(57)【要約】【課題】簡便かつ高精度にがん症状の判定を行うことができるがん症状の判定方法を提供すること。【解決手段】生体試料中に含まれるがんマーカー化合物を検出することによりがん症状を判定する方法であって、前記がんマーカー化合物が、炭素数１０〜１６のアルコール、及び炭素数１０〜１６の不飽和脂肪酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物であるがん症状の判定方法である。【選択図】図４
2019164083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中に含まれるがんマーカー化合物を検出することによりがん症状を判定する方法であって、
前記がんマーカー化合物が、炭素数１０〜１６のアルコール、及び炭素数１０〜１６の不飽和脂肪酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物であることを特徴とするがん症状の判定方法。
【請求項２】
がんマーカー化合物が、デカノール、ドデカノール、テトラデカノール、ヘキサデカノール、デセン酸、ドデセン酸、テトラデセン酸、ヘキサデセン酸、デカジエン酸、ドデカジエン酸、テトラデカジエン酸、及びヘキサデカジエン酸から選ばれる少なくとも１種の化合物であることを特徴とする請求項１記載のがん症状の判定方法。
【請求項３】
がんマーカー化合物が、ヘキサデカノール、デセン酸、ドデセン酸、及びテトラデカジエン酸から選ばれる少なくとも１種の化合物であることを特徴とする請求項２記載のがん症状の判定方法。
【請求項４】
生体試料が、ヒトから採取された試料であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のがん症状の判定方法。
【請求項５】
生体試料が、尿、血液、唾液、汗及び呼気から選ばれる少なくとも１種の試料であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のがん症状の判定方法。
【請求項６】
生体試料が、尿及び唾液から選ばれる少なくとも１種の試料であることを特徴とする請求項５記載のがん症状の判定方法。
【請求項７】
がんが、乳がん、大腸がん及び胃がんから選ばれる少なくとも１種のがんであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のがん症状の判定方法。
【請求項８】
がんの有無、がんの進行度合い、及びがんリスクの度合いから選ばれるいずれかを判定することを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のがん症状の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳がん等のがんの症状を簡易かつ高精度に判定することができるがん症状判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、心筋梗塞や脳梗塞等の血管系疾患と共に、死亡原因が上位の疾患である。がんの中でも、乳がんは、日本女性がかかる割合（罹患率）が最も多く、その罹患率は増加の一途をたどっている。
【０００３】
がんは、早期発見が非常に重要であるが、現在、検診、診断するには、血液採取、病理診断等、侵襲的な診断方法に頼っており、これが費用や時間の点で受診者の負担となり、結果として、早期発見ができていないのが現状である。また、国等が推奨する乳がん検診は、３０歳以上が対象であり、触診、マンモグラフィ（乳房Ｘ線撮影）が検査メニューとなっており、２、３年に１回の受診が推奨されているが、怪しいものは陽性と判断するという擬陽性の問題、医師の負担の問題、受信者が再検査を受けず早期発見を遅らせる問題などがある。
【０００４】
一方、このようながんの症状を発見する様々な手法が提案されている。
例えば、特定のタンパク質又は該タンパク質をコードするｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現の減少や増加を検出する乳がん患者手術治療後の予後を判定する方法が提案されている（特許文献１参照）。
【０００５】
また、採取された血液中のインドール−３−酢酸、馬尿酸、クエン酸、３−インドキシル硫酸、チオプロリン、ウロカニン酸、アセト酢酸、６−ヒドロキシヘキサン酸、デカン酸、シス−アコニット酸、ラウリン酸、Ｏ−アセチルカルニチン、シスチン、リバビリン、３−フェニルプロピオン酸、ヒドロキシプロリン、およびピペコリン酸からなる群から選択される１以上の化合物の含有量を測定する工程を含む、大腸癌を診断する方法が提案されている（特許文献２参照）。
【０００６】
しかしながら、いずれの手法も、簡便さや正確性を十分に備えた手法とはいえない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−２４５９６０号公報
【特許文献２】特開２０１１−１０６９９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、簡便かつ高精度にがん症状の判定を行うことができるがん症状の判定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
匂いに敏感である犬は、匂いでがんを判別していることが知られている。この犬は、がん由来の揮発性物質をかぎ分けていると考えられるが、現在、判定精度の高いがん由来の揮発性物質は発見されていない。
【００１０】
本発明者らは、犬の匂いに対する感度が非常に高いこと、及びがん由来の揮発性物質が発見されていないことに着目し、難揮発性物質（揮発性が極めて少量である物質）に焦点を当て鋭意研究した結果、がん患者と健常者に違いのあるがんマーカー化合物を見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下のとおりのものである。
［１］生体試料中に含まれるがんマーカー化合物を検出することによりがん症状を判定する方法であって、前記がんマーカー化合物が、炭素数１０〜１６のアルコール、及び炭素数１０〜１６の不飽和脂肪酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物であることを特徴とするがん症状の判定方法。
［２］がんマーカー化合物が、デカノール、ドデカノール、テトラデカノール、ヘキサデカノール、デセン酸、ドデセン酸、テトラデセン酸、ヘキサデセン酸、デカジエン酸、ドデカジエン酸、テトラデカジエン酸、及びヘキサデカジエン酸から選ばれる少なくとも１種の化合物であることを特徴とする［１］記載のがん症状の判定方法。
［３］がんマーカー化合物が、ヘキサデカノール、デセン酸、ドデセン酸、及びテトラデカジエン酸から選ばれる少なくとも１種の化合物であることを特徴とする［２］記載のがん症状の判定方法。
【００１２】
［４］生体試料が、ヒトから採取された試料であることを特徴とする［１］〜［３］のいずれか記載のがん症状の判定方法。
［５］生体試料が、尿、血液、唾液、汗及び呼気から選ばれる少なくとも１種の試料であることを特徴とする［１］〜［４］のいずれか記載のがん症状の判定方法。
［６］生体試料が、尿及び唾液から選ばれる少なくとも１種の試料であることを特徴とする［５］記載のがん症状の判定方法
［７］がんが、乳がん、大腸がん及び胃がんから選ばれる少なくとも１種のがんであることを特徴とする［１］〜［６］のいずれか記載のがん症状の判定方法。
［８］がんの有無、がんの進行度合い、及びがんリスクの度合いから選ばれるいずれかを判定することを特徴とする［１］〜［７］のいずれか記載のがん症状の判定方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の判定方法によれば、簡便かつ高精度にがん症状の判定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Porapak Type Qカラム抽出法を用いたがん細胞培養株（MCF-7）培養液抽出物及び正常線維芽細胞株（KMST-6）培養液抽出物のGC-FID分析の結果を示す図であり、上図ががん細胞培養株（MCF-7）培養液抽出物を示し、下図が正常線維芽細胞株（KMST-6）培養液抽出物を示す。
【図２】液液抽出法を用いた乳がん陽性症例の尿抽出物GC-MS分析の結果を示す図である。
【図３】OASIS MAX固相抽出カラムを用いた乳がん陰性群及び陽性群由来尿検体のLC-MS分析（EIC分析 : 3-デセン酸（内標準） = 196.1223 m/z, デセン酸 = 196.1223 m/z 5-Z-ドデセン酸 = 197.1536 m/z, テトラデカジエン酸 = 223.1693 m/z）の結果を示す図である。
【図４】がん未罹患者及びがん患者由来尿検体における不飽和脂肪酸（デセン酸，5-Z-ドデセン酸，テトラデカジエン酸）の定量結果（クレアチニン補正値として）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のがん症状の判定方法は、生体試料中のがんマーカー化合物を検出することによりがん症状を判定する方法であって、がんマーカー化合物が、炭素数１０〜１６のアルコール、及び炭素数１０〜１６の不飽和脂肪酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物であることを特徴とする。
【００１６】
本発明の判定の対象となるがんとしては、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、膵臓がん、腎がん、食道がん、甲状腺がん、前立腺がん、子宮がん、子宮内膜がん、卵巣がんなどを挙げることができる。これらの中でも、本発明の判定方法は、乳がん、大腸がん及び胃がんをより高い精度で判定することができる。
【００１７】
本発明における生体試料を採取する対象は、特に制限されるものではないが、脊椎動物であることが好ましく、哺乳類であることがより好ましく、ヒトであることが特に好ましい。また、生体試料の種類としては、尿、血液、唾液、汗、呼気等を挙げることができ、これらの中でも、非侵襲的かつ容易に採取でき、保管も容易なことから、尿又は唾液が好ましく、尿が特に好ましい。
【００１８】
本発明のがんマーカー化合物は、上記のように、炭素数１０〜１６のアルコール、及び炭素数１０〜１６の不飽和脂肪酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物である。これら化合物は、がん患者の生体試料に含まれる特有の物質であり、がんマーカー化合物として有用である。これらのがんバイオマーカー化合物の検出の組合せ等により、がんの種類を特定することも可能である。
【００１９】
炭素数１０〜１６のアルコールとしては、具体的に、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノールを挙げることができ、デカノール、ドデカノール、テトラデカノール、ヘキサデカノールが好ましく、ヘキサデカノールが特に好ましい。また、直鎖アルコール（１級アルコール）であることが好ましい。
【００２０】
炭素数１０〜１６の不飽和脂肪酸としては、具体的に、デセン酸、ウンデセン酸、ドデセン酸、トリデセン酸、テトラデセン酸、ペンタデセン酸、ヘキサデセン酸、デカジエン酸、ウンデカジエン酸、ドデカジエン酸、トリデカジエン酸、テトラデカジエン酸、ペンタデカジエン酸、ヘキサデカジエン酸等を挙げることができ、デセン酸、ドデセン酸、テトラデセン酸、ヘキサデセン酸、デカジエン酸、ドデカジエン酸、テトラデカジエン酸、及びヘキサデカジエン酸が好ましく、デセン酸、ドデセン酸、テトラデカジエン酸が特に好ましい。具体的には、例えば、4-Z-デセン酸、5-Z-ドデセン酸、5,8-(Z,Z)-テトラデカジエン酸を挙げることができる。不飽和結合（二重結合）の数としては１〜３個程度が好ましく、１個又は２個であることが特に好ましい。不飽和結合の位置は特に限定されず、また、シス体、トランス体のいずれであってもよい。また、直鎖脂肪酸であることが好ましい。
【００２１】
生体試料に含まれるがんマーカー化合物を検出する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）、抗原−抗体反応法に基づく表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）等を挙げることができる。
【００２２】
本発明においては、具体的に、がんの有無（がんの再発・転移を含む）、がんの進行度合い、がんリスクの度合い等を判定することができる。
【００２３】
がんの有無は、例えば、がんマーカー化合物量の閾値到達の有無により判定することができる。また、がんの進行度合いやがんリスクの度合いは、同様に、各レベルの閾値の到達の有無により判定することができ、また、がんマーカー化合物量の変化により判定することができる。なお、ここでいうがんマーカー化合物量とは、必ずしも絶対量をいうものではなく、基準との相対的な量であってもよい。
【００２４】
がんマーカー化合物量の閾値としては、例えば、健常者及びがん患者から検出されるがんマーカー化合物量の統計的データから一般的な閾値を決定することができる。また、個々の対象（ヒトなど）のデータから個々の閾値を決定することもできる。また、閾値は０であってもよい。すなわち、がんマーカー化合物の有無を検出してもよい。
【００２５】
がんマーカー化合物量の変化により判定する方法としては、例えば、個々の対象（ヒトなど）から継続的に生体試料に含まれるがんマーカー化合物量を測定（検出）し、その対象の過去のがんマーカー化合物量と比較することにより、がん症状の判定を行う方法を挙げることができる。具体的には、定期健診毎に生体試料に含まれるマーカー化合物量を測定し、がんマーカー化合物量を比較する方法や、投薬開始時から継続的に生体試料に含まれるマーカー化合物量を測定し、がんマーカー化合物量を比較する方法や、手術後から継続的に生体試料に含まれるマーカー化合物量を測定し、がんマーカー化合物量を比較する方法等を挙げることができる。
【実施例】
【００２６】
１．GC-MS法によるがんマーカー化合物量の測定
（１）GC充填剤を用いたカラム回収法
【００２７】
（方法）
Porapak Type Q （20 cm3, Waters社製）をカラムに充填し、1 mM HCl、ジエチルエーテル、メタノールを用いて順次洗浄、コンディショニング後、試料溶液（がん細胞（MCF-7）培養液及び正常線維芽細胞（KMST-6）培養液）を負荷した。試料負荷後のカラムを水で洗浄し、ジエチルエーテルにて吸着成分を溶出、回収した。回収後のジエチルエーテル溶液に対して、十分量の無水硫酸ナトリウムを加え、脱水し、40℃の湯浴中で濃縮したものをGC-MS（あるいはGC-FID）にて分析した。
【００２８】
GC分析用カラムには、DB-FFAP（Film : 0.25 μm, Length : 30 m, アジレント・テクノロジー社製）を用いた。GC条件は、GC/MS装置 : GCMS-QP2010（島津製作所製）, GC-FID装置 : GC-18A（島津製作所製）, 流速 : 1.5 mL/min（GC-FID分析の場合 : 0.95 mL/min）, スプリットレス, 昇温プログラム : 40 - 240℃, 5℃/min, インジェクション温度 : 230℃, 検出器温度 : 240℃, キャリアーガス : He, インジェクション量 : 1 μL（GC-FIDの場合 : 5 μL）, スキャン範囲 : 40-500 m/z, イオン源温度 : 200℃, インターフェイス温度 : 230℃, 検出器電圧 : 0.1 kVを用いた。
【００２９】
（結果）
図１に示すように、がん細胞（MCF-7）培養液において、正常線維芽細胞（KMST-6）培養液と比較して顕著に高いピークとして、1-ヘキサデカノール （保持指標（RI） : 2330）及び5-Z-ドデセン酸（RI : 2453）が検出された。なお、具体的な化合物名は、GC-MS NIST Libraryより特定した。
【００３０】
（２）液液抽出法
（方法）
試料溶液（乳がん陽性症例のヒト尿）に対して、内標準物質として3-デセン酸を終濃度 : 0.1 nL/mL (100 ppb)となるように添加し、0.5 M塩酸を用いて酸性化した溶液に対して、2倍量のジエチルエーテルを添加した。その後、激しく撹拌（2 min）し、4℃にて一晩液液抽出した。その後、遠心分離（500 rpm, 30 sec, 4℃）に供し、上層の有機層を回収し、無水硫酸ナトリウムを添加することで脱水した。その後、窒素雰囲気下にて濃縮したものをGC-MS（あるいはGC-FID）にて分析した。
【００３１】
GC分析用カラムには、DB-FFAP（Film : 0.25 μm, Length : 30 m, アジレント・テクノロジー社製）を用いた。GC条件は、GC/MS装置 : GCMS-QP2010（島津製作所製）, GC-FID装置 : GC-18A（島津製作所製）, 流速 : 1.5 mL/min（GC-FID分析の場合 : 0.95 mL/min）, スプリットレス, 昇温プログラム : 40 - 240℃, 5℃/min, インジェクション温度 : 230℃, 検出器温度 : 240℃, キャリアーガス : He, インジェクション量 : 1 μL（GC-FIDの場合 : 5 μL）, スキャン範囲 : 40-500 m/z, イオン源温度 : 200℃, インターフェイス温度 : 230℃, 検出器電圧 : 0.1 kVを用いた。
【００３２】
（結果）
図２に示すように、乳がん陽性症例のヒト尿において、1-ヘキサデカノールが検出された。
【００３３】
２．LC-MS法によるがんマーカー化合物量の測定
（方法）
陰イオン交換型固相抽出カラムであるOASIS MAX Plus（固相 : 225 mg, Waters社製）を、メタノール、5%アンモニア水にて順次コンディショニングを行った。内標準物質（3-デセン酸 : 終濃度 100 ppb）を添加したヒト尿（乳がん陽性群及び乳がん陰性群）に対して、等倍量の5%アンモニア水を添加し、コンディショニング後のOASIS MAXカラムに負荷した。その後、5%アンモニア水、メタノールで順次洗浄し、2%ギ酸/メタノール溶液を用いて吸着物質を溶出、回収した。その後、遠心エバポレーターを用いて濃縮し、ポアサイズ0.45 μmのシリンジフィルターにより濾過した溶液をLC-TOF/MSにて分析した。
【００３４】
LC-MS分析条件は、LC装置 : Agilent 1200（アジレント・テクノロジー社製）, カラム : Cosmosil 5C18 MS-II （ナカライテスク社製）, 流速 : 0.2 mL/min, カラム温度 : 40℃, インジェクション量 : 20 μL, 溶離液（グラジエントプログラム） : 0-100%acetonitorile/0.1%FA (5-25 min), MS装置 : microTOF II（ブルカーダルトニクス社製）, 検出モード : Negative, Capillary Exit : -90.0 V, Hexapole RF : 100 Vppを用いた。解析には、分析対象化合物のプロトン脱離型イオン（[M-H]-）のExtracted ion chromatogram（EIC）を用いた。
【００３５】
（結果）
図３及び図４に示すように、乳がん陽性群の尿検体において、デセン酸（[M-H]- = 169.1223 m/z）、5-Z-ドデセン酸（[M-H]- = 197.1536 m/z）及びテトラデカジエン酸（[M-H]-= 223.1693 m/z）が、乳がん陰性群の尿検体と比較して有意に高い値（尿中クレアチニン補正後の値として）を示した。
【００３６】
以上のとおり、ヘキサデカノール、デセン酸、ドデセン酸、及びテトラデカジエン酸は、がんマーカー化合物として極めて有用であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明のがん症状の判定方法は、死亡原因上位のがんの症状を判定できることから、産業上有用である。
【図１】
2019164083.tif 000003
【図２】
2019164083.tif 000004
【図３】
2019164083.tif 000005
【図４】
2019164083.tif 000006