(57)【要約】      （修正有）【課題】酵母の存否を確認する検査において、広範囲の種類の酵母を精度高く特異的に検出することを可能とする方法の提供。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）のオリゴヌクレオチドプローブの少なくともいずれかを含む、５１種類の酵母を一つのマイクロアレイに配置して、検出可能とした、酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ。（ａ）特定の塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドプローブ、（ｂ）上記（a）の各オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各オリゴヌクレオチドプローブ【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のオリゴヌクレオチドプローブの少なくともいずれかを含む、酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ。
（ａ）配列番号１〜１２に示す塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドプローブ
（ｂ）上記（a）の各オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各オリゴヌクレオチドプローブ
【請求項２】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドプローブと、以下の（ｃ）又は（ｄ）のオリゴヌクレオチドプローブの少なくともいずれかを含む、酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブのセット。
（ｃ）配列番号１３〜３１に示す塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドプローブ
（ｄ）上記（ｃ）の各オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各オリゴヌクレオチドプローブ
【請求項３】
請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチドプローブと、以下の（ｅ）又は（ｆ）のオリゴヌクレオチドプローブの少なくともいずれかを含む、酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブのセット。
（ｅ）配列番号３２〜３８に示す塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドプローブ
（ｆ）上記（ｅ）の各オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各オリゴヌクレオチドプローブ
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブと、以下の（ｇ）又は（ｈ）のオリゴヌクレオチドプローブの少なくともいずれかを含む、酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブのセット。
（ｇ）配列番号３９〜４２に示す塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドプローブ
（ｈ）上記（ｇ）の各オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各オリゴヌクレオチドプローブ
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブと、以下の（ｉ）又は（ｊ）のオリゴヌクレオチドプローブの少なくともいずれかを含む、酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブのセット。
（ｉ）配列番号４３〜４８に示す塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドプローブ
（ｊ）上記（ｉ）の各オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各オリゴヌクレオチドプローブ
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブと、以下の（ｋ）又は（ｌ）のオリゴヌクレオチドプローブの少なくともいずれかを含む、酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブのセット。
（ｋ）配列番号４９〜５２に示す塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドプローブ
（ｌ）上記（ｋ）の各オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各オリゴヌクレオチドプローブ
【請求項７】
請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチドプローブと、以下の（ｍ）又は（ｎ）のオリゴヌクレオチドプローブの少なくともいずれかを含む、酵母菌を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブのセット。
（ｍ）配列番号３２〜５２に示す塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドプローブ
（ｎ）上記（ｍ）の各オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各オリゴヌクレオチドプローブ
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブが基板上に配置されたことを特徴とする酵母検出用マイクロアレイ。
【請求項９】
請求項１〜７の少なくともいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブが基板上に配置されたマイクロアレイと、
酵母のＤＮＡのＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号５３に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号５４に示す塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットが含まれる溶液と、を有する
ことを特徴とする酵母検出用キット。
【請求項１０】
請求項１〜７の少なくともいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブが基板上に配置されたマイクロアレイと、
酵母のＤＮＡのＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号５３に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号５４に示す塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、及び酵母のＤＮＡのβチューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号５５に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号５６に示す塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットが含まれる溶液と、を有する
ことを特徴とする酵母検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品や環境において問題視される真菌の検出及び同定に有効なオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食品製造現場や臨床現場、農業現場、文化財保護環境等において、カビや酵母などの真菌が存在するか否かを検査して安全性、健全性を確認するとともに、その繁殖を防止することが重要となっている。
このような真菌の検査において、遺伝子を用いた同定法が行われている。すなわち、環境中から採取した真菌からＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法などにより標的領域を増幅し、その増幅産物を解析することで、環境中の真菌を同定することが行われている。増幅産物を解析する方法としては、電気泳動によって増幅産物のサイズを分析する方法や、増幅産物と相補的に結合するプローブを配置したマイクロアレイを用いる方法などが提案されている（特許文献１、２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５６７０６２３号公報
【特許文献２】特許第５１９６８４８号公報
【特許文献３】特許第５３２８３４３号公報
【特許文献４】特許第５３１７４３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、これまで屋内環境におけるカビ検査技術の開発を行い、空気中に浮遊している、あるいは環境中に付着しているカビを検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを基板上に配置した各種マイクロアレイを作成している。
ところで、カビと同じ真菌に属する酵母は、拭き取りなどの採取手法によってカビと共に環境中から採取され、ＤＮＡの増幅工程においてカビの遺伝子と共に酵母の遺伝子も同時に増幅されている。しかしながら、カビはマイクロアレイにより検出される一方、酵母については、これを検出可能なオリゴヌクレオチドプローブがマイクロアレイに配置されていないため、酵母の遺伝子の増幅産物がカビの検査工程において実際には得られているにも拘わらず、酵母は検出されていなかった。
【０００５】
ここで、酵母は、その種類によって、食品に変敗現象を起こしたり、人にカンジダ症を引き起こすなどの問題を生じるものがあるため、酵母を検出可能にすることは有益である。
酵母を検出する技術としては、特許文献３に記載の微生物検出用オリゴヌクレオチドや、特許文献４に記載のプローブセットを挙げることができる。これらの技術を用いれば、特定の酵母について検出することが可能である。
【０００６】
しかしながら、未だ数多く酵母については、それらを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブが開発されておらず、検出することができない状況であった。
そこで、本発明者らは、鋭意研究し、多数の酵母についての有害性の報告状況等を整理して、このうち５１種類の酵母を検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ（プローブは５２種類）を開発することに成功した。
【０００７】
すなわち、配列番号１〜１２に係る酵母は、食品や農業等に悪影響を与える種類であり、これらを検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ（特に、酵母のＤＮＡのＩＴＳ領域から選択されたもの）については、これまで見当たらなかった。
また、配列番号１３〜３１に係る酵母は、変敗現象を引き起こす可能性のある酵母として、その分布を把握しておくために、検出可能としたものである。これらを検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ（特に、酵母のＤＮＡのＩＴＳ領域から選択されたもの）については、これまで見当たらなかった。
【０００８】
ここで、発明者らが既に開発済みのカビ検査用のマイクロアレイにおいては、同属・同亜属のカビを一括で検出可能にしている。その理由は、近縁のカビ種であれば生育可能環境（温度・湿度・水分活性）、特徴（耐熱性、好冷性、毒素産生）等の性質が似ている結果、同様の被害を起こすためである。酵母についても、現時点においてその有害性の報告がなされていない種類であっても、性質が類似すれば同様の被害を起こす潜在的な危険性がある。そこで、本発明者らは、このような潜在的な危険性のある酵母として、配列番号１３〜３１に係る酵母を検出可能とした。
【０００９】
また、配列番号３２〜５２に係る酵母は、食品や医療現場において有害性が報告されており、またこれらを検出可能なオリゴヌクレオチドプローブについての報告が既にあるものである。
しかしながら、本願発明が対象とする５１種類の酵母を１つのマイクロアレイに配置して、同時に検出可能な特有のオリゴヌクレオチドプローブについては報告されていない。
【００１０】
なお、複数の酵母のそれぞれのＤＮＡにおける特定の標的領域のうち、それぞれの酵母にのみ特異的に結合する塩基配列を有し、かつ他の種類の酵母には結合しない塩基配列を選択してプローブを作成すれば、理論上は、各プローブによりこれら複数の酵母をそれぞれ特異的に検出することができる。ところが、実際にはこのようにして得られたプローブであっても有効に機能するとは限らない。このため、各プローブを作成するためには、実験によってプローブの効果を確認し、有効に機能するプローブを見いだす作業が必要であり、非常に多くの試行錯誤の繰り返しを要するものとなっている。
【００１１】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、広範囲の種類の酵母を迅速かつ精度高く特異的に検出することが可能な酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ、酵母検出用マイクロアレイ、及び酵母検出用キットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本発明の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブは、以下の（ａ）又は（ｂ）のオリゴヌクレオチドプローブの少なくともいずれかを含む、酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブとしてある。
（ａ）配列番号１〜１２に示す塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドプローブ
（ｂ）上記（a）の各オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各オリゴヌクレオチドプローブ
【００１３】
また、本発明の酵母検出用マイクロアレイは、少なくとも上記のオリゴヌクレオチドプローブが基板上に配置された構成としてある。
また、本発明の酵母検出用キットは、少なくとも上記のオリゴヌクレオチドプローブが基板上に配置されたマイクロアレイと、酵母のＤＮＡのＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号５３に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号５４に示す塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットが含まれる溶液とを有する構成としてある。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、広範囲の種類の酵母を迅速かつ精度高く特異的に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施形態に係る酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１〜１２）の塩基配列を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１３〜３１）の塩基配列を示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係る酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号３２〜５２）の塩基配列を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係る酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブにより検出する対象の酵母の標的領域を増幅させるためのプライマーセットの塩基配列を示す図である。
【図５】本発明の実施形態に係る酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１〜１２）について、試験１において個別に検出された蛍光強度（Ｓ／Ｎ比値）を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係る酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１３〜３１）について、試験１において個別に検出された蛍光強度（Ｓ／Ｎ比値）を示す図である。
【図７】本発明の実施形態に係る酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号３２〜５２）について、試験１において個別に検出された蛍光強度（Ｓ／Ｎ比値）を示す図である。
【図８】本発明の実施形態に係る酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブについて、試験２（試料１〜４）において混合した酵母、菌株番号、及び対応配列番号を示す図である。
【図９】本発明の実施形態に係る酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブについて、試験２（試料５〜８）において混合した酵母、菌株番号、及び対応配列番号を示す図である。
【図１０】本発明の実施形態に係る酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブについて、試験２（試料９〜１２）において混合した酵母、菌株番号、及び対応配列番号を示す図である。
【図１１】本発明の実施形態に係る酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１〜１８）について、試験２において混合して検出された蛍光強度（Ｓ／Ｎ比値）を示す図である。
【図１２】本発明の実施形態に係る酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１９〜３６）について、試験２において混合して検出された蛍光強度（Ｓ／Ｎ比値）を示す図である。
【図１３】本発明の実施形態に係る酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号３７〜５２）について、試験２において混合して検出された蛍光強度（Ｓ／Ｎ比値）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ、酵母検出用マイクロアレイ、及び酵母検出用キットの一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の本実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
【００１７】
［酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ］
本実施形態の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１〜５２によりそれぞれ特定される塩基配列からなる核酸断片である。
まず、配列番号１〜１２に係る酵母は、食品や農業等に悪影響を与える変敗現象を生じる種類である。
具体的には、配列番号１のプローブにより検出されるカザクスタニア・エクシグア(Kazachstania exigua)は、異臭（エタノール臭）、膨張（腐敗によるガスの発生）、及び異物生成（斑点）を起こす。
配列番号２のプローブにより検出されるハンセニアスポラ・オズモフィラ(Hanseniaspora osmophila)は、異臭を起こし、またショウジョウバエ(Drosophila sp.)と共生関係にあるため、ハエ体表から媒介される果実や食品への酵母汚染に関与するという問題がある。
【００１８】
また、配列番号３〜７のプローブによりそれぞれ検出される、ハンセニアスポラ・オクシデンタリス（Hanseniaspora occidentalis）、ハンセニアスポラ・バルビエンシス（Hanseniaspora valbyensis）、クラビスポラ・ルシタニアエ（Clavispora lusitaniae）、ラチャンセア・サーモトレランス（Lachancea thermotolerans）、ジゴトルラスポラ・ロレンティナス（Zygotorulaspora florentinus）にも、ショウジョウバエ(Drosophila sp.)と共生関係にあるため、ハエ体表から媒介される酵母汚染に関与するという問題がある。
【００１９】
配列番号８のプローブにより検出されるデバリヨマイセス・カルソニ(Debaryomyces carsonii)は、異臭を起こす。
配列番号９のプローブにより検出されるサッカロマイコプシス・カプスラリス（Saccharomycopsis capsularis）は、異物生成（黒色斑点）を起こす。
配列番号１０、１１のプローブによりそれぞれ検出されるトルラスポラ・グロボサ（Torulaspora globosa）、トルラスポラ・デルブリッキー（Torulaspora delbrueckii）は、高糖又は高塩で長期間保存可能な保存食品の腐敗酵母である。
配列番号１２のプローブにより検出されるエレモセシウム・アシュビイ（Eremothecium ashbyi）は、大豆子実汚班病を引き起こす。
【００２０】
そこで、本実施形態の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブは、以下の（ａ）又は（ｂ）のオリゴヌクレオチドプローブの少なくともいずれか、これらの二以上、又はこれらの全てを含む、酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ（以下、Ａグループのプローブと称する場合がある。）とすることが好ましい。
（ａ）配列番号１〜１２に示す塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドプローブ
（ｂ）上記（a）の各オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各オリゴヌクレオチドプローブ
このような本実施形態の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブによれば、これまでは検出することができなかった、食品や農業等に悪影響を与える変敗現象を生じる酵母を検出することが可能となる。
【００２１】
また、配列番号１３〜３１に係る酵母は、変敗現象を引き起こす可能性を潜在的に有する種類である。
具体的には、配列番号１３のプローブにより検出されるバーネットザイマ・プラテンシス（Barnettozyma pratensis）、配列番号１４のプローブにより検出されるカンジダ・ベルティ（Candida berthetii）、配列番号１５のプローブにより検出されるカンジダ・マルトーサ（Candida maltosa）、配列番号１６のプローブにより検出されるシテロマイセス・マトリテンシス（Citeromyces matritensis）、配列番号１７のプローブにより検出されるイサチェンキア・オクシデンタリス（Issatchenkia occidentalis）、配列番号１８のプローブにより検出されるカザクスタニア・ユニスポラ（Kazachstania unispora）、配列番号１９のプローブにより検出されるクレガーヴァンリッジャ・フルクシューム（Kregervanrija fluxuum）、配列番号２０のプローブにより検出されるリンドネラ・サトゥルヌス（Lindnera saturnus）、配列番号２１のプローブにより検出されるロデロマイセス・エロンギスポラス（Lodderomyces elongisporus）、配列番号２２のプローブにより検出されるナカセオマイセス・デルフェンシス（Nakaseomyces delphensis）である。
【００２２】
また、配列番号２３のプローブにより検出されるナウモビア・カステリ（Naumovia castellii）、配列番号２４のプローブにより検出されるパフォマイセス・サーモトレランス（Phaffomyces thermotolerans）、配列番号２５のプローブにより検出されるピキア・ファリノサ（Pichia farinosa）、配列番号２６のプローブにより検出されるピキア・ファーメンタンス（Pichia fermentans）、配列番号２７のプローブにより検出されるサツルニスポラ・アシャルニ（Saturnispora ahearnii）、配列番号２８のプローブにより検出されるテトラピシスポラ・ファフィ（Tetrapisispora phaffii）、配列番号２９のプローブにより検出されるヴァンデルワルトザイマ・ポリスポラ（Vanderwaltozyma polyspora）、配列番号３０のプローブにより検出されるウィッカーハモミセス・シフェリイ（Wickerhamomyces ciferrii）、配列番号３１のプローブにより検出されるジゴアスカス・ヘレニカス（Zygoascus hellenicus）である。
【００２３】
そこで、本実施形態の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブは、以下の（ｃ）又は（ｄ）のオリゴヌクレオチドプローブの少なくともいずれか、これらの二以上、又はこれらの全てを含む、酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ（以下、Ｂグループのプローブと称する場合がある。）とすることも好ましい。また、ＡグループとＢグループのプローブのセットとすることも好ましい。
（ｃ）配列番号１３〜３１に示す塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドプローブ
（ｄ）上記（ｃ）の各オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各オリゴヌクレオチドプローブ
このような本実施形態の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブによれば、これまでは検出することができなかった、潜在的な危険性のある酵母を検出することが可能となる。
【００２４】
また、配列番号３２〜３８に係る酵母は、異臭（エタノール臭）、膨張（腐敗によるガスの発生）、異物生成（斑点）、及び保存食品（高糖／高塩）の腐敗のうちの多くを起こす。
具体的には、配列番号３２〜３５のプローブによりそれぞれ検出される、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、ジゴサッカロマイセス・バイリ（Zygosaccharomyces bailii）、ジゴサッカロマイセス・ビスポラス（Zygosaccharomyces bisporus）、ジゴサッカロマイセス・メリス（Zygosaccharomyces mellis）は、上記の全ての問題を生じ得る。
また、配列番号３６、３７のプローブによりそれぞれ検出される、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）は、異臭（エタノール臭）、膨張（腐敗によるガスの発生）、異物生成（斑点）を起こす。
また、配列番号３８のプローブにより検出されるデバリヨマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）は、異臭、異物生成（斑点）、及び保存食品（高糖／高塩）の腐敗を起こす。
【００２５】
さらに、配列番号３９〜４２に係る酵母は、真菌症（カンジダ症）などを引き起こす。
具体的には、配列番号３９、４０のプローブによりそれぞれ検出される、カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）は、異物生成（斑点）及び真菌症（カンジダ症）を引き起こし、配列番号４１、４２のプローブによりそれぞれ検出される、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、ピキア・ギリエルモンディ（Pichia guilliermondii）は、真菌症（カンジダ症）を引き起こす。
【００２６】
また、配列番号４３〜４８に係る酵母は、異臭、及び異物生成を起こす。
具体的には、配列番号４３〜４５のプローブによりそれぞれ検出される、ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・ミニュータ（Rhodotorula minuta）、ロドトルラ・ムシラギノーサ（Rhodotorula mucilaginosa）は、異臭、及び異物生成（赤色斑点）を起こす。また、配列番号４６〜４８のプローブによりそれぞれ検出される、ブレッタノマイセス・クステルシアヌス（Brettanomyces custersianus）、ブレッタノマイセス・ナーデネンシス（Brettanomyces naardenensis）、デッケラ・ブルクセレンシス（Dekkera bruxellensis）は、ビール腐敗酵母であり、異臭、及び異物生成（濁り）を起こす。
【００２７】
さらにまた、配列番号４９〜５２に係る酵母は、各種問題を生じる。
具体的には、配列番号４９のプローブにより検出されるヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）は、異臭を起こす。配列番号５０のプローブにより検出されるマラセチア・フルフル（Malassezia furfur）は、脂質要求性であり、ヒト手指に存在する。配列番号５１のプローブにより検出されるトリコスポロン・クタネウム（Trichosporon cutaneum）は、感染症起因菌である。配列番号５２のプローブにより検出されるクリプトコッカス・ローレンティ（Cryptococcus laurentii）は、脂質分解活性を備え、また低温で増殖する性質を備えている。
【００２８】
そこで、本実施形態の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブは、以下の（ｅ）又は（ｆ）のオリゴヌクレオチドプローブの少なくともいずれか、これらの二以上、又はこれらの全てを含む、酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ（以下、Ｃグループのプローブと称する場合がある。）とすることも好ましい。また、Ａグループ、Ｂグループ、及びＣグループの二以上のグループのプローブのセットとすることも好ましい。
（ｅ）配列番号３２〜３８に示す塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドプローブ
（ｆ）上記（ｅ）の各オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各オリゴヌクレオチドプローブ
【００２９】
また、本実施形態の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブは、以下の（ｇ）又は（ｈ）のオリゴヌクレオチドプローブの少なくともいずれか、これらの二以上、又はこれらの全てを含む、酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ（以下、Ｄグループのプローブと称する場合がある。）とすることも好ましい。また、Ａグループ、Ｂグループ、Ｃグループ、及びＤグループの二以上のグループのプローブのセットとすることも好ましい。
（ｇ）配列番号３９〜４２に示す塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドプローブ
（ｈ）上記（ｇ）の各オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各オリゴヌクレオチドプローブ
【００３０】
さらに、本実施形態の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブは、以下の（ｉ）又は（ｊ）のオリゴヌクレオチドプローブの少なくともいずれか、これらの二以上、又はこれらの全てを含む、酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ（以下、Ｅグループのプローブと称する場合がある。）とすることも好ましい。また、Ａグループ、Ｂグループ、Ｃグループ、Ｄグループ、及びＥグループの二以上のグループのプローブのセットとすることも好ましい。
（ｉ）配列番号４３〜４８に示す塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドプローブ
（ｊ）上記（ｉ）の各オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各オリゴヌクレオチドプローブ
【００３１】
また、本実施形態の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブは、以下の（ｋ）又は（ｌ）のオリゴヌクレオチドプローブの少なくともいずれか、これらの二以上、又はこれらの全てを含む、酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ（以下、Ｆグループのプローブと称する場合がある。）とすることも好ましい。また、Ａグループ、Ｂグループ、Ｃグループ、Ｄグループ、Ｅグループ、及びＦグループの二以上のグループのプローブのセットとすることも好ましい。
（ｋ）配列番号４９〜５２に示す塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドプローブ
（ｌ）上記（ｋ）の各オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各オリゴヌクレオチドプローブ
【００３２】
さらにまた、本実施形態の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブは、以下の（ｍ）又は（ｎ）のオリゴヌクレオチドプローブの少なくともいずれか、これらの二以上、又はこれらの全てを含む、酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ（以下、Ｇグループのプローブと称する場合がある。）とすることも好ましい。また、Ａグループ、Ｂグループ、及びＧグループの二以上のグループのプローブのセットとすることも好ましい。
（ｍ）配列番号３２〜５２に示す塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドプローブ
（ｎ）上記（ｍ）の各オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する各オリゴヌクレオチドプローブ
【００３３】
なお、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）を検出するための配列番号３６のプローブは、βチューブリン遺伝子から選択されたものであり、これ以外の配列番号１〜３５、及び３７〜５２のプローブは、ｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域から選択されたものである。
【００３４】
［プローブの合成］
本実施形態の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブは、いずれも２５〜３９塩基の長さであり、一般的なＤＮＡ合成装置により合成できる。後述する実施例で用いた配列番号１〜５２に示す塩基配列からなるプローブは、いずれもＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。なお、実施例でＰＣＲに用いた配列番号５３〜５６に示す塩基配列からなるプライマーも１９〜２６塩基の長さであり、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。
【００３５】
また、本実施形態における配列番号１〜５２に示す塩基配列からなるプローブは、当該配列そのものに限定されず、配列番号１〜５２に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプローブを用いることができる。また、配列番号１〜５２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブを用いることもできる。また、これらのプローブや、配列番号１〜５２に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブを用いることもできる。
【００３６】
なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１〜５２に示す塩基配列からなるＤＮＡに対して高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１〜５２に示す塩基配列からなるＤＮＡとそれぞれ相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
【００３７】
［酵母検出用マイクロアレイ］
本実施形態の酵母検出用マイクロアレイは、上述した酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブが基板上に配置されたことを特徴とする。
この酵母検出用マイクロアレイは、配列番号１〜５２に示す塩基配列を有するプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
例えば、この酵母検出用マイクロアレイとして、貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
【００３８】
本実施形態の酵母検出用マイクロアレイは、配列番号１〜５２に示す塩基配列を有するプローブの全部又は一部を固定化したものとすることができる。また、上記の各種グループのプローブのセット毎に、プローブを固定化したものとすることができる。
【００３９】
［酵母の検出方法］
本実施形態の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ及び酵母検出用マイクロアレイを用いた酵母の検出方法は、例えば以下のような方法とすることができる。
すなわち、（１）酵母の採取、（２）ＤＮＡの抽出、（３）標的領域の増幅、及び（４）増幅産物の確認を含むものとすることができる。
【００４０】
（１）酵母の採取
まず、酵母を環境中から採取する。例えば、食品工場の壁、床、ドア、窓、製造設備（器械、包丁、バット）、タンク、作業員手指、作業服等から検体を拭き取ることによって採取する。次に、得られた検体を液体窒素などにより凍結して、酵母の細胞を破砕する。
【００４１】
（２）ＤＮＡの抽出
次に、得られた酵母の細胞の破砕物からゲノムＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡの抽出は、ＣＴＡＢ法（Cetyl  trimethyl  ammonium  bromide）による方法やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
【００４２】
（３）標的領域の増幅
次に、抽出したゲノムＤＮＡにおける標的領域を増幅させる。すなわち、ゲノムＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅させる。この標的領域の増幅方法は、特に限定されないが、ＰＣＲ法を好適に用いることができる。ＰＣＲ法では、標的領域を増幅させるためのプライマーセットを含有するＰＣＲ反応液を用いて、標的領域を増幅させる。ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
本実施形態では、例えば以下のような反応条件でＰＣＲを行うことにより、各酵母の標的領域を好適に増幅させることができる。
（ａ）９５℃  １０分、（ｂ）９５℃（ＤＮＡ変性工程）  ３０秒、（ｃ）５６℃（アニーリング工程）  ３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程）  ６０秒（（ｂ）〜（ｄ）を４０サイクル）、（ｅ）７２℃  １０分
【００４３】
ＰＣＲ用反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP））、プライマーセット、核酸合成酵素（Ｎｏｖａ  Ｔａｑ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、蛍光標識試薬（Ｃｙ５−ｄＣＴＰなど）、検体のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。なお、緩衝液としては、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を用いることができる。
【００４４】
本実施形態の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ及び酵母検出用マイクロアレイを用いた酵母の検出方法では、酵母のゲノムＤＮＡにおけるｒＤＮＡのＩＴＳ領域及び／又はβチューブリン遺伝子を標的領域として、ＤＮＡ断片の増幅が行われる。
ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとしては、配列番号５３及び５４の塩基配列からなるもの（配列番号５３：フォワードプライマー、配列番号５４：リバースプライマー）を好適に用いることができる。また、βチューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとしては、配列番号５５及び５６の塩基配列からなるもの（配列番号５５：フォワードプライマー、配列番号５６：リバースプライマー）を好適に用いることができる。
【００４５】
（４）増幅産物の確認
次に、増幅産物を本実施形態の酵母検出用マイクロアレイに滴下し、これに配置されたプローブにハイブリダイズした増幅産物の標識を検出することで、増幅産物の有無を確認する。これによって、検査対象の環境中に存在している酵母を特定することができる。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴ（Ｒ）を用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。測定結果は、Ｓ／Ｎ比値（Signal  to  Noise  ratio）値として得ることが好ましい。Ｓ／Ｎ比値にもとづいて、測定結果が陽性であるか陰性であるかを精度高く判定することができるためであり、一般にＳ／Ｎ比値が３以上の場合に、陽性と判定することができる。本明細書中に記載のＳ／Ｎ比値は、（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値にて算出される。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。
【００４６】
［酵母検出用キット］
本実施形態の酵母検出用キットには、酵母のＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させるための上記のプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが配置された本実施形態の酵母検出用マイクロアレイとが含まれる。
すなわち、上述した本実施形態の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブが基板上に配置されたマイクロアレイと、酵母のＤＮＡのＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号５３に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号５４に示す塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットが含まれる溶液とを有するものとすることが好ましい。
【００４７】
また、上述した本実施形態の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブが基板上に配置されたマイクロアレイと、酵母のＤＮＡのＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号５３に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号５４に示す塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、及び酵母のＤＮＡのβチューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号５５に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号５６に示す塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットが含まれる溶液とを有するものとすることも好ましい。
【００４８】
本実施形態の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ、酵母検出用マイクロアレイ、及び酵母検出用キットによれば、酵母を特異的に識別できる上記の５２種類のプローブを用いることにより、広範囲の種類の酵母を適切に検出することができる。
したがって、酵母の存否を確認するための環境検査等において、広範囲の種類の酵母を迅速かつ精度高く検出することが可能になっている。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明の実施形態に係る酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブ、酵母検出用マイクロアレイ、及び酵母検出用キットの効果を確認するために行った試験について、具体的に説明する。
【００５０】
［試験１］
酵母検出用マイクロアレイとしては、ジーンシリコン（Ｒ）（東洋鋼鈑株式会社製）を用い、配列番号１〜５２のプローブを配置したものを使用した。各プローブは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成したものを使用した。また、各プローブの基板への固定化は、マイクロアレイヤーにより行った。
【００５１】
検出対象の酵母は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（NITE  Biological  Resource  Center）から入手した菌株を使用した。具体的には、図５〜図７に示すように、以下の５１種類の酵母の菌株を使用した。
【００５２】
カザクスタニア・エクシグア（NBRC 1128）、ハンセニアスポラ・オズモフィラ（NBRC 10832）、ハンセニアスポラ・オクシデンタリス（NBRC 1819）、ハンセニアスポラ・バルビエンシス（NBRC 0115）、クラビスポラ・ルシタニアエ（NBRC 10059）、ラチャンセア・サーモトレランス（NBRC 1985）、ジゴトルラスポラ・フロレンティナス（NBRC 1088）、デバリヨマイセス・カルソニ（NBRC 0946）、サッカロマイコプシス・カプスラリス（NBRC 0672）、トルラスポラ・グロボサ（NBRC 1160）、トルラスポラ・デルブリッキー（NBRC 0955）、エレモセシウム・アシュビイ（NBRC 0557）、バーネットザイマ・プラテンシス（NBRC 10696）、カンジダ・ベルティ（NBRC 10266）、カンジダ・マルトーサ（NBRC 1977）、シテロマイセス・マトリテンシス（NBRC 0954）、イサチェンキア・オクシデンタリス（NBRC 1904）、カザクスタニア・ユニスポラ（NBRC 0316）、クレガーヴァンリッジャ・フルクシューム（NBRC 0773）、リンドネラ・サトゥルヌス（NBRC 10697）、ロデロマイセス・エロンギスポラス（NBRC 1676）、ナカセオマイセス・デルフェンシス（NBRC 10602）、ナウモビア・カステリ（NBRC 1992）、パフォマイセス・サーモトレランス（NBRC 10024）、ピキア・ファリノサ（NBRC 1163）、ピキア・ファーメンタンス（NBRC 1124）、サツルニスポラ・アシャルニ（NBRC 10942）、テトラピシスポラ・ファフィ（NBRC 1672）、ヴァンデルワルトザイマ・ポリスポラ（NBRC 10782）、ウィッカーハモミセス・シフェリイ（NBRC 0793）、ジゴアスカス・ヘレニカス（NBRC 1575）、カンジダ・クルセイ（NBRC 1395）、ジゴサッカロマイセス・バイリ（NBRC 1098）、ジゴサッカロマイセス・ビスポラス（NBRC 1131）、ジゴサッカロマイセス・メリス（NBRC 1615）、サッカロマイセス・セレビジエ （NBRC 10217）、デバリヨマイセス・ハンセニ（NBRC 0015）、カンジダ・パラプシローシス（NBRC 1396）、カンジダ・トロピカリス（NBRC 1400）、カンジダ・グラブラータ（NBRC 0622）、ピキア・ギリエルモンディ（NBRC 10279）、ロドトルラ・グルティニス（NBRC 1125）、ロドトルラ・ミニュータ（NBRC 0715）、ロドトルラ・ムシラギノーサ（NBRC 0909）、ブレッタノマイセス・クステルシアヌス（NBRC 1585）、ブレッタノマイセス・ナーデネンシス（NBRC 1588）、デッケラ・ブルクセレンシス（NBRC 0677）、ヤロウィア・リポリティカ（NBRC 1548）、マラセチア・フルフル（NBRC 0656）、トリコスポロン・クタネウム（NBRC 1198）、クリプトコッカス・ローレンティ（NBRC 0609）
【００５３】
これらの酵母を菌株毎に個別に培養した。培養は、ＰＤＡ培地またはＭ４０Ｙ培地を用いて、２５℃の暗所で、７日間静置させて行った。
さらに、培養した酵母のコロニーを採取し、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に個別に入れ、液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置を用いて、酵母の細胞を破砕した。
次いで、ＤＮＡ抽出装置により酵母のゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法により、各酵母のＩＴＳ領域及び／又はβ−チューブリン遺伝子を菌株毎に増幅した。
【００５４】
ここで、ＰＣＲ用反応液としては、一律に、酵母のＤＮＡのＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号５３に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号５４に示す塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、及び酵母のＤＮＡのβチューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号５５に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号５６に示す塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットが含まれるものを使用した。なお、これらのプライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。
【００５５】
ＰＣＲ用反応液としては、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、菌株毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．Ampdirect(G/Crich)  4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)  4.0μl
３．dNTPmix  1.0μl
４．Cy-5dCTP  0.2μl
５．ITS領域フォワードプライマー(2.5μM)  1.0μl
６．ITS領域リバースプライマー(2.5μM)  1.0μl
７．βチューブリン遺伝子フォワードプライマー(10μM)  1.0μl
８．βチューブリン遺伝子リバースプライマー(10μM)  1.0μl
９．NovaTaq  HotStart  DNA  polymerase  0.2μl
１０．Template  DNA（100pg/μl）  1.0μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
【００５６】
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（Ｒ）  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃  １０分
（b）９５℃  ３０秒
（c）５６℃  ３０秒
（d）７２℃  ６０秒（（b）〜（d）を４０サイクル）
（e）７２℃  １０分
【００５７】
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、９４℃で５分間加温し、上記の酵母検出用マイクロアレイに滴下した。このマイクロアレイを４５℃で１時間静置し、上記の緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物を洗い流した。
そして、標識検出装置（ＢＩＯＳＨＯＴ（Ｒ），東洋鋼鈑株式会社製）を用いて、酵母検出用マイクロアレイに配置された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定して、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値（（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を取得した。その結果を図５〜図７に示す。
【００５８】
これらの図に示されるように、配列番号１〜５２に示される塩基配列をそれぞれ有するプローブにおけるＳ／Ｎ比値は、いずれも３以上となっており、陽性を示している。
このように、これらのプローブは、ぞれぞれの対象酵母を検出するために、有効に機能することが分かった。
【００５９】
［試験２］
検出対象の複数の酵母のＤＮＡにおける標的領域を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲを行った場合に、本実施形態の酵母検出用マイクロアレイに配置したプローブが有効に機能するかを確認するための試験を行った。
【００６０】
酵母検出用マイクロアレイは、試験１と同じものを使用した。また、検出対象の酵母も試験１と同じ菌株を使用した。
本試験では、図８〜図１０に示すように、これらの酵母をランダムに５種類ずつ組み合わせ、以下の１２グループの試料を作成し、それぞれの試料毎に酵母の培養を行った。したがって、一部の酵母は、複数の試料に重複して含まれている。
【００６１】
（試料１）
ハンセニアスポラ・オズモフィラ（対応配列番号２）、パフォマイセス・サーモトレランス（対応配列番号２４）、テトラピシスポラ・ファフィ（対応配列番号２８）、ジゴサッカロマイセス・メリス（対応配列番号３５）、ブレッタノマイセス・ナーデネンシス（対応配列番号４７）
【００６２】
（試料２）
ジゴトルラスポラ・フロレンティナス（対応配列番号７）、カンジダ・ベルティ（対応配列番号１４）、ロデロマイセス・エロンギスポラス（対応配列番号２１）、ピキア・ファリノサ（対応配列番号２５）、デバリヨマイセス・ハンセニ（対応配列番号３８）
【００６３】
（試料３）
ハンセニアスポラ・バルビエンシス（対応配列番号４）、イサチェンキア・オクシデンタリス（対応配列番号１７）、ナカセオマイセス・デルフェンシス（対応配列番号２２）、ジゴサッカロマイセス・バイリ（対応配列番号３３）、カンジダ・パラプシローシス（対応配列番号３９）
【００６４】
（試料４）
ラチャンセア・サーモトレランス（対応配列番号６）、エレモセシウム・アシュビイ（対応配列番号１２）、バーネットザイマ・プラテンシス（対応配列番号１３）、ピキア・ファーメンタンス（対応配列番号２６）、ブレッタノマイセス・クステルシアヌス（対応配列番号４６）
【００６５】
（試料５）
カザクスタニア・エクシグア（対応配列番号１）、ナウモビア・カステリ（対応配列番号２３）、ヴァンデルワルトザイマ・ポリスポラ（対応配列番号２９）、ジゴサッカロマイセス・ビスポラス（対応配列番号３４）、デッケラ・ブルクセレンシス（対応配列番号４８）
【００６６】
（試料６）
ハンセニアスポラ・オクシデンタリス（対応配列番号３）、トルラスポラ・グロボサ（対応配列番号１０）、カザクスタニア・ユニスポラ（対応配列番号１８）、ロドトルラ・グルティニス（対応配列番号４３）、クリプトコッカス・ローレンティ（対応配列番号５２）
【００６７】
（試料７）
クラビスポラ・ルシタニアエ（対応配列番号５）、カンジダ・マルトーサ（対応配列番号１５）、クレガーヴァンリッジャ・フルクシューム（対応配列番号１９）、カンジダ・グラブラータ（対応配列番号４１）、マラセチア・フルフル（対応配列番号５０）
【００６８】
（試料８）
サッカロマイコプシス・カプスラリス（対応配列番号９）、ウィッカーハモミセス・シフェリイ（対応配列番号３０）、サッカロマイセス・セレビジエ（対応配列番号３６、３７）、ピキア・ギリエルモンディ（対応配列番号４２）、ロドトルラ・ミニュータ（対応配列番号４４）
【００６９】
（試料９）
トルラスポラ・デルブリッキー（対応配列番号１１）、リンドネラ・サトゥルヌス（対応配列番号２０）、カンジダ・クルセイ（対応配列番号３２）、サッカロマイセス・セレビジエ（対応配列番号３６、３７）、トリコスポロン・クタネウム（対応配列番号５１）
【００７０】
（試料１０）
シテロマイセス・マトリテンシス（対応配列番号１６）、サツルニスポラ・アシャルニ（対応配列番号２７）、カンジダ・トロピカリス（対応配列番号４０）、ロドトルラ・ムシラギノーサ（対応配列番号４５）、ヤロウィア・リポリティカ（対応配列番号４９）
【００７１】
（試料１１）
デバリヨマイセス・カルソニ（対応配列番号８）、エレモセシウム・アシュビイ（対応配列番号１２）、ヴァンデルワルトザイマ・ポリスポラ（対応配列番号２９）、ジゴサッカロマイセス・メリス（対応配列番号３５）、デッケラ・ブルクセレンシス（対応配列番号４８）
【００７２】
（試料１２）
クレガーヴァンリッジャ・フルクシューム（対応配列番号１９）、サツルニスポラ・アシャルニ（対応配列番号２７）、ジゴアスカス・ヘレニカス（対応配列番号３１）、ロドトルラ・ミニュータ（対応配列番号４４）、トリコスポロン・クタネウム（対応配列番号５１）
【００７３】
培養は、ＰＤＡ培地またはＭ４０Ｙ培地を用いて、２５℃の暗所で、７日間静置させて行った。
そして、試料毎に培養した酵母のコロニーを一括して採取し、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に試料毎に入れ、液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置を用いて、酵母の細胞を破砕した。
次いで、ＤＮＡ抽出装置により酵母のゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法により、各酵母のＩＴＳ領域及び／又はβ−チューブリン遺伝子を試料毎に同時に増幅した。ＰＣＲ法で用いたプライマーセットは、試験１におけるものと同一である。
【００７４】
ＰＣＲ用反応液としては、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、試料毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．Ampdirect(G/Crich)  4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)  4.0μl
３．dNTPmix  1.0μl
４．Cy-5dCTP  0.2μl
５．ITS領域フォワードプライマー(2.5μM)  1.0μl
６．ITS領域リバースプライマー(2.5μM)  1.0μl
７．βチューブリン遺伝子フォワードプライマー(10μM)  1.0μl
８．βチューブリン遺伝子リバースプライマー(10μM)  1.0μl
９．NovaTaq  HotStart  DNA  polymerase  0.2μl
１０．Template  DNA（各50pg/μl、計250pg/μl）  1.0μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
【００７５】
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（Ｒ）  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  タカラバイオ株式会社製）により、試験１と同様の条件で、ＤＮＡの増幅を行うと共に、酵母検出用マイクロアレイに配置された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定し、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値を取得した。その結果を図１１〜図１３に示す。
【００７６】
これらの図に示されるように、各試料に含まれるプローブにおけるＳ／Ｎ比値は、いずれも３以上となっており、陽性を示している。また、これらのプローブは、特異性が高く、偽陽性反応は見られなかった。
このように、本実施形態の酵母検出用オリゴヌクレオチドプローブは、検出対象の複数の酵母のＤＮＡにおける標的領域を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲを行った場合でも、有効に機能することが分かった。
【００７７】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、本実施形態の酵母検出用マイクロアレイに配置するプローブは、１種類につき１スポットずつに限定されるものではなく、それぞれのプローブを複数スポットずつ配置しても良い。また、本実施形態の検出対象酵母以外の酵母や、カビを検出するためのその他のプローブが、本実施形態におけるプローブと共にマイクロアレイに配置されていても良く、適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、環境検査、食品検査、疫学的環境検査、臨床試験、家畜衛生、植物病害診断等において、複数種類の酵母を特異的かつ多重に検出する場合に好適に利用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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