(57)【要約】 【課題】細胞内で分解される構造を有する生分解性化合物と、それを含む脂質粒子、ならびにその脂質粒子を含む医薬組成物の提供。【解決手段】実施形態による化合物は、下記式（１）：  Ｑ−Ｌ−ＣＨＲ２        （１）（式中、Ｑは、窒素を含まない非カチオン性脂肪族基であり、Ｌは、単結合または窒素を含まない脂肪族基であり、Ｒは、生分解性基を含む脂肪族基である）で表されるものである。この化合物は、その他の脂質、凝集を低減できる脂質と組わせて脂質粒子とすることができる。さらにこの脂質粒子は、細胞に活性剤を送達する医薬組成物に適用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
Ｑ−Ｌ−ＣＨＲ２        （１）
（式中、
Ｑは、窒素を含まず、オキシを含む、非カチオン性脂肪族基であり、
Ｌは、単結合または窒素を含まない脂肪族基であり、
Ｒは、同一であるか、または異なる、Ｃ１２〜Ｃ２４の脂肪族基であり、少なくとも一つのＲは、その主鎖中または側鎖中に、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、および−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）
で表されることを特徴とする化合物。
【請求項２】
前記Ｌが、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−および−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）ＯＲ’−Ｏ−（ここで、Ｒ’は水素、非カチオン性脂肪族基、または−ＣＨＲ２である）、からなる群から選択されるエステル構造を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記Ｌが、下記式（１Ａ）：
−ＬＡａ−Ｌ0−ＬＡａ−    （１Ａ）
（式中、
ＬＡは、それぞれ独立に、酸素置換されていてもよい、アルキレン、またはシクロアルキレンであり、
Ｌ0は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−、および−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−からなる群から選択されるエステル構造であり、
ａはそれぞれ独立に０〜６の数である）
で表される、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記Ｑが、下記式（１Ｂ−１）：
Ｑ０−［（ＣＨ２）ｂ１−Ｏ−］ｂ２−    （１Ｂ−１）
（式中、
Ｑ０は、水素、ハロゲン、アルキルまたはアルケニルであり、
ｂ１は、０〜３の数であり、
ｂ２は、１〜３の数であり、
式（１Ｂ）中に含まれる炭素の総数が６以下である）
で表される、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
前記Ｑが、下記式（１Ｂ−２）：
Ｑ１−ＬＢ−    （１Ｂ−２）
（式中、
Ｑ１は、シクロエーテルであり、
ＬＢは、アルキレンある）
で表される、請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
前記Ｒが、下記式（１Ｃ）：
−ＬＣ１−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＬＣ２    （１Ｃ）
（式中、
ＬＣ１はアルキレンであり、
ＬＣ２はアルケニルである）
で表される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
前記ＬＣ１および前記ＬＣ２が、それぞれ下記式（１Ｃ−１）および（１Ｃ−２）：
−（ＣＨ２）ｃ１−      （１Ｃ−１）
−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｃ２−Ｈ      （１Ｃ−２）
（式中、
ｃ１は、１〜１０の数であり、
ｃ２は、１〜１０の数である）
で表される請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記ｃ１が４〜８の数である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記Ｒに含まれる、最も長い分子鎖が８原子以上である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
下記式（１−０１）〜（１−２０）で表される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【化１−１】
2019052102.tif 000008
【化１−２】
2019052102.tif 000009
【化１−３】
2019052102.tif 000010
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載された化合物を含む脂質粒子。
【請求項１２】
膜を形成する脂質と、凝集を低減できる脂質とをさらに含む請求項１１記載の脂質粒子。
【請求項１３】
前記の膜を形成する脂質が、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、
１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、
１，２−ジミリストイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１４：０  ＤＡＰ）、
１，２−ジパルミトイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１６：０  ＤＡＰ）、
１，２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１８：０  ＤＡＰ）、
Ｎ−（４−カルボキシベンジル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（オレオイロキシ）プロパン（ＤＯＢＡＱ）、
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホクロリン（ＤＯＰＣ）、
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホクロリン（ＤＬＰＣ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）、および
コレステロール、からなる群から選択され、
前記凝集を低減できる脂質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質である、請求項１２に記載の脂質粒子。
【請求項１４】
活性剤をさらに含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の脂質粒子。
【請求項１５】
前記活性剤が、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アプタマー、およびリボザイムからなる群から選択された核酸である、請求項１４に記載の脂質粒子。
【請求項１６】
核酸と結合する化合物をさらに含む、請求項１５に記載の脂質粒子。
【請求項１７】
前記核酸と結合する化合物が、塩基性タンパク質、または塩基性ペプチドである、請求項１６に記載の脂質粒子。
【請求項１８】
前記核酸と結合する化合物が、プロタミンまたはヒストンである、請求項１６または１７に記載の脂質粒子。
【請求項１９】
細胞内での核酸の発現を調節する化合物をさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の脂質粒子。
【請求項２０】
請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の脂質粒子と、担体とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２１】
請求項１１または１２に記載の脂質粒子と、細胞に前記脂質粒子を導入する導入剤を含む組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内で分解される構造を有する生分解性化合物と、それを含む脂質粒子に関する。また、本発明はその脂質粒子を含む、核酸のような活性剤の送達のために使用される組成物およびキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
各種の疾病治療を目的としたリポソームの検討が進められている。リポソームは、脂質で構成されるナノメーターオーダーの粒径を有する微小なカプセルであり、その内部に種々の化合物等を内包でき、また生体適合性などにも優れていることから、治療薬や活性剤を、生体内の標的部位に選択的に送達するのに理想的な材料である。このような目的には、一般的に平均粒子径が１００ｎｍ以上の、巨大な一枚膜リポソーム（ＬＵＶ）が用いられるが、その膜を構成する材料については、種々の材料が開発されている。
【０００３】
このようなリポソームは、単一の脂質で構成することが可能である。このような場合、例えば脂質は頭部とそれに結合した疎水性部とを有するリン脂質が用いられ、この脂質が会合して膜を形成して、活性剤等を内包できる微小なカプセルを構成する。しかしながら、リポソームに優れた特性を付与するために、それを構成するために脂質混合物が用いられるのが一般的である。そして、この脂質混合物は、生分解性に優れた脂質、形成されるリポソームの凝集を抑制する脂質、内包物の漏出抑制効果を有する脂質、膜融合効果を有する脂質などの組み合わせを含んでいる。
【０００４】
そして、リポソームの特性をより向上させるために、それぞれの脂質について検討がなされている。例えば、遺伝子導入に特化された医療向けリポソームには、高い生分解性、高い生体適合性、高い活性剤導入性、および低い細胞毒性を満たすことが好ましく、そのようなリポソームを構成できる脂質が望ましい。
【０００５】
このような脂質として種々の化合物が開発されているが、適用する生体の状態や治療しようとする疾病は多岐にわたっている。これらの条件に応じて、選択できる脂質の種類を増やすことが望ましい。さらには、従来のリポソームを超える特性を有するリポソームを構成できる脂質が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５８９３６１１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の課題に対して、本実施形態は、リポソームを構成することができる脂質として、新規な化合物と、それを用いた脂質粒子ならびに組成物およびキットを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本実施形態による化合物は、下記式（１）：
Ｑ−Ｌ−ＣＨＲ２        （１）
（式中、
Ｑは、窒素を含まず、オキシを含む、非カチオン性脂肪族基であり、
Ｌは、単結合または窒素を含まない脂肪族基であり、
Ｒは、同一であるか、または異なる、Ｃ１２〜Ｃ２４の脂肪族基であり、少なくとも一つのＲは、その主鎖中または側鎖中に、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、および−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）
で表されることを特徴とするものである。
【０００９】
また、実施形態による脂質粒子は、前記の化合物を含むことを特徴とするものである。
【００１０】
また、実施形態による組成物は、前記脂質粒子と、担体とを含むことを特徴とするものである。
【００１１】
また、実施形態によるキットは、前記脂質粒子と、細胞に前記脂質粒子を導入する導入剤を含む組成物を含むものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１による化合物の高速液体クロマトグラフィによる測定結果を示す図。
【図２】実施例１Ａと比較例１ＡによるリポソームのＤＮＡ内包量を示すグラフ。
【図３】実施例１Ａと比較例１Ａによるリポソーム取込み量を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［定義］
本実施形態において、〜を用いて数値範囲を示した場合、特に限定されない限り、これらは両方の端点を含み、単位は共通である。例えば、１０〜２５モル％は、１０モル％以上２５モル％以下を意味する。
【００１４】
本実施形態において、「Ｃｘ〜Ｃｙ」および「Ｃｘ」などの記載は、分子または置換基中の炭素の数を意味する。例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキルは、１以上６以下の炭素を有するアルキルを意味する。また、本実施形態においてハロゲン化アルキルとは、アルキル中の１つ以上の水素がフッ素などのハロゲンに置き換えられたものをいい、例えばフルオロアリールとは、アリール中の１つ以上の水素がフッ素に置き換えられたものをいう。
【００１５】
本実施形態において、特に限定されない限り、アルキルとはアルカンの任意の炭素から一個の水素を除去した一価基を意味する。そしてアルキルとの用語は直鎖状または分岐鎖状アルキルを包含する。さらに、シクロアルキルとは環状構造を含むアルキルを意味する。環状構造に直鎖状または分岐鎖状アルキルが置換したものもシクロアルキルと称する。
【００１６】
また、アルケルとはアルケンの任意の炭素から一個の水素を除去した一価基を意味する。
【００１７】
また、炭化水素基とは、１価または２価以上の、炭素および水素を含み、必要に応じて、酸素または窒素を含む基を意味する。そして、脂肪族基とは、芳香環を含まない炭化水素基であって、鎖状、分岐鎖状、または環状のいずれの構造をとってもよく、またそれらの組み合わせであってもよい。また、特に限定されない限り、脂肪族記は不飽和結合を含んでいてもよい。さらに、特に限定されない限り、脂肪族基は、窒素、酸素、硫黄、セレン、フッ素、塩素、臭素などのヘテロ原子を含んでいてもよい。また、脂肪族基は、１価基であっても、多価基であってもよい。また、芳香族炭化水素基とは、芳香環を含み、必要に応じて脂肪族炭化水素基を置換基として有する。
【００１８】
［生分解性脂質化合物］
実施形態による化合物は、リポソームを構成する脂質として適切な化合物である。そして、その疎水部に生分解性基を有しており、生分解性脂質化合物として機能するものである。そして、その頭部にはカチオン性基を含んでおらず、生体に適用した場合には細胞内でのタンパク質の結合が抑制され、毒性が低いという特徴を有している。また、リポソームがこの脂質化合物によって構成されると、リポソームの表面が非カチオン性となるため、細胞への障害性が低くなり、核酸等の活性剤の導入率が高くなる。
【００１９】
このような脂質化合物は、下記一般式（１）で表されるものである。以下、式中のＱを頭部、Ｒを疎水性基と称することがある。
Ｑ−Ｌ−ＣＨＲ２        （１）
（式中、
Ｑは、窒素を含まず、オキシを含む、非カチオン性脂肪族基であり、
Ｌは、単結合または窒素を含まない脂肪族基であり、
Ｒは、同一であるか、または異なる、Ｃ１２〜Ｃ２４の脂肪族基であり、少なくとも一つのＲは、その主鎖中または側鎖中に、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、および−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）
【００２０】
実施形態による化合物のひとつの特徴は、頭部Ｑがカチオン性基を含まないことである。Ｑはアニオン性基を含むこともできるが、極性基を含まない中性基であることが好ましい。窒素原子はカチオン性基を構成することが多いので、Ｑは窒素原子を含まないことが必要である。
【００２１】
Ｌは、頭部Ｑと、二つの疎水性基を含む−ＣＨＲ２とを結合する連結基である。この連結基は、単結合であっても、また脂肪族基であってもよい。ただし、この連結基は窒素を含まないことが必要である。
【００２２】
また、Ｌが脂肪族基である場合、その構造中にエステル構造を有することが好ましい。そのような構造を有することで、例えば頭部の構造を含む化合物と疎水性基部分を含む化合物とをエステル反応させることで、一般式（１）で表される化合物の調製が容易になる。このようなエステル構造は、カルボン酸、カルボン酸塩化物、リン酸、チオカルボン酸などの酸基と、アルコール、チオールなどのヒドロキシまたはメルカプトとの反応により形成されるものである。
【００２３】
具体的には、Ｌには、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、および−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）ＯＲ’−Ｏ−（ここで、Ｒ’は水素、非カチオン性脂肪族基、または−ＣＨＲ２である）、からなる群から選択されるエステル構造を含むことが好ましい。ここで、リン酸は多塩基酸であるため、頭部Ｑを複数有すること、または式一般式（１）の−ＣＨＲ２と同等の構造を複数有することもできる。これらのエステル構造のうち、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、および−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−からなる群から選択されるエステル構造が特に好ましい。
【００２４】
Ｌが脂肪族基であって、エステル構造を含む場合、Ｌは下記一般式（１Ａ）
−ＬＡａ−Ｌ0−ＬＡａ−    （１Ａ）
（式中、
ＬＡは、それぞれ独立に、酸素置換されていてもよい、アルキレン、またはシクロアルキレンであり、
Ｌ0は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−、および−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ-からなる群から選択されるエステル構造であり、
ａはそれぞれ独立に０〜６の数である）
で表されるものであることが好ましい。ここで、ＬＡに含まれる炭素数は特に限定されないが、２つのＬＡに含まれる炭素の総数が１〜６であることが好ましい。
【００２５】
また、Ｑはオキシを含む。オキシとは２価の連結基−Ｏ−を意味する。ただし、上記したＬに含まれるエステル構造中の−Ｏ−は、本実施形態においてはオキシに含めない。すなわち、Ｑがたとえばカルボキシラト−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−を含む場合、Ｑはそれに含まれる−Ｏ−とは別にオキシを含む。
【００２６】
実施形態による化合物において、オキシは、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロゲン化オキシ、エーテル構造、アルキレンオキシなどに含まれている。また、化合物に含まれるオキシは複数であってもよい。
【００２７】
好ましいＱの一例は、下記一般式（１Ｂ−１）で表すことができる。
Ｑ０−［（ＣＨ２）ｂ１−Ｏ−］ｂ２−    （１Ｂ−１）
（式中、
Ｑ０は、水素、ハロゲン、アルキルまたはアルケニルであり、
ｂ１は、０〜３の数であり、
ｂ２は、１〜３の数であり、
式（１Ｂ）中に含まれる炭素の総数が６以下である）
ここで、アルキルはＣ１〜Ｃ３アルキルであることが好ましく、アルケニルはＣ２〜Ｃ３アルケニルであることが好ましい。
【００２８】
また、Ｑは環状エーテル構造としてオキシを含むことも好ましい。具体的には、好ましいＱの一例は、下記一般式（１Ｂ−２）で表すことができる。
Ｑ１−ＬＢ−    （１Ｂ−２）
（式中、
Ｑ１は、シクロエーテルであり、
ＬＢはアルキレンである）
ここで、シクロエーテルは炭素数が３〜６であることが好ましい。
【００２９】
実施形態による化合物は、頭部に結合した、−ＣＨＲ２を有している。ここでＲは疎水性基を表し、二つのＲは同一であっても異なっていてもよい。疎水性基は、比較的長い炭化水素鎖を含むものが一般的である。そして、その一部にカルボキシラト等を含む連結基、具体的には−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、および−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−からなる群から選択される連結基を含む。これらの連結基は、実施形態による化合物がリポソームに利用された場合に、生分解性基として機能する。
【００３０】
好ましい疎水性基Ｒの一例は、下記式（１Ｃ）で表すことができる。
−ＬＣ１−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＬＣ２    （１Ｃ）
（式中、
ＬＣ１はアルキレンであり、
ＬＣ２はアルケニルである）
【００３１】
ＬＣ１およびＬＣ２は、分岐鎖構造や環状構造を有していてもよいが、分岐構造を有する場合には側鎖は少ないことが好ましく、直鎖状であることが最も好ましい。
【００３２】
より具体的には、ＬＣ１およびＬＣ２が、それぞれ下記式（１Ｃ−１）および（１Ｃ−２）で表されるものであることが好ましい。
−（ＣＨ２）ｃ１−      （１Ｃ−１）
−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｃ２−Ｈ      （１Ｃ−２）
（式中、
ｃ１は、１〜１０の数であり、
ｃ２は、１〜１０の数である）
【００３３】
ここで、疎水性基が十分な疎水性を発揮するために、ｃ１は４〜８の数であることが好ましく、また疎水性基Ｒに含まれる、最も長い分子鎖が８原子以上であることが好ましい。
【００３４】
実施形態による化合物の各部位は、上記したとおりの構造を有するものであるが、実施形態による化合物は、下記式（１−０１）〜（１−２０）で表される構造を有するものが好ましい。
【化１−１】
2019052102.tif 000002
【化１−２】
2019052102.tif 000003
【化１−３】
2019052102.tif 000004
【００３５】
これらのうち、（１−０１）〜（１−０７）はリポソームに用いた場合に優れた特性を発揮することができるので特に好ましい。
【００３６】
［化合物の製造方法］
このような化合物は、例えば下記の工程図に従って製造することができる。
【化２】
2019052102.tif 000005
【００３７】
このような化合物の合成方法は、従来知られている脂質化合物の合成プロセスに比較すると工程数が少なく、より効率の高い製造が可能となる。
【００３８】
［脂質粒子］
実施形態に寄れば脂質粒子が提供される。この脂質粒子の代表例はリポソームであるが、それに限定されず、核酸等と複合したリポプレックスなども包含される。またリポソームは、一枚膜リポソーム、多重層膜リポソームのいずれであってもよい。
【００３９】
実施形態による脂質粒子は、上記した式（１）で表される化合物を含むものである。また、望ましくは膜を形成する脂質と、凝集を低減できる脂質とをさらに含むものである。上記式（１）で表される化合物も、膜を形成する脂質として機能するが、実施形態においては、「膜を形成する脂質」は、上記式（１）の化合物を包含しないものとする。
【００４０】
膜を形成する脂質とは、一般的にリポソームに用いられる脂質であれば、任意に用いることができる。この脂質は生分解性に優れた脂質であることが好ましい。
【００４１】
このような膜を形成する脂質の具体例は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、およびセレブロシドなどである。実施形態において脂質粒子に用いる膜を形成する脂質は目的とするリポソームのサイズや生体中におけるリポソームの安定性などを考慮して適切に選択される。これらのうち、ジアシルホスファチジルコリン、およびジアシルホスファチジルエタノールアミンは好ましいものである。ここで脂質に含まれるアシル基の炭化水素鎖の長さは１０〜２０であることが好ましい。この炭化水素鎖は飽和炭化水素基であっても、不飽和炭化水素基であってもよい。
【００４２】
このような膜を形成する脂質は種々のものが知られており、例えば、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、
１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、
１，２−ジミリストイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１４：０  ＤＡＰ）、
１，２−ジパルミトイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１６：０  ＤＡＰ）、
１，２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１８：０  ＤＡＰ）、
Ｎ−（４−カルボキシベンジル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（オレオイロキシ）プロパン（ＤＯＢＡＱ）、
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホクロリン（ＤＯＰＣ）、
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホクロリン（ＤＬＰＣ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）、および
コレステロール
などを好ましいものとして挙げることができる。これらは、リポソーム等の膜を形成する機能に加えて、膜の融合効果も発揮することができる。
【００４３】
実施形態に用いられる、凝集を低減できる脂質は、脂質粒子の調合中に粒子同士の凝集を含む機能を発揮するものである。このような脂質としては種々のものが知られており、実施形態による脂質粒子には任意のものを選択して用いることができる。このような脂質の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質、オメガ−アミノ（オリゴエチレングリコール）アルカン酸モノマーから誘導されるポリアミドオリゴマー（米国特許第６，３２０，０１７号）、モノシアロガングリオシドなどが挙げられる。より具体的には、米国特許第６，３２０，０１７号に挙げられている、ＡＴＴＡ８−ＤＰＳＥなどのＡＴＴＡ脂質や、米国特許第５，８２０，８７３号、同第５，５３４，４９９号、および同第５，８８５，６１３号に記載されているポリエチレングリコール脂質コンジュゲートを用いることができる。
【００４４】
ＰＥＧ修飾脂質は、脂質粒子が形成されたときに、脂質粒子の表面にアンカリング脂質部分を形成することができる。このようなＰＥＧ修飾脂質の例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば特許第３９２０３３０号明細書に記載されているＣ１４  ＰＥＧ−ＣｅｒまたはＣ２０  ＰＥＧ−Ｃｅｒ）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール（例えばト１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール−メトキシポリエチレングリコール；ＰＥＧ−ＤＭＧ）およびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールが挙げられる。このうち、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロールおよびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールが特に好ましい。
【００４５】
ＰＥＧなどの嵩高い修飾基を脂質表面に結合させる場合、修飾基と脂質粒子との結合が脂質粒子ないしリポソームの安定性に影響する。例えば米国特許第５，８２０，８７３号には、ＰＥＧ修飾脂質におけるアシル鎖の長さ、アシル鎖の飽和度、および立体障害頭部基のサイズなどの特性が、脂質粒子の安定性に影響を及ぼすことを示している。したがってこれらの特性を調整することで、目的に応じた脂質粒子を得ることができる。例えば、ＰＥＧ修飾脂質における修飾基を短くすることによってより早く脂質粒子を喪失させたり、修飾基を長くすることによって、血漿中の滞留時間を長くすることなどが可能である。その結果、脂質粒子の標的組織への送達を改善できる場合もある。
【００４６】
脂質粒子は、さらにその他の脂質を含むこともできる。このようなその他の脂質は、脂質粒子において一般的に用いられている物から任意に選択して用いることができる。例えば、毒性を調整するために、相対的に毒性の低い脂質を組み合わせることができる。また、脂質粒子に配位子を結合させるための官能基を導入するために、特定の構造を有する脂質を組み合わせることもできる。
【００４７】
さらには脂質粒子をリポソームとして用いる場合には、その内包物の漏出を抑制するための脂質としてステロール、例えばコレステロールを含むこともできる。さらに脂質粒子に標的作用物質をカップリングさせることもできる。このような場合のカップリング方法は、従来知られている任意の方法を採用することができる。
【００４８】
これらの脂質を組み合わせて脂質粒子が構成されるが、その脂質粒子を構成する各脂質の配合比は目的に応じて調整されるので、限定されるものではない。しかし、脂質粒子に用いられる脂質の総モル数を基準として、一般に、
式（１）で表される脂質化合物を２５〜７５モル％、
膜を形成する脂質を２５〜７５  モル％、
凝集を低減できる脂質を、１〜１０モル％
で配合されるのが一般的であり、好ましくは
式（１）で表される脂質化合物を２５〜５０モル％、
膜を形成する脂質を４７．５〜７２．５モル％、
凝集を低減できる脂質を、１〜１０モル％、例えば２．５モル％
である。ここで、式（１）の化合物と、膜を形成する脂質とのバランスが重要であり、一方だけが存在しても活性剤の導入率が十分高くならない。このため、式（１）の化合物と、膜を形成する脂質との配合比は、モル数基準で１：０．５〜１：３であることが好ましく、１：１〜１：２であることがより好ましい。
【００４９】
実施形態による脂質粒子は、さらに活性剤を含むことができる。実施形態において活性剤とは、細胞、組織、器官、または被検体に特定効果を与えることのできる物質である。特定効果は、生物学的、生理学的、または美容的効果のいずれであってもよい。実施形態による脂質粒子を用いることで、さまざまな活性剤を生体内の目的部位に送達することができる。この活性剤は、脂質粒子の内部に封入されていても、外側または内側の脂質表面に結合していても、また脂質層の内部に配置されていてもよい。
【００５０】
活性剤の典型的な例は核酸であり、例えばプラスミド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡ、アプタマー、およびリボザイムからなる群から選択された核酸が挙げられる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、ａＤＮＡ、プラスミド、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、ｍＲＮＡなどを用いることもできる。
【００５１】
ｍｉＲＮＡとしては、ヌクレオチド単位が１７〜２５個連結したｍｉＲＮＡを用いることができる。）。１つのより好ましい実施形態では、核酸はヌクレオチド単位が１５〜５０個または２０〜３０個連結したオリゴヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡは、例えば、ヌクレオチド単位を１６〜３０個を含み、二本鎖領域を有するものあることができる。別の実施形態では、核酸は、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、スーパーｍｉｒ、ｍｉＲＮＡ模倣体、またはｍｉＲＮＡインヒビターである。スーパーｍｉｒとは、ＲＮＡもしくはデオキシリボ核酸ＤＮＡ、またはこれらの両方、あるいは、これらの変性体の一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖のオリゴマーまたはポリマーであって、ｍｉＲＮＡと実質的に同一のヌクレオチド配列を有するとともに、その標的に対してアンチセンスであるオリゴマーまたはポリマーを指す。ｍｉＲＮＡ模倣体は、１つ以上のｍｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング能を模倣する目的で用いることのできる分子群を表す。したがって、「ｍｉＲＮＡ模倣体」という用語は、ＲＮＡｉ経路に入れるとともに、遺伝子発現を調節することができる合成非コードＲＮＡを指す（すなわち、ｍｉＲＮＡは、内在性ｍｉＲＮＡの供給源から精製することによっては得られない）。
【００５２】
核酸を脂質粒子に組み合わせる場合、核酸の形態は特に限定されない。この核酸は、例えば、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであることができる。二本鎖ＲＮＡの例としてはｓｉＲＮＡが挙げられる。一本鎖核酸としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボ酵素、ｍｉＲＮＡ、および三本鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５３】
実施形態による脂質粒子は、核酸を含む場合には、核酸と結合する化合物をさらに含むことができる。このような化合物としては、塩基性タンパク質、または塩基性ペプチドが挙げられ、好ましくはプロタミン、ヒストン、およびそれらの塩が挙げられる。たとえばヒストンおよびその塩は、核酸と結合し、核酸分子を畳み込む性質をもっている。またプロタミンは、核酸と結合し、さらにその核酸を巻き込む性質を持っている。このため、これらの化合物は脂質粒子に核酸を封入するのに有効である。
【００５４】
また、実施形態による脂質粒子は、細胞内での核酸の発現を調節する化合物をさらに含むことができる。細胞内での核酸の発現を調整することによりリポソームが送達された細胞に対して、可視化や細胞死の効果が得られるので、好ましい。このような化合物としてはレチノイン酸、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、アスコルビン酸などが挙げられる。
【００５５】
また、実施形態による脂質粒子は、リポタンパク、アポリポタンパクなどを含んでいてもよい。
【００５６】
活性剤として、その他の治療剤を用いることもできる。用いることのできる治療剤の具体例は、ペプチド、ポリペプチド、サイトカイン、増殖因子、アポトーシス因子、分化誘発因子、細胞表面受容体およびそのリガンド、ホルモンなどが挙げられる。より具体的には、治療剤は、抗炎症化合物、抗うつ薬、興奮薬、鎮痛薬、抗生物質、避妊薬、解熱剤、血管拡張薬、血管新生阻害剤、細胞血管作動薬（ｃｙｔｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｇｅｎｔｓ）、シグナル伝達阻害剤、心臓血管薬、腫瘍薬、ホルモン、およびステロイドが挙げられる。
【００５７】
脂質粒子に活性剤を組み合わせる場合、活性剤がより高い導入率で脂質粒子に導入されることが好ましい。また、脂質の特性に依存する細胞毒性による細胞死が低いことも好ましい。従来知られている脂質粒子を用いて核酸を導入した場合、一般的には導入率が低く、細胞毒性による細胞死の割合も高かった。これに対して、本実施形態による脂質粒子を用いた場合には、核酸の導入率が高く、細胞死も低減することができる。具体的には、従来の脂質粒子においては、導入率が１０％程度、エレクトロポレーションによる細胞死が６０〜７０％であるのに対して、実施形態による脂質粒子を用いた場合には、それぞれ７０％以上、３０％以下に低減される。
【００５８】
実施形態による脂質粒子は、目的に応じて任意の大きさに形成させることができる。しかしながら、実施形態による脂質粒子を医薬用途に用いようとする場合には、脂質粒子はナノオーダーサイズの粒子とされるのが一般的である。具体的には、実施形態による脂質粒子の平均粒子径は、一般に５０ｎｍ〜３００ｎｍであり、好ましくは５０ｎｍ〜２００ｎｍである。脂質粒子のサイズは、任意の方法で調整することができる。例えば、超音波処理によって脂質粒子を小さくすることができる。また、ポリカーボネート膜やセラミック膜を透過させて、脂質粒子を分別することでサイズ調整をすることもできる。なお、実施形態において、脂質粒子の平均粒子径は、例えば動的光散乱法を用いたゼータサイザーによって測定することができる。
【００５９】
また実施形態による脂質粒子のインビボ半減期（ｔ１／２）は、一般に３時間未満であり、好ましくは２時間未満、特に好ましくは１時間未満である。ここで、インビボ半減期とは、例えば肝臓中、脾臓中、または血漿中の半減期を意味する。実施形態においては、脂質を構成する式（１）の化合物が生分解性基を有することによって、生分解性基を含まない脂質からなる脂質粒子に比較して、半減期が例えば１０％未満となっている。
【００６０】
［脂質粒子の製造方法］
実施形態による脂質粒子は、従来知られている任意の方法で製造することができる。脂質粒子やリポソームを製造する方法としては、バンガム法、有機溶媒抽出法、界面活性剤除去法、凍結融解法などが知られており、それらを採用することもできる。また、例えば、式（１）で表される化合物、さらには膜を形成する脂質と、凝集を低減できる脂質とを、アルコールなどの有機溶媒に導入し、水性緩衝液を添加することで自然発生的に脂質粒子を形成させることもできる。この水性緩衝液に活性剤を組み合わせておくことで、脂質粒子に活性剤を導入することが可能である。
【００６１】
本実施形態による脂質粒子は、活性剤を細胞へ送達するために使用することができる。特に核酸等の活性剤の細胞への送達は、遺伝子工学、組み換えタンパク質の生産、及び遺伝子治療や細胞診断として知られている医療技術など、あらゆる分野で用いられる。
［組成物］
本実施形態による脂質粒子は、組成物として用いることができる。例えば、本実施形態の脂質粒子と担体とを含む組成物が提供される。このような組成物は医薬用途にも適用できるものである。
【００６２】
担体としては、従来知られているものから任意に選択して用いることができるが、例えば、水、生理食塩水のような食塩水、グリシン水溶液、緩衝液などが挙げられる。さらにこれらの担体に加え、安定性を改良するなどの目的で、アルブミン、リポタンパク、アポリポタンパク、グロブリンなどの糖タンパクを組合せてもよい。
【００６３】
実施形態による組成物は、標準的な方法により調製することができる。担体としては、生理食塩水が用いられることが一般的である。食塩水またはその他の塩含有担体を含む組成物中では、担体は好ましくは、脂質粒子の形成の後に加える。したがって、脂質粒子と核酸などの活性剤を組み合わせた後に、その組成物を生理食塩水のような製薬学的に許容可能な担体で希釈することが一般的である。
【００６４】
実施形態による組成物は、必要に応じて補助剤を含んでもよい。たとえば、医薬用途の場合、製薬学的に許容可能な補助剤、例えばｐＨ調整剤、緩衝化剤、張度調整剤などを補助剤として含めることで、医薬組成物を生理的状態に近づけることができる。このような機能を奏する補助剤としては、ナトリウムアセテート、ナトリウムラクテート、ナトリウムクロリド、カリウムクロリド、カルシウムクロリドなどが挙げられる。また、実施形態による組成物は、貯蔵安定性を改良するための脂質保護剤を含むこともできる。このような保護剤としては、フリーラジカルによるダメージを抑制する、α−トコフェロールのような脂肪親和性フリーラジカルクエンチャーや、脂質の過酸化損傷を抑制するフェリオキサミンのような水溶性キレーターが挙げられる。
【００６５】
その他、前記した活性剤などを組成物に添加することもできる。この活性剤は、脂質粒子に組み合わせた活性剤と同一のものであっても、異なったものであってもよい。また、核酸と結合する化合物や核酸の発現を調整する化合物を組成物に添加することもできる。
【００６６】
実施形態による組成物中に含まれる脂質粒子の濃度は、特に限定されず、組成物中に含まれる脂質粒子の含有率は、一般に０．０１〜３０質量％、好ましくは０．０５〜１０質量％である。脂質粒子の濃度は、目的に応じて適切に選択することができる。
【００６７】
実施形態による組成物は、従来の周知の方法によって滅菌することができる。滅菌された組成物は、そのまま投与可能な製剤として包装することのほか、乾燥させて包装することもできる。乾燥した組成物は、投与の直前に滅菌水溶液と組み合わせることで投与可能な調製物とすることができる。
【００６８】
実施形態による組成物は、キット形態とすることもできる。実施形態によるキットは、前記した脂質粒子と、細胞に前記脂質粒子を導入する導入剤を含むが、その形態は任意である。例えば活性剤を含まない脂質粒子を担体に分散させた分散物と活性剤とを個別容器に収容したキットや、乾燥させた脂質粒子と、活性剤と、担体とを個別容器に収容したキットなどが挙げられる。さらに、乾燥させた脂質粒子または脂質粒子分散物と、活性剤とを個別の製品とし、利用者が各製品を目的に応じて選択できるようにすることもできる。
該キットには、核酸導入の際に使用する試薬を組み合わせることができる。
【００６９】
［医薬組成物の利用方法］
実施形態による脂質粒子を医薬用途に用いた場合、組成物は、ヒトまたは動物の各種疾病の治療に用いることができる。脂質粒子と組み合わせる活性剤として治療剤を適用することで治療剤を目的細胞に送達することで治療が可能となる。
【００７０】
例えば、各種の核酸を細胞に送達して接触させて疾患の予防又は治療をすることが可能である。このような核酸としては、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、プラスミド、アンチセンス、またはリボザイムが挙げられる。また、核酸の送達は、インビトロまたはインビボのいずれで行うことができる。
【００７１】
インビボ投与の方法としては、医薬組成物は、好ましくは非経口投与、すなわち、関節内投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与が採用される。医薬組成物の静脈内投与または腹腔内投与を、ボーラス注入によって行うこともできる。
【００７２】
また、実施形態による医薬調製物を標的組織に直接塗布して、医薬組成物を標的組織に接触させることもできる。また、点滴による髄膜等への投与、内視鏡器具による投与も可能である。
【００７３】
特定の実施形態では、医薬組成物による処理は、一般に、生理学的温度（約３７℃）で、１〜２４時間、好ましくは２〜８時間の期間で行われる。インビトロによる適用において、対象となる細胞は特に限定されない。例えば、脊椎動物の細胞であっても、非脊椎動物の細胞であっても、あるいは植物の細胞であってもよい。しかしながら、好ましい実施形態では、細胞は動物細胞であり、より好ましくは哺乳類細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。
【実施例】
【００７４】
［実施例１］  化合物（１−０７）の合成
前記した製造プロセスに従って、化合物（１−０７）の合成を行った。具体的には、下記の通りの操作を行った。
【００７５】
アルゴン雰囲気下、１００ｍＬ容４つ口フラスコにマグネシウム（３．４８ｇ，１４２．９９ｍｍｏｌ，４．４ｅｑ．）とジエチルエーテル（２５ｍＬ）とヨウ素（１ｍｇ）を仕込んだ。９−ブロモノン−１−エン（２０．００ｇ，９７．４９ｍｍｏｌ，３ｅｑ．）を還流させながら滴下した。１時間反応させ、滴下漏斗に得られたグリニャール試薬をジエチルエーテル（３２．８ｍＬ）と共に移した。ギ酸エチル（２．４１ｇ，３２．４９ｍｍｏｌ，１ｅｑ．）とジエチルエーテル（３２．８ｍＬ）を仕込んだ２００ｍＬ  ４つ口フラスコに、０℃以下で１時間かけてグリニャール試薬を滴下した。１時間室温で反応させた後、アセトン（２０ｍＬ）を加え、水（４０ｍＬ）と１０％Ｈ２ＳＯ４水溶液（５３ｍＬ）を順次添加して分液した。水層をジエチルエーテル（５０ｍＬ）を用いてさらに２回抽出し、すべての有機層をまとめてＮａＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（１８．３３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２００ｇ）で精製した。展開液は、最初にヘキサンを用い、次いで酢酸エチルとヘキサンの混合液（酢酸エチル２％を用いた。この結果、白色固体である中間体１を７．４３ｇ（収率８１％）得た（工程１）。
【００７６】
アルゴン雰囲気下で、２００ｍＬ容４つ口フラスコに中間体１（５．００ｇ，１７．８０ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）とジクロロメタン（ＤＣＭ、５０ｍＬ）を仕込み、溶解させ、さらにトリエチルアミン（３．６３ｇ，３５．６ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）を添加した。０℃で４−メトキシブチリルクロライド（４．８６ｇ，３５．６ｍｍｏｌ，２ｅｑ．）を滴下した。終夜攪拌し、水（４００ｍＬ）に反応液を添加して分液し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水（４００ｍＬ）と飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（１９．３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２００ｇ、展開液：酢酸エチルとヘキサンの混合液（酢酸エチル２％））で精製し、無色透明オイルである中間体２を６．４３ｇ（収率９５％）得た（工程２）。
【００７７】
５００ｍＬ容４つ口フラスコに中間体２（６．１ｇ，１６．０３ｍｍｏｌ，１ｅｑ．）を入れジクロロメタン（１２０ｍＬ）とアセトニトリル（１２０ｍＬ）に溶かし、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（４１４．９ｍｇ，０．９８９ｍｍｏｌ，Ｒｕ＝４０％）を添加した。１０℃以下で水（１８０ｍＬ）に溶かした過ヨウ素酸ナトリウム（３４．２８ｇ，１６０．３ｍｍｏｌ，１０ｅｑ．）を滴下し、１０℃で終夜攪拌した。反応終了後、反応液に水（３０ｍＬ）を加えて分液した。有機層に飽和食塩水（１００ｍＬ）を加え、色が変わるまで３％Ｎａ２Ｓ水溶液を滴下した。１Ｍ  ＨＣｌを酸性になるまで加え、分液した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過濃縮して得た粗体（７．８ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ）で精製した。展開液は、最初クロロホルムを用い、次いでメタノールとクロロホルムの混合液（メタノール１０％）を用いた。この結果、褐色オイルである中間体３を４．３２ｇ（収率６４％）を得た（工程３）。
【００７８】
２００ｍＬ容４つ口フラスコに中間体３（２．０ｇ，４．８ｍｍｏｌ，１ｅｑ．）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶かし、シス−２−ノナン−１−オール（１．６ｇ，１１．７ｍｍｏｌ，２．４４ｅｑ．）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、５８ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ，０．１ｅｑ．）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、３ｇ，２３．５ｍｍｏｌ，４．９ｅｑ．）及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣｌ、２２．５ｇ，１１．７ｍｍｏｌ，２．４４ｅｑ．）を加え、室温下で終夜攪拌した。反応液を水（１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で順次洗浄し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（３．８ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５０ｇ、展開液メタノールとクロロホルムの混合液（メタノール１０％））で精製した。この結果、微黄色オイルである化合物（１−０７）を３００ｍｇ（収率９％）得た（工程４）。
【００７９】
次いで、得られた化合物（１−０７）を高速液体クロマトグラフィを用いて分析した。
分析には高速液体クロマトグラフ質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ、アジレント社製）を用いて分析した。液体クロマトグラフィ部の移動相Ａは１００％メタノール、移動相Ｂには１０ｍＭ酢酸アンモニウム、カラムはシリカＣ８を用いた。質量分析部のイオン化方法はエレクトロスプレー法を選択し、イオン分離は四重極を用いた。化合物（１−０７）をメタノールに溶解し５μｇ／ｍＬの溶液とし、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで１．０μＬ注入した。式（１−０７）から算出される分子量を根拠として、検出するイオン質量範囲を６００−９００に設定し測定したところ、ｍ／ｚ（重量電荷比）＝６８２．６の位置にメインピークを検出した。このｍ／ｚ比は、式（１−０７）の化合物にアンモニウムイオンが結合したイオンのｍ／ｚに一致する。他に目立ったピークは検出されなかった。得られた結果は図１に示した通りである。この結果より、合成して得られた化合物が式（１−０７）で示されるものであることが確認できた。
【００８０】
［実施例２］  リポソームの作製
プラスミド溶液とペプチドを用いて、コア複合体を作製した。プラスミドは、サイトメガロウイルス初期プロモーター／エンハンサー：：ＮＬｕｃ遺伝子：：ＩＲＥＳ：：シミアンウイルス４０複製開始タンパク質遺伝子：：転写終結シグナル：：複製開始配列を組込んだプラスミド（ｐＡｍｐ−ＣＭＶ−ＮＬｕｃ）を使用した。ペプチドは、サケ由来のプロタミンを用いた。マイクロチューブに、ペプチド溶液（０．２４ｍｇ／ｍＬ，１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ５．４）１００μＬを分注した。分注したペプチド溶液をボルテックスミキサー（１，５００ｒｐｍ）で撹拌しながら、プラスミド溶液（０．１５ｍｇ／ｍＬ，１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ５．４）を２００μＬを滴下混合してコア複合体を作製した。
【００８１】
コア複合体を内包するリポソームは、エタノール注入法で調整した。リポソームは、ＦＡＣＳで細胞取り込み率を測定するために、ローダミン蛍光色素結合脂質（Ｒｈｏｄ−ＰＥ）で標識した。マイクロチューブに、５０μＬの脂質溶液を分注した。脂質溶液として、下記式（Ｒ−０１）で表される化合物：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ−ＰＥＧ：Ｒｈｏｄ−ＰＥ＝５：４：３：０．３：０．１ｍｏｌ（比較例１Ａ）、または  式（１−０７）の化合物：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ−ＰＥＧ：Ｒｈｏｄ−ＰＥ＝５：４：３：０．３：０．１  ｍｏｌ（実施例１Ａ）を用いた。
【化３】
2019052102.tif 000006
【００８２】
分注した脂質溶液をボルテックスミキサー（１５００ｒｐｍ）で撹拌しながら、コア複合体５０μＬを滴下して混合した。滴下後、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．４）を４００μＬを穏やかに添加して、リポソームを調製した。更に１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．４）を４００μＬ加え、穏やかに混合した後、限外濾過スピンカラム（ＰＴ−１０１４、株式会社アプロサイエンス製）を用いてバッファー交換と濃縮をおこない、１００μＬのリポソーム（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．３）を作製した。
【００８３】
得られたリポソームについて、内包ＤＮＡ量の測定を行った。測定は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）でおこなった。０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（商品名）を含むＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液９５μＬに、リポソーム溶液５．０μＬを加えて穏やかに縣濁した。室温に３０分間静置した後、溶液にＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で２００倍希釈したＰｉｃｏＧｒｅｅｎ溶液１００μＬを加えてよく混合した。室温に５分間静置した後、溶液の蛍光強度（励起波長：４８５ｎｍ，蛍光波長：５３０ｎｍ）をマイクロタイタープレートリーダー：Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ−９４０（商品名、ベルトール社製）で測定した。ＤＮＡ濃度は、既知濃度のλＤＮＡで作成した検量線を用いて定量した。得られた数値から、リポソーム内包ＤＮＡ量を、溶液１ｍＬあたりのＤＮＡ量（μｇ  ＤＮＡ／ｍＬ）として算出した。結果を図２に示した。式（１−０７）の化合物を含むリポソームは、式（Ｒ−０１）の化合物を含むリポソームより、内包ＤＮＡ量が高いことが明らかとなった。
【００８４】
次に、細胞へのリポソーム取り込み率の測定を行った。
リポソーム取込み率はフローサイトメーター（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、ＦＡＣＳ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）で測定した。細胞は、ヒトＴ細胞性白血病細胞：Ｊｕｒｋａｔ  （ＡＴＣＣより購入）を使用した。４ウェルディッシュ（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ）に、１×１０６細胞／ｍＬの細胞縣濁液を２００μＬ播種した後、ローダミン標識リポソーム溶液を１０μＬ添加した。添加後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で４８時間培養した後、培養液ごと細胞を回収した。細胞縣濁液から、遠心（２００ｘｇ、５ｍｉｎ、４℃）（微量高速冷却遠心機ＭＸ−３０７型、株式会社トミー精工製）により細胞を回収した後、５００μＬの１％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水に細胞を縣濁してＦＡＣＳ用の試料を調整した。この試料に含まれるローダミン蛍光細胞の頻度分布をＦＡＣＳで測定して、リポソームの細胞内取込み効率を算出した。結果を図３に示した。細胞のリポソーム取込み率は、式（Ｒ−０１）の化合物を含むリポソームよりも、式（１−０７）の化合物を含むリポソームが高いことが明らかとなった。
【００８５】
［実施例３］細胞への核酸導入性能の比較
細胞の導入性は、ＧＦＰを発現するプラスミドベクター（ｐＤＮＡ）であるｐＣＭＶ−ＥＧＦＰを細胞へ導入した時のＧＦＰ発現量を、ＦＡＣＳを用いて測定することで評価した。細胞は、ヒト初代正常乳腺細胞（ＨＭＥＣ：ＬＩＦＥＬＩＮＥ製品、倉敷紡績株式会社から入手）を使用した。５×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞数で２４ウェルプレートに播種し、２４時間後、ウェルあたりｐＤＮＡを０．５μｇずつ添加して導入した。従来の脂質粒子は、ポリアミドアミンデンドロンを極性基とするカチオン性脂質からなる脂質粒子を使用しＷｅｌｌあたり１２．５μＬ添加した。エレクトロポレーションは、ポレーションパルスを１５０Ｖ  １０ｍｓ、ドライビングパルスを１０Ｖ  ５０ｍｓを５回印加した。本発明の脂質（１−０７）を使用したリポソームは、Ｗｅｌｌあたり、１０μＬ添加した。
【００８６】
４８時間後、細胞を回収し、ＦＡＣＳにより導入されたＧＦＰの発現に基づく蛍光を発する細胞の割合を定量化した。細胞の生存率は、４８時間後に回収した細胞をＰＩ染色した後、ＦＡＣＳによりＰＩに基づく蛍光を発する死細胞の割合から算出した。
【表１】
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【００８７】
以上の通り、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の組み合わせ、省略、置き換え、変更などを行うことが可能である。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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