(57)【要約】      （修正有）【課題】生分解点を有するジアミン架橋剤、架橋剤と酸性多糖のカルボキシ基とを直接縮合することにより得られる酸性多糖架橋体、及び酸性多糖架橋体からなる癒着防止剤の提供。【解決手段】多価アミンの一級アミノ基と酸性多糖のカルボキシ基とがアミド結合により架橋を形成してなる酸性多糖架橋体であって、当該多価アミンは、末端が一級アミノ基を有し、分子内にエステル又はチオエステルを有し、末端の一級アミノ基の間の直鎖上に該エステル又はチオエステルのカルボニル炭素を有する、酸性多糖架橋体。多価アミンがジアミンであり、ジアミンの両端の一級アミノ基の少なくとも一つとエステル又はチオエステルのカルボニル炭素との間の直鎖の原子数が１〜５である。酸性多糖が、コンドロイチン硫酸又はその塩である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
両端が一級アミノ基であり、分子内にエステル又はチオエステル結合を有するジアミン化合物であって、当該アミノ基の少なくとも一つと当該エステル又はチオエステルのカルボニル炭素との間の直鎖の原子数が１〜５であるジアミン化合物からなる、酸性多糖用のジアミン架橋剤。
【請求項２】
下記一般式（Ｉ）：
【化３３】
2019218546.tif 000039
[式中、両端の一級アミノ基間の直鎖の原子数は、５〜１２であって、
Ｘ及びＹは、それぞれ独立に、単結合、置換若しくは無置換のアルキレン基、置換若しくは無置換のアルケニレン基又は置換若しくは無置換のアルキニレン基を表し、ただし、Ｘ及びＹが同時に単結合であることはなく；
Ｚは、酸素原子、又は硫黄原子を表し；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−ＣＯＯＲ５基、置換若しくは無置換のアルキル基、置換若しくは無置換のアルケニル基又は置換若しくは無置換のアルキニル基を表し；
上記Ｘ及びＹにおけるアルキレン基、アルケニレン基及びアルキニレン基中の−ＣＨ2−は、アミド基（−ＣＯＮＨ−）、エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、エーテル基（−Ｏ−）、イミノ基（−ＮＨ−）及びフェニレン基からなる群より選択される１以上の基で置き換えられていてもよく、ただし、式（Ｉ）中の−ＣＯ−Ｚ−と、Ｘ又はＹに含まれうるエステル基、アミド基、エーテル基（−Ｏ−）及びイミノ基（−ＮＨ−）は、直接隣り合うことがなく、
上記Ｒ１及びＲ２におけるアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基中の−ＣＨ２−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−、−ＮＲ６−及び−Ｓ−からなる群より選択される１以上の基で置き換えられていてもよく；
上記Ｘ、Ｙ、Ｒ１及びＲ２における置換基は、ヒドロキシ基、炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基、インドリル基、ジアゾリル基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＭｅ基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＭｅ２基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ５基、−Ｓ−Ｍｅ基及び−ＳＨ基からなる群より選択され、Ｘ及びＹの置換基は、さらに４−ヒドロキシフェニル基、ハロゲン原子、ニトロ基及びニトリル基からなる群より選択されてもよく、ここでそれぞれのｎは、独立して０〜４の整数を表し；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子又はフェニル基で置換されてもよいアルキル基を表す]
で示される、酸性多糖用のジアミン架橋剤。
【請求項３】
Ｚが、酸素原子である、請求項２に記載のジアミン架橋剤。
【請求項４】
両端のアミノ基間の直鎖の原子数が、５〜８である、請求項３に記載のジアミン架橋剤。
【請求項５】
両端のアミノ基間の直鎖の原子数が、５又は６である、請求項３に記載のジアミン架橋剤。
【請求項６】
Ｒ１が、水素原子又は置換若しくは無置換のアルキル基を表し；
Ｒ２が、水素原子、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基又は−ＣＯＯＲ５基を表し；
Ｘが、単結合又はハロゲン原子で置換されてもよいアルキレン基を表し；
Ｙが、置換又は無置換のアルキレン基を表し；
Ｒ１における置換基が、メチル基、フェニル基、インドリル基、−ＣＯＯＲ５基及び−Ｓ−Ｍｅ基からなる群より選択され；
Ｙの置換基がメチル基、フェニル基及び−ＣＯＯＲ５基からなる群より選択される；
請求項２〜５のいずれか１項に記載のジアミン架橋剤。
【請求項７】
Ｘが、単結合を表し；Ｙが、＞ＣＲ７Ｒ８基を表し；
Ｒ７及びＲ８が、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、インドリル基、ジアゾリル基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＭｅ基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＭｅ２基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ５基、−ＳＨ基、ハロゲン原子、ニトロ基又はニトリル基を表す、
請求項２〜５のいずれか１項に記載のジアミン架橋剤。
【請求項８】
Ｒ２が、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基又は−ＣＯＯＲ５基を表し；
Ｒ７が、水素原子を表し；
Ｒ８が、水素原子又はメチル基を表す；
請求項７に記載のジアミン架橋剤。
【請求項９】
Ｘ及びＹの少なくとも一つが、フェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−ＣＯＯＲ５基、ハロゲン原子、ニトロ基又はニトリル基によって置換されている、請求項４又は５に記載のジアミン架橋剤。
【請求項１０】
Ｒ７及びＲ８が、それぞれ独立に、水素原子、フェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−ＣＯＯＲ５基、ハロゲン原子、ニトロ基又はニトリル基を表す、請求項７に記載のジアミン架橋剤。
【請求項１１】
Ｒ１が、水素原子、−（ＣＨ２）２−Ｓ−ＣＨ３基、−（ＣＨ２）３もしくは４−ＮＨＭｅ基、−（ＣＨ２）３もしくは４−ＮＭｅ２基又は−（ＣＨ２）１もしくは２−ＣＯＯＲ５基を表す、請求項１０に記載のジアミン架橋剤。
【請求項１２】
Ｒ２が、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基又は−ＣＯＯＲ５基を表し、Ｒ７及びＲ８が、水素原子を表す、請求項１１に記載のジアミン架橋剤。
【請求項１３】
Ｒ１が、水素原子を表す、請求項１２に記載のジアミン架橋剤。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のジアミン架橋剤の一級アミノ基と、酸性多糖のカルボキシ基とが、アミド結合により架橋を形成してなる、酸性多糖架橋体。
【請求項１５】
請求項９〜１３のいずれか１項に記載のジアミン架橋剤の一級アミノ基と、酸性多糖のカルボキシ基とが、アミド結合により架橋を形成してなる、酸性多糖架橋体。
【請求項１６】
酸性多糖が、グリコサミノグリカン、カルボキシメチルセルロース又はアルギン酸である、請求項１４又は１５に記載の酸性多糖架橋体。
【請求項１７】
酸性多糖が、グリコサミノグリカンである、請求項１６に記載の酸性多糖架橋体。
【請求項１８】
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸である、請求項１７に記載の酸性多糖架橋体。
【請求項１９】
酸性多糖が、グリコサミノグリカン、カルボキシメチルセルロース又はアルギン酸である、請求項１５に記載の酸性多糖架橋体。
【請求項２０】
酸性多糖が、グリコサミノグリカンである、請求項１９に記載の酸性多糖架橋体。
【請求項２１】
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸である、請求項２０に記載の酸性多糖架橋体。
【請求項２２】
請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の酸性多糖架橋体を含む、医用材料。
【請求項２３】
請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の酸性多糖架橋体を含む、組織膨隆材。
【請求項２４】
請求項１５、１９〜２１のいずれか１項に記載の酸性多糖架橋体を含む、癒着防止材。
【請求項２５】
下記一般式（ＩＩ）：
【化３４】
2019218546.tif 000040
[式中、
Ｒ１は、水素原子、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−ＣＯＯＲ５基、置換若しくは無置換のアルキル基、置換若しくは無置換のアルケニル基又は置換若しくは無置換のアルキニル基を表し；
Ｒ２’は、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基又は−ＣＯＯＲ５を表し；
上記Ｒ１におけるアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基中の−ＣＨ２−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−、−ＮＲ６−及び−Ｓ−からなる群より選択される１以上の基（ただし、Ｒ５がベンジル基である場合、−Ｏ−は除かれる）で置き換えられていてもよく；
上記Ｒ１における置換基は、ヒドロキシ基、炭素数１〜６のアルキル基、インドリル基、ジアゾリル基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＭｅ基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＭｅ２基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ５基及び−ＳＨ基からなる群より選択され（ただし、Ｒ２’が−ＣＯＮＨ２基である場合、−ＳＨ基は除かれる）、ここでそれぞれのｎは、独立して０〜４の整数を表し；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子又はフェニル基で置換されてもよいアルキル基を表し；
Ｒ８’は、水素原子又はメチル基を表す]
で示される化合物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の化合物の一級アミノ基と、酸性多糖のカルボキシ基とが、アミド結合により架橋を形成してなる、酸性多糖架橋体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生分解点を有するジアミン架橋剤、当該架橋剤と酸性多糖のカルボキシ基とを直接縮合することにより得られる酸性多糖架橋体、及びその医用用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖を共有結合させることにより得られる多糖架橋体は、多糖自体の生体適合性の高さから、各種医用材料として期待され、これまで様々な研究が行われてきた。
【０００３】
架橋方法としては、例えば、下記の４つのカテゴリーを挙げることができる。
（１）ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドのようなアルデヒド架橋剤による架橋法。
（２）多糖が有するカルボキシ基と多糖が有する水酸基による、架橋基を用いない自己架橋法。
（３）ジエポキシド、ジビニルスルホン、ジアミン、ジヒドラジドなどのホモ二官能性架橋剤、又はエピハロヒドリンなどのヘテロ二官能性架橋剤による架橋法。
（４）光反応性基、重合性官能基、アミノ基、チオール基、ハロゲンなどの官能基が導入された多糖と、上記官能基に対して相補的な反応性基が導入された多糖とを反応させることによる架橋法。
【０００４】
（１）に関しては、例えば、特表２０１３−５０３６８８号公報に、架橋剤として用いられるホルマリンやグルタルアルデヒドが、生体内のタンパク質とも架橋反応を起こして、組織毒性を起こすという記載があり、安全性の面で課題がある。
【０００５】
（２）の自己架橋法に関しては、ヒアルロン酸（ＨＡ）を例に挙げると、一部又は全てのカルボキシ基が同一の多糖分子又は他の多糖分子のアルコール基でエステル化された自己架橋エステル結合ヒアルロン酸が欧州特許第３４１７４５号に開示されている。また、ヒアルロン酸の水溶液を酸性条件下で凍結し、ついで解凍することを少なくとも１回行うことによって生成する自己架橋エステル結合ヒアルロン酸が国際公開第９９／１０３８５号に開示されている。更にまた、凍結を行うことなく５％以上の濃度となるようにヒアルロン酸と酸性溶液を混合・共存させることにより生成する自己架橋エステル結合ヒアルロン酸が国際公開第０１／５７０９３号に開示されている。ヒアルロン酸の水溶液を酸性条件下で凍結する方法では、凍結時間が長くなるにつれて溶解性半減期も長くなるが、過度の凍結時間ではヒアルロン酸が低分子量化し、溶解性半減期が逆に短くなることが認められている。また、自己架橋体では、架橋剤を用いていないので、架橋剤の化学構造を利用した分解消失時間の制御が不可能である。
【０００６】
（３）に関しては、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）に代表されるジエポキシド架橋剤によるヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸（ＣＳ）の架橋体が特表２０１１−５０５３６２号公報に開示されている。
【０００７】
（４）に関しては、Adv. Mater., 2011, 23(12), H41-56 (Jason A. Burdickら)に、ヒアルロン酸のカルボキシ基や水酸基に対し、アジピン酸ジヒドラジド、チラミド、メタクリレート、グリシジルメタクリレート、チオプロピオニルヒドラジド、ブロモアセテートなどが導入された例が開示されている。
【０００８】
多糖の物理的性質の効率的な改変を目指した例として、多糖のカルボキシ基をジアミンで架橋する方法が挙げられる（上記の（３）に該当）。例えば特開２０００−７０３５６号公報には、アルギン酸（Ａｌｇ）やヒアルロン酸などのカルボキシ基とエチレンジアミンなどのアルキルジアミンを反応させた架橋体が開示されている。また、特表２００２−５２９５４９号公報には、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）と１，３−ジアミノプロパンを反応させた架橋体が、それぞれ開示されている。なお、ジアミンを架橋剤として用いコンドロイチン硫酸誘導体を製造したとの報告がある（Biomaterials, 1995, 16, 473-478 (Amnon Sintovら)）。しかしその後、この製造方法を再現し種々の分析法を用いても、結局コンドロイチン硫酸の架橋は確認されず（J. Biomater. appl., 1998, 12, 201-221 (C. Bourieら））、実際はコンドロイチン硫酸架橋体が得られないことが明らかとなった。
【０００９】
また、架橋した酸性多糖を分解消失させる目的で、生分解点としてエステルを選択した報告もいくつか存在する。例えば、Adv. Mater., 2011, 23(12), H41-56 (Jason A. Burdickら)には、ヒアルロン酸に対して、チラミドや、グリシジルメタクリレートを導入し、ラジカル反応や重合反応により架橋した例が報告され、特開平６−７３１０２号公報には、光感受性化合物をヒアルロン酸、又はコンドロイチン硫酸のカルボキシ基にエステル結合を介して導入し、光架橋した例が報告されている。これらは、反応性基の導入、架橋反応という２段階の反応により得られる架橋体である。
【００１０】
一方、生分解点を有するジアミン架橋剤で、最も単純な構造の化合物として、下記右の２−アミノエチル−２−アミノアセテート（ＧｌｙＣ２Ｎ）が例示される。本ジアミンの類縁構造では、ボールドウィン則(Baldwin's rules)(分子内求核反応の起こりやすさについての経験則)(J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1976, 734-736. (Jack E. Baldwin)、J. Org. Chem., 1977, 42 (24), 3846-3852. (Jack E. Baldwinら))によると、エステル結合のカルボニル基(求電子性基)とアミノ基(求核性基)が、５員環の形成可能な状態(5-exo-trig型)にあるため、分子内求核置換反応が起こり易いことが理解される(下記を参照)。一般的にexo-trig型では、比較的単純な構造である場合、３〜７員環の遷移状態が起こり易いことが知られている。
【００１１】
【化１】
2019218546.tif 000002
上記の左は、ボールドウィン則の一例であり、右は、ＧｌｙＣ２ＮのＯ→Ｎアシル転位を示す。
【００１２】
分子内反応の起こり易さの具体例として、類似構造である−α−アミノ酸−（エステル結合）−セリン又はトレオニン−という構造は、水中、生理条件下で、セリンの遊離アミノ基が、エステル結合のカルボニル炭素に対して分子内求核反応（Ｏ→Ｎアシル転位）を起こし、容易に、−α−アミノ酸−（アミド結合）−セリン又はトレオニン−という構造に変換される(Org. Lett., 2008, 10(22), 5243-5246 (Natalia N.ら)、J. Org. Chem. 2006, 71, 6171-6177 (Irene Coinら))。また、Ｓ→Ｎアシル転位も同様の反応に利用される(Science, 1994, 266(5186), 776-779 (Dawson P.E.ら))。このような構造は、一般的にSwitch peptideやNative Chemical Ligationと呼ばれ、ペプチドの化学合成や構造変換の手法としてよく用いられる。
これらの事実から、生分解点を有するジアミン架橋剤は、分子内求核置換反応が起こり易いことが予想され、現に酸性多糖架橋剤として使用された報告はない。
【００１３】
上記ジアミン構造を部分構造として有する化合物を、架橋反応に用いた報告はある。例えば、国際公開第９６／３４６１８号では、２−アミノエチル−２−アミノアセテートとヘキサメチレンジシアネートを混合することで、多官能性架橋剤を調製し、アミノ基を有するタンパク質を架橋する方法が開示されている。また、例えば、国際公開第９９／１１７０３号では、アルギン酸やポリグルタミン酸、カルボキシメチルセルロースをジヒドラジドや、ジカルボン酸で架橋する例が報告されており、ジヒドラジド骨格中や、ジカルボン酸骨格中に２−アミノグリシナート骨格が存在する。
【００１４】
上記報告でも、ＧｌｙＣ２Ｎのような構造を架橋構造に用いる場合は、分子内反応を抑制するため、両端アミノ構造をジカルボキシ基やジヒドラジドに変換しており、分子内に生分解点を有するジアミンが直接、架橋剤として用いられたものではない。
【００１５】
このように、酸性多糖の架橋剤については、種々の検討が実施されているが、一つの分子種で、酸性多糖の高い生体適合性を保ったまま、医用材料の用途に合わせて物理的応力と分解消失時間を簡便かつ同時に制御しうるジアミン架橋剤の報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特表２０１３−５０３６８８号公報
【特許文献２】欧州特許第３４１７４５号
【特許文献３】国際公開第９９／１０３８５号
【特許文献４】国際公開第０１／５７０９３号
【特許文献５】特表２０１１−５０５３６２号公報
【特許文献６】特開２０００−７０３５６号公報
【特許文献７】特表２００２−５２９５４９号公報
【特許文献８】特開平６−７３１０２号公報
【特許文献９】国際公開第９６／３４６１８号
【特許文献１０】国際公開第９９／１１７０３号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Adv. Mater., 2011, 23(12), H41-56 (Jason A. Burdickら)
【非特許文献２】Biomaterials, 1995, 16, 473-478 (Amnon Sintovら.)
【非特許文献３】J. Biomater. appl., 1998, 12, 201-221 (C. Bourieら.）
【非特許文献４】J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1976, 734-736. (Jack E. Baldwin)
【非特許文献５】J. Org. Chem., 1977, 42 (24), 3846-3852.  (Jack E. Baldwinら)
【非特許文献６】Org. Lett., 2008, 10(22), 5243-5246 (Natalia N.ら)
【非特許文献７】J. Org. Chem. 2006, 71, 6171-6177 (Irene Coinら)
【非特許文献８】Science, 1994, 266(5186), 776-779 (Dawson P.E.ら)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上述のように糖鎖の架橋方法は、これまで活発に検討されてきた。しかし、上述の例では、（３）の方法では、ジエポキシド架橋剤では各種多糖の物性値が劇的に変換できることが報告されているが、分解消失時間の制御を簡便かつ物性値の変換と同時に達成できていない。アルキルジアミン架橋剤では、架橋剤に生分解点が存在しないため、架橋剤の分解に起因する消失時間の制御は構造上不可能である。また、（４）の方法では、反応性基の導入、架橋反応という２段階の反応が必要であり煩雑である。つまり、安全性・調製の簡便さ・物理的性質変換の効率・分解消失性のすべてを兼ね備えた理想的な架橋剤は見出されていない。特に、物理的性質の効率的な改変と分解消失性を同時に兼ね備えた架橋剤を見出すことは、特に難易度が高いと言える。
【００１９】
多糖架橋体を含む医用材料を、例えば組織膨隆材、癒着防止材として使用する場合、当該多糖架橋体には、高い生体適合性はもちろんのこと、投与後に組織と組織を分離する物理的応力(バリア性能)と、必要期間後の速やかな分解消失性能を併せ持つことが特に求められている。また、癒着防止材としての多糖架橋体には、物理的応力を高めると残留時間が長くなり、速やかな分解消失性を保持させると物理的応力が不足する、という課題が存在する。相反する事象であるため、本課題の難易度は極めて高く、両性質を併せ持つ多糖架橋体が癒着防止材として実用化された例はない。
【００２０】
一つの分子種で、酸性多糖の高い生体適合性を保ったまま、医用材料の用途に合わせて物理的応力と分解消失時間を簡便かつ同時に制御しうるジアミン架橋剤は知られていなかった。
そこで、本発明は、酸性多糖のカルボキシ基と直接縮合反応させることにより、適切な物理的応力と必要期間後の速やかな分解消失性を併せ持つ酸性多糖架橋体を創出可能な、実用性の高いジアミン架橋剤、及び当該架橋剤を用いた医用材料としての酸性多糖架橋体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、上記目的を考慮し、医用材料の用途に応じて、適切な物理的応力と必要期間後の分解消失性を併せ持つ酸性多糖架橋体を創出可能なジアミン架橋剤を開発すべく、鋭意検討した。
【００２２】
その結果、アミノ酸又はその誘導体と、アミノアルコール又はその誘導体を主原料とする特定の置換基を有し、生分解点を少なくとも一つ有するジアミン架橋剤を酸性多糖との架橋反応に付すことで、一つの分子種で、得られる酸性多糖架橋体の物理的応力と分解消失時間を簡便かつ同時に制御可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は以下の通りである。
【００２３】
（１）両端が一級アミノ基であり、分子内にエステル又はチオエステル結合を有するジアミン化合物であって、当該アミノ基の少なくとも一つと当該エステル又はチオエステルのカルボニル炭素との間の直鎖の原子数が１〜５であるジアミン化合物からなる、酸性多糖用のジアミン架橋剤である。
（２）下記一般式（Ｉ）：
【化２】
2019218546.tif 000003
[式中、両端の一級アミノ基間の直鎖の原子数は、５〜１２であって、
Ｘ及びＹは、それぞれ独立に、単結合、置換若しくは無置換のアルキレン基、置換若しくは無置換のアルケニレン基又は置換若しくは無置換のアルキニレン基を表し、ただし、Ｘ及びＹが同時に単結合であることはなく；
Ｚは、酸素原子又は硫黄原子を表し；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−ＣＯＯＲ５基、置換若しくは無置換のアルキル基、置換若しくは無置換のアルケニル基又は置換若しくは無置換のアルキニル基を表し；
上記Ｘ及びＹにおけるアルキレン基、アルケニレン基及びアルキニレン基中の−ＣＨ2−は、アミド基（−ＣＯＮＨ−）、エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、エーテル基（−Ｏ−）、イミノ基（−ＮＨ−）及びフェニレン基からなる群より選択される１以上の基で置き換えられていてもよく、ただし、式（Ｉ）中の−ＣＯ−Ｚ−と、Ｘ又はＹに含まれうるエステル基、アミド基、エーテル基（−Ｏ−）及びイミノ基（−ＮＨ−）は、直接隣り合うことがなく、
上記Ｒ１及びＲ２におけるアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基中の−ＣＨ２−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−、−ＮＲ６−及び−Ｓ−からなる群より選択される１以上の基で置き換えられていてもよく；
上記Ｘ、Ｙ、Ｒ１及びＲ２における置換基は、ヒドロキシ基、炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基、インドリル基、ジアゾリル基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＭｅ基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＭｅ２基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ５基、−ＳＭｅ基及び−ＳＨ基からなる群より選択され、Ｘ及びＹの置換基は、さらに４−ヒドロキシフェニル基、ハロゲン原子、ニトロ基及びニトリル基からなる群より選択されてもよく、ここでそれぞれのｎは、独立して０〜４の整数を表し；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子又はフェニル基で置換されてもよいアルキル基を表す]
で示される、酸性多糖用ジアミン架橋剤である。
【００２４】
（３）Ｚが、酸素原子である、上記（２）に記載のジアミン架橋剤である。
【００２５】
（４）両端のアミノ基間の直鎖の原子数が、５〜８である、上記（３）に記載のジアミン架橋剤である。
【００２６】
（５）両端のアミノ基間の直鎖の原子数が、５又は６である、上記（３）に記載のジアミン架橋剤である。
【００２７】
（６）Ｒ１が、水素原子又は置換若しくは無置換のアルキル基を表し；
Ｒ２が、水素原子、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、又は−ＣＯＯＲ５基を表し；
Ｘが、単結合又はハロゲン原子で置換されてもよいアルキレン基を表し；
Ｙが、置換又は無置換のアルキレン基を表し；
Ｒ１における置換基が、メチル基、フェニル基、インドリル基、−ＣＯＯＲ５基及び‐Ｓ−Ｍｅ基からなる群より選択され；
Ｙの置換基がメチル基、フェニル基及び−ＣＯＯＲ５基からなる群より選択される；
上記（２）〜（５）のいずれか１に記載のジアミン架橋剤である。
【００２８】
（７）Ｘが、単結合を表し；Ｙが、＞ＣＲ７Ｒ８基を表し；
Ｒ７及びＲ８が、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、インドリル基、ジアゾリル基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＭｅ基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＭｅ２基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ５基、−ＳＨ基、ハロゲン原子、ニトロ基又はニトリル基を表す、
上記（２）〜（５）のいずれか１に記載のジアミン架橋剤である。
【００２９】
（８）Ｒ２が、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基又は−ＣＯＯＲ５基を表し；
Ｒ７が、水素原子を表し；
Ｒ８が、水素原子又はメチル基を表す；
上記（７）に記載のジアミン架橋剤である。
【００３０】
（９）Ｘ及びＹの少なくとも一つが、フェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−ＣＯＯＲ５基、ハロゲン原子、ニトロ基又はニトリル基によって置換されている、上記（４）又は（５）に記載のジアミン架橋剤である。
【００３１】
（１０）Ｒ７及びＲ８が、それぞれ独立に、水素原子、フェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−ＣＯＯＲ５基、ハロゲン原子、ニトロ基又はニトリル基を表す、上記（７）に記載のジアミン架橋剤である。
【００３２】
（１１）Ｒ１が、水素原子、−（ＣＨ２）２−Ｓ−ＣＨ３基、−（ＣＨ２）３もしくは４−ＮＨＭｅ基、−（ＣＨ２）３もしくは４−ＮＭｅ２基又は−（ＣＨ２）１もしくは２−ＣＯＯＲ５基を表す、上記（１０）に記載のジアミン架橋剤である。
【００３３】
（１２）Ｒ２が、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基又は−ＣＯＯＲ５基を表し、Ｒ７及びＲ８が、水素原子を表す、上記（１１）に記載のジアミン架橋剤である。
【００３４】
（１３）Ｒ１が、水素原子を表す、上記（１２）に記載のジアミン架橋剤である。
【００３５】
（１４）上記（１）〜（１３）のいずれか１に記載のジアミン架橋剤の一級アミノ基と、酸性多糖のカルボキシ基とが、アミド結合により架橋を形成してなる、酸性多糖架橋体である。
【００３６】
（１５）上記（９）〜（１３）のいずれか１に記載のジアミン架橋剤の一級アミノ基と、酸性多糖のカルボキシ基とが、アミド結合により架橋を形成してなる、酸性多糖架橋体である。
【００３７】
（１６）酸性多糖が、グリコサミノグリカン、カルボキシメチルセルロース又はアルギン酸である、上記（１４）又は（１５）に記載の酸性多糖架橋体である。
【００３８】
（１７）酸性多糖が、グリコサミノグリカンである、上記（１６）に記載の酸性多糖架橋体である。
【００３９】
（１８）グリコサミノグリカンが、コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸である、上記（１７）に記載の酸性多糖架橋体である。
【００４０】
（１９）酸性多糖が、グリコサミノグリカン、カルボキシメチルセルロース又はアルギン酸である、上記（１５）に記載の酸性多糖架橋体である。
【００４１】
（２０）酸性多糖が、グリコサミノグリカンである、上記（１９）に記載の酸性多糖架橋体である。
【００４２】
（２１）グリコサミノグリカンが、コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸である、上記（２０）に記載の酸性多糖架橋体である。
【００４３】
（２２）上記（１４）〜（２１）のいずれか１に記載の酸性多糖架橋体を含む、医用材料である。
【００４４】
（２３）上記（１４）〜（２１）のいずれか１に記載の酸性多糖架橋体を含む、組織膨隆材である。
【００４５】
（２４）上記（１５）、（１９）〜（２１）のいずれか１に記載の酸性多糖架橋体を含む、癒着防止材である。
【００４６】
（２５）下記一般式（ＩＩ）：
【化３】
2019218546.tif 000004
[式中、
Ｒ１は、水素原子、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−ＣＯＯＲ５基、置換若しくは無置換のアルキル基、置換若しくは無置換のアルケニル基又は置換若しくは無置換のアルキニル基を表し；
Ｒ２’は、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基又は−ＣＯＯＲ５を表し；
上記Ｒ1におけるアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基中の−ＣＨ２−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−、−ＮＲ6−及び−Ｓ−からなる群より選択される１以上の基（ただし、Ｒ５がベンジル基である場合、−Ｏ−は除かれる）で置き換えられていてもよく；
上記Ｒ1における置換基は、ヒドロキシ基、炭素数１〜６のアルキル基、インドリル基、ジアゾリル基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＭｅ基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＭｅ２基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ５基及び−ＳＨ基からなる群より選択され（ただし、Ｒ２’が−ＣＯＮＨ２基である場合、−ＳＨ基は除かれる）、ここでそれぞれのｎは、独立して０〜４の整数を表し；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子又はフェニル基で置換されてもよいアルキル基を表し；
Ｒ８’は、水素原子又はメチル基を表す]
で示される化合物である。
（２６）上記（２５）に記載の化合物の一級アミノ基と、酸性多糖のカルボキシ基とが、アミド結合により架橋を形成してなる、酸性多糖架橋体である。
【発明の効果】
【００４７】
本発明のジアミン架橋剤は、酸性多糖に適切な物理的応力と分解消失性を付与することができる。このため、当該架橋剤を酸性多糖との架橋反応に付すことによって得られる酸性多糖架橋体は、適切な物理的応力と必要期間後の速やかな分解消失性を併せ持つので実用性が高く、また、その構造も明確であり、癒着防止材及び組織膨隆材に代表される医用材料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ＣＳ架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＣ２Ｎ／ＡｌａＣ２ＭｅＮ／ＡｌａＣ２Ｍｅ２Ｎ／ＮＣ２Ｎ）膨潤物の粘度経時変化を示す図である。
【図２】ＨＡ架橋体（ＨＡ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２／ＡｌａＣ２ＭｅＮ／ＮＣ２Ｎ）膨潤物の粘度経時変化を示す図である。
【図３】ＣＭＣ架橋体（ＣＭＣ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２／ＡｌａＣ２ＭｅＮ／ＮＣ２Ｎ）膨潤物の粘度経時変化を示す図である。
【図４】Ａｌｇ架橋体（Ａｌｇ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２／ＡｌａＣ２ＭｅＮ／ＮＣ２Ｎ）膨潤物の粘度経時変化を示す図である。
【図５】ＣＳ架橋体膨潤物の物理的応力を示す図である。
【図６】ＣＳ架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＳｅｒＥｔ／ＧｌｙＣ２Ｎ／ＡｌａＣ２ＭｅＮ／ＡｌａＣ２Ｍｅ２Ｎ）ラット腹部皮下での残留性能評価を示す図である。
【図７】ＣＳ架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）の膨潤／消失試験結果を示す図である。
【図８】ＨＡ架橋体（ＨＡ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）の膨潤／消失試験結果を示す図である。
【図９】ＣＭＣ架橋体（ＣＭＣ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）の膨潤／消失試験結果を示す図である。
【図１０】Ａｌｇ架橋体（Ａｌｇ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）の膨潤／消失試験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本明細書において、アルキル基とは、１〜１２個の炭素原子、好ましくは１〜８個の炭素原子を有する１価の直鎖状の飽和脂肪族炭化水素基、又は３〜１２個の炭素原子、好ましくは３〜８個の炭素原子を有する１価の分岐若しくは環状の飽和脂肪族炭化水素基をいう。アルキレン基とは、１〜１２個の炭素原子、好ましくは１〜８個の炭素原子を有する２価の直鎖状の飽和脂肪族炭化水素基、又は３〜１２個の炭素原子、好ましくは３〜８個の炭素原子を有する２価の分岐若しくは環状の飽和脂肪族炭化水素基をいう。
【００５０】
アルケニル基とは、少なくとも１つの二重結合を有する、２〜１２個の炭素原子、好ましくは２〜８個の炭素原子を有する１価の直鎖状の脂肪族炭化水素基、又は３〜１２個の炭素原子、好ましくは３〜８個の炭素原子を有する１価の分岐の脂肪族炭化水素基をいう。アルケニレン基とは、少なくとも１つの二重結合を有する、２〜１２個の炭素原子、好ましくは２〜８個の炭素原子を有する２価の直鎖状の脂肪族炭化水素基、又は３〜１２個の炭素原子、好ましくは３〜８個の炭素原子を有する２価の分岐の脂肪族炭化水素基をいう。
【００５１】
アルキニル基とは、少なくとも１つの三重結合を有する、２〜１２個の炭素原子、好ましくは２〜８個の炭素原子を有する１価の直鎖状の脂肪族炭化水素基、又は３〜１２個の炭素原子、好ましくは３〜８個の炭素原子を有する１価の分岐の脂肪族炭化水素基をいう。アルキニレン基とは、少なくとも１つの三重結合を有する、２〜１２個の炭素原子、好ましくは２〜８個の炭素原子を有する２価の直鎖状の脂肪族炭化水素基、又は３〜１２個の炭素原子、好ましくは３〜８個の炭素原子を有する２価の分岐の脂肪族炭化水素基をいう。
【００５２】
アリーレン基とは、環構成原子として６〜２０個の炭素原子を有する、２価の単環式又は多環式の芳香族炭化水素基をいう。具体的には、フェニレン（１，２−、１，３−又は１，４−フェニレン）、ナフチレンなどを挙げることができる。
【００５３】
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。また組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【００５４】
なお、本明細書においては、酸性多糖架橋体は、（酸性多糖種）−（ジアミン架橋剤種）の様式で表す。また、ジアミン架橋剤の略号については、化合物名の後ろにカッコ書で示すものを用いる。
例えば、コンドロイチン硫酸ナトリウムをジアミン架橋剤２−アミノエチル−２−アミノアセテート（ＧｌｙＣ２Ｎ）・２塩酸塩で架橋して得られるコンドロイチン硫酸架橋体は、ＣＳ-ＧｌｙＣ２Ｎのように表記する。
【００５５】
以下、本発明を発明の実施形態により詳説する。
酸性多糖
酸性多糖は、カルボキシ基を有する多糖を指し、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシエチルデキストラン、カルボキシメチルプルラン、カルボキシエチルプルラン、カルボキシメチルアミロース、カルボキシエチルアミロース、酸化セルロース、アルギン酸などが挙げられる。この中でも、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、カルボキシメチルセルロース及びアルギン酸からなる群より選択される少なくとも１種が好ましく、コンドロイチン硫酸及びコンドロイチンからなる群より選択される少なくとも１種がより好ましい。また酸性多糖のカルボキシ基や硫酸基は、塩を形成していない遊離酸の状態であっても、また薬学的に許容される塩の状態であってもよい。
【００５６】
薬学的に許容される塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属イオンとの塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属イオンとの塩；などが挙げられる。酸性多糖誘導体は、生体への適用性及び親和性の観点から、薬学的に許容されるアルカリ金属イオンとの塩であることが好ましく、ナトリウム塩であることがより好ましい。
【００５７】
酸性多糖は、その種類に応じ、天然源から入手、又は公知の方法で製造することができる。
【００５８】
酸性多糖の分子量は特に制限されず、酸性多糖を構成する単糖の種類、目的等に応じて適宜選択される。酸性多糖の重量平均分子量は例えば、１０，０００〜５，０００，０００とすることができ、１５，０００〜２，０００，０００であることが好ましく、１５，０００〜１，０００，０００であることがより好ましい。また、分子量に代わる指標として溶液の粘度によって所望の酸性多糖を選択することもできる。
【００５９】
酸性多糖としてヒアルロン酸を選択する場合、その重量平均分子量は特に限定されず、目的（例えば、医用材料としての用途等）に応じて適宜選択することができる。重量平均分子量は、例えば１０，０００〜５，０００，０００とすることができ、製造効率上の観点から、５０，０００〜３，０００，０００であることが好ましく、２００，０００〜１０００，０００であることがより好ましい。
【００６０】
酸性多糖としてコンドロイチン硫酸を用いる場合、その種類は特に限定されず、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ等のいずれのコンドロイチン硫酸を用いることも可能である。コンドロイチン硫酸の種類は、目的（例えば、医用材料としての用途等）により適宜選択してもよい。コンドロイチン硫酸の重量平均分子量は特に限定されず、目的等に応じて適宜選択することができる。重量平均分子量は、１０，０００〜１００，０００であることが好ましく、１０，０００〜５０，０００であることがより好ましい。
【００６１】
酸性多糖としてカルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロースを用いる場合、粘度（分子量）及びエーテル化度（置換度）は特に限定されず、目的（例えば、医用材料としての用途等）に応じて適宜選択できる。カルボキシ基がナトリウム塩となっている場合、エーテル化度が０．５〜１．３であって、粘度が１質量％水溶液とした際に１０〜１８，０００（ｍＰａ・ｓ）であることが好ましく、エーテル化度が０．５〜１．０であって、粘度が１質量％水溶液とした際に、５０〜６，０００（ｍＰａ・ｓ）であることがより好ましい。粘度は２５℃条件下でＢ型回転粘度計を用いて測定することができる。
【００６２】
酸性多糖としてアルギン酸を用いる場合、粘度（分子量）は特に限定されず、目的（例えば、医用材料としての用途等）に応じて適宜選択できる。カルボキシ基がナトリウム塩である場合の粘度は、１質量％水溶液とした際に、１０〜１，０００（ｍＰａ・ｓ）であることが好ましく、８０〜６００（ｍＰａ・ｓ）であることがより好ましい。粘度は２５℃条件下でＢ型回転粘度計を用いて測定することができる。
【００６３】
ジアミン架橋剤
ジアミン架橋剤は、両端が一級アミノ基であり、分子内にエステル又はチオエステル結合を有するジアミン化合物であって、当該アミノ基の少なくとも一つと当該エステル又はチオエステルのカルボニル炭素との間の直鎖の原子数が１〜５であるジアミン化合物からなる、酸性多糖用ジアミン架橋剤である。ここで、「〜間の直鎖」というときは、化合物中の２点間を最小の原子数で連結する構造を指す。
このようなジアミン化合物や、例えば、両端が一級アミノ基であり、その両端アミノ基間の直鎖上に上記カルボニル炭素を有する構造において、その両端アミノ基間の直鎖の原子数が５〜１２であるときには、前記の経験則上、exo-trig型の３〜７員環の遷移状態をとりやすい構造となる。
このような遷移状態を取りやすい構造のジアミン化合物は、架橋に用いることはできないと認識されていたものであるが、本発明者らは、そのような化合物であっても酸性多糖の架橋に用いることができることを初めて見出した。
上記化合物としては下記一般式（Ｉ）で表されるジアミン架橋剤を例示できる。
【化４】
2019218546.tif 000005
[式中、両端のアミノ基間の直鎖の原子数は、５〜１２であって、
Ｘ及びＹは、それぞれ独立に、単結合、置換若しくは無置換のアルキレン基、置換若しくは無置換のアルケニレン基又は置換若しくは無置換のアルキニレン基を表し、ただし、Ｘ及びＹが同時に単結合であることはなく；
Ｚは、酸素原子又は硫黄原子を表し；
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立に、水素原子、−ＣＯＮＲ3Ｒ4基、−ＣＯＯＲ5基、置換若しくは無置換のアルキル基、置換若しくは無置換のアルケニル基又は置換若しくは無置換のアルキニル基を表し；
上記Ｘ及びＹにおけるアルキレン基、アルケニレン基及びアルキニレン基中の−ＣＨ2−は、アミド基（−ＣＯＮＨ−）、エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、エーテル基（−Ｏ−）、イミノ基（−ＮＨ−）及びフェニレン基からなる群より選択される１以上の基で置き換えられていてもよく、ただし、式（Ｉ）中の−ＣＯ−Ｚ−と、Ｘ又はＹに含まれうるエステル基、アミド基、エーテル基（−Ｏ−）及びイミノ基（−ＮＨ−）は、直接隣り合うことがなく、
上記Ｒ１及びＲ２におけるアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基中の−ＣＨ２−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−、−ＮＲ６−及び−Ｓ−からなる群より選択される１以上の基で置き換えられていてもよく；
上記Ｘ、Ｙ、Ｒ１及びＲ２における置換基は、ヒドロキシ基、炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基、インドリル基、ジアゾリル基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＭｅ基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＭｅ２基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ５基、−ＳＭｅ基及び−ＳＨ基からなる群より選択され、Ｘ及びＹの置換基は、さらに４−ヒドロキシフェニル基、ハロゲン原子、ニトロ基及びニトリル基からなる群より選択されてもよく、ここでそれぞれのｎは、独立して０〜４の整数を表し；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子又はフェニル基で置換されてもよいアルキル基を表す]
で示される、ジアミン架橋剤。
【００６４】
ジアミン架橋剤においては、ジアミン架橋剤構造は、両端アミノ基間の直鎖上に、生体中で分解可能な結合、すなわち生分解点を少なくとも１つ有していることが好ましい。分解可能な結合としては、エステル結合、チオエステル結合などが好ましく、エステル結合がより好ましい。本明細書では、生分解点とは、式（Ｉ）における−Ｃ（＝Ｏ）−Ｚ−に相当する構造を意味し、特に断りが無い限り、エステル結合、もしくはチオエステル結合を表す。生分解点の数は、１つ又は２つが好ましく、１つがより好ましい。
【００６５】
酸性多糖架橋体の分解消失時間は、ジアミン架橋剤の生分解点(エステル結合又はチオエステル結合)近傍の基Ｘ、Ｙ上の置換基の種類や数、Ｒ１、Ｒ２基の選択により容易に制御することができる。すなわち、酸性多糖の種類に依存せず、酸性多糖架橋体の生体内での消失速度が制御可能となる。
【００６６】
一般式（Ｉ）で示されるジアミン架橋剤における置換基の位置は、生分解点の安定性に影響を及ぼす位置であれば基Ｘ、Ｙ中のどの位置でもよく、具体的には、生分解点のα位、β位及びγ位からなる群より選択される少なくとも一つを好ましく選択することができる。基Ｘ、Ｙが単結合の場合には、置換基を有しうるＲ１、Ｒ２の構造で酸性多糖架橋体の生体内での分解消失時間が制御される。置換基の数は、目的に応じて選択可能であり、例えば、０〜８であることが好ましく、１〜４であることがより好ましい。
【００６７】
置換基の種類は、例えば、電子吸引性基、電子供与性基及び立体障害性基からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【００６８】
例えば、基Ｘ、Ｙに導入する置換基、及びＲ１、Ｒ２が電子吸引性基である場合、無置換の場合よりも生分解点が分解しやすくなり、酸性多糖架橋体の分解消失時間が短くなる傾向がある。したがって、電子吸引性基の強さ、例えば電気陰性度、ハメット定数等を指標として電子吸引基を選択することにより、酸性多糖架橋体の分解消失時間を所望の範囲に容易に調整することが可能である。すなわち、強い電子吸引性基を選択することで酸性多糖架橋体の生体内での分解消失時間を短縮できる傾向がある。具体的には、フッ素、塩素、臭素のようなハロゲン原子を導入する場合、電気陰性度の順（Ｆ＞Ｃｌ＞Ｂｒ）に酸性多糖の生体内での分解消失時間が短くなる傾向がある。
【００６９】
電子吸引性基は、基Ｘ、Ｙ、及びＲ１、Ｒ２に導入可能であれば特に制限されず、通常用いられる電子吸引性基から適宜選択することができる。電子吸引性基として具体的には、フッ素、塩素、臭素などのハロゲン原子；カルボキシ基などが好ましい。
【００７０】
基Ｘ、Ｙに導入する置換基、及びＲ１、Ｒ２が電子供与性基であると、生分解点の共有結合が無置換の場合よりも分解し難くなり、酸性多糖架橋体の生体内での分解消失時間が延長する傾向がある。電子供与性基は、例えば、ハメット定数を指標として選択することができる。
【００７１】
電子供与性基は、基Ｘ、Ｙ及びＲ１、Ｒ２に導入可能であれば特に制限されず、通常用いられる電子供与性基から適宜選択することができる。電子供与性基として具体的には、アルケニル基、アルキニル基などを挙げることができる。
【００７２】
基Ｘ、Ｙ及びＲ１、Ｒ２に導入する置換基が立体障害性基であると、酸性多糖架橋体の生体内での分解消失時間が延長する傾向がある。立体障害性基は、例えば基Ｘが単結合の場合には、Ｒ１を、アミノ酸の疎水性指標（Hydropathy index）を指標として選択することもできる。
【００７３】
立体障害性基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等の直鎖状アルキル基；イソプロピル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基等の分岐鎖アルキル基；シクロヘキシル基等の環状アルキル基；フェニル基等のアリール基などを挙げることできる。これらの中でも分岐鎖アルキル基、環状アルキル基等が好ましい。
【００７４】
基Ｘ、Ｙ及びＲ１、Ｒ２における置換基は、電子吸引性基、電子供与性基及び立体障害性基のそれぞれに明確に区別できるわけではないが、ハメット定数、疎水性指標等を指標として、置換基の種類及びその置換位置を選択することで、酸性多糖架橋体の生体内での消失速度を制御することができる。
【００７５】
更に、電子吸引性基及び電子供与性基の両方を導入して分解消失速度を微調整することも可能であるし、電子吸引性又は電子供与性と立体障害性とを併せ持つ置換基を導入して、酸性多糖架橋体の生体内での分解消失速度を微調整することも可能である。
【００７６】
このような基Ｘ及びＹに導入可能な置換基、ならびにＲ1及びＲ2に導入可能な電子吸引性基、電子供与性基及び立体障害性基は、ヒドロキシ基、炭素数１〜６のアルキル基、インドリル基、ジアゾリル基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＭｅ基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＭｅ２基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ５基及び−ＳＨ基からなる群より選択され、Ｘ及びＹの置換基は、さらにフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、ハロゲン原子、ニトロ基及びニトリル基からなる群より選択されてもよく、ここでそれぞれのｎは、独立して０〜４の整数を表す。
【００７７】
ジアミン架橋剤構造は、上述の一般式（Ｉ）の構造を有することが好ましい。中でも両端アミノ基間の直鎖の原子数は、５〜１２が好ましく、５〜８がより好ましく、５又は６が最も好ましい。
【００７８】
ジアミン架橋剤は、天然由来のアミノ酸又はその誘導体のみで構成される構造が好ましい。例えば、セリン誘導体、トレオニン誘導体、チロシン誘導体及びシステイン誘導体からなる群より選択されるアミノ酸誘導体の少なくとも一つの−ＯＨ基もしくは−ＳＨ基と、天然由来のアミノ酸のカルボキシ基の縮合反応で得られる、エステル結合もしくはチオエステル結合を有するジアミン架橋剤がより好ましい。この場合、セリン誘導体、トレオニン誘導体、チロシン誘導体及びシステイン誘導体のカルボキシ基は、エステル構造又はアミド構造型がさらに好ましい。
【００７９】
天然由来のアミノ酸として具体的には、グリシン、アラニン、β−アラニン、アスパラギン、セリン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、チロシン、トリプトファン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、ヒスチジン、ノルバリン、ノルロイシン、イソセリン、アミノ酪酸、アミノ吉草酸、アミノヘプタン酸、アミノオクタン酸、アミノデカン酸、アミノウンデカン酸、アミノドデカン酸及びこれらの構造異性体を挙げることができる。
【００８０】
これらの中でも、グリシン、アラニン、β−アラニン、アスパラギン、セリン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、チロシン、トリプトファン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、ヒスチジン、ノルバリン、ノルロイシン、イソセリンを好ましく用いることができる。
【００８１】
アミノ酸が、アスパラギン酸、グルタミン酸である場合は、側鎖のカルボキシ基が、エステル構造又はアミド構造を有していることがより好ましい。
また本発明において、リジン、オルニチン又はアルギニンの誘導体を用いる場合は、側鎖のアミノ基がＮ−アルキル化されているものを用いることができる。
【００８２】
本発明におけるジアミン架橋剤の上記の要件を充足する上記式（Ｉ）の化合物とその好ましい態様は、以下のとおりである。
本発明の酸性多糖用ジアミン架橋剤は、上述のとおりであり、当該架橋剤を構成する式（Ｉ）の化合物において、Ｘ及びＹは、それぞれ独立に、単結合（ただし、Ｘ、Ｙが同時に単結合であることはない）、置換若しくは無置換のアルキレン基、置換若しくは無置換のアルケニレン基又は置換若しくは無置換のアルキニレン基を表す。
【００８３】
Ｘは、好ましくは、単結合又はハロゲン原子で置換されてもよいアルキレン基であり、より好ましくは単結合である。
別の好ましい態様においては、Ｘは、好ましくはフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−ＣＯＯＲ５基、ハロゲン原子、ニトロ基又はニトリル基によって置換されたアルキレン基、アルケニレン基又はアルキニレン基である。
【００８４】
Ｙは、好ましくは、置換若しくは無置換のアルキレン基であり、ここでＹにおける置換基は、好ましくはメチル基、フェニル基及び−ＣＯＯＲ５基からなる群より選択される。別の好ましい態様においては、Ｙは、好ましくは＞ＣＲ７Ｒ８を表し、ここでＲ7及びＲ8は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、インドリル基、ジアゾリル基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＭｅ基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＭｅ２基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ５基、−ＳＨ基、ハロゲン原子、ニトロ基又はニトリル基を表し、好ましくは、それぞれ独立に、水素原子、フェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−ＣＯＯＲ５基、ハロゲン原子、ニトロ基又はニトリル基を表し、更に好ましくは水素原子を表す。別の好ましい態様では、Ｒ７は、水素原子を表し、Ｒ８は、水素原子又はメチル基を表す。
【００８５】
Ｚは、酸素原子又は硫黄原子を表し、好ましくは酸素原子を表す。
【００８６】
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−ＣＯＯＲ５基、置換若しくは無置換のアルキル基、置換若しくは無置換のアルケニル基又は置換若しくは無置換のアルキニル基を表す。
【００８７】
Ｒ１は、好ましくは、水素原子又は置換若しくは無置換のアルキル基を表し、水素原子であることがより好ましい。
ここでＲ１におけるアルキル基の置換基は、好ましくはメチル基、フェニル基、インドリル基、−ＣＯＯＲ５基及び−Ｓ−Ｍｅ基からなる群より選択される。別の好ましい態様においては、Ｒ１は、好ましくは、水素原子、−（ＣＨ２）２−Ｓ−ＣＨ３基、−（ＣＨ２）３もしくは４−ＮＨＭｅ基、−（ＣＨ２）３もしくは４−ＮＭｅ２基又は−（ＣＨ２）１もしくは２−ＣＯＯＲ５基を表す。
【００８８】
Ｒ２は、好ましくは水素原子、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基又は−ＣＯＯＲ５基を表す。別の好ましい態様においては、Ｒ２は、好ましくは−ＣＯＮＲ3Ｒ4基又は−ＣＯＯＲ5基を表す。
【００８９】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子又はフェニル基で置換されてもよいアルキル基を表す。
【００９０】
ジアミン架橋剤を構成する（Ｉ）の化合物において、両端のアミノ基間の直鎖の原子数は、５〜１２であり、好ましくは５〜８であり、より好ましくは５又は６である。
【００９１】
上記のジアミン架橋剤は、２価の塩を形成した状態で好ましく用いられる。塩の種類は特に制限されないが、薬学的に許容される塩が好ましい。具体的には、塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩又は硝酸塩から選択される少なくとも一つが好ましく、塩酸塩がより好ましい。
【００９２】
ジアミン架橋剤の分岐構造
一般式(Ｉ)で示されるジアミン架橋剤中の基Ｘ、Ｙが有する置換基、あるいはＲ１又はＲ２に、構造中の生分解点と末端の１級アミノ基を併せ持つ置換基が選択された場合、トリアミン架橋剤となる。このように生分解点を併せ持つ分岐１級アミノ基が１つ以上存在するような多価アミン架橋剤を用いても、同様の酸性多糖架橋体を製造することができる。ただし、反応制御の観点から、１級アミノ基が２つであるジアミン構造がより好ましい。
【００９３】
以下に、式（Ｉ）で示されるジアミン架橋剤の具体例を示す。
２−アミノエチル−２−アミノアセテート（ＧｌｙＣ２Ｎ）。例えば、ＧｌｙＣ２Ｎ・２塩酸塩（化合物４）（実施例１）
（Ｓ）−エチル−２−アミノ−３−（２−アミノアセトキシ）プロパノエート（ＧｌｙＳｅｒＥｔ）。例えば、ＧｌｙＳｅｒＥｔ・２塩酸塩（化合物７）（実施例２）
（Ｓ）−２，３−ジアミノ−３−オキソプロピル  ２−アミノアセテート（ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）。例えば、ＧｌｙＳｅｒＮＨ２・２塩酸塩（化合物１０）（実施例３）
（Ｓ）−２−アミノ−３−（メチルアミノ）−３−オキシプロピル−２−アミノアセテート（ＧｌｙＳｅｒＮＨＭｅ）。例えば、ＧｌｙＳｅｒＮＨＭｅ・２塩酸塩（化合物１４）（実施例４）
（Ｓ）−２−アミノ−３−（ジメチルアミノ）−３−オキシプロピル−２−アミノアセテート（ＧｌｙＳｅｒＮＭｅ２）。例えば、ＧｌｙＳｅｒＮＭｅ２・２塩酸塩（化合物１７）（実施例５）
（Ｓ）−エチル−２−アミノ−４−（２−アミノアセトキシ）ブタノエート（ＧｌｙＨｏｍｏＳｅｒＥｔ）。例えば、ＧｌｙＨｏｍｏＳｅｒＥｔ・２塩酸塩（化合物２０）（実施例６）
（２Ｓ）−１−アミノプロパン−２−イル−２−アミノプロパノエート（ＡｌａＣ２ＭｅＮ）。例えば、ＡｌａＣ２ＭｅＮ・２塩酸塩（化合物２４）（実施例７）
（Ｓ）−１−アミノ−２−メチルプロパン−２−イル−２−アミノプロパノエート（ＡｌａＣ２Ｍｅ２Ｎ）。例えば、ＡｌａＣ２Ｍｅ２Ｎ・２塩酸塩（化合物２７）（実施例８）
１−アミノプロパン−２−イル−２−アミノアセテート（ＧｌｙＣ２ＭｅＮ）。例えば、ＧｌｙＣ２ＭｅＮ・２塩酸塩（化合物２９）（実施例９）
１−アミノ−２−メチルプロパン−２−イル−２−アミノアセテート（ＧｌｙＣ２Ｍｅ２Ｎ）。例えば、ＧｌｙＣ２Ｍｅ２Ｎ・２塩酸塩（化合物３１）（実施例１０）
Ｓ−（２−アミノエチル）−２−アミノエタンチオエート（ＧｌｙＳＣ２Ｎ）。例えば、ＧｌｙＳＣ２Ｎ・２塩酸塩（化合物３４）（実施例１１）
４−（２−アミノエチル）フェニル−２−アミノアセテート（ＧｌｙＰｈＣ２Ｎ）。例えば、ＧｌｙＰｈＣ２Ｎ・２塩酸塩（化合物３７）（実施例１２）
（Ｓ）−２−アミノエチル−２−（２−アミノアセトキシ）プロパノエート（ＧｌｙＬａｃＣ２Ｎ）。例えば、ＧｌｙＬａｃＣ２Ｎ・２塩酸塩（化合物４２）（実施例１３）
（Ｓ）−２−アミノ−３−ベンジルアミノ−３−オキソプロピル−２−アミノアセテート（ＧｌｙＳｅｒＮＨＢｎ）。例えば、ＧｌｙＳｅｒＮＨＢｎ・２塩酸塩（化合物４５）（実施例１４）
（Ｓ）−２−アミノ−３−（オクチルアミノ）−３−オキソプロピル−２−アミノアセテート（ＧｌｙＳｅｒＮＨＣ８）。例えば、ＧｌｙＳｅｒＮＨＣ８・２塩酸塩（化合物４８）（実施例１５）
（Ｓ）−３−アミノ−４−エトキシ−４−オキソブチル−８−アミノオクタノエート（ＯｃｔＨｏｍｏＳｅｒＥｔ）。例えば、ＯｃｔＨｏｍｏＳｅｒＥｔ・２塩酸塩（化合物５２）（実施例１６）
２−アミノエチル ２−（２−アミノアセトアミド）アセテート（ＧｌｙＧｌｙＣ２Ｎ）。例えば、ＧｌｙＧｌｙＣ２Ｎ・２塩酸塩（化合物５５）(実施例４３)
２−（２−アミノエトキシ）エチル ２−アミノアセテート（ＧｌｙＣ２ＯＣ２Ｎ）。例えば、ＧｌｙＣ２ＯＣ２Ｎ・２塩酸塩（化合物５８）（実施例４４）
２−（（２−アミノエチル）アミノ）エチル ２−アミノアセテート（ＧｌｙＣ２ＮＣ２Ｎ）。例えば、ＧｌｙＣ２ＮＣ２Ｎ・３塩酸塩（化合物６１）（実施例４５）
（Ｓ）−２−アミノエチル ２−アミノ−４−メチルペンタノエート（ＬｅｕＣ２Ｎ）。例えば、ＬｅｕＣ２Ｎ・２塩酸塩（化合物６４）（実施例４６）
（Ｓ）−２−アミノエチル ２−アミノ−３−フェニルプロパノエート（ＰｈｅＣ２Ｎ）。例えば、ＰｈｅＣ２Ｎ・２塩酸塩（化合物６７）（実施例４７）
（Ｓ）−２−アミノエチル ２−アミノ−３−（１Ｈ−インドル−３−イル）プロパノエート（ＴｒｐＣ２Ｎ）。例えば、ＴｒｐＣ２Ｎ・２塩酸塩（化合物７０）（実施例４８）
（Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−４−（エチルアミノ）−４−オキソブタン−２−イル ２−アミノプロパノエート（ＡｌａＴｈｒＮＨＥｔ）。例えば、ＡｌａＴｈｒＮＨＥｔ・２塩酸塩（化合物７４）（実施例４９）
（Ｓ）−２−アミノエチル ２−アミノ−４−（メチルチオ）ブタノエート（ＭｅｔＣ２Ｎ）。例えば、ＭｅｔＣ２Ｎ・２塩酸塩（化合物７７）（実施例５０）
２−アミノエチル ３−アミノ−２−フルオロプロパノエート（βＡｌａ（Ｆ）Ｃ２Ｎ）。例えば、βＡｌａ（Ｆ）Ｃ２Ｎ・２塩酸塩（化合物８１）（実施例５１）
２−アミノエチル ２−アミノ−２−メチルプロパノエート（（Ｍｅ）ＡｌａＣ２Ｎ）。例えば、（Ｍｅ）ＡｌａＣ２Ｎ・２塩酸塩（化合物８４）（実施例５２）
【００９４】
以上のように、本発明における架橋剤では、比較的単純な構造の化合物を用いることができる。なかでも反応効率や生体適合性を考慮した場合、本発明における架橋剤は、低分子量で単純な構造であることがより望ましい。
【００９５】
式（ＩＩ）の化合物について
本発明の一つの実施態様は、下記一般式（ＩＩ）：
【化５】
2019218546.tif 000006
[式中、
Ｒ１は、水素原子、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−ＣＯＯＲ５基、置換若しくは無置換のアルキル基、置換若しくは無置換のアルケニル基又は置換若しくは無置換のアルキニル基を表し；
Ｒ２’は、−ＣＯＮＲ３Ｒ４基又は−ＣＯＯＲ５を表し、；
上記Ｒ1におけるアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基中の−ＣＨ２−は、＞Ｃ＝Ｏ、−ＣＯＮＨ−、アリーレン、−Ｏ−、−ＮＲ６−及び−Ｓ−からなる群より選択される１以上の基（ただし、Ｒ５がベンジル基である場合、−Ｏ−は除かれる）で置き換えられていてもよく；
上記Ｒ1における置換基は、ヒドロキシ基、炭素数１〜６のアルキル基、インドリル基、ジアゾリル基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＭｅ基、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＭｅ２基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＲ３Ｒ４基、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ５基及び−ＳＨ基からなる群より選択され（ただし、Ｒ２’が−ＣＯＮＨ２基である場合、−ＳＨ基は除かれる）、ここでそれぞれのｎは、独立して０〜４の整数を表し；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子又はフェニル基で置換されてもよいアルキル基を表し；
Ｒ８’は、水素原子又はメチル基を表す]
で示される化合物にも関する。
【００９６】
以上のように、本発明の化合物としては、比較的単純な構造のものを採用することができる。
一般式（ＩＩ）の化合物を用いた酸性多糖架橋体について
本発明の一つの実施態様は、一般式（ＩＩ）の化合物の一級アミノ基と、酸性多糖のカルボキシ基とが、アミド結合により架橋を形成してなる、酸性多糖架橋体にも関する。
【００９７】
式（Ｉ）で示されるジアミン架橋剤の製造方法
式（Ｉ）で示されるジアミン架橋剤は、天然から入手可能な化合物、又は所望の基を有する市販の化合物から出発し、下記反応スキーム及び実施例に記載の方法を参照することによって、当業者が容易に製造することができる。
【化６】
2019218546.tif 000007
【００９８】
上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、Ｙ及びＺは、式（Ｉ）において定義したとおりであり、Ｐｒは、Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）などのアミノ基の保護基を表す。
具体的には、式（Ｉ）で示されるジアミン架橋剤は、保護されたアミノ基を有する式(III)の化合物、及び保護されたアミノ基を有する式（IV）の化合物を、溶媒中、縮合剤の存在下、場合により塩基の存在下、反応させることにより、式（III）の化合物が有する−ＣＯＯＨ基を、式（IV）の化合物が有する−ＯＨ基もしくは−ＳＨ基と縮合させることによって調製することができる。好ましくは、先に述べたように、天然由来のアミノ酸誘導体、例えば、セリン誘導体、トレオニン誘導体、チロシン誘導体及びシステイン誘導体からなる群より選択されるアミノ酸誘導体の少なくとも一つの−ＯＨ基もしくは−ＳＨ基と、生体由来のアミノ酸のカルボキシ基とを縮合することによって得ることができる。
【００９９】
溶媒としては、式（III）の化合物及び式（IV）の化合物が溶解する溶媒であれば特に限定されないが、有機溶媒が好ましい。有機溶媒は、特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、１，２−ジクロロエタン、テトラヒドロフランなどが挙げられる。これらの中でも、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミドが好ましい。
【０１００】
縮合剤としては、各種縮合剤を用いることができるが、なかでもジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）、ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢＯＰ−Ｃｌ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）などを好ましく用いることができる。
【０１０１】
塩基としては、各種塩基を用いることができるが、なかでもトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）などを好ましく用いることができる。
【０１０２】
縮合反応時の温度は、特に限定されず、使用する溶媒により適宜選択されるが、５〜６０℃が好ましく、１５〜３０℃がより好ましい。
【０１０３】
酸性多糖架橋体及びその製造方法について
架橋とは、ある高分子と他の高分子との間に共有結合を形成することをいう。この共有結合は、同一高分子内でも異なる高分子間でもよい。
酸性多糖架橋体は、酸性多糖同士が架橋しているものをいい、同一の又は異なる酸性多糖分子内の基が共有結合により架橋しているものを含む。
本発明においては、酸性多糖架橋体は、酸性多糖分子内のカルボキシ基がジアミン架橋剤のアミノ基を介してアミド結合により架橋したものをいう。例えば、通常用いられるアミド化方法によって共有結合を形成させるという一段階の反応で得られる。２つのカルボキシ基は、同一の多糖分子内の基でも、異なる多糖分子の基でもよい。すなわち、本発明の一つの実施態様は、酸性多糖の２つのカルボキシ基とジアミン架橋剤の２つのアミノ基とを縮合反応により縮合させる工程を含む、酸性多糖架橋体の製造方法に関する。
【０１０４】
アミド化方法としては例えば、溶媒中、水溶性カルボジイミド（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、ＤＭＴ−ＭＭ（４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドＮ水和物）等の縮合剤を用いる方法、対称酸無水物法、混合酸無水物法、活性エステル法などの方法を用いて、酸性多糖及びジアミン架橋剤を架橋反応させる方法を挙げることができる。アミド化方法の反応条件は、使用する酸性多糖とジアミン架橋剤に応じて適宜選択される。
【０１０５】
各種酸性多糖に対するジアミン架橋剤の仕込み当量としては、対応する酸性多糖のカルボキシ基１．００当量（１．００ｅｑ)に対して、ジアミン架橋剤０．００１〜０．５００当量が好ましく、０．００３〜０．４００当量がより好ましく、０．００５〜０．３００当量が最も好ましい。ここで、「当量」というときは、特に断りがない限り、モル当量を指す。
【０１０６】
酸性多糖のカルボキシ基とジアミン架橋剤とを反応させる場合、溶媒中の酸性多糖の濃度は、好ましくは０．５〜５０wt％、より好ましくは１〜４０wt％である。
【０１０７】
架橋反応時の溶媒としては、酸性多糖及びジアミン架橋剤が溶解する溶媒であれば特に限定されないが、水及び水混和性有機溶媒との混合溶媒が好ましく、酸性多糖の濃度も考慮し適宜選択される。
【０１０８】
水混和性有機溶媒は、特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、第三級ブタノールなどの低級アルコール類、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類、アセトン、１，４−ジオキサン、テドラヒドロフラン、アセトニトリルが挙げられる。これらの中でも、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサンが好ましい。これらの水混和性有機溶媒は、水に対して単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【０１０９】
架橋反応時の温度は、特に限定されず、使用する溶媒により適宜選択されるが、５〜６０℃が好ましく、１５〜３０℃がより好ましい。
【０１１０】
架橋反応後の架橋体を含む反応液を、１）攪拌あるいは粉砕工程、２）沈殿工程、３）洗浄工程、４）乾燥工程を経由させることで、最終的に乾燥粉末状態の酸性多糖架橋体が得られる。
【０１１１】
攪拌方法は、当業者によって一般的に行われる方法で行うことができ、特に限定されない。粉砕方法は特に限定されないが、スパーテルでの粉砕や、湿式粉砕に適する装置が用いられる。粉砕物の平均粒子径は、最終的に得られる酸性多糖架橋体の医用用途によって、あるいは粉砕に用いる装置によって適宜設定される。
【０１１２】
沈殿工程、洗浄工程、及び乾燥工程は、当業者によって一般的に行われる方法で行うことができ、特に限定されない。
【０１１３】
架橋反応時のアミド化法、反応溶媒、酸性多糖の濃度、ジアミン架橋剤の構造、及び架橋剤の仕込み当量は、使用する酸性多糖と、医用材料に求められる性質によって、適宜選択される。
【０１１４】
架橋率
上記の方法によって得られる酸性多糖架橋体の架橋率は、以下の一般式(Ａ)で定義される。
【数１】
2019218546.tif 000008
(上記式中、Ｒは、−ＯＨ、−ＯＮａ、又はＮＨ架橋剤を表す)
【０１１５】
酸性多糖架橋体膨潤物の物理的応力
酸性多糖架橋体膨潤物とは、酸性多糖架橋体が水分を吸収し膨張した状態を指す。また、本発明における物理的応力とは、酸性多糖架橋体膨潤物が外側から力を受けたとき、それに応じて内部に現れる抵抗力を意味する。応力の大きさは単位面積に作用する内力の大きさにより定義される。
酸性多糖架橋体膨潤物の物理的応力は、特に制限されないが、その医用用途により適宜選択される。物理的応力は、ジアミン架橋剤の種類、ジアミン架橋剤の仕込み当量、酸性多糖の種類、酸性多糖架橋体の濃度又は薬学的に許容される塩の添加により、容易に制御することができる。
【０１１６】
酸性多糖架橋体の平衡膨潤濃度
本発明においては、平衡膨潤濃度とは、酸性多糖架橋体粉末が水分を吸収し平衡状態に達した濃度を表す。具体的には、生理食塩水に接したフィルター上に酸性多糖架橋体粉末を静置し、３日後に生理食塩水を吸収して膨潤した酸性多糖架橋体の重量から算出することができる。
【０１１７】
製剤条件
上記の方法により調製される本発明の酸性多糖架橋体は、医用用途に応じて適宜加工して、所望の形状又は剤形にすることができる。具体的には、医学的に許容される溶媒を用いた膨潤物又は懸濁液、あるいは粉末、顆粒の形状又は剤形が好ましく、医薬的に許容される添加剤や賦形剤を含んでいてもよい。
【０１１８】
滅菌方法
本発明の酸性多糖架橋体を含む医用用途のための滅菌方法は、特に制限されないが、医用用途の目的、製剤条件、及び投与器具を考慮し、適宜選択される。具体的には、ＥＯＧ滅菌、放射線滅菌、及び湿熱（高圧蒸気）滅菌などが例示される。この内、放射線滅菌、湿熱滅菌が好ましい。
【０１１９】
医用材料
本発明での酸性多糖架橋体は、各種医用材料として使用することができるが、その医用材料としては、例えば組織膨隆材又は癒着防止材を例示できる。その用途に応じて、酸性多糖の種類、反応時の酸性多糖の濃度、ジアミン架橋剤の構造及び仕込み当量を、適宜選択することができる。
【０１２０】
組織膨隆材
本発明では、組織膨隆材の適用分野としては、以下を例示することができる。
（１）泌尿器科領域
腹圧性尿失禁（ＳＵＩ）、膀胱尿管逆流症（ＶＵＲ）
本発明の酸性多糖架橋体を泌尿器科領域用の組織膨隆材とする場合、例えば酸性多糖架橋体を粉状物として、又は溶媒に膨潤させて生体内に投与することができる。膨潤させる溶媒は、薬学的に許容される塩を含んだ、生理食塩水又はリン酸緩衝液などが好ましい。組織膨隆材として投与する場合の濃度は、組織膨隆材としての用途に求められる性能に応じて適宜決定することができ、通常用いられる方法により投与できる。
【０１２１】
癒着防止材
本発明では、癒着防止材の適用分野として以下を例示することができる。
（１）産婦人科領域
不妊症治療時の骨盤内手術、子宮手術(Uterus operation)、卵管手術(Tubal operation)、卵巣手術(Ovarian operation)、子宮内膜症治療手術(Endometiosis treatment operation)、帝王切開術(Cesarean section)、骨盤内癒着剥離術等に伴う癒着の防止。
本発明の酸性多糖架橋体を産婦人科領域用の癒着防止材とする場合、術後の創傷部位に、例えば酸性多糖架橋体を粉末の形態で適用することができる。
（２）消化器手術領域
腹部手術後の腸管癒着等に伴う癒着の防止。
本発明の酸性多糖架橋体を消化器手術領域用の癒着防止材とする場合、術後の創傷部位に、例えば酸性多糖架橋体を粉末の形態で適用することができる。
（３）整形外科領域
アキレス腱手術、屈筋腱手術、関節形成術、椎弓切除術等に伴う癒着の防止。
本発明の酸性多糖架橋体を整形外科領域用の癒着防止材とする場合、術後の創傷部位に、例えば酸性多糖架橋体を粉末の形態で適用することができる。
【０１２２】
酸性多糖架橋体の分解消失時間
酸性多糖架橋体の生体内での分解消失時間は、特に制限されないが、その医用用途により適宜選択され、１週間〜２年の期間が好ましく、１週間〜１年の期間がより好ましい。具体的には、酸性多糖架橋体を癒着防止材として使用する場合には、その生体内での分解消失時間は、３日間〜６週間であるのが好ましく、３日間〜４週間であるのがより好ましい。また、酸性多糖架橋体を組織膨隆材として使用する場合には、その生体内での分解消失時間は、２〜４８週間であるのが好ましく、４〜２４週間であるのがより好ましい。分解消失時間は、ジアミン架橋剤の構造を適宜選択することにより、容易に制御することができる。
【実施例】
【０１２３】
以下、本発明を実施例及び試験例により具体的に詳説する。しかしながら、これにより本発明の技術的範囲が制限されるべきものではない。なお、特に断りのない限り「％」は質量基準である。
【０１２４】
実施例１
２−アミノエチル−２−アミノアセテート（ＧｌｙＣ２Ｎ）・２塩酸塩（化合物４）の合成
以下の手順で化合物４を合成した。
【化７】
2019218546.tif 000009
化合物２は、東京化成（株）より購入した。
【０１２５】
（工程１）
Ｂｏｃ−エタノールアミン（化合物２）（２．６５ｇ、１６．４mmol）を、ジクロロメタン（１５mL）に溶解させ、Ｂｏｃ−グリシン（化合物１）（２．９７ｇ、１６．９mmol）を添加した。この溶液に、氷冷下、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）（４８２mg、３．９５mmol）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）（３．９７ｇ、２０．７mmol）を添加し、室温下、１３時間攪拌した。反応液を減圧濃縮後、残液に酢酸エチル（６００mL）を添加し、０．３Ｎ  塩酸（２００mL）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２００mL）、飽和食塩水（２００mL）で順次洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１／３）で精製して、化合物３（５．２３ｇ、１６．４mmol）を、無色透明粘性液体として得た（収率１００％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.45-1.46(18H, m, Boc×2), 3.40-3.41(2H, m, CH2), 3.92(2H, d, J=6Hz, CH2), 4.22(2H, t, J=6Hz), 4.85(1H, brs, NH), 5.04(1H, brs, NH)
ESI-MS: Calcd for C14H26N2O6 [M+H]+, 319.2; found 319.2
【０１２６】
（工程２）
化合物３（３．００ｇ、９．４２mmol）に、氷浴下、４Ｎ  塩化水素／１，４−ジオキサン（３０mL）を添加し、室温で２時間攪拌した。反応液にジエチルエーテル（１５０mL）を添加し、白色固体を沈殿させた。上清を除去し、ジエチルエーテル（２００mL）による沈殿洗浄を５回繰返した。沈殿を真空乾燥することで、標記の化合物４（１．５５ｇ、８．１３mmol）を白色固体として得た（収率８６％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 3.10(2H, brs, CH2), 3.85(2H, s, CH2), 4.39(2H, q, J=2Hz), 8.45(3H, brs, NH3), 8.64(3H, brs, NH3)
【０１２７】
実施例２
（Ｓ）−エチル−２−アミノ−３−（２−アミノアセトキシ）プロパノエート（ＧｌｙＳｅｒＥｔ）・２塩酸塩（化合物７）の合成
以下の手順で化合物７を合成した。
【化８】
2019218546.tif 000010
化合物５は、Biochemical Pharmacology, 2006, 71(3), 268-277に記載の方法により合成した。
【０１２８】
（工程１）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−エタノールアミンの代わりに化合物５を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物５（３．３８ｇ、１４．５mmol）と化合物１（２．５４ｇ、１４．５mmol）より、化合物６（５．１２ｇ、１３．１mmol）を無色透明粘性液体として得た（収率９０％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.29(3H, t, 7Hz, CH2CH3), 1.45(18H, m, Boc×2), 3.91(2H, d, J=6Hz), 4.23(2H, dd, J=15Hz, 7Hz, CH2CH3), 4.44-4.50(2H, m, CH2), 4.55-4.58(1H, m, CH), 4.99(1H, brs, NH), 5.33(1H, m, NH)
ESI-MS: Calcd for C17H30N2O8 [M+H]+ 391.2; found 391.2
【０１２９】
（工程２）
実施例１（工程２）において、化合物３の代わりに化合物６を用いた以外は実施例１（工程２）と同様にして、化合物６（５．１２ｇ、１３．１mmol）より、標記の化合物７（３．４５ｇ、１３．１mmol）を白色固体として得た（収率１００％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 1.25(3H, t, 7Hz, CH2CH3), 3.83(2H, dd, 30Hz, 18Hz, CH2), 4.24(2H, dd, 14Hz, 7Hz, CH2CH3), 4.49-4.55(2H, m, CH2), 4.66(1H, dd, 12Hz, 3Hz, CH), 8.74(3H, brs, NH3), 9.07(3H, brs, NH3)
【０１３０】
実施例３
（Ｓ）−２，３−ジアミノ−３−オキソプロピル  ２−アミノアセテート（ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）・２塩酸塩（化合物１０）の合成
以下の手順で化合物１０を合成した。
【化９】
2019218546.tif 000011
化合物８は、Synthetic Communications, 1989, 19(9-10), 1603-9に記載の方法により合成した。
【０１３１】
（工程１）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−エタノールアミンの代わりに化合物８を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物８（６５１mg、３．１９mmol）と化合物１（６１５mg、３．５１mmol）より、化合物９（１．０９ｇ、３．０２mmol）を白色固体として得た（収率９５％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.45-1.46(18H, m, Boc×2), 3.85-3.94(2H, m, CH2), 4.39-4.48(3H, m, CH2, CH), 5.09(1H, brs, NH), 5.45(1H, brs, NH), 5.57(1H, brs, NH2), 6.42(1H, brs, NH2)
ESI-MS: Calcd for C15H27N3O7 [M+H]+ 362.2, ; found 362.3
【０１３２】
（工程２）
実施例１（工程２）において、化合物３の代わりに化合物９を用いた以外は実施例１（工程２）と同様にして、化合物９（１．０９ｇ、３．０２mmol）より、標記の化合物１０（６５４mg、２．８０mmol）を白色固体として得た。（収率９２％）
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 3.81(1H, d, J=17Hz, CH2), 3.85(1H, d, J=17Hz, CH2), 4.13(1H, dd, J=6Hz, 4Hz, CH), 4.50(1H, dd, J=12Hz, 6Hz, CH2), 4.57(1H, dd, J=12Hz, 4Hz, CH2), 7.70(1H, brs, NH2), 8.15(1H, brs, NH2), 8.55(6H, brs, NH3×2)
ESI-MS: Calcd for C5H11N3O3 [2M+H]+ 323.2, ; found 323.2
【０１３３】
実施例４
（Ｓ）−２−アミノ−３−（メチルアミノ）−３−オキシプロピル−２−アミノアセテート（ＧｌｙＳｅｒＮＨＭｅ）・２塩酸塩（化合物１４）の合成
以下の手順で化合物１４を合成した。
【化１０】
2019218546.tif 000012
【０１３４】
（工程１）
Ｂｏｃ−セリン（化合物１１）（１．００ｇ、４．８７mmol）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（３０mL）に溶解し、室温下、１２Ｍ  メチルアミン水溶液（０．６０mL、７．２０mmol）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド・Ｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）（２．７０ｇ、９．７４mmol）を加え、室温で２時間攪拌した。水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝１：０〜９：１）にて精製し、化合物１２（１．００ｇ、４．５９mmol）を白色固体として得た（収率９４％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.46(9H, s, Boc), 2.83(3H, d, 4.9Hz, CH3), 3.65(1H, m, CH), 4.10-4.15(2H, m, CH2), 5.56(1H, brs, NH), 6.67(1H, brs, NH)
ESI-MS: Calcd for C9H18N2O4 [M+H]+, 219.1; found 219.2
【０１３５】
（工程２）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−エタノールアミンの代わりに化合物１２を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物１２（８１０mg、３．７１mmol）と化合物１（７１６mg、４．０９mmol）より、化合物１３（１．１８ｇ、３．１５mmol）を白色固体として得た（収率８５％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.46(18H, m, Boc×2), 2.84(3H, d, 4.9Hz, CH3), 3.87-3.89(2H, m, CH2), 4.35-4.46(3H, m, CH2 and CH), 5.37(1H, brs, NH), 6.38(1H, brs, NH), 7.26(1H, brs, NH)
ESI-MS: Calcd for C16H29N3O7 [M+H]+, 376.2; found 376.3
【０１３６】
（工程３）
実施例１（工程２）において、化合物３の代わりに化合物１３を用いた以外は実施例１（工程２）と同様にして、化合物１３（１．１８ｇ、３．１５mmol）より、標記の化合物１４（７７３mg、３．１２mmol）を白色固体として得た（収率９９％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 2.49(3H, d, J=5Hz, CH3), 3.81(1H, d, J=17Hz, CH2), 3.86(1H, d, J=17Hz, CH2), 4.13(1H, dd, J=4Hz, 6Hz, CH), 4.47(1H, dd, J=6Hz 12Hz, CH2), 4.52(1H, dd, J=4Hz, 12Hz, CH2),8.55(6H, brs, NH3), 8.75(1H, brs, NH)
ESI-MS: Calcd for C6H13N3O3 [M+H]+ 176.1, ; found 176.1
【０１３７】
実施例５
（Ｓ）−２−アミノ−３−（ジメチルアミノ）−３−オキシプロピル−２−アミノアセテート（ＧｌｙＳｅｒＮＭｅ２）・２塩酸塩（化合物１７）の合成
以下の手順で化合物１７を合成した。
【化１１】
2019218546.tif 000013
化合物１５は、Tetrahedron, 2004, 60(10), 2247-2257に記載の方法により合成した。
【０１３８】
（工程１）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−エタノールアミンの代わりに化合物１５を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物１５（６０８mg、２．６２mmol）と化合物１（５０５mg、２．８８mmol）より、化合物１６（８５８mg、２．２０mmol）を白色固体として得た（収率８４％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.44-1.45(18H, m, Boc×2), 2.97(3H, s, CH3), 3.16(3H, s, CH3), 3.88 (1H, dd, J=5Hz, 18Hz, CH2), 3.97(1H, dd, 6Hz, 18Hz, CH2), 4.03(1H, dd, 8Hz, 11Hz, CH2), 4.41(1H, dd, 4Hz, 11Hz, CH2), 4.92-4.96(1H, m, CH), 5.05(1H, brs, NH), 5.56(1H, d, J=8Hz, NH), 7.26(1H, brs, NH)
ESI-MS: Calcd for C17H31N3O7 [M+H]+ 390.2, ; found 390.2
【０１３９】
（工程２）
実施例１（工程２）において、化合物３の代わりに化合物１６を用いた以外は実施例１（工程２）と同様にして、化合物１６（８５３mg、２．１９mmol）より、標記の化合物１７（５０９mg、１．９４mmol）を白色固体として得た（収率８９％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 2.93(3H, s, CH3), 3.12(3H, s, CH3), 3.81(1H, d, J=17Hz, CH2), 3.88(1H, d, J=17Hz, CH2), 4.33(1H, dd, J=7Hz, 12Hz, CH2), 4.56(1H, dd, 3Hz 12Hz, CH2), 4.65(1H, dd, J=3Hz, 7Hz, CH2),8.54(6H, brs, NH3×2)
ESI-MS: Calcd for C7H15N3O3 [M+H]+ 190.1, ; found 190.1
【０１４０】
実施例６
（Ｓ）−エチル−２−アミノ−４−（２−アミノアセトキシ）ブタノエート（ＧｌｙＨｏｍｏＳｅｒＥｔ）・２塩酸塩（化合物２０）の合成
以下の手順で化合物２０を合成した。
【化１２】
2019218546.tif 000014
化合物１８は、Journal of Organic Chemistry, 2008, 73(8), 3212-3217に記載の方法により合成した。
【０１４１】
（工程１）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−エタノールアミンの代わりに化合物１８を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物１８（２．１９ｇ、８．８７mmol）と化合物１（１．６１ｇ、９．１９mmol）より、化合物１９（３．５９ｇ、８．８７mmol）を無色透明粘性液体として得た。（収率１００％）
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.29(3H, t, J=7Hz, CH2CH3), 1.44-1.45(18H, m, Boc x2), 2.00-2.08(1H, m, CH), 2.00-2.25(1H, m, CH), 3.85-3.95(2H, m, CH2), 4.10-4.29(4H, m, CH2CH3, CH2), 4.35-4.43(1H, m, CH), 4.77-5.16(2H, m, NH)
ESI-MS: Calcd for C18H32N2O8 [M+H]+, 405.2; found 405.3
【０１４２】
（工程２）
実施例１（工程２）において、化合物３の代わりに化合物１９を、４Ｎ  塩化水素／１，４−ジオキサンの代わりに４Ｎ  塩化水素／酢酸エチルを用いた以外は実施例１（工程２）と同様にして、化合物１９（１．９２ｇ、４．７５mmol）より、標記の化合物２０（１．３２ｇ、４．７５mmol）を白色固体として得た（収率１００％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 1.25(3H, t, J=7Hz, CH2CH3), 2.18-2.27(2H, m, CH2), 3.78(2H, s, CH2), 4.17-4.26(3H, m, CH2CH3, CH), 4.27-4.31(2H, m, CH2), 8.72(6H, brs, NH3 x2)
【０１４３】
実施例７
（２Ｓ）−１−アミノプロパン−２−イル−２−アミノプロパノエート（ＡｌａＣ２ＭｅＮ）・２塩酸塩（化合物２４）の合成
以下の手順で化合物２４を合成した。
【化１３】
2019218546.tif 000015
化合物２２は、Journal of Medicinal Chemistry, 2004, 47(5), 1259-1271に記載の方法により合成した。
【０１４４】
（工程１）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−エタノールアミンの代わりに化合物２２を、Ｂｏｃ−グリシン（化合物１）の代わりにＢｏｃ−Ｌ−アラニン（化合物２１）を用いて、さらにトリエチルアミンを化合物２２の１．０９当量添加した以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物２２（４．６２ｇ、２６．４mmol）と化合物２１（５．０３ｇ、２６．４mmol）より、化合物２３（６．０２ｇ、１７．４mmol）を無色透明粘性液体として得た（収率６６％）。
1H-NMR(500MHz, CDCl3, 55℃, δ)1.23(3H, t, J=7Hz, CH3), 1.37(3H, t, J=8Hz, CH3), 1.43(9H, s, Boc), 1.45(9H, s, Boc), 3.17-3.23(1H, m), 3.36(1H, brs), 4.20-4.22(1H, m), 4.78(1H, brs), 4.99(1H, brs), 5.00-5.02(1H, m)
【０１４５】
（工程２）
実施例１（工程２）において、化合物３の代わりに化合物２３を用いた以外は実施例１（工程２）と同様にして、化合物２３（２．１１ｇ、６．０９mmol）より、標記の化合物２４（１．３３ｇ、６．０９mmol）を白色固体として得た（収率１００％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 1.28(3H, dd, J=1Hz, 7Hz, CH3), 1.46(3H, d, J=8Hz, CH3), 2.98-3.03(1H, dd, J=9Hz, 14Hz), 3.12(1H, dd, J=2Hz, 14Hz), 3.33(1H, brs), 4.05(0.5H, q, J=8Hz), 4.16(0.5H, q, J=8Hz), 5.09(1H, q, J=7Hz), 8.54(6H, brs, NH3×2)
【０１４６】
実施例８
（Ｓ）−１−アミノ−２−メチルプロパン−２−イル−２−アミノプロパノエート（ＡｌａＣ２Ｍｅ２Ｎ）・２塩酸塩（化合物２７）の合成
以下の手順で化合物２７を合成した。
【化１４】
2019218546.tif 000016
化合物２５は、Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 2006, 253(1-2), 198-202に記載の方法により合成した。
【０１４７】
（工程１）
実施例７（工程１）において、化合物２２の代わりに化合物２５を用いた以外は実施例７（工程１）と同様にして、化合物２５（４．７０ｇ、２４．８mmol）と化合物２１（４．７１ｇ、２４．９mmol）より、化合物２６（４．７２ｇ、１３．１mmol）を無色透明粘性液体として得た（収率４７％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,55℃,δ) 1.34(3H, d, J=8Hz, CH3), 1.43(6H, s, CH3×2), 1.44(18H, s, Boc×2), 3.41(2H, d, J=5Hz, CH2), 4.12(1H, q, J=8Hz, CH), 4.88(1H, brs, NH), 5.11(1H, brs, NH)
【０１４８】
（工程２）
実施例１（工程２）において、化合物３の代わりに化合物２６を用いた以外は実施例１（工程２）と同様にして、化合物２６（１．０１ｇ、２．８０mmol）より、標記の化合物２７（６５１mg、２．７９mmol）を白色固体として得た（収率１００％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 1.43(3H, d, J=7Hz, CH3), 1.54(3H, s, CH3), 1.56(3H, s, CH3), 3.08-3.16(2H, m, CH2), 4.01(1H, brs, CH), 8.51(3H, brs, NH3), 8.75(3H, brs, NH3)
【０１４９】
実施例９
１−アミノプロパン−２−イル−２−アミノアセテート（ＧｌｙＣ２ＭｅＮ）・２塩酸塩（化合物２９）の合成
以下の手順で化合物２９を合成した。
【化１５】
2019218546.tif 000017
化合物２２は、Journal of Medicinal Chemistry, 2004, 47(5), 1259-1271に記載の方法により合成した。
【０１５０】
（工程１）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−エタノールアミンの代わりに化合物２２を用いて、さらにトリエチルアミンを化合物２２の１．１１当量添加した以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物２２（５．４１ｇ、２８．５mmol）と化合物１（５．０２ｇ、２８．５mmol）より、化合物２８（４．４５ｇ、１３．４mmol）を無色透明粘性液体として得た（収率４７％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,55℃,δ) 1.24(3H, d, J=7Hz, CH3), 1.44(9H, s, Boc), 1.46(9H, s, Boc), 3.16-3.21(1H, m, CH), 3.35(1H, brs, CH), 3.86(2H, d, J=6Hz, CH2), 4.75(1H, brs, NH), 4.94(1H, brs, NH), 5.02(1H, q, J=7Hz, CH)
【０１５１】
（工程２）
実施例１（工程２）において、化合物３の代わりに化合物２８を用いた以外は実施例１（工程２）と同様にして、化合物２８（４．１１ｇ、１２．４mmol）より、標記の化合物２９（２．４１ｇ、１１．８mmol）を白色固体として得た（収率９５％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 1.29(3H, d, J=7Hz, CH3), 3.00(1H, dd, J=9Hz,13Hz, CH), 3.10(1H, d, J=13Hz, CH), 3.78(1H, d, J=17Hz, CH), 3.92(1J, d, J=17Hz, CH), 5.09-5.13(1H, m, CH), 8.39(3H, brs, NH3), 8.53(3H, brs, NH3)
【０１５２】
実施例１０
１−アミノ−２−メチルプロパン−２−イル−２−アミノアセテート（ＧｌｙＣ２Ｍｅ２Ｎ）・２塩酸塩（化合物３１）の合成
以下の手順で化合物３１を合成した。
【化１６】
2019218546.tif 000018
化合物２５は、Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 2006, 253(1-2), 198-202に記載の方法により合成した。
【０１５３】
（工程１）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−エタノールアミンの代わりに化合物２５を用いて、さらにトリエチルアミンを化合物２５の１．１０当量添加した以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物２５（２．７１ｇ、１４．３mmol）と化合物１（２．５２ｇ、１４．４mmol）より、化合物３０（６５５mg、１．８９mmol）を無色透明粘性液体として得た（収率１３％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,55℃,δ) 1.45(18H, s, Boc×2), 1.53(6H, s, CH3×2), 3.38(2H, t, J=8Hz, CH2), 3.78(1H, d, J=6Hz, CH), 4.46(1H, d, J=6Hz, CH), 4.95(1H, brs, NH), 5.17(1H, brs, NH)
【０１５４】
（工程２）
実施例１（工程２）において、化合物３の代わりに化合物３０を用いた以外は実施例１（工程２）と同様にして、化合物３０（６５５mg、１．８９mmol）より、標記の化合物３１（４００mg、１．８３mmol）を白色固体として得た（収率９７％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 1.53(3H, s, CH3), 1.57(3H, s, CH3), 3.10(1H, s, CH),3.13(1H, s, CH), 3.74(1H, s, CH), 3.96(1H, d, J=6Hz, CH), 8.43(3H, brs, NH3), 8.50(3H, brs, NH3)
【０１５５】
実施例１１
Ｓ−（２−アミノエチル）−２−アミノエタンチオエート（ＧｌｙＳＣ２Ｎ）・２塩酸塩（化合物３４）の合成
以下の手順で化合物３４を合成した。
【化１７】
2019218546.tif 000019
化合物３２は、アルドリッチ社より購入した。
【０１５６】
（工程１）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−エタノールアミンの代わりに化合物３２を、ＥＤＣＩの代わりにビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢＯＰ−Ｃｌ）を化合物３２の１．２０当量添加し、さらにトリエチルアミンを化合物３２の２．４０当量添加した以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物３２（２．００ｇ、１１．３mmol）と化合物１（２．１７ｇ、１２．４mmol）より、化合物３３（３．７８ｇ、１１．３mmol）を無色透明粘性液体として得た（収率１００％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.44-1.47(18H, m, Boc×2), 3.03-3.07(2H, m, CH2), 3.30-3.31(2H, m, CH2),4.05(2H, d, J=6Hz, CH2), 4.82(1H, brs, NH), 5.12-5.22(1H, m, NH)
ESI-MS: Calcd for C14H26N2O5S [M+H]+, 335.2; found 335.2
【０１５７】
（工程２）
実施例６（工程２）において、化合物１９の代わりに化合物３３を用いた以外は実施例６（工程２）と同様にして、化合物３３（１．３６ｇ、４．０７mmol）より、標記の化合物３４（８２１mg、３．９６mmol）を白色固体として得た（収率９７％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 2.97-3.00(2H, m, CH2), 3.25(2H, t, J=7Hz, CH2), 4.09(2H, brs, CH2), 8.37(3H, brs, NH3), 8.60(3H, brs, H3N)
ESI-MS: Calcd for C4H10N2OS [M+H]+, 135.1; found 135.1
【０１５８】
実施例１２
４−（２−アミノエチル）フェニル−２−アミノアセテート（ＧｌｙＰｈＣ２Ｎ）・２塩酸塩（化合物３７）の合成
以下の手順で化合物３７を合成した。
【化１８】
2019218546.tif 000020
化合物３５は、東京化成（株）より購入した。
【０１５９】
（工程１）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−エタノールアミンの代わりにＮ−Ｂｏｃ−チラミン（化合物３５）を、ジクロロメタンの代わりにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物３５（２．００ｇ、８．４３mmol）と化合物１（１．６２ｇ、９．２６mmol）より、化合物３６（３．３０ｇ、８．３７mmol）を白色固体として得た（収率９９％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.44(9H, s, Boc), 1.47(9H, s, Boc), 2.70-2.81(2H, m, CH2), 3.36-3.73(2H, m, CH2), 4.16-4.17(2H, m, CH2), 4.55(1H, brs, NH), 5.08(1H, brs, NH), 7.04(2H, d, J=9Hz, Ph), 7.20(2H, d, J=9Hz, Ph)
ESI-MS: Calcd for C20H30N2O6 [M+NH4]+, 412.2; found 412.3
【０１６０】
（工程２）
実施例６（工程２）において、化合物１９の代わりに化合物３６を用いた以外は実施例６（工程２）と同様にして、化合物３６（９９６mg、２．５２mmol）より、標記の化合物３７（６７４mg、２．５２mmol）を白色固体として得た（収率１００％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 2.92-2.95(2H, m, CH2), 3.02-3,05(2H, m, CH2), 4.07(2H, s, CH2), 7.14-7.17(2H, m, Ph), 7.35-7.38(2H, m, Ph), 8.25-8.61(6H, m, NH3×2)
ESI-MS: Calcd for C10H14N2O2 [M+H]+, 195.1; found 195.2
【０１６１】
実施例１３
（Ｓ）−２−アミノエチル−２−（２−アミノアセトキシ）プロパノエート（ＧｌｙＬａｃＣ２Ｎ）・２塩酸塩（化合物４２）の合成
以下の手順で化合物４２を合成した。
【化１９】
2019218546.tif 000021
化合物３８は、東京化成（株）より購入した。
【０１６２】
（工程１）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−エタノールアミン（化合物２）の代わりに化合物３８を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物３８（５．００ｇ、２７．８mmol）と化合物１（５．１０ｇ、２９．１mmol）より、化合物３９（８．６０ｇ、２５．５mmol）を白色固体として得た（収率９２％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.45(9H, s, Boc), 1.51-1.52(3H, m, CH3), 3.92-4.08(2H, m, CH2), 4.98(1H, brs, NH), 5.15-5.23(3H, m, CH2, CH), 7.32-7.39(5H, m, Ph)
ESI-MS: Calcd for C17H23NO6 [M+NH4]+, 355.2; found 355.2
【０１６３】
（工程２、３）
化合物３９（４．６０ｇ、１３．６mmol）を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（５０mL）に溶解させ、１０％パラジウム炭素（Ｐｄ／Ｃ）（２３２mg、５．０５wt％）を添加し、水素雰囲気下、室温で終夜攪拌した。反応液を濾過し、ろ液を減圧濃縮することで、化合物４０の粗精製体（３．８２ｇ）を無色透明粘性液体として得た。
続けて、実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−グリシン（化合物１）の代わりに化合物４０を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、得られた化合物４０の粗精製体全量と化合物２（２．２０ｇ、１３．７mmol）より、化合物４１（３．８２ｇ、９．７８mmol）を白色固体として得た（２工程収率７２％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.45(18H, s, Boc×2), 1.52-1.53(3H, m, CH3), 3.37-3.41(2H, m, CH2), 3.92-4.06(2H, m, CH2), 4.15-4.27(2H, m, CH2), 5.04(2H, brs, NH×2), 5.12(1H, dd, J=14Hz, 7Hz, CH)
ESI-MS: Calcd for C17H30N2O8 [M+H]+, 391.2; found 391.3
【０１６４】
（工程４）
実施例６（工程２）において、化合物１９の代わりに化合物４１を用いた以外は実施例６（工程２）と同様にして、化合物４１（１．０１ｇ、２．５８mmol）より、標記の化合物４２（６４５mg、２．４５mmol）を白色固体として得た（収率９５％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 1.51(3H, d, J=7Hz, CH3), 3.11(2H, t, J=5Hz, CH2), 3.86-3.97(2H, s, CH2), 4.29-4.32(2H, m, CH2), 5.24(1H, dd, J=14Hz, 7Hz, CH), 8.50(6H, brs, NH3×2)
ESI-MS: Calcd for C7H14N2O4 [M+H]+, 191.1; found 191.1
【０１６５】
実施例１４
（Ｓ）−２−アミノ−３−ベンジルアミノ−３−オキソプロピル−２−アミノアセテート（ＧｌｙＳｅｒＮＨＢｎ）・２塩酸塩（化合物４５）の合成
以下の手順で化合物４５を合成した。
【化２０】
2019218546.tif 000022
【０１６６】
（工程１）
Ｂｏｃ−Ｌ−セリン（化合物１１）（２．００ｇ、９．７７mmol）をメタノール（ＭｅＯＨ）（３０mL）に溶解させ、ベンジルアミン（１．６３mL、１４．６mmol）、ＤＭＴ−ＭＭ（３．９７ｇ、１４．４mmol）を順次添加し、室温で４時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（５０mL）で希釈した後、水（５０mL×３）、０．５Ｎ  ＨＣｌ水溶液（５０mL）、飽和食塩水（５０mL）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、ろ液を減圧濃縮した。残渣を真空乾燥することで、化合物４３（２．８２ｇ、９．５９mmol）を白色固体として得た（収率９８％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.41(9H, s, Boc), 3.54(1H, brs, OH), 3.67-3.70(1H, m, CH), 4.06(1H, d, J=9Hz, CH), 4.19(1H, m, CH), 4.38-4.45(2H, m, CH2), 5.69(1H, d, J=8Hz, NH), 7.16(1H, brs, HN), 7.23-7.32(5H, m, Ph)
ESI-MS: Calcd for C15H22N2O4 [M+H]+, 295.2; found 295.4
【０１６７】
（工程２）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−エタノールアミン（化合物２）の代わりに化合物４３を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物４３（１．６４ｇ、５．５６mmol）と化合物１（１．０４ｇ、５．９１mmol）より、化合物４４（２．２５ｇ、４．９８mmol）を白色固体として得た（収率９０％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.41-1.42(18H, s, Boc×2), 3.79(2H, d, J=6Hz, CH2), 4.35-4.48(5H, m, CH2×2, CH), 5.31(1H, m, NH), 5.68(1H, d, J=7Hz, NH), 7.15(1H, m, NH), 7.22-7.31(5H, m, Ph)
ESI-MS: Calcd for C22H33N3O7 [M+H]+, 452.2; found 452.4
【０１６８】
（工程３）
実施例６（工程２）において、化合物１９の代わりに化合物４４を用いた以外は実施例６（工程２）と同様にして、化合物４４（１．１６ｇ、２．５８mmol）より、標記の化合物４５（７８５mg、２．４２mmol）を白色固体として得た（収率９４％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 3.81(2H, dd, J=32Hz, 17Hz, CH2), 4.25(1H, t, J=5Hz, CH), 4.36(2H, ddd, J=26Hz, 15Hz, 6Hz, CH2), 4.54-4.69(2H, m, CH2), 7.25-7.36(5H, m, Ph), 8.63-8.68(6H, brs, NH3×2), 9.37(1H, t, J=6Hz, NH)
ESI-MS: Calcd for C12H17N3O3 [M+H]+, 252.1; found 252.2
【０１６９】
実施例１５
（Ｓ）−２−アミノ−３−（オクチルアミノ）−３−オキソプロピル−２−アミノアセテート（ＧｌｙＳｅｒＮＨＣ８）・２塩酸塩（化合物４８）の合成
以下の手順で化合物４８を合成した。
【化２１】
2019218546.tif 000023
【０１７０】
（工程１、２）
実施例１４（工程１）において、ベンジルアミンの代わりにｎ−オクチルアミンを用いた以外は実施例１４（工程１）と同様にして、化合物１１（２．００ｇ、９．７４mmol）とｎ−オクチルアミン（２．４７mL、１４．６mmol）より、化合物４６の粗精製体（３．３１ｇ）を白色固体として得た。
続けて、実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−エタノールアミン（化合物２）の代わりに化合物４６を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物４６の粗精製体（２．０５ｇ、６．０４mmol（純度９３．０wt％換算））と化合物１（１．１７ｇ、６．６７mmol）より、化合物４７（２．６１ｇ、５．５３mmol）を無色透明粘性液体として得た（２工程収率９２％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 0.88(3H, t, J=7Hz, CH3), 1.26-1.29(10H, m, CH2×5), 1.45-1.52(20H, m, CH2, Boc×2), 3.25(2H, dd, J=14Hz,7Hz, CH2), 3.87-3.92(2H, m, CH2), 4.36-4.44(3H, m, CH, CH2), 5.16(1H, brs, NH), 5.46(1H, brs, NH), 6.49(1H, brs, NH)
ESI-MS: Calcd for C23H43N3O7 [M+H]+, 474.3; found 474.5
【０１７１】
（工程３）
実施例６（工程２）において、化合物１９の代わりに化合物４７を用いた以外は実施例６（工程２）と同様にして、化合物４７（１．２３ｇ、２．６１mmol）より、標記の化合物４８（８０３mg、２．３２mmol）を白色固体として得た（収率８９％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 0.86(3H, t, J=7Hz, CH3), 1.26-1.30(10H, m, CH2×5), 1.41-1.45(2H, m, CH2), 3.09-3.13(2H, m, CH2), 3.82(2H, dd, J=26Hz, 18Hz, CH2), 4.13(1H, dd, J=6Hz, 5Hz, CH), 4.49(2H, ddd, J=22Hz, 12Hz, 5Hz, CH2), 8.58(6H, brs, NH3×2), 8.78(1H, t, J=6Hz, NH)
ESI-MS: Calcd for C13H27N3O3 [M+H]+, 274.2; found 274.3
【０１７２】
実施例１６
（Ｓ）−３−アミノ−４−エトキシ−４−オキソブチル−８−アミノオクタノエート（ＯｃｔＨｏｍｏＳｅｒＥｔ）・２塩酸塩（化合物５２）の合成
以下の手順で化合物５２を合成した。
【化２２】
2019218546.tif 000024
化合物１８は、Journal of Organic Chemistry, 2008, 73(8), 3212-3217に記載の方法により合成した。
【０１７３】
（工程１、２）
８−アミノオクタン酸（化合物４９）（１．４９ｇ、９．３９mmol）を１，４−ジオキサン：１規定  水酸化ナトリウム水溶液＝２：１（３０mL）に溶解させた。氷冷下、ジオキサン：水＝２：１（３０mL）に溶解させた二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（２．４７ｇ、１１．３mmol）を滴下し、室温で１５時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチル（４５mL）で希釈した後、水（７５mL×２）、０・２規定  塩酸（５０mL）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、ろ液を減圧濃縮した。残渣を真空乾燥することで、化合物５０の粗精製体（２．７３ｇ）を白色固体として得た。
続けて、実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−グリシン（化合物１）の代わりに化合物５０を、Ｂｏｃ−エタノールアミン（化合物２）の代わりに化合物１８を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物５０の粗精製体（１．０２ｇ、３．５２mmol（純度８９．２wt％換算））と化合物１８（１．１０ｇ、４．４５mmol）より、化合物５１（１．１７ｇ、２．４７mmol）を白色固体として得た（２工程収率：７０％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.27-1.31(11H, m, CH3, CH2×4), 1.44(18H, brs , Boc×2), 1.60-1.62(2H, m, CH2), 1.99-2.04(1H, m, CH), 2.16-2.20(1H, m, CH), 2.28(2H, t, J=8Hz, CH2), 3.09-3.10(2H, m, CH2), 4.12(1H, dt, J=12Hz, 6Hz, CH), 4.16-4.23(3H, m, CH2, CH), 4.38-4.39(1H, m, CH), 4.58(1H, brs, NH), 5.18(1H, d, J=7Hz, NH)
ESI-MS: Calcd for C24H44N2O8 [M+H]+, 489.3; found 489.4
【０１７４】
（工程３）
実施例６（工程２）において、化合物１９の代わりに化合物５１を用いた以外は実施例６（工程２）と同様にして、化合物５１（１．１７ｇ、２．４０mmol）より、標記の化合物５２（７７５mg、２．１５mmol）を白色粘性液体として得た（収率８９％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 1.23-1.31(9H, m, CH3, CH2×3), 1.49-1.60(4H, m, CH2×2), 2.16-2.21(2H, m, CH2), 2.29(2H, t, J=8Hz, CH2), 2.72(2H, m, CH2), 4.02-4.05(1H, m, CH), 4.12-4.23(4H, m, CH2×2), 8.15(3H, brs, NH3), 8.82(3H, brs, NH3)
ESI-MS: Calcd for C14H28N2O4 [M+H]+, 289.2; found 289.2
【０１７５】
実施例１７
化合物７によるコンドロイチン硫酸架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＳｅｒＥｔ）の調製
（方法Ａ）
ＣＳ（ナトリウム塩、局外規、生化学工業（株）社製）１．７０ｇ（カルボキシ基換算：３．３３mmol、１．００ｅｑ）を１０％となるよう注射用水（ＷＦＩ）に溶解させ、エタノール（ＥｔＯＨ）１７．０mlを混和した。実施例２で合成した化合物７（３６．８mg、０．０４２ｅｑ）（ジアミン架橋剤）の５０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液（１．７０mL）と４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド・Ｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）（２３２mg、０．２５２ｅｑ：ジアミン架橋剤の６倍量）の５０％（ｖ／ｖ）エタノール溶液（１．７０mL）を順次添加し、室温で１０分攪拌した後、終夜静置した。
終夜静置後の架橋反応物にＷＦＩ（２２５mL）を加え、４時間激しく攪拌し、固形化した反応物を破砕した。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液（１．５０ｇ／６．００mL）を加え、ＥｔＯＨを滴下し、沈殿させた。沈殿をろ取し、９０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ  １５０mLで３回、ＥｔＯＨ  １５０mLで２回洗浄した。得られた沈殿を４２℃で終夜減圧乾燥することで、化合物７によるコンドロイチン硫酸架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＳｅｒＥｔ）（１．４５ｇ）を白色粉末として得た。
【０１７６】
（方法Ｂ：類似物の調製）
化合物７の当量を（０．０３０、０．０３１、０．０３４、０．０５０、０．０６０ｅｑ）とした以外は、実施例１７（方法Ａ）と同様の方法でＣＳ架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＳｅｒＥｔ）を白色粉末として得た（各約１．４０ｇ）。
【０１７７】
実施例１８
化合物１０によるコンドロイチン硫酸架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）の調製
実施例１７（方法Ａ）において、化合物７の代わりに化合物１０（実施例３で合成）を用いて、化合物１０の当量を（０．０３０、０．０４０、０．０５０、０．０６０ｅｑ）、ＣＳ量を１．６４ｇ、初期ＣＳ濃度を２０．５％とした以外は、実施例１７（方法Ａ）と同様にして、ＣＳ架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）を白色粉末として得た（各約１．００ｇ）。
【０１７８】
（架橋率の算出）
得られたＣＳ架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）の架橋率を以下の式（Ａ）のように定義して算出した。
【数２】
2019218546.tif 000025
(上記式中、Ｒは、−ＯＨ、−ＯＮａ、又はＮＨ架橋剤を表す)
結果は、下表に示した通り、ジアミン架橋剤の仕込み当量に相関して増加することが確認された。
【表１】
2019218546.tif 000026
【０１７９】
実施例１９
化合物４によるコンドロイチン硫酸架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＣ２Ｎ）の調製
実施例１７（方法Ａ）において、化合物７の代わりに化合物４（実施例１で合成）を用いて、化合物４の当量を（０．０１５、０．０１９、０．０２３、０．０２７、０．０３５ｅｑ）、ＣＳ量を１．００ｇとした以外は、実施例１７（方法Ａ）と同様にして、ＣＳ架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＣ２Ｎ）を白色粉末として得た（各約０．６ｇ）。
【０１８０】
実施例２０
化合物１０によるコンドロイチン硫酸架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）の調製
実施例１７（方法Ａ）において、化合物７の代わりに化合物１０（実施例３で合成）を用いて、化合物１０の当量を（０．０３０、０．０３３、０．０３６、０．０４０、０．０４２、０．０４５、０．０４８ｅｑ）、ＣＳ量を１．７０ｇとした以外は、実施例１７（方法Ａ）と同様にして、ＣＳ架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）を白色粉末として得た（各約１．５０ｇ）。
【０１８１】
実施例２１
化合物１４によるコンドロイチン硫酸架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＳｅｒＮＨＭｅ）の調製
実施例１７（方法Ａ）において、化合物７の代わりに化合物１４（実施例４で合成）を用いて、化合物１４の当量を（０．０３０、０．０３５、０．０４０、０．０４５、０．０５０ｅｑ）とした以外は、実施例１７（方法Ａ）と同様にして、ＣＳ架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＳｅｒＮＨＭｅ）を白色粉末として得た（各約１．５０ｇ）。
【０１８２】
実施例２２
化合物１７によるコンドロイチン硫酸架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＳｅｒＮＭｅ２）の調製
実施例１７（方法Ａ）において、化合物７の代わりに化合物１７（実施例５で合成）を用いて、化合物１７の当量を（０．０３０、０．０３５、０．０４０、０．０４５、０．０５０ｅｑ）とした以外は、実施例１７（方法Ａ）と同様にして、ＣＳ架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＳｅｒＮＭｅ２）を白色粉末として得た（各約１．５０ｇ）。
【０１８３】
実施例２３
化合物２０によるコンドロイチン硫酸架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＨｏｍｏＳｅｒＥｔ）の調製
実施例１７（方法Ａ）において、化合物７の代わりに化合物２０（実施例６で合成）を用いて、化合物２０の当量を（０．０１６、０．０１９、０．０２８、０．０３８ｅｑ）とした以外は、実施例１７（方法Ａ）と同様にして、ＣＳ架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＨｏｍｏＳｅｒＥｔ）を白色粉末として得た（各約１．５０ｇ）。
【０１８４】
実施例２４
化合物２４によるコンドロイチン硫酸架橋体（ＣＳ−ＡｌａＣ２ＭｅＮ）の調製
実施例１７（方法Ａ）において、化合物７の代わりに化合物２４（実施例７で合成）を用いて、化合物２４の当量を（０．０２８、０．０３３、０．０３６、０．０４２、０．０５４ｅｑ）とした以外は、実施例１７（方法Ａ）と同様にして、ＣＳ架橋体（ＣＳ−ＡｌａＣ２ＭｅＮ）を白色粉末として得た（各約１．５０ｇ）。
【０１８５】
実施例２５
化合物２７によるコンドロイチン硫酸架橋体（ＣＳ−ＡｌａＣ２Ｍｅ２Ｎ）の調製
実施例１７（方法Ａ）において、化合物７の代わりに化合物２７（実施例８で合成）を用いて、化合物２７の当量を（０．０４６、０．０５４、０．０５８、０．０６２ｅｑ）とした以外は、実施例１７（方法Ａ）と同様にして、ＣＳ架橋体（ＣＳ−ＡｌａＣ２Ｍｅ２Ｎ）を白色粉末として得た（各約１．５０ｇ）。
【０１８６】
実施例２６
化合物１０によるヒアルロン酸架橋体（ＨＡ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）の調製
（方法Ｃ）
ヒアルロン酸ナトリウム（以下、ＨＡ）（生化学工業（株）社製）１．００ｇ（カルボキシ基換算：２．４９mmol、１．００ｅｑ）を２．３４wt％となるようＷＦＩに溶解させ、エタノール４２．７mLを混和した。化合物１０（実施例３で合成）（５５．５mg、０．０９５ｅｑ）とＤＭＴ−ＭＭ（３９４mg、０．５７１ｅｑ：ジアミン架橋剤の６倍量）を、それぞれ５０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ水溶液（計７．１０mL）に溶解させ、順次添加し、室温にて１０分間攪拌した後、終夜静置した。
終夜静置後の架橋反応物にＷＦＩ（５０mL）とＮａＣｌ／ＷＦＩ溶液（１．００ｇ／４．００mL）を加え、４時間激しく攪拌し、固形化した反応物を破砕した。以降の操作は、実施例１７（方法Ａ）に記載の方法と同様にして、ヒアルロン酸架橋体（ＨＡ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）（１．０２ｇ）を白色粉末として得た。
【０１８７】
（方法Ｄ：類似物の調製）
化合物１０の当量を（０．１５１、０．１９０ｅｑ）とした以外は、実施例２６（方法Ｃ）と同様の方法でＨＡ架橋体（ＨＡ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）を白色粉末として得た（各約１．００ｇ）。
【０１８８】
実施例２７
化合物２４によるヒアルロン酸架橋体（ＨＡ−ＡｌａＣ２ＭｅＮ）の調製
実施例２６（方法Ｃ）において、化合物１０の代わりに化合物２４（実施例７で合成）を用いて、化合物２４の当量を（０．０９５、０．１５１、０．１９０ｅｑ）とした以外は、実施例２６（方法Ｃ）と同様にして、ＨＡ架橋体（ＨＡ−ＡｌａＣ２ＭｅＮ）を白色粉末として得た（各約１．００ｇ）。
【０１８９】
実施例２８
化合物１０によるカルボキシメチルセルロース架橋体（ＣＭＣ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）の調製
（方法Ｅ）
実施例２６（方法Ｃ）において、ＨＡの代わりにカルボキシメチルセルロースナトリウム［Ｇｌｃ繰返し数≒５００］（以下、ＣＭＣ）（東京化成（株）社製）を用いて、初期ＣＭＣ量を１．１１ｇ（カルボキシ基換算：２．５２mmol、１．００ｅｑ）、ＣＭＣ濃度を２．３２wt％、添加ＥｔＯＨ量を３２mLとした以外は、実施例２６（方法Ｃ）と同様にして、化合物１０（実施例３で合成）（０．１６８、０．２２４、０．２８０ｅｑ）により、ＣＭＣ架橋体（ＣＭＣ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）を白色粉末として得た（各約０．９５ｇ）。
【０１９０】
実施例２９
化合物２４によるカルボキシメチルセルロース架橋体（ＣＭＣ−ＡｌａＣ２ＭｅＮ）の調製
実施例２８（方法Ｅ）において、化合物１０の代わりに化合物２４（実施例７で合成）を用いて、ＣＭＣ量を０．５６ｇ、化合物２４の当量を（０．１８０、０．２４０、０．３００ｅｑ）とした以外は、実施例２８（方法Ｅ）と同様にして、ＣＭＣ架橋体（ＣＭＣ−ＡｌａＣ２ＭｅＮ）を白色粉末として得た（各約０．４７ｇ）。
【０１９１】
実施例３０
化合物１０によるアルギン酸架橋体（Ａｌｇ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）の調製
（方法Ｆ）
実施例２６（方法Ｃ）において、ＨＡの代わりにアルギン酸ナトリウム［粘度値５００〜６００mPa・s］（以下、Ａｌｇ）（和光純薬（株）社製）を用いて、初期Ａｌｇ量を１．０８ｇ（カルボキシ基換算：５．４６mmol、１．００ｅｑ）、Ａｌｇ濃度を１．２３wt％、添加ＥｔＯＨ量を２９．３mLとした以外は、実施例２６（方法Ｃ）と同様にして、化合物１０（実施例３で合成）（０．１２３、０．１４６、０．１６８ｅｑ）により、Ａｌｇ架橋体（Ａｌｇ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）を白色粉体として得た（各約０．９５ｇ）。
【０１９２】
実施例３１
化合物２４によるアルギン酸架橋体（Ａｌｇ−ＡｌａＣ２ＭｅＮ）の調製
実施例３０（方法Ｆ）において、化合物１０の代わりに化合物２４（実施例７で合成）を用いて、ＣＭＣ量を０．５４ｇ、化合物２４の当量を（０．１２３、０．１４６、０．１６８ｅｑ）とした以外は、実施例３０（方法Ｆ）と同様にして、Ａｌｇ架橋体（Ａｌｇ−ＡｌａＣ２ＭｅＮ）を白色粉末として得た（各約０．４６ｇ）。
【０１９３】
比較例１
エタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩によるコンドロイチン硫酸架橋体（ＣＳ−ＮＣ２Ｎ）の調製
実施例１７（方法Ａ）において、化合物７の代わりにエタン−１，２−ジアミン（ＮＣ２Ｎ）・２塩酸塩を用いて、エタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩の当量を０．０２２、０．０３０ｅｑ、ＤＭＴ−ＭＭの当量を０．１３２、０．１２０ｅｑ、ＣＳ量を１．７０、５．００ｇとした以外は、実施例１７（方法Ａ）と同様にして、ＣＳ架橋体（ＣＳ−ＮＣ２Ｎ）を白色粉末として得た（各、１．５０ｇ、４．８５ｇ）。
【０１９４】
比較例２
エタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩によるヒアルロン酸架橋体（ＨＡ−ＮＣ２Ｎ）の調製
実施例２６（方法Ｃ）において、化合物１０の代わりにエタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩を用いて、エタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩の当量を（０．０８５、０．１３５、０．１７０ｅｑ）とした以外は、実施例２６（方法Ｃ）と同様にして、ＨＡ架橋体（ＨＡ−ＮＣ２Ｎ）を白色粉末として得た（各約１．００ｇ）。
【０１９５】
比較例３
エタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩によるカルボキシメチルセルロース架橋体（ＣＭＣ−ＮＣ２Ｎ）の調製
実施例２８（方法Ｅ）において、化合物１０の代わりにエタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩を用いて、ＣＭＣ量を０．５６ｇ、エタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩の当量を（０．１５０、０．２００、０．２５０ｅｑ）とした以外は、実施例２８（方法Ｅ）と同様にして、ＣＭＣ架橋体（ＣＭＣ−ＮＣ２Ｎ）を白色粉末として得た（各約０．４５ｇ）。
【０１９６】
比較例４
エタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩によるアルギン酸架橋体（Ａｌｇ−ＮＣ２Ｎ）の調製
実施例３０（方法Ｆ）において、化合物１０の代わりにエタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩を用いて、Ａｌｇ量を０．５４ｇ、エタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩の当量を（０．１１０、０．１３０、０．１５０ｅｑ）とした以外は、実施例３０（方法Ｆ）と同様にして、Ａｌｇ架橋体（Ａｌｇ−ＮＣ２Ｎ）を白色粉末として得た（各約０．４２ｇ）。
【０１９７】
実施例３２
ＣＳ架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＣ２Ｎ／ＡｌａＣ２ＭｅＮ／ＡｌａＣ２Ｍｅ２Ｎ／ＮＣ２Ｎ）膨潤物の粘度経時変化（in vitro試験）
実施例１９、２４、２５で調製したＣＳ−ＧｌｙＣ２Ｎ、ＣＳ−ＡｌａＣ２ＭｅＮ、ＣＳ−ＡｌａＣ２Ｍｅ２Ｎ、及び比較例１で調製したＣＳ−ＮＣ２Ｎ(対照試験用)の白色粉末に２０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水を添加した。その結果ゼリー状のＣＳ架橋体の膨潤物が得られた。これを用いて、ＣＳ架橋体膨潤物の分解消失時間が制御可能であるか否か（すなわち組織膨隆材としての必要期間後の消失性能）を評価した。膨潤物の濃度は１．７５％、ｐＨは生体条件付近の７．５、静置温度は変化速度を加速させるために６０℃として、膨潤物の粘度の経時変化を測定した。粘度は、生体組織内での残留性に関与し、一定以下の粘度値まで低下すると、速やかに投与部位から消失することが知られている。例えば、未架橋の原料ＣＳの粘度値（ＬＮ（Pa・s））は−５程度であり、生体内では数時間で速やかに消失することが確認されている。よって、未架橋のＣＳの粘度値は、残留性の指標として使用可能である。さらに後述するように、実施例３７に記載のin vivo試験と、本in vitro試験結果は相関することも確認済みである。
粘度は、Ｅ型回転粘度計ＴＶ−Ｌ（コーン：ＣＯＲＤ−１、１°３４′×Ｒ２４、又はＣＯＲＤ−６、３°×Ｒ９．７）（東機産業社製）を用いて測定し、２５℃、５rpmでの粘度値（Pa・s）を採用した。
結果を図１に示した。ここで、図１の凡例における括弧内の数値は、ジアミン架橋剤の仕込み当量を表す。生分解点の無いエタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩によるＣＳ架橋体（ＣＳ−ＮＣ２Ｎ）では、生体組織からの消失（架橋部分の分解）を意味する低粘度化は全く観察されなかった。これに対し、生分解点としてエステル結合を有するジアミン架橋剤で調製されたＣＳ−ＧｌｙＣ２Ｎ、ＣＳ−ＡｌａＣ２ＭｅＮ、ＣＳ−ＡｌａＣ２Ｍｅ２ＮなどのＣＳ架橋体は、数日〜数ヵ月の範囲で分解消失時間が制御可能な、医用材料として好ましい物質であることが示された。
【０１９８】
実施例３３
ＨＡ架橋体（ＨＡ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２／ＡｌａＣ２ＭｅＮ／ＮＣ２Ｎ）膨潤物の粘度経時変化（in vitro試験）
実施例２６、２７で調製した、ＨＡ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２、ＨＡ−ＡｌａＣ２ＭｅＮについて、その膨潤物の組織膨隆材としての必要期間後の消失性能を評価するため、粘度の経時変化を測定した。試験の加速化の目的で、膨潤液のｐＨを９．０、温度を５０℃とした以外は、実施例３２と同様の方法で実施した。対照試験として、比較例２で調製したＨＡ−ＮＣ２Ｎ、及び原料ＨＡ（未架橋）を用いた。結果を図２に示した。ここで、図２の凡例における括弧内の数値は、ジアミン架橋剤の仕込み当量を表す。
生分解点の無いエタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩によるＨＡ架橋体（ＨＡ−ＮＣ２Ｎ）では、実施例３２の結果と同様に、生体組織からの消失（架橋部分の分解）を意味する低粘度化は全く観察されなかった。一方、生分解点を有するジアミン架橋剤により調製されたＨＡ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２やＨＡ−ＡｌａＣ２ＭｅＮなどのＨＡ架橋体は、そのエステル構造の安定性に由来する、分解消失時間の顕著な差が確認された。原料ＨＡ（未架橋）の粘度にはほとんど変化が見られないことから、観察されたＨＡ架橋体の粘度変化は、ジアミン架橋剤の分解に依存していることが確認された。このように、生分解点を有するジアミンを用いることで、ＨＡでも、生体内で数日〜数ヵ月の範囲で分解消失時間が制御可能な、医用材料として好ましい架橋体を調製可能であることが示された。
また、本実施例により、膨潤物のｐＨを生体条件のｐＨより高くしても、酸性多糖架橋体の分解消失傾向を確認できることが示された。
【０１９９】
実施例３４
ＣＭＣ架橋体（ＣＭＣ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２／ＡｌａＣ２ＭｅＮ／ＮＣ２Ｎ）膨潤物の粘度経時変化（in vitro試験）
実施例２８、２９で調製した、ＣＭＣ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２、ＣＭＣ−ＡｌａＣ２ＭｅＮ膨潤物の組織膨隆材としての必要期間後の消失性能を評価するため、粘度の経時変化を測定した。試験の加速化の目的で、膨潤液のｐＨを１１．０とした以外は、実施例３３と同様の方法で実施した。対照試験として、比較例３で調製したＣＭＣ−ＮＣ２Ｎ、及び原料ＣＭＣ（未架橋）を用いた。結果を図３に示した。ここで、図３の凡例における括弧内の数値は、ジアミン架橋剤の仕込み当量を表す。
生分解点の無いエタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩によるＣＭＣ架橋体（ＣＭＣ−ＮＣ２Ｎ）、及び原料ＣＭＣ（未架橋）では、試験期間中、大きな粘度低下は観察されなかった。これに対して、実施例３２、３３の結果と同様に、生分解点を有するジアミン架橋剤により調製された、ＣＭＣ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２やＣＭＣ−ＡｌａＣ２ＭｅＮでは、生体組織からの消失（架橋部分の分解）を意味する低粘度化が観察され、エステル構造に由来する分解消失時間の顕著な差が確認された。このように、生分解点を有するジアミン架橋剤を用いることで、ＣＭＣでも、生体内で数日〜数ヵ月の範囲で分解消失時間が制御可能な、医用材料として好ましい性質を有する架橋体が調製可能であることが示された。
【０２００】
実施例３５
Ａｌｇ架橋体（Ａｌｇ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２／ＡｌａＣ２ＭｅＮ／ＮＣ２Ｎ）膨潤物の粘度経時変化（in vitro試験）
実施例３０、３１で調製した、Ａｌｇ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２、Ａｌｇ−ＡｌａＣ２ＭｅＮ膨潤物の組織膨隆材としての必要期間後の消失性能を評価するため、粘度の経時変化を実施例３４と同様の方法で実施した。対照試験として、比較例４で調製したＡｌｇ−ＮＣ２Ｎ、及び原料Ａｌｇ（未架橋）を用いた。結果を図４に示した。ここで、図４の凡例における括弧内の数値は、ジアミン架橋剤の仕込み当量を表す。
生分解点の無いエタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩によるＡｌｇ架橋体（Ａｌｇ−ＮＣ２Ｎ）、及び原料Ａｌｇ（未架橋）では、試験期間中、大きな粘度低下は観察されなかった。これに対して、実施例３２、３３、３４の結果と同様に、生分解点を有するジアミン架橋剤により調製されたＡｌｇ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２やＡｌｇ−ＡｌａＣ２ＭｅＮなどのＡｌｇ架橋体では、生体組織からの消失（架橋部分の分解）を意味する低粘度化が観察され、エステル構造に由来する分解消失時間の顕著な差が確認された。このように、生分解点を有するジアミン架橋剤を用いることで、アルギン酸でも、生体内で数日〜数ヵ月の範囲で分解消失時間が制御可能な、医用材料として好ましい性質を有する架橋体が調製可能であることが示された。
【０２０１】
実施例３６
ＣＳ架橋体の物理的応力の測定
本試験では、ＣＳ架橋体膨潤物が有する、組織膨隆材として必要な、組織と組織を分離するための物理的応力を測定した。
まず本試験に先立ち、後述の実施例３８に記載の膨潤／消失試験を生理食塩水で実施し、３日後の膨潤物の重量から、各ＣＳ架橋体の平衡膨潤濃度を算出した。
実施例２４で調製されたＣＳ架橋体（ＣＳ−ＡｌａＣ２ＭｅＮ）を用いて、平衡膨潤濃度の１．５倍の濃度になるように生理食塩水で膨潤物を調製し、底面積３．８cm2の円柱状容器に、表面が平坦になるよう１ｇ分充填した。押し込み速度を４mm/sec、底から５mmまで侵入した後、開始点に戻る、円筒形プローブの直径を１０mm、とした以外は、ＪＩＳ規格Ｋ６５０３  にかわ及びゼラチン（５．４ゼリー強度）記載の方法に従い、歪みと応力の関係を調査した。結果を表２及び図５に示した。ここで、図５の凡例における括弧内の数値は、ジアミン架橋剤の仕込み当量を表す。
ジアミン架橋剤により架橋されたＣＳ−ＡｌａＣ２ＭｅＮは、未架橋の原料ＣＳより顕著に高い応力を示し、また架橋剤の当量を制御することで、医用材料としての組織膨隆材に用いる際の、最適な物理的応力を制御可能であることが示された。
【表２】
2019218546.tif 000027
【０２０２】
実施例３７
ＣＳ架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＳｅｒＥｔ／ＧｌｙＣ２Ｎ／ＡｌａＣ２ＭｅＮ／ＡｌａＣ２Ｍｅ２Ｎ）ラット腹部皮下での残留性能評価（in vivo試験）
以下の方法により、各種ＣＳ架橋体膨潤物のラット腹部皮下での残留性能を評価した。
（１）雄性Ｗｉｓｔａｒラット（７週齢）に対して、イソフルラン麻酔下、平衡膨潤濃度の被験物質を４００μL/siteにて腹部皮下に注入した。
（２）注入一定期間後に、残留物周囲の組織を採取して残留物を分離した。重量を測定して残留性能の指標とした。（注入時重量を１００％とした時のラット腹部皮下残留重量率（％））
（３）本試験で用いるＣＳ架橋体は、それぞれ実施例１７、１９、２４、２５で調製したものを使用した。また対照試験として用いるＣＳ架橋体（ＣＳ−ＮＣ２Ｎ）は、比較例１で調製したものを使用した。
（４）本試験に先立ち、各ＣＳ架橋体に対して、実施例３８に記載の膨潤／消失試験を生理食塩水で実施し、３日後の膨潤物の重量から、平衡膨潤濃度を算出した。それぞれのＣＳ架橋体について、ｐＨ５．２の緩衝液で、平衡膨潤濃度になるように膨潤物を調製し、本試験で使用した。
図６に示した結果から分かるように、生分解点を有するジアミン架橋剤を種々選択して製造されたＣＳ架橋体膨潤物は、生体内での残留性能が２週〜２４週〜最大１年程度まで変化することが確認された。ここで、図６の凡例における括弧内の数値は、ジアミン架橋剤の仕込み当量を表す。本結果は、実施例３２に示された、in vitro試験（粘度の経時変化）結果との相関性も高かった。このように、生分解点を有するジアミン架橋剤を用いて調製される酸性多糖架橋体は、投与部位や使用目的に合わせて、残留時間が厳密に制御可能な生体適合性の高い組織膨隆材として、極めて有用と言える。
【０２０３】
実施例３８
ＣＳ架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）の膨潤／消失試験（in vitro）
理想的な癒着防止材には、高い癒着防止性能のみならず、必要期間後の速やかな消失を併せ持つことが望まれる。本試験系においては、フィルターを経由して水分を吸収し膨潤する性質が、創部を分離する癒着防止性能を表し、フィルターから流出し重量が減少していく過程が、生体内での分解消失性能を表す。
本試験においては、具体的には、０．２２μｍフィルターと、生理条件の加速試験を意図した緩衝液（ｐＨ１０．９）を用いた。試験試料粉末１ｍｇ当たりの膨潤物全重量（ｍｇ）を膨潤度として縦軸に示し、その経時変化を追跡した。
（試験試料）
実施例１８で調製したＣＳ架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）を使用した。
（結果）
試験の結果を図７に示した。ここで、図７の凡例における括弧内の数値は、ジアミン架橋剤の仕込み当量を表す。図７から分かる通り、ＧｌｙＳｅｒＮＨ２で架橋したＣＳ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２架橋体では、いずれの仕込み当量においても、急激な膨潤と、速やかな分解消失が確認された。本結果は、実施例４２に記載したin vivoでの癒着防止性能／分解消失性能と極めて良く相関していた。このことから、本試験系における、図７に示した重量変化パターンに近い重量変化パターンを有する架橋体は、in vivoでも癒着防止性能／分解消失性能を併せ持つことが示された。
【０２０４】
実施例３９
ＨＡ架橋体（ＨＡ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）の膨潤／消失試験（in vitro）
（試験方法）
実施例３８に記載の試験方法と同様の方法で実施した。
（試験試料）
実施例２６、比較例２で調製したＨＡ架橋体（ＨＡ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２及びＨＡ−ＮＣ２Ｎ）を用いた。
（結果）
試験の結果を図８に示した。ここで、図８の凡例における括弧内の数値は、ジアミン架橋剤の仕込み当量を表す。図８から分かる通り、ＨＡ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２においても、実施例３８と同様な膨潤／消失特性が示され、癒着防止剤として有用であることが示された。また、生分解点の無いエタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩によるＨＡ架橋体（ＨＡ−ＮＣ２Ｎ）では、膨潤はするものの、ジアミン架橋剤の分解による消失は全く観察されなかった。本結果も、実施例４２に記載したin vivoでの癒着防止性能／分解消失性能と極めて良く相関しており、ジアミン架橋剤構造中の生分解点が、適切な分解消失性能を制御する上で、極めて重要であることが示された。
【０２０５】
実施例４０
ＣＭＣ架橋体（ＣＭＣ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）の膨潤／消失試験（in vitro）
（試験方法）
実施例３８に記載の試験方法と同様の方法で実施した。
（試験試料）
実施例２８、比較例３で調製したＣＭＣ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２及びＣＭＣ−ＮＣ２Ｎを用いた。
（結果）
試験の結果を図９に示した。ここで、図９の凡例における括弧内の数値は、ジアミン架橋剤の仕込み当量を表す。図９から分かる通り、ＣＭＣ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２においても、実施例３８と同様な膨潤／消失特性が示され、癒着防止材として有用であることが示された。また、生分解点の無いエタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩によるＣＭＣ架橋体（ＣＭＣ−ＮＣ２Ｎ）でも、実施例３９と同様な結果が示された。
【０２０６】
実施例４１
Ａｌｇ架橋体（Ａｌｇ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２）の膨潤／消失試験（in vitro）
（試験方法）
実施例３８に記載の試験方法と同様の方法で実施した。
（試験試料）
実施例３０、比較例４で調製したＡｌｇ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２及びＡｌｇ−ＮＣ２Ｎを用いた。
（結果）
試験の結果を図１０に示した。ここで、図１０の凡例における括弧内の数値は、ジアミン架橋剤の仕込み当量を表す。図１０から分かる通り、Ａｌｇ−ＧｌｙＳｅｒＮＨ２においても、実施例３８と同様な膨潤／消失特性が示され、癒着防止材として有用であることが示された。また、生分解点の無いエタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩によるＡｌｇ架橋体（Ａｌｇ−ＮＣ２Ｎ）でも、実施例３９と同様な結果が示された。
【０２０７】
実施例４２
ＣＳ架橋体のラット子宮角癒着モデルでの癒着防止性能／分解消失性能試験（in vivo）
（１．試験動物）
Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）系（ＳＰＦ）雌性ラットを７週齢で購入し、試験前１週間の予備飼育を行った後、本試験に使用した。各試験物質群５個体ずつとした。
（２．試験方法）
（２−１．ラット子宮角癒着モデルの作製）
イソフルラン吸入麻酔下（濃度３％、流速２〜３L/min）にてラット腹部を毛刈りし、アルコール消毒した後に約４cm正中切開した。ラット右腹壁筋層を露出させ、直径８mmの角膜移植用トレパンを用いて、正中切開部より約１．５cm背側の位置に円形の切開を入れた。円形切開部の内部筋層をピンセットで剥離し、円形欠損層を作製した。続いて右子宮角を露出させ、眼科剪刀を用いて、卵巣側約１cmの位置より子宮頸部に向かって２〜３mm間隔で計４ヶ所、切開創を作製した。傷口からの出血は電気メスで随時止血した。強固な癒着形成を促進させるために、腹壁欠損創と子宮角切開創が隣接するように子宮角の両端２ヶ所を８／０の縫合糸を用い腹壁に一針縫合した。
［試験群］：腹壁欠損部と子宮角切創部の間に上記の酸性多糖架橋体粉末、未架橋酸性多糖粉末、各２５mg/siteと、市販品であるセプラフィルム（１×３cm）を挟み込み試験群とした。
［対照群］：試験群に用いたと同じ動物の左側腹壁と子宮角を同様の手術を行い、こちらには何も挟み込まず対照群とした。
（３．評価方法）
埋め込み７日後にラットをエーテル麻酔下で頚動脈より放血屠殺後解剖し、癒着発生率を指標に候補物質の癒着防止効果を評価した。ここで、癒着防止効果は、各試験物質群（５個体）と癒着の発生が認められた固体との比として評価した。また、試験物質の分解性は、試験終了後、腹腔内の試験物質濃度をカルバゾール硫酸法により測定し、無処置群と比較して、投与した被験物質がほとんど検出されない場合を『消失』、明確に検出される場合を『残留』として評価した。
（４．結果）
試験の結果を表３に示した。
【表３】
2019218546.tif 000028
【０２０８】
表３の結果から分かるように、本癒着モデルにおいて、市販品のセプラフィルム（比較例Ａ）や未架橋原料であるコンドロイチン硫酸ナトリウム（ＣＳ）（比較例Ｂ）は、消失はするものの癒着防止効果を全く示さなかった。
【０２０９】
一方、本発明の生分解点を有するジアミンリンカーによるＣＳ架橋体は、顕著な癒着防止効果とともに、必要期間後の速やかな分解消失性を併せ持つことが確認され、癒着防止材として極めて有用であることが示された。
【０２１０】
また、分解点の無いエタン−１，２−ジアミン・２塩酸塩で架橋したＣＳ−ＮＣ２Ｎ（比較例Ｃ）は、顕著な癒着防止効果は示すものの、必要期間後においても試験物質が残留することが確認された。
【０２１１】
このことから、適切な時間で分解する本発明の酸性多糖用ジアミン架橋剤を使用することによって得られる、本発明の酸性多糖架橋体は、高い癒着防止性能と速やかな分解消失性能を併せ持つことが確認された。
【０２１２】
実施例４３
２−アミノエチル ２−（２−アミノアセトアミド）アセテート（ＧｌｙＧｌｙＣ２Ｎ）・２塩酸塩（化合物５５）の合成
以下の手順で化合物５５を合成した。
【化２３】
2019218546.tif 000029
化合物５３は、Chem-Impex International社より購入した。
【０２１３】
（工程１）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−グリシン（化合物１）の代わりに化合物５３を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物５３（２．０１ｇ、８．６３mmol）と化合物２（１．３９ｇ、８．６１mmol）より、化合物５４（２．５０ｇ、６．６５mmol）を白色固体として得た（収率７７％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.44-1.46(18H, s, Boc×2), 3.40-3.41(2H, m, CH2NHBoc), 3.85(2H, d, J=6Hz, BocNHCH2), 4.07(2H, d, J=5Hz, NHCH2COO), 4.12(2H, t, J=5Hz, COOCH2), 4.92(1H, brs, NHBoc), 5.21(1H, brs, BocNH), 6.70(1H, brs, CONH)
ESI-MS: Calcd for C16H29N3O7 [M+NH4]+, 393.2; found 393.2
【０２１４】
（工程２）
実施例６（工程２）において、化合物１９の代わりに化合物５４を用いた以外は実施例６（工程２）と同様にして、化合物５４（１．０５ｇ、２．７９mmol）より、標記の化合物５５（６９２mg、２．７９mmol）を白色固体として得た（収率１００％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 3.08(2H, d, J=5Hz,COOCH2), 3.64(2H, s, NH3CH2), 4.05(2H, d, J=7Hz, CONHCH2), 4.30(2H, t, J=5Hz, CH2NH3), 8.37(6H, brs, NH3×2), 9.07(1H, t, J=7Hz, CONH)
ESI-MS: Calcd for C6H13N3O3 [M+H]+, 176.1; found 176.2
【０２１５】
実施例４４
２−（２−アミノエトキシ）エチル ２−アミノアセテート（ＧｌｙＣ２ＯＣ２Ｎ）・２塩酸塩（化合物５８）の合成
以下の手順で化合物５８を合成した。
【化２４】
2019218546.tif 000030
化合物５６は、Biochemical and Biophysical Research Communications 374 (2008) 419-423に記載の方法により合成した。
【０２１６】
（工程１）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−エタノールアミン（化合物２）の代わりに化合物５６を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物１（２．０１ｇ、１１．４mmol）と化合物５６（２．３６ｇ、１１．５mmol）より、化合物５７（４．１４ｇ、 １１．４mmol）を無色透明粘性液体として得た（収率１００％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.45(18H, m, Boc×2), 3.31-3.32(2H, m, CH2NHBoc), 3.54(2H, t, J=5Hz, CH2CH2NHBoc), 3.66-3.69(2H, m, CH2), 3.94(2H, d, J=6Hz, BocNHCH2), 4.28-4.32(2H, m, CH2), 4.97-5.01(2H, m, NH×2)
ESI-MS: Calcd for C16H30N2O7 [M+H]+, 363.2; found 363.2
【０２１７】
（工程２）
実施例６（工程２）において、化合物１９の代わりに化合物５７を用いた以外は実施例６（工程２）と同様にして、化合物５７（１．０１ｇ、２．７８mmol）より、標記の化合物５８（６５４mg、２．７８mmol）を白色粘性半固体として得た（収率１００％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 2.94-2.95(2H, m, CH2NH3), 3.61-3.70(4H, m, CH2, CH2CH2NH3), 3.81(2H, brs, NH3CH2), 4.30-4.31(2H, m, CH2), 8.27(3H, brs, CH2NH3), 8.65(3H, brs, NH3CH2)
ESI-MS: Calcd for C6H14N2O3 [M+H]+, 163.1; found 163.1
【０２１８】
実施例４５
２−（（２−アミノエチル）アミノ）エチル ２−アミノアセテート（ＧｌｙＣ２ＮＣ２Ｎ）・３塩酸塩（化合物６１）の合成
以下の手順で化合物６１を合成した。
【化２５】
2019218546.tif 000031
化合物５９は、Journal of Applied Polymer Science, 121(2), (2011) 666-674に記載の方法により合成した。
【０２１９】
（工程１）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−エタノールアミン（化合物２）の代わりに化合物５９を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物１（１．５０ｇ、８．５６mmol）と化合物５９（２．６１ｇ、８．５７mmol）より、化合物６０（３．９５ｇ、８．５６mmol）を無色透明粘性液体として得た（収率１００％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.43-1.45(27H, m, Boc×3), 3.27-3.35(4H, m, CH2NHBoc, CH2CH2NHBoc), 3.47(2H, brs, CH2), 3.92(2H, brs, BocNHCH2), 4.24-4.28(2H, m, CH2), 4.66-4.99(1H, m, NHBoc), 5.22-5.30(1H, m, BocNH)
ESI-MS: Calcd for C21H39N3O8 [M+H]+, 462.3; found 462.3
【０２２０】
（工程２）
実施例６（工程２）において、化合物１９の代わりに化合物６０を用いた以外は実施例６（工程２）と同様にして、化合物６０（１．８３ｇ、３．９７mmol）より、標記の化合物６１（１．０７ｇ、３．９７mmol）を白色固体として得た（収率１００％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 3.26-3.33(6H, m, CH2×3), 3.91(2H, s, H3NCH2), 4.49(2H, t, J=5Hz, CH2), 8.64-10.05(8H, m, NH3×2, NH2)
ESI-MS: Calcd for C6H15N3O2 [M+H]+, 162.1; found 162.2
【０２２１】
実施例４６
（Ｓ）−２−アミノエチル ２−アミノ−４−メチルペンタノエート（ＬｅｕＣ２Ｎ）・２塩酸塩（化合物６４）の合成
以下の手順で化合物６４を合成した。
【化２６】
2019218546.tif 000032
化合物６２は、東京化成工業株式会社より購入した。
【０２２２】
（工程１）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−グリシン（化合物１）の代わりに化合物６２を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物６２の１水和物（３．１０ｇ、１２．４ mmol）と化合物２（２．００ｇ、１２．４mmol）より、化合物６３（４．３２ｇ、１１．５mmol）を白色固体として得た（収率９３％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,55℃,δ) 0.95(3H, s), 0.96(3H, s), 1.45(18H, s), 1.50(1H, m), 1.59(1H, m), 1.70(1H, m), 3.41(2H, m), 4.16-4.27(3H, m), 4.86-4.93(2H, m)
ESI-MS: Calcd for C18H34N2O6 [M+H]+, 375.2; found 375.4
【０２２３】
（工程２）
実施例６（工程２）において、化合物１９の代わりに化合物６３を用いた以外は実施例６（工程２）と同様にして、化合物６３（１．０１ｇ、２．７０mmol）より、標記の化合物６４（６６８mg、２．７０mmol）を白色固体として得た（収率１００％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 0.90(6H, dd, J=3Hz, 7Hz, CH3×2), 1.66-1.83(3H, m, CH(CH3)2, CHCH2CH), 3.13(2H, t, J=5Hz, OCH2), 3.98(1H, t, J=7Hz, NH2CH), 4.31-4.43(2H, m, CH2NH3), 8.63(6H, brs, NH3×2)
ESI-MS: Calcd for C8H18N2O2 [M+H]+, 175.1; found 175.3
【０２２４】
実施例４７
（Ｓ）−２−アミノエチル ２−アミノ−３−フェニルプロパノエート（ＰｈｅＣ２Ｎ）・２塩酸塩（化合物６７）の合成
以下の手順で化合物６７を合成した。
【化２７】
2019218546.tif 000033
化合物６５は、東京化成工業株式会社より購入した。
【０２２５】
（工程１）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−グリシン（化合物１）の代わりに化合物６５を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物６５（３．２９ｇ、１２．４mmol）と化合物２（２．０１ｇ、１２．５mmol）より、化合物６６（４．６５ｇ、１１．４mmol）を白色固体として得た（収率９２％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,55℃,δ) 1.43(9H, s), 1.45(9H, s), 3.06(2H, m), 3.29(2H, m), 4.14(2H, m), 4.54(1H, m), 4.64(1H, s), 4.99(1H, d, J=7Hz), 7.17(2H, m), 7.24-7.33(3H, m)
ESI-MS: Calcd for C21H32N2O6 [M+H]+, 409.2; found 409.4
【０２２６】
（工程２）
実施例６（工程２）において、化合物１９の代わりに化合物６６を用いた以外は実施例６（工程２）と同様にして、化合物６６（１．０３ｇ、２．５３mmol）より、標記の化合物６７（６９５mg、２．４７mmol）を白色固体として得た（収率９８％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 3.05-3.13(2H, m, OCH2), 3.18-3.26(2H, m, CH2Ph), 4.25-4.39(3H, m, NH3CH, CH2NH3), 7.26-7.36(5H, m, Ph), 8.66(6H, brs, NH3×2)
ESI-MS: Calcd for C11H16N2O2 [M+H]+, 209.1; found 209.3
【０２２７】
実施例４８
（Ｓ）−２−アミノエチル ２−アミノ−３−（１Ｈ−インドル−３−イル）プロパノエート（ＴｒｐＣ２Ｎ）・２塩酸塩（化合物７０）の合成
以下の手順で化合物７０を合成した。
【化２８】
2019218546.tif 000034
化合物６８は、東京化成工業株式会社より購入した。
【０２２８】
（工程１）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−グリシン（化合物１）の代わりに化合物６８を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物６８（３．７７ｇ、１２．４mmol）と化合物２（２．００ｇ、１２．４mmol）より、化合物６９（４．６１ｇ、１０．３mmol）を白色固体として得た（収率８３％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,55℃,δ) 1.43(9H, s), 1.44(9H, s), 3.26(4H, m) 4.10(2H, m), 4.61(2H, m), 5.07(1H, d, J=7Hz), 7.04(1H, d, J=2Hz), 7.14(1H, m), 7.21(1H, m), 7.37(1H, d, J=8Hz), 7.59(1H, d, J=8Hz), 8.09(1H, s)
ESI-MS: Calcd for C23H33N3O6 [M+H]+, 448.2; found 448.4
【０２２９】
（工程２）
実施例６（工程２）において、化合物１９の代わりに化合物６９を用いた以外は実施例６（工程２）と同様にして、化合物６９（１．０１ｇ、２．２６mmol）より、標記の化合物７０（７２５mg、２．２６mmol）を白色固体として得た（収率１００％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 3.05-3.12(2H, m, OCH2), 3.33-3.40(2H, m, CH2CH), 4.21-4.37(3H, m, CH, CH2NH3), 7.02(1H, dt, J=8Hz, 1Hz, Ph-H), 7.10(1H, dt, J=8Hz,1Hz, Ph-H), 7.29(1H, d, J=3Hz, HC=C), 7.38(1H, d, J=8Hz, Ph-H), 7.58(1H, d, J=8Hz, Ph-H), 8.58(6H, brs, NH3×2), 11.09(1H, d, J=2Hz, NH)
ESI-MS: Calcd for C13H17N3O2 [M+H]+, 248.1; found 248.3
【０２３０】
実施例４９
（Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−４−（エチルアミノ）−４−オキソブタン−２−イル ２−アミノプロパノエート（ＡｌａＴｈｒＮＨＥｔ）・２塩酸塩（化合物７４）の合成
以下の手順で化合物７４を合成した。
【化２９】
2019218546.tif 000035
化合物７１は、Sigma-Aldrich社より購入した。
【０２３１】
（工程１、２）
Ｂｏｃ−トレオニン（化合物７１）（３．００ｇ、１３．７mmol）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）/ １．８３ Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液 ＝ ３/１（３０mL）に溶解し、室温下、エチルアミン塩酸塩（１．１２ｇ、１３．７mmol）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド・Ｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）（６．４４ｇ、２３．３mmol）を加え、メタノール / 水 ＝ １/４（３７．５mL）を追加し、室温で終夜攪拌した。反応液を濃縮した後、０．５Ｎ 塩酸を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、溶媒を減圧留去した。残渣を乾燥することで、化合物７２（３．３９ｇ、ｃｒｕｄｅ）を白色粘性半固体として得た。
続けて、実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−グリシン（化合物１）の代わりにＢｏｃ−アラニン（化合物２１）を、Ｂｏｃ−エタノールアミン（化合物２）の代わりに化合物７２を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物２１（２．５９ｇ、１３．７mmol）と化合物７２（３．３９ｇ、ｃｒｕｄｅ）、及びトリエチルアミン（２．１０mL、１５．１mmol)の追加により、化合物７３（３．７２ｇ、８．９２mmol）を白色アモルファスとして得た（２工程収率６５％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.16(3H, t, J=8Hz, CH2CH3), 1.24(3H, d, J=7Hz, OCHCH3), 1.35(3H, d, J=7Hz, BocNHCHCH3), 1.42-1.47(18H, m, Boc×2), 3.26-3.38(2H, m, CH2CH3), 4.17-4.25(2H, m, BocNHCH, CHNHBoc), 4.99-5.00(1H, m, BocNH), 5.29(1H, brs, OCH), 5.50(1H, brs, NHBoc), 6.17-7.00(1H, m, CONH)
ESI-MS Calcd for C19H35N3O7 [M+H]+, 418.3; found 418.3
【０２３２】
（工程３）
実施例６（工程２）において、化合物１９の代わりに化合物７３を用いた以外は実施例６（工程２）と同様にして、化合物７３（１．０４ｇ、２．４９mmol）より、標記の化合物７４（７２３mg、２．４９mmol）を白色固体として得た（収率１００％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 1.06(3H, t, J=7Hz, CH2CH3), 1.29(3H, d, J=7Hz, OCHCH3), 1.45(3H, d, J=7Hz, H3NCHCH3), 3.08-3.22(2H, m, CH2CH3), 3.98(1H, d, J=6Hz, CHNH3), 4.08-4.09(1H, m, H3NCH), 5.16(1H, dq, J=7Hz, 7Hz, OCH), 8.74-8.79(6H, m, NH3×2), 9.04(1H, t, J=6Hz, CONH)
ESI-MS: Calcd for C9H19N3O3 [M+H]+, 218.2; found 218.2
【０２３３】
実施例５０
（Ｓ）−２−アミノエチル ２−アミノ−４−（メチルチオ）ブタノエート（ＭｅｔＣ２Ｎ）・２塩酸塩（化合物７７）の合成
以下の手順で化合物７７を合成した。
【化３０】
2019218546.tif 000036
化合物７５は、東京化成工業株式会社より購入した。
【０２３４】
（工程１）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−グリシン（化合物１）の代わりに化合物７５を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物７５（２．０１ｇ、８．０６mmol）と化合物２（１．３０ｇ、８．０６mmol）より、化合物７６（３．０６ｇ、７．８１mmol）を白色固体として得た（収率９７％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.45(18H, s, Boc×2), 1.92-1.99(1H, m, SCH2CH), 2.11-2.16(4H, m, SCH3, SCH2CH), 2.55(2H, t, J=8Hz, SCH2), 3.41-3.42(2H, m, CH2NH), 4.19-4.25(2H, m, OCH2), 4.38-4.39(1H, m, NHCH), 4.99(1H, brs, NHBoc), 5.21-5.23(1H,m,BocNH)
ESI-MS: Calcd for C17H32N2O6S [M+H]+, 393.2; found 393.5
【０２３５】
（工程２）
実施例６（工程２）において、化合物１９の代わりに化合物７６を用いた以外は実施例６（工程２）と同様にして、化合物７６（１．００ｇ、２．５６mmol）より、標記の化合物７７（６０１mg、２．２６mmol）を白色粘性半固体として得た（収率８９％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 2.07(3H, s, Me), 2.12-2.20(2H, m, SCH2CH2), 2.58-2.71(2H, m, SCH2), 3.14(2H, d, J=5Hz, CH2NH3), 4.13(1H, brs, NH3CH), 4.33-4.44(2H, m, CH2CH2NH3), 8.51(3H, brs, NH3), 8.93(3H, brs, NH3)
ESI-MS: Calcd for C7H16N2O2S [M+H]+, 193.1; found 193.2
【０２３６】
実施例５１
２−アミノエチル ３−アミノ−２−フルオロプロパノエート（βＡｌａ（Ｆ）Ｃ２Ｎ）・２塩酸塩（化合物８１）の合成
以下の手順で化合物８１を合成した。
【化３１】
2019218546.tif 000037
化合物７８は、東京化成工業株式会社より購入した。
【０２３７】
（工程１、２）
化合物７８（１．３０ｇ、９．０７mmol）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２６mL）と １Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液（１８．１mL）に溶解し、氷冷下、Ｂｏｃ２Ｏ（２．０８ｇ、９．５２mmol）と水（７mL）を添加した後、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧濃縮し、残液を１Ｎ 塩酸でｐＨ１に調整し、クロロホルム（１５０mL×４）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残渣を室温下、真空乾燥し、化合物７９（２．０４ｇ、ｃｒｕｄｅ）を無色透明粘性液体として得た。
続けて、実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−グリシン（化合物１）の代わりに化合物７９を用いた以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物７９（２．０４ｇ、ｃｒｕｄｅ）と化合物２（１．４６ｇ、９．０６mmol）により、化合物８０（２．２１ｇ、６．３０mmol）を白色固体として得た（２工程収率７０％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.44-1.45(18H, m, Boc×2), 3.43(2H, brs, CH2NHBoc), 3.54-3.63(1H, m, BocNHCH), 3.81-3.85(1H, m, BocNHCH), 4.13-4.17(1H, m, OCH), 4.36-4.37(1H, m, OCH), 4.92-5.03(2H, m, CHF, BocNH), 5.44(1H, brs, NHBoc)
ESI-MS: Calcd for C15H27FN2O6 [M+H]+, 351.2; found 351.2
【０２３８】
（工程３）
実施例６（工程２）において、化合物１９の代わりに化合物８０を用いた以外は実施例６（工程２）と同様にして、化合物８０（１．０３ｇ、２．９４mmol）より、標記の化合物８１（６６０mg、２．９４mmol）を白色固体として得た（収率１００％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 3.10-3.18(2H, m, CH2NH3), 3.37-3.51(2H, m, NH3CH2), 4.35-4.44(2H, m, OCH2), 5.50-5.62(1H, m, CHF), 8.46-8.64(6H, m, NH3×2)
ESI-MS: Calcd for C5H11FN2O2 [M+H]+, 151.1; found 151.1
【０２３９】
実施例５２
２−アミノエチル ２−アミノ−２−メチルプロパノエート（（Ｍｅ）ＡｌａＣ２Ｎ）・２塩酸塩（化合物８４）の合成
以下の手順で化合物８４を合成した。
【化３２】
2019218546.tif 000038
化合物８２は、東京化成工業株式会社より購入した。
【０２４０】
（工程１）
実施例１（工程１）において、Ｂｏｃ−グリシン（化合物１）の代わりに化合物８２を用い、また、トリエチルアミン（２．５０mL、１７．９mmol）を追加した以外は実施例１（工程１）と同様にして、化合物８２（３．００ｇ、１４．８mmol）と化合物２（２．８７ｇ、１７．８mmol）より、化合物８３（２．５０ｇ、７．２２mmol）を無色透明粘性液体として得た（収率４９％）。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,δ) 1.43-1.45(18H, m, Boc×2), 1.48(6H, s, CH3×2), 3.42(2H, d, J=5Jz, CH2NHBoc), 4.23(2H, t, J=5Hz, OCH2), 4.94(1H, brs, BocNH), 5.16(1H, brs, NHBoc)
ESI-MS: Calcd for C16H30N2O6 [M+NH4]+, 347.2; found 347.3
【０２４１】
（工程２）
実施例６（工程２）において、化合物１９の代わりに化合物８３を用いた以外は実施例６（工程２）と同様にして、化合物８３（９３９mg、２．７１mmol）より、標記の化合物８４（５８７mg、２．６８mmol）を白色固体として得た（収率９９％）。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6,δ) 1.53(6H, s, CH3×2), 3.15(2H, t, J=5Hz, CH2), 4.34-4.36(2H, m, CH2), 8.29-8.77(6H, brs, NH3×2)
ESI-MS: Calcd for C6H14N2O2 [M+H]+, 147.1; found 147.1
【０２４２】
実施例５３
化合物３７によるコンドロイチン硫酸架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＰｈＣ２Ｎ）の調製
実施例１７（方法Ａ）において、化合物７の代わりに化合物３７（実施例１２で合成）を用いて、化合物３７の当量を（０．０３０、０．０４０、０．０５０ｅｑ）、ＣＳ量を０．８０ｇとした以外は、実施例１７（方法Ａ）と同様にして、ＣＳ架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＰｈＣ２Ｎ）を白色粉末として得た（各約０．６５ｇ）。
【０２４３】
実施例５４
化合物４２によるコンドロイチン硫酸架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＬａｃＣ２Ｎ）の調製
実施例１７（方法Ａ）において、化合物７の代わりに化合物４２（実施例１３で合成）を用いて、化合物４２の当量を（０．０４０、０．０５０、０．０６０ｅｑ）、ＣＳ量を０．８０ｇとした以外は、実施例１７（方法Ａ）と同様にして、ＣＳ架橋体（ＣＳ−ＧｌｙＬａｃＣ２Ｎ）を白色粉末として得た（各約０．７８ｇ）。
【０２４４】
実施例５５
化合物５２によるコンドロイチン硫酸架橋体（ＣＳ−ＯｃｔＨｏｍｏＳｅｒＥｔ）の調製
実施例１７（方法Ａ）において、化合物７の代わりに化合物５２（実施例１６で合成）を用いて、化合物５２の当量を（０．０６０、０．０８０、０．１００ｅｑ）、ＣＳ量を０．８０ｇとした以外は、実施例１７（方法Ａ）と同様にして、ＣＳ架橋体（ＣＳ−ＯｃｔＨｏｍｏＳｅｒＥｔ）を白色粉末として得た（各約０．６２ｇ）。
【０２４５】
実施例５６
化合物８１によるコンドロイチン硫酸架橋体（ＣＳ−βＡｌａ（Ｆ）Ｃ２Ｎ）の調製
実施例１７（方法Ａ）において、化合物７の代わりに化合物８１（実施例５１で合成）を用いて、化合物８１の当量を（０．０３０、０．０４０、０．０５０ｅｑ）、ＣＳ量を０．８０ｇとした以外は、実施例１７（方法Ａ）と同様にして、ＣＳ架橋体（ＣＳ−βＡｌａ（Ｆ）Ｃ２Ｎ）を白色粉末として得た（各約０．６９ｇ）。
【０２４６】
実施例５７
化合物８４によるコンドロイチン硫酸架橋体（ＣＳ−(Ｍｅ)ＡｌａＣ２Ｎ）の調製
実施例１７（方法Ａ）において、化合物７の代わりに化合物８４（実施例５２で合成）を用いて、化合物８４の当量を（０．１００、０．３００ｅｑ）、ＣＳ量を０．８０ｇとした以外は、実施例１７（方法Ａ）と同様にして、ＣＳ架橋体（ＣＳ−(Ｍｅ)ＡｌａＣ２Ｎ）を白色粉末として得た（各約０．６１ｇ）。
【０２４７】
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
【図１】
2019218546.tif 000041
【図２】
2019218546.tif 000042
【図３】
2019218546.tif 000043
【図４】
2019218546.tif 000044
【図５】
2019218546.tif 000045
【図６】
2019218546.tif 000046
【図７】
2019218546.tif 000047
【図８】
2019218546.tif 000048
【図９】
2019218546.tif 000049
【図１０】
2019218546.tif 000050
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月12日(2019.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多価アミンの一級アミノ基と酸性多糖のカルボキシ基とがアミド結合により架橋を形成してなる酸性多糖架橋体であって、当該多価アミンは、末端が一級アミノ基を有し、分子内にエステル又はチオエステルを有し、末端の一級アミノ基の間の直鎖上に該エステル又はチオエステルのカルボニル炭素を有する、酸性多糖架橋体。
【請求項２】
前記多価アミンがジアミンである、請求項１に記載の酸性多糖架橋体。
【請求項３】
前記ジアミン化合物の両端の一級アミノ基の少なくとも一つとエステル又はチオエステルのカルボニル炭素との間の直鎖の原子数が１〜５である、請求項２に記載の酸性多糖架橋体。
【請求項４】
前記酸性多糖が、グリコサミノグリカンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酸性多糖架橋体。
【請求項５】
前記グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸又はその塩である、請求項４に記載の酸性多糖架橋体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の酸性多糖架橋体を含む、癒着防止材。