(57)【要約】      （修正有）【課題】ＴＮＦ受容体を介するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマーのシグナル伝達を調節する化合物及び化合物とトリマーとの複合体の治療的使用方法の提供。【解決手段】式（５）の化合物、又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物、及び該化合物とＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質との複合体。2019218382.tif 000014【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合し、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体を介するトリマータンパク質のシグナル伝達を調節することができる化合物を同定する方法であって、トリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の平均数を決定するステップ、それによって、化合物が受容体を介するシグナル伝達を調節することができるかどうかを同定するステップを含む、上記方法。
【請求項２】
対照と比較して、トリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の平均数を決定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対照が、化合物の非存在下でＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマー及び必要な受容体を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
対照と比較したトリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の平均数の減少が、化合物が受容体を介するシグナル伝達を調節することができることを同定する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
対照が、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマー、必要な受容体、及び受容体を介するトリマーのシグナル伝達を調節することが公知の化合物を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
対照と比較したトリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の同等の平均数、又は対照と比較したトリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の平均数の減少が、化合物が受容体を介するシグナル伝達を調節することができることを同定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
トリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の平均数が、３：１〜１０：１（受容体：トリマー）のモル比で決定される、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
化合物が、トリマー−化合物複合体あたりに平均３個未満の受容体が結合すると決定される場合、受容体を介するトリマータンパク質のシグナル伝達を調節することができると同定される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
化合物が、トリマー−化合物複合体あたりに平均２個の受容体が結合すると決定される場合、受容体を介するトリマータンパク質のシグナル伝達を調節することができると同定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
化合物が、トリマー−化合物複合体あたりに平均１個の受容体が結合すると決定される場合、受容体を介するトリマータンパク質のシグナル伝達を調節することができると同定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
トリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の数が、
（ａ）イオン移動度質量分析；及び／又は
（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー；及び／又は
（ｃ）凝集アッセイ；及び／又は
（ｄ）Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動；及び／又は
（ｅ）結晶解析
によって決定される、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＴＮＦスーパーファミリーメンバーがＴＮＦαであり、受容体がＴＮＦ−Ｒである、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合し、必要な受容体を介するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達を調節することができる化合物であって、対照と比較して、トリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の同等の平均数、又はトリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の平均数の変化をもたらす、上記化合物。
【請求項１４】
化合物の非存在下でＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマーと必要な受容体とを含む対照と比較して、トリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の平均数の減少をもたらす、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマー、必要な受容体、及び受容体を介するトリマーのシグナル伝達を調節することが公知の化合物を含む対照と比較して、トリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の同等の平均数、又はトリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の平均数の減少をもたらす、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１６】
トリマー−化合物複合体あたりに結合する平均３個未満の受容体をもたらす、請求項１３、１４又は１５に記載の化合物。
【請求項１７】
トリマー−化合物複合体あたりに結合する平均２個の受容体をもたらす、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
トリマー−化合物複合体あたりに結合する平均１個の受容体をもたらす、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１９】
結合した受容体の平均数が３：１〜１０：１（受容体：トリマー）のモル比で決定される、請求項１３から１８までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
ＴＮＦスーパーファミリーメンバーがＴＮＦαであり、受容体がＴＮＦ−Ｒである、請求項１３から１９までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
式（５）の化合物、又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【化１】
2019218382.tif 000013
【請求項２２】
ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質と、請求項１３から２１までのいずれか一項に記載の化合物とを含む複合体。
【請求項２３】
ヒト又は動物の身体の治療方法における使用のための、請求項１３から２１までのいずれか一項に記載の化合物又は請求項２２に記載の複合体。
【請求項２４】
化合物が受容体を介してトリマーによって誘導されるシグナル伝達に拮抗する、自己免疫障害及び炎症障害；神経障害及び神経変性障害；疼痛障害及び侵害障害；並びに心血管障害の処置及び／又は防止における使用のための、請求項２３に記載の化合物又は複合体。
【請求項２５】
関節リウマチ、クローン病、乾癬、全身性エリテマトーデス、アルツハイマー病、パーキンソン病及びてんかんの処置及び／又は防止における使用のための、請求項２４に記載の化合物又は複合体。
【請求項２６】
請求項１３から２１までのいずれか一項に記載の化合物、又は請求項２２に記載の複合体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＮＦ受容体を介するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマーのシグナル伝達を調節する化合物を同定するための方法に関する。特に、本発明は、新規低分子モジュレータの同定に関する。本発明はまた、そのような方法によって同定される化合物及び化合物とトリマーとの複合体にも関する。化合物及び複合体を、治療的に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーは、細胞生存及び細胞死を調節する主な機能を共有するタンパク質ファミリーである。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーは、「ジェリーロール」β構造を形成する、逆平行β鎖を含む２つの逆平行βプリーツシートを含む、共通のコアモチーフを共有する。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーにより共有される別の共通の特徴は、ホモ又はヘテロトリマー複合体の形成である。それは、特定のＴＮＦスーパーファミリー受容体に結合し、活性化するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのこれらのトリマー形態である。
【０００３】
ＴＮＦαは、ＴＮＦスーパーファミリーの典型的なメンバーである。ＴＮＦα産生の調節異常は、有意に医学的に重要ないくつかの病状に関与してきた。例えば、ＴＮＦαは、関節リウマチ、炎症性腸疾患（クローン病を含む）、乾癬、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、疼痛、てんかん、骨粗鬆症、喘息、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び多発性硬化症（ＭＳ）に関与してきた。ＴＮＦスーパーファミリーの他のメンバーも、自己免疫疾患を含む病状に関与してきた。
【０００４】
ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの従来のアンタゴニストは、大分子であり、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの、その受容体に対する結合を阻害することによって作用する。従来のアンタゴニストの例としては、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））及びセルトリズマブペゴール（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））などの抗ＴＮＦα抗体、特に、モノクローナル抗体、又はエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））などの可溶性ＴＮＦα受容体融合タンパク質が挙げられる。
【発明の概要】
【０００５】
受容体がＴＮＦモノマーと比較して同等の濃度又は過剰の濃度で存在する場合（すなわち、少なくとも１：１（受容体：モノマー）；少なくとも３：１（受容体：トリマー）のモル（濃度）比）、ＴＮＦトリマーは、典型的には３個の受容体に結合する。本発明者らは、ＴＮＦシグナル伝達を調節する低分子実体（ＳＭＥ）を同定した。これらのＳＭＥ化合物は、トリマー形態のＴＮＦに結合すること、並びにトリマーのコンフォメーション変化を誘導すること、及び／又は安定化することによって作用する。化合物が結合したトリマーは、必要な受容体に対する変化した親和性、特に、第２及び第３の受容体に対する減少した親和性を有し、トリマー−化合物複合体あたりの結合する受容体数を減少させる。したがって、受容体を介する下流のシグナル伝達は減少する。したがって、これらの化合物を、ＴＮＦにより媒介される状態の処置において使用することができる。本発明者らはまた、この様式でＴＮＦシグナル伝達を調節することができる化合物を同定することができる方法も開発した。
【０００６】
本発明は、したがって、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合し、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体を介するトリマータンパク質のシグナル伝達を調節することができる化合物を同定する方法であって、トリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の平均数を決定することによって、化合物が受容体を介するシグナル伝達を調節することができるかどうかを同定することを含む、上記方法を提供する。
【０００７】
本発明はまた、
−  ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合し、必要な受容体を介するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達を調節することができる化合物であって、対照と比較して、トリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の同等の平均数、又はトリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の平均数の変化をもたらす、上記化合物；
−  式（５）の化合物、又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物；
−  ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質と、上記で定義された化合物とを含む複合体；
−  ヒト又は動物の身体の治療方法における使用のための、上記で定義された化合物又は複合体；及び
−  上記で定義された化合物又は複合体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物
も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】化合物の非存在下においてＴＮＦα／ＴＮＦ−Ｒ１シグナリングに関与する相互作用を示す。ＴＮＦαトリマーは、最初の２個の受容体に９３ｐＭのＫＤで結合し、第３の受容体にほぼ１μＭのＫＤで結合する。これらのトリマー及び受容体の複合体（３個の受容体が結合している）は、次いで、受容体の二量化を介してラフト構造を形成し、下流シグナリングを生じる。
【図２】化合物−安定化ＴＮＦαトリマーと相互作用する２個の受容体二量体のみを有する結晶構造を示す。
【図３】ＴＮＦα／ＴＮＦ−Ｒ１シグナリングに対する２種類の化合物（Ａ及びＢ）の効果を示す。両方の化合物が受容体二量体の形成に効果を及ぼさないが、変形したコンフォメーションを有するトリマーの形成を誘導及び／又は安定化する。第１の型の化合物（Ａ）を有するトリマーは、第１及び第２の受容体に結合するが、第３の受容体に対しては親和性が減少している。したがって、トリマーは、２個の受容体のみと結合を形成する。第２の化合物（Ｂ）を有するトリマーは、第１の受容体に結合するが、第２及び第３の受容体に対しては親和性が減少している。それゆえ、トリマーは、１個の受容体のみと結合を形成する。トリマーあたりの受容体結合数の減少は、ラフト形成を妨害する。
【図４Ａ】ＴＮＦ受容体を介したＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマーのシグナリングを調節することができる、式（１）の化合物の構造を示す。
【図４Ｂ】ＴＮＦ受容体を介したＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマーのシグナリングを調節することができる、式（２）の化合物の構造を示す。
【図４Ｃ】ＴＮＦ受容体を介したＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマーのシグナリングを調節することができる、式（３）の化合物の構造を示す。
【図４Ｄ】ＴＮＦ受容体を介したＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマーのシグナリングを調節することができる、式（４）の化合物の構造を示す。
【図４Ｅ】ＴＮＦ受容体を介したＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマーのシグナリングを調節することができる、式（５）の化合物の構造を示す。
【図５】化合物（２）、ＴＮＦα、及び（トリマー−化合物複合体に対して３．２倍過剰の）ＴＮＦＲ１を使用する、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）実験の結果を示す。低濃度の化合物（９０μＭ）で、優勢ピークは、トリマー−化合物複合体あたり３個の受容体結合に相当する。このピークはわずかなショルダーを有し、トリマー−化合物複合体の一部が２個の受容体に結合していることを示す。化合物の濃度が増加し、ＴＮＦトリマーの濃度に対して過剰（６９０μＭ）で存在するとき、優勢ピークは、トリマー−化合物複合体あたり２個の受容体結合に相当する。しかしながら、ピークのわずかなショルダーは、一部のトリマーが３個全ての受容体に依然として結合していることを示す。図では、ＴＮＦαのみを含む対照並びにＴＮＦα及びＴＮＦＲ１を含む対照（化合物の非存在下での負の対照）の結果も示している。ＴＮＦα及びＴＮＦＲ１の負の対照では、トリマー−化合物複合体あたり３個の受容体が結合する。これは、ＴＮＦＲ１をＴＮＦαトリマーに対して３．２倍過剰でプレインキュベートすることにより達成される。さらなるデータを図６に示す。
【図６】図５に記載のＳＥＣ実験に対する対照を示す。ＴＮＦαを様々な濃度のＴＮＦＲ１（トリマーに対して１．２〜５倍過剰の範囲の受容体）とインキュベートした。増大濃度のＴＮＦＲ１を加えるとき、ＴＮＦαを有する複合体の分子量は増加する（左にシフトする）。ＴＮＦαトリマーの濃度に対して５倍過剰のＴＮＦＲ１の添加は、３．２倍過剰で使用する場合を超えて複合体の分子量を増加させない。このことは、ＴＮＦαが、３個のＴＮＦＲ１対３個のＴＮＦαモノマー（トリマーあたり３個のＴＮＦＲ１）のモル比で飽和することを示唆する。
【図７】化合物（５）、ＴＮＦα、及び（トリマー−化合物複合体の濃度に対して３．５倍過剰の）ＴＮＦＲ１を使用する、ＳＥＣ実験の結果を示す。結果は、対照についても示しており、第１の対照は、化合物の非存在下でのＴＮＦα及び受容体である。第２及び第３の対照も、化合物の非存在下でのＴＮＦα及び受容体であるが、第３の受容体結合部位、並びに第３及び第２の受容体結合部位で、相互作用を破壊するようにＴＮＦαが変異されている。ＴＮＦα及び受容体である対照は、トリマーあたり３個の受容体結合を示すピークを示す。１個の受容体結合部位で変異を有する対照は、トリマーあたり２個の受容体結合に相当するピークを示し、２つの部位で変異を有する対照は、トリマーあたり１個の受容体結合に相当するピークを示す。化合物（５）の存在下で取得されるピークは、第２及び第３の対照の中間にあり、それゆえ、トリマー結合がそれぞれ２個の受容体と１個の受容体との混合であることを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、化合物（１）の存在下におけるトリマー−化合物複合体あたり２個の受容体結合を明らかにする結晶解析実験の結果を示す。図８Ａ〜８Ｄは、同じ結晶構造の代替図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、化合物（１）の存在下におけるトリマー−化合物複合体あたり２個の受容体結合を明らかにする結晶解析実験の結果を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、化合物（１）の存在下におけるトリマー−化合物複合体あたり２個の受容体結合を明らかにする結晶解析実験の結果を示す。
【図８Ｄ】図８Ｄは、化合物（１）の存在下におけるトリマー−化合物複合体あたり２個の受容体結合を明らかにする結晶解析実験の結果を示す。
【図９】増大濃度の化合物（３）を用いたＦＲＥＴ実験の結果を示す。ブロッキング抗体を用いて観察されるような完全阻害では、ＴＮＦαへの受容体の結合はなく、つまりＦＲＥＴシグナルの完全阻害が生じる。この実験の場合、ＦＲＥＴシグナルは部分的に阻害されている。化合物の最高濃度で最大阻害は２９％であり、３個の受容体のうち１個が、ＴＮＦトリマーへの結合から阻害されていることが示唆される。
【図１０】増大濃度の化合物（４）を用いたＦＲＥＴ実験の結果を示す。再び、ＦＲＥＴシグナルは部分的に阻害されている。化合物の最高濃度で、最大阻害は３６％である。図９で記載される観察と同様に、３個の受容体のうち１個がＴＮＦトリマーへの結合から阻害されていることが示唆される。
【図１１】イオンモビリティ質量分析による受容体結合化学量論の解析を示す。対照（ＴＮＦα及び過剰のＴＮＦＲ１を含む）では、トリマー化合物複合体あたり平均して３個の受容体が結合していることが示される。対照的に、化合物（３）の存在下では、受容体化学量論が減少し、トリマー−化合物複合体あたり２個の受容体結合が優勢である。
【図１２】ＴＮＦα及びＴＮＦＲ１を用いた対照試料における解離定数の決定を示す。増大濃度のＴＮＦＲ１をＴＮＦαに加えるとき、様々な質量種が出現し、その後、最初にＴＮＦαに１個のＴＮＦＲ１が結合した種、続いてＴＮＦαに２個のＴＮＦＲ１が結合した種、最後にＴＮＦαに３個のＴＮＦＲ１が結合した種の出現が対応して消失する。
【図１３】ＴＮＦα、ＴＮＦＲ１及び化合物（３）を用いた試料における解離定数の決定を示す。この決定から、第３の受容体でのＴＮＦＲ１とＴＮＦαとの相互作用が顕著に劣ること（親和性が低いこと）（０．２２ｎＭ〜９．６１２ｎＭ）が示される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
配列表の説明
配列番号１及び２は、実施例で使用した配列を示す。
配列番号３は、Ｃ１８５＿０１９７４．０のＨＣＶＲを示す。
配列番号４は、Ｃ１８５＿０１９７４．０のＬＣＶＲを示す。
配列番号５は、Ｃ１８５＿０１９７４．０のｍＩｇＧ１重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、Ｃ１８５＿０１９７４．０のカッパ軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、Ｃ１８５＿０１９７９．０のＨＣＶＲを示す。
配列番号８は、Ｃ１８５＿０１９７９．０のＬＣＶＲを示す。
配列番号９は、Ｃ１８５＿０１９７９．０のｍＩｇＧ１重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、Ｃ１８５＿０１９７９．０のカッパ軽鎖のアミノ酸配列を示す。
【００１０】
開示される方法及び生成物の異なる適用を、当業界における特定の必要性に応じて調整することができることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態のみを記述するためのものであり、限定を意図するものではないことも理解されるべきである。
【００１１】
さらに、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、本文が明確に別途記述しない限り、複数の指示対象を含む。
【００１２】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、上掲であっても、下掲であっても、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１３】
ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのモジュレータを同定するための方法
本発明は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合し、必要なＴＮＦスーパーファミリー受容体を介するトリマータンパク質のシグナル伝達を調節することができる化合物を同定する方法（アッセイ）に関する。本発明の方法によって同定される化合物は、したがって、モジュレータとして公知でもある。
【００１４】
以下にさらに記載されるように、本発明の方法によって同定される化合物は、一般的には、必要な受容体を介するＴＮＦのシグナル伝達を防止する、又は減少させる（阻害する）。そのような化合物は、ＴＮＦシグナル伝達のアンタゴニストである。しかしながら、本発明の方法を使用して、必要な受容体を介するＴＮＦのシグナル伝達を増加させる（増強する）アゴニスト化合物を同定することもできる。両方の場合、化合物は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーとその受容体との高親和性相互作用と競合する必要なく、ＴＮＦシグナル伝達を調節することができる。
【００１５】
本発明の方法によって同定される化合物は、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合する。化合物は、したがって、ＴＮＦスーパーファミリー受容体の天然のアゴニストに、すなわち、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合するアロステリックなモジュレータである。ＴＮＦトリマーに結合することができる化合物をスクリーニングする方法は、以下でさらに考察される。
【００１６】
現在公知の２２種のＴＮＦスーパーファミリーメンバーが存在し、それらは、ＴＮＦα（ＴＮＦＳＦ１Ａ）、ＴＮＦβ（ＴＮＦＳＦ１Ｂ）、ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）、ＢＡＦＦ（ＴＮＦＳＦ１３Ｂ／ＢｌｙＳ）、ＡＰＲＩＬ（ＴＮＦＳＦ１３）、ＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４）、ＲＡＮＫＬ（ＴＮＦＳＦ１１／ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＳＦ１２）、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦＳＦ１０）、ＴＬ１Ａ（ＴＮＦＳＦ１５）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）、リンホトキシン、リンホトキシンβ（ＴＮＦＳＦ３）、４−１ＢＢＬ（ＴＮＦＳＦ９）、ＣＤ２７Ｌ（ＴＮＦＳＦ７）、ＣＤ３０Ｌ（ＴＮＦＳＦ８）、ＥＤＡ（エクトジスプラシン）、ＥＤＡ−Ａ１（エクトジスプラシンＡ１）、ＥＤＡ−Ａ２（エクトジスプラシンＡ２）、ＦＡＳＬ（ＴＮＦＳＦ６）、ＮＧＦ及びＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＳＦ１８）である。
【００１７】
本発明の方法を使用して、２２種の公知のＴＮＦスーパーファミリーメンバーを含む、任意のＴＮＦスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達を調節する化合物を同定することができる。本発明の方法を使用して同定される化合物は、トリマー形態の１又は複数のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに特異的に結合することができる。本発明の方法によって同定される化合物は、ただ１つのＴＮＦスーパーファミリーメンバーに特異的に結合することができるが、他の任意のＴＮＦスーパーファミリーメンバーには結合しない。本発明の方法によって同定される化合物はまた、２つ、３つ、４つ、又は最大で全てのＴＮＦスーパーファミリーメンバーに特異的に結合することもできる。
【００１８】
特異的とは、化合物が、ＴＮＦスーパーファミリーの他のメンバーを含んでもよい、他の任意の分子との有意な交差反応性なしに、目的の分子又は複数の分子に、この場合、トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合することが理解される。交差反応性を、任意の好適な方法、例えば、表面プラズモン共鳴によって評価することができる。トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの化合物と、トリマー形態のその特定のＴＮＦスーパーファミリーメンバー以外の分子との交差反応を、化合物がトリマー形態の目的のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合する強さの少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は１００％の強さで他の分子に結合する場合、有意と考えることができる。トリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに特異的である化合物は、それがトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合する強さの９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％又は２０％未満で別の分子に結合することができる。好ましくは、化合物は、それがトリマー形態のＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合する強さの２０％未満、１５％未満、１０％未満又は５％未満、２％未満又は１％未満で他の分子に結合する。
【００１９】
好ましくは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは、ＴＮＦαである。ＴＮＦαは、可溶性（ＴＮＦαｓ）と膜結合型（ＴＮＦαｍ）の両方で存在する。本明細書でＴＮＦαを言う場合、これはＴＮＦαｓとＴＮＦαｍ型の両方を包含する。特に好ましくは、ＴＮＦαは、ＴＮＦαｓ型にある。
【００２０】
現在公知の３４種のＴＮＦ受容体が存在し、それらは、４−１ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９／ＣＤ１３７）、ＮＧＦ  Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ１６）、ＢＡＦＦ  Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、オステオプロテゲリン（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＲＥＬＴ（ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ）、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）、ＴＡＣＩ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）、ＤｃＲ３（ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ）、ＴＮＦＲＨ３（ＴＮＦＲＳＦ２６）、ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ１（ＴＮＦＲＳＦ２３）、ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ２（ＴＮＦＲＳＦ２２）、ＴＮＦ−Ｒ１（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦ−Ｒ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、ＤＲ６（ＴＮＦＲＳＦ２１）、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、ＥＤＡＲ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、Ｆａｓ（ＴＮＦＲＳＦ６／ＣＤ９５）、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ）、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＴＲＯＹ（ＴＮＦＲＳＦ１９）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）、ＴＷＥＡＫ  Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＴＲＡＭＰ（ＴＮＦＲＳＦ２５）、リンホトキシンβ  Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ３）及びＸＥＤＡＲである。
【００２１】
必要な受容体は、特定のＴＮＦスーパーファミリーメンバーと連動して作用する受容体である。特に、必要な受容体は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーによって活性化される受容体である。ＴＮＦスーパーファミリーのトリマーは受容体に結合し、受容体の活性化は下流のシグナル伝達をもたらす。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーとその必要な受容体との組合せは、当業界で公知である。
【００２２】
好ましくは、本発明の方法を使用して、ＴＮＦ−Ｒ１（ＴＮＦＲ１）及びＴＮＦ−Ｒ２（ＴＮＦＲ２）を介するシグナル伝達を調節する化合物を同定する。本明細書でＴＮＦ−Ｒを言う場合、これはＴＮＦ−Ｒ１とＴＮＦ−Ｒ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）などの、ＴＮＦ−Ｒ１とＴＮＦ−Ｒ２の両方を包含する。より好ましくは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーはＴＮＦαであり、ＴＮＦ受容体はＴＮＦ−Ｒ１又はＴＮＦ−Ｒ２である。さらにより好ましくは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーはＴＮＦαであり、ＴＮＦ受容体はＴＮＦ−Ｒ１である。最も好ましくは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーはＴＮＦαｓであり、ＴＮＦ受容体はＴＮＦ−Ｒ１である。
【００２３】
本発明の方法を使用して、ＴＮＦ−Ｒ１を介するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達を特異的に調節することによって作用する化合物を同定することができる。特に、化合物は、ＴＮＦ−Ｒ１を介するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達を調節することによって作用することができるが、ＴＮＦ−Ｒ２を介するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達に対する効果はない。
【００２４】
ＴＮＦスーパーファミリーメンバー及びその受容体を、精製するか、又は培養細胞、組織試料、体液若しくは培養培地中などの混合物中に提供することができる。
【００２５】
本発明の方法では、必要な受容体を介するトリマータンパク質のシグナル伝達を調節する化合物が同定される。シグナル伝達の調節は、必要な受容体を介するシグナル伝達の増加（増強）を指してもよい。シグナル伝達を増加させる化合物は、アゴニスト化合物である。しかしながら、本発明の方法を使用して同定される化合物は、一般的には、必要な受容体を介するシグナル伝達を防止する、又は減少させる（阻害する）。そのような化合物は、アンタゴニストとして公知である。
【００２６】
シグナル伝達のレベルを検出するために、ＴＮＦスーパーファミリー受容体シグナル伝達の下流の効果を測定するアッセイを実施することができる。例えば、Ｌ９２９マウス線維肉腫細胞殺傷アッセイを使用して、ＴＮＦによる細胞死の刺激を評価することができる。ヒト単球によるＴＮＦ誘導性ＩＬ−８産生の阻害を使用して、試験化合物がその受容体を介するＴＮＦシグナル伝達を阻害するかどうかを評価することもできる。そのようなアッセイは、当業界で周知である。
【００２７】
本発明の方法によって同定される化合物は、化合物−トリマー複合体の形態にあるＴＮＦスーパーファミリーメンバーが受容体に結合する場合、ＴＮＦ受容体を介するシグナル伝達を完全に、又は部分的に阻害することができる。化合物は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー受容体を介するシグナル伝達を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少させるように作用することができる。シグナル伝達のレベルの任意の変化を、アルカリホスファターゼ又はルシフェラーゼによるレポーター遺伝子活性、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎなどの機械を使用するＮＦ−κＢ転座、下流エフェクターのリン酸化、シグナル伝達分子の動員、又は細胞死の測定を含む適切な技術によって測定することができる。
【００２８】
本発明の方法によって同定される化合物は、化合物−トリマー複合体の形態にあるＴＮＦスーパーファミリーメンバーが受容体に結合する場合、ＴＮＦ受容体を介するシグナル伝達の下流の効果の少なくとも１つを調節することができる。そのような効果は、本明細書で考察され、ＴＮＦスーパーファミリー誘導性ＩＬ−８、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＩＬ２及びＶＣＡＭ産生、ＴＮＦスーパーファミリー誘導性ＮＦ−κＢ活性化及び好中球動員を含む。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの下流の効果を測定するための標準的な技術が当業界で公知である。本発明の方法によって同定される化合物は、ＴＮＦ受容体を介するシグナル伝達の下流の効果の少なくとも１、２、３、４、５、１０又は最大で全部に調節することができる。
【００２９】
本発明の方法によって同定される化合物の活性を、ＩＣ５０又は半数最大効果濃度（ＥＣ５０）値などの標準的な用語を使用して定量することができる。ＩＣ５０値は、特定の生物学的又は生化学的機能の５０％の阻害に必要とされる化合物の濃度である。ＥＣ５０値は、その最大効果の５０％に必要とされる化合物の濃度である。本発明の方法によって同定される化合物は、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ以下のＩＣ５０又はＥＣ５０値を有してもよい。ＩＣ５０及びＥＣ５０値を、任意の適切な技術を使用して測定することができ、例えば、サイトカイン産生を、ＥＬＩＳＡを使用して定量することができる。次いで、ＩＣ５０及びＥＣ５０値を、シグモイド型用量応答モデルとしても知られる標準的な４パラメータロジスティックモデルを使用して生成することができる。
【００３０】
本発明では、化合物のライブラリーをスクリーニングして、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのモジュレータを同定することができる（すなわち、本明細書に開示される方法を使用する）。そのようなライブラリーは、典型的には、少なくとも２６０種の化合物を含む。好ましくは、そのようなライブラリーは、少なくとも３００種、少なくとも５００種又はさらには少なくとも１０００種の化合物を含む。
【００３１】
本発明の方法では、トリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の平均数を決定して、ＴＮＦシグナル伝達を調節することができる化合物を同定する。全ての化合物の非存在下で、受容体がＴＮＦモノマーと比較して同等の、又は過剰の濃度で存在する場合（１：１（受容体：モノマー）より高い；３：１（受容体：トリマー）より高いモル比）、典型的には、ＴＮＦトリマーあたり３個の受容体が結合する。次いで、これらのトリマー及び受容体複合体は、受容体ダイマーの形成によってラフトを形成する。ラフトは、下流のシグナル伝達を担う。
【００３２】
これは、ＴＮＦトリマーと受容体の相互作用、並びにＴＮＦα及びＴＮＦ−Ｒ１シグナル伝達に関与するラフトの形成を示す図１に例示される。図面に示されるように、ＴＮＦαトリマーは、約９３ｐＭの親和性（ＫＤ）で第１及び第２の必要な受容体に結合する。次いで、トリマーは、約１μＭのＫＤで第３及び最後の受容体に結合する。
【００３３】
本発明の方法を使用して同定される化合物は、ＴＮＦトリマー内のコンフォメーション変化を誘導する、及び／又は安定化する。これらのトリマーは、受容体に対する、特に、親和性が減少している場合、第２及び第３の受容体に対する変化した親和性を有する。この減少した親和性は、トリマー−化合物複合体あたりに結合する受容体数の減少をもたらす。例えば、図２に示されるように、トリマー−化合物複合体あたり、２個のみの受容体ダイマーが結合することができる（通常の条件下で結合する３個の受容体の代わりに）。
【００３４】
図３は、ＴＮＦα／ＴＮＦ−Ｒ１シグナル伝達に対する２つの型の化合物の効果を示す。両化合物とも、受容体ダイマーの形成に対する効果はないが、歪曲したコンフォメーションを有するトリマーの形成を誘導する、及び／又は安定化する。第１の型の化合物を有するトリマーは、第１及び第２の受容体に結合するが、第３の受容体に対する親和性が減少している。したがって、トリマーは、結合した２個のみの受容体と共に形成する。第２の化合物を有するトリマーは、第１の受容体に結合するが、第２及び第３の受容体に対する親和性が減少している。したがって、トリマーは、結合した１個のみの受容体と共に形成する。両方の型の化合物は、したがって、トリマーあたりに結合する受容体の数の減少のため、シグナル伝達ラフトの形成を阻害する。
【００３５】
これを考慮して、本発明の方法は、トリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の平均数を決定して、ＴＮＦシグナル伝達を調節する化合物を同定することを含む。用語「平均」は、トリマー／受容体の混合集団がほぼ確実に試料中に存在するという事実を反映する。例えば、いくつかの化合物が受容体３個に対するトリマーの親和性を減少させるとき、いくつかのトリマーは化合物の存在下で３個全部の受容体に依然として結合することができるが、大部分のトリマーは２個の受容体のみが結合している。
【００３６】
用語「平均」とは、最頻値、すなわち、試料中に最も頻繁に存在するトリマー−化合物複合体あたりに結合する受容体の数を指してもよい。最頻値を、実験結果から視覚的に決定することができる。これは、以下の実施例のセクションに例示される。
【００３７】
また、実験データを分解して、３、２、１又は０個の受容体が結合した試料中のトリマーの割合（パーセンテージ）の定量的測定を同定することもできる。そのような方法は、当業界で日常的である。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、それぞれ、異なる数の受容体が結合したトリマーに対応する、異なる溶出容量でピークを分解することができる。次いで、ピーク下面積を算出し、その面積を使用して、３、２、１又は０個の受容体に結合する試料中のトリマーの割合（パーセンテージ）を決定することができる。次いで、最頻平均は、最も高いパーセンテージで存在するトリマーあたりに結合する受容体の数を指す。
【００３８】
用語「平均」は、平均値を指してもよい。
【００３９】
最頻値と平均値の両方を例示するために、方法（以下に記載されるものなど）が試料中に存在するトリマーの５％に１個の受容体が結合することを同定する場合、７５％は２個の受容体が結合しており、２０％は３個の受容体が結合しており、最頻値はトリマーあたりに結合した２個の受容体である。平均値は、トリマーあたりに結合した２．１５個の受容体である（（５ｘ１＋７５ｘ２＋２０ｘ３）／１００）。
【００４０】
平均値をこの方法で決定する場合、０〜０．４の結果は、トリマーあたり平均で０個の受容体が結合したことを示すと取られ、０．５〜１．４の結果は、トリマーあたり平均で１個の受容体が結合することを示すと取られ、１．５〜２．４の結果は、トリマーあたり平均で２個の受容体が結合することを示すと取られ、２．５より高い結果は、トリマーあたり平均で３個の受容体が結合することを示すと取られる。
【００４１】
本発明の方法では、トリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の平均数は、典型的には、対照と比較して決定される。対照試料は、試験化合物を含む試料と同じ方法で処理される。特に、対照試料は、同じ試薬、トリマー及び受容体の濃度などの、試験化合物を含む試料と同じ実験条件にかけられる。さらに、対照に関するトリマーあたりに結合した受容体の平均数は、試験化合物に関するものと同じ実験方法を使用して決定される。
【００４２】
トリマーあたりに結合した受容体の平均数は、通常、試験試料及び対照について同じ時間で決定される。換言すれば、実験は同時に実行される。しかしながら、対照におけるトリマーあたりに結合した受容体の平均数に関する値を、試験試料に対する実験を実行する前に決定してもよい。そのような値を、例えば、コンピュータ上に記録することができる。
【００４３】
結果間の有効な比較を可能にするために、対照に関するトリマーあたりに結合した受容体の平均数は、試験試料に関するものと同じ方法で算出される（すなわち、上記で考察された最頻値又は平均値）。
【００４４】
対照試料は、化合物の非存在下でＴＮＦスーパーファミリーのトリマーと必要な受容体とを含んでもよい（陰性対照）。換言すれば、対照試料は、試験化合物が存在しないことを除いて、試験化合物試料と同一である。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマーと必要な受容体は、上記で考察されたもののいずれかであってよいが、対照及び試験試料中で同じである（また、同じ濃度で存在する）。
【００４５】
好ましくは、対照試料が化合物の非存在下でＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマーと必要な受容体とを含む場合、対照と比較した試験試料中でのトリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の平均数の低下／減少は、化合物が受容体を介するシグナル伝達を調節することができることを同定する。換言すれば、対照試料と比較して試験化合物を含む試料中で、トリマーあたり、平均でより少数の受容体が結合すると同定される場合、試験化合物は受容体を介するトリマータンパク質のシグナル伝達を調節することができると同定される。
【００４６】
例えば、対照がトリマーあたりに結合した受容体が平均３個であると決定される場合の最頻値を使用して算出される場合、試験化合物は、トリマー−化合物複合体あたり、平均でより２個以下の受容体が結合すると決定される場合、シグナル伝達を調節することができると同定することができる。化合物の非存在下で、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマーと、必要な受容体とを含む陰性対照は、トリマーあたり平均３個の受容体に結合することがわかると予想される（受容体が、ＴＮＦモノマーと比較して同等の濃度で、又は過剰で；少なくとも１：１（受容体：モノマー）又は３：１（受容体：トリマー）のモル比で存在する場合）。それにも拘わらず、対照がトリマーあたり平均２個の受容体が結合すると同定される場合、試験化合物は、トリマー−化合物複合体あたり、平均で１又は０個の受容体が結合すると決定される場合、シグナル伝達を調節することができると同定される。最後に、対照が、トリマーあたり平均で１個の受容体が結合したと同定される場合、試験化合物は、トリマー−化合物複合体あたり、平均で０個の受容体が結合すると決定される場合、シグナル伝達を調節することができると同定される。
【００４７】
上記で算出されたように、平均として平均値を使用する場合、同じ理由が適用される。
【００４８】
陰性対照と比較した、トリマーあたりに結合した受容体の平均数の減少を、単純に３、２、１又は０個の受容体に結合する試料中でのトリマーのパーセンテージに基づいて算出することもできる。この場合、対照試料と、３、２、１又は０個の受容体が結合した試験化合物を含有する試料との両方においてトリマーのパーセンテージを同定することがまず必要である。次いで、化合物の存在がある特定の数の受容体が結合するトリマーのパーセンテージの変化をもたらす場合、試験化合物は、シグナル伝達を調節することができると同定される。そのような算出は、典型的には、３個の受容体が結合する試料中のトリマーのパーセンテージに基づくものであり、３個の受容体が結合したトリマーのパーセンテージの減少は、シグナル伝達を調節するアンタゴニスト化合物を示す（２、１又は０個の受容体に結合するトリマーのパーセンテージは、同時に増加しなければならない）。
【００４９】
例示するために、受容体とトリマーのみを含む（化合物を含まない）陰性対照において、９０％のトリマーが３個の受容体に結合することを見出し、１０％のトリマーが２個の受容体に結合することを見出すことができる。次いで、化合物が３個の受容体に結合する９０％未満のトリマーをもたらす場合、試験化合物を、シグナル伝達を調節することができると同定することができる。より低いパーセンテージのトリマーが３個の受容体に結合している場合、２、１又は０個の受容体に結合するトリマーのパーセンテージは増加しているはずである。したがって、トリマー−化合物複合体あたりに結合する受容体の平均数は、対照と比較して減少する。
【００５０】
好ましくは、試験化合物は、試験化合物試料中で、３個の受容体が結合したトリマーのパーセンテージが、陰性対照試料（化合物の非存在下でＴＮＦスーパーファミリーメンバーと受容体とを含む）中で３個の受容体が結合したトリマーのパーセンテージと比較して少なくとも１０％減少する（すなわち、少なくとも１０％低い）、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％減少する場合、シグナル伝達を調節することができると同定される。
【００５１】
或いは、対照は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマー、必要な受容体、及び受容体を介するシグナル伝達を調節することが公知の化合物（いわゆる「陽性対照」）を含んでもよい。受容体を介するシグナル伝達を調節することが公知の化合物は、トリマーあたりに結合した受容体の平均数を２、１又は０に減少させる（トリマーが全ての化合物の非存在下で３個の受容体に結合する条件下で）ことが公知の任意の化合物であってもよい。そのような化合物を、本明細書に記載の方法を使用して同定することができる。トリマーあたりの受容体の平均数を２に減少させることが公知の化合物の例は、化合物（１）〜（４）であり、トリマーあたりの受容体の平均数を１近くまで減少させることが公知の化合物の例は、化合物（５）である。陽性対照は、これらの例示的化合物のいずれか１つを含んでもよい。
【００５２】
上記のように、陽性対照試料は、試験化合物を含む試料と同じ方法で処理され、対照試料と試験化合物試料の両方について同じ実験条件、方法及び計算が使用される。トリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の平均数は、通常、試験化合物試料と対照について同時に決定されるが、試験化合物試料に対する実験を行う前に決定することもできる。
【００５３】
好ましくは、陽性対照試料がＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマー、必要な受容体、及び受容体を介するシグナル伝達を調節することができることが公知の化合物を含む場合、対照と比較した試験試料中のトリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の同等の平均数、又は対照と比較した試験試料中のトリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の平均数の減少は、化合物が受容体を介するシグナル伝達を調節することができることを同定する。換言すれば、試験化合物は、平均で、同一又はより少ない数の受容体が、陽性対照と比較して試験化合物を含む試料中でトリマーあたりに結合すると同定される場合、受容体を介するトリマータンパク質のシグナル伝達を調節することができると同定される。
【００５４】
例えば、陽性対照が、トリマーあたりに結合した平均２個の受容体を有すると決定される場合に最頻値（上記）を使用して算出される場合、試験化合物は、トリマー−化合物複合体あたり、平均で２個以下の受容体（２個の受容体、１個の受容体又は０個の受容体）が結合すると決定される場合、シグナル伝達を調節することができると同定される。同様に、対照がトリマーあたりに平均１個の受容体が結合すると同定される場合、試験化合物は、トリマー−化合物複合体あたり、平均で１又は０個の受容体が結合すると決定される場合、シグナル伝達を調節することができると同定される。対照がトリマーあたりに平均０個の受容体が結合したと同定される場合、試験化合物は、これもトリマー−化合物複合体あたり平均で０個の受容体が結合すると決定される場合、シグナル伝達を調節することができると同定される。
【００５５】
平均として平均値を使用する場合も同じ理由が適用される。
【００５６】
再度、陽性対照と比較した、トリマーあたりに結合した受容体の同等の平均数、又はトリマーあたりに結合した受容体の平均数の減少を、３、２、１又は０個の受容体に結合する試料中のトリマーの割合（パーセンテージ）を使用して算出することもできる。上記のように、対照試料と、３、２、１又は０個の受容体が結合した試験化合物を含有する試料の両方においてトリマーのパーセンテージを同定することがまず必要である。次いで、化合物の存在が、対照と比較して望ましい数の受容体が結合した（又はより少ない数の受容体が結合した）トリマーの同等のパーセンテージ、又は増加した／より高いパーセンテージをもたらす場合、試験化合物はシグナル伝達を調節することができると同定される。そのような算出を、２個以下の受容体が結合した、１個以下の受容体が結合した、又は０個の受容体が結合した試料中のトリマーのパーセンテージに焦点を合わせることができる。
【００５７】
例示するために、陽性対照試料において、化合物は、３個の受容体に結合する３０％のトリマー及び２個の受容体に結合する７０％のトリマーをもたらすことができる。次いで、化合物が２個以下（２、１又は０個）の受容体に結合する少なくとも７０％のトリマーをもたらす場合、試験化合物を、シグナル伝達を調節することができると同定することができる。
【００５８】
本文脈における「同等のパーセンテージ」とは、典型的には、互いに１０％以下、好ましくは、５％以下にある値を指す。例えば、２個の受容体に結合する７０％のトリマーをもたらす試験化合物は、７５％のトリマーが２個の受容体に結合する対照と同等のパーセンテージの、２個の受容体に結合するトリマーをもたらすと見ることができる。
【００５９】
対照と直接比較することなく、トリマー−化合物複合体あたりに結合する受容体の数の決定に単純に基づき、化合物を、シグナル伝達を調節することができると同定することもできる。
【００６０】
このシナリオでは、平均３個未満の受容体がトリマー−化合物複合体あたりに結合すると決定される場合、化合物を、受容体を介するトリマータンパク質のシグナル伝達を調節することができると同定することができる。トリマー−化合物複合体あたりに結合する受容体の平均数は、上記のように平均値又は最頻値であってもよい。好ましくは、化合物がトリマーあたりに結合する平均２個の受容体をもたらす場合、化合物は、受容体を介するトリマータンパク質のシグナル伝達を調節することができると同定される。より好ましくは、化合物がトリマーあたりに結合する平均１個の受容体をもたらす場合、化合物は、受容体を介するトリマータンパク質のシグナル伝達を調節することができると同定される。また、化合物がトリマーあたりに結合する平均０個の受容体をもたらす場合、化合物を、受容体を介するトリマータンパク質のシグナル伝達を調節することができると同定することもできる。そのような化合物の例は、以下でより詳細に考察される。
【００６１】
トリマー−化合物複合体あたりに結合する受容体の平均数は、典型的には、ほぼ同等の濃度（１：１のモル比）の受容体とＴＮＦモノマーで決定される。１：１比の受容体：モノマーは、３：１比の受容体：トリマーに一致する。
【００６２】
受容体の濃度は、モノマーの濃度と比較してわずかに過剰であってもよい。実験は、好ましくは、約１０：１（受容体：トリマー）までのモル比で行われる。実験を、約３：１〜１０：１（受容体：トリマー）の範囲内の任意のモル比で行ってもよい。好ましくは、アッセイは、約３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１又は１０：１（受容体：トリマー）の比で行われる。いくつかの場合、アッセイは、複数の濃度の受容体：トリマー、例えば、約３：１、６：１及び１０：１で行われる。これらの滴定は、実施例のセクションにより詳細に例示される。
【００６３】
典型的には、トリマー−化合物複合体あたりに結合する受容体の平均数を決定するための実験は、化合物が、化合物によるトリマーの完全な占有を確保する化合物の濃度で存在する場合に実行される。以下で考察されるように、化合物によるトリマーの占有を、質量分析を使用して決定することができる。化合物は、トリマーの濃度と比較して等しい濃度で存在してもよい（１：１の比の化合物：トリマー；１：３の比の化合物：ＴＮＦモノマー）。しかしながら、化合物は、典型的にはＴＮＦトリマーの濃度に対して過剰に存在する。例えば、化合物は、トリマーの濃度に対して１．５倍〜５００倍過剰に存在してもよい。好ましくは、化合物は、トリマーの濃度に対して５倍〜１００倍過剰、より好ましくは、トリマーの濃度に対して１０倍〜５０倍過剰に存在する。化合物は、ＴＮＦトリマーの濃度に対して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍又は少なくとも５００倍過剰で存在してもよい。
【００６４】
以下の実施例に示されるように、様々な濃度の化合物を用いて実験を行うことができる。
【００６５】
トリマーあたりに結合する受容体の平均数を、任意の好適な技術を使用して、例えば、イオン移動度質量分析、サイズ排除クロマトグラフィー、凝集アッセイ、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動及び／又は結晶解析を使用して決定することができる。これらの技術を、単独で、又は好ましくは、組み合わせて使用して、トリマーあたりに結合する受容体の平均数を決定することができる。例えば、前記技術のいずれか２、３、４又は５つを一緒に使用してもよい。
【００６６】
イオン移動度質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）は、イオン移動度分光分析と質量分析とを組み合わせて、試験試料中の成分を同定するものである。ＩＭＳ−ＭＳを行うため、及び得られたデータを分解するための方法は、当業界で周知であり、以下の実施例のセクションにさらに例示される。
【００６７】
例示的手順では、試験化合物を、室温で一晩、ＴＮＦと共にインキュベートする。自然の質量スペクトルを最初に記録して、化合物が、化合物の添加の前にＴＮＦを１００％占有することを確保する。換言すれば、自然の質量スペクトルは、化合物がトリマーに結合していることを確保する。化合物は、典型的には、上記のように、トリマーの濃度に対して過剰に存在する。次いで、必要なＴＮＦ受容体を添加し、インキュベートした後、試料のイオン移動度質量スペクトルを収集する。
【００６８】
イオン移動度質量分析アッセイを、受容体：トリマーの任意の好適な比で、典型的には、３：１〜１０：１のおよその比、例えば、３：１、６：１及び／又は１０：１（受容体：トリマー）で行う。多くの場合、イオン移動度質量分析アッセイを、試験試料についていくつかの濃度比で行う。
【００６９】
また、イオン移動度質量分析を使用して、３個の受容体の、ＴＮＦトリマーへの結合に関する親和性データを提供することもできる。これは、以下の実施例のセクションに例示される。
【００７０】
ＴＮＦトリマーあたりに平均で結合する受容体の数を決定するために使用することができる別の技術は、サイズ排除クロマトグラフィーである。サイズ排除クロマトグラフィー法は当業界で周知であり、そのサイズに基づいて溶液中の成分を分離することを含む。溶液中のより小さい成分は、よりゆっくりと溶出し、より大きい成分と比較してより大きい溶出容量を必要とする。
【００７１】
３個の受容体に結合するＴＮＦトリマーは、２個のみの受容体に結合するトリマーよりも大きいであろう。３個の受容体に結合するトリマーは、したがって、２個の受容体又は１個の受容体に結合するトリマーと比較して小さい容量で溶出される。したがって、異なる溶出容量でのピークを使用して、トリマーあたりに結合した受容体の平均数を同定することができる。これは、以下の実施例のセクションにより詳細に例示される。
【００７２】
例示的なサイズ排除クロマトグラフィー手順では、ＴＮＦトリマーを、過剰の化合物と共にインキュベートする。化合物によるＴＮＦトリマーの占有を、上記のような、ＩＭＳ−ＭＳによって決定することができる。次いで、試料を、受容体と共にインキュベートし、サイズ排除ＨＰＬＣによって分析する。
【００７３】
典型的には、サイズ排除クロマトグラフィー実験を、３：１〜１０：１のおよその比、例えば、３：１、６：１及び／又は１０：１の受容体：トリマーで行う。好ましくは、化合物を、様々な濃度比で試験する。
【００７４】
２個の受容体が結合した、又は１個の受容体が結合したトリマーに関する移動（ピーク）位置を確立するための対照を、以下の実施例のセクションに例示する。これらの対照は、第３、又は第２及び第３の受容体の結合が損傷したＴＮＦα突然変異体を含む。
【００７５】
ＴＮＦトリマーあたりに結合する受容体の平均数を決定するのに使用することができる別の技術は、凝集アッセイである。
【００７６】
トリマーあたりに結合した受容体の平均数を決定するための別の好適なアッセイは、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）である。ＦＲＥＴを使用して、２個のフルオロフォア（ドナー及びアクセプター）が互いにごく接近しているかどうかを決定することができる。
【００７７】
本発明のアッセイでは、受容体を、例えば、ドナーフルオロフォアでタグ付けしてもよい。次いで、トリマーを、例えば、アクセプターフルオロフォア（おそらくリンカーを介して）でタグ付けする。典型的には、実験は、１：１の比の受容体：モノマーで行われるが、受容体の滴定を実施してもよい。同様に、実験を、様々な濃度で存在する試験化合物を用いて実施することができる。これは、以下の実施例に例示される。
【００７８】
最後に、結晶解析を使用して、トリマーあたりに結合する受容体の平均数を決定することができる。結晶解析技術は当業界で周知である。
【００７９】
本発明の方法は全て、化合物が受容体を介するシグナル伝達を調節することができることを同定する出力を提供することを含む。出力は、例えば、実験室ノートにおける記録情報であってもよい。また、出力は、コンピュータ上の記録情報であってもよい。
【００８０】
化合物及び複合体
本発明はまた、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合し、必要な受容体を介するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達を調節することができる化合物にも関する。化合物は、対照と比較して、トリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の対応する平均数、又は平均数の変化をもたらす。そのような化合物を、上記の方法によって同定することができる。
【００８１】
ＴＮＦスーパーファミリーメンバー及び必要な受容体は、上記のもののいずれかであってよい。
【００８２】
化合物を、質量分析などの、当業界で公知の日常的な方法を使用して、ＴＮＦトリマーへの結合について容易にスクリーニングすることができる。また、質量分析を使用して、試料中のＴＮＦトリマー自体の存在を同定することもできる。
【００８３】
質量分析法としては、例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ  ＭＳ）、表面増強レーザー脱離／イオン化質量分析（ＳＥＬＤＩ  ＭＳ）、飛行時間質量分析（ＴＯＦ  ＭＳ）及び液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ  ＭＳ）が挙げられる。
【００８４】
化合物は、その化学式又は構造に関して限定されない。化合物は、典型的には１０００Ｄａ以下、好ましくは７５０Ｄａ以下、より好ましくは６００Ｄａ以下の分子量を有する低分子実体（ＳＭＥ）である。化合物は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマー内に存在する中心空間の内部（すなわち、トリマーのコア）に結合してもよい。トリマーのコア内での化合物の結合を、日常的な方法を使用して、例えば、結晶解析を使用して検出することができる。化合物は、ベンゾイミダゾール部分又はそのイソスターを含んでもよい。
【００８５】
化合物は、少なくとも１つのＴＮＦスーパーファミリーメンバーに結合し、必要な受容体を介するＴＮＦスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達を調節する。シグナル伝達の調節は、本発明の方法の文脈で上記されている。１：１のモル比の受容体：モノマーで、又は過剰の受容体の存在下で、ＴＮＦトリマーは通常、平均３個の受容体に結合する。本発明の化合物は、対照と比較して、トリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の同等の平均数、又はトリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の平均数の変化をもたらすことによってシグナル伝達を調節する。
【００８６】
上記のように、対照は、化合物の非存在下でＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマー及び受容体を含んでもよい（陰性対照）。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマー及び受容体は、試験化合物と対照の両方について同じであり、試験化合物試料及び対照は同じ実験条件（例えば、試薬の濃度）及び方法にかけられる。
【００８７】
対照は、試験化合物を含む試料と同時に実行してもよい。或いは、対照は、試験化合物試料の前に実行してもよい。
【００８８】
対照が化合物の非存在下でＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマー及び受容体を含む場合、アッセイを等しい（１：１）モル比のＴＮＦモノマー：受容体で実行する場合、又は受容体がモノマーの濃度と比較して過剰に存在する場合、トリマーあたり平均３個の受容体が結合すると予想される。アンタゴニスト化合物は、そのような条件下でトリマーあたりに結合する受容体の平均数の減少をもたらす。トリマーあたりに結合する受容体の平均数の減少を決定する方法は、上記で考察されている。
【００８９】
或いは、対照は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマー、必要な受容体、及び受容体を介するトリマーのシグナル伝達を調節することが公知の化合物を含んでもよい（陽性対照）。再度、ＴＮＦスーパーファミリーのトリマー及び受容体は、試験化合物と対照の両方について同じであり、試験化合物試料及び対照は、同じ実験条件（例えば、試薬の濃度）及び方法にかけられる。典型的には、対照は、試験化合物と同時に実行される。しかしながら、対照はまた、試験化合物試料の前に実行してもよい。
【００９０】
対照がＴＮＦスーパーファミリーメンバーのトリマー、必要な受容体、及び受容体を介するトリマーのシグナル伝達を調節することが公知の化合物を含む場合、化合物は、それが対照と比較してトリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の同等の平均数、又は対照と比較してトリマー−化合物複合体あたりに結合した受容体の平均数の減少をもたらす場合、シグナル伝達を調節することができると同定される。この方法で化合物を同定する方法は、上記されている。
【００９１】
拮抗化合物は、トリマー−化合物複合体あたりに結合する平均３個未満の受容体をもたらす（化合物の非存在下で、トリマー−化合物複合体あたり平均で３個の受容体が結合する条件下で）。好ましくは、そのような条件下で、試験化合物は、トリマー−化合物複合体あたりに結合する平均２個の受容体をもたらす。そのような化合物の例としては、化合物（１）〜（４）が挙げられる。別の試験化合物がシグナル伝達を調節することができるかどうかを評価する場合、これらの化合物を陽性対照化合物として使用することができる。
【００９２】
より好ましくは、試験化合物は、トリマー−化合物複合体あたりに結合する平均１個の受容体をもたらす。そのような化合物の例としては、トリマーあたりに結合する単一の受容体に対するシフトをもたらす化合物（５）が挙げられる。再度、別の試験化合物がシグナル伝達を調節することができるかどうかを評価する場合、これらの化合物を陽性対照化合物として使用することができる。
【００９３】
試験化合物はまた、トリマー−化合物複合体あたりに結合する平均０個の受容体をもたしてもよい。
【００９４】
本発明はまた、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質と、化合物とを含む複合体に関する。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質と、化合物は、上記のもののいずれかであってもよい。
【００９５】
トリマー−化合物複合体を同定するための抗体
本発明者らは、本発明の化合物と、トリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーとを含む複合体に選択的に結合する抗体を開発した。これらの抗体を使用して、ＴＮＦを阻害することができるさらなる化合物を同定することができる。
【００９６】
特に、本発明者らは、本発明の化合物との複合体にあるヒトＴＮＦαに対して生じるＣＡ１８５＿０１９７４及びＣＡ１８５＿０１９７９と呼ばれる２つの抗体を同定した。ＣＡ１８５＿０１９７４の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は配列番号３に示され、ＣＡ１８５＿０１９７４の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）は配列番号４に示される。完全長ＩｇＧ１重鎖は配列番号５（１９７４ＨＣ  ｍＩｇＧ１フル）に示され、完全長軽鎖（１９７４  ＬＣカッパフル）は配列番号６に示される。
【００９７】
ＣＡ１８５＿０１９７９のＨＣＶＲは配列番号７に示され、ＣＡ１８５＿０１９７９のＬＣＶＲは配列番号８に示される。ＣＡ１８５＿０１９７９の完全長ＩｇＧ１重鎖は配列番号９（１９７９  ＨＣ  ｍＩｇＧ１フル）に示され、完全長軽鎖は配列番号１０（１９７９  ＬＣカッパフル）に示される。
【００９８】
当業者であれば、上記のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ又は完全長配列対を含む抗体を、標準的な技術を使用して容易に生成することができる。
【００９９】
ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合し、受容体を介するシグナル伝達を調節することができる化合物を決定するための本発明の方法は、したがって、配列番号３／４又は７／８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を有する抗体がトリマー−化合物複合体に結合するかどうかを同定することを含んでもよい。同様に、方法は、配列番号５／６又は９／１０の配列対を有する抗体がトリマー−化合物複合体に結合するかどうかを同定することを含んでもよい。本明細書に記載の他のアッセイに加えて、抗体アッセイを使用してもよい。
【０１００】
本発明の抗体を、例えば、標準的なＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロッティングにより、化合物−トリマー複合体に対する結合について試験することができる。抗体の結合選択性を、例えば、フローサイトメトリーにより、抗体の、標的タンパク質を発現する細胞に対する結合をモニタリングすることによって決定することもできる。したがって、本発明のスクリーニング方法は、ＥＬＩＳＡ若しくはウェスタンブロットを実行することにより、又はフローサイトメトリーにより、化合物−トリマー複合体に結合することができる抗体を同定するステップを含んでもよい。
【０１０１】
本明細書に記載の抗体は、少なくとも１つの化合物−トリマー複合体、すなわち、化合物−トリマー複合体中のエピトープを選択的（又は特異的）に認識する。抗体、又は他の化合物は、それが選択的であるが、他のタンパク質には実質的に結合しない、又は低い親和性で結合するタンパク質に対して優先的に、又は高い親和性で結合する場合、タンパク質「に選択的に結合する」又は「を選択的に認識する」。
【０１０２】
本発明の例では、化合物−トリマー複合体は、典型的には、１ｎＭ未満の親和性で配列番号３／４若しくは７／８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（又は配列番号５／６若しくは９／１０の配列対）を有する抗体に結合することができる。換言すれば、本発明の方法は、配列番号３／４若しくは７／８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（又は配列番号５／６若しくは９／１０の配列対）を有する抗体が１ｎＭ未満のＫＤ−ａｂでトリマー−化合物複合体に結合することを同定することによって、化合物がＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質に結合し、受容体を介するシグナル伝達を調節することができることを決定することを含んでもよい。いくつかの例では、ＫＤ−ａｂは、５００ｐＭ未満、又は２００ｐＭ未満であってもよい。親和性を、表面プラズモン共鳴によって決定することができる。ＴＮＦは、典型的には、ヒトＴＮＦαである。
【０１０３】
同様に、本発明の複合体は、化合物−トリマー複合体が、配列番号３／４若しくは７／８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（又は配列番号５／６若しくは９／１０の配列対）を有する抗体に結合する、トリマーＴＮＦスーパーファミリーメンバーと化合物との複合体であってもよい。再度、ＴＮＦは、典型的にはヒトＴＮＦαであり、結合親和性は、典型的には１ｎＭ未満（又は５００ｐＭ／２００ｐＭ未満）である。結合親和性は、典型的には、表面プラズモン共鳴によって決定される。
【０１０４】
治療指標
ＴＮＦαは、ＴＮＦスーパーファミリーの典型的なメンバーである。ＴＮＦαは、免疫調節及び炎症応答を媒介する多面的なサイトカインである。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＴＮＦαは細菌、寄生虫及びウイルス感染に対する応答に関与することも知られている。特に、ＴＮＦαは、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（クローン病を含む）、乾癬、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、疼痛、てんかん、骨粗鬆症、喘息、敗血症、発熱、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び多発性硬化症（ＭＳ）並びにがんにおいて役割を有することが知られている。ＴＮＦαはまた、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、虚血性脳卒中、免疫複合体媒介性糸球体腎炎、ループス腎炎（ＬＮ）、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ−）関連糸球体腎炎、微小変化型疾患、糖尿病性腎症（ＤＮ）、急性腎傷害（ＡＫＩ）、閉塞性尿路疾患、腎同種移植拒絶、シスプラチン誘導性ＡＫＩ及び閉塞性尿路疾患における役割を有することが知られている。
【０１０５】
ＴＮＦスーパーファミリーの他のメンバーは、自己免疫疾患及び免疫不全に関与することが公知である。特に、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーは、ＲＡ、ＳＬＥ、がん、ＭＳ、喘息、鼻炎、骨粗鬆症及び多発性ミエローマ（ＭＭ）に関与することが公知である。ＴＬ１Ａは、臓器移植片拒絶において役割を果たすことが公知である。
【０１０６】
本発明の方法を使用して同定される化合物、又はＴＮＦ−トリマー化合物複合体を、ヒト又は動物の身体の治療方法において使用することができる。化合物又は複合体を使用して、従来のＴＮＦスーパーファミリーメンバーモジュレータによって処置、防止又は改善することができる任意の状態を処置、防止又は改善することができる。化合物又は複合体を、単独で、又は従来のＴＮＦスーパーファミリーメンバーモジュレータと組み合わせて使用することができる。
【０１０７】
原理的には、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーによるＴＮＦ受容体を介する病的シグナル伝達から、又はＴＮＦスーパーファミリーメンバーによるＴＮＦ受容体を介するシグナル伝達の欠陥から、部分的又は全体的に生じる任意の状態を、本発明に従って処置、防止又は改善することができる。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーによるＴＮＦ受容体を介する病的シグナル伝達は、正常な生理学的レベルのシグナル伝達を超えるＴＮＦ受容体を介するシグナル伝達の増加、最初は正常であったが、正常な生理学的シグナルに応答して停止することができないＴＮＦ受容体を介するシグナル伝達及び正常の生理学的規模範囲内にあるが、非生理的手段によって開始するＴＮＦ受容体を介するシグナル伝達を含む。好ましい実施形態では、本発明は、ＴＮＦαによって媒介又は影響される状態の処置、防止又は改善に関する。
【０１０８】
ＴＮＦαと相互作用する化合物は、したがって、様々なヒトの病気の処置及び／又は防止において有益である。これらのものとしては、自己免疫障害及び炎症障害；神経障害及び神経変性障害；疼痛障害及び侵害障害；並びに心血管障害が挙げられる。
【０１０９】
炎症障害及び自己免疫障害としては、全身性自己免疫障害、自己免疫性内分泌障害及び臓器特異的自己免疫障害が挙げられる。全身性自己免疫障害としては、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、血管炎、多発性筋炎、強皮症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、関節リウマチ及びシェーグレン症候群が挙げられる。自己免疫性内分泌障害としては、甲状腺炎が挙げられる。臓器特異的自己免疫障害としては、アジソン病、溶血性貧血又は悪性貧血、糸球体腎炎（グッドパスチャー症候群を含む）、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病、若年性糖尿病、ブドウ膜炎、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、天疱瘡、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肺炎、自己免疫性心臓炎、重症筋無力症、自然不妊症、骨粗鬆症、喘息及び筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む）が挙げられる。
【０１１０】
神経障害及び神経変性障害としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷、頭部外傷、発作及びてんかんが挙げられる。
【０１１１】
心血管障害としては、血栓症、心臓肥大、高血圧、心臓の不規則収縮（例えば、心不全中の）、及び性的障害（勃起障害及び女性性的機能障害を含む）が挙げられる。
【０１１２】
特に、化合物又は複合体を使用して、炎症障害、ＣＮＳ障害、免疫障害及び自己免疫障害、疼痛、骨粗鬆症、発熱及び臓器移植拒絶を処置又は防止することができる。好ましい実施形態では、化合物又は複合体を使用して、関節リウマチ、炎症性腸疾患（クローン病を含む）、乾癬、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、喘息、敗血症、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、喘息、鼻炎、がん及び骨粗鬆症を処置又は防止することができる。別の好ましい実施形態では、化合物又は複合体を使用して、関節リウマチ（ＲＡ）、非特異的炎症性関節炎、浸食性骨疾患、軟骨炎、軟骨変性及び／又は破壊、若年性炎症性関節炎、スティル病（若年及び／又は成人開始型）、若年性特発性関節炎、若年性特発性関節炎（少関節炎型と多関節炎型の両方）、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎、不確定大腸炎、回腸嚢炎を含む）、乾癬、乾癬性関節症、強直性脊椎炎、シェーグレン病、アルツハイマー病（ＡＤ）、ベーチェット病、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、虚血性脳卒中、疼痛、てんかん、骨粗鬆症、骨減少症、慢性疾患の貧血、悪液質、糖尿病、脂質異常症、代謝症候群、喘息、慢性閉塞性気道（又は肺）疾患、敗血症、発熱、呼吸窮迫症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、免疫複合体媒介性糸球体腎炎、ループス腎炎（ＬＮ）、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ−）関連糸球体腎炎、微小変化型疾患、糖尿病性腎症（ＤＮ）、急性腎傷害（ＡＫＩ）、閉塞性尿路疾患、腎同種移植拒絶、シスプラチン誘導性ＡＫＩ及び閉塞性尿路疾患、眼疾患（糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、未熟児網膜症、加齢黄斑変性、黄斑浮腫、増殖性及び／又は非増殖性網膜症、新血管形成を含む角膜血管新生、網膜静脈閉塞、様々な形態のブドウ膜炎及び角膜炎を含む）、甲状腺炎、様々な形態の肝線維症、様々な形態の肺線維症を含む線維化障害、全身硬化症、強皮症、がん並びにがん関連合併症（骨格合併症、悪液質及び貧血を含む）を処置又は防止することができる。
【０１１３】
医薬組成物、用量及び用量レジメン
本発明の方法を使用して同定される化合物及び化合物−トリマー複合体は、典型的には、薬学的に許容される担体と一緒に、医薬組成物中に製剤化される。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生理的に適合する任意且つ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。担体は、例えば、注射又は輸注による、非経口、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、眼内、腹腔内、皮下、脊髄又は他の非経口投与経路にとって好適であってよい。或いは、担体は、局所、表皮又は粘膜投与経路などの非非経口（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）投与にとって好適であってよい。好ましい実施形態では、担体は、経口投与にとって好適である。投与経路に応じて、モジュレータを、酸の作用及び化合物を不活化し得る他の自然条件から化合物を保護するための材料中でコーティングすることができる。
【０１１５】
本発明の医薬組成物は、１又は複数の薬学的に許容される塩を含んでもよい。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の望ましい生物活性を保持し、いかなる望ましくない毒性効果も与えない塩を指す。そのような塩の例としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。
【０１１６】
好ましい薬学的に許容される担体は、水性担体又は希釈剤を含む。本発明の医薬組成物中で用いることができる好適な水性担体の例としては、水、緩衝化水及び塩水が挙げられる。他の担体の例としては、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びその好適な混合物、オリーブ油などの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。
【０１１７】
治療組成物は、典型的には、製造及び保存の条件下で無菌性であり、安定でなければならない。組成物を、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高い薬物濃度にとって好適な他の規則的構造として製剤化することができる。
【０１１８】
本発明の医薬組成物は、さらなる活性成分を含んでもよい。
【０１１９】
また、化合物又は複合体と、使用のための指示書とを含むキットも本発明の範囲内にある。キットは、上記で考察されたさらなる治療剤又は予防剤などの、１又は複数のさらなる試薬をさらに含有してもよい。
【０１２０】
化合物及び化合物−トリマー複合体又はその製剤若しくは組成物を、予防的及び／又は治療的処置のために投与することができる。
【０１２１】
治療的適用では、化合物及び化合物−トリマー複合体を、状態又は１若しくは複数のその症状を治癒させる、軽減する、又は部分的に停止させるのに十分な量で、上記の障害又は状態に既に罹患している対象に投与する。そのような治療的処置は、疾患症状の重症度の低下、又は無症状期間の頻度若しくは持続時間の増大をもたらし得る。これを達成するのに十分な量を、「治療有効量」と定義する。
【０１２２】
予防的適用では、製剤を、状態又は１若しくは複数のその症状のその後の効果を防止する、又は減少させるのに十分な量で、上記の障害又は状態のリスクがある対象に投与する。これを達成するのに十分な量を、「予防有効量」と定義する。それぞれの目的のための有効量は、疾患又は傷害の重症度並びに対象の体重及び全身状態に依存する。
【０１２３】
投与のための対象は、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、は虫類などを含む。ヒトに対する投与が好ましい。
【０１２４】
化合物又は化合物−トリマー複合体を、当業界で公知の１又は複数の様々な方法を使用して、１又は複数の投与経路により投与することができる。当業者であれば理解できるように、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて変化する。化合物又は本発明の化合物−トリマー複合体のための投与経路の例としては、例えば、注射又は輸注による、静脈内、筋肉内、皮内、眼内、腹腔内、皮下、脊髄又は他の非経口投与経路が挙げられる。本明細書で使用される語句「非経口投与」は、通常は注射による、腸内投与及び局所投与以外の投与様式を意味する。或いは、本発明の方法によって同定される化合物又は本発明の化合物−トリマー複合体を、局所、表皮又は粘膜投与経路などの、非非経口経路により投与することができる。好ましい実施形態では、本発明の方法によって同定される化合物又は本発明の化合物−トリマー複合体は、経口投与のためのものである。
【０１２５】
化合物又は化合物−トリマー複合体の好適な用量を、技術のある医師によって決定することができる。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者にとって毒性的であることなく、特定の患者のための望ましい治療応答、組成、及び投与様式を達成するのに有効である活性成分の量を得るために変化し得る。選択される用量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与の時間、用いられる特定の化合物の排出速度、処置の持続時間、用いられる特定の組成物と共に使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、年齢、性別、体重、状態、処置される患者の全身の健康及び以前の病歴、並びに医学界で周知の因子などの、様々な薬物動態学的因子に依存する。
【０１２６】
好適な用量は、例えば、処置される患者の約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、典型的には、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であってもよい。例えば、好適な用量は、１日当たり約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重又は１日当たり約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。
【０１２７】
用量レジメンを、最適な望ましい応答（例えば、治療応答）を提供するように調整することができる。例えば、治療状況の緊急性によって示されるように、単回用量を投与してもよく、数回に分割された用量を経時的に投与してもよく、又は用量を比例的に減少若しくは増加させてもよい。本明細書で使用される用量単位形態とは、処置される対象にとって単一用量として適する物理的に個別の単位を指す；それぞれの単位は、必要とされる薬学的担体と関連する所望の治療効果をもたらすように算出される活性化合物の所定量を含有する。
【０１２８】
投与は、単一又は複数の用量にあってもよい。複数用量を、同じか、又は異なる経路により、同じか、又は異なる位置に投与することができる。或いは、用量は、持続放出製剤によるものであってもよく、その場合、低頻度の投与が必要である。用量及び頻度は、患者におけるアンタゴニストの半減期及び望ましい処置の持続時間に応じて変化してもよい。
【０１２９】
上記のように、化合物又は化合物−トリマー複合体を、１又は複数の他の治療剤と共に同時投与することができる。例えば、他の薬剤は、鎮痛剤、麻酔剤、免疫抑制剤又は抗炎症剤であってもよい。
【０１３０】
２つ以上の薬剤の組合せ投与を、いくつかの異なる方法で達成することができる。両方とも単一の組成物中で一緒に投与するか、又はそれらを組合せ治療の一部として別々の組成物中で投与してもよい。例えば、一方を、他方の前、後に、又はそれと同時に投与してもよい。
【０１３１】
以下の例は、本発明を例証するものである。
【実施例】
【０１３２】
（例１（Ａ））  −  式（１）、（２）、（３）及び（４）の化合物の合成
化合物（１）の合成は、ＷＯ２０１３／１８６２２９（例４９０）に開示されている。
化合物（２）の合成は、ＷＯ２０１３／１８６２２９（例２）に開示されている。
化合物（３）の合成は、ＷＯ２０１４／００９２９５（例４）に開示されている。
化合物（４）の合成は、ＷＯ２０１３／１８６２２９（例８９）に開示されている。
【０１３３】
（例１（Ｂ））  −  式（５）の化合物の合成
命名法
化合物は、ＡＣＤ／Ｎａｍｅ  Ｂａｔｃｈ（Ｎｅｔｗｏｒｋ）バージョン１２．０又はＡｃｃｅｌｙｒｓ  Ｄｒａｗ４．０を補助に用いて命名した。
【０１３４】
略語
ＤＣＭ：ジクロロメタン                  ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド    ＭｅＯＨ：メタノール
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド          ＳｉＯ２：シリカ
Ｅｔ２Ｏ：ジエチルエーテル              ｈ：時間
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン              ＲＴ：保持時間
ｒ．ｔ．：室温                          ＭｅＣＮ：アセトニトリル
ｂｒ．：ブロード                        Ｍ：質量
ブライン：飽和塩化ナトリウム水溶液
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＬＣＭＳ：液体クロマトグラフィー質量分析
ＥＳ＋：エレクトロスプレーポジティブイオン化
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
【０１３５】
分析条件
全てのＮＭＲは、３００ＭＨｚ又は４００ＭＨｚのいずれかで取得した。
【０１３６】
空気又は水分に敏感な試薬が関与する全ての反応は、乾燥溶媒及びガラス器具を使用して、窒素雰囲気下で行った。
【０１３７】
全ての化合物のＬＣＭＳデータは、下記の方法を使用して決定した。
【０１３８】
方法１：
Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ−ＳＱＤ、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８、２．１×５０ｍｍ、１．７μｍカラム
移動相Ａ：１０ｍＭのギ酸アンモニウム＋０．１％アンモニア
移動相Ｂ：９５％ＭｅＣＮ＋５％Ｈ２Ｏ＋０．１％アンモニア
勾配プログラム（流量１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃）：
時間      Ａ％  Ｂ％
０．００  ９５    ５
０．５０  ９５    ５
１．７５    ５  ９５
２．００    ５  ９５
２．２５  ９５    ５
【０１３９】
異なる解析条件が使用される場合に、ＬＣＭＳデータについて異なる保持時間（ＲＴ）が取得されうることは、当業者にとって明らかである。
【０１４０】
旋光度は、Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ＰｏｌＡＡＲ  ２００１旋光計を使用して測定した。
【０１４１】
中間体１
【化１】
2019218382.tif 000002
（６−ブロモ−７−フルオロ−２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イル）［２−（ジフルオロメトキシ）フェニル］−メタノール−エナンチオマーＡ
ラセミ体の標題化合物を、特許出願ＷＯ２０１４／００９２９５に記載の以下の手順に従って調製した。そのように調製したラセミ体混合物を、以下に詳述するキラルクロマトグラフィーにより、エナンチオマー成分に分離した：
【０１４２】
ラセミ体（６−ブロモ−７−フルオロ−２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イル）［２−（ジフルオロメトキシ）フェニル］−メタノールを、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤでＬＣ条件（１００＊５００ｍｍ＊ｍｍ、流量３００ｍＬ／分、３０℃、２−ＰｒＯＨ／ヘプタン  １／９、７．５ｇ／Ｌの濃度で２３０ｍＬの溶液を注入）下で精製することによって、標題化合物を単離した。第１の溶出エナンチオマー（ＲＴ２７分）を収集し、画分を蒸発させてエナンチオマーＡを得た。［α］−１２．８°。第２の溶出エナンチオマー（ＲＴ５０分）を収集し、画分を蒸発させてエナンチオマーＢを得た。［α］＋１２．７°
【０１４３】
中間体２
【化２】
2019218382.tif 000003
【０１４４】
３−（トリフルオロメチル）アゼチジン−３−オール
氷／ブライン浴で約−５℃に冷却した１−ｂｏｃ−３−アゼチジノン（１１．３ｇ、５８．４ｍｍｏｌ）及び（トリフルオロメチル）トリメチルシラン（９．２２ｇ、６４．３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１００ｍＬ）に、フッ化セシウム（９．７７ｇ、６４．３ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。得られた混合物を室温で撹拌して、４時間後、ＴＬＣ解析により、出発物質の完全消費とより極性の小さな成分とが示された。反応を飽和塩化アンモニウム水溶液（１００ｍＬ）の添加によりクエンチし、水相をＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機相を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、揮発性物質を真空中で除去し、粗油状物を得た。そのように得られた油状物をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（４０ｍＬ）を加えた。混合物を、周囲温度で４時間撹拌した。揮発物を真空中で除去し、残渣をトルエン（３×１５０ｍＬ）と共沸させて、標題化合物のトリフルオロ酢酸塩を褐色固体（１５ｇ）として得た。1H NMR (400 MHz, d6DMSO):  δ/ppm 9.48 (s, 2 H), 7.95 (d, J  0.3 Hz, 1 H), 4.28 (d, J 13.1 Hz, 2 H), 4.06 (m, 2 H).
【０１４５】
そのように得られた化合物を、次の反応で、さらに精製することなく使用した。
【０１４６】
中間体３
【化３】
2019218382.tif 000004
１−［５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ピリミジン−２−イル］−３−（トリフルオロメチル）アゼチジン−３−オール
中間体２（１２ｇ）のアセトニトリル（１５０ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（３０ｍＬ）及び２−クロロ−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ピリミジン（１６ｇ）を加え、反応液を６５℃で１８時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、固体残渣を粉砕し、蒸留水で洗浄してベージュ色固体を得て、高真空下で乾燥させて標題化合物をベージュ色固体（１８．５ｇ）として得た。1H NMR (300 MHz, d6 DMSO): δ/ppm 8.53 (2H, s), 7.46 (1H, s), 4.33-4.31 (2H, m), 4.10-4.08 (2H, m), 1.29 (12H, s). LCMS (ES+) RT 1.14分, 346.0 (M+H)+.
【０１４７】
化合物（５）
【化４】
2019218382.tif 000005
１−［５−［３−［（Ｓ）−［２−（ジフルオロメトキシ）フェニル］−ヒドロキシ−メチル］−７−フルオロ−２−メチル−イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−６−イル］ピリミジン−２−イル］−３−（トリフルオロメチル）アゼチジン−３−オール（エナンチオマーＡ）
中間体１（０．７ｇ、２ｍｍｏｌ）、中間体３（０．７ｇ、２ｍｍｏｌ）、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン−パラジウム（ＩＩ）ジクロリドジクロロメタン錯体（３６ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）及び２Ｍの炭酸ナトリウム（２ｍＬ）のジオキサン（１２ｍＬ）中混合物を脱気し、３時間還流した。冷却した反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、ブラインで２回洗浄し、有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、真空中で濃縮した。残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、０〜９０％ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）に装填し、標題化合物をクリーム色固体（５００ｍｇ、５０％）として得た。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 8.51 (m, 3 H), 7.95 (dd, J1 2.3 Hz, J2 6.7 Hz, 1 H), 7.46 (m, 2 H), 7.36 (m, 2 H), 7.12 (m, 2 H), 6.42 (d, J 4.4 Hz, 1 H), 6.18 (d, J 4.4 Hz, 1 H), 4.35 (m, 2 H), 4.13 (d, J 10.2 Hz, 2 H), 2.12 (s, 3 H). LCMS (ES+) RT 1.34分, 540.0 (M+H)+. [α] + 39.7°.
【０１４８】
（例２）  −  ＴＮＦα／ＴＮＦＲ１／化合物複合体の解析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、様々な化合物の非存在下又は存在下における、ＴＮＦαに結合するＴＮＦＲ１受容体の数を決定した。化合物（２）は、下記プロトコル１に記載の条件下で試験した。化合物（５）は、プロトコル２に記載されるように試験した。
【０１４９】
プロトコル１
化合物（２）を、３００μＭの融合ＴＮＦαトリマーに、化合物の最終濃度範囲９０μＭ〜６９０μＭで、ＤＭＳＯ濃度は１．０％で一定に保ちながら、加えた。ＴＮＦα及び化合物の試料を、４℃の温度で一晩インキュベートした。
【０１５０】
受容体を、最終濃度２４０μＭ（トリマーに対して３．２倍過剰）で、上記のように調製した７５μＭの化合物−トリマー複合体に加えた。ＤＭＳＯの最終濃度は０．２５％であった。混合物を２２℃で１時間インキュベートした。
【０１５１】
ＨＰＬＣを使用する解析的サイズ排除の条件は以下の通りであった：注入体積：５０μｌ；ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷ  Ｌ×Ｉ．Ｄ．３０ｃｍ×７．５ｍｍカラム、１０μｍの粒径；１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌのバッファー。タンパク質について、トリマーヒトＴＮＦαの単一ポリペプチド鎖は、ヒトＴＮＦα残基Ｖ７７−Ｌ２３３、続けて、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒによって一緒に連結されたヒトＴＮＦα残基Ｄ８６−Ｌ２３３の２つのさらなるリピートで構成された（配列はＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１０３７５に基づく）。ヒトＴＮＦＲ１（Ｖ４３−Ｎ１８４）（Ｎ５４Ｄ、Ｃ１８２Ｓ）は、配列Ｐ１９４３８（ＵｎｉＰｒｏｔ）に基づいた。
【０１５２】
結果を図５に示す。図において、数字１〜３は、ＴＮＦαトリマーに結合する受容体の数を指す。この図に示されるように、増大濃度の化合物（２）の添加は、結合する受容体の数を、トリマーあたり平均３個からトリマーあたり平均２個へ減少させた。特に、低濃度の化合物（９０μＭ）では、トリマーあたり３個の受容体結合を示すピーク（トリマーあたり２個の受容体結合のわずかなショルダーを伴う）が観察される。過剰濃度の化合物（６９０μＭ）では、優勢ピークは、トリマーあたり３個の受容体結合のピークに相当するわずかなショルダーを伴う、トリマーあたり２個の受容体結合に相当する。それゆえ、この濃度の化合物で、トリマー化合物複合体の大部分は２個の受容体に結合している。
【０１５３】
ＴＮＦαに結合する１、２及び３個の受容体の予測される移動を観察するための別個の実験では、様々な濃度のＴＮＦＲ１（ＴＮＦαトリマーの濃度に対して１．２、２．２、３．２及び５倍過剰）をＴＮＦαに添加した。結果を図６に示す。この図に示されるように、受容体の濃度を増加させると、複合体の分子量が増加（左にシフト）し、トリマーあたりの受容体結合数が１から３へシフトすることが示唆される。ＴＮＦＲ１の濃度をさらに増加させても効果はないことから、最大で３個の受容体がＴＮＦαトリマーを占拠する。
【０１５４】
プロトコル２
化合物（５）を、２０μＭのＴＮＦαトリマーに、最終濃度２００μＭ（トリマー：化合物の比１：１０）で、ＤＭＳＯ濃度は２．０％で一定に保ちながら、加えた。ＴＮＦα及び化合物の試料を、４℃の温度で一晩インキュベートした。受容体を最終濃度３５μＭで、１０μＭのトリマー−化合物複合体に加えた（トリマー−化合物複合体に対して３．５倍過剰の受容体）。ＤＭＳＯの最終濃度は１．０％であった。混合物を２２℃で１時間インキュベートした。
【０１５５】
ＨＰＬＣを使用する解析的サイズ排除の条件は、以下の通りであった：注入体積：５０μｌ；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３００、Ｌ×Ｉ．Ｄ．３０ｃｍ×１０ｍｍカラム、１３〜１５μｍの粒径；及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌのバッファー。
【０１５６】
ＴＮＦαは、ヒトＴＮＦα残基Ｖ７７−Ｌ２３３、続けて、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒによって一緒に連結されたヒトＴＮＦα残基Ｄ８６−Ｌ２３３の２つのさらなるリピートで構成される、トリマーヒトＴＮＦαの単一ポリペプチド鎖であった（配列はＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１０３７５に基づく）。ヒトＴＮＦＲ１は、配列ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１９４３８に基づく（Ｖ４３−Ｎ１８４）（Ｎ５４Ｄ、Ｃ１８２Ｓ）であった。
【０１５７】
ＴＮＦαに結合する１、２及び３個の受容体の予測される移動のためのマーカーを確立するために、１、２及び３個の受容体結合部位で相互作用を破壊するヒトＴＮＦαの点変異を、同じ最終濃度１．０％のＤＭＳＯを含むバッファー中の３．５×受容体（トリマーに対して３．５倍過剰の受容体）に加えた。
【０１５８】
図７は、化合物（５）トレースと、１、２及び３個の受容体に結合するように変異させたＴＮＦαを示す対照トレースとの重ね合わせを示す。化合物（２）と比較して、化合物（５）を含有するピークは、１個の受容体結合の近くへ移動している。
【０１５９】
（例３）  −  マウスＴＮＦα−ＴＮＦＲ１−化合物（１）の三元複合体を示す結晶解析
マウスＴＮＦα（ＶＣ６５３５、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０６８０４）の可溶性形態を融合タンパク質として大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）で発現した。このタンパク質は、以下の最終配列を有する：
ＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＨＱＶＥＥＱＬＥＷＬＳＱＲＡＮＡＬＬＡＮＧＭＤＬＫＤＮＱＬＶＶＰＡＤＧＬＹＬＶＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＤＹＶＬＬＴＨＴＶＳＲＦＡＩＳＹＱＥＫＶＮＬＬＳＡＶＫＳＰＣＰＫＤＴＰＥＧＡＥＬＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＱＬＳＡＥＶＮＬＰＫＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＶＩＡＬ（配列番号１）
【０１６０】
細胞を濃縮培地中３７℃で前培養し、０．１％のアラビノース添加で誘導し、２５℃で一晩、ベクターｐＥＭＢ５４で発現させた。このベクターは、切断可能なＮ末端Ｈｉｓ６Ｓｍｔ−タグを導入する。細胞を溶解し、Ｎｉ−ＮＴＡキレートクロマトグラフィーにより精製した。融合タンパク質を、イミダゾールを含有するバッファーを用いて溶出し、プロテアーゼの添加により切断した。最終切断ＴＮＦαタンパク質を、減算型Ｎｉキレートクロマトグラフィー工程で精製して融合タグを除去し、さらに、サイズ排除クロマトグラフィーで精製して残余の不純物を除去した。最終ＴＮＦα産物を、２０．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、液体窒素中で急速凍結した。
【０１６１】
ヒトＴＮＦＲ１（ＶＣ５６０２、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１９４３８）の細胞外ドメインを、バキュロウイルス感染昆虫細胞で分泌タンパク質として発現した。このタンパク質は、以下の最終配列を有する：
ＧＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＤＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＥＣＥＳＧＳＦＴＡＳＥＮＨＬＲＨＣＬＳＣＳＫＣＲＫＥＭＧＱＶＥＩＳＳＣＴＶＤＲＤＴＶＣＧＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦＮＣＳＬＣＬＮＧＴＶＨＬＳＣＱＥＫＱＮＴＶＣＴＣＨＡＧＦＦＬＲＥＮＥＣＶＳＳＳＮ（配列番号２）
【０１６２】
融合タンパク質プラスミドを、切断可能なＮ末端分泌シグナル及びＨｉｓタグ化融合タンパク質をコードするｐＥＭＢ５０発現ベクターにクローニングした。ウイルスを、バキュロウイルス発現系を使用して生成した。感染した昆虫細胞は、融合タンパク質を培地へ分泌した。融合タンパク質をＮｉ−ＮＴＡキレートクロマトグラフィーにより精製し、イミダゾール勾配を使用してＮｉカラムから溶出した。溶出したタンパク質をプロテアーゼで切断し、Ｎ末端Ｈｉｓ融合タグを除去した。続いて、切断ＴＮＦＲ１を減算型Ｎｉキレートクロマトグラフィー工程で精製し、サイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。最終ＴＮＦＲ産物を、８．８ｍｇ／ｍｌに濃縮し、液体窒素中で急速凍結した。
【０１６３】
精製マウスＴＮＦα（２０．５ｍｇ／ｍｌ、ＶＣ６５３５）を、６モル過剰の化合物（１）（ＤＭＳＯ中１００ｍＭ）と３７℃で３時間インキュベートし、その後、４℃で一晩インキュベートした。翌日、ヒトＴＮＦＲ１（８．８ｍｇ／ｍｌ、ＶＣ５６０２）を、最終モル比が３個のＴＮＦαモノマー（１個のトリマーに相当）：３個のＴＮＦＲ１受容体となるように加えた。三元複合体（サイトカイン、リガンド、受容体）を１時間インキュベートしてから、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌで予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除カラム（２３ｍｌ）に負荷した。最終精製三元複合体を１８．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、直ちに結晶化を試みた。
【０１６４】
三元複合体を、シッティングドロップ蒸気拡散法により、０．５μｌの複合体と、０．５μｌの８００ｍＭ酒石酸ナトリウムカリウム、０．５％ＰＥＧ５０００ＭＭＥ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５を、１００μｌの同じ結晶化溶液で混合することにより、結晶化した。結晶を、初期設定後ほぼ２カ月間、データ収集のために採取した。結晶を、パラフィン油に短時間浸漬し、液体窒素中で直接凍結し、２０１２年８月１７日にＡｒｇｏｎｎｅ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ、ｂｅａｍｌｉｎｅ  ２１−ＩＤＦでデータ収集した。
【０１６５】
化合物（１）と複合体化したマウスＴＮＦα（ＶＣ６５３５）及びヒトＴＮＦＲ（ＶＣ５６０２）の構造を、Ｐｈａｓｅｒを使用し、複合体化ヒトＴＮＦα構造に基づく導入モデルを用いて、分子置換により解明した。データをＸＤＳで統合し、ＳＣＡＬＡを使用して拡張した。初期構造決定及び精密化は、３．１５Åの分解能で単結晶からのデータを使用した。Ｃｏｏｔ（Emsley, P. and Cowtan, K. 2004. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. Dec;60(Pt 12 Pt 1):2126-32. PMID: 15572765)及びＲｅｆｍａｃ（Murshudov, G.N., Vagin, A.A., and Dodson, E.J. 1997. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. May 1;53(Pt3):240-55. PMID: 15299926）を使用する反復マニュアルモデル構築を、Ｒ及びＲｆｒｅｅがＲ＝０．２２２、Ｒｆｒｅｅ＝０．２７２に達するまで継続した。モデルの質を、Ｃｏｏｔ及びＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙを使用して検証した（Lovell, S.C., Davis, I.W., Arendall W.B., de Bakker, P.I., Word, J.M., Prisant, M.G., Richardson, J.S., and Richardson, D.C. 2003. Structure validation by Dalpha geometry: phi, psi and Cbeta deviation. Proteins. Feb 15;50(3):437-50. PMID: 12557186）。最終データ処理及び精密化統計を表１に列挙する。
【表１】
2019218382.tif 000006
【０１６６】
結晶構造は、図８Ａ〜Ｄに示されるように、トリマー−化合物複合体あたり２個の受容体結合を示す。
【０１６７】
（例４）  −  ＴＮＦα−ＴＮＦＲ１  ＴＲ−ＦＲＥＴ
均一性時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイを展開して、融合ＴＮＦαトリマーへのＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ））結合の化合物媒介減少を測定した。
【０１６８】
テルビウム標識ストレプトアビジンは、ビオチン化融合ＴＮＦαトリマーとの複合体において、ＦＲＥＴペアのドナー部分を形成した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（ＡＦ４８８）コンジュゲートＴＮＦＲ１（ＥＣＤ）を、ＦＲＥＴアクセプターとして使用した。
【表２】
2019218382.tif 000007
【０１６９】
標識タンパク質をそれぞれ、バッファー溶液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）中７．５ｎＭの最終アッセイ濃度（ＴＮＦモノマー：受容体の濃度比１：１）に希釈した。３倍希釈液を用いて化合物を１０点滴定で試験した。最終アッセイにおける最大化合物濃度は２５μＭであった。アッセイの最終ＤＭＳＯ濃度は５体積％であった。
【０１７０】
２０時間インキュベートした後、プレートを、ＬＪＬ  Ａｎａｌｙｓｔプレートリーダーを使用して読み取った。試料を３３０ｎｍで励起し、蛍光読取りを、テルビウムドナー及びＡＦ４８８アクセプターの発光波長のそれぞれ４９５ｎｍ及び５２０ｎｍで行った。ＦＲＥＴ比は、アクセプター数をドナー数で割算し、１０，０００を乗算することによって計算した。
【０１７１】
妨害分子の非存在下で、ＴＮＦＲ１は、融合ＴＮＦαトリマーと複合体を形成し、ＦＲＥＴシグナルを生成する。妨害分子は、ＴＮＦＲ１の結合を妨げ、続いてＦＲＥＴシグナルを阻害する。
【０１７２】
ＦＲＥＴの阻害は完全又は部分的である場合があり、阻害によって、結合するＴＮＦＲ１（ＥＣＤ）の減少があり、ＴＮＦα−ＴＮＦＲ１（ＥＣＤ）化学量論の減少が示される。抗体による完全阻害は、１００％である。
【０１７３】
図９及び１０は、化合物（３）及び化合物（４）を用いて観察された部分的阻害を表す。化合物の最高濃度で、最大阻害は、それぞれ２９％及び３６％である。この値は、可能性のある３個の受容体結合のうち１つの平均阻害（３３％と予測される）に相当する。
【０１７４】
（例５）  −  イオンモビリティ質量分析によるＴＮＦ受容体結合化学量論の解析
ヒトＴＮＦαを、使用前に脱塩し、２０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．４にバッファー交換した。ｚｅｂａスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ、７ｋＤａ  ＭＷＣＯ）と続くマイクロ透析（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ  ｍｉｎｉ透析ユニット、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）との組み合わせにより、タンパク質の十分な脱塩とネイティブ質量分析による良好な分解能のシグナル生成を確実にした。ＴＮＦα（２０μＭ）を小分子ＴＮＦα阻害剤（化合物（３））、２００μＭ、２％ＤＭＳＯと１：１（ｖ：ｖ）で加えた。化合物を、２０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．４を使用して、１０ｍＭのＤＭＳＯストックから希釈した。ＴＮＦα（２０μＭ）をバッファー（２０ｍＭ、酢酸アンモニウム、ｐＨ７．４、２％ＤＭＳＯ）と１：１（ｖ：ｖ）で加えて、ＤＭＳＯのみの対照も調製した。両方の溶液を室温で一晩インキュベートし、その後、小分子含有試料を非共有結合性飛行時間型質量分析（Ａｄｖｉｏｎ  ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅイオン源を備えたＷａｔｅｒｓ  ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ）により解析し、ＴＮＦαが十分に結合されたことを確認した。
【０１７５】
ヒトＴＮＦＲ１（残基４１〜１８４、Ｃ１８２Ｓ、脱グリコシル化）を、ネイティブＭＳ解析のために、ｚｅｂａスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ、７ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用する２０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．４へのバッファー交換により調製した。受容体を先に調製したＴＮＦα試料のアリコートに１：１（ｖ：ｖ）で加え、５、１０及び２３μＭのＴＮＦＲを含有する、実験あたり３つの試料を得た（それぞれの試料の最終ＴＮＦα濃度は５μＭであった）。試料を２時間インキュベートし、イオンモビリティ質量分析（Ａｄｖｉｏｎ  ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅイオン源を備えたＷａｔｅｒｓ  Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２  Ｑ−ＴＯＦ質量分析計）により解析した。
【０１７６】
１、２又は３個の受容体がＴＮＦαに結合するとき有意な質量差が得られることから、質量分析により、受容体化学量論を一意に決定することができる。しかしながら、使用する質量電荷比（ｍ／ｚ）スケールでの電荷状態の重複による問題があり、例えば、２０電荷を有する解析物（ＭＷ２０，０００Ｄａ）から、１６電荷を有する解析物（ＭＷ３２，０００）と同じｍ／ｚ値２０００が得られる。それゆえ「ドリフト時間」及び質量電荷比の両方の測定により追加で分離度が得られるイオンモビリティ質量分析が、これらの実験のために必要とされる。解析物のドリフト時間は、その質量、電荷、及びコンフォメーションに依存し、分析計内のガス充填モビリティセルを通過するために各解析物が要する時間の長さとして測定される。得られるｍ／ｚ対ドリフト時間の二次元プロットにより、受容体化学量論の明確な割当てが可能になる。
【０１７７】
対照実験において、加えたモル過剰のＴＮＦＲがＴＮＦαの濃度の３倍より大きいとき、ＴＮＦαトリマーあたり３個の受容体の結合が観察された。小分子ＴＮＦα阻害剤、例えば、化合物（３）の存在下で、受容体の化学量論は減少し、ＴＮＦαトリマーあたりの２個の受容体結合が優勢となった（図１１を参照されたい）。
【０１７８】
（例６）  −  ＴＮＦαへのＴＮＦＲ１親和性に対する化合物（３）の効果を測定する質量分析解析
化合物ストック：
２μｌの１０ｍＭ  ＤＭＳＯストック、プラス２μｌのＤＭＳＯを、９６μｌの２０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファーに加え、１００μｌの２００μＭ化合物（３）、４％ＤＭＳＯを得た。
【０１７９】
タンパク質ストック：
ＴＮＦは、２×Ｚｅｂａカラムを使用して脱塩し、続いて２０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ７．４内へ透析した。ＴＮＦＲは、２×ｚｅｂａカラムを使用して脱塩し、続いて２０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ７．４内へ透析した。Ａ２８０測定を行い、タンパク質試料の最終濃度を確認した。
【０１８０】
化合物をＴＮＦ（４０μＭ）へ１：１（ｖ：ｖ）で加え、室温で一晩インキュベートした（最終ＤＭＳＯ濃度＝２％）。
【０１８１】
ＤＭＳＯのみの対照試料も調製した。
【０１８２】
各試料について、５μＬのＴＮＦプラス化合物又はＴＮＦプラスＤＭＳＯのみを、それぞれの指定された濃度で、５μＬのＴＮＦＲに加えた。最終［ＴＮＦ］は５μＭであった。
【０１８３】
試料を、解析前にＴＮＦＲと２時間インキュベートした。
【０１８４】
化合物（３）の存在下で、５０００ｎＭのｈＴＮＦα及び５０００ｎＭのｈＴＮＦαを含有する溶液を、１０００、２０００、４０００、６０００、８０００、１００００及び２３０００ｎＭの濃度範囲で、ｈＴＮＦＲ１（残基４１〜１８４を含む細胞外ドメイン）で滴定した。
【０１８５】
イオンモビリティ質量スペクトル解析を、Ａｄｖｉｏｎ  Ｎａｎｏｍａｔｅ−Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２機器で実施した。以下の機器パラメータを利用した。
コーン＝５０Ｖ
イオン源温度＝２０℃
トラップ／移動衝突エネルギー＝オフ
トラップガスフロー＝０．４ｍＬ／分
ヘリウムセル＝１８０ｍＬ／分
ＩＭＳ（Ｎ２）＝９０ｍＬ／分
トラップＤＣバイアス＝４０Ｖ
モビリティトラッピング手動解除−利用不可
ＩＭＳ波遅延＝４５０ｕｓ
ＩＭＳ波速度＝７５０ｍ／ｓ
ＩＭＳ波高  ４０Ｖ
バッキング＝６．２１ｍｂａｒ
トラップ  ２．０５ｅ−２ｍｂａｒ
ＩＭＳ  ３．４７ｍｂａｒ
ＴＯＦ  １．２ｅ−６ｍｂａｒ
Ｑｕａｄプロファイル：
４０００、５０００、６０００（ドウェル３０、ランプ（ｒａｍｐ）３０）
範囲  ５００〜８０００
【０１８６】
データは、ｄｒｉｆｔｓｃｏｐｅソフトウェアにおいてそれぞれの種の質量スペクトルを抽出することにより解析した。得られたスペクトルをスムージング（５０／５）し、全ての電荷状態にわたるピーク高さを合計した。
【０１８７】
ＴＮＦ種（受容体結合なし）、ＴＮＦ＋１Ｒ種（１個の受容体が結合）、ＴＮＦ＋２Ｒ種（２個の受容体が結合）及びＴＮＦ＋３Ｒ種（３個の受容体が結合）に相当するピークのイオンカウントを測定した。正規化イオンカウントは、カウントしたイオンの合計数で割算したそれぞれの種のイオンの分率として計算した。これらの値を、平衡状態におけるそれぞれの種のモル分率と等価として使用した。２つの実験からのデータを下記表にまとめる。
【表３】
2019218382.tif 000008
【表４】
2019218382.tif 000009
【０１８８】
これらのデータから平衡定数を誘導するために、平衡状態の系をトランスフォーメーションによって表した：
【数１】
2019218382.tif 000010
【０１８９】
ネイティブ質量分析データに最も良く一致する解離定数のセットＫ１、Ｋ２及びＫ３を計算するために、ＴＮＦ、ＴＮＦ＋１Ｒ、ＴＮＦ＋２Ｒ及びＴＮＦ＋３Ｒ種についてこれらの種の測定されたモル分率に最も近いモル分率を生ずるＫ１、Ｋ２、Ｋ３の値を、関数の最小化によって得た：
【数２】
2019218382.tif 000011
ここでＴ０は、ＴＮＦの初期量を表し、Ｒｍｉｎ、Ｒ、Ｒｍａｘは、Ｒｍｉｎから開始してＲｍａｘで終了する、アッセイされる受容体Ｒの初期濃度を表す。分率ｆｏｂｓは、ネイティブ質量分析測定により平衡で観察されるＴＮＦ、ＴＮＦ＋１Ｒ、ＴＮＦ＋２Ｒ及びＴＮＦ＋３Ｒ種のモル分率（例えば、ｆＴＮＦｏｂｓ）である。ｆｃａｌｃは、ＢｉｏＮｅｔＧｅｎ  ＢＮＧＬモデリングツール（Blinov, M. L., Faeder, J. R., Goldstein, B., and Hlavacek, W. S. (2004) BioNetGen: software for rule-based modeling of signal transduction based on the interactions of molecular domains. Bioinformatics 20, 3289-3291）を使用し、Ｔ０、Ｒ０並びにＫ１、Ｋ２及びＫ３の値を入力して、平衡方程式を解くことにより計算されるそれぞれの種についてのモル分率（例えば、ｆＴＮＦｃａｌｃ）である。誤差関数は、ＳｃｉＰｙ／ＮｕｍＰｙフレームワーク（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｃｓ．ｓｃｉｐｙ．ｏｒｇ／ｄｏｃ／ｎｕｍｐｙ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に実装されたｂｒｕｔｅ  ｆｏｒｃｅ最小化ユーティリティを使用して最小化した。全データ処理解析は、必要なときにＢｉｏＮｅｔＧｅｎルーチンを呼び出すＰｙｔｈｏｎプログラミング言語（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｙｔｈｏｎ．ｏｒｇ／）で実施した。
【０１９０】
データ解析後、３個の受容体結合事象に対応する３つの平衡定数（Ｋ１、Ｋ２及びＫ３）を、化合物（３）あり及びなしで、ＴＮＦと受容体との混合物について計算した。データは、平衡状態における全ての種のモル分率を「Ｙ」軸にプロットし、ＴＮＦの固定した初期濃度に加えた受容体の濃度を「Ｘ」軸にプロットすることにより視覚化した。記号は、ネイティブ質量分析実験で測定された種の観察されたモル分率を表し、トレースは、平衡定数Ｋ１、Ｋ２及びＫ３から計算された予測濃度に相当する。これらのグラフを図１２及び１３に示す。
【表５】
2019218382.tif 000012
【０１９１】
（例７）  −  Ｍａら（２０１４）及びＳｉｌｖｉａｎら（２０１１）の化合物及び複合体は、本発明の化合物及び複合体と異なる特徴を有する
Ma et al. (2014) JBC 289:12457-12466, C87の１２４５８頁に記載されているように、Ｃ８７は、ＴＮＦβの外部表面との相互作用において、ＴＮＦＲ１のループ２／ドメイン２由来の７アミノ酸ペプチドによって占められる空間に適応する分子を見つけることを試みるバーチャルスクリーニングを通じて発見された。ＭａらからのＣ８７化合物、及びSilvian et al. (2011) ACS Chemical Biology 6:636-647からのＢＩＯ８８９８化合物を、本発明者によって試験した。
【０１９２】
知見の要約
Ｍａらで記載されたＣ８７についてのＢｉａｃｏｒｅ観察結果は再現することができなかった。
細胞におけるＴＮＦ特異的阻害の証拠は観察されなかった。
さらにＣ８７は、ミリモルの親和性に感受性である質量分析で結合が観察されなかった。
広範な結晶学的試みで、アポ−ＴＮＦ（化合物なしのＴＮＦ）のみが製造された。
蛍光偏光（ＦＰ）アッセイにおいて、Ｃ８７は、蛍光読出しを有する化合物の干渉レベルを超える有意な阻害を示さなかった。
ＴＮＦαの熱融解温度の安定化を測定するＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒで、Ｃ８７についての小さな安定化が示された。
要約すると、トリマーの中心にＣ８７が結合している証拠は見つからなかった。圧倒的多数のデータが、ＴＮＦαとの直接的相互作用がないことを示唆した。ＢＩＯ８８９８もＴＮＦαに結合しないことが分かった。
【０１９３】
細胞−ＴＮＦ誘導性ＨＥＫ  ＮＦＫＢレポーター遺伝子アッセイ
Ｃ８７を、ＴＮＦαと１時間プレインキュベートしてから、ＮＦκＢの制御下にＳＥＡＰで安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞に加えた。適切なカウンタースクリーンも、非ＴＮＦ関連（オフターゲット）活性を検出するために試験した。アッセイを一晩インキュベートした後、阻害を、対照化合物による１００％ブロッキングと比較して測定した。最大Ｃ８７濃度は１０，０００ｎＭであり、３倍段階希釈した。
【０１９４】
阻害効果は検出されず、オフターゲット活性に帰属させることはできなかった。
【０１９５】
Ｂｉａｃｏｒｅ
ａｖｉ−タグリンカーを使用してＴＮＦを固定化し、Ｃ８７にチップを通過させた。一実験では、最高濃度の１０μＭからＣ８７の用量応答を行った。結合は何ら観察されなかった。
【０１９６】
第２の実験では、チップを通過するＣ８７の流量は減少した。小さなシフトが観察されたが、全体的な結合は無視できる程度であった。
【０１９７】
Ｍａらに記載のＴＮＦへのＣ８７の結合は、Ｙ軸上のＲＵ値に基づいた超化学量論である可能性が高かった。チップ上の標準ＴＮＦ密度で、この値は、単純な１：１結合について、予測されるよりも３０倍高い領域にあった。
【０１９８】
別の実験では、ＢＩＯ８８９８を、Ｂｉａｃｏｒｅ４０００機器のＳＰＲにより、ＣＤ４０Ｌの固定化可溶性形態及びＴＮＦαの可溶性形態に対して試験した。１７μＭの幾何平均ＩＣ５０がＣＤ４０Ｌに対する結合について決定され、一方で、このアッセイにおいて、ＴＮＦαに対する結合は１００μＭまでの濃度で検出されなかった。
【０１９９】
質量分析
４００μＭの濃度でＣ８７のヒトＴＮＦα（２０μＭ）への結合の証拠はなかった。より低い分子量（約４７３Ｄａ）種が、５％未満の占有率で結合しているようである。Ｃ８７は、５０３Ｄａの分子量を有する。４００μＭの濃度での占有率に基づいて、低分子量種の１ｍＭを超える親和性が予測される。
【０２００】
結晶学
全体的に、ＴＮＦαとのＣ８７の結晶化について、本出願に記載の化合物における通常的手段の試験条件を含め、多大な努力が注がれた。これには、様々リガンド濃度、様々なタンパク質濃度、及び様々な浸漬時間での多数の結晶化の試みの設定が含まれる。いくつかの結晶が観察され、解析によって、塩、つまり化合物を有しないＴＮＦであることが分かった。
【０２０１】
蛍光偏光（ＦＰ）
Ｃ８７を、蛍光化合物（プローブ）に対するアッセイの前に１時間、ＴＮＦαと共にプレインキュベートした。蛍光化合物との直接的（同じ部位で結合する）又は間接的（ＴＮＦを妨害する）のいずれかの競合が、ＦＰの減少により検出される。
【０２０２】
阻害曲線の外挿により、約１００μＭのＩＣ５０が得られた。しかしながら、最高濃度の阻害剤で蛍光消光が観察され、差し引くと、このアッセイでＣ８７の阻害は無視できる程度となった。
【０２０３】
Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ
Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒは、タンパク質を安定化又は妨害のいずれかをする化合物によるＴＮＦαの融解温度（Ｔｍ）の変化を測定する。３．８℃での安定化効果が５００μＭの濃度のＣ８７で観察されることから、非特異的でありうる弱い結合の可能性が示唆される。
【０２０４】
Sequence listing 
SEQ ID NO: 1
DKPVAHVVANHQVEEQLEWLSQRANALLANGMDLKDNQLVVPADGLYLVYSQVLFKGQGCPDYVLLTHTVSRFAISYQEKVNLLSAVKSPCPKDTPEGAELKPWYEPIYLGGVFQLEKGDQLSAEVNLPKYLDFAESGQVYFGVIAL
SEQ ID NO: 2  
GSVCPQGKYIHPQDNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRHCLSCSKCRKEMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLFQCFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCTCHAGFFLRENECVSSSN
SEQ ID NO: 3 (HCVR of 1974)
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SEQ ID NO: 4 (LCVR of 1974)
DIQMTQSPASLPASPEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSASRSGTQYSLKISRLQVEDFGIFYCLQGQSTPYTFGAGTKLELK
SEQ ID NO: 5 (1974 HC mIgG1 full)
DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSAYYMAWVRQAPTKGLEWVASINYDGANTFYRDSVKGRFTVSRDNARSSLYLQMDSLRSEDTATYYCTTEAYGYNSNWFGYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO: 6 (1974 LC kappa full)
DIQMTQSPASLPASPEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPQLLIYGATSLADGVPSRFSASRSGTQYSLKISRLQVEDFGIFYCLQGQSTPYTFGAGTKLELKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO: 7 (HCVR of 1979)
EVHLVESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITNSYWDWIRKFPGNKMEWMGYINYSGSTGYNPSLKSRISISRDTSNNQFFLQLNSITTEDTATYYCARGTYGYNAYHFDYWGRGVMVTVSS 
SEQ ID NO: 8 (LCVR of 1979)
DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPHLLIYGTTSLADGVPSRFSGSRSGTQYSLKISGLQVADIGIYVCLQAYSTPFTFGSGTKLEIK 
SEQ ID NO: 9 (1979 HC mIgG1 full)
EVHLVESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITNSYWDWIRKFPGNKMEWMGYINYSGSTGYNPSLKSRISISRDTSNNQFFLQLNSITTEDTATYYCARGTYGYNAYHFDYWGRGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
SEQ ID NO: 10 (1979 LC Kappa full)
DIQMTQSPASLSASLEEIVTITCQASQDIGNWLSWYQQKPGKSPHLLIYGTTSLADGVPSRFSGSRSGTQYSLKISGLQVADIGIYVCLQAYSTPFTFGSGTKLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
【図１】
2019218382.tif 000015
【図２】
2019218382.tif 000016
【図３】
2019218382.tif 000017
【図４Ａ】
2019218382.tif 000018
【図４Ｂ】
2019218382.tif 000019
【図４Ｃ】
2019218382.tif 000020
【図４Ｄ】
2019218382.tif 000021
【図４Ｅ】
2019218382.tif 000022
【図５−１】
2019218382.tif 000023
【図５−２】
2019218382.tif 000024
【図６】
2019218382.tif 000025
【図７】
2019218382.tif 000026
【図８−１】
2019218382.tif 000027
【図８−２】
2019218382.tif 000028
【図９】
2019218382.tif 000029
【図１０】
2019218382.tif 000030
【図１１−１】
2019218382.tif 000031
【図１１−２】
2019218382.tif 000032
【図１２】
2019218382.tif 000033
【図１３】
2019218382.tif 000034
【配列表】
2019218382000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月30日(2019.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（５）の化合物、又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【化１】
2019218382.tif 000035
【請求項２】
ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるトリマータンパク質と、請求項１に記載の化合物とを含む複合体。
【請求項３】
ヒト又は動物の身体の治療のための、請求項１に記載の化合物又は請求項２に記載の複合体を含む剤。
【請求項４】
化合物が受容体を介してトリマーによって誘導されるシグナル伝達に拮抗する、自己免疫障害及び炎症障害；神経障害及び神経変性障害；疼痛障害及び侵害障害；並びに心血管障害の処置及び／又は防止における使用のための、任意に関節リウマチ、クローン病、乾癬、全身性エリテマトーデス、アルツハイマー病、パーキンソン病及びてんかんの処置及び／又は防止における使用のための、請求項３に記載の剤。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物、又は請求項２に記載の複合体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【外国語明細書】
2019218382000001.pdf