(57)【要約】      （修正有）【課題】中枢神経や骨へ効率的にIDS供給を行い、Hunter症候群の遺伝子治療を可能とする新規ベクタープラスミドを提供する。【解決手段】CMV hybrid 5’LTR-Ψ-RRE-cPPT-PGK-IDS cDNA-WPREmut9-3’LTRからなるベクタープラスミド、CMV hybrid 5’LTR-Ψ-RRE-cPPT-CD11b-IDS cDNA-WPREmut9-3’LTRからなるベクタープラスミド、及びCMV hybrid 5’LTR-Ψ-RRE-cPPT-MND-IDS cDNA-WPREmut9-3’LTRからなるベクタープラスミド。【選択図】図２
2019122371.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CMV hybrid 5’LTR-Ψ-RRE-cPPT-PGK-IDS cDNA-WPREmut9-3’LTRからなるベクタープラスミドであって、配列番号１に記載の塩基配列を含むベクタープラスミド。
【請求項２】
CMV hybrid 5’LTR-Ψ-RRE-cPPT-CD11b-IDS cDNA-WPREmut9-3’LTRからなるベクタープラスミドであって、配列番号２に記載の塩基配列を含むベクタープラスミド。
【請求項３】
CMV hybrid 5’LTR-Ψ-RRE-cPPT-MND-IDS cDNA-WPREmut9-3’LTRからなるベクタープラスミドであって、配列番号3に記載の塩基配列を含むベクタープラスミド。
【請求項４】
請求項１,2又は3記載のベクタープラスミドを備えるレンチウイルスベクターシステム。
【請求項５】
請求項4記載のレンチウイルスベクターシステムが導入されて形質転換された細胞。
【請求項６】
請求項5記載の細胞を治療上有効量含む、細胞製剤。
【請求項７】
請求項５記載の細胞を治療上有効量含む、Hunter症候群の予防及び／又は治療のための細胞製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Hunter症候群の遺伝子治療のためのレンチウイルスベクターシステムに用いられるベクタープラスミド、そのベクタープラスミドを備えるレンチウイルスベクターシステム、そのレンチウイルスベクターシステムが導入された細胞、及び、その細胞を含む細胞製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Hunter症候群はムコ多糖症II型(以下、Mucopolysaccharidosis type II, MPSIIと記載することがある。)であり、ムコ多糖分解酵素活性の欠損又は低下によって、結合織を中心とした全身の諸臓器に不完全に分解されたムコ多糖が蓄積することにより、様々な症状を呈する遺伝性代謝異常症である。ムコ多糖症の中では唯一、X染色体劣性遺伝を示し、出生男児の11〜13万人に1人発症すると報告されている。
【０００３】
原因としては、X染色体短腕（Xq28）に位置する、リゾゾーム加水分解酵素の一つであるイズロネート−2-スルファターゼ（以下、iduronate-2-sulfatase:IDSと記載することがある。)遺伝子の異常と考えられている。遺伝子異常には突然変異から欠失まであり、genotypeの多様性がphenotypeの多様性を反映していると考えられている。
【０００４】
MPSIIはIDSの欠損により全身にグリコサミノグリカン(GAG)が蓄積し、中枢神経、骨、心臓等の障害を呈し、重症例は10代で死に到る。既存の治療法には酵素補充療法(ERT)、造血幹細胞移植(HSCT)がある。
【０００５】
酵素補充療法は欠損している酵素を薬剤として体内に補充する治療法で、継続的に行う必要がある(非特許文献１乃至６)。実施時期が早ければ早いほど効果があり、症状が進行する前に毎週酵素を補充することで、さまざまな症状の予防や進行を抑制することが可能である。しかし、骨変形や心弁膜症等完成した病変や中枢神経症状を酵素補充療法のみで治療することは困難であり、また投与に伴いアレルギー・アナフィラキシー等の副作用が生じることもある。更に酵素補充療法は費用も高額である上に週に一度、生涯にわたり実施しなければならないため、患者にとって大きな負担となる。
【０００６】
造血幹細胞移植は、脳や心臓の症状進行の抑制を期待できる治療法であり、病変が完成される前の２歳くらいまでの時期であれば検討される治療方法である(非特許文献７乃至１０)。骨髄移植を行い造血幹細胞が生着すると、自分で酵素をつくれるようになるため、酵素補充療法の頻度を下げることも可能となる。しかし、造血幹細胞移植も中枢神経系に効果が充分ではない、２歳未満で移植治療しないと効果は望めない、適切なドナー（骨髄提供者）が得られない、Graft Versus Host Disease(GVHD)等の重篤な副作用の危険がある等の問題点を有する。
【０００７】
Hunter症候群の標準的治療である酵素補充療法は、上述のように、毎週の通院が生涯必要であるため患者さんのQOLに大きく影響する。また造血幹細胞移植も、上述のように、感染症や拒絶反応のリスクがある上に、ドナーを探す必要もある。そこで、患者の負担が軽減される新規治療法が切望される。新規治療方法として患者自身の骨髄を利用する遺伝子治療がある。これはウイルスベクターを用いて患者の骨髄に正常な遺伝子を組み込む方法で、他人の骨髄を利用するよりも酵素活性が向上し、頭や骨、心臓弁膜への効果も期待される。また、自分の骨髄を利用することで感染症や拒絶反応のリスクもなくなり、ドナーを探す必要もなくなる。
【０００８】
本発明者は、モデルマウスに(B6/MPS II)ウイルス・プロモーター（MNDプロモーター：モロニーマウス白血病ウイルスLTR/骨髄増殖肉腫ウイルスエンハンサー)を用いIDS遺伝子を造血幹細胞に発現させるとERTやHSCTでは達成できなかった、MPSIIモデルマウスの脳のGAGを減少させることに成功している(非特許文献１１)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Muenzer J, Gucsavas-Calikoglu M, McCandless SE, et al：A phase I/II clinical trial of enzyme replacement therapy in mucopolysaccharidosis II （Hunter syndrome）. Mol Genet Metab 2007；90：329−337.
【非特許文献２】Muenzer J, Wraith JE, Beck M, et al：A phase II/III clinical study of enzyme replacement therapy with idursulfase in mucopolysaccharidosis II （Hunter syndrome）. Genet Med 2006；8：465−473.
【非特許文献３】O kuyama T, Tanaka A, Suzuki Y, et al：Japan Elaprase Treatment（JET） study：idursulfase enzyme replacement therapy in adult patients with attenuated Hunter syndrome（MucopolysaccharidosisII, MPS II）. Mol Genet Metab 2010；99：18−25.
【非特許文献４】Muenzer J, Beck M, Eng CM, et al：Long-term, open-labeled extension study of idursulfase in the treatment of Hunter syndrome. Genet Med 2011；13：95−101.
【非特許文献５】da Silva EM, Strufaldi MW, Andriolo RB, et al：Enzyme replacement therapy with idursulfase for mucopolysaccharidosis type II（ Hunter syndrome）. Syst Rev 2016；2：CD008185.
【非特許文献６】Parini R, Rigoldi,b M, Tedescoet L, et al：Enzymatic replacement therapy for Hunter disease：Up to 9 years experience with 17 patients. Mol Genet Metab Rep 2015；3：65−74.
【非特許文献７】Guffon N, Bertrand Y, Forest I, et al：Bone marrow transplantation in children with Hunter syndrome：outcome after 7 to 17 years. J Pediatr 2009；154：733−737.
【非特許文献８】Kato S, Yabe H, Takakura H, et al：Hematopoietic stem cell transplantation for inborn errors of metabolism：a report from the research committee on transplantation for inborn errors of metabolism of the Japanese ministry of health, labour and welfare and the working group of the Japan society for hematopoietic cell transplantation. Pediatr Transplant 2016；20：203−214.
【非特許文献９】Vellodi A, Young E, Cooper A, et al：Long-term follow-up following bone marrow transplantation for Hunter disease. J Inherit Metab Dis 1999；22：638−648.
【非特許文献１０】Tanaka A, Okuyama T, Suzuki Y, et al：Long-term ef-cacy of hematopoietic stem cell transplantation on brain involvement in patients with mucopolysaccharidosis type II：a nationwide survey in Japan. Mol Genet Metab 2012；107：513−520.
【非特許文献１１】Toya Ohashi, Hematopoietic Stem Cell Gene Therapy Corrects Neuropathic Phenotype in Murine Model of Mucopolysaccharidosis Type II, HUMAN GENE THERAPY 2015; 26: 357-366.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、MPS IIにおいて中枢神経や骨に効率的にIDSを供給させるベクターコンストラクトおよび遺伝子導入方法を含めた遺伝子治療法は実現されていない。
【００１１】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、各臓器はもとより中枢神経や骨系統へ効率的にIDS供給を行い、Hunter症候群の遺伝子治療を可能とする新規ベクタープラスミドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明にかかるベクタープラスミドは、CMV hybrid 5’LTR-Ψ-RRE-cPPT-PGK-IDS cDNA-WPREmut9-3’LTRからなるベクタープラスミドであって、配列番号１に記載の塩基配列を含むベクタープラスミドである。
【００１３】
また、本発明にかかるベクタープラスミドは、CMV hybrid 5’LTR-Ψ-RRE-cPPT-CD11b-IDS cDNA-WPREmut9-3’LTRからなるベクタープラスミドであって、配列番号２に記載の塩基配列を含むベクタープラスミドである。
【００１４】
また、本発明にかかるベクタープラスミドは、CMV hybrid 5’LTR-Ψ-RRE-cPPT-MND-IDS cDNA-WPREmut9-3’LTRからなるベクタープラスミドであって、配列番号３に記載の塩基配列を含むベクタープラスミドである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、中枢神経や骨系統へ効率的にIDS供給を行い、Hunter症候群の遺伝子治療を可能とする新規ベクタープラスミドが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】レンチウイルスベクターシステムについて説明する図である。
【図２】図1で示したシステムに含まれる4種のプラスミドのうち、3種類のベクタープラスミドを説明する図である。
【図３】遺伝子治療6か月後において、血清、小脳、大脳、心臓、肝臓、脾臓におけるIDS酵素活性の実測値を示す図である。
【図４】遺伝子治療6か月後において、小脳、大脳、心臓、肝臓、脾臓におけるGAG蓄積量の実測値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１８】
本発明にかかるレンチウイルスベクターシステムは、図１に記載されているように、本発明にかかるベクタープラスミド、パッケージングプラスミド、Revプラスミド、VSV-Gエンベローププラスミドを有する。これらが統合されて細胞に感染しゲノムに組込まれた状態をプロウイルスという。
【００１９】
レンチウイルスベクターの作製方法を記載する。まずHIV-1のプロウイルスゲノムをベクター、パッケージング、Rev、エンベロープの４つのプラスミドに分割する（図１）。
【００２０】
パッケージングプラスミドは、エンベロープ以外のウイルス遺伝子をコードしておりウイルス粒子を作るための蛋白質をトランスに供給する。非分裂細胞への感染に修飾遺伝子産物は必要ではないため、修飾遺伝子(vif,fpr,vpu,nef)は削除される。修飾遺伝子産物はHIV-1の複製に必須ではないが重要であり、HIV-1の病原性とも深く関わっているため、削除により安全性は高まる。またtatはHIV-1の複製に必須であるので、tatをパッケージングプラスミドから削除することにより安全性は更に高くなる。なおパッケージングプラスミドは、パッケージングシグナル(Ψ)を持たないので、このプラスミドから転写されたRNAはウイルス粒子内には取り込まれない。
【００２１】
Revは転写後のRNAに作用し、スプライシングを受けていないmRNAを選択的に核外へ運びだすことで構造蛋白質が翻訳される。第三世代ではパッケージングプラスミドとは別のプラスミドとしている。
【００２２】
エンベローププラスミドは、HIV-1のエンベロープではCD4陽性細胞にしか感染することができないので、宿主域を広げるためVSV-G(vesicular stomatitis virus G gylcoprotein)を用いている。VSV-Gのレセプターはリン脂質であると考えられており、VSV-Gをエンベロープとして用いることにより、細胞表面の受容体には依存せずにウイルス粒子と細胞との膜融合が起こる。従って、基本的に動物種、細胞腫を問わずに感染させることができるようになる。またVSV-Gは物理的に強く、超遠心によってウイルス粒子を容易に濃縮することができる。
【００２３】
ベクタープラスミドはパッケージングシグナル(Ψ)を含んだ両端のLTR（転写発現を制御する繰り返し配列）間に目的とする遺伝子が組み込まれている。更に逆転写に必須のプライマー結合部位を持ち、このプラスミドから転写されたRNAはウイルス粒子内に取り込まれる。HIV-1のLTRプロモーター活性は、tat非存在下では非常に弱いので、組み込んだ外来遺伝子の発現には内部プロモーター(図1 Pro)を使用する。本実施形態では内部プロモーターはPGK / CD11b / MND プロモーターであり詳細は図2に示されている。この3種類の導入効率などの性能を比較し最適なものを使用する。組込まれる挿入外来遺伝子（図１Purpose gene）はMPS IIの欠損酵素を発現する遺伝子IDS cDNAである。RRE(rev responsive element)は、Revが結合し完全長のウイルスゲノムRNAが効率よく核から細胞質へ輸送されるのに必要である。レトロウイルスは逆転写の際、３’LTRの直上流にあるPPT(polypurine tract)配列からプラス鎖の合成が始まるが、レンチウイルスにはゲノム中央部分にcPPT(central polypurine tract)と呼ばれる同じ配列がもう一箇所あり、ここからも合成が行われるため、最終的な二本鎖cDNAには中央にDNAフラップと呼ばれる約100塩基対の３本鎖構造ができる。cPPT配列は逆転写の効率に影響を与えることが示唆されており、cPPT配列をベクターに組み込むことにより、遺伝子導入効率が高くなる。WPRE（woodchuk hepatitis virus posttranscriptional regulatory element：ウッドチャック転写後調節エレメント）は、発現効率を上昇させるために組み込まれている。即ち、WPREはmRNAの核から細胞質への能動的な輸送と細胞質でのmRNAの安定性を高める役割があるとされており、この配列をベクターに組み込むことにより、titer及び導入遺伝子の発現効率が上がる。また3’LTRのU3にあるエンハンサー/プロモーター部分を削除することでプロウイルス状態で3’5’両方のLTRともプロモーター活性を持たないことになり、５’Ｒ領域からの全ゲノムの転写は起こらないことになる。これによりHIV-1増殖力等欠損株に該当するレンチウイルスベクターでポジションペーパーの要件「３．プロウイルスにおいてLTRのプロモーター活性を持たず、HIV全ゲノムが転写されないもの」を満たす、SIN  (self inactivating)ベクターとされる。また5’ LTRのU3をCMVプロモーターに置換することによりtat依存性がなくなり、パッケージングプラスミドからtatを削除することが可能になる。なおベクタープラスミドにおいて組込む目的遺伝子は前述のようにIDSで共通であるが、内部プロモーターの違いによって3種類準備している。すなわちCMV hybrid 5’LTR-Ψ-RRE-cPPT-PGK-IDS cDNA-WPREmut9-3’LTRからなり、配列番号１に記載の塩基配列(配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加、および／又は挿入された塩基配列も含む。)を含むベクタープラスミド、CMV hybrid 5’LTR-Ψ-RRE-cPPT-CD11b-IDS cDNA-WPREmut9-3’LTRからなり、配列番号2に記載の塩基配列(配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加、および／又は挿入された塩基配列も含む。)を含むベクタープラスミド、CMV hybrid 5’LTR-Ψ-RRE-cPPT-MND-IDS cDNA-WPREmut9-3’LTRからなり、配列番号3に記載の塩基配列(配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、欠失、付加、および／又は挿入された塩基配列も含む。)含むベクタープラスミ��、の3種類である（図２）。このうち、CMV hybrid 5’LTR-Ψ-RRE-cPPT-MND-IDS cDNA-WPREmut9-3’LTRからなるベクタープラスミドと同じプロモーター(MND)を搭載した第二世代レンチウイルスベクターにてMPSIIモデルマウスの脳のGAGを減少させることに成功しており、上述のベクタープラスミドは中枢神経や骨へ効率的にIDS供給が可能であると考えられる。
【００２４】
次に本発明にかかるベクタープラスミドの作製方法について記載する。ベクタープラスミドは、目的のDNA断片(IDS cDNA)を目的のベクタープラスミド(pLGT1 plasmid)に載せるクローニング操作により行われる。
【００２５】
まずインサートDNAの準備（目的のDNA断片IDS cDNAの調製）では、あらかじめ目的DNA断片の制限酵素切断箇所を確認し、次に使用するベクタープラスミドのクローニングサイトに合わせて、切り出しに使用する制限酵素を選定する。制限酵素サイトは5'-MluI ACGCGT / 3'-BamHI GGATCCである。
【００２６】
次にベクタープラスミドの準備では、目的のベクタープラスミド(pLGT1 plasmid)のクローニングサイトを制限酵素で切断して、ベクターの線状化を行う。そしてインサートDNAと線状化プラスミドとのライゲーションを行い本発明にかかるベクタープラスミドを作製する。
【００２７】
上述の４つの(packaging, rev, envelope, vector) プラスミドシステムは第３世代レンチウイルスベクターと呼ばれており、システム全体でHIV-1ゲノムの1/3以上を削除しており、野生型のHIV-1が産生する可能性はほとんどない。各プラスミド間の相同領域も最小限にしてあるので、相同組み換えによって自立増殖能を持ったウイルスが産生する可能性もほとんどない。
【００２８】
次にレンチウイルスベクターの使用態様を記載する。
【００２９】
構築した３種類のプロモーターの違うベクタープラスミドにそれぞれ、第三世代パッケージングプラスミド、Revプラスミド、VSV-Gエンベローププラスミドを大量培養した293T細胞にco-transfectionし、３日後に上清の培養液を回収する。この時点で培養液はウイルス粒子が含まれており、これを超遠心で精製し、-80℃で分注保存する。保存はウイルス活性が低下しないとされる１年以内とする。保存したベクターウイルスは37℃で瞬時に液体に戻し使用する。
【００３０】
また、本発明にかかる細胞は、本発明にかかるレンチウイルスベクターシステムが導入されて形質転換された細胞である。本発明にかかるレンチウイルスベクターシステムが導入される細胞は、特に限定されるものではないが、例えば、T細胞、NK細胞又はその前駆細胞（造血幹細胞、リンパ球系幹細胞等）を用いることができる。なお造血幹細胞はCD34陽性細胞である。
【００３１】
また、本発明にかかる細胞製剤は、本発明にかかるレンチウイルスベクターシステムが導入されて形質転換された細胞を治療上有効量含む、細胞製剤である。細胞製剤には、例えば１回の投与用として、104個〜1010個の細胞を含有させることが可能である。また、細胞の保護を目的としてジメチルスルフォキシド（DMSO）や血清アルブミン等、細菌の混入を阻止する目的で抗生物質等、細胞の活性化、増殖又は分化誘導等を目的とした各種の成分（ビタミン類、サイトカイン、成長因子、ステロイド等）等の成分を細胞製剤に含有させてもよい。
【００３２】
本発明にかかる細胞製剤は、例えばHunter症候群の予防及び／又は治療のための細胞製剤である。本明細書において「予防」には疾患の発症を抑えること及び遅延させることが含まれ、疾患になる前の予防だけでなく、治療後の疾患の再発に対する予防も含まれる。一方「治療」には、症状を治癒すること、症状を改善すること及び症状の進行を抑えることが含まれる。
【００３３】
MPSIIモデルマウスは、ヒト造血幹細胞移植可能なNOGマウス（NOD/Shi-scid, IL-2RγKO）のIDSをCRISPR/Cas9でノックアウトしてモデルマウス（NOG/MPS II）とした。またB6マウス(C57BL/6マウス)のIDSをCRISPR/Cas9でノックアウトしてモデルマウス（B6/MPS II）とした。
【００３４】
MPSIIモデルマウスを遺伝子診断し、８週令のヘミ接合のオスマウスに前処置を施しその大腿骨から骨髄を摘出する。これを培養後、マイクロビーズ法等で分離抽出したマウス造血幹細胞系列に精製したウイルスベクターをMOI=50で感染させ遺伝子導入する。この導入後の骨髄幹細胞を、別のヘミ接合オスマウスに半致死量の放射線照射を加えた後、尾静脈注射により投与する。このあと20週令以上まで経過観察し、循環血中の酵素(IDS)活性、各臓器特に中枢神経、骨、心臓等における酵素活性、基質(GAG)蓄積を分析する。また中枢機能を評価するために行動試験を実施する。これらをプロモーターの違う３種類のウイルスベクターで施行し、各群間で評価を行う。
【００３５】
以下に、B6/MPS IIマウス、NOG/MPS IIマウスへの遺伝子治療の実施を記載する。B6/MPS IIマウスの造血幹細胞に３種類のIDSを発現するレンチウイルスベクターを感染させ致死量放射線を照射もしくは抗c-kit抗体(ACK2)＋低線量放射線照射したB6/MPS IIマウスに移植する。抗c-kit抗体を使用する理由は以下の通りである。本遺伝子治療では患者の造血幹細胞を死滅させ、遺伝子導入された造血幹細胞が生着出来るように骨髄ニッチを開ける必要がある。造血幹細胞はc-kit等を介して骨髄のニッチに存在し、このニッチに存在することにより細胞分裂せず幹細胞としての機能、すなわち多分化能、自己複製能を維持している(dormancyと呼ばれる)。細胞分裂をしないため放射線、抗癌剤等に耐性である。そのため患者の造血幹細胞を死滅させるためには大量の抗癌剤/放射線照射が必要である。しかし一旦、造血幹細胞がニッチより離脱すると分裂を開始し放射線、抗癌剤への感受性が増す。つまり低線量の放射線でも造血幹細胞は死滅する。よって抗c-Kit抗体をレシピエントに投与するとレシピエントの造血幹細胞はニッチより離脱、分裂を開始し、放射線感受性になる。これにより低線量の放射線でも前処置として充分な可能性があり、強力な前処置を回避できる。
【００３６】
ヒトCD34陽性細胞に3種類のIDSを発現するレンチウイルスベクターを感染させ、NOG/MPS IIマウスに移植する。これはヒト造血幹細胞を標的とするため、より臨床に近い治療である。前処置は免疫不全マウスであるため低線量の放射線照射で充分である。
【００３７】
生化学的評価は、心臓、肝臓、脾臓、中枢神経、骨等の各部位におけるIDS活性ならびにGAGの測定を行なう。GAGの測定は疾患特異的GAG測定法(Shimada Y et al. Mol Genet Metab2016)に改良を加えた液体クロマトグラフィー質量分析法（LC/MS/MS）を用いる方法で行なう。具体的には、組織から抽出・精製したGAGの非還元末端に存在する2-硫酸化イズロン酸を組換えIDSとイズロニダーゼを用いてイズロン酸として切り出し、Multiple Reaction Monitoring (MRM) モードにて定量分析を行う。
【００３８】
病理学的評価は、神経細胞内等のGAGの蓄積を通常の光学顕微鏡、電子顕微鏡で行なう。脳に関してはで２次性に炎症性変化と伴に現れるLAMP2陽性細胞、GFAP陽性細胞、BSI-B4陽性細胞、GM3陽性細胞の数、面積を免疫組織学的手法を用いて検討する。またオートファジーと関連するといわれるSCMAS陽性細胞も検討する。
【実施例】
【００３９】
（１）ベクタープラスミドの作製
レンチウイルスベクタープラスミドの基本ベクターを以下の手順で作製した。pLV-SIN-CMV Neoベクター（タカラバイオ社製）を元に5’ HIV-1 LTRのU3プロモーター領域をCMVプロモーターと置換したハイブリッドLTRを作製し、パッケージングシグナル下流のGag残存配列を削減、内部プロモーターPCMVIEからネオマイシン耐性遺伝子までを除去し、WPRE配列に含まれるX proteinの発現を抑制させるためにmut9配列（1塩基除去によるX proteinフレームシフト）に変更し、3’ SIN LTR領域にcHS4 core insulator配列（正方向）を搭載したレンチウイルスベクタープラスミドpLGT1を構築した。IDS cDNA断片をベクタープラスミドpLGT1に載せるクローニング操作により、ベクタープラスミドを作製した。
【００４０】
まずインサートDNAの準備（IDS cDNA断片の調製）では、あらかじめ目的DNA断片の制限酵素切断箇所を確認し、次に使用するベクタープラスミドのクローニングサイトに合わせて、切り出しに使用する制限酵素を選定した。制限酵素サイトは5'-MluI ACGCGT / 3'-BamHI GGATCCであった。
【００４１】
基質DNA(≦1μg)、Hind III(1μl)、BamH I(1μl)、10×K Buffer(2μl)、滅菌蒸留水(20μl)を混合して反応液を調製した。37℃で1時間反応させ、反応液の半分（10 μl程度）にLoading Bufferを加えてアガロースゲル電気泳動を行い、切断を確認した。目的DNA断片のバンドを含むゲルを切り出した。NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを用いて、ゲルからDNAを精製し、インサートDNA溶液とした。ベクターとの連結に使用する制限酵素切断部位を5’側に付加したプライマーを用いて、インサートDNAのPCR増幅を行った。
【００４２】
次にベクタープラスミドの準備では、目的のベクタープラスミド(pLGT1 plasmid)のクローニングサイトを制限酵素で切断して、ベクターの線状化を行った。ベクタープラスミドDNA(≦1μg)、Hind III(1μl)、BamH I(1μl)、10×K Buffer(2μl)、滅菌蒸留水(20μl)を混合して反応液を調製した。37℃で1時間反応させ、NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを用いて、反応液からDNAを精製した。回収した溶液をプラスミドDNA溶液とした。
【００４３】
そしてDNA Ligation Kitを使用し、インサートDNA溶液100 fmol、プラスミドDNA溶液50 ng（25 fmol）、Ligation Mix 7.5 μl、滅菌蒸留水 up to 15 μlを混合し、16℃、30分反応させた。これにより、インサートDNAと線状化プラスミドとのライゲーションを行い本発明にかかるベクタープラスミドを作製した。
【００４４】
（２）ウイルスのパッケージング
レンチウイルスのパッケージングでは、パッケージングプラスミドpCAG-HIVgp、VSVG/REVプラスミドpCMV-VSV-G-RSV-Revに加え、上記で作製したSINベクタープラスミドpLGT1 plasmidを使用した。
【００４５】
直径10cmのPoly-L-Lysine処理したディッシュにサブコンフルエント状態の293T細胞を5×106/10 ml DMEM培地/dish (5-6倍希釈)で細胞を播種した。37℃・5%または10% CO2インキュベーターで約24時間培養し、70-80%コンフルエントにした。
【００４６】
1.5 mlエッペンドルフチューブまたは5 mlポリスチレンチューブ(Falcon 2058)にHBSS 500 μl/ディッシュ1枚を用意した。ディッシュ1枚あたり以下のプラスミドDNAを加えボルテックスまたはピペッティングで混合した。
【００４７】
パッケージングプラスミド(pCAG-HIVgp)           3 μg
VSV-G, Revプラスミド(pCMV-VSV-G-RSV-Rev)     3 μg
SINベクタープラスミド                   6 μg
ディッシュ１枚あたりPEI (1 mg/ml) 24 μlを加えボルテックスまたはピペッティングで混合し、室温で15-20分放置した。ピペットマン(P1000)で数回ピペッティングで混合した後少量ずつ均一にディッシュに播き、37℃・5%または10% CO2インキュベーターで12-16時間培養した。
【００４８】
培養上清を吸引除去しDMEM培地(+10 μM Forskolin) 7.5 ml (37℃)と置換した。37℃・5%または10% CO2インキュベーターで約48時間培養した。
【００４９】
ウイルス含有培養上清を回収し0.45 μmフィルターを通して浮遊細胞等を除去した。濃縮しない場合にはフィルターろ過液をこのまま分注して-80℃で保存した。濃縮する際は0.45 μmフィルターを通したウイルス含有培養上清をAmicon Ultra-0.5 (100K)に移しフィルターカップの容量(〜500 μl)までHBSSでメスアップし14,000×g (アングル)4℃で10-30分遠心を行い、下のチューブ内のろ過液を廃棄した。
【００５０】
新しいチューブにフィルターカップを逆向きにセットし1,000×g, 4℃で2分遠心を行い下の新しいチューブにウイルス液を回収した。フィルターカップにHBSS〜100 μl (<4 μl/dish)を添加してメンブレンを数回ピペッティングで洗った後下のチューブに回収した。
【００５１】
フィルターカップに残ったウイルス液を回収するため再びフィルターカップを逆向きにセットし1,000×g, 4℃で2分遠心を行いすべてのウイルス液を下のチューブに回収した。回収したウイルス液をPBS(-)で10ｍｌまでメスアップし、50,000×g (BECKMAN SW28だと19,400 rpm)4℃で2時間超遠心を行った。上清をデカントまたは吸引除去しピペットマン(P200)を使用して1ｍｌのＰＢＳに懸濁させた。50ｍｌの遠心管に移して3時間Vortexした。
【００５２】
Vortex懸濁液を1.5ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、デブリをペレットとして除去するため、5000rpmで1分間遠心し上清をピペットでスクリューキャップのついたチューブに分注し-80℃で保存し、1年以内に使用することとした。
【００５３】
（３）ex vivo 遺伝子治療
上記3種類のレンチウイルスベクターを用いて以下の方法でex vivo Gene Therapy を施行した。まずMPSIIモデルマウスを遺伝子診断し、８週令のヘミ接合のオスマウスに前処置を施しその大腿骨から骨髄を摘出した。これを培養後、マイクロビーズ法等で分離抽出したマウス造血幹細胞系列に精製したウイルスベクターをMOI=50で感染させ遺伝子導入した。この導入後の骨髄幹細胞を、別のヘミ接合オスマウスに半致死量の放射線照射を加えた後、尾静脈注射により投与した。このあと20週令以上まで経過観察し、循環血中の酵素(IDS)活性、各臓器特に中枢神経、骨、心臓等における酵素活性、基質(GAG)蓄積を分析した。これらをプロモーターの違う３種類のウイルスベクターで施行し、各群間で評価を行った。
【００５４】
図３に示されるように、遺伝子治療6か月後のIDS酵素活性は、血清、小脳、大脳、心臓、肝臓、脾臓において3種類のうちMNDプロモーターを搭載したベクターで治療した群が、有意差をもって高い酵素活性を示した。またこの治療群では6か月後血清、肝臓、脾臓、心臓で正常群の10倍以上と著しく高い酵素活性を示した。
【００５５】
図４に示されるように、遺伝子治療6か月後の基質(GAG)蓄積量は3種類のうちMNDプロモーターを搭載したベクターで治療した群が、小脳、大脳、心臓、肝臓、脾臓において正常群と有意差なく改善していた。PGKプロモーター、CD11bプロモーターを搭載したベクターで治療した群では大脳、小脳において正常群と有意差が見られた。
【００５６】
以上の結果から、MNDプロモーターを搭載したベクターが中枢神経系を含めて最も導入効率が良いと判明した。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
Hunter症候群の遺伝子治療に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００５８】
配列番号１〜３：ベクター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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