(57)【要約】【課題】、神経細胞死を抑制することができる、新たな薬剤及び神経細胞死抑制用食品組成物を提供すること。【解決手段】本発明の神経細胞死抑制剤は石蓮花の抽出物を含有することを特徴とする。また、本発明の神経細胞死抑制用食品組成物は石蓮花の抽出物を含有することを特徴とする。本発明における石蓮花の抽出に用いる溶媒としては、有機溶媒を用いることが好ましく、例えばエーテル、ＴＨＦ、酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルム等を用いることができる。好ましいのは水に難溶性の有機溶媒であり、さらに好ましいのはジメチルエーテルである。【選択図】図２
2019094302.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
石蓮花の抽出物を含有する神経細胞死抑制剤。
【請求項２】
前記抽出物はエーテル抽出物である請求項１に記載の神経細胞死抑制剤。
【請求項３】
石蓮花の抽出物を含有することを特徴とする神経細胞死抑制用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経の細胞死を抑制する神経細胞死抑制剤及び神経細胞死抑制用食品組成物に関し、神経細胞死が関与する疾病（例えば、認知症等）の研究用ツール等に好適に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞は神経系を構成する細胞であり、情報処理と情報伝達という動物にとって非常に重要な役割を担っている。神経細胞に異変が生ずると、様々な疾病を引き起こす。例えば、アルツハイマー症は脳の神経細胞が細胞死することによって発症する。また、パーキンソン病は中脳黒質のドーパミン神経細胞が減少することによって発症する。
【０００３】
従来、脳内神経細胞の細胞死は、アミロイド蛋白の蓄積が原因であるとして、アミロイド蛋白の蓄積防止を目的として様々な薬剤が開発されてきた。しかしながら、こうして開発された薬剤は認知症の治療薬として充分な薬効を奏するものはなく、アミロイド蛋白の蓄積が認知症の直接的な原因であるとする説には疑問が生じている。
【０００４】
このため、脳内に蓄積するタウ蛋白が認知症の原因であるとする説が注目され、タウ蛋白の蓄積を防止する薬剤が開発された。しかしながら、これらの薬剤についても、未だ認知症の治療薬として充分な薬効を奏するものはなく、認知症治療薬（あるいは防止薬）の開発は暗礁に乗り上げた状況となっている。
【０００５】
したがって、認知症の治療や予防を目的とする創薬開発には、神経細胞死を引き起こす薬剤や神経細胞死を防止する薬剤について、それらの作用を研究し、発病の機構を再検討することが必要である。また、神経細胞死を抑制する薬剤を開発することにより、認知症等の神経細胞死に関係する病気の治療薬や予防薬となることも期待できる。
【０００６】
従来、神経細胞死を引き起こす薬剤として、ドウモイ酸が知られている（非特許文献１）。しかしながら、神経細胞死を抑制する薬剤についてはあまり知られておらず、新たな神経細胞死抑制剤の開発が望まれていた。
【０００７】
なお、本件発明の神経細胞死抑制剤とは作用効果が異なるが、本件発明におと同様、石蓮花を原料とする薬剤として血糖値降下剤（特許文献１〜３）や糖吸収抑制剤（特許文献４）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−２０３９９３号公報
【特許文献２】特開２００６−１６０７１０号公報
【特許文献３】特開２００３−１７１３０５号公報
【特許文献４】特開２００６−２４１０５４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Olga M. Pulido  Domoic Acid Toxicologic Pathology  A Review  Mar. Drugs 2008, 6, 180-219
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記従来の問題点を解決するためになされたものであり、神経細胞死を抑制することができる、新たな薬剤を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は上記課題を解決するため、神経細胞死を引き起こす薬剤であるドウモイ酸に着目した（下記化学式参照）。
【００１２】
【化１】
2019094302.tif 000003
【００１３】
ドウモイ酸は駆虫薬として用いられていた紅藻ハナヤナギから分離・同定されたイミノ酸であり、グルタミン酸及びアスパラギン酸の分子骨格を有する分子である。グルタミン酸及びアスパラギン酸は脳内の興奮性神経伝達物質であり、過量に放出されると神経細胞死を起こすことが知られている。ドウモイ酸は、このような興奮性神経伝達物質の３種の薬物受容体（NMDA, AMPA, Kainate 受容体）のうち、カイニン酸受容体に作用する。他の受容体と同様に過量は細胞外からのカルシウム流入と貯蔵部位からのカルシウム遊離によって細胞内カルシウム濃度を挙げてミトコンドリアの変形とATP産生能を低下させる。その結果、ドウモイ酸は、カスペース９の細胞外への遊離などから神経細胞のアポトーシスそしてdeathに導く。
【００１４】
本発明者は、ドウモイ酸が有する神経細胞死誘発作用を利用し、その作用を抑制する物質を多くの天然物の中からスクリーニングすることにした。そして、鋭意研究を行った結果、石蓮花からの抽出物が神経細胞死抑制剤として有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明の神経細胞死抑制剤は、石蓮花の抽出物を含有することを特徴とする。本発明者は、ラットの腹腔内に石蓮花抽出物を投与した場合、ドウモイ酸の神経細胞死の作用が抑制されることを見出している。その抑制効果は、石蓮花の抽出物の中でも有機溶媒抽出物（さらに好ましくはエーテル抽出物）が強いことを見出している。
【００１６】
また、本発明の食品組成物は、石蓮花の抽出物を含有するため、神経細胞死を抑制する効果を奏することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ラットの脳組織の水平断面図である。
【図２】ドウモイ酸を脳内注射したラットのParietal cortex（頭頂皮質）部分の光学顕微鏡写真である（写真左側は石蓮花抽出物投与無し（実施例１）、写真右側は石蓮花抽出物投与有あり（比較例１））。
【図３】ドウモイ酸を脳内注射したラットのDentate gyrus（歯状回）部分の光学顕微鏡写真である（写真左側は石蓮花抽出物投与無し（実施例１）、写真右側は石蓮花抽出物投与有あり（比較例１））。
【図４】ドウモイ酸を脳内注射したラットのCA4部分の光学顕微鏡写真である（写真左側は石蓮花抽出物投与無し（実施例１）、写真右側は石蓮花抽出物投与有あり（比較例１））。
【図５】ドウモイ酸を脳内注射したラットのEntorhinal cortex（嗅内皮質）部分の光学顕微鏡写真である（写真左側は石蓮花抽出物投与無し（実施例１）、写真右側は石蓮花抽出物投与有あり（比較例１））。
【図６】ドウモイ酸を脳内注射したラットのPRh部分の光学顕微鏡写真である（写真左側は石蓮花抽出物投与無し（実施例１）、写真右側は石蓮花抽出物投与有あり（比較例１））。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明において用いられる「石蓮花」の用語は漢薬名であり、ベンケイソウ科に属する石蓮属植物の総称として用いられている。
【００１９】
また、同属植物は、地域によっては多数の異名を有しており、例えば、メキシコなど熱帯アメリカではエチェバリア グラウカ(Echevariaglauca)またはコチレドン グラウカ(Cotyledonglauca)の別名でも知られており、本発明における石蓮花とは、それらの中でいずれかに限定されるものではない。
【００２０】
上記の石蓮属植物としては、例えばシノクラスラ インディカ(Sinocrassulaindica、石蓮)、シノクラスラ ウンナンエンシス(Sinocrassulayunnanensis、雲南石蓮)、シノクラスラ アンビグア(Sinocrassulaambigua、長萼石蓮)、シノクラスラ デンシロスラータ(Sinocrassuladensirosulata、密叶石蓮)、シノクラスラ テキネシス(Sinocrassulatecinesis、徳欽石蓮)、シノクラスラ ラナイスチラ(Sinocrassulalanaistyla、長柱石蓮)などが挙げられ、エチェバリア グラウカまたはコチレドン グラウカが含まれることもあり、それらの葉や茎を用いることができる。また、石蓮属植物を原料する健康食品素材を用いることもできる。
【００２１】
本発明において、石蓮花は所定の部位または全草を採取して直ちに、あるいは乾燥し、それを抽出原料とすることができる。これらの抽出原料は抽出効率を高めるために細断・粉砕したものを用いることが好ましい。
【００２２】
本発明における石蓮花の抽出に用いる溶媒としては、有機溶媒を用いることが好ましく、例えばエーテル、ＴＨＦ、酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルム、炭化水素、ジクロロメタン、四塩化炭素、アセトン、各種アルコール類等を用いることができる。それらの有機溶媒は混合溶媒として抽出に用いてもよい。好ましいのは水に難溶性の有機溶媒であり、さらに好ましいのはジメチルエーテルである。
【００２３】
抽出は、室温で行ってもよいし、加温してもよい。抽出温度は、室温と溶媒の沸点の間で任意に設定できる。加温抽出の場合は、還流して抽出することにより、抽出率をさらに高めることができる。
【００２４】
抽出後に、固形物をろ別して得られる抽出液は、常法により濃縮して抽出エキスとしてもよい。濃縮は、減圧下に低温で行うのが好ましい。濃縮は抽出液が乾固するまで行ってもよい。抽出エキスは、そのまま本発明の組成物を調製するのに用いてもよいが、粉末状または凍結乾燥品等として用いてもよい。これらの固形物とする方法は、当該分野で公知の方法を採用することができる。
【００２５】
したがって、本発明における抽出物とは、抽出液、抽出エキス、およびそれらを固形化して得られる固形物のいずれをも包含する。
【００２６】
なお、抽出液は、そのまま使用してもよいが、濃縮する前あるいは後にクロマトグラフ法、イオン交換クロマトグラフ法、溶媒による分配抽出等を単独あるいは組み合わせて精製してもよい。
【００２７】
石蓮花の抽出物は、そのままの状態、または適当な媒体で希釈して、あるいは医薬品の製造分野において公知の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤または液剤等、種々の医薬品の形態で使用することができる。用量としてはup-and-down 法により50% 有効量を算出するなどして適宜決定すればよいが、エーテル抽出物の場合0.1〜10mg/kg B.Wが好ましく、さらに好ましいのは0.2〜5mg/kg B.Wである。
【００２８】
これらの医薬品形態においては、適当な媒体を添加してもよい。そのような媒体としては、医薬的に許容される賦形剤、例えば結合剤(例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガントまたはポリビニルピロリドン)、充填剤(例えば乳糖、砂糖、トウモロコシ澱粉、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン)、滑沢剤(例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはポリエチレングリコール)、崩壊剤(例えば馬鈴薯澱粉)または湿潤剤(例えばラウリル硫酸ナトリウム)等が挙げられる。
【００２９】
また、石蓮花の抽出物を食品に添加したものを神経細胞死抑制用食品組成物として利用することができる。食品組成物の形態としては、例えば、固形、半固形または液体の製品、具体的には、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤または液剤等のほか、クッキー、せんべい、ゼリー、ようかん、ヨーグルト、まんじゅう等の菓子類、清涼飲料、お茶類、栄養飲料、スープ等の形態が挙げられる。
これらの食品の製造工程において、あるいは最終製品に、石蓮花の抽出物を添加して、神経細胞死抑制用食品組成物とすることができる。
【００３０】
本発明の神経細胞死抑制用食品組成物は錠剤とし、通常の方法でコーティングしてもよい。また、液体製剤とし、例えば水性または油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップまたはエリキシルの形態であってもよく、使用前に水または他の適切な賦形剤で再生する乾燥製品として提供してもよい。こうした液体製剤は、通常の添加剤、例えば懸濁化剤(例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン水添加食用脂)、乳化剤(例えばレシチン、ソルビタンモノオレエートまたはアラビアゴム)、(食用脂を含んでいてもよい)非水性賦形剤(例えばアーモンド油、分画ココヤシ油またはグリセリン、プロピレングリコールまたはエチルアルコールのような油性エステル)、保存剤(例えばｐ -ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピル、またはソルビン酸)、および所望により着色剤または香料等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明の神経細胞死抑制剤を具体化した実施例について説明する。
（実施例１）
・石蓮花の抽出
石蓮花は予め乾燥試料をエーテル抽出し、エバポレーターにて乾燥した後、エタノールに溶解して保存した。
【００３２】
・神経細胞死抑制効果試験
上記石蓮花抽出物のエタノール溶液を、無麻酔にてドウモイ酸脳内注射の前日及び当日3時間前に（合計2回）定められた用量を腹腔内投与した。用量決定は、石蓮花用量希釈段階の前処置にてup-and-down 法により50% 有効量を算出し、石蓮花の用量はエーテル抽出物0.5mg/kg B.W.とした。なお、試験を行ったラットの個体数は10例以上とした。
【００３３】
上記のようにして石蓮花抽出物を腹腔内投与したラットについて、Urethane 1 g/kg i.p.を用いて麻酔を施し、頭蓋骨頭頂部に27 G注射針を刺入できるようにドリルで穴を開けた。脳定位装置にて垂直方向にドリルで穴を開け、その穴に注射針を挿入し、約3.5 mmの深さに達した後、3×10-7 g/ml のドウモイ酸溶液 20 μl（切片作成後分りやすいようにカーボン添加）を注入した。その後、ゆっくり注射針を引き抜いて創部を消毒し縫合した。
【００３４】
・アポトーシス検出方法
ドウモイ酸で処理したラットは、翌日に４％パラホルムアルデヒド溶液で全身を灌流固定して、パラフィン包埋し、パラフィンブロックを薄切した。切片の厚さは1μmである。切片をグラスプレパラートに載せて固定し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。別のプレパラートではアポトーシス検出キット（和光：コード293-71501、TdT-mediated uUTP backend labeling 3’-OH terminal transferase手法）に従った。発色はPOD conjugated antibodyを浸漬させて、ウォッシュ後、DABで発色させた。アポトーシスは細胞核が茶褐色に発色することで容易に判別できる。さらにヘマトキシリン染色を軽く行い、アポトーシスになっていない細胞の核は、青暗色である。
【００３５】
（比較例１）
比較例１では石蓮花抽出物の替りに生理食塩水を腹腔内投与した。その他の処置については実施例１と同様であり、説明を省略する。
【００３６】
＜結  果＞
ラットの脳組織の水平断面図を図１に示す。また、ドウモイ酸を脳内に注入した後の各部位における光学顕微鏡写真を図２〜図６に示す。
【００３７】
・Parietal cortexにおける結果（図２参照）
図２の左側写真に示すように、比較例１（すなわち生理食塩水を投与したcontrol）では、側頭部前野に位置するParietal cortexにおいて、Tunel陽性細胞が束をなして密集しており、その大部分は、比較的小さい細胞であった。中には陰性細胞は少し散見された。以上のことから、石蓮花抽出物を投与しなかった比較例１においては、ドウモイ酸によって神経細胞死が顕著に引き起こされることが分かった。これに対して、図２の右側写真に示すように、石蓮花抽出物を投与した実施例１では、そのようなTunel陽性細胞はほとんど観察されず、神経細胞死の抑制効果が顕著に認められた。
【００３８】
・Dentate Gyrus（図３参照）及びCA4（図４参照）における結果
いっぽう、比較例１では海馬帯におけるHillおよびCA4に隣接する歯状回では、大きな細胞と小さな細胞がともにTunel染色陽性の細胞が認められ、小さな細胞が集まっている部位の大きな細胞が強く陽性に染まっていた（図３及び図４参照）。これらの結果から、ドウモイ酸による神経細胞死が顕著に認められた。これに対して、石蓮花抽出物を事前投与した実施例１では、小さな陽性細胞はほとんど見られず、大きな細胞がわずかに陽性になっている程度であって、神経細胞死の抑制効果が顕著に認められた。
【００３９】
・Entorhinal cortex（図５参照）及びPRh（図６参照）における結果
また、Entorhinal cortex及びPRhでは、比較例１においてTunel染色陽性の細胞は小さな細胞に限って認められた。一方、石蓮花抽出物を事前投与した実施例１では、このような小さな細胞についても陽性になることが抑制されていることが分かった。これらの小さな細胞は神経細胞と思われるが、神経膠細胞も石蓮花抽出物によってTunel染色が陰性化し、ドウモイ酸によって引き起こされるアポトーシス細胞死を石蓮花が強く抑制することが示された。
【００４０】
（有効用量について）
石蓮花の有効用量を調べた結果を表１に示す。この表に基づきup-and-down法によって50％有効用量を求めた結果、0.15mg/kg B.W.と算出された。上記の神経細胞死抑制効果試験は、すべて1 mg/kg B.W.を用いたものであり、50％有効量の約10倍であるため、ラット全例で十分な有効性を示したと考えられる。
【００４１】
【表１】
2019094302.tif 000004
【００４２】
以上の試験結果から、石蓮花のエーテル抽出物が神経細胞のドウモイ酸によるアポトーシスを予防的に抑制することが明確に示された。ドウモイ酸は、グルタミン酸・アスパラギン酸と同じ構造を有しており、自然発症の認知症予防に石蓮花エーテル抽出物が有効であることを示唆する。脳内の神経細胞のアポトーシスを石蓮花そのものによって直接的に抑制するだけでなく、神経膠細胞も石蓮花抽出物によってTunel染色が陰性化し、アポトーシス細胞死が強く抑制されたことから、今後の重大な神経変性疾患の解明における薬理学的ツールとして役立てることができる。また、それらの疾患の治療薬としても期待できるものである。
【００４３】
この発明は、上記発明の実施形態の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【図１】
2019094302.tif 000005
【図２】
2019094302.tif 000006
【図３】
2019094302.tif 000007
【図４】
2019094302.tif 000008
【図５】
2019094302.tif 000009
【図６】
2019094302.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月9日(2018.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
【図１】ラットの脳組織の水平断面図である。
【図２】ドウモイ酸を脳内注射したラットのParietal cortex（頭頂皮質）部分の光学顕微鏡写真である（写真左側は石蓮花抽出物投与無し（比較例１）、写真右側は石蓮花抽出物投与有あり（実施例１））。
【図３】ドウモイ酸を脳内注射したラットのDentate gyrus（歯状回）部分の光学顕微鏡写真である（写真左側は石蓮花抽出物投与無し（比較例１）、写真右側は石蓮花抽出物投与有あり（実施例１））。
【図４】ドウモイ酸を脳内注射したラットのCA4部分の光学顕微鏡写真である（写真左側は石蓮花抽出物投与無し（比較例１）、写真右側は石蓮花抽出物投与有あり（実施例１））。
【図５】ドウモイ酸を脳内注射したラットのEntorhinal cortex（嗅内皮質）部分の光学顕微鏡写真である（写真左側は石蓮花抽出物投与無し（比較例１）、写真右側は石蓮花抽出物投与有あり（実施例１））。
【図６】ドウモイ酸を脳内注射したラットのPRh部分の光学顕微鏡写真である（写真左側は石蓮花抽出物投与無し（比較例１）、写真右側は石蓮花抽出物投与有あり（実施例１））。
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月22日(2019.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
石蓮花のエーテル抽出物を含有する神経細胞死抑制剤。
【請求項２】
石蓮花のエーテル抽出物を含有することを特徴とする神経細胞死抑制用食品組成物。