(57)【要約】【課題】フィーカリバクテリウム属の菌の培養方法を提供すること。【解決手段】ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清の存在下に、フィーカリバクテリウム属の菌を培養することを特徴とするフィーカリバクテリウム属の菌の培養方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清の存在下に、フィーカリバクテリウム属の菌を培養することを特徴とするフィーカリバクテリウム属の菌の培養方法。
【請求項２】
時間の経過による、培養液中のフィーカリバクテリウム属の菌の生菌数及び／又は生菌数の含有割合の減少が抑制されていることを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
ビフィドバクテリウム属の菌が、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム  ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、及びビフィドバクテリウム  インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）からなる群より選択される１以上であることを特徴とする請求項１又は２に記載の培養方法。
【請求項４】
ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清を含有する培養液。
【請求項５】
培養液全体に対するビフィドバクテリウム属の菌の培養上清の割合が１〜１００体積％であることを特徴とする請求項４に記載の培養液。
【請求項６】
培養液が、フィーカリバクテリウム属の菌の培養液であることを特徴とする請求項４又は５に記載の培養液。
【請求項７】
培養開始後の最大生菌数に対する、最大生菌数に達したときから６〜１２時間の範囲に属するいずれかの時点を経過したときの生菌数の減少の割合が、ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清を含有しない培養液のそれより小さいことを特徴とする請求項４〜６に記載の培養液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィーカリバクテリウム属の菌の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィーカリバクテリウム属の菌は、超嫌気性菌であるため培養が困難であるところ、フィーカリバクテリウム プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）は、ビフィドバクテリウム  アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）と共培養することにより増殖が促進され、その増殖にはビフィドバクテリウム  アドレセンティス由来の酢酸が関与していることが知られている（非特許文献１）。尚、酢酸の液性は酸性である。
【０００３】
しかしながら、共培養ではなく、ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清の存在下、すなわちビフィドバクテリウム属の菌の不存在下に、フィーカリバクテリウム属の菌を培養することを特徴とするフィーカリバクテリウム属の菌の培養方法はこれまでに報告がない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｄａｖｉｄ  Ｒｉｏｓ−Ｃｏｖｉａｎら、“Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｕｔｙｒａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｒｏｓｓｆｅｅｄｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  ａｎｄ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ．”、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０１５年９月２９日発行、Ｖｏｌ．３６２、Ｎｏ．２１、Ｆｉｇ．２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、フィーカリバクテリウム属の菌の培養方法を提供することを目的とする。好ましくは、本発明は、目的とするフィーカリバクテリウム属の菌の収量を向上させる、又は時間の経過による、培養液中のフィーカリバクテリウム属の菌の生菌の減少を抑制させる、フィーカリバクテリウム属の菌の培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清の存在下に、フィーカリバクテリウム属の菌を培養することによって、時間の経過による、培養液中のフィーカリバクテリウム属の菌の生菌数の含有割合の減少を抑制することができることを見出し、この知見に基づいてさらに研究を進め、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の発明に関する。
〔１〕ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清の存在下に、フィーカリバクテリウム属の菌を培養することを特徴とするフィーカリバクテリウム属の菌の培養方法。
〔２〕時間の経過による、培養液中のフィーカリバクテリウム属の菌の生菌数及び／又は生菌数の含有割合の減少が抑制されていることを特徴とする前記〔１〕に記載の培養方法。
〔３〕ビフィドバクテリウム属の菌が、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム  ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、及びビフィドバクテリウム  インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）からなる群より選択される１以上であることを特徴とする前記〔１〕又は〔２〕に記載の培養方法。
〔４〕ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清を含有する培養液。
〔５〕培養液全体に対するビフィドバクテリウム属の菌の培養上清の割合が１〜１００体積％であることを特徴とする前記〔４〕に記載の培養液。
〔６〕培養液が、フィーカリバクテリウム属の菌の培養液であることを特徴とする前記〔４〕又は〔５〕に記載の培養液。
〔７〕培養開始後の最大生菌数に対する、最大生菌数に達したときから６〜１２時間の範囲に属するいずれかの時点を経過したときの生菌数の減少の割合が、ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清を含有しない培養液のそれより小さいことを特徴とする前記〔４〕〜〔６〕に記載の培養液。
〔８〕前記〔１〕に記載の方法によって得られる培養液から採取されるフィーカリバクテリウム属の菌。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、フィーカリバクテリウム属の菌の培養方法を提供することができる。好ましくは、本発明は、目的とするフィーカリバクテリウム属の菌の収量を向上させる、又は時間の経過による、培養液中のフィーカリバクテリウム属の菌の生菌の減少を抑制させる、フィーカリバクテリウム属の菌の培養方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、コントロール培地及び実施例１の培地におけるフィーカリバクテリウム属の菌の生菌数（１２、１８、及び２４時間培養液）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のフィーカリバクテリウム属の菌の培養方法は、ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清の存在下に、フィーカリバクテリウム属の菌を培養することを特徴とする。
【００１１】
〔ビフィドバクテリウム属の菌〕
ビフィドバクテリウム属の菌として、例えばビフィドバクテリウム  ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂ．  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム  ブレーベ（Ｂ．  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム  インファンティス（Ｂ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム  アドレセンティス（Ｂ．  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム  シュードロンガム（Ｂ．  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム  サーモフィルム（Ｂ．  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）等が挙げられる。ビフィドバクテリウム  ビフィダムとして特にビフィドバクテリウム  ビフィダムＧ９−１（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  Ｇ９−１）が好ましい。さらに本発明において用いられるビフィドバクテリウム属の菌は、例えば、形態的特徴（例えば、コロニーの形状、細胞の形等）、生理、生化学性状（例えば、糖の資化性、生育温度、至適ｐＨ等）、化学分類学的性状（菌体脂肪酸組成等）等の性状を既知のビフィドバクテリウム属の菌と比較し、その性状の比較結果に基づき同定した菌であってもよく、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析に基づき同定した菌等であってもよい。ビフィドバクテリウム属の菌は、１種単独で使用してもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００１２】
〔ビフィドバクテリウム属の菌の取得方法〕
ビフィドバクテリウム属の菌の菌体は、例えばＡＴＣＣ（登録商標）又はＩＦＯ等の機関や財団法人  日本ビフィズス菌センター、独立行政法人  製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター等から容易に入手することができる。また、市販されているものを適宜使用することもできる。
培養前のビフィドバクテリウム属の菌は凍結保存状態であってもよい。
【００１３】
〔ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清の調製方法〕
（１）ビフィドバクテリウム属の菌の培養（１）
通常、ビフィドバクテリウム属の菌を培地に接種し培養する。
【００１４】
ビフィドバクテリウム属の菌を培養するために用いる培地（以下、単に培地Ａと略記する場合がある。）として、例えばブレインハートインフュージョン培地等の、栄養性の高い汎用増殖培地を適量（例えば１〜１０ｗ／ｖ％、好ましくは１〜５ｗ／ｖ％）含有する培地等が挙げられる。
培地Ａは、その他に、糖類、アミノ酸、酵母エキス、水又はそれらの任意の組み合わせ等を含有していてもよい。上記ブレインハートインフュージョン培地、糖類、アミノ酸及び酵母エキスは、市販品を入手して使用することができる。
糖類としては、例えば、単糖類、二糖類、三糖類、四糖類、オリゴ糖、又は多糖等が挙げられる。特に二糖類として、セロビオース、マルトース、トレハロース、スクロース、ラクツロース、ラクトース、又はそれらの任意の組み合わせが例示され、中でも、セロビオース及び／又はマルトースが好ましい。培地Ａ中の糖類の含有割合は、例えば０．１〜１ｗ／ｖ％であってもよく、０．１〜０．５ｗ／ｖ％であってもよい。
アミノ酸として、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、ピロリシン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、セレノシステイン、バリン、トリプトファン、チロシン又はそれらの任意の組み合わせが例示され、中でもシステインが好ましい。培地Ａ中のアミノ酸の含有割合は、例えば０．０１〜０．１ｗ／ｖ％であってもよく、０．０１〜０．０５ｗ／ｖ％であってもよい。
酵母エキスとは、例えば、原料となる酵母体を自己消化や酵素添加等により分解してエキス化したものをいう。培地Ａ中の酵母エキスの含有割合は、例えば０．１〜１ｗ／ｖ％であってもよく、０．１〜０．５ｗ／ｖ％であってもよい。
培地Ａは、ブレインハートインフュージョン培地、セロビオース、マルトース、システイン、酵母エキス、水を任意の割合で含有する培地が特に好ましい。
培地Ａの液性は中性（例えば、ｐＨ６〜８、ｐＨ７〜８）であることが好ましく、中性にするためにｐＨ調整剤を使用してもよい。
上記例示した各成分を混合して、高圧蒸気滅菌器を用いて加熱滅菌して、培地を調製することができる。
培地Ａの一例として、後述の製造例１に記載のＬＹＢＨＩ液体培地が挙げられる。
上記したような培地を用いることで、ビフィドバクテリウム属の菌が増殖しやすくなる。
【００１５】
ビフィドバクテリウム属の菌を培地Ａに接種する際の、培地Ａに対するビフィドバクテリウム属の菌の割合は、例えば、1×１０５〜1×１０９ｃｆｕ／ｍＬであってもよく、1×１０６〜1×１０８ｃｆｕ／ｍＬであってもよい。
【００１６】
上記培養の温度は、例えば３５〜３９℃であることが好ましく、３６〜３８℃であることがより好ましい。当該範囲内で、ビフィドバクテリウム属の菌が増殖しやすくなる。
上記培養の時間は、例えば１２〜２４時間であることが好ましく、１８〜２４時間であることがより好ましい。
【００１７】
（２）ビフィドバクテリウム属の菌の培養（２）
上記（１）で得られた培養液を、上記（１）に記載の培地Ａで、任意の割合で希釈し、さらに上記（１）に記載の培養温度及び培養時間にて、ビフィドバクテリウム属の菌を培養してもよい。希釈の割合は例えば１０倍又は１００倍希釈であってもよい。このサイクルを任意の回数繰り返してもよい。
【００１８】
（３）ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清の取得
上記（１）又は（２）で得られた培養液を、遠心して、上清を回収する。
回収した上清の液性を中性（ｐＨ６〜８、ｐＨ６．５〜７．５、ｐＨ６．８〜７．２、ｐＨ６．９〜７．１、又はｐＨ７．０）に調製後、滅菌することで、ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清が得られる。
遠心は、例えば、室温で、３,０００×gで１０分間行うことが好ましい。
滅菌は、例えば、フィルター濾過により行うことが好ましい。その際のフィルターの孔径は、例えば０．０１〜０．３μｍであることが好ましく、０．２〜０．２２μｍであることがより好ましい。その他、公知の滅菌方法（湿熱滅菌法、乾熱滅菌法、高周波滅菌法等の加熱法；酸化エチレンガス滅菌法、過酸化水素による滅菌法等のガス法；ガンマ線照射滅菌法、電子線照射滅菌法等の放射線法等を含む）により滅菌を行ってもよい。
ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清の調製方法として、後述の製造例２を参照してもよい。
【００１９】
（４）ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清含有培地の調製
ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清と培地Ａとを混合することにより、ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清含有培地（以下、単に培地Ｂと略記する場合がある。）を調製することができる。
培地Ｂに対するビフィドバクテリウム属の菌の培養上清の含有割合は、例えば１〜５０体積％であってもよく、１０〜５０体積％であってもよく、２０〜４０体積％であってもよい。
【００２０】
〔ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清又はそれを含有する培地の性質〕
ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清又はそれを含有する培地は、通常、既に滅菌処理が行われているため、実質的にはビフィドバクテリウム属の菌が殺滅されている状態である。具体的には、生育可能なビフィドバクテリウム属の菌が、ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清又はそれを含有する培地中に存在する確率が、１／１００００００以下で無菌保証水準を満たすことが好ましい。
ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清又はそれを含有する培地のｐＨは中性であることが好ましく、具体的にはｐＨ６〜８であることが好ましく、ｐＨ６．５〜７．５であることがより好ましく、ｐＨ６．８〜７．２であることがより好ましく、ｐＨ６．９〜７．１であることがより好ましく、ｐＨ７．０であることが特に好ましい。
【００２１】
〔フィーカリバクテリウム属の菌〕
本発明において用いられるフィーカリバクテリウム属の菌は、特に限定されるものでなく、例えば、フィーカリバクテリウム プラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）等であってもよい。フィーカリバクテリウム プラウスニッツィイとしては、例えば、フィーカリバクテリウム プラウスニッツィイ ＡＴＣＣ２７７６８、フィーカリバクテリウム プラウスニッツィイ ＡＴＣＣ２７７６６等が挙げられる。さらに本発明において用いられるフィーカリバクテリウム属の菌は、例えば、形態的特徴（例えば、コロニーの形状、細胞の形等）、生理、生化学性状（例えば、糖の資化性、生育温度、至適ｐＨ等）、化学分類学的性状（菌体脂肪酸組成等）等の性状を既知のフィーカリバクテリウム属の菌と比較し、その性状の比較結果に基づき同定した菌であってもよく、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析に基づき同定した菌等であってもよい。フィーカリバクテリウム属の菌は、１種単独で使用してもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００２２】
〔フィーカリバクテリウム属の菌の取得方法〕
フィーカリバクテリウム属の菌の菌体は、例えば、ヒト又は非ヒト動物の糞便等から分離及び精製する等して、自然界又は生体内から取得することができ、又は、例えばＡＴＣＣ又はＩＦＯ等の機関や財団法人  日本ビフィズス菌センター、独立行政法人  製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター等から入手することができる。また、市販されているものを適宜使用することもできる。
培養前のフィーカリバクテリウム属の菌は凍結保存状態であってもよい。
【００２３】
〔フィーカリバクテリウム属の菌の準備〕
フィーカリバクテリウム属の菌を培地に接種し、嫌気下で培養し、フィーカリバクテリウム属の菌を準備することができる。
フィーカリバクテリウム属の菌を培養するために用いる培地として、例えば、前記培地Ａを用いてよい。
フィーカリバクテリウム属の菌を培地Ａに接種する際の、培地Ａに対するフィーカリバクテリウム属の菌の割合は、例えば、1×１０４〜1×１０８ｃｆｕ／ｍＬであってもよく、1×１０５〜1×１０７ｃｆｕ／ｍＬであってもよい。
上記培養の温度は、例えば３５〜３９℃であることが好ましく、３６〜３８℃であることがより好ましい。当該範囲内で、フィーカリバクテリウム属の菌が増殖しやすくなる。
上記培養の時間は、例えば２０〜５０時間であることが好ましく、２４〜４８時間であることがより好ましい。
嫌気下でフィーカリバクテリウム属の菌を培養するために、嫌気ボックス又は嫌気チャンバーを使用してもよい。嫌気ボックス又は嫌気チャンバーは、市販されているものを用いてよい。
培養して得られたフィーカリバクテリウム属の菌を含有する培地を以下、培養液Ｃと略記する場合がある。
【００２４】
〔フィーカリバクテリウム属の菌の培養方法〕
培地Ｂに培養液Ｃを接種、又は培地Ｂと培養液Ｃとを接触若しくは混合する等して、ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清の存在下フィーカリバクテリウム属の菌を培養する。
培養液Ｃと培地Ｂの体積比（培養液Ｃ：培地Ｂ）は、例えば１：（５０〜１００）であることが好ましく、１：（９０〜９９）であることが好ましい。
上記培養の温度は、例えば３５〜３９℃であることが好ましく、３６〜３８℃であることがより好ましい。
上記培養の時間は、例えば１２〜４８時間であることが好ましく、１８〜４８時間又は１８〜２４時間であることがより好ましい。
嫌気下でフィーカリバクテリウム属の菌を培養するために、嫌気ボックス又は嫌気チャンバーを使用してもよい。嫌気ボックス又は嫌気チャンバーは、市販されているものを用いてよい。
フィーカリバクテリウム属の菌の培養方法において、用いる培地、試験器具は２４時間以上嫌気ボックス内で還元したものを用いることが好ましい。
フィーカリバクテリウム属の菌の培養方法として、後述の試験例１を参照してもよい。
【００２５】
上記フィーカリバクテリウム属の菌の培養方法によって得られる培養液から採取されるフィーカリバクテリウム属の菌も本発明の範疇である。
フィーカリバクテリウム属の菌は、脂肪関連疾患及び／又は炎症の予防又は治療に有用である。脂肪関連疾患の例として、メタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）（非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を含む）、高脂血症、肝硬変又は肝臓がん等が挙げられる。炎症の例として、機械的刺激、熱、紫外線等、強酸、強アルカリ、有害薬品、細菌、ウイルス、寄生虫等の外因性炎症、アレルギー、自己免疫異常（例えば、アトピー性皮膚炎、関節リウマチ等）、炎症物質の産生（例えば、エンドトキシン）、臓器の機能異常又はストレス（例えば、腱鞘炎、変形性関節症）等の内因性炎症等が挙げられる。すなわち、フィーカリバクテリウム属の菌は、特に、医薬又は食品の分野で有用である。
【００２６】
〔ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清を含有する培養液〕
本発明はまた、ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清を含有する培養液を提供する。当該培養液は、フィーカリバクテリウム属の菌を含有していなくてもよく（上記培地Ｂ参照）、含有していてもよい。当該培養液がフィーカリバクテリウム属の菌を含有しない場合、当該培養液は、フィーカリバクテリウム属の菌の培養のための培養液として有用である。当該培養液がフィーカリバクテリウム属の菌を含有する場合、当該培養液は、フィーカリバクテリウム属の菌をビフィドバクテリウム属の菌の培養上清に接種した直後の培養液であってもよく、フィーカリバクテリウム属の菌をビフィドバクテリウム属の菌の培養上清に接種して、一定時間（例えば１２〜４８時間）、フィーカリバクテリウム属の菌を培養させた後の培養液であってもよい。
【００２７】
当該培養液がフィーカリバクテリウム属の菌を含有しない場合、当該培養液に対するビフィドバクテリウム属の菌の培養上清の割合は、例えば、１〜５０体積％であってもよく、１０〜５０体積％であってもよく、２０〜４０体積％であってもよい。上記割合のビフィドバクテリウム属の菌の培養上清を含有することにより、より優れた本発明の効果が得られ得る。
当該培養液がフィーカリバクテリウム属の菌を含有する場合、当該培養液に対するビフィドバクテリウム属の菌の培養上清の割合は、例えば、１〜５０体積％であってもよく、１０〜５０体積％であってもよく、２０〜４０体積％であってもよい。上記割合のビフィドバクテリウム属の菌の培養上清を含有することにより、より優れた本発明の効果が得られ得る。
【００２８】
〔フィーカリバクテリウム属の菌の生菌数〕
当該培養液がフィーカリバクテリウム属の菌を含有する場合、培養開始後の最大生菌数に達したときから６〜１２時間の範囲に属するいずれかの時点を経過したときのフィーカリバクテリウム属の菌の生菌数は、５×１０６ｃｆｕ／ｍＬ以上（例えば５×１０６ｃｆｕ／ｍＬ〜１×１０８ｃｆｕ／ｍＬ）であることが好ましい。この場合において、培養開始後、すなわちフィーカリバクテリウム属の菌をビフィドバクテリウム属の菌の培養上清を含有する培地に接種後、最大生菌数に達するまでの時間は、培養条件により変更し得るが、例えば約１１〜１３時間（特に約１２時間）であってもよい。
【００２９】
〔フィーカリバクテリウム属の菌の生菌数の減少抑制〕
本発明のフィーカリバクテリウム属の菌の培養方法により、又は、ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清を含有する培養液を使用することにより、時間の経過による、培養液中のフィーカリバクテリウム属の菌の生菌数の含有割合の減少を抑制し得る。すなわち、本発明のフィーカリバクテリウム属の菌の培養方法により、又は、ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清を含有する培養液を使用することにより、ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清を含有しない培養液を使用する場合に比べて、培養開始後の最大生菌数に対する、最大生菌数に達したときから、例えば６〜１２時間の範囲に属するいずれかの時点を経過したときの生菌数の減少の割合が小さい。
具体的には、例えば、培養開始後の最大生菌数に対する、最大生菌数に達したときから６時間経過したときの生菌数の減少の割合が０％〜９０％であることが好ましく、０％〜８０％であることがより好ましく、０％〜７０％であることがさらに好ましく、０％〜６０％であることがさらに好ましく、０％〜５０％であることがさらに好ましく、０％〜４０％であることがさらに好ましく、０％〜３０％であることがさらに好ましく、０％〜２０％であることがさらに好ましく、０％〜１０％であることが特に好ましい。また、例えば、培養開始後の最大生菌数に対する、最大生菌数に達したときから１２時間経過したときの生菌数の割合が０％〜９５％であることが好ましく、０％〜９０％であることがより好ましく、０％〜８０％であることが特に好ましい。
【００３０】
〔フィーカリバクテリウム属の菌の生菌数の測定〕
平板培養法により、フィーカリバクテリウム属の菌の生菌数を測定することができる。具体的には、例えば、３７℃で一定時間（例えば１２、１８又は２４時間）、嫌気ボックス内で培養したコントロール培地及びビフィドバクテリウム属の菌の培養上清含培地を、希釈液を用いて１０倍希釈を繰り返し、１００μＬ中の生菌数が２０〜２００個となるよう希釈し、ペトリ皿に５０℃に保ったカンテン培地を２０ｍＬ加えて、固化させておいたカンテン培地に希釈した培養液１００μＬを塗沫し、３７℃の嫌気ボックス内にて４８〜７２時間培養し、出現したコロニー数及び希釈倍率から培養液１ｍＬ中の生菌数を求めることができる。なお、試験に用いる培地、試験器具は２４時間以上嫌気ボックス内で還元したものを用い、作業は嫌気ボックス内にて実施することが好ましい。
上記希釈液の調製方法として、後述の製造例３を参照してもよい。
上記カンテン培地は、培地Ａにカンテンを適量加えて、滅菌して調製しうる。上記カンテン培地の調製方法として、後述の製造例４を参照してもよい。
フィーカリバクテリウム属の菌の培養方法として、後述の試験例２を参照してもよい。
【００３１】
本発明は、本発明の効果を奏する限り、本発明の技術的範囲内において、上記の構成を種々組み合わせた態様を含む。
【実施例】
【００３２】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、多くの変形が本発明の技術的思想内で当分野において通常の知識を有する者により可能である。
【００３３】
〔製造例１〕ＬＹＢＨＩ液体培地の調製
下記の成分を混合し、ｐＨを７．２〜７．６に調整し、高圧蒸気滅菌器を用いて１２１℃で１５分間加熱して滅菌してＬＹＢＨＩ液体培地を調製した。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
〔製造例２〕ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清の調製
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  Ｇ９−１の凍結保存菌株（凍結保存時の培養液中の菌数：約１０９ｃｆｕ／ｍＬ）を、ＬＹＢＨＩ液体培地１０ｍＬに接種し、３７℃、１８〜２４時間培養した。本培養液をＬＹＢＨＩ液体培地１００ｍＬに１％接種し、３７℃、１８〜２４時間培養後、遠心（３,０００×g、１０分間、室温）して上清を回収し、ｐＨ７.０に調製後、フィルター（０.２２μｍ）で濾過滅菌し、ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清を調製した。
【００３６】
〔製造例３〕希釈液の調製
下記の成分を混合し、ｐＨを６．８〜７．０に調整し、高圧蒸気滅菌器を用いて１２１℃で１５分間加熱して滅菌して、希釈液を調製した。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
〔製造例４〕ＬＹＢＨＩカンテン培地の調製
製造例１で製造したＬＹＢＨＩ液体培地の組成にカンテン１５ｇを加え、高圧蒸気滅菌器を用いて１２１℃で１５分間加熱して滅菌して、ＬＹＢＨＩカンテン培地を調製した。
【００３９】
〔実施例１〕ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清含有培地
製造例１で製造したＬＹＢＨＩ液体培地と、製造例２で製造したビフィドバクテリウム属の菌の培養上清とを、体積比７：３の割合で混合し、３０体積％ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清含有ＬＹＢＨＩ液体培地を製造した。
【００４０】
〔試験例１〕フィーカリバクテリウム属の菌の培養方法
Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ標準株ＡＴＣＣ２７７６８（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ ＡＴＣＣ２７７６８）の凍結保存菌株（凍結保存時の培養液中の菌数：約１０８ｃｆｕ／ｍＬ）をＬＹＢＨＩ液体培地１０ｍＬに接種し、２４〜４８時間嫌気ボックス内で培養した。本培養液をＬＹＢＨＩ液体培地（コントロール培地）及び実施例１の培地に１体積％接種し、３７℃、１２、１８又は２４時間嫌気ボックス内で培養した。なお、試験に用いる培地、試験器具は２４時間以上嫌気ボックス内で還元したものを用いた。
【００４１】
〔試験例２〕フィーカリバクテリウム属の菌の生菌数の測定
（測定方法）
平板培養法により、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｚｎｉｔｚｉｉ  ＡＴＣＣ  ２７７６８の生菌数を測定した。すなわち、３７℃、１２、１８又は２４時間嫌気ボックス内でＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｚｎｉｔｚｉｉ  ＡＴＣＣ  ２７７６８を培養したコントロール培地及び実施例１の培地を、希釈液を用いて１０倍希釈を繰り返し、１００μＬ中の生菌数が２０〜２００個となるよう希釈した。ペトリ皿に５０℃に保ったＬＹＢＨＩカンテン培地を２０ｍＬ加えて固化させておいたカンテン培地に希釈した培養液１００μＬを塗沫し、３７℃の嫌気ボックス内にて４８〜７２時間培養し、出現したコロニー数及び希釈倍率から培養液１ｍＬ中の生菌数を求めた。なお、試験に用いる培地、試験器具は２４時間以上嫌気ボックス内で還元したものを用い、作業は嫌気ボックス内にて実施した。
【００４２】
（測定結果）
コントロール培地及び実施例１の培地を用いて３７℃で１２、１８及び２４時間嫌気ボックス内で培養した培養液中の生菌数を図１に示した。フィーカリバクテリウム属の菌の生菌数は、コントロール培地では、培養１２時間後に４．０７×１０７ｃｆｕ／ｍＬ、１８時間後に３．４３×１０６ｃｆｕ／ｍＬ、２４時間後に１．７１×１０６ｃｆｕ／ｍＬと変化し、培養１２時間以降に生菌数の低下が認められた。一方、実施例１の培地では、培養１２時間後に６．４０×１０７ｃｆｕ／ｍＬ、１８時間後に５．８９×１０7ｃｆｕ／ｍＬ、２４時間後に１．８０×１０7ｃｆｕ／ｍＬと変化し、コントロール培地での培養と比較すると培養１２時間以降の生菌数低下が抑制された。ビフィドバクテリウム属の菌の培養上清を培養培地に含有させることにより、時間の経過による培養液中のフィーカリバクテリウム属の菌の生菌数の減少が抑制され、培養液中のフィーカリバクテリウム属の菌の生菌数が長時間維持されることが示された。
尚、コントロール培地又は実施例１の培地を用いた培養開始時のフィーカリバクテリウムの菌数は、６．９３×１０５ｃｆｕ／ｍＬであった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の方法は、フィーカリバクテリウム属の菌の培養に有用である。特に、医薬又は食品の分野で有用なフィーカリバクテリウム属の生菌を増殖させるのに有用である。
【図１】
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