(57)【要約】【課題】効率的な細胞内導入を可能とする細胞膜透過ペプチドを提供する。【解決手段】細胞膜透過性を有するF-(L-Leu-L-Leu-Aib)l-(Gly)m-(Arg)n-NH2で表されるペプチドである。lは３〜５のいずれかの整数であり、ｍは０〜３のいずれかの整数であり、ｎは８〜１０のいずれかの整数であり、Fは、リンカーを介して又は介さないで、ペプチドのＮ末端に結合した蛍光標識としてのフルオロセイン化合物である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜透過性を有する下記の式(I)
F-(L-Leu-L-Leu-Aib)l-(Gly)m-(Arg)n-NH2・・・(I)
〔式中、
lは３〜５のいずれかの整数であり、
ｍは０〜３のいずれかの整数であり、
ｎは８〜１０のいずれかの整数であり、
Fは、リンカーを介して又は介さないで、ペプチドのＮ末端に結合した蛍光標識としてのフルオロセイン化合物である。〕で表されるペプチド。
【請求項２】
前記フルオロセイン化合物は、5-FAM又は6-FAMである請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載のペプチドと、細胞内に輸送すべきカーゴ分子とを含む構築物。
【請求項４】
前記カーゴ分子は、核酸である請求項３記載の構築物。
【請求項５】
前記核酸はsiRNAである請求項４記載の構築物。
【請求項６】
細胞内に輸送すべきカーゴ分子と、請求項１又は２記載のペプチドとを結合させて構築物を得る工程と、
前記構築物を細胞に導入する工程と、を有する、
カーゴ分子を細胞内に輸送する方法。
【請求項７】
前記カーゴ分子は、核酸である請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記核酸はsiRNAである請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜透過性を有するペプチドに関し、具体的にはsiRNA等の核酸を効率的に細胞内に輸送できる細胞膜透過性を有するペプチドに関する。また、そのペプチドとカーゴ分子とからなる構築物に関する。更に、カーゴ分子を細胞内に輸送する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞透過性を有するペプチド(以下、細胞膜透過ペプチド(Cell-Penetrating Peptides;CPPs)と略することがある。)を用いて、細胞内にsiRNA等の核酸を導入する手法が注目されている。細胞内に導入したいsiRNA等の核酸にCPPsを細胞内導入ベクターとして化学的に結合させるか、又は、遺伝子工学的にCPPsと導入したいsiRNA等の核酸との融合タンパク質を調製し、細胞培養液に混合することで、効率よく細胞内に目的分子が導入される。
【０００３】
CPPsとして実際に用いられている代表的なものとして、(1)アルギニン等の塩基性アミノ酸に富むもの、(2)塩基性部分と疎水性部分を有する両親媒性ペプチド、(3)疎水性配列に若干の塩基性配列を含むペプチド、(4)疎水性ペプチド等が挙げられる。
【０００４】
ペプチドベクターは様々な物質の導入に有効であるが、siRNA等の核酸の導入には不向きである場合がある。体内でsiRNAを安定に保持・保護する一方、ひとたび標的細胞に到達すればこれを速やかに放出するという、いわば相反する二つの機能を高次に満足するペプチドベクターは実現が困難である。
【０００５】
非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３には、効率的な細胞内導入を可能とするCPPsが検討されており、CPPsの膜透過におけるカチオン性官能基の重要性や、オリゴアルギニンのペプチドヘリカル構造が細胞膜透過性の向上に寄与すること等が記載されている。
【０００６】
非特許文献４には、ロイシンとAibからなる短鎖ペプチド(Leu-Leu-Aib)3をヘリカルプロモータとしてノナアルギニン(Arg)9とコンジュゲートした細胞膜透過ペプチドF-βAla-(Arg)9-(Gly)3-(L-Leu-L-Leu-Aib)3-NH2が記載されている。しかし、この細胞膜透過ペプチドは細胞毒性が強いため、標的細胞に対するsiRNAの導入は確認されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】M. Oba, Y. Demizu, H. Yamashita, M. Kurihara, M. Tanaka, Bioorg. Med. Chem. 2015, 23, 4911-4918.
【非特許文献２】H. Yamashita, Y. Demizu, T. Shoda, Y. Sato, M. Oba, M. Tanaka, M. Kurihara, Bioorg. Med. Chem. 2014, 22, 2403-2408.
【非特許文献３】H. Yamashita, M. Oba, T. Misawa, M. Tanaka, T. Hattori, M. Naito, M. Kurihara, Y. Demizu, ChemBioChem 2016, 17, 137-140.
【非特許文献４】親水性分子の細胞内導入を志向した細胞膜高透過性ペプチドの開発  三澤隆史  日本薬学会第136回年会要旨集  2016年3月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、siRNA等の核酸の効率的な細胞内導入を可能とする細胞膜透過ペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明にかかる細胞膜透過ペプチドは、細胞膜透過性を有する下記の式(I)で表されるペプチドである。
F-(L-Leu-L-Leu-Aib)l-(Gly)m-(Arg)n-NH2・・・(I)
式中、lは３〜５のいずれかの整数であり、ｍは０〜３のいずれかの整数であり、ｎは８〜１０のいずれかの整数であり、Fは、リンカーを介して又は介さないで、ペプチドのＮ末端に結合した蛍光標識としてのフルオロセイン化合物である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、効率的な細胞内導入を可能とする細胞膜透過ペプチドが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明にかかる細胞膜透過ペプチドの生理的条件下における二次構造を示すＣＤスペクトル測定の結果である。
【図２】本発明にかかる細胞膜透過ペプチドを使用して修飾型siRNA又は標準型siRNAを細胞に導入したときの各タンパク質の発現量を示す電気泳動写真図と、それを定量化した棒グラフである。
【図３】細胞膜透過ペプチドのsiRNA導入活性に重要な部位の検討にかかる各タンパク質の発現量を示す電気泳動写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１３】
本発明者らは、細胞膜透過性を有するオリゴアルギニン(Arg)nに対し、ヘリカル構造の形成を誘起する疎水性型ヘリカルテンプレート配列H-(L-Leu-L-Leu-Aib)l-NH2を連結させたBlockペプチドをデザインした。オリゴアルギニン(Arg)nに疎水性型ヘリカルテンプレート配列を連結させることで、アルギニン配列がヘリカル構造を形成し、両親媒性を獲得すると考えられる。
【００１４】
本発明にかかる細胞膜透過ペプチドは、下記式(I)で示される。
【００１５】
F-(L-Leu-L-Leu-Aib)l-(Gly)m-(Arg)n-NH2・・・(I)
式中、lは３〜５のいずれかの整数であり、ｍは０〜３のいずれかの整数であり、ｎは８〜１０のいずれかの整数である。Fは、リンカーを介して又は介さないで、ペプチドのＮ末端に結合した蛍光標識としてのフルオロセイン化合物である。式(I)で示される細胞膜透過ペプチドは、細胞毒性をほとんど示さず、しかも、細胞培養液内でsiRNAを安定に保持する一方、標的細胞内に到達すれば速やかに放出する特性を有するため、効率的なsiRNAの細胞内導入と遺伝子発現抑制が可能である。
【００１６】
Fは、リンカーを介した蛍光標識である場合が好ましく、リンカーとしては例えばβ-Ala等がある。蛍光標識としてはフルオレセイン化合物である限り、特に限定されるものではなく、例えば下記に示す化合物が挙げられる。好ましくは5-FAM若しくは6-FAM又はこれらの混合物である。
【００１７】
【化１】
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【００１８】
下記に本実施形態にかかる細胞膜透過ペプチドの好適な場合の構造式を示す。下記式においてRは例えばOHである。
【００１９】
【化２】
2019118307.tif 000004
【００２０】
式(I)において、lは３が好ましく、ｍは３が好ましく、ｎは９が好ましい。この最も好ましい本実施形態にかかる細胞膜透過ペプチドの構造式を示す。
【００２１】
【化３】
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【００２２】
本実施形態にかかる構築物は、本実施形態にかかる細胞膜透過ペプチドと、細胞内に輸送すべきカーゴ分子とを含む。細胞膜透過ペプチドとカーゴ分子とは共有結合的又は非共有結合的に結合する。
【００２３】
カーゴ分子は、特に限定されるものではないが、例えば、核酸、タンパク質、薬剤、又は、ナノ粒子の何れかであり、好ましくは核酸である。
【００２４】
カーゴ分子である核酸は、ポリヌクレオチドでもオリゴヌクレオチドでもよく、DNAでもRNA分子でもよい。DNAの場合、プラスミドDNA、cDNA、ゲノミックDNA又は合成DNAでもよい。DNA及びRNAは２本鎖でも１本鎖でもよい。カーゴ分子は2本鎖RNAであるsiRNAが特に好ましい。
【００２５】
本実施形態にかかるカーゴ分子を細胞内に輸送する方法は、細胞内に輸送すべきカーゴ分子と、本実施形態にかかるペプチドとを結合させて構築物を得る工程と、その構築物を細胞に導入する工程と、を有する。
【００２６】
本実施形態にかかる構築物を生体（ヒトを含む動物、特に、ヒトを含む哺乳類）に投与する方法としては、経口、注射、点眼、点鼻、経肺、皮膚を介した吸収のいずれでも良く、好ましくは注射である。例えば、本実施形態にかかる構築物を静脈注射による全身投与又は患部に注射することによる局所投与が可能である。
【００２７】
本実施形態にかかる構築物によれば、遺伝子又はタンパク質の導入される細胞内での機能を調べることが可能である。例えば、機能を調べたい遺伝子の発現を抑制するsiRNA核酸を細胞内に導入して遺伝子の発現を抑制することによってその遺伝子の機能を調べることが可能である。
【００２８】
また本実施形態にかかる構築物によれば、細胞の性質を変えることができる。例えば、特定のmRNAを分解できるsiRNAをカーゴ分子として細胞に投与すれば、そのmRNAがコードする機能性タンパク質の発現量を低下させた細胞が得られる。
【実施例】
【００２９】
（１）ペプチド合成
マイクロウェーブを用いたFmoc固相法により、(Arg)9、A6K、Block3〜Block9のペプチドを合成した。Block3〜Block9のペプチドは下記式(I’)で示され、F,l,m,nは下記表１で示される。5,6-FAMは5-FAMと6-FAMとのisomer mixtureである。5,6-TAMRAは5-TAMRAと6-TAMRAとのisomer mixtureである。Block3,4,5,9は本実施例にかかるペプチドである。(Arg)9、A6K、Block6,7,8は比較例にかかるペプチドである。
【００３０】
F-β-Ala-(L-Leu-L-Leu-Aib)l-(Gly)m-(Arg)n-NH2・・・(I’)
【００３１】
【表１】
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【００３２】
(Arg)9は下記式(II)で示されるペプチドである。
【００３３】
5,6-FAM-βAla-(Arg)9-NH2・・・(II)
Argは下記で示される。
【００３４】
【化４】
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【００３５】
またA6Kのペプチドは下記式(III)で示される。Aはアラニンであり、Kはリシンである。
【００３６】
5,6-FAM-β-Ala-AAAAAAK-NH2・・・(III)
（２）ペプチドの二次構造解析
得られたペプチドは逆相HPLCにより精製し、MALDI-MS及びLC-TOFMSによって同定した。ペプチドの溶液状態における二次構造は20 mM PBS buffer solution (pH = 7.4)：メタノール＝１：１溶媒を用い、CDスペクトル測定(190~260 nm)によって解析を行なった。その結果、本発明にかかるblockペプチドはヘリカル構造を形成していることが示された（図１）。
【００３７】
（３）siRNAの導入
siRNA導入効果に関しては、エストロゲン受容体ERα及びアポトーシス阻害タンパク質XIAPに対する化学修飾を施したsiRNA（Stealth RNAiTM siRNA(Thermo Fisher Scientific); 25-mer）各３種をOpti-MEM(登録商標)（Thermo Fisher Scientific）上で各種ペプチドと懸濁し、10分後に細胞に添加した。XIAPやERαに対するsiRNAには標的特異性や血清中における安定性の高い修飾型siRNA（25-mer）を用いた。また、芳香族炭化水素受容体(Aryl hydrocarbon receptor; AhR)及び転写因子Notch1に対する非修飾標準siRNA（21-mer）３種もしくは２種をOpti-MEM(登録商標)（Thermo Fisher Scientific）上で各種ペプチドと懸濁し、10分後に細胞に添加した。
【００３８】
上述したsiRNAの塩基配列を以下に示す。なお、末端のttはオーバーハングであり、DNAのチミジン2塩基である。
XIAP siRNA#1: 5’-ACACUGGCACGAGCAGGGUUUCUUU-3’（配列番号１）
XIAP siRNA#2: 5’-GAAGGAGAUACCGUGCGGUGCUUUA-3’ （配列番号２）
XIAP siRNA#3: 5’-CCAGAAUGGUCAGUACAAAGUUGAA-3’ （配列番号３）
ERalpha siRNA#1: 5’-CGACAUGCUGCUGGCUACAUCAUCU-3’ （配列番号４）
ERalpha siRNA#2: 5’-UCACAGACACUUUGAUCCACCUGAU-3’ （配列番号５）
ERalpha siRNA#3: 5’-GACCGAAGAGGAGGGAGAAUGUUGA-3’ （配列番号６）
AhR siRNA#1: 5’-GCUCUGAAUGGCUUUGUAUtt-3’ （配列番号７）
AhR siRNA#2: 5’-GCUACCACAUCCACUCUAAtt-3’ （配列番号８）
AhR siRNA#3: 5’-CCUGUAAUCAGCCUGUAUUtt-3’ （配列番号９）
NOTCH1 siRNA#1: 5’-GCAACAGCUCCUUCCACUUtt-3’ （配列番号１０）
NOTCH1 siRNA#2: 5’-GCAUGGUGCCGAACCAAUAtt-3’ （配列番号１１）
各標的タンパク質の細胞内発現量をウェスタンブロット法により検出し、定量化することで輸送効率を評価した。
【００３９】
（４）Block3の実験結果
Block3は、修飾型siRNAと共にMCF-7細胞に処理すると、siRNA配列依存的に標的タンパク質(XIAP、ERα)の発現量を減少させることが明らかになった（図2(a)）。
【００４０】
またBlock3は、標準型siRNA（化学修飾を施した修飾型siRNAに対して、化学修飾を施していないsiRNAを標準型siRNAと記載することがある。）と共にMCF-7細胞に処理しても、siRNA配列依存的に標的タンパク質(AhR、NOTCH1))の発現量を減少させることが明らかになった（図2(b)）。
【００４１】
またBlock3は、修飾型siRNAと共にHeLa細胞又はHepG2細胞に処理しても、siRNA配列依存的に標的タンパク質(XIAP)の発現量を減少させることが明らかになった（図2(c)）。
【００４２】
（５）その他のペプチドの実験結果
Block3のどの構造がsiRNA導入活性に重要であるか調べるためにその他のペプチドと活性を比較した（図3）。
【００４３】
図3(a)のLane 8,10,12,14を参照するに、グリシンリンカーを持たないBlock4は、Block3と比較するとそのsiRNA導入効果はやや減弱することが明らかになった。
【００４４】
図3(a)のLane 2,4,6を参照するに、蛍光標識をFITCに変更したBlock5は、Block3と比較するとそのsiRNA導入効果はやや減弱することが明らかになった。図3(c)のLane 8を参照するに、蛍光標識をTAMRAに変更したBlock9は、Block3と比較するとそのsiRNA導入効果はやや減弱することが明らかになった。これらの結果から、フルオロセイン化合物は、5-FAM又は6-FAMであることがsiRNA導入効率に好ましいことが判明した。
【００４５】
図3(c)のLane 2を参照するに、(Arg)9はXIAPの発現量を抑制できなかった。図3(c)のLane 4を参照するに、A6KはXIAPの発現量を抑制できなかった。図3(b)を参照するに、Block6,7,8はXIAPの発現量を抑制できなかった。これらの結果から、(Arg)9やヘリカルプロモータ配列単独ではsiRNA導入効果を示さず、(Arg)9に対して適切な長さ(l=3〜5)のヘリカルプロモータ配列の連結が、siRNA導入活性に必須であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
標的細胞における遺伝子機能の調査、標的細胞の改変等に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００４７】
配列番号１〜４：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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