(57)【要約】【課題】外来インスリン産生細胞を皮下白色脂肪組織内に共存させることにより、皮下白色脂肪組織内に新たにインスリン産生細胞を産生すること。【解決手段】この発明は、外来インスリン産生細胞を糖尿病罹患レシピエントの皮下白色脂肪組織部位、例えば鼠蹊部の皮下白色脂肪組織内に移植することにより、その皮下白色脂肪組織内に新たにレシピエント由来のインスリン産生細胞を創生することを特徴としている。また、前記外来インスリン産生細胞を、栄養血管が広範囲に分布している前記皮下白色脂肪組織に共存させることにより、前記皮下白色脂肪組織内の共存部位の近接部位に新たなインスリン産生細胞を産生すること等にも特徴を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来インスリン産生細胞を、栄養血管が広範囲に分布している皮下白色脂肪組織内に共存させることにより、新たなインスリン産生細胞を前記皮下白色脂肪組織内に産生させることを特徴とするインスリン産生細胞創生方法。
【請求項２】
請求項１に記載のインスリン産生細胞創生方法において、前記外来インスリン産生細胞を、栄養血管が広範囲に分布している前記皮下白色脂肪組織に共存させることにより、前記皮下白色脂肪組織内の共存部位の近接部位に新たなインスリン産生細胞を産生することを特徴とするインスリン産生細胞創生方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のインスリン産生細胞創生において、前記共存が、外来インスリン産生細胞をレシピエントの皮下白色脂肪組織内に移植することによりなされることを特徴とするインスリン産生細胞創生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は膵臓内膵島以外の生体内組織におけるインスリン産生細胞創生に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、代表的な生活習慣関連疾患であり、炭水化物、脂質ならびにタンパク質を適切に維持ならびに利用できない複雑な慢性疾患である。糖尿病はまた様々な遺伝的、環境的要因により生起されるインスリン産生欠乏もしくはインスリン機能低下による異常な高血糖レベルに特徴がある。糖尿病の症状が進行すると、網膜症、腎症、神経障害等の合併症を引き起こし、脳卒中、脳血管障害等の発作の原因となって、その結果、患者の生活の質(QOL)の著しい低下をもたらして、最終的には患者を致命的な予後に至らしめることになる。
【０００３】
最近では、糖尿病患者数は世界中で約3.5億人にも達すると推定されている（非特許文献１）。しかも、糖尿病の総患者数は、糖尿病に罹患していると強く疑われる患者や、糖尿病予備軍の患者数を加えると、その数は膨大な数になり、明らかに大問題である。それに加えて、ごく限られた数の糖尿病患者しか適切な治療を受けていないことも医学的にも、経済的にも非常に大きな問題である。
【０００４】
糖尿病には２つの主要な形態、つまり１型糖尿病（T1DM）と２型糖尿病（T2DM）とがある。１型糖尿病（以前はインスリン依存糖尿病（IDDM）として知られていた）はインスリンを産生する膵β細胞が特異的に破壊され、インスリンが枯渇することに特徴がある。この１型糖尿病は、子供や若年者にしばしば発症する。２型糖尿病（以前は非インスリン依存糖尿病（NIDDM）として知られていた）は、インスリン産生膵β細胞の機能不全によるインスリン産生不足や筋肉や肝臓の細胞が膵臓で産生されたインスリンに適切に反応できないときなどのインスリンの相対的不足により発症する。この２型糖尿病は、大人に最も頻繁に発生するが、若者にも増加していることが注目されている。２型糖尿病は総糖尿病患者数の約90%を占めている。特に、２型糖尿病患者数は、肥満、運動不足の生活習慣、加齢によって急激に増加している。さらに注目すべきことは、２型糖尿病の多くの若年患者に膵臓の自己免疫異常が認められことから、２型糖尿病を１型糖尿病から区別すること、またはその逆の区別が難しい症例が増加していることである。
【０００５】
上記したように、１型糖尿病（T1DM）患者は、ランゲルハンス島（膵島）内のインスリン産生β細胞が免疫細胞の浸潤により完全にもしくはほぼすべてが破壊され、血液中のグルコース値の急激な変動を引き起こして、最終的には生命ならびに死に関わる高血糖（高血糖症）に関連する合併症の原因となる事象により、インスリン産生能力を喪失している。したがって、１型糖尿病患者は、１日に複数回のインスリン注射もしくはインスリンポンプによるインスリンを外部から投与することによるインスリン療法に依存せざるを得ない（非特許文献２）。
【０００６】
しかしながら、１型糖尿病患者がインスリンによる高度な治療を受けたとしても、血中グルコース濃度を安定的にかつ持続的に維持し、高血糖症によって引き起こされる慢性的な長期にわたる臓器障害を引き起こす合併症を予防するのは困難である。インスリン療法はまた過剰なインスリン投与の原因にもなり、それにより致命的にもなりうる重大な意識の変調を伴う急性低血糖症の発症の危険性を増加させる結果にもなる。かかる困難と危険性があるにもかかわらず、現在ではインスリン療法は、突然死に繋がる緊急状態から１型糖尿病を救命するのに非常に重要な役割を果たしている。しかしながら、インスリン療法は、あくまでも対処治療であって、１型糖尿病を完全に根治させる療法にはなりえず、低血糖症の危険性や長期にわたる合併症の発症などの非常に困難な問題が解決されないままになっている（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
１型糖尿病を治療するかかるインスリン療法の別の方法として、膵臓から単離したランゲルハンス膵島のインスリン産生β細胞を１型糖尿病患者に直接移植する膵島移植法がある。この膵島移植法は、膵島細胞に障害を有する糖尿病患者にとっては理論的には優れた方法であって、臨床においても1960年代後半から幅広い試みがなされている内分泌補完療法である。この膵島移植は今では１型糖尿病治療に対する非常に有望な取り組みである。この膵島移植は、膵島細胞を肝臓の門脈に点滴にて注入するだけで移植する簡便な方法であるので、全臓器を移植する手術に比べて、手術的にも極めて安全で、かつ、危険性が高い患者にとっても実施ができるという利点がある。この膵島移植はまた腹部の手術や血管吻合の必要がないことからも利点がある。これらに加えて、この膵島移植は、たとえ移植拒否反応が起こっても除去の必要がなく、患者の負担が極めて低いという利点もある（例えば、特許文献１参照）。
【０００８】
しかしながら、この膵島移植法は、早期の移植片拒絶のために移植膵島の生着率が極めて低いという欠点に直面している。したがって、１型糖尿病患者が１人のドナーの膵臓から膵島細胞の移植を受けたとしても、インスリン非依存になることができない（例えば、非特許文献３、４）。移植した膵島細胞が早期に喪失する割合は移植した膵島細胞総数の60%程度であると推定されている。したがって、現在の膵島移植においては、１人の糖尿病患者を良好な状態に治療するためには２人もしくはそれ以上の人の膵臓からの膵島細胞を繰り返し移植する必要がある（例えば、非特許文献３、４、５参照）。
【０００９】
しかしながら、この膵島移植はまた、膵島移植片が末梢門脈中に塞栓を形成して糖尿病患者の肝臓内に着床し、対応領域において虚血性変質を引き起こすという危険性がある。このことは、移植後免疫反応を引き起こして、膵島細胞片に対して有害な炎症性サントカインを放出する結果になりかねない。インスリンを分泌するβ細胞は、例えばIFN-γ、TNF-α、IL-1β等の炎症誘発サイトカインに曝露されると障害を受け、生着率が著しく低下する（例えば、非特許文献６）。
【００１０】
ヒトの患者に対する膵島細胞の臨床移植が初めて行われたのは、ミネソタ大学で行われた1974年である。しかしながら、その実績は、他の臓器移植に比べて、最近まで貧弱なものであった。しかしながら、2000年になって、アルバータ大学から、ステロイド剤を全く使用しないで免疫抑制を用いたいわゆる「エドモントン・プロトコール（Edmonton Protocol）」と呼ばれる臨床的膵島移植プロトコール下ではインスリンが極めて高率で放出されたとの報告が出された（例えば、非特許文献４）。それ以来、膵島移植は、１型糖尿病治療のブレイクスルーとなる方法として確立した。
【００１１】
上記したように、膵島移植は根本的な糖尿病治療法として有用性が高まっているけれども、膵島移植を成功させるためには更なる改良が必要である。その理由は、現在の膵島移植は、例えば、膵島細胞の生着率が低いこと、かかる低生着率のために多量の膵島細胞の点滴が必要なこと、さらにはドナーの数が少ないことなどの数々の問題になお直面しているためである。2006年に、シャピロら(A.M. Shapiro et al.）による、エドモントン・プロトコールを用いた膵島移植した患者の結果についての報告によると、膵島移植によって一旦はインスリン療法が必要でなくなった患者の76%が移植２年後にはインスリン療法を再開していた。
【００１２】
さらに、大きな問題は、現在の膵島移植では、肝臓に移植した膵島細胞の生着率が低いために、１人の糖尿病レシピエントのために、２人以上のドナーが必要であることである。このことは、ドナーが少ないという観点からしても喫緊に解決すべきことである。この問題が解決されて、ドナーとレシピエントとの割合が改善して１対１という割合になったとしたら、膵島移植は、爆発的に普及し、糖尿病治療に多大なる貢献をすることが期待される。
【００１３】
このように膵島移植はいくつかの問題点に直面しているけれども、肝臓内膵島デリバリーを改善するという10年にも亘る研究の結果、肝臓内スペースは、膵島に対して栄養的かつ物理的な支持体となり、かつ、移植した膵島細胞の生着ならびに機能を長期間維持するのに本質的な役割を果たすことが判明した。したがって、膵島移植は、糖尿病治療にとって魅力的な方法であり、現在では、糖尿病患者の門脈経由の肝臓は臨床設定における移植部位である（例えば、非特許文献４、７参照）。しかしながら、一方では、肝脈管系は生着や機能を制限する敵対的な環境であるとの報告もある（非特許文献８、９）。この結果、膵島移植に対する多くの別の部位が、膵島の生着ならびに機能を最適化し、必要な移植膵島細胞塊の数を減少し、かつ、免疫原性を低下させるかどうか調べられた（非特許文献９、１０）。
【００１４】
肝臓門脈内部位に加えて、例えば、腎臓被膜下部位、脾臓、大網、膵臓、胃腸壁、胸腺や脳や精巣等の免疫保護部位、骨髄等の筋骨格部位、皮下部位などを含む多くの別の移植部位が調べられた（例えば、非特許文献９、１１、１２）。上記したように患者の多くの別の移植部位が試験されたけれども、これまで患者を非インスリン依存にすることはできなかった。その結果、門脈内膵島移植は、経験的に患者において使用するための最善の部位として認められている（非特許文献９）。
【００１５】
しかしながら、肝臓の門脈内部位以外の新規移植部位の開発は、糖尿病患者に移植された膵島細胞の損失を少なくするため、また移植すべき膵島細胞の不足に関わる問題を克服するためにも必要である。
【００１６】
さらに、最新の研究では、インスリンとグルカゴンの両者の顆粒を含有する膵島細胞が明らかになった。これまでは、インスリンはランゲルハンス島のβ細胞で産生され、グルカゴンはそのα細胞で産生されると知られていた（非特許文献１３参照）。さらに、数十年の間インスリン欠乏が糖尿病の唯一の問題であると考えられていたけれども、グルカゴンもまた糖尿病の病因にも重要な役割を果たしていることが示唆された（非特許文献１４）。
【００１７】
したがって、これらの膵島細胞は、糖尿病患者に一旦移植されるとin vivoでこれらのホルモンを分泌するのに何らかの役割を果たしていることが期待される。
【００１８】
上記の背景技術を前提として、本発明者は、鋭意研究した結果、膵島細胞を移植するに際して取り扱いが簡単で、かつ、一旦移植した膵島細胞に不具合が生じた場合にすぐに摘出可能な新規の皮下移植部位を見いだした。皮下移植は従来の報告では、１匹の糖尿病レシピエントラットの糖尿病を治療するのに５匹以上のドナーラットからの約5,000個の膵島細胞が必要である（非特許文献１５）という程度に生着効率が非常に低いとの報告がある。
【００１９】
そこで、本発明者は、生着効率がこのように低いのは栄養血管が不足していることで移植後に膵島細胞が低酸素で死に至ったのではないかと理由付けをした。そして、鼠蹊部の皮下白色脂肪組織部両側に下腹壁動静脈の栄養血管が通っていることから（非特許文献１６）、鼠蹊部の皮下白色脂肪組織を新規な皮下移植部位として選択して、膵β細胞を移植したところ生着効率の改善が見だされた（特許文献２）。
【００２０】
ところが、非常に驚いたことに、本発明者は、膵β細胞を移植した鼠蹊部の皮下白色脂肪組織内の移植部位の近接部位に膵β細胞が創生されていることを見いだした。膵臓以外の組織に、ドナー由来ではなく、レシピエントに由来する膵β細胞が見いだされたことは極めて画期的なことである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】特開２００８−１８９５７４号公報
【特許文献２】国際公開第２０１５／１５９８８９号
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Danaei, G., et al. Lancet, 2011, 378(9785): 31-40
【非特許文献２】Atkinson, M.A., et al. N. Engl. J. Med. 1994; 331:1428-1436
【非特許文献３】Ricordi, C., et. al., 2004, Nat. Rev. Imunol., 4:259-268
【非特許文献４】Shapiro, A. M., 2000, N. Engl. J. Med., 343:230-238
【非特許文献５】Ryan, E. A., et. al., 2002, Diabetes, 51:2148-2157
【非特許文献６】Rabinovitch, A., 1993., Diabetes Rev., 1: 215-240
【非特許文献７】McCall, M., et al. Cold Spring Herb. Perspect. Med. 2, a007823, 2012
【非特許文献８】Chentoufi, A.A., et al., Clin. Develop. Immun., vol. 2011, Article ID 103738, 2 pages, 2011;
【非特許文献９】Pepper, A.R., et al., Clin. Develop. Immun., vol. 2013, Article ID 352315, 1-13 pages
【非特許文献１０】Merani, S., et al., British Journal of Surgery, vol. 95, no. 12, pp. 1449-1461, 2008
【非特許文献１１】Komori, J., et al. Nat. Biotechnol. 30, 976-983 (2012)
【非特許文献１２】Kakabadze, Z., et al. The American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons 13, 2550-2557 (2013)
【非特許文献１３】Unger, R.H. and Orci, L. Lancet. 1975; 1(7897):14-16
【非特許文献１４】Bramswig, N.C., et al. The Journal of Clinical Investigation, Vol. 123, No. 3, pp. 1275-1284, 2013
【非特許文献１５】Kawakami, Y., Pancreas, 23, 375-381 (2001)
【非特許文献１６】Vitali, A., et al., J. Lipid Res. 53, 619-629 (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
そこで、本発明者は、単離膵島を皮下白色脂肪組織に移植することにより、移植膵島近傍の皮下白色脂肪組織内にレシピエント由来の新規インスリン産生細胞である膵β細胞が創生していることを見いだして、本発明を完成した。
【００２４】
したがって、この発明は、インスリン産生細胞である膵β細胞を、皮下白色脂肪組織に創生することからなるインスリン産生細胞創生方法を提供することを目的としている。
【００２５】
またこの発明は、その好ましい態様として、栄養血管が広範に分布している皮下白色脂肪組織内に外来インスリン産生細胞を共存させることにより、その皮下白色脂肪組織内に新たなインスリン産生細胞を創生することからなるインスリン産生細胞創生方法を提供することを目的としている。
【００２６】
またこの発明は、そのさらに好ましい態様として、インスリン産生細胞を栄養血管が広範に分布している皮下白色脂肪組織に移植することにより、その皮下白色脂肪組織内の移植部位の近接部位に新たなインスリン産生細胞を創生することからなるインスリン産生細胞創生方法を提供することを目的としている。
【００２７】
なお、本明細書で使用する用語「皮下白色脂肪組織」とは、糖尿病罹患レシピエントの皮下白色脂肪組織であって、その体内に局在するとともに、その膵島細胞に必須の栄養を補給できる栄養補給血管がその領域に広範に循環・分布している皮下白色脂肪組織を意味するものとする。かかる皮下白色脂肪組織としては、例えば、下腹壁動静脈が循環している鼠蹊部、腋下、背中または腹部などの皮下白色脂肪組織を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これらの組織のうち、血管がその領域全体に分布しているので、鼠蹊部が好ましい。
【００２８】
本明細書で使用する用語「栄養血管」とは、移植膵島に必須の栄養を皮下白色脂肪組織に補給できる血管を意味するものとする。かかる血管としては、例えば、動脈、静脈および／または毛細血管を挙げることができる。
【００２９】
本明細書で使用する用語「外来インスリン産生細胞」とは、共存する皮下白色脂肪組織を構成する細胞とは由来が異なるインスリン産生細胞を意味している。つまり、例えば、外来インスリン産生細胞はドナー由来であり、皮下白色脂肪組織はレシピエント由来であることを意味している。なお、外来インスリン産生細胞は、同種由来であっても、異種由来であっても制限はない。
【００３０】
本明細書で使用する用語「共存」とは、皮下白色脂肪組織内に外来インスリン産生細胞が共に生存している状態を意味している。外来インスリン産生細胞が皮下白色脂肪組織内に共存する方法としては、例えば、糖尿病罹患レシピエントの皮下白色脂肪組織内にインスリン産生細胞を移植する方法などがある。また、外来のインスリン産生細胞が皮下白色脂肪組織内に共存するためには、皮下白色脂肪組織と外来インスリン産生細胞が共栄養状態、つまり共存するための栄養供給を受けている必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
上記目的を達成するために、この発明は、外来インスリン産生細胞を、栄養血管が広範囲に分布している皮下白色脂肪組織内に共存させることにより、新規にインスリン産生細胞を皮下白色脂肪組織内に産生させることからなるインスリン産生細胞創生方法を提供する。
【００３２】
上記目的を達成するより好ましい態様として、この発明は、外来インスリン産生細胞を、栄養血管が広範囲に分布している皮下白色脂肪組織、好ましくは鼠蹊部の皮下白色脂肪組織に移植により共存させることにより、その皮下白色脂肪組織内の共存部位の近接部位に新たなインスリン産生細胞を産生することからなるインスリン産生細胞創生方法を提供する。
【発明の効果】
【００３３】
この発明は、糖尿病レシピエントの皮下白色脂肪組織、例えば、鼠蹊部、腋下、背中などの栄養血管が広範囲に分布している皮下白色脂肪組織の部位に新しいインスリン産生細胞を創生することから、ドナー１個体からの移植インスリン産生細胞数を低減させることが期待できることから、ドナー不足による膵島細胞移植の大問題を軽減できる一助になりうるという大きな利点を有する。更にはレシピエント由来インスリン細胞誘導因子が見出されれば、その因子の皮下脂肪組織内投与のみでインスリン産生細胞を創生でき、膵島移植を必要としない画期的な糖尿病治療の開発に繋がる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、新規膵島移植部位としてのマウス鼠蹊部皮下白色脂肪組織の一部を示す図である。図１（Ａ）は、ピンセットで持ち上げた状態の左側鼠蹊部の皮下白色脂肪組織を示す。図１（Ａ）、１（Ｂ）には鼠蹊部の皮下白色脂肪組織の栄養血管が見える。長短矢印は大腿部動静脈ならびに下腹壁動静脈をそれぞれ示す。
【図２】図２は、マウス鼠蹊部皮下白色脂肪組織への膵島移植の手法を示す図である。図２ａは左側鼠蹊部皮膚切開部の上面図である。図２ｂは鼠蹊部皮下白色脂肪組織に作成した小さなポケットを示す。図２ｃ、２ｄは、ポケット内部に留置したチューブ先端に取り付けた膵島を示す。図面中、矢印はポケット中の膵島をそれぞれ示し、矢じり印はチューブ先端の膵島を示す。図２ｅはピンセットで持ったポケットの開口部を示す。図２ｆはホッチキスで閉じたポケットの開口部を示す。目盛は1mmである。
【図３】図３は、移植膵島を含む脂肪組織内の経時的インスリン含量の変化を示す説明図である。
【図４Ａ】図４Ａは、マウス単離膵島細胞を移植した皮下白色脂肪組織のウエスタンブロットの結果を示す説明図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、内因性マーカー（β-actin）との発現量の比を示す図である。
【図５】図５は、マウス単離膵島細胞移植120日後のレシピエント脂肪組織内GFP・インスリン・細胞の免疫染色組織像を示す図である。
【図６】図６は、RNAseqによる移植膵島細胞周囲の脂肪組織内メッセージの網羅的解析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
この発明は、外来インスリン産生細胞を糖尿病レシピエントの皮下白色脂肪組織に移植して共存させることにより、インスリン産生細胞を移植した皮下白色脂肪組織内の移植部位に近接した部位に新たなインスリン産生細胞を創生することからなるインスリン産生細胞創生方法に関するものである。
【００３６】
この発明において、外来インスリン産生細胞の共存部位は、皮下白色脂肪組織が局在する様々な身体部分のうち、インスリン産生細胞が生着しインスリンを分泌する足場として利用できる皮下白色脂肪組織部位であって、かつ、その皮下白色脂肪組織内に外来インスリン産生細胞に栄養を補給するのに必須の栄養補給血管が組織内に循環し分布している限り、いかなる皮下白色脂肪組織の部位であってもよい。かかる共存部位として好ましい例としては、鼠蹊部、腋下、背中または腹部などが挙げられる。これらの組織のうち、循環している下腹壁動静脈が移植膵島細胞に栄養を補給することができることから、鼠蹊部が好ましい。
【００３７】
この発明において使用する外来インスリン産生細胞としては、例えば、ヒト膵島細胞、ブタ等の異種膵島細胞の他に、ES細胞、iPS細胞から創生されたインスリン産生細胞を挙げることができる。
【００３８】
また、この発明において、外来インスリン産生細胞を皮下白色脂肪組織内に共存させる１つの方法である移植方法としては、例えば、ドナーのインスリン産生細胞をカプセルなどに封入した細胞封入容器を糖尿病レシピエントの体内皮下白色脂肪組織に埋設することにより、またはドナーからの移植用インスリン産生細胞を糖尿病レシピエントの体内皮下白色脂肪組織に注射などで直接移植する方法などを挙げることができる。なお、インスリン産生細胞を封入したカプセルなどの細胞封入容器を移植する場合、一旦移植したインスリン産生細胞が移植片拒絶を引き起こしたときにその容器を除去できるという利点がある。
【実施例１】
【００３９】
この発明を実施例により詳細に説明するが、下記実施例は、この発明を限定するものでは一切なく、例示の目的だけで説明するものである。したがつて、この発明は、上記の明細書の記載ならびに下記の実施例から派生するあらゆる改変ならびに改良をこの発明の範囲内に包含するものである。
【００４０】
〔材料ならびに方法〕
（マウス）
ドナーマウスとしてC57BL/6を用いた。マウスは特定の無菌室で飼育し、8〜16週齢で実験に使用した。全ての実験は福岡大学動物管理使用委員会の事前承認を受けたプロトコールに従って実施した。
【００４１】
膵島は文献記載の手法（Sutton, R., et al., Transplantation, 42, 689-691 (1986); Okeda, T., et al., Endocrinol. Jpn. 26, 495-499 (1979)）に従って単離した。単離した膵島は、CO2培養器（5% CO2+95% 空気）内で10%FBS添加培地（D-MEM、ニッスイ）を用いて24℃で１夜培養し、ドナーとして使用した。膵島は、STZ注射３日目に、STZ(Sigma)(180mg/kg)誘発糖尿病シンジェニックレシピエントマウスの左側鼠蹊部皮下白色脂肪組織に移植した。
【００４２】
図１は、マウスの左側鼠蹊部皮下白色脂肪組織の解剖所見を示す。図１（Ａ）と図１（Ｂ）は、栄養血管が認められる左側鼠蹊部皮下白色脂肪組織をピンセット（左側）で持ち上げた状態をそれぞれ示す。図中、長短矢印は大腿部動静脈と下腹壁動静脈とをそれぞれ示す。
【００４３】
図２はマウス鼠蹊部皮下白色脂肪組織へ膵島移植をした状態を示す。図２（ａ）はマウスの左側鼠蹊部皮下白色脂肪組織の皮膚切開口部を上から見た図である。図２（ｂ）は鼠蹊部皮下白色脂肪組織に設けた小さなポケットを示していて、縫合糸で開口を開いた状態に保っている。図２（ｃ）、図２（ｄ）はポケット内部に留置したチューブ先端に存在する膵島細胞を示す。図２（ｃ）、図２（ｄ）中、矢印はポケットに配置した膵島細胞を示し、矢じり印はチューブ先端の膵島細胞を示す。図２（ｅ）は鉗子で保持したポケットの開口部を示し、図２（ｆ）はホッチキスの針で閉口したポケットの開口部を示す。図中、目盛は1mmである。
【００４４】
膵島移植後経時的に移植膵島を含む脂肪組織内のインスリン含有量を測定した。その結果を図３に示す。図３に示すように、移植30日後には、脂肪組織内のインスリン含有量は急激に減少したが、移植60日後ならびに120日後には脂肪組織内のインスリン含有量が増加しているのが判明した。
【実施例２】
【００４５】
実施例１と同様にして、レシピエントにmouse-insulin promotor (MIP)-GFPマウス(C57BL/6バックグラウンド)を用いた。このマウスの膵β細胞はGFPで標識されており、膵臓内膵島以外の組織でGFPが検出されればそれはレシピエント由来であることの証左になる。ドナーの野生型C57BL/6マウスからドナー２匹分の単離膵島400個をSTZ糖尿病MIP-GFPレシピエントの鼠蹊部皮下白色脂肪組織内に移植した。移植膵島を含む脂肪組織について抗GFP抗体を用いたウエスタンブロット法を行ったところ、移植後１２０日目にGFP蛋白を検出した（図４Ａ）。内因性対照としてβ-actinを用い、GFP発現量との比を図４Ｂに示した。
【実施例３】
【００４６】
実施例２と同様に移植した移植後120日目のレシピエントSTZ糖尿病MIP-GFPマウスの脂肪組織について常法に従って免疫染色をした。図５にその免疫染色組織像を示す。
【００４７】
左図はGFP蛋白（左上に矢印で示す）と移植膵島のインスリン（下部）の免疫染色組織像を示す。中央上側の図は左図のGFP蛋白の拡大免疫染色組織像、また右上側の図はインスリンの免疫染色組織像、中央下側の図は細胞のDAPIによる核免疫染色組織像を示す。右下側の図は、これら３個の免疫染色組織像を合わせた像を示しており、この図からGFPとインスリンの免疫染色組織像が重なり合っていて、しかも移植細胞に隣接して存在していることが分かる。この結果は、新規に移植膵島の移植部位の近接部位にレシピエント由来のインスリン産生細胞が創生していることを示している。
【実施例４】
【００４８】
実施例３で確認されたGFPとインスリンの免疫染色組織像が重なる部分、つまり移植後60日目と120日目の移植膵島周囲脂肪組織を、RNAseqによってメッセージの網羅的解析を常法に従って行った。その結果、図６に示すように、insulin I、 insulin II、Pdx1、MafA、Nkx6.1、Ngn3などのβ細胞関連メッセージが増幅しているのが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
この発明は、同種同系膵島移植後の皮下脂肪細胞内にレシピエント由来の新規なインスリン産生細胞が産生していることから、膵島を皮下白色脂肪組織内に移植することが糖尿病罹患レシピエントの皮下白色脂肪組織内に新規にインスリン産生細胞を産生する新規な膵β細胞を誘導するいわゆるin vivoリプログラミング法を提供することになる。つまり、本発明は糖尿病治療に対する新規な戦略を提供するものである。また、本発明は、皮下白色脂肪組織内にレシピエント由来の膵β細胞を発現させるための膵β細胞発現剤を提供するものであるとも言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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