(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトおよび動物に対する投与に適した治療用ポリペプチドの生産に適切な植物（例えばタバコ属品種）の提供。【解決手段】キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子内にＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼにより誘導した変異を入れることにより、ヒトおよび動物に対する投与に適した治療用ポリペプチドの生産に適切な植物を作製するための材料および方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のＸｙｌＴ対立遺伝子のそれぞれにおける変異および複数のＦｕｃＴ対立遺伝子のそれぞれにおける変異を含む、タバコ属の植物または植物細胞であって、
前記の植物または植物細胞は、前記の植物または植物細胞で生産される糖タンパク質のＮ−グリカン構造上に、β−１，２−キシロシル−またはコアα−１，３−フコシル糖を検出可能なレベルで生産しない、
タバコ属の植物または植物細胞。
【請求項２】
請求項１の植物または植物細胞であって、
前記変異が、配列番号１、２、または３に記載の１つまたは複数の配列における変異である、
植物または植物細胞。
【請求項３】
請求項１の植物または植物細胞であって、
前記変異が、１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼにより誘導されたものである、
植物または植物細胞。
【請求項４】
請求項３の植物または植物細胞であって、
前記の１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼが、転写アクチベーター様の（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼである、
植物または植物細胞。
【請求項５】
請求項４の植物または植物細胞であって、
前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのそれぞれが、配列番号４５〜６３のいずれかに記載の配列に結合する、
植物または植物細胞。
【請求項６】
請求項１の植物または植物細胞であって、
前記の植物または植物細胞が、異種ポリペプチドをコードする核酸を含む、
植物または植物細胞。
【請求項７】
請求項１の植物または植物細胞であって、
前記変異のそれぞれが、１つよりも多いヌクレオチドの欠失である、
植物または植物細胞。
【請求項８】
請求項１の植物または植物細胞であって、
前記の複数のＸｙｌＴ対立遺伝子および前記の複数のＦｕｃＴ対立遺伝子のそれぞれが、内因性の核酸配列の欠失を有し、いかなる外因性の核酸も含まない、
植物または植物細胞。
【請求項９】
請求項１の植物または植物細胞であって、
前記の植物または植物細胞が、ベンサミアナタバコ植物または植物細胞である、
植物または植物細胞。
【請求項１０】
ポリペプチドを生産する方法であって：
（ａ）複数のＸｙｌＴ対立遺伝子のそれぞれにおける変異および複数のＦｕｃＴ対立遺伝子のそれぞれにおける変異を含む、タバコ属の植物または植物細胞を提供するステップ、
ここで、前記の植物または植物細胞は、前記の植物または植物細胞で生産される糖タンパク質のＮ−グリカン構造上に、β−１，２−キシロシル−およびコアα−１，３−フコシル糖を検出可能なレベルで生産せず、
前記の植物または植物細胞は、（ｉ）ヌクレオチド配列（（ｉｉ）植物を発現可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリペプチドをコードする）、および、（ｉｉｉ）転写終結およびポリアデニル化に関与する配列、を含む核酸を含み、
前記ポリペプチドは前記植物にとって異種であり；および、
（ｂ）前記異種ポリペプチドが生産される十分な条件下および時間で、前記の植物または植物細胞を培養するステップ、
を含む、
方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法であって、
前記異種ポリペプチドを前記の植物または植物細胞から分離するステップをさらに含む、
方法。
【請求項１２】
請求項１０の方法であって、
前記変異が、１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼにより誘導されたものである、
方法。
【請求項１３】
請求項１２の方法であって、
前記の１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼが、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼである、
方法。
【請求項１４】
請求項１３の方法であって、
前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのそれぞれが、配列番号４５〜６３のいずれかに記載の配列に結合する、
方法。
【請求項１５】
複数のＸｙｌＴ対立遺伝子のそれぞれにおける変異および複数のＦｕｃＴ対立遺伝子のそれぞれにおける変異を含む、タバコ属の植物を作製するための方法であって、
前記方法が：
（ａ）機能性ＸｙｌＴ対立遺伝子および機能性ＦｕｃＴ対立遺伝子を含むタバコ属の植物細胞の集団を、内因性ＸｙｌＴ配列を標的とする１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼおよび内因性ＦｕｃＴ配列を標的とする１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼに接触させるステップ、
（ｂ）前記集団から、複数のＸｙｌＴ対立遺伝子および複数のＦｕｃＴ対立遺伝子が不活化されている細胞を選択するステップ、および、
（ｃ）前記の選択された植物細胞をタバコ属の植物に再生するステップ（ここで前記タバコ属の植物は、複数のＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および複数のＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を含み、前記植物で生産される糖タンパク質のＮ−グリカン構造上に、β−１，２−キシロシル−またはコアα−１，３−フコシル糖を検出可能なレベルで生産しない）、
を含む、
方法。
【請求項１６】
請求項１５の方法であって、
前記タバコ属の植物細胞がプロトプラストである、
方法。
【請求項１７】
請求項１６の方法であって、
１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のベクターを用いて、前記プロトプラストを形質転換するステップを含む、
方法。
【請求項１８】
請求項１７の方法であって、
前記の１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼが、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼである、
方法。
【請求項１９】
請求項１８の方法であって、
前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのそれぞれが、配列番号４５〜６３のいずれかに記載の配列を標的とする、
方法。
【請求項２０】
請求項１６の方法であって、
前記プロトプラスト中に、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼタンパク質を導入するステップを含む、
方法。
【請求項２１】
請求項１６の方法であって、
前記プロトプラストを培養して植物株を生産するステップをさらに含む、
方法。
【請求項２２】
請求項１６の方法であって、
前記プロトプラストから、ＸｙｌＴ遺伝子座の少なくとも一部分またはＦｕｃＴ遺伝子座の少なくとも一部分を含むゲノムＤＮＡを分離するステップを含む、
方法。
【請求項２３】
請求項１５の方法であって、
前記タバコ属の植物細胞がベンサミアナタバコ植物細胞である、
方法。
【請求項２４】
複数のＸｙｌＴ対立遺伝子のそれぞれにおける変異および複数のＦｕｃＴ対立遺伝子のそれぞれにおける変異を含む、タバコ属の植物を生産するための方法であって：
（ａ）少なくとも１つのＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および少なくとも１つのＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を含む第一のタバコ属の植物を、少なくとも１つのＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および少なくとも１つのＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を含む第二のタバコ属の植物と交配して子孫を得るステップ；および、
（ｂ）前記子孫から、複数のＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および複数のＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を含むタバコ属の植物を選択するステップ、
を含む、
方法。
【請求項２５】
請求項２４の方法であって、
変異が、１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼにより誘導されたものである、
方法。
【請求項２６】
請求項２５の方法であって、
前記の１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼが、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼである、
方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法であって、
前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのそれぞれが、配列番号４５〜６３のいずれかに記載の配列に結合する、
方法。
【請求項２８】
請求項２４の方法であって、
前記変異のそれぞれが、１つよりも多いヌクレオチドの欠失である、
方法。
【請求項２９】
請求項２４の方法であって、
前記子孫が、前記対立遺伝子のそれぞれにおける前記変異に関してホモ接合型である、
方法。
【請求項３０】
１つまたは複数のＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および１つまたは複数のＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を含む、タバコ属の植物または植物細胞であって、
前記の植物または植物細胞で生産される糖タンパク質のＮ−グリカン構造上のβ−１，２−キシロシル−およびコアα−１，３−フコシル糖のレベルが、前記変異を含まない対応する植物または植物細胞と比較して低下している、
タバコ属の植物または植物細胞。
【請求項３１】
請求項３０の植物または植物細胞であって、
前記変異が、配列番号１、２、または３に記載の１つまたは複数の配列における変異である、
植物または植物細胞。
【請求項３２】
請求項３０の植物または植物細胞であって、
前記変異が、１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼにより誘導されたものである、
植物または植物細胞。
【請求項３３】
請求項３２の植物または植物細胞であって、
前記の１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼが、転写アクチベーター様の（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼである、
植物または植物細胞。
【請求項３４】
請求項３３の植物または植物細胞であって、
前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのそれぞれが、配列番号４５〜６３のいずれかに記載の配列に結合する、
植物または植物細胞。
【請求項３５】
請求項３０の植物または植物細胞であって、
前記の植物または植物細胞が、組み換えポリペプチドをコードする核酸を含む、
植物または植物細胞。
【請求項３６】
請求項３０の植物または植物細胞であって、
前記変異のそれぞれが、１つよりも多いヌクレオチドの欠失である、
植物または植物細胞。
【請求項３７】
請求項３０の植物または植物細胞であって、
前記の１つまたは複数のＸｙｌＴ対立遺伝子および前記の１つまたは複数のＦｕｃＴ対立遺伝子のそれぞれが、内因性の核酸配列の欠失を有し、いかなる外因性の核酸も含まない、
植物または植物細胞。
【請求項３８】
請求項３０の植物または植物細胞であって、
前記の植物または植物細胞が、ベンサミアナタバコ植物または植物細胞である、
植物または植物細胞。
【請求項３９】
ポリペプチドを生産するための方法であって：
（ａ）１つまたは複数のＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および１つまたは複数のＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を含む、タバコ属の植物または植物細胞を提供するステップ、
ここで、前記の植物または植物細胞で生産される糖タンパク質のＮ−グリカン構造上のβ−１，２−キシロシル−およびコアα−１，３−フコシル糖のレベルは、前記変異を含まない対応する植物または植物細胞と比較して低下していて、
前記の植物または植物細胞は、（ｉ）ヌクレオチド配列（（ｉｉ）植物を発現可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリペプチドをコードする）、および、（ｉｉｉ）転写終結およびポリアデニル化に関与する配列、を含む組み換え核酸を含み、
前記ポリペプチドは前記植物にとって異種であり；および、
（ｂ）前記異種ポリペプチドが生産される十分な条件下および時間で、前記の植物または植物細胞を培養するステップ、
を含む、
方法。
【請求項４０】
請求項３９の方法であって、
前記の植物または植物細胞から、前記異種ポリペプチドを分離するステップをさらに含む、
方法。
【請求項４１】
請求項３９の方法であって、
前記変異が、１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼにより誘導されたものである、
方法。
【請求項４２】
請求項４１の方法であって、
前記の１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼが、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼである、
方法。
【請求項４３】
請求項４２の方法であって、
前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのそれぞれが、配列番号４５〜６３のいずれかに記載の配列に結合する、
方法。
【請求項４４】
１つまたは複数のＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および１つまたは複数のＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を含むタバコ属の植物を作製するための方法であって、
前記方法が：
（ａ）機能性ＸｙｌＴ対立遺伝子および機能性ＦｕｃＴ対立遺伝子を含むタバコ属の植物細胞の集団を、内因性ＸｙｌＴ配列を標的とする１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼおよび内因性ＦｕｃＴ配列を標的とする１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼに接触させるステップ、
（ｂ）前記集団から、１つまたは複数のＸｙｌＴ対立遺伝子および１つまたは複数のＦｕｃＴ対立遺伝子が不活化されている細胞を選択するステップ、および、
（ｃ）前記の選択された植物細胞をタバコ属の植物に再生するステップ（ここで前記タバコ属の植物は、１つまたは複数のＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および１つまたは複数のＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を含み、前記植物で生産される糖タンパク質のＮ−グリカン構造上のβ−１，２−キシロシル−およびコアα−１，３−フコシル糖のレベルが、前記変異を含まない対応する植物と比較して低下している）、
を含む、
方法。
【請求項４５】
請求項４４の方法であって、
前記タバコ属の植物細胞がプロトプラストである、
方法。
【請求項４６】
請求項４５の方法であって、
１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のベクターを用いて、前記プロトプラストを形質転換するステップを含む、
方法。
【請求項４７】
請求項４６の方法であって、
前記の１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼが、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼである、
方法。
【請求項４８】
請求項４７の方法であって、
前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのそれぞれが、配列番号４５〜６３のいずれかに記載の配列を標的とする、
方法。
【請求項４９】
請求項４５の方法であって、
前記プロトプラスト中に、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼタンパク質を導入するステップを含む、
方法。
【請求項５０】
請求項４５の方法であって、
前記プロトプラストを培養して植物株を生産するステップをさらに含む、
方法。
【請求項５１】
請求項４５の方法であって、
前記プロトプラストから、ＸｙｌＴ遺伝子座の少なくとも一部分またはＦｕｃＴ遺伝子座の少なくとも一部分を含むゲノムＤＮＡを分離するステップを含む、
方法。
【請求項５２】
請求項４４の方法であって、
前記タバコ属の植物細胞がベンサミアナタバコ植物細胞である、
方法。
【請求項５３】
１つまたは複数のＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および１つまたは複数のＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を含むタバコ属の植物を生産するための方法であって：
（ａ）少なくとも１つのＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および少なくとも１つのＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を含む第一のタバコ属の植物を、少なくとも１つのＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および少なくとも１つのＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を含む第二のタバコ属の植物と交配して子孫を得るステップ；および、
（ｂ）前記子孫から、１つまたは複数のＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および１つまたは複数のＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を含むタバコ属の植物を選択するステップ、
を含む、
方法。
【請求項５４】
請求項５３の方法であって、
変異が、１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼにより誘導されたものである、
方法。
【請求項５５】
請求項５４の方法であって、
前記の１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼが、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼである、
方法。
【請求項５６】
請求項５５の方法であって、
前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのそれぞれが、配列番号４５〜６３のいずれかに記載の配列に結合する、
方法。
【請求項５７】
請求項５３の方法であって、
前記変異のそれぞれが、１つよりも多いヌクレオチドの欠失である、
方法。
【請求項５８】
請求項５３の方法であって、
前記子孫が、前記対立遺伝子のそれぞれにおける前記変異に関してホモ接合型である、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７９０，８５０号および２０１２年１１月１日に出願された米国仮出願第６１／７２１，１９４号からの優先権の利益を主張する。
【０００２】
本明細書は、特にキシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子内に標的ノックアウトを作製することにより、ヒトおよび動物に対する投与のための治療用タンパク質の生産に適した植物を作製するための材料および方法に関する。また、本明細書は、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性が欠失した、または、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性が低下した、タバコ属品種に関する。
【背景技術】
【０００３】
動物糖タンパク質とは異なり、植物糖タンパク質は、β（１，２）キシロシルおよびコア−α（１，３）フコシル残基を有し、末端のβ（１，４）ガラクトシル残基およびシアル酸がない。β−１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（「ＸｙｌＴ」）は、ＵＤＰ−キシロースからタンパク質結合Ｎ−グリカンのコアβ−結合マンノースへの、キシロースの転移を触媒する。この酵素は植物および一部の非脊椎動物種に特有であり、人間または他の脊椎動物では生じない。α−１，３−フコシルトランスフェラーゼ（「ＦｕｃＴ」）は、ＧＤＰ−フコースからタンパク質結合Ｎ−グリカンのコアβ−結合Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）への、フコースの転移を触媒する。この酵素は、植物およびヒトを含む動物種で見られる。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書は、特にキシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子内に標的ノックアウトを作製することにより、ヒトおよび動物に対する投与に適した治療用タンパク質の生産に特に有用である植物を作製するための材料および方法を提供する。また、本明細書は、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性が欠失した、または、対応する標準のタバコ属品種と比較してキシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性が低下した、タバコ属品種を提供する。
【０００５】
本開示は、少なくとも一部分において、ヒトおよび動物に対する投与のためのタンパク質を生産するのに適した植物を、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の全コピーをノックアウトすることにより作製することができるという知見に基づく。また本開示は、少なくとも一部分において、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性が欠失したベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）品種の開発に基づく。キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性が欠失した生育可能な植物の作製ができるということは、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性を有する植物で生産されるタンパク質と比較して免疫原性またはアレルギー反応の発生率がより低い、ヒトおよび動物に対する投与のための治療用タンパク質の生産を手助けすることができる。
【０００６】
加えて、本開示は、少なくとも一部分において、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の１つまたは複数のコピーを、遺伝子の転写および／またはコードされるポリペプチドの翻訳が、対応する野生型の植物または植物細胞と比較して減少するように、ノックアウトするかそれ以外の方法で変異を導入することにより、ヒトおよび動物に対する投与のためのタンパク質を生産するのに適した植物を作製することができるという知見、および、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性が低下したベンサミアナタバコ品種の開発に基づく。キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性が低下した生育可能な植物の作製ができるということは、ヒトおよび動物に対する投与のための治療用タンパク質の生産を手助けすることもできる。植物により生産されるタンパク質中のグリカンレベルの低減は、植物に特異的な特性の一部をタンパク質から取り除き得る。そのようなタンパク質は、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性が低下していない植物で生産されるタンパク質よりも、免疫原性またはアレルギー反応の発生率が低下し得る。そのようなタンパク質はまた、グリカンレベルが低下していないタンパク質と比較して、機能性活性も改善し得る。
【０００７】
一態様では、本明細書の特徴は、複数のＸｙｌＴ対立遺伝子のそれぞれにおける変異、および、複数のＦｕｃＴ対立遺伝子のそれぞれにおける変異を有する、タバコ属の植物または植物細胞であり、前記の植物または植物細胞は、前記の植物または植物細胞で生産される糖タンパク質のＮ−グリカン構造上に、β−１，２−キシロシル−またはコアα−１，３−フコシル糖を検出可能なレベルで生産しない。変異は、配列番号１、２、または３に記載の１つまたは複数の配列にあってよい。変異は、１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼにより誘導されたものであってよい。１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼは、転写アクチベーター様の（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼであってよい。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼはそれぞれ、配列番号４５〜６３のいずれかに記載の配列に結合することができる。植物または植物細胞は、異種ポリペプチドをコードする核酸を含んでよい。各変異は、１つよりも多いヌクレオチドの欠失であってよい。複数のＸｙｌＴ対立遺伝子および複数のＦｕｃＴ対立遺伝子はそれぞれ、内因性の核酸配列の欠失を有してよく、いかなる外因性の核酸も含まない。植物または植物細胞は、ベンサミアナタバコ植物または植物細胞であってよい。
【０００８】
別の態様では、本明細書の特徴は、ポリペプチドを生産するための方法である。当該方法は、（ａ）複数のＸｙｌＴ対立遺伝子のそれぞれにおける変異および複数のＦｕｃＴ対立遺伝子のそれぞれにおける変異を有する、タバコ属の植物または植物細胞を提供するステップ、ここで、前記の植物または植物細胞は、前記の植物または植物細胞で生産される糖タンパク質のＮ−グリカン構造上に、β−１，２−キシロシル−およびコアα−１，３−フコシル糖を検出可能なレベルで生産せず、前記の植物または植物細胞は、（ｉ）ヌクレオチド配列（（ｉｉ）植物を発現可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリペプチドをコードする）、および、（ｉｉｉ）転写終結およびポリアデニル化に関与する配列、を含む核酸を含み、ここで、前記ポリペプチドは植物にとって異種であり；および、（ｂ）前記異種ポリペプチドが生産される十分な条件下および時間で、前記の植物または植物細胞を培養するステップ、を含んでよい。当該方法は、植物または植物細胞から、異種ポリペプチドを分離するステップをさらに含んでよい。変異は、１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼにより誘導されたものであってよい。１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼであってよい。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼはそれぞれ、配列番号４５〜６３のいずれかに記載の配列に結合することができる。
【０００９】
別の態様では、本明細書の特徴は、複数のＸｙｌＴ対立遺伝子のそれぞれにおける変異および複数のＦｕｃＴ対立遺伝子のそれぞれにおける変異を有する、タバコ属の植物を作製するための方法である。当該方法は、（ａ）機能性ＸｙｌＴ対立遺伝子および機能性ＦｕｃＴ対立遺伝子を有するタバコ属の植物細胞の集団を、内因性ＸｙｌＴ配列を標的とする１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼおよび内因性ＦｕｃＴ配列を標的とする１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼに接触させるステップ、（ｂ）前記集団から、複数のＸｙｌＴ対立遺伝子および複数のＦｕｃＴ対立遺伝子が不活化されている細胞を選択するステップ、および、（ｃ）選択された植物細胞をタバコ属の植物に再生するステップ（ここで前記タバコ属の植物は、複数のＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および複数のＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を含み、前記植物で生産される糖タンパク質のＮ−グリカン構造上に、β−１，２−キシロシル−またはコアα−１，３−フコシル糖を検出可能なレベルで生産しない）を含んでよい。タバコ属の植物細胞は、プロトプラストであってよい。当該方法は、１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のベクターを用いてプロトプラストを形質転換するステップを含んでよい。前記の１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼであってよい。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのそれぞれは、配列番号４５〜６３のいずれかに記載の配列を標的としてよい。当該方法は、プロトプラスト中に、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼタンパク質を導入するステップを含んでよい。当該方法は、プロトプラストを培養して植物株を生産するステップをさらに含んでよい。当該方法は、プロトプラスト由来のＸｙｌＴ遺伝子座の少なくとも一部分またはＦｕｃＴ遺伝子座の少なくとも一部分を含むゲノムＤＮＡを分離するステップを含んでよい。タバコ属の植物細胞は、ベンサミアナタバコ植物細胞であってよい。
【００１０】
さらに別の態様では、本明細書の特徴は、複数のＸｙｌＴ対立遺伝子のそれぞれにおける変異および複数のＦｕｃＴ対立遺伝子のそれぞれにおける変異を有する、タバコ属の植物を生産するための方法である。当該方法は、（ａ）少なくとも１つのＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および少なくとも１つのＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を有する第一のタバコ属の植物を、少なくとも１つのＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および少なくとも１つのＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を有する第二のタバコ属の植物と交配して子孫を得るステップ；および、（ｂ）子孫から、複数のＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および複数のＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を有するタバコ属の植物を選択するステップ、を含んでよい。変異は、１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼにより誘導されたものであってよい。前記の１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼであってよい。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのそれぞれは、配列番号４５〜６３のいずれかに記載の配列に結合することができる。各変異は、１つよりも多いヌクレオチドの欠失であってよい。前記子孫は、対立遺伝子のそれぞれにおける変異に関してホモ接合型であってよい。
【００１１】
また、本明細書の特徴は、１つまたは複数のＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および１つまたは複数のＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を有する、タバコ属の植物または植物細胞であり、ここで、前記の植物または植物細胞で生産される糖タンパク質のＮ−グリカン構造上のβ−１，２−キシロシル−およびコアα−１，３−フコシル糖のレベルは、変異を含まない対応する植物または植物細胞と比較して低下する。変異は、配列番号１、２、または３に記載の１つまたは複数の配列に存在してよい。変異は、１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼにより誘導されたものであってよい。１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼは、転写アクチベーター様の（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼであってよい。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのそれぞれは、配列番号４５〜６３のいずれかに記載の配列に結合することができる。植物または植物細胞は、異種ポリペプチド（例えば、組み換えポリペプチド）をコードする核酸を含んでよい。各変異は、１つよりも多いヌクレオチドの欠失であってよい。１つまたは複数のＸｙｌＴ対立遺伝子および１つまたは複数のＦｕｃＴ対立遺伝子のそれぞれは、内因性の核酸配列の欠失を有してよく、いかなる外因性の核酸も含まない。植物または植物細胞は、ベンサミアナタバコ植物または植物細胞であってよい。
【００１２】
別の態様では、本明細書の特徴は、ポリペプチドを生産するための方法である。当該方法は、（ａ）１つまたは複数のＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および１つまたは複数のＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を含む、タバコ属の植物または植物細胞を提供するステップ、ここで、前記の植物または植物細胞で生産される糖タンパク質のＮ−グリカン構造上のβ−１，２−キシロシル−およびコアα−１，３−フコシル糖のレベルは、変異を含まない対応する植物または植物細胞と比較して低下していて、前記の植物または植物細胞は、（ｉ）ヌクレオチド配列（（ｉｉ）植物を発現可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリペプチドをコードする）、および、（ｉｉｉ）転写終結およびポリアデニル化に関与する配列、を含む組み換え核酸を含み、前記ポリペプチドは植物にとって異種である；および、（ｂ）前記異種ポリペプチドが生産される十分な条件下および時間で、前記の植物または植物細胞を培養するステップ、を含んでよい。当該方法は、植物または植物細胞から異種ポリペプチドを分離するステップをさらに含んでよい。変異は、１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼにより誘導されたものであってよい。１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼであってよい。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのそれぞれは、配列番号４５〜６３のいずれかに記載の配列に結合することができる。
【００１３】
さらに別の態様では、本明細書の特徴は、１つまたは複数のＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および１つまたは複数のＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を有する、タバコ属の植物を作製するための方法である。当該方法は、（ａ）機能性ＸｙｌＴ対立遺伝子および機能性ＦｕｃＴ対立遺伝子を有するタバコ属の植物細胞の集団を、内因性ＸｙｌＴ配列を標的とする１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼおよび内因性ＦｕｃＴ配列を標的とする１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼに接触させるステップ、（ｂ）前記集団から、１つまたは複数のＸｙｌＴ対立遺伝子および１つまたは複数のＦｕｃＴ対立遺伝子が不活化されている細胞を選択するステップ、および、（ｃ）前記の選択された植物細胞をタバコ属の植物に再生するステップ（ここで前記タバコ属の植物は、１つまたは複数のＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および１つまたは複数のＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を含み、前記植物で生産される糖タンパク質のＮ−グリカン構造上のβ−１，２−キシロシル−およびコアα−１，３−フコシル糖のレベルが、変異を含まない植物と比較して低下している）、を含んでよい。タバコ属の植物細胞は、プロトプラストであってよい。当該方法は、１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のベクターを用いてプロトプラストを形質転換するステップを含んでよい。１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼであってよい。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのそれぞれは、配列番号４５〜６３のいずれかに記載の配列を標的とすることができる。当該方法は、プロトプラスト中に、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼタンパク質を導入するステップを含んでよい。当該方法は、プロトプラストを培養して植物株を生産するステップをさらに含んでよい。当該方法は、ＸｙｌＴ遺伝子座の少なくとも一部分またはＦｕｃＴ遺伝子座の少なくとも一部分を含むゲノムＤＮＡを、プロトプラストから分離するステップを含んでよい。タバコ属の植物細胞は、ベンサミアナタバコ植物細胞であってよい。
【００１４】
別の態様では、本明細書の特徴は、１つまたは複数のＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および１つまたは複数のＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を有するタバコ属の植物を生産するための方法である。当該方法は、（ａ）少なくとも１つのＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および少なくとも１つのＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を含む第一のタバコ属の植物を、少なくとも１つのＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および少なくとも１つのＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を含む第二のタバコ属の植物と交配して子孫を得るステップ；および、（ｂ）前記子孫から、１つまたは複数のＸｙｌＴ対立遺伝子における変異および１つまたは複数のＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を含むタバコ属の植物を選択するステップ、を含んでよい。変異は、１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼにより誘導されたものであってよい。１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼであってよい。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのそれぞれは、配列番号４５〜６３のいずれかに記載の配列に結合することができる。各変異は、１つよりも多いヌクレオチドの欠失であってよい。前記子孫は、対立遺伝子のそれぞれにおける変異に関してホモ接合型であってよい。
【００１５】
他に定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が関連する当業者の一人によって一般に理解されるのと同様の意味を有する。本明細書中に記載のものと同様または同等の方法および材料を用いて本発明を実施することができるが、適切な方法および材料を以下に示す。本明細書中に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により援用される。矛盾する場合は、本明細書（定義を含む）が支配する。加えて、材料、方法、および実施例は説明目的のみであり、限定を意図しない。
【００１６】
本発明の１つまたは複数の実施態様の詳細を、添付の図面および以下の説明に示す。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明と図面および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＸｙｌＴ  ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの標的部位を示す。ＸｙｌＴ遺伝子の両方（ＸｙｌＴ１およびＸｙｌＴ２）のＤＮＡ配列を、開始コドン（ＡＴＧ）から示す（配列番号１；２つのＸｙｌＴ遺伝子のＤＮＡ配列は、この領域内で同一である）。下線を引いた配列は、ＸｙｌＴ遺伝子を認識するＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの標的部位を示す。
【図２】図２は、ＦｕｃＴ  ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの標的部位を示す。２つのＦｕｃＴ遺伝子のＤＮＡ配列を、開始コドン（ＡＴＧ）から示す（ＦｕｃＴ１、配列番号２；ＦｕｃＴ２、配列番号３）。下線を引いた配列は、ＦｕｃＴ遺伝子を認識するＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの標的部位を示す。ＦｕｃＴ１およびＦｕｃＴ２間の配列の違いを太字で示す。
【図３】図３は、ＸｙｌＴ遺伝子における、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼにより誘導された変異の例を示す。ＸｙｌＴ１遺伝子（上のパネル）またはＸｙｌＴ２遺伝子（下のパネル）のいずれかにおいて、各パネルの一番上の行は、ＸｙｌＴ＿Ｔ０４  ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの認識部位のＤＮＡ配列を示す（下線および大文字）。他の配列は、不正確な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により誘導された代表的な変異を示し、欠失サイズを右に示す。
【図４】図４は、ＦｕｃＴ遺伝子における、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼにより誘導された変異の例を示す。ＦｕｃＴ１遺伝子（上のパネル）またはＦｕｃＴ２遺伝子（下のパネル）のいずれかにおいて、各パネルの一番上の行は、ＦｕｃＴ２＿Ｔ０２  ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの認識部位のＤＮＡ配列を示す（下線および大文字）。他の配列は、不正確なＮＨＥＪにより誘導された代表的な変異を示し、欠失サイズを右に示す。
【図５】図５は、ＮＢ１３−１０５ａおよびＮＢ１３−２１３ａ植物株におけるＦｕｃＴ１およびＦｕｃＴ２の変異プロファイルを示す。各アライメントに関して、上の配列は野生型ベンサミアナタバコ由来であり、下の配列は植物変異体ＮＢ１３−１０５ａまたはＮＢ１３−２１３ａ由来である。ＦｕｃＴ２＿Ｔ０２  ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの認識部位は、各アライメントにおいて下線が引かれている。
【図６】図６は、ＮＢ１５−１１ｄおよびＮＢ１２−１１３ｃ植物株におけるＸｙｌＴ１およびＸｙｌＴ２の変異プロファイルを示す。各アライメントに関して、上の配列は野生型ベンサミアナタバコ由来であり、下の配列は植物変異体ＮＢ１５−１１ｄまたはＮＢ１２−１１３ｃ由来である。ＸｙｌＴ＿Ｔ０４  ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの認識部位は、各アライメントにおいて下線が引かれている。
【図７】図７は、ＮＢ１４−２９ａ植物株におけるＦｕｃＴ１およびＦｕｃＴ２の変異プロファイルを示す。各アライメントに関して、上の配列は野生型ベンサミアナタバコ由来であり、下の配列はＮＢ１４−２９ａ由来である。ＦｕｃＴ２＿Ｔ０２  ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの認識部位は、各アライメントにおいて下線が引かれている。
【図８】図８は、ＮＢ１４−２９ａ植物株におけるＸｙｌＴ１およびＸｙｌＴ２の変異プロファイルを示す。各アライメントに関して、上の配列は野生型ベンサミアナタバコ由来であり、下の配列はＮＢ１４−２９ａ由来である。ＸｙｌＴ＿Ｔ０４  ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの認識部位は、各アライメントにおいて下線が引かれている。
【図９】図９は、ＮＢ１３−１０５ａ、ＮＢ１３−２１３ａおよび野生型ベンサミアナタバコにおける、フコースを有するＮ−グリカンの相対的強度を比較する。Ｎ−グリカンのデータは、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ（マトリクス援助レーザー脱着−イオン化飛行時間型質量分析法）を介して内因性のベンサミアナタバコタンパク質から得られた。
【図１０】図１０は、ＮＢ１２−１１３ｃ、ＮＢ１５−１１ｄおよび野生型ベンサミアナタバコにおける、キシロースを有するＮ−グリカンの相対的強度を比較する。Ｎ−グリカンのデータは、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳを介して内因性のベンサミアナタバコタンパク質から得られた。
【図１１】図１１は、ＮＢ１４−２９ａおよび野生型ベンサミアナタバコにおける、フコースおよびキシロースを有するＮ−グリカンの相対的強度を比較する。Ｎ−グリカンのデータは、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳを介して内因性のベンサミアナタバコタンパク質から得られた。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書は、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性が欠失したタバコ属の植物、ならびに、そのような植物を生産するための方法、および、ヒトおよび動物に対する投与に適したポリペプチドを生産するためにそのような植物を用いる方法を提供する。タバコ属の種類は、例えば、ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、ｔａｂａｃｕｍ、ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、ａｃａｕｌｉｓ、ａｃｕｍｉｎａｔｅ、ａｆｒｉｃａｎａ、ａｌａｔａ、ａｍｅｇｈｉｎｏｉ、ａｍｐｌｅｘｉｃａｕｌｉｓ、ａｒｅｎｔｓｉｉ、ａｔｔｅｎｕａｔｅ、ａｚａｍｂｕｊａｅ、ｂｅｎａｖｉｄｅｓｉｉ、ｂｏｎａｒｉｅｎｓｉｓ、ｂｕｒｂｉｄｇｅａｅ、ｃａｖｉｃｏｌａ、ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ、ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ、ｃｏｒｙｍｂｏｓａ、ｃｕｔｌｅｒｉ、ｄｅｂｎｅｙｉ、ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ、ｅｘｉｇｕａ、ｆｏｒｇｅｔｉａｎａ、ｆｒａｇｒａｎｓ、ｇｌａｕｃａ、ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、ｇｏｏｄｓｐｅｅｄｉｉ、ｇｏｓｓｅｉ、ｈｅｓｐｅｒｉｓ、ｈｅｔｅｒａｎｔｈａ、ｉｎｇｕｌｂａ、ｋａｗａｋａｍｉｉ、ｋｎｉｇｈｔｉａｎａ、ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ、ｌｉｎｅａｒｉｓ、ｌｏｎｇｉｂｒａｃｔｅａｔａ、ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ、ｍａｒｉｔｉｍｅ、ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ、ｍｉｅｒｓｉｉ、ｍｕｔａｂｉｌｉｓ、ｎｅｓｏｐｈｉｌａ、ｎｏｃｔｉｆｌｏｒａ、ｎｕｄｉｃａｕｌｉｓ、ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ、ｏｔｏｐｈｏｒａ、ｐａａ、ｐａｌｍｅｒｉ、ｐａｎｉｃｕｌａｔａ、ｐａｕｃｉｆｌｏｒａ、ｐｅｔｕｎｉｏｄｅｓ、ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ、ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ、ｒａｉｍｏｎｄｉｉ、ｒｅｐａｎｄａ、ｒｏｓｕｌａｔａ、ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ、ｒｕｓｔｉｃａ、ｓｅｔｃｈｅｌｌｉｉ、ｓｉｍｕｌａｎｓ、ｓｏｌａｎｉｆｏｌｉａ、ｓｐｅｇａｚｚｉｎｉｉ、ｓｔｅｎｏｃａｒｐａ、ｓｔｏｃｋｔｏｎｉｉ、ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ、ｔｈｒｙｓｉｆｌｏｒａ、ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ、ｔｒｕｎｃａｔａ、ｕｍｂｒａｔｉｃａ、ｕｎｄｕｌａｔｅ、ｖｅｌｕｔｉｎａ、ｗｉｇａｎｄｉｏｉｄｅｓ、およびｗｕｔｔｋｅｉの種を含む。
【００１９】
ベンサミアナタバコには、キシロシルトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）遺伝子ファミリーにおいて少なくとも２つのメンバー（ＸｙｌＴ１およびＸｙｌＴ２）、および、フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）遺伝子ファミリーにおいて少なくとも２つのメンバー（ＦｕｃＴ１およびＦｕｃＴ２）が存在する。自然発生のタバコ属ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴのヌクレオチド配列の代表例を表４に示す。本明細書で提供されるタバコ属の植物、細胞、植物部位、種子、およびそれらの子孫は、各遺伝子の発現が減少または完全に阻害されるように、複数の内因性ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ対立遺伝子のそれぞれにおいて変異を有することができる。植物、細胞、部位、種子、および子孫は、そこに生産される糖タンパク質のＮ−グリカン構造上に、β−１，２−キシロシル−またはコアα−１，３−フコシル糖を検出可能なレベルで示さない。
【００２０】
一部の実施態様では、本明細書で提供されるタバコ属の植物、細胞、植物部位、種子、およびそれらの子孫は、各遺伝子の発現が減少する（例えば、部分的または完全に減少する）ように、１つまたは複数の内因性ＸｙｌＴ対立遺伝子および１つまたは複数の内因性ＦｕｃＴ対立遺伝子において、変異を有することができる。発現レベルの低下は、ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ変異を含まない対応する標準の植物、細胞、部位、種子、および子孫において生産される糖タンパク質のＮ−グリカン構造上のβ−１，２−キシロシル−およびコアα−１，３−フコシル糖のレベルと比較して、そこに生産される糖タンパク質のＮ−グリカン構造上のβ−１，２−キシロシル−およびコアα−１，３−フコシル糖のレベルが低下した、植物、細胞、部位、種子、および子孫を生産するのに十分であってよい。
【００２１】
本明細書で提供される植物、植物細胞、植物部位、種子、および植物子孫は、レアカットエンドヌクレアーゼ、例えばＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ系を用いて生産し、ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ遺伝子内に標的ノックアウトを作製することができる。したがって、本開示は、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼを使用した、ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ遺伝子の全ての対立遺伝子における標的ノックアウトに起因したヒトおよび動物の治療用タンパク質の生産に特に適する、植物および関連産物（例えば、種子および植物部位）を生産するための材料および方法を提供する。所望の植物材料を生産するために用いられる、他のレアカットで配列特異的なヌクレアーゼは、改変ホーミングエンドヌクレアーゼまたは亜鉛フィンガーヌクレアーゼを含む。
【００２２】
「植物」および「植物部位」は、親植物の特徴的な形質を保持する細胞、組織、器官、種子、および切断部位（例えば、根、葉、および花）を指す。「種子」は、受精の存在下または不存在下で形成されるかを問わず、および、種子構造が稔性または不稔性であるか否かに関係なく、開花におけるその正常な成熟ポイントに続く植物の胚珠の連続的な分化により形成される任意の植物構造を指す。
【００２３】
用語「対立遺伝子（単数または複数）」は、特定の遺伝子座における遺伝子の１つまたは複数の任意の代替型を意味する。生物の２倍体（または複２倍体）細胞では、所定の遺伝子の対立遺伝子は、染色体上の特定の位置または遺伝子座に存在する。１つの対立遺伝子は、相同染色体ペアの各染色体上に存在する。「ヘテロ接合型」対立遺伝子は、対応する相同染色体ペア上に個々に位置する特定の遺伝子座に存在する、２つの異なる対立遺伝子である。「ホモ接合型」対立遺伝子は、細胞中の対応する相同染色体ペア上に個々に位置する特定の遺伝子座に存在する、２つの同一の対立遺伝子である。
【００２４】
本明細書において用いられる「野生型」は、天然に最も一般的に生じるような、植物または遺伝子の典型的な型を指す。「野生型ＸｙｌＴ対立遺伝子」は、機能性ＸｙｌＴタンパク質をコードする自然発生のＸｙｌＴ対立遺伝子（例えば、自然発生のタバコ属の植物に見られる）であり、一方で、「ＸｙｌＴ対立遺伝子変異体」は、機能性ＸｙｌＴタンパク質をコードしないＸｙｌＴ対立遺伝子である。そのような「ＸｙｌＴ対立遺伝子変異体」は、その核酸配列内に１つまたは複数の変異を含むことができ、その変異（単数または複数）は、植物または植物細胞においてインビボで検出可能な量の機能性ＸｙｌＴタンパク質をもたらさない。同様に、「野生型ＦｕｃＴ対立遺伝子」は、機能性ＦｕｃＴタンパク質をコードする自然発生のＦｕｃＴ対立遺伝子であり、一方で、「ＦｕｃＴ対立遺伝子変異体」は、機能性ＦｕｃＴタンパク質をコードしないＦｕｃＴ対立遺伝子である。そのような「ＦｕｃＴ対立遺伝子変異体」は、その核酸配列内に１つまたは複数の変異を含むことができ、その変異（単数または複数）は、植物または植物細胞においてインビボで検出可能な量の機能性ＦｕｃＴタンパク質をもたらさない。
【００２５】
本明細書における用語「レアカットエンドヌクレアーゼ」は、約１２〜４０ｂｐの長さ（例えば、１４〜４０ｂｐの長さ）の認識配列（標的配列）を有する核酸配列を標的とするエンドヌクレアーゼ活性を有する、天然または改変のタンパク質を指す。典型的なレアカットエンドヌクレアーゼは、それらの認識部位の内部を切断し、３’ＯＨまたは５’ＯＨ突出を有する４ｎｔスタガードカットを生じる。これらのレアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、例えばホーミングエンドヌクレアーゼの野生型または変異タンパク質であってよく、より具体的には、ドデカペプチドファミリー（ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号７９）に属し；ＷＯ２００４／０６７７３６を参照）、または、ＤＮＡ結合ドメインと切断活性を有する触媒ドメインとを結合する融合タンパク質に由来してよい。ＴＡＬ−エフェクターエンドヌクレアーゼおよび亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインとＤＮＡ結合ドメインとの融合の例である。カスタマイズされたＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼは、商品名ＴＡＬＥＮ（商標）（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）の下で市販されている。レアカットエンドヌクレアーゼの総説に関しては、Ｂａｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：２３−２６，２０１２を参照。
【００２６】
本明細書において用いられる「突然変異誘発」は、変異が選択ＤＮＡ配列内に導入されるプロセスを指す。本明細書に記載の方法では、例えば、突然変異誘発は、植物細胞において選択ＤＮＡ配列を標的としたＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼによってなされる二本鎖ＤＮＡ切断を介して生じる。そのような突然変異誘発は、「ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼにより誘導される変異」を生じ、標的遺伝子の発現が減少する。突然変異誘発に続いて、植物は、公知の技術（例えば、従来の生育方法による種まきの後の自家受粉）を用いて、処理細胞から再生することができる。
【００２７】
ある場合には、核酸は、代表的なＸｙｌＴまたはＦｕｃＴヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７５％の配列相同性を有するヌクレオチド配列を有してよい。例えば、ヌクレオチド配列は、代表的な自然発生のＸｙｌＴまたはＦｕｃＴヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列相同性を有することができる。
【００２８】
特定の核酸またはアミノ酸の配列と、特定の配列識別番号により参照される配列との間の、配列相同性のパーセントは、以下のようにして決定する。始めに、核酸またはアミノ酸の配列を、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．１４およびＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．１４を含むＢＬＡＳＴＺの独立型からのＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｂｌ２ｓｅｑ）プログラムを用いて、特定の配列識別番号で示される配列と比較する。このＢＬＡＳＴＺの独立型は、ｆｒ．ｃｏｍ／ｂｌａｓｔまたはｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにてオンラインで得ることができる。Ｂｌ２ｓｅｑプログラムの使い方を説明する指示書は、ＢＬＡＳＴＺに付属のリードミーファイルで見ることができる。Ｂｌ２ｓｅｑは、２つの配列間の比較を、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを用いて行なう。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために用いられ、一方で、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために用いられる。２つの核酸配列を比較するために、オプションは以下のように設定する：−ｉは比較される第一の核酸配列を含むファイルに設定し（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）；−ｊは、比較される第二の核酸配列を含むファイルに設定し（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）；−ｐは、ｂｌａｓｔｎに設定し；−ｏは、任意の所望のファイル名に設定し（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）；−ｑは−１に設定し；−ｒは２に設定し；そして、全ての他のオプションは、それらのデフォルトの設定のままにする。例えば、以下のコマンドを用いて２つの配列間の比較を含む出力ファイルを出力することができる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ  −ｉ  ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ  −ｊ  ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ  −ｐ  ｂｌａｓｔｎ  −ｏ  ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ  −ｑ  −１  −ｒ  ２。２つのアミノ酸配列を比較するために、Ｂｌ２ｓｅｑのオプションは、以下のように設定する：−ｉは、比較される第一のアミノ酸配列を含むファイルに設定し（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）；−ｊは、比較される第二のアミノ酸配列を含むファイルに設定し（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）；−ｐは、ｂｌａｓｔｐに設定し；−ｏは、任意の所望のファイル名に設定し（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）；そして、全ての他のオプションは、それらのデフォルトの設定のままにする。例えば、以下のコマンドを用いて、２つのアミノ酸配列間の比較を含む出力ファイルを出力することができる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ  −ｉ  ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ  −ｊ  ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ  −ｐ  ｂｌａｓｔｐ  −ｏ  ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ。２つの比較配列がホモロジーを共有する場合は、指定の出力ファイルは、それらのホモロジー領域をアライメント配列として示す。２つの比較配列がホモロジーを共有しない場合は、指定の出力ファイルは、アライメント配列を示さない。
【００２９】
アライメントしたら、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数をカウントすることによりマッチ数を決定する。同定配列（例えば、配列番号１）に示す配列長、または、連結長（例えば、同定配列に示す配列由来の１００の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基）のいずれかでマッチ数を割った後に、生じた値に１００をかけることにより、配列相同性のパーセントを決定する。例えば、配列番号１に示す配列とアライメントした場合に８０マッチを有する核酸配列は、配列番号１に示す配列と８８．９％相同である（すなわち、８０÷９０×１００＝８８．９）。なお、配列相同性のパーセント値は四捨五入する。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３、および７５．１４は７５．１に切り捨てられ、一方で、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８、および７５．１９は７５．２に切り上げられる。なおまた、長さの値は常に整数である。
【００３０】
内因性の標的配列を選択する方法、および、そのような配列を標的とするＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼを生産する方法は、他で記載されるとおりに行なってよい。例えば、国際公開公報ＷＯ２０１１／０７２２４６を参照し、それはその全体が参照により本明細書中に援用される。ＴＡＬエフェクターは、キサントモナス属内の植物病原細菌に見られる。これらのタンパク質は、宿主ＤＮＡに結合することにより、および、エフェクター特異的な宿主遺伝子を活性化することにより、疾患において重要な役割を果たし、または、防御を引き起こす（例えば、Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：１１２２−１１２５，２００５；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：１０５０３−１０５０８，２００６；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８−６５１，２００７；Ｓｕｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：１０７２０−１０７２５，２００７；および、Ｒｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４５−６４８，２００７を参照）。特異性は、エフェクター可変性の不完全な数（ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ）、典型的には３４アミノ酸リピートに依存する（Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６３：２５６−２７２，２００６；および、ＷＯ２０１１／０７２２４６）。多型は、主に、繰り返しの１２位および１３位に存在し、本明細書において「ｒｅｐｅａｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ−ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ（ＲＶＤ）」と呼ぶ。
【００３１】
ＴＡＬエフェクターのＲＶＤは、一部の縮重を有しかつ明らかなコンテキスト依存なく、それらの標的部位内のヌクレオチドに直接的な直線状で対応（１つのＲＶＤが１つのヌクレオチドに対応）する。タンパク質−ＤＮＡ認識に関するこのメカニズムは、新規の標的特異的なＴＡＬエフェクターの標的部位の予測、ならびに、標的部位の選択および選択部位に対する結合特異性を有する新規のＴＡＬエフェクターの設計を可能にする。
【００３２】
ＴＡＬエフェクターのＤＮＡ結合ドメインは、エンドヌクレアーゼ配列などの他の配列と融合することができ、特異的な選択ＤＮＡ配列を標的とするキメラエンドヌクレアーゼをもたらし、それゆえに、標的配列において、または標的配列付近で、ＤＮＡの切断を生じる。ＤＮＡでのそのような切断（すなわち、二本鎖切断）は、例えばＮＨＥＪまたは相同組換えを介して、野生型ＤＮＡ配列に変異を誘導することができる。ある場合には、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼを用いて、複合体ゲノムにおいて部位特異的な突然変異誘発を促進することができ、ノックアウトし、またはそれ以外では遺伝子機能をかなりの精度かつ高効率で変化させる。以下の実施例に記載のように、ベンサミアナタバコのＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ対立遺伝子のそれぞれを標的とするＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼを用いて、内因性遺伝子を突然変異誘発することができ、これらの遺伝子を検出可能に発現しない植物をもたらす。一部のエンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）が二量体として機能するという事実を用いて、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの標的特異性を高めることができる。例えば、ある場合には、異なるＤＮＡ配列（例えば、図１および図２に示した下線を引いた標的配列）を標的としたＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの単量体ペアを用いることができる。２つのＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ認識部位が極めて接近している場合、図１および図２に示すように、不活性の単量体は一体となってＤＮＡを切断する機能性酵素を産出することができる。ＤＮＡ結合がヌクレアーゼを活性化するように要求することで、高い部位特異的な制限酵素を産出することができる。
【００３３】
本明細書において用いられる用語「発現」は、センスまたはアンチセンスのｍＲＮＡを産生する特定の核酸配列の転写、および／または、ポリペプチド（例えば治療用タンパク質）を産生するセンスｍＲＮＡ分子の翻訳（その後に翻訳後イベントが続く、または続かない）を指す。
【００３４】
植物または植物細胞における遺伝子またはポリペプチドの「発現の低下」は、遺伝子の転写および／またはコードされるポリペプチドの翻訳が、対応する野生型植物または植物細胞と比較して減少するように、遺伝子またはポリペプチドを、阻害、中断、ノックアウト、またはノックダウンすることを含む。発現レベルは、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、ドットブロットハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｕｎ−ｏｎおよび／またはｎｕｃｌｅａｒ  ｒｕｎ−ｏｆｆ、ＲＮａｓｅプロテクション、または免疫学的および酵素学的方法、例えばＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、およびウェスタンブロッティングなどの方法を用いて測定することができる。
【００３５】
ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼを用いて内因性遺伝子内に変異を有する植物、植物細胞、または植物部位を生産する方法は、例えば、本明細書中の実施例に記載の方法を含む。例えば、選択されたＸｙｌＴまたはＦｕｃＴ配列（例えば、図１に示すＸｙｌＴ配列または図２に示すＦｕｃＴ配列）を標的とするＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードする核酸を、それらを発現することができる植物細胞（例えばプロトプラスト）中に形質転換することができる。細胞を続けて分析して、例えば上述のように発現レベルを検出するための核酸に基づく分析またはタンパク質に基づく分析を介して、または、ゲノム遺伝子座での変異を検出するための核酸に基づく分析（例えば、ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンシング、または、ＰＣＲの後のＴ７Ｅ１アッセイ；Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９：９２８３−９２９３，２０１１）を用いて、標的部位（単数または複数）に変異が導入されているかどうか決定することができる。
【００３６】
突然変異誘発された集団またはその集団の次の世代を、変異に由来する所望の特性（単数または複数）（例えば、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性の欠失、または、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性の低下）に関してスクリーニングすることができる。あるいは、突然変異誘発された集団またはその集団の次の世代を、ＸｙｌＴまたはＦｕｃＴ遺伝子における変異に関してスクリーニングすることができる。例えば、Ｍ１植物の子孫Ｍ２世代を、ＸｙｌＴまたはＦｕｃＴ遺伝子における変異の存在に関して評価してよい。「集団」は、一般的な遺伝子プールを共有する個体の任意のグループである。本明細書において用いられる「Ｍ０」は、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼに曝された植物細胞（およびそれから生育した植物）を指し、一方で、「Ｍ１」は、自家受粉したＭ０植物により生産された種子およびそのような種子から生育した植物を指す。「Ｍ２」は、自家受粉したＭ１植物の子孫（種子および植物）であり、「Ｍ３」は、自家受粉したＭ２植物の子孫であり、および、「Ｍ４」は、自家受粉したＭ３植物の子孫である。「Ｍ５」は、自家受粉したＭ４植物の子孫である。「Ｍ６」、「Ｍ７」などは、それぞれ、前の世代の自家受粉した植物の子孫である。本明細書において用いられる用語「自家（ｓｅｌｆｅｄ）」は、自家受粉を意味する。
【００３７】
１つまたは複数のＭ１タバコ植物は、個々の突然変異誘発した（Ｍ０）植物細胞（およびそれから生育した植物）から得ることができ、および、少なくとも１つの植物は、ＸｙｌＴまたはＦｕｃＴ遺伝子内に変異を含むものとして同定することができる。Ｍ１タバコ植物は、ＸｙｌＴおよび／またはＦｕｃＴの遺伝子座での対立遺伝子変異体に関してヘテロ接合型であってよく、そして、野生型の対立遺伝子の存在に起因して、キシロシル−またはフコシルトランスフェラーゼ活性を示す。あるいは、Ｍ１タバコ植物は、ＸｙｌＴまたはＦｕｃＴの遺伝子座に対立遺伝子変異体を有してよく、そして、キシロシル−またはフコシルトランスフェラーゼ活性が欠失した表現型を示す。そのような植物は、ヘテロ接合型であってよく、そして、そのようなドミナントネガティブの抑制の現象に起因して、野生型対立遺伝子の存在にもかかわらず、キシロシル−またはフコシルトランスフェラーゼ活性が欠失していてよく、または、ＸｙｌＴまたはＦｕｃＴの遺伝子座において両方の対立遺伝子で独立に誘導された変異に起因してホモ接合型であってよい。
【００３８】
ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ対立遺伝子変異体を保有するタバコ植物は、新規かつ有用な株、品種および雑種を作製するための植物繁殖プログラムにおいて用いることができる。したがって、一部の実施態様では、ＸｙｌＴ遺伝子における少なくとも１つの変異およびＦｕｃＴ遺伝子における少なくとも１つの変異を含む、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、またはその後の世代のタバコ植物を、第二のタバコ属の植物と交配し、そして、ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ遺伝子の変異が存在する交配の子孫を同定する。第二のタバコ属の植物は、本明細書に記載される種および品種の１つであってよいことが理解されよう。第二のタバコ属植物は、それを交配した植物と同一のＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ変異を含むことができ、異なるＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ変異を含むことができ、または、ＸｙｌＴおよび／またはＦｕｃＴの遺伝子座において野生型であることができることも理解されよう。
【００３９】
繁殖は、公知の方法により行なうことができる。ＤＮＡフィンガープリンティング、ＳＮＰまたは同様の技術を、マーカー利用選抜（ｍａｒｋｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  （ＭＡＳ））の繁殖プログラムで用いて、ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ対立遺伝子変異体を他のタバコ類へ移行または繁殖してよい。例えば、繁殖者は、農学的に望ましい遺伝子型を有する対立遺伝子変異体を含む遺伝子型の雑種形成から、分離集団を作製することができる。Ｆ２または戻し交配世代における植物は、ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ配列またはそれらのフラグメントから開発されたマーカーを用いてスクリーニングすることができる。対立遺伝子変異体を保有するものとして同定された植物を戻し交配または自家受粉して、スクリーニングする第二の集団を作製することができる。期待する遺伝様式または用いるＭＡＳ技術に応じて、所望の個々の植物の同定を助けるために、戻し交配の各サイクルの前に選択植物を自家受粉することが必要であってよい。循環性の親の所望の表現型に戻るまで、戻し交配または他の繁殖方法を繰り返すことができる。
【００４０】
成功した交配は、稔性でありかつ必要に応じて親のうちの１つと戻し交配することのできるＦ１植物を生じる。一部の実施態様では、標準的な方法に従って、例えば、本明細書に記載のＸｙｌＴおよびＦｕｃＴに関するヌクレオチド配列情報に基づくプライマーを用いたＰＣＲ方法を用いて、Ｆ２世代における植物集団はＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ遺伝子発現に関してスクリーニングされ、例えばＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ遺伝子の不存在に起因して、植物はＸｙｌＴおよびＦｕｃＴを発現することができないことが同定される。選択植物はそれから、親のうちの１つと交配し、第一の戻し交配（ＢＣ１）世代植物を自家受粉してＢＣ１Ｆ２集団を生産し、それを再び、変異型のＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ遺伝子の発現に関してスクリーニングする（例えば、ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ遺伝子のヌルバージョン）。戻し交配、自家受粉、およびスクリーニングの工程は繰り返され、例えば少なくとも４回、稔性でありかつ循環性の親と合理的に類似する植物を最終のスクリーニングが産出するまで繰り返される。この植物は、必要に応じて自家受粉することができ、その後、その子孫を再びスクリーニングして、その植物がＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ遺伝子発現が欠失していることを確認することができる。場合により、選択植物の細胞遺伝学的分析を行なって、染色体組および染色体対合の関係を確認することができる。選択植物の繁殖者の種子は、例えば、フィールドテスト、ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴに関するヌル状態の確認、および／または、キシロシル−およびフコシルトランスフェラーゼ活性のレベルを決定するための乾葉の分析を含む、標準的な方法を用いて生産することができる。
【００４１】
第一のタバコ親変異体と第二の野生型タバコ親との間の交配から生じるオリジナルのＦ１雑種が、タバコ親変異体に戻し交配または雑種形成される状況では、戻し交配の子孫を自家受粉して、ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ対立遺伝子変異体に関してスクリーニングされるＢＣ１Ｆ２世代を作製することができる。
【００４２】
本明細書に記載のタバコ植物変異体を用いた植物繁殖プログラムの結果は、新規かつ有用な株、雑種および品種であり得る。本明細書において用いられる用語「品種」は、同種の他の植物からそれらを区別する不変の特徴を共有する植物の集団を指す。品種は、常にではないが市販されることが多い。１つまたは複数の特徴的な形質を保有しながら、品種は、その品種内の個体間の非常に小さな全般的多様性により、さらに特徴付けることができる。「純系」品種は、数世代の自家受粉および選択、または、組織または細胞培養技術を用いた単一の親からの栄養繁殖により作製され得る。品種は本質的に、別の株または品種から得ることができる。植物の新品種の保護に関する国際条約（１９６１年１２月２日。１９７２年１１月１０日、１９７８年１０月２３日、および１９９１年３月１９日に、ジュネーブにて改正）によって定義されるとおり、品種は、ａ）原品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせに起因する本質的な特徴の発現を保持しながら、原品種から、または、主に原品種から得られる品種から、主に得られる場合；ｂ）原品種から明確に区別可能である場合；および、ｃ）派生行為（ａｃｔ  ｏｆ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）に起因する違いを除き、原品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせに起因する本質的な特徴の発現において原品種に準ずる場合、には、原品種から「本質的に得られる」。本質的に得られる品種は、例えば、形質転換、戻し交配、原品種の植物からの個体変異、体細胞繁殖系変異、または、天然または誘導の変異の選択により得ることができる。品種から区別される「株」は、非商業的に、例えば植物研究において用いられる植物のグループを表すことが最も多い。株は、典型的に、１つまたは複数の対象となる形質について、個体間で全般的な多様性をほとんど示さないが、他の形質については、個体間で多少の多様性があってよい。
【００４３】
雑種のタバコ品種は、第一の品種の雌親植物（すなわち種子親）の自家受粉を防止し、第二の品種の雄親植物からの花粉を雌親植物に受粉させ、そして、Ｆ１雑種種子を雌性植物上に形成させることにより、生産することができる。雌性植物の自家受粉は、花の発達の初期段階で花の雄しべを取り去ることにより防ぐことができる。あるいは、雄性不稔性の形態を用いて、雌親植物での花粉形成を防ぐことができる。例えば、雄性不稔性は、細胞質雄性不稔性（ＣＭＳ）、またはトランスジェニック雄性不稔性により生産することができ、ここで、導入遺伝子は、小胞子形成および／または花粉形成を阻害し、または自家不和合性である。ＣＭＳを含む雌親植物が特に有用である。雌親植物がＣＭＳである実施形態では、花粉を雄性稔性植物から採取し、ＣＭＳ雌親植物の柱頭に手作業で塗り、そして、生じるＦ１種子を収穫する。
【００４４】
本明細書に記載の品種および株を用いて、単交雑タバコＦ１雑種を形成することができる。そのような実施態様では、親品種の植物を実質的に均質の隣接集団として生育させて、雄親植物から雌親植物への自然の他家受粉を促進することができる。雌親植物上に形成されるＦ１種子は、従来の方法により選択的に収穫される。２つの親植物の品種を大量に育成して、自家受粉の結果として雄親上に形成される種子と雌親上に形成される種子のＦ１雑種の混合物を収穫することもできる。あるいは、単交雑Ｆ１雑種を雌親として使用して異なる雄親と交配する三法交配を行なうことができる。別の代替法としては、ダブル交配雑種を作製することができ、その方法では２つの異なる単交雑のＦ１子孫をそれら自身で交配する。ダブル交配雑種を形成する場合、自家不和合性を特に効果的に用いて雌親の自家受粉を防ぐことができる。
【００４５】
本開示はまた、ポリペプチド（例えば、治療用糖タンパク質）を生産する方法も提供する。ある場合には、本明細書で提供される植物、細胞、植物部位、種子、および子孫は、異種ポリペプチド（例えば組み換えポリペプチド）をコードする核酸分子を含むことができる。ある場合には、本明細書で提供される方法は、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼにより誘導される変異を、複数の内因性ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ対立遺伝子のそれぞれにおいて（例えば、２以上の内因性ＸｙｌＴ対立遺伝子および２以上の内因性ＦｕｃＴ対立遺伝子において）有する、タバコ属の植物、植物細胞、または植物部位を提供するステップを含むことができ、前記の植物、植物細胞、または植物部位は、異種ポリペプチド（例えば組み換えポリペプチド）をコードする核酸をさらに含む。ある場合には、本明細書で提供される方法は、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼにより誘導される変異を、１つまたは複数の内因性ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ対立遺伝子に（例えば、１つまたは複数の内因性ＸｙｌＴ対立遺伝子および１つまたは複数の内因性ＦｕｃＴ対立遺伝子に）有する、タバコ属の植物、植物細胞、または植物部位を提供するステップを含むことができ、前記の植物、植物細胞、または植物部位は、異種ポリペプチド（例えば組み換えポリペプチド）をコードする核酸をさらに含む。異種ポリペプチドのコード配列は、植物を発現可能なプロモーターに作動可能に連結することができ、また、転写終結およびポリアデニル化に関与する配列にも作動可能に連結することができる。ある場合には、当該方法はまた、ポリペプチドを生産するのに十分な条件下（例えば、温室中および／または水中条件の、適切な温度、湿度、明／暗、気流、および栄養状態）および時間（例えば、６〜１２時間、１２〜２４時間、２４〜４８時間、４８時間〜７日、７日〜３０日、または、３０日を超えて）、植物または植物細胞を保持するステップを含むこともできる。ある場合には、ポリペプチドを生産する方法は、植物または植物細胞から、発現ポリペプチドを分離するステップをさらに含むことができる。そのようなポリペプチドを分離するための技術は、例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、および電気泳動などの従来技術を含むことができる。
【００４６】
「植物を発現可能なプロモーター」とは、植物細胞での転写を制御する（開始する）ことが可能なＤＮＡ配列である。これは、植物起源の任意のプロモーター、ならびに、植物細胞での転写を指示することが可能な非植物起源の任意のプロモーター［例えば、ウイルスまたは細菌起源のプロモーター、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｔ−ＤＮＡ遺伝子プロモーター、組織特異的または器官特異的プロモーター、例えば種子特異的プロモーター、器官特異的プロモーター（例えば、茎−、葉−、根−、または葉肉−特異的プロモーター）］を含む。
【００４７】
ある場合には、本明細書で提供されるタバコ属の植物、植物細胞、植物部位、種子、または子孫は、異種ポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。「異種ポリペプチド」とは、植物または植物細胞で自然発生しないポリペプチドである。これは、植物または植物細胞により天然で発現されるポリペプチドである同種ポリペプチドとは対照的である。翻訳後のＮ−グリコシル化を受ける異種および同種ポリペプチドを、本明細書では、それぞれ、異種または同種の糖タンパク質と呼ぶ。
【００４８】
ヒトまたは動物に対する投与のための、本明細書で提供される植物および方法を用いて生産することができる異種ポリペプチドの例は、制限されずに、サイトカイン、サイトカイン受容体、増殖因子、増殖因子受容体、増殖ホルモン、インスリン、プロ−インスリン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子受容体、トロンボポエチン、トロンビン、ナトリウム利尿ペプチド、凝固因子、抗−凝固因子、組織プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、カルシトニン、ＣＤタンパク質、ＣＴＬＡタンパク質、Ｔ−細胞およびＢ−細胞受容体タンパク質、骨形態形成タンパク質、神経栄養因子、リウマチ因子、ＲＡＮＴＥＳ、アルブミン、リラキシン、マクロファージ抑制タンパク質、ウイルスタンパク質または抗原、表面膜タンパク質、酵素、制御タンパク質、免疫調節性タンパク質、ホーミング受容体、輸送タンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｇ−タンパク質共役受容体タンパク質、神経調節性タンパク質、抗原（例えば、細菌またはウイルス抗原）、および抗体またはそれらのフラグメントを含む。ある場合には、植物により生産されるポリペプチドを、ワクチンとして用いることができる。
【００４９】
「抗体」とは、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥのクラスの抗体、ならびに、組み換え抗体、例えば、単鎖抗体、キメラおよびヒト化抗体、および、多重特異性抗体を含む。また、用語「抗体」は、前述した全てのフラグメントおよび誘導体も指し、エピトープに特異的に結合する能力を保持した、それらの任意の改変または誘導体化した変異をさらに含んでよい。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体、ラクダ化抗体（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ラクダ抗体（ｃａｍｅｌｉｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖｓ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）フラグメント、抗−イディオタイプ抗体、細胞内抗体、合成抗体、および上記の任意のエピトープ結合フラグメントを含む。また、用語「抗体」は、免疫グロブリンのＦｃ領域と同じ領域を含む融合タンパク質も指す。
【００５０】
本発明は、以下の実施例でさらに説明され、それは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【００５１】
実施例１−ＦｕｃＴおよびＸｙｌＴ遺伝子ファミリーを突然変異誘発する配列特異的なヌクレアーゼの設計
【００５２】
ベンサミアナタバコにおいて、２つのＦｕｃＴ遺伝子（ＦｕｃＴ１およびＦｕｃＴ２）および２つのＸｙｌＴ遺伝子（ＸｙｌＴ１およびＸｙｌＴ２）における変異を求めた。それぞれの遺伝子は２つの対立遺伝子を有するので、これらの遺伝子の不活化は、８個の標的部位の変異導入を要した。
【００５３】
ベンサミアナタバコにおけるＸｙｌＴ遺伝子ファミリーのメンバーを完全に不活化またはノックアウトするために、開始コドン付近のタンパク質コード領域を標的とする配列特異的なヌクレアーゼを設計した。コード配列の最初の９０ｂｐは、ＸｙｌＴ１およびＸｙｌＴ２遺伝子間で同一である（図１）。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ認識部位を特異的に同定するソフトウェア、例えばＴＡＬＥ−ＮＴ  ２．０を用いて、最初の９０ｂｐ内のＸｙｌＴ遺伝子ファミリーを標的とするように４つのＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼペアを設計した（Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４０：Ｗ１１７−１２２，２０１２）。ＸｙｌＴ遺伝子に関するＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ認識部位を図１において下線を引き、表１にリスト化する。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼは、他で記載されるものと同様の方法を用いて合成した（Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９：ｅ８２，２０１１；Ｒｅｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：４６０−４６５，２０１２；および、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：１４９−１５３，２０１１）。
【００５４】
ＦｕｃＴ１およびＦｕｃＴ２遺伝子のコード配列の最初の１３０ｂｐは保存されているが同一ではない（図２）。ＦｕｃＴ遺伝子ファミリーを標的とするＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼは、上述したのと同様のストラテジーを用いて設計したが、ＦｕｃＴ遺伝子配列はＸｙｌＴ１およびＸｙｌＴ２よりも多岐にわたるため、全ての４つのＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ標的部位において配列多様性が存在する（図２中の太字）。ＦｕｃＴ遺伝子に関するＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ認識部位を図２において下線を引き、表１にリスト化する。標的部位１および２は、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ認識部位内にヌクレオチド多型を含む。そこで、２つのＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼペアをそれぞれの標的領域に関して作製し、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼがそれらの標的を認識する可能性を高めた。標的部位３および４に関しては、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼＤＮＡ認識部位間のスペーサー領域内に配列の多様性が生じるので、単一のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼペアが、両方の遺伝子内の同一の標的配列に結合する。
【００５５】
実施例２−酵母における、ＦｕｃＴおよびＸｙｌＴに関するＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ活性
【００５６】
ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ遺伝子を標的とするＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの活性を評価するために、他で記載のもの（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８６：７５７−７６１，２０１０）と同様の方法により、酵母において活性分析を行なった。これらの分析のために、非機能性β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子内にクローン化されたＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ認識部位を有する標的プラスミドを構築した。レポーター遺伝子がＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼにより切断されたらダイレクトリピート間で組み換えが生じて機能がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に復元されるように、標的部位の両側にβ−ガラクトシダーゼコード配列のダイレクトリピートを配置した。したがって、β−ガラクトシダーゼ活性は、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの切断活性の尺度としての役割を果たした。
【００５７】
酵母アッセイでは、２つのＸｙｌＴに関するＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼペア（ＸＹＬ＿Ｔ０３およびＸＹＬ＿Ｔ０４）が、２つの異なる温度条件下（すなわち、３７℃と３０℃）で、高い切断活性を示した。５つのＦｕｃＴに関するＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼペア（標的部位１に関して２つ、標的部位２に関して２つ、および、標的部位４に関して１つ）が、３７℃と３０℃の両方で高い切断活性を示した。切断活性をベンチマークのヌクレアーゼ、Ｉ−ＳｃｅＩに標準化した。結果を表２に要約する。
【００５８】
実施例３−ＦｕｃＴおよびＸｙｌＴに関するＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの、ベンサミアナタバコにおけるそれらの内因性標的部位での活性
【００５９】
ベンサミアナタバコにおける内因性標的部位でのＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ活性を、プロトプラスト中でＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼを発現させて、ＮＨＥＪにより導入された変異に関するＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの標的部位を調べることにより測定した。プロトプラストの調製方法は、他で記載のとおりに実施した（Ｗｒｉｇｈｔｅｔａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４４：６９３−７０５，２００５）。手短には、１００％エタノール、５０％漂白剤、それから滅菌蒸留水で連続的に洗浄することにより種子を滅菌した。滅菌した種子を、鉄で補充したＭＳアガロース培地上に植えた。Ｗｒｉｇｈｔら（上記）により記載の方法を用いて、若くて拡張している葉からプロトプラストを分離した。
【００６０】
ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードするプラスミドを、ＹＦＰをコードするプラスミドと一緒に、他で記載のとおりに（Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２：１５６５−１５７２，２００７）、ＰＥＧが仲介する形質転換によりベンサミアナタバコのプロトプラストへ導入した。処置の２４時間後、ＹＦＰ蛍光をモニターするフローサイトメーターを用いて形質転換されたプロトプラストのアリコートを評価することにより、形質転換の効率を測定した。形質転換されたプロトプラストの残りを回収し、ＣＴＡＢに基づく方法によりゲノムＤＮＡを調製した。プロトプラストから調製されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ認識部位を含むおよそ３００ｂｐのフラグメントをＰＣＲにより増幅した。それから、ＰＣＲ産物を４５４ピロシーケンシングに供した。スペーサー領域における挿入／欠失（インデル）変異を有するシーケンスリードは、ＮＨＥＪによる、切断されたＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ認識部位の不正確な修復から生じたものと考えられた。突然変異誘発の頻度を、合計のシーケンスリードのうちのＮＨＥＪ変異を有するシーケンスリードの数として計算した。それからその値を、形質転換の効率により標準化した。
【００６１】
ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのペア、ＸｙｌＴ０３およびＸｙｌＴ０４の、それらの標的遺伝子に対する活性を、表３に要約する。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのペアの両方が、ＸｙｌＴ１およびＸｙｌＴ２の両方において、２８．２％から７３．８％に至る非常に高い頻度のＮＨＥＪ変異を誘導した。ＸｙｌＴ１およびＸｙｌＴ２における、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼにより誘導された変異の例を、図３に示す。ＦｕｃＴ１＿Ｔ０２およびＦｕｃＴ２＿Ｔ０２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのペアに関して、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのペアのそれぞれの認識部位は、各ペアを含む２つのＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのうちの１つにおける１ｂｐの多型を除き、ＦｕｃＴ１およびＦｕｃＴ２遺伝子の両方で保存されていた。表３に要約するように、これらのＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのペアは、両方の遺伝子において、ＮＨＥＪにより誘導される変異を２４．７％から４６．５％に至る高い頻度で生じた。ＦｕｃＴ１およびＦｕｃＴ２遺伝子座でのＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼにより誘導される変異の例を、図４に示す。
【００６２】
実施例４−ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼにより誘導される変異をＸｙｌＴまたはＦｕｃＴに有するベンサミアナタバコ株
【００６３】
ＸｙｌＴまたはＦｕｃＴ遺伝子において変異を有するベンサミアナタバコ株を作製した。４５４のピロシーケンスデータに基づき、最も高い切断活性を有するＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのペア（ＸｙｌＴ＿Ｔ０４およびＦｕｃＴ２＿Ｔ０２）を選択して、ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ遺伝子を突然変異誘発した。滅菌した葉からプロトプラストを分離して、以下のうちの１つをコードするプラスミドを用いて形質転換した：（ｉ）ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼＸｙｌＴ＿Ｔ０４；（ｉｉ）ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼＦｕｃＴ２＿Ｔ０２；または（ｉｉｉ）ＹＦＰ。形質転換の効率を、ＹＦＰプラスミドの送達によりモニターし、蛍光顕微鏡を用いて、または、上述のフローサイトメトリーにより、可視化した。
【００６４】
形質転換後、プロトプラスト由来のカルスを生産した（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｚｅｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：２９９−３０２，１９８５）。ＰＥＧが仲介する形質転換の直後に、プロトプラストを、小さいペトリ皿に１×１０５／ｍｌの細胞密度でＫ３Ｇ１培地中に再懸濁し、暗所にて２５℃で保管した。形質転換後４日目に、プロトプラストの大部分がそれらの最初の細胞分裂を開始しているときに、プロトプラスト培養物を、培地Ｃ（上記のＶａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｚｅｎら）に４倍希釈した。７日目および１０日目に、プロトプラスト培養物を、ＭＳ培地に２倍希釈した。形質転換後１８日目に、カルスを光学顕微鏡下で同定し、そして、形質転換後１ヶ月に、プロトプラスト由来のカルスは目で確認できた。これらの可視のカルスを、発芽誘導培地に移した。数ｃｍの長さの新芽が現れた後、それらを根元で切断して、根の誘導培地に移した。根が形成された時点で、それらを土に移した。
【００６５】
葉の組織の小片を用いて、再生植物からゲノムＤＮＡを調製した。ＤＮＡサンプルを、標的遺伝子座のＰＣＲ増幅およびＤＮＡシーケンスにより分析して、ＸｙｌＴまたはＦｕｃＴにおける変異を有するこれらの植物を同定した。図５に示すように、植物株ＮＢ１３−１０５ａは、ＦｕｃＴ１遺伝子の対立遺伝子の両方に同一の１３ｂｐ欠失を、および、ＦｕｃＴ２遺伝子の対立遺伝子の両方に同一の１４ｂｐの欠失を保持している。植物株ＮＢ１３−２１３ａは、ＦｕｃＴ１の２つの対立遺伝子に、２０ｂｐおよび１２ｂｐの欠失を保持した。また、ＮＢ１２−２１３ａは、ＦｕｃＴ２の２つの対立遺伝子にも、１３ｂｐおよび２ｂｐの欠失を保持した。植物株ＮＢ１２−２１３ａは、したがって、全てのＦｕｃＴの標的−ＦｕｃＴ１の２つの対立遺伝子およびＦｕｃＴ２の２つの対立遺伝子に、変異を有する。図６に示すように、植物株ＮＢ１５−１１ｄは、ＸｙｌＴ１対立遺伝子のそれぞれに異なる７ｂｐの欠失を有し、ＸｙｌＴ２の１つの対立遺伝子内に８ｂｐの欠失を有する。植物株ＮＢ１２−１１３ｃは、ＸｙｌＴ１の１つの対立遺伝子内に７ｂｐの欠失を有し、ＸｙｌＴ２の２つの対立遺伝子のそれぞれに３５ｂｐおよび５ｂｐの欠失を有する。改変植物から種子を収穫して、子孫において変異の遺伝をモニターし、改変した遺伝子座の安定した遺伝性伝達を確認した。
【００６６】
実施例５−ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼにより誘導される変異をＸｙｌＴおよびＦｕｃＴに有するベンサミアナタバコ株
【００６７】
全ての４つのＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ遺伝子の全ての対立遺伝子に変異を有するベンサミアナタバコ株を作製するために、プロトプラストを、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ、ＸｙｌＴ＿Ｔ０４およびＦｕｃＴ２＿Ｔ０２の両方を用いて形質転換した（Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２：１５６５−１５７２，２００７；および、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６１：２０−２７，２０１２）。上述のとおり（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：２９９−３０２，１９８５）、小植物を再生して、ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ遺伝子における変異についてスクリーニングした。スクリーニングは、標的のＰＣＲ増幅および増幅産物のＤＮＡ配列分析により行なった。
【００６８】
この方法を用いて、植物株ＮＢ１４−２９ａを、４つの遺伝子座の全ての８つの対立遺伝子に欠失変異を有するものとして同定した。この植物株は、ＦｕｃＴ１における４４ｂｐの欠失に関してホモ接合型であり、および、ＦｕｃＴ２における２ｂｐおよび４０ｂｐの欠失に関してヘテロ接合である（図７）。この同一植物株、ＮＢ１４−２９ａは、ＸｙｌＴ１における５ｂｐの欠失に関してホモ接合型であり、および、ＸｙｌＴ２における６ｂｐおよび５４９ｂｐの欠失に関してヘテロ接合である（図８）。変異の伝達をＮＢ１４−２９ａの子孫においてモニターし、変異は遺伝性であることが示された。
【００６９】
別の試験では、１つまたは複数のＸｙｌＴ対立遺伝子における変異を有するベンサミアナタバコ株を、１つまたは複数のＦｕｃＴ対立遺伝子における変異を有するベンサミアナタバコ株と交配する。その後の世代において、生じる子孫を、親株に存在する全ての変異に関してホモ接合型であるこれらの個体についてスクリーニングする。さらなる交配を、他のＦｕｃＴまたはＸｙｌＴ遺伝子に変異を有する他の株を用いて行なってよい。そのような反復の交配を用いて、ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴの対立遺伝子変異体に関してホモ接合型である植物を生産する。変異に関するスクリーニングは、ＰＣＲ増幅および個々の植物からのＰＣＲ産物のダイレクトＤＮＡシーケンスにより行なう。
【００７０】
実施例６−α１，３−フコースのレベルが低下し、検出可能なβ１，２−キシロースが欠失した、ベンサミアナタバコ株の変異体
【００７１】
ベンサミアナタバコ株の変異体における、内因性タンパク質上のα１，３−フコースおよびβ１，２−キシロースの存在を、質量分析により評価した（Ｎｏｒｔｈｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９：４９８−５０６，２００９）。同様の方法を用いて（Ｓｔｒａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．６：３９２−４０２，２００８）、可溶性タンパク質を、ＮＢ１３−１０５ａ、ＮＢ１３−２１３ａ、ＮＢ１５−１１ｄ、ＮＢ１２−１１３ｃ、および、野生型ベンサミアナタバコの緑葉から分離した。ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＡおよびＦによる消化により、タンパク質からＮ−グリカンを遊離した。遊離したＮ−グリカンを、Ｕｌｔｒａ  Ｃｌｅａｎ  ＳＰＥ  Ｃａｒｂｏｇｒａｐｈカラム（Ａｌｌｔｅｃｈ）を用いて精製し、インビトロでメチル化した。パーメチル化Ｎ−グリカンを、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ（マトリクス援助レーザー脱着−イオン化飛行時間型質量分析法）により分析した（Ｋａｒａｓ  ａｎｄ  Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６０：２５９−２８０，１９８８）。
【００７２】
Ｎ−グリコシル化の分析は、野生型ベンサミアナタバコと比較して、ＮＢ１３−１０５ａおよびＮＢ１３−２１３ａにおいて、フコシル化のレベル低下（６０％を超える）を示した（図９）。ＮＢ１５−１１ｄおよびＮＢ１２−１１３ｃにおけるＸｙｌＴ１およびＸｙｌＴ２の変異は、葉のタンパク質上の検出不可能なレベルのキシロシル化をもたらした（図１０）。
【００７３】
また、Ｎ−グリコシル化の分析を、ＦｕｃＴおよびＸｙｌＴ遺伝子の全ての８つの対立遺伝子に変異を有する、ＮＢ１４−２９ａ株から精製された内因性タンパク質に関しても行なった（図７および図８）。ＮＢ１３−１０５ａ株およびＮＢ１３−２１３ａ株のように、フコシル化はＮＢ１４−２９ａにおいて有意に減少した（図１１）。内因性タンパク質上のβ１，２−キシロースの存在もＮＢ１４−２９ａにおいて減少したが（図１１）、ＮＢ１５−１１ｄおよびＮＢ１２−１１３ｃに関して見られたほどではなかった（図１０）。これは、ＮＢ１４−２９ａ株が、ＸｙｌＴ２の１つの対立遺伝子にインフレーム変異を有する（具体的には、６ｂｐの欠失を有する、図８）ことが理由であると考えられた。そして、この対立遺伝子は、キシロシルトランスフェラーゼ活性を有する機能性タンパク質を生産することができると考えられる。
【００７４】
実施例７−ベンサミアナタバコ株の変異体は、発現ポリペプチド上のα１，３−フコースおよびβ１，２−キシロースのレベルが低下する。
【００７５】
ベンサミアナタバコ株の変異体において発現する異種ポリペプチド上のα１，３−フコースおよびβ１，２−キシロースの存在を、質量分析により評価する（Ｓｔｒａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．６：３９２−４０２，２００８）。ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧなど）のような異種ポリペプチドを、例えばアグロバクテリウム浸潤（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２２：５４３−５５１，２０００）または変異株から得たプロトプラストのエレクトロポレーションによって、ベンサミアナタバコ株の変異体内にそのポリペプチドに関するコード配列を導入することにより発現させる。アグロバクテリウム浸潤の９日後またはエレクトロポレーションの４８時間後に、全ポリペプチドを植物変異体から抽出し、プロテインＧを用いてＩｇＧを精製する。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから対応するバンドを切り取ることにより、精製した抗体の重鎖を分離する。このバンド中の重鎖タンパク質を、Ｓｔｒａｓｓｅｒら（上記）により記載されるとおりしてＬＣ−ＭＳによるグリカン分析に用いる。
【００７６】
【表１】
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【００７７】
【表２】
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【００７８】
【表３】
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【００７９】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【００８０】
［他の実施態様］
本発明はその詳細な説明とともに記載されているが、前述の記載は説明目的であり、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定しないことが理解されるべきである。他の態様、利益、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年9月28日(2018.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載のタバコ属の植物または植物細胞。
【外国語明細書】
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