(57)【要約】【課題】癌又は感染症の治療方法の提供。【解決手段】本発明は、新規組換え融合タンパク質、例えば、ワクシボディと呼ばれる、T細胞免疫応答及びB細胞免疫応答双方を引き起こすことが可能なヒト抗体に基づく分子等に関する。本発明はまた、これらの特異的融合タンパク質による癌又は感染症の治療方法に関する。【選択図】図１
2019033762.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの同一のアミノ酸鎖のホモ二量体タンパク質であって、
各アミノ酸鎖が、配列番号1のアミノ酸配列5-70と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むターゲティング単位、及び抗原単位を含み、
ターゲティング単位と抗原単位とが二量体形成モチーフを介して結合される、ホモ二量体タンパク質。
【請求項２】
ターゲティング単位が、配列番号1のアミノ酸3-70を含む、請求項１に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項３】
ターゲティング単位が、配列番号1のアミノ酸5-70から成る、請求項１又は２に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項４】
ターゲティング単位が、配列番号1のアミノ酸3-70から成る、請求項１〜３のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項５】
ターゲティング単位が、配列番号1のアミノ酸1-70から成る、請求項１〜４のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項６】
抗原単位が抗原scFvである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項７】
リンカー、例えば、（G4S）3リンカーが、抗原scFvにおいてVHとVLとを結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項８】
抗原scFvが、骨髄腫又はリンパ腫細胞によって産生されるモノクローナルIgに由来する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項９】
抗原単位が、テロメラーゼ又はその機能部分である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項１０】
テロメラーゼがhTERTである、請求項９に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項１１】
抗原単位が細菌に由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項１２】
細菌由来の抗原単位が、結核抗原及びブルセラ症抗原から選択される、請求項１１に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項１３】
抗原単位がウイルスに由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項１４】
ウイルス由来の抗原単位がHIVに由来する、請求項１３に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項１５】
HIV由来の抗原単位が、gp120又はGagに由来する、請求項１４に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項１６】
抗原単位が、インフルエンザウイルス血球凝集素（HA）、ヌクレオプロテイン、M2抗原; 単純ヘルペス2型の抗原糖タンパク質D; 及びヒトパピローマウイルス抗原、例えば、E1、E2、E6、E7、L1及びL2から成るリストから選択される任意の１つ、から成るリストから選択される、請求項１３に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項１７】
抗原単位が癌関連又は癌特異的抗原である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項１８】
癌の抗原単位が、メラノーマ抗原、例えば、メラノーマ抗原のチロシナーゼ、TRP-1又はTRP2である、請求項１７に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項１９】
癌抗原単位が、前立腺癌抗原、例えば、前立腺癌抗原PSAである、請求項１７に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項２０】
癌抗原単位が、ヒトパピローマウイルスに由来する、例えば、E1、E2、E4、E6及びE7から成るリストから選択される子宮頸癌抗原である、請求項１７に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項２１】
二量体形成モチーフが、ヒンジ領域、及び任意には二量体形成を促進する他の領域、例えば、免疫グロブリン領域を含み、任意にはヒンジ領域と免疫グロブリン領域とがリンカーを介して結合される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項２２】
ヒンジ領域が、Igに由来する、例えば、IgG3に由来する、請求項２１に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項２３】
ヒンジ領域が、１、２、又は複数の共有結合を形成する能力を有する、請求項２１又は２２に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項２４】
共有結合がジスルフィド架橋である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項２５】
二量体形成モチーフの免疫グロブリン領域が、C末端のC領域、又はC領域と実質的に相同の配列である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項２６】
C末端のC領域がIgGに由来する、請求項２５に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項２７】
二量体形成モチーフの免疫グロブリン領域が、ホモ二量体化する能力を有する、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項２８】
免疫グロブリン領域が、非共有結合性相互作用を介してホモ二量体化する能力を有する、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項２９】
非共有結合性相互作用が疎水性相互作用である、請求項２８に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項３０】
二量体形成領域が、CH2領域を含まない、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項３１】
二量体形成モチーフが、リンカーを介してヒトIgG3のCH3領域へ結合されるヒンジエクソンh1及びh4から成る、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項３２】
リンカーがG3S2G3SGリンカーである、請求項２１〜３１のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項３３】
抗原単位と二量体形成モチーフとが、リンカー、例えば、GLSGLリンカーを介して結合される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項３４】
ホモ二量体タンパク質が、配列番号1のアミノ酸1-70を含まない、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項３５】
ターゲティング単位が、配列番号2のアミノ酸3-70を含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項３６】
ターゲティング単位が、配列番号2のアミノ酸5-70から成る、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項３７】
ターゲティング単位が、配列番号2のアミノ酸3-70から成る、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項３８】
ターゲティング単位が、配列番号2のアミノ酸1-70から成る、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項３９】
ホモ二量体タンパク質が、配列番号2のアミノ酸1-70を含まない、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項４０】
ターゲティング単位がそれぞれ、68個以下のアミノ酸、例えば、68、67、又は66個のアミノ酸から成る、請求項1-4、6-37、39のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項４１】
ターゲティング単位が、ターゲティング単位の1及び2位にアミノ酸配列APを含まない、請求項1-4、6-37、39-40のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項４２】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質が、第二のホモ二量体タンパク質の結合性と比較して増大された結合性を有する第一のホモ二量体タンパク質であって、ここで第二のホモ二量体タンパク質が、配列番号2のアミノ酸1-70から成るターゲティング単位を有することのみ第一のホモ二量体タンパク質と異なり、増大された結合性が、CCR1、CCR3及びCCR5から選択されるいずれか１つのケモカイン受容体に関する結合性である、ホモ二量体タンパク質。
【請求項４３】
請求項１〜４２のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質を形成することができる単量体タンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項４４】
ベクターに含まれる、請求項４３に記載の核酸分子。
【請求項４５】
患者においてホモ二量体タンパク質の産生を誘発するための、患者への投与用に調製される、請求項４３又は４４に記載の核酸分子。
【請求項４６】
医薬としての使用のための、請求項１〜４２のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質又は請求項４３又は４４に記載の核酸分子。
【請求項４７】
請求項１〜４２のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質、又は請求項４３又は４４に記載の核酸分子を含む、医薬組成物。
【請求項４８】
請求項４３又は４４に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項４９】
請求項１〜４２のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質を調製するための方法であって、
ａ）請求項４３又は４４に記載の核酸分子を細胞集団中にトランスフェクトし、
ｂ）細胞集団を培養し、
ｃ）細胞集団から発現されたホモ二量体タンパク質を回収し精製する、
ことを含む、方法。
【請求項５０】
請求項１〜４２のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質、又はホモ二量体タンパク質を形成することができる単量体タンパク質をコードする請求項４３又は４４に記載の核酸分子の、免疫学的有効量を含む、癌又は感染症に対するワクチンであって、ワクチンがT細胞免疫応答及びB細胞免疫応答の双方を引き起こすことができ、ホモ二量体タンパク質が癌又は感染症に特異的な抗原単位を含む、ワクチン。
【請求項５１】
医薬的に許容される担体及び/又はアジュバントをさらに含む、請求項５０に記載のワクチン。
【請求項５２】
癌が、多発性骨髄腫若しくはリンパ腫、悪性メラノーマ、HPV誘発性の癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、及び/又は肝癌である、請求項５０又は５１に記載のワクチン。
【請求項５３】
感染症が、結核、インフルエンザ、ヘルペス、CMV、HPV、HBV、HIV、ブルセラ症、及び/又はHSV-2から成るリストから選択される、請求項５０又は５１に記載のワクチン。
【請求項５４】
患者における癌又は感染症の治療方法であって、請求項１〜４２のいずれか１項に記載のホモ二量体タンパク質、又はホモ二量体タンパク質を形成することができる単量体タンパク質をコードする請求項４３又は４４に記載の核酸分子を、それを必要とする患者に投与すること含み、ここでホモ二量体タンパク質が癌又は感染症に特異的な抗原単位を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、T細胞免疫応答及びB細胞免疫応答の双方を引き起こし得る、新規組換え融合タンパク質、例えば、ワクシボディ（vaccibody）と呼ばれるヒト抗体に基づく分子に関する。本発明はまた、これらの特異的融合タンパク質による、癌又は感染症、例えば、多発性骨髄腫又はインフルエンザ等の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAワクチン接種は、免疫応答を誘発する技術上簡素な方法である。しかしながら、小動物における成功は臨床試験において未だ再現されていない。一部のストラテジーは現在、DNAワクチンの有効性を増大するために続けられている。
【０００３】
抗原提示細胞（APC）へのタンパク質抗原のターゲティングは、T及びB細胞応答を改善しうる。組換え免疫グロブリン（Ig）分子は、斯かる目的に適切である。例えば、短い抗原エピトープは、Ig定常領域においてβ鎖間のループに取って代わることができ、一方でAPC上の表面分子に特異的な可変（V）領域に組換えIgを装着させることによって標的抗原デリバリーが得られる。しかしながら、このようなストラテジーは未同定のエピトープを含む大きな抗原には不適当であり、さらに短いT細胞エピトープを有する組換えIg分子は立体構造を有するエピトープに対して抗体を誘発できない。これらの制限を克服するため、立体構造のエピトープを維持しながら少なくとも550個のアミノ酸サイズの感染性又は腫瘍性抗原を発現する標的Igベースのホモ二量体DNAワクチン（ワクシボディ）が産生されている。
【０００４】
ケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド3（CCL3）は、ヒトにおいてCCL3遺伝子によってコードされるタンパク質である。CCL3は、マクロファージ炎症性タンパク質-1α（MIP-1α）としても知られるが、多形核白血球の動員及び活性化における急性炎症状態に関与するCCケモカインファミリーに属するサイトカインである。マウスCCL3は69個のアミノ酸の成熟ケモカインをコードしている単一のコピー遺伝子であるが、ヒト相同体が複製且つ変異され、２つの非対立変異体、LD78α（CCL3）及びLD78β（CCL3-L1）を生じており、これらは共にマウスCCL3と74%相同性を示している。
【０００５】
これまで、有効性の欠如が原因でヒトでの使用に認可されたDNAワクチンはない。また、一部の感染症に使用可能である効果的なワクチンは存在しない。特に、ヒトへの使用に認可された治療上のDNA癌ワクチンはない。
【０００６】
国際公開第2004/076489号は、ワクシボディと呼ばれる組換えのヒト抗体に基づく分子に関する。これは、T細胞及びB細胞免疫応答を引き起こすことが可能である。
【０００７】
米国特許出願第20070298051号は、哺乳類における免疫原への免疫応答を増強するためのMIP-1-アルファの使用に関する。
【０００８】
欧州特許第920522号は、サイトカイン又はケモカインをコードするヌクレオチド配列を含むcDNA標的生成物を含むポリヌクレオチドベクターワクチンに関する。
【０００９】
Fredriksen AB等（Mol Ther 2006;13:776-85）は、抗原提示細胞への腫瘍抗原を標的とするDNAワクチンに関して記載する。
【００１０】
Fredriksen AB及びBogen B（Blood 2007;110: 1797-805）は、マウスケモカイン-イディオタイプ融合DNAワクチンに関して記載する。
【００１１】
本発明の目的
本発明の実施形態は、弱抗原、例えば、骨髄腫細胞に由来するイディオタイプ抗原等にも、効率的な免疫応答を引き起こすことができる融合タンパク質を供することを目的とする。
【００１２】
さらに、例えば、弱抗原、例えば、骨髄腫細胞に由来するイディオタイプ抗原等に対しても効率的な免疫応答を引き起こす融合タンパク質をコードするDNAポリヌクレオチド等のポリヌクレオチドを供することもまた、本発明の実施形態の目的とする。これらのポリヌクレオチドは、疾患特異的抗原又は疾患関連抗原を特徴とする癌又は感染症に対する免疫賦活性組成物又はワクチンとして使用できる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
今回本発明者は、ヒトケモカインLD78βの全長及びその切断型が、APC表面への抗原エピトープを標的にするターゲティング単位（targeting unit）としての使用に適することを発見した。ケモカイン、又はその切断型は、ホモ二量体タンパク質コンストラクトの形態でAPCの表面上でケモカイン受容体に結合し、２つの同一ケモカインが結合してより効率的なターゲティング及びシグナル伝達を供することを促進する。ホモ二量体コンストラクトは、２つの同一の抗原エピトープをAPCへ送達しそしてそれらをT細胞へ提示することをさらに供する。ホモ二量体タンパク質コンストラクトが比較的大きいサイズあっても、細胞はインタクト分子を産生し排出できる。
【００１４】
つまり、第一の態様において、本発明は、２つの同一のアミノ酸鎖のホモ二量体タンパク質であって、ここで各アミノ酸鎖が、配列番号1のアミノ酸配列5-70と少なくとも80 %配列同一性を有するアミノ酸配列を含むターゲティング単位、及び抗原単位を含み、ターゲティング単位及び抗原単位が、二量体形成モチーフを介して結合されている、ホモ二量体タンパク質に関する。
【００１５】
第二の態様において、本発明は、２つの同一のアミノ酸鎖のホモ二量体タンパク質であって、各アミノ酸鎖が配列番号1のアミノ酸3-70を含むターゲティング単位、及び抗原単位を含み、ここでターゲティング単位及び抗原単位が二量体形成モチーフを介して結合される、ホモ二量体タンパク質に関する。
【００１６】
第三の態様において、本発明は、本発明のホモ二量体タンパク質を形成することができる単量体タンパク質をコードする核酸分子に関する。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、医薬としての使用のための本発明のホモ二量体タンパク質に関する。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、医薬としての使用のための、本発明のホモ二量体タンパク質を形成することができる単量体タンパク質をコードする核酸分子に関する。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、本発明のホモ二量体タンパク質を含む医薬組成物に関する。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、本発明のホモ二量体タンパク質を形成することができる単量体タンパク質をコードする核酸分子を含む医薬組成物に関する。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は、本発明のホモ二量体タンパク質を形成することができる単量体タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、本発明のホモ二量体タンパク質を調製するための方法であって、
ａ）本発明の核酸分子を細胞集団にトランスフェクトし、
ｂ）細胞集団を培養し、
ｃ）細胞集団から発現されたホモ二量体タンパク質を回収して精製する、
ことを含む方法に関する。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、癌又は感染症に対する、本発明のホモ二量体タンパク質又は本発明のホモ二量体タンパク質を形成することができる単量体タンパク質をコードする核酸分子の免疫学的有効量を含むワクチンであって、ワクチンがT細胞及びB細胞免疫応答双方を引き起こすことができ、ホモ二量体タンパク質が癌又は感染症に関する抗原単位を含むワクチンに関する。
【００２４】
さらなる態様において、本発明は、癌又は感染症に対する免疫調節性又は免疫賦活性組成物であって、本発明のホモ二量体タンパク質又は本発明のホモ二量体タンパク質を形成することができる単量体タンパク質をコードする核酸分子の免疫学的に有効な量を含み、ここで、免疫調節性又は免疫賦活性組成物がT細胞及びB細胞免疫応答の双方を引き起こすことが可能であり、ホモ二量体タンパク質が癌又は感染症に関連する抗原単位を含む組成物に関する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、患者における癌又は感染症の治療方法であって、本発明のホモ二量体タンパク質、又は本発明のホモ二量体タンパク質を形成することができる単量体タンパク質をコードする核酸分子を、それを必要とする患者に投与することを含み、ここでホモ二量体タンパク質が癌又は感染症に関連する抗原単位を含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、本試験で使用される融合ワクチンを表す。（A）は、ホモ二量体ケモカイン-抗原融合タンパク質（ワクシボディ（vaccibody））の模式的構造を表わす。ターゲティング単位、二量体形成単位及び抗原単位は、様々な単位で表わされる部分として示される。全コンストラクトにおいて、二量体形成単位及びヒンジは、ヒトIgG3に由来する。G3S2G3SGリンカーは、ヒンジエクソンh1+h4をCH3領域に結合する。GLSGLリンカーは、CH3と抗原単位とを結合し、一方（G4S）3リンカーは、抗原単位においてVHとVLとを結合する。（B）は、ヒトCCL3アイソフォームのNH2末端配列（アミノ酸1-12）、及びその点変異対照（C11S、太文字で表示）を表わす。スラッシュは、欠失を示す。（C）は、C11S点突然変異が、ケモカイン構造においてS-S架橋を破壊することが推定されることを表す（右側）。
【００２７】
【図２】図２は、ELISA及びウエスタンブロットによって、LD78β発現ワクシボディの特性評価を表す。5日目に採取した一過性にトランスフェクトした293E細胞の上清を、ワクシボディ分子の異なる成分に特異的なmAbsを使用することによってELISAで試験した。（A）望ましいターゲティング単位を有するワクシボディをコードするscFv315を、DNP-BSAコート（scFv315を結合する）への結合、及びビオチン標識HP6017（CH3二量体形成モチーフを結合する）での検出によって評価した。（B）望ましいターゲティング単位を有するCκCκをコードするワクシボディを、187.1 mAb（マウスCκを結合する）コートへの結合及びビオチン標識187.1 mAbでの検出によって評価した。（C）望ましいターゲティング単位を有するHAをコードするワクシボディを、MCA878-G（抗CH3二量体形成モチーフ）への結合及びビオチン標識された抗HA mAb H36-4-52での検出によって評価した。（D）非還元条件下のビオチン標識HP6017でプローブしたワクシボディのウエスタンブロットを示す。左から順に、（LD78βFv315）2、（LD78βC11SFv315）2、（LD78β-2Fv315）2である。
【００２８】
【図３】図３は、LD78βワクシボディタンパク質が、ヒト細胞上のケモカイン受容体に結合することを表す。25 μg/mLの望ましいホモ二量体ワクシボディタンパク質を、ヒトCCR5（A、B）、又はヒトCCR1（C、D）で安定してトランスフェクトしたHEK 293細胞と混合した。結合されたワクシボディタンパク質を、scFv315抗原単位に特異的なビオチン標識Ab2.1-4 mAbによって、続いてPE-ストレプトアビジンによって検出した。太線:（LD78βFv315）2（A、C）及び（LD78β-2Fv315）2（B、D）ワクシボディ。（A）の点線:（LD78β（C11S）Fv315）2。斜線ヒストグラム: ビオチン標識Ab2.1-4 mAb及びPE-ストレプトアビジン単独。
【００２９】
【図４】図４は、LD78βワクシボディタンパク質がマウスケモカイン受容体に結合し、マウス細胞の走化性を誘発することを表す。（LD78βFv315）2ワクシボディ（オープンヒストグラム）｛C11S変異体（斜線ヒストグラム）ではない｝は、CD11b+BALB/c脾細胞に結合し（A）、リンパ球性Esb/MP細胞上で走化性活性を表す（B）。
【００３０】
【図５】図５は、LD78βターゲティング単位を有するワクシボディがCD4+ T細胞へのMHCクラスII制限提示に関して、抗原をマウス（A）及びヒト（B）APCへ有効に送達することを表す。（A）抗原単位としてscFv315を有する精製ワクシボディの異なる量を、照射（8 gy）BALB/c脾細胞と混合し、続いてTCRトランスジェニックマウス由来のId（λ2315）特異的Th2 T細胞を添加した。48時間後、培養物を3Hチミジンで２４時間パルス標識（pulse）した。（B）一過性にトランスフェクトした293E細胞由来のマウスCκ含有ワクシボディ上清の異なる量（CκCκのモル濃度（M）として発現）を、DR4*01 PBMCと混合し、続いて照射しマウスCκ-特異的T18 T細胞と混合した。48時間後、プレートを3Hチミジンで24時間パルス標識した。
【００３１】
【図６】図６は、LD78βFv315ワクシボディDNAで免疫したマウスにおける抗Id315免疫応答を表す。マウスをDNAの皮内投与によって免疫し、続いて即座に注射部位の電気穿孔を行った。ある種のワクシボディ及び対照を示す。３週間後に得られた血清を、M315骨髄腫タンパク質を結合している抗Id IgG1（A）又はIgG2a（B）抗体に関して試験した。一群あたり最大7匹のマウスの平均を示す。p値は、４週におけるLD78β vs LD78β（C11S）（*）、及びLD78β vs （FvNIP）2ワクシボディ（**）を意味する。
【００３２】
【図７】図７は、LD78βワクシボディによるCD4+及びCD8+インフルエンザ赤血球凝集素特異的T細胞応答の誘発を表す。マウス（n=3）を、DNAの皮内投与によって免疫し、続いて即座に注射部位の電気穿孔を行った（Dermavax、Cytopulse、USA）。ある種のワクシボディ及び対照を示す。3週間後にマウスを屠殺し、それぞれの脾細胞懸濁液を望ましいMHCクラスII-及びクラスI-制限合成HAペプチド、又は無関係のペプチドでのエリスポットアッセイにおいて使用した。IFNγ 応答を評価した。p値は、LD78β vs LD78βC11S及びLD78β vs 0.9% NaCl（*）、及びLD78βC11S vs 0.9% NaCl（**）を意味する。
【００３３】
【図８】図８は、LD78βワクシボディがアカゲザルCCR5に結合することを表す。25 μg/mLのワクシボディタンパク質を、アカゲザルCCR5を安定してトランスフェクトしたHEK 293と混合した。結合されたワクシボディタンパク質を、scFv315抗原単位に特異的なビオチン標識Ab2.1-4 mAbによって、続いてPE-ストレプトアビジンによって検出した。太線は、（A）においてワクシボディ（LD78βFv315）2を、（B）において（LD78β-2Fv315）2を示す。（A）の点線は、（LD78β（C11S）Fv315）2ワクシボディを示す。A及びB双方において、斜線ヒストグラムはビオチン標識Ab2.1-4 mAb及びPE-ストレプトアビジン単独を示す。
【００３４】
【図９】図９は、インフルエンザの致死的曝露に対する保護を表す。Balb/cマウスにを、電気穿孔（DermaVax）と組み合わせて25μg DNAで皮内に一度免疫し、14日後にPR8インフルエンザウイルス（H1N1）の致死量を曝露した（n= 6/群）。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の詳細な説明
DNAワクチンの有効性は、増大する必要がある。マウスにおいて有望なストラテジーは、ケモカイン受容体を介して抗原提示細胞（APC）への抗原を標的にする、融合タンパク質をコードするDNAを作成することである。大型動物及びヒトに対するDNAワクチンの改良のために、このストラテジーを拡張することが重要である。本発明によれば、ヒトMIP-1αケモカインは、異なる抗原単位と融合できる。融合タンパク質は、ターゲティング及び抗原単位の機能活性及び立体構造を正確にそれぞれ保持する。融合タンパク質は、クローン化ヒトCD4+T細胞の応答を改善できる。さらに、LD78β融合タンパク質はマウスケモカイン受容体に結合するので、ヒトDNAワクチンはマウスにおいて試験できる。本発明のLD78β DNA融合ワクチンは、マウスにおいてプラズミド注入及び皮膚電気穿孔後に、改善されたT細胞及び抗体応答を誘発した。CD8+T細胞応答は特に増強され、それは効率的な交差提示を示している。LD78βの２つのアミノ酸NH2-切断型は、本発明者等によって、インビトロ（in vitro）で全長LD78βと比較してマウス細胞に優れた結合を有することが分かった。驚いたことに、LD78 βの全長型は、インビボ（in vivo）のマウスモデルで優れた効果を示した。LD78β-ワクチンタンパク質は本発明者によって、アカゲザルCCR5に結合することが分かり、このことは非ヒト霊長類における標的DNA免疫化のきっかけとなる。
【００３６】
本発明のワクシボディは、組換えIgベースのホモ二量体ワクチンとすることができ、各鎖はIgヒンジ及びCH3に直接結合したターゲティング単位から構成され、その組合わせは共有結合性ホモ二量体形成を誘発する（図1A）。
【００３７】
マウスCCL3は69個のアミノ酸の成熟ケモカインをコードする単一のコピー遺伝子であるが、ヒト相同体が複製且つ変異されて２つの非対立性変異体、LD78α（CCL3）及びLD78β（CCL3-L1）が産生されており、共にマウスCCL3と74%相同性を示している。２つの変異体は96%相同性を有し、違いは2位におけるS又はP及び39及び47位におけるGとSとのスワップである。
【００３８】
本発明によれば、ヒトCCL3変異体及び異なる抗原単位は、機能タンパク質として作成し発現できる。特に本発明は、抗原提示細胞への抗原デリバリーを標的にする、融合ワクチンにおけるLD78β及びその天然のアイソフォームの利用に関する。
【００３９】
本発明のワクシボディは、ワクチン（免疫賦活性組成物）の免疫原性の改良を目的とする。プロフェッショナル抗原提示細胞上のLD78β受容体への抗原デリバリーを標的にする、融合タンパク質をコードするDNAワクチンは本発明の範囲内である。
【００４０】
LD78β又はそのNH2切断型を備えたワクシボディは、本発明者によってインビトロ（in vitro）でマウス又はアカゲザル又はヒトCCR1及び/又はCCR5（LD78βに関する受容体）を発現している細胞に結合することが分かり、対照の標的化されていないワクシボディと比較して、DNA注入及び電気穿孔後にインビトロ（in vitro）での抗原デリバリー及びインビボ（in vivo）での体液性及び細胞性免疫応答の増大を供した。
【００４１】
本発明の組換えタンパク質は、多発性骨髄腫を含む多くのタイプの癌又は感染症の治療において有用なヒト抗体様分子となり得る。ワクシボディと呼ばれるこれらの分子はまた、APCに結合し、T細胞及びB細胞免疫応答を共に引き起こすことができる。さらに、ワクシボディはAPCに二価で結合し、強力な免疫応答のより効率的な誘発を促進する。ワクシボディは、APC上の表面分子に関して特異性を有するターゲティング単位から成る単量体単位の二量体を含み、それは二量体形成モチーフ、例えば、ヒンジ領域及びCγ3領域等を介して、COOH末端又はNH2末端に存在する抗原単位に結合される。本発明はまた、斯かる組換えタンパク質をコードするDNA配列、このDNA配列を含む発現ベクター、斯かる発現ベクターを含む細胞株、ワクシボディDNA、ワクシボディRNA、又はワクシボディタンパク質での免疫化による哺乳類の選択的治療、及び最終的に医薬及び斯かる分子を含むキットに関する。
【００４２】
本発明のタンパク質中の二量体形成モチーフは、ヒンジ領域及び免疫グロブリン領域（例えば、Cγ3領域）、例えば、C末端のC領域（CH3領域）、又は実質的に斯かるC領域と相同である配列を含むように作成できる。ヒンジ領域は、Ig由来とすることができ、鎖間共有結合、例えば、ジスルフィド架橋の形成を介して二量体形成に寄与する。さらにそれは、可変距離を有して発現されたAPC上の２つのターゲティング単位が、同時に２つの標的分子に結合することを可能にする領域間の可動性スペーサーとして機能する。免疫グロブリン領域は、非共有結合性相互作用、例えば、疎水性相互作用を介してホモ二量体形成に寄与する。好ましい実施形態において、CH3領域はIgGに由来する。これらの二量体形成モチーフは、他の多量体形成部分（例えば、他のIgアイソタイプ/サブクラス由来）と交換することができる。好ましくは、二量体形成モチーフは、天然のヒトタンパク質、例えば、ヒトIgG等に由来する。
【００４３】
二量体形成モチーフは抗原単位及びターゲティング単位に対して任意の方向性を有することができると理解されるべきである。一実施形態において、抗原単位は二量体形成モチーフのCOOH-末端に存在し、ターゲティング単位は二量体形成モチーフのN-末端に存在する。他の実施形態において、抗原単位は二量体形成モチーフのN-末端であり、ターゲティング単位は、二量体形成モチーフのCOOH-末端に存在する。
【００４４】
参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第2004/076489号は、本発明に従って使用できる核酸配列及びベクターを開示する。
【００４５】
本発明のタンパク質は、任意の起源のポリペプチドに対する免疫応答の誘発に最適となり得る。特異的なエピトープを含む十分な長さの任意の抗原配列は、本発明のタンパク質における抗原単位として使用できる。このような抗原単位の最短の長さは、約9個のアミノ酸とすることができる。したがって一部の実施形態において、抗原単位はこのような抗原単位をコードする核酸配列の少なくとも約27個のヌクレオチドに相当する、少なくとも9個のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。このような抗原配列は、癌タンパク質又は感染病原体由来とすることができる。このような癌配列の例は、テロメラーゼ、より詳細にはhTERT、チロシナーゼ、TRP-1/TRP-2メラノーマ抗原、前立腺特異抗原及びイディオタイプである。感染病原体は、細菌性、例えば、結核抗原及びブルセラ症由来のOMP31、又はウイルス起源、より詳細には、HIV由来の配列、例えば、gp120由来の配列、HSV-2由来の糖タンパク質D、及び赤血球凝集素、核タンパク質及びM2等のインフルエンザウイルス抗原とすることができる。ワクシボディフォーマットにおけるこのような配列の挿入は、免疫応答の両アームの活性化にも繋がり得る。あるいは、抗原単位は、抗体又はその断片とすることができ、例えば、B細胞リンパ腫又は多発性骨髄腫を有する患者の骨髄腫/リンパ腫M成分とも呼ばれる、骨髄腫又はリンパ腫細胞によって産生されるモノクローナルIgに由来するC-末端scFv等とすることができる。このようなscFvは、イディオタイプ抗原を提示する。
【００４６】
特定の実施形態において、また本明細書中に記載される実施例においても使用される、本発明のタンパク質の抗原単位は、BALB/c形質細胞腫MOPC315.4に由来する骨髄腫タンパク質M315のscFvである。M315のλ2315軽鎖はCDR3ループにおいて３つの明確な体細胞突然変異を有し、明確に定義された系においてモデルとなるイディオタイプT細胞エピトープとして機能する（Bogen, Malissen et al. 1986; Bogen and Lambris 1989）。
【００４７】
ワクシボディタンパク質、ワクシボディDNA、又はワクシボディRNAによる免疫化（後者の２つは例えば、続く電気穿孔と共にか、又はそれなしに筋肉内又は皮内注入によって行われる）は全て、実現可能な方法である。
【００４８】
本発明のタンパク質のターゲティング単位は、ケモカイン受容体に結合することを介してAPCへのタンパク質を標的にする。
【００４９】
本発明のタンパク質は遺伝的に構築することができ、DNAは適した宿主細胞、例えば、NS0細胞、293E細胞、CHO細胞又はCOS-7細胞等にトランスフェクトすることができる。トランスフェクタントは、組換えタンパク質を産生且つ分泌する。
【００５０】
本発明は、本発明の上記の組換えベースのタンパク質、DNA/RNA配列、又は発現ベクターを含む医薬に関する。必要に応じて、本医薬はさらに医薬的に両立する担体を含む。適した担体及びこのような医薬製剤は、当業者に周知である。適した担体は、例えば、通常のリン酸緩衝食塩水、水、エマルション、例えば、油/水エマルション、湿潤剤、滅菌溶液等である。医薬は、経口又は非経口で投与することができる。非経口の投与方法は、局所的、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内又は鼻腔内投与を含む。適した投与量は、主治医によって決定され、異なる因子、例えば、患者の年齢、性別及び体重、投与の種類等によって決定される。さらに、本発明は、本発明の分子又はその変性変異体をコードする核酸の免疫学的に有効な量を含む、癌又は感染症に対するワクチン組成物又は免疫賦活性組成物であって、T細胞及びB細胞免疫応答双方を引き起こすことが可能な組成物に関する。本発明はまた、診断、医療又は科学目的のワクシボディDNA、RNA、又はタンパク質を含むキットに関する。
【００５１】
本発明はさらに、本発明の組換え分子を調製する方法に関し、本発明の分子を含むベクターを細胞集団にトランスフェクトし、細胞集団を培養し、細胞集団から発現された組換えタンパク質を回収し、発現されたタンパク質を精製することを含む。
【００５２】
上記のヌクレオチド配列は、好ましくは、例えば、特異的なプロモーターの制御下で、遺伝子治療に適するベクターに挿入でき、細胞に導入できる。好ましい実施形態において、斯かるDNA配列を含むベクターは、ウイルス、例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス又はアデノ随伴ウイルスである。レトロウイルスが、特に好ましい。適したレトロウイルスの例は、例えば、MoMuLV又はHaMuSVである。遺伝子治療の目的のため、本発明のDNA/RNA配列はまた、コロイド分散の形態で標的細胞に輸送できる。それらは、例えば、リポソーム又はリポプレックスを含む。
【００５３】
本発明はまた、本明細書中に規定のアミノ酸配列と、又は本明細書中に規定の特異的な特性を有するポリペプチドと、所定の配列同一性又は配列相同性を有するポリペプチド又はポリペプチド内の領域若しくはモチーフの使用を含む。本発明は特に、配列番号1と所定の配列同一性を有するペプチド、又はその相同体を含む。本明細書中で使用される用語「相同体」とは、対象のアミノ酸配列又は対象のヌクレオチド配列と配列同一性を有するものを意味し、対象のアミノ酸配列は好ましくは配列番号1である。
【００５４】
一態様において、相同であるアミノ酸配列及び/又はヌクレオチド配列は、配列番号1のポリペプチドの機能活性を保持し、そして/又は配列番号1のポリペプチドの活性を増強するポリペプチドを供し、そして/又はコードするべきである。
【００５５】
本明細書中で相同配列とは、対象配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%同一となり得るアミノ酸配列を含むことを意味する。典型的には、相同体は、対象のアミノ酸配列と同一の活性部位等を含むことができる。相同性は類似性（すなわち、同様の化学的性質/機能を有するアミノ酸残基）の観点から考えることもできるが、本発明に関しては配列同一性に関する相同性を表すことが好ましい。
【００５６】
配列同一性の比較は、目測で、又はより通常は、容易に利用可能なアライメントプログラムを用いて行うことができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、２つ又は３つ以上の配列（配列間の違いに繋がったであろう進化事象を最も反映するもの）を複雑な比較アルゴリズムを使用して配列比較する。よって、これらのアルゴリズムはスコアリングシステムで作動し、同一又は類似のアミノ酸配列にはスコアを加え、ギャップ、ギャップ伸長及び非類似のアミノ酸配列の挿入にはスコアを減じる。比較アルゴリズムのスコアリングシステムは、
i）ギャップが挿入されているごとに、ペナルティスコアを割り当てること（ギャップペナルティスコア）、
ii）存在するギャップがさらなる位置と共に伸長されているごとに、ペナルティスコアを割り当てること（伸長ペナルティスコア）、
iii）同一のアミノ酸のアライメントに高スコアを割り当てること、及び
iV）同一でないアミノ酸の配列に変数スコア（variable score）を割り当てること、
を含む。
【００５７】
大抵のアライメントプログラムは、ギャップペナルティを修正できる。しかしながら、アライメントにこのようなソフトウェアを使用する場合、初期設定値を使用することが好ましい。
【００５８】
非同一のアミノ酸のアライメントに提供されるスコアは、スコアリング行列（置換行列とも呼ばれる）に従って割り当てられる。このような置換行列で供されるスコアは、進化中に一アミノ酸が他のアミノ酸で置換される尤度は変化し、尤度は置換されるアミノ酸の物理的/化学的性質次第であるという事実を反映している。例えば、他の極性アミノ酸で置換される極性アミノ酸の尤度は、疎水性アミノ酸で置換されるものと比較して高い。よって、スコアリング行列は同一のアミノ酸に最も高いスコアを、同一でないが類似のアミノ酸にそれより低いスコアを、そして同一でなく類似でないアミノ酸に関してさらに低いスコアを割り当てることができる。最も頻繁に使用されるスコアリング行列は、PAM行列（Dayhoff et al.（1978）、Jones et al.（1992））、BLOSUM行列（Henikoff and Henikoff（1992））及びGonnet行列（Gonnet et al.（1992））である。
【００５９】
このようなアライメントの実行に適したコンピュータープログラムは、ベクターNTI（Invitrogen Corp.）及びClustalV、ClustalW及びClustalW2プログラム｛Higgins DG & Sharp PM（1988）、Higgins et al.（1992）、Thompson et al.（1994）、Larkin et al.（2007）｝を含むがそれらに限定されない。異なるアライメント手段の選択は、www.expasy.orgのExPASyプロテオミクスサーバーから利用できる。配列アライメントを実行できるソフトウェアの他の例は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）であり、これは現在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/で確認できる国立バイオテクノロジー情報センターのホームページから利用でき、最初にAltschul等の（1990） J. Mol. Biol. 215; 403-410に記載された。
【００６０】
ソフトウェアはアライメントを生じると直ちに、%類似性及び%配列同一性の計算が可能である。ソフトウェアは典型的には配列比較の一部としてこれを行い、数値結果を生じる。
【００６１】
一実施形態において、配列アライメントを実施するためにClustalWソフトウェア使用することが好ましい。好ましくは、ClustalWでのアライメントは、ペアワイズアライメントのための次のパラメータと共に行う。
【００６２】
【表１】
2019033762.tif 000003
【００６３】
ClustalW2は、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所によって、EMBL-EBIホームページ、www.ebi.ac.ukでインターネット上で、ツール-配列分析-ClustalW2で利用できる。現在、ClustalW2ツールの正確なアドレスは、www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2である。
【００６４】
他の実施形態において、配列アライメントを行うためにベクターNTI（Invitrogen）においてプログラムAlign Xを使用することが好ましい。一実施形態において、次の初期設定と共にExp10を使用できる:
ギャップ開始ペナルティ: 10
ギャップ伸長ペナルティ: 0.05
ギャップセパレーションペナルティ（Gapseparation penalty）範囲: 8
スコア行列: blosum62mt2
【００６５】
よって本発明はまた、本明細書中に規定のタンパク質、ポリペプチド、モチーフ又は領域の任意のアミノ酸配列、特に配列番号1のアミノ酸配列の変異体、相同体及び誘導体の使用を含む。
【００６６】
配列、特に配列番号1の変異体、相同体及び誘導体の配列は、無変化であり、機能上同等の物質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換もまた有することができる。物質の二次結合活性（secondary binding activity）が保持される限り、アミノ酸置換は計画的に、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び/又は残基の両親媒性特質の類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電のアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含み、正に帯電のアミノ酸は、リジン及びアルギニンを含み、同様の親水性値を有する無電荷の極性頭部基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンを含む。
【００６７】
本発明はまた、保存的置換｛置換（substitution）及び置換（replacement）はどちらも、存在するアミノ酸残基の別の残基との交換を意味するために使用される｝、すなわち、同種の置換、例えば、塩基性残基の塩基性残基への置換、酸性残基の酸性残基への置換、極性残基の極性残基への置換等を生じうる保存的置換を含む。非保存的置換は、すなわち、残基の１つのクラスから他のクラスへの置換により、あるいは、非天然アミノ酸、例えば、オルニチン（以下、Zと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Bと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以下、Oと呼ぶ）、ピリジルアラニン（pyriylalanine）、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンの関与により生じ得る。
【００６８】
行うことができる保存的置換は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、脂肪族アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、ヒドロキシルアミノ酸（セリン、トレオニン）、大きなアミノ酸（フェニルアラニン及びトリプトファン）及び小さなアミノ酸（グリシン、アラニン）の群に含まれる。
【００６９】
置換は、アルファ*及びアルファ-二置換*アミノ酸、N-アルキルアミノ酸*、乳酸*、天然のアミノ酸のハロゲン誘導体、例えば、トリフルオロチロシン*等、p-Cl-フェニルアラニン*、p-Br-フェニルアラニン*、p-I-フェニルアラニン*、L-アリル-グリシン*、β-アラニン*、L-α-アミノ酪酸*、L-γ-アミノ酪酸*、L-α-アミノイソ酪酸*、L-ε-アミノカプロン酸#、7-アミノヘプタン酸*、L-メチオニンスルホン#*、L-ノルロイシン*、L-ノルバリン*、p-ニトロ-L-フェニルアラニン*、L-ヒドロキシプロリン#、L-チオプロリン*、フェニルアラニン（Phe）のメチル誘導体、例えば、4-メチル-Phe*、ペンタメチル-Phe*、L-Phe（4-アミノ）#、L-Tyr（メチル）*、L-Phe（4-イソプロピル）*、L-Tic（1、2、3、4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボキシル酸）*、L-ジアミノプロピオン酸#及びL-Phe（4-ベンジル）*等を含む非天然のアミノ酸によってもまた可能である。記号*は、（相同性又は非保存的置換に関する）上記説明の目的に利用され、誘導体の疎水性を示し、一方「#」は、誘導体の親水性を示すために利用され、「#*」は、両親媒性特性を示す。
【００７０】
変異アミノ酸配列は、アミノ酸スペーサー、例えば、グリシン又はβ-アラニン残基に加えて、アルキル基、例えば、メチル、エチル又はプロピル基を含む配列の、任意の２つのアミノ酸残基間に挿入することができる適したスペーサー基を含むことができる。変異のさらなる形態は、ペプトイド形態の１又は２以上のアミノ酸残基の存在を含み、このことは当業者は理解できるであろう。誤解の回避のため、「ペプトイド形態」とは、α-炭素の置換基がα-炭素よりも残基の窒素原子上にある変異アミノ酸残基を意味するために使用する。ペプトイド形態のペプチドの調製方法は、例えば、Simon RJ et al.（1992）、Horwell DC.（1995）等で、当技術分野で周知である。
【００７１】
一実施形態において、本発明のホモ二量体タンパク質において使用される変異ターゲティング単位は、配列番号1のアミノ酸5-70の配列、及びそれと少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%アミノ酸配列同一性を有する変異体である。
【００７２】
一態様において、好ましくは本発明で使用されるタンパク質又は配列は、精製された形態である。用語「精製」とは、所定の成分が高レベルで存在することを意味する。成分は望ましくは組成物に存在する主たる活性成分である。
【００７３】
「変異体」とは、タンパク質、ポリペプチド、単位、モチーフ、領域又は核酸を意味する。用語「変異体」は、用語「突然変異体（mutant）」と互換的に使用できる。変異体は、アミノ酸又はヌクレオチド配列の１又は２以上の位置における挿入、置換、トランスバージョン、トランケーション、及び/又は転化それぞれを含む。用語「変異ポリペプチド」、「ポリペプチド」、「変異体」及び「変異体酵素」とは、配列番号1のアミノ酸配列から修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチド/タンパク質を意味する。変異ポリペプチドは、特定の割合、例えば、配列番号1、又は配列番号1のアミノ酸配列5-70と80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【００７４】
「変異核酸」は、本明細書中に提示されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成が可能な配列に相補的な配列を含むことができる。例えば、変異配列は、ストリンジェントな条件下で、例えば、50°C及び0.2X SSC（1X SSC = 0.15 M NaCl、0.015 Mクエン酸ナトリウム、pH 7.0）で、本明細書中に示されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成が可能な配列に相補的である。より詳細には、用語「変異体」とは、高ストリンジェントな条件下で、例えば、65°C及び0.1X SSCで、本明細書中に示されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成が可能な配列に相補的な配列を含む。変異核酸の融点（Tm）は、野生型核酸のTmの約1、2、又は3℃未満とすることができる。変異核酸は、配列番号1又は本発明のホモ二量体タンパク質を形成することができる単量体タンパク質をコードする核酸と、特定のパーセント、例えば、80%、85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
【００７５】
本明細書中で使用する用語「ホモ二量体タンパク質」とは、水素結合、イオン（荷電）相互作用、実際の共有結合性ジスルフィド結合、又はこれらの相互作用の一部の組合わせによって、単一の二量体タンパク質として１つに結合される２つの単一の同一のアミノ酸鎖、又はサブユニットを含むタンパク質を意味する。
【００７６】
本明細書中で使用する用語「二量体形成モチーフ」とは、抗原単位と、ヒンジ領域及び二量体形成に寄与し得る任意の第二の領域を含むターゲティング単位との間のアミノ酸配列を意味する。第二の領域は、免疫グロブリン領域とすることができ、任意にはヒンジ領域と第二の領域とがリンカーを介して結合されている。従って、二量体形成モチーフは抗原単位とターゲティング単位とを接続するよう機能するが、本発明のホモ二量体タンパク質への２つの単量体タンパク質の二量体形成を促進するヒンジ領域もまた含む。
【００７７】
本明細書中で使用する用語「ターゲティング単位」とは、MHCクラスI制限によって、CD4+T細胞へのMHCクラスII-制限提示又はCD8+T細胞への交差提示を供するための、抗原を有するタンパク質をマウス又はヒトAPCへ送達する単位を意味する。
【００７８】
本明細書中で使用する用語「抗原単位」とは、任意の分子、例えば、抗体又は他の免疫系成分、例えば、T細胞上の表面受容体等によって特異的に認識され得るペプチド等を意味する。免疫応答を誘発することができる免疫原、例えば、抗体のイディオタイプ免疫原等もまた斯かる定義に含まれる。用語「エピトープ」又は「抗原エピトープ」とは、特徴的な分子表面、例えば、抗原単位内の短いペプチド配列によって供される分子表面等を意味するために使用される。一部の実施形態において、抗原単位は２つ又は３つ以上の抗原エピトープを含む。
【００７９】
用語「ヒンジ領域」とは、鎖間共有結合、例えば、ジスルフィド架橋等の形成を介して、二量体形成を促進するホモ二量体タンパク質のペプチド配列を意味する。ヒンジ領域は、Ig由来とすることができ、Ig、例えば、IgG3のヒンジエクソンh1+h4等とすることができる。
【００８０】
本明細書中で使用する用語「免疫賦活性組成物」とは、例えば、リンパ球機能、特に、T細胞活性化等のT細胞機能を活性又は抑制することによって、免疫系を活性化することができる任意の治療上の組成物を意味する。
【００８１】
本発明の特定の実施形態
一部の実施形態において、抗原単位は癌関連又は癌特異的抗原である。
【００８２】
用語「癌関連抗原」とは、必ずしも特定の癌に特異的でなくてよいが、斯かる癌の癌細胞表面上で過剰発現される任意の抗原を意味する。斯かる用語は、用語「癌抗原」と互換的に使用できる。
【００８３】
一部の実施形態において、抗原単位は抗原scFvである。一部の実施形態において、リンカー、例えば、（G4S）3リンカー等は、抗原scFvにおいてVHとVLとを結合する。一部の実施形態において、抗原scFvは、骨髄腫又はリンパ腫細胞によって産生されるモノクローナルIgに由来する。
【００８４】
一部の実施形態において、抗原単位は、テロメラーゼ、又はその機能部分である。一部の実施形態において、テロメラーゼはhTERTである。
【００８５】
一部の実施形態において、抗原単位はメラノーマ抗原である。一部の実施形態において、メラノーマ抗原は、チロシナーゼ、TRP-1、又はTRP-2である。
【００８６】
一部の実施形態において、抗原単位は前立腺癌抗原である。一部の実施形態において、前立腺癌抗原はPSAである。
【００８７】
一部の実施形態において、抗原単位は子宮頸癌抗原である。一部の実施形態において、子宮頸癌抗原は、ヒトパピローマウイルスE1、E2、E4、E6、及びE7から成るリストから選択される。
【００８８】
一部の実施形態において、抗原単位は細菌に由来する。
【００８９】
一部の実施形態において、細菌由来の抗原単位は結核抗原である。
【００９０】
一部の実施形態において、細菌由来の抗原単位はブルセラ症抗原である。
【００９１】
一部の実施形態において、抗原単位はウイルスに由来する。
【００９２】
一部の実施形態において、ウイルス由来の抗原単位はHIVに由来する。一部の実施形態において、HIV由来の抗原単位はgp120又はGagに由来する。
【００９３】
一部の実施形態において、抗原単位は、インフルエンザウイルス血球凝集素（HA）、ヌクレオプロテイン、及びM2抗原; 単純ヘルペス2型の抗原糖タンパク質D;及びヒトパピローマウイルス抗原、例えば、E1、E2、E6、E7、L1及びL2から成るリストから選択される任意の１つから成るリストから選択される。
【００９４】
一部の実施形態において、二量体形成モチーフが、ヒンジ領域及び任意には、二量体形成を促進する他の領域、例えば、免疫グロブリン領域等を含み、任意にはこれらはリンカーを介して結合される。
【００９５】
一部の実施形態において、ヒンジ領域が、Ig、例えば、IgG3に由来する。
【００９６】
一部の実施形態において、ヒンジ領域が、１、２、又は複数の共有結合を形成する能力を有する。一部の実施形態において、共有結合がジスルフィド架橋である。
【００９７】
一部の実施形態において、二量体形成モチーフの免疫グロブリン領域が、C末端のC領域、又はC領域と実質的に相同の配列である。一部の実施形態において、C末端のC領域は、IgGに由来する。
【００９８】
一部の実施形態において、二量体形成モチーフの免疫グロブリン領域が、ホモ二量体化する能力を有する。
【００９９】
一部の実施形態において、二量体形成モチーフの免疫グロブリン領域は、非共有結合性相互作用を介して、ホモ二量体化する能力を有する。一部の実施形態において、非共有結合性相互作用は、疎水性相互作用である。
【０１００】
一部の実施形態において、二量体形成領域はCH2領域を含まない。
【０１０１】
一部の実施形態において、二量体形成モチーフが、リンカーを介してヒトIgG3のCH3領域に結合されるヒンジエクソンh1及びh4から成る。
【０１０２】
一部の実施形態において、ヒンジ領域と、二量体形成を促進する他の領域、例えば、免疫グロブリン領域等とを結合するリンカーが、G3S2G3SGリンカーである。
【０１０３】
一部の実施形態において、抗原単位及び二量体形成モチーフが、リンカー、例えば、GLSGLリンカー等を介して結合される。
【０１０４】
一部の実施形態において、ターゲティング単位が、配列番号1のアミノ酸3-70を含む。
【０１０５】
一部の実施形態において、ターゲティング単位が、配列番号1のアミノ酸5-70から成る。
【０１０６】
一部の実施形態において、ターゲティング単位が、配列番号1のアミノ酸3-70から成る。
【０１０７】
一部の実施形態において、ターゲティング単位が、配列番号1のアミノ酸1-70から成る。
【０１０８】
一部の実施形態において、ホモ二量体タンパク質が、配列番号1のアミノ酸1-70を含まない。
【０１０９】
一部の実施形態において、ターゲティング単位が、配列番号2のアミノ酸3-70を含む。
【０１１０】
一部の実施形態において、ターゲティング単位が、配列番号2のアミノ酸5-70から成る。
【０１１１】
一部の実施形態において、ターゲティング単位が、配列番号2のアミノ酸3-70から成る。
【０１１２】
一部の実施形態において、ターゲティング単位が、配列番号2のアミノ酸1-70から成る。
【０１１３】
一部の実施形態において、ホモ二量体タンパク質が、配列番号2のアミノ酸1-70を含まない。
【０１１４】
一部の実施形態において、ターゲティング単位が、68個以下のアミノ酸、例えば、68、67、又は66個等のアミノ酸から成る。
【０１１５】
一部の実施形態において、ターゲティング単位が、ターゲティング単位の1及び2位においてアミノ酸配列APを含まない。
【０１１６】
一部の実施形態において、ホモ二量体タンパク質は、第二のホモ二量体タンパク質の結合性と比較して、増大された結合性を有する第一のホモ二量体タンパク質であって、ここで第二のホモ二量体タンパク質が、配列番号2のアミノ酸1-70から成るターゲティング単位を有することのみ第一のホモ二量体タンパク質と異なり、増大された結合性が、CCR1、CCR3及びCCR5から選択される任意の１つのケモカイン受容体に関する。一部の実施形態において、本願の核酸分子はベクターによって含まれる。
【０１１７】
一部の実施形態において、本発明の核酸分子は、患者においてホモ二量体タンパク質の産生を誘発するための患者への投与のために調製される。
【０１１８】
一部の実施形態において、本発明のワクチン又は免疫賦活性組成物は、医薬的に許容される担体及び/又はアジュバントを含む。
【０１１９】
一部の実施形態において、本発明のワクチン又は免疫賦活性組成物又は医薬組成物によって治療される癌は、多発性骨髄腫又はリンパ腫、悪性メラノーマ、HPV誘発性の癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、及び/又は肝癌である。
【０１２０】
一部の実施形態において、本発明のワクチン又は免疫賦活性組成物又は医薬組成物によって治療される感染症は、インフルエンザ、ヘルペス、CMV、HPV、HBV、ブルセラ症、HIV、HSV-2及び結核から成るリストから選択される。
【０１２１】
本発明の番号付き実施形態:
１．２つの同一のアミノ酸鎖のホモ二量体タンパク質であって、各アミノ酸鎖が配列番号1のアミノ酸配列5-70と少なくとも80 %配列同一性を有するアミノ酸配列を含むターゲティング単位、及び抗原単位を含み、ターゲティング単位と抗原単位とが二量体形成モチーフを介して結合されている、ホモ二量体タンパク質。
【０１２２】
２．抗原単位が抗原scFvである、実施形態1に記載のホモ二量体タンパク質。
【０１２３】
３．リンカー、例えば、（G4S）3リンカー等が、抗原scFvにおいてVHとVLとを結合する、実施形態1又は2に記載のホモ二量体タンパク質。
【０１２４】
４．抗原scFvが、骨髄腫又はリンパ腫細胞によって産生されるモノクローナルIgに由来する、実施形態1-3のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１２５】
５．抗原単位が、テロメラーゼ又はその機能部分である、実施形態1に記載のホモ二量体タンパク質。
【０１２６】
６．テロメラーゼがhTERTである、実施形態5に記載のホモ二量体タンパク質。
【０１２７】
７．抗原単位が細菌に由来する、実施形態1に記載のホモ二量体タンパク質。
【０１２８】
８．細菌由来の抗原単位が、結核抗原及びブルセラ症抗原から選択される、実施形態7に記載のホモ二量体タンパク質。
【０１２９】
９．抗原単位がウイルスに由来する、実施形態1に記載のホモ二量体タンパク質。
【０１３０】
１０．ウイルス由来の抗原単位がHIVに由来する、実施形態9に記載のホモ二量体タンパク質。
【０１３１】
１１．HIV由来の抗原単位が、gp120又はGagに由来する、実施形態10に記載のホモ二量体タンパク質。
【０１３２】
１２．抗原単位が、インフルエンザウイルス血球凝集素（HA）、ヌクレオプロテイン、M2抗原;及び単純ヘルペス2抗原糖タンパク質Dから成るリストから選択される、実施形態9に記載のホモ二量体タンパク質。
【０１３３】
１３．抗原単位が癌関連又は癌特異的抗原である、実施形態1に記載のホモ二量体タンパク質。
【０１３４】
１４．癌の抗原単位が、メラノーマ抗原、例えば、メラノーマ抗原チロシナーゼ、TRP-1又はTRP2等である、実施形態13に記載のホモ二量体タンパク質。
【０１３５】
１５．癌の抗原単位が、前立腺癌抗原、例えば、前立腺癌抗原PSA等である、実施形態13に記載のホモ二量体タンパク質。
【０１３６】
１６．癌の抗原単位が、子宮頸癌抗原、例えば、E1、E2、E4、E6、E7、L1及びL2から成るリストから選択される、子宮頸癌抗原等である、実施形態13に記載のホモ二量体タンパク質。
【０１３７】
１７．二量体形成モチーフが、ヒンジ領域、及び任意には二量体形成を促進する他の領域、例えば、免疫グロブリン領域を含み、任意にはこれらがリンカーを介して結合される、実施形態1-16のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１３８】
１８．ヒンジ領域が、Ig由来、例えば、IgG3由来等である、実施形態17に記載のホモ二量体タンパク質。
【０１３９】
１９．ヒンジ領域が、１、２、又は複数の共有結合を形成する能力を有する、実施形態17又は18に記載のホモ二量体タンパク質。
【０１４０】
２０．共有結合がジスルフィド架橋である、実施形態17-19のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１４１】
２１．二量体形成モチーフの免疫グロブリン領域が、C末端のC領域、又はC領域と実質的に相同の配列である、実施形態17-20のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１４２】
２２．C末端のC領域がIgGに由来する、実施形態21に記載のホモ二量体タンパク質。
【０１４３】
２３．二量体形成モチーフの免疫グロブリン領域が、ホモ二量体化する能力を有する、実施形態17-22のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１４４】
２４．免疫グロブリン領域が、非共有結合性相互作用を介してホモ二量体化する能力を有する、実施形態17-23のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１４５】
２５．非共有結合性相互作用が疎水性相互作用である、実施形態24に記載のホモ二量体タンパク質。
【０１４６】
２６．二量体形成領域がCH2領域を含まない、実施形態1-25のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１４７】
２７．二量体形成モチーフが、リンカーを介してヒトIgG3のCH3領域へ結合されるヒンジエクソンh1及びh4から成る、実施形態1-26のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１４８】
２８．リンカーがG3S2G3SGリンカーである、実施形態17-27のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１４９】
２９．抗原単位と二量体形成モチーフとが、リンカー、例えば、GLSGLリンカー等を介して結合される、実施形態1-28のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１５０】
３０．ターゲティング単位が、配列番号1のアミノ酸3-70を含む、実施形態1-29のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１５１】
３１．ターゲティング単位が、配列番号1のアミノ酸5-70から成る、実施形態1-29のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１５２】
３２．ターゲティング単位が、配列番号1のアミノ酸3-70から成る、実施形態1-29のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１５３】
３３．ターゲティング単位が、配列番号1のアミノ酸1-70から成る、実施形態1-30のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１５４】
３４．ホモ二量体タンパク質が、配列番号1のアミノ酸1-70を含まない、実施形態1-29のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１５５】
３５．ターゲティング単位が、配列番号2のアミノ酸3-70を含む、実施形態1-29のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１５６】
３６．ターゲティング単位が、配列番号2のアミノ酸5-70から成る、実施形態1-29のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１５７】
３７．ターゲティング単位が、配列番号2のアミノ酸3-70から成る、実施形態1-29のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１５８】
３８．ターゲティング単位が、配列番号2のアミノ酸1-70から成る、実施形態1-29のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１５９】
３９．ホモ二量体タンパク質が、配列番号2のアミノ酸1-70を含まない、実施形態1-29のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１６０】
４０．各ターゲティング単位が、68個以下のアミノ酸、例えば、68、67、又は66個のアミノ酸から成る、実施形態1-32、35-37のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１６１】
４１．ターゲティング単位が、ターゲティング単位の1及び2位にアミノ酸配列APを含まない、実施形態1-30、35のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１６２】
４２．ホモ二量体タンパク質が、ターゲティング単位が配列番号2のアミノ酸1-70から成ることを除き同一のホモ二量体タンパク質の結合性と比較して、CCR1、CCR3及びCCR5から選択されるいずれか１つのケモカイン受容体に関して増大された結合性を有する、実施形態1-41のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質。
【０１６３】
４３．実施形態1-42のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質を形成することができる単量体タンパク質をコードする核酸分子。
【０１６４】
４４．ベクターに含まれる、実施形態43に記載の核酸分子。
【０１６５】
４５．患者においてホモ二量体タンパク質の産生を誘発するための、患者への投与用に調製される、実施形態43又は44に記載の核酸分子。
【０１６６】
４６．医薬としての使用のための、実施形態1-42のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質又は実施形態43又は44に記載の核酸分子。
【０１６７】
４７．実施形態1-42のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質、又は実施形態43又は44に記載の核酸分子を含む、医薬組成物。
【０１６８】
４８．実施形態43又は44に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【０１６９】
４９．実施形態1-42のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質の調製方法であって、
ａ）実施形態43又は44に記載の核酸分子を細胞集団にトランスフェクトし、
ｂ）細胞集団を培養し、
ｃ）細胞集団から発現されたホモ二量体タンパク質を回収し精製する、
ことを含む方法。
【０１７０】
５０．実施形態1-42のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質、又はホモ二量体タンパク質を形成することができる単量体タンパク質をコードする実施形態43又は44に記載の核酸分子の免疫学的に有効な量を含む、癌又は感染症に対するワクチンであって、ワクチンがT細胞免疫応答及びB細胞免疫応答の双方を引き起こすことができ、ホモ二量体タンパク質が癌又は感染症に特異的な抗原単位を含む、ワクチン。
５１．医薬的に許容される担体及び/又はアジュバントをさらに含む、実施形態50に記載のワクチン。
５２．癌が、多発性骨髄腫又はリンパ腫、悪性メラノーマ、HPV誘発性の癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、及び/又は肝癌である、実施形態50又は51に記載のワクチン。
５３．感染症が、結核、インフルエンザ、ヘルペス、CMV、HPV、HBV、HIV、ブルセラ症、及び/又はHSV-2から成るリストから選択される、実施形態50又は51に記載のワクチン。
５４．患者における癌又は感染症の治療方法であって、実施形態1-42のいずれか１つに記載のホモ二量体タンパク質、又はホモ二量体タンパク質を形成することができる単量体タンパク質をコードする実施形態43又は44に記載の核酸分子を、それを必要とする患者に投与すること含み、ここでホモ二量体タンパク質が癌又は感染症に特異的な抗原単位を含む、方法。
【実施例】
【０１７１】
実施例１
マウス及び細胞株
BALB/cマウスをTaconic（Ry、Denmark）から購入した。Id（λ2315）特異的T細胞受容体（TCR）トランスジェニックマウスはこれまでに記載されている（Bogen B et al. Eur J Immunol 1992 Mar;22（3）:703-9及びSnodgrass HR et al. Eur J Immunol 1992 Aug;22（8）:2169-72を参照）。TCRは、IgA MOPC315マウス形質細胞腫によって産生されるλ2315軽鎖のアミノ酸91-101を認識し、I-EdクラスII分子上に提示される。本試験は、National Committee for Animal Experiments（Oslo、Norway）による認可を受けた。MOPC 315.4（IgA、λ2315）、HEK 293及びHEK 293E細胞は、ATCCから得た。hCCR5及びhCCR1が安定してトランスフェクトされたHEK 293は、Mario Mellado（Madrid、Spain）及びZack Howard（Frederick、MD）からそれぞれ提供を受けた。アカゲザル（GenBank AF005660）が安定してトランスフェクトされたHEK 293を、Pfizer Inc.、（Groton、CT）から得た。マウスリンパ腫Esb/MP細胞は、Jo Van Damme（Leuven、Belgium）から提供を受けた。
【０１７２】
ヒトMIP1a/CCL3のクローニング（LD78α又はLD78β-をコードするワクシボディ）
成熟LD78α及びLD78β（GenBank NM_002983及びNG_004113、それぞれ）をコードする遺伝子を、健常ドナー由来のCD14エンリッチの、骨髄由来の単球のcDNAから増幅した。順方向プライマー（イタリック体は、BsmI制限部位）は、
LD78α: GGTGTGCATTCCGCATCACTTGCTGCTGAC（配列番号3）;
LD78β: GGTGTGCATTCCGCACCACTTGCTGCTGAC（配列番号4）;
であり、逆方向プライマー（イタリック体は、BsiWI制限部位）は、
GACGTACGACTCACCTGCAACTCAGCTCCAGGTC（配列番号5）であった。68個のアミノ酸長（3-70）のLD78β-2を、順方向プライマー（イタリック体は、BsmI制限部位）: GGTGTGCATTCCCTTGCTGCTGACACGCC（配列番号6）を使用してクローン化した。
【０１７３】
11位でC残基の代わりにSを有する点変異されたLD78α及びLD78βを、次のプライマー: 順方向プライマーCCGACCGCCTCCTGCTTCAG（配列番号7）及び逆方法プライマーCTGAAGCAGGAGGCGGTCGG（配列番号8）を使用して、quick change PCRによって生じた。増幅されたケモカイン遺伝子を、BsmI/BsiWI制限部位の使用によってワクシボディのコンストラクトIlhFpLNOH2のターゲティングカセットに挿入した（Fredriksen AB et al. Mol Ther 2006 Apr;13（4）:776-85を参照）。生じるワクシボディコンストラクトは、hCCL3由来のターゲティング単位及び抗原単位としてのVH-VL方向のMOPC315 scFvを有するホモ二量体タンパク質をコードした。これらの単位は、ヒトヒンジエクソンh1及びh4及びIgG3のCH3領域から成るホモ二量体形成モチーフを介して結合された。
【０１７４】
上記のワクシボディ中の抗原単位（scFv315）は、ペアのマウスCκ領域（Tunheim G et al. Vaccine 2007 Jun 11;25（24）:4723-34）又はH1N1 A/Puerto Rico/8/34（Mt. Sinai）由来のインフルエンザウイルス血球凝集素（HA）（G. Grodeland、manuscript in preparation）と交換した。
【０１７５】
ワクチンタンパク質産生の評価
一過性にトランスフェクトした293E細胞の上清を、次のELISAにおいて試験した。scFv315ワクシボディ: コーティングとしてのDNP-BSA（M315に結合する）及び検出のためのビオチン標識モノクローナルHP6017（抗CH3二量体形成モチーフ）; HAワクシボディ: コーティングとしてのMCA878G（抗CH3二量体形成モチーフ）及び検出のための抗HAビオチン標識mAB H36-4-52; マウスCκCκワクシボディ: コーティングとしての187.1 mAb（マウスCκに結合する）及び検出のためのビオチン標識187.1。
【０１７６】
ワクシボディタンパク質の産生、精製、定量化及びプロテオミクス特性評価
抗原単位としてscFv315を有するワクシボディタンパク質を、（M315により結合された）DNPセファロースカラム上で安定してトランスフェクトされたNS0細胞の上清から親和性精製した。精製されたタンパク質を、4-20%トリスグリシンゲルに負荷した。膜を移動後、タンパク質をビオチン標識HP6017又は（M315に結合する）Ab2-1.4 mAbsで、続いてストレプトアビジンHRPで検出した。ワクシボディタンパク質を、基準としてBSA及びmCCL3ワクシボディをそれぞれ使用してBradford及びELISAによって定量化した（Fredriksen AB et al. Mol Ther 2006 Apr;13（4）:776-85を参照）。Fv315を有するLD78β及びLD78β-2ワクシボディに相当するタンパク質バンドは、クーマシー染色されたポリアクリルアミドゲルから切除し、上記の通りトリプシンのゲル中消化に供した。
【０１７７】
ヒト及びマウスCCR5及びCCR1への結合
濃度0.2〜25 μg/mLのワクシボディタンパク質を使用して、親又は安定してトランスフェクトされたHEK293細胞又はBALB/c脾細胞｛FSC/SSCによってCD11b+ CD3-細胞上でゲートした（gated）｝を染色した。結合されたワクシボディタンパク質を、（hIgG3のCH3に結合する）ビオチン標識HP6017又は（M315に結合する）Ab2-1.4 mAbsによって、続いてストレプトアビジンPEによって検出した。FACScalibur上で細胞を分析した。
【０１７８】
走化性アッセイ
インビトロ（in vitro）の細胞遊走を、上記の通り24-ウェルのトランスウェルプレート（Corning）によって評価した。8 μm又は5 μmのポアポリカーボネート膜を、HEK 293細胞及びEsb/MPに関して、それぞれ使用した。組換えケモカインは、Peprotech由来であった。結果（複製試料の平均値±標準誤差）は、自発性細胞遊走中の走化性因子の存在下での（すなわち、培地単独の存在下での）遊走細胞の数の倍増として規定される走化性指標として示す。
【０１７９】
T細胞刺激アッセイ
BALB/c脾細胞を照射し（8 Gy）、TCR-トランスジェニックマウス由来のインビトロ（in vitro）で極性化されたId315特異的Th2細胞の添加前に、濃度20〜0.04 μg/mLのscFv315を含むワクシボディタンパク質と混合した。λ2315の配列89-107に相当するIdペプチドを、正の対照として使用した。
【０１８０】
３人の異なるDR4*01健常ドナー由来のヒトPBMCを、抗原単位としてのマウスCκCκを有するワクシボディタンパク質を含む、一過性にトランスフェクトした293E細胞由来の上清と混合し、照射（20 Gy）し、DR4*01によって提示されるマウスCkアミノ酸40-48を認識するT18 T細胞クローンを添加した。48時間後、プレートを3H-チミジンで24時間パルス標識し、回収した。
【０１８１】
マウス免疫化
ワクシボディDNAを、Endofree-megaプラズミド精製システム（Qiagen）を使用して精製した。滅菌0.9% NaCl中の0.5 mg/mLワクシボディDNAの25 μLの溶液を、マウスの下背の両側に皮内に注入し、続いてDermavax（Cytopulse、Sweden）を使用して電気穿孔を行った。群は3〜7匹のマウスから構成された。
【０１８２】
抗Id315抗体測定
一回の免疫化の３、４及び６週後に、マウスから採血した。骨髄腫タンパク質M315（IgA、λ2）をコーティングとして使用し、マウス血清中の抗Id315Absをビオチン標識抗マウスIgG1a又は抗マウスIgG2aa（BD Pharmingen）によって検出した。エンドポイントタイターを算出した。
【０１８３】
エリスポットアッセイ
MilliporeのMultiscreenプレート（Millipore、Billerca、MA、USA）を抗マウスIFNγ（AN18）（12μg/ml）でコーティングし、続いて10%FCSを含むRPMI-1640（Invitrogen、NY、USA）で２時間ブロックした。単細胞の脾細胞をそれぞれ、DNAワクチン接種したマウスから3週間前にHA含有ワクシボディ又はNaClで調製し、106、5x105及び2.5x105細胞/ウェルで、次のProImmune（Oxford、UK）から販売されるHA由来のペプチドの１つと共に一晩インキュベートした: SVSSFERFEIPK（アミノ酸107-119、I-Ed-制限）、HNTNGVTAACSHEG（アミノ酸126-138、I-Ad-制限）又はIYSTVASSL（アミノ酸633-641、Kd制限）。プレートをPBS中で洗浄し、付着細胞を脱イオン水中で５分間のインキュベーションによって溶解し、ビオチン標識抗マウスIFNγ（1μg/ml）（XMG1.2、Pharmingen）及びストレプトアビジンアルカリホスファターゼ複合体（1:3000）（GE Healthcare、Little Chalfont Buckinghamshire、UK）でインキュベーションした。IFNγ産生細胞を、BCIP/NBTキット（Zymed Laboratories Inc、Carlsbad、CA、USA）を使用することによって検出し、Zeiss Axioplan 2イメージングシステム上でZeissから購入したKSエリスポットversion 4.3.56でカウントを行った（objective: Epiplan-Neofluar 5x、442320）。
【０１８４】
ワクシボディ-HAコンストラクトでのマウスのワクチン接種
マウスを麻酔し、剪毛し、下背領域の両側に25μl DNA（0,5mg/ml）を皮内に迅速にワクチン接種し、続いて皮膚電気穿孔（DermaVax/CytoPulse）を行った。14日後に、マウスをヒポノルム/ドルミカムで麻酔し、20μlインフルエンザ（A/Puerto Rico/8/34（Mt. Sinai）ウイルス（5xLD50）を曝露した。曝露後マウスの体重を測定し、臨床徴候に関して厳重にモニターした。
【０１８５】
ヒトCCL3ベースのワクシボディのコンストラクション及び発現
図1Aに示すように、様々なhCCL3ベースのターゲティング単位、ヒトIg由来のホモ二量体形成単位及び様々な抗原単位を有するホモ二量体ワクシボディを作成した。使用したLD78α、LD78β、LD78β-2のNH2末端のアミノ酸配列及びケモカイン構造LD78β（C11S）へのC11S点突然変異の推定上の効果を、図1B及び1Cにそれぞれ示す。一貫して低い発現であったLD78β-2ワクシボディを除いて、全てのワクシボディが一過性にトランスフェクトした293E細胞によって同程度に発現された（図2A-C）。
【０１８６】
抗原単位としてscFv315を有するワクシボディタンパク質の完全性を、SDS-PAGEによって試験した。膜ブロッティング後に約110 kDaの単独バンドが、適したmAbsでの染色により確認できた（図2D及び他のコンストラクトに関する図示のないデータ）。変異（C11S）ワクシボディのサイズの明らかな増大は、おそらくS-Sバンドの欠如によるStokes半径の増加に起因する（図1C）。還元条件下で、期待される通り、単量体に相当する約55 kDAの単独バンドを観察した（データ不掲載）。
【０１８７】
培地中のNS0細胞又はウシ胎仔血清は、LD78βの翻訳後修飾を生じるCD26活性を有し得るので、LD78βワクシボディタンパク質のNH2末端のアミノ酸配列をさらに確認した。MALDI-TOF質量分析によるLD78βIhF及びLD78β-2IhFワクシボディタンパク質のトリプシン消化物の分析は、もっぱらm/z 1988.89及びm/z 1820.78においてシグナルを示し、これらはN-末端ペプチドAPLAADTPTACCFSYTSR（配列番号9）及びLAADTPTACCFSYTSR（配列番号10）（データ不掲載）にそれぞれ相当する。よって、純粋な全長のLD78β又はNH2-切断型LD78β-2ワクシボディは、安定してトランスフェクトされたNS0細胞から発現され、精製することができる。
【０１８８】
LD78βワクシボディ及びNH2-切断型は、ヒト及びマウスケモカイン受容体に結合する。
個体間のCCR5発現における変異性を考慮して、PBMCよりも、hCCR5を安定してトランスフェクトしたHEK 293を、機能性試験に使用した。LD78β及びLD78β-2ワクシボディ（それらの点変異カウンターパートでない）は、hCCR5-トランスフェクトHEK 293細胞に結合した（図3A、B及び不掲載データ）。NH2-切断型LD78β-2ワクシボディは、全長LD78βワクシボディより強力な結合を示した。点変異LD78β（C11S）ワクシボディは、hCCR5-トランスフェクト細胞に結合しなかった（図3A）。LD78β-2（LD78βワクシボディでない）はまた、hCCR1発現HEK 293に結合し（図3C、D及び不掲載データ）、これはこれまでの報告と一致する。親の、トランスフェクトされなかったHEK 293細胞の染色は存在しない（図示なし）。
【０１８９】
LD78βワクシボディ（その点変異カウンターパートでない）は、CD11b+ BALB/c脾細胞に結合し（図4A）、且つEsb/MP細胞の走化性を誘発し（図4B）、よってこれはマウスにおけるLD78β発現ワクシボディの試験に関して理論根拠を供している。
【０１９０】
ケモカイン受容体を介したAPCへの抗原の送達は、マウス及びヒトの系においてインビトロ（in vitro）でのT細胞応答を改善する。
scFv315抗原単位を発現するLD78βワクシボディと混合したBALB/c脾細胞は、TCRトランスジェニックマウスからId315-特異的Th2細胞の増殖を誘発した（図5A）。C11S突然変異が導入された同様のワクシボディは、~100分の1に減少された、T細胞を刺激する能力を有した。等モル濃度のLD78βワクシボディとCDR3突然変異を含むIdペプチドとを比較した場合、抗原提示に関するAPCの負荷においてワクシボディはペプチドより最大30倍効果的であることが分かった（図示なし）。
【０１９１】
ヒトT細胞応答に関して、モデル抗原としてマウスCκCκを発現するLD78βワクシボディを、ドナーPBMC、及びDR4*01に関連するマウスCκのアミノ酸40-48を認識するクローン化T18 CD4+ T細胞と混合した。野生型と点変異LD78βとの違いは、マウスの系ほど明白でなかった（図5B）。さらに、標的抗原デリバリーは、非標的化NIP-特異的ワクシボディより、LD78βで優れることが示される（図5B）。重要なことに、LD78β-2ワクシボディは、LD78βワクシボディより優れていた。同様の結果は、３つの異なるドナーを使用して得られた（不掲載）。
【０１９２】
scFv315を含むLD78βワクシボディによってマウスにおいて誘発された、改善された抗Id体液性応答
M315骨髄腫タンパク質のVH + VL Idは非情に弱い自己抗原であり、実際、完全及び不完全なフロイントアジュバントと共に複数の免疫化を含む広範囲の免疫化スキームは、抗Id抗体を検出するために必要であった。よって我々は、皮内にLD78βscFv315ワクシボディDNAを電気穿孔と併せて注入したマウスが、抗Id抗体を生じるかを試験した。抗Id315IgG1（図6A）及びIgG2a（図6B）応答が、LD78βをコードするワクシボディで免疫したマウスにおいて検出され、さらにscFv315の立体構造の完全性がLD78βワクシボディにおいて維持されていることを示している（図6）。C11S点変異ワクシボディを受けているマウスにおいて記録されたIgG1応答は顕著に少なく、一方でIgG2aに関する違いは、顕著でなかった。さらに、非標的化の対照ワクシボディ（抗NIP）で免疫したマウスにおいて、IgG1及びIgG2a双方に関して統計上顕著に低いAb応答が観察された。これらの結果は全体で、標的抗原デリバリーが弱い自己モデル腫瘍抗原への抗体応答を改善することを示す。
【０１９３】
マウスにおけるワクシボディ投与後の、インフルエンザ赤血球凝集素特異的CD4+及びCD8+ T細胞応答の誘発
CD8+ T細胞応答の誘発を、赤血球凝集素（HA）が標的抗原として機能するインフルエンザモデルにおいて調べた。株A/Puerto Rico/8/34（Mt.Sinai）由来のHA（H1N1）は、BALB/cマウス（H-2d）が応答する３つのエピトープを発現することが知られている。これらの２つはそれぞれ、MHCクラスII-制限、I-Edによって制限されたSVSSFERFEIPK（配列番号11）（アミノ酸107-119）及びI-Adによって制限されたHNTNGVTAACSHEG（配列番号12）（アミノ酸126-138）である。3つ目のエピトープ、IYSTVASSL（配列番号13）（アミノ酸633-641）は、MHCクラスI-制限（Kd）である。単回の皮内LD78βワクシボディDNA免疫化及び電気穿孔の後、非標的（C11S）ワクシボディ及びシャム免疫化（NaCl）に対して、標的ワクシボディについてクラスIエピトープへのIFNγ応答の有意な増大が観察された（図7A）。クラスIIエピトープへの応答は、若干増大したが、ターゲティングの効果は有意でなかった（本願試験において一免疫化のみ送達された）（図7A）。
【０１９４】
LD78βワクシボディは、アカゲザルCCR5に結合する。
CCR5は、サルを含む異なる種に亘って保存されている。ヒト及びマカクCCR5遺伝子は非常に近似したアミノ酸を有する（相同性98%）。ヒトのように、マカクは２つのCCL3アイソフォームを有する。LD78β及びLD78β-2ワクシボディは、用量依存的態様でアカゲザルCCR5発現HEK 293細胞に結合し、一方でC11S点変異LD78βは同一細胞に結合しなかった（図8、及び不掲載データ）。この結果は、ヒト使用を対象としたLD78β及びLD78β-2を有するワクシボディは、ヒトへの適用に先立ち、上記のようにマウスにおいて試験できるだけでなく、アカゲザルにおいてもまた試験できることを示す。
【０１９５】
LD78β-HAワクシボディ（LD78β-2-HAワクシボディでない）は、インフルエンザからマウスを保護する。
図9に示すように、マウスにLD78 βの２つの形態、LD78β又はLD78β-2のいずれかをワクチン接種した。LD78βの全長バージョンは、インフルエンザ感染からのマウスの保護に関して優れた効果を有することが示された。
【０１９６】
配列:
LD78β（配列番号1）: APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA
LD78α（配列番号2）: ASLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPGVIFLTKRSRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年12月5日(2018.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つのアミノ酸鎖を含むホモ二量体タンパク質を形成可能なアミノ酸鎖をコードする核酸分子であって、
各アミノ酸鎖が、配列番号１のアミノ酸配列５−７０と少なくとも９４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むターゲティング単位、及び抗原単位を含み、
当該ターゲティング単位と当該抗原単位とが二量体形成モチーフを介して連結されており、
ここで当該ターゲティング単位が、配列番号１の１１位に対応する位置でＣからＳへの変異を含まず、かつ核酸分子が対照への投与の際に、前記対象において前記抗原単位に対するCD８+細胞応答を高めることができる、前記核酸分子。
【請求項２】
前記ターゲティング単位が、配列番号1のアミノ酸3-70を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ターゲティング単位が、配列番号1のアミノ酸5-70から成る、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ターゲティング単位が、配列番号1のアミノ酸3-70から成る、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記ターゲティング単位が、配列番号1のアミノ酸1-70から成る、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記二量体形成モチーフが、ヒンジ領域を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記二量体形成モチーフが、二量体形成を促進する他の領域をさらに含む、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記二量体形成モチーフと、別のドメインが、リンカーを介して連結される、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記他の領域が、免疫グロブリン領域である、請求項７又は８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記ヒンジ領域が、Igに由来する、請求項６〜９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記ヒンジ領域が、IgG3に由来する、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記二量体形成モチーフの免疫グロブリンドメインが、カルボキシ末端のCドメイン、又は当該Cドメインと実質的に相同の配列である、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記抗原単位と二量体形成モチーフとが、リンカーを介して連結されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記リンカーが、GLSGLリンカーである、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記ターゲティング単位が、配列番号2のアミノ酸3-70を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記ターゲティング単位が、配列番号2のアミノ酸5-70から成る、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１７】
前記ターゲティング単位が、配列番号2のアミノ酸3-70から成る、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記ターゲティング単位が、配列番号2のアミノ酸1-70から成る、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記ターゲティング単位がそれぞれ、68個以下のアミノ酸から成る、請求項1〜１８のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記ターゲティング単位が、ターゲティング単位の1及び2位にアミノ酸配列APを含まない、請求項1〜１９のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項２１】
ベクターに含まれる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２２】
患者においてホモ二量体タンパク質の産生を誘発するための、患者への投与用に調製される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ワクチン組成物。
【請求項２４】
対象に投与した際に、当該対象においてCD8+細胞応答を高めることができる、請求項２３に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
２つのアミノ酸鎖を含むホモ二量体タンパク質であって、
各アミノ酸鎖が、配列番号1のアミノ酸配列5-70と少なくとも９４%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むターゲティング単位、及び抗原単位を含み、
当該ターゲティング単位と当該抗原単位とが二量体形成モチーフを介して連結され、そして当該ホモ二量体タンパク質が、請求項１〜２１のいずれか一項に定義される核酸分子によりコードされる、前記ホモ二量体タンパク質。
【請求項２６】
対象へ投与の際に前記核酸分子が、前記対象において前記抗原単位に対するCD8+細胞応答を高めることができる、請求項２５に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項２７】
医薬として使用される、請求項２５又は２６に記載のホモ二量体タンパク質。
【請求項２８】
請求項２５又は２６に記載のホモ二量体タンパク質、又は請求項１〜２２のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、医薬組成物。
【請求項２９】
２つのアミノ酸鎖を含むホモ二量体タンパク質を形成可能なアミノ酸鎖をコードする請求項１〜２２のいずれか一項に記載される核酸分子を含む宿主細胞であって、
各アミノ酸鎖が、配列番号1のアミノ酸配列5-70と少なくとも９４%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むターゲティング単位、及び抗原単位を含み、
当該ターゲティング単位と当該抗原単位とが二量体形成モチーフを介して連結され、そして当該ホモ二量体タンパク質が、ワクチンとして適しており、当該ターゲティング単位が、配列番号１の１１位に対応する位置でCからSへの変異を含まない、前記宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２５又は２６に記載の二量体タンパク質を製造する方法であって、以下の：
a)請求項１〜２２のいずれか一項に記載される核酸分子を細胞集合にトランスフェクトし；
b)当該細胞集合を培養し；
c)当該細胞集合から発現された二量体タンパク質を回収し、そして精製する
を含む、前記方法。
【請求項３１】
癌又は感染性疾患に対するワクチンであって、免疫学的に有効量の請求項２５又は２６に記載のホモ二量体タンパク質、又は当該二量体タンパク質を形成可能なモノマータンパク質をコードする請求項１〜２２のいずれか一項に記載の核酸分子を含み、ここで当該ワクチンが、T細胞及びB細胞免疫応答の両者を引き起こすことができ、そして当該ホモ二量体タンパク質が、当該癌又は感染性疾患に特異的な抗原単位を含む、前記ワクチン。
【請求項３２】
前記ワクチンが対象へと投与される際に、当該対象において抗原単位に対するCD8+細胞応答を高めることができる、請求項３１に記載のワクチン。
【請求項３３】
医薬として許容される担体及び/又はアジュバントをさらに含む、請求項３１又は３２に記載のワクチン。
【請求項３４】
前記癌が、複数の多発性骨髄腫若しくはリンパ腫、悪性メラノーマ、HPV誘発性の癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、及び/又は肝癌である、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項３５】
前記感染性疾患が、結核、インフルエンザ、ヘルペス、CMV、HPV、HBV、HIV、ブルセラ症、及び/又はHSV-2から成るリストから選択される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のワクチン。
【外国語明細書】
2019033762000001.pdf