(57)【要約】【課題】幹細胞よりナチュラルキラー細胞を発生させる方法を提供すること。【解決手段】多能性幹細胞よりＮＫ細胞を作製するための方法であって、第１無血清培地の中で多能性幹細胞を培養すること、未分化幹細胞を凝集させて造血前駆細胞の作製のために培養される胚様体を形成すること、および無血清培地の中でそれらの前駆細胞を培養してＮＫ細胞を作製することを含む方法。そのようなＮＫ細胞を、例えば、癌および感染症の治療において使用するための方法も提供される。一連の方法は胚様体の形成に利用可能であり、且つ、本実施形態と一致して使用され得る。【選択図】無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６３７，５９２号の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｒ０１  ＨＬ７７９２３、Ｔ３２  ＨＤ０６０５３６およびＴ３２  ＧＭ００８２４４の国庫補助によって為された。政府は本発明にある特定の権利を有する。
【０００３】
１．本発明の分野
本発明は概して幹細胞分化の分野に関する。より具体的には、本発明は癌細胞および／またはウイルス感染細胞の殺滅に使用することができるナチュラルキラー細胞を発生させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．先行技術の説明
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞は細胞傷害性リンパ球であり、自然免疫系における役割を果たす。例えば、ＮＫ細胞はウイルス感染細胞および腫瘍に応答することができる。ＮＫ細胞は獲得免疫応答における役割も果たす。一般に、ＮＫ細胞は骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃、および胸腺において分化および成熟する。
【０００５】
多能性幹細胞は、３種の一次胚葉、すなわち、外肺葉、内胚葉、および中胚葉の全ての派生物を含む特定の細胞種に分化することができる。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）はヒト初期胚胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は特定の遺伝子の発現により非多能性細胞（典型的には成体体細胞）から人工的に得られた一種の多能性幹細胞である。マウスまたはヒトの骨髄またはヒト臍帯血（ＵＣＢ）より単離された造血細胞集団から出発するリンパ球新生の過程が文書になっているが、リンパ球系列に分化する未分化ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣの能力についてわかっていることは比較的少ない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
未分化幹細胞よりナチュラルキラー細胞を作製するための方法であって、
無血清培地中に未分化幹細胞を配置すること、
遠心凝集により、前記無血清培地の中で前記未分化幹細胞を凝集させ、且つ遠心胚様体を形成すること、
前記遠心胚様体からの前駆細胞の産生を誘導するために前記無血清培地の中で前記遠心胚様体を培養すること、および
第２無血清培地の中で前記前駆細胞を培養して前記前駆細胞より前記ナチュラルキラー細胞を作製すること
を含む前記方法。
（項目２）
前記未分化幹細胞が未分化ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記未分化幹細胞が未分化人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記第１無血清培地が前駆細胞の産生を誘導するための増殖因子を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記第１無血清培地がＳＣＦ複合体、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
マウス間質が存在しない状態で前記胚様体を培養する前記ステップを実施する、項目１に記載の方法。
（項目７）
マウス間質細胞が存在しない状態で前記胚様体を培養する前記ステップを実施する、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記第２無血清培地がナチュラルキラー細胞誘導性増殖因子を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記第２無血清培地がインターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン７（ＩＬ７）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）、ＳＣＦ複合体、およびＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記第２無血清培地の中で前記前駆細胞を培養する前記ステップが、外来性間質細胞が存在しない状態にある、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記第２無血清培地の中で前記前駆細胞を培養する前記ステップが、外来性間質細胞が存在しない状態にある、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記前駆細胞がＣＤ３４を発現するＣＤ３４＋細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記前駆細胞がＣＤ３４とＣＤ４３を共発現するＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記前駆細胞がＣＤ３４とＣＤ４５を共発現するＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記方法が、前記前駆細胞が発現するタンパク質に基づいて前記前駆細胞を選別する細胞選別ステップを前記遠心胚様体培養ステップと前記前駆細胞の培養の間に含まない、項目１に記載の方法。
（項目１６）
作製される前記ナチュラルキラー細胞がＣＤ５６、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄのうちの１つ以上を発現する、項目１に記載の方法。
（項目１７）
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を不活性化して不活化ａＡＰＣを作製すること、および
前記ナチュラルキラー細胞を前記不活化ａＡＰＣと共培養すること
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記共培養ステップが１：１の前記不活化ａＡＰＣに対する前記ナチュラルキラー細胞の比率を有する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
不活化ａＡＰＣを作製するための薬剤で人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を処理すること、および
インターロイキン２（ＩＬ２）を含む培地の中で前記ナチュラルキラー細胞を前記不活化ａＡＰＣと共培養すること
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記共培養ステップが約５：１から１：５の前記不活化ａＡＰＣに対する前記ナチュラルキラー細胞の比率を有する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
多能性幹細胞よりナチュラルキラー細胞を作製するための方法であって、
（ａ）第１無血清培地の中で前記多能性幹細胞を凝集させ、それによって胚様体を形成すること、
（ｂ）第２無血清培地の中で前記胚様体を培養し、それによって造血前駆細胞を作製すること、および
（ｃ）インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、ＳＣＦ、およびＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を含む第３無血清培地の中で前記造血前駆細胞を培養し、それによってナチュラルキラー細胞を作製すること
を含む前記方法。
（項目２２）
前記多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
遠心凝集によって前記の凝集を実施する、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記第２無血清培地がＳＣＦ、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
マウス間質またはマウス間質細胞が存在しない状態で前記胚様体を培養する前記ステップを実施する、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
外来性の間質または間質細胞が存在しない状態で前記造血前駆細胞を培養する前記ステップを実施する、項目２１に記載の方法。
（項目２７）
前記造血前駆細胞がＣＤ３４を発現する、項目２１に記載の方法。
（項目２８）
前記造血前駆細胞がＣＤ３４とＣＤ４３を共発現する、項目２１に記載の方法。
（項目２９）
前記造血前駆細胞がＣＤ３４とＣＤ４５を共発現する、項目２１に記載の方法。
（項目３０）
前記方法が細胞選別ステップをステップ（ｂ）とステップ（ｃ）の間に含まない、項目２１に記載の方法。
（項目３１）
作製される前記ナチュラルキラー細胞がＣＤ５６、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄのうちの１つ以上を発現する、項目２１に記載の方法。
（項目３２）
前記ナチュラルキラー細胞を不活化人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と共培養することをさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目３３）
約５：１から１：５の不活化ａＡＰＣに対するナチュラルキラー細胞の比率で前記共培養を実施する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
インターロイキン２（ＩＬ２）を含む培地の中で前記ナチュラルキラー細胞を不活化ａＡＰＣと共培養することをさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目３６）
ステップ（ｂ）の培養を６〜２０日間実行する、項目２１に記載の方法。
（項目３７）
ステップ（ｃ）の培養を２０〜６０日間実行する、項目２１に記載の方法。
（項目３８）
必要とする患者に項目２１に記載の方法によって作製されたナチュラルキラー細胞の有効量を投与することを含む、患者を治療する免疫療法。
（項目３８）
（ａ）項目２１に記載の方法によってナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を作製すること、および
（ｂ）必要とする患者に前記ＮＫ細胞の有効量を投与すること
を含む、患者を治療する免疫療法。
（項目３９）
前記患者が癌患者である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記患者が感染症を有する、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記患者がウイルス感染症を有する、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記患者がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染している、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記多能性細胞が前記患者に由来する、項目３８に記載の方法。
第１の実施形態では、未分化多能性幹細胞よりＮＫ細胞を作製するための方法は、第１無血清培地中に未分化幹細胞を配置すること、遠心凝集（ｓｐｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）により、第１無血清培地の中で未分化細胞を凝集させ、且つ、胚様体（ＥＢ）を形成すること（遠心胚様体（ｓｐｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ）（遠心ＥＢ（ｓｐｉｎ  ＥＢｓ））を形成することになる）、遠心ＥＢから前駆細胞の産生を誘導するために第１無血清培地の中で遠心ＥＢを培養すること、および前駆細胞からＮＫ細胞を作製するための第２無血清培地の中でそれらの前駆細胞を培養することを含む。その方法は未分化ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または未分化人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である未分化幹細胞を使用する。
【０００７】
さらなる実施形態では、多能性幹細胞よりＮＫ細胞を作製するための方法であって、（ａ）第１無血清培地の中で多能性幹細胞を凝集させ、それによって胚様体を形成すること、（ｂ）第２無血清培地の中で胚様体を培養し、それによって造血前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）を作製すること、および（ｃ）インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、および／またはＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を含む第３無血清培地の中で造血前駆細胞を培養し、それによってナチュラルキラー細胞を作製することを含む前記方法が提供される。幾つかの態様では、それらの多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞または人工多能性幹細胞などのヒト細胞である。ある特定の態様では、本実施形態の第２無血清培地はＳＣＦ、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）および／または血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む。さらなる態様では、約９０日未満の期間、例えば、約１０日、２０日、２５日、または３０日と４０日、４５日、５０日、６０日、７０日または８０日の間の期間にわたってその方法を実行する。例えば、幾つかの態様では、３日と３０日の間の期間、例えば３〜２５日、６〜２０日または６〜１５日の間の期間にわたってステップ（ｂ）の培養を実行する。同様に、幾つかの態様では、５日と１００日の間の期間、例えば５〜８０日、１０〜７０日または２０〜６０日の間の期間にわたってステップ（ｃ）の培養を実行する。
【０００８】
一連の方法は胚様体の形成に利用可能であり、且つ、本実施形態と一致して使用され得る。例えば、１つの態様では、遠心凝集により胚様体の凝集を実施する。胚様体とそれらに由来する細胞を培養するための方法も当技術分野において周知である。幾つかの態様では、例えば、Ｍ２１０−Ｂ４マウス間質細胞などのマウス間質が存在しない状態で胚様体の培養ステップを実施する。幾つかの態様では、胚様体の培養は外来性の間質が存在しない状態、または間質細胞が存在しない状態にある。本明細書中において使用される場合、外来性の間質は、胚様体の細胞と遺伝的に異なる細胞（例えば、胚様体と同じ多能性幹細胞に由来しない細胞）など、培養物に添加される間質細胞を指す。
【０００９】
幾つかの態様では、本実施形態の方法はＣＤ３４を発現するＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４とＣＤ４３を共発現するＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞、および／またはＣＤ３４とＣＤ４５を共発現するＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞を含む前駆細胞を作製する。本方法の実施形態では、第２無血清培地の中で前駆細胞を培養するステップは、例えば、ＥＬ０８−１Ｄ２外来性間質細胞などの外来性間質細胞が存在しない状態にある。さらなる態様では、その方法はＥＢ培養ステップと前駆細胞培養ステップの間に（例えば、前駆細胞が発現する糖タンパク質に基づいて）前駆細胞を選別する細胞選別ステップを必要としない（および、含まない）。したがって、最初の培養ステップに由来する前駆細胞のバッチは、それらの間に細胞選別ステップを挟むことなく、第２無血清培地を使用する培養に直接移転され得る。幾つかの態様では、その方法は、例えばＣＤ５６、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄのうちの１つ以上を発現するＮＫ細胞などのＮＫ細胞を作製する。
【００１０】
未分化幹細胞よりＮＫ細胞を作製するための方法の実施形態は、幾つかの事例では、第１無血清培地中に未分化幹細胞を配置すること、第１無血清培地の中で未分化細胞を凝集させ、且つ、ＥＢを形成すること、ＥＢから前駆細胞の産生を誘導するために第１無血清培地の中でＥＢ（例えば、遠心ＥＢ）を培養すること、前駆細胞からＮＫ細胞を作製するための第２無血清培地の中でそれらの前駆細胞を培養することを含む。幾つかの態様では、方法は不活化（例えば、放射線照射）人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の獲得または作製をさらに含む。そのようなａＡＰＣを作製するための方法は当技術分野において公知であり、且つ、本明細書においてさらに詳述される。したがって、幾つかの態様では、ＮＫ細胞は不活化ａＡＰＣと共培養される。ＮＫ細胞をａＡＰＣと共培養するステップは、例えばインターロイキン２（ＩＬ２）を含む培地の中で行われ得る。幾つかの態様では、約５：１から約１：５の不活化ａＡＰＣに対するナチュラルキラー細胞の比率でその共培養を実施する。例えば、ＮＫ細胞とａＡＰＣの共培養は１：１（ＮＫ細胞：ａＡＰＣ）、２：１（ＮＫ細胞：ａＡＰＣ）または１：２（ＮＫ細胞：ａＡＰＣ）の比率であり得る。
【００１１】
癌細胞および／またはウイルス感染細胞を殺滅するための方法は上記のＮＫ細胞を作製するための方法を含み、ＮＫ細胞を取り出し、且つ、固形塊の癌細胞にそれらのＮＫ細胞を送達することをさらに含む。その送達ステップはＮＫ細胞の動物またはヒトへの注射であり得る。
【００１２】
１つの実施形態では、本開示は、（ａ）第１無血清培地の中で多能性幹細胞を凝集させ、それによって胚様体を形成すること、（ｂ）第２無血清培地の中で胚様体を培養し、それによって造血前駆細胞を作製すること、および（ｃ）インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を含む第３無血清培地の中で造血前駆細胞を培養し、それによってナチュラルキラー細胞を作製することを含む、多能性幹細胞よりナチュラルキラー細胞を作製するための方法を提供する。
【００１３】
ある特定の態様では、それらの多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。ある特定の態様では、マウス間質またはマウス間質細胞が存在しない状態でステップ（ｂ）の培養を実施することができる。ある特定の態様では、外来性の間質または間質細胞が存在しない状態でステップ（ｃ）の培養を実施することができる。１つの態様では、その方法は細胞選別ステップをステップ（ｂ）とステップ（ｃ）の間に含まない。ステップ（ｂ）の培養を４〜４０日間、好ましくは６〜２０日間実行することができる。ステップ（ｃ）の培養を１０〜１００日間、好ましくは２０〜６０日間実行することができる。
【００１４】
幾つかの態様では、造血前駆細胞はＣＤ３４を発現することができ、ＣＤ３４とＣＤ４３を共発現することができ、またはＣＤ３４とＣＤ４５を共発現することができる。１つの態様では、作製されるナチュラルキラー細胞はＣＤ５６、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄのうちの１つ以上を発現することができる。
【００１５】
上で詳述したように、１つの態様では、本方法はナチュラルキラー細胞を放射線照射（そうでない場合は不活化）人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と共培養することをさらに含み得る。ＩＬ−２を含む培地の中で前記の共培養を実施することができる。約５：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５または１：１０の不活化ａＡＰＣに対するナチュラルキラー細胞の比率で前記共培養を実施することができる。
【００１６】
さらなる実施形態では、本開示は、必要とする患者に本実施形態の方法によって作製されたナチュラルキラー細胞の有効量を投与することを含む、患者を治療する免疫療法を提供する。一層さらなる実施形態では、（ａ）本実施形態の方法によってナチュラルキラー細胞の集団を作製すること、および（ｂ）必要とする患者にそれらのＮＫ細胞の有効量を投与すること、を含む免疫療法が提供される。例えば、幾つかの態様では、その患者は癌患者またはウイルス感染症などの感染症を有する患者である。幾つかの態様では、その患者はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染している。当業者は、本実施形態の治療方法は幾つかの態様では自家幹細胞に由来するＮＫ細胞（例えば、患者の血液試料または臍帯血試料から作製した細胞）を使用することを伴い得ることを理解する。他の態様では、それらのＮＫ細胞は異種細胞に由来し得る。
【００１７】
本願の明細書中において使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は１以上を意味し得る。本願の特許請求の範囲の中において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語と併せて使用されるとき、「ａ」または「ａｎ」という単語は１または１超を意味し得る。
【００１８】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢のみ、または選択肢が相互排除的関係にあることを指すと明白に示されない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は選択肢のみ、および「および／または」を指す定義を維持する。本明細書中において使用される場合、「別の」は少なくとも２つ目のもの、またはそれ以降のものを意味し得る。
【００１９】
本願を通して「約」という用語は、ある値がその値を決定するために用いられた装置、方法の固有の誤差の分散、または試験対象の間に存在する分散を含むことを示すために使用される。
【００２０】
本発明の他の目的、特徴および利点は次の詳細な説明より明らかとなる。しかしながら、本発明の好ましい実施形態が示されるが、この詳細な説明から本発明の精神と範囲の範囲内にある様々な変更と改変が当業者に明らかになるので、詳細な説明と具体的な実施例は例示のみを意図して提供されていることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
次の図面は本明細書の一部を形成し、且つ、本発明のある特定の態様をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書中に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の内の１つ以上を参照することによってより良く理解され得る。
【図１】未分化幹細胞よりＮＫ細胞を作製するための方法の実施形態の流れ図を示す図である。
【図２】未分化幹細胞よりＮＫ細胞を作製するための方法の実施形態を示す図である。遠心ＥＢ法を用いる未分化ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣからの造血細胞の発生とＮＫ細胞の発生の概略図。
【図３】未分化ヒト多能性幹細胞よりＮＫ細胞を作製するための方法の実施形態を示す図である。
【図４Ａ】造血前駆細胞を作製するための培養ステップ中の細胞分化の結果の例を示す図である。凝集したｈＥＳＣまたはｉＰＳＣがそれぞれ個々のウェルの中で別々の遠心ＥＢを形成し、１１日の期間にわたって増殖する。第７日、第９日、および第１１日に４倍の倍率で写真を撮った。第１１日にＥＢの周囲に造血性を示す多数の細胞が存在する。
【図４Ｂ】ｈＥＳＣ由来細胞およびｉＰＳＣ由来細胞についての細胞分化のサイトメトリー分析を示す図である。遠心ＥＢは（図７〜８中のように）マウス間質細胞との共培養よりもｈＥＳＣおよびｉＰＳＣに由来する造血前駆細胞を高い頻度で作製した。遠心ＥＢ培養の１１日目に個々のＥＢを収集し、解離させ、ＣＤ３４、ＣＤ４３、およびＣＤ４５に対する抗体で染色した。
【図４Ｃ】様々な分子を発現する遠心ＥＢのパーセンテージの例を示す図である。遠心ＥＢ系において作製された高レベルの血液前駆細胞の定量。ＣＤ３４のみを発現する細胞、またはＣＤ４５、ＣＤ４３、ＣＤ３１、およびＣＤ７３と組合せてＣＤ３４を発現する細胞のパーセンテージが示されている。各ドットは別々の実験の結果を表す。線は平均値±ＳＥＭを表す。
【図４Ｄ】様々なエフェクター分子を発現する得られたＮＫ細胞の例を示す図である。ｈＥＳＣ（ＥＬ０８−１Ｄ２フィーダーを使用して、または使用せずに）、ＰＢ−ＮＫ、またはｉＰＳＣ（ＵＣＢｉＰＳ７）から得られたＣＤ５６＋ＮＫ細胞。ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞およびｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞はＣＤ１１７−９４＋で均一な、活性化ＰＢ−ＮＫと類似する成熟集団を形成した。それぞれのＮＫ細胞はＫＩＲ、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、およびアポトーシス誘導リガンドＴＲＡＩＬを含む様々なエフェクター分子も発現した。少なくとも３回の独立した実験を表すヒストグラム。
【図５】未分化幹細胞よりＮＫ細胞を作製するための方法の実施形態の流れ図を示す図である。
【図６Ａ】図５に示される工程を用いて作製されたＮＫ細胞の結果を示す図である。（Ａ）図２〜４のように作製され、その後にａＡＰＣと共に７０日間さらに培養されたｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞の細胞数。
【図６Ｂ】同上。（Ｂ）３週間の培養の後にＥＬ０８−１Ｄ２使用ＮＫ細胞培養物とフィーダー不使用ＮＫ細胞培養物の両方は増殖前の表現型を維持し、且つ、増殖させたＰＢ−ＮＫ細胞と類似していた。それぞれのＮＫ細胞は継続してＣＤ９４＋ＣＤ１１７−であるＣＤ５６＋ＮＫ細胞の純粋培養物を含有した。それぞれのＮＫ細胞は高レベルのＫＩＲ、ＣＤ１６、およびＮＫＧ２Ａを発現し、ほんのわずかなパーセンテージの細胞しかＮＫＧ２Ｃを発現しなかった（ｎ＝３）。
【図６Ｃ】同上。（Ｃ）増殖させたＮＫ細胞はそれらのインビトロ機能を保持した。それぞれのＮＫ細胞をＫ５６２標的に対する標準５１Ｃｒ放出細胞傷害アッセイで試験した（それぞれについてｎ＝３）。データは平均値±ＳＥＭとして表される。
【図７】造血系分化を支援するマウス間質との共培養ステップ、および細胞選別ステップを必要とする比較方法の流れ図を示す図である。
【図８Ａ】前駆細胞のＣＤ３４とＣＤ４５の発現の結果を示す図である。Ｍ２１０−Ｂ４間質上に２１日間配置した後のｈＥＳＣ（Ｈ１、Ｈ９）またはｉＰＳＣ（ＢＪ１−ｉＰＳ、ＤＲｉＰＳ１６、ＵＣＢｉＰＳ７）に由来するＣＤ３４＋ＣＤ４５＋前駆細胞。
【図８Ｂ】前駆細胞のＣＤ３４およびＣＤ４５の発現率を示す図である。各株について少なくとも４回の別々の実験のｈＥＳＣおよびｉＰＳＣの分化効率。
【図８Ｃ】得られたＮＫ細胞の細胞傷害の結果を示す図である。Ｋ５６２腫瘍細胞に対する細胞傷害アッセイ。ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞およびｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞はＵＣＢ由来ＮＫ細胞よりも有意に高いレベルでＣＭＬ標的細胞を殺滅する。細胞傷害性の平均値はＨ１（ｎ＝２）を除いてｎ＝３であり、ＢＪ１ｉＰＳ由来ＮＫ細胞抗腫瘍活性は以前に示されている（Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。
【図９】インビボ腫瘍治療結果の結果を示す図である。
【図１０】ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からの機能性ＮＫ細胞の誘導を示す図である。ｈＥＳＣ、ｉＰＳＣ（ＢＪ１−ｉＰＳ、ＮＨＤＦ−ｉＰＳ、ＵＣＢ−ｉＰＳ）、またはＵＣＢ由来ＣＤ３４＋細胞から得られたＮＫ細胞または成体末梢血から単離されたＮＫ細胞（ＰＢ−ＮＫ）。ヒストグラムプロットをＣＤ５６＋イベントに対するゲートにかける。ＫＩＲプロットはＫＩＲ抗体（ＣＤ１５８ａ／ｈ、ＣＤ１５８ｅ１／ｅ２、およびＣＤ１５８ｉ）のカクテルを使用した。ＰＢ−ＮＫと同様に、ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞およびｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は機能的に成熟したＮＫ細胞のマーカー（ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６１）を発現した。ヒストグラムは少なくとも３回の独立した実験を表す。略語：ｉＰＳ、人工多能性幹；ＫＩＲ、キラー免疫グロブリン様受容体；ＮＫ、ナチュラルキラー；ＰＢ、末梢血；ＵＣＢ、臍帯血。
【図１１】フィーダー不使用条件における機能性ＮＫ細胞の誘導を示す図である。白血病細胞株Ｋ５６２に対する細胞傷害アッセイ（細胞種当たりＮ＝４）。ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞およびｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は活性化ＰＢ−ＮＫ細胞と同様に、且つ、ＵＣＢ−ＮＫ細胞よりも有意に好適に（ｐ＝０．００５４）Ｋ５６２細胞を殺滅する。データは平均値±ＳＥＭとして表される。略語：ＣＭＬ、慢性骨髄性白血病；ＥＳ、胚性幹；ｈＥＳＣ、ヒト胚性幹細胞；ｉＰＳＣ、人工多能性幹細胞；ＮＫ、ナチュラルキラー；ＰＢ、末梢血；ＵＣＢ、臍帯血。
【図１２】ｈＰＳＣ由来間質が成熟ＮＫ細胞の発生を支援することを示す図である。（Ａ）ＥＬ０８−１Ｄ２間質細胞の存在下、または非存在下で増殖させたｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞。ＥＬ０８細胞を含む、または含まない培養から４週間の時点でそれらの間質細胞は５６．８倍の増殖をもたらし、フィーダー不使用細胞は４０．４倍増殖した。各条件についてＮ＝４。（Ｂ）２週間のＮＫ細胞培養の後のｈＥＳＣ由来間質。４０倍の倍率で細胞の画像を撮った。その後、造血細胞を洗い流し、間質層のみを評価するために細胞の画像を再度撮った。間質細胞もＧＦＰを発現し、それらのｈＥＳＣ起源を示した（使用した親Ｈ９株はＧＦＰ＋であるように遺伝子操作されている）。（Ｃ）フィーダー不使用条件から得られた間質は内皮細胞（ＣＤ３１）と間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の両方に典型的な表面抗原を発現するが、全血球増殖性マーカーＣＤ４５または骨髄マーカー（ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１１ｃ）を発現することはない。（Ｄ）フィーダー不使用条件から得られた間質はＵＣＢ由来ＣＤ３４＋  ＨＳＣからのＮＫ細胞の発生を支援した。各間質層（ＥＬ０８−１Ｄ２、ＨＵＶＥＣ、無フィーダー間質）をＮＫ細胞（ＣＤ５６）の存在について第２８日に評価した。間質無し、サイトカインのみの条件も示されている。次にＣＤ５６＋イベントをＣＤ１１７、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、およびＫＩＲの発現について評価した（Ｎ＝２）。略語：ＥＳ、胚性幹；ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質；ＨＵＶＥＣ、ヒト臍静脈内皮細胞；ＫＩＲ、キラー免疫グロブリン様受容体；ＮＫ、ナチュラルキラー。
【図１３】遠心ＥＢ由来ＮＫ細胞が様々な標的に対して機能的であることを示す図。（Ａ）フィーダー使用条件またはフィーダー不使用条件におけるｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞、ＵＣＢ由来ＮＫ細胞、およびＰＢ−ＮＫ細胞をＩＦＮγ分泌およびＣＤ１０７ａ発現についてＫ５６２標的に対して試験した。エフェクターを標的と共に５時間保温し、フローサイトメトリーにより分析した。（Ｂ）標準５１Ｃｒ放出アッセイを用いて各エフェクター集団を骨髄腫（ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６、ＯＰＭ−２）標的および膵臓癌（Ｓ２０１３、Ｓ２ＶＰ１０）標的に対しても試験した。データは平均値±ＳＥＭとして表される。略語：ＩＦＮγ、インターフェロンγ；ＮＫ、ナチュラルキラー；ＰＢ、末梢血；ＵＣＢ、臍帯血。
【図１４】遠心ＥＢ由来ＮＫ細胞が系列特異的因子を発現することを示す図である。各ＮＫ細胞集団をＮＫ細胞の発生に重要な遺伝子について逆転写酵素ＰＣＲにより試験した。ＰＢ−ＮＫ細胞と比較するとｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞とｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞はＥ４ＢＰ４、Ｅ２Ａ、およびＩＤ２を発現する。それらは多能性因子ＯＣＴ４またはＢ細胞系列特異的転写因子ＰＡＸ５を発現しない。
【図１５】遠心ＥＢ由来ＮＫ細胞が活性化受容体ＮＫｐ４６を介して誘導され得ることを示す図である。ｈＥＳＣ、ｉＰＳＣ、および末梢血に由来するＮＫ細胞を、ＮＫｐ４６活性化受容体を介するリダイレクト殺滅、または逆ＡＤＣＣについて試験した。各エフェクター株を（抗体のＦｃ部分に結合することができる）Ｐ８１５標的細胞へ添加する前にアイソタイプ対照または抗ＮＫｐ４６抗体と事前保温した。その後、エフェクター標的間比率を上げてＮＫ細胞をＰ８１５標的細胞と共保温した。
【図１６】遠心ＥＢが内皮細胞と間葉系間質細胞の両方の前駆細胞を含有することを示す図である。（Ａ）第１１日（ＮＫ細胞条件への移転日）の遠心ＥＢを内皮細胞（ＣＤ３１）マーカーまたは間葉系間質細胞（ＣＤ７３）マーカーの存在について分析した。ＣＤ３４＋細胞の大部分がＣＤ３１を共発現する。フローサイトメトリープロットは少なくとも３回の独立した実験を表す。
【図１７】ホタルルシフェラーゼを発現するヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）からのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の誘導。（Ａ）ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞の誘導の概略図。ＧＦＰ−ルシフェラーゼ＋  ｈＥＳＣを解離させ、播種して遠心ＥＢ条件で１１日間培養した。その後、ＮＫ細胞発生を支援する条件に細胞を移した。（Ｂ）遠心ＥＢ培養中の１１日後に細胞を解離させ、ＦＡＣ分析のために前駆細胞マーカーＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＣＤ４３について染色した。遠心ＥＢ由来前駆細胞は高レベルのＣＤ３４、ＣＤ４３、およびＣＤ４５を発現した。（Ｃ）ＮＫ細胞培養中の４週間後に細胞を回収し、ＦＡＣ分析のために染色した。ＧＦＰとルシフェラーゼを発現するｈＥＳＣはＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ａを発現するＮＫ細胞の純粋集団に分化する。各フロープロットは少なくとも５回の独立した実験を表す。ＥＢ、胚様体。
【図１８−１】ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞の存続性を示す図である。（Ａ）静脈内（ＩＶ）注射されたｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞と腹腔内（ＩＰ）注射されたｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞の存続性がＮＫ細胞注射後の表示されている時点（Ｄ＝日）で生物発光画像法によりモニターされた。（Ｂ）静脈内（ＩＶ）投与と腹腔内（ＩＰ）投与により細胞を受容している、非注射対照と比較されるマウスにおけるｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞ルシフェラーゼシグナルの定量。ＩＰ注射ＮＫ細胞は全部で２５日間存続し、ＩＶ注射細胞は第４日までに検出不能になった。（Ｃ）非注射対照と比較したＩＶ注射ＮＫ細胞とＩＰ注射ＮＫ細胞の脾臓、骨髄、腹膜、および末梢血内の生着を評価するための第１９日における幾匹かのマウスの分析。ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞をそれらのＧＦＰの発現について、またはＣＤ５６表面抗原およびＣＤ４５表面抗原の染色について分析した。プロットは４匹のＩＰマウスおよび３匹のＩＶマウスを表す。非注射対照群については２匹のマウスを分析した。
【図１８−２】同上。
【図１９】ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞のインビボ輸送をモニターするための二元生物発光画像撮影を示す図である。腫瘍細胞（ｍｂＧｌｕｃ＋、上の列）とＮＫ細胞（ホタルルシフェラーゼ＋、Ｆｌｕｃ、下の列）の両方の存在についての９日の期間にわたる１匹のマウスのモニタリング。腫瘍部位へのＮＫ細胞輸送をこの特定のマウスにおいて第９日に見ることができる。
【図２０】ＴｕｒｂｏＦＰ６５０発現Ｋ６５２細胞を利用する改良二元レポーター画像撮影を示す図である。（Ａ）ＴｕｒｂｏＦＰ６５０レポーターで修飾されたＫ５６２細胞をＦＡＣＳにより分析および選別した。（Ｂ）５匹のマウスにＴｕｒｂｏＦＰ６５０＋  Ｋ５６２腫瘍細胞と１０×１０６個のＮＫ細胞の両方を注射し、２週間追跡した。画像により（Ｂ）第９日と（Ｃ）第１２日におけるホタルルシフェラーゼを発現するｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞の輸送が示される。（Ｄ）Ｋ５６２腫瘍組織量は第０日、第９日、および第１２日におけるＴｕｒｂｏＦＰ６５０シグナルを測定することにより定量された。ＮＫ細胞シグナル（全ＮＫ細胞または輸送されたＮＫ細胞）はホタルルシフェラーゼ活性を測定することにより定量された。それらの輸送されたＮＫ細胞は腫瘍領域と共局在するＮＫ細胞シグナルの量を定量することにより測定された。
【図２１】インビボＮＫ細胞輸送の免疫組織化学（ＩＨＣ）による確認を示す図である。（Ａ）生物発光画像法により輸送が確認されたマウスの腫瘍組織をホルマリン固定し、そして、ＩＨＣの前にパラフィン包埋した。その後、切片を表示されている濃度のアイソタイプ（ＩｇＧ１）抗体または抗ＮＫｐ４６抗体で染色した。アイソタイプ抗体およびＮＫｐ４６抗体を連続切片に作用させた。（Ｂ）腫瘍のみのマウスはＮＫ細胞の染色を示さなかったが、陽性対照であるヒト扁桃組織（Ｃ）には多数のＮＫ細胞が存在した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
抗腫瘍リンパ球の養子移入は過去２０年にわたって癌治療の分野において強い関心を持たれてきた。ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は抗癌免疫療法用リンパ球の有望な供給源である。サイトカイン産生ＮＫ細胞は自然免疫系の一部であり、事前に抗原を曝露せずにヒト白血球抗原適合を必要としない強力な抗腫瘍活性を示す。Ｔ細胞ベースの養子免疫療法もＮＫ細胞ベースの養子免疫療法も難治性悪性腫瘍を有する患者を治療するために使用されてきた（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｍｂｅｒｇ，  ２００７、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。これらの治療法の使用拡大に対する主要な障害は細胞調整とドナー選択の必要性である。ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からのＴ細胞の発生が報告されているが、それは比較的に不充分なままである（Ｇａｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。
【００２３】
対照的に、抗腫瘍能と抗ウイルス能を有するＮＫ細胞を作製するためにヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）と人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を使用することが実施されている（Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１、Ｗｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９、Ｗｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞は成熟表現型を有し、サイトカインを分泌し、且つ、インビトロとインビボで血液悪性腫瘍と固形悪性腫瘍の両方に対して細胞傷害性である（Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１、Ｗｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９、Ｗｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。それ故、多能性幹細胞からのＮＫ細胞の誘導は難治性悪性腫瘍を有する数千人もの患者を治療するための強力な抗腫瘍反応を有する標準化され、容易に入手可能な治療薬を提供することができるだろう。これまでヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からの造血細胞の発生についての研究はマウス間質細胞層の使用を含む不完全限定条件を用いてきており、且つ、少数のｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ由来造血前駆細胞の選別など、限られた規模で行われてきた。マウス間質層を使用することが（マスターセルバンクが使用される場合）臨床応用を完全に妨げることはないが、異種細胞を除外する培養系を使用することがＮＫ細胞の発生のためのより限定的な条件を提供する。マウス間質支持体を除外することにより、ＮＫ細胞ライセンシングを促進する受容体リガンド間相互作用を研究するための重要な発生モデルも提供される。
【００２４】
本明細書は、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣからの機能性ＮＫ細胞の発生のための効率的な系ならびに臨床応用に適切な改良された方法を記載する。本発明者らは、細胞選別しない状態で、且つ、異種間質細胞を必要とせずにｈＥＳＣおよびｉＰＳＣからＮＫ細胞を効率的に作製するための二段階培養系を用いた。限定的な条件と人工抗原提示細胞（例えば、膜結合型インターロイキン２１を発現するａＡＰＣ）を使用するこの新しい組合せの胚様体形成によって、幾つかの異なるｈＥＳＣ株およびｉＰＳＣ株から成熟した機能性のＮＫ細胞を作製することが可能になる。とりわけ、本明細書において詳述されるＮＫ細胞の作製のための無フィーダー限定培養条件は機能性ＮＫ細胞の産生の点で以前のフィーダー細胞ベースの系よりも効率的であった（例えば、図４Ｂと図７〜８を比較参照のこと）。異なるｈＥＳＣ株およびｉＰＳＣ株の造血系細胞発生の効率は様々であったが、試験した全ての細胞株が機能性ＮＫ細胞を産生することができた。これらの方法を用いることにより２５０，０００個よりも少ない投入ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣにより１人の患者を治療するために充分な細胞傷害性ＮＫ細胞を作製することができる。なお、この戦略はインビトロでの通常のＮＫ細胞の発生と育成を研究するための遺伝子操作可能なプラットフォームを提供する。
【００２５】
本開示は、臨床応用のための多数の細胞傷害性ＮＫ細胞を作製するために無フィーダー系を使用することができることを実証する。この無フィーダー系において得られたＮＫ細胞はマウス間質細胞を使用して増殖させた細胞と類似する遺伝型および表現型を有した  （Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１、Ｗｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。ＫＩＲとＣＤ１６の両方を含む高レベルのエフェクター分子がｈＥＳＣおよびｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞の表面に発現した。間質ベースの方法と無フィーダー方法の間のＫＩＲとＣＤ１６の発現レベルの顕著な差異は発生カイネティクスに起因するようであった。Ｍ２１０−Ｂ４間質ベースの方法を使用するとき、ＮＫ細胞分化の前にＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋前駆細胞の集団を濃縮する必要があるが、ＮＫ細胞分化は低い頻度（２％〜１０％）でしかこれらの細胞を生じないからである（図１）。遠心ＥＢの直接移転によってＮＫ細胞発生が成功するようになったが、前駆細胞の出発時の比較的低いパーセンテージ（２６．２±６．６％；図２）が原因で最適なＣＤ１６とＫＩＲの獲得により長い時間がかかることがあり得る。しかしながら、どちらの方法を用いて得られたＮＫ細胞もａＡＰＣとの増殖の後にＫＩＲ、ＣＤ１６と他の典型的なＮＫ細胞表面受容体および抗原を発現することを実証することができるので、それらのＮＫ細胞の間に本質的な差異は存在しない。なお、間質ベースＮＫ細胞もフィーダー不使用ＮＫ細胞もほぼ等しいレベルで腫瘍標的とウイルス感染標的を殺滅するので機能的には類似している。
【００２６】
Ｉ．定義
「分化」は培養中かインビボであまり特殊化していない細胞が、分化が無い同一条件下にあるときよりも特殊化した細胞種の細胞になって、少なくとも１つの新しい細胞種の子孫細胞を形成する過程のことである。ある特定の条件下では、その新しい細胞種の特徴を有する子孫細胞の割合は好ましい順に少なくとも約１％、５％、２５％またはそれより高い割合であり得る。
【００２７】
「分化細胞」という用語は、本明細書中において使用される場合、特殊化していない表現型から特殊化した表現型に発達した前駆細胞を指すことができる。例えば、胚性細胞は腸の上皮細胞に分化することができる。分化細胞は例えば胎児または生産（せいざん）動物から単離され得る。
【００２８】
「未分化細胞」という用語は、本明細書中において使用される場合、特殊化していない表現型を有し、且つ、分化することができる前駆細胞を指すことができる。未分化細胞の例は幹細胞である。
【００２９】
「多能性」は、細胞がその子孫細胞を介して生殖細胞を含む成体動物を構成するあらゆる細胞を生じることができることを意味する。胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、および胚性生殖細胞がこの定義の下で多能性細胞である。
【００３０】
「胚性幹細胞」という用語は、本明細書中において使用される場合、インビトロ細胞培養状態で維持される、胚から単離された多能性細胞を指すことができる。そのような細胞は、生殖細胞を含む成体動物を構成するあらゆる細胞をインビボで生じる能力を培養状態で保持する培養胚から単離された急速分裂培養細胞である。胚性幹細胞はフィーダー細胞を使用して、または使用せずに培養され得る。胚性幹細胞は、胚盤胞期の胚および前胚盤胞期の胚を含むあらゆる発生段階の胚から単離された胚性細胞より確立され得る。胚性幹細胞は球形の細胞形態を有することがあり得、且つ、フィーダー層上で球系の細胞集塊に増殖し得る。胚性幹細胞は当業者に周知である。
【００３１】
ＩＩ．細胞培養
「培養された（ｃｕｌｔｕｒｅｄ）」という用語は、細胞に関して本明細書中において使用される場合、インビトロ環境において細胞分裂を行っている、または細胞分裂を行っていない１個以上の細胞を指すことができる。インビトロ環境は、例えば適切な液体培地または寒天培地などのインビトロでの細胞の維持に適切である当技術分野において公知のあらゆる培地のことであり得る。
【００３２】
出発細胞と分化細胞は一般に培地と培養条件について異なる要求事項を有する。出発細胞の培養に適切であることが知られている培地の存在下および培養条件の下で分化因子の導入後に少なくとも初期段階の培養を実行することは普通のことである。この後に分化細胞に適切であることが知られている分化培地の存在下および培養条件の下での後続の培養期間が続く。分化に充分な時間の後に分化した細胞は分化細胞の増殖のために増殖培地中でさらに培養され得る。そのような増殖培地は１つ以上の上述のシグナル伝達阻害剤を含んでもよく、または基本的にこれらの阻害剤を含まない培地を含んでもよい。分化条件は基本的にフィーダー細胞を含まないことがあり得る。さらなる態様では、分化培地は化学的に限定されることがあり得る。
【００３３】
本実施形態に従う培地は血清含有培地または無血清培地であり得る。無血清培地は未処理または未精製血清を含まない培地を指し、よって精製された血液由来成分または動物組織由来成分（例えば、増殖因子）を有する培地を含み得る。異種動物由来成分の汚染混入を防ぐ態様から血清は幹細胞のものと同じ動物に由来し得る。
【００３４】
本実施形態に従う培地は血清代替物を含んでも含まなくてもよい。血清代替物には、アルブミン（例えば、高脂質アルブミン、組換えアルブミン、植物デンプン、デキストランおよびタンパク質加水分解物などのアルブミン代替物）、トランスフェリン（または他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２‐メルカプトエタノール、３’‐チオールグリセロール、またはそれらの同等物を適宜含有する物質が挙げられ得る。
【００３５】
多能性細胞の維持
多能性細胞は、本実施形態の分化プロトコルの前に様々な方法を用いて未分化状態で培養および維持され得る。ある特定の実施形態では、多能性細胞は、限定フィーダー非依存培養系を用いて、例えば、ＴｅＳＲ培地またはＥ８培地（例えば、参照により組み込まれるＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ８（５）：４２４−４２９，  ２０１１を参照のこと）において基本的に未分化状態で培養および維持され得る。例えば、ＴｅＳＲ培地は未分化ヒト胚性幹細胞を培養するために使用され得る限定培地である。ＴｅＳＲ培地にはＴｅＳＲ１培地とｍＴｅＳＲ培地の両方が含まれる。ＴｅＳＲはｂＦＧＦ、ＬｉＣｌ、γ‐アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、ピペコリン酸およびＴＧＦβを含み、ＴｅＳＲを利用する様々な方法が以前に、例えば、参照により全体が組み込まれる米国特許出願公開第２００６／００８４１６８号およびＬｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６ａ、２００６ｂ）に記載されている。あるいは、非限定条件を用いることができる。例えば、多能性細胞は、未分化状態で幹細胞を維持するために線維芽細胞フィーダー細胞上または線維芽細胞フィーダー細胞に曝露された培地上で培養され得る。
【００３６】
フィーダー非依存培養系および培地を使用してｈＥＳＣまたはｉＰＳＣなどの多能性細胞を培養および維持することができる。これらのアプローチによりマウス線維芽細胞「フィーダー層」を必要とすることなくヒト胚性幹細胞を基本的に未分化状態で維持することができる。本明細書に記載されるように、必要に応じてコストなどを減少させるために様々な改変をこれらの方法に行うことができる。
【００３７】
事実上あらゆる多能性またはヒト胚性幹細胞株が本明細書に記載される限定条件下で分化し得ることが予期される。例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ９、ｈＥＳ２、ｈＥＳ３、ｈＥＳ４、ｈＥＳ５、ｈＥＳ６、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＨＳＦ１、ＨＳＦ６、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３Ｂ、および／またはＨ１４などは本明細書に記載される方法を介して分化し得る。ある特定の実施形態ではヒト多能性細胞を使用することが好ましくあり得るが、幾つかの例では造血系分化に適した哺乳類、マウス、霊長類のものなど他の多能性細胞を使用することも可能であり得る。
【００３８】
ヒト胚性幹細胞に加えてｉＰＳＣが本明細書に記載される方法を介して造血前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）に培養および／または分化され得る。ｉＰＳＣは幹細胞様特性を有する再プログラム化体細胞である  （Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７、Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。当業者が理解するように、「多能性細胞」という用語には胚盤胞に自然に生じる、または胚盤胞に由来する細胞ならびに幹細胞への脱分化を誘導された、または幹細胞様状態に戻る細胞が含まれる（例えば、Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７を参照のこと）。
【００３９】
幾つかの態様では、マトリックス成分が、実質的または基本的に未分化状態で多能性細胞を培養および維持するための限定培地に含まれ得る。適切な半固形マトリックス中で培養されるとコロニー形成細胞（ＣＦＣ）と呼ばれる個々の前駆細胞が増殖して別々の細胞培養物またはコロニーを形成することができる。細胞懸濁液を栄養分およびサイトカインを添加したメチルセルロースまたはコラーゲンなどの半固形培地に加え、続いて例えば約３７℃で保温することによりＣＦＣアッセイを実施することができる。
【００４０】
様々なマトリックス成分を使用してｈＥＳＣまたはｉＰＳＣなどの多能性細胞を培養および維持することができる。例えば、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、およびビトロネクチンを組合せて使用して、参照により全体が組み込まれるＬｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）に記載されるように、胚性細胞の培養と維持に適した固形支持体を提供することができる。
【００４１】
マトリゲル（商標）を使用して細胞培養と多能性細胞の維持のための基材を提供することもできる。マトリゲル（商標）はマウス腫瘍細胞から分泌され、ＢＤバイオサイエンス社（ニュージャージー州、米国）から市販されているゼラチン様タンパク質混合物である。その混合物は多くの組織に見出される複雑な細胞外環境に似ており、且つ、細胞培養用の基材として細胞生物学によって使用されている。マトリゲル（商標）を含む限定培地中でのヒト胚性幹細胞の培養と維持のための方法が、例えば、Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．
（２００６）に記載されており、且つ、造血系分化前の多能性細胞の培養のために用いられ得る。当業者に理解されるように、ヒト胚性幹細胞の培養と維持のためのその他の方法を本実施形態と共に用いることができることが理解される。
【００４２】
ＩＩＩ．ＮＫ細胞分化
本明細書に開示される方法は、未分化幹細胞（ｈＥＳＣ、ｉＰＳＣ）より造血細胞を発生させるための適切な条件を提供することを対象にする。幹細胞の分化は胚様体（ＥＢ）の形成によって誘導される。転写因子と細胞表面抗原の発現の分析から、その方法により幹細胞が通常のヒト個体発生の間に観察されるものと類似の発生カイネティクスに従うようにすることができると示唆される。
【００４３】
ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣなどの多能性幹細胞は無限の自己増殖が可能であるが、適切な条件下で分化するように誘導または支援されると骨髄造血細胞系列、赤血球造血細胞系列、および巨核球造血細胞系列に派生する能力を保持する。
【００４４】
ｈＥＳＣ由来ＮＫ（ｈＥＳＣ−ＮＫ）細胞も直接細胞介在性細胞傷害および抗体依存的細胞介在性細胞傷害、ならびにサイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ‐γ）に非常に優れている。ｈＥＳＣ−ＮＫ細胞のようにｉＰＳＣ由来ＮＫ（ｉＰＳＣ−ＮＫ）細胞も癌細胞を殺滅する類似の能力を獲得する。ｈＥＳＣ−ＮＫ細胞とｉＰＳＣ−ＮＫ細胞は成体末梢血から単離されたＮＫ細胞と類似の活性化受容体および阻害性受容体を発現する。
【００４５】
ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣは２段階インビトロ分化計画を用いてＮＫ細胞に分化することができる。その２段階分化計画は（ステージ１）遠心ＥＢを使用する幹細胞からの造血前駆細胞の作製、および（ステージ２）ステージ１より得られた遠心ＥＢからのＮＫ細胞の分化を含む。２段階インビトロ分化計画の例が下で詳細に提供される。しかしながら当業者は、様々な方法が多能性細胞からの造血前駆細胞の作製のために使用され得ることを理解する。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３７２，６４２号は造血前駆細胞を作製するための非常に効率的な培養系を詳述する。
【００４６】
ステージ１．遠心ＥＢによるｈＥＳＣまたはｉＰＳＣからの造血前駆細胞の作製例
１．ＴｒｙｐＬＥ適応未分化ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣを低密度ＭＥＦフィーダー上またはフィーダー細胞の非存在下で維持する。遠心ＥＢ分化を始める１日または２日前にＴｒｙｐＬＥ適応ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣを新しいＭＥＦ（または無フィーダー系）に１：１の比率で継ぎ、それにより分化開示日にそれらの細胞が８０％〜９０％の集密になる。
２．遠心ＥＢの播種を準備するために各９６ウェルプレートの外側の３６ウェルに１５０μｌの滅菌水をピペットで分注して蒸発によるウェル体積の減少を最小限にする。
３．ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣから培地を吸引し、１．０ｍｌの加熱済みＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔを各ウェルに添加する。ＥＳ／ｉＰＳＣがプレートから剥離し始めるまでプレートを恒温器（３７℃）に設置する。ＴｒｙｐＬＥが加熱済みの場合、これには通常約５分かかり、プレートを５分よりも長く恒温器に設置したままにしないことが好ましい。
４．解離させた細胞をコニカルチューブに収集し、ピペット内で上げ下げして集塊を壊す。ＴｒｙｐＬＥを１倍体積のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ポリビニルアルコール基本脂質ＢＰＥＬ培地と少なくとも１倍体積のＤＰＢＳで希釈する。細胞を１５００ｒｐｍ、８℃で５分間遠心する。上清を除き、細胞を５ｍｌのＢＰＥＬ培地と５ｍｌのＤＰＢＳに再懸濁する。細胞を再度遠心する。
５．上清を除き、細胞を５〜１０ｍｌのＢＰＥＬ培地に再懸濁する。集塊を除去するために細胞を７０μｍのフィルターに通して新しい５０ｍｌのコニカルチューブに移す。フィルターに通した細胞の数を数え、播種のために使用される細胞を５０ｍｌのコニカルチューブに等分する。細胞を遠心し、そして、それらをステージＩ遠心ＥＢ分化培地で再懸濁して３×１０４細胞／ｍｌにする。
６．外側のウェルに１５０μｌの水を入れて準備した９６ウェルプレートの内側の６０ウェルのそれぞれに１００μｌの細胞アリコットを移す。９６ウェルプレートを４８０ｇ、８℃で４分間遠心する。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で８〜１１日間、造血前駆ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞が作製されるまで保温する。ＥＢが形成している分化の最初の３日の間はプレートを乱さないこと（注記５）。ある特定の条件下でＣＤ３４＋細胞のパーセンテージは約４０％〜６０％であり得、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージは最大で２０％〜４０％であり得る。第１１日までに好適な分化により初期ＥＢの周囲により多くの造血細胞があるはずである。ＥＢ中に残っている大半の細胞は内皮／間葉系前駆細胞集団である。
【００４７】
上で考察したように、内皮前駆細胞のフィーダー不使用細胞作製のための他の方法を本実施形態に従って用いることができる。例えば、多能性細胞を造血前駆細胞または内皮細胞に分化させるある特定の方法は、ａ）少なくとも１つの増殖因子（すなわち、多能性の維持に適切な増殖因子）を含む限定培地中に複数の実質的に未分化の多能性細胞を獲得すること、ｂ）ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＧＭＣＳＦを含まない、または基本的に含まない限定培地中でそれらを所望により培養すること、ｃ）それらの複数の細胞における分化の促進に充分な量のＢＭＰ４とＶＥＧＦを含むさらなる限定培地においてそれらの細胞を培養すること、およびｄ）それらの複数の細胞における増殖と分化の促進に充分な量の（１）ＩＬ−３およびＦｌｔ３リガンド、または（２）ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２またはＦＧＦ‐２模倣物、およびＩＧＦのどちらかを含む限定培地においてそれらの細胞を培養すること、を含む（例えば、米国特許第８，３７２，６４２号を参照のこと）。
【００４８】
ステージ２．ＮＫ細胞の作成例
１．半分ずつの培地の交換を５〜６日毎に実施する。最初の週の間にＮＫ細胞分化培地は１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３を含み、最初の培地の交換でそれを取り除く。ＮＫ細胞発生の表現型解析はフローサイトメトリーにより実施され得る。
２．成熟ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞が得られる。それらの細胞はフローサイトメトリーにより表現型解析され得る。ｈＥＳ／ｉＰＳ細胞由来ＮＫ細胞のインビトロ機能は標準５１Ｃｒ放出アッセイまたは細胞傷害性顆粒もしくはサイトカインの放出についての免疫学的アッセイによる腫瘍細胞（例えば、Ｋ５６２）への直接細胞溶解活性の測定によって分析され得る。
【００４９】
ＩＶ．造血前駆細胞を作製するためのその他の方法
上記のとおり、一連の方法を用いてさらにＮＫ細胞の作製のための造血前駆細胞の集団を作製することができる。ある特定の好ましい態様では、造血前駆細胞は限定培養条件を用い、且つ、フィーダー細胞を使用することにより作製される。例えば、多能性細胞を部分的に、基本的に、または完全に解離または個別化した後にそれらの細胞を限定培地中でさらに培養して造血系分化を促進することができる。多能性細胞の造血前駆細胞と造血細胞系列への分化を実質的に促進することができるのは特別な組合せの増殖因子である。特別な組合せの増殖因子の順次適用を用いて多能性細胞の造血系分化をさらに促進することができる。ある特定の実施形態では、特別な組合せの増殖因子が多能性細胞の造血系分化に重要である。例えば、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、およびＧＭＣＳＦの組合せを使用して造血系分化を促進することができる。ある特定の態様では、ＢＭＰ４とＶＥＧＦ（および所望によりＦＧＦ−２）を含む第１培地への細胞培養物の順次曝露と続くＦｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、およびＧＭＣＳＦを含む第２培地中での培養により多能性細胞の造血前駆細胞および造血細胞への造血系分化を増加させることができる。幾つかの態様では、ＢＭＰ４とＶＥＧＦを含有する培地にＦＧＦ−２（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）を含めて多能性細胞からの造血前駆細胞の作製効率を少なくとも２倍にすることができる。
【００５０】
多能性細胞の造血前駆細胞への造血系分化は限定条件または非限定条件を用いて実施され得るが、結果生じる細胞をヒト対象に投与することが意図されている実施形態では限定条件が一般に好ましいことが理解される。造血幹細胞を多能性幹細胞より限定条件下で（例えば、ＴｅＳＲ培地およびマトリゲル（商標）などのマトリックス成分を用いて、またはＥ８培地中で）培養することができ、造血細胞はそれらの多能性細胞から得られた胚様体より作製され得る。他の実施形態では、多能性細胞をＯＰ９細胞またはマウス胚性線維芽細胞上で共培養し、続いて分化させることができる。
【００５１】
多能性細胞より分化過程の一部として胚様体を形成させることができる。分化誘導のための「胚様体」（ＥＢ）、または増殖細胞クラスターの形成は一般に多能性幹細胞のＥＢへのインビトロ凝集を伴い、且つ、内肺葉起源、外肺葉起源、および中肺葉起源を示す複数の種類の組織への多能性幹細胞の突発的で無作為な分化を可能とする。立体的なＥＢはこのように造血細胞および内皮細胞の一部を作製するために使用され得る。
【００５２】
ＥＢは上で詳述したように形成され得る。幾つかの態様では、マトリゲル（商標）被覆プレート上での無フィーダー培養に適応した未分化ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣは集密時に約３７℃で約１０分間のコラゲナーゼＩＶ（１ｍｇ／ｍｌ）処理を用いて回収され得る。保温後にウェルを洗浄してコラゲナーゼが無い状態にし、ＥＢ基本培地中でウェルをこそぐことによりＥＢを形成することができる。その培地は次の日に様々なサイトカイン製剤を含有するＥＢ分化培地に交換され得る。
【００５３】
ＥＢ形成を促進するためにそれらの細胞を低結合性プレートに移し、約２０％のＢＩＴ９５００（ステムセル・テクノロジーズ社）またはセラム・リプレイスメント３、約１％のＮＥＡＡ、約１ｍＭのＬ−グルタミン、および約０．１ｍＭのメルカプトエタノール、約０．７５％のＢＳＡ、および約５０ｕｇ／ｍｌのアスコルビン酸を添加されたＩＭＤＭを含有する「ＥＢ基本培地」の中で一晩培養することができる。次の日にそれらの細胞を各ウェルから回収し、遠心分離することができる。その後、それらの細胞を、その他の増殖因子を添加されたＥＢ基本培地を含む「ＥＢ分化培地」に再懸濁することができる。例えば、幾つかの態様では、約１０〜１００ｎｇ／ｍｌの骨形成因子（ＢＭＰ−４）、例えば、約５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４、約１０〜１００ｎｇ／ｍｌの血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）例えば、約５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、約２５〜７５ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）、約２５〜７５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、約１０〜１００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−３（ＩＬ−３）、約１０〜１００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−６（ＩＬ−６）、所望により約２０〜４０ｎｇ／ｍｌの顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、所望により約２０〜４０ｎｇ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、所望により約０．２Ｕ／ｍｌのエリスロポエチン（ＥＰＯ）、所望により約２５ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン（ＴＰＯ）、および所望により約２５〜７５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２を添加されたＥＢ分化培地を使用する。ＥＢを１５ｍＬチューブに移し、それらの凝集体を約５分間静置させることにより培地を４日毎に交換することができる。ある特定の実施形態では、ＥＢ分化培地はＢＭＰ４（例えば、約１０〜１００ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（例えば、約１０〜１００ｎｇ／ｍｌ）、および所望によりＦＧＦ−２（例えば、約２５〜７５ｎｇ／ｍｌまたは約５０ｎｇ／ｍｌ）を含むことができる。幾つかの態様では、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦおよび所望によりＦＧＦ２を添加された初回ＥＢ分化培地を使用し、続いて上で示されたようにＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＴＰＯ、ＩＬ−６および／またはＩＬ−３を添加された第２ＥＢ分化培地において培養する。
【００５４】
上清を吸引し、新しい分化培地と交換することができる。あるいは、２日毎に細胞に新しい培地を半分ずつ供給することができる。それらの細胞を分化過程の間の異なる時点で回収することができる。
【００５５】
例えば、限定培地を使用して造血系ＣＤ３４＋分化を誘導することができる。上で詳述したように、その限定培地は増殖因子ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３および／またはＧＭＣＳＦを含有し得る。多能性細胞を、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、および所望によりＦＧＦ−２を含む第１限定培地の中で培養し、続いて（Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、およびＧＭＣＳＦ）か（Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−６、およびＴＰＯ）のどちらかを含む第２培地の中で培養することができる。その第１培地と第２培地はＳＣＦ、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＦＧＦ−２、および／またはＴＰＯのうちの１つ以上を含んでもよい。実質的な低酸素状態（例えば、２０％未満のＯ２）は造血系分化または内皮分化をさらに促進し得る。
【００５６】
細胞は機械的手段または酵素的手段により（例えば、トリプシンまたはＴｒｙｐＬＥ（商標）を用いて）実質的に個別化され得る。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫ阻害剤；例えば、Ｈ１１５２またはＹ−２７６３２）を培地に含めてもよい。これらのアプローチは、例えば、ロボットによる自動化を用いて自動化され得ると予想される。
【００５７】
多能性細胞の造血前駆細胞への造血系分化に限定的方法を用いることがある特定の例では好ましくあり得るが、それにもかかわらず非限定的アプローチが様々な実施形態において用いられ得る。ヒトＥＳＣから造血幹細胞を分化させるための１つの非限定的方法はマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー層またはマウス間質細胞株ＯＰ９などのフィーダー細胞上でＥＳＣを培養することを伴い、それによりＣＤ３４＋への強固な分化が誘導される。簡単に説明すると、ＥＳＣを増殖因子の存在下でＭＥＦ上に培養することができ、それらのＭＥＦはそれらの細胞へ基材とおそらくは幾つかの栄養を提供する。限定条件と対照的にＯＰ９細胞の使用は一般にＣＤ３４＋分化を誘導するために特別な増殖因子を必要としない。これらの過程が起こる機構は完全には理解されていない。このアプローチをある特定の増殖因子および血清と併用することもできる  （Ｗａｎｇ，  ２００７）。ＭＥＦは、多くの場合、ヒトＥＳＣの培養と維持にも使用される。下記のプロトコルなどのマウス胚性線維芽細胞上での培養を活用する方法はＦＢＳの代わりにＫｎｏｃｋｏｕｔ（商標）血清代替物を含むように改変され得る。
【００５８】
次の非限定プロトコルを多能性細胞の造血細胞への造血系分化のために用いることができる。Ｈ１細胞を日常的にＭＥＦ上で維持し、その後、αＭＥＭ＋２０％の限定ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯの中にほぼ集密状態のＯＰ９間質細胞上に１×１０５細胞／ウェル（１ウェルは９．６ｃｍ２である）の割合で移転させることができる。細胞に新しい培地を第２日と第４日に供給することができる。第７日にコラゲナーゼＩＶを使用して細胞を新しいＯＰ９細胞に移して１：３に分けることができる。細胞に新しい培地を第８日と第１０日に供給することができる。第１１日にコラゲナーゼＩＶを使用して細胞を新しいＯＰ９細胞に移して１：１に分け、続いてトリプシン／ＥＤＴＡにより個々の細胞を獲得し、且つ、培地をαＭＥＭ＋１０％の限定ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯに交換することができる。第１４〜１６日からさらに１ｍｌのこの培地を添加することにより細胞に栄養補給することができる。ある特定の実施形態では、ＯＰ９細胞が関与する分化方法は、全体が参照により具体的に組み込まれるＧａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６に記載されるように実施され得る。
【００５９】
Ｖ．限定培地と成分
本明細書に記載されるように、好都合にも１つ以上の限定培地を使用して多能性細胞の造血前駆細胞および／またはＮＫ細胞への造血系分化を促進することができる。とりわけ、血清およびマウスフィーダー層などの動物製品の排除により動物製品への細胞の曝露に関するリスクを減少させることができ、より安全にヒト対象へ投与され得るだろう細胞の作製が可能になる。伝統的な幹細胞培養物の発生は幹細胞の様々な細胞種への分化に適した血清製品とマウスフィーダー層に依存していたので、これらの伝統的手法は分化が実施され得る規模を制限し、生物学的変動性と汚染物混入の可能性を上昇させ、且つ、他の場合であれば有用であることが分かるところであるＥＳ細胞の応用治療法における使用を非常に妨げてきている。本実施形態に従って使用され得る様々な培地成分が下に詳述される。
【００６０】
Ａ．増殖因子
様々な増殖因子を使用して多能性細胞の造血前駆細胞への造血系分化を促進することができる。ある特定の実施形態では、本実施形態の限定培地は、例えば、（ＢＭＰ−４およびＶＥＧＦ）または（ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ＦＬＴ−３、ＩＬ−３、およびＧＭＣＳＦ）などの１つ、２つ、またはそれより多くの増殖因子を含有し得る。
【００６１】
本実施形態の限定培地に含めることができる増殖因子にはＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１５、インスリン関連増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン関連増殖因子２（ＩＧＦ２）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ）が含まれるが、これらに限定されない。本実施形態の限定培地はこれらの因子の内の１つ、２つ、３つ、またはそれより多くを含有し得る。例えば、細胞の増殖を向上させるために、または細胞の分化状態を調節するために他の増殖因子を限定培地に含めることができる。ある特定の実施形態では、限定培地は少なくとも（ＢＭＰ−４およびＶＥＧＦ、および所望によりＦＧＦ−２）または（ＦＬＴ−３、ＩＬ−３、およびＧＭＣＳＦ）を含有し得る。これらの実施形態では、必要ではないが、１つ以上の追加の増殖因子を限定培地に含めることができる。例えば、ＧＭＣＳＦは分化過程の第２段階で約２５ｎｇ／ｍｌのＴＰＯまたはＳＣＦを使用して置換され得る。様々な量（例えば、Ｙａｍａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８、Ｆａｄｉｌａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７、Ｂａｓｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７に記載の量）のこれらの因子を使用して細胞応答を刺激することができる。例えば、細胞の細胞増殖または分化を促進するために約１〜５０ｎｇ／ｍＬ、約５〜２５ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯを含めることができる。様々な実施形態では、ＳＣＦを約５〜１００ｎｇ／ｍＬまで、約１０〜５０ｎｇ／ｍＬまで、または約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で限定培地に含めることができる。様々な実施形態では、ＩＬ−６を約５〜５０ｎｇ／ｍＬまで、約５〜２５ｎｇ／ｍＬまで、または約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で限定培地に含めることができる。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は造血前駆細胞からの顆粒球の作製のために使用され得る。
【００６２】
１．ＢＭＰ−４
骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ−４）は骨形成タンパク質グループのメンバーであり、腹部中肺葉誘導物質である。ＢＭＰは成体のヒト骨髄（ＢＭ）において発現し、且つ、骨再形成と骨成長に重要である。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ４を含むことは培養の最初の２〜３日に必要とされるだけであり、その後はその系から取り除くことができ、分化に有害な効果は無い。
【００６３】
ＢＭＰ−４は造血前駆細胞の増殖能と分化能の調節に重要である  （Ｂｈａｒｄｗａｊ
ｅｔ  ａｌ．，  ２００１、Ｂｈａｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９、Ｃｈａｄｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。なお、ＢＭＰ−４はヒト胎児、新生児、および成体の造血前駆細胞における初期造血細胞発生を調節することができる  （Ｄａｖｉｄｓｏｎ
ａｎｄ  Ｚｏｎ，  ２０００、Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８、Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。例えば、ＢＭＰ−４は成体供給源および新生児供給源からの高純度未分化ヒト造血細胞（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の増殖と分化を調節することができ  （Ｂｈａｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）、ＢＭＰ−４はヒト胚性幹細胞において造血系分化を促進することができる  （Ｃｈａｄｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。
【００６４】
ＢＭＰ−４を約５〜１００ｎｇ／ｍＬ、約２０〜１００ｎｇ／ｍＬ、約２０〜５０ｎｇ／ｍＬ、約１０〜３０ｎｇ／ｍＬ、約１５〜３０ｎｇ／ｍＬ、約２０〜３０ｎｇ／ｍＬ、またはそれらの中に導き出せるあらゆる範囲の濃度で限定培地に含めることができる。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ−４は限定培地の中に約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含まれる。
【００６５】
２．ＶＥＧＦ
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は胚循環系の形成と血管形成に関与する重要なシグナル伝達タンパク質である。ＶＥＧＦは血管内皮および他の細胞種（例えば、ニューロン、癌細胞、腎臓上皮細胞）を含む様々な細胞種に影響を与え得る。インビトロではＶＥＧＦは内皮細胞の細胞分裂促進と細胞移動を刺激することができる。ＶＥＧＦ機能は癌、糖尿病、自己免疫疾患、および眼血管疾患を含む様々な疾患状態において重要であることも示されている。
【００６６】
ＶＥＧＦを約１０〜１００ｎｇ／ｍＬまで、約２０〜１００ｎｇ／ｍＬまで、約１０〜５０ｎｇ／ｍＬまで、約１５〜３０ｎｇ／ｍＬまで、約２０〜３０ｎｇ／ｍＬまで、約２０〜５０ｎｇ／ｍＬまで、またはそれらの中に導き出せるあらゆる範囲の濃度で限定培地に含めることができる。ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦは限定培地の中に約２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含まれる。
【００６７】
３．ＦＧＦ−２
塩基性線維芽細胞増殖因子はｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２とも呼ばれ、四肢神経系の発生、創傷治癒、および腫瘍増殖を含む広範囲の生物学的プロセスに関係があるとされている増殖因子である。ｂＦＧＦはヒト胚性幹細胞のフィーダー非依存増殖を支援するために使用されてきているが  （Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）、以前の研究より、ｂＦＧＦが造血細胞の発生または生存に影響を与える可能性はないことが示されている  （Ｒａｔａｊｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６．）。ある特定の実施形態では、ｂＦＧＦは分化誘導のために必要とされない。したがって、様々な実施形態では、それは本実施形態の培地に含まれ得る、または本実施形態の培地から除外され得る。
【００６８】
ｂＦＧＦを約５〜約１００ｎｇ／ｍＬまで、５〜約５０ｎｇ／ｍＬまで、約５〜約２５ｎｇ／ｍＬまで、約２５〜約５０ｎｇ／ｍＬまで、またはそれらの中に導き出せるあらゆる範囲の濃度で限定培地に含めることができる。ある特定の実施形態では、ｂＦＧＦは限定培地の中に約２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、または約７５ｎｇ／ｍＬの濃度で含まれる。これらの濃度は多能性細胞を未分化状態または実質的な未分化状態で維持するために使用される培地に特に有用であり得る。様々な実施形態では、ＦＧ２（例えば、約１００ｎｇ／ｍｌの）を細胞の多能性の維持のために使用することができる。造血系分化を促進するために細胞を約５〜５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度のＦＧＦ２に曝露することができる。
【００６９】
様々な実施形態では、より低い濃度のｂＦＧＦを造血系分化の前の「事前調整」培養期において限定培地に含めることができる。例えば、約５ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬまで、約１０ｎｇ／ｍＬから約３０ｎｇ／ｍＬまで、約１５ｎｇ／ｍＬから約２５ｎｇ／ｍＬまで、約５０ｎｇ／ｍＬ未満、約４０ｎｇ／ｍＬ未満、約３０ｎｇ／ｍＬ未満、または約１０、１５、２０、２５、または３０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを細胞の造血前駆細胞への分化前に多能性細胞の事前調整培養物における限定培地に含めることができる。ある特定の実施形態では、ｂＦＧＦ（例えば、約２５〜７５ｎｇ／ｍＬまたは約５０ｎｇ／ｍｌ）またはＦＧＦ−２と０．１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βを添加された増殖因子を含まないＴｅＳＲ培地を造血系分化の前の多能性細胞の事前調整培養物において使用することができる。ある特定の実施形態では、この事前調整ステップは後の造血系分化の誘導に必須であり得る。
【００７０】
多能性細胞が（例えば、ＴＧＦ−βとＦＧＦ−２を添加された増殖因子を含まないＴｅＳＲ培地中において約１日間）事前調整された後、次いでＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、およびＦＧＦ−２（例えば、約２５〜５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＥＢ分化培地の中に細胞を入れることができる。下の実施例に示されるように、ＦＧＦ−２を含むことによりｈＥＳＣまたはｉＰＳＣなどの多能性細胞の造血前駆細胞への造血系分化の効率が少なくとも２倍になり得る。
【００７１】
ある特定の実施形態では、酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ４、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１７またはＦＧＦ１８などの他の線維芽細胞増殖因子をｂＦＧＦと、例えば、上記の濃度で置換することができ、または共に含めることができると考えられる。あるいは、ＦＧＦ−２模倣化合物をＦＧＦ−２と置換して実質的または基本的に同じ作用を促進することができる。ＦＧＦ−２模倣物にはＦＧＦ−２模倣ペプチド、抗体、および小分子が含まれる。例えば、合成ペプチドＦ２Ａ４−Ｋ−ＮＳはＦＧＦ−２の作用をインビトロおよびインビボで模倣し  （Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）、且つ、本実施形態の様々な実施形態においてＦＧＦ−２と置換され得る。
【００７２】
ＦＧループ（ＦＧＬ）ペプチドは本実施形態のある特定の実施形態において使用することができるＦＧＦ−２模倣物の別の例である。ＦＧＬは、ＮＣＡＭのＦＧＦＲ１への結合部位の部分であるＮＣＡＭの第２のＦ３モジュール中の１５アミノ酸配列である。ＦＧＬはＦＧＦＲ１に結合、これを活性化すること、および神経突起伸長を刺激することが示されている  （Ｋｉｓｅｌｙｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。
【００７３】
ＢｉｏＳＥＴ  Ｆ２ＡペプチドもＦＧＦ−２と置換され得る。ＢｉｏＳＥＴ  Ｆ２Ａペプチド天然ヒトＦＧＦ−２増殖因子の合成模倣物である。ＢｉｏＳＥＴ  Ｆ２ＡペプチドとＦ２Ａ４−ＫＮＳペプチドはＦＹＩトルニエ社またはバイオサーフェイス・エンジニアリング・テクノロジーズ社（「ＢｉｏＳＥＴ」）より入手可能である。ＦＧＦ−２模倣化合物の組合せも本実施形態の様々な実施形態においてＦＧＦ−２と置換され得ることが考えられる。
【００７４】
４．ＩＬ−３
インターロイキン−３（ＩＬ−３）は多能性造血細胞の生存、増殖および分化に関与する造血性増殖因子である。ヒトを含む５種の哺乳類動物においてＩＬ−３をコードする遺伝子が単離され、発現されて成熟型組換えタンパク質を産出している。ヒトＩＬ−３遺伝子は２個の保存的システイン残基と２か所の可能性があるＮ−結合グリコシル化部位を有する１３３アミノ酸からなるタンパク質をコードする（Ｗａｇｅｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）。
【００７５】
ある特定の実施形態では、ＩＬ−３は本実施形態の培地の中に２．５〜約５０ｎｇ／ｍＬまで、２．５〜約５０ｎｇ／ｍＬまで、約５〜約５０ｎｇ／ｍＬまで、約５〜約２５ｎｇ／ｍＬまで、約５〜約１５ｎｇ／ｍＬまで、またはそれらの中に導き出せるあらゆる範囲の濃度で含まれる。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３は限定培地の中に約２．５、５、１０、１５、２０、２５、または約３０ｎｇ／ｍＬの濃度で含まれる。下の実施例に示されるように、Ｆｌｔ３リガンドとＩＬ−３は多能性細胞の造血前駆細胞への造血系分化に対して相乗的作用を及ぼし得る。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３を含むことは多能性細胞の培養の最初のおよそ１〜３週間に、または多能性細胞の造血系分化を促進するための培地の中での培養のおよそ５日目からおよそ７日目までに培地の中に含まれ、その後はその系から取り除くことができ、分化に有害な効果はほとんど、または基本的に無い。
【００７６】
５．ＦＬＴ３リガンド
Ｆｌｔ３リガンドはＦＬＴ−３リガンドとも呼ばれ、ＦＬＴ３の内在性リガンドである。ＦＬＴ３は未成熟造血前駆細胞によって発現される受容体チロシンキナーゼである。ＦＬＴ３のリガンドは経膜タンパク質または可溶性タンパク質であり、且つ、造血系細胞および骨髄間質細胞を含む様々な細胞によって発現される。他の増殖因子と組み合わせてＦｌｔ３リガンドは幹細胞、骨髄前駆細胞およびリンパ系前駆細胞、樹状細胞およびナチュラルキラー細胞の増殖および発生を刺激することができる。受容体の活性化により、造血細胞における増殖、生存および他のプロセスを制御する様々なシグナル伝達経路に関与することが知られている様々な重要なアダプタータンパク質のチロシンリン酸化が引き起こされる。ＦＬＴ３とＦＬＴ３に影響する突然変異は白血病の予後と治療など、病理学上の疾患にも重要である  （Ｄｒｅｘｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。
【００７７】
ある特定の実施形態では、Ｆｌｔ３リガンドは本実施形態の培地の中に５〜約１００ｎｇ／ｍＬまで、５〜約５０ｎｇ／ｍＬまで、約１０〜約３０ｎｇ／ｍＬまで、約１５〜約３０ｎｇ／ｍＬまで、約２０〜約３０ｎｇ／ｍＬまで、またはそれらの中に導き出せるあらゆる範囲の濃度で含まれる。ある特定の実施形態では、Ｆｌｔ３リガンドは限定培地の中に約２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含まれる。ある特定の実施形態では、Ｆｌｔ３リガンドは多能性細胞の培養の最初のおよそ１〜３週間に、または多能性細胞の造血系分化を促進するための培地の中での培養のおよそ５日目からおよそ７日目までに培地の中に含まれ、その後はその系から取り除くことができ、分化に有害な効果はほとんど、または基本的に無い。
【００７８】
６．顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子はＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭＣＳＦと略記されることもあり、マクロファージ、Ｔ細胞、肥満細胞、内皮細胞および線維芽細胞によって分泌されるタンパク質である。ＧＭＣＳＦは白血球増殖因子として機能し得るサイトカインであり、ＧＭＣＳＦは幹細胞を刺激して顆粒球（好中球、好酸球、および好塩基球）および単球を産生することができる。単球は血液循環より退出し、マクロファージに成熟することができる。したがって、ＧＭＣＳＦは免疫／炎症カスケードにおける役割を果たすことができ、それによって少数のマクロファージの活性化が、感染に立ち向かうための重要なプロセスであるそれらの数の急速な増加を引き起こすことができる。活性型のＧＭＣＳＦは通常インビボではホモ二量体として細胞外に見出される。ＧＭＣＳＦは酵母細胞内で発現されるとモルグラモスチムまたはサルグラモスチム（リューカイン）とも呼ばれる。ある特定の実施形態では、組換え技術により作製された増殖因子を使用して多能性細胞の造血系分化を促進することができる。
【００７９】
ある特定の実施形態では、ＧＭＣＳＦは本実施形態の培地の中に約２．５〜約１００ｎｇ／ｍＬまで、２．５〜約５０ｎｇ／ｍＬまで、約５〜約５０ｎｇ／ｍＬまで、約５〜約２５ｎｇ／ｍＬまで、約５〜約１５ｎｇ／ｍＬまで、またはそれらの中に導き出せるあらゆる範囲の濃度で含まれる。ある特定の実施形態では、ＧＭＣＳＦは限定培地の中に約２．５、５、１０、１５、２０、２５、または約３０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれる。ある特定の実施形態では、ＧＭＣＳＦリガンドを含むことは多能性細胞の培養の最初のおよそ１〜３週間に、または多能性細胞の造血系分化を促進するための培地の中での培養のおよそ５日目からおよそ７日目までに培地の中に含まれ、その後はその系から取り除くことができ、分化に有害な効果はほとんど、または基本的に無い。
【００８０】
７．幹細胞因子
幹細胞因子（ＳＣＦ）はＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）に結合するサイトカインである。ＳＣＦは「ＫＩＴリガンド」、「ｃ−ｋｉｔリガンド」、または「スチール因子」としても知られる。ＳＣＦは２つの形態で、すなわち、細胞表面結合型ＳＣＦと可溶性（または遊離型）ＳＣＦの形態で存在する。可溶性ＳＣＦは通常メタロプロテアーゼによる表面結合型ＳＣＦの切断によりインビボで産生される。ＳＣＦは造血幹細胞および他の造血前駆細胞の生存、増殖、および分化に重要であり得る。インビボではＳＣＦは赤血球系における最初期の赤血球前駆細胞であるＢＦＵ−Ｅ（赤芽球バースト形成単位）細胞をＣＦＵ−Ｅ（赤血球コロニー形成単位）に変えることができる。
【００８１】
ある特定の実施形態では、ＳＣＦは本実施形態の培地の中に約５〜約１００ｎｇ／ｍＬまで、５〜約５０ｎｇ／ｍＬまで、約１０〜約３０ｎｇ／ｍＬまで、約１５〜約３０ｎｇ／ｍＬまで、約２０〜約３０ｎｇ／ｍＬまで、またはそれらの中に導き出せるあらゆる範囲の濃度で含まれる。ある特定の実施形態では、ＳＣＦは限定培地の中に約２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含まれる。
【００８２】
８．ＩＬ−６
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は炎症誘発性サイトカインである。インビボではＩＬ−６はＴ細胞とマクロファージによって分泌され、且つ、炎症を引き起こす外傷または他の組織損傷に対する免疫応答を刺激する。ＩＬ−６はある特定の細菌に対する応答において役割を果たすこともでき、骨芽細胞はインビボでＩＬ−６を分泌して破骨細胞形成を刺激する。ヒトでは数多くの血管の中膜における平滑筋細胞が炎症誘発性サイトカインとしてＩＬ−６を産生することができ、ＩＬ−６は発熱の重要なインビボメディエーターである。
【００８３】
ある特定の実施形態では、ＩＬ−６は本実施形態の培地の中に約２．５〜約１００ｎｇ／ｍＬまで、２．５〜約５０ｎｇ／ｍＬまで、約５〜約５０ｎｇ／ｍＬまで、約５〜約２５ｎｇ／ｍＬまで、約５〜約１５ｎｇ／ｍＬまで、またはそれらの中に導き出せるあらゆる範囲の濃度で含まれる。ある特定の実施形態では、ＩＬ−６は限定培地の中に約２．５、５、１０、１５、２０、２５、または約３０ｎｇ／ｍＬの濃度で含まれる。
【００８４】
９．ＴＰＯ
トロンボポエチンまたはＴＰＯは主に肝臓と腎臓によってインビボで産生され、且つ、骨髄において血小板のインビボ産生に関与する糖タンパク質ホルモンである。ある特定の実施形態では、ＴＰＯは本実施形態の培地の中に約２．５〜約１００ｎｇ／ｍＬまで、５〜約７５ｎｇ／ｍＬまで、約１０〜約５０ｎｇ／ｍＬまで、約１５〜約３５ｎｇ／ｍＬまで、約２５ｎｇ／ｍｌ、またはそれらの中に導き出せるあらゆる範囲の濃度で含まれる。ある特定の実施形態では、ＴＰＯは限定培地の中に約２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含まれる。
【００８５】
Ｂ．ＲＯＣＫ阻害剤およびＰＫＣ阻害剤
本発明の一層さらなる態様では、ＥＳ細胞のアポトーシスを減少させる、または（例えば、細胞集団の分割中またはＥＢの形成前の）細胞の解離の後に生存を促進する分子などの追加の培地成分をＥＳ細胞増殖培地の中に含めることができる。限定培地はＥＳ細胞の播種、培養、維持、または分化のために使用され得、且つ、Ｒｈｏ非依存性キナーゼの阻害剤および／またはタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の阻害剤を含有し得る。ある特定の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤および／またはＰＫＣ阻害剤を使用して個別化後の多能性細胞の生存分化効率を向上させることができる。ある特定の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤および／またはＰＫＣ阻害剤を、ＴｅＳＲまたはｍＴｅＳＲ培地およびマトリックス成分を含む播種用培地に含めることができる。
【００８６】
ある特定の実施形態では、限定培地はＹ−２７６３２またはその誘導体のような１つ以上のＲｈｏ関連キナーゼ阻害剤を含み得る。さらに、幾つかの態様では、限定培地はＨＡ−１００を含み得る。
【００８７】
ＨＡ−１００またはＹ−２７６３２はＥＳ細胞増殖培地中に、例えば、約１〜１５μＭ、５〜１５μＭ、１〜３０μＭ、５〜３０μＭ、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０μＭ、またはそれらの中に導き出せるあらゆる範囲の濃度で存在し得る。ある特定の実施形態では、ＨＡ−１００またはＹ−２７６３２はＥＳ細胞増殖培地中に約１０〜２０μＭで存在する。
【００８８】
本実施形態に従うＥＳ細胞増殖培地に含めることができる他のＲＯＣＫ阻害剤にはＨ−１１５２（（Ｓ）‐（＋）‐２‐メチル‐１‐［（４‐メチル‐５‐イソキノリニル）スルホニル］ホモピペラジン）が挙げられる。Ｈ−１１５２はＨＡ−１００よりも約１０倍高い力価を示す。したがって、Ｈ−１１５２はＥＳ細胞増殖培地中に、例えば、約０．１〜１０μＭ、約０．５〜５μＭ、約１〜３μＭ、または約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、または５μＭ、またはそれらの中に導き出せるあらゆる範囲の濃度で存在し得る。ある特定の実施形態では、ＨＡ−１００はＥＳ細胞増殖培地中に約１μＭで存在する。個別化されたヒトＥＳ細胞の９６ウェルプレートにおける非常に効率的な（ＨＡ−１００と類似しているが、１０倍低い濃度での）播種を可能とするＨ−１１５２。他の場合であれば細胞集塊の状態で継代される個別化されたＨＥＳ細胞はより均一なウェル当たりの細胞密度を可能とし、それは細胞ベースの小分子スクリーニングの厳密な前提条件である。Ｈ−１１５２はこのように本実施形態に従う自動化細胞培養を伴うＥＳ細胞ベースの小分子スクリーニングのプロトコルにおいて使用され得る。Ｈ−１１５２は以前に、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＩｋｅｎｏｙａ  ｅｔ  ａｌ．
２００２  およびＳａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２に記載されている。
【００８９】
ＥＳ細胞増殖培地に含めることができる他のＲＯＣＫ阻害剤にはＹ−２７６３２、Ｎ−（４−ピリジル）−Ｎ’−（２，４，６−トリクロロフェニル）ウレア、３−（４−ピリジル）−１Ｈ−インドール、グリシル−Ｈ１１５２（（Ｓ）‐（＋）‐２‐メチル−４−グリシル−１−（４−メチルイソキノリニル−５−スルホニル）ホモピペラジン）および／またはＨＡ１１００（ヒドロキシファスジル（Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｕｓｄｉｌ））が挙げられる。Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド）はシグマ・アルドリッチ社から市販されており、以前に記載されている（例えば、Ｍａｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００を参照のこと）。
【００９０】
細胞生存を促進するために使用することができる例となるＲＯＣＫ阻害剤にはＨＡ１００、Ｈ１１５２、（＋）‐ｔｒａｎｓ‐４‐（１‐アミノエチル）‐１‐（ピリジン‐４‐イルアミノカルボニル）シクロヘキサンジヒドロクロリド一水和物（例えば、国際公開第０００７８３５１号、国際公開第０００５７９１３号）、イミダゾピリジン誘導体（例えば、米国特許第７３４８３３９号）、置換型ピリミジン誘導体およびピリジン誘導体（例えば、米国特許第６９４３１７２号）および置換型イソキノリンスルホニル化合物（例えば、欧州特許出願公開第００１８７３７１号）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
ＰＫＣ阻害剤をＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて、またはＲＯＣＫ阻害剤の代替物として使用することが予想される。例えば、造血前駆細胞への分化前に多能性細胞を解離または個別化させた後に、例えば、ＰＫＣ阻害剤を使用して細胞生存を促進することができる。使用することができるＰＫＣ阻害剤には、例えば、Ｖ５ペプチド（例えば、米国特許第７４５９４２４号）、ポリミキシンＢ、カルホスチンＣ、パルミトイル−ＤＬ−カルニチン、ステアロイルカルニチン、ヘキサデシルホスホコリン、スタウロスポリンおよびその誘導体、サンギバマイシン；サフィンゴール、Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン；塩化チェレリスリン、メリチン；塩化デカリニウム；エラグ酸、ＨＢＤＤＥ、１−Ｏ−ヘキサデシル−２−Ｏ−メチル−ｒａｃ−グリセロール、ヒペルシン（Ｈｙｐｅｒｃｉｎ）、Ｋ−２５２、ＮＧＩＣ−Ｊ、フロレチン、ピセアタンノール、クエン酸タモキシフェン、置換型ピペラジンおよびチアジン（例えば、米国特許第６８１５４５０号）が含まれる。
【００９２】
Ｃ．他の成分
限定培地は栄養素、アミノ酸、抗生物質、緩衝剤などのような追加の成分を含有することもできる。ある特定の実施形態では、本実施形態の限定培地は非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ペニシリン・ストレプトマイシン、およびモノチオグリセロールを含有し得る。
【００９３】
ＢＩＴ９５００（ステムセル・テクノロジーズ社、バンクーバー、カナダ）を本実施形態の限定培地中に、例えば、およそ約１０％から約３０％までの量で、または約２０％の量で含めることもできる。ＢＩＴ９５００はイスコブＭＤＭ中に事前試験済みのバッチのウシ血清アルブミン、インスリンおよびトランスフェリン（ＢＩＴ）を含有する。ＢＩＴ９５００は５０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＮａＨＣＯ３により緩衝）、５０μｇ／ｍＬのｒｈインスリン、１ｍｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン（鉄飽和済み）を含有する。ある特定の実施形態では、ＫＯＳＲは限定培地が必要とされない実施形態においてＢＩＴ９５００と置換され得る。ＫＯＳＲは（例えば、ギブコ／インビトロジェン社より、カタログ番号１０８２８）市販されており、以前に国際公開第９８／３０６７９号に記載されている非限定培地である。
【００９４】
ＢＩＴの使用は、上記のように、ＨＩＴによって置換され得る。ＨＩＴは、血清アルブミンなどの成分がヒトの成分（例えば、ヒト血清アルブミン）であることを除いてＢＩＴについて記載された組成物を含む。例えば、ＨＩＴの使用は可能性がある感染症などのリスクが特に懸念される実施形態において好ましくあり得る。
【００９５】
セラム・リプレイスメント３（シグマ・アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州）もＢＩＴ９５００と置換され得る。セラム・リプレイスメント３はヒトタンパク質だけ（すなわち、ヒト血清アルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒト組換えインスリン）を含有する。セラム・リプレイスメント３は増殖因子、ステロイドホルモン、グルココルチコイド、細胞接着因子、検出可能なＩｇまたは有糸分裂促進因子を含有しない。下の実施例に示されるように、セラム・リプレイスメント３を含むことは、ある特定の実施形態では、分化をさらに促進し得る。
【００９６】
様々な実施形態では、限定培地は１種以上のビタミン、ミネラル、塩、脂質、アミノ酸、または他の成分を含有し得る。例えば、本実施形態の限定培地はＴｅＳＲ培地に存在する１つ以上の成分を、例えば、ＴｅＳＲに含まれるのと同一または同等の濃度で含有し得る。
【００９７】
ＶＩ．細胞の分離
胚性幹細胞またはｉＰＳＣからの造血（例えば、ＣＤ３４＋、ＣＤ４３＋）前駆細胞の調製の後にその細胞集団からさらに進んだ細胞、または実質的に分化した細胞（例えば、造血前駆細胞、内皮細胞など）の１つ以上の亜集団を実質的に精製または分離することが望ましいことがあり得る。ＦＡＣＳなどのフローサイトメトリー、または磁気活性化細胞選別を用いる細胞分離の方法を用いて異種細胞集団から造血細胞を分離することができる。例となる細胞分離プロトコルも下の実施例に示されている。
【００９８】
Ａ．磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）
磁気活性化細胞選別機（ＭＡＣＳ）を使用して分化したｈＥＳＣから細胞を単離することができる。ＭＡＣＳは通常抗ＣＤ３４抗体などの抗体を磁性ビーズと組合せて利用してカラム上で細胞を分離する。ＭＡＣＳは、ある特定の実施形態では、おそらくはＦＡＣＳに伴う細胞へのレーザー照射のため、ＦＡＣＳと比べて細胞に対してより穏やかであり、細胞の生存性と完全性に好適に影響し得る。
【００９９】
ＭＡＣＳ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（商標）カラムまたはＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）（ミルテニー・バイオテック社、カリフォルニア州、米国）を含む様々なＭＡＣＳ製品が市販されており、それらは製造業者の指示書に従って使用され得る。ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ（ＥＤＴＡ無し）を細胞単離の緩衝液として使用することができる。幾つかの実験では、死細胞除去キット（ミルテニー・バイオテック社）を使用してＣＤ３４＋細胞の単離前に死細胞を除去することができる。必要であれば、繰返しＭＡＣＳカラムを使用することができる。
【０１００】
Ｂ．ＦＡＣＳ
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いてＣＤ３４＋細胞を分離することもできる。ＦＡＣＳは細胞を分離するために、例えば、蛍光タグを含む抗ＣＤ３４抗体への結合に起因して細胞により示される程度または蛍光を活用する。この様にＦＡＣＳは異種細胞集団から造血系ＣＤ３４＋細胞を分離するために使用され得る。
【０１０１】
例えば、次のプロトコルを用いて造血細胞を定量するためのＦＡＣＳを実施することができる。細胞は１％ＦＢＳまたは０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で調製され、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の組合せ、例えば、ＣＤ３１−ＰＥ（クローンＷＭ−５９）、ＣＤ３４−ＡＰＣ（クローン５８１、８Ｇ１２）、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ（クローンＨＩ３０）（全てＢＤファーミジェン社より）、およびＫＤＲ−ＰＥ（クローン８９１０６）（Ｒ＆Ｄシステム社）を用いて４℃で１５〜３０分間標識され得る。特定の抗体について１：５０希釈とＩｇＧ対照について１：２００希釈を用いることができる。試料はＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｓｂｕｒ（商標）（ベクトン・ディッキンソン社、ニュージャージー州、米国）または別の類似の機器により分析され得る。
【０１０２】
ＶＩＩ．バイオリアクターとロボットによる自動化
幹細胞の培養および／または多能性細胞からのＮＫ細胞の分化のための１つ以上のステップを自動化することができる。ロボットまたは他のものによる自動化を用いる工程の自動化により細胞の生産、培養、および分化のためのより効率的で経済的な方法が可能になり得る。例えば、ロボットによる自動化はヒト胚性幹細胞の培養、継代、培地の添加、分化培地の添加、分化培地での培養、および、例えば磁気分離またはＦＡＣＳを用いる細胞種の分離のうちの１つ以上に当たって活用され得る。
【０１０３】
バイオリアクターを本実施形態に従う細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、造血細胞など）の培養、維持、および／または分化のための本実施形態に当たって使用することもできる。バイオリアクターには細胞量の増加をもたらすために工程の「大規模化」を可能にするという利点がある。バッチバイオリアクター、フェドバッチバイオリアクター、連続バイオリアクター（例えば、連続撹拌タンクリアクターモデル）、および／またはケモスタットを含む様々なバイオリアクターを本実施形態に対して使用することができる。
【０１０４】
例えば、スピナーフラスコを使用して、増加した数の細胞の生産を可能にするために多能性細胞の維持および／または分化のための方法を大規模化することができる。ある特定の実施形態では、次のプロトコルを使用してスピナーフラスコにおけるにおけるＥＢ形成を促進することができる：未分化状態のｈＥＳＣとｉＰＳＣをマトリゲル被覆プレート上での無フィーダー培養に適応させ、且つ、集密時に、例えば、約３７℃で約５分間のＴｒｙｐＬＥ処理を用いて回収することができる。それらの細胞は、約２０％のＢＩＴ９５００（ステムセル・テクノロジーズ社）またはセラム・リプレイスメント−３（シグマ・アルドリッチ社）、約１％のＮＥＡＡ、約１ｍＭのＬ−グルタミン、および約０．１ｍＭのメルカプトエタノール、約０．７５％のＢＳＡ、約５０ｕｇ／ｍｌのアスコルビン酸および約１μＭのＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｈ−１１５２）を添加されたＩＭＤＭを含有するＥＢ基本培地中に回収され得る。その後、それらの細胞をｍｌ当たり約５０〜２００万細胞の密度でスピナーフラスコ（例えば、１２５ｍｌのコーニング社の）に入れることができる。スピナーを３０〜４０ｒｐｍに一晩設定してＥＢ形成を促進することができる。あるいは、それらの細胞を低結合性プレート中に静置条件下で２４時間置くことができるだろう。細胞密度および／またはスピナーフラスコの運動の速度は使用する特定のスピナーフラスコまたはバイオリアクターに応じて変わり得ることが一般に認識されている。およそ１２〜２４時間の培養の後にそれらの細胞を、例えば、約６０ＲＰＭの速度で回転するスピナーフラスコ内の磁気撹拌プラットフォーム上のＲＯＣＫ阻害剤を含まないがサイトカインを含むＥＢ分化培地の中に入れることができる。スピナーフラスコのサイドキャップを緩めてガス移動を可能にすることができる。それらの細胞をＢＭＰ−４、約ＶＥＧＦ、およびＦＧＦ−２が添加されたＥＢ基本培地中に入れることができる。分化のおよそ４日目に懸濁されたＥＢ凝集体がフラスコの底に１５〜２０分間定着できるようにスピナーフラスコを動かさずにいることによってそれらの細胞に栄養を供給することができる。その後、消費された培地を吸引することができる（例えば、１２５ｍｌのスピナー内に約２０ｍＬが残るようにする）。その後、それらの細胞を穏やかに回転させることができ、且つ、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、およびＦＧＦ−２を含有する新しい培地をそれらの細胞に添加することができる。実質的により早い、または遅い回転速度を利用することができることが予想されるが、スピナーフラスコを造血系分化の全過程を通して約４０〜６０ｒｐｍに設定することができる。分化のおよそ５〜６日目に消費された培地を上記のように吸引した。それらの細胞を追加の増殖因子が添加されたＥＢ基本培地に入れることができる。消費された培地を上記のようにおよそ８日目と１０日目に吸引することができる。ＥＢ培養物を分化のおよそ１２日目に回収することができる。細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ３４＋またはＣＤ４５＋）の表現型発現について染色して集団の造血前駆細胞量を定量することができる。
【０１０５】
本実施形態に関する使用が具体的に考えられるロボットによる自動化は、例えば、テカン社（カリフォルニア州、米国）から入手され得る。ロボット工学はキャップ穴開けプローブおよび試料間の持越しを最小化するための使い捨てチップなどの液体処理ツールを含み得る。様々な実施形態では、ロボット工学は（例えば、ｈＥＳＣの維持または増殖、ｈＥＳＣの造血細胞への分化、または赤血球などの後の系譜への造血細胞の分化などの間に）細胞を培養するための１つ以上のバイオリアクターと併せて利用され得る。下の実施例に示されるように、造血前駆細胞の維持と作製のための条件はテカンＣｅｌｌｅｒｉｔｙ（商標）システム（工業的に適当なロボットプラットフォーム）を使用して少なくとも部分的または完全に自動化され得る。テカンＣｅｌｌｅｒｉｔｙ（商標）は、テカン液体処理ロボット（Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ  ２００）、５００個のロボフラスコ（商標）に対する収容能力を有する自動化恒温器（Ｓｔｏｒｅｘ  ５００）、培地貯蔵冷蔵庫、Ｃｅｄｅｘ細胞計数器、懸濁液細胞の増殖および播種のためのスピナーフラスコ、およびプレートと８チャンネル固定化チップピペットを扱うためのＲＯＭＡロボットアームを装備している。ＥＢ分化プロトコルの一部、基本的に全て、または全てを自動化することができる。例えば、分化の１２日目にそれらの細胞をテカンＣｅｌｌｅｒｉｔｙシステムにより回収し、マーカーの細胞表面染色のために手作業で洗浄することができる。染色後にそれらの細胞を、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターに連結したＨｙｐｅｒｃｙｔを使用して分析することができる。この過程は造血前駆細胞集団のハイスループットスクリーニングに使用され得る。ある特定の実施形態では、未分化ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣは、例えば、マトリゲル（商標）被覆ロボフラスコ（コーニング社）を上記の方法により使用してロボット上で培養され得る。ＥＢの維持、播種、栄養供給、および／または回収は、例えば、テカンＣｅｌｌｅｒｉｔｙ（商標）システムを使用して部分的または完全に自動化され得る。このロボットはスピナーフラスコを含むための収容能力を有し、またはバイオリアクターが多数の細胞を作製するために使用され得る。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、本実施形態の方法を最小化または「小規模化」することが有用であり得る。これらのアプローチは、例えば、それらの方法が、例えば、細胞の脱分化または特定の系列への分化を促進し得る化合物のハイスループットスクリーンを含む場合に特に有用であり得る。ハイスループットスクリーンを用いて候補物質の１つ以上の特性（例えば、毒性、分化を促進する、または減少させる能力、など）を評価することもできる。それらの方法の小規模化は低結合性プレート（例えば、９６ウェルプレート）および／または低酸素（例えば、約２５％未満のＯ２または約５％のＯ２）条件下での細胞の培養の使用を伴い得る。ある特定の実施形態では、次の方法を使用することができる：マトリゲル被覆プレート上での無フィーダー培養に適応した未分化状態のｈＥＳＣまたはｉＰＳＣを、約０．１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦと約２０ｎｇ／ｍｌのゼブラフィッシュＦＧＦが添加された増殖因子を含まないＴｅＳＲを使用して２４時間事前調整することができる。それらの細胞は集密時に、例えば、約３７℃で約５分間のＴｒｙｐＬＥ処理を用いて回収され得る。それらの細胞は、約２０％のＢＩＴ９５００またはセラム・リプレイスメント−３、約１％のＮＥＡＡ、約１ｍＭのＬ−グルタミン、および約０．１ｍＭのメルカプトエタノール、約０．７５％のＢＳＡ、約５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸および約１μＭのＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｈ−１１５２）を添加されたＩＭＤＭを含有するＥＢ基本培地中に回収され得る。ＥＢ形成を開始するためにそれらの細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含有するＥＢ基本培地中にウェル当たり約１０万細胞の密度で低結合性９６ウェルプレートに入れることができる。使用する細胞の正確な濃度は同様の効果を達成するために変更され得ることが予想される。ＥＢ形成は低Ｏ２条件で播種物を培養することによっても促進され得る。約１２〜２４時間後に約５０ｎｇ／ｍｌの骨形成因子（ＢＭＰ−４）、約５０ｎｇ／ｍｌの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、および約２５ｎｇ／ｍｌのゼブラフィッシュＦＧＦ−２を含有するＥＢ分化培地にそれらの細胞を入れることができる。例えば、９６ウェルプレート内のウェル当たり約３００μｌの培地を使用することができる。分化のおよそ３〜４日目に、消費された培地の半量（例えば、１００〜１５０μｌの間）を穏やかに取り除き、そして、等量の新しい培地を加えることによりそれらの細胞に半分の栄養供給をすることができる。分化のおよそ５〜６日目に消費された培地を上記のように吸引することができ、且つ、それらの細胞を、例えば、（１）約２５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド、約１０ｍｇ／ｍｌのＩＬ−３および約１０ｎｇ／ｍｌＧＭＣＳＦ、または（２）約２５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド、約２５ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、約２５ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、約１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、および約１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６を含有する培地のどちらかが添加されたＥＢ基本培地に入れることができる。分化中のＥＢ培養物に新しい培地を上記のように分化のおよそ８日目と１０日目に半分供給することができる。ＥＢ培養物を分化のおよそ１２日目に回収することができる。これらのアプローチをうまく用いて様々な細���系列（例えば、赤血球、巨核球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、顆粒球）を作製することができ、且つ、ｉＰＳＣまたはｈＥＳＣを使用して同様の結果を得ることができる。
【０１０７】
本実施形態の方法は、個々の細胞をプレートに接着させるように細胞を誘導するための培地にＲＯＣＫ阻害剤のＨＡ１００および／またはＨ１１５２を含むことにより、ロボットによる自動化を用いて単一細胞アッセイに活用され得る。ロボット上で小分子ＨＡ１００またはＨ１１５２またはＹ−２７６３２の培養系への添加は、ＥＳ、ｈＥＳＣ、およびｉＰＳＣを含む多能性細胞の生存度を大いに改善させることができる。ある特定の実施形態では、ＴｅＳＲ培地における多能性細胞の生存は、特にそれらの細胞がタンパク質分解的または機械的に集塊に分離された、または個別化された後にＲＯＣＫ阻害剤またはａＰＫＣ阻害剤を含むことにより改善され得る。ＲＯＣＫ阻害剤は個別化されたｈＥＳ細胞の表面への接着と増殖を促進することができる。多能性細胞の維持または増殖、ならびに造血前駆細胞または特定の造血系列への分化の過程の幾つか、または全てを自動化することができる。自動化方法の全ての一部は限定条件を活用することができる。
【０１０８】
ＶＩＩＩ．人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）とその使用
本実施形態の幾つか態様はａＡＰＣおよびＮＫ細胞組成物の調製におけるその使用に関連する。抗原提示系の調製と使用に関する全般的な案内については、例えば、各々参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２２５，０４２号、第６，３５５，４７９号、第６，３６２，００１号および第６，７９０，６６２号、米国特許出願公開第２００９／００１７０００号および第２００９／０００４１４２号、および国際公開第２００７／１０３００９号）を参照のこと。
【０１０９】
ある特定の態様では、ＮＫ細胞の増殖のために使用されるａＡＰＣは（例えば、Ｋ５６２細胞の場合のように）ＭＨＣ／ＨＬＡクラスＩをほとんど、または全く発現しない。ＮＫ細胞増殖に具体的に適応されるａＡＰＣ系の例は、例えば、各々参照により本明細書に組み込まれるＤｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２、Ｃａｍｐａｎａ  ｅｔ  ａｌ．
２００９  およびＣｈｏ  ｅｔ  ａｌ．の概説，  ２００９の中に見出され得る。
【０１１０】
他の好ましい実施形態では、ａＡＰＣは不活化（例えば、化学処理または放射線照射）を受けることができ、その結果、不活化の後に細胞増殖または複製が基本的に起こらない。したがって、不活化はａＡＰＣの重要なＡＰＣ機能を維持し、一方、ａＡＰＣを使用して開発された細胞療法製品の安全性に対する懸念を軽減するのに役立つ。不活化とａＡＰＣに関する方法については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９００１７０００号を参照のこと。
【０１１１】
その後、不活化ａＡＰＣ培養物を治療上効果的なＮＫ細胞の集団の活性化と富化に適切であるように長時間の間に維持することができる。幾つかの態様では、ａＡＰＣは、ＮＫ細胞が増殖するときに周期的に（例えば、３日毎、５日毎または週毎）ＮＫ培養物に添加される。したがって、幾つかの態様では、ＮＫ細胞の増殖は２、３、４、５、１０またはそれより多くのａＡＰＣの共培養サイクルを含む。
【０１１２】
ＩＸ．細胞傷害性ＮＫ細胞の使用法
この系の効率の改善と成分の明確化によってｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ由来細胞の臨床応用が実現可能になる。現在のＮＫ細胞ベースの養子免疫療法はキログラム当たり約２×１０７細胞からなるＮＫ細胞含有臨床製品（通常約５０％のＮＫ細胞を含む）を使用する  （Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。我々のａＡＰＣを含まない方法は約１３×１０６個の未分化ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣ（約１枚の６ウェルプレート）からこの数のＮＫ細胞を提供するだろう。ａＡＰＣを使用することは患者当たり１０６個未満の未分化ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣしか現行のＮＫ細胞用量で必要とされないことを意味するだろう。
【０１１３】
この工程は、末梢血ＮＫ（ＰＢ−ＮＫ）細胞のために使用される個々のアフェレーシスドナーによって作製されるＮＫ細胞よりも実質的に多くのＮＫ細胞を単一の均一でよく特徴解析されている出発細胞集団から出発して作製するために用いられ得る。なお、これらの方法は、移植片対宿主病を防止するためにＴ細胞に対する抗ＣＤ３抗体とパッセンジャーリンパ球症候群を防止するためにＢ細胞に対する抗ＣＤ２０抗体の減損を必要とする細胞調整の量を末梢血のものと比べて減少させる。Ｔ細胞もＢ細胞も本方法の培養物に存在しない（Ｋａｕｆｍａｎ，  ２００９）。ＫＩＲとアロ反応性についての拡大する知識であって、特定のＫＩＲハプロタイプ（セントロメア性Ｂ／Ｂ）は同種異型造血幹細胞移植を受けている患者における残留白血病の除去に最適である（Ｃｏｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）ということを示す大規模コホートの対象において近年に確立された概念を用いて最適のＮＫ細胞「スーパードナー」を創出するために多様な遺伝的背景に由来するＮＫ細胞が作製され得るだろう。他の腫瘍を有する患者の治療の改善も、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、および骨髄腫細胞に対する細胞溶解活性を有するこれらのｈＥＳＣ由来細胞とｉＰＳＣ由来細胞を用いて実現可能であり得る（Ｗｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）（図４）。ＨＩＶまたは他の慢性ウイルス感染症の治療も可能であり得る（Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。なお、抗腫瘍および抗ウイルスキメラ抗原受容体を有するｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを設計して免疫療法のための標的化リンパ球の容易に入手可能な製品を提供することが可能であり得る（Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１、Ｔｏｒｉｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２、Ｋｎｏｒｒ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ，  ２０１０、Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。
【０１１４】
ｈＥＳＣ由来細胞とｉＰＳＣ由来細胞の臨床応用は着実に前進し続けている。実際に研究により、ｈＥＳＣから得られた網膜色素上皮細胞の送達が一つの型の黄斑変性を有する患者において安全であり、且つ、有効であり得ることが示されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ
ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ由来造血細胞の臨床使用は１０年間にわたって非常に興味深いものであった（Ｋａｕｆｍａｎ，  ２００９）。細胞数を厳密に考えると、治療のために充分なｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞を創出する能力は１ユニットの赤血球（ＲＢＣ）（ユニット当たり１０１２個のＲＢＣ）の作製に必要とされる細胞の数よりもありそうである。臨床応用により適切な非挿入方法を用いるヒトｉＰＳＣのより効率的な誘導に対する研究も前進している（Ｒｏｂｉｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｌｅｙ，  ２０１２）。それ故、多数の細胞傷害性ＮＫ細胞を作製する能力は、多様な臨床治療のためのｈＥＳＣ由来造血系製品およびｉＰＳＣ由来造血系製品の展望がそう遠くない将来に実現され得ることを意味する。
【実施例】
【０１１５】
Ｘ．実施例
次の実施例は本発明の好ましい実施形態を示すために含まれている。当業者は、これに続く実施例において開示される技術は本発明の実施においてよく機能すると発明者により発見された技術であり、したがって、本発明の実施の好ましい形態を構成すると考えられ得ることを理解すべきである。しかしながら、当業者は本開示に照らして、多くの変更を本発明の精神と範囲から逸脱することなく開示されている特定の実施形態に実行することができ、それでも同様または類似の結果を得ることができることを理解するべきである。
【０１１６】
（実施例１）
本実施形態の方法
図１は未分化幹細胞よりナチュラルキラー細胞を作製するための方法の実施形態の流れ図（１００）を示す。方法（１００）は未分化ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣなどの未分化幹細胞を使用する。その方法は、第１無血清培地の中に未分化幹細胞を配置すること（１０２）、遠心凝集により、第１無血清培地の中で未分化幹細胞を凝集させ（１０４）、且つ遠心ＥＢを形成すること、遠心ＥＢから前駆細胞の産生を誘導するために第１無血清培地の中で遠心ＥＢを培養すること（１０６）、および前駆細胞よりナチュラルキラー細胞を作製するための第２無血清培地の中で前駆細胞を培養すること（１０８）を含む。
【０１１７】
図２は前記の方法の流れ図（１００）をなぞる、流れ図（１００）を２段階、すなわち、（２０２）と（２０４）に分割する概略図を示す。ステージＩ（２０２）では造血前駆細胞が遠心ＥＢ（２０６）とその後の培養プロセス（２０８）によりｈＥＳＣまたはｉＰＳＣから作製される。細胞のステージ１からステージ２への直接移転（２１０）の後にステージ２（２０４）においてＮＫ細胞が作製される（２１２）。
【０１１８】
図３は、より凝集しやすい未分化幹細胞を作製するために細胞の分化を促進する前に未分化幹細胞（ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣ）を調製する（３０２）方法（３００）の実施形態を示す。それらの幹細胞は、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン社）中の幹細胞を低密度マウス胚様体線維芽細胞（例えば、９０，０００細胞／ウェルのＭＥＦ）上で最少でも１０継代の間継代させることにより調製され得る（３０２）。ｉＰＳＣについてはＵＣＢ由来ＣＤ３４＋造血前駆細胞から得られたＵＣＢｉＰ７株を使用することができる。ＴｙｐＬＥ適応ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣを作製し、６０％〜７０％辺りの集密度の培養物を解離させ、７０ミクロンの滅菌フィルターに通すことができる。どのような分化の兆候も欠く純粋なｈＥＳＣの培養物だけを使用することが好ましい。それらの細胞を通常ｈＥＳＣ培地の中で低密度ＭＥＦと１：１で、細胞増殖によって好ましくは１０継代目で起きる、より希釈された比率での継代が可能になるまで継代することができる。遠心ＥＢになるＴｒｙｐＬＥ通過ｈＥＳＣを樹立するために約７０％の集密度の適応した細胞をＴｒｙｐＬＥで解離させ、７０μｍのフィルターに通してあらゆる集塊を取り除く。調製ステップ（３０２）を除いて図３に示されるステップの残りは図２に示されるステップと実質的に同じである。よって、対応するステップは同じ参照文字を使用して特定化される。図３はフローサイトメトリーによって実施された第１１日の後の細胞分化の分析（３０４）を示し、前駆細胞がＣＤ３４とＣＤ４５を発現することを示す。
【０１１９】
前記の方法は第１無血清培地の中に未分化幹細胞を配置すること（１０２）を含む。第１無血清培地は、サイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、増殖因子、コロニー刺激因子、細胞結合タンパク質、またはそれらのあらゆる組合せを含むが、これらに限定されないナチュラルキラー細胞誘導性増殖因子を含む。第１無血清培地はＳＣＦ複合体、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を含み得る。例えば、幹細胞を、丸底９６ウェルプレートのウェル当たり幹細胞因子（ＳＣＦ、４０ｎｇ／ｍｌ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ）、および骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４、２０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＢＰＥＬ培地中に３０００細胞の濃度（１００μｌの体積）で第１無血清培地の中に入れることができる（１０２）。ＢＰＥＬ培地は２００ｍＬの体積で作製され得、且つ、イスコブの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、８６ｍＬ、インビトロジェン社）、Ｇｌｕｔａｍｘ  Ｉ含有Ｆ１２栄養混合物（８６ｍＬ、インビトロジェン社）、１０％の脱イオン化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、５ｍＬ、シグマ社）、５％ポリビニルアルコール（１０ｍＬ、シグマ社）、リノール酸（１ｍｇ／ｍＬ溶液の２０ｕＬ、シグマ社）、リノレン酸（１ｍｇ／ｍＬ溶液の２０ｕＬ、シグマ社）、シンセコール５００倍溶液（シグマ社）、α−モノチオグリセラル（シグマ社）、無タンパク質ハイブリドーマ混合物ＩＩ（インビトロジェン社）、アスコルビン酸（５ｍｇ／ｍＬ、シグマ社）、Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ（インビトロジェン社）、インスリン‐トランスフェリン‐セレニウム１００倍溶液（インビトロジェン社）、ペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロジェン社）を含有し得る。その後、プレートの外側のウェルを滅菌水で満たして培地の蒸発を防ぐ。
【０１２０】
前記の方法は遠心凝集により第１無血清培地の中で未分化幹細胞を凝集させ（１０４）、且つ遠心ＥＢを形成することを含む。遠心凝集はマウス間質を使用することが無い血液細胞分化のための遠心胚様体（遠心ＥＢ）プロトコルを用いる。マウス間質を使用することなく分化を誘導するための遠心ＥＢプロセスが類似の結果を達成すること、およびそのプロセスはマウス間質を使用するプロセスよりも効率的であることが発見されている。それらの細胞は、第１無血清培地の中で未分化細胞を凝集させ、且つ、遠心ＥＢを形成するために凝集させられる（１０４）。例えば、それらの細胞と培地を含有するプレートを室温で１，５００ＲＰＭ、５分間遠心して凝集させ、５％ＣＯ２を含む３７℃の恒温器に設置する。
【０１２１】
前記の方法は遠心ＥＢから前駆細胞の産生を誘導するために第１無血清培地の中で遠心ＥＢを培養すること（１０６）をさらに含む。その方法の実施形態はＭ２１０−Ｂ４マウス間質の非存在下で実施される胚様体を培養するステップ（１０６）を含む。その方法の別の実施形態はあらゆるマウス間質の非存在下で実施される胚様体を培養するステップ（１０６）を含む。培養ステップ（１０６）の間にプレートの中での遠心ＥＢの形成を確実にするためにそれらの細胞を第１無血清培地から少なくとも３日間取り出さないことが好ましい。遠心ＥＢ分化は８〜１１日間、または９〜１２日間、または好ましくは１１日間のこれらの条件下で促進される。
【０１２２】
図４Ａは第７日の後（４０２）、第９日の後（４０４）、および第１１日の後（４０６）の細胞分化の結果を示す。前記の方法は、ＣＤ３４を発現するＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４とＣＤ４３を共発現するＣＤ３４＋ＣＤ４３＋細胞、および／またはＣＤ３４とＣＤ４５を共発現するＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞を含む前駆細胞を作製する。図４Ｂはフローサイトメトリーによって実施された細胞分化の分析を示す。フローサイトメトリーは次の抗体：全てベクトン・ディッキンソン社から入手することができるＣＤ３４−ＡＰＣ、ＣＤ４５−ＰＥ、ＣＤ３１−ＰＥ、ＣＤ３１−ＡＰＣ、ＣＤ−７３ＰＥ、ＣＤ４３−ＰＥ、ＮＫｐ４６−ＰＥ、ＮＫｐ４４−ＰＥ、ＣＤ５６−ＡＰＣ、ＣＤ１６−ＰｅｒｃｐＣｙ５．５、ＣＤ１１７−ＰｅｒｃｐＣｙ５．５、ベックマン・コールター社より入手することができるＣＤ１５８ａ／ｈ−ＰＥ、ＣＤ１５８ｊ−ＰＥ、ＣＤ１５８ｉ−ＰＥ、ＣＤ１５８ｅ１／ｅ２、ＣＤ１５９ａ−ＰＥおよびＣＤ１５９ａ−ＡＰＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｎｃｅ社から入手することができるＣＤ１０７ａＰｅｒｃｐＣｙ５．５およびＩＮＦ−γ  ＰａｃＢｌｕｅを使用して実施され得る。フローサイトメトリーはＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒまたはＬＳＲＩＩで実行され得、ＦｌｏｗＪｏ（ツリースター社）を使用してデータ解析され得る。図４Ｂは、例えば、ＣＤ３４を発現するｈＥＳＣ由来造血細胞（５５．９±６．４％）を示し、多くがＣＤ４３（４１．８±９．５１％）またはＣＤ４５（２６．２±６．６％）を共発現する。図４ＢはＣＤ３４（１２．０６±５．４０％）およびＣＤ４５（３．２０±１．４３％）を発現するｉＰＳＣ由来造血細胞も示す。図４ＣはＣＤ３４のみを発現する遠心ＥＢの一例とＣＤ４５、ＣＤ４３、ＣＤ３１、およびＣＤ７３とのＣＤ３４の共発現のパーセンテージを示す。
【０１２３】
遠心ＥＢ分化を誘導するための細胞の培養（１０６）から８〜１１日後、または９〜１２日後、または好ましくは１１日後にウェルプレートを別のウェルに直接移して前駆細胞からナチュラルキラー細胞を作製するための第２無血清培地の中での培養（１０８）を開始することができる。その方法は、遠心ＥＢの培養ステップと前駆細胞の培養ステップの間に前駆細胞が発現する糖タンパク質に基づいて前駆細胞を選別するための細胞選別の必要性を除外する。図４Ｄに示されるように、得られたＮＫ細胞はＫＩＲ、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、およびアポトーシス誘導リガンドＴＲＡＩＬを含む様々なエフェクター分子を発現することもできる。
【０１２４】
第２無血清培地は、サイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、増殖因子、コロニー刺激因子、細胞結合タンパク質、またはそれらのあらゆる組合せを含むが、これらに限定されないＮＫ細胞惹起増殖因子を含む。例えば、第２無血清培地はＳＣＦ複合体、ＶＥＧＦ、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含み得る。例えば、第２無血清培地はＩＬ３、インターロイキン７（ＩＬ７）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）、ＳＣＦ複合体、およびＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を含み得る。未分化幹細胞よりナチュラルキラー細胞を作製するための方法の実施形態では、第２無血清培地の中で前駆細胞を培養するステップは外来性間質細胞が存在しない状態にある。未分化幹細胞よりナチュラルキラー細胞を作製するための方法の実施形態では、第２無血清培地の中で前駆細胞を培養するステップはＥＬ０８−１Ｄ２外来性間質細胞が存在しない状態にある。例えば、上記の例の遠心ＥＢ分化の９６ウェルプレートの６ウェルを、サイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、増殖因子、コロニー刺激因子、細胞結合タンパク質、またはそれらのあらゆる組合せを含むが、これらに限定されないＮＫ細胞惹起増殖因子の２４ウェルプレートの１つのウェルに直接移すことができる。それらの２４ウェルプレートはウェル当たり１００，０００個の放射線照射（３０００ｒａｄ）ＥＬ０８−１Ｄ２細胞を含有することができる。６ウェルの遠心ＥＢを未被覆２４ウェルプレートに直接移すことができる。その方法により、ＣＤ５６、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄを発現するナチュラルキラー細胞が作製される。
【０１２５】
培養ステップ（１０８）は約４週間かかることがあり得る。直接移転（培養ステップ（１０８）の開始）後から最初の２週間の内にＥＬ０８−１Ｄ２間質を用いて観察されるものと同様のレベルで遠心ＥＢから非接着性造血細胞の増殖が存在する。なお、培養ステップ（１０８）は細胞にそれら自体の接着性細胞を培養下で産生させる。言い換えると、遠心ＥＢ細胞は外来性間質細胞が存在しない状態でそれら自体の遠心ＥＢ間質細胞層を培養物中に産生する。遠心ＥＢ間質細胞層はＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−Ｅ）に加えて高レベルのＣＤ３１およびＣＤ７３を発現し、それらはＮＫ細胞の発生とキラー免疫グロブリン様受容体１０の獲得に重要である。なお、遠心ＥＢ間質細胞はＵＣＢ由来ＣＤ３４＋細胞からのＮＫ細胞の発生も支援する。これらの限定条件を用いて培養物はＥＬ０８−１Ｄ２間質細胞を利用する条件と類似するＮＫ細胞を含有する。これらの細胞は成熟ＮＫ細胞表現型を発現し、且つ、それらの間質由来の相対物と全く同程度に細胞傷害性を有する。これらの細胞はサイトカインＩＦＮ‐γを分泌することもできる。これらのデータは、あらゆる選別またはマウス間質細胞の支援も無い状態での機能的細胞傷害性リンパ球のインビトロ誘導の成功を示す。異種フィーダー層が無いので、これはＮＫ細胞の育成、ならびに養子免疫療法のための１つの明確なヒト供給源を研究するための遺伝子操作可能な系を提供する。
【０１２６】
ＮＫ細胞が発生した後にそれらのＮＫ細胞を人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）とさらに共培養してＮＫ細胞をさらに増殖させることができる。図５は未分化幹細胞よりナチュラルキラー細胞を作製するための方法の別の実施形態の流れ図（５００）を示す。流れ図（５００）は図１に示されるステップ（１０２）、（１０４）、（１０６）、（１０８）と類似のステップ（５０２）、（５０４）、（５０６）、（５０８）を示す。流れ図（５００）は、第１無血清培地の中に未分化幹細胞を配置すること（５０２）、遠心凝集により、第１無血清培地の中で未分化幹細胞を凝集させ（５０４）且つ遠心ＥＢを形成すること、遠心ＥＢから前駆細胞の産生を誘導するために第１無血清培地の中で遠心ＥＢを培養すること（５０６）、前駆細胞からナチュラルキラー細胞を作製するために第２無血清培地の中で前駆細胞を培養すること（５０８）、放射線照射ａＡＰＣを作製するために放射線で人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を照射すること（５１０）、およびナチュラルキラー細胞を放射線照射ａＡＰＣと共培養すること（５１２）を示す。共培養培地はインターロイキン２（ＩＬ−２）を含むこともできる。本方法の実施形態では、共培養ステップは１：１の放射線照射ａＡＰＣに対するナチュラルキラー細胞の比率を有する。
【０１２７】
クローン９．ｍｂＩＬ−２１を使用してａＡＰＣは得られたＮＫ細胞のさらに２〜３倍の対数増加を引き起こすことができる。それらのａＡＰＣ増殖細胞はそれらのＮＫ細胞表現型ならびにインビトロ活性を維持する。これらのｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞は２か月よりも長い期間に培養下で維持され得、断続的に増殖させられ得る。
【０１２８】
図６Ａは人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を用いるＮＫ細胞増殖を示す。ａＡＰＣと１×１０６個のｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞を含有する培養物を第１０日、第２１日、第４９日および第７０日にＮＫ細胞の増殖について評価した（第１０日と第２１日：ｎ＝４、第４９日と第７０日：ｎ＝２）。図６ＢはＮＫ細胞培養物について３週間の増殖の後の分析を示し、その分析はＮＫ細胞が増殖前の表現型を維持し、且つ、比較対象の増殖済みＰＢ−ＮＫ細胞に類似していることを示す。各細胞培養物はＣＤ９４＋ＣＤ１１７−のままであるＣＤ５６＋ＮＫ細胞の純粋培養物を含有することができる。各細胞培養物は高レベルのＫＩＲ、ＣＤ１６およびＮＫＧ２Ａを発現することができ、わずかなパーセンテージな細胞しかＮＫＧ２Ｃを発現しない（ｎ＝３）。図６Ｃは、増殖したＮＫ細胞がＫ５６２標的に対する標準５１クロム放出細胞傷害アッセイにおいて試験されると（それぞれに対してｎ＝３）、癌細胞を殺滅するそれらのインビトロ機能を維持していることを示す。さらに、ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞およびｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞がＨＩＶ感染細胞を殺滅することが研究から示されている。
【０１２９】
この系の効率の改善と成分の明確化によってｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ由来細胞の臨床応用が実現可能になる。現在のＮＫ細胞ベースの養子免疫療法はキログラム当たり約２×１０７細胞からなるＮＫ細胞含有製品（〜５０％のＮＫ細胞）を使用する。図１に示される工程は約１３×１０６個の未分化ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣからこの数のＮＫ細胞を提供することができる。図５に示されるように、ａＡＰＣ共培養プロセスを付け加えることにより、患者当たり１０６個未満の未分化ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣしか現行のＮＫ細胞用量で必要とされない。
【０１３０】
比較として、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣからのＮＫ細胞の作製は造血系分化を支援するマウス間質との共培養を必要とする方法によって実施され得る。図７の流れ図（７００）はＭ２１０−Ｂ４を使用する間質細胞共培養による造血系分化（７０２）の比較的方法を示す。未分化ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣを胎児ウシ血清（ＦＢＳ）中で１４〜２４日間、および好ましくは２１日間共培養する。これらの条件下でＣＤ３４＋細胞および／またはＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞を含む造血前駆細胞をｈＥＳＣまたはｉＰＳＣから発生させることができる（フローサイトメトリーによる分析（７０４）によって示される）。その後、この比較的方法において、ＣＤ３４＋細胞および／またはＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞を他の培養細胞から陽性選別するために細胞選別（７０６）が実施されなければならない。細胞選別（７０６）は磁気選別または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって実施され得る。その後、選別されたＣＤ３４＋細胞および／またはＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞を、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞からのＮＫ細胞の発生のために（サイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、増殖因子、コロニー刺激因子、細胞結合タンパク質、またはそれらのあらゆる組合せを含むが、これらに限定されない）ナチュラルキラー細胞誘導性増殖因子を用いるＮＫ細胞発生条件においてＥＬ０８−１Ｄ２細胞を用いる間質細胞共培養（７０８）に移す。約４〜５週間の後に成熟ＮＫ細胞が通常発生する。
【０１３１】
図８Ａ〜８Ｃは図７に開示される方法を使用することによりｈＥＳＣおよびｉＰＳＣから生じたＮＫ細胞の特性の例を示す。２つの異なるｈＥＳＣ株（Ｈ１およびＨ９）および３つの異なるｉＰＳＣ株（ＢＪ１−ｉＰＳ１２、ＵＣＢｉＰＳ７、およびＤＲｉＰＳ１６）が示されている。図８Ａはそれらの幹細胞株のそれぞれについて各細胞株のＣＤ３４とＣＤ４５の発現を示す。図８Ｂはそれらの細胞株のそれぞれの３４／４５発現比率のパーセントを示す。図８Ｃはそれらの細胞株から得られたＮＫ細胞（ＰＢ−ＮＫ、ＵＣＢ−ＮＫ、ＵＣＢ−ｉＰＳ７−ＮＫ、ＤＲｉＰＳ１６−ＮＫ、Ｈ９−ＮＫ、Ｈ１−ＮＫ）の腫瘍標的に対する細胞傷害性を示す。
【０１３２】
癌細胞を殺滅するための方法は上で開示されたＮＫ細胞を作製するための方法を含み、ＮＫ細胞を取り出し、且つ、ＮＫ細胞を癌細胞に送達することをさらに含む。送達ステップは、動物またはヒトの循環系へのＮＫ細胞の静脈内注射によることがあり得る。あるいは、ＮＫ細胞は腹腔内注射されるか、癌細胞に直接、または癌細胞の近傍へ注射されることがあり得るだろう。図９は細胞傷害性比較分析の結果を示す。細胞傷害性比較分析ではルシフェラーゼ標識白血病癌細胞株をマウスに注射した。３日後にそれらのマウスのうちの１匹を臍帯血（ＵＣＢ）由来ＮＫ細胞で処置し、別のマウスをｈＥＳＣ−ＮＫ細胞で処置した。図９は対照マウス（９０２）、ＵＣＢ由来ＮＫ細胞を受領したマウス（９０４）、およびｈＥＳＣ−ＮＫ細胞を受領したマウス（９０６）の間の細胞傷害性比較の結果を示す。２１日後には非注射対照（９０２）における癌細胞はマウス全体に広がった。ＵＣＢ由来ＮＫ細胞はマウス（９０４）においてある程度まで増殖を抑制することができた。ｈＥＳＣ−ＮＫ細胞はマウス（９０６）において癌細胞を排除した。これらの結果は癌細胞を急速に効率的に排除するｈＥＳＣ−ＮＫ細胞の能力を示す。したがって、ｈＥＳＣ−ＮＫ細胞とｉＰＳＣ−ＮＫ細胞は直接細胞介在性細胞傷害と抗体依存的細胞性細胞傷害性の両方によりヒト腫瘍細胞を溶解することができる。さらに、活性化ｈＥＳＣ−ＮＫ細胞およびｉＰＳＣ−ＮＫ細胞はサイトカイン産生を上方制御する。よって、ｈＥＳＣ−ＮＫ細胞は新規の臨床治療法のための抗腫瘍リンパ球の「普遍的」供給源として役立つことができるだろう。さらに、ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞はｈＥＳＣ−ＮＫ細胞と同程度に癌細胞を急速に効率的に排除する類似の能力を有する。ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞は癌細胞の殺滅のために上に開示された方法を使用して患者に特有の基盤より効率的に得ることができることが期待される。
【０１３３】
（実施例２）
癌治療のためのヒト多能性幹細胞からのナチュラルキラー細胞の臨床規模の誘導
ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣの維持と間質細胞介在性分化
ｈＥＳＣ（Ｈ９およびＨ１）およびｉＰＳＣ（ＵＣＢｉＰＳ７、ＮＨＤＦ−ｉＰＳ、ＢＪ１−ｉＰＳ）をマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で維持した。Ｍ２１０−Ｂ４細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関、マナサス、バージニア州）上での造血前駆細胞の間質細胞介在性分化を以前に記述されたように（Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０、Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９、Ｗｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）実行した。簡単に説明すると、未分化ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣを、ＲＰＭＩ１６４０（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）、１５％の限定胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（ハイクローン社、ローガン、ユタ州）、２ｍＭのＬ−グルタミン（セルグロ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）社、マナサス、バージニア州）、１％の非必須アミノ酸（インビトロジェン社）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロジェン社）、および０．１ｍＭのβ‐メルカプトエタノール（インビトロジェン社）を含有する培地中でＭ２１０−Ｂ４上に配置した。培地を週に３回交換し、１８〜２１日後にＣＤ３４＋ＣＤ４５＋前駆細胞濃縮（Ｗｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）のために細胞を回収した。１００，０００個のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞を１ｍＬのＮＫ細胞惹起サイトカイン（インターロイキン［ＩＬ］−３、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、幹細胞因子［ＳＣＦ］、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体−３リガンド［ＦＬＴ３Ｌ］、全てニュージャージー州、ロッキーヒルのペプロテック社より）と共にＥＬ０８−１Ｄ２間質上に配置した。ＮＫ細胞培養物には４〜５日毎に０．５ｍＬのサイトカイン含有培地が注がれた。成熟ＮＫ細胞をＥＬ０８−１Ｄ２上での培養から２８〜３５日の時点で測定した。
【０１３４】
遠心ＥＢの作製
凝集しやすい遠心ＥＢを作製するためにｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを低密度ＭＥＦ（例えば、９０，０００細胞／ウェル）上のＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン社）中において最少でも１０継代の間継代させた。遠心ＥＢ試験について、発明者らは将来のインビボ実験のために緑色蛍光タンパク質／ホタルルシフェラーゼコンストラクト（Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）  で改変されたＨ９株を使用した。ｉＰＳＣについて、発明者らは臍帯血（ＵＣＢ）ＣＤ３４＋造血前駆細胞に由来するＵＣＢｉＰ７株を試験した。ＴｙｐＬＥ適応ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣを作製するため、約６０％〜７０％集密状態の培養物を解離させ、７０μｍの滅菌フィルターに通した。どのような分化の兆候も欠く純粋なｈＥＳＣの培養物だけを使用した。細胞を通常ｈＥＳＣ培地の中で低密度ＭＥＦと１：１で、細胞増殖によって通常１０継代目辺りで起きる、より希釈された比率での継代が可能になるまで継代した。ステージＩの遠心ＥＢになるＴｒｙｐＬＥ通過ｈＥＳＣを樹立するために約７０％の集密度の適応した細胞をＴｒｙｐＬＥで解離させ、７０μｍのフィルターに通してあらゆる集塊を取り除いた。その後、細胞を計数し、丸底９６ウェルプレートのウェル当たりＳＣＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）、血管内皮細胞増殖因子（２０ｎｇ／ｍｌ）、および骨形成タンパク質４（２０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＢＰＥＬ（ウシ血清アルブミンポリビニルアルコール基本脂質）培地中に３０００細胞の濃度（１００μｌの体積）で配置した。ＢＰＥＬ培地は２００ｍｌの体積で作製され、且つ、イスコブの改変ダルベッコ培地（８６ｍｌ；インビトロジェン社）、ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ含有Ｆ１２栄養混合物（８６ｍｌ；インビトロジェン社）、１０％の脱イオン化ウシ血清アルブミン（５ｍＬ；シグマ・アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州）、５％ポリビニルアルコール（１０ｍｌ；シグマ・アルドリッチ社）、リノール酸（１ｍｇ／ｍｌ溶液の２０μＬ、シグマ・アルドリッチ社）、リノレン酸（１ｍｇ／ｍｌ溶液の２０μＬ、シグマ・アルドリッチ社）、シンセコール５００倍溶液（シグマ・アルドリッチ社）、α−モノチオグリセラル（シグマ・アルドリッチ社）、無タンパク質ハイブリドーマ混合物ＩＩ（インビトロジェン社）、アスコルビン酸（５ｍｇ／ｍｌ、シグマ・アルドリッチ社）、ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（インビトロジェン社）、インスリン‐トランスフェリン‐セレニウム１００倍溶液（インビトロジェン社）、ペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロジェン社）を含有した。プレートの外側のウェルを滅菌水で満たして培地のあらゆる蒸発を防いだ。その後、プレートを室温で１，５００ＲＰＭ、５分間遠心して凝集させ、５％ＣＯ２を含む３７℃の恒温器内で平静に設置した。プレートの中での遠心ＥＢの形成を確実にするために細胞を少なくとも３日間取り出さなかった。
【０１３５】
遠心ＥＢからのＮＫ細胞分化
遠心ＥＢ分化の１１日目に９６ウェルプレートの６ウェルを上記のＮＫ細胞惹起増殖因子の２４ウェルプレートの１つのウェルに直接移した。最初、それらの２４ウェルプレートはウェル当たり１００，０００個の放射線照射（３０００ｒａｄ）ＥＬ０８−１Ｄ２細胞を含有した。完全限定条件について、６ウェルの遠心ＥＢを未被覆２４ウェルプレートに直接移した。分析日に各ウェルを回収、濾過、および洗浄した。
【０１３６】
フローサイトメトリー
次の抗体を使用した：全てベクトン・ディッキンソン社（フランクリンレイクス、ニュージャージー州）からのＣＤ３４−ＡＰＣ、ＣＤ４５−ＰＥ、ＣＤ３１−ＰＥ、ＣＤ３１−ＡＰＣ、ＣＤ−７３ＰＥ、ＣＤ４３−ＰＥ、ＮＫｐ４６−ＰＥ、ＮＫｐ４４−ＰＥ、ＣＤ５６−ＡＰＣ、ＮＫＧ２Ｄ−ＰＥ、ＴＲＡＩＬ−ＰＥ、ＦＡＳリガンド−ＰＥ、ＣＤ１６−ＰｅｒｃｐＣｙ５．５、およびＣＤ１１７−ＰｅｒｃｐＣｙ５．５、ベックマン・コールター社（フラートン、カリフォルニア州）から得たＣＤ１５８ａ／ｈ−ＰＥ、ＣＤ１５８ｊ−ＰＥ、ＣＤ１５８ｉ−ＰＥ、ＣＤ１５８ｅ１／ｅ２、およびＣＤ１５９ａ−ＰＥおよびＣＤ１５９ａ−ＡＰＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（サンディエゴ、カリフォルニア州）から得たＣＤ１０７ａＰｅｒｃｐＣｙ５．５およびＩＮＦ−γＰａｃＢｌｕｅ。フローサイトメトリーはＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒまたはＬＳＲＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社、サンディエゴ、カリフォルニア州）で実行され、データはＦｌｏｗＪｏ（ツリースター社、アシュランド、オレゴン州）を使用して解析された。
【０１３７】
遺伝子発現
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のために全ＲＮＡがＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州）を使用して細胞から調製された。全ＲＮＡの単離に続いて相補性ＤＮＡがＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（ライフテクノロジーズ社、グランドアイランド、ニューヨーク州）を使用して作製された。その後、ＲＴ−ＰＣＲがペルティア・サーマルサイクラー２００を使用して表１に記載されるプライマーとサイクル数で生じたｃＤＮＡに対して実施された。アニーリング温度はＯＣＴ４を除く全てのプライマーについては５５℃に設定され、ＯＣＴ４は６０℃のアニーリング温度を有した。その後、ＰＣＲの産物を電気泳動により０．９％アガロースゲルで分離した。
【表１】
2019122415.tif 000002
【０１３８】
インビトロ細胞傷害
腫瘍標的（Ｋ５６２、ＳＶＰ１０、Ｓ２０１３、ＯＰＭ２、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６）をクロム５１（５１Ｃｒ）と共に３７℃で２時間保温し、３回洗浄し、表示されているエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比率でＮＫ細胞と共培養した。４時間の期間の後に細胞を回収し、分析した。特異的な５１Ｃｒ溶解が次の等式を使用して計算された：特異的溶解のパーセンテージ＝１００×（試験放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）。リダイレクト抗体依存的細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイについてＰ８１５標的を上記のように保温した。標的細胞へのＮＫ細胞の添加の３０分前にエフェクターをアイソタイプ対照（カタログ番号４００１５３；バイオレジェンド社、サンディエゴ、カリフォルニア州）またはＮＫｐ４６抗体（カタログ番号３３１９０４；バイオレジェンド社）のどちらかと保温した。５時間の保温の後に細胞を回収し、上記のように分析した。
【０１３９】
ＣＤ１０７ａアッセイとＩＦＮγアッセイ
ＮＫ細胞を１：１のエフェクター対標的比率でＫ５６２標的と共に、またはＫ５６２標的を含まずに保温した。ＣＤ１０７ａ−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５抗体を各ウェルに添加し、１時間保温した。その後、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐとＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤバイオサイエンス社）を各ウェルに添加し、さらに４時間保温した。保温の完了時に細胞を洗浄し、ＣＤ５６ＡＰＣで染色し、氷上において２％のパラホルムアルデヒドで１０分間固定した。その後、細胞は１％のサポニンを４℃で２０分間用いて透過処理され、洗浄され、ＩＦＮγについて染色された。
【０１４０】
間質細胞機能性アッセイ
ＮＫ細胞培養物の中で得られた間質に特徴的な内皮細胞と間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を評価するため、非接着性細胞を最初に洗い流し、その後、接着層をトリプシン処理し、洗浄した。細胞を内皮マーカー（ＣＤ３１）およびＭＳＣマーカー（ＣＤ７３）、ならびに造血系マーカー（ＣＤ４５）、単球／マクロファージマーカー（ＣＤ１４、ＣＤ１５）、および樹状細胞マーカー（ＣＤ１１ｃ）で染色した。ＮＫ細胞発生を支援する間質細胞層（ＥＬ０８−１Ｄ２、ヒト臍静脈内皮細胞［ＨＵＶＥＣ］、無フィーダー間質）のそれぞれの能力を評価するため、それぞれを２４ウェルプレートのウェル当たり１００，０００細胞の割合で配置し、放射線照射した（３，０００ｒａｄ）。ＨＵＶＥＣを以前に記載されたように培養した（Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。その後、各ウェルに臍帯血に由来する５００個のＣＤ３４＋細胞を播種した。間質無しの条件はＵＣＢ由来ＣＤ３４＋細胞と培地のみを含有した。その後、細胞を上記の標準ＮＫ細胞条件下で培養した。
【０１４１】
人工抗原提示細胞増殖
ＥＬ０８−１Ｄ２またはフィーダー不使用条件からｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞を増殖させるため、それぞれをクローン９．ｍｂＩＬ−２１人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）  （Ｄｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）との培養下に置いた。培養第１週の間にａＡＰＣを１０，０００ｒａｄで放射線照射し、２：１の比率でＮＫ細胞に添加した（第０日）。その後のａＡＰＣを用いる刺激（７日毎）では１：１の比率であった。培養物に週に３回栄養補給し（ＲＰＭＩ１６４０、１５％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍｌのインターロイキン−２）、最適な増殖のために細胞数を２５０，０００細胞／ｍＬに維持した。
【０１４２】
統計分析
群間の差異はＰｒｉｓｍ４（グラフパッド・ソフトウェア社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用するスチューデントのｔ検定ポストホック分析またはＡＮＯＶＡを用いて比較された。結果は０．０５以下のＰ値で有意であると見なされた。
【０１４３】
ｈＥＳＣ由来造血前駆細胞およびｉＰＳＣ由来造血前駆細胞はＮＫ細胞に発生することができる。
初期の研究は２つの異なるｈＥＳＣ株（Ｈ１およびＨ９）および３つの異なるｉＰＳＣ株（ＢＪ１−ｉＰＳ１２、ＵＣＢｉＰＳ７、およびＤＲｉＰＳ１６）の造血細胞とＮＫ細胞の発生能を比較するために間質細胞共培養モデル  （Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１、Ｗｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９、Ｗｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）  を使用した。ＵＣＢｉＰＳ７とＤＲｉＰＳ１６を発明者らの研究室で得て、特徴解析した。この方法では、ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣはＦＢＳのみを含有する培地の中でＭ２１０−Ｂ４間質細胞上で培養される。３週間の期間にわたって全てのｈＥＳＣ株およびｉＰＳＣ株はＣＤ３４とＣＤ４５を共発現する造血前駆細胞を産生した（図８Ａ、８Ｂ、および１０）。Ｈ９細胞は最も高いパーセンテージのＣＤ３４とＣＤ４５を発現する造血前駆細胞（６．４６±１．７５％）を生じさせたが、他のｈＥＳＣ株およびｉＰＳＣ株は一貫してより少ない数の造血前駆細胞を産出した：Ｈ１ｈＥＳＣ株について１．４５±０．１８％、ＵＣＢｉＰＳ７株について２．４６±１．７１％、ＤＲｉＰＳ１６株について０．９２±０．１４％、およびＢＪ１−ｉＰＳ株について１．４３±０．３５％（図８Ｂ）。これらの数は、間質細胞ベースの系を使用する造血系発生の効率が比較的制限される（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９、Ｌｅｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）  、発明者らおよび他の者が以前に示したものと類似している。様々なｉＰＳＣ株が様々な数の造血前駆細胞を生じさせることを示した後で、我々はｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞集団のそれぞれからＮＫ細胞を作製した。ここで、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞を選別し、マウス間質細胞株ＥＬ０８−１Ｄ２およびサイトカイン（ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＬ−３）  （Ｗｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）を含むヒトＮＫ細胞発生を支援することが知られている条件で４週間培養した。ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣの別個の株が様々な頻度で造血前駆細胞を生じさせたが、各細胞株は表現型が成熟した機能性ＮＫ細胞を産生することができた。ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞とｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の両方はＣＤ５６、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄを発現する細胞の均一な集団からなる（図１０）。また、５種全てのｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ集団に由来するＮＫ細胞が、末梢血から単離されたＮＫ細胞（ＰＢ−ＮＫ）と同様に腫瘍細胞を殺滅することができた（図８Ｃ）。これらの結果は、個々のｈＥＳＣおよびｉＰＳＣは造血前駆細胞を派生するそれらの能力に再現性がある差異を有するが、それぞれが成熟した細胞傷害性について活性があるＮＫ細胞を作製することができることを示した。
【０１４４】
前駆細胞の作製強化はｈＰＳＣ由来ＮＫ細胞の誘導において細胞選別を除外する。
ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣからのＮＫ細胞の誘導を仲介するために、および培養効率を改善するために必要とされる特定の刺激をより良く理解するための努力の中で、発明者らはこれらの方法を完全無フィーダーおよび無血清培養系に翻訳するための段階的アプローチをとった。まず、「遠心ＥＢ」方法  （Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８、Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）  を使用して造血前駆細胞を作製するために未分化ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを支援した。ここで、限定された数（３，０００細胞）の未分化ｈＥＳＣ（Ｈ９）またはｉＰＳＣ（ＵＣＢｉＰＳ７）を９６ウェル形式で無血清培地の中で遠心して凝集させた（図２）。１１日の期間にわたってこれらの培養物は造血細胞発生と増殖を示した（図４Ａ）。この方法はＭ２１０−Ｂ４マウス間質の必要性を取り除いただけではなく、発明者らはこの方法がｈＥＳＣとｉＰＳＣの両方からの造血前駆細胞のより高頻度でより一貫した作製を可能にすることを見出した。ｈＥＳＣについて、発明者らは大部分の造血細胞がＣＤ３４を発現し（５５．９±６．４％）、多くがＣＤ４３（４１．８±９．５１％）またはＣＤ４５（２６．２±６．６％）を共発現することを見出した（図４Ｂおよび４Ｃ）。ｉＰＳＣはＣＤ３４＋細胞（１２．０６±５．４０％）およびＣＤ４５＋細胞（３．２０±１．４３％）も産生したが、通常ｈＥＳＣよりも少なかった。この方法はｈＥＳＣとｉＰＳＣの両方についてＭ２１０−Ｂ４間質ベースの系に対する著しい改善をもたらす（図８Ａ、８Ｂ、および１０）。
【０１４５】
発明者らは次に遠心ＥＢ系において作製された造血前駆細胞のＮＫ細胞を派生する能力を試験した。これを行うため、発明者らは解離または選別を行うことなくサイトカインおよびＥＬ０８−１Ｄ２間質を含有するＮＫ細胞惹起条件に遠心ＥＢを直接移した。以前に示されたように、このステージＩＩ培養系は４週間の期間にわたって信頼できるＮＫ細胞の発生を提供する  （Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１、Ｗｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。間質細胞共培養由来前駆細胞と同様に、遠心ＥＢ由来造血前駆細胞はついには成熟ＮＫ細胞表現型に至るＮＫ細胞表面マーカーを獲得した（図４Ｄ）。実際に、発明者らは遠心ＥＢ由来細胞が、ＣＤ１１７が存在しない状態でＣＤ９４を発現するＣＤ５６＋ＮＫ細胞の均一な集団に分化することを見出した（Ｗｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。なお、これらの細胞は高レベルのＫＩＲ、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、およびＴＲＡＩＬを発現した。それらの細胞はＮＫ細胞系列と一致する遺伝子発現プロファイルも有する。それらの細胞はＩＤ２、Ｅ２Ａ、およびＥ４ＢＰ４を発現した（図１４）。それらの細胞はＢ細胞系列特異的転写因子ＰＡＸ５を発現しなかった。また、親株と対照的にｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞およびｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は多能性因子ＯＣＴ４を発現しなかった。遠心ＥＢ由来ＮＫ細胞（ｈＥＳＣとｉＰＳＣの両方に由来する）は正しい表現型と遺伝型を有するだけではなく、ＰＢ−ＮＫ細胞と同様のレベルでＫ５６２腫瘍細胞を殺滅し、且つ、ＵＣＢ由来ＮＫ細胞よりも高い細胞傷害性を有した（図１１）。なお、発明者らはｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞およびｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞に発現された活性化受容体であるＮＫｐ４６により仲介される特異的な殺滅を示した。ＰＢ−ＮＫ細胞と同様に、ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞およびｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は逆ＡＤＣＣアッセイによりＰ８１５標的を殺滅するように誘導され得た（図１５）。これらのデータは、遠心ＥＢアプローチが多数の造血前駆細胞を作製するための無フィーダー系を提供するだけではなく、これらの前駆細胞が活性化ＰＢ−ＮＫ細胞と類似する細胞傷害性機能を有する表現型が成熟したＮＫ細胞に分化するために選別を必要としないことを示す。
【０１４６】
ｈＰＳＣ由来間質は造血前駆細胞からのＮＫ細胞発生を支援する。
ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣからのＮＫ細胞発生に必要とされる条件をより完全に明確化するため、発明者らは次にＮＫ細胞促進サイトカイン（ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ）を含有し、ＥＬ０８−１Ｄ２または他の外来性間質細胞を含まない無フィーダーおよび無血清ステージＩＩ系における遠心ＥＢ由来細胞を試験した（図２）。移転後の最初の２週間以内にＥＬ０８−１Ｄ２間質を用いて見られるものと同様のレベルで遠心ＥＢに由来する非接着性造血細胞の増殖があった（図１２Ａ）。なお、発明者らはこれらの細胞がそれら自体の接着性細胞を培養下で産生し始めることを見出した（図１２Ｂ）。発明者らはｈＥＳＣからの内皮細胞（ＥＣ）と間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の発生を以前に示している（Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０、Ｋｏｐｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。ここで、発明者らはこれらの細胞種（ＣＤ３４＋ＣＤ３１＋ＥＣとＣＤ３４＋ＣＤ７３＋ＭＳＣ）の両方（図１６）が遠心ＥＢ培養物の中で日常的に産生されることを示した。骨髄に存在するＥＣおよびＭＳＣなどの非造血細胞はインビボでＮＫ細胞を支援することが知られているので、発明者らはこれらの接着性細胞はインビトロでｈＥＳＣからのＮＫ細胞の成長を効率的に支援することができると仮説を立てた  （Ｃａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７、Ｍｒｏｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。顕著なことに、発明者らは遠心ＥＢ間質細胞層がＮＫ細胞発生とＫＩＲの獲得に重要であることが知られているＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＨＬＡ−Ｅ）（Ｋｉｍ
ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）に加えて高レベルのＣＤ３１およびＣＤ７３を発現することを見出した（図１２Ｃ）。なお、これらの遠心ＥＢ由来間質細胞はＥＬ０８−１Ｄ２間質と同様に、且つ、ヒト臍静脈内皮細胞またはサイトカイン単独よりも効率的にＵＣＢ由来ＣＤ３４＋細胞からのＮＫ細胞の発生を支援する（図１２Ｄ）。
【０１４７】
外来性間質細胞を使用せずにこれらの限定条件を用いてＮＫ細胞はＥＬ０８−１Ｄ２間質細胞を使用するステージＩＩ条件と比べて同様の数と表現型に発生した（図１０および４Ｄ）。これらの細胞は成熟ＮＫ細胞表現型を発現し、且つ、細胞傷害アッセイにおいてそれらの間質由来相対物と同等であり、適切なＮＫ細胞育成とエフェクター機能の獲得を示した。遠心ＥＢ由来ＮＫ細胞は脱顆粒化し、ＩＦＮ‐γを産生し、且つ、膵臓癌および多発性骨髄腫を含む多様な腫瘍標的に対する活性も有した（図１３）。これらのデータはどのような選別またはマウス間質細胞支援も無い状態での機能的細胞傷害性リンパ球のインビトロ誘導の成功を初めて示す。異種フィーダー層の回避は、ヒトＮＫ細胞の育成ならびに養子免疫療法のための明確なヒト供給源を研究するための新しい遺伝子操作可能な系を提供する。
【０１４８】
抗腫瘍免疫療法用のｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞の臨床規模の増殖
このＥＢベースのアプローチは顕著な増殖および臨床的実用可能性を示すが、発明者らは次に別の臨床的に操作可能な方法を介して作製されるＮＫ細胞の数をさらに増加させることを目標とした。近年、幾つかのグループが養子免疫療法用のＴ細胞またはＮＫ細胞の増殖にａＡＰＣを使用している  （Ｆｕｊｉｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９、Ｄｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。このアプローチの１つの主要な障害は高レベルのインビトロ増殖がテロメアの短縮化と細胞老化を引き起こすことである。ＤｅｎｍａｎらはＰＢ−ＮＫ細胞の顕著な増殖を引き起こすが、テロメアの長さとインビトロ活性を維持する膜結合型ＩＬ−２１（クローン９．ｍｂＩＬ−２１）を発現するａＡＰＣ株を作製した  （Ｄｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。発明者らはこれらのａＡＰＣがｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞のさらなる増殖を引き起こし得るか試験し、クローン９．ｍｂＩＬ−２１発現ａＡＰＣがＥＬ０８−１Ｄ２由来ＮＫ細胞と無フィーダー由来ＮＫ細胞の両方でさらに２〜３倍の対数増加を仲介することを見出した。ａＡＰＣ増殖性細胞はそれらのＮＫ細胞表現型ならびにインビトロ活性を維持した（図６Ｂおよび６Ｃ）。なお、これらのｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞は２か月よりも長い間に培養状態で維持され得、断続的に増殖させられ得た。まとめると、遠心ＥＢ法とａＡＰＣ増殖は癌免疫療法のためにｈＰＳＣから充分なヒトＮＫ細胞を作製するための直接的で応用可能なアプローチを提供する。
【０１４９】
（実施例３）
インビボ輸送と免疫療法を研究するための操作されたヒト胚性幹細胞由来リンパ球
ｈＥＳＣ維持および造血系分化
ｈＥＳＣを低密度（９０，０００細胞／６ウェルプレートのウェル）のマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上に維持した。ｈＥＳＣからの造血前駆細胞の作製は確立された方法（Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）を用いて達成された。凝集しやすい遠心胚様体（ＥＢ）を作製するためにｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを低密度ＭＥＦ（９０，０００細胞／ウェル）上のＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン社）中において継代させた。ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞をインビボで追跡するために我々はＧＦＰ／ホタルルシフェラーゼコンストラクトで改変されたＨ９株を使用した  （Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。６０％〜７０％辺りの集密状態のＴｒｙｐＬＥ適応ｈＥＳＣを解離させ、７０ミクロンの滅菌フィルターに通した。その後、細胞を計数し、丸底９６ウェルプレートのウェル当たり幹細胞因子（ＳＣＦ、４０ｎｇ／ｍＬ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬ）、および骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４、２０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＢＰＥＬ培地（Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）の中に３０００細胞の濃度（１００ｍＬの体積）で配置した。プレートの外側のウェルを滅菌水で満たして培地のあらゆる蒸発を防いだ。その後、プレートを室温で１，５００ＲＰＭ、５分間遠心して凝集させ、５％ＣＯ２を含む３７℃の恒温器内で平静に設置した。
【０１５０】
遠心ＥＢからのＮＫ細胞分化
分化第１１日に９６ウェルプレートの６ウェルを、ＮＫ細胞惹起サイトカイン（ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＳＣＦ、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体−３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、全てペプロテック社より）の２４ウェルプレートの１つのウェルに直接移した（Ｗｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。ＮＫ細胞培養物には４〜５日毎に０．５ｍＬのサイトカイン含有培地が注がれた。成熟ＮＫ細胞を培養から２８〜３５日の時点で測定した。ＮＫ細胞培養の４週間後に人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を使用して細胞をさらに増殖した（Ｄｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）．
【０１５１】
細胞株
Ｋ５６２細胞をアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手した。ｍｂＧＬｕｃを発現するＫ５６２細胞は次のように作製された。まず、膜結合型ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼ（ｍｂＧｌｕｃ）を、次のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した：５’−ＣＡＴＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＣＡＧＴＧＡＣＴＧＣＣＣＴＡＣＴＧＣＴＴ−３’（配列番号１５）および５’−ＣＡＴＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＴＣＣＧＣＣＴＧＴＧＧＴＴ−３’（配列番号１６）。ＥｃｏＲＩ部位に下線が引いてある。次にｍｂＧｌｕｃ断片を消化し、ＥｃｏＲ１消化したｍＣＡＧｓプロモーターと内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の間にＥｃｏＲＩスプライス部位を含有するｐＫＴ２−ｍＣＡＧｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ：ｚｅｏコンストラクトにサブクローン化した。方向はサブクローン化されたｍｂＧｌｕｃ配列の遠位末端内部の部位における制限酵素消化により確認された。Ｋ５６２細胞を発現するｔｕｒｂｏＦＰ６５０を作製するために我々はプライマー５’−ＣＡＴＡＣＡＡＴＣＧＡＴＡＴＧＧＧＡＧＡＧＧＡＴＡＧＣＧＡ−３’（配列番号１７）および５’−ＣＡＴＡＣＡＡＧＡＴＣＴＡＴＣＡＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡＴＣＣＧＧＴ−３’（配列番号１８）を使用してｔｕｒｂｏＦＰ６５０（エブロジェン（Ｅｖｒｏｇｅｎ）社）を含有する配列を上記のようにＰＣＲ増幅した。ＣｌａＩ部位とＢｇｌＩＩ部位に下線をそれぞれ引いてある。次にＰＣＲ断片をＣｌａＩとＢｇｌＩＩで消化し、ｐＫＴ２−ｍｂＧｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ：ｚｅｏコンストラクトへＧＦＰ：ｚｅｏ融合タンパク質の代わりにライゲートした。その後、確認されたコンストラクトはＬｏｎｚａ４Ｄヌクレオフェクター装置を使用してＫ５６２細胞に形質移入された。Ｔｕｒｂｏ−ＦＰ６５０発現Ｋ５６２細胞をＦＡＣｓＡｒｉａ細胞選別機（ＢＤバイオサイエンス社）で選別した。
【０１５２】
ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞の輸送を追跡するためのインビボ蛍光および生物発光画像撮影
腫瘍接種の２４時間前に６〜８週齢の非肥満糖尿病／γ鎖ノックアウト型重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ｇＣ−／−）マウス（ジャクソン・ラボラトリーズ社）に致死未満線量（２２５〜２５０ｃＧｙ）の放射線照射を施した。総計で１×１０６個のｍｂＧｌｕｃ＋  Ｋ５６２細胞またはｍｂＧｌｕｃ＋／ｔｕｒｂｏＦＰ６５０＋  Ｋ５６２細胞を２０％のＦＢＳ（ライフテクノロジーズ社）が添加された２００ｍＬのイスコブの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ハイクローン・ラボラトリーズ社）に再懸濁した。その後、細胞をマウスの左上胸部に皮下注射した。腫瘍を４日間（ｍｂＧｌｕｃ＋）または７日間（ｔｕｒｂｏＦＰ６５０＋）生着させた。その後、２０％のＦＢＳが添加された３００ｍＬのＩＭＤＭに再懸濁された１０×１０６個のｈＥＳＣ−ＮＫ細胞のＩＰ注射をマウスに施した。全ての実験について、ＮＫ細胞点滴を受領しないマウスが陰性対照として含まれ、腫瘍のみのマウスが腫瘍移植の陽性対照として含まれた。全てのマウスがＮＫ細胞注射後の最初の７日の間に毎日ＩＬ−２（１×１０４Ｕ／マウス）とＩＬ−１５（１０ｎｇ／マウス）のＩＰ注射を受け、続いてマウスが殺処理されるまで２〜３日毎にＩＬ−２のみのＩＰ注射を受けた。全てのマウスがミネソタ大学の動物実験委員会により表明されたガイドラインと米国国立衛生研究所の動物実験ガイドに従って飼育され、処置され、取り扱われた。腫瘍進行とＮＫ細胞輸送を同時に追跡するために我々は二元画像法計画を活用した。ｍｂＧｌｕｃ＋  Ｋ５６２細胞とＦｌｕｃ＋  ｈＥＳＣ−ＮＫ細胞を追跡するために生物発光画像撮影がＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ画像撮影システム（カリパー（Ｃａｌｉｐｅｒ）ライフサイエンス社）を使用して実施された。画像撮影の前にマウスをイソフルランにより麻酔した。生物発光画像は、セレンテラジン（３２０ｍｇ；ナノライト・テクノロジー社）のＩＶ注射から１０〜１５秒後に、またはＤ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ；ＧＯＬＤバイオテクノロジー社）のＩＰ注射から１０分後に１分の露光を用いて獲得された。マウスをセレンテラジンの注射後に個体ごとに画像撮影し、Ｄ−ルシフェリンの注射前に回復させた。光学画像はＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア第４．２版（カリパー・ライフサイエンス社）を使用して解析された。
【０１５３】
ｔｕｒｂｏＦＰ６５０＋  Ｋ５６２細胞とＦｌｕｃ＋  ｈＥＳＣ−ＮＫ細胞を追跡するために蛍光および生物発光画像撮影を、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ画像撮影システムを使用して実施した。画像撮影の前にマウスを記載通りに麻酔した。生物発光画像はＤ−ルシフェリンのＩＰ注射から１０分後に総計で１分の露光で獲得された。直後に蛍光画像シーケンスを、自動露出設定を使用してｔｕｒｂｏＦＰ６５０（励起：６０５、発光：６６０〜７２０）とバックグランドシグナル（励起：５７０、発光：６４０〜７２０）の放射スキャンを実施することにより獲得した。腫瘍とバックグランドシグナルを分離させるために蛍光画像シーケンスをスペクトル分解し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア第４．２版（カリパー・ライフサイエンス社）を使用して標準尺度に合わせた。
【０１５４】
免疫組織化学
殺処理時に収集された腫瘍組織を１０％ホルマリン中で２４〜３６時間固定し、パラフィンに包埋した。標準的なプロトコルに従って４ミクロンの切片がミクロトームを使用して切り出され、非帯電スライドグラスに貼り付けられ、再水和された。スライドはＯｓｔｅｒスチーマー中で３０分間ｐＨ６．０のクエン酸緩衝液を用いて前処理され、そして、１５分間冷却させられた。一次抗体を次の濃度で使用した：ヒトＮＫｐ４６（Ｒ＆Ｄシステムズ社；ＡＦ１８５０、１：１００）、ＩｇＧ１κアイソタイプ対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社；カタログ番号１４−４７１４−８２、１：５０）。抗体検出はホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンとＤＡＢクロマジェン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）（コーヴァンス社）によるものであった。組織切片をヘマトキシリン中で対比染色した。実験毎にヒト扁桃組織を陽性対照として染色し、且つ、ＮＫ細胞注射を受けていないマウスの腫瘍組織を陰性対照として染色した。画像は１０倍、４０倍、および６３倍の対物レンズの倍率で撮影された。
【０１５５】
インビボ追跡のためのルシフェラーゼ発現ｈＥＳＣからのＮＫ細胞の作製
マウス異種移植モデルにおけるリンパ球輸送を試験するために発明者らはｈＥＳＣからＮＫ細胞を誘導するよく特徴解析されている分化プロトコルを用いた  （Ｗｏｌｌ  ｅｔ
ａｌ．，  ２００５、Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１、Ｗｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞はインビトロとインビボの両方で強力な抗腫瘍活性を有するが、腫瘍の消失はＮＫ細胞輸送の直接的な結果であることが示されていた。ホタルルシフェラーゼとＧＦＰを発現するように改変されたｈＥＳＣ（Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）  を使用して、発明者らは最初に造血前駆細胞に分化し、後にＮＫ細胞に分化する能力を示した（図１７）。ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞の機能をインビボでさらに探索するために発明者らはＮＫ細胞の存続性および輸送、ならびに腫瘍組織量をモニターするためのモデルを開発した。発明者らはＩＶ経路またはＩＰ経路を介して免疫不全マウスに移転されたときのｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞の生存を比較した。通常、養子免疫療法のエフェクター細胞はＩＶ投与されてきた。養子移入されたＮＫ細胞を用いる白血病の治療にとって、これらのエフェクターが脾臓および骨髄を含む腫瘍病変部位に移動し得ることが重要である。しかしながら、これは卵巣癌などの全ての悪性腫瘍に最適な送達系ではあり得ない。なお、ＩＰアプローチを使用する非造血系区画または非リンパ系区画へのＮＫ細胞の注射はより厳密な輸送試験を提供し得る。マウスは最初の７日の間にＩＬ−２（１０，０００単位／マウス）とＩＬ−１５（１０ｎｇ／マウス）の注射も受け、続いて試験の終了まで１日おきにＩＬ−２（１０，０００単位／マウス）の注射も受けた。ＮＫ細胞のＩＰ送達を受けているマウスはＩＶ注射されたマウスと比べて長くなった存続性を有した（図１８）。ＮＫ細胞のＩＶ送達は最初にマウスの肺に細胞を輸送したが、第４日までに無くなった。一方、ＮＫ細胞のＩＰ送達は４週間よりも長い存続性を引き起こす。第１９日にマウスを殺処理し、末梢血、脾臓、骨髄、および腹膜の中での生着を調査した。ＮＫ細胞送達の両方の経路が、ＧＦＰ＋とＣＤ５６＋ＣＤ４５＋細胞表面抗原によって測定されると末梢血、骨髄、および脾臓の中で低レベルの生着を有した。しかしながら、ＩＶ注射したマウスまたは対照と比べてＩＰ注射したマウスの腹膜において高レベルのＮＫ細胞が存在した（図１８）。これは生物発光画像法データと一致し、且つ、ＮＫ細胞のＩＰ送達がインビボでＮＫ細胞の改善された存続性を可能とし、輸送の研究に最適であろうという結論になった。
【０１５６】
ＮＫ細胞はインビボで存続し、腫瘍と共局在する。
次に発明者らは、リンパ球存続性のよく特徴解析されているレポーターとして我々のｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞によって安定して発現されるホタルルシフェラーゼ（Ｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２、Ｎｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔａｇ，  ２００６）をインビボで利用した。ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞の強力な抗腫瘍活性をインビボで示す以前の研究はルシフェラーゼ陽性腫瘍細胞を使用した。しかしながら、発明者らはＮＫ細胞を同時に追跡することができなかった。ＮＫ細胞と腫瘍の両方を同じマウスで撮影するために発明者らはガウシアルシフェラーゼファミリーの別のルシフェラーゼレポーターを採用した。膜につながれるように改変された組み換え型のそのガウシアタンパク質（膜結合型ガウシアルシフェラーゼ、ｍｂＧｌｕｃ）（Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）を使用して、発明者らは２つの異なる基質を利用して腫瘍とＮＫ細胞の両方を同じマウスで撮影することができた。発明者らはｍＣＡＧＳプロモーターによって駆動されるスリーピング・ビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）骨格にｍｂＧｌｕｃ遺伝子を最初にサブクローン化した。発明者らはＫ５６２腫瘍細胞を安定的に形質導入し、ルシフェリン（ホタルルシフェラーゼによって活性化される）には応答しないが、基質であるセレンテラジン（ガウシアルシフェラーゼによって活性化される）に応答するルシフェラーゼ活性を有する細胞を選択することができた。
【０１５７】
両方のレポーターをインビボで使用するために発明者らはｍｂＧＬｕｃの基質であるセレンテラジンはインビボで急速に分解される  （Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）という事実を利用した。ホタルルシフェラーゼ（ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞において発現する）は相互にインビボで安定しており（Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）  、２番目に送達された。これらの２つのレポーターを使用することで、発明者らはｍｂＧｌｕｃ＋腫瘍細胞を最初に撮影し、次に同じマウスにおいてホタルｌｕｃ発現ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞を撮影することができた。発明者らは致死未満線量で放射線照射したマウスの中でＫ５６２腫瘍細胞をＮＫ細胞注射前の４日間に生着させることにより我々の最初のモデル  （Ｗｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）  を再現した。この試験の目的はＮＫ細胞輸送を試験することであったので、発明者らは腫瘍をよりよく増殖させるために腫瘍用量を１００万細胞に増加させた。発明者らの以前の研究は完全な腫瘍の消失を示しており、マウス当たり２００，０００細胞の用量を使用した。第０日にＮＫ細胞をＩＰ投与し、マウスをサイトカインで処置した。マウスを第０日、第４日、第７日、第９日から第１２日に腫瘍サイズとＮＫ細胞輸送の両方について評価した。ここで、ＮＫ細胞は腫瘍部位に移動することができた（図１９）。これは第９日と第１２日の間に起きるのが典型的であったが、マウスの中で様々であった。なお、全てのマウスが生物発光によって輸送を示したわけではなかった（６匹のマウスのうちの４匹が輸送を示した）。このように、ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞はこの二元生物発光系において輸送について追跡され得る。全てのマウスが輸送を示したわけではないが、これは生物発光シグナルを示すのに必要なルシフェラーゼ＋細胞の絶対数と陰性マウスが検出限界未満であり得ることが原因であり得た。なお、マウスの腫瘍組織量の増加（１×１０６細胞対２００，０００細胞）は充分なＮＫ細胞が蓄積し、バックグランドよりも強い生物発光シグナルを発するために必要であった。
【０１５８】
ホタルルシフェラーゼと蛍光タンパク質ｔｕｒｂｏＦＰ６５０を用いる改善型二元レポーター画像法
ホタルルシフェラーゼと併せてｍｂＧｌｕｃを使用することにより、信頼できるが、技術的には困難であるＮＫ細胞輸送を研究するためのモデルが提供された。これは主にガウシアルシフェラーゼの基質であるセレンテラジンが静脈内送達される必要があるからである。これは幾つかの理由のために困難であった。まず、基質の消失動態のため、限られた数のマウスしか同時に画像撮影することができなかった（Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，
２００９）。また、セレンテラジン基質を繰り返し注射することにより時間と共に尾静脈の損傷が引き起こされる。このことを打開するために発明者らは、インビボで画像撮影され得るつい最近記載された蛍光レポーター  （Ｓｃｈｅｒｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）を利用した。ＴｕｒｂｏＦＰ６５０は赤色側に偏移した蛍光レポーター（励起５９２ｎｍ、発光６５０ｎｍ）であり、最適なインビボ画像撮影のための組織浸透性を有する。それは２つ目の基質の送達を必要することもない。発明者らはスリーピング・ビューティーを使用してＫ５６２細胞中でｔｕｒｂｏＦＰ６５０タンパク質を発現させるために同様のクローニングアプローチを用いた。ＴｕｒｂｏＦＰ６５０の安定な発現はフローサイトメトリーにより測定された。１週間よりも長い期間の安定的な形質導入を確認した後に上と同じパラメーターを用いて細胞を選別した。選別された細胞はＴｕｒｂｏＦＰ６５０タンパク質の発現を維持し、さらなるインビボ試験に使用した（図２０）。
【０１５９】
上と同じインビボモデルを使用してマウスに１００万個のＴｕｒｂｏＦＰ６５０＋  Ｋ５６２腫瘍細胞を移植し、７日間生着させた。その後、第０日にマウスにホタルルシフェラーゼ発現ＮＫ細胞を腹腔内投与し、輸送について追跡した。二元ルシフェラーゼ試験と同様に、ＮＫ細胞は５匹のマウスのうちの４匹でｔｕｒｂｏＦＰ６５０＋腫瘍細胞を追跡することができ、これはＮＫ細胞注射後９〜１２日の間に起きた（図２０）。腫瘍組織量とＮＫ細胞の量を同時に測定することができることが重要である。まず、ｔｕｒｂｏＦＰ６５０は腫瘍進行の信頼できるインビボマーカーを提供する。発明者らは腫瘍組織量の有意な増加を全てのマウスにおいて第９日（Ｐ＝０．００２７）と第１２日（Ｐ＝０．００２２）の両方で観察した。次に発明者らはそれらのマウスのそれぞれにおける全ＮＫ細胞シグナルのレベルを測定し、前のようにレベルが第０日から第９日（０．０００１）まで、または第１２日（Ｐ＝０．０００１）までに有意に低下することを観察した。交換的に、発明者らは腫瘍部位におけるＮＫ細胞シグナルの上昇を第９日（Ｐ＝０．０２４６）と第１２日（Ｐ＝０．００４３）に観察しており、これはｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞の腫瘍部位への輸送の成功を示した。これらのデータはｍｂＧｌｕｃと比べたレポーターとしてのｔｕｒｂｏＦＰ６５０の使用を支援する。セレンテラジンベースのレポーターを使用することの技術的制約を打開することにより、これらの研究は時間と共に２つの細胞集団をモニターするための改良されたインビボ系を提供する。
【０１６０】
免疫組織化学により確認された腫瘍へのｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞の輸送
腫瘍部位におけるＮＫ細胞を決定的に示すために発明者らはマウスから取り出された腫瘍をより詳しく調べた。腫瘍部位におけるヒトＮＫ細胞の存在を確認するために発明者らは腫瘍を取り出し、それらをパラフィン包埋し、免疫組織化学をＮＫ細胞輸送の定性的な確認手段として用いた。腫瘍のみ（ＮＫ細胞注射無し）の群およびアイソタイプ対照と比べて、生物発光画像法により示されたＮＫ細胞輸送を有するマウスはＩＨＣでＮＫｐ４６により示されるように存在するヒトＮＫ細胞を有した（図２１）。ヒト扁桃組織を陽性対照として用いた。ＮＫｐ４６は、ＣＤ５６が他の種類の組織も標識することができるので、ヒトＮＫ細胞のより特異的なマーカーである。ＩＨＣ染色で陽性のＮＫ細胞は染色された各腫瘍組織切片全体に均一に散在しており、切片当たり１５〜２０個のｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞が存在した。これらのデータはＮＫ細胞の腫瘍部位への輸送、およびホタルルシフェラーゼを使用する生物発光画像法がリンパ球のインビボ輸送を研究するための有効なモデルであることをさらに支持する。
【０１６１】
考察
これらの研究により、ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞の腫瘍部位への輸送を示し、且つ、ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞が腫瘍細胞をインビボで直接殺滅するという仮説を強力に支持することができたことが重要である。二元生物発光画像撮影モデルを活用しなかったら、輸送は識別するのがもっと困難であったろう。なお、生物発光画像法を用いることによりＩＨＣよりも簡単で迅速な定量が可能となった。全てのマウスが生物発光画像法により輸送を大いに示したわけではなく、輸送の兆候は９〜１２日にわたる範囲であった。しかしながら、生物発光定量は腫瘍領域においてＮＫ細胞シグナルの蓄積に著しい差異を示す（図２０）。いくらかのＮＫ細胞の輸送は我々の検出限界未満である可能性がある。すなわち、ＮＫ細胞は実際に腫瘍に移動することができるが、腫瘍環境内に留まるための正確なシグナルを受け取らない。この場合では、腫瘍内存続性と活性を改善するために腫瘍特異的受容体を有するＮＫ細胞を改変することができるだろう（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。これは、ヒトＴ細胞においてキメラ抗原受容体を使用して近年達成された  （Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１、Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣはそのような改変のために最適なプラットフォームを提供する。それらの研究は、非改変ｈＥＳＣ由来ＮＫ細胞が疾患を消失させるために腫瘍部位に移動するという我々の最初の発見も確認する。
【０１６２】
まとめると、これらのデータはマウスにおいてヒト細胞の２つの異なる集団を追跡するためのモデル系を提供し、それは抗腫瘍治療に限定されるべきではない。ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ由来細胞と組み合わされた２つの多様なレポーター系を使用することは、多数の生物学システムへの広範な適用可能性を有する。治療目的にとって、ｈＥＳＣからほとんどあらゆる血液細胞を派生させる能力のため、新しい治療法のための細胞バンクを提供することができるだろう（Ｋａｕｆｍａｎ，  ２００９）。あるいは、ｉＰＳＣ作製が比較的に簡単であること、およびこのプロセスの技術的進歩を考えると、治療のために患者の自家細胞を使用するという考えも合理的である（Ｄａｌｅｙ，  ２００７）。ｈＰＳＣはリンパ球の発生と輸送の研究における機能獲得型アプローチと機能喪失型アプローチを取り入れるためのプラットフォームも提供する。これらのプロセスに影響する特定の分子の構成的ノックダウンまたは条件的ノックダウンは有益であり、本来は遺伝的改変に抵抗的を示す一次供給源から単離された細胞（ＨＳＣまたは末梢血）を使用することに優る大きな利点であろう。
【０１６３】
本明細書において開示および請求された方法の全ては本開示を踏まえると過度の実験を行うことなく実施および履行され得る。本発明の組成物と方法は好ましい実施形態との関係で記載されているが、本発明の構想、精神、および範囲から逸脱することなくそれらの方法、および本明細書に記載される方法のステップまたは一連のステップに変更を行うことができることは当業者に明らかである。より具体的には、本明細書に記載される薬剤を化学的にも生理学的にも関連するある特定の薬剤で置換することができ、同一または類似の結果が達成されるだろうことは明らかである。当業者にとって明らかである全てのそのような置換物および改変は添付されている特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、および構想の範囲内にあるとみなされる。
【０１６４】
参照文献
次の参照文献は、それらが本明細書において記載される細目を補完する例となる処置または他のことについての細目を提供する限り、特異的に参照により本明細書に組み込まれる。
米国特許第６，２２５，０４２号明細書
米国特許第６，３５５，４７６号明細書
米国特許第６，３６２，００１号明細書
米国特許第６，７９０，６６２号明細書
米国特許第６，８１５，４５０号明細書
米国特許第６，９４３，１７２号明細書
米国特許第７，３４８，３３９号明細書
米国特許第７，４５９，４２４号明細書
米国特許出願公開第２００９／００１７０００号明細書
米国特許出願公開第２００９／０００４１４２号明細書
欧州特許出願公開第００１８７３７１号明細書
国際公開第９８／３０６７９号
国際公開第００／０５７９１３号
国際公開第００／０７８３５１号
国際公開第２００７／１０３００９号
Ｂａｓｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，  ４７（１１）：２１５３−６０，  ２００７
Ｂｈａｒｄｗａｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２（２）：１７２−８０，  ２００１．
Ｂｈａｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ
ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．
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Ｃａｍｐａｎａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６９（９）：４０１０−４０１７，  ２００９．
Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ，  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＣＤ２８  ａｎｄ  ＣＤ１３７  ｄｏｍａｉｎｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０６：３３６０−３３６５，  ２００９．
Ｃａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，  ９９：９３７−９４３，  １９９７．
Ｃｈａｄｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ＢＭＰ−４  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ，  １０２（３）：９０６−１５，  ２００３．
Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｋｏｒｅａｎ  Ｊ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．  ２９（２）：  ８９−９６，  ２００９．
Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  ２７：５５９−５６７，  ２００９．
Ｃｏｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｏｎｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｆｔｅｒ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．
Ｂｌｏｏｄ，  １１６：２４１１−２４１９，  ２０１０．
Ｄａｌｅｙ，  Ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  Ｅｄｕｃ．  Ｐｒｏｇ．，  ２００７：１７−２２，  ２００７．
Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｚｏｎ，  Ｔｕｒｎｉｎｇ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ  ｉｎｔｏ  ｂｌｏｏｄ：  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，  ５０：４５−６０，  ２０００．
Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  ｃｏｍｍｏｎｌｙ  ｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ
ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ３５１（Ｐｔ  １）：９５−１０５，  ２０００．
Ｄｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ＩＬ−２１  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，  ７：ｅ３０２６４，  ２０１２．
Ｄｒｅｘｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，  ２２（２）：７１−７３，  ２００４．
Ｆａｄｉｌａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ＦＬＴ３Ｌ，  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ，  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６，  ａｎｄ  ＩＬ−３  ｐｒｏｄｕｃｅ  ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１ａ−／ｃ−  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｄｅｖ．，  １６（５）：８４９−５５，  ２００７
Ｆｕｊｉｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ６９：４０１０−４０１７，  ２００９．
Ｇａｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０３：１１７４２−１１７４７，  ２００６．
Ｇａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ
ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｔｒａｃｔａｂｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．，  ４（２）：４３６−４２，  ２００６
Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｐａｂｌｅ
ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，  ３８：２４６−２５７，  ２０１０．
Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ
ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ．  Ｂｌｏｏｄ，  ９２（１１）：４１２８−３７，  １９９８．  
Ｉｋｅｎｏｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｈｏ−ｋｉｎａｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｅｄ  ａｌａｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  Ｃ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  （ＭＡＲＣＫＳ）  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｈ−１１５２，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｈｏ−ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．  Ｊ．
Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ８１（１）：９−１６，  ２００２．
Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｔｏｗａｒｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ，  １１４：３５１３−３５２３，  ２００９．
Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｈｏｓｔ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４３６：７０９−７１３，  ２００５．
Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ５：ｅ９３６４，  ２０１０．
Ｋｉｓｅｌｙｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  １１（６）：６９１−７０１，  ２００３．
Ｋｎｏｒｒ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ
ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １５６：１４７−１５４，  ２０１０．
Ｋｏｐｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓ  ＭＳＣ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｏｎｅ，  ４７：７１８−７２８，  ２０１０．
Ｌｅｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｎｉｃｈｅｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ３：８５−９８，  ２００８．
Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  １７：８３３−８３９，  ２００６．
Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｗｉｎｄｏｗ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｖｉｔａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  １６：１１６９−１１７９，  ２００９．
Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｍｂｅｒｇ，  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ７：３２９−３３９，  ２００７．
Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  （２）：１８５−１８７，  ２００６ａ．
Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ３（８）：６３７−６４６，  ２００６ｂ．
Ｍａｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８５（５４２９）：８９５−８，１９９９．
Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ，  ９６：１５９１−１５９３，  ２０００．
Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｂｌｏｏｄ，  １０５：３０５１−３０５７，  ２００５．
Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＣＣＲ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  １７：４７１９−４７３０，  ２０１１．
Ｍｒｏｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５  ｉｎ
ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ５６＋  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ＣＤ３４＋  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ，  ８７：２６３２−２６４０，  １９９６．
Ｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ，  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ
Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｂｌｏｏｄ，  １１６：２８，  ２０１０．
Ｎｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔａｇ，  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ
ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：  ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｐｒｏｂｉｎｇ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ６：４８４−４９０，  ２００６．
Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ｕｓｅ
ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂａｓｅｄ，  ａｎｉｍａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ  （ＡＰＥＬ）  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｓ  ｓｐｉｎ
ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ３：７６８−７７６，  ２００８．
Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｏｒｃｅｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｅｄ
ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｓｔｅｒｓ  ｒｏｂｕｓｔ，  ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ，  １０６：１６０１−１６０３，  ２００５．
Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅ  ａｎｔｉ−ＨＩＶ−１  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ８５：４３−５０，  ２０１１．
Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ３６５：７２５−７３３，  ２０１１．
Ｒａｔａｊｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．，  ９３（４）：７７２−７８２，  １９９６．
Ｒｏｂｉｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｌｅｙ，  Ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４８１：２９５−３０５，  ２０１２．
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐａｔｈ  ｔｏ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，  ８：２９９−３０８，  ２００８．
Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｉｔｆａｌｌｓ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２１：２１５−２２３，  ２００９．
Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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