(57)【要約】【課題】本発明はイメージング、動態評価を正確に実施可能であり、且つ、様々な小胞に汎用性が高く適応可能であり、小胞の本来の挙動や特性を評価することができる標識小胞、その製造方法等を提供することを目的とする。【解決手段】小胞をビオチンで標識してビオチン修飾小胞を得る工程（工程１）及び工程１で得られたビオチン修飾小胞と量子ドット付加されたアビジンを作用させ、アビジン類−ビオチンの結合を介して小胞を量子ドットで標識する工程(工程２)を含む、小胞を量子ドットで標識する方法、及び該標識方法によって標識小胞を製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
量子ドット付加されたアビジン類−ビオチン結合体で標識されていることを特徴とする、標識された小胞。
【請求項２】
小胞ひとつにつき１−５個の割合の量子ドットで標識されている、請求項１の標識された小胞。
【請求項３】
小胞が直径１０ｎｍ−８００ｎｍである、請求項１の標識された小胞。
【請求項４】
小胞が細胞外小胞である、請求項１の標識された小胞。
【請求項５】
細胞外小胞がエキソソームである、請求項１の標識された小胞。
【請求項６】
以下の工程を含む、量子ドット付加されたアビジン類−ビオチン結合体で標識された小胞の製造法；
工程１：小胞の膜上タンパク質をビオチンで標識してビオチン修飾小胞を得る工程；
工程２：工程１で得られたビオチン修飾小胞に、量子ドット付加されたアビジンを作用させ、アビジン類−ビオチンの結合を介して小胞を量子ドットで標識し、量子ドット付加されたアビジン類−ビオチン結合体で標識された小胞を製造する工程。
【請求項７】
量子ドット付加されたアビジン類−ビオチン結合体で標識された小胞の量子ドットを励起させ、当該量子ドットから放出される蛍光を観察することによる、標識された小胞の定量的動態評価方法。
【請求項８】
アビジン類、ビオチン及び量子ドットを含む、小胞標識用キット。
【請求項９】
量子ドットでストレプトアビジンが修飾されている、請求項８のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は標識された小胞、特にin vitroでの動態評価がより正確に実施可能な標識された小胞、その製造方法等に関する。
【０００２】
（発明の背景）
近年、脂質膜を有する小胞をドラッグデリバリーに用いる研究が行なわれている。中でも注目されているのが細胞外小胞の一種であるエキソソームである。エキソソーム（Exosome）は後期エンドソーム区画由来の直径30nm〜200nm程度の小型脂質小胞であり、腫瘍細胞、樹状細胞、網状赤血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血小板、上皮細胞等の様々な種類の細胞から細胞外に分泌されることが知られている。エキソソームの膜表面上にはテトラスパニン（Tetraspanin）と呼ばれる4回膜貫通型のタンパク質ファミリーが多く発現しており、当該ファミリーに含まれるCD9やCD63といった分子が一般的なエキソソームのマーカーとして知られている。また、エキソソームの内部にはタンパク質、脂質、核酸などが含まれている。エキソソームは、細胞外に分泌された後、血液や尿、唾液などの体液を介して隣接もしくは離れた組織に取り込まれ、細胞間情報伝達の担い手として機能することが示唆され、また、別の細胞に運搬されることによって当該別の細胞の機能的変化や生理的変化を引き起こすと考えられている。エキソソームの役割としては、例えば、感染性病原体や腫瘍に対する適応免疫応答の媒介、組織修復、神経伝達や病原性タンパク質の運搬が挙げられる。
さらに、その運搬能が着目され、現在、がんなどをはじめとする様々な疾患において、エキソソーム由来の分子を創薬ターゲットとした研究や、上記分子をドラッグデリバリーシステムのツールとして利用するなど、様々な研究が行われている。
エキソソームに代表される小胞をドラッグデリバリーシステムのツール等として利用する場合、その動態を追跡するために小胞の標識が必要となる。小胞のイメージング、動態評価の為には、一般に脂溶性の蛍光色素（例えば、PKH）を小胞膜表面に挿入することにより小胞を蛍光標識する方法が用いられている（非特許文献１）。
【０００３】
近年、細胞内機能を調べるための新しいプローブとして量子ドットが報告されている。量子ドットとは、粒径のサイズによって蛍光波長が異なるという特徴を有する直径数nmの半導体素材からなるナノクリスタルである（非特許文献２）。量子ドットには、蛍光色素として、CdSe（セレン化カドミウム）、CdTe（テルル化カドミウム）といった半導体素材が使用されている。量子ドットは、(i)生細胞のイメージングおよび動態研究に適した長期の光安定性を有し、(ii)全ての色を一つの光源で励起可能であり、(iii)in vivo以降の蛍光免疫研究への柔軟性を有し、（iv）低いチャネル間クロストークによる狭帯域で対照的な蛍光スペクトルを有する、といった蛍光特性を有することから、タンパク質やオリゴヌクレオチド、低分子等を標識することにより、イメージング及び動態研究、蛍光免疫研究に利用されている。非特許文献３には、タンパク質−１次抗体−ビオチン化２次抗体−量子ドット標識ストレプトアビジンの複合体を形成させることで所望のタンパク質を量子ドット標識する方法が開示されている。また、タンパク質−１次抗体−量子ドット標識２次抗体、もしくはタンパク質−量子ドット標識抗体の複合体形成を利用してエキソソームを量子ドットで標識する方法も報告されている（非特許文献４〜７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Dutta S, et al., PLoS One. 2014 May 15;9(5):e97580
【非特許文献２】Watson A, et al., Biotechniques. 2003 Feb;34(2):296-300
【非特許文献３】Howarth M, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 May 24;102(21):7583-8
【非特許文献４】Wang J, et al., Stem Cells Int. 2016;2016:2639728
【非特許文献５】Oosthuyzen W, et al., J Physiol. 2013 Dec 1;591(23):5833-42
【非特許文献６】Dragovic RA, et al., Methods. 2015 Oct 1;87:64-74
【非特許文献７】Elfeky O, et al., Placenta. 2017 Feb;50:60-69
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、小胞を蛍光標識する方法として、脂溶性の蛍光色素を小胞膜表面に挿入する方法が知られている。しかしながら、上記方法には、(i)評価中に脂溶性蛍光色素が外れてしまい、正確な評価ができない、(ii)細胞膜に非特異的に吸着するため、生体由来小胞本来の挙動が見えにくい、(iii)感度が低いため、一定量の小胞が必要（例えばエキソソームであれば最低109粒子以上／実験）である、(iv)群間での相対評価は可能であるが絶対評価が難しい、という課題があった。
また前記のように、タンパク質を量子ドットで標識する方法として、(i)タンパク質−１次抗体−ビオチン化２次抗体−量子ドット標識ストレプトアビジン、（ii）タンパク質−１次抗体−量子ドット標識２次抗体、または(iii)タンパク質−量子ドット標識抗体の複合体形成させる方法が知られているが、いずれも小胞の表面に存在するタンパク質に対する抗体を利用した方法であるため、抗体によるサイズの増加、及び抗体が結合することによってタンパク質活性部位の機能が低下する可能性があり、in vitroやin vivoでの小胞の挙動や特性が正しく評価できないことが懸念されていた。また、例えばエキソソームであればその種類によって膜表面に発現しているタンパク質が異なる為、エキソソームの種類によって標識の可否や標識効率が異なることが懸念されていた。
本発明は、小胞、特に生体由来の細胞外小胞の挙動や特性を正確に評価することができる、標識された小胞、その製造方法等の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に鑑み、小胞の標識方法を種々検討した結果アビジン類−ビオチンの相互作用を利用して量子ドットで小胞（特に、エキソソーム）を標識する場合、小胞への量子ドットの付加割合を調整することが可能であり、その結果小胞の物理学的特性、生理学的な特性を損なわず、その本来の挙動や特性が評価できることを見出した。例えば小胞がエキソソームである場合、１つのエキソソームを１つ〜少数の量子ドットで標識することが可能になり、定量的なエキソソームの標識に成功して本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］量子ドット付加されたアビジン類−ビオチン結合体で標識されていることを特徴とする、標識された小胞、
［２］小胞ひとつにつき１−５個の割合の量子ドットで標識されている、上記［１］の標識された小胞、
［３］小胞が直径１０ｎｍ−８００ｎｍである、上記［１］の標識された小胞、
［４］小胞が細胞外小胞である、上記［１］の標識された小胞、
［５］細胞外小胞がエキソソームである、上記［１］の標識された小胞、
［６］以下の工程を含む、量子ドット付加されたアビジン類−ビオチン結合体で標識された小胞の製造法；
工程１：小胞の膜上タンパク質をビオチンで標識してビオチン修飾小胞を得る工程；
工程２：工程１で得られたビオチン修飾小胞に、量子ドット付加されたアビジン類を作用させ、アビジン類−ビオチンの結合を介して小胞を量子ドットで標識し、量子ドット付加されたアビジン類−ビオチン結合体で標識された小胞を製造する工程、
［７］量子ドット付加されたアビジン類−ビオチン結合体で標識された小胞の量子ドットを励起させ、当該量子ドットから放出される蛍光を観察することによる、標識された小胞の定量的動態評価方法、
［８］アビジン類、ビオチン及び量子ドットを含む、小胞標識用キット、及び
［９］量子ドットでストレプトアビジンが修飾されている、上記［８］のキット
を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
標識されたエキソソームを用いてイメージング、動態（挙動）評価を実施した場合、以下の利点がある。
(1)評価中に量子ドットが外れることがなく、評価を正確に実施可能。
(2)エキソソームの細胞指向性を検出可能。
(3)細胞内に取り込まれたエキソソームの個数を数値化することが可能。
(4)感度が高いため、エキソソームの必要数が減り実験の効率化が可能。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の標識エキソソームの一実施態様を模式的に示した図である［エキソソーム図：フナコシ株式会社HP、http://www.funakoshi.co.jp/contents/8298より（一部改変)］。
【図２】ビオチン修飾エキソソームと量子ドット修飾ストレプトアビジンとを各混合比率で混合して得られた調製物の粒子サイズの分布を示したグラフである。
【図３】細胞内への量子ドット標識エキソソームの取りこみを評価したグラフである。（横軸：蛍光値、縦軸：細胞数）
【図４】細胞内へのPKH標識エキソソームの取りこみを評価したグラフである。（横軸：蛍光値、縦軸：細胞数）
【図５】細胞内への量子ドット標識エキソソームの取りこみを共焦点顕微鏡で観察した像である。
【図６】細胞内へのPKH標識エキソソームの取りこみを共焦点顕微鏡で観察した像である。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
以下、本発明について詳細に説明する。
１．標識小胞及びその製造方法
本発明は、量子ドット付加されたアビジン類−ビオチン結合体で標識されている標識された小胞を提供する（以下、本発明の標識小胞とも称する）。本明細書においてアビジン類とは、ビオチンと結合して結合体を形成する化合物を意味する。本明細書におけるアビジン類としては、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等が挙げられ、アビジン類としては、ストレプトアビジンが好ましい。
【００１０】
ビタミンの一種であるビオチンは、下記構造を有し、吉草酸側鎖を誘導体化させることで種々の反応性基を組み込むことができる。
【００１１】
【化１】
2019017341.tif 000002
【００１２】
また、ビオチンは約244ダルトンと比較的小さいので生物学的活性を著しく変化させずに、様々なタンパク質や分子類へ結合させることができる。
本発明の標識小胞において、ビオチンは小胞に膜タンパク質を介して結合している、すなわち、小胞がビオチンで修飾されている（以下、この態様をビオチン修飾小胞とも称する）。ビオチンと小胞の膜タンパク質との結合は直接的であってもリンカーを介した結合であってもよく、ビオチンの誘導体化により導入した活性エステル基と小胞膜上のタンパク質中のアミノ基との間のアミド結合であってもよい。ビオチンと小胞の膜タンパク質との結合としては、ビオチンの誘導体化により導入した活性エステル基と小胞膜上のタンパク質中のアミノ基との間のアミド結合が好ましい。
ビオチンとアビジン類を結合させることが所望される物質との結合は、商業的に入手可能な試薬またはキットを用いて、常法にしたがって実施することができる。
【００１３】
ビオチン結合性タンパク質であるアビジンは、質量67,000〜68,000ダルトン（ニワトリアビジンの場合）を有し、4個の128アミノ酸サブユニット（各サブユニットは一個のビオチン分子に結合）から形成されている。アビジンはビオチン分子に対して極めて高い親和性を有し最大4つのビオチン分子と広範なpH範囲および温度範囲で安定的に結合することができる。ストレプトアビジンは、四量体のビオチン結合性タンパク質であり、ストレプトマイセス  アビジニから単離され、質量60,000ダルトンを有する。アビジンと同様に、ビオチンに対して極めて高い親和性がある(Kd = 10-14〜15M)。ニュートラアビジンは、脱グリコシル化アビジンとも称し、質量60,000ダルトンを有する。ニュートラアビジンはアビジンに比べて質量が小さく、ビオチン結合親和性が高いと同時に非特異的結合度が低い。
本発明の標識小胞において、アビジン類は後述する標識としての量子ドットに結合している、すなわち、アビジン類が量子ドットで修飾されている（以下、量子ドットで修飾されたアビジン類を量子ドット修飾アビジン類とも称する）。量子ドットとアビジン類の結合は直接的であってもリンカーを介した結合であってもよく、また架橋剤（例、カルボジイミド架橋剤）を用いた結合でもよい。量子ドットとアビジン類の結合としては、架橋剤（例、カルボジイミド架橋剤）を用いた結合（特に、−NHCO-を介した結合）が好ましい。
アビジン類は商業的に入手可能であり、アビジン類とそれを結合させることが所望される物質との結合は商業的に入手可能な試薬またはキットを用いて、常法にしたがって実施することができる。
【００１４】
本発明において用いられる小胞は、細胞から放出される生体由来の小胞および人工的に製造される小胞などを含む。これらの小胞は、脂質膜によって包まれる内部空間を有する粒形状の構造体であり、脂質膜は一重であってもよく、二重であってもよいが、膜上に複数の膜タンパク質を有している。小胞の直径は10nm〜800nm、好ましくは20nm〜500nm、より好ましくは30nm〜200nmである。大きすぎると細胞内への取りこみ効率が悪くなり、小さすぎると標識しにくい。
生体由来の小胞としてはエキソソーム等の細胞外小胞等が挙げられ、人工的に製造される小胞としてはリポソーム等が挙げられる。
生体由来の小胞は、その内部空間にタンパク質、脂質、核酸などを含んでいてもよく、いかなる動物種または植物種由来のものであってもよい。上記動物種としては、例えば、脊椎動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ラット、マウス、ハムスタ−、ウサギ、ヤギ、ニワトリ、サケ、マグロ等）が挙げられる。生体由来の小胞の由来としては、薬物、核酸などの生理活性物質を導入する標的細胞と同一種類の動物または植物由来であることが好ましく、標的細胞が生体内の細胞である場合には、標的細胞と同じ動物に由来する小胞が好ましい。また、生体由来の小胞が由来する細胞種は特に限定されないが、例えば、腫瘍細胞、樹状細胞、マクロファ−ジ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血小板、網状赤血球、上皮細胞、線維芽細胞、幹細胞、ｉＰＳ細胞等の様々な種類の細胞を挙げることができる。また、生体由来の小胞は種々の体液、例えば、血液、尿、腹水などから調製することもできる。本発明で用いる小胞は商業的に入手することも可能である。
本発明で用いる小胞として好ましくは生体由来のものであり、さらに好ましくは細胞外小胞、特に好ましくはエキソソーム（とりわけ、ヒト由来のエキソソーム）である。エキソソームは、その種類にかかわらずある一定量の膜タンパク質を発現していることが知られていることから、これら膜タンパク質をビオチンないしアビジン類で修飾するに際して、修飾効率の調整が可能である。これは、ビオチン−アビジン類の結合を介して少数の（１〜５個、好ましくは１個）量子ドットでエキソソームを標識しようとする場合の標識効率の調整にも有利である。
【００１５】
本発明において用いられる量子ドットは、通常採用される検出方法で検知可能な光を発する限り、特に限定されないが、例えば、金属原子と５Ｂ族若しくは６Ｂ族原子とからなる量子ドット；好ましくは、Cd、Zn、Hg、Cu、Ag、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Zr、Mo、Ta、W、Ir、Eu、Sm及びMgからなる群より選ばれる少なくとも１種の金属原子と、S、Se及びTeからなる群より選ばれる少なくとも１種の５Ｂ族若しくは６Ｂ族原子からなる量子ドット；更に好ましくはCdSeが例示される。量子ドットの平均粒子径としては、通常2〜6nm、好ましくは2.5〜5nm、更に好ましくは2.5〜3nmが挙げられる。
量子ドットは、従来公知の方法に従って製造でき、また商業的に入手可能である。例えば、Qdot525、Qdot565、Qdot585、Qdot605、Qdot655、Qdot705及びQdot800（全て商品名；life technologies社）等を利用することができる。
【００１６】
本発明の標識小胞は、小胞が量子ドット−アビジン類−ビオチン結合体で標識されていればその形態は特に限定されないが、好ましくは小胞の膜に膜タンパク質を介して結合したビオチンに量子ドットで修飾されたアビジン類が結合した形態をとる。本発明の標識小胞の例である、標識されたエキソソーム（以下、標識エキソソームともいう）の模式図を図１に示す。
図１で示されるように、本発明の標識エキソソームは、１つのエキソソームに１つの量子ドットが結合していることが好ましい。１つのエキソソームに１つの量子ドットが結合していることにより、後述のように標識エキソソームを動態評価試験に供した際に細胞内に取りこまれたエキソソームの個数を数値化することが可能となり、得られるデータを定量的に評価することが可能となる。さらに１つの量子ドットがエキソソームに結合した場合は、エキソソームの物理学的特性に与える影響が少なく、エキソソーム本来の挙動や特性が評価できると期待される。
【００１７】
本発明の標識小胞は、例えば以下の方法によって製造することができる（以下、本発明の製造方法とも称する）。
工程１：小胞の膜上タンパク質をビオチンで標識してビオチン修飾小胞を得る工程
工程２：工程１で得られたビオチン修飾小胞に、量子ドット付加されたアビジン類を作用させ、アビジン類−ビオチンの結合を介して小胞を量子ドットで標識し量子ドット標識小胞、即ち、量子ドット付加されたアビジン類−ビオチン結合体で標識された小胞を得る工程
工程１で使用する小胞は常法に従い製造することができる。具体的には、例えば生体由来の小胞であれば、細胞外に分泌される小胞を回収する方法や細胞の破砕処理によって細胞内の小胞を回収する方法がある。小胞がエキソソームであれば細胞から常法（超遠心法を用いて培養上清中のある一定サイズの粒子を回収する方法等）に従いエキソソームを回収することができる。工程１に含まれる小胞の膜上タンパク質のビオチン化は当技術分野で通常実施される方法または該方法に準じた方法によって行うことができ、例えば、上記方法により回収した小胞のビオチン化は常法（例えば、Guesdon JL, et al., The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem. 1979 Aug;27(8):1131-9.に記載された方法）に従って行なうことができる。
本工程で用いる小胞は直径１０ｎｍ〜８００ｎｍ程度であることが好ましく、特に２０ｎｍ〜５００ｎｍ、さらに好ましくは３０ｎｍ〜２００ｎｍである。エキソソームは一般的に直径３０ｎｍ〜２００ｎｍである。小胞はあらかじめ浮遊密度やサイズにより分画しておくことが望ましい。さらに、エキソソームのみを分離するためには、超遠心による分離に加え、市販のエキソソーム膜表面のタンパク質（たとえばCD9、CD63、CD81）に対する抗体を用いた分画キット（たとえばThermoFischer社からDynabeads（商品名））、アフィニティメンブレンを用いたフィルトレーションキット（例えばQUIAGEN社製のexoEasy Maxi Kit）を用いることもできる。エキソソーム膜表面のタンパク質のビオチン化は簡便には、ビオチン化試薬（例、Biotin Labeling Kit-NH2（同仁株式会社製）を用いて実施することができる。エキソソーム膜タンパク質の５０％以上、好ましくは９０％以上がビオチン化されていることが望ましい。
工程２は、工程１によって得られたビオチン修飾小胞と量子ドット付加されたアビジン類とを混合することで実施される。
該混合の条件としては、小胞の品質に悪影響が出ない限り特に限定されないが、リン酸緩衝液等の溶液中、４〜３７℃、好ましくは１５〜３７℃、より好ましくは室温で、２分〜１時間、好ましくは５〜３０分、より好ましくは８〜１２分間インキュベーションすることで量子ドット標識小胞を得ることができる
量子ドット付加されたアビジン類としては、市販されているもの（たとえばThermoFischer社製  Qdotストレプトアビジンコンジュゲート）が使用できるが、予め量子ドットとアビジン類とを架橋剤（例、カルボジイミド架橋剤）で結合させて調製しておくこともできる。
ビオチン修飾小胞と量子ドット付加されたアビジン類との混合比率は、小胞が量子ドットで標識される限り特に限定されないが、小胞がエキソソームの場合、後述の実施例で示されるように、量子ドット付加されたアビジン類１ｐｍｏｌあたりビオチン修飾エキソソームを１×１０８〜１×１０１１粒子、好ましくは２．５×１０８〜１×１０１０粒子、より好ましくは５×１０８〜１×１０９粒子の混合比率で混合することで、１つのエキソソーム（通常、直径３０ｎｍ〜２００ｎｍ）あたり１つの量子ドットで標識されたエキソソームが得られる。
本発明はまた、上記本発明の量子ドット標識小胞の製造方法に準じて下記の工程を実施することによって、小胞を量子ドットで標識する方法を提供することができる（以下、本発明の標識方法とも称する）。
工程１：小胞の膜上タンパク質をビオチンで修飾してビオチン修飾小胞を得る工程。
工程２：工程１で得られたビオチン修飾小胞と量子ドット付加されたアビジン類を作用させ、アビジン類−ビオチンの結合を介して小胞を量子ドットで標識する工程。
本発明の標識方法で用いる各試薬はそれらをまとめて試薬キットして提供され得る。具体的にはビオチン（ビオチン化試薬として提供されても良い）、アビジン類及び量子ドットを含む小胞標識用キットとして提供され得る。所望により他の試薬、例えばアビジン類を量子ドットで標識する為の架橋剤等や、ビオチン修飾小胞を製造する為のビオチン化試薬も含めることができる。また、予め量子ドット付加されたアビジン類（量子ドット修飾アビジン類）を調製し、それをキットに含めることもできる。当該キットには、その使用説明書、即ち、ビオチン及び量子ドット修飾アビジン類を用いて小胞（好ましくはエキソソーム）を修飾する方法を記載した当該キットの使用説明書を含めることができる。そのような使用説明書には、当該キット中の試薬を用いて所望の標識小胞を得るための、小胞個数と試薬量の最適な組み合わせ割合が記載されていてもよい。
【００１８】
２．小胞のイメージング方法
本発明は、上記本発明の標識小胞、上記本発明の製造方法で得られた標識小胞、及び上記本発明の標識方法で標識された小胞を用いた小胞のイメージング方法を提供することができる（以下、本発明のイメージング方法とも称する）。
本発明のイメージング方法は、アビジン類−ビオチン相互作用を介して量子ドット標識された小胞を用いること以外は、従来の小胞のイメージング方法（蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡による観察、in vivoイメージング装置による観察等）に準じて実施することができるが、結合量が既知の量子ドット（好ましくは小胞あたり１分子の量子ドット）を標識プローブとして用いる為、その結果はより正確且つ特異的なものとなる。
例えば、本発明の標識小胞（量子ドット付加されたアビジン類−ビオチン結合体で標識された小胞）において、量子ドットを励起させ、当該量子ドットから放出される蛍光を観察することによって、標識された小胞の定量的動態評価が可能となる。本発明はそのような定量的動態評価法をも提供する。
【実施例】
【００１９】
以下に小胞としてエキソソームを用いた実施例および参考例を示し、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１）
１．エキソソームのビオチン修飾
HEK293F細胞の培養上清からエキソソームを回収した。回収したエキソソームをBiotin Labeling Kit - NH2（同仁株式会社製）を用いてビオチン標識した。
標識前後のエキソソーム平均粒子サイズをナノサイトLM10 （マルバーン社製）で測定した。結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】
2019017341.tif 000003
【００２１】
２．ストレプトアビジンの量子ドット修飾
Qdot（商品名）525 ITKTM Carboxyl Quantum Dots（Thermo Fisher Scientific社製）でストレプトアビジン（Invitrogen社製）を修飾した。Qdotの濃度情報は商品添付文書を参照した。修飾反応にはN-ethyl-N'-dimethylaminopropyl-carbodiimide (EDC) （Thermo Fisher Scientific社製）を用いた。修飾反応後に、フリー体のストレプトアビジンを精製除去し、量子ドット修飾ストレプトアビジンを得た。量子ドットの回収率は１００％と仮定して濃度を算出し、以降の実験に用いた。
修飾前後の量子ドット粒子のサイズをゼータサイザー（マルバーン社製）で測定した。結果を表２に示す。
【００２２】
【表２】
2019017341.tif 000004
【００２３】
３．エキソソームの量子ドット標識
１.で調製したビオチン修飾したエキソソームと２．で調製した量子ドットで修飾したストレプトアビジンとを各混合比率（Ｎｏ．１〜４）で混合し、室温で10分インキュベーションした。ビオチン修飾エキソソームの粒子数はナノサイト LM10 （マルバーン社製）で測定した。本検討は一定量の量子ドットに対して混合すべき適切なエキソソーム粒子数を評価することを目的として行った。各混合比率で得られた調製物の粒子サイズをゼータサイザーで測定した。結果を表３、図２に示す。
【００２４】
【表３】
2019017341.tif 000005
【００２５】
得られたサイズから、各混合比率で得られた調製物中で量子ドットでエキソソームが修飾されているかを判断した結果を表４に示す。調製物の平均粒子サイズが量子ドット修飾ストレプトアビジン単体と同等に小さい場合、調製物中の大多数の量子ドットがフリー体の量子ドットとして存在することを示す。
【００２６】
【表４】
2019017341.tif 000006
【００２７】
（実施例２）
１．エキソソームのビオチン修飾
MDA-MB231 LN細胞の培養上清からエキソソームを回収し、実施例１と同様にエキソソームをビオチン修飾した。
２．ストレプトアビジンの量子ドット修飾
実施例１と同様に行った。
３．エキソソームの量子ドット標識
量子ドット修飾ストレプトアビジンとビオチン修飾エキソソームを以下の割合で混合し、室温で10分インキュベーションすることで、量子ドット標識エキソソームを調製した。ビオチン修飾エキソソームの粒子数はナノサイト LM10 （マルバーン社製）で測定した。
（量子ドット修飾ストレプトアビジン（pmol）: ビオチン修飾エキソソーム（particles）=1: 5×108）
混合前後の粒子サイズと粒子数をナノサイトNS300（マルバーン社製）で測定した。蛍光検出、側方散乱光検出でそれぞれ蛍光粒子、非蛍光粒子を検出し測定した。結果を表５に示す。
【００２８】
【表５】
2019017341.tif 000007
【００２９】
得られた結果から、量子ドット修飾ストレプトアビジン（pmol）:ビオチン修飾エキソソーム（particles）=1: 5×１０8の条件では、エキソソームの量子ドットによる標識効率は約50%であること、サイズの変化から一つのエキソソームに標識されている量子ドットは1つであることが推察される。
【００３０】
（実施例３）
１．エキソソームのビオチン修飾
MDA-MB231 LN細胞、PC-3M L細胞の培養上清からそれぞれエキソソームを回収し、実施例１と同様にエキソソームをビオチン修飾した。
２．ストレプトアビジンの量子ドット修飾
実施例１と同様に行った。
３．エキソソームの量子ドット標識
量子ドット修飾ストレプトアビジンとビオチン修飾エキソソームを以下の割合で混合し、室温で10分インキュベーションすることで、Qdot標識エキソソームを調製した。ビオチン修飾エキソソームの粒子数はナノサイトLM10 （マルバーン社製）で測定した。
（量子ドット修飾ストレプトアビジン修飾（pmol）: ビオチン修飾エキソソーム（particles）=1: 5×108）
４．細胞取り込みの評価
前日に播種したMDA-MB231 LN細胞に、量子ドット標識した２種のエキソソームまたは量子ドットを添加した。添加サンプルの詳細を表６に示す。サンプル添加２４時間後に細胞をPBSで洗浄し、フローサイトメーター（BioRad社製）で、量子ドット由来の蛍光を有する細胞の割合を測定した。結果を図３および表７に示す。蛍光を有する細胞の割合は、FCSデータ解析ソフト「FLOWJO」を用いて未処理細胞の蛍光値および細胞数と比較し算出した。
【００３１】
【表６】
2019017341.tif 000008
【００３２】
【表７】
2019017341.tif 000009
【００３３】
２種類のエキソソームの取り込み率に差がみられた。また、量子ドット自体の取り込みはほぼ見られなかった。
【００３４】
（比較例１）
１．エキソソームのPKH修飾
実施例３と同様にMDA-MB231 LN細胞、PC-3M L細胞の培養上清からエキソソームを回収した。PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit（シグマ社製）を用いてエキソソームをPKHで標識した。フリー体のPKHを限外ろ過で除去した後、PKH標識エキソソームのPKH蛍光値を測定した。
２．細胞取り込みの評価
前日に播種したMDA-MB231 LN細胞に、PKH標識した２種のエキソソームまたはPKHを添加した。添加サンプルの詳細を表８に示す。サンプル添加３時間後に細胞をPBSで洗浄し、フローサイトメーターで、PKH由来の蛍光を有する細胞の割合を測定した。結果を図４および表９に示す。蛍光を有する細胞の割合は、FCSデータ解析ソフト「FLOWJO」を用いて未処理細胞の蛍光値および細胞数と比較し算出した
【００３５】
【表８】
2019017341.tif 000010
【００３６】
【表９】
2019017341.tif 000011
【００３７】
２種類のエキソソームの取り込み率の間にほぼ差は見られなかった。PKH自身の取り込みも見られ、バックグラウンドが高いことが示された。
【００３８】
（実施例４）
１．エキソソームのビオチン修飾
MDA-MB231 LN細胞の培養上清からエキソソームを回収し、実施例１と同様にエキソソームをビオチン修飾した。
２．ストレプトアビジンの量子ドット修飾
実施例１と同様に行った。
３．エキソソームの量子ドット標識
量子ドット修飾ストレプトアビジンとビオチン修飾エキソソームを以下の割合で混合し、室温で10分インキュベーションすることで、量子ドット標識エキソソームを調製した。
（量子ドット修飾ストレプトアビジン（pmol）:ビオチン修飾エキソソーム（particles）=1:5×108）
４．細胞取り込みの評価
前日に播種したMDA-MB231 LN細胞に、量子ドット標識したエキソソーム又は量子ドットを添加した。添加サンプルの詳細を表１０に示す。添加５時間後に細胞をPBSで洗浄し、共焦点顕微鏡で観察した。結果を図５に示す。
【００３９】
【表１０】
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【００４０】
MDA-MB231 LN細胞への量子ドット自体の取り込みはほぼ見られなかったが、エキソソームの取り込みは鮮明に検出された。
【００４１】
（比較例２）
１．エキソソームのPKH標識
MDA-MB231 LN細胞からエキソソームを回収し、比較例１と同様にエキソソームをPKH標識した。
２．細胞取り込みの評価
前日に播種したMDA-MB231 LN細胞に、PKH標識したエキソソームおよびPKHを添加した。添加サンプルの詳細を表１１に示す。添加５時間後に細胞をPBSで洗浄し、共焦点顕微鏡で観察した。結果を図６に示す。
【００４２】
【表１１】
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【００４３】
MDA-MB231 LN細胞へのPKH標識エキソソームの細胞内取り込みは見られたが、PKH自身の取り込みも見られ、バックグラウンドが高いことが示された。またPKH標識エキソソームの検出感度は実施例４の量子ドット標識エキソソームに比べて低いことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
ビオチン結合体は低分子であるため、エキソソームの表面の膜に結合した場合にも、 エキソソームの物理学的特性、生理学的な特性を損なわず、エキソソーム本来の挙動や特性が評価できると期待される。エキソソームにはある一定量の膜タンパク質が発現しているため、どのようなエキソソームも一定の効率でビオチン修飾が可能であり、結果、一定の効率で量子ドットを標識することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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