(57)【要約】      （修正有）【課題】カオトロピック剤を用いなくても試料中から核酸を効率よく抽出する方法の提供。【解決手段】固相抽出法により、核酸を含む試料から核酸を抽出する核酸抽出方法であって、核酸を含む試料と、酸化グラフェン及び２価以上の金属カチオンを含有し、且つ前記２価以上の金属カチオンの含有割合が、前記酸化グラフェンに対して５，０００〜１００，０００ｐｐｍｗである、核酸吸着液とを混合する工程（１）と、混合後の混合液から、固形物を回収する工程（２）と、前記固形物と核酸溶出液とを接触する工程（３）と、に液状物を回収する工程（４）と、を有する、核酸抽出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相抽出法により、核酸を含む試料から核酸を抽出する核酸抽出方法であって、
核酸を含む試料と、酸化グラフェンおよび２価以上の金属カチオンを含有し、且つ前記２価以上の金属カチオンの含有割合が、前記酸化グラフェンに対して５，０００〜１００，０００ｐｐｍｗである、核酸吸着液とを混合する工程（１）：
混合後の混合液から、固形物を回収する工程（２）；
前記固形物と核酸溶出液とを接触する工程（３）；ならびに
液状物を回収する工程（４）；
を有することを特徴とする、核酸抽出方法。
【請求項２】
前記２価以上の金属カチオンが、２価または３価の金属カチオンである請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項３】
前記２価の金属カチオンが、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、およびＡｌ３＋である請求項２に記載の核酸抽出方法。
【請求項４】
前記核酸溶出液が、キレートを含有する請求項１〜３のいずれかに記載の核酸抽出方法。
【請求項５】
前記酸化グラフェンの酸素原子含有率が、２０質量％以上である請求項１〜４のいずれかに記載の核酸抽出方法。
【請求項６】
酸化グラフェンおよび２価以上の金属カチオンを含有し、且つ前記２価以上の金属カチオンの含有割合が、前記酸化グラフェンに対して５，０００〜１００，０００ｐｐｍｗである核酸吸着液；ならびに核酸溶出液；を含む、核酸抽出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸抽出方法および核酸抽出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
検体（試料）中に含まれる核酸の解析や同定は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などにより核酸を増幅することにより行われる。ところで、検体には核酸以外に大量の生体関連物質が共存しており、ヘモグロビンなどの生体関連物質は、ＰＣＲを阻害することが知られている。よって、検体中に含まれる核酸を解析や同定するためには、検体中から純度の高い核酸を抽出する必要がある。
【０００３】
検体中から核酸を抽出する方法としては、固相抽出法の一つであるブーム核酸抽出法が知られている。この方法は、タンパク質などの生体関連物質の水素結合を切るためのグアニジンチオシアネート緩衝液などのカオトロピック剤の存在下、シリカビーズに核酸を吸着させることにより行われる方法である。しかしながら、カオトロピック剤はＰＣＲを阻害することが知られている。よって、この方法では、抽出した核酸中にカオトロピック剤が残存するというリスクがあり、そのリスクをなくすためカオトロピック剤を使用しない核酸抽出法の検討が進められてきた。
【０００４】
例えば、カオトロピック剤を使用しない核酸抽出法としては、特許文献１に記載の、酸化グラフェンとセルロースを用いた方法が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ２０１６／０８４９４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、カオトロピック剤を用いなくても試料中から核酸を効率よく抽出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、例えば、以下の［１］〜［７］である。
［１］固相抽出法により、核酸を含む試料から核酸を抽出する核酸抽出方法であって、
核酸を含む試料と、酸化グラフェンおよび２価以上の金属カチオンを含有し、且つ前記２価以上の金属カチオンの含有割合が、前記酸化グラフェンに対して５，０００〜１００，０００ｐｐｍｗである、核酸吸着液とを混合する工程（１）：
混合後の混合液から、固形物を回収する工程（２）；
前記固形物と核酸溶出液とを接触する工程（３）；ならびに
液状物を回収する工程（４）；
を有することを特徴とする、核酸抽出方法
【０００８】
［２］前記２価以上の金属カチオンが、２価または３価の金属カチオンである前記［１］に記載の核酸抽出方法。
【０００９】
［３］前記２価の金属カチオンが、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、およびＡｌ３＋である前記［２］に記載の核酸抽出方法。
【００１０】
［４］前記核酸溶出液が、キレートを含有する前記［１］〜［３］のいずれかに記載の核酸抽出方法。
【００１１】
［５］前記酸化グラフェンの酸素原子含有率が、２０質量％以上である前記［１］〜［４］のいずれかに記載の核酸抽出方法。
【００１２】
［６］少なくとも、酸化グラフェン１００質量部および２価以上の金属カチオン０．５〜１０質量部を含む核酸吸着液；ならびに核酸溶出液；を含む、核酸抽出キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の核酸抽出方法によれば、カオトロピック剤を用いなくても試料中から核酸を効率よく抽出することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜核酸抽出方法＞
本発明の核酸抽出方法は、
固相抽出法により、核酸を含む試料から核酸を抽出する核酸抽出方法であって、
核酸を含む試料と、酸化グラフェンおよび２価以上の金属カチオンを含有し、且つ前記２価以上の金属カチオンの含有割合が、前記酸化グラフェンに対して５，０００〜１００，０００ｐｐｍｗである、核酸吸着液とを混合する工程（１）：
混合後の混合液から、固形物を回収する工程（２）；
前記固形物と核酸溶出液とを接触する工程（３）；ならびに
液状物を回収する工程（４）；
を有する。
【００１５】
本発明の核酸抽出方法は、酸化グラフェン（固相）に核酸を含む試料（液相）を接触させることで、酸化グラフェンに核酸が吸着し、そして核酸が吸着した酸化グラフェンを取り出すことで核酸を抽出する。そして、酸化グラフェンに核酸を吸着させる際、２価以上の金属カチオンの含有割合が、前記酸化グラフェンに対して５，０００〜１００，０００ｐｐｍｗであれば、核酸の酸化グラフェンへの吸着が効率よく行え、その結果、検体中から核酸を効率よく抽出することができる。
なお、本明細書において「核酸」とはＤＮＡおよび／またはＲＮＡを示す。
【００１６】
＜１．工程（１）＞
工程（１）は、核酸を含む試料（以下、「試料」ともいう）と、酸化グラフェンおよび２価以上の金属カチオン（以下、「多価金属カチオン」ともいう）を含み、且つ前記２価以上の金属カチオンの含有割合が、前記酸化グラフェンに対して５，０００〜１００，０００ｐｐｍｗである、核酸吸着液とを混合する工程である。
つまり、試料と核酸吸着液を混合することで、固相担体である酸化グラフェンに核酸を直接または間接的に吸着させる工程である。
【００１７】
酸化グラフェンは、核酸を吸着させる基や構造がある一方、エノラート構造等の核酸の吸着を阻害する基を有しているものと考えられる。
核酸は相対的に負に帯電しているため、負に帯電したエノラート構造とは電気的に反発する。このため、酸化グラフェン単独では、核酸を効率よく抽出させることができなかったものと推定される。
【００１８】
本願の核酸抽出方法では、酸化グラフェンと共に多価金属カチオンを含有する核酸吸着液を用いる。多価金属カチオンは、相対的に負に帯電した核酸と、負に帯電したエノラート構造とのイオン結合により繋げることで、これまで電気的に反発していたものを解消するだけでなく、イオン結合により繋げる効果を有するものと推定される。
以上の理由により、本発明の核酸抽出方法は、核酸吸着液により検体中から核酸を効率よく吸着することができると推定される。
【００１９】
試料と核酸吸着液との混合は、試料の入っている容器に核酸吸着液を入れても、核酸吸着液の入っている容器に試料を入れてもどちらでもよい。
また、試料と核酸吸着液との混合は、混合効率を上げるために、ボルティックミキサー、振動攪拌機、回転攪拌機、および超音波処理などを用いることができる。
混合時間は、通常、５〜２０分間であり、混合温度は、通常、１０〜４０℃である。
【００２０】
＜１−１．試料＞
試料としては、血液、皮膚、毛髪、臓器等の生体組織由来の検体；尿、糞便、喀痰等の排泄物由来の検体；細菌、ウィルス等の微生物由来の検体；ならびにこれらの検体を含む検体；等の核酸を含む試料が挙げられる。
【００２１】
試料と核酸吸着液とを混合する前に、試料から核酸を吸着しやすくするために、試料は、核酸以外の試料中に含まれる生体物質等の物質を破壊や分散させる前処理を行うことができる。
【００２２】
前記前処理としては、例えば、
リン酸緩衝液、およびトリス緩衝液等緩衝液、ならびにこれら緩衝液に、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸、ビピリジン、およびポルフィリン等のキレートを含有する液などのｐＨを調整する処理；
凍結乾燥後の粉砕などの物理的に破壊する処理；
試料が血液由来の場合、溶血剤により核酸を含まない赤血球を破壊する処理：
ライシス溶液などの細胞を酵素により分解する処理；
カオトロピック塩などのカオトロピック剤により、試料から核酸を溶出させる処理；
が挙げられる
【００２３】
ただし、カオトロピック剤により、試料から核酸を溶出させる処理を行うと、溶出された核酸は断片化されているものが多く、一部の核酸解析法には不向きである。特に、核酸溶出によりカオトロピック剤を完全に除去していないと、ＰＣＲによる相補的ＤＮＡの合成反応の効率を低下させる。
【００２４】
本発明の核酸抽出方法では、カオトロピック剤を用いない、または用いるとしても少量であり、少量であっても、検体中から核酸を効率よく抽出することができることから、これらの前処理のなかでもカオトロピック剤による試料から核酸を溶出させる処理は行わない方が好ましい。
【００２５】
試料は、核酸吸着液１ｍｌに対して検体が、通常、１０〜２００ｍｇ、好ましくは５０〜１００ｍｇとなる量を用いる。
また、必要に応じて、試料は水や、アルコール等の水溶性有機溶剤により薄めてもよい。
【００２６】
＜１−２．核酸吸着液＞
核酸吸着液は、酸化グラフェン、および多価金属カチオンを含有し、且つ前記２価以上の金属カチオンの含有割合が、前記酸化グラフェンに対して５，０００〜１００，０００ｐｐｍｗである。
核酸吸着液は、通常、酸化グラフェンの分散液であり、前記分散液の分散媒としては、例えば、水、アルコール等の水溶性有機溶剤が挙げられる。なお、本発明における「水」は、塩化ナトリウムやリン酸塩等を含む生理食塩水であってもよい。核酸吸着液中に含まれる分散媒の量は、核酸吸着液中に含まれる酸化グラフェンの濃度が、通常、０．１〜５質量％、好ましくは０．２〜２質量％となる量である。
【００２７】
＜１−２−１．酸化グラフェン＞
酸化グラフェンは、例えば、グラファイトを過マンガン酸カリウムと濃硫酸の混合液や、亜硝酸ナトリウム、および過酸化水素等の酸化剤で酸化し、次いで超音波照射等により層状に剥離することで得られる。
【００２８】
酸化グラフェンは、グラフェンに酸素含有基や構造が導入された酸化物であり、ＳＰ２結合で炭素原子が結合した６員環炭素骨格を有するグラフェンに、水酸基、エポキシ基、カルボニル基、およびカルボキシル基、並びにエノラート等のこれらの基からプロトンが解離した構造を有すると考えられている。また、酸化グラフェンは酸素含有基や構造以外の基や構造を有していてもよい。
【００２９】
酸化グラフェン中の酸素原子含有率は、２０質量％以上、好ましくは２０〜７０質量％、より好ましくは４０〜５０質量％である。前述のとおり、酸化グラフェンの酸素含有基や構造は核酸を多価金属カチオンと共に吸着するための基であり、酸化グラフェン中に含まれる酸素含有率が上述の範囲であるならば、効率よく核酸を吸着させることができる。なお、酸化グラフェン中の酸素原子含有率は、Ｘ線電子分光法により測定した値である。
【００３０】
酸化グラフェンは、単層であっても、２層以上の多層であってもよい。
また、酸化グラフェンは、シート状であっても、粒子状であっても、どのような形状であってもよい。酸化グラフェンがシート状であるならばその厚みは、通常、０．８〜２ｎｍであり、酸化グラフェンが粒子状であるならその粒子径は、通常、２〜２０ｎｍである。
なお、酸化グラフェンがシート状である場合、その厚みは、原子間顕微鏡（ＡＦＭ）で測定した値であり、酸化グラフェンが粒子状である場合、その一次粒子径は、透過型電子顕微鏡により測定した値である。
【００３１】
酸化グラフェンは、核酸との吸着を効率よく行えるようにするため、その比表面積は広い方が好ましく、通常、１００ｍ２／ｇ以上、好ましくは５００〜２０００ｍ２／ｇである。酸化グラフェンの比表面積を広くするために、例えば、酸化グラフェンのシートや粒子を多孔質化してもよい。
【００３２】
酸化グラフェンは、磁性物質との複合体であってもよい。磁性物質との複合体とすることで、工程（２）において、工程（１）により得られた混合液から酸化グラフェンを含む固形物を回収する際、磁性物質の磁性を用いた回収方法を行うことができる。
【００３３】
前記磁性物質とは、強磁性体、軟磁性体または反強磁性体の物質であり、具体的には、鉄、マンガン、コバルト、およびクロム等の金属、並びに四三酸化鉄、およびγ−一重三二酸化鉄等の金属酸化物が挙げられる。
【００３４】
前記複合体としては、例えば、磁性物質からなる磁性粒子の表面を酸化グラフェンのシートで被われた複合体、磁性物質からなる磁性粒子と粒子状の酸化グラフェンとの二次粒子である複合体が挙げられる。
【００３５】
＜１−２−２．多価金属カチオン＞
多価金属イオンは、相対的に負に帯電した核酸と、酸化グラフェンのエノラート構造等負に帯電した構造とを繋げるものであり、より詳しくは、正に帯電した多価金属カチオンを介して、相対的に負に帯電した核酸と、負に帯電した酸化グラフェンとをイオン結合により繋げる役割を担っていると考えられる。
【００３６】
多価金属カチオンとしては、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、およびＮｉ２＋等の２価金属カチオン；Ｆｅ３＋、およびＡｌ３＋等の３価金属カチオン；ならびにＣｒ６＋等の４価以上の金属カチオン；が挙げられる。これらの中でも、検体中から核酸を効率よく吸着できることから、２価金属カチオンまたは３価金属カチオンが好ましく、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、およびＡｌ３＋がより好ましい。
【００３７】
これはエノラート構造が１価のアニオンであり、且つ核酸も相対的に負に帯電しているから、多価金属カチオンが２価以上であれば、電気的中性を形成することができ、その結果、核酸と酸化グラフェンとを効率よくイオン結合させることができるためであると推定される。
多価金属カチオンは、核酸吸着液中に１種のみ含んでもよく、複数種含んでもよい。
【００３８】
多価金属カチオンのカウンターアニオンとしては、Ｃｌ−、ＳＯ４２−、およびＮＯ３−等が挙げられる。
多価金属カチオンは、後から多価金属カチオンの源となる金属塩を、酸化グラフェンを含有する分散液に添加してもよく、または、酸化グラフェンの製造に用いた触媒由来の多価金属カチオンであってもよい。
後者の場合、多価金属カチオンのカウンターアニオンは前記触媒由来である。
【００３９】
核酸吸着液中に含まれる多価金属カチオンの含有量は、酸化グラフェン１００質量部に対して、０．５〜１０質量部、好ましくは０．５〜５質量部、より好ましくは０．５〜２質量部である。
前記範囲であれば、多価金属カチオンによる酸化グラフェンの凝集による酸化グラフェン分散液の分散不良なく、多価金属カチオンを介して、酸化グラフェンに核酸を吸着することができる。
【００４０】
＜１−２−３．その他成分＞
前記核酸吸着液は、酸化グラフェンおよび多価金属カチオン、ならびに前記分散媒および多価金属カチオンのカウンターアニオン以外にも、例えば、前記「＜１−１．試料＞」に記載の試料の前処理で用いる、カオトロピック剤、緩衝液、溶血剤、およびライシス液等の前処理液、ならびに界面活性剤、消泡剤、水溶性有機溶剤、およびセルロースを含有することができる。
【００４１】
なお、その他成分として、カオトロピック剤は、前記「＜１−１．試料＞」に記載の理由と同じく、カオトロピック剤を用いない、または用いるとしても少量、具体的には、核酸吸着液中に含まれる酸化グラフェン１００質量部に対して、１０質量部以下が好ましい。
その他成分は、核酸吸着液中に１種のみ含んでもよく、複数種含んでもよい。
【００４２】
＜１−２−４．核酸吸着液の製造＞
核酸吸着液は、酸化グラフェンを水等の分散媒にて均一に分散して酸化グラフェンの分散液を調製した後、多価金属イオンの源となる金属塩および任意に前記その他成分を前記分散液に溶解させるか、または多価金属イオンが酸化グラフェンの製造に用いた触媒由来である場合は、任意に前記その他成分を前記分散液に溶解させることで製造することができる。
【００４３】
核酸吸着液のｐＨは、通常、２〜７、好ましくは３〜６である。前記ｐＨが前記範囲内であれば、核酸の水酸基と酸化グラフェンの水酸基の間で、静電反発が起こりにくくなるため、核酸の吸着が効率よく行える。
なお、ｐＨは、２３℃で、堀場製作所製のｐＨ電極（製品名：９６２５−１０Ｄ）で測定した値である。
【００４４】
＜２．工程（２）＞
工程（２）は、前記工程（１）により得られた混合後の混合液から、固形物を回収する工程である。前記固形物は、核酸を直接および／または間接的に吸着した酸化グラフェンである。
【００４５】
前記混合液から固形物を回収する方法としては、例えば、遠心分離により固形物を沈降させた後、上澄みを破棄する方法、および濾別する方法、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
また、酸化グラフェンが磁性物質との複合体である場合、前記複合体を磁化させることで、前記複合体は擬似凝集体を形成するため、容易に前記混合液から固形物を回収することができる。
【００４６】
前記遠心分離における最大回転速度は、通常、８，０００〜２０，０００ｒｐｍ、時間は、通常、１０〜６０分間である。
【００４７】
固形物を回収後、固形物を水やアルコール等の水溶性有機溶剤で洗浄してもよい。
【００４８】
＜３．工程（３）＞
工程（３）は、前記工程（２）により回収した固形物と、核酸溶出液とを接触させて、固形物から核酸を溶出させ、液状物を得る工程である。
固形物から核酸を溶出させる溶出先は液層（液状物）である。前記液層は、核酸溶出液由来の液体である。
【００４９】
固形物から核酸の溶出には、固形物の入っている容器に核酸溶出液を入れても、核酸溶出液の入っている容器に固形物を入れてもどちらでもよい。
核酸溶出液の使用量は、通常、前記固形物１μｇに対して、１０〜１，０００μｌである。
また、固形物から核酸を効率良く溶出させるために、固形物と核酸溶出液とを接触させた後、加熱処理、攪拌処理、および超音波処理等の処理を行うことができる。
前記加熱処理は、通常、６０〜９５℃で、５〜２０分間である。
【００５０】
＜３−１．核酸溶出液＞
核酸溶出液は、固形物から核酸を溶出させるものである。
核酸溶出液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、およびグッド緩衝液等の緩衝液、ならびにこれら緩衝液に、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸、ビピリジン、ポルフィリン、およびグルコン酸等のキレートを含有する液などが挙げられる。
【００５１】
これら核酸溶出液のなかでも、キレートを含有する液が核酸を効率よく溶出させることができることから好ましい。
前記固形物は、核酸が、多価金属カチオンを介して、間接的に酸化グラフェンに吸着した構造を有しているものと推定される。核酸溶出液中にキレートを含有すると、キレートと錯体形成する多価金属カチオンが効率よく取り除かれ、その結果、間接的に酸化グラフェンに吸着していた核酸が溶出することになると推定される。よって核酸溶出液中にキレートを含むと、核酸が効率よく溶出されることになり、その結果、検体中から核酸を効率よく抽出することができるようになると推定される。
【００５２】
核酸溶液中に含まれるキレートの含有割合は、通常、０．００５〜０．１質量％、好ましくは０．１〜０．０５％である。
【００５３】
＜４．工程（４）＞
工程（４）は、工程（３）により得られた、核酸を含む液状物を回収する工程である。前記液状物は、核酸および核酸溶出液由来の液体を含むものである。
液状物を回収する方法としては、例えば、遠心分離により固形物を沈降させた後、上澄みを回収する方法、および濾別し濾液を回収する方法、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
【００５４】
前記遠心分離における最大回転速度は、通常、８，０００〜２０，０００ｒｐｍ、時間は、通常、１０〜６０分間である。
【００５５】
液状物を回収後、液状物を濃縮や透析などを行ってもよい。
本発明の核酸抽出方法により得られた核酸は、高純度の核酸を効率よく得られることから、ポリメラーゼ連鎖反応等の検体中に含まれる核酸を解析や同定のための操作において有用に用いることができる。
【００５６】
＜５．核酸抽出キット＞
本発明の核酸抽出キットは、酸化グラフェンおよび２価以上の金属カチオンを含有し、且つ前記２価以上の金属カチオンの含有割合が、前記酸化グラフェンに対して５，０００〜１００，０００ｐｐｍｗである核酸吸着液；ならびに核酸溶出液；を有する。
核酸吸着液の詳細については、前記「＜１−２．核酸吸着液＞」に記載したとおりであり、核酸溶出液の詳細については、前記「＜３−１．核酸溶出液＞」に記載したとおりである。
【００５７】
本発明の核酸抽出キットは、前記核酸吸着液および前記核酸溶出液以外に、ライシス液、アルコール等の洗浄液、および自動化された精製操作システムを有してもよい。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
【００５９】
＜核酸吸着液の製造＞
［製造例１Ａ］核酸吸着液１の製造
市販の酸化グラフェン水分散液（商品名「Ｒａｐ−ｓＧＯ」、仁科マテリアル社製）を核酸吸着液１とした。核酸吸着液１中に含まれる酸化グラフェンの含有割合は１質量％である。
【００６０】
［製造例２Ａ］核酸吸着液２の製造
酸化グラフェン水分散液（商品名「Ｒａｐ−ｓＧＯ」、仁科マテリアル社製）１００ｍＬを入れた遠沈管に、濃塩酸（２．７Ｍ）１００ｍＬ入れて、最大回転数５，０００ｒｐｍを１０分間で遠心分離した後、濾過した。濾物を再度濃塩酸（２．７Ｍ）１００ｍＬと混ぜ合わせ、最大回転速度５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後濾過して濾物を得る、一連の操作を３回行った。
次いで、濾物を純水１００ｍＬと混ぜ合わせ、最大回転速度２１，０００ｒｐｍを３０分間で遠心分離した後、濾過して濾物を得る一連の操作を７回行った。７回の操作により濾液のｐＨは７になった。
濾物と純水を混ぜ合わせ固形分濃度が１質量％となるように調製し、超音波ホモジナイザーで固形分を分散し、核酸吸着液２を製造した。核酸吸着液２中に含まれる酸化グラフェンの含有割合は１質量％である。
【００６１】
［製造例３Ａ］核酸吸着液３の製造
製造例２Ａで得た核酸吸着液２に、塩化ナトリウム水溶液を、ナトリウムイオンの含有割合が、酸化グラフェンに対して約１０，０００ｐｐｍｗとなる量加え、均一に分散し、核酸吸着液３を製造した。核酸吸着液３中に含まれる酸化グラフェンの含有割合は１質量％である。
【００６２】
［製造例４Ａ〜７Ａ］核酸吸着液４〜７の製造
塩化カルシウム（ＩＩ）水溶液の代わりに、それぞれ、塩化マンガン（ＩＩ）水溶液、塩化亜鉛（ＩＩ）水溶液、塩化アルミニウム（ＩＩＩ）水溶液を用いた以外は製造例３Ａの核酸吸着液３の製造と同様の操作にて、それぞれ、核酸吸着液４〜７を製造した。
【００６３】
核酸吸着液１〜７中に含まれる、酸化グラフェンに対する金属カチオンの含有割合をＩＣＰ−ＡＥＳで測定した。その結果を下記表１に示す。
【００６４】
【表１】
2019033715.tif 000002
【００６５】
＜核酸溶出液の製造＞
［製造例１Ｂ］核酸溶出液１の製造
商品名「ＣＡＰＳ分子生物学用」（同仁化学研究所社製）、純水、水酸化ナトリウム、およびエチレンジアミン四酢酸を、エチレンジアミン四酢酸が１ｍｍｏｌ／Ｌであり、且つｐＨが１１となるよう混合し、核酸溶出液１を製造した。
【００６６】
［製造例２Ｂ］核酸溶出液２の製造
商品名「２−アミノ−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール」（和光純薬工業社製）、純水、塩酸水溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）、およびエチレンジアミン四酢酸を、エチレンジアミン四酢酸が１ｍｍｏｌ／Ｌであり、且つｐＨが９．０となるよう混合し、核酸溶出液２を製造した。
【００６７】
＜核酸抽出＞
［実施例１］
マイクロチューブに、核酸吸着液１を５００μｌ、核酸を含む試料（商品名「Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  ｈｅｒｒｉｎｇ  ｓｐｅｒｍ」、製品番号「Ｄ７２９０」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製）を純水で１０倍に希釈した液を１００μｌ、および純水を４００μｌ入れ、ボルティックミキサーで均一に混合した後、２３℃で１５分間静置した。
次いで、最大回転速度１４，５００ｒｐｍを３０分間で遠心分離した後、上澄み液をμピペットで除去し、固形物を回収した。
【００６８】
前記固形分に核酸溶出液１を１０００μｌ加えた後、８０℃で１５分間加熱した。加熱後、最大回転速度１４，５００ｒｐｍを６０分間で遠心分離した後、上澄み液をμピペットで回収した。
核酸を含む試料からの核酸の回収率（質量％）を、この上澄み液の２６０ｎｍにおける吸光度と、前記試料を純水で１００倍に希釈した液の２６０ｎｍにおける吸光度と対比することで、測定した。評価結果を表２に示す。
【００６９】
［実施例２〜６、比較例１〜３］
表２に示す核酸吸着液および核酸溶出液を用いた以外は、実施例１と同様の操作にて、核酸を抽出し、核酸を含む試料からの核酸の回収率（質量％）を測定した。評価結果を表２に示す。
【００７０】
【表２】
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