(57)【要約】【課題】本発明の一態様は、新規のパーキンソン病の治療薬、および新規のパーキンソン病の治療薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。【解決手段】ＰＥＲＫ活性化剤を含むパーキンソン病の処置用医薬、およびＰＥＲＫの活性化状態を指標としたパーキンソン病の処置用医薬をスクリーニングするための方法を提供する。【選択図】図４
2019052125.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ様ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）活性化剤を含むことを特徴とする、パーキンソン病の処置用医薬。
【請求項２】
上記ＰＥＲＫ活性化剤が、ＰＥＲＫの立体構造を変化させて、その二量体化を誘導し、二量体化したＰＥＲＫを自己リン酸化させる薬剤であることを特徴とする、請求項１に記載のパーキンソン病の処置用医薬。
【請求項３】
上記パーキンソン病が、ＬＲＲＫ２の遺伝子変異に起因するパーキンソン病であることを特徴とする、請求項１または２に記載のパーキンソン病の処置用医薬。
【請求項４】
上記ＬＲＲＫ２の遺伝子変異が、配列番号３で示されるアミノ酸配列においてＮ末端側から２０１９番目のグリシンがセリンに置換されていることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載のパーキンソン病の処置用医薬。
【請求項５】
以下の工程：
（ａ）試験物質と、細胞またはＰＥＲＫとを接触させる接触工程、および
（ｂ）ＰＥＲＫの活性化状態を評価する評価工程
を含むことを特徴とする、パーキンソン病の処置用医薬をスクリーニングするための方法。
【請求項６】
上記（ｂ）の評価工程が、上記（ａ）において試験物質と細胞とを接触させる場合には、ＰＥＲＫのリン酸化、Ｅ３ユビキチンリガーゼのリン酸化、ミトフシン２の発現量、ＬＣ３−ＩＩの発現量およびｐ６２の発現量からなる群より選択される少なくとも一つを評価することを含み、上記（ａ）において試験物質とＰＥＲＫとを接触させる場合には、ＰＥＲＫの基質のリン酸化を評価することを含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記（ａ）の細胞が、変異型ＬＲＲＫ２が発現している細胞であることを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
上記変異型ＬＲＲＫ２が、配列番号３で示されるアミノ酸配列においてＮ末端側から２０１９番目のグリシンがセリンに置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記（ａ）の試験物質とＰＥＲＫとを接触させる接触工程が、ＡＴＰの存在下、試験物質と、ＰＥＲＫと、ＰＥＲＫの基質とを接触させることを含むことを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パーキンソン病の処置用医薬、およびパーキンソン病の処置用医薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（以下、「ＰＤ」と称することもある。）は、個体の運動制御を困難にする不可逆的かつ進行性の神経変性疾患である。
【０００３】
パーキンソン病の原因の９０％以上が孤発性ではあるが、いくつかの遺伝子における突然変異が家族性パーキンソン症候群の発症を引き起こすことが報告されている。これらの遺伝性の突然変異の中で、leucine-rich repeat serine/threonine kinase 2（以下、「ＬＲＲＫ２」と称する。）遺伝子の突然変異は、すべてのＰＤの１〜２％で生じ、この疾患の最も共通した遺伝学的要因を示す。
【０００４】
パーキンソン病の臨床症状を基礎づける病理学的な指標は、レビ小体（以下、「ＬＢ」と称することもある。）と呼ばれる細胞内封入体の存在により特徴づけられる黒質におけるドーパミン神経細胞の欠損である（非特許文献１）。ＬＢは、適切に折りたたまれなかったα−シヌクレインが豊富であり、パーキンソン病の病原種であることが提案されている。しかし、孤発性ＰＤおよび家族性（遺伝学的）ＰＤの基礎となる共通の分子イベントについては、十分に解明されていない。
【０００５】
Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓでの研究では、野生型ＬＲＲＫ２の発現が、６−ＯＨＤＡまたはα−シヌクレインにより誘導される神経毒性に対してドーパミン神経細胞を保護することが報告されている（非特許文献２）。また、ＬＲＲＫ２相同体を欠損したＣ．  ｅｌｅｇａｎｓは、ＥＲストレスに対して、自発性の神経変性を生じたり、過剰な感受性を示すことが報告されている（非特許文献３）。しかし、哺乳動物では、ＬＲＲＫ２の突然変異による病態におけるＥＲストレスの関与は、十分に解明されていない。
【０００６】
現在までに、パーキンソン病の治療法としては、例えば、ドーパミン補充療法が行われている。この方法は、ドーパミン神経細胞の変性に伴う脳内ドーパミンの減少を抑制することを目的として、ドーパミンを体外から投与することにより行われる。また、別の治療方法としては、変性したドーパミン神経細胞を代替するために、ｉＰＳ細胞由来のドーパミン神経細胞の移植が計画されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Dauer, W. and Przedborski, S., Neuron 39, 889-909, 2003
【非特許文献２】Yuan, Y. et al., PloS one 6, e22354, 2011
【非特許文献３】Samann, J. et al., The Journal of biological chemistry 284, 16482-16491, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、ドーパミン補充療法には、パーキンソン病の進行に伴い耐性ができるという問題がある。また、ｉＰＳ細胞由来のドーパミン神経細胞の移植については、その有効性が未だ十分に立証されていない。したがって、パーキンソン病の治療に有効な新たな治療方法の開発が望まれている。
【０００９】
上記のような事情に鑑み、本発明の一態様は、新規のパーキンソン病の治療薬、および新規のパーキンソン病の治療薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、パーキンソン病に関与する変異型ＬＲＲＫ２が発現している細胞（以下、「変異型ＬＲＲＫ２発現細胞」と称することもある。）において観察されるＥＲ−ミトコンドリア異常が、ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ様ＥＲキナーゼ（以下、「ＰＥＲＫ」と称する。）活性化剤の導入により回復することを初めて見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の一実施形態は以下の構成を包含する。
【００１１】
〔１〕ＰＥＲＫ活性化剤を含むことを特徴とする、パーキンソン病の処置用医薬。
【００１２】
〔２〕上記ＰＥＲＫ活性化剤が、ＰＥＲＫの立体構造を変化させて、その二量体化を誘導し、二量体化したＰＥＲＫを自己リン酸化させる薬剤であることを特徴とする、〔１〕に記載のパーキンソン病の処置用医薬。
【００１３】
〔３〕上記パーキンソン病が、ＬＲＲＫ２の遺伝子変異に起因するパーキンソン病であることを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載のパーキンソン病の処置用医薬。
【００１４】
〔４〕上記ＬＲＲＫ２の遺伝子変異が、配列番号３で示されるアミノ酸配列においてＮ末端側から２０１９番目のグリシンがセリンに置換されていることを特徴とする、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のパーキンソン病の処置用医薬。
【００１５】
〔５〕以下の工程：
（ａ）試験物質と、細胞またはＰＥＲＫとを接触させる接触工程、および
（ｂ）ＰＥＲＫの活性化状態を評価する評価工程
を含むことを特徴とする、パーキンソン病の処置用医薬をスクリーニングするための方法。
【００１６】
〔６〕上記（ｂ）の評価工程が、上記（ａ）において試験物質と細胞とを接触させる場合には、ＰＥＲＫのリン酸化、Ｅ３ユビキチンリガーゼのリン酸化、ミトフシン２の発現量、ＬＣ３−ＩＩの発現量およびｐ６２の発現量からなる群より選択される少なくとも一つを評価することを含み、上記（ａ）において試験物質とＰＥＲＫとを接触させる場合には、ＰＥＲＫの基質のリン酸化を評価することを含むことを特徴とする、〔５〕に記載の方法。
【００１７】
〔７〕上記（ａ）の細胞が、変異型ＬＲＲＫ２が発現している細胞であることを特徴とする、〔５〕または〔６〕に記載の方法。
【００１８】
〔８〕上記変異型ＬＲＲＫ２が、配列番号３で示されるアミノ酸配列においてＮ末端側から２０１９番目のグリシンがセリンに置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする、〔７〕に記載の方法。
【００１９】
〔９〕上記（ａ）の試験物質とＰＥＲＫとを接触させる接触工程が、ＡＴＰの存在下、試験物質と、ＰＥＲＫと、ＰＥＲＫの基質とを接触させることを含むことを特徴とする、〔５〕または〔６〕に記載の方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の一態様における医薬は、細胞内におけるＥＲ−ミトコンドリア異常を回復させることによりパーキンソン病を処置するという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａは、コントロールまたはツニカマイシンで処理後のＭＥＦ細胞において、小胞体ストレス応答（以下、「ＵＰＲ」と称する。）のＰＥＲＫブランチのイムノブロットを示す図である。図１Ｂは、コントロールまたはツニカマイシンで処理後のＭＥＦ細胞において、ＵＰＲのＩＲＥ１ａブランチのイムノブロットを示す図である。図１Ｃは、コントロールまたはツニカマイシンで処理後のＭＥＦ細胞（ｐ５ＸＡＴＦ６−ＧＬ３プラスミドおよびレニラプラスミドが導入されている）において、ＵＰＲのＡＴＦ６ブランチの転写活性を示す図である。図１Ｄは、ＰＥＲＫ−ΔＮまたはＰＥＲＫ  ｓｈＲＮＡで処理後のＭＥＦ細胞において、ＬＣ３−ＩＩおよびｐ６２のイムノブロットを示す図である。
【図２】図２Ａは、単離ＰＥＲＫ、単離Ｅ３ユビキチンリガーゼ、および［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いたインビトロキナーゼアッセイを示す図である。図２Ｂは、ＭＡＲＣＨ５およびＭＵＬＡＮ間のＲＩＮＧドメインのアミノ酸配列アライメントを示す図である。図２Ｃは、ＰＥＲＫ−ΔＮ、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、および野生型ＭＡＲＣＨ５もしくはＭＵＬＡＮまたは突然変異型ＭＡＲＣＨ５もしくはＭＵＬＡＮを用いたインビトロキナーゼアッセイを示す図である。図２Ｄは、Ｅ１酵素、ＡＴＰ、ＨＡタグ化Ｕｂ、ＵｂｃＨ７、Ｈｉｓタグ化ミトフシン２、および野生型ＭＡＲＣＨ５もしくはＭＵＬＡＮまたは突然変異型ＭＡＲＣＨ５もしくはＭＵＬＡＮを用いたインビトロユビキチンアッセイを示す図である。
【図３】図３Ａは、コントロールまたはツニカマイシンで処理後のＭＥＦ細胞、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞、およびＬＲＲＫ２−ＩＮ−１で処理したＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞において、ＥＲストレス下でのリン酸化Ｅ３ユビキチンリガーゼおよびＰＥＲＫのイムノブロットを示す図である。図３Ｂは、ミトフシン２（Ｍｆｎ２）またはミトフシン２  ｓｈＲＮＡ（Ｍｆｎ２  ｓｈＲＮＡ）をトランスフェクトしたＭＥＦ細胞を、コントロールまたはツニカマイシンで処理した後の、全体およびリン酸化ＰＥＲＫ、ＭＡＲＣＨ５およびＭＵＬＡＮのイムノブロットを示す図である。図３Ｃは、ＭＡＲＣＨ５およびＭＵＬＡＮ、またはリガーゼ欠損ＭＡＲＣＨ５（Ｈ４３Ｗ）およびＭＵＬＡＮ（Ｃ３３９Ａ）の混合物をトランスフェクトしたＭＥＦ細胞を、コントロールまたはツニカマイシンで処理した後の、ミトフシン２、ならびに全体およびリン酸化ＰＥＲＫのイムノブロットを示す図である。
【図４】図４Ａは、ＰＥＲＫ、Ｅ３ユビキチンリガーゼ、およびミトフシン２（Ｍｆｎ２）から構成されるフィードバックループを示す概要図である。図４Ｂは、ＰＥＲＫアクチベーター（ＥＩＦ２ＡＫ３  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＰＥＲＫ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−１および２）、Ｓａｌｕｂｒｉｎａｌ（ＰＥＲＫ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−３））またはＰＥＲＫインヒビター（ＧＳＫ２６０６４１４）の存在下、コントロールまたはツニカマイシンで処理後のＭＥＦ細胞において、ＬＣ３−ＩＩおよびｐ６２のイムノブロットを示す図である。図４Ｃは、ＦＲＥＴを用いて、ミトコンドリアマトリクス内の遊離Ｃａ２+ダイナミクスを測定した結果を示す図である。図４Ｄは、ＦＲＥＴを用いて、ミトコンドリアマトリクス内の遊離Ｃａ２+ダイナミクスを測定した結果を示す図である。図４Ｅは、ＦＲＥＴを用いて、ミトコンドリアマトリクス内の遊離Ｃａ２+ダイナミクスを測定した結果を示す図である。
【図５】図５は、パーキンソン病に関与すると考えられるＬＲＲＫ２の遺伝子変異を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態の一例について詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【００２４】
本明細書において「遺伝子」とは、ヌクレオチドの重合体を意図し、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と同義で使用される。遺伝子は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）でも存在しうるし、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態でも存在しうる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。遺伝子は化学的に合成してもよい。また、本明細書において「ポリヌクレオチド」と記載した場合、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。
【００２５】
本明細書において「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と同義で使用される。
【００２６】
本明細書中、塩基およびアミノ酸の表記は、ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を適宜使用する。
【００２７】
〔１．パーキンソン病の処置用医薬〕
本発明の一実施形態において、ＰＥＲＫ活性化剤を含むことを特徴とする、パーキンソン病の処置用医薬を提供する（本明細書において、適宜「本発明の医薬」と呼ぶ。）。
【００２８】
本願の発明者は、以前に、パーキンソン病に関与する変異型ＬＲＲＫ２が発現している細胞が、ＥＲ−ミトコンドリア間のＣａ２＋輸送の減少により誘導されるミトコンドリア異常を示すとの知見を得ていた（本願の出願時において未公表）。この知見を基に、変異型ＬＲＲＫ２発現細胞を用いてさらに検討を進めた結果、変異型ＬＲＲＫ２発現細胞において観察されるＥＲ−ミトコンドリア異常がＰＥＲＫ活性化剤の導入により回復すること、およびそのメカニズムを初めて見出すことに成功した。
【００２９】
本願の発明者が見出したＰＥＲＫ活性化剤の導入（ＰＥＲＫ活性化）によるＥＲ−ミトコンドリア異常の回復メカニズムの概要は、以下の通りである（図４Ａを参照）。
・通常の状態の細胞では、ＥＲ内でＧｒｐ７８／Ｂｉｐ（ＢｉＰ）がＰＥＲＫに結合して、ＰＥＲＫを不活性な状態としている。
・ＥＲストレスを感知すると、ＢｉＰがＰＥＲＫから解離し、ＰＥＲＫが活性化（二量体化および自己リン酸化）される。
・活性化したＰＥＲＫは、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（ＭＡＲＣＨ５／ＭＵＬＡＮ）をリン酸化し、活性化させる。
・活性化したＥ３ユビキチンリガーゼは、ミトフシン２をユビキチン化／分解し、ミトフシン２を減少させる。
・ミトフシン２は、ＰＥＲＫの活性を抑制する方向に働くため、ミトフシン２の減少により、ＰＥＲＫ活性化がさらに促進される。
・このような、ＰＥＲＫからのＢｉＰの解離→ＰＥＲＫの活性化→Ｅ３ユビキチンリガーゼの活性化→ミトフシン２のユビキチン化／分解→さらなるＰＥＲＫの活性化を含むメカニズム、すなわち、ポジティブフィードバックメカニズムにより、ＰＥＲＫの活性化が促進される。
・一方、変異型ＬＲＲＫ２は、Ｅ３ユビキチンリガーゼの抑制を介して、ＰＥＲＫの活性を阻害する。この結果、変異型ＬＲＲＫ２発現細胞では、ＥＲ−ミトコンドリア異常が生じる。
・変異型ＬＲＲＫ２発現細胞にＰＥＲＫ活性化剤を導入することにより、ＥＲ−ミトコンドリア異常が回復する。
【００３０】
したがって、ＰＥＲＫ活性化剤を含むことを特徴とする本発明の医薬は、従来の治療方法では、例えば、耐性が生じる等の理由により治療が困難であったパーキンソン病の患者に対して、新規の有効な治療方法を提供することができる。
【００３１】
本明細書において「ＰＥＲＫ」は、配列番号１で示されるペプチドであり、全長１１１４アミノ酸残基から構成される（塩基配列は、配列番号２で示される）。ＰＥＲＫは、ＥＲ膜上に存在し、ミスフォールドタンパク質により引き起こされるＥＲストレスのセンサーとして機能する。
【００３２】
本明細書において「ＬＲＲＫ２」は、配列番号３で示されるペプチドであり、全長２５２７アミノ酸残基から構成される（塩基配列は、配列番号４で示される）。ＬＲＲＫ２は、ロイシンリッチリピートキナーゼファミリーのメンバーであり、細胞質中や、ミトコンドリア外膜に結合して存在する。
【００３３】
本明細書において「Ｅ３ユビキチンリガーゼ」は、ユビキチンシステムにおいて機能するユビキチン転移酵素を意味する。ユビキチンシステムでは、３つの酵素、すなわち、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、およびユビキチン転移酵素（ユビキチンリガーゼ）（Ｅ３）により、標的タンパク質のユビキチン化が行われる。
【００３４】
本明細書において「ＭＡＲＣＨ５」は、全長２７８アミノ酸残基から構成されるペプチドであり、ＮＣＢＩの受託番号ＮＭ０２７３１４で示される。ＭＡＲＣＨ５は、ミトコンドリア外膜上に存在するＥ３ユビキチンリガーゼであり、ミトコンドリアの形態の制御等に関与する。
【００３５】
本明細書において「ＭＵＬＡＮ」は、全長３５２アミノ酸残基から構成されるペプチドであり、ＮＣＢＩの受託番号ＮＭ０２６６８９で示される。ＭＵＬＡＮは、ＮＦ−κＢの制御において中心的な役割を果たすＥ３ユビキチンリガーゼであり、ミトコンドリアダイナミクスやアポトーシス過程に関与する。
【００３６】
本明細書において「ミトフシン２」（別名、「Ｍｆｎ２」、「ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ２」とも称される。）は、全長７５７ミノ酸残基から構成されるペプチドであり、ＮＣＢＩの受託番号ＮＭ００１２８５９２０で示される。ミトフシン２は、ＥＲ膜上およびミトコンドリア膜上に存在する膜タンパク質であり、ＥＲおよびミトコンドリアの結合や、ミトコンドリアネットワークの維持等に関与する。
【００３７】
本明細書において「ＰＥＲＫ活性化剤」は、上記のポジティブフィードバックメカニズム、すなわち、ＰＥＲＫからのＢｉＰの解離→ＰＥＲＫの活性化→Ｅ３ユビキチンリガーゼの活性化→ミトフシン２のユビキチン化／分解→さらなるＰＥＲＫの活性化を含むメカニズムを正に制御する薬剤を意味する。本明細書において「ＰＥＲＫ活性化剤」は、上記のポジティブフィードバックメカニズムを正に制御する薬剤であって、ＰＥＲＫを不活性状態から活性化状態へ移行させ得る薬剤であれば、特に限定されない。
【００３８】
本発明の一実施形態において、ＰＥＲＫ活性化剤は、例えば、上記のポジティブフィードバックメカニズムに関与する、ＰＥＲＫからのＢｉＰの解離を促進する薬剤、ＰＥＲＫを直接活性化する薬剤、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、ＭＡＲＣＨ５および／またはＭＵＬＡＮ）を活性化する薬剤、ミトフシン２のユビキチン化／分解を促進する薬剤等であり得る。
【００３９】
本発明の一実施形態において、ＰＥＲＫからのＢｉＰの解離を促進する薬剤、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（例えば、ＭＡＲＣＨ５および／またはＭＵＬＡＮ）を活性化する薬剤、ミトフシン２のユビキチン化／分解を促進する薬剤は、特に限定されることなく、当該技術分野において使用され得る任意の薬剤であり得る。
【００４０】
なお、ＰＥＲＫを直接活性化する薬剤については、後述する。
【００４１】
ＰＥＲＫが不活性状態から活性化状態へ移行するメカニズムは、例えば、David Ron & Peter Walter, Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response, 2007, Nature Revew Molecular Cell Biology, 8: 519-529に記載されている。簡潔には、ＥＲストレスによりＰＥＲＫからＢｉＰが解離した後、ＰＥＲＫが２量体を形成し自己リン酸化することにより、ＰＥＲＫ自身のキナーゼ活性を亢進する。
【００４２】
したがって、本発明の一実施形態において、ＰＥＲＫ活性化剤は、ＰＥＲＫの立体構造を変化させて、その二量体化を誘導し、二量体化したＰＥＲＫを自己リン酸化させる薬剤であり得る。
【００４３】
後述する実施例においては、ＰＥＲＫ活性化剤の一例として、複数の低分子化合物を用いた実験を行っている。実施例で使用されている化合物は、各々構造や作用機序が異なっているが、いずれの化合物を用いた場合でも、ＰＥＲＫの立体構造の変化、二量体の形成、自己リン酸化を経てＰＥＲＫが活性化され、その結果として、変異型ＬＲＲＫ２発現細胞のＥＲ−ミトコンドリア異常が回復している。したがって、ＰＥＲＫの立体構造を変化させて、その二量体化を誘導し、二量体化したＰＥＲＫを自己リン酸化させる薬剤は、本発明の一実施形態におけるＰＥＲＫ活性化剤の範囲に包含される。
【００４４】
本発明の一実施形態において、ＰＥＲＫ活性化剤としては、例えば、ＤＨＢＤＣ（Calbiochem製）、ＥＩＦ２ＡＫ３  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＣＣＴ０２０３１２（３２４８７９）、Calbiochem製）、Ｓａｌｕｂｒｉｎａｌ（ＣＡＳ  ４０５０６０−９５−９、Cayman Chemical製）等が挙げられる。
【００４５】
本発明の一実施形態において、処置の対象となるパーキンソン病は、パーキンソン病の全般にわたり、孤発性のパーキンソン病および家族性のパーキンソン病を含む。
【００４６】
本明細書において「孤発性のパーキンソン病」は、主に４０歳から５０歳以降に発症の多い、遺伝的要因によらないパーキンソン病を意味する。孤発性のパーキンソン病では、加齢とともに、ドーパミン神経細胞内のミトコンドリアの遺伝子変異（欠失）が蓄積し、ドーパミン神経細胞の機能障害が生じる。そのため、ミトコンドリアの機能は、孤発性のパーキンソン病の発症に重要な役割を担うと考えられる。
【００４７】
本明細書において「家族性のパーキンソン病」は、１つまたは複数の遺伝的要因により生じるパーキンソン病を意味する。家族性のパーキンソン病における遺伝的要因は、例えば、α−シヌクレイン、ＤＪ−１、ＬＲＲＫ２、ＰＩＮＫ１、Ｐａｒｋｉｎ等における遺伝子変異が挙げられる。
【００４８】
本発明の一実施形態において、処置の対象となるパーキンソン病は、好ましくは、ＬＲＲＫ２に遺伝子変異を有している。後述する実施例に示すように、変異型ＬＲＲＫ２発現細胞において観察されるＥＲ−ミトコンドリア異常は、ＰＥＲＫ活性化剤の導入により回復するため、本発明の医薬は、ＬＲＲＫ２に遺伝子変異を有しているパーキンソン病の処置においてより有利である。
【００４９】
本発明の一実施形態において、パーキンソン病におけるＬＲＲＫ２の遺伝子変異は、例えば、Ｇ２０１９Ｓ（Ｎ末端側から２０１９番目のグリシンがセリンに置換）、Ｒ１４４１Ｇ（Ｎ末端側から１４４１番目のアルギニンがグリシンに置換）、Ｒ１４４１Ｃ（Ｎ末端側から１４４１番目のアルギニンがシステインに置換）、Ｒ１４４１Ｈ（Ｎ末端側から１４４１番目のアルギニンがヒスチジンに置換）、Ｙ１６９９Ｃ（Ｎ末端側から１６９９番目のチロシンがシステインに置換）、Ｉ２０２０Ｔ（Ｎ末端側から２０２０番目のイソロイシンがスレオニンに置換）等が挙げられる。なお、Ｇ２０１９Ｓの遺伝子変異を有するＬＲＲＫ２を、以下において、「ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）」とも称する。その他の遺伝子変異についても同様の表記が可能である。
【００５０】
本明細書において「処置」とは、処置を必要とする対象に対して処置効果をもたらす行為を意味する。処置効果とは、予防効果および治療効果を包含する概念であり、例えば、以下の類型の効果であり得る。
（１）医薬を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の発症を防止する、またはリスクを低減する。
（２）医薬を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の再発を防止する、またはリスクを低減する。
（３）医薬を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の兆候が生じることを防止する、またはリスクを低減する。
（４）医薬を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の重症度を低減する。
（５）医薬を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の重症度の増加、または進行を防止する。
（６）医薬を投与しなかった場合と比較して、疾患に係る１つ以上の症状の重症度の増加速度、または進行速度を低減する。
【００５１】
本発明の医薬は、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤等を含むことができる。予防または治療的使用のための薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤は、薬学分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載されている。薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤の選択は、意図された投与経路および標準的薬学的慣行に従って、当業者によって容易に選択され得る。また、本発明の医薬は、任意の適切な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、被覆剤または可溶化剤をさらに含み得る。
【００５２】
本発明の医薬は、任意の投与経路により投与される。本発明の医薬は、特に限定されないが、例えば、処置対象に対して、経口、粘膜、筋肉内、静脈内、皮下、眼内または経皮的に投与され得る。本発明の医薬は、また、目的に応じて任意の剤型をとることもできる。さらに、本発明の医薬の処方は、疾患の重症度、有効成分、投与経路等に応じて、当業者により適宜設定され得る。
【００５３】
〔２．パーキンソン病の処置用医薬のスクリーニング方法〕
本発明の一実施形態において、ＰＥＲＫの活性化状態を指標とすることを特徴とする、パーキンソン病の処置用医薬をスクリーニングするための方法を提供する。
【００５４】
上述の通り、本願の発明者は、変異型ＬＲＲＫ２発現細胞において観察されるＥＲ−ミトコンドリア異常がＰＥＲＫ活性化剤の導入により回復することを見出した。したがって、ＰＥＲＫの活性化状態を指標とすることにより、有効なパーキンソン病の処置用医薬をスクリーニングすることができる。
【００５５】
本発明の一実施形態において、以下の工程を含むことを特徴とする、パーキンソン病の処置用医薬をスクリーニングするための方法を提供する：
（ａ）試験物質と、細胞またはＰＥＲＫとを接触させる接触工程、および
（ｂ）ＰＥＲＫの活性化状態を評価する評価工程。
【００５６】
本発明の一実施形態において、試験物質としては、任意の物質が使用され得る。試験物質の種類は特に限定されず、例えば、天然物の抽出物中に存在する化合物、低分子合成化合物、合成ペプチド等が用いられる。本発明の一実施形態において、スクリーニングに使用される試験物質は、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリー等に含まれる化合物であってよい。本発明の一実施形態において、スクリーニングに使用される試験物質は、好ましくは、低分子化合物であり、より好ましくは、低分子化合物の化合物ライブラリーであり得る。化合物ライブラリーは、市販の化合物ライブラリーを用いてもよく、当該技術分野における通常の方法により構築された化合物ライブラリーを用いてもよい。
【００５７】
本発明の一実施形態において、スクリーニングに使用される細胞は、ＰＥＲＫの活性化状態を評価できる細胞であれば特に限定されない。本発明の一実施形態において、スクリーニングに使用される細胞としては、例えば、ＭＥＦ細胞、Ｎ２７ラットドーパミン作動性神経細胞株、ＳＣＣ０４８細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞株等が挙げられる。
【００５８】
本発明の一実施形態において、スクリーニングに使用される細胞は、変異型ＬＲＲＫ２がパーキンソン病、特に家族性パーキンソン病の主要な病因の一つと考えられているために、変異型ＬＲＲＫ２が発現している細胞であることが好ましい。
【００５９】
本発明の一実施形態において、変異型ＬＲＲＫ２が発現している細胞は、変異型ＬＲＲＫ２を元々細胞内に有している細胞であってもよく、正常な（野生型の）ＬＲＲＫ２を有している細胞において、変異型ＬＲＲＫ２を誘導した細胞であってもよい。前者の細胞は、例えば、パーキンソン病を患う患者から医学的な手段により入手することができる。また、後者の細胞は、例えば、ゲノム編集技術により、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ノックインシステムにより得ることができる。
【００６０】
本発明の一実施形態において、変異型ＬＲＲＫ２は、例えば、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）、ＬＲＲＫ２（Ｒ１４４１Ｇ）、ＬＲＲＫ２（Ｒ１４４１Ｃ）、ＬＲＲＫ２（Ｒ１４４１Ｈ）、ＬＲＲＫ２（Ｙ１６９９Ｃ）、ＬＲＲＫ２（Ｉ２０２０Ｔ）等が挙げられる。本発明の一実施形態において、変異型ＬＲＲＫ２は、好ましくは、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）であり得る。
【００６１】
本発明の一実施形態において、スクリーニングに使用されるＰＥＲＫは、特に限定されない。本発明の一実施形態において、スクリーニングに使用されるＰＥＲＫは、細胞内で発現している内因性のＰＥＲＫを単離したものであってもよいし、細胞内で発現している外因性のＰＥＲＫを単離したものであってもよい。また、本発明の一実施形態において、スクリーニングに使用されるＰＥＲＫは、インビトロで構築されたものであってもよいし、化学合成されたものであってもよい。ＰＥＲＫの細胞からの単離、インビトロでの構築、化学合成等は、当該技術分野における任意の方法に基づいて行うことができる。
【００６２】
本明細書において「接触」とは、２以上の物質が物理的に触れる程度まで近接することを意味する。
【００６３】
本発明の一実施形態において、試験物質と細胞との接触は、細胞が培養されている容器に試験物質を添加することにより行われてもよく、試験物質を含む溶液中に細胞を添加することにより行われてもよい。試験物質と細胞との接触は、好ましくは、細胞が培養されている容器に試験物質を添加することにより行われる。
【００６４】
本発明の一実施形態において、試験物質と細胞との接触時間は、試験物質がＰＥＲＫを活性化する物質である場合に、ＰＥＲＫを活性化させるのに十分な時間であれば特に限定されないが、例えば、３０分であり得る。
【００６５】
本発明の一実施形態において、試験物質と細胞とを接触させる際の温度も特に限定されることなく、例えば、３０℃であり得る。
【００６６】
本発明の一実施形態において、試験物質とＰＥＲＫとの接触は、ＡＴＰの存在下、試験物質と、ＰＥＲＫと、ＰＥＲＫの基質とを接触させることであることが好ましい。この場合における試験物質とＰＥＲＫとの接触は、ＡＴＰ、試験物質、ＰＥＲＫおよびＰＥＲＫの基質が一つの溶液中に同時に存在するような方法で行われればよく、その方法は特に限定されない。
【００６７】
本発明の一実施形態において、ＰＥＲＫの基質は、特に限定されないが、例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼであり、好ましくは、ＭＡＲＣＨ５および／またはＭＵＬＡＮであり得る。ＭＡＲＣＨ５およびＭＵＬＡＮは、図４Ａに示すように、パーキンソン病に関与する小胞体ストレスに関係した分子であると考えるため、ＰＥＲＫの基質としてＭＡＲＣＨ５および／またはＭＵＬＡＮを用いる場合、より有効にパーキンソン病の処置用医薬をスクリーニングすることができる。
【００６８】
本発明の一実施形態において、試験物質とＰＥＲＫとの接触時間は、試験物質がＰＥＲＫを活性化する物質である場合に、ＰＥＲＫを活性化させるのに十分な時間であれば特に限定されないが、例えば、３０分であり得る。
【００６９】
本発明の一実施形態において、試験物質とＰＥＲＫとを接触させる際の温度も特に限定されることなく、例えば、３０℃であり得る。
【００７０】
本発明の一実施形態において、ＰＥＲＫの活性化状態を評価することは、ＰＥＲＫの活性化状態を直接的または間接的に評価できる指標に基づく評価であれば特に限定されない。
【００７１】
本発明の一実施形態において、（ａ）の接触工程において試験物質と細胞とを接触させる場合には、ＰＥＲＫの活性化状態を評価することは、ＰＥＲＫのリン酸化、Ｅ３ユビキチンリガーゼのリン酸化、ミトフシン２の発現量、ＬＣ３−ＩＩの発現量およびｐ６２の発現量からなる群より選択される少なくとも一つを評価することであり得る。
【００７２】
本発明の一実施形態において、（ａ）の接触工程において試験物質とＰＥＲＫとを接触させる場合には、ＰＥＲＫの活性化状態を評価することは、ＰＥＲＫの基質のリン酸化を評価することであり得る。
【００７３】
本発明の一実施形態において、ＰＥＲＫの活性化状態を評価することは、ＰＥＲＫのリン酸化、Ｅ３ユビキチンリガーゼのリン酸化、ミトフシン２の発現量、ＬＣ３−ＩＩの発現量およびｐ６２の発現量からなる群より選択される少なくとも一つを検出すること、またはＰＥＲＫの基質のリン酸化を検出することを含み得る。
【００７４】
本発明の一実施形態において、上記リン酸化または発現量の検出の方法としては、当該技術分野で使用される任意の方法が使用され得る。リン酸化の検出方法としては、例えば、インビトロキナーゼアッセイ、抗リン酸化セリン抗体および／または抗リン酸化スレオニン抗体を用いた免疫沈降物のウェスタンブロット等が挙げられる。また、発現量の検出方法としては、例えば、イムノブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、高速液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣＭＳ）等が挙げられる。
【００７５】
本発明の一実施形態において、ＰＥＲＫは、〔１．パーキンソン病の処置用医薬〕の項において記載した通りである。本発明の一実施形態において、検出の対象となるＰＥＲＫのリン酸化部位は、リン酸化によりＰＥＲＫが活性化される部位であれば特に限定されないが、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側から９８０番目のスレオニンであり得る。
【００７６】
本発明の一実施形態において、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、好ましくは、ＭＡＲＣＨ５および／またはＭＵＬＡＮであり得る。本発明の一実施形態において、Ｅ３ユビキチンリガーゼ、ＭＡＲＣＨ５およびＭＵＬＡＮは、〔１．パーキンソン病の処置用医薬〕の項において記載した通りである。
【００７７】
本発明の一実施形態において、検出の対象となるＭＡＲＣＨ５のリン酸化部位は、リン酸化によりＭＡＲＣＨ５が活性化される部位であれば特に限定されない。
【００７８】
また、本発明の一実施形態において、検出の対象となるＭＵＬＡＮのリン酸化部位は、リン酸化によりＭＵＬＡＮが活性化される部位であれば特に限定されない。
【００７９】
本発明の一実施形態において、上記リン酸化部位の検出は、特定のリン酸化部位の検出であってもよいし、不特定のリン酸化部位の検出であってもよい。また、上記リン酸化部位の検出は、１つのリン酸化部位の検出であってもよいし、複数のリン酸化部位の検出であってもよい。
【００８０】
本明細書において「ＬＣ３−ＩＩ」は、全長１２１アミノ酸残基から構成されるペプチドであり、ＮＣＢＩの受託番号ＮＭ０２５７３５で示される。ＬＣ３−ＩＩは、オートファジーフラックスに関与するタンパク質であり、ＰＥＲＫが活性化されると、その下流に位置するＬＣ３−ＩＩの発現量が低下することから、ＬＣ３−ＩＩの発現量を評価することにより、ＰＥＲＫの活性化状態を評価することができる。
【００８１】
本明細書において「ｐ６２」は、全長４４２アミノ酸残基から構成されるペプチドであり、ＮＣＢＩの受託番号ＮＭ０１１０１８で示される。ｐ６２は、オートファジーフラックスに関与するタンパク質であり、ＰＥＲＫが活性化されると、その下流に位置するｐ６２の発現量が低下することから、ｐ６２の発現量を評価することにより、ＰＥＲＫの活性化状態を評価することができる。
【００８２】
本発明の一実施形態において、ミトフシン２は、〔１．パーキンソン病の処置用医薬〕の項において記載した通りである。ＰＥＲＫが活性化されると、その下流に位置するミトフシン２の発現量が低下することから、ミトフシン２の発現量を評価することにより、ＰＥＲＫの活性化状態を評価することができる。
【００８３】
本発明の一実施形態において、ＰＥＲＫの活性化状態の評価は、特に限定されないが、例えば、以下のような方法により行われ得る。
【００８４】
（１）試験物質と細胞とを接触させた場合に、試験物質と細胞とを接触させていないときと比較して、ＰＥＲＫのリン酸化の上昇、Ｅ３ユビキチンリガーゼのリン酸化の上昇、ミトフシン２の発現量の低下、ＬＣ３−ＩＩの発現量の低下およびｐ６２の発現量の低下のうちの少なくとも一つが検出された場合に、上記試験物質がパーキンソン病の処置用医薬であると評価する。
【００８５】
（２）試験物質とＰＥＲＫとを接触させた場合に、試験物質とＰＥＲＫとを接触させていないときと比較して、ＰＥＲＫの基質のリン酸化の上昇が検出された場合に、上記試験物質がパーキンソン病の処置用医薬であると評価する。
【００８６】
本明細書中の記載に基づけば、当業者は、本発明の医薬の別の形態（例えば、キット）や、本発明の医薬を用いて疾患を処置（予防および／または治療）する方法、本発明のスクリーニング方法により同定された物質（医薬）を用いて疾患を処置（予防および／または治療）する方法等もまた本発明の範囲内であることを、容易に理解する。
【００８７】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８８】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、実施例においては、パーキンソン病の代表例として、ＬＲＲＫ２の遺伝子変異に起因するパーキンソン病について記載する。
【００８９】
また、本実施例において、単に「ＭＥＦ細胞」と記載した場合は、「野生型のＭＥＦ細胞」を意味する。
【００９０】
〔実施例１〕
＜ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞における促進されたＵＰＲ＞
（１−１）
本願の発明者および他のグループは、以前に、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞がＥＲストレスの影響をより受けやすいことを示すデータを得ていた（Mercado et al., 2013、Samann et al., 2009、Yuan et al., 2011）。そこで、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞において、ＵＰＲによりＥＲのホメオスタシスが変化しているか否かを調べるために実験を行った。
【００９１】
簡潔には、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞およびＭＥＦ細胞を、コントロールまたはツニカマイシン（１μｇ／ｍｌ）で３時間処理した。その後、ＰＢＳで２回洗浄し、イムノブロットにかけた。
【００９２】
イムノブロットは、簡潔には以下の通り行った。すなわち、細胞融解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動して、分子量にしたがってタンパク質を分離した後、ニトロセルロース膜に転写した。このタンパク質を転写したニトロセルロース膜を、各種一次抗体と共に約１６時間インキュベートした。ＴＢＳＴで洗浄後、二次抗体（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ）と共に１時間インキュベートした。ＴＢＳＴで洗浄後、ＥＣＬで標的分子を蛍光発色させて、検出した。
【００９３】
また、ルシフェラーゼレポーターアッセイを以下の通り行った。すなわち、エレクトロポレーション法により、ＡＴＦのためのルシフェラーゼコンストラクトをコードする０．５ｍｇの５  Ｘ  ＡＴＦ−ＧＬ３（ｐ５ＸＡＴＦ６−ＧＬ３プラスミド、Promega製）および０．５ｍｇのＴＫレニラ（レニラプラスミド、Promega製）を、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞およびＭＥＦ細胞にトランスフェクトした。次いで、トランスフェクトしたＭＥＦ細胞を、１Ｍのツニカマイシンでさらに２４時間インキュベートした。Ｄｕａｌ−ＧＬ０  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Promega製）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定および決定した。
【００９４】
その結果を図１Ａ〜１Ｃに示す。なお、図１Ａおよび１Ｂにおいて、コントロールのレベルに対して標準化した値を、一番下のレーンで示す。
【００９５】
[結果]
ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞は、ＭＥＦ細胞と比較して、ＥＲストレスに応答して、パーキンソン病患者の黒質で観察されるＰＥＲＫおよびｅＩＦ２のより多くのリン酸化を示すことが報告されている（Hoozemans et al., 2007、Mercado et al., 2013）。また、ＭＥＦ細胞において、ＰＥＲＫおよびｅＩＦ２αのリン酸化を誘導するＥＲストレスの処理を行うと、下流のシグナル伝達タンパク質ＡＴＦ４、ＧＡＤＤ３４、およびＣＨＯＰの発現が減少することが報告されている（Munoz et al., 2013）。本実施例では、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞が、ＭＥＦ細胞と比較して、ＡＴＦ４、ＧＡＤＤ３４、およびＣＨＯＰのリン酸化を増加させることが示された（図１Ａ）。
【００９６】
一方、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞において、ＸＢＰ１の発現により想定されるＩＲＥ１ａブランチの活性は、ＭＥＦ細胞におけるものと同様であった（図１Ｂ）。さらに、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞において、ルシフェラーゼアッセイにより想定されるＡＴＦ６の転写活性はまた、ＭＥＦ細胞におけるものと同様であった（図１Ｃ）。
【００９７】
したがって、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）は、ＰＥＲＫ／ＣＨＯＰブランチの基底活性を増加させ、ＥＲストレスに応答して、さらにＰＥＲＫ／ＣＨＯＰブランチの活性を促進することが示された。この結果は、促進されたＵＰＲブランチの活性がＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞における過剰なＥＲストレスを反映することを示唆した。
【００９８】
（１−２）
ＵＰＲ活性は、ミトコンドリア機能およびオートファジーの変化を誘導することが報告されている（Bernales et al., 2006、Sano and Reed, 2013）。そこで、ＰＥＲＫにより仲介されるＵＰＲがオートファジーフラックスを誘導するか否かを検討するために、ＥＲストレスで処理したＭＥＦ細胞について、ＬＣ３−ＩＩおよびｐ６２の変化を調べた。
【００９９】
簡潔には、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞およびＭＥＦ細胞に、５μｇのキナーゼ活性型ＰＥＲＫ−ΔＮ（Cullinan et al., 2003）またはＰＥＲＫ  ｓｈＲＮＡを導入し、約２４時間インキュベートした。その後、ＰＢＳで２回洗浄し、イムノブロットにかけた。イムノブロットは、上述の通り行った。
【０１００】
その結果を図１Ｄに示す。なお、図１Ｄにおいて、コントロールのレベルに対して標準化した値を、一番下のグラフで示す。
【０１０１】
[結果]
ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞のＬＣ３−ＩＩおよびｐ６２は、ＥＲストレスに応答して、ＭＥＦ細胞のＬＣ３−ＩＩおよびｐ６２よりも増加した。これは、キナーゼ活性型ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）がオートファジーフラックスを誘導したことを示す。ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞において増加したＬＣ３−ＩＩおよびｐ６２は、キナーゼ活性型ＰＥＲＫ−ΔＮの導入により一部回復した（減少した）。ＰＥＲＫ活性がＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞で生じるという結果とあわせると、オートファジーフラックスにおける下流のシグナル伝達経路は、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）により促進され、キナーゼ活性型ＰＥＲＫの過剰発現により回復する（減少する）ことが示唆された。
【０１０２】
〔実施例２〕
＜ＰＥＲＫによるＥ３ユビキチンリガーゼのリン酸化＞
（２−１）
本願の発明者は、以前に、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞が、減少したＥＲ−ミトコンドリアＣａ２＋輸送により引き起こされるミトコンドリア異常を示すことを見出した。そこでは、ＭＡＭ形成のために必要とされるＭＡＲＣＨ５およびＭＵＬＡＮを含むミトコンドリアＥ３ユビキチンリガーゼの活性が、キナーゼ活性型ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）により抑制されていた。ＰａｒｋｉｎのようなＥ３ユビキチンリガーゼは、ＰＩＮＫ１により仲介されるリン酸化により活性化されるが、ＭＡＲＣＨ５およびＭＵＬＡＮをリン酸化するキナーゼは、不明であった。ＭＡＭにおけるＰＥＲＫおよびＥ３ユビキチンリガーゼ間の近接性を考慮すると、ＭＡＲＣＨ５およびＭＵＬＡＮは、ＰＥＲＫの基質であるとの仮説が立てられる。そこで、この仮説を実証するために、以下に示すインビトロキナーゼアッセイを行った。
【０１０３】
簡潔には、２μｇの単離Ｅ３ユビキチンリガーゼ、６μＣiの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ）、および４μｇの単離ＰＥＲＫを含む、４０μｌのキナーゼバッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＡＴＰ）を用いて、３０℃で３０分間反応を行った。反応混合物を１２％  ＳＤＳ／ＰＡＧＥにかけて、フォトイメイザーを用いたオートラジオグラフィーにより視覚化した。
【０１０４】
その結果を図２Ａに示す。
【０１０５】
[結果]
単離ＰＥＲＫ、単離Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いたインビトロキナーゼアッセイにより、ＰＥＲＫがＥ３ユビキチンリガーゼを直接リン酸化することが明らかとなった。
【０１０６】
（２−２）
ＭＡＲＣＨ５およびＭＵＬＡＮは、ミトコンドリアＲＩＮＧ  Ｅ３ユビキチンリガーゼに属する。ＲＩＮＧＥ３ユビキチンリガーゼの他のメンバーであるＰａｒｋｉｎは、ＰＩＮＫ１により、ＲＩＮＧドメインの上流に位置するＮ末端ユビキチン様ドメインであるセリン６５でリン酸化されることが報告されている（Shiba-Fukushima et al., 2012、Kondapalli et al., 2012）。以前に証明されたリン酸化部位に基づいて（Shiba-Fukushima et al., 2012、Kondapalli et al., 2012）、ＭＡＲＣＨ５およびＭＵＬＡＮのリン酸化部位は、ＲＩＮＧドメインの外側に位置することが明らかとなった。リン酸化される候補のアミノ酸残基は、２つのタンパク質のトポロジカルマッピングにより選択された（ＭＡＲＣＨ５は、４つの膜ドメインからなり、ＭＵＬＡＮは、２つの膜ドメインからなる。）。ここで、ＲＩＮＧドメインと同様に細胞質領域に位置するセリンまたはスレオニン残基をアラニンに突然変異させ、キナーゼアッセイにより解析した結果、１つの保存されたアミノ酸が、ＰＥＲＫによりリン酸化されることが検出された（図２Ｂ）。なお、ＲＩＮＧドメインを特徴づけるシステイン残基を四角の枠囲みで示し、リン酸化のための候補セリン残基を太字で示す。
【０１０７】
この知見を確認するために、ＭＡＲＣＨ５のセリン１３およびＭＵＬＡＮのセリン３００を、部位特異的変異誘発によりアラニンに突然変異させたものを用いて、インビトロキナーゼアッセイを行った。
【０１０８】
インビトロキナーゼアッセイは、簡潔には、４μｇのＰＥＲＫ−ΔＮ、６μＣiの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、および２μｇの野生型ＭＡＲＣＨ５もしくはＭＵＬＡＮまたは突然変異型ＭＡＲＣＨ５もしくはＭＵＬＡＮを含む、４０μｌのキナーゼバッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＡＴＰ）を用いて、３０℃で３０分間反応を行った。反応混合物を１２％  ＳＤＳ／ＰＡＧＥにかけて、フォトイメイザーを用いたオートラジオグラフィーにより視覚化した。
【０１０９】
その結果を図２Ｃに示す。
【０１１０】
[結果]
単離ＰＥＲＫ−ΔＮ、突然変異型ＭＡＲＣＨ５もしくはＭＵＬＡＮおよび［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いたインビトロキナーゼアッセイの結果、オートラジオグラフィーで視覚化した際に両方のアッセイにおいて弱いリン酸化バンドのみが見られたため、突然変異させたセリンがＰＥＲＫによるリン酸化部位の１つであることを示した。
【０１１１】
（２−３）
一般に、酵素活性の翻訳後制御は、リン酸化、スモ化およびユビキチン化を含むタンパク質修飾により行われる（Deshaies and Joazeiro, 2009）。ＰＥＲＫにより仲介されるリン酸化がＥ３ユビキチンリガーゼの活性に影響を与えるか否かを調べるために、ＡＴＰの存在下、組み換えＨＡタグ化Ｕｂ、Ｅ１およびＥ２（ＵｂｃＨ７）酵素、Ｈｉｓ６タグ化ミトフシン２、ならびにＭｙｃタグ化Ｅ３ユビキチンリガーゼを用いたインビトロユビキチンアッセイを行った。
【０１１２】
簡潔には、９０ｎＭ  Ｅ１酵素、４ｍＭ  ＡＴＰ、０．４ｍＭ  ＨＡタグ化Ｕｂ、０．０４μｇ／μｌ  ＵｂｃＨ７、０．０４μｇ／μｌのＨｉｓタグ化ミトフシン２、および０．０４μｇ／μｌの野生型ＭＡＲＣＨ５もしくはＭＵＬＡＮまたは突然変異型ＭＡＲＣＨ５もしくはＭＵＬＡＮを含む、全量１００ｍｌのユビキチンバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）で反応を行った。３７℃で２時間のインキュベーションを行った後、３０００Ｘｇで遠心分離にかけた。Ｈｉｓタグ化ミトフシン２を含むペレットをユビキチンバッファーで洗浄し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにかけた。２０ｍｌのＮｉ−ＮＴＡビーズを含むＮｉ−ＮＴＡ結合バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０）で、上清をインキュベートした。Ｎｉ−ＮＴＡビーズをＮｉ−ＮＴＡ結合バッファーで洗浄し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにかけた。
【０１１３】
その結果を図２Ｄに示す。
【０１１４】
[結果]
ユビキチン化ミトフシン２の量は、リン酸化欠損ＭＡＲＣＨ５（Ｓ１３Ａ）またはＭＵＬＡＮ（Ｓ３００Ａ）を用いたアッセイで減少し、リン酸化模倣ＭＡＲＣＨ５（Ｓ１３Ｄ）およびＭＵＬＡＮ（Ｓ３００Ｄ）を用いたアッセイで増加した。したがって、ＰＥＲＫのリン酸化は、ミトフシン２に対するＥ３ユビキチンリガーゼの活性を増加させることが示された。ツニカマイシンのようなＥＲストレスが、自己リン酸化を介してＰＥＲＫを活性化するという結果と合わせると、ＥＲストレスにより仲介されたＰＥＲＫの活性化がＥ３ユビキチンリガーゼをリン酸化し、次いで、リン酸化Ｅ３ユビキチンリガーゼのミトフシン２に対するリガーゼ活性を促進するとの仮説が有望であることが示唆された。
【０１１５】
〔実施例３〕
＜ＬＲＲＫ２による、Ｅ３ユビキチンリガーゼを介したＰＥＲＫ活性の抑制＞
（３−１）
本願の発明者は、以前に、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）がキナーゼ依存的な方法でＥ３ユビキチンリガーゼを抑制することを見出した。そこで、上記の実施例の結果と合わせると、Ｅ３ユビキチンリガーゼを制御するために、ＰＥＲＫは、ＬＲＲＫ２と拮抗的に作用するとの仮説が立てられる。この仮説を立証するために、Ｅ３ユビキチンリガーゼのリン酸化を、ツニカマイシンで処理したＭＥＦ細胞で解析した。
【０１１６】
簡潔には、ＭＥＦ細胞、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞、およびＬＲＲＫ２−ＩＮ−１（ＣＡＳ  １２３４４８０−８４−２、Calbiochem製）で処理したＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞を、コントロールまたはツニカマイシン（１μｇ／ｍｌ）で４時間処理した。次いで、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、ＰＥＲＫについては、イムノブロットにかけ、ＭＡＲＣＨ５およびＭＵＬＡＮについては、免疫沈降後、イムノブロットにかけた。免疫沈降は、簡潔には以下の通り行った。すなわち、ＮＰ４０含有融解液を用いて、処理後のＭＥＦ細胞のタンパク質を可溶化し、プロテインＧセファロースに結合した一次抗体と４時間混和した。混合物から、ビーズを遠心（１０，０００回転、１分）にて分離し、３回洗浄した。抗体に結合したタンパク質をＳＤＳバッファーに融解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動して、分子量にしたがってタンパク質を分離した後、ニトロセルロース膜に転写した。イムノブロットは、上述の通り行った。
【０１１７】
その結果を図３Ａに示す。なお、図３Ａにおいて、全タンパク質レベルに対するリン酸化タンパク質の比率を、一番下のグラフで示す。
【０１１８】
[結果]
より多くのＥ３ユビキチンリガーゼのリン酸化は、ツニカマイシンで処理したＭＥＦ細胞で検出された。しかし、ツニカマイシンで処理したＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞では、より低いＥ３ユビキチンリガーゼのリン酸化を示した。また、キナーゼ阻害ＬＲＲＫ２−ＩＮ−１で処理したＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞では、Ｅ３ユビキチンリガーゼのリン酸化を回復した。
【０１１９】
これらのことから、Ｅ３ユビキチンリガーゼのリン酸化は、キナーゼ活性型ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）により抑制されることが明らかとなった。注目すべきは、ミトフシン２のレベルは、Ｅ３ユビキチンリガーゼのリン酸化レベルと相関するということである。これは、図２で示されたように、リン酸化Ｅ３ユビキチンリガーゼが、ミトフシン２をユビキチン化し、分解する活性を促進するという知見を支持している。
【０１２０】
Ｅ３ユビキチンリガーゼのリン酸化は、ＬＲＲＫ２およびＰＥＲＫのキナーゼ活性の共通の標的であると考えられる。ここで、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）とＰＥＲＫとが相互作用する方法として、２つの方法が考えられる。１つ目は、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）がＰＥＲＫ活性を直接抑制することであり、２つ目は、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）が活性型ＰＥＲＫによるＥ３ユビキチンリガーゼのリン酸化を抑制することである（さらに、その両方の場合も考えられる）。
【０１２１】
ツニカマイシンにより誘導されるリン酸化ＰＥＲＫのレベルを比較すると、リン酸化ＰＥＲＫは、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞において減少を示さなかった（図３Ａ）。この結果は、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）が、ＰＥＲＫ活性を直接抑制するのではなく、ＰＥＲＫ活性とＥ３ユビキチンリガーゼのリン酸化との間の工程を抑制することを示唆する。この見解は、本願の発明者により以前に示された、自己リン酸化型ＬＲＲＫ２がＥ３ユビキチンリガーゼに直接結合するという報告とも一致する。
【０１２２】
まとめると、ＰＥＲＫは、損傷したミトコンドリア構成成分の除去に加えて、ミトフシン２のような基質のユビキチン化および分解を増加させるために、Ｅ３ユビキチンリガーゼをリン酸化することを介してＭＡＭの形成に関与していると考えられる。
【０１２３】
（３−２）
次いで、ＰＥＲＫ活性におけるＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）の影響を解析した。ＰＥＲＫ活性は、ＥＲ内腔中のＢｉＰと結合することにより妨害されることが報告されている（Hetz, 2012）。ＥＲストレスに応答して、ＢｉＰがＰＥＲＫから解離し、ＰＥＲＫのダイマー化および自己リン酸化が開始する。その結果、活性化されたＰＥＲＫは、ｅＩＦ２αのような基質をリン酸化する。
【０１２４】
このようなこの制御システムに加えて、ミトフシン２は、ＭＡＭのＥＲ側で、ＰＥＲＫ活性を直接制御することが報告されている（Munoz et al., 2013、Celardo et al., 2016）。ここで、ミトフシン２の欠損は、過剰にＰＥＲＫを活性化し、その後のＵＰＲで、あまりにも多くのＵＰＲが細胞アポトーシスを誘導する。本願の発明者は、以前に、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞において、ミトフシン２に対するＥ３ユビキチンリガーゼが不活化されて、生じたミトフシン２の蓄積がミトコンドリア異常を引き起こすことを見出した。
【０１２５】
したがって、蓄積したミトフシン２がＰＥＲＫ活性を減少させ、それにより、ＥＲストレスに応答して、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞におけるＵＰＲを減少させるという仮説が立てられる。この場合において、減少したＵＰＲにより引き起こされるより多くの損傷したミトコンドリアがＥＲ機能を悪化させる可能性が考えられる。この可能性を検証するために、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞にミトフシン２  ｓｈＲＮＡを導入する実験を行った。
【０１２６】
簡潔には、ＭＥＦ細胞に、５μｇのミトフシン２（Ｍｆｎ２）またはミトフシン２  ｓｈＲＮＡ（Ｍｆｎ２  ｓｈＲＮＡ）を導入し、約１６時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、該ＭＥＦ細胞を、コントロールまたはツニカマイシン（１μｇ／ｍｌ）で４時間処理した。次いで、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、ＰＥＲＫについては、イムノブロットにかけ、ＭＡＲＣＨ５およびＭＵＬＡＮについては、免疫沈降後、イムノブロットにかけた。なお、ミトフシン２  ｓｈＲＮＡは、内因性のミトフシン２をコントロールのほぼ１０％まで減少させた。免疫沈降およびイムノブロットは、上述の通り行った。
【０１２７】
その結果を図３Ｂに示す。なお、図３Ｂにおいて、全タンパク質レベルに対するリン酸化タンパク質の比率を、一番下のグラフで示す。
【０１２８】
[結果]
ミトフシン２  ｓｈＲＮＡは、ＥＲストレスに応答して、部分的にＰＥＲＫキナーゼ活性を回復した。この結果と一致して、ミトフシン２  ｓｈＲＮＡは、ＭＡＲＣＨ５およびＭＵＬＡＮのリン酸化を増加させた。したがって、ミトフシン２は、ＰＥＲＫの不活化を介してＥ３ユビキチンリガーゼを抑制することが示された。ＰＥＲＫ欠損ＭＥＦ細胞がＥＲストレスへの感受性を減少させるという以前の報告（Verfaillie et al., 2012）と合わせると、ＰＥＲＫおよびＬＲＲＫ２は、異なる細胞機能に関与するが、機能の欠損（ＰＥＲＫ）または機能の獲得（ＬＲＲＫ２）を生じる両遺伝子の突然変異は、同様の表現型、すなわち、ＥＲストレスに応答して減少したＵＰＲを生じると考えられる。
【０１２９】
〔実施例４〕
＜ＥＲストレスに応答したＰＥＲＫ活性のポジティブフィードバック＞
上記実施例におけるインビトロでの実験は、ミトフシン２のレベルを介したＬＲＲＫ２およびＰＥＲＫの機能的なつながりを示した。本願の発明者は、以前に、ミトフシン２のレベルは、Ｅ３ユビキチンリガーゼにより制御されており、Ｅ３ユビキチンリガーゼの活性は、そのリン酸化状態に依存することを見出している。このことより、ＰＥＲＫがＥ３ユビキチンリガーゼの活性化およびミトフシン２の分解を介して自身を活性化していることが考えられる。
【０１３０】
このようなＰＥＲＫに関するポジティブフィードバック機構が、ＥＲストレスに応答して生じるか否かを調べるために、ＭＡＲＣＨ５およびＭＵＬＡＮ、またはリガーゼ欠損ＭＡＲＣＨ５（Ｈ４３Ｗ）およびＭＵＬＡＮ（Ｃ３３９Ａ）をトランスフェクトしたＭＥＦ細胞を用いて、免疫沈降−イムノブロットを行った。
【０１３１】
簡潔には、ＭＥＦ細胞に、５μｇのＭＡＲＣＨ５およびＭＵＬＡＮの混合物、または５μｇのリガーゼ欠損ＭＡＲＣＨ５（Ｈ４３Ｗ）および ＭＵＬＡＮ（Ｃ３３９Ａ）の混合物を導入し、約１６時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、該ＭＥＦ細胞を、コントロールまたはツニカマイシン（１μｇ／ｍｌ）で４時間処理した。次いで、ＰＢＳで２回洗浄し、イムノブロットにかけた。イムノブロットは、上述の通り行った。
【０１３２】
その結果を図３Ｃに示す。なお、図３Ｃにおいて、全ＰＥＲＫレベルに対するリン酸化ＰＥＲＫレベルの比率、およびアクチンに対するミトフシン２の比率を、一番下のグラフで示す。
【０１３３】
[結果]
内因性のリン酸化ＰＥＲＫは、ＭＡＲＣＨ５およびＭＵＬＡＮの導入により増加したが、リガーゼ欠損ＭＡＲＣＨ５（Ｈ４３Ｗ）およびＭＵＬＡＮ（Ｃ３３９Ａ）の導入により増加しなかった。同時に、ミトフシン２のレベルは、ＭＡＲＣＨ５およびＭＵＬＡＮの導入により減少したが、リガーゼ欠損ＭＡＲＣＨ５（Ｈ４３Ｗ）およびＭＵＬＡＮ（Ｃ３３９Ａ）の導入により減少しなかった。したがって、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ミトフシン２のユビキチン仲介分解を介して、ＰＥＲＫキナーゼ活性を活性化することが示された。
【０１３４】
まとめると、ＰＥＲＫからのＢｉＰ解離による最初のＰＥＲＫキナーゼ活性が、ＰＥＲＫによるＥ３ユビキチンリガーゼのリン酸化を含むポジティブフィードバックループにスイッチを入れ、Ｅ３ユビキチンリガーゼによりミトフシン２を減少させ、ミトフシン２の減少によりＰＥＲＫ活性化を促進することが示唆された（図４Ａ）。
【０１３５】
〔実施例５〕
＜ＰＥＲＫ活性化によるＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）仲介ミトコンドリア異常の回復＞
図４Ａで示したモデルでは、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）は、ＰＥＲＫによるＥ３ユビキチンリガーゼのリン酸化を妨害する可能性が考えられる。そこで、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞におけるミトフシン２とＰＥＲＫ活性との相互関係を調べるために、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞において、ＰＥＲＫ活性を促進する実験を行った。
【０１３６】
簡潔には、ＭＥＦ細胞およびＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞を、ＰＥＲＫアクチベーターまたはＰＥＲＫインヒビターの存在下、コントロールまたはツニカマイシン（１μｇ／ｍｌ）で４時間処理した。ＰＥＲＫアクチベーターとしては、３μＭのＥＩＦ２ＡＫ３  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＣＣＴ０２０３１２（３２４８７９）、Calbiochem製）、または１０μＭ  のＳａｌｕｂｒｉｎａｌ（ＣＡＳ  ４０５０６０−９５−９、Cayman Chemical製）を用いた。また、ＰＥＲＫインヒビターとしては、０．３μＭ  ＧＳＫ２６０６４１４（ＣＡＳ  １３３７５３１−８９−１、TOCRIS製）を用いた。なお、ＥＩＦ２ＡＫ３  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＣＣＴ０２０３１２（３２４８７９））は、６−ブロモ−３−[５−（４−ブロモ−フェニル）−１−（３−ジエチルアミノ−プロピオニル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−３−イル]−４−フェニル−１Ｈ−キノリン−２−オンで示される化合物である。また、Ｓａｌｕｂｒｉｎａｌ（ＣＡＳ  ４０５０６０−９５−９）は、３−フェニル−Ｎ−[２，２，２−トリクロロ−１−[[（８−キノリニルアミノ）チオキソメチル]アミノ]エチル]−２−プロペンアミドで示される化合物である。
【０１３７】
次いで、ＰＢＳで２回洗浄し、イムノブロットにかけた。イムノブロットは、上述の通り行った。
【０１３８】
カルシウムイメージングは、簡潔には以下の通り行った。すなわち、ミトコンドリアカメレオン発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．０−２ｍｔ−ｃａｍｅｌｅｏｎ）は、Dr. Roger Tsien（カリフォルニア大学）から提供を受けた（Palmer et al., 2006）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Invitrogen製）を用いて、３．５ｃｍのコンフォーカルディッシュに播種したＭＥＦ細胞に、５μｇのｐｃＤＮＡ３．０−２ｍｔ−ｃａｍｅｌｅｏｎをトランスフェクトした。２日後、細胞を２回洗浄し、Ｈａｎｋｓ’  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ、１４２ｍＭ  ＮａＣｌ、５．６ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．３４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．４４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、４．２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および５．６ｍＭ  グルコース、ｐＨ７．４）で維持した。カルシウムイメージング実験は、蛍光レーザー顕微鏡を用いて行った。カメレオンのＤｕａｌ−ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｒａｔｉｏ  ｉｍａｇｉｎｇは、ＢＰ４２０／１０  励起フィルター、４４０／５２０  ダイクロイックミラー、およびフィルターチェンジャーを用いて切り替えられる２つの発光フィルター（シアン蛍光タンパク質のためにＢＰ４７２／３０、およびＹＦＰのためにＢＰ５４２／２７）を用いて行った。暴露時間は１００ｍｓであり、イメージは３秒毎に集めた。ベースライン（５０秒）の測定値をブラジキニン（ＢＫ）の最初のパルスの前に得た。ＢＫをＨＢＳＳに溶解し、２．５μＭの濃度とした。いくつかの実験では、ＢＫで刺激する前に、ＭＥＦ細胞を２−アミノ−エトキシジフェニルボレート（２−ＡＰＢ、２０μＭ）で、室温で３０分間プレインキュベートした。以前に示された方法（Palmer-AE, Chem Biol, 2006, 13: 521）により、ミトコンドリア内の自由Ｃａ２+濃度を決定した。
【０１３９】
ミトコンドリアのＣａ２＋吸収は、透過型ＭＥＦ細胞で行った。細胞質のイオン組成を模倣するバッファー（１３０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、５ｍＭ  コハク酸、５ｍＭ  リンゴ酸、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ピルビン酸、０．５ｍＭ  ＡＴＰおよび０．１ｍＭ  ＡＤＰ（ｐＨ７．０））で、ＭＥＦ細胞を維持した。バッファーに、１００μＭ  ＥＧＴＡまたは２ｍＭ  ＥＧＴＡのいずれか、および２ｍＭ  ＨＥＥＤＴＡ−バッファーＣａ２＋を補充した（１または２μＭ）。ＦＲＥＴイメージングの間、５０ｍＭのジギトニンを用いた１分間の潅流により、ＭＥＦ細胞に孔をあけた。ミトコンドリアのＣａ２＋吸収速度を、ＳＬＯＰＥエクセル関数を用いた一次導関数として計算し、３つの時間点について平滑化した。Ｃａ２＋添加の間に到達したより高い値が最大のＣａ２＋吸収スピードを示す。
【０１４０】
その結果を図４Ｂ〜４Ｅに示す。なお、図４Ｂにおいて、コントロールのレベルに対して標準化した値を、一番下のグラフで示す。図４Ｃおよび４Ｄにおいて、絶対ミトコンドリアＣａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｍ）は、ＭＥＦ細胞において、ブラジキニン（２．５μＭ）に応答して変化する。図４Ｄおよび４Ｅにおいて、エラーバーは、６回の独立した実験からの±ＳＤを示す。Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔを用いたＯｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ。＊は、コントロールＭＥＦ細胞と比較して、Ｐ＜０．０５を示す。
【０１４１】
[結果]
いずれのＰＥＲＫアクチベーターも、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）により増加したオートファジーフラックスを回復させる（減少させる）ことに成功した。ＰＥＲＫアクチベーターは、さらに、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）により減少したＥＲ−ミトコンドリアＣａ２＋輸送を回復させた（図４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅ）。対照的に、ＰＥＲＫインヒビターは、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞における、オートファジーフラックスの増加およびＥＲ−ミトコンドリアＣａ２＋輸送に影響を与えなかった。したがって、ＵＰＲのために必要とされるＰＥＲＫキナーゼ活性は、ＬＲＲＫ２（Ｇ２０１９Ｓ）発現ＭＥＦ細胞におけるＥＲ−ミトコンドリア異常を回復させることに成功した。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明を用いれば、これまでにはなかった新たなパーキンソン病の処置用医薬、およびそのような医薬を探索するためのスクリーニング方法を提供できるので、医薬分野のさらなる発展に貢献し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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