(57)【要約】【課題】新規な心不全の予防または治療用医薬、当該医薬による治療が有効な心不全患者を選択する方法、および心不全の予防または治療用薬物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。【解決手段】副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２のアンタゴニストを有効成分として含有する心不全の予防または治療用医薬、被験者の血中副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２のアゴニスト濃度を測定する工程と測定値が基準値より高い被験者を選択する工程を含む上記医薬による治療が有効な被験者を選択する方法、ならびに、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２とそのリガンドの結合を阻害する物質または副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２とそのリガンドの結合によって引き起こされる細胞内シグナル伝達を阻害する物質を選択する工程を含む心不全の予防または治療用薬物のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２のアンタゴニストを有効成分として含有する心不全の予防または治療用医薬。
【請求項２】
心不全が慢性心不全である請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
請求項１または２に記載の医薬による治療が有効な被験者を選択する方法であって、被験者の血中副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２のアゴニスト濃度を測定する工程と、測定値が基準値より高い被験者を選択する工程を含む方法。
【請求項４】
副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２とそのリガンドの結合を阻害する被験物質、または、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２とそのリガンドの結合によって引き起こされる細胞内シグナル伝達を阻害する被験物質を選択する工程を含む、心不全の予防または治療用薬物のスクリーニング方法。
【請求項５】
心不全の予防または治療用医薬を製造するための副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２のアンタゴニストの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心不全の予防または治療用医薬に関するものである。より詳細には、本発明は、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２のアンタゴニストを有効成分として含有する心不全の予防または治療用医薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
米国の心不全患者数は約600万人（2010年、米国心臓病学会）、日本の心疾患患者数は170万人（平成26年、厚生労働省）であり、心不全患者数は非常に多い。心不全患者は、息苦しさ、動悸などの心不全症状により日常生活が制限され、特に高齢者では心不全症状により外出が困難となり、医療を含めた十分な社会サービスが受けられないことも多い。特に超高齢社会を迎えた日本では、心不全治療の発展は心不全患者の生活の質の向上に繋がることが期待される。
【０００３】
心不全は、心臓が血液を送り出して組織灌流を維持することができないときに生じる予後不良のありふれた心血管疾患である。冠状動脈心疾患や高血圧等の心血管疾患の治療の向上にもかかわらず、心不全の予後は依然として不良である。いくつかのメカニズムが、弁疾患、心筋症または心筋梗塞後の心不全の発症に寄与している。ほとんどの場合、心臓リモデリングは、環境要求、および心肥大を誘発するホルモン活性化や高血圧などの様々な刺激に応答して起こる。肥大成長は、心室壁のストレスを軽減するための主要なメカニズムである。しかし、心臓は長期のストレスで代償不能になり、心不全を引き起こす。
【０００４】
全ての細胞は、細胞外刺激に応答する膜貫通シグナル伝達系を有する。Gタンパク質共役受容体（G protein-coupled receptors: GPCRs）は、細胞表面受容体の最大のスーパーファミリーであり、多数の生理学的および病理学的プロセスに関与している。GPCR媒介シグナル伝達は、代謝性疾患、免疫学的疾患および神経変性疾患、ならびに癌および感染症を含む様々な疾患に関与する。従って、GPCRsは魅力的な薬物標的であると考えられている。
【０００５】
心臓では、GPCRsは、カテコールアミンやアンジオテンシンIIなどの細胞外刺激に応答して心機能を調節し、心機能不全および線維症に関与する。GPCR阻害剤は心不全患者の治療に広く使用されている（非特許文献１、２）。心臓はいくつかのGPCRsを発現するが、βアドレナリン受容体阻害薬とアンジオテンシンII受容体阻害薬のみが慢性心不全患者の長期治療として臨床的に使用されている。これらの利用可能な治療法があるにもかかわらず、死亡率および入院率は10年以上比較的高く維持されており、さらに未知の因子が病態生理に関与している可能性が示唆されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kang, M., K.Y. Chung, and J.W. Walker. 2007. G-protein coupled receptor signaling in myocardium: not for the faint of heart. Physiology (Bethesda). 22:174-184. http://dx.doi.org/10.1152/physiol.00051.2006
【非特許文献２】Capote, L.A., R. Mendez Perez, and A. Lymperopoulos. 2015. GPCR signaling and cardiac function. Eur. J. Pharmacol. 763(Pt B):143-148. http://dx.doi.org/10.1016/j.ejphar.2015.05.019
【非特許文献３】Tamargo, J., and J. Lopez-Sendon. 2011. Novel therapeutic targets for the treatment of heart failure. Nat. Rev. Drug Discov. 10:536-555. http://dx.doi.org/10.1038/nrd3431
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
慢性心不全の治療は１９８０年代以降顕著な進歩がなく、既存薬を用いても心不全患者数は全世界で増加し続けている。そこで、本発明は、新規な心不全の予防または治療用医薬、および当該医薬による治療が有効な心不全患者を選択する方法を提供することを課題とする。また、本発明は、心不全の予防または治療用薬物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２のアンタゴニストを有効成分として含有する心不全の予防または治療用医薬。
［２］心不全が慢性心不全である前記［１］に記載の医薬。
［３］前記［１］または［２］に記載の医薬による治療が有効な被験者を選択する方法であって、被験者の血中副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２のアゴニスト濃度を測定する工程と、測定値が基準値より高い被験者を選択する工程を含む方法。
［４］副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２とそのリガンドの結合を阻害する被験物質、または、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２とそのリガンドの結合によって引き起こされる細胞内シグナル伝達を阻害する被験物質を選択する工程を含む、心不全の予防または治療用薬物のスクリーニング方法。
［５］心不全の予防または治療用医薬を製造するための副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２のアンタゴニストの使用。
［６］心不全の予防または治療における使用のための副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２のアンタゴニスト。
［７］前記［１］または［２］に記載の医薬の有効量を哺乳動物に投与する工程を含む心不全の予防または治療方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、新規な心不全の予防または治療用医薬、および当該医薬による治療が有効な心不全患者を選択する方法を提供することができる。本発明の方法で選択した患者に対して本発明の医薬を投与することにより、心不全の治療効果を格段に改善することができる。また、本発明のスクリーニング方法により選択される薬物は、心不全の予防または治療用医薬の有効成分として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】横行大動脈縮窄術（TAC; transverse aortic constriction）の2週間後の成体マウス心筋細胞におけるGタンパク質共役受容体（GPCR）遺伝子の発現を定量RT-PCRで分析した結果を示す図である。
【図２】TACまたは偽手術（sham）の2週間後の成体マウス心筋細胞におけるCrhr2、Adrb1およびPtger1の発現を分析した結果を示す図であり、（A）はタンパク質の発現量をウエスタンブロッティングで測定した結果、（B）はmRNAの発現量を定量RT-PCRで測定した結果である。
【図３】TACまたは偽手術（sham）の2週間後の成体マウスの血漿Ucn2濃度を測定した結果を示す図である。
【図４】各種ヒト組織におけるCrhr2の発現をウエスタンブロッティングで検出した結果を示す図である。
【図５】Ucn2（25, 50または100ng/g/day）または生理食塩水を放出する浸透圧ポンプをマウス皮下に埋め込み、4週間後の血漿Ucn2濃度を測定した結果を示す図である。
【図６】Ucn2（100ng/g/day）または生理食塩水（sham）を放出する浸透圧ポンプを皮下に埋め込んだマウスの4週間後の心臓の写真である。
【図７】Ucn2（25, 50または100ng/g/day）または生理食塩水を放出する浸透圧ポンプを皮下に埋め込んだマウスの4週間後の左室重量/脛骨長比を示す図である。
【図８】Ucn2（100ng/g/day）または生理食塩水（sham）を放出する浸透圧ポンプを皮下に埋め込んだマウスの4週間後の左室内径短縮率を示す図である。
【図９】Ucn2（100ng/g/day）または生理食塩水（sham）を放出する浸透圧ポンプを皮下に埋め込んだマウスの4週間後の収縮期血圧を示す図である。
【図１０】Ucn2（100ng/g/day）または生理食塩水（sham）を放出する浸透圧ポンプを皮下に埋め込んだマウスの4週間後の血中脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）濃度を示す図である。
【図１１】心筋細胞特異的Crhr2ノックアウトマウスの心筋細胞におけるCrhr2の発現を、Cre-/tamoxifen-、Cre+/tamoxifen-およびCre-/tamoxifen+の各マウスの心筋細胞におけるCrhr2の発現と比較した結果を示す図である。
【図１２】Ucn2（100ng/g/day）または生理食塩水（sham）を放出する浸透圧ポンプを皮下に埋め込んだ心筋細胞特異的Crhr2ノックアウトマウスおよびコントロールマウス（αMHC-CreERT2+/-Crhr2wt/wt）の4週間後の左室重量/脛骨長比を示す図である。
【図１３】Ucn2（100ng/g/day）または生理食塩水（sham）を放出する浸透圧ポンプを皮下に埋め込んだ心筋細胞特異的Crhr2ノックアウトマウスおよびコントロールマウス（αMHC-CreERT2+/-Crhr2wt/wt）の4週間後の左室内径短縮率を示す図である。
【図１４】TACまたは偽手術（sham）を行った心筋細胞特異的Crhr2ノックアウトマウスおよびコントロールマウス（αMHC-CreERT2+/-Crhr2wt/wt）の術後4週間目の左室重量/脛骨長比を示す図である。
【図１５】TACまたは偽手術（sham）を行った心筋細胞特異的Crhr2ノックアウトマウスおよびコントロールマウス（αMHC-CreERT2+/-Crhr2wt/wt）の術後4週間目の左室の線維化を観察した結果を示す図であり、（A）はピクロシリウスレッド染色標本の観察像、（B）は線維化領域を定量した結果である。
【図１６】TACを行った心筋細胞特異的Crhr2ノックアウトマウスおよび野生型マウスの左室内径短縮率の経時変化を示す図である。
【図１７】TACを行った心筋細胞特異的Crhr2ノックアウトマウスおよび野生型マウスの左室拡張末期径の経時変化を示す図である。
【図１８】TACを行った心筋細胞特異的Crhr2ノックアウトマウスおよび野生型マウスの生存率を示す図である。
【図１９】圧負荷誘発心不全に対するCrhr2アンタゴニストの効果を確認するための実験計画を示す図である。
【図２０】TAC1週間後にCrhr2アンタゴニスト（100ng/g/day）を放出する浸透圧ポンプを皮下に埋め込んだマウスの収縮期血圧の経時変化を示す図である。
【図２１】TACまたは偽手術の1週間後にCrhr2アンタゴニスト（100ng/g/day）を放出する浸透圧ポンプを皮下に埋め込んだマウス（TAC-Crhr2 antagonist、sham -Crhr2 antagonist）、および、TACまたは偽手術の1週間後に生理食塩水を放出する浸透圧ポンプを皮下に埋め込んだマウス（TAC-control、sham-control）の左室内径短縮率の経時変化を示す図である。
【図２２】図21と同じ４種類のマウスの術後35日目の血中脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）濃度を示す図である。
【図２３】図21と同じ４種類のマウスの術後35日目の左室重量/脛骨長比を示す図である。
【図２４】図21と同じ４種類のマウスの術後35日目の線維化領域を定量した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者らは、Gタンパク質共役受容体（GPCR）の1種である副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体２（corticotropin releasing hormone receptor 2、以下「Crhr2」と記す）が心不全モデルマウスの心臓に高発現すること、Crhr2欠損心不全モデルマウスでは心不全の発症が抑制されることを見出した。さらに、心不全モデルマウスにCrhr2アンタゴニストを投与すると、心不全が有意に改善することを見出した。また、健常者と心不全患者の血中Crhr2アゴニスト（ウロコルチン2）濃度を測定したところ、心不全患者では血中Crhr2アゴニスト濃度が上昇していることが明らかになった。
特表2012-508014には、Crhr2ペプチド作動薬（アゴニスト）の投与が心不全や糖尿病等の治療に有効であることが開示されている。本発明はCrhr2アンタゴニストが心不全の予防または治療に有効であることを見出したものであり、特表2012-508014に開示された発明と全く逆の、予想外の発明である。
【００１２】
〔心不全の予防または治療用医薬〕
本発明は、Crhr2アンタゴニストを有効成分として含有する心不全の予防または治療用医薬を提供する。心不全は心臓のポンプ機能の障害により、体組織の代謝に見合う十分な血液を供給できない状態であり、時間経過より急性心不全、慢性心不全に分類される。本発明の医薬は、慢性心不全および急性心不全のどちらの治療にも使用できるが、慢性心不全の治療に使用することが好ましい。
【００１３】
Crhr2アンタゴニストは、Crhr2にリガンドが結合することによって引き起こされる細胞内シグナル伝達を阻害する化合物を意味する。そのような化合物は天然に存在する化合物であってもよいし、人工的に合成された化合物であってもよい。また、低分子化合物であってもよいし、タンパク質のような高分子化合物であってもよい。
【００１４】
Crhr2アンタゴニストとして、Crhr2とそのリガンドの結合を阻害する化合物を好適に用いることができる。具体的には、Crhr2と特異的に結合する抗体またはペプチド、Crhr2のリガンドと特異的に結合する抗体またはペプチドなどが挙げられる。Crhr2のリガンドとしては、例えばウロコルチン2（以下「Ucn2」と記す）が挙げられる。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Fab、F(Ab')2、Fab'、Fv、scFv等）でもよい。抗体はヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体が好ましい。Crhr2にリガンドが結合することによって引き起こされる細胞内シグナル伝達を阻害する抗体の好ましい態様としては、Crhr2に結合することによって細胞内シグナル伝達を阻害する抗体（抗Crhr2中和抗体）、またはUcn2に結合することによって細胞内シグナル伝達を阻害する抗体（抗Ucn2中和抗体）を挙げることができる。
【００１５】
Crhr2またはUcn2と特異的に結合する抗体は、Crhr2もしくはそのフラグメント、または、Ucn2もしくはそのフラグメントを抗原として公知の方法により製造することができる。ヒトを含む主要な哺乳動物のCrhr2およびUcn2をコードする核酸配列情報およびアミノ酸配列情報は公知のデータベース（DDBJ/GenBank/EMBL等）から取得することができ、これらの遺伝情報および公知の遺伝子組み換え技術を用いて製造した組み換えCrhr2または組み換えUcn2を抗原として用いることができる。Crhr2と特異的に結合するペプチドは、公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Fmoc法、Boc法）または液相合成法により製造することができる。
【００１６】
本発明には、Crhr2アンタゴニストとして、Crhr2にリガンドが結合することによって引き起こされる細胞内シグナル伝達を抑制または遮断する低分子化合物を好適に用いることができる。このような低分子化合物としては、Crhr2と相互作用してリガンドのCrhr2への結合を阻害する低分子化合物、例えば、(9aR,13aR)-N-(2-アミノエチル)-15-オキソ-9a,10,11,12,13,13a,14,15-オクタヒドロ-9H-ベンゾ[7,8]キナゾリノ[5,4-ab]フェナジン-8-カルボキサミド（BMCL, 765-770, 1999）などのWO9808821に開示される化合物、トランス-5-クロロ-N-[4-(3-エチル-2-オキソ-2,3-ジヒドロベンゾイミダゾール-1-イルメチル)-シクロヘキシル]-2-メチル-ニコチンアミドなどのWO2011092293に開示される化合物、トランス-2-クロロ-N-(4-{[4-(2-クロロ-4-メトキシ-フェニル)-5-メチル-1H-ピラゾール-3-イルアミノ]-メチル}-シクロヘキシル)-5-トリフルオロメチル-ベンズアミドなどのWO2011095450に開示される化合物、4-(4,5-ジフェニル-1H-イミダゾール-2-イル)-N,N-ジメチルアニリンなどの特開平11-180958に開示される化合物などが挙げられる。また、本発明には、従来、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体（Crhr）アンタゴニストの低分子化合物として報告のある低分子化合物、例えば、WO9413643、WO9413644、WO9413661、WO9413676、WO9413677、WO9533727、WO9533750、WO9534563、EP691128、EP576350、EP659747、WO9510506、WO9639400、WO9635689、WO9808846、WO02088095、WO03008412、US5063245等に開示される化合物も用い得る。その他、本発明の技術思想には、将来開示されるCrhr2アンタゴニストも含まれ、これらも好適に用いることができる。
【００１７】
本発明の医薬は、Crhr2アンタゴニストを有効成分とし、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、経口投与のための製剤としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。これらの製剤は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。非経口投与のための製剤としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記有効成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製される。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート80、HCO-50等）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記有効成分を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
【００１８】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
【００１９】
本発明の医薬には、有効成分を0.001〜50質量％、好ましくは0.01〜10質量％、更に好ましくは0.1〜1質量％含有することができる。本発明の医薬の投与量は、目的、疾患の種類、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、有効成分の種類などを考慮して、適宜設定される。約65〜70kgの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、１日当たり0.02mg〜4000mg程度が好ましく、0.1mg〜200mg程度がより好ましい。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
【００２０】
〔本発明の医薬による治療が有効な被験者を選択する方法〕
本発明は、上記本発明の医薬による治療が有効な被験者を選択する方法を提供する。本発明の選択方法は、被験者の血中Crhr2アゴニスト濃度を測定する工程と、測定値が基準値より高い被験者を選択する工程を含むものであればよい。被験者は、既に心不全の診断を受けている者に限定されず、心不全の疑いがある者であってもよい。心不全の疑いがある者としては、息切れやむくみの自覚症状がある者が挙げられる。
【００２１】
Crhr2アゴニストとしてはUcn2、ウロコルチン1（Ucn1）、ウロコルチン3（Ucn3）、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（Crh）、サウバジン（Sauvagine）、類縁ペプチドを含めたCrhペプチドファミリーなどが挙げられる。より好ましくは、Ucn2である。
Crhr2アゴニストがUcn2である場合、例えば、被験者の血液から分離した血漿を試料として、ELISA等の免疫学的手法を用いて血中濃度を測定することができる。
【００２２】
基準値には、同時に測定した健常者試料におけるUcn2の血中濃度を用いることができる。また、健常者試料におけるUcn2の血中濃度の蓄積された測定値（健常者蓄積データ）に基づいて任意の基準値を設定してもよい。好ましくは、健常者蓄積データに基づいて設定された基準値を用いることである。健常者は、慢性疾患に罹患していない成人が好ましく性別は問わない。高齢でないことがより好ましい。
【００２３】
被験者のUcn2血中濃度の測定値が基準値より高い場合に、当該被験者は本発明の医薬による治療が有効な被験者であると判定することができる。例えば、測定値が基準値より２倍以上高い場合に本発明の医薬による治療が有効な被験者であると判定してもよく、測定値が基準値より３倍以上高い場合に本発明の医薬による治療が有効な被験者であると判定してもよい。基準値より測定値が高いほど、本発明の医薬による高い治療効果が期待できる。
【００２４】
〔スクリーニング方法〕
本発明は、心不全の予防または治療用薬物のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、Crhr2とそのリガンドの結合を阻害する被験物質、または、Crhr2とそのリガンドの結合によって引き起こされる細胞内シグナル伝達を阻害する被験物質を選択する工程を含むものであればよい。本発明のスクリーニング方法により選択された被験物質は、心不全の予防または治療用医薬の有効成分として有用な薬物である。
【００２５】
本発明のスクリーニング方法を適用する被験物質は特に限定されないが、例えば、核酸、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等が挙げられる。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。これら被験物質は塩を形成していてもよく、被験物質の塩としては生理学的に許容される酸や塩基との塩が用いられる。
【００２６】
Crhr2とそのリガンドの結合を阻害する物質を選択する場合、例えば、被験物質とCrhr2とそのリガンドを接触させる工程と、Crhr2とそのリガンドの結合を確認する工程と、Crhr2とそのリガンドの結合を阻害する被験物質を選択する工程を含むスクリーニング方法を用いることができる。Crhr2のリガンドとしてはUcn2を用いることができる。Crhr2およびUcn2は、天然タンパク質および組み換えタンパク質のいずれでもよい。また、Crhr2発現細胞を用いてもよい。
【００２７】
被験物質とCrhr2とUcn2を接触させる方法は特に限定されない。例えば、Crhr2とUcn2を含む反応系を準備し、ここに被験物質を添加する方法が挙げられる。接触時間、接触温度は特に限定されず、適宜選択すればよい。Crhr2とUcn2の結合を確認する方法は特に限定されず、Crhr2とUcn2の結合レベルを確認できる公知の方法を適宜選択して使用することができる。例えば、ELISA法、蛍光偏光法、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴などを好適に用いることができる。ELISA法を用いる場合、Crhr2およびUcn2のいずれか一方を固相化し、そこに他方および被験物質を添加して反応させ、Crhr2とUcn2の結合レベルを適当な一次抗体および二次抗体を用いて検出すればよい。
【００２８】
被験物質を接触させない対照群におけるCrhr2とUcn2の結合レベルと比較して、被験物質を接触させた場合にCrhr2とUcn2の結合レベルが低下していれば、当該被験物質を目的物質として選択することができる。被験物質がCrhr2とUcn2の結合レベルを低下させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない場合の両者の結合レベルと比較して、結合レベルを50％以下に低下させる被験物質であってもよく、25％以下に低下させる被験物質であってもよい。
【００２９】
Crhr2とそのリガンドの結合によって引き起こされる細胞内シグナル伝達を阻害する物質を選択する場合、例えば、Crhr2発現細胞とそのリガンドを含む培養系に被験物質を添加する工程と、Crhr2の下流のシグナル伝達状態を確認する工程と、Crhr2とそのリガンドの結合によって引き起こされる細胞内シグナル伝達を阻害する物質を選択する工程を含むスクリーニング方法を用いることができる。Crhr2のリガンドとしてはUcn2を用いることができる。
【００３０】
Crhr2発現細胞は、内因性のCrhr2を発現する細胞でもよく、組み換えCrhr2を発現する細胞でもよい。例えば、Crhr2発現ベクターと、cAMP応答配列（CRE: cAMP-responsive element）の下流にレポーター遺伝子連結したベクターを共導入したHEK293細胞を用いることができる。このようなレポーター遺伝子を導入したCrhr2発現細胞を用いる場合、Crhr2の下流のシグナル伝達状態は、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することにより確認することができる。レポーター遺伝子は、一般に用いられているものであれば特に限定されず、例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）等をコードする遺伝子が挙げられる。
【００３１】
被験物質を接触させない対照群におけるレポーター遺伝子の発現レベルと比較して、被験物質を接触させた場合の発現レベルが低下していれば、当該被験物質を目的物質として選択することができる。被験物質がレポーター遺伝子の発現レベルを低下させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない場合の発現レベルと比較して、発現レベルを50％以下に低下させる被験物質であってもよく、25％以下に低下させる被験物質であってもよい。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３３】
＜材料と方法＞
（１）材料
抗Crhr2抗体（sc-20550）、抗β-アクチン抗体（sc-47778）、抗Adrb1抗体（sc-568）、抗Ptger1抗体（sc-22648）は、Santa Cruz Biotechnology社から入手した。ヒト組織サンプルはBioChain社から入手した。
【００３４】
（２）ウエスタンブロッティング
プロテアーゼ阻害剤混合物とホスファターゼ阻害剤混合物（Roche）を含有するRIPAバッファー（Wako）で細胞および組織サンプルを溶解した。BCA protein assay（Thermo Fisher Scientific）を用いてタンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質をSDS-PAGEで分離し、PVDF膜上に転写した。シグナル検出には、ECLまたはECL Plusウエスタンブロッティング検出キット（GE Healthcare）を用いた。
【００３５】
（３）成体マウス心室心筋細胞の単離
心筋細胞をWolskaおよびSolaro（1996, Am. J. Physiol. 271:H1250-H1255）に記載されているように単離した。手順としては、まず、マウスをヘパリン処理し（5,000IU/kg）、ペントバルビタールナトリウム50mg/kgで麻酔した。心臓を迅速に取り出し、尖っていない24ゲージの針を用いて大動脈からカニューレ挿入し、次いで、冠状動脈の逆行性灌流のための灌流装置に接続し、灌流バッファー（135 mM NaCl, 4.0mM KCl, 0.33mM NaH2PO4, 1.0mM MgCl2, 10mM Hepes, 5mM taurine, 10mM 2,3-butanedione monoxime, and 10mM glucose, pH 7.4）で3分間（5ml/分）潅流した。次に、灌流バッファーに0.4mg/mlコラゲナーゼD（Roche）、0.5mg/mlコラゲナーゼB（Roche）および0.06mg/mlプロテアーゼXIV（Sigma-Aldrich）を添加した酵素バッファーで10分間潅流した。潅流装置から心臓を取り出した後、心房を除去し、心室を切断して鉗子で優しく小片に分離し、5％BSAを含む灌流バッファー中で数回ピペッティングした。2.0mMのL-グルタミン、10mMの2,3-ブタンジオンモノオキシム、10μg/mlのインスリン、5.5μg/mlのトランスフェリン、5.0ng/mlのセレンおよび0.1％のBSAを含むMEM（Thermo Fisher Scientific）に細胞を播いた。1時間経過後に培地を除去し、接着細胞をBSA不含培地に再懸濁し、通常1〜2時間以内に使用した。
【００３６】
（４）mRNA発現解析
GPCRの発現を解析するために、成体マウス心筋細胞からRNAを抽出した。RNAの抽出にはRNeasy Miniキット（QIAGEN）を用い、製造者のプロトコールに従って行った。逆転写には、Quanti Tect Reverse Transcriptionキット（QIAGEN）を用いた。定量は、LightCycler 480 Probe Master System（Roche）および各GPCRに特異的なプライマーセットを用いて行った。マウスの尾から得られたゲノムDNAを、RNA 1ngあたりの遺伝子コピー数を計算するためのユニバーサルスタンダードとして使用した（Yun et al., 2006, Nucleic Acids Res. 34:e85）。
【００３７】
（５）タモキシフェン誘導性心筋細胞特異的Crhr2ノックアウトマウス（cmc-Crhr2-KO）
C57BL/6背景のCrhr2tm1a(KOMP)Wtsiマウスは、カリフォルニア大学デイビス校および子供病院オークランド研究所のノックアウトマウスプログラム（KOMP）によって作製された。Crhr2tm1a(KOMP)WtsiマウスとFlp組み換え酵素を発現するマウスを交配させて、Crhr2コンディショナルノックアウトマウス（Crhr2flox/floxマウス）を得た。Crhr2flox/floxマウスを、野生型C57BL/6の遺伝的背景マウスに少なくとも10回バッククロスした。Crhr2flox/floxマウスにαMHC-CreERT2系統を交配させることにより、タモキシフェン誘導性の心筋細胞特異的Crhr2ノックアウトマウス（cmc-Crhr2-KOs）を作製した（Takefuji et al., 2012, Circulation. 126:1972-1982）。100μlのMiglyolに溶解した1mgのタモキシフェンを5日間連続して腹腔内注射することにより、floxedアレルのCre媒介組み換えを誘導した。溶媒処理マウスにはMiglyolのみを与え、αMHC-CreERT2+/-Crhr2wt/wtマウスをコントロールとして用いた。誘導終了2週間後に実験を行った。
【００３８】
（６）外科的介入：浸透圧ミニポンプおよび横行大動脈縮窄術（TAC; transverse aortic constriction）
8〜10週齢の雄性マウスを50mg/kgのペントバルビタールナトリウムで麻酔し、Ucn2（25, 50, 100ng/g/day, ペプチド研究所）またはアンチサウバジン-30（100ng/g/day, Medical & Biological Laboratories）を含む浸透圧ミニポンプ（Alzet）を、背部皮下に4週間埋め込んだ。
TACは麻酔および挿管下で行った。大動脈弓が見えるように開胸した。次いで、横行大動脈を、右腕頭動脈と左総頸動脈との間で、7-0 縫合糸を用いて尖っていない24ゲージの針に寄せて結紮した。偽手術は大動脈を結紮しないこと以外同じように行った。
【００３９】
50mg/kgのペントバルビタールナトリウムで麻酔したマウスに経胸壁心エコー検査を行った。左室収縮末期径および左室拡張末期径を測定して、15MHzプローブを備えたAcuson Sequoia C-512（Siemens）を用いて、Mモードにおける左室内径短縮率％（％FS）を計算した。収縮期血圧（SBP）は、マウスを拘束しながら自動血圧計（BP98A; Saffron）を用いてテールカフ法により測定した。
マウス血漿Ucn2およびBNPは、Ucn2 ELISAキット（矢内原）およびBNPエンザイムイムノアッセイキット（RayBiotech Inc.）をそれぞれ用いて、製造者の説明書に従って定量した。
【００４０】
（７）組織学的分析
組織サンプルはOCTコンパウンド（サクラファインテック）で包埋し、液体窒素で急速凍結した。左室心筋切片（6μmスライス）を、標準プロトコールでピクロシリウスレッド染色し、BX51顕微鏡（Olympus）で観察した。20個の無作為な画像における心筋線維化をImageJソフトウェアで定量化した。
【００４１】
（８）ヒト被験者の臨床データ
2006年8月から2011年11月まで名古屋大学病院で非虚血性拡張型心筋症（NIDCM; nonischemic dilated cardiomyopathy）と診断された患者の血液サンプルを採取した。すべての患者は病気が安定しており、実験室分析、心エコー検査および心臓カテーテル検査による詳細な心臓検査のために入院した。NIDCMは、既知の全身状態によって引き起こされる冠状動脈性心疾患、心臓弁膜症または二次心筋疾患が存在しない状態において、左室造影で50％未満の左室駆出率（LVEF）および拡張左室腔（心エコー検査により決定される左室拡張末期径が、> 55mm）として定義され、心筋内生検によって判断される。52人のうち36人（69.2％）がアンジオテンシン変換酵素阻害薬またはアルドステロン受容体拮抗薬を服用し、30人（57.7％）がβ遮断薬を服用し、21人（40.4％）がミネラルコルチコイド受容体拮抗薬を服用した。朝、仰向けで20分間安静にした絶食患者の肘正中静脈から血液サンプルを採取した。代謝性疾患、心血管疾患、または癌性疾患の病歴のない、地域密着型のコホート研究の年齢および性別が一致した健康な参加者からコントロール血液サンプルを採取した。BMIはBMI=体重(kg)/身長(m)2の式で計算した。収縮期血圧（SBP）および拡張期血圧（DBP）は、適切なカフサイズで各被験者の右腕に配置して、血圧計で測定した。血漿総コレステロール、クレアチニンおよびグルコースレベルを、酵素的方法によって測定した。BNPレベル（RayBiotech Inc.）およびUcn2レベル（USCN Life Science）をELISAによって測定した。
【００４２】
（９）研究の承認
臨床試験プロトコールは、名古屋大学医学部倫理審査委員会および自治医科大学の承認を受けた。すべての試験対象からインフォームドコンセントを得た。この研究における動物の世話および動物の使用のすべての手順は、名古屋大学医学部の動物倫理審査委員会によって承認された。
【００４３】
（１０）統計解析
データは、動物実験では平均±SEM、およびヒト被験者では平均±SD、中央値（四分位範囲）または対象数（％）として示される。動物実験の全ての統計的分析は、GraphPad Prism 6で行った。2つのグループ間の比較は、対応のないスチューデントt検定またはカイ二乗検定を用いて行い、2つ以上のグループ間の検定は、ボンフェローニ事後検定を伴う分散分析を用いて行った。生存曲線をKaplan Meyer推定およびLog-rank（Mantel-Cox）試験で分析した。異なる時点での2つ以上の群間の比較は、二元配置分散分析、続いてボンフェローニ事後検定によって行った。Ucn2はヒトの研究で歪んだ分布を示していたため、分析の前に変数を対数変換し、パラメータ調整を伴う一般的な線形モデルを使用して差を評価した。有意性はP<0.05として定義された（*, P<0.05; **, P<0.01; ns, 有意差なし）。
【００４４】
＜結果＞
（１）継続的Crhr2活性化はマウスにおいて心不全を引き起こす
心筋細胞で発現され、心不全に関連するGPCRsを同定するために、系統的探索を行った。このために、我々は、偽手術または横行大動脈縮窄術（TAC）の2週間後の成体マウス心筋細胞における475種類のGPCRsの遺伝子コピー数を決定するために、非バイアス定量RT-PCR（qRT-PCR）分析を行った。データは、成体マウス心筋細胞が約80個のGPCRsを発現すること（RNA 1ngあたり5コピー以上）を明らかにし、Crhr2、Adrb1、Ptger1およびGpr157が最も大量であった（図1）。Crhr2発現は、TAC後2週目の左室における遺伝子およびタンパク質レベルで顕著に増加したが、Adrb1の発現は減少し、Ptger1の発現は変化がなかった（図2(A)および(B)）。さらに、TACは血液中のUcn2レベルを有意に増加させた（図3）。各種ヒト組織のウエスタンブロット分析は、Crhr2がもっぱら心臓で発現され、他の組織では検出されないことを示した（図4）。まとめると、これらの結果は、Crhr2が心筋細胞において高発現し、圧負荷誘発心不全後に増加することを示す。
【００４５】
Ucn2の急性静脈内注射は心収縮を加速することが示されているが（Coste et al., 2000, Nat. Genet. 24:403-409）、血漿Ucn2レベルの慢性的増加が心機能に影響するかどうかは不明であった。インビボでの長期Ucn2アップレギュレーションの効果を調べるために、我々はUcn2を放出する浸透圧ポンプをマウス皮下に埋め込んだ。持続的Ucn2注入4週間後の血液分析により、血中Ucn2レベルがTAC後に観察されたレベルと同様に上昇したことが明らかになった（図5）。さらに、動物は、左室重量/脛骨長比が用量依存的に増加して心肥大を示した（図6、7）。これは、収縮期血圧に有意な影響を与えることなく（図9）左室内径短縮率の低下を伴った（図8）。さらに、持続的Ucn2注入は、圧負荷および容量負荷に応答して心筋細胞によって分泌される脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）の血中濃度を有意に増加させた（図10）。まとめると、これらの結果は、血漿Ucn2の慢性的増加が心臓機能を損なうことを示す。
【００４６】
（２）心不全患者における血漿Ucn2レベルの上昇
これらの知見に基づいて、我々は260名の健常被験者（血漿BNP<5.8 pg/ml）および52名の非虚血性拡張型心筋症患者（血漿BNP=246.8±362 pg/ml）における血漿Ucn2レベルを測定した。患者集団の臨床情報を表1に示す。両方のグループが類似したボディ・マス・インデックス（BMI）、血漿総コレステロールおよび血漿グルコースレベルを示したが、非虚血性拡張型心筋症患者は有意に低い収縮期血圧および拡張期血圧、ならびに有意に高いクレアチニンレベルを示した。注目すべきは、非虚血性拡張型心筋症患者は、健常対照より有意に高いUcn2レベル（中央値7.5倍）を示し、測定されたすべてのパラメータの調整後において有意なままであった（P<0.01）。したがって、これらのデータは、増加した血漿Ucn2がヒトにおける心不全と強く関連していることを示し、Ucn2測定が慢性心不全の新規診断マーカーとなりうることを示唆している。
【００４７】
【表１】
2019094333.tif 000002
【００４８】
（３）Crhr2欠損マウスにおける心臓肥大、線維化および心不全の軽減
インビボでの心筋細胞におけるCrhr2の機能的意義を調べるために、我々は、αMHC-CreERT2マウスとCrhr2flox/floxマウスを交配することによりタモキシフェン誘導性心筋細胞特異的Crhr2欠損マウス（cmc-Crhr2-KO）を作製した。ウエスタンブロッティングによりタモキシフェン誘導性組み換えの効率を分析したところ、タモキシフェン処理した心筋細胞特異的Crhr2ノックアウトマウスから単離した心筋細胞においてCrhr2が検出されないことが示された（図11）。cmc-Crhr2 KOマウスにおけるタモキシフェン処理前後の左室重量/脛骨長比または心機能に差異は観察されなかった（図12、13）。特に、cmc-Crhr2 KOマウスは、Ucn2誘導肥大応答を示さなかった（図12）。さらに、4週間の持続的Ucn2注入はコントロールマウスの左室内径短縮率を減少させたが、cmc-Crhr2-KOマウスでは左室内径短縮率の減少を有意に抑制した（図13）。これらの結果は、持続的Ucn2注入がCrhr2を介して心筋細胞に直接影響を及ぼすことを示す。
【００４９】
心筋細胞特異的Crhr2欠損が圧負荷誘発心不全からマウスを守るかどうかを調べるために、我々はcmc-Crhr2 KOマウスにTAC手術を行った。コントロールマウスでは、左室重量/脛骨長比の事後解析によってわかるように、TACは有意な心肥大をもたらしたが、心筋細胞特異的Crhr2ノックアウトマウスは左室重量/脛骨長比が有意に低かった（図14）。また、ピクロシリウスレッド染色によってわかるように、心筋細胞特異的Crhr2ノックアウトマウスはTAC4週間後の線維化が有意に少なかった（図15(A)、(B)）。さらに、心筋細胞特異的Crhr2ノックアウトマウスは、TAC後4、12および24週目の心エコー検査でわかるように、左室内径短縮率のさらなる悪化に耐性であった（図16）。心室拡張は、術後12週目に野生型マウスで観察されたが、心筋細胞特異的Crhr2ノックアウトマウスでは観察されなかった（図17）。Crhr2欠損は、術後8か月目の死亡率を有意に改善した（図18）。まとめると、これらの結果は、心筋細胞特異的Crhr2欠損マウスは圧負荷誘発心不全に耐性であることを実証する。
【００５０】
（４）圧負荷誘発心不全に対するCrhr2アンタゴニストの効果
我々は、次に、Crhr2アンタゴニストであるアンチサウバジン-30（Ruhmann et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:15264-15269）による治療が、マウスの確立した心肥大の進行を軽減するか否かを調べた。このために、TAC手術の1週間後に持続的アンチサウバジン-30注入を開始した（図19）。興味深いことに、Crhr2アンタゴニスト治療は、収縮期血圧に有意な影響を及ぼさずに心拍出量のさらなる悪化からマウスを保護した（図20、21）。これらの保護効果は、血漿BNP、心肥大および心臓線維化の強力な減少を伴った（図22、23、24）。アンチサウバジン-30に代えてUcn2を、TAC手術の1週間後から4週間持続注入すると、TAC誘導性の心機能障害が加速された。これらの結果は、Crhr2の遮断が慢性心不全を治療するための新規治療アプローチとなりうることを示唆している。
【００５１】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
2019094333.tif 000003
【図２】
2019094333.tif 000004
【図３】
2019094333.tif 000005
【図４】
2019094333.tif 000006
【図５】
2019094333.tif 000007
【図６】
2019094333.tif 000008
【図７】
2019094333.tif 000009
【図８】
2019094333.tif 000010
【図９】
2019094333.tif 000011
【図１０】
2019094333.tif 000012
【図１１】
2019094333.tif 000013
【図１２】
2019094333.tif 000014
【図１３】
2019094333.tif 000015
【図１４】
2019094333.tif 000016
【図１５】
2019094333.tif 000017
【図１６】
2019094333.tif 000018
【図１７】
2019094333.tif 000019
【図１８】
2019094333.tif 000020
【図１９】
2019094333.tif 000021
【図２０】
2019094333.tif 000022
【図２１】
2019094333.tif 000023
【図２２】
2019094333.tif 000024
【図２３】
2019094333.tif 000025
【図２４】
2019094333.tif 000026