(57)【要約】【課題】  フィーダーフリーの環境で多能性幹細胞を培養可能であり、基材の温度を変化させることにより、タンパク質分解酵素を用いることなく多能性幹細胞を基材から剥離可能である培養基材を提供する。【解決手段】  基材表面に、水に対する応答温度が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性高分子による層を有し、前記層にマトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びコラーゲンからなる群から選択される少なくとも１種類の生体由来物質が固定化されていることを特徴とする多能性幹細胞の培養基材。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材表面に、水に対する応答温度が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性高分子による層を有し、前記層にマトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びコラーゲンからなる群から選択される少なくとも１種類の生体由来物質が固定化されていることを特徴とする多能性幹細胞の培養基材。
【請求項２】
前記温度応答性高分子が、少なくとも下記（Ａ）及び（Ｂ）のブロックセグメントを含有するブロック共重合体であることを特徴とする、請求項１に記載の多能性幹細胞の培養基材。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜８０℃の範囲にある温度応答性重合体ブロックセグメント。
（Ｂ）多能性幹細胞接着性を有するブロックセグメント。
【請求項３】
前記温度応答性高分子が、少なくとも下記（Ａ）及び（Ｂ）のブロックセグメントを含有するブロック共重合体であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の多能性幹細胞の培養基材。
（Ａ）ＬＣＳＴが０℃〜８０℃の範囲にある温度応答性重合体ブロックセグメント。
（Ｂ）水不溶性ブロックセグメント。
【請求項４】
前記（Ｂ）のブロックセグメントが、下記一般式（１）で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含んでなるブロック重合体であることを特徴とする請求項２又は３に記載の多能性幹細胞の培養基材。
【化１】
2019033742.tif 000014
［式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、Ｑはエステル結合、アミド結合、ウレタン結合又はエーテル結合から選択される２価の結合であり、Ｒ２は下記一般式（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）若しくは（８）で表される置換基、炭素数１〜３０の炭化水素基又は水素原子を示す。
【化２】
2019033742.tif 000015
（式中、Ｒ３は炭素数１〜１０の２価の炭化水素基であり、Ｒ４およびＲ５は各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基である。）
【化３】
2019033742.tif 000016
（式中、Ｒ６は炭素数１〜１０の２価の炭化水素基であり、Ｒ７は炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、Ｒ８及びＲ９は各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、Ｘはスルホン酸アニオン基、カルボン酸アニオン基又はリン酸アニオン基である。）
【化４】
2019033742.tif 000017
（式中、Ｒ１０は水素原子又は炭素数１〜３０のアルキル基であり、ｉは１〜３００の整数であり、ｊは０〜６０の整数である。）
【化５】
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（式中、Ｒ１１は水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基である。）
【化６】
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（式中、Ｒ１２は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基であり、Ｒ１３は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６は、互いに独立して、水素原子又は炭素数１〜２の炭化水素基である。）
【化７】
2019033742.tif 000020
（式中、Ａはエーテル結合又はエステル結合であり、Ｒ１７は炭素数１〜５の２価の炭化水素基を表し、Ｒ１８はフッ素原子を表し、ｎは０〜４の整数を表す。）
【化８】
2019033742.tif 000021
（式中、Ｒ１９は炭素数１〜５の２価の炭化水素基を表すが、存在しなくとも良い。Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３及びＲ２４は各々独立して、水素原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基又は炭素数１〜４の炭化水素基を表す。）］
【請求項５】
（Ａ）及び（Ｂ）のブロックセグメントを含有するブロック共重合体が、（Ａ）のブロックセグメントの構成単位比率８０〜９９ｗｔ％であるブロック共重合体であることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載の多能性幹細胞の培養基材。
【請求項６】
温度応答性高分子が、１種類のブロック共重合体、又は２種類のブロック共重合体の混合物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の多能性幹細胞の培養基材。
【請求項７】
基材が多孔質基材であり、前記多孔質基材の細孔径が培養する多能性幹細胞よりも小さなものであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の多能性幹細胞の培養基材。
【請求項８】
下記試験によるラミニン吸着率が１０％以上であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の多能性幹細胞の培養基材。
リン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに対して０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のラミニン５１１−Ｅ８フラグメント溶液を２〜２．５μＬ添加した溶液を、基材の基材面積における単位面積当たりの量で０．２ｍＬ／ｃｍ２基材上に滴下し、３７℃で２４時間静置した時、下記式より求めたラミニン吸着率。
【数１】
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【請求項９】
多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の多能性幹細胞の培養基材。
【請求項１０】
以下の［１］〜［３］工程を経て、未分化の多能性幹細胞を製造する、多能性幹細胞の製造方法。
［１］請求項１〜９のいずれかに記載の培養基材に多能性幹細胞を播種する工程。
［２］前記培養基材に播種された多能性幹細胞を温度応答性高分子の応答温度以上の温度の液体中で培養する工程。
［３］培養基材を温度応答性高分子の応答温度未満の温度に冷却し、前記液体中で培養された多能性幹細胞を基材から剥離する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基材に温度応答性高分子による層を有することによって、温度変化により多能性幹細胞を剥離させることができる培養基材、並びに、量産性に優れ、細胞にダメージを与えることなく多能性幹細胞を製造可能な多能性幹細胞の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞は、生体の様々な組織に分化する能力（分化万能性）を持つ細胞であり、再生医療分野における細胞ソースとして、大きな注目が寄せられている。多能性幹細胞を再生医療に応用するには、まず必要な数の多能性幹細胞を未分化状態で増殖させ、単一細胞又は細胞凝集塊（細胞シートを除く）として回収することが必須である。
【０００３】
多能性幹細胞の未分化状態を維持するには、マウス胎仔由来の繊維芽細胞にガンマ線照射や抗生物質投与で作成されたフィーダー細胞を足場として培養する方法がある。しかし、フィーダー細胞を用いた多能性幹細胞の培養方法は、培養のプロセスを複雑化させ、また、異種動物間での内在性ウィルスの感染が起こりうる。特に医療用途においては、異種動物間のフィーダー細胞の使用をできる限り回避した培養方法が求められる。
【０００４】
上記問題を解決するために、ラミニンなどの細胞外マトリックスで被覆されたｉＰＳ細胞の培養基材（特許文献１）が知られている。このような基材によれば、フィーダー細胞を使用せず、すなわち、フィーダーフリーの環境で、多能性幹細胞の未分化状態を維持したまま培養することができる。しかし、このような基材で増殖した多能性幹細胞を基材から細胞を剥離させる際は、タンパク質分解酵素が用いられている。タンパク質分解酵素は多細胞表面にあるタンパク質を分解し、多能性幹細胞と基材間の結合および多能性幹細胞間の結合を切断する役目を担っている。一方、タンパク質分解酵素は細胞の生存率に悪影響を与えることが知られており、タンパク質分解酵素を用いずに細胞を基材から分離する手法は細胞にダメージを与えない方法として重要である。
【０００５】
タンパク質分解酵素を用いることなく細胞を剥離する方法として、温度応答性を有する基材を用いる方法が知られている。例えば、特許文献２では、水に対する上限もしくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃である温度応答性高分子が被覆された細胞培養支持体を用い、温度変化により細胞を剥離せしめ、細胞シートを回収する方法が開示されている。しかしながら特許文献２に記載の方法では、多能性幹細胞に適用することはできないという問題があった。さらには、特許文献２では細胞シートの回収を主目的としており、単一細胞又は細胞の凝集塊を得るものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１５−１７８５２６号公報
【特許文献２】特開２００９−１３１２７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、フィーダーフリーの環境で多能性幹細胞を培養可能であり、培養基材の温度を変化させることにより、タンパク質分解酵素を用いることなく多能性幹細胞を培養基材から剥離可能であり、多能性幹細胞を単一細胞又は細胞凝集塊として回収可能な培養基材を提供することにある。
【０００８】
本発明の目的はまた、量産性に優れ、細胞にダメージを与えることなく、単一細胞又は細胞凝集塊として多能性幹細胞を製造可能な多能性幹細胞の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、以上の点を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、温度応答性高分子による層を有する培養基材、並びに、特定の多能性幹細胞の製造方法が上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明によれば、基材表面に、水に対する応答温度が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性高分子による層を有し、前記層にマトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びコラーゲンからなる群から選択される少なくとも１種類の生体由来物質が固定化されていることを特徴とする多能性幹細胞の培養基材が提供される。
【００１１】
本発明はまた、以下の［１］〜［３］工程を経て、未分化の多能性幹細胞を製造する、多能性幹細胞の製造方法に関するものである。
［１］上記培養基材に多能性幹細胞を播種する工程。
［２］前記培養基材に播種された多能性幹細胞を温度応答性高分子の応答温度以上の温度の液体中で培養する工程。
［３］培養基材を温度応答性高分子の応答温度未満の温度に冷却し、前記液体中で培養された多能性幹細胞を基材から剥離する工程。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、フィーダーフリーの環境で多能性幹細胞を培養可能であり、培養基材の温度を変化させることにより、タンパク質分解酵素を用いることなく多能性幹細胞を基材から剥離可能であり、多能性幹細胞を単一細胞又は細胞凝集塊として回収可能な培養基材を提供することができる。また、量産性に優れ、細胞にダメージを与えることなく、単一細胞又は細胞凝集塊として多能性幹細胞を製造可能な多能性幹細胞の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の培養基材の構成要素を示す模式図
【図２】水溶液の透過率測定によるＬＣＳＴの測定結果の一例
【図３】対水接触角測定による応答温度の測定結果の一例
【図４】実施例８の培養基材表面の水中ＡＦＭ像
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための形態（以下、単に「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。以下の本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。
【００１５】
本明細書において、「温度応答性高分子」とは、温度変化によって親水性／疎水性の程度が変化する高分子を示す。また、水分子の存在下で高分子の温度を低温から高温へ昇温していく場合に、ある温度を境に高分子の親水性／疎水性の程度がより疎水性に変化し、水溶性から水不溶性に変化する温度応答性高分子が存在し、この境界温度を「下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ；Ｌｏｗｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）」という。一般に、温度応答性高分子がＬＣＳＴ未満の温度において水に溶解する場合、ＬＣＳＴ以上の温度では水に不溶となる。温度応答性高分子が水不溶性である場合には、ＬＣＳＴを有しないが、温度変化によって親水性／疎水性の程度が変化する応答温度を有する。
【００１６】
また、本明細書において、「生体由来物質」とは、生物の体内に存在する物質であるが、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記生体由来物質をベースとして化学的に合成した物質であっても良い。生体由来物質に特に限定はないが、例えば、生体を構成する基本材料である核酸、タンパク質、多糖や、これらの構成要素であるヌクレオチドやヌクレオシド、アミノ酸、各種の糖、あるいは脂質やビタミン、ホルモンである。
【００１７】
また、本明細書において、「多能性幹細胞接着性」とは、多能性幹細胞を培養する温度において、多能性幹細胞が培養基材に接着することである。
【００１８】
また、本明細書において、ブロックセグメントが「水不溶性を有する」とは、該ブロックセグメントを構成する単量体単位のみからなるホモポリマーの少なくとも一部が水に不溶であることを示す。
【００１９】
また、本明細書において、「多能性幹細胞増殖性」とは、培養温度における多能性幹細胞の増殖しやすさを示し、増殖性を有するとは、多能性幹細胞が培養温度において培養基材に接着し、増殖可能であることを示す。さらに、増殖性が高いとは、同一の培養期間で比較した際に、より多くの多能性幹細胞へと増殖することを示す。
【００２０】
また、本明細書において、「多能性幹細胞剥離性」とは、培養基材上で増殖した多能性幹細胞の培養基材からの剥離しやすさを示し、「剥離性を有する」とは、培養基材上で増殖した多能性幹細胞が外部刺激によって培養基材から剥離可能であることを示す。さらに、「剥離性が高い」とは、短時間の冷却や弱い応力等の、より弱い外部刺激によって多能性幹細胞が培養基材から剥離することを示す。また、「冷却剥離性を有する」とは、剥離性を有し、さらに培養基材を冷却することによって、冷却しない場合と比較して剥離性が高まることを示す。ここで、本明細書において「外部刺激」とは、超音波や振動、対流等の力学的刺激、光や電気、磁気等の電磁気学的刺激、加温や冷却等の熱力学的刺激を示し、酵素反応等の生物反応によるものを除く。
【００２１】
本発明の培養基材は、基材表面に水に対する応答温度が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性高分子による層を有する。温度応答性高分子による層を有することにより、本発明の培養基材は多能性幹細胞の冷却剥離性を有する。温度応答性高分子による層を有しない場合、多能性幹細胞の冷却剥離性を有しない。ここで、本発明において「培養基材」とは、多能性幹細胞の培養を行う物品全体（例えば、図１の符号１０で示される部分。）を示し、基材と温度応答性高分子による層を含む。また、本発明において「基材」とは、温度応答性高分子による層で被覆されるベース基材（例えば、図１の符号１で示される部分。）を示す。
【００２２】
本発明において、前記温度応答性高分子は、応答温度が０℃〜５０℃の範囲にある。応答温度が０℃〜５０℃の範囲にあることにより、本発明の培養基材は体温（３７℃）付近で多能性幹細胞接着性及び増殖性を有すると共に、細胞にダメージを与えない温度域において冷却剥離性を有する。応答温度を有しない場合、冷却剥離性を有しない。体温付近で多能性幹細胞接着性及び増殖性を付与すると共に、細胞にダメージを与えない温度域における冷却剥離性を付与するのに好適であることから、応答温度が１０℃〜４０℃の範囲にあることが好ましく、１５℃〜３５℃の範囲にあることがさらに好ましく、１５℃〜３０℃が特に好ましく、１５℃〜２５℃が最も好ましい。応答温度以上の温度では、温度応答性高分子は疎水性を有することから、タンパク質が吸着しやすく、吸着されたタンパク質を足場にして、細胞の接着培養が可能となる。一方で、温度を低下させた場合、親水性に変化することで、細胞の剥離が促進される。応答温度が０℃未満であれば細胞にダメージを与えない温度域において冷却剥離性を付与することが困難となり、５０℃を超えれば体温付近で多能性幹細胞接着性及び増殖性を有さず、細胞培養が困難となる。また、培養操作における培地交換の際に室温の培地を用いる場合においては、培地交換の際に細胞が剥離することを抑制するのに好適のため、応答温度が０℃〜３０℃の範囲にあることが好ましく、５℃〜２５℃の範囲にあることがさらに好ましく、５℃〜２０℃が特に好ましく、１０℃〜２０℃が最も好ましい。
【００２３】
本発明において、前記温度応答性高分子の種類としては特に限定はないが、基材に被覆されたブロック共重合体、アジド基等の反応性基を介して基材に固定化された共重合体、モノマーを基材に塗布して基材上で電子線重合又はラジカル重合を行うことにより基材上に固定化された重合体等を好適に用いることができる。
【００２４】
本発明において、前記温度応答性高分子は、少なくとも下記（Ａ）及び（Ｂ）のブロックセグメントを含有するブロック共重合体であることが好ましい。
（Ａ）ＬＣＳＴが０℃〜８０℃の範囲にある温度応答性重合体ブロックセグメント。
（Ｂ）水不溶性を有するブロックセグメント、又は多能性幹細胞接着性を有するブロックセグメント。
【００２５】
ブロック共重合体がブロックセグメント（Ａ）を含有することにより、本発明の培養基材に体温付近で多能性幹細胞接着性及び増殖性を付与しやすく、また、細胞にダメージを与えない温度域に冷却剥離性を付与しやすい。
【００２６】
ここで、本発明において「ブロックセグメント（Ａ）のＬＣＳＴ」と表記した場合は、ブロックセグメント（Ａ）を構成する繰り返し単位のみからなるホモポリマーのＬＣＳＴを示す。ブロックセグメント（Ａ）のＬＣＳＴは前記ホモポリマーが水に不溶化する温度であり、例えば、前記ホモポリマーを０．６ｗｔ％溶解させた水溶液において、１℃／分の速度で水溶液を昇温しながら、波長５００ｎｍの光の透過率を測定することで求めることができる。低温からＬＣＳＴに到達するまでは概ね一定の透過率を示すが、ＬＣＳＴ付近で白濁するため透過率が急激に低下し、その後は透過率が再び概ね一定となる曲線が得られる（例えば、図２）。この曲線において、ＬＣＳＴ未満の温度における透過率と、ＬＣＳＴ以上の温度における透過率の平均値の透過率となる温度を求めることにより（中点法）、ＬＣＳＴを求めることができる。測定する温度範囲はＬＣＳＴ未満の温度で透過率が概ね一定となる５℃以上の温度域を含み、さらにＬＣＳＴ以上の温度で透過率が一定となる５℃以上の温度域を含む範囲である。
【００２７】
また、本発明のブロック共重合体が水不溶性ブロックセグメントを有する場合は、水に不溶であるが、温度変化によって親水性／疎水性の程度が変化する温度を求めることにより、応答温度を測定することができる。例えば、ブロック共重合体が被覆された基材を水に浸漬し、水中における気泡の接触角を測定することにより、ブロック共重合体の親水性／疎水性の程度を測定する。次に、水の温度を変化させることにより、ブロック共重合体の温度を変化させ、温度が安定化するまで待った後に、再度気泡の接触角を測定することで、種々の温度における接触角を求める。応答温度未満では気泡の接触角が大きな値（対水接触角が小さな値）で概ね一定であるが、応答温度を境に気泡の接触角が小さな値（対水接触角が大きな値）となり、応答温度以上では概ね一定となる曲線が得られる（例えば、図３）。この曲線において、応答温度未満の温度における接触角と、応答温度以上の温度における接触角の平均値の接触角となる温度を求めることにより（中点法）、応答温度を求めることができる。測定する温度範囲は応答温度未満の温度で接触角が概ね一定となる１０℃以上の温度域を含み、さらに応答温度以上の温度で接触角が概ね一定となる１０℃以上の温度域を含む範囲である。
【００２８】
温度応答性高分子の応答温度の制御法として代表的なものに、共重合するモノマーの性質と、その共重合率を調整するものがある。温度応答性高分子に親水性のモノマーを共重合したものは、その組成の増加とともに応答温度は高温側にシフトする。一方、温度応答性高分子に疎水性のモノマーを共重合したものは、その組成の増加とともに応答温度は低温側にシフトする。このような観点から、ブロックセグメント（Ａ）の好適なＬＣＳＴは共重合させるブロックセグメント（Ｂ）のモノマーの性質によって変化するが、温度応答性高分子の応答温度を０〜５０℃とするのに好適であることから、ブロックセグメント（Ａ）のＬＣＳＴとしては、好ましくは１０〜７５℃、さらに好ましくは１０〜６０℃、特に好ましくは２０〜５０℃である。
【００２９】
前記ブロックセグメント（Ａ）を構成する単量体単位としては特に制限はないが、例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物；Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等のＮ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体；Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等のＮ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体；１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等の環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体；メチルビニルエーテル等のビニルエーテル；Ｎ−プロリンメチルエステルアクリルアミド等のプロリン誘導体を挙げることができ、ブロック共重合体の応答温度を０〜５０℃とするのに好適であることから、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミドが好ましく、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドがさらに好ましく、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが特に好ましい。また、培養操作における培地交換の際に室温の培地を用いる場合においては、ブロック共重合体の応答温度を室温よりも低い温度とするのに好適であることから、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−プロリンメチルエステルアクリルアミドが好ましい。
【００３０】
本発明において、ブロック共重合体が水不溶性を有するブロックセグメント（Ｂ）を含有することにより、培養液への温度応答性高分子の混入を抑制しやすく、好ましい。
【００３１】
本発明におけるブロックセグメント（Ｂ）はまた、培養基材の多能性幹細胞接着性を高めるのに好適であることから、ブロックセグメント（Ｂ）の単量体単位からなるホモポリマーが多能性幹細胞接着性を有することが好ましい。多能性幹細胞接着性を有するものとしては、特に限定されるものではないが、例えば、イオン性基、親水性基、疎水性基等を有するもの、また、それらを基材表面に被覆後、ガンマ線照射、プラズマ処理、コロナ処理等などで表面処理を施したものが挙げられる。
【００３２】
本発明におけるブロックセグメント（Ｂ）はまた、ブロック共重合体の応答温度を０〜５０℃の範囲とするのに好適であることから、ブロック共重合体の応答温度制御に寄与するブロックであることが好ましい。ブロック共重合体がブロックセグメント（Ｂ）を有することにより、ブロックセグメント（Ａ）の応答温度を高温側あるいは低温側にシフトさせ、ブロック共重合体の応答温度を０〜５０℃の範囲に制御することができる。ブロック共重合体がブロックセグメント（Ｂ）を有することにより、ブロック共重合体の応答温度の制御が可能であり、ブロックセグメント（Ｂ）を構成する単量体単位として様々なモノマーの使用が可能である。ブロック共重合体の応答温度制御のために、ブロックセグメント（Ｂ）には例えば、親水性のモノマー、疎水性のモノマー、さらにはその両方を使用してもよい。
【００３３】
また、本発明におけるブロックセグメント（Ｂ）は、多能性幹細胞の剥離性を高めるのに好適であることから、多能性幹細胞の剥離に必要な冷却時間の短縮に寄与するブロックであることが好ましい。ブロック共重合体がブロックセグメント（Ｂ）を有することにより、培養基材をブロック共重合体の応答温度よりも低温にした場合、ブロック共重合体に水が入り込みやすくなり、細胞とブロック共重合体の接着力が弱まりやすくなり、多能性幹細胞の剥離に必要な時間が短縮できる。このために、ブロック共重合体がブロックセグメント（Ｂ）を有することで、多能性幹細胞の剥離に必要な時間が短縮できるものである。多能性幹細胞の剥離に必要な冷却時間の短縮のために、ブロックセグメント（Ｂ）には例えば、親水性のモノマーを使用することが好ましい。
【００３４】
さらに、本発明におけるブロックセグメント（Ｂ）は、ブロック共重合体を基材へ強固に固定化するのに好適であることから、基材への接着に寄与するブロックであることが好ましい。ブロックセグメント（Ｂ）が基材への接着に寄与するブロックであることにより、培養基材をブロック共重合体の応答温度よりも低温にした場合も基材へブロック共重合体を安定に被覆させ続けることができる。このために、ブロックセグメント（Ｂ）が基材への接着に寄与するブロックであることにより、ブロック共重合体の基材への固定化は、化学的な被覆に限定されず、物理的に被覆させることも出来る。ブロック共重合体と基材への接着性を高めるために、ブロックセグメント（Ｂ）にはたとえば、疎水性のモノマー、反応性官能基を有するモノマーを使用することが好ましい。
【００３５】
本発明において、水不溶性を高めるのに好適であることから、ブロックセグメント（Ｂ）は、下記一般式（１）で表される繰り返し単位の内、少なくとも１種類の繰り返し単位を含んでなるブロック重合体であることが好ましい。
【００３６】
【化１】
2019033742.tif 000003
【００３７】
［式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、Ｑはエステル結合、アミド結合、ウレタン結合又はエーテル結合から選択される２価の結合であり、Ｒ２は下記一般式（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）若しくは（８）で表される置換基、炭素数１〜３０の炭化水素基又は水素原子を示す。
【００３８】
【化２】
2019033742.tif 000004
【００３９】
（式中、Ｒ３は炭素数１〜１０の２価の炭化水素基であり、Ｒ４およびＲ５は各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基である。）
【００４０】
【化３】
2019033742.tif 000005
【００４１】
（式中、Ｒ６は炭素数１〜１０の２価の炭化水素基であり、Ｒ７は炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、Ｒ８及びＲ９は各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、Ｘはスルホン酸アニオン基、カルボン酸アニオン基又はリン酸アニオン基である。）
【００４２】
【化４】
2019033742.tif 000006
【００４３】
（式中、Ｒ１０は水素原子又は炭素数１〜３０のアルキル基であり、ｉは１〜３００の整数であり、ｊは０〜６０の整数である。）
【００４４】
【化５】
2019033742.tif 000007
【００４５】
（式中、Ｒ１１は水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基である。）
【００４６】
【化６】
2019033742.tif 000008
【００４７】
（式中、Ｒ１２は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基であり、Ｒ１３は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６は、互いに独立して、水素原子又は炭素数１〜２の炭化水素基である。）
【００４８】
【化７】
2019033742.tif 000009
【００４９】
（式中、Ａはエーテル結合又はメチレン基であり、Ｒ１７は炭素数３〜５の２価の炭化水素基を表し、Ｒ１８はフッ素原子を表し、ｎは０〜４の整数を表す。）
【００５０】
【化８】
2019033742.tif 000010
【００５１】
（式中、Ｒ１９は炭素数１〜５の２価の炭化水素基を表すが、存在しなくとも良い。Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３及びＲ２４は各々独立して、水素原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基又は炭素数１〜４の炭化水素基を表す。）］
本発明における一般式（１）において、Ｒ１は水素原子又はメチル基である。Ｑはエステル結合、アミド結合、ウレタン結合又はエーテル結合から選択される２価の結合であり、エステル結合またはアミド結合が好ましく、エステル結合が特に好ましい。一般式（１）において、Ｒ２は一般式（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）若しくは（８）で表される置換基、炭素数１〜３０の炭化水素基又は水素原子を示す。
【００５２】
一般式（１）において、Ｒ２は水不溶性を高めるため、多能性幹細胞接着性及び増殖性を高めるため、ブロック共重合体の応答温度を高温側にシフトさせるため、あるいは、多能性幹細胞の剥離性を高めるために好適であることから、一般式（２）で表される置換基を用いることが好ましい。一般式（２）において、Ｒ３は炭素数１〜１０の２価の炭化水素基であり、多能性幹細胞の剥離性を高めるために好適であることから、好ましくは炭素数１〜６の２価の炭化水素基、特にアルキレン基を用いる。このようなアルキレン基として、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基などが例示され、好ましくはエチレン基である。Ｒ４およびＲ５は各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、多能性幹細胞の剥離性を高めるために好適であることから、Ｒ４及びＲ５が同時にメチル基またはエチル基であることが好ましく、特にメチル基であることが好ましい。
【００５３】
本発明における一般式（２）で表される置換基としては、アミノメチル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル基、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノメチル基、アミノエチル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル基、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル基、３−アミノプロピル基、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−プロピル基、３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）−プロピル基等を例示できるが、多能性幹細胞の剥離性を高めるために好適であることから、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルアミノメチル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル基、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル基である。
【００５４】
一般式（１）においてＲ２が一般式（２）で表される単量体単位としては、特に制限はないが、例えば、２−ジメチルアミノエチルアクリレート、２−ジメチルアミノエチルメタクリレート、２−ジエチルアミノエチルアクリレート、２−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド等を挙げることができる。
【００５５】
一般式（１）において、Ｒ２は水不溶性を高めるため、多能性幹細胞接着性及び増殖性を高めるため、ブロック共重合体の応答温度を高温側にシフトさせるため、あるいは、多能性幹細胞の剥離性を高めるために好適であることから、一般式（３）で表される置換基を用いることができる。一般式（３）において、Ｒ６は炭素数１〜１０の２価の炭化水素基であり、多能性幹細胞の剥離性を高めるために好適であることから、好ましくは、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基等の炭素数１〜６の２価のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレン基である。Ｒ７は炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、多能性幹細胞の剥離性を高めるために、好ましくは、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基等のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレン基である。Ｒ８およびＲ９は各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、多能性幹細胞の剥離性を高めるために好適であることから、好ましくはＲ８及び９が同時に水素原子またはメチル基であり、更に好ましくは同時にメチル基である。Ｘはスルホン酸アニオン基、カルボン酸アニオン基又はリン酸アニオン基である。
【００５６】
本発明における一般式（３）で表される置換基としては、ジメチル（エチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム基、ジメチル（エチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム基、ジメチル（エチル）（３−カルボキシラトプロピル）アミニウム基、ジメチル（プロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム基、ジメチル（プロピル）（４−スルホナトブチル）アミニウム基、ジメチル（エチル）（２−スルホナトエチル）アミニウム基、ジメチル（エチル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム基、ジメチル（エチル）（２−ホスホナトエチル）アミニウム基、ジメチル（エチル）（３−ホスホナトプロピル）アミニウム基等を例示できるが、多能性幹細胞の剥離性を高めるために好適であることから、好ましくはジメチル（エチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム基、ジメチル（エチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム基、ジメチル（プロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム基、ジメチル（プロピル）（４−スルホナトブチル）アミニウム基、ジメチル（エチル）（２−スルホナトエチル）アミニウム基である。
【００５７】
一般式（１）において、Ｒ２が一般式（３）で表される単量体単位としては、特に制限はないが、例えば、Ｎ−（３−スルホプロピル）−Ｎ−メタクロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムベタイン、Ｎ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン等を挙げることができる。
【００５８】
一般式（１）において、Ｒ２は水不溶性を高めるため、多能性幹細胞接着性及び増殖性を高めるため、ブロック共重合体の応答温度を高温側または低温側にシフトさせるため、あるいは、剥離性を高めるために好適であることから、一般式（４）で表される置換基を用いることが好ましい。一般式（４）において、Ｒ１０は水素原子又は炭素数１〜３０のアルキル基であり、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基等を例示できるが、多能性幹細胞の剥離性を高めるために好適であることから、好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基である。ただし、一般式（４）においてｉは１〜３００の整数であり、ｊは０〜６０の整数である。
【００５９】
本発明における一般式（４）で表される置換基としては、ポリエチレングリコール基、２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシエチル基、ヒドロキシメチル基、２−メトキシエチル基、フルフリル基、テトラヒドロフルフリル基等を例示できるが、多能性幹細胞の剥離性を高めるために好適であることから、好ましくはポリエチレングリコール基、２−メトキシエチル基またはテトラヒドロフルフリル基である。
【００６０】
一般式（１）において、Ｒ２が一般式（４）で表される単量体単位としては、特に制限はないが、例えば、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド、ポリエチレングリコールモノアクリレート、ポリエチレングリコールモノメタクリレート、ポリプロピレングリコールモノアクリレート、ポリプロピレングリコールモノメタクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノアクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノメタクリレート、ジエチレングリコールモノメチルエーテルアクリレート、ジエチレングリコールモノメチルエーテルメタクリレート、ジエチレングリコールモノエチルエーテルアクリレート、ジエチレングリコールモノエチルエーテルメタクリレート、２−メトキシエチルアクリレート、２−メトキシエチルメタクリレート、２−エトキシエチルアクリレート、２−エトキシエチルメタクリレート、３−ブトキシエチルアクリレート、３−ブトキシエチルメタクリレート、３−ブトキシエチルアクリルアミド、フルフリルアクリレート、フルフリルメタクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレート、テトラヒドロフルフリルメタクリレート等を挙げることができる。
【００６１】
一般式（１）において、水不溶性を高めるため、多能性幹細胞接着性及び増殖性を高めるため、Ｒ２はブロック共重合体の応答温度を高温側または低温側にシフトさせるため、あるいは、多能性幹細胞の剥離性を高めるために好適であることから、一般式（５）で表される置換基を用いることができる。一般式（５）において、Ｒ１１は水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基である。
【００６２】
一般式（１）において、Ｒ２が一般式（５）で表される単量体単位としては、特に制限はないが、例えば、メトキシメチルアクリレート、メトキシメチルメタクリレート、２−エトキシメチルアクリレート、２−エトキシメチルメタクリレート、３−ブトキシメチルアクリレート、３−ブトキシメチルメタクリレート、３−ブトキシメチルアクリルアミド等を挙げることができる。
【００６３】
一般式（１）において、Ｒ２は水不溶性を高めるため、多能性幹細胞接着性及び増殖性を高めるため、ブロック共重合体の応答温度を高温側にシフトさせるため、あるいは、多能性幹細胞の剥離性を高めるために好適であることから、一般式（６）で表される置換基を用いることができる。一般式（６）において、Ｒ１２は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基であり、多能性幹細胞の剥離に必要な冷却時間を短縮させるために好適であることから、好ましくは炭素数１〜６の２価の炭化水素基、特にアルキレン基である。このようなアルキレン基として、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基等が例示され、好ましくはエチレン基である。Ｒ１３は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、多能性幹細胞の剥離に必要な冷却時間を短縮させるために好適であることから、好ましくは炭素数１〜４のアルキレン基、例えばメチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基などが例示され、エチレン基が特に好ましい。
【００６４】
Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６は、互いに独立して、水素原子又は炭素数１〜２の炭化水素基、例えばメチル基又はエチル基であり、多能性幹細胞の剥離性を高めるために好適であることから、特にＲ１４、Ｒ１５、及びＲ１６が同時に水素原子又はメチル基、特にメチル基であることが好ましい。
【００６５】
本発明における一般式（６）で表される置換基としては、２−エチルホスホリルコリン基、３−プロピルホスホリルコリン基、４−ブチルホスホリルコリン基、６−ヘキシルホスホリルコリン基、１０−デシルホスホリルコリン基、ω−（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン基等を例示できるが、多能性幹細胞の剥離性を高めるために好適であることから、好ましくは２−エチルホスホリルコリン基を用いる。
【００６６】
一般式（１）において、Ｒ２が一般式（６）で表される単量体単位としては、特に制限はないが、例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、４−（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルコリン、ω−（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２−アクリルアミドエチルホスホリルコリン、３−アクリルアミドプロピルホスホリルコリン、４−アクリルアミドブチルホスホリルコリン、６−アクリルアミドヘキシルホスホリルコリン、１０−アクリルアミドデシルホスホリルコリン、ω−（メタ）アクリルアミド（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン等を挙げることができる。
【００６７】
一般式（１）において、Ｒ２は水不溶性を高めるため、多能性幹細胞接着性及び増殖性を高めるため、ブロック共重合体の応答温度を低温側にシフトさせるため、あるいは基材にブロック共重合体を化学的な結合によって被覆させるために好適であることから、一般式（７）で表されるフェニルアジド基を有する置換基を用いることができる。一般式（７）において、Ａはエーテル結合又はエステル結合である。Ｒ１７は炭素数１〜５の２価の炭化水素基を表し、プロピレン基、ブチレン基、ペンタメチレン基、フェニレン基が挙げられる。Ｒ１８はフッ素原子を表し、ｎは０〜４の整数を表す。
【００６８】
一般式（１）において、Ｒ２が一般式（７）で表される単量体単位としては、特に制限はないが、例えば、４−アジドフェニルアクリレート、４−アジドフェニルメタクリレート、２−（（４−アジドベンゾイル）オキシ）エチルアクリレート、２−（（４−アジドベンゾイル）オキシ）エチルメタクリレート等を挙げることができる。
【００６９】
一般式（１）において、Ｒ２は水不溶性を高めるため、多能性幹細胞接着性及び増殖性を高めるため、ブロック共重合体の応答温度を高温側または低温側にシフトさせるため、基材にブロック共重合体を物理的な相互作用によって被覆させるために、あるいは、基材にブロック共重合体を化学的な結合によって被覆させるために好適であることから、一般式（８）で表される、芳香環を有する置換基を用いることが好ましい。一般式（８）において、Ｒ１９は炭素数１〜５の２価の炭化水素基を表すが、存在しなくとも良い。Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３及びＲ２４は各々独立して、水素原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基又は炭素数１〜４の炭化水素基を表す。一般式（１）において、Ｒ２が一般式（８）で表される単量体単位としては、特に制限はないが、例えば、２−ヒドロキシフェニルアクリレート、２−ヒドロキシフェニルメタクリレート、３−ヒドロキシフェニルアクリレート、３−ヒドロキシフェニルメタクリレート、４−ヒドロキシフェニルアクリレート、４−ヒドロキシフェニルメタクリレート、Ｎ−（２−ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ−（２−ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド等を挙げることができる。
【００７０】
一般式（１）において、Ｒ２は水不溶性を高めるため、多能性幹細胞接着性及び増殖性を高めるため、ブロック共重合体の応答温度を低温側にシフトさせるため、あるいは基材にブロック共重合体を物理的な相互作用によって被覆させるために好適であることから、炭素数１〜３０の炭化水素基を用いることが好ましく、基材にブロック共重合体を安定に被覆させるため、好ましくは炭素数４〜１５の炭化水素基である。Ｒ２が炭素数１〜３０の炭化水素基で表される単量体単位としては、特に制限はないが、例えば、ｎ−ブチルアクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、イソブチルアクリレート、イソブチルメタクリレート、ｔ−ブチルアクリレート、ｔ−ブチルメタクリレート、ｎ−ヘキシルアクリレート、ｎ−ヘキシルメタクリレート、ｎ−オクチルアクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、ｎ−デシルアクリレート、ｎ−デシルメタクリレート、ｎ−ドデシルアクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−テトラデシルアクリレート、ｎ−テトラデシルメタクリレート等を挙げることができる。
【００７１】
本発明における（Ａ）及び（Ｂ）のブロックセグメントを含有するブロック共重合体の構造は特に限定されるものではないが、少なくとも（Ａ）及び（Ｂ）のブロックセグメントを含有するジブロック共重合体であることが好ましい。また、ブロックセグメント（Ａ）とブロックセグメント（Ｂ）は直接結合していてもよいし、スペーサーを介して結合していてもよい。なお、ブロックセグメント（Ｂ）を構成する繰り返し単位が２種類以上の場合、それらの配列はブロック配列であってもよいし、ランダム配列、交互配列であってもよい。
【００７２】
本発明における（Ａ）及び（Ｂ）のブロックセグメントを含有するブロック共重合体中のブロックセグメント（Ａ）の構成単位比率は、多能性幹細胞の冷却剥離性を高める観点から、好ましくは４０〜９９ｗｔ％であり、さらに好ましくは６０〜９９ｗｔ％であり、特に好ましくは８０〜９９ｗｔ％であり、最も好ましくは９０ｗｔ％を超えるものである。一方で、ブロック共重合体の水不溶性を高める観点から、ブロックセグメント（Ｂ）の構成単位比率は、好ましくは１〜５０ｗｔ％であり、好ましくは１〜２５ｗｔ％であり、さらに好ましくは３〜１５ｗｔ％であり、最も好ましくは５〜１５ｗｔ％である。
【００７３】
本発明における温度応答性高分子の分子量としては特に制限はないが、ブロック共重合体の強度を高めるのに好適のため、数平均分子量で１０００〜１００万であることが好ましく、２０００〜５０万であることがさらに好ましく、５０００〜３０万であることが特に好ましく、１万〜２０万であることが最も好ましい。
【００７４】
本発明における温度応答性高分子は、必要に応じて連鎖移動剤や重合開始剤、重合禁止剤等を含んでいてもよい。連鎖移動剤としては特に制限はなく、一般に使用されるものを好適に用いることができるが、例えば、ジチオベンゾエート、トリチオカルボナート、４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド、２−シアノプロパン−２−イル  Ｎ−メチル−Ｎ−（ピリジン−４−イル）カルバモジチオアート、２−プロピオン酸メチルメチル（４−ピリジニル）カルバモジチオアートを挙げることができる。また、重合開始剤としては特に制限はなく、一般に使用されるものを好適に用いることができるが、例えば、アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、過酸化水素、ペルオキソ二硫酸カリウム、過酸化ベンゾイル、トリエチルボラン、ジエチル亜鉛等を挙げることができる。さらに、重合禁止剤としては特に制限はなく、一般に使用されるものを好適に用いることができるが、ヒドロキノン、ｐ−メトキシフェノール、トリフェニルフェルダジル、２，２，６，６−テトラメチルピペリジニル−１−オキシル、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジニル−１−オキシル等を挙げることができる。
【００７５】
本発明における温度応答性高分子の合成方法としては、特に限定はないが、（株）エヌ・ティー・エス発行、“ラジカル重合ハンドブック”、ｐ．１６１〜２２５（２０１０）に記載のリビングラジカル重合技術を用いることができる。
【００７６】
本発明において、多能性幹細胞接着性及び増殖性、剥離性を高めるのに好適であることから、温度応答性高分子による層が、層厚５〜１０００ｎｍを有することが好ましく、５〜２００ｎｍがさらに好ましく、２０〜１００ｎｍが特に好ましく、３５〜８０ｎｍが最も好ましい。
【００７７】
本発明において、温度応答性高分子の種類に特に限定はないが、被覆にばらつきを生じず、培養される多能性幹細胞の状態を均一にするのに好適であることから、１種類のブロック共重合体、又は２種類のブロック共重合体の混合物であることが好ましく、１種類のブロック共重合体であることがさらに好ましい。ここで、本発明において「温度応答性高分子の種類」については、ブロック共重合体を構成する全てのブロックが同一の場合に同一種類のブロック共重合体と見なす。ここで、ブロックが同一であるとは、ブロックが主に１種類の単量体単位で構成される場合には、ｗｔ％比で最も多く含まれる単量体単位が同一の場合を示し、また、ブロックが２種類以上の単量体単位によって構成される場合には、ｗｔ％比が多い上位２つの単量体単位が同一の場合を示す。培養される多能性幹細胞の状態を均一にするのにより好適であることから、各ブロックの多分散度（重量平均分子量Ｍｗ／数平均分子量Ｍｎ）が１〜２０であることが好ましく、１〜１０であることがさらに好ましく、１〜５であることが特に好ましく、１〜２であることが最も好ましい。
【００７８】
本発明において、前記温度応答性高分子による層は、前記層上に固定化された生体由来物質を有し、前記生体由来物質は、マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びコラーゲンからなる群から選択される少なくとも１種類である。
【００７９】
温度応答性高分子よりなる層に固定化された生体由来物質を有することにより、本発明の培養基材は多能性幹細胞を培養することができる。温度応答性高分子による層に生体由来物質を有しない場合、培養基材への多能性幹細胞の接着力が弱く、多能性幹細胞を培養することができない。
【００８０】
また、生体由来物質の変性を抑制することができ、多能性幹細胞の増殖性を高めることができるため、生体由来物質は共有結合ではなく非共有結合により固定化されていることが好ましい。ここで、本発明において「非共有結合」とは、静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合、π−π相互作用、双極子−双極子相互作用、ロンドン分散力、その他のファンデルワールス相互作用等、分子間力に由来する共有結合以外の結合力を示す。生体由来物質のブロック共重合体への固定化は、単一の結合力によるものであっても、複数の組み合わせであってもよい。
【００８１】
本発明において、生体由来物質の固定化方法は特に限定されるものではないが、例えば、温度応答性高分子による層を有する基材に生体由来物質の溶液を所定時間塗布することで固定化させる方法や、多能性幹細胞を培養する培養液中に生体由来物質を添加することで固定化する方法を好適に用いることができる。
【００８２】
本発明において、前記生体由来物質は、マトリゲル、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン及びコラーゲンからなる群から選択される少なくとも１種類である。生体由来物質がマトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンのいずれか、又はこれらの組み合わせであることにより、本発明の培養基材は多能性幹細胞接着性及び増殖性を有する。生体由来物質がマトリゲル、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、コラーゲンのいずれでもない場合、多能性幹細胞接着性及び増殖性を有しない。多能性幹細胞接着性及び増殖性を付与するのに好適であることから、少なくともラミニンを含む４種類の組み合わせであることがさらに好ましく、ラミニンとマトリゲル、ラミニンとフィブロネクチン、又はラミニンとコラーゲンのいずれかの組み合わせであることが特に好ましく、ラミニン単独であることが最も好ましい。
【００８３】
これら生体由来物質は、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、制限酵素等で切断した断片や、これら生体由来物質をベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。
【００８４】
本発明において、前記マトリゲルとしては、入手容易性から、市販品としては例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）やＧｅｌｔｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を好適に用いることができる。
【００８５】
前記ラミニンの種類は特に限定されるものではないが、例えば、ヒトｉＰＳ細胞の表面に発現しているα６β１インテグリンに対して高活性を示すことが報告されているラミニン５１１、ラミニン５２１又はラミニン５１１−Ｅ８フラグメントを用いることができる。前記ラミニンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記ラミニンをベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（（株）ニッピ製）を好適に用いることができる。
【００８６】
前記ビトロネクチンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記ビトロネクチンをベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、ビトロネクチン，ヒト血漿由来（和光純薬工業（株）製）やｓｙｎｔｈｅｍａｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＶＴＮ−Ｎ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を好適に用いることができる。
【００８７】
前記フィブロネクチンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記フィブロネクチンをベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、フィブロネクチン溶液、ヒト血漿由来（和光純薬工業（株）製）やＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（タカラバイオ（株）製）を好適に用いることができる。
【００８８】
前記コラーゲンの種類は特に限定されるものではないが、例えば、ｔｙｐｅＩコラーゲンやｔｙｐｅＩＶコラーゲンを用いることができる。前記コラーゲンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記コラーゲンをベースとした合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、コラーゲンＩ，ヒト（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）やコラーゲンＩＶ，ヒト（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）を好適に用いることができる。
【００８９】
本発明において、多能性幹細胞の増殖性及び剥離性を高めるのに好適であることから、下記試験によるラミニン吸着率が１０％以上であることが好ましく、２０％以上であることがさらに好ましく、２０％〜８０％であることが特に好ましく、３０％〜６０％であることが最も好ましい。
［ラミニン吸着率試験］
リン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに対して０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のラミニン５１１−Ｅ８フラグメント溶液を２〜２．５μＬ添加した溶液を、培養基材の単位面積当たりの量で０．２ｍＬ／ｃｍ２基材上に滴下し、３７℃で２４時間静置した時、下記式より求めたラミニン吸着率。
【００９０】
【数１】
2019033742.tif 000011
【００９１】
ここで、培養基材に吸着したラミニン５１１−Ｅ８フラグメントの重量、及び、培養基材上に滴下した溶液に含まれるラミニン５１１−Ｅ８フラグメントの重量の測定方法については特に制限はないが、例えば、ＨｉＬｙｔｅ  ＦｌｕｏｒＴＭ  ６４７  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学研究所製）を用いて蛍光標識したラミニン５１１−Ｅ８フラグメントを用い、ラミニン吸着率を蛍光測定によって求める方法を挙げることができる。
【００９２】
本発明において、多能性幹細胞の増殖性及び剥離性を高めるのに好適であることから、培養基材のラミニン５１１−Ｅ８フラグメントの吸着量が、５〜５０００ｎｇ／ｃｍ２であることが好ましく、１０〜１０００ｎｇ／ｃｍ２であることがさらに好ましく、１５〜５００ｎｇ／ｃｍ２であることが特に好ましく、２０〜１００ｎｇ／ｃｍ２であることが最も好ましい。ラミニン５１１−Ｅ８フラグメントは、市販品としては例えばｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ニッピ社製）等を用いることができる。
【００９３】
本発明において温度応答性高分子による層が被覆される基材の材質は、特に限定されるものではないが、通常細胞培養に用いられるガラス、ポリスチレン等の物質のみならず、一般に形態付与が可能である物質、例えば、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタラート、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート等の高分子化合物や、セラミックス、金属類などを用いることができる。培養操作の容易性から、基材の材質がガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタラート、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンの内少なくとも１種類を含むことが好ましく、ガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタラート、ポリエチレンの内少なくとも１種類を含むことがさらに好ましく、可撓性を高めるのに好適であることからポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタラート、ポリエチレンが特に好ましい。
【００９４】
また、基材は多能性幹細胞接着性を有することが好ましい。
【００９５】
基材の形状としては特に制限はなく、板、フィルムのような平面形状であってもよいし、ファイバー、多孔質粒子、多孔質膜、中空糸であってもよい。また、一般に細胞培養等に用いられる容器（ペトリ皿等の細胞培養皿、フラスコ、プレート等）であっても差し支えない。培養操作の容易性から、板、フィルムのような平面形状、又は平膜の多孔質膜であることが好ましい。
【００９６】
本発明において、多能性幹細胞の剥離性を高めるのに好適であることから、基材が多孔質基材であり、多孔質基材の細孔径が培養する多能性幹細胞よりも小さなものであることが好ましい。基材が多孔質基材であることにより、多能性幹細胞の剥離性を高めることができる。また、多孔質基材の細孔径が多能性幹細胞よりも小さなものであることにより、多能性幹細胞接着性及び増殖性を高めることができる。また、多能性幹細胞接着性及び増殖性を高めるのに好適であることから、前記細孔径が８μｍ以下であることがさらに好ましく、３μｍ以下であることが特に好ましく、１μｍ以下であることが最も好ましい。さらに、能性幹細胞の剥離性を高めるのに好適であることから、前記細孔径が０．０１μｍ以上であることがさらに好ましく、０．０５μｍ以上であることが特に好ましく、０．１μｍ以上であることが最も好ましい。ここで、本発明において多孔質基材の「細孔径」とは、多孔質基材が有する細孔の、多孔質基材の面内方向に沿った直径の平均値を示し、多孔質基材のレーザー顕微鏡像や走査型電子顕微鏡像、透過型電子顕微鏡像において２０点以上の細孔について該直径を測定し、平均値を求めることによって算出することができる。
【００９７】
本発明において、多能性幹細胞接着性及び増殖性及び剥離性を高めるのに好適であることから、多孔質基材の細孔の細孔密度が、１０〜１０１０個／ｃｍ２であることが好ましく、１０３〜１０９個／ｃｍ２がさらに好ましく、１０５〜１０９個／ｃｍ２が特に好ましく、１０５〜１０７個／ｃｍ２が最も好ましい。また、多孔質基材の透明性を高め、顕微鏡による細胞の観察を容易とするのに好適であることから、多孔質基材の細孔の細孔密度が、１０７個／ｃｍ２以下であることが好ましく、１０６個／ｃｍ２以下であることがさらに好ましく、１０５個／ｃｍ２以下であることが特に好ましく、１０４個／ｃｍ２以下であることが最も好ましい。ここで、本発明において多孔質基材の細孔の「細孔密度」とは、多孔質基材の基材面積当たりに存在する細孔の数を示し、多孔質基材のレーザー顕微鏡像や走査型電子顕微鏡像、透過型電子顕微鏡像において、多孔質基材の細孔の孔径の２００倍以上の長さを一辺とする正方形の領域において細孔の数を求めることで算出することができる。なお、本発明において多孔質基材の「基材面積」とは、多孔質基材に細孔が存在しないと仮定した場合の、多孔質基材の一主面の表面積を示す。
【００９８】
本発明において、多孔質基材が有する細孔の形状に特に制限はないが、多能性幹細胞接着性及び増殖性及び剥離性を高めるのに好適であることから、平坦部及び細孔を有する平膜であることが好ましい。また、位相差顕微鏡による多能性幹細胞の観察を可能とするのに好適であることから、多孔質基材が有する細孔が、円柱状の形状であることが好ましく、独立した円柱状の形状であることがさらに好ましい。細孔の形状が円柱状の形状であるこの面の細胞の形状を観察するのに好適である。
【００９９】
本発明の基材表面に温度応答性高分子による層を形成させる方法としては、基材に温度応答性高分子を、（１）化学的な結合によって被覆させ層を形成させる方法、（２）物理的な相互作用によって被覆させ層を形成させる方法、を単独または併用して行うことができる。すなわち、（１）化学的な結合による方法としては、紫外線照射、電子線照射、ガンマ線照射、プラズマ処理、コロナ処理等を用いることができる。さらに、温度応答性高分子と基材が適当な反応性官能基を有する場合は、ラジカル反応、アニオン反応、カチオン反応等の一般に用いられる有機反応を利用することができる。（２）物理的な相互作用による方法としては、温度応答性高分子との相溶性が良く、塗工性のよいマトリックスを媒体とし、塗布、はけ塗り、ディップコーティング、スピンコーティング、バーコーディング、流し塗り、スプレー塗装、ロール塗装、エアーナイフコーティング、ブレードコーティング、グラビアコーティング、マイクログラビアコーティング、スロットダイコーティングなど通常知られている各種の方法を用いることが可能である。
【０１００】
本発明において、多能性幹細胞の種類は特に限定されるものではないが、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、体細胞由来胚性幹細胞（核移植ＥＳ細胞又はｎｔＥＳ細胞）を用いることができ、特に好ましくは人工多能性幹細胞である。また、多能性幹細胞の由来動物は特に限定されるものではないが、例えば、哺乳動物由来であることができる。哺乳動物の例には、げっ歯類（マウス、ラット等）、霊長類（サル、ヒト等）が含まれ、また実験動物であってもよく、コンパニオンアニマルであってもよい。本発明において、好ましくは霊長類由来であり、特に好ましくはヒト由来である。
【０１０１】
本発明は、前記培養基材を用い、未分化の多能性幹細胞を製造する方法にも関する。前記手法は、以下の［１］〜［３］工程を経て、未分化の多能性幹細胞を製造する、多能性幹細胞の製造方法である。
［１］前記培養基材に多能性幹細胞を播種する工程。
［２］前記培養基材に播種された多能性幹細胞を温度応答高分子の応答温度以上の温度の液体中で培養する工程。
［３］培養基材を温度応答高分子の応答温度未満の温度に冷却し、前記液体中で培養された多能性幹細胞を基材から剥離する工程。
【０１０２】
以下、本発明の製造方法における［１］〜［３］工程について詳細に述べる。
【０１０３】
本発明の多能性幹細胞の製造方法における［１］工程は、前記培養基材を用い、前記培養基材に多能性幹細胞を播種する工程である。本発明において「細胞を播種する」とは、細胞が分散した培地（以下、「細胞懸濁液」と表記する。）を培養基材上に塗布、又は、培養基材に注入する等により、細胞懸濁液と培養基材とを接触させることを示す。応答温度が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性高分子による層を有する基材を用いることにより、後述する［３］工程において温度変化により多能性幹細胞を培養基材から剥離することができる。培養基材が温度応答性高分子による層を有していない場合、［３］工程において温度変化により多能性幹細胞を基材から剥離することができない。また、培養基材が温度応答性高分子による層に固定化された生体由来物質を有することにより、後述する［２］工程で多能性幹細胞を培養することができる。培養基材が温度応答性高分子による層に固定化された生体由来物質を有していない場合、［２］工程で多能性幹細胞を培養することができない。
【０１０４】
前記［１］〜［３］工程においては、多能性幹細胞の未分化性を維持させるのに有効な条件で、培養が実施される。未分化性を維持させるのに有効な条件としては、特に制限はないが、例えば、培養開始時の多能性幹細胞の密度を上記播種の際の細胞密度として記載した好ましい範囲とすること、適切な液体培地の存在下で行うことなどが挙げられる。多能性幹細胞の未分化性を維持させるのに有効な培地としては、例えば、多能性幹細胞の未分化性を維持するための因子として知られている、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、アスコルビン酸、炭酸水素ナトリウム、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、ＣＣＬ２、アクチビン、２−メルカプトメタノールのうち１つ以上を添加した培地を好適に用いることができる。多能性幹細胞の未分化性を維持するのに特に好適であることから、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、アスコルビン酸、炭酸水素ナトリウム、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）を含有する培地を用いることがさらに好ましく、塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地を用いることが最も好ましい。
【０１０５】
前記塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地の種類に特に制限はないが、例えば、市販品としては、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ製）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ製）、Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ製）、Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０３（味の素（株）製）、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）、ＴｅＳＲ−Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）、ＲｅｐｒｏＮａｉｖｅ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＸＦ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＦＦ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＦＦ２（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（バイオロジカルインタストリーズ社製）、ｉＳＴＥＭ（タカラバイオ（株）製）、ＧＳ２−Ｍ（タカラバイオ（株）製）、ｈＰＳＣ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＤＸＦ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（株）製）等を挙げることができる。多能性幹細胞の未分化状態を維持するのに好適であることから、Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）又はＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０３（味の素（株）製）が好ましく、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）又はＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０３（味の素（株）製）がさらに好ましく、ＳｔｅｍＦｉｔ  ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）が特に好ましい。
【０１０６】
前記［１］工程において、多能性幹細胞の播種方法に特に制限はないが、例えば、前記基材に細胞懸濁液を注入することで行うことが出来る。播種の際の細胞密度は特に制限はないが、細胞を維持することができ、かつ増殖させることができるように、１．０×１０２〜１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましく、５．０×１０２〜５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がさらに好ましく、１．０×１０３〜２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が特に好ましく、１．２×１０３〜１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が最も好ましい。
【０１０７】
前記［１］工程で用いる培地としてはまた、多能性幹細胞の生存を維持するのに好適であることから、前記塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地にさらにＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤を添加した培地を用いることが好ましい。特にヒトの多能性幹細胞を用いる場合であって、ヒトの多能性幹細胞の細胞密度が低い状態において、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤が添加されていると、ヒトの多能性幹細胞の生存維持に効果的な場合がある。Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤としては、例えば、（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）−４−（１−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ（和光純薬工業（株）製Ｙ−２７６３２）、１−（５−Ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（和光純薬工業（株）製ＨＡ１０７７）を用いることができる。培地に添加されるＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤の濃度としては、ヒトの多能性幹細胞の生存維持に有効な範囲であってヒトの多能性幹細胞の未分化状態に影響を与えない範囲であり、好ましくは１μＭ〜５０μＭであり、より好ましくは３μＭ〜２０μＭであり、さらに好ましくは５μＭ〜１５μＭであり、最も好ましくは８μＭ〜１２μＭである。
【０１０８】
前記［１］工程を開始するとまもなく、多能性幹細胞は培養基材に接着し始める。
【０１０９】
本発明の多能性幹細胞の製造方法における［２］工程では、前記播種された多能性幹細胞を温度応答性高分子の応答温度以上の温度で培養する。培養温度が温度応答性高分子の応答温度以上であることにより、多能性幹細胞を増殖させることができる。培養温度が温度応答性高分子の応答温度未満の場合、多能性幹細胞を増殖させることができない。細胞の増殖能や生理活性，機能維持に好適であることから、培養温度としては、好ましくは３０〜４２℃、さらに好ましくは３２〜４０℃、特に好ましくは３６〜３８℃、最も好ましくは３７℃である。
【０１１０】
前記［２］工程を開始して２２〜２６時間後に、最初の培地交換を行うことが好ましい。その４８〜７２時間後に２度目の培地交換を行い、その後、２４〜４８時間毎に培地交換を行うことが好ましい。この間、多能性幹細胞は増殖し、コロニーと呼ばれる細胞塊を形成する。コロニーの大きさが１ｍｍ前後になるまで培養を継続させ、その後［３］工程に移行する。
【０１１１】
本発明の多能性幹細胞の製造方法における［３］工程では、多能性幹細胞が培養された培養基材を温度応答性高分子の応答温度未満の温度に冷却し、前記培養された多能性幹細胞を培養基材から剥離する。多能性幹細胞を短時間で剥離させ、冷却によるダメージを低減するために、冷却する際の温度として好ましくは０〜３０℃であり、より好ましくは３〜２５℃であり、さらに好ましくは５〜２０℃である。また、細胞へのダメージを低減するために、冷却時間としては１２０分以下が好ましく、９０分以下がさらに好ましく、７５分以下が特に好ましく、６０分以下が最も好ましい。
【０１１２】
前記［３］工程における培養基材の冷却方法としては特に制限はないが、例えば、培養基材を保冷庫に入れて冷却する方法、培養基材をクールプレートの上に載せて冷却する方法、冷却した培地あるいは緩衝液に交換して所定時間静置する方法等を用いることができる。
【０１１３】
また、前記［３］工程においては、多能性幹細胞を短時間で剥離させ、冷却によるダメージをより低減するために、冷却時に、培養された多能性幹細胞を含む液体に対流を生じさせる工程を含んでも良い。対流を生じさせる方法としては特に限定はないが、例えば、培養液をピペッティングさせることやポンプ、撹拌翼を用いる等の方法により、機械的に液体内部に強制対流を発生させる方法の他、培養基材に物理的な振動を加える方法、温度差を与えることによりマランゴニ対流等の自然対流を発生させる方法を挙げることが出来る。
【０１１４】
本発明の培養基材は、大量の細胞を培養する際に、細胞を剥離する工程を簡略化し細胞の量産性を高めるのに好適であることから、弱い外部刺激で細胞が剥離することが好ましく、冷却及びピペッティング、冷却及びタッピングで剥離することがさらに好ましく、冷却及びタッピングで剥離することが特に好ましい。冷却のみで剥離することが最も好ましい。ここで、本発明において「ピペッティング」とは、ピペットマン等の器具を用いて培養液の吸引及び吐出を繰り返すことにより、培養環境に対流を生じさせる操作を示す。また、「タッピング」とは、培養容器を叩く等により培養環境に振動を与える操作を示す。
【実施例】
【０１１５】
以下、本発明を実施するための形態を挙げて本発明について詳細に説明するが、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。また本発明の要旨の範囲内で適宜に変更して実施することができる。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。
＜重合体の組成＞
核磁気共鳴測定装置（日本電子（株）製、商品名ＪＮＭ−ＧＳＸ４００）を用いたプロトン核磁気共鳴分光（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル分析、又は核磁気共鳴測定装置（ブルカー製、商品名ＡＶＡＮＣＥＩＩＩＨＤ５００）を用いたカーボン核磁気共鳴分光（１３Ｃ−ＮＭＲ）スペクトル分析より求めた。
＜重合体の分子量、分子量分布＞
重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ装置は東ソー（株）製  ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣを用い、カラムは東ソー（株）製  ＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＡＷＭ−Ｈを２本用い、カラム温度を４０℃に設定し、溶離液は１０ｍＭトリフルオロ酢酸ナトリウムを含む１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロー２−イソプロパノールまたは１０ｍＭ臭化リチウムを含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いて測定した。測定試料は１．０ｍｇ／ｍＬで調製して測定した。分子量の検量線は、分子量既知のポリメタクリル酸メチル（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．製）を用いた。
＜表面構造＞
温度応答性高分子が被覆された基材の培養温度における表面構造観察は、水中ＡＦＭ装置（島津製作所製ＳＰＭ−９６００）によって測定した。カンチレバーはＢＬ−ＡＣ４０ＴＳ−Ｃ２（オリンパス（株）製）を用いて測定した。
【０１１６】
実施例１  
［ブロック共重合体の合成］
試験管に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン１．５０ｇ（５．１ｍｍｏｌ）、ＲＡＦＴ剤として４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド４３ｍｇ（１０６μｍｏｌ、開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル１．７ｍｇ（１０μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液１０．２ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１８時間反応させた。反応後、反応溶液をアセトン：メタノール＝２０：１混合溶液２００ｍＬに注ぎ込み、析出した黄色固体をろ過し、１日減圧乾燥し、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体を得た。
【０１１７】
試験管に上記２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体１．０ｇ、ｎ−ブチルメタクリレート２．４０ｇ（１６．９ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル２．５ｍｇ（１５μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液１７ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で２４時間反応させた。反応後、反応溶液をヘキサン３００ｍＬに注ぎ込み、析出した淡黄色固体をろ過し、１日減圧乾燥して、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ブチルメタクリレートの重合体（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン／ｎ−ブチルメタクリレートジブロック重合体）を得た。
【０１１８】
試験管に上記２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン／ｎ−ブチルメタクリレートジブロック重合体０．５ｇ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド０．６２ｇ（５．５ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル０．２ｍｇ（１μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液５．５ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で２４時間反応させた。反応後、反応溶液をヘキサン２００ｍＬに注ぎ込み、析出した白色固体をろ過し、１日減圧乾燥して、トリブロック共重合体を得た。
【０１１９】
得られたトリブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］
前記ブロック共重合体０．０１ｇをエタノール４．９９ｇに溶解し、ブロック共重合体の０．２ｗｔ％エタノール溶液を調製した。さらに、０．２ｗｔ％エタノール溶液１ｍＬとエタノール３ｍＬを混合し、０．０５ｗｔ％のエタノール溶液を調製した。この溶液を細胞培養用６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製、材質：ポリスチレン）の各ウェルに０．４２ｍＬずつ加え、２時間減圧乾燥した。さらに、純水中に２４時間浸漬させて洗浄し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
［ブロックセグメント（Ａ）のＬＣＳＴ測定］
４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド２．２６ｇ（２０ｍｍｏｌ）及びアゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）をジオキサン２０ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をヘキサン２５０ｍＬに注ぎ、析出した白色固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド重合体を得た。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド重合体を純水に溶解させ、０．６ｗｔ％水溶液とした。この溶液を光路長１ｃｍの石英セルに入れ、１℃／分の速度で昇温しながら、分光光度計（（株）日立ハイテクノロジーズ製、ＵＨ−５３００）で波長５００ｎｍの光の透過率を測定した。中点法によりＬＣＳＴを求めたところ、ＬＣＳＴは３２℃であった。
［ブロック共重合体の応答温度測定］
前記ブロック共重合体が被覆された基材の水中、３７℃、２０℃及び１０℃での気泡接触角（θ）（°）を測定し、３７℃、２０℃及び１０℃の対水接触角（１８０−θ）（°）を算出した。θは協和界面科学（株）製接触角計ＤＭ３００を用いて、水中、３μＬの気泡の接触角を測定した。
【０１２０】
３７℃、２０℃及び１０℃での対水接触角を表２に示す。２０℃での対水接触角は３７℃での対水接触角よりも低く、前記ブロック共重合体が被覆された基材は温度応答性を示し、応答温度は２０〜３７℃の範囲にあることが分かった。また、２０〜４５℃の範囲において同様に５℃間隔で対水接触角測定を行い、中点法によって応答温度を求めたところ、応答温度は３４℃であった。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記ブロック共重合体が被覆された基材にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を１３００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を０．２ｍＬ／ｃｍ２加えた。また、細胞播種から２４時間後までは、前記培地にＹ−２７６３２（和光純薬工業（株）製）（濃度１０μＭ）とｉＭａｔｒｉｘ−５１１溶液（（株）ニッピ製）（２．５μＬ／ｍＬ）を添加した培地を使用して培養した。
【０１２１】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（３）の条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、凝集塊として回収出来た。
【０１２２】
実施例２
［ブロック共重合体の合成］
試験管に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン１．５０ｇ（５．１ｍｍｏｌ）、ＲＡＦＴ剤として４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド２５．３ｍｇ（６３μｍｏｌ）、開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル１ｍｇ（３μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液１０．２ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１８時間反応させた。反応後、反応溶液をアセトン：メタノール＝２０：１混合溶液２００ｍＬに注ぎ込み、析出した黄色固体をろ過し、１日減圧乾燥し、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体を得た。
【０１２３】
試験管に上記２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体１．５０ｇ、ｎ−ブチルメタクリレート１．７１ｇ（１２．０ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル２ｍｇ（１３μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液１２ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で２４時間反応させた。反応後、反応溶液をヘキサン３００ｍＬに注ぎ込み、析出した淡黄色固体をろ過し、１日減圧乾燥して、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン／ｎ−ブチルメタクリレートジブロック重合体を得た。
【０１２４】
試験管に上記２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン／ｎ−ブチルメタクリレートジブロック共重合体０．７５ｇ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド０．９３ｇ（８．２ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル０．３ｍｇ（２μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液８．２ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で２４時間反応させた。反応後、反応溶液をヘキサン２００ｍＬに注ぎ込み、析出した白色固体をろ過し、１日減圧乾燥して、トリブロック共重合体を得た。
【０１２５】
得られたトリブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］
前記ブロック共重合体を用いたこと以外は、実施例１［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］と同じ方法で作製した。
［ブロック共重合体の応答温度測定］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１［ブロック共重合体が被覆された基材の濡れ性］と同じ方法で測定した。
【０１２６】
３７℃、２０℃及び１０℃での対水接触角を表２に示す。２０℃での対水接触角は３７℃での対水接触角よりも低く、前記ブロック共重合体が被覆された基材は温度応答性を示し、応答温度は２０〜３７℃の範囲にあることが分かった。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］で培養を行った。
【０１２７】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（３）の条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、凝集塊として回収出来た。
【０１２８】
実施例３  
［ブロック共重合体の合成］
試験管に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを３．００ｇ（１０．２ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート３．３７ｇ（２３．７ｍｍｏｌ）、ＲＡＦＴ剤として４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド４６ｍｇ（１１３μｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル４ｍｇ（２３μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液３０ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で２１時間反応させた。反応後、反応溶液をアセトン：メタノール＝２０：１混合溶液５００ｍＬに注ぎ込み、析出した淡黄色固体をろ過し、１日減圧乾燥して、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン／ｎ−ブチルメタクリレートランダム共重合体を得た。
【０１２９】
試験管に上記２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン／ｎ−ブチルメタクリレートランダム共重合体１．５０ｇ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１．８５ｇ（１６．４ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル０．５ｍｇ（３μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液１２．６ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で２４時間反応させた。反応後、反応溶液をヘキサン５００ｍＬに注ぎ込み、析出した白色固体をろ過し、１日減圧乾燥して、ジブロック共重合体を得た。
【０１３０】
得られたジブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］
前記ブロック共重合体を用いたこと以外は、実施例１［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］と同じ方法で作製した。
［ブロック共重合体の応答温度測定］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１［ブロック共重合体が被覆された基材の濡れ性］と同じ方法で測定した。
【０１３１】
３７℃、２０℃及び１０℃での対水接触角を表２に示す。２０℃での対水接触角は３７℃での対水接触角よりも低く、前記ブロック共重合体が被覆された基材は温度応答性を示し、応答温度は２０〜３７℃の範囲にあることが分かった。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］で培養を行った。
【０１３２】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（３）の条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、凝集塊として回収出来た。
【０１３３】
実施例４
［ブロック共重合体の合成］
三方コックを備えた試験管に、４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエートのプロパーギルエステル体０．５７ｇ（１．８ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート１２．８０ｇ（９０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）６０ｍｇ（０．３６ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液９０ｍＬに溶解した。試験管を液体窒素に浸して凍結し、真空ポンプで減圧脱気を行い、室温に戻した。この操作を３回繰り返し、試験管内の溶存酸素を除去した後、６５℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール３００ｍＬに注ぎ、析出した赤色油状物質を回収して減圧乾燥し、末端アルキンを有するｎ−ブチルメタクリレート重合体を得た。
【０１３４】
三方コックを備えた試験管に、上記末端アルキンを有するｎ−ブチルメタクリレート重合体５．９５ｇ（０．７ｍｍｏｌ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１５．８４ｇ（１４０ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル１１．５ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１４０ｍＬに溶解させた。試験管を液体窒素に浸して凍結し、真空ポンプで減圧脱気を行い、室温に戻した。この操作を３回繰り返し、試験管内の溶存酸素を除去した後、６５℃で４３時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応液を濃縮した。濃縮液をヘキサン１０００ｍＬに注ぎ、析出した淡赤色固体を回収して減圧乾燥し、末端アルキンを有するＮ−イソプロピルアクリルアミド／ｎ−ブチルメタクリレートジブロック共重合体を得た。
【０１３５】
一方、三方コックを備えた試験管に４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエートの３−アジドプロピルエステル体０．２０ｇ（０．５７ｍｍｏｌ）、ポリエチレングリコールメタクリレート（Ａｌｄｒｉｃｈ製、Ｍｎ＝３００）１２．０１ｇ（４０ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ１８．８ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン２８ｍＬを加えて溶解させた。試験管を液体窒素に浸して凍結し、真空ポンプで減圧脱気を行い、室温に戻した。この操作を３回繰り返し、試験管内の溶存酸素を除去した。試験管を６５℃に昇温し、６５℃で２．５時間重合した。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応液を濃縮した。濃縮液をヘキサン５００ｍｌに注ぎ、底に付着した赤色油状物を回収した。ヘキサン３００ｍＬで２回洗浄し、得られた赤色油状物を真空乾燥し、末端アジドを有するポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロックを得た。
【０１３６】
続いて三方コックを備えた試験管に、前記末端アルキンを有するＮ−イソプロピルアクリルアミド／ｎ−ブチルメタクリレートジブロック共重合体０．５０ｇ、上記末端アジドを有するポリエチレングリコールメタクリレート重合体０．９４ｇを加え、窒素置換を行った。窒素バブリングを行ったＤＭＦ９ｍＬを加え溶解させた。臭化銅（Ｉ）３８ｍｇ、２，２’−ビピリジル８４ｍｇ、ＤＭＦ１ｍＬで別途調製した溶液を窒素気流下で試験管に加え、室温で４８時間反応させた。反応終了後、三方コックを取り外し、空気に触れさせて銅触媒を失活させた。反応液を活性アルミナを詰めたカラムに通して銅触媒を取り除き、その溶液をロータリーエバポレーターで濃縮した。濃縮液を純水５０ｍＬにゆっくり注ぎ、析出した固形分を遠心分離（３０００ｒｐｍ×３分）により回収した。得られた固形分をメタノール２ｍｌＬ溶解させ、再度純水５０ｍｌにゆっくり注ぎ、析出した固形分を遠心分離（３０００ｒｐｍ×３分）により回収した。真空乾燥により、ポリエチレングリコールメタクリレート重合体とｎ−ブチルメタクリレート重合体とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロックからなるトリブロック共重合体を得た。
【０１３７】
得られたブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］
前記ブロック共重合体を用いたこと以外は、実施例１［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］と同じ方法で作製した。
［ブロック共重合体の応答温度測定］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１［ブロック共重合体が被覆された基材の濡れ性］と同じ方法で測定した。
【０１３８】
３７℃、２０℃及び１０℃での対水接触角を表２に示す。２０℃での対水接触角は３７℃での対水接触角よりも低く、前記ブロック共重合体が被覆された基材は温度応答性を示し、応答温度は２０〜３７℃の範囲にあることが分かった。また、２０〜４５℃の範囲において同様に５℃間隔で対水接触角測定を行い、中点法によって応答温度を求めたところ、応答温度は３４℃であった。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］で培養を行った。
【０１３９】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、０．２５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸溶液を加え、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（３）の条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、単一細胞として回収出来た。
【０１４０】
実施例５
［ブロック共重合体の合成］
ポリエチレングリコールメタクリレート１２．０１ｇの代わりに２−メトキシエチルアクリレート５．２０ｇ（４０ｍｍｏｌ）を用い、６５℃で９時間重合したこと以外は実施例４［ブロック共重合体の合成］と同様の方法で合成を行い、ジブロック共重合体を合成した。
【０１４１】
得られたジブロック共重合体の組成、ＭｎおよびＭｗ／Ｍｎを表１に示す。
［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］
前記ブロック共重合体を用いたこと以外は、実施例１［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］と同様の方法で作製した。
［ブロック共重合体の応答温度測定］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１［ブロック共重合体が被覆された基材の濡れ性］と同じ方法で測定した。
【０１４２】
３７℃、２０℃及び１０℃での対水接触角を表２に示す。２０℃での対水接触角は３７℃での対水接触角よりも低く、前記ブロック共重合体が被覆された基材は温度応答性を示し、応答温度は２０〜３７℃の範囲にあることが分かった。また、２０〜４５℃の範囲において同様に５℃間隔で対水接触角測定を行い、中点法によって応答温度を求めたところ、応答温度は３３℃であった。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］で培養を行った。
【０１４３】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、０．２５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸溶液を加え、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（３）の条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、単一細胞として回収出来た。
【０１４４】
実施例６
［ブロック共重合体の合成］
試験管に、４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド３６ｍｇ（９０μｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート１．２８ｇ（９ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３ｍｇ（１８μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液９ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール２５０ｍＬに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、ｎ−ブチルメタクリレート重合体を得た。
【０１４５】
試験管に、前記ｎ−ブチルメタクリレート重合体０．８ｇ（１．０ｍｍｏｌ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１．０ｇ（８．８ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル１．６ｍｇ（９．９μｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン９ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１５時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応液を濃縮した。濃縮液をヘキサン２００ｍＬに注ぎ、析出した淡黄色固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートのジブロック共重合体を得た。
［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］
前記ブロック共重合体を用いたこと以外は、実施例１［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］と同様の方法で作製した。
［ブロック共重合体の応答温度測定］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１［ブロック共重合体が被覆された基材の濡れ性］と同じ方法で測定した。
【０１４６】
３７℃、２０℃及び１０℃での対水接触角を表２に示す。２０℃での対水接触角は３７℃での対水接触角よりも低く、前記ブロック共重合体が被覆された基材は温度応答性を示し、応答温度は２０〜３７℃の範囲にあることが分かった。また、２０〜４５℃の範囲において同様に５℃間隔で対水接触角測定を行い、中点法によって応答温度を求めたところ、応答温度は３２℃であった。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記ブロック共重合体が被覆された基材にｉＭａｔｒｉｘ−５１１溶液（（株）ニッピ製）（ＰＢＳ（−）で約４．２μｇ／ｍＬに希釈）を０．１２ｍＬ／ｃｍ２添加し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で１時間静置した。その後ｉＭａｔｒｉｘ−５１１溶液を除去し、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を１３００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を０．２ｍＬ／ｃｍ２加えた。また、細胞播種から２４時間後までは、前記培地にＹ−２７６３２（和光純薬工業（株）製）（濃度１０μＭ）を添加し培養した。
【０１４７】
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］で培養を行った。
【０１４８】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、０．２５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸溶液を加え、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（３）の条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、単一細胞として回収出来た。
【０１４９】
実施例７
［ブロック共重合体の合成］
試験管に、４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート７．１１ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール２５０ｍＬに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、ｎ−ブチルメタクリレート重合体を得た。
【０１５０】
試験管に、前記ｎ−ブチルメタクリレート重合体０．９ｇ（０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド２．６５ｇ（２３．５ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１５ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１７時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をアセトンで希釈し、ヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した淡黄色固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートのジブロック共重合体を得た。
［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］
前記ブロック共重合体をエタノールに溶解させ、０．５ｗｔ％溶液とした。この溶液を直径３．５ｃｍのディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製、材質：ポリスチレン）に５０μＬ滴下し、１０００ｒｐｍで６０秒間スピンコートした。室温で１時間乾燥した。さらに、純水中に２４時間浸漬させて洗浄し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
［ブロック共重合体の応答温度測定］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１［ブロック共重合体が被覆された基材の濡れ性］と同じ方法で測定した。
【０１５１】
３７℃、２０℃及び１０℃での対水接触角を表２に示す。２０℃での対水接触角は３７℃での対水接触角よりも低く、前記ブロック共重合体が被覆された基材は温度応答性を示し、応答温度は２０〜３７℃の範囲にあることが分かった。また、２０〜４５℃の範囲において同様に５℃間隔で対水接触角測定を行い、中点法によって応答温度を求めたところ、応答温度は３３℃であった。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］で培養を行った。
【０１５２】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、０．２５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸溶液を加え、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（３）の条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、単一細胞として回収出来た。
【０１５３】
実施例８
［ブロック共重合体の合成］
試験管に、４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート７．１１ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール２５０ｍＬに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、ｎ−ブチルメタクリレート重合体を得た。
【０１５４】
試験管に、前記ｎ−ブチルメタクリレート重合体０．９ｇ（０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド８．１４ｇ（７２ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１５ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１７時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をアセトンで希釈し、ヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した淡黄色固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートのジブロック共重合体を得た。
［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］
前記ブロック共重合体を用いたこと以外は、実施例７［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］と同様の方法で作製した。
［ブロック共重合体の応答温度測定］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例７［ブロック共重合体が被覆された基材の濡れ性］と同じ方法で測定した。
【０１５５】
３７℃、２０℃及び１０℃での対水接触角を表２に示す。２０℃での対水接触角は３７℃での対水接触角よりも低く、前記ブロック共重合体が被覆された基材は温度応答性を示し、応答温度は２０〜３７℃の範囲にあることが分かった。また、２０〜４５℃の範囲において同様に５℃間隔で対水接触角測定を行い、中点法によって応答温度を求めたところ、応答温度は３３℃であった。
［ブロック共重合体が被覆された基材表面の構造］
前記ブロック共重合体が被覆された基材表面の３７℃における水中ＡＦＭ像を図４に示した。前記ブロック共重合体による層は相分離構造を形成し、ブロック共重合体の被覆量の多い領域と少ない領域が存在していた。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］で培養を行った。
【０１５６】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（２）及び（３）の条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、凝集塊として回収出来た。
【０１５７】
実施例９
［ブロック共重合体の合成］
三方コックを備えた試験管に、４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエートのプロパーギルエステル体９５ｍｇ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド６．８ｇ、ＡＩＢＮ８ｍｇを加え、１，４−ジオキサン２０ｍｌに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、７０℃で２４時間攪拌し重合した。重合終了後、反応液をヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した桃色固体をろ過により回収し、乾燥して、末端アルキンを有するＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体を得た。
【０１５８】
一方、三方コックを備えた試験管に、４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエートの３−アジドプロピルエステル体０．１８ｇ、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド５．３ｇ、ＡＩＢＮ２６ｍｇを加え、ＤＭＦ２０ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、７０℃で２４時間攪拌し重合した。重合終了後、反応液を純水５００ｍＬに注ぎ、析出した桃色固体をろ過により回収し、乾燥して、末端アジドを有するＮ−（４−ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド重合体を得た。
【０１５９】
続いて、三方コックを備えた試験管に、前記末端アルキンを有するＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体０．６５ｇ、上記末端アジドを有するＮ−（４−ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド重合体０．３０ｇを加え、窒素置換を行った。窒素バブリングを行ったＤＭＦ９ｍＬを加え溶解させた。臭化銅（Ｉ）１４ｍｇ、２，２’−ビピリジル３１ｍｇ、ＤＭＦ１ｍＬで別途調製した溶液を窒素気流下で試験管に加え、室温で４８時間反応させた。反応終了後、三方コックを取り外し、空気を触れさせて銅触媒を失活させた。反応液を活性アルミナを詰めたカラムに通して銅触媒を取り除き、その溶液をロータリーエバポレーターで濃縮した。濃縮液をメタノール／アセトン混合溶媒へ溶解させて、ヘキサンを少しずつ加え、析出する重合体を回収した。再沈殿精製を３回繰り返し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−（４−ヒドロキシフェニル）メタクリルアミドのジブロック共重合体を得た。
［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］
前記ブロック共重合体を用いたこと以外は、実施例７［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］と同様の方法で作製した。
［ブロック共重合体の応答温度測定］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１［ブロック共重合体が被覆された基材の濡れ性］と同じ方法で測定した。
【０１６０】
３７℃、２０℃及び１０℃での対水接触角を表２に示す。２０℃での対水接触角は３７℃での対水接触角よりも低く、前記ブロック共重合体が被覆された基材は温度応答性を示し、応答温度は２０〜３７℃の範囲にあることが分かった。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］で培養を行った。
【０１６１】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、０．２５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸溶液を加え、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（３）の条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、単一細胞として回収出来た。
【０１６２】
実施例１０
［ブロック共重合体の合成］
試験管に、４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルメタクリレート７．１１ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール２５０ｍＬに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、ｎ−ブチルメタクリレート重合体を得た。
【０１６３】
試験管に、前記ｎ−ブチルメタクリレート重合体０．９ｇ（０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド８．１４ｇ（７２ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン１５ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１７時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をアセトンで希釈し、ヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した淡黄色固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミドとｎ−ブチルメタクリレートのジブロック共重合体を得た。
［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］
前記ブロック共重合体を用いたこと以外は、実施例７［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］と同様の方法で作製した。
［ブロックセグメント（Ａ）のＬＣＳＴ測定］
４−シアノ−４−［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド２．２６ｇ（２０ｍｍｏｌ）及びアゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）をジオキサン２０ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をヘキサン２５０ｍＬに注ぎ、析出した白色固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド重合体を得た。Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド重合体を純水に溶解させ、０．６ｗｔ％水溶液とした。この溶液を光路長１ｃｍの石英セルに入れ、１℃／分の速度で昇温しながら、分光光度計（日立製ＵＨ−５３００）で波長５００ｎｍの光の透過率を測定した。中点法によりＬＣＳＴを求めたところ、ＬＣＳＴは１７℃であった。
［ブロック共重合体の応答温度測定］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１［ブロック共重合体が被覆された基材の濡れ性］と同じ方法で測定した。
【０１６４】
３７℃、２０℃、及び１０℃での対水接触角を表２に示す。１０℃での対水接触角は２０℃での対水接触角よりも低く、前記ブロック共重合体が被覆された基材は温度応答性を示し、応答温度は１０〜２０℃の範囲にあることが分かった。また、５〜３０℃の範囲において同様に５℃間隔で対水接触角測定を行い、中点法によって応答温度を求めたところ、応答温度は１８℃であった。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］で培養を行った。
【０１６５】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（２）及び（３）の条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、凝集塊として回収出来た。
【０１６６】
実施例１１
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
実施例８で作製したブロック共重合体が被覆された基材にＭａｔｒｉｇｅｌ溶液（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）を０．０５ｍＬ／ｃｍ２添加し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で１時間静置した。その後Ｍａｔｒｉｇｅｌ溶液を除去し、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を１３００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素製）を０．２ｍＬ／ｃｍ２加えた。また、細胞播種から２４時間後までは、前記培地にＹ−２７６３２（和光純薬製）（濃度１０μＭ）を添加した培地を使用して培養した。
【０１６７】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（２）及び（３）の条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、凝集塊として回収出来た。
【０１６８】
実施例１２
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
実施例８で作製したブロック共重合体が被覆された基材にＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＶＴＮ−Ｎ）溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）（ＰＢＳ（−）で約５０μｇ／ｍＬに希釈）を０．６３ｍＬ／ウェル添加し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で１時間静置した。その後ｉＭａｔｒｉｘ−５１１溶液を除去し、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を１３００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を０．２ｍＬ／ｃｍ２加えた。また、細胞播種から２４時間後までは、前記培地にＹ−２７６３２（和光純薬工業（株）製）（濃度１０μＭ）を添加した培地を使用して培養した。
【０１６９】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（２）及び（３）の条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、凝集塊として回収出来た。
【０１７０】
実施例１３
［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］
実施例８で合成したブロック共重合体をエタノールに溶解させ、０．５ｗｔ％溶液とした。この溶液を孔径０．４μｍ、１．８×１０６個／ｃｍ２の細孔を有する多孔質膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製、商品名Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）カルチャーインサート、材質：ポリエチレンテレフタレート）に５０μＬ滴下し、１０００ｒｐｍで６０秒間スピンコートした。室温で１時間乾燥した。さらに、純水中に２４時間浸漬させて洗浄し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を培地に浸漬して固定し、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を１３００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を０．２ｍＬ／ｃｍ２加えた。また、細胞播種から２４時間後までは、前記培地にＹ−２７６３２（和光純薬工業（株）製）（濃度１０μＭ）とｉＭａｔｒｉｘ−５１１溶液（（株）ニッピ製）（２．５μＬ／ｍＬ）を添加した培地を使用して培養した。
【０１７１】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（１）〜（３）の全ての条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、凝集塊として回収出来た。
【０１７２】
実施例１４
［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］
実施例８で合成したブロック共重合体をエタノールに溶解させ、０．５ｗｔ％溶液とした。この溶液を孔径０．４μｍ、１．１×１０８個／ｃｍ２の細孔を有する多孔質膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製、商品名Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）カルチャーインサート、材質：ポリエチレンテレフタレート）に５０μＬ滴下し、１０００ｒｐｍで６０秒間スピンコートした。室温で１時間乾燥した。さらに、純水中に２４時間浸漬させて洗浄し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１３［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］で培養を行った。
【０１７３】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（１）〜（３）の全ての条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、凝集塊として回収出来た。
【０１７４】
実施例１５
［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］
実施例８で合成したブロック共重合体をエタノールに溶解させ、０．５ｗｔ％溶液とした。この溶液を孔径０．４μｍ、１．０×１０８個／ｃｍ２の細孔を有する多孔質膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製、商品名Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）カルチャーインサート、材質：ポリカーボネート）に５０μＬ滴下し、１０００ｒｐｍで６０秒間スピンコートした。室温で１時間乾燥した。さらに、純水中に２４時間浸漬させて洗浄し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１３［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］で培養を行った。
【０１７５】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（１）〜（３）の全ての条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、凝集塊として回収出来た。
【０１７６】
実施例１６
［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］
実施例８で合成したブロック共重合体をエタノールに溶解させ、０．５ｗｔ％溶液とした。この溶液を孔径１μｍ、１．８×１０６個／ｃｍ２の細孔を有する多孔質膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製、商品名Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）カルチャーインサート、材質：ポリエチレンテレフタレート）に５０μＬ滴下し、１０００ｒｐｍで６０秒間スピンコートした。室温で１時間乾燥した。さらに、純水中に２４時間浸漬させて洗浄し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１３［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］で培養を行った。
【０１７７】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（３）の条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、凝集塊として回収出来た。
【０１７８】
実施例１７
［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］
実施例８で合成したブロック共重合体をエタノールに溶解させ、０．５ｗｔ％溶液とした。この溶液を孔径３μｍ、５．８×１０５個／ｃｍ２の細孔を有する多孔質膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製、商品名Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）カルチャーインサート、材質：ポリエチレンテレフタレート）に５０μＬ滴下し、１０００ｒｐｍで６０秒間スピンコートした。室温で１時間乾燥した。さらに、純水中に２４時間浸漬させて洗浄し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１３［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］で培養を行った。
【０１７９】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（３）の条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、凝集塊として回収出来た。
【０１８０】
実施例１８
［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］
実施例８で合成したブロック共重合体をエタノールに溶解させ、０．５ｗｔ％溶液とした。この溶液を孔径３μｍ、１．７×１０６個／ｃｍ２の細孔を有する多孔質膜（グライナー社製、商品名ＴｈｉｎＣｅｒｔ（商標）  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｓｅｒｔｓ、材質：ポリエチレンテレフタレート）に５０μＬ滴下し、１０００ｒｐｍで６０秒間スピンコートした。室温で１時間乾燥した。さらに、純水中に２４時間浸漬させて洗浄し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１３［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］で培養を行った。
【０１８１】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（２）及び（３）の条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、凝集塊として回収出来た。
【０１８２】
実施例１９
［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］
実施例８で合成したブロック共重合体をエタノールに溶解させ、０．５ｗｔ％溶液とした。この溶液を孔径８μｍ、６．２×１０４個／ｃｍ２の細孔を有する多孔質膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製、商品名Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）カルチャーインサート、材質：ポリエチレンテレフタレート）に５０μＬ滴下し、１０００ｒｐｍで６０秒間スピンコートした。室温で１時間乾燥した。さらに、純水中に２４時間浸漬させて洗浄し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１３［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］で培養を行った。
【０１８３】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（３）の条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、凝集塊として回収出来た。
【０１８４】
実施例２０
［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］
実施例８で合成したブロック共重合体をエタノールに溶解させ、０．５ｗｔ％溶液とした。この溶液を孔径０．２μｍの細孔を有する多孔質膜（帝人（株）製、商品名ミライム、材質：ポリエチレン）に５０μＬ滴下し、１０００ｒｐｍで６０秒間スピンコートした。室温で１時間乾燥した。さらに、純水中に２４時間浸漬させて洗浄し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記ブロック共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１３［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］で培養を行った。
【０１８５】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（２）及び（３）の条件においてほぼ全ての細胞が剥離し、凝集塊として回収出来た。
【０１８６】
比較例１
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］においてｉＭａｔｒｉｘ−５１１溶液を添加せず、その他は実施例１と同様にして多能性幹細胞の培養を行った。細胞は接着せず死滅し、多能性幹細胞は培養できなかった。
【０１８７】
比較例２
［共重合体の合成］
試験管にＮ−（４−ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド４．７８ｇ（２７ｍｍｏｌ）、４−アジド安息香酸とヒドロキシエチルメタクリレートの縮合体０．８３ｇ（３ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル４９ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド１８ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で６９時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール２５０ｍＬに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド／アジドランダム共重合体を得た。
［共重合体が被覆された基材の作製］
前記共重合体を用いたこと以外は、実施例１［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］と同様の方法で作製した。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
前記共重合体が被覆された基材を用いたこと以外は、実施例１［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］と同様の方法で培養を行った。
【０１８８】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に位相差顕微鏡で細胞の様子を観察した。いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（１）〜（３）のいずれにおいても細胞は剥離せず、温度応答性高分子による層の非存在では温度低下による多能性幹細胞の回収は出来なかった。
【０１８９】
比較例３
基材にブロック共重合体を被覆せず、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ細胞培養用６ウェルプレートをそのまま用い、その他は実施例１と同様にして評価した。
［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］
Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製細胞培養用６ウェルプレートをそのまま用いたこと以外は、実施例１［多能性幹細胞培養評価および剥離評価］と同様の方法で培養を行った。
【０１９０】
細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に位相差顕微鏡で細胞の様子を観察した。いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい前記培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、（１）基材を４℃に冷却した場合、（２）基材を４℃に冷却して２０回タッピングを行った場合、（３）基材を４℃に冷却して１０回ピペッティングを行った場合のそれぞれで細胞の剥離を確認した。（１）〜（３）のいずれにおいても細胞は剥離せず、ブロック共重合体非存在では温度低下による多能性幹細胞の回収は出来なかった。
【０１９１】
比較例４
［重合体の合成］
試験管に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド５．６５ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、１，４−ジオキサン５０ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド重合体を得た。
［重合体が被覆された基材の作製］
前記重合体を用いたこと以外は、実施例１［ブロック共重合体が被覆された基材の作製］と同様の方法で作製した。しかし、純水中に２４時間浸漬させて洗浄したところ、重合体の大部分は溶解してしまった。重合体が水に溶解する場合、培養液へ重合体が溶出し、細胞を汚染してしまうため、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド重合体は培養で使用できないことがわかった。
【０１９２】
【表１】
2019033742.tif 000012
【０１９３】
【表２】
2019033742.tif 000013
【符号の説明】
【０１９４】
１  基材
２  ブロック共重合体
３  生体由来物質
１０  培養基材
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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