(57)【要約】【課題】患者の血液凝固パラメーターの監視を改善するために、凝固検定および凝固パラメーター測定における改善を提供すること。【解決手段】非常に小さな容積の血液を用いる凝固パラメーターの測定のための組成物及び方法が提供される。有利なことに、本明細書に記載される方法は、一滴の血液（約２０μＬ）から遂行されることができ、一般的に、随意的に多重化された型式の他の測定を遂行するための十分なサンプルを残せる。前記の方法および機器は、熟練した操作者を必要とせず、およびポイント・オブ・サービスで遂行されることができ、このことは血液凝固疾患およびその治療を管理するために重要な特徴である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［相互参照］
本出願は、２０１２年７月１８日に出願された米国特許仮出願第６１／６７３，２２７号による優先権を主張し、この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
凝固は、それにより、血液または血液血漿が凝血塊を形成する複雑なプロセスである。それは、恒常性、損傷された血管からの血液損失の停止、の重要な一部分であり、損傷された血管壁が、出血を停止し、損傷された血管の修復を開始するために、血小板およびフィブリンを含む凝血塊に覆われる。不適切な凝固は、出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）の増大された危険性をもたらす可能性があり、および過剰の凝固は、閉塞性の凝固（血栓形成）をもたらし得るので、この凝固プロセスは、緊密に制御され、および生物学の至る所で高度に保存されている。
【０００３】
血液凝固疾患は、非常に危険であり、およびそれらを治療する治療的手段および凝固を制御することは、管理が困難であり、および危険でもある。加えて、多くの患者が、心臓弁の置換を受けた後に、ワーファリンなどの抗凝血薬により長期にわたって治療され、および監視を受ける必要がある。凝固パラメーター、とりわけ、プロトロンビン時間（“ＰＴ”；数学的に変換された、国際標準比“ＩＮＲ”としても表わされる）、およびより包括的な健康の一部としての、活性化部分トロンボプラスチン時間（“ａＰＴＴ”）、ならびに生体指標および他の治療薬が測定される治療監視プログラムを監視できることは、ますます有益でありる。ＰＴ、ＩＮＲおよびａＰＴＴは、臨床検査室において、比較的大量の血液または血漿を必要とし、典型的には固定容積の真空管に５ｍＬが採集される、従来の方法を用いて測定され得る。患者の血液凝固パラメーターの監視を改善するために、凝固検定および凝固パラメーター測定における改善が必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、非常に小さな容積の血液サンプルを用いる、凝固パラメーター測定の課題に対する必要性を認識し、それに対する解決を提供した。有利なことに、本明細書に記載される方法は、一滴の血液（約２０μＬ）から導出された小量の血液または血漿により遂行され得る一方、一般的には、随意的に多重形式である、他の測定のために十分なサンプルを残すことができる。本方法および機器は熟練したオペレーターを必要とせず、およびポイント・オブ・サービスにおいて遂行されることができ、これらは、用量の調節および薬物治療の頻度における有用な情報を提供することにより、血液凝固疾患およびその治療を管理するために重要な特徴である。＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊
【０００５】
いくつかの実施形態では、凝固を検定するための方法は：Ａ）非常に少ない容積の血液サンプル（例えば、２０μｌ以下）における凝固を監視すること、および／またはＢ）血液サンプルの全てまたは一部分を希釈すること、および希釈された血液サンプルを検定に用いること、従って、検定に用いられるサンプルの全体量を減少させることを含む。
【０００６】
一態様では、希釈された、または希釈されていないサンプルにより凝固検定を遂行するための、様々な技法が提供される。一実施形態では、凝固検定は、初期の凝血塊が容器の表面に接着することを助ける、高い表面積対容積比を有する、小さな容器の中で遂行される。別の実施形態では、凝固プロセスにおいて、凝血塊の強さおよび／または濁度（光散乱に起因する）を増加させる、外因性の物質（例えば、フィブリノーゲン）がサンプルに加えられる。別の実施形態では、小さなビーズが血液サンプルに加えられ、およびビデオ画像化が、ビーズが重力により沈降し、および凝血塊形成に伴い動きを減少または停止するに連れた、ビーズの動きを追跡するために用いられる。別の実施形態では、小さな蛍光性のビーズが、血液サンプルに加えられ、および蛍光顕微鏡が、ビーズがブラウン運動、対流および／または空気の流れにより動かされ、および凝血塊形成に伴い動きを減少または停止するに連れた動きを追跡するために用いられる。．別の実施形態では、血液サンプルが、力により、容器を通じて前に推進され、およびビデオ画像化が、サンプルの動きおよび凝血塊形成に連れた容器中でのサンプルの動きの減少、および停止を追跡するために用いられる。
【０００７】
一態様では、本明細書において提供されるものは、被験者の血液サンプルの凝固時間を測定するために方法である。この方法は（ａ）被験者の血液サンプルの、凝固反応を開始すること（ｂ）凝固反応の一組の画像を取得すること、および（ｃ）血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析することを含む。
【０００８】
一態様では、本明細書において提供されるものは、被験者の血液サンプルの凝固時間を測定するために方法である。この方法は（ａ）被験者からの血液サンプルを、非血管ルートを介して被験者から取得した血液より取得すること、（ｂ）被験者の血液サンプルの、凝固反応を開始すること、（ｃ）凝固反応の一組の画像を取得すること、、および（ｄ）血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析することを含み、ステップ（ａ）〜（ｄ）を遂行するための時間が約１時間以下である。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｄ）を遂行するための時間が約３０分以下である。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｄ）を遂行するための時間が約１０分以下である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１μｌ以下の血液サンプルが凝固検定に用いられる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、凝固反応容積は、約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１μｌ以下である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、前記一組の画像の個々の画像はピクセル化され、および少なくとも１、１０、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１０，０００ピクセルを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、この方法は、希釈後のサンプルの凝固時間が、約３０秒〜約１０分になることができるように、血液サンプルを希釈することを更に含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、この方法は、フィブリノーゲンを凝固反応に加えることを更に含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、開始ステップは、凝固開始剤を血液サンプルに加えることを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、前記血液サンプルは、血漿サンプルである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、前記血液サンプルは、指先の突き刺しを用いて取得される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、前記画像は、前記凝固反応の光散乱画像である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、前記凝固時間は、散乱された光の強度の遷移に基づいて測定される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、前記方法は、前記一組の画像を取得する前に複数のビーズを前記血液サンプルに加えることを更に含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、１００、または１０００個のビーズが前記血液サンプルに加えられ得る。
【００２０】
いくつかの実施形態では、前記複数のビーズは、少なくとも２つの異なるサイズのビーズを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、前記複数のビーズは、約１μｍ〜５μｍのサイズを有する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、前記複数のビーズは、約５μｍ〜５０μｍのサイズを有する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、前記複数のビーズは、１つ以上のポリスチレン、ラテックス、アクリル、またはガラスを含む。特定の態様では、前記ビーズは、ｆｒｏｍｔｈｅ反応媒体とは異なる屈折率を有する（例えば、約１、２、３、４、５、８、１０、１５、１６、２０、２５、３０、３５、４０、または５０％高いかまたは低い）か、または不透明であり得る。加えて、前記ビーズは、反応媒体とは異なる密度を有し得る（例えば、約１、２、３、４、５、８、１０、１５、１６、２０、２５、３０、３５、４０、または５０％高いかまたは低い）。いくつかの検定では、前記反応媒体は約１．０１ｇ／ｃｃの密度を有する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、前記一組の画像を分析するステップは、ビーズが実質的に静止した時点を探すことを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、前記一組の画像を分析するステップは、ビーズの可動性の遷移が起きた時点を探すことを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ビーズの可動性の遷移は、凝固反応におけるビーズの沈降の原則により証明される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、前記一組の画像を分析するステップは、ビーズの動きを測定するために、前記一組の画像の２つの画像を比較することを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、前記２つの画像が実質的に同じである場合に、前記ビーズは、実質的に静止している。
【００２９】
いくつかの実施形態では、前記ビーズは標識される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、前記ビーズは蛍光性の標識により標識される。
【００３１】
別の態様では、被験者の血液サンプルの複数の凝固パラメーターを測定する方法が提供される。この方法は（ａ）被験者の血液サンプルを取得することであって、前記血液サンプル約５０μｌ以下であり、（ｂ）前記血液サンプルから血漿サンプルを調製すること、および（ｃ）前記複数の凝固パラメーターを測定するために、血漿サンプルを用いて複数の検定を遂行することを含み、少なくとも１つの前記複数のパラメーターは凝固時間である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、凝固パラメーターの１つが：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）、国際標準比（ＩＮＲ）、出血時間、凝固因子、抗リン脂質抗体、希釈ラッセル蛇毒時間法（ｄｉｌｕｔｅ  Ｒｕｓｓｅｌｌ’ｓ
ｖｉｐｅｒ  ｖｅｎｏｍ  ｔｉｍｅ）（ｄＲＶＶＴ）、および血小板機能、トロンボエラストグラフィー（ｔｈｒｏｍｂｏｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＴＥＧまたはＳｏｎｏｃｌｏｔ）、および真性グロブリン溶解時間（ｅｕｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ）（ＥＬＴ）より成る群から選択される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、約１０μｌ未満の血漿サンプルが、前記複数の検定の個々の検定のために用いられる。いくつかの実施形態では、約２μｌ未満の血漿サンプルが、前記複数の検定の個々の検定のために用いられる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、前記複数の検定のいくつか、またはそれぞれの反応容積は、約６μｌ以下である。いくつかの実施形態では、前記複数の検定のいくつか、またはそれぞれの反応容積は、約１０μｌ以下である。
【００３５】
いくつかの実施形態では、凝固時間を測定するための検定を遂行する時間は、または約１時間、３０分、１０分、５分、または１分以下である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、凝固反応の一組の画像を取得することは（ｉ）少なくとも１つの前記複数の検定の一組の画像を取得することおよび（ｉｉ）凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析することを含む。
【００３７】
一態様では、被験者の血液サンプルの凝固時間を測定するための機器が提供される。この機器は（ａ）被験者からの前記血液サンプルに、凝血塊の形成に適切な条件下で凝固開始剤を加え、それにより凝固反応を開始するために構成された構成要素、（ｂ）凝固反応の一組の画像を取得するために構成された構成要素、および（ｃ）前記血液サンプルの凝固時間を測定するために前記一組の画像を分析する構成要素を含む。
【００３８】
一態様では、被験者の血液サンプルの凝固時間を測定するシステムが提供される。このシステムは（ａ）被験者からの前記血液サンプルに、凝血塊の形成に適切な条件下で凝固開始剤を加え、それにより凝固反応を開始するために構成された機器（ｂ）凝固反応の一組の画像を取得するためのカメラ、および（ｃ）前記血液サンプルの凝固時間を測定するために前記一組の画像を分析するコンピュータを含む。
【００３９】
いくつかの態様では、抗凝血化された血液サンプルが、本明細書において提供される検定の全てと共に用いられ得る。抗凝血化された血液サンプルを凝固検定で用いるために調製するために、抗凝血剤の効果を逆転する試薬が、抗凝血剤に対して過剰に加えられる。Ｆｏｒｔｈｅ抗凝血剤エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸塩、およびシュウ酸塩に対して、適切な試薬はカルシウム（Ｃａ２＋）であり；抗凝血剤ヘパリンに対して、適切な試薬はポリブレンである。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるものは、凝固のための混合物を検定する方法であり、この方法は：オリジナルの生物学的サンプルの一定量を含む混合物の凝固反応を開始することであって、この混合物は：ｉ）５００マイクロリットル未満の合計容積を有し、ｉｉ）５０マイクロリットル未満のオリジナルの生物学的サンプルを含み、およびｉｉｉ）９５容積％未満のオリジナルの生物学的サンプルを含み；この混合物を照明すること、およびこの混合物からの光を検出すること；およびこの混合物を、凝固について、この混合物からの光の分析に基づいて分析すること。
【００４１】
実施形態では、本明細書で提供されるオリジナルの生物学的サンプルの一定量を含む混合物を含む方法において、この混合物は、５００、４００、３００、２００、１００、７５、５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、または０．１マイクロリットル．
【００４２】
実施形態では、本明細書で提供されるオリジナルの生物学的サンプルの一定量を含む混合物を含む方法において、この混合物は、オリジナルの生物学的サンプルの５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、または０．１マイクロリットル未満を含む。
【００４３】
実施形態では、本明細書で提供されるオリジナルの生物学的サンプルの一定量を含む混合物を含む方法において、この混合物は、オリジナルの生物学的サンプルの容積の９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満を含み得る。
【００４４】
実施形態では、本明細書で提供される混合物からの光を検出することを含む方法において、この混合物からの光を検出することは、この混合物の画像を得ることを含む。
【００４５】
実施形態では、本明細書で提供される混合物の画像を得ることを含む方法において、この方法は、画像の目的の領域（ＲＯＩ）を特定するために画像を分析することを更に含み、画像の目的の領域は、この混合物の画像化された情報を含む。
【００４６】
実施形態では、本明細書で提供される画像中のＲＯＩを特定することを含む方法では、この方法は、ＲＯＩ中での平均光強度を決定するために、画像をＲＯＩを分析することを更に含む。
【００４７】
実施形態では、本明細書で提供される混合物の画像を取得することを含む方法では、この方法は、少なくとも経時的にこの混合物の第一の画像および第二の画像を取得することを含み、この混合物の凝固時間は、第一の画像のＲＯＩにおける光強度と、第二の画像のＲＯＩにおける光強度の差を決定することを含む分析に基づいて決定される。
【００４８】
実施形態では、本明細書で提供される混合物の画像を取得することを含む方法では、この混合物の画像は、ＣＣＤまたはＣＭＯＳセンサーにより取得される。
【００４９】
実施形態では、本明細書で提供される混合物の画像を取得することを含む方法では、この混合物の画像を取得することは、この混合物のビデオを取得することを含む。
【００５０】
実施形態では、本明細書で提供される混合物からの光を検出することを含む方法では、この混合物からの光を検出することは、この混合物を透過した光を検出することを含む。
【００５１】
実施形態では、本明細書で提供される混合物を透過した光を検出することを含む方法では、この混合物を透過した光は経時的に検出される。
【００５２】
実施形態では、本明細書で提供される混合物を透過した光を検出することを含む方法では、この混合物の凝固時間は、この混合物を透過した光の強度が、この混合物を透過した光のベースライン強度に比較して、選択された量だけ低減された、時間を決定することを含む分析に基づいて特定される。
【００５３】
実施形態では、本明細書で提供される混合物を透過した光を検出することを含む方法では、この混合物の凝固時間は、この混合物を透過した光の強度が、この混合物を透過した光のベースライン強度に比較して、２０％以上低減された、時間を決定することを含む分析に基づいて特定される。
【００５４】
実施形態では、本明細書で提供される混合物からの光を検出することを含む方法では、この混合物からの光を検出することは、この混合物により散乱された光を検出することを含む。
【００５５】
実施形態では、本明細書で提供される混合物により散乱された光を検出することを含む方法では、この混合物により散乱された光は経時的に検出される。
【００５６】
実施形態では、本明細書で提供される混合物により散乱された光を検出することを含む方法では、  この混合物の凝固時間は、この混合物により散乱された光の強度が、この混合物により散乱された光のベースライン強度に比較して、選択された量だけ増大した、時間を決定することを含む分析に基づいて特定される。
【００５７】
実施形態では、本明細書で提供される混合物により散乱された光を検出することを含む方法では、この混合物の凝固時間は、この混合物により散乱された光の強度が、この混合物により散乱された光のベースライン強度に比較して、２０％以上低減された、時間を決定することを含む分析に基づいて特定される。
【００５８】
実施形態では、本明細書で提供される混合物を透過した光またはこの混合物により散乱された光を検出することを含む方法では、この混合物を透過した光またはこの混合物により散乱された光は、ＣＣＤセンサー、ＣＭＯＳセンサー、光ダイオード、または光電子増倍管（ＰＭＴ）により検出される。
【００５９】
実施形態では、本明細書で提供されるオリジナルの生物学的サンプルの一定量を含む混合物を含む方法において、この混合物は、外因性のフィブリノーゲンを含む。実施形態では、この外因性のフィブリノーゲンは、前記混合部中に少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。実施形態では、前記外因性のフィブリノーゲンは、この混合物中に、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００ｍｇ／ｍｌ未満存在する。実施形態では、前記外因性のフィブリノーゲンは、この混合物中に、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、および０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、または２００ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。
【００６０】
実施形態では、本明細書で提供されるオリジナルの生物学的サンプルの一定量を含む混合物中の凝固反応を含む方法において、このオリジナルの生物学的サンプルは全血である。実施形態では、このオリジナルの生物学的サンプルは、被験者から採血された後に、何らかの液体の添加により希釈されていない、被験者からの全血である。
【００６１】
実施形態では、本明細書で提供されるオリジナルの生物学的サンプルの一定量を含む混合物中の凝固反応を含む方法において、このオリジナルの生物学的サンプルは血漿である。実施形態では、このオリジナルの生物学的サンプルは、被験者から採血された後に、何らかの液体の添加により希釈されていない、被験者からの血漿である。
【００６２】
実施形態では、本明細書で提供されるオリジナルの生物学的サンプルの一定量を含む混合物中の凝固反応を含む方法において、この混合物は白色光源により照明される。
【００６３】
実施形態では、本明細書で提供されるオリジナルの生物学的サンプルの一定量を含む混合物中の凝固反応を含む方法において、この混合物は１つ以上の選択された波長の光で照明される。
【００６４】
実施形態では、本明細書で提供されるオリジナルの生物学的サンプルの一定量を含む混合物中の凝固反応を含む方法において、この混合物は光放出ダイオード（ＬＥＤ）からの光により照明される。  
【００６５】
実施形態では、本明細書において開示される光学的信号は、光であってよい。実施形態では、本明細書において開示される光学的信号は可視スペクトル外の電磁放射であってよい。
【００６６】
この要旨は、以下の発明の詳細な説明で更に記載される概念の単純化された形態における選択を紹介するために提供される。この要旨は、主張される主題の主要な特徴または本質的な特性を特定することを意図しておらず、主張される主題の範囲を限定するために用いられることを意図していない。
［参照による組み込み］
【００６７】
本明細書において言及される、全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許及び特許出願のそれぞれが、参照により組み込まれるために、あたかも明確に、及び個々に参照により示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。組み込まれた刊行物は、米国特許出願公開第２０１０／００８１１４４Ａ１号；米国特許第７，８８８，１２５号；米国特許出願公開第２０１１／００９３２４９Ａ１号；米国特許出願公開第２００９／０３１８７７５Ａ１号；米国特許第７，２９１，４９７号；米国特許第８，０１２，７４４号；米国特許出願公開第２００６／０２６４７８３Ａ１号；米国特許出願公開第２００７／０２２４０８４Ａ１号；および米国特許出願第１３／２４４，９４７号を含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
被験者の血液サンプルの凝固時間を測定するための方法であって：
（ａ）  被験者の血液サンプルの凝固反応を開始すること；
（ｂ）  前記凝固反応の２つ以上の画像の一組を取得すること；および
（ｃ）  前記血液サンプルの凝固時間を測定するために前記一組の画像を分析することを含む方法。
（項目２）
被験者の血液サンプルの凝固時間を測定するための方法であって：
（ａ）  １ｍｌ以下の血液サンプルを被験者から得ること；
（ｂ）  前記血液サンプルの凝固反応を開始すること；
（ｃ）  前記凝固反応の２つ以上の画像の一組を取得すること；および
（ｄ）  前記血液サンプルの凝固時間を測定するために前記一組の画像を分析することを含む方法であって、ステップ（ａ）〜（ｄ）を遂行するための時間の量が約１時間以下である方法。
（項目３）
ステップ（ａ）〜（ｄ）を遂行するための時間の量が約３０分以下である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記血液サンプルの容積が約１μｌ以下である、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
前記一組の画像の個々の画像が、ピクセル化されおよび少なくとも１０，０００ピクセルを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目６）
希釈後の前記血液サンプルの凝固時間が約１分〜約１０分であることができるように、前記血液サンプルを希釈することを更に含む、項目１または２に記載の方法。
（項目７）
フィブリノーゲンを凝固反応に加えることを更に含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記開始することのステップが、凝固開始剤を前記血液サンプルに加えることを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目９）
前記血液が血漿サンプルである、項目１または２に記載の方法。
（項目１０）
前記血液サンプルが非血管的経路から得られる、項目１または２に記載の方法。
（項目１１）
前記画像が、凝固反応の光散乱画像である、項目１または２に記載の方法。
（項目１２）
前記凝固時が、前記散乱された光の強度の遷移に基づいて測定される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
一組の画像を取得する前に、複数のビーズを前記血液サンプルに加えることを更に含む、項目１または２に記載の方法。
（項目１４）
前記複数のビーズが、少なくとも２つの異なるサイズのビーズを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記複数のビーズが、約１μｍ〜５μｍの間の任意のサイズから選ばれる少なくとも２つの異なるサイズのビーズを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記複数のビーズが、約５μｍ〜５０μｍの間の任意のサイズから選ばれる少なくとも２つの異なるサイズのビーズを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記複数のビーズが、ラテックス、ポリスチレン、アクリル、またはガラスの１つ以上のを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
前記一組の画像を分析するステップが、前記ビーズが実質的に静止する時点の位置を決定することを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
前記一組の画像を分析するステップが、前記ビーズの可動性の遷移が生じる時点の位置を決めることを含む、項目１３に記載の方法。
（項目２０）
前記ビーズの可動性の遷移が、前記凝固反応における、前記ビーズの沈降の減速により証明される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記一組の画像を分析するステップが、前記ビーズの動きを測定するために、前記一組の画像の２つの画像を、比較することを含む、項目１３に記載の方法。
（項目２２）
前記２つの画像が、実質的に同一である場合に、前記ビーズが、実質的に静止している、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ビーズが標識される、項目１５または１６に記載の方法。
（項目２４）
前記ビーズが蛍光性の標識により標識される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
被験者の血液サンプルの複数の凝固パラメーターを測定するための方法であって：
（ａ）  被験者の血液サンプルを取得することであって、前記血液サンプルはまたは約１ｍｌ以下であり；および
（ｂ）  前記複数の凝固パラメーターを測定するために、前記サンプルを用いて複数の検定を遂行することを含む方法。
（項目２６）
少なくとも１つの前記凝固パラメーターが以下の検定から構成される群から選ばれる項目２５に記載の方法：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）、国際標準比（ＩＮＲ）、フィブリノーゲン、出血時間、凝固因子、抗リン脂質抗体、Ｄ−ダイマー、希釈ラッセル蛇毒時間法（ｄｉｌｕｔｅ  Ｒｕｓｓｅｌｌ’ｓ
ｖｉｐｅｒ  ｖｅｎｏｍ  ｔｉｍｅ）（ｄＲＶＶＴ）、血小板機能、トロンボエラストグラフィー（ｔｈｒｏｍｂｏｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＴＥＧまたはＳｏｎｏｃｌｏｔ）、および真性グロブリン溶解時間（ｅｕｇｌｏｂｕｌｉｎｌｙｓｉｓｔｉｍｅ）（ＥＬＴ）。
（項目２７）
前記複数の検定の個々の検定で約２μｌ未満のサンプルが用いられる、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記複数の検定のそれぞれの反応容積が、約６０μｌ以下である、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
ステップ（ａ）〜（ｃ）を遂行する時間の量が約１時間以下である、項目２５に記載の方法。
（項目３０）
ステップ（ａ）〜（ｃ）を遂行する時間の量が約３０分以下である、項目２５に記載の方法。
（項目３１）
前記ステップ（ｃ）が：
（ｉ）  少なくとも１つの前記複数の検定の２つ以上の画像の一組を得ること；および
（ｉｉ）  前記凝固時間を測定するために前記一組の画像を分析することを含む、項目２５に記載の方法。
（項目３２）
前記一組の画像の個々の画像が、ピクセル化されおよび少なくとも１０，０００ピクセルを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
被験者の血液サンプルの凝固時間を測定する機器であって：
（ａ）  凝固開始剤を、被験者からの前記血液サンプルに凝血塊の形成に適切な条件下で加え、それにより凝固反応を開始するために構成された構成要素；
（ｂ）  前記凝固反応の２つ以上の画像の一組を取得するために構成された構成要素；および
（ｃ）  前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析する構成要素を含む機器。
（項目３４）
被験者の血液サンプルの凝固時間を測定するシステムであって：
（ａ）  凝固開始剤を、被験者からの前記血液サンプルに凝血塊の形成に適切な条件下で加え、それにより凝固反応を開始するために構成された機器；
（ｂ）  前記凝固反応の２つ以上の画像の一組を取得するために構成されたカメラ；および
（ｃ）  前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析するコンピュータを含むシステム。
（項目３５）
前記血液サンプルが赤血球（ＲＢＣ）を含み、および前記一組の画像を分析するステップが、前記ＲＢＣが実質的に静止する時点の位置を決めることを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目３６）
前記血液サンプルが赤血球（ＲＢＣ）を含み、および前記一組の画像を分析するステップが、前記ＲＢＣの可動性の遷移が生じる時点の位置を決めることを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目３７）
前記ＲＢＣの可動性の遷移が、前記凝固反応におけるＲＢＣの沈降の減速により証明される、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記血液サンプルがＲＢＣを含み、および前記一組の画像を分析するステップが、前記ＲＢＣの動きを測定するために、前記一組の画像の２つの画像を比較することを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目３９）
前記２つの画像が実質的に同じ場合に、前記ＲＢＣは実質的に静止している、項目３４に記載の方法。
（項目４０）
前記ＲＢＣが標識されている、項目３４または３５に記載の方法。
（項目４１）
前記ＲＢＣが、蛍光性の標識で標識される、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
前記方法が、血漿サンプルを前記血液サンプルから調製すること、および前記複数の凝固パラメーターを測定するために、前記血漿サンプルを、複数の検定に用いることを更に含む、項目２５に記載の方法。
（項目４３）
前記凝固反応の、２つ以上の画像の一組を取得するために構成された、前記構成要素、および前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析する構成要素が、前記機器内の同じ装置の部分である、項目３２に記載の機器。
（項目４４）
前記凝固反応の２つ以上の画像の一組を取得するために構成されたカメラ、および前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析するコンピュータが、システム内の同じ装置の部分である、項目３３に記載の機器。
（項目４５）
前記凝固反応の２つ以上の画像の一組を取得するために構成されたカメラ、および前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析するコンピュータが、システム内の同じ装置の部分ではない、項目３３に記載の機器。
（項目４６）
前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析するコンピュータが、前記凝固反応の２つ以上の画像の一組を取得するために構成されたカメラとは遠隔に配置される、項目４４に記載のシステム。
（項目４７）
前記血液サンプルが２０μｌ以下である、項目２に記載の方法。
（項目４８）
前記血液サンプルが約２０μｌ以下である、項目２５に記載の方法。
（項目４９）
前記一組の２つ以上の画像がビデオ画像を含む、項目１〜４２のいずれかに記載の方法。（項目５０）
被験者の血液サンプルの複数の凝固時間を測定するための方法であって：
（ａ）  被験者の血液サンプルの凝固反応を開始すること；
（ｂ）  前記凝固反応のビデオを取得すること；および
（ｃ）  前記血液サンプルの凝固時間を測定するために前記ビデオを分析することを含む方法。
（項目５１）
前記方法がポイント・オブ・サービスの場所で遂行される、項目１〜４２のいずれかに記載の方法。
（項目５２）
少なくとも機器またはシステムの一部分がポイント・オブ・サービスの場所に配置される、項目４３〜４６のいずれかに記載の方法。
（項目５３）
前記機器またはシステムが、クラウドコンピューティング・インフラストラクチャーを介して動的に制御され得る、項目４３〜４６または５２のいずれかに記載の方法。
（項目５４）
凝固について、混合物を検定するための方法であって：
Ａ）オリジナルの生物学的サンプルの一定量を含む混合物における凝固反応を開始することであって、この混合物は：ｉ）２００マイクロリットルと同程度の全体の容積を有し、ｉｉ）２０マイクロリットルと同程度のオリジナルの生物学的サンプルを含み、およびｉｉｉ）容積により８０％と同程度のオリジナルの生物学的サンプルを有し；
Ｂ）混合物を照射することおよびこの混合物からの光学的信号を検出すること；および
Ｃ）この混合物からの光学的信号の分析に基づいて、この混合物を分析することを含む方法。
（項目５５）
前記混合物からの光学的信号を検出するステップが前記混合物の画像を取得することを含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
目的の領域（ＲＯＩ）の画像を特定するために前記画像を分析することを更に含み、画像の目的の領域が、混合物の画像化された情報を含む、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記ＲＯＩにおける、平均光学的信号強度を決定するために、前記画像のＲＯＩを分析することを更に含む、項目５５に記載の方法。
（項目５８）
少なくとも混合物の第一の画像および第二の画像を経時的に取得することを更に含み、前記混合物の凝固時間が、第一の画像のＲＯＩにおける光学的信号強度、および第二の画像のＲＯＩにおける光学的信号強度における差を、決定することを含む分析に基づいて、決定される、項目５５に記載の方法。
（項目５９）
混合物の画像がＣＣＤまたはＣＭＯＳセンサーにより取得される、項目５５〜５８のいずれかに記載の方法。
（項目６０）
混合物の画像を取得するステップが、この混合物のビデオを取得することを含む、項目５５〜５９のいずれかに記載の方法。
（項目６１）
前記混合物からの光学的信号を検出するステップが、前記混合物を通過して透過された光学的信号を検出することを含む、項目５４に記載の方法。
（項目６２）
前記混合物を通過して透過された光学的信号が、経時的に検出される、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記混合物を通過して透過された光学的信号の強度が、前記混合物を通過して透過された光学的信号のベースラインと比較して、選択された量だけ低下される時間を決定することを含む分析に基づき、前記混合物の凝固時間を特定することを更に含む、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記混合物を通過して透過された光学的信号の強度が、前記混合物を通過して透過された光学的信号のベースラインと比較して、２０％以上低下される時間を決定することを含む分析に基づき、前記混合物の凝固時間を特定することを更に含む、項目６２に記載の方法。
（項目６５）
前記混合物からの光学的信号を検出するステップが、前記混合物により散乱された光学的信号を検出することを含む、項目５４に記載の方法。
（項目６６）
前記混合物により散乱された光学的信号が、経時的に検出される、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記混合物により散乱された光学的信号の強度が、前記混合物により散乱された光学的信号のベースライン強度に比較して、選択された量だけ増大される時間を決定することを含む分析に基づいて、前記混合物の凝固時間を特定することを更に含む、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記混合物により散乱された光学的信号の強度が、前記混合物により散乱された光学的信号のベースライン強度に比較して、２０％以上増大される時間を決定することを含む分析に基づいて、前記混合物の凝固時間を特定することを更に含む、項目６６に記載の方法。（項目６９）
前記混合物を通過して透過された、または前記混合物により散乱された光学的信号が、ＣＣＤセンサー、ＣＭＯＳセンサー、光ダイオード、または光電子増倍管（ＰＭＴ）により検出される、項目６１〜６８に記載の方法。
（項目７０）
前記混合物が外因性のフィブリノーゲンを含む、項目５４〜６９に記載の方法。
（項目７１）
前記混合物中の前記外因性のフィブリノーゲンの濃度が、少なくとも１ｍｇ／ｍｌである、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記混合物中の前記外因性のフィブリノーゲンの濃度が、０．５〜２０ｍｇ／ｍｌである、項目７０に記載の方法。
（項目７３）
前記オリジナルの生物学的サンプルが全血である、項目５４〜７２に記載の方法。
（項目７４）
前記オリジナルの生物学的サンプルが血漿である、項目５４〜７３に記載の方法。
（項目７５）
前記混合物が、５０マイクロリットルと同等の全体の容積を有する、項目５４〜７４に記載の方法。
（項目７６）
前記混合物が、５マイクロリットルと同程度の前記オリジナルの生物学的サンプルを含む、項目５４〜７５に記載の方法。
（項目７７）
前記混合物が、容積により５０％と同程度のオリジナルの生物学的サンプルを含む、項目５４〜７６に記載の方法。
（項目７８）
前記混合物が、白色光源により照射される、項目５４〜７７に記載の方法。
（項目７９）
前記混合物が、１つ以上の選択された波長の光により照射される、項目５４〜７７に記載の方法。
（項目８０）
前記混合物が、光放出ダイオード（ＬＥＤ）からの光により照射される、項目５４〜７７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
図面では、
【００６９】
【図１】図１は、血漿サンプルの凝固前（左の容器）から凝固後（右の容器）への、光散乱における増加を示す。
【００７０】
【図２】図２は、平均光散乱信号対血漿サンプルの凝固の間の時間のプロットを示す。
【００７１】
【図３】図３は、平均光散乱信号対４−パラメーター対数ロジスティック関数プログレス曲線へ適合された時間のプロットを示す。
【００７２】
【図４】図４は、ＰＳＮＲ法により分析された、代表的な反応時間のコースを示す。
【００７３】
【図５】図５は、ビーズ沈降の実施形態の概略図を示す。
【００７４】
【図６】図６は、蛍光性顕微鏡の実施形態の概略図を示す。
【００７５】
【図７】図７は、顕微鏡の実施形態に適切なキュベットの概略図を示す。
【００７６】
【図８】図８は、血漿サンプルＰＴ活性化因子の測定についての、時間の関数としての相関因子のプロットを示す。
【００７７】
【図９】図９は、ビデオ画像からのバックグラウンドを除去するための方法を示す。
【００７８】
【図１０】図１０は、光散乱によるＰＴ測定の例示的な結果を示す。
【００７９】
【図１１】図１１は、光散乱によるＰＴＴ測定の例示的な結果を示す。
【００８０】
【図１２】図１２は、ビーズ沈降によるＰＴ測定の例示的な結果を示す。
【００８１】
【図１３】図１３は、ビーズ沈降によるＰＴＴ測定の例示的な結果を示す。
【００８２】
【図１４】図１４は、例示的な蛍光性顕微鏡の実施形態で取得された画像を示す。
【００８３】
【図１５】図１５は、蛍光性の顕微鏡によるＰＴ測定の例示的な結果を示す。
【００８４】
【図１６】図１６は、光散乱により測定されたヒト血漿サンプルの凝固時間への、加えられたヘパリンの効果の例示的な結果を示す。
【００８５】
【図１７】図１７は、図１６の結果に基づいて、校正されたＰＴＴへのヘパリンの用量反応を示す。
【００８６】
【図１８】図１８は、ヒト血漿サンプル（正常被検者およびワーファリン治療を受けている被験者）における、光散乱による、ＰＴ測定の例示的な結果を示す。
【００８７】
【図１９】図１９は、平均光散乱信号対双一次の曲線に適合された凝固検定の時間のプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
［発明の詳細な説明］
本発明の実施形態を記載する前に、そのような実施形態は例としてのみ提供され、および本明細書に記載された発明の様々な代替物が、本発明の実施において用いられ得ることを理解されたい。膨大な変形、変更、および置換が、本発明を逸脱することなく、当業者により行われるであろう。
【００８９】
定義されない限り、本明細書において用いられる、全ての技術的および科学的用語は、本発明の属する分野の当業者により共通に理解されるものと同じ意味を有する。しかしながら、本明細書に記載されるものと、同様の、または等価な方法および物質が、本発明の実施または試験において用いられることができ、適切な方法および物質が以下に記載される。対立する場合には、定義を含む本特許明細書が支配する。．加えて、物質、方法、および実施例は説明のためだけのものであり、および制限することを意図されていない。膨大な変形、変更、および置換が、本発明を逸脱することなく、当業者により行われるであろう。
定義
【００９０】
冠詞「ａ（１つ）」「ａｎ（１つ）」「ｔｈｅ（前記の）」は、非制限的である。例えば、“ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ”は、フレーズの意味の最も広い定義ｉを含み、１つより多い方法であり得る。
【００９１】
「被験者」は、ヒトまたは動物であってよい。この被験者は生きていても、または死んでいてもよい。この被験者は、患者、臨床試験の被検者、または前臨床試験の被験者であってよい。被験者は、診断、治療、および／または疾患予防を受けることができる。この被験者は、医療専門家のケアの下にあっても、またはなくてもよい。
【００９２】
「血液サンプル」は、血液または任意の血液の分画、血液誘導体などのサンプルである。血漿は、血液分画の一例である。この血液サンプルは、任意の適切な容積を有することができ、任意の適切な方法により得られることができ、任意の時間に被験者の任意の部位から採取されることができ、および任意の適切な容器に採取されることなどができる。血液は、栄養素および酸素などの必要な物質を細胞に送達し、および代謝的な廃棄産物を同じ細胞から運び去る、特殊化した動物（ヒトを含む）内の体液である。血液サンプルは、任意の適切な添加物、随意的に１つ以上の抗凝固剤を有することができる。「血液サンプル」は、希釈された血液サンプルも含む。
【００９３】
「血漿」は、全血中の血液細胞がその中に通常は懸濁する血液の液体構成成分である。それは、細胞外流体（細胞の外側の全ての体液）の血管内の流体部分である。それはほとんど水であり（容積により約９３％）および溶解したタンパク質、グルコース、凝固因子、無機イオン、ホルモンおよび二酸化炭素（血漿は、排せつ産物の輸送の主な媒体である）。血液血漿は抗凝固剤を含む血液の管を、血液細胞が管の底に沈降するまで遠心分離機内で回転する（遠心分離する）ことにより調製されることができる。この血液血漿は次いで吸引されるか、または抜き取られる。
【００９４】
「血液血清」はフィブリン、フィブリノーゲンまたは他の凝固因子のない血液血漿である（すなわち、全血マイナス両方の細胞および凝固因子）。
【００９５】
血液サンプルは、「非静脈ルート」、すなわち、血液が静脈および動脈から針により採血されない、により得られ得る。非静脈ルートは、血液サンプルが、静脈血（脱酸素された血液）または動脈血（酸素化された血液）のいずれかであるかは、限定しない。静脈血および動脈血の両方が適切である。身体の毛細血管から血液を得ることは、非静脈ルートの一例である。
【００９６】
「指先の突き刺し」、「指先穿刺」、または同様のものは、血液サンプルを非静脈ルートにより得るために適切な方法の一例である。ここで、鋭い先端または刃が、指（または身体の任意の他の部分）の皮膚を貫通するために用いられることができ、血液が身体から発することを引き起こす。指先穿刺は、かかと、随意的に、例えば乳児のかかとに行うことができる。血液は、毛細管、ピペット、拭い綿、滴下、または当技術分野で周知の任意の他の機構を用いて採取し得る。
【００９７】
用語「凝血」“ｃｌｏｔｔｉｎｇ”および「凝固」“ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ”は、それらの文法的な変形物と共に、互換可能に用いられる。それらは、流体または流体の任意の部分が固体化および／または高度に粘稠になるいかなるプロセスをも指す。一般に、本明細書において用いられる「凝血」および「凝固」は、上記で記載されるように、それにより、血液が凝血塊を形成する生物学的プロセスである。
【００９８】
「凝固反応」は、それにより血液が凝固する、いかなるプロセスをも含む、それにより流体が凝固するいかなるプロセスをも含む。本明細書に記載されるこの凝固反応は、自然で、修飾されていないなどであることができるか、または修飾された、操作された、制御されたなどであり得る。
【００９９】
「凝固開始試薬」は、凝固反応を開始するために、血液サンプルに加えられる任意の物質である。本明細書に記載される、例示的な凝固開始試薬は、トロンボプラスチンおよびカルシウム・プラス・トロンボプラスチンを含む。
【０１００】
「凝固時間」は、凝固開始試薬の添加などの事象の開始から、凝血塊の形成までの間に経過する時間の量である。本明細書に記載される、検定の１つのバージョンでは、凝血塊の形成は、ビーズを加えること、およびそれらが実質的に静止し、および／または可動性の遷移を受けることを観察することにより検出される。
【０１０１】
用語「ビーズ」および「粒子」は、小さな（本明細書に記載される）、本明細書に記載される画像化に適切な、物質の固体要素を意味するために互換可能に用いられる。
【０１０２】
「実質的に停止する」は、ビーズなどの物体が、凝固反応媒体（すなわち、反応媒体中に懸濁している）に対して、いかなる方向にも動かないことを意味する。凝固時間に先立つ、前記ビーズの移動速度の約０．０１％、約０．１％、または約１％を含む、小量の動きは許容される。
【０１０３】
凝固時間も、事象の開始から、一般的に前記ビーズの動きの減速を意味する、前記ビーズの「可動性の遷移」まで伸びることができる。
【０１０４】
「凝固パラメーター」は、凝固反応の性質の任意の定量的または定性的測定である。凝固パラメーターは、本明細書に記載されるまたは当技術分野で周知の凝固時間に関係づけされ得る。
【０１０５】
「画像」は、特定の物理的な対象と同様の見かけを有する、任意の人工物、例えば二次元の写真、写真の一組、またはビデオである。画像は、カメラによる光の捕捉を含み得る。
【０１０６】
画像は「画素化され」得る、つまり画像はピクセルを含むことを意味する。
【０１０７】
本明細書において使用される、「ポイント・オブ・サービス」の位置は、被験者がサービス（例えば検査、監視、治療、診断、ガイダンス、サンプル収集、ＩＤ確認、医療サービス、非医療サービス等）を受けることのできる場所を含むことができ、および制限なく、被験者の自宅、被験者の勤務先、ヘルスケア提供者（例えば、医師）の場所、病院、緊急治療室、手術室、診療所、ヘルスケア専門家の執務室、臨床検査室、小売店［例えば薬局（例えば、小売り薬局、臨床薬局、病院薬局）、ドラッグストア、スーパーマーケット、食品雑貨店、等］、運送用車両（例えば自家用車、ボート、トラック、バス、航空機、バイク、救急自動車、移動ユニット、消防車／トラック、救命救急車、司法遂行車両、警察車両、又は前記被験者を一点から他へ移動するよう設定されている車両等）、移動医療ケアユニット、可動ユニット、学校、デイケアセンター、手荷物検査場、戦場、健康支援生活住居、政府のオフィス、オフィスビルディング、テント、体液サンプル取得施設（例えば血液収集センター）、被験者がアクセスを望み得る位置の入り口の場所またはその近くの場所、被験者がアクセスを望み得る機器上またはその近くの場所、被験者がアクセスを望み得る場所またはその近くの場所（例えば、被験者がコンピュータにアクセスしたい場合には、そのコンピュータの位置）、サンプル処理機器がサンプルを受け取る位置、または本明細書の別の場所に記載される任意の他のポイント・オブ・サービス位置を含み得る。いくつかの実施形態では、ポイント・オブ・サービスはポイント・オブ・ケアである。本明細書において使用される、「ポイント・オブ・ケア」は、被験者が医療関連サービス（例えば、治療、試験、監視、診断、カウンセリング、サンプル採取など）を受けることのできる、被験者または被験者の近傍の任意の位置（例えば、被験者の自宅または勤務先、グローサリー・ストア、ドラッグ・ストア、医療クリニック、病院、学校など）を指す。
【０１０８】
「ビデオ」画像は、経時的に順次収集された一連の画像である。ビデオ画像は、例えば、少なくとも１フレーム／分、少なくとも１フレーム／１０秒、少なくとも１フレーム／秒、少なくとも１０フレーム／秒、少なくとも２０フレーム／秒、少なくとも３０フレーム／秒、少なくとも４０フレーム／秒、少なくとも５０フレーム／秒、少なくとも１００フレーム／秒、または少なくとも２００フレーム／秒を含む、任意の速度で収集され得る。
凝固パラメーター
【０１０９】
凝固は、生物学を通じて高度に保存されている。哺乳類では、凝固は典型的には細胞の（血小板）およびタンパク質（凝固因子）構成要素の両方を含む（しかしながら、状況次第では血小板が存在しなくても血漿は凝血する）。ヒトの中のシステムは、最も広範囲に研究され、およびそれゆえに最もよく理解されている。
【０１１０】
凝固は、血管への傷害が血管の内皮のライニングを損傷した後に、ほとんど瞬間的に開始する。前記血液の組織因子などの分子への曝露は、血液血小板および凝固因子である血漿タンパク質フィブリノーゲンの変化を開始する。血小板は、直ちに傷害部位に栓を形成する。これは典型的には１次止血と称される。二次的な止血が典型的には同時に生じる。凝固因子または凝血因子などの、前記血液血漿中のタンパク質が、複雑なカスケードの中でフィブリン鎖を形成し、血小板の栓を強化する。このカスケードは、少なくとも約１３の血液凝固因子を含み、そのなかのいずれの欠陥も、凝固疾患をもたらし得る。更に、この凝固カスケードは組織因子経路（外因性経路としても知られる）および接触活性化経路（内因性経路としても知られる）を含む。臨床検査は、しばしばこの内在する凝固プロセスの複雑性を除去するために設計され、および単一の容易に利用されるパラメーターを報告する。
【０１１１】
一般に、凝固パラメーターは、凝固事象の開始から凝血塊の形成までの間の時間である、「凝固時間」を測定することにより決定される。凝固パラメーターは、測定された凝固時間を包含する。場合によっては、凝固パラメーターは、特定の試薬の存在下の、特定の温度などにおける凝固時間である。
【０１１２】
莫大な試験および／または検定が、凝固系の機能を評価するために開発されており、そのどれもが、本明細書に記載される方法を用いる測定に適切である。上記で紹介され、下記でより詳細に記載されるように、通常の凝固パラメーター検定は、ａＰＴＴ、ＰＴ、およびＩＮＲを含む。当技術分野で通常は周知の他の凝固パラメーター検定は、クラウス（Ｃｌａｕｓｓ）法によりしばしば行われる、フィブリノーゲン試験、血小板計数検定、およびしばしば、シーメンス社（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＰＦＡ−１００ＴＭアナライザーで行われる、血小板機能試験を含む。更なる凝固検定および／または当技術分野で周知の臨床的手順は、トロンビン凝固時間（ＴＣＴ）試験、出血時間検定、混合試験（患者の血漿が正常血漿と混合されたときに異常性が修正されるかどうか）、凝固因子検定、抗リン脂質抗体検定、Ｄ−ダイマー試験、遺伝的試験（例えば、第Ｖ因子ライデン（ｆａｃｔｏｒ  Ｖ  Ｌｅｉｄｅｎ）、プロトロンビン変異（Ｇ２０２１０Ａ）、希釈ラッセル蛇毒時間法（ｄＲＶＶＴ）検定、多岐にわたる血小板機能試験、トロンボエラストグラフィー検定（ＴＥＧまたはＳｏｎｏｃｌｏｔ）、および真性グロブリン溶解時間（ｅｕｇｌｏｂｕｌｉｎｌｙｓｉｓ  ｔｉｍｅ）（ＥＬＴ）を含む。
【０１１３】
前記接触活性化（内因性）経路は、血漿の「接触因子」の活性化により開始され、および活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験（以前はカオリン・セファリン凝固時間、“ＫｃｃＴ”と称された）により測定され得る。この方法は、歴史的に、カルシウムに結合することによる凝固を停止するために、血液をシュウ酸塩またはクエン酸塩を含む容器に収集することを含んだ。この内因性経路は、シュウ酸塩またはクエン酸塩の効果を逆転するために、リン脂質、活性化剤（シリカ、セライト、カオリン、エラグ酸などの）、およびカルシウムを添加することにより活性化される。凝血塊が形成されるまでの時間が測定される。この試験は、反応混合物からの組織因子が不在であるために、「部分的」と称される。
【０１１４】
特定の実施形態では、本発明の方法は、サンプルの凝固時間を長くし得るサンプルの希釈を含む。実施形態では、サンプルの希釈により、サンプルの凝固時間を増加することは、例えば、サンプルの凝固反応の開始からサンプルの凝固までの時間を増大させるために有用である。このことは、例えばこのことが、凝固が、光検出器に移動されるまでに、より多くの時間を許容するか、または逆も同様であることにより有益であり得る。別の実施例では、サンプルの希釈により、サンプルの凝固時間を増加することは、その間に検定の凝固時間が正確に評価される、より長い時間フレームを提供できるために有利である。実施形態では、希釈されたサンプルは、校正曲線の調製により、希釈されていないサンプルと比較されることができる（例えば、凝固時間の比較）。
【０１１５】
異常なａＰＴＴ時間は、凝固阻害剤の存在、または特定の凝固因子の量または機能における不足を示し得る。試験が、そのケースを区別するために遂行されることができ、サンプルは正常な血漿により希釈される（最初に５０：５０）。もし異常性が消えない場合には、このサンプルは、ヘパリン、抗リン脂質抗体、または凝固因子に特異的な抗体などの阻害剤を含む可能性がある。異常なａＰＴＴ時間が修正されれば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および／またはヴォン・ヴィレブランド（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子における欠陥があり得る。本開示は、ａＰＴＴ測定およびａＰＴＴ測定を含む混合試験の両方を包含する。
【０１１６】
組織因子（外因性）経路は、組織因子（特異的な細胞のリポタンパク質）の放出により開始され、およびプロトロンビン時間（ＰＴ）試験により測定され得る。ＰＴの結果は、ワーファリンなどの経口抗凝血剤の用量を監視するために、肝臓障害を示すために、またはビタミンＫの状況を示すために、しばしば比率（ＩＮＲ値）として報告される。ＰＴは、凝固因子Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩおよびＸを測定する。この方法は、歴史的に血液のクエン酸塩を含む容器内への収集および血液細胞を血漿から分離するための遠心分離を含む。典型的に、過剰のカルシウムがＥＤＴＡ／クエン酸塩／シュウ酸塩により抗凝血化された血漿に加えられ、組織因子（因子ＩＩＩとしても知られる）が加えられ、およびサンプルが凝血塊になるまでの時間が観察される。この凝固時間は、使用される分析システムにより実質的に変化し、および試験を遂行するために用いられた、製造者の組織因子の異なるバッチの間でも変動する。前記ＩＮＲは、結果を標準化するために考案された。等式１に見られるように、前記ＩＮＲは、プロトロンビン比（平均の正常な対照血漿についての結果により分割された患者についてのプロトロンビン時間）をＩＳＩで累乗したものである。このＩＳＩ（国際感受性指標）は、特定のバッチの組織因子が、どのように国際的参照組織因子と比較されるかを示す。ＩＳＩは通常は１．０〜２．０であり、および組織因子の製造者により報告される。
【０１１７】
【数１】
2019002939.tif 000002
【０１１８】
約５．０などの高いＩＮＲレベルは、出血の高い可能性があることを示す。０．５などの低いＩＮＲレベルは、凝血塊を形成する高い可能性があることを示す。健康な人に対する正常な範囲は、一般的には約０．９〜１．３である。ワーファリンによる治療を受けている人の正常範囲は、約２．０〜３．０であるが、例えば機械的な心臓弁を持つ人たちの目標のＩＮＲは、より高い。
【０１１９】
患者のフィブリノーゲン疾患についての定量的および定性的スクリーニングは、前記トロンビン凝固時間（ＴＣＴ）の測定により達成され得る。血液中に存在する、フィブリノーゲンの正確な量の測定は、一般的にはフィブリノーゲン試験に対するクラウス法を用いて行われる。多くの分析器が、プロトロンビン時間凝血のグラフからの「誘導されたフィブリノーゲン」レベルを測定する能力を有する。本明細書に記載される方法および機器は、フィブリノーゲンの量および／または質を測定するために、同様に用いられ得る。
【０１２０】
もし凝固因子が、接触活性化または組織因子経路の一部であれば、その因子における欠陥は、必ずしも全ての凝固パラメーター試験に影響を与えない。例えば、血友病Ａは、接触活性化経路の一部である因子ＶＩＩＩの欠陥である。血友病Ａは、従って、異常に延長されたａＰＴＴ試験をもたらすが、ＰＴ試験は正常である。本明細書に記載される方法および機器が、多重化された使用しやすい型式における血液の一滴からの様々な凝固試験を含む、複数の試験を可能にすることは有益である。
凝固測定方法、機器およびシステム
【０１２１】
本明細書に記載される方法、機器およびシステムは、上記で言及された任意の凝固パラメーターを測定するために、および／または抗凝血剤により薬物治療される人間における薬剤の用量の効果を監視するために用いられることができる。抗凝血剤は凝血を阻害し、および血液が凝固する時間を増加させ、およびトロンビン疾患の薬物療法のために、または医療機器中で使用され得る。例示的な抗凝血剤は、ワーファリン、アセノクマロールフェンプロクーモン、およびフェニンジオンなどのクマジン；低分子量ヘパリンなどのヘパリン及びその誘導体；フォンダパリヌクスおよびイドラパリヌクスなどの、第Ｘａ因子の合成ペンタサッカリド阻害剤；アルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、ジメラガガトラン（ｘｉｍｅｌａｇａｔｒａｎ）およびダビガルタンを含む直接的なトロンビン阻害剤；リバロキサバンおよびアピキサバンなどの直接的な第Ｘａ因子阻害剤；およびバトロキソビンおよびヘメンチンなどの他のタイプを含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるものは被験者の血液サンプルの凝固時間を測定するための方法、機器およびシステムである。いくつかの実施形態では、この方法は、凝血塊の形成に適切な条件下で、凝固開始剤を被験者からの前記血液サンプルを加えること、それにより凝固反応を開始すること；凝固反応の一組の画像を取得すること；および前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、被験者から非血管経路で血液サンプルを取得することを、更に含む。
【０１２３】
一実施形態では、機器は、凝血塊の形成に適切な条件下で、凝固開始剤を被験者からの前記血液サンプルに加え、それにより凝固反応を開始する能力を有する構成要素；凝固反応の一組の画像を取得する能力を有する構成要素；および前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析する能力を有する構成要素を含む。前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析する能力を有する構成要素は、機器内の、凝固反応の２つ以上の画像を取得するために構成された構成要素と、同じ装置の一部分であり得る。前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析する能力を有する前記構成要素は、前記機器内に埋め込まれ得る。前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析する能力を有する構成要素は、複数の分析のタイプを遂行するために構成されることができ、および／またはそれは前記機器の内部の複数の用途に用いられ得る。前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析する能力を有する構成要素は、前記機器から遠隔に配置され得る。前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析する能力を有する構成要素は、クラウドコンピューティング・インフラストラクチャー（例えば、クラウドコンピューティング）中に配置され得る。前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析する能力を有する構成要素は、クラウド中に配置されることができ、およびこの機器は、クラウドから動的に制御されるために構成され得る。いくつかの実施形態では、前記機器は、凝固検定分析の結果に基づき、二次的手順に影響を与えるために構成され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される凝固検定を遂行する能力のある機器は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願１３／２４４，９４７号に記載されるような機器として構成されることができる。
【０１２４】
前記主題のシステムは、凝血塊の形成に適切な条件下で、凝固  開始剤を  被験者からの前記血液サンプルに加え    、それにより凝固反応を開始する能力を有する機器；凝固反応の一組の画像を取得する能力を有するカメラ；およびおよび前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析する能力を有するコンピュータを含む。前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析する能力を有するコンピュータは、機器内の、凝固反応の２つ以上の画像を取得するために構成されたカメラと、同じ装置の一部分であり得る。前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析する能力を有するコンピュータは、前記システム内に埋め込まれ得る。前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析する能力を有するコンピュータは、複数の分析  のタイプを遂行するために構成されることができ、および／またはそれは前記システムの内部の複数の用途に用いられ得る。前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析する能力を有するコンピュータは、凝固反応の２つ以上の一組の画像を取得するために構成されたカメラから遠隔に配置され得る。前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析する能力を有するコンピュータは、クラウド中に配置されることができる。前記血液サンプルの凝固時間を測定するために、前記一組の画像を分析する能力を有するコンピュータは、クラウド中に配置されることができ、および前記システムは、クラウドから動的に制御されるために配置され得る。前記システムは、凝固検定分析の結果に基づき、二次的手順に影響を与えるために構成され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される凝固検定を遂行する能力のあるシステムは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願１３／２４４，９４７号に記載されるようなシステムとして構成されることができる。
【０１２５】
一態様では、本明細書に記載される方法、機器およびシステムは、小さな容積の血液または血漿を用いて凝固時間を測定する。前記血液は、指先穿刺により得られることができ、約２０μＬの容積を持つ一滴が一般的に得られる。本明細書に記載される凝固測定法は、この全量（または約２、約３、または約４滴をふくむ２０μＬを超える容積でさえ）を使用することができる。この方法は、一滴未満の血液も用い得る。場合によっては、一滴の血液が、随意的に多重の形式における、凝固またはそれ以外のいくつかの測定に用いられ得る。
【０１２６】
本明細書に記載される方法、機器およびシステムにおいて用いられる血液または血漿の容積は、任意の適切な量であり得る。いくつかの実施形態では、個の容積は、約１ｍｌ、約５００μＬ、約４００μＬ、約３００μＬ、約２００μＬ、約１００μＬ、約７５μＬ、約５０μＬ、約４０μＬ、約２０μＬ、約１０μＬ、約９μＬ、約８μＬ、約７μＬ、約６μＬ、約５μＬ、約４μＬ、約３μＬ、約２μＬ、約１μＬ、約０．８μＬ、約０．６μＬ、約０．４μＬ、約０．２μＬ、約０．１μＬ、約０．０５μＬ、約０．０１μＬなどである。いくつかの実施形態では、この容積は、最大でも約１ｍｌ、最大でも約５００μＬ、最大でも約４００μＬ、最大でも約３００μＬ、最大でも約２００μＬ、最大でも約１００μＬ、最大でも約７５μＬ、最大でも約５０μＬ、最大でも約４０μＬ、最大でも約２０μＬ、最大でも約１０μＬ、最大でも約９μＬ、最大でも約８μＬ、最大でも約７μＬ、最大でも約６μＬ、最大でも約５μＬ、最大でも約４μＬ、最大でも約３μＬ、最大でも約２μＬ、最大でも約１μＬ、最大でも約０．８μＬ、最大でも約０．６μＬ、最大でも約０．４μＬ、最大でも約０．２μＬ、最大でも約０．１μＬ、最大でも約０．０５μＬ、最大でも約０．０１μＬなどである。実施形態では、本明細書において提供される方法は、２００μＬ、１００μＬ、７５μＬ、５０μＬ、４０μＬ、２０μＬ、１０μＬ、９μＬ、８μＬ、７μＬ、６μＬ、５μＬ、４μＬ、３μＬ、２μＬ、１μＬ、０．８μＬ、０．６μＬ、０．４μＬ、０．２μＬ、０．１μＬ、０．０５μＬ、０．０１μＬ、０．００５μＬ、または０．００１μＬ未満のオリジナルの（希釈されていない）サンプルがこの方法を遂行するために用いられる場合に用いられる。
【０１２７】
そのような実施形態では、本明細書で提供される方法は、全体の反応混合物の低い容積により遂行され得る。例えば、本明細書で提供される方法は、反応混合物の全体の容積が、２００μＬ、１００μＬ、７５μＬ、５０μＬ、４０μＬ、２０μＬ、１０μＬ、９μＬ、８μＬ、７μＬ、６μＬ、５μＬ、４μＬ、３μＬ、２μＬ、１μＬ、０．８μＬ、０．６μＬ、０．４μＬ、０．２μＬ、０．１μＬ、０．０５μＬ、０．０１μＬ、０．００５μＬ、または０．００１μＬである場合に遂行され得る。反応混合物の全体の容積の中で、本明細書において方法を遂行するために十分であると開示された、任意の容積のオリジナルの（希釈されていない）サンプル（例えば、２００μＬ、１００μＬ未満など）が存在し得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、前記機器またはシステム顕微鏡および／またはカメラを含む。このカメラ  は、ビデオ  カメラであってよい。  この顕微鏡は、明視野、  暗視野、または蛍光  顕微鏡のために構成され得る。    前記機器またはシステムは、カートリッジを受け取るために更に構成され得る。この  カートリッジは血液  サンプル  および／または凝固検定を遂行するための試薬を含み得る。前記機器またはシステム  は統合されたサンプル  処理機構  および／または前記機器またはシステム  は自動化されたサンプル  処理機構を有し得る。いくつかの態様では、  前記機器またはシステム  は、血液  サンプルを含むカートリッジを受け取るために、および自動化された凝固検定を遂行するために構成されることができる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ユーザーは血液サンプルの容積を被験者からカートリッジ内に導入し得る。血液の容積は１ｍｌ以下、５００μＬ以下、４００μＬ以下、３００μＬ以下、２００μＬ以下、１００μＬ以下、７５μＬ以下、５０μＬ以下、４０μＬ以下、３０μＬ以下、２０μＬ以下、１５μＬ以下、１０μＬ以下、９μＬ以下、８μＬ以下、７μＬ以下、６μＬ以下、５μＬ以下、４μＬ以下、３μＬ以下、２μＬ以下、１μＬ以下、０．８μＬ以下、０．６μＬ以下、０．５μＬ以下、０．４μＬ以下、０．３μＬ以下、０．２μＬ以下、または０．１μＬ以下などの少ない量であることができる。前記カートリッジは、前記血液サンプルと混合するための抗凝血剤を含み得る。前記カートリッジは機器内に導入され得る。実施形態では、前記血液サンプルがカートリッジ中に導入される前に、抗凝血剤が血液サンプルと混合され得る。カートリッジ中または機器中のいずれかで、前記血液サンプルは、血漿部分および血液細胞を含む充填された部分に分離され得る。代替的に、前記血液サンプルは全血であり続けることができる。前記血液サンプル機器内で１つ以上の異なる検定ユニットに分配されることができ、および１つ以上の異なる検定のために用いられ得る。前記血液サンプルは機器内で流体輸送機器により分配され得る。前記血液サンプルは希釈され得る。前記血液サンプルは、１つ以上の試薬と混合され得る。この試薬以下の機能の１つ以上を遂行し得る：Ａ）抗凝血剤の効果を逆転させる（例えば、ＥＤＴＡを含むサンプルへのカルシウムイオンの添加は、ＥＤＴＡの抗凝固剤効果を逆転させ得る）；Ｂ）サンプルの凝固を促進する（例えば、リン脂質、シリカ、セライト、カオリン、エラグ酸など）；Ｃ）凝固反応の可視化を促進する（例えば、観察され得る小さいビーズまたは他の粒子）；Ｄ）凝固した凝血塊の強さおよび／または質量を増加させる（例えば、フィブリノーゲン）；またはＥ）血液サンプルの検体の反応容器内での非特異的な結合を減少させる（例えば、洗剤またはタンパク質）。前記試薬は、その上追加的な機能も遂行し得る。前記試薬は液体または乾燥形状であり得る。ショ糖、トレハロース、ポリエチレングリコール、またはアルブミンなどの試薬は、迅速な溶解のために製剤された浸食される薄膜中などの、様々な乾燥形状の任意のものの中に製剤され得る。この血液サンプルと試薬の混合物は、凝固反応に関係する１つ以上の画像取得する能力のある任意の機器により観察され得る。ビデオ画像が取得され得る。反応の凝固時間を決定するために、凝固反応の画像が分析されることができる。凝固反応の分析は、コンピュータまたは機器の他の構成要素の支援下に遂行され得る。反応の凝固時間が、次いで被験者の医学的状態の分析に用いられ得る。前記方法の１つ以上のステップは、ポイント・オブ・サービスまたはポイント・オブ・ケアーの場所で遂行され得る。本明細書に記載された方法の遂行では、ポイント・オブ・ケアーの場所では、医療従事者が、特定の被験者に関する検定データに基づき、その被験者のための治療決断を迅速に下すことを可能にする。
サンプル取扱いおよび反応  チャンバー
【０１３０】
本明細書に記載されるサンプル、  試薬、および凝固検定は、様々な反応容器  のタイプにより、取り扱われ、および収容され得る。サンプル  取扱い  機器および反応容器  は、  例えば、  ウエル、  管、  キュベットでもあり得る開放端のチップ、または四角形または正方形の断面の毛細管であり得る。  本明細書において使用されるチップは、サンプル  チップ、  キュベットチップ、  反応チャンバー、キュベット、  毛細管、サンプル  取扱い  機器、またはサンプル  輸送機器とも称される。サンプル  はソースからチップまたは管の中に採集され得る。チップは密閉され得る。そのような密閉は永久的であるか、または可逆的であり得る。検定  が読み取られる準備ができると、凝固反応は、画像  分析のための光学的システムまたは他のタイプの読み取りに提示されることができる。  多くの検定が平行して処理され得る。実施形態では、複数の異なる検定反応混合物が同一の反応容器に支持されることができるように、反応容器  は複数の別個の流体的に分離された空洞を含むことができる。検定の読み出しは、検定  プロトコールおよび／またはインキュベーション時間に応じて、順次または同時であり得る。変化速度の測定  を含む検定では、検定要素が異なる時間に、１回より多く光学的システム  に提示され得る。  
流体および物質取扱い機器
【０１３１】
流体輸送装置は機器の一部であり得る。流体輸送機器はシステムの一部であり得る。流体輸送機器または装置は、複数のヘッドを有し得る。いかなる数のヘッドも流体輸送機器の一部であり得る。一実施例では、流体輸送機器は一列に取り付けられ、距離により隔てられた約８個のヘッドを有する。一実施形態では、これらのヘッドは、様々なチップと圧入により係合し得る先細のノズルを有する。これらのチップは、それらが器具から自動的に除去され、および使用後に機器の筐体内に廃棄されることを可能にする特徴を有することができる。一実施形態では、前記検定チップは澄んでありおよび透明であり、および光電子増倍管またはカメラセンサーなどの光学的検出器により、検出され得る検定がその中で行われる、キュベットと同様であることができる。
【０１３２】
一実施例では、システムのプログラム可能なプロセスは、指示またはコマンドを含むことができ、および閉鎖された空間内で、ピストンを引き抜く（液体を中に引き込むために）ことか、または延伸すること（液体を排出するために）のいずれかにより、液体を輸送するための指示に従い、流体輸送機器を操作し得る。移動される空気の容積および動きの速度の両方が、例えば、プログラム可能なプロセッサ正確に制御され得る。
【０１３３】
サンプル（または試薬）の希釈剤（または他の試薬）との混合は、混合されるべき構成要素を共通の管の中に吸引すること、および次いで、組合わせられた液体の容積の大部分の分画を、チップの中で繰り返し上下吸引することにより達成され得る。管の中で乾燥された試薬の溶解は、同様の様式で行われ得る。サンプルおよび試薬の除去は、液体を機器内の受け器または吸収剤のパッドに排出することで達成され得る。プログラム可能なプロセッサからの指示またはプロトコールに従い、別の試薬がチップ内に抜き取られ得る。
【０１３４】
システムは、検定ユニットまたはチップを移動させるための、ホルダーまたは係合器を含み得る。係合器は真空組立品または、検定ユニットチップのボスの中にぴったりと嵌るために設計された組立品を含み得る。例えば、チップを移動するための手段は、流体輸送機器のヘッドと同様の様式で移動され得る。前記機器は、係合器またはホルダーの位置に従い、ステージ上にも移動され得る。
【０１３５】
一実施形態では、チップを移動するための器具は、本明細書に記載される流体  輸送  機器などの、サンプルの容積を移動するための機器と同じである。例えば、サンプル  収集チップは、収集  チップ上のボスに従って、ピペットヘッドの上に嵌められ得る。  この収集チップは、次いで機器およびシステム中に液体を分配するために用いられ得る。  液体が分配された後で、  この収集チップは廃棄されることができ、および前記ピペットヘッド  は、ｏｎｔｏ  ａｎ検定ユニットの上に、検定ユニットのボスに従って、嵌めこまれ得る。検定ユニットのチップは、次いで試薬ユニットから試薬ユニットへと移動されることができ、および試薬が、ピペットヘッドにより提供される、吸引またはピペット型の動作により検定ユニットに分配され得る。前記ピペットヘッド  は、吸引または注射器型の動作により、収集  チップ、検定ユニット、または試薬ユニット内で混合も行い得る。
【０１３６】
別の実施形態では、凝固検定を含む液体を収容するチップは、ピペッティング機器から切り離され、および器具内の特定の位置または廃棄可能なユニット内に「駐車」され得る。必要に応じて、チップは、液体が流出することを防止するために、封を使って蓋をかぶせられ得る。いくつかの実施形態では、この封はビニールの封である。本明細書で開示される、または本明細書にその全体が組み込まれる、米国特許出願第１３／２４４，９４７号もしくは米国特許８，０８８，５９３号に記載される、流体および物質取扱い機器の任意の変形が採用され得る。
例示的なサンプルチップ
【０１３７】
様々な容器形状が、サンプルチップ、反応チャンバー、毛細管およびキュベットとして利用され得る。例えば、キュベットは、円形、円筒形、正方形、長方形、立方体形、円錐形、ピラミッド形、または流体のサンプルを保持する能力のある任意の他の形状であり得る。光線が直角または他の角度（０度以外の）でキュベット表面に衝突する、長方形のキュベットが用いられ得る。そのような長方形のキュベットでは、照明される液体のサンプルも長方形であり、およびキュベットにより画成される。円形の断面を有するキュベットも用いられ得る。
【０１３８】
可変経路長のキュベットが、検定反応を最適化および引き延ばすために、ならびに検定を測定するために要求されるサンプルの量を最小化するために、用いることができる。キュベットは、その少なくとも１つの領域では、その断面との関係でより長くなることができる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、検定キュベットの１つのバージョンは、光線の方向において円形の断面を有する。円形の断面を有するキュベットの使用は、限定はされないが、以下のものを含むいくつかの利点を有し得る：
【０１４０】
１．  光学的経路長が正確に定義され得る。射出成型された部品の寸法精度は１〜２％変動係数（ＣＶ）よりも良い。従来のミクロタイター・プレートでは、強制されない液体メニスカスは、経路長における不正確さを誘導し得る。
【０１４１】
２．  開放端の特性およびチップの円形断面が、良好な流体取扱い特性を与え、液体の吸引を非常に正確にする。
【０１４２】
３．  チップの光学的画像が、チップ位置および液柱の境界を特定し、ならびに信号が最大になるチップの中心を非常に正確に見つける能力を提供する。
【０１４３】
４．  同じチップ中で、１つより多い液体サンプルがインキュベートされ、および分析され得る。このことは、チップの狭い部分においては、隣接する「一塊の（ｓｌｕｇ）」液体との間に、ごくわずかな物質輸送しか生じないためである（軸方向において）。
【０１４４】
本明細書に開示されるか、またはその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／３５５，４５８号に記載される、キュベットまたは画像化システムまたは方法における任意の変形が採用され得る。
【０１４５】
例示的なチップは以下の一般的な特徴を有し得る：
【０１４６】
チップ長：０．５〜４ｃｍ。
【０１４７】
チップ外径：０．２〜１．０ｃｍ。
【０１４８】
チップ内径：０．１〜０．５ｃｍ。
【０１４９】
チップ液体収容能力：０．５〜５０μＬ。
【０１５０】
チップ寸法精度：一般的に２％または＋／−０．００１ｃｍより良い。
【０１５１】
チップ構成：前記チップは、流体の密封を形成するために、一般的にピペット（円筒形）と係合する特徴を有する。画像化のために用いられる、一般的に円筒形または円錐形の領域がある。チップの下端は、重力下で垂直の液柱を保持することを助けるために、典型的には狭い。
【０１５２】
チップ材料：好適には澄んだプラスチック（ポリスチレン、ポリプロピレンなど）（例えば、可視光を＞８０、６０、４０、２０％透過させる）。他の適切な材料は除外されない。
【０１５３】
一実施例では、流体的に前記円筒に接続され、およびピペッターの先細の特徴と係合することが可能であるために適応されるために、円筒の上端は、切り取られた円筒形「ボス（ｂｏｓｓ）」になっている。チップの下端は、チップが垂直に配向され、ピペッターに取り付けらていないときに液体内容物を保持することを可能にする特徴を提供するために狭められている。チップの下端の外部形状は、その中にチップ端が圧入される可撓性の（ビニールの）キャップにより流体的に密封される能力を有するために、典型的には円筒形のシャフトの主部分から、端に向かって直径が減少され、幾分先がとがっている。チップは通常は成形されたプラスチック（ポリスチレン、ポリプロピレンなど）により形成される。前記チップは、サンプルについての情報が画像化により取得され得るように、透明または透光性である。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、前記チップは（１）ピペットヘッドと気密な密閉を形成するために係合し得る上部特徴、（２）基本的に円筒形（または非常にわずかな抜き勾配を持つ円錐形）のシャフトおよび狭い、先のとがった下部チップとともに構成される。このチップは、蓋と共に液密な密閉を形成し得る。この先のとがった形状は、中程度の力の下で、蓋との良好な一致を助ける。チップの材料は、射出成型されたポリスチレンであってよい。
【０１５５】
密閉は、サンプル封じ込め手段の狭い端に対して、器具のステージのｚ方向への動きにより生成された力を用いて、容易に圧入されるビニールまたは他の物質で形成された蓋を用いて達成されることができる。
試薬および反応
【０１５６】
いかなるユーザーも本明細書に記載される方法を遂行し得る。このユーザーは被験者自身であり得る。このユーザーは、医師または看護婦などの医学的に訓練された人物であることができるが、このことは必ずしも必要ではない。このユーザーは、本明細書に記載される方法を遂行するために、一般的なまたは特殊な技術的訓練を受けることができるが、ｂｕｔこのことは必ずしも要求されない。この方法は、２人以上のによっても遂行されることができ、例えば様々なが様々なステップを遂行する。
【０１５７】
本明細書に記載される方法は、あらかじめ採血された血液および／または血漿サンプルにより開始され得る。そのような実施形態では、前記サンプルは、しばしば添加された抗凝血剤、典型的にはＥＤＴＡを有する。本明細書に記載される方法は、被験者から血液を取得することからも開始し得る。前記血液は、非血管的な経路（例えば、毛細血管から、例えば、針を含まない）からも取得され得る。前記血液は、例えば指先穿刺から得ることができる。前記血液は、任意の適切な容器中に収集され得る。いくつかの実施形態では、前記血液はカートリッジ中に収集される。前記容器および／または収集カートリッジは、典型的にはＥＤＴＡである抗凝血剤を含み得る。この抗凝血剤は、前記血液サンプルと自然に混合するか、および／または前記血液サンプルに溶解し得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、サンプル（一般的に抗凝血剤を含む）は遠心分離される。遠心分離は、前記血液が、充填された形成された要素および血漿に分離されることができるような、適切な時間および遠心力の組み合わせで遂行され得る。この形成された要素は、一般的に主に赤血球により構成され、および血漿は一般的に実質的に細胞を含まない。遠心分離は、必ずしもいつも必要とは限らない。いくつかの実施形態全血により遂行され得る。この全血は希釈され得る。いくつかの実施形態は、遠心分離分離を用いることなく、例えば血液細胞を凝集させる試薬の添加などにより、血液から血漿を調製することもできる。
【０１５９】
血漿の全部または一部が検定で用いられ得る。この血漿は、多重化された型式におけるいくつかの検定の間で分配され得る。低容積の血漿をピペッティングするための適切な方法は、例えば米国特許出願第１３／２４４，９４７号および米国特許第８，０８８，５９３号に開示される。いくつかの実施形態では、この血漿は以下に記載されるように希釈された。この血漿は任意の適切な流体中に希釈され得る。例示的な流体は、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）、およびイミダゾール、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、トリエタノールアミン、または他の中性範囲（すなわち、約ｐＨ５〜９）の緩衝試薬を含む溶液を含む。この血漿および／または血漿サンプルは、凝固パラメーターの測定および／または血漿を多重化された型式の検定に分配する前、間または後のいずれか１つ以上で希釈されることができる。
【０１６０】
随意的に希釈されたサンプルの少ない容積が、次いで特定の試薬と混合される。この混合は、一般的に約１０秒未満、約５秒未満、以下約１秒未満など迅速に行われる。この試薬は、一般的に（ａ）必要に応じて、抗凝血剤の効果を逆転させる試薬、（ｂ）凝固を促進する試薬、および（ｃ）希釈されたサンプルのための、フィブリノーゲン、または以下に記載されるタンパク質などの１つ以上の補助的な試薬を含む。場合によっては、蛍光性または他の粒子の分散物が、以下に記載される画像化による凝固時間の決定のために加えられ得る。
【０１６１】
前記抗凝血剤の効果を逆転させる試薬は任意の適切な試薬であり得る。例えば、カルシウムイオンが、の効果を逆転させるために加えられ得る。この随意的にＣａＣｌ２中の形態のカルシウムイオンは、過剰に加えられ得る。実施形態では、カルシウムは、本明細書で提供される凝固反応に、反応中のカルシウムイオン（Ｃａ２＋）が、少なくとも０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、または１００ｍｇ／ｍｌであるか、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、もしくは１００ｍｇ／ｍｌ未満であるか、または０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、または７５ｍｇ／ｍｌおよび０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、または１００ｍｇ／ｍｌの間であることができるように加えられ得る。
【０１６２】
前記凝固を促進する試薬（「凝固開始試薬」）は、測定される凝固パラメーターに応じて変化し得る。上述のように、ＰＴおよび／またはＩＮＲの測定は、組織因子および脂質を含むプロトロンビン試薬の添加を含む。ａＰＴＴ検定は、リン脂質プラスシリカ、セライト、カオリンまたはエラグ酸などの活性化剤を用いる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、１つ以上の試薬が、濃縮されたまたは乾燥された形態で存在する。濃縮された試薬は、サンプル希釈の量を低減させ得る。乾燥された試薬に関しては、サンプルの乾燥された試薬との混合は、この試薬をサンプル中に急速に溶解、および／または分散させる。この乾燥された試薬は、繰り返される吸引または混合のための手段により、サンプル中に溶解および／または分散され得る。試薬が濃縮されたまたは乾燥された形態で安定であれば、いかなる試薬も濃縮または乾燥されることができ、冷蔵、保存剤などの必要性を回避できる可能性がある。とりわけ、ＰＴ試薬、ａＰＴＴ試薬、および／またはＣａＣｌ２は濃縮および／または乾燥され得る。試薬の全てが１つの乾燥された試薬中に組み合わせられることができる。例えば、この試薬は、迅速な溶解のために製剤された、ショ糖、トレハロース、ポリエチレングリコール、アルブミンなどとの製剤を含む、浸食される薄膜の形態中にあることができる。ＰＴおよび／またはＩＮＲ測定において使用するために適切な乾燥された試薬の１つの製剤は、米国特許第５，１６４，５９８号に見出すことができる。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、血漿は試薬試薬と混合され、次いで一般的に制御された温度でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、前記温度は約１５°Ｃ、約２０°Ｃ、約２５°Ｃ、約３０°Ｃ、約３５°Ｃ、約４０°Ｃ、約４５°Ｃ、約５０°Ｃなどである。いくつかの実施形態では前記温度は約１５°Ｃ〜約５０°Ｃ、約３０°Ｃ〜約４０°Ｃなどの間である。場合によっては前記インキュベーションのステップは省略され得る。例えば、ａＰＴＴ検定は、インキュベーションを必要としない。
希釈の方法
【０１６５】
いくつかの実施形態では、血液または血漿サンプルは希釈される。サンプルを希釈することは少なくとも３つの潜在的な利点を与える。第一に、希釈は必要とされるサンプルの量を低下させ得る。いくつかの実施形態では、希釈される血漿の等分が、凝固パラメーター測定のために蓄えられると、残りは他の検定のために用いられ得る。更に、例えば、サンプルの１０倍の希釈は、１０分の１の少ないサンプルを用いる方法を可能にする。第二に、希釈は、脂肪血（乳白色に見え得る高脂質含量のサンプル）サンプルからの光散乱を減少させる。第三に、希釈は凝固時間を増加させる。このことは検定の時間依存性を少なくするために有益である。すなわち、サンプルを試薬に混合するステップ、またはカメラを動かすことが、あまりにも急速に行われなくてもよい。そのようなステップを遂行することは、流れが層流である小容積のサンプルを用い、カメラが小容積に一直線になる必要があるなどの場合に、とりわけ課題となる。
【０１６６】
前記凝固時間は、随意的に操作手順を、より時間依存性ではなくし、より正確および／または的確にするために十分に長く、ならびに随意的にポイント・オブ・ケアにおいて遂行され、リアルタイムに近い結果を与えるためには十分短い、任意の適切な時間であり得る。いくつかの実施形態では、  前記凝固検定  は他の生体指標または治療薬剤の測定と平行して行われる（すなわち、多重化される）  。  これらの実施形態では、凝固時間が多重化された検定において、遂行される他の測定  時間と同様になることができるために、サンプルを希釈することが、有益および／または実際的である。随意的に凝固時間は、他の生体指標または治療薬剤検定の最も長いものと、同様であるかまたはより短い。  
【０１６７】
いくつかの実施形態では、希釈された、または希釈されていないサンプルのいずれかを用いる前記凝固時間は、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分などである。いくつかの実施形態では、希釈された、または希釈されていないサンプルのいずれかを用いる前記凝固時間は、約１分未満、約２分未満、約３分未満、約４分未満、約５分未満、約６分未満、約７分未満、約８分未満、約９分未満、約１０分未満、約１５分未満、約２０分未満、約２５分未満、約３０分未満などである。いくつかの実施形態では、希釈された、または希釈されていないサンプルのいずれかを用いる前記凝固時間は、約１分〜約２分、約１分〜約５分、約２分〜約１０分、約５分〜約８分などである。
【０１６８】
サンプルは任意の適切な程度に希釈されることができ、随意的に、任意の適切な凝固時間を達成するために希釈され得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、約１．２倍、約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約７．５倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、または約１００倍に希釈される。いくつかの実施形態では、サンプルは、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍に希釈される。いくつかの実施形態では、サンプルは、最大でも約１．２倍、最大でも約１．５倍、最大でも約２倍、最大でも約３倍、最大でも約４倍、最大でも約５倍、最大でも約７．５倍、最大でも約１０倍、最大でも約２０倍、最大でも約３０倍、最大でも約４０倍、最大でも約５０倍、または最大でも約１００倍に希釈された。いくつかの実施形態では、サンプルは、希釈された約１．２倍〜約２倍、約２倍〜約５倍、約５倍〜約２０倍、または約５倍〜約５０倍に希釈された。実施形態では、サンプルは、オリジナルのサンプルの（容積により）９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、０．１％以下、０．０５％以下、０．０１％以下、０．００５％以下、または０．００１％以下のオリジナルのサンプルを含むように希釈され得る（すなわち、本明細書で用いられる、１００μｌの希釈されたサンプルの例示的な合計容積中に、オリジナルのサンプルを８０％以下の濃度で含む希釈されたサンプルは、８０μｌ未満のオリジナルの（希釈されていない）サンプルを含む；同様に、１００μｌの希釈されたサンプルの例示的な合計容積中に、オリジナルのサンプルを２％以下で含む希釈されたサンプルは、２μｌ未満のオリジナルの（希釈されていない）サンプルを含む）。このオリジナルのサンプルは、例えば、希釈されていない全血または血漿であり得る。実施形態では、凝固反応は、希釈されたサンプルを、反応中にオリジナルのサンプルの最終濃度（容積による）で、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、０．１％以下、０．０５％以下、０．０１％以下、０．００５％以下、または０．００１％以下の反応混合物中のオリジナルのサンプルを含み得る（すなわち、１００μｌの希釈されたサンプルの例示的な反応の合計容積中に、オリジナルのサンプルを反応中に、８０％以下の濃度で含む凝固反応は、８０μｌ未満のオリジナルの（希釈されていない）サンプルを含む；同様に、１００μｌの希釈されたサンプルの例示的な反応の合計容積中に、オリジナルのサンプルを反応中に、２％以下の濃度で含む凝固反応は、２μｌ未満のオリジナルの（希釈されていない）サンプルを含む）。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、ポイント・オブ・ケアーにおいて、この検定を用いて、リアルタイムに近い結果を達成するためには、短時間が望ましいために、全体の凝固検定を短時間で完結することが望ましい。全体の検定時間は、随意的に指先穿刺により血液を採血することから、凝固パラメーターの報告のために画像を分析するために画像を捕捉するために、前記血液に特定の試薬を加えるまでにわたる。全体の検定時間は、それを必要性とする患者に、抗凝血剤の用量を計算および／または投与するために、報告された凝固パラメーターを使用するまでにわたる。いくつかの実施形態では、全体の検定時間は、約１分、約３分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約３０分などである。いくつかの実施形態では、全体の検定時間は、約１分未満、約３分未満、約５分未満、約１０分未満、約１５分未満、約２０分未満、約３０分未満などである。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、特定の  条件下でのサンプルの希釈は、凝固の際のサンプルの凝血塊  および／または濁度の機械的な  強さを低下させ得る。特定の  例では、凝血塊  強さが減少されると、凝固が生じる時間を決定することが困難になるために不利益であり得る。  本開示は希釈を補償するための一連の随意的な方法を包含する。  
【０１７１】
いくつかの実施形態では、この方法は、小さな容器および／または高い表面積対容積比を有する容器中で遂行され得る。このことは、初期の凝血塊が容器の表面に接着することを助ける。容器のサイズおよび／または表面積は、以下に記載されるような、凝固時間が、サンプル全体の往復する動きにより決定される場合には考慮の対象となり得る。容器の容積および／または容器の表面積対容積比は、本明細書に記載される方法が、確実におよび正確に遂行され得るような、任意の適切な値であり得る。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、小さな粒子、フィブリノーゲン、界面活性剤、および／またはタンパク質などの補助的な試薬が加えられ得る。そのような補助的な試薬は、より凝固の際に強い凝血塊の形成を支持および／またはサンプルの濁度を増加させ得る。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、サンプルの粘度における変化を可視化するためにサンプルに小さな粒子が加えられ得る。小さな粒子の動きにおける低下は、サンプル  の粘度における増加に関連付けられることができ、およびサンプル  凝固の指示を提供し得る。
【０１７４】
いかなる特定の理論に拘束されることなしに、本発明の方法  の多くのバージョンにおいて、一旦凝固が生じると、重力は、希釈サンプルにおける凝固に対してさえも、粒子の動きに対する粘性抵抗に打ち勝つためには弱すぎると考えられる。粒子の画像化が、本明細書に記載される凝固時間のために用いられ得る。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンがサンプルに加えられ得る。追加されるフィブリノーゲンは、凝血塊が形成する時に、より強固な凝血塊を提供することができ、および／または増加された濁度を提供できる。フィブリノーゲンは、随意的に動物から導出され、随意的にウシ・フィブリノーゲンであり得る。加えるためのフィブリノーゲンの量は、適切な機械的な強さの凝血塊および／または濁度が形成されることができるための、任意の量であり得る。様々な実施形態では、希釈されたサンプルには、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、または約１０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンが補われる。様々な実施形態では、希釈されたサンプルには。少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンが補われる。実施形態では、本明細書で提供される凝固反応は、外因性フィブリノーゲンの凝固反応における最終濃度が、少なくとも０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、もしくは１００ｍｇ／ｍｌ、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、もしくは１００ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、または７５ｍｇ／ｍｌから０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、もしくは１００ｍｇ／ｍｌになることができるように外因性フィブリノーゲンにより補われ得る。
【０１７６】
実施形態では、凝固反応は、反応中のオリジナルのサンプルの最終的濃度（例えば、希釈されていない血漿または全血）が、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、０．１％以下、０．０５％以下、０．０１％以下、０．００５％以下、または０．００１％以下になるように、希釈されたサンプルを含むことができ、およびこの凝固反応は、凝固反応中の外因性フィブリノーゲンの最終濃度が、少なくとも０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、または１００ｍｇ／ｍｌであるか、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、もしくは１００ｍｇ／ｍｌ未満であるか、または０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、もしくは７５ｍｇ／ｍｌから０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、もしくは１００ｍｇ／ｍｌの間になることができるための、外因性フィブリノーゲンを更に含み得る。
【０１７７】
希釈  を補償するための他の方法を使用すること、および／または本明細書に記載される方法を、互いに組み合わせて使用するか、または他の方法と組み合わせて使用することも可能である。      例えば、希釈されたサンプルにおける凝固時間を決定するために、フィブリノーゲンおよび粒子を加えることが可能である。本明細書の他の部分で議論されるように、  実施形態では、凝固検定のために希釈されたサンプルの使用により様々な利点が与えられ得る。従って、サンプルの希釈を補償するためのフィブリノーゲンまたは他の試薬の使用  は、凝固検定における希釈されたサンプルの使用  に付随する利点の実現を許容する一方で、効果的および測定可能な希釈されたサンプルの凝固をそれでも達成する。
【０１７８】
場合によっては、血液および／または血漿サンプルの希釈は、例えば管またはピペットチップなどの表面への吸着により、サンプルからの凝固因子の逸失を導き得る。いくつかの実施形態では、凝固因子の損失を防止および／または低下するために、界面活性剤および／またはタンパク質がサンプルに加えられ得る。この目的に適切な例示的な界面活性剤はトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００である。この目的に適切な例示的なタンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。界面活性剤および／またはタンパク質の濃度は、凝固因子の損失が、任意の許容可能なレベルまで低下されることができる、適切な濃度であり得る。
画像
【０１７９】
本明細書に記載される機器およびシステムは、カメラ、ＣＣＤセンサーを含む機器、ＣＭＯＳセンサーを含む機器または任意の他の画像化能力を有する、卓上、またはより大きな機器などの任意の画像化機器を含み得る。本明細書に記載される方法は、凝固パラメーターを測定するために光学的方法を用い得る。いくつかの実施形態では、サンプルの凝固は、サンプルの濁度および光散乱を増加し得る。フィブリノーゲンの添加は、本明細書に記載されるように検出されることができるように、凝血塊の濁度および光散乱を増加するための一方法である。
【０１８０】
他の実施形態では、サンプルは最初から濁っており、および／または懸濁される粒子の添加により最初から濁っているようにされ、この懸濁される粒子は、しばしば裸眼ではそれ自身を視認できないが濁った霞みを生成する。最初に濁っているサンプルは、全体の流体から粒子が沈降するにつれて、経時的に濁りが少なくなるが、サンプルの凝固は、粒子の沈降を停止、または大幅に遅くすることができ、および／または濁度の減少を遅くし得る。いくつかの実施形態では、凝固時間は、サンプルの全体の濁度の減少速度の停止または遅延化により決定され得る。濁度による凝固時間の決定は、光学的技法（光を含む）により、および画像の捕捉を含み得るが、画像を使用することを必ずしも含まない。例えば、実施形態では、濁度は、サンプルを通過する光またはサンプルにより散乱される光の吸収により測定され、そのいずれかが、例えば光電子増倍管または光ダイオードにより感知され得る。いくつかの実施形態では、本明細書の方法により得られる画像は光散乱画像であり、および随意的には、ピクセル化されない。サンプルを通過する長い光路を持つこと、またはサンプルの経路長を増すことは、濁度における変化を含む測定の感度を増すための一手段である。
【０１８１】
本明細書に記載される方法は、凝固パラメーターを測定するために画像を用い得る。この画像はビデオ画像であるか、または時間が設定された写真的画像であり得る。これらの画像は、カメラ、鏡、レンズ、顕微鏡などの光学的機器により捕捉され得る。これらの画像は二次元的または三次元的であり得る。これらの画像は黒白、グレー・スケールまたはカラーであり得る。これらの画像は、デジタルまたはアナログ画像のデジタル化を含むアナログであってよい。これらの画像はピクセル化されることができ、このことは、その画像が様々な分光学の形態を含む他の光学的現象から画像が区別され得る複数のピクセルを含むことを意味する。二次元的画像は、画像を複数の行および列に分割することによりピクセル化されることができ、それぞれの要素（行および列の位置）がピクセルを定義する。
【０１８２】
前記画像は任意の適切な数のピクセルにピクセル化される。一実施形態では、前記画像５１２行および５１２列に変換され、２６２，１４４ピクセルを定義する。いくつかの実施形態では、前記画像は、約１０，０００ピクセル、約５０，０００ピクセル、約６０，０００ピクセル、約１００，０００ピクセル、約２００，０００ピクセル、約５００，０００ピクセル、約１、０００，０００ピクセル、約５、０００，０００ピクセル、約１０，０００，０００ピクセル、または約５０，０００，０００ピクセルを含む。いくつかの実施形態では、前記画像は、少なくとも約１０，０００ピクセル、少なくとも約５０，０００ピクセル、少なくとも約６０，０００ピクセル、少なくとも約１００，０００ピクセル、少なくとも約２００，０００ピクセル、少なくとも約５００，０００ピクセル、少なくとも約１、０００，０００ピクセル、少なくとも約５、０００，０００ピクセル、少なくとも約１０，０００，０００ピクセル、または少なくとも約５０，０００，０００ピクセルを含む。いくつかの実施形態では、所定の面積が特定の数のピクセルを含む、ピクセル密度および／または解像度が、報告され得る。
【０１８３】
一態様では、前記方法は、画像の時系列を用いる凝固時間の決定について記載する。画像は、任意の適切な速度で補足され得る。前記速度は一定、または凝固の時間的経過にわたって変化することができ、随意的に、サンプル中で凝血塊が形成される時間の周囲でより多くの画像が捕捉され得る。いくつかの実施形態では、画像は、秒当たり約１フレーム、秒当たり約５フレーム、秒当たり約１０フレーム、秒当たり約１５フレーム、秒当たり約２０フレーム、秒当たり約３０フレーム、秒当たり約５０フレーム、秒当たり約１００フレーム、秒当たり約５００フレームなどの速度で捕捉される。いくつかの実施形態では、画像は少なくとも秒当たり約１フレーム、少なくとも秒当たり約５フレーム、少なくとも秒当たり約１０フレーム、少なくとも秒当たり約１５フレーム、少なくとも秒当たり約２０フレーム、少なくとも秒当たり約３０フレーム、少なくとも秒当たり約５０フレーム、少なくとも秒当たり約１００フレーム、少なくとも秒当たり約５００フレームなどの速度で補足される。いくつかの実施形態では、フレーム捕捉の中間に位置する凝固時間を見積もるために補間方法が用いられ得る。
【０１８４】
前記画像は、コンピュータ可読媒体上に保存され得る。前記画像はリアルタイムで処理されるか、後の時間に処理され得る。前記画像は、手動で処理され得るか、またはコンピュータにより実行される方法を用いて処理され得る。
凝固分析のための光学的設定
【０１８５】
凝固分析は、光学的設定を用いて遂行され得る。この光学的設定は、制限することなく光源および光検出器を含む。典型的に、前記光源は凝固反応に到達する光を提供し、および前記検出器は反応からの光（例えば、反応により散乱された光、反射された光、または反応を通過した光）を検出する。
【０１８６】
前記光源は、例えば、１つ以上の白色光源、単色ＬＥＤ、蛍光性のランプまたはＬＥＤからの広帯域幅の光、ＬＥＤアレイ、赤色、緑色、および青色光源の混合物、ＬＥＤにより活性化されたリン、蛍光灯、白熱ランプ、レーザー、または閃光電球などのアーク源であり得る。
【０１８７】
様々な光検出器が、本明細書において提供される方法およびシステムとともに用いられ得る。実施形態では、ＣＣＤセンサーまたはＣＭＯＳセンサーなどの画像センサーが用いられ得る。画像センサーはカメラの一部として提供され得る。カメラは、開口部またはレンズを含み得る。実施形態では、カメラのレンズは、３５ｍｍを含む、５〜１００ｍｍの間の任意の焦点距離を有し得る。前記レンズは、標準撮影距離を持つガラスであるか、またはウエブカムレンズであり得る。実施形態では、光検出器は、光電子増倍管（ＰＭＴ）または光ダイオード（例えば、アバランシェ光ダイオード、広範囲光ダイオード、ＰＩＮ光ダイオード、および単一波長光ダイオードを含む）などの光子計数器／検出器であってよい。いくつかの実施形態では、ＰＩＮダイオードは、ＰＭＴに匹敵する感度の検知機器を作成するために、増幅器と連結され得る。検出器は、電球または発光ダイオード（ＬＥＤ）などの光源を含み得る。前記光源は、結果を検出するために、検定を照明し得る。前記検出器は、前記光源を検定まで送達するためのレンズまたは光ファイバーなどの光学系も含み得る
【０１８８】
前記光源および検出器は、互いに対しておよび凝固反応支持物（例えば、容器、表面、管、チップなど）に対して、様々な構成を有することができる。例えば、前記光源および検出器の両方が反応支持物と一直線にあることができ、または１つもしくは前記光源および検出器の両方が反応支持物または互いに対して一定の角度にあり得る。一実施例では、前記光源は凝固反応支持物と一直線にあり、および前記検出器は、反応支持物に対して９０度の角度にあり得る。開口部が、前記光源または反応支持物および前記検出器の間にあってよい。反応支持物が、前記光源からの光が反応に到達し、および反応からの光が前記検出器に到達できるように、光学的経路中に移動されたときに反応の画像が撮影され得る。実施形態では、反応支持物は、ｘ、ｙ、またはｚ次元のいずれかまたは全てでの移動により、光学的経路中に、または光学的経路から移動し得る。実施形態では、凝固反応支持物は、光源および／または検出器との伝達状態に移動され得る。実施形態では、前記光源および／または検出器は、凝固反応支持物との伝達状態に移動され得る。実施形態では、凝固反応支持物、光源、および検出器の１つ、２つ、または３つ全部が少なくとも他の２つの内の１つに対して移動され得る。実施形態では、光検出器から少なくともいくらか離れた位置から光検出器に光を向かわせるために、１つ以上の光ファーバーケーブルが、ＣＣＤセンサーまたはＰＭＴ光検出器に接続されることができる。
【０１８９】
反応支持物／サンプル容器は、背面照射、前面照射、または斜め（側面）照射され得る。背面照射は、光散乱を検出する（比濁法）目的で用いられ得る。光学的配列は、広い、均一に照射された背後野（ｒｅａｒ  ｆｉｅｌｄ）、および被写体に遮断される、特別に形状づけられた光線の形態を取り得る。前面照射も用いられ得る。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、凝固の画像化のための光学的設定は、散乱された光を測定するために構成され得る。一態様では、散乱された光を測定するための設定は、光源および検出器を含む。前記光源は拡散した光を提供し得る。サンプルは、光学的に澄んだチップまたは他の支持物などの容器中に保持される。前記容器は、ポリスチレンまたはアクリルなどの澄んだ物質で形成され得る。容器の光経路（内径）は、例えば、約０．０５、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはより多いミリメーターであり得る。前記容器は、典型的には検出器から約２０〜５０ミリメーターの間隔で検出器の前に配置される（しかしながら他の間隔も用いられ得る）。前記検出器は、本明細書の他の場所に記載される任意の検出器であり得る。
【０１９１】
前記検出器は、レンズおよびフィルターなどの光学的構成要素を含んでも、または含まなくてもよい。フィルターは、周囲から、いかなる迷光も除去することによりバックグラウンドを低下させるために用いられ得る。サンプルは、前記検出器に対して９０度の角度（または照明する光線に対してゼロ以外の任意の角度）から照明され得る。前記光源は、サンプル支持物に対して、側面から（前記検出器から、ほぼ９０度の角度で）、頂部から、または他の位置から配向され得る。前記光源は、拡散または非拡散の、および任意の波長の、または波長の組わせの任意の光源であってよい。前記光源の波長は、前記検出器の最大の分光感度に適合するように選ばれ得る。
【０１９２】
蛍光励起においては、被写体は蛍光照明の目的のために、正面から照明され得る。前記光源は、ＬＥＤまたはレーザーなどの単色光であり得る。斜めの照明も蛍光励起において用いられ得る。被写体は、放出された光子が出現する角度から、通常９０度である角度で励起される。この形態の照明は、被写体（背面照射される）の直接後ろと同様に、側面から出る蛍光放出の散乱の検出を可能にする。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、蛍光性の放出は、励起光線に対して９０度で撮像される。いくつかの実施形態では、典型的には高強度ＬＥＤである光子源は、ビーム拡散器および成形レンズを通過し、平行または徐々に発散する励起ビームを生成する。この励起ビームは、バンドパスフィルターを通過し、および蛍光的に標識されたサンプルを持つ溶液を含む容器（管、キュベット、またはピペットチップ）から成るサンプルを照明する。等方的に放出された蛍光は、ストークス・シフトされた蛍光を通過させるために適切な、ロングまたはバンドパスフィルターによる励起光から、スペクトル的に分離される。光は次いでデジタルカメラまたは他の検出器上のレンズにより撮像される。蛍光強度が、生成された画像から画像分析を介して抽出される。
【０１９４】
他の実施形態では、透過された光は、励起波長の光を除くための光学的フィルタリングの後に撮像される。いくつかの実施形態では、典型的には高強度ＬＥＤである光子源は、ビーム拡散器および成形レンズを通過し、ゆっくりと発散する楕円の励起ビームを発生する。この励起ビームはバンドパスフィルターを通過し、およびそれぞれが、蛍光的に標識された物質を持つ溶液を含む、１つ以上のサンプル容器（管、キュベット、またはピペットチップ）として提示されるサンプルを照射する。等方的に放射された蛍光は、ストークス・シフトされた蛍光を通過させるために適切な、ロングまたはバンドパスフィルターによる励起光から、スペクトル的に分離される。光は、次いで、デジタルカメラ上のカメラレンズを介して撮像される。蛍光強度が、生成された画像から画像分析を介して抽出される。この光学的設定は、複数の管の配列の画像を同時に生成するために用いられ得る。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、画像化は蛍光、暗視野照明、または明視野照明を用いて生じ得る。
【０１９６】
暗視野照明は、例えば、環状光（試料の上方又は下方に配置された）、暗視野照明のアッベ集光レンズ、ドーナッツ形鏡を持つ暗視野照明の集光レンズ、対物レンズの周囲のスリーブの中に内蔵された落射暗視野照明の集光レンズ、又は環状光と、不透明なライト・ストップ（ｄａｒｋ  ｓｔｏｐ）が装備されたステージ集光レンズの組み合わせの使用により達成され得る。基本的には、これらの光学的部品は、使用される対象物の開口数（ＮＡ）よりも大きなＮＡの光円錐を生成する。照明スキームの選択は、要求される倍率、機械的な設計の考慮、画像化センサーのサイズなどの、多数の検討事項に依存する。環状光に基づく照明スキームは、一般に、より広い領域に渡る均一な暗視野照明を提供する一方で、同時に全体システムの機械的な設計における十分な柔軟性を提供する。
【０１９７】
明視野照明は、ケーラー（Ｋｏｅｈｌｅｒ）照明を生成するためのステージ−集光レンズとともに、白色光源の使用により達成され得る。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、自動的なフィルター・ホイール（ｆｉｌｔｅｒ  ｗｈｅｅｌ）が用いられることができる。この自動的なフィルター・ホイールは、同一視野上の複数の蛍光色素分子の画像化を可能にするために、画像化の光学的経路の制御を可能にする。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、画像に基づく自動焦点方式が行われ得る。自動焦点方式を達成するために、対象のｚ−位置（例えば、垂直位置）（すなわち、その試料からの距離）を制御するために画像に基づくアルゴリズムが用いられることができる。簡単に言えば、小さい画像（例えば、１２８ｘ１２８ピクセル）は、暗視野、明視野、または他のタイプの照明を用い、速い速度で捕捉される。この画像は、画像の鮮明さを測定するための自動焦点機能を導出するために分析される。高速検索アルゴリズムに基づき、対象の次のｚ−位置が計算される。この対象は新しいｚ−位置に移動されることができ、及び別の小さな画像が捕捉され得る。この閉ループのシステムは、焦点調節のための他のハードウエアの使用を必要としない。Ｘ及びＹ方向（例えば、水平方向）への平行移動を可能にするために、顕微鏡のステージが、コンピュータ制御された自動コマ送り機構モーターに接続され得る。全ての位置において、望ましい数の画像が捕捉され、及び前記ステージは次のＸＹ位置へ移動される。
【０２００】
ＣＣＤ、ＥＭＣＣＤ、ＣＭＯＳを持つカメラ、またはいくつかの場合には光電子増倍管が、信号の検出に用いられる。
光散乱の方法
【０２０１】
いくつかの実施形態では、前記凝固時間は光散乱により決定され得る。反応混合物が、ピペットチップまたは毛細管に毛細管力または吸引のいずれかにより採取される。これらのチップまたは毛細管は、限定はされないが、ガラスまたはポリスチレンまたはポリメタクリル酸メチル（アクリル）などの澄んだプラスチックを含む光学的に澄んだ物質から形成され得る。いくつかの実施形態では、前記ピペットチップまたは毛細管は長くおよび細い。例えば、１μＬの反応混合物が、０．５ｍｍの直径の毛細管に採取されると、約５．１ｍｍの液柱が生じる。
【０２０２】
前記ピペットチップまたは毛細管は、随意的に検定の間の蒸発を防ぐために、次いで密封されるか、または蓋をされることができる。チップまたは毛細管を密封するための１つの適切な方法は、更に少ない容積の鉱油を吸入することである。前記ピペットチップまたは毛細管は、前記チップまたは毛細管表面からの、光散乱を低下させることにより画像化を改善するために、油で被覆され得る。
【０２０３】
前記ピペットチップまたは毛細管  は、次いで暗い背景の正面に吊り下げられおよび照明され得る。  一般に、照明の方向は、光がチップまたは毛細管  を照明するが、カメラまたは他の  光検出器に直接入射しないようにできるものである。  例えば、  このカメラ  が前記チップまたは毛細管の正面にあると、    光はその側面から入射し得る。
【０２０４】
前記チップまたは毛細管は光学的に観測される。光ダイオードまたはＰＭＴなどの単純な光検出器が用いられ得る。随意的にビデオカメラであるカメラも用いられ得る。カメラは、例えば、ＣＣＤまたはＣＭＯＳセンサーを含み得る。いくつかの実施形態ではカメラの使用は画像処理によりサンプルの位置を決定でき、それによりこの方法をピペッティング誤差およびサンプル配置に対して影響を受けにくくする点で有益である。いくつかの実施形態では、前記チップまたは毛細管は、反射率または吸光分光法により観測される。
【０２０５】
凝固が生じるときに、フィブリノーゲンは重合しおよびサンプルの濁度を増加させる。追加的な光が、反応混合物から散乱され、カメラまたは光検出器により、前記検出器中に散乱された照明光における増加として登録される。図１は、凝固前の反応混合物１００および凝固後の反応混合物１０５を示す。示された位置１００から位置１０５までの濁度における増加に注意されたい。更に、図１では、前記チップの下部１０１は油で被覆されている一方、前記チップの上部は油１０２により被覆されていない。油で被覆されていない部分１０２と比較した場合の、チップの油で被覆された部分１０１からの低い光散乱に注意されたい。
【０２０６】
画像分析は、検定混合物を通過した光のみを分析することを可能にし、このことは特に非常に小さな検定容量の場合に適切である。例えば、画像分析を用いて、容器の壁から反射または散乱された光は分析から除外され得る。別の実施例では、画像分析を用いて、検定混合物を含む画像の領域のサイズが決定されることができ、これは次に容器中の検定混合物の容積を決定するために用いられ得る。このことは、例えば、異なる容積の検定混合物全体にわたる信号の正規化を可能にする。別の実施形態では、画像分析を用いて、検定混合物を含む容器または検定混合物の容器中の位置が決定され得る。このことは、検定混合物を含む容器または検定混合物の容器中の位置が、同じ光学的設定における異なる検定走査全体を通じて時に変動し得る場合ですら、検定混合物からの光の正確な測定を可能にする。一般に、画像分析は、分析のための画像中の目的の範囲（ＲＯＩ）の特定を可能にする。典型的に、画像のＲＯＩは、全体の画像の内の検定混合物を含む画像部分である。随意的に、ＲＯＩは画像中で特定されることができ、およびＲＯＩ中の光／信号の強度が決定され得る。複数の画像が取得される所定の検定混合物について、同じ検定混合物の複数の画像の全体にわたるＲＯＩにおける信号の強度が測定および分析されることができ、および検定混合物における凝固の時間を決定するために用いられ得る。典型的に、検定混合物の凝固状態における変化は、ＲＯＩにおける信号における変化をもたらす。
【０２０７】
光散乱における増加の開始の時間は、希釈されたサンプルについての凝固時間であり、および適切な凝固パラメーターを与えるために適切に変換され得る。希釈された凝固時間の凝固パラメーターへの変換は、独立して特性化されたサンプルによるシステムの校正を介して行われ得る。
光散乱データの分析  
【０２０８】
上述のように散乱された光が測定される実施形態では、図２に示すようなタイプのデータが得られる。図示されるように、平均の信号が時間に対してプロットされる。この場合には、時間は水平軸上にありおよびちょうど５０秒未満から、右方の３００秒を超えるところまで延伸している。平均信号強度は垂直軸にプロットされ、および反応の開始におけるちょうど０．２未満の平均強度ユニットから終点のちょうど０．４５ユニットまで延伸する。図３は、４パラメーター対数ロジスティック関数のプログレス曲線に適合された２からのデータを示す。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、前記凝固時間は、図２中のプロットされたデータの定義された部分および／または図３に描かれている前記プログレス曲線から推算されることができる。例えば、前記凝固時間は、最大の光散乱の約１０％、約５０％、または約８０％などの光散乱が到達する場合として、定義され得る。用いるための曲線の最適点は、臨床的懸念のある範囲に亘る凝固パラメーター値を持つ臨床サンプルのための、許容されるすでに承認されている（ｐｒｅｄｉｃａｔｅ）方法による結果との相関により決定され得る。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、前記散乱光強度データは、図１９に示されるように、曲線に適合され得る。描写されるように、平均信号が時間に対してプロットされている。この場合には、時間は水平軸、および平均信号強度は垂直軸にプロットされる。図１９では、Ｓ字状の曲線が平均光強度データであり、およびそれは双線形の曲線に適合されている。いくつかの実施形態では、前記凝固時間は、図１９に描かれる双線形の適合の任意の低美された部分から推算され得る。例えば、前記凝固時間は、光散乱のベースライン・レベルの上の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の光散乱信号が到達する場合と定義され得る。
【０２１１】
実施形態では、凝固反応の光散乱による分析を含む方法は、凝固反応を通過して透過された光の量を測定し得る。サンプルが凝固するにつれ、それはより不透明になり、より多くの光を散乱し、およびより少ない光を透過する。実施形態では、凝固反応を通過して透過された光が測定された検定の凝固時間は、凝固反応検定を通過して透過された光の量が、サンプルを通過した光透過のベースラインから、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％だけ減少する点として定義され得る。
粒子ビーズ沈降方法
【０２１２】
いくつかの実施形態では、前記凝固時間は、凝血塊の形成時に、サンプル中の顕微鏡的な粒子またはビーズの沈降の速度が停止または減速することにより決定され得る。ビーズは、サンプルに、任意の適切な濃度で、凝固に先立つ任意の時間の前に加えられ得る。いくつかの実施形態では、前記ビーズは、混合される試薬の濃縮されたまたは乾燥された混合物の一部であり、サンプル中に懸濁、および／または溶解されおよび再懸濁される。
【０２１３】
図５に転じて、前記方法は、ビーズ５００を含むサンプルを毛細管またはピペットチップ５０５などの透明な容器中に抜き取ることを含む。前記毛細管またはピペットの種類は、随意的に約０．５ｍｍの狭い直径を有することができる。前記毛細管は、前記ビーズが、前記チップまたは毛細管の最も長い寸法に沿って、重力により沈降できるように、典型的には垂直に配向される。前記ビーズの沈降は、経時的にカメラ５１０により撮像される。前記カメラはビデオカメラであるか、および／または粒子を画像化する能力のある顕微鏡に連結され得る。いくつかの実施形態では、可視化の方法はビデオ顕微鏡である。いくつかの実施形態では、前記カメラはウエブカムである。いくつかの実施形態では、このウエブカムは毛細管またはチップから約１０ｍｍ離れて取り付けられる。
【０２１４】
用語「ビーズ」および「粒子」は互換可能に用いられる。前記ビーズは、凝固の時に停止、または減速する、適切な速度で沈降できるような、任意のサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、前記ビーズ約５μｍ、約１０μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約４５μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、または約１００μｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、前記ビーズは最大でも約５μｍ、最大でも約１０μｍ、最大でも約２０μｍ、最大でも約２５μｍ、最大でも約３０μｍ、最大でも約３５μｍ、最大でも約４０μｍ、最大でも約４５μｍ、最大でも約５０μｍ、最大でも約６０μｍ、またはａｔｍｏｓｔ約１００μｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、前記ビーズ約５μｍ〜約１００μｍ、約２０μｍ〜約６０μｍ、または約２５μｍ〜約４０μｍの直径を有する。前記ビーズは、ポリスチレンまたはラテックスを含む任意の適切な物質から形成されることができ、それらは球状を含む任意の形状であることができ、およびそれらは任意の適切な密度を有し得る。
【０２１５】
様々なサイズの、様々な形状の、様々な密度を有する、様々な物質で作成されたなどのビーズは、異なる速度で沈降し、および／または様々な割合で凝血塊中に保持される。いくつかの実施形態では、粒径分布を有するビーズ混合物が用いられ得る。いくつかの実施形態では、複数の異なるサイズを有するビーズ混合物が用いられ得る。図５に示されるように、２５μｍの直径を有するビーズ５１５および４５μｍの直径を有するビーズ５２０の混合物が用いられ得る。様々な形状の、様々な密度を有する、様々な物質で作成されたなどのビーズの混合物が用いられ得る。一態様では、ビーズの混合物が用いられ得る。ビーズの混合物は、方法の感度、方法の再現性、方法により測定可能な凝固時間の範囲などを改善するために、複数の沈降時間および／または凝血塊保持特性を提供する。
【０２１６】
時間が進行するにつれ、前記ビーズは、図５中の表示５２５に示されるように、重力下で沈降する、いくつかの実施形態では、前記ビーズの動きは、対流、空気の流れ、磁場、ブラウン運動などの任意の他の適切な力を、随意的に重力と組み合わせることにより駆動され得る。前記ビーズは、それらが、媒体未満の密度を有する場合には、重力下で媒体中を流れることも可能である。いかなる特定の理論に拘束されることなしに、希釈された血漿中にを防止する。いくつかの実施形態では、凝血塊の強さは、上述したように外因性のフィブリノーゲンの添加により増大される。いくつかの実施形態では、前記ビーズ沈降方法は、光散乱法よりも、より少ない外因性のフィブリノーゲンを用い得る。前記凝固時間は、前記ビーズが弱い力の下で動きを停止する時間、および／または弱い力の下で運動の速度が大幅に低下する時間であり得る。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、前記凝固時間は、ビーズの動きの停止を決定するための、画像の分析により決定され得る。いくつかの実施形態では、随意的に任意の適切なアルゴリズムにより、前記画像分析は自動化され得る。例えば、各フレームの各ピクセルおよびビデオの最後のフレームの間の平均二乗差異などの差異パラメーターが計算され得る。凝固が生じおよびビーズの動きが停止するとき、ビデオの最終フレームは凝血塊形成およびビデオの終わりまでの間の、全てのフレームにほぼ類似する。この実施例では、差異パラメーターは、凝固が生じるとすぐに、ゼロ近くまで落下する。この落下が始まる時間が前記凝固時間を表し、これは必要に応じて凝固パラメーターに変換され得る。
【０２１８】
別の実施形態では、ピーク信号対雑音比（“ＰＳＮＲ”）が前記凝固時間を決定するために用いられ得る。ＰＳＮＲは、画像“Ｉ”および“Ｋ”の間の差異を、等式２において定義される平均二乗誤差（“ＭＳＥ”）により評価する
【数２】
2019002939.tif 000003
式中、ＰＳＮＲは等式３において定義される
【数３】
2019002939.tif 000004
ここでＭＡＸＩは画像の最大強度であり、ならびに“ｍ”および“ｎ”はピクセル単位での前記画像の寸法（幅ｘ長さ）である。
【０２１９】
図４は、ＰＳＮＲ方法により分析される、代表的な反応の時間的経過を示す。ＰＳＮＲプログレス曲線は、ＰＳＮＲ値が１５からちょうど３５を超える上端まで延伸する垂直軸に沿って示される。時間は、ちょうど５０未満からちょうど３００秒をこえる右端まで延伸する水平軸上に示される。いくつかの実施形態では、このＰＳＮＲデータは、一次または二次関数などの単純な関数に適合され、および増加の中点が決定され、および記載されたように校正を介して凝固パラメーターに関連付けられる。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、前記凝固時間は、顕微鏡により決定され得る。一実施形態では、全血の凝固が、顕微鏡下で赤血球の動きを観察することにより測定され得る。この全血サンプルは希釈され得る。検定が赤血球を含む場合、これらの赤血球は上記のビーズ沈降方法において記載されるビーズと同様の機能を果たす。
蛍光顕微鏡法
【０２２１】
いくつかの実施形態では、前記凝固時間は、蛍光性のビーズの動きを蛍光性の顕微鏡により観察することにより決定され得る。適切な蛍光性のビーズは、カルボン酸修飾ミクロスフェアーを含む。適切なカルボン酸修飾ミクロスフェアーは、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．（カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））から、商標名ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ、カタログ番号Ｆ−８８１６として入手できる。この蛍光性のビーズは、スペクトルの真紅の部分を含む、任意の適切な波長において蛍光を発し得る。この蛍光性のビーズは、任意の適切なサイズでもあり得る。いくつかの実施形態では、前記ビーズは、それらが反応媒体中では重力では沈降しないか、または重力により、ゆっくり沈降し、およびサンプルが凝固した時に動きを停止できるようなサイズを有する。一実施形態では、この蛍光性の球体は約１μｍの直径を有する。
【０２２２】
上記で記載されたビーズ沈降方法におけるように、任意の適切な濃度蛍光性のビーズが、乾燥された試薬などと共に加えられる。図６に示されるように、サンプル６００は、毛細管またはピペットチップに、必ずしも抜き取られなくてもよく、および滴としてスライド６０５上に配置され得る。蛍光性のビーズ６１０を含むサンプルは、約２μＬを含む、任意の適切な容積であり得る。顕微鏡の対物レンズ片６１５は、サンプルを焦点面６２０において撮像する。顕微鏡対物レンズ片６１５に対するスライド６０５の位置は、焦点面６２０の深さを変えるため、および／またはサンプルの様々な領域を撮像するために変化され得る。いくつかの実施形態では、前記スライドは、検定反応容積内のいくつかの視野が捕捉され得るように、システム的に顕微鏡対物レンズ片に対して移動される。スライドおよび顕微鏡対物レンズ片の相対的な位置も、バックグラウンド領域ではなくサンプルのみが可視化されることを保証し得る。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、サンプルはキュベット上に配置される。このキュベットは、顕微鏡対物レンズ６１５に関して、それを位置決めすることにより撮像されることができ、またはこのキュベットは、スライド６０５の上に配置されることもできる。例示的なキュベットは、図７中の平面図７００および側面図７０５に描写されている。この例示的なキュベットは２つの層を有する。上層７１０は、アクリルのスペーサー物質であり、および下層７１５標準ガラスのカバーラップであり得る。上層は約８０μｍを含む、任意の適切な厚さを有し得る。この上層は随意的に約２ｍｍの直径であり、随意的にレーザー・カッターにより製作される、ポート７２０を有し得る。上層７１０を含むアクリル物質は、下層７１５に接着する接着性の側面を有する。上層及び下層は、約０．２５μＬのサンプルを保持する能力のある、約２ｍｍの直径および８０μｍの深さの小型のサンプル壁が形成されるように組み立てられる。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、前記キュベットは、サンプル保持のための機械加工されたポートを持つ光透過性アクリルのスラブから形成される。いくつかの実施形態では、前記キュベットは、キュベットを親水性にするために、プラズマでエッチングされた表面を持つ、射出成型されたプラスチックである。
【０２２５】
蛍光性のビーズの動きは、空気の流れ（図６、表示６２５）、対流およびブラウン運動の混合物により駆動される。いくつかの実施形態では、このサンプルは、蛍光性のビーズ励起波長で照射される。いくつかの実施形態では、このサンプルは、キセノン・アーク燈で照射される。前記蛍光性のビーズは、放射波長の照射を発し、それは顕微鏡により観察される。いくつかの実施形態では、この顕微鏡は、倒立（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）蛍光顕微鏡であることができ顕微鏡対物レンズ６１５は、サンプル６００の下にある。この顕微鏡は、蛍光性のビーズが撮像され、およびそれらの動きが分析されることができるための、任意の適切な拡大力を有し得る。一実施形態では、２０ｘ対物レンズレンズが用いられる。前記ビーズの動きは、カメラにより記録される。このカメラは、冷却されたＣＣＤカメラであり得る。前記画像は、秒当たり約５フレームの速度を含む、任意の適切な速度で撮影され得る。いくつかの実施形態では、前記画像は、蛍光性のビーズの放出波長において取得される。
【０２２６】
前記凝固時間は、蛍光性のビーズの動きがいつ停止するかを決定するために、記録された画像を分析することにより決定される。いくつかの実施形態では、１００〜２００の画像が取得される。前記画像は本明細書に記載されるように、本明細書に記載される凝固パラメーターにより校正により関係づけられる凝固時間を決定するために分析され得る
【０２２７】
一実施形態では、全血の凝固が、顕微鏡下で赤血球の動きを観察することにより測定され得る。この全血サンプル希釈され得る。いくつかの実施形態では、前記赤血球は、蛍光標識され得る。前記赤血球は通常の顕微鏡で観察され得るか、または蛍光標識されている場合には、蛍光性の顕微鏡により観察され得る。赤血球を含む検定では、これらの赤血球は、上記の蛍光性の顕微鏡法において記載されたように、前記ビーズと同様の機能を果たす。
推進された液柱法
【０２２８】
いくつかの実施形態では、前記凝固時間は、サンプルの全体の動きを画像化することにより決定され得る。この方法では、凝固したサンプルは、毛細管の内部などの容器の内部に接着しおよび凝固の後に動きを停止する。このサンプルは、空気圧的な手段を含む任意の方法で移動され得る。
【０２２９】
前記運動は往復、円形などを含む任意の様式であり得る。前記運動は、ｃａｎｂｅ規則的または不規則的であることができ、および任意の適切な距離を横切ることができる。いくつかの実施形態では、前記全体の動きは、約１ｍｍ、約２ｍｍ、約４ｍｍ、約６ｍｍ、約８ｍｍ、約１０ｍｍ、約２０ｍｍ、または約３０ｍｍなどの、数ミリメーターの単位である。いくつかの実施形態では、前記全体の動きは、少なくとも約１ｍｍ、少なくとも約２ｍｍ、少なくとも約４ｍｍ、少なくとも約６ｍｍ、少なくとも約８ｍｍ、少なくとも約１０ｍｍ、少なくとも約２０ｍｍ、または少なくとも約３０ｍｍである。いくつかの実施形態では、前記全体の動きは、最大でも約１ｍｍ、最大でも約２ｍｍ、最大でも約４ｍｍ、最大でも約６ｍｍ、最大でも約８ｍｍ、最大でも約１０ｍｍ、最大でも約２０ｍｍ、または最大でも約３０ｍｍである。
【０２３０】
前記運動は任意の適切な頻度を有し得るか、または任意の適切な時間尺度上で生じ得る。いくつかの実施形態では、前記全体の動きは、約０．５秒、約１秒、約２秒、約４秒、約６秒、約８秒、または約１０秒などの秒のオーダーにある。いくつかの実施形態では、前記全体の動きは最大でも約０．５秒、最大でも約１秒、最大でも約２秒、最大でも約４秒、最大でも約６秒、最大でも約８秒、または最大でも約１０秒の時間の尺度にある。
【０２３１】
前記サンプルは血液または血漿であってよい。推進された液柱法では、顕微鏡の画像化は、必要ない場合がある。関連する画像は、一般的に毛細管容器に関する全体の流体サンプルの位置である。容器は一般的に透明であり、そのために、血液の場合、サンプルは、その赤色のために容易に区別され得る。血漿は、一般的に本質的に透明であり、従っていくつかの実施形態では全体の血漿サンプルの検出はより困難であり得る。いくつかの実施形態では、血漿サンプルは、毛細管中のサンプルの端にある空気と液体の間のメニスカスからの光の反射により撮像され得る。特定の実施形態において、画像から位メニスカスの位置を特定することが困難な場合、メニスカスの可視化を改善するために、染料または他の適切な物質がサンプルに加えられ得る。別の実施例では、最初に目視できない場合でさえ、いったん凝固が生じると、散乱に起因してメニスカスは可視化される。
【０２３２】
サンプルは希釈されるまたは希釈されても、またはされなくてもよい。いくつかの実施例は、希釈された血漿を利用する実施形態を含む可能性があり、場合によっては、適切に強い凝血塊を形成し得ない。しかしながら、前記凝血塊は、外因性のフィブリノーゲンまたは高い容積分率の中間的（ｎｅｕｔｒａｌｌｙ）に浮上性ビーズの添加により強化することにより、適切に強くすることができる。特定の理論にとらわれることなく、前記ビーズは、初期の凝血塊が、そこに接着する、より大きな表面積を提供し、このことは、試薬およびサンプル混合物の増加する粘度の効果を強固にするか、または増加させ、および形成された凝血塊が、毛細管に接着し、および動きを止めることを可能にする。前記容積分率は、凝血塊が毛細管に接着できるための任意の適切な分率であってよい。いくつかの実施形態では、検定は約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％の検定容積がビーズであり得るように調製される。いくつかの実施形態では、検定は、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少の検定容積がビーズであり得るように調製される。推進された液柱方法においては、前記ビーズは、例えば直径において約１０μｍであるなど、より大きくてよい。ビーズの添加は、有効サンプル容積が増加され、および従ってサンプルの希釈を与えなくても小さなサンプル容積の可視化を支援し得るという、別の有益な効果を有し得る。
画像処理および分析
【０２３３】
画像は、本明細書に記載される少容積の凝固測定方法により取得され得る。一般に、前記画像は、一般的に前記凝固時間より長い、時間の期間にわたって取得され得る。捕捉される、最後の画像は、一般的に凝固したサンプルの画像である。
【０２３４】
例示的な数のピクセルを含む、画像のピクセル化は上記に記載されている。いくつかの実施形態では、それぞれの画像は、５１２ｘ５１２ピクセルのアレイ（２６２，１４４全体のピクセル）を含む。それぞれの画像は、寸法が５１２ｘ３２（行ｘ列、または列ｘ行）の１６の細片に分割され得る。それぞれの細片は、次いで、それぞれの対応するフーリエ変換された画像に変換され、および修正されたフーリエ変換された細片を持つ、５１２ｘ５１２の画像を形成するために、再び組み立てられる。いくつかの実施形態では、取得された最後の画像を取り上げて、および同じ様式で変換することにより、参照画像が生成される。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、粒子ビーズ沈降法および蛍光顕微鏡法（上述の）の分析などの分析は、変換された画像のそれぞれの列の相関係数を、変換された参照画像の対応する列により計算することを含む。この相関係数は等式４に従い計算され得る、
【数４】
2019002939.tif 000005
式中、ｘｉおよびｘｉｒｅｆは、それぞれ画像および参照画像の列のｉ番目の要素である。相関因子の値は０〜１まで変化する。最終画像の相関因子（それ自身に相関する）は１．０である。
【０２３６】
相関因子は、それぞれの列について取得され、および２つの画像の全体の相関は、全ての列にわたって計算された相関因子の中央値である。従って、全ての画像について、その参照画像との相関を定量化する、単一値が計算され得る。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、前記相関因子は、図８に示されるように時間の関数としてプロットされる。血漿サンプルにおけるＰＴの測定のための、この実施例では相関因子は垂直軸上にあり、および０．０から最上部の１．０の範囲に亘る。時間は水平軸上にあり、および０から右の１００秒の範囲に亘る。前記凝固時間未満の時間においては、可能性として対流およびブラウン拡散の力による粒子の動きに起因して、前記画像は最終画像には不完全にしか相関されない。凝固の開始点では、ゲルおよび粒子への流体の遷移は、その場所に停止される。凝固を過ぎると、粒子の位置は有意には変化せず、およびそれ故に最終画像と強く相関するために、図８に見られるように、この相転移は、計算された相関因子における劇的な上昇により示される。この実施例では、前記凝固時間は、およそ４０秒に見える。自動化された設定では、凝固時間を示す変曲点を推算するためにＳ字状曲線がデータに適合され得る。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、希釈されたサンプルについて測定された凝固時間は、希釈されたサンプルを用いない他の方法に対して得られたものより長い。希釈されたサンプルの結果は、異なる方法の結果を相関すること、および希釈されていないサンプルについての方法からの結果と等しい、希釈されたサンプルからの結果を与えるために設計された数学的補正を適用することにより、希釈されていないサンプルの結果と一致させることができる。
ビデオ画像化の考慮
【０２３９】
いくつかの実施形態では、ビデオ画像が、前記凝固時間を決定するために用いられる。例えば、粒子の沈降または光散乱における変化が測定される場合、実質的に全てのバックグラウンドを除外する一方で、反応容積の大幅な分率を撮像する必要がある。この目的は、特徴認識ソフトウェアを用いて達成し得る。
【０２４０】
図９に転じて、検定キュベット９００の画像が作成される。屈折率の差９０５によりキュベットの壁が特定され、および前記画像９１０から除外される。反応容積のメニスカスも、特定され９１５および前記画像９２０から除外される。最終収穫画像９２０は、次いで画像分析のために用いられる。実施形態では、収穫された画像は、目的の領域（ＲＯＩ）画像であり得る。実施形態では、本明細書で提供される画像を収穫するための手順は、静止画像でも用いられ得る。
凝固因子の測定
【０２４１】
凝固因子濃度および／または活性を測定するための方法、機器、およびシステムも、本明細書において提供される。凝固因子の濃度および／または活性を測定するための方法は、多重化された様式において行われることができるか、または多重化される分析を行う能力のある、随意的に一滴の血液により複数の検定が行われる、機器またはシステム中で行われ得る。いくつかの態様では、１つ以上の凝固時間の検定が、被験者からの血液サンプルにより行われ、および凝固因子の濃度および／または機能に向けられた１つ以上の検定も遂行され得る。いくつかの態様では、被験者からの血液サンプルについての凝固時間が、特定の範囲の外部にある場合、被験者からの血液サンプルは、凝固因子の濃度および／または機能についても分析される。この手順は、血液サンプルが特定の凝固時間を持つ場合に、凝固因子についての検定を遂行するためにプログラムされた、システムまたは機器中で遂行され得る。前記システムまたは機器は、クラウド・コンピューティング・インフラストラクチャーなどにより、遠隔的にプログラムされることもできる。
【０２４２】
特定の凝固パラメーターは、凝固時間以外の方法によって測定可能である。例えば、本明細書に記載されるものは、凝固因子および／またはそのレギュレーターの濃度および／または機能を測定するための方法、機器およびシステムである。例示的な凝固因子および／またはそのレギュレーターは、ヴォン・ヴィレブランド（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、第Ｉ因子Ｉ（フィブリノーゲン）、第Ｉａ因子（フィブリン）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第ＩＩａ因子（トロンビン）、第Ｖ因子、第Ｖａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第ＩＸ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、コラーゲン、血小板、血小板活性化因子、血小板因子４、トロンボキサンＡ２、プロテインキナーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２、組織因子、高分子キニノゲン、プレカリクレイン、カリクレイン、プロテインＣ、トロンボモジュリン、カルシウム、ビタミンＫ、プロテインＳ、抗トロンビン、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、プロスタサイクリンなどを含む。凝固因子の命名法においては小文字の“ａ”は活性化形態を示す。例えば第ＸＩＩａ因子は第ＸＩＩ因子の活性化形態である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、凝固因子の活性な、および不活性な形態を区別する。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、凝固因子の濃度および／または活性は、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定される。ＥＬＩＳＡを遂行することは、特定の抗原（例えば、凝固因子）に対する特異性を持つ少なくとも１つの抗体を含む。未知の量の光源を持つサンプルが、固体の支持物上に、非特異的（表面への吸着による）または特異的（“サンドイッチ”ＥＬＩＳＡにおいて同じ抗原に対して特異的な別の抗体による捕捉による）のいずれかにより固定化される。抗原が固定化された後に、検出抗体が加えられ、抗原との複合体を形成する。この検出抗体は、酵素に共有結合的に結合され得るか、または酵素にバイオコンジュゲーションを介して結合した二次的な抗体により、それ自身が検出され得る。各ステップの間に、前記固定化された物質は、典型的には、特異的に結合されていないタンパク質または抗体を除去するために、温和な潜在溶液により洗浄される。最終洗浄ステップの後に、前記プレートは、可視的な信号を生成するために、酵素の基質を加えることにより現像され、この可視的な信号は、サンプル中の光源の量を示す。小容積で、ＥＬＩＳＡ反応を遂行するための方法は、例えば、米国特許第８，０８８，５９３号に記載されており、この特許は、参照によりその全体が全ての目的で本明細書に組み込まれる。前記特許に記載されるように、ＥＬＩＳＡなどの比色的な方法は、小さな容積中で行われる場合に、多色画像化および複数の光経路からの利益を受け得る。
多色画像および複数の光経路
【０２４４】
本明細書に記載される一態様は、画像に基づく分析を用いる凝固  分析を提供する。このシステム  は１つ以上の検出スペクトル領域を用いる光学的信号を測定し得るカメラを含み得る。例えば、カメラ  は赤、緑、および青の検出スペクトル領域を用いる  光学的信号を測定し得る。この測定された信号は、本明細書に記載される１つ以上のアルゴリズムを用いて、翻訳され得る３つの測定値を含み得る。１つ以上の検出スペクトル領域の使用は、単一の検出スペクトル領域の使用に比べて、検定のダイナミックレンジを増加することができ、および測定  の正確性を増加させ得る。
【０２４５】
更に本明細書で提供されるものは、それぞれが、複数の明確な経路長を持つ反応チャンバーの中に含まれる、サンプルおよび検定反応生成物の光学的測定を遂行するためのシステム、機器および方法である。反応チャンバーは、より多いまたはより少ない光吸収が観察されることができるように、複数の明確な経路長を有し得る。前記複数の明確な経路長は、選択された検定プロトコルのダイナミックレンジにおける増加を可能にする。反応チャンバーの画像は、サンプルまたはその検定反応生成物についての情報を得るために本明細書に記載されるように分析されることができる。単一の反応チャンバー内の複数の利用可能な経路長、および３つのチャンネル検出スペクトル領域の利用の組み合わせは、所定の検定のダイナミックレンジを大幅に増強する。
コンピュータによる実行
【０２４６】
本明細書に記載される方法、機器、およびシステムは、プログラム可能なコンピュータの支援により実行され得る。例えば、画像のピクセル化、光散乱データの分析、画像処理および分析、ビデオ画像処理方法などは、コンピュータにプログラム化されることができ、および／またはプログラム化されたコンピュータにより遂行され得る。コンピュータ支援は、迅速な、自動化された方法、機器またはシステムを達成するために、好適であり得る。
【０２４７】
例えば、サンプル中に存在することが疑われる検体を特性化するためのコンピュータに支援された方法が用いられ得る。このコンピュータに支援された方法は、サンプルのデジタル画像を取得することを含むことができ、このデジタル画像は、少なくともピクセルの二次元のアレイを含み、およびそれぞれのピクセルが複数の強度値を含む、それぞれの強度値が、区別される検出スペクトル領域に対応し；プログラム可能な機器の支援により、取得された強度値は、各検出スペクトル領域のダイナミックレンジを定義する所定の値の一組に相関付けられ；および取得された強度値を所定の値の一組に相関付けることに基づいて、サンプル中の検体の存在および／または量を予測する。
追加的な検定
【０２４８】
本明細書に記載される方法、機器、およびシステムは、サンプルの粘度または固相／液相状態に変化をもたらす任意の検定を分析するために用いられ得る。例えば、本明細書に記載されるビーズが、サンプルの粘度または固相／液相状態に変化をもたらす任意の検定に加えられることができ、および前記ビーズの運動の画像分析が、サンプルの粘度または固相／液相状態の変化の時間の決定のために用いられ得る。本明細書に記載される他の実施例では、サンプルの濁度における変化は、光散乱により観察され得る。サンプルの粘度または固相／液相状態に変化をもたらす、および／または光散乱に変化をもたらす任意の検定は、本明細書において提供される方法により観測され得る。本明細書に記載される他の実施例では、サンプルの粘度または固相／液相状態の変化は、このサンプルの運動の、液柱を通過した画像化により観察され得る。本明細書で提供される方法により分析され得る検定は、サンプルの粘度または固相／液相状態または光散乱に変化をもたらす限り、血液凝固因子を含まない検定を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法により、凝集検定が分析され得る。本明細書で提供される方法により分析される検定の他の例は：（１）血小板凝集検定、（２）比濁分析的（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ）免疫検定、（３）粒子により増強される比濁分析的免疫検定、（４）比濁的（ｔｕｒｂｉｄｏｍｅｔｒｉｃ）免疫検定、（４）ラテックス凝集免疫検定、および（５）アメリカカブトガニ変形（アメーバ）細胞溶解物（Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ
Ｌｙｓａｔｅ）（ＬＡＬ）試験（例えば、細菌のエンドトキシン、および細菌性疾患の検出のため）を含み得る。
【実施例】
【０２４９】
実施例１−光散乱によるＰＴ測定
ＰＴ凝固パラメーターの光散乱による測定は以下の物質により遂行された：
・  血漿サンプル：ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル１（正常凝固血漿対照）；ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル２（軽度の異常凝固血漿対照）；およびＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル３（高度の異常凝固血漿対照）（いずれもＢｉｏＭｅｄｉｃａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，カナダ、ノバスコシア（Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ）より）
・  ウシフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１０ｍｇ／ｍｌのＨｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）ｐＨ７．４中のストック
・  再構成されたＰＴ試薬（ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭＰＴプラスカルシウム、ＢｉｏＭｅｄｉｃａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，カナダ、ノバスコシア（Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ））
・  １ｘＨｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）
・  ０．０２ＭＣａＣｌ２
【０２５０】
これらの物質が、光散乱によるＰＴ凝固パラメーターの測定のための以下の手順において用いられた。全てのステップは、室温で、自動化された液体取扱い器を用いて遂行された。
１）フィブリノーゲンがＰＢＳの２．５ｍｇ／ｍｌ溶液に溶解された（溶液Ａ）
２）０．２容積の各血漿サンプルが０．８容積の溶液Ａに混合された（すなわち、各血漿サンプルは５倍に希釈された）
３）ｔ＝０において、１容積の希釈された血漿が、１容積のＰＴ試薬と混合され、およびこの混合物の２μｌをチップ中に吸引した
４）鉱油１μｌを吸引し、チップを、可視化する部分が油に覆われるために、油に十分深く浸漬した
５）カメラ／光検出器に移動させ、およびビデオ記録を開始した
６）凝固が生じた後に記録を停止した（典型的には＜１０分）
７）ステップ３〜６を、更に追加の４回繰り返した。
例示的な結果が図１０に示される。ここで、前記凝固時間は垂直軸に示され、および０から１２０秒まで延伸している。水平軸上のレベル１、２、および３は、それぞれＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル１、２、および３のサンプルを示す。各レベルについての５つの異なる点は、レベル１、２、および３の血漿サンプルのそれぞれについての、重複検定の個々の結果を示す。グラフに提供されている平均値は、レベル１、２、および３の血漿サンプルについてそれぞれ５回行われた検定における、秒単位での平均凝固時間を示す。ＰＴ凝固パラメーターは光散乱により決定された。簡潔に言うと、凝固パラメーターを決定するために、ビデオ記録からの画像が自動化された処理に付された、反応混合物のみを含む目的の範囲（ＲＯＩ）が決定された。それぞれのチップの目的の領域は、前記チップの壁の間、および前記チップの反応混合物のメニスカスの間として規定された。最上部のメニスカスは、空気／反応混合物界面であり、および底部のメニスカスは、反応混合物／油の界面である。目的の領域の定義後に、分析アルゴリズムが、ビデオ記録の各フレームについて、ＲＯＩにおける平均光強度を決定した。前記凝固時間は、ＲＯＩにおける平均光強度が、ベースラインから上昇を始める時間として定義された。  
実施例２−光散乱によるａＰＴＴの測定
【０２５１】
ａＰＴＴ凝固パラメーターの光散乱による測定は以下の物質により遂行された：
・  ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル１（正常凝固血漿対照）およびＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル３（高度の異常凝固血漿対照）（いずれもＢｉｏＭｅｄｉｃａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，カナダ、ノバスコシア（Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ）より）
・  ウシフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１０ｍｇ／ｍｌのＨｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）ｐＨ７．４中のストック
・  再構成されたａＰＴＴ試薬（ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭＡＰＴＴ、ＢｉｏＭｅｄｉｃａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，カナダ、ノバスコシア（Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ））
・  １ｘＨｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）
・  ０．０２ＭＣａＣｌ２
【０２５２】
これらの物質が、光散乱によるａＰＴＴ凝固パラメーターの測定のための以下の手順において用いられた。全てのステップは、室温で、自動化された液体取扱い器を用いて遂行された。
１）フィブリノーゲンがＰＢＳの５ｍｇ／ｍｌ溶液に溶解された（溶液Ａ）
２）０．２容積の各血漿サンプルが０．８容積の溶液Ａに混合された（すなわち、各血漿サンプルは５倍に希釈された）
３）１容積の希釈された血漿を１容積のａＰＴＴ試薬と混合し、および３分間インキュベートした。
４）ｔ＝０において、１μｌのこの混合物を１μｌの０．２ＭＣａＣｌ２と混合しおよびチップ中に吸引した
５）鉱油１μｌを吸引し、チップを、可視化する部分が油に覆われるために、油に十分深く浸漬した
６）カメラ／光検出器に移動させ、およびビデオ記録を開始した
７）凝固が生じた後に記録を停止した（典型的には＜１０分）
８）ステップ３〜７を更に２回（レベル３サンプル）または４回（レベル１サンプル）繰り返した例示的な結果が図１１に示される。ここで、前記凝固時間は、垂直軸に示され、および０から６：２９まで延伸する。水平軸上のレベル１および３は、それぞれＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル１および３のサンプルを示す。各レベルについての異なる点は、レベル１および３の血漿サンプルによる重複検定の個々の結果を示す。ａＰＴＴ凝固パラメーターは、実施例１で述べたように、光散乱により決定された。
実施例３−ビーズ沈降によるＰＴ測定
【０２５３】
ビーズ沈降によるＰＴ凝固パラメーターの測定は以下の物質により遂行された：
・  血漿サンプル：ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル１（正常凝固血漿対照）；ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル２（軽度の異常凝固血漿対照）；およびＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル３（高度の異常凝固血漿対照）（いずれもＢｉｏＭｅｄｉｃａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，カナダ、ノバスコシア（Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ）より）
・  再構成されたＰＴ試薬（ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭＰＴプラスカルシウム、ＢｉｏＭｅｄｉｃａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，カナダ、ノバスコシア（Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ））
・  ビーズのスラリー（例えば、２５ｕｍおよび４５ｕｍの直径のビーズの１：１混合物（例えば、Ｐｏｌｙｂｅａｄ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ペンシルバニア州）、ＨＢＳ中で洗浄され、遠心分離され、および過剰の液体を除去した）
・  １ｘＨＢＳ（Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水ｐＨ７．４）
・  ０．０２ＭＣａＣｌ２
【０２５４】
ビーズ沈降によるＰＴ凝固パラメーターの測定のために、これらの物質が以下の手順において用いられた全てのステップは、室温で、自動化された液体取扱い器を用いて遂行された。
１）各血漿サンプルが、希釈されたＨＢＳで５倍に希釈された
２）ビーズを１：４でＰＴ試薬と混合した（例えば、１０μｌビーズ＋４０μｌＰＴ試薬）
３）ｔ＝０で、１μｌの希釈された血漿と、１．２５μｌのビーズ／ＰＴ試薬混合物に混合し、およびこの混合物をチップ中に吸引した
４）鉱油１μｌを吸引し、チップを、可視化する部分が油に覆われるために、油に十分深く浸漬した
５）カメラ／光検出器に移動させ、およびビデオ記録を開始した
６）凝固が生じた後に記録を停止した（典型的には＜１０分）
７）ステップ３〜６を更に１回（レベル１サンプル）、３回（レベル２サンプル）、または２回（レベル３サンプル）繰り返した。
【０２５５】
例示的な結果が図１２に示される。ここで、前記凝固時間は垂直軸に示され、および０から１２０秒まで延伸している。水平軸上のレベル１、２、および３は、それぞれＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル１、２、および３のサンプルを示す。各レベルについての異なる点は、レベル１、２、および３の血漿サンプルのそれぞれについての、重複検定の個々の結果を示す。グラフに提供されている平均値は、レベル１、２、および３の血漿サンプルについてそれぞれ５回行われた検定における、秒単位での平均凝固時間を示す。ＰＴ凝固パラメーターは、本明細書の他の場所に記載されるビーズ沈降検定により決定された。実施例４−ビーズ沈降によるａＰＴＴ測定
【０２５６】
ａＰＴＴ凝固パラメーターの光散乱による測定は以下の物質により遂行された：
・  血漿サンプル：ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル１（正常凝固血漿対照およびＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル２（軽度の異常凝固血漿対照）（いずれもＢｉｏＭｅｄｉｃａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，カナダ、ノバスコシア（Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ）より）
・  再構成されたａＰＴＴ試薬（ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭＡＰＴＴ、ＢｉｏＭｅｄｉｃａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，カナダ、ノバスコシア（Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ））
・  ビーズのスラリー（例えば、２５ｕｍおよび４５ｕｍの直径のビーズの１：１混合物（例えば、Ｐｏｌｙｂｅａｄ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ペンシルバニア州）、ＨＢＳ中で洗浄され、遠心分離され、および過剰の液体を除去した）
・  １ｘＨＢＳ（Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水ｐＨ７．４）
・  ０．０２ＭＣａＣｌ２
【０２５７】
ビーズ沈降によるａＰＰＴ凝固パラメーターの測定のために、これらの物質が以下の手順において用いられた全てのステップは、室温で、自動化された液体取扱い器を用いて遂行された。
１）各血漿サンプルが、希釈されたＨＢＳで５倍に希釈された
２）ビーズを１：１で０．２ＭＣａＣｌ２と混合した（例えば、１０μｌビーズ＋１０μｌ０．２ＭＣａＣｌ２）
３）１容積の希釈された血漿を１容積のａＰＴＴ試薬と混合し、および３分間インキュベートした
４）ｔ＝０において、１μｌのこの混合物を１μｌのビーズ／ＣａＣｌ２混合物と混合し、およびチップ中に吸引した
５）鉱油１μｌを吸引し、チップを、可視化する部分が油に覆われるために、油に十分深く浸漬した
６）カメラ／光検出器に移動させ、およびビデオ記録を開始した
７）凝固が生じた後に記録を停止した（典型的には＜１０分）
８）ステップ３〜７を更に３回繰り返した。
【０２５８】
例示的な結果が図１３に示される。ここで、前記凝固時間は垂直軸に示され、および０から最上部の３００秒まで延伸している。水平軸上のレベル１、および２は、それぞれＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル１、および２のサンプルを示す。各レベルについての異なる点は、レベル１および２の血漿サンプルによる重複検定の個々の結果を示す。ａＰＰＴ凝固パラメーターは、本明細書の他の場所に記載されるビーズ沈降検定により決定された。
実施例５−蛍光性の顕微鏡によるａＰＴＴの測定
【０２５９】
ａＰＴＴ凝固パラメーターの蛍光性の顕微鏡による測定は、以下の物質により遂行された：
・  血漿サンプル：ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル１（正常凝固血漿対照）；ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル２（軽度の異常凝固血漿対照）；およびＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル３（高度の異常凝固血漿対照）（いずれもＢｉｏＭｅｄｉｃａ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＩｎｃ．，カナダ、ノバスコシア（Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ）より）
・  再構成されたａＰＴＴ試薬（例えば、ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭＡＰＴＴ、ＢｉｏＭｅｄｉｃａＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＩｎｃ．，カナダ、ノバスコシア（ＮｏｖａＳｃｏｔｉａ））
・  １ｘＨＢＳ（Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水ｐＨ７．４）
・  ０．０２ＭＣａＣｌ２＋容積により０．３％蛍光性のビーズ（例えば、ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓカルボン酸修飾ミクロスフェアー、１．０μｍ、真紅蛍光性（６２５／６４５）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ｆ−８８１６））
【０２６０】
蛍光性の顕微鏡によるａＰＰＴ凝固パラメーターの測定のために、これらの物質が以下の手順において用いられた全てのステップは、室温で、自動化された液体取扱い器を用いて遂行された。
・  血漿を５倍に希釈した（ＨＢＳによる）
・  １μｌの蛍光性のビーズを含むＣａＣｌ２をスライドの上に加えた
・  スライド表面の滴の〜２０％内部を見るために、対物レンズの焦点を合わせた
１μｌの希釈された血漿を１μｌのａＰＴＴ試薬と混合し、および３分間インキュベートした
・  ｔ＝０において、１μｌのこの混合物をスライド上のＣａＣｌ２／ビーズ混合物に加え、よく混合しておよび画像の記録を開始した
・  凝固が生じた後に記録を停止した（典型的には＜１０分）
実施例  ６  −蛍光性の顕微鏡によるＰＴ測定
【０２６１】
ＰＴ凝固パラメーターの蛍光性の顕微鏡による測定は、以下の物質により遂行された：・  血漿サンプル：ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル１（正常凝固血漿対照）；ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル２（軽度の異常凝固血漿対照）；およびＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル３（高度の異常凝固血漿対照）（いずれもＢｉｏＭｅｄｉｃａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，カナダ、ノバスコシア（Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ）より）
・  再構成されたＰＴ試薬（ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭＰＴプラスカルシウム、ＢｉｏＭｅｄｉｃａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，カナダ、ノバスコシア（Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ））＋容積により０．２％の蛍光性のビーズ（例えば、ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓカルボン酸修飾ミクロスフェアー、１．０μｍ、真紅蛍光性（６２５／６４５）（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ｆ−８８１６））
・  １ｘＨＢＳ（Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水ｐＨ７．４）
・  ０．０２ＭＣａＣｌ２＋容積により０．３％の蛍光性のビーズ（例えば、ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓカルボン酸修飾ミクロスフェアー、１．０μｍ、真紅蛍光性（６２５／６４５）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ｆ−８８１６））
【０２６２】
蛍光性の顕微鏡によるＰＴ凝固パラメーターの測定のために、これらの物質が以下の手順において用いられた全てのステップは、室温で、自動化された液体取扱い器を用いて遂行された。
１）各血漿サンプルが希釈されたＨＢＳで５または１０倍に希釈された
２）１．５μｌの蛍光性ビーズを含むＰＴ試薬をスライドの上に加えた
３）スライド表面の滴の〜２０％内部を見るために、対物レンズの焦点を合わせた
４）ｔ＝０において、１．５μｌのこの混合物をスライド上のＣａＣｌ２／ビーズ混合物に加え、よく混合しておよび画像の記録を開始した
５）凝固が生じた後に記録を停止した（典型的には＜１０分）
６）ステップ４〜５を更に２回（レベル１のサンプル）、３回（レベル２のサンプル）、または４回（レベル３のサンプル）繰り返した
【０２６３】
例示的な顕微鏡の結果が図１４に示されている。ここで、サンプル画像は、血漿（１０倍に希釈された）を持つサンプルおよびＰＴ活性化因子のサンプル・ウエル内での沈降の後に取得された。前記画像は、５秒１４００，２５秒１４０５、５０秒１４１０，および１００秒１４１５において撮影された。５０秒および１００秒での画像は、ほとんど同一であり、５０から１００秒の間では限定された粒子の動きしかなかったことを表している。粒子の動きは、５０秒において、またはその前に停止されたことを示唆する。画像分析は、上記に記載された方法を用いて前記凝固時間を決定するために用いられた。
【０２６４】
図１５は、１：５に希釈された血漿サンプルの蛍光性の顕微鏡によるＰＴ測定の例示的な結果を示す。ここで、凝固時間は、垂直軸に対数尺度で１０〜１０００秒の範囲で示される。水平軸のレベル１、２、およびは、ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭ対照レベル１、２、および３のサンプルをそれぞれ示す。各レベルについての異なる点は、レベル１、２、および３の血漿サンプルのそれぞれについての、重複検定の個々の結果を示す。グラフに提供されている平均値は、レベル１、２、および３の血漿サンプルについてそれぞれ５回行われた検定についての、秒単位での平均凝固時間を示す。
実施例７−光散乱によるａＰＴＴの測定
【０２６５】
ａＰＴＴ凝固パラメーターの光散乱による測定は、以下の物質により遂行された：
・  ヘパリンを含むヒト血漿
・  Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）ｐＨ７．４中のウシフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１０ｍｇ／ｍｌのストック
・  再構成されたａＰＴＴ試薬（例えば、ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭＡＰＴＴ、ＢｉｏＭｅｄｉｃａＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＩｎｃ．，カナダ、ノバスコシア（ＮｏｖａＳｃｏｔｉａ））
・  １ｘＨｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）
・  ０．０２ＭＣａＣｌ２
・  ブタヘパリン（ブタ腸粘膜よりのヘパリン・リチウム塩、Ｓｉｇｍａｈ０８７８）
【０２６６】
光散乱によるａＰＰＴ凝固パラメーターの測定のために、これらの物質が以下の手順において用いられた全てのステップは、室温で、自動化された液体取扱い器を用いて遂行された。
１）フィブリノーゲンが、５ｍｇ／ｍｌでＰＢＳに溶解された（溶液Ａ）
２）異なる濃度のヘパリンを含む、ヒト血漿の様々なサンプルを調製した。これらのサンプルを調製するために、０〜１Ｕ／ｍｌの範囲の濃度でヘパリンを含むサンプルを産生するために、ヘパリンが、異なるヒト血漿の等分に加えられた
３）０．２容積の各血漿サンプルを、０．８容積の溶液Ａと混合した（すなわち、各血漿サンプルは５倍に希釈された）
４）５μｌの各希釈された血漿を、５μｌのａＰＴＴ試薬に混合し、および３分間インキュベートした
５）ｔ＝０において、ｍｉｘｅｄ１μｌの希釈された血漿／ａＰＴＴ試薬の混合物を、１μｌの０．２ＭＣａＣｌ２と混合し、およびチップ中に吸引した
６）鉱油１μｌを吸引し、チップを、可視化する部分が油に覆われるために、油に十分深く浸漬した
７）カメラ／光検出器に移動させ、およびビデオ記録を開始した
８）凝固が生じた後に記録を停止した（典型的には＜１０分）
【０２６７】
例示的な結果が図１６に示されている。ここで、凝固時間は垂直軸上に秒で示されている。異なる血漿サンプル中のヘパリン濃度がＵ／ｍｌで水平軸上に示されている。実施例１に記載されるように、凝固パラメーター（濁りの始まり）は経時的な濁度測定により決定された。
【０２６８】
図１６の検定の用量―反応は、ヘパリン濃度の推算を提供するために校正された。図１７に示される結果は、臨床的な目的の範囲に亘って、この検定がヘパリン濃度について、優秀な結果を与えたことを確定した。
【０２６９】
上述のように検定を遂行することに加えて、前記血漿サンプルのａＰＴＴ検定が、Ｈｅｌｅｎａ  Ｃａｓｃａｄｅ  ａＰＴＴシステム（Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、テキサス州ビューモント（Ｂｅａｕｍｏｎｔ））により、製造者のプロトコルに従い行われた。図１６からのデータが、ａＰＴＴの推算値を提供するために校正された場合、およびその結果が、Ｈｅｌｅｎａ  Ｃａｓｃａｄｅ  ａＰＴＴシステム上で同じ血漿サンプルを用いた結果と比較された場合、以下の相関が得られた：ａＰＴＴ（本発明の方法）＝１．００＊Ｈｅｌｅｎａ  ａＰＴＴ；Ｒ2＝０．８２は、２つの方法の間の良好な一致
を示す。
【０２７０】
Ｈｅｌｅｎａ法により決定された凝固パラメーターは、既知のヘパリン濃度とも相関付けられた。以下が観察された：ｙ（ＨｅｌｅｎａａＰＴＴ）＝ｘ（ヘパリン濃度）＊３４１＋１３．９；Ｒ2＝０．７３であり、上記で記載された前記方法との相関の結果（すな
わち、実施例７における）よりも不良な相関であった。
実施例  ８  −光散乱によるＰＴ測定
【０２７１】
ＰＴ凝固パラメーターの光散乱による測定は、以下の物質により遂行された：
・  ＥＤＴＡを含む、ワーファリン療法中の被験者、及びワーファリン療法を受けていない被験者からのサンプルを含む、ヒト血漿の様々なサンプル
・  Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）ｐＨ７．４中のウシフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１０ｍｇ／ｍｌのストック
・  １ｘＨｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）
・  再構成されたＰＴ試薬（ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭＰＴプラスカルシウム、ＢｉｏＭｅｄｉｃａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，カナダ、ノバスコシア（Ｎｏｖａ  Ｓｃｏｔｉａ））検定  本明細書で開示される検定のため）
・  ０．０２ＭＣａＣｌ２
【０２７２】
光散乱によるａＰＰＴ凝固パラメーターの測定のために、これらの物質が以下の手順において用いられた全てのステップは、室温で、自動化された液体取扱い器を用いて遂行された。
１）フィブリノーゲンが、２．５ｍｇ／ｍｌでＰＢＳに溶解された（溶液Ａ）
２）０．２容積の異なる血漿サンプルを、０．８容積の溶液Ａと混合した（すなわち、各血漿サンプルは５倍に希釈された）
３）希釈された血漿の５μｌの等分を調製した
４）ｔ＝０において、５μｌの各希釈された血漿を５μｌのＨｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓトロンボプラスチン試薬（参照方法の検定のため）またはＱｕｉｋＣｏａｇＴＭＰＴプラスカルシウムＰＴ試薬（本明細書で開示される検定方法のため）のいずれかと混合し、およびこの混合物の２μｌをチップ中に吸引した
４）鉱油１μｌを吸引し、チップを、可視化する部分が油に覆われるために、油に十分深く浸漬した
５）カメラ／光検出器に移動させ、およびビデオ記録を開始した
６）凝固が生じた後に記録を停止した（典型的には＜１０分）
【０２７３】
上述のように検定を遂行することに加えて、血漿サンプルによる、ＰＴ検定は、Ｈｅｌｅｎａ  Ｃａｓｃａｄｅ  ＰＴシステムによっても、製造者のプロトコルに従い行われた。これらの方法を比較した例示的な結果が図１８に示される。グラフ上のそれぞれの点は異なるサンプルを表す。ここで、ＰＴ（ＱｕｉｋＣｏａｇＴＭＰＴプラスカルシウムＰＴ試薬）＝１．００（ＰＴ  Ｈｅｌｅｎａ  Ｃａｓｃａｄｅ）；Ｒ２＝０．９２であった。
【０２７４】
当業者に理解されるように、本明細書で開示される実施形態に対する様々な代替物、修正および等価物を使用することが可能である。従って、現在の発明の範囲は、上記の記載を参照して決定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲、およびそれらの等価物の完全な範囲を参照して決定されるべきである。好適であるか、またはないかに関わらず、任意の特徴が、好適であるか、またはないかに関わらず、他の特徴と組み合わされ得る。「ｍｅａｎｓ  ｆｏｒ（ための手段）」の語句を使用して、所定の請求項が明確に言明されていない限り、添付された請求項は、手段プラス機能の限定を含むものとは解釈されない。本明細書の記載、以下の特許請求範囲の全体を通して用いられるように、「ａ（１つ）」「ａｎ（１つ）」「ｔｈｅ（前記の）」は、文脈において明白に示さない限り、複数の意味を含むことを理解されたい。更に、本明細書の記載、および以下の特許請求の範囲の全体を通して用いられる、「ｉｎ（〜の中に）」の意味は、文脈で明白に示されない限り、「ｉｎ（〜の中に）」、および「ｏｎ（〜の上に）」を含む。最後に、更に、本明細書の記載、および以下の特許請求の範囲の全体を通して用いられる、「ａｎｄ（および）」、「ｏｒ（または）」の意味は、文脈で明白に示されない限り、接続詞および離接的接続詞を含み、交換可能に使用され得る。従って、文脈で明白に指示しない限り、文脈の中で「ａｎｄ（および）」、または「ｏｒ（または）」という用語が使用される場合、そのような接続の使用法は「ａｎｄ／ｏｒ（および／または）」を除外しない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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