(57)【要約】【課題】環境要因による高尿酸血症の発症メカニズムや痛風発作の発症メカニズムの研究に有用な、ヒト健常者と同等のヒト尿酸代謝モデル動物を提供する。【解決手段】前記ヒト尿酸代謝モデル動物は、キサンチンデヒドロゲナーゼ遺伝子の機能を喪失または低活性で発現し、且つ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼを高活性で発現する、非ヒト動物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キサンチンデヒドロゲナーゼ遺伝子の機能を喪失または低活性で発現し、且つ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼを高活性で発現する、非ヒト動物またはその一部。
【請求項２】
前記キサンチンデヒドロゲナーゼ遺伝子の機能を喪失した、請求項１に記載の非ヒト動物またはその一部。
【請求項３】
更に、ウリカーゼ遺伝子の機能を喪失した、請求項２に記載の非ヒト動物またはその一部。
【請求項４】
更に、ヒト由来のキサンチンデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する、請求項３に記載の非ヒト動物またはその一部。
【請求項５】
更に、ウリカーゼ遺伝子の機能を喪失し、前記キサンチンデヒドロゲナーゼ遺伝子として、プロモーターの活性を低下させたキサンチンデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する、請求項１に記載の非ヒト動物またはその一部。
【請求項６】
非ヒト動物がげっ歯類である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の非ヒト動物またはその一部。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の非ヒト動物またはその一部の、ヒト尿酸代謝モデル動物としての使用。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の非ヒト動物またはその一部を使用することを特徴とする、ヒト尿酸代謝に関連する疾患に対する治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
ヒト尿酸代謝に関連する疾患が発症する環境下において、請求項１〜５のいずれか一項に記載の非ヒト動物またはその一部に被験物質を接触させ、対照と比較することにより、前記疾患に対する治療剤または予防剤の候補を選択する、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト尿酸代謝モデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
高尿酸血症の罹患患者数は増大しており、痛風や尿路結石の原因となるだけではなく、心血管障害や腎障害の独立した危険因子でもあるため、高尿酸血症の発症メカニズムを明らかにする研究の重要性が高まっている。しかしながら、ヒトでは進化に伴い偽遺伝子化したために尿酸分解酵素ウリカーゼの機能が喪失しているのに対し、ウリカーゼ遺伝子（Ｕｏｘ）が保存されているために血清尿酸値がヒトの２５分の１しかないマウスは高尿酸血症の研究に用いることができなかった。
【０００３】
ヒト尿酸代謝モデルとなるマウスを作出するために、ウリカーゼ遺伝子ノックアウトマウス（Ｕｏｘ−ＫＯマウス：非特許文献１）を導入した。Ｕｏｘ−ＫＯマウスの血清尿酸値はヒトの２分の１に上昇したが、Ｕｏｘ−ＫＯマウスの尿中尿酸排泄量は体重当たりヒトの２５倍と過剰であるという問題点が明らかになった。アロプリノールやフェブキソスタットなどキサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）阻害薬を投与しても尿中尿酸排泄量はヒトの１０倍、ヒポキサンチン、キサンチンを含めた尿中プリン体排泄量はヒトの２５倍と不変であり、過剰な尿中尿酸排泄による腎機能の低下が問題であった。
【０００４】
尿中プリン体排泄量の過剰はヒポキサンチンを変換するヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）の欠損症（レッシュ＝ナイハン症候群）で認めることから、マウスのＨＰＲＴについて検討したところ、ＨＰＲＴタンパク質のＮ末から２番目のアミノ酸がアラニンであるヒトおよび野ネズミとは異なり、プロリンであるＣ５７ＢＬ／６系統などの研究用マウスではＨＰＲＴタンパク質の分解亢進によりＨＰＲＴ活性が野ネズミの３０分の１と低活性であると報告されていた（非特許文献２）。そこで、ＨＰＲＴ遺伝子座位のあるＸ染色体中央部分のみ野ネズミ由来で、他の染色体はＣ５７ＢＬ／６由来であるＢ６コンソミック系統ＭＳＭマウス（Ｂ６−ＣｈｒＸＣＭＳＭマウス：非特許文献３）を導入し、同マウスがＨＰＲＴ高活性であることを確認した（非特許文献４）。
【０００５】
本発明者は、前記Ｕｏｘ−ＫＯマウスと前記Ｂ６−ＣｈｒＸＣＭＳＭマウスとを交配させることにより、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯマウスを作出した。このＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯマウスにＸＤＨ阻害薬を投与すると、尿中尿酸排泄量がヒトの２５倍から３倍へと減少し、ＨＰＲＴによるプリン体生合成基質であるホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）の消費に伴い尿中プリン体排泄量もヒトの２５倍から１５倍へと６割に減少した（未発表データ）。しかし、過剰量のＸＤＨ阻害薬を投与してもこれ以上は減少しなかった。
【０００６】
ところで、キサンチンデヒドロゲナーゼ（Ｘｄｈ）遺伝子の機能を消失させたＸｄｈ−ＫＯマウスが知られており、ヘテロ接合体は野生型と差がなく生存するが、ホモ接合体は１０日齢〜１４日齢頃より成長が止まり、１か月齢で死亡する（非特許文献５）。ヒトのキサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）遺伝子欠損によるキサンチン尿症では、無尿酸血症および無尿酸尿症である以外は無症状で生存に全く問題がないこととは大きな違いである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Wu X, Wakamiya M, Vaishnav S, Geske R, Montgomery C Jr, Jones P, Bradley A, Caskey CT: Hyperuricemia and urate nephropathy in urate oxidase-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A 91(2):742-746. 1994
【非特許文献２】Johnson GG, Kronert WA, Bernstein SI, Chapman VM, Smith KD: Altered turnover of allelic variants of hypoxanthine phosphoribosyltransferase is associated with N-terminal amino acid sequence variation. J. Biol. Chem., 263, 9079-9082. 1988
【非特許文献３】Takada T, Mita A, Maeno A, Sakai T, Shitara H, Kikkawa Y, Moriwaki K, Yonekawa H, Shiroishi T:Mouse inter-subspecific consomic strains for genetic dissection of quantitative complex traits. Genome Res. 18: 500-508. 2008
【非特許文献４】Watanabe T, Tomioka NH, Watanabe T, Suzuki Y, Tsuchiya M, Hosoyamada M: The Mechanism of False in Vitro Elevation of Uric Acid Level in Mouse Blood. Biol. Pharm. Bull. 39, 1081-1084. 2016
【非特許文献５】Ohtsubo T, Rovira II, Starost MF, Liu C, Finkel T: Xanthine oxidoreductase is an endogenous regulator of cyclooxygenase-2. Circ Res. 2004 Nov 26;95(11):1118-24. 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように、高等霊長類を除く、げっ歯類等の哺乳動物では、ヒトでは機能が喪失しているウリカーゼ遺伝子が保存されているため、高尿酸血症の研究に用いることができなかった。本発明の課題は、環境要因による高尿酸血症の発症メカニズムや痛風発作の発症メカニズムの研究に有用な、ヒト健常者と同等のヒト尿酸代謝モデル動物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題は、本発明による、
［１］キサンチンデヒドロゲナーゼ（Ｘｄｈ）遺伝子の機能を喪失または低活性で発現し、且つ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を高活性で発現する、非ヒト動物またはその一部、
［２］前記キサンチンデヒドロゲナーゼ（Ｘｄｈ）遺伝子の機能を喪失した、［１］の非ヒト動物またはその一部（ＨＰＲＴ高活性−Ｘｄｈ−ＫＯ）、
「３」更に、ウリカーゼ（Ｕｏｘ）遺伝子の機能を喪失した、［２］の非ヒト動物またはその一部（ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ）、
［４］更に、ヒト由来のキサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）遺伝子を有する、［３］の非ヒト動物またはその一部（ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ−ヒトＸＤＨ低発現）、
［５］更に、ウリカーゼ（Ｕｏｘ）遺伝子の機能を喪失し、前記キサンチンデヒドロゲナーゼ（Ｘｄｈ）遺伝子として、プロモーターの活性を低下させたキサンチンデヒドロゲナーゼ（Ｘｄｈ）遺伝子を有する、［１］の非ヒト動物またはその一部（ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯ−非ヒトＸｄｈ低発現）、
［６］非ヒト動物がげっ歯類である、［１］〜［５］のいずれの非ヒト動物またはその一部、
［７］［１］〜［５］のいずれかの非ヒト動物またはその一部の、ヒト尿酸代謝モデル動物としての使用、
［８］［１］〜［５］のいずれかの非ヒト動物またはその一部を使用することを特徴とする、ヒト尿酸代謝に関連する疾患に対する治療剤または予防剤のスクリーニング方法、
［９］ヒト尿酸代謝に関連する疾患が発症する環境下において、［１］〜［５］のいずれかの非ヒト動物またはその一部に被験物質を接触させ、対照と比較することにより、前記疾患に対する治療剤または予防剤の候補を選択する、［８］のスクリーニング方法
により解決することができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ヒトでは機能が喪失しているウリカーゼ遺伝子が保存されている非ヒト動物であっても、環境要因による高尿酸血症の発症メカニズムや痛風発作の発症メカニズムの研究に有用な、ヒト健常者と同等のヒト尿酸代謝モデル動物を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の非ヒト動物は、キサンチンデヒドロゲナーゼ（Ｘｄｈ）遺伝子の機能を喪失または低活性で発現し、且つ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を高活性で発現する、非ヒト動物である。
【００１２】
本発明において、「非ヒト動物」とは、ヒト尿酸代謝モデルとなることができる、ヒト以外の動物であれば、特に限定されるものではないが、非ヒト哺乳動物が好ましい。非ヒト哺乳動物としては、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、サルを挙げることができ、げっ歯類が好ましく、マウスが特に好ましい。
【００１３】
本発明において、「非ヒト動物の一部」とは、非ヒト動物由来の器官、組織、細胞、体液、及びこれらの破砕物または抽出物を意味する。
【００１４】
本発明において、「遺伝子の機能を喪失する」とは、遺伝子の全部または一部が欠損することによって、遺伝子の発現が抑制されるか、あるいは、遺伝子が発現してもその遺伝子産物の活性が失われている状態を意味する。
また、本発明において、「遺伝子が低活性で発現する」とは、ある態様では、非ヒト動物が本来有する遺伝子にコードされるタンパク質の活性が、当該非ヒト動物の野生型と比較して低下している状態を意味し、また、別の態様では、非ヒト動物が本来有する遺伝子に対応する外来性遺伝子（例えば、ヒト由来遺伝子）にコードされるタンパク質の活性が、非ヒト動物が本来有する遺伝子にコードされるタンパク質の活性と比較して低い状態を意味する。
【００１５】
本発明において、「ＨＰＲＴを高活性で発現する」とは、ある態様では、非ヒト動物の異なる系統のＨＰＲＴ活性を比較した場合に、相対的に高い活性を示す系統と同程度の活性を示すことを意味する。あるいは、別の態様では、ヒトと同程度のＨＰＲＴ活性を示すことを意味する。
背景技術欄で示したように、野ネズミ又はヒトでは、ＨＰＲＴタンパク質のＮ末から２番目のアミノ酸がアラニンであるのに対して、研究用マウスでは、同アミノ酸がプロリンであるため、ＨＰＲＴタンパク質の分解亢進によりＨＰＲＴ活性は野ネズミの３０分の１と低活性を示す。Ｎ末から２番目のアミノ酸がアラニンであるＨＰＲＴタンパク質をコードする遺伝子を非ヒト動物に導入することにより、ＨＰＲＴを高活性で発現させることができる。
【００１６】
キサンチンデヒドロゲナーゼ（Ｘｄｈ）遺伝子の機能を喪失または低活性で発現し、且つ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を高活性で発現する、本発明の非ヒト動物には、Ｘｄｈ遺伝子の状態や、Ｘｄｈ遺伝子、ＨＰＲＴ遺伝子以外の遺伝子の状態に基づいて、以下の非ヒト動物（１）〜（４）が含まれる：
（１）前記Ｘｄｈ遺伝子の機能を喪失した非ヒト動物、すなわち、非ヒト動物が本来有するＸｄｈ遺伝子の機能を喪失し、且つ、ＨＰＲＴを高活性で発現する、非ヒト動物（以下、ＨＰＲＴ高活性−Ｘｄｈ−ＫＯ非ヒト動物と称することがある）、
（２）前記（１）の非ヒト動物において、更に、ウリカーゼ（Ｕｏｘ）遺伝子の機能を喪失した非ヒト動物、すなわち、Ｕｏｘ遺伝子及びＸｄｈ遺伝子の機能を共に喪失し、且つ、ＨＰＲＴを高活性で発現する、非ヒト動物（以下、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ非ヒト動物と称することがある）、
（３）前記（２）の非ヒト動物において、更に、ヒト由来のキサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）遺伝子を有する非ヒト動物、すなわち、Ｕｏｘ遺伝子及び前記Ｘｄｈ遺伝子の機能を共に喪失し、ＨＰＲＴを高活性で発現し、ヒト由来のキサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）遺伝子を有する、非ヒト動物（以下、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ−ヒトＸＤＨ低発現非ヒト動物と称することがある）、
（４）前記（１）の非ヒト動物において、更に、Ｕｏｘ遺伝子の機能を喪失し、前記Ｘｄｈ遺伝子として、プロモーターの活性を低下させたＸｄｈ遺伝子を有する非ヒト動物、すなわち、Ｕｏｘ遺伝子の機能を喪失し、ＨＰＲＴを高活性で発現し、且つ、プロモーターの活性を低下させた非ヒト動物由来のＸｄｈ遺伝子を有する、非ヒト動物（以下、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯ−非ヒトＸｄｈ低発現非ヒト動物と称することがある）。
【００１７】
前記（１）のＨＰＲＴ高活性−Ｘｄｈ−ＫＯ非ヒト動物は、非ヒト動物が本来有するＸｄｈ遺伝子の機能を喪失し、且つ、ＨＰＲＴを高活性で発現する非ヒト動物であれば、特に限定されるものではなく、それ自体公知の各種作出方法若しくはそれらの変法、又はそれらの組合せにより作出することができる。例えば、キサンチンデヒドロゲナーゼノックアウト非ヒト動物（例えば、Ｘｄｈ−ＫＯマウス：非特許文献５）とヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ高活性非ヒト動物（例えば、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯマウス：後述する実施例１、Ｂ６−ＣｈｒＸＣＭＳＭマウス：非特許文献３）とを交配することにより、ＨＰＲＴ高活性−Ｘｄｈ−ＫＯ非ヒト動物を作出することができる。より具体的には、交配により得られた産仔から、Ｈｐｒｔ、Ｘｄｈの各遺伝子のジェノタイピングによりＨｐｒｔ（ａ／ｂ）／Ｘｄｈ（−／＋）［但し、Ｈｐｒｔ−ａアレルは高活性型、Ｈｐｒｔ−ｂアレルは低活性型］を得たのち、交配を重ねてＨｐｒｔ（ａ／ａ）／Ｘｄｈ（−／−）であるＨＰＲＴ高活性−Ｘｄｈ−ＫＯ非ヒト動物を得ることができる。
【００１８】
キサンチンデヒドロゲナーゼは、キサンチンを基質として尿酸を生成する酵素であり、ＨＰＲＴ高活性−Ｘｄｈ−ＫＯ非ヒト動物では、キサンチンデヒドロゲナーゼ遺伝子の機能の全部または一部が失われているため、例えば、キサンチン尿症のモデル動物として使用することができる。また、キサンチン尿症、又はキサンチン尿症による尿路結石の治療薬または予防薬のスクリーニング方法に使用することができる。
【００１９】
前記（２）のＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ非ヒト動物は、非ヒト動物が本来有するＵｏｘ遺伝子及びＸｄｈ遺伝子の機能を共に喪失し、且つ、ＨＰＲＴを高活性で発現する非ヒト動物であれば、特に限定されるものではなく、それ自体公知の各種作出方法若しくはそれらの変法、又はそれらの組合せにより作出することができる。例えば、キサンチンデヒドロゲナーゼノックアウト非ヒト動物（例えば、Ｘｄｈ−ＫＯマウス：非特許文献５）とヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ高活性非ヒト動物（例えば、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯマウス：後述する実施例１）とを交配することにより、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ非ヒト動物を作出することができる。より具体的には、交配により得られた産仔から、Ｈｐｒｔ、Ｘｄｈ、Ｕｏｘの各遺伝子のジェノタイピングによりＨｐｒｔ（ａ／ｂ）／Ｘｄｈ（−／＋）／Ｕｏｘ（−／＋）［但し、Ｈｐｒｔ−ａアレルは高活性型、Ｈｐｒｔ−ｂアレルは低活性型］を得たのち、交配を重ねてＨｐｒｔ（ａ／ａ）／Ｘｄｈ（−／−）／Ｕｏｘ（−／−）であるＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ非ヒト動物を得ることができる。
【００２０】
ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ非ヒト動物では、キサンチンデヒドロゲナーゼ遺伝子の機能の全部または一部が失われているため、例えば、キサンチン尿症のモデル動物として使用することができる。また、キサンチン尿症、又はキサンチン尿症による尿路結石の治療薬または予防薬のスクリーニング方法に使用することができる。
また、前記（３）のＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ非ヒト動物を作出するための交配用非ヒト動物として使用することができる。
【００２１】
前記（３）のＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ−ヒトＸＤＨ低発現非ヒト動物は、非ヒト動物が本来有するＵｏｘ遺伝子及びＸｄｈ遺伝子の機能を共に喪失し、ＨＰＲＴを高活性で発現し、ヒト由来のＸＤＨ遺伝子を有する非ヒト動物であれば、特に限定されるものではなく、それ自体公知の各種作出方法若しくはそれらの変法、又はそれらの組合せにより作出することができる。例えば、ヒトＸＤＨ遺伝子を導入したヒトキサンチンデヒドロゲナーゼ低発現トランスジェニック非ヒト動物（例えば、ヒトＸＤＨ低発現Ｔｇマウス：後述する実施例２−１）を予め作出し、このヒトＸＤＨ低発現Ｔｇ非ヒト動物と、前記（２）のＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ非ヒト動物（例えば、ＨＰＲＴ高活性Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯマウス：後述の実施例１）とを交配することにより、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ−ヒトＸＤＨ低発現非ヒト動物を作出することができる。
【００２２】
なお、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ−ヒトＸＤＨ低発現非ヒト動物における「低発現」とは、ノックアウトする前の非ヒト動物が本来有するＸｄｈ遺伝子の発現量と比べて、導入したヒトＸＤＨの発現量が相対的に低いことを意味する。例えば、マウスでは、マウスＸｄｈ転写量に比べてヒトＸＤＨ転写量が１／５０〜１／２００であることが好ましい。
ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ−ヒトＸＤＨ低発現非ヒト動物では、導入するヒトＸＤＨ遺伝子のプロモーターとして、ヒトＸＤＨ遺伝子のプロモーターをそのまま利用することもできるし、それ以外のプロモーターを利用することもできるが、ヒトＸＤＨ遺伝子のプロモーターをそのまま利用すると、ヒト健常者と同等の発現量が期待できるため、好ましい。
【００２３】
ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ−ヒトＸＤＨ低発現非ヒト動物は、ヒト健常者と同等のヒト尿酸代謝モデル動物として使用することができ、例えば、環境要因による高尿酸血症の発症メカニズムや痛風発作の発症メカニズムの研究に有用である。例えば、高脂肪食摂取、利尿薬投与、アルコール摂取などが高尿酸血症を引き起こすことは良く知られているが、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ−ヒトＸＤＨ低発現非ヒト動物に高脂肪食、利尿薬、アルコールなどを投与することにより、高尿酸血症の発症メカニズムを解析することができる。
【００２４】
前記（４）のＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯ−非ヒトＸｄｈ低発現非ヒト動物は、Ｕｏｘ遺伝子の機能を喪失し、ＨＰＲＴを高活性で発現し、且つ、プロモーターの活性を低下させた非ヒト動物由来のＸｄｈ遺伝子を有する非ヒト動物であれば、特に限定されるものではなく、それ自体公知の各種作出方法若しくはそれらの変法、又はそれらの組合せにより作出することができる。例えば、マウスＸｄｈプロモーター領域のゲノム編集によりマウスキサンチンデヒドロゲナーゼ低発現非ヒト動物（例えば、マウスＸｄｈ低発現マウス：後述する実施例３−１）を予め作出し、このマウスＸｄｈ低発現非ヒト動物と、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯ非ヒト動物（例えば、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯマウス：後述の実施例１）とを交配することにより、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯ−非ヒトＸｄｈ低発現非ヒト動物を作出することができる。
【００２５】
なお、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯ−非ヒトＸｄｈ低発現非ヒト動物における「低発現」とは、非ヒト動物が本来有するＸｄｈ遺伝子の発現量と比べて、ゲノム編集後のＸｄｈの発現量が相対的に低いことを意味する。例えば、マウスでは、元のマウスＸｄｈ転写量に比べて編集後のＸｄｈ転写量が１／５０〜１／２００であることが好ましい。
【００２６】
ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯ−非ヒトＸｄｈ低発現非ヒト動物は、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ−ヒトＸＤＨ低発現非ヒト動物と同様に、ヒト健常者と同等のヒト尿酸代謝モデル動物として使用することができ、例えば、環境要因による高尿酸血症の発症メカニズムや痛風発作の発症メカニズムの研究に有用である。例えば、高脂肪食摂取、利尿薬投与、アルコール摂取などが高尿酸血症を引き起こすことは良く知られているが、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯ−非ヒトＸｄｈ低発現非ヒト動物に高脂肪食、利尿薬、アルコールなどを投与することにより、高尿酸血症の発症メカニズムを解析することができる。
【００２７】
本発明の非ヒト動物またはその一部は、ヒト尿酸代謝に関連する疾患に対する治療剤または予防剤のスクリーニング方法に使用することができる。
【００２８】
本発明において、「ヒト尿酸代謝に関連する疾患」としては、ヒト尿酸代謝に関連する疾患であれば特に限定されるものではないが、例えば、高尿酸血症またはキサンチン尿症、及びそれらに関連する疾患を挙げることができる。具体的には、高尿酸血症、痛風、尿路結石、心血管障害（例えば、動脈硬化）、腎障害（例えば、家族性若年性高尿酸血症性腎症、進行性慢性腎不全）、腎性低尿酸血症を挙げることができる。
【００２９】
前記（１）のＨＰＲＴ高活性−Ｘｄｈ−ＫＯ非ヒト動物、あるいは、前記（２）のＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ非ヒト動物は、キサンチン尿症のモデル動物として使用することができるため、キサンチン尿症、又はキサンチン尿症による尿路結石の治療薬または予防薬のスクリーニング方法に使用することに適している。
例えば、前記非ヒト動物またはその一部に被験物質を接触させ、対照と比較して、キサンチン尿症又はその指標に緩和が認められた被験物質を、キサンチン尿症、又はキサンチン尿症による尿路結石の治療剤または予防剤の候補物質として選択することができる。
【００３０】
前記（３）のＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ−ヒトＸＤＨ低発現非ヒト動物、あるいは、前記（４）のＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯ−非ヒトＸｄｈ低発現非ヒト動物は、ヒト健常者と同等のヒト尿酸代謝モデル動物として使用することができるため、ヒト尿酸代謝に関連する疾患（特には高尿酸血症）を発症する環境下（例えば、高脂肪食摂取飼育下、利尿薬投与飼育下、アルコール摂取飼育下）におくと、ヒト尿酸代謝に関連する疾患（特には高尿酸血症）のモデル動物として使用できる。
【００３１】
例えば、ヒト尿酸代謝に関連する疾患（特には高尿酸血症）において、前記非ヒト動物またはその一部に被験物質を接触させ、対照と比較して、ヒト尿酸代謝に関連する疾患（特には高尿酸血症）又はその指標に緩和が認められた被験物質を、同疾患の治療剤または予防剤の候補物質として選択することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
《実施例１：ＨＰＲＴ高活性−Ｘｄｈ−ＫＯマウス及びＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯマウスの作出》
本実施例では、以下に述べる手順に従って、キサンチンデヒドロゲナーゼノックアウトマウス（Ｘｄｈ−ＫＯマウス：非特許文献５）とヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ高活性ウリカーゼノックアウトマウス（ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯマウス）とを交配することにより、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ高活性キサンチンデヒドロゲナーゼノックアウトマウス（ＨＰＲＴ高活性−Ｘｄｈ−ＫＯマウス）及びヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ高活性ウリカーゼ・キサンチンデヒドロゲナーゼダブルノックアウトマウス（ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯマウス）を作出する。
なお、前記ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯマウスは、ウリカーゼノックアウトマウス（Ｕｏｘ−ＫＯマウス：非特許文献１）とヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ高活性マウス（Ｂ６−ＣｈｒＸＣＭＳＭマウス：非特許文献３）とを交配することにより作出した。
【００３４】
具体的には、Ｘｄｈ−ＫＯマウスとＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯマウスとを交配し、産仔の耳パンチ片よりＨｐｒｔ（ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ法による：非特許文献４）、Ｘｄｈ、Ｕｏｘ各遺伝子のジェノタイピングによりＨｐｒｔ（ａ／ｂ）／Ｘｄｈ（−／＋）／Ｕｏｘ（−／＋）［但し、Ｈｐｒｔ−ａアレルは高活性型、Ｈｐｒｔ−ｂアレルは低活性型］を得たのち、交配を重ねてＨＰＲＴ高活性−Ｘｄｈ−ＫＯマウス（Ｈｐｒｔ（ａ／ａ）／Ｘｄｈ（−／−））及びＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯマウス（Ｈｐｒｔ（ａ／ａ）／Ｘｄｈ（−／−）／Ｕｏｘ（−／−））を得る。
Ｈｐｒｔ（ａ／ａ）／Ｘｄｈ（−／−）マウス及びＨｐｒｔ（ａ／ａ）／Ｘｄｈ（−／−）／Ｕｏｘ（−／−）を得た後、尿中ヒポキサンチン、キサンチン濃度をクレアチニン濃度と共にＨＰＬＣを用いて測定し、尿中プリン体排泄量がヒトの尿中尿酸排泄量である０．３（モル／モルＣｒ）に近いものを選別する。
【００３５】
比較例としてのＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯマウスと、得られたＨＰＲＴ高活性−Ｘｄｈ−ＫＯマウスについて、尿中プリン体排泄量を測定したところ、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯマウスが７．０９±０．３７（モル／モルＣｒ）であるのに対して、ＨＰＲＴ高活性−Ｘｄｈ−ＫＯマウスでは３．０４±０．０４（モル／モルＣｒ）と、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯマウスの約４割まで減弱した。
背景技術欄で先述したとおり、比較例のＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯマウスはＸＤＨ阻害薬を投与した状態で、尿中プリン体排泄量がＨＰＲＴ低活性Ｕｏｘ−ＫＯマウスに対して６割まで減弱したが、本発明のＨＰＲＴ高活性−Ｘｄｈ−ＫＯマウスは、ＸＤＨ阻害薬の投与なしでＨＰＲＴ低活性Ｕｏｘ−ＫＯマウスに対して４割の減弱を達成した。
【００３６】
《実施例２：ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ−ヒトＸＤＨ低発現マウスの作出》
本実施例では、以下に述べる手順に従って、ヒトキサンチンデヒドロゲナーゼ低発現トランスジェニックマウス（ヒトＸＤＨ低発現Ｔｇマウス）を作出した後、このヒトＸＤＨ低発現Ｔｇマウスと、実施例１のＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯマウスとを交配することにより、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ高活性ウリカーゼ・キサンチンデヒドロゲナーゼダブルノックアウト・ヒトキサンチンデヒドロゲナーゼ低発現マウス（ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ−ヒトＸＤＨ低発現マウス）を作出する。
【００３７】
＜実施例２−１：ヒトＸＤＨ低発現Ｔｇマウスの作出＞
ヒトＸＤＨ遺伝子プロモーターは−４６３ｂｐ〜−８４２ｂｐの間に抑制配列があるため、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型に、ヒトＸＤＨプロモーターの−８４２ｂｐ〜０ｂｐの８４２ｂｐの領域のＰＣＲクローニングを行い、ＤＮＡクローンを得る。一方、ヒト肝臓トータルＲＮＡから作製したヒト肝臓ＲＴ産物を鋳型に、ヒトＸＤＨ  ｃＤＮＡ（翻訳配列）のＰＣＲクローニングを行い、ｃＤＮＡクローンを得る。ミニサークルｐａｒｅｎｔプラスミドに対して、５’−ヒトＸＤＨプロモーター配列−ヒトＸＤＨ  ｃＤＮＡ（翻訳配列）−３’となるように、ギブソン・アセンブリー法にて挿入し、ヒトＸＤＨプロモーター−ヒトＸＤＨ  ｃＤＮＡ−ＭＣ  ｅａｓｙベクターを作製する。ミニサークル化した後、制限酵素にて線状化し、ＰＣＲ精製キットにて精製し、トランスジェニックマウス作製用トランスジーンとする。
導入遺伝子のマウス受精卵への注入とトランスジェニックマウスの作製は外部機関に委託し、トランスジェニックマウスを得る。
トランスジェニックマウスが得られたら、交配により子孫伝達を確認し、Ｘｕ．２０００の方法に従って、トランスジェニックマウスの肝臓よりトータルＲＮＡを抽出して逆転写反応を行い、マウスＸｄｈ  ｃＤＮＡ量及びヒトＸＤＨ  ｃＤＮＡ量を定量ＰＣＲにより測定する。マウス肝臓のＸｄｈ転写量はヒト肝臓のＸＤＨ転写量の１００倍であることが報告されており、マウスＸｄｈ転写量に比べてヒトＸＤＨ転写量が約１００分の１である系統を選別し、ヒトＸＤＨ低発現Ｔｇマウスとする。
【００３８】
＜実施例２−２：ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ−ヒトＸＤＨ低発現マウスの作出＞
実施例１のＨＰＲＴ高活性Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯマウスと、実施例２−１のヒトＸＤＨ低発現Ｔｇマウスとを交配させて、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−Ｘｄｈ−ＤＫＯ−ヒトＸＤＨ低発現マウスを作出する。導入されたヒトＸＤＨ遺伝子は、定量ＰＣＲを用いてゲノム内量を定量してホモ接合体とヘテロ接合体とを識別し、ホモ接合体を繁殖維持することにより健常者のヒト尿酸代謝モデルマウスを樹立する。
【００３９】
《実施例３：ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯ−マウスＸｄｈ低発現マウスの作出》
本実施例では、以下に述べる手順に従って、マウスキサンチンデヒドロゲナーゼ低発現マウス（マウスＸＤＨ低発現マウス）を作出した後、このマウスＸＤＨ低発現マウスと、実施例１のＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯマウスとを交配することにより、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ高活性ウリカーゼノックアウト・マウスキサンチンデヒドロゲナーゼ低発現マウス（ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯ−マウスＸｄｈ低発現マウス）を作出する。
【００４０】
＜実施例３−１：マウスＸｄｈ低発現マウスの作出＞
本実施例では、マウスＸｄｈプロモーター領域のゲノム編集によりマウスＸｄｈ低発現マウスを作出する。
マウスゲノムＤＮＡを鋳型に、マウスＸｄｈプロモーターＤＮＡをＰＣＲクローニングする。ガイドＲＮＡ選別用に、ミニサークルｐａｒｅｎｔプラスミドに対して、マウスＸｄｈプロモーター下流に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が結合するように、ギブソン・アセンブリー法にて挿入し、マウスＸｄｈプロモーター−ＧＦＰ  ｃＤＮＡ−ＭＣ  ｅａｓｙベクターを作製する。ミニサークル化した後、制限酵素にて線状化し、ＰＣＲ精製キットにて精製し、ガイドＲＮＡ選別用遺伝子とする。ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎＴＭ３０００を用いてマウス正常肝細胞株ＡＭＬ−１２に遺伝子導入し、ＧＦＰ陽性細胞をクローニングする。
【００４１】
ヒトＸＤＨプロモーターのシスエレメント活性は−２２８〜−１３８の間にあることが報告されているので、マウスＸｄｈプロモーターも同様の部位を中心にガイドＲＮＡを設計する。前記ＧＦＰ陽性細胞に、核移行シグナル付き野生型Ｃａｓ９タンパク質発現ベクターと、ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）とを、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＣＲＩＳＰＲＭＡＸＴＭ  Ｃａｓ９  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて導入する。ＧＦＰシグナルが減弱するガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を選別する。
外部機関に委託し、ガイドＲＮＡを用いてマウス受精卵にＣａｓ９  ｍＲＮＡと共にマイクロインジェクションし、ゲノム編集されてマウスＸｄｈ発現が約１００分の１に減弱したマウスをマウスＸｄｈ低発現マウスとする。
【００４２】
＜実施例３−２：ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯ−マウスＸｄｈ低発現マウスの作出＞
実施例１で用いたＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯマウスと、実施例３−１のマウスＸｄｈとを交配することにより、ＨＰＲＴ高活性−Ｕｏｘ−ＫＯ−マウスＸｄｈ低発現マウスを作出する。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、ヒト健常者と同等のヒト尿酸代謝モデル動物を提供することができ、前記モデル動物を用いることにより、ヒト尿酸代謝に関連する疾患に対する治療剤または予防剤をスクリーニングすることができる。