(57)【要約】      （修正有）【課題】多機能タンパク質セリン／スレオニンキナーゼであるＣＨＫ１を阻害することができ、神経芽細胞腫及び／または軟部組織肉腫の治療に有用である化合物の提供。【解決手段】癌の治療方法であって、それを必要とする患者に、有効量の５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである化合物、またはその薬学的に許容される塩、または前記その薬学的に許容される塩の溶媒和物を投与することを含み、前記癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療方法であって、それを必要とする患者に、有効量の５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである化合物、またはその薬学的に許容される塩、または前記その薬学的に許容される塩の溶媒和物を投与することを含み、前記癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される、方法。
【請求項２】
前記癌は、神経芽細胞腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌は、横紋筋肉腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記横紋筋肉腫は、胞巣状横紋筋肉腫または胎児性横紋筋肉腫である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記癌は、骨肉腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記癌は、ユーイング肉腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記癌は、線維形成性小円形細胞腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記癌は、平滑筋肉腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記塩は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルギ酸塩である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記塩は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル二塩酸塩である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記塩は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸塩である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記塩は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記塩は、２θ±０．０２°＝１２．６４°、２１．２５°、及び２６．１５°にピークを有するＸ線粉末回折パターンを特徴とする結晶形態の、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物、その塩、またはその溶媒和物を、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤のうちの１つ以上と共に投与する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法は、電離放射線を投与することをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法は、１つ以上の化学療法剤を投与することをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法は、５−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン、ビンクリスチン、イホスファミド、イリノテカン、シクロホスファミド、及びタキソールからなる群から選択される１つ以上の化学療法剤を投与することをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群から選択される癌の治療のための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩、または前記その薬学的に許容される塩の溶媒和物の使用。
【請求項２１】
前記癌は、神経芽細胞腫である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記癌は、横紋筋肉腫である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
前記横紋筋肉腫は、胞巣状横紋筋肉腫または胎児性横紋筋肉腫である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記癌は、骨肉腫である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２５】
前記癌は、ユーイング肉腫である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２６】
前記癌は、線維形成性小円形細胞腫瘍である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２７】
前記癌は、平滑筋肉腫である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２８】
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩である、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
前記塩は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルギ酸塩である、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
前記塩は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル二塩酸塩である、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３２】
前記塩は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸塩である、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３３】
前記塩は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩である、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３４】
前記塩は、２θ±０．０２°＝１２．６４°、２１．２５°、及び２６．１５°にピークを有するＸ線粉末回折パターンを特徴とする結晶形態の、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３５】
電離放射線と組み合わせた、請求項２０〜３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３６】
１つ以上の化学療法剤と組み合わせた、請求項２０〜３５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３７】
５−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン、ビンクリスチン、イホスファミド、イリノテカン、シクロホスファミド、及びタキソールからなる群から選択される１つ以上の化学療法剤と組み合わせた、請求項２０〜３５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３８】
神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群から選択される、癌の治療における使用のための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである化合物、またはその薬学的に許容される塩、または前記その薬学的に許容される塩の溶媒和物。
【請求項３９】
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである、請求項３８に記載の使用のための化合物、またはその薬学的に許容される塩、またはその薬学的溶媒和物。
【請求項４０】
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである、請求項３８に記載の使用のための化合物。
【請求項４１】
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルギ酸塩である、請求項３８に記載の使用のための化合物。
【請求項４２】
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル二塩酸塩である、請求項３８に記載の使用のための化合物。
【請求項４３】
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸塩である、請求項３８に記載の使用のための化合物。
【請求項４４】
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩である、請求項３８に記載の使用のための化合物。
【請求項４５】
前記化合物は、２θ±０．０２°＝１２．６４°、２１．２５°、及び２６．１５°にピークを有するＸ線粉末回折パターンを有する結晶形態の、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩である、請求項３８に記載の使用のための化合物。
【請求項４６】
前記癌は、神経芽細胞腫である、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
【請求項４７】
前記癌は、横紋筋肉腫である、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
【請求項４８】
前記癌は、胞巣状横紋筋肉腫または胎児性横紋筋肉腫から選択される、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
【請求項４９】
前記癌は、骨肉腫である、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
【請求項５０】
前記癌は、ユーイング肉腫である、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
【請求項５１】
前記癌は、線維形成性小円形細胞腫瘍である、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
【請求項５２】
前記癌は、平滑筋肉腫である、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
【請求項５３】
前記使用は、電離放射線と同時に、別々に、または順次組み合わせられる、請求項３８〜５２のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
【請求項５４】
前記使用は、１つ以上の化学療法剤と同時に、別々に、または順次組み合わせられる、請求項３８〜５３のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
【請求項５５】
前記使用は、５−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン、ビンクリスチン、イホスファミド、イリノテカン、シクロホスファミド、及びタキソールからなる群から選択される、１つ以上の化学療法剤と同時に、別々に、または順次組み合わせられる、請求項３８〜５３のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
軟部組織肉腫と診断された個体の２０％〜２５％は全生存率が低く、生存期間中央値が１２ヶ月と短いと推定されている。神経芽細胞腫に関しては、高リスク神経芽細胞腫患者の転帰は低く、長期生存率は５０％未満である。したがって、神経芽細胞腫及び／または軟部組織肉腫を治療するための新規なアプローチが必要である。
【背景技術】
【０００２】
ＣＨＫ１は、ＤＮＡ合成中のＤＮＡ損傷応答及び複製フォークライセンスを促進するために重要な多機能タンパク質セリン／スレオニンキナーゼである。ＣＨＫ１小分子阻害剤は、固形腫瘍及びヘム悪性腫瘍の臨床研究を受けている。ＤＮＡ損傷修復におけるＣＨＫ１及びＣＨＫ２の役割のために、ＣＨＫ１／２の阻害剤は、癌の治療における使用のための関心を受けている。例えば、ＵＳ８３１４１０８は、ＣＨＫ１／２阻害剤である、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルギ酸塩、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル二塩酸塩、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸塩、及び５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩を開示している。
【０００３】
しかしながら、神経芽細胞腫及び／または軟部組織肉腫の治療に有益であり得るＤＮＡ損傷剤の増強剤として効果的に作用し得る細胞周期チェックポイントの強力な阻害剤であるＣＨＫ１阻害剤に対する必要性が依然として存在する。本発明は、神経芽細胞腫及び／または軟部組織肉腫の治療に有益であり得るＣＨＫ１の強力な阻害剤である、アミノピラゾール化合物またはその薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物に関する。化合物またはその薬学的に許容される塩またはその塩の溶媒和物は、神経芽細胞腫及び／または軟部組織肉腫の治療に有益であり得る、組織培養及びインビボでのＤＮＡ損傷剤による処置によって誘導されるＣＨＫ１媒介細胞周期停止を強力に排除する。さらに、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩またはその塩の溶媒和物は、神経芽細胞腫及び／または軟部組織肉腫の治療に有益であり得るＣＨＫ２の阻害も提供する。さらに、ＣＤＫ１のような特定の他のプロテインキナーゼの阻害がないと、神経芽細胞腫及び／または軟部組織肉腫の治療のための化合物またはその薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物を使用する場合の望ましくない影響を最小限に抑えることによる治療利益を提供することができる。
【発明の概要】
【０００４】
本発明はまた、ＣＨＫ１のアンタゴニストであり、神経芽細胞腫及び／または小児及び成人軟部組織肉腫のより安全で効果的な治療の必要性に取り組むことができるアミノピラゾール化合物、またはその薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物を提供する。
【０００５】
本発明は、神経芽細胞腫及び／または軟部組織肉腫の治療のための５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物を伴う使用または方法を企図する。他の非限定的な実施形態は、神経芽細胞腫及び／または軟部組織肉腫の治療における使用のためのまたは治療する方法としての、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルギ酸塩、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル二塩酸塩、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸塩、及び５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩を含む。
【０００６】
特定の実施形態として、本発明は、神経芽細胞腫及び／または軟部組織肉腫の治療における使用のためのまたは治療する方法としての、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである化合物を提供する。
【０００７】
本発明は、神経芽細胞腫及び／または軟部組織肉腫の治療における使用のためのまたは治療する方法としての、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルのギ酸、二水素塩化物及びメタンスルホン酸塩を提供する。
【０００８】
本発明はまた、神経芽細胞腫及び／または軟部組織肉腫の治療における使用のためのまたは治療する方法としての、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩である化合物を提供する。
【０００９】
本発明は、神経芽細胞腫及び／または軟部組織肉腫の治療における使用のためのまたは治療する方法としての、２θ±０．０２°＝１２．６４°、２１．２５°及び２６．１５°にピークを有するＸ線粉末回折パターンを特徴とする結晶形態の５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩を提供する。
【００１０】
本発明は、神経芽細胞腫及び／または脂肪肉腫を除く軟部組織肉腫を治療するための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物を伴う使用または方法を企図する。他の非限定的な実施形態は、神経芽細胞腫及び／または脂肪肉腫を除く軟部組織肉腫の治療における使用のためのまたは治療する方法としての、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルギ酸塩、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル二塩酸塩、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸塩、及び（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩を含む。
【００１１】
特定の実施形態として、本発明は、神経芽細胞腫及び／または脂肪肉腫を除く軟部組織肉腫の治療における使用のためのまたは治療する方法としての、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである化合物、提供する。
【００１２】
本発明は、神経芽細胞腫及び／または脂肪肉腫を除く軟部組織肉腫の治療における使用のためのまたは治療する方法としての、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルのギ酸、二水素塩化物及びメタンスルホン酸塩を提供する。
【００１３】
本発明はまた、神経芽細胞腫及び／または脂肪肉腫を除く軟部組織肉腫の治療における使用のためのまたは治療する方法としての、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩である化合物を提供する。
【００１４】
本発明は、神経芽細胞腫及び／または脂肪肉腫を除く軟部組織肉腫を含む癌の治療における使用のためのまたは治療する方法としての、２θ±０．０２°＝１２．６４°、２１．２５°及び２６．１５°にピークを有するＸ線粉末回折パターンを特徴とする結晶形態の５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩を提供する。
【００１５】
本発明は、神経芽細胞腫及び／または軟部組織肉腫の治療における使用のためのまたは治療する方法としての、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤のうちの１つ以上とを含む薬学的組成物を提供する。本発明は、神経芽細胞腫及び／または脂肪肉腫を除く軟部組織肉腫の治療における使用のためのまたは治療する方法としての、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤のうちの１つ以上とを含む薬学的組成物を提供する。本発明は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される、癌の治療における使用のためのまたは癌を治療する方法としての、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩または薬学的に許容される塩の溶媒和物と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤のうちの１つ以上とを含む薬学的組成物を提供する。
【００１６】
本発明は、癌を治療する方法を提供し、本方法は、それを必要とする患者に、有効量の５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩または薬学的に許容される塩の溶媒和物を投与することを含み、その癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される。さらに、本発明はまた、癌を治療する方法を提供し、本方法は、それを必要とする患者に、有効量の５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩または薬学的に許容される塩の溶媒和物、及び電離放射線を投与することを含み、その癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される。本発明は、癌を治療する方法を提供し、本方法は、それを必要とする患者に、有効量の５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物、及び少なくとも１つの化学療法剤を投与することを含み、その癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される。本発明は、癌を治療する方法を提供し、本方法は、それを必要とする患者に、有効量の５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物と、少なくとも１つの化学療法剤と、電離放射線とを投与することを含み、その癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される。
【００１７】
本発明は、癌の治療のための医薬の製造のための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物の使用を提供し、その癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される。さらに、本発明は、癌の治療のための医薬の製造のための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩または薬学的に許容される塩の溶媒和物の使用を提供し、その治療は電離放射線との組み合わせ療法を含み、その癌が、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される。本発明は、組み合わせ療法による癌の治療のための医薬の製造のための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩または薬学的に許容される塩の溶媒和物の使用を提供し、その組み合わせ療法の治療は、同じ患者への前記薬物の投与と、１つ以上の他の化学療法薬の投与とを含み、その癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される。本発明は、組み合わせ療法による癌の治療のための医薬の製造のための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩または薬学的に許容される塩の溶媒和物の使用を提供し、その組み合わせ療法の治療は、同じ患者への前記薬物の投与と１つ以上の他の化学療法薬及び電離放射線の投与とを含み、その癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される。
【００１８】
本発明は、療法に使用するための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物を提供する。本発明はまた、癌の治療に使用するための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、癌の治療において電離放射線と同時に、別々に、または順次組み合わせて使用するための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物を提供する。さらに、本発明は、癌の治療において１つ以上の化学療法剤と同時に、別々に、または順次組み合わせて使用するための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物を提供する。
【００２０】
本発明は、癌の治療に使用するための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物を提供し、その癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される。さらに、本発明はまた、癌の治療において電離放射線と同時に、別々に、または順次組み合わせて使用するための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩または薬学的に許容される塩の溶媒和物を提供し、その癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、繊維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される。本発明は、癌の治療において１つ以上の化学療法剤と同時に、別々に、または順次組み合わせて使用するための５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩または薬学的に許容される塩の溶媒和物を提供し、その癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、繊維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される。本発明は、癌の治療において１つ以上の化学療法剤と電離放射線とを同時に、別々に、または順次組み合わせて使用するための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩または薬学的に許容される塩の溶媒和物を提供し、その癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、繊維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される。
【００２１】
本発明は、癌の治療のための医薬の製造のための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩または薬学的に許容される塩の溶媒和物の使用を提供し、前記医薬は、電離放射線と同時に、別々に、または順次組み合わせて投与され、その癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、繊維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される。
【００２２】
本発明は、癌の治療のための医薬の製造のための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩または薬学的に許容される塩の溶媒和物の使用を提供し、前記医薬はまた、少なくとも１つの化学療法剤を含み、または少なくとも１つの化学療法剤と同時に、別々に、または順次組み合わせて投与され、その癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、繊維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される。
【００２３】
本発明は、癌の治療において電離放射線と同時に、別々にまたは順次組み合わせて使用するための５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物を提供し、その癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、繊維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される。
【００２４】
本発明は、癌の治療において少なくとも１つの化学療法剤と同時に、別々にまたは順次組み合わせて使用するための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩または薬学的に許容される塩の溶媒和物を提供し、その癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される。
【００２５】
本発明は、癌治療における少なくとも１つの化学療法剤と電離放射線と同時、別々または順次組み合わせて使用するための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩または溶媒和物を提供し、その癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、繊維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される。
【００２６】
本発明は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物を薬学的に許容される担体及び場合により他の治療成分と共に含む薬学的組成物を提供し、その癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、繊維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される。
【００２７】
（５−（５−（２−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩は、単剤として、Ｓ期中に二本鎖ＤＮＡ切断を生じて複製の破局及び最終的には有糸分裂の破局につながる、ＣＨＫ１／ＣＨＫ２小分子阻害剤である。さらに、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩によるＣＨＫ１の阻害は、ドキソルビシン及びゲムシタビンのような遺伝毒性物質による処理後のＤＮＡ損傷応答を無効にし、ＤＮＡ損傷及びこれらの薬剤に対するアポトーシス応答を増強する。
【００２８】
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩の有効性は、神経芽細胞腫のマウスモデルとヒト小児及び成体肉腫においてインビボで測定可能である。５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（１０ｍｇ／ｋｇ）は、ヒト横紋筋肉腫、繊維形成性小円形細胞腫瘍（ＤＳＲＣＴ）、骨肉腫、及びユーイング肉腫の、細胞由来異種移植片（ＣＤＸ）または患者由来異種移植片（ＰＤＸ）のいずれかを有するヌードマウスに、３日、１日２回投与し、４日休止する、投薬スケジュールで皮下投与することができる。腫瘍体積及び体重は、週に２回測定することができる。腫瘍特異的パラメータは、免疫組織化学によって評価することができる。
【００２９】
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩は、不変から完全な退縮までの７／１３の小児腫瘍モデルにおいて強力な単剤活性を引き起こす。注目すべきことに、ＤＳＲＣＴのＰＤＸモデルでは、４回の投与サイクルの後に完全な退縮が観察される。治療を中止すると、ＤＳＲＣＴのＰＤＸモデルにおいて５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩で再チャレンジした場合の腫瘍退縮を含めて、治療後５０日で腫瘍増殖が観察される。ＳＪＣＲＨ−３０ａＲＭＳモデルでは、治療中に観察された完全な退縮は薬物の投与中止をすると直ちに逆転し、その後の再増殖は１０ｍｇ／ｋｇの５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩によるさらなる治療に耐性がある。しかしながら、この同じモデルでは、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水和物＋ドキソルビシンは、治療を中止してから２ヶ月超の間、検出可能な腫瘍増殖のない耐久性のある完全な退縮をもたらす。
【００３０】
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩は、平滑筋肉腫のＰＤＸモデルにおいても活性であったが、脂肪肉腫では活性がなかった。５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩単独で及び化学療法と組み合わせることで、肉腫のヒトＰＤＸ及びＣＤＸモデルの増殖を有意に阻害し得る。
【００３１】
本発明は、ＣＨＫ１を阻害する、及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の複製、染色体の分離または細胞分裂の欠損を特徴とする癌の治療に有用な、アミノピラゾール化合物、またはその薬学的に許容される塩またはその薬学的に許容される塩の溶媒和物に関する。
【００３２】
化学療法剤の非限定的な例には、５−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、ダクチノマイシン、エトポシド、ビンクリスチン、イホスファミド、イリノテカン、シクロホスファミド、シスプラチン、タキソール及びそれらの組み合わせが含まれる。本明細書に記載の方法及び使用の実施形態は、膀胱癌、結腸癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、腎癌及び子宮癌からなる群から選択される他の癌を含む。さらに、本発明は、その横紋筋肉腫が肺胞性横紋筋肉腫及び／または胚性横紋筋肉腫である、本明細書に記載の方法及び使用の実施形態を提供する。
【００３３】
本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩またはその塩の溶媒和物は、互変異性体として存在し得る。互変異性体が存在する場合、それらの各形態及び混合物は、本発明において考慮される。
【化１】
2019218361.tif 000002
【００３４】
他に定義されない限り、本発明は、実施例３の化合物の薬学的に許容される塩、ならびに実施例３の化合物の遊離塩基またはその薬学的に許容されるそれらの塩の溶媒和物を含む。本明細書で使用される用語「薬学的に許容される塩」は、実施例３の化合物の塩を指す。薬学的に許容される塩の例及びそれらの調製方法は、当技術分野において慣用的である。例えば、Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ”，ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，（２００２）；Ｇｏｕｌｄ，Ｐ．Ｌ．，“Ｓａｌｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｄｒｕｇｓ”，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３：２０１−２１７（１９８６）及びＢａｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｓａｌｔ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎｅｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｔｉｔｉｅｓ”，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４：４２７−４３５（２０００）を参照されたい。
【００３５】
薬学的に許容される塩に加えて、他の塩が本発明に含まれる。それらは、化合物の精製において、または他の薬学的に許容される塩の調製において中間体になり得るか、または同定、特徴付け、または精製に有用である。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「患者」は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物を指す。より詳細には、用語「患者」はヒトを指す。
【００３７】
用語「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」（または「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療」（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、症状、障害、状態または疾患の進行または重症度を緩徐化、中断、阻止、抑制、低減、または逆転させるプロセスを指す。
【００３８】
本明細書で使用する用語「有効量」は、本明細書に記載の本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩またはその塩の溶媒和物の量もしくは用量を、単独で、または電離放射線もしくは化学療法薬と組み合わせて、患者への単回投与または複数回投与時に、診断または治療下の患者に所望の効果を提供する。有効量は、哺乳動物の種などのいくつかの因子例えば、その大きさ、年齢、及び一般的な健康状態、必要に応じて他の薬剤の同時投与、関与する特定の疾患、疾患の程度または重症度、個々の患者の応答、投与される特定の化合物、投与の様式、投与された製剤のバイオアベイラビリティ特性、選択された投与レジメン、付随する医薬品の使用、その他の関連する状況、を考慮することにより、当業者に認められる診断者によって容易に決定することができる。本発明を何ら限定するものとして解釈されるべきではないが、２０〜１５０ｍｇ／ｍ２は、本明細書に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩または塩の溶媒和物の有効量を表す。
【００３９】
本明細書で使用される用語「組み合わせ療法」は、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはその塩の溶媒和物、及び少なくとも１つの化学療法剤の別々の、同時の、または順次の投与を指す。さらに、「組み合わせ療法」という用語は、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩またはその塩の溶媒和物と、電離放射線との別々の、同時の、または順次の投与を指す。用語「組み合わせ療法」はまた、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩またはその塩の溶媒和物と、電離放射線、及び少なくとも１つの化学療法剤との別々の、同時の、または順次の投与を指す。
【００４０】
当業者であれば、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩は、代わりに２−ピラジンカルボニトリル、５−［［５−［２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル］−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］アミノ］モノメシレート一水塩と呼ぶことができることを認識するであろう。
【００４１】
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルの化合物、またはその薬学的に許容される塩またはその塩の溶媒和物は、薬学的組成物の一部として投与するために配合されてもよい。このように、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルの化合物、またはその薬学的に許容される塩またはその塩の溶媒和物を、１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と組み合わせて含む薬学的組成物は、本発明の重要な実施形態である。薬学的組成物及びそれらの調製方法の例は、当技術分野で周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，２２ｎｄ  ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）を参照されたい。
【００４２】
本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩またはその塩の溶媒和物は、それを生物学的に利用可能にするいずれかの経路によって投与することができる。例えば、化合物、またはその薬学的に許容される塩またはその塩の溶媒和物は、経口で、皮下で、筋肉内に、静脈内に、経皮的に、局所的に、鼻腔内に、直腸に、口腔内に等で投与することができる。あるいは、化合物、またはその薬学的に許容される塩またはその塩の溶媒和物を、注入によって投与してもよい。ＩＶ注入が好ましい投与経路である。
【００４３】
「ＡＴＣＣ」はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを指し、「ＡＴＭ」は血管拡張性失調症変異を指し、「ＡＴＰ」はアデノシン三リン酸を指し、「ＡＴＲ」は運動失調及びラド関連キナーゼを指し、「ＢＣＡ」はビシンコニン酸を指し、「ｂ．ｉ．ｄ．」は１日２回の投薬を指し、「Ｂｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ」はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルを指し、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを指し、「ＣＴＧ」はＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏｗ試薬を指し、「ＤＰＢＳ」はダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水を指す、「ＤＩＡＤ」はジイソプロピルアゾジカルボキシレートを指し、「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを指し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し、「ＤＴＴ」はジチオスレイトールを指し、「ＤＳＲＣＴ」は繊維形成性小円形細胞腫瘍を指し、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を指し、「ＥＲＫ」は細胞外シグナル調節キナーゼを指し、「ＥｔＯＨ」はエタノールを指し、「ＥＷＳ」はユーイング肉腫を指し、「ＦＢＳ」はウシ胎児血清を指し、「Ｇ２Ｍ」は細胞周期のＧ２及びＭ期を指し、「ＨＢＳＳ」はハンクスの平衡塩類溶液を指し、「ＨＥＰＥＳ」は、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸を指し、「ｈｎＲＮＰ」はヘテロ核リボヌクレオタンパク質を指し、「ＨＲＰ」は西洋ワサビペルオキシダーゼを指し、「ＬＭＳ」は平滑筋肉腫を指し、「ＭＥＭ」は最小必須培地を指し、ＭｅＯＨ」はメタノールまたはメチルアルコールを指し、「ＮＢＭ」は神経芽細胞腫を指し、「ＯＳ」は骨肉腫を指し、「ＰＢＳ」はリン酸緩衝生理食塩水を指し、「ＰＢＳＴ」はリン酸緩衝食塩水Ｔｗｅｅｎ−２０を指し、「Ｐｈ」はフェニルを指し、「ｐＨＨ３」はリン酸化ヒストンＨ３を指し、「ＰＩ」はヨウ化プロピジウムを指し、「ＰＫＣ」はプロテインキナーゼＣを指し、「ＲＭＳ」は横紋筋肉腫を指し、「ＲＮＡアーゼ」はリボヌクレアーゼＡを指し、「ＲＰＭＩ」はＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅを指し、「ＳＤＳ」は、ドデシル硫酸ナトリウムを指し、「ＳＴ」は軟部組織を指し、「ＴＢＳＴ」はトリス緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ−２０を指し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指し、「ＴＲ−ＦＲＥＴ」は時間分解蛍光エネルギー移動を指し、「Ｔｒｉｓ」はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを指し、「Ｔｒｉｔｏｎ（商標）−Ｘ」は、４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコールｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテルを指し、「Ｔｗｅｅｎ−２０」はポリソルベート２０を指す。
【００４４】
以下の調製及び実施例は、本発明をさらに詳細に説明し、化合物、またはその薬学的に許容される塩またはその塩の溶媒和物の典型的な合成を示すために提供さる。
ルートＡ
調製１
５−イソチオシアナトピラジン−２−カルボニトリル
【化２】
2019218361.tif 000003
【００４５】
ＴＨＦ（４ｍＬ）中のチオホスゲン（１．８６ｇ、１５ｍｍｏｌ）の溶液を、ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）及びＴＨＦ（２５ｍＬ）中の５−アミノピラジン−２−カルボニトリル（１．２０ｇ、１０ｍｍｏｌ）及びピリジン（２ｍＬ）の溶液に室温で加える。反応混合物を室温で３時間撹拌する。混合物を濃縮し、粗生成物を酢酸エチルで希釈し、ろ過し、濃縮して標記化合物を得る。
調製２
（ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−アセチル−３−メトキシフェノキシ）プロピルカルバメート
【化３】
2019218361.tif 000004
【００４６】
ＤＩＡＤ（２．８２ｇ，１４．０ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル３−ヒドロキシプロピルカルバメート（２．４５ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）、１−（２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）エタノン（１．９４ｇ、１１．７ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（３．６６ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に室温で加える。１８時間撹拌後、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル：０−６０％勾配）に付して標記化合物（１．６０ｇ、４２％）を得る。
実施例１
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルギ酸塩
【化４】
2019218361.tif 000005
【００４７】
ＴＨＦ（７．６ｍＬ、７．６ｍｍｏｌ）中のリチウムヘキサメチルジシラザンの１Ｍ溶液を、乾燥ＴＨＦ（２５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル３−（２−アセチル−３−メトキシフェノキシ）プロピルカルバメート（１．０８ｇ、３．１７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に室温でゆっくりと加える。１０分間撹拌した後、ＴＨＦ（４ｍＬ）中の５−イソチオシアナトピラジン−２−カルボニトリル（０．５１０ｇ、３．１７ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌を続ける。反応混合物を濃縮し、ＥｔＯＨ（５０ｍＬ）及び酢酸（５ｍＬ）に再溶解し、続いてヒドラジン水和物（２ｍＬ）を添加する。次いで、得られた反応混合物を１２０℃で２分間加熱する。次いで、反応混合物を室温に冷却し、水（１００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチルで抽出する（２×１００ｍＬ）。有機部分を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮する。粗生成物をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に再溶解し、トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）で処理し、室温で１５分間撹拌する。溶媒を除去し、粗生成物（１．２０ｇ）を、ＨＰＬＣを用いて精製して、標記化合物（０．０４６ｇ、３．５％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６６．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
ルートＢ
調製３
１−［２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル］エタノン
【化５】
2019218361.tif 000006
【００４８】
フラスコに１−（２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）エタノン（３０ｇ、１８０．５ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（４９．９ｇ、３６１ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム（２．６８ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）、及びＴＨＦ中の４−メトキシベンジルクロライド（２７．０ｍＬ、１９８．６ｍｍｏｌ）を装入し、混合物を加熱して一晩還流する。混合物を室温に冷却し、水で希釈し、酢酸エチルで抽出する。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、濃縮する。粗生成物を、酢酸エチル／ヘキサンの溶離液を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、標記生成物（３２．５１ｇ、５７％）を白色固体として得る。
調製４
１−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−３，３−ビス（メチルチオ）プロプ−２−エン−１−オン
【化６】
2019218361.tif 000007
【００４９】
５００ｍＬ丸底フラスコに９５％ＮａＨ（７．２８ｇ、２８８ｍｍｏｌ）を装入し、乾燥ＤＭＳＯを加えた（１７０ｍＬ）。得られた不均一混合物に、乾燥ＤＭＳＯ（６０ｍＬ）中の１−［２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル］エタノン（４１．２ｇ、１４４ｍｍｏｌ）を滴下で加える。混合物を室温で１０分間撹拌し、その時点で二硫化炭素を滴下で添加し（８．６９ｍＬ、１４４ｍｍｏｌ）、直ぐにヨウ化メチル（１８．０ｍＬ、２８８ｍｍｏｌ）を加える。慎重な添加を促す両方の試薬の添加中、熱とガスが発生する。均質な溶液を室温で１８時間撹拌し、次いで３容量の水にゆっくりと注ぐ。固体生成物をろ過し、高真空下で乾燥させて、標記化合物をオレンジ色の固体として得る。
調製５
５−ブロモ−Ｎ−（５−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）ピラジン−２−アミン
【化７】
2019218361.tif 000008
【００５０】
５−ブロモピラジン−２−アミン（３．７３ｇ、２１．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解し、混合物を−７８℃に冷却する。ｎ−ブチルリチウムのヘキサン溶液（１０．３２ｍＬ、２３．５ｍｍｏｌ）をゆっくりと加える。反応混合物を低温で１５分間撹拌し、次いでゆっくりと室温に温め、さらに１時間撹拌する。混合物を０℃に再冷却し、１−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−３，３−ビス（メチルチオ）プロプ−２−エン−１−オン（８．３９ｇ、２１．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液を、カニューレを介して加える。この溶液は均質になり、室温で１５分間撹拌され、その後１０時間加熱還流される。次いで、溶液を室温に冷却し、溶媒を減圧下で除去する。固体残渣をＥｔＯＨ（１５０ｍＬ）に溶解し、氷酢酸（１．３ｍＬ、２３．５ｍｍｏｌ）を加える。ヒドラジン水和物（５．２５ｍＬ、１０７ｍｍｏｌ）を加え、溶液をさらに８時間還流する。混合物を室温に冷却し、真空下で濃縮する。生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ）で精製して、標記化合物（５．７６ｇ、７４％）を褐色固体として得る。
調製６
２−（３−（５−ブロモピラジン−２−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−メトキシフェノール
【化８】
2019218361.tif 000009
【００５１】
５−ブロモ−Ｎ−（５−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）ピラジン−２−アミン（３．１ｇ、６．４３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１００ｍＬ）に溶解する。ＨＣｌガスを反応混合物中に２０分間吹き込む。混合物を２時間撹拌し、溶媒を減圧下で除去する。残渣を３：１クロロホルム／イソプロパノール（１００ｍＬ）に再溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１００ｍＬ）と合わせる。層を分離し、水層を酢酸エチルで抽出する（３×５０ｍＬ）。合わせた有機層を濃縮し、ＭｅＯＨで摩砕して、標記化合物（１．５ｇ、６４％）を褐色固体として得る。
調製７
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（３−（５−ブロモピラジン−２−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−メトキシフェノキシ）プロピルカルバメート
【化９】
2019218361.tif 000010
【００５２】
ＤＩＡＤ（１．７３ｍＬ、８．７６ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル３−ヒドロキシプロピルカルバメート（０．８３ｍＬ、４．８３ｍｍｏｌ）、２−（３−（５−ブロモピラジン−２−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−メトキシフェノール）（１．５９ｇ、４．３８ｍｍｏｌ）及びポリスチレントリフェニルホスフィン（５．９１ｇ、８．７６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に室温で添加した。４５分間撹拌した後、反応物をろ過し、溶媒を減圧下で除去する。得られた残渣をクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）して、標記化合物（１．２７ｇ、５４％）を黄色固体として得る。
調製８
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（３−（５−シアノピラジン−２−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−メトキシフェノキシ）プロピルカルバメート
【化１０】
2019218361.tif 000011
【００５３】
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中、ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（３−（５−ブロモピラジン−２−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−メトキシフェノキシ）プロピルカルバメート（０．３７８ｇ、０．７３０ｍｍｏｌ）及びシアン化亜鉛（０．１０ｇ、０．８７０ｍｍｏｌ）の溶液を窒素気流で１時間脱気し、次いで８０℃に加熱する。反応物にＰｄ（Ｐｈ３Ｐ）４（０．０８０ｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を一晩加熱する。反応物を室温に冷却し、減圧下で濃縮する。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ）で精製して、標記化合物（０．２５１ｇ、７３％）を得る。
ルートＣ
調製９
（Ｅ）−５−（３−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１−（メチルチオ）−３−オキソプロプ−１−エニルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル
【化１１】
2019218361.tif 000012
【００５４】
エアースターラーロッド及びパドル、温度計、水凝縮器及び窒素バブラーを備えた５リットルのフランジネックフラスコに、水素化ナトリウム（２２．４ｇ、５６０．１ｍｍｏｌ）及び無水ＴＨＦ（３Ｌ）を装入する。十分に撹拌した混合物に、２−アミノ−５−シアノピラジン（６７．０ｇ、５５７．８ｍｍｏｌ）を１．５時間かけて少しずつ添加し、発泡させた。内部温度は全体を通して２２℃のままに保たれる。混合物を３５分間撹拌する。次いで、１−（２−メトキシ−６−（４−メトキシ−ベンジルオキシ）−フェニル）−３，３−ビス−メチルスルファニル−プロペノン（１４６．０ｇ、３７３．９ｍｍｏｌ）を２２℃で１時間かけて添加する。黄色の懸濁液を室温で４５分間撹拌し、次いで反応が穏やかな還流状態になるまで加熱する。６５℃で１９時間後、反応混合物を１５℃に冷却する。次いで、混合物を二等分に分割し、各ロットを水（２Ｌ）中でクエンチし、酢酸エチルで抽出する（２×１Ｌ）。有機抽出物を合わせ、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、４０℃で、減圧下で濃縮して、さらに精製することなく次の段階で使用される、黄色／橙色固体として標記化合物（１９６ｇ、１００％粗製物）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４６３．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
調製１０
５−（５−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル
【化１２】
2019218361.tif 000013
【００５５】
エアースターラーロッド及びパドル、温度計、水凝縮器及び窒素バブラーを備えた１０Ｌのフランジネックフラスコに、（Ｅ）−５−（３−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１−（メチルチオ）−３−オキソプロプ−１−エニルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル（１９６ｇ、４２３．８ｍｍｏｌ）及び無水ＥｔＯＨ（３Ｌ）を加える。窒素下で撹拌懸濁液に、ヒドラジン水和物（４１．０ｍＬ、８３８．７ｍｍｏｌ）及び氷酢酸（６６．０ｍＬ、１．１５モル）を加える。わずかに発熱が認められる。黄色の懸濁液を６５℃に加温する。次いで、加熱を中止し、反応混合物を室温に冷却させる。混合物を窒素雰囲気下で一晩放置する。固体をろ過により収集し、新鮮なＥｔｏＨで洗浄し、４５℃で真空乾燥させて、明るい黄色固体の標記化合物（１４０ｇ、２段階で収率８７％）を得る。生成物をさらに精製することなく次の段階で使用する。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４２９．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
調製１１
５−（５−（２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル
【化１３】
2019218361.tif 000014
【００５６】
エアースターラーロッド及びパドル、温度計、水凝縮器及び苛性溶液ガススクラバーへの出口を備えた１０Ｌのフランジネックフラスコに、５−（５−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル（１４０ｇ、３２６．７６ｍｍｏｌ）及び４Ｎ  ＨＣｌ（２５００ｍＬ、１０．０モル）の１，４−ジオキサン溶液を加えた。混合物を６０〜６５℃で１．５時間よく撹拌し、５０℃に冷却する。合計４時間後、１，４−ジオキサン中の４Ｎ  ＨＣｌをさらに添加し（１０００ｍＬ）、６５℃への加熱を再開した。この温度で１時間後、加熱を停止し、混合物を撹拌しながら一晩室温に冷却させる。混合物を大きな焼結漏斗でろ過する。収集した固体を新鮮な１，４−ジオキサンで洗浄し、次いで簡単に乾燥させる。バルクフィルターケーキを１０Ｌフラスコに戻し、水（２Ｌ）及び酢酸エチル（３．５Ｌ）と共に激しく撹拌する。次いで、濃アンモニア（４４０ｍＬ）を添加することにより混合物をアルカリ性にする。溶液をろ過し、次いで５Ｌの分液漏斗に移す。水層を分離し、酢酸エチル（０．５Ｌ）で再び抽出する。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮する。固体を４５℃で真空乾燥して１０１．３ｇを得る。粗生成物を温無水ＴＨＦ（２．２Ｌ）中に懸濁させ、イソヘキサンを用いて湿式充填したシリカのパッド（１ｋｇ）に充填する。生成物を酢酸エチルで溶出する。合わせた画分を部分的に濃縮し、得られた沈殿物をろ過により収集し、４０℃で一晩真空乾燥して、標記化合物（６０．９ｇｍ、６０％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３０９．２［Ｍ＋１］＋。
調製１２
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（３−（５−シアノピラジン−２−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−メトキシフェノキシ）プロピルカルバメート
【化１４】
2019218361.tif 000015
【００５７】
エアースターラーロッド及びパドル、温度計、均圧滴下漏斗及び窒素バブラーを備えた５Ｌのフランジネック丸底フラスコに、５−（５−（２−ヒドロキシ−６−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル（４７．０ｇ、１５２ｍｍｏｌ）及び無水ＴＨＦ（１．２Ｌ）を装入する。撹拌懸濁液を窒素下で０℃に冷却する。大きなマグネチックスターラーバー、温度計、及び窒素バブラーを備えた別の２Ｌ  ３首丸底フラスコに、トリフェニルホスフィン（４４．０ｇ、１６８ｍｍｏｌ）及び無水ＴＨＦ（６００ｍＬ）を装入する。撹拌した溶液を窒素下で０℃に冷却し、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（３４．２ｇ、１６９ｍｍｏｌ）を加え、白濁溶液を形成させる。３〜４分後、無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のｔ−ブチル−Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−カルバメート（３０．３ｇ、１７３ｍｍｏｌ）の溶液を加え、混合物を３〜４分間撹拌する。次いで、この混合物を出発物質の撹拌懸濁液に０℃で５分間かけて添加する。反応混合物はすぐに暗色の溶液になり、室温までゆっくりと温める。６．５時間後、無水ＴＨＦ（１５０ｍＬ）中のＰＰｈ３（８ｇ）、ＤＩＡＤ（６．２ｇ）及びカルバメート（５．４ｇ）を用いて上記のようにしてより多くの試薬を調製する。この混合物を反応混合物に加え、−５℃に冷却し、混合物を一晩放置して室温まで温める。溶媒を真空中で除去する。得られた粘稠な溶液をシリカパッド上に充填し、生成物を酢酸エチルで溶出する。濃縮画分を別々にＭｅＯＨで摩砕し、得られた固体をろ過によって回収する。合わせた固形物を再びＭｅＯＨ（４００ｍＬ）で摩砕し、次いでろ過により単離し、５０℃で一晩真空乾燥させて、標記化合物（３１．３ｇ、４４％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４６６．２［Ｍ＋１］＋。
実施例２
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル二塩酸塩
【化１５】
2019218361.tif 000016
【００５８】
エアースターラーロッド及びパドル、温度計、及びバブラーを取り付けた空気凝縮器を備えた５Ｌのフランジネック丸底フラスコに、ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（３−（５−シアノピラジン−２−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−メトキシフェノキシ）プロピルカルバメート（３０．９ｇ、６６．３ｍｍｏｌ）及び酢酸エチル（３Ｌ）を装入する。機械的に撹拌された黄色の懸濁液を１０℃直下まで冷却する。次いで、氷浴を所定の位置にして、レクチャーボトルからの塩化水素を、ガス注入管を通して１５分間激しく泡立てる。５時間後、混合物は外観が顕著に濃厚になる。固体をろ過によって収集し、酢酸エチルで洗浄し、次いで６０℃で一晩真空乾燥して、標記化合物（３０．０ｇ、１００％）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ２．０５（ｍ，２Ｈ），２．９６（ｍ，２Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），４．１２（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），６．０８（ｂｒ  ｓ，３Ｈ），６．７７７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７８２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．３４（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．５５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．７１（ｓ，１Ｈ），１０．８３（ｓ，１Ｈ），１２．４３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６６．２［Ｍ＋１］＋。
実施例３
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル
【化１６】
2019218361.tif 000017
【００５９】
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル二塩酸塩（３．０ｇ、６．８４ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）に懸濁する。１Ｎ  ＮａＯＨを添加する（２００ｍＬ，２００ｍｍｏｌ）。混合物を窒素下、室温で５時間磁気的に撹拌する。固体をろ過により収集し、水で十分に洗浄する。フィルターケーキを５０℃で一晩真空乾燥して、遊離塩基（２．２６ｇ、９０％）を黄色固体として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１．８１（ｍ，２Ｈ），２．７３（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），４．０９（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），６．７６（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），６．９３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．３１（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．６７（ｓ，１Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ／ＥＳ  ｍ／ｚ  ３６６．２［Ｍ＋１］＋。
実施例４
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸塩
【化１７】
2019218361.tif 000018
【００６０】
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル（１．０ｇ、２．７４ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１００ｍＬ）に懸濁する。ＭｅＯＨ（２．７４ｍＬ、２．７４ｍｍｏｌ）中のメタンスルホン酸の１Ｍ溶液を撹拌しながら混合物に滴下する。固体をほぼ完全に溶解し、超音波処理し、１５分間撹拌し、ろ過し、５０ｍＬまで濃縮する。この溶液を−１５℃で一晩冷却し、形成した固体をろ過によって集める。固体を真空オーブンで一晩乾燥して、黄色固体（０．９３８ｇ、７４％）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１．９７（ｍ，２Ｈ），２．２８（ｓ，３Ｈ），２．９５（ｍ，２Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），４．０９（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），６．７５３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７６６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．３３（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｂｒ  ｓ，３Ｈ），８．４９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．６４（ｓ，１Ｈ），１０．７０（ｓ，１Ｈ），１２．３１（ｓ，１Ｈ）。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６６．２［Ｍ＋１］＋。
ルートＤ
調製１３
１−［２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル］エタノン
【化１８】
2019218361.tif 000019
【００６１】
２２Ｌフラスコに、１−（２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）エタノン（１３００ｇ、７．８２ｍｏｌ）及びＤＭＦ（１０．４Ｌ）を加え、撹拌して溶液を得る。炭酸カリウム（２７００ｇ、１９．５４ｍｏｌ）を少しずつ加え、混合物を少なくとも３０分間撹拌する。温度を＜３０℃に維持しながら、添加漏斗を用いて、塩化４−メトキシベンジル（１４７００ｇ、９．３９ｍｏｌ）をこの混合物に２．５時間かけて滴下する。反応混合物を３５℃に加温し、反応をその温度で１２時間保持する。反応変換をＨＰＬＣでモニターし、３５℃で１３時間後に完了したとみなす。スラリーをろ過し、得られた固体をＤＭＦ（１Ｌ）で洗浄する。ろ液の酢酸エチル及び水による抽出処理後、濃縮し、ろう状の黄色の固体が得られる。ろう状の黄色固体にメチルｔ−ブチルエーテル（２．６Ｌ）を加える。得られたスラリーを撹拌する。今や自由に流れるスラリーをろ過し、メチルｔ−ブチルエーテル（１Ｌ）で洗浄する。白色固体を真空乾燥して、標記化合物の標記化合物（１５３９ｇ、６９％）を得る。融点１０５〜１０７℃。
調製１４
１−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−３，３−ビス（メチルチオ）プロプ−２−エン−１−オン
【化１９】
2019218361.tif 000020
【００６２】
窒素雰囲気下の無水ＤＭＳＯ（１１．０Ｌ）中のリチウムｔｅｒｔ−ブトキシド（６０２．４ｇ、７．５２ｍｏｌ）の混合物に、１−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）エタノン（１０００．０ｇ、３．４９ｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を３０分間撹拌し、内部温度を３０℃未満に維持しながらＣＳ２（２５９ｍＬ、４．２９６ｍｏｌ）を１〜１．５時間かけてゆっくりと添加する。周囲温度で少なくとも１時間撹拌した後、内部温度を３０℃未満に維持しながらヨードメタン（１０００ｇ、７．０４５ｍｏｌ）をゆっくりと添加する。得られた混合物を周囲温度で３０分〜１時間撹拌する。ＨＰＬＣにより反応の完了を確認する。得られた反応混合物を冷却し、続いて水及び酢酸エチルで抽出した。得られた有機部分を濃縮してスラリーを得、これをろ過し、酢酸エチル（１Ｌ）、続いてメチルｔ−ブチルエーテル（２×１Ｌ）で洗浄する。単離した固体を真空オーブン中、４０℃で乾燥させて、標記化合物（１０５７ｇ、７７％）を得る。融点９３〜９４℃；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３９１．２［Ｍ＋１］＋。
調製１５
（Ｅ）−５−（３−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１−（メチルチオ）−３−オキソプロプ−１−エニルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル
【化２０】
2019218361.tif 000021
【００６３】
乾燥した不活性の２２Ｌフラスコに、水素化ナトリウム（１５９．２ｇ、３．９８ｍｏｌ）及びＴＨＦ（１０．４Ｌ）を加える。混合物を５〜１５℃に冷却する。水素の放出を制御するために、５−イソシアノピラジン−２−アミン（３８２．２ｇ、３．１８ｍｏｌ）を３０分間かけて４回に分けて添加し、発泡が添加の間に沈静化し、温度を１０℃に維持することを可能にする。温度を１５℃に上昇させながら混合物を１５〜９０分間撹拌する。反応混合物に、１−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−３，３−ビス（メチルチオ）プロプ−２−エン−１−オン（１０３６ｇ、２．６５ｍｏｌ）を、発泡を制御するため小分けにして添加する。得られたスラリーを１５分間撹拌する。混合物を６６℃で穏やかに還流するまで加熱する。反応変換をＨＰＬＣでモニターする。反応混合物を冷却水（１４．２Ｌ）中でクエンチし、続いて酢酸エチルで抽出する。有機部分を濃縮してスラリーを形成し、それをろ過して標記化合物（９５７ｇ、７８％）を得る。融点１２８〜１３５℃；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４６３．２［Ｍ＋１］＋。
調製１６
５−（５−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル
【化２１】
2019218361.tif 000022
【００６４】
ＥｔＯＨ（１１．２８Ｌ）及び酢酸（３１８ｍＬ、５．５４５ｍｏｌ）を合わせる。反応物を窒素パージしながらブリーチスクラバー（ｂｌｅａｃｈ  ｓｃｒｕｂｂｅｒ）に通気する。（Ｅ）−５−（３−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１−（メチルチオ）−３−オキソプロプ−１−エニルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル（９４０ｇ、１．９３１ｍｏｌ）及びＥｔＯＨ／酢酸溶液を２２Ｌの反応フラスコに加える。得られた褐色スラリーにヒドラジン一水塩（１９７ｇ、３．９３５ｍｏｌ）を加え、わずかな発熱を生じる。得られた黄色スラリーをゆっくりと６５〜７０℃に加熱し、ＨＰＬＣでモニターする。反応の持続時間は１時間未満である。濃いスラリーを１〜２時間かけて３０℃未満に徐々に冷却する。スラリーをろ過し、冷ＥｔＯＨで洗浄する。この物質を４０℃で真空乾燥して、標記化合物（８２０ｇ、９９．１％）を得る。融点２１５〜１１７℃；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４２９．２［Ｍ＋１］＋。
調製１７
５−（５−（２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル二塩酸塩
【化２２】
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【００６５】
以下の全ての操作は、ＨＣｌガス発生を制御するために苛性スクラバーシステムに通気される。５−（５−（２−メトキシ−６−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル（１．２４ｋｇ、２．８９ｍｏｌ）及びジオキサン中４Ｎ  ＨＣｌ（２６．０６ｋｇ、９９．２８モル）を６０Ｌのガラス反応器に入れる。スラリーを６０〜７０℃にゆっくりと加熱する。反応をＨＰＬＣでモニターする。９時間後、反応は完了したと判断される。褐色のスラリーを２０℃に冷却し、一晩保持する。酸性反応混合物をろ過し、ケーキを酢酸エチル（７Ｌ）で洗浄する。湿ったケーキを一定重量まで真空乾燥させて、標記化合物（１０１０ｇ、補正収率９１．８４％）を得る。融点２２５〜２２８℃（遊離塩基）；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３０９．２［Ｍ＋１］＋。
調製１８
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（３−（５−シアノピラジン−２−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−メトキシフェノキシ）プロピルカルバメート
【化２３】
2019218361.tif 000024
【００６６】
ＴＨＦ（６．１８Ｌ、１０容量）中で５−（５−（２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル（６１８ｇ、１．６２ｍｏｌ）をスラリー化し、アセトン／氷浴で５〜０℃に冷却する。トリエチルアミン（３３０ｇ、３．２５ｍｏｌ）を、添加漏斗を通して−５〜５℃で３０〜４０分間かけて添加する。得られたスラリーを−５〜５℃で６０〜９０分間撹拌する。不溶性トリエチルアミン塩酸塩をろ過し、フェノール（（５−（２−ヒドロキシ−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルの溶液を適切な反応容器に収集する。ケーキをＴＨＦ（１．２４Ｌ）ですすぐ。このフェノールのＴＨＦ溶液を必要になるまで１５〜２０℃に保持する。トリフェニルホスフィン（１０７４ｇ、４．０５ｍｏｌ）を室温でＴＨＦ（４．３３Ｌ）に溶解する。透明な無色の溶液をアセトン／氷浴で−５〜５℃に冷却する。ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（７９５ｇ、３．８９ｍｏｌ）を滴下漏斗から４０〜６０分かけて滴下し、温度を１０℃未満に保つ。得られた濃厚な白色スラリーを冷却して−５〜０℃に戻す。ｔｅｒｔ−ブチル３−ヒドロキシプロピルカルバメート（７１７ｇ、４．０５モル）を最低限のＴＨＦ（８００ｍＬ）に溶解する。ｔｅｒｔ−ブチル３−ヒドロキシプロピルカルバメート／ＴＨＦ溶液を、添加漏斗を介して−５〜５℃で２０〜３０分かけて試薬スラリーに添加する。調製した試薬を、使用準備が整うまで−５〜０℃の氷浴中で撹拌する。
【００６７】
調製した試薬スラリー（２０％）を１５〜２０℃で基質溶液に添加する。残りの試薬は氷浴に戻される。基質溶液を周囲温度で３０分間撹拌し、ＨＰＬＣ用にサンプリングする。試薬の第２の約２０％部分を基質に添加し、周囲温度で撹拌し、以前と同様にサンプリングする。試薬の添加は、ＨＰＬＣによる反応完了のモニタリングを続けながら継続される。完了した反応物を濃縮し、温ＭｅＯＨ（４．３３Ｌ、５０〜６０℃）で摩砕し、続いて氷浴で冷却する。得られた黄色の沈殿物をろ過し、冷ＭｅＯＨ（２Ｌ）ですすぎ、一定重量まで乾燥して、標記化合物の標記化合物（５４４ｇ、７２％）を得る。融点２１４〜２１６℃；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４６６．２［Ｍ＋１］＋。
実施例５
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩
【化２４】
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【００６８】
３０Ｌ反応器中でｔｅｒｔ−ブチル３−（２−（３−（５−シアノピラジン−２−イルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−メトキシフェノキシ）プロピルカルバメート（１４３０ｇ、３．０７ｍｏｌ）をアセトン（２１．５Ｌ）でスラリー化する。メタンスルホン酸（１４８４ｇ、１５．３６ｍｏｌ）を、添加漏斗を通して中程度の流れで加える。スラリーを約５２℃で１〜３時間加熱還流し、ＨＰＬＣ分析による反応完了をモニターする。完了した反応物を還流から４．５時間かけて１５〜２０℃に冷却する。５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルジメシラート塩の黄色のスラリーをろ過し、アセトン（７Ｌ）ですすぎ、真空オーブン中で乾燥する。ジメシルレート塩（１６０８ｇ、２．８８ｍｏｌ）を水（１６Ｌ）中でスラリー化する。水酸化ナトリウム（水性５０％、２２８ｇ、２．８５ｍｏｌ）をゆっくりとスラリーに注ぐ。スラリーを６０℃に加熱し、１時間撹拌する。次にこれを４時間かけて１６℃に冷却し、ろ過する。湿ったフィルターケーキをアセトン（４Ｌ）ですすぎ、４０℃の真空オーブン中で一定重量まで乾燥させて、標記化合物（８３３ｇ、９４％）を得る。融点２２２．６℃；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６６．２［Ｍ＋１］＋。
代替の調製、実施例５
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩
【００６９】
粗５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩を以下の手順を用いて精製する。工業グレード５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（１２２１ｇ、２．５５ｍｏｌ）を、１：１アセトン／水（１４．７Ｌ）の溶媒混合物中でスラリー化する。混合物を５０〜５５℃に加温することにより固体を溶解する。この溶液を５０〜５５℃で０．２２μカートリッジフィルターを通して研磨ろ過（ｐｏｌｉｓｈ  ｆｉｌｔｒａｔｅ）する。この溶液をゆっくりと約４２〜４５℃のシーディング温度まで冷却し、シーディングする。ゆっくりとした冷却を、次の３０〜６０分にわたって継続して、核生成を確認する。薄いスラリーを３８℃から１５℃まで３時間かけて冷却する。真空蒸留を準備し、アセトンを１１０〜９０ｍｍ及び２０〜３０℃で除去する。混合物を３０〜１５℃まで１４時間かけて冷却し、１５℃で２時間保持し、次いでろ過する。再結晶した物質を１９：１の水／アセトン（２Ｌ）で、次いで水（６Ｌ）ですすぎ、４０℃の真空オーブン中で一定重量まで乾燥させて標記化合物（１０２４ｇ、８３．９％）を得る。融点２２２．６℃；ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６６．２［Ｍ＋１］＋。
【００７０】
位置感応検出器を有する４０ｋＶ及び４０ｍＡで動作するＣｕＫα源（λ＝１．５４０５６オングストローム）を備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｄ８  Ａｄｖａｎｃｅ粉末回折計でＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンを得ることができる。各サンプルは、０．６ｍｍの発散スリット、１０．３９ｍｍの検出スリットで、２θ±０．０２で０．０２６°のステップサイズ、０．３秒のステップ時間を用いて、２θ±０．０２で４°〜３５°の間で走査される。一次及び二次ソーラースリットはそれぞれ２°であり、抗散乱スリット（ａｎｔｉｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｓｌｉｔ）は６．１７ｍｍであり、空気散乱シンク（ａｉｒ  ｓｃａｔｔｅｒ  ｓｉｎｋ）が適所にある。
【表１】
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【００７１】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析は、Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ  ＤＳＣ装置（モデルＤＳＣ８２２ｅ）で実施することができる。サンプルを、ピンホール付き密閉アルミニウムパン内で窒素パージ５０ｍＬ／分と共に、１０℃／分にて、２５〜３５０℃で加熱する。熱重量分析（ＴＧＡ）は、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＴＧＡ装置（Ｍｏｄｅｌ  ＴＧＡ／ＳＤＴＡ  ８５１ｅ）で行うことができる。サンプルを、ピンホール付き密閉アルミニウムパン内で窒素パージ５０ｍＬ／分と共に、１０℃／分にて、２５℃〜３５０℃で加熱する。ＤＳＣからの熱プロファイルは、８０℃〜１４０℃の弱い広範な吸熱を示し、続いて２２２℃開始（２２５℃、ピーク）で鋭い融解吸熱を示す。２５〜１４０℃のＴＧＡでは４％の質量損失が見られる。
【００７２】
以下のアッセイの結果は、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩またはその塩の溶媒和物が、ＣＨＫ１阻害剤、ＣＨＫ２阻害剤、及び抗癌剤として有用であるという証拠を示す。本明細書で使用される場合、「ＩＣ５０」は、その薬剤について可能な最大阻害応答の５０％を生じる薬剤の濃度を指し、「ＥＣ５０」は、その薬剤に対して可能な最大応答の５０％を生じる薬剤の濃度を指す。
【００７３】
ＣＨＫ１生化学アッセイ
ＣＨＫ１生化学活性に対する化合物の効果は、ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを用いて決定することができる。このアッセイでは、テルビウム標識抗体を使用して、キナーゼ、フルオレセイン標識基質、及びＡＴＰの反応から形成されたリン酸化生成物を検出する。抗体は、リン酸化基質に結合し、アクセプターシグナル（フルオレセイン）対ドナーシグナル（テルビウム）の比として計算されるＴＲ−ＦＲＥＴ値の増加をもたらす。
【００７４】
キナーゼ反応（２５μｌの反応体積）を、９６ウェルハーフエリア黒ポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａ、カタログ番号３６９４）中で実施する。反応はＡＴＰの添加により開始される。最終反応条件は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、２ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０４ｎＭフルオレセイン−ＰＫＣ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＰＶ３５０６）、３０μＭ  ＡＴＰ、１．５ｎＭ活性ＣＨＫ１酵素（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号１４−３４６）、４％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ及び実施例２の化合物の段階希釈（１：３段階希釈、２０μＭ、１０点から開始）である。ＡＴＰ添加後、反応物を室温で７５分間インキュベートし、次いで１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２．１ｎＭ  Ｔｂ−ｐＳｅｒ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＰＶ３５７４）を含む２５μｌのＴＲ−ＦＲＥＴ希釈緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号ＰＶ３５７４）の添加で終了させる。クエンチした反応物を室温で６０分間インキュベートし、次いでＥｘ３４０ｎｍ、Ｅｍ４９５ｎｍ及びＥｍ５２０ｎｍ波長のフィルターを備えるＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社のＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを用いてＴＲ−ＦＲＥＴを測定した。
【００７５】
ＩＣ５０測定のために、各プレート上で行った対照からのＴＲ−ＦＲＥＴ比を用いて、各濃度の阻害パーセントを計算する。次に、１０点化合物濃度データを、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ  ４．０を使用して４パラメータロジスティック方程式に適合させる。得られた曲線から、絶対値のＩＣ５０値を算出する。このアッセイにおいて実施例２の化合物は、＜０．００１μＭのＩＣ５０を有すると測定された。これは、本発明の化合物がＣＨＫ１の強力な阻害剤であることを実証する。
ＣＨＫ２生化学アッセイ
【００７６】
ＣＨＫ２生化学活性に対する化合物の効果は、ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを用いて決定することができる。このアッセイでは、テルビウム標識抗体を使用して、キナーゼ、フルオレセイン標識基質、及びＡＴＰの反応から形成されるリン酸化生成物を検出する。抗体は、リン酸化基質に結合し、アクセプターシグナル（フルオレセイン）対ドナーシグナル（テルビウム）の比として計算されるＴＲ−ＦＲＥＴ値の増加をもたらす。
【００７７】
キナーゼ反応（２５μｌの反応体積）を、９６ウェルハーフエリアブラックポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａ、カタログ番号３６９４）中で実施する。反応はＡＴＰの添加により開始される。最終反応条件は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、２ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、１０４ｎＭフルオレセイン−ＰＫＣ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＰＶ３５０６）、３０μＭ  ＡＴＰ、２．５ｎＭ活性ＣＨＫ２酵素（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号１４−３４７）、４％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ及び実施例２の化合物の段階希釈（１：３段階希釈、２０μＭ、１０点から開始）である。ＡＴＰ添加後、反応物を室温で７５分間インキュベートし、次いで１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２．１ｎＭ  Ｔｂ−ｐＳｅｒ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＰＶ３５７４）を含む２５μｌのＴＲ−ＦＲＥＴ希釈緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号ＰＶ３５７４）の添加で終了させる。クエンチした反応物を室温で６０分間インキュベートし、次いでＥｘ３４０ｎｍ、Ｅｍ４９５ｎｍ及びＥｍ５２０ｎｍ波長のフィルターを備えるＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社のＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを用いてＴＲ−ＦＲＥＴを測定した。
【００７８】
ＩＣ５０測定のために、各プレート上で行った対照からのＴＲ−ＦＲＥＴ比を用いて、各濃度の阻害パーセントを計算する。次に、１０点化合物濃度データを、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ  ４．０を使用して４パラメータロジスティック方程式に適合させる。得られた曲線から絶対値のＩＣ５０値を算出する。このアッセイにおいて実施例２の化合物は、＜０．００４７μＭのＩＣ５０を有すると測定された。これは、本発明の化合物がＣＨＫ２の強力な阻害剤であることを示す。
【００７９】
ＣＨＫ１自己リン酸化細胞アッセイ
ＣＨＫ１の阻害剤は、タンパク質のキナーゼ活性が、ＤＮＡ損傷応答が活性化された細胞における基質をリン酸化するのを防止する。ＣＨＫ１の容易に検出可能な基質は、ＣＨＫ１自体の自己リン酸化部位であり、セリン２９６である。以下の免疫ブロットアッセイは、ＣＨＫ１上のセリン２９６のリン酸化量及び間接的にＣＨＫ１タンパク質キナーゼの活性レベルを測定するのに使用できる。ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣから購入）を、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（商標））、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ（商標））、１×ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ（商標））を補充した、ＭＥＭ  ｗ／Ｅａｒｌｅ’ｓ塩類（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ｗ／Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ（商標））中で培養し、１×１０５細胞を２４ウェル細胞培養プレートの１ウェルあたり６００μＬのＭＥＭ培養培地（上記）にプレーティングした。細胞を３７℃、５％ＣＯ２、及び湿度９５％〜１００％で２４時間インキュベートする。培養培地中のドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ）の４μＭストックの１６μＬを各適切なウェルに添加して１００ｎＭのドキソルビシンの最終濃度を作製する。ＣＨＫ１阻害剤化合物を添加する前に、プレートをインキュベーターにさらに２４時間戻す。化合物を１００％ＤＭＳＯ中で、１０ｍＭで可溶化し、次いで４０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中で２ｍＭに希釈し、次いで培地＋４％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯで１００μＭに希釈する。続いて化合物（１：３）の連続希釈を１００μＭ〜０．００５μＭの範囲にわたって調製する。化合物ストックの６６μＬをプレート中の適切なウェルに添加して、０．４％（ｖ／ｖ）の最終ＤＭＳＯ濃度及び最終化合物の濃度範囲１μＭ〜０．０００５μＭを生成する。プレートをインキュベーターにさらに２時間戻し、次いで細胞溶解及び処理のために取り出した。培地をプレートから取り出し、各ウェルを０．５ｍｌの氷冷ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（商標））で１回洗浄し、全ての液体を除去し、プレートを手順の残りの間氷上に置く。各ウェルに、ホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）及びプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含むＣｅｌｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる氷冷溶解緩衝液７５μＬを添加する。１０分後、各ウェルをこすり取り、溶解物を氷上の１．５ｍＬのポリプロピレン製微量遠心管に移す。各溶解物を、水／氷浴中に懸濁させながら、プレートのキュフォンソニケーター（Ｍｉｓｏｎｉｘ）で４５秒間超音波処理する。各サンプル５０μＬを、４×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（２４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４０％グリセロール、０．０５％ブロモフェノールブルー、８％ｗ／ｖ  ＳＤＳ及び２０％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール）２５μＬを含む０．５ｍＬポリプロピレン製微量遠心管に移し、９５℃で５分間加熱し、−８０℃で凍結保存する。残りの溶解物をタンパク質濃度の測定に使用する（ＢＣＡ（商標）タンパク質アッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。試料緩衝液中の各細胞溶解物５  μｇをＥ−９６ウェルゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に適用し、メーカーの使用説明書に従って電気泳動に付す。当技術分野で十分に理��されている手順（Ｔｏｗｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９）に従って、タンパク質をゲルからＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動転写する。膜を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳＴ）で短時間すすいで、ＴＢＳＴ／５％（ｖ／ｖ）再構成カーネーション（登録商標）インスタントミルク中に２５℃で１時間浸漬した。膜をＴＢＳＴで５分間４回洗浄し、次いでウサギ抗ホスホＣＨＫ１（セリン２９６）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の適切な希釈液を含むＴＢＳＴ／５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中に４℃で２４時間浸漬する。膜を２５℃で５分間ＴＢＳＴで４回洗浄し、次いでＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にコンジュゲートしたロバ抗ウサギＩｇＧの適切な希釈物を含むＴＢＳＴ／５％ミルク中に２５℃で２時間浸して、自己リン酸化ＣＨＫ１タンパク質を検出する。膜を２５℃で５分間ＴＢＳＴで再び４回洗浄する。膜上に固定された抗原−抗体−レポーターコンジュゲートを、化学発光イメージャ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を使用してメーカーが推奨するように、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｆｅｍｔｏ  ＨＲＰ−検出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）で検出する。ホスホ−ＣＨＫ１（ｓｅｒ２９６）バンド強度は、「Ｔｏｔａｌ  Ｌａｂ」ソフトウェア（非線形動力学）を用いて計算する。ドキソルビシン誘発ＣＨＫ１自己リン酸化の阻害パーセントは、以下の式を用いて計算される：阻害％＝（試料ホスホＣＨＫ１バンド強度−ドキソルビシンなし陰性対照ホスホＣＨＫ１バンド強度）／（ドキソルビシン陽性対照ホスホＣＨＫ１バンド強度−ドキソルビシンなし陰性対照ホスホＣＨＫ１バンド強度）×１００。実施例２の化合物は、このアッセイにおいて、＜０．０００５μＭのＥＣ５０を有することが測定される。このことは、本発明の化合物がＣＨＫ１の強力な阻害剤であることを実証する。
【００８０】
ドキソルビシン誘発Ｇ２Ｍチェックポイント抑止ＨｅＬａ細胞ベースの洞察アッセイ
ＣＨＫ１の阻害剤は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ドキソルビシンで処置したｐ５３マイナス腫瘍細胞におけるＧ２Ｍ  ＤＮＡ損傷チェックポイントを無効にする。Ｇ２Ｍチェックポイント抑止の測定は、セリン１０上のヒストンＨ３のリン酸化であり、これは、細胞がＧ２Ｍチェックポイントを横切って有糸分裂に入る後に起こる。以下の高含量イメージングアッセイを使用して、細胞中のヒストンＨ３のリン酸化を測定することができる。ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣから購入）を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを補充したＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ（商標））中で培養し、ポリＤ−リシンでコートしたクリアボトムブラックプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔカタログ番号３５０４６４０）（ウェルあたり１００μＬ）中に２０００細胞／ウェルでプレーティングする。次いで、プレートを細胞培養インキュベーター内で１８〜２４時間インキュベートする（３７℃、５％ＣＯ２及び９５％相対湿度）。最初のインキュベーションの後、６２５ｎＭのドキソルビシンを含むＧｉｂｃｏ（商標）ＭＥＭ培地１０％ＦＢＳの２０μＬをプレートの適切なウェルに加え、最終濃度１２５ｎＭとする。プレートをインキュベーターに２４時間戻し、Ｇ２Ｍチェックポイントで細胞を停止させるのに十分である。翌日、細胞を実施例２の化合物で処理する。実施例２の化合物を１００％ＤＭＳＯ中、１０ｍＭで可溶化し、次いで４％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ−ＭＥＭ中５０μＭから開始する１０倍ストックに希釈する。その後、化合物（１：２）の連続希釈液を５０μＭ〜０．３９μＭ範囲にわたって調製する。化合物ストックの１３μＬをプレート中の適切なウェルに添加して、０．４％の最終ＤＭＳＯ濃度及び５μＭ〜０．０３９μＭの間の最終化合物濃度範囲を生成する。プレートをインキュベーターにさらに７時間戻し、次いで固定のために取り出した。液体を注意深く各ウェルから除去し、１００μＬのＰＲＥＦＥＲ（商標）固定剤（Ａｎａｔｅｃｈ  ＬＴＤ．カタログ番号４１４）を添加する。プレートを室温で２０分間保持し、固定剤を除去し、次いで細胞をＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（商標）カタログ番号１４０４０）中の０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００  Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２８３１４）を１００μＬ／ウェルで１０分間添加することによって透過性にする。溶液を除去し、プレートを１ウェルあたり１００μＬのＤＰＢＳで２回洗浄し、続いて５０μｇ／ｍＬのＲＮＡａｓｅ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｒ−６５１３）を含む１００μＬのＤＰＢＳを室温で１時間にわたって加える。ＲＮＡａｓｅ溶液を除去し、ウサギ抗ｐＨＨ３（ｓｅｒ１０）（ＵＢＩカタログ番号０６−５７０）＋１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ（商標）カタログ番号１５２６０）の１：５００希釈物を含む５０μＬのＲＮＡａｓｅ溶液を各ウェルに添加することによってセリン１０（ｐＨＨ３）上でリン酸化されたヒストンＨ３の存在について細胞を染色した。プレートを密封し、４℃で一晩保温する。一次抗体は、各プレートを１ウェルあたり１００μＬのＤＰＢＳで２回洗浄することによって除去され、ＤＰＢＳ＋１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中のＡｌｅｘａ  ｄｙｅ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ１１００８）に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧの１：７５０希釈液５０μＬで置き換える。プレートは、光から保護するためにアルミホイルで覆われた室温で１時間保持される。プレートを再度１００μＬのＤＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬの１５ｎＭのＰＩ（元の溶液からＰＢＳでの１：１００希釈液、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号Ｐ３５６６）で置き換える。プレートは黒いシールでシールされ、プレートを光から保護する。プレートを３０分間インキュベートして核を染色する。プレートを、４８８ｎｍ励起（ＴＴＰ  ＬＡＢＴＥＣＨ  ＬＴＣ）を用いて、ＡＣＵＭＥＮ  ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）レーザー走査蛍光マイクロプレートサイトメーターでスキャンして、２Ｎ及び４Ｎを含むｐＨＨ３及びＤＮＡ含有量を測定する。ｐＨＨ３陽性細胞は、Ａｌｅｘａ４８８からの５１９ｎｍにおける平均強度によって同定される。ＰＩ／ＤＮＡからの６５５〜７０５ｎｍでの全強度を用いて、細胞周期（２Ｎ細胞、４Ｎ細胞）における個々の細胞及び亜集団を同定する。各集団の最終的な読み出しは、ｐＨＨ３の％、２Ｎの％及び４Ｎの％の最終アッセイ出力を生じる全細胞の％に対して正規化することによって決定される。次いで１００ｎＭの阻害剤対照化合物の最大濃度で細胞を処理して各化合物の最終％活性を測定することにより１００％活性を測定する。０％活性は、化合物処理なしに基づく。相対ＥＣ５０は、１００％の対照最大に対するｐＨＨ３の％を決定する、ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＢＡＳＥ（商標）、Ｅｘｃｅｌ適合、４つのパラメータのロジスティック適合を用いた曲線適合化、式２０５を用いることにより決定される。実施例２の化合物は、このアッセイにおいて、０．０１０５μＭのＥＣ５０を有することが測定される。これは、本発明の化合物がＧ２Ｍ  ＤＮＡ損傷チェックポイントを無効にすることを実証する。
【００８１】
ＥＣｔｆｓ（二倍過敏症）アッセイ
ＣＨＫ１の阻害剤は、Ｓ期のチェックポイントの無効化を介してゲムシタビン（または他の細胞傷害剤）の抗増殖活性を増強し、ＤＮＡ損傷を持続的かつ増加させることができる。ＤＮＡ損傷後の腫瘍細胞増殖の継続能力は、細胞がＤＮＡを複製する能力を決定することによって分析することができる。このアッセイは、細胞がＤＮＡ損傷を修復する機会を得た後に、そのＤＮＡを複製する細胞の能力を評価する。このアッセイでは、細胞をゲムシタビンで処理し、次に実施例２の化合物で処理する。回復期の後、Ｓ期中に放射性チミジンをＤＮＡに組み込む能力について細胞をアッセイする。ＥＣｔｆｓパラメータは、ＣＨＫ１阻害の非存在下でこのアッセイで測定したゲムシタビンのＧＩ９０濃度の半分を減少させるのに必要なＣＨＫ１阻害剤の濃度の尺度である。ＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣから入手）をＲＰＭＩ１６４０＋（Ｇｉｂｃｏ（商標））１０％（ｖ／ｖ）の熱不活性化ＦＢＳ中で増殖させる。これらの細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  ９６ウェル組織培養プレート上に１．３×１０３／ウェルでプレーティングする。細胞をプレーティングした後、３７℃に戻す前に、組織培養プレートを室温で４５分間保持する。ゲムシタビンを添加する前にプレートを２４時間インキュベートする。ゲムシタビンを添加する前に、培地を全てのウェルから取り出し、１ウェルあたり１５０μｌの新しいＲＰＭＩ培地と交換する。１０ｍＭのゲムシタビンストックをＰＢＳ中で調製する。ゲムシタビン希釈液をＲＰＭＩ培地中４倍濃度で調製し、１ウェルあたり５０μＬでウェルに添加した。使用されるゲムシタビンの最高最終濃度は８０μＭであり、希釈は４倍段階で進行する。２時間後、ゲムシタビン含有培地をウェルから取り出し、１５０μｌ／ウェルの新鮮ＲＰＭＩ培地で置き換える。実施例２の化合物（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を最初にＤＭＳＯ中で２０００倍の最終濃度に希釈し、次いでＲＰＭＩ培地で１：５００に希釈してウェルに添加するための４倍ストックを生成する。添加容量は５０μＬである。化合物の希釈は、５０００ｎＭで開始して、２倍段階で進行する。実施例２の化合物を添加して２４時間後、阻害剤を含む培地を吸引除去し、１ウェルあたり２００μＬの新鮮ＲＰＭＩ培地と交換する。実施例２の化合物を除去して７２時間後、トリチウム化チミジン標識を開始する。３Ｈ−チミジン（ＮＥＴ０２７Ｘ００１、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、比活性２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、完全ＲＰＭＩで１：２０に希釈して、０．０５ｍＣｉ／ｍＬの濃度を得る。この溶液の２０μＬを各ウェルに加え、１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンを生成する。細胞を２２時間標識する。３Ｈ−チミジンを含む培地をウェルから完全に除去する。次いで、プレートを−２０℃で数時間凍結する。組み込まれた３Ｈ−チミジンを含むＤＮＡを採取するために、プレートを数分間解凍し、次いで１ウェルあたり１２０μＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨを各ウェルに添加する。次いで、各プレートを３７℃で、ローテーター上でゆっくりと混合しながら１０分間インキュベートする。ＤＮＡをＦｉｌｔｅｒｍａｔｅ  １９６  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で採取し、９６ウェルＵｎｉｆｉｌｔｅｒ  ＧＦ／Ｃプレート（Ｐ���ｒｋｉｎＥｌｍｅｒ番号６００５１７４）上に収集する。細胞が標識された組織培養プレートのウェルを水で洗浄する（５×）。Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレート膜を、１ウェルあたりさらに４．５ｍＬで洗浄する（３×１．０ｍＬ及び最後に１．５ｍＬ洗浄）。ＵｎｉｆｉをＢａｃｋｓｅａｌ接着シート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で密封し、ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の５０μＬ／ウェルを加える。次いで、各プレートをトップシール透明接着シート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で密封する。１ウェルあたり１分でＴｏｐｃｏｕｎｔシンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でプレートを計数する。３Ｈ−チミジンカウント／分（ｃｐｍ）を分析及びプロットのためにＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）にエクスポートする。ゲムシタビン用量応答は、実施例２の化合物の各濃度について決定される。これを行うために、ゲムシタビンの非存在下での実施例｛２の化合物の濃度の平均ｃｐｍとして１００％の取り込みを設定し、ｃｐｍ＝０（１分あたりのカウントなし）として取り込まない（１００％阻害）と設定してｃｐｍを標準化する。Ｐｒｉｓｍでデータをプロットするために、ゲムシタビン濃度をｌｏｇ値に変換し、用量応答曲線を非線形回帰によって適合させる。上部と下部のどちらの適合も制限されない。ＥＣｔｆｓ値は０．３ｎＭである。さらに、３ｎＭの実施例２の化合物は、ＨＴ２９結腸癌細胞においてゲムシタビンのＥＣ５０を３７ｎＭから５ｎＭまで７倍減少させる。実施例２の化合物の作用はまた、ゲムシタビンについての５２から組み合わせに対する７３への増殖阻害の割合を増加させる。単独で、３ｎＭの［１］実施例２の化合物はＨＴ２９細胞の増殖にほとんど影響を与えない。
【００８２】
ＣＨＫ１インビボ標的阻害アッセイ
Ｃａｌｕ−６細胞（ＡＴＣＣ）を増殖培地（１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（商標））、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ（商標））、１×ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ（商標））を補充したＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ（商標））とのＥａｒｌｅ’ｓ塩とのＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で培養し、増殖させる。細胞を採取し、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、増殖培地（血清を含まない）中の１×１０６個の細胞を同量のＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリックス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＮＪ）と混合し、予め照射した（４．５Ｇｙ）ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮからの胸腺欠損ヌード）の側腹部に皮下注射する。移植後の１５日目（腫瘍サイズ＝１５０〜２００ｍｍ３）に、毎日１５０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内経路により動物に生理食塩水（Ｈｏｓｐｉｒａ、Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ）で新鮮に配合されたゲムシタビンを動物に投与する。６時間後、動物に、メタンスルホン酸／２０％カプチソール（ＣＹＤＥＸ、Ｏｖｅｒｌａｎｄ  Ｐａｒｋ、ＫＳ）のモル比で配合された実施例２の化合物を、１５ｍｇ／ｋｇの用量を下方に変化させる静脈内経路によって投与する。ＣＨＫ１阻害剤投与の２時間後に動物を屠殺し、腫瘍を採取し、ホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）及びプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含む氷冷Ｃｅｌｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＦＮＮ００１１）で直ちに処理する。腫瘍を、１５秒間高に設定した電動式組織ホモジナイザー（Ｐｏｗｅｒｇｅｎ  ７００）を用いて、氷冷した１５ｍＬのポリプロピレン円錐管中１．５〜２．０ｍＬの溶解緩衝液中で処理する。試料を氷上に保ったまま、２５ゲージの針を備えた１ｍＬのシリンジを通して４回、溶解物を吸引する。次に、０．３５ｍＬの腫瘍溶解物を、０．１５ｍＬの４×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（２４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８，４０％グリセロール、０．０５％ブロモフェノールブルー、８％ｗ／ｖ  ＳＤＳ及び２０％（ｖ／ｖ）ベータメルカプトエタノール）を含む１．５ｍＬのポリプロピレン微量遠心管に移す。次いで、サンプルを混合し、９５℃で５分間加熱し、Ｍｉｓｏｎｉｘ３０００プレートホーンソニケーターで高出力を用いて１分間超音波処理する。次いで、サンプルを氷上で保存するか、またはウェスタンブロットによる標的阻害評価のために−８０℃で保存する。残りの溶解物をタンパク質濃度の測定に使用する（ＢＣＡ（商標）ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。［１］試料緩衝液中の各腫瘍溶解物５μｇをＥ−Ｐａｇｅ９６ウェルゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に適用し、メーカーの使用説明書に従って電気泳動に付す。当技術分野で十分に理解されている手順（Ｔｏｗｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９７９）に従って、タンパク質をニトロセルロースプロトランＢＡ８３膜（Ｗｈａｔｍａｎ）に移す。次に膜を処理して、セリン２９６上で自己リン酸化されたＣＨＫ１タンパク質を測定する。膜を水、次いで１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳＴ）で短時間すすぎ、ＴＢＳＴ／５％（ｗ／ｖ）再構成Ｃａｒｎａｔｉｏｎ（登録商標）インスタントミルク中に２５℃で１時間浸漬する。次いで膜をＴＢＳＴで５分間４回洗浄する。膜を、ウサギ抗ホスホＣＨＫ１（セリン２９６）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の適切な希釈液中のＴＢＳＴ／５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中に、４℃で１６時間浸漬する。次に、膜を２５℃で５分間ＴＢＳＴで４回洗浄し、次いでＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にコンジュゲートしたロバ抗ウサギＩｇＧの適切な希釈物を含むＴＢＳＴ／５％ミルク中に２５℃で２時間浸漬して、ホスホ−ＣＨＫ１（ｓｅｒ２９６）を検出する。膜を２５℃で５分間ＴＢＳＴで４回洗浄する。メンブレン上に固定された抗原−抗体−レポーターコンジュゲートを、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｆｅｍｔｏ  ＨＲＰ−検出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）で、製造元の推奨にする方法で検出される。
【００８３】
信号はＦＵＪＩ  ＬＡＳ−４０００イメージングシステムを使用して検出され捕捉される。
Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＣＨＫ１（ｓｅｒ２９６）バンド強度は、「Ｔｏｔａｌ  Ｌａｂ」ソフトウェア（非線形動力学）を用いて計算される。ゲムシタビン誘発ＣＨＫ１自己リン酸化の阻害パーセントを、以下の式を用いて計算する：阻害％＝（試料ホスホＣＨＫ１バンド強度−平均ゲムシタビン（最大）陽性対照ホスホＣＨＫ１バンド強度）／（平均陰性対照（最小）ホスホＣＨＫ１バンド強度−平均ゲムシタビン（最大）陽性対照ホスホＣＨＫ１バンド強度）×１００。
【００８４】
実施例２の化合物は、このアッセイにおいて、０．０３ｍｇ／ｋｇのＣＨＫ１自己リン酸化のための標的調節有効用量５０（ＴＭＥＤ５０）を有すると測定される。
【００８５】
ヒト腫瘍異種移植片モデル
腫瘍死をもたらすＣＨＫ１阻害剤の能力は、Ｃａｌｕ−６肺及びＨＴ−２９結腸腫瘍異種移植の有効性モデルを用いてインビボで決定することができる。Ｃａｌｕ−６肺癌細胞（ＡＴＣＣ）を、増殖培地（１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（商標））、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ（商標））及び１×ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ（商標））を補充した、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ（商標）を含むＭＥＭ  ｗ／Ｅａｒｌｅ’ｓ塩（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で培養し、及びＨＴ−２９結腸癌細胞（ＡＴＣＣ）を増殖培地（１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（商標））を補充したＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ（商標）））で培養して、増殖させる。細胞を採取し、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、増殖培地（血清を含まない）中の５×１０６細胞（ＨＴ−２９）または１×１０６細胞（Ｃａｌｕ−６）を、同量のＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリクス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＮＪ）と混合し、次いでヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡからのＣＤ−１ｎｕ／ｎｕ）の側腹部に皮下注射した。移植後約１６日（１５０〜２００ｍｍ３）に、ゲムシタビンを毎日生理食塩水で新鮮に配合し、６０ｍｇ／ｋｇ用量の腹腔内経路により動物に投与する。２４時間後、静脈内経路によりメタンスルホン酸／２０％Ｃａｐｔｉｓｏｌ（ＣＹＤＥＸ、Ｏｖｅｒｌａｎｄ  Ｐａｒｋ、ＫＳ）のモル比で配合された実施例２の化合物を動物に投与する。休止１日後、投与を３サイクル以上繰り返す（ＣＨＫ１阻害剤オフセット＋２４時間で、Ｑ３Ｄｘ４）。各投与群は９匹の動物からなる。腫瘍応答は、治療過程中に週に２回行われる腫瘍体積測定によって決定される。腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）は、ビヒクル処置対照群の平均腫瘍サイズから、化合物処置群の平均腫瘍サイズの減少率として計算される。実施例２の化合物は、単独で、及びゲムシタビンと組み合わせて、ＨＴ−２９及びＣａｌｕ−６腫瘍異種移植片モデルの両方において優れた用量依存性抗腫瘍活性を示し、ゲムシタビン単独よりも腫瘍増殖阻害が最大で６倍増加する。
【００８６】
単一薬剤の有効性投与
腫瘍死をもたらすＣＨＫ１阻害剤の能力は、Ｃａｌｕ−６肺異種移植の有効性モデルを用いてインビボで決定することができる。Ｃａｌｕ−６肺癌細胞（ＡＴＣＣ）を上記のように培養する。細胞を採取し、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、増殖培地（血清を含まない）中の１×１０６個の細胞（Ｃａｌｕ−６）を同量のＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリックス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＮＪ）と混合し、次いでヌードマウスＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡからのＣＤ−１ｎｕ／ｎｕ）の側腹部に皮下注射する。移植（１５０〜２００ｍｍ３）後約１６日目に、実施例２の化合物を１５ｍｇ／ｋｇ（皮下（ＳＣ）、１日２回（ＢＩＤ×５日、休止２日）×３サイクルで投与する。腫瘍応答は、治療過程中に週に２回行われる腫瘍体積測定によって決定される。５日間のＢＩＤスケジュール（１５ｍｇ／ｋｇ）で投与した実施例２の化合物は、先に記載したゲムシタビンと実施例２の化合物との組み合わせスケジュールに優れた増殖阻害を提供する。完全な腫瘍退縮は迅速かつ耐久性がある。
【００８７】
単層増殖及び細胞毒性アッセイ
ＣＨＫ１阻害剤の有効性の１つの尺度は、制御されていない複製起点活性化のために培養中の癌細胞の増殖を阻害する能力である。（Ｃｏｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ６：２７６０−２７６７，２００７）。広範な種類の腫瘍に由来する細胞株におけるＣＨＫ１阻害剤の抗増殖活性の決定は、どの腫瘍型がＣＨＫ１阻害剤による化学療法に対して臨床的に応答性であり得るかを示す。以下に記載される細胞増殖アッセイは、ドイツのＯｎｃｏｔｅｓｔ、ＧｍｂＨで実施される。３０種の固形腫瘍細胞は、それぞれ１〜６種の異なる細胞株（Ｏｎｃｏｔｅｓｔ、ＧｍｂＨ）によって示される１３種の異なる腫瘍組織型に由来する。それらは、膀胱、脳、結腸、胃、肝臓、肺、乳房、卵巣、膵臓、腎臓及び子宮体の癌、ならびに黒色腫及び胸膜中皮腫から確立される。全ての細胞株は、患者由来の腫瘍異種移植片からのＯｎｃｏｔｅｓｔで確立されている（Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）．ドナー異種移植片の起源は、Ｆｉｅｂｉｇ  ｅｔ  ａｌ。（Ｆｉｅｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９２及び１９９９）に記載される。細胞株は、毎週１〜２回定期的に継代培養され、２０継代まで培養液中に維持される。全ての細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＰＡＡ、Ｃoｌｂｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及び０．１ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン（ＰＡＡ、Ｃoｌｂｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（ＰＡＡ、Ｃoｌｂｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃で増殖させる。これらの細胞株に対する化合物の細胞傷害活性を評価するために、改変ＰＩアッセイを使用する。簡潔に述べると、接着細胞をトリプシン処理により指数期培養から回収し、カウントし、９６ウェル平底マイクロタイタープレートで、細胞株に応じた細胞密度（４．０００〜２０．０００細胞／ウェル）でプレーティングする。細胞を付着させて指数関数的増殖を再開させるための２４時間の回復期間の後、１０μＬの、培養培地（６対照ウェル／プレート）または実施例２の化合物を含む培養培地を添加する。実施例２の化合物のストック溶液をＤＭＳＯ中に１ｍＭの濃度で調製する。その後の希釈は、以下のように完全ＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地で行う：ＤＭＳＯ原液を最初に１：２２（４．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ含有）に希釈する。この溶液を用いて、細胞培養培地中で連続希釈（半対数または２倍）を行う。最終希釈段階（１：１５）のために、それぞれの最終化合物溶液１０μＬ／ウェルを、１４０μＬ／ウェル培養培地に直接添加する。最終ＤＭＳＯ濃度は≦０．３％（ｖ／ｖ）である。実施例２の化合物は、１０点濃度曲線において３回適用して、処理を４日間続けた。４日間の処理の後、培地を除去し、７μｇ／ｍＬＰＩ水溶液２００μＬで置き換える。生存細胞の数を測定するために、細胞は凍結により透過性にされ、化合物による処理後にウェルに付着したままである全ての細胞が死滅する。最後に、ＰＩ蛍光をＣｙｔｏｆｌｕｏｒ  ４０００マイクロプレートリーダー（励起λ＝５３０ｎｍ、発光λ＝６２０ｎｍ）を用いて測定し、生存可能な全細胞数を決定する。増殖阻害は、試験／対照×１００（％Ｔ／Ｃ）値として表される。Ｔ／Ｃ値に基づいて、非線形回帰（ｌｏｇ［阻害剤濃度］対応答（％Ｔ／Ｃ））を用いて相対ＩＣ５０値を決定する。実施例２の化合物は、これらの腫瘍細胞株の大部分の増殖を、２０ｎＭ未満のＥＣ５０で阻害する。
【００８８】
５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩への小児細胞株のインビトロ応答
細胞溶解物は、最終濃度５及び５０ｎＭで２４時間、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）で処理した、胚性及び肺胞性横紋筋肉腫（それぞれＲＤ及びＳＪＣＲＨ３０）、骨肉腫（Ｓａｏｓ−２）及びユーイング肉腫（ＲＤ−ＥＳ）細胞株から得ることができる。
【００８９】
ウェスタンブロットは、上記の細胞溶解物を使用して実行することができる。前記ウェスタンブロットの分析は、細胞株を５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）で処理した場合にＣＨＫ１タンパク質レベルが変化しないこと、及び処理によりホスホＣＨＫ１（Ｓ３４５）レベルが増加することを示す。ＣＨＫ１阻害により、より高いレベルのＤＮＡ損傷が観察され得る。したがって、ＤＮＡ損傷のシグナルであるγＨ２ＡＸのレベルは、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）での処理により増加する。ＣＨＫ１阻害後に増加することが知られているホスホ−ＥＲＫ１／２（Ｔ２０２／Ｙ２０４）レベルもまた、４つの細胞株のうち３つにおいて増加し、非応答性ＲＤ−ＥＳ細胞株は４つのうち最もインビトロで感受性が低い。これらのデータはまた、ホスホ−ｈｎＲＮＰ−Ｃレベルの増加によっても支持されており、これは、ＲＤ−ＥＳ細胞系においても影響を受けないＣＨＫ１阻害のマーカーである。ホスホＡＫＴのレベルは、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）で処理した後に変化しないようである。
【００９０】
異種移植腫瘍モデル
以下のプロトコールは、有効薬学的成分に応答して腫瘍体積の減少を測定するために使用することができる。ヒトＮＢＭ癌細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ、番号ＣＲＬ−２２２６）を培養し、採取し、ＨＢＳＳ及びＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の１：１溶液２００μＬ中の５×１０６個の細胞をメスのＣＤ−１  ｎｕ／ｎｕマウス（２０−２４ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右後部側腹部に皮下注射する。培養中のヒトＮＢＭ癌細胞ＫＥＬＬＹ（Ｓｉｇｍａ−番号９２１１０４１１）を増殖させ、採取し、ＨＢＳＳとＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の１：１溶液２００μＬ中の５×１０６細胞を、メスＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウス（２０−２４ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右後部側腹部に皮下注射する。培養中のヒトＮＢＭ癌細胞ＩＭＲ−３２（ＡＴＣＣ、番号ＣＣＬ−１２７）を増殖させ、採取し、ＨＢＳＳとＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の１：１溶液２００μＬ中の５×１０６細胞をメスＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウス（２０−２４ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右後部側腹部に皮下注射する。
【００９１】
ヒトＲＭＳ癌細胞ＳＪＣＲＨ−３０（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）を培養で増殖させ、採取し、２００μＬのＨＢＳＳ中の５×１０６個の細胞を、メスの胸腺欠損ヌードマウス（２０−２２ｇ、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右後部側腹部に皮下注射する。ヒトの横紋筋肉腫癌細胞ＲＤ（ＡＴＣＣ、番号ＣＣＬ−１３６）を培養で増殖させ、採取し、２００μＬのＨＢＳＳ中の５×１０６個の細胞を、メスの胸腺欠損ヌードマウス（２０−２２ｇ、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右後部側腹部に皮下注射する。
【００９２】
全ての「ＣＴＧ」モデル（ヒトＲＭＳ、ＤＳＲＣＴ、ＥＷＳ、ＯＳ及びＬＭＳ患者由来異種移植モデルを包含する）では、メスのＮＣｒヌード自然発生突然変異マウス（５−８週齢、Ｔａｃｏｎｉｃ）は、特定の継代ロットからそれぞれ移植されたドナー動物から採取した腫瘍断片で側腹部領域の片側に移植される。
【００９３】
全ての「ＳＴ」モデル（ＲＭＳ及びＬＭＳを包含する）について、患者由来の異種移植片は、生存可能なヒト腫瘍組織から樹立され、腫瘍異種性を維持するために制限された回数だけ動物において継代培養される。皮下モデルでは、胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｒｌ：ＮＵ（ＮＣｒ）−Ｆｏｘｎ１ｎｕ）またはＣＢ−１７ＳＣＩＤマウス（ＣＲＬ−ＣＢ１７／Ｉｃｒ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＩｃｒＩｃｏＣｒｌ）は、特定の継代ロットからそれぞれ移植された宿主動物から採取した腫瘍断片で片側の側腹に注射または移植される。全ての試験で、移植後７日目から週２回の腫瘍増殖と体重を測定する。腫瘍の大きさが１５０〜３００ｍｍ３に達する時、動物をランダム化し、４〜７匹の動物のグループに分類する。試験化合物を適切なビヒクル（例えば、ビヒクルは滅菌水中の２０％Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）とすることができる）中に調製し、３日間連続して皮下投与し、その後４日間の投与休暇を行い、最低４週間反復する。腫瘍応答は、治療の過程で週に２回行われる腫瘍体積測定によって決定される。５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）は、以下の表２に示す％Ｔ／Ｃまたは％退縮値を有することが分かる。これらの結果は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）が、骨肉腫（ＣＴＧ−０２４２）、ユーイング肉腫（ＣＴＧ−０９９４）、ＤＳＲＣＴ（ＣＴＧ−０９２６）、ＲＭＳ（ＣＴＧ−１２１３、ＣＴＧ−１１１６、ＳＪＣＲＨ−３０及びＳＴ１６２）、及びＮＢＭ（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＫＥＬＬＹ、ＩＭＲ−３２）、ＬＭＳ（ＣＴＧ−１００６、ＳＴ１５４７）を含むヒト異種移植モデルの範囲において有意な抗腫瘍活性を示すことを示す。
【表２】
2019218361.tif 000027
【００９４】
異種移植腫瘍モデル：組み合わせの研究
組み合わせ療法は、腫瘍増殖を効果的にブロックし、単一の薬剤に応答してしばしば発症する獲得した腫瘍耐性を克服することができる癌治療の方法である。インビボＳＪＣＲＨ−３０  ＲＭＳモデルにおいて、肉腫標準治療、ドキソルビシンと組み合わせて、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）を試験することができる。（表３を参照されたい。）この組み合わせ有効性試験は、上記のように胸腺欠損ヌードマウスで行うことができる。この試験で使用したビヒクルは、滅菌水中の２０％Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）であり、３日間連続して皮下投与し、その後４日間の投与休暇を行い、最低４週間繰り返した。ドキソルビシン（滅菌水中５％デキストロース）は、１週間に１回静脈内投与され、他方５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）は、滅菌水中２０％Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中で投与され、３日間連続して皮下投与され、その後、４日間の投与休暇が行われる。治療期間は４週間続く。
【００９５】
単剤としての５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）の投与は、その時点で腫瘍再増殖が起こる３８日目までの初期完全応答を生じる。５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）＋ドキソルビシンによる腫瘍の治療は完全な応答をもたらし、腫瘍再増殖をもたらさない。（表３を参照；８７％退縮、ｐ＜０．００１）。５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）とドキソルビシンとの組み合わせは、有意な体重減少がないので、許容されるようである。これらの結果は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）とドキソルビシンとの組み合わせが、いずれかの薬剤の単独投与と比較して腫瘍増殖を阻害する上でより有効であり得ることを示唆する。    
【表３】
2019218361.tif 000028
【表４】
2019218361.tif 000029
【００９６】
表４に示されるように、小児肉腫細胞株は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）を用いたインビボ治療に対して非常に感受性である。５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）は、試験したマウスモデルのインビボでの小児肉腫のほぼ４１％（７／１７）において単一の薬剤として有効であり、結果は安定疾患から完全応答に及ぶ。インビボで評価した大人の肉腫モデル（１０／１２；８３％）の大部分は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）による単剤処置に感受性であった。５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）とドキソルビシン、イホスファミドまたはイリノテカンとの組み合わせは、ＳＪＣＲＨ３０異種移植片における獲得された耐性を回避するようである。
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月30日(2019.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
表４に示されるように、小児肉腫細胞株は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）を用いたインビボ治療に対して非常に感受性である。５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）は、試験したマウスモデルのインビボでの小児肉腫のほぼ４１％（７／１７）において単一の薬剤として有効であり、結果は安定疾患から完全応答に及ぶ。インビボで評価した大人の肉腫モデル（１０／１２；８３％）の大部分は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）による単剤処置に感受性であった。５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩（実施例５）とドキソルビシン、イホスファミドまたはイリノテカンとの組み合わせは、ＳＪＣＲＨ３０異種移植片における獲得された耐性を回避するようである。
本発明は、以下の態様を含む。
［１］
癌の治療方法であって、それを必要とする患者に、有効量の５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである化合物、またはその薬学的に許容される塩、または前記その薬学的に許容される塩の溶媒和物を投与することを含み、前記癌は、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群より選択される、方法。
［２］
前記癌は、神経芽細胞腫である、［１］に記載の方法。
［３］
前記癌は、横紋筋肉腫である、［１］に記載の方法。
［４］
前記横紋筋肉腫は、胞巣状横紋筋肉腫または胎児性横紋筋肉腫である、［３］に記載の方法。
［５］
前記癌は、骨肉腫である、［１］に記載の方法。
［６］
前記癌は、ユーイング肉腫である、［１］に記載の方法。
［７］
前記癌は、線維形成性小円形細胞腫瘍である、［１］に記載の方法。
［８］
前記癌は、平滑筋肉腫である、［１］に記載の方法。
［９］
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩である、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１０］
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］
前記塩は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルギ酸塩である、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１２］
前記塩は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル二塩酸塩である、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１３］
前記塩は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸塩である、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１４］
前記塩は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩である、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１５］
前記塩は、２θ±０．０２°＝１２．６４°、２１．２５°、及び２６．１５°にピークを有するＸ線粉末回折パターンを特徴とする結晶形態の、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩である、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１６］
前記化合物、その塩、またはその溶媒和物を、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤のうちの１つ以上と共に投与する、［１］〜［１５］のいずれか１項に記載の方法。
［１７］
前記方法は、電離放射線を投与することをさらに含む、［１］〜［１６］のいずれか１項に記載の方法。
［１８］
前記方法は、１つ以上の化学療法剤を投与することをさらに含む、［１］〜［１７］のいずれか１項に記載の方法。
［１９］
前記方法は、５−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン、ビンクリスチン、イホスファミド、イリノテカン、シクロホスファミド、及びタキソールからなる群から選択される１つ以上の化学療法剤を投与することをさらに含む、［１］〜［１７］のいずれか１項に記載の方法。
［２０］
神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群から選択される癌の治療のための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩、または前記その薬学的に許容される塩の溶媒和物の使用。
［２１］
前記癌は、神経芽細胞腫である、［２０］に記載の使用。
［２２］
前記癌は、横紋筋肉腫である、［２０］に記載の使用。
［２３］
前記横紋筋肉腫は、胞巣状横紋筋肉腫または胎児性横紋筋肉腫である、［２２］に記載の使用。
［２４］
前記癌は、骨肉腫である、［２０］に記載の使用。
［２５］
前記癌は、ユーイング肉腫である、［２０］に記載の使用。
［２６］
前記癌は、線維形成性小円形細胞腫瘍である、［２０］に記載の使用。
［２７］
前記癌は、平滑筋肉腫である、［２０］に記載の使用。
［２８］
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩である、［２０］〜［２７］のいずれか１項に記載の使用。
［２９］
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである、［２０］〜［２７］のいずれか１項に記載の使用。
［３０］
前記塩は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルギ酸塩である、［２０］〜［２７］のいずれか１項に記載の使用。
［３１］
前記塩は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル二塩酸塩である、［２０］〜［２７］のいずれか１項に記載の使用。
［３２］
前記塩は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸塩である、［２０］〜［２７］のいずれか１項に記載の使用。
［３３］
前記塩は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩である、［２０］〜［２７］のいずれか１項に記載の使用。
［３４］
前記塩は、２θ±０．０２°＝１２．６４°、２１．２５°、及び２６．１５°にピークを有するＸ線粉末回折パターンを特徴とする結晶形態の、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである、［２０］〜［２７］のいずれか１項に記載の使用。
［３５］
電離放射線と組み合わせた、［２０］〜［３４］のいずれか１項に記載の使用。
［３６］
１つ以上の化学療法剤と組み合わせた、［２０］〜［３５］のいずれか１項に記載の使用。
［３７］
５−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン、ビンクリスチン、イホスファミド、イリノテカン、シクロホスファミド、及びタキソールからなる群から選択される１つ以上の化学療法剤と組み合わせた、［２０］〜［３５］のいずれか１項に記載の使用。
［３８］
神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、及び平滑筋肉腫からなる群から選択される、癌の治療における使用のための、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである化合物、またはその薬学的に許容される塩、または前記その薬学的に許容される塩の溶媒和物。
［３９］
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである、［３８］に記載の使用のための化合物、またはその薬学的に許容される塩、またはその薬学的溶媒和物。
［４０］
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルである、［３８］に記載の使用のための化合物。
［４１］
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルギ酸塩である、［３８］に記載の使用のための化合物。
［４２］
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル二塩酸塩である、［３８］に記載の使用のための化合物。
［４３］
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸塩である、［３８］に記載の使用のための化合物。
［４４］
前記化合物は、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩である、［３８］に記載の使用のための化合物。
［４５］
前記化合物は、２θ±０．０２°＝１２．６４°、２１．２５°、及び２６．１５°にピークを有するＸ線粉末回折パターンを有する結晶形態の、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルメタンスルホン酸一水塩である、［３８］に記載の使用のための化合物。
［４６］
前記癌は、神経芽細胞腫である、［３８］〜［４５］のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
［４７］
前記癌は、横紋筋肉腫である、［３８］〜［４５］のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
［４８］
前記癌は、胞巣状横紋筋肉腫または胎児性横紋筋肉腫から選択される、［３８］〜［４５］のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
［４９］
前記癌は、骨肉腫である、［３８］〜［４５］のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
［５０］
前記癌は、ユーイング肉腫である、［３８］〜［４５］のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
［５１］
前記癌は、線維形成性小円形細胞腫瘍である、［３８］〜［４５］のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
［５２］
前記癌は、平滑筋肉腫である、［３８］〜［４５］のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
［５３］
前記使用は、電離放射線と同時に、別々に、または順次組み合わせられる、［３８］〜［５２］のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
［５４］
前記使用は、１つ以上の化学療法剤と同時に、別々に、または順次組み合わせられる、［３８］〜［５３］のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
［５５］
前記使用は、５−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン、ビンクリスチン、イホスファミド、イリノテカン、シクロホスファミド、及びタキソールからなる群から選択される、１つ以上の化学療法剤と同時に、別々に、または順次組み合わせられる、［３８］〜［５３］のいずれか１項に記載の使用のための化合物、その塩、またはその溶媒和物。
【外国語明細書】
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