(57)【要約】【課題】常温域だけでなく低温域でもパン生地発酵力が高い冷凍耐性製パン用酵母、当該酵母を用いたパン類の製造方法等を提供する。【解決手段】サッカロマイセス・バヤヌス・バー・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ  ｖａｒ．  ｕｖａｒｕｍ）  Ｂ３５Ｌ１株と、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  Ｈ２４Ｕ１Ｍ株とを交雑することで、低温パン生地発酵力も高い冷凍耐性製パン用酵母の取得ができ、当該酵母を用いることで冷凍生地から効率的にパン類を製造できる。【選択図】図１
2019033696.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小麦粉１００重量％当たり糖５重量％を含んでなるパン生地における炭酸ガス発生量が、３０℃で２時間測定（パン生地１０ｇ）した場合に４５ｍＬ以上となり、４℃では２４時間測定（パン生地１０ｇ）した場合に１５ｍＬ以上となり、かつ、小麦粉１００重量％当たり糖５重量％を含んでなるパン生地を３０℃・湿度７５％で１時間発酵後、−３０℃で３０分急速冷凍し、急速冷凍後−２０℃で２時間冷凍保存した後の炭酸ガス発生量が、３０℃で５時間測定（パン生地２０ｇ）した場合に１２０ｍＬ以上となり、急速冷凍後−２０℃で２１日間冷凍保存した後の炭酸ガス発生量が、３０℃で５時間測定（パン生地２０ｇ）した場合に７５ｍＬ以上となる、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する製パン用酵母。
【請求項２】
製パン用酵母サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ.  ＨＢ３５株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４６９）。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の製パン用酵母を含有するパン生地。
【請求項４】
請求項３に記載のパン生地を４〜３０℃で発酵させ、その後焼成することを特徴とする、パン類の製造方法。
【請求項５】
サッカロマイセス・バヤヌス・バー・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ  ｖａｒ．  ｕｖａｒｕｍ）  Ｂ３５Ｌ１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０９）と、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  Ｈ２４Ｕ１Ｍ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０８）とを交雑することを特徴とする、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する冷凍耐性及び低温高発酵性製パン用酵母の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製パン用酵母等に関するものである。詳細には、サッカロマイセス・バヤヌス・バー・ウバルムに属する菌株とサッカロマイセス・セレビシエに属する菌株の交雑により作出した、低温パン生地においても高い発酵力を有する冷凍耐性製パン用酵母、当該酵母を使用したパン類の製造方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
焼きたてのパンを販売するオーブンフレッシュベーカリーにおいて、製品は様々な方式で製造されているが、その方式は大きく二つに分けることができる。ひとつは、小麦粉、水、砂糖、食塩、油脂、酵母等を混捏した生地を発酵後、焼成する工程を一気に行うスクラッチ方式であり、自家製パンができるものの、パン製造設備を全て揃えなければならない上に手間と時間がかかるという欠点がある。
【０００３】
もう一つは、ベークオフ方式であり、工場において原料混合、生地調製、一次発酵、分割、成形後、急速冷凍された形態で届けられた冷凍パン生地を使う方法である。小規模の店舗内であっても、この冷凍パン生地を解凍して、その後の発酵、焼成工程を行うだけでパン類を製造することができるため、熟練した製パン職人は不要で、少量多品種のパン生産が可能であり、オーブンフレッシュベーカリーでは広く普及している。このような冷凍生地製パン法においては、パン生地中での凍結障害を受けにくい冷凍耐性を備えた製パン用酵母が使われている。
【０００４】
また、スクラッチ方式の変法に相当するものとして冷蔵生地製パン法がある。一般的に、パン生地は２７〜３０℃で数時間発酵させるが、この方法は５℃程度の冷蔵庫内でパン生地を１２〜４８時間保存・熟成させた後で発酵し、焼成するというものである。
【０００５】
通常の製パン用酵母では、５℃前後で長時間保存中のパン生地においてもゆっくりと発酵が進行して代謝活性が劣化することにより、発酵段階で十分な発酵ができず、焼成したパンの比容積が低下してしまう。そこで、この冷蔵生地製パン法では、低温ではパン生地発酵が抑制されて常温域になるとパン生地発酵力が回復するような低温感受性を備えた製パン用酵母が使用されている（特許文献１〜３など）。さらに、パン生地中における冷凍耐性と低温感受性の両方の形質を兼ね備えた製パン用酵母も開発されている（特許文献４など）。
【０００６】
一方、ベークオフ方式（冷凍生地製パン法）を採用している店舗などにおいては、冷凍パン生地の解凍から焼成までの時間を短縮して効率化を図らなければならず、使用する製パン用酵母には解凍中などの低温状態のパン生地においてもすばやくパン生地を発酵させるような形質が求められると言える。しかしながら、製パン業界では、上記のように低温においてパン生地発酵が抑制されるような製パン用酵母の形質のみが注目されており、これとは反対の低温パン生地発酵力が高い製パン用酵母は見当たらないのが現状である。
【０００７】
このような技術背景において、常温域だけでなく低温域でもパン生地発酵力が高い、冷凍生地製パン法おいて有用な冷凍耐性製パン用酵母等の開発が当業界において必要とされていると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平７−２４６０８７号公報
【特許文献２】特開２０１０−０２２３２２号公報
【特許文献３】特開２０１３−１７２７３９号公報
【特許文献４】特開平９−２２００８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、常温域だけでなく低温域でもパン生地発酵力が高い冷凍耐性製パン用酵母、当該酵母を用いたパン類の製造方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究の結果、サッカロマイセス・バヤヌス・バー・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ  ｖａｒ．  ｕｖａｒｕｍ）  Ｂ３５Ｌ１株と、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  Ｈ２４Ｕ１Ｍ株とを交雑することで、低温パン生地発酵力も高い冷凍耐性製パン用酵母を取得することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）小麦粉１００重量％当たり糖５重量％を含んでなるパン生地における炭酸ガス発生量が、３０℃で２時間測定（パン生地１０ｇ）した場合に４５ｍＬ以上となり、４℃では２４時間測定（パン生地１０ｇ）した場合に１５ｍＬ以上となり、かつ、小麦粉１００重量％当たり糖５重量％を含んでなるパン生地を３０℃・湿度７５％で１時間発酵後、−３０℃で３０分急速冷凍し、急速冷凍後−２０℃で２時間冷凍保存した後の炭酸ガス発生量が、３０℃で５時間測定（パン生地２０ｇ）した場合に１２０ｍＬ以上となり、急速冷凍後−２０℃で２１日間冷凍保存した後の炭酸ガス発生量が、３０℃で５時間測定（パン生地２０ｇ）した場合に７５ｍＬ以上となる、サッカロマイセス属に属する製パン用酵母。
（２）冷凍耐性及び低温高発酵性を兼ね備えた製パン用酵母サッカロマイセスｓｐ．  ＨＢ３５株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４６９）。
（３）（１）又は（２）に記載の製パン用酵母を含有するパン生地（特に冷蔵パン生地又は冷凍パン生地）。
（４）（３）に記載のパン生地を４〜３０℃で発酵させ（例えば４〜１０℃の低温域から２７〜３０℃の発酵温度帯まで昇温するのと並行して発酵させ且つ発酵温度帯に到達してからも発酵を続け）、その後（発酵終了後）焼成することを特徴とする、パン類の製造方法。
（５）サッカロマイセス・バヤヌス・バー・ウバルム  Ｂ３５Ｌ１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０９）と、サッカロマイセス・セレビシエ  Ｈ２４Ｕ１Ｍ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０８）とを交雑することを特徴とする、サッカロマイセス属に属する冷凍耐性及び低温高発酵性製パン用酵母の作出方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、通常の発酵温度帯だけでなく、低温状態のパン生地においてもすばやくパン生地を良好に発酵させる冷凍耐性製パン用酵母を取得することができ、当該酵母を用いることで、冷凍生地製パン法において冷凍パン生地の解凍から焼成までの時間をより短縮でき、パン類製造の更なる効率化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１で行った交雑株取得の工程概略を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明においては、まず低温域（４〜１０℃程度）でのパン生地発酵力が高い冷凍耐性製パン用酵母作出のために、ワイン醸造用酵母として知られているサッカロマイセス・バヤヌス・バー・ウバルム  ＮＢＲＣ１０９７０株のリジン要求性変異株であるＢ３５Ｌ１株と、冷凍耐性製パン用酵母として知られているサッカロマイセス・セレビシエ  Ｈ２４株のウラシル要求性変異株であるＨ２４Ｕ１Ｍ株とを交雑する。
【００１５】
このリジン要求性変異株Ｂ３５Ｌ１株やウラシル要求性変異株Ｈ２４Ｕ１Ｍ株の取得は定法により行えば良く、特段の限定はないが、例えば、ＵＶや化学物質（エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、亜硝酸等）などでＮＢＲＣ１０９７０株、Ｈ２４株を変異処理した後に所定の選択培地（リジン要求性変異株の場合はα−アミノアジピン酸含有培地など、ウラシル要求性変異株の場合は５−フルオロオロチン酸含有培地など）で選択する方法などが例示される。そして、これら変異株を用いて希少接合（ｒａｒｅ  ｍａｔｉｎｇ）により交雑を行うのが好ましいが、交雑法についてもこれに限定されるものではない。
【００１６】
そして、このＢ３５Ｌ１株とＨ２４Ｕ１Ｍ株の交雑により、ＨＢ３５株などの冷凍耐性を兼ね備えた低温パン生地発酵力も高い製パン用酵母交雑株が容易に取得できる。そして、このＨＢ３５株は、この交雑により取得できた交雑株の中で極めて有用な製パン用酵母であり、以下に示すような菌学的性質を有する。
【００１７】
（Ａ）形態学的性質
ＹＰＤ液体培地（乾燥酵母エキス１．０％、ハイポリペプトン２．０％、グルコース２．０％）で３０℃、１日間培養したときの細胞は球形又は楕円形で、大きさは４〜６μｍ×６〜８μｍで、多極出芽する。また、ＹＰＤ寒天平板培地で３０℃、１日間培養したときのコロニーは淡褐色で、光沢がある。また、ＳＰＯ寒天培地（酢酸カリウム１．０％、酵母エキス０．１％、グルコース０．０５％、寒天２．０％）上で２５℃、７日培養すると２〜４個の球形の胞子を形成する。
（Ｂ）生理的性質
温度２０〜３７℃で生育する。
（Ｃ）糖の発酵性
グルコース：＋
ガラクトース：＋
スクロース：＋
マルトース：＋
ラクトース：−
ラフィノース：＋
トレハロース：−
メリビオース：＋
（Ｄ）炭素源の資化性
グルコース：＋＋
ガラクトース：＋＋
Ｌ−ソルボース：−
スクロース：＋＋
マルトース：＋＋
セロビオース：−
トレハロース：＋
ラクトース：−
メリビオース：−
ラフィノース：＋
メレジトース：−
イヌリン：−
可溶性デンプン：−
Ｄ−キシロース：−
Ｌ−アラビノース：−
Ｄ−アラビノース：−
Ｄ−リボース：−
Ｌ−ラムノース：−
リビトール：−
Ｄ−マンニトール：＋
グリセロール：＋＋
エタノール：＋＋
α−メチルグルコシド：＋＋
サリシン：−
コハク酸：−
クエン酸：−
ミオイノシトール：−
Ｄ−グルコサミン：−
【００１８】
また、交雑親株であるＢ３５Ｌ１株及びＨ２４Ｕ１Ｍ株は、以下に示すような菌学的性質を有する。
【００１９】
＜Ｂ３５Ｌ１株＞
（Ａ）形態学的性質
ＹＰＤ液体培地（乾燥酵母エキス１．０％、ハイポリペプトン２．０％、グルコース２．０％）で３０℃、１日間培養したときの細胞は球形又は楕円形で、大きさは５〜９μｍ×４〜８μｍで、多極出芽する。また、ＹＰＤ寒天平板培地で３０℃、１日間培養したときのコロニーは淡褐色で、光沢がある。また、ＳＰＯ寒天培地（酢酸カリウム１．０％、酵母エキス０．１％、グルコース０．０５％、寒天２．０％）上で２５℃、７日培養すると３〜４個の球形の胞子を形成する。
（Ｂ）生理的性質
温度２０〜３３℃で生育する。
（Ｃ）糖の発酵性
グルコース：＋
ガラクトース：＋
スクロース：＋
マルトース：＋
ラクトース：−
ラフィノース：＋
トレハロース：−
メリビオース：＋
（Ｄ）炭素源の資化性
グルコース：＋＋
ガラクトース：＋＋
Ｌ−ソルボース：−
スクロース：＋＋
マルトース：＋＋
セロビオース：−
トレハロース：＋
ラクトース：−
メリビオース：−
ラフィノース：＋＋
メレジトース：−
イヌリン：−
可溶性デンプン：−
Ｄ−キシロース：−
Ｌ−アラビノース：−
Ｄ−アラビノース：−
Ｄ−リボース：−
Ｌ−ラムノース：−
リビトール：−
Ｄ−マンニトール：＋
グリセロール：＋＋
エタノール：＋＋
α−メチルグルコシド：＋
サリシン：−
コハク酸：−
クエン酸：−
ミオイノシトール：−
Ｄ−グルコサミン：−
【００２０】
＜Ｈ２４Ｕ１Ｍ株＞
（Ａ）形態学的性質
ＹＰＤ液体培地（乾燥酵母エキス１．０％、ハイポリペプトン２．０％、グルコース２．０％）で３０℃、１日間培養したときの細胞は球形又は楕円形で、大きさは４〜６μｍ×３〜５μｍで、多極出芽する。また、ＹＰＤ寒天平板培地で３０℃、１日間培養したときのコロニーは淡褐色で、光沢がある。また、ＳＰＯ寒天培地（酢酸カリウム１．０％、酵母エキス０．１％、グルコース０．０５％、寒天２．０％）上で２５℃、７日培養しても胞子の形成は認められない。
（Ｂ）生理的性質
温度２０〜３５℃で生育する。
（Ｃ）糖の発酵性
グルコース：＋
ガラクトース：＋
スクロース：＋
マルトース：＋
ラクトース：−
ラフィノース：＋
トレハロース：−
メリビオース：−
（Ｄ）炭素源の資化性
グルコース：＋＋
ガラクトース：＋＋
Ｌ−ソルボース：−
スクロース：＋＋
マルトース：＋＋
セロビオース：−
トレハロース：＋
ラクトース：−
メリビオース：−
ラフィノース：＋
メレジトース：＋
イヌリン：−
可溶性デンプン：−
Ｄ−キシロース：−
Ｌ−アラビノース：−
Ｄ−アラビノース：−
Ｄ−リボース：−
Ｌ−ラムノース：−
リビトール：−
Ｄ−マンニトール：−
グリセロール：−
エタノール：＋＋
α−メチルグルコシド：−
サリシン：−
コハク酸：−
クエン酸：−
ミオイノシトール：−
Ｄ−グルコサミン：−
【００２１】
これらＨＢ３５株、Ｂ３５Ｌ１株及びＨ２４Ｕ１Ｍ株は、いずれも独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、ＨＢ３５株は２０１７年（平成２９年）５月１１日付け、Ｂ３５Ｌ１株及びＨ２４Ｕ１Ｍ株は２０１７年（平成２９年）７月１４日付けで寄託されており、その受託番号は、それぞれＮＩＴＥ  Ｐ−０２４６９、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０９及びＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０８である。
【００２２】
そして、このような冷凍耐性を兼ね備えた低温パン生地発酵力も高い製パン用酵母交雑株を用いて、冷凍生地製パン法によりパン類を製造する。これに限定されるものではないが、製パン用酵母と小麦粉などの他の原料を混ぜ合わせて混捏しパン生地を作製した後、冷凍処理を行って冷凍パン生地とし、必要な場面でこの冷凍パン生地を解凍して２７〜３０℃まで生地の昇温を行うのと共に（同時並行で）生地の発酵を行い、２７〜３０℃に到達してからも必要であれば発酵を継続し、発酵終了後に焼成等を行う工程が例示される。本発明においては、パン生地の温度が４〜２７℃の状態でも発酵が一定程度以上進んでいること、及び、その後にパン生地が通常の発酵温度である２７〜３０℃となっても十分に発酵が進むことが特徴である。
【００２３】
なお、本発明において製パン用酵母の低温パン生地発酵力が高いという基準は、小麦粉１００重量％当たり糖５重量％を含んでなるパン生地における炭酸ガス発生量が、低温域の代表温度として、４℃で２４時間測定（パン生地１０ｇ）した場合に１５ｍＬ以上、好ましくは２０ｍＬ以上となり、さらに通常の製パン用酵母発酵温度帯の代表温度として、３０℃で２時間測定（パン生地１０ｇ）した場合に４５ｍＬ以上となる発酵力を有し、且つ、この３０℃でのパン生地発酵力に対するこの４℃でのパン生地発酵力の比率が４０％以上であることを意味する。
【００２４】
また、本発明において製パン用酵母の冷凍耐性の基準は、小麦粉１００重量％当たり糖５重量％を含んでなるパン生地を３０℃・湿度７５％で１時間発酵後、−３０℃で３０分急速冷凍し、急速冷凍後−２０℃で２時間冷凍保存した後の炭酸ガス発生量が、３０℃で５時間測定（パン生地２０ｇ）した場合に１２０ｍＬ以上、好ましくは１３０ｍＬ以上となり、且つ、急速冷凍後−２０℃で２１日間冷凍保存した後の炭酸ガス発生量が、３０℃で５時間測定（パン生地２０ｇ）した場合に７５ｍＬ以上、好ましくは８０ｍＬ以上となることを意味する。
【００２５】
このようにして、優れた低温増殖能を備えるワイン醸造用酵母であるサッカロマイセス・バヤヌス・バー・ウバルムに属する菌株のリジン要求性変異株であるＢ３５Ｌ１株と、高いパン生地発酵力と冷凍耐性を兼ね備える製パン用酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ  Ｈ２４株のウラシル要求性変異株であるＨ２４Ｕ１Ｍ株との交雑により、高い低温パン生地発酵力とパン生地中における冷凍耐性を兼ね備えた製パン用酵母菌株を作出でき、当該酵母菌株を用いることで、冷凍生地製パン法によるパン類製造の更なる効率化を図ることができる。
【００２６】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではなく、本発明の技術的思想内においてこれらの様々な変形が可能である。
【実施例１】
【００２７】
（交雑株の取得）
本発明の交雑株は、次のような方法で取得した。
【００２８】
独立行政法人製品評価技術基盤機構の微生物コレクションから入手したサッカロマイセス・バヤヌス・バー・ウバルム  ＮＢＲＣ１０９７０株から北本の方法（日本醸造協会誌，８４［１］，３４−３７，１９８９）によってリジン要求性変異株Ｂ３５Ｌ１株を分離した。一方、冷凍生地用パン酵母菌株サッカロマイセス・セレビシエに由来して接合型ａを示す一倍体菌株Ｈ２４株から、北本の方法（日本醸造協会誌，８４［１２］，８４９−８５３，１９８９）によってウラシル要求性変異株Ｈ２４Ｕ１Ｍ株を分離した。
【００２９】
次に、このＢ３５Ｌ１株とＨ２４Ｕ１Ｍ株を用いて、希少接合により交雑を行った。具体的には、この両株について、一白金耳分の菌体を試験管（直径１．８ｃｍ×長さ１０．５ｃｍ）の中のＹＰＤ培地（乾燥酵母エキス：１．０％、ハイポリペプトン：２．０％、グルコース：２．０％、寒天：２．０％）３ｍｌに接種し、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）した。２４時間後、培養液１ｍｌを無菌的に遠心分離にかけて回収した菌体を滅菌水で２回洗浄した。この菌体を液体ＭＭ培地（Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ：０．６７％、グルコース：２．０％）３ｍｌに懸濁し、３０℃で２４時間、振盪培養（１５０ｒｐｍ）した。この培養液０．０３ｍｌを別の新しい液体ＭＭ培地（最少液体培地）に接種し、同様に４８時間振盪培養したところ、植菌直後は透明であった培養液は菌体の増殖により白濁した。この培養液中の増殖した酵母細胞をＭＭ寒天平板培地上で画線接種することにより交雑株ＨＢ３５株を純粋分離した。この交雑株取得の工程概略を図１に示した。
【実施例２】
【００３０】
（パン生地発酵力確認試験）
実施例１で得られた交雑株ＨＢ３５株の３０℃及び４℃におけるパン生地発酵力を、ＮＢＲＣ１０９７０株、Ｈ２４株、交雑親株であるＢ３５Ｌ１株とＨ２４Ｕ１Ｍ株、及び、市販パン酵母分離株であるサッカロマイセス・セレビシエ  ＨＰ４６７及びＨＰ２１６株と比較確認するため、以下の試験を実施した。
【００３１】
ＨＢ３５株、ＮＢＲＣ１０９７０株、Ｈ２４株、Ｂ３５Ｌ１株、Ｈ２４Ｕ１Ｍ株、ＨＰ４６７株、ＨＰ２１６株の各菌株を、試験管中のＹＰＤ培地（乾燥酵母エキス：１．０％、ハイポリペプトン：２．０％、グルコース：２．０％）３ｍｌで３０℃、２４時間往復振盪培養（１５０ｒｐｍ）し、そのうちの０．６ｍｌを３００ｍｌバッフル付き三角フラスコ中のＹＰＳ培地（バクト酵母エキス：２．０％、バクトペプトン：４．０％、ＫＨ２ＰＯ４：０．２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．１％、ＮａＣｌ：２．０％、アデカノールＬＧ−２９４：０．０５％、スクロース：２．０％）６０ｍｌに接種して３０℃、２４時間旋回振盪培養（１５０ｒｐｍ）した。培養後の菌体は遠心分離で回収し、蒸留水で２回洗浄してから乾燥させた吸収板の上に数分間置いて培養湿菌体を得た。培養菌体の固形分は約３０％になるが、一部を乾燥させて正確な数値を算出し、以下の実験では固形分３３％に換算した重量として培養菌体を生地調製に使用した。
【００３２】
各酵母について、小麦粉（強力）１０ｇ、スクロース０．５ｇ及びＮａＣｌ０．２ｇを含む蒸留水５．５ｍｌと、酵母菌体０．２ｇを含む懸濁液１．０ｍｌを１分間混捏した。調製した低糖パン生地（小麦粉重量に対して５％スクロース及び２％ＮａＣｌを含む）は２．４ｃｍ×２０ｃｍの試験管に入れ、発生する炭酸ガス量を飽和食塩水中のメスシリンダーに導いて、３０℃では２時間、４℃では２４時間当たりに発生する炭酸ガス発生量をパン生地発酵力としてそれぞれ測定した。これらの操作はすべて３０℃又は４℃で行った。
【００３３】
この結果を下記表１に示す。交雑株ＨＢ３５株は、３０℃でのパン生地発酵力が４８．１ｍｌ／２ｈ／１０ｇ小麦粉、４℃でのパン生地発酵力が２２．１ｍｌ／２４ｈ／１０ｇ小麦粉であり、３０℃でのパン生地発酵力に対する４℃でのパン生地発酵力の比率を算出すると４５．９％になった。Ｈ２４株、Ｈ２４Ｕ１Ｍ株及びＨＰ４６７株の３０℃でのパン生地発酵力は４４ｍｌ／２ｈ／１０ｇ小麦粉以上と比較的高い値であったが、３０℃でのパン生地発酵力に対する４℃でのパン生地発酵力の比率は２５％未満であった。ＮＢＲＣ１０９７０株及びＢ３５Ｌ１株の３０℃でのパン生地発酵力に対する４℃でのパン生地発酵力の比率は高かったが、これは３０℃でのパン生地発酵力がその他の菌株の半分程度しかなかったために製パン用酵母菌株としての利用は不適であった。したがって、交雑株ＨＢ３５株は他の菌株と異なり、３０℃及び４℃の両方における高いパン生地発酵力を備えていることが明らかとなった。
【００３４】
【表１】
2019033696.tif 000003
【実施例３】
【００３５】
（冷凍耐性確認試験）
実施例１で得られた交雑株ＨＢ３５株の冷凍耐性を、市販パン酵母分離株であるサッカロマイセス・セレビシエ  ＨＰ４６７株及びＨＰ７５８株（冷凍耐性を備えた株）と冷凍生地を低温状態から発酵させる過程における炭酸ガス発生量の変化で比較確認するため、以下の試験を実施した。
【００３６】
実施例２の方法で培養したＨＢ３５株、ＨＰ４６７株及びＨＰ７５８株の各酵母菌体４．０ｇ（固形分３３％換算）、小麦粉（カメリア）２００ｇ、砂糖１０．０ｇ、食塩４．０ｇ、ショートニング１０．０ｇ、アスコルビン酸溶液１．０ｍｌ（０．１ｍｇ／ｍｌ）及び蒸留水１３３ｍｌをピンミキサーで３分間混捏し、捏ね上げたときの温度が２１．０±１．０℃になるようにパン生地を調製した。これを直ぐに２０ｇに分割して丸め、３０℃、湿度７５％で、１時間発酵後、−３０℃、３０分冷凍庫で急速凍結した。凍結させた生地は−２０℃の冷凍庫に移し、適宜保存した。凍結生地は７、１４及び２１日後、各菌株につき３個を取り出してファーモグラフ（アトー株式会社）で炭酸ガス発生量を５時間測定した。なお、−２０℃、２時間保存後に解凍したものを凍結０日目として測定した。
【００３７】
この結果を下記表２に示す。交雑株ＨＢ３５株の凍結０日目及び２１日目のパン生地発酵力はそれぞれ１３６．６ｍｌ／５ｈ／２０ｇパン生地及び８０．９ｍｌ／５ｈ／２０ｇパン生地であり、凍結０日目に対する凍結７日目のパン生地発酵力の比率を算出すると５９．２％になった。この値は冷凍耐性を備えた株であるＨＰ７５８株の７１．１％よりは低いものの、冷凍耐性のないＨＰ４６７株の３８．３％より十分に高い値であった。したがって、交雑株ＨＢ３５株はパン生地中における高い冷凍耐性を備えていることが明らかとなった。
【００３８】
【表２】
2019033696.tif 000004
【００３９】
以上より、サッカロマイセス・バヤヌス・バー・ウバルム  Ｂ３５Ｌ１株と、サッカロマイセス・セレビシエ  Ｈ２４Ｕ１Ｍ株とを交雑することにより、高い低温パン生地発酵力とパン生地中における冷凍耐性を兼ね備えた優れた製パン用酵母菌株を作出でき、当該菌株を適用することにより冷凍生地を使ったパン類生産を大幅に効率化できるようになることが示された。
【００４０】
本発明を要約すれば、以下の通りである。
【００４１】
本発明は、常温域だけでなく低温域でもパン生地発酵力が高い冷凍耐性製パン用酵母、当該酵母を用いたパン類の製造方法等を提供することを目的とする。
【００４２】
そして、サッカロマイセス・バヤヌス・バー・ウバルム  Ｂ３５Ｌ１株と、サッカロマイセス・セレビシエ  Ｈ２４Ｕ１Ｍ株とを交雑することで、低温パン生地発酵力も高い冷凍耐性製パン用酵母の取得ができ、当該酵母を用いることで冷凍生地から効率的にパン類を製造できる。
【受託番号】
【００４３】
本発明において寄託されている微生物の受託番号を下記に示す。
（１）サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．  ＨＢ３５株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４６９）。
（２）サッカロマイセス・バヤヌス・バー・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ  ｖａｒ．  ｕｖａｒｕｍ）  Ｂ３５Ｌ１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０９）。
（３）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  Ｈ２４Ｕ１Ｍ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０８）。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年11月10日(2017.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
サッカロマイセス・バヤヌス・バー・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ  ｖａｒ．  ｕｖａｒｕｍ）  Ｂ３５Ｌ１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０９）と、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  Ｈ２４Ｕ１Ｍ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０８）とを希少接合により交雑することを特徴とする、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する冷凍耐性及び低温高発酵性製パン用酵母の作出方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究の結果、サッカロマイセス・バヤヌス・バー・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ  ｖａｒ．  ｕｖａｒｕｍ）  Ｂ３５Ｌ１株と、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  Ｈ２４Ｕ１Ｍ株とを希少接合により交雑することで、低温パン生地発酵力も高い冷凍耐性製パン用酵母を取得することができることを見出し、本発明を完成した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）小麦粉１００重量％当たり糖５重量％を含んでなるパン生地における炭酸ガス発生量が、３０℃で２時間測定（パン生地１０ｇ）した場合に４５ｍＬ以上となり、４℃では２４時間測定（パン生地１０ｇ）した場合に１５ｍＬ以上となり、かつ、小麦粉１００重量％当たり糖５重量％を含んでなるパン生地を３０℃・湿度７５％で１時間発酵後、−３０℃で３０分急速冷凍し、急速冷凍後−２０℃で２時間冷凍保存した後の炭酸ガス発生量が、３０℃で５時間測定（パン生地２０ｇ）した場合に１２０ｍＬ以上となり、急速冷凍後−２０℃で２１日間冷凍保存した後の炭酸ガス発生量が、３０℃で５時間測定（パン生地２０ｇ）した場合に７５ｍＬ以上となる、サッカロマイセス属に属する製パン用酵母。
（２）冷凍耐性及び低温高発酵性を兼ね備えた製パン用酵母サッカロマイセスｓｐ．  ＨＢ３５株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４６９）。
（３）（１）又は（２）に記載の製パン用酵母を含有するパン生地（特に冷蔵パン生地又は冷凍パン生地）。
（４）（３）に記載のパン生地を４〜３０℃で発酵させ（例えば４〜１０℃の低温域から２７〜３０℃の発酵温度帯まで昇温するのと並行して発酵させ且つ発酵温度帯に到達してからも発酵を続け）、その後（発酵終了後）焼成することを特徴とする、パン類の製造方法。
（５）サッカロマイセス・バヤヌス・バー・ウバルム  Ｂ３５Ｌ１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０９）と、サッカロマイセス・セレビシエ  Ｈ２４Ｕ１Ｍ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５０８）とを希少接合により交雑することを特徴とする、サッカロマイセス属に属する冷凍耐性及び低温高発酵性製パン用酵母の作出方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
このリジン要求性変異株Ｂ３５Ｌ１株やウラシル要求性変異株Ｈ２４Ｕ１Ｍ株の取得は定法により行えば良く、特段の限定はないが、例えば、ＵＶや化学物質（エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、亜硝酸等）などでＮＢＲＣ１０９７０株、Ｈ２４株を変異処理した後に所定の選択培地（リジン要求性変異株の場合はα−アミノアジピン酸含有培地など、ウラシル要求性変異株の場合は５−フルオロオロチン酸含有培地など）で選択する方法などが例示される。そして、これら変異株を用いて希少接合（ｒａｒｅ  ｍａｔｉｎｇ）により交雑を行う。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
そして、このＢ３５Ｌ１株とＨ２４Ｕ１Ｍ株の希少接合による交雑により、ＨＢ３５株などの冷凍耐性を兼ね備えた低温パン生地発酵力も高い製パン用酵母交雑株が容易に取得できる。そして、このＨＢ３５株は、この交雑により取得できた交雑株の中で極めて有用な製パン用酵母であり、以下に示すような菌学的性質を有する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
このようにして、優れた低温増殖能を備えるワイン醸造用酵母であるサッカロマイセス・バヤヌス・バー・ウバルムに属する菌株のリジン要求性変異株であるＢ３５Ｌ１株と、高いパン生地発酵力と冷凍耐性を兼ね備える製パン用酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ  Ｈ２４株のウラシル要求性変異株であるＨ２４Ｕ１Ｍ株との希少接合による交雑により、高い低温パン生地発酵力とパン生地中における冷凍耐性を兼ね備えた製パン用酵母菌株を作出でき、当該酵母菌株を用いることで、冷凍生地製パン法によるパン類製造の更なる効率化を図ることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
以上より、サッカロマイセス・バヤヌス・バー・ウバルム  Ｂ３５Ｌ１株と、サッカロマイセス・セレビシエ  Ｈ２４Ｕ１Ｍ株とを希少接合によって交雑することにより、高い低温パン生地発酵力とパン生地中における冷凍耐性を兼ね備えた優れた製パン用酵母菌株を作出でき、当該菌株を適用することにより冷凍生地を使ったパン類生産を大幅に効率化できるようになることが示された。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
そして、サッカロマイセス・バヤヌス・バー・ウバルム  Ｂ３５Ｌ１株と、サッカロマイセス・セレビシエ  Ｈ２４Ｕ１Ｍ株とを希少接合により交雑することで、低温パン生地発酵力も高い冷凍耐性製パン用酵母の取得ができ、当該酵母を用いることで冷凍生地から効率的にパン類を製造できる。