレーム内になくてはならず、且つ、内部終止コドンを含んでいてはならない。
【０２０７】
幾つかの実施形態では本開示の改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＺｓｃａｎ４部分をコードする核酸分子はヒトＺＳＣＡＮ４、マウスＺｓｃａｎ４ｃ、マウスＺｓｃａｎ４ｄ又はマウスＺｓｃａｎ４ｆ、又はそれらの機能性断片若しくは変異体である。改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質をコードする核酸分子は本明細書に記載されるあらゆるＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体を含み得る。Ｚｓｃａｎ４の機能性断片及び変異体は、例えば、幹細胞の多能性を増加させる能力、ゲノム安定性を促進する能力、又はテロメア長を増加させる能力などのＺｓｃａｎ４の１つ以上の生物活性を保持するあらゆるＺｓｃａｎ４断片又は変異体を含む。
【０２０８】
幾つかの実施形態では本開示の改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＺｓｃａｎ４部分をコードする核酸分子は、例えば、配列番号１〜１０及び２１〜３０のいずれか１つに由来するヌクレオチド配列を含み得る。幾つかの実施形態では本開示の改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＺｓｃａｎ４部分をコードする核酸分子はマウスＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド又はそのホモログである。幾つかの実施形態では本開示の改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＺｓｃａｎ４部分をコードする核酸分子はヒトＺＳＣＡＮ４ポリヌクレオチド又はそのホモログである。幾つかの実施形態では本開示の改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＺｓｃａｎ４部分をコードする核酸分子はＺｓｃａｎ４ａポリヌクレオチド、Ｚｓｃａｎ４ｂポリヌクレオチド、Ｚｓｃａｎ４ｃポリヌクレオチド、Ｚｓｃａｎ４ｄポリヌクレオチド、Ｚｓｃａｎ４ｅポリヌクレオチド、又はＺｓｃａｎ４ｆポリヌクレオチドである。幾つかの実施形態では本開示の改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＺｓｃａｎ４部分をコードする核酸分子は配列番号１〜１０及び２１〜３０のいずれか１つに由来するヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０２０９】
幾つかの実施形態では本開示の改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＺｓｃａｎ４部分をコードする核酸分子はヒトＺＳＣＡＮ４ポリヌクレオチド又はそのホモログである。幾つかの実施形態では本開示の改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＺｓｃａｎ４部分をコードする核酸分子は配列番号７のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０２１０】
幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４融合タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質をコードする核酸分子はそのＺｓｃａｎ４配列とその誘導性受容体配列及び／又は誘導性リガンド結合ドメイン配列、例えば、ＥＲＴ２コード配列との間にリンカー配列を含む。リンカーは当技術分野においてよく知られており、且つ、適切なリンカーの選択は優に当業者の能力の範囲内である。リンカーは、２分子の間、例えば、２つの核酸分子又は（例えば、融合タンパク質内の）２つのペプチドの間のスペーサーとして機能する１つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸を指すことができる。幾つかの実施形態ではリンカーは１〜１００個のアミノ酸、例えば、１〜５０個又は５〜１０個のアミノ酸である。幾つかの実施形態ではそのリンカーは少なくとも２個のアミノ酸（ａａ）、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個又は少なくとも１００個のａａ、例えば、２〜５０個又は２〜１０個のａａである。幾つかの実施形態ではそのリンカーはＡｌａ−Ｓｅｒのアミノ酸配列を含む。
【０２１１】
本明細書において開示される改変型Ｚｓｃａｎ４コード核酸分子、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２コード核酸分子を含むベクターも提供される。発現（プラスミド）ベクター（例えば、ｐＰｙＣＡＧ−ＢｓｔＸＩ−ＩＰ）、又はウイルスベクター（例えば、センダイウイルスベクターなどのパラミクソウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクター）などのあらゆる適切な発現ベクターが企図されている。多数の発現ベクター及びウイルスベクターが当技術分野において知られており、且つ、適切なベクターの選択は優に当業者の能力の範囲内である。
【０２１２】
本明細書に記載される改変型Ｚｓｃａｎ４核酸分子又はベクター、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２核酸分子又はベクターを含む単離細胞が本明細書においてさらに提供される。幾つかの実施形態ではその細胞はヒト細胞である。そのヒト細胞の起源はあらゆる適切な種に由来し得る。そのヒト細胞は本明細書に記載されるあらゆる種類のヒト細胞を含み得る。
【０２１３】
改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質をコードする核酸分子又はベクターを含む組成物も本明細書において提供される。それらの組成物は担体又は希釈剤、例えば、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤をさらに含み得る。本明細書に記載される前記核酸分子及びベクターによってコードされる改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質がさらに提供される。
【０２１４】
組換え改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質も本明細書において提供される。幾つかの実施形態ではその組換え改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質はヒトＺＳＣＡＮ４、マウスＺｓｃａｎ４ｃ、マウスＺｓｃａｎ４ｄ又はマウスＺｓｃａｎ４ｆ、又はそれらの機能性断片若しくは変異体である。その改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２組換え融合タンパク質のＺｓｃａｎ４部分は本明細書に記載されるあらゆるＺｓｃａｎ４ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、断片、又は変異体を含み得る。Ｚｓｃａｎ４の機能性断片及び変異体は、例えば、ゲノム安定性を向上させる能力、又はテロメア長を増加させる能力などのＺｓｃａｎ４の１つ以上の生物活性を保持するあらゆるＺｓｃａｎ４断片又は変異体を含む。
【０２１５】
幾つかの実施形態では改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＺｓｃａｎ４タンパク質部分はマウスＺｓｃａｎ４ポリペプチド又はそのホモログ若しくはオルソログである。幾つかの実施形態では改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＺｓｃａｎ４タンパク質部分はヒトＺＳＣＡＮ４ポリペプチド、又はそのホモログ若しくはオルソログである。幾つかの実施形態では改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＺｓｃａｎ４タンパク質部分はＺｓｃａｎ４ａポリペプチド、Ｚｓｃａｎ４ｂポリペプチド、Ｚｓｃａｎ４ｃポリペプチド、Ｚｓｃａｎ４ｄポリペプチド、Ｚｓｃａｎ４ｅポリペプチド、又はＺｓｃａｎ４ｆポリペプチドである。幾つかの実施形態では改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＺｓｃａｎ４タンパク質部分は配列番号１１〜２０及び３１〜４０のいずれか１つに由来するアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２１６】
幾つかの実施形態では改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＺｓｃａｎ４タンパク質部分はヒトＺＳＣＡＮ４ポリペプチド又はそのホモログ若しくはオルソログである。幾つかの実施形態では改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のＺｓｃａｎ４タンパク質部分は配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２１７】
当業者は分子的技術を使用してＺｓｃａｎ４タンパク質の断片及び変異体を容易に調製することができる。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４タンパク質の断片はＺｓｃａｎ４ポリペプチドの少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０又は少なくとも５００の連続的アミノ酸を含む。追加の実施形態ではＺｓｃａｎ４の断片は、限定されないが、ゲノム安定性の向上及び／又はテロメア長の増加などのＺｓｃａｎ４の機能を付与する断片である。
【０２１８】
改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質を含む組成物も本明細書において提供される。それらの組成物は薬学的に許容可能な担体又は希釈剤などの担体又は希釈剤、例えば、生理食塩水をさらに含み得る。
【０２１９】
Ｚｓｃａｎ４−ΔＣを含む組成物、ベクター及び細胞
Ｃ末端短縮を有するＺｓｃａｎ４タンパク質（本明細書においてＺｓｃａｎ４−ΔＣと呼ぶ）をコードする単離核酸分子も本明細書において提供される。そのＣ末端短縮型Ｚｓｃａｎ４は少なくとも１つのジンクフィンガードメインの欠失を含む。したがって、幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は１つ、２つ、３つ又は４つのジンクフィンガードメインの欠失を有する。
【０２２０】
幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をコードする核酸分子はＣ末端短縮型のヒトＺＳＣＡＮ４、マウスＺｓｃａｎ４ｃ、マウスＺｓｃａｎ４ｄ又はマウスＺｓｃａｎ４ｆである。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質は４つ全てのジンクフィンガードメインの欠失を有するヒトＺＳＣＡＮ４又はマウスＺｓｃａｎ４ｃのどちらかである。Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をコードする核酸分子は本明細書に記載されるあらゆるＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドのＣ末端短縮を含み得る。
【０２２１】
幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をコードする核酸分子のＺｓｃａｎ４部分は、例えば、配列番号１〜１０及び２１〜３０のいずれか１つに由来するヌクレオチド配列を含み得る。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をコードする核酸分子のＺｓｃａｎ４部分はマウスＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド又はそのホモログである。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をコードする核酸分子のＺｓｃａｎ４部分はヒトＺＳＣＡＮ４ポリヌクレオチド又はそのホモログである。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をコードする核酸分子のＺｓｃａｎ４部分はＺｓｃａｎ４ａポリヌクレオチド、Ｚｓｃａｎ４ｂポリヌクレオチド、Ｚｓｃａｎ４ｃポリヌクレオチド、Ｚｓｃａｎ４ｄポリヌクレオチド、Ｚｓｃａｎ４ｅポリヌクレオチド、又はＺｓｃａｎ４ｆポリヌクレオチドである。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をコードする核酸分子のＺｓｃａｎ４部分は配列番号１〜１０及び２１〜３０のいずれか１つに由来するヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０２２２】
幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をコードする核酸分子のＺｓｃａｎ４部分はヒトＺＳＣＡＮ４ポリヌクレオチド又はそのホモログである。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をコードする核酸分子のＺｓｃａｎ４部分は配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０２２３】
本明細書において企図されているＺｓｃａｎ４−ΔＣ核酸配列は、遺伝暗号の結果として縮重している配列を含む。２０種類の天然アミノ酸が存在し、それらのアミノ酸のほとんどが１種類より多くのコドンによって指定される。したがって、全ての縮重ヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列によってコードされるＺｓｃａｎ４−ΔＣポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変わっていない限り、含まれる。
【０２２４】
本明細書において開示されるＺｓｃａｎ４−ΔＣコード核酸分子を含むベクターも提供される。発現（プラスミド）ベクター（例えば、ｐＰｙＣＡＧ−ＢｓｔＸＩ−ＩＰ）、又はウイルスベクター（例えば、センダイウイルスベクターなどのパラミクソウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクター）などのあらゆる適切な発現ベクターが企図されている。多数の発現ベクター及びウイルスベクターが当技術分野において知られており、且つ、適切なベクターの選択は優に当業者の能力の範囲内である。
【０２２５】
本明細書に記載されるＺｓｃａｎ４−ΔＣ核酸分子又はベクターを含む単離細胞が本明細書においてさらに提供される。幾つかの実施形態ではその細胞はヒト細胞である。そのヒト細胞の起源はあらゆる適切な種に由来し得る。そのヒト細胞は本明細書に記載されるあらゆる種類のヒト細胞を含み得る。
【０２２６】
Ｚｓｃａｎ４ΔＣタンパク質をコードする核酸分子又はベクターを含む組成物も本明細書において提供される。それらの組成物は担体又は希釈剤、例えば、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤をさらに含み得る。
【０２２７】
本明細書に記載される前記核酸分子及びベクターによってコードされるＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質がさらに提供される。
【０２２８】
組換えＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質も本明細書において提供される。幾つかの実施形態では組換えＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質はＣ末端短縮型のヒトＺＳＣＡＮ４、マウスＺｓｃａｎ４ｃ、マウスＺｓｃａｎ４ｄ又はマウスＺｓｃａｎ４ｆである。組換えＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質のＺｓｃａｎ４部分は本明細書に記載されるあらゆるＺｓｃａｎ４ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、断片、又は変異体を含み得る。
【０２２９】
幾つかの実施形態では組換えＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質のＺｓｃａｎ４タンパク質部分はマウスＺｓｃａｎ４ポリペプチド又はそのホモログ若しくはオルソログである。幾つかの実施形態では組換えＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質のＺｓｃａｎ４タンパク質部分はヒトＺＳＣＡＮ４ポリペプチド、又はそのホモログ若しくはオルソログである。幾つかの実施形態では組換えＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質のＺｓｃａｎ４タンパク質部分はＺｓｃａｎ４ａポリペプチド、Ｚｓｃａｎ４ｂポリペプチド、Ｚｓｃａｎ４ｃポリペプチド、Ｚｓｃａｎ４ｄポリペプチド、Ｚｓｃａｎ４ｅポリペプチド、又はＺｓｃａｎ４ｆポリペプチドである。幾つかの実施形態では組換えＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質のＺｓｃａｎ４タンパク質部分は配列番号１１〜２０及び３１〜４０のいずれか１つに由来するアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２３０】
幾つかの実施形態では組換えＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質のＺｓｃａｎ４タンパク質部分はヒトＺＳＣＡＮ４ポリペプチド又はそのホモログ若しくはオルソログである。幾つかの実施形態では組換えＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質のＺｓｃａｎ４タンパク質部分は配列番号１７に由来するアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２３１】
本明細書において開示されるＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質を含む単離細胞が本明細書においてさらに提供される。幾つかの実施形態ではそれらの細胞はヒト細胞である。そのヒト細胞の起源はあらゆる適切な種に由来し得る。そのヒト細胞は本明細書に記載されるあらゆる種類のヒト細胞を含み得る。
【０２３２】
Ｚｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質を含む組成物も本明細書において提供される。それらの組成物は薬学的に許容可能な担体又は希釈剤などの担体又は希釈剤、例えば、生理食塩水をさらに含み得る。
【０２３３】
ヒト細胞へＺｓｃａｎ４ポリペプチドを導入する方法
それぞれのタンパク質をヒト細胞などの細胞へ直接的に送達することによってＺｓｃａｎ４ポリペプチドを導入することが可能である。例えば、標準的方法に従って電気穿孔法、顕微注入、陽イオン性脂質又はナノ粒子を用いてタンパク質送達を達成することができる。あるいは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）との融合によりそれらのタンパク質を改変して細胞へのタンパク質の侵入を促進することができる。ＣＰＰ及びナノ粒子の使用については本明細書においてさらに詳細に考察する。
【０２３４】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）
ＣＰＰは、膜を横断するタンパク質、核酸又は他の化合物の導入を受容体と無関係に促進するポリペプチドのファミリーである（Ｗａｄｉａ及びＤｏｗｄｙ、Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ．  Ｓｃｉ．誌、第４巻（第２号）：９７〜１０４頁、２００３年）。典型的には、ＣＰＰは、ＣＰＰが結合している化合物の細胞エンドソームへの細胞取込を促進することができる短鎖ポリカチオン性配列である。ＣＰＰの例にはポリアルギニンタグ及びタンパク質導入ドメインが挙げられる。当技術分野において知られているあらゆるタンパク質導入ドメインを使用することができる。適切なタンパク質導入ドメインの例には、限定されないが、ＨＩＶ  Ｔａｔ、ＨＩＶ  Ｖｐｒ、ＨＩＶ  Ｖｐ２２、ホメオドメイン（ＨＤ）含有タンパク質のＨＤ、及び合成タンパク質導入ドメインが挙げられる。
【０２３５】
細胞へタンパク質又は核酸を送達するある特定のペプチドの能力は、Ｔａｔタンパク質は膜を通過し、転写を開始することが示されたＨＩＶがコードするＴａｔタンパク質について最初に述べられた。その後、タンパク質の導入に必要なＴａｔタンパク質の部分はＴａｔペプチドと呼ばれる１１アミノ酸ポリペプチドだけであることがわかった。他のタンパク質と融合されるとそのＴａｔペプチドは１５〜１２０ｋＤａまでの様々なサイズのこれらのタンパク質を組織培養中の細胞に送達することが示されている（Ｆｒａｎｋｅｌ及びＰａｂｏ、Ｃｅｌｌ誌、第５５巻（第６号）：１１８９〜９３頁、１９８８年；Ｇｒｅｅｎ及びＬｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、第１３４巻（第３号）：８４９〜５５頁、１９８８年；Ｖｉｖｅｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．誌、第２７２巻（第２５号）：１６０１０〜７頁、１９９７年；Ｙｏｏｎら、Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、第４２巻（第４号）：３２８〜３５頁、２００４年；Ｃａｉら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．誌、第２７巻（第４号）：３１１〜９頁、２００６年）。
【０２３６】
他の公知のＣＰＰにはＰＥＮＥＴＲＡＴＩＮ（商標）、ショウジョウバエ・アンテナペディア・ホメオボックス遺伝子の第３ヘリックス由来の１６アミノ酸ペプチド（米国特許第５８８８７６２号明細書；Ｄｅｒｏｓｓｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．誌、第２６９巻：１０４４４〜１０４５０頁、１９９４年；Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．誌、第２１巻：４５〜４８頁、２０００年）、トランスポータン、リシンによって連結されている神経ペプチドガラニンのＮ末端に由来する１２アミノ酸と１４アミノ酸タンパク質マストパランから構成される２７アミノ酸キメラペプチド（米国特許第６８２１９４８号明細書；Ｐｏｏｇａ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．誌、第１２巻：６７〜７７頁、１９９８年；Ｈａｗｉｇｅｒ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．誌、第３巻：８９〜９４頁、１９９９年）、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のＶＰ２２タンパク質由来ペプチド（Ｅｌｌｉｏｔｔら、Ｃｅｌｌ誌、第８８巻：２２３〜２３３頁、１９９７年）；ＨＳＶ−２のＵＬ−５６タンパク質（米国特許出願公開第２００６／００９９６７７号明細書）、及びＨＩＶ−１のＶｐｒタンパク質（米国特許出願公開第２００５／０２８７６４８号明細書）が含まれる。加えて、ポリアルギニン、ポリリシン及び他のもののような多数の人工ペプチドもＣＰＰとして機能することが知られている（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１０６１９７号明細書、第２００６／００２４３３１号明細書、第２００５／０２８７６４８号明細書、及び第２００３／０１２５２４２号明細書；Ｚｈｉｂａｏら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．誌、第２巻：３３９〜３４７頁、２０００年；及びＬａｕｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．誌、第１８巻：１２６９〜１２７２頁、２０００年を参照のこと）。
【０２３７】
Ｚｈｏｕら（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ誌、第４巻：３８１〜３８４頁、２００９年）はポリアルギニンペプチドタグの成功的使用について記載している。加えて、Ｋｉｍら（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ誌、第４巻：４７２〜４７６頁、２００９年）はヒト胎児線維芽細胞へタンパク質を送達するためのＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質導入ドメインの成功的使用について記載している。
【０２３８】
ナノ粒子
ナノ粒子は、急速放出又は制御放出のどちらかに適した合成小分子ベース、タンパク質ベース、ペプチドベース、細胞ベース及び核酸ベースの生物学的治療薬などの封入化薬品を運搬することができるサブミクロン（約１０００ｎｍ未満）サイズの薬品送達担体である。当技術分野においてよく知られている処理法を用いて様々な分子（例えば、タンパク質、ペプチド及び核酸分子）を効率的にナノ粒子に封入することができる。ナノ粒子に封入された分子は、ナノ粒子内に含有されているか、又はナノ粒子の表面に結合されているかのどちらかである分子、又はそれらの組合せの分子（Ｚｓｃａｎ４核酸又はタンパク質等）を指すことができる。
【０２３９】
幾つかの例ではヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤が、それらの細胞への送達を支援するためにナノ粒子によって封入される。本開示の方法に関する使用に適切なナノ粒子が当技術分野において知られており、且つ、下で簡単に説明されている。
【０２４０】
本明細書に記載される方法に関して使用されるナノ粒子はあらゆる種類の生体適合性ナノ粒子、例えば、ポリアミドナノ粒子、ポリカーボネートナノ粒子、ポリアルケンナノ粒子、ポリビニルエーテルナノ粒子、及びセルロースエーテルナノ粒子を含むがこれらに限定されない高分子ナノ粒子などの生物分解性ナノ粒子であり得る。幾つかの実施形態ではそれらのナノ粒子は生体適合性で生物分解性の物質から作製されている。幾つかの実施形態ではそれらのナノ粒子はポリ（乳酸）又はポリ（グリコール酸）、又はポリ（乳酸）とポリ（グリコール酸）の両方を含むナノ粒子を含むが、それらのナノ粒子に限定されない。幾つかの実施形態ではそれらのナノ粒子はポリＤ，Ｌ−乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子である。
【０２４１】
ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）及びポリグリコライド（ＰＧＡ）などの他の生物分解性高分子材料を本明細書に記載される方法に関して使用することが企図されている。その他の有用なナノ粒子には生物分解性ポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子が含まれる（Ｖａｕｔｈｉｅｒら、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．  Ｒｅｖ．誌、第５５巻：５１９〜４８頁、２００３年）。
【０２４２】
様々な種類の生物分解性で生体適合性のナノ粒子、ＰＬＧＡナノ粒子をはじめとするそのようなナノ粒子を作製する方法、並びに様々な合成化合物、タンパク質及び核酸を封入する方法が当技術分野においてよく記載されている（例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８０７４号明細書、米国特許出願公開第２００７００９２５７５号明細書、米国特許第２００６／０２４６１３９号明細書、米国特許第５７５３２３４号明細書、米国特許第７０８１４８９号明細書、及びＰＣＴ出願国際公開第２００６／０５２２８５号を参照のこと）。
【０２４３】
レチノイド
ある特定の実施形態ではＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤はレチノイドである。レチノイドは、ビタミンＡに化学的に関連する化合物の一分類を指すことができる。レチノイドは、主に上皮細胞の増殖を調節する仕様のために医療において使用されている。レチノイドは、視覚における役割、細胞増殖と分化の調節、骨組織の増殖、免疫機能、及び腫瘍抑制遺伝子の活性化をはじめとする身体中の多数の重要で多様な機能を有する。レチノイドの例には全トランス型レチノイン酸（ａｔＲＡ）、９−ｃｉｓレチノイン酸（９−ｃｉｓＲＡ）、１３−ｃｉｓＲＡ及びビタミンＡ（レチノール）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４４】
様々なレチノイドが当技術分野において知られており、且つ、本明細書に記載される方法において使用され得る。レチノイドは、限定されないが、全トランス型レチノイン酸、９−ｃｉｓレチノイン酸、１３−ｃｉｓレチノイン酸、又はビタミンＡを含み得る。
【０２４５】
酸化ストレスを誘発する薬剤
ある特定の実施形態ではＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤は酸化ストレスを誘発する薬剤である。酸化ストレスは、反応性酸素種の産生と反応性中間産物を直ぐに無毒化する生体システムの能力との間の不均衡、又は反応性酸素種の産生とそれらの反応性中間産物によって生じた損傷を修復する生体システムの能力との間の不均衡を指すことができる。組織の正常な酸化還元状態の妨害が、タンパク質、脂質、及びＤＮＡをはじめとする細胞の全ての構成成分に損傷を与える過酸化物とフリーラジカルの産生を介する毒性効果の原因になり得る。本開示の方法の幾つかの実施形態では酸化ストレスを誘発する薬剤は過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）である。
【０２４６】
酸化ストレスを誘発する様々な薬剤が当技術分野において知られており、且つ、本明細書に記載される方法において使用され得る。
【０２４７】
テロメア長の増加とゲノム安定性の向上
本開示のある特定の態様は、例えば１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現（例えば、タンパク質発現）を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させることによって１つ以上のヒト細胞においてテロメア長を増加させる方法及び／又はゲノム安定性を向上させる方法に関する。本明細書において開示されるように、発現の一時的上昇及び／又はわずかに短期間（例えば、約１時間から約２３時間まで、又は約１日から約１０日まで）の発現上昇がヒト細胞におけるテロメア長の増加及び／又はゲノム安定性の向上に充分である。また、幾つかの実施形態ではヒト細胞におけるＺｓｃａｎ４発現の一時的上昇の反復によってＺｓｃａｎ４の発現上昇の効果が増強される。ある特定の実施形態ではＺｓｃａｎ４発現の一時的上昇は４時間毎、８時間毎、１２時間毎、１６時間毎、２４時間毎、３２時間毎、４０時間毎、４８時間毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、１週間毎、２週間毎、３週間毎、４週間毎、１か月毎、２か月毎、３か月毎、４か月毎、６か月毎、７か月毎、８か月毎、９か月毎、１０か月毎、１１か月毎、１年毎、２年毎、３年毎、４年毎、５年毎、６年毎、７年毎、８年毎、９年毎、１０年毎、１１年毎、１２年毎、１３年毎、１４年毎、１５年毎、１６年毎、１７年毎、１８年毎、１９年毎、２０年毎、２１年毎、２２年毎、２３年毎、２４年毎、２５年毎、２６年毎、２７年毎、２８年毎、２９年毎、３０年毎、３５年毎、４０年毎、４５年毎、又は５０年毎に繰り返される。
【０２４８】
接触は、直接的な物理的会合状態の配置を指すことができ、固体におけるものと液体におけるものの両方を含む。「接触」は「曝露」と互換的に使用され得る。幾つかの事例では「接触」は形質移入、例えば、細胞への核酸分子の形質移入を含む。ゲノム安定性とテロメア長を測定する方法は当技術分野において日常的なものであり、本開示は特定の方法に限定されない。本明細書において提供される特定の例は例示的なものである。
【０２４９】
幾つかの実施形態ではテロメア長はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４タンパク質発現を上昇させる薬剤と接触した前記ヒト細胞において、例えばＺｓｃａｎ４発現を上昇させる前記薬剤と接触していない対応するヒト細胞におけるＺｓｃａｎ４タンパク質発現と比べて少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．１５倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．２５倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．３５倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．４５倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．５５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６．０倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７．０倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８．０倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９．０倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、少なくとも１，０００倍、少なくとも２，０００倍、少なくとも３，０００倍、少なくとも４，０００倍、少なくとも５，０００倍、少なくとも６，０００倍、少なくとも７，０００倍、少なくとも８，０００倍、少なくとも９，０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも２５，０００倍、少なくとも５０，０００倍、少なくとも７５，０００倍、少なくとも１００，０００倍、少なくとも１２５，０００倍、少なくとも１５０，０００倍、少なくとも１７５，０００倍、少なくとも２００，０００倍、少なくとも２２５，０００倍、少なくとも２５０，０００倍、少なくとも２７５，０００倍、少なくとも３００，０００倍、少なくとも３２５，０００倍、少なくとも３５０，０００倍、少なくとも３７５，０００倍、少なくとも４００，０００倍、少なくとも４２５，０００倍、少なくとも４５０，０００倍、少なくとも４７５，０００倍、少なくとも５００，０００倍、少なくとも５２５，０００倍、少なくとも５５０，０００倍、少なくとも５７５，０００倍、少なくとも６００，０００倍、少なくとも６２５，０００倍、少なくとも６５０，０００倍、少なくとも６７５，０００倍、少なくとも７００，０００倍、少なくとも７２５，０００倍、少なくとも７５０，０００倍、少なくとも７７５，０００倍、少なくとも８００，０００倍、少なくとも８２５，０００倍、少なくとも８５０，０００倍、少なくとも８７５，０００倍、少なくとも９００，０００倍、少なくとも９２５，０００倍、少なくとも９５０，０００倍、少なくとも９７５，０００倍、又は少なくとも１，０００，０００倍増加する。細胞中のＺｓｃａｎ４タンパク質発現を測定するための、又は細胞あたりのタンパク質数（すなわち、タンパク質化学量論）を定量するための当技術分野において知られており、且つ、本明細書において開示されるあらゆる方法を用いることができる。
【０２５０】
他の実施形態では１つ以上のヒト細胞においてテロメア長を増加させる方法、及び／又はゲノム安定性を向上させる方法は、本開示の改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質をコードする核酸分子又はベクターと１つ以上のヒト細胞を接触させることを含む。他の実施形態では前記方法は本開示の改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、例えば、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質とヒト細胞又はヒト細胞集団を接触させることを含む。
【０２５１】
さらに他の実施形態では１つ以上のヒト細胞においてテロメア長を増加させる方法、及び／又はゲノム安定性を向上させる方法は本明細書において開示されるＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をコードする核酸分子又はベクターとヒト細胞又はヒト細胞集団を接触させることを含む。他の実施形態では前記方法は本明細書において開示されるＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質とヒト細胞又はヒト細胞集団を接触させることを含む。
【０２５２】
Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２又はＺｓｃａｎ４−ΔＣをコードする核酸分子、及びＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２タンパク質又はＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質をヒト細胞に送達する方法が当技術分野において知られており、且つ、本明細書に記載されている。
【０２５３】
幾つかの実施形態ではテロメア長はヒト細胞において、例えばＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２タンパク質又はＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質などの改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、又はＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２タンパク質若しくはＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質などの改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質をコードする核酸と接触していないヒト細胞と比べて（又はＺｓｃａｎ４の頻繁な活性化を経験していないヒト細胞において予期される値、又は値の範囲と比べて）少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１５５％、又は少なくとも１６０％増加する。幾つかの実施形態ではテロメア長はヒト細胞において、例えばＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２タンパク質又はＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質などの改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質、又はＺｓｃａｎ４−ＥＲＴ２タンパク質若しくはＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質などの改変型Ｚｓｃａｎ４タンパク質をコードする核酸と接触していないヒト細胞と比べて（又はＺｓｃａｎ４の頻繁な活性化を経験していないヒト細胞において予期される値、又は値の範囲と比べて）少なくとも少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．１５倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．２５倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．３５倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．４５倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．５５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６．０倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７．０倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８．０倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９．０倍、少なくとも９．５倍、又は少なくとも１０倍増加する。
【０２５４】
幾つかの実施形態ではテロメア長はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤と接触していない１つ以上のヒト細胞において測定される。幾つかの例ではテロメア長が例えばＺｓｃａｎ４発現を上昇させる前記薬剤と接触していないヒト細胞におけるテロメア長と比べて長い場合、そのテロメア長はヒト細胞において増加している。例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、定量的ＦＩＳＨ（Ｑ−ＦＩＳＨ）、又はテロメアｑＰＣＲによってヒト細胞においてテロメア長を検出することができる。
【０２５５】
ゲノム安定性
幾つかの実施形態ではゲノム安定性はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤と接触した１つ以上のヒト細胞において、例えばＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる前記薬剤と接触していない対応するヒト細胞と比べて少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％向上する。
【０２５６】
ゲノム安定性を測定する方法は当技術分野において日常的なものであり、本開示は特定の方法に限定されない。本明細書において提供される特定の例は例示的なものである。
【０２５７】
幾つかの例では、ヒト細胞、例えば、Ｚｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤（例えば、Ｚｓｃａｎ４核酸、Ｚｓｃａｎ４タンパク質、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ又はＺｓｃａｎ４−ΔＣなどのＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤）と接触したヒト細胞におけるゲノム安定性は核型分析を実施することにより測定される。例えばＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる前記薬剤と接触していない細胞と比べて核型異常（染色体融合及び断片化等）の存在が減少している、又はそれどころか存在していない場合、ゲノム安定性が向上している。例えば、中期停止を誘導し、その後に中期染色体伸展標本を調製することによりヒト細胞において核型分析を実施することができる。
【０２５８】
幾つかの例ではヒト細胞、例えば、Ｚｓｃａｎ４、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ、又はＺｓｃａｎ４−ΔＣのタンパク質又は核酸と接触したヒト細胞におけるゲノム安定性は姉妹染色分体交換（ＳＣＥ）を測定することによって測定される。Ｚｓｃａｎ４の頻繁な活性化を経験していない幹細胞などの対照と比べてＳＣＥの存在が減少している場合、ゲノム安定性が向上している。例えば、中期伸展標本においてＳＣＥを検出することによって幹細胞においてＳＣＥを測定することができる。
【０２５９】
Ｚｓｃａｎ４の治療上の使用法
Ｚｓｃａｎ４の発現によってテロメア長が増加し、ゲノム安定性が向上し、ゲノム異常及び／又は染色体異常が修正され、ＤＮＡ損傷から細胞が保護され、且つ／又はＤＮＡ修復が増強されることが本明細書において開示される。ＤＮＡ修復は、細胞がその細胞のゲノムをコードするＤＮＡ分子に対する損傷を特定し、修正する一群の過程を指すことができる。したがって、ヒト細胞においてゲノム安定性を向上させるための、ＤＮＡ損傷から細胞を保護するための、ＤＮＡ修復を増強するための、及びテロメア長を増加させるためのヒト細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現上昇に関連する方法が本明細書において提供される。
【０２６０】
ヒト細胞療法を必要とする対象、例えば、テロメア延長を必要とするヒト細胞、又はテロメア異常及び／若しくは染色体異常の修正を必要とするヒト細胞を有する対象を処置するための方法が提供される。これらの方法はヒト細胞の使用を含み得る。幾つかの実施形態ではそれらの方法は、ヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と１つ以上のヒト細胞を接触させることを含み得る。それらの１つ以上のヒト細胞におけるＺｓｃａｎ４の発現上昇によって、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較すると前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長が誘導される。
【０２６１】
テロメア延長を必要とする対象を処置するための方法が提供される。幾つかの実施形態ではそれらの方法は、前記対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長を誘導することを含み得る。幾つかの実施形態ではそれらの方法は、１つ以上のヒト細胞を単離すること、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させること、及び前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与することを含み得る。Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長が誘導される。
【０２６２】
テロメア異常及び／又は染色体異常に関連する疾患又は健康状態を治療するための方法も提供される。幾つかの実施形態ではそれらの方法は、治療を必要とする対象中の１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記対象に投与し、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞におけるテロメア延長並びに／又はテロメア異常及び／若しくは染色体異常の修正を誘導してテロメア異常及び／又は染色体異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療することを含み得る。幾つかの実施形態ではそれらの方法は、テロメア異常及び／又は染色体異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象から１つ以上のヒト細胞を単離すること、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させること、及び前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与してテロメア異常及び／又は染色体異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療することを含み得る。Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてテロメア延長並びに／又はテロメア異常及び／若しくは染色体異常の修正が誘導される。幾つかの実施形態ではそれらの方法は、テロメア異常及び／又は染色体異常に関連する疾患又は健康状態を患う対象からヒト骨髄細胞を単離すること、前記ヒト骨髄細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記ヒト骨髄細胞を接触させること、及び前記接触済みヒト骨髄細胞を前記対象に移植してテロメア異常及び／又は染色体異常に関連する前記疾患又は健康状態を治療することを含み得る。Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記ヒト骨髄細胞においてテロメア延長並びに／又はテロメア異常及び／若しくは染色体異常の修正が誘導される。
【０２６３】
１つ以上のヒト細胞のゲノム安定性を向上させるための方法も提供される。幾つかの実施形態ではそれらの方法は、１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と１つ以上のヒト細胞を接触させ、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較してＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞においてゲノム安定性を向上させることを含み得る。
【０２６４】
１つ以上のヒト細胞のＤＮＡ修復能を向上させるための方法も提供される。幾つかの実施形態ではそれらの方法は、１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と１つ以上のヒト細胞を接触させ、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較してＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞におけるＤＮＡ修復能を向上させることを含み得る。
【０２６５】
１つ以上のヒト細胞を若返らせるための、及び／又は１つ以上のヒト細胞の寿命を延長するための方法も提供される。幾つかの実施形態ではそれらの方法は、１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と１つ以上のヒト細胞を接触させ、前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞と比較してＺｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞を若返らせること、及び／又は前記１つ以上のヒト細胞の寿命を延長することを含み得る。
【０２６６】
対象内の組織又は器官を若返らせるための、及び／又は対象内の組織又は器官の寿命を延長するための方法が提供される。幾つかの実施形態ではそれらの方法は、組織又は器官の寿命の延長を必要とする対象に前記組織又は器官においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与し、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記組織又は器官を若返らせること、及び／又は前記組織又は器官の寿命を延長することを含み得る。
【０２６７】
組織専属性幹細胞（すなわち、ヒト身体の器官及び／又は組織に内在する組織幹細胞）における１つ以上の欠損に関連する疾患又は健康状態、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための方法が提供される。幾つかの実施形態ではそれらの方法は、治療を必要とする対象の組織専属性幹細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を前記組織専属性幹細胞に投与し、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によってそれらの細胞の劣化を防止することを含み得る。
【０２６８】
若返りを必要とする対象を若返らせるための、及び／又は寿命の延長を必要とする対象の寿命を延長するための方法が提供される。幾つかの実施形態ではそれらの方法は、前記対象にＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤を投与し、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記対象を若返らせること、及び／又は前記対象の寿命を延長することを含み得る。ある特定の実施形態ではそれらの方法は、前記対象より１つ以上のヒト細胞を単離すること、前記１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と前記１つ以上のヒト細胞を接触させ、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって前記１つ以上のヒト細胞を若返らせること、及び／又は前記１つ以上のヒト細胞の寿命を延長すること、及び前記接触済みの１つ以上のヒト細胞を前記対象に投与して前記対象を若返らせること、及び／又は前記対象の寿命を延長することを含み得る。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる前記薬剤の投与は、限定されないが、処置器官及び／又は組織に内在する組織幹細胞、始原細胞、及び／又は最終分化細胞を若返らせるために身体の各器官及び組織に前記薬剤を注入すること、前記対象の循環血液に前記薬剤を注入すること、前記対象の脳脊髄液に前記薬剤を注入すること、前記対象のリンパ系に前記薬剤を注入すること、前記対象の肺組織に前記薬剤を投与すること、前記対象の食道、胃及び腸を含む消化器官及び消化組織に前記薬剤を投与すること、前記対象の門脈に前記薬剤を注入すること、及び皮膚及び皮膚付属器、例えば、毛包及び汗腺に前記薬剤を局所投与することを含み得る。処置対象における組織幹細胞、始原細胞、及び／又は最終分化細胞の若返りの全体的効果は、前記対象の若返り及び／又は前記対象の老化の遅延化であると考えられる。処置対象における組織幹細胞、始原細胞、及び／又は最終分化細胞の若返りは前記対象の寿命の延長を引き起こすとも考えられる。
【０２６９】
例えば、癌を有する対象にＺｓｃａｎ４ポリペプチド又はポリヌクレオチドを投与することによってその対象を治療する方法が本明細書において提供される。対象は生きている多細胞脊椎動物生物であって、ヒト及び非ヒト哺乳類動物を含む区分を指すことができる。幾つかの実施形態では前記方法はそのような治療法を必要とする患者、例えば、癌と診断された対象を選択することをさらに含む。癌は異常な細胞増殖又は制御されていない細胞増殖を特徴とする悪性腫瘍を指すことができる。多くの場合に癌に関連する他の特徴は転移、隣接する細胞の正常な機能への干渉、サイトカイン又は他の分泌性産物の異常なレベルでの放出、及び炎症応答又は免疫学的応答の抑制又は悪化、周辺組織若しくは器官又は遠位組織若しくは器官の浸潤、例えば、リンパ節の浸潤等を含む。転移性疾患は、元の腫瘍部位を離れ、例えば血流又はリンパ系を介して身体の他の部分に移動する癌細胞を指すことができる。
【０２７０】
本明細書において開示される方法の幾つかの実施形態では、前記対象にＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドが投与される。幾つかの例では前記対象にＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドを含むベクターが投与される。Ｚｓｃａｎ４発現ベクターの作製方法及び使用方法が本願の他の節において記載されている。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド（又はＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチドを含むベクター）は例えば注射によって腫瘍細胞から腫瘍組織に直接的に投与される。
【０２７１】
幾つかの実施形態では前記対象にＺｓｃａｎ４ポリペプチドが投与される。幾つかの実施形態では本開示のＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド及び／又はＺｓｃａｎ４ポリペプチドは、Ｚｓｃａｎ４ポリヌクレオチド、Ｚｓｃａｎ４ポリペプチド、及び／又はＺｓｃａｎ４発現を誘導する薬剤の腫瘍細胞への送達を支援するためにナノ粒子によって封入される。本開示の方法に関する使用に適切なナノ粒子が当技術分野において知られており、且つ、下で説明される。
【０２７２】
ナノ粒子は、急速放出又は制御放出のどちらかに適した合成小分子ベース、タンパク質ベース、ペプチドベース及び核酸ベースの生物学的治療薬などの封入化薬品を運搬することができるサブミクロン（約１０００ｎｍ未満）サイズの薬品送達担体である。当技術分野においてよく知られている処理法を用いて様々な分子（例えば、タンパク質、ペプチド及び核酸分子）を効率的にナノ粒子に封入することができる。
【０２７３】
本明細書に記載される組成物及び方法に関して使用されるナノ粒子はあらゆる種類の生体適合性ナノ粒子、例えば、ポリアミドナノ粒子、ポリカーボネートナノ粒子、ポリアルケンナノ粒子、ポリビニルエーテルナノ粒子、及びセルロースエーテルナノ粒子を含むがこれらに限定されない高分子ナノ粒子などの生物分解性ナノ粒子であり得る。幾つかの実施形態ではそれらのナノ粒子は生体適合性で生物分解性の物質から作製されている。幾つかの実施形態ではそれらのナノ粒子はポリ（乳酸）又はポリ（グリコール酸）、又はポリ（乳酸）とポリ（グリコール酸）の両方を含むナノ粒子を含むが、それらのナノ粒子に限定されない。幾つかの実施形態ではそれらのナノ粒子はポリＤ，Ｌ−乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子である。
【０２７４】
ＰＬＧＡは吸収性縫合糸及び生物分解性移植物において使用されているＦＤＡにより認可されたバイオマテリアルである。ＰＬＧＡナノ粒子は、限定されないが、皮下、静脈内、眼、口及び筋肉内をはじめとする多数の投与経路を介した様々な薬品の薬品送達系においても使用されている。投与は有効な経路によって薬剤を対象に提供又は供給することを指すことができる。例となる投与経路には注入（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内又は動脈内等）が含まれるが、これらに限定されない。ＰＬＧＡは単量体構成成分であり、天然の代謝副産物である乳酸とグリコール酸に分解し、このことがその材料を生体適合性が高いものにする。加えて、ＰＬＧＡはナノ粒子合成のための臨床グレードの材料として市販されている。
【０２７５】
ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）及びポリグリコライド（ＰＧＡ）などの他の生物分解性高分子材料を本明細書に記載される組成物及び方法に関して使用することが企図されている。その他の有用なナノ粒子には生物分解性ポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子が含まれる（Ｖａｕｔｈｉｅｒら、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．  Ｒｅｖ．誌、第５５巻：５１９〜４８頁、２００３年）。粘膜付着性陽イオン性高分子であるキトサンで被覆されたポリ（ラクチド−グリコライド）ナノ粒子を使用して経口吸着を高めることもできる。そのようなナノ粒子の製造業者は例えばＴａｋｅｕｃｈｉら（Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．  Ｒｅｖ．誌、第４７巻：３９〜５４頁、２００１年）によって記載されている。
【０２７６】
ヒト用途のために現在使用されている生物分解性重合体の中ではＰＬＡ、ＰＧＡ、及びＰＬＧＡがインビボ加水分解を起こして無害な乳酸とグリコール酸になるので概ね安全であることが知られている。これらの重合体は術後除去が必要とされないときの縫合糸の作製、及びカプセル化酢酸ロイプロリドの製剤に使用されており、そのことはヒトでの使用についてＦＤＡによって認可されている（Ｌａｎｇｅｒ及びＭｏｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第２４９巻：１５２７頁、１９９０年）；Ｇｉｌｄｉｎｇ及びＲｅｅｄ、Ｐｏｌｙｍｅｒ誌、第２０巻：１４５９頁、１９７９年；Ｍｏｒｒｉｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ誌、第１２巻：５頁、１９９４年）。これらの重合体の分解速度はそれらの重合体のグリコライド／ラクチド比と分子量によって変化する。したがって、前記重合体の分子量とグリコライド／ラクチド比、並びにカプセル製剤の粒度と被覆厚を調節することによって封入分子（タンパク質又はペプチド等）の放出を数か月にわたって持続することができる（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．誌、第４巻：１５５頁、１９８６年）。
【０２７７】
幾つかの実施形態では本明細書に記載される組成物及び方法に関して使用されるナノ粒子は直径が約５０ｎｍから約１０００ｎｍまでのサイズ範囲にある。幾つかの実施形態では前記ナノ粒子は約６００ｎｍ未満である。幾つかの実施形態では前記ナノ粒子は直径が約１００〜約６００ｎｍである。幾つかの実施形態では前記ナノ粒子は直径が約２００〜約５００ｎｍである。幾つかの実施形態では前記ナノ粒子は直径が約３００〜約４５０ｎｍである。当業者であれば、ナノ粒子のサイズは調製方法、臨床用途、及び使用される画像撮影用物質に応じて変化し得ることを容易に理解する。
【０２７８】
様々な種類の生物分解性で生体適合性のナノ粒子、ＰＬＧＡナノ粒子をはじめとするそのようなナノ粒子を作製する方法、並びに様々な合成化合物、タンパク質及び核酸を封入する方法が当技術分野においてよく記載されている（例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８０７４号明細書、米国特許出願公開第２００７００９２５７５号明細書、米国特許第２００６／０２４６１３９号明細書、米国特許第５７５３２３４号明細書、米国特許第７０８１４８９号明細書、及びＰＣＴ出願国際公開第２００６／０５２２８５号を参照のこと）。
【０２７９】
幾つかの実施形態では１つ以上のヒト細胞はそれらの１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と接触する。本明細書において使用される場合、Ｚｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と接触したヒト細胞を「Ｚｓｃａｎ４+ヒト細胞」と呼ぶ。本明細書において開示されるように、「Ｚｓｃａｎ４＋細胞」は、限定されないが、Ｚｓｃａｎ４を一時的に発現する細胞を含む。すなわち、Ｚｓｃａｎ４＋細胞は必ずしもＺｓｃａｎ４との接触を持ち続けない、又はＺｓｃａｎ４を断続的に発現する。本開示の幾つかの実施形態において開示されるように、Ｚｓｃａｎ４の作用は急速であり、通常は一時的で短時間の接触（例えば、数時間から数日の程度）しか必要としない。テロメアの場合では一時的なＺｓｃａｎ４作用によってテロメアが一旦延長するとテロメアは徐々にしか短くならないのでＺｓｃａｎ４は長時間必要とされない。よって、「Ｚｓｃａｎ４＋ヒト細胞」はＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤と接触している細胞とＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤と接触したが前記薬剤ともはや接触していない細胞の両方を含み得る。Ｚｓｃａｎ４＋ヒト細胞は、障害又は疾患を治療するために治療を必要とする対象に投与され得る。
【０２８０】
本明細書において提供される方法を用いて治療され得る対象は、家畜などの哺乳類対象又はヒト対象を含み得る。対象は胎児、新生児、幼児、小児、及び／又は成体を含み得る。幾つかの実施形態ではヒト細胞療法、特にＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤の投与を含む治療法から利益を受けるだろう対象の選択のように、治療される対象が選択される。
【０２８１】
Ｚｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤の投与から利益を得ることができる障害又は疾患の例にはテロメア短縮に関連する障害又は疾患が挙げられる。Ｚｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤の投与から利益を得ることができる障害又は疾患のその他の例には癌、自己免疫疾患、及び神経損傷又は神経変性障害などの細胞の再生が有益である疾患、並びに盲目症、難聴、歯の喪失、関節炎、心筋梗塞、骨髄移植、脱毛症、クローン病、糖尿病、筋ジストロフィー、及びデュシェンヌ型筋ジストロフィーが挙げられる。特定の例ではこれらの障害のうちの１つ以上を有する対象が本明細書において開示される治療に選ばれる。
【０２８２】
幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４処置を必要とする本開示の対象はテロメア異常に関連する疾患又は健康状態を有する。テロメア異常は１つ以上のテロメア機能を混乱させるテロメアのあらゆる変化、例えば、テロメア短縮、テロメアＤＮＡリピートの中断、又はテロメアＤＮＡの突然変異を指すことができる。Ｚｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤から利益を得ることができるテロメア異常に関連する例となる疾患又は健康状態は、限定されないが、テロメア短縮疾患、骨髄機能不全症候群、加齢性テロメア短縮疾患、及び早期老化障害を含み得る。
【０２８３】
Ｚｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤から利益を得ることができるテロメア短縮疾患又は健康状態は、限定されないが、先天性角化不全症、ホイエラール・レイダーソン症候群、レーヴェース症候群、コーツプラス症候群、特発性肺性線維症、肝硬変、膵臓線維症、及び変性疾患、例えば、アルツハイマー病及び骨関節炎を含み得る。
【０２８４】
Ｚｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤から利益を得ることができる骨髄機能不全症候群の疾患又は健康状態は、限定されないが、ファンコーニ貧血、無巨核球性血小板減少症、再生不良性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化不全症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、ピアソン症候群、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、血小板減少症、及び骨髄異型性症候群を含み得る。
【０２８５】
Ｚｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤から利益を得ることができる加齢性テロメア短縮疾患又は早期老化疾患である疾患又は健康状態は、限定されないが、ウェルナー症候群、ブルーム症候群、ハッチソン・ギルフォード早老症候群、コケイン症候群、色素性乾皮症、毛細管拡張性運動失調症、ロスモンド・トムソン症候群、硫黄欠乏性毛髪発育異常症、ジュバーグ・マルシジ症候群、及びダウン症を含み得る。
【０２８６】
幾つかの実施形態では本開示の対象は染色体異常に関連する疾患又は健康状態を有する。染色体異常は染色体ＤＮＡの失われた部分、余分な部分、又は不規則な部分を生じる染色体中のあらゆる変則、変化、又は突然変異を指すことができる。ある特定の実施形態では染色体異常は異常な数の染色体又は１本以上の染色体における構造異常を生じ得る。ある特定の実施形態では染色体異常は異数性などの核型異常を含み得る。本明細書において使用される場合、異数性は異常な数の染色体全体又は染色体部分を指すことができ、限定されないが、染色体ヌリソミー、染色体モノソミー、染色体トリソミー、染色体テトラソミー、及び染色体ペンタソミーを含む。ヒトの異数性の例には、限定されないが、２１番染色体トリソミー、１６番染色体トリソミー、１８番染色体トリソミー（エドワーズ症候群）、１３番染色体トリソミー（パトー症候群）、Ｘ染色体モノソミー（ターナー症候群）、ＸＸＸ異数性、ＸＸＹ異数性、及びＸＹＹ異数性が挙げられる。ヒト部分異数性の例には、限定されないが、１ｐ３６領域重複、１７番染色体（ｐ１１．２ｐ１１．２）領域重複症候群、ペリツェウス・メルツバッハー病、２２番染色体（ｑ１１．２ｑ１１．２）領域重複症候群、及びネコ眼症候群が挙げられる。幾つかの実施形態では異数性は性染色体又は常染色体のうちの１つ以上の欠失を含む場合があり得、それらの欠失によってネコなき症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン、ウィリアムス・ボイレン症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、遺伝性圧脆弱性ニューロパチー、スミス・マゲニス症候群、神経線維腫症、アラジール症候群、口蓋心臓顔面症候群、ディジョージ症候群、ステロイドスルファターゼ欠損、カルマン症候群、線型皮膚欠陥症の小眼症、副腎低形成、グリセロールキナーゼ欠損、ペリツェウス・メルツバッハー病、Ｙ染色体上の精巣決定因子、無精子症（ａ因子）、無精子症（ｂ因子）、無精子症（ｃ因子）、又は１ｐ３６領域欠失などの健康状態が生じ得る。よって、ある特定の実施形態では異数性、又は異数性に関連する疾患、障害、若しくは健康状態を治療するためにＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤を使用することができる。
【０２８７】
限定されないが、免疫不全、自己免疫疾患、自己免疫障害、慢性潰瘍、アテローム性硬化症、癌、神経損傷、変性障害、神経変性障害、創傷治癒、筋肉修復、心筋修復、軟骨置換、関節炎、骨関節炎、歯科再生、盲目症、網膜色素上皮細胞の増殖性の減退に起因する加齢性盲目症、難聴、骨髄機能不全、骨髄移植、糖尿病、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、遺伝病、遺伝子変異、及びＤＮＡ損傷を含む様々な種類の疾患、障害、及び健康状態がＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤から利益を得ることができる。
【０２８８】
癌は異常な細胞増殖又は制御されていない細胞増殖を特徴とする悪性腫瘍を含む。癌はしばしばゲノム不安定性、染色体異常、ＤＮＡ突然変異、及び異常テロメア制御と関連する。ゲノム安定性の向上及び染色体異常の修正などの本明細書に記載されるＺｓｃａｎ４活性に基づくと、癌患者を治療するために本開示のＺｓｃａｎ４生物製剤（例えば、ヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる本開示の薬剤）を投与してよい。実施例１７において本明細書で開示されるように、申請者はＺｓｃａｎ４生物製剤が癌細胞の増殖速度を遅くすることができることを示した。よって、幾つかの実施形態ではゲノム不安定性、染色体異常、ＤＮＡ突然変異、及び／又は異常テロメア制御に起因して癌細胞がより侵攻性になることを防ぐためにヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる本開示の薬剤を投与してよい。さらに、癌細胞の増殖を抑制する癌患者の身体能力を増強するために免疫細胞などのＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞を癌患者に投与してよい。他の実施形態では腫瘍を除去した患者においてＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞を使用してよく、その場合に除去された組織及び／又は器官を再構成するためにＺｓｃａｎ４＋細胞から分化した特定の細胞を使用する。他の実施形態では癌細胞の成長（例えば、増殖）を抑制するためにヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる本開示の薬剤を投与してよい。
【０２８９】
ヒト癌組織（例えば、腫瘍）は癌幹細胞を含み、癌幹細胞は活発に増殖しておらず、且つ、癌化学療法（例えば、シスプラチンなどの化学療法剤を用いる治療）に対して抵抗性を有することが知られている。癌幹細胞は化学療法による治療を生き延びることができ、それでその治療の後にその癌の再発が起こると考えられる。内在性ＺＳＣＡＮ４の発現がある特定の癌幹細胞において起こり、それでそれらの細胞に化学療法剤からの保護が提供されるとも考えられる。したがって、癌幹細胞における１種類以上の化学療法剤に対する抵抗性を低下させることによって、又は除去することによって化学療法を受けている癌患者又は化学療法を受ける癌患者におけるそれらの１種類以上の化学療法剤に対する応答性を改善するために、ＺＳＣＡＮ４に特異的なｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどの内在性ＺＳＣＡＮ４の発現を低下させる薬剤を前記患者に投与することができると考えられる。
【０２９０】
本明細書において提供されるＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤から利益を得ることができる例となる癌には心臓の癌（例えば、肉腫（血管肉腫、繊維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、繊維腫、脂肪腫及び奇形腫）；肺癌（例えば、気管支原性癌（鱗状細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞上皮（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫）；胃腸管癌（例えば、食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）；胃癌（上皮癌、リンパ腫、平滑筋肉腫）；膵臓癌（膵管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）；小腸癌（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経繊維腫、繊維腫）；大腸癌（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；泌尿生殖路癌（例えば、腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍、腎芽腫、リンパ腫、白血病）；膀胱癌及び尿道癌（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）；前立腺癌（腺癌、肉腫）；精巣癌（精上皮腫、奇形腫、胎生期癌、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、繊維腫、繊維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫）；肝臓癌（例えば、肝癌（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫）；骨癌（例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、繊維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液繊維腫、類骨骨腫及び巨細胞腫）；神経系癌（例えば、頭骨（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫＞松果体腫！、多形神経膠芽腫、希突起神経膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄（神経繊維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫））；婦人科癌（例えば、子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、腫瘍前子宮頸部異形成症）、卵巣（卵巣癌、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、類内膜性腫瘍、ブレナー腫瘍、明細胞癌、非分類癌、顆粒膜／莢膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、陰門（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、繊維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫、胎児型横紋筋肉腫、卵管（癌））；血液癌（例えば、血液（骨髄性白血病（急性及び慢性）、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異型性症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫））；皮膚癌（例えば、悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、黒子、異型性母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚繊維腫、ケロイド、乾癬）；及び副腎癌（例えば、神経芽細胞腫）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２９１】
幾つかの実施形態では自己免疫疾患を有する患者が治療に選ばれる。自己免疫疾患は異常免疫応答、例えば、自己抗原又は対象自身の細胞若しくは組織に対して特異的である抗体又は細胞傷害性Ｔ細胞の産生の結果生じる疾患を指すことができる。自己免疫疾患は身体中に通常存在する物質及び組織に対する身体の過剰に活発な免疫応答によって生じ得る。幾つかの例では自己免疫疾患は（例えば、甲状腺炎では）ある特定の器官に限定され、又は様々な場所の特定の組織に影響を及ぼし得る（例えば、肺と腎臓の両方の基底膜を冒し得るグッドパスチャー病）。よって、幾つかの実施形態では自己免疫疾患を有する患者の免疫系を修正することによって対象における自己免疫疾患を治療するため、造血幹細胞及び／又は免疫細胞などのＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞、及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる本開示の薬剤を使用することができる。本明細書において提供されるＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤から利益を得ることができる例となる自己免疫疾患にはリウマチ性関節炎、若年性少関節炎、コラーゲン誘発関節炎、アジュバント誘発関節炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、自己免疫性胃萎縮、尋常性天疱瘡、乾癬、尋常性白斑、１型糖尿病、非肥満糖尿病、重症筋無力症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性唾液腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性血小板減少性紫斑症、グッドパスチャー症候群、アジソン病、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、自己免疫性溶血性貧血、及び悪性貧血が含まれるが、これらに限定されない。
【０２９２】
幾つかの実施形態では選択される対象は神経損傷を経験したことがある者、又は神経変性障害を患っている者である。神経損傷は神経系に対する（例えば、脳又は脊髄又は特定の神経細胞に対する）外傷であって、損傷を受けた患者の運動及び／又は記憶に悪影響を及ぼす外傷を指すことができる。例えば、そのような患者は構音障害（発話障害）、片側不全麻痺又は片麻痺を患う場合があり得る。神経損傷は、神経系に対する（例えば、脳又は脊髄又は特定の神経細胞に対する）外傷であって、損傷を受けた患者の運動及び／又は記憶に悪影響を及ぼす外傷から生じ得る。そのような外傷は感染性因子（例えば、最近又はウイルス）、毒物、落下又は他の種類の事故に起因する傷害、又は遺伝的障害によって、又は他の不明の理由のために引き起こされ得る。よって、幾つかの実施形態では神経損傷を患ったことがある患者の神経系の中の組織幹細胞を若返らせ、その神経系の中の組織幹細胞の若返りにより神経細胞とグリア細胞を産生し、その結果として神経系の欠陥を修復することによって対象の神経損傷を治療するため、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、及び／又は免疫細胞などのＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞、及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる本開示の薬剤を使用することができる。幾つかの実施形態では患者は自動車事故又は飛び込み事故などの事故の結果生じた、又は脳卒中の結果生じた脳又は脊髄の傷害などの神経損傷を患ったことがあってよい。
【０２９３】
神経変性疾患は脳及び脊髄の細胞が失われる健康状態である。神経変性疾患は時を経て機能不全及び能力低下を引き起こす神経細胞の劣化又は神経細胞のミエリン鞘の劣化から生じる。結果として生じる健康状態は運動に関する問題（運動失調症等）及び記憶に関する問題（認知症等）を引き起こし得る。よって、幾つかの実施形態では神経変性疾患を患う患者の神経系の中の組織幹細胞を若返らせ、その神経系の中の組織幹細胞の若返りにより神経細胞とグリア細胞を産生し、その結果として神経系の欠陥を修復することによって対象の神経変性疾患を治療するため、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、及び／又は免疫細胞などのＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞、及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる本開示の薬剤を使用することができる。幾つかの実施形態では前記Ｚｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又は前記薬剤は前記対象の神経系を若返らせ、且つ、前記疾患の変性状態を元に戻す。本明細書において提供されるＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤から利益を得ることができる例となる神経変性疾患には副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、アルコール中毒症、アレキサンダー病、アルパーズ病、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症（ルー・ゲーリッグ病）、毛細管拡張性運動失調症、バッテン病（シュピールマイヤー・フォクト・シェーグレン・バッテン病としても知られる）、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、カナバン病、脳性麻痺、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病（脊髄小脳失調症３型）、多系統委縮症、多発性硬化症、ナルコレプシー、ニーマンピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、亜急性連合性脊髄変性症併発性悪性貧血、シュピールマイヤー・フォクト・シェーグレン・バッテン病（バッテン病としても知られる）、脊髄小脳失調症、脊髄性筋委縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、中毒性脳症が含まれるが、これらに限定されない。
【０２９４】
本明細書に記載される方法を用いてＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞を得ることができる、又は生成することができる。哺乳類対象へＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞を投与する方法が当技術分野において知られている。例えば、Ｚｓｃａｎ４＋ヒト細胞は皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、静脈内投与又は動脈内投与などの注射によりそのような治療法を必要とする対象に投与される。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞は治療を必要とする領域に、例えば、癌の器官又は組織に、又は脳若しくは脊髄に直接的に投与される。幾つかの実施形態ではＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞は単独で投与される、薬学的に許容可能な担体が存在する中で（例えば、適切な重合体中に封入されて）投与される、又は他の治療薬が存在する中で投与される。幾つかの実施形態では少なくとも２０，０００細胞のＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞、例えば、少なくとも５０，０００細胞、少なくとも１００，０００細胞、少なくとも５００，０００細胞、少なくとも１，０００，０００細胞、又は少なくとも２，０００，０００細胞のＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞が対象に投与される。
【０２９５】
幾つかの態様では本開示の方法はＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤の治療量の使用を伴う。薬剤の治療量は意図した目的を達成するのに充分な治療薬の量を指すことができる。例えば、テロメア異常に関連する疾患又は健康状態を治療するためのＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤の治療量はその疾患又は健康状態、又はその疾患若しくは健康状態の１つ以上の症状の軽減に充分な量である。幾つかの例では治療量はその疾患又は健康状態、又はその疾患若しくは健康状態の症状を１００％治療できなくてもよい。しかしながら、その疾患又は健康状態のあらゆる公知の特徴又は症状の減少、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、又はそれより高い割合での減少は治療的であり得る。所与の治療薬の治療量はその薬剤の性質、投与経路、その治療薬を受容する対象の体格及び／又は年齢、及び投与目的などの要因によって変化する。それぞれ個々の事例における治療量は当技術分野における確立した方法に従って当業者によって過度の実験が行われることなく経験的に決定され得る。
【０２９６】
幾つかの態様では本開示の方法は医薬品の使用を伴う。医薬品は対象又は細胞に適切に投与されると所望の治療効果又は予防効果を引き起こすことができる化合物、小分子、又は他の組成物、例えば、Ｚｓｃａｎ４＋ヒト細胞を指すことができる。「保温」は薬品が細胞と相互作用するのに充分な量の時間を含む。「接触」は固体状態又は液体状態の薬品を細胞と共に保温することを含む。
【０２９７】
本開示において有用な薬学的に許容可能な担体は従来品である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ．Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ著、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、ペンシルバニア州、イーストン、第１５版（１９７５年）は本明細書において開示されるＺｓｃａｎ４タンパク質、Ｚｓｃａｎ４核酸分子、レチノイド、酸化ストレスを誘発する薬剤、及び細胞の薬学的送達にとって適切な組成物と製剤について記載している。一般に、担体の性質は使用されている特定の投与モードに依存する。例えば、非経口製剤は通常は、水、生理食塩水、平衡塩溶液、ブドウ糖水溶液、グリセロール又は同種のものなどの薬学的及び生理学的に許容可能な液体をベヒクルとして内包する注射可能液体を含む。固形組成物（例えば、粉末形態、丸薬形態、錠剤形態、又はカプセル形態）について、従来の非毒性固形担体は例えば薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、又はステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は湿潤剤又は乳化剤、保存料、及びｐＨ緩衝剤等のような少量の非毒性補助剤、例えば、酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレートを含み得る。
【０２９８】
一例では、Ｚｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤は半透性高分子膜に封入され、その高分子膜が宿主対象の組織部位に移植される。そのような方法は、治療物質の制御放出能を用いて治療物質の局所的長期慢性送達を達成することができる。化合物及び細胞の封入についての記載に関して米国特許第５５７３５２８号明細書を参照されたい。１つの実施形態ではＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤は高分子膜内に封入される。その後、その封入高分子膜は宿主対象の組織部位に移植される。１つの実施形態ではその組織部位は中枢神経系、例えば、脳又は脊髄である。
【０２９９】
前記半透性高分子膜は合成膜又は天然膜であり得る。使用することができる重合体の例にはポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアクリロニトリル・ビニルクロリド共重合体（Ｐ［ＡＮ／ＶＣ］、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸・グリコール酸）共重合体、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン等が挙げられる。高分子膜内に封入されたＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤の送達は、細胞に対する宿主拒絶と免疫応答、及び拒絶と炎症に関連する問題を回避することができる。加えて、高分子膜内に含まれる細胞はその重合体からなる壁（すなわち、個々の繊維、原繊維、フィルム、スプレー、液的、粒子等からなる壁）によって免疫監視機構から隠されているが、それでいてなお細胞生存性を維持し、その高分子壁を介した分子、栄養素、及び代謝産物の輸送が可能である。重合体封入細胞の移植はＡｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９１年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ誌、第１１１巻：２６９〜２７５頁によって開発されており、非ヒト霊長類とヒトの両方について使用することに成功している（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９４年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ誌、第５８巻：１２７５〜１２７７頁）。米国特許第６１１０９０２号明細書も参照されたい。
【０３００】
１つの実施形態では最初にコラーゲン、アガロース又はＰＶＡ（ポリビニルアルコール）のいずれかからなるマトリックスにＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞を包埋することによってＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞を封入する。その後に包埋した細胞をポリアクリロニトリル：ポリビニルクロリドの６０：４０共重合体からなるポリプロピレンでできた中空繊維に注入する。それらの繊維を断片状に切断し、移植用に末端を封着する。１つの実施形態では封入細胞は約２０，０００〜約２，０００，０００細胞のＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞を有する。
【０３０１】
幾つかの例ではＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞は外来性起源の細胞である。外来性細胞は、治療のためにそれらの細胞が移植される対象とは異なる起源から得られた細胞を指すことができる。外来性細胞は同じ種の他の生物に由来し得る（例えば、ヒト患者において使用するためのヒト由来細胞）。外来性細胞は異種起源由来、すなわち、治療的処置を受ける対象と異なる種に由来することもできる（例えば、ヒトにおいて使用するためのマウス細胞）。Ｚｓｃａｎ４＋ヒト細胞を遺伝的に同質な起源から、すなわち、それらの細胞を受容する対象から採取することもできる。対象からの細胞の採取後にそれらの細胞を遺伝的に改変し（例えば、Ｚｓｃａｎ４をコードする核酸を導入する）、又はＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞について選択／濃縮し、その後でその対象に再移植することができる。それらの細胞は遺伝的に同質であるので免疫応答が無いことが予期される。
【０３０２】
１つの態様ではＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞を不死化する。例えば、限定されないが、当技術分野においてよく知られている方法によって細胞を（組織培養中は低温で細胞がよく増殖するが、一旦患者に移植されて３７℃で維持されると分裂を停止するように）条件的に不死化することができ、又は細胞を構成的に不死化することができる（例えば、ラージＴ抗原発現コンストラクトによる形質移入、又はエプスタイン・バール・ウイルスによる不死化）。宿主対象へＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞を送達する別の方法は組織部位の標的領域にそれらの細胞を直接的に移植することである。一旦移植されるとこれらの細胞は生き残り、移動し、宿主組織に継目なく統合する。１つの実施形態では宿主対象の神経系、例えば、発生中の神経系又は外傷を受けた神経系又は神経障害を有する対象の神経系にＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞を直接的に移植する。発生中の神経系に移植されるとＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞は正常な発生過程に関与し、宿主の発生上の合図に応答する。それらの移植された神経前駆細胞は確立された移動経路に沿って移動し、神経系の広い領域に広く行き渡り、宿主発生プログラムと共同して時間的及び領域的に適切に神経系譜とグリア系譜の両方の子孫細胞へ分化する。移植されたＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞は混乱を起こすことなく宿主神経前駆細胞並びに分化細胞と混合することができる。それらの移植された細胞は欠陥がある特定の神経細胞集団又はグリア細胞集団と置き換わることができ、欠陥がある機能を回復することができ、広い分布区域で外来性遺伝子を発現することができる。
【０３０３】
発生した神経系にＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞を移植することもできる。それらの移植された神経前駆細胞は安定した移植物を形成することができ、宿主神経系内で移動することができ、宿主神経前駆細胞及び分化細胞と混合及び相互作用することができる。それらの神経前駆細胞は欠陥がある特定の神経細胞集団又はグリア細胞集団と置き換わることができ、欠陥がある機能を回復することができ、宿主の神経系における再生治癒過程を活性化することができる。１つの実施形態では前記の安定した移植物は中枢神経系又は末梢神経系において構築された移植物である。
【０３０４】
類似の方法を使用してヒト細胞療法を必要とするあらゆる領域にＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞を直接的に移植することができる。そのような細胞は未分化状態でもよく、所望の細胞種にインビトロで分化していてもよい（その後でそのような細胞を必要とする対象に投与される）。例えば、器官再生が望ましい場合、例えば、癌を治療するために除去された、又は他の理由のために失われた器官又は組織の交換のため（例えば、歯、毛髪、耳又は眼の細胞、皮膚又は筋肉）。１つの実施形態では、例えば、心筋梗塞のために失われた心臓組織又は心臓細胞を再生するためにＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞を心臓に直接的に移植する。１つの実施形態では、例えば、糖尿病を有する対象の細胞を再生するためにＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞を膵臓に直接的に移植する。１つの実施形態では、例えば、癌を有する対象の骨髄細胞を再生するためにＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞を直接的に骨に移植する、又は全身投与する。
【０３０５】
患者の治療に最も適切な治療用量と治療計画は、治療される疾患又は健康状態によって、及び患者の体重と他のパラメーターに従って変化する。有効な投与量と治療プロトコルを従来法によって決定することができ、その方法は実験動物において低用量から始まって、後に効果をモニターしながら投与量を増加し、且つ、計画的に投与計画を変更する。所与の対象にとって最適な投与量を決定するとき、医師は多数の要因を考慮に入れることができる。要因には患者の体格、患者の年齢、患者の一般健康状態、治療中の特定の疾患、疾患の重症度、患者内の他の薬品の存在等が含まれる。試験投与量は動物試験の結果と臨床文献を考慮した後に選択される。
【０３０６】
以上より、特定の障害に関連する症状、特にテロメア異常に関連する症状を軽減又は改善するためにＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤を対象に投与する。癌治療の治療エンドポイントは腫瘍のサイズ又は体積の減少、腫瘍に対する血管形成の減少、又は腫瘍転移の減少を含み得る。腫瘍が除去されている場合、別の治療エンドポイントは除去された組織又は器官の再生であり得る。当技術分野における方法、例えば、腫瘍の画像撮影又は腫瘍マーカー若しくは癌の存在についての他の指標の検出を用いて癌治療の有効性を測定することができる。自己免疫疾患治療の治療エンドポイントは自己免疫応答の減少を含み得る。当技術分野における方法、例えば、自己免疫抗体の測定を用いて自己免疫疾患治療の有効性を測定することができ、処置対象におけるそのような抗体の減少はその治療が成功したことを示している。神経変性障害治療の治療エンドポイントは神経変性関連欠陥の減少、例えば、運動欠陥、記憶欠陥、又は行動欠陥が増加することの減少を含み得る。当技術分野における方法を用いて、例えば、認知障害を測定することにより神経変性障害治療の有効性を測定することができ、処置対象におけるそのような障害の減少はその治療が成功したことを示している。神経損傷治療の治療エンドポイントは損傷関連欠陥の減少、例えば、運動欠陥、記憶欠陥、又は行動欠陥が増加することの減少を含み得る。当技術分野における方法を用いて、例えば、運動性及び柔軟性を測定することにより神経損傷治療の有効性を測定することができ、処置対象におけるそのようなものの上昇はその治療が成功したことを示している。治療は１００％の有効性を必要としない。例えばＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞及び／又はヒト細胞においてＺｓｃａｎ４発現を上昇させる薬剤を用いる治療が無いときと比べた前記疾患（又はその症状）の少なくとも約１０％、約１５％、約２５％、約４０％、約５０％、又はそれより高い割合での減少が有効と見なされる。
【０３０７】
幾つかの例ではＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞はマウス又は他の小哺乳類動物では約１×１０4細胞から約１×１０7細胞までの用量で投与され、又はヒト若しくは他の大哺乳類動物では約１×１０4細胞から約１×１０10細胞までの用量で投与される。１つの特定的で非限定的な実施形態では治療有効量は約１×１０6細胞である。治療している対象において所望の効果を達成するために他の治療薬（例えば、化合物、小分子、又はペプチド）を治療有効量でＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞と組み合わせて（例えば、直前又は直後に、又は同時に）投与することができる。有効量のＺｓｃａｎ４＋ヒト細胞を治療期間中に１回の投与で、又は数回の投与で投与してよく、例えば、毎日投与してよい。しかしながら、Ｚｓｃａｎ４＋ヒト細胞の有効量は投与される薬剤、治療している対象、病気の重症度と種類、及び薬剤の投与法に依存することを当業者は理解する。
【０３０８】
例えば、Ｚｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤を対象の皮膚に塗布することによりＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤を使用して、皮膚の若返り、アトピー性皮膚炎の治療、又は皮膚損傷の治療を必要とする前記対象において皮膚を若返らせる、アトピー性皮膚炎を治療する、又は皮膚損傷を治療することもできる。
【０３０９】
例えば、Ｚｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤を対象の頭皮に塗布することによりＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤を使用して、脱毛の治療を必要とする前記対象において毛髪の成長を刺激することにより脱毛を治療することもできる。機能不全が白髪の原因となる毛包中のメラノサイト幹細胞のテロメア長を増加させるために、及び／又はゲノム安定性を向上させるためにＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤を頭皮に塗布することによってＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤を使用して、白髪化の防止又は治療を必要とする対象において白髪化を防止又は治療することもできる。
【０３１０】
本明細書において開示されるように、角膜上皮幹細胞が角膜を再生し、それ故に、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇による角膜上皮幹細胞におけるテロメア長の増加及び／又はゲノム安定性の向上が、角膜の若返りを必要とする対象において角膜を若返らせると考えられる。ドライアイの治療を必要とする対象においてドライアイを治療するために角膜におけるＺｓｃａｎ４の発現上昇を用いることもできる。よって、例えば、Ｚｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤を対象の角膜に投与することによりＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤を使用して、角膜の若返り及び／又はドライアイの治療を必要とする前記対象において角膜を若返らせる、及び／又はドライアイを治療することもできる。
【０３１１】
本明細書において開示されるように、特発性肺性線維症はテロメア短縮によって引き起こされることが知られている。よって、例えば、特発性肺性線維症を治療するために対象がＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤（例えば、本開示のＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド）を吸入することができるようにその薬剤を製剤することによりＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤を使用して、特発性肺性線維症の治療を必要とする前記対象において特発性肺性線維症を治療することもできる。
【０３１２】
例えば、本開示の薬剤が血管内皮細胞と接触し、血管内皮細胞のテロメア長を増加し、及び／又は血管内皮細胞のゲノム安定性を向上し、それによって対象のアテローム性硬化症及び／又は冠動脈疾患を治療するように前記対象の血流に前記薬剤を投与することによってＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤を使用して、アテローム性硬化症及び／又は冠動脈疾患の治療を必要とする前記対象においてアテローム性硬化症及び／又は冠動脈疾患を治療することもできる。
【０３１３】
例えば、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇が１つ以上のヒト細胞又は対象において１種類以上の遺伝毒性物質に対する抵抗性を上昇させるようにＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤（例えば、本開示のＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド）と１つ以上のヒト細胞を接触させることによって、又は１種類以上の遺伝毒性物質に対する抵抗性を必要とする対象にそのような薬剤を投与することによってＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤を使用して、前記１つ以上のヒト細胞、及び／又はそのような抵抗性を必要とする前記対象における１種類以上の遺伝毒性物質に対する抵抗性を提供することもできる。有利なことに、マイトマイシンＣ及びシスプラチンを含むがこれらに限定されないあらゆる公知の遺伝毒性物質又は遺伝毒性薬品に対する抵抗性を提供するためにＺｓｃａｎ４発現を用いることができる。
【０３１４】
ＤＮＡメチル化パターンがヒト胚性幹（ＥＳ）細胞のＤＮＡメチル化パターンと異なるｉＰＳ細胞ゲノム中の領域が存在することが知られており、そのことがｉＰＳ細胞において問題を引き起こすと考えられる（例えば、Ｏｈｉ，  Ｙら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ誌、２０１１年５月；第１３巻（第５号）：５４１〜９頁を参照のこと）。理論に捉われることを望むものではないが、Ｚｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤はヒトＥＳ細胞のＤＮＡメチル化パターンにより類似しているＤＮＡメチル化パターンをヒトｉＰＳ細胞において誘導することによりｉＰＳ細胞を改良すると考えられる。よりヒトＥＳ細胞様のＤＮＡメチル化パターンをヒトｉＰＳにおいて誘導することによって、そのような細胞を治療に使用するのにより安全なものにすることができるとさらに考えられる。よって、ある特定の実施形態では、例えば、Ｚｓｃａｎ４の発現上昇によって１つ以上のヒトｉＰＳ細胞においてヒト胚性幹細胞様ＤＮＡメチル化パターンが誘導されるように１つ以上のヒトｉＰＳ細胞をＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤（例えば、本開示のＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド）と接触させることによってＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤を使用して、１つ以上のヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞においてヒト胚性幹細胞様ＤＮＡメチル化パターンを誘導することができる。
【０３１５】
Ｚｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤を使用して体外受精（ＩＶＦ）の成功率を上昇させるために老化した卵母細胞を若返らせ、且つ、卵母細胞とインビトロ受精卵母細胞の両方、例えば、接合子又は１細胞期と胚盤胞期の間の着床前胚において核型異常を修正することもでき、全期間の健康的な妊娠の成功率を例えば高齢の女性において上昇させることもでき、異数性などの核型異常を修正することもでき、ダウン症などの発達障害の危険性を低下させることもできる。そのような治療は体外受精（ＩＶＦ）のために、及びＩＶＦ専門病院において特に有用であり得る。よって、ある特定の実施形態では、例えばＺｓｃａｎ４の発現上昇が１つ以上のヒト卵母細胞を若返らせるように、１つ以上のヒト卵母細胞のゲノム安定性を向上させるように、及び／又は前記１つ以上のヒト卵母細胞における１つ以上の核型異常を修正するようにＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤（例えば、本開示のＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド）と１つ以上のヒト卵母細胞を接触させることによってＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤を使用して、前記１つ以上のヒト卵母細胞を若返らせることができ、前記１つ以上のヒト卵母細胞のゲノム安定性を向上させることができ、及び／又は前記１つ以上のヒト卵母細胞における１つ以上の核型異常を修正することができる。幾つかの実施形態では前記１つ以上のヒト卵母細胞はＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる前記薬剤との接触前に対象から単離される。他の実施形態では前記１つ以上のヒト卵母細胞がＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる前記薬剤で処理されたところでそれらの細胞が体外受精を受ける。
【０３１６】
他の実施形態では、例えばＺｓｃａｎ４の発現上昇が１つ以上のヒト受精卵母細胞においてゲノム安定性を向上させるように、及び／又は１つ以上の核型異常を修正するようにＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤（例えば、本開示のＺｓｃａｎ４ポリヌクレオチド）と１つ以上のヒト受精卵母細胞を接触させることによってＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤を使用して、前記１つ以上のヒト受精卵母細胞においてゲノム安定性を向上させることができ、及び／又はより多くの核型異常のうちの１つを修正することができる。幾つかの実施形態では前記１つ以上のヒト受精卵母細胞はＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤との接触前に体外受精によって受精した。他の実施形態では前記１つ以上のヒト卵母細胞は受精させられる前に対象から単離される。さらに他の実施形態では前記１つ以上の受精卵母細胞は１細胞期と胚盤胞期の間の着床前胚である。
【０３１７】
ある特定の実施形態ではＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる本開示の薬剤は、限定されないが、２１番染色体トリソミー（ダウン症）、１６番染色体トリソミー、１８番染色体トリソミー（エドワーズ症候群）、１３番染色体トリソミー（パトー症候群）、Ｘ染色体モノソミー（ターナー症候群）、ＸＸＸ異数性、ＸＸＹ異数性、及びＸＹＹ異数性などの異数性；１ｐ３６領域重複、１７番染色体（ｐ１１．２ｐ１１．２）領域重複症候群、ペリツェウス・メルツバッハー病、２２番染色体（ｑ１１．２ｑ１１．２）領域重複症候群、及びネコ眼症候群などの部分異数性；並びにネコなき症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン、ウィリアムス・ボイレン症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、遺伝性圧脆弱性ニューロパチー、スミス・マゲニス症候群、神経線維腫症、アラジール症候群、口蓋心臓顔面症候群、ディジョージ症候群、ステロイドスルファターゼ欠損、カルマン症候群、線型皮膚欠陥症の小眼症、副腎低形成、グリセロールキナーゼ欠損、ペリツェウス・メルツバッハー病、Ｙ染色体上の精巣決定因子、無精子症（ａ因子）、無精子症（ｂ因子）、無精子症（ｃ因子）、及び１ｐ３６領域欠失などの健康状態を含む１つ以上の核型異常を修正する。
【０３１８】
本明細書において開示されるように、ヒト遺伝子ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及びＤＵＸ４は、Ｚｓｃａｎ４遺伝子がヒト細胞において発現すると発現が未制御状態になるマーカー遺伝子である。したがって、ヒト細胞におけるＺｓｃａｎ４の効果についてのマーカーとしてＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及びＤＵＸ４を使用することができると考えられる。よって、幾つかの実施形態では、例えば１つ以上のヒト細胞においてＺｓｃａｎ４の発現を上昇させる薬剤と１つ以上のヒト細胞を接触させること、前記１つ以上のヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルを測定すること、及び前記１つ以上のヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルを前記薬剤と接触していない１つ以上の対応するヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルと比較し、前記１つ以上のヒト細胞におけるＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及び／又はＤＵＸ４の発現レベルの上昇によって前記１つ以上のヒト細胞における１つ以上のＺｓｃａｎ４誘導性作用の存在を示すことによる、１つ以上のヒト細胞における１つ以上のＺｓｃａｎ４誘導性作用を測定するための方法が提供される。
【０３１９】
幾つかの実施形態では本開示の対象は非ヒト動物である。非ヒト動物はヒト以外の全ての動物を指すことができる。非ヒト動物には非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、及び家禽などの家畜、イヌ、ネコ、ウマ、ハムスター、げっ歯類、例えば、マウスなどのスポーツ動物又はペット、又はライオン、トラ、若しくはクマなどの動物園で見られる動物が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態では非ヒト動物はマウスである。
【０３２０】
別途説明されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は本開示が属する技術分野の当業者が共通して理解するものと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は文脈が別途明確に指示しない限り複数形の指示物を含む。同様に、「又は」という単語は文脈が別途明確に指示しない限り「及び」を含むものとする。したがって、「Ａ又はＢを含む」はＡ又はＢを含むこと、又はＡ及びＢを含むことを意味する。核酸又はポリペプチドについて与えられている全ての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、及び全ての分子量値又は分子質量値は近似値であり、且つ、説明のために提供されていることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載される方法及び材料と類似又は同等の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法と材料を以下に記載する。本明細書において言及された全ての特許出願公開、特許出願、特許、及び他の参照文献は全体が参照により援用される。矛盾がある場合は用語の説明を含み本明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び実施例はただの例示であり、それらが限定的なものであることは意図されていない。
【０３２１】
後続の実施例はある特定の特徴及び／又は実施形態を例示するために提供されている。これらの実施例は記載される特定の特徴又は実施形態に本開示を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０３２２】
実施例１：Ｚｓｃａｎ４発現はマウス胚性幹細胞において染色体異常を修正する
この実施例は、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ又はＺｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターのどちらかによるＺｓｃａｎ４の発現がマウス胚性幹（ＥＳ）において染色体異常を修正し得るという発見について説明する。この実施例はＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡとＺｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターを治療的生物製剤として使用することができることも示す。
【０３２３】
材料と方法
細胞培養
ＭＣ１ＺＥマウスＥＳ細胞株は以前に報告された（Ａｍａｎｏら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ誌、２０１３年；第４号：１９６６頁）。ＭＣ１ＺＥ細胞は長期培養（継代数３３）のために貧弱な核型（すなわち、細胞のたった約２０％が正倍数性を有する）と外来性遺伝子の組込みを示す典型的なマウスＥＳ細胞として使用された。以前に説明されたように完全ＥＳ培地（Ａｍａｎｏら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ誌、２０１３年；第４号：１９６６頁）：ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１５％ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、１０００Ｕ／ｍｌ白血病阻止因子（ＬＩＦ）（ＥＳＧＲＯ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、及びペニシリン／ストレプトマイシン（５０Ｕ／５０μｇ／ｍｌ）の中で細胞を５％ＣＯ２中３７℃で培養した。培地を毎日交換し、日常的に２〜３日毎に細胞を継代処理した。
【０３２４】
合成ｍＲＮＡ
修飾型ｍＲＮＡの合成のため、Ｗａｒｒｅｎら（Ｗａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ誌、２０１０年１１月５日；第７巻（第５号）：６１８〜３０頁）によって以前に報告されているようにｍＲＮＡ合成を実施した。Ｗａｒｒｅｎらのこれらのプロトコルを使用して、哺乳類細胞におけるＲＮＡ安定性並びに翻訳効率を上昇させるために修飾型ｄＮＴＰ混合物を使用するヒトＺＳＣＡＮ４又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする鋳型ＤＮＡのインビトロ転写によりｍＲＮＡを合成した。次の修飾型ｄＮＴＰ、すなわち、３’−０−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  ＡＲＣＡキャップ類似体、５−メチルシチジントリホスフェート、及びシュードウリジントリホスフェートを使用した。
【０３２５】
センダイウイルスベクター
マウスＺｓｃａｎ４ｃ（ＳｅＶ１８＋ｍＺｓｃａｎ４／ΔＦ）又はヒトＺＳＣＡＮ４（ＳｅＶ１８＋ｈＺＳＣＡＮ４／ΔＦ）のどちらかを発現するセンダイウイルスベクターは、ＭＢＬ（株式会社医学生物学研究所）によってカスタム作製された。これらのベクターを本明細書においてそれぞれ「ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４」又は「ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４」と呼ぶ。対照として同じセンダイベクターを使用したが、そのベクターはＺｓｃａｎ４よりも緑色蛍光タンパク質変異体を発現した。これらのセンダイベクターはＦタンパク質を欠いており、したがって、伝染性ではない（Ｉｎｏｕｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ誌、第７７巻：２３２３８〜３２４６頁、２００３年）。
【０３２６】
マウスＺｓｃａｎ４ｃ融合タモキシフェン制御可能ＥＲＴ２ドメイン（ＳｅＶ１８＋ｍＺＥＲＴ２／ΔＦ）又はヒトＺＳＣＡＮ４融合タモキシフェン制御可能ＥＲＴ２ドメイン（ＳｅＶ１８＋ｈＺＥＲＴ２／ΔＦ）のどちらかを発現するセンダイベクターは、ＭＢＬ（株式会社医学生物学研究所）によってカスタム作製された。これらのベクターを本明細書においてそれぞれ「ＳｅＶｍＺＥＲＴ２」又は「ＳｅＶｈＺＥＲＴ２」と呼ぶ。これらのセンダイベクターもＦタンパク質を欠いており、したがって、伝染性ではない（Ｉｎｏｕｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ誌、第７７巻：２３２３８〜３２４６頁、２００３年）。
【０３２７】
さらに、マウスＺｓｃａｎ４（ＳｅＶ１８＋ｍＺｓｃａｎ４／ＴＳ１５ΔＦ）又はヒトＺＳＣＡＮ４（ＳｅＶ１８＋ｈＺＳＣＡＮ４／ＴＳ１５ΔＦ）のどちらかを発現する温度感受性センダイベクターは、ＭＢＬ（株式会社医学生物学研究所）によってカスタム作製された。これらのベクターを本明細書においてそれぞれ「ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４−ＴＳ１５」又は「ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５」と呼ぶ。これらのセンダイベクターは３５℃で機能的であり、３７℃で不活性である（Ｂａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ誌、２０１１年；第１０８巻（第３４号）：１４２３４〜１４２３９頁）。対照として同じセンダイベクターを使用したが、そのベクターはＺｓｃａｎ４よりも緑色蛍光タンパク質変異体を発現した。このベクターを本明細書において「ＳｅＶＡＧ−ＴＳ１５」と呼ぶ。これらのセンダイベクターもＦタンパク質を欠いており、したがって、伝染性ではない（Ｉｎｏｕｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ誌、第７７巻：２３２３８〜３２４６頁、２００３年）。
【０３２８】
核型分析
Ａｍａｎｏら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ誌、２０１３年；第４号：１９６６頁に記載されるように実施したＧバンド染色法により核型分析を実施した。
【０３２９】
結果
マウス又はヒトＺＳＣＡＮ４をコードする合成ｍＲＮＡはマウス胚性幹細胞において染色体異常を修正する
図１Ａは実験手順を示している。ＭＣ１ＺＥマウスＥＳ細胞（第３３継代）を５×１０４細胞／ウェルの濃度で６ウェルディッシュに播種し、５μｌのリポフェクタミン（ＲＮＡｉＭＡＸ：ライフテクノロジーズ、カリフォルニア州、米国）を使用して１μｇの合成ＧＦＰ  ｍＲＮＡ（対照）又は１μｇの合成ヒトＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡのどちらかで形質移入した。ＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入された細胞に加えて非形質移入細胞も対照として使用した。細胞を２〜３日毎に継代処理し、続いて合成ｍＲＮＡで形質移入した。細胞の核型分析を第３３継代の時点（１回目の形質移入から３日後）、第３４継代の時点（３回目の形質移入から３日後）、第３６継代の時点（４回目の形質移入から３日後）、及び第４０継代の時点（７回目の形質移入から３日後）に実施した。
【０３３０】
図１Ｂに示されているように、ヒトＺＳＣＡＮ４の合成ｍＲＮＡによるマウスＥＳ細胞の形質移入によって染色体異常が修正され、正常な核型（正倍数性）を有する細胞の数が増加した。有意レベルの修正を見るには１回目の形質移入で充分であったが、反復形質移入（例えば、７回）によって正倍数性を有する細胞の数が約２０％から４０％までさらに増加した。これらの結果は細胞へのヒトＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡの導入によって染色体数の異常を修正することができることを示している。
【０３３１】
ヒトＺＳＣＡＮ４を発現するセンダイウイルスベクターはマウス胚性幹細胞において染色体異常を修正する
図２ＡはマウスＺｓｃａｎ４ｃ又はヒトＺＳＣＡＮ４のどちらかを発現するセンダイウイルスベクターでマウスＥＳ細胞を処理した後の核型分析のまとめを示している。ＭＣ１ＺＥマウスＥＳ細胞（第３３継代又は第３４継代）を５×１０４細胞／ウェルの濃度で６ウェルディッシュに播種し、図２Ａに示されているＭＯＩでＳｅＶＡＧ（対照）、ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４、又はＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４のいずれかを用いて処理した。追加の対照として何の処理も受けていないＭＣ１ＺＥ細胞を使用した。３日後に細胞の核型を分析した。図２Ａに示されているように、ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４又はＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４との接触によってマウスＥＳ細胞の核型を劇的に改善することができる。興味深いことに、それらの結果はヒトＺＳＣＡＮ４がマウスＺｓｃａｎ４ｃよりも好適に機能したことを示している。
【０３３２】
図２ＢはマウスＺｓｃａｎ４ｃ−ＥＲＴ２融合タンパク質又はヒトＺＳＣＡＮ４−ＥＲＴ２融合タンパク質のどちらかを発現するセンダイウイルスベクターでマウスＭＣ１ＺＥ  ＥＳ細胞を処理した後の核型分析のまとめを示している。ＥＲＴ２ドメインと融合したそのタンパク質は細胞培養培地中のタモキシフェン（Ｔｍｘ）の存在によって活性化され得ることが知られている。ＭＣ１ＺＥマウスＥＳ細胞（第３３継代又は第３４継代）を５×１０４細胞／ウェルの濃度で６ウェルディッシュに播種し、図２Ｂに示されているＭＯＩでＳｅＶｍＺＥＲＴ２又はＳｅＶｈＺＥＲＴ２のどちらかを用いて処理した。対照として何の処理も受けていないＭＣ１ＺＥ細胞を使用した。図２Ｂに示されているように、ＳｅＶｍＺＥＲＴ２又はＳｅＶｈＺＥＲＴ２のどちらかによる処理はＴｍｘが無くても染色体異常を修正することができる。しかしながら、染色体異常を修正するＳｅＶｍＺＥＲＴ２及びＳｅＶｈＺＥＲＴ２の能力はＴｍｘの添加によってさらに増強された。それらの結果もヒトＺＳＣＡＮ４がマウスＺｓｃａｎ４ｃよりも好適に機能することを示しており、融合タンパク質であるヒトＺＳＣＡＮ４−ＥＲＴ２によってＴｍｘの存在下で正倍数性を有する細胞の数が１５％から５３％まで増加した。
【０３３３】
図３はマウスＺｓｃａｎ４ｃ又はヒトＺＳＣＡＮ４のどちらかを発現する温度感受性センダイウイルスベクターでＭＣ１ＺＥマウスＥＳ細胞を処理した後の核型分析のまとめを示している。ＭＣ１ＺＥマウスＥＳ細胞（第３３継代又は第３４継代）を５×１０４細胞／ウェルの濃度で６ウェルディッシュに播種し、図３に示されているＭＯＩでＳｅＶＡＧ−ＴＳ１５（対照）、ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４−ＴＳ１５、又はＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５のいずれかを用いて処理した。追加の対照として何の処理も受けていないＭＣ１ＺＥ細胞を使用した。これらのベクターとそれらの細胞を接触させた後に細胞を３５℃で３日間（図３Ａ）、３５℃で６日間（図３Ｂ）、及び３５℃で３日間培養した後に３７℃で３日間（図３Ｃ）培養した。ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４−ＴＳ１５又はＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５のどちらかと細胞を接触させることによる染色体異常の修正が３種類全ての条件で観察された。驚くべきことに、染色体異常の修正についてヒトＺＳＣＡＮ４はマウスＺｓｃａｎ４ｃよりも好適に機能することがわかった。したがって、これらの結果はマウス細胞においてもヒトＺＳＣＡＮ４が驚くべきことにマウスＺｓｃａｎ４ｃよりも優れた結果をもたらすことを示している。実際には細胞をヒトＺＳＣＡＮ４（すなわち、ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５）で処理し、細胞を３５℃で３日間培養した後に３７℃で３日間することによって最良の結果が観察された。その処理によって正倍数性を有する細胞の数が１９％から５３％まで増加した。これらの実験では温度感受性センダイベクターで処理された細胞を３５℃という許容温度で３日間培養し、続いて３７℃という不活性化温度で３日間培養することは、一時的なＺｓｃａｎ４の発現を意味する。対照的に、温度感受性センダイベクターで処理された細胞を３５℃という許容温度で６日間全体にわたって培養することは、連続的Ｚｓｃａｎ４発現を意味する。これらの条件に基づくと、それらの結果は染色体異常の修正について一時的なＺｓｃａｎ４の発現が連続的Ｚｓｃａｎ４の発現よりも好適に機能することを示している。
【０３３４】
実施例２：マウス胚性幹細胞に対するＺｓｃａｎ４生物製剤の効果
マウスゲノムに組み込まれたプラスミドベクターからの外来性マウスＺｓｃａｎ４ｃの強制発現によってＴｍｅｍ９２遺伝子、Ｓｔｒａ８遺伝子、及び内在性Ｚｓｃａｎ４遺伝子を含むユニークな遺伝子セットの発現が誘導されることがこれまでに示されている（Ａｍａｎｏら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ誌、２０１３年；第４号：１９６６頁）。
【０３３５】
この実施例はＺｓｃａｎ４生物製剤（例えば、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ又はＺｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターのどちらかによるＺｓｃａｎ４の発現）がマウス胚性幹（ＥＳ）細胞において同じ機能を発揮することを示す。
【０３３６】
材料と方法
細胞培養
ＭＣ１マウス胚性幹（ＥＳ）細胞株は、マウスゲノムに組み込まれている外部より導入されたＺｓｃａｎ４ｃ遺伝子の機能を示すために典型的なマウス多能性幹細胞として以前に使用された（Ａｍａｎｏら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ誌、２０１３年；第４号：１９６６頁）。以前に説明された完全ＥＳ培地（Ａｍａｎｏら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ誌、２０１３年；第４号：１９６６頁）：ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１５％ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、１０００Ｕ／ｍｌ白血病阻止因子（ＬＩＦ）（ＥＳＧＲＯ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、及びペニシリン／ストレプトマイシン（５０Ｕ／５０μｇ／ｍｌ）の中でＭＣ１細胞を５％ＣＯ２中３７℃で培養した。培地を毎日交換し、日常的に２〜３日毎に細胞を継代処理した。
【０３３７】
合成ｍＲＮＡ
修飾型ｍＲＮＡの合成のため、Ｗａｒｒｅｎら（Ｗａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ誌、２０１０年１１月５日；第７巻（第５号）：６１８〜３０頁）によって以前に報告されているようにｍＲＮＡ合成を実施した。Ｗａｒｒｅｎらのこれらのプロトコルを使用して、哺乳類細胞におけるＲＮＡ安定性並びに翻訳効率を上昇させるために修飾型ｄＮＴＰ混合物を使用するヒトＺＳＣＡＮ４又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする鋳型ＤＮＡのインビトロ転写によりｍＲＮＡを合成した。次の修飾型ｄＮＴＰ、すなわち、３’−０−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  ＡＲＣＡキャップ類似体、５−メチルシチジントリホスフェート、及びシュードウリジントリホスフェートを使用した。
【０３３８】
センダイウイルスベクター
マウスＺｓｃａｎ４ｃ（ＳｅＶ１８＋ｍＺｓｃａｎ４／ΔＦ）又はヒトＺＳＣＡＮ４（ＳｅＶ１８＋ｈＺＳＣＡＮ４／ΔＦ）のどちらかを発現するセンダイウイルスベクターは、ＭＢＬ（株式会社医学生物学研究所）によってカスタム作製された。これらのベクターを本明細書においてそれぞれ「ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４」又は「ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４」と呼ぶ。対照として同じセンダイを使用したが、そのベクターはＺｓｃａｎ４よりも緑色蛍光タンパク質変異体を発現した。これらのセンダイベクターはＦタンパク質を欠いており、したがって、伝染性ではない（Ｉｎｏｕｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ誌、第７７巻：２３２３８〜３２４６頁、２００３年）。
【０３３９】
マウスＺｓｃａｎ４ｃ融合タモキシフェン制御可能ＥＲＴ２ドメイン（ＳｅＶ１８＋ｍＺＥＲＴ２／ΔＦ）又はヒトＺＳＣＡＮ４融合タモキシフェン制御可能ＥＲＴ２ドメイン（ＳｅＶ１８＋ｈＺＥＲＴ２／ΔＦ）のどちらかを発現するセンダイベクターは、ＭＢＬ（株式会社医学生物学研究所）によってカスタム作製された。これらのベクターを本明細書においてそれぞれ「ＳｅＶｍＺＥＲＴ２」又は「ＳｅＶｈＺＥＲＴ２」と呼ぶ。これらのセンダイベクターもＦタンパク質を欠いており、したがって、伝染性ではない（Ｉｎｏｕｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ誌、第７７巻：２３２３８〜３２４６頁、２００３年）。
【０３４０】
さらに、マウスＺｓｃａｎ４（ＳｅＶ１８＋ｍＺｓｃａｎ４／ＴＳ１５ΔＦ）又はヒトＺＳＣＡＮ４（ＳｅＶ１８＋ｈＺＳＣＡＮ４／ＴＳ１５ΔＦ）のどちらかを発現する温度感受性センダイベクターは、ＭＢＬ（株式会社医学生物学研究所）によってカスタム作製された。これらのベクターを本明細書においてそれぞれ「ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４−ＴＳ１５」又は「ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５」と呼ぶ。これらのセンダイベクターは３５℃で機能的であり、３７℃で不活性である（Ｂａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ誌、２０１１年；第１０８巻（第３４号）：１４２３４〜１４２３９頁）。対照として同じ温度感受性センダイベクターを使用したが、そのベクターはＺｓｃａｎ４よりも緑色蛍光タンパク質変異体を発現した。このベクターを本明細書において「ＳｅＶＡＧ−ＴＳ１５」と呼ぶ。これらのセンダイベクターもＦタンパク質を欠いており、したがって、伝染性ではない（Ｉｎｏｕｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ誌、第７７巻：２３２３８〜３２４６頁、２００３年）。
【０３４１】
結果
図４Ａは合成ｍＲＮＡでのＭＣ１マウスＥＳ細胞の形質移入の後にＴｍｅｍ９２遺伝子、Ｓｔｒａ８遺伝子、Ａｃｔｂ（β−アクチン対照）遺伝子、及び内在性Ｚｓｃａｎ４遺伝子の発現レベルをモニターするｑＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示している。ＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入された対照細胞と比較して、ヒトＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡは内在性マウスＺｓｃａｎ４遺伝子の発現を上昇させた。
【０３４２】
図４ＢはマウスＺｓｃａｎ４ｃ又はヒトＺＳＣＡＮ４のどちらかを発現するセンダイウイルスベクターとＭＣ１マウスＥＳ細胞を接触させた後にＴｍｅｍ９２遺伝子、Ｓｔｒａ８遺伝子、Ａｃｔｂ（β−アクチン対照）遺伝子、及び内在性Ｚｓｃａｎ４遺伝子の発現レベルをモニターするｑＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示している。空のセンダイベクター（ＳｅＶＡＧ）と接触した対照細胞と比較して、ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４とＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４の両方がＴｍｅｍ９２遺伝子、Ｓｔｒａ８遺伝子、及び内在性Ｚｓｃａｎ４遺伝子の発現を上昇させた。ＳｅＶｍＺＥＲＴ２とＳｅＶｈＺＥＲＴ２はＴｍｘの存在下でも機能する。同様に、マウスＺｓｃａｎ４ｃ又はヒトＺＳＣＡＮ４のどちらかを発現する温度感受性センダイベクターもＭＣ１細胞において機能した（図４Ｃ）。
【０３４３】
これらの結果はＺｓｃａｎ４生物製剤がＺｓｃａｎ４を発現するセンダイベクター又は合成Ｚｓｃａｎ４  ｍＲＮＡの形態でマウスＥＳ細胞において、マウスゲノムに組み込まれているマウスＺｓｃａｎ４ｃ導入遺伝子と同様に機能することができることを示している。理論に捉われることを望むものではないが、Ｚｓｃａｎ４生物製剤は、使用しやすいこととゲノムへの望まないＤＮＡ組込みが除外されていることのためにマウス細胞用の試薬及びヒト細胞用の治療薬としての利点を有すると考えられる。また、Ｚｓｃａｎ４生物製剤は、細胞を遺伝子操作するためにかなりの量の時間を費やすことよりも、むしろ細胞培養培地へのＺｓｃａｎ４生物製剤の添加という簡単な手順だけを必要とする。
【０３４４】
実施例３：ヒト人工多能性幹細胞に対するＺｓｃａｎ４生物製剤の効果
遺伝子ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及びＤＵＸ４は、マウスＺｓｃａｎ４ｃ遺伝子又はヒトＺＳＣＡＮ４遺伝子が導入遺伝子ベースの遺伝子発現システムによって過剰発現すると発現上昇するマーカー遺伝子として特定されている。
【０３４５】
この実施例はＺｓｃａｎ４生物製剤（例えば、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ又はＺｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターのどちらかによるＺｓｃａｎ４の発現）がマウス多能性幹細胞において使用された導入遺伝子ベースのＺｓｃａｎ４過剰発現システムと同様にヒトｉＰＳ細胞において機能し得ることを示す。この実施例はヒトＺＳＣＡＮ４をコードする合成ｍＲＮＡとヒトＺＳＣＡＮ４を発現するセンダイウイルスベクターをヒト多能性幹細胞の処理用の治療的生物製剤として使用することができることも示す。
【０３４６】
材料と方法
細胞培養
ヒト包皮線維芽細胞由来人工多能性幹（ｈｉＰＳ）細胞（システムバイオサイエンス、カリフォルニア州、米国）を、有糸分裂不活化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）と製造業者の指示に従って２０％ノックアウト血清代替品と１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ライフテクノロジーズ、カリフォルニア州、米国）を添加した培地の上で培養した。培地を毎日交換し、７日毎にアキュターゼを使用して細胞を継代処理した。
【０３４７】
合成ｍＲＮＡ
修飾型ｍＲＮＡの合成のため、Ｗａｒｒｅｎら（Ｗａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ誌、２０１０年１１月５日；第７巻（第５号）：６１８〜３０頁）によって以前に報告されているようにｍＲＮＡ合成を実施した。Ｗａｒｒｅｎらのこれらのプロトコルを使用して、哺乳類細胞におけるＲＮＡ安定性並びに翻訳効率を上昇させるために修飾型ｄＮＴＰ混合物を使用するマウスＺｓｃａｎ４ｃ、ヒトＺＳＣＡＮ４、又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする鋳型ＤＮＡのインビトロ転写によりｍＲＮＡを合成した。次の修飾型ｄＮＴＰ、すなわち、３’−０−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  ＡＲＣＡキャップ類似体、５−メチルシチジントリホスフェート、及びシュードウリジントリホスフェートを使用した。
【０３４８】
センダイウイルスベクター
マウスＺｓｃａｎ４ｃ（ＳｅＶ１８＋ｍＺｓｃａｎ４／ΔＦ）又はヒトＺＳＣＡＮ４（ＳｅＶ１８＋ｈＺＳＣＡＮ４／ΔＦ）のどちらかを発現するセンダイウイルスベクターは、ＭＢＬ（株式会社医学生物学研究所）によってカスタム作製された。これらのベクターを本明細書においてそれぞれ「ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４」又は「ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４」と呼ぶ。対照として同じセンダイベクターを使用したが、そのベクターはＺｓｃａｎ４よりも緑色蛍光タンパク質変異体を発現した。これらのセンダイベクターはＦタンパク質を欠いており、したがって、伝染性ではない（Ｉｎｏｕｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ誌、第７７巻：２３２３８〜３２４６頁、２００３年）。
【０３４９】
マウスＺｓｃａｎ４ｃ融合タモキシフェン制御可能ＥＲＴ２ドメイン（ＳｅＶ１８＋ｍＺＥＲＴ２／ΔＦ）又はヒトＺＳＣＡＮ４融合タモキシフェン制御可能ＥＲＴ２ドメイン（ＳｅＶ１８＋ｈＺＥＲＴ２／ΔＦ）のどちらかを発現するセンダイベクターは、ＭＢＬ（株式会社医学生物学研究所）によってカスタム作製された。これらのベクターを本明細書においてそれぞれ「ＳｅＶｍＺＥＲＴ２」又は「ＳｅＶｈＺＥＲＴ２」と呼ぶ。これらのセンダイベクターもＦタンパク質を欠いており、したがって、伝染性ではない（Ｉｎｏｕｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ誌、第７７巻：２３２３８〜３２４６頁、２００３年）。
【０３５０】
さらに、マウスＺｓｃａｎ４（ＳｅＶ１８＋ｍＺｓｃａｎ４／ＴＳ１５ΔＦ）又はヒトＺＳＣＡＮ４（ＳｅＶ１８＋ｈＺＳＣＡＮ４／ＴＳ１５ΔＦ）のどちらかを発現する温度感受性センダイベクターは、ＭＢＬ（株式会社医学生物学研究所）によってカスタム作製された。これらのベクターを本明細書においてそれぞれ「ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４−ＴＳ１５」又は「ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５」と呼ぶ。これらのセンダイベクターは３５℃で機能的であり、３７℃で不活性である（Ｂａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ誌、２０１１年；第１０８巻（第３４号）：１４２３４〜１４２３９頁）。対照として同じ温度感受性センダイベクターを使用したが、そのベクターはＺｓｃａｎ４よりも緑色蛍光タンパク質変異体を発現した。このベクターを本明細書において「ＳｅＶＡＧ−ＴＳ１５」と呼ぶ。これらのセンダイベクターもＦタンパク質を欠いており、したがって、伝染性ではない（Ｉｎｏｕｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ誌、第７７巻：２３２３８〜３２４６頁、２００３年）。
【０３５１】
結果
図５ＡはヒトＺＳＣＡＮ４をコードする合成ｍＲＮＡがＳＥＲＰＩＮＢ４の発現を誘導することができることを示している。図５ＢはＳｅＶｍＺｓｃａｎ４、ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４、ＳｅＶｍＺＥＲＴ２（Ｔｍｘ＋条件）、及びＳｅＶｈＺＥＲＴ２（Ｔｍｘ＋条件）がＳＥＲＰＩＮＢ４の発現を誘導することができ、ＤＮＭＴ３ＬとＤＵＸ４の発現をある程度誘導することができることを示している。同様に、マウスＺｓｃａｎ４ｃ又はヒトＺＳＣＡＮ４のどちらかを発現する温度感受性センダイベクターはＤＮＭＴ３Ｌの発現を誘導することができる（図５Ｃ）。
【０３５２】
これらの結果は、Ｚｓｃａｎ４がヒトｉＰＳ細胞に対するＺｓｃａｎ４の効果に関するマーカー（例えば、ＳＥＲＰＩＮＢ４、ＤＮＭＴ３Ｌ、及びＤＵＸ４）を誘導するので、Ｚｓｃａｎ４生物製剤がＺｓｃａｎ４を発現するセンダイベクター又は合成Ｚｓｃａｎ４  ｍＲＮＡの形態でヒト多能性幹細胞、例えば、ヒトｉＰＳ細胞において機能することができることを示している。これらのマーカーはＺｓｃａｎ４生物製剤の品質と有効性の測定（品質管理［ＱＣ］）に有用でもあり得る。
【０３５３】
実施例４：ヒト多能性幹細胞の品質を改善するためのＺｓｃａｎ４発現
この実施例は、Ｚｓｃａｎ４生物製剤（例えば、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ又はＺｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターのどちらかによるＺｓｃａｎ４の発現）を活用して１つ以上の染色体異常を修正し、且つ、１つ以上のエピジェネティックエラーを修正することによってＺｓｃａｎ４生物製剤はヒト胚性幹（ＥＳ）細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を含むがこれらに限定されないヒト多能性幹細胞の品質を改善することができるという発見について説明する。とりわけ、Ｚｓｃａｎ４生物製剤は他の方法では脱メチル化することが難しい幾つかのＤＮＡ領域を一時的に脱メチル化することによってヒトｉＰＳ細胞における誤ったＤＮＡメチル化パターンを修正することができることが示される。例えば、ＤＮＡメチル化パターンがヒトｉＰＳ細胞とヒトＥＳ細胞の間で異なるゲノム中の領域が存在する。したがって、ヒトｉＰＳ細胞におけるそのような誤ったＤＮＡメチル化パターンを修正することが重要である。単にヒトｉＰＳ細胞をＺｓｃａｎ４生物製剤に曝露することによりＤＮＡメチル化問題を修正するＺｓｃａｎ４生物製剤の能力は、治療に使用するためにヒトｉＰＳ細胞の安全性を改善する重要な技術であり得ると考えられる。ヒトｉＰＳ細胞においてＤＮＡメチル化問題を修正するＺｓｃａｎ４生物製剤の能力は既存のヒトｉＰＳ細胞の改善も可能にする。
【０３５４】
実施例５：Ｚｓｃａｎ４発現はヒト先天性角化不全症線維芽細胞の寿命を延長し、ヒト先天性角化不全症線維芽細胞のテロメア長を伸長する
この実施例はＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ又はＺｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターのどちらかによるヒトＺＳＣＡＮ４の発現がヒト先天性角化不全症線維芽細胞の寿命の延長を誘導し、ヒト先天性角化不全症線維芽細胞のテロメア長の伸長も誘導するという発見について説明する。この実施例はヒトＺＳＣＡＮ４をコードする合成ｍＲＮＡとヒトＺＳＣＡＮ４を発現するセンダイウイルスベクターを治療的生物製剤として使用することができることも示す。
【０３５５】
材料と方法
細胞培養
先天性角化不全症（ＤＫＣ：Ｘ連鎖性）を有する患者から単離された線維芽細胞をコリエル細胞レポジトリーから購入した（カタログＩＤ：ＡＧ０４６４６）。コリエルカタログ情報によるとその細胞のドナーである１１歳の白人男性は罹患しており、皮膚発疹、貧血症、爪ジストロフィー及び食道異常を提示している。家族歴は陰性である。生検試料を未発症の皮膚から生存中に採取した。細かく切り刻んだ組織からなる外植片を使用して１９８１年２月２１日に培養を開始した。細胞形態は線維芽細胞様である。細胞分裂レベル（ＰＤＬ）は凍結時に５．４１であり、継代数は５であった。
【０３５６】
コリエル細胞レポジトリーからＤＫＣ細胞を受領した後にそれらの細胞をさらに数継代にわたって培養した。コリエル細胞レポジトリーによって推奨される条件下で、すなわち、１５％ウシ胎児血清（不活化されていない）を添加されたアール塩及び非必須アミノ酸を有するイーグル最小必須培地でそれらの細胞を培養した。
【０３５７】
合成ｍＲＮＡ
修飾型ｍＲＮＡの合成のため、Ｗａｒｒｅｎら（Ｗａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ誌、２０１０年１１月５日；第７巻（第５号）：６１８〜３０頁）によって以前に報告されているようにｍＲＮＡ合成を実施した。Ｗａｒｒｅｎらのこれらのプロトコルを使用して、哺乳類細胞におけるＲＮＡ安定性並びに翻訳効率を上昇させるために修飾型ｄＮＴＰ混合物を使用するヒトＺＳＣＡＮ４又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする鋳型ＤＮＡのインビトロ転写によりｍＲＮＡを合成した。次の修飾型ｄＮＴＰ、すなわち、３’−０−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  ＡＲＣＡキャップ類似体、５−メチルシチジントリホスフェート、及びシュードウリジントリホスフェートを使用した。
【０３５８】
センダイウイルスベクター
ヒトＺＳＣＡＮ４（ＳｅＶ１８＋ｈＺＳＣＡＮ４／ΔＦ）を発現するセンダイベクターはＭＢＬ（株式会社医学生物学研究所）によってカスタム作製された。そのベクターを本明細書において「ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４」と呼ぶ。このセンダイベクターはＦタンパク質を欠いており、したがって、非伝染性である（Ｉｎｏｕｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ誌、第７７巻：３２３８〜３２４６頁、２００３年）。実験に１０のＭＯＩ（感染多重度）を使用した。
【０３５９】
テロメアサザンブロット分析
製造業者の指示に従ってＴｅｌｏＴＡＧＧＧテロメア長アッセイキット（ロッシュ・アプライド・サイエンス、インディアナ州、米国）を使用してサザンブロット分析により細胞のテロメア長を測定した。
【０３６０】
結果
ヒトＺＳＣＡＮ４をコードする合成ｍＲＮＡはヒト先天性角化不全症線維芽細胞の寿命を延長する
ＤＫＣ細胞を５×１０４細胞／ウェルの濃度で６ウェルディッシュに播種し、その後に５μｌのリポフェクタミン（ＲＮＡｉＭＡＸ：ライフテクノロジーズ、カリフォルニア州、米国）を使用して１μｇの合成ｍＲＮＡで形質移入した。次の日に培地を交換した。毎週、細胞を１：２の比率で継代処理し、５０ｎｇ／ｍｌのＢ１８Ｒ（Ｉ型ＩＦＮ阻害剤：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州、米国）の存在下において合成ｍＲＮＡで形質移入した。試料を三組調製した。自動化細胞計数装置Ｍｏｘｉ  Ｚ（ＯＲＦＬＯ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アイダホ州、米国）を使用して細胞数を数えた。細胞数をＰＤＬ＝０から始まるＰＤＬ（細胞分裂レベル）に変換した（コリエル細胞レポジトリー由来の情報によるとＰＤＬ＝９にほぼ等しい第９継代から正規化された）。
【０３６１】
図６は６０日にわたる細胞増殖アッセイの結果を示している。対照実験において、ＧＦＰ  ｍＲＮＡの反復形質移入ではＤＫＣ細胞の増殖パターンは変化しない。およそ培養２０日後（ＰＤＬ＝約２）に細胞は増殖を停止し、細胞老化を経験する。対照的に、ヒトＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡの反復形質移入はＤＫＣ細胞の寿命を延長する。それらの細胞は約４０日（ＰＤＬ＝約４）まで増殖し続けた。ｈＺＳＣＡＮ４処理が無制限の増殖能を有する腫瘍様細胞にそれらの細胞を形質転換しなかったことに留意することが重要である。これらの結果はｈＺＳＣＡＮ４処理がＤＫＣ患者に由来する細胞を腫瘍に形質転換することなくそれらの細胞の寿命を延長することができることを示している。
【０３６２】
ヒトＺＳＣＡＮ４を発現するセンダイウイルスベクターはヒト先天性角化不全症線維芽細胞の寿命を延長する
ＤＫＣ細胞を５×１０４細胞／ウェルの濃度で６ウェルディッシュに播種し、６時間後にそれらの細胞をＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４ベクターと１０のＭＯＩで２４時間接触させた。対照として２つ目のＤＫＣ細胞の試料を、同じ方法だがＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４ベクターへの曝露を含まない方法で培養した。１週間毎、又は２週間ごとに細胞を継代処理した。自動化細胞計数装置Ｍｏｘｉ  Ｚ（ＯＲＦＬＯ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アイダホ州、米国）を使用して細胞数を数えた。細胞数をＰＤＬ＝０から始まるＰＤＬ（細胞分裂レベル）に変換した（コリエル細胞レポジトリー由来の情報によるとＰＤＬ＝９にほぼ等しい第９継代から正規化された）。
【０３６３】
図７Ａは細胞増殖アッセイの結果を示している。対照実験において、ＤＫＣ細胞は典型的な増殖パターンを示す。およそ培養２５日後（およそＰＤＬ＝２）に細胞は増殖を停止し、細胞老化を経験する。対照的に、ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４ベクターと接触したＤＫＣ細胞は細胞寿命の増加を示す。ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４処理が無制限の増殖能を有する腫瘍様細胞にそれらの細胞を変化させることがないことに留意することが重要である。
【０３６４】
図７Ｂは第２８日における細胞形態を示している。ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４処理細胞は未処理対照細胞よりも好適な形態を示している。
【０３６５】
これらの結果はＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４処理がＤＫＣ患者に由来する細胞を腫瘍に形質転換することなくそれらの細胞の寿命を延長することができることを示している。
【０３６６】
ヒトＺＳＣＡＮ４をコードする合成ｍＲＮＡはヒト先天性角化不全症線維芽細胞においてテロメア長を伸長する
図８Ａは実験の手順を示している。ＤＫＣ細胞を１×１０5細胞／１０ｃｍ培養ディッシュの濃度で１０ｃｍ培養ディッシュに播種した。その後、２５μｌのリポフェクタミン（ＲＮＡｉＭＡＸ：ライフテクノロジーズ、カリフォルニア州、米国）を使用して５μｇの合成ｍＲＮＡで各１０ｃｍディッシュ中の細胞を形質移入した。次の日に培地を交換した。１枚のディッシュの細胞を第７日に回収し、ゲノムＤＮＡを抽出した。別のディッシュの細胞を１：２の比率で継代処理し、その後に２５μｌのリポフェクタミンを使用して５μｇの合成ｍＲＮＡで形質移入した。細胞を第１５日に回収し、ゲノムＤＮＡを抽出した。その後、そのゲノムＤＮＡをテロメア長アッセイの対象とした。
【０３６７】
図８Ｂはテロメア長アッセイの結果を示している。以前に（Ｗｏｎｇ  Ｊ．Ｍ．、Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｋ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．誌（２００６年）、第２０巻（第２０号）、２８４８〜２８５８頁）報告されているように、ＤＫＣ線維芽細胞のテロメア長は正常細胞のテロメア長よりも短く、ＤＫＣ細胞を培養すると急速にさらに短くなる。対照実験において、ＧＦＰ−ｍＲＮＡでの形質移入はＤＫＣ細胞のテロメア長短縮パターンを変えなかった。対照的に、ヒトＺＳＣＡＮ４−ｍＲＮＡでの形質移入はＤＫＣ細胞のテロメア長を伸長し、テロメア長が短くなることを防止した。これらの結果はＤＫＣ疾患表現型の主要な原因であるＤＫＣ細胞のテロメア長短縮がｈＺＳＣＡＮ４−ｍＲＮＡを用いる細胞処理によって救援され得ることを示している。
【０３６８】
実施例６：Ｚｓｃａｎ４発現はヒトウェルナー症候群細胞の寿命を延長する
ＷＳ患者は早期老化の出現を特徴とする。培養中のＷＳ患者の細胞は高い割合の染色体切断、転座及び欠失を示す。したがって、ＷＳ患者はゲノム安定性及び／又は染色体安定性を向上させることができる処理を必要とする。
【０３６９】
この実施例はＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡがウェルナー症候群（ＷＳ）患者から単離された線維芽細胞の寿命を延長することができることを示す。この実施例はヒトＺＳＣＡＮ４をコードする合成ｍＲＮＡを治療的生物製剤として使用することができることも示す。
【０３７０】
材料と方法
細胞培養
ウェルナー症候群（ＷＳ）を有する患者から単離された線維芽細胞をコリエル細胞レポジトリーから購入した（カタログＩＤ：ＡＧ０３１４１）。コリエルカタログ情報によると「ドナーは３０歳の白人女性であり、色素沈着し、且つ、萎縮した皮膚、白内障及びタイプＶ高脂血症といった早期老化の特徴を有した。生検試料を生存中に１９７８年９月２０日に採取した。細かく切り刻んだ皮膚組織からなる外植片を使用して培養を開始した。細胞形態は線維芽細胞様である。核型は検査した細胞の８０％で４６本、ＸＸであり、ランダムな染色体異常を示す。７４８番において終止コドンが生じる｛Ｇｌｎ７４８ＴＥＲ（Ｑ７４８Ｘ）｝ＷＲＮ遺伝子のヌクレオチド２４７６におけるＣからＴへの変移（２４７６Ｃ＞Ｔ）についてホモ接合性である。累積細胞分裂レベル（ＰＤＬ）は凍結時に１７．９７であり、継代数は１１であった。」コリエル細胞レポジトリーからＷＳ細胞を受領した後にそれらの細胞をさらに数継代にわたって培養した。コリエル細胞レポジトリーによって推奨される条件、すなわち、１５％ウシ胎児血清（不活化されていない）を添加されたアール塩アール塩を含むイーグル最小必須培地：ダルベッコ改変ＭＥＭの中でそれらの細胞を培養した。
【０３７１】
合成ｍＲＮＡ
修飾型ｍＲＮＡの合成のため、Ｗａｒｒｅｎら（Ｗａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ誌、２０１０年１１月５日；第７巻（第５号）：６１８〜３０頁）によって以前に報告されているようにｍＲＮＡ合成を実施した。Ｗａｒｒｅｎらのこれらのプロトコルを使用して、哺乳類細胞におけるＲＮＡ安定性並びに翻訳効率を上昇させるために修飾型ｄＮＴＰ混合物を使用するヒトＺＳＣＡＮ４又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする鋳型ＤＮＡのインビトロ転写によりｍＲＮＡを合成した。次の修飾型ｄＮＴＰ、すなわち、３’−０−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  ＡＲＣＡキャップ類似体、５−メチルシチジントリホスフェート、及びシュードウリジントリホスフェートを使用した。
【０３７２】
結果
ＷＳ細胞を５×１０４細胞／ウェルの濃度で６ウェルディッシュに播種し、その後に第０日に５μｌのリポフェクタミン（ＲＮＡｉＭＡＸ：ライフテクノロジーズ、カリフォルニア州、米国）を使用して１μｇの合成ｍＲＮＡで形質移入した。次の日に培地を交換した。同じｍＲＮＡを用いる２回目の形質移入を第３日に実施した。それらの細胞の成長に応じて１週間毎又は２週間毎に細胞を１：２の比率で継代処理した。試料を三組調製した。細胞数を０のＰＤＬから始まるＰＤＬに変換した（コリエル細胞レポジトリー由来の情報によると、細胞老化に近い１９の累積ＰＤＬにほぼ等しい）。
【０３７３】
図９は細胞増殖アッセイの結果を示している。合成ＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入されたＷＳ細胞を対照として使用した。図９に示されているように、合成ＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入されたＷＳ細胞は細胞老化を経験し、増殖を停止した。対照的に、合成ｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡを用いるＷＳ細胞の形質移入はＷＳ細胞にさらに２単位上のＰＤＬをもたらし、したがって、ＷＳ細胞の寿命を延長した（図９）。重要なことに、それらの結果はそれらの細胞が最終的には増殖を停止したので、合成ｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡが無制限の細胞増殖を提供しなかったことを示している。合成ｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡを用いた結果と同様に、ＷＳ細胞の寿命延長はヒトＺＳＣＡＮ４を発現するＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４センダイウイルスベクター又はＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５センダイウイルスベクターと接触した細胞においても観察された。理論に捉われることを望むものではないが、治療的生物製剤としてのＺＳＣＡＮ４の使用が処理細胞において細胞形質転換及び／又は癌を引き起こすことはないようであると考えられる。これらの結果はｈＺＳＣＡＮ４処理がＷＳ患者の細胞を腫瘍に形質転換することなくそれらの細胞の寿命を延長することができることを示している。
【０３７４】
実施例７：患者のテロメア短縮を治療するためのＺｓｃａｎ４発現
図１０はＺｓｃａｎ４を使用する１つの処理モードを例示している。この手法は骨髄機能不全と白血病を有する患者を治療するために病院で日常的に行われている骨髄移植法と非常に類似している。骨髄は造血幹細胞と間葉系幹細胞を含んでおり、その骨髄が患者から吸引され、その直後にＺｓｃａｎ４（例えば、ヒトＺＳＣＡＮ４を担持するセンダイベクター）に曝露される。このＺｓｃａｎ４への曝露は一時的で短時間のものである。理論に捉われることを望むものではないが、それらの骨髄細胞を前記患者に投与して戻すとＺｓｃａｎ４の発現が消失すると考えられる。あるいは、温度を切り替えることによってＺｓｃａｎ４の発現を止めることができるので、温度感受性センダイベクターを使用することができる。あるいは、融合タンパク質ｈＺＳＣＡＮ４−ＥＲＴ２を担持するセンダイベクターを使用することができ、タモキシフェンの添加によってその融合タンパク質をオン状態にすることができ、タモキシフェンの除去によってオフ状態にすることができる。あるいは、合成ｍＲＮＡの限定的な半減期のためにＺＳＣＡＮ４タンパク質の産生は一時的であるので、ｈＺＳＣＡＮ４−ｍＲＮＡなどの合成ｍＲＮＡを使用することができる。その後、そのようにしてＺｓｃａｎ４により若返らされた骨髄細胞が患者の骨髄及び造血コンパートメントに再定植する。この一時的なＺｓｃａｎ４接触の長期効果に基づくと、理論に捉われることを望むものではないが、この手法はたった１回必要とされるか、又は長い間隔の時間（例えば、数年）の後に定期的に必要とされると考えられる。理論に捉われることを望むものではないが、Ｚｓｃａｎ４により若返らされた骨髄細胞は病気の骨髄細胞との競争に勝ち、そうしてそれらの病気の骨髄細胞に置き換わると考えられる。以上より、標準的骨髄移植時に実施されている病気の骨髄細胞を排除するための骨髄への放射線照射が必要ではなくなると考えられる。
【０３７５】
実施例８：ヒト線維芽細胞においてテロメアを伸長するＺｓｃａｎ４発現
この実施例はＺｓｃａｎ４過剰発現によってヒト線維芽細胞においてテロメア延長が誘導されるという発見について説明する。
【０３７６】
材料と方法
細胞培養
成人の皮膚（約３０歳）から単離された初代ヒト成人皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）をライフテクノロジーズ（カタログ番号：Ｃ−０１３−５Ｃ）から購入した。ファンコーニ貧血相補群Ａ（ＦＡＮＣＡ）患者から単離された線維芽細胞（ＧＭ０１３０９）をコリエル細胞レポジトリーから購入した。標準的培養条件下で、すなわち、１０％ウシ胎児血清を添加されたＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）でこれらの細胞を維持した。
【０３７７】
ｑＰＣＲによるテロメア定量
以前に記載された方法（Ｃａｗｔｈｏｎ，  Ｒ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．誌、２００２年５月１５日；第３０巻（第１０号）：ｅ４７；及びＣａｌｌｉｃｏｔｔ，  ＲＪら、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ誌、２００６年）を用いてｑＰＣＲによるテロメア定量を実施した。ＤＮｅａｓｙ血液及び組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて５×１０5細胞を越える線維芽細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。ナノドロップを使用してｇＤＮＡ試料の品質を評価した。テロメア長を決定するｑＰＣＲ用に１．８を超えるＡ２６０／２８０吸光度比と約２のＡ２６０／２３０吸光度比を有するゲノムＤＮＡ試料を使用した。
【０３７８】
テロメアＰＣＲに使用したプライマーは次の通りであった。
ｔｅｌ１ｂ：５’−ＣＧＧＴＴＴ（ＧＴＴＴＧＧ）5ＧＴＴ−３’（配列番号４１）；及び
ｔｅｌ２ｂ：５’−ＧＧＣＴＴＧ（ＣＣＴＴＡＣ）5ＣＣＴ−３’（配列番号４２）
各プライマーを３００ｎＭの終濃度で使用した。
【０３７９】
単一コピー遺伝子ＰＣＲに使用したプライマーは次の通りであった。
３６Ｂ４ｕ：５’−ＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧＴＡＡＴＣＣ−３’（配列番号４３）；及び
３６Ｂ４ｄ：５’−ＣＣＣＡＴＴＣＴＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧＧＧＴＡＣＡＡ−３’（配列番号４４）
３６Ｂ４ｕプライマーを３００ｎＭの終濃度で使用し、３６Ｂ４ｄプライマーを５００ｎＭの終濃度で使用した。
【０３８０】
最終で２０μｌのｑＰＣＲ反応を９６ウェルプレートの１つのウェルに設置し、その反応は２０ｎｇのｇＤＮＡ、プライマー、及び１×Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲグリーン（アプライドバイオシステムズ）を含んだ。Ｔｅｌ１ｂ／２ｂ  ＰＣＲ用のテロメアＰＣＲサーマルサイクリングプログラムは、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間及び５６℃で１分間のサイクルを４０サイクルであった。３６Ｂ４  ＰＣＲ用のテロメアＰＣＲサーマルサイクリングプログラムは、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間及び５８℃で１分間のサイクルを４０サイクルであった。ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ  ｑＰＣＲマシーン（アプライドバイオシステムズ）を使用してそれらの試料を処理した。２０〜２２近辺の試料Ｃｔ値を得るように閾値レベルを設定した。各試料におけるテロメア長の評価のためにΔΔＣｔ法を使用して相対的テロメア／単一コピー遺伝子比（相対Ｔ／Ｓ比）を計算した。
【０３８１】
センダイウイルスベクター
ヒトＺＳＣＡＮ４（ＳｅＶ１８＋ｈＺＳＣＡＮ４／ΔＦ）を発現するセンダイベクターはＭＢＬ（株式会社医学生物学研究所）によってカスタム作製された。このセンダイベクターはＦタンパク質を欠いており、したがって、非伝染性である（Ｉｎｏｕｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ誌、第７７巻：３２３８〜３２４６頁、２００３年）。
【０３８２】
結果
ヒトＺＳＣＡＮ４の過剰発現は正常なヒト成体線維芽細胞においてテロメア長を急速に増加させる
ヒト成体皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）を標準的培養条件下で培養した。細胞を継代処理した翌日に１つの細胞試料をゲノムＤＮＡ抽出（未処理対照）用に回収した。２つ目の細胞試料にＳｖｈＺＳＣＡＮ４センダイウイルスベクターを形質導入した。
【０３８３】
形質導入した細胞を形質導入から２日後（ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４処理第２日）又は３日後（ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４処理第３日）に回収した。その後、回収した細胞のテロメア長をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定し、対照未処理対照細胞に対する相対的テロメア長（Ｔ／Ｓ比）を計算した。
【０３８４】
図１１に示されているように、テロメアの平均長が第２日及び第３日の後に増加した。とりわけ、ＺＳＣＡＮ４の形質導入から２日後にＨＤＦａ細胞は約１．４のＴ／Ｓ比を有し、一方で対照細胞は１．０のＴ／Ｓ比を有した（図１１）。同様に、ＺＳＣＡＮ４の形質導入から３日後にＨＤＦａ細胞は約１．４のＴ／Ｓ比を有した（図１１）。これらの結果はＺＳＣＡＮ４を形質導入されなかった対照細胞と比較してＺＳＣＡＮ４の形質導入の２日後にＨＤＦａ細胞が相対的テロメア長の約４０％の増加を有したことを示している。
【０３８５】
ヒトＺＳＣＡＮ４の過剰発現はファンコーニ貧血相補群Ａを有する患者より単離された線維芽細胞においてテロメア長を急速に増加させる
ＦＡＮＣＡ患者から単離されたＧＭ０１３０９線維芽細胞を標準的培養条件下で培養した。細胞を継代処理した翌日に１つの細胞試料をゲノムＤＮＡ抽出（未処理対照）用に回収した。２つ目の細胞試料にＳｖｈＺＳＣＡＮ４センダイウイルスベクターを形質導入した。
【０３８６】
形質導入した細胞を形質導入から２日後（ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４処理第２日）又は３日後（ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４処理第３日）に回収した。その後、回収した細胞のテロメア長をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定し、対照未処理対照細胞に対する相対的テロメア長（Ｔ／Ｓ比）を計算した。
【０３８７】
図１２に示されているように、テロメアの平均長が第２日の後にわずかに増加し、第３日の後に劇的に増加した。とりわけ、ＺＳＣＡＮ４の形質導入から２日後にＧＭ０１３０９細胞は約１．１のＴ／Ｓ比を有し、一方で対照細胞は１．０のＴ／Ｓ比を有した（図１２）。この結果はＺＳＣＡＮ４を形質導入されなかった対照細胞と比較してＺＳＣＡＮ４の形質導入の２日後にＧＭ０１３０９細胞が相対的テロメア長の約１０％の増加を有したことを示している。
【０３８８】
ＺＳＣＡＮ４の形質導入から３日後にＧＭ０１３０９細胞は約２．６のＴ／Ｓ比を有した（図１２）。この結果はＺＳＣＡＮ４を形質導入されなかった対照細胞と比較してＺＳＣＡＮ４の形質導入の３日後にＧＭ０１３０９細胞が相対的テロメア長の約１６０％の増加を有したことを示している。
【０３８９】
実施例９：Ｚｓｃａｎ４発現はヒト線維芽細胞の寿命を延長する
この実施例はヒトＺＳＣＡＮ４をコードする合成ｍＲＮＡが健康な成人から単離された皮膚線維芽細胞の寿命を延長することができるという発見について説明する。この実施例はヒトＺＳＣＡＮ４をコードする合成ｍＲＮＡを治療的生物製剤として使用することができることも示す。
【０３９０】
材料と方法
細胞培養
成人の皮膚から単離された初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）をライフテクノロジーズから購入した。製造業者の情報によると、それらのＨＤＦａ細胞は少なくとも１２回細胞分裂（ＰＤＬ）することができる。製造業者の指示に従ってＨＤＦａ細胞を培養した。それらのＨＤＦａ細胞を受領した後にそれらの細胞が指数関数的に増殖しないように、且つ、細胞老化に近づくように数継代にわたってそれらの細胞を培養した。
【０３９１】
合成ｍＲＮＡ
修飾型ｍＲＮＡの合成のため、Ｗａｒｒｅｎら（Ｗａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ誌、２０１０年１１月５日；第７巻（第５号）：６１８〜３０頁）によって以前に報告されているようにｍＲＮＡ合成を実施した。Ｗａｒｒｅｎらのこれらのプロトコルを使用して、哺乳類細胞におけるＲＮＡ安定性並びに翻訳効率を上昇させるために修飾型ｄＮＴＰ混合物を使用するヒトＺＳＣＡＮ４又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする鋳型ＤＮＡのインビトロ転写によりｍＲＮＡを合成した。次の修飾型ｄＮＴＰ、すなわち、３’−０−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  ＡＲＣＡキャップ類似体、５−メチルシチジントリホスフェート、及びシュードウリジントリホスフェートを使用した。
【０３９２】
結果
細胞老化に近いステージのＨＤＦａ細胞を１×１０5細胞／ウェルの濃度で６ウェルディッシュに播種し、その後に第０日に５μｌのリポフェクタミン（ＲＮＡｉＭＡＸ：ライフテクノロジーズ、カリフォルニア州、米国）を使用して１μｇの合成ｍＲＮＡで形質移入した。次の日に培地を交換した。同じｍＲＮＡを用いる２回目の形質移入を第３日に実施した。それらの細胞の成長に応じて１週間毎又は２週間毎に細胞を１：２の比率で継代処理した。試料を三組調製した。細胞数を０のＰＤＬから始まるＰＤＬに変換した。
【０３９３】
図１３は細胞増殖アッセイの結果を示している。合成ＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入されたＨＤＦａ細胞を対照として使用した。２週間後に合成ＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入されたＨＤＦａ細胞は細胞老化を経験し、ゆっくりと増殖した（図１３）。対照的に、合成ｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡで形質移入されたＨＤＦａ細胞はさらに２〜３ＰＤＬ多く増殖し、したがって、細胞老化に近いＨＤＦａ細胞の寿命を延長した（図１３Ａ及び１３Ｂ）。合成マウスＺｓｃａｎ４  ｍＲＮＡは寿命延長をもたらさないようであった。この結果はＨＤＦａ細胞の寿命延長についてヒトＺＳＣＡＮ４がマウスＺｓｃａｎ４ｃよりも好適に機能することを示している（図１３Ｃ）。しかしながら、それらの細胞が最終的には増殖の速度を遅くしたので、又は増殖を停止したので、合成ｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡは無制限の細胞増殖を提供することがなかった。合成ｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡを用いた結果と同様に、ＨＤＦａ細胞の寿命延長はヒトＺＳＣＡＮ４を発現するＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４センダイウイルスベクター又はＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５センダイウイルスベクターと接触した細胞においても観察された。したがって、治療的生物製剤としてのＺＳＣＡＮ４の使用が処理細胞において細胞形質転換及び／又は癌を引き起こすことが観察されなかった。これらの結果はｈＺＳＣＡＮ４処理がＨＤＦａ細胞を腫瘍に形質転換することなくそれらの細胞の寿命を延長することができることを示している。
【０３９４】
実施例１０：Ｚｓｃａｎ４生物製剤によるヒト間葉系幹（ＭＳ）細胞におけるテロメア長伸長
この実施例はヒトＺＳＣＡＮ４を発現する温度感受性センダイウイルスベクターがヒト間葉系幹（ＭＳ）細胞においてテロメア長を伸長することができるという発見について説明する。この実施例は、骨髄移植を含むがこれに限定されない成体幹細胞療法を改善するための生物製剤としてヒトＺＳＣＡＮ４を発現するセンダイウイルスベクターを使用することができることも示す。
【０３９５】
材料と方法
細胞培養
ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をライフテクノロジーズ（カリフォルニア州、米国）から購入した。製造業者の情報によるとＡＤＳＣは骨髄由来間葉系幹細胞と非常に類似した表現型特徴と機能特徴を示した。ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞があらゆる可能な表現型に成長又は分化する能力を失う前にそれらの細胞を４〜５継代まで増殖させることができる。製造業者に推奨される条件でそれらの細胞を培養した。
【０３９６】
センダイウイルスベクター
マウスＺｓｃａｎ４（ＳｅＶ１８＋ｍＺｓｃａｎ４／ＴＳ１５ΔＦ）又はヒトＺＳＣＡＮ４（ＳｅＶ１８＋ｈＺＳＣＡＮ４／ＴＳ１５ΔＦ）のどちらかを発現する温度感受性センダイベクターは、ＭＢＬ（株式会社医学生物学研究所）によってカスタム作製された。これらのベクターを本明細書においてそれぞれ「ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４−ＴＳ１５」又は「ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５」と呼ぶ。これらのセンダイベクターは３５℃で機能的であり、３７℃で不活性である（Ｂａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ誌、２０１１年；第１０８巻（第３４号）：１４２３４〜１４２３９頁）。対照として同じ温度感受性センダイベクターを使用したが、そのベクターはＺｓｃａｎ４よりも緑色蛍光タンパク質変異体を発現した。このベクターを本明細書において「ＳｅＶＡＧ−ＴＳ１５」と呼ぶ。これらのセンダイベクターもＦタンパク質を欠いており、したがって、伝染性ではない（Ｉｎｏｕｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ誌、第７７巻：２３２３８〜３２４６頁、２００３年）。
【０３９７】
テロメアサザンブロット分析
製造業者の指示に従ってＴｅｌｏＴＡＧＧＧテロメア長アッセイキット（ロッシュ・アプライド・サイエンス、インディアナ州、米国）を使用してサザンブロット分析により細胞のテロメア長を測定した。
【０３９８】
結果
第２継代のヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を１．５×１０5細胞の密度で１０ｃｍディッシュに播種し、（第０日に）１０のＭＯＩで温度感受性センダイベクターと接触させた。１０μＭのＨ2Ｏ2を含む培地の中で細胞を培養し、３５℃で３日間にわたって維持し、続いて３７℃で培養した。第７日に細胞を１：２の比率で継代処理した。第１０日の別の継代処理の後に細胞を再度１０のＭＯＩで前記温度感受性センダイベクターと接触させ、３５℃で３日間培養し、続いて３７℃で培養した。その後、第１４日（第３継代）、第２０日、第２７日、第４２日、及び第６２日（第７継代）に細胞を継代処理した。典型的な細胞培養条件下よりも速くテロメア長が短くなるように１０μＭのＨ2Ｏ2を含む培地の中で細胞を培養した。
【０３９９】
図１４はテロメア長アッセイの結果を示している。平均テロメア長（図の凡例中に示される）は製造業者のプロトコルに従ってサザンブロット分析に基づいて推定された。図１４に示されているように、ヒトＺＳＣＡＮ４（ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５）はヒトＭＳＣのテロメア長を増加させたが、一方でマウスＺｓｃａｎ４（ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４−ＴＳ）はテロメア長に影響しないようであった。これらの結果はヒトＭＳＣにおけるテロメア長短縮がヒトＺＳＣＡＮ４生物製剤を用いる細胞処理によって救援され得ることを示している。理論に捉われることを望むものではないが、本明細書に記載されるヒトＺＳＣＡＮ４の効果を他の培養ヒト組織幹細胞に適用することができると考えられる。ヒトＺＳＣＡＮ４生物製剤はヒト組織に内在する（すなわち、インビボ）ヒト組織幹細胞においてテロメア長を伸長する（例えば、細胞の若返り）こともできるとも考えられる。
【０４００】
実施例１１：組織専属性幹細胞の欠陥を有する患者を治療するためのＺｓｃａｎ４発現
組織専属性幹細胞（すなわち、ヒト身体の器官及び／又は組織に内在する組織幹細胞）における１つ以上の欠損によって引き起こされる多数の疾患が存在する。例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーは筋幹細胞（筋衛星細胞）の早期老化と関連することが知られている。Ｚｓｃａｎ４生物製剤（例えば、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ又はＺｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターのどちらかによるＺｓｃａｎ４の発現）は組織幹細胞を若返らせることができるという本明細書に記載される結果に基づくと、組織専属性幹細胞におけるＺｓｃａｎ４発現によってそれらの細胞における疾患関連欠陥を修正することができると考えられる。デュシェンヌ型筋ジストロフィーの事例では、筋細胞の早期劣化を防止するためにデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する患者の筋細胞、特に筋幹細胞にＺｓｃａｎ４生物製剤を投与することによってＺｓｃａｎ４発現を用いてデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する患者を治療することができると考えられる。
【０４０１】
実施例１２：糖尿病を有する患者を治療するためのＺｓｃａｎ４発現
ヒトＺＳＣＡＮ４はヒト膵臓中の幾つかの組織幹細胞においてまれにではあるが自然に発現していることが示されている。Ｚｓｃａｎ４生物製剤（例えば、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ又はＺｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターのどちらかによるＺｓｃａｎ４の発現）は組織幹細胞と最終分化細胞を若返らせることができるという本明細書に記載される結果に基づくと、膵臓細胞がさらに劣化することを防止し、それによってβ細胞の産生を促進するために糖尿病を有する患者の膵臓細胞、特に内在性膵臓組織幹細胞にＺｓｃａｎ４生物製剤を投与することによってＺＳＣＡＮ４発現を用いて糖尿病を有する患者を治療することができると考えられる。
【０４０２】
実施例１３：アトピー性皮膚炎及び他の皮膚損傷を有する患者を治療するためのＺｓｃａｎ４発現
Ｚｓｃａｎ４生物製剤（例えば、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ又はＺｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターのどちらかによるＺｓｃａｎ４の発現）は組織幹細胞と最終分化細胞を若返らせることができるという本明細書に記載される結果に基づくと、皮膚組織幹細胞と皮膚細胞がさらに劣化することを防止し、それによって新しい皮膚組織幹細胞と皮膚細胞の産生を促進するためにアトピー性皮膚炎又は他の皮膚損傷を有する患者の皮膚、特に内在性皮膚組織幹細胞に（例えば、局所投与により）Ｚｓｃａｎ４生物製剤を曝露することによってＺｓｃａｎ４発現を用いてアトピー性皮膚炎又は他の皮膚損傷を有する患者を治療することができると考えられる。
【０４０３】
実施例１４：最終分化細胞、始原細胞、又は組織専属性幹細胞をはじめとする身体中の細胞を若返らせることによる個体の若返りのための、又は個体の老化を遅らせるためのＺｓｃａｎ４発現
ヒト身体中のほとんど全ての器官及び組織は身体のそれらの器官及び組織に内在する組織専属性幹細胞によって維持されると考えられる。例えば、腸は腸陰窩に内在する腸管幹細胞に由来する成熟細胞と分化細胞の連続産生により維持される。同様に、皮膚は皮膚幹細胞に由来する皮膚上皮の連続産生により維持され、一方で毛髪は毛包幹細胞によって維持される。比較的に速い速度で老化及び劣化する完全分化細胞と比較して、組織幹細胞は例えばテロメア長を維持することによってそれらの質と若さを維持する傾向がある（図１５）。しかしながら、組織幹細胞さえもそれらの若さを徐々に失う（図１５）。したがって、全般的な老化、及び若々しい外観と機能の漸進的な喪失は組織専属性幹細胞の老化と劣化の結果と考えられ得る。
【０４０４】
Ｚｓｃａｎ４生物製剤（例えば、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ又はＺｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターのどちらかによるＺｓｃａｎ４の発現）は胚性幹（ＥＳ）細胞と間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を若返らせることができるという本明細書に記載される結果に基づくと、ヒト身体の各器官及び／又は組織に内在する組織幹細胞におけるＺｓｃａｎ４発現が回復し、そうしてその器官及び／又は組織を正常な（すなわち、若い）外観と機能に復元することができると考えられる。このことはヒトＺＳＣＡＮ４がヒト膵臓中の幾つかの組織幹細胞においてまれにではあるが自然に発現しているという観察に基づいている。さらに、Ｚｓｃａｎ４生物製剤（例えば、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ又はＺｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターのどちらかによるＺｓｃａｎ４の発現）は皮膚線維芽細胞などの最終分化細胞を若返らせることができるという本明細書に記載される結果に基づくと、ヒト身体の各器官及び／又は組織に内在する最終分化細胞及び／又は始原細胞におけるＺｓｃａｎ４発現が回復し、そうしてその器官及び／又は組織を正常な（すなわち、若い）外観と機能に復元することができると考えられる。
【０４０５】
この実施例は、身体を若返らせ、そうして身体を正常な（すなわち、若い）外観と機能に復元するためにヒト身体の器官及び組織に内在する組織幹細胞、最終分化細胞、及び／又は始原細胞においてＺｓｃａｎ４生物製剤（例えば、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ又はＺｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターのどちらかによるＺｓｃａｎ４の発現）を発現させるための手法について説明する。とりわけ、本明細書に記載されるＺｓｃａｎ４生物製剤は、その生物製剤を必要とする対象の身体の各器官及び組織にＺｓｃａｎ４生物製剤を直接的に注入すること、又は前記対象の循環血液にＺｓｃａｎ４生物製剤を注入して身体中の全ての器官及び組織にそのＺｓｃａｎ４生物製剤を送達することのどちらかによって前記対象に投与される。あるいは、又は加えて、そのＺｓｃａｎ４生物製剤を脳脊髄液に注入し、それによってそのＺｓｃａｎ４生物製剤を身体中の全ての神経器官及び神経組織に送達することができる。あるいは、又は加えて、そのＺｓｃａｎ４生物製剤をリンパ系に注入し、それによってそのＺｓｃａｎ４生物製剤を身体中の全てのリンパ器官及びリンパ組織に送達することができる。あるいは、又は加えて、そのＺｓｃａｎ４生物製剤を肺組織に吸入し、それによってそのＺｓｃａｎ４生物製剤を肺組織に送達することができ、それによってそのＺｓｃａｎ４生物製剤を肺組織に送達することができる。あるいは、又は加えて、そのＺｓｃａｎ４生物製剤を摂食し、それによって身体の食道、胃、及び腸をはじめとする全ての消化器官及び消化組織にそのＺｓｃａｎ４生物製剤を送達することができる。あるいは、又は加えて、そのＺｓｃａｎ４生物製剤を門脈に注入し、それによってそのＺｓｃａｎ４生物製剤を身体の肝臓に送達することができる。あるいは、又は加えて、そのＺｓｃａｎ４生物製剤を皮膚又は頭皮に局所的に塗布し、それによってそのＺｓｃａｎ４生物製剤を身体の皮膚及び皮膚付属器、例えば、毛包及び汗腺に送達することができる。これらの手法は前記対象の各器官及び／又は組織の中の組織幹細胞、始原細胞、及び最終分化細胞をＺｓｃａｎ４生物製剤に曝露し、それによってその処置された器官及び／又は組織に内在するそれらの組織幹細胞、始原細胞、及び／又は最終分化細胞を若返らせる。処置対象における組織幹細胞、始原細胞、及び／又は最終分化細胞の若返りの全体的効果は、前記対象の若返り及び／又は前記対象の老化の遅延化であると考えられる。処置対象における組織幹細胞、始原細胞、及び／又は最終分化細胞の若返りは前記対象の寿命の延長を引き起こすとも考えられる。
【０４０６】
実施例１５：Ｚｓｃａｎ４発現はヒトダウン症患者より単離された線維芽細胞において２１番染色体トリソミーを修正する
この実施例はＺｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ又はＺｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターのどちらかによるヒトＺＳＣＡＮ４の発現によってダウン症患者より単離された線維芽細胞の２１番染色体トリソミー核型を修正することができるという発見について説明する。この実施例はヒトＺＳＣＡＮ４をコードする合成ｍＲＮＡとヒトＺＳＣＡＮ４を発現するセンダイウイルスベクターを治療的生物製剤として使用することができることも示す。
【０４０７】
材料と方法
細胞培養
ダウン症（ＤＳ、２１番染色体トリソミー）を有する患者から単離された線維芽細胞をコリエル細胞レポジトリーから購入した（カタログＩＤ：ＡＧ０６８７２）。コリエルカタログ情報によるとドナーは１歳の白人女性であった。そのドナーはダウン症（２１番染色体トリソミー）の典型的な特徴を有した。死後、皮膚生検試料を１９８３年５月１９日に採取した。細かく切り刻んだ皮膚組織からなる外植片を使用して培養を開始した。核型は４７本、ＸＸ、＋２１である。細胞形態は線維芽細胞様である。累積細胞分裂レベル（ＰＤＬ）は凍結時に１０．５であり、継代数は５であった。コリエル細胞レポジトリーからＤＳ細胞を受領した後にそれらの細胞をさらに数継代にわたって培養した。コリエル細胞レポジトリーによって推奨される条件下で、すなわち、１０％ウシ胎児血清（不活化されていない）を添加されたアール塩及び非必須アミノ酸を有するイーグル最小必須培地でそれらの細胞を培養した。
【０４０８】
合成ｍＲＮＡ
修飾型ｍＲＮＡの合成のため、Ｗａｒｒｅｎら（Ｗａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ誌、２０１０年１１月５日；第７巻（第５号）：６１８〜３０頁）によって以前に報告されているようにｍＲＮＡ合成を実施した。Ｗａｒｒｅｎらのこれらのプロトコルを使用して、哺乳類細胞におけるＲＮＡ安定性並びに翻訳効率を上昇させるために修飾型ｄＮＴＰ混合物を使用するヒトＺＳＣＡＮ４又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする鋳型ＤＮＡのインビトロ転写によりｍＲＮＡを合成した。次の修飾型ｄＮＴＰ、すなわち、３’−０−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  ＡＲＣＡキャップ類似体、５−メチルシチジントリホスフェート、及びシュードウリジントリホスフェートを使用した。
【０４０９】
センダイウイルスベクター
ヒトＺＳＣＡＮ４（ＳｅＶ１８＋ｈＺＳＣＡＮ４／ΔＦ）を発現するセンダイベクターはＭＢＬ（株式会社医学生物学研究所）によってカスタム作製された。そのベクターを本明細書において「ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４」と呼ぶ。このセンダイベクターはＦタンパク質を欠いており、したがって、非伝染性である（Ｉｎｏｕｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ誌、第７７巻：３２３８〜３２４６頁、２００３年）。実験に１０のＭＯＩ（感染多重度）を使用した。
【０４１０】
さらに、ヒトＺＳＣＡＮ４（ＳｅＶ１８＋ｈＺＳＣＡＮ４／ＴＳ１５ΔＦ）を発現する温度感受性センダイベクターはＭＢＬ（株式会社医学生物学研究所）によってカスタム作製された。このベクターを本明細書において「ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５」と呼ぶ。このセンダイベクターは３５℃で機能的であり、３７℃で不活性である（Ｂａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ誌、２０１１年；第１０８巻（第３４号）：１４２３４〜１４２３９頁）。このセンダイベクターもＦタンパク質を欠いており、したがって、伝染性ではない（Ｉｎｏｕｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ誌、第７７巻：２３２３８〜３２４６頁、２００３年）。実験に２５のＭＯＩ（感染多重度）を使用した。
【０４１１】
核型分析
Ｇバンド染色法による通常の核型分析に加えて２１番染色体のセントロメア領域に特異的にハイブリダイズするプローブ（ＣＨＲ２１−１０−ＧＲ：Ｅｍｐｉｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ニューヨーク州、米国）を使用する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により各培養細胞に存在する２１番染色体のコピーを計数した。間期細胞核において３つの蛍光ドットの検出は２１番染色体トリソミー（ダウン症）を表し、一方で２つの蛍光ドットの検出は２１番染色体の正常なコピー数（正常）を表す。
【０４１２】
結果
ヒトＺＳＣＡＮ４をコードする合成ｍＲＮＡはダウン症患者より単離された線維芽細胞（２１番染色体トリソミー）において染色体異常を修正する
第７継代のダウン症（ＤＳ）線維芽細胞を５×１０5細胞／ウェルの濃度で１０ｃｍ培養ディッシュに播種し、その後に２５μｌのリポフェクタミン（ＲＮＡｉＭＡＸ：ライフテクノロジーズ、カリフォルニア州、米国）を使用して５μｇの合成ｍＲＮＡ（ｈＺＳＣＡＮ４又はＧＦＰ）で形質移入した。ＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入された細胞に加えて非形質移入細胞も対照として使用した。１つの実験（１回の形質移入）では第５日に全ての細胞を継代処理し、その後に第１０日（第９継代）に核型を分析した。別の実験（２回の形質移入）では第５日に細胞を継代処理した後にＧＦＰ  ｍＲＮＡ又はｈＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡのどちらかによる２回目の形質移入を実施し、その後に第１０日（第９継代）に核型を分析した。
【０４１３】
図１６Ａは２１番染色体プローブを使用するＦＩＳＨを実行した後の細胞核の代表的な画像を示している。各ドットは細胞核に存在する２１番染色体の数を表している。２つのドットは２１番染色体の正常なダイソミーを表し、一方で３つのドットは２１番染色体のトリソミーを表す。図１６Ｂは１回の形質移入実験における２１番染色体の数のまとめを示している。ヒトＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡで形質移入してから１０日後に１４％の細胞が正常な数の２１番染色体を有している。図１６Ｃは２回の形質移入実験における２１番染色体の数のまとめを示している。ヒトＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡで２回形質移入することで１７％の細胞が正常な数の２１番染色体を有する。対照的に、非形質移入細胞とＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入された細胞の両方が、一見したところ正常な２１番染色体を有する細胞をわずかな割合（３％未満）でしか示していない。これらは誤差の範囲内である。これらの結果は細胞へのヒトＺＳＣＡＮ４  ｍＲＮＡの導入によって染色体数の異常を修正することができることを示している。
【０４１４】
ヒトＺＳＣＡＮ４を発現するセンダイウイルスベクターはダウン症患者より単離された線維芽細胞（２１番染色体トリソミー）において染色体異常を修正する
図１７Ａは実験手順を示している。ダウン症線維芽細胞（ＤＳ）細胞を第８継代（第０日）において５×１０4細胞／ウェルの濃度で６ウェルディッシュに播種した。１日後に細胞を２５のＭＯＩでＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５により処理し、３５℃で３日間保持した。その後、そのディッシュを３７℃に移し、その実験の残りの期間に３７℃で保持した。第９日、第１２日、及び第１５日に細胞を継代処理した。第１５日の継代処理後に細胞を１０のＭＯでＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４により処理した。その後、第１８日及び第２１日に細胞を継代処理した。第２１日の継代処理後に細胞を１０のＭＯＩでＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４により処理した。第２４日にＦＩＳＨにより核型分析を実施した（図１７Ｂ）。第３０日の継代処理後に細胞を１０のＭＯＩでＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４により処理した。第３９日の継代処理後に細胞を１０のＭＯＩでＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４により処理した。第４２日にＦＩＳＨにより核型分析を実施した（図１７Ｃ）。センダイウイルスベクターと接触することなく並行して培養された細胞（未処理）、又は並行して培養され、且つ、ＧＦＰ変異体を発現する対照センダイベクターと接触した細胞を対照として使用した。２人の経験豊かな研究者が独立してＦＩＳＨ像を採点した。２つの蛍光ドット（２本の２１番染色体：正常）；３つの蛍光ドット（３本の２１番染色体：２１番染色体トリソミー、ダウン症）。
【０４１５】
図１７Ｂは対照細胞、及びＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５で１回とＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４で２回処理された（３回の処理）細胞における２１番染色体の数のまとめを示している。それらの結果はヒトＺＳＣＡＮ４を発現するセンダイウイルスベクターによるダウン症線維芽細胞の処理がそれらの細胞の３０％近くにおいて２１番染色体トリソミーの修正を誘導することを示した。
【０４１６】
図１７Ｃは未処理対照細胞、対照センダイベクターで処理された対照細胞、及びＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５で１回とＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４で４回処理された（５回の処理）細胞における２１番染色体の数のまとめを示している。それらの結果はヒトＺＳＣＡＮ４を発現するセンダイウイルスベクターで繰返し処理されたダウン症線維芽細胞がそれらの細胞の５５％近くで２１番染色体トリソミーの修正を誘導することを示している。
【０４１７】
これらの結果は細胞へのヒトＺＳＣＡＮ４の導入によって染色体数の異常を修正することができることを示している。
【０４１８】
実施例１６：卵母細胞を若返らせるための、及び卵母細胞と着床前胚において染色体異常を修正するためのＺｓｃａｎ４発現
母親の加齢時に受精に成功する卵母細胞の能力が劇的に低下し、流産と先天異常の危険性が増加する。近年の研究により母親の加齢性流産と先天異常は主に卵母細胞における染色体分配の誤りが原因であることが明らかになった。この時点では染色体分配の誤りを防止又は修正することにより老化した卵母細胞の能力の反転させることができるという報告は存在していない。
【０４１９】
マウス着床前胚の正常な発生では内在性Ｚｓｃａｎ４は２細胞胚において一時的に、且つ、多量に発現する（Ｆａｌｃｏら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ誌、２００７年；第３０７巻：５３９〜５０頁）。我々はＺｓｃａｎ４発現が正常な発生にとって重要であることも示している（Ｆａｌｃｏら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ誌、２００７年；第３０７巻：５３９〜５０頁）。同様に、ヒトＺＳＣＡＮ４はヒト６細胞期〜８細胞期の胚において一時的に発現する（Ｖａｓｓｅｎａら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ誌、２０１１年；第１３８巻：３６９９〜７０９頁）。接合体ゲノム活性化はマウスでは２細胞期に起こり、ヒトでは６細胞期〜８細胞期に起こるので、Ｚｓｃａｎ４の発現がヒト着床前胚発生に必要であると考えられる。
【０４２０】
この実施例はＺｓｃａｎ４生物製剤が卵母細胞を若返らせることができ、マウス着床前胚において染色体異常を修正することができる手順について説明する。本特許出願において示されているマウスＺｓｃａｎ４遺伝子とヒトＺＳＣＡＮ４遺伝子との間の機能的類似性に基づくと、及びヒトＺＳＣＡＮ４遺伝子の優越性にも基づくと、マウス胚の結果をヒト胚に直接的に適用することができると考えられる。これらの手法をインビトロ受精（ＩＶＦ）専門病院において実施することができる。これらの手法はダウン症と他の核型問題の危険性を全ての年齢の女性に対して低下させることができ、そのことは妊娠リスクガイドラインによれば３５歳を超える女性にとって特に有益であり得る。
【０４２１】
材料と方法
卵母細胞採取
高齢マウス（すなわち、４５週齢を越えるマウス）と若齢マウス（８週齢）をジャクソン研究所から購入する。卵核胞状態の卵母細胞（ＧＶ卵母細胞）を高齢マウスと若齢マウスから採取する。若齢マウスに由来する卵母細胞を対照として使用する。
【０４２２】
合成ｍＲＮＡ
修飾型ｍＲＮＡの合成のため、Ｗａｒｒｅｎら（Ｗａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ誌、２０１０年１１月５日；第７巻（第５号）：６１８〜３０頁）によって以前に報告されているようにｍＲＮＡ合成を実施する。Ｗａｒｒｅｎらのプロトコルを使用して、哺乳類細胞におけるＲＮＡ安定性並びに翻訳効率を上昇させるために修飾型ｄＮＴＰ混合物を使用するマウスＺｓｃａｎ４ｃ、ヒトＺＳＣＡＮ４、又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする鋳型ＤＮＡのインビトロ転写によりｍＲＮＡを合成する。次の修飾型ｄＮＴＰ、すなわち、３’−０−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  ＡＲＣＡキャップ類似体、５−メチルシチジントリホスフェート、及びシュードウリジントリホスフェートを使用した。
【０４２３】
センダイウイルスベクター
マウスＺｓｃａｎ４ｃ（ＳｅＶ１８＋ｍＺｓｃａｎ４／ΔＦ）又はヒトＺＳＣＡＮ４（ＳｅＶ１８＋ｈＺＳＣＡＮ４／ΔＦ）のどちらかを発現するセンダイベクターは、ＭＢＬ（株式会社医学生物学研究所）によってカスタム作製される。これらのベクターを本明細書においてそれぞれ「ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４」又は「ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４」と呼ぶ。対照として同じセンダイベクターを使用するが、そのベクターはＺｓｃａｎ４よりも緑色蛍光タンパク質変異体を発現した。これらのセンダイベクターはＦタンパク質を欠いており、したがって、伝染性ではない（Ｉｎｏｕｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ誌、第７７巻：２３２３８〜３２４６頁、２００３年）。
【０４２４】
マウスＺｓｃａｎ４ｃ融合タモキシフェン制御可能ＥＲＴ２ドメイン（ＳｅＶ１８＋ｍＺＥＲＴ２／ΔＦ）又はヒトＺＳＣＡＮ４融合タモキシフェン制御可能ＥＲＴ２ドメイン（ＳｅＶ１８＋ｈＺＥＲＴ２／ΔＦ）のどちらかを発現するセンダイベクターは、ＭＢＬ（株式会社医学生物学研究所）によってカスタム作製される。これらのベクターを本明細書においてそれぞれ「ＳｅＶｍＺＥＲＴ２」又は「ＳｅＶｈＺＥＲＴ２」と呼ぶ。これらのセンダイベクターもＦタンパク質を欠いており、したがって、伝染性ではない（Ｉｎｏｕｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ誌、第７７巻：２３２３８〜３２４６頁、２００３年）。
【０４２５】
さらに、マウスＺｓｃａｎ４（ＳｅＶ１８＋ｍＺｓｃａｎ４／ＴＳ１５ΔＦ）又はヒトＺＳＣＡＮ４（ＳｅＶ１８＋ｈＺＳＣＡＮ４／ＴＳ１５ΔＦ）のどちらかを発現する温度感受性センダイベクターは、ＭＢＬ（株式会社医学生物学研究所）によってカスタム作製される。これらのベクターを本明細書においてそれぞれ「ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４−ＴＳ１５」又は「ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５」と呼ぶ。これらのセンダイベクターは３５℃で機能的であり、３７℃で不活性である（Ｂａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ誌、２０１１年；第１０８巻（第３４号）：１４２３４〜１４２３９頁）。対照として同じセンダイベクターを使用するが、そのベクターはＺｓｃａｎ４よりも緑色蛍光タンパク質変異体を発現した。このベクターを本明細書において「ＳｅＶＡＧ−ＴＳ１５」と呼ぶ。これらのセンダイベクターもＦタンパク質を欠いており、したがって、伝染性ではない（Ｉｎｏｕｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ誌、第７７巻：２３２３８〜３２４６頁、２００３年）。
【０４２６】
結果
卵核胞状態の卵母細胞（ＧＶ卵母細胞）を採取し、その後に第Ｉ減数分裂と第ＩＩ減数分裂に向かって進ませるためにインビトロ成熟（ＩＶＭ）の対象とする。ＩＶＭ時に卵母細胞をＺｓｃａｎ４生物製剤（例えば、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ又はＺｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターのどちらか）と接触させ、その後に精子でインビトロ受精させる。あるいは、受精卵母細胞／１細胞（接合子）期と胚盤胞期の間の着床前胚をＺｓｃａｎ４生物製剤（例えば、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ又はＺｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターのどちらか）と接触させる。接触方法は合成Ｚｓｃａｎ４  ｍＲＮＡの標準的リポフェクタミン形質移入、Ｚｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターのウイルス感染、及びマイクロマニピュレーターによるＺｓｃａｎ４生物製剤の細胞質内注入を含み得る。
【０４２７】
その後、Ｚｓｃａｎ４処理受精卵母細胞をＫＳＯＭ培地の中で３７℃、５％ＣＯ2で９６時間培養する。
【０４２８】
理論に捉われることを望むものではないが、胚盤胞期へうまく発生することができる接合子の数に関して若齢マウス由来の卵母細胞と同等の高齢マウス由来の卵母細胞がＺｓｃａｎ４処理によって生じると考えられる。それにより生じた胚盤胞を受容雌マウスに移して健康な子供の出生率をチェックする。Ｚｓｃａｎ４生物製剤を用いる処理によって胚の核型と品質を改善することにより老化した卵母細胞からの正常な胚発生の成功率が改善されると考えられる。
【０４２９】
理論に捉われることを望むものではないが、上記の方法は老化した卵母細胞からの正常な胚発生の成功率を改善するため、及び胚の核型と品質を改善するためにヒト卵母細胞及び受精卵母細胞／着床前胚に適用することができるとも考えられる（図１８）。
【０４３０】
実施例１７：Ｚｓｃａｎ４発現はヒト癌細胞の増殖を抑制する
この実施例はマウスＺｓｃａｎ４又はヒトＺＳＣＡＮ４のどちらかを発現する温度感受性センダイウイルスベクターによって癌細胞の増殖を抑制することができるという発見について説明する。この実施例はＺｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターを治療的生物製剤として使用することができることも示す。
【０４３１】
材料と方法
細胞培養
ＨＣＴ１１６ヒト大腸癌細胞を米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から購入した。ＨＣＴ１１６細胞はヒト成人男性の大腸癌に由来する。ＡＴＣＣによると「その基幹系統の染色体数は二倍体に近く、形式上の数は４５（６２％）であり、多倍数体が６．８％の割合で生じる。この株はｒａｓ癌原遺伝子のコドン１３に突然変異を有する。」ＡＴＣＣの推奨に従ってＨＣＴ１１６細胞を培養した。
【０４３２】
センダイウイルスベクター
マウスＺｓｃａｎ４（ＳｅＶ１８＋ｍＺｓｃａｎ４／ＴＳ１５ΔＦ）又はヒトＺＳＣＡＮ４（ＳｅＶ１８＋ｈＺＳＣＡＮ４／ＴＳ１５ΔＦ）のどちらかを発現する温度感受性センダイベクターは、ＭＢＬ（株式会社医学生物学研究所）によってカスタム作製された。これらのベクターを本明細書においてそれぞれ「ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４−ＴＳ１５」又は「ＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５」と呼ぶ。これらのセンダイベクターは３５℃で機能的であり、３７℃で不活性である（Ｂａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ誌、２０１１年；第１０８巻（第３４号）：１４２３４〜１４２３９頁）。対照として同じ温度感受性センダイベクターを使用したが、そのベクターはＺｓｃａｎ４よりも緑色蛍光タンパク質変異体を発現した。このベクターを本明細書において「ＳｅＶＡＧ−ＴＳ１５」と呼ぶ。これらのセンダイベクターはＦタンパク質を欠いており、したがって、伝染性ではない（Ｉｎｏｕｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ誌、第７７巻：２３２３８〜３２４６頁、２００３年）。
【０４３３】
結果
ＨＣＴ１１６細胞（第９継代）試料を８×１０4細胞／ウェルの濃度で培養した。細胞試料を２０のＭＯＩで次のセンダイベクター、すなわち、ＳｅＶＡＧ−ＴＳ１５（対照）、ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４−ＴＳ１５、又はＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５のうちの１つを用いて処理し、３５℃で培養した（第０日）。それら３種類の処理試料のそれぞれを三組調製した。第３日に各処理試料を継代処理し、同じセンダイベクターで処理した。自動化細胞計数装置Ｍｏｘｉ  Ｚ（ＯＲＦＬＯ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アイダホ州、米国）を使用して細胞数を数えた。第７日に各処理試料を継代処理し、同じセンダイベクターで処理した。細胞数を数えた（第７日）。第１０日に各処理試料を継代処理し、同じセンダイベクターで処理した。細胞数を数えた（第１０日）。第１４日に各処理試料を継代処理し、同じセンダイベクターで処理した。細胞数を数えた（第１４日）。それらの実験を通して細胞を３５℃で培養した。細胞数を第０日について０のＰＤＬから始まるＰＤＬに変換した。
【０４３４】
図１９はＨＴＣ１１６細胞試料の成長曲線を示している。対照群（すなわち、未処理群及びＳｅＶＡＧ−ＴＳ１５処理群）と比較して、ＳｅＶｍＺｓｃａｎ４−ＴＳ１５又はＳｅＶｈＺＳＣＡＮ４−ＴＳ１５のどちらかを用いる処理によってＨＴＣ１１６細胞の増殖が抑制された。図１９に示されているように、ヒトＺＳＣＡＮ４は驚くべきことに癌細胞増殖の抑制においてマウスＺｓｃａｎ４よりも好適であった。したがって、これらの結果はヒトＺＳＣＡＮ４が驚くべきことにマウスＺｓｃａｎ４ｃよりも優れた結果をもたらすことを示している。これらの結果はｈＺＳＣＡＮ４処理によって癌細胞の増殖を抑制することができることをさらに示している。理論に捉われることを望むものではないが、Ｚｓｃａｎ４発現因子は癌治療に使用され得ると考えらえる。
【０４３５】
実施例１８：ヒト細胞又は個体のＤＮＡ修復能を向上させるためのＺｓｃａｎ４発現
この実施例はＺｓｃａｎ４生物製剤によってヒト細胞のＤＮＡ修復能が向上し得るという発見について説明する。マイトマイシンＣ又はシスプラチンなどの遺伝毒性物質は用量依存的にヒト細胞を殺滅することが知られている。遺伝毒性物質に曝露され、その後にＺｓｃａｎ４生物製剤（例えば、Ｚｓｃａｎ４をコードする合成ｍＲＮＡ又はＺｓｃａｎ４を発現するセンダイウイルスベクターのどちらかによるＺｓｃａｎ４の発現）で処理される細胞はその遺伝毒性物質に対して抵抗性になる。そのＺｓｃａｎ４生物製剤による遺伝毒性物質に対する抵抗性はそれらの細胞におけるＺｓｃａｎ４発現により誘導されたＤＮＡ修復能の強化に起因することがわかっている。したがって、（１）ＤＮＡ修復欠損に関連する疾患を有する患者のＤＮＡ修復能を改善するため、（２）癌治療薬などの遺伝毒性物質によって損傷を受けることから生殖腺などの特定の組織及び／又は器官を保護するため、及び（３）毒性化学物質又は放射性降下物の存在などの有害環境から組織、器官、及び／又は個体を保護するためにＺｓｃａｎ４生物製剤を使用することができる。
【０４３６】
実施例１９：癌を治療するためのある特定の癌幹細胞におけるＺｓｃａｎ４の抑制
癌組織（例えば、腫瘍）は癌幹細胞を含み、癌幹細胞は活発に増殖しておらず、且つ、癌化学療法（例えば、シスプラチンなどの毒性薬剤を用いる治療）に対して抵抗性を有することが知られている。癌幹細胞は化学療法による治療を生き延びることができ、それでその治療の後にその癌の再発が起こると考えられる。Ｚｓｃａｎ４の存在によって細胞に遺伝毒性物質に対する抵抗性を提供することができるので、内在性Ｚｓｃａｎ４の発現がある特定の癌幹細胞において起こり、それでそれらの細胞に遺伝毒性物質からの保護が提供されると考えられる。したがって、癌を有する患者の癌幹細胞を処理するためにＺｓｃａｎ４に特異的なｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどの内在性Ｚｓｃａｎ４の発現を低下させる薬剤を使用してそれらの癌幹細胞における遺伝毒性物質に対する抵抗性を低下させて、又は除去して癌治療に対する患者の応答を改善することができると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2019122398.tif 000016
【図１４】
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【図１５】
2019122398.tif 000018
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月26日(2019.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファンコーニ貧血、先天性角化不全症、又はホイエラール・レイダーソン症候群に付随する骨髄機能不全を治療するための細胞組成物の製造方法であって、以下の：
（ｉ）  単離された１又は複数のヒト骨髄細胞又は血液細胞を、Ｚｓｃａｎ４をコードする単離核酸分子又はＺｓｃａｎ４タンパク質と接触させる工程、
を含み、
ここでＺｓｃａｎ４をコートする単離核酸分子又はＺｓｃａｎ４タンパク質は、１又は複数のヒト骨髄細胞又は血液細胞において、テロメアの伸長を誘導し、
前記細胞組成物が、ファンコーニ貧血、先天性角化不全症、又はホイエラール・レイダーソン症候群に付随する骨髄機能不全であって、テロメア短縮により引き起こされる骨髄不全を患う対象に移植される、前記方法。
【請求項２】
前記１以上の骨髄細胞又は血液細胞が、ファンコーニ貧血、先天性角化不全症、又はホイエラール・レイダーソン症候群を患う対象から単離された細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１以上のヒト骨髄細胞又は血液細胞が、Ｚｓｃａｎ４をコードする単離核酸分子と接触される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記単離核酸が、合成ｍＲＮＡである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記単離核酸分子が、ベクター中に含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターが、センダイウイルスベクターである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｚｓｃａｎ４が、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質又はＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｚｓｃａｎ４が、マウスＺｓｃａｎ４、ヒトＺｓｃａｎ４、又はそのホモログである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記１又は複数のヒト骨髄細胞又は血液細胞が、前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質と接触される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質が、細胞浸透性ペプチドと融合されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質が、マウスＺｓｃａｎ４タンパク質又はヒトＺＳＣＡＮ４タンパク質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記血液細胞が、末梢血細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法により製造されたファンコーニ貧血、先天性角化不全症、又はホイエラール・レイダーソン症候群に付随する骨髄機能不全を治療するための細胞組成物。
【請求項１４】
１又は複数のヒト細胞において、テロメア伸長を誘導するための組成物であって、Ｚｓｃａｎ４をコードする単離核酸分子又はＺｓｃａｎ４タンパク質を含み、ここでテロメア伸長により、テロメア異常に付随する疾患又は状態が治療され、ここでテロメア異常に付随する疾患又は状態が、骨髄機能不全症候群であり、ただし前記ヒト対象の生殖細胞遺伝的同一性を変更することはない、前記組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、テロメア異常に付随する疾患又は状態を患う対象から単離された１又は複数のヒト細胞と接触されて、前記１又は複数のヒト細胞においてテロメアの伸長を誘導し、前記接触された１又は複数のヒト細胞が、前記対象に投与されて、テロメア異常に付随する疾患又は状態が治療される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記骨髄機能不全症候群が、ファンコーニ貧血、無巨核球性血小板減少症、再生不良性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化不全症、ホイエラール・レイダーソン症候群、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、ピアソン症候群及びシュバッハマン・ダイアモンド症候群、血小板減少症、及び骨髄異形成症候群からなる群から選ばれる、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記１又は複数のヒト細胞が、ヒト骨髄細胞であり、前記接触されたヒト骨髄細胞が、対象に移植され、そしてテロメア異常に付随する前記骨髄機能不全が、ファンコーニ貧血、先天性角化不全症から選ばれる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記１又は複数のヒト細胞が、成人幹細胞、組織幹細胞、前駆細胞、誘導多能性幹細胞、体細胞、骨髄細胞、成熟細胞、又は分化細胞である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
Ｚｓｃａｎ４の発現増加が一過的である、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項２０】
前記単離核酸分子が、合成ｍＲＮＡである、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項２１】
前記単離核酸分子が、ベクターを含む、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項２３】
前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質が、細胞浸透性ペプチドに融合されている、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項２４】
前記Ｚｓｃａｎ４タンパク質が、マウスＺｓｃａｎ４タンパク質又はヒトＺＳＣＡＮ４タンパク質、又はそれらのホモログである、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【請求項２５】
Ｚｓｃａｎ４が、Ｚｓｃａｎ４−ＥＲＴ２融合タンパク質又はＺｓｃａｎ４−ΔＣタンパク質である、請求項１４又は１５に記載の組成物。
【外国語明細書】
2019122398000001.pdf