(57)【要約】      （修正有）【課題】アルカリホスファターゼを哺乳動物細胞で経済的なレベルで高発現することが可能な細胞の取得方法、及びその培養精製方法の提供。【解決手段】以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むアルカリホスファターゼの生産方法であって、アルカリホスファターゼ生産量が１００ｍｇ／Ｌ以上である、方法：（Ａ）特定のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を、哺乳動物細胞へ導入する工程；（Ｂ）薬剤耐性を利用して前記遺伝子が導入された哺乳動物細胞を選別する工程；（Ｃ）前記（Ｂ）で導入した遺伝子を、薬剤耐性を利用して増幅する工程。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むアルカリホスファターゼの生産方法であって、アルカリホスファターゼ生産量が１００ｍｇ／Ｌ以上である、方法：
（Ａ）配列番号３であらわされるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を、哺乳動物細胞へ導入する工程；
（Ｂ）薬剤耐性を利用して前記遺伝子が導入された哺乳動物細胞を選別する工程；
（Ｃ）前記（Ｂ）で導入した遺伝子を、薬剤耐性を利用して増幅する工程。
【請求項２】
アルカリホスファターゼ生産量が３００ｍｇ／Ｌ以上である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物細胞がミエローマ細胞である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（Ｃ）における薬剤耐性を利用した遺伝子増幅がｄｈｆｒ−ＭＴＸ遺伝子増幅法である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
変異型ｄｈｆｒを用いる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程（Ｃ）により得られた、アルカリホスファターゼ生産量が増大した哺乳動物細胞を培地中で培養する工程をさらに含み、前記培地が亜鉛イオンを１０〜２５０μＭ含有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記培養する工程における、細胞培養基材がホローファイバーであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
配列番号３であらわされるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子が、変異型ｄｈｆｒを用いてｄｈｆｒ−ＭＴＸ遺伝子増幅法により遺伝子増幅され、アルカリホスファターゼの生産量が１００ｍｇ／ｍＬ以上であるミエローマ細胞。
【請求項９】
以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むアルカリホスファターゼ生産用哺乳動物細胞の製造方法であって、前記細胞は１００ｍｇ／Ｌ以上のアルカリホスファターゼ生産能力を有する、方法：
（Ａ）配列番号３であらわされるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を、哺乳動物細胞へ導入する工程；
（Ｂ）薬剤耐性を利用して前記遺伝子が導入された哺乳動物細胞を選別する工程；
（Ｃ）前記（Ｂ）で導入した遺伝子を、薬剤耐性を利用して増幅する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換えアルカリホスファターゼを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰと略する）は、抗原抗体反応などの検出系にホースラディッシュパーオキシダーゼと並んでよく利用される酵素である。種々の動物から単離されたＡＬＰの中で、ウシ小腸由来の酵素の比活性が高いことから主に使用されている。また天然型のＡＬＰには高活性型（ＣＩＰＩＩ）と中活性型（ＣＩＰＩ）が存在することが知られているが、高活性なＡＬＰは子牛小腸からしか精製することができず、安定供給は課題の一つであった。
【０００３】
近年遺伝子工学技術を用い、ＣＨＯ細胞で高活性遺伝子組換えＡＬＰを生産する方法（特許文献１）やピキア酵母で発現する方法が報告されている（特許文献２）。
ＣＨＯ細胞（動物細胞）での発現系では、細胞内の分泌経路において付加された糖鎖をトリミングして適切な形に修正するため、天然型に近い糖鎖が得られる利点があるが、発現量が少ないため経済性に問題があることが報告さている（特許文献２）。
ピキア酵母で産業上利用できる程度の発現量は得られているが、酵母でタンパク質を発現する際には過剰にＮ型糖鎖が付加される傾向が強いため、分子量が大きくなる、分子の均一性に欠ける等の問題を生じる（非特許文献１）。これらは、免疫学的測定において、ＡＬＰ標識後のゲルろ過での精製に支障が生じることが考えられる。また、医療用途においてはアレルゲン性の問題を生じることが危惧される。
非特許文献３では、遺伝子組み換えの手法を用いてＡＬＰのアミノ酸に変異を導入することで、酵母におけるＡＬＰ発現の糖鎖付加の不均一性を解消しているが、変異導入を行ったことで、天然型のＡＬＰとは一次構造が異なり、修飾される糖鎖構造も異なっている。
これまで、動物細胞でＡＬＰを発現した際に最も天然型に近いＡＬＰが作製可能なことは知られていたが、発現量が低いことによる経済的な問題のために実施されてこなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４２９５３８６号公報
【特許文献２】特許第３６５７８９５号公報
【特許文献３】特開２００８−５７３４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄｅａｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４２６，３０９−３２２（１９９９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＡＬＰを経済的な発現量で生産可能な動物細胞発現株及び生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する。
［１］
以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むアルカリホスファターゼの生産方法であって、アルカリホスファターゼ生産量が１００ｍｇ／Ｌ以上である、方法：
（Ａ）配列番号３であらわされるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を、哺乳動物細胞へ導入する工程；
（Ｂ）薬剤耐性を利用して前記遺伝子が導入された哺乳動物細胞を選別する工程；
（Ｃ）前記（Ｂ）で導入した遺伝子を、薬剤耐性を利用して増幅する工程。
［２］
アルカリホスファターゼ生産量が３００ｍｇ／Ｌ以上である［１］に記載の方法。
［３］
哺乳動物細胞がミエローマ細胞である［１］または［２］に記載の方法。
［４］
工程（Ｃ）における薬剤耐性を利用した遺伝子増幅がｄｈｆｒ−ＭＴＸ遺伝子増幅法である［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
変異型ｄｈｆｒを用いる［４］に記載の方法。
［６］
工程（Ｃ）により得られた、アルカリホスファターゼ生産量が増大した哺乳動物細胞を培地中で培養する工程をさらに含み、前記培地が亜鉛イオンを１０〜２５０μＭ含有する、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
前記培養する工程における、細胞培養基材がホローファイバーであることを特徴とする［６］に記載の方法。
［８］
配列番号３であらわされるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子が、変異型ｄｈｆｒを用いてｄｈｆｒ−ＭＴＸ遺伝子増幅法により遺伝子増幅され、アルカリホスファターゼの生産量が１００ｍｇ／ｍＬ以上であるミエローマ細胞。
［９］
以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むアルカリホスファターゼ生産用哺乳動物細胞の製造方法であって、前記細胞は１００ｍｇ／Ｌ以上のアルカリホスファターゼ生産能力を有する、方法：
（Ａ）配列番号３であらわされるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を、哺乳動物細胞へ導入する工程；
（Ｂ）薬剤耐性を利用して前記遺伝子が導入された哺乳動物細胞を選別する工程；
（Ｃ）前記（Ｂ）で導入した遺伝子を、薬剤耐性を利用して増幅する工程。
【０００８】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
（１）ＡＬＰ遺伝子配列
天然型のアルカリホスファターゼ遺伝子の３’付近には、ＧＰＩアンカーをコードする配列が含まれているため、この領域を含んだ形で組換えタンパクとして発現させた場合には、細胞膜上のタンパクとして発現する。細胞膜上に発現した場合、精製工程が煩雑になるため、ＡＬＰ活性に影響を与えない範囲で３’のアミノ酸を短くすることが好ましい。好ましくは配列番号１に示す５００番目のアミノ酸より短い配列、更に好ましくは、４９０番目より短い配列である。
（２）哺乳動物細胞
発現に用いる哺乳動物細胞は一般的に組換えタンパクの生産に用いられる細胞を用いればよく、特に限定されない。例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ミエローマ細胞などが例示できる。中でも、ＨＧＰＲＴ（ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）を欠損させたミエローマ細胞はデノボ経路によるＤＮＡ合成系のみを有するため、ｄｈｆｒ−ＭＴＸ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ−メトトレキサート）遺伝子増幅法を行う際に、サルベージ経路によるＤＮＡ合成を考慮する必要がなく、血清含有培地や、ＨＴ（ヒポキサンチン・チミジン）含有培地を使用可能なため、好ましい。
（３）遺伝子導入方法
哺乳動物細胞への遺伝子導入は効率的な遺伝子導入が行える方法であればよく、特に限定されない。例えば、リポフェクション、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法等を例示できる。中でも、導入効率の観点からエレクトロポレーション法による遺伝子導入が好ましい。
（４）薬剤耐性による細胞選別
薬剤耐性による細胞選別は薬剤耐性遺伝子を発現ベクター内に導入することで行えばよい。薬剤耐性遺伝子にはネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン耐性遺伝子などを用いればよい。例えば、タンパク発現ベクター上にネオマイシン耐性遺伝子を導入し、細胞培養培地中にＧ４１８を添加することで、選別を行ってもよい。
（５）遺伝子増幅
本発明における遺伝子増幅法は、哺乳動物細胞内の目的の発現タンパク遺伝子を増やす方法であればよく、特に限定されない。例えばＩＲ／ＭＡＲ（哺乳動物複製開始領域／核マトリックス結合領域）遺伝子増幅法、ｄｈｆｒ／ＭＴＸ遺伝子増幅法などを例示できる。ミエローマ細胞を用いてｄｈｆｒ／ＭＴＸ遺伝子増幅法を行う際、発現ベクターに導入するｄｈｆｒ遺伝子はＭＴＸに対して感受性の低い変異型であることが好ましい。ＭＴＸを用いた遺伝子増幅を行う際、細胞にとって、薬剤感受性の低い変異型ｄｈｆｒ遺伝子を増幅した方が、ミエローマ細胞が生来保有していたｄｈｆｒ遺伝子を増幅するのに比べＭＴＸへの耐性を獲得しやすいため、有利に遺伝子増幅される。
【０００９】
変異型ｄｈｆｒは文献１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０（１９８３）２４９５）に記載のものを用いてもよいし、文献２（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０（１９９３）１１７９７）に記載のものを用いてもよい。特に本発明では文献１に記載のｄｈｆｒアミノ酸配列の２２番目がアルギニンに置換された変異体を用いることが好ましい。
（６）培養
ＡＬＰは活性中心に亜鉛イオンを必要とするため、培養する細胞に毒性を示さない程度で亜鉛塩を添加することが好ましい。亜鉛塩の添加濃度は、好ましくは１０μＭ〜２５０μＭ、さらに好ましくは１５μＭ〜３０μＭである。亜鉛塩としては、硫酸亜鉛、酢酸亜鉛、塩化亜鉛が例示できるがこれらに限定されない。好ましくは、塩化亜鉛が例示できる。
【００１０】
培養基材も特に限定されない。培養シャーレを用いて静置培養を行ってもよいし、細胞密度を増すためにフラスコを用いた振とう培養を行ってもよい。また、培養液中の栄養状態をコントロールするために、ジャーファーメンターを用いて培養してもよいし、培地中のＡＬＰを濃縮するためにホローファイバーによる培養を行ってもよい。本発明では特に、後の精製工程を簡便に行うため、ホローファイバーを用いた濃縮培養を行うことが好ましい。培地としては、通常動物細胞を培養するのに用いられるものであってよく、Ｅ−ＲＤＦ（極東製薬）が例示できるがこれらに限定されない。
（７）生産量  
生産量の評価は特開２０１７−１９２３８１に記載のように、培養上清中のＡＬＰを２種の抗ＡＬＰ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡで行ってもよいし、培養上中のＡＬＰの活性値（Ｕ／ｍＬ）を測定しておき、精製後に測定される比活性（Ｕ／ｍｇ）と合わせて算出してもよい。
（８）精製
ＡＬＰの精製は哺乳動物細胞の培養上清を用いて当該業者において公知な方法を用いて行えばよい。例えば特開２０１７−１９２３８１に記載のように、クロマトグラフィーによる分離法、特に疎水性カラム及び陰イオン交換カラムを用いる方法によって行えばよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法では、経済的な発現量で高活性ＡＬＰを生産する哺乳動物細胞を構築し、精製ＡＬＰを取得することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＭＴＸ遺伝子増幅各段階でのクローニングした細胞によるＡＬＰ発現量を示す図である。
【図２】実施例９で得られた、Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷカラムにより分離されたクロマトグラムを示す図である。
【図３】実施例９で得られた、ＤＥＡＥ−５ＰＷカラムにより分離されたクロマトグラムを示す図である。
【図４】実施例１０で得られたゲルろ過分析の結果を示す図である。
【実施例】
【００１３】
［実施例１］  ＡＬＰをコードする遺伝子の作製
特開２０１７−１９２３８１に記載のＡＬＰアミノ酸配列（ＣＩＰＩＩ−ＣＩＰＩ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｐｒｏｔｅｉｎ、配列番号１）をもとに、シグナル配列を特許第６１３１０７４号公報に記載のシグナル配列に置換し、Ｃ末が４８７番目のＤである配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号３）を合成し、ネオマイシン耐性遺伝子配列を有する動物細胞用発現ベクターに組み込んだ。
【００１４】
［実施例２］変異型ｄｈｆｒ遺伝子の作製
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０８，６７３；１９９０の中で使用されるｐＥＣＥ−ｄｈｆｒの遺伝子配列を基に、ＫＯＤ−ＰＬＵＳ−ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（東洋紡績社製）を用いて、ｄｈｆｒ遺伝子配列をＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０（１９８３）２４９５に記載の変異ｄｈｆｒ遺伝子配列へ改変した。作製した変異ｄｈｆｒ遺伝子配列は、実施例１に記載の発現ベクターに組み込んだ。
【００１５】
［実施例３］哺乳動物細胞への遺伝子導入及び薬剤スクリーニング
実施例１、２のようにして作製したＡＬＰ発現ベクターをＮｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いてミエローマ細胞にエレクトロポレーションにより導入した。遺伝子導入後のミエローマ細胞は浮遊培養用シャーレ（住友ベークライト社製）で１０％のウシ血清を含むＥ−ＲＤＦ培地（極東製薬社製）で１日培養した後、Ｇ４１８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）を５００μｇ／ｍＬになるよう添加し、１週間培養した。Ｇ４１８含有培地で１週間の培養の後、セルカウントを行い、０．５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるよう３８４ｗｅｌｌ培養プレート（グライナー社製）に播種した。
【００１６】
［実施例４］イムノアッセイによる、ＡＬＰ発現株のスクリーニング
実施例３のようにして３８４ｗｅｌｌ培養プレートに播種した細胞のうち、どのｗｅｌｌの発現量が多いかのスクリーニングには、下記に示すイムノアッセイの手法で行った。
（１）固相化用緩衝液（１２ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）で、抗ＡＬＰ抗体（特開２０１７−１９２３８１に記載のＡＰＡ０５．３抗体）を１μｇ／ｍｌとなるように希釈し、５０μＬを３８４ウエルのＥＬＩＳＡプレートに添加し、１時間室温でインキュベートし、ＡＰＡ０５．３をＥＬＩＳＡプレートに固相化した。
（２）該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液（２０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、３％ＢＳＡを含むＰＢＳを添加し、１時間室温でインキュベートすることで該ＥＬＩＳＡプレートをブロッキングした。
（３）その後、実施例３で作製した３８４ｗｅｌｌ培養プレートの上清を、特開２００８−７９５１７に記載のレプリケータを用いて、０．３％ＢＳＡ−ＰＢＳを含むＰＢＳが５０μＬ／ｗｅｌｌで分注されたＥＬＩＳＡプレートに移し、一時間反応させた。
（４）  洗浄用緩衝液で洗浄後、４−ＭＵＰ溶液（１Ｍ  ジエタノールアミン、０．５ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  ４−メチルウンベリフェリルりん酸（４−ＭＵＰ））を添加し、３０分間室温でインキュベートした。該ＥＬＩＳＡプレートの蛍光強度（励起波長３６０ｎｍ、発光波長４６５ｎｍ）をプレートリーダーで測定した。
【００１７】
蛍光強度の強かった上位のｗｅｌｌから細胞を回収し、遺伝子増幅を行った。
【００１８】
［実施例５］薬剤耐性を利用した遺伝子増幅（ｄｈｆｒ−ＭＴＸ遺伝子増幅法）
ｄｈｆｒ−ＭＴＸ遺伝子増幅法による発現量上昇は、実施例４で得た発現量の高いクローンに対して実施した。培地は塩化亜鉛２５μＭ、１０％ウシ血清を含むＥ−ＲＤＦ培地を用いた。まず、４μＭのＭＴＸを含有する上記培地で、実施例４で得たクローンを培養した。培養期間はＭＴＸ添加前と細胞増殖速度が同等になるまでとし、３〜４週間培養を継続した。その後、０．５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるよう３８４ｗｅｌｌ培養プレート（グライナー社製）に播種した。１〜２週間経過後、実施例４に記載のイムノアッセイにより、ＡＬＰ発現量の増幅したクローンを選別した。
【００１９】
選別したクローンをもとに、４０μＭのＭＴＸを含有する培地を用いて上記と同様の方法により、ＡＬＰ発現量の増幅したクローンを選別した。
【００２０】
ＭＴＸ添加各段階でのクローニングした細胞によるＡＬＰ発現量を図１に示す。
［実施例６］シャーレでのＡＬＰ発現細胞の培養
浮遊培養用シャーレを用いた細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で、静置培養を行った。培養培地は１０％のウシ血清、２５μＭのＺｎＣｌ２を含むＥ−ＲＤＦ培地を用いた。発現量の測定を行う際は、１×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｍＬに細胞濃度を調整し、１０日間静置培養した後培養上清のＡＬＰ活性測定を行った。
［実施例７］培養上清中ＡＬＰの活性測定
培養上清中のＡＬＰ活性（Ｕ／ｍＬ）の測定は下記に示す方法で行った。
（１）培養上清をＡＬＰ希釈液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μＭ  ＺｎＣｌ２、２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）に希釈し、希釈系列を作製した。
（２）その後活性測定緩衝液（パラニトロフェニルフォスフェート（ＰＮＰＰ）３９１ｍｇを１００ｍＬの０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９．６、１ｍＭＭｇＣｌ２，０．１ｍＭＺｎＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ））５００μＬに（１）を２０μＬ添加した。
（３）２５℃で１０分間静置後に４０５ｎｍの吸光度を測定した。
（４）吸光度が１．０付近になる希釈倍率の測定液と活性濃度既知の標準サンプル（０．５９７Ｕ／ｍＬ，ウシ小腸ＡＬＰ  ＡＬＰＩ−１３Ｇ  Ｌｏｔ  １７０６ＡＡ、Ｂｉｏｚｙｍｅ社）を比較することで、培養上清中のＡＬＰの活性を測定した。
ＭＴＸ添加各段階でのクローニングした細胞による培養上清中ＡＬＰ活性を表１に示す。
【００２１】
【表１】
2019122303.tif 000003
【００２２】
［実施例８］ホローファイバーを用いたＡＬＰ発現細胞の培養
ホローファイバーでの細胞培養は、ＦｉｂｅｒＣｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓカートリッジ（ＦｉｂｅｒＣｅｌｌ社  セルロース膜  ＭＷＣＯ；５ｋＤａ）を用いて行った。浮遊培養用シャーレで拡大培養し、３．３×１０８Ｃｅｌｌｓの細胞をホローファイバーに播種した。培地はＥＣＳ（Ｅｘｔｒａｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｓｐａｃｅ）は１０％のウシ血清、２５μＭのＺｎＣｌ２を含むＥ−ＲＤＦ培地を用い、ＩＣＳ（Ｉｎｎｅｒｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｓｐａｃｅ）は２５μＭのＺｎＣｌ２を含むＥ−ＲＤＦ培地を用いた。細胞の培養は３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで行った。細胞の生育は培地中のグルコース消費をモニターすることで確認した。
［実施例９］ＡＬＰの精製
ＡＬＰの精製は以下の方法で行った。
（１）培養上清に硫酸アンモニウムを５５％飽和となるよう添加し、４℃で０．５時間放置、その後４℃、８０００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により、沈殿画分として硫安塩析物を得た。
（２）沈殿画分をＰＢＳで溶解し、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍとした後、Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷカラム（２１．５ｍｍ×１５０ｍｍ、東ソー株式会社）を接続した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した。Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷカラムカラムクロマトグラフィーは、１Ｍ硫酸アンモニウムを含むＰＢＳを平衡化緩衝液とし、流速５ｍｌ／分の硫安濃度１Ｍから０Ｍまでの６０分のリニアグラジエント溶出を行った。そのときのクロマトグラムを図２に示す。
（３）図２に示したフラクションを回収し、硫酸アンモニウムを６０％飽和となるよう添加し、４℃で０．５時間放置、その後４℃、８０００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により、沈殿画分として硫安塩析物を得た。その後、透析により２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μＭ  ＺｎＣｌ２）で平衡化させた。
（４）その後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−５ＰＷ（２５ｍｍ×１５０ｍｍ、東ソー株式会社）に供給した後、塩化ナトリウム濃度を０Ｍから０．２５Ｍまでの６０分のリニアグラジエント溶出を行なった。１分ごとにフラクションを試験管に分取し、各溶出フラクションにつき２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）とＰＮＰＰ法による活性（Ａ４０５）を測定した。Ａ４０５の測定は各フラクションを４０００倍に希釈したものを用いて、実施例６に記載の方法で行った。結果を図３に示す。この結果得られた比活性（Ａ４０５／Ａ２８０）の高いフラクションに、高純度のＡＬＰが含まれる。前記比活性の高い、フラクションＮｏ．２１〜２６を回収し、硫酸アンモニウムを６０％飽和となるよう添加し、４℃で０．５時間放置、その後４℃、８０００ｒｐｍ、２０分の遠心分離により、沈殿画分として硫安塩析物を得た。その後、透析により２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μＭ  ＺｎＣｌ２）で平衡化させた。
［実施例１０］精製した変異体の純度と比活性の確認
精製したＡＬＰの純度を確認するために、ゲルろ過カラム（Ｇ３０００ｓｗｘｌ  東ソー株式会社）を用いて純度を確認した。ゲルろ過のコントロールとして、市販の高活性ウシ小腸ＡＬＰ（ＡＬＰＩ−１３Ｇ  Ｌｏｔ  １７０６ＡＡ、Ｂｉｏｚｙｍｅ社）も同時に分析した。この結果から、両者の純度は同等であると見積もれた（図４）。
【００２３】
ＡＬＰの比活性をＰＮＰＰ法にて比較した結果を表２に示す。タンパク質濃度は、１ｍｇ／ｍｌのＡＬＰのＡ２８０の吸光度を０．７６として計算した。
【００２４】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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