(57)【要約】      （修正有）【課題】複数の転写様活性化因子エフェクター（ＴＡＬＥ）リピートドメインをコードするポリペプチドを作製する方法ならびにそのタンパク質の提供。【解決手段】１個もしくは複数の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）リピートドメインおよび／または１個もしくは複数のＴＡＬＥリピートドメインのうち１個もしくは複数の部分を含む第１の組をコードしている配列を有する第１の核酸を用意するステップと；同様に第２の組をコードしている配列を有する第２の核酸を用意するステップと；第１および第２のライゲーション可能な末端を介して第１の核酸と第２の核酸とをライゲーションして第１のライゲーションされた核酸を作製し、第１のライゲーションされた核酸が固体支持体に連結され、第１のライゲーションされた核酸が前記第１および第２の組を含むポリペプチドをコードするステップとを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１個もしくは複数の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）リピートドメイ
ンおよび／または１個もしくは複数のＴＡＬＥリピートドメインのうち１個もしくは複数
の部分を含む第１の組をコードしている配列を含む第１の核酸を用意するステップと；
（ｂ）第１の核酸を第１の酵素と接触させ、第１の酵素が第１のライゲーション可能な
末端を形成するステップと；
（ｃ）１個もしくは複数のＴＡＬＥリピートドメインおよび／または１個もしくは複数
のＴＡＬＥリピートドメインのうち１個もしくは複数の部分を含む第２の組をコードして
いる配列を含む第２の核酸を用意するステップと；
（ｄ）第２の核酸を第２の酵素と接触させ、第２の酵素が第２のライゲーション可能な
末端を形成し、第１および第２のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと
；
（ｅ）第１および第２のライゲーション可能な末端を介して第１の核酸と第２の核酸と
をライゲーションして第１のライゲーションされた核酸を作製し、第１のライゲーション
された核酸が固体支持体に連結され、第１のライゲーションされた核酸が前記第１および
第２の組を含むポリペプチドをコードするステップとを含む方法。
【請求項２】
第１の組が、ポリペプチド中で第２の組に対してＮ末端側にある、請求項１に記載の方
法。
【請求項３】
第２の組が、ポリペプチド中で第１の組に対してＮ末端側にある、請求項１に記載の方
法。
【請求項４】
第１および第２の酵素が第１および第２の制限エンドヌクレアーゼであり、第１の制限
エンドヌクレアーゼが第１の核酸中の部位で切断して第１の切断末端を形成し、第２の制
限エンドヌクレアーゼが第２の核酸中の部位で切断して第２の切断末端を形成し、第１お
よび第２のライゲーション可能な末端が第１および第２の切断末端である、請求項１に記
載の方法。
【請求項５】
第１のライゲーションされた核酸が、第１の制限エンドヌクレアーゼに認識される制限
部位を含まない、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ｆ）第１のライゲーションされた核酸を第３の酵素と接触させ、第３の酵素が第３の
ライゲーション可能な末端を形成するステップと；
（ｇ）１個もしくは複数のＴＡＬＥリピートドメインおよび／または１個もしくは複数
のＴＡＬＥリピートドメインのうち１個もしくは複数の部分を含む第３の組をコードして
いる配列を含む第３の核酸を用意するステップと；
（ｈ）第３の核酸を第４の酵素と接触させ、第４の酵素が第４のライゲーション可能な
末端を形成し、第３および第４のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと
；
（ｉ）第３および第４のライゲーション可能な末端を介して第１のライゲーションされ
た核酸と第３の核酸とをライゲーションして、固体支持体に連結された第２のライゲーシ
ョンされた核酸を作製し、第２のライゲーションされた核酸が前記第１、第２および第３
の組を含むポリペプチドをコードするステップと
をさらに含む、請求項１または４に記載の方法。
【請求項７】
第３および第４の酵素が、第３および第４の制限エンドヌクレアーゼであり、第３の制
限エンドヌクレアーゼが第１のライゲーションされた核酸中の部位で切断して第３の切断
末端を形成し、第４の制限エンドヌクレアーゼが第３の核酸中の部位で切断して第４の切
断末端を形成し、第３および第４のライゲーション可能な末端が第３および第４の切断末
端である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ライゲーションされた核酸が、第１のエンドヌクレアーゼに認識される制限部位を含ま
ず、第１および第３の制限エンドヌクレアーゼが同一である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第２および第４の制限エンドヌクレアーゼが同一である、請求項７または８に記載の方
法。
【請求項１０】
（ｊ）第２のライゲーションされた核酸を第５の酵素と接触させ、第５の酵素が第５の
ライゲーション可能な末端を形成するステップと；
（ｋ）１個もしくは複数のＴＡＬＥリピートドメインおよび／または１個もしくは複数
のＴＡＬＥリピートドメインのうち１個もしくは複数の部分を含む第４の組をコードして
いる配列を含む第４の核酸を用意するステップと；
（ｌ）第４の核酸を第６の酵素と接触させ、第６の酵素が第６のライゲーション可能な
末端を形成し、第５および第６のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと
；
（ｍ）第５および第６のライゲーション可能な末端を介して第２のライゲーションされ
た核酸と第４の核酸とをライゲーションして、固体支持体に連結された第３のライゲーシ
ョンされた核酸を作製し、第３のライゲーションされた核酸が前記第１、第２、第３およ
び第４の組を含むポリペプチドをコードするステップと
をさらに含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１１】
第５および第６の酵素が第５および第６の制限エンドヌクレアーゼであり、第５の制限
エンドヌクレアーゼが第２のライゲーションされた核酸中の部位で切断して第５の切断末
端を形成し、第６の制限エンドヌクレアーゼが第４の核酸中の部位で切断して第６の切断
末端を形成し、第５および第６のライゲーション可能な末端が第５および第６の切断末端
である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第２のライゲーションされた核酸が、第１のエンドヌクレアーゼに認識される制限部位
を含まず、第１、第３および第５の制限エンドヌクレアーゼが同一である、請求項１１に
記載の方法。
【請求項１３】
第２、第４および第６の制限エンドヌクレアーゼが同一である、請求項１１または１２
に記載の方法。
【請求項１４】
第２の組が、１〜４個のＴＡＬＥリピートドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
第１および第２のライゲーション可能な末端がそれぞれ、１〜１０ヌクレオチドの突出
を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
第１の酵素がＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである、請求項１から１４のいずれかに
記載の方法。
【請求項１７】
第１のライゲーションされた核酸を前記固体支持体から分離し、第１のライゲーション
された核酸をベクターに挿入することをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記
載の方法。
【請求項１８】
第２のライゲーションされた核酸を固体支持体から分離し、第２のライゲーションされ
た核酸をベクターに挿入することをさらに含む、請求項６から９のいずれか一項に記載の
方法。
【請求項１９】
第３のライゲーションされた核酸を固体支持体から分離し、第３のライゲーションされ
た核酸をベクターに挿入することをさらに含む、請求項１０から１３のいずれか一項に記
載の方法。
【請求項２０】
ベクターが発現ベクターである、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
発現ベクターが、エフェクタードメインをコードしている配列を含み、ベクターがポリ
ペプチドとエフェクタードメインとの融合タンパク質をコードしている配列を含むように
第１、第２または第３のライゲーションした核酸がベクターに挿入される、請求項２０に
記載の方法。
【請求項２２】
エフェクタードメインがヌクレアーゼドメインである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞に発現ベクターを挿入することをさらに含む、請求項２０から２２のいずれか一項
に記載の方法。
【請求項２４】
ポリペプチドまたは融合タンパク質を発現させることをさらに含む、請求項２３に記載
の方法。
【請求項２５】
ポリペプチドまたは融合タンパク質を精製することをさらに含む、請求項２４に記載の
方法。
【請求項２６】
表７に開示されている標的ヌクレオチド配列に結合する転写活性化因子様エフェクター
（ＴＡＬＥ）ドメインを含むポリペプチド。
【請求項２７】
標的ヌクレオチド配列が半部位である、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
ヌクレアーゼドメインを含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
実施例７に開示されているアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３０】
請求項２６から２９のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項３１】
請求項３０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３２】
請求項３０に記載の核酸または請求項３１に記載のベクターを含む細胞。
【請求項３３】
１、２、３および４個のＴＡＬＥリピートドメインまたはその部分をコードしている配
列を含む核酸のライブラリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は２０１１年７月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／５０８，３６６号
、および２０１２年２月２１日に出願された第６１／６０１，４０９号、および２０１２
年３月１３日に出願された第６１／６１０，２１２号の利益を主張し、上述した各出願の
全内容を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究についての記載
この発明は、米国国立衛生研究所によって裁定された補助金番号ＤＰ１  ＯＤ００６８
６２のもとに政府援助で行われた。政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全
体を参照により本明細書に組み込む。２０１２年７月１１日に作成された前記ＡＳＣＩＩ
コピーは、２９５３９３６Ｗ．ｔｘｔと命名され、サイズは４５９，６７３バイトである
。
【０００４】
この発明は、ペプチドをコードする核酸および複数の転写様活性化因子エフェクター（
ＴＡＬＥ）リピートドメインをコードするポリペプチドを作製する方法ならびにそのタン
パク質自体に関する。
【背景技術】
【０００５】
キサントモナス属の植物病原性細菌のＴＡＬＥタンパク質は、宿主ＤＮＡに結合し、エ
フェクター特異的宿主遺伝子を活性化することによって、病害において重要な役割を果た
す、または防御を誘発する（例えば、Guら、2005、Nature 435:1122；Yangら、2006 Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 103:10503；Kayら、2007、Science 318:648；Sugioら、2007、P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 104:10720；およびRomerら、2007、Science 318:645を参照
のこと）。核酸配列に対する特異性は、エフェクター（様々な数の不完全な、通常約３３
〜３５アミノ酸のリピート）に依存する（Schornackら、2006、J. Plant Physiol. 163:2
56）。各リピートは標的配列中の１個のヌクレオチドに結合し、そのヌクレオチドに対す
る各リピートの特異性は前後配列に殆ど左右されないので、専用の配列特異的ＴＡＬＥタ
ンパク質の開発が可能となる（Moscouら、2009、Science 326:1501；Bochら、2009、Scie
nce 326:1509-1512）。
【発明の概要】
【０００６】
本出願は、少なくとも一部において、専用ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質をコード
する核酸を組み立てるための迅速、簡単かつ容易に自動化可能な方法の開発に基づいてい
る。
【０００７】
したがって、この開示は、（ａ）１個もしくは複数（例えば、２個以上、３個以上、４
個以上、５個以上、６個以上、１〜６個、２〜６個、３〜６個、４〜６個、５個または６
個、１、２〜５個、３〜５個、４個または５個、１〜４個、２〜４個、３個または４個、
１〜３個、２個または３個、１個または２個、１、２、３、４、５個または６個）の転写
活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）リピートドメインおよび／または１個もしくは複
数のＴＡＬＥリピートドメインのうち１個もしくは複数の部分を含む第１の組をコードし
ている配列を有する第１の核酸を用意するステップと；（ｂ）第１の核酸を第１の酵素と
接触させ、第１の酵素が第１のライゲーション可能な末端を形成するステップと；（ｃ）
１個もしくは複数（例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、１〜
６個、２〜６個、３〜６個、４〜６個、５個または６個、１、２〜５個、３〜５個、４個
または５個、１〜４個、２〜４個、３個または４個、１〜３個、２個または３個、１個ま
たは２個、１、２、３、４、５個または６個）のＴＡＬＥリピートドメインおよび／また
は１個もしくは複数のＴＡＬＥリピートドメインのうち１個もしくは複数の部分を含む第
２の組をコードしている配列を有する第２の核酸を用意するステップと；（ｄ）第２の核
酸を第２の酵素と接触させ、第２の酵素が第２のライゲーション可能な末端を形成し、第
１および第２のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと；（ｅ）第１およ
び第２のライゲーション可能な末端を介して第１の核酸と第２の核酸とをライゲーション
して第１のライゲーションされた核酸を作製し、第１のライゲーションされた核酸が固体
支持体に連結され、第１のライゲーションされた核酸が前記第１および第２の組を含むポ
リペプチドをコードするステップとを含む方法を特徴とする。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本方法は、（ｂ）第１の核酸を第１の酵素と接触させる
前にまたは（ｅ）第１および第２の核酸をライゲーションする前に、固体支持体に第１の
核酸を連結させることを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、固体支持体に第
１のライゲーションされた核酸を連結することを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、第１の組は、ポリペプチド中で第２の組に対してＮ末端
側にある。いくつかの実施形態において、第２の組は、ポリペプチド中で第１の組に対し
てＮ末端側にある。
【００１０】
いくつかの実施形態において、第１および第２の酵素は第１および第２の制限エンドヌ
クレアーゼであり、第１の制限エンドヌクレアーゼは第１の核酸中の部位で切断して第１
の切断末端を形成し、第２の制限エンドヌクレアーゼは第２の核酸中の部位で切断して第
２の切断末端を形成し、第１および第２のライゲーション可能な末端は第１および第２の
切断末端である。制限エンドヌクレアーゼを使用するとき、第１のライゲーションされた
核酸は、第１の制限エンドヌクレアーゼに認識される制限部位を含むことができない。
【００１１】
本方法は、（ｆ）第１のライゲーションされた核酸を第３の酵素と接触させ、第３の酵
素が第３のライゲーション可能な末端を形成するステップと；（ｇ）１個もしくは複数（
例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、１〜６個、２〜６個、３
〜６個、４〜６個、５個または６個、１、２〜５個、３〜５個、４個または５個、１〜４
個、２〜４個、３個または４個、１〜３個、２個または３個、１個または２個、１、２、
３、４、５個または６個）のＴＡＬＥリピートドメインおよび／または１個もしくは複数
のＴＡＬＥリピートドメインのうち１個もしくは複数の部分を含む第３の組をコードして
いる配列を含む第３の核酸を用意するステップと；（ｈ）第３の核酸を第４の酵素と接触
させ、第４の酵素が第４のライゲーション可能な末端を形成し、第３および第４のライゲ
ーション可能な末端が対合可能であるステップと；（ｉ）第３および第４のライゲーショ
ン可能な末端を介して第１のライゲーションされた核酸と第３の核酸とをライゲーション
して、固体支持体に連結された第２のライゲーションされた核酸を作製し、第２のライゲ
ーションされた核酸が前記第１、第２および第３の組を含むポリペプチドをコードするス
テップとをさらに含むことができる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、第３および第４の酵素は、第３および第４の制限エンド
ヌクレアーゼであり、第３の制限エンドヌクレアーゼは第１のライゲーションされた核酸
中の部位で切断して第３の切断末端を形成し、第４の制限エンドヌクレアーゼは第３の核
酸中の部位で切断して第４の切断末端を形成し、第３および第４のライゲーション可能な
末端は第３および第４の切断末端である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ライゲーションされた核酸は、第１のエンドヌクレアー
ゼに認識される制限部位を含まず、第１および第３の制限エンドヌクレアーゼは同一であ
る。いくつかの実施形態において、第２および第４の制限エンドヌクレアーゼは同一であ
る。
【００１４】
本方法は、（ｊ）第２のライゲーションされた核酸を第５の酵素と接触させ、第５の酵
素が第５のライゲーション可能な末端を形成するステップと；（ｋ）１個もしくは複数（
例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、１〜６個、２〜６個、３
〜６個、４〜６個、５個または６個、１、２〜５個、３〜５個、４個または５個、１〜４
個、２〜４個、３個または４個、１〜３個、２個または３個、１個または２個、１、２、
３、４、５個または６個）のＴＡＬＥリピートドメインおよび／または１個もしくは複数
のＴＡＬＥリピートドメインのうち１個もしくは複数の部分を含む第４の組をコードして
いる配列を有する第４の核酸を用意するステップと；（ｌ）第４の核酸を第６の酵素と接
触させ、第６の酵素が第６のライゲーション可能な末端を形成し、第５および第６のライ
ゲーション可能な末端が対合可能であるステップと；（ｍ）第５および第６のライゲーシ
ョン可能な末端を介して第２のライゲーションされた核酸と第４の核酸とをライゲーショ
ンして、固体支持体に連結された第３のライゲーションされた核酸を作製し、第３のライ
ゲーションされた核酸が前記第１、第２、第３および第４の組を含むポリペプチドをコー
ドするステップとをさらに含むことができる。当業者は、同様の付加のステップを用いて
、本方法を繰り返すことができることを認識できよう。そのような方法は、この開示に含
まれる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、第５および第６の酵素は第５および第６の制限エンドヌ
クレアーゼであり、第５の制限エンドヌクレアーゼは第２のライゲーションされた核酸中
の部位で切断して第５の切断末端を形成し、第６の制限エンドヌクレアーゼは第４の核酸
中の部位で切断して第６の切断末端を形成し、第５および第６のライゲーション可能な末
端は第５および第６の切断末端である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、第２のライゲーションされた核酸は、第１のエンドヌク
レアーゼに認識される制限部位を含まず、第１、第３および第５の制限エンドヌクレアー
ゼは同一である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、第２、第４および第６の制限エンドヌクレアーゼは同一
である。
【００１８】
いくつかの実施形態において、固体支持体および連結されている核酸は、例えば、上記
のステップ（ａ）〜（ｍ）のいずれかの後に単離される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、第２、第３または第４の組は、１〜４個のＴＡＬＥリピ
ートドメインを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ライゲーション可能な末端は、１〜１０ヌクレオチドの
突出を含む。いくつかの実施形態において、ライゲーション可能な末端は、平滑末端であ
る。いくつかの実施形態において、突出は、１つまたは複数のヌクレオチドの存在下でエ
キソヌクレアーゼおよびポリメラーゼを使用して生成できる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、上記の方法において使用される酵素または制限エンドヌ
クレアーゼは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである。
【００２２】
本方法は、ライゲーションされた核酸を固体支持体から分離し、ライゲーションされた
核酸（またはＴＡＬＥリピートアレイコード配列を含めたその処理された誘導体）をベク
ター、例えば、発現ベクターに挿入することをさらに含むことができる。発現ベクターは
、ポリペプチドとエフェクタードメインとの融合タンパク質をコードしている配列を形成
するように構成されているエフェクタードメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）をコ
ードしている配列を含むことができる。細胞に発現ベクターを挿入して、細胞に直接に影
響を及ぼすか、またはポリペプチドもしくは融合タンパク質を発現させることができる。
ポリペプチドまたは融合タンパク質を発現させる場合、本方法は、ポリペプチドまたは融
合タンパク質を発現させ、精製することをさらに含むことができる。
【００２３】
別の態様において、この開示は、本明細書に開示されている標的ヌクレオチド配列（例
えば、表６または表７）（例えば、「半部位（half site）」）に結合するＴＡＬＥタン
パク質、ＴＡＬＥタンパク質を含むＴＡＬＥヌクレアーゼ、本明細書に開示されている標
的部位（例えば、表６または表７）に結合するＴＡＬＥタンパク質対（例えば、ＴＡＬＥ
Ｎｓ）および上記のいずれかをコードする核酸を特徴とする。いくつかの実施形態におい
て、ＴＡＬＥタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼおよびＴＡＬＥタンパク質対（例えば、
ＴＡＬＥＮｓ）は、実施例７に開示されているものである。ＴＡＬＥタンパク質、ＴＡＬ
ＥヌクレアーゼおよびＴＡＬＥタンパク質対（例えば、ＴＡＬＥＮｓ）をコードする核酸
は、実施例７に開示されているものまたは実施例７に開示したタンパク質をコードする他
の配列でもよい。本開示は、本明細書に開示されているＴＡＬＥタンパク質、ＴＡＬＥヌ
クレアーゼまたはＴＡＬＥタンパク質対（例えば、ＴＡＬＥＮｓ）をコードする核酸を含
むベクターおよび細胞、ならびにＴＡＬＥタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＴＡ
ＬＥタンパク質対（例えば、ＴＡＬＥＮｓ）を発現させる、細胞培養を含めた方法も含む
。ＴＡＬＥタンパク質、ＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＴＡＬＥタンパク質対（例えば、Ｔ
ＡＬＥＮｓ）を発現させる本方法は、細胞培養からＴＡＬＥタンパク質、ＴＡＬＥヌクレ
アーゼまたはＴＡＬＥタンパク質対（例えば、ＴＡＬＥＮｓ）を単離することも含み得る
。
【００２４】
別の態様において、本発明は、１個または複数のＴＡＬＥドメインをコードしている配
列を含む核酸（例えば、プラスミド）の組、アーカイブまたはライブラリを特徴とする。
いくつかの実施形態において、組、アーカイブまたはライブラリは、１、２、３および／
または４個の（または、４個より多い（例えば、５個、６個またはそれより多い））ＴＡ
ＬＥリピートドメインをコードしている配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸
の組、ライブラリまたはアーカイブは、１、２、３、４個の（または、４個より多い（例
えば、５個、６個またはそれより多い））ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列に結合
するＴＡＬＥリピートドメインをコードしている配列を含む。いくつかの実施形態におい
て、組、ライブラリまたはアーカイブは、ＴＡＬＥリピートドメインをコードする配列を
囲んで制限部位（例えば、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの部位）を含む。
【００２５】
本明細書に記載の方法は、ＴＡＬＥリピートの多量のＰＣＲ増幅を回避し、それによっ
てＰＣＲエラーによる変異の導入を回避することを含めた、いくつかの利点をも提供する
。さらに、任意の望ましい長さのＴＡＬＥリピートアレイを構築することができ、その方
法は容易に多重化および／または自動化できる。
【００２６】
別段の規定がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は
、この発明が属する分野の当業者であれば一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
本明細書に記載の方法および材料に類似したまたは同等のそれは、本発明の実施または試
験に使用することができるが、適切な方法および材料については後述される。本明細書に
記載の全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体を参照により組み
込む。不一致がある場合、用語の定義を含めて、本願明細書が優先されることになる。加
えて、材料、方法および例は単なる例示であり、制限することを意図するものではない。
【００２７】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細については、添付の図面および下記の説明に
記載されている。本発明の他の特徴、目的および利点については、説明および図面、なら
びに特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＴＡＬＥタンパク質をコードする核酸を組み立てる典型的な方法を示す模式図である。
【図２】単一（１マー）、２マー、３マーおよび４マーのＴＡＬＥリピートドメインをコードする核酸の典型的なアーカイブを示す模式図である。
【図３】ｐＵＣ５７−ΔＢｓａＩプラスミドの配列である。このプラスミドは、ＢｓａＩ制限部位を破壊する単一塩基の変異（太字、下線を引いた、小文字）を除いてプラスミドｐＵＣ５７と同一である。
【図４Ａ】α／ε、β、γおよびδ型の典型的なＴＡＬＥリピートのポリペプチド配列である。各型に特有の多形残基が、太字およびイタリックで表される。Ａに結合するための超可変のトリプレットＳＮＩが下線で表される。
【図４Ｂ】図４Ａの典型的なＴＡＬＥリピートのポリヌクレオチド配列である。
【図５Ａ】発現プラスミドｐＪＤＳ７０、ｐＪＤＳ７１、ｐＪＤＳ７４、ｐＪＤＳ７６およびｐＪＤＳ７８の共通配列である。可変配列の領域は、ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（下線を引いた太字）として図示される。
【図５Ｂ】発現プラスミドｐＪＤＳ７０、ｐＪＤＳ７１、ｐＪＤＳ７４、ｐＪＤＳ７６およびｐＪＤＳ７８の共通配列である。可変配列の領域は、ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（下線を引いた太字）として図示される。
【図６】増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）遺伝子および本明細書に記載の合成ＴＡＬＥタンパク質に対する結合部位の位置の概念図である。
【図７】ｅＧＦＰレポーター遺伝子に結合し、切断するように設計されたＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするプラスミドでトランスフェクションした２日後および５日後の、ＴＡＬＥヌクレアーゼ修飾ｅＧＦＰ陰性細胞の％を表す棒グラフである。
【図８】ＴＡＬＥヌクレアーゼによって誘導されるｅＧＦＰの挿入−欠失変異体の配列である。欠失した塩基を破線で表し、挿入された塩基を二重下線で表す；ＴＡＬＥＮ標的半部位に一本線の下線を引く。挿入または欠失した塩基の正味の数が、右に示される。
【図９】１７マーＴＡＬＥアレイ調製物をコードしている組み立てられたＤＮＡ断片の電気泳動ゲルを示す図である。
【図１０】１６マーＴＡＬＥアレイ調製物の電気泳動ゲルを示す図である。
【図１１Ａ】改変ＤＲ−ＴＡＬＥ−０００３のヌクレオチド配列である。
【図１１Ｂ】改変ＤＲ−ＴＡＬＥ−０００３のポリペプチド配列である。
【図１２Ａ】改変ＤＲ−ＴＡＬＥ−０００６のヌクレオチド配列である。
【図１２Ｂ】改変ＤＲ−ＴＡＬＥ−０００６のポリペプチド配列である。
【図１３Ａ】改変ＤＲ−ＴＡＬＥ−０００５のヌクレオチド配列である。
【図１３Ｂ】改変ＤＲ−ＴＡＬＥ−０００５のポリペプチド配列である。
【図１４Ａ】改変ＤＲ−ＴＡＬＥ−００１０のヌクレオチド配列である。
【図１４Ｂ】改変ＤＲ−ＴＡＬＥ−００１０のポリペプチド配列である。
【図１５Ａ】改変ＤＲ−ＴＡＬＥ−００２３のヌクレオチド配列である。
【図１５Ｂ】改変ＤＲ−ＴＡＬＥ−００２３のポリペプチド配列である。
【図１６Ａ】改変ＤＲ−ＴＡＬＥ−００２５のヌクレオチド配列である。
【図１６Ｂ】改変ＤＲ−ＴＡＬＥ−００２５のポリペプチド配列である。
【図１７Ａ】改変ＤＲ−ＴＡＬＥ−００２０のヌクレオチド配列である。
【図１７Ｂ】改変ＤＲ−ＴＡＬＥ−００２０のポリペプチド配列である。
【図１８Ａ】改変ＤＲ−ＴＡＬＥ−００２２のヌクレオチド配列である。
【図１８Ｂ】改変ＤＲ−ＴＡＬＥ−００２２のポリペプチド配列である。
【図１９Ａ】ＥＧＦＰ遺伝子破壊アッセイにおける４８個のＴＡＬＥＮ対および４個のＺＦＮ対の活性を表す棒グラフである。染色体に組み込まれたＥＧＦＰレポーター遺伝子を持つＵ２ＯＳ細胞を、ヌクレアーゼをコードしているプラスミドを用いてトランスフェクションした２日後および５日後に測定したＥＧＦＰ陰性細胞のパーセンテージが示される。３つの独立したトランスフェクションのＥＧＦＰ破壊の平均パーセントおよび平均値の標準誤差が示される。
【図１９Ｂ】ＴＡＬＥＮｓの長さによってグループ化した、図１９Ａの平均ＥＧＦＰ破壊活性を表す棒グラフである。
【図２０Ａ】２日後〜５日後の平均パーセントＥＧＦＰ破壊値の比を表すグラフである。図１９Ｂのデータを使用して、各ＴＡＬＥＮ長のグループについて比が算出された。１より大きい値は、２日後と比較して、５日後のＥＧＦＰ破壊細胞の平均の減少を表す。
【図２０Ｂ】ＴＡＬＥＮｓの様々な長さによってグループ化した２日後〜５日後の平均ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞の比を表すグラフである。０日目に、ｔｄＴｏｍａｔｏをコードする対照プラスミドを、ヌクレアーゼをコードするプラスミドと一緒にトランスフェクトした。
【図２１Ａ】内在性ヒト遺伝子で、組み立てられたＴＡＬＥＮに誘導される変異のＤＮＡ配列および頻度を表す図である。各内在性遺伝子標的について、ＴＡＬＥＮ標的半部位に下線を引き、遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を箱で囲んで、野生型（ＷＴ）配列を一番上の行に表す。欠失は破線で、挿入は小文字と二重下線で表される。挿入（＋）または欠失（Δ）のサイズが、各変異部位の右に表される。各変異体が単離された回数が、括弧内に示される。変異頻度は、分析した配列の合計数で除した同定された変異体の数として算出される。いくつかの遺伝子について、ＴＡＬＥＮ標的部位の配列を超えて広がるより大きな欠失も同定したことに留意されたい。
【図２１Ｂ】内在性ヒト遺伝子で、組み立てられたＴＡＬＥＮに誘導される変異のＤＮＡ配列および頻度を表す図である。各内在性遺伝子標的について、ＴＡＬＥＮ標的半部位に下線を引き、遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を箱で囲んで、野生型（ＷＴ）配列を一番上の行に表す。欠失は破線で、挿入は小文字と二重下線で表される。挿入（＋）または欠失（Δ）のサイズが、各変異部位の右に表される。各変異体が単離された回数が、括弧内に示される。変異頻度は、分析した配列の合計数で除した同定された変異体の数として算出される。いくつかの遺伝子について、ＴＡＬＥＮ標的部位の配列を超えて広がるより大きな欠失も同定したことに留意されたい。
【図２１Ｃ】内在性ヒト遺伝子で、組み立てられたＴＡＬＥＮに誘導される変異のＤＮＡ配列および頻度を表す図である。各内在性遺伝子標的について、ＴＡＬＥＮ標的半部位に下線を引き、遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を箱で囲んで、野生型（ＷＴ）配列を一番上の行に表す。欠失は破線で、挿入は小文字と二重下線で表される。挿入（＋）または欠失（Δ）のサイズが、各変異部位の右に表される。各変異体が単離された回数が、括弧内に示される。変異頻度は、分析した配列の合計数で除した同定された変異体の数として算出される。いくつかの遺伝子について、ＴＡＬＥＮ標的部位の配列を超えて広がるより大きな欠失も同定したことに留意されたい。
【図２１Ｄ】内在性ヒト遺伝子で、組み立てられたＴＡＬＥＮに誘導される変異のＤＮＡ配列および頻度を表す図である。各内在性遺伝子標的について、ＴＡＬＥＮ標的半部位に下線を引き、遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を箱で囲んで、野生型（ＷＴ）配列を一番上の行に表す。欠失は破線で、挿入は小文字と二重下線で表される。挿入（＋）または欠失（Δ）のサイズが、各変異部位の右に表される。各変異体が単離された回数が、括弧内に示される。変異頻度は、分析した配列の合計数で除した同定された変異体の数として算出される。いくつかの遺伝子について、ＴＡＬＥＮ標的部位の配列を超えて広がるより大きな欠失も同定したことに留意されたい。
【図２１Ｅ】内在性ヒト遺伝子で、組み立てられたＴＡＬＥＮに誘導される変異のＤＮＡ配列および頻度を表す図である。各内在性遺伝子標的について、ＴＡＬＥＮ標的半部位に下線を引き、遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を箱で囲んで、野生型（ＷＴ）配列を一番上の行に表す。欠失は破線で、挿入は小文字と二重下線で表される。挿入（＋）または欠失（Δ）のサイズが、各変異部位の右に表される。各変異体が単離された回数が、括弧内に示される。変異頻度は、分析した配列の合計数で除した同定された変異体の数として算出される。いくつかの遺伝子について、ＴＡＬＥＮ標的部位の配列を超えて広がるより大きな欠失も同定したことに留意されたい。
【図２２】ＴＡＬＥリピートドメインまたはＴＡＬＥリピートドメインの一部を含有する、ＴＡＬＥタンパク質をコードする核酸を組み立てる典型的な方法の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本明細書に記載の方法を使用して、対象の特異的配列に結合するためのＴＡＬＥリピー
トドメインを含有する改変タンパク質を組み立てることができる。リピートは、高度に保
存されている約３３〜３５アミノ酸の共通配列内では少数のアミノ酸しか異ならないので
、ＴＡＬＥリピートドメインリピートの長いアレイ（例えば、１２個以上）を組み立てる
ことが難しい場合がある。ＰＣＲ組立てをすると、不要な変異が導入されることがある。
これら構築物の高度な反復性により構築物が不安定化し、組換えが起こりやすくなる可能
性があるので、およびこれらの中間構築物を継代する必要性によりこれらの手法を自動化
することが困難になるので、大腸菌（E. coli）における中間プラスミド構築物の継代を
１回または複数回含む階層的な組立て方法も問題を含む可能性がある。
【００３０】
ＴＡＬエフェクター
キサントモナス属の植物病原性細菌のＴＡＬエフェクターは、宿主ＤＮＡに結合し、エ
フェクター特異的宿主遺伝子を活性化することによって、病害において重要な役割を果た
す、または防御を誘発する。特異性は、エフェクター（様々な数の不完全な、通常約３３
〜３５アミノ酸のリピート）に依存する。主にリピートの１２位および１３位に多形が存
在し、本明細書において「リピート可変二残基（diresidue）」（ＲＶＤ）と称する。Ｔ
ＡＬエフェクターのＲＶＤは、直接的に、線型様式で、１つのヌクレオチドに対して１つ
のＲＶＤで、多少の縮重を伴い、明らかな前後配列の依存性無しにその標的部位中のヌク
レオチドに対応する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド特異性を付与する多形
領域は、三残基（triresidue）またはトリプレットとして発現されてよく、例えば、残基
１１、１２および１３を包含する。
【００３１】
各ＤＮＡ結合リピートは、標的ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含むこ
とができ、各ＤＮＡ結合リピートは標的ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識に関与し、Ｒ
ＶＤは：Ｃ認識用のＨＡ；Ｃ認識用のＮＤ；Ｃ認識用のＨＩ；Ｇ認識用のＨＮ；Ｇ認識用
のＮＡ；ＧもしくはＡ認識用のＳＮ；Ｔ認識用のＹＧ；およびＧ認識用のＮＫ、のうちの
１つまたは複数、ならびにＣ認識用のＨＤ；Ｔ認識用のＮＧ；Ａ認識用のＮＩ；Ｇもしく
はＡ認識用のＮＮ；ＡもしくはＣもしくはＧもしくはＴ認識用のＮＳ；ＣもしくはＴ認識
用のＮ＊（＊はＲＶＤの第２位におけるギャップを表す）；Ｔ認識用のＨＧ；Ｔ認識用の
Ｈ＊（＊はＲＶＤの第２位におけるギャップを表す）；およびＴ認識用のＩＧ、のうちの
１つまたは複数を含むが、これに限定されるものではない。
【００３２】
ＴＡＬＥタンパク質は、（例えば、植物において生物燃料またはバイオ再生可能なエネ
ルギーに有用な形質を付加するまたは強化するための）ゲノム工学において、相同組換え
を促進可能な標的したキメラヌクレアーゼとして研究および生物工学に役立つ。これらの
タンパク質は、例えば、転写因子として、特に、非限定例としては、病原体（例えば、ウ
イルス）に対する治療法など非常に高いレベルの特異性を必要とする治療適用にも有用で
ある。
【００３３】
組立て方法
ＴＡＬＥリピートドメインアレイを組み立てる本明細書に記載の方法の例は、図１に示
されており、（１）固体支持体への付着に適したリンカーを有する、単一のＮ末端ＴＡＬ
Ｅリピートドメイン（１マー）をコードしている単一のビオチン化ＰＣＲ産物を用意する
ステップと（ここで示す例では、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用する
が、他の固体支持体およびその固体支持体に最初のＤＮＡ断片を係留する他の方法も利用
可能である）；（２）（例えば、ＩＩＳ型制限酵素を使用して）１マーＤＮＡの３’末端
に突出を作成するステップと；（３）４個のＴＡＬＥリピートドメイン（すなわち、予め
組み立てられた４マー）を含有する第２の断片をライゲーションして、５マーを形成する
ステップと；（４）固体支持体へ５マーを付着させるステップと；（５）追加的な予め組
み立てられたＴＡＬＥリピートドメイン（例えば、望ましい最終的なアレイ長に応じて１
、２、３または４個のＴＡＬＥリピートドメインをコードしているＤＮＡの断片（複数可
））をライゲーションして、長いアレイを形成するステップと、（６）（例えば、最初の
ビオチン化ＤＮＡ産物の５’末端に部位が組み込まれているＩＩＳ型制限酵素を使用する
ことにより）ＴＡＬＥリピートをコードしている伸長したＤＮＡを固体支持体から遊離さ
せるステップとを含む。次いで、最終的な断片は、適切な発現プラスミドにライゲーショ
ンするように調製できる。
【００３４】
別法として、本方法は、（１）固体支持体に単一のＮ末端ＴＡＬＥリピートドメインを
コードする単一のビオチン化ＰＣＲ産物を付着させるステップと（ここで示す例では、ス
トレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用するが、マルチウェルプレートのストレ
プトアビジンコーティングしたウェルなど他の固体支持体およびその固体支持体に最初の
ＤＮＡ断片を係留する他の方法も利用可能である）、（２）（例えば、ＩＩＳ型制限酵素
を使用して）固定されているＤＮＡの３’末端に突出を作成するステップと、（３）４個
のＴＡＬＥリピートドメインを含有する第２の断片をライゲーションするステップと、（
４）ステップ（２）および（３）のサイクルを追加して長いアレイを形成するステップと
、（５）最終サイクルにおいて、望ましい最終的なアレイ長に応じて１、２、３または４
個のＴＡＬＥリピートドメインをコードするＤＮＡの断片のライゲーションを実施するス
テップと、（６）（例えば、最初のビオチン化ＤＮＡ産物の５’末端に部位が組み込まれ
ているＩＩＳ型制限酵素を使用することにより）ＴＡＬＥリピートをコードしている伸長
したＤＮＡを固体支持体から遊離させるステップの通り進められる。
【００３５】
本明細書に記載の方法に基づいてＴＡＬＥリピートドメインアレイを組み立てる方法の
別の例は、図２２に示されており、（１）固体支持体への付着に適したリンカーを有する
単一のＮ末端ＴＡＬＥリピートドメインの一部（部分的１マー）をコードする単一のビオ
チン化ＰＣＲ産物を用意するステップと（ここで示す例では、ストレプトアビジンコーテ
ィング磁気ビーズを使用するが、他の固体支持体およびその固体支持体に最初のＤＮＡ断
片を係留する他の方法も利用可能である）；（２）（例えば、ＩＩＳ型制限酵素を使用し
て）部分的な１マーＤＮＡの３’末端に突出を作成するステップと；（３）２個の部分的
および３個の完全なＴＡＬＥリピートからなるを含有する第２の断片をライゲーションす
るステップと；（４）固体支持体へ第２の断片を付着させるステップと；（５）追加的な
予め組み立てられたＴＡＬＥリピートドメインまたはＴＡＬＥリピートドメインの一部（
例えば、望ましい最終的なアレイ長に応じて１、２、３または４個のＴＡＬＥリピートド
メイン（またはＴＡＬＥリピートドメインの一部）をコードするＤＮＡの断片（複数可）
）をライゲーションして、長いアレイを形成するステップと、（６）（例えば、最初のビ
オチン化ＤＮＡ産物の５’末端に部位が組み込まれているＩＩＳ型制限酵素を使用するこ
とにより）ＴＡＬＥリピートをコードしている伸長したＤＮＡを固体支持体から遊離させ
るステップとを含む。次いで、最終的な断片は、適切な発現プラスミドにライゲーション
するように調製できる。
【００３６】
１個または複数のＴＡＬＥリピートドメイン（または一部）をコードしている最初の核
酸は、固体支持体に連結される。最初の核酸は、任意の手段（例えば、化学合成、ＰＣＲ
またはプラスミドからの切断）によって調製できる。加えて、核酸は、任意の手段、例え
ば、共有結合または非共有結合によって固体支持体に連結できる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、結合対の一方のメンバーで修飾された核酸を使用し、結
合対の他方のメンバーを固体支持体に組み込むことにより、核酸は非共有結合的に連結さ
れる。結合対の一メンバーは、第１および第２部分のうちの一方になり、前記第１および
前記第２部分は互いに対して特異的な結合親和性を有する。本発明において使用する適切
な結合対には、それだけには限らないが、抗原／抗体（例えば、ジゴキシゲニン／抗ジゴ
キシゲニン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）／抗ＤＮＰ、ダンシル−Ｘ／抗ダンシル、フル
オレセイン／抗フルオレセイン、ルシファーイエロー／抗ルシファーイエロー、ペプチド
／抗ペプチド、リガンド／受容体およびローダミン／抗ローダミン）、ビオチン／アビジ
ン（または、ビオチン／ストレプトアビジン）およびカルモジュリン結合タンパク質（Ｃ
ＢＰ）／カルモジュリンがある。他の適切な結合対には、ＦＬＡＧ−ペプチドなどのポリ
ペプチド（Hoppら、1988、BioTechnology、6:1204 10）；ＫＴ３エピトープペプチド（Ma
rtinら、Science 255:192 194（1992））；チューブリンエピトープペプチド（Skinnerら
、J. Biol. Chem. 266:15163-66（1991））；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチド
タグ（Lutz-Freyerinuthら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87:6393 97（1990））と、そ
れらに対する各抗体がある。
【００３８】
いくつかの実施形態において、１個または複数のＴＡＬＥリピートドメインをコードし
ている個々の核酸は、プラスミドのアーカイブまたはライブラリ中に存在する（図２を参
照のこと）。１〜４個のＴＡＬＥリピートドメインをコードしている核酸を示すが、プラ
スミドのライブラリは、４個より多い（例えば、５個、６個またはそれより多い）ＴＡＬ
Ｅリピートドメインをコードしている核酸を含有できる。別法として、図２２に示される
通り、１個または複数のＴＡＬＥリピートドメインの部分または一部をコードしている核
酸を結合させて、ＴＡＬＥリピートドメインの望ましい全長アレイをコードする最終的な
ＤＮＡ断片を形成することもできる。特定のヌクレオチドまたはヌクレオチドの組に対し
て結合特異性を持つ多くのＴＡＬＥリピートドメイン配列が、当技術分野において公知で
あり、当業者は、これら公知の配列および本明細書の開示に基づいてプラスミドライブラ
リを設計し、調製することができる。
【００３９】
本明細書では、固体支持体とは、核酸を連結可能な任意の固体もしくは半固体または不
溶性支持体のことを指す。そのような材料には、それだけに限らないが、ポリスチレン、
ポリカーボネート、ポリプロピレン、ナイロン、ガラス、デキストラン、キチン、砂、軽
石、アガロース、多糖、デンドリマー、バッキーボール、ポリアクリルアミド、シリコン
、ゴムならびに固相合成、親和性分離および精製、ハイブリダイゼーション反応、免疫測
定法および他のそのような用途の支持体として使用される他の材料など、生物化学的分子
の合成および分析のための支持体として使用される任意の材料がある。固体支持体は、微
粒子であることができ、あるいはマイクロタイターディッシュもしくはウェル、スライド
ガラス、シリコンチップ、ニトロセルロースシート、ナイロンメッシュまたは他のそのよ
うな材料など連続平面状であることができる。微粒子の場合、通常、粒子は、５〜１０ｍ
ｍの範囲またはより小さい少なくとも１つの大きさを有する。本明細書において、そのよ
うな粒子は、「ビーズ」と総称され、多くの場合球状であるが必ずしもそうではない。し
かし、そのような言及は基材の幾何学的形状を限定するものではなく、ランダム形状、針
状、繊維状および細長い形状を含めた任意の形状であることができる。また、おおよそ球
状の「ビーズ」、特に液相で使用可能な微小球体も意図される。追加的な成分が本明細書
に記載の方法に干渉しない限り、「ビーズ」は、磁石を使用して分離するための磁性また
は常磁性粒子（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を
参照のこと）などの追加的な成分を含むことができる。
【００４０】
制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＩＩ型もしくはＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ）
で切断することによって、または１つまたは複数のヌクレオチドの存在下でエキソヌクレ
アーゼ活性およびポリメラーゼ活性を持つ酵素（複数可）を使用して末端を「削り込む（
chewing back）」ことによって、ライゲーション可能な末端を作製できる（Aslanidisら
、1990、Nucl. Acids Res.、18:6069-74を参照のこと）。適切な酵素は、当業者に公知で
ある。制限エンドヌクレアーゼを使用する場合、核酸は、適切な位置に酵素のための制限
部位を含むように設計できる。
【００４１】
ライゲーション反応の後に、５’または３’突出を持つライゲーションされていない任
意の末端は、ポリメラーゼ（例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性と５’→３’ポ
リメラーゼ活性の両方を持つＤＮＡポリメラーゼ）の使用により「平滑化」できる。この
平滑化ステップにより、望ましくないまたは部分的な組立て産物の出現を減らすことがで
きる。別法として、これらの末端は、対合可能な突出を持つ「ヘアピン」オリゴ（Briggs
ら、2012、Nucleic Acids Res、PMID: 22740649）を使用してまたは１方の末端に対合可
能な突出を持ち、他方の末端に平滑末端を持つ短い二本鎖ＤＮＡによってキャップするこ
とができる。
【００４２】
さらに下流で処理するためのライゲーションした核酸を調製するために、期待されるサ
イズの核酸を選抜し、不完全なライゲーションによって形成される少量の産物の存在量を
減らすことが有益な場合がある。サイズによって核酸を選抜する方法は、当技術分野にお
いて公知であり、ゲル電気泳動（例えば、スラブゲル電気泳動またはキャピラリーゲル電
気泳動（例えば、Carusoら、2003、Electrophoresis、24:1-2:78-85を参照のこと））、
液体クロマトグラフィー（例えば、サイズ除外クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグ
ラフィー（例えば、Huberら、1995、Anal. Chem.、67:578-585を参照のこと））、および
ラボオンチップシステム（例えば、ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＸＴシステム、Ｃａｌｉ
ｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）がある。いくつかの
実施形態において、サイズ除外ステップは、自動化システム、例えば、自動化ゲル電気泳
動システム（例えば、Ｐｉｐｐｉｎ  Ｐｒｅｐ（商標）自動化ＤＮＡサイズ選抜システム
、Ｓａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して実施できる。
【００４３】
自動化
本明細書に開示されている本方法は、手作業で実施することができ、または本明細書に
記載の新規な方法にしたがってプログラムされている適合するソフトウェアパッケージ（
例えば、Ｍａｅｓｔｒｏ（商標）液体処理ソフトウェア）もしくは本明細書に記載の特定
の方法ステップを実施するために設計され実行される新規なソフトウェアパッケージによ
って制御される実験室自動化ハードウェア（例えば、ＳｃｉＣｌｏｎｅ  Ｇ３  Ｌｉｑｕ
ｉｄ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）により実行することができる。実験室自動化ハ
ードウェアによって実施されるとき、本方法は、本明細書に記載の方法ステップにしたが
った標準的なプログラミング技法を使用するコンピュータプログラムによって実行できる
。
【００４４】
自動化実験室システムロボットの例には、Ｓｃｉｃｌｏｎｅ（商標）Ｇ３液体処理ワー
クステーション（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、
ＭＡ）、Ｂｉｏｍｅｋ（登録商標）ＦＸ液体処理システム（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔ
ｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＴｅｋＢｅｎｃｈ（商標）自動化
液体処理プラットフォーム（ＴｅｋＣｅｌ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅ
ｔｔｓ）、およびＦｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ（登録商標）自動化プラットフォーム（Ｔｅｃ
ａｎ  Ｔｒａｄｉｎｇ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）がある。
【００４５】
プログラムは、少なくとも１台のプロセッサ、少なくとも１つのデータ記憶システム（
揮発性および不揮発性メモリならびに／または記憶素子、例えば、ＲＡＭおよびＲＯＭを
含む）、コンピュータキーボード、電話、またはワイヤレスの携帯デバイス（ＰＤＡなど
）などのデバイスに対してアクセス可能になる少なくとも１つの通信ポート、および場合
によってはモニタ、プリンタまたはウェブサイトなど少なくとも１つの出力デバイスを含
む、プログラム可能なコンピュータで実行するように設計できる。中央コンピュータは、
研究室自動化ハードウェアの制御を可能にするクロックおよび通信ポートも含む。これら
は全て、公知の技術、ソフトウェアおよびデバイスを使用して実行される。システムは、
データ（例えば、本明細書に記載の１つまたは複数の方法ステップの手順を記載している
データ）を含むデータベースも含む。
【００４６】
プログラムコードは、利用者によるデータ入力（例えば、処理しようとするサンプルの
位置、操作のタイミングおよび頻度、分注または吸引される液体の量、システム中のある
位置から別の位置へのサンプルの移動）およびデータベース中のデータに適用されて、本
明細書に記載の機能が実施される。システムは、質問を生成することも、利用者にメッセ
ージを提供することもできる。本明細書に記載の通り、出力情報は、反応物を含有する容
器を操作、加熱、撹拌などする機器（例えば、ロボット）に適用される。加えて、そのシ
ステムは、電話、プリンタもしくはモニタなど１つもしくは複数の出力デバイス、または
合成および／もしくはその進捗に関する情報を利用者に提供するためのウェブサイトにア
クセス可能な、コンピュータモニタ上のウェブページを含むことができる。
【００４７】
好ましくは、新規な方法を実現する各プログラムは、高いレベルの手続き的またはオブ
ジェクト指向のプログラミング言語により実行されて、コンピュータシステムと通信する
。しかし、プログラムは、必要に応じてアセンブリ言語または機械語で実行することもで
きる。どんな場合でも、言語は、コンパイラ型またはインタプリタ型言語であることがで
きる。
【００４８】
記憶媒体またはデバイスをコンピュータによって読み込み、本明細書に記載の手順を実
施する場合、好ましくは、一般的なまたは特殊用途のプログラム可能なコンピュータによ
って読取り可能な記憶媒体もしくはデバイス（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、光学的、磁気的
）にそのような各コンピュータプログラムを記憶させて、コンピュータを設定し、動作さ
せる。システムはまた、プログラムで設定されている、コンピュータ読取り可能なまたは
機械読取り可能な記憶媒体（電子装置で読取り可能な媒体）として実行できると考えられ
、それにより、こうして設定された記憶媒体は、コンピュータまたは機械を特定のおよび
所定の方法で動作させて、本明細書に記載の機能を実施する。
【００４９】
新規な方法は、データ記憶の様々な手段を使用して実行できる。ファイルは、記録可能
な媒体で物理的に、または専用のイントラネットもしくはインターネットで電子的に（例
えば電子メールによって）転送することができる。ファイルは、ＲＳＡ  Ｓｅｃｕｒｉｔ
ｙ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）およびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（登録商
標）のような会社の標準的な暗号化ソフトウェアを使用して暗号化することができる。フ
ァイルは、様々な形式、例えば、スプレッドシートまたはデータベースで記憶することが
できる。
【００５０】
本明細書では、「電子装置」という用語は、任意の適切なコンピューティングもしくは
処理装置、またはデータもしくは情報を記憶するために設定または適合されている他のデ
バイスを含むことを意図する。本発明とともに使用するのに適した電子装置の例には、独
立型コンピューティング装置；ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワー
ク（ＷＡＮ）、インターネット、イントラネットおよびエクストラネットを含めた通信ネ
ットワーク；例えばパーソナル携帯情報機器（ＰＤＡ）、携帯電話、「スマートフォン」
、ポケットベルなどの電子機器；ならびに局所型および分散型処理システムがある。
【００５１】
本明細書では、「記憶される」とは、電子装置で読取り可能な媒体に情報をコードする
ための方法のことを指す。当業者は、公知の媒体に情報を記録するための現在公知の方法
のいずれかを容易に採用して、配列情報を含む製品を生成することができる。
【００５２】
様々なソフトウェアプログラムおよび形式を使用して、電子装置で読取り可能な媒体に
方法データを記憶することができる。例えば、データおよび機械命令は、自動化システム
に備わっているソフトウェアのシステムに組み込みことができ、ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ
（登録商標）およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｏｒｄ（登録商標）など市販のソ
フトウェアで書式化される文書処理テキストファイルで表示でき、または例えばＭｉｃｒ
ｏｓｏｆｔ  Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＳＱＬ  Ｓｅｒｖｅｒ（
登録商標）、Ｓｙｂａｓｅ（登録商標）、Ｏｒａｃｌｅ（登録商標）などのデータベース
アプリケーションに記憶されるＡＳＣＩＩファイルの形態で、ならびに他の形態で表示で
きる。任意の数のデータ処理装置構築形式（例えば、テキストファイルまたはデータベー
ス）を利用して、適切なデータおよび機械命令を記録した媒体を得るかまたは形成し、そ
れによって本明細書に記載の方法を実行することができる。
【００５３】
電子装置で読取り可能な形態で情報を提供することにより、プログラム可能なコンピュ
ータは、研究室自動化ハードウェアと通信し、制御して、本明細書に記載の方法を実施す
ることができる。当業者は、電子装置で読取り可能な形態（または電子装置で読取り可能
な形態に変換される形態）でデータを入力して、研究室自動化ハードウェアによる様々な
方法ステップの完了について記述することができる。
【００５４】
ポリペプチド発現系
本発明の改変タンパク質を使用するには、通常、改変タンパク質をコードする核酸から
それを発現させる必要がある。これは、様々な方法で実施できる。例えば、通常、改変Ｔ
ＡＬＥリピートタンパク質をコードしている核酸を原核生物もしくは真核生物細胞への形
質転換用中間ベクターにクローニングして、複製および／または発現させる。改変ＴＡＬ
Ｅタンパク質をコードしている核酸を格納もしくは操作するまたはタンパク質を産生させ
るための中間ベクターは、通常、原核生物ベクター、例えばプラスミドもしくはシャトル
ベクターまたは昆虫ベクターである。改変ＴＡＬＥリピートタンパク質をコードしている
核酸も、通常、発現ベクターにクローニングされて、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺
乳動物細胞もしくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞または原生動物細胞に施与される。
【００５５】
クローニングした遺伝子または核酸を発現させるために、通常、改変ＴＡＬＥリピート
タンパク質は転写を指令するためのプロモーターを含有する発現ベクターにサブクローニ
ングされる。適切な細菌および真核生物プロモーターは、当技術分野で周知であり、例え
ば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual（第3版 2001）；Kriegler、
Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual（1990）；およびCurrent Protoco
ls in Molecular Biology（Ausubelら編、2010）に記載されている。改変ＴＡＬＥリピー
トタンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（E. coli）、バチルス
属種、およびサルモネラ属において利用可能である（Palvaら、1983、Gene 22:229-235）
。そのような発現系用のキットは、市販されている。哺乳動物細胞、酵母および昆虫細胞
用の真核生物発現系は、当技術分野で周知であり、市販もされている。
【００５６】
改変ＴＡＬＥリピートタンパク質核酸の発現を指令するために使用されるプロモーター
は、具体的な用途によって決まる。例えば、通常、強い構成的プロモーターを使用して、
改変ＴＡＬＥリピートタンパク質を発現させ精製する。それに対し、改変ＴＡＬＥリピー
トタンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで施与して、遺伝子調節する場合、改変ＴＡＬＥリピート
タンパク質の具体的な用途に応じて構成的なまたは誘導可能なプロモーターのいずれかを
使用することができる。加えて、改変ＴＡＬＥリピートタンパク質を施与するのに好まし
いプロモーターは、ＨＳＶ  ＴＫなどの弱いプロモーターまたは類似の活性を有するプロ
モーターであり得る。通常、プロモーターは、トランス活性化に応答する要素、例えば、
低酸素応答要素、Ｇａｌ４応答要素、ｌａｃリプレッサー応答要素ならびにｔｅｔ調節系
およびＲＵ−４８６系などの小分子制御系を含むこともできる（例えば、Gossen & Bujar
d、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:5547；Oliginoら、1998、Gene Ther.、5:491
-496；Wangら、1997、Gene Ther.、4:432-441；Neeringら、1996、Blood、88:1147-55；
およびRendahlら、1998、Nat. Biotechnol.、16:757-761を参照のこと）。
【００５７】
通常、プロモーターに加えて、発現ベクターは、宿主細胞（原核生物または真核生物の
いずれか）における核酸の発現に必要な全ての追加の要素を含有する転写ユニットまたは
発現カセットを含有する。したがって、通常の発現カセットは、例えば転写産物の効率的
なポリアデニル化、転写終結、リボゾーム結合部位または翻訳終結に必要な、例えばＴＡ
ＬＥリピートタンパク質シグナルをコードしている核酸配列に動作可能に連結されたプロ
モーターを含有する。カセットの追加の要素には、例えば、エンハンサーおよび異種スプ
ライシングされるイントロンシグナル（heterologous spliced intronic signals）があ
り得る。
【００５８】
細胞に遺伝情報を運搬するのに使用される具体的な発現ベクターは、改変ＴＡＬＥリピ
ートタンパク質の使用目的（例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物、などにおける
発現）に応じて選択される。標準的な細菌発現ベクターには、ｐＢＲ３２２をベースとし
たプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３ＤならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなど市販の融合発
現系などのプラスミドがある。好ましい融合タンパク質は、マルトース結合タンパク質、
「ＭＢＰ」である。そのような融合タンパク質を使用して、改変ＴＡＬＥリピートタンパ
ク質を精製できる。便利な単離方法を可能にし、発現をモニターし、細胞および細胞内の
局在をモニターするために、組換えタンパク質にエピトープタグ（例えば、ｃ−ｍｙｃま
たはＦＬＡＧ）を付加することもできる。
【００５９】
真核生物ウイルス由来の調節要素を含有する発現ベクターは、真核生物発現ベクター（
例えば、ＳＶ４０ベクター、乳頭腫ウイルスベクターおよびエプスタインバーウイルスか
ら得られるベクター）にしばしば使用される。他の典型的な真核生物ベクターには、ｐＭ
ＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイル
スｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチ
オネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモー
ター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核生物細胞における発現に対して有効であるこ
とが示されている他のプロモーターの指示の下でタンパク質の発現を可能にする他の任意
のベクターがある。
【００６０】
いくつかの発現系は、安定にトランスフェクトされた細胞系の選択用マーカー（チミジ
ンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼおよびジヒドロ葉酸還元酵素
など）を有する。昆虫細胞において、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュ
ロウイルスプロモーターの指示の下に、改変ＴＡＬＥリピートタンパク質をコードしてい
る配列を含むバキュロウイルスベクターを使用するなど、高収率な発現系も適している。
【００６１】
通常発現ベクターに含まれる要素には、大腸菌（E. coli）において機能するレプリコ
ン、組換えプラスミドを保有する細菌の選抜を可能にする抗生物質耐性をコードしている
遺伝子、およびプラスミドの非必須領域への組換え配列の挿入を可能にする固有の制限部
位もある。
【００６２】
標準的なトランスフェクション法を使用して、大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳
動物、酵母または昆虫細胞系を作製し、次いで標準的な技術を使用してそのタンパク質を
精製する（例えば、Colleyら、1989、J. Biol. Chem.、264:17619-22；Guide to Protein
Purification、Methods in Enzymology、182巻（Deutscher編、1990）を参照のこと）。
真核生物および原核生物細胞の形質転換は、標準的な技術にしたがって実施される（例え
ば、Morrison、1977、J. Bacteriol. 132:349-351；Clark-Curtiss & Curtiss、Methods 
in Enzymology 101:347-362（Wuら編、1983）を参照のこと）。
【００６３】
宿主細胞に外来のヌクレオチド配列を導入するためのどんな周知の手順も使用できる。
これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、
エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドＤＮＡ、
プラスミドベクター、ウイルスベクター、エピソーム性および組み込み型の両方、ならび
にクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来の遺伝物質を
宿主細胞に導入するための任意の他の周知の方法の使用を含む（例えば、Sambrookら、上
記を参照のこと）。使用される特定の遺伝子工学手順は、最良のタンパク質を発現可能な
宿主細胞に、少なくとも１つの遺伝子を成功裏に導入できればよい。
【００６４】
ＴＡＬＥタンパク質の特徴づけ
本発明の方法を使用して設計した改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質をさらに特徴
づけて、選択した用途にとって望ましい特徴を有することを確認できる。例えば、ＴＡＬ
Ｅリピートアレイタンパク質は、細菌２ハイブリッド、細菌プロモーター抑制、ファージ
ディスプレイもしくはリボゾームディスプレイシステムを使用してまたは電気泳動移動度
シフトアッセイもしくは「ＥＭＳＡ」を使用してアッセイすることができる（Buratowski
& Chodosh、Current Protocols in Molecular Biology 12.2.1-12.2.7ページ）。同様に
、当技術分野において公知の他の任意のＤＮＡ結合アッセイを使用して、選択したタンパ
ク質のＤＮＡ結合特性を検証することができる。
【００６５】
一実施形態において、細菌「２ハイブリッド」システムを使用して、本発明のＴＡＬＥ
リピートタンパク質を発現させ、試験する。細菌２ハイブリッドシステムには、タンパク
質発現とＤＮＡ結合「アッセイ」が同じ細胞の中で起こるというさらなる利点が有り、し
たがって、別々のＤＮＡ結合アッセイを組み立てない。
【００６６】
細菌２ハイブリッドシステムを使用してＤＮＡ結合タンパク質を発現させ、アッセイす
る方法については、Joungら、2000、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、97:7382；Wrightら、
2006、Nat. Protoc、1:1637-52；Maederら、2008、Mol. Cell、31:294-301；Maederら、2
009、Nat. Protoc.、4:1471-1501；および米国特許出願番号第２００２／０１１９４９８
号に記載されており、参照によりその内容を本明細書に組み込む。概略説明すると、細菌
２ハイブリッドシステムにおいて、ＤＮＡ結合タンパク質は、レポーター遺伝子（例えば
、ヒスチジン３（ＨＩＳ３）、ベータラクタマーゼ抗生物質耐性遺伝子、またはベータ−
ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子）の発現を制御する弱いプロモーターの上流に対象
の配列を持つ細菌株中で発現される。細胞によって発現されるＤＮＡ結合タンパク質が標
的部位配列に結合する細胞において、レポーター遺伝子の発現が起こる。したがって、レ
ポーター遺伝子に関連した活性（例えば、選択培地上での成長、ベータ−ガラクトシダー
ゼの発現）を検出することによって、標的部位に結合するＤＮＡ結合タンパク質を発現し
ている細菌細胞が同定される。
【００６７】
いくつかの実施形態において、結合親和性および特異性の算出も行われる。これは、様
々な方法で行うことができる。選択されたＴＡＬＥリピートアレイタンパク質が対象の配
列に結合する親和性を測定し、そのＫＤを単位として定量化できる。ＴＡＬＥリピートア
レイタンパク質の実際のＫＤを正確に測定する限り、任意のアッセイ系を使用することが
できる。一実施形態において、ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質がその標的に結合する
ＫＤは、ＥＭＳＡを使用して測定される。
【００６８】
一実施形態において、ＥＭＳＡを使用して、選択されたＴＡＬＥリピートアレイタンパ
ク質が対象の配列（すなわち、特異的なＫＤ）および非特異的ＤＮＡ（すなわち、非特異
的ＫＤ）の両方に結合するＫＤを決定する。当技術分野において公知の、任意の適切な非
特異的または「競合」二本鎖ＤＮＡを使用できる。いくつかの実施形態において、仔ウシ
胸腺ＤＮＡまたはヒト胎盤ＤＮＡが使用される。特異的なＫＤに対する非特異的ＫＤの比
が、特異性比である。高い特異性で結合するＴＡＬＥリピートアレイタンパク質の特異性
比は高い。選択したＴＡＬＥのグループのどれを所与の目的に使用すべきか決める際に、
この測定は非常に有用である。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＡＬＥリピートアレイタンパ
ク質を使用するには、高い親和性結合だけでなく高い特異性結合も必要である。
【００６９】
キメラＴＡＬＥタンパク質の構築
多くの場合、専用設計のＴＡＬＥリピートアレイＤＮＡ結合ドメインを作製する目的は
、ある機能を実施するのに使用可能なＴＡＬＥリピートアレイタンパク質を得ることにあ
る。ＴＡＬＥリピートアレイＤＮＡ結合ドメインを単独で使用して、例えば遺伝子上の特
異的部位に結合させて、それにより他のＤＮＡ結合ドメインの結合を遮断することができ
る。しかし、いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質は、ＴＡ
ＬＥリピートアレイＤＮＡ結合ドメインおよびいくつかの望ましい特異的機能（例えば、
遺伝子活性化）または酵素活性を有する追加的なドメイン、すなわち、「機能的ドメイン
」を含有するキメラＴＡＬＥタンパク質の構築に使用される。
【００７０】
本明細書に記載の方法を使用して設計され、作製されるキメラＴＡＬＥリピートアレイ
タンパク質を使用して任意の機能を実施することができ、例えば、特定のＤＮＡ配列に対
するいくつかの特定の酵素活性、および他の型の合成または改変ＤＮＡ結合分子に関して
既に記載されている任意の機能を標的することが望ましい。改変ＴＡＬＥリピートアレイ
ＤＮＡ結合ドメインは、疾病の治療（例えば、米国特許出願第２００２／０１６０９４０
号および米国特許第６，５１１，８０８号、第６，０１３，４５３号および第６，００７
，９８８号ならびに国際特許出願公開第ＷＯ０２／０５７３０８号を参照のこと）に、ま
たはさもなければ所与の遺伝子の構造または機能をｉｎ  ｖｉｖｏで変更するのに有用な
、キメラタンパク質の構築に使用できる。本発明の改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク
質は、研究ツールとして、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏいずれにおけ
る機能的ゲノム学研究の実施にも有用である（例えば、米国特許第６，５０３，７１７号
および米国特許出願第２００２／０１６４５７５号を参照のこと）。
【００７１】
機能的な組換えタンパク質を生成するために、通常、改変ＴＡＬＥリピートアレイＤＮ
Ａ結合ドメインは、少なくとも１つの「機能的」ドメインに融合されることになる。合成
のＴＡＬＥリピートアレイタンパク質に機能的なドメインを融合して機能的転写因子を形
成することは、当業者によって一般的に実践されている日常の分子生物学技術しか含まな
い、例えば、米国特許第６，５１１，８０８号、第６，０１３，４５３号、第６，００７
，９８８号、第６，５０３，７１７号および米国特許出願第２００２／０１６０９４０号
を参照のこと）。
【００７２】
機能的なドメインは、ＴＡＬＥタンパク質のＣ末端またはＮ末端を含めた任意の好適な
位置で改変ＴＡＬＥリピートアレイドメインと結合することができる。本発明の方法を使
用して作製される改変タンパク質に付加するのに適切な「機能的」ドメインについては、
米国特許第６，５１１，８０８号、第６，０１３，４５３号、第６，００７，９８８号お
よび第６，５０３，７１７号ならびに米国特許出願第２００２／０１６０９４０号に記載
されている。
【００７３】
一実施形態において、機能的ドメインは、核に移行されるタンパク質を規定する核局在
化ドメインである。いくつかの核局在化配列（ＮＬＳ）は公知であり、任意の適切なＮＬ
Ｓを使用できる。例えば、多くのＮＬＳは、二連塩基性（bipartite basic）リピートと
呼ばれる複数の塩基性アミノ酸を有する（Garcia-Bustosら、1991、Biochim. Biophys. A
cta、1071:83-101に概説されている）。二連塩基性リピートを含有するＮＬＳは、キメラ
タンパク質の任意の部分に配置することができ、核の内側に局在化するキメラタンパク質
を得られる。通常、本発明のキメラタンパク質の最終的な機能が、核に局在化するタンパ
ク質を必要とするように、核局在化ドメインは常に最終的なキメラタンパク質に組み込ま
れることが好ましい。しかし、改変ＴＡＬＥリピートアレイドメイン自体または最終的な
キメラタンパク質中の別の機能的ドメインが固有の核移行機能を有する場合、別の核局在
化ドメインを付加する必要がない場合がある。
【００７４】
別の実施形態において、機能的ドメインは、キメラタンパク質を使用して対象とする遺
伝子の転写を活性化できるような転写活性化ドメインである。当技術分野において公知の
任意の転写活性化ドメイン、例えば、ＶＰ１６ドメインは単純ヘルペスウイルスを形成し
（Sadowskiら、1988、Nature、335:563-564）または細胞性転写因子ＮＦ−ｋａｐｐａＢ
のｐ６５ドメイン（Rubenら、1991、Science、251:1490-93）などを使用することができ
る。
【００７５】
さらに別の実施形態において、機能的ドメインは、キメラタンパク質を使用して対象と
する遺伝子の転写を抑制できるような転写抑制ドメインである。当技術分野において公知
の任意の転写抑制ドメイン、例えば、多くの天然に存在するＫＲＡＢタンパク質中に見ら
れるＫＲＡＢ（クルッペル関連ボックス（Kruppel-associated box））ドメイン（Thiese
nら、1991、Nucleic Acids Res.、19:3996）などを使用することができる。
【００７６】
さらなる実施形態において、機能的ドメインは、メチル基転移酵素（または、メチラー
ゼ）ドメイン、脱メチル化ドメイン、デアミナーゼドメイン、ヒドロキシラーゼドメイン
、アセチル化ドメイン、または脱アセチル化ドメインなどのＤＮＡ修飾ドメインである。
そのようなドメインの多くは当技術分野において公知であり、得られるキメラタンパク質
の望ましい機能に応じて、任意のそのようなドメインを使用できる。例えば、ＤＮＡメチ
ル化ドメインを、ＴＡＬＥリピートアレイＤＮＡ結合タンパク質に融合させることができ
、このドメインを使用して、特定のＤＮＡ配列を標的にしてメチル化できることが示され
た（Xuら、1997、Nat. Genet.、17:376-378）。遺伝子のメチル化の状態は、その発現お
よび調節に影響を及ぼし、さらに、ＤＮＡメチル化の欠陥に関連付けられたいくつかの疾
病がある。
【００７７】
なお、さらなる実施形態において、機能的ドメインは、ヒストンアセチラーゼまたはヒ
ストンデアセチラーゼ（またはＨＤＡＣ）ドメインなどのクロマチン修飾ドメインである
。そのようなドメインの多くは当技術分野において公知であり、得られるキメラタンパク
質の望ましい機能に応じて、任意のそのようなドメインを使用できる。ヒストンデアセチ
ラーゼ（ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２など）は、遺伝子抑制に関与している。したがって
、改変ＴＡＬＥタンパク質を使用して対象とする特定の遺伝子にＨＤＡＣ活性を標的する
ことにより、対象とする遺伝子の発現を抑制することができる。
【００７８】
他の実施形態において、機能的ドメインは、制限エンドヌクレアーゼ（または制限酵素
）ドメインなどのヌクレアーゼドメインである。適切な改変ＴＡＬＥリピートアレイＤＮ
Ａ結合ドメインにヌクレアーゼ酵素を融合させることによって、そのＤＮＡ切断活性は、
特定の標的配列を標的にすることができる。この方法で、配列特異的キメラ制限酵素を作
製できる。いくつかのヌクレアーゼドメインが当技術分野において公知であり、任意の適
切なヌクレアーゼドメインを使用できる。例えば、Kimら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci
. USA、6:1156-60によって教示されるように、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば
、ＦｏｋＩ）のエンドヌクレアーゼドメインを使用できる。いくつかの実施形態において
、エンドヌクレアーゼは、ＵＳ２００８／０１３１９６２に記載の通り、改変ＦｏｋＩバ
リアントである。組換えＤＮＡ分子を構築する実験室手順において、または相同組換えを
促進するためのゲノムＤＮＡにおける二本鎖ＤＮＡ切断の作製においてなど、特定のＤＮ
Ａ配列の切断が要求されるどんな状況においても、そのようなキメラエンドヌクレアーゼ
を使用することができる（Kimら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、6:1156-60；Bibi
kovaら、2001、Mol. Cell. Biol.、21:289-297；Porteus & Baltimore、2003、Science、
300:763；Millerら、2011、Nat. Biotechnol.、29:143-148；Cermakら、2011、Nucl. Aci
ds Res.、39:e82）。間違いを起こしやすい非相同末端結合によるＴＡＬＥヌクレアーゼ
誘導二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復することにより、ＤＳＢ部位に挿入または欠失変異を効
率的に導入できる（Millerら、2011、Nat. Biotechnol.、29:143-148；Cermakら、2011、
Nucl. Acids Res.、39:e82）。別法として、外生的に導入した「ドナーテンプレート（do
nor template）」を用いる相同組換え修復によるＤＳＢの修復により、切断部位における
正確な塩基変更または挿入を高効率で導入できる（Bibikovaら、2003、Science、300:764
；Urnovら、2005、Nature、435:646-651；Porteusら、2003、Science、300:763；Miller
ら、2011、Nat. Biotechnol.、29:143-148）。
【００７９】
いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、キメラタンパク質を使用して、例え
ばヒトゲノムの特定の位置に外生的なＤＮＡを挿入できるようなインテグラーゼドメイン
である。
【００８０】
他の適切な機能的なドメインには、サイレンサードメイン、核ホルモン受容体、レゾル
バーゼドメイン癌遺伝子転写因子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、
ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）、キナーゼ
、ホスファターゼ、ならびにＤＮＡの構造および／または遺伝子の発現を修飾するその他
のタンパク質がある。転写調節に関与するキナーゼに由来する適切なキナーゼドメインに
ついては、Davis、1995、Mol. Reprod. Dev.、42:459-67に概説されている。適切なホス
ファターゼドメインについては、例えばSchonthal & Semin、1995、Cancer Biol. 6:239-
48に概説されている。
【００８１】
機能的ドメインへのＴＡＬＥリピートアレイの融合は、当業者に周知の標準的な組換え
ＤＮＡ技術によって実施でき、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning; A Laboratory 
Manual 第3版（2001）などの基礎的な実験教科書、ならびに米国特許第６，５１１，８０
８号、第６，０１３，４５３号、第６，００７，９８８号および第６，５０３，７１７号
ならびに米国特許出願第２００２／０１６０９４０号に記載されている。
【００８２】
いくつかの実施形態において、２個以上の改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質を連
結して、最終的なＤＮＡ結合ドメインを作製する。２個以上の改変タンパク質の連結は、
共有結合または非共有結合手段によって実施できる。共有結合の場合、改変タンパク質は
、アミノ酸リンカーを使用して共有結合できる（例えば、米国特許出願第２００２／０１
６０９４０号ならびに国際出願ＷＯ０２／０９９０８４およびＷＯ０１／５３４８０を参
照のこと）。このリンカーは、所望のアミノ酸の任意の列であることができる。一実施形
態において、リンカーは、標準的なＴＧＥＫＰリンカーである。どのようなリンカーを使
用しても、標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning; A Lab
oratory Manual 第3版（2001）に記載のものなど）を使用して、そのような連結タンパク
質を作製することができる。
【００８３】
改変タンパク質がキメラエンドヌクレアーゼの生成に使用される実施形態において、キ
メラタンパク質は二量体化ドメインを保有することができ、したがってエンドヌクレアー
ゼはダイマーとして機能すると考えられる。任意の適切な二量体化ドメインを使用できる
。一実施形態において、エンドヌクレアーゼドメイン自体が、二量体化活性を保有する。
例えば、固有の二量体化活性を有するＦｏｋＩのヌクレアーゼドメインを使用できる（Ki
mら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci.、93:1156-60）。
【００８４】
改変タンパク質による遺伝子発現調節を決定するためのアッセイ
様々なアッセイを使用して、改変ＴＡＬＥリピートタンパク質による遺伝子発現調節の
レベルを決定できる、例えば米国特許第６，４５３，２４２号を参照のこと。個々の改変
ＴＡＬＥリピートタンパク質の活性は、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏア
ッセイを使用して、例えば、免疫測定法（例えば、抗体を用いるＥＬＩＳＡおよび免疫組
織化学的アッセイ）、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ＲＮａｓｅプロテクシ
ョン、ノーザン、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドアレイ実
験）、比色アッセイ、増幅アッセイ、酵素活性アッセイ、腫瘍成長アッセイ、表現型アッ
セイ、などを使用して、例えば、タンパク質もしくはｍＲＮＡレベル、産物レベル、酵素
活性、腫瘍成長；レポーター遺伝子の転写活性化もしくは抑制；二次メッセンジャーレベ
ル（例えば、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、ＩＰ３、ＤＡＧ、Ｃａ２＋）；サイトカインおよびホ
ルモン産生レベル；ならびに血管新生を測定することにより、評価できる。
【００８５】
ＴＡＬＥタンパク質は、例えば、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞
、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞などの培養細胞を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで最初に活性を
試験することができる。いくつかの実施形態において、ヒト細胞が使用される。多くの場
合、改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質は、レポーター遺伝子を用いる一過性の発現
系を使用して最初に試験され、次いで標的内在性遺伝子の調節が細胞および動物において
、ｉｎ  ｖｉｖｏとｅｘ  ｖｉｖｏの両方で試験される。改変ＴＡＬＥリピートアレイタ
ンパク質を細胞において組換えにより発現させる、動物に移植した細胞において組換えに
より発現させる、またはトランスジェニック動物において組換えにより発現させることが
でき、および後述する送達媒体を使用してタンパク質として動物または細胞に投与するこ
ともできる。細胞は、固定化することも、溶液中に存在させることも、動物に注射するこ
とも、またはトランスジェニックもしくは非トランスジェニック動物中に天然に存在する
こともできる。
【００８６】
本明細書に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの１つを使用して、
遺伝子発現の変調が試験される。サンプルまたはアッセイを、改変ＴＡＬＥリピートアレ
イタンパク質で処理し、未処理の対照サンプルと比較して、変調の程度を調べる。内在性
遺伝子の発現を調節するためには、ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質のＫＤは、理想的
には２００ｎＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ、最も好
ましくは２５ｎＭ以下である。改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質の効果は、上述の
パラメータのいずれかを調べることによって測定できる。任意の適切な遺伝子発現、表現
型または生理的変化を使用して、改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質の影響を評価で
きる。無傷の細胞または動物を使用して機能的結果を決定する場合、腫瘍成長、血管新生
、ホルモン放出、既知のおよび特徴づけられていない両方の遺伝子マーカーに対する転写
変化（例えば、ノーザンブロットまたはオリゴヌクレオチドアレイ実験）、細胞成長また
はｐＨ変化などの細胞代謝における変化、ならびにｃＧＭＰなど細胞内二次メッセンジャ
ーの変化など様々な効果も測定できる。
【００８７】
内在性遺伝子発現を調節するための好ましいアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施でき
る。１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ形式において、ＥＬＩＳＡアッセイを使用してタン
パク質の産生を調べることにより、培養細胞において内在性遺伝子発現の改変ＴＡＬＥリ
ピートアレイタンパク質調節が測定される。試験サンプルは、空のベクターまたは別の遺
伝子を標的にしている無関係なＴＡＬＥリピートアレイタンパク質で処理した対照細胞と
比較される。
【００８８】
別の実施形態において、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現レベルを測定することにより、内在
性遺伝子発現の調節をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定する。遺伝子発現のレベルは、増幅（例え
ば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＬＣＲを使用して）、またはハイブリダイゼーションアッセイ（例え
ば、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプロテクション、ドットブロット）を
使用して測定される。一実施形態において、ＲＮａｓｅプロテクションが使用される。タ
ンパク質またはｍＲＮＡのレベルは、本明細書に記載の通り、直接的または間接的に標識
した検出薬剤（例えば、蛍光または放射性標識された核酸、放射性または酵素標識された
抗体、など）を使用して検出される。
【００８９】
別法として、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、ＣＡＴまたは
ベータ−ガラクトシダーゼなど）に動作可能に連結された標的遺伝子プロモーターを使用
して、レポーター遺伝子系を考案できる。通常、レポーター構築物は、培養細胞に共トラ
ンスフェクトされる。ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質で処理した後、レポーター遺伝
子の転写、翻訳または活性の量が、当業者に公知の標準的な技術にしたがって測定される
。
【００９０】
内在性遺伝子発現の調節をモニターするのに有用なアッセイ形式の別の例は、ｉｎ  ｖ
ｉｖｏで実施される。このアッセイは、腫瘍促進遺伝子、血管新生など腫瘍支持に関与す
る遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ）の発現を阻害する、またはｐ５３など癌抑制遺伝子を活性
化する、ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質を調べるのに特に有用である。このアッセイ
において、改変ＴＡＬＥタンパク質を発現している培養腫瘍細胞を、免疫不全マウス（無
胸腺マウス、放射線照射マウスまたはＳＣＩＤマウスなど）に皮下注射する。適切な期間
の後、好ましくは４〜８週間後に、例えば、体積によってまたは２つの最大寸法（two la
rgest dimensions）によって腫瘍成長を測定し、対照と比較する。（例えば、Ｓｔｕｄｅ
ｎｔのｔ検定を使用して）統計的に有意に縮小した腫瘍は、成長が阻害されたと考えられ
る。別法として、腫瘍血管新生の程度も測定できる。内皮細胞特異的抗体を使用する免疫
測定法を使用して、腫瘍の血管新生および腫瘍内の血管の数を染色する。（例えばＳｔｕ
ｄｅｎｔのｔ検定を使用して）統計的に有意に血管の数が減少した腫瘍は、血管新生が阻
害されたと考えられる。
【００９１】
トランスジェニックおよび非トランスジェニック動物を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで内
在性遺伝子発現の調節を調べることもできる。トランスジェニック動物は、改変ＴＡＬＥ
リピートアレイタンパク質を発現できる。別法として、改変ＴＡＬＥリピートアレイタン
パク質を一過性に発現する動物、または送達媒体の形で改変ＴＡＬＥリピートアレイタン
パク質が投与された動物を使用することができる。内在性遺伝子発現の調節は、本明細書
に記載のアッセイのうちいずれか１つを使用して試験される。
【００９２】
遺伝子治療における改変ＴＡＬＥリピート含有タンパク質の使用
同様に、遺伝子治療適用において、本発明の改変タンパク質を使用して、遺伝子発現を
調節するまたは遺伝子配列を変更することができる。類似の方法が、合成ジンクフィンガ
ータンパク質について記載されている、例えば米国特許第６，５１１，８０８号、米国特
許第６，０１３，４５３号、米国特許第６，００７，９８８号、米国特許第６，５０３，
７１７号、米国特許出願第２００２／０１６４５７５号および米国特許出願第２００２／
０１６０９４０号を参照のこと。
【００９３】
従来通りのウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子導入方法を使用して、哺乳動物細
胞または標的組織に、改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質をコードしている核酸を導
入できる。そのような方法を使用して、改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質をコード
している核酸を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に投与できる。好ましくは、改変ＴＡＬＥリピ
ートアレイタンパク質をコードしている核酸が、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで
の遺伝子治療適用のために投与される。非ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡプラスミ
ド、ネイキッド核酸、およびリポソームなどの送達媒体と複合化した核酸がある。ウイル
スベクター送達系にはＤＮＡおよびＲＮＡウイルスがあり、それらは細胞への送達後に、
エピソームゲノムまたは組み込みゲノムのいずれかを有する。遺伝子治療の手順の総説に
ついては、Anderson、1992、Science、256:808-813；Nabel & Felgner、1993、TIBTECH、
11:211-217；Mitani & Caskey、1993、TIBTECH、11:162-166；Dillon、1993、TIBTECH、1
1:167-175；Miller、1992、Nature、357:455-460；Van Brunt、1988、Biotechnology、6:
1149-54；Vigne、1995、Restorat. Neurol. Neurosci.、8:35-36；Kremer & Perricaudet
、1995、Br. Med. Bull.、51:31-44；Haddadaら、Current Topics in Microbiology and 
Immunology DoerflerおよびBohm（編）（1995）；およびYuら、1994、Gene Ther.、1:13-
26を参照のこと。
【００９４】
改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質をコードしている核酸の非ウイルス送達の方法
には、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソー
ム、免疫リポソーム、ポリカチオンもしくは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮ
ＡもしくはＲＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡもしくはＲＮＡの薬剤で強化された取込
みがある。リポフェクションについては、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、第
４，９４６，７８７号および第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクショ
ン試薬は、商業的に販売されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬ
ｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクショ
ンに適している陽イオン性および中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒのそれ、ＷＯ９１／１７
４２４、ＷＯ９１／１６０２４がある。細胞に（ｅｘ  ｖｉｖｏ投与）または標的組織に
（ｉｎ  ｖｉｖｏ投与）送達できる。
【００９５】
免疫脂質複合体など標的となるリポソームを含めた、脂質：核酸複合体の調製について
は当業者に周知である（例えば、Crystal、1995、Science、270:404-410；Blaeseら、199
5、Cancer Gene Ther.、2:291-297；Behrら、1994、Bioconjugate Chem. 5:382-389；Rem
yら、1994、Bioconjugate Chem.、5:647-654；Gaoら、Gene Ther.、2:710-722；Ahmadら
、1992、Cancer Res.、52:4817-20；米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，
３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号
、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号および第
４，９４６，７８７号を参照のこと）。
【００９６】
改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質をコードしている核酸を送達するためのＲＮＡ
またはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、体内の特定の細胞にウイルスを標的し、核に
ウイルスペイロード（viral payload）を輸送するための高度に進化した方法を利用する
。ウイルスベクターは患者に直接投与すること（ｉｎ  ｖｉｖｏ）も、またはそのベクタ
ーを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を処理し、その修飾された細胞を患者に投与するこ
と（ｅｘ  ｖｉｖｏ）もできる。ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質を送達するための従
来通りのウイルスに基づく系には、遺伝子導入用の、レトロウイルス、レンチウイルス、
アデノウイルス、アデノ随伴、センダイ、および単純ヘルペスウイルスベクターがあり得
る。現在、ウイルスベクターは、標的細胞および組織における遺伝子導入に最も効率的で
汎用性が高い方法である。宿主ゲノムへの組み込みはレトロウイルス、レンチウイルスお
よびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入法を用いて可能になり、多くの場合、挿入した導入遺
伝子の長期にわたる発現が得られる。加えて、多くの異なる細胞型および標的組織におい
て、高い形質導入効率が観察された。
【００９７】
外来のエンベロープタンパク質を組み込むことによってレトロウイルスの指向性を変更
し、標的細胞の潜在的標的集団を広げることができる。レンチウイルスベクターとは、非
分裂細胞を形質導入するまたはそれを感染させ、通常、高いウイルス力価を産生すること
ができるレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子導入系の選
択は、標的組織によって決まる。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来配
列に対するパッケージング能を有するシス作用性の長い末端リピートから構成される。最
小のシス作用性ＬＴＲはベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次いでこの
ベクターを使用して標的細胞に治療的な遺伝子を組み込み、それによって導入遺伝子の永
続的な発現を得る。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイ
ルス（Murine leukemia virus）（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（Gibbon ape 
leukemia virus）（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（Simian immunodeficiency viru
s）（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（Human immunodeficiency virus）（ＨＩＶ）お
よびその組合せに基づくものがある（例えば、Buchscherら、1992、J. Virol.、66:2731-
39；Johannら、1992、J. Virol.、66:1635-40；Sommerfeltら、1990、Virololgy、176:58
-59；Wilsonら、1989、J. Virol.、63:2374-78；Millerら、1991、J. Virol.、65:2220-2
4；ＷＯ９４／２６８７７を参照のこと）。
【００９８】
改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質の一過性の発現が好ましい適用においては、ア
デノウイルスに基づく系が使用できる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞
型において非常に高い形質導入効率の能力があり、細胞分裂を必要としない。そのような
ベクターでは、高い力価と発現レベルが得られた。このベクターは、比較的単純な系にお
いて大量に作製できる。例えば、核酸およびペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生において、
ならびにｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏでの遺伝子治療手順のために、アデノ随伴
ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも使用して、標的核酸で細胞を形質導入する（例えば、
Westら、1987、Virology 160:38-47；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４
６４１；Kotin、1994、Hum. Gene Ther.、5:793-801；Muzyczka、1994、J. Clin. Invest
.、94:1351を参照のこと）。組換えＡＡＶベクターの構築については、米国特許第５,１
７３,４１４号；Tratschinら、1985、Mol. Cell. Biol. 5:3251-60；Tratschinら、1984
、Mol. Cell. Biol.、4:2072-81；Hermonat & Muzyczka、1984、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA、81:6466-70；およびSamulskiら、1989、J. Virol.、63:3822-28を含めた多数の刊
行物に記載されている。
【００９９】
具体的には、臨床試験における遺伝子導入用として最も頻繁に使用されている系である
レトロウイルスベクターを用いて、現在のところ少なくとも６つのウイルスベクター手法
が利用可能である。これらのウイルスベクターは全て、ヘルパー細胞系に挿入された遺伝
子による欠損ベクターの補完を含む手法を利用して、形質導入作用物質を生成する。
【０１００】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験において使用されたレトロウイルスベクター
の例である（Dunbarら、1995、Blood、85:3048；Kohnら,1995、Nat. Med.、1:1017；Male
chら、1997、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、94:12133-38）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは
、遺伝子治療の臨床試験において使用された最初の治療ベクターであった（Blaeseら、19
95、Science、270:475-480）。ＭＦＧ−Ｓパッケージ化ベクターに関しては、５０％以上
の形質導入効率が観察された（Ellemら、1997、Immunol Immunother.、44:10-20；Dranof
fら、1997、Hum. Gene Ther.、1:111-112）。
【０１０１】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損非病原性のパルボウイルスア
デノ随伴２型ウイルスに基づく遺伝子送達システムの有望な代替手段である。通常、ベク
ターは、導入遺伝子発現カセットに隣接しているＡＡＶの１４５ｂｐ逆方向末端反復しか
保持しないプラスミドから得られる。形質導入細胞ゲノムに組み込むことによる、効率的
な遺伝子導入および導入遺伝子の安定した送達は、このベクター系にとって重要な特徴で
ある（Wagnerら、1998、Lancet、351:1702-1703；Kearnsら、1996、Gene Ther.、9:748-5
5）。
【０１０２】
複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生することができ、
多数の異なる細胞型を容易に感染させるので、大腸ガンの遺伝子療法に主に使用される。
大部分のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよびＥ３遺伝
子を置きかえ；その後、複製欠損ベクターは、欠失している遺伝子機能をトランスに補填
するヒト２９３細胞中で増殖するように改変される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓および
筋肉系組織などに見られる分裂しない分化した細胞を含めた複数の型の組織をｉｎ  ｖｉ
ｖｏに形質導入することができる。従来通りのＡｄベクターは、高い輸送力を有する。臨
床試験におけるＡｄベクターの使用の例には、筋肉注射を用いて抗腫瘍免疫化するための
ポリヌクレオチド療法が含まれる（Stermanら、1998、Hum. Gene Ther. 7:1083-89）。臨
床試験における遺伝子導入用アデノウイルスベクターの使用のさらなる例には、Roseneck
erら、1996、Infection、24:15-10；Stermanら、1998、Hum. Gene Ther.、9:7 1083-89；
Welshら、1995、Hum. Gene Ther.、2:205-218；Alvarezら、1997、Hum. Gene Ther. 5:59
7-613；Topfら、1998、Gene Ther.、5:507-513；Stermanら、1998、Hum. Gene Ther.、7:
1083-89がある。
【０１０３】
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染させる能力があるウイルス粒子を形成
する。そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレ
トロウイルスをパッケージングするΨ２細胞またはＰＡ３１７細胞がある。遺伝子治療に
使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子に核酸ベクターをパッケージングす
るプロデューサー細胞系によって生成される。通常、ベクターは、パッケージングおよび
その後の宿主への組み込みに必要とされる最小限のウイルス配列を含有しており、他のウ
イルス配列は、発現させようとするタンパク質のための発現カセットと置きかえられてい
る。失ったウイルス機能は、パッケージング細胞系によってトランスに補填される。例え
ば、遺伝子治療に使用されるＡＡＶベクターは、通常、パッケージングおよび宿主ゲノム
への組み込みに必要とされるＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列しか保有しない。ウイルスＤ
ＮＡは細胞系にパッケージングされ、その細胞系は他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐ
およびｃａｐをコードしているがＩＴＲ配列を欠いているヘルパープラスミドを含有する
。細胞系は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡ
Ｖベクターの複製およびヘルパープラスミド由来ＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパ
ープラスミドはＩＴＲ配列を欠くため、大量にパッケージングされない。アデノウイルス
による汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶより感受性である熱処理によって低減で
きる。
【０１０４】
多くの遺伝子治療適用において、遺伝子治療ベクターは、高い特異性を保持して特定の
組織型に送達されることが望ましい。通常、ウイルスベクターを修飾して、ウイルス外表
面にあるウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させること
により、所与の細胞型に対する特異性を持たせる。対象の細胞型に存在する既知の受容体
に対して親和性を有するように、リガンドは選ばれる。例えば、モロニーマウス白血病ウ
イルス（Moloney murine leukemia virus）を修飾して、ｇｐ７０と融合したヒトヘレグ
リンを発現させることができ、組換えウイルスが、ヒト上皮細胞増殖因子受容体を発現し
ている特定のヒト乳癌細胞に感染することを、Hanら、1995、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A、92:9747-51は報告した。この原理は、リガンド融合タンパク質を発現しているウイル
スと受容体を発現している標的細胞といった他の対にも拡張できる。例えば、線状ファー
ジを改変して、実質的に任意の選ばれた細胞受容体に対して特異的結合親和性を有する抗
体断片（例えば、ＦａｂまたはＦｖ）を提示することができる。前記説明は、主にウイル
スベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することもできる。特
定の標的細胞による取り込みに有利に働くと考えられる特定の取り込み配列を含むように
、そのようなベクターを改変することができる。
【０１０５】
後述するように、遺伝子治療ベクターは、通常、全身性投与（例えば、静脈内、腹膜内
、筋肉内、皮下もしくは頭蓋内点滴）または局所適用によって個々の患者に投与すること
により、ｉｎ  ｖｉｖｏで送達できる。別法として、個々の患者から外植された細胞（例
えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または幹細胞（例えば、万能ドナー造血幹細胞
、胚性幹細胞（ＥＳ）、部分的に分化した幹細胞、非多能性幹細胞、多能性幹細胞、人工
多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）（例えば、Sipioneら、Diabetologia、47:499-508、2004を
参照のこと））などの細胞に、ベクターをｅｘ  ｖｉｖｏで送達することができ、その後
、通常、ベクターを組み込んだ細胞を選抜した後に、患者にその細胞を再移植する。
【０１０６】
診断、研究または遺伝子治療のためのｅｘ  ｖｉｖｏ細胞トランスフェクション（例え
ば、宿主生物にトランスフェクトした細胞を再注入することによる）は、当業者に周知で
ある。好ましい実施形態において、細胞は、対象生物から単離され、改変ＴＡＬＥリピー
トアレイタンパク質をコードしている核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）でトランスフェクト
され、対象生物（例えば、患者）に再注入して戻される。ｅｘ  ｖｉｖｏトランスフェク
ションに適している様々な細胞型は、当業者に周知である（例えば、Freshneyら、Cultur
e of Animal Cells、A Manual of Basic Technique（第5版 2005）および患者から細胞を
単離し培養する方法の考察についてその中で引用している参考文献を参照のこと）。
【０１０７】
一実施形態において、幹細胞（例えば万能ドナー造血幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ）、部
分的に分化した幹細胞、非多能性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞
）（例えば、Sipioneら、Diabetologia、47:499-508、2004）を参照のこと）が、細胞の
トランスフェクションおよび遺伝子治療の、ｅｘ  ｖｉｖｏ手順に使用される。幹細胞を
使用する利点は、それらをｉｎ  ｖｉｔｒｏで他の細胞型に分化させられること、または
骨髄移植する哺乳動物（細胞のドナーなど）に導入できることである。ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ
ＦＮガンマおよびＴＮＦ−アルファなどのサイトカインを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで
ＣＤ３４＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞型へと分化させる方法は、公知である（Inaba
ら、1992、J. Exp. Med.、176:1693-1702を参照のこと）。
【０１０８】
幹細胞は、既知の方法を使用して、形質導入および分化のために単離できる。例えば、
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）
、ならびに１ａｄ（分化抗原提示細胞）など不要な細胞に結合する抗体を用いて骨髄細胞
をパニングすることによって、骨髄細胞から幹細胞を単離することができる（Inabaら、1
992、J. Exp. Med.、176:1693-1702を参照のこと）。
【０１０９】
生物に改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質をコードしている核酸を含有するベクタ
ー（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム、など）を直接投与して、ｉ
ｎ  ｖｉｖｏで細胞に形質導入することもできる。別法として、ネイキッドＤＮＡを投与
することができる。投与は、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるために通常
使用している経路のうちいずれかによる。そのような核酸を投与するのに適した方法が利
用可能であり、当業者に周知である、また、２つ以上の経路を使用して特定の組成物を投
与できるが、特定の経路は多くの場合別の経路よりも迅速であり、より有効な反応をもた
らすことができる。別法として、改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質の安定な処方を
投与することもできる。
【０１１０】
医薬として許容される担体は、投与される特定の組成物によって、およびその組成物を
投与するのに使用される特定の方法によって、ある程度決定される。したがって、後述す
るように、幅広い種類の適切な処方の医薬組成物が利用可能である（例えば、Remington
：The Science and Practice of Pharmacy、第21版、2005を参照のこと）。
【０１１１】
送達媒体
本発明の改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質などのポリペプチド化合物を投与する
のに重要な因子は、ポリペプチドが、細胞の原形質膜または核などの細胞内区画の膜を横
断できるということを確認することである。細胞膜は脂質−タンパク質二重層から構成さ
れ、小さい、非イオン性親油性化合物を自由に透過させるが、極性化合物、高分子および
治療的または診断用薬剤を本質的に透過しない。しかし、改変ＴＡＬＥリピートアレイタ
ンパク質などのポリペプチドを、細胞膜を通って移行させる能力を有する、タンパク質お
よびリポソームなど他の化合物が記載されている。
【０１１２】
例えば、「膜移行ポリペプチド」のアミノ酸の部分配列は、膜移行担体として機能する
能力を持つ両親媒性または疎水性である。一実施形態において、ホメオドメインタンパク
質は、細胞膜を通って移行する能力を有する。ホメオドメインタンパク質（アンテナペデ
ィア）の最も短い内在化可能なペプチドは、アミノ酸４３〜５８位からなるタンパク質の
第３へリックスであることが判明した（例えば、Prochiantz、1996、Curr. Opin. Neurob
iol.、6:629-634を参照のこと）。別の部分配列、シグナルペプチドのｈ（疎水性）ドメ
インが、類似の細胞膜移行特性を有することが判明した（例えば、Linら、1995、J. Biol
. Chem.、270:14255-58を参照のこと）。
【０１１３】
タンパク質の細胞への取り込みを促進するのに、タンパク質に連結可能なペプチド配列
の例には、それだけには限らないが：ＨＩＶのｔａｔタンパク質のペプチド断片（Endoh
ら、2010、Methods Mol. Biol.、623:271-281；Schmidtら、2010、FEBS Lett.、584:1806
-13；Futaki、2006、Biopolymers、84:241-249）；ｐ１６タンパク質のアミノ酸８４〜１
０３位に対応する２０残基のペプチド配列（Fahraeusら、1996、Curr. Biol.、6:84を参
照のこと）；アンテナペディアの６０アミノ酸長のホメオドメインの第３へリックス（De
rossiら、1994、J. Biol. Chem.、269:10444）；カポジ線維芽細胞成長因子（Ｋ−ＦＧＦ
）ｈ領域などのシグナルペプチドのｈ領域（上記Linら）；または、ＨＳＶ由来ＶＰ２２
移行ドメイン（Elliot & O'Hare、1997、Cell、88:223-233）がある。また、例えば、Car
onら、2001、Mol Ther.、3:310-318；Langel、Cell-Penetrating Peptides: Processes a
nd Applications（CRC Press、Boca Raton FL 2002）；El-Andaloussiら、2005、Curr. P
harm. Des.、11:3597-3611；およびDeshayesら、2005、Cell. Mol. Life Sci.、62:1839-
49を参照のこと。細胞の取り込みを向上させる他の適切な化学的部分を、本明細書に記載
のＴＡＬＥリピートアレイタンパク質に化学的に連結することもできる。
【０１１４】
毒素分子も、細胞膜を通ってポリペプチドを輸送する能力を有する。多くの場合、その
ような分子は、少なくとも２つの要素（「二成分毒素」と呼ばれる）：移行もしくは結合
ドメインまたはポリペプチド、および別の毒素ドメインまたはポリペプチドから構成され
る。通常、移行ドメインまたはポリペプチドは細胞受容体に結合し、次いで、毒素が細胞
内に輸送される。細胞質ゾルにペプチドを送達する試みにおいて、ウェルシュ菌（Clostr
idium perfringens）イオタ毒素、ジフテリア毒素（ＤＴ）、シュードモナス外毒素Ａ（
ＰＥ）、百日咳毒素（ＰＴ）、炭疽菌（Bacillus anthracis）毒素および百日咳アデニル
酸シクラーゼ（ＣＹＡ）を含めたいくつかの細菌毒素が、内部またはアミノ末端との融合
物として使用された（Aroraら、1993、J. Biol. Chem.、268:3334-41；Perelleら、1993
、Infect. Immun.、61:5147-56；Stenmarkら、1991、J. Cell Biol.、113:1025-32；Donn
ellyら、1993、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:3530-34；Carbonettiら、1995、Abstr.
Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 95:295；Seboら、1995、Infect. Immun.、63:3851-5
7；Klimpelら、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:10277-81；およびNovakら、1992
、J. Biol. Chem.、267:17186-93）。
【０１１５】
そのような部分配列を使用して、改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質を、細胞膜を
通って移行させることができる。改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質は、そのような
配列に都合よく融合することができまたはそれを用いて誘導体化することができる。通常
、移行配列は、融合タンパク質の一部として提供される。任意選択で、リンカーを使用し
て、改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質と移行配列とを連結できる。任意の適切なリ
ンカー、例えば、ペプチドリンカーを使用できる。
【０１１６】
改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質を、リポソーム、および免疫リポソームなどの
リポソーム誘導体を介して動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞に導入することもできる。
「リポソーム」という用語は、水相を封入している１つまたは複数の同心円状に秩序立っ
た脂質二重層から構成される小胞のことを指す。通常、水相は、細胞に送達される化合物
（すなわち、改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質）を含有する。
【０１１７】
リポソームは原形質膜と融合し、それによって、細胞質ゾル中に化合物を放出する。別
法として、リポソームは、細胞によって輸送小胞に貪食されるまたは取り込まれる。一旦
エンドソームまたはファゴソームに入ると、リポソームは、分解されるかまたは輸送小胞
の膜と融合し、その内容物を放出する。
【０１１８】
現行のリポソームによる薬物送達方法において、リポソームは最終的に透過性になり、
封入されている化合物（例えば、改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質または同じもの
をコードしている核酸）を標的組織または細胞で放出する。全身的または組織特異的送達
のためには、例えば、体内の様々な作用物質の作用によってリポソーム二重層が経時的に
分解する受動的な方法でこれは達成され得る。別法として、活性化合物の放出は、薬剤を
使用してリポソーム小胞の透過性変化を誘導することを含む。環境がリポソーム膜の近く
で酸性になるときにそれらが不安定化するように、リポソーム膜を構築することができる
（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、84:7851（1987）；Biochemistry、28:908（198
9）を参照のこと）。標的細胞によってリポソームが飲食運動されるとき、例えば、その
リポソームは不安定化され、内容物を放出する。この不安定化は、フソジェネシス（fuso
genesis）と称される。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は、
多くの「膜融合」系の主成分である。
【０１１９】
通常、そのようなリポソームは、改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質および脂質成
分（例えば、中性および／またはカチオン性脂質）を含み、場合によっては、予め定めら
れた細胞表面受容体またはリガンド（例えば、抗原）に結合する抗体などの受容体認識分
子を含む。例えば、Szokaら、1980、Annu. Rev. Biophys. Bioeng.、9:467、米国特許第
４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６
１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８
５号、第４，８３７，０２８号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第
４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３
７，０２８号、第４，９４６，７８７号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７４２４、Deamer
& Bangham、1976、Biochim. Biophys. Acta、443:629-634；Fraleyら、1979、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA、76:3348-52；Hopeら、1985、Biochim. Biophys. Acta、812:55-65；
Mayerら、1986、Biochim. Biophys. Acta、858:161-168；Williamsら、1988、Proc. Natl
. Acad. Sci. USA、85:242-246；Liposomes（Ostro（編、1983（第1章））；Hopeら、198
6、Chem. Phys. Lip.、40:89；Gregoriadis、Liposome Technology (1984)およびLasic、
Liposomes: from Physics to Applications（1993））に記載のとおり、様々な方法がリ
ポソームの調製に利用可能である。適当な方法には、例えば、超音波処理、押出加工、高
圧／均質化、微小流動化、界面活性剤透析、小さいリポソーム小胞のカルシウム誘導性融
合およびエーテル−融合方法があり、その全てが当技術分野で周知である。
【０１２０】
特定の実施形態において、特定の細胞型、組織などに特異的な標的化部分を使用して、
リポソームを標的することが望ましい。様々な標的化部分（例えば、リガンド、受容体お
よびモノクローナル抗体）を使用するリポソームの標的化については、以前に記載されて
いる（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号および第４，６０３，０４４号を参照の
こと）。
【０１２１】
標的化部分の例には、新生物（前立腺癌特異的抗原およびＭＡＧＥなど）と関連する抗
原に特異的なモノクローナル抗体がある。癌遺伝子（ｒａｓまたはｃ−ｅｒｂＢ２など）
の活性化または過剰発現の結果生じる遺伝子産物を検出することによって、腫瘍を診断す
ることもできる。加えて、多くの腫瘍は、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）および癌
胚抗原（ＣＥＡ）など、通常は胎児の組織によって発現される抗原を発現する。Ｂ型肝炎
コアおよび表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタインバーウイルス抗
原、ヒト免疫不全１型ウイルス（Human immunodeficiency type-1 virus）（ＨＩＶ１）
ならびに乳頭腫ウイルス抗原などの様々なウイルス抗原を使用して、ウイルス感染の部位
を診断できる。例えばインテグリン（例えば、ＶＣＡＭ−１）、セレクチン受容体（例え
ば、ＥＬＡＭ−１）など、炎症部位で発現する表面分子によって特異的に認識される分子
を使用して、炎症を検出することができる。
【０１２２】
リポソームに標的化薬剤を結合させるための標準的な方法を使用できる。一般に、これ
らの方法は、リポソーム脂質成分（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）への組み
込みを含み、その脂質成分を、標的化薬剤を付着させるために活性化する、または脂質誘
導体化ブレオマイシンなどの親油性化合物を誘導体化できる。例えば、プロテインＡを組
み込んだリポソームを使用して、抗体を標的したリポソームを構築できる（Renneisenら
、1990、J. Biol. Chem.、265:16337-42およびLeonettiら、1990、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA、87:2448-51を参照のこと）。
【０１２３】
用量
治療適用の場合、ジンクフィンガータンパク質について記載されたのと類似の方法で、
患者に投与すべき改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質の用量が算出される、例えば米
国特許第６，５１１，８０８号、米国特許第６，４９２，１１７号、米国特許第６，４５
３，２４２号、米国特許出願第２００２／０１６４５７５号および米国特許出願第２００
２／０１６０９４０号を参照のこと。本開示において、用量は、患者において経時的に有
益な治療応答をもたらすのに十分であるべきである。加えて、特定の用量計画は、実験設
定における（例えば、機能的ゲノム学研究、および細胞または動物モデルにおける）表現
型変化を決定するのに有用な場合がある。用量は、利用される特定の改変ＴＡＬＥリピー
トアレイタンパク質の有効性、特異性およびＫＤ、標的細胞の核容積および患者の状態、
ならびに治療される患者の体重または表面積によって決定されることになる。特定の患者
への特定の化合物またはベクターの投与に付随する任意の有害副作用の存在、性質および
程度によっても、用量サイズは決定されることになる。
【０１２４】
医薬組成物および投与
本発明の改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質を投与するのに適切な医薬組成物は、
ジンクフィンガータンパク質について記載されたように決定できる、例えば米国特許第６
，５１１，８０８号、米国特許第６，４９２，１１７号、米国特許第６，４５３，２４２
号、米国特許出願第２００２／０１６４５７５号および米国特許出願第２００２／０１６
０９４０号を参照のこと。遺伝子発現の変調のためおよび治療または予防適用（例えば、
癌、虚血、糖尿病性網膜症、黄斑変性、慢性関節リウマチ、乾癬、ＨＩＶ感染、鎌状赤血
球性貧血、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、神経変性疾患、血管系疾患、嚢胞性線
維症、脳卒中など）のために、改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質、および改変ＴＡ
ＬＥリピートアレイタンパク質をコードしている発現ベクターを患者に直接投与すること
ができる。ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質に媒介される遺伝子治療によって阻害でき
る微生物の例には、病原性細菌、例えば、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリ
ア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌およびコノコッキ（conococci）、クレ
ブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネ
ラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス菌中毒、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症および
ライム病細菌；感染性真菌、例えば、アスペルギルス属、カンジダ属；胞子虫（例えば、
マラリア原虫）、根足虫（例えば、エントアメーバ属）および鞭毛虫（トリパノソーマ属
、リーシュマニア属、トリコモナス属、ジアルジア属など）などの原生動物；ウイルス性
疾患、例えば、肝炎（Ａ、ＢまたはＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−
１、ＨＳＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶおよびＥＢＶ）、ＨＩＶ、エボラ、アデノウイル
ス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コク
サッキーウイルス、コモウイルス、ＲＳウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ロータウイ
ルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、牛痘ウイルス、ＨＴＬＶウイルス
、デング熱ウイルス、乳頭腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルスおよびアルボウ
イルス脳炎ウイルスなどがある。
【０１２５】
治療上有効な量の投与は、ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質を治療しようとする組織
と最終的に接触させるために通常使用している経路のうちいずれかによる。ＴＡＬＥリピ
ートアレイタンパク質は、任意の適切な方法で、好ましくは、医薬として許容される担体
と共に投与される。そのような変調物質を投与するのに適した方法が利用可能であり、当
業者に周知である、また、２つ以上の経路を使用して特定の組成物を投与できるが、特定
の経路は多くの場合別の経路よりも迅速であり、より有効な反応をもたらすことができる
。
【０１２６】
医薬として許容される担体は、投与される特定の組成物によって、およびその組成物を
投与するのに使用される特定の方法によって、ある程度決定される。したがって、後述す
るように、幅広い種類の適切な処方の医薬組成物が利用可能である（例えば、Remington:
The Science and Practice of Pharmacy、第21版、2005を参照のこと）。
【０１２７】
改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質は、単独でまたは他の適切な成分と組合せて、
吸入によって投与される噴霧処方にできる（すなわち、「霧状」にできる）。エアロゾル
処方は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など加圧された許容し得る噴霧剤に
入れることができる。
【０１２８】
例えば、静脈内、筋肉内、皮内および皮下経路などによる非経口投与用として好適な処
方には、水性および非水性の等張無菌注射溶液（酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、および処
方を対象とするレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる）、ならび
に水性および非水性の無菌懸濁液（懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および防腐剤を
含むことができる）がある。開示されている組成物は、例えば、静脈内注入、経口的、局
所的、腹膜内、膀胱内でまたはクモ膜下腔内によって投与できる。化合物の処方は、アン
プルおよびバイアルなど、単位用量または複数用量の密封容器中に存在できる。注入用液
および懸濁液を、前述の種類の無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製できる。
【０１２９】
ＴＡＬＥヌクレアーゼの使用
例えば、２つの部位で切断しその間の配列を欠失させることによって、単一部位での切
断とそれに続く非相同な末端の結合によって、および／またはある部位で切断して１もし
くは２または数ヌクレオチドを取り除くまたは置きかえることによって、本明細書に記載
の方法を使用して改変されたＴＡＬＥヌクレアーゼを使用してゲノム配列に変異を誘導で
きる。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥヌクレアーゼを使用して、動物、植物、菌
類または細菌ゲノムに変異を誘導する。標的した切断を使用して、（例えば、機能的ゲノ
ム学または標的検証のために）遺伝子ノックアウトを形成することも、（例えば、細胞工
学またはタンパク質過剰発現のために）標的化したゲノムへの配列挿入（すなわち、遺伝
子ノックイン）を促進することもできる。挿入は、相同組換えによる染色体配列の置きか
えによって、または標的した組み込みによって可能であり、染色体中の対象領域と相同な
配列に隣接している新規な配列（すなわち、対象領域に存在しない配列）を使用して、相
同組換えにより予め定められた目的部位に新規な配列を挿入する。外生的なＤＮＡも、隣
接する相同性配列を必要とせずにＴＡＬＥヌクレアーゼ誘導二本鎖切断部に挿入できる（
Orlandoら、2010、Nucl. Acids Res.、1-15、doi:10.1093/nar/gkq512参照のこと）。
【０１３０】
下記の実施例３において実証されているように、本明細書に記載の方法によって作製さ
れるＴＡＬＥヌクレアーゼは、哺乳動物細胞において部位特異的突然変異生成を誘導する
ことができた。本明細書に記載の方法によって作製されるＴＡＬＥヌクレアーゼが、他の
細胞型および生物においても機能して、効率的な部位特異的突然変異生成を誘導し得るこ
とは、熟練した専門家には容易に認識されよう（例えば、Cadeら、2012、Nucleic Acids 
Res.、PMID: 22684503およびMooreら、2012、PLoS One、PMID: 22655075を参照のこと）
。
【０１３１】
同じ方法を使用して、野生型配列を変異体配列と置きかえる、または１つの対立遺伝子
を異なる対立遺伝子に変換することもできる。
【０１３２】
感染しているまたは組み込まれたウイルスゲノムを標的にした切断は、宿主におけるウ
イルス感染症の治療に使用することができる。加えて、ウイルス受容体をコードしている
遺伝子の標的した切断を使用して、そのような受容体の発現を遮断し、それによって、宿
主生物におけるウイルスの感染および／またはウイルス拡散を予防することができる。ウ
イルス受容体（例えば、ＨＩＶに対するＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４受容体）をコードして
いる遺伝子を標的にした突然変異生成を使用して、受容体をウイルスと結合できなくし、
それによって、新たな感染を予防し、既存の感染の拡散を遮断することができる。標的に
できるウイルスまたはウイルス受容体の非限定的な例には、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２
などの単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイ
ンバーウイルス（ＥＢＶ）ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＨＶ６およびＨ
ＨＶ７がある。ウイルスの肝炎科には、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス
（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Δ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイル
ス（ＨＥＶ）および肝炎Ｇウイルス（ＨＧＶ）がある。標的され得る他のウイルスまたは
それらの受容体には、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルスなど）；カリチウイ
ルス科；トガウイルス（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；フラビウイル
ス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラボドウイルス科（例え
ば、狂犬病ウイルスなど）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、流行性
耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルスなど）；オルソミクソウイルス科（例え
ば、インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型およびＣ型など）；ブニヤウイルス科；アレナウ
イルス科；レトロビラ科；レンチウイルス（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；Ｈ
ＩＶ−１（別名ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなど）ＨＩＶ−ＩＩ）；サ
ル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザウイル
スおよびダニ媒介性脳炎ウイルスがあるが、それだけには限らない。これらのおよび他の
ウイルスの説明については、例えば、Virology, 3rd Edition (W. K. Joklik編、1988)；
Fundamental Virology, 4th Edition（KnipeおよびHowley編、2001）を参照のこと。ＨＩ
Ｖに対する受容体には、例えば、ＣＣＲ−５およびＣＸＣＲ−４がある。
【０１３３】
類似の様式で、標的したＤＮＡの切断とそれに続く非相同な末端の結合によって、感染
している細菌のゲノムに突然変異を起こして、細菌の感染を遮断するまたは改善すること
ができる。
【０１３４】
開示されている、標的した組換えについての方法を使用して、任意のゲノム配列を相同
だが同一でない配列と置きかえることができる。例えば、変異体ゲノム配列をその野生型
の対応配列と置きかえることができ、それによって、例えば、遺伝的疾患、遺伝病、癌お
よび自己免疫疾患の治療方法を提供できる。同様の様式において、本明細書に開示されて
いる、標的した組換え方法を使用して、ある遺伝子の１つの対立遺伝子を、異なる対立遺
伝子と置きかえることができる。
【０１３５】
典型的な遺伝的疾患には、それだけには限らないが、軟骨形成不全、色盲、酸性マルタ
ーゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ番号１０２７００）、副腎白質ジ
ストロフィー、アイカルディ症候群、アルファ−１抗トリプシン欠乏症、アルファ−サラ
セミア、アンドロゲン不応症候群、アペール症候群、不整脈源性右室、異形成、毛細血管
拡張性運動失調症、バース症候群、ベータサラセミア、青色ゴムまり様母斑症候群、カナ
バン病、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、ネコ猫鳴き症候群、嚢胞性線維症、有痛脂肪症、外胚
葉性形成異常、ファンコニ貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱エックス症候群、ガラ
クトース血症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）、血色素沈
着症、ベータ−グロビンの第６コドンにおけるヘモグロビンＣ変異（ＨｂＣ）、血友病、
ハンチントン舞踏病、フルラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター症候群
、クラッベ病、ランガー−ギーディオン症候群、白血球接着不全症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ番
号１１６９２０）、白質萎縮症、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、
ムコ多糖症（ＭＰＳ）、爪膝蓋骨症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ニーマンピック病
、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダーウィリ症候群、早老症、プロテウス症候群、
網膜芽腫、レット症候群、ルビンシュタインテイビ症候群、サンフィリポ症候群、重症複
合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シュバッハマン症候群、鎌状赤血球疾病（鎌状赤血球性貧
血）、スミスマグニス症候群、スティックラー症候群、テイサックス病、血小板減少性橈
骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トレチャーコリンズ症候群、トリソミー、結節硬化症、ターナ
ー症候群、尿素サイクル異常症、フォンヒッペルリンドウ病、ワーデンブルグ症候群、ウ
ィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット−アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖リンパ球
増殖性症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ番号３０８２４０）がある。
【０１３６】
標的されたＤＮＡ切断および／または相同組換えによって治療できるさらなる典型的な
疾病には、後天性免疫不全症、リソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病、ＧＭ１、ファブ
リー病およびテイサックス病）、ムコ多糖症（例えば、ハンター病、ハーラー病）、異常
血色素症（例えば、鎌状赤血球症、ＨｂＣ、アルファ−サラセミア、ベータ−サラセミア
）および血友病がある。
【０１３７】
特定の場合には、多能性細胞（例えば、造血幹細胞）におけるゲノム配列の変更が望ま
れる。造血幹細胞の可動化、濃縮および培養の方法は、当技術分野において公知である。
例えば、米国特許第５，０６１，６２０号；第５，６８１，５５９号；第６，３３５，１
９５号；第６，６４５，４８９号および第６，６６７，０６４号を参照のこと。ＳＣＩＤ
および鎌状赤血球貧血症を含むがこれに限らない様々な疾患を治療するために、治療した
幹細胞を患者に戻すことができる。
【０１３８】
多くの場合、対象の領域は変異を含み、ドナーポリヌクレオチドは対応する野生型配列
を含む。同様に、望む場合には、野生型ゲノム配列を変異体配列によって置きかえること
ができる。例えば、遺伝子を変異させるか、または制御配列をより低く非病的な発現レベ
ルを支持する配列と置きかえるかいずれかによって、癌遺伝子の過剰発現を反転させるこ
とができる。別の例として、ＡｐｏＡＩ遺伝子の野生型対立遺伝子をＡｐｏＡＩ  Ｍｉｌ
ａｎｏ対立遺伝子によって置きかえて、アテローム性動脈硬化症を治療することができる
。実際、特定のゲノム配列に依存するどんな病理も、本明細書に開示されている方法およ
び組成物を使用して、任意の様式で修正または軽減することができる。
【０１３９】
標的した切断および標的した組換えを使用して、非コード配列（例えば、マイクロＲＮ
Ａおよび長鎖非コードＲＮＡをコードしている配列、ならびにプロモーター、エンハンサ
ー、イニシエーター、ターミネーター、スプライス部位などの調節配列）を変更し、それ
によって遺伝子産物の発現のレベルを変更することもできる。そのような方法は、例えば
、治療目的、機能的ゲノム学および／または標的検証研究用として使用できる。
【０１４０】
本明細書に記載の組成物および方法は、同種異系移植に対する宿主の免疫反応を解決す
るための新規な手法および系も可能にする。特に、同種異系幹細胞（または、任意の型の
同種異系細胞）が宿主レシピエントに移植されるときに直面する主要な問題は、主に移植
した細胞の表面にある主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の認識によって媒介される宿主免疫
系による拒絶反応の高い危険性である。ＭＨＣは、共通のベータサブユニットおよび可変
のアルファサブユニットから構成されるヘテロ二量体として機能するＨＬＡクラスＩタン
パク質（複数可）を含む。ＨＬＡがない幹細胞から得られる組織移植片は、宿主の免疫応
答を逃れることが実証された。例えば、Coffmanら、1993、J. Immunol.、151:425-35；Ma
rkmannら、1992、Transplantation、54:1085-89；Kollerら、1990、Science、248:1227-3
0を参照のこと。本明細書に記載の組成物および方法を使用して、組織不適合性に関与す
るＨＬＡタンパク質をコードしている遺伝子を、そのコード配列もしくは調節配列のいず
れかにおいて、組換えによって切断、突然変異または変更することができ、それによって
その遺伝子の発現を遮断するまたは機能しない産物を発現させる。例えば、本明細書に記
載の通りＴＡＬＥヌクレアーゼ融合タンパク質を使用して共通のベータサブユニット遺伝
子（ベータ２ミクログロブリン）をコードしている遺伝子を不活性化することにより、Ｈ
ＬＡクラスＩを細胞から取り除いて、任意のドナーからＨＬＡクラスＩヌル幹細胞を迅速
かつ確実に生成することができ、それによって、幹細胞移植中にドナー／レシピエントＭ
ＨＣハプロタイプを厳密に適合させる必要性が低下する。
【０１４１】
任意の遺伝子（例えば、ベータ２ミクログロブリン遺伝子）の不活化は、例えば、単一
の切断事象によって、切断とそれに続く非相同な末端の結合によって、２つの部位での切
断とそれに続く結合により２つの切断部位の間の配列を欠失させることによって、ミスセ
ンスまたはナンセンスコドンの組換えをコード領域に標的することによって、または無関
係な配列（すなわち、「スタッファー」配列（"stuffer" sequence））の組換えを遺伝子
もしくはその調節領域に標的して、その遺伝子もしくはその調節領域を破壊することによ
って、達成できる。
【０１４２】
ＷＯ０１／８３７９３にて開示されているように、標的したクロマチン構造の修飾を使
用して、細胞のクロマチンへの融合タンパク質の結合を促進できる。
【０１４３】
さらなる実施形態において、ＴＡＬＥ結合ドメインとリコンビナーゼ（または、その機
能的な断片）との１つまたは複数の融合物を使用して、本明細書に開示されているＴＡＬ
Ｅ−切断ドメイン融合物に加えてまたはそれの代わりに、標的した組換えを促進できる。
例えば、共有されている米国特許第６,５３４,２６１号およびAkopianら (2003) Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 100:8688-8691を参照のこと。
【０１４４】
さらなる実施形態において、開示されている方法および組成物を使用して、活性に二量
体化（ホモ二量体化またはヘテロ二量体化のいずれか）を必要とする転写活性化または抑
制ドメインを含むＴＡＬＥリピートＤＮＡ結合ドメインの融合物を提供する。これらの場
合、融合ポリペプチドは、ＴＡＬＥリピートＤＮＡ結合ドメインと機能的ドメインモノマ
ー（例えば、二量体転写活性化または抑制ドメインからのモノマー）を含む。適切な状態
にある標的部位にそのような２つの融合ポリペプチドが結合することによって二量体化が
可能になり、それによって機能的な転写活性化または抑制ドメインが再構成される。
【０１４５】
植物における遺伝子発現の調節
改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質を使用して、例えば耐病性の増大、構造的多糖
、貯蔵多糖、風味、タンパク質ならびに脂肪酸の修飾、果実の成熟、収量、色、栄養学的
特徴、保存能力の改善などの形質について植物を加工できる。特に、油の産生の強化（例
えば、脂肪種子において産生される脂肪酸の修飾）に対する作物種の加工は対象のもので
ある。
【０１４６】
種子油は主にトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）で構成され、それは脂肪酸のグリセリ
ンエステルである。これらの植物油の商業生産は、主に、６種の主要な油料植物（大豆、
アブラヤシ、菜種、ヒマワリ、綿実およびピーナッツ）で占められている。植物油は大部
分（９０％）が、マーガリン、ショートニング、サラダ油および揚げ油としてヒト食用に
使用されている。残りの１０％は、潤滑剤、油脂化学品、生物燃料、界面活性剤および他
の産業用途などの非食品用途に使用されている。
【０１４７】
これら用途のそれぞれにおいて使用される油の望ましい特徴は、特に、鎖長およびＴＡ
Ｇを構成する脂肪酸中に存在する二重結合の数の点で大きく異なる。これらの特性は、膜
流動性および温度感受性を制御するために、植物によって操作されている。ＴＡＬＥリピ
ートアレイタンパク質を使用して同じ特性を制御し、それによって食用および工業用とし
て改善された特徴を持つ油を産生することができる。
【０１４８】
脂肪種子作物のＴＡＧ中にある主要な脂肪酸は、長さが１６〜１８個の炭素であり、０
〜３個の二重結合を含有する。パルミチン酸（１６：０［１６個の炭素：０個の二重結合
］）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）およびリノレン酸（１８：３）
が主要である。二重結合の数または飽和度は、得られる油の溶融温度、反応性、料理の仕
上がりおよび健康性状を決定する。
【０１４９】
オレイン酸（１８：１）からリノール酸（１８：２）への転換（その後１８：３の形成
の前駆体になる）に関与する酵素は、デルタ−１２−オレイン酸デサチュラーゼ（オメガ
−６デサチュラーゼとも呼ばれる）である。脂肪酸不飽和化経路におけるこのステップを
遮断することにより、ポリ不飽和脂肪酸の代わりにオレイン酸が蓄積するはずである。
【０１５０】
一実施形態において、改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質を使用して、大豆のＦＡ
Ｄ２−１遺伝子の発現を調節する。ミクロソームのデルタ−６デサチュラーゼをコードし
ている２つの遺伝子が、最近、大豆からクローニングされ、ＦＡＤ２−１およびＦＡＤ２
−２と呼ばれる（Heppardら、1996、Plant Physiol. 110:311-319）。ＦＡＤ２−１（デ
ルタ−１２デサチュラーゼ）は、大豆種子におけるオレイン酸不飽和化の大部分を制御し
ていると思われる。したがって、改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質を使用して、植
物におけるＦＡＤ２−１の遺伝子発現を変調することができる。具体的には、改変ＴＡＬ
Ｅリピートアレイタンパク質を使用して、大豆のＦＡＤ２−１遺伝子の発現を阻害し、そ
れによって油種子におけるオレイン酸（１８：１）の蓄積を増強することができる。さら
に、改変ＴＡＬＥタンパク質を使用して、デルタ−９デサチュラーゼ、他の植物由来のデ
ルタ−１２デサチュラーゼ、デルタ−１５デサチュラーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラ
ーゼ、アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、ス
ターチ合成酵素、セルロース合成酵素、スクロース合成酵素、老化関連遺伝子、重金属キ
レート剤、脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ＥＰＳＰ合成酵
素、植物ウイルス遺伝子、植物真菌病原体遺伝子および植物細菌病原体遺伝子など、その
他の植物遺伝子の発現を変調できる。
【０１５１】
また、植物細胞の形質転換に適切な組換えＤＮＡベクターを使用して、植物細胞にタン
パク質（例えば、改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質）をコードしている核酸を送達
する。様々な高等植物種を形質転換する技術は周知であり、技術的な科学文献に記載され
ている（例えば、Weisingら、1988、Ann. Rev. Genet.、22:421-477を参照のこと）。所
望のＴＡＬＥリピートアレイタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、形質転換植物の意図
する組織においてＴＡＬＥタンパク質の転写を指令する転写および翻訳開始調節配列と結
合される。
【０１５２】
例えば、再生した植物の全組織における改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質の発現
を指令する植物プロモーター断片を利用できる。そのようなプロモーターは、本明細書に
おいて「構成的」プロモーターと称され、発生または細胞分化の最も環境的な条件および
状態下で活性がある。構成的プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス（Ｃ
ａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium 
tumefaciens）のＴ−ＤＮＡから得られる１’−または２’−プロモーターおよび当業者
に公知の様々な植物遺伝子由来の他の転写開始領域がある。
【０１５３】
別法として、植物プロモーターは、特定の組織における改変ＴＡＬＥリピートアレイタ
ンパク質の発現を指令することができ、さもなければ、より的確な環境もしくは発生制御
下で指令できる。ここではそのようなプロモーターは、「誘導性」プロモーターを指す。
誘導性プロモーターによる転写に影響を及ぼし得る環境条件の例には、嫌気性条件または
光の存在がある。
【０１５４】
発生制御下のプロモーターの例には、特定の組織（果実、種子または花など）において
のみ転写を開始するプロモーターがある。例えば、ポリガラクツロナーゼプロモーターの
使用は、果実におけるＴＡＬＥリピートアレイタンパク質の発現を指令することができ、
ＣＨＳ−Ａ（ペチュニア由来カルコン合成酵素Ａ）プロモーターは、植物の花におけるＴ
ＡＬＥリピートアレイタンパク質の発現を指令することができる。
【０１５５】
ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質配列を含むベクターは、通常、植物細胞に選択可能
な表現型を付与するマーカー遺伝子を含むことになる。例えば、マーカーは、殺生物剤耐
性、特に、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシンに対する耐性な
どの抗生物質耐性、またはクロルスルフロンまたはバスタに対する耐性などの除草剤耐性
をコードできる。
【０１５６】
そのようなＤＮＡ構築物は、様々な従来技術によって所望の植物宿主ゲノムに導入でき
る。例えば、ＤＮＡ構築物は、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよび
マイクロインジェクションなどの技術を使用して植物細胞のゲノムＤＮＡに直接導入でき
、またはＤＮＡ構築物は、微粒子銃法（ＤＮＡ粒子衝突など）を使用して植物組織に直接
導入できる。別法として、ＤＮＡ構築物を適切なＴ−ＤＮＡ隣接領域と結合し、従来通り
のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主ベクター
に導入することもできる。細胞が細菌に感染したとき、アグロバクテリウム・ツメファシ
エンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主の毒性機能が、植物細胞ＤＮＡへの構築物お
よび隣接するマーカーの挿入を指令することになる。
【０１５７】
マイクロインジェクション技術は、当技術分野において公知であり、科学文献および特
許文献によく記載されている。ポリエチレングリコール沈殿を使用するＤＮＡ構築物の導
入については、Paszkowskiら、1984、EMBO J.、3:2717-22に記載されている。エレクトロ
ポレーション技術については、Frommら 1985、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82:5824に
記載されている。微粒子銃形質転換技術については、Kleinら、1987、Nature、327:70-73
に記載されている。
【０１５８】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）媒介形質転換
技術については、科学文献によく記載されている（例えば、Horschら、1984、Science、2
33:496-498；およびFraleyら、1983、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、80:4803を参照のこ
と）。
【０１５９】
上記の形質転換技術のいずれかにより得られた形質転換植物細胞を培養して、形質転換
した遺伝子型、したがって所望のＴＡＬＥリピートアレイタンパク質に制御される表現型
を保有する完全体植物を再生できる。そのような再生技術には、組織培養増殖培地におけ
る特定の植物ホルモンの操作を利用し、通常、ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質ヌクレ
オチド配列と一緒に導入した殺生物剤および／または除草剤マーカーを利用する。培養さ
れたプロトプラストからの植物再生についてはEvansら、Protoplasts Isolation and Cul
ture、Handbook of Plant Cell Culture、124-176（1983）；およびBinding、Regenerati
on of Plants、Plant Protoplasts、21-73（1985）に記載されている。再生は、植物カル
ス、外植片、器官またはそれらの一部分から得ることもできる。そのような再生技術につ
いては、Kleeら、1987、Ann. Rev. Plant Phys.、38:467-486に一般に記載されている。
【０１６０】
機能的ゲノム学アッセイ
改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質には、表現型の結果および遺伝子発現の機能を
決定するためのアッセイ用途もある。集中的な大量配列決定の取り組みと一体化した最近
の分析技術の進歩により、これまで利用可能であった分子標的よりはるかに多くの標的を
同定し、特徴づける機会が形成された。遺伝子およびその機能に関するこの新たな情報は
、基本的な生物学的理解を向上させ、治療的介入用として多くの新規標的を提示すること
になる。いくつかの場合において、分析ツールが新たなデータの生成に対応できていない
。一例は、包括的な差次的遺伝子発現の測定における最近の進歩によって提供される。遺
伝子発現マイクロアレイ、差次的ｃＤＮＡクローニング頻度、サブトラクティブハイブリ
ダイゼーションおよびディファレンシャルディスプレイ法に代表されるこれらの方法は、
異なる組織においてまたは特定の刺激に応答して上方もしくは下方制御される遺伝子を非
常に迅速に同定することができる。そのような方法は、例えば、形質転換、腫瘍進行、炎
症反応、神経障害などの生物学的プロセスを調査するためにますます使用されている。差
次的に発現している遺伝子の多くは、所与の生理現象と相関するが、差次的に発現してい
る個々の遺伝子と現象との間の原因となる関係を実証することは、労働集約的である。今
日まで、差次的に発現している遺伝子に対して機能を決定する簡易な方法は、差動的な遺
伝子発現を観察する能力に対応できていない。
【０１６１】
本明細書に記載の改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質を使用して、差次的に発現し
ている遺伝子の機能を迅速に分析することができる。改変ＴＡＬＥタンパク質を使用して
、容易に任意の内在性標的遺伝子を上方もしくは下方制御するまたはノックアウトする、
あるいは内在性もしくは内在性遺伝子をノックインすることができる。遺伝子特異的ＤＮ
Ａ結合ドメインを形成するには、非常に少量の配列情報しか必要としない。これにより、
改変ＴＡＬＥリピートアレイ技術は、十分に特徴づけられていない差次的に発現する遺伝
子の長いリストの分析にとって理想的になる。モデル系において、簡単に、候補遺伝子ご
とにＴＡＬＥリピートアレイタンパク質に基づくＤＮＡ結合ドメインを築くこと、上方ま
たは下方制御するキメラ人工転写因子を形成すること、および候補遺伝子のスイッチを一
つずつ入り切りすることによって検討中の表現型（例えば、形質転換またはサイトカイン
に対する応答）に対する上方または下方制御の結果を試験することができる。
【０１６２】
加えて、より多量の実験的制御が、従来の方法によって実現されるよりも改変ＴＡＬＥ
リピートアレイタンパク質によって得られる。改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質の
産生および／または機能を、小分子制御下に置くことができるからである。この手法の例
は、Ｔｅｔ−Ｏｎ系、エクジソン調節系および変異体プロゲステロン受容体を含むキメラ
因子を組み込んでいる系によって提供される。これらの系は全て、改変ＴＡＬＥリピート
アレイタンパク質の機能および／または発現を小分子制御下に置くことによって、対象と
する任意の内在性遺伝子もしくは任意の導入遺伝子の小分子制御を間接的に可能にする。
【０１６３】
トランスジェニック動物
改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質のさらなる用途は、動物モデルにおいて遺伝子
発現を操作することである。細胞系と同様に、トランスジェニックマウスまたはゼブラフ
ィッシュなどのトランスジェニック動物への異種遺伝子の導入またはそれらにおける内在
性遺伝子のノックアウトは、かなり直接的な方法である。したがって、動物における改変
ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質のトランスジェニックなまたは一過性の発現は、容易
に実施できる。
【０１６４】
活性化ドメインに融合されている、適切な改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質をト
ランスジェニックにまたは一過性に発現させることによって、対象とする標的遺伝子を過
剰発現させることができる。同様に、リプレッサーまたはサイレンサードメインに融合さ
れている、適切な改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質をトランスジェニックにまたは
一過性に発現させることによって、対象とする標的遺伝子の発現を下方制御できる、また
はさらにスイッチを切って「機能的ノックアウト」を形成することができる。対象とする
標的遺伝子の挿入または欠失によるノックインまたはノックアウト変異は、ＴＡＬＥヌク
レアーゼを使用して調製することができる。
【０１６５】
２つの共通した課題が、多くの場合、標準的なトランスジェニックおよびノックアウト
技術の良好な適用を防げる；胚性致死性および発生の補償である。遺伝子が発生において
重要な役割を果たすときに、胚性致死性は起こる。発生の補償とは、ノックアウトされて
いる遺伝子産物を関連する遺伝子産物で代用することであり、その遺伝子の機能の除去が
別の生理的変化を引き起こす場合、ノックアウトマウスにおいて表現型の欠如が頻繁に生
じる。
【０１６６】
トランスジェニック改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質の発現は、例えば、前の部
分で説明したように、小分子調節系を使用して一時的に制御できる。したがって、発生に
おける所望の段階で改変ＴＡＬＥリピートアレイタンパク質の発現スイッチを入れること
によって、成体（または、発生の遅い段階）において遺伝子を過剰発現させるまたは「機
能的にノックアウトする」ことができ、このようにして、胚性致死性および発生の補償の
問題を避けることができる。
[実施例]
【実施例１】
【０１６７】
ストレプトアビジンコーティングした磁気ビーズを使用するＴＡＬＥリピートアレイの組
立て
１、２、３または４個のＴＡＬＥリピートドメインをコードしているＤＮＡプラスミド
のアーカイブ（約８５０個の異なるプラスミド）を形成して、任意の望ましい長さの複数
のＴＡＬＥアレイをコードする核酸を組み立てた。１、２、３または４個のＴＡＬＥリピ
ートドメインを含む合成アレイをｐＵＣ５７−ΔＢｓａＩ主鎖にクローニングすることに
よって、プラスミドを形成した（図３）。ＴＡＬＥリピートは、α、βγδε、βγδ、
βγ’、βγ、δε’およびβの配置のものであり、表１に示したヌクレオチドに結合す
るための超可変トリプレット残基を各位置に含んだ。ＴＡＬＥリピート型のポリペプチド
およびヌクレオチド配列は、それぞれ図４Ａおよび図４Ｂに示される。長い正確なリピー
ト配列による組換え媒介変異の可能性を減らすために、ポリペプチドおよびポリヌクレオ
チド配列を４つの型の中で少し変化させた。
【０１６８】
【表１】
2019122392.tif 000002
【０１６９】
標的配列ＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣ（配列番号４１）に結合するように設計さ
れた１６個のＴＡＬＥリピートをｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み立てることによって、ｅＧＦＰ
遺伝子に標的した１６マーのＴＡＬＥリピートアレイを形成した。最初のステップにおい
て、ＮＮＮトリプレット（Ｇ）を含むα−型ＴＡＬＥリピートを保有するプラスミドを、
ビオチン化フォワードプライマー  ビオチン−ＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＡＣＣ
ＴＧＡＣＣ（配列番号４２）とリバースプライマーＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＴＣＴＴＡＡＧ
ＧＣＣＧＴＧＧ（配列番号４３）とを使用するＰＣＲによって増幅した。ＱＩＡ  Ｑｕｉ
ｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して増幅した断片（５０μｌ）を精製し
、０．１×溶出緩衝液（ＱＩＡ  Ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットに提供される）４０μｌ
に溶出し、ＮＥＢ  Ｂｕｆｆｅｒ４中でＢｓａＩ  ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉ
ｏｌａｂｓ（ＮＥＢ））を用いて、５０℃で１５分間消化した（溶出液４０μｌ、ＮＥＢ
ｕｆｆｅｒ４  ５μｌ、ＢｓａＩ  ＨＦ  ５μｌ）。ＱＩＡ  Ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キ
ットを使用して消化した断片を精製し、０．１×溶出緩衝液（５０μｌ）に溶出した。
【０１７０】
各々が以下の可変アミノ酸ＳＨＤ、ＳＮＩ、ＮＮＮおよびＳＮＧ（配列５’−ＣＡＧＴ
−３’に結合するように設計されている）のうちの１つを保有するリピートをコードする
４個のＴＡＬＥリピートドメインサブアレイユニット（βγδε）を含有するプラスミド
を、１００μｌ（［約２００ｎｇ／μｌ］プラスミド５０μｌ、ＮＥＢｕｆｆｅｒ２  １
０μｌ、ＢｂｓＩ  １０μｌ、水３０μｌ）中で、ＮＥＢｕｆｆｅｒ２中でＢｂｓＩ（Ｎ
ＥＢ）を用いて、３７℃で２時間消化した。消化物１００μｌにＮＥＢｕｆｆｅｒ４  ２
５μｌ、１００×ＢＳＡ（ＮＥＢ）２．５μｌ、水１０７．５μｌおよびＸｂａＩ（ＮＥ
Ｂ）５μｌを添加し、その消化物を３７℃で５分間インキュベートした。次いで、その混
合物にＢａｍＨＩ  ＨＦ  ５μｌを添加し、３７℃で５分間消化し、その後、ＳａｌＩ  
ＨＦ（ＮＥＢ）５μｌを添加し、さらに３７℃で５分間消化した。ＱＩＡ  Ｑｕｉｃｋ  
ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、得られた断片を精製し、０．１×溶出緩
衝液１８０μｌに溶出した。
【０１７１】
最初のライゲーションのために、アルファユニット消化物２μｌを、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ（４００Ｕ／μｌ；ＮＥＢ）２．５μｌおよびＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅ
ｒ（ＱＬＢ）（ＮＥＢ）２７μｌと混合した。この混合物３１．５μｌに、最初に消化し
たサブアレイ２２．５μｌを添加し、混合物を、室温で１５分間ライゲーションした。１
×Ｂ＆Ｗ緩衝液（５．０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１
．０Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０）５０μｌを用いてＤｙｎａｂｅａｄ
ｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５μｌを３
回洗浄し、Ｂ＆Ｗ緩衝液５４μｌに再懸濁することにより、磁気ビーズを調製した。ライ
ゲーションした混合物を、洗浄したビーズに添加し、（５分間毎に混合しながら）室温で
１５分間インキュベートした。次いで、混合物を、ＳＰＲＩｐｌａｔｅ９６ウェルＲｉｎ
ｇ  ｍａｇｎｅｔ上に３分間静置した。次いで、上清を吸引し、１×Ｂ＆Ｗ緩衝液１００
μｌを添加して、ＤｙｎａＭａｇ−９６  Ｓｉｄｅ  ｍａｇｎｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）を使用して、チューブ内でビーズを左右に３１回動かすことによって混合しながら洗
浄した。次いで、Ｂ＆Ｗ緩衝液を吸引し、１×ＢＳＡ  １００μｌを混合しながら添加し
、次いで吸引した。ライゲーションされ、ビーズに結合している核酸（αβγδε）を、
ＢｓａＩ  ＨＦ混合物５０μｌ（ＮＥＢｕｆｆｅｒ４  ５μｌ、ＢｓａＩ  ＨＦ  ２μｌ
、水４３μｌ）に再懸濁した。
【０１７２】
消化物を５０℃で１０分間インキュベートし、１×Ｂ＆Ｗ緩衝液５０μｌを添加した。
消化物を磁石上に３分間静置し、上清を吸引した。上述の通り、１×Ｂ＆Ｗ緩衝液１００
μｌおよび１×ＢＳＡ  １００μｌでビーズを洗浄した。洗浄したビーズに、各々が以下
の可変アミノ酸ＮＮＮ、ＳＨＤ、ＳＮＧおよびＳＮＧ（ＤＮＡ配列５’−ＧＣＴＴ−３’
に結合するように設計されている）のうちの１つを保有するリピートをコードする４個の
ＴＡＬＥリピートドメインサブアレイユニット（βγδε）を含有する消化したプラスミ
ド（２２．５μｌ）およびリガーゼ混合物（Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  
２５μｌ、ＤＮＡリガーゼ２μｌ）２７．５μｌを添加した。上下にピペットしてビーズ
を再懸濁し、混合物を、５分間毎に混合しながら室温で１５分間インキュベートした。ラ
イゲーション液に、１×Ｂ＆Ｗ緩衝液５０μｌを添加し、混合物を磁石上に３分間静置し
た。上述の通り、上清を吸引し、１×Ｂ＆Ｗ緩衝液１００μｌおよび１×ＢＳＡ  １００
μｌでビーズを洗浄した。ライゲーションされ、ビーズに結合している核酸（αβγδε
βγδε）を、ＢｓａＩ  ＨＦ混合物５０μｌ（ＮＥＢｕｆｆｅｒ４  ５μｌ、ＢｓａＩ
ＨＦ  ２μｌ、水４３μｌ）に再懸濁した。上述の通り、さらに２つのＴＡＬＥリピー
トサブアレイユニットを順次ライゲーションした、１つ目は、各々が以下の可変アミノ酸
ＳＨＤ、ＳＮＩ、ＮＮＮおよびＳＨＤ（ＤＮＡ配列５’−ＣＡＧＣ−３’に結合するよう
に設計されている）のうちの１つを保有するリピートをコードする４個のＴＡＬＥリピー
トサブアレイユニット（βγδε）を、２つ目は、各々が以下の可変アミノ酸ＳＨＤ、Ｎ
ＮＮおよびＳＨＤ（ＤＮＡ配列５’−ＣＧＣ−３’に結合するように設計されている）の
うちの１つを保有するリピートをコードする３個のＴＡＬＥリピートサブアレイユニット
（βγδ）である。最終的なＴＡＬＥリピートアレイは、標的ＤＮＡ配列５’−ＧＣＡＧ
ＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣ−３’（配列番号４４）に結合するように設計されている個々
のＴＡＬＥリピートを含むαβγδεβγδεβγδεβγδ形式のサブユニットを含有
した。
【０１７３】
最終的なライゲーションステップの後に、構築物をＢｓａＩ  ＨＦで消化して、最後に
発現ベクターにクローニングし、１×Ｂ＆Ｗ緩衝液および１×ＢＳＡでビーズを洗浄した
。洗浄したビーズを、ＢｂｓＩ混合物（ＮＥＢｕｆｆｅｒ２  ５μｌ、ＢｂｓＩ  ５μｌ
、水４０μｌ）５０μｌに再懸濁し、１５００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で２時間イン
キュベートして、ビオチン化５’末端を切断し、組み立てられたＴＡＬＥリピートアレイ
を磁気ビーズから遊離させた。消化した混合物を、ＭｉｎＥｌｕｔｅカラム精製（ＱＩＡ
ＧＥＮ）によって精製し、ＢｓｍＢＩで消化したＴＡＬＥ発現ベクターにライゲーション
した。ライゲーションした混合物を、化学的にコンピテントなＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞に形
質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ１００プレート上で終夜プレート培養した。
【０１７４】
発現ベクターは、以下の要素：Ｔ７プロモーター、核局在化シグナル、ＦＬＡＧタグ、
ＴＡＬＥ１３タンパク質由来のアミノ酸１５３〜２８８（Millerら、2011、Nat. Biotech
nol.、29:143-148によって定義された番号付け）、ＴＡＬＥリピートアレイをコードして
いるＤＮＡ断片をクローニングできる２つの隣接するＢｓｍＢＩ制限部位、０．５ＴＡＬ
Ｅリピート、ＴＡＬＥ１３タンパク質のＣ末端由来のアミノ酸７１５〜７７７（Millerら
、2011、Nat. Biotechnol.、29:143-148によって定義された番号付け）および野生型Ｆｏ
ｋＩ切断ドメインを各々保有する。
【０１７５】
プラスミドは、Ｃ末端０．５ＴＡＬＥリピートの同一性の点で異なる。プラスミドｐＪ
ＤＳ７０は、（Ａヌクレオチドを認識するための）ＳＮＩ  ＲＶＤを含む０．５ＴＡＬＥ
リピートをコードし、プラスミドｐＪＤＳ７１は、（Ｃヌクレオチドを認識するための）
ＳＨＤ  ＲＶＤを含む０．５ＴＡＬＥリピートをコードし、プラスミドｐＪＤＳ７４は、
（Ｇヌクレオチドを認識するための）ＮＮＮ  ＲＶＤを含む０．５ＴＡＬＥリピートをコ
ードし、プラスミドｐＪＤＳ７６は、（Ｇヌクレオチドを認識するための）ＳＮＫ  ＲＶ
Ｄを含む０．５ＴＡＬＥリピートをコードし、およびプラスミドｐＪＤＳ７８は、（Ｔヌ
クレオチドを認識するための）ＮＧ  ＲＶＤを含む０．５ＴＡＬＥリピートをコードする
。全てのプラスミドは、図５Ａ〜５Ｂに示される共通配列を共有し、ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ
（下線を引き太字）として印をつけた９個のヌクレオチド位置でだけ異なっている。これ
らの９ｂｐの配列とプラスミド名も以下の表２に示される。
【０１７６】
【表２】
2019122392.tif 000003
【０１７７】
この実施例は、予め組み立てられたＴＡＬＥリピートサブアレイユニットを使用する、
固定化された基質上でのＴＡＬＥリピートアレイの構築を実証している。上記の方法は、
クローニングステップまでを、１日で実施できる。
【実施例２】
【０１７８】
ストレプトアビジンコーティングプレートを使用するＴＡＬＥリピートアレイの組立て
実施例１で説明した通り、ＴＡＬＥリピートは、ＤＮＡプラスミド（約８５０個の異な
るプラスミド）のアーカイブを使用して組み立てられる。標的配列に結合するように設計
された１６個のＴＡＬＥリピートをｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み立てることによって、１６マ
ーＴＡＬＥリピートアレイを形成した。最初のステップにおいて、ＮＮＮトリプレット（
Ｇ）を含むα−型ＴＡＬＥリピートを保有するプラスミドを、ビオチン化フォワードプラ
イマー  ビオチン−ＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣ（配列番号４２
）とリバースプライマーＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＴＣＴＴＡＡＧＧＣＣＧＴＧＧ（配列番号
４３）とを使用するＰＣＲによって増幅した。ＱＩＡ  Ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（
ＱＩＡＧＥＮ）を使用して増幅した断片（５０μｌ）を精製し、０．１×溶出緩衝液（Ｑ
ＩＡ  Ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットに提供される）４０μｌに溶出し、ＮＥＢ  Ｂｕｆ
ｆｅｒ４中でＢｓａＩ  ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ））を
用いて、５０℃で１５分間消化した（溶出液４０μｌ、ＮＥＢｕｆｆｅｒ４  ５μｌ、Ｂ
ｓａＩ  ＨＦ  ５μｌ）。ＱＩＡ  Ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用して消化した断
片を精製し、０．１×溶出緩衝液（５０μｌ）に溶出した。
【０１７９】
各々が以下の可変アミノ酸ＳＨＤ、ＳＮＩ、ＮＮＮおよびＳＮＧ（配列５’−ＣＡＧＴ
−３’に結合するように設計されている）のうちの１つを保有するリピートをコードする
４個のＴＡＬＥリピートドメインサブアレイユニット（βγδε）を含有するプラスミド
を、１００μｌ（［約２００ｎｇ／μｌ］プラスミド５０μｌ、ＮＥＢｕｆｆｅｒ２  １
０μｌ、ＢｂｓＩ  １０μｌ、水３０μｌ）中で、ＮＥＢｕｆｆｅｒ２中でＢｂｓＩ（Ｎ
ＥＢ）を用いて、３７℃で２時間消化した。消化物１００μｌにＮＥＢｕｆｆｅｒ４  ２
５μｌ、１００×ＢＳＡ（ＮＥＢ）２．５μｌ、水１０７．５μｌおよびＸｂａＩ（ＮＥ
Ｂ）５μｌを添加し、その消化物を３７℃で５分間インキュベートした。次いで、その混
合物にＢａｍＨＩ  ＨＦ  ５μｌを添加し、３７℃で５分間消化し、その後、ＳａｌＩ  
ＨＦ（ＮＥＢ）５μｌを添加し、さらに３７℃で５分間消化した。ＱＩＡ  Ｑｕｉｃｋ  
ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、得られた断片を精製し、０．１×溶出緩
衝液１８０μｌに溶出した。
【０１８０】
最初のライゲーションのために、アルファユニット消化物２μｌを、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ（４００Ｕ／μｌ；ＮＥＢ）２．５μｌおよびＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅ
ｒ（ＱＬＢ）（ＮＥＢ）２７μｌと混合した。この混合物３１．５μｌに、最初の消化し
たサブアレイ２２．５μｌを添加し、混合物を、室温で１５分間ライゲーションした。次
いで、ライゲーション混合物を、２×Ｂ＆＠緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、
ストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ）のウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートした。上清を、吸引した
。上下に１０回ピペットすることによって、１×ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００ｕ
ｌで９６ウェルプレートの各ウェルを洗浄した後に、１×ＢＳＡを廃棄した。１×ＢＳＡ
でこれを合計２回繰り返して洗浄した。次いで、ＢｓａＩ  ＨＦ混合物（ＮＥＢｕｆｆｅ
ｒ４  ５μｌ、ＢｓａＩ  ＨＦ  ２μｌ、水４３μｌ）５０μｌを、ストレプトアビジン
コーティングしたウェルに結合しているライゲーションした核酸（αβγδε）に添加し
た。
【０１８１】
消化物を５０℃で１０分間インキュベートし、次いで、上清を吸引した。次いで、上下
に１０回ピペットすることによって、１×Ｂ＆Ｗ緩衝液２００μｌおよび１×ＢＳＡ  ２
００μｌでウェルを２回洗浄した後に、各上清を除去した。各々が以下の可変アミノ酸Ｎ
ＮＮ、ＳＨＤ、ＳＮＧおよびＳＮＩのうちの１つを保有するリピートをコードする４個の
ＴＡＬＥリピートドメインサブアレイユニット（βγδε）をコードしている消化したプ
ラスミド２２．５μｌおよびリガーゼ混合物（Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ
２５μｌ、ＤＮＡリガーゼ２μｌ）２７．５μｌをウェルに添加した。上清を、上下に
ピペットすることによって混合し、混合物を室温で１５分間インキュベートした。上述の
通り、上清を取り除き、１×Ｂ＆Ｗおよび１×ＢＳＡでウェルを洗浄した。次いで、Ｂｓ
ａＩ  ＨＦ混合物（ＮＥＢｕｆｆｅｒ４  ５μｌ、ＢｓａＩ  ＨＦ  ２μｌ、水４３μｌ
）５０μｌをウェルに結合しているライゲーションした核酸（αβγδεβγδε）に添
加した。上述の通り、さらに２つのＴＡＬＥリピートサブアレイユニットを順次ライゲー
ションした。１つ目は、各々が以下の可変アミノ酸ＳＨＤ、ＳＮＩ、ＮＮＮおよびＳＮＧ
のうちの１つを保有するリピートをコードする４個のＴＡＬＥリピートサブアレイユニッ
ト（βγδε）を、２つ目は、各々が以下の可変アミノ酸ＳＨＤ、ＳＮＩ、ＮＮＮおよび
ＳＨＤのうちの１つを保有するリピートをコードする３個のＴＡＬＥリピートサブアレイ
ユニット（βγδ）である。最終的なＴＡＬＥリピートアレイは、標的ＤＮＡ配列に結合
するように設計されている個々のＴＡＬＥリピートを含むαβγδεβγδεβγδεβ
γδ形式のサブユニットを含有した。
【０１８２】
最終的なライゲーションステップの後に、ウェル中の断片をＢｓａＩ  ＨＦで消化して
、最後に発現ベクターにクローニングした。次いで、ウェルを１×Ｂ＆Ｗ緩衝液で洗浄し
、１×ＢＳＡで２回洗浄した。次いで、ＢｂｓＩ混合物（ＮＥＢｕｆｆｅｒ２  ５μｌ、
ＢｂｓＩ  ５μｌ、水４０μｌ）５０μｌをウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベ
ートして、ビオチン化５’末端を切断し、それによって、組み立てられたＴＡＬＥリピー
トアレイをウェルから遊離させた。実施例１で説明するように、消化した混合物を精製し
、ライゲーションし、形質転換した。
【実施例３】
【０１８３】
ＴＡＬＥヌクレアーゼを使用する部位特異的突然変異生成
本明細書に記載の方法によって形成されるＴＡＬＥリピートドメインの有効性を実証す
るために、（実施例１で説明した通り）ＴＡＬＥリピートアレイを構築し、ＴＡＬＥヌク
レアーゼ発現ベクターにクローニングして、図６および表３に示されるｅＧＦＰコード配
列に標的にされたＴＡＬＥヌクレアーゼモノマーをコードしているプラスミドを産生した
。ＴＡＬＥヌクレアーゼモノマーの核酸およびポリペプチド配列は、図１１Ａ〜１８Ｂに
示される。
【０１８４】
【表３】
2019122392.tif 000004
【０１８５】
Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）非ウイルス性トランスフェクション（Ｌｏｎｚａ、
Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用し、プログラムＤＮ−１００を用いて、４Ｅ５
Ｕ２ＯＳ−ｅＧＦＰ細胞に、溶液ＳＥ中のプラスミドＤＮＡ４００ｎｇをヌクレオフェ
クトした。２日目および５日目に、細胞をフローサイトメトリーによって分析した（図７
）。ＴＡＬＥヌクレアーゼ誘導二本鎖切断の、非相同な末端の結合（ＮＨＥＪ）に媒介さ
れる突然変異性修復により、ｅＧＦＰ発現が破壊された（ｅＧＦＰ陰性細胞）。試験した
８個全てのＴＡＬＥヌクレアーゼ対は、高いパーセンテージでｅＧＦＰ陰性（ｅＧＦＰ−
）細胞を誘導した（ｙ軸）。ｅＧＦＰ−細胞のパーセンテージが２日目と５日目の間に少
ししか減少していないことから、変更が安定して誘導されたことが示唆される。
【０１８６】
変異したｅＧＦＰ遺伝子のサブセットを細胞から増幅し、配列決定した。得られた変異
が図８に示される。ヒトＵＳＯＳ−ｅＧＦＰ細胞中の発現プラスミドＳＱＴ７０／ＳＱＴ
５６にコードされる、ＴＡＬＥヌクレアーゼによって標的にされる配列に、図８の一番上
の段に示される野生型（ＷＴ）配列中で下線を引いている。ＴＡＬＥヌクレアーゼ対によ
って誘導される挿入および欠失変異が、欠失した塩基を破線で表し、挿入された塩基を二
重下線で表して、以下に示される。挿入または欠失した塩基の正味の数が、右に示される
。括弧で特に明記しない限り、全ての変異は一回単離された。全体の突然変異生成頻度（
４６％）も表される。
【実施例４】
【０１８７】
ＴＡＬＥリピートアレイの自動組立て
実施例１に記載の組立て方法が自動化されて、Ｓｃｉｃｌｏｎｅ（商標）Ｇ３液体処理
ワークステーション（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏ
ｎ、ＭＡ）を９６ウェルプレートで使用して実施された。ライゲーションおよびビーズに
連結する前の核酸の消化ならびに組み立てられたＴＡＬＥリピートアレイを磁気ビーズか
ら遊離させた後のステップを除いて、全てのステップが自動化された。再懸濁および混合
動作の回数を僅かに変形して手作業で行う場合、自動化されたステップを基本的に実施し
た。２つの１７マーの組立ての結果が、図９に示される。予想されるサイズ（１７マーに
相当する）の主要な産物が見られる。不完全にライゲーションした産物の持ち越しによっ
て産生したと思われる、少量の余分な１３マー、９マーおよび５マー産物も見られる。類
似の結果が図１０に見られ、Ｎ末端１マーサブアレイからの１６マー（１）、３つの４マ
ーサブアレイ（４Ａ、４Ｂ、４Ｃ）、およびＣ末端３マーサブアレイ（３Ｄ）の組立ての
結果を示している。
【０１８８】
本明細書に記載の方法を自動化して、ＴＡＬＥリピートアレイをコードしている核酸を
迅速かつ再現性よく合成できることが、この実施例から実証される。
【実施例５】
【０１８９】
組立て方法
アミノ酸およびＤＮＡ配列が少し異なる４つの別個のＴＡＬＥリピート主鎖が反復様式
で存在する構造を使用して、ＴＡＬＥリピートアレイを形成した。アレイ中の最初のアミ
ノ末端ＴＡＬＥリピートを、αユニットと指定した。これの後に、β、γおよびδユニッ
トが続き、次いで５’末端のＩＩＳ型制限部位（クローニングに必要な、αユニット上の
固有の突出を作成可能にするために必要である）の位置が異なることを除いてαユニット
と基本的に同一であるεユニットが続いた。次いで、εユニットの後に、さらにまたβ、
γ、δおよびεユニットのリピートが続いた。クローニングに必要な３’末端の作成に関
連する制約により、少し修飾したＤＮＡ配列が、カルボキシ末端γまたはεユニットで終
わるＴＡＬＥリピートアレイに必要とされた。これらのバリアントユニットを、γ＊およ
びε＊と指定した。
【０１９０】
ＴＡＬＥリピートユニット（すなわち−α、β、γ、δ、ε、γ＊、およびε＊）の各
型に対して、４つのプラスミド系列を商業的に合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、各々が、
４種類のＤＮＡ塩基のうち１種類を指定する５つのリピート可変二残基（ＲＶＤ）（ＮＩ
＝Ａ；ＨＤ＝Ｃ；ＮＮ＝Ｇ；ＮＧ＝Ｔ、ＮＫ＝Ｇ）のうちの１つを保有した。これらのプ
ラスミドの完全長ＤＮＡ配列が、表４および図３に提供される。これらのプラスミドの３
５個全てについて、ＴＡＬＥリピートドメインをコードしている配列は、５’末端におい
て固有のＸｂａＩおよびＢｂｓＩ制限部位と、ならびに３’末端において固有のＢｓａＩ
およびＢａｍＨＩ制限部位と隣接している。加えて、互いに隣接するように設計されたユ
ニット（例えば−βとγ、またはδとε）をコードしている任意のプラスミドのＢｓａＩ
およびＢｂｓＩ消化によって生成される突出は、相補的である。これらの３５個の異なる
プラスミドならびにＢｓａＩおよびＢｂｓＩ制限部位を介する連続ライゲーションを使用
して、βγ、βγδε、βγδ、βγ＊およびδε＊リピートの全ての可能な組合せのア
ーカイブを組み立てた。合計で、このアーカイブは、５個のα、５個のβ、２５個のβγ
組合せ、６２５個のβγδε組合せ、１２５個のβγδ組合せ、２５個のβγ＊組合せお
よび２５個のδε＊組合せをコードしている８２５個の異なるプラスミドからなった（表
５）。これら８２５個のプラスミドおよび単一のＴＡＬＥリピートをコードしている当初
３５個のプラスミドのうちの１０個（５個のαおよび５個のβプラスミド）が、本方法の
実践に必要とされる。表５に掲げた８３５個のプラスミドのこのアーカイブを用いて、本
方法を使用して任意の望ましい長さおよび組成のＴＡＬＥリピートアレイを構築すること
ができる。
【０１９１】
【表４】
2019122392.tif 000005
2019122392.tif 000006
2019122392.tif 000007
2019122392.tif 000008
2019122392.tif 000009
【０１９２】
【表５】
2019122392.tif 000010
2019122392.tif 000011
2019122392.tif 000012
2019122392.tif 000013
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2019122392.tif 000015
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2019122392.tif 000019
2019122392.tif 000020
2019122392.tif 000021
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2019122392.tif 000023
2019122392.tif 000024
2019122392.tif 000025
2019122392.tif 000026
2019122392.tif 000027
2019122392.tif 000028
2019122392.tif 000029
2019122392.tif 000030
【０１９３】
組立てに使用するαユニットをコードしているＤＮＡ断片を調製するために、鋳型とし
て各αユニットプラスミドを用い、プライマーｏＪＳ２５８１（５’−ビオチン−ＴＣＴ
ＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣ−３’（配列番号２３７））およびｏＪＳ
２５８２（５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＴＣＴＴＡＡＧＧＣＣＧＴＧＧ−３’（配列番号
２３８））を使用してＰＣＲを２０ラウンド実施した。得られたＰＣＲ産物は、５’末端
においてビオチン化された。次いで、各αＰＣＲ産物を４０単位のＢｓａＩ−ＨＦ制限酵
素で消化して４ｂｐの突出を生成し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥ
Ｎ）を使用して、最終生成物を０．１×ＥＢ  ５０μｌに溶出したことを除き製造業者の
説明書にしたがって精製した。
【０１９４】
β、βγδε、βγδ、βγ、βγ＊、およびδε＊リピートをコードしているＤＮＡ
断片を調製するために、これらのプラスミド各１０μｇを、ＮＥＢｕｆｆｅｒ２中で、５
０単位のＢｂｓＩ制限酵素を用いて、３７℃で２時間消化し、続いて５分間隔で添加され
るＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ−ＨＦおよびＳａｌＩ−ＨＦ酵素を各々１００単位使用して、Ｎ
ＥＢｕｆｆｅｒ４中で、３７℃で連続制限消化を実施した。後者の組の制限消化は、この
より大きなＤＮＡ断片が、組立て方法の間に実施されるその後のライゲーションに干渉し
ないことを確実にするするために、プラスミド主鎖を切断するように設計された。次いで
、これらの制限消化反応物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を
使用して、最終生成物を０．１×ＥＢ  １８０μｌに溶出したことを除き製造業者の説明
書にしたがって精製した。
【０１９５】
全ての組立てステップは、Ｓｃｉｃｌｏｎｅ  Ｇ３液体処理ワークステーション（Ｃａ
ｌｉｐｅｒ）を９６ウェルプレートで使用してならびにＳＰＲＩｐｌａｔｅ  ９６−ｒｉ
ｎｇ  ｍａｇｎｅｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびＤｙ
ｎａＭａｇ−９６  Ｓｉｄｅ  ｍａｇｎｅｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を
使用して実施した。最初の組立てステップにおいて、ビオチン化αユニット断片を最初の
βγδε断片にライゲーションし、次いで、得られたαβγδε断片を、２×Ｂ＆Ｗ緩衝
液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｃ１
ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に
結合させる。次いで、プレートを磁石上に静置することによってビーズをウェルの側面に
引き寄せ、次いで、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）を含むＢ＆Ｗ緩衝液１０
０μｌで洗浄し、さらにまた０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｎｅｗ  
Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）１００μｌで洗浄した。磁石からプレートを取り外し
、各ウェル中で溶液にビーズを再懸濁し、ＢｓａＩ−ＨＦ制限酵素を用いてビーズに結合
している断片を消化し、プレートを磁石上に静置し、Ｂ＆Ｗ／Ｔｗｅｅｎ２０  １００μ
ｌで続いて０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ  １００μｌで洗浄し、その後、次の断片をライゲ
ーションすることによって、新たなβγδε断片をライゲーションした。この方法を追加
的なβγδεユニットと一緒に複数回繰り返して、ビーズ結合断片を延長した。発現ベク
ターに全長断片をクローニング可能になるように、ライゲーションされる最後の断片は、
常にβ、βγ＊、βγδ、またはδε＊ユニットであった（δε＊ユニットで終わる断片
の前は、常に、βγユニットがライゲーションされる点に注目されたい）。
【０１９６】
ビーズに結合している最終的な全長断片をＢｓａＩ−ＨＦ制限酵素４０単位で、続いて
ＢｂｓＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）２５単位で消化した。Ｂ
ｂｓＩでの消化により、断片がビーズから遊離され、断片をクローニングするための固有
の５’突出が生成された。ＢｓａＩ−ＨＦでの消化により、クローニングするための固有
の３’突出が作成された。
【０１９７】
組み立てられたＴＡＬＥリピートアレイをコードしているＤＮＡ断片を、４つのＴＡＬ
ＥＮ発現ベクターのうちの１つにサブクローニングした。これらの各ベクターは、ＣＭＶ
プロモーター、哺乳動物細胞発現用に最適化された翻訳開始コドン、３重のＦＬＡＧエピ
トープタグ、核局在化シグナル、ＴＡＬＥ１３タンパク質のアミノ酸１５３〜２８８（Mi
llerら、2011、Nat. Biotechnol.、29:143-148）、２つの固有かつ接近して位置するＩＩ
Ｓ型ＢｓｍＢＩ制限部位、考え得る４つのＲＶＤ（それぞれＡ、Ｃ、ＧまたはＴヌクレオ
チドを認識する、ＮＩ、ＨＤ、ＮＮまたはＮＧ）のうちの１つをコードしている０．５Ｔ
ＡＬＥリピートドメイン、ＴＡＬＥ１３タンパク質のアミノ酸７１５〜７７７、ならびに
野生型ＦｏｋＩ切断ドメインを含んだ。全てのＤＮＡ断片は、ＢｓｍＢＩで消化された４
つのＴＡＬＥＮ発現ベクターのいずれかへの定方向クローニングを可能にする突出を保有
した。
【０１９８】
サブクローニング用のＴＡＬＥＮ発現ベクターを調製するために、プラスミドＤＮＡ  
５μｇを、ＮＥＢｕｆｆｅｒ３中で、ＢｓｍＢＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）５０単位で、５５℃で８時間消化した。製造業者の説明書にしたがってＡ
ｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）９０μｌを使用して、消化したＤＮＡを
精製し、５ｎｇ／μｌの最終濃度になるように１ｍＭトリスＨＣｌに希釈した。Ｔ４  Ｄ
ＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）４００Ｕを使用して、ＴＡＬ
ＥＮ発現ベクターに組み立てられたＴＡＬＥリピートアレイをライゲーションした。ライ
ゲーション産物を、化学的にコンピテントなＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。各
ライゲーションについて６個のコロニーを採集し、アルカリ溶菌ミニプレップ手順によっ
てプラスミドＤＮＡを単離した。同時に、プライマーｏＳＱＴ３４（５’−ＧＡＣＧＧＴ
ＧＧＣＴＧＴＣＡＡＡＴＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＧ−３’（配列番号２３９））、とｏＳＱ
Ｔ３５（５’−ＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＴＣＡＣＴＴＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＧＧＧ−３’
（配列番号２４０））とを使用するＰＣＲによって、同じ６個のコロニーをスクリーニン
グした。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｘｃｅｌキャピラリー電気泳動システム（Ｑｉａｇｅｎ）
で分析した。正しいサイズのＰＣＲ産物を含有しているクローンからのミニプレップＤＮ
Ａを、プライマーｏＳＱＴ１（５’−ＡＧＴＡＡＣＡＧＣＧＧＴＡＧＡＧＧＣＡＧ−３’
（配列番号２４１））、ｏＳＱＴ３（５’−ＡＴＴＧＧＧＣＴＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣ
−３’（配列番号２４２））、およびｏＪＳ２９８０（５−ＴＴＡＡＴＴＣＡＡＴＡＴＡ
ＴＴＣＡＴＧＡＧＧＣＡＣ−３’（配列番号２４３））を用いるＤＮＡ配列確認に送った
。
【０１９９】
ライゲーションした最終的な断片は１、２または３個のＴＡＬＥリピートをコードでき
るので、本明細書に開示されている方法を使用して、任意の望ましい数のＴＡＬＥリピー
トからなるアレイを組み立てることができる。最終的な全長ＴＡＬＥリピートアレイをコ
ードしている組み立てられたＤＮＡ断片は、制限酵素消化によってビーズから遊離され、
最良の、所望の発現ベクターに直接クローニングすることができる。
【０２００】
本方法は、ロボット化液体処理ワークステーションを使用して９６ウェル形式で効率的
に実践できる。自動化すれば、様々な長さからなる９６種類の異なるＴＡＬＥリピートア
レイをコードしているＤＮＡ断片を、１日未満で組み立てることができる。断片の、中程
度のスループット組立ては、マルチチャネルピペットと９６ウェルプレートを使用して１
日〜２日で実施できる。次いで、いずれかの手法を使用して組み立てられた断片を発現ベ
クター（例えば、ＴＡＬＥＮとしての発現用）にクローニングして、１週間未満で配列を
検証したプラスミドを生成することができる。自動化組立て手法を使用して、配列を検証
したＴＡＬＥリピートアレイ発現プラスミドを速やかにかつ安価に作製できる。
【実施例６】
【０２０１】
ヒト細胞に基づくレポーターアッセイを使用する、組み立てられたＴＡＬＥＮｓの大規模
試験
ヒト細胞において、ゲノム編集に対するＴＡＬＥＮｓの強力さを大規模試験するために
、実施例５に記載の方法を使用して、ＥＧＦＰレポーター遺伝子の全体に点在する異なる
部位に標的にされた４８個のＴＡＬＥＮ対をコードしている一連のプラスミドを構築した
。ＴＡＬＥＮ対の各モノマーは、同数のリピート（８．５〜１９．５個の範囲）を含有し
、これらの対は、各ＴＡＬＥＮモノマーによって結合される「半部位」の間に固定長の「
スペーサー」配列（１６ｂｐ）を保有する部位に標的にされた（表６）。
【０２０２】
【表６】
2019122392.tif 000031
2019122392.tif 000032
2019122392.tif 000033
【０２０３】
ヒト細胞において、染色体的に組み込まれたＥＧＦＰレポーター遺伝子のコード配列を
破壊する能力について、４８個の各ＴＡＬＥＮ対を試験した。このアッセイにおいて、Ｅ
ＧＦＰコード配列内のＴＡＬＥＮ誘導切断のＮＨＥＪ媒介修復は、ＥＧＦＰの発現を消失
させた。トランスフェクションの２日後および５日後に、この消失を、フローサイトメト
リーを使用して定量的に評価した。（活性がある各ＴＡＬＥＮ対の活性を検出できること
を確認するために、その遺伝子のヌクレオチド位置５０３をまたはその上流に位置する部
位だけを標的にした。この位置は、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いて変異
させたとき、ＥＧＦＰ機能を破壊すると以前に示していた位置である（Maederら、2008、
Mol. Cell 31:294-301）。）顕著に、このアッセイにおいて、４８個全てのＴＡＬＥＮ対
が著しいＥＧＦＰ遺伝子破壊活性を示した（図１９Ａ）。トランスフェクション２日後に
おいて、ＴＡＬＥＮｓに誘導されたＥＧＦＰ破壊細胞の正味のパーセンテージは９．４％
〜６８．０％の範囲であり、ＯＰＥＮ（Oligomerized Pool Engineering）法によって最
初に作製された４個のＥＧＦＰ標的ＺＦＮ対を用いて観察したパーセンテージ破壊と同等
のレベルであった（図１９Ａ）。これらの結果は、わずか８．５個のＴＡＬＥリピートを
含有するＴＡＬＥＮｓが、著しいヌクレアーゼ活性を保有しており、ヒト細胞において、
ＴＡＬＥＮｓの強力さの大規模な証明になることを実証している。
【０２０４】
興味深いことに、トランスフェクション５日後のＥＧＦＰ陰性細胞のパーセンテージの
再定量から、より短い長さのＴＡＬＥＮｓ（８．５〜１０．５リピートから構成されるも
のなど）を発現している細胞はＥＧＦＰ破壊細胞のパーセンテージにおいて著しい減少を
示し、一方でより長いＴＡＬＥＮｓを発現している細胞は示さないことが明らかになった
（図１９Ａ〜Ｂおよび図２０Ａ）。この効果の１つの潜在的説明は、より短い長さのＴＡ
ＬＥＮｓの発現に関連する細胞毒性である。この仮説に整合して、より短い長さのＴＡＬ
ＥＮｓをコードしているプラスミドをトランスフェクトした細胞において、トランスフェ
クション２日後〜５日後にｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞のパーセンテージにおいてより大き
な減少が観察された（図２０Ｄ）（ｔｄＴｏｍａｔｏをコードしているプラスミドは、０
日目に、ＴＡＬＥＮ発現プラスミドと一緒に共トランスフェクトした）。総合すれば、こ
の結果から、より短い長さのＴＡＬＥＮｓはより長い長さのＴＡＬＥＮｓと同程度に活性
があるが、前者はヒト細胞において、より大きな細胞毒性を引き起こし得ることが示唆さ
れる。
【０２０５】
ＥＧＦＰ実験により、５つの計算的に得られた設計ガイドライン（Cermakら、2011、Nu
cleic Acids Res.、39:e82）のうちの４つを評価する機会も得られた。Ｃｅｒｍａｋによ
って提唱されるガイドラインは、以下の通りである：
１．半部位の最初のヌクレオチドのちょうど５’のヌクレオチドは、チミンであるべ
きである。
２．半部位の最初のヌクレオチドは、チミンであるべきでない。
３．半部位の２番目のヌクレオチドは、アデノシンであるべきでない。
４．標的半部位の最も３’のヌクレオチドは、チミンであるべきである。
５．標的半部位内の各ヌクレオチドの組成は、天然に存在する結合部位で観察される
パーセンテージ組成と、標準偏差の２倍を超えて異なるべきでない。天然に存在する全て
のＴＡＬＥ結合部位のパーセンテージ組成は：Ａ＝３１±１６％、Ｃ＝３７±１３％、Ｇ
＝９±８％、Ｔ＝２２±１０％である。したがって、潜在的ＴＡＬＥ結合部位のヌクレオ
チド組成は：Ａ＝０％〜６３％、Ｃ＝１１％〜６３％、Ｇ＝０％〜２５％およびＴ＝２％
〜４２％であるべきである。
【０２０６】
これらのガイドラインは、潜在的ＴＡＬＥＮ標的部位を同定する際に利用者を支援する
ために、ＴＡＬＥ−ＮＴウェブサーバ（boglabx.plp.iastate.edu/TALENT/TALENT/）によ
り実行された。ＥＧＦＰに標的した配列の全４８個が、これらのガイドラインの１つまた
は複数を満たさなかった（しかし、その部位の全てが５’Ｔの要件を満たした点に注目さ
れたい）。これら４８部位について観察された約１００％の成功率は、これらのガイドラ
インに従わない標的配列に対してＴＡＬＥＮｓを容易に得られることを実証している。加
えて、４つの設計ガイドライン各々について、トランスフェクション２日後または５日後
のいずれにおいても、ガイドライン違反とＴＡＬＥＮ誘導突然変異生成のレベルとの間に
、どんな統計的に有意な相関も見出せなかった。ガイドライン違反の総数と突然変異誘発
性ＴＡＬＥＮ活性レベルとの間に有意な相関も見出せなかった。したがって、この結果は
、潜在的なＴＡＬＥＮ標的部位を同定する場合に、前述の５つの設計ガイドラインのうち
の４つを満たさないことは、成功率またはヌクレアーゼ効率に悪影響を与えないと思われ
ることを示している。
【実施例７】
【０２０７】
組み立てられたＴＡＬＥＮｓを使用する内在性ヒト遺伝子の高スループット変更
染色体的に組み込まれたレポーター遺伝子を用いてＴＡＬＥＮプラットフォームの強さ
を確立し、次に、この高い成功率がヒト細胞中の内在性遺伝子でも観察できるかどうかを
決定した。これを試験するために、実施例５に記載の組立て法を使用して、９６個の異な
るヒト遺伝子へと標的にされるＴＡＬＥＮ対を改変した：７８個の遺伝子はヒト癌に関係
し（VogelsteinおよびKinzler、2004、Nat. Med.、10:789-799）、１８個の遺伝子は遺伝
子発現のエピジェネティックな調節に関与する（表７）。各遺伝子について、タンパク質
コード配列のアミノ末端近くで切断するようにＴＡＬＥＮ対を設計した。但しいくつかの
場合、反復の配列の存在により、隣接する下流のエキソンまたはイントロン中の別の部位
が標的された（表７）。ＥＧＦＰ  ＴＡＬＥＮｓを用いた結果から、１６、１７、１８、
１９または２１ｂｐのスペーサー配列を持つ部位を切断する、１４．５、１５．５または
１６．５個のリピートからなるＴＡＬＥＮｓを構築した。標的部位の全ては、各半部位の
５’末端にＴを有した。
【０２０８】
【表７】
2019122392.tif 000034
2019122392.tif 000035
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2019122392.tif 000041
【０２０９】
９６個のＴＡＬＥＮ対が、意図した内在性遺伝子標的にＮＨＥＪに媒介される挿入また
は欠失（ｉｎｄｅｌ）変異を導入する能力を、以前に記載されているＴ７エンドヌクレア
ーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）アッセイ（Mussolinoら、2011、Nucleic Acids Res.、39:9283-93；K
imら、2009、Genome Res.、19:1279-88）を少し修正した方法を使用して、培養ヒト細胞
で試験した。このＴ７ＥＩアッセイで、９６個のＴＡＬＥＮ対のうちの８３個は、意図し
た内在性遺伝子標的部位におけるＮＨＥＪに媒介された突然変異生成の証拠を示した（全
体成功率約８６％）（表７）。観察されたＴＡＬＥＮ誘導突然変異生成の効率は、２．５
％〜５５．８％の範囲であり、平均２２．５％であった。Ｔ７ＥＩアッセイによって同定
した変異の分子的に確認するために、様々な効率で突然変異生成を誘導した１１個の異な
るＴＡＬＥＮ対について標的座を配列決定した（図２１Ａ〜Ｄ）。予想通り、この配列決
定から、Ｔ７ＥＩアッセイによって決定したものと同様の頻度で、期待した標的遺伝子部
位におけるｉｎｄｅｌが明らかになった。
【０２１０】
表７の内在性ヒト遺伝子に標的にされた９６対のＴＡＬＥＮｓのうち１４対のヌクレオ
チドおよびアミノ酸配列を、以下に提示する。各ＴＡＬＥＮモノマーを、以下の通りに提
示する：
（１）書式で提示される情報を含むヘッダ：遺伝子標的＿左または右モノマー＿５’
→３’に示される標的ＤＮＡ部位＿ＴＡＬＥリピートモノマー、および表４に示されるコ
ードで使用される０．５リピートプラスミド。
（２）ＮｈｅＩ部位からＢａｍＨＩ部位の間にある、活性に必要なＴＡＬＥのＮ末端
部分、ＴＡＬＥリピートアレイ、Ｃ末端０．５ＴＡＬＥリピートドメイン、および活性に
必要なＣ末端の６３個のアミノ酸、をコードしているＤＮＡ配列。この配列は、以下に示
すプラスミド「ベクター配列」中に存在し、ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ部位に隣接する下
線を引いたＸに取って代わる、
（３）翻訳開始点（ＮｈｅＩ部位の少しだけ３’側に位置し、Ｎ末端ＦＬＡＧエピト
ープタグを含む）から、（ＴＡＬＥリピートアレイからＦｏｋＩ切断ドメインまでのリン
カーとして機能する）Ｇｌｙ−Ｓｅｒ配列（ＢａｍＨＩ部位によってコードされる）まで
の間に示される、活性に必要なＴＡＬＥのＮ末端部分、ＴＡＬＥリピートアレイ、Ｃ末端
０．５ＴＡＬＥリピートドメイン、および活性に必要なＣ末端の６３個のアミノ酸のアミ
ノ酸配列。
【０２１１】
ベクター配列
2019122392.tif 000042
2019122392.tif 000043
2019122392.tif 000044
【０２１２】
【表８】
2019122392.tif 000045
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2019122392.tif 000101
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【０２１３】
他の実施形態
本発明のいくつかの実施形態について記載してきた。しかし、本発明の精神と範囲から
逸脱することなく様々な修正を作製できることは理解されよう。したがって、他の実施形
態は、以下の請求項の範囲にある。
【図１】
2019122392.tif 000103
【図２】
2019122392.tif 000104
【図３】
2019122392.tif 000105
【図４Ａ】
2019122392.tif 000106
【図４Ｂ】
2019122392.tif 000107
【図５Ａ】
2019122392.tif 000108
【図５Ｂ】
2019122392.tif 000109
【図６】
2019122392.tif 000110
【図７】
2019122392.tif 000111
【図８】
2019122392.tif 000112
【図９】
2019122392.tif 000113
【図１０】
2019122392.tif 000114
【図１１Ａ】
2019122392.tif 000115
【図１１Ｂ】
2019122392.tif 000116
【図１２Ａ】
2019122392.tif 000117
【図１２Ｂ】
2019122392.tif 000118
【図１３Ａ】
2019122392.tif 000119
【図１３Ｂ】
2019122392.tif 000120
【図１４Ａ】
2019122392.tif 000121
【図１４Ｂ】
2019122392.tif 000122
【図１５Ａ】
2019122392.tif 000123
【図１５Ｂ】
2019122392.tif 000124
【図１６Ａ】
2019122392.tif 000125
【図１６Ｂ】
2019122392.tif 000126
【図１７Ａ】
2019122392.tif 000127
【図１７Ｂ】
2019122392.tif 000128
【図１８Ａ】
2019122392.tif 000129
【図１８Ｂ】
2019122392.tif 000130
【図１９Ａ】
2019122392.tif 000131
【図１９Ｂ】
2019122392.tif 000132
【図２０Ａ】
2019122392.tif 000133
【図２０Ｂ】
2019122392.tif 000134
【図２１Ａ】
2019122392.tif 000135
【図２１Ｂ】
2019122392.tif 000136
【図２１Ｃ】
2019122392.tif 000137
【図２１Ｄ】
2019122392.tif 000138
【図２１Ｅ】
2019122392.tif 000139
【図２２】
2019122392.tif 000140
【配列表】
2019122392000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月8日(2019.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
他の実施形態
本発明のいくつかの実施形態について記載してきた。しかし、本発明の精神と範囲から逸脱することなく様々な修正を作製できることは理解されよう。したがって、他の実施形態は、以下の請求項の範囲にある。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
（ａ）１個もしくは複数の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）リピートドメインおよび／または１個もしくは複数のＴＡＬＥリピートドメインのうち１個もしくは複数の部分を含む第１の組をコードしている配列を含む第１の核酸を用意するステップと；
（ｂ）第１の核酸を第１の酵素と接触させ、第１の酵素が第１のライゲーション可能な末端を形成するステップと；
（ｃ）１個もしくは複数のＴＡＬＥリピートドメインおよび／または１個もしくは複数のＴＡＬＥリピートドメインのうち１個もしくは複数の部分を含む第２の組をコードしている配列を含む第２の核酸を用意するステップと；
（ｄ）第２の核酸を第２の酵素と接触させ、第２の酵素が第２のライゲーション可能な末端を形成し、第１および第２のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと；
（ｅ）第１および第２のライゲーション可能な末端を介して第１の核酸と第２の核酸とをライゲーションして第１のライゲーションされた核酸を作製し、第１のライゲーションされた核酸が固体支持体に連結され、第１のライゲーションされた核酸が前記第１および第２の組を含むポリペプチドをコードするステップとを含む方法。
［２］
第１の組が、ポリペプチド中で第２の組に対してＮ末端側にある、上記［１］に記載の方法。
［３］
第２の組が、ポリペプチド中で第１の組に対してＮ末端側にある、上記［１］に記載の方法。
［４］
第１および第２の酵素が第１および第２の制限エンドヌクレアーゼであり、第１の制限エンドヌクレアーゼが第１の核酸中の部位で切断して第１の切断末端を形成し、第２の制限エンドヌクレアーゼが第２の核酸中の部位で切断して第２の切断末端を形成し、第１および第２のライゲーション可能な末端が第１および第２の切断末端である、上記［１］に記載の方法。
［５］
第１のライゲーションされた核酸が、第１の制限エンドヌクレアーゼに認識される制限部位を含まない、上記［４］に記載の方法。
［６］
（ｆ）第１のライゲーションされた核酸を第３の酵素と接触させ、第３の酵素が第３のライゲーション可能な末端を形成するステップと；
（ｇ）１個もしくは複数のＴＡＬＥリピートドメインおよび／または１個もしくは複数のＴＡＬＥリピートドメインのうち１個もしくは複数の部分を含む第３の組をコードしている配列を含む第３の核酸を用意するステップと；
（ｈ）第３の核酸を第４の酵素と接触させ、第４の酵素が第４のライゲーション可能な末端を形成し、第３および第４のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと；
（ｉ）第３および第４のライゲーション可能な末端を介して第１のライゲーションされた核酸と第３の核酸とをライゲーションして、固体支持体に連結された第２のライゲーションされた核酸を作製し、第２のライゲーションされた核酸が前記第１、第２および第３の組を含むポリペプチドをコードするステップと
をさらに含む、上記［１］または［４］に記載の方法。
［７］
第３および第４の酵素が、第３および第４の制限エンドヌクレアーゼであり、第３の制限エンドヌクレアーゼが第１のライゲーションされた核酸中の部位で切断して第３の切断末端を形成し、第４の制限エンドヌクレアーゼが第３の核酸中の部位で切断して第４の切断末端を形成し、第３および第４のライゲーション可能な末端が第３および第４の切断末端である、上記［６］に記載の方法。
［８］
ライゲーションされた核酸が、第１のエンドヌクレアーゼに認識される制限部位を含まず、第１および第３の制限エンドヌクレアーゼが同一である、上記［７］に記載の方法。
［９］
第２および第４の制限エンドヌクレアーゼが同一である、上記［７］または［８］に記載の方法。
［１０］
（ｊ）第２のライゲーションされた核酸を第５の酵素と接触させ、第５の酵素が第５のライゲーション可能な末端を形成するステップと；
（ｋ）１個もしくは複数のＴＡＬＥリピートドメインおよび／または１個もしくは複数のＴＡＬＥリピートドメインのうち１個もしくは複数の部分を含む第４の組をコードしている配列を含む第４の核酸を用意するステップと；
（ｌ）第４の核酸を第６の酵素と接触させ、第６の酵素が第６のライゲーション可能な末端を形成し、第５および第６のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと；
（ｍ）第５および第６のライゲーション可能な末端を介して第２のライゲーションされた核酸と第４の核酸とをライゲーションして、固体支持体に連結された第３のライゲーションされた核酸を作製し、第３のライゲーションされた核酸が前記第１、第２、第３および第４の組を含むポリペプチドをコードするステップと
をさらに含む、上記［６］または［７］に記載の方法。
［１１］
第５および第６の酵素が第５および第６の制限エンドヌクレアーゼであり、第５の制限エンドヌクレアーゼが第２のライゲーションされた核酸中の部位で切断して第５の切断末端を形成し、第６の制限エンドヌクレアーゼが第４の核酸中の部位で切断して第６の切断末端を形成し、第５および第６のライゲーション可能な末端が第５および第６の切断末端である、上記［１０］に記載の方法。
［１２］
第２のライゲーションされた核酸が、第１のエンドヌクレアーゼに認識される制限部位を含まず、第１、第３および第５の制限エンドヌクレアーゼが同一である、上記［１１］に記載の方法。
［１３］
第２、第４および第６の制限エンドヌクレアーゼが同一である、上記［１１］または［１２］に記載の方法。
［１４］
第２の組が、１〜４個のＴＡＬＥリピートドメインを含む、上記［１］に記載の方法。
［１５］
第１および第２のライゲーション可能な末端がそれぞれ、１〜１０ヌクレオチドの突出を含む、上記［１］から［１４］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］
第１の酵素がＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである、上記［１］から［１４］のいずれかに記載の方法。
［１７］
第１のライゲーションされた核酸を前記固体支持体から分離し、第１のライゲーションされた核酸をベクターに挿入することをさらに含む、上記［１］から［５］のいずれか一項に記載の方法。
［１８］
第２のライゲーションされた核酸を固体支持体から分離し、第２のライゲーションされた核酸をベクターに挿入することをさらに含む、上記［６］から［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］
第３のライゲーションされた核酸を固体支持体から分離し、第３のライゲーションされた核酸をベクターに挿入することをさらに含む、上記［１０］から［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［２０］
ベクターが発現ベクターである、上記［１７］から［１９］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］
発現ベクターが、エフェクタードメインをコードしている配列を含み、ベクターがポリペプチドとエフェクタードメインとの融合タンパク質をコードしている配列を含むように第１、第２または第３のライゲーションした核酸がベクターに挿入される、上記［２０］に記載の方法。
［２２］
エフェクタードメインがヌクレアーゼドメインである、上記［２１］に記載の方法。
［２３］
細胞に発現ベクターを挿入することをさらに含む、上記［２０］から［２２］のいずれか一項に記載の方法。
［２４］
ポリペプチドまたは融合タンパク質を発現させることをさらに含む、上記［２３］に記載の方法。
［２５］
ポリペプチドまたは融合タンパク質を精製することをさらに含む、上記［２４］に記載の方法。
［２６］
表７に開示されている標的ヌクレオチド配列に結合する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ドメインを含むポリペプチド。
［２７］
標的ヌクレオチド配列が半部位である、上記［２６］に記載のポリペプチド。
［２８］
ヌクレアーゼドメインを含む、上記［２６］に記載のポリペプチド。
［２９］
実施例７に開示されているアミノ酸配列を含むポリペプチド。
［３０］
上記［２６］から［２９］のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
［３１］
上記［３０］に記載の核酸を含むベクター。
［３２］
上記［３０］に記載の核酸または上記［３１］に記載のベクターを含む細胞。
［３３］
１、２、３および４個のＴＡＬＥリピートドメインまたはその部分をコードしている配列を含む核酸のライブラリ。
【外国語明細書】
2019122392000001.pdf