(57)【要約】【課題】候補化合物による皮膚及び毛髪における色素の蓄積の制御を評価可能なスクリーニング方法及びキットを提供する。【解決手段】色素の蓄積を制御する候補化合物をスクリーニングする方法は、細胞培養容器に、間葉系細胞及び上皮系細胞を同時に播種し共培養することで、毛包原基を形成させる形成工程と、前記毛包原基を培養し、色素を蓄積させる蓄積工程と、前記蓄積工程の間、又は、前記蓄積工程の後に、前記毛包原基と候補化合物とを接触させる接触工程と、前記候補化合物との接触有無による前記毛包原基の色素の蓄積度を比較する比較工程と、を備える方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
色素の蓄積を制御する候補化合物をスクリーニングする方法であって、
細胞培養容器に、間葉系細胞及び上皮系細胞を同時に播種し共培養することで、毛包原基を形成させる形成工程と、
前記毛包原基を培養し、色素を蓄積させる蓄積工程と、
前記蓄積工程の間、又は、前記蓄積工程の後に、前記毛包原基と候補化合物とを接触させる接触工程と、
前記候補化合物との接触有無による前記毛包原基の色素の蓄積度を比較する比較工程と、を備えるスクリーニング方法。
【請求項２】
前記細胞培養容器が酸素透過性を有する材質からなる請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記形成工程において、前記細胞培養容器に播種される前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞の合計細胞数が１．０×１０３ｃｅｌｌｓ以上８．０×１０３ｃｅｌｌｓ以下である請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記形成工程及び前記蓄積工程における合計培養期間が６日以上である請求項１〜３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記形成工程及び前記蓄積工程における合計培養期間が６日以上２１日以下である請求項１〜４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
色素の蓄積を制御する候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、
間葉系細胞及び上皮系細胞を含み、前記間葉系細胞において色素が蓄積している毛包原基を備えるキット。
【請求項７】
更に、酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器を備える請求項６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、色素の蓄積を制御する候補化合物をスクリーニングする方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、色素の蓄積を制御する候補化合物をスクリーニングする方法としては、メラノサイト又はメラノーマ細胞を二次元的に培養したものや、セルインサートでケラチノサイトを共培養したものを用いて、候補物質を添加してメラニン産生量の変化やメラニン産生及び色素の蓄積に関連する遺伝子の発現量の変化を測定する方法が一般的であった（例えば、特許文献１及び２参照）。
【０００３】
一方、本発明者らはこれまで、再生毛包原基の集合体の製造方法を開発してきた（例えば、特許文献３参照）。具体的には、規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を供給しながら共培養することで、毛包原基を形成させる工程を備える方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−２１５２８６号公報
【特許文献２】特開２０１５−２２３１３４号公報
【特許文献３】国際公開第２０１７／０７３６２５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１及び２に記載のスクリーニング方法では、皮膚を構成する最小限の細胞を用いており、生体内での色素の蓄積の機構を反映していなかった。また、候補化合物による毛髪における色素の蓄積の制御を評価する手法は未だ開発されていなかった。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、候補化合物による皮膚及び毛髪における色素の蓄積の制御を評価可能なスクリーニング方法及びキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係るスクリーニング方法は、色素の蓄積を制御する候補化合物をスクリーニングする方法であって、細胞培養容器に、間葉系細胞及び上皮系細胞を同時に播種し共培養することで、毛包原基を形成させる形成工程と、前記毛包原基を培養し、色素を蓄積させる蓄積工程と、前記蓄積工程の間、又は、前記蓄積工程の後に、前記毛包原基と候補化合物とを接触させる接触工程と、前記候補化合物との接触有無による前記毛包原基の色素の蓄積度を比較する比較工程と、を備える方法である。
【０００８】
上記第１態様に係るスクリーニング方法において、前記細胞培養容器が酸素透過性を有する材質からなってもよい。
【０００９】
前記形成工程において、前記細胞培養容器に播種される前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞の合計細胞数が１．０×１０３ｃｅｌｌｓ以上８．０×１０３ｃｅｌｌｓ以下であってもよい。
【００１０】
前記形成工程及び前記蓄積工程における合計培養期間が６日以上であってもよい。
【００１１】
前記形成工程及び前記蓄積工程における合計培養期間が６日以上２１日以下であってもよい。
【００１２】
本発明の第２態様に係るキットは、色素の蓄積を制御する候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、間葉系細胞及び上皮系細胞を含み、前記間葉系細胞において色素が蓄積している毛包原基を備える。
【００１３】
上記第２態様に係るキットは、更に、酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器を備えてもよい。
【発明の効果】
【００１４】
上記態様のスクリーニング方法及びキットによれば、候補化合物による皮膚及び毛髪における色素の蓄積の制御を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１における培養１７日目の各毛包原基の様子を示す画像である。
【図２】実施例２における培養６日目の各毛包原基の様子を示す画像である。右側の画像は、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種して共培養することで得られる毛包原基である。左側の画像は、間葉系細胞のみを播種して培養することで得られるスフェロイドである。各スケールバーは１０００μｍを示す。
【図３】実施例３におけるデキサメタゾン存在下又は非存在下で５日間培養した毛包原基及び間葉系細胞のみからなるスフェロイドでのメラニン産生量を比較したグラフである。
【図４Ａ】実施例４における毛包原基の培養に用いられたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）スフェロイドチップを撮影した画像である。
【図４Ｂ】実施例４における培養１７日目の毛包原基の様子を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜色素の蓄積を制御する候補化合物をスクリーニングする方法＞
本実施形態のスクリーニング方法は、色素の蓄積を制御する候補化合物をスクリーニングする方法である。本実施形態のスクリーニング方法は、形成工程と、蓄積工程と、接触工程と、比較工程とを備える方法である。
【００１７】
前記形成工程では、細胞培養容器に、間葉系細胞及び上皮系細胞を同時に播種し共培養することで、毛包原基を形成させる。
前記蓄積工程では、前記毛包原基を培養して、色素を蓄積させる。
前記接触工程では、前記蓄積工程の間、又は、前記蓄積工程の後に、前記毛包原基と候補化合物とを接触させる。
前記比較工程では、前記候補化合物との接触有無による前記毛包原基の色素の蓄積度を比較する。
【００１８】
本実施形態のスクリーニング方法は、間葉系細胞及び上皮系細胞を含み、間葉系細胞において色素が蓄積している毛包原基を用いることで、従来のスクリーニング方法よりも生体に近い条件下で、候補化合物による皮膚及び毛髪における色素の蓄積の制御を評価することができる。また、本実施形態のスクリーニング方法で用いられる毛包原基は色素の蓄積に加えて、発毛活性を有するため、白髪抑制剤となり得る候補化合物のスクリーニングを特に好適に行うことができる。
【００１９】
なお、本明細書において、「間葉系細胞」とは、間葉組織由来の細胞又はその細胞を培養して得られる細胞を意味する。間葉系細胞としては、例えば、毛乳頭細胞、真皮毛根鞘細胞、発生期の皮膚間葉系細胞、万能細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞等）から誘導された毛包間葉系細胞等が挙げられる。
【００２０】
本明細書において、「上皮系細胞」とは、上皮組織由来の細胞及びその細胞を培養して得られる細胞を意味する。上皮系細胞としては、例えば、バルジ領域の外毛根鞘最外層細胞、毛母基部の上皮系細胞、万能細胞万能細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞等）から誘導された毛包上皮系細胞等が挙げられる。
【００２１】
これら細胞の由来としては、動物であり、脊椎動物が好ましく、哺乳動物がより好ましい。
哺乳動物としては、例えば、ヒト、チンパンジー及びその他の霊長類；イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ラット（ヌードラットも包含する）、マウス（ヌードマウス及びスキッドマウスも包含する）、モルモット等の家畜動物、愛玩動物及び実験用動物等が挙げられ、これらに限定されない。
中でも、細胞の由来としては、ヒトであることが特に好ましい。
【００２２】
本明細書において、「毛包原基」とは、毛包のもととなる組織を意味し、主に、上述の間葉系細胞及び上述の上皮系細胞から構成されている。毛包原基が形成される流れとしては、まず、上皮系細胞が肥厚し、間葉系細胞側に陥入することで、間葉系細胞の細胞集塊（スフェロイド）を包み込む。次いで、間葉系細胞のスフェロイドを包み込んだ上皮性細胞は毛母原基を形成し、間葉系細胞のスフェロイドは毛誘導能を持つ毛乳頭を形成することで、毛母原基及び毛乳頭等からなる毛包原基を形成する。この毛包原基では、毛乳頭が毛母原基に増殖因子を提供しており、毛母原基の分化を誘導し、分化した細胞は毛を形成することができる。また、形成された毛包原基は、経時的に色素を蓄積する。
【００２３】
本明細書において、「毛包」とは、表皮が内側に筒状に入り込んだ部分であって、毛を産生する皮膚の付属器官を意味する。
【００２４】
本明細書において、「色素の蓄積」とは、メラニンが過剰に蓄積して細胞（主に、間葉系細胞）が着色される状態を意味する。
【００２５】
本実施形態のスクリーニング方法の各工程について、以下に詳細を説明する。
【００２６】
［形成工程］
形成工程では、細胞培養容器に、間葉系細胞及び上皮系細胞を同時に播種し共培養することで、前記間葉系細胞において色素が蓄積している毛包原基を形成させる。具体的には、まず、間葉系細胞及び上皮系細胞を含む細胞混合懸濁液を調製する。このとき、間葉系細胞及び上皮系細胞の混合比は、間葉系細胞：上皮系細胞＝１：２〜２：１であることが好ましく、１：１．５〜１．５：１であることがより好ましく、１：１であることがさらに好ましい。
【００２７】
次いで、調製した細胞混合懸濁液を細胞培養容器に注入する。播種する細胞数は細胞培養容器の大きさに応じて適宜調整することができる。例えば、細胞培養容器の容量が０．０５ｍＬ以上０．６ｍＬ以下程度（好ましくは、０．１ｍＬ以上０．３ｍＬ以下）である場合、細胞培養容器に播種される間葉系細胞及び上皮系細胞の合計細胞数が１．０×１０３ｃｅｌｌｓ以上８．０×１０３ｃｅｌｌｓ以下であることが好ましく、４．０×１０３ｃｅｌｌｓ以上８．０×１０３ｃｅｌｌｓ以下であることがより好ましい。
【００２８】
合計細胞数を上記下限値以上とすることで、毛包原基の形成効率がより優れ、一方、上記上限値以下とすることで、続く蓄積工程において、色素の蓄積がより促進された毛包原基が得られる。
【００２９】
次いで、間葉系細胞及び上皮系細胞を共培養する。培養期間は、１日以上６日以下が好ましく、３日程度がより好ましい。これは、培養開始から１日目から３日目までにおいて、間葉系細胞及び上皮系細胞から毛包原基が形成されるためである。
【００３０】
培養温度は２５℃以上４０℃未満（好ましくは、３７℃）とすることができる。
【００３１】
また、形成工程において、酸素を供給しながら共培養することが好ましい。酸素を供給しながら共培養する方法としては、細胞培養容器に酸素を直接吹きかける等して酸素を供給しながら培養する方法や、酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器を用いて培養する方法等が挙げられる。中でも、全面から酸素を供給でき、得られた毛包原基がより優れた毛髪再生効率を達成できることから、酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器を用いて培養する方法が好ましい。
【００３２】
形成工程において、毛包原基が形成される流れとしては、まず、上皮系細胞が肥厚し、間葉系細胞側に陥入することで、間葉系細胞のスフェロイドを包み込む。続いて、間葉系細胞のスフェロイドを包み込んだ上皮性細胞は毛母原基を形成し、間葉系細胞のスフェロイドは毛誘導能を持つ毛乳頭を形成する。これにより、細胞培養容器のウェル内に毛母原基及び毛乳頭等からなる毛包原基が形成される。さらに、培養を継続することで、毛包原基に含まれる間葉系細胞に色素が沈着される。また、得られた毛包原基では、毛乳頭が毛母原基に増殖因子を提供しており、毛母原基の分化を誘導し、分化した細胞は毛を形成することができる。さらに、形成工程において、毛包原基が分化し、毛包を形成していてもよい。
【００３３】
（細胞培養容器）
細胞培養容器は、観察のしやすさ、スクリーニング効率から、複数のウェルが規則的に１つの基板に配置されているものが好ましい。本明細書においては、基板に配置された個々のウェルを細胞培養容器と想定する。このようなものとしては、市販のものを用いてもよいし、特許文献３（国際公開第２０１７／０７３６２５号）に記載の方法等で作製してもよい。
【００３４】
また、基板におけるウェルの密度は、例えば２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下とすることができ、例えば５０個／ｃｍ２以上２５０個／ｃｍ２以下とすることができ、例えば１００個／ｃｍ２以上２００個／ｃｍ２以下とすることができる。密度が上記範囲であることにより、哺乳動物の毛穴（特に、ヒトを含む霊長類の毛穴）の密度と同程度の密度で毛包原基が配置された状態で培養することができる。
【００３５】
また、ウェルの開口形状について、特別な限定はない。例えば、円形状、四角状、六角状、ライン状等であってもよく、中でも、毛穴に近い形状であるという観点から、円形状であることが好ましい。
【００３６】
ウェルの開口部の直径及び深さについて、間葉系細胞及び上皮系細胞を含む混合細胞集塊（以下、「混合スフェロイド」とも呼ぶ。）を収容し培養できる大きさであれば特別な限定はないが、直径については、哺乳動物の毛穴と同程度の大きさとすることができ、例えば、２０μｍ以上１ｍｍ以下とすることができる。また、深さについては、例えば１ｍｍ以下とすることができる。
【００３７】
得られる毛包原基の配置及び大きさは、ウェルの開口形状、直径及び深さ等に依存する。そのため、ウェルの開口形状、直径及び深さを適宜調製することができる。
【００３８】
細胞培養容器の材質は、細胞培養に適したものとすることができ、特別な限定はない。例えば、透明なガラス、ポリマー材等が挙げられる。中でも、酸素透過性を有するポリマー材が好ましい。酸素透過性を有するポリマー材として具体的には、例えば、フッ素樹脂、シリコンゴム（例えば、ポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）：ＰＤＭＳ）等）等が挙げられる。これらの材質を単独で使用してもよいし、組み合わせて使用してもよい。
【００３９】
本明細書において、「酸素透過性」とは、分子状の酸素を透過し、細胞培養容器のウェル内まで到達させる性質を表している。具体的な酸素透過率としては、約１００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以上５０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以下であってよく、約１１００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以上３０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以下であってよく、約１２５０ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以上２７５０ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以下であってよい。なお、「２４ｈ」は２４時間を意味し、「ａｔｍ」とは、気圧をの単位を意味する。すなわち、上記単位「ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ」は、１気圧の環境下において、２４時間で透過する酸素の１ｍ２あたりの容量（ｃｍ３）を表している。酸素透過率が上記範囲である材質からなる細胞培養容器を使用することにより、十分な量の酸素を混合スフェロイドに供給でき、毛包原基を形成することができる。
【００４０】
また、市販のものとしては、例えば、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標） ９６Ｕプレート等が挙げられる。
【００４１】
（培地）
形成工程で用いられる培地としては、特別な限定はなく、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地とすることができる。
【００４２】
培地に含まれる無機塩は、細胞の浸透圧平衡の維持を助けるために、及び、膜電位の調節を助けるためのものである。
無機塩としては、特別な限定はなく、例えば、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛等の塩が挙げられる。塩は、通常、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、及び、重炭酸塩の形で用いられる。
一般的に、培地中の無機塩の重量オスモル濃度は、例えば２００ｍＯｓｍ／ｋｇ以上４００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下とすることができ、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下とすることができ、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下とすることができ、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３００ｍＯｓｍ／ｋｇ未満とすることができ、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇとすることができる。
【００４３】
炭水化物としては、特別な限定はなく、例えば、グルコース、ガラクトース、マルトース、フルクトース等が挙げられる。
一般的に、培地中の炭水化物（好ましくは、Ｄ−グルコース）の濃度としては、０．５ｇ／Ｌ以上２ｇ／Ｌ以下であることが好ましい。
【００４４】
アミノ酸としては、特別な限定はなく、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、及び、それらの組み合わせ等が挙げられる。
一般的に、培地に含まれるグルタミンの濃度は０．０５ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下（通常、０．１ｇ／Ｌ以上０．７５ｇ／Ｌ以下) とすることができる。培地に含まれるグルタミン以外の各アミノ酸は、０．００１ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下(通常、０．０１ｇ／Ｌ以上０．１５ｇ／Ｌ以下) とすることができる。アミノ酸は合成由来でもよい。
【００４５】
ビタミンとしては、特別な限定はなく、例えば、チアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ナイアシンアミド（ビタミンＢ３）、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム（ビタミンＢ５）、ピリドキサール／ピリドキサミン／ピリドキシン（ビタミンＢ６）、葉酸（ビタミンＢ９）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、カルシフェロール（ビタミンＤ２）、ＤＬ−αトコフェロール（ビタミンＥ）、ビオチン（ビタミンＨ）、メナジオン（ビタミンＫ）、塩化コリン、ｍｙｏ−イノシトール等が挙げられる。
【００４６】
培地は、さらに抗生物質、血清、成長因子、又は、ホルモンを含んでいてもよい。
【００４７】
抗生物質としては、例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシン、アンピシリン、ミノマイシン、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタシン、タイロシン、オーレオマイシン等、通常の動物細胞の培養に用いられるものが挙げられる。これらの抗生物質を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
一般的に、培地に含まれる抗生物質の濃度は、特別な限定はなく、例えば０．１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下とすることができる。
【００４８】
血清としては、例えば、ＦＢＳ／ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ／Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ＮＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）、ＣＳ（Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ＨＳ（Ｈｏｒｓｅ  Ｓｅｒｕｍ）等が挙げられ、これらに限定されない。
一般的に、培地に含まれる血清の濃度は、例えば２質量％以上１０質量％以下とすることができる。
【００４９】
成長因子としては、例えば、細胞増殖因子、細胞接着因子等が挙げられ、これらに限定されない。
成長因子としてより具体的には、例えば、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、酸性繊維芽細胞成長因子（ａｃｉｄｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ａＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ―ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１：ＩＧＦ−１）、マクロファージ由来成長因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＭＤＧＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（Ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＡＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）等が挙げられる。これらの成長因子を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
一般的に、培地に含まれる成長因子の濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下とすることができる。
【００５０】
ホルモンとしては、例えば、インスリン、グルカゴン、トリヨードチロニン、副腎皮質ホルモン（ハイドロコーチゾン等）等が挙げられる。これらのホルモンを単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
一般的に、培地に含まれるホルモンの濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下とすることができる。
【００５１】
また、成長因子及びホルモンを含む培地添加剤として、ウシ脳下垂体抽出物（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ：ＢＰＥ）を用いてもよい。
【００５２】
中でも、形成工程で用いられる培地としては、間葉系細胞増殖用培地及び上皮系細胞増殖用培地を混合したものが好ましい。
【００５３】
間葉系細胞増殖用培地及び上皮系細胞増殖用培地の混合比としては、容量比で、間葉系細胞増殖用培地：上皮系細胞増殖用培地＝１：１であることが好ましい。
【００５４】
間葉系細胞増殖用培地としては、任意の抗生物質及び任意の血清、並びに、必要に応じて、任意の成長因子及び任意のホルモンを添加した公知の基本培地を用いることができる。
前記公知の基本培地としてより具体的には、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、ＤＭＥＭ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ等が挙げられる。
また、任意の抗生物質、任意の血清、任意の成長因子、及び、任意のホルモンを含む間葉系細胞増殖用培地としては、例えば、毛乳頭細胞増殖培地（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＰＣＧＭ）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）等が挙げられる。
【００５５】
上皮系細胞増殖用培地としては、塩化カルシウムを含み、無血清であって、上皮成長因子、並びに、必要に応じて任意の抗生物質及び任意のホルモンを添加した公知の上皮系細胞用基本培地を用いることができる。
前記公知の皮系細胞用基本培地としてより具体的には、例えば、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２（クラボウ社製）、角化細胞基本培地２（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）、ＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）等が挙げられる。
また、上皮成長因子、任意の抗生物質、及び、任意のホルモンを含む上皮系細胞増殖用培地としては、例えば、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ社製）、角化細胞増殖培地２（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）等が挙げられる。
【００５６】
［蓄積工程］
次いで、形成された毛包原基をさらに培養し、色素を蓄積させる。
形成工程及び蓄積工程における合計培養期間は、６日以上が好ましく、６日以上２１日以下がより好ましい。これは、以下の流れで毛包原基が形成され、色素が蓄積するためである。すなわち、間葉系細胞及び上皮系細胞を同時に播種して培養を開始してから１日目から３日目までにおいて、間葉系細胞及び上皮系細胞から毛包原基が形成される。次いで、培養開始から４日目から５日目までにおいて、色素の蓄積が開始される。さらに、培養開始から６日目以降において、毛包原基において蓄積された色素を視認しやすくなる。一方、合計培養期間が上記上限値以下であることで、色素の蓄積度（特に、毛包原基における黒色部の割合及び黒色の濃さ）がプラトンに達する前であり、続く接触工程において、候補化合物による影響を観察しやすくなる。
【００５７】
毛包原基の培養条件、培養容器及び培地は、上記形成工程において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００５８】
［接触工程］
次いで、前記蓄積工程の間、又は、蓄積工程後に、毛包原基と、候補化合物とを接触させる。
【００５９】
なお、本明細書において、「候補化合物」としては、本実施形態のスクリーニング方法で使用可能な任意の物質を意味する。候補化合物としては、例えば、有機又は無機の低分子化合物、タンパク質、ペプチド、核酸、糖類、脂質、植物抽出物、ポリマー等が挙げられ、これらに限定されない。
【００６０】
接触時間については、特別な限定はなく、適宜選択すればよい。前記蓄積工程の間に候補化合物を接触させる場合は、蓄積工程の開始から蓄積工程の終了まで接触させてもよく、蓄積工程の途中の一定の期間に接触させてもよい。また、前記蓄積工程の後に候補化合物を接触させる場合は、接触時間は、例えば１０時間以上３０日以下とすることができる。
【００６１】
接触条件としては、特別な限定はなく、毛包原基中の各細胞が生存可能な条件であればよい。具体的には、例えば、２５℃以上４０℃未満（好ましくは、３７℃）の温度で、５％ＣＯ２環境下等が挙げられる。
【００６２】
接触方法としては、例えば、毛包原基を培養している培養液に直接候補化合物を滴下して接触させる方法や、毛包原基を培養する培地を用いて候補化合物を希釈したものを毛包原基に添加して接触させる方法等が挙げられる。
【００６３】
［比較工程］
次いで、候補化合物との接触有無による前記毛包原基の色素の蓄積度の経時的な変化を比較する。具体的には、対照として候補化合物と接触させていない毛包原基を準備し、候補化合物存在下及び非存在下における色素の蓄積度を測定する。このとき、色素の蓄積度を経時的に測定し、その変化量を算出してもよい。これにより、候補化合物の影響を比較することができる。
【００６４】
色素の蓄積度としては、後述の実施例に示すように、例えば、毛包原基の画像を用いて測定された、毛包原基の全体の面積に対する、毛包原基中の黒色部分の面積の割合を用いることができる。又は、例えば、色素の蓄積に関連する遺伝子（例えば、ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １、ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２、ＭＩＴＦ等）の発現量を用いることができる。
【００６５】
接触工程を蓄積工程の間に行う場合には、候補化合物を以下のとおり判定することができる。例えば、候補化合物非存在下での毛包原基の色素の蓄積度の経時的な増加量に対して、候補化合物存在下での毛包原基の色素の蓄積度の経時的な増加量が大きい場合には、当該候補化合物が色素の蓄積促進剤であると判定することができる。一方、候補化合物非存在下での毛包原基の色素の蓄積度の経時的な増加量に対して、候補化合物存在下での毛包原基の色素の蓄積度の増加量が小さい、又は、候補化合物存在下での毛包原基の色素の蓄積度の減少量が大きい場合には、当該候補化合物が色素の蓄積抑制剤であると判定することができる。さらに、候補化合物非存在下での毛包原基の色素の蓄積度の増加量に対して、候補化合物存在下での毛包原基の色素の蓄積度の増加量が同程度である場合には、当該候補物質は、色素の蓄積の制御能を有しないと判定することができる。
【００６６】
また、接触工程を蓄積工程後に行う場合には、候補化合物を以下のとおり判定することができる。例えば、候補化合物非存在下での毛包原基の色素の蓄積度に対して、候補化合物存在下での色素の蓄積度が大きい場合には、当該候補化合物が色素の蓄積促進剤であると判定することができる。一方、候補化合物非存在下での毛包原基の色素の蓄積度に対して、候補化合物存在下での色素の蓄積度が小さい場合には、当該候補化合物が色素の蓄積抑制剤であると判定することができる。さらに、候補化合物非存在下での毛包原基の色素の蓄積度に対して、候補化合物存在下での色素の蓄積度が同程度である場合には、当該候補物質は、色素の蓄積の制御能を有しないと判定することができる。
【００６７】
本実施形態のスクリーニング方法を用いて、色素の蓄積促進剤であると判定された候補化合物は、白髪抑制剤として有用である。また、色素の蓄積抑制剤であると判定された候補化合物は、色素沈着を生じる疾患に対する治療剤又は美白を目的とする化粧品として有用である。色素沈着を生じる疾患としては、例えば、皮膚癌、色素性母斑、ケロイド、色素沈着過度（肝斑を含む）、発疹等が挙げられる。
【００６８】
なお、本明細書において、「美白」とは、皮膚の色をより透明に、より明るく若しくはより白くする、又は、皮膚のほくろ、しみ若しくはそばかす等を減少させるという意味である。
【００６９】
＜色素の蓄積を制御する候補化合物をスクリーニングするためのキット＞
本実施形態のキットは、色素の蓄積を制御する候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、毛包原基を備える。前記毛包原基は、間葉系細胞及び上皮系細胞を含み、前記間葉系細胞において色素が蓄積している。
【００７０】
本実施形態のキットによれば、生体により近い条件下で、候補化合物による皮膚及び毛髪における色素の蓄積の制御を評価することができる。また、本実施形態のキットは、色素の蓄積の制御機構の解析、色素の蓄積抑制剤及び色素の蓄積促進剤（特に、白髪抑制剤）の薬剤スクリーニング、色素性母斑の病態メカニズム解明に好適に用いられる。
【００７１】
［毛包原基］
本実施形態のキットに含まれる毛包原基は、間葉系細胞及び上皮系細胞を含み、前記間葉系細胞において色素が蓄積している。そのため、毛包原基の色素の蓄積度を測定することで、色素の蓄積を制御する候補化合物をスクリーニングすることができる。毛包原基の形成方法については、上述の「色素の蓄積を制御する候補化合物をスクリーニングする方法」の「形成工程」に記載の方法と同様の方法である。
【００７２】
［細胞培養容器］
本実施形態のキットは、上記毛包原基に加えて、更に、細胞培養容器を備えていてもよい。細胞培養容器としては、上述の「色素の蓄積を制御する候補化合物をスクリーニングする方法」の「形成工程」に記載のものと同様のものが挙げられる。中でも、酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器であることが好ましい。
【００７３】
［その他構成］
本実施形態のキットは、上記毛包原基及び上記細胞培養容器に加えて、更に、培地、色素の蓄積度の測定手段等を備えていてもよい。
【００７４】
培地としては、上述の「色素の蓄積を制御する候補化合物をスクリーニングする方法」の「形成工程」に記載のものと同様のものが挙げられる。中でも、間葉系細胞増殖用培地及び上皮系細胞増殖用培地であることが好ましい。
【００７５】
色度沈着度の測定手段としては、例えば、画像撮影装置及び画像解析装置を有する顕微鏡、色度沈着に関連する遺伝子（例えば、ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １、ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２、ＭＩＴＦ等）の発現量を測定するためのプライマー等が挙げられ、これらに限定されない。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７７】
［実施例１］ｉｎ  ｖｉｔｒｏ色素沈着モデルの構築
１．毛包原基の形成
（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
胎齢１８日齢のＣ５７ＢＬ／６マウス胎児より背部皮膚を採取し、中尾らが報告した方法（参考文献１：Toyoshima, K., et al., “Fully functional hair follicle regeneration through the rearrangement of stem cells and their niches”, Nat. Commun., vol.3, no.784, 2012.）を一部改変した方法を用いて、間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。より具体的には、妊娠マウスＣ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌの子宮内の胎齢１８日齢のマウス胎児の背部皮膚を採取し、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）ＩＩ（Ｗａｋｏ社製）による処理を４℃で３０ｒｐｍの振盪条件で１時間行い、上皮層と間葉層とを分離した。次いで、上皮層は１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ（Ｗａｋｏ社製）による処理を１時間２０分、さらにトリプシンによる処理を１０分行い、上皮系細胞を単離した。一方、間葉層は１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ（Ｗａｋｏ社製）による処理を１時間２０分行い、間葉系細胞を単離した。
【００７８】
（２）毛包原基形成工程
次いで、Ｐｒｉｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）  ９６Ｕ  ｐｌａｔｅに、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が０．５、１、２、４、８、１６及び３２×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル（全細胞数１、２、４、８、１６、３２及び６４×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように注入し、１７日間培養を行った。培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）（１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）含有）とＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績社製）とを１：１で混合した培地（以下、「ＤＭＥＭ−ＫＧ２混合培地」とも呼ぶ。）を用いた。培地交換は毎日行った。
【００７９】
次いで、培養１７日目に、１ｍＬのコニカルチューブに回収し、デジタルカメラ（Ｃａｎｏｎ社製、Ｔｏｕｇｈ）で色素の蓄積を観察した。結果を図１に示す。また、各細胞数における色素の蓄積度を、毛包原基全体の面積に対する黒色部分の面積の割合を測定することで評価した。結果を以下の表１に示す。
【００８０】
【表１】
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【００８１】
図１及び表１から、全ての細胞数において、毛包原基の間葉系細胞が位置する部分が黒ずむ（色素沈着する）様子が観察された。また、細胞数が多すぎる場合（１６、３２及び６４×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）では、色素の蓄積が弱くなる傾向が観察された。一般にメラノサイトは低酸素ストレスで発生する活性酸素により色素の蓄積が抑制されることがわかっている。そのため、細胞数が多い場合では、低酸素ストレスで発生する活性酸素により色素の蓄積が抑制されたと推察された。
【００８２】
［実施例２］間葉系細胞及び上皮系細胞の共培養による効果の確認試験
１．毛包原基の形成
（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
実施例の「１．」の「（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の採取」と同様の方法を用いて、マウスの間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。
【００８３】
（２）毛包原基形成工程
次いで、Ｐｒｉｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）  ９６Ｕ  ｐｌａｔｅに、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が２×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル（全細胞数４×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように注入し、６日間培養を行った。対照として、Ｐｒｉｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）  ９６Ｕ  ｐｌａｔｅに、間葉系細胞のみを含む細胞懸濁液を、細胞が２×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように注入し、６日間培養を行った。培地は、ＤＭＥＭ−ＫＧ２混合培地を用いた。培地交換は毎日行った。
【００８４】
次いで、培養６日目に、１ｍＬのコニカルチューブに回収し、デジタルマイクロスコープ（ＫＥＹＥＮＣＥ社製）で色素の蓄積を観察した。結果を図２に示す。図２において、スケールバーは１０００μｍを示す。また、図２において、黒矢頭は毛包原基における色素の蓄積部を示す。
さらに、色素の蓄積度を、毛包原基全体の面積に対する黒色部分の面積の割合を測定することで評価した。結果を以下の表２に示す。なお、図２及び表２において、「上皮＋間葉」とは、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種して共培養することで得られる毛包原基を示す。また、「間葉のみ」とは、間葉系細胞のみを播種して培養することで得られるスフェロイドを示す。
【００８５】
【表２】
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【００８６】
図２及び表２から、毛包原基（「上皮＋間葉」）では色素の蓄積が見られたのに対し、間葉系細胞のスフェロイド（「間葉のみ」）ではほとんど見られなかった。これは、毛包原基（「上皮＋間葉」）では、上皮系細胞との相互作用により、間葉系細胞の色素の蓄積が促進されたためと推察された。
【００８７】
［実施例３］色素の蓄積促進剤（デキサメタゾン）の添加による毛包原基でのメラニン産生量の評価
１．毛包原基の形成
（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
実施例の「１．」の「（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の採取」と同様の方法を用いて、マウスの間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。
【００８８】
（２）毛包原基形成工程
次いで、Ｐｒｉｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）  ９６Ｕ  ｐｌａｔｅに、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が２×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル（全細胞数４×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように注入し、３日間培養を行い、毛包原基を形成させた。次いで、デキサメタゾンを各濃度（０、５、１５又は３０ｎＭ）で添加し、さらに５日間培養を行った。対照として、Ｐｒｉｍｅ  ｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）  ９６Ｕ  ｐｌａｔｅに、間葉系細胞のみを含む細胞懸濁液を、細胞が２×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように注入し、３日間培養を行って、間葉系細胞のみからなるスフェロイドも準備し、次いで、デキサメタゾンを添加せずにさらに５日間培養した。培地は、ＤＭＥＭ−ＫＧ２混合培地を用いた。培地交換は毎日行った。
【００８９】
（３）メラニン産生量の定量
次いで、細胞を播種して培養を開始してから８日目（すなわち、デキサメタゾンの添加から５日目）に、１ｍＬのコニカルチューブに回収し、水酸化ナトリウム溶液中で６０℃３０分間インキュベートすることにより、メラニンを抽出した。次いで、吸光度計を用いて、４０５ｎｍの吸光度を測定することで、メラニン産生量を定量した。結果を図３に示す。図３において、「ｍｅｓ  ０ｎＭ」とは、対照である、デキサメタゾン非存在下（０ｎＭ）で培養した間葉系細胞のみからなるスフェロイドを示す。また、図３のグラフにおいて、縦軸は、デキサメタゾン非存在下（０ｎＭ）で培養した毛包原基のメラニン産生量を１とした場合での相対量を示している。
【００９０】
図３から、毛包原基において、デキサメタゾンの添加濃度が増加するに伴い、メラニン産生量が増加する傾向が観察された。一方で、対照として作製した間葉系細胞のみからなるスフェロイドでは、メラニン産生がほとんど見られなかった。
【００９１】
［実施例４］酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ色素沈着モデルの構築
１．毛包原基の形成
（１）規則的にウェルを配置したＰＤＭＳスフェロイドチップの作製
ＣＡＤソフト、Ｖ  Ｃａｒｖｅ  Ｐｒｏ  ６．５を用いて、作製するスフェロイド容器のパターンをコンピューターで設計した。切削機を用いて、設計したパターン通りにオレフィン系基板を切削することで、パターンをもつ凹鋳型を作製した。この鋳型にエポキシ樹脂（クリスタルリジン、日新レジン社製）を流しこみ、１日硬化させた。次いで、離型することで、パターンをもつ凸鋳型を形成した。形成した凸鋳型を６ｃｍデッシュ底面に固定し、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（信越シリコーン社製）を流し込み、これを固化した。次いで、凸鋳型を離型することで、ＰＤＭＳに規則的なパターンが形成されたＰＤＭＳスフェロイドチップを作製した（図４Ａ参照）。ＰＤＭＳスフェロイドチップのウェル数は２５０個であった。
【００９２】
（２）間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
実施例の「１．」の「（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の採取」と同様の方法を用いて、マウスの間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。
【００９３】
（３）毛包原基形成工程
次いで、（２）で採取した間葉系細胞及び上皮系細胞を遠心後、新しい培地を添加して、上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を調製した。次いで、それぞれの細胞が４×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル（全細胞数８×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように（１）で作製したＰＤＭＳスフェロイドチップに播種し、培養した。培地は、２ｍＬのＤＭＥＭ−ＫＧ２混合培地を用いた。培地交換は毎日行った。
次いで、培養１７日目に、１ｍＬのコニカルチューブに回収し、デジタルカメラ（Ｃａｎｏｎ社製、Ｔｏｕｇｈ）で色素の蓄積を観察した。結果を図４Ｂに示す。
【００９４】
図４Ｂから、毛包原基は酸素環境が改善されたＰＤＭＳスフェロイドチップ内でも、９６ウェルプレートと同様に色素の蓄積が確認された。一般のマイクロアレイチップでこのような高細胞密度の培養を行うと、１７日の培養中に細胞は酸素枯渇により大きなダメージを受ける。しかし、今回作製したＰＤＭＳスフェロイドチップでは、培養中の酸素供給を考慮し、材質に高い酸素透過性を示すポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いた。そのため、大量の毛包原基を２ｍＬという少ない培地内で培養しても、細胞に重篤なダメージを与えることなく、毛包原基において色素が蓄積する様子が観察できたと考えられる。また、このＰＤＭＳスフェロイドチップでの大量サンプル評価は薬剤スクリーニングを行う上で有用である。
【００９５】
以上のことから、上皮系細胞及び間葉系細胞を含み、間葉系細胞が色素の蓄積している毛包原基を用いることで、候補化合物による皮膚及び毛髪における色素の蓄積を評価することができることが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本実施形態のスクリーニング方法及びキットは、色素の蓄積の制御機構の解析、色素の蓄積抑制剤及び色素の蓄積促進剤（特に、白髪抑制剤）の薬剤スクリーニング、色素性母斑の病態メカニズム解明に好適に用いられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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