(57)【要約】【課題】  至適増殖温度が５０℃以上である好熱菌において比較的低温でタンパク質を発現させることができるタンパク質発現方法。【解決手段】  好熱菌においてタンパク質を発現させるタンパク質発現方法であって、  至適増殖温度が５０℃以上である好熱菌に、次の（ａ）〜（ｃ）：  （ａ）配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列  （ｂ）プロモーター活性を有し、配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列  （ｃ）ゲオバチルス属菌由来であり、プロモーター活性を有し、かつ、配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなるプロモーターと、前記プロモーターに発現可能に連結されたタンパク質をコードするＤＮＡとを含む遺伝子構築物を導入して、形質転換体を得る第１の工程と、  ５０℃以上の培養温度で前記形質転換体を培養して増殖させる第２の工程と、  第２の工程の後、培養温度を５０℃以下かつ第２の工程の培養温度よりも１０℃以上低い温度に変えて前記タンパク質を発現させる第３の工程と、を含むことを特徴とする、タンパク質発現方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
好熱菌においてタンパク質を発現させるタンパク質発現方法であって、
至適増殖温度が５０℃以上である好熱菌に、次の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列
（ｂ）プロモーター活性を有し、配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列
（ｃ）ゲオバチルス属菌由来であり、プロモーター活性を有し、かつ、配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列
からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなるプロモーターと、前記プロモーターに発現可能に連結されたタンパク質をコードするＤＮＡとを含む遺伝子構築物を導入して、形質転換体を得る第１の工程と、
５０℃以上の培養温度で前記形質転換体を培養して増殖させる第２の工程と、
第２の工程の後、培養温度を５０℃以下かつ第２の工程の培養温度よりも１０℃以上低い温度に変えて前記タンパク質を発現させる第３の工程と、
を含むことを特徴とする、タンパク質発現方法。
【請求項２】
前記タンパク質の至適温度が５０℃以下かつ前記好熱菌の至適増殖温度よりも１０℃以上低い温度であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質発現方法。
【請求項３】
第２の工程の培養温度が５０〜７５℃であることを特徴とする請求項１又は２のうちのいずれか一項に記載のタンパク質発現方法。
【請求項４】
第３の工程の培養温度が２５〜４５℃であることを特徴とする請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載のタンパク質発現方法。
【請求項５】
好熱菌によりタンパク質を製造するタンパク質製造方法であって、
請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載のタンパク質発現方法により前記タンパク質を発現させる工程と、
前記タンパク質を回収する第４の工程と、
を含むことを特徴とする、タンパク質製造方法。
【請求項６】
好熱菌においてタンパク質を発現させるためのプロモーターであって、
次の（ｄ）〜（ｆ）：
（ｄ）配列番号１〜８のうちのいずれかに記載の塩基配列
（ｅ）プロモーター活性を有し、配列番号１〜８のうちのいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列
（ｆ）ゲオバチルス属菌由来であり、プロモーター活性を有し、かつ、配列番号１〜８のうちのいずれかに記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列
からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなり、かつ、
請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載のタンパク質発現方法又は請求項５に記載のタンパク質製造方法に用いられる、
ことを特徴とするプロモーター。
【請求項７】
好熱菌においてタンパク質を発現させる発現ベクターの作製用キットであって、請求項６に記載のプロモーターと、タンパク質をコードするＤＮＡを前記プロモーターに発現可能に連結可能な配列と、を有するベクターを含むことを特徴とする、発現ベクター作製用キット。
【請求項８】
好熱菌においてタンパク質を発現させる発現ベクターであって、請求項６に記載のプロモーターと、前記プロモーターに発現可能に連結されたタンパク質をコードするＤＮＡと、を有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項９】
請求項６に記載のプロモーターと、前記プロモーターに発現可能に連結されたタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む遺伝子構築物が導入されてなることを特徴とする形質転換体。
【請求項１０】
前記遺伝子構築物が、至適増殖温度が５０℃以上である好熱菌に導入されていることを特徴とする、請求項９に記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好熱菌におけるタンパク質発現方法及びタンパク質製造方法、並びに、それらに用いるプロモーター、発現ベクター作製用キット、発現ベクター、及び形質転換体に関し、より詳しくは、好熱菌において低温でタンパク質を発現させる方法及びタンパク質を製造する製造方法、並びに、それらに用いるプロモーター、発現ベクター作製用キット、発現ベクター、及び形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、タンパク質を製造する方法としては、各種生物体内のタンパク質を抽出する方法の他、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを宿主微生物に導入した形質転換体を培養して当該タンパク質を発現させる方法が知られており、前記宿主微生物としては、大腸菌や酵母菌等が汎用されている。また、このように形質転換体においてタンパク質を発現させる方法では、ＲＮＡポリメラーゼに認識されるプロモーターに目的ＤＮＡを発現可能に連結した発現ベクター等の遺伝子構築物を用いることが一般的であり、前記プロモーターとしては、例えば、大腸菌由来のｌａｃ、ｔｒｐ、ｇａｌ等のプロモーターが知られている。しかしながら、従来の宿主微生物を用いた方法では、目的とするタンパク質に加えて、当該宿主微生物由来のタンパク質も同時に発現してしまうため、目的とするタンパク質の発現を制御しながら効率良く製造するためのプロモーターやタンパク質発現方法の開発が望まれている。
【０００３】
目的とするタンパク質の発現を制御することを目的としたプロモーターとしては、例えば、国際公開第１９９９／０２７１１７号（特許文献１）及び特開２００６−３４０７２９号公報（特許文献２）において、大腸菌由来のｃｓｐＡ遺伝子の低温誘導発現プロモーターが記載されている。さらに、Ｓｕｐａｃｈｏｋ  Ｓｉｎｃｈａｉｋｕｌら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００２、２、ｐ．１３１６−１３２４（非特許文献１）及びＳｕｐａｃｈａｉ  Ｔｏｐａｎｕｒａｋら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００５、５、ｐ．４４５６−４４７１（非特許文献２）には、それぞれ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（バチルス・ステアロサーモフィルス）  Ｐ１及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＬＳ３３において、低温で発現が誘導されるコールドショックプロテインが存在することが記載されている。
【０００４】
また、目的とするタンパク質の発現を制御することを目的とする方法としては、例えば、特開２０１１−１６０７７８号公報（特許文献３）において、耐熱性酵素をコードしている遺伝子を用いて抗酸菌を形質転換することにより形質転換体を得る工程と前記形質転換体を加熱処理することにより固定化耐熱性酵素を得る工程とを含む製造方法が記載されている。しかしながら、これまで好熱菌において、好熱菌の至適増殖温度よりも低い低温でタンパク質を発現させることができるタンパク質発現方法及び該発現方法に用いるためのプロモーターやそれを含む遺伝子構築物は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第１９９９／０２７１１７号
【特許文献２】特開２００６−３４０７２９号公報
【特許文献３】特開２０１１−１６０７７８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｕｐａｃｈｏｋ  Ｓｉｎｃｈａｉｋｕｌら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００２、２、ｐ．１３１６−１３２４
【非特許文献２】Ｓｕｐａｃｈａｉ  Ｔｏｐａｎｕｒａｋら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００５、５、ｐ．４４５６−４４７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、至適増殖温度が５０℃以上である好熱菌において比較的低温でタンパク質を発現させることができるタンパク質発現方法及びタンパク質製造方法、並びに、それらに用いるプロモーター、発現ベクター作製用キット、発現ベクター、及び形質転換体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、至適増殖温度が高温（５０℃以上）の好熱菌に、特定の塩基配列からなるプロモーターと、前記プロモーターに発現可能に連結されたタンパク質をコードするＤＮＡとを導入して得られた形質転換体を、先ず高温（５０℃以上）で培養し、次いで低温（５０℃以下かつ前記高温よりも１０℃以上低い温度）で培養することによって、前記形質転換体の増殖段階と前記タンパク質の発現段階とを分けることができ、更に前記好熱菌由来のタンパク質の発現や酵素活性が抑制される低温において十分に目的とするタンパク質を発現させることができるため、目的のタンパク質を低温で選択的に効率よく得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明のタンパク質発現方法は、好熱菌においてタンパク質を発現させるタンパク質発現方法であって、
至適増殖温度が５０℃以上である好熱菌に、次の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列
（ｂ）プロモーター活性を有し、配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列
（ｃ）ゲオバチルス属菌由来であり、プロモーター活性を有し、かつ、配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列
からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなるプロモーターと、前記プロモーターに発現可能に連結されたタンパク質をコードするＤＮＡとを含む遺伝子構築物を導入して、形質転換体を得る第１の工程と、
５０℃以上の培養温度で前記形質転換体を培養して増殖させる第２の工程と、
第２の工程の後、培養温度を５０℃以下かつ第２の工程の培養温度よりも１０℃以上低い温度に変えて前記タンパク質を発現させる第３の工程と、
を含むことを特徴とする方法である。
【００１０】
本発明のタンパク質発現方法においては、前記タンパク質の至適温度が５０℃以下かつ前記好熱菌の至適増殖温度よりも１０℃以上低い温度であることが好ましい。
【００１１】
また、本発明のタンパク質発現方法においては、第２の工程の培養温度が５０〜７５℃であることが好ましく、また、第３の工程の培養温度が２５〜４５℃であることが好ましい。
【００１２】
本発明のタンパク質製造方法は、好熱菌によりタンパク質を製造するタンパク質製造方法であって、本発明のタンパク質発現方法によりタンパク質を発現させる工程と、前記タンパク質を回収する第４の工程と、を含むことを特徴とする製造方法である。
【００１３】
本発明のプロモーターは、好熱菌においてタンパク質を発現させるためのプロモーターであって、
次の（ｄ）〜（ｆ）：
（ｄ）配列番号１〜８のうちのいずれかに記載の塩基配列
（ｅ）プロモーター活性を有し、配列番号１〜８のうちのいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列
（ｆ）ゲオバチルス属菌由来であり、プロモーター活性を有し、かつ、配列番号１〜８のうちのいずれかに記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列
からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなり、かつ、
本発明のタンパク質発現方法又は本発明のタンパク質製造方法に用いられる、
ことを特徴とするものである。
【００１４】
また、本発明の発現ベクター作製用キットは、好熱菌においてタンパク質を発現させる発現ベクターの作製用キットであって、本発明のプロモーターと、タンパク質をコードするＤＮＡを前記プロモーターに発現可能に連結可能な配列と、を有するベクターを含むことを特徴とするものである。
【００１５】
さらに、本発明の発現ベクターは、好熱菌においてタンパク質を発現させる発現ベクターであって、本発明のプロモーターと、前記プロモーターに発現可能に連結されたタンパク質をコードするＤＮＡと、を有することを特徴とするものである。
【００１６】
また、本発明の形質転換体は、本発明のプロモーターと、前記プロモーターに発現可能に連結されたタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む遺伝子構築物が導入されてなることを特徴とするものであり、前記形質転換体としては、前記遺伝子構築物が、至適増殖温度が５０℃以上である好熱菌に導入されているものであることが好ましい。
【００１７】
なお、本発明において、「至適増殖温度」とは、微生物が最も急速に増殖する温度を指し、各温度で微生物を一定時間培養して得られる比増殖速度が最も大きくなる温度をその微生物の至適増殖温度とすることができる。また、本発明において、「至適温度」とは、タンパク質において最も安定にその機能が活性化される温度を指し、例えば、前記タンパク質が酵素の場合には、その反応速度が最も大きくなる温度をし、前記タンパク質が蛍光タンパク質である場合には、その蛍光強度が最も大きくなる温度を指し、前記タンパク質がタンパク質タグや結合タンパク質である場合には、これらのタグ機能又は結合機能が最も高くなる温度を指す。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、至適増殖温度が５０℃以上である好熱菌において比較的低温でタンパク質を発現させることができるタンパク質発現方法及びタンパク質製造方法、並びに、それらに用いるプロモーター、発現ベクター作製用キット、発現ベクター、及び形質転換体を提供することが可能となる。そのため、宿主微生物である好熱菌由来のタンパク質の発現や酵素活性が抑制される低温域（好ましくは５０℃以下かつ第２の工程の培養温度よりも１０℃以上低い温度、より好ましくは２５〜４５℃、更に好ましくは３０〜４２℃）において、目的とするタンパク質を選択的に発現させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】各プロモーターを用いた培養毎に、第３の培養の培養条件と細胞蛍光強度との関係をそれぞれ示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
【００２１】
＜タンパク質発現方法、タンパク質製造方法＞
本発明のタンパク質発現方法は、
好熱菌においてタンパク質を発現させるタンパク質発現方法であって、
至適増殖温度が５０℃以上である好熱菌に、次の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列
（ｂ）プロモーター活性を有し、配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列
（ｃ）ゲオバチルス属菌由来であり、プロモーター活性を有し、かつ、配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列
からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなるプロモーターと、前記プロモーターに発現可能に連結されたタンパク質をコードするＤＮＡとを含む遺伝子構築物を導入して、形質転換体を得る第１の工程と、
５０℃以上の培養温度で前記形質転換体を培養して増殖させる第２の工程と、
第２の工程の後、培養温度を５０℃以下かつ第２の工程の培養温度よりも１０℃以上低い温度に変えて前記タンパク質を発現させる第３の工程と、
を含む。また、本発明のタンパク質製造方法は、好熱菌によりタンパク質を製造するタンパク質製造方法であって、
前記タンパク質発現方法により前記タンパク質を発現させる工程と、
前記タンパク質を回収する第４の工程と、
を含む。
【００２２】
（第１の工程）
本発明に係る第１の工程は、好熱菌に、プロモーターと、前記プロモーターに発現可能に連結されたタンパク質をコードするＤＮＡとを含む遺伝子構築物を導入して、形質転換体を得る工程である。
【００２３】
〔好熱菌〕
本発明において、「好熱菌」とは、至適増殖温度が５０℃以上である微生物である。このような好熱菌としては、好熱性真正細菌、超好熱性真正細菌、好熱性古細菌及び超好熱性古細菌が挙げられ、発現が容易である観点からは、好熱性真正細菌又は超好熱性真正細菌であることが好ましい。なお、本発明において、好熱性とは、微生物の至適増殖温度が５０℃以上８０℃未満であることを指し、超好熱性とは、微生物の至適増殖温度が８０℃以上であることを指す。
【００２４】
前記好熱性真正細菌及び超好熱性真正細菌としては、公的機関から入手可能であり、形質転換体の作製の実績がある、又は形質転換体の作製が比較的容易である傾向にある観点から、ゲオバチルス属、バチルス属、サーマス属、サーモトガ属、シュードサーモトガ属、サーモデスルフォバクテリウム属、アクウィフェクス属であることが好ましく、ゲオバチルス属、バチルス属、サーマス属、サーモトガ属であることがより好ましく、ゲオバチルス属であることが特に好ましい。
【００２５】
前記ゲオバチルス属としては、ゲオバチルス・サーモグルコシダシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ、至適増殖温度：５５℃）、ゲオバチルス・カウストフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ、至適増殖温度：５５℃）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、至適増殖温度：５５℃）、ゲオバチルス・サブテラネウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓ、至適増殖温度：５５℃）、ゲオバチルス・ウゼネンシス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｕｚｅｎｅｎｓｉｓ、至適増殖温度：５５℃）、ゲオバチルス・サーモカテニュラタス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、至適増殖温度：６０℃）、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、至適増殖温度：６０℃）、ゲオバチルス・サーモレオボランス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、至適増殖温度：６０℃）が挙げられる。
【００２６】
前記バチルス属としては、バチルス・サーマンタルクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ、至適増殖温度：５５℃）が挙げられ、前記サーマス属としては、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、至適増殖温度：７５℃）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、至適増殖温度：７０℃）が挙げられる。
【００２７】
また、前記サーモトガ属としては、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  至適増殖温度：８０℃）、サーモトガ・ナフトフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎａｐｈｔｈｏｐｈｉｌａ、至適増殖温度：８０℃）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、至適増殖温度：８５℃）、サーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ、至適増殖温度：８０℃）が挙げられ、前記シュードサーモトガ属としては、シュードサーモトガ・レティンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ、至適増殖温度：６５℃）が挙げられる。
【００２８】
さらに、前記サーモデスルフォバクテリウム属としては、サーモデスルフォバクテリウム・コムネ（Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ、至適増殖温度：７０℃）が挙げられ、前記アクウィフェクス属としては、アクウィフェクス・アエオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、至適増殖温度：８５℃）、アクウィフェクス・ピロフィラス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ、至適増殖温度：８５℃）が挙げられる。
【００２９】
前記好熱性古細菌及び超好熱性古細菌としては、公的機関から入手可能であり、形質転換体の作製の実績がある、又は形質転換体の作製が比較的容易である傾向にある観点から、アエロパイラム属、アルカエオグロバス属、メタノカルドコッカス属、メタノサーモバクター属、ピロコッカス属、スルフォロバス属であることが好ましい。前記アエロパイラム属としては、アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、至適増殖温度：９０℃）が挙げられ、前記アルカエオグロバス属としては、アルカエオグロバス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、至適増殖温度：８５℃）が挙げられ、前記メタノカルドコッカス属としては、メタノカルドコッカス・ヤナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、至適増殖温度：８０℃）が挙げられ、前記メタノサーモバクター属としては、メタノサーモバクター・サームオートトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、至適増殖温度：６５℃）が挙げられる。
【００３０】
また、前記ピロコッカス属としては、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、至適増殖温度：９７℃）、ピロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、至適増殖温度：９５℃）、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｉｉ、至適増殖温度：９０℃）が挙げられ、前記スルフォロバスとしては、スルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、至適増殖温度：７０℃）、スルフォロバス・トコダイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、至適増殖温度：７５℃）が挙げられる。
【００３１】
上記の中でも、本発明に係る好熱菌としては、比較的至適増殖温度が低く、第３の工程において目的とするタンパク質を安定に発現させやすい傾向にある観点から、ゲオバチルス属菌、バチルス属菌、サーマス属菌であることが好ましく、ゲオバチルス属菌であることがより好ましく、ゲオバチルス・カウストフィラスであることが特に好ましい。
【００３２】
本発明に係る好熱菌の至適増殖温度としては、５０℃以上であることが必要である。好熱菌の至適増殖温度が前記下限未満であると、形質転換体の増殖段階とタンパク質の発現段階とを分けることが困難となる。また、前記好熱菌の至適増殖温度としては、形質転換体の増殖段階とタンパク質の発現段階とをより区別することができ、かつ、形質転換体を増殖させるための培養がより容易であるという観点から、５０〜７５℃であることが好ましく、５０〜６５℃であることがより好ましい。
【００３３】
〔プロモーター〕
本発明のタンパク質発現方法及びタンパク質製造方法に用いられるプロモーターは、次の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列
（ｂ）プロモーター活性を有し、配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列
（ｃ）ゲオバチルス属菌由来であり、プロモーター活性を有し、かつ、配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列
からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなる。
【００３４】
本発明者らは、好熱菌であるゲオバチルス・カウストフィラスの、「（ａ）配列番号１〜９に示される塩基配列」（以下、それぞれ、
ＧＫ０６４７プロモーター（ｐＧＫ０６４７、配列番号：１に記載の塩基配列）、
ＧＫ１０３６プロモーター（ｐＧＫ１０３６、配列番号：２に記載の塩基配列）、
ＧＫ００３７プロモーター（ｐＧＫ００３７、配列番号：３に記載の塩基配列）、
ＧＫ０６６６プロモーター（ｐＧＫ０６６６、配列番号：４に記載の塩基配列）、
ＧＫ０４２１プロモーター（ｐＧＫ０４２１、配列番号：５に記載の塩基配列）、
ＧＫ３１０２プロモーター（ｐＧＫ３１０２、配列番号：６に記載の塩基配列）、
ＧＫ１７１０プロモーター（ｐＧＫ１７１０、配列番号：７に記載の塩基配列）、
ＧＫ０５５６プロモーター（ｐＧＫ０５５６、配列番号：８に記載の塩基配列）、及び
ＧＫ１３５６プロモーター（ｐＧＫ１３５６、配列番号：９に記載の塩基配列）
という）が、ゲオバチルス・カウストフィラスの至適増殖温度（５５℃）よりも１０℃以上低い温度において、同塩基配列に連結されたタンパク質の発現を誘導するプロモーターとして機能することを見い出した。
【００３５】
本発明に係るプロモーターとしては、目的とするタンパク質をより選択的に発現させることが可能となる観点から、前記好熱菌由来のタンパク質の発現や酵素活性が抑制される低温域でプロモーター活性を有することが必要であり、下記の第２の工程の培養温度よりも１０℃以上低い温度、かつ、５０℃以下、より好ましくは２５〜４５℃、更に好ましくは３０〜４２℃においてプロモーター活性を有していることが好ましい。また、前記好熱菌由来のタンパク質の発現や酵素活性が促進される高温域では目的とするタンパク質の発現を抑制して低温域でより選択的に発現させる観点から、本発明に係るプロモーターとしては、好ましくは５０℃を超える温度、より好ましくは５０℃を超えて７５℃以下、更に好ましくは５０℃を超えて６５℃以下において、プロモーター活性を有していないことが好ましい。なお、上記（ａ）の塩基配列がプロモーター活性を有していることは、例えば、前記塩基配列に蛍光タンパク質等のレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結した遺伝子構築物を調製し、これを宿主細胞に導入した形質転換体において前記レポータータンパク質が発現することを確認することで評価することができる。このようなプロモーター活性としては、前記塩基配列を用いて得られる、２５〜４５℃における、前記レポータータンパク質発現量（質量）が、６０℃における、前記レポータータンパク質発現量（質量）の、２倍以上であることが好ましく、４倍以上であることがより好ましい。
【００３６】
また、自然界において、塩基配列の変異は起こり得ることである。さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、例えば、ゲオバチルス・カウストフィラス由来の配列番号１〜９で示される塩基配列が得られた場合、その配列を改変し、プロモーター活性を維持した又はより向上させた配列を調製することもできる。したがって、本発明に係るプロモーターの他の態様には、「（ｂ）プロモーター活性を有し、配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列」からなるプロモーターも含まれる。
【００３７】
ここで「複数」とは、改変後の塩基配列がプロモーター活性を有する範囲における塩基の改変数であり、通常１〜８０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜数個（例えば、１〜１０個、１〜８個、１〜４個、１〜２個）である。また、前記改変数としては、改変前の全塩基数に対して、通常３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１５％以下、更に好ましくは１４％以下（例えば、０．５〜１４％、０．５〜１１％、０．５〜６％、０．５〜５％、０．５〜４％）である。
【００３８】
また、自然界において、同じ属に含まれる微生物間において、同様の機能を有する塩基配列は類似する傾向にある。さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、例えば、ゲオバチルス・カウストフィラス由来の配列番号１〜９で示される塩基配列が得られた場合、同じゲオバチルス属に含まれる微生物から当該塩基配列と配列同一性の高い塩基配列を得て、プロモーター活性を有する又はより活性の高い配列を調製することもできる。したがって、本発明に係るプロモーターの他の態様には、「（ｃ）ゲオバチルス属菌由来であり、プロモーター活性を有し、かつ、配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列」からなるプロモーターも含まれる。
【００３９】
ここで「配列同一性」とは、（ｃ）の塩基配列（改変後）がプロモーター活性を有する範囲における、配列番号１〜９で示される塩基配列（改変前）と改変後との２つの塩基配列間の塩基配列が一致する割合であり、７０％以上あればよいが、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、更に好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。
【００４０】
上記（ｂ）、（ｃ）の塩基配列（改変後の塩基配列）がプロモーター活性を有していることは、例えば、前記改変後の塩基配列に蛍光タンパク質等のレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結した遺伝子構築物を調製し、これを宿主細胞に導入した形質転換体において前記レポータータンパク質が発現することを確認することで評価することができる。このようなプロモーター活性としては、改変後の塩基配列を用いて得られるレポータータンパク質発現量（質量）が、改変前の塩基配列を用いて得られるレポータータンパク質発現量（質量）の、通常５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上であり、更に好ましくは９０％以上である。また、前記プロモーター活性としては、下記の第２の工程の培養温度よりも１０℃以上低い温度、かつ、５０℃以下、より好ましくは２５〜４５℃、更に好ましくは３０〜４２℃におけるプロモーター活性であることが好ましい。
【００４１】
本発明に係るプロモーターとしては、次の（ｄ）〜（ｆ）：
（ｄ）配列番号１〜８のうちのいずれかに記載の塩基配列
（ｅ）プロモーター活性を有し、配列番号１〜８のうちのいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列
（ｆ）ゲオバチルス属菌由来であり、プロモーター活性を有し、かつ、配列番号１〜８のうちのいずれかに記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列
からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなることが好ましく、次の（ｇ）〜（ｉ）：
（ｇ）配列番号１〜３のうちのいずれかに記載の塩基配列
（ｈ）プロモーター活性を有し、配列番号１〜３のうちのいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列
（ｉ）ゲオバチルス属菌由来であり、プロモーター活性を有し、かつ、配列番号１〜３のうちのいずれかに記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列
からなる群から選択されるいずれかの塩基配列からなることが好ましい。配列番号１〜３に記載の塩基配列、すなわち、ｐＧＫ０６４７、ｐＧＫ１０３６及びｐＧＫ００３７は、２５〜４５℃におけるレポーター活性が６０℃におけるレポーター活性に比べて十分に高くより優れたプロモーター活性を有しており、かつ、より安定して形質転換体を得られる傾向にある。
【００４２】
〔タンパク質をコードするＤＮＡ〕
本発明に係るタンパク質としては、特に制限されず、低エネルギーで有機物を合成・分解することができる；食品、医薬品、化粧品及び機能性材料等の様々な分野において広く用いられているといった観点からは、酵素であることが好ましく、融合タグ、レポーターとして機能させるという観点からは、蛍光タンパク質；Ｈｉｓタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ＦＬＡＧタグ等のタンパク質タグ；ストレプトアビジン、マルトース結合タンパク質等の結合タンパク質などのタンパク質であることが好ましい。
【００４３】
本発明に係るタンパク質としては、微生物由来であっても動物由来であっても植物由来であってもよく、これらを元に改変を加えた非天然由来のものであってもよいが、５０℃以下でより安定に発現する傾向にあり、かつ、より効率的・選択的に発現させることが可能となる観点から、至適温度が５０℃以下かつ前記好熱菌の至適増殖温度よりも１０℃以上低い温度であることが好ましく、２５〜４５℃であることがより好ましく、３０〜４２℃であることが更に好ましい。
【００４４】
前記微生物由来タンパク質としては、低温菌及び中温菌由来タンパク質が挙げられる。なお、本発明において、「低温菌及び中温菌」とは、至適増殖温度が５０℃以下である微生物である。また、前記低温菌とは、至適増殖温度が３０℃未満である微生物を指し、前記中温菌とは、至適増殖温度が３０〜５０℃である微生物を指す。このような低温菌及び中温菌としては、真正細菌、古細菌、真核生物が挙げられ、真正細菌であることがより好ましい。
【００４５】
前記低温菌及び中温菌としての真正細菌としては、特に制限されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、至適増殖温度：３７℃）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、至適増殖温度：３０℃）、コリネバクテリウム・グルタミウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、至適増殖温度：２８℃）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、至適増殖温度：３０℃）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、至適増殖温度：３７℃）、シュードモナス・メバロニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、至適増殖温度：３０℃）が挙げられる。前記低温菌及び中温菌としての古細菌としても、特に制限されないが、例えば、メタノサルキナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、至適増殖温度：３７℃）が挙げられる。また、前記低温菌及び中温菌としての真核生物としても、特に制限されないが、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、至適増殖温度：２５℃）が挙げられる。これらの中でも、前記低温菌及び中温菌としては、その微生物由来のタンパク質の使用実績が多い傾向にある観点から、大腸菌、枯草菌、クロストリジウム・アセトブチリクム、サッカロマイセス・セレビシエが好ましく、大腸菌が特に好ましい。
【００４６】
上記の好熱菌、低温菌及び中温菌は、例えば、ＢＧＳＣ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ）、ＡＴＣＣ（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ））、ＮＰＭＤ（独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター）等の公的な機関や、民間販売会社から入手することができる。
【００４７】
本発明に係る微生物由来タンパク質としては、例えば、大腸菌由来の糖代謝系酵素、解糖系酵素、非メバロン酸経路酵素、ブタノール発酵酵素、脂肪酸合成酵素；枯草菌由来の解糖系酵素、非メバロン酸経路酵素、ブタノール発酵酵素；コリネバクテリウム・グルタミウム由来のブタノール発酵酵素、シキミ酸経路酵素；ラクトコッカス・ラクチス由来のブタノール発酵酵素；クロストリジウム・アセトブチリクム由来のアセトン−ブタノール−エタノール発酵酵素；シュードモナス・メバロニ由来のメバロン酸経路酵素；メタノサルキナ・マゼイ由来のメバロン酸経路酵素；サッカロマイセス・セレビシエ由来の解糖系酵素、エタノール発酵酵素、メバロン酸経路酵素等の酵素が挙げられる。
【００４８】
前記大腸菌由来の糖代謝系酵素としては、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）が挙げられる。また、前記大腸菌、前記枯草菌又は前記サッカロマイセス・セレビシエ由来の解糖系酵素としては、ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ−１、フルクトース１，６−ビスリン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、ホスホピルビン酸ヒドラターゼ、ピルビン酸キナーゼが挙げられる。
【００４９】
さらに、前記大腸菌又は前記枯草菌由来の非メバロン酸経路酵素としては、ＤＯＸＰシンターゼ、ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、４−ジホスホヂチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰシンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰレダクターゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼが挙げられる。
【００５０】
また、前記大腸菌由来のブタノール発酵酵素としては、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼが；前記枯草菌由来のブタノール発酵酵素としては、アセト乳酸合成酵素が；コリネバクテリウム・グルタミウム由来のブタノール発酵酵素としては、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、アルコール脱水素酵素が；前記ラクトコッカス・ラクチス由来のブタノール発酵酵素としては、ケト酸デカルボキシラーゼが；それぞれ挙げられる。
【００５１】
さらに、前記大腸菌由来の脂肪酸合成酵素としては、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ＡＣＰ−アセチルトランスフェラーゼ、ＡＣＰ−マロニルトランスフェラーゼ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、β−ケトアシルＡＣＰレダクターゼ、３−ヒドロキシアシルＡＣＰデヒドラーゼ、エノイルＡＣＰレダクターゼが挙げられる。
【００５２】
前記コリネバクテリウム・グルタミウム由来のシキミ酸経路酵素としては、７−ホスホ−２−デヒドロ−３−デオキシアラビノヘプトン酸アルドラーゼ、３−デヒドロキナ酸シンターゼ、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、３−ホスホシキミ酸１−カルボキシビニルトランスフェラーゼ、コリスミ酸シンターゼ、コリスミ酸ムターゼが挙げられる。
【００５３】
前記クロストリジウム・アセトブチリクム由来のアセトン−ブタノール−エタノール発酵酵素としては、ピルビン酸シンターゼ、チオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトニルＣｏＡヒドラターゼ、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、エタノールデヒドロゲナーゼ、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ブタノールデヒドロゲナーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼが挙げられる。
【００５４】
前記シュードモナス・メバロニ由来のメバロン酸経路酵素としては、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼが；メタノサルキナ・マゼイ又はサッカロマイセス・セレビシエ由来のメバロン酸経路酵素としては、アセチルＣｏＡシンターゼ、アセチルＣｏＡ−アセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸Δ−イソメラーゼが；前記サッカロマイセス・セレビシエ由来のエタノール発酵酵素としては、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼが；それぞれ挙げられる。
【００５５】
また、前記動物由来タンパク質としては、特に限定されないが、例えば、オワンクラゲ由来の蛍光タンパク質（ｖｅｎｕｓ、ＧＦＰ、ｃｅｒｕｌｅａｎ等）、造礁サンゴ由来の蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ等）が挙げられる。さらに、前記植物由来タンパク質としても特に限定されないが、例えば、イソプレン合成酵素が挙げられる。また、前記以外のタンパク質としては、例えば、前記タンパク質タグや前記結合タンパク質が挙げられる。
【００５６】
本発明に係るタンパク質としては、上記のうちの１種を単独で発現させても２種以上を組み合わせて発現させてもよく、上記のうちの２種以上の融合タンパク質であってもよい。
【００５７】
上記のタンパク質をコードするのＤＮＡの配列情報は、公的に利用可能なデータベース、例えば、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において入手することができる。
【００５８】
〔遺伝子構築物、発現ベクター作製用キット、発現ベクター〕
本発明のタンパク質発現方法及びタンパク質製造方法に用いられる遺伝子構築物は、前記プロモーターと、前記プロモーターに発現可能に連結された前記タンパク質をコードするＤＮＡとを含むものである。前記遺伝子構築物としては、前記プロモーター及び前記タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現カセットの形態であっても、前記発現カセットが自己複製能を持つプラスミドに挿入された発現ベクターの形態であってもよい。
【００５９】
本発明に係る遺伝子構築物においては、前記タンパク質をコードするＤＮＡが前記プロモーターに発現可能に連結していることが必要である。本発明において、前記プロモーターは、一般に、前記タンパク質をコードするＤＮＡの上流に位置させ、好ましくは０〜１５塩基上流、より好ましくは０〜５塩基上流に位置させる。
【００６０】
前記遺伝子構築物を得る方法としては、特に制限されず、公知の方法を適宜採用することができる。例えば、本発明に係るプロモーター及び目的タンパク質をコードするＤＮＡを単離し、次いで、単離したプロモーター及び目的タンパク質をコードするＤＮＡを、発現ベクターの母体となるプラスミドに導入することによって得ることができる。
【００６１】
したがって、本発明のタンパク質発現方法及びタンパク質製造方法に用いられる発現ベクター作製用キットは、好熱菌においてタンパク質を発現させる発現ベクターの作製用キットであって、前記プロモーターと、前記タンパク質をコードするＤＮＡを前記プロモーターに発現可能に連結可能な配列と、を有するベクターを含む。また、本発明のタンパク質発現方法及びタンパク質製造方法に用いられる発現ベクターは、前記プロモーターと、前記プロモーターに発現可能に連結されたタンパク質をコードするＤＮＡと、を有する。ここで、前記タンパク質をコードするＤＮＡを前記プロモーターに発現可能に連結可能な配列としては、特に制限されず、例えば、制限酵素に認識される塩基配列や、これらが複数集まったマルチクローニングサイトが挙げられる。
【００６２】
前記発現ベクターは、前記プライマー及び前記タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能な状態で含むベクターであり、前記好熱菌内で自己複製可能であることが好ましく、例えば、プラスミド、ファージ、コスミドを基本に構築することができる。前記発現ベクターの母体となるプラスミドは、発現ベクターを導入する好熱菌の種類や導入方法に応じて適宜選択することができ、具体的には、例えば、ｐＧＫＥ（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｈｉｒｏｋａｚｕら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１５年１月、８１（１）、ｐ．１４９−１５８）、ｐＮＷ３３Ｎ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：  ＡＹ２３７１２２．１）、ｐＵＢ１１０（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：  Ｍ１９４６５．１）、ｐＳＴＫ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：  Ｄ２９９８９．１）、ｐＴＢ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：  Ｍ６３８９１．１）等のプラスミド及びその誘導体が挙げられる。
【００６３】
前記発現ベクターとしては、前記プライマー及び前記タンパク質をコードするＤＮＡの他に、これを実際に前記好熱菌に導入して前記タンパク質を発現させるために、その発現を制御するポリヌクレオチド配列や形質転換体を選択するための遺伝子マーカー等を更に含んでいることが好ましい。また、前記タンパク質を精製するための精製用タグ配列や、前記タンパク質を好熱菌外に分泌させる分泌シグナル配列等を更に含んでいてもよい。
【００６４】
前記発現を制御するポリヌクレオチド配列としては、例えば、ターミネーター、又はシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が挙げられる。前記遺伝子マーカーとしては、形質転換体の選択方法に応じて適宜選択することができ、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
【００６５】
前記発現ベクターの作製方法は、特に制限されず、公知の方法、又は公知の方法に適宜修飾、改変を加えた方法を適宜採用することができる。例えば、前記プロモーターと前記タンパク質をコードするＤＮＡと必要に応じて前記ターミネーター等とを連結して発現カセットを作製し、これを前記プラスミドに導入することで前記発現ベクターを得ることができる。また、例えば、前記プロモーターを有するベクターを調製し、これに前記タンパク質をコードするＤＮＡを連結することで前記発現ベクターを得ることができる。前記発現ベクターを作製するための酵素や条件についても特に限定されず、市販のものを適宜選択して用いることができる。
【００６６】
本発明に係るプロモーターを単離する方法としては、例えば、ゲオバチルス属菌から抽出したゲノムＤＮＡを、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、ＢＡＣベクター等のベクターと連結してＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを作製し、本発明に係るプロモーターの塩基配列（例えば、配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列）に基づいて作成したプローブを用いたハイブリダイゼーションによって前記ライブラリーから所望のゲノムＤＮＡを単離する方法；本発明に係るプロモーターの塩基配列（例えば、配列番号１〜９のうちのいずれかに記載の塩基配列）に基づいて作成したプライマーを用いて、ゲオバチルス属菌のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを実施し、増幅したＤＮＡ断片を適当なベクターと連結することによって所望のゲノムＤＮＡを単離する方法；人工的に化学合成する方法が挙げられる。
【００６７】
本発明に係るタンパク質をコードするＤＮＡを単離する方法としては、例えば、目的のタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、同タンパク質を有する生物（例えば、低温菌及び／又は中温菌や他の生物）由来のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを実施し、増幅したＤＮＡ断片を適当なベクターと連結することによって所望のゲノムＤＮＡを単離する方法；目的のタンパク質を有する生物（例えば、低温菌及び／又は中温菌や他の生物）からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出し、これを基に合成したｃＤＮＡを適当なベクターと連結してＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを作製し、目的のタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて作製したプローブを用いたハイブリダイゼーションによって前記ライブラリーから所望のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを単離する方法；人工的に化学合成する方法が挙げられる。
【００６８】
〔形質転換体〕
本発明のタンパク質発現方法及びタンパク質製造方法に用いられる形質転換体は、前記好熱菌に前記遺伝子構築物が導入されてなる形質転換体である。前記遺伝子構築物としては、自己複製可能な発現ベクターの形態で導入されていても、前記発現カセットの形態で前記好熱菌のゲノムに組み込まれていてもよい。
【００６９】
前記形質転換体を得る方法としては、特に制限されず、公知の方法又は公知の方法に適宜改変を加えた条件を適宜採用することができる。例えば、前記発現ベクターを前記高熱菌に導入し、接合伝達等によって前記遺伝子構築物を前記好熱菌のゲノムに組み込むことによって目的の形質転換体を得ることができる。また、前記発現ベクターとして自己複製が可能な発現ベクターを調製して前記好熱菌に導入することによって目的の形質転換体を得ることもできる。
【００７０】
前記好熱菌に前記発現ベクターを導入する形質転換方法としては、特に制限されず、公知の方法又は公知の方法に適宜改変を加えた方法を適宜採用することができ、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法を用いることができる。また、前記発現ベクターが導入される好熱菌としては、必要に応じて、特定の機能が欠損するように既に形質転換されたものや変異体であってもよい。
【００７１】
（第２の工程）
本発明に係る第２の工程は、５０℃以上の培養温度で前記形質転換体を培養して増殖させる工程である。第２の工程の培養温度が前記下限未満であると、形質転換体の増殖段階と前記タンパク質の発現段階とを分けることが困難となる。また、第２の工程の培養温度としては、形質転換体の増殖段階と前記タンパク質の発現段階とをより区別することができ、かつ、形質転換体を増殖させるための培養がより容易であるという観点から、５０〜７５℃であることが好ましく、５０〜６５℃であることがより好ましい。
【００７２】
（第３の工程）
本発明に係る第３の工程は、第２の工程の後、培養温度を、５０℃以下かつ第２の工程の培養温度よりも１０℃以上低い温度に変えて前記タンパク質を発現させる工程である。第３の工程の培養温度が前記上限を超えると、形質転換体の増殖段階と前記タンパク質の発現段階とを分けることが困難となる。また、第３の工程の培養温度としては、前記好熱菌由来のタンパク質の発現や酵素活性がより抑制され、形質転換体の増殖段階と前記タンパク質の発現段階とをより区別することができ、かつ、形質転換体の死滅を抑制する観点から、第２の工程の培養温度よりも１０℃以上低い温度、かつ、２５〜４５℃であることが好ましく、３０〜４２℃であることがより好ましい。
【００７３】
また、本発明においては、前記形質転換体が対数増殖期にあるとき、より具体的には前記形質転換体を培養する培養液のＯＤ６００が１．０以下、更に好ましくは０．５〜１．０であるときに、培養温度を、第２の工程の培養温度から第３の工程の培養温度に変えることが好ましい。培養温度を変えるときのＯＤ６００が前記下限未満の場合には、形質転換体の増殖が十分ではないために前記タンパク質の発現量が少なくなる傾向にあり、他方、前記上限を超える場合には、前記タンパク質を発現させることが困難となる傾向にある。なお、本発明において、ＯＤ６００値とは、形質転換体を培養している培養液（培地、微生物等、培養系に含まれる全成分を含む）の６００ｎｍにおける吸光度のことを指す。
【００７４】
また、本発明において、培養温度を第２の工程の温度から第３の工程の温度に変えた後の培養時間、すなわち、第３の工程の培養時間としては、宿主微生物である好熱菌の種類や培養条件にもよるが、例えば、前記好熱菌としてゲオバチルス属（より好ましくはゲオバチルス・カウストフィラス）を用いた場合には、１時間以上であることが好ましく、３〜４８時間であることがより好ましく、３〜２４時間であることが更に好ましい。温度変更後の培養時間が前記下限未満の場合には、前記タンパク質の発現量が少なくなる傾向にあり、他方、前記上限を超える場合には、発現速度が低下して前記タンパク質の発現量が安定しなくなる傾向にある。
【００７５】
前記第２の工程及び第３の工程において、上記以外の形質転換体を培養する条件（培地の組成、培地のｐＨ、ガス（酸素、二酸化炭素等）濃度等）としては、特に制限されず、宿主微生物である好熱菌の種類に応じて、公知の培養条件、又は公知の培養条件に適宜修飾、改変を加えた条件から選択することができる。
【００７６】
本発明に係る第３の工程においては、前記好熱菌を用いた形質転換体の増殖を抑制しつつ、目的の前記タンパク質を優先的に発現させることができる。
【００７７】
（第４の工程）
本発明のタンパク質製造方法は、第３の工程の後、同工程で発現させた前記タンパク質を回収する第４の工程を含む。
【００７８】
本発明においては、例えば、前記発現ベクターとして分泌シグナル配列を含むベクターを用い、第２の工程後に培地を交換し、第３の工程で前記タンパク質を発現させることにより、前記タンパク質を選択的に培地中に得ることができる。また、分泌シグナル配列を含むベクターを用いなかった場合でも、目的のタンパク質が酵素である場合、得られる酵素（タンパク質）の至適温度付近では宿主微生物である好熱菌由来の酵素の活性が抑制されるため、形質転換体を含む培養液をそのまま粗酵素として酵素反応に用いることができる。したがって、前記タンパク質を回収する方法としては、第３の工程後の培地をそのまま回収する方法も含む。
【００７９】
さらに、前記タンパク質を回収する方法としては、形質転換体の培養終了後（第３の工程後）、培地から形質転換体を遠心分離や濾過等によって集菌して破砕し、得られた破砕液中のタンパク質を精製する方法が挙げられる。なお、この方法においては、前記破砕液をそのまま粗タンパク質として用いることもできる。
【００８０】
前記タンパク質を精製する方法としては、特に制限されず、限外濾過法、塩析法、有機溶媒沈殿法、膜分離法、クロマト分離法を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。さらに、前記発現ベクターとして精製用タグ配列を含むベクターを用いた場合には、精製用タグを付加したタンパク質をタグ付きタンパクの精製用カラムを用いて精製してもよい。
【００８１】
本発明のタンパク質発現方法及びタンパク質製造方法によって得られたタンパク質は、前記タンパク質の種類に応じて、様々な用途に利用することができる。例えば、前記タンパク質が酵素である場合には、前記酵素と、その基質と、必要に応じて前記酵素の補酵素とを接触させて反応せしめる酵素反応に用いることができる。このような酵素反応における各成分の濃度、溶媒の種類、温度条件、反応温度等については、前記タンパク質の種類に応じて適宜調整することができる。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８３】
＜遺伝子発現変動評価＞
（ＲＮＡサンプルの調製）
先ず、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ（ゲオバチルス・カウストフィラス）  ＨＴＡ４２６をＬＢ寒天培地上で生育させ、ＬＢ液体培地で６０℃において前培養した後、培養液（２００μＬ）をＬＢ液体培地（２０ｍＬ、三角フラスコ）に接種して振盪培養した。ＯＤモニター（タイテック社製）を用いて測定されるＯＤ６００が１．０になったところで培養液の入った三角フラスコを１８℃の水槽に５分間浸けて急冷し、続いて、１８℃で振盪培養した。急冷してから１時間培養後の培養液２．５ｍＬから菌体を回収し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製してＲＮＡサンプル２を得た。ＲＮＡ精製にはＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）及びＲＮＡ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。また、同様にして、１８℃に急冷してから６時間培養後の培養液から菌体を回収し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製してＲＮＡサンプル３を得た。
【００８４】
さらに、急冷する温度を３０℃又は４２℃としたこと以外は上記と同様にして、急冷してから１時間培養後及び６時間培養後の各培養液から菌体を回収してｔｏｔａｌ  ＲＮＡをそれぞれ精製し、各ＲＮＡサンプル４〜７を得た。また、急冷前の培養液（ＯＤ６００＝１．０）２．５ｍＬからも菌体を回収し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製してＲＮＡサンプル１を得た。得られたＲＮＡサンプル１〜７の急冷後の培養温度及び培養時間を下記の表１に示す。
【００８５】
【表１】
2019033695.tif 000002
【００８６】
（ＲＮＡ−ｓｅｑ、プロモーターのＲＰＫＭ値比較）
次いで、得られたＲＮＡサンプル１〜７をＲＮＡ−ｓｅｑ解析に供して各サンプルにおいて発現したＲＮＡ量を推定し、ＲＰＫＭ（ｒｅａｄｓ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅａｄｓ）値を求めた。なお、ＲＮＡ−ｓｅｑ解析は株式会社生物技研に依頼して行った（受注番号：９６０９１５０５）。
【００８７】
ＲＮＡ−ｓｅｑ解析において、ｒｐｏＢ（ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｂ）遺伝子のＲＰＫＭ値が各サンプル間でおよそ均一であったことから、各遺伝子について、サンプル１〜７間でのＲＰＫＭ値の変動を比較した。その結果、ＧＫ０６４７遺伝子、ＧＫ１０３６遺伝子、ＧＫ００３７遺伝子、ＧＫ０６６６遺伝子、ＧＫ０４２１遺伝子、ＧＫ３１０２遺伝子、ＧＫ１７１０遺伝子、ＧＫ０５５６遺伝子、ＧＫ１３５６遺伝子、ＧＫ０８６５遺伝子において、（１）サンプル４におけるＲＰＫＭ値が１０，０００以上、又は、（２）サンプル４におけるＲＰＫＭ値が５，０００以上、サンプル４におけるＲＰＫＭ値がサンプル１におけるＲＰＫＭ値の５倍以上、かつ、サンプル５におけるＲＰＫＭ値が２，５００以上、でありＲＰＫＭ値の変動が低温において特に大きいことが確認された。各遺伝子の各サンプルにおけるＲＰＫＭ値をｒｐｏＢ遺伝子の各サンプルにおけるＲＰＫＭ値と併せて下記の表２に示す。なお、周辺遺伝子の解析より、表２に示す遺伝子は全てモノシストロニックであると推定された。
【００８８】
【表２】
2019033695.tif 000003
【００８９】
ＧＫ０６４７遺伝子、ＧＫ１０３６遺伝子、ＧＫ００３７遺伝子、ＧＫ０６６６遺伝子、ＧＫ０４２１遺伝子、ＧＫ３１０２遺伝子、ＧＫ１７１０遺伝子、ＧＫ０５５６遺伝子、ＧＫ１３５６遺伝子、ＧＫ０８６５遺伝子から、それぞれ、これらの遺伝子のプロモーターの位置を推定し、順に、
ＧＫ０６４７プロモーター（ｐＧＫ０６４７、配列番号：１に記載の塩基配列）、
ＧＫ１０３６プロモーター（ｐＧＫ１０３６、配列番号：２に記載の塩基配列）、
ＧＫ００３７プロモーター（ｐＧＫ００３７、配列番号：３に記載の塩基配列）、
ＧＫ０６６６プロモーター（ｐＧＫ０６６６、配列番号：４に記載の塩基配列）、
ＧＫ０４２１プロモーター（ｐＧＫ０４２１、配列番号：５に記載の塩基配列）、
ＧＫ３１０２プロモーター（ｐＧＫ３１０２、配列番号：６に記載の塩基配列）、
ＧＫ１７１０プロモーター（ｐＧＫ１７１０、配列番号：７に記載の塩基配列）、
ＧＫ０５５６プロモーター（ｐＧＫ０５５６、配列番号：８に記載の塩基配列）、
ＧＫ１３５６プロモーター（ｐＧＫ１３５６、配列番号：９に記載の塩基配列）、
ＧＫ０８６５プロモーター（ｐＧＫ０８６５、配列番号：１０に記載の塩基配列）
とした。
【００９０】
ＧＫ０６４７プロモーター（ｐＧＫ０６４７）
（実施例１）
＜発現ベクターの調製＞
ｐＧＡＭ５９プラスミド（配列番号：１１に記載の塩基配列）に、プロモーター活性をモニターするためのレポータータンパク質として、Ｎａｇａｉ  Ｔ．ら、「Ａ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００２年１月、２０（１）、ｐ．８７−９０に記載の黄色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡをゲオバチルス属菌にコドンを合わせ、ＳｐｈＩ切断部位及びＢａｍＨＩ切断部位を付加した合成ＤＮＡ（ｖｅｎｕｓ、配列番号：１２に記載の塩基配列）が含まれるゲオバチルス用ｖｅｎｕｓの発現プラスミド（ｐＧＡＭ５９−ｖｅｎｕｓ）に、ＧＫ０６４７プロモーター（ｐＧＫ０６４７）を挿入して、ｐＧＫ０６４７と、ｐＧＫ０６４７に連結されたｖｅｎｕｓとからなる発現カセットを有する発現ベクターを作製した。すなわち、先ず、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラ社製）を用いて、次の条件：
プライマー［Ｐｇｋ０６４７（−２５０Ｆ，ＨｉｎｄＩＩＩ）プライマー、配列番号：１３に記載の塩基配列；Ｐｇｋ０６４７（０Ｒ，ＳｐｈＩ）プライマー、配列番号：１４に記載の塩基配列］：各１０ｐｍｏｌ（０．３μＭ）
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：０．５μＬ（１．２５ｕｎｉｔ）
５×ＰＳバッファー：６μＬ（１×）
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ：２．５μＬ（２００μＭ  ｅａｃｈ）
鋳型ＤＮＡ（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ＭＫ２４２染色体ＤＮＡ）：１μＬ（０．１μｇ）
滅菌水：１９μＬ（ｆｉｎａｌ  ３０μＬ）
サイクル：９８℃で１０秒；５５℃で５秒；７２℃で３０秒；を３０サイクル
でＰＣＲを行い、ｐＧＫ０６４７を単離・増幅した。次いで、得られたＰＣＲ産物（ｐＧＫ０６４７）及びｐＧＡＭ５９−ｖｅｎｕｓを、それぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩで切断し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラ社製）を用いて、次の条件：
ｐＧＫ０６４７：１μＬ（０．０１μｇ）
ｐＧＡＭ５９−ｖｅｎｕｓ：１μＬ（０．０１μｇ）
２×Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ：２μＬ
１６℃で３０分間
で連結し、ｐＧＫ０６４７とｐＧＫ０６４７に連結されたｖｅｎｕｓとを有する発現ベクター（ｐＧＡＭ５９−ｐＧＫ０６４７／ｖｅｎｕｓ）を得た。
【００９１】
＜形質転換＞
宿主微生物として、Ｓｕｚｕｋｉ  Ｈｉｒｏｋａｚｕら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１５年１月、８１（１）、ｐ．１４９−１５８に記載のゲオバチルス属の好熱菌（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ＭＫ２４２、至適増殖温度：５５℃）を用いた。先ず、Ｓｕｚｕｋｉ  Ｈｉｒｏｋａｚｕら、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１２年９月、２２（９）、ｐ．１２７９−１２８７に記載の方法にしたがって大腸菌ＢＲ４０８と大腸菌ＤＨ５αとを混合し、Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ培地プレートに塗布した。白色を示すコロニー、すなわちＸ−ｇａｌを分解しないコロニーとして、大腸菌ＢＲ４０８と大腸菌ＤＨ５αとの接合伝達体（ＤＨ５α［ｐＵＰ３０７］）を得た。
【００９２】
次いで、上記で得られた発現ベクター（ｐＧＡＭ５９−ｐＧＫ０６４７／ｖｅｎｕｓ）を大腸菌ＤＨ５αに導入し、これをＤＮＡ供与体とし；Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ＭＫ２４２をＤＮＡ受容体とし；上記で得られたＤＨ５α［ｐＵＢ３０７］を接合伝達ヘルパーとして、Ｓｕｚｕｋｉ  Ｈｉｒｏｋａｚｕら、「Ａ  ｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＴＡ４２６」、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０１３年、７７（１１）、ｐ．２３１６−２３１８に記載の方法にしたがって、前記発現ベクターをＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ＭＫ２４２に導入した形質転換体（ＭＫ２４２形質転換体；Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ＭＫ２４２のゲノムにｐＧＫ０６４７及びｐＧＫ０６４７に連結されたｖｅｎｕｓが組み込まれた形質転換体）を得た。
【００９３】
＜形質転換体の培養＞
先ず、得られたＭＫ２４２形質転換体をＬＢ培地５ｍＬを入れた試験管内において６０℃で培養し、ＯＤ６００＝０．５〜１．０になるまで第２の工程の培養を行った。次いで、培養温度を４２℃に変えて２１時間、第３の工程の培養を行った後、培養液１ｍｌをマイクロチューブに分注して下記のプロモーター活性評価までそのまま凍結保存した。また、比較のために、第２の工程の培養直後（第３の工程の培養時間：０時間）の培養液１ｍｌもマイクロチューブに分注して下記のプロモーター活性評価までそのまま凍結保存した。
【００９４】
（実施例２〜３）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養を３０℃（実施例２）又は１８℃（実施例３）にしたこと以外は実施例１と同様にして、各培養液を得た。
【００９５】
（比較例１）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養をそのまま６０℃としたこと以外は実施例１と同様にして、培養液を得た。
【００９６】
ＧＫ１０３６プロモーター（ｐＧＫ１０３６）
（実施例４）
ＰＣＲにおいて下記の表３に示すプライマーを用い、ＧＫ０６４７プロモーターに代えてＧＫ１０３６プロモーター（ｐＧＫ１０３６）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、発現ベクターの調製、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、第３の工程後の培養液を得た。
【００９７】
（実施例５〜６）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養を３０℃（実施例５）又は１８℃（実施例６）にしたこと以外は実施例４と同様にして、各培養液を得た。
【００９８】
（比較例２）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養をそのまま６０℃としたこと以外は実施例４と同様にして、培養液を得た。
【００９９】
ＧＫ００３７プロモーター（ｐＧＫ００３７）
（実施例７）
ＰＣＲにおいて下記の表３に示すプライマーを用い、ＧＫ０６４７プロモーターに代えてＧＫ００３７プロモーター（ｐＧＫ００３７）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、発現ベクターの調製、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、第３の工程後の培養液を得た。
【０１００】
（実施例８〜９）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養を３０℃（実施例８）又は１８℃（実施例９）にしたこと以外は実施例７と同様にして、各培養液を得た。
【０１０１】
（比較例３）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養をそのまま６０℃としたこと以外は実施例７と同様にして、培養液を得た。
【０１０２】
ＧＫ０６６６プロモーター（ｐＧＫ０６６６）
（実施例１０）
ＰＣＲにおいて下記の表３に示すプライマーを用い、ＧＫ０６４７プロモーターに代えてＧＫ０６６６プロモーター（ｐＧＫ０６６６）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、発現ベクターの調製、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、第３の工程後の培養液を得た。
【０１０３】
（実施例１１〜１２）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養を３０℃（実施例１１）又は１８℃（実施例１２）にしたこと以外は実施例１０と同様にして、各培養液を得た。
【０１０４】
（比較例４）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養をそのまま６０℃としたこと以外は実施例１０と同様にして、培養液を得た。
【０１０５】
ＧＫ０４２１プロモーター（ｐＧＫ０４２１）
（実施例１３）
ＰＣＲにおいて下記の表３に示すプライマーを用い、ＧＫ０６４７プロモーターに代えてＧＫ０４２１プロモーター（ｐＧＫ０４２１）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、発現ベクターの調製、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、第３の工程後の培養液を得た。
【０１０６】
（実施例１４〜１５）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養を３０℃（実施例１４）又は１８℃（実施例１５）にしたこと以外は実施例１３と同様にして、各培養液を得た。
【０１０７】
（比較例５）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養をそのまま６０℃としたこと以外は実施例１３と同様にして、培養液を得た。
【０１０８】
ＧＫ３１０２プロモーター（ｐＧＫ３１０２）
（実施例１６）
ＰＣＲにおいて下記の表３に示すプライマーを用い、ＧＫ０６４７プロモーターに代えてＧＫ３１０２プロモーター（ｐＧＫ３１０２）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、発現ベクターの調製、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、第３の工程後の培養液を得た。
【０１０９】
（実施例１７〜１８）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養を３０℃（実施例１７）又は１８℃（実施例１８）にしたこと以外は実施例１６と同様にして、各培養液を得た。
【０１１０】
（比較例６）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養をそのまま６０℃としたこと以外は実施例１６と同様にして、培養液を得た。
【０１１１】
ＧＫ１７１０プロモーター（ｐＧＫ１７１０）
（実施例１９）
ＰＣＲにおいて下記の表３に示すプライマーを用い、ＧＫ０６４７プロモーターに代えてＧＫ１７１０プロモーター（ｐＧＫ１７１０）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、発現ベクターの調製、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、第３の工程後の培養液を得た。
【０１１２】
（実施例２０〜２１）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養を３０℃（実施例２０）又は１８℃（実施例２１）にしたこと以外は実施例１９と同様にして、各培養液を得た。
【０１１３】
（比較例７）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養をそのまま６０℃としたこと以外は実施例１９と同様にして、培養液を得た。
【０１１４】
ＧＫ０５５６プロモーター（ｐＧＫ０５５６）
（実施例２２）
ＰＣＲにおいて下記の表３に示すプライマーを用い、ＧＫ０６４７プロモーターに代えてＧＫ０５５６プロモーター（ｐＧＫ０５５６）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、発現ベクターの調製、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、第３の工程後の培養液を得た。
【０１１５】
（実施例２３〜２４）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養を３０℃（実施例２３）又は１８℃（実施例２４）にしたこと以外は実施例２２と同様にして、各培養液を得た。
【０１１６】
（比較例８）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養をそのまま６０℃としたこと以外は実施例２２と同様にして、培養液を得た。
【０１１７】
ＧＫ１３５６プロモーター（ｐＧＫ１３５６）
（実施例２５）
ＰＣＲにおいて下記の表３に示すプライマーを用い、ＧＫ０６４７プロモーターに代えてＧＫ１３５６プロモーター（ｐＧＫ１３５６）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、発現ベクターの調製、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、第３の工程後の培養液を得た。
【０１１８】
（実施例２６〜２７）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養を３０℃（実施例２６）又は１８℃（実施例２７）にしたこと以外は実施例２５と同様にして、各培養液を得た。
【０１１９】
（比較例９）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養をそのまま６０℃としたこと以外は実施例２５と同様にして、培養液を得た。
【０１２０】
ＧＫ０８６５プロモーター（ｐＧＫ０８６５）
（比較例１０）
ＰＣＲにおいて下記の表３に示すプライマーを用い、ＧＫ０６４７プロモーターに代えてＧＫ０８６５プロモーター（ｐＧＫ０８６５）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、発現ベクターの調製、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、第３の工程後の培養液を得た。
【０１２１】
（比較例１１〜１２）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養を３０℃（比較例１１）又は１８℃（比較例１２）にしたこと以外は比較例１０と同様にして、各培養液を得た。
【０１２２】
（比較例１３）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養をそのまま６０℃としたこと以外は比較例１０と同様にして、培養液を得た。
【０１２３】
ＧＫ１８９４プロモーター（ｐＧＫ１８９４）
（比較例１４）
ＰＣＲにおいて下記の表３に示すプライマーを用い、ＧＫ０６４７プロモーターに代えて、Ｈｉｒｏｋａｚｕ  Ｓｕｚｕｋｉら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１３年、７９（１７）、ｐ．５１５１−５１５８に記載のＧＫ１８９４プロモーター（ｐＧＫ１８９４、配列番号：３７に記載の塩基配列）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、発現ベクターの調製、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、第３の工程後の培養液を得た。
【０１２４】
（比較例１５〜１６）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養を３０℃（比較例１５）又は１８℃（比較例１６）にしたこと以外は比較例１４と同様にして、各培養液を得た。
【０１２５】
（比較例１７）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養をそのまま６０℃としたこと以外は比較例１４と同様にして、培養液を得た。
【０１２６】
ＧＫ２１５０プロモーター（ｐＧＫ２１５０）
（比較例１８）
ＰＣＲにおいて下記の表３に示すプライマーを用い、ＧＫ０６４７プロモーターに代えて、Ｈｉｒｏｋａｚｕ  Ｓｕｚｕｋｉら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１３年、７９（１７）、ｐ．５１５１−５１５８に記載のＧＫ２１５０プロモーター（ｐＧＫ２１５０、配列番号：３８に記載の塩基配列）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、発現ベクターの調製、形質転換、及び形質転換体の培養を行い、第３の工程後の培養液を得た。
【０１２７】
（比較例１９〜２０）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養を３０℃（比較例１９）又は１８℃（比較例２０）にしたこと以外は比較例１８と同様にして、各培養液を得た。
【０１２８】
（比較例２１）
形質転換体の培養において、第３の工程の培養をそのまま６０℃としたこと以外は比較例１８と同様にして、培養液を得た。
【０１２９】
実施例１〜２７及び比較例１〜２１において、それぞれ、各プロモーターの単離のためにＰＣＲで用いたプライマーを下記の表３に示す。
【０１３０】
【表３】
2019033695.tif 000004
【０１３１】
＜プロモーター活性評価＞
各実施例及び比較例で凍結保存しておいた各培養液を融解し、分光蛍光強度計（ＦＰ−８３００  ＤＳ型、日本分光株式会社製）を用いて、励起光：５１５ｎｍ、蛍光：５２８ｎｍの条件において、それぞれ蛍光強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を測定した。また、各培養液の菌体濁度（ＯＤ６００）をそれぞれ測定し、プローモーターと培養条件との各組み合わせについて、菌体あたりの蛍光強度（細胞蛍光強度［ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ／ＯＤ６００］）を次式：
細胞蛍光強度＝蛍光強度／菌体濁度
により求めた。下記の表４に、各プロモーターを用いた培養について、第３の培養の各培養条件における各細胞蛍光強度をそれぞれ示す。また、表４には、各プロモーターを用いた培養について、第２の培養直後（培養０時間）における細胞蛍光強度もそれぞれ併せて示す。さらに、図１には、各プロモーターを用いた培養毎に、第３の培養の培養条件と細胞蛍光強度との関係をそれぞれ示す。
【０１３２】
【表４】
2019033695.tif 000005
【０１３３】
以上の結果から明らかなように、本発明のタンパク質発現方法（実施例１〜２７）においては、第３の培養で、培養温度を６０℃から４２℃、３０℃、１８℃（より好ましくは４２℃又は３０℃）に変えると、目的タンパク質である黄色蛍光タンパク質（ｖｅｎｕｓ）の発現量が増加し、培養温度が４２℃以下という低温である第３の工程において、目的タンパク質を選択的に発現できることが確認された。特に、ｐＧＫ０６４７、ｐＧＫ１０３６、ｐＧＫ００３７、ｐＧＫ０６６６、ｐＧＫ０４２１、ｐＧＫ３１０２、ｐＧＫ１７１０、ｐＧＫ０５５６を用いた場合においては、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓにおいて従来公知であったプロモーター（ｐＧＫ１８９４、ｐＧＫ２１５０）を用いた場合に比べて、目的タンパク質の発現量が６０℃では少ないのに対して、４２℃又は３０℃では有意に多くなった。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
以上説明したように、本発明によれば、至適増殖温度が５０℃以上である好熱菌において比較的低温でタンパク質を発現させることができるタンパク質発現方法及びタンパク質製造方法、並びに、それらに用いるプロモーター、発現ベクター作製用キット、発現ベクター、及び形質転換体を提供することが可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【０１３５】
配列番号：１１
＜２２３＞  ｐＧＡＭ５９プラスミド
配列番号：１２
＜２２３＞  ｖｅｎｕｓ
配列番号：１３
＜２２３＞  Ｐｇｋ０６４７（−２５０Ｆ，ＨｉｎｄＩＩＩ）プライマー
配列番号：１４
＜２２３＞  Ｐｇｋ０６４７（０Ｒ，ＳｐｈＩ）プライマー
配列番号：１５
＜２２３＞  Ｐｇｋ１０３６（−２５０Ｆ，ＨｉｎｄＩＩＩ）プライマー
配列番号：１６
＜２２３＞  Ｐｇｋ１０３６（０Ｒ，ＳｐｈＩ）プライマー
配列番号：１７
＜２２３＞  Ｐｇｋ００３７（−２５０Ｆ，ＨｉｎｄＩＩＩ）プライマー
配列番号：１８
＜２２３＞  Ｐｇｋ００３７（０Ｒ，ＳｐｈＩ）プライマー
配列番号：１９
＜２２３＞  Ｐｇｋ０６６６（−２５０Ｆ，ＨｉｎｄＩＩＩ）プライマー
配列番号：２０
＜２２３＞  Ｐｇｋ０６６６（０Ｒ，ＳｐｈＩ）プライマー
配列番号：２１
＜２２３＞  Ｐｇｋ０４２１（−２５０Ｆ，ＨｉｎｄＩＩＩ）プライマー
配列番号：２２
＜２２３＞  Ｐｇｋ０４２１（０Ｒ，ＳｐｈＩ）プライマー
配列番号：２３
＜２２３＞  Ｐｇｋ３１０２（−２５０Ｆ，ＨｉｎｄＩＩＩ）プライマー
配列番号：２４
＜２２３＞  Ｐｇｋ３１０２（０Ｒ，ＳｐｈＩ）プライマー
配列番号：２５
＜２２３＞  Ｐｇｋ１７１０（−２５０Ｆ，ＨｉｎｄＩＩＩ）プライマー
配列番号：２６
＜２２３＞  Ｐｇｋ１７１０（０Ｒ，ＳｐｈＩ）プライマー
配列番号：２７
＜２２３＞  Ｐｇｋ０５５６（−２５０Ｆ，ＨｉｎｄＩＩＩ）プライマー
配列番号：２８
＜２２３＞  Ｐｇｋ０５５６（０Ｒ，ＳｐｈＩ）プライマー
配列番号：２９
＜２２３＞  Ｐｇｋ１３５６（−２５０Ｆ，ＨｉｎｄＩＩＩ）プライマー
配列番号：３０
＜２２３＞  Ｐｇｋ１３５６（０Ｒ，ＳｐｈＩ）プライマー
配列番号：３１
＜２２３＞  Ｐｇｋ０８６５（−２５０Ｆ，ＨｉｎｄＩＩＩ）プライマー
配列番号：３２
＜２２３＞  Ｐｇｋ０８６５（０Ｒ，ＳｐｈＩ）プライマー
配列番号：３３
＜２２３＞  １８９４Ｆプライマー
配列番号：３４
＜２２３＞  １８９４Ｒプライマー
配列番号：３５
＜２２３＞  ２１５０Ｆプライマー
配列番号：３６
＜２２３＞  ２１５０Ｒプライマー
【図１】
2019033695.tif 000006
【配列表】
2019033695000001.app