(57)【要約】      （修正有）【課題】乾燥中の（ポリ）ペプチドのアンフォールディングを防止し、および／または乾燥後の（ポリ）ペプチドの（リ）フォールディングを誘導する方法の提供。【解決手段】（ポリ）ペプチドを水溶液に埋め込む段階を含み、該水溶液は（i）少なくとも3種類の異なるアミノ酸；または（ii）少なくとも1種類のジペプチドもしくはトリペプチドを含み、（a）糖類；ならびに（b-i）タンパク質；および／または（b-ii）変性作用化合物；ならびに（c）シラン類を含まないかまたは実質的に含まない方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥中の（ポリ）ペプチドのアンフォールディングを防止し、および／または乾燥後の（ポリ）ペプチドの（リ）フォールディングを誘導するための方法であって、（ポリ）ペプチドを水溶液に埋め込む段階を含み、その際、水溶液は
（i）少なくとも3種類の異なるアミノ酸；または
（ii）少なくとも1種類のジペプチドもしくはトリペプチド
を含み、水溶液は
（a）糖類；ならびに
（b-i）タンパク質；および／または
（b-ii）変性作用化合物；ならびに
（c）シラン類
を含まないかまたは実質的に含まない方法。
【請求項２】
少なくとも3種類のアミノ酸が、
（i-a）グルタミン酸とグルタミンの組合わせ、および／または
（i-b）アスパラギン酸とアスパラギンの組合わせ
を含まない、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも3種類のアミノ酸が、下記の群：
（a）非極性、脂肪族R基をもつアミノ酸；
（b）極性、非荷電R基をもつアミノ酸；
（c）正に荷電したR基をもつアミノ酸；
（d）負に荷電したR基をもつアミノ酸；および
（e）芳香族R基をもつアミノ酸
から選択される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
水溶液が、下記の各群から選択される少なくとも1種類のアミノ酸：
（a）非極性、脂肪族R基をもつアミノ酸；
（b）極性、非荷電R基をもつアミノ酸；
（c）正に荷電したR基をもつアミノ酸；
（d）負に荷電したR基をもつアミノ酸；および
（e）芳香族R基をもつアミノ酸
を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
水溶液が、少なくとも下記のアミノ酸：
（a）アラニン、グルタミン酸、リジン、トレオニンおよびトリプトファン；
（b）アスパラギン酸、アルギニン、フェニルアラニン、セリンおよびバリン；
（c）プロリン、セリン、アスパラギンおよび／またはアスパラギン酸、トレオニンお
よびフェニルアラニン；
（d）チロシン、イソロイシン、ロイシン、トレオニンおよびバリン；あるいは
（e）アルギニン、グリシン、ヒスチジン、アラニン、グルタミン酸、リジンおよびト
リプトファン；あるいは
（f）アラニン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、リジン
を含む、請求項1、3または4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも1種類のアミノ酸が、天然の非タンパク源アミノ酸および合成アミノ酸から
なる群から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
水溶液がさらに、サポニンもしくは脂肪酸またはその誘導体を含む、請求項1〜6のいず
れか1項に記載の方法。
【請求項８】
サポニンがグリチルリチン酸またはその誘導体である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
脂肪酸が短鎖および中鎖脂肪酸からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
水溶液の賦形剤と（ポリ）ペプチドのw／w比が1：1〜500：1である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
（ポリ）ペプチドが組換え（ポリ）ペプチドである、請求項1〜9のいずれか1項に記載
の方法。
【請求項１２】
（ポリ）ペプチドが1以上の分子内ジスルフィド結合を有する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
（リ）フォールディングした（ポリ）ペプチドが生物学的に活性である、請求項1〜12
のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
乾燥が凍結乾燥、風乾、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥または発泡乾燥である、請求項1〜13
のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項1（ii）に記載の少なくとも1種類のジペプチドが、カルノシン、グリシルトリロシン、グリシルグリシンおよびグリシルグルタミンからなる群から選択される、請求項1
〜14のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾燥中の（ポリ）ペプチドのアンフォールディングを防止し、および／または乾燥後の（ポリ）ペプチドの（リ）フォールディングを誘導するための方法であって、（ポリ）ペプチドを水溶液に埋め込む段階を含み、その際、水溶液は（i）少なくとも3種類の異なるアミノ酸；または（ii）少なくとも1種類のジペプチドもしくはトリペプチド
を含み、水溶液は（a）糖類；ならびに（b-i）タンパク質；および／または（b-ii）変性作用化合物；ならびに（c）シラン類を含まないかまたは実質的に含まない方法に関する
。
【０００２】
本明細書中に特許出願および製造業者のマニュアルを含めた多数の文献を引用する。これらの文献の開示内容は本発明の特許性に関係があるとは考えられないが、それの全体を本明細書に援用する。より詳細には、援用した文献は、それぞれ個々の文献を具体的かつ個々に援用すると指示したと同程度に援用される。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質はアミノ酸の配列から構成される大型の高分子であり、それらの生物活性状態に対応するユニークな3D構造を特徴とする。タンパク質分子の自然構造は、共有結合、疎水性相互作用、静電相互作用（電荷反発およびイオン対合＝塩橋）、水素結合およびファン-デル-ワールス力を含めたさまざまな相互作用間の微妙な平衡の結果である。これらの力のうち、疎水性相互作用が優勢な力であると思われる。タンパク質内およびタンパク質-溶媒の相互作用は両方とも、タンパク質の構造およびそれの安定性の維持に重要な役
割を果たす。自然状態の安定化エネルギーは多くの場合5〜20 kcal／molであり、これは
数個の水素結合のものに等しいので、タンパク質は一般にきわめて安定というわけではない。フォールディングした状態はフォールディングしていない状態よりわずかに安定であるにすぎないので、タンパク質環境のいかなる変化もタンパク質の分解または不活性化を誘発する可能性がある。
【０００４】
タンパク質の安定性は、不安定化力と安定化力の平衡化の結果である。不安定化力は主にアンフォールディングのエントロピーの大幅な増加に起因し、安定化力は幾つかの非共有結合相互作用により供給される。これらの相互作用のいずれかが攪乱されると平衡がシフトしてタンパク質が不安定になり、この繊細な平衡を攪乱してタンパク質の安定性に影響を及ぼす多数の要因が知られている。これらには、たとえば温度、pH、イオン強度、金属イオン、表面吸着、剪断、振とう、添加物、溶媒、タンパク質の濃度、純度、多型性、圧力、および凍結／融解-乾燥が含まれる。タンパク質の不安定性をもたらす可能性があ
る化学的変換には、たとえばアミド分解、酸化、加水分解、異性化、スクシンイミド化、ジスルフィド結合の形成または破断、非ジスルフィド架橋、および脱グリコシルが含まれる。したがって、タンパク質医薬の開発における最も大きな難題のひとつは、物理的および化学的な不安定性に対処すること、ならびに許容できる貯蔵寿命を達成するためにタンパク質を安定化できる配合物を提供することである。
【０００５】
タンパク質不安定性の一般的な現象はタンパク質凝集物の形成であり、それは可溶性または不溶性、化学的または物理的、可逆的または不可逆的である可能性がある。特定の条件下で（または時には時間／貯蔵寿命に伴なって）、タンパク質の二次、三次および四次構造が変化して、タンパク質のアンフォールディングおよび／またはそれに続くタンパク質凝集物形成が起きる可能性がある。タンパク質の凝集はタンパク質に基づく療法薬に関する多数の有害な作用の原因となる重要事項として直ちに現われ、それには有効性、生物
学的利用能、安定性の喪失、およびタンパク質療法薬に対する望ましくない宿主免疫応答の動員が含まれる。特に、療法用タンパク質で治療している間に療法用タンパク質に対する抗体が発現する可能性があり、それはこれらの療法用タンパク質の臨床効果を中和し、または他の形で損ない、また、たとえば自己タンパク質との交差反応性などの重篤な副作用を伴なう可能性もある。したがって、タンパク質医薬中の何らかの凝集物の存在は製品販売について一般に許容できない。タンパク質凝集は多様な物理的要因により誘発される可能性があるが、タンパク質凝集、ならびにタンパク質凝集の速度および機序は、一般にタンパク質依存性である。
【０００６】
タンパク質の安定性に影響を及ぼす最も重要な要因は温度である。一般に、温度が高いほどタンパク質の安定性は低くなる。タンパク質は通常は一定の温度範囲で安定である。高温は多くのタンパク質医薬の変性を引き起こす。高温でのタンパク質変性は実験条件によっては可逆的である可能性があるが、高温は化学分解をも促進し、たとえばアスパラギン酸残基の加水分解、アスパラギン残基またはグルタミン残基のアミド分解を増大させる。最も重要なことは、タンパク質の分解機序が温度に応じてしばしば変化することである；これは、たとえば冷却鎖が中断される可能性のある噴霧乾燥または貯蔵および輸送に際して特に関係がある。
【０００７】
さらに、タンパク質はしばしば狭いpH範囲内でのみ安定であり、タンパク質凝集の速度はpHによって強い影響を受ける可能性がある。配合物のpHは、温度と同様に、タンパク質の物理的安定性および化学的安定性の両方に影響を及ぼす可能性がある。異なるpHで異なる化学分解が促進される場合がある。これにより、同じタンパク質について異なるpHで分解生成物が異なる理由が説明される。加水分解はアスパラギン酸残基において軽度の酸性条件下で容易に起きる可能性がある。アスパラギン残基およびグルタミン残基のアミド分解は、強酸性、中性および塩基性条件下で容易に起きる。塩基性条件下では、ペプチド結合の加水分解、アミド分解、アルギニンからオルニチンへの加水分解、β-脱離およびラ
セミ化、ならびに二重結合形成など、多くの反応が起きる可能性がある。化学的安定性に対するpHの影響は、賦形剤の存在下ではさらに変化する可能性がある。
【０００８】
タンパク質は、多くの表面および界面、たとえば容器の表面、氷／水の界面、および空気／水の界面に吸着する可能性もある。空気／水の界面におけるタンパク質吸着はタンパク質分子を繋ぎ留める領域の形成から開始し、その後、界面に吸着された分子の再配向および再配列がこれに続く。吸着の程度はタンパク質依存性であり、タンパク質のサイズおよびpIには依存しないように思われる。タンパク質、たとえばIgGの二次構造は、そのよ
うな吸着表面で有意に変化する可能性がある。したがって、表面吸着はタンパク質の損失および／または不安定化をもたらす可能性がある。タンパク質の表面吸着は通常は濃度依存性であり、特定のタンパク質濃度を上回ると-少なくとも特定のタンパク質については-最大に達する可能性がある。たとえばタンパク質の無菌濾過、透析または濃縮のために用いる容器またはメンブレンのタイプ（すなわち材料）が、表面へのタンパク質吸着に著しい影響をもつ。タンパク質の表面吸着は、さらにたとえば凍結乾燥または噴霧乾燥などの乾燥プロセスに際して特に関係がある。
【０００９】
タンパク質の取扱いも安定性に影響を及ぼす。たとえば、タンパク質は振とうまたは剪断によって変性する可能性がある。たとえば乾燥試料の再構成に際して用いる振とうは、疎水性である空気／水の界面、または空気／表面の界面を形成する可能性があり、その結果、タンパク質分子が界面に整列してタンパク質アンフォールディングが生じ、空気または表面に対する疎水性残基の接触が最大となり、凝集が開始する。振とうに際してタンパク質凝集を引き起こす疎水性表面は、気体または固体のいずれかの可能性がある。同様に、たとえば噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥に際して遭遇する剪断もタンパク質の疎水性領域を露出させ、これにより凝集が開始する。異なるタンパク質は剪断不活性化に対して異なる程度に耐容できる。タンパク質構造の剛性およびタンパク質表面の疎水性残基の数が、そのような剪断耐容性のレベルの相異に関係する。
【００１０】
塩類もタンパク質の安定性に対して影響をもつ可能性があるが、それらの影響は複雑である；その理由の一部は、タンパク質の完全に露出した表面および完全または部分的に埋没した内部に対する複雑なイオン性相互作用である。塩類は、塩類のタイプおよび濃度、イオン性相互作用の性質、ならびにタンパク質中の荷電残基の存在および量に応じて、安定化し、不安定化し、あるいはタンパク質の安定性に対して影響をもたない場合がある。塩類の影響はさらに、イオン化可能な基の荷電状態を支配する溶液のpHに強く依存する。
【００１１】
金属イオンも、タイプおよび濃度に応じてタンパク質を安定化し、または不安定化する可能性がある。負の対イオンもタンパク質の安定性に著しい正または負の影響を及ぼす可能性があるので、タンパク質の安定性に対する金属イオンの関与は慎重に解釈すべきである。個々のタンパク質分子に必要な安定化用金属イオンの数はタンパク質依存性であり、タンパク質の安定性を得るために金属イオンを相互交換できる場合とできない場合がある。金属イオンは、タンパク質の二次構造に大きな影響を及ぼすことなくタンパク質の安定性に著しい影響を及ぼすことができる。タンパク質配合物中の痕跡量の金属イオンがタンパク質の酸化を触媒する可能性がある；すなわち、フェントン(Fenton)経路により、特に残基メチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、プロリン、アルギニン、リジンまたはトレオニンを標的とする。この触媒作用は金属イオンの濃度に依存し、この金属触媒反応はアスコルビン酸またはRSHなどの還元剤の存在下で促進される可能性がある。金属イオン、酸素および還元剤は、タンパク質を酸化できる反応性酸素種を生成する可能性がある。
【００１２】
金属イオンと密接な関係があるのはキレート化剤、たとえばEDTAおよびクエン酸であり、それらはタンパク質および／またはそれの重要な金属イオンに結合することによりタンパク質を不安定化し、あるいはいずれか有害な金属イオンに結合することによりタンパク質を安定化する可能性がある。遷移金属イオンはタンパク質の酸化を触媒する可能性があるので、イオンキレート化剤はタンパク質を金属触媒による酸化から保護することができるはずである。しかし、多くの場合、キレート化剤の影響はより複雑である。正味の影響は、金属イオン、酸化機序、およびキレート化剤のタイプに依存する。
【００１３】
さらに、タンパク質凝集は一般に濃度依存性である。タンパク質の濃度がそれの凝集に及ぼす影響は、凝集の機序および実験条件に依存する。場合により、タンパク質濃度は化学分解にもある程度影響を及ぼす。他方、濃厚なタンパク質溶液は凍結誘発によるタンパク質凝集および活性損失に対して、より抵抗性である可能性がある。
【００１４】
痕跡量の酵素、金属イオン、または他の混在物の存在はタンパク質の安定性に影響を及ぼす可能性があるので、タンパク質調製物の純度は他の重要な観点である。
タンパク質-溶媒系の体積はアンフォールディング状態ではより小さいので、高圧はさ
らにタンパク質アンフォールディングを引き起こす可能性がある。言い換えると、アンフォールディングしたタンパク質はフォールディングしたタンパク質より圧縮されやすく、これが凍結乾燥または噴霧凍結乾燥に際して役割をもつ可能性がある。
【００１５】
同様に多くの化学反応がタンパク質医薬の不活性化に関与する。多くの場合、タンパク質において幾つかの反応が同時に起きる可能性があり、このためタンパク質分解生成物の分離および同定がきわめて困難になる。タンパク質の化学的不活性化を防止するために、優勢な反応をまず同定して阻害すべきである。これは、配合物のpHを促進傾向がある範囲から離して調整することにより、ある程度達成できる。タンパク質中の不安定アミノ酸の位置は、それらの化学反応性を判定する際に重要である。タンパク質中の多くのアミノ酸
の化学反応には一定の位置フレキシビリティーが要求され、したがって反応速度は高いフレキシビリティーをもつ変性タンパク質または小型ペプチドの方が天然タンパク質より高い可能性がある。したがって、潜在的な化学分解を防止または阻止するためには、天然タンパク質のコンホメーションを保護する必要がある。
【００１６】
多くの場合にタンパク質の主要な分解経路であるアミド分解も、タンパク質医薬における最も一般的な分解経路であると思われる。タンパク質中のアミド分解されやすい2つの
アミノ酸はアスパラギンおよびグルタミンであるが、アスパラギンの方がより不安定なアミノ酸である。水溶液中におけるタンパク質およびペプチド中のアスパラギンのアミド分解は、ペプチド結合の加水分解よりはるかに速い速度で進行する可能性がある。タンパク質におけるアミド分解の速度、機序および位置は、pH依存性である。さらに、タンパク質におけるアスパラギンおよび／またはグルタミンの相対位置がそれらの相対的なアミド分解速度に影響を及ぼし、タンパク質中のアミド分解部位に隣接するアミノ酸も影響を及ぼす。最も不安定な配列はAsn-Glyであると思われ、タンパク質におけるアミド分解速度は
さらにタンパク質の二次構造によって影響を受ける。
【００１７】
タンパク質の不活性化をもたらす可能性がある他の化学反応は酸化である。特に、ヒスチジン、システイン、トリプトファンおよびチロシン残基の側鎖は酸化される可能性がある部位である。これらの部位における酸化は、痕跡量の遷移金属イオンにより触媒され（部位特異的プロセス）、あるいは酸化剤により、または露光に際して、増強される可能性がある（部位特異的ではないプロセス）。部位特異性は、特定の金属結合サイトにおける反応性酸素種の生成およびそれによる酸化に起因する。最も容易に酸化される部位はメチオニンおよびシステイン上のチオ基である。タンパク質中のメチオニン残基は大気中の酸素によって容易に酸化される可能性がある。配合物のpHは、酸化剤の酸化能、触媒金属イオンとイオン化性アミノ酸の結合親和性、および酸化中間体の安定性を変化させることにより、酸化の速度に影響を及ぼす場合がある。さらにタンパク質がガンマ線または電子線などの電離性放射線に曝露されると、発生した反応性酸素種によりタンパク質中のアミノ酸側鎖の酸化が起きる場合がある。
【００１８】
ジスルフィド結合は、タンパク質の活性および安定性の両方の制御に際してしばしば重要である。タンパク質中の遊離システイン残基は容易に酸化されてジスルフィド結合を形成し、あるいはチオ-ジスルフィド交換を引き起こし、それによりタンパク質の凝集また
は重合を引き起こす可能性がある。タンパク質におけるチオ-ジスルフィド交換は、イオ
ン化したチオール基（チオレートアニオン）とジスルフィド結合の反応である。チオール-ジスルフィド交換の速度は求核性チオールのイオン化度に依存し、したがって一般に求核性チオール基のpKを超えるまでは反応のpHが上昇するのに伴なって上昇する。タンパク質が遊離システイン残基をもたない場合ですら、なおジスルフィド結合スクランブリングは起きる可能性があり、これがタンパク質凝集を引き起こす。
【００１９】
タンパク質の成分であるアミノ酸は、さらに酸および塩基による加水分解の対象となる。-X-Asp-Y-配列の場合を除いて、大部分のペプチド結合は安定である。加水分解に際してアスパラギン酸はスクシンイミド中間体を形成し、これはAsnのアミド分解に際して得られるスクシンイミド中間体に類似する。さらに、特にアスパラギン酸のC側残基がプロリンである場合、環状の無水物中間体が形成される可能性もある。多くの場合、加水分解はアスパラギン残基のアミド分解の後続反応である。
【００２０】
グリシンを除いて、アミノ酸はさらにラセミ化の可能性をもつ。アスパラギン酸-Xペプチド結合は、アスパラギン酸とイソアスパラギン酸の間で環状イミド（スクシンイミド）中間体を介した可逆的異性化を受けやすい。スクシンイミド中間体は通常は安定ではなく、数時間以内に有意の加水分解が起きる可能性がある。アミド分解と同様に、アスパラギン酸異性化の速度はタンパク質におけるそれの位置および可動性によって強く影響される。イソアスパラギン酸形成は、無傷タンパク質の比較的構造不定なドメインまたは一過性アンフォールディングを受けやすいドメインで起きる可能性が最も高い。
【００２１】
スクシンイミド中間体の形成は、タンパク質におけるアスパラギンのアミド分解およびアスパラギン酸の異性化に先立って起きる可能性がある。事実、スクシンイミドの形成はタンパク質におけるイソアスパラギン酸誘導体形成の原因である。アスパラギンは中性およびアルカリ性条件でスクシンイミド形成によりアミド分解するが、タンパク質におけるAsp-Gly結合の形成は4〜5の最適pHで起きる可能性がある。スクシンイミド形成の速度は
、不安定残基の隣接基およびタンパク質のコンホメーションによって強く影響される。
【００２２】
タンパク質はさらに、非ジスルフィド経路で共有結合した二量体および多量体を形成する可能性がある。たとえば、ホルムアルデヒド仲介による架橋は、凍結した破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドの貯蔵中に著しい凝集を引き起こし、したがってホルムアルデヒド不活性化した液体および固体の両方の形態のウイルスワクチン配合物を貯蔵することに対する関心が高まっている。
【００２３】
タンパク質は脱グリコシルにより化学変換される可能性もあり、これによってタンパク質はより熱変性されやすくなる；炭水化物部分の機能のひとつは、タンパク質を熱分解および加水分解による不活性化から保護することだからである。グリコシル化がタンパク質の安定性に及ぼす効果は、タンパク質毎に著しく異なる。
【００２４】
最後に、糖類はしばしばタンパク質安定剤として液状および固形の両方の配合物中に用いられるが、還元性糖類は、特に高温でタンパク質中のアミノ基と反応して炭水化物付加物を形成する可能性がある。このきわめて複雑な褐変経路はメイラード(Maillard)反応として知られる。
【００２５】
前記のすべての影響は種々のタイプのストレスがタンパク質に付与された際に-同時ま
たは個別に-起きる可能性がある；たとえば、タンパク質の単離および精製、たとえば凍
結乾燥、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥もしくは発泡乾燥によるタンパク質の乾燥、溶液状または乾燥後のタンパク質の貯蔵、ならびに乾燥後の再構成に際して。
【００２６】
特にタンパク質の乾燥に際してかなりのストレスがかかる。たとえば、凍結乾燥に際しては、液体が凍結するのに伴ってそれから純粋な氷の結晶が生成する。タンパク質がこの氷-水の界面に接触すると変性、たとえば凍結損傷が生じる可能性がある。さらに、適切
な安定剤が存在しない状態での乾燥に際してタンパク質から水和シェル(hydration shell)が除かれると、タンパク質の構造がさらに不安定になる可能性がある。さらに、圧力、pH値またはイオン濃度の変動、ならびに添加剤の濃度効果、温度変動および剪断力も、乾
燥に際してタンパク質の安定性に影響を及ぼす。酸素の影響、表面作用または加水分解も、タンパク質を不活性化または変性させる可能性がある。乾燥タンパク質の貯蔵に際して、ストレス要因、たとえば残留水分、露光、酸化および貯蔵温度がさらに乾燥タンパク質の変性および不活性化に作用する可能性がある。前記のすべての観点がタンパク質の再構成における問題および活性損失をもたらす可能性がある。
【００２７】
目的とするタンパク質の構造修飾を行なうのはより複雑であるので、一般に適用されるタンパク質安定化方法は賦形剤の添加に基づく。賦形剤は凝集を減らし、タンパク質の特定の化学分解も遅延させることができる。それらの安定化効果は濃度依存性およびタンパク質依存性であるが、高濃度の賦形剤がより効果的であるとは限らず、場合により負の影響をもつ可能性がある。頻繁に用いられるタンパク質安定剤には、糖類およびポリオール類、アミノ酸、アミン類、塩類、ポリマーならびに界面活性剤が含まれ、これらはそれぞ
れ異なる安定化効果を発揮することができる。
【００２８】
賦形剤は幾つかの理由で配合物に添加され、ある賦形剤は配合物の一部となるための1
より多い効果または目的をもつ場合がある。賦形剤の選択に際しては、物理的安定性および化学的安定性を共に最適化しなければならない。賦形剤はしばしば物理的不安定化プロセス（タンパク質凝集）を遅延または防止するために用いられる。溶媒誘発によるタンパク質安定化の特定の機序があり、これは具体的には配合物中の賦形剤に関係する。安定化は、タンパク質安定化力の強化により、変性状態の不安定化により、またはタンパク質への賦形剤の直接結合により達成される。
【００２９】
したがって医薬配合物における安定剤の主な機能は、タンパク質の単離および精製、たとえば凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥もしくは発泡乾燥によるタンパク質の乾燥、溶液状または乾燥後のタンパク質の貯蔵、および乾燥後の再構成に際してタンパク質に付与される種々のタイプのストレスに対して、タンパク質を保護することである。
【００３０】
溶液中でフォールディングしたタンパク質を囲む水の構造は、タンパク質の自然構造を維持するのにきわめて重要である。安定化する賦形剤、たとえば糖類およびアミノ酸の存在により、賦形剤とペプチド主鎖の好ましくない熱力学的相互作用のためタンパク質の表面から賦形剤が優先的に排除され（いわゆる優先排除モデル）、こうして、バルク溶液より多量の水分子がタンパク質の表面に存在するのでタンパク質が優先的に水和されることによって、タンパク質を安定化することができる。このプロセスは、タンパク質が一般的なストレスを受けた際に、たとえば単離、精製、溶液状態での貯蔵、および液状のタンパク質医薬配合物の調製に際して、安定化作用をすると考えられる。優先排除によるタンパク質安定化は優先的に排除される賦形剤の濃度に依存し、少なくとも局所的に十分な量の水が存在する必要がある。
【００３１】
タンパク質の乾燥に際して、賦形剤の濃度が上昇し、残留する湿潤領域で優先排除効果が増強される。このプロセスのため、タンパク質は、残留する水分子がさらなる乾燥（凍結乾燥など）により除去されるまで、それの自然形態の水和状態を維持する。この残留水が除かれる際に、タンパク質と賦形剤の官能基の間に次第に水素結合が形成され、これがタンパク質と水和シェルを構成していた周囲の水分子との失われつつある相互作用に置き換わる（水置換、優先的相互作用）。したがって、タンパク質に対してリオプロテクタント(lyoprotectant)および／またはクリオプロテクタント(cryoprotectant)効果をもつ賦
形剤を一般に添加して、含水率の変化に際してタンパク質の安定性を最適化する。そのような賦形剤の例には、たとえば糖類およびポリオール類が含まれるが、他の賦形剤、たとえば界面活性剤およびアミノ酸も含まれる。凍結乾燥配合物の開発に一般に用いられる賦形剤は、たとえばKofi Bedu-Addo 2004 (Pharmaceutical Technology, Lyophilization; 2004: 10-30)に述べられている。
【００３２】
凍結乾燥プロセスでガラス状態のタンパク質を含有する乾燥粉末が得られ、これはしばしば非晶質賦形剤および残留水を含む。乾燥状態では、化学分解およびアンフォールディングの速度はタンパク質の可動性および周囲の賦形剤分子によって影響される。そのような可動性はガラス状態の乾燥タンパク質では大幅に低下し、それは非晶質賦形剤、たとえばトレハロースの存在によってさらに安定化することができる。残留水分は、選択したプロセス条件と合わせて、その系の固体状態特性（すなわち、非晶質-対-結晶質）に依存するであろう。
【００３３】
賦形剤は乾燥粉末配合物を最適化するためにも添加される。乾燥粉末は、有用であるためには一定の特徴をもつ必要がある。たとえば、凍結乾燥ケーキは許容できる外観が要求され（これが安定性の指標となるので）、速やかに溶解すべきであり、かつ配合物からの
噴出（すなわち、再構成後の製品の発泡）は阻止しなければならない。この目的で、増量剤、たとえば糖類およびポリオール類が一般に選択される；それらはクリオプロテクタントおよびリオプロテクタントとしても作用できるからである。適切な賦形剤を選択する際には、まず固体状態特性を考慮すべきである。たとえば、マンニトールは通常は結晶化し、したがって良好な構造安定性を備えたケーキを生成するであろう。しかし、マンニトールは異なる安定性をもつ3種類の異なる多型形態（α、β、δ）およびマンニトール半水和物（それは貯蔵中に結晶水を放出する場合がある）として結晶化する可能性があり、マンニトールの固体状態は適用する凍結乾燥条件および他の賦形剤の存在に依存する。スクロースは通常は凍結乾燥に際して非晶質のままであり、これはタンパク質の安定性にとっては望ましいが、それは初期乾燥後の含水率を高め、最終製品の潮解および崩壊のリスクを高める。
【００３４】
タンパク質間の直接相互作用が凝集をもたらすことが最も多いので、これらの相互作用の防止によってもタンパク質を安定化できる。たとえば、アルギニンはあるタンパク質に強く結合することが先に報告され、一方でそれは他の表面から排除されることも報告された。
【００３５】
調製方法、貯蔵条件、温度、バイアルの適切な選択により、あるいは抗酸化剤、たとえばアスコルビン酸の添加により、化学的不安定性を最小限に抑えることができる。アスコルビン酸はタンパク質の酸化を防止するための抗酸化剤として作用する。他方で、それは金属イオンと酸素の存在下でのアスコルビン酸の還元性のため、金属触媒によるタンパク質の酸化を促進もする。この後者の作用は、通常はキレート化剤、たとえばEDTA、DTPA、DFOを共添加することにより避けられる。
【００３６】
界面への吸着は、一般に（理想的には）タンパク質自体より界面活性が高い賦形剤の添加により避けられる。主に、界面活性剤または他のタンパク質を用いて、容器の内面に競合的にコートまたは吸着させ、あるいは送達システムの調製に際して形成される表面に吸着させる。界面活性剤はイオン性または非イオン性のいずれかとして分類できる。タンパク質の表面吸着または凝集を防止または低減するためには、比較的低い臨界ミセル濃度（CMC）のため、低濃度の非イオン性界面活性剤でしばしば十分である。一般に用いられる非イオン性界面活性剤の例には、ポロキサマー（Pluronic F-68）およびポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル（Brij35）、ポリソルベート80、20、ヒト血清アルブミンなどが含まれる。これらの界面活性剤のうちあるもの、特にポリソルベートには、それらの構造に取り込まれたエーテル結合に由来するアルキルペルオキシドが混在する場合があり、それはタンパク質の酸化を促進する可能性があるので不利である。表面吸着を防止するためにポリマーおよびデキストランも使用できるが、大型PEGのみがタンパク質に対する安定化効果をもつと報告され、一方で小型PEGはアンフォールディングを誘発すると思われる。選択する界面活性剤濃度は避ける必要がある作用に依存するが、一般にそれは界面活性剤の単層が界面に存在するCMC値のすぐ上である。一般に用いられるイオン性界面活性剤の例には、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（CTAC）およびセチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）が含まれる。
【００３７】
配合物の調製プロセスに際して、たとえば乾燥プロセスに際して、タンパク質の微小環境が変化するため局所pHの変化が起きる可能性がある。乾燥プロセスにおいて、ある成分は他のものより長期間、溶液中に留まり、それが3 pH単位を超えるpHシフトをもたらす可能性がある。pHは温度依存性であるので、より小さなpH変化は、温度変化、たとえば凍結乾燥、噴霧乾燥、貯蔵などに際しても遭遇する。しかし、タンパク質は通常は狭いpH範囲で安定であるにすぎない。したがって、最初に適切な配合物を開発する際に重要な段階は、特にpH3〜10の範囲でのpH安定性を調べることである。
【００３８】
pHの維持は、適切な緩衝系を用いることにより達成される。しかし、残念ながら特定の緩衝剤選択のための一般的法則はない。通常はpH変化を避けるための特定の賦形剤を添加するのではなく、可能ならばきわめて低い濃度の緩衝剤を使用すべきである。緩衝剤を選択する際には、pH値はアミド分解反応における主要な制御変数であると思われるので緩衝系は配合物の化学的安定性に影響を及ぼす場合があること、および凝集速度は緩衝剤の選択によって影響を受けることを考慮すべきである。
【００３９】
塩類はpHおよび張度の調整のために頻繁に用いられる。凍結に際して、純溶媒（水）がまず凍結して残留液相（凍結濃縮相）における塩類濃度が上昇し、これによりイオン強度が増大する。
【００４０】
最後に、場合により、バルク溶液の安定性要求または投与経路に関する要求のため、等張配合物が要求されることがある。マンニトール、スクロース、グリシン、グリセロールおよび塩化ナトリウムなどの賦形剤は、良好な張度調整剤である。張度改変剤は配合物中ではなく希釈剤中に含有させることもできる。
【００４１】
国際出願WO 2005/007185には、しばしば用いられる安定剤であるヒト血清アルブミン（HAS）を添加せずにタンパク質医薬を安定化する試みが記載されている。WO 2005/007185
で用いた安定化溶液は、代わりに下記のものを含む：（i）好ましくは非イオン性のディ
タージェントである界面活性物質、すなわち界面活性剤、および（ii）少なくとも2種類
のアミノ酸の混合物、その際、これらの少なくとも2種類のアミノ酸はグルタミン酸およ
びグルタミン、またはアスパラギン酸およびアスパラギンである。アミノ酸の安定化効果を彼ら自身が調べた唯一の例（表2）は、界面活性剤ポリソルベート80の不存在下ではタ
ンパク質溶液の安定化はみられないか、あるいは実質的ではない-限られた期間の-安定化がみられるにすぎないことが認められたことを示す。
【００４２】
国際出願WO 2008/000780では、少なくとも30％または少なくとも40％のフェニルアラニンを含有させた場合、タンパク質を含有する噴霧乾燥粉末が安定化され、有利な空気力学的挙動をもつ。粉末にフェニルアラニンを添加するため、タンパク質の凝着性および吸着性が変化して粒子間相互作用が低下する。粉末粒子の表面をより疎水性にすることによって、粉末の空気力学的特性が改善され、こうしてそれはより肺適用に適したものになる。アミノ酸を含有する溶液によるタンパク質のフォールディング誘発またはアンフォールディング防止は、WO 2008/000780では考慮されていない。
【００４３】
欧州特許出願EP 1789019には、新規なオリゴ糖混合物の添加によって安定化された肺適用のためのタンパク質医薬の噴霧乾燥粉末が記載されている。国際出願WO 2010/151703には、ペプチドまたはポリペプチドの安定性を高め、凝集を減らし、または免疫原性を低下させるための、少なくとも1種類のアルキルグリコシドを含む医薬組成物が開示されてい
る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００４４】
【特許文献１】WO 2005/007185
【特許文献２】WO 2008/000780
【特許文献３】EP 1789019
【特許文献４】WO 2010/151703
【非特許文献】
【００４５】
【非特許文献１】Kofi Bedu-Addo 2004 (Pharmaceutical Technology, Lyophilization; 2004: 10-30)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００４６】
まとめると、配合科学者は幾つかの要因について十分な知識をもつことがきわめて重要である：有効成分の物理的および化学的安定性をいかにして最適化するか；特定の賦形剤を配合物にいかにして合理的に含有させるか；最適条件をいかにして得るか；アップスケーリングに際しての安定性問題をいかにして防止するか；そして最後に、意図する投与経路に適した配合物、すなわち吸収バリヤーを克服できるものをいかにして設計するか。賦形剤の選択は、しばしばこれまでの経験、およびどの賦形剤が当局により承認されているかに基づく。賦形剤は一般に、（i）調製プロセスのエンドポイントの達成、たとえば乾燥粉末が得られることを保証する；（ii）液状配合物が一定のpH値に留まることを保証する；または（iii）製造により誘発される特定の作用、たとえば吸着に対してタンパク質を安定化するように選択される。しかし、あるタンパク質に有用と思われるものが他のタンパク質に対しては有害な作用をもつ可能性がある。
【００４７】
大型タンパク質においては、それらの組成の多様性および両親媒性が特定の挙動、たとえばコンホメーション安定性、およびアンフォールディング／変性を構成する。普遍的な安定化方策の一般化が現在まで成功していないほど、異なるタンパク質間の構造上の相異はきわめて重大である。種々の形のストレスを受けた際のタンパク質のアンフォールディングを防止し、および／または適正なフォールディングを保証するのに適した方法を提供することに多くの研究が注がれているという事実にもかかわらず、たとえばタンパク質のミスフォールディングによる凝集または非特異的免疫原性の増大について依然として問題がある。さらにまた、現在は、安定なタンパク質配合物を開発する前に、通常はタンパク質の基礎的特性を調べる必要がある。これらの特性には、タンパク質の純度、pI、ならびに種々のpHおよび種々の緩衝系における溶解性および安定性が含まれる。これらのデータを用いて、通常はタンパク質配合問題に対処する。
【００４８】
たとえば固体状態相互作用から生じる不安定性を低減するために機能性賦形剤の数を可能な限り少なく維持することが望ましいが、潜在的な不安定化作用の量が大きいためしばしば数種類の賦形剤を添加することが必要になる。さらに、目的とする各タンパク質について、それぞれに適した賦形剤を同定するために煩雑な調査が必要である。したがって、タンパク質をフォールディングさせるために、または製造および貯蔵プロセスに際して種々の形のストレスを受けた際のそれらのアンフォールディングを防止するために、これらの問題を克服する、かつ大部分のタンパク質およびペプチドに適切であって個別に調査する必要性が除かれる、改良された手段を求める要望が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００４９】
この要望は、特許請求の範囲に記載する態様を提供することにより対処される。
したがって、本発明は、（ポリ）ペプチドのアンフォールディングを防止し、および／または（ポリ）ペプチドの（リ）フォールディングを誘導するための方法であって、（ポリ）ペプチドを水溶液に埋め込む段階を含み、その際、水溶液は（i）少なくとも3種類の異なるアミノ酸；または（ii）少なくとも1種類のジペプチドもしくはトリペプチドを含
み、水溶液は（a）糖類；ならびに（b-i）タンパク質；および／または（b-ii）変性作用化合物；ならびに（c）シラン類を含まないかまたは実質的に含まない方法に関する。
【００５０】
本発明は、乾燥中の（ポリ）ペプチドのアンフォールディングを防止し、および／または乾燥後の（ポリ）ペプチドの（リ）フォールディングを誘導するための方法であって、（ポリ）ペプチドを水溶液に埋め込む段階を含み、その際、水溶液は（i）少なくとも3種類の異なるアミノ酸；または（ii）少なくとも1種類のジペプチドもしくはトリペプチド
を含み、水溶液は（a）糖類；ならびに（b-i）タンパク質；および／または（b-ii）変性
作用化合物；ならびに（c）シラン類を含まないかまたは実質的に含まない方法に関する
。
【００５１】
本発明による用語“（ポリ）ペプチド”は、最高30個のアミノ酸からなるペプチドのグループおよび30個より多いアミノ酸からなるポリペプチドのグループを含む、一群の分子を記載する。用語“（ポリ）ペプチド”には、タンパク質およびタンパク質フラグメントも含まれる。（ポリ）ペプチドは二量体、三量体およびより高次のオリゴマー、すなわち1より多い（ポリ）ペプチド分子からなるものを形成することができる。そのような二量
体、三量体などを形成する（ポリ）ペプチド分子は、同一でも異なってもよい。したがって、対応する高次構造体はホモ-またはヘテロ二量体、ホモ-またはヘテロ三量体などと命名される。ホモ-またはヘテロ二量体なども、用語“（ポリ）ペプチド”の定義に含まれ
る。用語“（ポリ）ペプチド”と“タンパク質”は本明細書中で互換性をもって用いられる。用語“（ポリ）ペプチド”は、自然修飾された（ポリ）ペプチドであってその修飾がたとえば翻訳後修飾、たとえばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などにより行なわれるものをも表わす。そのような修飾は当技術分野で周知である。
【００５２】
本明細書中で用いる用語“（ポリ）ペプチドのアンフォールディング”は、（ポリ）ペプチドの特徴的な三次元構造の喪失に関する。本明細書中で用いる用語“（ポリ）ペプチドのアンフォールディング”には、（ポリ）ペプチドの部分的および完全なアンフォールディングが含まれる。アンフォールディングした（ポリ）ペプチドの構造は、ランダムコイルとも呼ばれる。（ポリ）ペプチドは、たとえばmRNAの配列からアミノ酸の直鎖に翻訳された直後にはアンフォールディングした状態（またはランダムコイル）で存在するが、化学的アンフォールディング、熱変性によるもの、圧力または酸化的損傷によるアンフォールディングもある。（ポリ）ペプチドの三次元構造（自然状態とも呼ばれる）はアミノ酸間の相互作用の結果であり、したがって（ポリ）ペプチドのアミノ酸配列によって決まる。三次元構造は機能にとって必須であるので、一般に（ポリ）ペプチドの少なくとも部分的なアンフォールディングは、その（ポリ）ペプチドの生物活性の喪失をもたらす。
【００５３】
本明細書中で用いる用語“（ポリ）ペプチドの（リ）フォールディング”は、たとえば変性または化学的アンフォールディングによりそれまでアンフォールディングしていた（ポリ）ペプチドを、その（ポリ）ペプチドの自然の三次元構造に戻すためにフォールディングまたはリフォールディングさせることを表わす。
【００５４】
本明細書中で用いる用語“乾燥”は、試料の液体含量を低下または除去することを表わす。好ましくは、残留液体含量は20％未満、たとえば10％未満、たとえば5％未満、より
好ましくは3％未満、たとえば2％未満、または1％未満である。最も好ましくは、液体は0．5％未満、またはそれ以下である。
【００５５】
本明細書中で用いる用語“埋め込む(embedding)”は、（ポリ）ペプチドを本発明によ
る溶液に完全に装入することに関する。
本発明によれば、乾燥前および乾燥中にタンパク質を溶液に埋め込み、これにより乾燥段階でのタンパク質のアンフォールディングを防止する。あるいは、またはさらに、乾燥タンパク質の再構成に際してタンパク質を溶液に埋め込んでもよく、これにより再構成タンパク質の適正なフォールディングが保証される。タンパク質を本発明による溶液中で乾燥させた場合に再構成は本発明の方法により定めた溶液とは異なる溶液中で実施でき、あるいはその逆も成り立つことは、当業者に認識されるであろう。好ましくは、タンパク質の乾燥と再構成を両方とも本発明による溶液中で実施し、その際、これらの段階に用いる溶液は同一であってもよく、異なる化合物を含んでもよい。
【００５６】
本明細書中で用いる用語“水溶液”は、当業者に周知であり、溶媒が水である溶液に関
する。
本発明による用語“アミノ酸”は、カルボン酸基、アミノ基、および異なるアミノ酸間で変動する側鎖をもつ、有機分子に関する。アミノ酸はタンパク質の必須構築ブロックである。本発明によれば、用語“アミノ酸”は、互いに結合してオリゴマーまたはポリマー、たとえばジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチドまたは（ポリ）ペプチドを形成していない、遊離アミノ酸を表わす。
【００５７】
本発明の溶液に含まれるアミノ酸は、天然アミノ酸および人工アミノ酸、またはこれらの天然もしくは人工アミノ酸の誘導体から選択できる。
天然アミノ酸は、たとえば20種類のアミノ酸、グリシン、プロリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、システイン、フェニルアニン、リジン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、メチオニン、セリン、バリン、チロシン、トレオニンおよびトリプトファンである。他の天然アミノ酸は、たとえばカルニチン、クレアチン、クレアチニン、グアニジノ酢酸、オルニチン、ヒドロキシプロリン、ホモシステイン、シトルリン、ヒドロキシリジンまたはベータ-アラニンである。
【００５８】
人工アミノ酸は、異なる側鎖長および／または側鎖構造をもち、ならびに／あるいはアルファ-C原子とは異なる部位にアミノ基をもつアミノ酸である。アミノ酸の誘導体は修飾アミノ酸であり、これには限定ではなくn-アセチル-トリプトファン、ホスホノセリン、
ホスホノトレオニン、ホスホノチロシン、メラニン、アルギニノコハク酸、およびその塩類、ならびにDOPAが含まれる。
【００５９】
本発明に関して、すべての用語が各アミノ酸の塩類をも含む。
本発明によれば、互いに異なる3種類以上のアミノ酸が溶液に含まれる。たとえば、用
語“少なくとも3種類の異なるアミノ酸”は、少なくとも4種類の異なるアミノ酸、たとえば少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10
種類のアミノ酸、またはそれ以上、たとえば少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18種類の異なるアミノ酸にも関する。この用語はさらに、厳密に3、厳密に4、厳密に5、厳密に6、厳密に7、厳密に8、厳密に9、厳密に10、厳密に11、厳密に12、厳密に13、厳密に14、厳密に15、厳密に16、厳密に17、厳密に18種類の異なるアミノ酸を含む。本明細書中でアミノ酸と言う場合、1分子より多くのそのアミノ酸を意図することは当業者に容易に理解されるであろう。したがって、種々のアミノ酸の記載量は、1タイプのアミノ酸の分子数ではなく異なるタイプのアミノ酸の量を限定することを意図する。したがって、たとえば用語“3種類の異なるアミノ酸”は3種類の異なるタイプのアミノ酸を表わし、その際、それぞれ個々のアミノ酸の量は具体的に限定されない。好ましくは、異なるアミノ酸の数は18を超えない。
【００６０】
本明細書中で用いる用語“ジペプチドまたはトリペプチド”は、それぞれ2または3個のアミノ酸からなるペプチドに関する。代表的なジペプチドはグリシルグルタミン（Gly-Gln、グルタミン単独と比較して高い安定性を生じる）、グリシルチロシン（Gly-Tyr、チロシン単独と比較して高い水溶性を生じる）、アラニルグルタミン（Ala-Gln、グルタミン単独と比較して高い水溶性を生じる）およびグリシルグリシンである。
【００６１】
天然ジペプチドの限定ではないさらに他の例は、カルノシン（ベータ-アラニル-L-ヒスチジン）、N-アセチル-カルノシン（N-アセチル-（ベータ-アラニル-L-ヒスチジン）、アンセリン（ベータ-アラニル-N-メチルヒスチジン）、ホモアンセリン（N-（4-アミノブチリル）-L-ヒスチジン）、キョートルフィン(kyotorphin)（L-チロシル-L-アルギニン）、バレニン(balenine)（またはオフィジン(ophidine))（ベータ-アラニル-Nタウ-メチルヒ
スチジン）、グロリン(glorin）（N-プロピオニル-γ-L-グルタミル-L-オルニチン-δ-la
c エチルエステル）およびバレッチン(barettin)（シクロ-［（6-ブロモ-8-エン-トリプ
トファン）-アルギニン］）である。
【００６２】
人工ジペプチドの例には、限定ではなくアスパルテーム（N-L-a-アスパルチル-L-フェ
ニルアラニン 1-メチルエステル）およびプソイドプロリンが含まれる。
代表的なトリペプチドは、グルタチオン（γ-グルタミル-システイニル-グリシン）な
らびにそれのアナログであるオフタルミン酸（L-γ-グルタミル-L-α-アミノブチリル-グリシン）およびノルオフタルミン酸（y-グルタミル-アラニル-グリシン）である。トリペプチドの限定ではないさらに他の例には、イソロイシン-プロリン-プロリン（IPP）、グ
リプロメート(glypromate)（Gly-Pro-Glu）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（TRH、チロリベリン(thyroliberin)またはプロチレリン(protirelin))（L-ピログルタミル-L-ヒスチジニル-L-プロリンアミド）、メラノスタチン(melanostatin)（プロリル-ロイシル-グ
リシンアミド）、ロイペプチン(leupeptin)（N-アセチル-L-ロイシル-L-ロイシル-L-アルギニナール）およびエイゼニン(eisenin)（pGlu-Gln-Ala-OH）が含まれる。医薬用途に関して用いる場合、少なくとも1種類のジ-またはトリペプチド、より好ましくは全部のジ-
またはトリペプチドが、何ら薬理学的特性を発揮しないことが好ましい。
【００６３】
好ましくは、少なくとも1種類のジペプチドはカルノシン、グリシルトリロシン、グリ
シルグリシンおよびグリシルグルタミンからなる群から選択される。
本発明によれば、溶液は1種類以上のジ-またはトリペプチドを含む。たとえば、用語“少なくとも1種類のジペプチドまたはトリペプチド”は、少なくとも2種類のジ-またはトリペプチド、たとえば少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9種類のジ-またはトリペプチドにも関する。この用語はさらに、厳密に1、厳密に2、厳密に3、厳密に4、厳密に5、厳密に6、厳密に7、厳密に8、厳密に9種類のジ-またはトリペプチドを含む。1種類より多いジ-またはトリペプチドが溶液に含まれる場合、そのジペプチドおよびトリペプチドの混合物は明白に本発明に含まれる。ジ-およびトリペプチドの数は互いに独立して選択でき、たとえば溶液は2種類のジペプチドおよび3種類のトリペプチドを含むことができる。本明細書中で特定数のジ-およびトリペプチドに言及する場合、その数は1タイプのジペプチドまたはトリペプチドの分子数ではなく異なるタイプのジ-およびトリペプチドの量を限定することを意図するものであることは当業者に容易に理解されるであろう。したがって、たとえば用語“4種類のジペプチドまたはトリペプチド”は、4種類の異なるタイプのジペプチドおよび／またはトリペプチドを表わし、その際、それぞれ個々のジ-および／またはトリペプチドの量は具体的に限定されない。好ましくは、（異なる）ジ-またはトリペプチドの数は9を超えない。
【００６４】
アミノ酸、ジペプチドおよび／またはトリペプチドの好ましい使用量は、0.1〜150 mg
／ml、好ましくは1〜100 mg／ml、より好ましくは10〜50 mg／ml、よりさらに好ましくは20〜35 mg／mlであり、最も好ましくはその量は25 mg／mlである。
【００６５】
本発明による用語“（a）糖類を含まないかまたは実質的に含まない”は、いずれかの
タイプの糖類、すなわち単糖、二糖またはオリゴ糖の形態の炭水化物、および糖アルコールを含まないかまたは実質的に含まない溶液を表わす。タンパク質フォールディングの方法に一般に用いられるけれども本発明によれば存在しない糖類の例には、限定ではなくサッカロース、トレハロース、スクロース、グルコース、ラクトース、ソルビトールまたはマンニトールが含まれる。溶液が0.1％（w／v）未満、より好ましくは0.01％（w／v）未満、よりさらに好ましくは0.001％（w／v）未満、最も好ましくは0.0001％（w／v）未満の糖類を含有する場合、その溶液は糖類を実質的に含まないとみなされる。
【００６６】
前記のように、糖類は、それぞれ凍結ストレスに対して（クリオプロテクタント）および乾燥ストレスに対して（リオプロテクタント）タンパク質を安定化するために当技術分
野でしばしば用いられる。さらに、糖類は張度調整剤として、および増量剤として配合物に添加される。
【００６７】
本明細書中で用いる用語“タンパク質を含まないかまたは実質的に含まない”は、（リ）フォールディングすべき、またはアンフォールディングを防止すべき（ポリ）ペプチド以外のいずれかのタンパク質（単数または複数）を含まないかまたは実質的に含まない溶液を表わす。たとえば溶液の汚染に関連する痕跡量のタンパク質が存在する可能性があり、その溶液がタンパク質を含まないという要件により除外されないことは、当業者に認識されるであろう。したがって、溶液が0.1％（w／v）未満、より好ましくは0.01％（w／v）未満、よりさらに好ましくは0.001％（w／v）未満、最も好ましくは0.0001％（w／v）未満の、（リ）フォールディングすべき、またはアンフォールディングを防止すべき（ポリ）ペプチド以外のタンパク質を含有する場合、その溶液はタンパク質を実質的に含まないとみなされる。
【００６８】
他のタンパク質、たとえばHSA、BSAなどは、界面への吸着、不必要な撹拌を避けるために、またバイアル内での不必要な空気または泡の形成を最小限に抑えるために、タンパク質溶液またはペプチド溶液にしばしば添加される。界面活性剤は、他のタンパク質と同様に、容器の内面に競合的にコートまたは吸着させるために、あるいは送達システムの調製に際して形成される表面に吸着させるために、配合物に添加される。
【００６９】
本発明によれば、溶液はさらに、“変性作用化合物を含まないかまたは実質的に含まない”ことが可能である；すなわち、溶液はタンパク質を（リ）フォールディングする方法に一般に用いられる、不溶性タンパク質凝集物（封入体）として現われるいずれかの変性作用剤を含まないかまたは実質的に含まない。そのような変性作用化合物の例には、限定ではなくカオトロピック溶媒添加物、たとえば尿素、塩化グアニジニウムまたはドデシル硫酸ナトリウム（SDS）が含まれる。溶液が0.01％（w／v）未満、より好ましくは0.001％（w／v）未満、最も好ましくは0.0001％（w／v）未満の変性作用化合物を含有する場合、その溶液は変性作用化合物を実質的に含まないとみなされる。
【００７０】
本明細書中で用いる用語“シラン類を含まないかまたは実質的に含まない”は、いずれかのシラン、たとえばシリル化合物と他の官能基を含むアルコキシシラン、有機機能性シラン、水素シラン（シロキサン）、シロキサン、およびオルガノシランを含まないかまたは実質的に含まない溶液を表わす。溶液が0.01％（w／v）未満、より好ましくは0.001％
（w／v）未満、最も好ましくは0.0001％（w／v）未満のシラン類を含有する場合、その溶液はシラン類を実質的に含まないとみなされる。
【００７１】
本発明方法による溶液に関する用語“含む(comprising)”は、明確に記載した化合物のほかにさらに他の成分が溶液中に存在する可能性があることを表わす。そのようなさらに他の成分の限定ではない例には、後記に述べるサポニンもしくは脂肪酸またはその誘導体が含まれる。好ましくは、溶液は記載したアミノ酸、またはジ-もしくはトリペプチド、
およびサポニンもしくは脂肪酸またはその誘導体からなるが、さらに他の化合物を含まない。より好ましくは、本発明による溶液は、記載したアミノ酸、またはジ-もしくはトリ
ペプチドのみからなる。
【００７２】
前記のように、適切な安定剤（単数または複数）の選択に際して従うための単一の確立された法則は現在はない；それは、一部は、タンパク質-共溶質の相互作用が明確かつ決
定的には理解されていないこと、および前記に概説したように多数の不活性化機序に起因するが、タンパク質のサイズが大きいこと、フォールディング、コンホメーション安定性およびアンフォールディング／変性など特定の挙動に影響を及ぼすそれらの組成変動性および両親媒性にも起因する。さらに、伝統的に用いられている組合わせの賦形剤の安定化
効果は個々のタンパク質に強く依存し、したがって限定された量でのみタンパク質の安定性を高めることができる。異なるタンパク質間のこれらの構造上の相異のため、普遍的な安定化方策の一般化はこれまで成功していない。
【００７３】
本発明によれば、本発明方法に従って定める溶液が天然（ポリ）ペプチドの乾燥に際してそのアンフォールディングを防止し、および／または再構成に際して（ポリ）ペプチドの適正な（リ）フォールディングを促進することが、予想外に見出された。言い換えると、本発明による溶液中で乾燥させると（ポリ）ペプチドの三次元構造が維持される。そのタンパク質に特徴的な三次元構造の維持は、それの機能および有効性に不可欠な前提条件である。前記のように、特定の条件またはストレスはタンパク質の二次、三次および四次構造を変化させ、続いて物理的不安定性の主な事象であるタンパク質のアンフォールディングおよび／または凝集をもたらす。タンパク質の三次元構造の変化は、潜在的な化学分解、アミド分解、ジスルフィド結合の変化、またはスクシンイミド形成に作用する。さらに、タンパク質、たとえばIgGの二次構造は吸着表面で著しく変化する可能性があり、タンパク質構造の剛性およびタンパク質表面の疎水性残基の数は剪断耐容性に影響を及ぼす可能性がある。本明細書中で述べる分解経路の性質の相異にもかかわらず、それらはすべて各タンパク質の三次元構造に依存し、あるいはそれにより影響を受ける。したがって、タンパク質の自然な三次元構造を維持するための本発明方法を提供することにより、これらの多様な影響の大部分により誘導される分解を防止できる。したがって本発明の方法は、タンパク質医薬の開発のためにタンパク質の基本的特性を調べることを要求する先行技術方法に優る著しい利点をもたらす。
【００７４】
アミノ酸は安定化溶液中に他の賦形剤と共に以前から用いられているので、本発明の知見は特に予想外である。しかし、タンパク質の構造および特性の複雑さ、タンパク質の安定性に影響を及ぼす多数の物理的および化学的要因、ならびにタンパク質の分解をもたらす可能性がある多量のストレスのため、少なくとも3種類の異なるアミノ酸または少なく
とも1種類のジ-もしくはトリペプチドが溶液中に存在すれば、特に乾燥に際して溶液中でのタンパク質のアンフォールディングを防止するのに十分であるとは決して考えられなかった。
【００７５】
付随する実施例に示すように、タンパク質の三次元構造が照射後ですら維持される。さらに、凍結および融解に際して結晶形成がみられず、したがって凍結乾燥方法に通常は伴なう負の作用が低減する。
【００７６】
本発明による溶液の安定化効果のため、タンパク質の三次元構造の変化が避けられ、そのようなタンパク質に対する望ましくない宿主免疫応答が発生するリスクが低減する。さらに、本発明溶液は当技術分野で一般に用いられる前記のいずれかの添加剤を含有せず、したがって溶液の調製に関連するコストが低減し、かつその（ポリ）ペプチドをたとえば療法用途に用いる場合に有害となる可能性のある添加剤を除去するためにそれ以上の精製段階を必要としないという、追加の利点をもたらす。乾燥タンパク質は温度ストレスに対して抵抗性であり、したがってたとえば連続冷却鎖の欠ける条件下での貯蔵に際してそれらを特に安定にする。
【００７７】
本発明の特に好ましい態様において、溶液はセチルトリメチルアンモニウムクロリド（CTAC）、N-ラウロイルサルコシン、Tween、Brij 35および／またはポリソルベートを含まない。化合物セチルトリメチルアンモニウムクロリド（CTAC）、N-ラウロイルサルコシン、Tween、Brij 35および／またはポリソルベートは、一般に用いられるイオン性または非イオン性界面活性剤の例である。本発明のより好ましい態様において、溶液はイオン性または非イオン性界面活性剤を含まない。
【００７８】
他の好ましい態様において、少なくとも3種類のアミノ酸は下記のものを含まない：（i-a）グルタミン酸とグルタミンの組合わせ、および／または（i-b）アスパラギン酸とアスパラギンの組合わせ。
【００７９】
別の好ましい態様において、少なくとも3種類のアミノ酸はフェニルアラニンを含まな
い。
本発明方法のさらに他の好ましい態様において、少なくとも3種類のアミノ酸は下記の
群から選択される：（a）非極性、脂肪族R基をもつアミノ酸；（b）極性、非荷電R基をもつアミノ酸；（c）正に荷電したR基をもつアミノ酸；（d）負に荷電したR基をもつアミノ酸；および（e）芳香族R基をもつアミノ酸。
【００８０】
天然アミノ酸、ただし天然アミノ酸以外のもの、たとえば人工アミノ酸も、上記の群に分類することができ(Nelson D.L. & Cox M.M., “Lehninger Biochemie” (2005), pp. 122-127)、それらから少なくとも3種類のアミノ酸を本発明による溶液のために選択する。
【００８１】
より好ましい態様において、少なくとも3種類のアミノ酸は異なる群（a）〜（e）から
選択される。言い換えると、この好ましい態様において、3種類のアミノ酸が溶液に含ま
れる場合、その3種類のアミノ酸は少なくとも2つの異なる群から、より好ましくは少なくとも3つの異なる群から、たとえば1つは（a）群から、1つは（b）群から、そして1つは（c）群から選択できる。さらに他の組合わせ、たとえば（b）-（c）-（d）、（c）-（d）-（e）、（e）-（a）-（b）、（b）-（d）-（e）なども本発明において明らかに考慮される。4種類のアミノ酸が溶液に含まれる場合にも同じことが適用され、その場合はアミノ酸は（a）〜（e）から選択される少なくとも2つの異なる群から、より好ましくは少なくとも3つの異なる群から、最も好ましくは4つの異なる群からのものであるべきである。特に、5種類のアミノ酸が溶液に含まれる場合、アミノ酸は（a）〜（e）から選択される少なくとも2つの異なる群から、より好ましくは少なくとも3つの異なる群から、より好ましくは少なくとも4つの異なる群から、最も好ましくは5つの異なる群からのものであるべきである。5種類より多いアミノ酸、たとえば6または7種類のアミノ酸が溶液に含まれる場合にも同じことが適用され、その場合これらのアミノ酸は（a）〜（e）から選択される少なくとも2つの異なる群から、より好ましくは少なくとも3つの異なる群から、より好ましくは少なくとも4つの異なる群から、最も好ましくは5つの異なる群から選択される。
【００８２】
本発明方法のよりさらに好ましい態様において、溶液は下記の各群から選択される少なくとも1種類のアミノ酸を含む：（a）非極性、脂肪族R基をもつアミノ酸；（b）極性、非荷電R基をもつアミノ酸；（c）正に荷電したR基をもつアミノ酸；（d）負に荷電したR基
をもつアミノ酸；および（e）芳香族R基をもつアミノ酸。
【００８３】
本発明に従って用いる溶液中に各群のアミノ酸が同じ数で存在する必要がないことは、さらに当業者には理解される。むしろ、各群のアミノ酸が少なくとも1種類存在する限り
、いかなる組合わせのアミノ酸も選択できる。
【００８４】
さらに、アミノ酸は溶液中に単分子として、ならびに／あるいはジ-および／またはト
リペプチドとして存在することができる。
本発明方法の他の好ましい態様において、溶液は少なくとも下記のアミノ酸を含む：（a）アラニン、グルタミン酸、リジン、トレオニンおよびトリプトファン；（b）アスパラギン酸、アルギニン、フェニルアラニン、セリンおよびバリン；（c）プロリン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸、トレオニン、フェニルアラニン；（d）チロシン、イソロイシン、ロイシン、トレオニン、バリン；または（e）アルギニン、グリシン、ヒスチジン、アラニン、グルタミン酸、リジン、トリプトファン。他の好ましい態様において、溶液は少なくとも下記のアミノ酸を含む：（f）アラニン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、リジン。
【００８５】
この態様によれば、少なくとも上記のいずれかの群（a）、（b）、（c）、（d）または（e）のアミノ酸が本発明による溶液中に存在する。言い換えると、上記のものより多い
アミノ酸が本発明溶液中に含まれてもよいが、少なくとも上記のアミノ酸は存在することが要求される。より好ましくは、溶液は上記のアミノ酸だけを含み、他のアミノ酸を含まない。群（f）のアミノ酸にも、必要な変更を加えて同じことが適用される。
【００８６】
本発明方法の他の好ましい態様において、1種類以上のアミノ酸は天然の非タンパク源
アミノ酸および合成アミノ酸からなる群から選択される。
本発明による用語“非タンパク源アミノ酸”は、自然界ではポリペプチドおよびタンパク質に取り込まれないアミノ酸に関する。非タンパク源アミノ酸は、タンパク源アミノ酸、すなわちL-α-アミノ酸から、翻訳後修飾により誘導できる。そのような非タンパク源アミノ酸は、たとえばランチオニン、2-アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、および神経伝達物質ガンマ-アミノ酪酸である。タンパク源L-アミノ酸のD-鏡像異性体も非タンパク源アミノ酸である。非タンパク源アミノ酸の限定ではないさらに他の例には、カルニチン、クレアチン、クレアチニン、グアニジノ酢酸、オルニチン、ヒドロキシプロリン、ホモシステイン、シトルリン、ヒドロキシリジンまたはベータ-アラニンが含まれる。
【００８７】
本明細書中で用いる用語“合成アミノ酸”は、自然界に存在しないアミノ酸に関する。合成アミノ酸の限定ではない例には、（2R）-アミノ-5-ホスホノ吉草酸、D-フェニルグリシンまたは（S）-および（R）-tert-ロイシンが含まれる。
【００８８】
他の好ましい態様において、（ポリ）ペプチドは、療法用タンパク質、たとえば抗体、増殖因子、サイトカイン、タンパク質もしくはペプチドホルモン、成長ホルモン、血液因子、療法用酵素、療法用ワクチン、またはそれらの生物活性を保持したそのフラグメントからなる群から選択される。これらの（ポリ）ペプチドは、たとえば療法または診断の目的に使用できる。そのような目的は当技術分野で周知である。
【００８９】
用語“抗体”には、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体およびそれらの結合特異性を保持したその誘導体が含まれる。この用語には、合成、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、またはその誘導体もしくはフラグメントであって、なおそれらの結合特異性を保持したものも含まれる。抗体のフラグメントには、特にFabフラグメント、F（ab'）2またはFvフラグメントが含まれる。抗体およびそのフラグメントの調製方法は当技術分野で周知であり、たとえば、Harlow and Lane “Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988、およびHarlow and Lane “Using Antibodies: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998に記載されている
。さらに、トランスジェニック動物を用いてヒト化抗体を発現させることができる。最も好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体の調製には、連続細胞系培養により産生される抗体を供給するいずれかの方法を使用できる。そのような方法の例には、ハイブリドーマ技術(Koehler and Milstein Nature 256 (1975), 495-497)、
トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72)、およびヒトモノクローナル抗体を調製するためのEBV-ハイブリドーマ技術(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96)
が含まれる。抗体はいかなるクラスの抗体であってもよい。抗体がモノクローナル抗体であって、IgG、IgMまたはIgYクラスのものであることが最も好ましい。IgY抗体はニワトリにおけるIgG抗体のアナログである。
【００９０】
本明細書中で用いる用語“増殖因子”は、細胞表面の受容体に結合して細胞の増殖および／または分化を活性化する一次結果をもたらすタンパク質を表わす。多くの増殖因子は
汎用性であって多種多様な細胞タイプにおいて細胞分裂を刺激するが、他のものは特定の細胞タイプに特異的である。本発明による好ましい増殖因子には、限定ではなく、エリスロポエチン、インスリン様増殖因子1（IGF-1、元はソマトメジンCと呼ばれた）およびイ
ンスリン様増殖因子2（IGF-2）が含まれる。
【００９１】
本発明による用語“サイトカイン”は、細胞コミニュケーション、免疫機能および胚形成に際して広範に使われる一群のシグナル伝達タンパク質に関する。サイトカインは多様な造血細胞および非造血細胞により産生され、ホルモンの場合と同様にオートクリン、パラクリンおよびエンドクリン作用を発揮することができる。しかし、多くのサイトカインは増殖因子活性を示す。サイトカインはユニークな増殖因子ファミリーである。サイトカインは、主に白血球から分泌されて、体液性および細胞性の両方の免疫応答ならびに食細胞の活性化を刺激する。リンパ球から分泌されるサイトカインはリンホカインと呼ばれ、一方、単給またはマクロファージにより分泌されるものはモノカインと呼ばれる。大きなファミリーのサイトカインが身体の種々の細胞により産生される。多くのリンホカインがインターロイキン（IL）としても知られている；それらは白血球により分泌されるだけでなく、白血球の細胞応答にも影響を及ぼすことができるからである。詳細には、インターロイキンは造血由来の細胞を標的とする増殖因子である。サイトカインには、限定ではなく、インターロイキン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球
マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）および骨形成タンパク質-2（BMP-2）が含ま
れる。
【００９２】
用語“タンパク質またはペプチドホルモン”は、生存動物において血流中へ分泌されてエンドクリン機能をもつ一群のペプチドを表わす。他のタンパク質と同様に、ペプチドホルモンは細胞においてアミノ酸からmRNA鋳型に従って合成され、mRNA自身は細胞核の内部でDNA鋳型から合成される。ペプチドホルモン前駆物質（プレプロホルモン）は、次いで
幾つかの段階で、一般に小胞体内においてプロセシングされ（これには、N末端シグナル
配列の除去および時にはグリコシル化が含まれる）、プロホルモンになる。プロホルモンは次いで膜結合した分泌小胞内へパッケージされ、これは特定の刺激、たとえば細胞質のカルシウムおよびcAMPの濃度上昇に応答して、細胞からエキソサイトーシスにより分泌できる。これらのプロホルモンはしばしば余分なアミノ酸残基を含み、それらはホルモン分子がフォールディングしてそれの活性コンフィギュレーションになるのを指令するのに必要であるが、ホルモンがフォールディングすると機能をもたない。細胞内の特異的エンドペプチダーゼは、プロホルモンが血流中へ放出される直前に開裂させて、成熟ホルモン形態の分子を生成する。成熟ペプチドホルモンは次いで血液により身体のすべての細胞に拡散し、そこでペプチドホルモンはそれらの標的細胞の表面にある特異的受容体と相互作用する。あるペプチド／タンパク質ホルモン（アンギオテンシンII、塩基性線維芽細胞増殖因子-2、副甲状腺ホルモン関連タンパク質）も、イントラクライン(intracrine)機序により細胞質または核にある細胞内受容体と相互作用する。幾つかの重要なペプチドホルモンが下垂体から分泌される。前下垂体は、乳腺に作用するプロラクトン、副腎皮質に作用してグルココルチコイドの分泌を調節する副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、ならびに骨、筋肉および肝臓に作用する成長ホルモンを分泌する。後下垂体は、抗利尿ホルモン（バソプレシンとも呼ばれる）、およびオキシトシンを分泌する。しかし、ペプチドホルモンは多種多様な臓器および組織により産生され、これには心臓（心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）または心房性ナトリウム利尿因子（ANF））および膵臓（インスリンおよびソマトスタチン）、胃腸管（コレシストキニン、ガストリン）、ならびに脂肪組織貯蔵体（レプチン）が含まれる。ある神経伝達物質はペプチドホルモンと同様な様式で分泌および放出され、ある‘神経ペプチド'は、血流中へ放出されるとホルモンとして作用するほかに神
経系において神経伝達物質として使われる場合がある。ペプチドホルモンが細胞表面の受容体に結合すると、第2メッセンジャーが細胞質中に出現し、それが細胞内応答を誘発す
る。ペプチドホルモンには、限定ではなく、インスリン、グルカゴン、ゴナドトロピン、
ヒト甲状腺刺激ホルモン、アンギオテンシンII、塩基性線維芽細胞増殖因子-2、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、バソプレシン、オキシトシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）または心房性ナトリウム利尿因子（ANF）、ソマトスタチン、コレシストキニン、ガストリン、ならびに脂肪組織貯蔵体（レプチン）が含まれる。
【００９３】
用語“成長ホルモン”（GH）は、アミノ酸191個の一本鎖ポリペプチドからなるタンパ
ク質系ペプチドホルモンを表わし、前下垂体の側翼内の成長ホルモン分泌細胞により貯蔵および分泌される。成長ホルモンが身体組織に及ぼす作用は、全般的に同化作用（構築）であると述べることができる。他の大部分のタンパク質ホルモンと同様に、それは細胞表面の特異的受容体との相互作用により作用する。小児期の身長の伸びは最も良く知られているGHの作用である。身長は少なくとも2つの機序によって刺激されると思われる：1．ポリペプチドホルモンは脂溶性ではないので、それらは筋繊維膜を透過できない。したがって、GHはそれの作用の一部を標的細胞上の受容体に結合することにより発揮し、そこでそれはMAPK／ERK経路を活性化する。この機序により、GHは軟骨の軟骨細胞の分裂および増
殖を直接刺激する。2．GHは、JAK-STAT信号伝達経路により、インスリン様増殖因子1（IGF-1、以前はソマトメジンCとして知られていた）、すなわちプロインスリンのホルモンホモログの産生も刺激する。肝臓はこのプロセスについてGHの主要な標的臓器であり、IGF-1産生の主要部位である。IGF-1は多種多様な組織に対して増殖刺激作用をもつ。追加のIGF-1が標的組織内で産生され、これによりそれはエンドクリンホルモンおよびオートクリン／パラクリンホルモンの両方であるようにみえる。IGF-1は骨芽細胞および軟骨細胞に対しても刺激作用をもち、骨成長を促進する。小児および青年において身長を伸ばすほかに、成長ホルモンは身体に対して他の多数の作用をもつ：カルシウム固定を増大させる、ならびに骨無機質化を強化および増大させる、筋節肥厚により筋質量を増加させる、脂質溶解を促進する、タンパク質合成を増大させる、脳を除くすべての内臓の増殖を刺激する、ホメオスタシスにおいて役割を果たす、肝臓によるグルコース取込みを低減する、肝臓における糖新生を促進する、膵島の維持および機能に寄与する、免疫系を刺激する。
【００９４】
ソマトトロピンは動物において自然に産生される成長ホルモン1であり、一方で用語ソ
マトトロピンは組換えDNA技術により製造される成長ホルモンを表わし、ヒトにおいて“HGH”と略記される。それは成長、細胞の増殖および再生を刺激する。
【００９５】
用語“血液因子”は、血液凝固カスケードの機能を支配するタンパク質を表わす。人体の凝固カスケードは一連の複雑な生化学反応を含み、それらは血液因子タンパク質により調節される。これらのタンパク質には、たとえばプロコアギュレーション因子、たとえばVIII因子およびIX因子、ならびにプロテインCおよびアンチトロンビンIIIを含む抗凝固因子が含まれる。
【００９６】
本明細書中で用いる用語“療法用酵素”は、化学反応を触媒し、これにより出発分子（基質）を異なる分子（生成物）に変換するタンパク質を表わす。療法用酵素の機能は、それらの分子構造およびコンホメーションに直接依存する。不可逆的なコンホメーション変化および不可逆的な凝集は、その療法用酵素の不活性化をもたらす。本発明による好ましい酵素には、限定ではなく、酵素置換療法によるリソソーム貯蔵減少の処置のための療法用酵素、すなわちヒトβ-グルコセレブロシダーゼ（ゴーシェ病）、ヒトガラクトシダーゼA（ファブリー病）、血栓溶解薬、すなわちスレプトキナーゼ（虚血性発作の処置における血栓溶解薬）、ウロキナーゼ、（組換え）組織プラスミノーゲンアクチベーター、TNKase；L-アスパラギナーゼ（細胞増殖抑制薬）、尿酸オキシダーゼ、パパインが含まれる。
【００９７】
本発明による用語“療法用ワクチン”は、弱毒病原体または死菌病原体（抗原）の免疫原部分、ウイルス溶解物の抗原性成分、または組換え製造した個々のタンパク源性ウイル
ス抗原に関する。
【００９８】
（ポリ）ペプチドを製造するために、当技術分野には多数の適切な方法がある。たとえば、（ポリ）ペプチドは適切な宿主において産生できる。宿主が単細胞生物、たとえば原核生物、哺乳動物または昆虫の細胞である場合、当業者は多様な培養条件を考慮できる。簡便には、生成した（ポリ）ペプチドを、培地、培養生物の溶解物、または単離した（生体）膜から、確立した手法により収穫する。多細胞生物の場合、宿主は生物の一部であるかまたは生物の一部に由来する細胞であってもよく、たとえば宿主細胞は植物の収穫可能な部分であってもよい。好ましい方法は、前記の宿主における（ポリ）ペプチドの組換え産生を伴なう。たとえば、本発明に従ってフォールディングすべき／アンフォールディング防止すべき（ポリ）ペプチドをコードする核酸配列をPCRにより合成し、発現ベクター
に挿入することができる。続いて適切な宿主をこの発現ベクターで形質転換することができる。その後、宿主を培養して目的とする（ポリ）ペプチドを産生させ、それ／それらを単離し、そして場合により本発明に使用する前に精製する。
【００９９】
本発明方法に使用する（ポリ）ペプチドを製造するための別法は、インビトロでのmRNA翻訳である。適切な無細胞発現系には、ウサギ網状赤血球溶解物、コムギ胚芽エキス、イヌ膵臓ミクロソーム膜、大腸菌(E. coli)S30抽出物、および対になった転写／翻訳系、たとえばTNT-system（Promega）が含まれる。これらの系は、コード領域および適宜なプロ
モーターエレメントを含むクローニングベクター、DNAフラグメントまたはRNA配列を添加すると、組換え（ポリ）ペプチドを発現することができる。
【０１００】
組換え製造のほかに、本発明方法に使用する（ポリ）ペプチドは合成により、たとえば固相法を用いる直接ペプチド合成により製造できる(参照：Stewart et al. (1969) Solid
Phase Peptide Synthesis; Freeman Co, San Francisco; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154)。合成によるペプチド合成は、手動法を用いて、または自動化により実施できる。自動合成は、たとえばApplied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer、カリフォルニア州フォスターシティー)を用いて、製造業者が提供する指示に従って達成できる。種々のフラグメントを個別に化学合成し、化学的方法で結合させて、全長分子を製造することができる。前記のように、化学合成、たとえばHoughton Proc. Natl. Acad. Sci. USA (82) (1985), 5131-5135が記載する固相法を使用できる。さらに、（ポリ）ペプチドは半合成的に、たとえば組換え製造と合成による製造の組合わせにより製造できる。
【０１０１】
（ポリ）ペプチドの単離および精製は、幾つかの既知方法のいずれかにより達成できる：たとえば、限定ではなく、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、逆相HPLC、ならびに分取ディスクゲル電気泳動。
【０１０２】
本発明方法の他の好ましい態様において、溶液はさらにサポニンもしくは脂肪酸またはその誘導体を含む。
サポニンは二次代謝産物を形成する一群の化合物であり、それらは天然源中にみられるか、天然源から誘導されるか、あるいは化学合成できる。サポニンは多様な植物種に特に多量にみられる。サポニンは両親媒性グリコシドであり、現象的には水溶液状で振とうした際にそれらが生じるセッケン様の発泡により、また構造的にはそれらの1以上の親水性
グリコシド部分と親油性ステロイド系またはトリテルペノイド系アグリコンとを組み合わせた組成により分類される。それらの構造多様性は、それらの物理化学的および生物学的特性に反映される。サポニンの例は、グリチルリチン酸(glycyrrhicic acid)、グリチル
レチン酸(glycyrrhetinic acid)、グルクロン酸、エスシン(escin)、ヘデラコシド(hederacoside)およびジギトニンである。
【０１０３】
脂肪酸は、飽和または不飽和であってよい長い非分枝脂肪族鎖（テイル）をもつカルボン酸である。それらの代謝によって多量のATPが得られるので、それらは重要なエネルギ
ー源である。大部分の天然脂肪酸は4から28までの偶数の炭素原子の鎖をもち、通常はト
リグリセリドまたはリン脂質から誘導される。脂肪酸は種々の長さをもち、これを利用してそれらを短鎖、中鎖または長鎖脂肪酸と分類する。短鎖脂肪酸（SCFA）は炭素原子6個
未満の脂肪族テイルをもつ脂肪酸であり；中鎖脂肪族（MCFA）は炭素原子6〜12個の脂肪
族テイルをもつ脂肪酸であり、それらは中鎖トリグリセリドを形成することができ；長鎖脂肪酸（LCFA）は炭素原子12個より長い脂肪族テイルをもつ脂肪酸であり；極長鎖脂肪酸（VLCFA）は炭素原子22個より長い脂肪族テイルをもつ脂肪酸である。限定ではない脂肪
酸の例には、不飽和脂肪酸、たとえばミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸(sapienic acid)、オレイン酸、リノール酸、α-リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルシン酸(erucic acid)、およびドコサヘキサエン酸、または飽和脂肪酸
、たとえばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸およびセロチン酸(cerotic acid)が含まれる。
【０１０４】
本発明方法の他のより好ましい態様において、サポニンはグリチルリチン酸またはその誘導体である。
グリチルリチン酸(glycyrrhizic acid)はグリチルリチン酸(glycyrrhicic acid)、グリチルリチン(glycyrrhizin)またはグリチルリチン酸(glycyrrhizinic acid)としても知ら
れ、下記の構造をもつ：
【０１０５】
【化１】
2019052169.tif 000002
【０１０６】
グリチルリチン酸は水溶性であり、カチオン分子有効成分と静電会合複合体を形成する潜在配位子となることができるアニオンとして存在する。理論により拘束されたくはないが、本発明者らは、アニオン性グリチルリチン酸が本発明の溶液中に存在するアミノ酸（すなわち、アルギニンまたはリジン）と静電相互作用、水素結合または両方により複合体を形成するという仮説を立てた。この複合体形成は、本発明の溶液がタンパク質の自然の三次元構造を維持する能力を増強すると考えられる。さらに、グリチルリチン酸がカチオン分子有効成分と静電会合複合体を形成する能力は、乾燥プロセスに際してタンパク質表面に露出したカチオン側鎖との相互作用を生じることができ、したがって自然なタンパク質構造がさらに安定化される。
【０１０７】
グリチルリチン酸の誘導体は当技術分野で周知であり、グリチルリチン酸をカルボキシル基およびヒドロキシル基において変換することにより、アミノ酸残基を炭水化物部分内へコンジュゲーションすることにより、または2-アセトアミド-β-D-グルコピラノシルアミンをグリチルリチン酸のグリコシド鎖内へ導入することにより製造されるものが含まれる。他の誘導体は、グリチルリチン酸のアミド、グリチルリチン酸と2つのアミノ酸残基
および遊離30-COOH官能基とのコンジュゲート、ならびにグリチルリチン酸分子の炭水化
物部分におけるアミノ酸アルキルエステルの少なくとも1つの残基のコンジュゲートであ
る。具体的な誘導体の例は、たとえばKondratenko et al. (Russian Journal of Bioorganic Chemistry, Vol 30(2), (2004), pp. 148-153)中にある。
【０１０８】
本発明により、意外にもグリチルリチン酸を前記溶液に添加すると（ポリ）ペプチドのフォールディングまたはリフォールディングがさらに助成され、そのアンフォールディングが防止されることが見出された。特に、グリチルリチン酸は通常は望ましくない凝集物を形成しやすい（ポリ）ペプチドの凝集を低減することが見出された。したがって、グリチルリチン酸の添加は、（ポリ）ペプチドが活性に必要な三次元構造に適正にフォールディングするのを促進または支持することによりその生物活性の維持または再生を補助する。
【０１０９】
本発明方法の他のより好ましい態様において、脂肪酸は短鎖および中鎖脂肪酸からなる群から選択される。
短鎖および中鎖脂肪酸は、より長い鎖をもつ脂肪酸と比較したそれらのより良好な水溶性のため、特に好ましい。
【０１１０】
本発明方法の他の好ましい態様において、溶液の賦形剤と（ポリ）ペプチドのw／w比は約1：1〜約500：1である。
本発明によれば、溶液の賦形剤は非水性の溶液成分であり、それらはフォールディングすべき、またはアンフォールディングから保護すべき（ポリ）ペプチドではない。
【０１１１】
より好ましくは溶液の成分と（ポリ）ペプチドのw／w比は約1：1〜約350：1、たとえば約5：1〜約200：1、または約10：1〜約100：1である。最も好ましくは、w／w比は約2：1
である。これらの比の間にあるいかなる数値も明らかに本発明に含まれることは理解されるであろう。さらに、本明細書中で用いる約という用語は、明確に記載した比およびそれから±10％の偏差を含む。
【０１１２】
本発明方法の他の好ましい態様において、（ポリ）ペプチドは組換え（ポリ）ペプチドである。
本発明方法のさらに他の好ましい態様において、（ポリ）ペプチドは1以上の分子内ジ
スルフィド結合をもつ。
【０１１３】
（ポリ）ペプチドは、少なくとも1つの分子内または分子間ジスルフィド結合の形成に
よって安定化できる。適切なシステイン残基は（ポリ）ペプチド中に自然に存在するか、あるいは適宜なアミノ酸をシステインに変異させることにより（ポリ）ペプチドに導入できる。たとえばWO 2009/007124に、scFvの免疫原ドメイン内へジスルフィド橋を導入すると、それらの特異性に影響を及ぼすことなく、あるいはそれらの親和性および機能性を低減することなく、かつこれらの分子の溶解性を喪失することなく、これらの分子の安定性が大幅に増大すると開示されている。
【０１１４】
本発明方法の他の好ましい態様において、フォールディングした（ポリ）ペプチドは生物学的に活性である。
用語“生物学的に活性”は、（ポリ）ペプチドの自然に存在する活性に関する。生物活性は、個々の（ポリ）ペプチドに依存し、他の分子に対する結合親和性（たとえば、抗体、リガンドまたは転写因子について）、または触媒活性（たとえば、酵素について）を含む。たとえば抗体の生物活性には、それの抗原の特異的結合が要求される。これに関して、用語“生物学的に活性である”は、フォールディングまたはリフォールディングした（ポリ）ペプチド（すなわち、乾燥および再構成の後の）の生物活性であって、その（ポリ）ペプチドの自然に存在する活性の少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、最も好ましくは少なくとも80％であるものを表わす。より好ましくは、フォールディングまたはリフォールディングした（ポリ）ペプチド（すなわち、乾燥および再構成の後の）の生物活性は、その（ポリ）ペプチドの自然に存在する活性の少なくとも90％、より好ましくは少なくとも100％である。
【０１１５】
前記のように、いずれか特定の（ポリ）ペプチドの生物活性は、それの三次元構造に直接依存する。したがって、（ポリ）ペプチドを（リ）フォールディングさせ、および／またはアンフォールディングを防止する方法を提供することにより、その（ポリ）ペプチドの生物活性を維持または回復する方法を本明細書に提示する。（ポリ）ペプチドの生物活性は、リフォールディングの場合は回復でき、アンフォールディング防止の場合は維持できることが認識されるであろう。
【０１１６】
本明細書中で用いる用語“乾燥製剤”は、液体含量を排除または低減した製剤を表わす。バイアルまたは細菌製剤を乾燥させるのに適した方法には、限定ではなく、凍結乾燥(lyophilisation (freeze-drying))、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥、および風乾、または発泡乾燥が含まれる。
【０１１７】
液体が体積の20％未満、たとえば10％未満、たとえば5％未満、より好ましくは体積の3％未満、たとえば2％未満、または1％未満まで減少した場合、液体含量は低減したとみなされる。
【０１１８】
本発明方法のさらに好ましい態様において、乾燥は凍結乾燥、噴霧乾燥、風乾、噴霧凍結乾燥、または発泡乾燥である。
凍結乾燥(lyophilisation、freeze-dryingとも言う)は当技術分野で周知であり、有機
材料を凍結させ、その後、材料中の凍結水を固相から気相へ直接昇華させるのに十分な熱を加えながら周囲圧力を低下させる工程を含む。好ましくは、水分の再吸収を防止するために凍結乾燥製剤を次いでシールする。
【０１１９】
噴霧乾燥も当技術分野で周知であり、溶液、懸濁液またはエマルジョンを単一工程で固体粉末に変換する方法である。一般に、液体製品の濃縮物を霧化装置へポンプ送入し、そこで小滴に破砕する。これらの液滴は高温の空気流に遭遇し、それらはなお乾燥空気中に懸濁した状態できわめて急速にその水分を失う。この乾燥粉末をサイクロン内で湿った空気から遠心作用により分離する-密な粉末粒子はサイクロン壁の方へ押しやられ、一方で
より軽い湿った空気は排気パイプを通して除去される。
【０１２０】
風乾は、水分が低下するまで、または完全に除去されるまで、試料を空気に曝露することにより達成される。
噴霧凍結乾燥も当技術分野で周知であり、凍結乾燥と噴霧乾燥に一般的な処理工程を組み合わせた方法である。本発明による溶液に装入した（ポリ）ペプチドを凍結媒体（たとえば、液体窒素）中へ霧化させると、これにより衝撃凍結した液滴の分散物が生成する。この分散物を次いで凍結乾燥装置で乾燥させる。
【０１２１】
発泡乾燥は感受性の高い生物療法薬を乾燥状態で保存するためのスケーラブルな手法である。真空発泡乾燥(vacuum foam drying)（VFD）は、中等度の温度および圧力で安定な
療法用生体分子、たとえばエリスロポエチン、酵素およびワクチンを安定化するために使用できる。生物医薬の懸濁液または溶液を真空下で、凍結点より高い、ただし100℃より
有意に低い温度で煮沸することにより、泡に変換する。この泡は材料の薄膜からなり、これから水を高温で効果的に除去できる。この方法は、低温での真空蒸発の原理に基づく。
【０１２２】
この態様によれば、それまで乾燥状態または非晶質状態で、すなわち凍結乾燥または噴霧乾燥した組成物として貯蔵されていた（ポリ）ペプチドを、本発明方法により再構成で
きる。意外にも、本発明溶液の存在下では、（ポリ）ペプチドはそれぞれ活性およびそれらの構造統合性を失うことなくそれらの自然状態にリフォールディングしうることが示された。
【０１２３】
前記のように、乾燥タンパク質は温度ストレスに対してより抵抗性であるという利点をもたらし、したがってそれらはたとえば連続冷却鎖の欠ける条件下での貯蔵に際して特に安定になる。さらに、付随する実施例に示すように、乾燥タンパク質の自然の三次元構造を失うことなくそれを殺菌することができる。したがって本発明は、タンパク質をβ線、γ線またはX線照射による分解から保護しながら細菌および／またはウイルスの数を減ら
すためにタンパク質製剤を殺菌するのを可能にする。その結果、無菌条件下での療法用タンパク質の調製に伴なう時間およびコストが削減される。
【０１２４】
別途定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語は本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解しているものと同じ意味をもつ。矛盾する場合、定義を含めて本明細書が優位であろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
図面は下記のものを示す：
【図１】図1は、グリチルリチン酸、すなわち（3β,18α）-30-ヒドロキシ-11,30-ジオキソオレアン-12-エン-3-イル 2-O-β-D-グルコピラヌロノシル-β-D-グルコピラノシドウロン酸の式を示す。
【図２Ａ】図2は、広角X線回折パターンおよび広角X線粉末回折パターンを示す。（A）埋め込まれていない表面のX線回折パターン；用いたキャリヤー材料に関する4つの特徴的ピークを含む。
【図２Ｂ】図2は、広角X線回折パターンおよび広角X線粉末回折パターンを示す。（B）埋め込まれた表面；グリチルリチン酸を含まない（非晶質構造）。
【図２Ｃ】図2は、広角X線回折パターンおよび広角X線粉末回折パターンを示す。（C）埋め込まれた表面；グリチルリチン酸を含む（非晶質構造；埋め込まれていないキャリヤーの回折信号が埋め込みにより覆われている）。
【図２Ｄ】図2は、広角X線回折パターンおよび広角X線粉末回折パターンを示す。（D）埋め込んだ状態で凍結乾燥した抗体試料のX線粉末回折パターン。
【図３】図3は、示差走査熱量測定実験のサーモグラムを示す。（A）凍結溶液の示差走査熱量測定（DSC）；グリチルリチン酸を含まない埋め込み溶液（上の曲線）、グリチルリチン酸を含む埋め込み溶液（［2 mg／ml］、中間の曲線）、およびグリチルリチン酸を含む埋め込み溶液（［5 mg／ml］、下の曲線）；矢印で指示する2つのガラス転移点を示す（グリチルリチン酸はアミノ酸溶液の低い方のTg'をほぼ2.5℃低下させる）、（B）埋め込み溶液の存在下で凍結乾燥した抗体固体のDSC；β線照射有りと無し。埋め込み溶液を110 mg（上2つの曲線）および77 mg（下2つの曲線）の抗体と凍結乾燥前に混合し（1.2：1の比率で）、処理せずに放置し（上から1および3つ目の曲線）、あるいはβ線照射した（下から1および3つ目の曲線）後、DSC測定した。ガラス転移点を矢印で示す。
【図４】図4は、Si上における埋め込みのスペクトル反射分析を示す。（A）乾燥マンニトール-アルブミン混合物（結晶質）の顕微鏡写真、および（B）Si上のナノコーティング（非晶質）。（C）ナノメートル範囲のナノコーティングの代表的な“レインボー”効果。
【図５−１】図5は、機能化した開放多孔質ポリウレタンフォームのSAXSイメージを示す。IgM分子の自己相似性、およびフラクタル寸法に及ぼす影響は、この図の上部の幾何学的皺構造モデル(geometrically wrinkled structure model)により描くことができ、その際、フラクタル寸法D＝3は閉鎖物体について計算されている。物理的にIgMは完全に脱水され、フラクタル寸法Dの低下はモデルの開放を生じる。後者は完全開放IgMユニット（再水和したもの）により推測できる。さらに、異なる長さ目盛におけるIgM分子の自己相似性を、それの特徴的なY字様構造に基づいてYモデルに描く。D＝3については、IgGアームの平均寸法κは直径κpより小さい。D＝2については両半径が等しく、D＝1については方程式2κ＝κpを適用できる。IgG構造モデルを灰色ビーズモデルにより示す。緑色ビーズモデル：IgMをIgGサブユニットのペンタマーとして構築する。上側パネルにおいて、大きな赤色オープンサークルはバックグラウンド補正した散乱強度に対応する。破線は分析フォームファクター(form factor)を示す。黒線は、灰色のIgG構造モデルおよびそれらの平均力(mean force)に基づくSAXSデータの完全当てはめを示す。
【図５−２】図5は、機能化した開放多孔質ポリウレタンフォームのSAXSイメージを示す。下側パネルにおいて、連結した小さいオープンサークルは対応する平均力を示す。（A）乾燥試料＊PU-IgMFas、PU-IgMFas-NC、および＊PU-IgMFas-NC（アステリスクはβ線照射を示す）のバックグラウンド補正した散乱強度。PU-IgMFasに対するそれらのフォームファクターの相対変化△P（Q）を示す（それぞれ、小さな赤色、灰色および黒色のオープンサークル）。D＝3について、平均力は顕著な起伏を保持し、多数のkTとして示される；ここで、kはボルツマン定数であり、Tはシステム温度である。（B）試料PU-IgMFasを再水和した。この系のフラクタル寸法は2.5に低下した。対応する平均力の起伏は低下した。（C）＊PU-IgMFasの再水和試料は測定可能な信号がないため分析できず、これに対し＊PU-IgMFas-NC試料はフラクタル寸法1.5および対応する平均力の起伏の低下を示した。
【図６Ａ】図6は、埋め込み後のIgMFasエピトープ認識の保存をELISAにより示す。（A／B）β線照射後の漸増量の組換えヒトFas抗原フラグメント（hFas：：Fc）に対する固定化IgMFas（（A）CH-11；（B）LO-MM-3）の結合。
【図６Ｂ】図6は、埋め込み後のIgMFasエピトープ認識の保存をELISAにより示す。（A／B）β線照射後の漸増量の組換えヒトFas抗原フラグメント（hFas：：Fc）に対する固定化IgMFas（（A）CH-11；（B）LO-MM-3）の結合。
【図６Ｃ】図6は、埋め込み後のIgMFasエピトープ認識の保存をELISAにより示す。（C）β線照射および／または埋め込み後の漸増量のエピトープペプチドに対する固定化IgMFasの結合。KD決定のために、データを1：1ラングミュア結合モデルに当てはめた。
【図７Ａ】図7は、PU-IgMFasによるアポトーシス誘導を示す。PU（ポリウレタン）フォーム試料の顕微鏡（A）およびラスター電子顕微鏡（B）写真。アポトーシス誘導アッセイのために、PUフォーム試料を円筒形の切片（この場合：3 cm3）に切断した。開放多孔質PUフォームの細孔直径は約1.5〜2 mmであった。
【図７Ｂ】図7は、PU-IgMFasによるアポトーシス誘導を示す。PU（ポリウレタン）フォーム試料の顕微鏡（A）およびラスター電子顕微鏡（B）写真。アポトーシス誘導アッセイのために、PUフォーム試料を円筒形の切片（この場合：3 cm3）に切断した。開放多孔質PUフォームの細孔直径は約1.5〜2 mmであった。
【図７Ｃ】図7は、PU-IgMFasによるアポトーシス誘導を示す。（C）種々の濃度の抗Fas IgMを含有するPU-IgMFasが、Fas陽性およびFas陰性ジャーカットT細胞においてアポトーシス誘導に及ぼす効果。
【図７Ｄ】図7は、PU-IgMFasによるアポトーシス誘導を示す。（D／E）重篤な損傷を受けた患者の好中球におけるアポトーシスのエクスビボ検出：蛍光染色（（D）、核の凝縮）、ならびにヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリー（（E）、DNA鎖断片）によるもの。
【図７Ｅ】図7は、PU-IgMFasによるアポトーシス誘導を示す。（D／E）重篤な損傷を受けた患者の好中球におけるアポトーシスのエクスビボ検出：蛍光染色（（D）、核の凝縮）、ならびにヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリー（（E）、DNA鎖断片）によるもの。
【図８】図8は、アデノウイルス5型（Ad5）感染性アッセイを示す。（A／B）Ad5試料を25 kGy（A）および40 kGy（B）でβ線照射した；埋め込み有りと無し。照射前と後の感染性ウイルス粒子の力価を示す。（C／D）同じ設定で、IgM抗体を照射した。照射前と後の相対抗原結合能を示す。
【図９−１】図9は、埋め込み溶液の提唱された機序を示す。（A）特に乾燥に際しての、溶液中のアミノ酸の多数の官能基間の相互作用。（B）アミノ酸の塩基性官能基とグリチルリチン酸分子内のアニオン性カルボキシル基との相互作用；高い非晶質状態の形成を誘発。
【図９−２】図9は、埋め込み溶液の提唱された機序を示す。（C）乾燥状態および非晶質状態におけるタンパク質、アミノ酸、およびグリチルリチン酸の間の分子相互作用を安定化することによる、タンパク質と水分子（水和シェル）の間の安定化水素結合の逐次置換。
【図１０】図10：（A）SDS-PAGE；列1：OVA対照、列2：分解OVA、列3：（OVA＋本発明溶液）SD、列3：マーカー（Pageruler（商標））；（B）CDスペクトル；OVA対照、分解OVA、および（OVA＋本発明溶液）SD（タンパク質単独のスペクトル）。
【図１１】図11は、OVAに結合した際のANSの蛍光強度の増大を示す。
【図１２】図12は、ANSと結合した後のOVA対照および（OVA＋本発明溶液）SDの（タンパク質単独のスペクトル）蛍光強度を示す。
【図１３】図13は、療法用抗TNF-α抗体によるTNF-α結合を示す。タンパク質マイクロチップ（UNIchip（登録商標））で抗体結合を分析した。A）TNF-α結合（t0は再構成したばかりの抗体を表わす；t6は40℃で貯蔵した6週間後の再構成抗体を表わす）および蛍光強度信号損失の経時的なタイムコース。誤差バーは4スポットからの平均±SD（2つの独立したマイクロチップアッセイの代表的データ）を表わす。ウシ血清アルブミン（BSA）を陰性対照として用い、これはTNF-αに対して何ら結合活性を示さなかった。t0とt6の間で＊p＜0.05または＊＊p＜0.005。B）0日目と6週後の4スポット（20 fmolの抗原／スポット）について示した蛍光強度損失。明るい蛍光（左）と中等度の蛍光（右）を示す。
【図１４】図14は、療法用抗TNF-α抗体の安定化を示す。特異的抗原に対する凍結乾燥（SPS有りまたは無し）後の抗体結合強度値を、抗TNF-α抗体対照（液体貯蔵）と対比したものを示す。誤差バーは、20 fmol／スポットの濃度でプリントした4スポットからの平均±SD（2つの独立したマイクロチップアッセイの代表的データ）を表わす。＊はグループ“抗TNF-α抗体t6”に対してp＜0.05；＊＊はグループ“抗TNF-α抗体t0”に対してp＜0.005。
【図１５】図15は、マイクロチップへの抗体の特異的結合および非特異的的結合ならびに得られる信号強度の相異の模式図を示す。
【図１６】図16は、抗ErbB2-ELISAの確立と評価を示す。このアッセイは、ErbB2抗原をマイクロチッププレートにカップリングさせ、プレート上の遊離のタンパク質結合部位をブロッキング緩衝液でブロックし、抗ErbB2抗体をErbB2抗原に結合させ、検出抗体を結合させ、そしてアルカリホスファターゼ基質であるp-ニトロフェニルホスフェートを酵素変換することを含む。読出しは、結合した（機能性）抗ErbB2抗体の量を405 nmでモニターする、時間および濃度依存性の発色反応である。応答と増大する抗ErbB2抗体濃度との関係は連続的で再現性があることが立証された。実験間精度を、n＝10の独立した実験で、再構成したばかりの療法用抗ErbB2抗体を用いて調べた。抗ErbB2抗体濃度範囲5〜50 ng／mLについて、濃度応答関係の直線的依存性が適合度R2＝0.989およびごくわずかな標準偏差で認められた。
【図１７】図17は機能性ELISAデータを示す。種々の用量の再構成した凍結乾燥抗ErbB2抗体配合物（β線およびγ線の照射有りと無し）において計算した抗ErbB2抗体の結合活性（対照に対する％）の比較を示す。業者の元の配合物中に再構成したばかりの20 ng／mLの抗ErbB2抗体（対照）を基準（100％）として用いた。凍結乾燥および照射した後の抗ErbB2抗体の機能性をモニターする実験はすべて、再構成した20 ng／mLの抗ErbB2抗体について実施された。すべての実験を少なくとも3回行ない、データを平均±SDとして表わす。SigmaStat 3.0を用いて、マン-ホイットニーの順位和検定(Mann-Whitney Rank Sum Test)を用いる非パラメーター解析を実施した。p＜0.01で差を有意とみなした。計算した有意性をアステリスクで強調する。
【図１８Ａ】図18は、種々のプロトコルによる凍結乾燥および後続照射した後の抗ErbB2抗体の非還元性SDS-PAGEゲルを示す。
【図１８Ｂ】図18は、種々のプロトコルによる凍結乾燥および後続照射した後の抗ErbB2抗体の非還元性SDS-PAGEゲルを示す。
【図１８Ｃ】図18は、種々のプロトコルによる凍結乾燥および後続照射した後の抗ErbB2抗体の非還元性SDS-PAGEゲルを示す。検出バンドの分子量を判定するために各ゲル上で分子量標準品を分析した（マーカー）。配合物に関して、試料を各処理条件について下記の順に装填した：SPS、業者の元の配合物、およびPBS。処理条件は左から右へ、非照射、25 kGyのβ線照射、40 kGyのβ線照射、25 kGyのγ線照射、および40 kGyのγ線照射である。照射の対応する線量および種類について、室温（RT）と-80℃での照射の相異を示す。ゲル中の主バンドは約160 kDaの分子量の無傷IgG1抗体に対応する。SPS配合物を含まない照射試料において、これらのバンドの強度は、260 kDaを上回る共有結合凝集物に対応するバンドの強度が増大するのと同程度に低下する。すべての列における痕跡量の分解は、ゲルについての試料調製の結果であり、下記のバンド分子量に割り当てられる：110 kDa-重鎖二量体、80〜60 kDa-重鎖／軽鎖二量体、50 kDa-重鎖、30〜20 kDa-軽鎖。
【図１９】図19は、蛍光に基づくマイクロプレート凝集アッセイを示す。蛍光に基づく半定量ProteoStat（登録商標）凝集アッセイからの結果は、図19の非還元性SDS-PAGEのパターンを立証する。非照射試料では痕跡量の凝集物が測定されたにすぎない。すべての照射したSPS配合試料において、凝集のわずかな増加が検出されたにすぎない。凝集の傾向は下記の配合物の順序で増大する：SPS＜＜元の配合物＜PBS。凝集物の測定量は照射の線量および種類に依存し、照射温度と共に種々の程度で減少する。
【図２０】図20は、凍結乾燥および後続照射した後の療法用抗ErbB2抗体のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を示す。図19および20に示す半定量所見は、それぞれ再構成した非照射および照射試料のSEC分析を用いた凝集の定量によって確認された。分子量標準品との比較により、溶出ピークについて下記の割り当てがなされた：高分子量凝集物（四量体、三量体、二量体）は5.5〜8 mLで溶出した；溶出体積8.5 mLにおける主ピークは約160 kDaの分子量の無傷IgG単量体と推定され、10〜11 mの溶出体積で痕跡量の分解が検出される。AおよびB：SPS中、元の配合物中、およびPBS中に配合した療法用抗ErbB2抗体の、凍結乾燥、40 kGyでのγ線照射の後のクロマトグラムの比較。無傷IgGに対応する主ピークの強度は、SPS配合物を含まない試料において凝集ピークの強度が増大するのと同程度に低下する。この凝集増大は、図20Bのこの比較の拡大図では強調されている。
【図２１】図21は、フーリエ変換赤外分光分析による、凍結乾燥後の療法用抗ErbB2抗体の二次構造分析を示す。再構成したばかりの抗体対照と比較した乾燥試料の正規化FT-IR吸収スペクトル。
【図２２】図22は、種々の組成の保護溶液により96ウェルELISAプレートに吸着させたヒト抗IL6-IgG抗体の40 kGy β線照射に対する安定化を、対応する抗IL6-ELISAモデルにおいて抗原結合活性によりモニターしたものを、非処理対照に対するパーセントで表わす。7種類のアミノ酸（アミノ酸混合物1：Ala、Arg、Gly、Glu、Lys、His、Trp）または5種類のアミノ酸（それぞれ、アミノ酸混合物2：Ala、Arg、Gly、Glu、Lys、およびアミノ酸混合物3：Ala、Gly、Glu、His、Trp）を含む組成物を用いた。アミノ酸混合物にグリチルリチン酸を、特にジペプチドであるカルノシンおよび他のジペプチドと組み合わせて補充すると、照射仲介による機能損失が種々の程度に救済された。
【図２３】図23は、40 kGyのβ線照射に対する、本発明による種々の組成の保護溶液との組合わせを用いて乾燥させた組換え乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性の保持を示す。酵素の還元補因子NADHがNADH＋に酸化され、同時に基質ピルビン酸が乳酸に還元された際の吸収低下を340 nmでモニターすることにより、酵素活性を測光法で測定した。酵素活性を非処理対照に対するパーセントで表わす。7種類のアミノ酸（アミノ酸混合物1：Ala、Arg、Gly、Glu、Lys、His、Trp）または5種類のアミノ酸（アミノ酸混合物2：Ala、Arg、Gly、Glu、Lys）を含む組成物を用いた。アミノ酸混合物にグリチルリチン酸を、特にジペプチドであるカルノシンおよび他のジペプチドと組み合わせて補充すると、照射仲介による機能損失が種々の程度に救済された。
【図２４−１】図24は、凍結乾燥および40 kGyのβ線照射など種々のタイプのストレスに対する種々の組成の保護溶液を配合した不活化インフルエンザA H1N1スプリットワクチンの活性、すなわちそれぞれの血球凝集活性を示す。
【図２４−２】図24は、凍結乾燥および40 kGyのβ線照射など種々のタイプのストレスに対する種々の組成の保護溶液を配合した不活化インフルエンザA H1N1スプリットワクチンの活性、すなわちそれぞれの血球凝集活性を示す。インフルエンザA H1N1スプリットワクチンを、ジペプチドであるカルノシン、他のジペプチド、およびグリチルリチン酸をそれぞれ補充した7種類のアミノ酸（アミノ酸混合物1：Ala、Arg、Gly、Glu、Lys、His、Trp）または5種類のアミノ酸（それぞれ、アミノ酸混合物2：Ala、Arg、Gly、Glu、Lys、およびアミノ酸混合物3：Ala、Gly、Glu、His、Trp）を含有する本発明組成物中に再緩衝化した。
【発明を実施するための形態】
【０１２６】
実施例により本発明を説明する。
【実施例】
【０１２７】
実施例1：材料および方法
埋め込み溶液
種々のアミノ酸L-アラニン、L-アルギニン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-リジン1塩酸塩、およびL-トリプトファン-ならびに場合によりグリチルリチン酸-を原液濃度100 g／Lになるように混和することにより、保護用埋め込み溶液を調製した。タンパク質を特異的に保護するために用いた最終溶液（1〜25 g／L）の重量：重量（w／w）比は＞2：1であった。すべての成分が無毒性であった。アミノ酸は静脈内注入用として承認されている(Fong and Grimley)。グリチルリチン酸は慢性肝炎の治療に静脈内適用するために承認されており、それの安全性は幾つかの臨床試験で十分に記載されている。埋め込み溶液中にグリチルリチン酸を1〜10000μg／mLで使用できる。
【０１２８】
生物学的に機能化したPU表面の作製
開放多孔質医療用ポリウレタンフォーム（KCI、米国テキサス州サンアントニオ）を3 cm3の円筒形試料に切断し、4μg／mLの抗Fas IgM（クローンCH11）とのカップリングを1時間行なった。試料をリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で4回洗浄した後、非特異的反応部位をブロックした。試料をH2Oで洗浄し、25 mg／mLの埋め込み溶液で30分間の埋め込み工程および後続の少なくとも90分間の乾燥を実施した。25 kGyのβ線照射（BGS、ドイツ、ブルーフザル）で殺菌を実施した。
【０１２９】
X線回折
広角X線回折（XRD）を用いて、埋め込み溶液の乾燥層の形態を調べた。銅アノード（40
kV、30 mA、波長0.154 nm）およびシンチレーション計数計を備えたX線回折計XRD 3000 TT（ドイツ、ザイフェルト）を用いた。乾燥膜を試料キャリヤーに装入し、5°から45°
までの2θ角度範囲において0.05°2θのステップおよびステップ当たり2秒で分析した。
分析はCoriolis Pharma Service GmbH（ドイツ、ミューニッヒ）により実施された。
【０１３０】
示差走査熱量測定
Mettler Toledo 821e（ドイツ、ギーセン）での示差走査熱量測定（DSC）を用いて、最大限に凍結濃縮した液体配合物のガラス転移温度（Tg'）を測定した。Tg'試料を約10 K／分の冷却速度で-80℃まで冷却した。ベースラインの吸熱シフトの中間点をTg'として採用した。分析はCoriolis Pharma Service GmbH（ドイツ、ミューニッヒ）により実施された。
【０１３１】
スペクトル反射率
膜から光を反射させ、得られる反射スペクトルをある波長範囲にわたって分析すること
により、薄膜の特性を測定した（Filmetrics Inc.、ドイツ、ミューニッヒ）。膜の異な
る界面から反射した光は位相内または位相外の可能性があるので、これらの反射は光の波長ならびに膜の厚さおよび指数に応じて付加または減少する。その結果はその膜に特徴的な反射スペクトルの強度振動である。膜の厚さを測定するために、特定のソフトウェア（Filmetrics Inc.）を用いて、測定スペクトルに可能な限り一致する理論的反射スペクトルを計算した。このプロセスは、反射スペクトルがどのようにみえるはずであるかを公称積層膜(nominal film stack)に基づいて初期予測することから開始した。これには、異なる層の、および試料を含む支持体の、厚さおよび屈折率に関する情報が含まれていた。この理論的反射スペクトルを、次いで膜の特性により、測定スペクトルに対する最良適合が見出されるまで調整した。
【０１３２】
粘度測定
落球粘度計（モデルAMVn、Anton Paar、ドイツ、オストフィルデルン）を用いて、25℃、角度α＝60°で試料の粘度を測定した。AVMnは球が透明液体および不透明液体中を転がる時間を回転球原理に従って測定する。各測定は、10回の試験とそれに続く平均粘度計算からなっていた。この分析はCoriolis Pharma Service GmbH（ドイツ、ミューニッヒ）により実施された。
【０１３３】
小角X線散乱
すべての小角X線散乱（SAXS）実験を、回転アノードジェネレーター（Nanostar，BRUKER AXS）により放射されるCu Ka線で実施した。このシステムはピンホールカメラおよび面検出器（VANTEC 2000）を備えていた。試料をステージホルダーに固定した。SAXS強度パターンを試料-検出器距離109 cmで20分ないし6時間取得した。すべてのデータをバックグラウンド散乱に対して補正し、次いでラジアル平均して関数I（Q）を得た；ここで、Q＝（4π／λ）sinθは散乱ベクトルであり、2θは入射ビームと回折ビームの間の角度であり、λ＝0.1542 nmはX線の波長である。ヒトIgM（2RCJ）(Perkins et al.)の相同溶液構造を初期コンフィギュレーションとして選択し、そのSAXSにインハウスフィッティングコードを当てはめおよび適用した。MCアルゴリズムを用いて、それらの位置が相同モデルに関して2 nmのサイズ制限内にあるように制限してランダムに散乱を作製した。この相同モデルはこのようにSAXSデータによってリファインされたが、数値再構築操作の永久補正値(permanent corrective)として各工程後に用いられた。単量体および自己集合体に最終的に当てはめた散乱曲線が得られる。
【０１３４】
殺菌
Beta-Gamma Service（ドイツ、ブルーフザル）により25〜40 kGyのβ線照射を用いて殺菌を行なった。
【０１３５】
ISO 11137 VDmax(Paunel-Gorgulu, Logters, et al.)に従った無菌性評価に関して、主な問題点は埋め込みが細菌／真菌の増殖に好都合であるかどうかであった。ハウジングを無菌的にすすぎ、流体を無菌容器に採集することにより、サンプリングを実施した。試料を膜濾過した後、好気性細菌、真菌および胞子形成細菌のコロニー形成単位測定のために膜をCASO寒天平板へ移した。分析はMedical Device Services（MDS，ドイツ、ミューニッヒ）により実施された。
【０１３６】
ウイルス感染性アッセイ
感染性／不活性化試験のために、アデノウイルス5型、Adenoid 75株(American Type culture collection, ATCC-VR-5）をヒト肺癌細胞系A549（ATTC-CCL-185）で増殖させた。ウイルスの増殖のために、37℃および5％ CO2で、5％ウシ胎仔血清（FCS）を補充した最小必須培地（MEM）において細胞を増殖させた。終末点滴定（96ウェルのマイクロタイタープレートにおいて希釈液当たり8ウェル）により、ウェル当たり50μLのウイルス希釈液および50μLのA549細胞（10〜15×103細胞）を用いてウイルス力価を測定した。この実験には、力価1.1×109の組織培養感染用量(tissue culture infectious dose)（TCID50）／mLを用いた。具体的には、体積50μLのウイルス懸濁液を37℃で無菌ポリスチロールチューブの底において乾燥させた。次いでこの乾燥ウイルスに50μLの埋め込み溶液を乗せ、再び37℃で乾燥させた。25 kGyまたは40 kGyでのβ線照射の後（対照は照射しなかった）、ウイルス／保護溶液2層を1 mLのMEMに再懸濁した。上記に従ってウイルス力価を再び測定した。培養物を接種の7日後に細胞変性効果(cytopathic effect)（CPE）について観察した。ウイルス対照を同等に、ただしβ線照射せずに処理した。ウイルス力価を、標準偏差を含むTCID50／mLとして表わす。力価低下をβ線照射後のウイルス力価と対照ウイルス力価の差として表わす。
【０１３７】
機能特性分析
ELISA：開放多孔質ポリウレタンフォームの表面に固定化したIgMの量を目視定量するために、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）を開発した。検出抗体として西洋わ
さびペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲートしたヤギ-抗マウスIgM抗体を用いた。TMB（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン；Sigma）を基質反応に用いた。
【０１３８】
抗原結合：固定化した抗Fas IgMの特異的機能性についての情報を得るために、組換え
抗原を用いて実験を行なった。hFas：Fc発現プラスミド（ps299-hFasFc；Pascal Schneiderにより提供、スイス、ローザンヌ）を安定トランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣細胞から、HiTrap Protein Aカラム1工程精製を用いて標準法に従って組換えhFas：Fcタンパク質を精製した。FasL仲介によるRKO細胞（ヒト大腸癌細胞系）の細胞死の阻害、およびヨウ化プロピジウム染色による低倍数体DNA含有細胞のフローサイトメトリー定量(Nicoletti et al.)により、hFas：Fcの生物活性を調べた。
【０１３９】
ペプチド結合：ヒトFasのイソ型1のペプチドアレイ（アミノ酸1-177および並べ替えた
ペプチド；寄託no.P25445）を、Fmoc化学によって、セルロース膜上の活性PEGスペーサーにおいてMultiPep RS機器（Intavis、ドイツ、ケルン）での自動並行ペプチド合成により、先の記載に従って合成した(Brandt, Dietrich and Koch; Koch and Mahler)。抗体との相互作用試験を公開された方法に従って実施した(Hilpert, Winkler and Hancock; Koch and Mahler)。結合した抗体を化学発光イメージングにより視覚化した。N末端ビオチニル化をもつ選択した可溶性エピトープペプチドをDiana Imhof（Institute of Biochemistry, University of Jena, ドイツ）から得た。
【０１４０】
T細胞および好中球におけるアポトーシス誘導：臨床関連機能の評価のために、Fas陰性およびFas陽性T細胞（ジャーカット細胞系）ならびに外傷患者から単離したばかりの好中球(University of DuesseldorfのEthics Review Boardから試験承認を得た、ドイツ)を、PU-IgMFasで4時間攻撃した。その後、細胞を収穫し、細胞をヨウ化プロピジウムで染色することによりアポトーシスを測定した。フローサイトメトリーはNicolettiのプロトコル(Nicoletti et al.)に従った。
【０１４１】
統計
すべての実験を少なくとも5回行なった。関連がある場合、データを平均±SEMとして提示する。統計分析をスチューデントのt検定により実施した（GraphPad Prism Program，version 5，GraphPad Software，カリフォルニア州サンディエゴ）。0.05未満のp値を統計的に有意とみなした。
【０１４２】
実施例2：本発明溶液の物理的特性
糖類はそれらの溶解性および水素結合を形成するOH基のため一般に用いられるリオプロテクタントであるが、高濃度におけるそれらの急速な結晶化は明らかな欠点である(Y. Ha
n et al.)。初期モル比500：1（糖：タンパク質）であれば、この比は乾燥プロセスでさ
らに増大する。したがって、結晶化が起き、これにより糖分子の利用能が低下し、結果的にそれらが水素結合を提供する能力は低下する。本発明者らは、あるグリコシド系の植物代謝産物、たとえばグリチルリチン酸（図1）が適切なリオプロテクタントとして作用す
ることを見出した；これはおそらくグリコシドOH基の存在によるものであろう。
【０１４３】
糖類とは対照的に、療法用として承認されているサポニンであるグリチルリチン酸(Baltina)は結晶化せず、特にアミノ酸と組み合わせた際にはむしろ非晶質ゲル（ガラス質状態）を形成し(Fuchs et al.)、これによりタンパク質が完全に乾燥するまでOH基を水素結合の形成のために提供する。選択したアミノ酸と組み合わせたグリチルリチン酸を含むガラス質状態の本発明溶液が凍結および乾燥に際して望ましくない微結晶形成の防止を補助するかどうかを調べるために、幾つかの実験法に従った（後記を参照）。
【０１４４】
キャリヤー材料上で乾燥させた本発明溶液の膜の物理的性質を広角X線回折（XRD）により測定した（図2A〜C）。コートした表面のXRDパターンは、用いたキャリヤー材料に関する4つの特徴的なピークを示した（図2A）。グリチルリチン酸を含まない補助溶媒溶液に
よるこの材料のコーティングは同じXRDパターンを生じ、これは追加の結晶化ピークをも
たない非晶質構造を示唆する（図2B）。本発明による溶液にグリチルリチン酸を補充すると、より顕著な非晶質性になり、コートされたキャリヤーの回折信号との干渉を生じた（図2C）。さらに、本発明による溶液の存在下で凍結乾燥した抗体固体は、非結晶質固体に一般的なハロー粉末XRDパターンを示した（図2D）。ピークが存在しないのは、分析した試料が非晶質状態で存在していたことを示す。
【０１４５】
凍結した補助溶媒溶液の示差走査熱量測定（DSC）による分析により、凍結濃縮された
非氷相の2つの熱転移が明らかになった（Tg'：最大限に凍結濃縮された相のガラス転移）：アミノ酸に典型的な-60℃におけるTg1'および-49℃におけるTg2'。凍結した本発明溶液のサーモグラムには特徴的な結晶化事象はみられなかった（図3A）。さらに、本発明による溶液の存在下で凍結乾燥した抗体固体のDSCサーモグラムは、何ら結晶化の証拠がない非晶質固体と一致した（図3B）。
【０１４６】
本発明溶液が表面上で均一な薄膜を形成できるかどうかを調べるために、マンニトール（糖アルコール）-アルブミン混合物または本発明による溶液でコートしたシリコン上で
、スペクトル反射率分析を実施した（図4）。スペクトル反射率はマンニトール-アルブミン混合物中でのマンニトールの結晶化を示し（図4A）、これに対し本発明による溶液の存在下では均一な膜が形成された（図4B）。対応する振動曲線により、それぞれ結晶質および非晶質の層特性が確認された（データを示していない）。本発明による溶液の膜は1.15
mPa＊（水：0.89 mPa＊）の粘度、および観察された特徴的な“レインボー”効果（図4C）によれば低ナノメートル範囲の厚さを示した。
【０１４７】
測定された本発明による溶液の重要な物理的パラメーターに基づいて、本発明者らは本発明溶液が凍結乾燥に際してのタンパク質の安定化に適すると結論した-さしてさらに試
験した。
【０１４８】
実施例3：小角X線散乱（SAXS）によりモニターした本発明溶液による抗Fas IgMの構造
安定化
本発明による溶液に埋め込む目的は、たとえば貯蔵または殺菌操作に際してタンパク質の構造および機能統合性を保存することである。本発明溶液が乾燥後（図5A）、β線照射後および再水和後（図5BおよびC）のポリウレタン（PU）-IgMFasの三次元構造の統合性に及ぼす保護効果をSAXSにより分析した(Horejs, Gollner, et al.; Horejs, Pum, et al.)。
【０１４９】
乾燥および再水和した試料の測定したバックグラウンド補正-散乱コントラストI（Q）
は、逆格子空間(reciprocal space)Q［nm-1］にIgMの特徴的な空間配列を描いた（図5A〜C，上パネル，大きな赤色オープンサークル）。これらの曲線から固定化IgM構造体を再構築するために、IgMパラメーターを数学的に自己相似性でありしたがってフラクタルであるとみなした(Horejs, Gollner, et al.; Horejs, Pum, et al.)。種々の長さ尺度でのIgM分子の自己相似性は、特徴的なY字様構造に基づく（図5，Y字モデル）。
【０１５０】
本発明者らは、本発明溶液に埋め込んだ後（PU-IgMFas-NC）、照射した後（＊PU-IgMFas）、または埋め込みおよび後続照射した後（＊PU-IgMFas-NC）の構造変化を、乾燥した固定化IgM分子と比較して調べた。処理していない固定化PU-IgMFasの信号は、PU単独のバックグラウンド信号と比較した場合、解像下限にあった。したがって本発明者らは、乾燥PU-IgMFasの形態係数の相対変化△P（Q）を計算した（図5A，上パネル，赤色、灰色および黒色の小さいオープンサークル）。相対散乱コントラストはマイナスである。最大差は非処理PU-IgMFas試料をPU-IgMFas-NCと比較した際にみられた（図5A，上パネル，大きな赤色オープンサークル）。埋め込みにより散乱コントラストはζ＝3とζ＝15 nmの間の特徴的な距離で低下した。これらの距離はIgM分子の平均エクステンションに対応し、IgM分子が完全に埋め込まれたことの証拠を提供する。
【０１５１】
PU-IgMFas試料を＊PU-IgMFasと比較した際（図5A，上パネル，小さい灰色オープンサークル）、散乱コントラストにおける有意の低下が再びみられ、それはζ＝3とζ＝12 nmの間で検出できた。この結果は主に、照射がコンホメーション変化を引き起こし(Gianfreda
and Scarfi; Kapoor and Priyadarsini; Stadtman and Levine; Zbikowska, Nowak and Wachowicz)、あるいはタンパク質内の結合の破断をもたらし、したがって電子コントラストが低下するという事実を反映している可能性がある。PU-IgMFasを＊PU-IgMFas-NCと比
較すると、散乱コントラストの相対差はPU-IgMFasと＊PU-IgMFas試料の間にみられた差と比較して低かった（図5A，上パネル，小さい黒色オープンサークル）。
【０１５２】
適用した分析モデルに従い、測定した散乱プロフィールを当てはめて、乾燥した固定化IgM分子についてIgGアームの平均サイズκ≒4.0〜6.0 nmを得た（図5A，破線）。さらに
、初期コンフィギュレーションとしてのIgGユニットセルの既知の三次元構造（Protein Data Bank：2RCJ）(Perkins et al.)に基づいて、図5Aの灰色ビーズモデルにより表わされる乾燥した固定化IgM分子のIgGサブユニットを再構築することができた。さらにコンピューター操作により、五量体IgM分子内のIgGサブユニットの空間配列、特に2つの反対側IgGアームを繋ぐ環の寸法κp、続いてそれらの開口角θを決定した。フラクタル寸法Dは、5つのIgGアームを含む特定の開口角θ（図5）に関係する。乾燥したすべての系が共通のフラクタル寸法D＝3をもつ。本発明者らは、乾燥したすべての試料がIgGアームについてθ≒0.51°またはθ≒29.22°の共通のIgM超構造をもつと予測した。乾燥試料＊PU-IgMFas、PU-IgMFas-NC、および＊PU-IgMFas-NCの予測IgM構造モデルを図5Aに緑色ビーズモデルにより示す。
【０１５３】
補足方法を用いて全SAXS信号を再構築するために、IgGアーム間の平均力を測定した。
これらを図5Aの下部に示す（連結した小さいオープンサークル）。平均力の起伏が高いことは、安定化してはいるが圧壊したタンパク質構造の指標となる。本発明者らはこの高い起伏をすべての乾燥試料における水和シェルの欠如と関係づけた。
【０１５４】
本発明溶液に埋め込んだ試料または埋め込まない試料を再水和して水和シェルを再構築した後、すべての試料の散乱コントラストは乾燥試料と比較してプラスであった。再水和PU-IgMFasの場合はフラクタル寸法がD＝2.5に低下し、これに対し＊PU-IgMFasについては測定可能な信号が得られなかった。この所見は、本発明溶液を用いないIgM分子が照射に
より破壊されたこと、およびPU-IgMFasの再水和の結果として水和シェルの再付加により
起きた角度θの増大を含む部分的に開放されたIgM超構造が生じたことの指標となる。対
応する平均力の起伏は低下し（図5Bの下部）、これはIgGアーム相互牽引がより少ないこ
とを示唆し、これはIgM超構造の部分的開放コンフィギュレーションと一致する。
【０１５５】
IgM超構造の開放、したがってリフォールディングは、＊PU-IgMFas-NC試料を再水和し
た場合はよりいっそう良好であった。IgGアームの構造モデルを計算した（図5Cの灰色ビ
ーズモデル）。フラクタル寸法がD＝1.5に低下するのに伴なって角度θは増大すると予想できる。本発明者らは埋め込みはタンパク質の再水和に好都合であると予測した。構造モデルと開放角θを組み合わせると、IgM分子についてかなり開放した構造モデルを再構築
できる。これを緑色ビーズモデルにより図5Cに示す。この場合も平均力を計算し、図5（
下部）に示した他の例より起伏が低いことを見出した。
【０１５６】
これらの結果は、乾燥後にタンパク質は本発明溶液により形成されたシェルに埋め込まれること、および三次元タンパク質構造が維持され、再構築後のリフォールディングが改善されることを示す。
【０１５７】
実施例4：固定化した抗Fas IgMの抗原結合の機能評価
次に、本発明溶液中への埋め込みによりIgMFasの機能性を保存できるかどうかを調べた。そのために、IgMFasをELISAプレートに固定化し、本発明溶液への埋め込みおよび／またはβ線照射を伴なう状態と伴わない状態で、高特異性組換えヒトFas抗原フラグメント（hFas：：Fc）の結合を証明した(Schneider et al.)。
【０１５８】
図6A／Bに示すように、hFas：：FcはIgMFasによって濃度依存性で認識された。保護し
ない状態では、＞25 kGyのβ線照射は抗原結合能の完全喪失によって立証されるようにIgMFasの機能損傷をもたらした。これと対照的に、本発明溶液中への埋め込みはIgMFasの抗原結合性に影響を及ぼさず、IgMFasを広範な濃度にわたって照射仲介損傷から保護した。IgMFasパラトープの機能統合性を分子レベルで調べるために、ペプチドアレイスクリーニングにより同定されたN末端ビオチニル化エピトープペプチド(ビオチン-RCKPNFFCNSTVCEHCDP-NH2)を用いた。IgMFasをELISAプレートに固定化し（β線照射および／または埋め込みを伴なう状態と伴わない状態）、漸増量のエピトープペプチドを用い、続いてこれをストレプトアビジンHRPコンジュゲートアッセイにより検出して証明した（図6C）。参考のために、埋め込みおよびβ線照射を伴なわないエピトープペプチドに対するIgMFasのKDは160±13 nMと測定された（データを示していない）。図6Cに示すように、β線照射はエピトープペプチドに対するIgMFasの親和性を劇的に低下させ（KD＝855±129 nM）、これは著しい照射誘発損傷を立証する。これと対照的に、β線照射の前に埋め込みを行なうと抗体パラトープの統合性は完全に維持され、これはエピトープペプチドに対するIgMFasのKDが保存されたことにより立証される（188±25 nM）。
【０１５９】
これらの結果により、本発明溶液がタンパク質の三次元構造を保存し、したがって乾燥および照射などのストレス条件下に置かれた場合ですらそれらの機能が維持されることが確認される。
【０１６０】
実施例5：PU-IgMFas-NCのアゴニスト的生物活性の機能評価
生物活性の維持をさらに調べるために、PU-IgMFas-NCがアポトーシスを誘導する能力(Logters et al.; Paunel-Gorgulu, Logters, et al.; Paunel-Gorgulu, Zornig, et al.; Scholz et al.)、およびFas感受性細胞を不活性化する能力(Zamzami and Kroemer)をインビトロで試験した。PU-IgMFas-NCによるアポトーシス誘導が受容体特異的であることを証明するために、Fas陽性およびFas陰性ジャーカットT細胞を標的として用いた。図7Cに示すように、アポトーシス誘導はPU-IgMFas-NCと共にインキュベートした後のFas陽性細胞においてのみ起きた。さらに、臨床関連設定でのPU-IgMFas-NCの潜在的な療法有効性を確認するために、重篤な障害をもつ外傷患者から得た高度に活性化したFas発現好中球(Paunel-Gorgulu, Zornig, et al.)(傷害重症度スコア＞16）を用いて、患者の好中球におけるPU-IgMFas-NC仲介アポトーシスを確認した。具体的には、核染色（図7D）およびフローサイトメトリー（図7E）により立証されるように、これらの好中球をエクスビボにおいてPU-IgMFas-NCで4時間攻撃した後、好中球核のアポトーシス関連凝集(Zamzami and Kroemer)がPU-IgMFas-NC処理細胞にみられたが、非処理細胞にはみられなかった。
【０１６１】
これらの結果は、本発明溶液がタンパク質の三次元構造を保存し、したがって乾燥および照射などのストレス条件下に置かれた場合ですらそれらの機能が維持されるという証拠をさらに提供する。
【０１６２】
実施例6：殺菌はポリペプチドの機能性を維持した状態で汚染を低減する
本発明溶液中へのポリペプチド埋め込みが、ポリペプチド製剤を汚染している可能性のある細菌またはウイルスを殺菌プロセスで不都合に保護する可能性があるかどうかを調べるために、機能化した埋め込みポリウレタンフォームの生物汚染度を測定した。PU-IgMFas-NCを収容した6つの異なるロットのそれぞれ＞70のプラスチックハウジングを、体外免疫調節に使用する予定で製造した。各ロットからの10の非殺菌PU-IgMFas-NC試料を基準として測定した。平均した生物汚染度は、モジュール当たり151±18個の細菌／真菌であった。≧25 kGyのβ線照射により殺菌を実施し、殺菌性の評価をISO 11137 VDmax(Paunel-Gorgulu, Logters, et al.)法に従って実施した。基準線量（8.5±0.8 kGy）で照射した60すべてのPU-IgMFas-NCモジュールが無菌であることが認められ、これによりNCを伴なう殺菌の有効性が確認された。
【０１６３】
さらに、化学的殺菌剤のウイルス致死効果を試験するための基準ウイルスであるヒトアデノウイルス5型（Ad5）を用いて、ウイルス不活性化試験を実施した(Kim et al.; Sauerbrei et al.)。具体的には、50μLのウイルス懸濁液を37℃において無菌ポリスチロールチューブの底で乾燥させた。次いでこの乾燥ウイルスに50μLの本発明溶液を乗せ、再び37℃で乾燥させた。25 kGyまたは40 kGyでβ線照射した後（対照は照射しなかった）、ウイルス／保護溶液の2層を1 mLのMEMに再懸濁し、終末点滴定法により感染性ウイルスの力価を測定した（図8A／B）。並行して、IgMについて同じ実験設定を用いた（LO-MM-3；図8C／D）。
【０１６４】
図8に示すように、β線照射はAd5の定量的不活性化をもたらした（25 kGyで≧99.9％の低下，40 kGyで≧99.999％の低下；図8A／B）が、IgM抗体の機能性は維持された。これらの結果は、本発明溶液がタンパク質の構造を選択的に安定化するが、照射誘導によるウイルス複製損傷を阻害しないことを立証する。したがって、本発明溶液中への埋め込みは製造プロセスでのウイルス汚染のリスクを生じない。
【０１６５】
実施例7：本発明溶液の活性の機能モデル
理論により拘束されたくはないが、本発明の発明者らは、図9に示すように、小分子間
、たとえばアミノ酸間（図9A）、アミノ酸とグリチルリチン酸の間（図9B）、およびアミノ酸／グリチルリチン酸とタンパク質構造体の間（図9C）の相互作用が本発明溶液の活性を仲介するという仮説を立てた。このモデルにおいて、グリチルリチン酸はタンパク質（イオン性相互作用および水素結合により）および小分子（たとえばアミノ酸と、グリコシド部分の3つのカルボキシル基およびアグリコンにより）の両方と相互作用する。優先排除の概念によれば、グリチルリチン酸は非荷電分子と一緒に、水の存在下で水溶液の表面張力を高めることにより、タンパク質の周囲の水和シェルの浸透溶解(osmolytic)安定化を支持することができる。この例では、種々のアミノ酸の間、およびアミノ酸とグリチルリチン酸の間の相互作用が、本発明溶液の強い非晶質性をもたらす。さらに、乾燥に際して、タンパク質はグリチルリチン酸および荷電アミノ酸と相互結合し、それが水分子を置換し、一方で優先結合の概念に従って水素結合によりタンパク質と相互作用する（図9C）。非晶質性は、特定の成分の抗酸化、ラジカル捕捉、および金属キレート化の特性との組合わせで、タンパク質の周囲のシェルの保護効果を支持することができる。
【０１６６】
実施例8：噴霧乾燥に際してのタンパク質の安定化
噴霧乾燥に際してタンパク質を安定化するための本発明溶液の有用性を確認するために、オボアルブミン（OVA）をモデルタンパク質として用い、本発明溶液と共に噴霧乾燥した。乾燥粉末を、次いで円偏光二色性（CD）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）および蛍光分光分析により、統合性について特性分析した。
【０１６７】
材料および方法
オボアルブミンはSigma（米国ミズーリ州セントルイス）から購入された。本発明溶液
は前記のものであった（埋め込み溶液を参照）。1-アニリノ-8-ナフタレンスルホネート
（ANS）もSigma（米国ミズーリ州セントルイス）から購入された。他のすべての試薬は分析グレードのものであった。
【０１６８】
噴霧乾燥タンパク質の調製
3％（w／v）のオボアルブミンを6％（w／v）の本発明溶液と共にBuechi B-290実験室用噴霧乾燥機（Buechi，スイス、フラヴィル)により噴霧乾燥した。入口空気温度を120℃に設定し、空気流は470 L／時であり、ポンプ速度は7.5 ml／分であり、出口空気温度は50
〜55℃であった。
【０１６９】
SDS-PAGE
SDS-PAGEをBio-Red Mini-Protean 3ゲル電気泳動システム（Bio-Red Laboratories，米国ハーキュレス）により実施した。10μlのタンパク質試料（0.5 mg／ml）を10μlの試料緩衝液と共にインキュベート（95℃，5分）した後に各ウェルに装入し、200 Vの電圧で約55分間の電気泳動を行なった。タンパク質をクーマシーブルー染色により視覚化した。
【０１７０】
円偏光二色性（CD）
Jasco J-715分光偏光計（ジャスコインタナショナル株式会社，日本、日立市）を用い
て、噴霧乾燥の前と後のタンパク質の二次構造を評価した。CDスペクトルを、遠UV範囲（200〜250 nm）領域においてサンプリング間隔1.0 nmで0.05 cmの路程のキュベット内で記録した。本発明溶液はCDにおいて若干の信号をもつので、それを限外濾過装置（Vivaspin 6，Sartorius Stedim biotechから，ドイツ、ゲッチンゲン）によりタンパク質から分離した。すべてのスペクトルは2つのスキャンの平均であり、バックグラウンド補正および正規化された。スペクトルを次いで純粋な／非処理タンパク質のものと比較した。
【０１７１】
蛍光分光分析
蛍光分光計（LS55，PerkinElmerから，米国ウォルサム）で1 cmの路程のキュベットを
用いて蛍光スペクトルを記録した。ANSを360 nmで励起することによりその固有蛍光を測
定し、390〜550 nmの範囲で発光スペクトルを記録した。蛍光スペクトルを溶媒のバック
グラウンドスペクトルに対して補正した。
【０１７２】
結果
OVA対照、および本発明溶液と共に噴霧乾燥したOVAの、SDS-PAGE分析を図10（A）に示
す。両試料に同じゲルパターンがみられ、低分子量バンドはみられなかった；これは、噴霧乾燥に際してOVA分子の分解が起きなかったことを示す。
【０１７３】
さらに、図10（B）に示すように、本発明溶液と共に噴霧乾燥したOVAのCDスペクトルは
OVA対照に類似し、これは再分散後に二次構造の変化がみられなかったことの指標となる
。
【０１７４】
1-アニリノ-8-ナフタレンスルホネート（ANS）は水中で実質的に非蛍光性であるが、タンパク質上に存在する疎水性部位に結合すると蛍光を示す。したがって、この蛍光はタンパク質が変性すると大幅に増大するので、変性度の尺度として役立つ（図11）。この現象を利用して噴霧乾燥後のOVAの統合性を解明した。図12にみられるように、対照OVAおよび本発明溶液と共に噴霧乾燥したOVAは同じ蛍光強度をもち、これは噴霧乾燥に際して変性
事象が起きなかったことの指標となる。
【０１７５】
結論として、一組の異なる手法により確認されたように、本発明溶液はオボアルブミンの噴霧乾燥に際してタンパク質の構造を保存するのに適している。
実施例9：凍結乾燥および40℃で6週間の貯蔵後のタンパク質の安定化
本発明の安定化および保護用の溶液(Stabilizing and Protecting Solution)（SPS）が療法用抗TNF-α抗体に及ぼす影響を判定するために、タンパク質マイクロアレイを簡便かつ迅速なツールとして採用した。UNIchip（登録商標）高密度タンパク質マイクロアレイ
は、抗体結合プロフィールの定量分析および特性分析のために設計されている(Feyen et al. 2008; Lueking et al. 2008; Lueking et al. 2005)。UNIchip（登録商標）マイクロアレイは384の前決定およびHisタグ精製した組換えヒトタンパク質をニトロセルロースコートしたスライドガラス上に含む。膜タンパク質、細胞内および細胞外タンパク質のセットを入手できる。抗体結合プロフィールのスクリーニングは、たとえば療法用抗体の特異性を解明するために、抗体の交差反応性による副作用を避けるために、または患者の血中の自己免疫抗体を検出するために、重要なツールである。
【０１７６】
9.1  材料および方法
UNIchip（登録商標）タンパク質マイクロアレイ
タンパク質マイクロアレイはProtagenにより、ニトロセルロースコートしたスライド上に作製された（UNIchip（登録商標）AV-400 Premium，ロット0421104；Protagen，ドイツ、ドルトムント）。各マイクロアレイには、種々の遺伝子オントロジークラスのものである384の異なる組換えヒトタンパク質がプリントされていた。さらに、19のヒト血清タンパク質および10の対照タンパク質がUNIchip（登録商標）AV-400マイクロアレイの内容に含まれる。これらのタンパク質は大腸菌タンパク質発現ライブラリーに由来し、先に公表されたようにHisタグを用いて精製された(Feyen et al. 2008)。それぞれの組換えヒトタンパク質はバイオチップ上に平均量20 fmol／スポットで四重にプリントされていた。さらに、抗体産生のための宿主として一般に用いられる種々の種に由来するIgGが、二次抗体による免疫検出のためのプロセス対照として種々の濃度でプリントされていた。このタンパク質バイオチップには、天然TNF-α（Sigma，ミズーリ州セントルイス）系列希釈液も下記の濃度でプリントされていた：10、8、6、4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.025、0.01、0.001、0.0005、0.0001 pmol／μl。これは、それぞれスポット当たり20、16、12、8、4、2、1、0.4、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.002 fmolのTNF-αに相当する。
【０１７７】
UNIchip（登録商標）AV-400におけるインキュベーション条件
別途指示しない限り、療法用抗TNF-α抗体を各実験につき2つのタンパク質バイオチッ
プ上でインキュベートした。先に決定された最適作業濃度2.5 mg／mlを用いた(Feyen et al. 2008)。
【０１７８】
タンパク質マイクロアレイを2％（w／v）ウシ血清アルブミン（BSA／TBST，0.1％［v／v］Tween 20）中、室温で1時間ブロックした。抗体を2％（w／v）BSA／TBSTに添加し、加湿雰囲気で16時間インキュベートした。3回のTBST洗浄、続いて二次抗体（ヤギ-抗ヒトIgG-Cy3（Dianova，ドイツ、ハンブルク）0.002 mg／mlと共に室温で1時間、2％（w／v）BSA／TBST中におけるインキュベーションの後、タンパク質マイクロアレイをTBST中で3回洗浄した。すべての抗体インキュベーション段階を200μlの体積で自動ハイブリダイゼーションステーション（Tecan HS 4800 Pro；Tecan，ドイツ、クライルスハイム）において実施した。結果の読出しを共焦点マイクロアレイリーダー（ScanArray 4000，Perkin Elmer Life Science；カリフォルニア州サンノゼ）により、すべてのタンパク質マイクロアレイにつき同一設定を用いて実施した。
【０１７９】
試料調製
下記の試料を調製した：
a）  5 mgの療法用抗TNF-α抗体を本発明のSPS溶液（7種類のアミノ酸の混合物；Arg，Ala，Gly，Lys，Glu，His，Trp，pH5.2〜7.5）で再緩衝化したもの；
b）  5 mgの療法用抗TNF-α抗体をSPS無しで再緩衝化したもの；
各調製物をバイアルに1.25 mgで小分けし、凍結乾燥した。試料に高温および時間のス
トレスを付与した。再構成した後、試料をUNIchip（登録商標）AV-400により分析した。
対照として、療法用抗TNF-α抗体を製造業者の指示に従って再構成し、溶解状態で高温（40℃）および時間（6週間；t6）のストレスを付与した。
【０１８０】
緩衝液
緩衝液を標準プロトコルに従って調製した。TBS緩衝液：10 mM Tris-HCl，pH7.5（Merck，ドイツ、ダルムシュタット），150 mM NaCl（Diagonal，ドイツ、ミュンスター）。ブロッキング緩衝液：10 mM Tris-HCl，pH7.5（Merck），150 mM NaCl（Diagonal），2％ BSA（Sigma）。TBS-T緩衝液：20 mM Tris-HCl，pH7.5（Merck），0.5 M NaCl（Diagonal），0.1％（v／v）Tween 20（Sigma）。
【０１８１】
イメージおよびデータの解析
イメージ解析をGenePix Pro 6.0（Molecular Devices，ドイツ、イスマニング）により実施した。
【０１８２】
各タンパク質スポットについてバックグラウンド差引き後に平均強度を決定した。バックグラウンド差引きのために中央バックグラウンド蛍光強度を用いた。
オフターゲット活性（OTA）を報告するために、各タンパク質の4つのタンパク質スポットの中央強度を決定した（四重試験）。
【０１８３】
1抗体についてのすべての実験に基づいて、それぞれのタンパク質またはタンパク質濃
度の中央強度の平均を、対応するIgGプロセス対照（たとえば、宿主IgGタンパク質のスポットへの二次抗体の結合から得られる蛍光強度）を用いて正規化した。下記の計算を正規化に用いた：抗原の信号／IgGプロセス対照の平均信号×100＝X単位。
【０１８４】
プリントされた系列抗原希釈液への結合を判定するために、試験した各濃度の4つのタ
ンパク質スポットの平均±SDを用いた（四重試験）。データグループ間の統計的有意性を判定するために、スチューデントのt検定を用いた。pが＜0.05である場合にデータグループ間の差を統計的に有意とみなした。
【０１８５】
9.2  低下した抗体機能の定量
マイクロチップ上にスポットすべき最適な抗原（TNF-α）濃度を決定するために、種々の量の標的抗原（範囲，0〜20 fmol／スポット）をプリントした。結合試験のために、療法用抗TNF-α抗体をマイクロチップに2.5 mg／mlの濃度で、再構築したばかり（t0）または6週間貯蔵後（t6）のいずれかの状態で添加した。蛍光信号強度により示される結合親
和性を経時的に測定した（図13）。図13Aに示すように、40℃で6週間貯蔵した後の抗TNF-α抗体の機能損失が濃度12、16および20 fmol／スポットでみられた（p＜0.05）が、0〜8
fmol／スポットの範囲の抗体濃度ではみられなかった。たとえば、20 fmol／スポットを用いた場合、時点t0での正規化した信号強度単位は700〜800の範囲であり、これに対し6
週間後には信号強度の低下（450単位）がみられた。経時的な蛍光強度損失を定性的に図13Bに示す。
【０１８６】
これらの結果は、20 fmolの抗原／スポットが以後の実験に適切であること、および抗
体機能の損失をモニターできる信号強度の範囲は安定化用配合物を試験するのに十分であることを示す。したがって、以下の実験においては抗原濃度20 fmol／スポットおよび2.5
mg／mlの療法用抗TNF-α抗体を標準として用いた。
【０１８７】
9.3  SPSによる抗体結合強度の保存
抗体の安定化における本発明溶液（SPS）の有効性を評価するために、療法用抗TNF-α
抗体をSPS中または製造業者が推奨する緩衝液中に再緩衝化し、凍結乾燥した。凍結乾燥
した後、試料を高温で貯蔵し、0日目（t0）および40℃で6週間貯蔵後（t6）の指示した時点で水中に再構築し、マイクロアレイ試験に用いた。両配合物の機能活性を、t0において製造業者の元の緩衝液中に新たに再構成して流体配合物として貯蔵した抗体（対照）と比較した。t0およびt6で再構成した直後、SPSを用いずに凍結乾燥した調製物は最大779／889（正規化した信号強度；対照の108／123％）のより高い信号強度で反応した。再構成した抗体のt6調製物（凍結乾燥していないもの）は、低下した信号強度を示した（456単位；63％）。これと対照的に、図14に示すように、SPSを含む配合物は時点t6でさらに増大した信号強度（138％）を示した。
【０１８８】
これらの結果により、特異的抗原に対する抗体結合強度を保存するSPSの安定化効果が
確認される。
9.4  結合特異性-オフターゲット活性（OTA）の数
SPS配合した療法用抗TNF-α抗体が非特異的的結合プロフィールを示すかどうかを調べ
るために、無関係なタンパク質に対する親和性をOTA数の計数により定量した。
【０１８９】
元の再緩衝化した療法用抗TNF-α抗体（対照）と、SPSを用いずに再緩衝化した後に凍
結乾燥した試料の比較により、凍結乾燥段階で有意数の高いOTAが生じたことが示される
（表1）。しかし、SPS配合した試料のOTA数は、製造業者の推奨に従った配合物（t0で212のOTA；t6で286のOTA）と比較して、両方の時点t0およびt6で低下した（それぞれ36およ
び150のOTA）。
【０１９０】
したがって、上記に示すように、SPS仲介による結合強度の保存は抗原特異性が大きく
、OTAにより表わされる非特異的的結合の結果ではない。
【０１９１】
【表１】
2019052169.tif 000003
【０１９２】
9.5  OTA信号強度値の決定
OTA数の評価のほかに、抗体結合プロフィールを解明する際の重要な観点としての非特
異的的結合強度を定量した（概要については図15を参照）。
【０１９３】
オフターゲット活性（OTA）をプロセス対照（ヒトIgG；250μg／ml）に対して正規化した。そのまま溶解した療法用抗TNF-α抗体調製物（対照）は、時点t0で6％のきわめて低
い平均OTA信号強度値をもつ212に及ぶOTAを示した（表1）。対照の平均OTA値プラスこの
平均の標準偏差の2倍を採用することにより、20％の有意性閾値を任意に決定した。詳細
には、わずか14のOTAが有意性閾値より高く、これは大部分のOTAが有意ではないとみなされたことを示す。T6の時点で、OTA数は10％の平均OTA値へのわずかな増大を伴なって286
にまで増加した。SPS配合した抗体はt0でわずか36のOTAを示した。しかし、平均信号強度は23％であり、したがって対照により得られたものよりわずかに高かった。さらに、15のOTAが信号強度値20％より高く、これには約50％の範囲のより高い値をもつOTAが含まれていた。ストレス条件下で、OTA数は150 OTAに増加し、これには20％より高い信号強度値を伴なう76のOTAが含まれていた（示していない）。全体として、これは平均信号強度値45
％となった（表1）。
【０１９４】
SPSを用いずに再構成した抗体調製物は、凍結乾燥後にT0で94に及ぶOTAを示した。得られた信号強度値は41％であった。より詳細には、51のOTAが信号強度値＞50％をもってい
た。ストレス条件下で、OTA数は135 OTAにまで増加し、平均信号強度83％を伴なっていた。
【０１９５】
全体として、これらの結果はSPS配合物がより少ないOTAの療法用抗TNF-α抗体をもたらしたことを示す。
したがって、この例はSPS法による保護下でそれぞれのコグネイト抗原TNF-αの抗体認
識が改善されたことを示す。一方で凍結乾燥は特異的抗原への結合活性を改善し、他方で凍結乾燥後のOTAは有意に増加した；これに対し、SPSを配合した抗体は製造業者の推奨に従って配合した抗体と比較してより低いOTAを生じた。これらの結果は、SPS配合して凍結乾燥した療法用抗TNF-α抗体を再構成したものが、元の配合物を用いて同じ処理を行なった療法用抗TNF-α抗体と比較して、再構成後に有意に低いオフターゲット活性（OTA）を
誘発し、40℃で6週間の貯蔵後ですら結合強度を保存していることを示す。結論として、
保存された抗体機能性により示されるように、SPSのタンパク質安定化効果を確認できた
。
【０１９６】
実施例10：照射したIgG1抗体に対するSPSの安定化効果
療法用抗ErbB2ヒト化IgG1抗体をモデル抗体として用いて、照射仲介によるタンパク質
損傷を防止するための本発明の安定化および保護用の溶液（SPS）の有効性を調べた。
【０１９７】
10.1  材料および方法
ELISA
固定化した組換えErbB2抗原（Sino Biological Inc.，中国、北京）を用いたELISAアッセイを確立し、可溶性抗ErbB2抗体抗体（Roche Pharma AG，ドイツ、グレンザッハ-ワイ
レン）の抗原特異的結合を定量評価した。ErbB2抗原をマイクロタイタープレートにカッ
プリングさせた後、FCSおよびTween 20（Sigma-Aldrich，ドイツ、ミューニッヒ）を含有するブロッキング緩衝液を用いて遊離のタンパク質結合部位をブロックした。抗ErbB2抗
体を添加した後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼコンジュゲートした二次抗体（Dianova，ドイツ、ハンブルク）を添加した。ErbB2への抗ErbB2抗体の特異的結合を
、測光法でアルカリホスファターゼ基質p-ニトロフェニルホスフェートの酵素変換により405 nmで検出した。時間および濃度に依存する発色反応により、機能性抗ErbB2抗体を定
量できる。
【０１９８】
ELISAは、405 nmで抗ErbB2抗体の濃度範囲5〜50 ng／mLについて直線的な用量応答曲線を示す。直線回帰を適用して、直線方程式をデータ点に当てはめた。市販の抗ErbB2抗体
配合物を照射実験に際して陽性対照として用いた。
【０１９９】
凍結乾燥および照射した後の抗ErbB2抗体の機能性をモニターするすべての実験を、再
構成したハーセプチン(Herceptin)（20 ng／mL）について実施した。
フーリエ変換赤外分光分析FT-IR
抗ErbB2抗体の二次構造を、水銀-カドミウム-テルル化物(mercury-cadmium-telluride)（MCT）検出器、ダイヤモンド-ATR-ユニットDuraSampI／RII（商標）（SensIR）およびOPUS 65ソフトウェア（Bruker Optics）を備えた、FT-IR分光計Equinox 55（Bruker Optics GmbH，ドイツ、エットリンゲン）により分析した。各スペクトルについて、240スキャンの蓄積を4 cm-1の解像度で4000から400 cm-1まで収集した。各実験の前に、対応する緩衝液および賦形剤溶液について基準スペクトルを記録して、バックグラウンド効果に対して補正した。二次派生スペクトルをOPUS-65ソフトウェアで計算し、最終タンパク質スペクトルを13点関数で調整した(smoothed)。
【０２００】
電気泳動
非還元SDS-PAGEを用いて抗体配合物の凝集および断片化をモニターした。Novex XCell II Mini細胞系およびNovex NuPAGEビスTrisゲル（4〜12％）を用い；10ウェル、厚さ1 mm（Invitrogen，ドイツ、ダルムシュタット）、NuPAGE MOPS泳動緩衝液で分析を実施した
。再構成した凍結乾燥物を最終濃度0.4 mg／mLになるようにLDS試料緩衝液（Invitrogen
）中に希釈した。試料を95℃で10分間変性させ、次いで10μLの試料をゲルのウェルに装
填した。タンパク質の適用量は4μg／ウェルであった。一定の電圧200 Vで分離を行ない
、泳動時間は約90分間であった。
【０２０１】
ゲルをクーマシーブリリアントブルーR250染色および脱染色溶液（BioRad，米国カリフォルニア州ハーキュレス）で染色した。分子量標準品を各ゲル上で分析して、検出したバンドの分子量を決定した（Novex Sharp Pre-Stained Standard，Invitrogen）。
【０２０２】
ProteoStat（登録商標）タンパク質凝集アッセイ
マイクロプレート凝集アッセイ（ProteoStat（登録商標）；Enzo Life Sciences，米国
ニューヨーク州ファーミンデール）を製造業者の推奨に従って実施した。簡単に述べると、試料を凝集アッセイ用に周囲温度でアッセイ緩衝液中に調製した。タンパク質凝集のモニタリングおよび検出のためのProteoStat（登録商標）陽性対照（凝集したリゾチーム）および陰性対照（天然リゾチーム）を凍結乾燥粉末（それぞれ300μg）として供給し、500μlの脱イオン水中に再構成して、40μMの原液を調製した；これは4℃で数週間貯蔵できる。これらの溶液をアッセイ緩衝液中に1：2希釈（20μM）した後に適用した。再構成した抗ErbB2抗体試料（20 mg／mL）をアッセイ緩衝液中に希釈して4.5 mg／mLの濃度にした。対照として、再構成したばかりの抗ErbB2抗体（20 mg／mL）を4.5 mg／mLに希釈した。透明底96ウェルマイクロプレート（μClear black；Greiner，ドイツ、フリッケンハウゼン）に、これらのタンパク質溶液98μLを供給した。2μLの調製したばかりのProteoStat（登録商標）検出試薬装填溶液を各ウェルに分配した。被験試料を入れたマイクロプレートを暗所で15分間、室温でインキュベートした。蛍光を融合蛍光マイクロプレートリーダーにより定量した（励起：550 nm；発光：603 nm；PerkinElmer，米国マサチュセッツ州）。
【０２０３】
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）
タンパク質の凝集および分解をSE-HPLCにより定量した。分析は、UV-280 nm検出器（Malvern Instruments，英国ウースターシャー州）およびTSKゲルG3000SWXL 7.8×300 nmカラム（トーソー・バイオサイエンス，日本、東京）を備えたHPLCシステムにより、30℃および流速0.5 mL／分で実施された。注入体積は50〜100μLであった。SE-HPLCの流動緩衝液はダルベッコ（Dulbecco）のPBS pH7.1（PAA Laboratories，オーストリア、パシング）であった。分子量標準品（BSA，Thermo Scientific；米国マサチュセッツ州ウォルサム）および偽緩衝液を各シーケンスに流した。凝集および断片化の量を、単量体ピークの曲線下面積、高分子量種の和および低分子量種の和との比較により％で決定した。
【０２０４】
照射プロトコル
殺菌はSterigenics（Leuven，ベルギー）により25または40 kGyのβ線または線照射を
用いて実施された。標準照射プロトコルに対する改変として、試料の一部を-80℃で照射
した。
【０２０５】
透析
抗ErbB2抗体（20 mg／mL）を、SPS（40 mg／mL）pH6、元の配合物、およびpH6に調整したダルベッコのPBSに対して、Thermo Scientificから購入したSlide-A-Lyzer（登録商標
）透析カセット（カットオフ3.5 kDa；体積3〜12 mL）を用いて一夜透析した。透析は最
適安定性を確保するために凍結乾燥の直前に実施された。抗体試料の一部をSPSまたはPBS中での再緩衝化のために透析した。
【０２０６】
凍結乾燥
凍結乾燥をEPSILON 2-6D（Martin Christ；ドイツ、オステローデ・アム・ハルツ）で
、下記の表2に示すプロトコルに従って行なった：
【０２０７】
【表２】
2019052169.tif 000004
【０２０８】
データ解析
すべての実験を少なくとも三重に行ない、データを平均±SDとして表わす。SigmaStat 3.0を用いて、マン-ホイットニーの順位和検定を用いる非パラメーター解析を実施した。p＜0.01で差を有意とみなした。
【０２０９】
10.2  照射がErbB2認識に及ぼす影響
照射が機能性抗原結合に及ぼす影響を調べるために、抗ErbB2 ELISAを確立した。図17
は、固定化した組換えErbB2および再構成したばかりの抗ErbB2抗体を用いて確立した標準曲線を表わす。この標準曲線により、抗ErbB2抗体20 ng／mLを以下の実験のための標準濃度として選択した。
【０２１０】
ストレスを付与した抗ErbB2抗体試料の機能活性を、再構成したばかりの元の抗ErbB2抗体（これを100％陽性対照と定義した）の機能活性と比較した。ErbB2抗体をSPS中に再緩
衝化し、凍結乾燥し、そしてELISAで試験した場合、抗体結合は115±13.7％であり、これに対し元の緩衝液中に再緩衝化した試料の抗原結合は95±5.2％であった（図2）。25 kGyでβ線およびγ線照射した後、SPS配合試料においてほぼ100％、元の緩衝液について83.2±6.4％〜87.4±1.9％の結合活性がみられた。試料を40 kGyで処理した場合、活性はSPS
配合試料において93.0±2.1％〜102.6±5.1％の範囲にあり、これに対し元の緩衝液につ
いては結合活性は63.19±2.1％〜71.8±4.5％の範囲にあった（図16）。
【０２１１】
10.3  照射が配合物の凝集物および断片の形成に及ぼす影響
照射後の療法用抗ErbB2 IgG1抗体の分子構造の統合性を分析するために、照射した試料の凝集状態を対照と比較した。療法に適用する生物製剤の凝集物含量は可能な限り低くなければならず（たとえば2％未満）、規定遵守に必須のパラメーターである。半定量非還
元SDS-PAGE（図18）および蛍光に基づくマイクロプレートアッセイ（図19）により、抗ErbB2抗体の実質的な凝集物および分解生成物の形成を、25および40 kGyのβ線およびγ線の両方の照射後に観察した。試料をSPS中で凍結乾燥および照射した場合、照射仲介による凝集物および分解生成物は顕著に減少することが認められた。この半定量所見をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）分析（図20）により確認した。SPS配合物と共に照射した試料について得られた選択したクロマトグラムを元の配合物およびPBS（陰性対照）と比較したものを、図20Aおよび20B（拡大）に示す。約160 kDaの分子量をもつ無傷IgG1単量体（M）に対応する主ピークは、保持体積8.5 mLで溶出する。二量体、三量体、四量体からなる高分子量凝集物(high molecular weight  aggregat)（HMW）およびおそらくIgG単量体のより高い分子量の凝集物の溶出範囲は、5.5〜8 mLにある。保持体積10〜11 mLでは、低分子量種(low molecular weight species)（LMW）の形のわずかな断片化の傾向がみられたにすぎない。HMW、LMWおよび単量体（M）のパーセント値を表3に挙げる。すべての実験において、SPS配合物は最大で20倍の凝集物および分解生成物の減少を生じた（p＜0.05）。
【０２１２】
【表３】
2019052169.tif 000005
【０２１３】
10.4  凍結乾燥仲介による二次構造変化はSPSにより防止される
凍結乾燥分子の二次構造を調べるために、FT-IR分析を実施した（図21）。すべてのス
ペクトルに1638 cm-1におけるアミド-I吸収バンドの変化はみられなかった。しかし、元
の配合物中および陰性対照PBS中に配合した乾燥抗体のスペクトルは、1547 cm-1におけるアミド-II吸収バンドのピーク位置および形状の両方においてかなりの変化を示し、これ
は凍結乾燥後にα-ヘリックス二次構造含量の実質的損失があるが、βシート含量には損
失がないことを示唆する。乾燥したSPS配合抗体については、二次構造の変化は検出され
なかった（図21および表4）。
【０２１４】
【表４】
2019052169.tif 000006
【０２１５】
したがって、これらの例によって、元の供給業者の配合物およびPBSを配合した試料に
おいて照射試料をSDS-PAGEおよび蛍光凝集アッセイにより分析した際に、有意の凝集が明らかになった。凝集物形成は副作用および認識されない免疫応答を誘発する可能性があるので、患者に対する重大なリスクである。したがって、療法用タンパク質の製造および貯蔵に際して、高いパーセントの単量体を保持することが必須である。抗ErbB2 IgG1抗体をSPS中に再配合するとこの重要な目標を達成できることが示された。
【０２１６】
SEC分析は、元の配合物においてはいずれのタイプの照射も療法用抗ErbB2 IgG1抗体の
著しい凝集および分解を誘導するが、SPS配合した試料においては誘導しないことを示し
、したがってSDS-PAGEおよび蛍光凝集試験による所見が確認された。興味深いことに、40
kGyで照射した後ですらSPS配合した生体分子はこの目標に達し、高分子量凝集物の含量
は約2％以下であった。
【０２１７】
実施例11：表面に吸着させたヒト抗IL6-IgG抗体の、種々の組成の保護溶液中への埋め
込み
40 kGyのβ線照射に対する、多種多様な組成の本発明の保護溶液による、ヒト抗IL6-IgG抗体の保護を分析した。
【０２１８】
96ウェルELISAプレートをヒト抗IL6-IgG抗体でコートした後、保護溶液を各ウェルに添加し、続いてプレートの真空乾燥を実施した。乾燥プレートを40 kGyでβ線照射し、対応する抗IL6-ELISAで抗原結合活性を測定した。抗IL6-IgG抗体への組換えヒトIL-6の特異的結合を、測光法により、西洋わさびペルオキシダーゼ基質TMBの酵素変換により450 nmで
検出した。図22に、抗原結合活性を非処理対照に対するパーセントで示す。7種類のアミ
ノ酸（アミノ酸混合物1：Ala，Arg，Gly，Glu，Lys，His，Trp）または5種類のアミノ酸
（それぞれ、アミノ酸混合物2：Ala，Arg，Gly，Glu，Lys、およびアミノ酸混合物3：Ala，Gly，Glu，His，Trp）を含む組成物を用いた。これらの実験により、長期貯蔵に対する認識されていない副作用（酸化感受性；吸湿性）をもつ可能性があるアミノ酸の除外は保護効果を低下させることが明らかになった。GAおよび／またはカルノシン、および／またはジペプチド（Gly-Tyr，Gly-GLy，Gly-Gln）をこれらの組成物に補充すると、組成物の保護効果を高めることができた。
【０２１９】
グリチルリチン酸を、特にジペプチドであるカルノシンおよび他のジペプチドと組み合わせてこれらのアミノ酸混合物に補充すると、照射仲介による機能損失が種々の程度に救済された（表5）。
【０２２０】
【表５】
2019052169.tif 000007
【０２２１】
実施例12：β線照射に対する種々の組成の保護溶液と組み合わせて乾燥させた組換え乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性の保持
凍結乾燥した組換え乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）を、多種多様な組成の本発明による
保護溶液に、約1：2，5の酵素／賦形剤比で溶解し、続いて凍結乾燥した。凍結乾燥を100μlの体積で行ない、乾燥試料を40 kGyでβ線照射した。試料を再構成した後、酵素の還
元型補因子NADHがNADH＋に酸化され、同時に基質ピルビン酸が乳酸に還元される際の吸収低下を340 nmでモニターすることにより、酵素LDH活性を測光法で測定した。酵素活性を
非処理対照に対するパーセントで表わす。7種類のアミノ酸（アミノ酸混合物1：Ala，Arg，Gly，Glu，Lys，His，Trp）または5種類のアミノ酸（アミノ酸混合物2：Ala，Arg，Gly，Glu，Lys）を含む組成物を用いた。グリチルリチン酸を、特にジペプチドであるカルノシンおよび他のジペプチドと組み合わせてこれらのアミノ酸混合物に補充すると、照射仲介による機能損失が種々の程度に救済された（表6）。
【０２２２】
【表６】
2019052169.tif 000008
【０２２３】
実施例13：不活化インフルエンザA H1N1スプリットワクチンの血球凝集活性は、血球凝集アッセイによりモニターして、凍結乾燥および乾燥配合物の40 kGyβ線照射に際して保持された
不活化インフルエンザA H1N1スプリットワクチンの供給業者の元の配合物を、2〜8℃で本発明による種々の組成の保護溶液と交換した。w／w（ワクチン／保護溶液の賦形剤）比は約1：50〜1：12.5であった。凍結乾燥を100μlの体積で行ない、凍結乾燥物を40 kGyのβ線照射で照射した。
【０２２４】
照射および再構成の後、試料の機能性を血球凝集アッセイ（HA）で評価した。図24に示すように、供給業者の元の配合物中で凍結乾燥したインフルエンザAスプリットワクチン
（凍結乾燥後に既に完全な血球凝集活性喪失を示した）と対照的に、種々の組成の本発明溶液中で凍結乾燥したインフルエンザAスプリットワクチンの再構成後には血球凝集活性
がほぼ完全に保持されていた。
【０２２５】
さらに、種々の組成の本発明による保護溶液中に配合した凍結乾燥試料の血球凝集活性は、凍結乾燥の前と後の活性と比較して、乾燥試料の40 kGyβ線照射および再構成の後にほぼ完全に保持されていた。7種類のアミノ酸（アミノ酸混合物1；Ala，Arg，Glu，Gly，Lys，His，Trp）または5種類のアミノ酸（それぞれ、アミノ酸混合物2；Ala，Arg，Glu，Gly，Lys、およびアミノ酸混合物3：Ala、Gly、Glu、His、Trp）を含む組成物を用いた。ジペプチドであるカルノシン、グリチルリチン酸、他のジペプチド、およびその組合わせを含有する組成物は、凍結乾燥仲介および／または照射仲介による機能損失に対する最良の保護をもたらした（表7）。選択したアミノ酸をジペプチドおよび／またはGAで置き換
えた後、組成物のモル浸透圧濃度はより低く、したがって療法の目的に有益となる可能性がある。
【０２２６】
【表７】
2019052169.tif 000009
【０２２７】
参考文献
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年12月25日(2018.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥中の（ポリ）ペプチドのアンフォールディングを防止し、および／または乾燥後の（ポリ）ペプチドの（リ）フォールディングを誘導するための方法であって、（ポリ）ペプチドを水溶液に埋め込む段階を含み、その際、前記水溶液は、少なくとも３種類の異なるアミノ酸を含み、ここで前記少なくとも３種類の異なるアミノ酸が、下記の群：
（ａ）非極性、脂肪族Ｒ基をもつアミノ酸；
（ｂ）極性、非荷電Ｒ基をもつアミノ酸；
（ｃ）正に荷電したＲ基をもつアミノ酸；
（ｄ）負に荷電したＲ基をもつアミノ酸；および、
（ｅ）芳香族Ｒ基をもつアミノ酸；
から選択されるものであり、
前記水溶液が、
（Ａ）糖類；
（Ｂ−ｉ）タンパク質；および／または、
（Ｂ−ｉｉ）変性作用化合物；ならびに、
（Ｃ）シラン類；
を含まないかまたは実質的に含まない、前記方法。
【請求項２】
水溶液が、下記の各群から選択される少なくとも１種類のアミノ酸：
（ａ）非極性、脂肪族Ｒ基をもつアミノ酸；
（ｂ）極性、非荷電Ｒ基をもつアミノ酸；
（ｃ）正に荷電したＲ基をもつアミノ酸；
（ｄ）負に荷電したＲ基をもつアミノ酸；および、
（ｅ）芳香族Ｒ基をもつアミノ酸；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
水溶液が、少なくとも下記のアミノ酸：
（ａ）アラニン、グルタミン酸、リジン、トレオニンおよびトリプトファン；
（ｂ）アスパラギン酸、アルギニン、フェニルアラニン、セリンおよびバリン；
（ｃ）プロリン、セリン、アスパラギンおよび／またはアスパラギン酸、トレオニンおよびフェニルアラニン；
（ｄ）チロシン、イソロイシン、ロイシン、トレオニンおよびバリン；
（ｅ）アルギニン、グリシン、ヒスチジン、アラニン、グルタミン酸、リジンおよびトリプトファン；または、
（ｆ）アラニン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、およびリジン；
を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１種類のアミノ酸が、天然の非タンパク源アミノ酸および合成アミノ酸からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
水溶液がさらに、サポニンもしくは脂肪酸またはその誘導体を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
サポニンがグリチルリチン酸またはその誘導体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
脂肪酸が短鎖および中鎖脂肪酸からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
水溶液の賦形剤と（ポリ）ペプチドのw／w比が１：１〜５００：１である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
（ポリ）ペプチドが組換え（ポリ）ペプチドである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
（ポリ）ペプチドが１以上の分子内ジスルフィド結合を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
（リ）フォールディングした（ポリ）ペプチドが生物学的に活性である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
乾燥が凍結乾燥、風乾、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥または発泡乾燥である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【外国語明細書】
2019052169000001.pdf