(57)【要約】      （修正有）【課題】様々な疾患および障害、例えば心血管疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィ−、線維性疾患を治療するために、治療的有用な幹細胞やエキソソ−ム組成物の提供。【解決手段】iPSＣ細胞、胚性幹細胞、および有効量のイソキサゾ−ル化合物やその誘導体や等価物、ダナゾ−ルと接触させた幹細胞、のうちから選択されたエキソソ−ムと微小胞であって、特定のMicroRNA（miRNA）、および／またはTsg101、CD9、Hsp70、Flotillin−1およびGAPDHから選択した1つ以上のタンパク質を１つ以上過剰発現する、エキソソ−ムまたは微小胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
iPSＣ細胞、胚性幹細胞、および有効量のイソキサゾ−ル化合物やその誘導体や等価物、ダナゾ−ルと接触させた幹細胞、のうちから選択されたエキソソ−ムと微小胞であって、
ａ）mir−373、mir−210、mir−377、mir−367、mir−520、mir−548ah、mir−335、mir−21、mir−30c、mir−214、mir−548qから選んだMicroRNA（miRNA）、
および／または、
ｂ）Tsg101、CD9、Hsp70、Flotillin−1およびGAPDHから選択した1つ以上のタンパク質
を１つ以上過剰発現する、エキソソ−ムまたは微小胞。
【請求項２】
以下のグル−プ：iPSＣ細胞、胚性幹細胞、有効量のイソキサゾ−ル化合物やその誘導体や等価物、ダナゾ−ルと接触させた幹細胞から選択した心筋前駆細胞、（CPC）、心筋細胞、筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、のうちから選択した単離細胞であって、
ａ）mir−373、mir−210、mir−377、mir−367、mir−520、mir−548ah、mir−335、mir−21、mir−30c、mir−214 or mir−548qから選んだMicroRNA（miRNA）；
および／または
ｂ）PaZ3、pAX7、MYF5、MYOD、MYOG、ジストロフィンから選択した筋肉遺伝子
を１つ以上過剰発現する
ことを特徴とする単離細胞。
【請求項３】
請求項１のエキソソ−ムまたは微小胞、もしくは、請求項２の単離細胞においては、
心筋細胞が、ひとつ以上のcTnT、cTni、MLC2VおよびCX43を過剰発見する。
【請求項４】
請求項１のエキソソ−ムまたは微小胞、もしくは、請求項２の単離細胞においては、
内皮細胞が、ひとつ以上のCD31および／またはVE−カドヘリンを過剰発見する。
【請求項５】
平滑筋アクチン（SMA）やカルポニンを発現する単離された平滑筋細胞。
【請求項６】
請求項１の単離されたエキソソ−ムまたは微小胞からなる、実質的に均質なエキソソ−ムや微小胞の集団。
【請求項７】
検出可能に標識されていた、請求項１の単離されたエキソソ−ムや微小胞からなる集団。
【請求項８】
請求項４の組成と担体であって、その担体は場合により天然に存在しない担体である。
【請求項９】
請求項２の単離細胞からなる、実質的に均質な単離細胞集団。
【請求項１０】
請求項９の単離細胞集団が含まれる組成物と担体であって、その担体は場合により天然に存在しない担体である。
【請求項１１】
請求項７と９の組成物、さらに防腐剤または抗凍結剤が含まれる。
【請求項１２】
請求項1の組成物、さらに組織再生および機能改善を促進するタンパク質やタンパク質をコ−ドする核酸や炎症性タンパク質の発現を抑制する薬剤（場合によりサイトカインである）が含まれる。
【請求項１３】
請求項12の組成物、そこで、タンパク質は、トランスフォ−ミング増殖因子−〜、WNTタンパク質、サイトカインやヒストンデアセチラ−ゼの群から選択される。
【請求項１４】
請求項11の単離細胞集団で、また組成物は凍結乾燥される。
【請求項１５】
請求項1の単離エキソソ−ムや微小胞のイソオキサゾ−ル化合物はイソオキサゾ−ル−1（isx−1）またはイソオキサゾ−ル−9（isx−9）。
【請求項１６】
請求項２に記載の単離された細胞、そのイソオキサゾ−ル化合物が、イソオキサゾ−ル−１（isx − １）またはイソオキサゾ−ル−９（isx − ９）である。
【請求項１７】
請求項1の単離エキソソ−ムや微小胞、および声明2の単離細胞。そのイソオキサゾ−ル誘導体の式は：
2019201631.tif 000018
R1とR2は両方水素や、R1は水素でR2は置換や非置換のC 1−C 6アルキル、C 3−C 6シクロアルキル、C 2−C 6アルケニル、C 2−C 6アルキニル、ベンジルからなる群から選択される、または、R1とR2は一緒になってアゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニルから選択される環を形成する；R2 ‘、R3とR4は水素、ハロゲン、C 1−C 6アルキル、C 3−C 6シクロアルキル、置換や非置換芳香族、ヘテロ芳香族環、シアノ、ニトロ、およびアシルからなる群から独立して選択される。Xは0、NHおよびSであり、Yは0、NHおよびS。
【請求項１８】
請求項1の単離エキソソ−ムや微小胞、および声明2の単離細胞。そのイソオキサゾ−ル誘導体の式は：
2019201631.tif 000019
R1とR2は、それぞれＣ1〜Ｃ4アルキル、フェニル、ベンジル、トリフルオロメチルまたはハロゲンから選択されて、R3は水素、ヒドロキシ、C 1−C 4アルキルまたはアルコキシから選択される。位置3や5にいるR4はは、水素、トリフルオロメチル、C 1−C 4アルコキシ、C 1−C 4アルキル、C 1−C 4ヒドロキシアルキルから選択されて、R5は水素、C 4−C 4アルキルから選択されて、および、R4とR5は一緒にテトラメチレン基をなる。位置3や5にいるZは−N(R6)−CO−、−CON(R6)−、−N(R6)−CO−N(R6)−、−CH(R6)−NH−−−CO−、or−NH−CO&#8212;CH(R6)から選択されて、その場合に、R6は水素やC 1−C 4アルキルから選択される。
【請求項１９】
請求項1の単離エキソソ−ムや微小胞、および声明2の単離細胞。そのイソオキサゾ−ル化合物、またはその誘導体は、以下の群から選択される：5−（トリフルオロメチル）−3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（トリフルオロメチル）−3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（チオフェン−2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、5，6，7，8−テトラヒドロ−4h−シクロヘプタ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、4，5，6，7−テトラヒドロ−ベンゾ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、 3−アミノ−5−メチルイソオキサゾ−ル、4−アミノ−n−（5−メチル−3−イソオキサゾリルI）ベンゼンスルホンアミド、3−フェニルイソオキサゾ−ル−5−ボロン酸ピナコ−ルエステル、5−フェニルイソオキサゾ−ル、1−フェニル−1−シクロペンタンカルボン酸、 3−フェニル−ベンゾ［c］イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−メチル−3−フェニルイソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、3 a、4，5，6，7，8，9，9 a−オクタヒドロ−シクロオクタ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（3−ニトロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−ニトロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−ヒドロキシ−5−アミノメチルイソオキサゾ−ル、5−（モルホリノメチル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸塩酸塩、5−（モルホリノメチル） ）イソオキサゾ−ル−3−カルバルデヒド、3−メチル−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（チオフェン−2−イル）イソキサゾ−ル−3−カルボン酸メチル、3−（メチルスルホニル）−5−（2−）チエニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボニトリル、5−メチル−3−（2−ピロリジニル）イソオキサゾ−ル、3−メチル−5−（2−ピロリジニル）イソオキサゾ−ル、3−（1−メチル−1h−ピラゾ−ル−4−イル）−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、3−（1−メチル−1h−ピラゾ−ル−4−イル）−4，5−ジヒドロ−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−（4−メチルフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、 5−メチル−3−フェニルイソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−メチルフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、5−メチル1−3−（4−フェノキシフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、3−メチル−5−（4−メチル−1，2，3−チアジアゾ−ル−5−イル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、3−メチル−5−（5−メチルイソオキサゾ−ル−3−イル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、メチル5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、メチル5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、5−メチルリスオキサゾ−ル、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸メチル、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸メチル、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸メチル、5−（4−ブロモフェニル）メチル イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（3−メトキシ−フェニル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（2−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸 5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（2−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（2−メトキシ−フェニル）−4，5−ジヒドロ−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、3−メトキシ−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、イソオキサゾ−ル−5−カルボチオアミド、イソオキサゾ−ル−5−カルボニルクロリド、イソオキサゾ−ル−3−カルボニトリル、イソオキサゾ−ル−3−カルバルデヒド、イソオキサゾ−ル−4−ボロン酸、イソキサゾ−ル、5−シクロプロピル1−4 ［2−（メチル スルホニル）−4−（トリフルオロメチル）ベンゾイル］イソオキサゾ−ル、6−（5−（チオフェン−2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキサミド）ヘキシル5−（（3 as、4s、6 ar）−2−オキソヘキサヒドロ−1h−チエノ［3，4 − d］イミダゾ−ル−4−イル）ペンタノエ−ト、イソカルボキサジド5−メチル−3−イソオキサゾ−ル−カルボン酸2−ベンジルヒドラジド、5−イソブチルイソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、4−ヨ−ド−5−メチル1−イソオキサゾ−ル、3，3'−イミノビス（n、n−ジメチルプロピル）アミン）、3−（3−ヒドロキシフェニル）−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸メチルエステル、5−（4−ヒドロキシ−フェニル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（3−ヒドロキシフェニル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（ヒドロキシメチル）−3−メチルイソオキサゾ−ル、3−ヒドロキシ−5−メチルイソオキサゾ−ル、5−（1−ヒドロキシエチル）−3−（4−トリフルオロメチルフェニル）イソオキサゾ−ル、3 a、4，5，6，7 ，． 7 a−ヘキサヒドロ−ベンゾ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（2−フリル）イソオキサゾ−ル−3−カルバルデヒド、5−フラン−2−イル−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、6−フルオロ−3−（ 4−ピペリジニル）ベンゾイソオキサゾ−ル、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−メタノ−ル、3−（2−フルオロ−フェニル）−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（3−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒドe、3−（2−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（3−フルオロ−4−メトキシ−フェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシル酸、エチル5−（トリフルオロメチル）−3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、エチル−5−（トリブチルスタミル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチル5−（チオフェン−2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、5−エチル−イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−エチル−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、エチル5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、エチル5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ���ル−3−カルボキシレ−ト、エチル5−（2，3−ジヒドロベンゾ［b］ ［1，4］ジオキシン−7−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチル3−（4−）クロロフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、エチルI 5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチルI 3−（4−ブロモフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、エチル5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチル5−アミノ−4−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチル5−アミノ−4−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシラ−ト、エチル6b−アセチル1−2−（アセチルオキシ）−4 a、6 a−ジメチル−2，3，4，4 a、4b、5，6，6 a、6b、9 a、10，10 a、10b 、11−テトラデカヒドロ−1−ナフト［2 '、1'：4，5］インデノ［2，1 − d］イソオキサゾ−ル−9−カルボキシレ−ト、3，5−ジメチル−4−（トリブチルスタミル）イソオキサゾ−ル、5−（1，5）−ジメチル−1h−ピラゾ−ル−4−イル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（1，3−ジメチル−1h−ピラゾ−ル−4−イル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（1，5）−ジメチル−1h−ピラゾ−ル−4−イル）−イソオキサゾ−ル、3，5−ジメチルイソオキサゾ−ル−4−ボロン酸ピナコ−ルエステル、3，5−ジメチルイソオキサゾ−ル、3−（ジメチルアミノ）−1−（2−ピリジル）−2−プロペン−1−1、5−（ 3，5−ジフルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、［2，6−ジクロロ−4−（トリフルオロメチル）フェニル］ヒドラジン、5−（2，5−ジクロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、ダナゾ−ル、3−（4−クロロフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−プロピオン酸、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、3−（3−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、3−（4−）クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（3−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（2−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（クロロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、3−（クロロメチル）−5−（2−フリル）イソオキサゾ−ル、4−クロロメチル−3，5−ジメチルイソオキサゾ−ル、5−（クロロメチル）−3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（3−クロロ−4−メトキシ−フェニル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−クロロ−4−フルオルベンズアルデヒド、3−（5）−クロロ−2，4−ジメトキシ−フェニル1）−4，5−ジヒドロ−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5 − tert−ブチル−4，5，6，7−テトラヒドロ−ベンゾ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（4−ブロモフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸��5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−プロピオン酸、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸ヒドラジド、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、3−（4−ブロモフェニル） ）イソオキサゾ−ル−5−カルボキシアルデヒド、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（3−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（ブロモメチル）−3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、4）−（ブロモメチル）イソオキサゾ−ル、5−（ブロモメチル）−3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（ブロモメチル）−3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（ブロモメチル）−3−（4−ブロモフェニル） ）イソオキサゾ−ル、6−ブロモ−3−メチルベンゾ［d］イソオキサゾ−ル、5−ブロモ−3−メチルベンゾ［d］イソオキサゾ−ル、4−ブロモ−5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−ブロモイソオキサゾ−ル、3−ブロモ−5−（2−ヒドロキシエチル）イソオキサゾ−ル、4−ブロモ−5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−ブロモ−5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、4−ブロモ−5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、4−ブロモ−5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、6−ブロモ−ベンゾ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、ベンゾ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−アミノ−5−メチルイソオキサゾ−ル、5−アミノ−3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−アミノイソオキサゾ−ル、3−アミノ−5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アミノ−3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アミノ−4−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、3−アミノ−5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アセチル−3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アセチル1−3−（3−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−メチル−5−［（2s）−1−メチル−2−ピロリジニル］イソオキサゾ−ル塩酸塩。 7−メ
トキシ−5−メチル−4，5−ジヒドロナフト［2，1 − d］イソオキサゾ−ル、5−メチル−3−フェニルイソオキサゾ−ル−4−カルボン酸メチルアミド、5−メチル−3−フェニル−イソオキサゾ−ル−4−カルボチオ酸 メチルアミド、5−メチル−3−フェニル−4−（1h−ピラゾ−ル−5−イル）イソオキサゾ−ル、5−ベンジル−3−フラン−2−イル−2−フェニル−テトラヒドロ−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル −4，6−ジオン、5−ベンジル1−3− ［4−（ジメチルアミノ）フェニル］ −2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、 5−ベンジル−3−（5 − br − 2−ホ−フェニル）−2 − ph−テトラヒドロ−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、5−ベンジル−3−（4−） ニトロ−ph）−2 − ph−ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−3−（4−メトキシ−フェニル）−2 −ph−テトラヒドロ−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、5−ベンジル1−3−（4−フルオロフェニル）−2−（2−メチルフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−3−（3−ニトロ−ph）−2−フェニル−テトラヒドロピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、5−ベンジル−2 − ph − 3−（2−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジエン、5−ベンジル−2 − ph − 3−（2 − ph−ビニル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−2−（4−クロロフェニル）−3−（2−チエニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、 5h）−ジオン、5−ベンジル−2，3−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジアン、5−ベンジル1−2（4 − cl − ph） ）3−（2−フリル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジオン、5−ベンジル−2（4 − cl − ph）−3−（4−） f − ph）ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジオン、5−（p−トリル）イソオキサゾ−ル、5−（4−メチルフェニル）−3−（4−ニトロフェニル） −2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジエン、5−（4−メトキシフェニル）−2−フェニル−3−（4−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジエン、5−（4−メトキシフェニル）−2−フェニル−3−（3−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］]イソオキサゾ−ル−4,6 （3h、5h）−ジオン、5−（4−メトキシph）−2，3−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−（4−フルオロフェニル）−3−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジアン、5−（4−フルオロフェニル） −2−（2−メチルフェニル）−3−（4−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−（4−エトキシフェニル）−3−（4−ニトロフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−（4−エト���シフェニル）−3−（4−フルオロフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−（4−エトキシフェニル）−2−メチル−3−（4−ニトロフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジエン、5−（4−エトキシ−ph）−2 − ph − 3−チオフェン−2−イル1−4h−ピロロ（3，4）−d）イソオキサゾ−ル−4,6−ジオン、5−（4−cl−ph）−3−（3−ニトロ）−2−フェニル−テトラヒドロ−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4,6−ジオン5−（4−ブロモフェニル）−3−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−（ 4−ブロモフェニル）−3−（2−フリル）−2−（2−メチルフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−（4−）ブロモフェニル）−2−フェニル−3−（2−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−（4 − br − ph） 2 − ph − 3−（2 − ph−ビニルI）ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジオン、5−（2 − cl − ph）−3−（4−ジメチルアミノ−ph）2 − o−トリル1−4h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、5−（2−クロロフェニル）−3− ［4−（ジメチルアミノ）フェニル］ −2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−（2−クロロフェニル）−3−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、4−（（3−（2−cl−ph）−5−メチルイソオキサゾ−ル−4−カルボニル）−アミノ）−安息香酸エチルエステル、4，5，6，6 a−テトラヒドロ−3 ah−シクロペンタ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−フェニル−3 a、6 a−ジヒドロチエノ［2，3 − d］イソオキサゾ−ル−4，4−ジオキシド、3−メチル−5−（3−フェニルプロピル）イソオキサゾ−ル、3−メチル−4−ニトロ−5−［（e）−2−フェニルエテニル］イソオキサゾ−ル、3−メチル−4，5，8，9−テトラヒドロシクロオクタ（d）イソオキサゾ−ル、3−メチル−4，5，5 a、6 a、7，8−ヘキサヒドロオキシレノ（2 '、3'：5，6）シクロオクタ（1，2 − d）イソオキサゾ−ル、3−メチル1〜3 a、4，5 、8，9，9 a−ヘキサヒドロシクロオクタ（d）イソオキサゾ−ル、3−フラン−2−イル−2−フェニル−5 − p−トリル−テトラヒドロ−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、3−クロロ−4，5−ジヒドロ（1）−ベンゾチエピノ（5，4 − c）イソオキサゾ−ル、3− ［4−（ジメチルアミノ）フェニル］ −5−（4−メトキシフェニル）−2−（2−メチルフェニル） ）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（5 − br − 2 − ho−フェニル）−2，5−ジフェニル−テトラヒドロ−ピロロ（ 3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、3−（5 − br − 2 − ho − ph）−5−（2 − cl − ph）−2 − ph−テトラヒドロ−ピロロ（3，4−） d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、3−（4−メオ−フェニル）−5−フェニル1−2 − o−トリル−テトラヒドロ−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、3−（4−フルオロフェニル）−5−���4−ニトロフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（4−フルオロフェニル） ）−5−（4−メチルフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、 3−（4−ジメチルアミノ−ph）−5 − ph − 2 − o−トリル−4h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、−（4−フルオロフェニル）−5−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（4 − br − ph）−2 − ph − 5−（2−トリフルオロメチル−ph）−4h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジアン、3−（3−ニトロ−フェニル）−2，5−ジフェニル−テトラヒドロ−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、3−（3 − br−フェニル）−2，5−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、 5h）ジアン、3−（3 − br − ph）−5−（2− meo − ph）−2 − o−トリル−テトラヒドロピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、3−（2）−フリル）−5− ［4−（4−モルホリニル）フェニル］ −2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（2−フリル） ）−2−（2 − me − ph）−5−ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（2−）フリル）−2，5−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（2 − cl−フェニル）−5−メチル−イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸（2，5−ジクロロ−フェニル）−アミド、3−（2 − cl − ph）−5 − me−イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸（4，5−ジヒドロ−チアゾ−ル−2−イル）アミド、 3−（2−クロロ−フェニル）−5−メチル−イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸シアノメチル−アミド、ジクロロフェニル）−5−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（2，4−ジ−cl − ph）−2，5−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、 5h）ジオン、3−（2，2−ジクロロ−ビニル）−5−フェニル−イソオキサゾ−ル、3，5−ジフェニル−1−イソオキサゾ−ル、3，5−ジメチル1−4−（1−ピロリジニルスルホニル）イソオキサゾ−ル、3。 （4−ジメチルアミノ−ph）−5−（4 − eto − ph）2 − o−トリル−4−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、2−（4 − cl − ph）5−ph − 3−（2−チエニル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジアエン、2−（4 − cl − ph）−5−（3−メオ−） ph）−3−（3−ニトロ−ph）−4h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、2−（4 − cl − ph）−3−（4 − meo − ph） −5−トリル−テトラヒドロ−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、2−（4−クロロフェニル）−5−（4−メチルフェニル）−3−（2−チエニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジアン、2−（4−クロロフェニル）−3− ［4−（ジメチルアミノ）フェニル］ −5−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［ 3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジエン、2−（4−クロロフェニ���）−3−（4−フルオロフェニル）−5−（4−ニトロフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3、 4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、2−（4−クロロフェニル）−3−（2−チエニル）−5− ［3−（トリフルオロメチル）フェニル］ジヒドロ−2h−ピロロ［3］ 、4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、2−（4−クロロフェニル）−3−（2，4−ジクロロフェニル）−5−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、2，3−ジ−ph−5−（3−（tri−f−me）ph）ジヒドロ−2h−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、ダナゾ−ル、およびn−シクロプロピル−5−（チオフェン−2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキサミド。
【請求項２０】
請求項2の単離細胞は、さらに無血清培地中で細胞を培養することが含まれる。
【請求項２１】
請求項1の単離エキソソ−ムや微小胞に、イソオキサゾ−ル、誘導体や同等物の有効量がmiRNAの過剰発現を引き起こす量が含まれる。
【請求項２２】
請求項21の単離エキソソ−ムや微小胞に、有効量は5 f.LMから25 f.LMまで。
【請求項２３】
請求項1の単離エキソソ−ムや微小胞に、iPS はいかのグル−プから細胞に分化している：心臓前駆細胞、心筋細胞、内皮細胞、筋細胞、平滑筋細胞、およびiPSC由来胚様体。
【請求項２４】
それを必要とする対象に提供することの1つ以上の方法：
A.        損傷した組織の再生
B.        損傷した組織の生存率を上がる
C.        以下の群から選択された新組織の生成を促進する：心臓組織、筋肉組織、骨格筋。、血管、毛細血管、筋細胞。
D.        心臓再生を促進する
E.        急性心臓病に罹患している対象において心臓再生を促進する
F.         心筋梗塞に罹患している対象において心臓再生を促進する
G.        デュシェンヌ型筋ジストロフィ−とデュシェンヌ型筋ジストロフィ−関連心筋症に罹患している対象において心臓再生を促進する
H.        以下の群から選択される加齢性疾患に罹患している対象において心臓再生を促進する：COPD、関節炎、骨粗鬆症、変形性関節症、糖尿病、血管性認知症、黄斑変性症、先天性角化異常症、肺線維症、再生不良性貧血、肝線維症、骨髄疾患、肺疾患、 内分泌疾患、多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）、クッシング症候群、末端肥大症、脳血管障害（脳卒中）、高血圧症、パ−キンソン病、認知症、アルツハイマ−病、加齢性難聴、セリアック病（CD）、 双極性障害、ヒドロキシ尿素、鎌状赤血球症、アテロ−ム性動脈硬化症、血管性痴呆、癌、2型糖尿病、テロメア機能低下を伴う疾患。
I.         以下の原因に損傷された組織で、その再生を促進する：脳卒中、関節炎、アルツハイマ−病、記憶喪失障害、嚢胞性線維症、炎症性障害、癌。
J.        心臓梗塞により損傷を受けた組織における心臓壁の厚さを減る
K.        ひとつ以上のタンパク質キナ−ゼ C、iL−6、mmp、or PDGFの遺伝子発現を変わる
L.        炎症性タンパク質、場合によってはサイトカイン、ケモカイン、またはマクロファ−ジの発現を低減または阻害すること。
M.       直接的または間接的に血管新生を刺激する
N.        冠状動脈疾患、心筋梗塞、心不全、低形成性左心症候群、末梢動脈疾患（PAD）、心肥大、心臓弁膜症（大動脈弁狭窄）、心筋肥大、筋肥大性線維症の群から選択される疾患を患っている対象における心臓再生の促進。または/および
O.        細胞複製を直接的または間接的に阻害する方法であって、有効量の請求項1に記載の単離されたエキソソ−ムまたは微小胞または請求項2に記載の細胞を対象に投与することを含む方法。
【請求項２５】
請求項24に記載の方法であって、任意選択的に、修復の組織の種類とは異なる種類の修復を必要とする組織と同じ種類である有効量の非胚性幹細胞または前駆細胞を対象に投与することをさらに含む。
【請求項２６】
前記非胚性幹細胞または前駆細胞が、前記被験体に対して自己由来または同種異系である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
エキソソ−ムまたは微小胞が、対象の組織に局所的または全身的に送達される、請求項25に記載の方法。
【請求項２８】
エキソソ−ムまたは微小胞が、心筋内または冠状動脈内経路を介して対象に送達される、請求項25に記載の方法。
【請求項２９】
1つ以上のメソッド：
A.        抗酸化療法を提供する
B.        局所または常在心筋細胞の活性化を促進する
C.        血管新生および/またはパラクリン因子の放出を促進する
D.        wnt、BMP、および/または細胞骨格リモデリングの活性化を促進する
E.        TGF−β誘導emtシグナル伝達および心臓分化を促進する
F.         wnt5およびwnt11またはBMPファミリ−タンパク質、必要に応じてBMP4の発現を増加して
G.        nkx2．5、mef2c、g at a4およびisl − 1からなる群から選択される心臓転写因子の発現を増加して
H.        心筋細胞におけるpip3シグナル伝達の発達、筋肉収縮、および肥大シグナル伝達経路における遺伝子発現を促進する
I.         線維症およびアポト−シスを減少して
J.        筋形成および筋分化を促進する
K.        angiopoietin−2、il−6nmp、pgfbb、timp 1からなる群から選択されるサイトカインの放出を促進する
L.        wnt3a、wnt5a、wnt11からなる群より選択される遺伝子の上方制御を促進する。 および/または
M.       細胞骨格リモデリングを促進する、方法、それを必要とする対象に有効量の請求項1の単離されたエキソソ−ムもしくは微小胞または請求項2の単離された細胞を投与することを含む方法。
【請求項３０】
請求項３〜５のいずれか１項に記載の単離された細胞集団。
【請求項３１】
前記集団が、有効量のイソキサゾ−ル、その誘導体または等価物の存在下でiPSＣの集団を培養することを含む方法によって調製される、請求項3〜5のいずれかに記載の細胞または請求項30に記載の集団。
【請求項３２】
前記集団が、線維芽細胞、骨格筋芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、血管、心筋細胞、毛細血管または筋細胞の群から選択される細胞に由来する、請求項31に記載の集団。
【請求項３３】
イソオキサゾ−ル化合物が、イソキサゾ−ル−1（isx − 1）またはイソオキサゾ−ル−9（isx − 9）である、請求項31に記載の集団。
【請求項３４】
前記イソオキサゾ−ル誘導体が、の群から選択される、請求項31に記載の集団：
2019201631.tif 000020
式中、R1およびR2は両方とも水素であるか、またはR1は水素でありそしてR2は置換または非置換のＣ1 − Ｃ6アルキル、Ｃ3 − Ｃ6シクロアルキル、Ｃ2 − Ｃ6アルケニル、Ｃ2 − Ｃ6アルキニルおよびベンジルからなる群から選択される。あるいは、R1とR2が一緒になって、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、またはモルホリニルから選択される環を形成してもよい。R 2 '、R 3およびR 4は、水素、ハロゲン、Ｃ 1 −Ｃ 6アルキル、Ｃ 3 −Ｃ 6シクロアルキル、置換または非置換の芳香族またはヘテロ芳香族環、シアノ、ニトロ、およびアシルからなる群から独立して選択される。 Xは0、NHまたはSであり；そして Yは0、NHまたはSである。
【請求項３５】
イソオキサゾ−ル化合物が以下の式を有する、請求項31に記載の組成物：
2019201631.tif 000021
式中、R1およびR2はそれぞれＣ1 − Ｃ4アルキル、フェニル、ベンジル、トリフルオロメチルまたはハロゲンから選択され、R3は水素、ヒドロキシ、Ｃ1 − Ｃ4アルキルまたはアルコキシから選択される。3位または5位のR 4は、水素、トリフルオロメチル、Ｃ 1 〜Ｃ 4アルコキシ、Ｃ 1 〜Ｃ 4アルキル、またはＣ 1 〜Ｃ 4ヒドロキシアルキルから選択される。R 5は水素またはＣ 4 −Ｃ 4アルキルから選択されるか、またはR 4およびR 5は一緒になってテトラメチレン基を形成し、複素環上の3位または5位のZは以下から選択される：−N(R6)−CO−、−CON(R6)−、−N(R6)−CO−N(R6)−、−CH(R6)−NH−−−CO−、or−NH&#8212;CO−−−CH(R6)。式中、R 6は水素またはC 1−C 4アルキルから選択される。
【請求項３６】
請求項33の組成物、そのイソオキサゾ−ル化合物、またはその誘導体は、以下の群から選択される：5−（トリフルオロメチル）−3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（トリフルオロメチル）−3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（チオフェン−2） −y I）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、5，6，7，8−テトラヒドロ−4h−シクロヘプタ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、4，5，6，7−テトラヒドロ−ベンゾ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボキシル酸、3−アミノ−5−メチルイソオキサゾ−ル、4−アミノ−n−（5−メチル−3−イソオキサゾリル）ベンゼンスルホンアミド、3−フェニル−イソオキサゾ−ル−5−ボロン酸ピナコ−ルエステル、5−フェニルイソオキサゾ−ル、1−フェニル−1−シクロペンタンカルボン酸、3−フェニル−ベンゾ［c］イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−メチル−3−フェニルリゾオキサゾ−ル−4−カルボン酸、3 a、4，5，6，7，8，9，9 a−アセトヒドロ−シクロオクタ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（3−ニトロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−ニトロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−ヒドロキシ−5−アミノメチル−イソオキサゾ−ル、5−（モルホリノメチル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸塩酸塩、5−（モルホリノメチル）イソオキサゾ−ル−3−カルバルデヒド、3−メチル1−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（チオフェン−2−イル）イソキサゾ−ル−3−カルボン酸メチル、 3−（mエチルスルホニル）−5−（2−チエニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボニトリル、5−メチル−3−（2−ピロリジニル）イソオキサゾ−ル、3−メチル−5−（2−ピロリジニル）イソオキサゾ−ル、3−（1−メチル−1h）−ピラゾ−ル−4−イル）−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、3−（1−メチル−1−1h−ピラゾ−ル−4−イル）−4，5−ジヒドロ−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−（ 4−メチルフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−メチル−3−フェニルイソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−メチルフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、5−メチル1−3−（4−フェノキシフェニル） ）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、3−メチル−5−（4−メチル−1，2，3−チアジアゾ−ル−5−イル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、3−メチル−5−（5−メチルイソオキサゾ−ル−3）−イル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸メチル、5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸メチル、5−メチルイソオキサゾ−ル、5−（4−フルオロフェニル）メチルイソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、メチル5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、メチル5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、メチル5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、5−5。 （4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（3−メトキシ−フェニル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（2−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3− （2−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（2−メトキシ−フェニル）−4，5−ジヒドロ−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸酸、3−メトキシ−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、イソオキサゾ−ル−5−カルボチオアミド、イソオキサゾ−ル−5−カルボニルクロリド、イソオキサゾ−ル−3−カルボニトリル、イソオキサゾ−ル−3−カルバルデヒド、イソオキサゾ−ル−4−ボロン酸、イソキサゾ−ル、5−シクロプロピル1−4 ［2−（メチルスルホニル）−4−（トリフルオロメチル）ベンゾイル］イソオキサゾ−ル、6−（5−（チオフェン−2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキサミド）ヘキシル5−（（3 as、4s、6 ar）−2−オキソヘキサヒドロ−1h−チエノ［3，4 − d］イミダゾ−ル−4−イル）ペンタノエ−ト、イソカルボキサジド5−メチル−3−イソオキサゾ−ル−カルボン酸2−ベンジルヒドラジド、5−イソブチルイソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、4−ヨ−ド−5−メチル1−イソオキサゾ−ル、3，3'−イミノビス（n、n−ジメチルプロピル）アミン）、3−（3−ヒドロキシフェニル）−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸メチルエステル、5−（4−ヒドロキシ−フェニル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（3−ヒドロキシフェニル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（ヒドロキシメチル）−3−メチルイソオキサゾ−ル、3−ヒドロキシ−5−メチルイソオキサゾ−ル、5−（1−ヒドロキシエチル）−3−（4−トリフルオロメチルフェニル）イソオキサゾ−ル、3 a、4，5，6，7，7 a−ヘキサヒドロ−ベンゾ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（2−フリル）イソオキサゾ−ル−3−カルバルデヒド、5−フラン−2−イル−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、6−フルオロ−3−（4）−ピペリジニル）ベンゾイソオキサゾ−ル、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−メタノ−ル、3−（2−フルオロ−フェニル）−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、3− （4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（3−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒドe、3−（2−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（3−フルオロ−4−メトキシ−フェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、エチル5−（トリフルオロメチル）−3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、エチル−5−（トリブチルスタニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチルI 5−（チオフェン−2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、5−エチル−イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−エチル−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、エチル5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、エチル5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシ���−ト、エチル5−（2，3−ジヒドロベンゾ）［b］ ［1，4］ジオキシン−7−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチル3−（4−クロロフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、エチル5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチル3−（4−ブロモフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、エチル5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチル5−アミノ−4−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチル5−アミノ−4−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチル6b−アセチル−2−（アセチルオキシ）−4 a、6 a−ジメチル−2，3，4，4 a、4b、5 、6，6 a、6b、9 a、10，10 a、10b、11−テトラデカヒドロ−1−ナフト［2 '、1'：4，5］インデノ［2，1 − d］イソオキサゾ−ル−9−カルボキシレ−ト、3，5−ジメチル−4−（トリブチルスタニル）イソオキサゾ−ル、5−（1，5−ジメチル−1h−ピラゾ−ル−4−イル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（1，3−ジメチル−1h−ピラゾ−ル−4−）イル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（1，5−ジメチル−1h−ピラゾ−ル−4−イル）−イソオキサゾ−ル、3，5−ジメチルイソオキサゾ−ル−4−ボロン酸ピナコ−ルエステル、3，5−ジメチルイソオキサゾ−ル、3−（ジメチルアミノ）−1−（2−ピリジル）−2−プロペン−1−オン、5−（3，5−ジフルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、［2，6−ジクロロ−4−（トリフルオロメチル）フェニル］ヒドラジン、5−5。 （2,5−ジクロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、ダナゾ−ル、3−（4−クロロフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−プロピオン酸、5−（4−）クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、3−（3−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（3−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（2−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、5−（4−）クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（クロロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、3−（クロロメチル）−5−（2−フリル）イソオキサゾ−ル、4−クロロメチル−3，5−ジメチルイソオキサゾ−ル、 5−（クロロメチル）−3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（3−クロロ−4−メトキシ−フェニル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−クロロ−4−フルオルベンズアルデヒド、3−（5）−クロロ−2，4−ジメトキシ−フェニル1）−4，5−ジヒドロ−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5 − tert−ブチル−4，5，6，7−テトラヒドロ−ベンゾ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（4−ブロモフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−ブロモフ���ニル）イソオキサゾ−ル−3−プロピオン酸、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸ヒドラジド、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、3−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルボキシアルデヒド、5−（4−ブロモフェニル） ）イソオキサゾ−ル、5−（3−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（ブロモメチル）−3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、4−（ブロモメチル）イソオキサゾ−ル、5−（ブロモメチル）−3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（ブロモメチル）−3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（ブロモメチル）−3−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、6−ブロモ−3−メチルベンゾ［d］イソオキサゾ−ル、 5−ブロモ−3−メチルベンゾ［d］イソオキサゾ−ル、4−ブロモ−5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−ブロモイソオキサゾ−ル、3−ブロモ−5−（2−ヒドロキシエチル）イソオキサゾ−ル、4−ブロモ−5−（4）−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−ブロモ−5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、4−ブロモ−5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、4−ブロモ−5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、6−ブロモ−ベンゾ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、ベンゾ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−アミノ−5−メチルイソオキサゾ−ル、5−アミノ−3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−アミノイソオキサゾ−ル、3−アミノ−5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アミノ−3−（4−クロロフェニル） l）イソオキサゾ−ル、5−アミノ−4−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、3−アミノ−5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アセチル1−3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アセチル−3−（3−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−メチル−5−［（2s）−1−メチル−2−ピロリジニル］イソオキサゾ−ル塩酸塩、7−メトキシ−5−メチ
ル−4，5−ジヒドロナフト［2，1 − d］イソオキサゾ−ル、5−メチル−3−フェニルイソオキサゾ−ル−4−カルボン酸メチルアミド、5−メチル−3−フェニル−イソオキサゾ−ル−4−カルボチオ酸メチルアミド、5−メチル−3−フェニル−4−（1h−ピラゾ−ル−5−イル） ）イソオキサゾ−ル、5−ベンジル−3−フラン−2−イル−2−フェニル−テトラヒドロ−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、5−ベンジル−3− ［4−（ジメチルアミノ）フェニル］ ］ −2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジアン、5−ベンジル−3−（5−br−2−ho−フェニル）−2−ph−テトラヒドロ−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4,6−ジオン、5−ベンジル1−3−（4−ニトロ−ph）−2 − ph−ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−3−（ 4−メトキシ−フェニル1）−2 − ph−テトラヒドロ−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、5−ベンジル1−3−（4−フルオロフェニル）−2−（2−メチルフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−3−（3−ニトロ−ph）−2−フェニル−テトラヒドロピロロ（3，4 − d） ）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、5−ベンジル−2 − ph − 3−（2−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジアン、5−ベンジル−2 − ph − 3−（2 − ph−ビニル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−2−（4−クロロフェニル） ）−3−（2−チエニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−2，3−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3、 4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジアン、5−ベンジル1−2（4 − cl − ph）3−（2−フリル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）ジオン、5−ベンジル−2（4−cl−ph）−3−（4−f−ph）ジヒドロ−2hピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4,6（3h） 、5h）ジオン、5−（p−トリル）イソオキサゾ−ル、5−（4−メチルフェニル）−3−（4）−ニトロフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジアエン、5−（4−メトキシフェニル）−2−フェニル1−3−（4−ピリジニル） ）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジアン、5−（4−メトキシフェニル）−2−フェニル−3−（3−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3］ ［4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−（4−メトキシph）−2，3−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、 5h）−ジオン、5−（4−フルオロフェニル）−3−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジアン、5−（4−フルオロフェニル）−2−（2−メチルフェニル）−3−（4−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジアン、5−5。 （4−エトキシフェニル）−3−（4−ニトロフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジアン、5−（4−エトキシフェニル）−3���（4−フルオロフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジアエン、5−（4−エトキシフェニル）−2−メチル−3−（4−）ニトロフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジエン、5−（4−エトキシ−ph）−2 − ph − 3−チオフェン−2−イル−4h−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4,6−ジオン、5−（4−cl−ph）−3−（3−ニトロ−ph）−2−フェニルテトラヒドロ−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、5−（4−ブロモフェニル）−3−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン。 5−（4−ブロモフェニル）−3−（2−フリル）−2−（2−メチルフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−5。 （4−ブロモフェニル）−2−フェニル−3−（2−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジアン、5−（4 − br − ph） ）2 − ph − 3−（2 − ph−ビニル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジオン、5−（2 − cl − ph）−3− （4−ジメチルアミノ−ph）2− o−トリル1−4h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、5−（2−クロロフェニル）−3− ［4−（ジメチルアミノ）フェニル］ −2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−（2−クロロフェニル）−3−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］ ］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジアン、4−（（3−（2 − cl − ph）−5−メチルイソオキサゾ−ル−4−カルボニル）−アミノ）−安息香酸エチルエステル、4，5，6 1，6 a−テトラヒドロ−3 ah−シクロペンタ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボキシル酸、3−フェニル−3 a、6 a−ジヒドロチエノ［2，3 − d］イソオキサゾ−ル4，4−ジオキシド、3−メチル−5−（3−3）フェニルプロピル）イソオキサゾ−ル、3−メチル−4−ニトロ−5−［（e）−2−フェニルエテニル］イソオキサゾ−ル、3−メチル−4，5，8，9−テトラヒドロシクロオクタ（d）イソオキサゾ−ル、3−メチル−4，5 、5 a、6 a、7，8−ヘキサヒドロオキシレノ（2 '、3'：5，6）シクロオクタ（1，2 − d）イソオキサゾ−ル、3−メチル1−3 a、4，5，8，9，9 a−ヘキサヒドロシクロオクタ（ d）イソオキサゾ−ル、3−フラン−2−イル−2−フェニル−5 − p−トリル−テトラヒドロ−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、3−クロロ−4，5−ジヒドロ（ 1）−ベンゾチエピノ（5，4 − c）イソオキサゾ−ル、3− ［4−（ジメチルアミノ）フェニル］ −5−（4−メトキシフェニル）−2−（2−メチルフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］]イソキサゾle − 4，6（3h、5h）−ジオン、3−（5 − br − 2 − ho−フェニル）−2，5−ジフェニル−テトラヒドロ−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、3−（5 − br − 2 − ho − ph）−5−（2 − cl − ph）−2 − ph−テトラヒドロ−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、3−（3−） 4−（メト−フェニル）−5−フェニル−2 − o−トリルテトラヒドロ−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、3−（4−フルオロフェニル）−5−（4−ニトロフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（4−フルオロフェニル）−5−（4−メチルフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、3−（4−ジメチルアミノ−ph）−5−ph−2−o−トリル1−4h−ピロロ（3,4） −d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、3−（4−フルオロフェニル）−5−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（4 − br − ph）−2 − ph − 5−（2−トリフルオロメチル−ph）−4h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジエン、3−（3−ニトロ）−フェニル）−2，5−ジフェニル−テトラヒドロ−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、3−（3 − br−フェニル）−2，5−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3、 4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジエン、3−（3 − br − ph）−5−（2− meo − ph）−2 − o−トリル−1−テトラヒドロピロロ（3，4 − d） ）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、3−（2−フリル）−5− ［4−（4 − m）オルホリニル）フェニル］ −2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（2−フリル）−2−（2 − me − ph）−5−ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（2−フリル）−2，5−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（2 − cl−フェニル）−5−メチル−イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸（2，5−ジクロロ−フェニル）−アミド、3−（2 − cl − ph）−5 − me−イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸（4，5−ジヒドロ−チアゾ−ル−2−）イル）アミド、3−（2−クロロ−フェニル）−5−メチル−イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸シアノメチル−アミド、ジクロロフェニル）−5−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4］ −d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジアン、3−（2，4−ジ−cl − ph）−2，5−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4； 6（3h、5h）ジオン、3−（2，2−ジクロロ−ビニル）−5−フェニル−イソオキサゾ−ル、3，5−ジフェニル−1−イソオキサゾ−ル、3，5−ジメチル［1−4−（1−ピロリジニル）スルホニル］ ）イソオキサゾ−ル、3（4−ジメチルアミノ−ph）−5−（4 − eto − ph）2 − o−トリル−4−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、2−（4 − cl−） ph）5 − ph − 3−（2−チエニル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジアエン、2−（4 − cl − ph）−5−（ 3−メオ−ph）−3−（3−ニトロ−ph）−4h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、2−（4 − cl − ph）−3−（4−） meo − ph）−5−トリル−テトラヒドロ−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、2−（4−クロロフェニル）−5−（4−メチルフェニル）−3−（2−チエニル）二価o − 2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジエン、2−（4−クロロフェニル）−3− ［4−（ジメチルアミノ）フェニル］ −5−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［4−］ 3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジエン、2−（4−クロ���フェニル）−3−（4−フルオロフェニル）−5−（4−ニトロフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3、 4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、2−（4−クロロフェニル）−3−（2−チエニル）−5− ［3−（トリフルオロメチル）フェニル］ジヒドロ−2h−ピロロ［3］ ［4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジエン、2−（4−クロロフェニル）−3−（2，4−ジクロロフェニル）−5−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4−］ d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジオン、2，3−ジ−ph − 5−（3−（トリ−f − me）ph）ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、ダナゾ−ル、およびn−シクロプロピル−5−（チオフェン−2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキサミド。
【請求項３７】
ヒト誘導多能性幹細胞（hiPSＣ）の集団から心臓または骨格筋原性前駆細胞の集団を調製する方法であって、場合により無血清培地中で培養された有効量のGivinost at（GIV）と接触させることを含む方法。
【請求項３８】
前記有効量のGIVが、1×106細胞当たり約100nM〜約30nMを含む、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
無血清培地およびRho−関連キナ−ゼ（ROＣK）阻害剤の存在下で前記細胞を培養することをさらに含む、請求項37に記載の方法。
【請求項４０】
Rho関連キナ−ゼ（ROＣK）阻害剤がチアゾビビン、Y27632、SR3677、またはGSK429286から選択される、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
無血清培地およびTGF − βI型受容体阻害剤の存在下で前記細胞を培養することをさらに含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４２】
前記TGF − βI型受容体阻害剤が、 SB431542、A8301 LY2157299、またはLY2109761からなる群より選択される、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が、Meoxl、Meox2、Tcfl5、Pax3、Pax7、MyoDl、MYF5、ジストロフィン、またはDESMINの群から選択される骨格筋形成遺伝子を過剰発現する、請求項37に記載の方法によって調製された細胞の集団。
【請求項４４】
前記細胞が、 Pitx2、ISll、Nkx2.5、Hand!、GATA4、Tbx5、TnnT2、Myl7、MLC2v、Myf2c、Cdh4、またはLhx2の群から選択されるxESI筋原性遺伝子を過剰発現する、請求項37に記載の方法によって調製された細胞の集団。
【請求項４５】
請求項43に記載の細胞の集団から単離されたエキソソ−ムまたは微小胞の集団。
【請求項４６】
請求項44に記載の細胞の集団から単離されたエキソソ−ムまたは微小胞の集団。
【請求項４７】
集団が実質的に均質である、請求項45または46に記載の集団。
【請求項４８】
それを必要とする対象に有効量の請求項43の細胞集団および/または有効量の請求項46のエキソソ−ムもしくは微小胞の集団を投与することを含む骨格筋再生方法。
【請求項４９】
それを必要とする対象に請求項44に記載の細胞集団の有効量および/または請求項47に記載のエキソソ−ムまたは微小胞の集団を有効量投与することを含む、心筋を再生する方法。
【請求項５０】
それを必要とする対象に請求項43の細胞集団の有効量および/または請求項46のエキソソ−ムまたは微小胞の集団の有効量を投与することを含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィ−（DMD）を治療する方法。
【請求項５１】
それを必要とする対象に請求項44に記載の細胞集団の有効量および/または請求項43に記載のエキソソ−ムまたは微小胞の集団を有効量投与することを含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィ−（DMD）に関連する心機能障害の治療方法。
【請求項５２】
前記エキソソ−ムまたは微小胞が約20nm〜約90nmの平均直径を有する、請求項45または46に記載のエキソソ−ムまたは微小胞の集団。
【請求項５３】
損傷を受けたまたは罹患した心臓組織の修復または再生のための、または以下の1つ以上の治療のための組成物：Hoyeraal−Hreidarsson症候群、先天性角化異常症、肺線維症、先天性角化異常症、骨髄不全、肺疾患、内分泌疾患、多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）、クッシング症候群、および末端肥大症、脳血管障害（ストロ−ク）、高 血圧高血圧症、パ−キンソン病、認知症、アルツハイマ−病、加齢性難聴、セリアック病（COPD）、双極性障害、ヒドロキシ尿素、鎌状赤血球症、高血圧、アテロ−ム性動脈硬化症、関節炎、骨粗鬆症、変形性関節症または血管性痴呆 、2型糖尿病、または短くなったテロメアの長さを扱うテロメラ−ゼ機能不全を伴う疾患。この組成物は合成マイクロRNA − 195阻害剤を含む。
【請求項５４】
組織を再生する方法、または以下の1つ以上の組織を治療する方法：Hoyeraal−Hreidarsson症候群、先天性角化異常症、肺線維症、先天性角化異常症、骨髄不全、肺疾患、内分泌疾患、多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）、クッシング症候群、および末端肥大症、脳血管障害（脳卒中）、高血圧高血圧症、パ−キンソン病、認知症、アルツハイマ−病、加齢性難聴、セリアック病、COPD、双極性障害、ヒドロキシ尿素、鎌状赤血球症、高血圧、アテロ−ム性動脈硬化症、関節炎、骨粗鬆症、変形性関節症、血管性痴呆または黄斑変性症、癌、2型糖尿病、またはテロメアの長さの短縮を伴うテロメラ−ゼ機能不全を伴う疾患、それを必要とする対象において、 有効量の1つ以上のマイクロRNAフラグメント、またはその誘導体を被験体に投与する。そして、1つ以上のマイクロRNAフラグメントの投与後、1つ以上のマイクロRNAフラグメントは損傷組織における遺伝子発現を変化させ、前記損傷組織の生存率を改善し、そして対象における新しい組織の形成を促進する。ここで投与は場合により有効量のダナゾ−ルをさらに含む。
【請求項５５】
前記マイクロRNAフラグメントまたはその誘導体が合成的に生成される、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
前記マイクロRNAフラグメントまたはその誘導体が、1つ以上の内因性マイクロRNA分子を模倣する配列を用いて合成される、請求項54に記載の方法。
【請求項５７】
マイクロRNAフラグメントまたはその誘導体が、場合によりオリゴヌクレオチドを介してそれらの安定性を増強するように修飾されている、請求項54に記載の方法。ここで、mRNAフラグメントは、早期分解することなくリポソ−ムベ−スのナノ粒子を介して投与され、さらに場合により、miRNAは安全に誘導される。
【請求項５８】
前記投与が、前記1つ以上のマイクロRNAフラグメント、またはそれらの誘導体を含む複数の合成リポソ−ムの投与を含む、請求項54に記載の方法。
【請求項５９】
エキソソ−ムまたはマイクロベシクルの集団を単離する方法であって、細胞をエキソソ−ムまたはマイクロベシクルを分泌するように誘導するために、ヒドロシラ−ゼ酵素の存在下で非非ヒトヒト再生細胞の集団を培養することを含む方法。
【請求項６０】
前記培養培地から前記分泌されたエキソソ−ムまたは微小胞を単離することをさらに含む、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
前記ヒドロラ−ゼがDNAse Iス−パ−ファミリ−の酵素のメンバ−を含む、請求項59に記載の方法。
【請求項６２】
前記加水分解酵素がスフィンゴミエリナ−ゼを含む、請求項59に記載の方法。
【請求項６３】
前記スフィンゴミエリナ−ゼが、リソソ−ム酸性スフィンゴミエリナ−ゼ、分泌型亜鉛依存性酸性スフィンゴミエリナ−ゼ、中性スフィンゴミエリナ−ゼ、およびアルカリ性スフィンゴミエリナ−ゼからなる群から選択されるタイプのものである、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
前記中性スフィンゴミエリナ−ゼが、マグネシウム依存性中性スフィンゴミエリナ−ゼおよびマグネシウム非依存性中性スフィンゴミエリナ−ゼのうちの1つまたは複数を含む、請求項62に記載の方法。
【請求項６５】
前記中性スフィンゴミエリナ−ゼがI型中性スフィンゴミエリナ−ゼ、2型中性スフィンゴミエリナ−ゼ、および3型中性スフィンゴミエリナ−ゼのうちの1つ以上を含む、請求項63に記載の方法。
【請求項６６】
合成マイクロRNA−373、マイクロRNA 373模倣体またはマイクロRNA 373エキソソ−ムのうちの1つまたは複数を含む組成物。
【請求項６７】
担体をさらに含む、請求項66に記載の組成物。
【請求項６８】
それを必要とする対象に有効量の請求項66に記載の組成物を投与することを含む線維性疾患を治療する方法。
【請求項６９】
前記線維性疾患が心筋線維症である、請求項68に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［参考文献］
この出願は35USC セクション120に含まれ、2014年4月17日に提出した『米国特許出願 第14／255,789号』と、2015年11月24日に提出された『米国特許出願第15／951,354号』と、2016年6月1日に提出した『米国特許出願第15／201,292号』に続けた一部継続出願である。それぞれの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［政府支持声明］
この発明は一部的に国立衛生科学院の援助金、RO1 HL126516 、HL134354とRO1 AR070029に支えられた。それゆえ、米国政府がこの発明の権利を持つ。
【０００３】
［EFS−WEBに提出したシ−ケンス表に参考すること］
この出願はEFS−Webを介して電子的に申請されており、一つtxtデジタルシ−ケンス表を含んでいる。このtxtファイルは、［2018−06−12 ISPH 004 ST25.txt］という名称で、2018年6月12日に作作成され、3,537バイトになったシ−ケンス表を含まれている。txtファイルは本明細書の一部であり、参照により本明細書に組み込まれる。コンピュ−タ可読形式で記録されたシ−クエンス表の内容は書かれたシ−クエンス表の内容に同一であり、新しい事項は含まない。
【背景技術】
【０００４】
この申請書の中には、本発明が関係する最新技術をより詳細に説明するために様々な技術的刊行物および特許刊行物が引用されている。 本明細書に記載の全ての刊行物は、参照により本出願に組み込まれる。
【０００５】
人工多能性幹 ( iPS ) 細胞は、心臓前駆細胞に分化することが可能であり、心疾患に対する治療や創薬スクリ−ニングをする際の重要な細胞供給源である。さらに、人工多能性幹細胞は癌を発生させる可能性があり、それらの細胞を利用した再生医療を臨床応用する際には、癌発生のリスクがない心筋前駆細胞を分化誘導することが重要である。そのため、リプログラムの効率を上げる努力がなされたり、ウイルスを使わないで人工多能性幹細胞を生成する方法が作られた。DNAメチルトランスフェラ−ゼ阻害剤（5’−アザシチジン、およびRG108）、ヒストンデアセチラ−ゼ阻害剤（バルプロ酸）、ヒストンメチルトランスフェラ−ゼ阻害剤（BIX＿01294）、Wnt3AとALK5阻害剤を含めて、誘導効率を上げる成長因子と化合物が多数発見された。（1−6）様々な実験のおかげで、移植前に人工多能性幹細胞を心原性細胞スペクトルに誘導できる方法が示されてきたが、このような方法は煩雑かつコストが高い上、多数の成長因子と化合物の投与が必要であり、薬の開発や臨床応用に必要な統一性と再現性が充分維持できない可能性が高い。したがって、現有の方法と技術を改善することが必要である。本明細書がこの要求を満たして、さらに、それに伴う優勢を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は、部分的には、人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）に適用される１つの低分子化合物のみを使用して、その方法から伝播された細胞を発現および事前調整する方法を提供する（例えば：心臓前駆細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、筋細胞、筋原細胞前駆細胞、心筋細胞および血管、ならびにそれらの細胞によって産生されるエキソソ−ムまたは微小胞）。細胞および細胞から単離されたエキソソ−ムまたは微小胞組成物は、常在性幹細胞、心筋細胞、筋細胞およびパラクリン因子を活性化する。さらに、これらの細胞およびエキソソ−ムまたはマイクロベシクルを製造するための既存の非効率的な方法を考えると、この１段階の商業的で規模が大きく安全な方法は、無数の細胞およびエキソソ−ムまたはマイクロベシクルを、心筋梗塞、デュシェンヌ型筋ジストロフィ−、筋肉病およびその他の疾患治療用に製造するのに最も経済的であり得る。
【０００７】
したがって、一態様では、エキソソ−ムまたは微小胞の単離された集団を含む単離された集団または組成物が本明細書に提供される。それらが、一方では、以下の群から選択される細胞から単離される：それぞれが以前に有効量のイソオキサゾ−ル化合物、その誘導体または等価物のイソオキサゾ−ル化合物と接触されていたiPS細胞、胚性幹細胞、または幹細胞。そこで、エキソソ−ムまたは微小胞が、 mir−373、mir−210、mir−377、mir−367、mir−520、mir−548ah、mir−335、mir−30c、mir−214、またはmir 5487の群から選択されるマイクロＲＮＡ ｍｉＲＮＡまたはｍｉｒ、およびTsg101、CD9、Hsp70、フロチリン−1、またはGAPDHから選択される1つまたは複数のタンパク質を過剰発現する。さらに、エキソソ−ムまたは微小胞は、mir−30cおよび／またはmir−21の一方または両方をさらに過剰発現し得る。一態様では、少なくとも70 %、または80 %、または85 %、または90 %、または95 %、または98 %の細胞が、記載のmirおよび／またはタンパク質を発現する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書でまた提供されるのは、細胞、または胚性幹細胞、幹細胞から選択される細胞から生成された、心筋前駆細胞（CPC）、心筋細胞、筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞の１つもしくは複数の細胞の単離された集団である。それぞれの細胞が以前にイソキサゾ−ル化合物、誘導体、またはそれらの等価物と接触していた、iPSC、胚性幹細胞、幹細胞から選択される細胞からそれぞれ生成され、そこで、集団の細胞が1つまたは複数のmir−373、mir−210 mir−377、mir−367、mir−520、mir−548ah、mir−335、mir−30c、mir−214、or mir−548q；またはpaZ3、PAX7、MYF5、MYOD、MYOGおよびジストロフィンの群から選択される筋肉遺伝子を過剰発現する。また、 cTnT、cTnl、cMLC2V、およびVE−cadherinの一つ以上を表現する心筋細胞が提供された。さらに、本明細書で提供されるのは、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）およびカルポニンの細胞または細胞集団である。一方では、少なくとも70 %、または80 %、または85 %、または90 %、または95 %、または98 %の細胞が記載のmirおよび／または筋肉遺伝子および／またはタンパク質を過剰発現する。エキソソ−ムまたは微小胞は、以下のいずれかについて単離され得る：心筋前駆細胞、心筋細胞、骨格筋、内皮細胞、筋細胞、または平滑筋細胞。
【０００９】
一態様では、集団または細胞が、一方で非天然の担体である薬学的に許容される担体をさらに含む。また、その組成物は、一態様では組成物の凍結乾燥および／または保存を容易にする保存料および／または凍結保存料を含む。さらに、組成物は、再生を容易にするタンパク質および／または組織の改善された機能またはタンパク質をコ−ドする核酸をさらに含む。そのような非限定的な例には、TGF−B、WNTタンパク質、サイトカイン、またはヒストンデアセチラ−ゼが含まれる。
【００１０】
損傷または罹患心臓組織の修復または再生のための組成物であって合成マイクロＲＮＡ − １４６ａを含む組成物がさらに提供される。組成物は、一態様では、天然に存在しない担体である薬学的に許容される担体をさらに含む。組成物はまた、組成物の凍結乾燥および／または保存を容易にする保存料および／または凍結保存料を含む。
【００１１】
合成マイクロRNA−373、マイクロma 373模倣体またはマイクロma373エキソソ−ムのうちの1つまたは複数を含む組成物がさらに提供される。一方では、組成物は、一態様では、然に存在しない担体である薬学的に許容される担体をさらに含む。また、組成物はまた、一態様では組成物の凍結乾燥および／または保存を容易にする保存料および／または凍結保存料を含む。これらの組成物は、それを必要とする対象に有効量を投与することによって線維性疾患を治療するのに有用である。 線維性疾患の非限定的な例は心筋線維症である。
【００１２】
エキソソ−ムまたは微小胞の集団または細胞は、有効量のイソキサゾ−ル化合物またはその誘導体の存在下で培養された幹細胞または前駆細胞の集団から単離される。 一態様では、イソオキサゾ−ル化合物は、イソオキサゾ−ル−1（isx−1）、イソオキサゾ−ル−9（isx−9）、またはダナゾ−ルから選択される。
【００１３】
以下のことを必要とする対象に提供することのうちの１つまたは複数のための方法も本明細書で提供される：破損組織の再生；破損組織の活力を改善；新たな心臓、筋肉、骨格組織、血管、毛細管、またある筋細胞の形成を促進する；心臓の回復を促進する；急性心臓事件があった対象の心臓回復を促進する；デュシェンヌ型筋ジストロフィ−、またデュシェンヌ型筋ジストロフィ−に関わり関連心筋症対象の心臓回復を促進する；年齢に関わる疾患がある対象の心臓回復を促進する：HHS症候群、肺線維症、再生不良性貧血、肝線維症、先天性角化異常症、肺疾患、内分泌疾患、骨髄不全、多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）、クッシング症候群、末端肥大症、脳血管障害（脳卒中）、 高血圧、パ−キンソン病、血管性痴呆、痴呆、黄斑変性、アルツハイマ−病、加齢性難聴、セリアック病、COPD、双極性障害、ヒドロキシ尿素、鎌状赤血球症、高血圧、アテロ−ム性動脈硬化 、関節炎、骨粗鬆症、変形性関節症、癌、2型糖尿病、または短るテロメアと関わるテロメラ−ゼ機能不全；脳卒中、関節炎、アルツハイマ−病、記憶喪失、嚢胞性線維症、炎症性疾患または癌に破損組織の再生を促進する；心筋梗塞に破損組織に心臓壁の厚さを減る；キナ−ゼC 、iL−6 、mmp 、PDGFという1つ以上のタンパク質の遺伝子発見を改変；炎症性タンパク質の表現を減少また阻害；場合によりサイトカイン、ケモカインまたマクロファ−ジ；直接と間接的に血管新生を促進する；直接と間接的に細胞複製を阻害する；本方法を必要する対象、有効量のエキソソ−ムと微小胞、また本明細書の通りな単離細胞とその組成物を管理し、以下の疾患がある対象の心臓再生を促進する：冠状動脈疾患、心筋梗塞、心不全、低形成左心症候群、末梢動脈疾患（PAD）、心臓肥大、心臓弁膜症（大動脈弁狭窄）、心筋肥大、肥大性線維症；さらに、本方法が主体の非胚性幹細胞また前駆細胞の管理が含まれる。この細胞は根拠的に修復が必要する組織の組織の同類である。使える幹細胞は、非胚性幹細胞また自家の前駆細胞である。
【００１４】
hiPSCを有効量のジビノスタット（GIV）と接触させることを含む、ヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）の集団から本明細書に記載の細胞の集団を調製する方法も本明細書で提供される。
【００１５】
さらに提供されるのは、以下のうちの１つまたは複数のための方法である：抗酸化療法を提供する；局所または常在心筋細胞の活性化を促進する；血管の新生またパラクリン因子の釈放を促進する；WNT、BMP、および細胞骨格の改造の活性化を促進する；TGF−βに誘導されたEMTシグナリングと心臓分化を促進する；WNT5とWNT11またBMP族のタンパク質およびBMP4の表現を増やす；以下の集団から選んだ心臓転写因子の表現を増やす：nkx2.5、mef2c、gata4とisl−1 ；心筋細胞、筋肉収縮とNF−AT肥大シグナル伝達経路へPIP3シグナリング経路を開発のために必要する遺伝子の表現を促進する；線維症とアポト−シスの減少；筋原性および筋分化を促進する；アンジオポエチン−2、Il−6nmp、pgfbb、timp1、または本明細書および図の中に表明した遺伝子が含まれる集団から選んだサイトカインの釈放を促進する；wnt3a、wnt5a、wnt11の集団から選んだ遺伝子の上片制御を促進する；また、細胞骨格リモデリングを促進する、それを必要とする対象に、有効量のエキソソ−ムもしくは微小胞の集団もしくは細胞、またはそれらを含む組成物を投与することを含む方法である。
【００１６】
さらに提供されるのは、細胞または細胞集団、ならびに本明細書に開示される方法によって調製された細胞および集団であり、少なくとも８０％、あるいは８５％、あるいは９０％、または95％、または97％、または99％、または100％の細胞が以下の群から選択される1つまたは複数のタンパク質を過剰発現する：cTN1、MLC2v、TNT、VE−カドヘリン、CD31、a−SMA（アクチン）、カルポニン、または Cx43。さらに提供されるのは、以下の群から選択される骨格筋形成遺伝子を過剰発現する細胞または細胞集団である：Meox1、Meox2、Tcf15、Pax3、Pax7、MyoD1、MYF5、ジストロフィン、またはDESMIN。当技術分野において公知であり、本明細書に簡単に記載されている方法が遺伝子、miRNAおよびタンパク質の表現を決定できる。細胞から単離された細胞、および微小胞、またはエキソソ−ム骨格筋が細胞の再生とDMDの治療方法に便利である。
【００１７】
また、本明細書に提供された細胞集団が以下の組から選んだxESI筋原性遺伝子を過剰表現する：Pitx2、IS11、Nkx2.5、Handi、GATA4、Tbx5、TnnT2、My17、MLC2v、Myf2e、Cdh4、またはLhx2。一方では、最低80％、または85％、または90％、または95％、または97％、または99％、または100％の細胞がxESI筋細胞を過剰表現する。当技術分野において公知であり、本明細書に簡単に記載されている方法が遺伝子、miRNAおよびタンパク質の表現を決定できる。こちらの細胞集団や細胞が、心筋組織の再生と、さらにデュシェンヌ型筋ジストロフィ−（DMD)と関わる心機能障害の治療に便利である。本方法がそれを必要する対象に有効量の記載されている細胞集団またエキソソ−ムおよび微小胞の集団が含まれる。
【００１８】
さらに、本明細書に提供されたのはこの細胞集団から単離されたエキソソ−ムおよび微小胞の集団である。
【００１９】
それを必要とする対象に有効量の本明細書に記載の細胞集団を投与することを含まれた心筋を再生する方法、および／または本明細書に記載のエキソソ−ムまたは微小胞の集団の有効量がさらに提供される。
【００２０】
それを必要とする対象において、損傷または罹患した心臓組織を修復または再生するための方法も本明細書で提供される。
【００２１】
さらに提供されるのは、損傷を受けたもしくは罹患している心臓組織の修復もしくは再生のための、またはそれらの１つもしくは複数の治療のための組成物である：HHS症候群、先天性角化異常症、肺線維症、再生不良性貧血、肝線維症、骨髄不全、肺疾患、内分泌疾患、多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）、クッシング症候群、および末端肥大症、脳血管疾患（脳卒中）、高血圧、パ−キンソン病、認知症、アルツハイマ−病、加齢性難聴、セリアック病（CD）、COPD、双極性障害、ヒドロキシ尿素、鎌状赤血球症、アテロ−ム性動脈硬化症、関節炎、骨粗鬆症、変形性関節症、血管性痴呆、または黄斑変性症、癌、2型糖尿病、または短るテロメアと関わるテロメラ−ゼ機能不全。本組成がMicroRNA−195抑制剤が含まれる。非限定的な例：HSTUD0320（SIGMAMISSION（登録商標）合成MicroRNA阻害剤）、人体HSA−miR−195−5pおよび抑制性 hsa − miR 195−5p miRNA /MicroRNAレンチベクタ−（ABM商品（abmgood.com）に販売されている）。有効量の骨髄幹細胞やIPS細胞がいる場合に、本組成がテロメアの伸長と老化した幹細胞の再生を促進、および協力する。この方法は、心不全などの心疾患を有する高齢患者、および心臓発作患者などの患者における心臓の心臓再生を促進する。
【００２２】
また、１つ以上のマイクロＲＮＡフラグメント、またはその誘導体を被験体に投与することを含む方法も提供される。１つ以上のマイクロＲＮＡフラグメントの投与後、１つ以上のマイクロＲＮＡフラグメントは損傷組織における遺伝子発現を変化させ、前記損傷組織の生存能力を改善し、そして対象における新しい組織の形成を促進する。一方では、そのMicroRNA断片や誘導体が合成的に生成された。一方では、そのMicroRNA断片や誘導体の合成がひとつ以上の内因性MicroRNA分子を真似るシ−ケンスを利用する。また、一方では、ここでそのMicroRNA断片や誘導体が安定性を上がるために修正されでいる。そのMicroRNA断片が治療医または専門家に決定された適切な方法に寄って投与する。非限定的な例が、記載されたひとつ以上のMicroRNA断片や誘導体が含まれる複数の合成リポソ−ムの投与が含まれる。
【００２３】
さらに提供されるのは、エキソソ−ムまたは微小胞を生成する方法で、細胞をエキソソ−ムまたは微小胞を分泌するように誘導するためにヒドロラ−ゼ酵素の存在下で非胚性ヒト再生細胞の集団を培養すること、それによってエキソソ−ムまたは微小胞を生成することを含む方法である。さらなる態様において、方法は、培地および／または細胞からエキソソ−ムまたは微小胞を単離することをさらに含む。
【００２４】
一方では、その加水分解酵素がのDNAse I 酵素ス−パ−ファミリ−の一つが含まれる。非限定的な例は、例えばスフィンゴミエリナ−ゼである。一方では、そのスフィンゴミエリナ−ゼのタイプが、リソソ−ム酸スフィンゴミエリナ−ゼ、分泌型亜鉛依存性酸性スフィンゴミエリナ−ゼ、中性スフィンゴミエリナ−ゼとアルカリ性スフィンゴミエリナ−ゼから選んである。さらに、その中性スフィンゴミエリナ−ゼがひとつ以上のマグネシウム依存性中性スフィンゴミエリナ−ゼ、またマグネシウム非依存性中性スフィンゴミエリナ−ゼが含まれる。また、その中性スフィンゴミエリナ−ゼがひとつ以上の中性スフィンゴミエリナ−ゼタイプI、中性スフィンゴミエリナ−ゼタイプ2、および中性スフィンゴミエリナ−ゼタイプ3が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
本特許と申請書が最低ひとつのカラ−図面が含まれる。そのカラ−図面を含めたパテンと申請書のコピ−が要請と必要な料金に応じて、事務局によって提供される。
【００２６】
【図１】図1は、多能性マ−カ−の表現のため、IPS細胞のキャラクタリゼ−ションを示した。胚性幹細胞の特殊くマ−クOct3/4、Sox2、Nanogおよび内因性Oct3/4を表現したIPS細胞クロンを示した代表的な顕微鏡写真である。
【００２７】
【図２】図2がDNAメチルトランスフェラ−ゼ（DNMT）活性アッセイの結果を示した。DNAメチル化分析が低分子化合物、イソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル様化合物に治療させたIPS細胞におけるDNAメチルトランスフェラ−ゼ活性分析の、治療されなかったIPS細胞と比べて、有意な（95％）阻害を示した。
【００２８】
【図３】図3A−3Bで示されたのは、低分子化合物、イソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル様化合物治療法が試験管内で細胞保護を誘導することと、低分子化合物治療法が酸化剤誘導アポト−シスを防ぎ、増殖を促進することである。図3Aの中、アポト−シスがTUNELアッセイごとに決めた。治療させないIPS細胞に比べて、事前に低分子化合物、イソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル様化合物へ治療したIPS細胞の中に観測されたTUNEL陽性細胞/顕微鏡視野が少なく。図3Bの中、治療させないIPS細胞に比べて、低分子化合物で治療したIPS細胞の分裂促進反応が増えることが著しく観測された。全数値が平均値± SEM、* p < 0.05対コントロ−ルとして表現する。
【００２９】
【図４】図4が（細胞損害を示した）チトクロムc細胞質移行を示した。H、Oへ暴露する後、治療しないIPS細胞と低分子化合物、イソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル様化合物に治療したIPS細胞のチトクロ−ムcの免疫染色、（100 μmol）、（DPAIの結合画像）、（元の倍率：200x）。治療しないIPS細胞に比べて、低分子化合物、イソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル様化合物に治療したIPS細胞のチトクロムC細胞質移行が著しく減る。
【００３０】
【図５】図5A−5Bに示されたのは、試験管内で、低分子化合物、イソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル様化合物がIPS細胞の心臓分化を抑えられることである。図5Aで示されたのは、低分子化合物で治療したIPS細胞内の心臓特異的遺伝子 Nkx−2.5と筋腫性アクチンの免疫染色である（DPAIの結合画像）、（の倍率：400x）。図5Bで示されたのは、治療しないIPS細胞内のと比べで、低分子化合物で治療したIPS細胞内の心筋細胞特異的マ−カ−Nkx−2.5のRT − PCR分析である。低分子化合物、イソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル様化合物に治療したIPS細胞内のNkx−2.5が、治療しないIPS細胞内のそれと比べで、大幅な上片制御を示した。
【００３１】
【図６】図6が、低分子化合物とイソオキサゾ−ル様化合物に治療したIPS細胞たい治療してない細胞のアフィメトリクスアッセイベ−スの遺伝子発見のプロフィリングを示し、Dnmt1、Dnmt3bとMax遺伝子に関連するタンパク質に発生した2−3倍の下方制御をさらに証明した。この現象が、DNA低メチル化、myc依存性細胞トランスフォ−メ−ションと関連する。その上で、ＣＣL7、ＣXＣR2、ＣXＣR5、内在性膜タンパク質2A、またはエフリンA3の2〜3倍の付随する上片制御があった。
【００３２】
【図７】図7A−7 は、低分子化合物とイソオキサゾ−ル様化合物に治療したIPS細胞たい治療してない細胞のmiR−Microアッセイ分析を示した。Microアッセイ分析で示した、治療してないIPS細胞のMIR表現プロフィ−ルが、低分子化合物で治療したIPS細胞とは全く異なっていた。（図7A−7D）治療してないIPS細胞と低分子化合物で治療したIPS細胞の中に観測された、再プログラミングと分化に重要なmiR。Microアッセイ分析が、低分子化合物で治療したIPS細胞にいる心臓特異miR−133とmiR−762の上片制御とmiR−290−295集団とlet−7族に関わった多能性の下方制御を示した。図7 は、低分子化合物およびイソオキサゾ−ル様化合物に治療したIPS細胞にいるGPCRシグナリングを示し。ウエスタンブロット分析が、低分子化合物で治療したIPS細胞の中のGA（pan）が、治療してないまたGPCR遮断薬、百日咳毒素の併用により遮断されるIPS細胞に対して、大幅な上片制御を示した。
【００３３】
【図８】図8A−8 が示したのは、イソオキサゾ−ルとイソオキサゾ−ル様化合物に治療したIPS細胞の移植が、試験管内で梗塞サイズ拡大と成長済み筋線維再生を減弱することである。一つの動物が冠状動脈結紮の後、その梗塞および梗塞周辺領域に全部3.6x105の細胞を注入された。動物が6週間また7日のあとで殺された。梗塞した心臓に大幅な新繊維再生が、梗塞サイズを減った（図8Cと8D）。治療してないIPS細胞の心臓移植のなかに観測されたiPS由来の成長細胞の数が非常に限られている（示させない）。心筋梗塞後の収縮期の左室寸法（LVESD）と心拡張期の左室寸法（LVEDD）が大幅な増加であり、それがイソオキサゾ−ルとイソオキサゾ−ル様化合物に治療したIPS細胞によって大幅で減った（図8.E）。同じく、治療によって心拍数短縮および駆出率が増加した（図8.F）。
【００３４】
【図９】図9A−9 は、実験2の中に記載した高齢と若いネズミの異種骨髄由来幹細胞（BMSCs）からとった小型幼若幹細胞（SJSCs）の特徴を示した。図9Aと9 は示したのは、高齢と若いネズミ両方のSJSCsがCD29、CD44、CD59、CD90には陽性ながら、CD45とCD117 Bには陰性のこと。図9Cの中、細胞増殖曲線がSJSCsの細胞増殖率がBMSCsより高いことを示した。BMSCsと比べて、高齢SJSCsがもっと多くな多能性マ−カ−を現れた、例えば八量体結合転写因子4（Oct−4）、Nanog、性決定領域Yボックス2（Sox−2）、Kruppel様因子4（Klf−4）、およびRex1.G。図9 はGata−4と筋細胞特異的エンハンサ−因子2C（Mef2c）みたいな心臓分化マ−カ−を示した。図9 はサ−チュイン1（Sirt1）およびテロメラ−ゼ逆転写酵素（Tert）みたいな抗老化マ−カ−を示した。図9Fの中で、高齢骨髄からのSJSCsが、高齢BMの他の細胞より、少ない老化関連β−ガラクトシダ−ゼ（β−gal）を発見した。図9 はインサイチュハイブリダイゼ−ション（FISH）分析の蛍光定量法であり、SJSCsがBMSCsより長いテロメアを保つことを証明した。BMSCsにより、SJSCsにいたテロメア短縮が遅れた。
【００３５】
【図１０】図10A−10 はSca − 17 CSCSの特徴を示した。図10AはCSC分離手順の簡単な説明で、図10 は、単離CSCs中のSca − 1+表現が免疫細胞化学およびフロ−サイトメトリ−に寄って確認されたことを示した。（ライトグレ−＝Sca−1+；ダ−クグレ−＝DAPI）図10Cで、ジスコイジンドメイン受容体2（DDR2)とプロリル4−ヒドロキシラ−ゼベ−タ（P4HB）抗体がCSC培養において陽性の場合が稀る。図10 は、単離Sca−1+細胞コロニ−にいる造血前駆細胞マ−カ−( c−kit ) 、多能性マ−カ−（10月4日、Sox2、Nanog）、幹細胞側集団マ−カ−（Bcrpl）、初期心臓系統マ−カ−（Nkx−2.5、GATA4、MEF2C）、および血管前駆細胞マ−カ−（Fiki）のRT−PCRの分析表現を示した。列の上の表記Cは培養コロニ−とその識別番号である。彼らは、フロ−サイトメトリ−の測定に寄って、継代5〜30回目までに約80〜90％のSca−1+陽性細胞を維持した。すべての実験はこの回目の中で行われた。バ−=100 μm
【００３６】
【図１１】図11A−11 は結合組織成長因子（CTGF）は電気刺激誘導接着斑キナ−ゼ（FAK）−AKT（FAK/AKT ）経路の主要な低下要因のことを示した。CTGFは、EleS誘導FAK/AKT経路の主要な低下要因である。図11 は、細胞外マトリックス（ECM）と細胞接着分子のためにとったリアルタイムPCRに基づく遺伝子発現プロファイリングの結果を示した。上片制御と下方制御された各遺伝子のうち4つが倍率変更に基づくで選んだ。図11Bと11Cで、結合組織成長因子（CTGF）のmRNA表現が従来のRT−PCRとリアルタイムPCR（n＝5）に寄って確認された。図11 は、電気刺激の心臓幹細胞（EleS CSCs）の免疫細胞化学によるCTGF陽性が、電気刺激してない心臓幹細胞（Non−EleS CSCs）より高い。
【００３７】
【図１２】図12A−12 は、Tertは幹細胞老化におけるmiR−195の直接なタ−ゲットのことを示した。図12 は、計算機解析に予測されたmTertはmiR−195の潜在的なタ−ゲットのことを示した。
【００３８】
図12B−12 は、抗mir−195に回復されたTert mRNA表現によるOMSＣトランスフェクションと、逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応およびウエスタンブロットで各々調べたテロメア特異的タンパク質TRF2を示した。図12Dに示したことで、mTert 3' UTRとプラスミド符号化miR−195が含まれるPEZX−Lucベクタ−によるコトランスフェクションが、減らすルシフェラ−ゼ活性（p < 0.01 対 PEZX−miR−SCトランスフェクトされた細胞）を表れた。トランスフェクション効率がウミシイタケルシフェラ−ゼ活性による正規化された。略語：OMSCs、高齢間葉系幹細胞；Tert、テロメラ−ゼ逆転写酵素；UTR、未翻訳領域。
【００３９】
【図１３】図13A−13 は、テロメア延長と抗老化マ−カ−再活性化によるmiR−195の廃止が、OMSCを活性化することを示した。図13 は、mCherryをレポ−タ−遺伝子（赤信号）が含まれるLenti−miR−195抑制剤とレンチ−スクランブルベクタ−の構造を示した。図13 は、miR−195の廃止が、大幅にOSMCsに老化関連するb−gal表現を、スクランブルトランスフェクトしたOMSCsより、減少したことを示した。図13 は、miR−195抑制剤にトランスフェクトした場合に、OMSCsのテロメアが大幅に再強化したこと示した。図13 は示したとおり、miR−195抑制剤が、OMSCsにいる末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラ−ゼDUTPニックエンド標識−陽性アポト−シス細胞死を著しく減少した。図13 は示したとおり、OMSCsに対miR−195のトランスフェクションが、TERT（示させない）表現、SIRT1、Bcl−2、またp−FOXO1とp−Aktのリン酸化を大幅に増加したが、p53と切断されたカスパ−ゼ3の表現が減少した。図13Fと13 は、細胞増殖アッセイとコロニ−形成アッセイにより調べるとおり、miR − 195のコックダウンによりOMSCs中の細胞増殖能力を大幅に回復することを示した。頭字語：OMSＣ、古い間葉系幹細胞； SIRT1、サ−チュイン（サイレント嵌合型情報規制2同族体）1； Bcl−2、B細胞リンパ腫2タンパク質；FOX01、横紋筋肉腫のフォ−クヘッド、またフォ−クヘッドボックスタンパク質01はタンパク質である、またp−FOX01はホスホフォ−クヘッドボックスタンパク質01、Akt、タンパク質キナ−ゼB（PKB）、Aktとしても知られている；p−Aktはホスホ−Aktである。
【００４０】
【図１４】図14A−14 は、試験管内でヒト人工多能性幹細胞中のイソオキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル様化合物を介した心臓前駆細胞の生成を示した。図14Aと14 は、多能性マ−カ−Oct4、Sox2、Tra−1−60、Tra−1−81とSSEA4の発見のため、免疫染色でヒトiPS細胞の特徴を示した（DAPIとの結合画像）。図14 は、hiPS細胞から心臓前駆細胞を生成する手順とその後の複数の細胞系統の細胞の生成の例示的な簡単な説明を示した。図14 は免疫染色で心臓前駆細胞の特徴およびマ−カ−Nkx2.5とGATA4を示した（DAPIとの結合画像）。図14 はヒトiPS細胞の拍動心筋細胞分化を示した。図14 は、免疫染色分析されたVE−カドヘリンとCD31の発見を示したように試験管内でヒト人工多能性幹細胞の拍動心筋細胞へと分化することを示した。図14 はカルセイン−AM色素で標識した血管前駆細胞による血管形成を示した。図14 は、試験管内でヒトiPS細胞の平滑筋前駆細胞へと分化することをα−SMAとカルプペニン免疫染色を示したとうに表す。
【００４１】
【図１５】図15Aと15Bは、CXCR4発見が筋前駆細胞（MPC）の遊走への影響と細胞遊走の走化性実験の略図を示した。図15Aは、1ウェルあたり30個の光学フィ−ルドを計算によってMP はコラ−ゲンゲルに侵入する方法を定量化することを示した。図15BはMPＣ細胞の遊走である。ヌルはGFP /ジストロフィン発現コントロ−ルMPCを示した；MPCCX4はCXCR4を過剰発現するMPCを発現するGFP /ジストロフィンを示した；MPCsi−CXCR4は、CXCR4遺伝子をノックダウンため、CXCR4を標的とするsiRNAで治療されたMPC ( MPCsi−CXCR4 ) を示した。デ−タは、MPＣ過剰発現ＣXＣR4の増加した移動を示した。 n=4、*p < 0.05 対コントロ−ル。
【００４２】
【図１６】図16A−16Dは、心臓線維芽細胞由来のヒトiPS細胞コロニ−がアキュタ−ゼと解離して、Y27632の存在下でメッキすることを示した。図16Aは概略的にヒトiPS細胞から心筋線維芽細胞を生成するための細胞培養条件を示した。簡単的に、hiPSCから筋前駆細胞（MPCs）を生成するため、ヒト心臓線維芽細胞から誘導されたヒト人工多能性幹（iPS）細胞 ( ATCC（登録商標） ACS−1021TM )が、ビトロネクチンXF（ステムセルテクノロジ−ズ株式会社）でコ−ティングされた6ウェルプレ−トへmTeSRTM1で培養した（ステムセルテクノロジ−ズ株式会社）。iPS細胞がReLeSRTMで4〜6日ごとに継代された（ステムセルテクノロジ−ズ株式会社）。iPS細胞からMPCへの分化のため、iPS細胞がACCUTASETMで単細胞に解離されて（ステムセルテクノロジ−ズ株式会社）、5 UM RHO/ROCK経路阻害剤を添加した上、mTeSRTM1を用いて1x10 9 cells/cm 2で播種した（Y−27632、ステムセルテクノロジ−ズ株式会社）。24時間後、培地を新鮮なmTeSRTM1に交換した。最初の三日間、mTeSRTM1が毎日更新された。そのあと、培地を、20 UM ISX−9を添加したmTeSRTM1に変更した（メッドケムエクスプレス）のうえ、1日おきに更新した。6日後、培地をRPMI 1640培地（サ−モフィッシャ−サイエンティフィック）に切り替えて、N−2サプリメント（サ−モフィッシャ−サイエンティフィック）と 20 ?M ISX−9を補給して、また、次の3−6日間1日おきに更新した。第9日、分化を始めるために低分子化合物（Isx9 & GIV）を適用して、そして分析した。図16Bは、Isx9とGivの治療による、相対的骨格筋遺伝子発現を示した。図16Cと16Dは筋肉遺伝子（PAX3、PAX7、MYF5、MYOG、MYOD）、特にISX−9の過剰発現優位性を示した。
【００４３】
【図１７】図17A−17FはhiPSC由来の心臓前駆細胞（CPC）の生成と特徴を示した。図17AはhiPSC−CPCsの生成の概略図である。図17Bは、1日目、3日目および7日目にRPMI/B27マイナスインスリン中でDMSOやISX−9に治療したhiPSＣの明視野を示した。図17Cは、Nkx2.5、GATA4、ISL−1とMef2c対0日目、P < 0.05および対3日目、P < 0.05の時間依存式を示した。3回の生物学的反復実験からの依存式を示した。図17Dは、DMSO組に比べる7日目のNkx2.5、GATA4、ISL−1 とMef2c ISX−9で上方制御した発見を示した。＊対DMSO組、P < 0.05。3回の生物学的反復実験からの結果を示した。図17Eは蛍光活性化セルソ−ティング分析（FACS）であり、ISX−9治療後の96.5 ± 2.3 %Nkx2.5陽性細胞を示した。図17Fの免疫蛍光染色が示すように、転写因子（Nkx2.5、GATA4、と ISL−1）が、ISX−9で治療したhiPSCの中に、高度に上方制御されたいた。スケ−ルバ−＝200 μm。
【００４４】
【図１８】図18A−18G：試験管内でCPCの3つの心臓系統細胞への分化。治療概要によると、CPCsはCM、EC、SMC特異的タンパク質を発見した（図18A）。CM前駆細胞はa−筋腫性アクチニン、cTni、MLC2v、cTnTおよびCx43を発見した。スケ−ルバ−＝50μm。（図18B）TEM下では、これらの細胞はリボソ−ムが散りばめられた小胞体、成長中な筋フィラメント、ミトコンドリアとグリコ−ゲン粒子に富んでいた。クロマチン材料が核質中に均一に分布していた。（図18C）内皮前駆細胞がVE−カドヘリンとCD31を発現した、スケ−ルバ−＝200 um。これらの細胞によるLDL取り込みが観察されたうえ（図18E）、チュ−ブ状構造も構成した（図18D）。（図18F）平滑筋前駆細胞がa− SMAとカルポニンを発現した、スケ−ルバ−＝200 um。（図18G）FACS分析が、基礎分化培地で95.2 + 2.1 % CMS、90.3 + 2.5 % ECsと92.3 + 1.8 % SMCsを明らかにした。
【００４５】
【図１９】図19A−19C：CPCsで全体性mRNAとmiRNAの発現プロファイル。（図19A）未分化hiPSC、DMSOとISX−9で治療したhiPSCの中、mRNA−seqにより検出した、差次的に発現されたmRNAのヒ−トマップ（Q < 10−15）。（図19B）差次的に発現されたDMSOとISX−9で治療したhiPSCの間で個々に大幅な増減を示したmiRNAのヒ−トマップ。（図19C）DMSO治療したhiPSCに比べて、ISX−9に誘導されたCPCに上方制御と下方制御された遺伝子の経路濃縮分析。
【００４６】
【図２０】図20A−20G：ISX−9治療に仲介された潜在的な重要なシグナル伝達経路。（図20A）3回の生物学的反復実験から、ISX−9治療がいるWnt5、Wnt11とWnt 3aの時間依存式対＊0日目、P < 0.05；＃対3日目、P < 0.05、n=6。（図20B）3回の生物学的反復実験から、DMSO組に比べて、ISX−9治療を7日目を続けたWnt5、Wnt11とWnt 3aの発現増加、＊対DMSO group、P < 0.05。ISX−9治療を7日目を続けたWnt5とWnt11の発現（図20C）と心臓転写因子（Nkx2.5、Mef2c、GATA4とISL 1）の発見。（図20D)それらの発見を、3回の生物学的反復実験から、3日目の治療だけを受ける組に比べる。＊対3日治療組、P < 0.05。3回の生物学的反復実験から、（図20E）ISX−9に誘導される心臓分化のシグナル伝達経路の研究プロトコルの概略説明。分化初期段階で、LY2109761でTGFBシグナル伝達経路を阻害、またはXAV939とIWP2で標準的なWntシグナル伝達経路を阻害する（図20F）、または分化後期にsiWnt5、siWnt11およびWIF−1で非標準Wntシグナル伝達の遮断（図20G）が、ISX−9治療と一緒、大幅に心臓転写因子の発見を減る。*対ISX−9組、P < 0.05。
【００４７】
【図２１】図21A−21G：ISX−9がCPCsにの細胞保護効果。（図21A）1％02の下で12時間および24時間の間でDMSOやISX−9で処理したRPMI/B 27培地にいるhiPSCsの形態変化。（図21B）24低酸素ストレス後のモック、DMSoとISX−9に治療された組の代表的なTUNEL染色画像。（図21C）TUNEL陽性細胞対DMSO組の半定量推定、P < 0.05。（図21D）異なる処理により細胞から放出されるパラクリン因子の濃度を比べるヒ−トマップ。行がサイトカインを示して、列が独立条件を示す。ヒ−トマップのカラ−スケ−ルは、サイトカインの絶対濃度（log 10、pg/ml）に応じて、右側にすべての値の最小値と最大値を示す。（図21E）Mi後3日目のTUNEL染色の画像である。宿主心筋細胞はa−肉腫アクチニンによって同定された。（図21F）異なる治療法を伴う梗塞領域の境界にいるTUNEL陽性細胞の定量化。*対DPBS組、P < 0.05；＃対hiPSC group、P < 0.05。（図21G）異なる組のネズミの心臓梗塞エリアの境界にいるTUNEL陽性心筋細胞の定量化。*対DPBS組、P < 0.05；＃対hiPSC group、P < 0.05。
【００４８】
【図２２】図22A−22H：CPCの移植はMI後の心臓リモデリングを逆転させた。移植後のネズミのLVESDの経時変化（図22A）、LVEDD（図22B）、FS（図22C）とEF（図22D)。* P < 0.05 対.同時点のDPBS治療組、# P < 0.05 対同時点のhiPSC治療組。DPBS=13、hiPSC=16 また CPC=16。（図22E）Mモ−ドとMI後3MについたBモ−ド心エコ−検査の代表的なエコ−グラフ。（図22F）MI後3Mでマッソントリクロ−ム染色で心臓線維症を7つのレベルで評価する。（図22G）代表的な心のセクション。（図22H）瘢痕組織サイズの定量化。* P < 0.05 対同時点のDPBS治療組、# P < 0.05 対同時点のhiPSC治療組（n＝5）。
【００４９】
【図２３】図23A−23J：梗塞された心臓に移植したCPCの心臓系統細胞への分化。（図23A−図23B）移植されたＣPＣは、PKH−26蛍光（赤色蛍光）によって同定される；筋肉繊維は、MI後3Mで、ヒト特異的cTnTまたα−サルコメリックアクチニン（緑色蛍光）によって免疫染色を介して可視化された。（図23C−図23D）MI後2Mで、梗塞された心臓のPKH−26、ECとSMCメ−カ−の免疫蛍光画像。スケ−ルバ−＝50 μm。（図23E−図23G）MI後72時間で梗塞と境界エリアにいる移植したCPCs（図23E）とhiPSCs（図23F）をヒトミトコンドリア抗原（human−mit）トラッキングによって、その代表的な免疫蛍光画像と定量化。* P < 0.05対hiPSC治療組、n＝3。（図23H−図23J）MI後三ヶ月で、cTnlとhuman−mittらキングを使ったCPCs ( FIG.23H )とhiPSCs ( FIG.23I）に治療されたネズミの梗塞と境界エリアにいる分化したCMの代表的な免疫蛍光画像と定量化。* P < 0.05対hiPSC治療組、n＝3。
【００５０】
【図２４】図24A−24DはiPSCとCPCISX−9からのエキソソ−ムのキャラクタリゼ−ション。図24AはiPSCとCPCISX−9から単離したエキソソ−ムのキャルクタリゼ−ションであり、透過型電子顕微鏡（TEM）による可視化した。ケ−ルバ−＝200 um。図24BはiPSCとCPCISX−9からのエキソソ−ムが、エキソソ−ム（Exo）特異的マ−カ−Tsg101で濃縮されたことを示した、代表的なウエスタンブロット。その他の一般的なエキソソ−ムマ−カ−は：CD9、Hsp70とFlotillin−1。カルネキシンがエキソソ−ムに存在しない。図24CはTRPSによる検出したiPSCとCPCISX−9からのエキソソ−ムの代表的なサイズ分布図譜。図24DがTRPSによる測量したエキソソ−ムの平均サイズを示す。iPSC由来のエキソソ−ムとCPCISX−9由来のエキソソ−ムとの間にサイズの有意差は観察されない。
【００５１】
【図２５】図25A−25BがmiRNA発現のプロファイリングとMicroアレイデ−タの検証を示す。図25Aは、Microアレイデ−タのヒ−トマップ分析であり、Exo−iPSC、Exo−EBおよびExo−CPCcomm中のmiRNAsにより、Exo−CPCISX−9中のmiRNAが著しくアップレギュレ−トされたことを示す。紅色と緑色がアップ−またはダウンレギュレ−トされたmiRNAsをそれぞれ区別する（P < 0.05）。n=3。図25BはレアルタイムPCRを使ったMicroアレイデ−タの検証。定量的デ−タが、Exo−CPCISX−9で大幅なmiR−373、miR−367、miR−520、miR−548ah、とmiR−548qの過剰発現を示す。RNA試料は3回の生物学的反復実験からのものである。＊、P < 0.001。
【００５２】
【図２６】図26A−26Eが、miR−373で強化されたCPC IISX−9−由来エキソソ−ムが線維芽細胞のTGFB刺激を逆転したことを示す。図26Aで、PKH26に表記されたCPC ISX−9（赤）からのエキソソ−ムが線維芽細胞と共にインキュベ−トして、線維芽細胞（緑、カルセインAM）の中で観測された上、主に核周囲領域に位置する。図26BはリアルタイムPCR結果であり、濃度25 nMと50 nMのanti−miR−373（miR−373阻害剤）が有効的にCPCs ISX−9中のmiR−373発見をダウンレギュレ−トされることを示す。図26Cが、25 nMのmiR−373に治療された後、CPCs ISX−9中のエキソソ−ム的miR−373の発見が大幅に阻害された。図26DがExo−CPC ISX−9またはanti−miR−373 − Exo CPC ISX−9に治療された線維芽細胞の中のmiR−37の発見を示すであり、3つの独立実験からの結果を表にした、n=3、P < 0.001。図26Eが、Exo−CPC ISX−9 または anti−miR−373−Exo − CPC ISX−9治療のあと、TGFBに刺激された線維芽細胞における線維化遺伝子の発現を示す。*対Exo−CPC ISX−9 組、n=3、P < 0.05。
【００５３】
【図２７】図27A−27Dが、CPCISX−9−由来エキソソ−ムが心筋梗塞（MI）後のネズミの心筋細胞の増殖を刺激することを示す。図27Aは、Exo−CPC ISX−9に治療されたネズミの、MI30日後のki67陽性心筋細胞（cTnT陽性）の代表的な画像。バ−＝50 μm。27Bは心筋梗塞30日後の梗塞周囲領域における心筋細胞の増殖の半定量的デ−タであり、ki67の陽性により示した。PBS組：n=940 三つの心臓からの心筋細胞；Exo−iPSC組：n=95 三つの心臓からの心筋細胞；Exo−CPCISX − 9組： n=951 三つの心臓からの心筋細胞。*対PBS組、P < 0.05；＃対Exo−iPSC組、P < 0.05。図27CはネズミのMI4週後のペリ−梗塞領域における細動脈の代表的な画像である。血管構造で細動脈はQ−SMA陽性染色（緑）により同定された。バ−＝100 μm。図27Dは、それぞれのiPSCから由来するエキソソ−ムに治療されたMIネズミの細動脈の定量的な推定であり、*対PBS group、P < 0.05；＃対Exo−iPSC group、P < 0.05、n＝3。
【００５４】
【図２８】図28A−28GがCPC ISX−9−由来エキソソ−ムが、梗塞したネズミにおける心臓リモデリングを逆転することを示す。図28Aが、MI30日後、三つの組からの代表的なMモ−ド心エコ−画像を示す。Exo−CPC ISX−9に治療されたMI後ネズミのLVDs ( 28B )とLVDd ( 28C )が、30日間で大幅に減少した。Exo − CP CISX−9治療が、大幅に EF ( 28D ) と FS ( 28E )を上がった。*対PBS group、P < 0.05；＃対Exo−iPSC group、P < 0.05、PBS組：n＝10、Exo−iPSC組：n＝9、Exo CPCISX−9：n＝11。EF、駆出率；FS、端数短縮；LVDd、拡張期左室寸法；LVDs、収縮期左室寸法。（28F）異なる治療のあとで、心臓の代表的なマッソンの三色染色切片。（28G）異なる治療の後で、ネズミの線維症の定量的推定。*対PBS group、P < 0.05；＃対Exo−iPSC group、P < 0.05、n＝4。
【００５５】
【図２９】図29は、iPSC −由来心臓前駆細胞から発生したエキソソ−ムによるパ−ソナライズ細胞−フリ−治療法を描く図表である。
【００５６】
【図３０】図30Aと30Bが、心筋および骨格筋遺伝子の発現に対する3つの低分子化合物（ISX9、Danzol、Givinostat）の効果を示す。IPS細胞における低分子化合物（ISX9、GIV）発現に対するジストロフィンのレアルタイムPCRである。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
［発明の詳細な説明］
定義
本発明の実施が、他に示さない限り、当分野の技術の範囲内で従来の組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学およびDNA組換技術を使用する。例えば：Sambrook、 FritschとManiatis（1989）分子クロ−ニング：実験室マニュアル第2版；F.M.Ausubelと他eds.（1987）現在の分子生物学プロトコル；酵素学の原稿方法シリ−ズ（アカデミックプレス株式会社）；PCR2：実用的なアプロ−チ（1995）（M.J.MacPherson、B.D.Hames と G.R.Taylor eds .）；Harlow と Lane、eds .（1998）抗体、実験室マニュアル；Harlow と Lane、eds .（1999）抗体の使用、実験室マニュアル；およびR.I.Freshney、ed .（1987）動物細胞培養。
【００５８】
すべての数値指定、例えばpH、温度、時間、濃度、および範囲が含まれる分子重量は、適当的に（＋）や（−）1.0や0.1で1の増分に変化する近似値である。明示的に述べられないが、全ての数値表示が用語[約]によって先行されることが理解されるべきである。また、明示的に述べられないが、本明細書に記載の試薬は単なる例示であり、その同等物は当技術分野において公知である。
【００５９】
明細書および請求項で使用されている通り、文脈が明確に指示しない限り、単数フォ−ムひとつ、1とその単語が複数参照に含まれる。
【００６０】
自己譲渡、自家移植などの用語は、細胞ドナ−が細胞置換療法のそのレシピエントでもある治療を指す。同種異系移植、同種異系移植、同種移植片などの用語は、細胞ドナ−は細胞補充療法のレシピエントと同じ種であるが、同じ個体ではない治療を指す。ドナ−の細胞とレシピエントとの組織適合性が一致した細胞移植は、同系移植と呼ばれる。異種移植、異種移植、異種移植片などの用語が、細胞ドナ−は細胞置換療法のレシピエントとは異なる種の治療を指す。
【００６１】
生体適合性足場は、組織−工学用の足場またはマトリックスであり、目的の組織を生成するための適切な細胞活性を支える基板として実行できる。それが、それらの細胞において望ましくない効果を引き出すことなく、または最終的な宿主において望ましくない局所的または全身的な応答を誘導することなく上、分子的および機械的シグナル伝達系を促進することである。また、生体適合性足場は植込み型機器の前駆体であり、その前駆体が、宿主に望ましくない局所的または全身的な影響を引き出すことなく、宿主に所望の程度の取り込みで、その意味された機能を果たす能力を有する。生体適合性足場は米国特許6638369に記載されている。
【００６２】
ここで使用されているように、心臓パッチおよびフィブリンに埋め込まれた心臓前駆体パッチ、または心外膜パッチは、生物工学で作った、iPS細胞またはiPS細胞由来の臓系統、または心臓前駆細胞が含まれるまた2Dや3次元（3D）の組織パッチである。
【００６３】
心筋細胞は、主に心臓の心筋を形成する特殊筋細胞である。心筋細胞が5個の主要部分が含まれる：1．インパルス伝導のための細胞膜（筋細胞膜）とT−細管、2．筋小胞体、収縮に必要なカルシウム貯蔵庫である、3．収縮要素、4．ミトコンドリアと、5．細胞核。心筋細胞が、これらに限定されないサブタイプに細分する：心房型心筋細胞、心室型心筋細胞、SA結節型心筋細胞、末梢型SA結節型心筋細胞、またはセントラルSA結節性心筋細胞。幹細胞は、心筋細胞の生理機能を模倣するように増殖させる上、またあるいは、心筋細胞に分化する。この分化が、これらに限定されないマ−カ−によって検出される：ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、アクチニン、トロポニン、トロポミオシン、GATA4、Mef2c、およびNkx−2.5.100641。心筋細胞マ−カ−[ミオシン重鎖]および[ミオシン軽鎖]は、収縮力を生み出す筋細胞に見られるモ−タ−タンパク質の大ファミリ−の一部である。これらのタンパク質が配列決定されそして特徴付けられた。例：GenBank Accession Nos.AAD29948、CAC70714、CAC70712、CAA29119、P12883、NP 000248、P13533、CAA37068、ABR18779、AAA59895、AAA59891、AAA59855、AAB91993、AAH31006、NP _ 000423 とABC84220。それらのタンパク質の遺伝子が、同じく、配列決定されて特徴付けられていた。例：GenBank Accession Nos.NM _ 002472 と NM _ 000432。
【００６４】
心筋細胞マ−カ−「ミオシン重鎖」および「ミオシン軽鎖」は、収縮力を生み出す原因となる筋肉細胞に見られるモ−タ−タンパク質の大きなファミリ−の一部である。これらのタンパク質は、配列決定され、そして特徴付けられている。例えば、GenBankアクセッション Nos . AAD29948、CAC70714、CAC70712、CAA29119、P12883、NP _000248、P13533、CAA37068、ABR18779、AAA59895、AAA59891、AAA59855、AAB91993、AAH31006、NP _ _000423、およびABC84220。これらのタンパク質の遺伝子もまた配列決定されそして特徴付けられている。例えば、GenBankアクセッション Nos.NM _ _002472とNM _ _000432。
【００６５】
心筋細胞マ−カ−アクチニンはMicroフィラメントタンパク質であり、すべての真核細胞の細胞質に見られる細胞骨格の最も細いフィラメント。アクチンポリマ−がアクトミオシン駆動収縮プロセスに役割を果たして、また、筋収縮におけるミオシンのATP加水分解依存性に作用のプラットフォ−ムとしての役割を果たす。このタンパク質が以下の例のように配列決定されそして特徴付けられた：GenBank Accession Nos.NP _ 001093、NP 001095、NP _ 001094、NP _ 004915、P35609、NP _ 598917、NP 112267、AAI07534、とNP 001029807。このタンパク質に遺伝子も配列決定されそして特徴付けられた。例：GenBank Accession Nos.NM _ 001102、NM _ 004924、とNM _ 001103 .
【００６６】
心筋細胞マ−カ−トロポニンは、骨格筋と心筋の筋肉収縮に不可欠な3つのタンパク質の化学物である。トロポニンはタンパク質[トロポミオシン]に結合する上、筋肉組織のアクチンフィラメント間の溝の中にある。トロポミオシンは心筋細胞マ−カ−として使用できる。これらのタンパクは配列決定されそして特徴付けられた。例：GenBank Accession Nos.NP 000354、NP _ 003272、P19429、NP _ 001001430、AAB59509、AAA36771、と NP 001018007。このタンパク質に遺伝子も配列決定されそして特徴付けられた。例：GenBank Accession Nos.NM _ 000363、NM _ 152263、とNM _ 001018007。
【００６７】
[クロ−ン増殖]は単一細胞を2つの同一娘細胞および同一細胞の集団に連続的に分裂させることによる細胞集団の成長のこと。
【００６８】
CTGF、またCCN2や結合組織成長因子としても知られてる、は細胞外マトリックス−関連、ヘパリン−結合タンパク質CCNファミリ−のマトリックス細胞タンパク質である。（CCN細胞内シグナル伝達タンパク質も参照する）
【００６９】
テロメラ−ゼ逆転写酵素（TERT）は酵素テロメラ−ゼの触媒サブユニットであり、テロメラ−ゼRNA成分（TERC）と共にテロメラ−ゼ複合体の最重要な単位を構成する。
【００７０】
miR−290−295細胞集塊は、初期胚形成中に新規で発現されたMicroRNA（ miRNAs）ファミリ−のメンバ−であり、マウス胚性幹細胞（ESC）および胚性癌細胞（ECC）に特異的である。そのようなものは当技術分野において公知であり、そして記載され他のは、例えば、 Lichnerと他（2011）分化、一月81（1）：11−24の中へ。
【００７１】
ケモカイン（ C &#8212; Cモチ−フ）配位子7（CCL7）は、以前、単球特異的ケモカイン3として知られた小型サイトカイン。そのタンパク質配列は登録番号番号NP_006264で入手可能ながら、マウス配列はNP_038682で利用可能である（また、 ncbi.nlm.nih.gov/gene/6354、最後は2014年4月16日でアクセスした）。
【００７２】
CXCR2ケモカイン受容体2（ CXCR2）はこの遺伝子によってコ−ドされたタンパク質で、G−タンパク質共役型受容体ファミリ−のメンバ−である。このタンパク質は、インタ−ロイキン8（ILS）の受容体であり、高い親和性でIL8に結合するながら、Gタンパク質活性化セカンドメッセンジャ−システムを介してシグナルを伝達する。この受容体はケモカイン（ C &#8212; Cモチ−フ）配位子7（CCL7）とも結合する。このタンパク質と遺伝子についた情報がnchbi.nlm.nih.gov/gene/3579に見つける（最後は2014年4月16日でアクセスした）。
【００７３】
内在性膜タンパク質2Aは幹細胞マ−カ−である。ヒト遺伝子の配列はUniProtKBに報告されながら、マウス配列はQ61500に報告されている（uniprot.org/uiprot、最後は2014年4月16日でアクセスした）。
【００７４】
DNA（シトシン−5）−メチルトランスフェラ−ゼ1は、DNMT1遺伝子によってコ−ドされた酵素である。このタンパク質とその遺伝子の完全なシ−ケンスは、遺伝子カ−ドで利用可能。org/cgi−bin/carddisp.pl ? 遺伝子=DNMT1、最後は2014年4月16日でアクセスした。タンパク質を検出するための抗体は市販されている、例えば、セルシグナリング技術から（DNMT1 ( D63A6 ) XP（登録商標） Rabbit mAb # 5032）。DNA（シトシン−5）−メチルトランスフェラ−ゼ3は、DNMT3遺伝子によってコ−ドされた酵素である。
【００７５】
EFNA3やエフリン A3はタンパク質受容体である。人タンパク質シ−クエンスが、ncbi.nlm.nih.gov/遺伝子/1944で報告された。タンパク質の検出と分析に役立つ抗体は、 R & Dシステムとサンタクル−ズバイオテクノロジ−から利用可能。
【００７６】
Let−7はMicroRNAファミリ−のことである。そのシ−ケンスが miRBaseで mirbase.org/cgi bin/mirna＿概略へ報告された。 pl ? fam=MIPF000002、最後は2014年4月16日でアクセスした。そのような検出方法は当技術分野において公知である。例えば、米国特許出願公開 No.2014 /0005251。
【００７７】
マクスは、MYCに結合する多能性マ−カ−である。 Chappellと他（2013）Genes & Dev.27: 725−733。
【００７８】
Tsg101遺伝子にコ−ドされたタンパク質が、ユビキチン−共役酵素の明らかに不活性な同族体のグル−プのメンバ−である。その遺伝子産物が、スタスミンと相互作用するコイルドコイルドメインと腫瘍形成に関与するサイトゾルリンタンパク質が含まれる。そのタンパク質は、細胞の成長と分化に役割を果たす可能性がありながら、負の成長調整剤としての役割のこともある。その腫瘍感受性遺伝子のインビトロ定常状態発現は、ゲノム安定性および細胞周期調節の維持に重要である。この遺伝子の突然突然変異と選択的スプライシングが乳がんでは高頻度で起こる上、乳癌の腫瘍形成および進行の間に欠陥が起こることを提案する。
【００７９】
CD9は、膜貫通4ス−パ−ファミリ−、テトラスパニンファミリ−としても知られて、そのメンバ−をコ−ドする。テトラスパニンは4つの膜貫通ドメインを持つ細胞表面糖タンパク質であり、その膜貫通ドメインが、他の細胞表面タンパク質と多量体複合体を形成する。コ−ドされたタンパク質は、分化、接着とシグナル伝達が含まれる、多くの細胞プロセスで機能している。また、この遺伝子の発見は、癌細胞の運動性および転移の抑制において重要な役割を果たす。
【００８０】
ここで使用されたように、MicroRNAsおよび miRNAsは、転写後調節因子を示す。その転写後調節因子が、通常、標的メッセンジャ−RNA転写物（ mRNAs）で3つの主要な未翻訳領域（ (3 ‘ UTRs )）の相補的配列に結合するであり、通常は遺伝子サイレンシングを引き起こす。一般的に言えば、miRNAは短い非コ−ドリボ核酸（RNA）分子である、例えば、21や22ヌクレオチドの長さ。MicroRNAsおよび miRNAsは互換的に使用される。
【００８１】
mir−373は ENSG00000199143 およびmirBase：has−mir−373として注釈される。
【００８２】
mir−210は ENSG00000199038 およびmirBase：has−mir−210 として注釈されるうえ、乳児突然死症候群の感受性と関連する。
【００８３】
Tcf15が発展早期で発見した基本的なヘリックス−ル−プ−ヘリックス転写因子をコ−ドであり、中胚葉およびその派生細胞型のパタ−ン形成に参加する可能性がある。この遺伝子は Ensemble: ENSG00000125878と Uniprot Q12870として注釈される。
【００８４】
mir−377はENSG00000199015およびmirBase：has−mir−377として注釈される。
【００８５】
mir−367はENSG00000199169およびmirBase：has−mir−367として注釈される。
【００８６】
mir−520CはENSG00000207738およびmirBase：has−mir−520cとして注釈される。
【００８７】
mir−548ahはENSG00000283682およびmirBase：has−mir−548ahとして注釈される。
【００８８】
ジストロフィンは遺伝子Dmdによりコ−ドされるタンパク質を意味して、Ensembl： ENSG00000198947 と Uniprot: P11523 として注釈される。このタンパク質は、細胞骨格を細胞外マトリックスに固定するジストロフィン糖タンパク質複合体の構成要素である。突然突然変異は、デュシェンヌ型筋ジストロフィ−、ベッカ−型筋ジストロフィ−および心筋症、ならびにそれらの等価物と関連する
【００８９】
mir−548qは ENSG00000221331 およびmirBase：has−mir−548q として注釈される。
【００９０】
mir−548qは ENSG00000221331 およびmirBase：has−mir−548q として注釈される。
【００９１】
mir−335がMicroRNA−335 をコ−ドして、 ENSG00000199043と miRBase: has−mir−335として注釈される。
【００９２】
mir−21がMicroRNA−21 をコ−ドして、 ENSG00000284190と miRBase: has−mir−21として注釈される。このmiRNAは幹細胞に発現しており、癌にも関与している。
【００９３】
mir−30c1が Ensemble: ENSG00000207962 と miRBase: has−mir−30c−1 として注釈されたMicroRNA をコ−ドして、ECMの維持と癌に関与している可能性がある。
【００９４】
mir−30c2が Ensemble: ENSG00000199094 と miRBase: has−mir−30c−2 として注釈されたMicroRNA をコ−ドする。miR−30c1に似ていて、mir−30c2はECMの維持と癌に関与している可能性がある。
【００９５】
Meox1が間葉ホメオボックス1タンパク質をコ−ドして、 Ensemble: ENSG00000005102と Uniprot: P50221として注釈される。このタンパク質は体節発生に役割を果たし、その遺伝的突然変異がクリッペル−フィ−ル症候群に関連する。
【００９６】
Meox2が間葉ホメオボックス2タンパク質をコ−ドして、Ensemble: ENSG00000106511と Uniprot: P23760として注釈される。この遺伝子が、神経発達および筋形成中の増殖および移動を調節するペアリングボックスファミリ−の転写因子のメンバ−をコ−ドする。この遺伝子の突然突然変異は、頭蓋顔面難聴手症候群、横紋筋肉腫、およびワ−ルデンブルグ症候群に関連する。
【００９７】
Pax3はEnsembl：ENSG00000135903およびUniprot：P23760として注釈が付ける。この遺伝子は、神経発達中および筋形成中の増殖および遊走を調節する、転写因子の対ボックスファミリ−のメンバ−をコ−ドする。この遺伝子の突然変異は、頭蓋顔面難聴手症候群、横紋筋肉腫、およびワ−ルデンブルグ症候群に関連する。
【００９８】
Pax7は Ensemble: ENSG00000009709とUniprot: P23759として注釈される。この遺伝子は、筋肉前駆細胞の増殖を調節するペアリングボックスファミリ−の転写因子のメンバ−をコ−ドする。それは胚発生に不可欠であり、横紋筋肉腫が含まれる癌に関与している。
【００９９】
MyoD1は Ensemble: ENSG00000129152 と Uniprot: P15172として注釈される。この遺伝子が細胞周期の抑制を介して筋細胞の分化を調節する筋原性ヘリックス−ル−プ−ヘリックス転写因子をコ−ドする。このタンパク質は他の主要な筋肉因子と相互作用することが知られる： Myf5、Myf6、および MyoG。
【０１００】
Myogが、筋肉特異的塩基性ヘリックスル−プ−ヘリックス転写活性化因子ミオゲニンをコ−ドする。
【０１０１】
Myh2がクラスIIまたは通常のミオシン重鎖をコ−ドして、モ−タ−タンパク質として骨格筋収縮の機能に作用する。その突然変異は封入体−身体ミオパチ− に関連する。Myh2はEnsemble: ENSG00000125414 and Uniprot: Q9UKX2として注釈される。
【０１０２】
Myh&aacute;が心筋ミオシンのα重鎖サブユニットを形成するモ−タ−タンパク質をコ−ドする。この遺伝子がEnsemble: ENSG00000197616とUniprot: P13533として注釈される。その突然変異は心房中隔欠損および肥大型心筋症に関連する。
【０１０３】
Tbxlが成長に重要なTボックス転写因子ファミリ−のメンバ−をコ−ドして、Ensemble: ENSG00000184058とUniprot: Q43435として注釈される。この遺伝子の突然変異は、神経堤の欠陥、ディジョ−ジ症候群、および流行性顔面症候群に関連する。
【０１０４】
Mesplが、体細胞性および心臓性中胚葉の発生、ならびに体節の体幹側パタ−ン形成に関与する基本的なヘリックス−ル−プ−ヘリックス転写因子をコ−ドする。Mesp1がEnsemble: ENSG00000166823 と Uniprot : QOBRJ9として注釈される。
【０１０５】
Desがタンパク質デスミンをコ−ドして、Ensemble: ENSG00000175084とUniprot : P17661として注釈される。デスミンは筋原線維の線維性ネットワ−クを形成する筋肉特異的クラスIII中間径フィラメントである。Desの突然変異は、心筋および骨格筋の筋障害と関連する。
【０１０６】
Cnntblは、標準Wntシグナル伝達経路の重要な要素のタンパク質β−カテニンをコ−ドする有名な遺伝子である。Wntの存在下で、β−カテニントランスは核に位置し、転写調節因子として作用する。また、このタンパク質は接触阻害の調節にも関与する。この遺伝子の突然変異は精神遅滞と結腸直腸癌に関連する。 Cnntbl遺伝子が Ensemble: ENSG00000168036とUniprot : P35222として注釈される。
【０１０７】
Pax7が Ensemble: ENSG00000009709とUniprot : P23759として注釈される。この遺伝子が筋肉前駆細胞の増殖を調節するペアリングボックスファミリ−の転写因子ファミリ−のメンバ−をコ−ドする。それは胚発生に不可欠であり、横紋筋肉腫が含まれる癌に関連する。
【０１０８】
Myf5遺伝子Ensemble: ENSG00000111049が、多数の筋形成因子の転写に結合して、それを促進する筋肉分化のマスタ−転写調節因子をコ−ドする ( Uniprot : P13349 )。Myf5の突然変異は、骨格筋癌と横紋筋肉腫に関連する。
【０１０９】
MyoD1がEnsemble: ENSG00000129152とUniprot : P15172として注釈される。この遺伝子が、細胞周期の抑制を介して筋細胞の分化を調節する筋原性ヘリックス−ル−プ−ヘリックス転写因子をコ−ドする。このタンパク質は他の主要な筋肉因子と相互作用することが知られる： Myf5、Myf6、と MyoG。
【０１１０】
XESI筋原性遺伝子は筋原性調節因子（ MRF ）を意味する。そのMRFは筋形成を調節する塩基性ヘリックス−ル−プ−ヘリックス（bHLH）転写因子MyoD、Myf5、ミオゲニン、およびMRF4である。これらのタンパク質が、EボックスDNAモチ−フに結合する保存された塩基性DNA結合ドメインが含まれる。[2]それらは、HLH−HLH相互作用を介して他のHLH含有タンパク質と二量体化する。
【０１１１】
Pitx2がENSG00000164093とUniprot : Q99697として注釈される。この遺伝子が、ホメオドメインタンパク質のバイコイドファミリ−に属するペアライクホメオドメイン転写因子2をコ−ドする。このタンパク質は、ホルモン、プロラクチンを調節し、目、歯、腹部の器官の発育にとって重要である。この遺伝子の突然変異はAxenfeld−Rieger症候群と関連する。
【０１１２】
ISL1は転写因子、ISL LIMホメオボックス1（Uniprot：P61371）をコ−ドする遺伝子 ( Ensemble: ENSG00000016082 ) である。このタンパク質が、運動ニュ−ロンと網膜神経節細胞の仕様に関連して、インスリン遺伝子の発現を調節する。その突然変異は成熟−発症糖尿病と膀胱萎縮と関連する。
【０１１３】
Nkx2.5が心臓発生に関与するマスタ−転写因子をコ−ドして、Ensemble: ENSG00000183072とUniprot P52952として注釈される。この遺伝子の突然変異は、心房中隔欠損、そして先天性甲状腺機能低下症の形をもたらす。
【０１１４】
Handlは、Ensemble: ENSG00000113196とUniprot : 096004として注釈された基本的なヘリックス−ル−プ−ヘリックス転写因子である。心臓発育の間に、 Handlは他のHandタンパク質と非対称的に発現して、心臓の形態形成と右心室および大動脈弓動脈の形成を指示する。Handタンパク質をコ−ドする遺伝子の突然変異は先天性心疾患と関連する。
【０１１５】
GATA4は、Ensemble: ENSG000001366574として注釈され、亜鉛−フィンガ−転写因子のgataファミリ−のメンバ−をコ−ドする。このタンパク質 Uniprot : P43694は胚形成、心臓の発達、そして心筋機能に重要である。その突然変異は中隔欠損やさまざまな種類の癌に関連する。
【０１１６】
Tbx5はTボックス遺伝子ファミリ−のメンバ−であり、保存されたDNA結合ドメインが含まれる。Tbx5の多数の転写産物がRefSeqでキュレ−ションされていて、そのEnsemble遺伝子識別子はENSG00000089225である。そのタンパク質製品、 Uniprot : Q99593は心臓や四肢の発達に重要である。この遺伝子の突然変異はホルト−オラム症候群に関連する。
【０１１７】
TnnT2は、心筋トロポニンT2（Uniprot：P45379）−トロポミオシン−トロポニン複合体の結合単位をコ−ドする遺伝子である。細胞内カルシウム濃度の変化に反応して、Tnnt2は筋肉収縮を調節する。この遺伝子は、Ensemble: ENSG00000118194として注釈され、家族性肥大型心筋症および拡張型心筋症と関連する。
【０１１８】
My17は、カルシウム結合モ−タ−タンパク質ミオシン軽鎖7をコ−ドする遺伝子である。この遺伝子は、Ensemble: ENSG00000106631とUniProt : 201449として注釈される。この遺伝子座での突然突然変異はFechtner症候群と家族性心房細動に関連する。
【０１１９】
MLC2v遺伝子（より一般的には、ヒトではMy12として表される）は、 Refseq : NM _ 00432とUniprot : P10916としてキュレ−ションされ、モ−タ−タンパク質ミオシン軽鎖2をコ−ドする。このタンパク質のカルシウム依存性リン酸化は収縮力の発生をもたらす。このタンパク質は心臓の発達と心臓の収縮性に機能して、その突然変異は中左室心室肥大型心筋症に関連する。抗体はInvitrogenおよびSanta Cruz Biotechnologyを通じて入手できる。
【０１２０】
Mef2cは（ Ensemble ID ENSG00000081189）RefSeqでキュレ−ションされた、8つ以上の選択的スプライストランスクリプトを作成する遺伝子である。そのタンパク質製品（ Uniprot : Q06413）は、MADSボックス転写エンハンサ−因子2ファミリ−のメンバ−であり、血管発生、心臓の形態形成、筋形成、および異なる状態の維持に役割を果たす。この遺伝子座内のゲノム異常は、精神遅滞、脳奇形、てんかん、および催不整脈性右室異形成5と関連する。Cell Signaling Technologies、Novus Biologicals、およびInvitrogenはすべて、このタンパク質の検出および研究用の製品を提供する。
【０１２１】
Cdh4遺伝子が、タンパク質、カドヘリン4をコ−ドする3つの転写突然変異体を生成する。カドヘリンス−パ−ファミリ−のメンバ−として、Chd4は脳のセグメンテ−ションとニュ−ロンの成長に重要なカルシウム依存性細胞接着分子として機能する。このタンパク質は腎臓や筋肉の発達にも関連する。 Cdh4は Refseq : NM ＿001252399とUniprot : P55283として注釈される。精製タンパク質、抗体、および他の検出キットは、Invitrogen、AbcamまたR＆Dシステムが含まれる供給元から広く入手可能である。
【０１２２】
Lhx2は、システインに富む亜鉛結合ドメインを有するLIMドメインファミリ−のメンバ−Limホメオボックス2タンパク質をコ−ドする。 Lhx2は Refseq : NM 004789と UniProt : P50458キュレ−ションされて、細胞の分化と、リンパ系と神経系の発育に関与する転写活性化因子として機能すると考えられる。Lhx2用の抗体およびELISA検出キットが、Origene、Santa Cruz BiotechnologyとInvitrogenから市販されている。
【０１２３】
Gaiは、ATPからのcAMPの生成物を阻害するヘテロ三量体Gタンパク質サブユニットである。代表的な配列は、GenBankの下で提供され、 Ref.: NM ＿ 002069とUnProt P63096である。このマ−カ−を認識する抗体は、Santa Cruz Biotechnologyから市販されている。
【０１２４】
細胞骨格改造は改造を意味して、ミクロフィラメント（アクチン）、微小管（チュ−ブリン）、および中間径フィラメント ( i.e.ビメンチン、ケラチン、デスミン）の動的再編成を意味して、真核細胞骨格が含まれる。複雑ではあるが、この過程は数分以内に起こり、そして細胞移動、細胞質分裂、および筋肉収縮などの生物学的機能を促進する。
【０１２５】
TGF−β誘導性emt（上皮−間葉転換）シグナル伝達の促進が上皮様特性を有する細胞の間葉様特性を有する細胞への分化転換を意味して、シグナル伝達分子TGF−βによって媒介される。EMTと呼ばれるこのプロセスの非限定的な生物学的役割は、癌、線維症、心臓の発達、そして心臓の分化が含まれる。トランスフォ−ミング増殖因子−β（TGF−β）は、発生中および癌中の両方でEMTの強力な誘導物質である。TGF−β誘導EMTでは、Smadタンパク質の活性化は、それらの核内移行、DNA結合、およびEMT転写因子の上方制御をもたらす。EMT転写因子の非限定的な例には、Snail、Twist、およびZebが含む。EMTは細胞骨格のリモデリングを必要とし、心臓分化は収縮心筋細胞へのIPS細胞のようなヒト多能性幹細胞（PSC）の効率的な分化を意味する。
【０１２６】
肥大シグナル伝達経路における心筋細胞、筋肉収縮およびnfにおけるpip3シグナル伝達の発生のための遺伝子の発現促進は、細胞増殖および生存に必要な下流の同化シグナル伝達経路を活性化するプロテインキナ−ゼAKTさ下流のシグナル伝達成分を活性化させる意向である。ホスファチジルイノシト−ル（3，4，5）−トリスホスフェ−ト（PtdIns（3，4，5）P3）は、PIP3と略され、クラスIホスホイノシチド3−キナ−ゼ（PI 3−キナ−ゼ）のホスファチジルイノシト−ル（4，5）−ビスリン酸（PIP2） リン酸化の生成物である。それは原形質膜に存在するリン脂質であり、心筋細胞におけるPIP3シグナルを伝達する。
【０１２７】
ホスホイノシチド3−キナ−ゼ（PI3K）は固有のチロシンキナ−ゼ活性を持つ受容体により心筋細胞で活性化される、例えばインスリン受容体（INSR）、成長因子受容体（IGF1受容体およびHGF受容体）、およびGタンパク質共役型受容体（GPCR）である。INSRとIGF1受容体の関与は受容体活性化と自己リン酸化を誘発する。そのあと、活性化された受容体はそれからいくつかの細胞内タンパク質基質をリン酸化して、最も顕著なのはインスリン受容体基質（IRS1−4）タンパク質である。チロシンリン酸化IRS1は下流のエフェクタ− PI3K を動員し活性化して、原形質膜中に存在するイノシト−ル含有リン脂質を基質として用いてホスファチジルイノシト−ル3、4、5−トリスリン酸（PIP3）を生成する。また、IRSタンパク質はアダプタShcとGrb−2を動員する。タンパク質チロシンホスファタ−ゼPTP1Bはこの受容体のホスホチロシン残基を脱リン酸化することによりINSRシグナル伝達を負に調節することに関連する。肝細胞増殖因子受容体（HGF受容体）が、（PI3KCクラス1A）触媒サブユニットを刺激する調節サブユニット（PI3KRクラス1A）の動員を介して、GAB1のチロシンリン酸化とそのPI3Kとの会合を誘導する。活性化されたアダプタShcおよびGRB−2が、 H−RASを活性化するリクル−ト交換因子SOS−RASをリクル−トしている [4]。H−RASはPI3K触媒サブユニット（PI3KCクラス1A）を直接刺激する。PI3Kはホスファチジルイノシト−ル4,5−二リン酸（PI（4,5）P2）をPIP3に変換する[6]。PIP3はPDKおよびAKT経路が含まれる多様なシグナルカスケ−ドを活性化するセカンドメッセンジャ−である。ホスファタ−ゼPTENはPI3K/AKTシグナル伝達経路に対する負の調節因子として作用して、PI（3、4、5）P3をPI（4、5）P2に変換する。AKTとPDKは、様々なインスリンと成長因子に誘導された細胞性反応を調停する多様なタンパク質をリン酸化する、例えばグリコ−ゲン合成、タンパク質合成、細胞周期開始とBADやBcl−xなどのアポト−シス因子の調節による細胞生存の促進すること ( L )。
【０１２８】
本明細書中で使用される場合、MicroRNAまたはmiRNAsとは、通常、一般的に遺伝子サイレンシングを引き起こすタ−ゲットメッセンジャ−RNA転写産物（mRNA）の3つの主要な非翻訳領域（3’UTR）にある相補的な配列に結合しテイル転写後調節因子ということである。通常、miRNAは短い非コ−ドリボ核酸（RNA）分子であり、例えば21または22ヌクレオチド長。用語MicroRNAおよびmirNAは互換的に使用される。
【０１２９】
mir−133は、未成熟または未分化表現型に関連づけられているMicroRNAを指す。 それを検出する方法には、例えば、Microアレイ−RT−PＣRとRNA−seqが含まれる。miR−133の市販キットは、EMD Millipore（SmartFlareTM Detection Probes）から入手可能であり、生細胞中のmiRNAの検出を可能にする。
【０１３０】
miR−762は非コ−ドRNAであり、多細胞生物における遺伝子発現の転写後調節に関連している。miR−762ヒト配列は登録番号No.MI0003892に報告されている（最後は2014年4月16日でアクセスした）。マウス配列は NR _ 030428.1 に報告されている（ ncbi.nlm.nih.gov/gene/79103に参考して、最後は2014年4月16日でアクセスした）。そのような検出方法は当技術分野において公知であり、そのキットは、例えば、Origeneから市販されている（ miR−762、origene.comに参考して、最後は2014年4月16日でアクセスした）。
【０１３１】
miR−133は未成熟または未分化の表現型に関連づけられているMicroRNAのことである。そのような検出方法としては、例えば、Microアレイ−RT−PＣRおよびRNA−seqが挙げられる。miR−133の市販のキットはEMD Millipore ( SmartFlareTM Detection Probes ) から入手できるながら、生細胞中のmiRNAの検出を可能にする。
【０１３２】
miR−762は多細胞生物における転写後の遺伝子発現制御に関連しているノンコ−ディングRNAである。miR−762ヒト配列は登録番号No.MI0003892 に報告されている（最後は2014年4月16日でアクセスした））。マウス配列は NR _ 030428.1 に報告されている（ ncbi.nlm.nih.gov/gene/79103に参考して、最後は2014年4月16日でアクセスした）。そのような検出方法は当技術分野において公知であり、そのキットは、例えば、Origeneから市販されている（ miR−762、origene.comに参考して、最後は2014年4月16日でアクセスした）。
【０１３３】
miR−195はRNA遺伝子であり、miRNAクラスに属することが報告される。miR−195に関連する疾患には、舌扁平上皮癌および原発性腹膜癌が含まれる。その関連経路の中には、癌におけるMicroRNAと心筋細胞肥大におけるMicroRNAがある。また、miR−195は MIRN195、Has−MIR − 195とMiRNA 195 として知られる。その配列および相同体は、遺伝子カ−ドのウェブペ−ジに報告されている。核酸配列は、GenB ank登録番号 AK098506 で報告されて、最後は2015年11月18日でアクセスした。
【０１３４】
ILS1は、インスリン遺伝子発現の調節において重要な役割を果たすインスリン遺伝子エンハンサ−タンパク質を指す。ISL1はまた、膵臓細胞系譜の発達の中心となることがわかって、運動ニュ−ロンの生成にも必要とされる。ISL1は心臓前駆細胞のマ−カ−として同定される。
【０１３５】
Tbx−5は心臓転写因子であり、Tボックス転写因子（ TBX5）とも呼ばれる。 Tbx−5はヒトにおいてTBX5遺伝子によってコ−ドされているタンパク質である。GeneCardsヒト遺伝子デ−タベ−スに示されているとおり、この遺伝子は系統発生的に保存された共通のDNA結合ドメインT−boxを共有する遺伝子ファミリ−のメンバ−である。T−box遺伝子は発生過程の調節に関与する転写因子をコ−ドする。この遺伝子は、ヒト12番染色体上の関連するファミリ−メンバ−T−box 3（尺骨乳房症候群）と密接に関連する。コ−ドされたタンパク質は、心臓の発達および四肢の同一性の特定において役割を果たす可能性がある。この遺伝子の突然変異は心臓や上肢に影響を及ぼす発達障害としたHolt−Oram症候群と関連する。この遺伝子について、異なるアイソフォ−ムをコ−ドするいくつかの転写産物変異体が記載されている。このタンパク質の受託番号は099593または A6ND77、または 015301、または Q96TBO。そのタンパク質に対する抗体は、 R & D Systems、Browse EMD、OriGene Antibodies、とNovus Biologicals から市販されている。
【０１３６】
ここで使用されているように、「組織の再生を容易にするおよび/または組織の機能を改善するタンパク質」という用語は、組織機能または骨機能を再生または再生または改善することができるタンパク質の意味である。そのタンパク質は、組織再生または骨機能を改善する潜在的なサイトカインである。ゲル形成特性により、ある種のタンパク質ポリマ−は生物医学的用途に非常に適したものになれ、例えば、手術および創傷における組織再生のこと。そのような非限定的な例には、歯周組織を増強するIGFBP5タンパク質と肝再生を活性化するPPARが含まれる。
【０１３７】
ここで使用されているように、「凍結乾燥」は、低温乾燥または凍結乾燥の意味である。
【０１３８】
細胞外エキソソ−ムまたは微小胞とも呼ばれる細胞由来のエキソソ−ムまたは微小胞は、試験管内と生体内で細胞によって放出される膜に囲まれた構造である。細胞外エキソソ−ムまたは微小胞は、タンパク質、脂質、および核酸を含み得る以上、体内の異なる細胞型が含まれる異なる細胞間の細胞間コミュニケ−ションを仲介することができる。2種類の細胞外エキソソ−ムまたは微小胞はエキソソ−ムや微小胞、および微小胞である。エキソソ−ムまたは微小胞は小さな脂質結合で、細胞外に分泌されたタンパク質とRNAの細胞間輸送を介した細胞間コミュニケ−ションを仲介するエキソソ−ムまたは微小胞である(El Andaloussi、S と他. ( 2013 ) Nature Reviews : Drug Discovery 12 ( 5 ) : 347 357 )。エキソソ−ムまたは微小胞の大きさは約30 nmから約200 nmの範囲である。エキソソ−ムまたは微小胞が、多小胞エンドソ−ム（MVE）と原形質膜との融合によって細胞から放出されたが、微小胞が原形質膜（PM）からの直接出芽の際に細胞から放出され、そして異なる因子と共にパッケ−ジングされる。微小胞が、一般的には、エキソソ−ムまたは微小胞よりも大きいであり、約200 nmから1 μmの範囲で、さまざまな機能を持つ。
【０１３９】
細胞由来のエキソソ−ムまたは微小胞は、biovision.comと novusbio.com から入手可能な市販キット、または本明細書に記載の方法を用いて真核細胞から単離することができる。細胞由来のエキソソ−ムまたは微小胞を単離することができる細胞の非限定的な例には幹細胞が含まれる。そのような幹細胞の非限定的な例には、成体幹細胞、胚性幹細胞、胚様幹細胞、非胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞が含まれる。
【０１４０】
本明細書に使用されたように、用語「過剰発現」、「過剰発現」などは、エキソソ−ムまたは微小胞が天然に含有するよりも高いレベルまで核酸またはタンパク質の発現を増加させることを包含することを意図している。この用語は、内因性ならびに異種の核酸およびタンパク質の過剰発現を包含することが意図されている。
【０１４１】
本明細書に使用されたように、e細胞由来のエキソソ−ムまたは微小胞の集団に関する「均質」という用語は、同量の外因性核酸および同量の外因性タンパク質を有する細胞由来の、同程度のサイズ、またはその組み合わせるエキソソ−ムまたは微小胞の集団を指す。均質な集団は、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約98％、または100％の細胞由来のエキソソ−ムまたは微小胞の集団であり、少なくとも1つの特性を共有する。均一集団の別の例は、エキソソ−ムまたは微小胞の約90％が直径50 nm未満である集団である。
【０１４２】
本明細書に使用されたように、「不均一」という用語は細胞由来のエキソソ−ムまたは微小胞の集団に関して、異なる量の外因性核酸、異なる量の外因性タンパク質、異なるサイズまたはそれらの組み合わせを有する細胞由来のエキソソ−ムまたは微小胞の集団を指す。
【０１４３】
「実質的に」という用語は、特性の完全な又はほぼ完全な程度または程度を指すであり、一方では、分離または精製されたエキソソ−ムまたは微小胞の集団の純度を定義する。
【０１４４】
細胞集団、細胞由来のエキソソ−ム、Microベシクル、またはmiRNAに対する「精製された集団」という用語は、本明細書に開示されたように、細胞由来のエキソソ−ムまたは微小胞が通常培地中に見られる他のいくつかの成分の一部または全部と比較した、所望のエキソソ−ムまたは微小胞またはmiRNA集団の濃縮またはのために、1つ以上の選択プロセスを受けた複数のものを指す。あるいは、「精製された」とは、馴化培地中に見られる残留の望ましくない成分の除去または減少を指すことができる（例えば、細胞片、可溶性タンパク質と他のもの）。本明細書で使用される「高度に精製された集団」をしめした細胞−由来エキソソ−ムまたは微小胞の集団の細胞片と可溶性タンパク質が、少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％または100％が、細胞−由来エキソソ−ムまたは微小胞とともに除去された。本明細書に記載のmirNAは、単離、精製、高度に精製された形態、均一、実質的に均一および不均一の形態で提供することができる。
【０１４５】
本明細書に使用されたように、「培地（単数）」および「培地（複数）」という用語は互換的に用いられて、細胞（例えば幹細胞）の増殖を支持するために使用される固体または液体物質を指す。好ましくは、本明細書で使用される培養培地は、幹細胞を未分化状態に維持することができる液体物質を指す。培地は、塩、栄養素、ミネラル、ビタミン、アミノ酸、核酸、サイトカインなどのタンパク質、成長因子およびホルモンなどの成分の組み合わせを含む水性培地であり得る。これらはすべて細胞増殖に必要であり、幹細胞を未分化状態に維持することができる。例えば、培地は、以下のような合成培地であり得る：最低限必要なメディア ( MEM−a ) ( HyClone Thermo Scientific、Waltham、Mass .、USA )、DMEM/F12、GlutaMAX ( Life Technologies、Carlsbad、Calif .、USA )、Neurobasal Medium ( Life Technologies、Carlsbad、Calif .、USA )、KO − DMEM ( Life Technologies、Carlsbad、Calif .、USA )、DMEM/F12 ( Life Technologies、Carlsbad、Calif .、USA )、そして本明細書にさらに記載されるように、必要な添加剤を補充する。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は培養培地の混合物であり得る。好ましくは、本開示の培地に含まれる全ての成分は実質的に純粋で組織培養グレ−ドである。「馴化培地」および「条件培地」は互換的に用いらて、細胞がある期間培養され、細胞が成分（例えばタンパク質、サイトカイン、化学物質など）を培地中に放出/分泌する培養培地を指す。
【０１４６】
「組成物」はまた、細胞、細胞集団、エキソソ−ムもしくはMicroベシクル、mirNA、またはそのような集団、または活性剤、および別の担体の組み合わせを包含することを意図している。例：化合物または組成物、不活性（例えば、検出可能な物質または標識）または活性、例えば、アジュバント、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなど。担体には以下の物を含まれる：生体適合性足場、医薬品添加物および添加物タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、および炭水化物（例えば単糖、二糖、三糖、四糖、およびオリゴ糖を含む糖；アルジト−ル、アルドン酸、エステル化糖などの誘導体化糖；多糖または糖ポリマ−）、これらは単独で又は組み合わせで存在することができ、単独で又は組み合わせで1〜99を含めて、重量または体積で99％である。例示的なタンパク質賦形剤としては、ヒト血清アルブミン ( HSA ) 、組換えヒトアルブミン（PHA）、ゼラチン、カゼインなどの血清アルブミンが挙げられる。緩衝能力においても機能し得る代表的なアミノ酸/抗体成分は、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテ−ムなどを含む。炭水化物賦形剤も本発明の範囲内にあると意図される。その例は、フルクト−ス、マルト−ス、ガラクト−ス、グルコ−ス、D−マンノ−ス、ソルボ−スなどの単糖類；ラクト−ス、スクロ−ス、トレハロ−ス、セロビオ−スなどの二糖類；ラフィノ−ス、メレジト−ス、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどの多糖類；マンニト−ル、キシリト−ル、マルチト−ル、ラクチト−ル、キシリト−ルソルビト−ル（グルシト−ル）およびミオイノシト−ルなどのアルジト−ルを含めるが、これに限定されない。
【０１４７】
防腐剤は、組成物中の薬剤の生存能力を高める組成物を意図している。非限定的な例としては、安息香酸塩（安息香酸ナトリウム、安息香酸など）、亜硝酸塩（亜硝酸ナトリウムなど）および亜硫酸塩（二酸化硫黄など）が挙げられる。
【０１４８】
凍結防止剤は、凍結および解凍手順中に薬剤を保護する化合物である。そのようなものの非限定的な例には、DMSO、グリセロ−ル、PEGが含まれる。
【０１４９】
「対照」は、比較目的で実験に使用される代替の対象または試料である。対照は「陽性」または「陰性」であり得る。例えば、実験の目的が遺伝子の変化した発現レベルと特定の表現型との相関関係を決定することである場合、一般には一つの陽性対照（そのような改変を有し、そして所望の表現型を示す、被験体由来のサンプル）と一つの陰性対照（変化した発現または表現型を欠く被験体または被験体由来の試料）を使用することが好ましい。さらに、実験の目的が、薬剤が幹細胞の分化またはエキソソ−ムもしくは微小胞もしくはmiRNAの発現に影響を及ぼすかどうかを決定することである場合に、陽性対照（分化または発現の変化に影響することが知られている側面を持つサンプル）と陰性対照（影響がないことがわかっている薬剤、または薬剤を添加していないサンプル）を使用することが好ましい。
【０１５０】
「培養する」という用語は、様々な種類の培地上または中での細胞または生物の試験管内で増殖を指す。培養で増殖した細胞の子孫は親細胞と完全に同一（すなわち、形態学的に、遺伝的に、または表現型的に）ではないかもしれないことが理解される。「拡大した」とは、細胞の増殖または分裂を意味する。
【０１５１】
本明細書に使用されたように、「検出可能に標識された」という用語は、作用物質（生物学的分子または低分子化合物）が、インビトロ（in−vitro）またはインビボ（in−vivo）で作用物質の存在の検出を容易にする別の分子、化合物またはポリマ−に結合していることを意味する。
【０１５２】
「検出可能な標識」は、検出されるべき組成物に直接的または間接的にコンジュゲ−トしている直接的または間接的に検出可能な化合物または組成物を意図する。例えば、N末端ヒスチジンタグ（AND−His）、磁気活性同位体（ 115Sn、117Sn と 119Sn）、非放射性同位元素（ 13C と SN）、「標識」組成物を生成するための抗体などのポリヌクレオチドまたはタンパク質。この用語はまた、緑色蛍光タンパク質（GFP）など挿入された配列の発現時にシグナルを提供するであろうポリヌクレオチドにコンジュゲ−トした配列も含む。標識は、それ自体で検出可能であり得る（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、または、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し得る。標識は小規模検出に適しているか、またはハイスル−プットスクリ−ニングにさらに適している可能性がある。そのようなものとして、適切なラベルには、これらに限定されないが、以下のアイテムを含まれる：磁気的に活性な同位体、非放射性同位体、放射性同位体、蛍光色素、発光化合物、色素、および酵素を含むタンパク質。標識は単に検出されてもよく、または定量化されてもよい。単純に検出される応答は、一般に、単にその存在が確認されるだけの応答を含んでおり、定量化される応答は、一般に、強度、分極、および/または他の特性などの定量化可能な（例えば、数値的に報告可能な）値を有する応答を含む。発光アッセイまたは蛍光配列では、検出可能な応答は、結合に実際に関与する配列成分と関連する発光団または蛍光団を用いて直接生成され得る、また他の（例えばレポ−タ−または指示薬）成分と会合した発光団または蛍光団を使用して、間接的に生成される。
【０１５３】
シグナルを生成する発光標識の例には、生物発光および化学発光が含まれるが、これらに限定されない。検出可能な発光応答は、一般に、発光シグナルの変化または発生を含む。アッセイ成分を発光標識するための適切な方法および発光団は、当技術分野において公知であり、例えば、 Haugland、Richard P.( 1996 ) 蛍光プロ−ブと化学薬品のハンドブック（第6版）に記載されている。発光プロ−ブの例としては、エクオリンおよびルシフェラ−ゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
適切な蛍光標識の例には、これらに限定されないが、以下のアイテムが含まれる：フルオレセイン、ロ−ダミン、テトラメチルロ−ダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラサイトグリ−ン、スチルベン、ルシファ−イエロ−、カスケ−ドブル−、およびテキサスレッド。他の適切な光学染料は、Haugland、Richard P.( 1996 ) 蛍光プロ−ブと化学薬品のハンドブック（第6版）に記載されている。
【０１５５】
本明細書に使用されたように、「発現」とは、ポリヌクレオチドがmRNAに転写される過程および/またはそのプロセスを指す。そのプロセスで、転写されたmRNAはその後、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、発現は真核細胞におけるmRNAのスプライシングを含み得る。
【０１５６】
「差次的に発現される」とは、遺伝子、エキソソ−ムもしくは微小胞、またはマ−カ−の上方または下方発現を意図する。例えば、対照と比較する。一方では、対照は、多能性細胞または幹細胞と比較して分化細胞である。遺伝子、タンパク質、細胞、集団、エキソソ−ムまたは微小胞、miRNA、またはマ−カ−に適用される「差次的に発現」は、天然環境で見いだされる発現レベルなどの対照と比較した場合の産物の示差的産生を指す。差別的に発現されるのは、遺伝子から転写されたmRNA、または遺伝子によってコ−ドされるタンパク質産物である。正常細胞、未処理細胞、未変性細胞または対照細胞の発現レベルと比べて、差次的に発現される遺伝子は過剰発現または過少発現 ( a.k.a.阻害 ) される可能性がある。一方では、それは1.5倍、2倍、少なくとも2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍、また10倍（つまり、過剰発現している）高いことを意味する、または、コントロ−ルサンプルで検出された発現レベルより低いことを意味する。「差次的に発現される」という用語はまた、対照細胞においてサイレントである場合に発現されるか、または対照細胞において発現される場合に発現されない細胞または組織中のヌクレオチド配列を指す。
【０１５７】
「幹細胞」という用語は、未分化または部分的に分化した状態にあり、自己複製および分化した子孫を生成する能力を有する細胞を指す。自己再生は、その発生能（すなわち、全能性、多能性、多能性など）を維持しながら、幹細胞が増殖してより多くのそのような幹細胞を生じさせる能力として定義される。「体性幹細胞」という用語は、本明細書では、胎児、幼若、および成人の組織を含む非胚性組織に由来する任意の幹細胞を指すために使用される。天然の体性幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋、心筋など、さまざまな成人の組織から単離される。例示的な天然の体性幹細胞としては、間葉系幹細胞（MSＣ）および神経幹細胞（NSＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、幹細胞または前駆細胞は胚性幹細胞であり得る。本明細書中で使用される場合、「胚性幹細胞」とは、受精後であるが妊娠の終了前に形成された組織に由来する幹細胞をいう。例えば：妊娠前の組織（胚盤胞など）、胚組織、または妊娠中はいつでも、通常妊娠の約10〜12週前に採取される胎児組織。最も頻繁には、胚性幹細胞は初期胚または胚盤胞に由来する多能性細胞である。胚性幹細胞は、ヒト組織を含むがこれに限定されない適切な組織から、または樹立胚細胞系から直接得ることができる。「胚様幹細胞」とは、胚性幹細胞の全てではないが1つ以上の特徴を共有する細胞を指す。
【０１５８】
「分化」は、特殊化されていない細胞が心臓、肝臓、または筋肉細胞などの特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスを説明する。「定方向分化」は、特定の細胞型への分化を誘導するための幹細胞培養条件の操作を指す。「脱分化」は、細胞の系統内でそれほどコミットされていない位置に戻る細胞を定義する。本明細書で使用されるとき、用語「分化または分化した」は、細胞の系統内でより確固たる（「分化」）位置を占める細胞を定義する。本明細書で使用されるとき、「中胚葉（または外胚葉または内胚葉）系統に分化する細胞」は、それぞれ特定の中胚葉、外胚葉または内胚葉系統に関与するようになる細胞を定義する。中胚葉系統に分化するかまたは特定の中胚葉細胞を生じさせる細胞の例には、限定されるものではないが、脂肪生成性、平滑筋形成性、軟骨形成性、心臓形成性、皮膚形成性、造血性、血管形成性、筋形成性、腎形成性、尿生殖原性、骨形成性、心膜形成性、または間質性の細胞が含まれる。
【０１５９】
本明細書に使用されたように、「分化または分化した」という用語は、細胞の系統内でより確固たる（「分化した」）位置を占める細胞を定義する。「脱分化」とは、細胞の系統内でそれほどコミットされていない位置に戻る細胞を定義する。誘導多能性幹細胞は、脱分化細胞の例である。
【０１６０】
本明細書に使用されたように、細胞の「系譜」は細胞の遺伝を定義する、例えば、その前身と後代。細胞の系譜は、細胞を発生および分化の遺伝的スキ−ム内に置く。
【０１６１】
「多系譜幹細胞」または「多分化能幹細胞」とは、それ自体および別個の発達系統から少なくとも2つのさらなる分化した子孫細胞を再生する幹細胞を指す。系譜は、同じ胚葉（すなわち、中胚葉、外胚葉または内胚葉）に由来してもよく、または異なる胚葉に由来してもよい。多系統幹細胞の分化から異なる発生系統を有する2つの子孫細胞の例は、筋形成細胞および脂肪生成細胞である（両方とも中胚葉起源のものであるが、それでも異なる組織を生じる）。別の例は、（外胚葉起源の）神経原性細胞および（中胚葉起源の）脂肪生成細胞である。
【０１６２】
「前駆体」または「前駆細胞」は、特定の種類の細胞に分化する能力を有する細胞を意味することを意図している。前駆細胞は幹細胞であり得る。前駆細胞はまた、幹細胞よりも特異的であり得る。前駆細胞は、単能性または多分化能性であり得る。成体幹細胞と比較して、前駆細胞は細胞分化の後期段階にあり得る。 前駆細胞の例としては、限定するものではないが、前駆神経細胞が挙げられる。
【０１６３】
「単為生殖幹細胞」は、卵の単為生殖活性化から生じる幹細胞を指す。 単為生殖幹細胞を作製する方法は当技術分野において公知である。例えば Cibelliと他.( 2002 ) 科学 295 ( 5556 ) : 819 、またVrana と他. ( 2003 ) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100 ( Suppl.1 ) 11911−6 .
【０１６４】
本明細書中で使用される場合、「多能性細胞」とは、少なくとも2つの異なる（遺伝子型的および/または表現型的に）さらなる分化した子孫細胞を生じ得る、それほど分化していない細胞を定義する。別の局面において、「多能性細胞」は、非多能性細胞、典型的には、歴史的に一個の以上の幹細胞特異的遺伝子の発現を誘導することにより製造された成体体細胞に由来する人工的に誘導された幹細胞である誘導多能性幹細胞（iPSC）を含む。そのような幹細胞特異的遺伝子としては、八量体転写因子のファミリ−が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、 Oct−3/4； Sox遺伝子ファミリ−（ Sox1、Sox2、Sox3、Sox 15 と Sox 18）； Klf遺伝子ファミリ−（ Klf1、Klf2、K1f4 と K1f5）； Myc遺伝子ファミリ−（ c−myc と L−myc）； Nanog遺伝子ファミリ−（ OCT4、NANOG と REX1）またはLIN28。iPSCの例は以下で記載されている：高橋と他 ( 2007 ) Cell advanceオンライン出版物 20 Nov.2007 : 高橋＆山中 ( 2006 ) 細胞 126 : 663−76 ;沖田と他 ( 2007 ) 自然 448 : 260−262 ; Yuと他. ( 2007 ) Science advanceオンライン出版物 20 Nov.2007；また、中川と他 ( 2007 ) Nat.Biotechnol.Advance オンライン出版物 30 Nov.2007 .
【０１６５】
「胚様体またはEB」は、培養中に形成される胚性幹細胞の三次元（3D）凝集体であり、その後の分化を促進する。浮遊培養で増殖すると、EB細胞は内臓内胚葉の外層に囲まれた細胞の小さな凝集体を形成する。成長および分化すると、EBは液体で満たされた腔と外胚葉様細胞の内層を有する嚢胞性胚様体に発達する。
【０１６６】
「人工多能性細胞」は、成体細胞から未成熟表現型に再プログラムされた胚様細胞を意図する。当技術分野において様々な方法が知られている。例えば、「多能性を誘発する簡単な方法：酸。 」 Nature、29 Jan.2014、 sciencedaily.com/releases/2014 /01/140129184445 で利用可能、2014年2月5日で最後にアクセスされた；また米国特許出願公開 No.2010/0041054。ヒトiPS細胞は幹細胞マ−カ−も発現しており、3つすべての胚葉に特徴的な細胞を生成することができる。
【０１６７】
本明細書中で使用される場合、「心臓前駆体」という用語は、最終的に由来する心臓細胞型に分化することができる動的前駆体を意味する。心臓前駆細胞（CPC）は心臓系譜への中胚葉の関与の初期段階を表し、古典的なCPCマ−カ− KDR/PDGFR−apos/CKITneg を示して、前駆細胞集団としての増殖および/または終末心臓細胞への分化のための許容条件に反応する。
【０１６８】
本明細書中で使用される場合、用語「骨格筋原性前駆体」は、P ax3およびP ax7の発現を特徴とし、そしてまた生後筋肉のサテライト細胞を生じる細胞を意図する。
【０１６９】
本明細書中で使用される場合、「線維芽細胞」は、以下のマ−カ−ビメンチン、ＣollA1、FSP−1を発現する細胞を意図する。
【０１７０】
本明細書中で使用される場合、「骨格筋芽細胞」は、以下のマ−カ−MyOG、デスミン、局所痛、ヒトα骨格アクチンを発現する細胞を意図する。
【０１７１】
本明細書中で使用される場合、「多能性細胞」とは、少なくとも2つの異なる（遺伝子型的および/または表現型的に）さらなる分化した子孫細胞を生じ得る低分化細胞を定義する。
【０１７２】
幼若または若年幹細胞は、抗老化遺伝子を保有する2ヶ月齢以下のマウスを対象とする。試験管内で 、細胞の大きさは平均約3〜5μmであり、胚性幹細胞マ−カ−、OCT4および表面マ−カ−、CD29、CD44とCD90を発現する。
【０１７３】
本明細書中で使用される場合、「線維芽細胞」は、以下のマ−カ−ビメンチン、ＣollA1、FSP−1を発現する細胞を意図する。
【０１７４】
本明細書中で使用される場合、「骨格筋芽細胞」は、以下のマ−カ−、Myog、Desmin、局所痛、ヒトα骨格アクチンを発現する細胞を意図する。
【０１７５】
本明細書中で使用される場合、用語「多能性遺伝子またはマ−カ−」は、未成熟または未分化の表現型、例えば、Oct 3/4、Sox 2、N anog、c − MycおよびLIN − 28とか関する発現遺伝子またはタンパク質を意図する。 そのようなものを同定する方法は当技術分野において公知であり、そのようなものを同定するためのシステムは、例えばEMD Millipore（MILLIPLEX（登録商標）Map Kit）から市販されている。
【０１７６】
「骨格筋芽細胞（SM）」は、基底板と筋細胞膜との間から単離することができる未成熟細胞である。それらは成熟骨格筋の層内核の2〜5％を占める。骨格筋芽細胞は、筋肉の損傷または疾患による筋肉の変性に反応して活性化された。骨格筋芽細胞が、 desmin、CD56、Pax3、Pax7、c−met、筋細胞核因子、M−cadherin、VCAM1、N−CAM、CD34、Leu−19、またsyndecan 3 と4 を発見する。細胞が多核筋管に分化するにつれて、活性化骨格筋芽細胞は最初にMyf−5および/またはMyoDを発現し、最後にミオゲニンおよびMRF4を発現する。
【０１７７】
本明細書中で使用される場合、用語「小幼若幹細胞（SJSＣ）」は、高い増殖および分化能を有する老齢骨髄由来幹細胞（BMSＣ）から単離された幹細胞を意図する。 Igura と他 ( 2013 ) 305 ( 8 ) : H1354−62.SJSCsが、 フロ−サイトメトリ−分析で調べたところ、CD29 ( + )/CD44 ( + )/CD59 ( + )/CD90 ( + ) 間葉系幹細胞マ−カ−を発見されたが、CD45（−）/ CD117（−）は陰性である。SJSＣは、BMSＣと比較してより高い増殖、コロニ−形成、および分化能力を示す。それらは心臓系統マ−カ−（Gata−4と筋細胞特異的エンハンサ−因子2C）、また多能性マ−カ−（八量体結合転写因子4、性決定領域Yボックス2、段階特異的胚性抗原1、およびNanog）とテロメラ−ゼ逆転写酵素およびサ−チュイン1などの老化防止因子を有意に発現することも報告されている。
【０１７８】
「骨髄間質細胞」または「間葉系間質細胞」とも呼ばれる「骨髄間質細胞」は、様々な細胞型に分化することができる多能性幹細胞である。MSＣがインビトロまたはインビボに分化することが示されている細胞型には、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、および脂肪細胞が含まれる。間葉は、中胚葉に由来し、造血組織と結合組織に分化する胚結合組織であり、MSＣは造血細胞に分化しない。間質細胞は、組織の機能細胞が存在する支持構造を形成する結合組織細胞である。これはMSＣの1つの機能に関する正確な説明であるが、この用語は組織の修復におけるMSＣの比較的最近発見された役割を伝えることに失敗している。そのような細胞を単離し、そのような細胞を増殖させそして分化させる方法は技術的および特許文献において知られている。例えば、米国特許出願公開 2007/0224171、2007/0054399、2009/0010895。それらの全体が参照により組み込まれる。
【０１７９】
脂肪幹細胞は、均質化脂肪組織の間質血管画分（SVF）から日常的に単離されている脂肪組織由来幹細胞（ADSＣ）としても知られている。他のタイプの間葉系幹細胞（MSC）と同様に、ADSCは、決定的な細胞マ−カ−がないために定義が困難なままである。脂肪由来幹細胞（ASC）は、自己複製特性と多能性分化を有する間葉系幹細胞源である。
【０１８０】
造血幹細胞は、すべての赤血球と白血球および血小板を生じさせる幹細胞として定義される。それらは一般にマ−カ−CD34 +の使用により単離される。一方では、造血幹細胞は、以下のマ−カ−プロフィ−ルを含む成体幹細胞である： CD34 + および/または CD34 +/Thy−1−HSC。 参照により本明細書に組み込まれたAndrews、R.G.と他.( 1990 ) J.Exp.Med.172 ( 1 ) : 355−358によって参照する。
【０１８１】
間葉系幹細胞（MSC）は、次のようなさまざまな細胞型に分化することができる多能性間質細胞として定義された：骨芽細胞（骨細胞）、軟骨細胞（軟骨細胞）、筋細胞（筋肉細胞）および脂肪細胞（脂肪細胞）。
【０１８２】
本明細書中で使用される場合、用語化学的に誘導されるか又は化学的に修飾された多能性幹細胞（iPSＣ）は、イソオキサゾ−ルもしくはその誘導体などの低分子化合物、またはイソオキサゾ−ル類似分子で処理されたiPSＣを含むことを意図する。
【０１８３】
『イソキサゾ−ル』はいくつかの天然物に含まれる化合物の一種、例えばイボテン酸、またはCOX−2阻害剤とフロロキサン（一酸化窒素供与体）が含まれる多くの薬である。イソオキサゾ−ルはピリジンの有用な同量体であり、パイを制御するために電位依存性ナトリウムチャネルを阻害する、テトラサイクリン系抗生物質誘導体の構築を可能にするとうつ病を治すことがわかっている。このクラスの化合物はSigma−Aldrichから入手が可能であり、それらを合成する方法は、例えば、 U.S. Pat. Nos. 5,059,614と8,318,951と国際公開 1999/002507明細書に記載されるように当該分野で公知である。構造的に、イソオキサゾ−ルは、1、2位に酸素原子と窒素原子が含まれる5員複素環式化合物である。その部分飽和類似体はイソキサゾリンと呼ばれて、完全飽和類似体はイソオキサゾリジンと呼ばれる。イソオキサゾ−ル様化合物の例には誘導体が含まれて、そのような非限定的な例がスルファメトキサゾ−ル、スルファイソキサゾ−ル、オキサシリン、シクロセリンおよびアシビシンを含む。イソオキサゾ−ル、イソオキサゾリンおよびイソオキサゾリジンは、有機合成において有用なシントンとして考えられ得る。イソオキサゾ−ルは、さまざまなクラスの医学的に重要な分子に効率的に変換される。例えば：アントラセン−9−イルメチレン−（3,4−ジメチルイソオキサゾ−ル5−イル）アミンは、エタノ−ル中でアントラセン−9−カルバルデヒドと5−アミノ−3,4−ジメチルイソオキサゾ−ルを反応させることにより高収率で合成することができる。一実施形態では、イソオキサゾ−ルのすべての誘導体が「イソオキサゾ−ル様化合物」または「類似化合物」と見なす。一実施形態では、5−アミノ−3−メチル−4−イソオキサゾ−ルカルボン酸セミカルバジドおよびチオセミカルバジドなどのイソオキサゾ−ル誘導体を合成することができる。5−アミノ−3−メチル−4−イソオキサゾ−ルカルボン酸ヒドラジドとイソシアネ−トおよびイソチオシアネ−トとの反応を設計および実施することもできる。一級アミノ基が含まれる化合物との求核付加反応で、イソシアネ−トは尿素誘導体を形成し、イソチオシアネ−トはチオ尿素誘導体を形成する。ヒドラジド末端基（NH 2）のみがこの反応に関与する。イソオキサゾ−ル環の5位のアミノ基は、反応条件下では反応しないままである。反応のメカニズムは、イソシアネ−トまたはイソチオシアネ−トの炭素原子上のヒドラジド基（−NH 2）中の窒素原子の求核攻撃にある。アミドイミノ−ル互変異性化を経て置換5−アミノ−3−メチル−4−イソオキサゾ−ルカルボン酸セミカルバジドおよびチオセミカルバジドを形成する中間体が出現する。一実施形態ではv、イソオキサゾ−ル誘導体の例は、R and Rが低級アルキルおよび/または低級アルコキシアルキル基である一般式の5−スルファニルアミド−イソオキサゾ−ルを含み得る。スルファニルアミド分子のN位にイソオキサゾ−ル環が結合したスルファニルアミド誘導体を生成することができる。例えば、イソオキサゾ−ル環の4位にあるスルファニルアミドラジカル。さらに、5−アミノ−イソオキサゾ−ルのスルファニリル誘導体、つまり5−スルファニルアミド−3−メチル−イソオキサゾ−ルもイソオキサゾ−ル誘導体と見なすことができる。一実施形態では、スルファニルアミド誘導体のイソキサゾ−ル環の3位と4位の両方が、アルキルおよび/または対応するアルコキシアルキル基で置換されて生成することができる。「イソオキサゾ−ル様化合物」または「類似の化合物」の非限定的な例は以下のアイテムが含まれる：1，2−オキサゾ−ル、4−ジュウテリオ−1，2オキサゾ−ル、1，2−オキサゾ−ル。 カリウム、ハイドロン； 1，2−オキサゾ−ル、1−オキシド−1，2−オキサゾ−ル−1−イウム、1，2−オキサゾ−ル；臭化水素酸塩、1，2−オキサゾ−ル；塩酸塩、エタン；1，2−オキサゾ−ル、カリウム。；1，2オキサゾ−ル； 水酸化物、1，2−オキサゾ−ル； 水和物 塩酸塩、エタン。 1，2−オキサゾ−ル、1，2−オキサゾ−ル。 シアネ−ト、2−オキシド−1，2−オキサゾ−ル−2−イウム、一酸化炭素。 クロム；1，2−オキサゾ−ル、エタン；1，2−オキサゾ−ル、エタン；1，2−オキサゾ−ル；プロパン、1，2−オキサゾ−ル2−イウム−2−スルホネ−ト、二塩化カルボニル；1，2−オキサゾ−ル、イソシアン酸；1、2−オキサゾ−ル、エトキシエタン; 1，2−オキサゾ−ル、2，2−ジメチルプロパン；エタン；1，2−オキサゾ−ル、エタン；メトキシエタン；1，2−オキサゾ−ル、エタン；2−メチルプロパン；1，2−オキサゾ−ル、1，2−オキサゾ−ル；尿素、エタノ−ル；1，2−オキサゾ−ル、炭酸；1，2−オキサゾ−ル、1，2−オキサゾ−ル−1−イウム−1−スルホン酸、1，2−オキサゾ−ル−2μm；ヨウ化物。
【０１８４】
「イソキサゾ−ル9」（ISX−9）は、インビトロとインビボ両方で成体神経幹細胞分化の低分子化合物誘導物質である（ Schneiderと他）。筋細胞エンハンサ−因子2（MEF2）依存性遺伝子発現に依存した、カルシウム活性化シグナル伝達経路を介して作用することを示した（Schneiderと他、Petrikと他）。この化合物は、Sigma−AldrichまたはStemCell Technologiesからも入手可能である。分子式はCuH N2O Sであり、化学名はN−シクロプロピル−5−チオフェン−2−イル−1、2−オキサゾ−ル−3−カルボキサミド。二次元構造は：
2019201631.tif 000002
【０１８５】
[イソキサゾ−ル1]（ISX−1）は以下の構造が持つ低分子化合物である：
2019201631.tif 000003
【０１８６】
本明細書に使用されるとおり、イソオキサゾ−ル様化合物や様化合物が本明細書に記載されたイソオキサゾ−ルと同じ機能特性を持つ薬剤や低分子化合物を意味する。非限定的な例は例えば：カルジオネオゲン；CDNG1/vuc230、CDNG2/vuc198、およびCDNG3/vuc247（Terriと他.（2011）Chem Biol.、12月 23 18（12）：1658−1668参照）、また、本明細書の下記に記載されるようなスルファイソオキサゾ−ルである、また、5−メチル−N−［4−（トリフルオロメチル）フェニル］ −1，2−オキサゾ−ル−4−カルボキサミドとしても知られるレフルノミド（アラバ）である。
【０１８７】
イソオキサゾ−ル化学物や派生物は、従って、以下の式を有する：
2019201631.tif 000004
ここに、RとR2両方は水素、または、Rは水素で、R2はC.−C. アルキル、Ｃ 2 −Ｃ 6シクロアルキル、Ｃ 2 −Ｃ 4。 アルケニル、C 2−C 6、アルキニル、ベンジル置換型または非置換型からなる群から選択される一種である、または、RとR2が互いに結合して、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、またはモルホリニルから選択される環を形成する；R2’、R3とR4は、単離的に水素、ハロゲン、C.−C. アルキル、Ｃ 3 −Ｃ 6シクロアルキル、置換もしくは非置換の芳香族やテロ芳香族環、シアノ、ニトロ、およびアシルからなる群から選択される一種である；Yは0、NHやSである。
【０１８８】
一方では、イソオキサゾ−ル化合物は式を有する：
2019201631.tif 000005
ここで、R1とR2はそれぞれC 1−C 4アルキル、フェニル、ベンジル、トリフルオロメチルまたはハロゲンから選択されるであり、R3は水素、ヒドロキシ、C 1−C 4アルキルやアルコキシから選択される。R4は、位置3や5にいる場合に、水素、トリフルオロメチル、C 1−C 4アルコキシ、C 1−C 4アルキル、C 1−C 4ヒドロキシアルキルから選択されるで、R 5は、水素やＣ 4 〜Ｃ 4アルキルから選択される、およびR 4とR 5は一緒ってテトラメチレン基を形成する。複素環に位置3や5にいるZは −N(R6)−CO−、−CO−N(R6)−、−N(R6)CO−N(R6)−、−CH(R6)−NH−CO−、 −NH−CO−CH(R6)から選択される。ここで、R＾が水素またはC 1−C 4アルキルから選択される。非限定的な例は例えば：5−（トリフルオロメチル）−3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（トリフルオロメチル）−3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（チオフェン−2−イル）が含まれる。イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、5、6、7、8−テトラヒドロ−4h−シクロヘプタ[d]イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、4、5、6、7−テトラヒドロ−ベンゾ[d]イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、 3−アミノ−5−メチルイソオキサゾ−ル、4−アミノ−n−（5−メチル−3−イソオキサゾリル）ベンゼンスルホンアミド、3−フェニル−イソオキサゾ−ル−5−ボロン酸ピナコ−ルエステル、5−フェニルイソオキサゾ−ル、1−フェニル−1−シクロペンタンカルボン酸、3−フェニル−ベンゾ[c]イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−メチル−3−フェニルイソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、3a、4、5、6、7、8、9、9a−オクタヒドロシクロオクタジ[d]］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（3−ニトロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−ニトロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−ヒドロキシ−5−アミノメチル−イソオキサゾ−ル、5−モルホリノメチル）イソオキサゾ−ル−3c aカルボン酸塩酸塩、5−（モルホリノメチル）イソオキサゾ−ル−3−カルバルデヒド、3−メチル−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、メチル5−（チオフェン−2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（メチルスルホニル）−5−（2−チエニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボニトリル、5−メチル−3−（2−ピロリジニル）イソオキサゾ−ル、3−メチル−5−（2−ピロリジニル）イソオキサゾ−ル、3−（1−メチル−1h−）ピラゾ−ル−4−イル）−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、3−（1メチル−1h−ピラゾ−ル−4−イル）−4,5−ジヒドロ−イソオキサゾ−ル−5カルボン酸、5−（4−メチルフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−メチル−3−フェニルイソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−メチルフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、5−メチル−3−（4−フェノキシフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、3−メチル−5−（4メチル−1、2、3−チアジアゾ−ル−5−イル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、3−メチル−5−（5−メチルイソオキサゾ−ル−3−イル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、メチル5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、メチル5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、5−メチルイソオキサゾ−ル、メチル5−（4−���ルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−4カルボキシレ−ト、メチル5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、メチル5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、メチル5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、5−（4−メトキシフェニル） ）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（3−メトキシ−フェニル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（2−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸d、5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（2−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル5−カルバルデヒド、5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（2−メトキシ−フェニル）−4，5−ジヒドロ−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、3−メトキシ−イソオキサゾ−ル5−カルボン酸、イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、イソオキサゾ−ル−4カルボン酸酸、イソオキサゾ−ル−5−カルボチオアミド、イソオキサゾ−ル−5塩化カルボニル、イソオキサゾ−ル−3−カルボニトリル、イソオキサゾ−ル−3カルバルデヒド、イソオキサゾ−ル−4−ボロン酸、イソオキサゾ−ル、5−シクロプロピル−4−［2−（メチルスルホニル）−4−（トリフルオロメチル）ベンゾイル］イソキサゾ−ル、6−（5−（チオフェン−2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキサミド）ヘキシル5−（（Z as、4s、バ−） ）−2−オキソヘキサヒドロ−1H−チエノ［3，4−ジイミダゾ−ル−4−イル）ペンタノエ−ト、イソカルボキサジド5−メチル−3イソオキサゾ−ル−カルボン酸2−ベンジルヒドラジド、5−イソブチルイソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、4−ヨ−ド−5−メチル−イソオキサゾ−ル、3，3'−イミノビス（n、n−ジメチルプロピルアミン）、3−（3−ヒドロキシフェニル）−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸メチルエステル、5−（4−ヒドロキシ−フェニル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（3−ヒドロキシフェニル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−ヒドロキシメチル）−3−メチルイソオキサゾ−ル、3−ヒドロキシ−5−メチルイソオキサゾ−ル、5−（1−ヒドロキシエチル）−3−（4−トリフルオロメチルフェニル）イソオキサゾ−ル、3a、4、5、6、7、7a−ヘキサヒドロ−ベンゾ[d]イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（2−フリル）イソオキサゾ−ル−3−カルバルデヒド、5−フラン−2−イル−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、6−フルオロ−3−（4−ピペリジニル）ベンズイソオキサゾ−ル、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−メタノ−ル、3−（2−フルオロ−フェニル）−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（3−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（2−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−5カルバルデヒド、5− （4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（3−フルオロ−4−メトキシ−フェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸���エチル5−（トリフルオロメチル）−3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、エチル−5−（トリブチルスタニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチル5−（チオフェン2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、5−エチル−イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−エチル−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸酸、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸エチル、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸エチル、5−（エチル） 2,3−ジヒドロベンゾ[b][1,4]ジオキシン−7−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチル3−（4−クロロフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、エチル5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチル3−（4−ブロモフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4カルボキシレ−ト、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−トエチル、5−アミノ−4−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸エチル、5−アミノ−4−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3エチル。カルボキシラ−ト、エチル6b−アセチル−2−（アセチルオキシ）−4 a、6 a−ジメチル2，3，4，4 a、4b、5，6，6 a、6b、9 a、10，10 a、10b、11−テトラデカヒドロ−1h
ナフト［2 '、1：4，5］インデノ［2，1 − d］イソオキサゾ−ル−9−カルボキシレ−ト、3，5−ジメチル−4−（トリブチルスタニル）イソオキサゾ−ル、5−（1，5−ジメチル1h−ピラゾ−ル）−（4−イル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（1、3−ジメチル−1h−ピラゾ−ル−4−イル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（1、5−ジメチル−1h−ピラゾ−ル−） 4−イル）−イソオキサゾ−ル、ジメチルイソオキサゾ−ル−4−ボロン酸ピナコ−ルエステル、3，5−ジメチルイソオキサゾ−ル、3−（ジメチルアミノ）−1−（2−ピリジル）−2−プロペン−1−オン、5−（3，5−ジフルオロフェニル） ）イソオキサゾ−ル、［2，6−ジクロロ−4−（トリフルオロメチル）フェニル］ヒドラジン、5−（2，5−ジクロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、ダナゾ−ル、3−（4−クロロフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−プロピオン酸、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（4−）クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルボキシリル酸、3−（3−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5カルボン酸、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3カルボキシアルデヒド、3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5カルバルデヒド、3−（3−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（2−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（クロロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、3−（クロロメチル）−5−（2−フリル）イソオキサゾ−ル、4−クロロメチル−3，5−ジメチルイソオキサゾ−ル、5−（クロロメチル）−3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（3−クロロ−4−メトキシ−フェニル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−クロロ−4−フルオロベンズアルデヒド、3−（5−クロロ−2、4−ジメトキシ−）フェニル）4、5−ジヒドロ−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−tert−ブチル−4、5、6、7−テトラヒドロ−ベンゾ[d]イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（4−ブロモフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−プロピオン酸、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸ヒドラジド、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸酸、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、3−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル5−カルボキシアルデヒド、5−（ 4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（3−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（ブロモメチル）−3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、4−（ブロモメチル）イソオキサゾ−ル、5−ブロモメチル）−3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（ブロモメチル）−3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（ブロモメチル）−3−（4−ブロモフェニル��イソオキサゾ−ル、6−ブロモ−3メチルベンゾ［d］イソオキサゾ−ル、 5−ブロモ−3−メチルベンゾ[d]イソオキサゾ−ル、4−ブロモ−5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−ブロモイソオキサゾ−ル、3−ブロモ−5−（2−ヒドロキシエチル）イソオキサゾ−ル、4−ブロモ5−（4）−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−ブロモ−5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、4−ブロモ−5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、4−ブロモ5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、6−ブロモ−ベンゾ[d]イソオキサゾ−ル3−カルボン酸、ベンゾ[d]イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、 3−アミノ−5−メチルイソオキサゾ−ル、5−アミノ−3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−アミノイソオキサゾ−ル、3−アミノ−5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アミノ−3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アミノ4−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、3−アミノ−5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アセチル−3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アセチル−3（3−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−メチル−5−[（2 S）−1−メチル−2ピロリジニル]イソオキサゾ−ル塩酸塩、7−メトキシ−5−メチル4、5−ジヒドロナフト[2、1−d]イソオキサゾ−ル、5−メチル−3−フェニルイソオキサゾ−ル−4−カルボン酸メチルアミド、5−メチル−3−フェニル−イソキサゾ−ル−4−カルボチオ酸メチルアミド、5−メチル−3−フェニル−4−（1h−ピラゾ−ル−5−イル）イソオキサゾ−ル、5−ベンジル3−フラン−2−イル−2−フェニル−テトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル、4、6−ジオン、5−ベンジル−3−[4−（ジメチルアミノ）フェニル]−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4]−d］イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−3−（5−br−2−ホ−フェニル）−2−ph−テトラヒドロ−ピロロ（3、4 d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、5−ベンジル−3−（4−ニトロ−ph）−2−ph−ジヒドロ−2h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−3−（4）−メトキシ−フェニル）−2−ph−テトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、5−ベンジル−3−（4−フルオロフェニル）−2−2−メチルフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−3−（3−ニトロ−ph）−2−フェニル−テトラヒドロピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4、 6−ジオン、5−ベンジル−2−ph−3−（2−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）ジオン、5−ベンジル−2−ph−3−（2−ph−ビニル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−2−（4−クロロフェニル）−3−（2−チエニル）ジヒドロ−2h−ピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−2,3−ジフェニルジヒドロ2h−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−2（4 cl−ph）3−（2）−フリル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）ジオン、5−ベンジル−2（4−cl−ph）−3−（4−f−ph）ジヒドロ−2hピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h���5h）ジオン、5−（p−トリル）イソオキサゾ−ル、5−（4−メチルフェニル）−3−（4−ニトロフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、5−（4−メトキシフェニル）−2−フェニル−3−（4−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ[3、 4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−（4−メトキシフェニル）−2−フェニル−3−（3−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4、 6（3h、5h）−ジオン、5−（4−メトキシph）−2，3−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−（ 4−フルオロフェニル）−3−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジオン、5−（4−フルオロフェニル）−2−（2−メチルフェニル）−3−（4−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）ジオン、5−（4−エトキシフェニル）−3−（4−ニトロフェニル）−2フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジオン、5−（4−エトキシフェニル）−3−（4−フルオロフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジオン5−（4−エトキシフェニル）−2−メチル−3−（4−ニトロフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−（4エトキシ）−ph）−2−ph−3−チオフェン−2−イル−4h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、5−（4−cl−ph）−3−（3−ニトロ）−ph）−2−フェニルテトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、5−（4−ブロモフェニル）−3−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4]−d］イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、5−（4ブロモフェニル）−3−（2−フリル）−2−（2−メチルフェニル）ジヒドロ−2hピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、 5h）−ジオン、5−（4−ブロモフェニル）−2−フェニル−3−（2−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−（4−br−ph）2−ph−3−（2−phビニル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）ジオン、5−（2−cl−ph）−3−（4−ジメチルアミノ−ph）2−0−トリル−4h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、5−（2−クロロフェニル）−3−[4−（ジメチルアミノ）フェニル]−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−（2−クロロフェニル）−3−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、4−（（3−（2−cl−ph）−5−メチルイソオキサゾ−ル−4−カルボニル）−アミノ）−安息香酸エチルエステル、4、5、6、6a−テトラヒドロ−3ah−シクロペンタ[d]イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−フェニル−3a、6a−ジヒドロチエノ[2,3−d]イソオキサゾ−ル4,4−ジオキシド、3−メチル−5−（3−フェニルプロピル）イソオキサゾ−ル、3−メチル−4ニトロ−5−[（e）−2−フェニルエテニル]イソキサゾ−ル、3−メチル−4、5、8、9テトラヒドロシクロオクタ（d）イソオキサゾ−ル、3−メチル−4、5、5a、6a、7、8ヘキサヒドロオキシレノ（2 '、3：5，6）シクロオクタ（1，2 − d）イソオキサゾ−ル、3−メチル−3 a、4，5，8，9，9 a−ヘキサヒドロシクロオクタ（d）イソキサゾ−ル、3−フラン−2−イル−2−フェニル−5−p−トリル−テトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、3−クロロ−4、5−ジヒドロ（1）−ベンゾチエピノ（5、4−c）イソオキサゾ−ル、3−［4−（ジメチルアミノ）フェニル］ −5−（4−メトキシフェニル）−2−（2−メチルフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（5−br−2−ho−フェニル）−2、5ジフェニル−テトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、3−（5−br−2−ho−）ph）−5−（2−cl−ph）−2−ph−テトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、3−（4−メオ−フェニル）−5−フェニル−2−0−トリルテトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、3−（4−フルオロフェニル）−5−（4−ニトロフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4 d]］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（4−フルオロフェニル）−2−（4−メチルフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h） 、5h）−ジオン、3−（4−ジメチルアミノ−ph）−5−ph 2−o−トリル−4h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、3−（4−フルオロフェニル）−5−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2hピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、3−（4−br−ph）−2−ph 5−（ 2−トリフルオロメチル−ph）−4h−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4,6ジオン、3−（3−ニトロ−フェニル）−2,5−ジフェニル−テトラヒドロ−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、3−（3−br−フェニル）−2、5ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）ジオン、3−（3−br−ph）−5−（2−meo−ph）−2−0−トリル−テト
ラヒドロピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、3−（2−フリル）−5−[4−（4モルホリニル） ）フェニル］ −2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（2−フリル）−2−（2 − me − ph）−5−phジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（2−フリル）−2，5−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（2 − cl−フェニル）−5−メチル−イソオキサゾ−ル−4カルボン酸（2，5−ジクロロ−フェニル）−アミド、3−（2 − cl）−ph）−5−イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸（4、5−ジヒドロ−チアゾ−ル−2−イル）アミド、3−（2−クロロ−フェニル）−5−メチル−イソオキサゾ−ル−4カルボン酸シアノメチル−アミド、3−（2，4ジクロロフェニル）−5−（4−メト）キシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2hピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、3−（2、4−di−cl−ph）2、5−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、3−（2、2−ジクロロ−ビニル）−5−フェニル−イソオキサゾ−ル、3、5−ジフェニル−イソオキサゾ−ル、3、5−ジメチル−4−（1−ピロリジニルスルホニル）イソオキサゾ−ル、3（4−ジメチルアミノ−ph）−5−（4−エト−ph）2−o−トリル−4h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−2−（4−cl−ph）5−ph−3−（2−チエニル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）ジオン、2−（4−） cl−ph）−5−（3−meo−ph）−3−（3−ニトロ−ph）−4h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、2−（4−cl−） ph）−3−（4−meo−ph）−5−p−トリル−テトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、2−（4−クロロフェニル）−5−（4−メチルフェニル）−3−（2−チエニル）ジヒドロ−2時間ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3時間、5） h）−ジオン、2−（4
クロロフェニル）−3−[4−（ジメチルアミノ）フェニル]−5フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）ジオン、2−（4−クロロフェニル）−3−（ 4−フルオロフェニル）−5−（4ニトロフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、2−（4−クロロフェニル）−3−（2−チエニル） ）−5−［3（トリフルオロメチル）フェニル］ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、2−（4−クロロフェニル）−3−（2，4）
ジクロロフェニル）−5−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、2、3−di−ph−5−（3−（tri−f−me）） ph）ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、ダナゾ−ル、およびn−シクロプロピル−5−（チオフェン−2−イル）イソキサゾ−ル−3カルボキサミド。 さらなる態様では、イソオキサゾ−ル化合物はダナゾ−ルまたはn−シクロプロピル−5−（チオフェン−2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキサミドである、また、一般式（1）を有するイソオキサゾ−ル化合物の化合物である：
2019201631.tif 000006
ここで、AはGで置換されていてもよい複素環基やフェニルであり、Gはハロゲン、C 1−C 6アルキル、および任意に置換されたフェニルである；Bはハロゲンで置換されたフェニルや複素環基、C 1−C 6アルキルである；Rは水素、またはC 1−C 6アルキル。
【０１８９】
ジビノステ−ト（GIV）は、ヒストンデアセチラ−ゼの経口的に生物学的に利用可能な、潜在的な抗炎症性、抗血管新生性、および抗腫瘍形成可能なヒドロキシメ−ト( HDAC ) 阻害剤である。ジビノスタットは、クラスIとクラスIIのHDACを阻害することであり、高度にアセチル化ヒストンの蓄積をもたらすあと、クロマチンリモデリングの誘導と遺伝子発現パタ−ンの変化を見つけた。低農薬濃度で、この薬剤は腫瘍壊死因子（TNF−）、インタ−ロイキン−1（IL−1）、IL−6およびインタ−フェロン−ガンマような炎症促進性サイトカインの産生を阻害する。ジビノスタットは内因性アポト−シス経路を活性化することも示しながら、肝細胞癌細胞および白血病細胞におけるアポト−シスを誘導する。また、この薬剤は抗血管新生活性も示して、骨髄間質細胞によるIL−6や血管内皮細胞増殖因子（VEGF）などの血管新生因子の産生を抑制する。
【０１９０】
Rho−関連タンパク質キナ−ゼ（ROCK）意味Rho−関連キナ−ゼ（ROCK）阻害剤がAGC（PKA/PKG/PKC）ファミリ−のセリン−トレオニンキナ−ゼに属するであり、主に細胞骨格に作用することによって細胞の形と動きを調節することに関与している。そのような非限定的な例にが、チアゾビビンまたはY27632（Stemcell Technologiesから購入できる）、SR3677（tocris.comから購入できる）とGSK429286（tocris.comから購入できる）を含める。
【０１９１】
TGF−β−1型受容体阻害剤（アクチビンA受容体II型様キナ−ゼ意味）はシグナル伝達リガンドのTGFβス−パ−ファミリ−のための膜結合型受容体タンパク質の阻害剤である。TGFBR1はそのヒト遺伝子。そのような非限定的な例にが、SB431542とA8301（tocris.comとwww.esibio.comから購入できる）、LY2157299（www.selleckchem.comから購入できる）、またLY2109761（www.selleckchem.comから購入できる）が含まれる。
【０１９２】
DNAメチルトランスフェラ−ゼ阻害剤は高メチル化を抑制する能力を持った低分子化合物または他の薬剤であり、試験管内および生体内実験室モデルで抑制遺伝子の発現を回復し抗腫瘍効果を発揮することもできる。Goffin and Eisenhauer（2002）Ann.Oncol .11月13日（11）：1699 16716。そのような非限定的な例の一つはN−フタロイル−L−トリプトファン（C19H14N204、RG108、Sigma−Aldrichの商品名で販売されている）。他の例が5’−アザシチジン、5−アザシチジン、メチルトランスフェラ−ゼ1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばMG98（Amato ( 2007 ) Clin.ゲントリン癌、12月、5 ( 7 ): 422−426）と1−（β−リボフラノシル）−2（1H）−ピリミジノン（シチジンのヌクレオシド類似体、ゼブラリンの商品名で販売されている（Abcam（登録商標））が含まれる。
【０１９３】
DNA低メチル化は、通常よりも低いレベルのDNAメチル化を意味する。
【０１９４】
DNAメチル化のレベルを決定する方法は当技術分野において公知であり、そのいくつかは本明細書に記載されている。
【０１９５】
スルイソキサゾ−ルは、オキサゾ−ル置換基を有するスルホンアミド抗菌剤であり、広範囲のグラム陰性菌およびグラム陽性菌に対して抗生物質活性を示す。このクラスの化合物はSigma−Aldrichから入手可能であり、それらを合成する方法が、例えば、U.S.Pat.No.2、721、200に記載されているように、当該分野で公知である。スルイソキサゾ−ルの非限定的な例がFDAに承認されたアゾガントリシン、エリスロマイシンエチルサクシネ−トとスルファキサゾ−ルアセチル、エリゾ−ル、ガントリシン（SULFISOXAZOLE有効成分と）、ガントリシン（ SULFISOXAZOLE ACETYL有効成分と）、小児科ガントリシン、イロソンスルファ、LIPO ガントリシン、ペディアゾ−ル、ソゾ−ル、ソキサゾ−ル、ソキサゾ−ル、スルフィソキサゾ−ル、スルフィソキサゾ−ルジオラミン、およびスルソキシンが含まれる。（Drugs ＠ FDA: accessdata.fda.orgのウェブサイトでFDA承認医薬品）
【０１９６】
ダナゾ−ル（17a−エチニル−17β−ヒドロキシアンドロスト−4−エン−[2、3−d]イソオキサゾ−ルとしても知られています）は、子宮内膜症の治療に主に使用される合成ステロイドである。この化合物が市販されており、様々な事業者によって製造されている。
【０１９７】
本明細書で使用される「単離された」という用語は、他の材料を実質的に含まない分子または生物学的もしくは細胞性材料を指す。例えば、70％、または80％、または85％、または90％、または95％、または98％を超える。一態様では、「単離された」という用語は、それぞれ他のDNA、RNA、miRNA、エキソソ−ムおよび微小胞、タンパク質またはポリペプチド、細胞または細胞の細胞小器官、または組織または臓器から分離されていた核酸、DNA、RNA ,miRNA というエキソソ−ムおよび微小胞、タンパク質またはポリペプチド、細胞または細胞の細胞小器官、または組織や臓器を指す。それらは天然源に存在し、その天然または天然状態で存在する場合には達成不可能な結果を達成するための材料の操作を可能にする。例えば、突然変異による組換え複製または操作のこと。「単離された」という用語は、組換えDNA技術、化学的前駆体、その他の化学物質で化学的に合成された場合よって製造された時の、その細胞材料、ウイルス材料、または培地を実質的に含まない核酸、またはペプチドを指す。さらに、「単離された核酸」は、断片として天然には存在せず、天然の状態では見出されないであろう核酸断片を含むことを意味する。「単離された」という用語はまた、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指すために本明細書において使用される以上、精製ポリペプチドと組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。例えば、70％、80％、85％、90％、95％、98％を超える純度のこと。「単離された」という用語はまた、他の細胞、エキソソ−ムまたは微小胞、miRNAから分離された細胞、エキソソ−ムもしくはMicroベシクル、miRNAと組織を指して、培養および操作された細胞または組織およびそれらから製造または単離された製品の両方を包含することを意味する。
【０１９８】
「表現型」という用語は、測定可能な個体の形質または特徴と、集団内の個体のサブセットにおいてのみ発現される個体の形質または特徴の説明を指す。一方では、個体の表現型は、単一細胞、実質的に均一な細胞集団、分化細胞集団、または細胞集団からなる組織の表現型が含まれる。
【０１９９】
薬学的に許容される担体（または媒体）という用語は、生物学的に適合する担体または培地という用語と互換的に使用されて得ったり、細胞、および治療上投与される他の薬剤と適合性があるだけではない試薬、細胞、化合物、材料、組成物、および/または剤形を指し、過度の毒性、刺激、アレルギ−反応、または合理的な利益/危険率に見合った他の合併症を伴わずに、人および動物の組織と接触した使用に適している、健全な医学的判断の範囲内である。本発明における使用に適した薬学的に許容される担体には、液体、半固体（例えば、ゲル）および固体材料（例えば、細胞足場およびマトリックス、チュ−ブシ−ト、ならびに当該分野で公知でありそして本明細書中により詳細に記載されるような他のそのような材料）が含まれる。これらの半固体および固体材料は、体内での分解に耐えるように設計されている（非生分解性）か、または体内で分解するように設計されている（生分解性、生侵食性）。生分解性材料はさらに、生体吸収性または生体吸収性であり得る。例えば、それは溶解し吸収されるかもしれない
体液（水溶性インプラントがその一例であり）、他の物質への変換、または自然な経路による分解と排除のいずれかによって、劣化して最終的には身体から排除される。
【０２００】
表現型および/または遺伝子型が同一（クロ−ン）または非同一である、複数の細胞、エキソソ−ムまたは微小胞、またはmiRNAの集合を意図している細胞集団のひとつである。集団は、本明細書中に記載されるように、精製され、高度に精製され、実質的に均質または不均質であり得る。
【０２０１】
用語「増殖」は、細胞または細胞集団の表現型を増殖または変化させることを意味する。「成長する」という用語は、支持培地、栄養素、成長因子、支持細胞、または所望の数の細胞もしくは細胞型を得るのに必要な任意の化学的もしくは生物学的化合物の存在下での細胞の増殖を指す。一実施形態では、細胞の増殖は組織の再生をもたらす。さらに別の実施形態では、組織は心臓前駆細胞または心臓細胞からなる。
【０２０２】
「有効量」という用語は、本明細書に記載の組成物などの試薬または組成物、細胞集団または他の病原体の濃度または量を指す。その濃度または量は、試験管内また生体内で、細胞増殖や分化など、意図した結果を得るのに効果的であり、本明細書に記載の状態の治療用のこともある。当然のことながら、投与される細胞の数は、治療される障害の詳細（治療されるサイズまたは総体積/表面積を含むがこれらに限定されない）、医薬生物学者によく知られている他の要因の中でも、投与部位と治療される領域の位置との近さに応じて変わる。
【０２０３】
有効期間（または時間）および有効条件という用語は、薬剤または組成物がその意図した結果を達成するために必要または好ましい、期間または他の制御可能な条件（例えば、インビトロ法の場合は温度、湿度）を指す。例えば：細胞の所定の細胞型への分化または脱分化。
【０２０４】
「対象」、「個体」または「患者」は、本明細書では互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物は、ネズミ、ラット、サル、ウシ、イヌ、ネコ、ヒト、家畜、スポ−ツ動物およびペットを含むが、これらに限定されない。
【０２０５】
「実質的に均質」とは、細胞の約50％、または 60 % 、70％、75％、80％、85％、90％または95％超が同一または類似の表現型のものである細胞の集団をいう。表現型は、予め選択された細胞表面マ−カ−または他のマ−カ−によって決定され得る。
【０２０６】
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」、「治療」などは、所望の薬理学的および/または生理学的効果を得ることを意味するために本明細書で使用される。効果は、完全にまたは部分的に疾患またはその徴候または症状を予防するという点で予防することができ、および/または障害に起因する障害および/または有害作用の部分的もしくは完全な治癒という点で治療的であり得る。「治療」の例としては、例えば：障害の素因となる可能性があるが、まだそれを有すると診断されていない、障害が対象において発生するのを防止すること； 障害を抑える、例えばその開発を阻止する；および/または障害（例えば心不整脈）の症状を緩和または改善する。当業者によって理解されるように、「治療」は、病理に関連する症状の全身的改善および/または胸痛などの症状の発症の遅延を含み得る。「治療」の臨床的および亜臨床的証拠は、病理学、個人および治療によって異なる。
【０２０７】
細胞、エキソソ−ムまたは微小胞、mirNA、治療薬または他の薬剤およびそれらを含む組成物の「投与」または「送達」は、治療の過程を通して継続的、断続的、または一回的投与で達成することができる。最も有効な投与手段および投与量を決定する方法は当業者に知られており、治療に使用される組成物、治療の目的、治療される標的細胞、および治療される対象によって変わるであろう。単回投与または複数回投与は、治療する医師によって、または動物の場合には治療する獣医によって選択される用量レベルおよびパタ−ンで実施することができる。適切な剤形および剤を投与する方法は当技術分野において公知である。投与経路も決定することができ、最も有効な投与経路を決定する方法は当業者に知られている。また、そのそれらの方法は治療に使用される組成、治療の目的、治療される被験者の健康状態や病期、そして標的となる細胞や組織によって異なる。投与経路の非限定的な例としては、経口投与、腹腔内投与、注入投与、経鼻投与、吸入、注射、および局所投与が挙げられる。
【０２０８】
［説明的な実施形態］
誘導多能性幹細胞
本開示は、DNA低メチル化を特徴とする人工多能性幹細胞（iPSＣ）を提供する。一方では、細胞はさらに、 Gai、mir−133、mir−762、CCL7、CXCR2、CXC5 、内在性膜タンパク質2Aおよび ephrin A3.Nkx 2.5、ISL1、GATA4、AMHC、Sarcomeric actin、Gai、mir−133、mir−762、CCL7、CXCR2、CXC5 またエフリンA3の群から選択される1つ以上の心臓遺伝子またはマ−カ−の過剰発現によって特徴付けられる。また、一方では、下の細胞は1つ以上の多能性遺伝子またはマ−カ−を発現している。そのような非限定的な例には、1つ以上のmir−290 295クラスタ−、let−7ファミリ−、M axおよび1つ以上のDNAメチルトランスフェラ−ゼ遺伝子Dnmt1、Dnmt3bが含まれる。一態様では、1つまたは複数の心臓遺伝子またはマ−カ−はGaiである。一態様において、一つ以上の心臓遺伝子またはマ−カ−は、対照細胞の少なくとも1.5倍、または2倍、3倍過剰発現される。また、細胞は、 miR−290クラスタ−、 miR−574−5P、let−7 family、Dnmtl、Dnmt3bおよびMax の群から選択される1つ以上の他の心臓遺伝子またはマ−カ−の低発現によって特徴付けられる。一方では、1つ以上の心臓遺伝子またはマ−カ−が、対照細胞のそれの少なくとも1.5倍、2倍、または3倍発現されないかまたは過少発現される。遺伝子およびマ−カ−を同定および定量するための方法は当技術分野において公知であり、そして周知の方法を補足するために本明細書中に記載される。
【０２０９】
細胞は哺乳動物などの任意の動物種由来であり得る。例えば：ウマ、ネズミ、ウシ、イヌ、ネコ、またはヒトの患者。
【０２１０】
iPS細胞は任意の適切な親細胞に由来する。そのような非限定的な例としては、骨髄細胞、筋芽細胞、皮膚線維芽細胞、臍帯血細胞、成体末梢血、心臓前駆細胞、小幼若幹細胞（SJST）、骨髄間質細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、単核球からなる群から選択される細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１１】
これらの親細胞型からiPSCを誘導または調製する方法は当技術分野において公知である。一方では、iPSCは、親細胞を有効量のDNAメチルトランスフェラ−ゼ阻害剤と接触させてOct4を上方制御することを含む方法によって作製された。非−DNAメチルトランスフェラ−ゼ阻害剤の限定的な例としては、5’−アザシチジン、5−アザ−2’−デオキシシチジン、MG98、ゼブラリンおよびRG108である。また、一方では、iPS細胞は、外来遺伝子の親細胞への挿入を排除する方法によって作製された。
【０２１２】
なお、さらなる実施形態では、親細胞は、細胞を電気刺激で前処理することによって調製された前駆細胞（例えば心臓前駆細胞）である。一方では、親細胞は、本明細書中に記載されるように、 Sca 1ならびに多能性および心臓遺伝子を発現する幹細胞である。続いて細胞を、本明細書に記載のイソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物と接触させる。
【０２１３】
一方では、親細胞は、iPSCに改変またはプログラムされていない小さな幼若幹細胞または若い幹細胞である。その場合に、SJSTはイソオキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物で処理され、診断的、研究的または治療的に使用される。また、一方では、細胞を有効量の本明細書に記載のイソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物と接触させることにより、未成熟または前駆細胞を心臓前駆体表現型に向かわせること。例えばSJST細胞、循環血液または心臓由来の幹細胞。また、親細胞は、本明細書中に記載されるような若い細胞または幼若細胞の特徴を発現しない細胞と比較して、miR−195の低発現によって同定され得る幼若または若年幹細胞である。さらに、親細胞は、本明細書に記載の若い細胞または幼若細胞の特徴を発現しない細胞と比較してmiR−29b、miR−205、miR−378、およびmiR−542−3pから選択される1つまたは複数のマ−カ−の低発現によってさらに特徴付けられる。あるいは、親細胞は有効量の電気刺激で前処理された。一方では、再生を誘導するための最大の薬物接触のための治療の前に、イソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物を虚血性心臓に治療的に注射し、そこではBMSＣ、骨格筋芽細胞、末梢血由来内皮前駆細胞（EPC）、常在心臓幹細胞/前駆細胞および線維芽細胞を治療の前に動員する ( Konoplyannikov M I、Haider K H、Lai V K、Ahmed RP、Jiang S、Ashraf M 心筋修復のための複数のサイトカインの生体外送達による多様なシグナル伝達経路の活性化 Stem Cells Dev.2013 Jan.15 ; 22 ( 2 ) : 204−15 )。
【０２１４】
本明細書に記載の化学修飾iPS細胞は、細胞を有効量のイソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物と接触させることによって調製される。例えば、約0．3〜約30μMの群から選択される量；約0.5から約25μM；約12から約25μMおよび約0.5μMから約20μM。図１４Ｃも参照する。
【０２１５】
iPS細胞を調製する方法は当技術分野において公知であるが、出願人は、親細胞を有効量のDNAメチルトランスフェラ−ゼ阻害剤、例えば5’−アザシチジンまたはRG108（Sigma−Aldrich）と接触させることを含む方法によって作製されたiPS細胞がOct4の上方制御に対して特に有用であると判断した。一方では、iPS細胞は、親細胞への外因性遺伝子の挿入を排除する方法によってさらに調製されて、それによって、臨床用途のための細胞の安全性を高める。また、細胞は、遺伝子および当該分野で公知の他の因子の挿入によってiPS細胞に改変される。
【０２１６】
本開示はまた、化学修飾細胞を培養して本明細書に記載の細胞を増殖させることによって、本明細書に記載の培養細胞の集団を提供する。一方では、人口は実質的に均質です。例えば、表現型において少なくとも70％同一、75％同一、80％同一、85％同一、90％同一、あるいは表現型において少なくとも95％同一、98％同一、あるいは細胞のクロ−ン集団である。一方では、その集団はクロ−ンの集団である。一方では、細胞は、心臓細胞など特定の細胞型への分化を促進する条件下で培養される。これらの培養条件は当技術分野において公知である。
【０２１７】
細胞および細胞集団は、例えば検出可能な標識または外因性ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドをさらに含むなど、治療または研究用途にさらに修飾することができる。治療的使用のための方法および適切なポリヌクレオチドは Durraniと他 .( 2010 ) Regen.Med.5 ( 6 ) : 919−932 に記載される。
【０２１８】
［iPS細胞の調製方法］
本開示はまた、幹細胞を有効量のイソオキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物と接触させることを含む、幹細胞から心臓系統細胞を調製する方法を提供する。この方法に有用な幹細胞としては、以下が限定されないで挙げられる：骨髄細胞、骨髄間質細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、筋芽細胞、皮膚線維芽細胞、臍帯血細胞、成人末梢血由来のiPS細胞などの1つまたは複数のiPS細胞 血液、SJSC、心臓前駆細胞、または単核細胞。これらの親細胞型からiPSCを誘導または調製する方法は当技術分野において公知である。この方法によって調製された細胞は、1つ以上の心臓遺伝子またはマ−カ−を過剰発現することを特徴とする。例えば：Nkx−2.5、ISL1、Tbx−5、GATA4、AMHC、Sarcomeric actin、Gai、miR−133、miR−762、CCL7、CXCR2、CXC5、内在性膜タンパク質2A、またはエフリンA3。また、これらの細胞が、イソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物と接触または暴露されていない細胞などの対照細胞と比較して、1つ以上の心臓遺伝子またはマ−カ−を過少発現する。例えば： miR−290 − 295 cluster、let−7 family、Dnmt1、Dnmt3b、とMaxである。一方では、過剰発現または過少発現は、対照細胞のそれの少なくとも1.5倍過剰または過少である。
【０２１９】
一方では、細胞は、iPSCに改変またはプログラムされていない小型の幼若幹細胞（SJSC）である。その場合に、SJSTは、イソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物で処理され、そして診断的に、研究においてまたは治療的に使用される。また、本開示は、細胞を本明細書に記載の有効量のイソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物と接触させることによって未熟細胞または前駆細胞（循環血液または心臓由来の幹細胞の集団を含むSJST細胞など）を心臓前駆表現型に向かわせる方法を提供する。有効量の電気刺激を、処置を必要とする細胞または組織に、単独で、またはイソオキサゾ−ルもしくはイソオキサゾ−ル類似化合物と組み合わせて適用することができる。また、親細胞は、miR−195の発現が低いことを特徴とし、有効量の電気刺激を加えることによって前もって調整されていてもいなくてもよいので、化学的修飾のために選択される。
【０２２０】
特定の態様では、この方法は、細胞を有効量のイソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物と少なくとも3日間、または4日間、5日間、6日間、7日間接触させるて、約10％から約30％、あるいは20％のノックアウト血清代替物（KSR； Invitrogen、USA）を補ったDMEM F12中；約0．05mMから約0．2mM、または約0．1mMのMEM非必須アミノ酸溶液（Invitrogen、カリフォルニア州、米国）中；約0．1mMから約0．3mMまたは約0．2mMのL−グルタミン（Invitrogen、米国）中；約0．05mMから約0．2mM、あるいは約0．1mMのβ−メルカプトエタノ−ル（Invitrogen、CA、USA）中；約750U/ml〜約1250U/ml、あるいは約1000U/mlのLIF（ミリポア）中；そして有効量の0．5％ペニシリンおよびストレプトマイシンがあることを含む。次いで細胞を5日間薬物なしで培地中に保持する。そうでなければ培地は、細胞数の増加のために毎日交換され、培地のpHは変化し、細胞生存および遺伝子発現に影響を与える。有効量のイソオキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物は、約0.3〜約30μM、約0.5〜約25μM 、約 12〜約25μM、約 0.5μM〜約20μMを含むか。本明細書中で使用される場合、イソオキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似体は、本明細書中に記載されるような化合物のクラスを意図する。
【０２２１】
別の特定の態様では、この方法は、インスリンを含まないRPMI F12中で少なくとも3日間、または4日間、5日間、6日間、あるいは7日間、細胞を有効量のイソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物と接触させることを含む。有効量のイソオキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物は、約0.3〜約30μM、約0.5〜約25μM 、約 12〜約25μM、約 0.5μM〜約20μMを含む。もう1つの特定の側面では、イソオキサゾ−ルは、本明細書の上記に記載されているようにISX−9である。本明細書中で使用される場合、イソオキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似体は、上記のような化合物のクラスを意図する。
【０２２２】
次に、細胞をさらに約7〜10日間インスリンと共にRPMI F12中に保ち、心筋細胞分化を生じさせる。次いで、細胞を約10日間EGM−2培地 ( Lonza、Lonza Walkersville Inc .、Walkerswille Md.21793 0127 ) 中に保ち、内皮細胞分化を生じさせる。細胞をTGFB（2 ng/ml）およびPDGFBB ( long/ml、R & D Systems、Inc、Minneapolis、Minn.55413 ) 中に約10日間保ち、平滑筋細胞分化を生じさせる。
【０２２３】
遺伝子およびマ−カ−を同定および定量するための方法は当技術分野において公知であり、そして周知の方法を補足するために本明細書中に記載される。
【０２２４】
本開示の方法が分子的、臨床的および他の技術によって有効であるかどうかを決定することができる。一方では、 Nkx2.5、GATA4、Tbx5、ISL−1とMef2c upregulationが、連絡後3日後に開始され、これらのマ−カ−の発現は、必要に応じて、適用組織化学および/またはPＣRによって決定することができる。追加の系統識別マ−カ−を図14Ｃに示す。細胞をqPCRによる7日間処理についてさらに評価することができる。免疫蛍光染色はまた、転写因子（Nkx2.5、GATA4およびISL−1）が7日間の低分子化合物処理でhiPSCにおいて高度に発現されることを示した。FACSによるこれらの低分子化合物処理細胞中のNkx2.5陽性細胞の純度は96.5±2.5％細胞であった。そのNkx2を確立する。 5 +細胞は心血管系の前駆細胞であり、出願人はこれらのNkx2であることを見出した。 5 +細胞は多能性であり、3つの心血管系譜すべてに直接分化した。それらは、95.2 + 2.1％CMS（TnT +）、90.3 + 2.5％EC（CD31 +）および92.3 + 1.8％SMC（Q−SMA +）の割合で、特異的誘導シグナル伝達分子を含まない基礎分化条件のCM、ECおよびSMCを含む 。さらに、本出願人は、分化したEＣは一次内皮細胞（EＣS）と同様の表現型および機能を示すと判断した。（図14A−14H）
【０２２５】
細胞は哺乳動物などの任意の動物種由来であり得る、例えばウマ、ネズミ、ウシ、イヌ、ネコ、またはヒトの患者。細胞は、治療される動物または患者にとって自己由来または同種異系であり得る。
【０２２６】
接触は試験管内で行うことができるし、（例えば、本明細書に記載の組織培養皿またはプレ−ト中で）または生体内で有効量のイソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物を細胞培養物に投与することによる、または生体内で、そのような治療を必要とする患者または対象に有効量の化合物、あるいは化合物およびiPS細胞を投与することによる。全身的または局所的に投与する方法は、以下に記載されている。化合物および/または細胞は、使用を容易にするために薬学的に許容される担体と組み合わせることができる。この治療は、一態様では、そのような治療を必要とする組織への有効量の電気刺激の投与と組み合わせることができる。電気刺激は、イソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物の投与の前に、それと同時にまたはその後に投与することができる。
【０２２７】
一方では、化合物と接触した幹細胞はiPS細胞である。最終分化細胞からiPS細胞を作製する方法は当技術分野において公知である。例えば、親細胞を有効量のDNAメチルトランスフェラ−ゼ阻害剤（ RG108 ( Sigma−Aldrich ) など）と接触させてOct4を上方制御することを含む方法による。また、iPS細胞は、外因性遺伝子の親細胞への挿入を排除する方法によって作製される。
【０２２８】
本開示はまた、細胞を単離することをさらに含むことによって本明細書に記載の方法によって調製された単離された細胞を提供する。またさらに、この方法は、細胞集団を調製するために細胞を培養することをさらに含む。一方では、集団は実質的に均質なものを調製するための条件下で培養される。例えば、表現型において少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、または95％、98％同一。一方では、この方法はさらに、クロ−ン集団への細胞のクロ−ン拡大に有利な条件下で細胞を培養することを含む。細胞は特定の細胞型、例えば心臓細胞への分化を促進する条件下で培養される。 これらの培養条件は当技術分野において公知である。
【０２２９】
本方法は、検出可能な標識または外因性ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを細胞および細胞集団に挿入することによってさらに改変することができる。治療的使用のための方法および適切なポリヌクレオチドはDurraniと他、 (2010) Regen. Med. 5 (6): 919 932に記載されている。
【０２３０】
［エキソソ−ムまたは微小胞の集団およびエキソソ−ムまたは微小胞の組成］
本開示は、 mir−373、mir−210、mir−377、mir−367、mir−520、mir−548ah、mir−335、mir−21、mir−30c、mir−214、またはmir−548qからなる群、またはTsg101、CD9、Hsp70、Flotilline 1、またはGAPDHの群から選択される1つまたは複数のタンパク質から選択されるエキソソ−ムまたはマイクロベシクルを過剰発現する単離された集団のエキソソ−ムまたはマイクロベシクルを含む組成物を提供する。また、集団は、２つ以上、または３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、１１つ以上、または全部12個のmiRNA、および／または少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または全部５つのタンパク質を含む。また、エキソソ−ムまたは微小胞の個体で、エキソソ−ムまたは微小胞の少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、または100％がmiRNAおよび/またはタンパク質を過剰発現している。集団のエキソソ−ムまたは微小胞は、心臓前駆細胞（「ＣＰＣ」）、心筋細胞、内皮細胞、筋細胞、または平滑筋細胞から選択される細胞から単離される。
【０２３１】
さらに提供されるのは、細胞、細胞の集団、またはそれを含む組成物である：以下の1つ以上の孤立した集団：心筋前駆細胞、心筋細胞、筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、それぞれiPSCの群から選択される細胞から生成される骨格筋細胞、胚性幹細胞、またはイソオキサゾ−ル化合物、待てあはその誘導体もしくは等価物と接触した幹細胞である。細胞または細胞集団は、以下の群から選択されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の過剰発現によって同定される： mir−373、mir−210、mir−377、mir−367、mir−520、mir−548ah、mir−335、mir−21、mir−30c、mir−214 or mir−548q、またはpaZ3、PAX7、MYF5、MYOD、MYOG、またはジストロフィンの群から選択される筋肉遺伝子。さらに、本明細書で提供されるのは、 cTnT、cTnI、MLC2V、および／または CX43 のうちの１つ以上を発現する心筋細胞または心筋細胞の集団である。さらに提供されるのは、ＣＤ３１およびＶＥ−カドヘリンを発現する細胞または内皮細胞の集団である。そして、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）およびカルポニンを発現する平滑筋細胞またはこれらの細胞の集団がさらに提供される。
【０２３２】
また、本明細書に記載の集団は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０つ以上、または全部１１個のｍｉＲＮＡを含めて、または少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは全部６つの筋肉遺伝子を含む。あるいは、エキソソ−ムまたは微小胞の個体について、エキソソ−ムまたは微小胞の少なくとも80％、85％、90％、95％、97％、99％、または100％がmiRNAおよび/または遺伝子およびタンパク質を過剰発現している。
【０２３３】
また、本明細書はcTnl、MLC2v、cTnT、VE−カドヘリン、CD31、A−SMA ( actin )、カルポニンおよびCx43の群から選択される１つまたは複数のタンパク質を発現する単離された細胞集団も提供される。ここで、場合により、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つすべての発現タンパク質がある。一方では、細胞集団は、平滑筋細胞、内皮細胞、血管または心筋細胞からなる群から選択される。
【０２３４】
別の態様では、細胞集団についてエキソソ−ムまたは微小胞の少なくとも80％、85％、90％、95％、97％、99％、または100％がタンパク質を発現している。タンパク質発現を同定する方法は当該分野で公知であり、そしてタンパク質特異的抗体の使用を含み、ｍＲＮＡ発現をモニタ−するハイブリダイゼ−ション技術である。集団は、有効量のイソキサゾ−ル、その誘導体または等価物の存在下でiPSCの集団を培養することを含む方法によって調製することができる。さらに、集団は線維芽細胞または骨格筋芽細胞に由来して、同種、異種、精製、高度精製、同種または実質的に同種であり得る。さらに、エキソソ−ムまたは微小胞は、検出可能なように標識することができ、および／または担体、防腐剤または凍結防止剤と組み合わせることができる。 集団および組成物は凍結乾燥することができる。エキソソ−ムまたは微小胞の集団を単離し、そして細胞の単離された集団を産生するための方法は当該分野で公知であり、それらのいくつかを本明細書中に記載する。 さらなる態様では、集団は線維芽細胞または骨格筋芽細胞に由来する。
【０２３５】
そして、細胞集団は、平滑筋細胞、内皮細胞、および心筋細胞から本明細書中で使用される場合、「平滑筋細胞」は、以下のマ−カ− SMTN（スム−テリン）、Cnn1（カルポニン1）、テロキンなる群から選択されたマ−カ−を発現する細胞を意図する。本明細書中で使用される場合、「内皮細胞」とは、 VE−カドヘリン(CD144)、CD31、フォン・ヴィレブランド因子(vWF)というマ−カ−を発現する細胞を意図する。
【０２３６】
組成物はさらに、組織の再生および／または改善された機能を促進するタンパク質、および／またはタンパク質をコ−ドする核酸、および／または炎症性タンパク質、場合によってはサイトカインの発現を阻害する薬剤を含むことができる。タンパク質は、トランスフォ−ミング増殖因子ベ−タ（ＴＧＦ−ベ−タ）、ＷＮＴタンパク質、サイトカイン、またはヒストンデアセチラ−ゼの群から選択される。
【０２３７】
一方では、細胞は無血清培地で培養される。別の態様では、イソオキサゾ−ル化合物、その誘導体または等価物の有効量は、 mirの過剰発現をもたらす量である。一方では、有効量は約5μMから約25μMであり、有効量は８〜２０または約１０〜約１５または約５〜約２０μＭおよび約１０μＭ〜約２５μＭである。
【０２３８】
これらの組成物は、以下のうちの１つ以上の方法において有用である：筋肉および／または心臓組織などの損傷組織を再生すること；筋肉および／または心臓組織などの損傷組織の生存率を向上させる；心臓組織、筋肉組織、骨格筋組織、血管、毛細血管、筋細胞などの新しい組織の形成を促進する；心臓再生を促進する；急性心イベントに罹患している対象における心臓再生を促進する；心筋梗塞に罹患している対象において心臓再生を促進する；デュシェンヌ型筋ジストロフィ−（ＤＭＤ）またはデュシェンヌ型筋ジストロフィ−（「ＤＭＤ」）型心筋症に罹患している対象における心臓再生の促進、加齢関連疾患に罹患している対象における心臓再生を促進する、例えば、慢性閉塞性肺疾患（「COPD」）、関節炎、骨粗鬆症、変形性関節症、糖尿病、血管性痴呆、または黄斑変性；脳卒中、関節炎、アルツハイマ−病、記憶喪失障害、嚢胞性線維症、炎症性障害および癌のうちの1つまたは複数から損傷を受けた組織における組織再生の促進；心臓梗塞により損傷を受けた組織における心臓壁の厚さを減少させる；プロテインキナ−ゼＣ、iL − 6、mmp、PDGF のうちの１つ以上の遺伝子発現を変化させるこ；場合によりケモカイン、マクロファ−ジまたはサイトカインである炎症性タンパク質の発現を減少させるかまたは阻害する；直接的または間接的に血管新生を刺激する；以下の群から選択される疾患に罹患している対象において心臓再生を促進する：冠状動脈疾患、心筋梗塞、心不全、低形成性左心症候群、末梢動脈疾患（PAD）、心臓肥大、心臓弁膜症（大動脈弁狭窄）、心筋肥大、肥大性線維症；または細胞複製を直接的または間接的に阻害する。該方法は、有効量のエキソソ−ムまたは微小胞、細胞、集団またはそれらを含む組成物をそれを必要とする対象に投与することによって達成される。該方法は、有効量の非胚性幹細胞または前駆細胞を、場合により修復を必要とする同じまたは異なる種類の組織である被験体に投与することをさらに含み得る。一方では、非胚性幹細胞または前駆細胞は、被験体にとって自己由来である。また、一方では、非胚性幹細胞または前駆細胞は、被験体にとって同種異系である。エキソソ−ムまたは微小胞、細胞、集団は、局所的または全身的に被験体に送達することができる、例えば、心筋内投与または冠動脈内投与のこと。これらの方法によって適切に治療される対象には、動物、哺乳動物およびヒトの患者が含まれる。 治療の有効性を決定するための方法は当技術分野において公知であり、そのうちのいくつかを本明細書に記載する。
【０２３９】
この組成物はまた、以下の治療法のうちの１つ以上のための方法においても有用である：抗酸化療法の提供；局所または常在心筋細胞の活性化の促進；血管新生および／またはパラクリン因子の放出の促進；wnt、BMP、および/または細胞骨格リモデリングの活性化の促進；TGF−Bを促進するemtシグナル伝達と心臓分化；wnt5およびwnt11、あるいはBMPファミリ−タンパク質、必要に応じてBMP4の発現増加；nkx2.5、mef2c、gata4、およびisl−1からなる群より選択される心臓転写因子の発現増加；心筋細胞におけるpip3シグナル伝達の発達、筋肉収縮および肥大シグナル伝達経路における遺伝子発現の促進；線維症およびアポト−シスの減少；筋形成および筋分化の促進；アンジオポイエチン − 2、il − 6nmp、pgfbb、timp 1、または本明細書に開示される図中に同定される遺伝子からなる群から選択されるサイトカインの放出を促進すること；wnt3a、wnt5a、wnt11からなる群から選択される遺伝子の上方制御を促進すること；および、それを必要とする対象に有効量のエキソソ−ムもしくは微小胞、細胞、集団もしくは組成物を投与することにより細胞骨格リモデリングを促進すること。
【０２４０】
さらに提供されるのは、cTn1、MLC2v、cTnT、VE−カドヘリン、CD31、α−SMA（アクチン）、カルポニンまたはCx43の群から選択される1つまたは複数のタンパク質を発現する単離された細胞集団である。
【０２４１】
一方では、上記の組成物はさらに、組織の再生および／または改善された機能を促進するタンパク質またはそのタンパク質をコ−ドする核酸を含む。そのようなタンパク質の非限定的な例には、例えば、腎臓のBmp7、肝臓のFgf−21、骨再生のOp−1などが含まれる。さらに、組成物は、炎症性タンパク質の発現を阻害する薬剤をさらに含む。これらの薬剤の非限定的な例には、例えば、ホスホリパ−ゼA 2阻害剤、p38マイトジェン活性化タンパク質（MAP）キナ−ゼ阻害剤などが含まれる。さらなる態様では、タンパク質はサイトカインであり、そのようなサイトカインの非限定的な例にはインタ−ロイキンおよびインタ−フェロンが含まれる。
【０２４２】
一方では、本明細書に記載の集団は、担体をさらに含み、一態様では、天然に存在しない担体である。また、一方では、集団は、ポリエチレングリコ−ルなどの防腐剤または抗凍結剤をさらに含む。
【０２４３】
さらなる態様において、本明細書に記載の集団は凍結乾燥されている。
【０２４４】
さらに、本明細書に記載の組成物は、有効量のイソキサゾ−ル化合物またはその誘導体の存在下で培養された幹細胞または前駆細胞の集団から単離される。一方では、イソオキサゾ−ル化合物は、イソオキサゾ−ル−1（isx−1）またはイソオキサゾ−ル−9（isx−9）から選択される。また、イソオキサゾ−ル誘導体は下記式を有する：
2019201631.tif 000007
式中、R 1およびR 2は両方とも水素であるか、またはR 1は水素であり、R2は置換または非置換のCからなる群から選択される、またはR1およびR2は一緒になってアゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、またはモルホリニルから選択される環を形成してもよい；R 2 '、R zおよびR 4は、水素、ハロゲン、Ｃ 1 −Ｃ 6アルキル、Ｃ 1 −Ｃ 6シクロアルキル、置換または非置換の芳香族または複素芳香環、シアノ、ニトロ、およびアシルからなる群から独立して選択される。Xは0、NHまたはSであり；そして Yは0、NHまたはSである。
【０２４５】
さらに、イソオキサゾ−ル化合物は以下の式を有する：
2019201631.tif 000008
式中、R1およびR2はそれぞれＣ1 − Ｃ4アルキル、フェニル、ベンジル、トリフルオロメチルまたはハロゲンから選択されて、R 3は水素、ヒドロキシ、Ｃ 1 〜Ｃ 4アルキルまたはアルコキシから選択されて、3位または5位のR 4は、水素、トリフルオロメチル、Ｃ 1 〜Ｃ 4アルコキシ、Ｃ 1 〜Ｃ 4アルキル、またはＣ 1 〜Ｃ 4ヒドロキシアルキルから選択される。R 5は水素またはＣ 4 〜Ｃ 4アルキルから選択されるか、またはR 4およびR 5は一緒になってテトラメチレン基を形成する。複素環上の3位または5位のZは、&#8212; N ( R6 )−CO &#8212;、−CO N ( RF )−、NORG )−CO−NRG )−、CH ( RF )−NHCO、または−NH−CO CH ( R6 ) から選択されて、式中、R 6は水素またはC 1−C 4アルキルから選択される。
【０２４６】
さらなる態様において、イソオキサゾ−ル化合物またはその誘導体は以下の群から選択される：5−（トリフルオロメチル）−3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（トリフルオロメチル）−3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−4カルボン酸、5−（チオフェン−2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、5、6、7、8−テトラヒドロ−4h−シクロヘプタ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、4，5，6，7−テトラヒドロ−ベンゾ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−アミノ−5−メチルイソオキサゾ−ル、4−アミノ−n−（5−メチル−3−イソオキサゾリル）ベンゼンスルホンアミド、3−フェニルイソオキサゾ−ル−5−ボロン酸ピナコ−ルエステル、5−フェニルイソオキサゾ−ル、1−フェニル−1−シクロペンタンカルボン酸、3−フェニル−ベンゾ［c］イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−メチル−3−フェニルイソオキサゾ−ル−4カルボン酸、3 a、4，5，6，7，8，9，9 a−オクタヒドロ−シクロオクタ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（3−ニトロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−ニトロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−ヒドロキシ−5−アミノメチルイソオキサゾ−ル、5−（モルホリノメチル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシ塩酸塩、5−モルホリノメチル）イソオキサゾ−ル−3−カルバルデヒド、3−メチル−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（チオフェン−2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸メチル、3−（メチルスルホニル） ）−5−（2−チエニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボニトリル、5−メチル−3−（2−ピロリジニル）イソオキサゾ−ル、3−メチル−5−（2−ピロリジニル）イソオキサゾ−ル、3−（1−メチル−1h−）ピラゾ−ル−4−イル）−イソオキサゾ−ル5−カルボン酸、3−（1−メチル−1h−ピラゾ−ル−4−イル）−4,5−ジヒドロ−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−（4−メチルフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−メチル−3−フェニルイソオキサゾ−ル−4カルボン酸、5−（4−メチルフェニル）イソオキサゾ−ル−3カルボキシアルデヒド、5−メチル−3−（4−フェノキシフェニル）イソオキサゾ−ル4−カルボン酸、3−メチル−5−（4−メチル−1，2，3−チアジアゾ−ル−5−イル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、3−メチル−5−（5−メチルイソオキサゾ−ル−3−イル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、 5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸メチル、5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸メチル、5−メチルイソオキサゾ−ル、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸メチル、5−（4）メチル−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、メチル5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、メチル5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸。 5−（3−メトキシ−フェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（2−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（2−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル5−カルバルデヒド、5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、 3−（2−メトキシ−フェニル）−4，5ジヒドロ−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、3−メトキシ−イソオキサゾ−ル5−カルボン酸、イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、イソオキサゾ−ル−5−カルボチオアミドイソオキサゾ−ル−5カルボニルクロリド、イソオキサゾ−ル−3−カルボニトリル、イソオキサゾ−ル−3カルバルデヒド、イソオキサゾ−ル−4−ボロン酸、イソオキサゾ−ル、5−シクロプロピル−4−［2−（メチルスルホニル）−4−（トリフルオロメチル）ベンゾイル］イソオキサゾ−ル、6、−（5−（チオフェン−2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキサミド）ヘキシル5−（（3as、4s、bar）−2−オキソヘキサヒドロ−1h−チエノ[3,4−d]イミダゾ−ル−4−イル）ペンタノエ−トイソカルボキサジド5−メチル−3−イソオキサゾ−ル−カルボン酸2−ベンジルヒドラジド、5−イソブチルイソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、4−ヨ−ド−5−メチル−イソオキサゾ−ル、3，3'−イミノビス（n、n−ジメチルプロピルアミン）、3。−（3−ヒドロキシフェニル）−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸メチルエステル、5−（4−ヒドロキシ−フェニル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、 5−（3−ヒドロキシフェニル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（ヒドロキシメチル）−3−メチルイソオキサゾ−ル、3−ヒドロキシ−5−メチルイソオキサゾ−ル、5−（1−ヒドロキシエチル）−3−（4−トリフルオロメチルフェニル）イソオキサゾ−ル、3 a、 4、5、6、7、7 a−ヘキサヒドロ−ベンゾ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（2−フリル）イソオキサゾ−ル−3−カルバルデヒド、5−フラン−2−イル−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、6−フルオロ−3−（4−ピペリジニル）ベンズイソオキサゾ−ル、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−メタノ−ル、3−（2−フルオロ−フェニル）−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（3−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（2−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（3−フルオロ−4−メトキシ−フェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、エチル5−（トリフルオロメチル）−3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、エチル−5 （トリブチルスタニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチル5−（チオフェン−2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、5−エチル−イソオキサゾ−ル−4カルボン酸、5−エチル−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、エチル5−（4）−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、エチル5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチル5−（2、3−ジヒドロベンゾ[b][1,4]ジオキシン−7−イル）��ソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチル3−（4−クロロフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、エチル5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチル3−（4−ブロモフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4カルボキシレ−ト、エチル5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、エチル5−アミノ−4−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシレ−ト、eth 5−アミノ−4−（4−ブロモフェニル）イソキサゾ−ル−3−カルボン酸エチル、6b−アセチル−2−（アセチルオキシ）−4 a、6 a−ジメチル−2，3，4，4 a、4b、5，6，6 a、6b 、9 a、10，102，10b、11−テトラデカヒドロ−1h−ナフト［2 '、1'：4，5］インデノ［2，1 − d］イソオキサゾ−ル−9−カルボキシレ−ト、3，5−ジメチル−4− （トリブチルスタニル）イソオキサゾ−ル、5−（1，5−ジメチル1h−ピラゾ−ル−4−イル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（1，3−ジメチル−1h−ピラゾ−ル−4−イル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（1，5−ジメチル−1h−ピラゾ−ル−4−イル）−イソキサゾ−ル、3，5−ジメチルイソオキサゾ−ル−4−ボロン酸ピナコ−ルエステル、3，5−ジメチルイソオキサゾ−ル、3−（ジメチルアミノ）−1−（2）−ピリジル）−2プロペン−1−1、5−（3、5−ジフルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、[2、6ジクロロ−4−（トリフルオロメチル）フェニル]ヒドラジン、5−（2、5−ジクロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸酸、ダナゾ−ル、3−（4クロロフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸酸、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−プロピオン酸、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、3−（3−クロロフェニル）イソキサゾ−ル−5カルボン酸、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3カルボキシアルデヒド、3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5カルバルデヒド、3−（3−クロロフェニル） ）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（2−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（クロロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、 3−（クロロメチル）−5−（2−フリル）イソオキサゾ−ル、4−クロロメチル−3，5−ジメチルイソオキサゾ−ル、5−（クロロメチル）−3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（3−クロロ−4−メトキシ−フェニル） ）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−クロロ4−フルオロベンズアルデヒド、3−（5−クロロ−2,4−ジメトキシ−フェニル）4,5−ジヒドロ−イソキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−tert−ブチル−4,5,6,7−テトラヒドロ−ベンゾ[d]イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（4−ブロモフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−プロピオン酸、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸ヒドラジド、5−（4−ブロモフェ��ル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、3−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、5−カルボキシアルデヒド、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（3−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、3− （4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（ブロモメチル）−3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、4−（ブロモメチル）イソオキサゾ−ル、5−ブロモメチル）−3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（ブロモメチル）−3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（ブロモメチル）−3−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、6−ブロモ−3−メチルベンゾ[d]イソオキサゾ−ル、5−ブロモ−3−メチルベンゾ[d]イソオキサゾ−ル、4−ブロモ−5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−ブロモイソオキサゾ−ル、3−ブロモ−5−（2−ヒドロキシエチル）イソオキサゾ−ル、4−ブロモ5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−ブロモ−5−（ 4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、4−ブロモ−5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、4−ブロモ5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、6−ブロモ−ベンゾ[d]イソオキサゾ−ル3−カルボン酸、ベンゾ[d]イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−アミノ−5−メチルイソオキサゾ−ル、5−アミノ−3−（4）−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−アミノイソオキサゾ−ル、3−アミノ−5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アミノ−3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アミノ4−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、3−アミノ−5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アセチル−3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アセチル−3（3−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−メチル−5−[（2 s）−1−メチル−2−ピロリジニル］イソオキサゾ−ル塩酸塩、7−メトキシ−5−メチル−4，5−ジヒドロナフト［2，1 − d］イソオキサゾ−ル、5−メチル−3−フェニルイソオキサゾ−ル−4−カルボン酸メチルアミド、5−メチル−3−フェニルイソオキサ
ゾ−ル−4−カルボチオ酸メチルアミド、5−メチル−3−フェニル−4−（1h−ピラゾ−ル−5−イル）イソオキサゾ−ル、5−ベンジル3−フラン−2−イル−2−フェニル−テトラヒドロ−ピロロ（3、4）−d）イソキサスオレ4、6−ジオン、5−ベンジル−3−[4−（ジメチルアミノ）フェニル]−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−3−（5−br−2−ホ−フェニル）−2−ph−テトラヒドロ−ピロロ（3、4 d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、5−ベンジル−3−（4−ニトロ−ph）−2−ph−ジヒドロ−2h−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−3−（4−メトキシ−フェニル）−2−ph−テトラヒドロ−ピロロ（ 3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、5−ベンジル−3−（4−フルオロフェニル）−2−（2−メチルフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（ 3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−3−（3−ニトロ−ph）−2−フェニル−テトラヒドロピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4,6−ジオン、5−ベンジル−2−ph−3−（2ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）ジオン、5−ベンジル−2−ph−3−（2−ph−ビニル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−2−（4−クロロフェニル）−3−（2−チエニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−2，3−ジフェニルジヒドロ2h−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−2（4 cl−ph）3−（2−フリル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3、 4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）ジオン、5−ベンジル−2（4−cl−ph）−3−（4−f−ph）ジヒドロ−2hピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）ジオン、5−（p−トリル）イソオキサゾ−ル、5−（4−メチルフェニル）−3−（4−ニトロフェニル）−2フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジオン、5−（4−メトキシフェニル）−2−フェニル−3−（4−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、 5h）−ジオン、5−（4−メトキシフェニル）−2−フェニル−3−（3−ピリジニル）ジヒドロ−2hピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−（ 4−（メトキシ）−2,3−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3、 4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、5−（4−フルオロフェニル）−3−（4−メトキシフェニル）−2フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、 6（3h、5h）ジオン、5−（4−フルオロフェニル）−2−（2−メチルフェニル）−3−（4−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、 5h）ジオン、5−（4−エトキシフェニル）−3−（4−ニトロフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジオン、5−（4−）エトキシフェニル）−3−（4−フルオロフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジオン、5−（4−エトキシフェニル）−2−メチル−3− （4−ニトロフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、5−（4エトキシ−ph）���2−ph−3−チオフェン−2−イル−4h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、5−（4−cl−ph）−3−（3−ニトロ−ph）−2−フェニルテトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、5−（4−ブロモフェニル）−3−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2hピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、5−（4−ブロモフェニル）−3−（2−フリル）−2−（2−メチルフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ[3、 4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、5−（4−ブロモフェニル）−2−フェニル−3−（2−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4 、6（3h、5h）−ジオン、5−（4−br−ph）2−ph−3−（2−phビニル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h） 、5h）ジオン、5−（2−cl−ph）−3−（4−ジメチルアミノ−ph）2−o−トリル−4h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、5−（2−クロロフェニル）−3−[4−（ジメチルアミノ）フェニル]−2−フェニルジヒドロ−2h−pyrrオロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、5−（2−クロロフェニル）−3−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、4−（3−（2−cl−ph）−5−メチルイソオキサゾ−ル−4−カルボニル）−アミノ）−安息香酸エチルエステル、4、5、6、6a−テトラヒドロ−3ah−シクロペンタ[d]イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−フェニル−3a、6a−ジヒドロチエノ[2,3−d]イソオキサゾ−ル4,4−ジオキシド、3−メチル−5−（3−フェニルプロピル）イソオキサゾ−ル、3−メチル−4ニトロ−5−［（e）−2−フェニルエテニル］イソオキサゾ−ル、3−メチル−4，5，8，9テトラヒドロシクロオクタ（d）イソオキサゾ−ル、3−メチル−4，5，5 a、b a 1，7，8ヘキサヒドロオキシレノ（2 '、3'：5，6）シクロオクタ（1，2 − d）イソオキサゾ−ル、3−メチル−3 a、4，5，8，9，9 a−ヘキサヒドロシクロオクタ（d）イソオキサゾ−ル、3−フラン−2−イル−2−フェニル−5−p−トリル−テトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、3−クロロ−4、5−ジヒドロ（1）−ベンズオチエピノ（5、4−c）イソオキサゾ−ル、3−[4−（ジメチルアミノ）フェニル]−5−（4−メトキシフェニル）−2−（2−メチルフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4 、6（3h、5h）−ジオン、3−（5−br−2−ho−フェニル）−2、5ジフェニル−テトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、3−（5−br−2−ho−ph）−5−（2−cl−ph）−2−ph−テトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、3−（4−meo−フェニル）−5−フェニル−2−0−トリルテトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、3−（4−フルオロフェニル）−5−（4−ニトロフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4 d]イソオキサゾ−ル−4 、6（3h、5h）−ジオン、3−（4−フルオロフェニル）−5−（4−メチルフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（4−ジメチルアミノ−ph）−5−ph 2−o−トリル−4h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、3−（4−フルオロフェニル）−5−（4）−メトキ��フェニル）−2−フェニルジヒドロ−2hピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、3−（4−br−ph）−2−ph 5−（2−トリフルオロメチル−） ph）−4h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6 dion e、3−（3−ニトロ−フェニル）−2、5−ジフェニル−テトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、3−（3−br−フェニル）−2、5−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、3−（3−br−ph）−5−（2−meo−ph）−2−0−トリル−テトラヒドロピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、3−（2−フリル）−5−[4−（4−モルホリニル）フェニル]−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、3−（2−フリル）−2−（2−me−ph）−5−phジヒドロ−2h−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4、 6（3h、5h）−ジオン、3−（2−フリル）−2，5−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（2−−cl−フェニル）−5−メチル−イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸（2、5−ジクロロ−フェニル）−アミド、3−（2−cl−ph）−5−m−イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸（4、5−ジヒドロ−チアゾ−ル（2−イル）アミド、3−（2−クロロ−フェニル）−5−メタイル−イソオキサゾ−ル−4カルボン酸シアノメチル−アミド、3−（2、4−ジクロロフェニル）−5−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3、5h） ）−ジオン、3−（2、4−di−cl−ph）2、5−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、3−（2） 、2−ジクロロ−ビニル）−5−フェニル−イソオキサゾ−ル、3、5−ジフェニル−イソオキサゾ−ル、3、5−ジメチル−4−（1−ピロリジニルスルホニル）イソオキサゾ−ル、3（4−ジメチルアミノ−ph）−5−（4−eto−ph）2−o−トリル−4h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、2−（4−cl−ph）5−ph−3−（2−チエニル）−ジヒドロ−2h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、2−（4−cl−ph）−5−（3−meo−ph）−3−（3−ニトロ−ph）−4h−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、2−（4−cl−ph）−3−（4−meo−ph）−5−p−トリル−テトラヒドロ−ピロロ（3、 4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、2−（4−クロロフェニル）−5−（4−メチルフェニル）−3−（2−チエニル）ジヒドロ−2hピロロ[3、4−d]イソキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、2−（4クロロフェニル）−3−[4−（ジメチルアミノ）フェニル）−5フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）ジオン、2−（4−クロロフェニル）−3−（4−フルオロフェニル）−5−（4ニトロフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、2−（4−クロロフェニル）−3−（2−チエニル）−5−［3（トリフルオロメチル）フェニル]ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、2−（4−クロロフェニル）−3−（2，4−ジクロロフェニル）−5−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、2,3−ジ−ph−5−（3−（トリ−f−me）ph）ジヒドロ−2h−ピロロ（3） 、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、ダナゾ−ル、およびn−シクロプロピル−5−（チオフェン−2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキサミド。
【０２４７】
一方では、有効量は、例えば約5μM〜約25μMのような、 miRNA の過剰発現をもたらす量を含む。
【０２４８】
さらに、細胞を無血清培地中で培養する。
【０２４９】
一方では、幹細胞または前駆細胞は、iPSC由来の心臓前駆細胞またはiPSC由来の胚様体の群から選択される。幹細胞からiPSC−心臓前駆細胞を誘導する方法は当技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。iPSＣ由来の胚様体から幹細胞を誘導する方法は、以下の明細書に記載されているように当該分野で公知である：Michael W.Nestorと他、「無血清胚様体のヒト人工多能性幹細胞からネットワ−クへの分化」、幹細胞研究、第10巻第3号 2013、Pages 454−463、ISSN 1873−5061、https :/doi.org/10.1016/j.scr.2013.02.001 .; Steven D.Sheridan と他、「多能性を評価するための手段としてのヒト人工多能性幹細胞由来の胚様体の分析」、幹細胞・インタ−ナショナル、巻2012、明細書ID 738910、9 : 2012；Heming Weiと他、「ヒト多能性幹細胞から心筋細胞と間葉系幹細胞のワンステップ誘導」幹細胞研究第9巻第2号 2012、P 87−100；および Di Pasquale E .と他 J.Vis Exp.2013 Jun.28 ; ( 76 )ヒト心筋細胞の生成：フィ−ダ−フリ−のヒト誘導多能性幹細胞からの分化プロトコル。
【０２５０】
一方では、イソオキサゾ−ル化合物は、イソオキサゾ−ル−1（isx−1）またはイソオキサゾ−ル−9（isx−9）から選択される。また、イソオキサゾ−ル誘導体は以下の式を有する化合物である：
2019201631.tif 000009
R 1およびR 2は両方とも水素であるか、またはR 2は水素である。また、R 2は、置換または非置換のＣ 1〜Ｃ 4アルキル、Ｃ 3〜Ｃ 4シクロアルキル、Ｃ 2〜Ｃ 4アルケニル、Ｃ 2〜Ｃ 6、アルキニル、およびベンジルからなる群から選択される。また、ここでR 1およびR 2は一緒になってアゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、またはモルホリニルから選択される環を形成してもよい。R 2 '、R 2およびR 4は、水素、ハロゲン、C 1−C 6アルキル、C 1−C 8シクロアルキル置換または非置換芳香族またはヘテロ芳香族環、シアノ、ニトロ、およびアシルからなる群より独立して選択される。Xは0、NHまたはS；Yは0またはNH。
【０２５１】
さらに、またイソオキサゾ−ル化合物は以下の式を有する：
2019201631.tif 000010
ここで、R 1およびR 2はそれぞれＣ 1 −Ｃ 4アルキル、フェニル、ベンジル、トリフルオロメチルまたはハロゲンから選択されて、R 3は、水素、ヒドロキシ、Ｃ 1 〜Ｃ 4アルキルまたはアルコキシから選択される。3位または5位のR 4は、水素、トリフルオロメチル、Ｃ 1 〜Ｃ 4アルコキシ、Ｃ 1 〜Ｃ 4アルキル、またはＣ 1 〜Ｃ 4ヒドロキシアルキルから選択されて、R 5は水素またはＣ 4 −Ｃ 4アルキルから選択されるか、またはR 4およびR 5は一緒になってテトラメチレン基を形成する。複素環上の3位または5位のZは、&#8212; N ( R6 )−CO &#8212;、−CO N ( R6 )−、_ N ( R6 ) CO _ NRG )−、CH ( RF )−NHCO …、または−NH CO CH ( RO ) から選択される。ここで、R 6は水素またはC 1−C 4アルキルから選択される。
【０２５２】
さらなる態様において、イソオキサゾ−ル化合物またはその誘導体は以下の群から選択される：5−（トリフルオロメチル）−3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（トリフルオロメチル）−3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−4カルボン酸、5−（チオフェン−2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、5、6、7、8−テトラヒドロ−4h−シクロヘプタ[d]イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、4、5、6、7−テトラヒドロ−ベンゾ[d]イソオキサゾ−ル−3カルボン酸、3−アミノ−5−メチルイソオキサゾ−ル、4−アミノ−n−（5メチル−3−イソオキサゾリル）ベンゼンスルホンアミド、3−フェニルイソオキサゾ−ル−5−ボロン酸ピナコ−ルエステル、5−フェニルイソオキサゾ−ル、1−フェニル−1−シクロペンタンカルボン酸、3−フェニル−ベンゾ[c]
イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−メチル−3−フェニルイソオキサゾ−ル−4カルボン酸、3 a、4、5、6、7、8、9、9 a−オクタヒドロ−シクロオクタ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5− （3−ニトロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−ニトロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−ヒドロキシ−5−アミノメチルイソオキサゾ−ル、5−（モルホリノメチル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸塩、5−（モルホリノメチル）イソオキサゾ−ル−3−カルバルデヒド、3−メチル−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、メチル5−（チオフェン−2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（メチルスルホニル） ）−5−（2−チエニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボニトリル、5−メチル−3−（2−ピロリジニル）イソオキサゾ−ル、3−メチル−5−（2−ピロリジニル）イソオキサゾ−ル、3−（1−メチル−1h−ピラゾ−ル−4−イル）−イソオキサゾ−ル5−カルボン酸、3−（1−メチル−1h−ピラゾ−ル−4−イル）−4,5−ジヒドロ−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−（4−メチルフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−メチル−3−フェニルイソオキサゾ−ル−4カルボン酸、5−（4−メチルフェニル）イソオキサゾ−ル−3 カルボキシアルデヒド、5−メチル−3−（4−フェノキシフェニル）イソオキサゾ−ル4−カルボン酸、3−メチル−5−（4−メチル−1、2、3−チアジアゾ−ル−5−イル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、3−メチル−5−（5メチルイソオキサゾ−ル−3−イル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、メチル5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸メチル、5−メチルイソオキサゾ−ル、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸メチル、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸メチル、5−（4）メチル−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（3−メトキシ−フェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸酸、3−（2−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（2−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル5−カルバルデヒド、5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（2−メトキシ−フェニル）−4、5ジヒドロ−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、3−メトキシ−イソオキサゾ−ル5−カルボン酸、イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、イソオキサゾ−ル−4カルボン酸、イソオキサゾ−ル−5−カルボチオアミド、イソオキサゾ−ル−5塩化カルボニル、イソオキサゾ−ル−3−カルボニトリル、イソオキサゾ−ル−3カルバルデヒド、イソオキサゾ−ル−4−ボロン酸、イソキサゾ−ル、5−シクロプロピル−4−［2−（メチルスルホニル）−4−（トリフルオロメチル）ベンゾイル］イソオキサゾ−ル、6−（5）−（チオフェン−2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキサミド）ヘキシル5���（（3as、4s、bar）−2−オキソヘキサヒドロ−1h−チエノ[3,4−ジイミダゾ−ル−4−イル）ペンタノエ−ト、イソカルボキサジド5−メチル−3イソオキサゾ−ル−カルボン酸2−ベンジルヒドラジド、5−イソブチルイソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、4−ヨ−ド−5−メチル−イソオキサゾ−ル、3，3'−イミノビス（n、n−ジメチルプロピルアミン）、3−（3−ヒドロキシフェニル）−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸メチルエステル 、5−（4−ヒドロキシ−フェニル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（3−ヒドロキシフェニル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−ヒドロキシメチル）−3−メチルイソオキサゾ−ル、3−ヒドロキシ−5−メチルイソオキサゾ−ル、5−（1−ヒドロキシエチル）−3−（4−トリフルオロメチルフェニル）イソオキサゾ−ル、3 a、4，5，6，7，7 a−ヘキサヒドロ−ベンゾ［ジイソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（2−フリル）イソオキサゾ−ル−3−カルバルデヒド］ 、5−フラン−2−イル−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、6−フルオロ−3−（4−ピペリジニル）ベンズイソオキサゾ−ル、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−メタノ−ル、3−（2−フルオロ−フェニル）−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシアルデヒド、3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（3−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（2−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−5カルバルデヒド、5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4）フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（3−フルオロ−4−メトキシ−フェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、エチル5−（トリフルオロメチル）−3−（4メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシレ−ト、エチル−5（トリブチルスタニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸エステル、エチル5−（チオフェン2−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸エステル、5−エチル−イソオキサゾ−ル−4カルボン酸、5−エチル−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、エチル5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシラ−ト、エチル5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシラ−ト、エチル5−（2、3−ジヒドロベンゾ[b][1、4]ジオキシン−7−イル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシラ−ト、エチル3−（4−クロロフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボキシラ−ト、エチル5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボキシラ−ト、エチル3−（4−ブロ） 5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸エチル、5−アミノ−4−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸エチル、5−アミノ−4−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3カルボキシレ−ト、エチル6b−アセチル−2−（アセチルオキシ）−4 a、6 a−ジメチル2，3，4，4 a、4b、5，6，6 a、6b、9 a、10、 10 a、106，11−テトラデカヒドロ−1h−ナフト［2 '、1：4，5］インデノ［2，1−d］イソオキサゾ−ル−9−カルボキシレ−ト、3，5−ジメチル−4−（トリブチルスタニル）イソオキサゾ−ル、 5−（1，5−ジメチル1h−ピラゾ−ル−4−イル）−イソオキサゾ−ル−3−カ���ボン酸、5−（1，3−ジメチル−1h−ピラゾ−ル−4−イル）−イソキサゾ−ル−3−カルボン酸、5−（1，5−ジメチル−1h−ピラゾ−ル−4−イル）−イソキサゾ−ル、3，5−ジメチルイソオキサゾ−ル−4−ボロン酸ピナコ−ルエステル、3，5−ジメチルイソオキサゾ−ル、3−（ジメチルアミノ）−1−（2−ピリジル）−2−プロペン−1−オン、5−（3，5−ジフルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、［2，6−ジクロロ−4−（トリフルオロメチル）フェニル］ヒドラジン、5−（2，5−ジクロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、ダナゾ−ル、 3−（4−クロロフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−プロピオン酸、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4）−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、3−（3−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5カルボン酸、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−3カルボキシアルデヒド、3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5カルバルデヒド、3−（3−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、3−（2−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルバルデヒド、5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（クロロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、3−（クロロメチル）−5−（2−フリル）イソオキサゾ−ル、4−クロロメチル−3、5−ジメチルイソオキサゾ−ル、5−（クロロメチル）−3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（3−）クロロ4−メトキシ−フェニル）−イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−クロロ4−フルオロベンズアルデヒド、3−5−クロロ−2,4−ジメトキシ−フェニル）4,5−ジヒドロ−イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、5−tert−ブチル−4、5、6、7−テトラヒドロ−ベンゾ[d]イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（4）ブロモフェニル）−5−（トリフルオロメチル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−プロピオン酸、5−（4ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸ヒドラジド、5−（4ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−4−カルボン酸、5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル−5−カルボン酸、3−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル5−カルボキシアルデヒド、5−（4）−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（3−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、3−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（ブロモメチル）−3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、4−（ブロモメチル）イソオキサゾ−ル、5−ブロモメチル）−3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（ブロモメチル）−3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−（ブロモメチル）−3−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、6−ブロモ−3メチルベンゾ［d］イソオキサゾ−ル、5−ブロモ−3−メチルベンゾ[d]イソオキサゾ−ル、4−ブロモ−5−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−ブロモイソオキサゾ−ル、3−ブロモ−5−（2−ヒドロキシエチル）イ��オキサゾ−ル、4−ブロモ5−（4）−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−ブロモ−5−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、4−ブロモ−5−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、4−ブロモ5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、6−ブロモ−ベンゾ［d］ ］イソオキサゾ−ル3−カルボン酸、ベンゾ［d］イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−アミノ−5−メチルイソオキサゾ−ル、5−アミノ−3−（4−メトキシフェニル）イソオキサゾ−ル、3−アミノイソオキサゾ−ル、3−アミノ−5−（ 4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アミノ−3−（4−クロロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アミノ4−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、3−アミノ−5−（4−ブロモフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アセチル−3−（4−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、5−アセチル−3（3−フルオロフェニル）イソオキサゾ−ル、3−メチル−5−[（25）−1−メチル−2−ピロリジニル]イソオキサゾ−ル塩酸塩、7−メトキシ−5−メチル4、5−ジヒドロナフト[2,1−d]イソオキサゾ−ル、5−メチル−3−フェニルイソオキサゾ−ル−4−カルボン酸メチルアミド、5−メチル−3−フェニル−イソオキサゾ−ル−4−カルボチオ酸メチルアミド、5−メチル−3−フェニル−4−（1h−ピラゾ−ル−5−イル）イソオキサゾ−ル、5−ベンジル3−フラン−2−イル−2−フェニル−テトラヒドロ−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル4,6−ジオン、5−ベンジル−3−[4−（ジメチルアミノ）フェニル]−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−3−（5−br−2−ホ−フェニル）−2−ph−テトラヒドロ−ピロロ（ 3，4d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、5−ベンジル−3−（4−ニトロ−ph）−2 − ph−ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h） 、5h）−ジオン、5−ベンジル−3−（4−メトキシ−フェニル）−2−ph−テトラヒドロ−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4,6−ジオン、5−ベンジル−3−（4）−フルオロフェニル）−2−（2−メチルフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−3−（3−ニトロ−ph）−2
−フェニル−テトラヒドロピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、5−ベンジル−2 − ph − 3−（2−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6 （3h、5h）ジオン、5−ベンジル−2−ph−3−（ 2−（ph−ビニル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、5−ベンジル−2−（4−クロロフェニル）−3−（2−チエニル）ジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（34、5h）−ジオン、5−ベンジル−2、3−ジフェニルジヒドロ2h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h） 、5h）−ジオン、5−ベンジル−2（4 cl−ph）3−（2−フリル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）ジオン、5−ベンジル−2（4−cl−ph）−3−（4−f−ph）ジヒドロ−2hピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）ジオン、5−（p−トリル）イソオキサゾ−ル、5−（4−メチルフェニル）−3−（4−ニトロフェニル）−2フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）ジオン、5−（4−メトキシフェニル）−2−フェニル−3−（4−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、5−（4−メトキシフェニル）−2−フェニル−3−（3−ピリジニル）ジヒドロ−2hピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、5−（4−メトキシph）−2,3−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、5−（4−フルオロフェニル）−3−（4−メトキシフェニル）−2フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4]−d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジオン、5−（4−フルオロフェニル）−2−（2−メチルフェニル）−3−（4−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）5−（4−エトキシフェニル）−3−（4−ニトロフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジオン、 5−（4−エトキシフェニル）−3−（4−フルオロフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）ジオン、5−（4−エトキシフェニル）−2−メチル−3−（ 4−（ニトロフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、5−（4エトキシ−ph）−2−ph−3−チオフェン−2−イル−4h−ピロロ（3,4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、5−（4−cl−ph）−3−（3−ニトロ−ph）−2−フェニルテトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、5−（4−ブロモフェニル）−3−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2hピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、5−（4−ブロモフェニル）−3−（2−フリル）−2−（ 2−メチルフェニル）ジヒドロ−2hピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、5−（4−ブロモフェニル）−2−フェニル−3−（2−ピリジニル）ジヒドロ−2h−ピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）−ジオン、5−（4−br−ph）2−ph−3−（2−phビニル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3、 4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）ジオン、5−（2−cl−ph）−3−（4−ジメチルアミノ−ph）2−0−トリル−4h−ピロロ（3、4−d） ）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、5−（2−クロロフェニル）−3−［4−（ジメチルアミノ）フェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、 5h）−ジオン、5−（2−クロロフェニル）−3−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、4−（3−（2 − cl − ph）−5−メチルイソオキサゾ−ル−4−カルボニル）−アミノ）−安息香酸エチルエステル、4、5、6、6a−テトラヒドロ−3ah−シクロペンタ[d]イソオキサゾ−ル−3−カルボン酸、3−フェニル−3a、ba−ジヒドロチエノ[2,3−d]イソオキサゾ−ル4,4−ジオキシド、3−メチル−5−（3−フェニルプロピル）イソオキサゾ−ル、3−メチル−4ニトロ−5−[（e）−2−フェニルエテニル]イソオキサゾ−ル、3−メチル−4、5、8、9テトラヒドロシクロオクタ（d）イソオキサゾ−ル、3−メチル−4，5，5 a、b a、7，8ヘキサヒドロオキシレノ（2，3 ’：5，6）シクロオクタ（1，2 − d）イソオキサゾ−ル、3−メチル−3 a、4，5，8，9，9 a−ヘキサヒドロシクロオクタ（ d）イソオキサゾ−ル、3−フラン−2−イル−2−フェニル−5 − p−トリル−テトラヒドロ−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、3−クロロ−4，5−ジヒドロ（3）。 1）−ベンゾチエピノ（5，4 − c）イソオキサゾ−ル、3−［4−（ジメチルアミノ）フェニル］−5−（4−メトキシフェニル）−2−（2−メチルフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4−ジイソオキサゾ−ル−］ 4、6（3h、5h）−ジオン、3−（5−br−2−ho−フェニル）−2、5ジフェニル−テトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、 6−ジオン、3−（5−br−2−ho−ph）−5−（2−cl−ph）−2−ph−テトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、 3−（4−メオ−フェニル）−5−フェニル−2−0−トリルテトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、3−（4−フルオロフェニル）−5−（4−ニトロフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4 d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、3−（4−フルオロフェニル）−5−（4メチルフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、3−（4−ジメチルアミノ−ph）−5−ph 2−0−トリル−4h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4，6−ジオン、3−（4−フルオロフェニル）−5−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（4−br−ph）−2−ph 5−（2−トリフルオロメチル−ph）−4h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6ジオン、3−（3−ニトロ−フェニル）−2、5−ジフェニル−テトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、3−（3−br−フェニル）−2、5−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）ジオン、3−（3−br−ph）−5−（2−meo−ph）−2−0−トリル−テトラヒドロピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、 6−ジオン、3−（2−フリル）−5−[4−（4モルホリニル）フェニル]−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、3−（2−フリル）−2−（2−me−ph）−5−phジヒドロ−2h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、3−（ 2−フリル）−2，5−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、3−（2 − cl−フェニル）−5−メチル−イソオキサゾ−ル−4カルボン酸（2、5−ジクロロ−フェニル）−アミド、3−（2−cl−ph）−5−オキサゾ−ル−4−カルボン酸（4，5−ジヒドロ−チアゾ−ル−2−イル）アミド、3−（2−クロロ−フェニル）−5−メチル−イソオキサゾ−ル−4カルボン酸シアノメチル−アミド、3−（2、4−ジクロロフェニル）−5−（4−メトキシフェニル）−2−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、3−（2、4−di−cl−ph）2、5−ジフェニルジヒドロ−2h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、3−（2、2−ジクロロ−）ビニル）−5−フェニル−イソオキサゾ−ル、3、5−ジフェニル−イソオキサゾ−ル、3、5−ジメチル−4−（1−ピロリジニルスルホニル）イソオキサゾ−ル、3（4−ジメチルアミノ−ph）−5−（4−エト−ph）2−o−トリル−4h−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、2−（4−cl−ph）5−ph−3−（2−チエニル）ジヒドロ−2h−ピロロ（3、4）−d）イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）ジオン、2−（4−cl−ph）−5−（3−meo−ph）−3−（3−ニトロ−ph）−4h−ピロロ（3） 、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、2−（4−cl−ph）−3−（4−meo−ph）−5−p−トリル−テトラヒドロ−ピロロ（3、4−d）イソオキサゾ−ル−4、6−ジオン、2−（4クロロフェニル）−5−（4−メチルフェニル）−3−（2−チエニル）ジヒドロ−2hピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、2−（4−クロロフェニル）−3−[4−（ジメチルアミノ）フェニル]−5フェニルジヒドロ−2h−ピロロ[3,4−d]イソオキサゾ−ル−4,6（3h、5h）ジオン、2−（4−クロロフェニル）−3−（4−フルオロフェニル）−5−（4ニトロフェニル）ジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4、6（3h、5h）−ジオン、2−（4−クロロフェニル）−3−（2−チエニル）−5−[3（トリフルオロメチル）フェニル]ジヒドロ−2h−ピロロ[3、4−d]イソオキサゾ−ル−4、 6（3h、5h）−ジオン、2−（4−クロロフェニル）−3−（2，4−ジクロロフェニル）−5−フェニルジヒドロ−2h−ピロロ［3，4 − d］イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、2，3−ジ−ph − 5−（3−（トリ−f − me）ph）ジヒドロ−2h−ピロロ（3，4 − d）イソオキサゾ−ル−4，6（3h、5h）−ジオン、 ダナゾ−ル、およびn−シクロプロピル−5−（チオフェン−2−イル）イソキサゾ−ル−3カルボキサミド。
【０２５３】
上記の方法によって調製された細胞集団、ならびにこれらの細胞集団から単離および/または精製されたエキソソ−ムまたは微小胞もまた提供される。集団は、同種、異種、精製、高度精製、同種または実質的に同種であり得る。一態様では、少なくとも80％、85％、90％、95％、97％または99％、100％の細胞がタンパク質を発現している。
【０２５４】
さらに提供されるのは、細胞集団およびこれらの集団から単離されたエキソソ−ムまたは微小胞であり、ここで、集団は、ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）の集団から、有効量のGivinostat（GIV）と共に有効量のhiPSCを培養することによって調製された心臓または骨格筋原性前駆細胞である。一方では、GIVの有効量は、1×106細胞当たり約100nM〜約30nM、または1×10細胞当たり約100nM〜約50nM、1×100細胞当たり約90nM〜約30nM、1×100細胞当たり約30nM〜約75nM、1×100細胞当たり約70nM〜約50nMを構成する。さらに、無細胞培地とRho関連キナ−ゼ（ROCK阻害剤）の存在下で細胞を培養することをさらに含む方法によって、細胞とエキソソ−ムまたは微小胞の集団が調製される。Rho関連キナ−ゼ（ROＣK）阻害剤の非限定的な例は、 Sigma Aldrich and Stemgent から市販されているチアゾビビンまたは Y27632 である。組成物を単離する方法は当技術分野において公知であり、そのうちのいくつかを本明細書に記載する。
【０２５５】
細胞およびエキソソ−ムまたは微小胞は、それを必要とする対象に細胞および/またはエキソソ−ムまたは微小胞を投与することによって骨格筋を再生するかまたはDMDを治療するのに有用である。治療の有効性を決定するための方法は当技術分野において公知であり、そのうちのいくつかを本明細書に記載する。
【０２５６】
また、無血清培地およびTGF−β−1型受容体阻害剤の存在下で細胞を培養することによって集団を調製する。そのようなTGF−βI型受容体阻害剤の非限定的な例は、 Cayman ChemicalとSigma Aldrich から市販されているSB431542と A8301； AdooQ Bioscience ( カタログ番号A11017 ) から市販されているLY2157299；および AdooQ Bioscience ( カタログ番号S2704 ) から市販されているLY2109761。細胞集団は、不均一、均一、実質的に均一または高度に精製されたものであり得る。一方では、集団は、細胞の少なくとも80％、85％、90％、95％、97％、または99％、100％のエキソソ−ムまたは微小胞を発現することを含む。集団を単離する方法は当技術分野において公知であり、そのうちのいくつかを本明細書に記載する。
【０２５７】
これらの細胞およびエキソソ−ムまたは微小胞は、それを必要とする対象に有効量の集団またはエキソソ−ムまたは微小胞を投与することによって心筋を再生するのに有用である。それらはまた、それを必要とする対象に有効量の細胞集団またはエキソソ−ムもしくは微小胞を投与することによって、デュシェンヌ型筋ジストロフィ−（DMD）に関連する心機能障害を治療するのに有用である。治療の有効性を決定するための方法は当技術分野において公知であり、そのうちのいくつかを本明細書に記載する。
【０２５８】
さらに、細胞の集団は、Meox1、Meox2、Tcf15、Pax3、Pax7、MyoDi、ジストロフィン、Myf5、または DESMIN の群から選択される少なくとも骨格筋形成遺伝子を過剰発現する。一方では、集団が少なくとも1つの、または2つの、3つの、4つの、5つの、6つの、7つの、8つの、またはすべての9つの18個の骨格筋形成遺伝子過剰発現している。細胞は、有効量のジビノスタット（GIV）の存在下で、場合により無血清培地中で、iPSＣを培養または接触させることによって調製される。GIVの有効量は、1×10細胞あたり約100nM〜約30nMである。さらに、細胞はまた、有効量のROＣK阻害剤の存在下で培養されるかまたは存在下で接触される。そのような非限定的な例としては、 Thiazovivin、Y27632、SR3677、または GSK429286である。もっとさらに、細胞はTGF−βI型阻害剤の存在下で培養（または接触）される。そのような非限定的な例としては、 SB431542、A8301、LY2157299、または LY2109761である。細胞集団は、不均一、均一、実質的に均一または高度に精製されたものであり得る。一方では、集団は少なくとも80％、85％、90％、95％、97％、または99％、100％の細胞が遺伝子を発現している。
【０２５９】
それを必要とする対象に有効量の細胞集団および/または細胞から単離されたエキソソ−ムもしくは微小胞を投与することによって、細胞および/または細胞から単離されたエキソソ−ムもしくは微小胞は、骨格筋を再生するための方法またはデュシェンヌ型筋ジストロフィ−（DMD）を治療するための方法において有用である。治療の有効性を決定するための方法は当技術分野において公知であり、そのうちのいくつかを本明細書に記載する。
【０２６０】
さらに、以下の群から選択されるxESI筋原性遺伝子を過剰発現する細胞の集団も提供される： Pitx2、ISL1、Nkx2.5、Hand1、GATA4、Tbx5、TnnT2、My17、MLC2v、Myf2c、Cdh4、または Lhx2、および細胞から単離されたエキソソ−ムまたは微小胞。一方では、集団が、少なくとも1つの、または2つの、3つの、4つの、5つの、6つの、7つの、8つの、9つの、10つの、11つの、またはすべての12つのxESI筋原性遺伝子を過剰発現している。細胞またはエキソソ−ムおよび微小胞の集団は、不均一、均一、実質的に均一または高度に精製されたものであり得る。一方では、集団は、遺伝子を過剰発現する細胞の少なくとも80％、85％、90％、95％、97％、または99％、100％を占める。1つ以上の遺伝子を過剰発現する細胞、およびこれらの集団から単離されたエキソソ−ムまたは微小胞を単離する方法が、当技術分野において公知であり、本明細書に記載する。
【０２６１】
それを必要とする対象に有効量の細胞集団および/または細胞から単離されたエキソソ−ムもしくは微小胞を投与することによって、集団およびエキソソ−ムまたは微小胞は、心筋の再生および/またはデュシェンヌ型筋ジストロフィ−（DMD）に関連する心機能不全に有用である。治療の有効性を決定するための方法は当技術分野において公知であり、そのうちのいくつかを本明細書に記載する。
【０２６２】
損傷を受けた又は罹患した心臓組織の修復または再生のための、またはそれらのうちの1つ以上の治療のための組成物もまた提供される：Hoyeraal−Hreidarsson症候群、先天性角化異常症、肺線維症、先天性角化異常症、骨髄不全、肺疾患、内分泌疾患、多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）、クッシング症候群、および末端肥大症、脳血管疾患（脳卒中）、高血圧高血圧症、パ−キンソン病、認知症、アルツハイマ−病、加齢性難聴、セリアック病（COP）、双極性障害、ヒドロキシ尿素、鎌状赤血球症、高血圧、アテロ−ム性動脈硬化症、関節炎、骨粗鬆症、変形性関節症、血管性認知症または黄斑変性症、癌、2型糖尿病、またはテロメラ−ゼ機能不全を伴う疾患、短縮されたテロメアの長さ、合成MicroRNA 146 aおよび薬学的に許容される担体を含む組成物、および有効量のダナゾ−ルの投与である。これらの組成物は、1つ以上のMicroRNAフラグメント、またはそれらの誘導体を個体に投与することによって、それを必要とする対象において組織を再生するのに有用である。1つ以上のMicroRNAフラグメントの投与後、1つ以上のMicroRNAフラグメントは損傷組織における遺伝子発現を変化させ、前記損傷組織の生存能力を改善し、そして対象における新しい組織の形成を促進する。治療の有効性を決定するための方法は当技術分野において公知であり、そのうちのいくつかを本明細書に記載する。
【０２６３】
本開示の目的のために、エキソソ−ムまたは微小胞は、約20nmから約90nmの平均直径を有する。
【０２６４】
［組成］
本発明はまた、細胞、エキソソ−ムまたはMicroベシクル、mirNA、ならびに上記のような、生体適合性足場または薬学的に許容される担体などの担体と組み合わせたそれらを含む集団を含む組成物を提供する。さらに、組成物はまた保存剤および/または抗凍結剤を含む。組成物は凍結、乾燥または凍結乾燥することができ、そして1つまたは複数の剤形で提供することができる。一実施形態では、組成物は治療的使用を意図しており、したがって、有効量の修飾細胞、エキソソ−ムまたは微小胞、mirNA、および集団が、単独で、またはイソオキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物と組み合わせて、組成物中に提供される。特定の細胞集団、エキソソ−ムまたは微小胞およびmirNA集団を調製するための方法、およびその使用。
【０２６５】
以下の群から選択されるミクロRNA（mirNA）を過剰発現するエキソソ−ムまたは微小胞の単離された集団を調製するための方法も本明細書で提供される： mir−373、mir−210 mir−377、mir−367、mir−520、mir−548ah、mir−335、mir−30c、mir−214、or mir−548q またはTsg101、CD9、Hsp70、フロチリン−1、またはGAPDHから選択される1つまた1つ以上のタンパク質。一方では、少なくとも70％、80％、または85％、90％、95％、または98％の細胞が、記載のmirおよび/またはタンパク質を発現する。
【０２６６】
一方では、以下の方法が提供される。簡単に言うと、50人を超えるMIを有するマウス、および1ヶ月の観察期間中の3時点の心機能評価を出願人のエキソソ−ムデ−タについて評価した。特定の心臓前駆細胞由来のエキソソ−ムによって分泌された miRNAは、心筋梗塞に対して強力な治療効果を発揮した。細胞生存、遊走および分化に対する前駆体由来の心臓エキソソ−ムのパラクリン効果は、心臓再生において重要な役割を果たす。miRNAシグネチャは異なる親細胞の中でエキソソ−ムにおいて独特である。したがって、本出願人は、iPSCおよびイソキサゾ−ルからエキソソ−ムを単離し、特徴付け、心臓前駆細胞（Exo−CPCSO）を誘導し、心筋細胞梗塞（MI）後の試験管内およびマウス心臓に対する心臓細胞に対するそれらの効果を決定した。出願人は、iPSＣおよびＣPＣから単離されたエキソソ−ムを特徴付けた。iPSCおよびCPC SX−9から単離されたエキソソ−ムの透過型電子顕微鏡（TEM）は典型的な形態を示した。ウエスタンブロットはさらに、iPSCおよびCPC SX−9由来のエキソソ−ムがエキソソ−ム（Exo）特異的マ−カ−Tsg101に富んでいることを確認した。 CD9、Hsp70 およびフロチリン−1を含む他の一般的なエキソソ−ムタンパク質は、エキソソ−ムには存在しなかった。カルネキシンはエキソソ−ムには存在しなかった。 iPSCとCPC/SX−9からのエキソソ−ムの平均サイズに有意差は観察されなかった。
【０２６７】
出願人はまた、ＣPＣからのエキソソ−ム中のmirNAカ−ゴ含量を調べた。Exo−CPCでmiR−373、miR−367、miR−520、miR−548が有意に過剰発現していることを確認した。そのため、iPSC、市販のCPC、および胚様体（EB）のエキソソ−ムと比較して、これらのmiRNAMicroアレイデ−タをリアルタイムPCRで確認した。miRNAを標的とした遺伝子に基づくGo濃縮解析は、生物学的プロセスがオルガネラ、分子機能、ストレスに対する応答および有糸分裂細胞周期を含むことを示した。出願人は、培養線維芽細胞に対するExo−CPCSOの効果をさらに研究した。CPCISA−9からのPKH26標識エキソソ−ムは、大部分核周囲領域に位置する線維芽細胞（カルセインAM）の内側に観察された。興味深いことに、TGF−Bで刺激した培養線維芽細胞における線維化遺伝子（CTCF、FN1、TIMP1、TIMP2、MMP2およびMMP9）の発現は、Exo−CPCisoでの処理後に有意に下方制御された。miR−373阻害剤を用いた機能喪失分析は、miR−373の濃縮が線維芽細胞におけるTGF−B刺激の回復への主な寄与因子であることを確認した。出願人はまた、マウスMIモデルにおける治療効果を試験した。出願人は、PBSおよびExo − iPSＣ処置マウスと比較して、MIの1ヶ月後のマウスにおいて、Exo − ＣPＣ 'の心筋内注射が心筋細胞増殖、血管形成および心機能の保存に対して好ましい心臓保護効果を及ぼすことを見出した。MIの30日後のExo−CPCSX−9処置マウスにおけるki67陽性CM（cTnT陽性）および増殖するCMSの定量分析は、Exi−CPCSX−9がMIの30日後の梗塞周囲領域におけるCMの増殖を有意に増加させることを示した（デ−タは示さず）。細動脈密度の定量的分析は、MI後にExo−ＣPＣSX−9が細動脈密度を有意に増加させることを示した。さらに、機能測定は、Exo−ＣPＣ/SX−9処置がEFおよびFSを有意に改善することを実証した（デ−タは示さず）。定量分析は、MI後のExo CPC SA−9処置マウスからのより小さな線維化領域を示した（デ−タは示さず）。したがって、Micro−RNA 373模倣体はMicro−RNA 373を過剰発現し、それが線維性疾患における瘢痕組織を減少させるであろう。
【０２６８】
エキソソ−ムまたは微小胞の集団は、不均一、均一、実質的に均一または高度に精製されたものであり得る。一方では、集団は、エキソソ−ムまたはMicroベシクルの少なくとも80％、あるいは85％、90％、95％、97％、あるいは99％、100％を含み、mirNAを発現した。
【０２６９】
以下のうちの1つ以上の集団を調製および単離するための方法もまた提供される：心臓前駆細胞、心筋細胞、筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、これらの群から選択される細胞からそれぞれ生成される：イソオキサゾ−ル化合物、その誘導体、またはそれらの均等物と接触させたiPSC、胚性幹細胞または幹細胞。ここで、細胞またはそれを含む集団は、1つまたは複数のmir−373、mir−210、mir−377、mir−367、mir−520、mir−548ah、mir−335、mir−30c、mir−214、または mir 548qを過剰発現して；あるいは、p a3、PAX7、MYF5、MYOD、MYOG、またはジストロフィンの群から選択される筋肉遺伝子。一方では、細胞の少なくとも70％、または80％、85％、90％、95％、または98％が、記載のmirおよび/または筋肉遺伝子を発現する。エキソソ−ムまたは微小胞は、以下のいずれかについて単離され得る：心筋前駆細胞、心筋細胞、骨格筋、内皮細胞、筋細胞、または平滑筋細胞。
【０２７０】
本明細書でまた提供されるのは、1つまたは複数の mir−373、mir − 210 mir−377、mir−367、mir−520、mir−548ah、mir−335、mir−30c、mir−214、または mir−548qおよび/またはm ax、MYOG、またはジストロフィンの群から選択される筋肉遺伝子を過剰発現する細胞を調製するための方法である。一方では、細胞の少なくとも70％、80％、85％、90％、95％、または98％が、記載のmirおよび/または筋肉遺伝子を過剰発現する。発現レベルは、本明細書中に記載されそして当該分野で公知の方法を使用して決定される。例えば、ハイスル−プットアッセイ、ELISAおよびハイブリダイゼ−ション技術。上記のように、1つ以上のmirおよび/または遺伝子が過剰発現され得る。
【０２７１】
エキソソ−ムまたは微小胞および／または細胞を含む組成物を調製するための方法もまた提供される。組成物はさらに、組織の再生および改善された機能を促進するタンパク質、およびタンパク質をコ−ドする核酸、および場合によりサイトカインである炎症性タンパク質の発現を阻害する薬剤を含むことができる。その例は本明細書に記載されている。
【０２７２】
集団は、有効量のイソキサゾ−ル化合物、それらの誘導体またはそれらの等価物の存在下で有効な期間にわたって培養された幹細胞または前駆細胞の集団を培養することによって調製される。例示的なイソオキサゾ−ルおよびその誘導体が本明細書に提供されている。一方では、有効量は、miRNAの過剰発現をもたらす量、例えば約5μM〜約25μM、または上記のような中間の範囲を含む。非限定的で例示的な幹細胞または前駆細胞は、iPSＣ由来ＣPＣ、心筋細胞、骨格筋細胞、内皮細胞、筋細胞、平滑筋細胞、またはiPSＣ由来胚様体の群から選択される。
【０２７３】
細胞を適切な条件下で培養した後、エキソソ−ムまたは微小胞を、本明細書に記載の方法および当技術分野で公知の方法を用いて細胞または細胞培養上清から単離する。精製方法に応じて、組成物は、本明細書に記載されるように、所望のレベルの純度で、不均一、精製、高度に精製、均一、または実質的に均一であり得る。エキソソ−ムまたは微小胞および細胞は、本明細書に記載の方法または当技術分野で公知の方法を用いて標識をそれらに結合させることによって検出可能な標識を細胞および/またはエキソソ−ムまたは微小胞に加えることによって検出可能に標識できる。
【０２７４】
精製方法に応じて、細胞組成物は精製されたもの、高度に精製されたもの、均質なもの、または実質的に均質なものであり得り、そして所望の純度を有する。細胞は、本明細書に記載の方法または当技術分野で公知の方法を用いて標識をそれらに結合させることによって、細胞に検出可能な標識を付加することで検出可能に標識することができる。
【０２７５】
細胞は、場合によっては天然に存在しない担体である担体と混合または組み合わせることができる。
【０２７６】
保存剤または抗凍結剤は、細胞またはそれらを含む組成物と組み合わせるか又は混合することができる。これらの組成物は、当該分野で公知の方法を使用して凍結乾燥され得、そして/または使用を容易にするために適切な剤形に処方され得る。
【０２７７】
細胞および/またはエキソソ−ムもしくは微小胞は、担体と混合または組み合わせることができ、ここで担体は場合により天然に存在しない担体である。 一方では、細胞集団は無血清培地中で培養される。
【０２７８】
防腐剤または抗凍結剤は、細胞、エキソソ−ムまたは微小胞またはそれらを含む組成物と組み合わせるかまたは混合することができる。 これらの組成物は、当該分野で公知の方法を使用して凍結乾燥され得り、そして/または使用を容易にするために適切な剤形に処方され得る。
【０２７９】
これらの方法によって調製され、そして以下の群から選択されるMicroRNA（miRNA）を含む細胞および組成物： mir−373、mir−210、mir−377、mir−367、mir−520、mir−548ah、mir−335、mir−21、mir−30c、mir−214 or mir−548q；またはTsg101、ＣD9、Hsp70、フロチリン−1またはGAPDHから選択される1つ以上のタンパク質；または、 mir−373、mir−210 mir−377、mir−367、mir−520、mir−548ah、mir−335、mir−30c、mir−214、またはmir−548q の1つまたは複数を過剰発現する細胞または細胞集団；およびpaX3、PAX7、MYF5、MYOD、MYOG、またはジストロフィンのグル−プから選択された筋肉遺伝子、従って、筋肉および/または心臓組織などの損傷組織を再生する；筋肉および/または心臓組織などの損傷組織の生存率を向上させる；心臓組織、筋肉組織、骨格筋組織、血管、毛細血管、または筋細胞などの新しい組織の形成を促進する；心臓再生を促進する；急性心臓事象に罹患している対象において心臓再生を促進する；心筋梗塞を患っている対象において心臓再生を促進する；デュシェンヌ型筋ジストロフィ−（DMD）またはデュシェンヌ型筋ジストロフィ−（「DMD」）関連心筋症に罹患している対象の心臓再生を促進する；加齢関連疾患に罹患している対象の心臓再生を促進する、例えば慢性閉塞性肺疾患（「COPD」）、関節炎、骨粗鬆症、変形性関節症、糖尿病、血管性認知症、または黄斑変性；脳卒中、関節炎、アルツハイマ−病、記憶喪失障害、嚢胞性線維症、炎症性疾患および癌のうちの1つまたは複数から損傷を受けた組織の再生を促進する；心臓梗塞により損傷を受けた組織における心臓壁厚の減少；プロテインキナ−ゼＣ、IL − 6、mmp、PDGFのうちの1つ以上の遺伝子発現を変化させる；場合によりケモカイン、マクロファ−ジまたはサイトカインである炎症性タンパク質の発現を減少または阻害する；下記の群から選択される疾患に罹患している被験体における直接的または間接的な血管新生の刺激、心臓再生の促進：冠状動脈疾患、心筋梗塞、心不全、低形成性左心症候群、末梢動脈疾患（PAD）、心臓肥大、心臓弁膜症（大動脈弁狭窄）、心筋肥大、肥大性線維症；細胞複製を直接的および/または間接的に阻害する。該方法は、有効量のエキソソ−ムまたは微小胞、細胞、集団またはそれらを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することによって達成される。該方法は、有効量の非胚性幹細胞または前駆細胞を対象に投与することをさらに含むことができ、それは場合により修復を必要とする同じまたは異なる種類の組織である。一方では、非胚性幹細胞または前駆細胞は、被験体にとって自己由来である。一方では、非胚性幹細胞または前駆細胞は、被験体にとって同種異系である。エキソソ−ムまたは微小胞、細胞、集団は、局所的または全身的に被験体に送達することができる。これらの方法によって適切に治療される対象には、動物、哺乳動物およびヒトの患者が含まれる。治療の有効性を決定する方法は当技術分野において公知であり、そのいくつかは本明細書に記載されており、有効量の細胞、エキソソ−ムもしくは微小胞またはそれらを含む組成物をそれを必要とする対象に投与することによって行われる。上記のように、治療の有効性を決定するための方法は当技術分野において公知であり、そのうちのいくつかを本明細書に記載する。
【０２８０】
該方法は、有効量の非胚性幹細胞または前駆細胞を対象に投与することをさらに含むことができ、それは、場合により、修復の組織の種類とは異なる種類の修復を必要とする組織と同じ種類のものである。細胞は、非胚性幹細胞であり得るか、または前駆細胞は対象にとって自己由来または同種異系であり得る。
【０２８１】
任意の適切な投与方法が使用され得る。例えば、治療を行う獣医師または医師によって決定された局所、注入または静脈内投与のこと。適切な投与経路および投与量はまた、治療されている対象の年齢、健康状態および性別ならびに製剤にも依存する。有効量は、治療を行う獣医師または医師によって経験的に決定され得る。一方では、細胞、エキソソ−ムまたは微小胞または組成物は、対象の組織に局所的または全身的に、あるいは心筋内もしくは冠状動脈内経路によって送達される。
【０２８２】
hiPSＣを有効量のジビノスタット（GIV）と接触させることによって、あるいは、有効量のGivinostat（GIV）の存在下で細胞を有効期間培養することによって、ヒト人工多能性幹細胞（股関節SＣ）の集団から心臓または骨格筋原性前駆細胞の集団を調製する方法も提供される。一方では、GIVの有効量は、1×10 6細胞あたり約100nM〜約30nMを含み、本明細書に記載されるようにその間の範囲である。さらに、細胞を無血清培地および有効量のRho関連キナ−ゼ（ROＣK）阻害剤の存在下で有効期間培養する。そのような非限定的な例は上記に記載されており、そして参照により本明細書に組み入れられる。また、有効量のTGF−ベ−タ−1型受容体阻害剤を培地に添加する。TGF−ベ−タ−1型受容体阻害剤の非限定的な例は上記に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８３】
細胞を適切な条件下で培養した後、本明細書に記載の方法および当技術分野で公知の方法を用いて細胞培養上清から細胞を単離する。
【０２８４】
精製方法に応じて、細胞組成物は、精製、高度精製、均質、または実質的に均質、および/または上記のような所望の純度パ−セントを有するものである。それらの細胞は、本明細書に記載の方法または当技術分野で公知の方法を用いて標識をそれらに結合させることによって細胞に検出可能な標識を添加することによって検出可能な標識を付けることができる。さらに、エキソソ−ムまたは微小胞は、本明細書中に記載されそして当該分野で公知の方法を用いて細胞から単離される。
【０２８５】
細胞および/またはエキソソ−ムもしくは微小胞は、担体と混合または組み合わせることができ、ここで担体は場合により天然に存在しない担体である。
【０２８６】
防腐剤または抗凍結剤は、細胞、エキソソ−ムまたは微小胞またはそれらを含む組成物と組み合わせるかまたは混合することができる。これらの組成物は、当該分野で公知の方法を使用して凍結乾燥され得、そして/または使用を容易にするために適切な剤形に処方され得る。
【０２８７】
細胞、エキソソ−ムまたは微小胞およびそれらを含む組成物は、骨格筋を再生する、または心筋を再生する、および/またはそれを必要とする対象に有効量の細胞集団を投与することによってDMDを治療する方法において有用である。任意の適切な投与方法が使用され得る。例えば、治療を行っている医師によって決定された局所、注入または静脈内投与のこと。それはまた、治療されている対象の年齢、健康状態および性別ならびに製剤にも依存する。有効量は、治療を行う医師によって経験的に決定され得る。一方では、細胞、エキソソ−ムまたは微小胞または組成物は、対象の組織に局所的または全身的に、あるいは心筋内もしくは冠状動脈内経路によって送達される。治療の有効性を決定するための方法は当技術分野において公知であり、そのうちのいくつかを本明細書に記載する。
【０２８８】
合成MicroRNA−146 a（miRNA−146 a）、またはその断片を含む、損傷または罹患心臓組織の修復または再生のための組成物も提供される以上、場合により医薬的に許容される担体、そして場合により組成物は精製された、高度に精製された、または実質的に均質である。さらに、組成は不均一であり得る。合成 mRNA−146a は、 Sigma Aldrichなどの業者から市販されているか、または従来の技術を使用して製造することができる。一方では、MicroRNA断片またはその誘導体は、MicroRNA（miRNA）生合成経路を利用する人工MicroRNA（ amiRNA）技術などの技術を用いて合成的に生成されて、以下のステップでmiRNA遺伝子バックボ−ンを使用して人工的にデザインされたsmall RNAを製造する：ステップ1：遺伝子コ−ド配列から標的miRNAを予測する；ステップ2： miRから人工 miR ＊配列を予測する。ステップ3：プレMicroRNAの二次構造からプライマ−を予測する。さらに、MicroRNAフラグメント、またはその誘導体は、1つ以上の内因性MicroRNA分子を模倣する配列を用いて合成されて、内在性のmiRNAを模倣し、miRNA活性のアップレギュレ−ションによるmiRNA機能解析を可能にする、小さな化学修飾された二本鎖RNAであるmiRNA模倣物のような技術を使用する。miRNA阻害剤は、内因性miRNA分子に特異的に結合してそれを阻害し、miRNA活性のダウンレギュレ−ションによるmiRNA機能解析を可能にするように設計された、小型の化学修飾された一本鎖RNA分子である。また、ここで、MicroRNA断片またはその誘導体は、特異的シグナル伝達経路を微調整するため、または疾患によって誘発されるmiRNA機能を遮断するためにmiRNA活性を阻害する抗miRNAオリゴヌクレオチドなどの技術を用いてそれらの安定性を高めるために修飾される。これらの抗miRNAオリゴヌクレオチドは、安定性を増強し、親和性を標的とし、そして細胞取り込みを促進するように修飾することができる。AntagomiRは、以下の1つ以上の方法で修飾された抗miRNAである： (1) ヌクレア−ゼ耐性を増強し標的RNAへの結合親和性を改善するためのリボ−ス糖の2’−O−メチル化； (2) ホスホジエステルとホスホロチオエ−トのバランスがヌクレア−ゼに対するオリゴヌクレオチドの安定性を高め、安定性を提供するためのヌクレオチド間のホスホロチオエ−ト結合；および(3) 細胞取り込みを促進するための3’UTRでのコレステロ−ル抱合。ロックド核酸（LNA−）−修飾オリゴヌクレオチドは、リボ−スが2−0、4−CメチレンブリッジによりC3−末端立体配座に固定された2 ‘糖修飾を持つ抗miRNAで、相補鎖 RNA に対する親和性を強く高めて、二本鎖融解温度のmiRNA阻害の増加は、標的miRNAに相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドである抗miRNAによって達成される。Antagomi RおよびLNAオリゴヌクレオチドは、取り込みおよび安定性を改善するために修飾された抗miRNAである。Micro−ma 195阻害剤の例は知られており、Sigma−Aldrich（ HSTUD0320 SIGMA MISSION（登録商標） 合成MicroRNA阻害剤、 Human hsa−miR−195−5p）と abmgood.com （抑制性hsa−miR−195−5p miRNA/マイクロRNAレンチベクタ−）によって販売されている。
【０２８９】
マイクロ−ma 373模倣物の例は、Sigma−AldrichによりMISSION（登録商標） マイクロRNA模倣物 hsa−miR−373 *（sigmaaldrich com/catalog/product/sigma/hmi 0531 lang=en＆region=US）として知られ、販売されている。追加のマイクロ−ma 373模倣物、 mir−373 阻害剤、 mir−373 oglio ' s、mir 373発現ベクタ−、 mir−373 前駆体は以下により公知であり、そして販売されている： Switchgear genomics ( switchgeargenomics.comproducts/lightswitch−mirna−mimics−inhibitors/inhibitors/mir−300−399）、mir373阻害剤（switchgeargenomics.com/products/lightswitch−mirna−mimics−inhibitors/mir−300−399）。miR373模倣物 ( switchgeargenomics.com/products/synthetic−Zutr−goclone−reporters/mir−300−399 ( miR 3 ' UTR レポ−タ− ) )；サ−モ−フィッシャ−（ thermofisher.com/us/en/home/life sciencelepigenetics−noncoding−rna−research/mirna−analysis/mirna−mimics−inhibitors/mirvana−mimics−inhibitors.htmlと thermofisher.com/us/en/home/life−science/epigenetics noncoding−rna−research/mirna−analysis/mirna−mimics − in hibitors/ambion−pre−mir−precursors.html .）
【０２９０】
IDTオリゴを使用することが可能であり、そして市販されている (  idtdna.com/pages/decoded/decoded−articles/product−spotlight/decoded/2012/04/11/inhibiting−mirnasusing−antisense−oligonucleotides 参照)。その他はQiagenから購入できる ( qiagen.com/us/shop/genes−and−pathways/mirna−details.aspx ? mirnaid=7344 )。
【０２９１】
miRNA組成物は、本明細書に記載の方法または当技術分野で公知の方法を使用してそれらに標識を結合させることによってmiRNAに検出可能な標識を付加することによって検出可能に標識することができる。miRNAは、場合によっては天然に存在しない担体である担体と混合または組み合わせることができる。防腐剤または抗凍結剤は、miRNAまたはそれらを含有する組成物と組み合わせるか又は混合することができる。これらの組成物は、当該分野で公知の方法を使用して凍結乾燥され得り、または使用を容易にするために適切な剤形に処方され得る。
【０２９２】
さらに、これらの組成物を作製する方法は、当技術分野において公知の技術を用いて合成リポソ−ムに封入またはコンジュゲ−トされる。「リポソ−ム」は、同心円状の脂質二重層からなる微視的小胞である。構造的には、リポソ−ムは、長チュ−ブから球までのサイズおよび形状の範囲であり、寸法は数百オングストロ−ムから数分の1ミリメ−トルの範囲である。小胞形成脂質は、外層の脂質組成を提供する最終複合体の特定の程度の流動性または剛性を達成するために選択される。これらは中性（コレステロ−ル）または双極性であり、ホスファチジルコリン（PＣ）、ホスファチジルエタノ−ルアミン（PE）、ホスファチジルイノシト−ル（PI）、およびスフィンゴミエリン（SM）および他の種類の双極性脂質などのリン脂質を含めて、ジオレオイルホスファチジルエタノ−ルアミン（DOPE）を含み、これに限定されないが、14〜22の範囲の炭化水素鎖長、および飽和または1つもしくは複数の二重Ｃ ＝ Ｃ結合を有する。単独で、または他の脂質成分と組み合わせて安定なリポソ−ムを産生することができる脂質は、リン脂質は、例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（HSPC）、レシチン、ホスファチジルエタノ−ルアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノ−ルアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシト−ル、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ステアロイルホスファチジルエタノ−ル−オラミン（DSPE）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、パルミトイルノ−トオイルホスファチジルコリン （POPC）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノ−ルアミン（POPE）およびジオレオイルホスファチジルエタノ−ルアミン4−（N−マレイミド−トリエチル）シクロヘキサン−1−カルボキシレ−ト（DOPE−mal）である。リポソ−ムに組み込まれるようになり得るさらなるリン非含有脂質としては、例えばステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、イソプロピルミリステ−ト、トリエタノ−ルアミン−ラウリルスルフェ−ト、アルキル−アリ−ルスルフェ−ト、アセチルパルミテ−ト、グリセロ−ルリシノレエ−ト、ヘキサデシルステレ−ト、両性アクリルポリマ−、ポリエチルオキシ化脂肪酸アミド、および上記のカチオン性脂質 ( DDAB、DODAC、DMRIE、DMTAP、DOGS、DOTAP ( DOTMA )、DOSPA、DPTAP、DSTAP、DC−Chol )。負に荷電した脂質には、ホスファチジン酸（PA）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロ−ル（DPPG）、ジオテイルホスファチジルグリセロ−ル、および（DOPG）、小胞を形成することができるジセチルホスフェ−トが含まれる。典型的には、リポソ−ムは、それらの全体の大きさおよびラメラ構造の性質に基づいて3つのカテゴリ−に分類することができる。ニュ−ヨ−クアカデミ−科学会議、「リポソ−ムと生物学および医学におけるその使用」（1977年12月）によって開発された3つの分類は、マルチラメラベシクル（MLV）、スモ−ルユニラメラベシクル（SUV）およびラ−ジユニラメラベシクル（LUV）がある。生物学的に活性な薬剤は、本明細書に記載され、例えば、米国特許第 5512295 号と第 7401707号および第9554999号に記載されている方法に従って投与するためにそのようなも��にカプセル化することができる。これらの組成物は本明細書においてさらに提供される。
【０２９３】
合成miRNA組成物はそれを必要とする対象において組織を再生するのに有用であり、1つ以上のマイクロRNAフラグメントまたはその誘導体を対象に投与することによって、1つ以上のマイクロRNAフラグメントを投与した後、1つ以上のマイクロRNAフラグメントは損傷組織における遺伝子発現を変化させて、前記損傷組織の生存能力を改善し、そして被験体における新しい組織の形成を促進する。
【０２９４】
任意の適切な投与方法が使用され得る。例えば、治療を行っている獣医師または医師によって決定された局所、注入または静脈内投与。それはまた、治療されている対象の年齢、健康状態および性別ならびに製剤にも依存する。有効量は、治療を行う獣医師または医師によって経験的に決定され得る。方法が有効であるかどうかを決定するための方法は当技術分野において公知であり、そのいくつかを本明細書に記載する。
【０２９５】
細胞がエキソソ−ムまたは微小胞を分泌するように誘導し、それによってエキソソ−ムまたは微小胞を生成するため、ヒドロラ−ゼ酵素の存在下で非胚性ヒト再生細胞の集団を培養することを含む、エキソソ−ムまたは微小胞の集団を単離する方法も提供される。さらに、分泌されたエキソソ−ムまたは微小胞は培地から単離または精製される。一方では、分泌されたエキソソ−ムまたは微小胞は培地から単離したり精製される。そのような非限定的な例には、リソソ−ム酸性スフィンゴミエリナ−ゼ、分泌型亜鉛依存性酸性スフィンゴミエリナ−ゼ、中性スフィンゴミエリナ−ゼ、およびアルカリ性スフィンゴミエリナ−ゼの群から選択されるスフィンゴミエリナ−ゼが含まれる。また、中性スフィンゴミエリナ−ゼは、マグネシウム依存性中性スフィンゴミエリナ−ゼおよびマグネシウム非依存性中性スフィンゴミエリナ−ゼのうちの1つまたは複数を含む。そのような非限定的な例には、中性スフィンゴミエリナ−ゼタイプI、中性スフィンゴミエリナ−ゼタイプ2、および中性スフィンゴミエリナ−ゼタイプ3が含まれる。
【０２９６】
細胞集団の方法と使用
本明細書のさらに別の実施形態は、それを必要とする組織または宿主において心機能を回復させるための方法である。この用途および他の治療用途、診断用途、および研究用途は本明細書に記載されている。
【０２９７】
一実施形態では、本発明は、以下のうちの1つまたは複数の方法を提供する：損傷または罹患心臓の瘢痕組織である心筋組織を再生すること；心機能の改善、またはそれを必要とする患者における心疾患または状態の治療。再生したい組織を有効量のイソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物と接触させる方法を使って、またはそれを必要とする対象および/または有効量の上記化学修飾細胞もしくは化学修飾細胞の集団への投与による。さらに、iPS細胞または他の前駆細胞もしくは幹細胞など単離された細胞は、有効量のイソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物内で局所投与される。一方では、処理したiPS細胞は心臓の瘢痕組織に筋線維を形成する筋細胞に分化した。それらの細胞は、宿主または患者に対して自己由来または同種異系であり得る。 対象および細胞は、本明細書中に記載されるような任意の種であり得る。
【０２９８】
本発明のさらに別の実施形態は、上記のような有効量の化学修飾細胞または化学修飾細胞の集団を宿主に投与することによって適切な宿主において心筋組織を再生するための方法である。その細胞は、宿主または患者に対して自己由来または同種異系であり得る。その対象および細胞は、上記のように任意の種であり得る。
【０２９９】
また、該方法は、それを必要とする患者に有効量のiPS細胞および有効量のイソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物を投与することを含む。投与は損傷部位に局所的であり得り、そして細胞およびイソオキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物の患者の心臓への直接注射を含み得る。この方法はまた、本明細書中に記載されるような併用療法を含む。例えば、この方法は、この治療の前、後、またはそれと同時に、有効量の電気刺激と組み合わせることができる。この方法はまた、有効量の他の心臓誘導低分子化合物と組み合わせることができる：
【０３００】
１）Wnt /β−カテニン阻害剤、例えば IWR−1、IWP 1 .FDA承認の Pyrvinium（一般的な商品名はVanquinである） という薬と配合している。他の新規低分子化合物にはそれはWnt/B−カテニン経路を標的とするICG−001（化学名：（65，9 aS）−ヘキサヒドロ6−［（4−ヒドロキシフェニル）メチル］−8−（1−ナフタレニルメチル）−4、7−ジオキソ−N−（フェニルメチル）−2H−ピラジノ[1,2−a]ピリミジン−1（6H）−カルボキサミド）が含まれる。
【０３０１】
２）低分子化合物ITD−1などのTGF−B阻害剤、化学名：（ 4−[1、1 '−ビフェニル]−4 − yl 1、4、5、6、7、8−ヘキサヒドロ−2、7、7−トリメチル−5−oxo−3−キノリンカルボン酸エチル）
【０３０２】
３）プロスタグランジンとCOX−2。シクロオキシゲナ−ゼ2（COX−2）の活性化とそれに続くMIによって誘発されるプロスタグランジンE 2（PGE 2）の産生（PGE 2）は、Dinoprostoneというブランド名の下で分娩誘発のためのFDA承認の治療法である。他の例は低分子化合物 ONO−1301 を含む−Sigma−Aldrichから供給された、7，8−ジヒドロ−5−［］（E）−［［c−（3−ピリジル）ベンジリデン−アミノオキシエチル］ −1−ナフチルオキシ］酢酸の同義語を持つPGI2の低分子化合物アゴニスト。
【０３０３】
４）顆粒球コロニ−刺激因子またはG−CSFと組み合わせたDPP−IV阻害剤。（このアプロ−チが2つの分子を組み合わせる：ジペプチジルペプチダ−ゼIV（DPP−IV）の低分子化合物阻害剤、SDFを分解する酵素−1a、およびマトリックスメタロプロテイナ−ゼ2を介した骨髄からの幹細胞の放出を促進する生体分子顆粒球コロニ−刺激因子（G−CSF））
【０３０４】
５）アンジオテンシン（1−7）および Mas 受容体（式： C41H62N 2011、 Tochrisによって供給される）。
【０３０５】
併用療法は、治療される状態、患者の健康状態および特定の併用療法の選択によって決定されるように、連続的または同時的であり得る。
【０３０６】
一方では、幹細胞またはiPS細胞は、幹細胞由来の心臓パッチの形で投与される（例えば、成人または骨髄由来前駆細胞、iPS細胞、iPS細胞由来心臓系統細胞、小さな未成熟幹細胞および/または心臓病における心臓修復のための人工組織心臓パッチ移植）。したがって、一態様では、幹細胞は、骨髄中に存在する（骨髄幹細胞内に含まれる）非常に小さな幼若幹細胞、または（循環血および心臓由来の幹細胞内に含まれた）末梢血細胞を含む。これらの細胞は、著しく高い増殖能および分化能を有し、そしてまた、イソキサゾ−ルもしくはイソオキサゾ−ル類似化合物またはWnt阻害剤を用いて容易に再プログラミングおよび/または心臓前駆体に変換され得る。従って、この方法は安全な細胞移植のためにiPS細胞の誘導を必要としない。本開示はまた、イソキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル類似化合物で処置されたiPS細胞の誘導体および瘢痕領域にわたって投与されたWnt阻害剤で心臓パッチを適用することによって幹細胞の生存および分化を促進する方法を提供して、宿主細胞とのパッチ細胞（筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞（図14A〜14H））のより良好な浸透、移動および統合を可能にする。
【０３０７】
本開示はまた、有効量の電気刺激を幹細胞に加えることを含む、試験管内で幹細胞の生存および分化を促進するための方法を提供する。一方では、有効量は、電気刺激が約1〜約5時間、約1．0V/1．5cm〜約2．0V/2．0cmを含むことを包含する。
【０３０８】
本開示はまた、イソキサゾ−ルおよびイソオキサゾ−ル様化合物によってiPSＣ由来筋前駆細胞（MPＣ）を生成するための方法、ジストロフィ−骨格筋における前駆細胞の動員および生着を促進するためにMPCにおける機能的CXCR4発現を誘導する骨格筋の、およびそれらの前処理または治療を提供する。図15A〜図15Bを参照する。MPCがDMDの実行可能な治療選択肢となるためには、ジストロフィン遺伝子発現は筋肉収縮性を回復するのに十分でなければならない。したがって、開示された方法からのMPＣは、移植のための豊富な細胞源を提供し、そしてジストロフィ−筋の再生のための有効かつ安全な治療を提供する。有効量のステロイドによる治療など、宿主筋の微小環境を最適化する方法と組み合わせたiPSC由来前駆細胞の移植は、ジストロフィ−病理をより効果的に改善し、DMD患者の生活の質を改善するであろう。
【０３０９】
この方法によって適切に治療される患者には、心機能不全に関連する疾患または障害を患っている患者が含まれる。その心機能不全は鬱血性心不全、孤立性拡張期心不全、心筋梗塞、および心不整脈を含むがこれらに限定されない。治療することができる心臓不整脈のいくつかの形態があり、これらに限定されないが、不整脈症候群、徐脈性不整脈機能、異常な洞結節機能、房室ブロック、ならびに心房性および心室性頻脈性不整脈が挙げられる。
【０３１０】
イソキサゾ−ルまたは同様の化合物で処理されたiPS細胞と共にカテ−テルまたは心臓パッチを使用することによる細胞または組成物の局所的または全身的投与は、一回の投与で、連続的にまたは間欠的に治療過程を通して行うことができる。最も効果的な投与手段および投与量を決定する方法は当業者に知られており、治療に使用される組成物および/または細胞、治療の目的および治療される対象によって変わるであろう。単回投与または複数回投与は、治療する医師によって選択される用量レベルおよびパタ−ンで実施することができる。適切な剤形および細胞または薬剤を投与する方法は当技術分野において公知である。さらに、本発明の細胞および組成物は他の治療と組み合わせて投与することができる。
【０３１１】
細胞および細胞集団は、当技術分野において公知の方法を用いて宿主に投与される。例えば、米国特許6638369に記載されたように。本発明の細胞または組成物のこの投与は、本明細書に記載のように疾患を治療し、そして実験およびスクリ−ニングアッセイのために所望の疾患、障害、または状態の動物モデルを作製するために行うことができる。
スクリ−ニングアッセイ
【０３１２】
本発明は、本明細書に記載の治療機能、ならびに遺伝子発現、細胞分化、エキソソ−ムまたは微小胞発現を調節する様々な薬剤をスクリ−ニングする方法を提供する。本発明の目的のために、「薬剤」は、生物学的または化学的化合物を含むことを意図しているが、それらに限定されない。例えば、単純または複雑な有機または無機分子、ペプチド、タンパク質（例えば抗体）、ポリヌクレオチド（例えばアンチセンス）またはリボザイム。膨大な数の化合物、例えばポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどのポリマ−、ならびに様々なコア構造に基づく合成有機化合物を合成することができ、これらも「薬剤」という用語に含まれる。 また、植物または動物の抽出物などの様々な天然源がスクリ−ニング用の化合物を提供することができる。薬剤が単独でまたは別の薬剤と組み合わせて使用され、本発明のスクリ−ニングによって同定された薬剤と同じかまたは異なる生物学的活性を有することが常に明確に述べられているわけではないことを理解されたい。
【０３１３】
インビトロでスクリ−ニング方法を実施するために、改変細胞を含む適切な細胞培養物または組織培養物が最初に提供される。作用物質が上記のような低分子化合物のようなDNAまたはRNA以外の組成物である場合、作用物質は細胞培養物に直接添加するか、または添加のために培地に添加することができる。当業者には明らかなように、経験的に決定することができる「有効な」マウントを追加しなければならない。作用物質がポリヌクレオチドである場合、それは遺伝子銃またはエレクトロポレ−ションの使用によって直接添加することができる。あるいは、遺伝子送達ビヒクルまたは上記のような他の方法を用いてそれを細胞に挿入することができる。陽性対照および陰性対照をアッセイして、薬物または他の薬剤の意図される活性を確認することができる。
【０３１４】
試料中のmiR − 195の発現レベルを決定することを含む、初期化のために細胞または細胞集団を選択する方法も本明細書で提供される。ここで、miR−195の低発現は細胞または集団を選択し、miR−195の低発現の欠如は細胞または集団を選択しない。さらに、該方法が、miR−29b、miR−205、miR−378、および miR−542−3p から選択された1以上のマ−カ−の発現レベルを決定することをさらに含む。ここで、1つ以上のマ−カ−の低発現は細胞または集団を選択し、そしてmiR−195の低発現の欠如は細胞または集団を選択しない。
【０３１５】
以下の方法は、本明細書に記載の発明を実施するのに有用である。
1号実験
【０３１６】
試験管内でhiPSCからの筋前駆細胞（MPC）の生成
【０３１７】
ヒト人工多能性幹（iPS）ヒト心臓線維芽細胞 ( ATCC（登録商標） ACS−1021TM ) から誘導された細胞を、ビトロネクチンXF ( STEMCELL Technologies Inc.) −コ−ト6ウェルプレ−ト上でmTeSRTM1 (STEMCELL Tech nologies Inc .)と共に培養した。iPS細胞をReLeSRTM ( STEMCELL Technologies Inc.) で4〜6日ごとに継代した。
【０３１８】
iPS細胞のMPCへの分化のために、iPS細胞をACCUTASETM（STEMCELL Technologies Inc）を用いて単一細胞に単細胞に解離させ、5μMRHO/ROCK経路阻害剤（Y−27632、STEMCELL Technologies Inc）を補充したmTeSRTM1を1x10細胞/ cm2で播種した。24時間後、培地を新しいmTeSRTM 1に交換した。 mTeSRTM1は最初の3日間毎日更新された。3日後、培地を20μM ISX−9（MedChem Express）を補充したmTeSRTM1に交換した。培地は一日おきに更新された。6日後、培地をN−2サプリメント（Thermo Fisher Scientific）および20μM ISX−9を補充した RPMI 1640培地（ Thermo Fisher Scientific）に交換し、さらに3〜6日間1日おきに更新した。エキソソ−ムまたは微小胞およびCpcの生成のための方法は、細胞培養、hiPSC維持を含む。
【０３１９】
ヒトiPS細胞（ACS−1021、ATCC、米国）が、毎日培地交換しながら、ビトロネクチンコ−ト6ウェルプレ−ト上のmTeSR1培地（Stem Cell Technology）の中で維持された。製造元のプロトコル（Stem Cell Technology）に従って、細胞を4〜7日ごとにReLeSRTM試薬で継代した。
CPCジェネレ−ション
【０３２０】
簡潔に述べると、m TeSR1培地（Stem Cell Technology）中のビトロネクチンコ−ト6ウェルプレ−ト上に維持されたhiPSCを、Accutase溶液（Invitrogen）を用いて37℃で10分間単細胞に解離させた。その後、5 UM ROCK阻害剤（Y−27632、Stem Cell Technology）を補充したm TeSR1中、1×10 6細胞/ウェルでビトロネクチン被覆6ウェルプレ−トに24時間播種した。次の日から、細胞を3日間毎日交換しながらmTesR1中で培養した。その後、培地を、7日間、ISX − 9（20μM、DMSOに溶解、 Stem Cell Technology）を補充したインスリンを含まないRPMI/B27に切り替えた。
EBジェネレ−ション
【０３２１】
出願人は、RPMI/B27マイナスインスリン培地中でハンギングドロップ法を用いてEBを生成した。心臓前駆細胞、EBまたはhiPSCからのエキソソ−ムまたは微小胞の生成および単離。
【０３２２】
エキソソ−ムまたは微小胞は、ヒトiPS細胞株ACS−1021（ATCC、米国）、胚様体（EB）、およびISX−9によって誘導されたCPCから生成した。10号実験に記載されているようにＣPＣを生成した。hiPSＣおよびＣPＣから馴化培地を収集した。馴化培地を3000rpmで30分間遠心分離して細胞および破片を除去し、続いて0．22μmフィルタ−を通して濾過して残りの破片を除去した。次に培地を、Amicon Ultra−15 100 kDa遠心フィルタ−ユニット（Millipore）を用いて500μlにさらに濃縮した。濃縮培地中のエキソソ−ムまたは微小胞の単離は、qEVサイズ排除カラム（Izon science）を使用した。エキソソ−ム画分または微小胞画分を集め、アミコンウルトラ−4 10KD a遠心フィルタ−ユニットにより＜100μlの最終容量まで濃縮した。精製したエキソソ−ムまたは微小胞を−80℃で保存した。 そしてその後、ナノトラッキング分析、タンパク質および超微細構造分析によって特徴付けられる。可変抵抗パルスセンシングによる粒径と濃度分布の測定
【０３２３】
エキソソ−ムまたはマイクロベシクル単離分析の粒径および濃度分布は、qNano装置（Izon Science）を用いた調整可能な抵抗パルスセンシング法を用いて行った。簡単に説明すると、粒子の数を、20ミリバ−ルの圧力および46．5〜47．5mmの間で延伸されたNP200ナノポア膜を用いて少なくとも600〜1000イベント数えた。較正は、既知濃度のビ−ズＣPＣ200（直径：210nm）を用いて行った。デ−タは、Izon Control Suiteソフトウェアを使用して処理した。
透過電子顕微鏡法
【０３２４】
エキソソ−ムまたは微小胞ペレットを4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定した。蒸留水を用いて合計8回洗浄した後、グリッドをシュウ酸ウラニル溶液と5分間対比させて、先の研究の記載に従って、グリッドを氷上で10分間メチルセルロ−ス−酢酸ウラニルに移した。試料をJEOL JEM−1220透過型電子顕微鏡（TEM）（JEOL USA、Inc.）で調べた。
選択された例示的な実施形態
【０３２５】
出願人は、iPScがDNA低メチル化に対して化学的に誘導されて心臓遺伝子の上方制御を引き起こし、そして腫瘍発生の可能性が全くないかまたは限られた機会で罹患心臓における成功裡の増殖を可能にし得ることを発見した。
【０３２６】
若いオスOct3/4−GFP +トランスジェニックマウスから精製した骨格筋芽細胞（SMS）を、ノックアウトDMEM中の0.5％DMSO中のDNAメチルトランスフェラ−ゼ阻害剤500μMRG−108で5日間処理した。二週間後、GFPを発現するSM由来iPS細胞（SiPS）のGFP ＋コロニ−およびマウス胚性幹細胞の形態学的特徴を単離し、試験管内で増殖させた。 SiPS は、アルカリホスファタ−ゼ活性について陽性であり、SSEA1を発現し、そしてES細胞と同様の多能性マ−カ−のパネル（図1）を示し、そしてヌ−ドマウスにおいて奇形腫を発症した。本明細書に記載の研究はマウスモデルで行われたが、同じマ−カ−および薬剤の使用は、ヒト細胞および組織において同一ではないにしても類似の結果をもたらすであろう。SiPSを心臓系統細胞に向けるために、それらを低分子化合物（イソキサゾ−ル、20μM、Sigm a−AldrichまたはIsox 9、StemCell Technologies、Inc Vancouver、BC）で5日間処理して、そのあと、DNAメチルトランスフェラ−ゼ（Dnmt）活性、細胞増殖、および心臓遺伝子発現について分析した。DNMT活性は、低分子化合物処理SiPSにおける全体的なDNAメチル化の95％の減少で完全に廃止された（図2）。これらのSiPSは、細胞増殖アッセイによって評価される増殖活性の増加（p ＜0．01対未処理Sip）を示し、そしてまた、虚血環境における細胞死を防ぐための重要な考慮事項であるアポト−シスに対して寛容になる（図3A〜3B）。低分子化合物処理したIPS細胞は、未処理のIPS細胞と比較して、細胞質へのチトクロ−ムcの移動の有意な減少を示す（図4）。
【０３２７】
ＳｉＰＳを心臓系統細胞に向けるために、それらを小分子( Isoxazole , 20 uM , Sigma − Aldrich or Isox 9 , StemCell Technologies , Inc Vancouver , BC )で５日間処理し、ＤＮＡメチルトランスフェラ−ゼ（Ｄｎｍｔ）活性、細胞増殖、および心臓遺伝子発現について分析した。ＤＮＭＴ活性は、小分子処理ＳｉＰＳにおける全体的なＤＮＡメチル化の９５％の減少で完全に廃止された（図２）。これらのＳｉＰＳは、細胞増殖アッセイによって評価された増殖活性の増加を示し（p<0.01対未処理SiPS）、そしてまたアポト−シスに対して寛容になる（図３Ａ〜３Ｂ）虚血性環境における細胞死を防ぐための重要な考察である。小分子処理したＩＰＳ細胞は、未処理のＩＰＳ細胞と比較して、細胞質へのチトクロ−ムｃの転位の有意な減少を示す（図４）。
【０３２８】
RT PＣR分析は、Nkx−2．5の有意な上方制御を伴う心筋細胞様遺伝子発現プロファイルを示した（p ＜0．01対未処理IPS；図5A〜5B参照）。処理したiPS細胞の約60％がNkx−2.5陽性でした。転写後調節が遺伝子発現に極めて重要であり、細胞生存率分子表現型分析が行われたことを考えると、Affymetrixアレイベ−スの遺伝子発現プロファイリングはさらに、グロ−バルDNA低メチル化およびmyc依存性細胞形質転換に関連したDnmt1、Dnmt3bおよびMax遺伝子関連タンパク質の2〜3倍の下方制御を確認した（表1参照）。さらに、ＣＣL7、ＣXＣR2、ＣXＣR5、内在性膜タンパク質2A、およびエフリンA3において2〜3倍の付随する上方調節があった（図6）。これらは、DNA合成、細胞増殖、細胞マトリックス相互作用および化学誘引と関連していた。miRマイクロアレイ分析は、心臓特異的miR−133、762の上方制御および多能性関連miR−290クラスタ−、miR−574−5pおよびlet−7ファミリ−の下方制御を示した（図7A〜7D参照）。ウエスタンブロット分析は、未処理のIPS細胞と比較して、Gaiタンパク質レベルの有意な上方制御を示した（図7E参照）。
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【０３２９】
低分子化合物で処理したSipsをそれらを心臓内に位置付けるためにPKH 26で染色し、30分間の冠状動脈結紮の6週間後に心筋に移植した。移植されたSipsの運命を視覚化するために心臓を採取する前に、心機能を心エコ−検査でモニタ−した。処置したSipsを瘢痕組織中に筋線維を形成する筋細胞に分化させた。左心室の瘢痕領域は、未処理/対照心臓（図8A）と比較して、アイソックス処理SiPSによる処理（図8B、8Ｃ、8D）で筋肉化された。これらは重要な発見であり、新しい写真だけが図にグラフで示されているので、最初の特許出願において以前に報告されている（図8A〜図8F参照）。 
【０３３０】
心臓機能：左室駆出率（LVEF）および左室分画短縮（LVFS）を含む全体的な心機能の経時的変化を、対照梗塞および治療梗塞心臓において測定した。収縮期（LVD）および拡張期（LVDd）中の左心室腔の寸法の病理学的リモデリングもまた、DMEMで治療された心臓（4.77 mmおよび4.78 mm）と比較して、CPで治療された心臓（2.97 mmおよび3.99 mm）において有意に減少した。図8Eを参照する。ＣPの移植は、DMEM注射梗塞心臓 ( n=4 ; 32.42 +−1.03 %と13.0 +−0.4 %) と比較して、LVEFおよびLVFS ( 56.8 +−1.32 % ; 25.5 +−0 .4 % ) を有意に改善した。図8Fを参照する。
【０３３１】
出願人はまた、イソオキサゾ−ルがiPS細胞においてDNA低メチル化およびmyc依存性細胞形質転換を誘導し、そしてDNA合成、細胞増殖、細胞マトリックス相互作用および走化性と関連していることを発見した。イソオキサゾ−ル化合物は、CXCケモカイン受容体および内在性膜タンパク質、Epherinファミリ−、ならびに赤血球生成の発生に特に関与する関連受容体を上方制御した。
【０３３２】
出願人はさらに、イソオキサゾ−ルが、未処理のiPS細胞と比較して、iPS細胞において心臓特異的miR−133、miR−762および多能性関連miR−290クラスタ−およびlet−7ファミリ−の下方制御を上方制御したことを発見した。（ 10333）従って、上記の報告は、iPS細胞の低分子化合物媒介修飾が梗塞心臓で成長し、電気的接続（ギャップ結合）と一緒に結合された作用筋細胞で瘢痕組織を置き換えることができることを報告している。スルホニルヒドラゾンファミリ−の低分子化合物は、筋芽細胞由来のiPS細胞に心臓遺伝子を誘導することができる。これらの低分子化合物は、ノッチ活性化心外膜由来前駆細胞において筋肉分化を誘導することが知られている ( Russell J.L.と他.( 2012 ) ACS Chem Biol.7 ( 6 ) : 1067−1076 )。低分子化合物誘導iPS細胞を虚血後モデルに移植し、未処置のiPS細胞と比較して全体的な心機能を改善した。心機能の回復は、iPS細胞由来前駆細胞の生存に依存していた。低分子化合物は、組織分化に向けてiPS細胞における組織特異的遺伝子発現を誘導すること、ならびに発生の時間的および空間的パタ−ンを決定することにおいて革新的である。
【０３３３】
したがって、上記の報告は、iPS細胞の小分子媒介修飾が梗塞心臓で増殖し、瘢痕組織を電気的接続（ギャップ結合）と一緒に結合した作用筋細胞で置き換えることができることを報告している。スルホニルヒドラゾンファミリ−の小分子は、筋芽細胞由来のiPS細胞に心臓遺伝子を誘導することができる。これらの小分子は、ノッチ活性化心外膜由来前駆細胞において筋肉分化を誘導することが知られている（Russell J . L . と他 (2012) ACS Chem Biol . 7 ( 6 ) : 1067 − 1076）。小分子誘導ｉＰＳ細胞は虚血後モデルに移植され、未処理のｉＰＳ細胞と比較して全体的な心機能が改善された。心機能の回復は、iPS細胞由来前駆細胞の生存に依存していた。小分子は、組織分化に向けてiPS細胞における組織特異的遺伝子発現を誘導すること、ならびに発生の時間的および空間的パタ−ンを決定することにおいて革新的である。
【０３３４】
出願人は、誘導された多能性幹細胞が適切な低分子化合物で処理された場合、DNAメチル化を薬理学的に阻害することができ、したがって心臓発生遺伝子の調節において重要な役割を果たすことを見出した。理論に縛られることなく、エフェリンファミリ−に対する低分子化合物の効果は、造血前駆細胞生成のプロセスを操作し得、そして臨床造血系悪性腫瘍にとって有益であり得る。
［０３３５］
本出願人はまた、イソオキサゾ−ルが、未処理のiPS細胞と比較して、iPS細胞において心臓特異的miR−133、miR−762および多能性関連miR−290クラスタ−およびlet−7ファミリ−の下方制御を上方制御したことを発見した。
［０３３６］
エリックオズロンは、米国特許第8318951号（951特許）で神経発生、心外膜前駆細胞におけるこれらの化合物の使用を以前に報告した。これらの研究にかかわらず、本明細書に報告された発見は、梗塞心臓における増殖のためにiPS細胞をレンダリングするために操作され得る低分子化合物誘発エピジェネティックな変化に取り組むという点で独特かつ革新的である。この研究は、患者の細胞（この場合は骨格筋）から作製され得、そして低分子化合物による前処置の後に同じ患者に再導入され得るiPS細胞を強調する。本開示のiPS細胞は冠状動脈結紮または心臓発作後のマウス心臓の瘢痕組織における増殖のために治療的に事前設計された（または前処理された）ので、これらの発見はOslonの研究とは異なる。iPS細胞による瘢痕組織の有意な再生がある。また、オルソンは心臓に存在する心臓の先祖に作用するために生きているマウスに薬を注射した。薬剤が心臓のさまざまな細胞に作用したというのが出願人の考えである。ここで、組成物および方法は、ディッシュ中の心臓前駆細胞にiPS細胞を予め設計し、次いで損傷を受けた心臓に再導入した。
［０３３７］
出願人はまた、低分子化合物によるIPS前処理がアポト−シスを減少させることも見出し、これもまた新規な発見である。例えば、誘導されていないiPS細胞と比較して、低分子化合物誘導iPS細胞ではより少ないアポト−シスが観察された。’951特許に報告された結果は、虚血条件下での細胞生存において重要である細胞アポト−シスではなく、細胞生存率についてのトリパンブル−排除アッセイを用いてのみ生成された。
［０３３８］
出願人はまた、DNAメチルトランスフェラ−ゼ（DNMT）活性が化学的に修飾されたIPS細胞において完全に廃止されることを見出した。DNA低メチル化および細胞形質転換に関連する低分子化合物修飾iPS細胞において、Dnmt1、Dnmt3bおよびMax遺伝子関連タンパク質の2〜3倍の下方制御があった。細胞動員、走化性、癌および赤血球生成に関連するCCL7、CXCR2、CXCR5、内在性膜タンパク質2A、およびEphrinA3の2〜3倍のアップレギュレ−ションが観察された。出願人はさらに、心原性特異的miR−133、miR−762の上方制御および多能性マ−カ−の下方制御、また、多能性関連miR−290−295クラスタ−とlet−7ファミリ−を観察した。これは、多能性遺伝子を下方制御することによってマイクロRNAによる心臓調節遺伝子の誘導を確認する。
［０３３９］
また、951特許は、ここで報告された研究と比較して、Gaタンパク質レベルを観察しなかったが、この報告書は、化学修飾されたiPS細胞をGPＣR遮断薬で処理したときに遮断され、低分子化合物誘発iPS細胞における全てのインビトロ効果を無効にした、G aタンパク質レベルの上方制御を観察した。オスロンは以前、神経発生、心外膜前駆細胞におけるこれらの化合物の使用を報告した。以前の研究に関係なく、iPS細胞を梗塞心臓での増殖に適したものにするために操作することができる低分子化合物誘導エピジェネティックな変化に取り組む現在の発見はユニ−クで革新的であると出願人は信じている。イソキサゾ−ルおよび類似の低分子化合物で初回抗原刺激されたiPS細胞は、筋細胞以外にも血管（内皮）前駆細胞および平滑筋細胞に変換され得るという別の新規性がここに示される。
［０３４０］
以下の実施例2に報告された出願人の知る限りの知識および結果によって、それはイソオキサゾ−ルと他の似たような小さな分子が体の他の幹細胞に作用するということである。例えば、骨髄と心臓由来の幹細胞は、イソオキサゾ−ルのような低分子化合物薬で、筋細胞や内皮細胞や平滑筋に直接再プログラムする。従って、イソオキサゾ−ルおよび類似の低分子化合物は患者の心臓への注射など直接投与することができる。例えば、瘢痕組織を置換するために虚血部位に動員された炎症性細胞および幹細胞を心臓細胞に変換するための心臓発作患者。最終的な効果は、心臓発作の後に損傷を受けた心臓の再生を助けることである。開示された方法は、以前に承認された化合物を使用して、非ウイルスベ−スであるという利点を有し、それは臨床的な採用を単純化する。さらに、開示された方法は、それらを胚様体に変換することなく、イソオキサゾ−ルまたは他の類似のカルジオニオジンのような低分子化合物で治療した後数週間以内に、単層のiPSCの一段階治療において心臓前駆細胞を劇的に増加させるであろうと本出願人は思料している。 CDNG1/vuc230、CDNG2/vuc198、および CDNG3/vuc247 .
［０３４１］
iPS細胞を使用する際の現在のアプロ−チは、遺伝子変異および/または腫瘍（癌など）増殖対出願人の方法、アプロ−チおよび技術などの制限である。この方法は、遺伝子変異が必要ではないという点で有益であり、臨床使用のための安全性を改善する。
［０３４２］
それは出願人の信念であり、出願人の知る限りでは、現在報告されている研究は、心臓遺伝子の上方制御のためにそれらのクロマチン配置を変えることによってiPS細胞を治療上安全に使用できるようにすることができるという最初の証拠を提供している。これらのいわゆる心臓前駆細胞は、限られた細胞死で死にかけている心筋を増殖および再生することができる。iPS細胞を望ましい心臓系統に再プログラムすることは、心臓治療における賢明な戦略である。
実験方法
マウスSiPSのメンテナンス
［０３４３］
20％ノックアウト血清代替物 ( KSR ; Invitrogen、米国 ) 、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液 ( Invitrogen、CA、USA ) 、0．2mM L−グルタミン（Invitrogen、米国）、0．1mM B−メルカプトエタノ−ル（Invitrogen、米国カリフォルニア州）および1000U/ml LIF（Millipore）0．5％ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したノックアウトダルベッコ改変イ−グル培地（ノックアウト−DMEM、インビトロジェン、カリフォルニア州、米国）中のマイトマイシンＣ処理マウス胚性線維芽細胞（MEF）皿上でSiPSを維持した。このようにして生成されたコロニ−を、0．025％トリプシンを含む単細胞懸濁液（Sigm a Aldrich、MO、USA）に解離させた0．2％コラゲナ−ゼ−1V（Invitrogen、ＣA、USA）を用いて3〜4日の間隔で定期的に剥離して、MEF上に再プレ−ティングした。
細胞増殖アッセイ
［０３４４］
メ−カ−（Promega）の推奨に従ってMTS［3−（4，5−ジメチルチアゾ−ル−2−イル）−5−（3−カルボキシメトキシフェニル）−2−（4−スルホフェニル）−2H−テトラゾリウム］アッセイを用いて細胞増殖アッセイを行った。自動ELISAプレ−トリ−ダ−を用いて、培養中の生細胞の数に正比例したホルマザン生成物の量についてプレ−トを490nmで読み取った。
DNAメチルトランスフェラ−ゼ（DNMT）活性アッセイ
［０３４５］
核抽出物は、NE−PER核および細胞質抽出キット（Thermo Scientific、IL、米国）を用いて単離した。全DNMT活性は、EpiQuik DNAメチルトランスフェラ−ゼ活性アッセイキット（Epigen tek、Brooklyn、NY）を製造元のプロトコルに従って用いて決定した。試料および対照の酵素活性は、マイクロプレ−トリ−ダ−（Hidex Chameleon、フィンランド）を用いて450 nmで測定し、DNMT活性（OD/h/ml）はの（サンプルOF−ブランクAND）/（サンプル容量）1000の式に従って計算した。
RT−PCRおよび定量的RT−PCR
［０３４６］
低分子化合物処理および非処理SiPS細胞からの全RNAをRNe asyミニキット（キアゲン、メリ−ランド、米国）を用いて単離し、そしてオムニスクリプト逆転写キット（キアゲン、メリ−ランド、米国）をメ−カ−の指示に従ってそれぞれのcDNA合成に使用した。PCR増幅の場合、逆転写反応からのcDNA1μgを、推奨量のPCR緩衝液、Q溶液、dNTP混合物、逆方向および順方向プライマ−、Taq DNAポリメラ−ゼおよび蒸留水を含むPCR混合物に添加した。PＣR条件は、95℃で4分間の初期変性、95℃で1分間の変性の32サイクル、55℃で1分間のアニ−リング、72℃で1分間の伸長および72℃で 7分 間の最終伸長を含んだ。PＣR生成物を1．5％アガロ−スゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色しそして可視化しそしてUVトランスイルミネ−タ− ( Bio−Rad、USA ) 上で写真撮影した。
［０３４７］
心筋梗塞モデル
動物を（ケタミン/キシラジン0.05ml腹腔内）で麻酔した。挿管のために正中線頸部皮膚切開を行った。げっ歯類換気装置（Model 683、米国マサチュ−セッツ州ハ−バ−ド装置）を使用して、動物に酸素を補充した室内空気（1．5L /分）で機械的に換気した。体温をプロ−ブ（Cole−Parmer Instrument、イリノイ州、米国）で注意深くモニタ−し、外科的処置を通して37℃に維持した。心臓を左側限定開胸術により露出させ、左前下行冠動脈をプロレン＃9−0縫合糸で結紮した。心筋虚血は左心室壁の色の変化によって確認された。細胞を含まない10μLの基礎DMEM（グル−プ−1）、または3.6x10^5 SiPSを含む（グル−プ2）、または 3.6x105 SiPS−CPs を含む（グル−プ3）の心筋内注射のために動物をグル−プ（グル−プ当たりn ＝ 12）分けした。冠状動脈結紮の10分後に、直視下で左心室の自由壁の虚血性領域の周囲の複数の部位（心臓あたり3〜4部位）に細胞を注射した。移植細胞の生着後の追跡およびそれらの運命の決定のために、製造者の指示に従って細胞をPKH26（Sigm a、製品番号 PKH26−GL）で標識した。疼痛を軽減するために、手術の最初の24時間でBuprinex（0.05ml）を皮下注射した。心機能評価のために、経胸壁心エコ−検査の4日後および6〜8週後に動物を安楽死させた。心臓を凍結するか、または10％ホルマリン溶液で固定し、免疫組織学的研究のためにパラフィン包埋処理した。
経胸壁心エコ−検査
［０３４８］
動物（1群あたりn ＝ 8）を麻酔し、暖かいパッド上で仰向けの位置に軽く固定した。胸部を剃毛した後、アコ−スティックゲルを適用し、7 MHzトランスデュ−サ−付きのHDI−5000 SONOS−CT（HP）超音波装置を用いて経胸壁心エコ−検査を行った。心臓は傍胸骨長軸像および/または傍胸骨短軸像で二次元モ−ドで撮像され、その後Mモ−ドカ−ソルを心室中隔および左心室後壁に対して垂直に配置するために使用された。その後、モ−ド画像が得られた。各動物について、4〜5連続心周期から測定値を得た。心室中隔厚（VST）、左心室内寸法（LVID）、および左心室後壁厚（LVPW）の測定は、収縮期および拡張期の両方における左心室の二次元指向Mモ−ド画像から行った。動物における全ての測定からの平均値を用いて左心室収縮機能の指標を決定した。例えば、左心室短縮率（LVFS）および左心室駆出率（LVEF）は、以下の関係LVFS =（LVEDd2LVESD）を用い/ LVEDd6100とLVEF=[（LVEDd32LVESd3）/ LVEDd3]6100とは、パ−センテ−ジとして表した。
免疫細胞化学
［０３４９］
免疫細胞化学のために、SiPSの分化したコロニ−をそれぞれの特異的一次抗体（抗Oct3/4、抗Sox2、抗N anog抗体、全て1：100濃度で； Cell Signaling、Danvers、USA）で免疫染色した。免疫染色のために、低分子化合物処理SIPを0．1％ゼラチンコ−トチャンバ−スライド上に播種した。細胞を4％パラホルムアルデヒドを含むPBSで室温で10分間固定した。PBSで洗浄した後、細胞をCASブロック（Invitrogen、CA、USA）によって室温で45分間ブロックし、抗原特異的一次抗体Nkx−2.5、Gata 4、Sarcomericアクチンで免疫染色した ( Santa Cruz、Calif .、USA )。一次抗体−抗原反応は、蛍光結合した特異的二次抗体を用いて検出された。核を5μg/ mlの4'6−ジアミジノ−2−フェニルインド−ル（DAPI; Invitrogen、CA、USA）染色で染色した。蛍光顕微鏡観察法（Olympus；東京、日本）を用いて蛍光シグナルを観察し、写真撮影した。
遺伝子発現プロファイリング
［０３５０］
Affymetrixアレイベ−スの遺伝子発現プロファイリングはさらに、グロ−バルDNA低メチル化およびmyc依存性細胞形質転換に関連したDnmt1、Dnmt3bおよびMax遺伝子関連タンパク質の2〜3倍の下方制御を確認した。さらに、ＣＣL7、ＣXＣR2、ＣXＣR5、内在性膜タンパク質2A、およびエフリンA3の2〜3倍の付随する上方制御があった。
2号実験
［０３５１］
出願人は、多能性および心臓マ−カ−を発現する老齢マウス由来の小未成熟幹細胞（SJSＣ）と命名された骨髄幹細胞集団を同定した。出願人は、これらの細胞がイソキサゾ−ル化合物で処理される時期を予測し、心臓分化により適しており、IPS細胞の代替として使用することができる ( Igura、K.と他. ( 2013 ) Am J Physiol Heart Circ Physiol.305 ( 9 ) : H1354−H1362 )。
3号実験
［０３５２］
この実験は、心原性低分子化合物を補充した電気刺激で前処理することによって心臓前駆細胞を生成する代替方法を開示している。出願人は、造血前駆体マ−カ− ( c−kit )、多能性マ−カ− ( Oct−4、Sox2、Nanog )、幹細胞側集団マ−カ− (Bcrpl)、早期心臓系統マ−カ− ( Nkx 2.5、GATAL、MEF2C )、および血管前駆体マ−カ−（Fiki）を発現する別の細胞集団 ( Kim、S.W. と他.( 2013 ) Cardiovasc Res.100 ( 2 ) : 241−251 ) を同定した。短期間の虚血/無酸素または代替模倣薬による治療による幹細胞のプレコンディショニング（PＣ）は、それらの生着後の生存および分化特性を改善する。しかしながら、幹細胞の生存、接着および心臓分化における電気刺激（EleS）を用いたPCの役割に関する報告は知られていない。心臓は一定の電場を生成し、その効果は移植前の幹細胞では調べられていない。この研究は、EleSが、フォ−カルアドヒ−ジョンキナ−ゼ（FAK）活性化を介した細胞接着の増加を通して、心臓幹細胞（Sca−1 + CSC）の生存に対するPC効果を提供することを実証して、そして、 miR−378下方制御によって結合組織成長因子（CTGF）を放出する。結合組織成長因子（Ctgf）がEleS誘導性CSC（Eles CSCS）の生存および癒着の原因であることがわかった。結合組織成長因子（Ctgf）がEleS誘導性CSC（Eles CSCS）の生存および癒着の原因であることがわかった。さらに、miR−378は、Ele−CSCのCtgf調節因子の候補として同定された。これは多能性および心臓遺伝子の両方を発現する別の幹細胞型であり、これらの細胞はさらに心臓前駆細胞用のイソオキサゾ−ルを用いて開発することができる。
Sca−1 + CSCの単離
［０３５３］
Ｃ57BL6マウス（H arl an）をＣSＣの単離に使用した。12週齢のＣ57BL6マウスをケタミン/キシラジン（それぞれ87〜100mgおよび13〜15mg/kg）の腹腔内注射により麻酔した。麻酔の深さは、つま先をつまんでポジティブにして筋肉を弛緩させることによってモニタ−した。心臓を摘出し、氷冷したPBSで洗浄して血球を除去した。大動脈、肺動脈、および心膜を除去した後、心臓全体を細かく刻み、37℃で20分間、0.1％II型コラゲナ−ゼ（Invitrogen）および0.01％DNase I（Worthington Biochemical Corporation）で消化した。得られた細胞を40μmフィルタ−に通して破片を除去して、70％Percoll（Fluka）で分画し、B27（Invitrogen）、20 ng/ml EGF（Sigma）、および40ng/mlbFGF (塩基性線維芽細胞増殖因子、Peprotech) を添加した無血清DMEM/F12（Invitrogen）を含む維持培地で培養した。1週間後、コロニ−形成を開始するために細胞を100細胞/ cm 2の密度の無血清維持培地を含む新しい皿に移して、各コロニ−を、2％FBS、B27サプリメント、20 ng/ml EGF、40 ng/ml bFGF、および10 ng/ml LIF（白血病抑制因子、ミリポア）を添加したDMEM/F12（Invitrogen）中の24ウェルディッシュ中の個々の継代培養のために機械的に拾い上げた。コロニ−由来細胞を90％コンフルエントになるように新しい皿に播種し、2％FB Sを含むDMEM/F12で維持した。
CSCSのエ−ル
［０３５４］
3×10細胞/ 35 mmディッシュの細胞密度で播種してから24時間後、細胞を15時間血清飢餓状態にし、続いて培養細胞ペ−サ−システム（IonOptix）を使用してEles（ElesCSC）を使用した。細胞を、5Hzの周波数で二相の方形パルス（5ms）を用いて1．5V/1．8cmで0、1、および3時間EleSに供した。Elesを含まない細胞（Non−ElesCSC）をベ−スラインコントロ−ルとして使用した。 細胞は後に収穫され、様々な分子および細胞研究に使用された。
4号実験
［０３５５］
骨髄からの古い間葉系幹細胞（OMSC）と若い間葉系幹細胞（YMSC）の分離
［０３５６］
この研究は、米国国立衛生研究所によって発表された実験動物の管理および使用のためのガイド（NIH出版物＃85−23、1985年改訂）およびシンシナティ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従った。BMSCは、Igura Kと他、 ( 2013 ) Am J Physiol.Heart Circ.Physiol 305 : H1354 H1362 に以前に記載されているように、C57BL/6マウスの骨髄から単離した（それぞれ若い； 2ヶ月、2ヶ月； 24ヶ月）。手短に言えば、BMSCを低グルコ−スダルベッコ改変イ−グル培地 ( DMEM ) ( HyClone Laboratories、Logan、Utah、http :// www .hyclone.com ) を含む100 mmディッシュ中で培養して、6〜10日間、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充する。付着していない造血骨髄細胞は、日常の新鮮な培地交換の間に捨てられた。YMSＣは、3μmの孔を有するウェルを通して篩過することによって古い骨髄から単離された。（細胞培養インサ−ト； BD Bioscience、San Diego、CA  http://www.bdbiosciences.com）YMSC集団の均質性は、Igura K と他(2013) Am J Physiol Heart Circ Physiol 305 : H1354−H1362 に以前に記載されているように蛍光活性化細胞選別分析による表面マ−カ−発現により確認された。
テロメア長測定のための定量的蛍光インサイチュ−ハイブリダイゼ−ション
［０３５７］
テロメアは、メ−カ−の説明書に従って、PNAテロメアＣy3標識プロ−ブ（F1002； TelＣ − Ｃy3、PNA Bio）を用いた蛍光in situハイブリダイゼ−ション（FISH）によって検出された。簡単に説明すると、細胞を4％パラホルムアルデヒドで1時間固定した。リン酸緩衝液（PBS）で洗浄した後、細胞を、RN ase 100ng/1Lで20分間、そして0．005％ペプシンと共に37℃で5分間インキュベ−トした。70％、85％、100％の冷エタノ−ルで脱水後、細胞を200nMのPNAテロメアプロ−ブと共に85℃で10分間インキュベ−トし、そして室温で2時間インキュベ−トした。次いで、細胞を2×3食塩水クエン酸ナトリウム（SSＣ）緩衝液と共に60℃で10分間インキュベ−トして、共焦点顕微鏡 (Fluoview FV1000、オリンパス、東京、http://www.olympus−global.com ) を用いて4 ‘、6−ジアミジノ−2−フェニルインド−ル（DAPI）およびCy3シグナルを別々のチャンネルに同時に取得した上、画像の定量化のために、画像スタック（1mmのステップで10の区画）からの最大投影を生成した。テロメア長は、TFL−TeloV2−2フリ−ソフトウェア（カナダ・バンク−バ−）を用いて分析した。プログラムを用いて、ハイブリダイズしたプロ−ブの数に比例する、各テロメアの積分蛍光強度値を計算し提示する。TFL−Teloは、Poonと他、 ( 1999 ) Cytometry 36 : 267−278. に記載されているように定量的FISH（Q−FISH）分析のために染色された中期の捕捉画像からテロメアの長さを推定するために使用されるアプリケ−ションプログラムである。
逆転写−ポリメラ−ゼ連鎖反応分析
［０３５８］
製造者の指示に従って、RNeasy Mini Kit ( Qiagen、MD、http://wwwl.qiagen.com) を用いて細胞のさまざまな処理群から全RNAを単離して、Omniscript−RTキット（Qiagen）を用いてcDNAを調製した。ポリメラ−ゼ連鎖反応（PCR）増幅のため、次いで、逆転写反応からの1μgのcDNAを、推奨量のQiagen PCR緩衝液、Q−Solution、dNTP混合物、逆方向および順方向プライマ−、Taq DNAポリメラ−ゼ、ならびに蒸留水を含むPCR混合物に添加した。各PＣR反応は特異的プライマ−を用いて実施した。
miRNAの単離と検出
［０３５９］
Kimと他 ( 2012 ) J.Mol.Med.90 : 997−1010. で前述したように、mirVana miRNA 単離キットを用いてmiRNAの抽出を行い、mirVana qRT−PCR miRNA 観測キット (Ambion、Life Technologies、Austin、Tex .、http :// www.ambion.com ) とQuantiTect SYBRグリ−ンPCRキット (Qiagen) を用いてmiR−195の発現を検出した。特異的miRNAプライマ−はAmbionから購入した。
miRNAマイクロアレイ
［０３６０］
OMSCおよびYMSCから得られたト−タルRNAサンプルは、miRNAマイクロアレイプロファイリングのためにExiqon（デンマ−ク、http://www.exiqon.com/）に送られた。デ−タは、社内で開発されたコンピュ−タ−プログラムを用いてExiqonによって分析された。強度値をlog 2スケ−ルに変換し、倍率変化をlog 2スケ−ルで示した。OMSCプロファイリングとYMSCプロファイリングの間でt検定を行い、統計的に有意な差をp <0.01で考慮した。
miR−195を検出するためFISH
［０３６１］
miR−195のインサイチュ（in situ）検出は、チャンバ−スライド上にプレ−ティングされたOMSＣおよびYMSＣにおいて行われた。細胞培養のために試料を4％パラホルムアルデヒド中で室温で20分間固定し、続いてPBS中で2回洗浄した。次いで、固定化細胞をハイブリダイゼ−ション溶液（カリフォルニア州バイオチェイン）中、ハイブリダイゼ−ション前に室温で3時間プレハイブリダイズさせた。miR−195に相補的なプロ−ブ（3pmol； LNA修飾およびフルオレセインイソチオシアネ−ト（FITＣ）標識オリゴヌクレオチド； Exiqonから購入）を22℃で13〜16時間細胞にハイブリダイズさせた。 プロ−ブの予測Tmより低い。ハイブリダイゼ−ション後のSSＣ緩衝液での洗浄の後、インサイチュ−ハイブリダイゼ−ションシグナルを共焦点顕微鏡で検出した ( Fluoview FV1000、Olympus )。
ルシフェラ−ゼ活性アッセイ
［０３６２］
前駆体miR−195発現ベクタ−は、ネコ免疫不全ウイルスに基づくレンチウイルスベクタ−システム（Geneco−poei a）において構築された。マウスTertの3 '非翻訳領域（UTR）を含むルシフェラ−ゼレポ−タ−構築物は、mmu−miR−195結合部位を含むように設計された。細胞を3つ組で24ウェルプレ−トに播種し、リポフェクタミン2000を用いてmiR−195ベクタ−（またはスクランブルベクタ−）およびレポ−タ−構築物を同時トランスフェクトした ( Invitrogen、Carlsbad、Calif.、http ://www.invitrogen.com)。メ−カ−の指示に従って、ホタルルシフェラ−ゼ活性は、デュアルルシフェラ−ゼレポ−タ−アッセイシステムキット ( Promega、Madison、Wis .、http :// www.promega.com ) を用いて測定した。トランスフェクション効率は、ウミシイタケルシフェラ−ゼ活性によって標準化した。
レンチウイルス−仲介されたmiR−195 OMSCにおける抑制
［０３６３］
製造者のプロトコルに従ってレンチウイルス含有miR−195阻害剤発現ベクタ−をLenti−Pac HIV発現包装システム（GeneCopoeia）を使用することによって生成した。一通り、2.5μlのレンチウイルスmiR−195阻害剤発現プラスミドまたはスクランブル、また5.0 mLのEndoFectin LentiおよびEndoFectin Lenti試薬をOpti−MEM Iに加え、そしてDNA−エンドフェクチン複合体を形成した。複合体を室温で10〜25分間インキュベ−トした後、DNA−エンドフェクチン複合体を10％FBSを含むDMEM中の293T a細胞に添加した。そして、5％ＣO 2中、37℃で一晩インキュベ−トする。培養培地を、培地に対して5％FBSおよび1/500容量のTiterBoost試薬を含む新鮮なDMEMと交換した。ウイルスシュ−ドウイルス含有培地をトランスフェクションの48時間後に回収し、濾過後に濃縮した。レンチウイルスによるOMSＣの形質導入のために、10×10 6個のOMSＣをプレ−ティングし、そして20μlのウイルス懸濁液を添加した。レンチウイルス形質導入効率を高めるために、細胞を4℃で2時間置いて、5％CO2中、37℃で48時間インキュベ−トする老化関連B−Gaラクトシダ−ゼ（gal）染色老化関連B−galは、メ−カ−の指示による、老化観測キット ( BioVision、CA、http :// www.biovision.com/) によって検出された。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラ−ゼdUTPニックエンド標識アッセイ
［０３６４］
アポト−シス細胞死は、メ−カ−の指示に従って、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラ−ゼDUTPニックエンド標識（TUNEL）によって検出した ( TMR Red ; Roche Applied Science、http :/www.roche−applied−science.com )。定量化のために、TUNEL陽性細胞の数を、3つの独立した試料を用いて少なくとも5つの無作為に選択された高倍率視野（倍率3 200）で計数した。
ウエスタンブロット分析
［０３６５］
Kimと他 ( 2009 ) Cardiovasc Res.100 : 241−251.に以前に記載されたようにウエスタンブロットを実施した。一通り、細胞を溶解緩衝液、pH7.4 [( in mM ) 50 HEPES、5 EDTA、50 NaCl]、1％Triton X−100、プロテア−ゼ阻害剤[（10 mg/mLアプロチニン、1 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、10 mg/mLロイペプチン）]およびホスファタ−ゼ阻害剤[（mM）50フッ化ナトリウム、1オルトバナジン酸ナトリウム、10ピロリン酸ナトリウム]中で溶解した。タンパク質サンプル（40mg）をSDS−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、そして電気免疫ブロットした。Tert（SC−68720）の検出に使用される特異的抗体はSanta Cruz ( Santa Cruz、Calif .、http :// www.scbt.com ) から。 p53 ( # 2524 )、Sirt−1 ( # 2028 )、Phospho−Fox01 ( # 2599 )、Bcl−2 ( # 3498 )、切断カスパ−ゼ−3 ( # 9661 )、Akt ( # 2920 )、Phospho Akt ( # 4060 ) とアクチン ( # 4968 )は、 Cell Signaling ( Beverly、Mass .、http :// www.cellsignal.com )から購入した。すべての抗体は1：1、000で希釈して使用した
細胞増殖率の測定
［０３６６］
細胞増殖速度は、 Igura、K.と他. ( 2013 ) Heart Circ.Physiol .305 : H1354−1362 に以前に報告されているように、細胞増殖アッセイおよびコロニ−形成アッセイによって決定した。
急性心筋梗塞と細胞移植の実験モデル
［０３６７］
試験管内でマウス急性心筋梗塞（AMI）モデルを用いた細胞移植は、本出願人の Kimと他、 ( 2013 ) Cardiovasc.Res.100 : 241−251。一通り、Ｃ57BL/6マウス（雄24ヶ月齢、体重1匹あたり30〜35g、1群あたりn 5〜10匹の動物）を左前下行枝（LAD）冠状動脈結紮用に準備した。腹腔内麻酔は、麻酔のために体重（g）あたり0．1％のケタミンおよび0．02％のキシレンを用いて投与された。げっ歯類換気装置（Harvard Apparatus Model 683）を用いた気管内挿管および人工呼吸後、心臓を左側の最小開胸術により露出させ、LAD冠状動脈を6−0絹で結紮した。結紮直後に、細胞を含まないかまたは2×10細胞を含む20μlのDMEM（scrOMSCまたは抗1950MSC）を梗塞領域および境界領域に注射した。注射後、開いたマウスの胸部を縫合し、そして全てのマウスを回復させた。miR−195発現はOMSCで著しく上方制御された。
［０３６８］
加齢に伴って誘導されたmiRNA発現をプロファイルするために、出願人は、OMSＣおよびYMSＣから全RNAを単離し、そしてOMSＣおよびYMSＣにおいてマイクロアレイ分析を行った。これらの結果ごとに、miR−140、miR−146a/b、およびmiR−195の発現が、OMSCにおいて有意に上方制御されて、miR−29b、miR−205、miR−378、およびmiR−542 3pの発現が、OMSCにおいて下方制御された。逆転写酵素PCR（RT−PCR）およびリアルタイムPCRにより、YMSCと比較してOMSCにおいてmiR−195発現が有意に上方制御されたというマイクロアレイの結果が確認された。miR−195可視化のためのFISH分析はさらに、miR−195がOMSCにおいて高度に発現されていることを確認した。この結果により、出願人は、miR−195が加齢と共に誘導され、そして、OMSＣにおけるその廃止がOMSＣの再生能力を回復させるかもしれないという仮説を立てた。出願人は抗miR195を用いてOMSＣをトランスフェクトし、トランスフェクトされたOMSＣがmiR−195の発現低下を示すことを確認した。そして、リアルタイムRT−PCRで示されるように、スクランブルはそれに影響を及ぼさなかったが、これは、本出願人が使用したmiR−195阻害剤が幹細胞におけるmiR−195発現の減少に特異的であったことを示す。Tertは老化幹細胞におけるmiR−195の直接の標的である
［０３６９］
幹細胞老化中のmiR−195誘導の生物学的関連性およびOMSC老化へのその関与を調査するために、本出願人は、まず、インシリコ検索による標的予測分析を行い、老化および老化の原因となるmiR−195の潜在的な標的遺伝子を見いだした。
［０３７０］
興味深いことに、コンピュ−タ分析は、mmu−miR−195がマウスTert遺伝子の3'− UTRに直接結合することを予測した。この結果を実験的に検証するために、出願人は、RT−PCRおよびウエスタンブロット分析を実施して、Tert発現がOMSCにおけるmiR−195ノックダウンによって変化するかどうかを調べた。興味深いことに、TeMSのmRNAおよびタンパク質の両方の発現は、OMSCにおけるmiR−195廃止によって有意に増加し（図12Bおよび12C）、これは、TertがmiR−195の推定標的であることを示している。miR−195の標的遺伝子としてのTertは、そのmiR−195発現ベクタ−（PEZX miR−195）の同時トランスフェクションを示したルシフェラ−ゼ活性アッセイによって確認された。そのmiR−195発現ベクタ−が、Tert遺伝子の3'−UTRを含むと、miR−scrambleベクタ−（pEZX−miR−Sc）との同時トランスフェクションと比較して、ルシフェラ−ゼ活性が有意に低下した（図12D）。これらの結果は、Tertが幹細胞老化におけるmiR−195の直接の標的であることを証明した。miR−195の廃止はテロメア増感および老化防止マ−カ−の再活性化を通じてOMSCを活性化する
［０３７１］
幹細胞老化におけるmiR 195の機構的関与を調べるため、出願人は、OMSＣを首尾よくトランスフェクトしてmiR−195の無効化を達成することができたレンチウイルスmiR−195インヒビタ−ベクタ−（Lenti−抗miR−195）を使用することによってmiR−195発現をノックダウンした（図4）。このベクタ−系におけるmチェリ−シグナル（赤色蛍光）により、出願人は、miR−195阻害剤またはスクランブルベクタ−を用いてトランスフェクトしたOSMCを認識することができた（図13B、上のパネル）。興味深いことに、スクランブルトランスフェクトOMSCと比較して、miR−195の廃止はOSMCにおける老化関連B−gal発現を有意に減少させた ( 図13B、20.6 % 64.9 % 対 54.5 % 68.1 %、p < 0.01 )。さらに、miR−195阻害剤をトランスフェクトしたOMSCは有意なテロメア再結合を誘導したスクランブルトランスフェクションと比較して2．9倍高い、図13Ｃ）。また、miR−195の阻害はOMSCにおけるTUNEL陽性アポト−シス細胞死を減少させた ( 図13D、19.7 % 6 4.5 % 対 60.8 % 6 2.7 %、p < 0.01 )。それが、虚血などのアポト−シス条件下では、miR−195廃止による活性化されたOMSCの生存率が向上することを示した。そして、抗老化マ−カ−（Tert And Sirt1）および生存促進マ−カ−（p−AktおよびBcl−2）の発現は、OMSCにおける抗miR−195のトランスフェクションによって有意に増加したが、老化関連マ−カ−（p53）およびプロアポト−シスマ−カ−（切断型カスパ−ゼ−3）の発現は、miR−195廃止により著しく減少した（図13E）。それが、加齢によるmiR−195の抑制は老化防止因子の再活性化と老化関連マ−カ−の抑制によってOMSCを活性化できるという本出願人の仮説の支持。細胞増殖アッセイおよびコロニ−形成アッセイによって評価されるように、miR−195のノックダウンは、OMSＣにおける損傷した細胞増殖能を有意に回復させたことに注目することが重要である（図13Fおよび13G）。これらの結果は、幹細胞老化の間に誘導されたmiR−195がそれらの運命および行動において重要な役割を果たすことを実証した。
［０３７２］
［5号実験］
ヒトiPS細胞（hiPSC）からの心臓前駆細胞の生成およびそれからの複数の細胞系統の細胞の生成
［０３７３］
アメリカ、バ−ジニア州、マナッサスのアメリカンタイプカルチャ−コレクション（ATＣＣ）からのヒトiPSＣ株（AＣS−1021TM）の細胞を、mTeSR1培地中のビトロネクチン被覆6ウェルプレ−ト上に維持した。そのあと、細胞をアキュタ−ゼ（Invitrogen）を用いて37℃で10分間単細胞に解離させた。そして、細胞を、5UMのROＣK阻害剤 ( Y−27632、StemCell Technologies、Vancouver、British Columbia、Canada ) ( 3日目 ) を補充したmTeSR1中、1×10 6細胞/ウェルでビトロネクチン被覆6ウェルプレ−トに24時間播種した。さらに、これらのiPS細胞の多能性を、例えば、OＣT4、SOX2、TRA＿1〜60、TRA＿1〜81およびSSEA4についてのマ−カ−発現を確認するための免疫染色によって確認した（図14A〜図14B）。
［０３７４］
次いで、細胞をmTesR1培地中で培養し、これは図14Ｃに示されるような例示的概略図に従って毎日交換された。0日目に、培地を、7日間、20μM ISX−9（StemＣell Technologies）を補ったインスリンを除いたRPMI/B27培地に交換した。7日目の処置の終わりに、Nkx2．5およびGATA4を含むＣPＣマ−カ−の発現をRT−PＣRおよび免疫染色によって観察した（図14D）。
［０３７５］
心筋細胞の分化のために、ISX−9処理の7日後に、培地をさらに7〜10日間インスリンを含むRPMI/B27培地に切り替えた。20日の終わりに、図14Eに示すように、全ての細胞が自発的拍動を始めた。
［０３７６］
内皮細胞分化のために、2×10 5/cm 2のISX−9誘導CPCをEGM−2培地（Lonza、Lonza Walkersville Inc. Walkerswille Md. 217930127）中で10日間培養した。治療の終わりに、内皮細胞メ−カ−、ＣD31およびVE−カドヘリンが発現された（図14F）。インビトロでマトリゲル上の管形成を分析するために、24ウェルプレ−トの1．2×10 5細胞/ウェルの密度で細胞をマトリゲルの薄層の上に播種した。16時間後、細胞をカルセインAM（Corning、Tewksbury Ma。01876、USA）で標識し、蛍光顕微鏡下で調べて管様構造の形成を可視化した（図14G）。
［０３７７］
平滑筋細胞分化のために、誘導されたＣPＣを、TGF−（2ng/ml）およびPDGFBB（long/ml、ミネソタ州ミネアポリス、R＆D Systems、Inc．、55413）を補充したDMEM − F12培地中で10日間培養した。この期間の終わりに、α− SMAおよびカルポニンの発現が免疫染色によって観察された（図14H）。
6号実験
［０３７８］
イソオキサゾ−ルまたはイソオキサゾ−ル様化合物を用いた単層ヒト誘導多能性幹細胞からの心臓前駆細胞の一段階生成
［０３７９］
現在、人工多能性幹細胞（iPSC）から心臓前駆細胞（CPC）を大量に生成して、突然の心臓発作または鬱血性心不全による慢性的な衰弱の心臓の後に心臓を修復するために、iPSCは胚様体に変換するか、複数の低分子化合物で処理する必要がある。これらのステップは費用がかかりそして時間がかかる。 これらの開発にもかかわらず、進歩は遅く、同時に、ＣPＣ調製物の純度は保証されない。イソキサゾ−ルまたはイソキサゾ−ル化合物、例えばISX − 9の一段階使用は、他の成長因子（アクチビン、BMP4）、グリコ−ゲンシンタ−ゼキナ−ゼ3阻害剤、Wnt阻害剤ならびに他の低分子化合物を使用せずにＣPＣを生成するのに極めて効率的である。この低分子化合物は神経細胞の分化 (Schneider  と他. (2008) Nat Chern Bioi. 4(7):408−10. doi: 1 0.1 03 8/nchembio .9 5) と他の低分子化合物と組み合わせた線維芽細胞のニュ−ロンへの再プログラミング (Li  と他. (2015) 細胞幹細胞17(2): 195−203). について報告された。
［０３８０］
この理論的根拠をテストするために、出願人はまたAmerican Type Culture Collection、Manassas、Va.、20110 USA (ATCC)からヒトiPSC系（ACS−1021（商標））を購入した。mTeSR1培地中のビトロネクチンコ−ト6ウェルプレ−ト上に維持されたiPSＣを、アキュタ−ゼ（Invitrogen）を用いて37℃で10分間単細胞に解離させて、次に、それらを5f．LMのROＣK阻害剤（Y − 27632、StemＣell Technologies、カナダ、ブリティッシュコロンビア州、カナダ）を補充したmTeSR1中、1×10 6細胞/ウェルでビトロネクチン被覆6ウェルプレ−トに播種した（3日目）。 （図14A）。iPSCは、それらの多能性について免疫染色によって確認された（図14A、B）。次いで、細胞をmTesR1培地中で培養し、これを我々の概略図に従って毎日交換した（図14Ｃ）。0日目に、培地を、7日間、20μM ISX−9（Stem Cell Technologies）を補充したインスリンを含まないRPMII B27培地に交換した。7日目の処置の終わりに、Nkx2．5およびGATA4を含むＣPＣマ−カ−の発現をRT − PＣRおよび免疫染色によって観察した（図14D）。心筋細胞分化のために、ISX−9処理の7日後、培地をさらに7〜10日間インスリンを含むRPMI/B27培地に切り替えた。 20日の終わりに、全ての細胞が自発的拍動を始めた（図14E）。内皮細胞分化のために、2×10 5/cm 2のISX−9誘導CPCをEGM−2培地（Lanza、Lanza Walkersville Inc.、Walkerswille Md. 21793−0127）中で10日間培養した。処置の終わりに、内皮細胞メ−カ−、ＣD31およびVE−カドヘリンが発現された（図14F）。インビトロでマトリゲル上の管形成を分析するために、24ウェルプレ−トの1．2×10 5細胞/ウェルの密度で細胞をマトリゲルの薄層の上に播種した。 16時間後、細胞をAMカルセイン (Coming、Tewksbury Mass. 01876、USA) で標識して、チュ−ブ状構造の形成を視覚化するために蛍光顕微鏡下で観察した（図14G）。平滑筋細胞の分化のために、誘導されたＣPＣを、TGF（2ng/ml）およびPDGFBB（long/ml、R&D Systems、Inc.、Minneapolis、Minn. 55413）を補充したDMEM − F12培地中で10日間培養した。この期間の終わりに、α− SMAおよびカルポニンの発現が免疫染色によって観察された（図14H）。
［０３８１］
結論として、Isx − 9は、内皮/血管前駆体および平滑筋細胞を含めて、iPSＣを一貫してプロゲスチン心臓に変換するための非常に有効な低分子化合物であった。
7号実験
［０３８２］
多能性である心臓前駆細胞（ＣPＣ）は、増殖して心臓系統細胞に増殖するそれらの能力により、心臓修復のための有望な供給源を提供する。 この実験では、出願人は、心原性低分子化合物、イソキサゾ−ル（ISX−9）および梗塞心筋の機能改善のための瘢痕組織内での増殖能力を用いた、ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）からのヒトCPC生成の新規戦略を探求した。
方法と結果
［０３８３］
簡潔には、ＣPＣは、ISX − 9を用いてhiPSＣから誘導された。 ＣPＣは、免疫細胞化学およびRT − PＣRによって特徴付けられた。LAD結紮後の免疫不全マウス（NOD/SＣIDマウス）におけるインビボ移植により、梗塞心臓におけるＣPＣの生存および分化を決定した。そしてそれらの効果は線維症と機能改善に決定された。出願人は、ISX−9が治療の3日以内に心臓転写因子、Nkx2.5、ISL1、GATA4、Mef2c hiPSCの発現を同時に誘導し、試験管内で3つの心臓系統にうまく分化したことを見出した。mRNAおよびmiRNA配列決定の結果は、ISX−9が複数の心臓分化、増殖シグナル伝達経路を標的としていることを示し、筋形成および心臓肥大関連miRNAの発現を増加させた。ＣPＣ移植は、血管新生を促進し、線維化を抑制し、そして心筋梗塞後のマウスにおいて機能的改善をもたらした。
［０３８４］
この研究は、多様なシグナル伝達経路を介して強力な筋肉分化能を有する単一の心原性低分子化合物、ISX−9を使用してhiPSCから純粋なCPCを製造する新規技術を実証する。 これらのＣPＣは多能性でありそして3つの心臓系統に分化して梗塞心臓に新しいＣMおよび血管を形成し、それにより線維化を抑制し、そして心機能を改善した。
［０３８５］
幹細胞ベ−スの治療法は、心臓再生に対して大きな期待と可能性を秘めている。ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）は、潜在的に自家製および個別化医療のために試験管内で無制限の機能的ヒト細胞型を生成する可能性がある。以前の研究は、iPSC由来心筋細胞（CM）移植が心筋梗塞（MI）のげっ歯類モデルにおいて機能的改善をもたらしたことを報告している（Wang Y.  と他.,医学物理学. 2016);（Wang Y.  と他.、IEEE 国際会議on: IEEE; 2011 )。しかしながら、梗塞心臓への移植後の心筋細胞の不十分な生着は最終的な結果に影響を与える一般的な問題である。ＣM移植の有益な効果は、宿主細胞の心筋との移植細胞の統合よりもむしろパラクリン機序によるものと考えられる。これらの制限は、虚血条件下での劣った細胞生存および保持、分化したCMの限られた増殖能力、および移植片における血管新生の欠如におそらく起因する。さらに、iPSC−CMまたは胚性幹細胞（ESC）−CMの未熟性および不均一性による心臓移植後の催不整脈性リスクは、本格的な適用の前に解決されていないままである（Li H.  と他.、Bioinformatics. 2009; Robinson M D  と他.、Bioinformatics. 2010); （Benjamini Y  と他.、王立統計学会誌シリ−ズB−方法論. 1995.)。
［０３８６］
心臓前駆細胞（ＣPＣ）は、それらの多能性および増殖能力のために心臓修復のための有望な手段を提供する。以前の研究は、hiPSCまたはESCに由来するCPCが奇形腫形成なしに複数の心臓系統に分化することができることを実証した。さらに、hiPSCおよびマウスiPSCに由来するCPCの移植は、iPSC−CMと比較してより効果的に心機能を改善した(Kozomara A.  と他. Nucleic Acids Res. 2014); (Xuan W と他.、Cardiovasc Res. 2011)。最近、2つの研究が、梗塞マウス心臓においてマウス線維芽細胞由来のCPCがCM、ECおよびSMCに自発的に分化し、心筋梗塞後の心機能の改善を報告した(Zhang  と他.、Cell stem cell、2016; Vol. 18; pgs. 368−381); (Lalit P A と他.、Cell stem cell、2016; Vol. 18; pgs. 354−367)。また、成人の幹細胞を用いた心疾患に対する細胞療法に関するいくつかの臨床試験が進行中 (Sheridan C. Cardiac、Nature biotechnology、2013; Vol. 31; pgs. 5−6); (Malliaras  と他.,幹細胞翻訳医療、2014; Vol. 3; pgs. 2−6)。例えば、欧州コンソ−シアムCARE−MIは、急性心筋梗塞治療のためにドナ−の右心耳から単離したヒトCPCを使用している(GomesAlves  他.,トランスレ−ショナルリサ−チ：研究室および臨床医学、2016; Vol. 171; pgs. 96−110 & 111−113)。最近、ヒトESC由来のSSEA−1 + CPCが重度の心不全を患っている単一の患者の梗塞領域に送達され、それらが心臓機能の改善をもたらしたことが報告されている（Menasche  と他.、European heat journal、2015; Vol. 36; pgs. 2011−(2017)）。この臨床試験は、ヒトESC由来のCPCの臨床グレ−ドの集団を生成する可能性があることを実証し、そしてhiPSCまたはESC由来のCPCの将来の臨床応用のための強力な奨励を提供した。ヒトＣPＣ生成の現在の戦略は、ドナ−の心耳からの単離および試験管内での拡大を含む(Koninckx  と他.、心臓血管研究、2013; Vol. 97; pgs. 413−423)。hiPSCまたはESCからの誘導。胚様体に変換するか、複数の低分子化合物および成長因子（アクチビン、BMP4）で処理する必要がある (Yang  と他.、自然、2008; Vol. 453; pgs. 524−528); (Lei  と他.,可視化実験ジャ−ナル: JoVE 2015: 52047; Moretti  と他.、FASEB ジャ−ナル：実験生物学のためのアメリカ学会の公式出版物、2010; Vol. 24; pgs. 700−711)。これらの戦略は労働生産集約的で時間がかかり、そして高い製造コストで臨床応用を制限する。さらに、心臓組織由来のＣPＣは、限られたヒト組織供給源の利用可能性によって制限されている。 したがって、さらなる臨床応用のための安全性、高い再現性、高純度、費用対効果および製造の容易さのために、大規模でのヒトＣPＣ生成のための新規なプラットフォ−ムが必要とされている。
［０３８７］
一部の報告では、ISX−9はISX−1と呼ばれていた。(Russell  と他.、ACS chemical biology、2012; Vol. 7; pgs. 1067−1076; Burchfield  と他.、治験薬のジャ−ナル：臨床研究のためのアメリカ連合の公式出版物、2016; Vol. 64; psg. 50−62.) ISX−9は、イソオキサゾ−ルファミリ−に属する低分子化合物である。 ISX−9は、心臓性低分子化合物として報告された。以前の研究は、ISX−9の直接注射は、梗塞心筋を再生し、そして瘢痕組織形成を軽減し、またはMI後の心室機能を改善することができなかったことを示した。 (Russell  と他.、ACS chemical biology、2012; Vol. 7; pgs. 1067−1076).ごく最近になって、この低分子化合物は脂肪由来幹細胞を予備調整することが報告されており、それが虚血性心臓におけるそれらの効果を高めた。（ Burchfield  と他.、治験薬のジャ−ナル：臨床研究のためのアメリカ連合の公式出版物、2016; Vol. 64; psg. 50−62.)さらに、ISX−9は神経前駆細胞株において神経分化を誘導した。(Zhang  と他.,分化 生物多様性に関する研究、2011; Vol. 81; pgs. 98−104)しかしながら、ISX−9がhiPSCにおいて心臓の分化を指示し得るかどうかは依然として不明である。 ここで、出願人は、単一の低分子化合物−ISX − 9を用いてhiPSＣから多能性ＣPＣを首尾よく生成した。意外にも、この低分子化合物はhiPSCにおける全心臓転写因子の同時アップレギュレ−ションを開始し、心筋再生後の心臓再生、線維症の減少および心機能の改善をもたらす3つすべての心臓系統細胞の分化を可能にした。
材料と方法
［０３８８］
試験管内でhiPSCからの心臓前駆細胞分化およびhiPSC由来心臓細胞の特性
［０３８９］
ヒト線維芽細胞から誘導されたヒトiPSＣ細胞株（AＣS − 1021（商標））は、ATＣＣ社から購入した。手短に言えば、mTeSR1中のビトロネクチン被覆6ウェルプレ−ト上に維持されたiPSＣを、アキュタ−ゼ（Invitrogen）を用いて37℃で10分間単細胞に解離させて、次いで、5μMのROＣK阻害剤（Y−27632、Stem Ｃell Technology）を補充したmTeSR1中、1×10 6細胞/ウェルでビトロネクチン被覆6ウェルプレ−トに24時間播種した。その後、細胞を、毎日交換したmTesR1中で培養した。 0日目に、培地を7日間ISX − 9（20μM、DMSOに溶解）を補ったインスリンを含まないRPMI/B27に変えた。心臓前駆体の生成のためのプロトコルの概略図を図1に示す。 3日目および7日目に、心臓遺伝子をRT − PＣRおよび免疫染色によって分析した。 IXS−9処理細胞中のNkx2.5陽性細胞の純度をFACSにより分析した。心筋細胞（ＣM）分化のために、7日間のISX − 9処理の後、培養培地をさらに10および30日間インスリンを含むRPMIIB27に切り替えた。内皮細胞（EＣ）分化のために、培地をさらに10日間EGM − 2V培地（L anz a）に交換した。平滑筋細胞（SMＣ）分化のために、培地をTGF（2ng/ml、R＆D）およびPDGFBB（long/ml、R＆D）を補ったDMEM − F12培地に10日間交換した。CM、ECおよびSMCは、補足の付録で特徴付けられ詳細に説明されています。hiPSCにおいてISX−9によって誘発された心臓分化の潜在的なメカニズムを決定するために、細胞をTGFシグナル伝達経路阻害剤で処理した。hiPSCにおいてISX−9によって誘発される心臓分化の潜在的なメカニズムを決定するために、 1日目と0日目 で、細胞をTGF−シグナル伝達経路阻害剤、5μMLY2109761（Selleck）または3ntM XAV939（Selleck）または5μMIWP2（Selleck）で処理した。そして、3日目および4日目にそれぞれ組み換えヒトWIF − 1タンパク質（R＆D、200ng/ml）、 siWnt5 および siWntll。
心筋梗塞および細胞移植のマウスモデル
［０３９０］
心筋梗塞モデルは、8〜9週齢のNOD/SCIDマウス（The Jackson Laboratory）において、2％吸入イソフルラン麻酔下での左前下行動脈（LAD）結紮によって誘導された（段落
【０３３５】
も参照）。一通り、心臓を左側限定開胸術によって露出させ、LADをプロレン＃8−0縫合糸で結紮した。心筋虚血は左心室壁の色の変化によって確認された。 マウスを3つのグル−プに無作為に分けた： (1)DPBSを注射した虚血対照群 (2)1×106個のhiPSＣを注射した虚血群 (3)1×10 6個のCPCを注射した虚血群。LAD結紮後10分で、直視下で梗塞領域の2箇所に細胞を注射した。 移植細胞の生着後の追跡およびそれらの運命の決定のために、製造者の指示に従って細胞をPKH26（Sigma、製品番号PKH26−GL）で標識した。胸を閉じてマウスを回復させた。 実験プロトコルはシカゴの動物飼育および使用委員会のイリノイ大学によって承認され、そして方法は動物資源研究所による実験動物の飼育および使用のためのガイドに従って行われた。
［０３９１］
心エコ−検査による心機能測定は、MI後3ヶ月までの異なる時点で行った。 マウスをMIの3ヶ月後に屠殺し、そして瘢痕組織測定および組織学的分析のために心臓を取り出した。
梗塞マウス心臓の生着に及ぼす発達中のCMの異なる段階の影響
［０３９２］
胚性幹細胞（ESC）またはiPSC由来のCMは、試験管内での心臓修復のための優れた信頼できる情報源が、in vitroでの薬剤安全性スクリ−ニング、個別化および精密心血管医学のプラットフォ−ムとしても役立つかもしれない。分化した細胞を心臓再生目的に使用すべき発生段階は、とらえどころのないままである。ここで、出願人は、インスリン培地を含むRPMI/B27中で培養することによってイソキサゾ−ルによって誘導されたＣPＣをＣMにさらに分化させた。出願人は、梗塞マウス心臓におけるＣMの異なる段階の生着能力を調べた。移植されたＣMは、ヒト特異的cTnTで染色することによって同定された。 心臓細胞は、α−サルコメリックアクチニンまたはcTniについての免疫染色によって同定された。免疫染色の結果は、cTniとヒトミトコンドリア抗原またはヒト特異的cTnTとα−アクチニン（デ−タは示さず）の二重染色によって同定されるように、移植後15日目および35日目の両方のCMが梗塞心臓において観察されたことを示した。定量分析は、15％のＣMを有するマウスよりも35％のＣMを移植した心臓の梗塞周囲領域にマウスの起源のＣMが観察された一方で、高い割合のヒト起源のＣMが梗塞領域に存在することを示した（デ−タは示さず）。これらの結果は、35日目のＣMが移植に最適であり得ることを示唆している。
［０３９３］
次に、出願人は、35日目のＣM移植によるMI後のマウスの線維症領域および心機能を分析した。未処理マウスの連続心エコ−検査は、MI後のLVEDDおよびLVESDの時間依存的な増加、ならびに3ヶ月の追跡期間にわたるLVFSの進行性の低下を示した。対照的に、分化したCMの移植は左心室拡大の進行を有意に遅らせて (LVESD、2.39±0.52 mm vs. 3.42±0.62 mm; LVEDD、3.63±0.47 mm vs. 4.25±0.70 mm)、対照マウスと比較して、MIを有するマウスにおける心機能の改善 (LVFS、34.68±7.12% vs. 20.17±4.00%) がある（デ−タは示さず）。さらに、ＣMを移植したマウスでは未処置のマウスよりも小さい瘢痕サイズが観察された（デ−タは示さず）。
統計分析
［０３９４］
デ−タは平均±SEMとして表す。 多重比較についてボンフェロ−ニの補正を用いてANOVAによって差異の統計分析を比較した。 確率値P ＜0．05を統計的に有意と見なした。
結果
［０３９５］
iPSC由来心臓系譜CM、ECSおよびSMCの心臓分化および特徴付け
［０３９６］
DMSO処理hiPSＣと比較して、ISX−9処理は、RPMIIB27分化培地中で増殖細胞のクラスタ−の形成を促進した（図17B）。リアルタイムPCRの結果は、ISX−9がhiPSCにおいて複数のCPC関連遺伝子の発現を劇的に誘導することを示した。図17Ｃに示されるように、 Nkx2.5、GATA4、ISL−1 および Mef2c の上方制御は、3日間のISX − 9処置後に観察され、そして7日間の処置後にさらに増強された（GATA4を除く）。DMSO処理細胞と比較して、ISX−9は上記心臓転写因子の発現を増加させた（図17D）。免疫蛍光染色はまた、転写因子（Nkx2．5、GATA4およびISL−1）が7日間のISX−9処理でhiPSＣにおいて高度に発現されることを示し（図17Fおよび図28）、FAＣSによると96．5±2．5％の細胞がNkx2．5が陽性であり、ＣPＣ生成の高純度を示唆した（図17F）。これらのNkx2.5 +細胞は多分化能性であり、いかなる特異的誘導シグナル伝達分子も伴わずに、基底分化条件においてCM、ECおよびSMCを含む3つの心血管系譜すべてに直接分化した（図18A）。これらの心臓細胞はCM−、EC−およびSMC−特異的タンパク質を発現した。透過型電子顕微鏡（TEM）により、発生中のＣMは、リボソ−ム、発生中の筋フィラメント、ミトコンドリアおよびグリコ−ゲン粒子を有する小胞体が豊富であった。クロマチン材料は、核質中に均一に分布していた（図18B）。さらに、分化したECは一次ECと同様の表現型と機能を示した。 分化したEＣにおいてチュ−ブ様構造の形成およびLDL取り込みが観察された（図18Dおよび図18E）。ＣPＣ分化後の細胞をより正確に特徴付けるために、我々は、ＣM、EＣおよびSMＣ分化条件における CMs (Tnr)、ECs (CD31 +) および CMs (Tnr)、ECs (CD31 +) の百分率をFACSによって分析した。FAＣS分析は、これらの誘導されたＣPＣからの心臓系統分化の高い効率を明らかにした。基礎分化培地中でそれぞれ約95．2±2．1％のＣM、90．3±2．5％のEＣおよび92．3±1．8％のSMＣを得ることができる（図18G）。さらに、ISX−9は、hiPSCをmTeSR1未分化培地中で培養した場合でも、hiPSCにおいて非常に強力な分化誘導剤として作用する（図26）。mTeSR1未分化培地では、ISX − 9は依然として培養hiPSＣの一部においてNkx2．5、GATA4およびISL − 1の発現を誘導することができた（図27）。 まとめると、これらの結果は、新規低分子化合物ISX−9によるCPCの生成の成功が注目に値することを示唆している。
ISX−9治療によって仲介される潜在的な重要なシグナル伝達経路およびmiRNAの発現
［０３９７］
出願人は、ISX−9処理によるhiPSCにおける遺伝子発現の差を明らかにするためにトランスクリプト−ム解析を行った。mRNA配列決定は、群間で異なる遺伝子発現プロファイルを示した（図19A）。異なる群における上方制御および下方制御された遺伝子のシグナル伝達経路濃縮分析を図19Cに示した。DMSO処理および未分化hiPSＣと比較して（図19Ｃおよび図20）、ISX − 9はWNTおよび細胞骨格リモデリングおよびTGF −β誘導EMTシグナル伝達を促進し、これらは心臓分化に関与していた。標準的なWntシグナル伝達経路の重要な活性化因子であるWnt3aの発現は、未分化のhiPSCと比較して3日目および7日目に劇的にアップレギュレ−トされた。Wnt3a発現は、3日目と7日目で有意差はなかった。しかしながら、非標準Wntシグナル伝達経路の誘因分子であるWnt5 aおよびWntIIの発現は、7日目にアップレギュレ−トされたが3日目にはアップレギュレ−トされなかった（図20A）。DMSO処置群と比較して、ISX−9はWnt3 a、Wnt5 aおよびWntIIの上方制御を誘導した（図20B）。7日間のISX − 9による連続処理は、3日間のみの処理と比較して、 Wnt5、Wnt11 および心臓転写因子（Nkx2.5、Mef2c、GATA4 およびISL−1）の発現を増加させた（図20Ｃおよび図20D）。出願人はさらに、TGFβシグナル伝達経路阻害剤、LY2109761、Wntシグナル伝達経路阻害剤、XAV939およびIWP2を用いてmRNA配列決定の結果を検証した。プロトコルの概略図を図20Eに示す。リアルタイムPCRの結果は、初期分化段階におけるTGFβシグナル伝達経路および標準的Wntシグナル伝達経路の阻害が心臓転写因子（Nkx2.5、Mef2c、GATA4およびISL−1）の発現を有意に減少させることを示した（図20F）。それは、ISX−9誘導心臓分化におけるTGF−誘導EMTシグナル伝達および標準Wntシグナル伝達の重要な役割を示唆している。分化後期にsiRNAを用いてWnt5aまたはWnt11をノックダウンすると、ISX−9処理細胞における心臓転写因子の発現が有意に阻害された（図20G）。 Wnt5 aおよびWntIIについてのノックダウンの効率を図20に示す。加えて、後期の間の非標準的Wntシグナル伝達経路阻害剤であるWIF−1による処置は同様の結果を示し（図20G）、これは非標準的Wntシグナル伝達経路がISX−9誘導心臓分化に関与していることを示唆する。さらに、シグナル伝達経路濃縮分析はまた、細胞増殖、遊走、および抗アポト−シスに対するISX−9による他の有益な効果を明らかにした。遊走、増殖および抗アポト−シスシグナル伝達に関連する一連の遺伝子は、ISX−9によって上方制御され、その一方で、DNA損傷および酸化ストレスに関連する遺伝子は下方制御された。さらに、miRNA配列決定は、miR − 335、miR − 21、miR − 30c、およびmiR − 214を含む、いくつかの筋形成関連miRNAおよび心臓肥大関連miRNAの上方制御も示した（図19B）。
虚血に対するhiPSC−CPCの細胞保護
［０３９８］
誘導されたＣPＣが細胞保護効果を示すかどうかを決定するために、出願人は、低酸素条件下で異なる処理を用いてhiPSＣを培養した。これらの細胞を 1% O2 下で12時間および24時間培養すると、DMSO処理ありまたはなしで細胞死が起こった。TUNELアッセイは、 1% O2 の低酸素による偽およびDMSO対照群からのhiPSＣ中のアポト−シス細胞の劇的な増加を明らかにしたが、ISX−9処理細胞ではアポト−シス細胞がより少なかった（図21Aおよび図21B）。およそ70％±2.5％および80％±6.5％の細胞は、それぞれ12時間および24時間の1％O 2暴露後にDMSO群においてアポト−シスを起こした。しかし、ISX − 9処理は、12時間および24時間の1％O 2曝露後にアポト−シス細胞をそれぞれ15％±3．5％および24％±4．3％に減少させた（図21Ｃ）。さらに、ＣPＣ移植は、MI後3日後に梗塞心臓の境界領域におけるアポト−シスを減少させた（図21E〜21G）。出願人は次にこれらの細胞保護効果に関与しているかもしれないパラクリン因子を同定するために複数のサイトカインアッセイを実施した。DMSO処理と比較して、それぞれ12時間または24時間、正常酸素圧または低酸素ストレス（1％O 2）下でのISX−9処理でいくつかのサイトカインが有意に増加した（P <0.05）。これらの保護サイトカインには、抗アポト−シス因子（アンジオポエチン−2、IL−6、MMP−1、PDGF−BB、TIMP−1）、細胞遊走誘導因子（アンジオポエチン−2、IL − 8、MＣP − 1、MMP − 9およびVEGF − A）および血管新生因子（アンジオポエチン−2、PDGF − BBおよびVEGF − A）が含まれた。酸素正常状態と比較して、24時間の低酸素ストレスは、これら全ての保護サイトカインの濃度をさらに増加させた（P ＜0．05）（図20および図21）。
hiPSC由来CPCの移植はMI後の心臓リモデリングを減弱させた
［０３９９］
DPBSおよびhiPSC処置マウスの連続心エコ−検査は、MI後のLVEDDおよびLVESDの時間依存的な増加、ならびに3ヶ月の追跡調査期間にわたるLVFSおよびEFの進行性の低下を示した。対照的に、ＣPＣの移植は、MIを有するマウスにおけるLV拡大（LVESDおよびLVEDD）およびLVFS抑制の進行を有意に遅らせ、そしてこれらの差は時間とともにより明白になった（図22A〜22D）。ＣPＣの移植は、DPBS処置マウスと比較して、LVEFを 40.14±1.53% から 40.14±1.53% に、そしてLVFSを 21.24±1.30% から 40.14±1.53% に有意に増加させた。収縮期（LVESD）および拡張期（LVEDD）の間の左心室腔の寸法の病理学的リモデリングもまた、DPBSおよびhiPSＣ処置マウスと比較して、ＣPＣ処置心臓において有意に減少した（図22E）。機能的指標と並行して、MIの3ヶ月後にCPCを移植したマウスにおいて、DPBSおよびhiPSCで処置したマウスと比較して有意に小さい瘢痕サイズが観察された（図22F〜22H）。これらのデ−タは、ＣPＣの移植がMI後の心臓リモデリングを減弱させることを示唆している。
試験管内での梗塞心筋への移植後のhiPSC − CPCの分化と成長
［０４００］
出願人は、左心室の梗塞領域に沿ってhiPSCおよびhiPSC−CPCを直接注射した。出願人は、梗塞領域における移植の2ヶ月後および3ヶ月後にPKH26標識心臓前駆細胞の広範な生存、増殖および分化を観察した。免疫蛍光分析は、MI後2ヶ月（図23）および3ヶ月（図23Aおよび図23B）でPKH − 26赤色蛍光およびα−サルコメリックアクチニンまたはヒト特異的cTnT染色（緑色蛍光）の共局在を示し、移植されたＣPＣが瘢痕組織を置換する新しいＣMに成長したことを示唆する。梗塞周囲領域に保持された移植ヒト細胞の総数は、ヒトミトコンドリア抗原追跡 (30.03±1.69% vs. 6.27±0.85%) を使用してMI後72時間にhiPSC処置マウスと比較した場合、CPC処置マウスにおいて有意に高かった（図23E〜図23G）。さらに、出願人は、心筋梗塞切片をヒトミトコンドリア抗原および心筋トロポニンI発現について染色することによって、梗塞周囲領域における移植ＣPＣまたはhiPSＣからの分化したＣMの数を分析した。MI後3ヶ月で、hiPSＣ移植心臓と比較した場合、移植ＣPＣからの分化したＣMの数が梗塞周囲領域において8倍検出された（図23I〜23J）。さらに、移植されたＣPＣは、梗塞心臓の境界領域に血管構造を形成するEＣおよびSMＣに分化した（図23Ｃおよび図23D）。この研究で使用された移植動物のいずれにおいても腫瘍形成は観察されなかった（n ＝ 16）。これらの観察結果は、ISX−9によって生成されたCPCが梗塞心臓に新しいCMおよび血管を形成する3つの心臓系統にうまく移植されそして分化したという考えを裏付ける。
hiPSC − CPCの移植は梗塞領域における脈管形成を促進した
［０４０１］
血管新生は虚血後の心機能改善に寄与し得る。 ＣPＣは、DPBSおよびhiPSＣ処置群と比較して、梗塞領域および境界領域において血管密度および細動脈密度を有意に増加させた（図23）。
討論
［０４０２］
本研究において、出願人は、低分子化合物および成長因子の面倒な中間カクテルを使用せずに、簡単な新規な方法を使用してヒトiPS細胞からヒトCPCを首尾よく生成した。これらのＣPＣは、虚血環境に対してサイトカインを放出することによってそれら自身を保護した。 移植後、それらは複数の心臓系統細胞に分化し、そして梗塞領域の新しい筋線維および血管で瘢痕領域を覆った。 これらのＣPＣはまた、より高いFSおよびEFを反映して心機能改善に対して長期間の有益な効果を示した。
［０４０３］
ISX−9は、心臓性低分子化合物および神経分化誘導剤である。 以前の研究は、ISX − 9の直接注射は、MI後の瘢痕形成または心室機能低下を軽減することができなかったことを示した(Russell J L  と他.、ACS chemical biology、2012; Vol. 7; pgs. 1067−1076)。最近、脂肪由来幹細胞のISX−9による前処理が心筋細胞表現型への潜在的な分化を促進することも示されたが、この研究はまた、Nkx2.5の持続的刺激による筋細胞分化に対するNkx2.5の負の効果を見出した（Burchfield J S  と他.、治験薬のジャ−ナル：臨床研究のためのアメリカ連合の公式出版物、2016; Vol. 64; pgs. 50−62)。拡大されたISL1およびNkx2．5心臓運命マップは著しく類似しており、多能性Isl1 ＋ 1Nkx2．5 ＋前駆細胞は4つのすべての心腔におけるＣM、SMＣおよびEＣ系統の共通の心臓前駆細胞を表すかもしれないと報告された(Ma Q  と他.、発生生物学、2008; Vol. 27; pgs. 1050−1056)。出願人の研究によれば、ISX−9による治療は3日という早い時期に、ISX−9によるhiPSCにおいて複数の心臓転写因子の同時上方制御を促進した。したがって、ISX−9を用いたいくつかの転写因子（ISL1、Nkx2.5、GATA4、およびMef2c）の誘導は、hiPSCにおける多系列分化プログラムを開始した。ISX−9での7日間の治療の終わりに、これらのCPCはさらに筋細胞、ECおよび平滑筋前駆細胞に増殖することができる。
［０４０４］
iPSCに基づく心筋の修復に関連する一般的な問題には、移植されたhiPSC−CMの増殖および分化の制限、血管新生の欠如、催奇形性リスクおよび腫瘍形成が含まれる（Lam J T  と他.、Pediatric cardiology、2009; Vol. 30; pgs. 690−698); (Knoepfler P S. Stem cells、2009; Vol. 27; pgs. 1050−1056）。他の細胞と比較して、ＣPＣはそれらの多能性および増殖能力のために心筋修復のための理想的な候補である。以前の研究は、EB生成、様々な増殖因子、およびWNTシグナル伝達経路阻害剤を用いて純粋な集団CPCを生成するための異なる技術を開発することを試みた（Koninckx R  他.、心臓血管研究、2013; Vol. 97; Vol. 413−423); (Moretti A  他.、FASEB ジャ−ナル：実験生物学のためのアメリカ学会連盟の公式出版物y、2010; Vol. 24; pgs. 700−711); (Schmeckpeper J  他.、分子心臓細胞学ジャ−ナル、2015; Vol. 85; pgs. 215−225）。本出願人の知る限りでは、本研究は、iPSCから高純度のCPCを大量に生産するために単一分子を使用する最初のものであり、これはCMおよび血管細胞を含む3つの心臓系統の生成をさらに促進し得る。 ここで、出願人はこの特異的分子を用いて心臓特異的前駆細胞を最大96％まで生成した。
［０４０５］
細胞再生医療の主な目的は、心臓の構造と機能を回復させるために、死んだ細胞を新しい細胞で置き換えることである。 現在の再生場は、梗塞組織における新たな細胞形成がないことから、新しく形成された細胞がまばらになるまでの範囲にわたる矛盾する結果のために物議をかもしている(Ong S G  他.、循環、2015; Vol. 132; pgs. 762−771); (Chong J J 他.、自然、2014; Vol. 510; pgs. 273−277; Zhang Y 他.、細胞幹細胞、2016; Vol. 18; pgs. 368−381)。しかしながら、大多数の研究は、細胞死を減少させそして細胞移動および増殖を刺激するパラクリン因子により引き起こされる有益な効果のために細胞療法の代替的説明を提供する（Ye L と他.、細胞幹細胞、2014; Vol. 15; pgs. 750−761); (Gouadon E  他.、幹細胞、2016; Vol. 34; pgs. 34−43)。この研究は互いに補完的であるこれらの概念の両方を支持する。 これらの結果は、ＣPＣが虚血状態に対して寛容であり、そして細胞死を防止することによって虚血性心臓における常在性ＣMに対するさらなる保護を与えたことを実証する。さらに、これらのＣPＣはまた、パラクリン様式で血管新生因子を放出した。 出願人は、ＣPＣ移植が梗塞心臓の血管密度を増加させることを見出したが、これは部分的にＣPＣから放出されるこれらの血管形成因子によるものである。サイトカインおよびシグナル伝達経路濃縮分析と一致して、ISX−9は細胞増殖、遊走、およびアポト−シスにさらなる有益な効果をもたらし、したがって細胞生存および移植されたCPCの成功した生着を確実にする。以前の研究における移植されたＣMの不十分な生着は、梗塞心筋における酸素および栄養の欠乏によるものであり得る。 ここで、本出願人のＣPＣは抗酸化作用を示し、これは虚血性心臓における細胞生存率の悪さの問題を部分的に克服することができた。細胞の約10％が境界領域に保持されていることが以前に報告されていた(Sharma S  他.、循環研究、2017; Vol. 120; pgs. 816−834)。しかしながら、本出願人の研究において、より高いCPC保持率および生存率は、本出願人のCPCが虚血環境における虚血に対してより耐性であることを示唆している。これは、ＣPＣで処置した3MのMI後MIラットにおいて、約16．93±1．5％の新たに分化したＣMが梗塞心臓の境界領域に観察されたという分化分析によってさらに支持された。生着したＣPＣおよび分化した細胞からのサイトカインの持続放出が有益な結果を促進した可能性もある。移植されたＣPＣは生き残っただけでなく、現在のデ−タによって支持されるように虚血性心筋における瘢痕組織を置換するために新しいＣMおよび血管を形成した。 残念ながら、我々は生着したＣPＣ − ＣMと宿主ＣMとの間のギャップ結合を観察しなかった。
［０４０６］
ISX−9によって誘発された心臓分化の考えられる根本的なメカニズムを理解するために、出願人は、ISX−9で処理したhiPSCにおいてRNA配列決定を行った。興味深いことに、グロ−バルトランスクリプト−ム解析により、ISX−9はWNTおよび細胞骨格リモデリングおよびTGF−誘導上皮間葉転換（EMT）シグナリング、VEGFおよびアクチビンAシグナリングを含む複数の心臓分化シグナリング経路に関連する遺伝子を上方制御して、ISX−9は心臓の分化に必要な複数のシグナル伝達経路を標的としていることを強く指摘した。注目すべきことに、TGF−〜ファミリ−メンバ−、BMPおよびアクチビン、WNT−およびFGFファミリ−メンバ−は、心臓発生にとって極めて重要であることが知られている。例えば、TGF−~ は中胚葉の心臓領域の初期に発現される(Puceat M 他. Cardiovascular research、2007; Vol. 74; pgs. 256−261)。成長因子および低分子化合物は、これらの重要な発生経路の操作を介して幹細胞における心臓分化の誘導に使用されてきた。TGF−~は骨髄幹細胞の未成熟ＣMへの分化を誘導しそしてESＣにおける心臓分化を誘導することが報告されている（Li T S  と他.,生化学的および生物物理学的研究コミュニケ−ション、2008; Vol. 366; pgs. 1074−1080; Lim J Y 他.、Molecules and cells、2007; Vol. 107; pgs. 186−199)。TGF −β活性の阻害は心臓転写因子Nkx2．5の誘導を阻害した（Lim J Y と他.、分子と細胞、2007; Vol. 107; pgs. 186−199）。出願人の結果は、LY2109761によるTGF − 1シグナル伝達の遮断がISX − 9によって誘導される心臓転写因子の発現を減少させることを示し、それは我々のRNA配列決定デ−タを検証した。 WNTタンパク質は、心臓の発生および分化の間に複数の役割を果たすことが示されている。Wnt/~−カテニンシグナル伝達は早期の心臓発生を増強したが、その後それは心臓の規格化に悪影響を示した(Gessert S  他.、Circulation research、2010; Vol. 107; pgs. 186−199)。阻害剤を用いたWnt/~−カテニンシグナル伝達の時間的調節は、強力な心筋細胞分化を促進することが実証された (Lian X  他.、アメリカ合衆国国立科学アカデミ−講演論文集、2012; Vol. 109; pgs. E1848−1857).。対照的に、非標準Wntシグナル伝達は心臓の特異化を促進した。 Wnt5aはMesp1によって上方制御されており、心臓形成において役割を果たす可能性がある (Gessert S  他.、循環研究、2010; Vol. 107; pgs. 186−199)。Wn5a/Wnt11は、間葉系幹細胞または骨髄幹細胞においてPKCの活性化を介して心原性プログラムを引き起こす可能性がある（Gessert S  他.、循環研究、2010; Vol. 107; pgs. 186−199）。注目すべきことに、Wnt5 aおよびWntIIは、主に非標準Wntシグナル伝達を誘発した。これらは、複数のメカニズムを通して標準Wntシグナル伝達を阻害することが示されている（Gessert S  他.、循環研究、2010; Vol. 107; pgs. 186−199）。さらに、Wnt5 aおよびWntIIは、標準的なWnt経路を阻害し、続いてAKTのカスパ−ゼ依存性分解を介して心臓前駆細胞の生成を促進することが報告された(Bisson J A  と他.,発生生物学、2015; Vol. 398; pgs. 80−96)。Wnt5 aおよびWntIIは、第２の心臓野前駆細胞の発生に不可欠であった（Cohen ED  と他.、発生、2012; Vol. 139; pgs. 1931−1940）。さらに、非標準的なWnt経路は細胞骨格の再配列に関連している（Cohen ED  他.、発生、2012; Vol. 139; pgs. 1931−1940）。経路濃縮分析により、WNTおよび細胞骨格リモデリングおよびWnt5aに関連する遺伝子がISX−9によって上方制御されていることが確認された。さらに、リアルタイムPCRの結果は、ISC−9がCPC分化の初期段階でWnt3a上方制御を誘導したのに対し、Wnt5aおよびWnt11は後期段階で上方制御されたことを示した。初期分化時のWnt経路の阻害および後期段階の非標準的Wnt経路の阻害は、心臓転写因子の発現低下をもたらした。 以前の研究からの発見と一致する（Cohen ED  他.、発生、2012; Vol. 139; pgs. 1931−1940）。出願人の結果は、Wnt5またはWntIIのいずれかのノックダウンが心臓転写因子発現の劇的な減少をもたらし、それらの関与が心臓前駆細胞の生成に必要であることを示唆していることを示した。まとめると、これらの結果はさらに、ISX − 9が標準的および非標準的Wntシグナル伝達の時間的および逐次的調節を介して心臓の分化および特異化を促進するかもしれないことを裏付けた。細胞が異なれば、ISX−9処理に対して異なる反応を示す可能性がある。 神経前駆細胞において、ISX − 9処理はそれらをニュ−ロンに向かって促進することが実証された(Schneider J W と他.,自然化学生物学、2008; Vol. 4; pgs. 408−410)。我々の結果に基づいて、ISX−9は初期段階でTGF−β誘導EMTシグナル伝達および標準Wntシグナル伝達の活性化を介してhiPSCにおいて中胚葉および心臓中胚葉分化を誘導する可能性がある。そして、継続的なISX−9刺激はCPC形成の後期にWnt5とWnt11のアップレギュレ−ションをもたらした。心臓分化の後期の間の標準的Wntシグナル伝達の阻害は、非標準的Wnt発現の有意なアップレギュレ−ションを示した (Mehta A  と他.、バイオチミカエバイオ物理法、2014; Vol. 1843; pgs. 2394−2402).。興味深いことに、Wnt5aおよびWnt11の喪失は第二の心臓前駆細胞の劇的な減少をもたらしたが、発生中の心臓における標準的なWntシグナル伝達の増加が観察されたCohen ED  と他.、発生、2012; Vol. 139; pgs. 1931−1940）。これらの研究は、心臓形成中の正準シグナリングと非正準シグナリングとの間のクロスト−クを示唆している。さらに興味深いことに、ISX−9は心臓転写因子の時間依存性発現であり、さらなる研究を必要とする複数の発生シグナル伝達経路を標的としている。さらに、筋肉遺伝子発生におけるISX−9の役割は、心筋細胞におけるPIP3シグナル伝達の発達、筋肉収縮およびNF−AT肥大シグナル伝達経路に関連する遺伝子の上方制御によってさらに強化された。したがって、出願人の結果は、ISX − 9がiPSＣにおける心臓分化の強力なプロモ−タ−であることを強く示唆している。
［０４０７］
多様なシグナル伝達経路を通じた心臓分化におけるその役割に照らしてISX−9はまた、miR−335、miR−21、miR−30c、およびmiR−214を含む筋形成miRNAおよび心臓肥大関連miRNAを活性化した。これらのmiRは、筋形成分化または筋肉再生において積極的な役割を果たすことが知られている。(Guess M G  と他.、PloS one、2015; Vol. 10; e0118229); (Wei Y と他.、Gene、2016; Vol. 592; pgs. 60−70); (Liu J と他.、The Journal ofbiological chemistry、2010; Vol. 285; pgs. 26599−26607); (BaiL  と他.、PloS one、2015; Vol. 10; e0119396); (MeyerS U  と他.、PloS one、2015; Vol. 10; e0135284)。心筋における最も豊富なmiRNAは、miR−let−7、miR−30cである(Yu S  と他.、Journal of cardiovascular translational research、201 0; Vol.3; pgs. 241−245)。miR−let−7ファミリ−は正常な心臓の維持において重要な役割を果たし、幹細胞由来のCMの成熟に必要である(Kuppusamy K T  と他.,アメリカ合衆国国立科学アカデミ−講演論文集、2015; Vol. 112; pgs. E2785−2794)。さらに、miR−21は心肥大に関与しており、胎児の心臓で高発現していた(Romaine S P  と他.、Heart、2015; Vol. 101; pgs. 921−928)。マウス幹細胞およびCMにおいてmiR−30cおよびmiR−335は上方制御されることが示されており、これは心臓発生中のそれらの潜在的な役割を示唆している(Thurn T  と他.、Circulation、2007; Vol. 116; pgs. 258−267)。ただし、幹細胞の心臓分化に重要なmiRNAとシグナル伝達経路の調節の根本的なメカニズムをよりよく理解するためにはさらなる研究が必要である。
［０４０８］
この研究は、多様なシグナル伝達経路を介して強力な筋肉分化能を有する単一の心原性低分子化合物、ISX−9を使用してhiPSCから純粋なCPCを製造する新規技術を実証する。これらのＣPＣは多能性でありそして3つの心臓系統に分化して梗塞心臓に新しいＣMおよび血管を形成し、それにより線維症を減少させそして機能指数を改善した。
分化型hiPSCにおけるWnt5aとWnt11のノックダウン
［０４０９］
Wnt5 aおよびWnt11は、前述のようにISX−9で処理した分化hiPSＣにおいてノックダウンされた。一通り、iSX−9処理の3日目に、リポフェクタミンRNAiMAXトランスを使用して、80％コンフルエンシ−の細胞を10nMサイレンサ−選択siRNA Wnt5a (Sense: UAUCAAUUCCGACAUCGAAtt (SEQ ID NO. 1 )、Antisense: UUCGAUGUCGGGAAUUGAUAc (SEQ ID NO. 2)) と Wnt11 (Sense: ACUUCUGCAUGAAGAAUGAtt (SEQ ID NO. 3)、Antisense: UCAUUCUUCAUGCAGAAGUca (SEQ ID NO.4)) でトランスフェクトした。Silencer&#8482;陰性対照1号siRNAはThermo Fisher科学サイレンサ− siRNAラベリングキットから入手して、トランスフェクション効率を決定するために使用した。48時間後、トランスフェクト細胞におけるWnt5 aおよびWnt11ノックダウンの確認をリアルタイムPＣRによって分析した。 7日目に、心臓転写因子発現の分析のために細胞を採取した。
免疫組織化学
［０４１０］
細胞免疫細胞化学のために、細胞を4％パラホルムアルデヒド（PFA）で室温で10分間固定した。 PBSで洗浄した後、細胞をブロッキング緩衝液（10％ウシ胎児血清および0．1％トリトンを含有するPBS）によって室温で1時間ブロックした。心臓前駆細胞（CPC）を、それぞれの特異的一次抗体Nkx2.5（abeam、ab91196、1：300）、GATA4（SC−1237、Santa Cruz、1：100）およびISL−1（ab86472、abeam、1：300）で免疫染色した。 hiPSC−CMは、α−肉腫アクチン、cTnT、cTni、MLC2VおよびCX43の発現によって特徴付けられた；hiPSC−ECはCD31およびVE−カドヘリンの発現を介して特徴付けられた；hiPSC−SMCは、α平滑筋アクチン（SMA）およびカルポニンの発現によって特徴付けられた。手短に言えば、hiPSC−CMをα−サルコメリックアクチニン(A7811、Sigma、1:200)、心筋トロポニンT(13−11、Thermo Fisher Scientific、1:200)、心筋トロポニンI(701585、Thermo Fisher Scientific、1:200)、 MLC2V (10906−1−AP、Protein Tech Group、1:200)および CX43 (ab11370、abeam、1:200)に対するそれぞれの特異的一次抗体で免疫染色した。hiPSC−ECを、ECマ−カ−CD31に対する抗体（ab24590、abeam、1：200）およびVE−カドヘリン(ab33168、abeam、1:200)で免疫染色した。hiPSC−SMCを、SMCマ−カ−SMA（ab5694、abeam、1：500）およびカルポニン(C−2678、sigma、1 :600)に対する抗体で免疫染色した。一次抗体−抗原反応は、蛍光結合した特異的二次抗体を用いて検出した。抗体とのインキュベ−ション後に毎回、サンプルをPBSで3回洗浄した。 4，6'−ジアミジノ−2−フェニルインド−ル（DAPI； Life technologies）によって5μg/mlで染色した後、核を可視化した。蛍光顕微鏡（オリンパス、東京、日本）を用いて蛍光シグナルを観察し、写真撮影した。
［０４１１］
組織学的分析は、DPBS、hiPSＣまたはＣPＣを用いた心筋梗塞（MI）を受けたマウスから無作為に選択された心臓に対して行われた（1群あたりn ＝ 6）。全ての心臓を室温で1時間4％PFAで固定し、4℃で一晩30％スクロ−スで置き換えた。これらのサンプルを光学的切断温度（OＣT）化合物（Tissue Tek）に包埋し、5μm厚の凍結切片にスライスした。α−肉腫アクチニン（A7811、Sigma、1：200）、ヒト心筋トロポニンTはマウスと交差反応しない（ab45923、abeam、1：200）。CD31（MA5−13188、Thermo Fisher Scientific、1：100）、α−SMA（ab5694、abeam、1：300）、心筋トロポニンI（701585、Thermo Fisher Scientific、1：200）、およびヒトミトコンドリア抗原（MAB1273、 ミリポアシグマ、1：200）は実施された。シグナルは、Dylight 405（Thermo Fisher Scientific）、Alexa Fluor 64 7およびAlexa Fluor 488二次抗体（Life technologies）を用いて可視化した。画像取得は共焦点顕微鏡（FV1000、オリンパス、日本）で行った。核をDAPIまたはQnuclear（商標）ディ−プレッドステイン（Thermo Fisher Scientific）で対比染色した。マッソントリクロ−ム染色は、製造元のプロトコル（HT−15、シグマ）に従って実施した。
梗塞サイズ測定
［０４１２］
梗塞サイズは、マッソンの三色染色面積と総左心室面積の比から頂点から4mm間隔でサンプリングした7つの切片の平均として決定した。手短に言えば、LV心筋層および梗塞瘢痕の総面積をレベルセット法および閾値法によって追跡した。 (Wang P Neurochemical research、2016; Vol. 41; pgs. 2627−2635); (Wang Y  IEEE International Conference on: IEEE、2011; pgs. 1−4); (Chen Y  Medical image analysis、2014; Vol. 18; pgs. 1−8)。それをデジタル画像で手動で洗練され、そして自動的に測定された。楕円によるレベルセット法は、心外膜が円形の輪郭で囲まれているという観察に基づくセグメンテ−ションに使用された。形状プライアを有するレベルセット定式化は効率的なセグメンテ−ション方法であることが実証されており、そして多くの技術が報告されている(Wang P と他、Neurochemical research、2016; Vol. 41; pgs. 2627−2635)。本研究では、提案された楕円の洗練されたレベルセットセグメンテ−ションエネルギ−定式化の一般式は次のようになる：
2019201631.tif 000012
ここで、 Edata は選択されたデ−タ添付用語を表し、 Eshape は予め形状を埋め込む。重みは、2つの項の間の影響のバランスをとる正のハイパ−パラメ−タ−に対応する。 Wang等（Wang P他、Neurochemical research、2016; Vol. 41; pgs. 2627−2635）が指摘したように、 Edataは任意のデ−タ添付用語である可能性があり、本研究では、狭帯域アクティブコンタ−がデ−タ添付用語として採用されている。心外膜のセグメンテ−ション後、色閾値法を実施して心臓組織および梗塞瘢痕を測定した。百分率で表される梗塞サイズは、全切片からの梗塞面積の合計を全切片からのLV面積の合計（梗塞瘢痕のないものを含む）で割って100を掛けることによって計算された。
フロ−サイトメトリ−
［０４１３］
ＣPＣおよびhiPSＣ − ＣM、hiPSＣEＣおよびhiPSＣ − SMＣの純度を検出するために、細胞を10分間のアキュタ−ゼ消化後2時間コラ−ゲンIV（幹細胞技術）で解離させた。解離した細胞をBD Cytofix/Cytoperm TM固定/透過処理キット（BD Biosciences）で固定し透過処理し、その後、Nkx2.5（abeam、ab91196、1：200）、cTnT（13−11、Thermo Fisher Scientific、1：200）、CD31およびSMA（ab5694、abeam、1：200）に対する抗体と4℃で 一晩でインキュベ−トした。3回洗浄した後、細胞をアイソタイプが一致したAlex a蛍光標識二次抗体（Life technologies）と共に室温で1時間インキュベ−トし、LSR IIフロ−サイトメ−タ−（BD Biosciences）によって検出した。アイソタイプが一致した正常IgGを陰性対照として使用した。
試験管内での内皮細胞の機能アッセイ
［０４１４］
試験管内でマトリゲル上の管形成を分析するために、hiPSC−ECを、24ウェルプレ−トの1.2×10 5細胞/ウェルの密度で、マトリゲルの薄層の上に播種した。16時間後、細胞をCalcein AM（Corning）で標識し、蛍光顕微鏡下でチュ−ブ状構造を可視化した。アセチル化低密度リポタンパク質の取り込みは、Alexa Fluor−594（Invitrogen）とコンジュゲ−トした5μg/ mlのac−LDLと共に細胞を4時間インキュベ−トすることによって評価した。 インキュベ−ションの後、細胞をDAPIで対比染色して核を可視化した。
細胞保護およびTUNEL染色
［０４１５］
ISX−9によって生成されたCPCの細胞保護を分析するため、ISX−9で処理したhiPSCをカバ−ガラスに再び蒔き、試験管内低酸素条件下（5％CO 2、94％N 2および1％O 2）、37℃で低酸素チャンバ−（INVIV02 500）中で12時間、24時間、擬似虚血に供した。hiPSＣは、0．5％DMSOを含むまたは含まないRPMIIB27中で培養した。培養細胞内の核DNA断片化を局在化するために、インサイチュ−末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラ−ゼ媒介dUTPニックエンド標識（TUNEL）は、市販のアポト−シス検出キット（Roche、USA）を使用して実施した。全ての手順は製造業者の指示に従って実施した。 細胞をDAPIで対比染色して核を可視化した。TUNEL陽性細胞の数は、同じ群の3枚のカバ−ガラスから無作為に10視野（20×）を数えることによって決定し、そして正常核を有する細胞の百分率として表した。虚血性心臓におけるＣPＣによる細胞保護をさらに決定するために、冠状動脈結紮の10分後にＣPＣを梗塞マウス心臓に移植した。 3日後、マウスを屠殺し、そして心臓組織をTUNEL染色のために処理した。心筋細胞は、α−サルコメリックアクチニン染色によって同定された。 細胞をDAPIで対比染色して核を可視化した。全TUNEL陽性細胞およびTUNEL陽性ＣMの数は、各心臓の境界領域から5視野（20×）を数えることによって決定した（n ＝ 3）。 DPBSおよびhiPSＣで処理した心臓を対照群とした。
試験管内でパラクリン機能の解析
［０４１６］
ISX−9によって誘導されたCPCが試験管内の虚血条件下で前血管原性および生存促進性サイトカインを発現および分泌したかどうかを調べて、我々は、正常および虚血条件下で、誘導されたＣPＣにおけるパラクリン因子を同定するために、複数の血管新生因子およびサイトカインアッセイ（Millipore）を実施した。一通り、誘発されたＣPＣを、低酸素条件下（5％ＣO 2、94％N 2および1％O 2）、37℃または通常の培養条件下で12時間24時間、インビトロで擬似虚血に供した。そして上清（n ＝ 4 /群）を集め、4℃で10，000gで10分間遠心分離し、そして−80℃で保存した。記載されているように、Luminexベ−スのプラットフォ−ム（Bio−Rad Bio Plex−100）を使用して、分泌因子の分析を行った。0．5％DMSO有りまたは無しでRPMI/B27中で培養したhiPSＣを対照群として用いた。
ISX−9処理によって生成されたCPCのRNAシ−ケンス
［０４１７］
未分化のhiPSC、DMSOまたはISX−9で処理したhiPSC(n=4)の間の遺伝子発現の差異を明らかにするために、mRNA配列決定トランスクリプト−ム分析を行った。未分化のhiPSＣ、DMSOまたはISX − 9で処理したhiPSＣにおける全体的なmirNA発現プロファイルもまた決定した。mRNA配列決定およびmirNA配列決定は、コアゲノミクスファシリティおよびイリノイ大学シカゴ校のDNAサ−ビスファシリティによって行われた。バイオインフォマティクスデ−タ解析は、シカゴのイリノイ大学で研究情報コアで行った。簡単に言えば、miRNAを含む全RNAを、製造元の指示に従って、QiagenのRNasey Plus ミニ−キットを用いて細胞から抽出した。その後、RNase−free DNase kit（Qiagen）を使ってDNAseを処理した。mRNA配列決定のために、QuantSeq 3'mRNA−Seq Library Kitを用いてシ−クエンシングライブラリ−を調製した(Lexogen Inc、産品 #015.96)。ライブラリ−調製のための投入量は、サンプルあたり500ngの全RNAであった。ライブラリ−を16サイクルでPCR増幅し、Qubit dsDNA HS配列を用いて定量した。mirNA配列決定のために、IlluminaのTruSeq Small RNA Coreソル−ションキットとTruseq Small RNA Indices A キットを用いて配列決定ライブラリ−を調製した(Illumina product #s： 15016911 and 15016912)。ライブラリ−調製のための投入量は、サンプルあたり1μgの全RNAであった。ライブラリ−を11サイクルでPCR増幅し、Qubit dsDNA HS配列を用いて定量した。配列決定ライブラリ−を等モル濃度でプ−ルして、配列決定はNextSeq 500（Illumina）で行った。シングルリ−ドは75 nt、また高出力（1レ−ンあたり約4億リ−ド）である。
［０４１８］
3'mRNA−seqデ−タの分析では、BWA memを使用して12サンプルのショ−トリ−ドをUCSCヒトhg19参照ゲノムにマッピングした(Li H と他、Bioinformatics、2009; Vol. 25; pgs. 1754−1760)。マッピング結果とUCSC hg38のトランスクリプト−ムアノテ−ションに基づいてfeatureCountsベ−スを使用して、各遺伝子のrawカウントとを定量化した。全サンプルにわたってゼロカウントを有する遺伝子をさらなる分析からフィルタ−にかけた。生カウントはR Bioconductorパッケ−ジを用いて、各試料中の各遺伝子のために百万（CPM）ごとにカウントするように正規化した(Robinson MD と他、Bioinformatics、2010; Vol. 26; pgs. 139−140)。示差的に発現される遺伝子（DEG）は、edgeRを用いて同定された。まずは、一般的線形モデル（GLM）尤度比検定（LRT）を、任意の群における遺伝子の平均発現値が他の試料群と有意に異なるDEGを同定するために実施した。生p値はBenjamini−Hochberg補正によって調整された(Benjamini Y と他、王立統計学会誌シリ−ズB−方法論、1995; Vol. 57; pgs. 289−300)。次に、ペアワイズ比較がDMSO vs. hiPSC、ISX−9 vs. hiPSCとISX−9 vs. DMSOの間に行われた。重要なペアのDEGを識別するため、サンプルグル−プの各ペア間の各遺伝子に対して同様なテストを実行した(Robinson MDと他、Biostatistics、2008; Vol. 9; pgs. 321−332)。正確検定からのp値もBenjamini−Hochberg補正によって補正した。同様に、miRNA−seqデ−タの解析では、BWAmemを用いて、12サンプルの3 'ショ−トリ−ドをNCBIヒトGRCh38参照ゲノムにマッピングした(Li H と他.、Bioinformatics、2009; Vol. 25; pgs. 1754−1760)。マッピング結果とmiRbaseからのmiRNAアノテ−ションに基づいてfeature Countsベ−スを使用して、各miRNAの転写産物の生カウントを定量した。正規化および示差分析は、mRNA配列デ−タ分析におけるのと同じ手順に従った。経路濃縮分析は、メタコアオンライン分析を用いて処理した。
受入番号
［０４１９］
この実験で報告されたRNA配列決定デ−タに関するGEOの受入番号はGSE95389およびGSE95390であった。
透過電子顕微鏡法
［０４２０］
分化した心筋細胞（ＣM）を2．5％（VolNol）グルタルアルデヒド、0．1Mカコジル酸緩衝液中で4℃で一晩固定した。そのあと、同じ緩衝液中の1％四酸化オスミウムで後固定し、2％酢酸ウラニル水溶液で染色して、アセトン中で脱水し、浸潤させ、そしてLX − 112樹脂（Ladd Research Industries、Burlington、Vt）中に包埋した。極薄60 nm切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。試料をJEOL JEM−1220透過型電子顕微鏡（TEM）（JEOL USA、Inc.）で調べた。
心エコ−検査
［０４２１］
マウスを吸入イソフルランで穏やかに麻酔し、暖かいパッド上で仰向けの位置に軽く固定した。髪を取り除いた後、音響ゲルを塗布して、経胸壁心エコ−検査は、L15−7ioトランスデュ−サ−を備えたPhilips iE33超音波装置を用いて行った。心臓は、傍胸骨長軸像または傍胸骨短軸像において二次元モ−ドで撮像された。その後、Mモ−ドカ−ソルを心室中隔および左心室後壁に垂直に配置し、Mモ−ド画像が得られた。各動物について、4〜5連続心周期から測定値を得た。収縮期および拡張期の両方における左心室の二次元指向Mモ−ド画像から、左心室拡張末期径（LVEDD）および左心室収縮末期径（LVESD）の測定を行った (Xuan W Cardiovasc Res、2011; Vol. 92; pgs. 385−393)。各動物における全ての測定からの平均値を使用して、左心室収縮機能の指標を決定した。例えば、以下の関係式を用いた左心室短縮率（LVFS）：LVFS=(LVEDD−LVESD)/LVEDDx100；次の関係式を使用した駆出率（EF）： EF=[(EDV−ESV)/EDV]x 100. LVFS。また、EFはパ−センテ−ジで示した。
qRT−PCR
［０４２２］
全RNAをRNe asyミニ−キット（Qi agen）を用いて単離した。逆転写は、 QuantiTect (Qiagen) 逆転写キット、または SuperScript（商標）IV VILO（商標）マスタ−ミックス(Thermo fisher Scientific Inc)を用いて行った。qRT−PCRが、他に記載されているように、定量SYBRグリ−ンリアルタイムPＣR法またはT aqm anプロ−ブ法を使用するリアルタイムシステムViiA（商標）7（ABI）またはQ3リアルタイムPCR装置（ABI）を用いて行った（プライマ−配列は表2に示される）。Wnt3a (Hs00263977 m1)、Wnt5a (Hs00998537_m1); Wntll (Hs01045905_m1); ISL−1 (Hs00158126_m1); Nkx2.5 (Hs00231763_m1); Mef2c (Hs00231149_m1); GATA4 (Hs00171403_m1); TUBA1A (Hs03045184_g1) のためのプロ−ブはThermo Fisher Scientific GAD PHから購入したて、TUBA1Aはロ−ディングコントロ−ルとして機能する。各遺伝子についた発現レベルの倍数変化は、式2−ll.ll.CTにより決定して、最終値を平均し、結果を平均値の標準誤差と共に倍数表現として表した(S.E.M.)。
2019201631.tif 000013
［０４２３］
［血管密度評価］
血管密度は、MI後3Mで屠殺した9匹の動物（各群3匹）において評価した。 anti−CD31抗体で染色した後、または400倍の倍率で蛍光顕微鏡を使用してa−SMAで、全マウスの梗塞領域および境界領域の27の切片（心臓あたり3つの切片）について盲検で血管数を数えた。血管密度はＣD31陽性血管構造を数えることによって決定し、そして細動脈密度はα− SMA陽性血管構造を数えることによって決定した。各区画の5つの高倍率視野を無作為に選択し、そして各視野内の血管の数を平均し、そして高倍率視野当たりの血管の数（0.2 mm2）として表した。
8号実験
［０４２４］
冠状動脈結紮後の心臓損傷と機能に対する異なる心臓前駆細胞由来のエキソソ−ムまたは微小胞の比較効果。
方法
細胞培養
［０４２５］
hiPSCの維持：ヒトiPSＣ細胞（AＣS − 1021、ATＣＣ、米国）をビトロネクチンコ−ト6ウェルプレ−ト上のmTeSR1培地（Stem Ｃell Technology）中で毎日培地交換しながら維持した。製造元のプロトコル（Stem Cell Technology）に従って、細胞を4〜7日ごとにReLeSR試薬で継代した。
［０４２６］
ＣPＣ生成：簡単には、mTeSR1培地（Stem Ｃell Technology）中のビトロネクチンコ−ト6ウェルプレ−ト上に維持されたhiPSＣが、37℃で10分間Accutase溶液（Invitrogen）を用いて単一細胞に解離して、次いで、5μMのROＣK阻害剤（Y−27632、Stem Ｃell Technology）を補充したmTeSR1中、1×10 6細胞/ウェルでビトロネクチン被覆6ウェルプレ−トに24時間の間に播種した。次の日、細胞をmTesR1中で3日間毎日交換しながら培養した。その後、培地を、ISX − 9（20μM、DMSOに溶解、Stem Ｃell Technology）を補充したインスリンを含まないRPMII B27に7日間切り替えた。
EBジェネレ−ション
［０４２７］
出願人は、RPMIIB27マイナスインスリン培地中でハンギングドロップ法を用いてEBを生成した。
心臓前駆細胞、EBまたはhiPSCからのエキソソ−ムまたは微小胞の生成および単離
［０４２８］
エキソソ−ムまたは微小胞を、ヒトiPS細胞株ACS−1021（ATCC、米国）、胚様体（EB）およびISX−9によって誘導されたCPCから生成した。CPCが、10号実験に記載されたように生成した。hiPSＣおよびＣPＣから、馴化培地を収集した。馴化培地を3000rpmで30分間遠心分離して細胞および破片を除去し、続いて0．22μmフィルタ−を通して濾過して残りの破片を除去した。次いで、培地を、Amicon Ultra−15 100 kDa遠心分離フィルタ−ユニット（Millipore）を用いて500μlにさらに濃縮した。濃縮培地中のエキソソ−ムおよび微小胞の単離は、qEVサイズ排除カラム（Izon science）を使用した。エキソソ−ム画分または微小胞画分を収集し、そしてAmicon Ultra−4 10KDa遠心分離フィルタ−ユニットにより、＜100μlの最終容量まで濃縮した。精製したエキソソ−ムまたは微小胞を−80℃で保存し、続いてナノトラッキング分析、タンパク質および超微細構造分析によって特徴付けた。
可変抵抗パルスセンシングによる粒径と濃度分布の測定
［０４２９］
エキソソ−ムまたは微小胞単離分析の粒径および濃度分布は、qNano装置（Izon Science）を用いた調整可能な抵抗パルスセンシング法を用いて行った。簡単に説明すると、20mbarの圧力および46．5〜47．5mmの間で延伸されたNP200ナノポア膜を使用して、粒子の数を少なくとも600〜1000イベント数えた。較正は、既知濃度のビ−ズＣPＣ200（直径：210nm）を用いて行った。 デ−タはIzon Control Suiteソフトウェアを使用して処理した。
透過電子顕微鏡法
［０４３０］
エキソソ−ムまたは微小胞ペレットを4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定して、蒸留水を用いて合計8回洗浄した後、グリッドをシュウ酸ウラニル溶液と5分間対比させて、先の研究の記載に従って、氷上で10分間メチルセルロ−ス−酢酸ウラニルに移した。試料が、JEOL JEM−1220透過型電子顕微鏡で調べた (TEM) (JEOL USA、Inc.)。
9号実験
［０４３１］
未発表要約からの低分子化合物を用いたヒト誘導多能性幹細胞からの心臓/骨格筋形成前駆細胞の生成：低分子化合物を用いたヒト誘導多能性幹細胞からの心臓/骨格筋形成前駆細胞の生成。
［０４３２］
この実験の目的は、細胞療法のための単一の低分子化合物を用いてヒト人工多能性幹細胞（hiPSＣ）の心臓（ＣMP）または骨格筋原性前駆細胞（SMP）への変換を評価することであった。
方法と結果
［０４３３］
hiPSC（細胞株として購入）を単層として培養し、低分子化合物のジビノスタット（GIV、ヒストンデアセチラ−ゼ阻害剤、10〜200nM）で7日間処理した。150nM GIVの濃度で、より高い細胞生存率（ＣＣK8アッセイ）およびより低い細胞毒性（LDHアッセイ）が観察された。7日後、GIVはCMPとSMPの両方を生成することによって二重の効果をもたらした。GIVに加えて、SMP仕様のためにmTeSR 1無血清培地をRho−associated kinase（ROCK）阻害剤（5 μMチアゾビビンまたは1 μM Y27632）とともに使用した。また、CMP仕様には、mTeSR&#8482;1無血清メディシンをALK4/5/7（TGFβtype−1 receptor）阻害剤（2 μM SB431542または1 μM A83−01）と併用し、また、4−8日後に評価された。GIVは最初の4日で骨格筋形成遺伝子のアップレギュレ−ションを増加させ（リアルタイムPCR分析）、8日後より高いレベルでさらに増加した。筋肉遺伝子は、Meox1 (21.4−fold)、Meox2 (3.9−fold)、Tcf15 (3.5−fold)、Pax3 (28−fold)、Pax7 (3.2−fold)、MyoD 1 (1. 7−fold)、ジストロフィン (3 .8−fold)、myogenin ( 6−fold)、Myh2 (5.6−fold)、Myh6 (3.4−fold)、Tbx1 (2.6−fold)、Mesp1 (2.4−fold)、desmin (1.9−fold) と β−catenin (1.6−fold)が含まれて、コントロ−ルに応じる。PＣR結果は、Pax3 (7−fold)、Pax7 (2.5−fold)、Myf5 (8−fold)、MyoDl (2−fold)、ジストロフィン (6−fold) と desmin (5−fold) を含むウエスタンブロットデンシトメトリ−で、コントロ−ルに対し確認した(P<0.05)。形態学的には、分化管の筋管または筋細胞様の形状が顕微鏡的に観察された。GIVは4日後に心筋筋形成遺伝子の上方制御を増加させ、8日後にはより高いレベルを増加させた。心臓遺伝子Pitx2 (56−fold)、ISll (6.9−fold)、Nkx2.5 (48−fold)、Hand! (14.1−fold)、GATA4 (5−fold)、Tbx5 (3.8−fold)、TnnT2 (5.7−fold)、Myl7 (16.1−fold)、MLC2v (8.9−fold)、Myf2c (1.4−fold)、Cdh4 (3.1−fold) と Lhx2 (2.7−fold) が含まれ、コントロ−ルに対する。
［０４３４］
hiPSＣのGIVによる前処理は、心筋梗塞およびデュシェンヌ型筋ジストロフィ−に対する細胞療法のためにインビトロで心臓/骨格筋原性前駆細胞の両方を産生するための実行可能な戦略を表す。
10号実験
［０４３５］
この実験は、冠状動脈結紮後の心臓損傷および機能に対する異なる心臓前駆細胞由来のエキソソ−ムの比較効果を開示する。簡単で言えば、ヒトiPS細胞（ACS−1021、ATCC、米国）を、毎日培地を交換しながら、ビトロネクチンコ−ト6ウェルプレ−ト上にmTeSR1培地（Stem Cell Technology）の中で維持した。製造元のプロトコルに従って、細胞を4〜7日ごとにReLeSR試薬で継代した（Stem Cell Technology）。CPCを生成するため、ビトロネクチンコ−ト6ウェルプレ−ト上にmTeSR1培地 (Stem Cell Technology)の 中で維持されたhiPSＣが、37℃で10分間Accutase溶液（Invitrogen）を用いて単一細胞に解離したながら、次いで、lx106細胞/ウェルmTeSRlでビトロネクチンでコ−ティングした6ウェルプレ−トへ播種し、5μMのROCK阻害剤（Y−27632、電池技術をSTEM）を補充し、24時間を続く。次の日、細胞を3日間毎日交換しながらmTesR1中で培養した。その後、培地を、ISX − 9を添加したインスリンを除いたRPMIIB27に切り替えて（20 uM、DMSOに溶解する、Stem Cell Technology）、7日を続く。EB生成のために、RPMI/B27マイナスインスリン培地中のハンギングドロップ法を使用した。心臓前駆細胞からエキソソ−ムを生成して単離するため、EB や hiPSCs、またはエキソソ−ムがヒトiPSC細胞株ACS−1021(ATCC、USA)、胚様体(EB) とISX−9が含まれるCPCsから生成された。ＣPＣが以前に記載されたように生成された。馴化培地が、hiPSCとのCPCから収集しました。馴化培地を3000rpmで30分間遠心分離して細胞および破片を除去したあと、残っている破片を除去するために、0.22 flill filterで濾過する。次いで、培地を、Amicon Ultra−15 100 kDa遠心分離フィルタ−ユニット（Millipore）を用いて、500μlにさらに濃縮した。濃縮培地中のエキソソ−ムの単離は、qEVサイズ排除カラムを使用した(Izon science)。エキソソ−ム画分が、最終容量<100フィルまでAmicon Ultra−4 10 KDa遠心フィルタ−ユニットにより集めて濃縮した。精製したエキソソ−ムを−80℃で保存したあと、ナノトラッキング分析、タンパク質および超微細構造分析によって特徴付けられる。エキソソ−ム単離分析の粒度および濃度分布が、qNano装置を用いた可変抵抗パルスセンシング法を用いて行った（Izon Science）。一通り、粒子の数は、20mbarの圧力を用いて少なくとも600から1000イベントカウントであり、NP200ナノポアメンブレンが46.5〜47.5 mmの間で伸ばした。既知濃度のビ−ズＣPＣ200を用いて較正を行った（直径：210μm）。デ−タは、Izon Control Suiteソフトウェアを使用して処理した。透過型電子顕微鏡のために、エキソソ−ムペレットを4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定した。蒸留水を用いて合計8回洗浄した後、グリッドをシュウ酸ウラニル溶液と5分間対比させて、以前の研究の説明によると氷上で10分間メチル−セルロ−ス−ウラニルアセテ−トに移した。試料がJEOL JEM−1220透過型電子顕微鏡で調べられた(TEM) (JEOL USA、Inc.)。
同値
［０４３６］
特に定義のない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に提供される全てのヌクレオチド配列は、5 ‘から3'方向に提示される。
［０４３７］
本明細書に例示的に記載された発明は、いずれかの要素と限りがなくても適切に実施することができる。本明細書ではそれを具体的に開示されていない。したがって、例えば、用語[含む]、[含めて]、[含める]などは、限定的ではなく拡大的に読まれるべきである。さらに、本明細書で使用されている用語および表現は、限定の用語じゃなく、説明の用語として使用されている。そして、そのような用語および表現の使用には、示され、説明された特徴またはその一部の均等物を排除する意味はない。しかし、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。
［０４３８］
従って、それは理解されるべき、本発明は好ましい実施形態によって具体的に開示されているが、また本明細書に開示されている本発明の実施形態の任意選択の特徴、変更、改良および変形は、当業者に頼ることができる。そして、その修正、改良および変形は本発明の範囲内にあると考えられることを理解されている。ここに提供される材料、方法、および実施例は好ましい実施形態の代表例であり、例示であり、本発明の範囲に対する限定として意味されていない。
［０４３９］
本発明は、本明細書において広く一般的に記載されている。一般的開示内に含まれるより狭い種および亜属分類のそれぞれもまた本発明の一部を形成する。これは、本発明の主題をこの属から排除する但書きや否定的な制限している一般説明を含み、切り取られた材料が本明細書に具体的に記載されているかどうかにかかわらない。
［０４４０］
そのうえ、本発明の特徴または態様がマ−カッシュグル−プに関して説明されている場合に、当業者は、本発明がそれによってMarknshグル−プの任意の個々のメンバ−またはメンバ−のサブグル−プに関しても記載されることを認識するであろう。
［０４４１］
本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により明示的に組み込まれる以上、それぞれが個別に参照により組み込まれている場合と同程度である。矛盾がある場合は、定義が含まれる本明細書が優先する。
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ−Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ−Ｆ】
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【図９Ａ−Ｃ】
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【図９Ｄ−Ｉ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１０Ｃ−Ｄ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ−Ｄ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
2019201631.tif 000038
【図１２Ｃ−Ｄ】
2019201631.tif 000039
【図１３Ａ−Ｂ】
2019201631.tif 000040
【図１３Ｃ】
2019201631.tif 000041
【図１３Ｅ】
2019201631.tif 000042
【図１３Ｆ】
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【図１４Ａ−Ｂ】
2019201631.tif 000044
【図１４Ｃ】
2019201631.tif 000045
【図１４Ｄ−Ｅ】
2019201631.tif 000046
【図１４Ｆ−Ｇ】
2019201631.tif 000047
【図１４Ｈ】
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【図１５Ａ−Ｂ】
2019201631.tif 000049
【図１６Ａ−Ｂ】
2019201631.tif 000050
【図１６Ｃ−Ｄ】
2019201631.tif 000051
【図１７Ａ−Ｂ】
2019201631.tif 000052
【図１７Ｃ−Ｄ】
2019201631.tif 000053
【図１７Ｅ−Ｆ】
2019201631.tif 000054
【図１８Ａ】
2019201631.tif 000055
【図１８Ｂ】
2019201631.tif 000056
【図１８Ｃ−Ｄ】
2019201631.tif 000057
【図１８Ｅ−Ｆ】
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【図１８Ｇ】
2019201631.tif 000059
【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
2019201631.tif 000061
【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ−Ｂ】
2019201631.tif 000063
【図２０Ｃ−Ｄ】
2019201631.tif 000064
【図２０Ｅ−Ｆ】
2019201631.tif 000065
【図２０Ｇ】
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【図２１Ａ−Ｂ】
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【図２１Ｃ−Ｄ】
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【図２１Ｅ】
2019201631.tif 000069
【図２１Ｆ−Ｇ】
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【図２２Ａ−Ｂ】
2019201631.tif 000071
【図２２Ｃ−Ｄ】
2019201631.tif 000072
【図２２Ｅ−Ｆ】
2019201631.tif 000073
【図２２Ｇ−Ｈ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
2019201631.tif 000076
【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ−Ｅ】
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【図２３Ｆ−Ｇ】
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【図２３Ｈ−Ｉ】
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【図２３Ｊ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ−Ｄ】
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【図２５Ａ−Ｂ】
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【図２６Ａ−Ｂ】
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【図２６Ｃ−Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ−Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８Ａ−Ｃ】
2019201631.tif 000092
【図２８Ｄ−Ｅ】
2019201631.tif 000093
【図２８Ｆ−Ｇ】
2019201631.tif 000094
【図２９】
2019201631.tif 000095
【図３０Ａ−Ｂ】
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【外国語明細書】
2019201631000001.pdf