(57)【要約】【課題】未だ確立されていない、壊死した心臓組織領域を長期的かつ抜本的に治癒し、心臓の機能性を回復させる有用な手法を提供することを課題とする。【解決手段】線維芽細胞を含む、心臓疾患を治療するための注射用組成物であって、該線維芽細胞はＣＤ１０６ポジティブ線維芽細胞を含む、好ましくはＣＤ９０ポジティブ線維芽細胞を含む注射用組成物により課題を解決する。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞を含む、心臓疾患を治療するための注射用組成物であって、該線維芽細胞はＣＤ１０６ポジティブ線維芽細胞を含む、注射用組成物。
【請求項２】
前記線維芽細胞はＣＤ９０ポジティブ線維芽細胞を含む、請求項１に記載の注射用組成物。
【請求項３】
前記線維芽細胞はＣｏｎｎｅｘｉｎ４３ポジティブ線維芽細胞を含む、請求項１又は２に記載の注射用組成物。
【請求項４】
前記注射用組成物に含まれる線維芽細胞全量に対し、ＣＤ１０６ポジティブ線維芽細胞の割合（細胞数基準）が０．０３％以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の注射用組成物。
【請求項５】
線維芽細胞を準備するステップ、及び
該線維芽細胞からＣＤ１０６ポジティブ線維芽細胞をスクリーニングするステップ、を含む、治療用線維芽細胞の製造方法。
【請求項６】
前記治療用線維芽細胞が心臓疾患の治療に用いられる、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
更に、線維芽細胞からＣＤ９０ポジティブ線維芽細胞をスクリーニングするステップ、を含む、請求項５又は６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記治療用線維芽細胞が、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３ポジティブ線維芽細胞を含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記治療用線維芽細胞の細胞全量に対し、ＣＤ１０６ポジティブ線維芽細胞の割合（細胞数基準）が０．０３％以上である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の製造方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維芽細胞を含む心臓疾患を治療するための注射用組成物に関し、更に詳細には、特定のタンパク質を発現した線維芽細胞を含む心臓疾患を治療するための注射用組成物に関する。また、注射用組成物に使用し得る治療用線維芽細胞を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞や心筋症に伴う心不全の生命予後は極めて不良であり、現在のところ根本的な治療方法は心臓移植のみである。しかしながら現状は、日本のみならず世界的に深刻なドナー不足であり、患者は十分な治療法を受けることができない問題がある。そこで近年、再生医療による心疾患治療に注目が集まっており、技術開発が行われている。
【０００３】
例えば、特許文献１等には細胞シートが開示されており、自己骨格筋芽細胞への展開が検討されている。また、特許文献２等には人工多能性幹細胞を用いた心筋シートによる心疾患の治療が検討されている。
しかしながらこれらの検討はあるものの、未だ長期にわたって有意に失われた心機能を回復させる手法は報告されておらず、壊死した心臓組織領域を長期的かつ抜本的に治癒し、心機能を回復させる手法の確立が求められている。
【０００４】
このような状況下、本発明者らはＶａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＶＣＡＭ−１、ＣＤ１０６）ポジティブである線維芽細胞を用いて、機能的な心臓細胞シートが得られることを見出している（特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−０８１８２９号公報
【特許文献２】国際公開第２０１３／１３７４９１号
【特許文献３】国際公開第２０１６／００６２６２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明では、未だ確立されていない、壊死した心臓組織領域を長期的かつ抜本的に治癒し、心機能を回復させる有用な手法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決すべく検討を進め、特定の線維芽細胞を壊死した心臓組織領域に投与（注入）することで、心臓疾患を治療し得ることを見出し、発明を完成させた。本発明は以下の第１の側面（発明Ａ）を含む。
【０００８】
（Ａ１）線維芽細胞を含む、心臓疾患を治療するための注射用組成物であって、該線維芽細胞はＶａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＶＣＡＭ−１、ＣＤ１０６）ポジティブ線維芽細胞を含む、注射用組成物。
（Ａ２）前記線維芽細胞はＴｈｙｍｕｓ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−１（Ｔｈｙ−１, ＣＤ９０）ポジティブ線維芽細胞を含む（Ａ１）に記載の注射用組成物。
（Ａ３）前記線維芽細胞はＣｏｎｎｅｘｉｎ４３（Ｃｘ４３）ポジティブ線維芽細胞を含む（Ａ１）又は（Ａ２）に記載の注射用組成物。
（Ａ４）前記注射用組成物に含まれる線維芽細胞全量に対し、ＣＤ１０６ポジティブ線維芽細胞の割合（細胞数基準）が０．０３％以上である（Ａ１）〜（Ａ３）のいずれかに記載の注射用組成物。
【０００９】
また本発明は以下の第２の側面（発明Ｂ）を含む。
（Ｂ１）線維芽細胞を準備するステップ、及び
該線維芽細胞からＣＤ１０６ポジティブ細胞をスクリーニングするステップ、を含む、治療用線維芽細胞の製造方法。
（Ｂ２）前記治療用線維芽細胞が心臓疾患の治療に用いられる、（Ｂ１）に記載の製造方法。
（Ｂ３）更に、線維芽細胞からＣＤ９０ポジティブ細胞をスクリーニングするステップ、を含む、（Ｂ１）又は（Ｂ２）に記載の製造方法。
（Ｂ４）前記治療用線維芽細胞が、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３ポジティブである線維芽細胞を含む、（Ｂ１）〜（Ｂ３）のいずれかに記載の製造方法。
（Ｂ５）前記治療用線維芽細胞の細胞全量に対し、ＣＤ１０６ポジティブ線維芽細胞の割合（細胞数基準）が０．０３％以上である、（Ｂ１）〜（Ｂ４）のいずれかに記載の製造方法。
【００１０】
また本発明は以下の第３の側面（発明Ｃ）を含む。
（Ｃ１）線維芽細胞を含む注射用組成物を、壊死した心臓組織領域、或いはその周辺に注射、及び／又は冠動脈内に注入することにより心臓疾患を治療する方法であって、該線維芽細胞はＣＤ１０６ポジティブ線維芽細胞を含む、方法。
（Ｃ２）前記線維芽細胞がＣＤ９０ポジティブ線維芽細胞を含む、（Ｃ１）に記載の心臓疾患を治療する方法。
（Ｃ３）前記線維芽細胞がＣｏｎｎｅｘｉｎ４３ポジティブ線維芽細胞を含む、（Ｃ１）に記載の心臓疾患を治療する方法。
（Ｃ４）前記注射用組成物に含まれる線維芽細胞全量に対し、ＣＤ１０６ポジティブ線維芽細胞の割合（細胞数基準）が０．０３％以上である、（Ｃ１）に記載の心臓疾患を治療する方法。
【００１１】
また本発明は以下の第４の側面（発明Ｄ）を含む。
（Ｄ１）線維芽細胞の注射用組成物としての使用であって、該線維芽細胞はＣＤ１０６ポジティブ線維芽細胞を含む、使用。
（Ｄ２）前記線維芽細胞がＣＤ９０ポジティブ線維芽細胞を含む、（Ｄ１）に記載の使用。
（Ｄ３）前記線維芽細胞が、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３ポジティブ線維芽細胞を含む、（Ｄ１）又は（Ｄ２）に記載の使用。
（Ｄ４）前記注射用組成物に含まれる線維芽細胞全量に対し、ＣＤ１０６ポジティブ線維芽細胞の割合（細胞数基準）が０．０３％以上である、（Ｄ１）〜（Ｄ３）のいずれかに記載の使用。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、壊死した心臓組織領域を治癒し、心機能を回復させる有効な手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ＣＤ１０６ポジティブマウス線維芽細胞のＶＣＡＭ−１タンパク質の局在化を示すグラフである。
【図１Ｂ】ＣＤ１０６ポジティブマウス線維芽細胞のＶＣＡＭ−１ポジティブの免疫蛍光画像である（図面代用写真）。
【図１Ｃ】それぞれの線維芽細胞のＣｏｎｎｅｘｉｎ４３ポジティブの免疫蛍光画像である（図面代用写真）。
【図２Ａ】ＣＤ１０６ポジティブマウス線維芽細胞注射後の心機能（Ejection  Fraction、左室駆出率）を示すグラフである。
【図２Ｂ】ＣＤ１０６ポジティブマウス線維芽細胞注射後の心機能（fractional shortening、左室内径短縮率）を示すグラフである。
【図２Ｃ】ラット心臓の心エコーイメージである（図面代用写真）。
【図３Ａ】ラット心臓の膠原線維化された梗塞領域のイメージである（図面代用写真）。
【図３Ｂ】ラット心臓の膠原線維化された梗塞領域の面積を示すグラフである。
【図４】左室内径短縮率（ＦＳ）及び左室駆出率（ＥＦ）の算出に用いたグラフである。
【図５】心エコーによるラット慢性心不全モデルの心機能経過観察スケジュールを示す。ＣＤ１０６ポジティブラット線維芽細胞による慢性心不全治療効果の検証は、細胞投与日から２週間ごとに１８週間まで心エコーで心機能の経過観察を行った。
【図６】心エコーによるラット慢性心不全モデルの心機能経過観察スケジュールを示す。ＣＤ１０６ポジティブヒト線維芽細胞による慢性心不全治療効果の検証は、細胞投与日から２週間ごとに１８週間まで心エコーで心機能の経過観察を行った。ＣＤ１０６ポジティブヒト線維芽細胞の最適投与量の検討は、細胞投与日から２週間ごとに８週間まで心エコーで心機能の経過観察を行った。コントロールは培地投与後、２週、４週、８週、１２週、１６週、１８週で心エコーによる心機能の経過観察を行った。
【図７】ＣＤ１０６ポジティブラット線維芽細胞（２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／５０μＬ）投与によるラット慢性心不全モデルの心機能回復効果を示す。（Ａ）は左室駆出率（ＬＶＥＦ＝（ＬＶＩＤｄ３−ＬＶＩＤｓ３）／ＬＶＩＤｄ３）、（Ｂ）は左室内径短縮率（ＬＶＦＳ＝（ＬＶＩＤｄ−ＬＶＩＤｓ）×１００／ＬＶＩＤｄ）、（Ｃ）は左室拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ）、（Ｄ）は左室収縮末期容積（ＬＶＥＳＶ）をそれぞれ示す。Ｎ＝４。
【図８】各種の心臓線維芽細胞におけるＣＤ１０６及びＣＤ９０の陽性細胞率（％）を示す。白人胎児（２１週）心臓由来線維芽細胞（ｃ２１ｗＦＣＦ）、白人成体（５０代）心臓由来線維芽細胞（ｃ５０ｙＡＣＦ）、黒人成体（６０代）心臓由来線維芽細胞（ｂ６０ｙＡＣＦ）の３種を比較解析した。
【図９】ａｕｔｏＭＡＣＳによりソーティングし、回収したＣＤ１０６ポジティブヒト線維芽細胞のＣＤ１０６−ＣＤ９０陽性細胞率（％）を示す。
【図１０】（Ａ）はＣＤ１０６ポジティブヒト線維芽細胞のＯｃｔ３／４陽性細胞率（％）、（Ｂ）はＣＤ１０６ポジティブヒト線維芽細胞のＮａｎｏｇ陽性細胞率（％）、（Ｃ）はＣＤ１０６ポジティブヒト線維芽細胞のＳｏｘ２陽性細胞率（％）を示す。Ｎ＝３。Ｎ．Ｓ．＝ｎｏｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ。
【図１１】ＣＤ１０６ポジティブヒト線維芽細胞の細胞特性。間質細胞・間葉系幹細胞マーカー（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、上皮細胞マーカー（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）、心筋細胞のギャップジャンクションマーカー（Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３）の局在を評価した。
【図１２】ＣＤ１０６ポジティブヒト線維芽細胞のＳＴＲＯ−１陽性細胞率（％）。ＦＳＣ−Ａ及びＳＳＣ−Ａで細胞領域を認識後、ＣＤ１０６（ＶｉｏＢｌｕｅ−Ａ）とＣＤ９０（ＰＥ−Ａ）に両陽性の細胞群の内、ＳＴＲＯ−１（ＦＩＴＣ−Ａ）に陽性の細胞率（％）を評価した。Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌは上記抗体のＩｓｏｔｙｐｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌを使用した。
【図１３】ＣＤ１０６ポジティブヒト線維芽細胞（２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／５０μＬ）投与によるラット慢性心不全モデルの心機能回復効果を示す。（Ａ）は左室駆出率（ＬＶＥＦ＝（ＬＶＩＤｄ３−ＬＶＩＤｓ３）／ＬＶＩＤｄ３）、（Ｂ）は左室内径短縮率（ＬＶＦＳ＝（ＬＶＩＤｄ−ＬＶＩＤｓ）×１００／ＬＶＩＤｄ）、（Ｃ）は左室拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ）、（Ｄ）は左室収縮末期容積（ＬＶＥＳＶ）をそれぞれ示す。Ｎ＝４。
【図１４】ＣＤ１０６ポジティブヒト線維芽細胞投与量の違いによるラット慢性心不全モデルの心機能回復効果を示す。（Ａ）は左室駆出率（ＬＶＥＦ＝（ＬＶＩＤｄ３−ＬＶＩＤｓ３）／ＬＶＩＤｄ３）、（Ｂ）は左室内径短縮率（ＬＶＦＳ＝（ＬＶＩＤｄ−ＬＶＩＤｓ）×１００／ＬＶＩＤｄ）、（Ｃ）は左室拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ）、（Ｄ）は左室収縮末期容積（ＬＶＥＳＶ）をそれぞれ示す。Ｎ＝４。Ｎ．Ｓ．＝ｎｏｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ。
【図１５】ＣＤ１０６ポジティブヒト線維芽細胞投与日前日の、ブタ慢性心不全モデルの心機能評価の結果を示す（図面代用写真）。
【図１６】ＣＤ１０６ポジティブヒト線維芽細胞投与４週後の、ブタ慢性心不全モデルの心機能評価の結果を示す（図面代用写真）。
【図１７】ＣＤ１０６ポジティブヒト線維芽細胞投与８週後の、ブタ慢性心不全モデルの心機能評価の結果を示す（図面代用写真）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について具体的実施形態を用いて詳細に説明するが、本発明は示された具体的実施形態にのみ限定されるものではない。
本発明の一実施形態は、線維芽細胞を含む、心臓疾患を治療するための注射用組成物であり、該線維芽細胞はＣＤ１０６ポジティブ（以下ＣＤ１０６＋とも表記する）線維芽細胞を含む。
【００１５】
線維芽細胞は、最終的に線維芽細胞または筋線維芽細胞となる全ての細胞が含まれる。すなわち、分化又は成熟段階の途中の細胞であって、その時点では線維芽細胞または筋線維芽細胞と同定できないものであっても、最終的に線維芽細胞または筋線維芽細胞となるものであれば、本実施形態において線維芽細胞の範囲に含まれる。さらに線維芽細胞と称されない細胞、例えば間質細胞、前駆細胞、幹細胞、筋芽細胞等であっても線維芽細胞と同様の機能を有する細胞であってＣＤ１０６＋である細胞は、本実施形態において線維芽細胞の範囲に含まれる。
なお、ＣＤ１０６＋線維芽細胞は、線維芽細胞や間葉系幹細胞の細胞骨格マーカーであるＶｉｍｅｎｔｉｎにポジティブである一方、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の最もよく知られた分子マーカーのひとつであるＳＴＲＯ−１にネガティブであるという特徴を有する。
【００１６】
線維芽細胞の由来に制限はなく、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）及びＭｕｓｅ細胞等の多能性幹細胞や、間葉系幹細胞などの成体幹細胞を分化させて用いてもよい。また、動物（ヒトを含む）から採取したプライマリー細胞を用いてもよく、株化した細胞を用いてもよい。心臓由来の線維芽細胞を用いることが好ましく、心外膜由来の線維芽細胞を用いることがより好ましい。
【００１７】
特に、ヒト由来の線維芽細胞を用いることで、注射による心臓疾患治療効果が高い。なお、ヒト由来の線維芽細胞は、ＣＤ１０６＋の線維芽細胞の割合がマウス等と比較して極めて低い。本発明者らの研究では、その割合は多くとも９．１％（細胞数換算）程度である。従って、後述するスクリーニングステップ等によりヒト由来ＣＤ１０６＋線維芽細胞の割合を向上させたヒト由来線維芽細胞集団ついても、本発明に含まれ得る。例えば、本発明の別の形態として、全ヒト由来線維芽細胞に占めるヒト由来ＣＤ１０６＋線維芽細胞の割合（細胞数）が１０％以上である、ヒト由来線維芽細胞集団であり得る。なお、全線維芽細胞に占めるＣＤ１０６＋線維芽細胞の割合（細胞数）は１５％以上であってよく、２０％以上であってよく、２５％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、１００％であってよい。なお、ここでのヒト由来線維芽細胞集団は、ヒト心臓由来線維芽細胞集団であってよく、ヒ
ト成人心臓由来線維芽細胞であってよく、ヒト胎児心臓由来線維芽細胞集団であってよい。
なお、ＣＤ１０６＋であることが知られた細胞を選択することで、細胞選別の処理を省くことができる。
【００１８】
ＣＤ１０６は、ＶＣＡＭ−１とも称され、血管内皮細胞等に発現する細胞接着分子として既知のタンパク質である。本実施形態では、ＣＤ１０６＋、即ちＶＣＡＭ−１ポジティブ（ＶＣＡＭ−１＋）線維芽細胞を、心臓疾患を治療するための注射用組成物として用いる。
注射用組成物として用いるＣＤ１０６＋線維芽細胞は、壊死した心臓組織領域に直接注射されることで、心臓疾患を治療することが可能となる。また、壊死した心臓組織領域の周辺部に注射してもよく、冠動脈内に注入してもよく、静脈、動脈、リンパ節、リンパ管へ注入してもよい。冠動脈内への注入や静脈、動脈、リンパ管への注入は、脈内へ注射によるものでもよく、カテーテルにより注入されるものでもよく、その他の既知の手法を用いてもよい。
注射の方法は特段限定されず、有針注射、無針注射等既知の注射手法を適用することができ、注入に用いるカテーテルの方法も既知の方法を適用することができ、特段限定されない。
【００１９】
注射用組成物は有効成分として治療上有効量のＣＤ１０６＋線維芽細胞が含まれていれば、他の線維芽細胞や他の成分を含んでもよく、他の線維芽細胞を含む場合、注射用組成物に含まれる線維芽細胞全量に対し、ＣＤ１０６＋線維芽細胞の割合は細胞数基準で０．０３％以上であってよく、０．１％以上であってよく、１％以上であってよく、２％以上であってよく、４％以上であってよく、５％以上であってよく、１０％以上であってよく、２０％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９８％以上であってよく、９９％以上であってよい。
また、注射用組成物に含まれるＣＤ１０６＋線維芽細胞は他の細胞、例えば心筋細胞と共培養した細胞であってよい。
【００２０】
本実施形態において心臓疾患は、心臓組織の障害、欠損、機能不全などに起因する疾患が含まれ、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張型心筋症などが例示されるが、これらに限られない。
【００２１】
注射用組成物に含まれるＣＤ１０６＋線維芽細胞は、ＣＤ９０ポジティブ（ＣＤ９０＋）であってよい。すなわち、注射用組成物はＣＤ９０ポジティブ線維芽細胞を含んでもよい。ＣＤ９０は、Ｔｈｙ−１とも称され、糖鎖に富むグリコシル−フォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合型分子であり、また神経組織、結合組織など様々なストロマ細胞株に発現するが、心筋細胞には発現しない。そのため、ＣＤ９０＋線維芽細胞は、心筋細胞を含まないことを示す。なおここでいう「ＣＤ９０＋線維芽細胞は、心筋細胞を含まない」とは、多少含まれていることは許容する概念であり、注射用組成物に含まれる全細胞に対して細胞数基準で５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、０．１％以下、０．０１％以下であってよい。
ＣＤ１０６＋線維芽細胞のうち、ＣＤ９０＋線維芽細胞である割合（細胞数基準）は３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９８％以上であってよく、１００％であってよい。
本発明のある態様では、ＣＤ１０６＋かつＣＤ９０＋の線維芽細胞を含む線維芽細胞集団が提供され得る。線維芽細胞集団中では、ＣＤ１０６＋かつＣＤ９０＋の線維芽細胞は
、細胞数の割合において、８．２％を超える、８．５％以上、９％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％であり得る。これらの態様において、ＣＤ１０６＋かつＣＤ９０＋の線維芽細胞は、例えば、ヒト由来であり得る。これらの態様において、ＣＤ１０６＋かつＣＤ９０＋の線維芽細胞は、例えば、心臓由来線維芽細胞であり得る。これらの態様において、ＣＤ１０６＋かつＣＤ９０＋の線維芽細胞は、例えば、ヒト心臓由来線維芽細胞であり得る。ＣＤ１０６＋かつＣＤ９０＋の線維芽細胞は、例えば、組織からＣＤ１０６＋であり、かつＣＤ９０＋である細胞をセルソーター等で濃縮して得ることができる。これらの態様では、線維芽細胞は、ヒト胎児から採取された線維芽細胞としてもよい。
【００２２】
ＣＤ１０６＋かつＣＤ９０＋線維芽細胞は、臓器の恒常性維持のためサイトカイン等を分泌して炎症反応を調整し、分泌されたサイトカイン・ケモカイン等が心筋組織の再生に適した微小環境を形成し、心筋細胞の増殖、心筋細胞の拍動調整、または血管新生を促すことで、心臓機能を改善させ得る。また、ＣＤ１０６＋かつＣＤ９０＋線維芽細胞は線維症の進行を抑制し得る。
従って本明細書には、ＣＤ１０６＋かつＣＤ９０＋線維芽細胞、または当該細胞の精製物を含む心臓炎症反応調整剤（または心臓の炎症抑制剤）の発明を含み得る。また、ＣＤ１０６＋かつＣＤ９０＋線維芽細胞、または当該細胞の培養上清を含む、心臓細胞のサイトカイン分泌促進剤、或いはＣＤ１０６＋かつＣＤ９０＋線維芽細胞の細胞溶解物または培養上清、または当該細胞の精製物を含むサイトカイン類分泌調整剤の発明を含み得る。また、ＣＤ１０６＋かつＣＤ９０＋線維芽細胞を含む、心臓組織における微小環境形成剤の発明を含み得る。そして、ＣＤ１０６＋かつＣＤ９０＋線維芽細胞を含む、心筋細胞増殖剤、心筋細胞の拍動調整剤、心筋細胞の成熟または血管新生促進剤の発明を含み得る。
【００２３】
換言すると、心臓炎症反応調整方法であって、ＣＤ１０６＋かつＣＤ９０＋線維芽細胞を壊死した心臓組織領域、或いはその周辺に注射する、及び／又は冠動脈内に注入するステップ、を含む方法であり得る。また、サイトカイン類分泌調整方法若しくはサイトカイン類分泌促進方法であって、ＣＤ１０６＋かつＣＤ９０＋線維芽細胞を壊死した心臓組織領域、或いはその周辺に注射する、及び／又は冠動脈内等に注入するステップ、を含む方法であり得る。また、心臓組織における微小環境形成方法であって、ＣＤ１０６＋かつＣＤ９０＋線維芽細胞を壊死した心臓組織領域、或いはその周辺に注射する、及び／又は冠動脈内等に注入するステップ、を含む方法であり得る。
サイトカイン類は、主に免疫や炎症に関係する情報伝達に関するタンパク質であり、既知のものが含まれる。
【００２４】
注射用組成物に含まれるＣＤ１０６＋線維芽細胞は、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３ポジティブ（Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３＋）線維芽細胞であってよい。すなわち、注射用組成物はＣｏｎｎｅｘｉｎ４３ポジティブ線維芽細胞を含んでもよい。
Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３は、血管の表面で動脈硬化性プラークとともに発現することや、心筋細胞のギャップジャンクションとして隣接する細胞と結合し、心臓の電気的な興奮を伝搬することが知られている膜貫通タンパク質である。Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３ポジティブであることで、心臓組織内の電気的シグナルのやりとりが可能となり、注射用組成物による治療効果を改善させると本発明者らは考えている。
ＣＤ１０６＋線維芽細胞のうち、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３＋線維芽細胞の割合（細胞数基準）は３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９８％以上であってよく、１００％であってよい。
【００２５】
注射用組成物は、注射用組成物として生理学的に許容される他の成分を含有してもよい。このような他の成分としては、生理食塩水、細胞保存液、細胞培養液、ハイドロゲル、細胞外マトリクス、凍結保存液等があげられる。
【００２６】
注射用組成物に含まれるＣＤ１０６＋線維芽細胞の割合は注射又は注入の態様等に基づいて適宜設定され、有効成分として治療上有効量のＣＤ１０６＋線維芽細胞が含まれていればよい。通常、注射用組成物において細胞全量に対するＣＤ１０６＋線維芽細胞の細胞数基準の割合は０．０３％以上であってよく、１％以上であってよく、５％以上であってよく、１０％以上であってよく、２５％以上であってよく、５０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９８％以上であってよく、１００％であってよい。
なお、注射用組成物に含まれるＣＤ１０６＋線維芽細胞数は、例えば１．０×１０２ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、５．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上とすることができる。また、注射用組成物に含まれるＣＤ１０６＋かつＣＤ９０＋の線維芽細胞数は、例えば１．０×１０２ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、５．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上とすることができる。注射用組成物に含まれるＣＤ１０６＋線維芽細胞数は、心臓疾患の状態に応じてさらに増減させてもよい。
【００２７】
以下、注射用組成物に含まれる線維芽細胞の製造方法を説明する。線維芽細胞の製造に関しては、本発明者らの既報（国際公開第２０１６／００６２６２号）が参照され、これに従ってもよい。
（線維芽細胞を準備するステップ）
線維芽細胞を準備するステップにおいて、線維芽細胞の由来は特に限定はされず、既に述べたとおりである。一方で、自家移植による形態であってよく、その場合には心臓疾患を患っている患者の心臓組織から単離した心臓線維芽細胞や、患者の成体（体性）幹細胞を分化させて単離した心臓線維芽細胞を準備する。また、ｉＰＳ細胞を分化させて、回収した線維芽細胞であってもよい。加えて、他家移植による形態であってよく、その場合には心臓細胞を提供するドナー由来の心臓組織や、動物等を利用して作製した心臓組織から単離した心臓線維芽細胞や、ドナーの成体（体性）幹細胞を分化させて単離した心臓線維芽細胞を準備する。また、ドナー由来のｉＰＳ細胞を分化させて、回収した線維芽細胞であってもよい。
【００２８】
（線維芽細胞を分離するステップ）
準備された線維芽細胞は、典型的にはディスパーゼ、コラゲナーゼのような酵素により処理されることで、培養のため分離され得る。分離はディスパーゼ、コラゲナーゼのような酵素により行われる他、初代培養前に必要とされる分離が可能であれば、その他の処理、例えば機械的処理であってよい。
【００２９】
（ＣＤ９０ポジティブ線維芽細胞をスクリーニングするステップ）
線維芽細胞は、ＣＤ９０＋線維芽細胞の割合を増やすためにスクリーニングされてよい。本スクリーニングにより、線維芽細胞から心筋細胞を除外することができる。スクリーニングには、抗ＣＤ９０抗体を用いた、フローサイトメトリー、磁気ビーズ法、アフィニティーカラム法、又はパニング法等のセルソーティング法が例示される。具体的には磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）や蛍光標識細胞分離法（ＦＡＣＳ）などを用いることができる。抗ＣＤ９０抗体は市販のものを用いてよく、また既知の方法により作製したものを用いてもよい。また、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれを用いてもよいが、特異性の観点からモノクローナル抗体を用いることが好ましい。更には、薬剤耐性遺伝子
を導入し、ＣＤ９０ネガティブ線維芽細胞を除外することで、スクリーニングしてもよい。また、蛍光タンパク質コード遺伝子を導入し、蛍光タンパク質ポジティブ細胞を蛍光標識細胞分離法（ＦＡＣＳ）などを用いて単離してもよい。
【００３０】
（接着力を有する細胞をスクリーニングするステップ）
線維芽細胞は、接着力の違いを利用してスクリーニングしてもよい。ＣＤ９０ポジティブ線維芽細胞は、ノンコート（ゼラチン等でコーティングを施していない）の培養皿に生着する性質を有しており、本ステップにより線維芽細胞の純度を高めることができる。具体的には、ノンコートの培養皿に線維芽細胞を播種し、例えば２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、又は２４時間培養を行い、培養皿に生着した線維芽細胞を回収することで、スクリーニングができる。
【００３１】
（ＣＤ１０６＋線維芽細胞をスクリーニングするステップ）
注射用組成物にＣＤ１０６＋線維芽細胞を含有させるため、典型的には、線維芽細胞はＣＤ１０６＋線維芽細胞をスクリーニングするステップに供される。このようなステップを経ずともＣＤ１０６＋線維芽細胞を入手できる場合には、本ステップは省略し得る。ＣＤ１０６＋線維芽細胞のスクリーニングには、抗ＣＤ１０６抗体（抗ＶＣＡＭ−１抗体）を用いた、フローサイトメトリー、磁気ビーズ法、アフィニティーカラム法、又はパニング法等のセルソーティング法が例示される。具体的には磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）や蛍光標識細胞分離法（ＦＡＣＳ）などを用いることができる。抗ＣＤ１０６抗体は市販のものを用いてよく、また既知の方法により作製したものを用いてもよい。更には、薬剤耐性遺伝子を導入し、ＣＤ１０６ネガティブ線維芽細胞を除外することで、スクリーニングしてもよい。また、蛍光タンパク質コード遺伝子を導入し、蛍光タンパク質ポジティブ細胞を蛍光標識細胞分離法（ＦＡＣＳ）などを用いて単離してもよい。また、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれを用いてもよいが、特異性の観点からモノクローナル抗体を用いることが好ましい。また、リアルタイムＰＣＲ、次世代シーケンサー、及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等の手法を用いて、細胞におけるＣＤ１０６遺伝子の発現を確認し、ＣＤ１０６遺伝子の発現群を単離してもよい。
【００３２】
（培養ステップ）
線維芽細胞は、所望の細胞数となるまで、及び／又は所望の機能が備わるまで等の目的で、培養ステップに供されてもよい。培養の条件に制限はなく、既知の細胞培養方法により行ってよい。
培養に用いられる培養液は、培養する細胞の種類等により適宜設定可能であるが、たとえば、ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０等が使用可能である。当該培養液にＦＣＳやＦＢＳ等の栄養物質や増殖因子、サイトカイン、抗生物質等を添加してもよい。
【００３３】
培養期間は、所望の細胞数となるまで、及び／又は所望の機能が備わるまで等の目的に応じて日数を適宜設定できる。例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、２週間、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月等の期間があげられる。
培養温度は、培養する細胞の種類に合わせて適宜設定可能であるが、例えば１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、２５℃以上、３０℃以上であってよく、また６０℃以下、５５℃以下、５０℃以下、４５℃以下、４０℃以下であってよい。
培養ステップは、複数回行ってもよい。例えばスクリーニングにより所望の線維芽細胞の純度を向上させ、その都度培養を行うことができる。
【００３４】
（回収ステップ）
培養した線維芽細胞は、回収ステップにより回収される。回収ステップは、トリプシン等のプロテアーゼにより細胞を剥離して回収してよいが、温度応答性培養皿を使用して、温度変化により細胞を剥離させ、回収してもよい。
【００３５】
本発明の別の実施形態としては、上記ステップのうち、ＣＤ１０６＋線維芽細胞をスクリーニングするステップ、を含む治療用線維芽細胞の製造方法であり得る。
また、上記ステップのうち、ＣＤ１０６＋線維芽細胞をスクリーニングするステップ、及びＣＤ９０＋線維芽細胞をスクリーニングするステップ、を含む治療用線維芽細胞の製造方法であり得る。
さらに、上記ステップのうち、１つ乃至２つ以上を任意に組み合わせた治療用線維芽細胞の製造方法であり得る。
【００３６】
また、本発明の別の実施形態としては、線維芽細胞を含む注射用組成物を、壊死した心臓組織領域、或いはその周辺、及び／又は冠動脈内、或いは静脈、動脈、リンパ節、リンパ管に注入することにより心臓疾患を治療する方法であって、該線維芽細胞はＣＤ１０６＋線維芽細胞を含む、方法であり得る。
更に、線維芽細胞の注射用組成物としての使用であって、該線維芽細胞はＣＤ１０６＋線維芽細胞を含む、使用であり得る。
更に、別の実施形態として、ＣＤ１０６＋線維芽細胞を含む、平面または立体の細胞組織であってよい。ＣＤ１０６＋線維芽細胞は他の細胞、例えば心筋細胞を共培養した上で平面または立体の細胞組織としてもよいが、共培養しなくても平面または立体の細胞組織として有効に機能する。平面または立体の細胞組織としては、例えば細胞シートや、セルファイバー、３Ｄプリンタにて形成された細胞組織などが例示されるが、これらに限られない。
【実施例】
【００３７】
以下に実施例を示し、本発明をより詳細に説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
［ＣＤ１０６+マウス線維芽細胞の投与による心臓機能改善］
＜動物と試薬＞
ワイルドタイプＣ５７ＢＬ／６マウスと、ワイルドタイプＳｌｃ：ＳＤラットは、日本エスエルシー株式会社（静岡、日本）から購入した。
以下の抗体は免疫蛍光染色及び蛍光標識細胞分離法（ＦＡＣＳ）に使用された：マウスモノクローナル抗ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、ウサギポリクローナル抗Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＭＡ）、マウスモノクローナル抗ビメンチン（Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）、及びＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８溶液（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＩ）。
二次抗体はＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  ＰＡ）から購入した。
【００３８】
＜線維芽細胞と心筋細胞＞
マウス心臓線維芽細胞は、ワイルドタイプＣ５７ＢＬ／６マウス（新生仔、１日齢）から、既報に従って得た（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０１１；３２：７３５５−７３６２）。得られた細胞は、１０ｃｍ培養皿にてｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで培養した。培養開始から３〜５日後、細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで剥離し、他の１０ｃｍ培養皿で継代培養した。
マウスの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）由来の心筋細胞（Ｃｏｒ．ＡＴ）はアキシオジェネシス社（Ｃｏｌｏｇｎｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）より購入した。心筋細胞の分化及び精製は指示書に従って行った。
【００３９】
＜ＣＤ１０６＋  マウス心臓線維芽細胞の蛍光標識細胞分離（ＦＡＣＳ）＞
マウス心臓線維芽細胞（２×１０７個／実験）をマウス抗ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）−ＰＥ抗体で染色した。染色は指示書に沿って行った。ＣＤ１０６＋線維芽細胞を、Ｓ３ｅセルソーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  ＰＡ）により分離した。
【００４０】
＜免疫蛍光染色＞
細胞を、既報（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０１１；３２：７３５５−７３６２）に記載のとおり、４％パラホルムアルデヒドで固定し、免疫蛍光染色を行った。染色サンプルは、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ
２２００  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，  ＵＫ）及びＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．９．２（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により解析された。
【００４１】
＜外科処置手順＞
ラットの心不全は吸入麻酔下で、左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）を３０分間閉塞し、その後血流を再灌流させることにより誘発させた。具体的には、まず１１日〜１２週齢の雄Ｓｌｃ：ＳＤラットを準備した（３６９．０−５０６．５ｇ，  日本エスエルシー株式会社，静岡）。塩酸メデトミジン０．１５ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム２ｍｇ／ｋｇ、酒石酸ブトルファノール２．５ｍｇ／ｋｇとなるように三種を混合し、生理食塩液で希釈したものを１０  ｍＬ／ｋｇの容量でラットに腹腔内投与して麻酔し、胸部周囲を毛刈り及び除毛した。除毛後、気管チューブを経口的に気管挿管し、小動物用人工呼吸器（型式ＳＮ−４８０−７×２Ｔ、株式会社シナノ製作所）により人工呼吸（Ｔｉｄａｌ  ｖｏｌｕｍｅ：２．０〜２．５  ｍＬ／ｓｔｒｏｋｅ、呼吸回数：７５  ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎ）を施し、吸入麻酔装置（型式ＫＮ−１０７１、株式会社夏目製作所）により２％イソフルランを用いて維持麻酔後、背位又は側臥位に固定した。
【００４２】
切開部位をイソジン液で消毒後、リドカインをスプレーして痛みを緩和した。胸部側壁を開胸して心臓を露出後、必要に応じて不整脈予防のため、アトロピン硫酸塩（０．０２
ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内投与した。糸付縫合針（６−０  ＶＩＣＲＹＬ)（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  ＮＪ）を用いて左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）を３０分間閉塞した。心電図をモニタし、ＳＴ電位の上昇及び心筋の白色化（肉眼観察）で閉塞の有無（心筋虚血の発生）を確認した。なお、心室細動（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ：ＶＦ）が出現した場合は蘇生（リング鑷子ピンセットにより心臓を直接刺激）を行い、心室細動を消失させた。閉塞３０分後に血流を再灌流させることにより虚血再灌流モデルを作製した。
【００４３】
再灌流後、心筋内注射してから閉胸して糸付縫合針（３−０  ＶＩＣＲＹＬ)（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  ＮＪ）で縫合し、縫合部位をイソジン液で消毒した。
【００４４】
ラットは以下の４つの処置グループに分けられた。
（Ｓ１）ＣＤ１０６＋マウス線維芽細胞及びマウス心筋細胞の注射（線維芽細胞：４×１０５個、心筋細胞１．６×１０６個を含むｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ＤＭＥＭ＋１０％Ｎｅｗ  Ｂｏｒｎ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ（ＮＢＣＳ）５０μＬ）
（Ｓ２）ＣＤ１０６＋マウス線維芽細胞の注射（線維芽細胞：２×１０６個を含むｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ＤＭＥＭ＋１０％ＮＢＣＳ５０μＬ）
（Ｓ３）外科処置のみ行ったグループ
（Ｓ４）外科処置を行わなかったグループ
細胞は、損傷領域周辺部２カ所に注射した（２５μＬ／注射）。
【００４５】
＜心機能の評価＞
作製したモデルラットの左心室機能は心臓超音波検査（心エコー検査）により、細胞注
射後０週から１０週まで、２週間おきに心機能をモニタし、比較評価を行った。
心臓超音波検査（心エコー検査）は、超音波診断装置（Ｎｏｌｕｓ、株式会社日立製作所）を用いた。具体的には、ラットの胸部に表在用リニア型探触子を当てＭ−ｍｏｄｅで左室拡張末期径（ＬＶＩＤｄ）、左室収縮末期径（ＬＶＩＤｓ）、左室拡張末期前壁厚（ＬＶＡＷｄ）、左室拡張末期自由壁厚（ＬＶＰＷｄ）及び左室収縮末期自由壁厚（ＬＶＰＷｓ）を測定した。左室拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ）及び左室収縮末期容積（ＬＶＥＳＶ）は、エコー装置に自動的に算出された値を採用した。さらに描出したＭ−ｍｏｄｅ画像から左室心外膜面の変位（Ｄ２）を測定した。左室伸展性指標ＥＭＩ＝（ＬＶＰＷｓ−ＬＶＰＷｄ）／（ＬＶＰＷｓ×Ｄ２）とその簡略化指標ＤＷＳ＝（ＬＶＰＷｓ−ＬＶＰＷｄ）／ＬＶＰＷｓを算出した。また、下記の式と図４から左室内径短縮率（ＦＳ）及び左室駆出率（ＥＦ）を算出した。
左室内径短縮率ＦＳ  ＝（ＬＶＩＤｄ−ＬＶＩＤｓ）／ＬＶＩＤｄ×１００
左室駆出率ＥＦ  ＝（ＬＶＥＤＶ−ＬＶＥＳＶ）／ＬＶＥＤＶ）×１００
【００４６】
＜組織学的実験＞
摘出した心臓の左心室は１０％緩衝ホルマリン液に浸漬固定した。左心室は結紮直下から心尖部にかけて長軸方向の長さが３等分になるよう短軸方向に３分割した。それぞれの心筋は起始部側を包埋面とし、１つのパラフィンブロックに包埋した。薄切し、マッソン・トリクローム染色を行った。マッソン・トリクローム染色の標本は画像解析装置（汎用画像処理”Ｗｉｎ  ＲＯＯＦ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．５”、株式会社三谷商事）に取り込み、それぞれ３部位について、画像解析装置により心筋梗塞面積（％）を測定した。
【００４７】
＜統計分析＞
心機能の評価は平均±ＳＥ（標準誤差）で表す。その他すべてのデータは平均±ＳＤ（標準偏差）で表す。３群以上の変動差は一元配置分散分析により算出した。その後、３群間の有意差は、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｔｅｓｔにより算出した。０．０５より低いｐ値は有意に異なると見なした。すべての統計計算はＳｔａｔｃｅｌソフトウエアを用いて行った。
【００４８】
＜マウス心臓線維芽細胞における、ＶＣＡＭ−１タンパク質の局在＞
心筋細胞の増殖と遊走を向上させるＣＤ１０６＋線維芽細胞を分離するため、マウス心臓線維芽細胞におけるＶＣＡＭ−１タンパク質の発現を調べた（図１Ａ）。ＣＤ１０６＋線維芽細胞の領域は、ネガティブ細胞を除くため、厳密に選択された。約３９．２％の心臓線維芽細胞がＣＤ１０６＋線維芽細胞であった。次に、ＣＤ１０６＋線維芽細胞が長期間均一にＶＣＡＭ−１を発現しているか否かを評価するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１８週までＣＤ１０６＋線維芽細胞を培養し、ＶＣＡＭ−１タンパク質の発現を評価した（図１Ｂ）。すべてのＣＤ１０６＋線維芽細胞について、１８週にわたりＶＣＡＭ−１タンパク質の高い発現レベルが維持され続けた。また、ＣＤ１０６＋線維芽細胞はＣｏｎｎｅｘｉｎ４３、即ち心筋電気的ネットワーク伝達のギャップ結合タンパク質を高発現していた（図１Ｃ）。これらの知見から、ＣＤ１０６＋線維芽細胞はＶＣＡＭ−１タンパク質を発現し続け、加えて、心臓の電気的な興奮を伝搬する能力を有すると理解できる。
【００４９】
＜ＣＤ１０６＋マウス線維芽細胞による、心筋梗塞の心臓機能の改善＞
心エコーにより、注射後２〜１０週において、左室駆出率（ＥＦ）と左室内径短縮率（ＦＳ）に関し、Ｓ１及びＳ２グループはＳ３及びＳ４グループと比較して改善が見られた。一方、Ｓ１及びＳ２グループ間で、ＥＦとＦＳでの有意差は見られなかった（図１Ａ、図２Ｂ）。それゆえ、ＣＤ１０６＋線維芽細胞の投与は心筋梗塞において損傷した心臓の収縮機能を改善したことが理解できる。そして、注射用組成物の組成において心筋細胞の存在は重要ではなかった。
【００５０】
＜ＣＤ１０６＋マウス線維芽細胞による、膠原線維化された梗塞領域の改善＞
注射後１０週において、心臓の病理組織標本を作製し、マッソン・トリクローム染色を行ったところ、Ｓ１及びＳ２グループの膠原線維化された梗塞領域は、有意に小さいことが確認できた（図３Ａ）。また、画像解析装置により、膠原線維化された梗塞領域の面積（％）を測定したところＳ２で有意に線維症の領域が小さいことが明らかとなった（図３Ｂ）。それゆえ、ＣＤ１０６＋線維芽細胞の投与が心筋梗塞を始めとする損傷した心臓の収縮機能を改善しただけでなく、膠原線維化を大きく抑制したことが理解できる。そして、注射用組成物の組成において心筋細胞の存在は重要ではなかった。
【００５１】
以上の実験より虚血性心疾患の効果的な治療における、ＶＣＡＭ−１ポジティブの線維芽細胞の重要性が初めて実証され、ＣＤ１０６＋線維芽細胞の投与が、心臓疾患の治療において好ましい結果を生むことが理解できる。ＶＣＡＭ−１ポジティブ線維芽細胞の投与は、虚血性心疾患の効果的な改善のための治療に使用され得る。また、ＶＣＡＭ−１を発現している心臓線維芽細胞の投与により、心臓機能の著しい改善と膠原線維化の著しい抑制が見られたことから、他の心臓疾患の治療に対しても、効果的であることが理解できる。
【００５２】
［ＣＤ１０６＋ラット線維芽細胞の投与による心臓機能改善］
次に、ＣＤ１０６＋ラット線維芽細胞の、ラットへの投与による心臓機能改善を確認した。
＜線維芽細胞と心筋細胞＞
ラット心臓線維芽細胞は、Ｓｌｃ：ＳＤ胎仔ラット（胎生２０日齢）から心臓を採材し、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で組織を破砕した後、基材表面への接着性の違いにより回収した。得られた細胞は、１０ｃｍ培養皿にて１０％ＮＢＣＳ添加ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ＤＭＥＭで培養した。培養開始から３〜５日後、細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで剥離し、他の１０ｃｍ培養皿で継代培養した。
【００５３】
＜セルソーティング＞
細胞は、ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）−Ｂｉｏｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｒａｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で一次免疫染色し、Ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で二次免疫染色した。染色した細胞は、ａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で、ＣＤ１０６陽性細胞のみを回収し、ＣＤ１０６＋ラット線維芽細胞とした。
【００５４】
＜慢性心不全ラットモデルの作製と心エコーの計測＞
ヌードラット（Ｆ３４４／Ｎ  Ｊｃｌ−ｒｎｕ／ｒｎｕ）８週齢、雄は日本クレア（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入した。１週間の馴化後、動物は実験動物用吸入麻酔器（ソフトランダー（新鋭工業株式会社，Ｓａｉｔａｍａ，Ｊａｐａｎ））を用いて、２％イソフルラン（麻酔補助剤；笑気：酸素＝７：３）にて吸入麻酔し、刈毛した。すばやく気管挿管を行い、そのまま０．５−２％イソフルラン（麻酔補助剤；笑気：酸素＝７：３）吸入麻酔ガスを人工呼吸器に接続して、麻酔を維持した。人工呼吸管理のもと、仰臥位に固定し、左第３肋骨から第５肋骨までの間で２−３本、肋軟骨の位置で縦方向に切断して開胸した。開創器により、術野を拡大後、心嚢膜を剥離して心臓を露出させた。左心房を持ち上げ、血管用糸付弱弯丸針（６−０：ネスコスーチャー）を用いて左心室の深さ約２ｍｍ、長さ４−５ｍｍに糸を通した。糸の両端を合わせてポリエチレンチューブ（ＰＥＳＯ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で作製したｓｎａｒｅを通し、動脈クレンメを用いて糸を絞り（ｓｎａｒｅ法）冠動脈を３０分間虚血した。３０分後、再灌流させ、状態が安定したら、出血がない事を確認し、胸腔ドレナージを行い、筋層及び皮膚を縫合した。皮膚は、皮内縫合を行うが、通常縫合を行った場合には、術後状態を観察しながら抜糸を行った。モデル作製後１週間の細胞投与日前日に、超音波画像診断装置（Ｘａｒｉｏ
ＳＳＡ−６６０Ａ  東芝メディカルシステムズ株式会社，Ｔｏｃｈｉｇｉ，Ｊａｐａｎ）を用いて心エコーを測定した。左室駆出率（ＬＶＥＦ＝（ＬＶＩＤｄ３−ＬＶＩＤｓ３）／ＬＶＩＤｄ３）が５５％以下の個体を慢性心不全モデルとみなし、ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞の投与実験を行った。
【００５５】
＜慢性心不全ラットモデルへのＣＤ１０６＋ラット線維芽細胞の投与＞
投与試験当日にＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞は、ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ＤＭＥＭ＋１０％ＮＢＣＳで希釈し、生存細胞数として、各個体につき、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／５０μＬの細胞懸濁液を投与した。コントロールは、ＤＭＥＭ＋１０％ＮＢＣＳのみを５０μＬ投与した。各群はＮ＝４で実施した。
動物は、モデル作製時と同一の手法で麻酔を維持し、人工呼吸管理のもと、梗塞巣の２ヶ所に分けて、３０Ｇ針付きカテーテルを用いて細胞懸濁液を５０μＬ全量投与した。状態が安定した後に、投与液の漏出及び出血がない事を確認し、胸腔ドレナージを行い、筋層及び皮膚を縫合した。皮膚は、皮内縫合を行うが、通常縫合を行った場合には、術後状態を観察しながら抜糸を行った。
【００５６】
＜心エコーによる慢性心不全モデルラットの心機能評価＞
ＣＤ１０６＋ラット線維芽細胞の投与を行った慢性心不全モデルは、図５に示すスケジュールに従い、超音波画像診断装置（Ｘａｒｉｏ  ＳＳＡ−６６０Ａ  東芝メディカルシステムズ株式会社，Ｔｏｃｈｉｇｉ，Ｊａｐａｎ）を用いて心エコーを測定し、経過観察を行った。具体的には、動物の胸部をバリカンにて毛刈し、胸部にプローブを当てＭ−ｍｏｄｅで以下の項目を測定した。主項目として、左室駆出率（ＬＶＥＦ＝（ＬＶＩＤｄ３−ＬＶＩＤｓ３）／ＬＶＩＤｄ３）、左室内径短縮率（ＬＶＦＳ＝（ＬＶＩＤｄ−ＬＶＩＤｓ）×１００／ＬＶＩＤｄ）、左室拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ）、左室収縮末期容積（ＬＶＥＳＶ）を測定した。副次項目としては、左室拡張末期径（ＬＶＩＤｄ）、左室収縮末期径（ＬＶＩＤｓ）、拡張末期左室前壁厚（ＬＶＡＷｄ=ＩＶＳＴｄ）、拡張末期左室後壁厚（ＬＶＰＷＴｄ）、心拍数（ＨＲ）を測定した。ＨＲを除く心機能値は、小数点以下１桁（小数点以下第２位を四捨五入する）で表し、副次項目のＨＲは小数点以下２桁（小数点以下第３位を四捨五入する）で表す。
【００５７】
［ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞の投与による心臓機能改善］
次に、ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞の、ラット及びブタへの投与による心臓機能改善を確認した。
＜細胞と抗体＞
心臓線維芽細胞は、次のメーカーから購入した。
白人胎児（２１週）心臓由来線維芽細胞（ｃ２１ｗＦＣＦ，Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ, ＣＡ）
白人成体（５０代）心臓由来線維芽細胞（ｃ５０ｙＡＣＦ，Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ, ＣＡ）
黒人成体（６０代）心臓由来線維芽細胞（ｂ６０ｙＡＣＦ，Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ, Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
【００５８】
＜セルソーティング＞
細胞は、ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）−Ｂｉｏｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で一次免疫染色し、Ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で二次免疫染色した。染色した細胞は、ａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で、ＣＤ１０６陽性細胞のみを回収し、ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞とした。
【００５９】
抗体は，次のメーカーから購入した。
ＢＶ４２１  Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ,  Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＲＵＯ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
ＰＥ−ＲＥＡ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｓ）Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）
Ｏｃｔ３／４−ＰＥ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）
Ｎａｎｏｇ−ＰＥ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）
Ｓｏｘ２−ＰＥ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）
ウサギポリクローナル抗Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
Ｈｕｍａｎ  ＳＴＲＯ−１  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）
その他の抗体は、すべてＡｂｃａｍから購入した。
二次抗体はＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。
【００６０】
細胞膜表面タンパク質を認識する抗体は、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した上で、免疫蛍光染色を実施した。Ｏｃｔ３／４−ＰＥ、Ｎａｎｏｇ−ＰＥ、Ｓｏｘ２−ＰＥに関しては、ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ, ＭＯ）で３０分間（室温）、細胞膜透過処理を実施し、免疫蛍光染色した。
【００６１】
＜フローサイトメトリー＞
免疫蛍光染色した細胞は１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｐｅｒ  ｔｒｉａｌの濃度で調製し、フローサイトメーター（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で解析した。ＦＳＣ−Ａ及びＳＳＣ−Ａで細胞領域を認識後、各種のマーカータンパク質に対する陽性細胞率（％、細胞数換算）を評価した。
【００６２】
＜慢性心不全ラットモデルの作製と心エコーの計測＞
上記に記載の手法と同じ方法で慢性心不全モデルを作製し、心エコーの計測を行った。
【００６３】
＜慢性心不全ラットモデルへのＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞の投与＞
投与試験当日にＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞は、ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ＤＭＥＭ＋１０％ＮＢＣＳで希釈し、生存細胞数として、各個体につき、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／５０μＬ、及び５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬの細胞懸濁液を投与した。各群はＮ＝４で実施した。動物の麻酔維持と細胞投与方法、及び縫合・抜糸は、上記に記載の方法と同様にで行った。
【００６４】
＜心エコーによる慢性心不全モデルラットの心機能評価＞
ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞の投与を行った慢性心不全モデルは、図６に示すスケジュールに従い、２週間ごとに超音波画像診断装置（Ｘａｒｉｏ  ＳＳＡ−６６０Ａ  東芝メディカルシステムズ株式会社，Ｔｏｃｈｉｇｉ，Ｊａｐａｎ）を用いて心エコーを測定し、経過観察を行った。具体的な手法は、上記に示したものと同様である。
【００６５】
＜慢性心不全ブタモデルの作製と心エコーの計測＞
ブタは３５−４０ｋｇのＬＷＤ種、ＳＰＦ家畜ブタを購入した（岡山ＪＡ畜産株式会社，Ｏｋａｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）。ブタの心不全モデルは、左前下行枝抹消をバルーンカテーテルで６０分間インフレーションさせ、３０分間のインターバル後に左前下行枝中間部を再度６０分間インフレーションさせることで作製した。
【００６６】
モデル作製後１週間の細胞投与日前日に、ＭＲＩを用いて心エコーを測定した。左室駆
出率（ＥＦ）が４５％未満の個体を慢性心不全モデルとみなし、ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞の投与実験を行った。
【００６７】
＜慢性心不全ブタモデルへのＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞の投与＞
作製したブタ心不全モデルは、麻酔導入後、仰臥位で術台に固定した。上記慢性心不全ブタモデルの作製の際と同様に、鼠蹂部から６Ｆｒシースを刺入させ、６Ｆｒガイディングカテーテルを０．０３５インチガイドワイヤを先行させ、上行大動脈部まで挿入させた。０．０３５インチガイドワイヤを抜去し、ガイディングカテーテル内のエアーを抜き、左冠動脈主幹部にエンゲージさせた。エンゲージ後、正中及びＬＡ０３０°の角度で確認造影を行い、冠動脈の状態を確認した。０．０１４インチガイドワイヤに沿わせて左前下行枝入口部直後にマイクロカテーテルを挿入させた。予めＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞が充填された５０ｍＬシリンジ（２．０×１０７ｃｅｌｌｓ／４０ｍＬ）を、シリンジポンプにセットし、挿入したマイクロカテーテルに接続させ、１ｍＬ／ｍｉｎの流速で４０分間投与した。細胞の投与終了後、マイクロカテーテル内のフラッシングとして、同様の流速で生理食塩液５ｍＬを投与した。すべての投与終了後、カテーテル、シースを抜去し、シース挿入箇所を圧迫止血し、麻酔から覚醒させ、ケージに戻した。なお、ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞の投与は、Ｎ＝１で実施した。
【００６８】
＜ＭＲＩによる慢性心不全モデルブタの心機能評価＞
ブタは、細胞投与日前、投与後４週、投与後８週にＭＲＩ検査を行った。深麻酔状態のブタをＭＲＩ室内の検査台の上に乗せ、仰臥位の状態で麻酔器の配管と気管チューブを接続し、胸部に心電図用電極を貼付した。胸部を覆うようにコイルを装着させ、ＭＲＩ本体（Ｓｉｇｎａ  ＥＸＣＩＴＥ  ＸＩ  ＴｗｉｎＳｐｅｅｄ  １．５Ｔ  Ｖｅｒ．１１．１，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の筒の中に入れ、撮像を行った。具体的にはまず、シネＭＲＩで心臓をカバーする範囲を体軸断面（Ａｘｉａｌ断面）で、２Ｄ  Ｆｉｅｓｔａ撮像した。次に得られたデータの中から、心尖部から左心室の長軸を通るような断面で、１心拍あたり２０スライス、２Ｄ  Ｆｉｅｓｔａ撮像した。撮像データの中から、拡張期のスライスを選び、心尖部から僧房弁付近を通るような長軸断面で２Ｄ  Ｆｉｅｓｔａ撮像した。さらに、拡張期のスライスを選び、左心室の長軸に対して垂直に通るような断面で、幅６−８ｍｍ間隔、心尖部から１０−１２スライス、２Ｄ  Ｆｉｅｓｔａ撮像した（短軸断面）。撮像で得られたデータは、ソフトフェアアプリケーションＣａｒｄｉａｃ  ＶＸを使用し、解析を行った。心機能の評価項目として、ＬＶＥＦ（左室駆出率％）、ＳＶ（一回拍出量ｍＬ）、ＥＤＶ（拡張末期容量ｍＬ）、ＥＳＶ（(収縮末期容量ｍＬ)を算出した。速度に関する指標として、ＨＲ（心拍数ｂｐｍ）、ＰＦＲ（最大充填速度ｍＬ／ｓ）、ＰＥＲ（最大駆出速度ｍＬ／ｓ）を算出した。その他には、Ｍａｓｓ  ＥＤ（ｇ）、Ｃａｒｄｉａｃ  Ｏｕｔｐｕｔ（Ｌ／ｍｉｎ）、Ｍａｓｓ（ｇ）、Ｍａｓｓ  ＥＳ（ｇ）、Ｅｎｄ−Ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  Ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  Ｖｏｌｕｍｅ（ｍＬ）、Ｅｎｄ−Ｓｙｓｔｏｌｉｃ  Ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  Ｖｏｌｕｍｅ（ｍＬ）を算出した。
【００６９】
また、心筋計時変化解析Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎと遅延造影ＬＧＥ解析を実施し、心筋非正常部位に存在する梗塞・線維化領域も定量的に算出した。心筋計時変化解析Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎは、まず造影剤（オムニスキャン静注３２％静注用）を静脈Ｊレートから急速静注し、造影剤が心筋を最初に通過する過程を画像化した（短軸断面）、撮像で得られたデータは、ソフトフェアアプリケーションＣａｒｄｉａｃＶＸを使用し、解析を行った。遅延造影ＬＧＥ解析は、まず造影剤（オムニスキャン静注３２％静注用０．２５ｍＬ／ｋｇ）を静脈投与してから１０−２０分後にＦａｓｔＧＲＥ撮像した（短軸断面）。撮像で得られたデータは、ソフトフェアアプリケーションＣａｒｄｉａｃＶＸを使用し、解析を行った。梗塞領域、線維化領域では、高信号に描写されるため、正常領域との違いをＲｅｇｉｏｎ  Ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＲＯＩ）解析で定量的に算出した。左室機能解析と同様に、数点を設定しオートで計測するが、明らかに領域が違うと思われる場合は、修正を行
った。なお、心筋組織中の梗塞部位の割合を％でも表した。
【００７０】
＜統計解析＞
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける検証のデータは平均±ＳＤ（標準偏差）で表す。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける検証のデータは平均±ＳＥ（標準誤差）で表す。２群間の有意差は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔで算出した。３群以上の変動差は一元配置分散分析により算出した。その後、３群間の有意差は、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｔｅｓｔにより算出した。０．０５より低いｐ値は有意に異なると見なした。
【００７１】
以下、実験結果を示す。
＜ＣＤ１０６＋ラット線維芽細胞によるラット慢性心不全モデルの治療効果＞
セルソーティングし、回収したＣＤ１０６＋ラット線維芽細胞を、ラット慢性心不全モデルに心筋内投与し、心不全の回復効果を細胞投与後１８週間で評価した。その結果を図７に示す。ＣＤ１０６＋ラット線維芽細胞の投与群はコントロールと比較して、投与後１８週においては、ＥＦが３２．９％改善し、ＦＳが１２．４％改善することが明らかとなった。また、ＬＶＥＤＶの極端な増大・減少や、ＬＶＥＳＶの増大は投与後１８週にわたって確認されなかった。なお、主項目（ＬＶＥＦ、ＬＶＦＳ、ＬＶＥＤＶ、ＬＶＥＳＶ）の内訳と、副次項目（ＬＶＩＤｄ、ＬＶＩＤｓ、ＩＶＳＴｄ、ＬＶＰＷＴｄ、ＨＲ）の内訳を表１〜９に示す。
【００７２】
【表１】
2019218408.tif 000003
【００７３】
【表２】
2019218408.tif 000004
【００７４】
【表３】
2019218408.tif 000005
【００７５】
【表４】
2019218408.tif 000006
【００７６】
【表５】
2019218408.tif 000007
【００７７】
【表６】
2019218408.tif 000008
【００７８】
【表７】
2019218408.tif 000009
【００７９】
【表８】
2019218408.tif 000010
【００８０】
【表９】
2019218408.tif 000011
【００８１】
以上の実験より慢性心不全の効果的な治療における、ＶＣＡＭ−１ポジティブの線維芽細胞の重要性が実証され、ＣＤ１０６＋線維芽細胞の投与が、慢性心不全の治療において好ましい結果を生むことが理解できる。ＶＣＡＭ−１ポジティブ線維芽細胞の注射は、慢性心不全だけでなく、上記示したとおり心筋梗塞も治療できたことから、他の心臓疾患治療に対しても、効果的であることが考えられる。
【００８２】
＜ヒト心臓線維芽細胞内のＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞の局在＞
ヒト胎児心臓から回収した心臓線維芽細胞（ＦＣＦ）と、ヒト成体心臓から回収した心臓線維芽細胞（ＡＣＦ）を２種用意し、マウスＣＤ１０６とマウスＣＤ９０に相同性を有するヒトＣＤ１０６とヒトＣＤ９０の発現レベルをフローサイトメトリーで評価した。結果を図８に示す。ＡＣＦはエピジェネティクスの影響を考慮し、２種類用意した。その結果、ｃ２１ｗＦＣＦは、ＣＤ１０６陽性細胞率が９．１３％、ＣＤ９０陽性細胞率が２４．５％、両陽性細胞（ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞）率が８．２０％で局在することが明らかとなった。一方で、ｃ５０ｙＡＣＦは、ＣＤ１０６陽性細胞率が１２．５３％、ＣＤ
９０陽性細胞率が５．７９％、両陽性細胞（ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞）率が１．７９％で局在することが明らかとなった。また、ｂ６０ｙＡＣＦは、ＣＤ１０６陽性細胞率が５．５５％、ＣＤ９０陽性細胞率が９６．３９％、両陽性細胞（ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞）率が５．４３％で局在することが明らかとなった。なお、上記陽性細胞率は全て細胞数基準である。
本結果から、すべての心臓線維芽細胞にＣＤ１０６+ヒト線維芽細胞が局在することが明らかとなった。
【００８３】
＜ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞のセルソーティング＞
ヒト心臓から回収した心臓線維芽細胞からＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞を高純度に回収するため、ａｕｔｏＭＡＣＳでＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞のセルソーティングを行った。ａｕｔｏＭＡＣＳでソーティングしたＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞の細胞特性を評価した。結果を図９に示す。回収したＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞はＣＤ１０６陽性細胞が９５．９８％で、ＣＤ９０陽性細胞が９２．２８％で、両陽性細胞が８９．１５％であることが明らかとなった。従って、ほぼすべての細胞がＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞のポピュレーションを示すマーカータンパク質であるＣＤ１０６、ＣＤ９０に陽性であることが明らかとなった。なお、上記陽性細胞率は全て細胞数基準である。
また、ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞が造腫瘍性及び多能性幹細胞のマーカーに陽性であるかを評価するため、ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞をＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２で免疫蛍光染色し、陽性細胞率（％、細胞数換算）の評価を行った。その結果を図１０に示す。ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞は、上記のマーカーに陰性であり、造腫瘍性や多能性幹細胞の性質は有さなかった。
【００８４】
＜ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞の細胞特性＞
ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞を線維芽細胞や間葉系幹細胞の細胞骨格マーカーであるＶｉｍｅｎｔｉｎ、上皮細胞のマーカーであるＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ、心筋細胞のギャップジャンクションのマーカーであるＣｏｎｎｅｘｉｎ４３で免疫蛍光染色したところ、すべてのＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞がＶｉｍｅｎｔｉｎとＣｏｎｎｅｘｉｎ４３を発現していることが分かった。その結果を図１１に示す。
また、ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞のＳＴＲＯ−１発現率をフローサイトメトリーで評価したところ、ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞はＳＴＲＯ−１に０．２９％陽性であり、ほぼすべてのＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞がＳＴＲＯ−１を発現しないことが明らかとなった。その結果を図１２に示す。「ＳＴＲＯ−１とは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の最もよく知られた分子マーカーのひとつで、細胞内カルシウムの喪失に応答して小胞体から細胞膜に局在を変える１回膜貫通型タンパク質である（Ｂａｒｋｈｏｒｄａｒｉａｎ  Ａ，  Ｓｉｓｏｎ  Ｊ，  Ｃａｙａｂｙａｂ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ：  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｐａｌａｔａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ２０１１；  ５：２７８−２８１.）。骨髄ストローマ細胞からＳＴＲＯ−１陽性、ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａ陰性の細胞分画を単離すると、高いコロニー形成能と多分化能を有する細胞集団を得ることができると知られている（Ｓｉｍｍｏｎｓ  ＰＪ，  Ｔｏｒｏｋ−Ｓｔｏｒｂ  Ｂ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｏｍａｌ
ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｂｙ
ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，  ＳＴＲＯ−１．  Ｂｌｏｏｄ１９９１；７８：５５−６２．，Ｔｏｍｏｈｉｋｏ  Ｋａｚａｍａ．Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｉｈｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．  ２０１６；７５（２）：６１−６６.）。」
【００８５】
＜ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞によるラット慢性心不全モデルの治療効果＞
上記ソーティングし、回収したＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞を、ラット慢性心不全モデルに心筋内投与し、心不全の回復効果を細胞投与後１８週間評価した。その結果を図１２に示す。ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞の投与群はコントロールと比較して、投与後１８週においては、ＥＦが３２．６０％改善し、ＦＳが１７．８５％改善することが明らかとなった。また、ＬＶＥＤＶの極端な増大・減少や、ＬＶＥＳＶの増大は投与後１８週にわたって確認されなかった。なお、主項目（ＬＶＥＦ、ＬＶＦＳ、ＬＶＥＤＶ、ＬＶＥＳＶ）の内訳と、副次項目（ＬＶＩＤｄ、ＬＶＩＤｓ、ＩＶＳＴｄ、ＬＶＰＷＴｄ、ＨＲ）の内訳を表１０〜１８に示す。コントロールの結果は、ＣＤ１０６＋ラット線維芽細胞によるラット慢性心不全モデルの治療効果の実験で得た結果を用いた。
【００８６】
【表１０】
2019218408.tif 000012
【００８７】
【表１１】
2019218408.tif 000013
【００８８】
【表１２】
2019218408.tif 000014
【００８９】
【表１３】
2019218408.tif 000015
【００９０】
【表１４】
2019218408.tif 000016
【００９１】
【表１５】
2019218408.tif 000017
【００９２】
【表１６】
2019218408.tif 000018
【００９３】
【表１７】
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【００９４】
【表１８】
2019218408.tif 000020
【００９５】
＜ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞の投与量の検討＞
ソーティングし、回収したＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞を、ラット慢性心不全モデルに２種類の濃度（２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／５０μＬ、及び５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬ）で心筋内投与し、心不全の回復効果を細胞投与後８週間で評価した。その結果を図１４に示す。ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞（２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／５０μＬ）投与群はコントロールと比較して、投与８週後においてＥＦが３０．１８％改善し、ＦＳが１５．６５％改善することが明らかとなった。また、ＬＶＥＤＶの極端な増大・減少や、ＬＶＥＳＶの増大は投与後８週にわたって確認されなかった。一方で、ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞（５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬ）投与群は、コントロールと比較して、投与８週後においてＥＦが２６．９０％改善し、ＦＳが１３．６３％改善することが明らかとなった。なお、投与８週後において、ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞（２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／５０μＬ）投与群とＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞（５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬ）投与群にＥＦ及びＦＳの有意な差は確認できなかった。しかしながら、投与量の増加に応じて、心不全治療効果が早期に確認できることが明らかとなった。コントロールの結果は、ＣＤ１０６＋ラット線維芽細胞によるラット慢性心不全モデルの治療効果の実験で得た結果を用いた。ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞（２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／５０μＬ）投与群の結果は、表２で得た結果を用いた。
また、主項目（ＬＶＥＦ、ＬＶＦＳ、ＬＶＥＤＶ、ＬＶＥＳＶ）の内訳と、副次項目（ＬＶＩＤｄ、ＬＶＩＤｓ、ＩＶＳＴｄ、ＬＶＰＷＴｄ、ＨＲ）の内訳は表１９−２７に示した。
【００９６】
【表１９】
2019218408.tif 000021
【００９７】
【表２０】
2019218408.tif 000022
【００９８】
【表２１】
2019218408.tif 000023
【００９９】
【表２２】
2019218408.tif 000024
【０１００】
【表２３】
2019218408.tif 000025
【０１０１】
【表２４】
2019218408.tif 000026
【０１０２】
【表２５】
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【０１０３】
【表２６】
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【０１０４】
【表２７】
2019218408.tif 000029
【０１０５】
＜ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞によるブタ慢性心不全モデルの治療効果＞
次に、解剖学的・生理学的にヒトに近しい心臓を有することが報告されているブタで、慢性心不全モデルを作製し、ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞による心不全の治療効果を評価した。結果を図１５、１６及び１７に示す。ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞投与日前日のＬＶＥＦは４３％、ＳＶは３０．４ｍＬ、ＥＤＶは７０．５ｍＬ、ＥＳＶは４０．０ｍＬ、ＨＲは１００ｂｐｍ、ＰＦＲは２３１ｍＬ／ｓ、ＰＥＲは１６１ｍＬ／ｓだった。また、ＲＯＩ解析により算出した梗塞重量（線維化領域重量）は１０．２ｇで、左室心筋重量は７８．１ｇであったことから、梗塞巣（線維化領域）（％）は、１３．１％であることが明らかとなった。
【０１０６】
一方で、ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞の投与後４週時点のＬＶＥＦは５８％、ＳＶは３８．６ｍＬ、ＥＤＶは６６．９ｍＬ、ＥＳＶは２８．２ｍＬ、ＨＲは９８ｂｐｍ、ＰＦＲは２３２ｍＬ／ｓ、ＰＥＲは２１５ｍＬ／ｓだった。ＬＶＥＦはＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞の投与後４週で１５％改善し、ＳＶは８．２ｍＬ改善することが明らかとなった。また、ＥＳＶが１１．８ｍＬ低減し、ＰＥＲが５４ｍＬ／ｓに向上していることから、心機能が改善されたことが明らかとなった。また、ＲＯＩ解析により算出した梗塞重量（線維化領域重量）は８．２３ｇで，左室心筋重量は８９．２ｇであったことから、梗塞巣（線維化領域）（％）は、９．２３％であることが明らかとなった。本結果から、ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞が梗塞重量（線維化領域重量）を１．９７ｇ低減することが明らかとなった。
【０１０７】
ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞の投与後８週時点のＬＶＥＦは５２％、ＳＶは３５．９ｍＬ、ＥＤＶは６９．２ｍＬ、ＥＳＶは３３．３ｍＬ、ＨＲは９２ｂｐｍ、ＰＦＲは２６３ｍＬ／ｓ、ＰＥＲは１５６ｍＬ／ｓだった。ＬＶＥＦはＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞の投与後８週で８％改善することが明らかとなった。また、ＲＯＩ解析により算出した梗塞重量（線維化領域重量）は８．５１ｇで，左室心筋重量は９１．６ｇであったことから、梗塞巣（線維化領域）（％）は、９．２９％であることが明らかとなった。本結果から、ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞の投与が梗塞重量（線維化領域重量）を投与から８週間で１．６９ｇ低減させることが明らかとなった。また，梗塞・線維化領域（％）は移植後４週とほぼ変化がなかった。本結果から、ＣＤ１０６＋ヒト線維芽細胞は、解剖学的・生理学的にヒトに近しいとされるブタの心不全においても、高い心機能回復効果をもたらすことが明らかとなった。
【図１Ａ】
2019218408.tif 000030
【図１Ｂ】
2019218408.tif 000031
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
2019218408.tif 000035
【図３Ａ】
2019218408.tif 000036
【図３Ｂ】
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【図４】
2019218408.tif 000038
【図５】
2019218408.tif 000039
【図６】
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【図７】
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【図８】
2019218408.tif 000042
【図９】
2019218408.tif 000043
【図１０】
2019218408.tif 000044
【図１１】
2019218408.tif 000045
【図１２】
2019218408.tif 000046
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2019218408.tif 000049
【図１６】
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【図１７】
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