(57)【要約】【課題】  FGF活性と毛成長及び／又は創傷治癒に影響を与えるジペプチドを提供しようとすること。【解決手段】  FGF活性と毛成長及び／又は創傷治癒に影響を与えるジペプチド若しくは当該ペプチドに修飾が施された修飾体又はそれらの塩。前記ジペプチド若しくはその修飾体又はそれらの塩を有効成分として含有することを特徴とする、毛成長を調節するための組成物、創傷治癒を促進するための組成物及び剃毛又は抜毛後の皮膚に適用するための外用組成物。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
FGF活性と毛成長及び／又は創傷治癒に影響を与えるジペプチド若しくは当該ペプチドに修飾が施された修飾体又はそれらの塩。
【請求項２】
ジペプチドがPro-IleまたはIle-Glyからなる配列を有する、請求項１記載のジペプチド若しくはその修飾体又はそれらの塩。
【請求項３】
請求項１記載のジペプチド若しくはその修飾体又はそれらの塩を有効成分として含有することを特徴とする、毛成長を調節するための組成物。
【請求項４】
請求項１記載のジペプチド若しくはその修飾体又はそれらの塩を有効成分として含有することを特徴とする、創傷治癒を促進するための組成物。
【請求項５】
請求項１記載のジペプチド若しくはその修飾体又はそれらの塩を有効成分として含有することを特徴とする、剃毛又は抜毛後の皮膚に適用するための外用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は線維芽細胞増殖因子 [Fibroblast Growth Factor (FGF)]活性に影響を与える又はFGF様活性を有するジペプチド、その修飾体及びそれらの塩、ならびにこれを有効成分として含有する、毛成長調節（抑毛及び育毛）又は創傷治癒に対して皮膚外用剤として有用な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞増殖因子（FGF）はヒト及びマウスで22種類のメンバーからなる。これらのFGFの作用を抑制するか、或いはFGF様の作用をする物質が知られており、これらの物質は、医薬品、医薬部外品又は化粧品などに利用されている。
【０００３】
FGF18は生理的に毛包における幹細胞領域に発現し、毛包幹細胞の活性化と増殖を抑制することにより毛成長周期のうち休止期を維持する因子であり、成長期に投与すると毛成長を抑制することが報告されている（非特許文献１）。FGF18タンパク質は、ヒトとマウスでは産生細胞の細胞質で207アミノ酸のポリペプチドとして合成され、それが細胞外に分泌される際にN末端のシグナルペプチドが切断され、181アミノ酸より成る分泌体として生理作用を発揮する。FGF18は７種類あるFGF受容体サブクラス（FGFR1c、FGFR1b、FGFR2c、FGFR2b、FGFR3c、FGFR3b、FGFR4）のうち主に2つ、すなわちFGFR3c、FGFR4と強く相互作用することによって、毛の休止期維持をはじめとして、骨や軟骨の形成や成長、肺の形成等の生命現象に関与していると考えられている。
【０００４】
この様に、FGF18とその活性制御因子は毛成長の制御因子として、ならびに、骨、軟骨の形成・成長・修復の制御因子として、医薬品などに応用することができると考えられる。しかし、FGF18ポリペプチドの全長を化学合成や遺伝子組換えにより生産するとコストが非常に高くなる。したがって、生産コストが低い短ペプチド及びその誘導体などの物質の中からFGF18アンタゴニスト（FGF18活性阻害物質）やFGF18アゴニスト（FGF18活性物質）を得ることができれば、FGF18の有する機能を制御する物質をより安価で大量に供給することが可能となる。
【０００５】
さらに、FGF18は分子量が約24 kDaと大きな親水性の高いポリペプチドである。一般に物質の経皮吸収性に関して、その物質が分子量500 Da以下程度で脂溶性が適度に高いと吸収性が高いと考えられている。したがって、仮にFGF18ポリペプチドの全長を健常な皮膚の表面に塗布したとしても、それが表皮角質を透過して表皮細胞や真皮細胞、皮下細胞に到達する効率は低い。したがって、分子量が小さく脂溶性が高い短ペプチド及びその誘導体などの物質の中からFGF18アンタゴニスト（FGF18活性阻害物質）やFGF18アゴニスト（FGF18活性物質）を得ることができれば、FGF18の有する機能を制御する物質をより効率良く、経皮吸収させることが可能となる。
【０００６】
一方、FGF1、FGF2、FGF7,FGF10などのFGFは生理的に皮膚及び皮膚付属器官の各種細胞で発現しており、創傷の局面ではそれらのFGFが真皮線維芽細胞や表皮角化細胞の増殖や遊走の促進に働くことにより、全体として創傷治癒を促進する。このうちFGF2とFGF7についてはそれらの組換え体タンパク質が医薬品として用いられており、FGF2は日本国内で皮膚潰瘍治療剤として、FGF7は米国内で口腔粘膜潰瘍の治療剤として承認され、高い治療効果をあげている。したがって、生産コストが低い短ペプチド及びその誘導体などの物質の中からこれらのFGFに対するアンタゴニスト（FGF活性阻害物質）やFGFアゴニスト（FGF活性物質）を得ることができれば、創傷治癒を調節するFGFの有する機能を制御する物質をより安価で大量に供給することが可能となる。
【０００７】
一方、FGFの各因子は、FGF受容体サブクラスである、FGFR1c、FGFR1b、FGFR2c、FGFR2b、FGFR3c、FGFR3bやFGFR4とそれぞれ特有の特異性をもって相互作用し、その活性を発揮する。例としてFGF18は、特にFGFR3cやFGFR4と強く相互作用することが知られている（非特許文献２参照）。一方、FGF1やFGF2は共にFGFR1cを強く活性化し、FGF1やFGF7は共にFGFR2bを強く活性化するが、FGF2はFGFR2bを活性化することはできず、FGF7はFGFR1cを活性化することができない（非特許文献２参照）。これらの受容体活性化能を考慮すれば、FGFR3cやFGFR4を活性化する物質は、FGF18の示す生理機能についても代替することができると期待される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Miho Kimura-Ueki, Yuko Oda, Junko Oki, Akiko Komi-Kuramochi, Emi Honda, Masahiro Asada, Masashi Suzuki and Toru Imamura. Hair cycle resting phase is regulated by cyclic epithelial FGF18 signaling. J. Invest. Dermatol. 132(5):1338-1345 (2012)
【非特許文献２】Zhang X, Ibrahimi OA, Olsen SK, Umemori H, Mohammadi M, Ornitz DM. Receptor specificity of the fibroblast growth factor family. The complete mammalian FGF family. J. Biol. Chem. 281(23):15694-15700 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、FGF活性と毛成長及び／又は創傷治癒に影響を与えるジペプチドを提供しようとするものである。すなわちFGF活性を調節する活性をもったジペプチドやその修飾体やそれらの塩、あるいはFGF様の活性をもったジペプチドやその修飾体やそれらの塩であって、毛の成長を調節し、及び／又は、創傷治癒に影響を与えるジペプチドやその修飾体やそれらの塩を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、生産コストの低減や経皮吸収性の向上や物質安定性の向上を期待して可能な限り短いジペプチド及びその類縁ペプチドを収集（合成）し、その中からFGF活性を調節する活性またはFGF様活性を持つジペプチドを探索した。その結果、驚くべき事に、Pro-IleまたはIle-Glyの配列を有するジペプチドが好ましい活性を有することを見出して、本発明を完成させた。
【００１１】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）FGF活性と毛成長及び／又は創傷治癒に影響を与えるジペプチド若しくは当該ペプチドに修飾が施された修飾体又はそれらの塩。
（２）ジペプチドがPro-IleまたはIle-Glyからなる配列を有する、（１）記載のジペプチド若しくはその修飾体又はそれらの塩。
（３）（１）記載のジペプチド若しくはその修飾体又はそれらの塩を有効成分として含有することを特徴とする、毛成長を調節するための組成物。
（４）（１）記載のジペプチド若しくはその修飾体又はそれらの塩を有効成分として含有することを特徴とする、創傷治癒を促進するための組成物。
（５）（１）記載のジペプチド若しくはその修飾体又はそれらの塩を有効成分として含有することを特徴とする、剃毛又は抜毛後の皮膚に適用するための外用組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、FGFR3c/BaF3細胞にFGF18タンパク質を様々な濃度で与え培養した場合の細胞数を示す。すなわちこの細胞に対する細胞増殖促進活性を示す。
【図２−１】図２−１は、FGFR3c/BaF3細胞にジペプチドPro-IleとFGF18タンパク質を様々な濃度の組み合わせで与え培養した場合の細胞数を示す。
【図２−２】図２−２は、FGFR3c/BaF3細胞にジペプチドPro-IleまたはジペプチドIle-Glyまたはアミノ酸Proまたはアミノ酸Ileまたはアミノ酸Glyを様々な濃度の組み合わせで与え培養した場合の細胞数を示す。
【図３−１】図３−１は、FGFR4/BaF3細胞にジペプチドPro-IleとFGF18タンパク質を様々な濃度の組み合わせで与え培養した場合の細胞数を示す。
【図３−２】図３−２は、FGFR4/BaF3細胞にジペプチドPro-IleまたはジペプチドIle-Glyまたはアミノ酸Proまたはアミノ酸Ileまたはアミノ酸Glyを様々な濃度の組み合わせで与え培養した場合の細胞数を示す。
【図４】図４は、マウス背部の休止期毛をもつ皮膚にジペプチドPro-Ileを毎日塗布した場合の経時的な毛成長の様子を示す。
【図５】図５は、マウス背部の休止期毛をもつ皮膚にジペプチドPro-Ileを毎日塗布した場合の経時的な毛成長の様子をスコアとして表した結果である。
【図６−１】図６−１は、マウス背部の成長期毛と休止期毛を両方もつ皮膚の体毛を引き抜き、抜毛により生じた創傷（浅い傷）部位にジペプチドPro-Ileを毎日塗布した場合の経時的な創傷治癒の様子を示す。
【図６−２】図６−２は、マウス背部の成長期毛と休止期毛を両方もつ皮膚の体毛を引き抜き、抜毛により生じた創傷（深い傷）部位にジペプチドPro-Ileを毎日塗布した場合の経時的な創傷治癒の様子を示す。
【図７】図７は、モデルヒト表皮培養細胞HaCaT細胞を用いたscratch wound assayの結果を示す。写真中央部に示す細胞の無い領域が、ジペプチドPro-Ileの存在下で12時間培養後にどのように変化したかについて、陰性対照、陽性対照とともに示している。
【図８】図８は、図７に示す実験と同様の実験を多くの試料について行い、その結果を定量化してグラフにしたものである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、FGF活性と毛成長及び／又は創傷治癒に影響を与えるジペプチド若しくは当該ペプチドに修飾が施された修飾体又はそれらの塩を提供する。
FGF活性は、FGFが呈する作用であれば特に限定されるものではないが、毛成長や創傷治癒に関する作用であるとよい。例えば、FGF5は毛周期に作用し、成長期毛包の退行期への移行を促進する作用が知られており、FGF18は生理的に毛包における幹細胞領域に発現し、毛包幹細胞の活性化と増殖を抑制することにより毛成長周期のうち休止期を維持する因子であり、成長期に投与すると毛成長を抑制することが報告されている。また、FGF1、FGF2、FGF7,FGF10などのFGFは生理的に皮膚及び皮膚付属器官の各種細胞で発現しており、創傷の局面ではそれらのFGFが真皮線維芽細胞や表皮角化細胞の増殖や遊走の促進に働くことにより、全体として創傷治癒を促進し、毛成長周期の成長期の局面ではそれらのFGFが毛母細胞の増殖を促進することなどにより毛成長を促進する。
【００１４】
本発明のジペプチド若しくはその修飾体又はそれらの塩がFGF活性と毛成長及び／又は創傷治癒に影響は、促進作用であっても、抑制作用であってもよく、また、その両方の作用であってもよい。本発明のジペプチドは、FGF（特に、FGF18）の部分的アゴニスト／部分的アンタゴニストとして作用しうる。また、部分的アゴニスト／部分的アンタゴニストとしての作用は、FGF18の濃度によっても変化しうる。
【００１５】
ジペプチドは、2つのアミノ酸が1つのペプチド結合で結合した分子であり、本発明のジペプチドを構成するアミノ酸は、天然のものであっても、合成のものであってもよいが、好ましくは、天然に存在するものであり、より好ましくは、生体のタンパク質を構成するものである。アミノ酸は、D体、L体、ラセミ体のいずれであってもよいが、好ましくは、L体である。天然のアミノ酸としては、グリシン（Gly）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、セリン（Ser）、スレオニン（Thr）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、ヒスチジン（His）、トリプトファン（Trp）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、プロリン（Pro）、オルニチン、シトルリンなどが挙げられる。後述の実施例では、Pro-Ileからなる配列を有するジペプチドが、FGF18活性と毛成長及び／又は創傷治癒に影響を与えることを示した。また後述の実施例では、ジペプチドIle-Glyが、FGF18が活性化能を有する受容体を活性化することを示した。Pro-Ileは、プロリンとイソロイシンがペプチド結合で結合した分子である。Ile-Glyは、イソロイシンとグリシンがペプチド結合で結合した分子である。本明細書におけるジペプチドは、ペプチド表記の慣例に従い、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。
ジペプチドは、市販のものを使用することができるが、公知の方法で合成してもよい。例えば、α−アミノ基を保護したアミノ酸とカルボキシル基を保護したアミノ酸を反応させ、ペプチド結合させた後、保護基を脱離するとよい。
【００１６】
ペプチドに修飾が施された修飾体としては、特に限定されるわけではないが、ジペプチドの有するアミノ基の修飾(-NHCOR; Rは低分子アルキル（例えば、C1-6アルキル、好ましくはC1-3アルキル））やカルボキシル基の修飾(-COOR; Rは低分子アルキル（例えば、C1-6アルキル、好ましくはC1-3アルキル）)である。また、C末端がアミド化（-CONH2）されてもよいし、Ｎ末端のアミノ基が置換基（例えば、ホルミル、アセチルなどのＣ2-6アルカノイル基、グアニジノアセチル、チエニルアクリリル、ピリジルアセチルなどのＣ1-8アシル基、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどのＣ1-6アルキル基、フェニル、ナフチルなどＣ6-10アリール基またはベンジル、フェネチルなどのＣ7-16アラルキル基、トシル基、ベンジルオキシカルボニル基など）で置換されてもよい。
【００１７】
ジペプチド又はその修飾体の塩としては、生理学的に許容される塩基（例えばアルカリ金属（ナトリウム、カリウム、リチウム）、アンモニウムなど）や酸（有機酸、無機酸）との塩を用いることができ、生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
【００１８】
本発明のジペプチド、その修飾体及びそれらの塩は、毛成長の調節（抑毛及び／又は育毛）に有効でありうる。よって、本発明は、上記ジペプチド若しくはその修飾体又はそれらの塩を有効成分として含有することを特徴とする、毛成長を調節するための組成物を提供する。
【００１９】
また、本発明のジペプチド、その修飾体及びそれらの塩は、創傷治癒の促進に有効でありうる。よって、本発明は、上記ジペプチド若しくはその修飾体又はそれらの塩を有効成分として含有することを特徴とする、創傷治癒を促進するための組成物を提供する。
【００２０】
本発明のジペプチド、その修飾体及びそれらの塩は、剃毛又は抜毛後の皮膚に適用するとよい。よって、本発明は、上記ジペプチド若しくはその修飾体又はそれらの塩を有効成分として含有することを特徴とする、剃毛又は抜毛後の皮膚に適用するための外用組成物を提供する。剃毛又は抜毛後の皮膚に適用することにより、毛の成長を抑制しつつ、創傷治癒を促進することができる。
【００２１】
本発明の組成物は、毛成長調節（抑毛及び育毛）及び／又は創傷治癒に対して皮膚外用剤として有用な、医薬、医薬部外品、化粧品などに利用しうる。化粧品としては、除毛剤、除毛後処理剤、脱毛剤、脱毛後処理剤、髭剃り剤、髭剃り前処理剤、髭剃り後処理剤などとして利用しうる。
【００２２】
本発明の組成物中の有効成分であるジペプチド、その修飾体又はそれらの塩の配合量は、組成物中に0.00001〜10質量％とするとよく、好ましくは、0.0001〜1質量％、より好ましくは、0.001〜0.1質量％である。
【００２３】
本発明の組成物の剤形は、所望の効果が得られる限り、特に限定されるものではないが、外用剤として適した剤形であるとよく、塗布剤（クリーム剤、軟膏剤、液剤、ゲル剤、ローション剤、チック剤など）、貼付剤（パップ剤、プラスター剤、テープ剤、パッチ剤など）、エアゾール剤などを挙げることができる。
【００２４】
組成物には、医薬、医薬部外品、化粧品などに使用される各種添加物（賦形剤、補助剤、添加剤など）を添加するとよい。
本発明の組成物は、成人の皮膚に塗布する場合、有効成分の量として、1日体表１cm2あたり、0.0001〜100 mg、好ましくは、0.001〜10 mg、より好ましくは、0.01〜1 mgの量で、１日複数回（例えば、１〜５回程度）使用するとよいが、この量は、年齢、体重、症状等によって変更しうる。
【００２５】
本発明のジペプチド、その修飾体及びそれらの塩は、同様の生理活性を有する他の成分と併用してもよい。同様の生理活性を有する他の成分としては、抑毛作用を有するFGF18、創傷治癒促進作用を有するFGF2及びFGF7、その他一般に創傷治療や抑毛に使用される成分などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。併用する場合には、単剤を組み合わせて適用してもよいし、合剤として適用してもよい。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２７】
〔実施例１〕
FGFR3c発現細胞及びFGFR4発現細胞に対するFGF18活性と、ジペプチドPro-Ileによるその活性の調節作用
文献の教示にしたがって、マウスIL-3依存性proB細胞であるBa/F3細胞株（理研BRCより入手：以後BaF3と表記）に、遺伝子発現操作によりFGFレセプター（FGFR)であるFGFR3c及びFGFR4を別々に導入して、FGFRが細胞表面に強制的に発現するR3c/BaF3細胞及びR4/BaF3細胞を作成した（Ornitz, DM., Xu, J., Colvin, JS., McEwen, DG., MacArthur, CA., Coulier, F., Gao, G. and Goldfarb, M., 1996. Receptor specificity of the fibroblast growth factor family. J. Biol. Chem. 271(25):15292-15297；Yoneda, A., Asada, M., Oda, Y., Suzuki, M. and Imamura, T., 2000. Engineering of an FGF-proteoglycan fusion protein with heparin-independent, mitogenic activity. Nat. Biotechnol. 18(6):641-644）。
【００２８】
次に、作製したR3c/BaF3細胞を、被験液としてFGF18（Recombinant Human FGF-18, PeproTech社、米国）、ジペプチド（Bachem社、スイス）などと共に培養した。陰性対照としてはリン酸緩衝生理食塩水を用いた。一定時間培養した後の細胞数を、WST-8を用いて、WST-8ホルマザンの産生量に伴う450 nmの発色を測定して求めた。
【００２９】
その結果、FGF18タンパク質は、その濃度に依存してR3c/BaF3細胞の増殖を促進することが示された。その結果を示すグラフより、FGF18濃度が0,5,50 ng/mlと増加するに従って、細胞数が徐々に多くなることが読み取れる（図１）。次に、FGF18を0,5,50ngのそれぞれの濃度で含む培養液にジペプチドPro-Ileを様々な濃度で添加し、一定時間培養した後の細胞数を求めた。その結果、FGF18濃度が5 ng/mlの時のR3c/BaF3細胞の増殖は、ジペプチドPro-Ileの濃度依存的に促進されることが見いだされた（図２−１）。またFGF18濃度が50 ng/mlの時の細胞増殖は、ジペプチドPro-Ileの濃度依存的に抑制されることが見いだされた（図２−１）。このように、ジペプチドPro-Ileは、R3c/BaF3細胞に対して、FGF18の部分的アゴニスト／部分的アンタゴニストとして作用すると考えられる。
【００３０】
次に、R3c/BaF3細胞について、FGF18を含まない培養液にジペプチドPro-Ile、またはジペプチドIle-Gly,またはアミノ酸であるPro（プロリン）、またはIle（イソロイシン）、またはGly(グリシン）を様々な濃度で添加し、一定時間培養した後の細胞数を求めた。その結果、R3c/BaF3細胞の増殖は、ジペプチドPro-IleまたはジペプチドIle-Glyの濃度依存的に促進されることが見いだされた（図２−２）。しかし、これらのジペプチドの構成単位アミノ酸である、Pro（プロリン）、またはIle（イソロイシン）、またはGly(グリシン）では、R3c/BaF3細胞の増殖は促進されないことが示された（図２−２）。このように、ジペプチドPro-IleまたはジペプチドIle-Glyは、R3c/BaF3細胞に対して、FGF18の部分的アゴニストとして作用すると考えられる。
【００３１】
次に、作製したR4/BaF3細胞をFGF18、ジペプチドなどと共に培養した。実験としては、FGF18を0,5,50 ng/mlのそれぞれの濃度で含む培養液にジペプチドPro-Ileを様々な培養液で添加し、一定時間培養した後の細胞数を求めた。その結果、FGF18濃度が5 ng/mlの時のR4/BaF3細胞の細胞増殖は、ジペプチドPro-Ileの濃度依存的に促進されることが見いだされた（図３−１）。またFGF18濃度が50 ng/mlの時の細胞増殖は、ジペプチドPro-Ileの濃度依存的に抑制されることが見いだされた（図３−１）。このように、ジペプチドPro-Ileは、R4/BaF3細胞に対しても、FGF18の部分的アゴニスト／部分的アンタゴニストとして作用すると考えられる。
【００３２】
次に、R4/BaF3細胞について、FGF18を含まない培養液にジペプチドPro-Ile、またはジペプチドIle-Gly,またはアミノ酸であるPro（プロリン）、またはIle（イソロイシン）、またはGly(グリシン）を様々な濃度で添加し、一定時間培養した後の細胞数を求めた。その結果、R4/BaF3細胞の増殖は、ジペプチドPro-IleまたはジペプチドIle-Glyの濃度依存的に促進されることが見いだされた（図３−２）。しかし、これらのジペプチドの構成単位アミノ酸である、Pro（プロリン）、またはIle（イソロイシン）、またはGly(グリシン）では、R4/BaF3細胞の増殖は促進されないことが示された（図３−２）。このように、ジペプチドPro-IleまたはジペプチドIle-Glyは、R4/BaF3細胞に対して、FGF18の部分的アゴニストとして作用すると考えられる。
【００３３】
〔実施例２〕
ジペプチドPro-Ileによる毛成長抑制作用
実験動物であるマウスを用いてジペプチドPro-Ileが毛成長に与える影響を解析した。C3H/HeNマウスのオス8週齢を用いた。この動物は背部皮膚の体毛が、毛成長周期のうち休止期にあることが知られている。背部皮膚の体毛を電気バリカンを用いて短く刈り込み、試験部位を作成した。この試験部位に100 μlの被検試料を塗布した。これを1日1回、21日間にわたり行った。試料は500 μMジペプチドPro-Ile溶液のほか、陰性対照としてリン酸緩衝生理食塩水、陽性対照として5% ミノキシジル溶液を用いた。溶媒はいずれも、水：プロピレングリコール:エタノール = 3：2：5混液を用いた。毎回の塗布処置前に、背部皮膚の写真を一定条件で撮影した。各試験群を3匹として、そのうち代表的な個体の写真を図４に示す。ImageJソフトウェアを利用して解析し、発毛状態をhair growth scoreとして定量化を行った。また統計処理を行った。その結果を図５に示す。この実験により、生理的に起こる新たな発毛と毛成長をジペプチドPro-Ileが抑制していることが示された（図５）。
【００３４】
〔実施例３〕
ジペプチドPro-Ileによる創傷治癒促進作用（動物実験）
実験動物であるマウスを用いてジペプチドPro-Ileが創傷治癒に与える影響を解析した。C3H/HeNマウス（日本エスエルシー株式会社）のオス7週齢を用いた。この動物は大部分の背部皮膚の体毛が、毛成長周期のうち成長期から休止期に入った時期にあることが知られている。マウスを麻酔後、背部皮膚の体毛をつまんで引き抜いた。この場合、ほとんどの毛は休止期にあるためスムーズに抜けたが、一部の毛は十分に休止期に入っていないためにその部分の皮膚は抜毛により創傷を生じた。この部分を試験部位として観察した。この試験部位に100 μlの被検試料を塗布した。これを1日1回、21日間にわたり行った。試料は500 μMジペプチドPro-Ile溶液のほか、陰性対照としてリン酸緩衝生理食塩水を用いた。溶媒はいずれも、水：プロピレングリコール:エタノール = 3：2：5混液を用いた。毎回の塗布処置前に、背部皮膚の写真を一定条件で撮影した。その部位の写真を図６に示す。この実験により、抜毛により生じる創傷において、ジペプチドPro-Ileがその治癒を促進していることが示された（図６-1, 2）。
【００３５】
〔実施例４〕
ジペプチドPro-Ileによる創傷治癒促進作用（培養細胞を用いた試験）
ヒト表皮細胞のモデル培養細胞であるHaCaT細胞（コスモ・バイオ株式会社から購入することができる）を用いてジペプチドPro-Ileが創傷治癒に与える影響を解析した。培養細胞を用いた創傷治癒モデルとして実施されるScratch Wound Assay （ひっかき傷試験）を行った。HaCaT細胞を24ウェルプレートに1 x 106 cells/well播種し、増殖用培養液10% FBS/DMEMで24時間培養して細胞をコンフルエント（培養表面を隙無く覆っている状態）に導いた。次に培養液を0.1% FBS/DMEM（starvation medium）に交換して2時間培養した。その後、均一に細胞が覆っている培養表面をプラスティックチップで線状になぞることにより、一定幅の細胞を除去した。その後starvation medium液中に被検試料を含む培養液を添加して、0〜24時間培養し、一定時間後に細胞を位相差顕微鏡により写真撮影した。その写真を図７に示す。この実験系では、培養細胞上に作成されたひっかき傷（創傷）は、周囲に存在する表皮細胞が遊走し増殖することでその傷を埋める（創傷治癒）作用を評価することができる。本実験の結果を定量的に評価した結果を図８に示す。これにより、ジペプチドPro-Ileは培養細胞上の創傷治癒を促進していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、毛成長調節及び／又は創傷治癒に有効な皮膚外用剤に利用できる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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