(57)【要約】      （修正有）【課題】金属、特に金属医療器具（ステントおよび塞栓用コイルなど）表面に選択的に結合するペプチドの提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列または該配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、該ペプチドに対する抗体、該ペプチドとをコードする核酸、２以上の該ペプチドを含むペプチド複合体、該ペプチドまたは該ペプチド複合体を含有する試薬、および該ペプチドまたは該ペプチド複合体が結合した金属器具。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
ニッケルおよび／またはチタンに選択的に結合する、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載のペプチド。
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド
【請求項３】
検出可能な標識化合物が結合した請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項５】
プラチナおよび／またはタングステンに選択的に結合する、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載のペプチド。
（ａ）配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド
【請求項６】
検出可能な標識化合物が結合した請求項４または請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１、請求項２および請求項３に記載のペプチド群から選択される２以上のペプチドを含むペプチド複合体。
【請求項８】
請求項４、請求項５および請求項６に記載のペプチド群から選択される２以上のペプチドを含むペプチド複合体。
【請求項９】
請求項１、請求項２、請求項４または請求項５のいずれかに記載のペプチドに対する抗体。
【請求項１０】
請求項１、請求項２、請求項４または請求項５のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項１１】
ニッケルおよび／またはチタン製器具の金属表面を検出するための検出試薬であって、請求項１、請求項２および請求項３に記載のペプチド群から選択されるペプチドおよび／または請求項７に記載のペプチド複合体を含有する試薬。
【請求項１２】
プラチナおよび／またはタングステン製器具の金属表面を検出するための検出試薬であって、請求項４、請求項５および請求項６に記載のペプチド群から選択される１以上のペプチドおよび／または請求項８に記載のペプチド複合体を含有する試薬。
【請求項１３】
請求項１ないし６のいずれかに記載のペプチドまたは請求項７もしくは８に記載のペプチド複合体が結合した金属器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属に結合するペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、脳動脈瘤や虚血性心疾患などの治療として、開頭または開胸手術よりも低侵襲性なステントやコイルを用いるインターベンション（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）治療が広く行われるようになってきた。これらの方法により患者への負担は大幅に減少した。しかし、金属製ステントやコイルは、生体適合性に乏しいため、これらの留置後に生じる、血管の再狭窄およびステント血栓症などの合併症が臨床上問題となっている。
【０００３】
インターベンション後の再狭窄については、薬剤溶出性ステント（ＤＥＳ：ｄｒｕｇ−ｅｌｕｔｉｎｇ  ｓｔｅｎｔ）の使用により、新生内膜形成が抑制され、ステント内の再狭窄率が著しく低下した。
これに対して、ステント血栓症については、金属製ステント使用時には希であったステント留置後１ヶ月以降に発生する遅発性ステント血栓症（ＬＳＴ：ｌａｔｅ  ｓｔｅｎｔ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）やステントの留置後１年以降に発生する超遅発性ステント血栓症（ＶＬＳＴ：ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ  ｓｔｅｎｔ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）が報告されるようになった（非特許文献１）。また、ステント留置後、抗血小板薬単剤服用期間中にもかかわらず虚血性イベントが発生した例もいくつか報告されるなど（非特許文献２）、新たな問題が浮上してきた。
【０００４】
現在、ＬＳＴやＶＬＳＴの予防のために、ＤＥＳの留置後アスピリンとチエノピリジン系抗血小板薬の併用投与（ＤＡＰＴ：ｄｕａｌ  ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）が主流となっている。ＤＡＰＴは長期継続が必要とされるが、適切な服用期間は明らかになっていない。また、出血リスクが有意に増加し（非特許文献３）、死亡リスクも上昇傾向にある（非特許文献４）。
【０００５】
以上のように、ＬＳＴやＶＬＳＴなどのステント血栓症の予防として、ＤＡＰＴは非常に有効ではあり、少なくとも金属表面が内皮細胞によって被覆されるまでは継続する必要がある。しかし、金属表面が内皮細胞で被覆された時期について明確なコンセンサスは得られておらず、また、被覆されたかどうかを調べる有効な手段が現在のところ存在していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】US2010/0048637 A1
【特許文献２】US6,683,108 B1
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】McFaddenら, Lancet 364:1519- 1521 2004
【非特許文献２】Ongら, JACC 45:947-953 2005
【非特許文献３】Mauriら, N Engl J Med. 371: 2155-2166 2014
【非特許文献４】Kereiakesら, JAMA. 313: 1113-1121 2015
【非特許文献５】Sekerら, Molecules 16:1426-1451 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記事情に鑑み、本発明は、内皮細胞によって被覆されていない金属製医療器具（例えば、ステントや塞栓用コイルなど）の表面をペプチドによって検出することを解決課題とした。
よって、本発明は、金属、特に、金属医療器具（ステントおよび塞栓用コイルなど）の表面に選択的に結合するペプチドの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、検出可能な標識を付したペプチドが、血液中でステントや塞栓用コイルなどの金属表面に選択的に結合すれば、留置されたこれらの医療器具の被覆されていない表面を選択的に検出することが可能であると考えた。そこで、ステントや塞栓用コイルなど、特に血管内に留置する金属製医療器具表面に選択的に結合するペプチドの調製を試みた。
発明者らは、ファージディスプレイ法により（非特許文献５）、ステント（Ni:Ti=55%:45%、STRYKER社）または塞栓用コイル（Pt:W=92%:8%、Boston Scientific社）に対して高いアフィニティーを有するペプチドを探索した。
本発明は以上の知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１３）である。
（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（２）ニッケルおよび／またはチタンに選択的に結合する、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載のペプチド。
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド
（３）検出可能な標識化合物が結合した上記（１）または（２）に記載のペプチド。
（４）配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（５）プラチナおよび／またはタングステンに選択的に結合する、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載のペプチド。
（ａ）配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド
（６）検出可能な標識化合物が結合した上記（４）または（５）に記載のペプチド。
（７）上記（１）、（２）および（３）に記載のペプチド群から選択される２以上のペプチドを含むペプチド複合体。
（８）上記（４）、（５）および（６）に記載のペプチド群から選択される２以上のペプチドを含むペプチド複合体。
（９）上記（１）、（２）、（４）または（５）のいずれかに記載のペプチドに対する抗体。
（１０）上記（１）、（２）、（４）または（５）のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。
（１１）ニッケルおよび／またはチタン製器具の金属表面を検出するための検出試薬であって、上記（１）、（２）および（３）に記載のペプチド群から選択されるペプチドおよび／または上記（７）に記載のペプチド複合体を含有する試薬。
（１２）プラチナおよび／またはタングステン製器具の金属表面を検出するための検出試薬であって、上記（４）、（５）および（６）に記載のペプチド群から選択される１以上のペプチドおよび／または上記（８）に記載のペプチド複合体を含有する試薬。
（１３）上記（１）ないし（６）のいずれかに記載のペプチドまたは上記（７）もしくは（８）に記載のペプチド複合体が結合した金属器具。
【発明の効果】
【００１１】
本発明にかかるペプチドを使用することにより、金属製医療器具（例えば、ステントや塞栓用コイルなど）の表面（金属表面）を検出することができる。
【００１２】
本発明にかかるペプチドを使用することにより、体内に留置された金属製医療器具（例えば、ステントや塞栓用コイルなど）の非被覆部分（例えば、血管内皮細胞などで被覆されていない表面部分）を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】蛍光標識した本発明のペプチドをステントに結合させたのち、蛍光顕微鏡で観察したときの顕微鏡写真である。非処理は、ペプチドによる処理を行っていないステントの顕微鏡写真である。
【図２】蛍光標識した本発明のペプチドをステントに結合させたのち、蛍光顕微鏡で観察したときの顕微鏡写真である。非処理は、ペプチドによる処理を行っていないステントの顕微鏡写真である。
【図３】蛍光標識した本発明のペプチドをステントに結合させたのち、蛍光顕微鏡で観察したときの顕微鏡写真である。非処理は、ペプチドによる処理を行っていないステントの顕微鏡写真である。
【図４】図１〜図３で観察した蛍光の蛍光強度を数値化したグラフである。
【図５】蛍光標識した本発明のペプチドを塞栓用コイルに結合させたのち、蛍光顕微鏡で観察したときの顕微鏡写真である。非処理は、ペプチドによる処理を行っていない塞栓用コイルの顕微鏡写真である。
【図６】蛍光標識した本発明のペプチドを塞栓用コイルに結合させたのち、蛍光顕微鏡で観察したときの顕微鏡写真である。非処理は、ペプチドによる処理を行っていない塞栓用コイルの顕微鏡写真である。
【図７】図５および図６で観察した蛍光の蛍光強度を数値化したグラフである。
【図８】４分岐のポリエチレングリコール（PEG）に本発明のペプチドを結合させたペプチド複合体の概念図である。
【図９】蛍光標識したペプチド複合体（４分岐PEGとペプチドの結合体）をステントに結合させたのち、蛍光顕微鏡で観察したときの顕微鏡写真である。非処理は、ペプチド複合体による処理を行っていないステントの顕微鏡写真である。
【図１０】蛍光標識したペプチド複合体（４分岐PEGとペプチドの結合体）をステントに結合させたのち、蛍光顕微鏡で観察したときの顕微鏡写真である。非処理は、ペプチド複合体による処理を行っていないステントの顕微鏡写真である。
【図１１】蛍光標識したペプチド複合体（４分岐PEGとペプチドの結合体）をステントに結合させたのち、蛍光顕微鏡で観察したときの顕微鏡写真である。非処理は、ペプチド複合体による処理を行っていないステントの顕微鏡写真である。
【図１２】図９〜図１１で観察した蛍光の蛍光強度を数値化したグラフである。
【図１３】蛍光標識したペプチド複合体（４分岐PEGとペプチドの結合体）を塞栓用コイルに結合させたのち、蛍光顕微鏡で観察したときの顕微鏡写真である。非処理は、ペプチド複合体による処理を行っていない塞栓用コイルの顕微鏡写真である。
【図１４】図１３で観察した蛍光の蛍光強度を数値化したグラフである。
【図１５】蛍光標識した本発明のペプチドをヒト血漿に浸漬させたステントに結合させたのち、蛍光顕微鏡で観察したときの顕微鏡写真である。コントロールペプチドにはステントには結合しないYT07を使用した。
【図１６】蛍光標識した本発明のペプチドをヒト血漿に浸漬させたステントに結合させたのち、蛍光顕微鏡で観察したときの顕微鏡写真である。コントロールペプチドにはステントには結合しないYT07を使用した。
【図１７】図１５および図１６で観察した蛍光の蛍光強度を数値化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の第１の実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４もしくは配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはこれらのペプチドと実質的に同一のペプチドである。
【００１５】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５で表されるアミノ酸からなるペプチドは、ニッケルおよび／またはチタン製の器具に選択的に結合する活性を持つ。ここで、「ニッケルおよび／またはチタン製の器具」とは、ニッケルのみ、チタンのみまたはニッケルおよびチタンの合金（ニッケル−チタン合金）を素材として製造された器具のことであり、特に好ましい器具は、ステント（生体の管状の組織または臓器（例えば、血管、気管、食道、十二指腸、大腸または胆道など）を内部から広げる医療器具のことで、金属でできた網目の筒状のもの）や塞栓用コイル（動脈瘤などの塞栓術に使用される金属製の細長い医療器具）などのように体内に留置する医療器具である。ニッケル−チタン合金の組成は特に限定されず、当該器具が医療器具（特に、ステントや塞栓用コイル）の場合、ニッケル−チタン合金によって製造された器具が形状記憶合金としての特性を有するものであれば、どのような組成であってもよい。あえて例示すれば、ニッケルが５０％〜６０％、チタンが４０％〜５０％含まれていればよい。
【００１６】
また、第１の実施形態において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同一のペプチドとは、ニッケルおよび／またはチタンに選択的に結合するペプチドであって、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載のペプチドである。
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド
【００１７】
本発明の第２の実施形態は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０もしくは配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、またはこれらのペプチドと実質的に同一のペプチドである。
【００１８】
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１で表されるアミノ酸からなるペプチドは、プラチナおよび／またはタングステン製の器具に選択的に結合する活性を持つ。ここで、「プラチナおよび／またはタングステン製の器具」とは、プラチナのみ、タングステンのみまたはプラチナおよびタングステンの合金（プラチナ−タングステン合金）を素材として製造された器具のことであり、特に好ましい器具は、ステントや塞栓用コイルなどのように体内に留置する医療器具である。プラチナ−タングステン合金の組成は特に限定されず、当該器具が医療器具（特に、ステントや塞栓用コイル）の場合、プラチナ−タングステン合金によって製造された器具が形状記憶合金としての特性を有するものであれば、どのような組成であってもよい。あえて例示すれば、プラチナが８５％〜１００％、チタンが０％〜２５％含まれていればよい。
【００１９】
また、第２の実施形態において、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同一のペプチドとは、プラチナおよび／またはタングステンに選択的に結合するペプチドであって、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載のペプチドである。
（ａ）配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０または配列番号２１で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド
【００２０】
第１の実施形態および第２の実施形態において、「１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列」と記す場合、置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸の数は、特に限定はしないが、たとえば、１、２または３個程度が好ましい。また、本明細書において、「90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列」は90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であれば、何％であってもよく、たとえば、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上であってもよい。
【００２１】
本発明の第１の実施形態および第２の実施形態にかかるペプチド（以下「本発明のペプチド」と記載する）には、検出可能な標識が結合していてもよい。ここで検出可能な標識とは、インビトロまたはインビボにおいて、検出することができ、標識からのシグナルを定量できるものであればどのようなものであってもよく、例えば、蛍光標識（例えば、fluorescein 、rhodamine 、Cy dye、AlexaR FluorおよびHiLyteTM Fluorなどの化学合成物質、GFPとその誘導体、phycoerythrin (PE)およびallophycocyanin (APC)のような蛍光タンパク質）や放射性標識（例えば、SPEC用標識として67Ga、99mTc、111In、123I、201TIなど、PET用標識として11C、13N、18F、15Oなど）が挙げられる。特に、生体内に存在するペプチド（例えば、体内に留置されたステントや塞栓用コイルに結合している標識ペプチド）の検出には、放射性標識が望ましく、放射性標識ペプチドはPET（positron emission tomography）法やSPECT（single photon emission computed tomography）法により検出および定量が可能である。
【００２２】
また、MRIによる検出も好ましい。MRIでの検出には、ガドリニウム（Gd）や超常磁性ナノ粒子（SPIO；Superparamagnetic iron oxide）によりペプチドを標識することが可能である。ガドリニウム用のキレート剤は、diethylenetriamine penta-acetic acid（DTPA）や1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA)がある。ガドリニウムをペプチドに結合させる方法としては、Leon-Rodriguezら, J. AM. CHEM. SOC. 124:3514-3515 2002などを参照のこと。また、超常磁性ナノ粒子を末端システインへ直接化学修飾することで結合させることができる（Egawaら, Biomaterials 54:158-167 2015などを参照のこと）。
【００２３】
本発明のペプチドのC末端は、通常カルボキシル基（-COOH）またはカルボキシレート（-COO-）の他、当該カルボキシル基は、アミド（-CONH2）やエステル（-COOR）等に化学修飾されていてもよい。ここで、エステル中のRとしては、炭素数１〜６のアルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルまたはｎ−ブチル）、炭素数３〜８のシクロアルキル基（例えば、シクロペンチルまたはシクロヘキシル）、炭素数１〜６のアリール基（例えば、フェニルまたはα−ナフチル）、フェニル−C1-2アルキル基（例えば、ベンジルまたはフェネチル）、α−ナフチル−C1-2アルキル基（例えば、α−ナフチルメチル）等が挙げられる。C末端以外にもそのペプチド鎖中にカルボキシル基を有するペプチドであって、当該カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては上記の各エステルが挙げられる。
【００２４】
また、本発明のペプチドのN末端は、通常アミノ基（-NH2）であるが、当該アミノ基は、ホルミル基またはアセチル基等の炭素数１〜６のアシル基等で化学修飾されていてもよい。その他、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したものや、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、-OH、-SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基またはグアニジノ基など）が適当な官能基（例えば、ホルミル基またはアセチル等）で化学修飾されているものや糖鎖の結合しているものも本発明のペプチドに含まれる。
また、本発明のペプチドには、非天然型のペプチド結合、例えば、ケトメチレンまたはチオアミドなどによって構成されるものも含まれる。
【００２５】
本発明のペプチドは、当該技術分野において周知の方法、例えば、遺伝子工学的な方法の他、化学的ペプチド合成法（固相法または液相法）によって調製することができる。
化学的にペプチドを合成する場合、本発明のペプチドを構成するペプチドの一部もしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。合成反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーまたは再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを単離精製することができる。
さらに、本発明には、本発明のペプチドをコードする核酸が含まれる。ここで核酸とは、DNAまたはRNAのいずれであってもよく、また、一本鎖および二本鎖のいずれであってもよい。当該核酸は、本発明のペプチドを合成するために使用することができる。当該核酸からの本発明のペプチドの合成は、当該技術分野において周知の方法などを利用して容易に実施することができる。例えば、当該ペプチドをコードするDNAを含有するベクターにより宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養して培養物から目的のペプチドを採取することにより、本発明のペプチドを得ることができる。
【００２６】
本発明のペプチドは、環状構造を有していてもよい。当該環状構造は、N末端とC末端が連結されている構造のみならず、いずれかの末端と側鎖との間、または側鎖同士で環化した構造であってもよい。環状構造を有するペプチドは、当業者であれば容易に製造することができる。また、環状ペプチドの製造を受託している企業等へその製造を依頼することもできる。
さらに、本発明の実施形態には、本発明のペプチドを複数含むペプチド複合体も含まれる。当該ペプチド複合体は、直接結合していても、リンカーなどによって間接的に結合していてもよい。例えば、複数アームを持つPEGをリンカーとして、PEGの各アームにマレイミド基などを介してペプチドを結合させることで、複数のペプチドを含むペプチド複合体を作製することができる。
【００２７】
本発明の第３の実施形態は、本発明のペプチドを有効成分として含有し、器具（特に、ステントや塞栓用コイルなど）の金属表面を検出するための検出試薬であって、本発明のペプチドまたはペプチド複合体を含む試薬（以下「本発明の検出試薬」と記載する）である。
より具体的には、ニッケルおよび／またはチタン製の器具の金属表面を検出するための検出試薬には、第１の実施形態にかかる１以上のペプチド、および／または第１の実施形態にかかる複数のペプチドを含む１以上のペプチド複合体が含まれてもよい。また、プラチナおよび／またはタングステン製の器具の金属表面を検出するための検出試薬には、第２の実施形態にかかる１以上のペプチド、および／または第２の実施形態にかかる複数のペプチドを含む１以上のペプチド複合体が含まれてもよい。
本発明の検出試薬に含まれる本発明のペプチドには、前述の検出可能な標識が結合していてもよい。
【００２８】
本発明の検出試薬は、ステントや塞栓用コイルが留置されている被験者の血流に投与し、本発明のペプチドまたはペプチド複合体を当該ステントや塞栓用コイルの金属露出部分に結合させ、結合したペプチドまたはペプチド複合体から得られるシグナル（蛍光シグナル、放射性シグナルまたはMRIシグナル）を検出し、定量することで、体内に留置されたステントや塞栓用コイルの露出部分（すなわち、内皮細胞等によって被覆されていない部分）をイメージングおよび定量することができる。本発明の検出試薬の形態は、本発明のペプチドが凍結乾燥された粉体であっても、本発明のペプチドが溶解された液体であってもよく、被験者に投与する上で適した形態であればどのような形態であってもよい。また、本発明の検出試薬には、有効成分である本発明のペプチドの他、必要に応じて、薬学的に許容可能な、緩衝剤、保存剤、注射用滅菌水、キレート化剤およびpH調整剤などが含まれていてもよい。
【００２９】
本発明の検出試薬は、キットの形態で、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明の検出試薬がキットとして供給される場合、当該検出試薬のうち複数の構成成分（例えば、本発明のペプチド、滅菌水または緩衝剤など）が別々の容器中に包装されていてもよく、使用直前に構成成分を混合してもよい。キット中に含まれる本発明のペプチドおよびその他の構成成分は、当該ペプチドや構成成分が活性を長期間有効に持続し得る材質の容器中に収納される必要がある。容器がアンプルである場合には、窒素ガスのような中性で不反応性ガスと共に構成成分を収納してもよい。アンプルの材質としては、ガラス、ポリカーボネートもしくはポリスチレンなどの有機ポリマーまたはセラミックなどがよく、本発明のペプチドを吸着する可能性のある金属は避けるべきである。
【００３０】
本発明の第４の実施形態は、本発明のペプチドが結合した金属器具である。当該金属器具は、ニッケルおよび／またはチタン製の器具、あるいは、プラチナおよび／またはタングステン製の器具が好ましく、特に、医療器具（ステントや塞栓用コイルなど）が好ましい。
【００３１】
本発明の第５の実施形態は、本発明のペプチドに対する抗体（以下「本発明の抗体」と記載する）である。本発明のペプチドを抗原とする抗体は、公知の方法により取得することができる。本発明の抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれでもよい。
本発明のペプチドの存在は、標識を結合させた抗体を介して間接的にペプチドを標識し、当該標識から得られるシグナルを取得することによっても検出することができる。この方法は、予め本発明のペプチドを結合させたステントや塞栓用コイルを留置した場合に、内皮細胞等で被覆されていない部分を検出する場合に有効である。
【００３２】
本発明の第６の実施形態は、医療器具（例えば、ステントや塞栓用コイル）が血管内に留置された被験者に対し、本発明の検出試薬および／または当該検出薬に含まれるペプチドに対する抗体であって検出可能な標識を結合させた抗体を投与して、当該医療器具を留置した部位から得られる標識シグナルを検出することを含む、当該医療器具の金属表面（すなわち、内皮細胞等によって被覆されていない金属表面）の検出方法である。
標識からのシグナルは、前述したように、PET（positron emission tomography）法やSPECT（single photon emission computed tomography）法により検出および定量が可能である。また、ガドリニウム造影剤や超常磁性ナノ粒子造影剤を用いたMRI法によっても検出および定量が可能である。
より具体的には、医療器具が、ニッケルおよび／またはチタン製である場合には、前記「本発明の検出試薬」が第１の実施形態にかかる１以上のペプチド、および／または第１の実施形態にかかる複数のペプチドを含む１以上のペプチド複合体を含むことが望ましい。また、医療器具が、プラチナおよび／またはタングステン製である場合には、前記「本発明の検出試薬」が第２の実施形態にかかる１以上のペプチド、および／または第２の実施形態にかかる複数のペプチドを含む１以上のペプチド複合体を含むことが望ましい。
【００３３】
本明細書において引用されたすべての文献の開示内容は、全体として明細書に参照により組み込まれる。また、本明細書全体において、単数形の「a」、「an」、および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものを含むものとする。
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３４】
１．本発明のペプチドの調製
ファージディスプレイ法
ファージディスプレイ法により、ステントあるいはコイルに対して高いアフィニティーを有するペプチドを探索した。12残基のペプチドを標的とし、Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library Kit（New england biolabs）を用いた。
対象のステント（Neuroform EZ, Stryker）、コイル（GDC 10-Soft coil, Boston Scientific）を70%エタノールにより滅菌し、PBS中で37℃に加温した。1.2×1010 pfuのファージライブラリーをステントまたはコイルに15分間暴露した後、0.1% tween20溶液（in PBS）およびPBSで洗浄することで非特異的にステントまたはコイルに吸着しているファージライブラリーを取り除いた。ステントまたはコイルに特異的に吸着したファージライブラリーをpH=2.2のGlycine-HCl溶液で溶出させることで、目的のファージライブラリーを得た。その後、大腸菌（ER2738）を用いてファージプールを十分に増幅させた。本工程を1パニングとし、計5パニング行うことで、ステントまたはコイルに対して高いアフィニティーを有するファージライブラリーを得た。
DNA抽出キット（Qiagen）を用いて得られたファージライブラリーのDNAを抽出した。シークエンシングはユーロフィンジェノミクス株式会社に外注した。
【００３５】
ペプチドの吸着実験
ファージディスプレイによって得られた配列をもとにペプチドを合成（委託合成、シグマアルドリッチ、ジェンスクリプトジャパン株式会社）し、各ペプチドのN末端にfluorescein isothiocyanate (FITC) を結合させた。C末端には、システインを導入している。これは、高分子などの化学修飾を行うためである。
ステントに選択的に結合するペプチドのアミノ酸配列を表１に、塞栓用コイルに選択的に結合するペプチドのアミノ酸配列を表２に示す。
【表１】
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【表２】
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【００３６】
調製したペプチドのN末端にはFITCを、C末端にはスペーサーとシステイン（GGGC）を導入した。0.5 mMペプチド溶液（in PBS）にステントまたはコイルを浸漬させ（37℃、30分間）、ペプチドを結合させた後、PBSで十分にリンスした後、ペプチドの結合の有無を検討するために、正立蛍光顕微鏡でステントまたはコイルを観察した。
その結果、表１および表２に記載したペプチドが、各々、ステントおよびコイルの表面に結合したことを確認した。
図１〜図３は、ステント表面に結合したペプチドからの蛍光を観察した図である。また、図１〜図３で観察した蛍光の蛍光強度を図４にまとめた。図５および図６は、塞栓用コイル表面に結合したペプチドからの蛍光を観察した図である。また、図５および図６で観察した蛍光の蛍光強度を図７にまとめた。図４および図７の結果は、ImageJ (National Institutes of Health)を用いて蛍光像を画像解析し、ステントまたはコイルからの蛍光強度およびバックグラウンドを数値化した。
ここで示したすべてのペプチドにおいて、ステントあるいはコイル表面への特異的な結合が見られた。これらの蛍光強度から、ペプチドの親和性が評価できる。バックグラウンドが大きな値を示すことは、金属表面からの脱離を示しており、ペプチドの配列によりその親和性が異なる。
【００３７】
PEG-ペプチド結合体の吸着実験
実際の使用においては、各ペプチド単独での使用も考えられるが、血中投与を考慮すると、例えば、PEGなどの枝分かれした高分子にペプチドを担持したペプチドの複合体の方が、ステントまたはコイルへ効率的に結合することが予想された。そこで、４つのアーム（分岐）を持つPEGの先端にペプチドを結合させた、ペプチドの複合体（PEG-ペプチド結合体）を作製することとした。
末端にマレイミド基を持ち、1分岐あたり分子量20,000 DaのPEG鎖を有する4分岐PEG（SUNBRIGHT PTE-200MA, NOF corporation）に、モル比1:4でペプチドを反応させた(室温、一晩)。ペプチドのC末端システインのチオールを介して、チオール・マレイミド反応により、4分岐PEGへ結合させた。0.5 mM PEG-ペプチド溶液(in PBS)にステントあるいはコイルを浸漬させ（37℃、30分間）、PBSで十分にリンスした後、蛍光顕微鏡で観察した。
図９〜図１１は、ステント表面に結合したペプチド複合体からの蛍光を観察した図である。また、図９〜図１１で観察した蛍光の蛍光強度を図１２にまとめた。
図１３は、塞栓用コイル表面に結合したペプチド複合体からの蛍光を観察した図である。また、図１３で観察した蛍光の蛍光強度を図１４にまとめた。蛍光強度の数値化の方法は前述の通りである。
ペプチド複合体に関しても、ステントやコイル表面からの蛍光が見られ、4分岐PEGとの結合体形成により、金属表面に対する結合能への影響は見られない。
【００３８】
血漿中のステントに対する吸着実験
次に、血漿中に存在するステントと、本発明のペプチドとの結合性について検討するために、血漿に接触させたステントにも本発明のペプチドが結合するかどうか調べた。
ヒト血漿にステントを浸漬させた（37℃、30分間）後、血漿からステントを取り出し、各ペプチド溶液(0.5 mM)およびPEG-ペプチド結合体溶液(0.5 mM)にステントを浸漬させた（37℃、30分間）。ステントをPBSで十分にリンスした後、蛍光顕微鏡で観察した。
図１５および図１６に、ステントの蛍光顕微鏡像を示し、観察された蛍光強度を図１７にまとめた。蛍光強度の数値化の方法は前述の通りである。
ここで示したペプチドおよびPEG-ペプチド結合体は、ヒト血漿中においてもステント表面へ特異的に結合した。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明のペプチドは、医療器具であるステントや塞栓用コイルの表面に選択的に結合するものである。従って、本発明のペプチドは、体内に留置した金属製医療器具の表面を評価する上で有用であり、医療分野においての利用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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