(57)【要約】      （修正有）【課題】緑内障、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、虚血性網膜症、視神経症、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、ブドウ膜炎、老年性白内障などの眼疾患を治療する方法を提供する。【解決手段】眼疾患の治療を必要とする被験者におけるその治療方法であって、タイワンプロポリス（ＴＰ）抽出物またはその活性成分の有効量を被験者に投与する工程を含む方法。および、ＴＰ抽出物またはその活性成分の有効量と、薬学的に許容可能な担体を含む、眼疾患治療用医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼疾患の治療を必要とする被験者においてそれを治療する方法であって、タイワンプロポリス（Ｔａｉｗａｎｅｓｅ  Ｐｒｏｐｏｌｉｓ、ＴＰ）抽出物の有効量を前記被験者に投与する工程を含むことを特徴とする、眼疾患を治療する方法。
【請求項２】
前記ＴＰ抽出物（ＴＰＥ）が、（ｉ）第１溶液でＴＰを１２〜６０時間抽出し、第１抽出物を得る工程と、（ｉｉ）前記第１抽出物の可溶画分を収集する工程と、（ｉｉｉ）可溶画分を２〜１０倍に濃縮し、ＴＰＥを得る工程と、を含む方法で作製されることを特徴とする、請求項１に記載の眼疾患を治療する方法。
【請求項３】
前記ＴＰＥが、プロポリンＣ １００ｍｇ、プロポリンＤ ８０ｍｇ、プロポリンＦ ３０ｍｇ、プロポリンＧ ５０ｍｇ以上を含むことを特徴とする、請求項２に記載の眼疾患を治療する方法。
【請求項４】
前記有効量が、酸化的ストレスおよび（または）低酸素症に誘発される損傷を受けたＲＰＥ細胞の生存率向上に有効な量；酸化的ストレスおよび（または）低酸素症に誘発される損傷を受けたＲＰＥ細胞の生存率向上に有効な量であり、かつ同時にヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の生存率にほぼまたはまったく影響力を持たない、またはＨＵＶＥＣの生存率低下に有効な量；眼血流の向上に有効な量；絡膜血管新生（ＣＮＶ）の減少に有効な量；ＲＰＥ機能の向上に有効な量；および上述の効果の組み合わせの達成に有効な量から構成される群より選択される量であることを特徴とする、請求項１に記載の眼疾患を治療する方法。
【請求項５】
前記有効量が、酸化的ストレスおよび（または）低酸素症に誘発される損傷を受けたＲＰＥ細胞の生存率向上に有効な量；酸化的ストレスおよび（または）低酸素症に誘発される損傷を受けたＲＰＥ細胞の生存率向上に有効な量であり、かつ同時にヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の生存率にほぼまたはまったく影響力を持たない、またはＨＵＶＥＣの生存率低下に有効な量；眼血流の向上に有効な量；絡膜血管新生（ＣＮＶ）の減少に有効な量；ＲＰＥ機能の向上に有効な量；および上述の効果の組み合わせの達成に有効な量から構成される群より選択される量であることを特徴とする、請求項２に記載の眼疾患を治療する方法。
【請求項６】
前記眼疾患が、緑内障、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、虚血性網膜症、視神経症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、ブドウ膜炎、老年性白内障で構成される群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の眼疾患を治療する方法。
【請求項７】
前記眼疾患がＡＭＤであることを特徴とする、請求項６に記載の眼疾患を治療する方法。
【請求項８】
前記ＡＭＤがドライ型ＡＭＤであることを特徴とする、請求項７に記載の眼疾患を治療する方法。
【請求項９】
前記ＴＰＥが、経口投与、非経口注射、硝子体内注射、または皮膚パッチで投与されることを特徴とする、請求項１に記載の眼疾患を治療する方法。
【請求項１０】
前記ＴＰＥが、眼軟膏剤、眼ゲル剤、眼クリーム剤、または点眼剤に製剤化されることを特徴とする、請求項１に記載の眼疾患を治療する方法。
【請求項１１】
前記眼疾患が眼の癌ではないことを特徴とする、請求項１に記載の眼疾患を治療する方法。
【請求項１２】
前記タイワンプロポリスがタイワングリーンプロポリス（Ｔａｉｗａｎｅｓｅ  ｇｒｅｅｎ  ｐｒｏｐｏｌｉｓ）であることを特徴とする、請求項１に記載の眼疾患を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は眼疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人口の高齢化が進むにつれて、視機能の低下がより顕著かつ深刻になっている。緑内障、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、視神経症、虚血性網膜症、老年性白内障などの加齢に密接な関係がある眼疾患が数多くある。これらの眼疾患は、高齢者の視力障害、さらには失明の主要な原因となっている。
【０００３】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）は一層の細胞で、網膜視細胞と脈絡膜血管の間に位置し、視細胞の機械的および代謝的サポートにおいて重要な役割を果たす。さらに、ＲＰＥの機能障害は、増殖硝子体網膜症（ＰＶＲ）、ブドウ膜炎、ＡＭＤなどいくつかの眼疾患の主因である。ＡＭＤと、糖尿病性網膜症（ＤＲ）などのその他疾患は、対光反応または代謝反応から生じる酸素ラジカルの影響に恐らく関連がある。
【０００４】
一方で、眼血流も緑内障、虚血性網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を含む数々の眼疾患に密接に関連している。したがって、前述の眼疾患の予防または治療には正常な眼血流の維持が不可欠である。
【０００５】
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は米国および西欧において６５歳を超える人々の失明を引き起こす一番の原因となっている。両大陸に共通する危険因子には、加齢、喫煙、高血圧、狭心症、家族歴陽性が含まれる。ＡＭＤには非滲出型と滲出型がある。非滲出型はゆっくり進行する中心性視力喪失を伴う中心網膜の萎縮が生じる。滲出型は、ブルッフ膜から網膜下腔への血管新生と、血管新生プロセスを通じた脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の発生によって特徴付けられる。血管新生は往々にして虚血と低酸素症によって引き起こされる。黄斑は血液供給源が１つしかなく、また網膜は人体内で最も酸素吸収量が多いため、虚血がＡＭＤの形成に強い関連性を持つことに驚きはない（Ｓｔｒａｕｓｓ  Ｏ．、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｓ．２００；８５（３）：８４５〜８８１）。
【０００６】
上皮は酸素圧と酸素ラジカル関連ストレスの変化に非常に脆弱であるため、虚血関連疾患中にＲＰＥで産生される活性酸素種（ＲＯＳ）がＲＰＥ細胞にとって有害である可能性がある。ＡＭＤの重要な「早期」の事象は酸化的損傷によるＲＰＥ細胞の喪失である。酸化的ストレスは、癌や糖尿病、神経変性疾患、心血管疾患など複数の加齢性慢性疾患の病因に関与していることが分かっている。
【０００７】
プロポリスはミツバチが木の芽や果物、樹液流動、その他植物から集めた樹脂状混合物である。異なる場所からのプロポリスは異なる活性成分を有することがある。さまざまな活性成分を有し、抗腫瘍（Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２００７、２５２：２３５〜２４３）、抗酸化（Ａｌｔｕｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２００８  Ｍａｒ  ２７;１２０１：１３５〜４２）、抗菌（Ｄｒａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７、１０３：１９１４〜１９２１）、抗ウイルス（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｔｉｖｉｒ  Ｃｈｅｍ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００８、１９：７〜１３）、抗真菌（Ｓｉｌｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．２００５、９９：３９〜４４）、抗炎症活性（Ｇｒｕｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  １９８８、４４：２３０〜２３２）などの幅広い生物活性を持つことが報告されている。しかしながら、出願人の知るところにおいて、プロポリスのどの活性成分についても既知の抗腫瘍活性により可能性として示唆される眼の癌を除き、眼疾患の治療に用いることができるという報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｔｒａｕｓｓ  Ｏ．、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｓ．２００；８５（３）：８４５〜８８１
【非特許文献２】Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２００７、２５２：２３５〜２４３
【非特許文献３】Ａｌｔｕｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２００８  Ｍａｒ  ２７;１２０１：１３５〜４２
【非特許文献４】Ｄｒａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７、１０３：１９１４〜１９２１
【非特許文献５】Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｔｉｖｉｒ  Ｃｈｅｍ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００８、１９：７〜１３
【非特許文献６】Ｓｉｌｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．２００５、９９：３９〜４４
【非特許文献７】Ｇｒｕｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  １９８８、４４：２３０〜２３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、必要とする被験者において眼疾患を治療する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、意外にも、タイワンプロポリス（Ｔａｉｗａｎｅｓｅ  ｐｒｏｐｏｌｉｓ）抽出物が眼疾患の治療に有効であることを見出した。
【００１１】
したがって、一態様において、本発明は必要とする被験者において眼疾患を治療する方法であって、タイワンプロポリス（ＴＰ）抽出物の有効量を被験者に投与する工程を含む、眼疾患の治療方法を提供する。
【００１２】
別の一態様において、本発明はタイワンプロポリス（ＴＰ）抽出物と、薬学的に許容可能な担体を含む、眼疾患治療用医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明によれば、ＴＰ抽出物（ＴＰＥ）は、ＴＰの水抽出物またはアルコール抽出物、あるいは相当または適切な溶媒系の抽出物である。
【００１４】
前述の概要の説明と、以下の詳細な説明は、本発明を限定するものではなく、例示と説明のみを目的としていると理解されるべきである。
【００１５】
本発明の前述の概要、および以下の詳細な説明は、添付の図面を参照しながら読むことでより理解されるであろう。本発明の例示を目的として、現時点で好ましい実施形態が図面に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１ＡはＡＲＰＥ−１９細胞の増殖に対するＴＰＥの効果を示す図である。ＡＲＰＥ−１９細胞がＴＰＥとともに７２時間培養された。図１ＢはＨＵＶＥＣの増殖に対するＴＰＥの効果を示す図である。ＨＵＶＥＣがＴＰＥとともに７２時間培養された。データは平均±ＳＥＭで示されている。各群ｎ＝６、*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１、ＴＰＥ群対ビークル対照群。
【図２】図２ＡはＡＲＰＥ−１９細胞中の低酸素症誘発障害に対するＴＰＥの効果を示す図である。ＡＲＰＥ−１９細胞がＴＰＥとともに７２時間培養された。図２ＢはＨＵＶＥＣ中の低酸素症誘発障害に対するＴＰＥの効果を示す図である。ＨＵＶＥＣがＴＰＥとともに７２時間培養された。標準条件（５％ＣＯ２と９５％空気）下においてビークル（３０％ＨＰ‐β‐ＣＤ溶液）で７２時間処理された対照群、低酸素条件（１％ Ｏ２、５％ ＣＯ２、９４％ Ｎ２）においてビークルで７２時間処理されたモデル群。データは平均±ＳＥＭで示されている。各群ｎ＝６、*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１対モデル群。
【図３】図３ＡはＲＰＥ−１９細胞中のＮａＩＯ３誘発障害に対するＴＰＥの効果を示す図である。ＡＲＰＥ−１９細胞がＴＰＥおよびＮａＩＯ３とともに７２時間培養された。図３ＢはＨＵＶＥＣ中のＮａＩＯ３誘発障害に対するＴＰＥの効果を示す図である。ＨＵＶＥＣがＴＰＥおよびＮａＩＯ３とともに７２時間培養された。データは平均±ＳＥＭで示されている。各群ｎ＝６、*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１対モデル群。
【図４】図４ＡはＲＰＥ−１９細胞中のＨ２Ｏ２誘発障害に対するＴＰＥの効果を示す図である。ＡＲＰＥ−１９細胞がＴＰＥおよびＨ２Ｏ２とともに２４時間培養された。図４ＢはＨＵＶＥＣ中のＨ２Ｏ２誘発障害に対するＴＰＥの効果を示す図である。ＨＵＶＥＣがＴＰＥおよびＨ２Ｏ２とともに２４時間培養された。データは平均±ＳＥＭで示されている。各群ｎ＝６、*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１対モデル群。
【図５】図５ＡはＡＲＰＥ−１９細胞中のＮａＮ３誘発障害に対するＴＰＥの効果を示す図である。ＡＲＰＥ−１９細胞がＴＰＥおよびＮａＮ３とともに７２時間培養された。図５ＢはＨＵＶＥＣ中のＮａＮ３誘発障害に対するＴＰＥの効果を示す図である。ＨＵＶＥＣがＴＰＥおよびＮａＮ３とともに７２時間培養された。データは平均±ＳＥＭで示されている。各群ｎ＝６、*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１対モデル群。
【図６】図６ＡはＡＡＲＰＥ−１９細胞中のｔ−ＢＨＰ誘発障害に対するＴＰＥの効果を示す図である。ＡＲＰＥ−１９細胞がＴＰＥおよびｔ−ＢＨＰとともに１２時間培養された。図６ＢはＨＵＶＥＣ中のｔ−ＢＨＰ誘発障害に対するＴＰＥの効果を示す図である。ＨＵＶＥＣがＴＰＥおよびｔ−ＢＨＰとともに１２時間培養された。データは平均±ＳＥＭで示されている。各群ｎ＝６、*Ｐ＜０.０５、**Ｐ＜０.０１対モデル群。
【図７】高眼圧症ラビットにおける眼血流に対する１％のＴＰＥの効果を示す図であって、ここで図７Ａは虹彩の血流をＱｍで示し；図７Ｂは毛様体の血流をＱｍで示し；および図７Ｃは毛脈絡膜の血流をＱｍで示す。
【図８】虚血発作後のラット網膜機能のｂ波回復に対するＴＰＥの効果を示す図である。アスタリスクは対照群と治療群間におけるＰ＜０.０５（*）とＰ＜０.０１（**）での有意差を表す。
【図９】レーザー誘発ＡＭＤラットモデルに対する１％のＴＰＥの効果を表す図である。アスタリスクは２つの値間におけるＰ＜０.０５での有意差を表す。
【図１０】ＮａＩＯ３誘発ドライ型ＡＭＤラットモデルに対する１％のＴＰＥの効果を表す図である。アスタリスクはＮａＩＯ３治療とＮａＩＯ３＋１％ＴＰＥ治療間のＰ＜０.０５での有意差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、タイワンプロポリス（ＴＰ）抽出物が眼疾患の治療に有効であるという思いがけない発見に基づいている。本発明は、ＴＰ抽出物の特異的な実践的応用、すなわち、眼疾患の治療および（または）予防における使用を対象とする。
【００１８】
一態様において、本発明は必要とする被験者において眼疾患を治療する方法であって、タイワンプロポリス（ＴＰ）抽出物の有効量を被験者に投与する工程を含む、眼疾患の治療方法を提供する。一部の実施態様において、タイワンプロポリスはタイワングリーンプロポリス（Ｔａｉｗａｎｅｓｅ  ｇｒｅｅｎ  ｐｒｏｐｏｌｉｓ）である。
【００１９】
本明細書で使用される「プロポリス」という用語は、ミツバチによって製造される産物を指す。プロポリスはミツバチが木の芽や液流動、その他植物から集めた樹脂状混合物であり、巣の中の不要な空間のシーラントとして使用されることが知られている。本発明において、台湾のミツバチによって作られたプロポリス（タイワンプロポリス）が使用される。プロポリスは紀元前３００年より民間薬として使用されてきた。近年、抗がん、抗ウイルス、抗菌を含むプロポリスの数多くの生物学的特性が報告されている。幅広い生物学的活性により、プロポリスは健康を増進し、疾病を予防するために食品や飲料に用いられている。ミツバチは多様な気温の気候帯にあるさまざまな植物からプロポリスを集め、プロポリスの成分に地域的な特徴を与えている。タイワンプロポリスはプレニルフラバノンのコア化学構造を持つ豊富なプロポリン（Ｐｒｏｐｏｌｉｎ）を含有する。タイワンプロポリスに類似したプロポリスは、沖縄、ソロモン諸島にもある（「Ｐａｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｐｏｌｉｓ」）。
【００２０】
本発明によれば、ＴＰ抽出物（ＴＰＥ）は、ＴＰの水抽出物またはアルコール抽出物、あるいは相当または適切な溶媒系の抽出物である。
【００２１】
本発明で使用されるＴＰＥは、（ｉ）第１溶液でＴＰを１２〜６０時間抽出し、第１抽出物を得る工程と、（ｉｉ）前記第１抽出物の可溶画分を収集する工程と、（ｉｉｉ）可溶画分を２〜１０倍に濃縮し、粗ＴＰＥ（ｃＴＰＥ）を得る工程と、を含む方法で作製することができる。前記第１溶液は、水またはアルコール溶液を含むがこれらに限らない。前記アルコール溶液は好ましくは５０〜１００％のアルコールを含み、より好ましくは８０〜１００％、さらに好ましくは９５％のアルコールを含む。本発明の一実施形態において、前記ＴＰＥは、（ｉ）ＴＰを９５％エタノールで約４８時間抽出して第１抽出物を得る工程と、（ｉｉ）アルコールをろ過して前記第１抽出物から固形物を取り除き、可溶画分を得る工程と、（ｉｉｉ）前記可溶画分を減圧下で約４倍に濃縮してｃＴＰＥを得る工程と、を含む方法により作製される。工程（ｉ）で、前記抽出の温度は好ましくは３５〜６０℃であり、より好ましくは４０〜５０℃、さらに好ましくは４５℃である。工程（ｉｉｉ）で、前記濃縮の温度は好ましくは３５〜５０℃であり、より好ましくは４５〜５０℃である。工程（ｉｉｉ）で、前記可溶画分は好ましくは３〜５倍、より好ましくは約４倍に濃縮される。各ｃＴＰＥは、ｃＴＰＥ１グラム当たり１００ｍｇのプロポリンＣ、８０ｍｇのプロポリンＤ、３０ｍｇのプロポリンＦ、５０ｍｇのプロポリンＧ以上を含有するという規格で、複数の標準成分量について分析された後混合され、１グラム当たりプロポリン３５０ｍｇ以上（プロポリンＣ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、その他プロポリスを含む）の規格の望ましい標準成分合計量を有する基準を満たす最終ＴＰ抽出物（ＴＰＥ）が取得された。
【００２２】
ｃＴＰＥと最終ＴＰＥを本発明で使用することができる。 
【００２３】
本明細書で使用される「眼疾患」という用語は、緑内障、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、虚血性網膜症、視神経症、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、ブドウ膜炎、老年性白内障を含むがこれらに限らない、目に関連する疾患を指す。眼疾患は、緑内障、ＡＭＤ、虚血性網膜症、視神経症、ＤＲ、ＤＭＥを含むがこれらに限らない、酸化的ストレスおよび（または）低酸素症に誘発される、目またはより具体的には網膜色素上皮（ＲＰＥ）および視細胞（ｐｈｏｔｏ  ｃｅｌｌ）の損傷に関連する疾患または異常とすることができる。眼疾患は、緑内障、虚血性網膜症、ＤＲ、ＡＭＤを含むがこれらに限らない、眼血流の減少に関連する疾患または異常とすることができる。
【００２４】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、タイワンプロポリスまたは活性成分の抽出物の所望される治療効果、または特定種類の反応の誘導を提供するに足る量を指す。必要とされる有効量は、被験者の疾患の状態、身体状態、年齢、性別、人種、体重などに応じて、被験者によって異なる。しかしながら、適切な有効量は通常の実験のみを使用して当業者が判断することが可能であろう。本発明の一実施形態において、前記有効量は、酸化的ストレスおよび（または）低酸素症に誘発される損傷を受けたＲＰＥ細胞の生存率向上に有効な量である。好ましい一実施形態において、前記有効量は、酸化的ストレスおよび（または）低酸素症に誘発される損傷を受けたＲＰＥ細胞の生存率向上に有効な量であり、かつ同時にヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の生存率にほぼまたはまったく影響力を持たない、またはＨＵＶＥＣの生存率低下に有効である。本発明の別の実施形態において、前記有効量は、眼血流の向上に有効な量である。さらに別の一実施形態において、前記有効量は、絡膜血管新生（ＣＮＶ）の減少に有効な量である。別の一実施形態において、前記有効量は、少なくとも、ＥＲＧによって測定されるそのｃ波振幅の向上または回復によるＲＰＥ機能の向上に有効な量である。たとえば、ＴＰＥは被験者に対し１日１〜３回経口投与することができる。各経口投与について、ＴＰＥの量は１０〜２００ｍｇ、好ましくは１０〜１２０ｍｇとすることができる。ＴＰＥは被験者に対し１日１〜１０回、１回１〜１０滴量、好ましくは１日１〜４回、１回１〜５滴量を点眼投与することができる。たとえば、被験者はＴＰＥを含む製剤を毎回３滴、１日３回使用することができる。眼局所投与の場合、ＴＰＥ０.０１〜１０％、好ましくはＴＰＥ０.１〜１．０％を使用することができる。 
【００２５】
本発明の実施例において、ＴＰＥは、虚血発作後の網膜機能障害、レーザー誘発ＡＭＤなどさまざまな眼疾患の治療に有効であることが明らかにされた。
【００２６】
したがって、ＴＰＥは、眼疾患を患う被験者に投与することができ、そのうち、前記眼疾患は、緑内障、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、虚血性網膜症、視神経症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、ブドウ膜炎、老年性白内障で構成される群より選択される。本発明の一実施例において、前記眼疾患はＡＭＤである。特定の一実施形態において、前記眼疾患はドライ型ＡＭＤである。前記眼疾患は、眼がんであってもなくてもよい。
【００２７】
別の一態様において、本発明はタイワンプロポリス（ＴＰ）抽出物と、薬学的に許容可能な担体を含む、眼疾患治療用医薬組成物を提供する。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な担体を用いて従来既知の方法で製造することができる。本明細書で使用される用語「薬学的に許容可能な担体」とは、任意の標準的な薬学的担体を指す。そのような担体は、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール、クレモフォール、ナノ粒子、リポソーム、重合体、およびそれらの組み合わせを含むことができるが、これらに限らない。
【００２９】
本発明の医薬組成物は、選択された投与方法に適した任意の形態に構成することができる。たとえば、経口投与に適した組成物は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、粉末剤などの固形剤形、および溶剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤などの液体剤形を含む。局所投与に役立つ剤形は、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、懸濁剤、滴剤、乳剤、パップ剤を含む。
【００３０】
標準の担体に加え、本発明の経口医薬組成物は、界面活性剤、吸入剤、溶解剤、安定剤、乳化剤、増粘剤、着色剤、甘味剤、香味剤、防腐剤など経口製剤で一般的に使用される１つ以上の賦形剤を添加することができる。前記賦形剤は当業者に既知である。
【００３１】
本発明によれば、前記医薬組成物は、経口投与、非経口投与、眼内注射（例：硝子体内注射）、皮膚パッチ、眼に対する局所投与など、任意の経路を通じて被験者に投与することができる。局所投与用の前記医薬組成物は、眼軟膏剤、眼ゲル剤、眼クリーム剤、点眼剤の形態に製剤化することができる。
【００３２】
以下、限定ではなく例示を目的として提供される次の実施例により、本発明についてさらに説明する。
【実施例１】
【００３３】
抗酸化に対するＴＰＥの効果
この研究では、酸化的ストレスと低酸素症に誘発された網膜色素上皮（ＡＲＰＥ−１９）細胞損傷に対するＴＰの効果と、この効果におけるＲＯＳの関与が調査された。
【００３４】
酸化反応によって産生されるフリーラジカルが、血管細胞および神経細胞の病理学的兆候と、自己免疫性糖尿病における膵島機能障害および（または）破壊に密接な関連性があることはよく知られている（Ｊ．Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、Ｊｒ．、Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６）。血管機能障害は眼の緑内障、ＡＭＤ、虚血性網膜症を引き起こすことがあり、一方で神経障害は緑内障と視神経症を引き起こすことがある。免疫性糖尿病における膵島破壊は、糖尿病性網膜症（ＤＲ）および糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）につながる可能性がある。したがって、抗酸化剤は前述の眼疾患の予防／緩和に非常に有用である。
【００３５】
材料および方法
【００３６】
１、材料
ＴＰ抽出物（ＴＰＥ）が実験室で作製された。タイワンプロポリスまたはタイワングリーンプロポリス（１ｋｇ）が９５％エタノール（６Ｌ）で、撹拌しながら４５℃に加熱して約４８時間抽出された。アルコールのろ過と不純物の除去後、液体抽出物が減圧下で約４倍に濃縮され、粗タイワンプロポリス抽出物（ｃＴＰＥ）が約５０％ｗ／ｗの抽出率で取得された。各ｃＴＰＥの成分はバッチ間で異なるため、各ｃＴＰＥは、ｃＴＰＥ１グラム当たり１００ｍｇのプロポリンＣ、８０ｍｇのプロポリンＤ、３０ｍｇのプロポリンＦ、５０ｍｇのプロポリンＧ以上を含有するという規格で、複数の標準成分量について分析された後混合され、１グラム当たりプロポリン３５０ｍｇ以上の規格の望ましい標準成分合計量を有する基準を満たす最終ＴＰ抽出物（ＴＰＥ）が取得された。
【００３７】
チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、純度９７．５％以上）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、５０重量％水溶液）、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔ−ＢＨＰ、７０重量％水溶液）、ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ３、純度９９.５％以上）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３、純度９９.５％以上）、ダルベッコ変法イーグル培地／ハムＦ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１：１）がＳｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（米国ミズーリ州セントルイス）よりすべて購入された。ヒト網膜色素上皮（ＡＲＰＥ−１９）細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、血管細胞系基礎培地、内皮細胞増殖キットがＡＴＣＣ（米国バージニア州マナサス）より購入された。
【００３８】
ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は視細胞（ｐｈｏｔｏｃｅｌｌ）と脈絡膜層の間にある重要／特異な細胞で、正常／良好な視機能／活動を維持するために、視細胞に栄養を提供し、かつ視細胞から代謝廃棄物を除去する。一方で、ＨＵＶＥＣは脈絡膜血管と網膜血管を含む体全体の血管系に存在する。特に脈絡膜血管新生により視機能に悪影響を及ぼす。ＶＥＧＦ阻害剤での血管新生抑制は、ウェット型ＡＭＤの治療において血管新生／血管形成を減少する主要なメカニズムである。このため、細胞増殖／ＲＰＥの増殖を向上できるが、ＨＵＶＥＣの細胞増殖に影響を与えない、またはこれを抑制する薬剤は、ＡＭＤの予防／治療に有用である。
【００３９】
２、細胞培養
ＡＲＰＥ−１９細胞が１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌのペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で増殖された。ＨＵＶＥＣが内皮細胞増殖キットを添加した血管細胞系基礎培地で増殖された。細胞は加湿インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２と９５％空気下において培養された。
【００４０】
３、ＡＲＰＥ−１９細胞とＨＵＶＥＣの生存率
ＭＴＴアッセイを使用してＡＲＰＥ−１９細胞とＨＵＶＥＣの生存率が測定された。１×１０５の細胞が９６ウェルプレート（１００μｌ／ウェル）に播種され、オーバーナイトで培養された。細胞なしの１００μｌの培地を添加して陰性対照が作製された。細胞はその後ＴＰ抽出物（ＴＰＥ）（０.１、０.３、１、３、１０μｇ／ｍｌ）および（または）酸化剤（ＮａＩＯ３、Ｈ２Ｏ２、ｔ−ＢＨＰ、ＮａＮ３）を加えた新鮮な培地で１２、２４、または７２時間処理された（２００μｌ／ウェル）。ビークル対照群がビークル（３０％ＨＰ‐β‐ＣＤ、ＨＰ‐β‐ＣＤの細胞における最終濃度は０.３％未満）で処理された。２０μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）がウェルに添加され、さらに４時間培養された。培養後、培地が廃棄され、１００μｌのＤＭＳＯを添加して生存細胞によってＭＴＴから産生されたホルマザンを溶解させた。吸光度がマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ―Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州）を使用して５７０ｎｍで測定された。次の式に従って細胞生存率が計算された：細胞生存率（％）＝（試験試料の吸光度−陰性対照の吸光度）／（ビークル対照の吸光度−陰性対照の吸光度）×１００％。
【００４１】
４、低酸素症処理
細胞はオーバーナイトで付着され、その後ＴＰＥまたはビークルに低酸素条件で７２時間暴露された。Ｎ２およびＣＯ２ガス源でＯ２およびＣＯ２コントローラ（Ｐｒｏｏｘモデル１１０およびＰｒｏ  ＣＯ２モデル１２０、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｉｘ  Ｌｔｄ．、米国ニューヨーク州レッドフィールド）により温度と湿度が管理された環境Ｃ−チャンバーを使用して、低酸素条件（１％Ｏ２、５％ＣＯ２、９４％Ｎ２）が維持された。
【００４２】
５、統計分析
すべてのデータは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍで示された。スチューデントｔ検定を使用して統計分析が実施された。Ｐ＜０.０５の値が統計的有意であると見なされる。
【００４３】
結果
【００４４】
１、ＡＲＰＥ−１９細胞とＨＵＶＥＣにおける細胞毒性
結果によると、ＴＰ抽出物（ＴＰＥ）は、０.０３、０.１、０.３、１、１０μｇ／ｍｌの濃度で、ＡＲＰＥ−１９細胞における細胞増殖に影響しなかった。しかし、ＡＲＰＥ−１９細胞の増殖は３μｇ／ｍｌの濃度で２１％有意に増加した（Ｐ＜０.０５、図１Ａ）。一方、ＴＰＥはＨＵＶＥＣの増殖を０.３および１０μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ１８％と９９％有意に阻害した（図１Ｂ）。
【００４５】
２、ＡＲＰＥ−１９細胞とＨＵＶＥＣにおける低酸素症誘発損傷に対するＴＰＥの効果
ＴＰＥは０.０３μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌで低酸素条件のＡＲＰＥ−１９細胞の生存率に影響しなかった（図２Ａ）。ＴＰＥは０.１μｇ／ｍｌの濃度で低酸素条件のＨＵＶＥＣの生存率を８％有意に増加した（Ｐ＜０.０５、図２Ｂ）。しかし、１０μｇ／ｍｌの濃度で、ＴＰＥはＨＵＶＥＣの生存率を９６％有意に減少させた（Ｐ＜０.０１）。
【００４６】
３、ＡＲＰＥ−１９細胞とＨＵＶＥＣにおけるＮａＩＯ３誘発障害に対するＴＰＥの効果
ＮａＩＯ３誘発障害はドライ型ＡＭＤのモデルである。ＴＰＥはＡＲＰＥ−１９細胞またはＨＵＶＥＣにおけるＮａＩＯ３誘発障害に０.０３μｇ／ｍｌ〜３μｇ／ｍｌでは影響しなかった。１０μｇ／ｍｌの濃度で、ＴＰＥはＡＲＰＥ−１９細胞における３０および１００μｇ／ｍｌのＮａＩＯ３誘発障害の生存率を有意に回復させた（Ｐ＜０.０５、図３Ａ）。しかし、ＨＵＶＥＣではＮａＩＯ３誘発障害を増加させた（Ｐ＜０.０１、図３Ｂ）。
【００４７】
４、ＡＲＰＥ−１９細胞とＨＵＶＥＣにおけるＨ2Ｏ2誘発障害に対するＴＰＥの効果
Ｈ２Ｏ２誘発障害は酸化的損傷のモデルである。０.０３μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌで、ＴＰＥはＡＲＰＥ−１９細胞における２００μＭのＨ２Ｏ２誘発障害を回復させた。特に１０μｇ／ｍｌの濃度で、ＴＰＥはＡＲＰＥ−１９細胞における２００μＭのＨ２Ｏ２誘発障害を６０％回復させた（Ｐ＜０.０１、図４Ａ）。一方で、ＴＰＥは０.０３μｇ／ｍｌ〜３μｇ／ｍｌでＨＵＶＥＣにおけるＨ２Ｏ２誘発障害に影響しなかった。しかし、１０μｇ／ｍｌのＴＰＥは、ＨＵＶＥＣにおける２００、４００、６００μＭのＨ２Ｏ２誘発障害をそれぞれ９３％、８６％、５８％増加させた（図４Ｂ）。
【００４８】
５、ＡＲＰＥ−１９細胞とＨＵＶＥＣにおけるＮａＮ３誘発障害に対するＴＰＥの効果
ＮａＮ３誘発障害は酸化的損傷の別のモデルである。ＴＰＥはＡＲＰＥ−１９細胞におけるＮａＮ３誘発障害に０.０３μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌでは影響しなかった。３および１０μｇ／ｍｌの濃度で、ＴＰＥはＡＲＰＥ−１９細胞におけるＮａＮ３誘発障害を有意に回復させた（Ｐ＜０.０１、図５Ａ）。０.０３、０.１、１μｇ／ｍｌの濃度で、ＴＰＥはＨＵＶＥＣにおける０.３ｍＭのＮａＮ３誘発障害を有意に回復させた。しかし、１０μｇ／ｍｌではＨＵＶＥＣにおける０.３ｍＭのＮａＮ３誘発障害を８４％増加させた（Ｐ＜０.０１、図５Ｂ）。ＴＰＥはＨＵＶＥＣにおける１ｍＭのＮａＮ３誘発障害を０.０３、０.３、３μｇ／ｍｌで回復させたが、１０μｇ／ｍｌではＨＵＶＥＣにおける１ｍＭのＮａＮ３誘発障害を７５％増加させた（Ｐ＜０.０１、図５Ｂ）。
【００４９】
６、ＡＲＰＥ−１９細胞とＨＵＶＥＣにおけるｔ−ＢＨＰ誘発障害に対するＴＰＥの効果
ｔ−ＢＨＰ誘発障害は酸化的損傷のさらに別のモデルである。３および１０μｇ／ｍｌの濃度で、ＴＰＥはＡＲＰＥ−１９細胞における５０および１００μＭのｔ−ＢＨＰ誘発障害を有意に回復させた（Ｐ＜０.０１、図６Ａ）。０.０３μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌで、ＴＰＥはＡＲＰＥ−１９細胞における２００μＭのｔ−ＢＨＰ誘発障害を回復させた（図６Ａ）。特に１０μｇ／ｍｌの濃度で、ＴＰＥはＡＲＰＥ−１９細胞における２００μＭのｔ−ＢＨＰ誘発障害を１０５％回復させた（Ｐ＜０.０１、図４Ａ）。しかし、１０μｇ／ｍｌのＴＰＥはＡＲＰＥ−１９細胞における５０および１００μＭのｔ−ＢＨＰ誘発障害をそれぞれ７７％と７３％増加させた（Ｐ＜０.０１、図６Ａ）。図６ＢはＨＵＶＥＣに対するＴＰＥの効果を示す。
【実施例２】
【００５０】
眼血流（ＯＢＦ）の向上
眼血流は緑内障、虚血性網膜症、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を含む数々の眼疾患に密接に関連している。したがって、前述の眼疾患の予防または治療には正常な眼血流の維持が不可欠である。
【００５１】
材料および方法
【００５２】
１、材料
０.５％アルカインは市販品が購入された。２０％滅菌高張性生理食塩溶液が試験室で調製された。着色ミクロスフェアがＥ−Ｚ  Ｔｒａｃ（米国カリフォルニア州ロサンゼルス）より購入された。着色ミクロスフェアは、ミクロスフェアが相互に貼り付かないように、０.０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０を含有する生理食塩水で希釈された。０.４ｍｌ中２００万ミクロスフェアが各時間点で注射された。
【００５３】
体重２.０〜３.０ｋｇのメスのニュージーランド白ウサギは市販品が購入された。動物の飼育と処理は機関のガイドラインに従って行われた。ＴＰ抽出物（ＴＰＥ）は実施例１に従って作製された。
【００５４】
２、方法
ウサギは筋肉内注射により３５ｍｇ／ｋｇのケタミンと５ｍｇ／ｋｇのキシラジンで麻酔された。その後は初回量の半量が１時間毎に投与された。着色ミクロスフェア注入用に右頸動脈を通じて左心室にカニューレが挿入され、血液試料採取用に大腿動脈にカニューレが挿入された。左眼がプロパラカイン塩酸塩点眼液（Ｂａｕｓｃｈ  ＆  Ｌｏｍｂ、Ｉｎｃ．、米国フロリダ州タンパ）１滴で処理された。針は左眼の前眼房に直接挿入され、４０ｍｍＨｇ生理食塩水マノメーターに接続された。高眼圧モデルでは眼血流が正常値の約３分の１に減少した。１０ｇ／ｌのフラボンまたはビークル（３０％ＨＰ−β−ＣＤ溶液）５０μｌが、高眼圧モデル確立の３０分後に左眼に局所注入された。眼血流がＴＰＥまたはビークルでの処理の０、３０、６０、１２０分後に着色ミクロスフェアによって測定された。各時間点で、２００万ミクロスフェアが基準として注入され、ミクロスフェア注入のちょうど１分後に血液試料が大腿動脈から取得された。血液試料がヘパリン処理チューブに採取され、容量が記録された。ウサギは最後の採血後、１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウム注射で安楽死された。左眼が摘出され、虹彩、毛様体、網膜、脈絡膜、網膜に切断された。すべての組織が秤量された。
【００５５】
試料処理およびミクロスフェア計数の詳細はＥ−Ｚ  Ｔｒａｃ（米国カリフォルニア州ロサンゼルス）により提供された。簡単には、溶血試薬が血液試料を入れたマイクロ遠心チューブに添加され、続いてボルテックスにかけて６０００ｒｐｍで３０分間遠心分離された。上清が除去され、組織／血液消化試薬ＩおよびＩＩが添加された。チューブに蓋をしてボルテックスにかけ、３０分間遠心分離された。上清が除去され、計数試薬が添加された後、ボルテックスにかけて１５分間遠心分離された。上清が除去され、ミクロスフェアが正確な量の計数試薬に再懸濁された。ミクロスフェアの数が顕微鏡下で血球計数器によりカウントされた。組織試料が入れられたマイクロ遠心チューブに組織／血液消化試薬Ｉが添加され、密封後９５℃で１５分間加熱された。その後チューブが３０秒間ボルテックスにかけられ、再加熱後、すべての組織試料が溶解されるまで再度ボルテックスで遠心分離された。組織試料がまだ熱いうちに組織／血液消化試薬ＩＩが添加され、続いてマイクロ遠心チューブに蓋をしてボルテックスにかけ、３０分間遠心分離された。その後のプロトコルは血液試料の処理に用いたものと同じであり、ミクロスフェアがカウントされた。
【００５６】
特定の時間点の各組織の血流量を次の式に従って算出した：Ｑｍ＝（Ｃｍ×Ｑｒ）／Ｃｒ。Ｑｍはμｌ／分／ｍｇで表した組織の血流量、Ｃｍは組織のミクロスフェア数、Ｑｒはμｌ／分で表した血液試料の流速、Ｃｒは基準血液試料中のミクロスフェア数である。
【００５７】
結果
虹彩、毛様体、網膜における血流は、１％のＴＰＥで薬物注入の１２０分後に有意に増加した（図７Ａ〜７Ｃ）。
【実施例３】
【００５８】
虚血発作後の網膜機能の増進
眼圧（ＩＯＰ）測定単独では、緑内障診断の唯一の決定要因とすべきでなく、ＩＯＰの減少単独を新規薬物開発の唯一の評価とすべきではない（Ｃｈｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｒｅｓ．１８：２６５〜２６９、１９８６）。理想的な緑内障治療薬は、ＩＯＰを低下させ、眼血流も改善できる必要がある（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｏｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．９：１１７〜１２４、１９９３）。眼のさまざまな部分における血流に関する研究は薬物の作用機序の理解につながるだけでなく、より安全な緑内障治療薬の開発にもつながる（Ｃｈｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｒｅｓ．１８：２６５〜２６９、１９８６）。さらに、網膜変性は失明原因の第１位、 緑内障では第２位となっている（Ｌｉｅｒｍａｎ、Ｍａｒｙ  Ａｎｎ  Ｌｉｅｂｅｒｔ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８７）。網膜症の多くは、血管拡張剤、抗凝血剤、血液粘度低下剤を含む数々の薬剤が試されているが、治療が難しい虚血性変性により引き起こされている（Ｏ‘Ｃｏｎｎｏｒ、Ｍｅｄｃｏｍ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９７４）。今日まで、これら薬剤のいずれも虚血性網膜症に福音をもたらすには至っていないようである（ＬａＶａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８５.）。したがって、虚血性網膜変性の治療に使用できる新しい薬剤の開発が重要である。虚血後の網膜機能の回復は、網膜電図写真におけるｂ波の振幅の回復によって判定することができる。緑内障に加え、ＡＭＤ、ＤＲ、ＤＭＥも網膜機能の回復を促進するこれら薬剤の恩恵を受けることができる。
【００５９】
材料および方法
【００６０】
１、材料
ＴＰ抽出物（ＴＰＥ）は実施例１に従って作製された。
【００６１】
２、方法 
網膜虚血実験についてはすでに説明がなされている（Ｃｈｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｏｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．９：１７９〜１８５、１９９３、およびＣｈｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｏｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０：４９３〜４９８、１９９４）。虚血発作前および後の網膜機能を評価するために網膜電図（ＥＲＧ）が実施された。ＥＲＧは、角膜に接触させて配置されたＡｇ／ＡｇＣｌ電極により記録された。１本のステンレス針が基準電極として二つの眼の間の皮下に挿入され、もう１本の針が接地電極として頸部に皮下挿入された。光刺激装置（ｐｈｏｔｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ；Ｇｒａｓｓ  ＰＳ２２  Ｆｌａｓｈ）を用いて眼から５インチで光のフラッシュを発生させ、ＥＲＧ電位をポリグラフで記録した。ＥＲＧシステムはＬＫＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）より購入された。１回（１０ミリ秒）の白色光刺激を用いて、ＥＲＧ  ａ波およびｂ波を誘発した。ｂ波の最大振幅をａ波の谷とｂ波のピークから測定した。
【００６２】
２時間以上暗順応させたＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラット（２００〜２５０ｇ）が筋肉内へのケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）投与で麻酔された。その後は初回量の半量が１時間毎に投与され、適切な麻酔が維持された。ＥＲＧ実験のため瞳孔が１％トロピカミド（５０μｌ）で散瞳された。視神経および後毛様体動脈周りの結紮による中心網膜および後毛様体動脈の閉塞によって網膜虚血が発生された。眼球孔の基部に配置されたマイクロピペットチップで結紮糸を３０分間きつくしぼり、網膜血管を閉塞させた。３０分の網膜虚血後、結紮糸が緩められ、網膜動脈が再灌流された。その後ＥＲＧが３０、６０、９０、１２０、１８０、２４０分の時点で測定された。ＴＰＥとビークルが中心網膜動脈の閉塞前に局所投与された。
【００６３】
３、統計分析
すべてのデータは平均±ＳＥＭで示された。スチューデントＴ検定を使用して結果の有意性が分析された。すべての実験でＰ値＜０.０５が有意であるとみなされた。
【００６４】
結果
中心網膜と後毛様体動脈が結紮されると、これら動脈の血流が停止し、ＥＲＧのｂ波は速やかにゼロになった。結紮が取り除かれると、それまで通りに血流が再開されたが、ｂ波の振幅は元のレベルの２０％しか回復されなかった。しかし、１％のＴＰＥが注入されると、ｂ波の振幅は元のレベルの約４０％に戻り、薬剤の作用は薬剤投与後少なくとも２４０分持続した（図８）。
【実施例４】
【００６５】
レーザー誘発ＡＭＤの抑制
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、西洋諸国の５０歳を超える患者における視力障害の第一の原因となっている疾患である。ＡＭＤの有病率は年齢と共に増加し、７５歳以上の人の３分の１が何らかの形のＡＭＤを罹患している。高齢人口に対するＡＭＤの大きな影響を踏まえ、過去十年間でこの状況に多くの関心が集まり、研究が行われている。
【００６６】
初期のＡＭＤは網膜色素上皮（ＲＰＥ）における病変とドルーゼン形成を伴う「ドライ型」で発生し、地図状萎縮および（または）脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を伴う「ウェット型」ＡＭＤへと進行することがある（Ｋｌｅｉｎ、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  １９９７；０４：７〜２１）。剥離したＲＰＥ下のブルッフ膜の破壊は、新しい未成熟の脈絡膜血管が網膜下腔へと成長するための入り口となり、ＣＮＶの形成につながる。ＣＮＶは網膜下腔内で液体漏出と出血を生じ、視界不良、視覚のゆがみ、突然の視力喪失を引き起こすことがある。治療しないと、これらの障害が進行して器質化された線維性瘢痕（円板状瘢痕と呼ばれる）を形成し、通常不可逆の中心性視力喪失を引き起こす。
【００６７】
材料および方法
ＴＰ抽出物（ＴＰＥ）は実施例１に従って作製された。ラットが無作為に２群に分けられた。対照群にはビークル（３０％ＨＰ−β−ＣＤ溶液）が注入された。実験群には５ｍｇ／ｍｌのＴＰＥ点眼剤が注入された。すべてのラットの両目に１滴の点眼剤が１日３回、レーザー誘発障害の前１週間と後４週間注入された。ラットはすべての手順に際してケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔された。瞳孔が１０ｍｇ／ｍｌのアトロピンと２５ｍｇ／ｍｌのフェニレフリンそれぞれ１滴で散瞳された。ＶＯＬＫ ｓｕｐｅｒ ｐｕｐｉｌ ＸＬ生体顕微鏡検査法レンズ（Ｋｅｅｌｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｉｎｃ．、米国ペンシルベニア州ブルームオール）を用いて眼底が視覚化された。２周波Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（Ｌａｓｅｒｅｘ  ＬＰ３５３２；Ｌｕｍｅｎｉｓ Ｉｎｃ．、米国ユタ州ソルトレークシティ）が５３２ｎｍ波長で使用された。レーザーパラメータはスポットサイズ１００μｍ、曝露０.１５秒、電力１５０〜２００ｍＷが使用された。視神経からほぼ等しい距離で眼底に５つのレーザースポットが作製された。急性の蒸気泡はブルッフ膜の破裂を示唆した。バブル形成を伴うレーザースポットのみが研究に含められた。網膜下出血を伴う病変は除外された。レーザー処置の２週間および４週間後、デジタル眼底カメラ（ＴＲＣ−５０ＥＸ：ＴＯＰＣＯＮ、日本東京）で蛍光眼底血管造影（ＦＡ）が実施された。１００ｍｇ／ｍｌのフルオレセインナトリウム塩が舌下静脈を介して注射された（０.５ｍｌ／ｋｇ）。早期（２分未満）と後期（７分超）のフルオレセインフェーズが取得された。３滴のフルオレセインナトリウム塩注射後、１００ｍｇ／ｍｌのフルオレセインイソチオシアネート−デキストランが舌下静脈を介して注射された（１．４ｍｇ／ｋｇ）。フルオレセイン画像が２０分以内に撮影された。Ｉｍａｇｅｎｅｔ２０００デジタル画像システム（Ｔｏｐｃｏｎ ＭｅｄｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、米国ニュージャージー州パラマス）によるＣＮＶ形成面積測定のため、最も鮮明な画質の画像が選ばれた。
【００６８】
結果
ラットの眼のブルッフ膜をレーザービームで破壊したとき、蛍光眼底血管造影でフルオレセイン漏出が測定された。ＣＮＶ形成面積がコンピュータで定量的に測定され、ｍｍ２で表された。図９から分かるように、対照の眼では約２.５ｍｍ２のＣＮＶ面積が形成され、これは１％ＴＰＥの注入により有意に抑制された。
【実施例５】
【００６９】
ＮａＩＯ３誘発ドライ型ＡＭＤの減少
２００４年の分析によると、４０歳を超える米国人の中で、ＡＭＤおよび（または）地図状萎縮が当該人口の１.４７％の少なくとも片目に存在し、１７５万人がＡＭＤを患っていることが報告された。ＡＭＤの有病率は年齢に伴って大幅に増加し、８０歳を超える白人女性の１５％以上が新生血管を伴うＡＭＤおよび地図状萎縮を罹患している。７００万人以上にＡＭＤ罹患の相当なリスクがある。急速に高齢化する人口を背景に、ＡＭＤ罹患者数は２０２０年に５０％増加して２９５万人に達する。別の研究で、米国白人人口における現在の全失明事例のうち５４％がＡＭＤによるものであることが報告されている。この研究は、２０２０年までに米国における失明者数が７０％も増加する可能性があると予測している。この研究はヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ３）誘発網膜色素上皮（ＲＰＥ）変性に対するＴＰＥの効果を観察するものである。
【００７０】
材料および方法
ＴＰ抽出物（ＴＰＥ）は実施例１に従って作製された。３０匹の８週齢オスブラウンノルウェー（ＢＮ）ラットが無作為に、正常群１０匹、ＮａＩＯ３群１０匹、ＴＰＥ＋ＮａＩＯ３群１０匹の３群に分けられた。対照群には溶媒（２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）がＮａＩＯ３注射なしの単独で注射された。ＮａＩＯ３群には溶媒と３５ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３注射が舌下静脈を介して注射された。一方、ＴＰＥ＋ＮａＩＯ３群には１％のＴＰＥ点眼剤＋３５ｍｇ／ｋｇのＮａＩＯ３注射が注射された。すべてのラットの両目に１滴が１日３回、ＮａＩＯ３注射の前１週間と後４週間注入された。２週間と４週間の終わりに、ＲＰＥ機能がＥＲＧのｃ波で測定された。
【００７１】
ＢＮラットは２時間暗順応させた後、筋肉内へのケタミン３５ｍｇ／ｋｇとキシラジン５ｍｇ／ｋｇ投与で麻酔された。その後は初回量の半量が１時間毎に投与された。すべてのラットの瞳孔が１％のアトロピンと２．５％のフェニレフリンそれぞれ１滴で散瞳された。記録前に０.５％のテトラカイン１滴が表面麻酔のために与えられた。ＥＲＧ測定中、すべてのラットは暖かく保たれた。Ｐｅａｃｈｅｙにより開発されたＤＣ−ＥＲＧ記録法に従って記録された。簡単に説明すると、Ｈａｎｋｓ平衡塩類溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）を充填した、直径１ｍｍのフィラメント付ガラスキャピラリー管（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国カリフォルニア州ノバート）を使用して、コネクタ付のＡｇ／ＡｇＣｌワイヤ電極に接続した。電極は角膜表面に配置された。応答は増幅され（ｄｃ−１００Ｈｚ、ゲイン＝１０００×；ＤＰ−３０１、Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国コネチカット州ハムデン）、１０Ｈｚまたは１０００Ｈｚでデジタル化された。データはｉＷＯＲＸ  ＬａｂＳｃｒｉｂｅ  Ｄａｔａ  Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｉＷｏｒｘ０ＣＢ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニューハンプシャー州ドーバー）で分析された。刺激輝度を調整するため、光路内にＮＤ（ニュートラルデンシティ）フィルタ（Ｏｒｉｅｌ、米国コネチカット州ストラトフォード）を配置した、ファイバーライト高強度照明装置（Ｄｏｌａｎ−Ｊｅｎｎｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、米国マサチューセッツ州）を使用して、光チャネルから光刺激が誘導された。この実験で使用された刺激輝度は、３．２２ログｃｄ／ｍ２で、刺激時間は４分間であった。ラットの眼が位置している光ファイバー束の出力側に焦点を絞ったＭｉｎｏｌｔａ（米国ニュージャージー州ラムジー）のＬＳ−１１０測光器により、輝度較正が行われた。
【００７２】
結果
ラットがＮａＩＯ３で処理されたとき、ＲＰＥ細胞の特異的な変性が引き起こされた。その結果、ＮａＩＯ３がドライ型ＡＭＤ動物モデルの構築に使用され、損傷を受けた細胞機能がＥＲＧのｃ波振幅で測定された。図１０から分かるように、対照のＥＲＧのｃ波はＮａＩＯ３により著しく抑制された。しかし、ＮａＩＯ３処理ラットの１％ＴＰＥによる処理は、ＥＲＧのｃ波を著しく回復させることができる。ＮａＩＯ３は眼でＲＰＥ細胞を特異的に変性させる強力な毒素である。その結果、ＥＲＧのｃ波はＮａＩＯ３処理済みの眼でほぼ完全に抑制された（図１０）。このＮａＩＯ３誘発ドライ型ＡＭＤモデルは１％ＴＰＥにより３倍回復可能であることに注意することが重要である（図１０）。ドライ型ＡＭＤは失明を引き起こす恐ろしい疾病であるため、ドライ型ＡＭＤを予防／治療できる薬剤は非常に貴重である。
【００７３】
本発明の広範な概念を逸脱することなく上述した実施態様に変更を加えることが可能であることは、当業者には明らかであろう。従って、本発明は開示された具体的な実施態様に限定されず、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の要旨と範囲内の変更は、本発明に含まれると理解される。
【図１】
2019218390.tif 000002
【図２】
2019218390.tif 000003
【図３】
2019218390.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019218390.tif 000009
【図９】
2019218390.tif 000010
【図１０】
2019218390.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月25日(2019.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼疾患の治療を必要とする被験者においてそれを治療する方法であって、タイワンプロポリス（Ｔａｉｗａｎｅｓｅ  Ｐｒｏｐｏｌｉｓ、ＴＰ）抽出物の有効量を前記被験者に投与する工程を含むことを特徴とする、眼疾患を治療する方法。
【外国語明細書】
2019218390000001.pdf