(57)【要約】【課題】担体に固定化したガングリオシドとの抗原抗体反応による試料中の抗ガングリオシド抗体の測定を高感度に行えるようにし、正確な測定結果が得られる方法、測定試薬キット及び洗浄液を提供する。【解決手段】試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する方法及び試薬キットにおいて、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することを特徴とするものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する方法において、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することを特徴とする試料中の抗ガングリオシド抗体の測定方法。
【請求項２】
試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬キットにおいて、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を含むことを特徴とする試料中の抗ガングリオシド抗体の測定試薬キット。
【請求項３】
試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する際に未反応の成分を除去するための洗浄液であって、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする洗浄液。
【請求項４】
試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する方法において、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することを特徴とする試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度の向上方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担体に固定化したガングリオシドを使用した試料中の抗ガングリオシド抗体の測定に関するものである。
本発明は、糖脂質分野、生化学分野、分析化学分野、臨床検査分野及び生命科学分野等において重要なものであるが、特に神経疾患等の診断において重要なものである。  
【背景技術】
【０００２】
ガングリオシド（シアロ糖脂質；シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質の総称）は、従来より神経組織に多く存在することが知られており、神経組織のガングリオシドに反応する抗体が体液中に産生されると重篤な神経症状を起こすことが知られるようになってきた。
これらの自己抗体は、先行感染した菌体に対するものとして体内に産生され、これが神経組織のガングリオシドと交差反応し、自己抗体として神経を傷害する自己免疫型の神経疾患を起こすことが知られている。
【０００３】
例えば、ガングリオシドに対する抗体（抗ガングリオシド抗体）の一つであるＩｇＧ型の抗ＧＭ１ａ抗体は、急性軸策型ギラン・バレー症候群などの運動神経疾患に関与することが知られている。
急性軸策型ギラン・バレー症候群の場合、食中毒菌として知られる菌体Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉが先行感染し、菌体のリポ多糖（ＬＰＳ）上のＧＭ１ａと類似のガングリオシド構造部分に対する抗体が体内に産生されることにより発病する（例えば、非特許文献１）。
そして、この抗体は血液中に見い出されることが判明している（例えば、非特許文献２及び非特許文献３）。
【０００４】
また、別の抗ガングリオシド抗体であるＩｇＧ型の抗ＧＱ１ｂ抗体は、フィッシャー症候群やビッカースタッフ型脳幹脳炎などの神経疾患に関与しており、その所見は脳幹梗塞などの他の中枢神経系疾患と類似しているが、その治療法は全く異なる。
そして、この抗体も患者血清中に見い出されることが判明している（例えば、非特許文献４及び非特許文献５）。
その他、感覚失調型ポリニューロパシーで抗ＧＤ２抗体、抗ＧＴ１ｂ抗体、及び抗ＧＱ１ｂ抗体が上昇するとの報告がある。
また、ガングリオシドと反応する抗体が癌患者由来試料より検出されるとの報告もある。
【０００５】
以上のように、研究レベルでは各種疾患と抗ガングリオシド抗体の関係が解き明かされ、臨床現場で使用できる抗ガングリオシド抗体の測定方法として、ＥＬＩＳＡ法による測定が実用化されている（例えば、特許文献１、特許文献２及び非特許文献６）。
【０００６】
しかしながら、抗ガングリオシド抗体の測定方法として使用されているＥＬＩＳＡ法は、検体によっては、その測定の感度が十分でないという問題があった。このため、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定値を疾患の検査に利用しようとする場合、この疾患の診断を誤らせる可能性があった。
従って、試料中の抗ガングリオシド抗体を、ガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定を行う場合、更なる測定感度の改善が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平９−１７８７４９号公報
【特許文献２】特開２００３−２９４７５２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】結城ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８巻，１７７１〜１７７５頁，１９９３年
【非特許文献２】Ａ．Ｊ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３５巻，２３４〜２３７頁，１９９４年
【非特許文献３】Ｌ．Ｈ．Ｖｉｓｓｅｒら，Ｂｒａｉｎ，１１８巻，８４１〜８４７頁，１９９５年
【非特許文献４】千葉ら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３１巻，６７７〜６７９頁，１９９２年
【非特許文献５】結城ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１１８巻，８３〜８７頁，１９９３年
【非特許文献６】小鷹ら，モダンメディア，５４巻３号，８２〜８６頁，２００８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の課題は、担体に固定化したガングリオシドとの抗原抗体反応による試料中の抗ガングリオシド抗体の測定を高感度に行えるようにし、正確な測定結果が得られる方法、測定試薬キット及び洗浄液を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する方法及び試薬キットにおいて、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することにより、測定の感度を向上させることができることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
［１］  試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する方法において、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することを特徴とする試料中の抗ガングリオシド抗体の測定方法。
[２]  試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬キットにおいて、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を含むことを特徴とする試料中の抗ガングリオシド抗体の測定試薬キット。
[３]  試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する際に未反応の成分を除去するための洗浄液であって、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする洗浄液。
[４]  試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する方法において、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することを特徴とする試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度の向上方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の抗ガングリオシド抗体測定方法、抗ガングリオシド抗体測定試薬キット、洗浄液及び抗ガングリオシド抗体測定における感度の向上方法は、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させたものである。
これにより、本発明においては、低値の抗ガングリオシド抗体までも再現性よく正確に測定することができるようになったものである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１４】
［１］洗浄液
１．総論
本発明の試料中の抗ガングリオシド抗体の測定方法においては、試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する方法において、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することを特徴とするものである。
【００１５】
また、本発明の試料中の抗ガングリオシド抗体の測定試薬キットにおいては、試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬キットにおいて、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を含むことを特徴とするものである。
【００１６】
また、本発明の洗浄液は、試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する際に未反応の成分を除去するための洗浄液であって、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とするものである。
【００１７】
また、本発明の試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度の向上方法においては、試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する方法において、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することを特徴とするものである。
【００１８】
本発明においては、以上のことにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させることができるものである。
【００１９】
２．洗浄液の成分等
本発明において、洗浄液としては、水又は水溶液等を挙げることができる。
本発明における洗浄液が水溶液である場合、当該洗浄液は緩衝剤、塩類、界面活性剤、又は防腐剤等を含有することができる。
【００２０】
（１）ｐＨ
本発明において、洗浄液のｐＨは特に限定はないものの、ｐＨ６．０［２０°Ｃ］以上とすることが好ましく、ｐＨ７．０［２０°Ｃ］以上とすることが特に好ましい。
【００２１】
また、この洗浄液のｐＨは、ｐＨ９．０［２０°Ｃ］以下とすることが好ましく、ｐＨ８．０［２０°Ｃ］以下とすることが特に好ましい。
【００２２】
（２）緩衝剤
本発明においては、洗浄液に、緩衝剤を適宜必要に応じて存在させることができる。
【００２３】
例えば、前記の「（１）ｐＨ」に記載のｐＨ域等において緩衝能を有する緩衝剤を、緩衝能を有する濃度において、洗浄液に含有させることができる。
【００２４】
このような緩衝剤としては、例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、リン酸、リン酸塩、ホウ酸、ホウ酸塩、グリシン、グリシルグリシン、イミダゾール、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕等を挙げることができる。
【００２５】
なお、本発明の洗浄液においては、前記の「（１）ｐＨ」に記載のｐＨ域のｐＨとなるように、当該洗浄液のｐＨを設定することが好ましい。
このため、前記の「（１）ｐＨ」に記載のｐＨ域等において緩衝能を有する緩衝剤を、緩衝能を有する濃度において、洗浄液に含有させることが好ましい。
【００２６】
なお、本発明における緩衝剤としては、グッドの緩衝剤又はリン酸塩が好ましい。
【００２７】
（３）塩類
本発明においては、洗浄液に、塩類を適宜必要に応じて存在させることができる。
【００２８】
この塩類としては、例えば、その陽イオンがアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、アンモニウムイオン、又はその他の金属イオン等である塩類を挙げることができる。
【００２９】
アルカリ金属イオンとしては、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、又はカリウムイオン等を挙げることができる。
【００３０】
アルカリ土類金属イオンとしては、例えば、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、又はカルシウムイオン等を挙げることができる。
【００３１】
その他の金属イオンとしては、例えば、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン、亜鉛イオン、又はアルミニウムイオン等を挙げることができる。
【００３２】
また、アンモニウムイオンとしては、例えば、一級のアンモニウムイオン、二級のアンモニウムイオン、三級のアンモニウムイオン、又は四級のアンモニウムイオン等を挙げることができる。
【００３３】
その他の陽イオンとしては、例えば、炭素原子、ケイ素原子、ホウ素原子、窒素原子（アンモニウムイオン以外の場合において）、リン原子、若しくは硫黄原子などが正の電荷を帯びている原子、又は原子団等を挙げることができる。
この具体的な例としては、炭素原子が正の電荷を帯びているコリンイオン等を挙げることができる。
【００３４】
なお、この陽イオンとしては、１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００３５】
また、本発明における塩類としては、例えば、その陰イオンが、例えば、有機化合物よりなる酸基、ハロゲンイオン、又はその他の無機化合物よりなる酸基等を挙げることができる。
【００３６】
この有機化合物よりなる酸基としては、例えば、酢酸イオン、クエン酸イオン、グルコン酸イオン、又はシュウ酸イオン等を挙げることができる。
【００３７】
ハロゲンイオンとしては、例えば、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、又はヨウ素イオン等を挙げることができる。
【００３８】
その他の無機化合物よりなる酸基としては、例えば、硫酸イオン、亜硫酸イオン、ピロ亜硫酸イオン、亜二チオン酸イオン、チオ亜硫酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、次亜硝酸イオン、ペルオキソ亜硝酸イオン、リン酸イオン、亜リン酸イオン、ピロ亜リン酸イオン、次亜リン酸イオン、二リン酸イオン、ホウ酸イオン、炭酸イオン、シアン酸イオン、イソシアン酸イオン、又はケイ酸イオン等を挙げることができる。
【００３９】
また、この陰イオンとしては、１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００４０】
本発明における塩類としては、アルカリ金属とハロゲンイオンとの塩類、又はアルカリ土類金属とハロゲンイオンとの塩類が好ましく、アルカリ金属とハロゲンイオンとの塩類がより好ましく、塩化ナトリウム、塩化カリウム若しくは塩化リチウムが更に好ましく、塩化ナトリウムが特に好ましい。
【００４１】
（４）界面活性剤
本発明においては、洗浄液に、界面活性剤を適宜必要に応じて存在させることができる。
この界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤等を挙げることができる。
【００４２】
〔１〕非イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）  ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリスチリルフェニルエーテル、又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレンエーテル化合物。
【００４３】
（ｂ）  グリセリン脂肪酸部分エステル、ソルビタン脂肪酸部分エステル、ペンタエリスリトール脂肪酸部分エステル、プロピレングリコールモノ脂肪酸エステル、又はショ糖脂肪酸部分エステルなどの多価アルコール部分エステル化合物。
【００４４】
（ｃ）  ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸部分エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸部分エステル、又はポリオキシエチレン化ひまし油などのポリオキシエチレン化多価アルコール脂肪酸エステル。
【００４５】
（ｄ）  脂肪酸ジエタノールアミド、Ｎ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルキルアミン、トリエタノールアミン脂肪酸エステル、又はトリアルキルアミンオキシドなどのアミド若しくはアミン化合物。
【００４６】
〔２〕陰イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）  脂肪族モノカルボン酸塩、Ｎ−アシロイルサルコシン塩、Ｎ−アシロイル−β−アラニン塩、若しくはＮ−アシロイルグルタミン酸塩などの脂肪族化合物カルボン酸塩；又はアビエチン酸塩などの環式化合物カルボン酸塩。
【００４７】
（ｂ）  ジアルキルスルホコハク酸塩、アルカンスルホン酸塩、若しくはヒドロキシアルカンスルホン酸塩などの脂肪族化合物スルホン酸塩；直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキルフェノキシポリオキシエチレンプロピルスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェノールスルホン酸塩、若しくはナフタレンスルホン酸塩−ホルムアルデヒド縮合物などの環式化合物スルホン酸塩；又はＮ−メチル−Ｎ−オレイルタウリンナトリウム、若しくはＮ−アルキルスルホコハク酸モノアミド二ナトリウム塩などの含窒素化合物スルホン酸塩。
【００４８】
（ｃ）  硫酸化ひまし油、硫酸化牛脚油、脂肪酸アルキルエステル・硫酸エステル塩、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、脂肪酸モノグリセリド硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキロイルアミド硫酸塩などの脂肪族化合物硫酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル硫酸エステル塩などの環式化合物硫酸エステル塩。
【００４９】
（ｄ）  アルキルリン酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル塩などの脂肪族化合物リン酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸エステル塩などの環式化合物リン酸エステル塩。
【００５０】
（ｅ）  スチレン−無水マレイン酸共重合物の部分けん化物、又はオレフィン−無水マレイン酸共重合物の部分けん化物などの重合型高分子化合物のけん化物。
【００５１】
（ｆ）  ナフタレンスルホン酸塩−ホルマリン縮合物などの重縮合型高分子化合物。
【００５２】
〔３〕陽イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）  モノアルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、又はトリアルキルアミン塩などの脂肪族化合物アミン塩。
【００５３】
（ｂ）  テトラアルキルアンモニウム塩などの脂肪族化合物第四級アンモニウム塩；又はトリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２−アルキル−１−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、若しくはＮ，Ｎ−ジアルキルモルホリニウム塩などの環状化合物第四級アンモニウム塩。
【００５４】
（ｃ）  ポリエチレンポリアミン脂肪族アミド塩、ポリエチレンポリアミン脂肪族アミドの尿素縮合物の塩、又はポリエチレンポリアミン脂肪族アミド尿素縮合物の第四級アンモニウム塩などのポリエチレンポリアミン誘導体。
【００５５】
〔４〕両性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）  Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−アルキル−Ｎ−カルボキシアルキレンアンモニウムベタインなどのカルボキシベタイン化合物。
【００５６】
（ｂ）  Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキレンカルボン酸塩などのアミノカルボン酸化合物。
【００５７】
（ｃ）  Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキル−Ｎ−スルホアルキレンアンモニウムベタインなどのスルホベタイン化合物。
【００５８】
（ｄ）  Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ビスポリオキシエチレン硫酸エステル塩などのアミノ硫酸エステル化合物。
【００５９】
（ｅ）  ２−アルキル−１−ヒドロキシエチル−１−カルボキシメチルイミダゾリニウム塩などのイミダゾリン化合物。
【００６０】
本発明においては、１種類の界面活性剤だけを用いてもよく、又は２種類以上の界面活性剤を組み合わせて用いてもよい。
【００６１】
本発明において、界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましい。
【００６２】
本発明において、洗浄液に含有させる界面活性剤の濃度としては、０．００１％（ｗ／ｖ）以上とすることが好ましく、０．０１％（ｗ／ｖ）以上とすることが特に好ましい。
【００６３】
また、洗浄液に含有させる界面活性剤の濃度としては、１．０％（ｗ／ｖ）以下とすることが好ましく、０．１％（ｗ／ｖ）以下とすることが特に好ましい。
【００６４】
（５）成分等まとめ
本発明における洗浄剤は、それに含まれる緩衝剤、塩類、及び界面活性剤の全ての成分を含めても、そのイオン強度は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、そのようになっていれば良い。
なお、本発明における洗浄剤のイオン強度は、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましく、７０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが更に好ましい。
【００６５】
［２］ガングリオシド
本発明において、ガングリオシドとは、シアル酸を含む糖脂質（シアロ糖脂質）のことであり、シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質の総称である。
このガングリオシドとしては、例えば、ＧＭ１、ＧＭ１ｂ、ＧＭ１−Ｆｕｃ、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＭ３（ＮｅｕＧｃ）、ＧＭ４、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ／ＮｅｕＧｃ）、ＧＤ３（ＮｅｕＧｃ）２、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ａ、ＧＱ１ｂ、ＧＱ１ｃ、ＧＰ１ａ、ＧＰ１ｂ、ＧＰ１ｃ、又はＬＭ１等を挙げることができる。
【００６６】
［３］抗ガングリオシド抗体
本発明において、抗ガングリオシド抗体は、前記したガングリオシドに対して特異的に結合することができる抗体である。
【００６７】
なお、抗ガングリオシド抗体としては、例えば、抗ＧＭ１抗体、抗ＧＭ１ｂ抗体、抗ＧＭ１−Ｆｕｃ抗体、抗ＧＭ２抗体、抗ＧＭ３抗体、抗ＧＭ３（ＮｅｕＧｃ）抗体、抗ＧＭ４抗体、抗ＧＤ１ａ抗体、抗ＧＤ１ｂ抗体、抗ＧＤ２抗体、抗ＧＤ３抗体、抗ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ／ＮｅｕＧｃ）抗体、抗ＧＤ３（ＮｅｕＧｃ）２抗体、抗ＧＴ１ａ抗体、抗ＧＴ１ｂ抗体、抗ＧＴ１ｃ抗体、抗ＧＱ１ａ抗体、抗ＧＱ１ｂ抗体、抗ＧＱ１ｃ抗体、抗ＧＰ１ａ抗体、抗ＧＰ１ｂ抗体、抗ＧＰ１ｃ抗体、又は抗ＬＭ１抗体等を挙げることができる。
【００６８】
本発明においては、特に、抗ＧＭ１抗体、及び抗ＧＱ１ｂ抗体の測定において好適である。
【００６９】
［４］担体
本発明において、担体は、前記のガングリオシドを固定化することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。
【００７０】
すなわち、ガングリオシドとの抗原抗体反応を利用して試料中の抗ガングリオシド抗体の測定を行う測定試薬及び測定方法に使用されている担体、又は使用することが可能な担体であればよい。
【００７１】
この担体の材質は、特に限定はなく、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるマイクロカプセル、ビーズ、マイクロタイタープレート（マイクロプレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の固相担体を用いることができる。
【００７２】
本発明において、担体としては、マイクロタイタープレートが好ましい。
【００７３】
本発明において、ガングリオシド（ガングリオシド抗原）を担体に固定化することは、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。
【００７４】
例えば、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、ガングリオシドと、担体とを、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、ガングリオシドと、担体の、それぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と前記の二価性の架橋試薬とを反応させること等により行うことができる。
【００７５】
更に、ガングリオシドを固定化した担体の自然凝集や、非特異的反応等を抑制するために処理を行う必要があれば、ガングリオシドを固定化した担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【００７６】
［５］試料
本発明において、試料とは、抗ガングリオシド抗体が存在する可能性があり、かつ抗ガングリオシド抗体の存在の有無、又は量の測定を行おうとするものであれば、どのようなものでもよい。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、髄液若しくは腹水などの体液、又は臓器、組織、若しくは筋肉などの抽出液、細胞若しくは菌体などの抽出液等、抗ガングリオシド抗体が含まれる可能性のあるものを挙げることができる。
【００７７】
本発明における試料としては、ヒトの血液、血清又は血漿が好ましい。
【００７８】
［６］測定方法
本発明の試料中の抗ガングリオシド抗体の測定方法は、試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する方法において、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することを特徴とするものである。
【００７９】
本発明の測定方法において、試料中の抗ガングリオシド抗体を、ガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定を行う方法の測定原理は、特に制限はなく、どのような測定原理のものであってもよい。
【００８０】
例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年発行；ＷＯ９８／２３９６３）等を挙げることができる。
【００８１】
そして、本発明の測定方法を、酵素免疫測定法などの標識免疫測定法を測定原理とする方法により実施する場合、サンドイッチ法、又は競合法等のいずれの手法においても本発明を適用することができる。
【００８２】
なお、本発明の測定方法においては、測定は用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【００８３】
なお、本発明においては、標識免疫測定法が好ましく、酵素免疫測定法又は発光免疫測定法が特に好ましい。
【００８４】
なお、本発明の測定方法においては、いずれの測定原理（測定法）に基づいて実施するにしても、その測定原理（測定法）の公知の手法に従って、測定を行えばよい。
【００８５】
［７］測定の例
本発明の測定方法を、酵素免疫測定法などの標識免疫測定法を測定原理とする方法により実施する場合を例にとって、以下具体的に説明を行う。
標識免疫測定法のサンドイッチ法により測定を行う場合の例を示す。
【００８６】
〔例１〕
（１）まず、以下のものを用意する。
担体：測定を行おうとする抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができるガングリオシドを固定化した担体（例えば、抗ＧＭ１抗体の測定においては、ＧＭ１をウェルに固定化したマイクロタイタープレート）
試料希釈液：緩衝剤を含有する水溶液
洗浄液：塩類を含有する水溶液であって、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるもの
【００８７】
（２）試料（ヒト血清）と試料希釈液との混合物を、担体のガングリオシドを固定化した部位に一定量添加し、一定時間接触させる。
これにより、試料中に測定対象物質である抗ガングリオシド抗体が存在する場合には、抗原抗体反応により、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体」の結合を形成させる。（例えば、「マイクロタイタープレートのウェル−ＧＭ１−抗ＧＭ１抗体」）
【００８８】
（３）この試料の添加、接触の後、担体のガングリオシドを固定化した部位を洗浄液で洗浄することにより、未反応の成分（この場合、未結合の試料成分）を除去する。（例えば、マイクロタイタープレートのウェルに洗浄液を添加し、そして除去することにより、担体に固定化したガングリオシドに結合していない成分を除去する。）
【００８９】
（４）この洗浄の後に、前記の抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質に酵素等の標識物質を結合させたものの一定量を、担体のガングリオシドを固定化した部位に添加して、一定時間接触させる。
【００９０】
なお、抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質としては、例えば、この抗ガングリオシド抗体に対する抗体、又はこの抗ガングリオシド抗体と結合することができるガングリオシド抗原等を挙げることができる。
【００９１】
より具体的には、この抗ガングリオシド抗体に対する抗体としては、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＤ抗体、及び抗ヒトＩｇＥ抗体より選ばれる１種又は２種以上の抗体等を挙げることができる。
【００９２】
また、この抗ガングリオシド抗体と結合することができる抗原としては、例えば、この抗ガングリオシド抗体と結合することができるガングリオシド抗原等を挙げることができる。（例えば、抗ガングリオシド抗体が抗ＧＭ１抗体である場合には、ＧＭ１を挙げることができる。）
【００９３】
この操作により、試料中に測定対象物質である抗ガングリオシド抗体が存在する場合には、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体−抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」の結合が形成される。（例えば「マイクロタイタープレートのウェル−ＧＭ１−抗ＧＭ１抗体−抗ヒトＩｇＧ抗体−標識酵素」）
【００９４】
（５）次に、担体のガングリオシドを固定化した部位を洗浄液で洗浄することにより、未反応の成分（この場合、未結合の「標識物質を結合した、抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質」）を除去する。（例えば、マイクロタイタープレートのウェルに洗浄液を添加し、そして除去することにより、担体に結合していない「抗ヒトＩｇＧ抗体−標識酵素」を除去する。）
【００９５】
（６）そして、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体−抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」の結合により担体に結合した標識物質を検出することにより、試料に含まれていた抗ガングリオシド抗体の測定を行う。
【００９６】
この測定においては、担体と標識物質が、試料に含まれていた抗ガングリオシド抗体を介して、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体−抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」と結合するので、担体に結合した標識物質の量を測定することにより、試料に含まれていた抗ガングリオシド抗体の有無、又は量を測定することができるものである。
【００９７】
なお、前記（４）において用いる「標識物質を結合した、抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質」として、「標識物質を結合した、クラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を使用することにより、試料中の抗ガングリオシド抗体を免疫グロブリンのクラス別に測定することが可能となる。
このクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体としては、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＤ抗体、又は抗ヒトＩｇＥ抗体等を挙げることができる。
【００９８】
また、これらの「標識物質を結合した、クラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を、それぞれ適当な割合で混合して使用することにより、免疫グロブリンのクラスに依存しない抗ガングリオシド抗体の測定を行うことができる。
【００９９】
更に、前記（４）において用いる「標識物質を結合した、抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質」として、「標識物質を結合した、サブクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を使用することにより、試料中の抗ガングリオシド抗体を免疫グロブリンのサブクラス別に測定することが可能となる。
このサブクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体としては、例えば、抗ヒトカッパー（κ）抗体、抗ヒトラムダ（λ）抗体、抗ヒトＩｇＧ１抗体、抗ヒトＩｇＧ２抗体、抗ヒトＩｇＧ３抗体、又は抗ヒトＩｇＧ４抗体等を挙げることができる。
【０１００】
また、これらの「標識物質を結合した、サブクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を、それぞれ適当な割合で混合して使用することにより、免疫グロブリンのサブクラスに依存しない抗ガングリオシド抗体の測定を行うことができる。
【０１０１】
なお、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体−抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」の結合により担体に結合した標識物質の検出であるが、酵素免疫測定法等の標識物質として酵素を用いて測定を行う方法及び試薬キットにおいては、標識酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成物の量を反応生成物の吸光度を測るなどの光学的方法等により測定を行う。
【０１０２】
蛍光免疫測定法等の標識物質として蛍光物質を用いて測定を行う方法及び試薬キットにおいては、標識蛍光物質による蛍光強度を測定することにより測定を行う。
【０１０３】
放射免疫測定法等の標識物質として放射性物質を用いて測定を行う方法及び試薬キットにおいては、標識放射性物質による放射線量を測定することにより測定を行う。
【０１０４】
発光免疫測定法等の標識物質として発光反応に係わる物質を用いて測定を行う方法及び試薬キットにおいては、標識物質が係わる発光反応系における発光量を測定することにより測定を行う。
【０１０５】
なお、前記の標識物質であるが、標識物質として酵素を用いる酵素免疫測定法等により測定を行う場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、又はα−アミラーゼ等の酵素を用いることができる。
【０１０６】
また、標識物質として蛍光物質を用いる蛍光免疫測定法等により測定を行う場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等の蛍光物質を用いることができる。
【０１０７】
そして、標識物質として放射性物質を用いる放射免疫測定法等により測定を行う場合には、トリチウム、ヨウ素１２５、又はヨウ素１３１等の放射性物質を用いることができる。
【０１０８】
また、測定を発光免疫測定法により行う場合には、アクリジニウムエステル、アルカリ性ホスファターゼ、パーオキシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を標識物質として用い、アクリジニウムエステル系、ジオキセタン化合物系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、又はＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系等により担体に結合した標識物質の検出を行うことができる。
【０１０９】
〔例２〕
（１）まず、以下のものを用意する。
担体：測定を行おうとする抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができるガングリオシドを固定化した担体（例えば、抗ＧＭ１抗体の測定においては、ＧＭ１をウェルに固定化したマイクロタイタープレート）
試料希釈液：緩衝剤を含有する水溶液
洗浄液：緩衝剤及び塩類を含む水溶液であって、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるもの
【０１１０】
（２）試料（ヒト血清）と試料希釈液との混合物を、担体のガングリオシドを固定化した部位に一定量添加し、一定時間接触させる。
これにより、試料中に測定対象物質である抗ガングリオシド抗体が存在する場合には、抗原抗体反応により、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体」の結合を形成させる。（例えば、「マイクロタイタープレートのウェル−ＧＭ１−抗ＧＭ１抗体」）
【０１１１】
（３）この試料の添加、接触の後、担体のガングリオシドを固定化した部位を洗浄液で洗浄することにより、未反応の成分（この場合、未結合の試料成分）を除去する。（例えば、マイクロタイタープレートのウェルに洗浄液を添加し、そして除去することにより、担体に固定化したガングリオシドに結合していない成分を除去する。）
【０１１２】
（４）この洗浄の後に、前記の抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質にビオチンを結合させたものの一定量を、担体のガングリオシドを固定化した部位に添加して、一定時間接触させる。
【０１１３】
なお、抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質としては、例えば、この抗ガングリオシド抗体に対する抗体、又はこの抗ガングリオシド抗体と結合することができるガングリオシド抗原等を挙げることができる。
【０１１４】
より具体的には、この抗ガングリオシド抗体に対する抗体としては、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＤ抗体、及び抗ヒトＩｇＥ抗体より選ばれる１種又は２種以上の抗体等を挙げることができる。
【０１１５】
また、この抗ガングリオシド抗体と結合することができる抗原としては、例えば、この抗ガングリオシド抗体と結合することができるガングリオシド抗原等を挙げることができる。（例えば、抗ガングリオシド抗体が抗ＧＭ１抗体である場合には、ＧＭ１を挙げることができる。）
【０１１６】
この操作により、試料中に測定対象物質である抗ガングリオシド抗体が存在する場合には、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体−抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質−ビオチン」の結合が形成される。（例えば「マイクロタイタープレートのウェル−ＧＭ１−抗ＧＭ１抗体−抗ヒトＩｇＧ抗体−ビオチン」）
【０１１７】
（５）次に、担体のガングリオシドを固定化した部位を洗浄液で洗浄することにより、未反応の成分（この場合、未結合の「ビオチンを結合した、抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質」）を除去する。（例えば、マイクロタイタープレートのウェルに洗浄液を添加し、そして除去することにより、担体に結合していない「抗ヒトＩｇＧ抗体−ビオチン」を除去する。）
【０１１８】
（６）この洗浄の後に、アビジン（又はストレプトアビジン）に酵素等の標識物質を結合させたものの一定量を、担体のガングリオシドを固定化した部位に添加して、一定時間接触させる。
【０１１９】
この操作により、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体−抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質−ビオチン−アビジン（又はストレプトアビジン）−標識物質」の結合が形成される。（例えば「マイクロタイタープレートのウェル−ＧＭ１−抗ＧＭ１抗体−抗ヒトＩｇＧ抗体−ビオチン−アビジン（又はストレプトアビジン）−標識酵素」）
【０１２０】
（５）次に、担体のガングリオシドを固定化した部位を洗浄液で洗浄することにより、未反応の成分（この場合、未結合の「アビジン（又はストレプトアビジン）に酵素等の標識物質を結合させたもの」）を除去する。（例えば、マイクロタイタープレートのウェルに洗浄液を添加し、そして除去することにより、担体に結合していない「アビジン（又はストレプトアビジン）−標識酵素」を除去する。）
【０１２１】
（６）そして、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体−抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質−ビオチン−アビジン（又はストレプトアビジン）−標識物質」の結合により担体に結合した標識物質を検出することにより、試料に含まれていた抗ガングリオシド抗体の測定を行う。
【０１２２】
この測定においては、担体と標識物質が、試料に含まれていた抗ガングリオシド抗体を介して、「担体−ガングリオシド−抗ガングリオシド抗体−抗ガングリオシド抗体と特異的に結合することができる物質−ビオチン−アビジン（又はストレプトアビジン）−標識物質」と結合するので、担体に結合した標識物質の量を測定することにより、試料に含まれていた抗ガングリオシド抗体の有無、又は量を測定することができるものである。
【０１２３】
なお、その他については、例１と同様である。
【０１２４】
［８］測定試薬  
本発明の試料中の抗ガングリオシド抗体の測定試薬は、試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬において、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を含むことを特徴とするものである。
【０１２５】
本発明においては、以上のことにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定試薬の感度を向上させることができるものである。
【０１２６】
なお、洗浄液及びその使用方法等の詳細については、前記の通りである。
【０１２７】
［９］洗浄液  
本発明の洗浄液は、試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する際に未反応の成分を除去するための洗浄液であって、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とするものである。
【０１２８】
本発明においては、以上のことにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させることができるものである。
【０１２９】
なお、洗浄液及びその使用方法等の詳細については、前記の通りである。
【０１３０】
［１０］試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度の向上方法
本発明の試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度の向上方法は、試料中の抗ガングリオシド抗体を、担体に固定化したガングリオシドと抗原抗体反応させることにより測定する方法において、未反応の成分を除去するための洗浄液として、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することを特徴とするものである。
【０１３１】
本発明においては、以上のことにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させることができるものである。
【０１３２】
なお、洗浄液及びその使用方法等の詳細については、前記の通りである。
【実施例】
【０１３３】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【０１３４】
〔実施例１〕（異なるイオン強度での抗ガングリオシド抗体の測定−１）
塩化ナトリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＭ１抗体（抗ガングリオシド抗体）の測定を行った。
【０１３５】
１．試薬の調製
（１）試料希釈液の調製
１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液〔ｐＨ７．６〕を調製した。ここに、塩化ナトリウムを６５ｍＭの濃度となるように添加し、調製を行った。
【０１３６】
（２）ＧＭ１抗原固定化担体の調製
ガングリオシドＧＭ１（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を１ウェル当たり２５０ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＭ１を前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固定化した。
次に、このガングリオシドＧＭ１が固定化されたウェル内に１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＭ１抗原固定化担体を調製した。
【０１３７】
（３）洗浄液の調製
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)を調製した。ここに、塩化ナトリウムをそれぞれ５０ｍＭ、１００ｍＭ又は１３７ｍＭの濃度になるように添加し、塩化ナトリウム濃度の異なる３種類の洗浄液の調製を行った。
この場合、各々の洗浄液のイオン強度は、それぞれ６８ｍｍｏｌ／Ｌ、１１８ｍｍｏｌ／Ｌ及び１５５ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
【０１３８】
（４）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
【０１３９】
（５）発色液
０．０２％ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン〕（同仁化学研究所）を含有する５ｍＭ過酸化水素水溶液を発色液として用いた。
【０１４０】
２．試料
抗ＧＭ１抗体陽性血清：
抗ＧＭ１抗体を含むことが確認されている１０種類の血清を、抗ＧＭ１抗体陽性血清として用意した。
【０１４１】
３．試料中の抗ガングリオシド抗体の測定
（１）試料である前記２の１０種類の抗ＧＭ１抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
【０１４２】
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（２）のＧＭ１抗原固定化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固定化されているＧＭ１抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１抗体を接触させ、反応させた。
【０１４３】
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
【０１４４】
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液で２，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。
【０１４５】
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
【０１４６】
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
【０１４７】
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０１４８】
（８）マイクロプレートリーダー〔サンライズ〕（テカン社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度差の測定値を得た。
【０１４９】
４．測定結果
以上の測定の結果を表１に示した。
【０１５０】
【表１】
2019002871.tif 000002
【０１５１】
この表より、洗浄液のイオン強度が１５５ｍｍｏｌ／Ｌの場合に比べて、１１８ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値は高く、更に６８ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値がより高いことが分かる。
【０１５２】
このことより、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させることができることが確かめられた。
【０１５３】
〔実施例２〕（異なるイオン強度での抗ガングリオシド抗体の測定−２）
塩化ナトリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＱ１ｂ抗体（抗ガングリオシド抗体）の測定を行った。
【０１５４】
１．試薬の調製
（１）試料希釈液の調製
１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液〔ｐＨ７．６〕を調製した。ここに、塩化ナトリウムを６５ｍＭの濃度となるように添加し、調製を行った。
【０１５５】
（２）ＧＱ１ｂ抗原固定化担体の調製
ガングリオシドＧＱ１ｂ（Ｈｙｔｅｓｔ社）を１ウェル当たり２５０ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＱ１ｂを前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固定化した。
【０１５６】
次に、このガングリオシドＧＱ１ｂが固定化されたウェル内に１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＱ１ｂ抗原固定化担体を調製した。
【０１５７】
（３）洗浄液の調製
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)を調製した。ここに、塩化ナトリウムをそれぞれ５０ｍＭ、１００ｍＭ又は１３７ｍＭの濃度になるように添加し、塩化ナトリウム濃度の異なる３種類の洗浄液の調製を行った。
この場合、各々の洗浄液のイオン強度は、それぞれ６８ｍｍｏｌ／Ｌ、１１８ｍｍｏｌ／Ｌ及び１５５ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
【０１５８】
（４）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
【０１５９】
（５）発色液
０．０２％ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン〕（同仁化学研究所）を含有する５ｍＭ過酸化水素水溶液を発色液として用いた。
【０１６０】
２．試料
抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清：
抗ＧＱ１ｂ抗体を含むことが確認されている１０種類の血清を、抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清として用意した。
【０１６１】
３．試料中の抗ガングリオシド抗体の測定
（１）試料である前記２の１０種類の抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
【０１６２】
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（２）のＧＱ１ｂ抗原固定化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固定化されているＧＱ１ｂ抗原と試料に含まれていた抗ＧＱ１ｂ抗体を接触させ、反応させた。
【０１６３】
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
【０１６４】
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液で７，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。
【０１６５】
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
【０１６６】
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
【０１６７】
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０１６８】
（８）マイクロプレートリーダー〔サンライズ〕（テカン社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度差の測定値を得た。
【０１６９】
４．測定結果
以上の測定の結果を表２に示した。
【０１７０】
【表２】
2019002871.tif 000003
【０１７１】
この表より、洗浄液のイオン強度が１５５ｍｍｏｌ／Ｌの場合に比べて、１１８ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値は高く、更に６８ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値がより高いことが分かる。
【０１７２】
このことより、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させることができることが確かめられた。
【０１７３】
〔実施例３〕（異なるイオン強度での抗ガングリオシド抗体の測定−３）
塩化カリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＭ１抗体（抗ガングリオシド抗体）の測定を行った。
【０１７４】
１．試薬の調製
（１）試料希釈液の調製
１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液〔ｐＨ７．６〕を調製した。ここに、塩化ナトリウムを６５ｍＭの濃度となるように添加し、調製を行った。
【０１７５】
（２）ＧＭ１抗原固定化担体の調製
ガングリオシドＧＭ１（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を１ウェル当たり２５０ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＭ１を前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固定化した。
【０１７６】
次に、このガングリオシドＧＭ１が固定化されたウェル内に１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＭ１抗原固定化担体を調製した。
【０１７７】
（３）洗浄液の調製
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)調製した。ここに、塩化カリウムをそれぞれ５０ｍＭ、１００ｍＭ又は１３７ｍＭの濃度になるように添加し、塩化カリウム濃度の異なる３種類の洗浄液の調製を行った。
この場合、各々の洗浄液のイオン強度は、それぞれ６８ｍｍｏｌ／Ｌ、１１８ｍｍｏｌ／Ｌ及び１５５ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
【０１７８】
（４）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
【０１７９】
（５）発色液
０．０２％ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン〕（同仁化学研究所）を含有する５ｍＭ過酸化水素水溶液を発色液として用いた。
【０１８０】
２．試料
抗ＧＭ１抗体陽性血清：
抗ＧＭ１抗体を含むことが確認されている１０種類の血清を、抗ＧＭ１抗体陽性血清として用意した。
【０１８１】
３．試料中の抗ガングリオシド抗体の測定
（１）試料である前記２の１０種類の抗ＧＭ１抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
【０１８２】
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（２）のＧＭ１抗原固定化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固定化されているＧＭ１抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１抗体を接触させ、反応させた。
【０１８３】
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
【０１８４】
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液で２，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。
【０１８５】
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
【０１８６】
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
【０１８７】
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０１８８】
（８）マイクロプレートリーダー〔サンライズ〕（テカン社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度差の測定値を得た。
【０１８９】
４．測定結果
以上の測定の結果を表３に示した。
【０１９０】
【表３】
2019002871.tif 000004
【０１９１】
この表より、洗浄液のイオン強度が１５５ｍｍｏｌ／Ｌの場合に比べて、１１８ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値は高く、更に６８ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値がより高いことが分かる。
【０１９２】
このことより、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させることができることが確かめられた。
【０１９３】
〔実施例４〕（異なるイオン強度での抗ガングリオシド抗体の測定−４）
塩化カリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＱ１ｂ抗体（抗ガングリオシド抗体）の測定を行った。
【０１９４】
１．試薬の調製
（１）試料希釈液の調製
１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液〔ｐＨ７．６〕を調製した。ここに、塩化ナトリウムを６５ｍＭの濃度となるように添加し、調製を行った。
【０１９５】
（２）ＧＱ１ｂ抗原固定化担体の調製
ガングリオシドＧＱ１ｂ（Ｈｙｔｅｓｔ社）を１ウェル当たり２５０ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＱ１ｂを前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固定化した。
【０１９６】
次に、このガングリオシドＧＱ１ｂが固定化されたウェル内に１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＱ１ｂ抗原固定化担体を調製した。
【０１９７】
（３）洗浄液の調製
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)を調製した。ここに、塩化カリウムをそれぞれ５０ｍＭ、１００ｍＭ又は１３７ｍＭの濃度になるように添加し、塩化カリウム濃度の異なる３種類の洗浄液の調製を行った。
この場合、各々の洗浄液のイオン強度は、それぞれ６８ｍｍｏｌ／Ｌ、１１８ｍｍｏｌ／Ｌ及び１５５ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
【０１９８】
（４）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
【０１９９】
（５）発色液
０．０２％ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン〕（同仁化学研究所）を含有する５ｍＭ過酸化水素水溶液を発色液として用いた。
【０２００】
２．試料
抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清：
抗ＧＱ１ｂ抗体を含むことが確認されている１０種類の血清を、抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清として用意した。
【０２０１】
３．試料中の抗ガングリオシド抗体の測定
（１）試料である前記２の１０種類の抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
【０２０２】
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（２）のＧＱ１ｂ抗原固定化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固定化されているＧＱ１ｂ抗原と試料に含まれていた抗ＧＱ１ｂ抗体を接触させ、反応させた。
【０２０３】
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
【０２０４】
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液で７，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。
【０２０５】
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
【０２０６】
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
【０２０７】
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０２０８】
（８）マイクロプレートリーダー〔サンライズ〕（テカン社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度差の測定値を得た。
【０２０９】
４．測定結果
以上の測定の結果を表４に示した。
【０２１０】
【表４】
2019002871.tif 000005
【０２１１】
この表より、洗浄液のイオン強度が１５５ｍｍｏｌ／Ｌの場合に比べて、１１８ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値は高く、更に６８ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値がより高いことが分かる。
【０２１２】
このことより、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させることができることが確かめられた。
【０２１３】
〔実施例５〕（異なるイオン強度での抗ガングリオシド抗体の測定−５）
緩衝剤濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＭ１抗体（抗ガングリオシド抗体）の測定を行った。
【０２１４】
１．試薬の調製
（１）試料希釈液の調製
１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液〔ｐＨ７．６〕を調製した。ここに、塩化ナトリウムを６５ｍＭの濃度となるように添加し、調製を行った。
【０２１５】
（２）ＧＭ１抗原固定化担体の調製
ガングリオシドＧＭ１（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を１ウェル当たり２５０ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＭ１を前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固定化した。
【０２１６】
次に、このガングリオシドＧＭ１が固定化されたウェル内に１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＭ１抗原固定化担体を調製した。
【０２１７】
（３）洗浄液の調製
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)、及び２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)をそれぞれ調製した。これらに、塩化ナトリウムをそれぞれ１３７ｍＭの濃度になるように添加し、緩衝剤濃度の異なる３種類の洗浄液の調製を行った。
この場合、各々の洗浄液のイオン強度は、それぞれ１４１ｍｍｏｌ／Ｌ、１４６ｍｍｏｌ／Ｌ及び１５５ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
【０２１８】
（４）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
【０２１９】
（５）発色液
０．０２％ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン〕（同仁化学研究所）を含有する５ｍＭ過酸化水素水溶液を発色液として用いた。
【０２２０】
２．試料
抗ＧＭ１抗体陽性血清：
抗ＧＭ１抗体を含むことが確認されている５種類の血清を、抗ＧＭ１抗体陽性血清として用意した。
【０２２１】
３．試料中の抗ガングリオシド抗体の測定
（１）試料である前記２の５種類の抗ＧＭ１抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
【０２２２】
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（２）のＧＭ１抗原固定化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固定化されているＧＭ１抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１抗体を接触させ、反応させた。
【０２２３】
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
【０２２４】
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液で２，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。
【０２２５】
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
【０２２６】
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
【０２２７】
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０２２８】
（８）マイクロプレートリーダー〔サンライズ〕（テカン社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度差の測定値を得た。
【０２２９】
４．測定結果
以上の測定の結果を表５に示した。
【０２３０】
【表５】
2019002871.tif 000006
【０２３１】
この表より、洗浄液のイオン強度が１５５ｍｍｏｌ／Ｌの場合に比べて、１４６ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値は高く、更に１４１ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値がより高いことが分かる。
【０２３２】
このことより、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させることができることが確かめられた。
【０２３３】
〔実施例６〕（異なるイオン強度での抗ガングリオシド抗体の測定−６）
緩衝剤濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＱ１ｂ抗体（抗ガングリオシド抗体）の測定を行った。
【０２３４】
１．試薬の調製
（１）試料希釈液の調製
１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液〔ｐＨ７．６〕を調製した。ここに、塩化ナトリウムを６５ｍＭの濃度となるように添加し、調製を行った。
【０２３５】
（２）ＧＱ１ｂ抗原固定化担体の調製
ガングリオシドＧＱ１ｂ（Ｈｙｔｅｓｔ社）を１ウェル当たり２５０ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＱ１ｂを前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固定化した。
【０２３６】
次に、このガングリオシドＧＱ１ｂが固定化されたウェル内に１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＱ１ｂ抗原固定化担体を調製した。
【０２３７】
（３）洗浄液の調製
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)、及び２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５)をそれぞれ調製した。これらに、塩化ナトリウムをそれぞれ１３７ｍＭの濃度になるように添加し、緩衝剤濃度の異なる３種類の洗浄液の調製を行った。
この場合、各々の洗浄液のイオン強度は、それぞれ１４１ｍｍｏｌ／Ｌ、１４６ｍｍｏｌ／Ｌ及び１５５ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
【０２３８】
（４）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
【０２３９】
（５）発色液
０．０２％ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン〕（同仁化学研究所）を含有する５ｍＭ過酸化水素水溶液を発色液として用いた。
【０２４０】
２．試料
抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清：
抗ＧＱ１ｂ抗体を含むことが確認されている５種類の血清を、抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清として用意した。
【０２４１】
３．試料中の抗ガングリオシド抗体の測定
（１）試料である前記２の５種類の抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
【０２４２】
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（２）のＧＱ１ｂ抗原固定化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固定化されているＧＱ１ｂ抗原と試料に含まれていた抗ＧＱ１ｂ抗体を接触させ、反応させた。
【０２４３】
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
【０２４４】
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液で７，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。
【０２４５】
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
【０２４６】
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
【０２４７】
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０２４８】
（８）マイクロプレートリーダー〔サンライズ〕（テカン社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度差の測定値を得た。
【０２４９】
４．測定結果
以上の測定の結果を表６に示した。
【０２５０】
【表６】
2019002871.tif 000007
【０２５１】
この表より、洗浄液のイオン強度が１５５ｍｍｏｌ／Ｌの場合に比べて、１４６ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値は高く、更に１４１ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値がより高いことが分かる。
【０２５２】
このことより、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することにより、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の感度を向上させることができることが確かめられた。
【０２５３】
〔参考例１〕（異なるイオン強度での抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ抗体の測定）
標識免疫測定法による試料中の抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ抗体の測定を、塩化ナトリウム濃度を変えることにより行った。
なお、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉは、夏型過敏性肺炎の原因微生物となる真菌である。
【０２５４】
１．試薬の調製
（１）試料希釈液
抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ抗体の測定試薬（体外診断用医薬品）である「トリコ・アサヒＡｂチェック」（シノテスト社）の「試料希釈液」を試料希釈液として用いた。
【０２５５】
（２）洗浄液の調製
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５)を調製した。ここに、塩化ナトリウムをそれぞれ５０ｍＭ、１００ｍＭ又は１３７ｍＭの濃度になるように添加し、塩化ナトリウム濃度の異なる３種類の洗浄液の調製を行った。
この場合、各々の洗浄液のイオン強度は、それぞれ７５ｍｍｏｌ／Ｌ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ及び１６２ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
【０２５６】
（３）Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ抗原固定化担体
前記の「トリコ・アサヒＡｂチェック」（シノテスト社）の「Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ抗原固定マイクロプレート」をＴ．ａｓａｈｉｉ抗原結合担体として用いた。
【０２５７】
（４）酵素標識抗体
前記の「トリコ・アサヒＡｂチェック」（シノテスト社）の「酵素標識抗体」を酵素標識抗体として用いた。
【０２５８】
（５）発色液
前記の「トリコ・アサヒＡｂチェック」（シノテスト社）の「発色液」を発色液として用いた。
【０２５９】
（６）反応停止液
前記の「トリコ・アサヒＡｂチェック」（シノテスト社）の「反応停止液」を反応停止液として用いた。
【０２６０】
２．試料
抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ抗体陽性血清：
抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ抗体を含むことが確認されている６種類の血清を、抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ抗体陽性血清として用意した。
【０２６１】
３．試料中の抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ抗体の測定
（１）試料である前記２の６種類の抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
【０２６２】
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（３）のＴ．ａｓａｈｉｉ抗原結合担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを３７℃にて１５時間反応させた。
これにより、担体に固定化されているＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ抗原と試料に含まれていた抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ抗体を接触させ、反応させた。
【０２６３】
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（２）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
【０２６４】
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、３７℃で２時間反応させた。
【０２６５】
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（２）の３種類の洗浄液毎に分けて洗浄した。
【０２６６】
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１５０μＬを、前記のウェルに分注し、３７℃で１時間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
【０２６７】
（７）前記の発色液の添加１時間後に、本実施例の１の（６）の反応停止液を、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０２６８】
（８）マイクロプレートリーダー〔サンライズ〕（テカン社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４９０ｎｍ、副波長：６５５ｎｍ）を測定して、吸光度差の測定値を得た。
【０２６９】
４．測定結果
以上の測定の結果を表７に示した。
【０２７０】
【表７】
2019002871.tif 000008
【０２７１】
この表より、洗浄液のイオン強度が１６２ｍｍｏｌ／Ｌの場合に比べて、１２５ｍｍｏｌ／Ｌや７５ｍｍｏｌ／Ｌの場合の方が得られた吸光度差の測定値がより低いことが分かる。
【０２７２】
このことより、試料中の抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ａｓａｈｉｉ抗体の測定においては、抗ガングリオシド抗体の測定の場合とは異なり、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用しても、測定の感度を向上させることができないことが確かめられた。
【０２７３】
すなわち、試料中の抗ガングリオシド抗体の測定の場合においてこそ、イオン強度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である洗浄液を使用することにより、測定の感度を向上させることができることが確かめられた。