(57)【要約】【課題】新規の白色腐朽菌及びその生産方法を提供する。【解決手段】受託番号NITE P-02428で特定される白色腐朽菌。当該白色腐朽菌は、リグニンを液体化する作用に優れる。当該白色腐朽菌をリグニンを含む培地で培養し、増殖させることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号NITE P-02428で特定される白色腐朽菌又はその変異株。
【請求項２】
請求項１に記載の白色腐朽菌又はその変異株をリグニンを含む培地で培養し、増殖させる工程を有する白色腐朽菌の生産方法。
【請求項３】
リグニンを含む分解対象物に受託番号NITE P-02428で特定される白色腐朽菌又はその変異株を接種して増殖させることにより、前記リグニンを含む分解対象物を分解してその一部又は全部を液体化する工程を有するリグニンを含む分解対象物の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグニンを液体化する作用に優れる新規の白色腐朽菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
白色腐朽菌は、木を脱色しながら腐朽させる一群の担子菌類であり、木材中のリグニンを分解する能力を有し、リグニンが分解された後に残留する、セルロース、ヘミセルロースの色である白色に変色させる性質を有する菌類である。
白色腐朽菌は菌株の違いによって分解作用が異なり、使用する白色腐朽菌によって得られる分解生成物の作用も異なる場合がある。これまでに白色腐朽菌を利用した応用技術が報告されている。例えば、特許文献１には白色腐朽菌によるプリオンの分解方法、特許文献２においてダイオキシンの分解方法に係る技術が報告されている。
【０００３】
一方、白色腐朽菌を利用した環境浄化関連技術が報告されている。例えば、特許文献３では、古紙等の難分解性物質を白色腐朽菌で分解処理する方法が報告されており、これを土壌改良に使用した例が報告されている。また、特許文献４には、特定の白色腐朽菌を利用して果樹剪定枝を処理する方法が報告されており、これを土壌改良材やコンポスト材に使用した例が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４５６８８３５号公報
【特許文献２】特開２００５−３４０５７号公報
【特許文献３】特開２００１−４６０５２号公報
【特許文献４】特開２００８−２４５６２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような背景から、現在においても有用な新規の白色腐朽菌の探索が行われている。
かかる状況下、本発明の目的は、リグニンの液体化する作用に優れる新規な白色腐朽菌を提供することにある。また、本発明の他の目的は、リグニンの液体化する作用に優れる白色腐朽菌を使用して、木材を分解する方法及びその分解生成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、キノコ栽培廃菌床における白色腐朽菌のスクリーニングを行ったところ、優れた液化現象を有する特定の菌株を発見し、本発明に至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
＜１＞  受託番号NITE P-02428で特定される白色腐朽菌又はその変異株。
＜２＞  前記＜１＞に記載の白色腐朽菌又はその変異株をリグニンを含む培地で培養し、増殖させる工程を有する白色腐朽菌の生産方法。
＜３＞  木材を含む分解対象物に受託番号NITE P-02428で特定される白色腐朽菌又はその変異株を接種して増殖させることにより、前記木材を含む分解対象物を分解してその一部又は全部を液体化する工程を有する木材の分解処理方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、木材等に含まれるリグニンを分解し液体化する作用に優れる白色腐朽菌が提供される。当該白色腐朽菌の有するリグニンの液体化作用により、リグニンを含む分解対象物の処理のために有効利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例の試料（分離精製後の乾燥粉末）の及び市販のフルボ酸のＩＲスペクトルである。
【図２】実施例の試料（分離精製後の乾燥粉末）及び市販のフルボ酸のＵＶスペクトルである。
【図３】実施例の試料（分離精製後の乾燥粉末）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４】実施例の試料（分離精製後の乾燥粉末）のＶｉｓ−ＵＶスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明について例示物等を示して詳細に説明するが、本発明は以下の例示物等に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において任意に変更して実施できる。なお、本明細書において、「〜」とはその前後の数値又は物理量を含む表現として用いるものとする。
【００１１】
本発明の白色腐朽菌は、受託番号NITE P-02428で特定される白色腐朽菌であり、より詳しくは、ファネロカエテ（Phanerochaete）属に属し、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに受託番号NITE P-02428で寄託されている菌株（識別のための表示：BMC-110012）である。以下、本発明の白色腐朽菌を、白色腐朽菌（NITE P-02428）と称する場合がある。
本発明の白色腐朽菌は、後述する実施例に記載するように、木材等に含まれるリグニンを分解して液体化する能力に優れる。
【００１２】
本発明の白色腐朽菌には、リグニンの液体化能を保持していれば、白色腐朽菌（NITE P-02428）の変異株も含まれるものとする。当該変異株は、例えば、白色腐朽菌（NITE P-02428）を公知の変異処理に供すること、又は経代培養による適応や自然変異により生産できる。なお、本発明の白色腐朽菌は、白色腐朽菌（NITE P-02428）のみでもよいし、白色腐朽菌（NITE P-02428）の変異株のみでもよいし、これらの共存したものであってもよい。
【００１３】
本発明の白色腐朽菌を利用して、リグニンを分解して液体化することができる。
分解対象物はリグニンを含むものであればよく、例えば、広葉樹、針葉樹、非木材系リグニン等が挙げられる。
広葉樹としては、具体的には、ブナ、シナ、シラカバ、ポプラ、ユーカリ、アカシア、ナラ、イタヤカエデ、センノキ、ニレ、キリ、ホオノキ、ヤナギ、セン、コナラ、クヌギ、トチノキ、ケヤキ、ミズメ、ミズキ、アオダモ等及びこれらの関連樹種、及びその廃棄物が例示される。
この中でも、ブナ科コナラ属の広葉樹であることが好ましく、特にはクヌギ（Quercus acutissima）であることが好ましい。
また、針葉樹としては、スギ、エゾマツ、カラマツ、クロマツ、トドマツ等及びこれらの関連樹種、及びその廃棄物が挙げられる。
非木材系リグニンとしては、具体的には、イネ、サトウキビ、ムギ、トウモロコシ、パイナップル、オイルパーム等の農産物及びその廃棄物；ケナフ、綿等の工業植物及びその廃棄物；アルファルファ、チモシー等の飼料作物及びその廃棄物；タケ、ササ等及びその廃棄物が例示される。
【００１４】
リグニンを含む分解対象物（典型的には木材）は、１種を用いても、２種以上を併せて用いてもよい。広葉樹は、本発明において好適な分解対象であり、広葉樹のみ、又は広葉樹とその他の原料を併用して用いることができる。
広葉樹とその他の原料を併用する場合、広葉樹の重量割合は５０重量％以上が好ましく、７５重量％以上がより好ましく、９０重量％以上がさらに好ましい。但し、当然に広葉樹のみ（広葉樹１００重量％）であってもよい。
【００１５】
分解対象物の形状については制限はなく、粉末状、チップ状、角材状、丸太状、フレーク状、繊維状等の如何なる形状のものであってもよい。効率的に白色腐朽菌による分解を行うという観点から、好ましくは粉末状である。
【００１６】
分解対象物の分解は、本発明の白色腐朽菌を分解対象物（リグニン）に接種し、培養することによって行われる。分解対象物に含まれるリグニンの分解において、白色腐朽菌（NITE P-02428）の生育可能な環境にするために、リグニンと水分とを必須とし、必要に応じて、白色腐朽菌の生育に必要とされる塩や栄養素（例えば、米糠、ふすま等）を添加してもよい。
【００１７】
分解対象物は、白色腐朽菌（NITE P-02428）を接種する前に、殺菌処理（オートクレーブによる加熱処理等）を行い、雑菌の繁殖を防止しておくことが好ましい。
【００１８】
分解対象物に種菌を接種する方法は、特に制限されず、公知の接種方法に従って行うことができる。例えば、分解対象物が粉末状の場合であれば、これらの表面に種菌を降りかける方法や、分解対象物と種菌を混合する方法が例示できる。
【００１９】
分解対象物に含まれるリグニンの分解の条件は、白色腐朽菌（NITE P-02428）やその変異株が生存可能な条件で選択すればよく、例えば、好気的条件下、温度１０〜４０℃である。また、分解物の液体化は分解初期から起こり、分解対象物の種類や培養条件等によって異なるが、液体化が目視で認められるのは２０日程度、より液体化を進行させるためには６０日以上が好ましい。
【００２０】
本発明の白色腐朽菌の生産方法は、本発明の白色腐朽菌（NITE P-02428）又はその変異株をリグニンを含む培地で培養し、増殖させる工程を有する。生産された白色腐朽菌は、種菌として使用することができる。
使用されるリグニンは、上述した広葉樹、針葉樹、非木材系リグニン等が挙げられ、これを、寒天、ゼラチン等の公知の培地用材料に添加して、培地とすることができる。白色腐朽菌（NITE P-02428）（又はその変異株）の生育可能な環境にするために、リグニンと水分とを必須とし、必要に応じて、白色腐朽菌の生育に必要とされる塩や栄養素（例えば、米糠、ふすま等）を添加してもよい。
白色腐朽菌（NITE P-02428）又はその変異株の培養条件は、従来公知の白色腐朽菌の場合と同様であり、例えば、ポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）培地上では、１０〜４０℃で好気的条件下で良好に生育することができる。
【００２１】
本発明の他の態様は、リグニンを含む分解対象物に受託番号NITE P-02428で特定される白色腐朽菌又はその変異株を接種して増殖させることにより、前記リグニンを含む分解対象物を分解してその一部又は全部を液体化する工程を有するリグニンを含む分解対象物の処理方法である。
【００２２】
処理対象となるリグニンを含む分解対象物は、上述した広葉樹、針葉樹、非木材系リグニン等が挙げられる。
本発明の処理方法では、リグニンを含む分解対象物を、液体化することができるという利点があり、木質系廃棄物の処理方法として好適である。木質系廃棄物としては、典型的には剪定枝、漂流木材、間伐材、建築廃材等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明により、環境への影響が少なく、またコストを大きく削減することができるリグニンを含む分解対象物（例えば、木質系廃棄物）の処理方法が提供される。
【００２４】
以上、本発明について述べたが、上記記載において、明示的に開示されていない事項（例えば、菌の培養に使用する容器等）などは、当業者が通常実施する範囲を逸脱するものではなく、通常の当業者であれば、容易に想定することが可能なものを採用することができ、制限的なものではない。
【実施例】
【００２５】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２６】
評価１．クヌギ木粉の分解・液化試験（白色腐朽菌のスクリーニング）
以下の９種類の白色腐朽菌を供試菌としてクヌギ木粉の分解・液化試験を行い、腐朽力及び液化力の強い菌株の選抜を行った。
供試菌１：シイタケ（Lentinula edodes）
供試菌２：エノキタケ（Flammulina velutipes）
供試菌３：ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）
供試菌４：カワラタケ（Trametes versicolor）
供試菌５：シワタケ（Phlebia tremellosa）
供試菌６：Phanerochaete chrysosporium
供試菌７：Phanerochaete sp.
供試菌８：Phlebia lindtneri
供試菌９：Phlebia aurea
【００２７】
なお、供試菌７は、大分県中津地区で入手したキノコ栽培廃菌床（野外に半年程度放置）のうち、腐朽が進んでいるものを数種選抜し、それぞれをＰＤＡ培地に接種したところ、糸状菌１種の生長を認めた。さらに、糸状菌の断片をＰＤＡ培地に接種し、純粋培養を試みた。得られた菌株を保存菌株とした。本菌株は、特許微生物寄託センター受託番号NITE P-02428で寄託されている菌株（識別のための表示：BMC-110012）である。
【００２８】
クヌギ木粉の分解・液化試験は以下の通り行った。
クヌギ材を丸鋸で切断して発生するクヌギ木粉を木粉培地用木粉とし、クヌギ木粉：脱脂米糠＝８：２（重量比）の割合で混合し、水分含量６０重量％になるように水を添加して十分に混合することにより、評価用の木粉培地を得た。
試験管（１８ｍｍφ×１８０ｍｍ）にフィルター受けを挿入し、その上に穴を開けたバルサシート（厚さ１ｍｍ）を設置したものを９本用意し、それぞれの試験管内に木粉培地１０ｇを入れ、オートクレーブで温度１２１℃、６０分処理した後に、供試菌１〜９を接種した。なお、供試菌（種菌）は１８ｍｍφ×１８０ｍｍＰＤＡスラント保存分より、５ｍｍ角程度を切り取り接種した。
供試菌の接種後２５℃で６０日間培養し、培地の収縮の程度から腐朽能を、分解液の生成の程度から木質液化能を定性的に評価した。
【００２９】
供試菌の腐朽能及び木質液化能の表１に示す。
なお、表１において、「腐朽能」及び「木質液化能」の評価基準は以下の通りである。
＜腐朽能＞
― ： 培地の収縮は認められない（目視：３％以下）  
+  ：培地の収縮が僅かに認められる（目視：１０％以下）
++ ：培地の収縮が認められる（目視：２５％以下）
+++：培地の収縮が顕著に認められる（目視：５０％以下）
＜木質液化能＞
― ：目視で分解液の生成は認められない。
+  ：目視で分解液の生成が培地中に認められるが、試験管の底には溜まっていない。
++ ：目視で分解液の生成が認められ、試験管の底に、深さ１ｃｍ未満で液体が溜まっている。
+++：目視で分解液の生成が顕著に認められ、試験管の底に、深さ１ｃｍ以上で液体が溜まっている。
【００３０】
2019017352.tif 000002
【００３１】
表１の通り、木質リグニンの分解能（培地の収縮）に優れ、かつ、液化能（分解液の生成）が顕著に認められる菌株として、供試菌７（Phanerochaete sp.（受託番号：NITE P-02428））が選抜された。
【００３２】
評価２．供試菌７（Phanerochaete sp.（NITE P-02428））による液化試験
供試菌７を使用して、評価１と同様の方法でクヌギ木粉の液化の日数依存性を評価した。その結果、日数が長いほど粉末クヌギは分解して液体化する傾向にあり、２０日では固形物、３０日では若干の液体を含む固形物、６０日では固形物と液体の混合物、１２０日目ではほぼ液体化していた。
【００３３】
＜参考例＞
評価３．供試菌７（Phanerochaete sp.（NITE P-02428））の木材分解によるフルボ酸の産生の確認
評価１に同様の方法でクヌギ木粉培地（粉末状クヌギと脱脂米糠（添加栄養物）と水とを、５：０．８：４（重量比））を作製し、これに供試菌７（白色腐朽菌（NITE P-02428））を接種後、２５℃に保たれた培養室で３０日間静置して、粉末クヌギの分解を行うことにより、リグニン分解物を得た。
得られたリグニン分解物に所定量の水を添加して撹拌することにより、リグニン分解物に含まれる成分を水に抽出し、リグニン分解物を含有する液状組成物を得た。得られた液状組成物を、遠心分離機にて固液分離を行い、液体部分をデカンテーションして得た液体を減圧乾燥器にて減圧乾燥し、乾燥粉末を得た。得られた乾燥粉末を、ＩＨＳＳ法(国際腐植学会指定の操作方法及び確認方法)に準じる方法により分離精製した。
【００３４】
分離精製後の乾燥粉末を実施例の試料として、ＦＴ−ＩＲ、ＵＶ、1Ｈ−ＮＭＲ、元素分析（Ｃ・Ｈ・Ｎコーダ）により解析した。抽出させた有用腐植物質を同定させるため、市販品のフルボ酸（コヨウ株式会社製）と比較検討した。
使用した装置は以下の通りである。
ＩＲ：日本分光(株)、FT/IR-5000型
ＵＶ：日本分光(株)、Ubest V-560型
ＮＭＲ：ブルカーバイオスピン(株)、S-NMR 600
元素分析：(株)パーキンエルマージャパン、CHNS/O アナライザー 2400 II
【００３５】
図１に実施例と市販品のフルボ酸のＩＲスペクトルを示す。３４００ｃｍ-1に水酸基（ＯＨ）、２９８０ｃｍ-1にメチレン基（-ＣＨ2-）及び１７００ｃｍ-1にカルボキシル基（ＣＯＯＨ）の波長に特徴的なピークが見られた。文献（環境中の腐植物質-その特徴と研究法-、ISBN-10: 4782705778）からも同様なピークが確認されており、フルボ酸特有の水酸基やカルボキシル基を多く有する構造であると考えられる。
図２に実施例と市販品のＵＶスペクトルを示す。どちらも同様な吸収曲線を示したが、実施例の方が２７０ｎｍ付近の吸収が大きかった。この付近の吸収帯は芳香環に由来するものと考えられ、実施例の試料は芳香環を市販のものより比較的多く含む構造であると考えられる。
【００３６】
図３に実施例の試料の1Ｈ−ＮＭＲを測定した結果を示した。０．８ｐｐｍに弱いシグナルの末端メチル基、１．１〜１．３ｐｐｍにβ位のメチル基及びメチレンのシグナルにそれぞれ帰属され、３．５〜４．０ｐｐｍにメトキシル基、アルコール性水酸基を含む置換脂肪族水素のシグナルに帰属された。
図４にKononovaにより提唱されているE4/E6比の結果を示した。Ｅ４/Ｅ６比は４６５ｎｍと６６５ｎｍの吸光度の比率であり、フルボ酸の特性付けに用いられている。文献（環境中の腐植物質-その特徴と研究法-、ISBN-10: 4782705778）によるとフルボ酸のＥ４/Ｅ６比は６．０〜８．５の間で変動すると定義されている。実施例の試料のＥ４/Ｅ６比は７．８なった。
また、元素分析を行ったところ、各試料のＣ，Ｈ，Ｎの含有量は市販品（Ｃ:29.16％、Ｈ：4.71％、Ｎ：4.99％）、実施例（Ｃ：38.65％、Ｈ：4.63％、Ｎ：2.93％）となった。文献（環境中の腐植物質-その特徴と研究法-、ISBN-10: 4782705778）と比較したところ、窒素含量が多いことが確認された。また、平均分子量は約１０００００であった。これらの結果から、実施例の試料（分離精製後の乾燥粉末）にフルボ酸の存在が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明の白色腐朽菌は、液体化したリグニン分解物の生産やフルボ酸の生産のための微生物として有効利用できるので産業的に有望である。
【受託番号】
【００３８】
受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４２８
寄託日：２０１７年２月２０日
寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター
識別の表示：ＢＭＣ−１１００１２
【図１】
2019017352.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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