(57)【要約】      （修正有）【課題】ＣＬＤ１８Ａ２標的免疫エフェクター細胞及びその調製方法と使用の提供。【解決手段】ＣＬＤ１８Ａ２標的キメラ抗原受容体及びその調製方法と使用が開示される。前記キメラ抗原受容体の細胞外結合ドメインはＣＬＤ１８Ａ２を特異的に認識する蛋白質を含み、前記キメラ抗原受容体で修飾された免疫エフェクター細胞は膵癌、胃癌などの腫瘍の治療に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫エフェクター細胞表面に発現されるキメラ抗原受容体であって、前記キメラ抗原受容体は順次に連結する細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを含み、前記細胞外結合ドメインはｃｌａｕｄｉｎ  １８．２（ＣＬＤ１８Ａ２）を特異的に認識する蛋白質を含み、前記細胞外結合ドメインは、配列番号４および６のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とするキメラ抗原受容体。
【請求項２】
免疫エフェクター細胞表面に発現されるキメラ抗原受容体であって、前記キメラ抗原受容体は細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを含み、前記細胞外結合ドメインはＣＬＤ１８Ａ２を特異的に認識する蛋白質を含み、前記キメラ抗原受容体は配列番号１９〜２２のいずれかを含むことを特徴とするキメラ抗原受容体。
【請求項３】
前記膜貫通ドメインはＣＤ８またはＣＤ２８の膜貫通ドメインおよびヒンジドメインの配列を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４】
前記細胞内シグナルドメイン配列は、ＣＤ３ζ、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４の細胞内シグナルドメイン配列、或いはそれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項５】
前記キメラ抗原受容体は、
ＣＬＤ１８Ａ２を特異的に認識する一本鎖抗体、ＣＤ８の膜貫通ドメインおよびＣＤ３ζの細胞内シグナルドメイン；
ＣＬＤ１８Ａ２を特異的に認識する一本鎖抗体、ＣＤ８の膜貫通ドメインおよびＣＤ１３７およびＣＤ３ζの細胞内シグナルドメイン；
ＣＬＤ１８Ａ２を特異的に認識する一本鎖抗体、ＣＤ２８の膜貫通ドメインおよびＣＤ２８およびＣＤ３ζの細胞内シグナルドメイン；または
ＣＬＤ１８Ａ２を特異的に認識する一本鎖抗体、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン；ＣＤ２８およびＣＤ１３７およびＣＤ３ζの細胞内シグナルドメイン；
の順番で連結する細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項６】
前記免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞を含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項７】
免疫エフェクター細胞表面に発現されるキメラ抗原受容体をコードする核酸であって、前記キメラ抗原受容体は細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを含み、前記細胞外結合ドメインはＣＬＤ１８Ａ２を特異的に認識する蛋白質を含み、前記核酸は配列番号１５〜１８のいずれかを含むことを特徴とする核酸。
【請求項８】
免疫エフェクター細胞表面に発現されるキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む発現ベクターであって、前記キメラ抗原受容体は細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを含み、前記細胞外結合ドメインはＣＬＤ１８Ａ２を特異的に認識する蛋白質を含み、前記核酸は配列番号１５〜１８のいずれかを含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項９】
前記発現ベクターはレンチウイルスプラスミドｐＷＰＴに由来することを特徴とする、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
免疫エフェクター細胞表面に発現されるキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む発現ベクターを含むウイルスであって、前記キメラ抗原受容体は細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを含み、前記細胞外結合ドメインはＣＬＤ１８Ａ２を特異的に認識する蛋白質を含み、前記核酸は配列番号１５〜１８のいずれかを含むことを特徴とするウイルス。
【請求項１１】
ｃｌａｕｄｉｎ  １８．２（ＣＬＤ１８Ａ２）標的遺伝子修飾免疫エフェクター細胞を調製する方法であって、請求項１または２に記載のキメラ抗原受容体、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、または請求項１０に記載のウイルスを用いることを含む方法。
【請求項１２】
請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、または請求項１０に記載のウイルスが形質導入されたことを特徴とする、遺伝子修飾免疫エフェクター細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の遺伝子修飾免疫エフェクター細胞であって、前記免疫エフェクター細胞はＴリンパ球、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞を含むことを特徴とする遺伝子修飾免疫エフェクター細胞。
【請求項１４】
腫瘍を抑制する医薬を調製するための方法であって、前記方法は請求項１２に記載の遺伝子修飾免疫エフェクター細胞を少なくとも1つ用いることを含み、前記腫瘍はｃｌａｕｄｉｎ  １８．２（ＣＬＤ１８Ａ２）陽性腫瘍であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍細胞治療分野に属し、より具体的には、本発明はＣＬＤ１８Ａ２標的免疫エフェクター細胞及びその調製方法と使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔリンパ球の腫瘍免疫応答における作用は重視されつつある。Ｔリンパ球による養子免疫療法は一部の腫瘍においてある程度の効果が得られ、且つ当該免疫療法は抗体療法の上記欠陥を解消できるものの、大部分の腫瘍に対する治療効果はまだ満足できない[Grupp SAら, Adoptive cellular therapy. Curr Top Microbiol Immunol.,.2011;344:149-72.]。近年、ＣＴＬの標的細胞に対する認識特異性がＴリンパ球受容体（T Cell Receptor, ＴＣＲ）に依存するという発見に基づき、人々は腫瘍細胞関連抗原に対する抗体のｓｃＦｖをＴリンパ球受容体のＣＤ３ζやＦｃεＲＩγ等の細胞内シグナル活性化モチーフと融合させてキメラ抗原受容体（Chimeric antigen receptor, ＣＡＲ）とし、且つそれをレンチウイルス感染等の手段によりＴリンパ球表面に遺伝子修飾する。このようなＣＡＲ  Ｔリンパ球は、主要組織適合性複合体（Major Histocompatibility Complex, ＭＨＣ）非拘束性の形態でTリンパ球を選択的に腫瘍細胞にターゲッティングし、且つ腫瘍を特異的に殺傷することができる。ＣＡＲ  Ｔリンパ球は、腫瘍の免疫療法分野における新規な免疫療法策である[Schmitz Mら. Chimeric antigen receptor-engineered T cells for immunotherapy of Cancer. J Biomed Biotechnol, 2010, doi:10.1155/2010/956304.]。
【０００３】
キメラ抗原受容体は、細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを含む。通常、細胞外ドメインは腫瘍関連抗原を認識できるｓｃＦｖを含み、膜貫通ドメインとしては、ＣＤ８、ＣＤ２８等の分子の膜貫通ドメインが用いられ、細胞内シグナルドメインとしては、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγ、および共刺激シグナル分子ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４等の細胞内シグナルドメインが用いられる。
【０００４】
細胞内シグナルドメインがＩＴＡＭのみを含むものは第１世代のＣＡＲ  Ｔリンパ球であり、それにおけるキメラ抗原受容体の各部分は、ｓｃＦｖ−ＴＭ−ＩＴＡＭの形態で連結している。このようなＣＡＲ  Ｔは、抗腫瘍の細胞傷害効果を引き起こすことができるが、サイトカインの分泌が少なく、且つ生体内で長続きの抗腫瘍効果を引き起こすことができない[Zhang T.ら, Chimeric NKG2D-modified T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in a manner involving multiple cytokines and cytotoxic pathways, Can Res 2007, 67(22):11029-11036.]。
【０００５】
その後開発した第２世代のＣＡＲ  Ｔリンパ球には、ＣＤ２８またはＣＤ１３７（４−１ＢＢともいう）の細胞内シグナルドメインが加えられ、それにおけるキメラ抗原受容体の各部分は、ｓｃＦｖ−ＴＭ−ＣＤ２８−ＩＴＡＭまたはｓｃＦｖ−ＴＭ−／ＣＤ１３７−ＩＴＡＭの形態で連結している。細胞内シグナルドメインによるＢ７／ＣＤ２８または４−１ＢＢＬ／ＣＤ１３７共刺激作用は、Ｔリンパ球の連続増殖を引き起こし、且つＴリンパ球からのＩＬ−２やＩＦＮ−γ等のサイトカインの分泌レベルを向上させるとともに、ＣＡＲ  Ｔの生体内での生存周期と抗腫瘍効果を向上させることができる[Dotti G.ら, CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor modified T cells in lymphoma patients. J Clin Invest,2011,121(5):1822-1826.]。
【０００６】
近年で開発した第３世代のＣＡＲ  Ｔリンパ球において、キメラ抗原受容体の各部分はｓｃＦｖ−ＴＭ−ＣＤ２８−ＣＤ１３７−ＩＴＡＭまたはｓｃＦｖ−ＴＭ−ＣＤ２８−ＣＤ１３４−ＩＴＡＭの形態で連結しており、ＣＡＲ  Ｔの生体内における生存周期とその抗腫瘍効果はさらに向上した[Carpenito C.ら, Control of large established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains. PNAS, 2009, 106(9): 3360-3365.]。
【０００７】
ＣＡＲ  Ｔリンパ球は腫瘍の免疫療法において将来性があるが、その高いリスクも考慮する必要がある。一例を挙げると、ある正常組織がＣＡＲに認識される特異性抗原を低発現することにより、ＣＡＲ  Ｔリンパ球は相応の抗原を発現する正常組織を損傷する恐れがある。例えば、腎細胞癌患者の腫瘍細胞に発現する抗原である炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）は、臨床に用いられるＣＡＲ  Ｔリンパ球養子療法の最初のケースであり、ＣＡＲ含有細胞のオフターゲット効果を報告した最初のケースでもある。患者にＣＡＲ  Ｔリンパ球を複数回導入すると、２〜４級肝毒性が示された。その原因は、肝胆管上皮細胞にＣＡＩＸが低発現するからであり、元の臨床試験は中止せざるを得ないとともに、患者に対する治療効果の評価も一切取り消された[Stoter G.ら, Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX: first clinical experience. J clin oncol, 2006, 24（13）: e20-e22.; Ngo MC.ら, Ex vivo gene transfer for improved adoptive immunotherapy of cancer. Human Molecular Genetics, 2011, R1-R7]。また、ＣＡＲにおける過剰の共刺激シグナルがエフェクター細胞の活性化に必要な閾値を低下させることにより、遺伝子修飾Ｔリンパ球は低レベルの抗原または抗原による惹起のない条件下でも活性化される恐れがあり、それで大量のサイトカインが放出され、いわゆる「サイトカインストーム」が引き起こされる可能性がある。このようなシグナル漏れ〔singnal leakage〕は標的細胞傷害性の喪失を引き起こすことにより、非特異的な組織損傷が生じる。例えば、Ｈｅｒ２に対する第３世代のＣＡＲを用いて肝と肺転移のある進行大腸癌患者を臨床治療する過程において、正常肺組織にＨｅｒ２が低発現するため、いわゆる「サイトカインストーム」が引き起こされ、患者はその原因により急死した[Morgan RA.ら, Report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing Erbb2. Molecular Therapy, 2010, 18 (4): 843-851.]。
【０００８】
ＣＡＲ  Ｔの設計において、対象とする抗原遺伝子は肝心な選択であり、生体内の遺伝子発現の複雑性および各種の管理不可能要因の原因で、ＣＡＲ  Ｔに好適に適用できる遺伝子の選択は非常に困難である。しかも、多くの腫瘍特異性抗原について、それを標的とし且つＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞の構築に適用できる特異性分子は見出しにくく、ＣＡＲ  Ｔの構築後、活性を有する細胞外結合ドメインが得られない場合が多く、それはＣＡＲ  Ｔ技術の発展の難点でもある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ＣＬＤ１８Ａ２標的免疫エフェクター細胞及びその調製方法と使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第一は、免疫エフェクター細胞表面に発現されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、ＣＬＤ１８Ａ２（claudin 18.2）を特異的に認識する蛋白質を含む細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを順次に含むキメラ抗原受容体を提供する。
【００１１】
一つの好ましい例において、前記ＣＬＤ１８Ａ２を特異的に認識する蛋白質は抗体またはリガンドである；好ましくは、前記抗体は一本鎖抗体またはドメイン抗体である。
もう一つの好ましい例において、前記膜貫通ドメインはＣＤ８またはＣＤ２８の膜貫通ドメインおよびヒンジドメインを含む配列である。
【００１２】
もう一つの好ましい例において、前記細胞内シグナルドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４の細胞内シグナルドメイン配列、或いはそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００１３】
もう一つの好ましい例において、前記キメラ抗原受容体は、
ＣＬＤ１８Ａ２を特異的に認識する一本鎖抗体、ＣＤ８およびＣＤ３ζ；
ＣＬＤ１８Ａ２を特異的に認識する一本鎖抗体、ＣＤ８、ＣＤ１３７およびＣＤ３ζ；
ＣＬＤ１８Ａ２を特異的に認識する一本鎖抗体、ＣＤ２８分子の膜貫通ドメイン（ＣＤ２８ａ）、ＣＤ２８分子の細胞内シグナルドメイン（ＣＤ２８ｂ）およびＣＤ３ζ；或いは
ＣＬＤ１８Ａ２を特異的に認識する一本鎖抗体、ＣＤ２８分子の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８分子の細胞内シグナルドメイン、ＣＤ１３７およびＣＤ３ζ；
の順番で連結する細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを含む。
【００１４】
もう一つの好ましい例において、前記キメラ抗原受容体は配列番号１９〜２２のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好ましい例において、前記免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞を含む。
【００１５】
本発明のもう一つは、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸を提供する。
一つの好ましい例において、前記核酸は配列番号１５〜１８のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有する。
【００１６】
本発明のもう一つは、前記核酸を含む発現ベクターを提供する。
一つの好ましい例において、前記発現ベクターはレンチウイルスプラスミドｐＷＰＴ（またはｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ）に由来する。
【００１７】
本発明のもう一つは、前記ベクターを含むウイルス（例えばレンチウイルス）を提供する。
本発明のもう一つは、前記キメラ抗原受容体、或いは前記核酸、或いは前記発現ベクター、或いは前記ウイルスの、ＣＬＤ１８Ａ２標的遺伝子修飾免疫エフェクター細胞を調製するための使用を提供する。
【００１８】
本発明のもう一つは、前記核酸、或いは前記発現ベクター、或いは前記ウイルスが形質導入された遺伝子修飾免疫エフェクター細胞を提供する。
本発明のもう一つは、その表面にキメラ抗原受容体が発現される遺伝子修飾免疫エフェクター細胞であって、前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列は配列番号１９〜２２のいずれかに示されるアミノ酸配列から選ばれる遺伝子修飾免疫エフェクター細胞を提供する。
【００１９】
本発明のもう一つは、前記遺伝子修飾免疫エフェクター細胞の、ＣＬＤ１８Ａ２陽性（高発現）腫瘍を抑制する医薬を調製するための使用を提供する。
もう一つの好ましい例において、前記ＣＬＤ１８Ａ２陽性腫瘍は膵癌、胃癌を含む。
【００２０】
本発明の他の面は、本文の開示内容により、当業者にとって自明である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】例示としての本発明にかかるＣＡＲをコードする配列を含むレンチウイルスベクターｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＣＡＲの構造の概念図である。
【図２】キメラ抗原受容体の各部分の連結順番の概念図である。
【図３】実施例１の抗ＣＬＤ１８Ａ２の一本鎖抗体の精製電気泳動図である。
【図４】ＣＬＤ１８Ａ１、ＣＬＤ１８Ａ２の安定発現細胞系のウエスタンブロット検出結果である。
【図５】フローサイトメーターによるＣＬＤ１８Ａ２一本鎖抗体とＣＬＤ１８Ａ１、ＣＬＤ１８Ａ２の結合特異性の検出結果である。
【図６】ライゲーション済のキメラ抗原受容体の電気泳動による同定である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明者らは、幅広く深く研究したところ、ＣＬＤ１８Ａ２遺伝子に基づくＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞及びその調製方法を初めて開示した。
ＣＬＤ１８Ａ２遺伝子
本発明者らは複数種の腫瘍特異性遺伝子を調査しておいた結果、このような遺伝子のうちのほとんどは一部の組織の正常細胞にも発現され、キメラ抗原受容体Ｔ細胞技術に適用できず、比較的に良好な腫瘍特異性発現特性を持つ腫瘍特異性遺伝子もあるけれども、それに基づいて設計したＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞は、相応の遺伝子が発現する蛋白質の抗原性が低い、若しくは発現箇所が不合理的である、若しくは発現量が足りないなどの原因で、或いは組換え・構築して得られるＴリンパ球が影響を受けて、その腫瘍殺傷能が低減または喪失する原因で、腫瘍細胞殺傷活性を有しない若しくは活性が低い、ということを見出した。
【００２３】
本発明者らは調査とスクリーニングを繰り返した結果、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞（例えばＴリンパ球）を設計するための標的遺伝子として、ＣＬＤ１８Ａ２遺伝子を見出した。
【００２４】
Ｃｌａｕｄｉｎ１８（ＣＬＤ１８）分子（Genbank登録番号：splice variant 1 （ＣＬＤ１８Ａ１）：NP.sub.-057453、NM.sub.-016369、及びsplice variant 2 （ＣＬＤ１８Ａ２）：NM.sub.-001002026、NP.sub.-001002026）は、分子量が約２７．９／２７．７２の膜貫通蛋白質である。Ｃｌａｕｄｉｎｓは上皮と内皮に位置する密着結合膜蛋白質である。
【００２５】
研究により分かるように、ＣＬＤ１８Ａ１は正常の肺および胃上皮に選択的に発現されるが、ＣＬＤ１８Ａ２の発現は胃上皮の分化済の短命細胞のみに限られ、胃幹細胞には発現されない；しかも、従来の研究から分かるように、ＣＬＤ１８Ａ２は多くの腫瘍細胞に発現される。ＣＬＤ１８Ａ２の上記特性に鑑み、本発明者らは、ＣＬＤ１８Ａ２がそれらの腫瘍の重要な治療標的であると推測した；さらに、後の大量の工夫で検証したところ、その推測を証明した。
【００２６】
キメラ抗原受容体及びそれをコードする核酸
本発明は、Ｔリンパ球表面に発現されるキメラ抗原受容体であって、ＣＬＤ１８Ａ２（claudin 18.2）を特異的に認識する蛋白質を含む細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを順次に含むキメラ抗原受容体を提供する。該キメラ抗原受容体をＴリンパ球の表面に発現させることで、ＣＬＤ１８Ａ２高発現腫瘍細胞に対する高度に特異的な細胞傷害作用をＴリンパ球に与えることができる。
【００２７】
本発明の好ましい形態として、前記細胞外結合ドメインはＣＬＤ１８Ａ２を特異的に認識する一本鎖抗体ｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２）を含む。前記キメラ抗原受容体蛋白質の細胞外結合ドメインはＣＤ８ヒンジドメインを介してＣＤ８またはＣＤ２８の膜貫通ドメインと連結し、膜貫通ドメインの次は細胞内シグナルドメインである。
【００２８】
本発明は前記キメラ抗原受容体をコードする核酸も含む。本発明にかかる核酸配列は、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であってもよい。ＤＮＡ形態はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは人工合成したＤＮＡを含む。ＤＮＡは一本鎖または二本鎖であってもよい。ＤＮＡはコード鎖または非コード鎖であってもよい。本発明にかかるキメラ抗原受容体蛋白質のアミノ酸配列をコードする核酸コドンは補同義コドンであってもよく、つまり、同一のアミノ酸配列をコードする複数種の補同義核酸配列はいずれも本発明の範囲内に含まれる。相応のアミノ酸をコードする補同義核酸コドンは本分野で公知である。さらに、本発明は、本発明と同様なアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはポリペプチドの断片、類似物および誘導体をコードする前記ポリヌクレオチドの変異体に関する。当該ポリヌクレオチドの変異体は、天然発生の対立遺伝子変異体または非天然発生変異体であってもよい。それらのヌクレオチド変異体は、置換変異体、欠失変異体および挿入変異体を含む。本分野で知られるように、対立遺伝子変異体とは、一つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失または挿入であってもよいが、それでコードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させないポリヌクレオチドの代替形態である。
【００２９】
ヒトＣＬＤ１８Ａ２を特異的に認識するモノクロナール抗体としては、従来技術で開示された抗体を用いることができる。ＣＬＤ１８Ａ２のＣ末端エピトープを認識する複数種のモノクロナール抗体は、それらを組換え・構築することにより殺傷活性を有するＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞が最終に得られる限り、適切な形態で本発明に適用することができる。本発明の好ましい形態として、一本鎖抗体が適用され、好ましくは、前記一本鎖抗体は、ＣＬＤ１８Ａ２を特異的に認識できるがＣＬＤ１８Ａ１を認識しない１６３および１７５抗体である。より好ましくは、それらはＦｃと連結する（ＳｃＦｖ−１６３およびｓｃＦｖ−１７５）。
【００３０】
本発明に使用される用語の「一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）断片」とは、リンカー〔linker〕を介して連結する重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む組換え蛋白質であって、それらの二つのドメインがリンカーで連結することにより、最終に抗原結合部位を形成する抗体断片を指す。通常、ｓｃＦｖのサイズは完全抗体の１／６である。一本鎖抗体は、一本のヌクレオチド鎖でコードされる一本のアミノ酸鎖配列であることが好ましい。本発明に使用される一本鎖抗体は、例えばアミノ酸の欠失、挿入、置換、付加及び／又は組換えのような本分野で既知の常用技術、及び／又は他の修飾方法を単独でまたは組み合わせて用いて、さらに修飾することができる。一つの抗体のアミノ酸配列に基づき、そのＤＮＡ配列にこのような修飾を導入する方法は、当業者にとって公知のもので、例えばSambrook、分子クローニング： 実験マニュアル、Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.を参照する。前述の修飾は核酸レベルで行うことが好ましい。さらに、前記一本鎖抗体はその誘導体を含んでもよい。本発明において、「抗体の誘導体」は、例えばファージディスプレイ技術で前記抗体の誘導体を得る場合、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステムに使用される表面プラズモン共鳴技術で、ＣＬＤ１８Ａ２抗原エピトープと結合するファージ抗体の効率を向上させることができる（Schier，ヒト抗体ハイブリドーマ7（1996），97-105；Malmborg,免疫学方法雑誌183(1995)，7-13）。さらに、例えばＷＯ  ８９／０９６２２に記載されたキメラ抗体の生成方法、ＥＰ−Ａ１０２３９４００およびＷＯ９０／０７８６１に記載されたヒト化抗体の生成方法、ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９４／０２６０２およびＷＯ９６／３３７３５に記載されたマウスにおけるヒト抗体のような異種抗体の生成方法によって生成する抗体の誘導体を含む。
【００３１】
本発明における用語の「特異的認識」とは、本発明にかかる二重特異性抗体が目的抗原以外の任意のポリペプチドと交差反応しない或いはほとんど交差反応しないことを意味する。その特異性の度合いは、免疫ブロット、免疫アフィニティークロマトグラフィー、フローサイトメトリー等を含む免疫学的技術により判断できるが、それらに限定されるものではない。本発明において、特異的認識はフローサイトメトリーにより確定することが好ましく、具体的な場合には、特異的認識の基準は当業者がよく知られる本分野の常識により判断できる。
【００３２】
キメラ抗原受容体の膜貫通ドメインは、ＣＤ８やＣＤ２８等の蛋白質の膜貫通ドメインから選ばれるものであってもよい。ＣＤ８やＣＤ２８はＴリンパ球の表面の天然マーカーである。ヒトＣＤ８蛋白質はαとβまたはγとδの二本の鎖からなるヘテロ二量体である。本発明の一つの実施形態において、膜貫通ドメインはＣＤ８αまたはＣＤ２８の膜貫通ドメインから選ばれるものである。また、ＣＤ８αヒンジドメイン〔hinge〕は柔軟な領域であるため、ＣＤ８またはＣＤ２８は膜貫通ドメインおよびヒンジドメインとともに、キメラ抗原受容体ＣＡＲの標的認識ドメインｓｃＦｖと細胞内シグナルドメインとの連結に用いられる。
【００３３】
細胞内シグナルドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４蛋白質の細胞内シグナルドメインおよびそれらの組み合わせから選ばれるものであってもよい。ＣＤ３分子は五つのサブユニットからなり、そのうち、ＣＤ３ζサブユニット（ＣＤ３  ｚｅｔａともいう；単にＺと記す）は３つのＩＴＡＭモチーフを含有し、当該モチーフはＴＣＲ−ＣＤ３複合体における重要なシグナル伝達ドメインである。ＣＤ３δＺはＩＴＡＭモチーフを持たないように短く切断されたＣＤ３ζ配列であり、本発明の実施においては通常陰性コントロールの構築に用いられる。ＦｃεＲＩγは主に肥満細胞および好塩基球の表面に分布し、一つのＩＴＡＭモチーフを含有し、構造、分布および機能上でＣＤ３ζと類似する。また、前記のように、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４は共刺激シグナル分子であり、それぞれのリガンドと結合すると、その細胞内シグナル領域による共刺激作用は、Ｔリンパ球の連続増殖を引き起こし、且つＴリンパ球からのＩＬ−２やＩＦＮ−γ等のサイトカインの分泌レベルを向上させるとともに、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞の生体内での生存周期と抗腫瘍効果を向上させることができる。
【００３４】
本発明にかかる核酸でコードされる抗ＣＬＤ１８Ａ２キメラ抗原受容体蛋白質は、
ｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２）−ＣＤ８−ＣＤ３ζ、
ｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２）−ＣＤ８−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ、
ｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２）−ＣＤ２８ａ−ＣＤ２８ｂ−ＣＤ３ζ、
ｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２）−ＣＤ２８ａ−ＣＤ２８ｂ−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ、
およびそれらの組み合わせから選ばれるものであってもよく、ただし、関連するキメラ抗原受容体蛋白質におけるＣＤ２８ａはＣＤ２８分子の膜貫通ドメインを示し、ＣＤ２８ｂはＣＤ２８分子の細胞内シグナルドメインを示す。前記各種の抗ＣＬＤ１８Ａ２キメラ抗原受容体はｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２）−ＣＡＲと併称する。
【００３５】
本発明の一つの実施形態において、本発明にかかる核酸は配列番号１５〜１８に記載の配列を有する。本発明のもう一つの実施形態において、本発明にかかる核酸は配列番号１９〜２２のうちの一つの配列を有するキメラ抗原受容体蛋白質をコードする核酸である。
【００３６】
発現ベクターおよび細胞
さらに、本発明は、前記Ｔリンパ球表面に発現するキメラ抗原受容体蛋白質をコードする核酸を含むベクターを提供する。一つの具体的な実施形態において、本発明に使用されるベクターはレンチウイルスプラスミドベクターｐＷＰＴ−ｅＧＦＰである。当該プラスミドは第３世代の自己不活性型レンチウイルスベクターシステムに属し、当該システムは、蛋白質Ｇａｇ／Ｐｏｌをコードし、Ｒｅｖ蛋白質をコードするパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２と、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質をコードするエンベローププラスミドＰＭＤ２．Ｇと、空ベクターｐＷＰＴ−ｅＧＦＰとの合計で三つのプラスミドを含み、目的核酸配列、即ちＣＡＲをコードする核酸配列の組換え・導入に用いることができる。空ベクターｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ（それ自身は次の試験におけるｍｏｃｋである）において、伸長因子−１α（elongation factor−１α、ＥＦ−１α）プロモーターにより強化型緑色蛍光蛋白質（enhanced green fluorescent protein、ｅＧＦＰ）の発現を調節・制御する。ＣＡＲをコードする目的核酸配列を含む組み換え発現ベクターｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＣＡＲは、口蹄疫ウイルス（foot-and-mouth disease virus、ＦＭＤＶ）由来のリボソーム跳躍配列（ribosomal skipping sequence 2A）（単にＦ２Ａと記す）によりｅＧＦＰとＣＡＲの共発現を実現する。
【００３７】
さらに、本発明は前記ベクターを含むウイルスを含む。本発明にかかるウイルスは、感染力を持つパッケージング済みのウイルスも含むが、感染力を持つウイルスのパッケージングに必要な成分を含有する未パッケージングのウイルスも含む。本分野で既知の、外来遺伝子をＴリンパ球に形質導入するための他のウイルスおよびそれと対応するプラスミドベクターも本発明に用いることができる。
【００３８】
本発明の一つの実施形態において、前記ウイルスは前記ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＣＡＲ組換えベクターを含む（即ちｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２）−ＣＡＲを含有する）レンチウイルスである。
【００３９】
さらに、本発明は、本発明にかかる核酸、または本発明にかかる前記核酸を含む前記組換えプラスミド、または前記プラスミドを含むウイルスが形質導入された遺伝子修飾Ｔリンパ球を提供する。非ウイルスおよびウイルスによる形質導入方法を含む本分野で常用の核酸形質導入方法はいずれも本発明に適用することができる。非ウイルスによる形質導入方法は、エレクトロポレーション法とトランスポゾン法を含む。Ａｍａｘａ社が最近開発したnucleofector核内トランスフェクターによれば、外来遺伝子を直接に細胞核に導入し、目的遺伝子の効率的な形質導入を実現することができる。また、眠れる森の美女トランスポゾンシステム（Sleeping Beauty system）またはPiggyBacトランスポゾン等のトランスポゾンシステムによる形質導入効率は、通常のエレクトロポレーションより大きく向上しており、nucleofectorトランスフェクターと眠れる森の美女トランスポゾンシステムの併用は既に報告されており[Davies JK.ら, Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res, 2010, 70(10): OF1-10.]、当該方法は高い形質導入効率を有するだけでなく、目的遺伝子の部位特異的組込みも実現できる。本発明の一つの実施形態において、キメラ抗原受容体遺伝子修飾Ｔリンパ球を実現する形質導入方法は、レトロウイルスやレンチウイルスのようなウイルスに基づく形質導入方法である。当該方法には、形質導入効率が高く、外来遺伝子が安定に発現でき、且つ体外培養Ｔリンパ球が臨床適用可能な数に至る時間を短縮できる等の利点がある。当該遺伝子改変Ｔリンパ球の表面では、形質導入された核酸は転写、翻訳によりその表面に発現している。各種の異なる培養腫瘍細胞に対してインビトロ細胞傷害性試験を行うことで、本発明にかかる抗ＣＬＤ１８Ａ２キメラ抗原受容体遺伝子修飾Ｔリンパ球は、高度に特異的な腫瘍細胞殺傷効果（細胞傷害性ともいう）を有することが証明された。よって、本発明にかかるキメラ抗原受容体蛋白質をコードする核酸と、当該核酸を含むプラスミドと、当該プラスミドを含むウイルスと、および前記核酸、プラスミドまたはウイルスが形質導入された遺伝子改変Ｔリンパ球は、腫瘍の免疫療法に効率的に用いることができる。
【００４０】
一つの実施形態において、本発明にかかる遺伝子修飾Ｔリンパ球は、配列番号１５〜１８のうちの一つの核酸でコードされて発現するキメラ抗原受容体がその表面に発現している。もう一つの実施形態において、本発明にかかる遺伝子改変Ｔリンパ球は、アミノ酸配列が配列番号１９〜２２から選ばれる一つであるキメラ抗原受容体がその表面に発現している。
【００４１】
ＣＬＤ１８Ａ２標的ＣＡＲ  Ｔに関する報告はまだないことに鑑み、本発明者らは、複数の腫瘍関連遺伝子からＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞（例えばＴリンパ球）に適切に用いられる標的遺伝子ＣＬＤ１８Ａ２を初めて成功に見出し、且つＣＬＤ１８Ａ２標的ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞を成功に調製したことによって、膵癌、胃癌などの腫瘍に新規な治療手段を提供した。
【００４２】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いるもので、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例に特に具体的な条件を説明しない実験方法は、例えばＪ．サムブルックら著、分子クローニング： 実験マニュアル、第三版、科学出版社、２００２に記載される条件、或いはメーカーの薦めの条件で行われる。
【実施例】
【００４３】
[実施例１]抗ＣＬＤ１８Ａ２一本鎖抗体の発現
本発明者らは研究・分析を繰り返したところ、ＣＬＤ１８Ａ２を認識するｓｃｆｖ抗体をいくつか同定し、単に１２５、１６３および１７５と記した。
【００４４】
ブリッジＰＣＲに基づく遺伝子合成技術により、１２５（配列番号１（ヌクレオチド）、２（アミノ酸））、１６３（配列番号３（ヌクレオチド）、４（アミノ酸））、１７５（配列番号５（ヌクレオチド）、６（アミノ酸））一本鎖抗体配列を合成し、Ｎｈｅ１／ＢａｍＨ１（ＮＥＢより購入）で二重酵素切断し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢより購入）を用いて、同様にＮｈｅ１／ＢａｍＨ１で二重酵素切断されたベクタープラスミドｐＣＭＶ−Ｖ５−Ｆｃ（該ベクターはマルチクローニングサイトの下流でヒト抗体Ｆｃ断片を融合発現し、以下は単にＶ５−Ｆｃと記し、上海鋭勁生物より購入）とライゲーションし、且つホスト菌ＴＯＰ１０に形質転換し、クローニングを掻き取り、ＰＣＲによって陽性クローニングを同定し、且つシーケンシングによって確認し、Ｖ５−ｓｃＦｖ−１２５−Ｆｃ、Ｖ５−ｓｃＦｖ−１６３−Ｆｃ、Ｖ５−ｓｃＦｖ−１７５−Ｆｃ真核発現プラスミドをそれぞれ得た。
【００４５】
前記発現プラスミドをそれぞれ良好に成長しているＨＥＫ−２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、３７℃、５％ＣＯ2、１２５ｒｐｍのシェーカーで連続に７日間培養し、４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心し、沈殿を除去し、上澄を収集し、且つ０．４５μｍろ過膜でろ過し、処理されたサンプルをprotein A（ＧＥより購入）アフィニティカラムでアフィニティ精製し、最終に精製一本鎖抗体−Ｆｃ融合蛋白質ｓｃＦｖ−１２５−Ｆｃ（単にｓｃＦｖ−１２５と記す）、ｓｃＦｖ−１６３−Ｆｃ（単にｓｃＦｖ−１６３と記す）、ｓｃＦｖ−１７５−Ｆｃ（単にｓｃＦｖ−１７５と記す）を得て、同定した結果は図３に示された。
【００４６】
［実施例２］ＣＬＤ１８Ａ１またはＣＬＤ１８Ａ２安定発現細胞系の構築
１．ＣＬＤ１８Ａ１とＣＬＤ１８Ａ２の発現ベクターの構築およびレンチウイルスの調製
ブリッジＰＣＲに基づく遺伝子合成技術により、ＣＬＤ１８Ａ１完全コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿０１６３６９）およびＣＬＤ１８Ａ１完全コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００１００２０２６）を全配列合成し、コードのｃ末端にＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＫ）を挿入し、且つ合成した遺伝子断片の両末端にそれぞれＭｌｕＩ／ＳａｌＩ（ＮＥＢより購入）の制限酵素切断部位を入れ、ＭｌｕＩ／ＳａｌＩで二重酵素切断し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、同様にＭｌｕＩ／ＳａｌＩで二重酵素切断されたベクタープラスミドｐＷＰＴ（ａｄｄｇｅｎｅ社より購入）とライゲーションし、ホスト菌ＴＯＰ１０に形質転換し、クローニングを掻き取り、ＰＣＲによって同定し、且つシーケンシングによって正確なレンチウイルスベクタープラスミドＰＷＰＴ−ＣＬＤ１８Ａ１、ＰＷＰＴ−ＣＬＤ１８Ａ２が得られたことを確認した。前記プラスミドをそれぞれパッケージングヘルパープラスミド（ｐＧａｇ−ｐｏｌ、ｐＲＥＶ、ｐＶｓｖ−ｇ（いずれもａｄｄｇｅｎｅ社より購入）と所定の比率で２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトし、トランスフェクションから４８ｈおよび７２ｈ後に、それぞれＣＬＤ１８Ａ１、ＣＬＤ１８Ａ２ウイルス液を収集し、分注し、−８０℃で保管した。
【００４７】
２．外来ＣＬＤ１８Ａ１、ＣＬＤ１８Ａ２安定発現系の構築およびウエスタンブロット検出
前記のように収集したＣＬＤ１８Ａ１またはＣＬＤ１８Ａ２ウイルス液をそれぞれ６ｃｍウェル内で展開された２９３Ｔ細胞に加え、７２ｈ後に細胞を収集し、細胞溶解液を用いて溶解を行った。また、ＣＬＤ１８Ａ２ウイルス液を用いてヒト胃癌ＢＧＣ−８２３（中国科学院上海細胞ライブラリーより購入、ＴＣＨｕ  １１）およびＮＣＩ−Ｎ８７（ＡＴＣＣより購入、ＣＲＬ−５８２２）細胞系にそれぞれ感染させ、細胞が満杯になるまで成長した後、細胞を収集し、細胞溶解液を用いて溶解を行った。溶解されて収集された細胞蛋白質を４０μｇ取り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を行い、その後ゲルに対してイムノブロッティングを行い、且つマウス抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈより購入）で染色した。ＰＢＳで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗マウス抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｌｕｚより購入）とともにインキュベートした後、ＥＣＬ試薬で発色し、最後に現像を行った。
【００４８】
ウエスタンブロット結果から示されたように、ＣＬＤ１８Ａ１またはＣＬＤ１８Ａ２がトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞（即２９３Ｔ−ＣＬＤ１８Ａ１、２９３Ｔ−ＣＬＤ１８Ａ２）及びＣＬＤ１８Ａ２がトランスフェクトされたＢＧＣ−８２３とＮＣＩ−Ｎ８７細胞（即ＢＧＣ−８２３−ＣＬＤ１８Ａ２、ＮＣＩ−Ｎ８７−ＣＬＤ１８Ａ２）においては、分子量が約２８ＫＤのバンドが検出されたが、トランスフェクトされていないブランク細胞においては、相応のバンドが検出されなかった（図４）ことにより、外来ＣＬＤ１８Ａ１、ＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞系の構築が成功したことは明らかになった。
【００４９】
３．フローサイトメトリーにより各細胞系と抗ＣＬＤ１８Ａ２抗体との結合状況を解析するプロトコル
蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）（ＢＤ社、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）により、一本鎖抗体ｓｃＦｖ−１２５、ｓｃＦｖ−１６３およびｓｃＦｖ−１７５のそれぞれの下記各細胞系との結合能を解析した。
【００５０】
具体的な方法は以下の通りであった。
１）．対数増殖期にある２９３Ｔ、２９３Ｔ−ＣＬＤ１８Ａ１、２９３Ｔ−ＣＬＤ１８Ａ２、ＢＧＣ−８２３、ＢＧＣ−８２３−ＣＬＤ１８Ａ２、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＮＣＩ−Ｎ８７−ＣＬＤ１８Ａ２腫瘍細胞を６ｃｍウェルに、接種した細胞の密度が約９０％になるように接種し、３７℃インキュウベーターで一晩培養した。
【００５１】
２）．１０ｍＭのＥＤＴＡで細胞を消化し、２００ｇ×５ｍｉｎで遠心して細胞を収集した。１×１０6〜１×１０7／ｍＬの濃度で１％仔牛血清含有リン酸塩緩衝液（ＮＢＳ  ＰＢＳ）中に再懸濁させ、１００ｕｌ／チューブの量でフローサイトメトリー専用チューブに加えた。
【００５２】
３）．２００ｇ×５ｍｉｎで遠心し、上澄を捨てた。
４）．受試抗体ｓｃＦｖ−１２５、ｓｃＦｖ−１６３およびｓｃＦｖ−１７５をそれぞれ加えるとともに、無関連抗体を陰性コントロールとして、抗体最終濃度を２０μｇ／ｍｌとし、１つのチューブにつき１００ｕｌ加えた。４５分間氷浴した。
【００５３】
５）．１つのチューブにつき１％  ＮＢＳ  ＰＢＳを２ｍｌ加え、２００ｇ×５ｍｉｎで遠心し、合計で２回行った。
６）．上澄を捨て、１：５０で希釈したＦＩＴＣ蛍光標識ヒツジ抗ヒト抗体（上海康成生物工程株式会社より購入）を、１つのチューブにつき１００ｕｌ加えた。４５分間氷浴した。
【００５４】
７）．１つのチューブにつき１％  ＮＢＳ  ＰＢＳを２ｍｌ加え、２００ｇ×５ｍｉｎで遠心し、合計で２回行った。
８）．上澄を捨て、３００ｕｌの１％ＮＢＳ  ＰＢＳ中に再懸濁させ、フローサイトメーターにより検出した。
【００５５】
９）．フローサイトメトリーデータ解析ソフトウェアＷｉｎＭＤＩ  ２．９を用いてデータを解析した。
フローサイトメトリーの結果から分かるように、一本鎖抗体ｓｃＦｖ−１２５は、ＣＬＤ１８Ａ１だけでなく、ＣＬＤ１８Ａ２安定発現２９３Ｔ細胞にも結合できる（図５）ことにより、該一本鎖抗体がＣＬＤ１８Ａ２に対する結合特異性に乏しいことは分かった。幸いなことに、一本鎖抗体ＳｃＦｖ−１６３およびｓｃＦｖ−１７５はＣＬＤ８Ａ２安定発現２９３Ｔを特異的に認識できるが、ＣＬＤ１８Ａ１安定発現２９３Ｔ細胞と結合しないことにより、それらの２つの一本鎖抗体がＣＬＤ１８Ａ２を特異的に認識できることは分かった。また、それらの２つの一本鎖抗体はＣＬＤ１８Ａ２安定トランスフェクションＢＧＣ−８２３またはＮＣＩ−Ｎ８７細胞系も特異的に認識できるが、ＣＬＤ１８Ａ２がトランスフェクトされていないＢＧＣ−８２３またはＮＣＩ−Ｎ８７細胞と結合しなかった。
【００５６】
［実施例３］本発明にかかる核酸でコードされるキメラ抗原受容体蛋白質を発現するレンチウイルスプラスミドの構築およびウイルスのパッケージング
表１では、本発明で例示されるキメラ抗原受容体の各部分の連結順番が説明され、それらの連結は図２にも示される。
【００５７】
【表１】
2019122380.tif 000002
【００５８】
１、核酸断片の増幅
（１）ｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２−１６３、ＣＬＤ１８Ａ２−１７５）配列の増幅
Ｖ５−ｓｃＦｖ−１６３−Ｆｃプラスミドを鋳型として、一部の２Ａ配列を含むフォワードプライマー（配列番号７）および一部のＣＤ８  ｈｉｎｇｅ配列を含むリバースプライマー（配列番号８）をプライマー対として採用し、ＰＣＲ増幅によってｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２−１６３）を得た；同様に、Ｖ５−ｓｃＦｖ−１７５−Ｆｃプラスミドを鋳型として、一部の２Ａ配列を含むフォワードプライマー（配列番号９）および一部のＣＤ８  ｈｉｎｇｅ配列を含むリバースプライマー（配列番号１０）をプライマー対として採用し、ＰＣＲ増幅によってｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２−１７５）を得た。
【００５９】
（２）キメラ抗原受容体の他の部分の核酸配列
抗ＣＬＤ１８Ａキメラ抗原受容体蛋白質のｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２−１６３、ＣＬＤ１８Ａ２−１７５）以外の他の部分の核酸配列はそれぞれ、中国特許出願番号２０１３１０１６４７２５．Ｘで開示された配列番号１８、２１の配列を鋳型として、ＰＣＲ手段により得られた。
【００６０】
ただし、ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ配列は、中国特許出願番号２０１３１０１６４７２５．Ｘに記載の配列番号１８のプラスミドを鋳型として、プライマー対（配列番号１１、１２）でＰＣＲ増幅によって得られた。
【００６１】
ＣＤ８−ＣＤ３ζ（Ｚ）およびＣＤ２８ａ−ＣＤ２８ｂ−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ（２８ＢＢＺ）の獲得：ｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）−ＣＤ８−ＣＤ３ζ（中国特許出願２０１３１０１６４７２５．Ｘにおける配列番号１８）およびｓｃＦｖ（ＧＰＣ３）−ＣＤ２８ａ−ＣＤ２８ｂ−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ  （中国特許出願２０１３１０１６４７２５．Ｘにおける配列番号２１）をそれぞれ鋳型として、プライマ−対（配列番号１３、１４）を用いて、ＰＣＲによって増幅し、ＣＤ８−ＣＤ３ζ（Ｚ）およびＣＤ２８ａ−ＣＤ２８ｂ−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ（２８ＢＢＺ）断片をそれぞれ得た。
【００６２】
２０１３１０１６４７２５．Ｘにおける配列番号１８は本発明における配列番号２３の配列に相応する。
２０１３１０１６４７２５．Ｘにおける配列番号２１は本発明における配列番号２４の配列に相応する。
【００６３】
２、核酸断片のライゲーション
前記のように得られたｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ核酸断片のそれぞれと、等モルのｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２−１６３）またはｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２−１７５）核酸断片と、及び等モルのＣＤ８−ＣＤ３ζ（Ｚ）またはＣＤ２８ａ−ＣＤ２８ｂ−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ（ＢＢＺ）核酸断片とを図２に示すように三つの断片でライゲーションし、且つＰＣＲし、ライゲーション条件を以下のようにした：初期変性：９４℃，４ｍｉｎ；変性：９４℃，４０ｓ；アニーリング：６０℃，４０ｓ；伸長：６８℃，１４０ｓ；５サイクルを行い、その後最終伸長：６８℃，１０ｍｉｎ、ＤＮＡポリメラーゼおよびフォワードプライマー（配列番号１１）とリバースプライマー（配列番号１４）を補充してから、ＰＣＲ増幅を３０リサイクル行い、増幅条件を、初期変性：９４℃，４ｍｉｎ；変性：９４℃，４０ｓ；アニーリング：６０℃，４０ｓ；伸長：６８℃，１４０ｓ；３０サイクルを行い、その後最終伸長：６８℃，１０ｍｉｎ、とした。増幅して得られた断片はそれぞれ（表２）：
ｅＧＦＰ−ｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２）−１６３−Ｚ        （配列番号１５、１９）、
ｅＧＦＰ−ｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２）−１６３−ＢＢＺ    （配列番号１６、２０）、
ｅＧＦＰ−ｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２）−１７５−Ｚ        （配列番号１７、２１）、
ｅＧＦＰ−ｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２）−１７５−ＢＢＺ    （配列番号１８、２２）。
【００６４】
結果同定は図６に示す。
【００６５】
【表２】
2019122380.tif 000003
【００６６】
３、レンチウイルスプラスミドベクターの構築
例示としての本発明にかかるレンチウイルスプラスミドベクターの構築に用いられるベクター系は、第３世代の自己不活性型レンチウイルスベクターシステムに属し、当該システムは、蛋白質Ｇａｇ／Ｐｏｌをコードし、Ｒｅｖ蛋白質をコードするパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２（ａｄｄｇｅｎｅより購入）と、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質をコードするエンベローププラスミドＰＭＤ２．Ｇ（ａｄｄｇｅｎｅより購入）と、空ベクターｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ（ａｄｄｇｅｎｅより購入）に基づき、目的遺伝子ＣＡＲをコードする組換え発現ベクターとの合計で三つのプラスミドを含む。
【００６７】
空ベクターｐＷＰＴ−ｅＧＦＰにおいて、伸長因子−１α（elongation factor−１α、ＥＦ−１α）プロモーターにより強化型緑色蛍光蛋白質（enhanced green fluorescent protein、ｅＧＦＰ）の発現を調節・制御するが、目的遺伝子ＣＡＲをコードする組換え発現ベクターにおいて、口蹄疫ウイルス由来のリボソーム跳躍配列（foot and mouth disease virus、ＦＭＤＶ、ribosomal skipping sequence、Ｆ２Ａ）によりｅＧＦＰと目的遺伝子ＣＡＲの共発現を実現する。Ｆ２Ａは口蹄疫ウイルスの２Ａ（「自己切断ポリペプチド２Ａ」ともいう）から由来のコア配列であり、２Ａの「自己切断」機能を有し、上流と下流の遺伝子の共発現を実現できる。２Ａは、スプライシングの効率が高く、上流・下流遺伝子の発現のバランスが良く、およびそれ自身の配列が短いという利点により、遺伝子治療用のマルチシストロン性ベクターの構築に有効で実行可能な策略を提供した。特に、キメラ抗原受容体遺伝子修飾Ｔリンパ球による免疫療法において、当該配列を用いて目的遺伝子とＧＦＰまたはｅＧＦＰの共発現を実現することが一般的であり、ＧＦＰまたはｅＧＦＰを検出することで、ＣＡＲの発現を間接に検出できる。
【００６８】
本実施例では、Ｆ２Ａを介して連結するｅＧＦＰと特異性ＣＡＲを共発現するレンチウイルス発現ベクターが構築され、ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＣＡＲと総称する（図１）。前記工程２で得られた目的遺伝子ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＣＡＲ（実施例３における１（２）を参照し、Ｆ２Ａの次のエレメントを単にＣＡＲと記す）をＭｌｕＩとＳａｌＩ制限酵素で二重酵素切断し、同様に二重酵素切断されたｐＷＰＴベクターにライゲーションすることで、各キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクターを構築した。構築されたベクターは、ＭｌｕＩとＳａｌＩ酵素切断により同定され、且つ塩基配列が正確に決定されると、レンチウイルスのパッケージングに適用できる。前記のように、ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＣＡＲは一本のｍＲＮＡに転写されるが、最終にｅＧＦＰと抗ＣＬＤ１８Ａ２キメラ抗原受容体という二本のペプチド鎖に翻訳され、そのうち、抗ＣＬＤ１８Ａ２キメラ抗原受容体はＣＤ８αシグナルペプチドの導きによって細胞膜に局在化する。
【００６９】
得られた各目的ＣＡＲ含有ベクターは以下の通りであった。
ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２）−１６３−Ｚ；
ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２）−１６３−ＢＢＺ；
ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２）−１７５−Ｚ；
ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ｓｃＦｖ（ＣＬＤ１８Ａ２）−１７５−ＢＢＺ。
【００７０】
４、プラスミドで２９３Ｔをトランスフェクトし、レンチウイルスをパッケージングする
６〜１０代目まで培養したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１１２６８）を１０ｃｍ培養ディッシュに６×１０6の密度で接種し、３７℃、５％  ＣＯ2で一晩培養し、トランスフェクションに用いた。培地は１０％牛胎児血清（ＰＡＡ社より購入）含有ＤＭＥＭ（ＰＡＡ社より購入）であり、翌日、トランスフェクションの約２時間前に、培地を無血清ＤＭＥＭに変更した。
トランスフェクションのステップは以下の通りであった。
【００７１】
４．１
２０μｇの空プラスミドｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ（ｍｏｃｋコントロール）または２０μｇの各目的遺伝子プラスミドｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＣＡＲをそれぞれ、１５μｇのパッケージングプラスミドＰＡＸ２および６μｇのエンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇとともに５００μＬ  ＭｉｌｌＱ水中に溶解させ、均一に混合し、
４．２
６２μＬ  ２．５Ｍ  ＣａＣｌ2（Ｓｉｇｍａ社より購入）を滴下し、１２００ｒｐｍ／ｍｉｎで均一に渦流混合し、
４．３  最後に５００μＬ  ２×ＨｅＢＳ（２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、１２ｍＭグルコース、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ社より購入）、ｐＨ７．０５、０．２２μＭ濾過除菌）を滴下し、１２００ｒｐｍ／ｍｉｎで１０ｓ均一に渦流混合し、
４．４
直ちに培養ディッシュに滴下し、軽く振とうして均一にし、３７℃、５％  ＣＯ2で４〜６ｈ培養した後、１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭに変更した。
【００７２】
トランスフェクションの次の日にトランスフェクション効率（即ち緑色蛍光を示した細胞の割合）を調査し、〜８０％の陽性トランスフェクション効率の場合はトランスフェクション実験成功とした。トランスフェクションから４８ｈまたは７２ｈ後、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社より購入）を用いてウイルスを濾過して収集し、そしてＢｅｃｋｍａｎ  Ｏｐｔｉｍａ  Ｌ−１００ＸＰ超遠心機を用いて２８０００ｒｐｍ、４℃で２時間遠心し、遠心上清を捨て、遠心で得られた沈殿を原液体積の１／１０〜１／５０のＱｕａｎｔｕｍ  ００７培地（ＰＡＡ社より購入）で再懸濁させ、１００μＬ／チューブで分注し、−８０℃で凍結保存し、ウイルスがＴリンパ球を滴定または感染することを待った。
【００７３】
５、ｍｏｃｋまたはｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＣＡＲがパッケージングされたレンチウイルスの力価を測定する
１日目、１×１０5／ｍＬの２９３Ｔ細胞を１００μＬ／ウェルで９６ウェル培養プレートに接種し、３７℃、５％  ＣＯ2で培養し、培地は１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭにした。２日目、５０μＬ／ウェルの培養上清を捨て、最終濃度６μｇ／ｍＬのポリブレンを含有する新鮮な前記培地を５０μＬ／ウェルで追加し、３７℃、５％  ＣＯ2で３０ｍｉｎインキュベートした。ウイルス原液を１０μＬ／ウェルで、またはウイルス濃縮液を１μＬ／ウェルで加え，５倍に希釈し、勾配を４つにし、重複ウェルを２つにし、３７℃、５％  ＣＯ2で培養した。感染から４８ｈ後、フローサイトメーターによりｅＧＦＰを検出し、陽性率が５〜２０％になる細胞数を好ましく選出し、力価（Ｕ／ｍＬ）＝陽性率×希釈倍数×１００×１０4で力価を算出した。リン酸カルシウムトランスフェクション法でパッケージングされた前記ｍｏｃｋ（即ち空ベクター）コントロールおよび各ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＣＡＲを含むウイルスの力価はいずれも約０．５〜２×１０6Ｕ／ｍＬのレベルであり、濃縮してから測定されたウイルスの力価は約２×１０7Ｕ／ｍＬであった。
【００７４】
［実施例４］組換えレンチウイルスでＣＴＬ細胞を感染する
健常人末梢血から密度勾配遠心法によりヒト末梢血単核球（上海市血液センターから提供する）を獲得し、末梢血単核球からＣＴＬ細胞磁気ビーズ（Stem Cell Technologiesより購入）ネガティブ分離方法によりＣＴＬを獲得し、分離されたＣＴＬ細胞について、フローサイトメトリーによりＣＴＬ細胞の純度を測定し、ＣＴＬ細胞の陽性率≧９５％のものを好ましく選出し、次の操作に進めた。Ｑｕａｎｔｕｍ  ００７リンパ球培地液（ＰＡＡ社より購入）を約１×１０6／ｍＬの密度で加えて培養し、且つ細胞：磁気ビーズの比率が１：１になるように抗ＣＤ３およびＣＤ２８抗体で共に覆われた磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）と、最終濃度１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−２（上海華新生物高技術株式会社）とを加え、２４ｈ刺激培養した。そして、ＭＯＩ≒５で前記レンチウイルスを用いてＣＴＬ細胞を感染した。感染された細胞を一日おきに５×１０5／ｍＬの密度で継代するとともに、リンパ球培地に最終濃度１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−２を追加した。
【００７５】
感染させたＣＴＬ細胞について、培養の８日目にフローサイトメトリーにより各異なるキメラ抗原受容体の発現を検出し、ｅＧＦＰがＣＡＲと共発現することから、ｅＧＦＰが検出された陽性細胞はキメラ抗原受容体を発現する陽性細胞であった。感染していないＴリンパ球を陰性コントロールとして、異なるキメラ抗原受容体を発現するウイルス感染ＣＴＬ細胞の陽性率は表３に示す。当該陽性率の結果から、レンチウイルス感染方法により、ある程度の陽性率を有するＣＡＲ+ＣＴＬ細胞が得られることは分かった。
【００７６】
【表３】
2019122380.tif 000004
【００７７】
ＣＴＬ細胞は、異なるキメラ抗原受容体がパッケージングされたウイルスにそれぞれ感染させた後、細胞密度５×１０5／ｍｌで一日おきに継代培養し、カウントし、且つ継代した細胞培地にＩＬ−２を（最終濃度が１００Ｕ／ｍｌになるように）追加し、培養の１１日目に約２０〜４０倍増幅したことから、異なるキメラ抗原受容体を発現するＣＴＬ細胞はインビトロである程度の数に増幅することができ、次のインビトロ傷害性試験およびインビボ試験に保障を与えることが分かった。
【００７８】
［実施例５］
キメラ抗原受容体を発現する細胞のインビトロ傷害性効果試験
インビトロ傷害性試験に用いられる材料は以下の通りであった。
【００７９】
表４に示される２９３Ｔと胃癌細胞系を標的細胞とし、エフェクター細胞を例えば、実施例４で検証され、インビトロで１２日間培養され、ＦＡＣＳによる検出におけるキメラ抗原受容体発現の陽性細胞とし、キメラ抗原受容体陽性（ＣＡＲ+）のＣＴＬと記し、エフェクター細胞対標的細胞比を場合によってそれぞれ３：１、１：１および１：３とし、標的細胞数を１００００／ウェルとし、異なるエフェクター細胞対標的細胞比によってエフェクター細胞を対応させた。各群ではいずれも重複ウェルを５つにし、５つの重複ウェルの平均値を取った。検出時点は１８時間目であった。
【００８０】
ただし、各試験群および各コントロール群は以下の通りであった。
各試験群：各標的細胞＋異なるキメラ抗原受容体を発現するＣＴＬ、
コントロール群１：標的細胞最大放出ＬＤＨ、
コントロール群２：標的細胞自発放出ＬＤＨ、
コントロール群３：エフェクター細胞自発放出ＬＤＨ。
【００８１】
検出方法：ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６非放射性細胞傷害性検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて行った。当該方法は比色法に基づく検出方法であり、51Ｃｒ放出法の代わりとして用いられる。ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）検出は乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を定量的に測定する。ＬＤＨは安定な細胞質酵素であり、細胞が溶解する時に放出され、その放出形態は放射性解析における51Ｃｒの放出形態と殆ど同様である。培地上清中に放出されたＬＤＨは、３０分間カップリングする酵素反応によって検出することができ、酵素反応において、ＬＤＨは一種のテトラゾリド（ＩＮＴ）を赤色のホルマザン（Formazan）に変換させることができる。生成される赤色の産物の量は溶解した細胞の数に比例する。具体的には、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６非放射性細胞傷害性検出キットの取扱説明書を参照する。
【００８２】
細胞傷害性の計算式は
【００８３】
【数１】
2019122380.tif 000005
【００８４】
である。
具体的には表４および表５に示すように、本発明にかかるキメラ抗原受容体（一本鎖抗体１６３または１７５が融合発現された）ＣＬＤ１８Ａ２−Ｚ  ＣＡＲ+を発現するＣＴＬおよびＣＬＤ１８Ａ２−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ+を発現するＣＴＬは、ＣＬＤ１８Ａ２高発現２９３Ｔ細胞に対して著しい殺傷作用を有するが、ＣＬＤ１８Ａ１高発現２９３Ｔ細胞に対して殺傷作用を有しないことにより、それらがＣＬＤ１８Ａ２細胞を選択的に殺傷できることは分かった。また、本発明にかかるキメラ抗原受容体ＣＬＤ１８Ａ２−Ｚ  ＣＡＲ+を発現するＣＴＬおよびＣＬＤ１８Ａ２−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ+を発現するＣＴＬは、ＣＬＤ１８Ａ２高発現の２種類の胃癌細胞系ＢＧＣ−８２３およびＮＣＩ−Ｎ８７に対しても著しい殺傷作用を有し（表４および表５を参照）、且つエフェクター細胞対標的細胞比勾配依存性、つまり、エフェクター細胞対標的細胞比が高いほど、細胞傷害作用が強いことを示すが、ＣＬＤ１８Ａ２を発現しないＢＧＣ−８２３およびＮＣＩ−Ｎ８７に対して特異的な細胞傷害作用を有しない。
エフェクター細胞対標的細胞比依存性のデータにより、本発明にかかる抗ＣＬＤ１８Ａ２キメラ抗原受容体を発現するＣＴＬの、ＣＬＤ１８Ａ２高発現胃癌細胞に対する特異的な細胞傷害作用はさらに明らかになる。
【００８５】
それに対し、ｍｏｃｋプラスミド（ＣＬＤ１８Ａ２−ＣＡＲを持っていない空プラスミドベクターｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ）を含有するウイルスにトランスフェクトされた空白コントロールとしてのＣＴＬは、前記３種のＣＬＤ１８Ａ２高発現細胞系に対する細胞傷害作用がいずれも非常に低い。ＣＬＤ１８Ａ２高発現細胞系に対するその細胞傷害作用は、本発明にかかる抗ＣＬＤ１８Ａ２キメラ抗原受容体を発現するＣＴＬの細胞傷害性のデータに比べて、非常に著しい差異を示した。
【００８６】
以上の結果から、ＣＬＤ１８Ａ２に対する一本鎖抗体を選択して構築したキメラ抗原受容体は、ＣＬＤ１８Ａ２高発現標的細胞を選択的に殺傷できることが分かった。また、細胞傷害性のデータからみれば、ＣＬＤ１８Ａ２−２８ＢＢＺのＣＡＲ  Ｔは、ＣＬＤ１８Ａ２−ＺのＣＡＲＴよりも、ＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞に対する傷害性が強い。
【００８７】
【表４】
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【００８８】
【表５】
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【００８９】
検討
現在、ＣＡＲ  Ｔ細胞は既に潜在の治療手段になった。しかし、多くの腫瘍、例えば胃癌について、ＣＡＲ  Ｔ細胞治療に関する報告はまだない。従来の研究から分かるように、ＣＬＤ１８Ａ２は胃組織の特異性マーカーである可能性があることから、胃癌などの腫瘍の治療標的になるかもしれない。しかしながら、現在のところ、ＣＬＤ１８Ａ２を治療標的とする薬物候補はモノクロナール抗体しかなく、それが相応の腫瘍の治療に成功に適用できるかどうかはまだ不明だ。よって、新規な治療手段を見つける必要がある。ＣＬＤ１８Ａ２の組織特異性を考えて、本発明は、ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて標的治療を行うことができれば、新規な抗癌製剤が得られると予想する。しかしながら、ＣＬＤ１８Ａ２抗原が密着結合蛋白質であることはよく知られており、ＣＡＲ  Ｔ細胞と接触して相応の標的細胞の殺傷を引き起こせるかどうかはまだ不明で。また、蛋白質の立体配座は、変化が少しでも生じると、その全体に大きな影響を与える可能性があることから、多くのモノクロナール抗体は一本鎖抗体になると、抗原結合活性または特異性を喪失してしまう。幸いなことに、本発明者らは、２つの一本鎖抗体（１６３および１７５）がモノクロナール抗体の抗原結合特異性を保持したことを見出した。更なる研究により、それらの２つの一本鎖抗体からなるＣＡＲ  Ｔ細胞がＣＬＤ１８Ａ２陽性細胞に対する選択的な殺傷作用を保持したことは分かった。本発明の結果から分かるように、ＣＬＤ１８Ａ２は確実にＣＡＲ  Ｔ細胞治療の標的とすることができ、ＣＬＤ１８Ａ２を標的とするＣＡＲ  Ｔ細胞は腫瘍治療の新規な手段候補である。
【００９０】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変更や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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