(57)【要約】【課題】マンノース及びタロースをそれぞれ効率よく製造できる方法及びその方法に用いることができる酵素又は酵素剤を提供すること。【解決手段】特定の特異的な挿入配列を含む、グルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質及びこのタンパク質を用いるマンノースの製造方法。特定の特異的な挿入配列を含む、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質及びこのタンパク質を用いるタロースの製造方法。これらタンパク質の製造方法。これらタンパク質を含む酵素剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列
の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質（但し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質を除く）。
【請求項２】
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列が、
一般式（１）：
Ｘ1ＡＰＱＩＫＦＤＸ2Ｘ3ＷＧＷＤＲＦＸ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10（但し、Ｘ1はＶ又はＩであり、Ｘ2はＩ又はＶであり、Ｘ3はＶ又はＩであり、Ｘ4はＮ、Ｔ又はＳであり、Ｘ5はＰ又はＥであり、Ｘ6はＤ又はＧであり、Ｘ7はＧ又はＤであり、Ｘ8はＬ、Ｖ、Ｑ又はＡであり、Ｘ9はＫ又はＱであり、Ｘ10はＳ、Ａ、Ｅ又はＫである）のアミノ酸配列、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５〜４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列が、
一般式（２）：
ＫＸ11ＰＡＩＮＩＸ12ＲＴＷＮＡＥＲＥＸ13Ｘ14ＥＸ15ＩＤ
（但し、Ｘ11はＬ又はＩであり、Ｘ12はＫ又はＹであり、Ｘ13はＡ又はＴであり、Ｘ14はＧ又はＮであり、Ｘ15はＫ又はＲである）のアミノ酸配列、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２４６〜２６７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の１〜２４５アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２６８〜４３０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、請求項１又は４に記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質を有効成分として含有する、グルコースとマンノースのエピメリ化剤。
【請求項７】
ガラクトースとタロースのエピメリ化活性をさらに有する請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項８】
（ｃ）配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列
の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５〜４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質（但し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質を除く）。
【請求項９】
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列が、配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５〜４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５〜４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列が、
一般式（２）：
ＫＸ11ＰＡＩＮＩＸ12ＲＴＷＮＡＥＲＥＸ13Ｘ14ＥＸ15ＩＤ
（但し、Ｘ11はＬ又はＩであり、Ｘ12はＫ又はＹであり、Ｘ13はＡ又はＴであり、Ｘ14はＧ又はＮであり、Ｘ15はＫ又はＲである）のアミノ酸配列、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２４６〜２６７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基アミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の１〜２４５アミノ酸残基アミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２６８〜４３０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１１】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２若しくは配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質または当該タンパク質のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を有し、かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質を有効成分とするグルコースとマンノースのエピメリ化剤。
【請求項１２】
グルコースおよびマンノースのエピメリ化活性並びにガラクトースおよびタロースのエピメリ化活性を有することが知られていないタンパク質から、（ａ）配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を有するタンパク質、または（ｂ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を有するタンパク質を選択すること及び
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）で選択したタンパク質から、グルコースとマンノースのエピメリ化活性、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性又はその両方を有するタンパク質を選択することを含む、
グルコースおよびマンノースのエピメリ化活性並びに／又はガラクトースおよびタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項１３】
（ｄ）アミノ酸配列既知又は未知のタンパク質のアミノ酸配列に、配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列若しくは配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を挿入すること、または（ｅ）アミノ酸配列既知又は未知のタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部の配列を、配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列若しくは配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列に改変すること、及び
（ｆ）（ｄ）または（ｅ）で挿入又は改変したタンパク質から、グルコースとマンノースのエピメリ化活性、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性又はその両方を有するタンパク質を選択することを含む、
エピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項１４】
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列が、
一般式（１）：
Ｘ1ＡＰＱＩＫＦＤＸ2Ｘ3ＷＧＷＤＲＦＸ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10（但し、Ｘ1はＶ又はＩであり、Ｘ2はＩ又はＶであり、Ｘ3はＶ又はＩであり、Ｘ4はＮ、Ｔ又はＳであり、Ｘ5はＰ又はＥであり、Ｘ6はＤ又はＧであり、Ｘ7はＧ又はＤであり、Ｘ8はＬ、Ｖ、Ｑ又はＡであり、Ｘ9はＫ又はＱであり、Ｘ10はＳ、Ａ、Ｅ又はＫである）のアミノ酸配列、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、請求項１２又は１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
（ａ）、（ｄ）又は（ｅ）のタンパク質が、配列番号２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有し、かつ
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上若しくは９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５〜４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有する、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１６】
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列が、
一般式（２）：
ＫＸ11ＰＡＩＮＩＸ12ＲＴＷＮＡＥＲＥＸ13Ｘ14ＥＸ15ＩＤ
（但し、Ｘ11はＬ又はＩであり、Ｘ12はＫ又はＹであり、Ｘ13はＡ又はＴであり、Ｘ14はＧ又はＮであり、Ｘ15はＫ又はＲである）のアミノ酸配列、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２４６〜２６７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、請求項１２又は１３に記載の製造方法。
【請求項１７】
（ｂ）、（ｄ）又は（ｅ）のタンパク質が、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上若しくは９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の１〜２４５アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有し、かつ
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上若しくは９０％以上のアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２６８〜４３０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有する、請求項１２、１３又は１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
グルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造である、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１９】
ガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造である、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２０】
グルコースに、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項６若しくは１１に記載のエピメリ化剤又は請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の方法で製造したタンパク質を作用させて、マンノースを生成させることを含む、マンノースの製造方法。
【請求項２１】
配列番号１０、配列番号１２若しくは配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質または当該タンパク質のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質を有効成分とするガラクトースとタロースのエピメリ化剤。
【請求項２２】
ガラクトースに、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法で製造したタンパク質、または請求項２１に記載のエピメリ化剤を作用させて、タロースを生成させることを含む、タロースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エピメリ化活性を有するタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
マンノースは、グルコースの異性体であり、コンニャクなどから抽出されるグルコマンナン、ヘミセルロース、あるいは細胞表面などに存在する糖鎖の構成糖として良く知られている。また、マンノースそのものとしてはクランベリーに含まれることが知られている。
【０００３】
マンノースの生体利用性は低く、経口摂取したマンノースの殆どは速やかに尿中に排出される。尿路感染症の原因菌は、当該菌が有するマンノース結合タンパク質 (レクチン) と、尿路表面細胞表面に存在する糖鎖の結合を介して尿路表面細胞へ付着し感染する、というメカニズムが提唱されている。先述の通り、経口摂取したマンノースは尿中に速やかに排出されるため、排出されたマンノースは当該菌のマンノースレクチンと細胞表面糖鎖への結合を阻害するため、尿路感染症を予防する効果が期待されている。
【０００４】
特許文献１にはマンノース含有糖組成物を有効成分とする有害菌感染抑制剤または有害菌感染防止用飼料に関わる技術が開示されている。特許文献２にはマンノースを有効成分とする飲食品の食感改良剤についての記述がある。
【０００５】
マンノースの調製法としては、化学反応法及び酵素法が知られている。
【０００６】
第一の化学反応法は、フラクトースを還元することでソルビトールとマンニトールを生成し、マンニトールを分取し、さらにマンニトールを酸化することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は多段階のステップおよび高温高圧での触媒反応を必要とするため、効率面で問題がある。
【０００７】
第二の化学反応法は、グルコマンナンやマンナンを加水分解することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、基質が高価でありかつ基質の調整に労力を要するという問題がある。
【０００８】
第三の化学反応法は、コプラミールなどのヘミセルロースを加水分解する手法である。しかし、この方法は、構成糖が多様であるためマンノースの収率が悪く、酸加水分解の場合はさらに収率が悪化し精製負荷が大きくなるという問題がある。
【０００９】
第四の化学反応法は、グルコースをアルカリ条件下で異性化することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、糖の分解が生じるため収率が悪く、精製負荷が大きいという問題がある。
【００１０】
第五の化学反応法は、同じくフルクトースをアルカリ条件下で異性化することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、第四の化学反応法と同様に収率および精製負荷の点で問題があり、またフルクトースがグルコースに比べ比較的高価である点およびフルクトースが反応系に残存してしまいマンノースとの分離が困難である点でも問題がある。
【００１１】
第一の酵素法としては、フルクトースにマンノースイソメラーゼを作用させることでマンノースを調製する方法である。しかし、原料となるフルクトースの価格面および反応系に残存するフルクトースの分離の点で問題がある。
【００１２】
第二の酵素法としては、グルコースあるいはフルクトースに対してアルドース−ケトースイソメラーゼ（Ａｌｄｏｓｅ−ｋｅｔｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、以下「ＡＫＩ」と記載する）を作用させることでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、反応系に残存するフルクトースの分離の点でやはり問題がある。
【００１３】
また、セロビオースなどの還元末端糖残基がβ−１，４結合で結合している２つ以上の糖残基からなる糖について、前記還元末端糖残基の２位の水酸基を２−エピメリ化（異性化）する反応、またはその逆反応を触媒する酵素として、セロビオース２−エピメラーゼ（Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ  ２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、以下「ＣＥ」と記載する）が知られている（特許文献３、特許文献４）。当該酵素により、グルコースがβ−１，４結合されたセロビオースを４−Ｏ−β−グルコシルマンノースへ変換、またはその逆反応を触媒することができる。また、特許文献４には、当該セロビオース２−エピメラーゼをグルコースに作用させると、マンノースが得られたことが記載されている（第三の酵素法）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００１−２１３７８１号
【特許文献２】特開２００１−２７５５８３号
【特許文献３】特開２０１２−１３０３３２号
【特許文献４】国際公開２０１０／０９００９５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかし、特許文献４に記載のＣＥを用いる第三の酵素法では、ＣＥがエピメリ化反応に加えアルドース−ケトース異性化反応も触媒する。そのため、マンノースと共にフルクトースも生成してしまい、副生するフルクトースの分離の点で問題がある。
また、これまで、ケトースを実質的に生成せずにアルドース間で異性化する酵素はＡＧＥやＣＥしか報告されておらず、非修飾単糖類にて同様の反応を行う酵素はこれまで全く知られていない。
【００１６】
本発明は、より安価・簡便にマンノースを製造する手段を提供することを目的とする。より詳細には、比較的安価な原料を用いてマンノースを効率よく製造できる方法及びその方法に用いることができる酵素又は酵素剤を提供することが本発明の課題であり、目的である。タロースを効率よく製造できる方法及びその方法に用いることができる酵素又は酵素剤を提供することも本発明の課題であり、目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、これまでにＣＥをはじめ、種々の糖の異性化酵素を探索してきた。
【００１８】
ルネラ・スリシフォルミス（Runella slithyformis）はゲノム上にＮ−アシルグルコサミン２−エピメラーゼ（Ｎ−ａｃｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、以下「ＡＧＥと記載する」）をコードすると推定される遺伝子を３種類有していることが知られている（Gene Bank）。それぞれを発現解析した結果、３種のうち２種はＣＥ活性を有していたが、残る１種についてはＡＧＥ活性およびＣＥ活性を有しなかった。このＡＧＥ活性およびＣＥ活性を有しなかったタンパク質について、各種糖質に対する反応性を検討した。その結果、このＣＥ活性を有しないタンパク質は、驚くべきことに、グルコースおよびマンノースに対して作用し、それぞれマンノースおよびグルコースを生成した。すなわち、当該タンパク質はグルコースとマンノースを相互に変換するマンノース２−エピメラーゼ（Ｍａｎｎｏｓｅ  ２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、以下「ＭＥ」と記載する）であることが明らかとなった。
【００１９】
さらに、ディアドバクター  ファーメンタンス（Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）からＡＧＥと推定されるタンパク質をコードする遺伝子をクローニングし、組換酵素の各種糖質に対する反応性を検討した。その結果、ＡＧＥと推定されるタンパク質の中に、ＭＥ活性を有するタンパク質があることが明らかとなった。
【００２０】
これらのタンパク質は、既知のＣＥ等の一次アミノ酸配列と比較すると特異的な挿入配列を有しており、当該挿入配列の存在がＭＥとしての機能上極めて重要であること、さらに当該挿入配列に類似する複数のＭＥを新たに見出し、本発明を完成するに至った。
【００２１】
本発明は以下の通りである。
［１］
（ａ）配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列
の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質（但し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質を除く）。
［２］
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列が、
一般式（１）：
Ｘ1ＡＰＱＩＫＦＤＸ2Ｘ3ＷＧＷＤＲＦＸ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10（但し、Ｘ1はＶ又はＩであり、Ｘ2はＩ又はＶであり、Ｘ3はＶ又はＩであり、Ｘ4はＮ、Ｔ又はＳであり、Ｘ5はＰ又はＥであり、Ｘ6はＤ又はＧであり、Ｘ7はＧ又はＤであり、Ｘ8はＬ、Ｖ、Ｑ又はＡであり、Ｘ9はＫ又はＱであり、Ｘ10はＳ、Ａ、Ｅ又はＫである）のアミノ酸配列、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、［１］に記載のタンパク質。
［３］
配列番号２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５〜４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、［１］又は［２］に記載のタンパク質。
［４］
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列が、
一般式（２）：
ＫＸ11ＰＡＩＮＩＸ12ＲＴＷＮＡＥＲＥＸ13Ｘ14ＥＸ15ＩＤ
（但し、Ｘ11はＬ又はＩであり、Ｘ12はＫ又はＹであり、Ｘ13はＡ又はＴであり、Ｘ14はＧ又はＮであり、Ｘ15はＫ又はＲである）のアミノ酸配列、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２４６〜２６７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、［１］に記載のタンパク質。
［５］
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の１〜２４５アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２６８〜４３０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、［１］又は［４］に記載のタンパク質。
［６］
［１］〜［５］のいずれか１項に記載のタンパク質を有効成分として含有する、グルコースとマンノースのエピメリ化剤。
［７］
ガラクトースとタロースのエピメリ化活性をさらに有する［１］〜［５］のいずれか１項に記載のタンパク質。
［８］
（ｃ）配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列
の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５〜４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質、又は
（ｂ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質（但し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質を除く）。
［９］
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列が、配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５〜４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５〜４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、［８］に記載のタンパク質。
［１０］
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列が、
一般式（２）：
ＫＸ11ＰＡＩＮＩＸ12ＲＴＷＮＡＥＲＥＸ13Ｘ14ＥＸ15ＩＤ
（但し、Ｘ11はＬ又はＩであり、Ｘ12はＫ又はＹであり、Ｘ13はＡ又はＴであり、Ｘ14はＧ又はＮであり、Ｘ15はＫ又はＲである）のアミノ酸配列、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２４６〜２６７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基アミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の１〜２４５アミノ酸残基アミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であり、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列が、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２６８〜４３０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、［８］に記載のタンパク質。
［１１］
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２若しくは配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質または当該タンパク質のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を有し、かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質を有効成分とするグルコースとマンノースのエピメリ化剤。
［１２］
グルコースおよびマンノースのエピメリ化活性並びにガラクトースおよびタロースのエピメリ化活性を有することが知られていないタンパク質から、（ａ）配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を有するタンパク質、または（ｂ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を有するタンパク質を選択すること及び
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）で選択したタンパク質から、グルコースとマンノースのエピメリ化活性、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性又はその両方を有するタンパク質を選択することを含む、
グルコースおよびマンノースのエピメリ化活性並びに／又はガラクトースおよびタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法。
［１３］
（ｄ）アミノ酸配列既知又は未知のタンパク質のアミノ酸配列に、配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列若しくは配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を挿入すること、または（ｅ）アミノ酸配列既知又は未知のタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部の配列を、配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列若しくは配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列に改変すること、及び
（ｆ）（ｄ）または（ｅ）で挿入又は改変したタンパク質から、グルコースとマンノースのエピメリ化活性、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性又はその両方を有するタンパク質を選択することを含む、
エピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法。
［１４］
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列が、
一般式（１）：
Ｘ1ＡＰＱＩＫＦＤＸ2Ｘ3ＷＧＷＤＲＦＸ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10（但し、Ｘ1はＶ又はＩであり、Ｘ2はＩ又はＶであり、Ｘ3はＶ又はＩであり、Ｘ4はＮ、Ｔ又はＳであり、Ｘ5はＰ又はＥであり、Ｘ6はＤ又はＧであり、Ｘ7はＧ又はＤであり、Ｘ8はＬ、Ｖ、Ｑ又はＡであり、Ｘ9はＫ又はＱであり、Ｘ10はＳ、Ａ、Ｅ又はＫである）のアミノ酸配列、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、［１２］又は［１３］に記載の製造方法。
［１５］
（ａ）、（ｄ）又は（ｅ）のタンパク質が、配列番号２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有し、かつ
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上若しくは９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５〜４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有する、［１２］〜［１４］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１６］
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列が、
一般式（２）：
ＫＸ11ＰＡＩＮＩＸ12ＲＴＷＮＡＥＲＥＸ13Ｘ14ＥＸ15ＩＤ
（但し、Ｘ11はＬ又はＩであり、Ｘ12はＫ又はＹであり、Ｘ13はＡ又はＴであり、Ｘ14はＧ又はＮであり、Ｘ15はＫ又はＲである）のアミノ酸配列、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２４６〜２６７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列である、［１２］又は［１３］に記載の製造方法。
［１７］
（ｂ）、（ｄ）又は（ｅ）のタンパク質が、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上若しくは９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の１〜２４５アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有し、かつ
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上若しくは９０％以上のアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２６８〜４３０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有する、［１２］、［１３］又は［１６］に記載の製造方法。
［１８］
グルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造である、［１２］〜［１７］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１９］
ガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造である、［１２］〜［１７］のいずれか１項に記載の製造方法。
［２０］
グルコースに、［１］〜［５］のいずれか１項に記載のタンパク質、［６］若しくは［１１］に記載のエピメリ化剤又は［１２］〜［１８］のいずれか１項に記載の方法で製造したタンパク質を作用させて、マンノースを生成させることを含む、マンノースの製造方法。
［２１］
配列番号１０、配列番号１２若しくは配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質または当該タンパク質のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質を有効成分とするガラクトースとタロースのエピメリ化剤。
［２２］
ガラクトースに、［７］〜［１０］のいずれか１項に記載のタンパク質、［１２］〜［１７］のいずれか１項に記載の方法で製造したタンパク質、または［２１］に記載のエピメリ化剤を作用させて、タロースを生成させることを含む、タロースの製造方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、安価なグルコースを原料とし、本発明者らが新たな基質特異性を有することを見出した複数のＭＥにより、グルコースをマンノースへそれぞれエピメリ化することでより、簡便かつ効率的にマンノースを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Runsl_4512遺伝子産物(RsME)の各種基質に対する反応性試験結果を示す。
【図２】RsMEのグルコース、マンノースおよびフルクトースに対する反応性試験結果を示す。
【図３】RsMEの最適pHを求める試験結果を示す。
【図４】RsMEのpH安定性試験結果を示す。
【図５】RsMEの熱安定性試験結果を示す。
【図６】RsMEのグルコースからのマンノース生成試験（温度依存性）結果を示す。
【図７】Dfer_5652遺伝子産物(DfME)の各種基質に対する反応性試験結果を示す。
【図８】DfMEの各種基質に対する反応性試験結果を示す。
【図９】DfMEの各種基質に対する反応性試験結果を示す。
【図１０】DfMEの最適pHを求める試験結果を示す。
【図１１】DfMEのpH安定性試験結果を示す。
【図１２】DfMEの熱安定性試験結果を示す。
【図１３】Emtol_1243遺伝子産物(EoME)の各種基質に対する反応性試験結果を示す。
【図１４】EoMEの各種基質に対する反応性試験結果を示す。
【図１５】Slin_6381遺伝子産物(SlME)の各種基質に対する反応性試験結果を示す。
【図１６】SlMEの各種基質に対する反応性試験結果を示す。
【図１７】Spirs_3060遺伝子産物(SsME)の各種基質に対する反応性試験結果を示す。
【図１８】SsMEの各種基質に対する反応性試験結果を示す。
【図１９】Trebr_2067遺伝子産物(TbME)の各種基質に対する反応性試験結果を示す。
【図２０】TbMEの各種基質に対する反応性試験結果を示す。
【図２１】Treaz_2550遺伝子産物(TaME)の各種基質に対する反応性試験結果を示す。
【図２２】TaMEの各種基質に対する反応性試験結果を示す。
【図２３ａ】挿入配列付近のタンパク質Ｒｕｎｓｌ＿４５１２およびＤｆｅｒ＿５６５２のアミノ酸配列、機能未知及び既知のＣＥ等の一次アミノ酸配列との比較表。
【図２３ｂ】タンパク質Ｒｕｎｓｌ＿４５１２を含む、機能未知のタンパク質であって挿入配列付近の一次アミノ酸配列比較表。
【図２３ｃ】タンパク質Ｄｆｅｒ＿５６５２を含む、機能未知のタンパク質であって挿入配列付近の一次アミノ酸配列との比較表。
【図２４】Ｒｕｎｓｌ＿４５１２遺伝子の塩基配列（配列番号１）及びこの塩基配列がコードするＲｕｎｓｌ＿４５１２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２５】Ｄｆｅｒ＿５６５２遺伝子の塩基配列（配列番号３）及びこの塩基配列がコードするＤｆｅｒ＿５６５２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図２６】Ｅｍｔｏｌ＿１２４３遺伝子の塩基配列（配列番号５）及びこの塩基配列がコードするＥｍｔｏｌ＿１２４３タンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図２７】Ｓｌｉｎ＿６３８１遺伝子の塩基配列（配列番号７）及びこの塩基配列がコードするＳｌｉｎ＿６３８１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図２８】Ｓｐｉｒｓ＿３０６０遺伝子の塩基配列（配列番号９）及びこの塩基配列がコードするＳｐｉｒｓ＿３０６０タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図２９】Ｔｒｅｂｒ＿２０６７遺伝子の塩基配列（配列番号１１）及びこの塩基配列がコードするＴｒｅｂｒ＿２０６７タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。
【図３０】Ｔｒｅａｚ＿２５５０遺伝子の塩基配列（配列番号１３）及びこの塩基配列がコードするＴｒｅａｚ＿２５５０タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書における糖質の記載について、特に明記しない場合はＤ体を表す。
【００２５】
＜グルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質＞
本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を有するグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質に関する。但し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質を除く。
（ａ）配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質。
【００２６】
前述したように、ルネラ・スリシフォルミス（Ｒｕｎｅｌｌａ  ｓｌｉｔｈｙｆｏｒｍｉｓ）（ＤＳＭ１９５９４）はゲノム上にＮ−アシルグルコサミン２−エピメラーゼ（ＡＧＥ）をコードすると推定される遺伝子を３種類有していることが知られている（Gene Bank）。本発明者等はそれぞれを発現解析した結果、３種のうち２種はＣＥ活性を有していたが、残る１種についてはＡＧＥ活性およびＣＥ活性を有しなかった。このＡＧＥ活性およびＣＥ活性を有しなかったタンパク質について、各種糖質に対する反応性を検討した（実施例１）。その結果、このＣＥ活性を有しないタンパク質は、驚くべきことに、グルコースおよびマンノースに対して作用し、それぞれマンノースおよびグルコースを生成した。すなわち、当該タンパク質はグルコースとマンノースを相互に変換するマンノース２−エピメラーゼ（ＭＥ）であることが明らかとなった。このＣＥ活性を有しないタンパク質が、配列番号２に示された１〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するタンパク質（Ｒｕｎｓｌ＿４５１２）である。Ｒｕｎｓｌ＿４５１２遺伝子の塩基配列は、配列番号１の塩基配列であり、またこの塩基配列からＲｕｎｓｌ＿４５１２は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることがＧｅｎｅ Ｂａｎｋに公開されている（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ  ＩＤ：ＷＰ＿０１３９３０１２４）。但し、配列番号２に示された１〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するタンパク質（Ｒｕｎｓｌ＿４５１２）は、本発明以前においては機能未知であった。
【００２７】
本発明においては、さらに、ディアドバクター  ファーメンタンス （Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）（ＤＳＭ１８０５３）からＡＧＥと推定されるタンパク質をコードする遺伝子をクローニングし、組換酵素の各種糖質に対する反応性を検討した（実施例２）。その結果、ＡＧＥと推定されるタンパク質の中に、ＭＥ活性を有するタンパク質（Ｄｆｅｒ＿５６５２）があることが明らかとなった。Ｄｆｅｒ＿５６５２遺伝子の塩基配列は、配列番号３の塩基配列であり、またこの塩基配列からタンパク質（Ｄｆｅｒ＿５６５２）は、配列番号４で表される１〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列からなることがＧｅｎｅ Ｂａｎｋに公開されている（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ  ＩＤ：ＷＰ＿０１５８１５０８２）。但し、タンパク質（Ｄｆｅｒ＿５６５２）本発明以前においては機能未知であった。
【００２８】
これら２つのタンパク質Ｒｕｎｓｌ＿４５１２およびＤｆｅｒ＿５６５２は、既知のＣＥ等の一次アミノ酸配列と比較すると特異的な挿入配列（以下、単に挿入配列ということがある）を有しており（図２３ａ〜ｃ）、この挿入配列の存在がＭＥとしての機能上極めて重要であろうと推定した。この挿入配列が、配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列である。次いで、Ｎ−ａｃｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ  （ＡＧＥ）等とデータベース上で推定され、更にこの挿入配列と一定以上の同一性を有する配列を有する機能未知のタンパク質を探索し、追加で５種のタンパク質の機能を検討した。それらが、エムティシシア  オリゴトロフィカ（Ｅｍｔｉｃｉｃｉａ ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、スピロソマ  リンガレ（Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ ｌｉｎｇｕａｌｅ）、セディミニスピロケータ  スマラジナエ（Ｓｅｄｉｍｉｎｉｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｓｍａｒａｇｄｉｎａｅ）、トレポネマ  ブレナボレンス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｂｒｅｎｎａｂｏｒｅｎｓｅ）およびトレポネマ  アゾトヌトリシウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｚｏｔｏｎｕｔｒｉｃｉｕｍ）のゲノム上にそれぞれ存在する、ＡＧＥ等とデータベース上で推定されている遺伝子にコードされたタンパク質であり、これらタンパク質の各種糖質に対する反応性を検討した。その結果、挿入配列を有するＡＧＥ等と推定されるタンパク質はいずれも、ＭＥ活性を有するタンパク質（Ｅｍｔｏｌ＿１２４３、Ｓｌｉｎ＿６３８１、Ｓｐｉｒｓ＿３０６０、Ｔｒｅｂｒ＿２０６７およびＴｒｅａｚ＿２５５０）であることが明らかとなった（実施例３〜７）。Ｅｍｔｏｌ＿１２４３、Ｓｌｉｎ＿６３８１、Ｓｐｉｒｓ＿３０６０、Ｔｒｅｂｒ＿２０６７およびＴｒｅａｚ＿２５５０遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列番号５、７、９、１１、１３の塩基配列であり、またこの塩基配列からタンパク質（Ｅｍｔｏｌ＿１２４３、Ｓｌｉｎ＿６３８１、Ｓｐｉｒｓ＿３０６０、Ｔｒｅｂｒ＿２０６７およびＴｒｅａｚ＿２５５０）は、それぞれ配列番号６、８、１０、１２及び１４で表されるアミノ酸配列からなることがＧｅｎｅ Ｂａｎｋに公開されている（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ  ＩＤ：それぞれ、ＷＰ＿０１５０２８０９２、ＡＤＢ４２３３９、ＷＰ＿０１３２５５６２０、ＷＰ＿０１３７５９１８５およびＷＰ＿０１５７１２９７７）。但し、これらのタンパク質は、本発明以前においては機能未知であった。
【００２９】
（ａ）のタンパク質における配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上であることができる。さらに（ａ）のタンパク質における配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、例えば、一般式（１）：
Ｘ1ＡＰＱＩＫＦＤＸ2Ｘ3ＷＧＷＤＲＦＸ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10（但し、Ｘ1はＶ又はＩであり、Ｘ2はＩ又はＶであり、Ｘ3はＶ又はＩであり、Ｘ4はＮ、Ｔ又はＳであり、Ｘ5はＰ又はＥであり、Ｘ6はＤ又はＧであり、Ｘ7はＧ又はＤであり、Ｘ8はＬ、Ｖ、Ｑ又はＡであり、Ｘ9はＫ又はＱであり、Ｘ10はＳ、Ａ、Ｅ又はＫである）のアミノ酸配列であることができる。
一般式（１）のアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８及び１０で表されるアミノ酸配列における挿入配列に基づき、かつＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10は、これらの挿入配列におけるバリエーションから決定されたものである。
【００３０】
（ａ）のタンパク質における配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、例えば、配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。これら２４１〜２６３アミノ酸残基（配列番号２、４、６、８）又は２４１〜２６４アミノ酸残基（配列番号１０）は、各タンパク質における挿入配列である。
【００３１】
（ａ）のタンパク質における配列番号２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上であることができる。さらに（ａ）のタンパク質における配列番号２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、例えば、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。
【００３２】
（ａ）のタンパク質における配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上であることができる。さらに（ａ）のタンパク質における配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、例えば、
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５〜４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。
【００３３】
（ｂ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上であることができる。さらに（ｂ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、例えば、一般式（２）：
ＫＸ11ＰＡＩＮＩＸ12ＲＴＷＮＡＥＲＥＸ13Ｘ14ＥＸ15ＩＤ
（但し、Ｘ11はＬ又はＩであり、Ｘ12はＫ又はＹであり、Ｘ13はＡ又はＴであり、Ｘ14はＧ又はＮであり、Ｘ15はＫ又はＲである）のアミノ酸配列であることができる。一般式（２）のアミノ酸配列は、配列番号１２及び１４で表されるアミノ酸配列における挿入配列に基づき、かつＸ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15は、これらの挿入配列におけるバリエーションから決定されたものである。
【００３４】
（ｂ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２４６〜２６７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることもできる。
【００３５】
（ｂ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上であることができる。さらに（ｂ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されたアミノ酸配列の１〜２４５アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。
【００３６】
（ｂ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上であることができる。さらに（ｂ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２６８〜４３０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。
【００３７】
尚、本願明細書においてアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列とは、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００３８】
本発明において、タンパク質がグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質であることは、実施例にも記載された以下の活性測定方法により確認することができる。
活性測定
10 mMマンノース、40 mM HEPES-NaOH緩衝液（pH 8.0）、およびタンパク質（酵素）を含む反応液100μLを37℃に20分間保持し、80℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止する。12000 rpmにて10分間遠心分離して得られた上清50μLに含まれるグルコース量をThio-NAD＋を用いたヘキソキナーゼ法により定量する。ヘキソキナーゼ法は、0.5 mM Thio-NAD＋、7 mM ATP、0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)、1.0 mM MgCl2、1.0 U/mL へキソキナーゼ (パン酵母由来、ナカライテスク) および1.0 U/mL G6Pデヒドロゲナーゼ (ナカライテスク) を含む発色試薬を反応液に等量添加して37℃に20分間保持し、G6Pの酸化反応に伴い生成されたThio-NADHの最大吸光波長405 nmの吸光度を分光光度計により測定する。酵素活性1 Uを1分間に1μmolのグルコースを生成する酵素量と定義する。
【００３９】
本発明のグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質には、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性をさらに有するタンパク質がある。ガラクトースとタロースのエピメリ化活性をさらに有するタンパク質であることは、実施例にも記載された以下の活性測定方法により確認することができる。
活性測定
10 mM ガラクトース、40 mM HEPES-Na緩衝液（pH 8.0）、およびタンパク質（酵素）を含む反応液100μLを37℃に20分間保持し、80℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止する。この反応停止液をHPLC分析に供し、酵素反応によって生成したタロースを検出する。なお、HPLCは『HILICpak VG-50 4E』カラム（Shodex社製）を用い、カラム温度40℃、流速0.6 ml/min、溶媒は80% アセトニトリルとして行う。酵素活性1 Uを1分間に1μmolのタロースを生成する酵素量と定義する。
【００４０】
＜エピメリ化剤＞
本発明は、上記本発明のタンパク質を有効成分として含有する、グルコースとマンノースのエピメリ化剤を包含する。エピメリ化剤は、グルコースとマンノースをエピメリ化することができればよく、上記本発明のタンパク質以外に、他の酵素、安定化剤、賦形剤など、通常の酵素製剤に用いる素材を含んでいてもよい。また、その形状も特に制限は無く、粉末状、液状でもよく、担体に固定化された固定化酵素であっても良い。本発明のエピメリ化剤は、例えば、基質であるグルコースの水溶液に添加することで使用することができる。
【００４１】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２若しくは配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質または当該タンパク質のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を有し、かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質を有効成分とするグルコースとマンノースのエピメリ化剤を包含する。
【００４２】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、それぞれＲｕｎｓｌ＿４５１２、Ｄｆｅｒ＿５６５２、Ｅｍｔｏｌ＿１２４３、Ｓｌｉｎ＿６３８１、Ｓｐｉｒｓ＿３０６０、Ｔｒｅｂｒ＿２０６７およびＴｒｅａｚ＿２５５０のタンパク質であり、これらは、前述したように、ＭＥ活性を有する。
【００４３】
本発明のエピメリ化剤は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２若しくは配列番号１４に示されたアミノ酸配列と同一性が７０％以上、７５％以上、好ましくは、同一性が８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上のアミノ酸配列を有し、かつグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質を有効成分として含有する。グルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質であることは前述の活性測定方法にて確認できる。
【００４４】
＜ガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質＞
本発明は、下記（ｃ）又は（ｄ）のアミノ酸配列を有するガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質も包含する。但し、本発明のガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質から、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質を除かれる。
（ｃ）配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５〜４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質。
（ｄ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列の挿入配列を有し、
前記挿入配列のＮ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列、及び
前記挿入配列のＣ末端側に配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列を有し、かつガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質。
【００４５】
（ｃ）のタンパク質における配列番号１０に示されたアミノ酸配列（１〜４２８アミノ酸残基）を有するタンパク質は、Ｓｐｉｒｓ＿３０６０タンパク質であり、このタンパク質は、グルコースとマンノースのエピメリ化活性に加えて、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性も有する。
【００４６】
（ｃ）のタンパク質における配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上であることができる。さらに、（ｃ）のタンパク質における配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。
【００４７】
（ｃ）のタンパク質における配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上であることができる。さらに（ｃ）のタンパク質における配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。
【００４８】
（ｃ）のタンパク質における配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５〜４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上であることができる。さらに（ｃ）のタンパク質における配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５〜４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５〜４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。
【００４９】
（ｄ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上であることができる。さらに、（ｄ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、一般式（２）：
ＫＸ11ＰＡＩＮＩＸ12ＲＴＷＮＡＥＲＥＸ13Ｘ14ＥＸ15ＩＤ
（但し、Ｘ11はＬ又はＩであり、Ｘ12はＫ又はＹであり、Ｘ13はＡ又はＴであり、Ｘ14はＧ又はＮであり、Ｘ15はＫ又はＲである）のアミノ酸配列、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２４６〜２６７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。
【００５０】
（ｄ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列（１〜４１９アミノ酸残基）を有するタンパク質は、Ｔｒｅｂｒ＿２０６７タンパク質であり、配列番号１４に示されたアミノ酸配列（１〜４３０アミノ酸残基）を有するタンパク質は、Ｔｒｅａｚ＿２５５０タンパク質であり、これらのタンパク質も、グルコースとマンノースのエピメリ化活性に加えて、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有する。
【００５１】
（ｄ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上であることができる。さらに、（ｄ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、例えば、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基アミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の１〜２４５アミノ酸残基アミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。
【００５２】
（ｄ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上であることができる。さらに、（ｄ）のタンパク質における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２６８〜４３０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。
【００５３】
本発明のタンパク質は、その由来は特に限定されるものではない。例えば、本発明のタンパク質は、各種遺伝子工学的技術により製造した組換えタンパク質であってもよいし、化学合成により製造した合成タンパク質であってもよい。
【００５４】
遺伝子工学技術により本発明の組換えタンパク質を製造する場合には、上述の本発明のタンパク質をコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を作成し、各種発現ベクターに組み込むことにより、本発明のタンパク質を発現させることができる。本発明のタンパク質をコードする核酸を作製するに当たり、アミノ酸の欠失、置換及び／または付加を施すためには、例えば、エラープローンＰＣＲ法、ＤＮＡシャッフリング法、各種部位特異的変異導入法などにより、任意の塩基の欠失、置換及び／または挿入を行うことができる。このようにして作製した本発明のタンパク質をコードする核酸を適当な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質を製造することができる。
【００５５】
本発明のタンパク質を製造するために利用可能な発現系としては、特に限定させるものではないが、例えば各種生物種（ホスト）において組換えタンパク質の発現を可能とする発現ベクターを利用することができる。利用可能な発現ベクターとしては、細菌、菌類（例えば、酵母類）等の微生物、植物、昆虫細胞、哺乳類細胞などのホストにおいてタンパク質の発現を可能とする各種発現ベクターを用いることが可能であり、ウイルスベクター（ファージベクターを含む）でもプラスミドベクターであってもよい。或いは、ウサギ網状赤血球ライセート、小麦胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いた無細胞タンパク質発現系を用いて、本発明のタンパク質を製造してもよい。
【００５６】
特定の生物種をホストとして用いた発現系で本発明のタンパク質を発現させる場合には、上記本発明のタンパク質をコードする核酸をベクター上に搭載し、このベクターによって宿主細胞を形質転換した後、形質転換させた宿主細胞を培養して培養物中に前記遺伝子がコードするタンパク質を蓄積し、蓄積したタンパク質を収集することを含む、製造方法により調製することができる。
【００５７】
本発明においては、本発明のタンパク質をコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターにより形質転換された形質転換体は本発明の一態様である。
【００５８】
本発明のタンパク質をコードする核酸の取得方法は特に限定されない。例えば、以下の実施例に記載の通り、本発明のタンパク質をコードする核酸を材料として本発明のタンパク質をコードする核酸を取得してもよいし、或いは本発明のタンパク質をコードする核酸を調製して、それに適当な置換等を行って、本発明のタンパク質をコードする核酸を製造してもよい。また、本発明のタンパク質をコードする核酸は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００５９】
本発明のタンパク質は、アミノ酸配列又はそれをコードする塩基配列が分かれば既存の方法で適宜調製することができる。このような製造方法に加えて本発明は以下の製造方法（１）及び（２）も包含する。
【００６０】
＜エピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法＞
本発明のグルコースおよびマンノースのエピメリ化活性並びに／又はガラクトースおよびタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法（１）は、グルコースおよびマンノースのエピメリ化活性並びにガラクトースおよびタロースのエピメリ化活性を有することが知られていないタンパク質から、（ａ）配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を有するタンパク質、または（ｂ）配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を有するタンパク質を選択すること及び
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）で選択したタンパク質から、グルコースとマンノースのエピメリ化活性、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性又はその両方を有するタンパク質を選択することを含む。
【００６１】
上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質の選択は、アミノ酸配列が既知のタンパク質のアミノ酸配列情報に基づいて行うことができる。本製造方法に用いるアミノ酸配列既知のタンパク質としては、後述の表５並びに図２３ｂ及び図２３ｃに示す、挿入配列を有するタンパク質を例示することができる。（ｃ）における選択したタンパク質から、グルコースとマンノースのエピメリ化活性、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性又はその両方を有するタンパク質の選択は、選択したタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを調製し、これを発現し、酵素活性を測定することで実施することができる。ＤＮＡ調製、発現は、前述の既存の方法で実施できる。酵素活性測定は、前述のとおりである。
【００６２】
本発明のグルコースおよびマンノースのエピメリ化活性並びに／又はガラクトースおよびタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法（２）は、（ｄ）アミノ酸配列既知又は未知のタンパク質のアミノ酸配列に、配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列若しくは配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列を挿入すること、または（ｅ）アミノ酸配列既知又は未知のタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部の配列を、配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列若しくは配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列に改変すること、及び
（ｆ）（ｄ）または（ｅ）で挿入又は改変したタンパク質から、グルコースとマンノースのエピメリ化活性、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性又はその両方を有するタンパク質を選択することを含む。
【００６３】
上記（ｄ）又は（ｅ）のタンパク質への配列挿入及び改変は、アミノ酸配列既知又は未知のタンパク質のアミノ酸配列情報に基づいて行うことができる。アミノ酸配列既知のタンパク質の例としては、図２３ａに示すタンパク質を挙げることができる。挿入及び改変したタンパク質から、グルコースとマンノースのエピメリ化活性、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性又はその両方を有するタンパク質の選択は、選択したタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを調製し、これを発現し、酵素活性を測定することで実施することができる。上記（ｄ）又は（ｅ）のタンパク質への配列挿入及び改変は、好ましくは、特許文献３及び４に記載のＣＥとアミノ酸配列の同一性が７０％以上のアミノ酸配列に対し実施するができる。グルコースとマンノースのエピメリ化活性、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性又はその両方を有するタンパク質が選択される確率が高くなるという観点から、好ましくは、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上であるタンパク質のアミノ酸配列に対して配列挿入及び／又は改変を行うのよりこのましい。また、上記（ｄ）又は（ｅ）のタンパク質への配列挿入及び改変は、図２３ａに示すアミノ酸配列既知のタンパク質に対して行うこともでき、アミノ酸配列既知のタンパク質は、機能既知であっても、機能未知であっても、本発明で特定する挿入配列を有さないアミノ酸配列であればよい。本発明で特定する挿入配列を挿入し、必要により、挿入配列部分またはその前後の配列の改変を行うこともできる。機能既知のタンパク質への、本発明で特定する挿入配列の挿入により、グルコースとマンノースのエピメリ化活性、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性又はその両方を有するタンパク質に改変される可能性がある。ＤＮＡ調製、発現は、前述の既存の方法で実施できる。酵素活性測定は、前述のとおりである。
【００６４】
グルコースおよびマンノースのエピメリ化活性並びに／又はガラクトースおよびタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法（１）及び（２）では、
（ａ）、（ｄ）又は（ｅ）における配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上であることができ、例えば、一般式（１）：
Ｘ1ＡＰＱＩＫＦＤＸ2Ｘ3ＷＧＷＤＲＦＸ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10（但し、Ｘ1はＶ又はＩであり、Ｘ2はＩ又はＶであり、Ｘ3はＶ又はＩであり、Ｘ4はＮ、Ｔ又はＳであり、Ｘ5はＰ又はＥであり、Ｘ6はＤ又はＧであり、Ｘ7はＧ又はＤであり、Ｘ8はＬ、Ｖ、Ｑ又はＡであり、Ｘ9はＫ又はＱであり、Ｘ10はＳ、Ａ、Ｅ又はＫである）のアミノ酸配列、配列番号２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６４アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。
【００６５】
エピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法（１）及び（２）では、
（ａ）、（ｄ）又は（ｅ）を経て、（ｃ）又は（ｆ）で調製されるタンパク質が、配列番号２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上若しくは９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有し、かつ
配列番号２に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上若しくは９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号４に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２３アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号６に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、
配列番号８に示されたアミノ酸配列の２６４〜４２７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１０に示されたアミノ酸配列の２６５〜４２８アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有するタンパク質であることができる。
【００６６】
エピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法（１）及び（２）では、
（ｂ）、（ｄ）又は（ｅ）における配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列は、好ましくは、同一性が８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上であることができ、例えば、
一般式（２）：
ＫＸ11ＰＡＩＮＩＸ12ＲＴＷＮＡＥＲＥＸ13Ｘ14ＥＸ15ＩＤ
（但し、Ｘ11はＬ又はＩであり、Ｘ12はＫ又はＹであり、Ｘ13はＡ又はＴであり、Ｘ14はＧ又はＮであり、Ｘ15はＫ又はＲである）のアミノ酸配列、
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２４１〜２６２アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２４６〜２６７アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列であることができる。
【００６７】
エピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法（１）及び（２）では、
（ｂ）、（ｄ）又は（ｅ）を経て、（ｃ）又は（ｆ）で調製されるタンパク質が、（ｂ）のタンパク質が、配列番号１２に示されたアミノ酸配列の１〜２４０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上若しくは９０％以上のアミノ酸配列、又は
配列番号１４に示されたアミノ酸配列の１〜２４５アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有し、かつ
配列番号１２に示されたアミノ酸配列の２６３〜４１９アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が５０％以上若しくは９０％以上のアミノ酸配列、又は配列番号１４に示されたアミノ酸配列の２６８〜４３０アミノ酸残基のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をさらに有するタンパク質であることができる。
【００６８】
本発明の製造方法（１）及び（２）は、グルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造である。本発明の製造方法は、ガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造であることもできる。ガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造においては、酵素活性の測定をガラクトースとタロースのエピメリ化活性について行えばよい。
【００６９】
＜マンノースの製造方法＞
本発明は、マンノースの製造方法を包含し、本発明のマンノースの製造方法は、グルコースに、本発明のグルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質、本発明のエピメリ化剤又は本発明の方法で製造したタンパク質を作用させて、マンノースを生成させることを含む。本発明のタンパク質等を用いるグルコースからマンノースの生成は、例えば、グルコースを含む固形分濃度１〜５０％程度の糖質水溶液を調製し、必要応じて酸又はアルカリを用いてｐＨを６〜１０程度に調整し、当該溶液に本発明のタンパク質を加え３０〜６０℃に１〜７２時間保持することでマンノース（マンノース含有糖質組成物）を製造することができる。上記酵素反応の後、必要に応じて常法を用いてマンノース含有糖質組成物に脱色・脱塩・精製処理などを施すことができる。さらに、得られたマンノース含有糖質組成物に樹脂分画処理等を施すことでマンノースと基質であるグルコース等を分離し、マンノース純度を高めることもできる。また、本発明のタンパク質を担体に固定して固定化酵素とし、当該固定化酵素に上記基質溶液を接触させることでマンノース（マンノース含有糖質組成物）を製造することもできる。
【００７０】
グルコースからマンノースを生成する際の基質としては、グルコース純品を用いても良いが、コスト等の点から他の糖質が含まれる糖組成物を用いてもよく、例えば、水飴、粉飴、ハイドロール（結晶グルコース製造の際に生ずる分蜜液）などを用いることができる。さらに、例えばデキストリン、澱粉等のグルコースを構成糖として含む糖質を原料とし、本発明のタンパク質と共に加水分解酵素を添加し、原料より基質となるグルコースを生成しつつグルコースからマンノースを製造することもできる。
【００７１】
＜ガラクトースとタロースのエピメリ化剤＞
本発明は、ガラクトースとタロースのエピメリ化剤を包含する。本発明のガラクトースとタロースのエピメリ化剤は、配列番号１０、配列番号１２若しくは配列番号１４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質または当該タンパク質のアミノ酸配列と同一性が７０％以上、７５％以上、好ましくは、同一性が８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上のガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質を有効成分とする。
【００７２】
＜タロースの製造方法＞
本発明は、タロースの製造方法を包含し、本発明のタロースの製造方法は、ガラクトースに、本発明のガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質、または本発明の方法で製造したガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質、または本発明のガラクトースとタロースのエピメリ化剤を作用させて、タロースを生成させることを含む。本発明のタンパク質等を用いるガラクトースからタロースの生成は、例えば、ガラクトースを含む固形分濃度１〜５０％程度の糖質水溶液を調製し、必要に応じて酸又はアルカリを用いてｐＨを６〜１０程度に調整し、当該溶液に本発明のタンパク質を加え３０〜６０℃に１〜７２時間保持することでタロース（タロース含有糖質組成物）を製造することができる。上記酵素反応の後、必要に応じて常法を用いてタロース含有糖質組成物に脱色・脱塩・精製処理などを施すことができる。さらに、得られたタロース含有糖質組成物に樹脂分画処理等を施すことでタロースと基質であるガラクトース等を分離し、タロース純度を高めることもできる。また、本発明のタンパク質を担体に固定して固定化酵素とし、当該固定化酵素に上記基質溶液を接触させることでタロース（タロース含有糖質組成物）を製造することもできる。
【００７３】
ガラクトースからタロースを生成する際の基質としては、ガラクトース純品を用いても良いが、コスト等の点から他の糖質が含まれる糖組成物を用いてもよい。さらに、例えば乳糖等のガラクトースを構成糖として含む糖質を原料とし、本発明のタンパク質と共に加水分解酵素を添加し、原料より基質となるガラクトースを生成しつつガラクトースからタロースを製造することもできる。
【実施例】
【００７４】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
【００７５】
［実施例１］
本実施例では、ルネラ  スリシフォルミス （Ｒｕｎｅｌｌａ  ｓｌｉｔｈｙｆｏｒｍｉｓ）からＮ−ａｃｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ（ＡＧＥ）と推定される機能未知のタンパク質（Ｒｕｎｓｌ＿４５１２）をコードする遺伝子をクローニングし、組換酵素の特性評価を行った。
【００７６】
（１）Ｒｕｎｓｌ＿４５１２遺伝子のクローニング
Ｒ．ｓｌｉｔｈｙｆｏｒｍｉｓ（ＤＳＭ１９５９４）から、Ｒｕｎｓｌ＿４５１２遺伝子をクローニングした。Ｒｕｎｓｌ＿４５１２遺伝子の塩基配列は、配列番号１の塩基配列であること、また前記塩基配列からＲｕｎｓｌ＿４５１２は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることがＧｅｎｅ Ｂａｎｋに公開されている。
【００７７】
（２）Ｒｕｎｓｌ＿４５１２遺伝子産物の調製
配列番号１に示すＲｕｎｓｌ＿４５１２遺伝子から終止コドンを除いたものをｐＥＴ２３ａのＮｄｅ１−Ｘｈｏ１サイトに導入して、ヒスチジンタグを付与したＲｕｎｓｌ＿４５１２発現ベクターを構築した。前記発現ベクターを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して、形質転換体を調製した。前記形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢＡ培地３０ｍＬに植菌し、３７℃で一晩培養した。これを、ＬＢＡ培地１Ｌに入れ、波長６００ｎｍの吸光度（Ａ600）が０．５になるまで３７℃で培養した。培養液を氷冷した後、終濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、０．１ｍｏｌ／Ｌイソプロピルβ−チオガラクトピラノシド１ｍＬを添加して、１６℃で２４時間培養した。培養液を７，０００×ｇ、４℃、１０分の条件で遠心分離し、菌体を回収した。菌体を０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む３０ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７）に懸濁し、超音波破砕により菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を１０，０００×ｇ、４℃、１０分の条件で遠心分離し、上清を回収した。得られた無細胞抽出液をニッケルイオンをキレートしたＣｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）  に供して組換Ｒｕｎｓｌ＿４５１２を精製した。すなわち，０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む３０ｍｍｏｌ／Ｌ  イミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７）で担体を洗浄後、０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む２５０ｍｍｏｌ／Ｌ  イミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７）により溶出した。得られた試料を１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７）に透析して以後の解析に用いた。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、単一のバンドであることを確認した。
【００７８】
（３）反応生成物のＴＬＣ分析
５０ｍＭ各種基質、５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ７）および０．１７２ｍｇ／ｍＬ  Ｒｕｎｓｌ＿４５１２からなる反応液５μＬを３７℃に４時間保持し、このうち１μＬを１−ブタノール／２−プロパノール／水＝２／２／１を展開溶媒としてＴＬＣに供した。糖をアニスアルデヒド／硫酸／酢酸＝１／２／９７をＴＬＣプレートに噴霧後，加熱することにより検出した。D-グルコース、D-マンノース、D-グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、D-アロース、D-ガラクトース、D-キシロース、L-フコース、L-アラビノース、L-ラムノース、D-グルコース6-リン酸、D-マンノース6-リン酸、D-フルクトース、D-リキソース、D-タガトース、D-キシルロース、L-ソルボース、D-タロース、D-アルトロース、β-1,4-マンノビオースおよびD-グルコン酸を基質とした。その結果を図１に示す。D-グルコースおよびD-マンノースからのみ反応生成物が検出された。
【００７９】
D-グルコース，D-マンノースおよびD-フルクトースに対する反応については，反応前後の試料をTLCにより分析した。上記と同様の組成の反応液20μLを同様に反応させ，TLCに供した。その結果を図２に示す。D-グルコースからのD-マンノースの生成，D-マンノースからのD-グルコースの生成が確認された。一方で、D-フルクトースからは反応生成物が検出されなかった。すなわち，Runsl_4512はD-グルコースとD-マンノースの相互変換を触媒するマンノース2-エピメラーゼであると判断された。
【００８０】
活性測定
10 mMマンノース，40 mM トリス-HCl緩衝液 (pH 7.8)および酵素を含む反応液0.1 mLを37℃に10分間保持し，80℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止した。12000 rpmにて5分間遠心分離して得られた上清50μLに含まれるグルコース量をF-キットを用いたヘキソキナーゼ法により定量した。当該反応条件下で得られたRunsl_4512の比活性は，0.864 U/mgであった。酵素活性1 Uを1分間に1μmolのグルコースを生成する酵素量と定義した。
【００８１】
最適pH
10 mMマンノース，80 mM ブリトン-ロビンソン緩衝液 (pH 6-10)および酵素を含む反応液0.1 mLを37℃に10分間保持し，80℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止した。上記と同様にグルコース生成量を求めた。その結果を図３に示す。最適pHは7.8であった。
【００８２】
pH安定性
酵素と0.1 Mブリトン-ロビンソン緩衝液(pH 3-12)からなる溶液0.1 mLを4℃に24時間保持した。この酵素活性を上記と同様に測定した。その結果を図４に示す。pH 6.3-9.8の範囲で安定であった。
【００８３】
温度安定性
酵素溶液0.1 mLを30〜60℃に15分間保持し，この活性を上記と同様に測定した。その結果を図５に示す。40℃以下で安定であった。
【００８４】
マンノースに対する速度パラメータ
10-100 mMマンノース，40 mM トリス-HCl緩衝液 (pH 7.8)および酵素を含む反応液0.1 mLを37℃に10分間保持し，80℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止した。得られた反応速度をミカエリスメンテンの速度式に回帰し，Km 55.8 mM，kcat 4.55 s-1を得た。
【００８５】
マンノースに対する反応の経時変化
0.1 Mマンノース，40 mMトリス-HCl緩衝液 (pH 7.8)，および酵素からなる反応液1 mLを37℃に保持し，適宜反応液50μLを採取して80℃に3分間保持して反応を停止した。このグルコース濃度を上記の方法で定量した。反応72時間でのグルコース濃度は72 mMであった。
【００８６】
グルコースからのマンノースの生成
4.2-16.6 μM Runsl_4512，40 mM Tris-HCl (pH 7.8)および30%グルコースからなる反応液0.5 mLを35〜55℃に保持し，24時間後に試料0.1 mLを採取して85℃にて10分間加熱して反応を停止した。これを6倍に希釈して10μLをHPLCに供した。HPLCではカラムにSugar D (ナカライ)を用い，カラム温度30℃，移動相80%アセトニトリル，流速1 mL/minとした。糖をRI検出器により検出した。その結果を図６に示した。酵素濃度8.3μM以上，50℃以下の反応条件では反応後のマンノース濃度はほぼ一定であり，7%となった。グルコースからのマンノースへの変換率は23%であった。
【００８７】
［実施例２］
本実施例では、ディアドバクター  ファーメンタンス （Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）からＮ−ａｃｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ（ＡＧＥ）と推定されるタンパク質（Ｄｆｅｒ＿５６５２）をコードする遺伝子をクローニングし、組換酵素の特性評価を行った。
【００８８】
（１）Ｄｆｅｒ＿５６５２遺伝子のクローニング
Ｄ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（ＤＳＭ１８０５３）から、Ｄｆｅｒ＿５６５２遺伝子をクローニングした。Ｄｆｅｒ＿５６５２遺伝子の塩基配列は、配列番号３の塩基配列であること、また前記塩基配列からＤｆｅｒ＿５６５２は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることがＧｅｎｅ Ｂａｎｋに公開されている。
【００８９】
（２）Ｄｆｅｒ＿５６５２遺伝子産物の調製
配列番号３に示すＤｆｅｒ＿５６５２遺伝子から終止コドンを除いたものをｐＥＴ２３ａのＮｄｅ１−Ｘｈｏ１サイトに導入して、ヒスチジンタグを付与したＤｆｅｒ＿５６５２発現ベクターを構築した。前記発現ベクターを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して、形質転換体を調製した。前記形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢＡ培地３０ｍＬに植菌し、３７℃で一晩培養した。これを、ＬＢＡ培地１Ｌに入れ、波長６００ｎｍの吸光度（Ａ600）が０．５になるまで３７℃で培養した。培養液を氷冷した後、終濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、０．１ｍｏｌ／Ｌイソプロピルβ−チオガラクトピラノシド１ｍＬを添加して、３７℃で４時間培養した。培養液を７，０００×ｇ、４℃、１０分の条件で遠心分離し、菌体を回収した。菌体を０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む３０  ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７）に懸濁し、超音波破砕により菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を１０，０００×ｇ、４℃、１０分の条件で遠心分離し、上清を回収した。得られた無細胞抽出液をニッケルイオンをキレートしたＣｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に供して組換Ｄｆｅｒ＿５６５２を精製した。すなわち，０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む３０ｍｍｏｌ／Ｌ  イミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７）で担体を洗浄後、０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む５００ｍｍｏｌ／Ｌ  イミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７）により溶出した。得られた試料を１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７）に透析して以後の解析に用いた。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、単一のバンドであることを確認した。
【００９０】
反応生成物のTLC分析
50 mM 各種基質、5 mM Tris-HCl (pH 8.0)および、0.0410 mg/ml Dfer_5652からなる反応液5μLを37℃に一晩保持し、このうち1μLをTLCに供した。展開溶媒は以下に示す。展開後のTLCプレートにアニスアルデヒド/硫酸/酢酸=1/2/97を噴射し、加熱することによって糖を検出した。基質としてD-グルコース、D-マンノース、L-ラムノース、D-タロース、D-アルトロース、D-ガラクトース、L-フコース、L-フルクトース、D-タガトース、L-ソルボース、D-リキソース、L-アラビノース、D-キシロース、D-キシルロース、N-アセチル-D-グルコサミン、β-1,4-マンノビオース、D-グルコサミンおよびD-グルコン酸を用いたところ、D-グルコース、D-マンノースからのみ反応生成物が検出された。
【００９１】
展開溶媒は基質ごとに異なるものを使った。
2-プロパノール/1-ブタノール/水＝2/2/1
D-グルコース、D-マンノース、D-ラムノース、D-タロース、D-アルトロース、D-ガラクトース、L-フコース、D-フルクトース、D-タガトース、L-ソルボース、D-リキソース、L-アラビノース、D-キシロース、D-キシルロース、N-アセチル-D-グルコサミン、β-1,4-マンノビオース
1-ブタノール/酢酸/水＝8/3/2 D-グルコサミン
2-プロパノール/1-ブタノール/水＝12/3/4 D-グルコン酸
【００９２】
その結果を図７、図８および図９に示した。基質試験の結果より、Ｄ−グルコースからＤ−マンノース、Ｄ−マンノースからＤ−グルコースが生成することが確認されたので、Dfer_5652はＤ−グルコースとＤ−マンノースの相互変換を触媒するマンノース 2-エピメラーゼであると判断された。
【００９３】
活性測定
10 mMマンノース、40 mM HEPES-NaOH緩衝液（pH 8.0）、および酵素を含む反応液100μLを37℃に20分間保持し、80℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止した。12000 rpmにて10分間遠心分離して得られた上清50 μLに含まれるグルコース量をThio-NAD＋を用いたヘキソキナーゼ法により定量した。即ち、0.5 mM Thio-NAD＋、7 mM ATP、0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)、1.0 mM MgCl2、1.0 U/mL へキソキナーゼ(パン酵母由来、ナカライテスク)および1.0 U/mL G6Pデヒドロゲナーゼ(ナカライテスク)を含む発色試薬を反応液に等量添加して37℃に20分間保持し、G6Pの酸化反応に伴い生成されたThio-NADHの最大吸光波長405 nmの吸光度を分光光度計により測定することで反応液中のグルコースを定量した。当該反応条件下で得られたDfer_5652の比活性は0.688 U/mgであった。ここでは、酵素活性1 Uを、1分間に1μmolのグルコースを生成する酵素量と定義した。
【００９４】
最適pH
10 mMマンノース、40 mMブリトンロビンソン緩衝液（pH 5.5-10.5）および酵素を含む反応液100μLを37℃に20 分間保持し、80℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止した。上記と同様にグルコース生成量を求めた。その結果を図１０に示した。最適pHは8.1であった。
【００９５】
pH安定性
酵素と50 mMブリトン-ロビンソン緩衝液（pH 5.5-12.5）からなる溶液100μLを4℃に24時間保持した。この溶液を酵素液として上記と同様に活性を測定した。その結果を図１１に示した。pH 6.3-9.6の範囲で安定であった。
【００９６】
温度安定性
酵素溶液60μLを20〜55℃に20分間保持し、上記活性測定と同様の手順で活性を測定した。その結果を図１２に示した。45℃以下で80%以上の活性が保持されていた。
【００９７】
マンノースに対する速度パラメータ
4-150 mMマンノース、40 mM HEPES-NaOH緩衝液(pH 8.0)および酵素を含む反応液100 μLを37℃に保持し、反応7分、14分の時点で80℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止した。得られた反応速度をプロットしたところ、飽和曲線が得られた。ミカエリスメンテンの速度式に回帰し、Km 66.4 mM、kcat 3.88 s-1を得た。
【００９８】
実施例１および実施例２において、MEであることが確認されたＲｕｎｓｌ＿４５１２およびＤｆｅｒ＿５６５２について機能既知のAGE、CE、AKIとそのアミノ酸配列を比較したところ、上記２つのMEは、機能既知タンパクのアミノ酸配列と比べ特定部位に挿入配列を有していることが判明した（図２３ａ〜ｃ）。この挿入配列がMEの機能に重要と考え、同様にＡＧＥ等とデータベース上で推定され挿入配列を有する機能未知のタンパク質５種について、その機能を確認した。
【００９９】
［実施例３〜７］
本実施例では、エムティシシア  オリゴトロフィカ（Ｅｍｔｉｃｉｃｉａ ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、スピロソマ  リンガレ（Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ ｌｉｎｇｕａｌｅ）、セディミニスピロケータ  スマラジナエ（Ｓｅｄｉｍｉｎｉｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｓｍａｒａｇｄｉｎａｅ）、トレポネマ  ブレナボレンス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｂｒｅｎｎａｂｏｒｅｎｓｅ）およびトレポネマ  アゾトヌトリシウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｚｏｔｏｎｕｔｒｉｃｉｕｍ）のゲノム上にそれぞれ存在する、ＡＧＥ等とデータベース上で推定されている遺伝子（それぞれ、Ｅｍｔｏｌ＿１２４３、Ｓｌｉｎ＿６３８１、Ｓｐｉｒｓ＿３０６０、Ｔｒｅｂｒ＿２０６７およびＴｒｅａｚ＿２５５０をコードする）を、大腸菌のコドン使用頻度に最適化して合成し、組換酵素として生産し、遺伝子産物の特性評価を行った。
【０１００】
目的遺伝子の合成
目的遺伝子は人工遺伝子合成を用い、ユーロフィンジェノミクス株式会社より購入した。目的遺伝子の設計は同社のHP上で行い、E. coli K12株のcodon usageに最適化した。合成された遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子を含むpEX-A2J1 (pUC系、Amp耐性) に挿入された状態で納入された。
【０１０１】
発現プラスミドの調製
E. coliでの発現検討を行うため、購入した目的遺伝子をpET23aのNdeIサイトおよびヒスチジンタグの間にサブクローニングした。pET23a、あるいは目的遺伝子が挿入されたpEX-A2J1を鋳型としてPCRを行い、線状化pET23aおよび終始コドンを除いた目的遺伝子を増幅した。PCRにはPrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara Bio) を用いた。得られたPCR反応液をアガロースゲル電気泳動し、泳動後のゲルより所望のサイズ付近に存在するバンドを切り出し、PCR増幅産物を切り出し後のゲルより抽出した。In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio) を用いて目的遺伝子をpET23aに挿入した。In-Fusion反応後のプラスミド増幅にはE. coli DH5αを用いた。得られたプラスミドをシーケンス解析し、目的遺伝子が正常に挿入されていることを確認した。
【０１０２】
E. coliでの発現
E. coli BL21(DE3)に発現プラスミドを導入した。100 mg/Lアンピシリンを含むLB培地30 mLにより形質転換体を37℃にて一晩培養し、同培地1 Lに植え継いだ。37℃で培養してA600が0.5-0.8になった段階で0.1 M IPTG 1 mLを添加し、18℃にて24時間培養した。これを遠心分離して菌体を回収し、-30℃にて保存した。
【０１０３】
組換え酵素の抽出
冷凍保存したペレットを0.5 M NaClを含む30 mMイミダゾール-HCl緩衝液(pH 7)に懸濁した。ソニケーションにより菌体を破砕した。遠心分離により得られた上清を0.45μmフィルターにてろ過したものを無細胞抽出液とし、沈殿は無細胞抽出液と同量の上記緩衝液に懸濁した。無細胞抽出液を、ニッケルイオンをキレートしたChelating Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)に供して組換え酵素を精製した。すなわち、上記緩衝液で担体を洗浄後、0.5 M NaClを含む500 mMイミダゾール-HCl緩衝液 (pH 7) により溶出した。溶出画分を回収し、Amicon Ultraを用いて液量が15 mLとなるまで濃縮した。得られた試料を20 mM HEPES-NaOH緩衝液 (pH 7)に透析した。0.45μmフィルターにてろ過し、ろ液を試料として以後の解析に用いた。試料のタンパク質濃度はアミノ酸配列から推定された比吸光度を測定したA280に乗じることで求めた。
【０１０４】
SDS-PAGE
DWで10倍希釈した各試料7.5μLに対し、同量のサンプルバッファーを添加し、99.9℃で5分間加熱したもの全量をSDS-PAGEに供したところ、いずれも単一のバンドであることを確認した。
【０１０５】
活性測定
10 mMマンノース、40 mM HEPES-NaOH緩衝液（pH 8.0）、および酵素を含む反応液100μLを37℃に30分間あるいは60分間保持し、80℃にて5分間加熱することで酵素反応を停止した。12000 rpmにて10分間遠心分離して得られた上清50μLに含まれるグルコース量をThio-NAD＋を用いたヘキソキナーゼ法により定量した。即ち、1 mM Thio-NAD＋、7 mM ATP、0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)、1.0 mM MgCl2、2.0 U/mL へキソキナーゼ (パン酵母由来、ナカライテスク) および2.0 U/mL G6Pデヒドロゲナーゼ (ナカライテスク) を含む発色試薬を反応液に等量添加して37℃に20 分間保持し、G6Pの酸化反応に伴い生成されたThio-NADHの最大吸光波長405 nmの吸光度を分光光度計により測定することで反応液中のグルコースを定量した。1分間に1μmolのグルコースを生成する酵素量を1 Uと定義した。結果を表１に示した。
【０１０６】
【表１】
2019033702.tif 000002
【０１０７】
Emtol_1243, Spirs_3060, Slin_6381, Trebr_2067, Treaz_2550の基質特異性の検討（TLC）
50 mm各種基質，5 mm HEPES-NaOH (pH 8.0) 0.5 mg/mL BSAおよび酵素を含む反応液5μLを37℃にて24時間保持し、1μLをTLC板にスポットした。各展開溶媒で展開した後のTLC板にアニスアルデヒド/硫酸/酢酸=1/2/97を噴霧し、加熱して糖を検出した。反応液中の酵素濃度を以下に示す．8.0μm Emtol_1243, 9.5μm Spirs_3060, 9.5μm Slin_6381, 10μm Trebr_2067, 9.5μm Treaz_2550．基質として、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−タロース、Ｄ−アロース、Ｄ−アルトロース、Ｌ−ソルボース、Ｄ−タガトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−リキソース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−フコース，セロビオース、β-(1,4)グルコシルマンノース、β-(1,4)マンノシルグルコース、β-(1,4)マンノビオース、ラクトース、エピラクトース、ラクチュロース、スクロース、マルトース、Ｎ−アセチルＤ−グルコサミンを用いた。展開溶媒として、単糖およびN-アセチルd-グルコサミンには2-プロパノール/1-ブタノール/水＝2/2/1溶液を、二糖には2-プロパノール/1-ブタノール/水＝12/3/4溶液をそれぞれ用いた。
その結果を図１３〜図２２に以下に示す。なお、いずれの図においてもＢ：Ｂｌａｎｋ（失活処理酵素添加区）、Ｒ：Ｒｅａｃｔｉｏｎ（酵素添加区）を意味する。
【０１０８】
各酵素の基質特異性について、表２に纏めた。いずれの酵素もグルコースからマンノース、マンノースからグルコースが生成することが確認されたので、グルコースとマンノースの相互変換を触媒するマンノース 2-エピメラーゼであると判断された。また、Spirs_3060、Trebr_2067 およびTreaz_2550の３つの酵素は、ガラクトースとタロースを相互に変換する触媒作用を有することも判明した。さらに、Treaz_2550は、ＣＥ活性等も有していた。
【０１０９】
【表２】
2019033702.tif 000003
反応性生物が確認されたものを＋、確認されなかったものを−、試験していないものを空欄にて表記した。
【０１１０】
既知のＡＧＥやＣＥ等のアミノ酸配列とＭＥ活性を有することが確認された上記７酵素のアミノ酸配列および他の機能未知のAGE等と推定されるタンパクのアミノ酸配列を比較し、挿入配列部分の比較結果を図２３ａ〜ｃに示した。なお、図２３ａに示された機能既知酵素に関する補足情報は下記通りである。
＊１：Porcine kidney 由来のAGE（FEBS Letters 587(2013) 840-846）
＊２：Anabaena sp.由来のAGE（FEBS Letters 587(2013) 840-846）
＊３：Rhodothermus marinus 由来のCE（特開2012-130332 号）
＊４：Ruminococcus albus 由来のCE（Appl. Microbiol. Biotechnol. (2008) 79, 433-441）
＊５：Caldicellulosiruptor saccharolyticus 由来のCE（国際公開2010/090095 号）
＊６：Escherichia coli 由来のAKI（J. Mol. Biol. (2008) 377，1443-1459）
＊７：Salmonella enteritica 由来のAKI（J. Mol. Biol. (2008) 377，1443-1459）
上記７酵素のアミノ酸配列の挿入配列を表３に示した。また、配列番号２に示されたＲｕｎｓｌ＿４５１２のアミノ酸配列とその他６酵素のアミノ酸配列の同一性及び配列番号１２に示されたＴｒｅｂｒ＿２０６７のアミノ酸配列とその他６酵素のアミノ酸配列の同一性を表４に示した。
【０１１１】
【表３】
2019033702.tif 000004
【０１１２】
【表４】
2019033702.tif 000005
【０１１３】
Ｒｕｎｓｌ＿４５１２のアミノ酸配列と同一性が４０％を下回る酵素であっても、挿入配列を有しているものは同様にＭＥ活性を有することが明らかとなった。図２３ａ及び表５に示された機能既知及び未知のタンパクについても、同挿入配列を有するものはＭＥ活性を有する可能性があり、さらには、図２３ｂ及び２３ｃ並びに表６表７に示された機能未知のタンパクについても、同挿入配列を有するものはME活性を有するものと強く推認され、本発明のグルコースおよびマンノースのエピメリ化活性並びに／又はガラクトースおよびタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質の製造方法における、グルコースおよびマンノースのエピメリ化活性並びにガラクトースおよびタロースのエピメリ化活性を有することが知られていないタンパク質として利用し、上記エピメリ化活性を有するタンパク質を製造することができる。
【０１１４】
【表５】
2019033702.tif 000006
【０１１５】
【表６】
2019033702.tif 000007
【０１１６】
【表７】
2019033702.tif 000008
【０１１７】
挿入配列の意義
本発明の酵素は一次アミノ酸配列の相同性から、α/α-6バレル構造を有するセロビオース2-エピメラーゼと立体構造が類似すると推察される。本発明の酵素に共通する特有の配列はＣＥで言うところの、α7ヘリックスとα8ヘリックス間のループの一部を構成し、ＣＥと比較して当該ループが延長された形となっている。当該ループは活性部位の一部を構成すると考えられており、当該ループに本酵素特有の配列が存在することで、ＣＥと比較して基質認識機構が変化し、グルコースおよびマンノースへの反応に好ましい活性部位の形状となっているものと推察される。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明は、グルコースとマンノースのエピメリ化活性を有するタンパク質及びガラクトースとタロースのエピメリ化活性を有するタンパク質など、エピメリ化活性を有するタンパク質に関連する分野に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１９】
配列番号１：Ｒｕｎｓｌ＿４５１２塩基配列
配列番号２：Ｒｕｎｓｌ＿４５１２アミノ酸配列
配列番号３：Ｄｆｅｒ＿５６５２塩基配列
配列番号４：Ｄｆｅｒ＿５６５２アミノ酸配列
配列番号５：Ｅｍｔｏｌ＿１２４３塩基配列
配列番号６：Ｅｍｔｏｌ＿１２４３アミノ酸配列
配列番号７：Ｓｌｉｎ＿６３８１塩基配列
配列番号８：Ｓｌｉｎ＿６３８１アミノ酸配列
配列番号９：Ｓｐｉｒｓ＿３０６０塩基配列
配列番号１０：Ｓｐｉｒｓ＿３０６０アミノ酸配列
配列番号１１：Ｔｒｅｂｒ＿２０６７塩基配列
配列番号１２：Ｔｒｅｂｒ＿２０６７アミノ酸配列
配列番号１３：Ｔｒｅａｚ＿２５５０塩基配列
配列番号１４：Ｔｒｅａｚ＿２５５０アミノ酸配列
配列番号１５〜４６：表６及び７に記載のタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４７〜５７：表５に記載のタンパク質のアミノ酸配列
【図１】
2019033702.tif 000009
【図２】
2019033702.tif 000010
【図３】
2019033702.tif 000011
【図４】
2019033702.tif 000012
【図５】
2019033702.tif 000013
【図６】
2019033702.tif 000014
【図７】
2019033702.tif 000015
【図８】
2019033702.tif 000016
【図９】
2019033702.tif 000017
【図１０】
2019033702.tif 000018
【図１１】
2019033702.tif 000019
【図１２】
2019033702.tif 000020
【図１３】
2019033702.tif 000021
【図１４】
2019033702.tif 000022
【図１５】
2019033702.tif 000023
【図１６】
2019033702.tif 000024
【図１７】
2019033702.tif 000025
【図１８】
2019033702.tif 000026
【図１９】
2019033702.tif 000027
【図２０】
2019033702.tif 000028
【図２１】
2019033702.tif 000029
【図２２】
2019033702.tif 000030
【図２３ａ】
2019033702.tif 000031
【図２３ｂ】
2019033702.tif 000032
【図２３ｃ】
2019033702.tif 000033
【図２４】
2019033702.tif 000034
【図２５】
2019033702.tif 000035
【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
2019033702.tif 000039
【図３０】
2019033702.tif 000040
【配列表】
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