(57)【要約】      （修正有）【課題】アルツハイマ病及びアルツハイマ関連障害の治療及び／又は診断のための新規ワクチン又は抗体の提供。【解決手段】個体においてアルツハイマ病又はアルツハイマ関連障害の発症を遅延させるため若しくは治療するためのワクチンであって、Ｎ末端切断型Ａβを含む生理的に許容されるプロトフィブリル／オリゴマの治療有効量を含有する、ワクチン。個体においてアルツハイマ病又はアルツハイマ関連障害の発症を遅延させるため若しくは治療するための抗体であって、１又はそれ以上の切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマに結合するが、完全長Ａβモノマとは交差反応性を示さないか若しくは実質的に交差反応性を示さず、場合によりＮ末端切断型Ａβモノマに交差反応性を示す、抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体においてアルツハイマ病またはアルツハイマ関連障害の発症を遅延させるためまたは治療するためのワクチンであって、Ｎ末端切断型Ａβを含む生理的に許容されるプロトフィブリル／オリゴマの治療有効量を含有する、ワクチン。
【請求項２】
プロトフィブリル／オリゴマが少なくとも５０％のＮ末端切断型Ａβを含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
プロトフィブリル／オリゴマがＡβｘ−ｙの１またはそれ以上を含み、前記式中、任意の組合せで、ｘは２、３、３（ｐＥ）、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１１（ｐＥ）または１２であり、およびｙは３８、３９、４０、４１、４２または４３である、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
プロトフィブリル／オリゴマが、任意の組合せでＡβ２〜４２、Ａβ３（ｐＥ）〜４２、Ａβ４〜４２またはＡβ１１（ｐＥ）〜４２の１またはそれ以上を含む、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
プロトフィブリル／オリゴマがＡβ３（ｐＥ）〜４２を含む、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
Ｎ末端切断型プロトフィブリル／オリゴマが疎水性有機物質で安定化されている、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項７】
個体においてアルツハイマ病またはアルツハイマ関連障害の発症を遅延させるためまたは治療するための方法であって、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のワクチンを個体に投与することを含む方法。
【請求項８】
個体においてアルツハイマ病またはアルツハイマ関連障害の発症を遅延させるためまたは治療するための抗体であって、１またはそれ以上の切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマに結合するが、完全長Ａβモノマとは交差反応性を示さないかまたは実質的に交差反応性を示さず、場合によりＮ末端切断型Ａβモノマに交差反応性を示す、抗体。
【請求項９】
２５ｎＭまたはそれ以下のＩＣ５０値を有する、１種類のＡβｘ−ｙを少なくとも８０％含む、または２種類もしくはそれ以上のＡβｘ〜ｙの１つの組合せを少なくとも８０％含むプロトフィブリル／オリゴマに結合し、前記式中、ｘが２、３、３（ｐＥ）、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１１（ｐＥ）または１２であり、およびｙが３８、３９、４０、４１、４２または４３である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
プロトフィブリル／オリゴマが、任意の組合せでＡβ２〜４２、Ａβ３（ｐＥ）〜４２、Ａβ４〜４２またはＡβ１１（ｐＥ）〜４２の１またはそれ以上を含む、請求項８または９に記載の抗体。
【請求項１１】
１００ｎＭまたはそれ以下のＩＣ５０値を有する、１００％Ａβ３（ｐＥ）〜４２を含むプロトフィブリル／オリゴマに結合する抗体。
【請求項１２】
モノクローナルである、請求項８乃至１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
抗体がヒト、ヒト化であるか、またはヒトにおける抗原性を低減するように改変されている、請求項８乃至１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
抗体がＩｇＧクラス、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４サブクラスである、請求項８乃至１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
抗体が低い補体活性を有する、請求項８乃至１４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
抗体がＦａｂフラグメント、例えばＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２またはダイアボディである、請求項８乃至１５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項８乃至１６のいずれか１項に記載の抗体を、プロトフィブリル／オリゴマを含有するまたは含有することが疑われる生物学的試料に添加し、抗体とプロトフィブリル／オリゴマの間で形成される複合体の濃度を測定することを含む、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマを検出するための方法。
【請求項１８】
抗体がＮ末端切断型Ａβモノマに交差反応性を示し、ならびに該方法が、抗体とＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマの間で形成される複合体、および抗体とＮ末端切断型Ａβモノマの間で形成される複合体の濃度を測定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項８乃至１６のいずれか１項に記載の抗体および医薬的に許容される緩衝剤を含有する組成物。
【請求項２０】
アルツハイマ病またはアルツハイマ関連障害の治療において使用するための、請求項８乃至１６のいずれか１項に記載の抗体または請求項１９に記載の組成物の使用。
【請求項２１】
個体においてアルツハイマ病またはアルツハイマ関連障害の発症を遅延させるためまたは治療するための方法であって、非Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマに特異的な抗体と組み合わせて、請求項８乃至１６のいずれか１項に記載の抗体を個体に投与することを含む方法。
【請求項２２】
個体においてアルツハイマ病またはアルツハイマ関連障害の発症を遅延させるためまたは治療するための方法であって、Ｎ末端切断型Ａβを含むプロトフィブリル／オリゴマ上の１つのエピトープおよび非Ｎ末端切断型Ａβを含むプロトフィブリル／オリゴマ上の１つのエピトープに結合する抗体を個体に投与することを含む方法。
【請求項２３】
アルツハイマ病またはアルツハイマ関連疾患の発症を遅延させるためまたは治療するための医薬組成物を製造するための、請求項８乃至１６のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性疾患(neurodegenerative)、特にアルツハイマ病ならびにアルツハイマ関連障害および疾患の予防、治療および診断に関する。本発明は、Ｎ末端切断型(N-terminal truncated)アミロイドβタンパク質（Ａβ）プロトフィブリル／オリゴマおよび完全長Ａβモノマには結合しないかまたは実質的に結合しない、そのようなプロトフィブリル／オリゴマに選択的な抗体を提供する。１つの実施形態では、抗体はＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４サブクラスまたはそれらの組合せまたはそれらの変異体(mutations)であり、高いＦｃ受容体結合(receptor binding)および低いＣ１（Ｃ１ｑ）結合を保持し、Ａβプロトフィブリルのクリアランスにおいて有効であり、炎症の危険度が低い。従って、本発明は、主たる態様として、能動免疫ならびに受動免疫(active and negative immunization)のための生成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマ病（ＡＤ）は、認知、記憶および行動の障害を引き起こす、進行性で不可逆的な神経変性障害(progressive and irreversible neurodegenerative disorder)である。高齢者集団における認知症の最も一般的な原因であり、おおよそ６５歳以上の５％および８０歳以上の２０％が罹患する。ＡＤは潜行性の発症および多数の認知機能の進行性低下(progressive deterioration)を特徴とする。神経病理学的には、細胞外および細胞内の両方の好銀性タンパク質様沈着物(argyrophillic proteineous deposits)を含む。老人斑(neuritic plaques)と称される細胞外沈着物は、主として異栄養性神経突起（腫脹し、変形した神経突起）に取り囲まれたアミロイドβタンパク質（Ａβ）から成る。これらの細胞外沈着物内のＡβは、βプリーツシート(pleated sheet)構造を有する原線維状(fibrillar)であることを特徴とする。これらの沈着物中のＡβは、特定の色素、例えばコンゴレッドで染色することができ、原線維状の超微細構造(fibrillar ultra structure)を呈する。老人斑中のその原線維状構造のＡβが備えるこれらの特徴がアミロイドという一般名の定義である。古典的な細胞内ＡＤ病変は神経原線維変化（ＮＦＴ）であり、これは、高リン酸化微小管関連タンパク質タウ(τ)のねじれた鎖で構成される、ペアードヘリカルフィラメント（ＰＨＦs）と呼ばれる線維状構造から成る。脳における高頻度の老人斑および神経原線維変化(neurofibrillary tangle)の沈着物が、死後に実施された場合の、ＡＤの診断基準である。ＡＤの脳はまた、肉眼的な脳萎縮、神経細胞喪失、局所炎症（ミクログリオーシスおよび星状細胞増加症）ならびにしばしば脳血管壁における脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）も示す。
【０００３】
ＡＤを示唆する脳病変、例えばアミロイド斑および神経原線維変化(neurofibrillary tangle)は、いくつかの他の障害でも認められる。３０歳以降では、ダウン症候群を有するほとんどすべての被験者が、沈着物とＮＦＴを伴うＡＤの典型的な神経病理学的特徴を発現している（Ｚｉｇｍａｎ  １９９６）。レビ小体型認知症(Dementia with Lewy Bodies)を有する症例の約５０％では、ＡＤを示す神経病変が共存する。並行する病変の存在が２つの異なる疾患を意味するのか、または単にそれぞれの障害の変形であるのかは不明である。時として、共病変を有する症例はＡＤのレビ小体型を有すると表される（Ｈａｎｓｅｎら、１９９０）。混合型認知症はＡＤと血管性脳症が合併したものを指すが、２つの障害の区別については意見が分かれる。混合型認知症の診断には、可能性のあるＡＤプラス別個の実体としての脳血管疾患の臨床／神経画像検査基準が用いられるが、血管性脳病変(vascular brain)と認知症との因果関係は明らかではない。オーストリアのウィーンにおける１５００名の認知症高齢被験者、そのうち８３０名は臨床的にＡＤの可能性が高い、高齢被験者の連続的な剖検シリーズにおいて、４１．５〜５２．０％は「純粋な」ＡＤを示し、７％は非定型ＡＤ、１６〜２０％はＡＤプラス脳血管病変、そして９％はＡＤプラスレビ小体病変を示した。これは、認知機能障害患者においてＡＤと多数の脳血管病変が頻繁に共存することを示唆する（Ｊｅｌｌｉｎｇｅｒ  ２００７）。
【０００４】
緑内障および加齢性黄斑変性(Age-Related Macular Degeneration)は世界的に失明の主要原因である。ＡＤ脳に関連する視力の喪失を導く、Ａβが関与する同様の病的機構を裏付ける証拠が増えつつある。加齢性黄斑変性では、数多くのおよび／または融合性のドルーゼン(drusen)が、臨床的に網膜色素上皮の地図状萎縮(geographic atrophy)に結びつく。Ａβはヒトドナーの眼のこれらのドルーゼンに沈着する（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ２００２）。Ｃ末端の線状エピトープ(linear epitope)を標的するモノクローナル抗体は、加齢性黄斑変性のマウスモデルにおいて潜在的治療能(therapeutic potential)を有することが明らかにされた（Ｄｉｎｇ  ２００８）。Ａβは実験的緑内障(experimental glaucoma)において網膜神経節細胞(retinal ganglion cells)のアポトーシスに関与することが報告されている（Ｇｕｏ  ２００７）。この動物モデルでは、網膜神経節細胞のアポトーシス誘導を、線状エピトープを有する市販の抗体での治療によって救済することができる。
【０００５】
封入体筋炎(inclusion body myositis)は高齢者における最も一般的な後天性筋疾患(muscle disease)である。典型的には、ＡＤの顕著な特徴、すなわちＡβ沈着物の存在、コンゴレッド色素で染まる封入体およびτ病変(tau pathology)が、この疾患を有する患者の筋生検で認められる（Ｎｅｅｄｈａｍ  ２００８）。結論として、Ａβ沈着物は神経変性障害ならびに眼および筋肉を侵す他の障害で認められ、疾患原因因子として関係づけることができる。
【０００６】
Ａβペプチドの２つの形態、Ａβ４０およびＡβ４２はＡＤ老人斑(neuritic  plaques)における主要な種であるが、ＡＤに関連する脳血管(cerebrovascular)アミロイドではＡβ４０が著明な種である。酵素活性により、Ａβは、健常被験者とＡＤ罹患被験者の両方において身体のすべての細胞中でアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる大型タンパク質から継続的に形成される。β−およびγ−セクレターゼ活性を介した２つの主要なＡＰＰプロセシング事象がＡβの産生を可能にし、一方α−セクレターゼと呼ばれる第三の酵素がＡβ配列を内側で切断することによってＡβの生成を妨げる（Ｓｅｌｋｏｅ、１９９４；Ｅｓｔｅｒ  ２００１；米国特許第５６０４１０２号明細書）。Ａβ４２は４２アミノ酸長のペプチドであり、すなわちＡβ４０と比較してＣ末端で２つのアミノ酸分だけ長い。Ａβ４２はより疎水性であり、且つＡβ二量体、Ａβ三量体、Ａβ四量体、より大きなＡβオリゴマ、例えばＡβプロトフィブリルまたはＡβフィブリルなどのより大型の構造のＡβペプチドへとより容易に凝集する（Ｊａｒｒｅｔ  １９９３）。Ａβフィブリルは疎水性で不溶性であるが、その他の構造はすべて疎水性が低く可溶性である。これらのより高度な分子構造のＡβペプチドはすべて、例えば電子顕微鏡検査におけるそれらの生物物理学的および構造的外観、ならびに、例えばサイズ排除クロマトグラフィ／ウエスタンブロット法での分析によるそれらの生化学的特徴に基づき、個別に定義される。これらのＡβペプチド、特にＡβ４２は、寿命の間に種々のより高度な分子構造のＡβへと徐々に集合する。年齢に強く依存する障害であるＡＤは、この集合過程がより急速に起こるほど生涯のより早期に発症する。これが、ＡＰＰプロセシング、Ａβ４２レベルおよびより高度な分子構造へのこれらの集合がＡＤの主要原因であると主張する、ＡＤの「アミロイドカスケード仮説」の中核をなす。ＡＤ脳についての他のすべての神経病理および認知症などのＡＤの症状は、何らかの形でＡβまたはその集合形態によって引き起こされる。
【０００７】
Ａβは種々の長さで、例えば１〜３８、１〜３９、１〜４０、１〜４１、１〜４２および１〜４３の長さで、ならびに様々な大きさのそれらのフラグメントとして、例えば１〜２８および２５〜３５のフラグメントとして存在し得る。また、ペプチドのＮ-末端で切断が起こり得る。Ｎ末端切断型単量体Ａβは、ＡＤ脳組織（Ｓｅｒｇｅａｎｔ  ２００３）およびＣＳＦから純粋なギ酸として抽出された不溶性Ａβから特徴づけられた。それらは種々の長さで存在し得る。一部の形態はまた、Ｍｅｔ３５で酸化され得る。これらのフラグメントの一部は、Ｎ-末端でメチル化され得るかまたはグルタミニルシクラーゼ（ＱＣ）によってＮ末端でピログルタミル残基を形成し得る。ＱＣ酵素は、Ｎ末端グルタミン酸およびグルタミンに作用して、Ｎ末端のピログルタミン酸（ｐＥ）修飾を生じさせる。そのようなピログルタミン酸修飾Ａβフラグメントの１つがＡβ３（ｐＥ）〜４２であり、これも細胞内局在を有することが示された。Ａβ３（ｐＥ）〜４２形態はまた、高い安定性と凝集傾向を有することも示されている。これらのペプチドはすべて、凝集して可溶性中間体および不溶性フィブリルを形成することができ、各々の分子形態が固有の構造的立体配座および生物物理学的特性を有する。単量体Ａβ１〜４２は、例えば、４２アミノ酸長の可溶性で非毒性のペプチドであり、正常なシナプス機能に関与することが示唆される。一定の条件下で、Ａβ１〜４２は二量体、三量体、四量体、五量体およびより大きなオリゴマ形態に凝集することができ、すべてが、異なる物理化学的特性、例えば分子の大きさ、ＥＭ構造およびＡＦＭ（原子間力顕微鏡検査）分子形状などを有する。より高い分子量の可溶性オリゴマＡβ形態の一例がプロトフィブリルであり（Ｗａｌｓｈ  １９９７）、これは一般に１００ｋＤａより大きい見かけ分子量を有し、直径４〜１１ｎｍおよび長さ２００ｎｍ未満の曲線線形構造を備える。近年、Ａβプロトフィブリルなどの可溶性オリゴマＡβが、海馬における記憶形成を反映すると考えられるシナプス可塑性の尺度である、長期増強（ＬＴＰ）を低下させることが明らかにされた（Ｗａｌｓｈ  ２００２）。さらに、突然変異形態であるオリゴマ北極型（Arctic）Ａβペプチド（下記参照）は野生型Ａβよりもはるかに重大な阻害作用を示す（おそらくそれらのＡβプロトフィブリルを形成するより強い傾向に起因して、脳におけるＬＴＰに対しｗｔＡβ＜９（Ｋｌｙｕｂｉｎ  ２００３））。
【０００８】
プロトフィブリルとは明らかに異なる他の可溶性オリゴマ形態も文献に記載されている。そのようなオリゴマ形態の１つはＡＤＤＬ（アミロイド由来拡散性リガンド）である（Ｌａｍｂｅｒｔ  １９９８）。ＡＤＤＬのＡＦＭ分析は、主に、１７〜４２ｋＤａの分子量を有するｚ軸に沿った４．７〜６．２ｎｍの小さな球状種を明らかにした（Ｓｔｉｎｅ  １９９６）。もう１つの形態はＡＳＰＤ（アミロスフェロイド）と呼ばれるものである（Ｈｏｓｈｉ  ２００３）。ＡＳＰＤはＡβ１〜４０の球状オリゴマである。毒性試験は、１０ｎｍより大きい球状ＡＳＰＤは低分子形態よりも毒性であることを示した（Ｈｏｓｈｉ  ２００３）。この見解は、早期発症型ＡＤを引き起こす北極型（Ｅ６９３）ＡＰＰ突然変異の最近の発見によって裏付けられた（米国特許出願公開第２００２／０１６２１２９号明細書；Ｎｉｌｓｂｅｒｔｈら、２００１）。この突然変異はＡβペプチド配列の内側に位置する。突然変異のキャリアは、それにより、Ａβペプチドの変異体、例えば北極型Ａβ４０および北極型Ａβ４２を生成する。北極型Ａβ４０および北極型Ａβ４２はどちらも、より高度な分子構造、すなわちプロトフィブリルへとはるかに容易に凝集する。
【０００９】
アルツハイマ病（ＡＤ）の脳では、細胞外アミロイドプラークが実質および血管壁で典型的に認められる。プラークは、アミロイドＡβ３８〜４３アミノ酸長の疎水性(long hydrophobic)で自己凝集性のペプチドから構成され、徐々に重合した後プラーク沈着する。可溶性Ａβオリゴマ種はアミロイドプラーク自体よりも疾患相関性が高いと提案されてきた（ＭｃＬｅａｎら、１９９９；Ｎａｓｌｕｎｄら、２０００）。これらの前フィブリル中間体Ａβ種の中で、オリゴマ形態はインビトロおよびインビボの両方で有害な生物学的作用を誘発することが示されており（Ｗａｌｓｈら、２００２）、従って疾患の病因において中心的役割を果たすと考えられる。様々な分子サイズのいくつかのオリゴマＡβ種が公知である。重要な点として、Ａβの単量体、オリゴマおよびフィブリル形態の立体配座(conformation)は異なっており、立体配座選択的抗体による標的となり得る。主要なＡβ病原体の同一性は明らかではないが、一部の証拠は、高分子量Ａβオリゴマが特に神経毒性であることを示唆する（Ｈｏｓｈｉら、２００３）。
【００１０】
早期発症型ＡＤを引き起こす、アミロイド前駆体(precursor)タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子における病原性突然変異(mutation)が記述されている。その１つであるスウェーデン型ＡＰＰ突然変異（Ｍｕｌｌａｎら、１９９２）はＡβレベルの上昇を生じさせる。Ａβドメイン内に位置する北極型ＡＰＰ突然変異（Ｅ６９３Ｇ）は、大型Ａβオリゴマであるプロトフィブリルの形成を促進することが認められ、これらのＡβ中間体が特に病原性であることを示唆した（米国特許出願公開第２００２／０１６２１２９号明細書；Ｎｉｌｓｂｅｒｔｈら、２００１）。北極型ＡＰＰ突然変異の同定およびＡβプロトフィブリルについての毒性作用の解明は、ＡＤの病因におけるＡβオリゴマへの注目を高めることになった。
【００１１】
アルツハイマ病のための治療戦略としての能動免疫法は（Ｓｃｈｅｎｋら、１９９９）によって最初に報告された。免疫戦略のための標的は、アルツハイマ斑において認められるフィブリル形態のＡβであった。フィブリル化Ａβをワクチン（ＡＮ−１７９２）として使用する活性Ａβワクチン接種の最近の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験は、少数の患者において髄膜脳炎(meningoenphalitis)が発症したため中止を余儀なくされた（Ｂａｙｅｒら、２００５）。この試験で見られた副作用は、おそらく血管壁の原線維性アミロイドに対して反応する抗Ａβ抗体によって引き起こされたと考えられる。ＣＡＡにおける原線維性アミロイドは血液脳関門（ＢＢＢ）にごく近接しており、従って抗原抗体反応がＢＢＢに損傷を生じさせ、Ｔリンパ球のＣＮＳへの浸潤をもたらした可能性がある（Ｐｆｅｉｆｅｒら、２００２；Ｒａｃｋｅら、２００５）。さらに、参加した患者のうちの少数しかＡβワクチンに対する免疫応答(immune response)を示さなかった。この試験は早期に終了されたが、活性Ａβ免疫(immunization)はＡＤ患者の小集団に対してしか有益であり得ないことを示唆すると思われる。
【００１２】
ヒトＡβプロトフィブリルに対して選択的なモノクローナル抗体が記述されている（国際公開第２００５／１２３７７５号）。高度に純粋で安定なヒトＡβプロトフィブリルを生成する方法は、北極型突然変異（Ｇｌｕ２２Ｇｌｙ）を有する合成Ａβ４２ペプチドの使用を含む。この突然変異は、免疫およびＡβプロトフィブリル選択的抗体についてのハイブリドーマスクリーニングを促進する。重要な点として、これらの抗体は野生型(wild type)ＡβプロトフィブリルとＡβ−Ａｒｃプロトフィブリルの両方に結合する。
【００１３】
Ａβフィブリル（Ｏ’Ｎｕａｌｌａｉｎ  ２００２）、ミセルＡβ（Ｋａｙｅｄ  ２００３）、ＡＤＤＬ（Ｌａｍｂｅｒｔ  ２００１）などのＡβの他の立体配座に関して選択的な抗体が記述されている。しかしながら、これらのいずれもがＡβプロトフィブリル選択的ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、アルツハイマ病およびアルツハイマ関連障害の治療および／または診断方法において使用するための、１またはそれ以上のＮ切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマに結合するが、完全長(full-length)Ａβモノマとは交差反応性(cross-reactivity)を示さないかまたは実質的に交差反応性を示さず、場合によりＮ末端切断型Ａβモノマに交差反応性を示す抗体を提供する。
【００１５】
本発明はまた、アルツハイマ病およびアルツハイマ関連障害を治療するおよび／または診断するための、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマを含有するワクチンを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
１つの実施形態では、本発明は、アルツハイマ病またはアルツハイマ関連障害の発症を遅延させるためまたは治療するためのワクチンであって、Ｎ末端切断型Ａβを含む生理的に許容されるプロトフィブリル／オリゴマの治療有効量を含有するワクチンを対象とする。もう１つの実施形態では、プロトフィブリル／オリゴマは、様々な比率での完全長ＡβペプチドとＮ末端切断型Ａβペプチドの組合せを含む。さらなる実施形態では、本発明のワクチンは、非安定化形態のＮ末端切断型プロトフィブリル／オリゴマよりも不溶性凝集形態への形成率が低い、生理的に許容される安定化されたＮ末端切断型プロトフィブリル／オリゴマの治療有効量を含有する。
【００１７】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、個体においてアルツハイマ病またはアルツハイマ関連障害の発症を遅延させるためまたは治療するための方法であって、本発明によるワクチンを個体に投与することを含む方法を対象とする。さらなる実施形態では、本発明は、Ｎ末端切断型Ａβを含むプロトフィブリル／オリゴマに対する抗体、すなわちインビボで形成されるプロトフィブリル／オリゴマにより効率的に結合する改善された抗体を作製するための、本発明によるワクチンの使用を対象とする。おそらく、完全長ならびにＮ末端切断型Ａβペプチドによって構成されるプロトフィブリル／オリゴマの混合物が存在する。
【００１８】
もう１つの実施形態では、本発明は、個体においてアルツハイマ病またはアルツハイマ関連障害の発症を遅延させるためまたは治療するための抗体であって、１またはそれ以上のＮ切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマに結合するが、完全長Ａβモノマとは交差反応性を示さないかまたは実質的に交差反応性を示さず、場合によりＮ末端切断型Ａβモノマに交差反応性を示す抗体を対象とする。もう１つの実施形態では、本発明は、個体においてアルツハイマ病またはアルツハイマ関連障害の発症を遅延させるためまたは治療するための方法であって、本発明による抗体を個体に投与することを含む方法を対象とする。
【００１９】
もう１つの実施形態では、本発明は、個体においてアルツハイマ病またはアルツハイマ関連障害の発症を遅延させるためまたは治療するための抗体を作製する方法であって、抗体またはそのフラグメントが、１またはそれ以上のＮ切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマに結合するが、完全長Ａβモノマとは交差反応性を示さないかまたは実質的に交差反応性を示さない、抗体の作製方法を対象とする。前記方法は、抗原を非ヒト動物に投与し、抗原に対して形成された抗体を収集することを含み、前記抗原は、可溶性Ａβ種である、安定化されたＮ末端切断型プロトフィブリル／オリゴマ、またはＮ末端切断型プロトフィブリル／オリゴマよりも不溶性凝集形態への形成率が低い安定化Ｎ末端切断型プロトフィブリル／オリゴマを含む。
【００２０】
なおさらなる実施形態では、本発明は、それぞれ、本発明による抗体またはワクチン、ならびにヒトおよび／または動物での使用に関して医薬的に許容される、例えば抗菌剤、アジュバント、緩衝剤、塩、ｐＨ調整剤、界面活性剤およびそれらの任意の組合せから成る群より選択される、１またはそれ以上の賦形剤を含有する、抗体組成物およびワクチン組成物を対象とする。
【００２１】
さらなる実施形態では、本発明は検出方法を対象とする。１つの実施形態では、単量体としてならびに可溶性凝集形態、すなわちオリゴマ／プロトフィブリルとしての可溶性Ｎ-末端切断型Ａβペプチドをインビトロで検出する方法は、本発明による抗体を、そのような化合物を含有するまたは含有することが疑われる生物学的試料に添加し、抗体と化合物の間で形成される任意の複合体を検出して、その濃度を測定することを含む。もう１つの実施形態では、Ｎ末端切断型Ａβ形態をインビボで検出する方法は、Ｎ末端切断型プロトフィブリル／オリゴマを担持することが疑われる個体に、検出可能なマーカで標識された本発明による抗体を投与し、標識抗体の検出によって、抗体と様々な可溶性Ｎ末端切断型Ａβ化合物との間で形成される複合体の存在を検出することを含む。
【００２２】
本発明のワクチン、抗体および方法は、アルツハイマ病およびアルツハイマ関連障害を対象とする診断および治療技術のために有益である。本発明のさらなる実施形態および態様は「発明を実施するための形態」で示され、本発明のさらなる利点がそれらから明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＳＥＣ−ＨＰＬＣによるＡβ３（ｐＥ）〜４２プロトフィブリルからのＡβ３（ｐＥ）〜４２モノマの分離を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、アルツハイマ病およびアルツハイマ関連障害の発症の遅延、治療および／または予防を含む、アルツハイマ病およびアルツハイマ関連障害を診断し、対処する(combating)ための様々な方法において使用するための抗体（受動免疫）およびワクチン（能動免疫）を提供する。
【００２５】
前記抗体およびワクチンは、ダウン症候群、脳血管性アミロイドーシス、混合型認知症、緑内障、加齢性黄斑変性および／または封入体筋炎を含むがこれらに限定されない、アルツハイマ病およびアルツハイマ病関連障害（アルツハイマ関連障害）の発症の遅延、治療および／または予防において使用し得る。これらの障害はまた、他の神経変性障害、例えばα−シヌクレイン関連疾患と合併して発症し得る。
【００２６】
抗体およびワクチンはまた、中でも特に、診断、観測または治療のための検出方法においても使用し得る。
【００２７】
アルツハイマ病の主たる病理は、細胞外毒性型可溶性Ａβオリゴマ形態のＡβペプチド、特にプロトフィブリルと呼ばれる高分子量型オリゴマ形態のＡβである。本開示において、「オリゴマ／プロトフィブリル」および「プロトフィブリル／オリゴマ」という用語は、プロトフィブリルを含むより高い分子量のオリゴマを指すために同義的に使用される。本発明は、Ｎ-末端切断型Ａβを含むプロトフィブリル／オリゴマに結合する治療用抗体を対象とする。本発明はまた、Ｎ末端切断型Ａβを含むプロトフィブリル／オリゴマを含有するワクチンを対象とする。
【００２８】
本発明による使用のためのＡβペプチドの群は、Ｎ-末端切断型であり、式Ａβｘ〜ｙ［式中、任意の組合せで、ｘは２、３、３（ｐＥ）、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１１（ｐＥ）または１２であり、およびｙは３８、３９、４０、４１、４２または４３である］である。例としては、例えばＡβ２〜４０、Ａβ３〜４０、Ａβ３（ｐＥ）〜４０、Ａβ４〜４０、Ａβ５〜４０、Ａβ６〜４０、Ａβ７〜４０、Ａβ８〜４０、Ａβ９〜４０、Ａβ１０〜４０、Ａβ１１〜４０、Ａβ１１（ｐＥ）〜４０、Ａβ１２〜４０、Ａβ２〜４２、Ａβ３〜４２、Ａβ３（ｐＥ）〜４２、Ａβ４〜４２、Ａβ５〜４２、Ａβ６〜４２、Ａβ７〜４２、Ａβ８〜４２、Ａβ９〜４２、Ａβ１０〜４２、Ａβ１１〜４２、Ａβ１１（ｐＥ）〜４２およびＡβ１２〜４２を含むが、これらに限定されない。
【００２９】
Ａβ３（ｐＥ）〜４０／４２およびＡβ１１（ｐＥ）〜４０／４２では、ペプチドは、それぞれ、そのＮ-末端で２または１０個のアミノ酸を欠失しており、Ｎ末端アミノ酸であるグルタミン酸がグルタミン酸のピログルタミル誘導体に環化している。
【００３０】
現在のところ、Ａβ２〜４２、Ａβ３（ｐＥ）〜４２、Ａβ４〜４２および／またはＡβ１１（ｐＥ）〜４２は特に重要であると思われ、様々な組合せでこれらの１またはそれ以上を含むプロトフィブリル／オリゴマに結合する抗体は、重要な治療的役割を果たすと考えられている。
【００３１】
本発明の１つの実施形態では、プロトフィブリル／オリゴマは、Ｎ-末端切断型Ａβペプチドを含むが、完全長Ａβペプチド、すなわち非Ｎ末端切断型Ａβペプチドを含まない。本明細書において、「完全長Ａβペプチド」および「非Ｎ末端切断型Ａβペプチド」という用語は同義的に使用され、Ｎ末端切断を有さないが、Ｃ末端切断は有してもよいまたは有さなくてもよいＡβペプチドを指す。
【００３２】
本発明のもう１つの実施形態では、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマは、Ｎ末端切断型Ａβと非Ｎ末端切断型Ａβの両方をそれらの任意の組合せで含み得る。理論に拘束されるものではないが、現在のところ、これは臨床状況の良好な予測を提供すると考えられる。
【００３３】
本発明のプロトフィブリル／オリゴマは、５０％以上のＮ末端切断型Ａβペプチド、例えば６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上または１００％の、上記で開示されるＮ末端切断型ペプチドのいずれかを単独で、または２種類もしくはそれ以上のＮ-末端切断型の組合せとして含む。そのようなプロトフィブリル構築物中の完全長ペプチドは、Ａβ１〜３８、Ａβ１〜３９、Ａβ１〜４０、Ａβ１〜４１、Ａβ１〜４２またはＡβ１〜４３またはこれらの任意の組合せであり得る。現在のところ、Ａβ１〜４０および特にＡβ１〜４２がそのような構築物の最も重要な成分であると考えられている。
【００３４】
本発明の抗体は、Ｎ末端切断型プロトフィブリル／オリゴマを含むプロトフィブリル／オリゴマに対して高い親和性を示し、これに結合することを特徴とする。この機能性は、Ａβ系の様々な種に対して惹起される公知の抗体と比較して重要な利点を提供する。従って、本発明の１つの態様による抗体は、８０％の、上記で定義されたＮ末端切断型Ａβｘ〜ｙの少なくとも１つの種または１つの組合せを含むプロトフィブリル／オリゴマに対して２５ｎＭ以下のＩＣ５０値、例えば１５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、さらには５ｎＭ以下のＩＣ５０値を有する。ＩＣ５０値を決定するための方法は、参照により本明細書に組み込まれる、Englund H. et al. in J. of Neurochemistry, 2007, 103, 334-345によって記述されている。阻害ＥＬＩＳＡ法において最大シグナルの半分を阻害するために必要な抗原（Ａβプロトフィブリル／オリゴマまたはモノマ）濃度がＩＣ５０値と定義され、抗原に対する抗体の親和性の評価として使用できる。プロトフィブリル／オリゴマ濃度は単量体サブユニット（〜４ｋＤ）のモル濃度として表される。
【００３５】
本発明の１つの実施形態によれば、プロトフィブリル／オリゴマは８０％のＡβ３（ｐＥ）〜４２および２０％のＡβ１〜４２を含む。
【００３６】
本発明の１つの実施形態では、抗体は、９０％の、Ｎ末端切断型Ａβｘ〜ｙの少なくとも１つの種または１つの組合せを含むプロトフィブリル／オリゴマに対して５０ｎＭ以下のＩＣ５０値、特に１００％の、上記で定義されたＮ末端切断型Ａβペプチドの少なくとも１つの種または１つの組合せを含むプロトフィブリル／オリゴマ、特に１００％のＡβ３（ｐＥ）−４２を含むプロトフィブリル／オリゴマに対して１００ｎＭ以下、例えば５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、さらには５ｎＭ以下ののＩＣ５０値を示す。
【００３７】
本発明の重要で且つ現在のところ好ましい実施形態によれば、Ｎ末端切断型Ａβモノマにも結合する抗体が提供される。本発明による抗体のさらなる特徴は、非切断型Ａβモノマへの結合を示さないかまたは実質的に結合を示さないことであり、これは、標準的なＥＬＩＳＡで測定した場合、１ｎＭ未満の濃度で検出可能な結合が存在しないことを意味する。
【００３８】
本発明のさらにもう１つの実施形態では、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマは北極型突然変異(mutation)（Ｅ２２Ｇ）を含む。
【００３９】
本発明のさらにもう１つの実施形態では、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマは、オランダ型突然変異（Ｅ２２Ｑ）またはイタリア型突然変異（Ｅ２２Ｋ）またはアイオワ型突然変異（Ｄ２３Ｎ）またはフランドル型突然変異（Ａ２１Ｇ）またはこれらの突然変異の２もしくはそれ以上の組合せを含む。
【００４０】
本発明のさらにもう１つの実施形態では、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマは、北極型、オランダ型、イタリア型、アイオワ型およびフランドル型突然変異を含む２またはそれ以上の突然変異の任意の組合せを含む。
【００４１】
これらのＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマのレベルを低下させることが免疫治療アプローチにとっての課題である。しかし、能動的に誘導されたまたは受動的に投与された抗体の画分は、脳におけるミクログリアの食作用プロセスによってそれらの標的に結合し、それを低減することができる。
【００４２】
本発明はまた、本発明による抗体または他の生成物の設計および開発を大きく促進する安定化されたＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマの作製のための方法を提供する。ヒトＡβモノマの分子量は約４ｋＤａである。２またはそれ以上のＡβモノマは、凝集して、広範囲の分子量を有する可溶性Ｎ末端切断型プロトフィブリル／オリゴマを形成することができる。支配的なオリゴマは、一般にプロトフィブリルと称される。しかし、これらのＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマは不安定であり、自然に重合して不溶性フィブリルになる。本発明は、抗体およびワクチンの開発のために、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマを安定化し、安定化されたＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマを、好ましくは高度に精製された形態で、単離する方法を提供する。本発明による安定化されたＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマは、非安定化Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマよりも低い不溶性凝集形態、すなわちフィブリルへの形成率を示す。これらの形態は高い毒性を示すため、特に興味深い。
【００４３】
加えて、Ｎ末端切断型のＡβは、組換え技術または固相ペプチド合成によって作製できる。さらに、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマは、アルツハイマ病を有する症例からの死後剖検されたヒト脳組織中の脳抽出物から直接誘導することができる。Ｎ末端切断型ペプチドから作製されたＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマの標本を種々の生理的緩衝液中で精製する。これらの試料標本を、モノクローナル抗体の発現のためにそのままマウスに注射するかまたはクロマトグラフィ法によって分画した後マウスに注射する。生成された抗体をヒト化した後、本明細書でさらに詳細に説明する受動ワクチン接種スキーム(passive vaccination scheme)においてまたは診断免疫測定法(diagnostic immunoassays)において患者を治療するために使用する。
【００４４】
さらに、マウスの免疫およびモノクローナル抗体の発現のために使用されるＮ-末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマはまた、健常個体またはアルツハイマ病および／もしくはアルツハイマ関連障害を有する患者からの生体組織または血液、脳脊髄液、尿もしくは唾液などの体液から単離し得る。Ｎ-末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマの安定化は、例えば構造修飾などの、様々な方法で実施し得る。１つの実施形態では、安定化剤に結合することによって構造修飾が達成される。結合は架橋の形態であり得る。特定の実施形態では、安定化剤は疎水性有機物質である。様々な実施形態において、疎水性有機物質は、飽和、不飽和もしくは多不飽和脂肪酸、またはそれらの誘導体、またはそれらの任意の組合せ、例えばそれらの任意の２つまたはそれ以上の組合せを含む。さらなる実施形態では、疎水性有機物質は反応性アルデヒドを含む。アルデヒドは、例えば、α，β−不飽和アルデヒドなどのアルケナールであり得る。適切な反応性アルデヒドは、４−ヒドロキシ−２−ノネナール、４−オキソ−２−ノネナール（ＯＮＥ）、マロンジアルデヒドおよびアクロレインを含むが、これらに限定されない。アルデヒドはまた、アルデヒド基を連結する２〜２５個の炭素原子のモノ不飽和または多不飽和炭素鎖を有するジアルデヒドであり得る。疎水性有機物質はＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマ立体配座を安定化するので、不溶性フィブリル立体配座へのさらなる凝集が防止される。
【００４５】
さらなる実施形態では、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマを、非イオン性および両性イオン性界面活性剤などの、しかしこれらに限定されない疎水性界面活性剤によって修飾することができる。そのような界面活性剤の例は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  （ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）、Ｔｗｅｅｎ−２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ−８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）およびＢｒｉｊ界面活性剤（脂肪アルコールのポリオキシエチレンエーテル）などの非イオン性界面活性剤、ならびにＣＨＡＰＳ（３−［（３−コルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）などの両性イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
他の適切な安定化剤は胆汁酸誘導体を含み、その例は、コール酸塩、デオキシコール酸塩およびタウロコール酸塩ならびにそれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されない。
【００４７】
安定化剤はまた、天然の生物学的分子の群から選択することができ、その例は、トリグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ガングリオシド、コレステロール、コレステロールエステル、長鎖（例えば約６〜３０個の炭素原子を含む）アルコール、および上記物質の任意の組合せを含むが、これらに限定されない。
【００４８】
安定化はまた、酒石酸ジスクシンイミジル、スベルイミド酸ビススルホスクシンイミジル、３，３−ジチオビス−スルホスクシンイミジルプロピオネートおよびそれらの任意の組み合わせなどの、しかしこれらに限定されないタンパク質架橋剤を使用して実施し得る。
【００４９】
もう１つの実施形態では、安定化Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマは１−α−ヒドロキシ−セコステロールを安定化剤として含む。
【００５０】
安定化剤は、架橋によるものを含めて、Ｎ末端切断型Ａβのモノマおよび／もしくはプロトフィブリル／オリゴマまたはそれらの組合せに結合して、安定化Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマを形成し得る。例えば、ＨＮＥおよびＯＮＥなどの不飽和脂肪酸に基づく反応性アルデヒドは、アルデヒド基または二重結合またはその両方によってオリゴマに結合し得る。後者はその後オリゴマの架橋を生じさせる。ＨＮＥは、例えば、オリゴマのヒスチジンおよびリシンに共有結合し得る。同様に、ＯＮＥはヒスチジンおよびリシンに共有結合し得る。アルデヒドはシッフ塩基を介してリシンに結合することができ、またはヒスチジンは、不飽和炭素鎖中の二重結合の炭素原子への求核攻撃(nucleophilic attack)を介して結合し得る。安定化剤、例えばＨＮＥおよびＯＮＥなどの反応性アルデヒドとＮ-末端切断型Ａβペプチドとの間の化学量論は、２：１〜５０：１またはそれ以上の広い範囲内で変動し得る。特定の実施形態では、２０：１を上回る、例えば２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１およびそれ以上のＨＮＥ修飾値は、望ましい高いプロトフィブリル形成を有する生成物を提供する。加えて、ＯＮＥに関しては、さらに低い比率、例えば５：１から、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１およびそれ以上が使用できる。
【００５１】
特に明記されない限り、上記で挙げた安定化剤はすべて、Ｎ末端切断型Ａβに結合することによってそれらの安定化作用をもたらし、安定化反応は、例えば、実施例で説明するようにインキュベーションによって実施し得る。安定化剤はまた、所望に応じて２またはそれ以上の組合せで使用し得る。
【００５２】
本発明のさらにもう１つの実施形態では、安定化Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマは、以下のタンパク質：α−シヌクレイン、タウ(tau)またはホスホタウの１またはそれ以上を任意の組合せで含み得る。これらの混合物は、付加的な成分が認知症、例えば、限定されることなく、アルツハイマ病およびまたレビ小体型アルツハイマ病を有する患者において認められ、従ってこれらの障害の抗体またはワクチン治療のための治療上重要なネオエピトープを提供するという点で有利である（Ｔｓｉｇｅｌｎｙら、２００８）。もう１つの利点は、付加的な成分がＮ-末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマの安定性を高めることである。
【００５３】
１つの実施形態では、本発明は、アルツハイマ病および／またはアルツハイマ関連障害の発症を遅延させるためまたは治療するためのワクチンを対象とする。本開示において、ワクチンという用語は、能動免疫のためにヒトまたは動物に投与するための生理的に許容される形態の組成物を指すのに使用される。ワクチンは、治療有効量のＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマ、例えば単離されたＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマを含有する。単離されたという用語は、可溶性Ｎ-末端切断型Ａβペプチドを含む、標本媒質、反応物等から分離されたＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマを指す。特定の実施形態では、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマは、可溶性Ｎ末端切断型Ａβペプチドを含む、標本媒質、反応物等から分離されている、上記で論じた安定化Ｎ-末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマである。さらなる特定実施形態では、ワクチンは、約１０〜５００μｇ／用量(dose)のＮ-末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマまたは安定化Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマを含有する。より特定の実施形態では、ワクチンは、約５０〜２５０μｇ／用量のＮ-末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマまたは安定化Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマを含有する。
【００５４】
能動免疫のためのワクチンは、ワクチン技術分野において従来使用される１またはそれ以上の賦形剤を含有してよく、その例は、賦形剤がヒトおよび動物での使用に関して医薬的に許容されることを条件として、１またはそれ以上の抗菌剤、アジュバント、緩衝剤、塩、ｐＨ調整剤、界面活性剤またはそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。ワクチンはまた、例えば凍結乾燥の間および／または凍結乾燥後のワクチンの安定を高める１またはそれ以上の賦形剤と共に、凍結乾燥し得る。適切な賦形剤の具体的な例は、マンニトールおよび／またはトレハロースを含むが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明はまた、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマに結合し、および好ましくはＮ末端切断型Ａβモノマにも結合する抗体を対象とする。そのような抗体を作製し、毒性形態のＮ末端切断型Ａβプロトフィブリルに対する特異的抗体の発現を最適化するために、安定化形態を含むＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマを抗原として使用し得る。そのような方法では、抗原を非ヒト動物に投与し、前記抗原に対して生成された抗体を収集する。治療効果を最大化するため、本発明によるＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマ抗原に対して惹起される抗体は、好都合には、天然形態のＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマおよび好ましくは体内に存在するＮ末端切断型モノマ、特に凝集した可溶性形態のＡβにも高い結合を示す。特定の実施形態では、抗体は、完全長モノマ、特にＡβ１〜４２モノマおよび／またはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）および／または他のアミロイドへの結合を示さないかまたは実質的に結合を示さない。そのような抗体を選択する１つの方法は、段階的に選択を行うことであり、最初に少なくとも１つのＮ-末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマに結合する抗体をスクリーニングし、これらの中で完全長Ａβモノマ、特にＡβ１〜４２モノマ、ＡＰＰおよび他のアミロイドに結合しないかまたは実質的に結合しない、他の重要な特徴を満たす種を選択して、その後、これらの抗体の中で野生型ヒトＮ末端切断型Ａβプロトフィブリルまたはインビボでの状況を反映するプロトフィブリルの混合物に良好に結合する抗体をスクリーニングする。
【００５６】
本発明の１つの態様によれば、本明細書で定義されるプロトフィブリル／オリゴマは、アルツハイマ病またはアルツハイマ関連障害の発症を遅延させるためまたは治療するための医薬組成物の製造に使用される。
【００５７】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書で定義される抗体は、アルツハイマ病またはアルツハイマ関連障害の発症を遅延させるためまたは治療するための医薬組成物の製造に使用される。
【００５８】
本発明のさらにもう１つの実施形態では、本明細書で述べる抗体は、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマおよび主として非Ｎ-末端切断型Ａβペプチドを含むＡβプロトフィブリル／オリゴマの両方に結合する。そのような抗体は、１つの抗体を使用することによって、これらのＡβプロトフィブリル／オリゴマ形態ならびに脳内の完全長ＡβとＮ末端切断型Ａβの混合物を含むプロトフィブリルの両方を低下させるのに有利である。従って、Ａβ系の２つのエピトープを認識する二重特異性抗体が本発明の１つの態様として提供される。本発明はさらに、そのような二重特異性抗体ならびに有効量の抗体を含有する医薬組成物の投与によってアルツハイマ病またはアルツハイマ関連障害の発症を遅延させるおよび／または治療するための方法を提供する。
【００５９】
あるいは、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマに対して、および場合によりＮ末端切断型モノマに対しても特異的な抗体は、非Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマ（非切断型）に結合する抗体と組み合わせて治療において使用でき、それによりＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマおよびＡβプロトフィブリル／オリゴマ（非切断型）の両方の治療的に重要な低減を達成する。本発明は、抗体のそのような組合せの投与によってアルツハイマ病またはアルツハイマ関連疾患の発症を遅延させるおよび／または治療するための方法を提供する。そのような投与は、両方の抗体を含有する単一医薬製剤を使用して、もしくは２つの組成物として同時に行うことができ、または２つの組成物を連続的に投与することもできる。従って、本発明は、有効量の２つの抗体を含有する医薬組成物、または２つの抗体の各々について１つずつ２つの別個の組成物を含むキットを提供する。
【００６０】
生じる抗体は、ＡβがＡβフィブリルに凝集する前にＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマに結合し、潜在的に、既に形成されたフィブリルの量も低減することができるモノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはそれらの活性フラグメントであり得る。特定の実施形態では、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル抗原を、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはそれらの活性フラグメントを作製するおよび／または進化させる(evolving)ために、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイおよび細菌ディスプレイなどの方法において使用し得る。より具体的には、モノクローナル抗体の作製のために、ハイブリドーマ技術および／またはファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイもしくは細菌ディスプレイなどの従来技術を使用し得る。そのような抗体は、マウス、ハムスターまたはラットなどのげっ歯動物(rodents)において作製し得る。ひとたび作製されれば、クローンを単離し、それらのそれぞれの抗原特異性に関してスクリーニングする。スクリーニングのために、２つの原則を用いる。第一に、抗体を精製Ｎ-末端切断型Ａβモノマ、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマおよびフィブリルに対してプローブする。これらの異なる立体配座(conformational)形態のＮ-末端切断型Ａβは、Ｎ末端切断型Ａβペプチドまたは安定化Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル、例えばＨＮＥ修飾型および／もしくはＯＮＥ修飾型をインキュベートし、その後ＨＰＬＣによってまたは遠心ろ過装置を用いて分画することによって作製できる。Ｎ末端切断型Ａβフィブリルは、インキュベーション混合物の遠心分離によって単離できる（実施例１）。スクリーニングは、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）によってまたは同様の方法によって実施し得る。第二に、トランスジェニック動物からの組織切片および／または病的アルツハイマヒト脳組織切片に関して抗体を評価する。
【００６１】
さらなる実施形態では、抗体は、変異型または野生型であるが、完全長Ａβモノマ形態、特にＡβ１〜４２、ＡＰＰまたはいかなる他のアミロイドにも結合しないかまたは実質的に結合しない、安定化ならびに非安定化ヒトＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマの両方と反応する。
【００６２】
抗体は、ヒト、ヒト化であり得るか、または当業者に公知の方法に従ってヒトにおける抗原性を低減するように改変され得る。抗原性の低減は、例えば抗体のＴ細胞エピトープを修飾するまたは除去することによって実施し得る。１つの実施形態では、抗体はＩｇＧクラスから、またはより好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４サブクラスから（ヒト抗体）選択される。
【００６３】
さらなる実施形態では、抗体はまた、低い補体活性および／または変化したＦｃ受容体結合特性を有し得る。これは、例えば、重鎖（ヒト）のアミノ酸配列の２９７、３２２もしくは３３１位で抗体のＦｃ部分を変異させる、または、例えばマウスＩｇＧにおける対応するアミノ酸を変異させることによって達成され得る（Duncan & Winter, Nature 1988, 332: 738-470およびIdusogie et al, Journal of Immunology, 2000, 164: 4178-84; 前記資料は参照により本明細書に組み込まれる）。低い補体活性はまた、当技術分野で公知の技術に従って、酵素的にまたは他の手段により抗体を脱グリコシル化することによっても達成され得る。抗体の変化したＦｃ受容体結合特性は、糖タンパク質に結合しているオリゴ糖構造を変化させることによって達成され得る（Jeffries, Nature, 2009, 8: 226-234）。抗体は、例えば血液脳関門透過性および神経細胞取り込みを改善するために、例えばＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２およびダイアボディ(DiFabody)から選択されるＦａｂフラグメントまたは、例えばｓｃＦｖ−ＦｃおよびｓｃＦａｂから選択される一本鎖抗体であり得る。それ故本明細書で使用される抗体が、抗原によって惹起される完全長タンパク質またはその活性フラグメントを指すことは明白である。
【００６４】
より具体的な実施形態では、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマ抗原をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分画し、単離する。画分を細胞培養モデルにおいてそれらのそれぞれの毒性に関して評価し、最も強い毒性を有する抗原画分を抗体作製のための抗原としてまたは能動免疫用の抗原として選択する。試料標本はまた、毒性を評価するために直接使用することもでき、最も顕著な毒性を示す試料を、抗体の選択および／もしくは作製のための抗原としてまたは能動免疫用の抗原として、好都合に使用し得る。
【００６５】
Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマ抗体は、本発明によるＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマを直接患者に投与すること（能動免疫）、または抗原に対するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体を惹起するためにげっ歯動物、例えばマウスもしくはウサギを免疫することによる投与に応答して形成され、それらをアルツハイマ病およびアルツハイマ関連障害などの神経変性障害を治療するための受動免疫プロトコールにおいて適用する。受動免疫の場合、特定の実施形態では、患者に投与する前に抗体をヒト化する。
【００６６】
能動免疫プロトコールに従って、選択されたＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマ抗原を投与し、顕著な毒性を有するＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマ種、特にプロトフィブリル／オリゴマ種に対する立体配座特異的抗体を生成する。受動免疫プロトコールに従って、そのようなＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマ種に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、抗体の反復注射後にそれらの作用を及ぼす。
【００６７】
選択的な実施形態では、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマに結合する抗体は、対照ヒト被験者またはアルツハイマ病を有する患者からの白血球に由来するヒト抗体であり得る。確立された技術に従って白血球からハイブリドーマを作製し、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／モノマおよび安定化Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマに結合するものをスクリーニングする。Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマに対するヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト抗体ライブラリをＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／モノマへの結合に関してスクリーニングすることによって得られる。ヒト対照被験者またはアルツハイマ病もしくはアルツハイマ関連疾患を有する患者からの血液中に存在するＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマに対する自己抗体も、使用のために単離し得る。前記自己抗体は、例えば収率および経済性を改善するためにＣＨＯ細胞において、組換え(recombinant)ＤＮＡ技術によって配列決定し、作製することができる。
【００６８】
特定の実施形態では、前述した抗体は、例えば投与に適する、組成物中で提供される。そのような組成物は、本明細書で述べる抗体、および医薬組成物中で従来使用される１またはそれ以上の賦形剤を含有し得る。抗体は治療有効量で含有される。特定の実施形態では、組成物は、意図される受容者の体重ｋｇ当たり約０．１〜５ｍｇ、またはより具体的には約０．５〜２ｍｇの量の抗体を含有する。
【００６９】
適切な賦形剤としては、そのような賦形剤がヒトおよび／または動物での使用に関して医薬的に許容されることを条件として、１またはそれ以上の抗菌剤、アジュバント、緩衝剤、塩、ｐＨ調整剤、界面活性剤またはそれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されない。組成物は、例えば凍結乾燥の間および／または凍結乾燥後の抗体の安定を高める賦形剤と共に、凍結乾燥された組成物であり得る。マンニトールおよび／またはトレハロースは凍結乾燥に適する賦形剤の非限定的な例である。
【００７０】
本明細書で述べるワクチンおよび抗体は、個体においてアルツハイマ病またはアルツハイマ関連障害を予防する、その発症を遅延させるまたは治療するための１またはそれ以上の方法において使用し得る。そのような方法は、本明細書で述べる抗体またはワクチンを個体に投与することを含む。個体は、例えば、アルツハイマ病に罹患していることが疑われるまたは罹患する危険度が高い被験者である。
【００７１】
被験者は、以下の特徴のいずれかを呈することによってそのような障害を有することが疑われ得る：早期疾患症状、陽性脳画像検査結果およびτまたはＰ−τのレベル上昇。脳画像検査方法の例としては、ＤａＴｓｃａｎ（１２３Ｉ−イオフルパン）または本明細書で述べるモノクローナル抗体を使用することによる陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）を含むが、これらに限定されない。
【００７２】
アルツハイマ病またはアルツハイマ関連障害の危険度が高いまたは前記疾患を有することが疑われる被験者を同定することにより、本明細書で述べる本発明の治療によって、例えばワクチン／抗原または抗体での能動または受動免疫を使用することによって、障害のさらなる発現が予防されるまたは発症もしくは進行が遅延される。
【００７３】
本明細書で述べる本発明の抗体はまた、検出方法においても使用でき、その具体的な例は、抗体を使用して、インビトロおよびインビボでＮ-末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマおよび／またはＮ-末端切断型Ａβモノマ種の変化したレベルを検出する診断免疫測定法を含む。標的形態のＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマは、種々のアルツハイマ関連障害または他の神経変性障害を有する患者からの種々の組織および体液において特異的に変化していることがあり、従ってアルツハイマ病およびアルツハイマ関連障害、特に上記で挙げたものについての早期生化学的マーカとして役立ち得る。
【００７４】
より具体的には、可溶性Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマをインビトロで検出する方法は、本発明による抗体を、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマおよび／または非Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマを含有するまたは含有することが疑われる生物学的試料に添加し、抗体とＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマおよび／または非Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマとの間で形成される任意の複合体を検出して、その濃度を測定することを含む。生物学的試料は、例えば血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）または脳生検であり得る。もう１つの実施形態では、Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマおよび／または非Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマをインビボで検出する方法は、脳内にＮ末端切断型プロトフィブリル／オリゴマおよび／または非Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマの病的なレベルまたは種を担持することが疑われる個体に、検出可能なマーカで標識された本発明による抗体を投与し、マーカの検出によって抗体とＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマおよび／または非Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマとの間で形成される任意の複合体の存在を検出することを含む。
【００７５】
Ｎ末端切断型Ａβ種に対する抗体を標識するために、当業者は、検出方法の選択に依存して、様々な選択肢、例えば、少し例を挙げるだけでも、１３１Ｉ、１４Ｃ、３Ｈまたは５８Ｇａなどの放射性リガンドが利用可能である。特に、放射性標識オリゴマ特異的抗体によるＰＥＴは、診断、治療観測等のために極めて重要であると考えられる。従って、本発明は、診断および治療観測のための様々な方法において使用するための、当業者によって容易に標識される抗体を提供する。
【００７６】
前述した方法および技術に従って、本明細書で述べる抗原および抗体を、アルツハイマ病理についての細胞培養モデルおよび／またはトランスジェニック動物モデルにおいてそれらの潜在的治療能に関して評価し得る。
【００７７】
本発明によるＮ末端切断型Ａβ形態に対する抗体はまた、アルツハイマ病を診断する患者試料におけるＮ末端切断型Ａβレベルの測定のための免疫検定法においても利用される。診断アッセイにおいて適用される検出方法は、主として固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）および／またはウエスタンブロット法などの免疫測定法に基づく。アルツハイマ病の初期徴候を有する患者またはこれらの障害を発現する危険度が高い個体からの広い範囲の組織が、それらのＮ-末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマ／モノマのレベルに関して検討され、そのような組織は、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）および脳生検を含むが、これらに限定されない。
【実施例】
【００７８】
本発明の様々な態様を以下の実施例において説明する。
【００７９】
［実施例１］Ａβ３（ｐＥ）〜４２切断型プロトフィブリル／オリゴマの作製
凍結乾燥Ａβ３（ｐＥ）〜４２を、１００μＭの最終濃度になるように１０ｍＭ  ＮａＯＨに溶解する。リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４を、５０μＭの最終ペプチド濃度になるように添加する。ペプチド溶液を室温または３７℃で５〜１５分間インキュベートする。凝集プロセスがロットごとにおよびまたバイアルごとに大きく異なるので、より大きな反応容量の設定の前に、小規模なパイロット反応速度実験において最適プロトフィブリル収率のためのインキュベーション時間を決定する。インキュベーション後、試料を１６０００×ｇ、＋４℃で５分間遠心分離して原線維状物質を除去し、その後前記物質をペレット化する。上清は、プロトフィブリル／オリゴマおよび様々な量のＡβ３（ｐＥ）〜４２モノマを含有する。上清１００μｌを、０．１〜０．６％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで平衡させたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラムに注入する。８０μｌ／分の流速でモノマからのプロトフィブリルの分離を実施する。ＵＶ吸光度を２１４および２８０ｎｍの波長によって観測する。１２〜１３分で溶出する空隙ピークはＡβ３（ｐＥ）〜４２プロトフィブリル／オリゴマを含む（図１参照）。１２〜１３分で溶出する画分を収集することにより、モノクローナルおよび／またはワクチン開発のための高度に純粋なＡβ３（ｐＥ）〜４２プロトフィブリル／オリゴマを単離する。
【００８０】
［実施例２］Ａβ３〜４２切断型プロトフィブリル／オリゴマの作製
凍結乾燥Ａβ３〜４２を、１００μＭの最終濃度になるように１０ｍＭ  ＮａＯＨに溶解する。リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４を、５０μＭの最終ペプチド濃度になるように添加する。ペプチド溶液を室温または３７℃で５〜１５分間インキュベートする。凝集プロセスがロットごとにおよびまたバイアルごとに大きく異なるので、より大きな反応容量の設定の前に、小規模なパイロット反応速度実験で最適プロトフィブリル収率のためのインキュベーション時間を決定する。＋３７℃でのインキュベーション後、試料を１６０００×ｇ、＋４℃で５分間遠心分離して原線維状物質を除去し、その後前記物質をペレット化する。上清は、プロトフィブリル／オリゴマおよび様々な量のＡβ３〜４２モノマを含有する。上清１００μｌを、０．１〜０．６％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで平衡させたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラムに注入する。８０μｌ／分の流速でモノマからのプロトフィブリル／オリゴマの分離を実施する。ＵＶ吸光度を２１４および２８０ｎｍの波長によって観測する。１２〜１３分で溶出する空隙ピークは、Ａβ３〜４２プロトフィブリル／オリゴマを含む。１２〜１３分で溶出する画分を収集することにより、モノクローナルおよび／またはワクチン開発のための高度に純粋なＡβ３〜４２プロトフィブリル／オリゴマを単離する。
【００８１】
［実施例３］安定化されたＡβ３（ｐＥ）〜４２切断型プロトフィブリル／オリゴマの合成
Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル抗原（すなわちプロトフィブリルおよび他のオリゴマを含む抗原）を生成するため、上述したヒト野生型Ｎ末端切断型Ａβ３（ｐＥ）〜４２を３５〜７５０μＭの濃度で使用する。Ａβ３（ｐＥ）〜４２がＨＮＥおよび／またはＯＮＥ（Cayman  Chemical社、Ann  Arbor、ミシガン州、米国）に結合している試料中で、これらの化合物を０．０１〜６５ｍＭの濃度で使用する。典型的な実験では、ＨＮＥおよび／またはＯＮＥとＡβ３（ｐＥ）〜４２の間のモル比は１：１から１００：１の範囲であるが、それぞれの化合物の割合はこの化学量論に限定されない。特定の実験では、ＨＮＥ修飾および／またはＯＮＥ修飾試料を還元するために水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を０．１〜１００ｍＭの濃度で使用する。一部の場合には、Ａβ３（ｐＥ）〜４２アミノ酸は、前記ＨＮＥ修飾の間に、ＨＮＥと結合する不安定で可逆的なシッフ塩基を形成するアミノ酸（リシンなど）を含み得る。別の場合には、Ａβ３（ｐＥ）〜４２アミノ酸は、前記ＯＮＥ修飾の間に、ＯＮＥと結合する不安定で可逆的なシッフ塩基を形成するアミノ酸（リシンなど）を含み得る。水素化ホウ素ナトリウムでの還元は、前記シッフ塩基結合を安定化する。試料を、撹拌しながらまたは撹拌せずに３７℃で３０分間から３０日間インキュベートする。試料の分子組成を確認するため、いくつかの方法を利用する。非修飾Ａβ３（ｐＥ）〜４２またはＨＮＥ修飾および／もしくはＯＮＥ修飾Ａβ３（ｐＥ）〜４２または他の反応性アルデヒドで修飾したＡβ３（ｐＥ）〜４２を１６，９００×ｇ、２１℃で５分間遠心分離して、任意の不溶性フィブリルを除去する。その後、ＳＥＣ−ＨＰＬＣシステムと２１４ｎｍ〜２８０ｎｍのＵＶ検出を用いて上清を分画し（以下で詳細に述べる）、Ａβ３（ｐＥ）〜４２プロトフィブリル／オリゴマおよびモノマを単離する。別の実験では、５〜１０００ｋＤａの分子カットオフ値で遠心ろ過装置を使用してＡβ３（ｐＥ）〜４２プロトフィブリル／オリゴマおよびモノマを分離する。典型的な実験では、試料であるＨＮＥおよび／またはＯＮＥ修飾Ａβｐ３〜４２  ５００μｌを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ遠心ろ過装置（Millipore社、Billerica、マサチューセッツ州）またはＶｉｖａｓｐｉｎ５００遠心装置（Sartorius社、Goettingen、ドイツ）のいずれかを１００ｋＤａのカットオフ値で使用して遠心分離する。試料を１０００〜１５０００×ｇにわたる速度で５〜３０分間遠心分離し、保持液を収集して、この保持液はＮ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマの大部分を含む。
【００８２】
−ＨＮＥ修飾Ｎ末端切断型Ａβプロトフィブリル／オリゴマ
典型的な実験では、ヒト野生型Ｎ末端切断型Ａβ３（ｐＥ）〜４２  １４０μＭを５．６ｍＭ  ＨＮＥと共に（例えばＨＮＥとＡβ３（ｐＥ）〜４２を４０：１の比率で）３７℃で２０時間インキュベートし、その後、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（Pierce Biotechnology社、Rockford、イリノイ州、米国）、Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００遠心装置（Sartorius社、Goettingen、ドイツ）またはＭｉｃｒｏｃｏｎ遠心ろ過装置（Millipore社、Billerica、マサチューセッツ州）のいずれかを製造者の指示に従って使用して過剰の非結合ＨＮＥを除去する。この初期ＨＮＥ修飾段階後、試料を直接分析する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の前に、すべての試料を１６，９００×ｇ、２２℃で５分間の遠心分離に供し、可溶性画分だけを、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＰＣ３．２／３０カラムを用いたＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析する。ＨＮＥ安定化Ａβ３（ｐＥ）〜４２プロトフィブリル／オリゴマは約１０〜１５分にピーク溶出する。
【００８３】
−ＯＮＥ修飾Ａβ３（ｐＥ）〜４２
典型的な実験では、ヒト野生型Ａβ３（ｐＥ）〜４２（１４０μＭ）を４．２ｍＭ  ＯＮＥと共に（例えばＯＮＥとＡβ３（ｐＥ）〜４２を４０：１の比率で）３７℃で２０時間インキュベートし、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（Pierce Biotechnology社、Rockford、イリノイ州、米国）、Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００遠心装置（Sartorius社、Goettingen、ドイツ）またはＭｉｃｒｏｃｏｎ遠心ろ過装置（Millipore社、Billerica、マサチューセッツ州）を製造者の指示に従って使用して過剰の非結合ＯＮＥを除去する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の前に、すべての試料を１６，９００×ｇ、２２℃で５分間の遠心分離に供し、可溶性画分だけを、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＰＣ３．２／３０カラムを用いたＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析する。ＯＮＥ安定化Ａβ３（ｐＥ）〜４２プロトフィブリル／オリゴマは約１０〜１５分に主要ピークとして溶出する。
【００８４】
−ＨＮＥおよびＯＮＥ修飾Ａβ３（ｐＥ）〜４２
典型的な実験では、ヒト野生型Ａβ３（ｐＥ）〜４２（１４０μＭ）を４．２ｍＭ  ＨＮＥおよび４．２ｍＭ  ＯＮＥと共に３７℃で２０時間インキュベートし、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（Pierce Biotechnology社、Rockford、イリノイ州、米国）、Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００遠心装置（Sartorius社、Goettingen、ドイツ）またはＭｉｃｒｏｃｏｎ遠心ろ過装置（Millipore社、Billerica、マサチューセッツ州）を製造者の指示に従って使用して過剰の非結合ＨＮＥおよびＯＮＥを除去する。すべての試料を１６，９００×ｇ、２２℃で５分間の遠心分離に供し、可溶性画分だけを、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＰＣ３．２／３０カラムを用いたＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析する。ＨＮＥおよびＯＮＥ安定化Ａβ３（ｐＥ）〜４２プロトフィブリル／オリゴマは約１０〜１５分に主要ピークとして溶出する。
【００８５】
［実施例４］Ｎ末端切断型プロトフィブリル／オリゴマで免疫したマウスにおけるＡβ３（ｐＥ）〜４２抗体
−免疫／ポリクローナル抗体
免疫スキームにおいてＢＡＬＢ／ｃマウスを使用する。初期免疫（例えば３〜６回）のために、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）＋０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０に希釈したＡβ３（ｐＥ）〜４２プロトフィブリル／オリゴマ製剤３０〜５０μｇをＩＳＣＯＭ  ５μｌと共にマウスに注射する。最終免疫のために、Ａβ３（ｐＥ）〜４２プロトフィブリル／オリゴマ製剤３０〜５０μｇをＩＳＣＯＭなしでマウスに注射する。免疫したマウスからの血漿をＡβ３（ｐＥ）〜４２プロトフィブリル／オリゴマに対する反応性に関して分析する。ポリクローナル抗体応答の特異性をＥＬＩＳＡによって分析する。典型的な実験では、平底高結合９６穴ポリスチレンマイクロタイタプレートをＡβ反応性抗体で被覆し、ウエルをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０でブロックして、その後Ａβ３（ｐＥ）〜４２モノマまたはＡβ３（ｐＥ）〜４２プロトフィブリル／オリゴマをＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０に希釈し、１ｎｇ／穴の最終濃度で添加する。免疫マウスからの血漿試料（免疫スケジュールの間に種々の時点で採取する）をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０に希釈し、ウエルに添加する。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Southern Biotech）を１／１００００の希釈で二次抗体として使用する。ＴＭＢ（Neogen Corp.）を用いて免疫反応性を視覚化する。
【００８６】
血清中で、Ａβ３（ｐＥ）〜４２プロトフィブリル／オリゴマを特異的に認識する抗体を検出する。上述したのと同様のＥＬＩＳＡ試験を他の切断型または非切断型のＡβ４２に関して、モノマとしておよびプロトフィブリル／オリゴマとしての両方で実施し、ポリクローナル応答の特異性を評価する。
【００８７】
−ハイブリドーマ／モノクローナル抗体
脾細胞を単離し、滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で摩砕して、１２００×ｇで１０分間遠心分離し、細胞富化ペレットを収集する。細胞をＰＢＳでさらに洗浄し、１２００×ｇで１０分間遠心分離する。細胞ペレットを、１％抗生物質を添加したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ、Invitrogen社、La Jolla、カリフォルニア州、米国）に再懸濁する。脾細胞をＤＭＥＭ中でＳｐ２／０細胞（マウス骨髄腫細胞株）と１：２の比率で混合する。細胞融合を促進するため、ポリエチレングリコール（Sigma-Aldrich社、St. Louis、ミズーリ州、米国）１ｍｌを細胞混合物に添加し、ＤＭＥＭを添加して反応を停止させる。細胞を採集し、ペレットを、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Cambrex社、Charles City、アイオワ州、米国）を添加した、同時にＨＡＴ培地添加物Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（商標）（Sigma-Aldrich社、St. Louis、ミズーリ州、米国）、１０％（ｖ／ｖ）ＢＭ馴化培地（Roche Diagnostics Scandinavia社、Bromma、スウェーデン）、１％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム（Cambrex社、Charles City、アイオワ州、米国）、１％（ｖ／ｖ）抗生物質（Sigma-Aldrich社、St. Louis、ミズーリ州、米国）および１％（ｖ／ｖ）Ｌ−グルタミン（Cambrex社、Charles City、アイオワ州、米国）も含有するＤＭＥＭに再懸濁して、細胞を９６穴細胞培養プレートに塗布する。
【００８８】
生成したハイブリドーマによって産生されたＡβ３（ｐＥ）〜４２プロトフィブリル／オリゴマ反応性抗体をスクリーニングするため、ＥＬＩＳＡプロトコールを使用する。典型的な実験では、平底高結合９６穴ポリスチレンマイクロタイタプレートをＡβ反応性抗体で被覆し、ウエルをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０でブロックして、その後Ａβ３（ｐＥ）〜４２モノマまたはＡβ３（ｐＥ）〜４２プロトフィブリル／オリゴマをＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０に希釈し、１ｎｇ／穴の最終濃度で添加する。ハイブリドーマからの細胞培養上清をウエルに添加する。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Southern Biotech）を１／１００００の希釈で二次抗体として使用する。強化Ｋ−Ｂｌｕｅ（登録商標）基質（ＴＭＢ）を用いて免疫反応性を視覚化する。Ａβ３（ｐＥ）〜４２反応性ハイブリドーマクローンを選択し、限界希釈アッセイ（ＬＤＡ）を用いてさらにサブクローニングする。
【００８９】
上述したのと同様のＥＬＩＳＡを他の切断型または非切断型のＡβ４２に関して、モノマとしておよびプロトフィブリル／オリゴマとしての両方で実施し、ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体の特異性を評価する。
【００９０】
Ａβ３（ｐＥ）〜４２プロトフィブリル／オリゴマ製剤を先に述べたように注射することによってハイブリドーマを生成する。他の形態の切断型Ａβ４２プロトフィブリル／オリゴマならびにＨＮＥおよび／もしくはＯＮＥまたは他のアルデヒドで修飾した切断型Ａβ４２プロトフィブリル／オリゴマ製剤も、他の形態の切断型Ａβ４２プロトフィブリル／オリゴマに結合するモノクローナル抗体を開発するための抗原として使用し、上述したようにＥＬＩＳＡスクリーニングを用いて試験する。
【００９１】
本発明による抗体に関する試験からの結合データは、Ａβ３（ｐＥ）〜４２モノマならびに１００％Ａβ３（ｐＥ）〜４２を含むプロトフィブリル／オリゴマに対する高い親和性、および完全長Ａβ１〜４２モノマには実質的に結合しないことを明らかにする。これは、これらすべての種に対して高い親和性を示し得るまたは完全長Ａβだけを含むプロトフィブリルに効率的に結合し得るが、Ｎ末端切断型Ａβ形態には実質的に親和性を示さない、先行技術の抗体とは明確に異なる。
【００９２】
本明細書で述べる特定の実施例および実施形態は、事実上単なる例示であり、特許請求の範囲によって定義される本発明の限定を意図するものではない。さらなる実施形態および実施例ならびにそれらの利点は、本明細書を考慮して当業者に明らかであり、特許請求される本発明の範囲内である。
【００９３】
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【図１】
2019218362.tif 000002
【配列表】
2019218362000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月23日(2019.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端切断型Ａβを含むプロトフィブリルに結合するが、完全長Ａβモノマとは交差反応性を示さないかまたは実質的に交差反応性を示さず、場合によりＮ末端切断型Ａβモノマに交差反応性を示す、抗体。
【請求項２】
２５ｎＭまたはそれ以下のＩＣ５０値を有する、１種類のＡβｘ〜ｙを少なくとも８０％含む、または２種類もしくはそれ以上のＡβｘ〜ｙの１つの組合せを少なくとも８０％含むプロトフィブリルに結合し、前記式中、ｘが２、３、３（ｐＥ）、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１１（ｐＥ）または１２であり、およびｙが３８、３９、４０、４１、４２または４３である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
プロトフィブリルが、任意の組合せでＡβ２〜４２、Ａβ３（ｐＥ）〜４２、Ａβ４〜４２またはＡβ１１（ｐＥ）〜４２の１またはそれ以上を含む、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
１００ｎＭまたはそれ以下のＩＣ５０値を有する、１００％Ａβ３（ｐＥ）〜４２を含むプロトフィブリルに結合する抗体。
【請求項５】
モノクローナルである、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
抗体がヒト、ヒト化であるか、またはヒトにおける抗原性を低減するように改変されている、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
抗体がＩｇＧクラス、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４サブクラスである、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
抗体が低い補体活性を有する、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
抗体がＦａｂフラグメント、例えばＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２またはダイアボディである、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の抗体を、プロトフィブリルを含有するまたは含有することが疑われる生物学的試料に添加し、抗体とプロトフィブリルの間で形成される複合体の濃度を測定することを含む、Ｎ末端切断型Ａβを含むプロトフィブリルを検出するための方法。
【請求項１１】
抗体がＮ末端切断型Ａβモノマに交差反応性を示し、ならびに該方法が、抗体とＮ末端切断型Ａβを含むプロトフィブリルの間で形成される複合体、および抗体とＮ末端切断型Ａβモノマの間で形成される複合体の濃度を測定する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の抗体および医薬的に許容される緩衝剤を含有する組成物。
【請求項１３】
アルツハイマ病またはアルツハイマ関連障害の発症の遅延または治療において使用するための、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の抗体または請求項１２に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
Ｎ末端切断型Ａβを含むプロトフィブリルに結合させるための又はアルツハイマ病若しくはアルツハイマ関連疾患の発症を遅延させるため若しくは治療するための組成物を製造するための、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の抗体の使用。