(57)【要約】【課題】  再生医療等製品に含まれ得る腫瘍形成の可能性のある細胞に対する標識マーカーのスクリーニング方法、および腫瘍形成の可能性のある細胞を標識できるマーカーを提供すること。【解決手段】  腫瘍形成能を有する多能性幹細胞と初期分化細胞を特異的に標識可能なマーカーをスクリーニングするために、各種マーカーによる染色結果を数値化することにより、目的に合致した染色マーカーを選択する。その結果として得られたＳＳＥＡ−４、ｒＢＣ２ＬＣＮ、およびアルカリフォスファターゼを用いることで、再生医療等製品に含まれる腫瘍形成細胞の検出が可能である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を特異的に染色できるマーカーのスクリーニング法であり、各種マーカーによる染色結果を数値化し、目的に合致した染色マーカーを選択する方法。
【請求項２】
多能性幹細胞から部分的に分化した細胞を染色できるマーカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多能性幹細胞を部分的に分化することにより初期分化細胞を得る工程、
初期分化細胞を染色マーカーで染色する工程、
初期分化細胞の画像を取得する工程、および
画像により、染色マーカーによる初期分化細胞の染色を検出する工程
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
部分的に分化した細胞が外胚葉系の細胞、中胚葉系の細胞、および内胚葉系の細胞からなる群より選択される１以上である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
部分的に分化した細胞が外胚葉系の細胞、中胚葉系の細胞、および内胚葉系の細胞からなる群より選択されるいずれか２つである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
部分的に分化した細胞が外胚葉系の細胞、中胚葉系の細胞、および内胚葉系の細胞である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項７】
染色マーカーが蛍光標識抗体である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
染色マーカーが酵素である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
染色マーカーがＳＳＥＡ−４、ｒＢＣ２ＬＣＮ、またはアルカリフォスファターゼである請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を染色するマーカーをスクリーニングする方法、特に腫瘍形成能を有する多能性幹細胞および初期分化を開始した多能性幹細胞（部分的に分化した細胞）を標識するための特定のマーカーのスクリーニング法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞は生体を構成するほぼ全ての細胞に分化が可能であるため、再生医療研究や創薬スクリーニングへの応用が期待されている。これまでに、多能性幹細胞から目的の細胞へ分化を誘導する手法の開発が進んでいる。
【０００３】
多能性幹細胞は、生体内に移植した場合には奇形腫を形成するため、多能性幹細胞から分化を誘導した細胞を再生医療などへ用いる場合は、多能性幹細胞および腫瘍形成の可能性がある細胞の混入を防ぐ必要がある。
【０００４】
多能性幹細胞由来細胞に含まれ得る腫瘍形成の可能性がある細胞を検出するためには、多能性幹細胞に特異的なマーカーを用いる方法が一般的である。しかしながら、完全に未分化な多能性幹細胞だけではなく、初期分化を誘導した細胞でも腫瘍形成のリスクを有しているため（非特許文献１）、部分的に分化が進んだ腫瘍形成の可能性がある細胞も検出する必要がある。しかしながら、これらの腫瘍形成の可能性がある細胞を検出できるマーカーのスクリーニング法および実際に標識可能なマーカーに関して、これまで報告はなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｒｏｎｇ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，２８７，３２３３８−３２３４５（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、多能性幹細胞から分化を誘導した細胞または再生医療などに用いるための再生医療等製品に含まれ得る腫瘍形成の可能性のある細胞を標識するためのマーカーをスクリーニングする方法、および腫瘍形成の可能性のある細胞を標識できるマーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち本発明は、以下のとおり例示できる。
［１］
多能性幹細胞を特異的に染色できるマーカーのスクリーニング法であり、各種マーカーによる染色結果を数値化し、目的に合致した染色マーカーを選択する方法。
［２］
多能性幹細胞から部分的に分化した細胞を染色できるマーカーを含む、［１］に記載の方法。
［３］
多能性幹細胞を部分的に分化することにより初期分化細胞を得る工程、
初期分化細胞を染色マーカーで染色する工程、
初期分化細胞の画像を取得する工程、および
画像により、染色マーカーによる初期分化細胞の染色を検出する工程
を含む、［２］に記載の方法。
［４］
部分的に分化した細胞が外胚葉系の細胞、中胚葉系の細胞、および内胚葉系の細胞からなる群より選択される１以上である、［２］または［３］に記載の方法。
［５］
部分的に分化した細胞が外胚葉系の細胞、中胚葉系の細胞、および内胚葉系の細胞からなる群より選択されるいずれか２つである、［２］または［３］に記載の方法。
［６］
部分的に分化した細胞が外胚葉系の細胞、中胚葉系の細胞、および内胚葉系の細胞である、［２］または［３］に記載の方法。
［７］
染色マーカーが蛍光標識抗体である、［１］から［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
染色マーカーが酵素である、［１］から［６］のいずれかに記載の方法。
［９］
染色マーカーがＳＳＥＡ−４、ｒＢＣ２ＬＣＮ、またはアルカリフォスファターゼである［１］から［６］のいずれかに記載の方法。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明において多能性幹細胞とは、生体内および生体外においてすべての細胞系譜に分化が可能な細胞のことをいう。具体的には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）があげられる。
【００１１】
本発明における部分的に分化した細胞すなわち初期分化細胞とは、多能性幹細胞から分化を誘導された細胞のことをいう。具体的には、外胚葉、中胚葉、内胚葉へ分化誘導を開始した細胞があげられるが、それに限定しない。ただし、完全に多能性幹細胞の性質を失った体細胞は含まれない。
【００１２】
本発明において、部分的な分化誘導の方法は未分化な多能性幹細胞に特定の処理を施して特定の期間培養を行なう方法であるが、処理の方法や期間は限定しない。例えば、Ｈｕｍａｎ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用することで、初期分化細胞を得ることができる。また、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２の添加により、初期分化を誘起することができる（Ｍａｌｄｏｎａｄｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，２２２−２２７，２０１６）。
【００１３】
マーカー選定の比較として、陰性対照となる細胞が必要である。陰性対照として用いる細胞の種類は限定しないが、多能性幹細胞および初期分化細胞よりも分化が進んだ体細胞である必要がある。また、ガン細胞や不死化した細胞ではなく、正常細胞であることが望ましい。例えば、間葉系幹細胞、繊維芽細胞株、その他正常細胞が挙げられる。さらに、多能性幹細胞から分化誘導を行なった体細胞も陰性対照として用いることが可能である。
【００１４】
腫瘍形成の可能性のある細胞の標識には、多能性幹細胞を特異的に染色し、分化した体細胞を染色しない試薬を用いる。例えば、細胞表面抗原もしくは細胞内抗原に対する抗体、細胞表面糖鎖と結合するタンパク質、または多能性幹細胞に特異的な酵素に対する基質を用いる。具体的には、細胞表面抗原（ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４）、細胞内抗原（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ）、細胞表面糖鎖結合性タンパク質（レクチン）（ｒＢＣ２ＬＣＮ）、酵素（アルカリフォスファターゼ）の基質が好ましいが、それに限定しない。また、抗体および細胞表面糖鎖結合性タンパク質については、蛍光色素を直接結合または染色試薬に結合する蛍光標識物質（抗体など）を用いて標識するが、方法は限定しない。酵素の検出には公知の方法または市販の染色試薬を用いることができる。例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＩＩ（リプロセル社製）があげられる。
【００１５】
標識された細胞は顕微鏡下により撮像し、画像解析ソフトウェアを用いて染色強度を数値化する。使用する画像解析ソフトに限定はなく、Ｉｍａｇｅ  Ｊなどを利用して数値化が可能である。各細胞の染色強度を数値化するために、例えば各細胞の核染色画像をマスクとして用い、Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＲＯＩ）を設定する方法があげられる。核染色に使用する試薬は限定しないが、例えば２−（４−ａｍｉｄｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）−１Ｈ−ｉｎｄｏｌｅ−６−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｉｎｅ（ＤＡＰＩ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅなどの蛍光を発する試薬が好ましい。ただし、多能性幹細胞を染色する試薬に蛍光色素を用いる場合は、核染色試薬と蛍光の波長が異なる必要がある。核抗原（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ）の数値化には、核染色画像のマスクをＲＯＩとして使用するが、細胞表面抗原については核を中心としてＲＯＩの範囲を拡大し、さらに核を含まない領域にＲＯＩを設定することで数値化が可能である。
【００１６】
個々の細胞の染色強度を比較することで、腫瘍形成細胞のスクリーニングに最適なマーカーを選定できる。例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥＸＣＥＬなどのソフトウェアを用いてヒストグラムを作成し、ピークの広がりや数などのパラメーターから最適なマーカーを選定する。選定の指標としては、（Ｉ）ピークが１本であること、（ＩＩ）ピークの広がりが少なく均一であること、（ＩＩＩ）未分化細胞のピークと初期分化細胞のピークとが離れすぎていないこと、および（ＩＶ）比較として用いた陰性対照（体細胞など）との区別が可能であること、などがあげられる。
【００１７】
染色強度の数値化は、核をマスクとしてＲＯＩを設定する方法以外に、簡易的な方法として細胞が存在する領域全体の染色強度を数値化し、平均値を求めることで比較が可能である。例えば、Ｉｍａｇｅ  Ｊなどのソフトウェアを用いて、ランダムに選択した細胞領域の染色強度を数値化することができる。細胞が存在しない領域の強度をブランクとして用いることで、定量的な比較が可能である。簡易的方法を用いた場合の、腫瘍形成の可能性がある細胞を染色するマーカー選定の指標として、（ｉ）未分化な多能性幹細胞と初期分化細胞の数値が比較的同等であること、（ｉｉ）比較として用いた陰性対照（体細胞など）との区別が可能であること、などがあげられる。
【００１８】
以上の方法を用いて、それぞれのマーカーで標識した細胞の染色強度を比較し腫瘍形成の可能性がある細胞を検出できるマーカーを選定できる。前述した８種類のマーカーについて検討した結果から、ＳＳＥＡ−４、ｒＢＣ２ＬＣＮ、アルカリフォスファターゼの３種類が多能性幹細胞および初期分化細胞を標識できるマーカーとして優れている。
【００１９】
本発明では、ＳＳＥＡ−４、ｒＢＣ２ＬＣＮ、アルカリフォスファターゼの３種類を腫瘍形成細胞の標識が可能なマーカーとして提案するが、上記のスクリーニング法を用いて新規の標識マーカーが同定された場合は、上記３種に限定しない。また、スクリーニングを実施する場合に、細胞が接着状態であるか、または単一細胞として分散した状態かは限定しない。接着した状態でスクリーニングする場合は、マーカーの発現場所やマーカーを発現する細胞のコロニー内での位置情報等を得られる点で好ましい。一方、酵素処理等で単一細胞として分散した細胞懸濁液を用いる場合は、１個の細胞を保持できる保持部を有する基板上に細胞懸濁液を導入することで、前記細胞を保持し、特定のマーカーで染色することで、当該マーカーを発現する目的の細胞を分離・回収しやすい点で好ましい。適宜、目的に合わせてスクリーニング形態を選択すればよい。
【００２０】
なお、前述した保持部を有する基板上に細胞を保持させる方法に特に限定は無く、保持部に細胞懸濁液を導入するだけでもよいし、細胞を含む液体を導入した後、遠心力を利用して保持部へ強制的に当該細胞を導入させてもよい。中でも細胞懸濁液を導入した後、誘電泳動力を利用して保持部へ細胞を導入させると、未分化細胞を保持部へ効率的に保持できる点で好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、腫瘍形成の可能性がある細胞を標識できる特異的なマーカーの選定と、それを用いた腫瘍形成の可能性がある細胞の検出による再生医療等製品などの品質評価が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例２および３で得られた細胞染色結果を示す図である。
【図２】実施例４で得られた蛍光画像の染色強度の数値化結果を示す図である。
【図３】実施例４で得られたアルカリフォスファターゼの染色強度の数値化結果を示す図である。
【図４】実施例５で用いた基板を示した図（分解図）である。
【図５】図４に示す基板の正面図である。
【図６】図４に示す基板を用いた、未分化細胞の検出法の一例を示した図である。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。
【００２４】
実施例１  ヒトｉＰＳ細胞および体細胞の培養ならびに初期分化細胞の誘導
（１）ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７株（ｉＰＳアカデミアジャパンより購入）はｉＭａｔｒｉｘ（ニッピ社製）をコートしたポリスチレンプレート上で、ＳｔｅｍＦｉｔ  
ＡＫ０２Ｎ培地（タカラバイオ社製）を用いて培養を行なった。
【００２５】
（２）陰性対照として用いた体細胞として、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ：ＬＯＮＺＡ社製）およびＭＲＣ−５細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲）を用いた。ヒト間葉系幹細胞は、ＭＳＣＧＭ培地（ＬＯＮＺＡ社製）を用いて培養を行ない、ＭＲＣ−５細胞は１０％ウシ胎児血清を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ：和光純薬社製）を用いて培養を行なった。染色時には、ｉＭａｔｒｉｘ（ニッピ社製）をコートしたポリスチレンプレート上で、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ培地（タカラバイオ社製）を用いて培養を行なった。
【００２６】
（３）初期分化細胞（外胚葉、中胚葉、内胚葉）は、２０１Ｂ７細胞をｉＭａｔｒｉｘ上に播種した翌日から、Ｈｕｍａｎ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて開始し、３日間分化誘導を実施した。方法は上記キットに付属のプロトコールに従った。また、ＲＯＣＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ−２７６３２：和光純薬社製）を１０μＭ添加して培養した細胞も比較として用いた。
【００２７】
実施例２  抗体およびレクチンを用いた細胞の染色
（１）実施例１に従って培養した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した後、病理組織固定剤（マイルドホルム１０Ｎ：和光純薬社製）を添加し、１０分間室温で静置することで細胞の固定を行なった。
【００２８】
（２）固定した細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）を含有するＰＢＳ溶液を添加し、２分間室温で静置することで細胞の膜透過処理を行なった。
【００２９】
（３）ＰＢＳで３回洗浄した後、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ溶液（ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）を添加し、１時間室温で静置することで非特異的反応の抑制処理を行なった。
【００３０】
（４）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液の除去後、表１に記載の一次抗体またはレクチンをＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で希釈したものを添加し、２時間室温で静置することで標識処理を行なった。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
（５）直接標識していない抗体（ＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ３／４）およびＮＡＮＯＧ）については、ＰＢＳで３回洗浄した後、さらに蛍光標識抗体（二次抗体）を添加し、２時間室温で反応させた。
【００３３】
（６）前記（４）または（５）の過程で、蛍光修飾抗体の処理と同時に、核を染色するために２−（４−ａｍｉｄｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）−１Ｈ−ｉｎｄｏｌｅ−６−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｉｎｅ（ＤＡＰＩ）を添加して反応させた。
【００３４】
（７）ＰＢＳで３回洗浄した後、蛍光顕微鏡およびＣＣＤカメラを用いて核およびそれぞれのマーカーの蛍光画像を撮像した。
【００３５】
上記の工程で染色した結果を図１に示す。マーカーの種類によって、未分化なヒトｉＰＳ細胞と初期分化細胞の染色性が異なることが明らかとなった。また、陰性対照であるｈＭＳＣおよびＭＲＣ−５細胞はいずれのマーカーでも染色されないことが示された。
【００３６】
実施例３  アルカリフォスファターゼ染色
（１）実施例１に従って培養した細胞をＳｔｅｍｇｅｎｔ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＩＩ（リプロセル社製）を用いて染色を行なった。方法は、キットのプロトコールに準じて行なった。
【００３７】
（２）染色した細胞の明視野画像を顕微鏡下で撮像した。
【００３８】
上記の工程で染色した結果を図１に示す。陰性対照として用いたｈＭＳＣおよびＭＲＣ−５細胞は染色されないことが示された。
【００３９】
実施例４  染色強度の数値化による初期分化細胞の染色が可能なマーカーのスクリーニング（その１）
上記実施例２で得られた染色画像から、下記の工程により染色強度の数値化を行なった。
【００４０】
（１）実施例２で得られた蛍光染色画像から、画像解析ソフトウェアであるＩｍａｇｅ  Ｊを用いてＤＡＰＩ染色画像から核の領域についてのマスクを作成した。凝集している場合や染色ムラなどの影響で、すべての細胞核を一度に選択することが困難であるため、閾値を変化させて数回にわけて作成したマスクを統合し、最終的に統合マスクを作成した。
【００４１】
（２）前記工程（１）で作成した統合マスクから、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いてＲｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＲＯＩ）の領域を設定した。
【００４２】
（３）核タンパク質に対する抗体で標識した画像（ＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ３／４）およびＮＡＮＯＧ）については、前記工程（２）のＲＯＩをそのまま用いて、標識画像の染色強度をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いて数値化した。
【００４３】
（４）細胞膜に存在するマーカー（ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ｒＢＣ２ＬＣＮ）については、前記工程（２）で作成したＲＯＩ（ＲＯＩ−１）を拡大した新たなＲＯＩ（ＲＯＩ−２）を作成し、ＲＯＩ−１とＲＯＩ−２で囲まれた領域を新たなＲＯＩ（ＲＯＩ−３）として設定した。設定したＲＯＩ−３を用いて、標識画像の染色強度をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いて数値化した。
【００４４】
（５）前記工程（３）および（４）で得られた染色強度の数値を用いてヒストグラムを作成した。
【００４５】
上記工程により得られたヒストグラムの結果を図２に示す。ヒストグラムの結果より、
腫瘍形成の可能性がある細胞の検出に適したマーカーのスクリーニングを行なった。ＴＲＡ−１−６０については内胚葉系および中胚葉系の初期分化細胞での発現増強があり、またＴＲＡ−１−８１では内胚葉系初期分化細胞で発現増強が見られた。そのため、ヒストグラムの分布が極端に異なるため、腫瘍形成の可能性がある細胞の検出には不向きであると考えられた。ＳＳＥＡ−３およびＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ３／４）については、同一の状態の細胞でも複数のピークが存在することから、染色の均一性に問題があり腫瘍形成細胞の検出用マーカーとしては適していないと判断した。また、ＮＡＮＯＧについては外肺葉系および中胚葉系初期分化細胞で発現が消失するため、腫瘍形成細胞の検出は不可と判断した。一方、ＳＳＥＡ−４およびｒＢＣ２ＬＣＮについては、（Ｉ）すべての状態の細胞でピークが１本であり、（ＩＩ）ピークの広がりが少なく均一であり、（ＩＩＩ）未分化細胞のピークと初期分化細胞のピークとが離れておらず、また（ＩＶ）比較として用いた陰性対照（体細胞）との区別が可能であることから、腫瘍形成の可能性がある細胞の検出に適したマーカーであることが示された。
【００４６】
実施例５  染色強度の数値化による初期分化細胞の染色が可能なマーカーのスクリーニング（その２）
実施例３で得られたアルカリフォスファターゼの画像について、下記の工程により数値化を行なった。
（１）ランダムな領域の強度をブランクとして数値化し、細胞が存在するランダムな領域の強度の数値化を行なった。
（２）複数の領域の染色強度から平均値を算出し、グラフ化を行なった。
【００４７】
以上の工程によって得られた結果を図３に示す。未分化ｉＰＳ細胞および初期分化細胞（外胚葉、中胚葉、内胚葉）いずれの場合でも、陰性対照のｈＭＳＣおよびＭＲＣ−５細胞よりも染色強度が高く、腫瘍形成の可能性がある細胞の検出に適していることが示された。
【００４８】
実施例６
前述した実施例では細胞集団に対してマーカーのスクリーニングを実施したが、単一細胞として分散した状態でも、同様にスクリーニングが可能か検討した。なお未分化細胞としてｉＰＳ細胞を、分化細胞としてＭＲＣ―５細胞を、マーカーとして上述のＳＳＥＡ―４を、それぞれ用いた。また分散液中の細胞を保持する手段として、図４および図５に示す基板１００を用いた。
【００４９】
図４および図５に示す基板１００は、
貫通孔１１ａを有した平板状の遮光部材１１と、貫通孔１２ａを有した平板状の絶縁体１２と、導入口１３ａ、排出口１３ｂおよび貫通部１３ｃを有した平板状のスペーサ１３とからなる細胞導入保持手段１０と、
細胞導入保持手段１０を上下方向に密着して挟むよう設けた電極２１・２２と、
電極２１・２２同士を接続する導線３０と、
電極２１・２２に信号を印加する信号発生器４０と、
を備えている。
【００５０】
遮光部材１１が有する貫通孔１１ａと絶縁体１２が有する貫通孔１２ａとは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通孔の位置が一致するよう遮光部材１１および絶縁体１２を設けている。貫通孔１１ａ、貫通孔１２ａおよび遮光部材１１の下部に密着して設けた電極基板２１により保持部５０が構成され、導入口１３ａから未分化細胞２１０・分化細胞２２０を含む液体を導入すると、貫通部１３ｃを通じて保持部５０へ細胞が導入される。電極２２はスペーサ１３上部に密着して設けており、導入口１３ａから導入した、細胞を含む液体の飛散や蒸発を防止している。
【００５１】
（１）ヒトｉＰＳ細胞の調製
（１−１）７日間培養したｉＰＳ細胞をＰＢＳで洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ  ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）とＶｅｒｓｅｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）との混合液で前記細胞を剥離した。
（１−２）剥離した細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄後、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド溶液に室温で４０分間浸することで、前記細胞を固定した。
（１−３）固定後、ＰＢＳで洗浄し、保存した。
【００５２】
（２）ＭＲＣ−５細胞の調製
（２−１）７日間培養したＭＲＣ−５細胞をＰＢＳで洗浄後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ  ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて前記細胞を剥離した。
（２−２）剥離した細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄後、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド溶液に室温で４０分間浸することで、前記細胞を固定した。
（２−３）固定後、ＰＢＳで洗浄し、保存した。
【００５３】
（３）誘電泳動用溶液の作製
（３−１）一方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、分子量５０００のポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）と、ＢＳＡ（３００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）とを、炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、１５ｍＬ）に溶解後、当該溶液を室温で３時間撹拌することでポリエチレングリコールを結合したＢＳＡ（ＰＥＧ−ＢＳＡ）を調製した。なお、調製する際、ｍＰＥＧ−ＮＨＳとＢＳＡとのモル比（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡ）を２となるようにした。調製後、分画分子量１００００の透析膜を用いて、純水への溶液置換を３日間行なった。
（３−２）（３−１）で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭマンニトールを含む溶液を作製し、これを誘電泳動用溶液とした。
【００５４】
（４）細胞分散液の調製
（４−１）（１）で保存したｉＰＳ細胞および（２）で保存したＭＲＣ−５細胞を抗ＳＳＥＡ４抗体および終濃度２μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩを含む（３）で作製した誘電泳動用溶液で懸濁し、６０分間室温で反応させることで細胞を染色した。
（４−２）（３）で作製した誘電泳動用溶液で２回洗浄後、ｉＰＳ細胞数、ＭＲＣ−５細胞数をカウントした。
（４−３）ＭＲＣ−５細胞１００万個に対し、１個、５個または１０個となるようｉＰＳ細胞をスパイクし、全量を８５０μＬに調製したものを細胞分散液とした。
【００５５】
（５）細胞の保持部への保持
（４）で調製した細胞分散液を、図４に示す基板１００に有した導入口１３ａから導入し、周波数１ＭＨｚの交流電圧４０を電極２１・２２に１０分間印加することで誘電泳動力６０を用いて細胞を基板１００が有する保持部５０に保持させた（図６ａ）。
【００５６】
（６）細胞の検出
保持部５０に保持された細胞が有する蛍光を、蛍光顕微鏡４００を用いてＣＭＯＳカメラで撮影することで観察し、ＤＡＰＩ陽性で認識される細胞数を全細胞数、ＤＡＰＩ陽性かつＳＳＥＡ４陽性の細胞数をｉＰＳ細胞（未分化細胞）数と判断した（図６ｂ）。
【００５７】
検出したｉＰＳ細胞数を表２に示す。実際の検出細胞数の平均値は０．８３個（スパイク数１個のとき）、４．６７個（スパイク数５個のとき）および９個（スパイク数１０個のとき）と、ｉＰＳ細胞スパイク数（理論値）とほぼ同等の結果となった。このことから、細胞分散液に対しても未分化細胞と分化細胞の判別が可能であり、本発明のスクリーニング方法が実施可能であることが分かった。
【００５８】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００５９】
多能性幹細胞を用いた再生医療の実現化のためには、多能性幹細胞から分化誘導して作製した再生医療等製品の品質評価が必要不可欠である。また、品質評価の重要な項目の一つとして、腫瘍形成の可能性のある細胞の有無を確認することにある。そのため、本発明のスクリーニング方法で選定されたマーカーを用いることで、再生医療等製品に混入した腫瘍形成の可能性のある細胞を検出することにより、再生医療等製品の産業利用の実現に寄与できる。
【符号の説明】
【００６０】
１００：基板
１０：細胞導入保持手段
１１：遮光部材
１２：絶縁体
１１ａ、１２ａ：貫通孔
１３：スペーサ
１３ａ：導入口
１３ｂ：排出口
１３ｃ：貫通部
２１・２２：電極基板
３０：導線
４０：信号発生器（交流電圧）
５０：保持部
６０：誘電泳動力
２００：細胞
２１０：未分化細胞
２２０：分化細胞
３００：標識タンパク質
４００：検出部（蛍光顕微鏡）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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