(57)【要約】【課題】  本発明は、高精度かつ高い特異性で短鎖核酸を検出又は定量できるプライマーセット、アッセイキット及び方法を提供することを課題としている。【解決手段】  実施形態の短鎖核酸伸長用プライマーセットは、標的短鎖核酸を伸長して伸長産物を得るためのものである。伸長産物は、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第１’の配列の相補配列及び第６の配列を含み、第１’の配列の相補配列がループプライマー配列である。当該プライマーセットは、第１の伸長用プライマー配列及び第６の配列の相補配列を含む第１の伸長用プライマーと、第２の伸長用プライマー配列、第４の配列、第３の配列及び第２の配列を含む第２の伸長用プライマーとを含む。【選択図】図１
2019017383.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の配列を含む標的短鎖核酸を伸長して、伸長産物を得るためのプライマーセットであって、
前記伸長産物は、互いに相補的な２本鎖の核酸であり、一方の鎖が５’から３’方向に向かって順に第２の配列、第３の配列、第４の配列、前記第１の配列の相補配列（以下、「第１’の配列」と記す）の相補配列及び第６の配列を含み、前記第１’の配列の相補配列がループプライマー配列であり、
（ａ）前記第１の配列とハイブリダイズする第１の伸長用プライマー配列及び前記第６の配列の相補配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む第１の伸長用プライマーと、
（ｂ）前記第１’の配列とハイブリダイズする第２の伸長用プライマー配列、前記第４の配列、前記第３の配列及び前記第２の配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む第２の伸長用プライマーと
を含む短鎖核酸伸長用プライマーセット。
【請求項２】
前記第２の配列がＦ２配列であり、
前記第３の配列がＦ１配列であり、
前記第４の配列がＢ１ｃ配列であり、
前記第６の配列がＢ２ｃ配列であり、
前記第１の伸長用プライマーは、前記第１の伸長用プライマー配列及びＢ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含み、
前記第２の伸長用プライマーは、前記第２の伸長用プライマー配列、前記Ｂ１ｃ配列、前記Ｆ１配列及び前記Ｆ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含み、
前記Ｂ２配列は前記Ｂ２ｃ配列と相補的である
請求項１に記載の短鎖核酸伸長用プライマーセット。
【請求項３】
前記伸長産物は、前記第１’の配列の相補配列と前記第６の配列との間に第５の配列を更に含み、前記第３の配列、前記第１’の配列の相補配列及び前記第５の配列のうち何れか１つがループプライマー配列又はループプライマー認識配列であり、
前記第１の伸長用プライマーは、前記第１の伸長用プライマー配列と前記第６の配列との間に前記第５の配列を更に含む
請求項１に記載の短鎖核酸伸長用プライマーセット。
【請求項４】
前記第２の配列がＦ２配列であり、
前記第３の配列がＦ１配列であり、
前記第４の配列がＢ１ｃ配列であり、
前記第５の配列がＬＢ配列であり、
前記第６の配列がＢ２ｃ配列であり、
前記第１の伸長用プライマーは、前記第１の伸長用プライマー配列、ＬＢｃ配列及びＢ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含み、
前記第２の伸長用プライマーは、前記第２の伸長用プライマー配列、前記Ｂ１ｃ配列、前記Ｆ１配列及び前記Ｆ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含み、
前記ＬＢ配列は前記ＬＢｃ配列と、前記Ｂ２配列は前記Ｂ２ｃ配列と相補的であり、
前記ＬＢ配列がループプライマー配列である
請求項３に記載の短鎖核酸伸長用プライマーセット。
【請求項５】
前記第２の配列がＦ２配列であり、
前記第３の配列がＦ１配列であり、
前記第４の配列がＢ１ｃ配列であり、
前記第５の配列がダミー配列であり、
前記第６の配列がＢ２ｃ配列であり、
前記第１の伸長用プライマーは、前記第１の伸長用プライマー配列、前記ダミー配列の相補配列及びＢ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含み、
前記第２の伸長用プライマーは、前記第２の伸長用プライマー配列、前記Ｂ１ｃ配列、前記Ｆ１配列及び前記Ｆ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含み、
前記Ｂ２配列は前記Ｂ２ｃ配列と相補的であり、
前記ダミー配列は、前記第１〜６の配列及びその相補配列とは異なる塩基配列であり、
前記第１’の配列の相補配列がループプライマー配列である
請求項３に記載の短鎖核酸伸長用プライマーセット。
【請求項６】
前記第２の配列がＦ２配列であり、
前記第３の配列がＬＦｃ配列であり、
前記第４の配列がＦ１配列であり、
前記第５の配列がＢ１ｃ配列であり、
前記第６の配列がＢ２ｃ配列であり、
前記第１の伸長用プライマーは、前記第１の伸長用プライマー配列、Ｂ１配列及びＢ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含み、
前記第２の伸長用プライマーは、前記第２の伸長用プライマー配列、前記Ｆ１配列、前記ＬＦｃ配列及びＦ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含み、
前記Ｂ１配列は前記Ｂ１ｃ配列と、前記Ｂ２配列は前記Ｂ２ｃ配列と相補的であり、
前記ＬＦｃ配列がループプライマー認識配列である
請求項３に記載の短鎖核酸伸長用プライマーセット。
【請求項７】
第１の配列を含む標的短鎖核酸を伸長し、増幅するためのプライマーセットであって、
請求項１に記載の短鎖核酸伸長用プライマーセット、及び前記短鎖核酸伸長用プライマーセットで前記標的短鎖核酸の前記第１の配列を伸長して得られる伸長産物を鋳型として前記第１’の配列を増幅して増幅産物を得るためのＬＡＭＰ増幅用プライマーセットを含み、
前記ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットは、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー及びループプライマーを含み、
前記ＦＩＰプライマーは、前記第２の配列及び前記第３の配列の相補配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含み、前記ＢＩＰプライマーは、前記第６の配列の相補配列及び前記第４の配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含み、
前記ループプライマーは、前記第１’の配列の相補配列と同じ配列を含む
短鎖核酸検出用プライマーセット。
【請求項８】
前記短鎖核酸伸長用プライマーセットが、請求項２に記載のプライマーセットであり、
前記ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットが、Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む前記ＦＩＰプライマーと、Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む前記ＢＩＰプライマーと、前記第１'の配列の相補配列を含む前記ループプライマーとを含み、
前記Ｆ１ｃ配列は、Ｆ１配列と、前記Ｂ１ｃ配列はＢ１配列と相補的である
請求項７に記載の短鎖核酸検出用プライマーセット。
【請求項９】
第１の配列を含む標的短鎖核酸を伸長し、増幅するためのプライマーセットであって、
請求項３に記載の短鎖核酸伸長用プライマーセット、及び前記短鎖核酸伸長用プライマーセットで前記標的短鎖核酸の前記第１の配列を伸長して得られる伸長産物を鋳型として前記第１’の配列を増幅して増幅産物を得るためのＬＡＭＰ増幅用プライマーセットを含み、
前記ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットは、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー及びループプライマーを含み、
前記伸長産物の前記第３の配列がループプライマー認識配列である場合、前記ＦＩＰプライマーは、前記第２の配列及び前記第４の配列の相補配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含み、前記ＢＩＰプライマーは、前記第６の配列の相補配列及び前記第４の配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含み、
前記伸長産物の前記第１’の配列の相補配列又は前記第５の配列がループプライマー配列である場合、前記ＦＩＰプライマーは、前記第２の配列及び前記第３の配列の相補配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含み、前記ＢＩＰプライマーは、前記第６の配列の相補配列及び前記第４の配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含み、
前記ループプライマーは、前記第３の配列がループプライマー認識配列である場合前記ループプライマー認識配列の相補配列を含み、前記第１’の配列の相補配列又は前記第５の配列がループプライマー配列である場合前記ループプライマー配列と同じ配列を含む
短鎖核酸検出用プライマーセット。
【請求項１０】
前記短鎖核酸伸長用プライマーセットが、請求項４に記載のプライマーセットであり、
前記ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットが、Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む前記ＦＩＰプライマーと、Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む前記ＢＩＰプライマーと、ＬＢ配列を含む前記ループプライマーとを含み、
前記Ｆ１ｃ配列は、Ｆ１配列と、前記Ｂ１ｃ配列はＢ１配列と相補的である
請求項９に記載の短鎖核酸検出用プライマーセット。
【請求項１１】
前記短鎖核酸伸長用プライマーセットが、請求項５に記載のプライマーセットであり、
前記ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットが、Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む前記ＦＩＰプライマーと、Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む前記ＢＩＰプライマーと、前記第１'の配列の相補配列を含む前記ループプライマーとを含み、
前記Ｆ１ｃ配列は、Ｆ１配列と、前記Ｂ１ｃ配列はＢ１配列と相補的である
請求項９に記載の短鎖核酸検出用プライマーセット。
【請求項１２】
前記短鎖核酸伸長用プライマーセットが、請求項６に記載のプライマーセットであり、
前記ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットが、Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む前記ＦＩＰプライマーと、Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む前記ＢＩＰプライマーと、ＬＦ配列を含む前記ループプライマーとを含み、
前記ＬＦ配列は前記ＬＦｃ配列と、前記Ｆ１ｃ配列はＦ１配列と、前記Ｂ１ｃ配列はＢ１配列と相補的である
請求項９に記載の短鎖核酸検出用プライマーセット。
【請求項１３】
請求項７又は９に記載の短鎖核酸検出用プライマーセットと、核酸伸長用試薬と、ＬＡＭＰ増幅用試薬とを含むアッセイキット。
【請求項１４】
前記短鎖核酸検出用プライマーセットの、前記短鎖核酸伸長用プライマーセットと前記ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットとが、別々の容器に収容されている請求項１３に記載のアッセイキット。
【請求項１５】
前記増幅産物の増加に伴って変化する電気的信号を生じる標識物質と、前記電気的信号を検出するための電気化学検出用デバイスとを更に含む請求項１３に記載のアッセイキット。
【請求項１６】
請求項１又は３に記載の短鎖核酸伸長用プライマーセットを用いて、試料中の、第１の配列を含む標的短鎖核酸を伸長する方法であって
前記第１の伸長用プライマーを前記第１の配列とハイブリダイズさせて前記第１の配列を伸長して前記第１’の配列を含む伸長中間産物を得ること、
前記伸長中間産物と前記標的短鎖核酸とを解離させること、並びに
前記第２の伸長用プライマーを前記伸長中間産物の前記第１’の配列とハイブリダイズさせ、前記第２の伸長用プライマー及び前記伸長中間産物を伸長させて、前記伸長産物を得ること
を含む短鎖核酸伸長方法。
【請求項１７】
請求項７又は９に記載の短鎖核酸検出用プライマーセットを用いて、試料中の、第１の配列を含む標的短鎖核酸を増幅する方法であって
請求項１６に記載の短鎖核酸伸長方法を実行すること、及び
前記伸長産物と、前記ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットと、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとを含む増幅反応液を等温増幅反応条件下で維持し、それによって前記伸長産物を鋳型として前記第１’の配列及び／又はその相補配列を増幅し、増幅産物を得ること
を含む短鎖核酸増幅方法。
【請求項１８】
請求項７又は９に記載の短鎖核酸検出用プライマーセットを用いて、試料中の、第１の配列を含む標的短鎖核酸を検出する方法であって
請求項１７に記載の方法を実行すること、及び
前記等温増幅反応条件下での維持中に、前記増幅産物を検出すること
を含む短鎖核酸検出方法。
【請求項１９】
前記増幅反応液は、前記増幅産物の増加に伴って変化する電気化学的信号を生じる標識物質を含み、前記検出は、前記電気化学的信号を検出することによって行われる請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、短鎖核酸伸長用プライマーセット、アッセイキット、短鎖核酸伸長方法、増幅方法及び検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な研究分野において、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）のような短鎖ＲＮＡが注目されている。ｓｉＲＮＡは２１〜２３塩基の人工的に合成された二本鎖ＲＮＡであり、生体内の遺伝子発現を抑制するために用いられる。ｍｉＲＮＡは１７〜２５塩基程度の一本鎖ＲＮＡであり、細胞内に存在し、遺伝子発現を調節する機能を持つことが知られている。特に、癌をはじめとする様々な疾患と、ｍｉＲＮＡの種類や発現量との関係について数多くの報告がなされている。また、ｍｉＲＮＡは血清中にもエキソソームに内包された形で存在することから、非侵襲の診断ツールとして大いに期待されている。
【０００３】
このような短鎖核酸断片の検出は、一般的には、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲによって行われる。しかしながら、短鎖核酸の配列は短いため、プライマーをアニールさせる領域を確保することが困難である。そのために、増幅や検出をすることや検出の高感度化が難しい。短鎖核酸を診断ツールとして臨床的に使用するために、短鎖核酸の検出技術の更なる開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊｉａｇｙａｎ Ｚｈｅｎｇｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕ．，２０１１，４７，９４６５
【非特許文献２】Ｗｅｎｆａｎｇ Ｄｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕ．，２０１６，５２，１２７２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、高精度かつ高い特異性で短鎖核酸を検出又は定量することができる短鎖核酸伸長用プライマーセット、アッセイキット及び短鎖核酸伸長方法、増幅方法及び検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
実施形態に従う短鎖核酸伸長用プライマーセットは、第１の配列を含む標的短鎖核酸を伸長して、伸長産物を得るためのプライマーセットである。伸長産物は、互いに相補的な２本鎖の核酸であり、一方の鎖が５’から３’方向に向かって順に第２の配列、第３の配列、第４の配列、前記第１の配列の相補配列（以下、「第１’の配列」と記す）の相補配列及び第６の配列を含む。第１’の配列の相補配列はループプライマー配列である。短鎖核酸伸長用プライマーセットは、第１の配列とハイブリダイズする第１の伸長用プライマー配列及び第６の配列の相補配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む第１の伸長用プライマーと、第１’の配列とハイブリダイズする第２の伸長用プライマー配列、第４の配列、第３の配列及び第２の配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む第２の伸長用プライマーとを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】第１の実施形態の標的短鎖核酸、伸長産物及び短鎖核酸伸長用プライマーセットの一例を示す模式図である。
【図２Ａ】第１の実施形態の伸長中間産物が得られる工程の一例を示す模式図である。
【図２Ｂ】第１の実施形態の伸長産物が得られる工程の一例を示す模式図である。
【図３】第１の実施形態の伸長産物及び短鎖核酸伸長用プライマーセットの一例を示す模式図である。
【図４】第１の実施形態の伸長産物及び短鎖核酸伸長用プライマーセットの一例を示す模式図である。
【図５】第１の実施形態の伸長産物及び短鎖核酸伸長用プライマーセットの一例を示す模式図である。
【図６】第１の実施形態の短鎖核酸伸長方法の一例を示すフローチャートである。
【図７Ａ】第１の実施形態の伸長産物及び短鎖核酸検出用プライマーセットの一例を示す模式図である。
【図７Ｂ】第１の実施形態の伸長産物及び短鎖核酸検出用プライマーセットの一例を示す模式図である。
【図８Ａ】第１の実施形態の伸長産物及び短鎖核酸検出用プライマーセットの一例を示す模式図である。
【図８Ｂ】第１の実施形態の伸長産物及び短鎖核酸検出用プライマーセットの一例を示す模式図である。
【図９Ａ】第１の実施形態の伸長産物及び短鎖核酸検出用プライマーセットの一例を示す模式図である。
【図９Ｂ】第１の実施形態の伸長産物及び短鎖核酸検出用プライマーセットの一例を示す模式図である。
【図１０】第１の実施形態の短鎖核酸増幅方法の一例を示すフローチャートである。
【図１１】第１の実施形態の短鎖核酸検出方法の一例を示すフローチャートである。
【図１２Ａ】第２の実施形態の伸長産物及び短鎖核酸検出用プライマーセットの一例を示す模式図である。
【図１２Ｂ】第２の実施形態の伸長産物及び短鎖核酸検出用プライマーセットの一例を示す模式図である。
【図１３Ａ】第２の実施形態の伸長産物及び短鎖核酸検出用プライマーセットの一例を示す模式図である。
【図１３Ｂ】第２の実施形態の伸長産物及び短鎖核酸検出用プライマーセットの一例を示す模式図である。
【図１４Ａ】第３の実施形態の伸長産物及び短鎖核酸検出用プライマーセットの一例を示す模式図である。
【図１４Ｂ】第３の実施形態の伸長産物及び短鎖核酸検出用プライマーセットの一例を示す模式図である。
【図１５Ａ】第３の実施形態の伸長産物及び短鎖核酸検出用プライマーセットの一例を示す模式図である。
【図１５Ｂ】第３の実施形態の伸長産物及び短鎖核酸検出用プライマーセットの一例を示す模式図である。
【図１６】例１において用いた短鎖核酸検出用プライマーセットＩの模式図である。
【図１７】例１における実験結果を示すグラフである。
【図１８】例２において用いた短鎖核酸検出用プライマーセットＩＩＩの模式図である。
【図１９】例２における実験結果を示すグラフである。
【図２０】例３において用いた短鎖核酸検出用プライマーセットＶの模式図である。
【図２１】例３における実験結果を示すグラフである。
【図２２】例４において用いた短鎖核酸検出用プライマーセットＶＩの模式図である。
【図２３】例４における実験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下に、図面を参照しながら種々の実施形態について説明する。各図は実施形態とその理解を促すための模式図であり、その形状や寸法、比などは実際と異なる個所があるが、これらは以下の説明と公知の技術を参酌して適宜、設計変更することができる。
【０００９】
（第１の実施形態）
・短鎖核酸伸長用プライマーセット
実施形態に従う短鎖核酸伸長用プライマーセットは、試料中の標的短鎖核酸を伸長し、伸長産物を得るためのプライマーセットである。例えば、伸長産物を増幅することによって試料中の標的短鎖核酸を検出又は定量することができる。
【００１０】
標的短鎖核酸、伸長産物及び短鎖核酸伸長用プライマーセットの一例を図１に示す。標的短鎖核酸（ｉ）は、後述する実施形態の短鎖核酸伸長方法において、短鎖核酸伸長用プライマーセットによって伸長される短鎖核酸である。標的短鎖核酸（ｉ）は、その少なくとも一部が塩基配列を含む核酸であればよい。例えば、標的短鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、Ｓ−オリゴ又はメチルホスホネートオリゴなどである。標的短鎖核酸（ｉ）は、天然由来の核酸であってもよいし、一部分又は全てが人工的に合成及び／又は設計された人工核酸であってもよい。標的短鎖核酸（ｉ）の塩基長は、例えば、約５０塩基以下である。
【００１１】
例えば、標的短鎖核酸（ｉ）は、短鎖ＲＮＡである。短鎖ＲＮＡは、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ）、又は核小体低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ）等の機能性ＲＮＡであってもよいし、機能性ＲＮＡでなくてもよい。或いは、人工ＲＮＡ又は５０塩基より長いＲＮＡを断片化して生じたＲＮＡであってもよい。
【００１２】
標的短鎖核酸（ｉ）は、第１の配列を含む。第１の配列は、図１に示されるように標的短鎖核酸（ｉ）の全長に亘る配列から選択された、連続した配列である。第１の配列は、標的短鎖核酸（ｉ）の全長に亘る配列であってもよい。第１の配列は、標的短鎖核酸（ｉ）を検出又は定量するための指標となり得る配列であり、例えば、標的短鎖核酸（ｉ）中に含まれる、標的短鎖核酸（ｉ）に特異的な配列であることが好ましい。第１の配列は、短鎖核酸伸長用プライマーセットによって伸長されるべき配列である。第１の配列の塩基長は、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基又は４０塩基〜５０塩基であることが好ましい。１０塩基〜５０塩基であれば、より好ましい。なお、第１の配列の相補的ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ、ｃＤＮＡ）と同じ塩基配列を有する核酸配列（以下、「第１’の配列」と記す）及びその相補配列は、後述する実施形態の短鎖核酸増幅方法及び検出方法において増幅されるべき標的である。
【００１３】
次に、実施形態の短鎖核酸伸長用プライマーセットを用いて標的短鎖核酸（ｉ）を伸長して得られる伸長産物（ｉｉ）について説明する。伸長産物（ｉｉ）は、互いに相補的な２本鎖の核酸である。伸長産物の一方の鎖は、５’から３’方向に向かって順に第２の配列、第３の配列、第４の配列、第１’の配列の相補配列、第５の配列及び第６の配列を含む。他方の鎖は、前記一方の鎖の相補配列であり、３’から５’方向に向かって順に第２の配列の相補配列、第３の配列の相補配列、第４の配列の相補配列、第１’の配列、第５の配列の相補配列及び第６の配列の相補配列を含む。
【００１４】
第１’の配列は、第１の配列の相補的ＤＮＡと同じ塩基配列を有する核酸配列である。第１’の配列は、例えば、第１の配列の相補的ＤＮＡであってもよい。或いは、第１’の配列は、第１の配列の相補的ＤＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドがそれと同じ種類の塩基を有するＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）及び／又はＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）で置き換わっている核酸配列であってもよい。
【００１５】
第１’の配列の相補配列は、第１の配列の塩基配列に対応する塩基配列を有する核酸配列である。例えば、標的短鎖核酸がＲＮＡである場合は、第１’の配列の相補配列の塩基配列は、Ｕ（ウラシル）がＴ（チミン）であることを除いて、第１の配列と同じである。また例えば、標的短鎖核酸がＤＮＡ、ＬＮＡ又はＰＮＡなどである場合は、第１’の配列の相補配列の塩基配列は、第１の配列と同じである。第１’の配列の相補配列は、ＤＮＡのみで構成されていてもよいし、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含んでいてもよい。
【００１６】
第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列及び第６の配列はそれぞれ、第１’の配列及びその相補配列とは異なる塩基配列を有する核酸配列である。また、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列及び第６の配列のそれぞれは、互いに異なる塩基配列を有する。第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列及び第６の配列のそれぞれは、ＤＮＡのみで構成されていてもよいし、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含んでいてもよい。これらの配列の塩基長はそれぞれ、例えば、５塩基〜３５塩基であることが好ましく、１０塩基〜３０塩基であればより好ましい。
【００１７】
第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列及び第６の配列の塩基配列は、人工的な配列であることが好ましい。人工的な配列とは、自然界に存在しない塩基配列である。これらの配列が人工的な配列であることによって、後述する短鎖核酸伸長用プライマーセットを用いて伸長産物を生成する際に、これらの配列が試料中に含まれる標的短鎖核酸以外の核酸と結合することを防止できる。その結果、標的短鎖核酸以外の配列を含む伸長産物が生成されることが防止される。それによって、検出結果が偽陽性となることを防止することができる。
【００１８】
人工配列は、例えば、４種の数字の乱数列を作成し、各数字にＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）に割り付けることによって容易に作成することができる。更に、このように作成した人工配列を、ＢＬＡＳＴ検索などによって登録された自然界に存在する配列かどうかを確認してもよい。そして、その配列と同じ配列或いは類似配列がないものを実施形態の第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列及び第６の配列として選択すれば、より好ましい人工配列が得られる。
【００１９】
また、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第５の配列及び第６の配列として、ＬＡＭＰ増幅用プライマー認識配列として効率のよい所望の人工配列を作成又は選択してもよい。その場合、伸長産物を増幅する際の増幅の安定性、特異性が更に向上される。
【００２０】
前記第３の配列、第１’の配列の相補配列及び第５の配列のうち何れか１つは、ループプライマー配列又はループプライマー認識配列である。ループプライマー認識配列とは、当該伸長産物を増幅する際に、後述するＬＡＭＰ増幅用プライマーセットに含まれるループプライマーが結合するための配列である。ループプライマー配列とは、ループプライマー認識配列の相補配列である。このようなループプライマー配列又はループプライマー認識配列が含まれていることによって、伸長産物がより早く、安定して増幅される。
【００２１】
伸長産物の一方の鎖は、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第１’の配列の相補配列、第５の配列及び第６の配列以外の配列を含んでいてもよい。例えば、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第１’の配列、第５の配列及び第６の配列の各々の配列と配列との間には、スペーサー配列が存在していてもよい。スペーサー配列については、第１の伸長用プライマー及び第２の伸長用プライマーの説明において記載する。
【００２２】
伸長産物は、後述する短鎖核酸伸長用プライマーセットに含まれる第１の伸長用プライマー及び第２の伸長用プライマーで第１の配列を伸長して得られるため、伸長産物の構成、即ち、核酸の種類及び塩基配列は、第１の伸長用プライマー及び第２の伸長用プライマーの構成に従って決定される。
【００２３】
短鎖核酸伸長用プライマーセットは、第１の伸長用プライマー（ｉｉｉ）と、第２の伸長用プライマー（ｉｖ）とを含む。
【００２４】
第１の伸長用プライマー（ｉｉｉ）は、一本鎖の核酸であり、第１の伸長用プライマー配列、第５の配列の相補配列及び第６の配列の相補配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。
【００２５】
第１の伸長用プライマー配列は、第１の配列とハイブリダイズして、第１の配列の全長に亘る相補配列（第１’の配列）を生成するためのプライマーとして働く核酸配列である。第１の伸長用プライマー配列は、例えば、第１’の配列の５’末端を含む連続した少なくとも５つの塩基配列を有する。この配列は、標的短鎖核酸の第１の配列の３’末端を含む連続した塩基配列とハイブリダイズすることができる。
【００２６】
第１の伸長用プライマー配列は、ＤＮＡのみで構成されていてもよいし、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含んでいてもよい。ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを多く含ませるほど第１の伸長用プライマー配列と第１の配列との結合力を強くすることができる。従って、含ませるＬＮＡ及び／又はＰＮＡの数は、第１の配列と第１の伸長用プライマー配列とのハイブリダイズの所望のＴｍ値に従って決定されればよい。例えば、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含ませてＴｍ値を高くすると、第１の配列と第１の伸長用プライマー配列とをハイブリダイズさせて伸長中間産物を得る後述する第１の伸長反応をより高い温度で行うことができる。それによって、非特異的な結合を抑制することが可能であり、より特異的に第１の配列の相補配列が生成するため、好ましい。その結果、より精度よく標的短鎖核酸を検出することが可能である。
【００２７】
第１の伸長用プライマー配列の塩基長は、例えば、５塩基〜２０塩基であることが好ましく、６塩基から１５塩基であればより好ましく、７塩基〜１２塩基であれば更に好ましい。
【００２８】
第５の配列の相補配列は、上述の第５の配列と相補的な核酸配列である。第６の配列の相補配列は、上述の第６の配列と相補的な核酸配列である。第５の配列の相補配列及び第６の配列の相補配列は、ＤＮＡのみで構成されていてもよいし、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含んでいてもよい。
【００２９】
第１の伸長用プライマー配列と第５の配列の相補配列との間、第５の配列の相補配列と第６の配列の相補配列との間にはそれぞれスペーサー配列が存在していてもよい。スペーサー配列は、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第１’の配列、第５の配列、第６の配列及びその相補配列とは異なり、かつ後述する伸長産物の増幅に悪影響を与えない核酸配列である。スペーサー配列は、ＤＮＡのみで構成されていてもよいし、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含んでいてもよい。例えば、スペーサー配列は、第１の伸長用プライマーの高次構造化を抑制するため、ポリＴ配列又はポリＡ配列などであることが好ましい。スペーサー配列の塩基長は、例えば、１塩基〜１６塩基であることが好ましい。しかしながら、スペーサー配列が第１の伸長用プライマーに含まれない方が、第１の伸長用プライマーをより短く設計することができるため好ましい。
【００３０】
第１の伸長用プライマーの全長は、１５塩基〜８０塩基であることが好ましい。第１の伸長用プライマーの全長に亘る構成、即ち、塩基配列は、所望の伸長産物が得られるように選択及び／又は設計されればよい。例えば、先に得たい伸長産物の構成を決定し、それに従って第１の伸長用プライマーの塩基配列を設計してもよい。
【００３１】
次に、第２の伸長用プライマー（ｉｖ）について説明する。第２の伸長用プライマー（ｉｖ）は、一本鎖の核酸であり、第２の伸長用プライマー配列、第４の配列、第３の配列及び第２の配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。
【００３２】
第２の伸長用プライマー配列は、第１’の配列の全長に亘る相補配列を生成するためのプライマーとして働く核酸配列である。例えば、第２の伸長用プライマー配列は、第１’の配列の相補配列の５’末端を含む連続した少なくとも５つの塩基配列を有する。この配列は、伸長中間産物の第１’の配列の３’末端を含む連続した塩基配列とハイブリダイズすることができる。
【００３３】
第２の伸長用プライマー配列は、ＤＮＡのみで構成されていてもよいし、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含んでいてもよい。ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを多く含ませるほど第２の伸長用プライマー配列の第１’の配列との結合力を強くすることができる。従って、含ませるＬＮＡ及び／又はＰＮＡの数は、第１’の配列と第２の伸長用プライマー配列とのハイブリダイズの所望のＴｍ値に従って決定されればよい。例えば、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含ませてＴｍ値を高くすると、第１’の配列と第２の伸長用プライマー配列とをハイブリダイズさせて伸長産物を得る後述する第２の伸長反応をより高い温度で行うことができる。それによって、非特異的な結合を抑制することが可能であるため好ましい。その結果、より精度よく標的短鎖核酸を検出することが可能である。
【００３４】
第２の伸長用プライマー配列の塩基長は、例えば、５塩基〜２５塩基であることが好ましく、８塩基から２１塩基であればより好ましく、１１塩基〜１８塩基であれば更に好ましい。
【００３５】
第２の配列、第３の配列及び第４の配列は、上で説明した第２の配列、第３の配列及び第４の配列と同じ核酸配列である。これらの配列は、それぞれＤＮＡのみで構成されていてもよいし、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含んでいてもよい。
【００３６】
第２の伸長用プライマー配列と第２配列との間、第２の配列と第３の配列との間、第３の配列と第４の配列との間には、それぞれスペーサー配列が存在していてもよい。スペーサー配列は、第２の配列、第３の配列、第４の配列、第１’の配列、第５の配列、第６の配列及びその相補配列とは異なり、かつ後述する伸長産物のＬＡＭＰ増幅に悪影響を与えないＤＮＡヌクレオチド配列である。スペーサー配列は、ＤＮＡのみで構成されていてもよいし、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含んでいてもよい。例えば、スペーサー配列は、第２の伸長用プライマーの高次構造化を抑制するため、ポリＴ配列又はポリＡ配列などであることが好ましい。スペーサー配列の塩基長は、例えば、１塩基〜１６塩基であることが好ましい。しかしながら、スペーサー配列が第２の伸長用プライマーに含まれない方が、第２の伸長用プライマーをより短く設計することができるため好ましい。
【００３７】
但し、第１の伸張プライマーを用いて得られる伸張中間産物に第２の伸張プライマーがハイブリダイズする際の結合力（Ｔｍ）を強めるという理由から、第１の伸張反応をＭ−ＭｕｌＶ酵素又はＭ−ＭｕｌＶ酵素を改変した酵素、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅなどを用いて実施することによって、第４の配列と第１’の相補配列の間にスペーサー配列を存在させることが好ましく、その場合、スペーサー配列は、ポリＧ配列であることが好ましい。
【００３８】
第２の伸長用プライマーの全長は、２５塩基〜１３０塩基であることが好ましい。第２の伸長用プライマーの全長に亘る構成、即ち、塩基配列は、所望の伸長産物が得られるように選択及び／又は設計されればよい。例えば、先に得たい伸長産物の構成を決定し、それに従って第２の伸長用プライマーの塩基配列を設計してもよい。
【００３９】
以上に説明した短鎖核酸伸長用プライマーセットによって、標的短鎖核酸を伸長して伸長産物を得る工程の一例を図２Ａ、２Ｂを用いて説明する。
【００４０】
まず、図２Ａに示すように、標的短鎖核酸１の第１の配列２に、第１の伸長用プライマー３の第１の伸長用プライマー配列４がハイブリダイズする。次に、後述する第１のＤＮＡポリメラーゼ（図示せず）によって、第１の配列２を鋳型とした、第１の伸長用プライマー配列４の３’末端の５’方向（白抜き矢印で示す）への伸長が進行する。それによって、第１’の配列５が生成する（以下、この一連の工程を「第１の伸長反応」と称する）。
【００４１】
標的短鎖核酸がＲＮＡである場合は、第１の伸長反応において、第１のＤＮＡポリメラーゼは逆転写酵素であり、第１の伸長用プライマーによる第１の配列の逆転写によって第１’の配列が生成される。
【００４２】
次いで、標的短鎖核酸１を第１’の配列５から解離することによって、第１’の配列５、第５の配列の相補配列及び第６の配列の相補配列をこの順番で含む伸長中間産物６が得られる。
【００４３】
次に、図２Ｂに示すように、伸長中間産物６の第１’の配列５に、第２の伸長用プライマー８の第２の伸長用プライマー配列９がハイブリダイズする。次いで、後述する第２のＤＮＡポリメラーゼ（図示せず）によって、第２の伸長用プライマー８と伸長中間産物６が、互いを鋳型として伸長する。即ち、第２の伸長用プライマー８の３’末端が伸長中間産物６を鋳型として伸長し、同時に、伸長中間産物６の３’末端が第２の伸長用プライマー８を鋳型として伸長する（白抜き矢印で示す）。その結果、二本鎖ＤＮＡの伸長産物１１が生成する（以下、この図２Ｂに示す一連の工程を「第２の伸長反応」と称する）。
【００４４】
以上に説明したように第１の実施形態の短鎖核酸伸長用プライマーセットによれば、３つの配列を有する第１の伸長用プライマーと、４つの配列を有する第２の伸長用プライマーを用いて、６つの配列を含む２本鎖の核酸の伸長産物が得られる。
【００４５】
このように第１の伸長用プライマーを第２の伸長用プライマーよりも短い配列に設計することによって、標的短鎖核酸がＲＮＡである場合、逆転写酵素の特性に従って低温で行われ得る逆転写反応（第１の伸長反応）において、第１の伸長用プライマーが高次構造化することを防止できる。また、長い第２の伸長用プライマーが高次構造をとっていたとしても、高温で行うことができる第２の伸長反応において、高次構造がほどかれ、効率よく第２の伸長反応が行われることが可能である。
【００４６】
また、第１の実施形態の第１の伸長用プライマー及び第２の伸長用プライマーの塩基配列は、従来のＬＡＭＰ増幅用に設計された短鎖核酸を伸長するためのプライマーよりも短く設計されている。そのため、これらのプライマーや伸長中間産物が従来よりも高次構造をとりにくい。その結果、上記第１及び第２の伸長反応の効率が向上し、また非特異的な伸長中間産物や伸長産物が生成しにくい。更に、当該伸長産物は、短鎖核酸を伸長した従来のＬＡＭＰ増幅用の伸長産物よりもプライマー認識配列が少ないが、ループプライマー配列又はループプライマー認識領域を１つ含む。そのため、伸長産物が早く、安定して増幅されることが可能である。
【００４７】
また、当該伸長産物は、増幅される際に非特異的な増幅が起こりにくく、かつ短鎖核酸の存在量が少なくても効率的に増幅される。従って、実施形態の短鎖核酸伸長用プライマーセットを用いれば、短鎖核酸をより精度よく検出又は定量することが可能である。
【００４８】
以上に説明した短鎖核酸伸長用プライマーセット及び伸長産物に含まれる各配列は、ＬＡＭＰ増幅用プライマーが結合するための認識配列であってもよい。そのような例を図３〜図５に示す。
【００４９】
図３に示す短鎖核酸伸長用プライマーセット及びそれを用いて得られる伸長産物において、第２の配列はＦ２配列であり、第３の配列はＦ１配列であり、第４の配列はＢ１ｃ配列であり、第５の配列はＬＢ配列であり、第６の配列はＢ２ｃ配列である。
【００５０】
従って、この例における第１の伸長用プライマーは、第１の伸長用プライマー配列、ＬＢｃ配列及びＢ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。第２の伸長用プライマーは、第２の伸長用プライマー配列、Ｂ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。伸長産物は、一方の鎖がＦ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、第１’の配列の相補配列、ＬＢ配列及びＢ２ｃ配列を５’から３’方向に向かってこの順番で含み、他方の鎖がＦ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、第１’の配列、ＬＢｃ配列及びＢ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ここで、Ｆ２配列はＦ２ｃ配列と、Ｆ１配列はＦ１ｃ配列と、Ｂ１配列はＢ１ｃ配列と、Ｂ２配列はＢ２ｃ配列と、ＬＢ配列はＬＢｃ配列と相補的である（以下の説明においても同様）。この例においては、第５の配列、即ち、ＬＢ配列がループプライマー配列である。
【００５１】
このような配列を有する短鎖核酸伸長用プライマーセットによれば、短鎖核酸をより特異的かつ効率的に伸長することが可能である。
【００５２】
図４に示す短鎖核酸伸長用プライマーセット及びそれを用いて得られる伸長産物において、第２の配列はＦ２配列であり、第３の配列はＦ１配列であり、第４の配列はＢ１ｃ配列であり、第５の配列はダミー配列であり、第６の配列はＢ２ｃ配列である。
【００５３】
ダミー配列とは、第１’の配列、Ｆ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列及びその相補配列とは異なる塩基配列を有する核酸配列である。また、ダミー配列は、後述する当該伸長産物を増幅するためのＬＡＭＰ増幅用プライマーに含まれる何れの認識配列及びその相補配列とも異なる塩基配列を有する核酸配列である。
【００５４】
従って、この例における第１の伸長用プライマーは、第１の伸長用プライマー配列、ダミー配列の相補配列及びＢ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。第２の伸長用プライマーは、第２の伸長用プライマー配列、Ｂ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。伸長産物は、一方の鎖がＦ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、第１’の配列の相補配列、ダミー配列及びＢ２ｃ配列を５’から３’方向に向かってこの順番で含み、他方の鎖がＦ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、第１’の配列、ダミー配列の相補配列及びＢ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。この例においては、第１’の配列の相補配列がループプライマー配列である。
【００５５】
このような配列を有する短鎖核酸伸長用プライマーセットによれば、得られた伸長産物を増幅する際、ループプライマーが第１’の配列に結合することによって増幅反応が加速され、安定して増幅産物が生成される。従って、伸長が正常に行われず、第１’の配列及びその相補配列が生成していない場合は、増幅産物が安定して生成しない。言い換えれば、第１’の配列及びその相補配列を含む所望の伸長産物が生成した場合に増幅産物が安定して得られ、非特異的な伸長産物は増幅されにくい。そのため、上記の短鎖核酸伸長用プライマーセットによれば、短鎖核酸を更に特異的に、精度よく検出又は定量することが可能である。
【００５６】
図５に示す短鎖核酸伸長用プライマーセット及びそれを用いて得られる伸長産物において、第２の配列はＦ２配列であり、第３の配列はＬＦｃ配列であり、第４の配列はＦ１配列であり、第５の配列はＢ１ｃ配列であり、第６の配列はＢ２ｃ配列である。
【００５７】
従って、第１の伸長用プライマーは、第１の伸長用プライマー配列、Ｂ１配列及びＢ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。第２の伸長用プライマーは、第２の伸長用プライマー配列、Ｆ１配列、ＬＦｃ配列及びＦ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。伸長産物は、一方の鎖がＦ２配列、ＬＦｃ配列、Ｆ１配列、第１’の配列の相補配列、Ｂ１ｃ配列及びＢ２ｃ配列を５’から３’方向に向かってこの順番で含み、他方の鎖がＦ２ｃ配列、ＬＦ配列、Ｆ１ｃ配列、第１’の配列、Ｂ１配列及びＢ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ここで、ＬＦ配列はＬＦｃ配列と相補的である。この例においては、第３の配列、即ち、ＬＦｃ配列がループプライマー認識配列である。
【００５８】
このような配列を有する短鎖核酸伸長用プライマーセットによれば、短鎖核酸をより特異的かつ効率的に伸長することが可能である。
【００５９】
短鎖核酸伸長用プライマーセットに含まれる各配列の塩基配列は、ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットの塩基配列を元に決定してもよい。例えば、予め決定された増幅効率に優れるＬＡＭＰ増幅用プライマーセットの塩基配列に従って短鎖核酸伸長用プライマーセットの塩基配列を決定すれば、その短鎖核酸伸長用プライマーセットを用いて生成される伸長産物がより効率よく増幅される。
【００６０】
・短鎖核酸伸長方法
以上に説明した短鎖核酸伸長用プライマーセットを用いて短鎖核酸を伸長する方法を以下に説明する。図６は、実施形態の短鎖核酸伸長方法の一例を示す概略フローである。当該方法は、試料中の、第１の配列を含む標的短鎖核酸を伸長する方法であり、以下の工程（Ｓ１）〜（Ｓ３）を含む。第１の伸長用プライマーを第１の配列とハイブリダイズさせて第１の配列を伸長して第１’の配列を含む伸長中間産物を得ること（Ｓ１）、伸長中間産物と標的短鎖核酸とを解離させること（Ｓ２）、第２の伸長用プライマーを前記伸長中間産物の第１’の配列とハイブリダイズさせ、第２の伸長用プライマー及び前記伸長中間産物を伸長させて、伸長産物を得ること（Ｓ３）。
【００６１】
以下に、短鎖核酸伸長方法の各工程について詳細に説明する。
【００６２】
工程（Ｓ１）において、第１の伸長用プライマーを第１の配列とハイブリダイズさせて前記第１の配列を伸長して第１’の配列を含む伸長中間産物を得る。工程（Ｓ１）は、例えば、試料と、第１の伸長用プライマーセットと、第１のＤＮＡポリメラーゼとを含む第１の伸長反応液を第１の伸長反応条件下に維持することによって行うことができる。
【００６３】
試料は、分析されるべき対象であり、標的短鎖核酸を含む可能性のあるものであればよい。試料は、例えば、動物から採取された血液、血清、白血球、リンパ液、髄液、尿、便、精液、汗、唾液、口腔内粘膜、喀痰、涙液、母乳、羊水、組織、バイオプシー、単離細胞若しくは培養細胞などの物質、植物の器官、単離細胞、培養細胞若しくは抽出物、微生物、細菌、真菌若しくはウイルスを含む混合物、環境から採取された環境物質、合成ＲＮＡを含む混合物、或いはそれらの何れかの混合物などの材料そのものであってもよい。或いは、それらを材料として調製された調製物であってもよい。
【００６４】
動物は、例えば、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、魚類又は節足動物、或いは動物界に属するその他の生物であり得る。哺乳類は、サル及びヒト等の霊長類、マウス及びラット等の齧歯類、イヌ、ネコ及びウサギ等の伴侶動物、ウマ、ウシ及びブタ等の家畜などの何れかの哺乳動物であり得る。
【００６５】
試料は、増幅反応を妨害しない状態にあることが好ましい。そのような状態にあることによって、実施形態の短鎖核酸増幅方法において標的短鎖核酸をより効率よく増幅することが可能である。増幅反応を妨害しない状態とは、例えば、試料中の何れかの成分の種類、成分の組み合わせ又は成分の濃度等が、増幅反応速度を低下させる、遅延させる又は停止させるようなものではない状態であることをいう。
【００６６】
上述の材料自体が増幅反応を妨害しない状態にある場合、その材料をそのまま試料として使用してもよい。或いは、得られた材料について、例えば、それ自身公知の何れかの手段により前処理を行って、増幅反応を妨害しない状態又はより増幅に適した状態の試料を得てもよい。前処理は、例えば、細切、ホモジナイズ、遠心、沈殿、抽出及び／又は分離などである。
【００６７】
例えば、抽出は、市販の核酸抽出キットを用いて行われてもよい。核酸抽出キットは、例えば、ｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）ＳＰ Ｋｉｔ（和光純薬製）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ｍｉＲＮＡ（タカラバイオ製）、ｍｉｒｐｒｅｍｉｅｒ（登録商標）ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｉｓｏｌａｒｉｏｎ Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ製）、ハイピュアｍｉＲＮＡアイソレーションキット（ロシュ・ライフサイエンス製）、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ｍｉＲＮＡ Ｋｉｔ、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｓｅｒｕｍ／ Ｐｌａｓｍａ Ｋｉｔ（ともにキアゲン製）、ｍｉＲＣＵＲＹ（登録商標） ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ − Ｂｉｆｌｕｉｄｓ（エキシコン製）、Ｐｌａｓｍａ／Ｓｅｒｕｍ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＮＯＲＧＥＮ製）などを用いることができるが、これらに限定されるものではない。或いは、このようなキットを使用せずに、例えば、材料を緩衝液で希釈し、８０〜１００℃の加熱処理を行い、遠心分離し、その上清を採取することによって抽出を行い、試料を得てもよい。
【００６８】
第１の伸長用プライマーとして、例えば、上述の何れかの第１の伸長用プライマーを用いることができる。
【００６９】
第１のＤＮＡポリメラーゼは、公知の何れかのＤＮＡポリメラーゼであればよく、第１の伸長用プライマーの種類及び／又は標的短鎖核酸の種類若しくは配列等に応じて選択される。第１のＤＮＡポリメラーゼとして、例えば、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ）、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｃｓａ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、  ９６−７  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＧｓｐＳＳＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、又はＴｉｎ  ｅｘｏ−  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いることができる。或いはＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをはじめとするＰＣＲ増幅に一般的に用いられる他のＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いることもできる。或いは、ＤＮＡを鋳型とした増幅が可能である逆転写酵素Ｍ−ＭｕＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｔｉｐｔａｓｅ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｔｉｐｔａｓｅなどを用いることができる。
【００７０】
標的短鎖核酸がＲＮＡである場合、第１のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、逆転写酵素である。逆転写酵素として、例えば、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、トランスクリプター逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）トランスクリプター逆転写酵素、又はＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素などを用いることができる。
【００７１】
第１の伸長用プライマーが、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含む場合、第１のＤＮＡポリメラーゼとして、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。
【００７２】
第１の伸長反応液は、これらの成分に加えて、更に、第１の伸長反応に必要な所望の成分を含み得る。そのような成分は、例えば、塩、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などの基質、反応試薬としての増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤、アニーリング特異性を増大するイオン、及び／又は逆転写酵素の補因子となるイオンなどであり得る。
【００７３】
以上に説明した第１の伸長反応液を第１の伸長反応条件下に維持することによって、第１の伸長反応が起こり、第１’の配列、第５の配列の相補配列及び第６の配列の相補配列を含む上記の伸長中間産物を得ることができる。第１の伸長反応条件は、当業者の通常の知識に基づいて、第１の伸長用プライマーの種類、伸長中間産物の種類及び／又はＤＮＡポリメラーゼの種類などに依存して選択すればよい。第１の伸長反応の反応温度は、例えば、約１０〜５５℃である。第１の伸長反応は、反応温度を一定に保持するか、複数の温度帯を一定時間ずつ保持するか、又は複数の温度帯を複数回のサイクルで繰り返すことで実施することが可能である。第１の伸長用プライマーがＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含む場合、第１の伸長反応の反応温度は、２０〜６５℃であることが好ましい。
【００７４】
例えば、前記維持によって、図２Ａに示す工程で標的短鎖核酸と結合した状態の伸長中間産物が得られる。
【００７５】
次に、工程（Ｓ２）において、伸長中間産物と標的短鎖核酸とを解離させる。解離は、例えば、第１の伸長反応の後、第１の伸長反応液を８０〜１００℃に加熱することによって行うことができる。
【００７６】
標的短鎖核酸がＲＮＡである場合、上記のような加熱によって、標的短鎖核酸が解離されるのと同時に逆転写酵素（第１のＤＮＡポリメラーゼ）が失活し得る。それによって、工程（Ｓ３）以降の工程に逆転写酵素が悪影響を及ぼすことを防ぐことができる。
【００７７】
次に、工程（Ｓ３）において、第２の伸長用プライマーを伸長中間産物の第１’の配列とハイブリダイズさせ、第２の伸長用プライマー及び伸長中間産物を伸長させて、伸長産物を得る。工程（Ｓ３）は、例えば、工程（Ｓ２）で得られた伸長中間産物と、第２の伸長用プライマーと、第２のＤＮＡポリメラーゼとを含む第２の伸長反応液を第２の伸長反応条件下に維持することによって行うことができる。
【００７８】
第２の伸長用プライマーとして、例えば、上述の何れかの第２の伸長用プライマーを用いることができる。
【００７９】
第２のＤＮＡポリメラーゼは、公知の何れかのＤＮＡポリメラーゼであればよく、第２の伸長用プライマーの種類及び／又は伸長中間産物の配列等に応じて選択される。そのような第２のＤＮＡポリメラーゼとして、例えば、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ）、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｃｓａ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、  ９６−７  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＧｓｐＳＳＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、又はＴｉｎ  ｅｘｏ−  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、或いはＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをはじめとするＰＣＲ増幅に一般的に用いられる他のＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いることもできる。或いは、ＤＮＡを鋳型とした増幅が可能である逆転写酵素Ｍ−ＭｕＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｔｉｐｔａｓｅ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｔｉｐｔａｓｅなどを用いることができる。第１の伸長反応と第２の伸長反応とを同じ種類のＤＮＡポリメラーゼで行うことができる場合、即ち、標的短鎖核酸がＤＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡなどである場合、第２のＤＮＡポリメラーゼとして第１のＤＮＡポリメラーゼを用いてもよい。その場合、第２の伸長反応を行う前に反応液に第２のＤＮＡポリメラーゼを添加する必要がなく、第１の伸長反応液にＤＮＡポリメラーゼ以外の第２の伸長反応液の成分を含ませたものを用いて第２の伸長反応を行ってもよい。
【００８０】
第２の伸長用プライマーが、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含む場合、第２のＤＮＡポリメラーゼとして、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。
【００８１】
第２の伸長反応液は、これらの成分に加えて、更に、第２の伸長反応に必要な所望の成分を含み得る。そのような成分は、例えば、塩、ｄＮＴＰなどの基質、反応試薬としての増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤、アニーリング特異性を増大するイオン、及び／又は逆転写酵素の補因子となるイオンなどであり得る。
【００８２】
以上に説明した第２の伸長反応液を伸長反応条件下に維持することによって、第２の伸長反応が起こり、伸長産物を得ることができる。伸長産物は、互いに相補的な２本鎖の核酸であって、一方の鎖が５’から３’方向に向かって順に第２の配列、第３の配列、第４の配列、第１’の配列の相補配列、第５の配列及び第６の配列を含み、第３の配列、第１’の配列の相補配列及び第５の配列のうち何れか１つがループプライマー配列又はループプライマー認識配列である。
【００８３】
第２の伸長反応条件は、当業者の通常の知識に基づいて、第２の伸長用プライマーの種類、伸長中間産物の種類及び／又はＤＮＡポリメラーゼの種類などに依存して選択すればよい。第２の伸長反応の反応温度は、例えば、約１０〜８０℃である。第２の伸長反応は、反応温度を一定に保持するか、複数の温度帯を一定時間ずつ保持するか、又は複数の温度帯を複数回のサイクルで繰り返すことで実施することが可能である。第２の伸長用プライマーがＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含む場合、第２の伸長反応の反応温度は、２０〜９０℃であることが好ましい。
【００８４】
前記維持によって、例えば、図２Ｂに示す工程で伸長産物が得られる。
【００８５】
以上に説明した第１の伸長反応及び第２の伸長反応は、第１の伸長反応液と第２の伸長反応液とを兼ねる反応液中で行うことができる。即ち、例えば、第１の伸長反応を行う前に、第１の伸長反応液に予め第２の伸長反応に必要な成分を含ませておいてもよい。又は、第１の伸長反応の後、その反応液に第２の伸長反応に必要な成分を添加して次の反応に用いてもよい。或いは、第１の伸長反応の後、その反応液の全て又は一部を、第２の伸長反応に必要な成分を含む溶液に添加して第２の伸長反応液としてもよい。例えば、第１の伸長用プライマー及び第２の伸長用プライマーの両方を予め第１の伸長反応液に含めておいてもよく、第２の伸長用プライマーを含まない第１の伸長反応液を用いて工程（Ｓ１）及び（Ｓ２）を行い、工程（Ｓ３）の前に第２の伸長用プライマーを反応液に含めておいてもよい。
【００８６】
このような短鎖核酸伸長方法によれば、短鎖核酸をより特異的かつ効率的に伸長することが可能である。
【００８７】
更なる実施形態によれば、１つの試料中の、塩基配列の異なる複数種類の標的短鎖核酸を伸長する方法が提供される。その場合、第１〜第ｎの短鎖核酸伸長用プライマーセットが用いられる。第１〜第ｎの短鎖核酸伸長用プライマーセットはそれぞれ、第１〜第ｎの標的短鎖核酸にそれぞれ含まれる第１１〜第１ｎの配列をそれぞれ伸長するための第１１〜第１ｎの伸長用プライマーと、第２１〜第２ｎの伸長用プライマーを含む。ここで、ｎは２以上の整数である。
【００８８】
この場合、例えば、前記１つの試料をｎ等分に分注し、そこにそれぞれ第１１〜第１ｎの伸長用プライマーを添加して第１１〜第１ｎの反応液を調製し、第１の伸長反応を行った後、各反応液において第２１〜第２ｎの伸長用プライマーを用いて第２の伸長反応を行ってもよい。又は、試料及び第１１〜第１ｎの伸長用プライマーの全てを含む第１の伸長反応液を調製し、第１の伸長反応を行った後、反応液をｎ等分に分注し、それぞれに第２１〜第２ｎの伸長用プライマー添加して第２１〜第２ｎの反応液を調製し、第２の伸長反応を行ってもよい。或いは、試料及び第１１〜第１ｎの伸長用プライマーを含む第１の伸長反応液において第１の伸長反応を行い、反応液を分注せずにその反応液において第２１〜第２ｎの伸長用プライマーを用いて第２の伸長反応を行ってもよい。詳しくは後述するが、このように反応液を分注しない場合、伸長産物を増幅する工程において反応液をｎ等分に分注するか又は電気化学検出用デバイスを用いることによって、ｎ種類の標的配列を区別して検出することができる。
【００８９】
このような短鎖核酸伸長方法によれば、複数種類の短鎖核酸をより特異的かつ効率的に伸長することが可能である。
・短鎖核酸検出用プライマーセット
次に、短鎖核酸伸長用プライマーセット及びＬＡＭＰ増幅用プライマーセットを含む短鎖核酸検出用プライマーセットについて説明する。短鎖核酸検出用プライマーセットは、標的短鎖核酸を伸長し、得られた伸長産物を増幅するためのプライマーセットである。ここにおいて「増幅」とは、プライマーセットと酵素を用いて鋳型核酸を連続して複製することを指す。実施形態において使用され得る増幅法は、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）増幅法である。
【００９０】
短鎖核酸検出用プライマーセットは、短鎖核酸伸長用プライマーセット及びＬＡＭＰ増幅用プライマーセットを含む。短鎖核酸伸長用プライマーセットは、上述の何れかの短鎖核酸伸長用プライマーセットであり、第１の伸長用プライマー及び第２の伸長用プライマーを含む。ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットは、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー及びループプライマーを含む。
【００９１】
短鎖核酸検出用プライマーセットと伸長産物の対応の例を図７Ａ〜図９Ｂに示す。
【００９２】
図７Ａは、伸長産物（ｉｉ）の第５の配列がループプライマー配列である例を示す。短鎖核酸伸長用プライマーセットは、図１の短鎖核酸伸長用プライマーセットである。ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットは、ＦＩＰプライマー（ｖ）、ＢＩＰプライマー（ｖｉ）及びループプライマー（ｖｉｉ）を含む。ＦＩＰプライマー（ｖ）は、第２の配列及び第３の配列の相補配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ＢＩＰプライマー（ｖｉ）は、第６の配列の相補配列及び第４の配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ループプライマー（ｖｉｉ）は、第５の配列を含む。
【００９３】
例えば、この例における短鎖核酸伸長用プライマーとして、図３に示す短鎖核酸伸長用プライマーセットを用いることができる。その場合の短鎖核酸検出用プライマーセットの一例を図７Ｂに示す。この例においては、ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットは、Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含むＦＩＰプライマーと、Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含むＢＩＰプライマーと、ＬＢ配列を含むループプライマーとを含む。
【００９４】
このような短鎖核酸検出用プライマーセットによれば、標的短鎖核酸をより特異的かつ効率的に伸長し、得られた伸長産物を早く安定的に増幅することができる。
【００９５】
図８Ａは、伸長産物（ｉｉ）の第１’の配列の相補配列がループプライマー配列である例を示す。この例においては、ＦＩＰプライマー（ｖ）は、第２の配列及び第３の配列の相補配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ＢＩＰプライマー（ｖｉ）は、第６の配列の相補配列及び第４の配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ループプライマー（ｖｉｉ）は、第１’の配列の相補配列を含む。
【００９６】
例えば、この例における短鎖核酸伸長用プライマーとして、図４に示す短鎖核酸伸長用プライマーセットを用いることができる。その場合の短鎖核酸検出用プライマーセットの一例を図８Ｂに示す。この例においては、ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットは、Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含むＦＩＰプライマーと、Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含むＢＩＰプライマーと、第１’の配列の相補配列を含むループプライマーとを含む。
【００９７】
このような短鎖核酸検出用プライマーセットによれば、標的短鎖核酸をより特異的かつ効率的に伸長し、得られた伸長産物を早く安定的に増幅することができる。更に、短鎖核酸検出用プライマーセットを用いれば、第１’の配列及びその相補配列を含む所望の伸長産物が生成した場合に、第１’の配列にループプライマーがハイブリダイズして増幅産物が安定して得られるため、非特異的な伸長産物が増幅されにくい。従って、短鎖核酸を更に特異的に増幅することが可能である。
【００９８】
図９Ａは、伸長産物（ｉｉ）の第３の配列がループプライマー認識配列である例を示す。この例においては、ＦＩＰプライマー（ｖ）は、第２の配列及び第４の配列の相補配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ＢＩＰプライマー（ｖｉ）は、第６の配列の相補配列及び第５の配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ループプライマー（ｖｉｉ）は、第３の配列の相補配列を含む。
【００９９】
例えば、この例における短鎖核酸伸長用プライマーとして、図５に示す短鎖核酸伸長用プライマーセットを用いることができる。その場合の短鎖核酸検出用プライマーセットの一例を図９Ｂに示す。この例においては、ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットは、Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含むＦＩＰプライマーと、Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含むＢＩＰプライマーと、前記ＬＦ配列を含むループプライマーとを含む。
【０１００】
このような短鎖核酸検出用プライマーセットによれば、標的短鎖核酸をより特異的かつ効率的に伸長し、得られた伸長産物を早く安定的に増幅することができる。
・短鎖核酸増幅方法
以上に説明した短鎖核酸検出用プライマーセットを用いて標的短鎖核酸を増幅する方法を以下に説明する。
【０１０１】
図１０は、実施形態の短鎖核酸増幅方法の一例を示す概略フローである。当該方法は、試料中の、第１の配列を含む標的短鎖核酸を増幅する方法であり、以下の工程（Ｓ１１）〜（Ｓ１４）を含む。第１の伸長用プライマーを第１の配列とハイブリダイズさせて第１の配列を伸長して第１’の配列を含む伸長中間産物を得ること（Ｓ１１）、伸長中間産物と標的短鎖核酸とを解離させること（Ｓ１２）、第２の伸長用プライマーを前記伸長中間産物の第１’の配列とハイブリダイズさせ、第２の伸長用プライマー及び前記伸長中間産物を伸長させて、伸長産物を得ること（Ｓ１３）、並びに伸長産物と、ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットと、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとを含む増幅反応液を等温増幅反応条件下で維持し、それによって伸長産物を鋳型として第１’の配列及び／又はその相補配列を増幅し、増幅産物を得ること（Ｓ１４）。
【０１０２】
まず工程（Ｓ１１）〜（Ｓ１３）を実行する。工程（Ｓ１１）〜（Ｓ１３）はそれぞれ、例えば、上述の短鎖核酸伸長方法の工程（Ｓ１）〜（Ｓ３）と同じ方法によって行うことができる。
【０１０３】
工程（Ｓ１４）において、前記工程（Ｓ１３）で得られた伸長産物と、ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットと、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとを含む増幅反応液を等温増幅反応条件下で維持する。
【０１０４】
ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットは、上記の何れかのＬＡＭＰ増幅用プライマーセットである。
【０１０５】
鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、伸長産物を鋳型として第１’の配列及びその相補配列を増幅する等温増幅反応を触媒するための酵素である。鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、特に限定するものではないが、例えば、Ｂｓｔ、Ｂｓｔ２．０、Ｂｓｔ３．０、ＧｓｐＳＳＤ、ＧｓｐＭ、Ｔｉｎ、Ｂｓｍ、Ｃｓａ、９６−７、ｐｈｉ２９、ＯｍｉｎｉＡｍｐ（登録商標）、Ａａｃ、ＢｃａＢＥＳＴ（登録商標）、ＤｉｓｐｌａｃｅＡｃｅ（登録商標）、ＳＤ、ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅ（登録商標）、ＴＯＰＯＴＡＱ、Ｉｓｏｔｈｅｒｍ２Ｇ、Ｔａｑ又はこれらの何れかの組み合わせなどであり得る。
【０１０６】
増幅反応液は、これらの成分に加えて、更に、増幅反応に必要な所望の成分を含み得る。そのような成分は、例えば、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などの基質、適切な増幅環境を維持するための塩類などであり得る。
【０１０７】
等温増幅反応条件は、当業者の通常の知識に基づいて、ＬＡＭＰ増幅用プライマーセット及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの種類などに依存して選択され得る。等温増幅反応条件は、例えば、温度５０〜７５℃の等温を３０〜９０分間などであるが、温度は、６０〜７０℃であることが好ましい。
【０１０８】
増幅反応液を等温増幅反応条件下で維持することによって、伸長産物を鋳型として第１’の配列及び／又はその相補配列が増幅され、第１’の配列及び／又はその相補配列を含む増幅産物が得られる。
【０１０９】
以上に説明した短鎖核酸増幅方法によれば、試料中の標的短鎖核酸をより特異的かつ効率的に伸長し、得られた伸長産物をより早く安定的に増幅することができる。更に、図８Ａ及び８Ｂに示す短鎖核酸検出用プライマーセットを用いれば、更に特異的に標的短鎖核酸を増幅することが可能である。
【０１１０】
更なる実施形態において、工程（Ｓ３）及び（Ｓ１３）で用いる第２のＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。その場合、工程（Ｓ３）及び（Ｓ１３）で用いられる第２のＤＮＡポリメラーゼを、工程（Ｓ１４）で鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとして用いてもよい。その場合、例えば、第２の伸長反応か終わった後に、増幅反応液に鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを添加せずに工程（Ｓ１４）を行ってもよい。その場合、用いる酵素の量が少なく、コストを削減できる。また、実験の手順がより簡便となる。
【０１１１】
以上に説明した第１の伸長反応、第２の伸長反応及び増幅反応は、第１の伸長反応液と第２の第２の伸長反応液と増幅反応液を兼ねる反応液中で行うことができる。即ち、例えば、第１の伸長反応を行う前に、第１の伸長反応液に予め第２の伸長反応及び増幅反応に必要な成分を含ませておいてもよく、又は、各反応の後、その反応液に次の反応に必要な成分を添加して次の反応に用いてもよい。或いは、各反応の後、その反応液の全て又は一部を、次の反応に必要な成分を含む溶液に添加してもよい。その場合、第１の伸長反応及び第２の伸長反応によって生成した非特異的産物を除去すること、伸長中間産物を第２の伸長反応のために分離すること、及び伸長産物を増幅反応のために分離することなどを行う必要がないため、操作がより簡便である。これは、標的短鎖核酸を特異的に伸長できる実施形態の短鎖核酸伸長用プライマーセットを用いることによって可能となる。
【０１１２】
・短鎖核酸検出方法
更なる実施形態において、標的短鎖核酸を検出する方法が提供される。
【０１１３】
図１１は、実施形態の短鎖核酸検出方法の一例を示す概略フローである。当該方法は、試料中の、第１の配列を含む標的短鎖核酸を検出する方法であり、以下の工程（Ｓ２１）〜（Ｓ２５）を含む。第１の伸長用プライマーを第１の配列とハイブリダイズさせて第１の配列を伸長して第１’の配列を含む伸長中間産物を得ること（Ｓ１１）、伸長中間産物と標的短鎖核酸とを解離させること（Ｓ１２）、第２の伸長用プライマーを前記伸長中間産物の第１’の配列とハイブリダイズさせ、第２の伸長用プライマー及び前記伸長中間産物を伸長させて、伸長産物を得ること（Ｓ１３）、伸長産物と、ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットと、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとを含む増幅反応液を等温増幅反応条件下で維持し、それによって伸長産物を鋳型として第１’の配列及び／又はその相補配列を増幅し、増幅産物を得ること（Ｓ２４）、工程（Ｓ２４）の増幅反応条件下での維持中に、得られた増幅産物を検出すること（Ｓ２５）を含む。
【０１１４】
工程（Ｓ２１）〜（Ｓ２４）は、例えば、上述の工程（Ｓ１１）〜（Ｓ１４）と同じ方法によって行うことができる。
【０１１５】
工程（Ｓ２５）において増幅反応条件下での維持中に、得られた増幅産物を検出する。増幅産物の検出は、例えば、濁度、光学的信号又は電気化学的信号等を指標に行うことができる。
【０１１６】
濁度を指標にして増幅産物を検出する場合、反応液の濁度を検出すればよい。反応液の濁りは、例えば、増幅産物又は増幅反応の存在に応じて生成するピロリン酸マグネシウムによって生じる。従って、例えば、増幅産物の存在量が多いほど濁度が高い。検出は、例えば、濁度計若しくは吸光度計を用いて、又は目視などによって行うことができる。
【０１１７】
光学的信号を指標にして増幅産物を検出する場合、例えば、カルセインを含む蛍光試薬やインターカレータなど、増幅産物又は増幅反応の存在に応じて変化する光学的信号を生ずる標識物質を増幅反応液に含ませておき、増幅反応条件下での維持中に標識物質からの光学的信号を検出すればよい。検出は、例えば、公知の何れかの光学センサを用いて、又は目視などによって行うことができる。
【０１１８】
電気化学的信号を指標にして増幅産物を検出する場合、例えば、増幅産物の増加に応じて変化する酸化還元反応等の電気化学的信号を生ずる標識物質を増幅反応液に含ませておき、増幅反応条件下での維持中に標識物質からの電気化学的信号を検出すればよい。検出は、例えば、後述する電気化学的信号を検出するための電極を備える電気化学検出用デバイスを用いて行うことができる。
【０１１９】
電気化学的信号を生ずる標識物質は、例えば、その酸化還元電位が電気化学的信号となり得る酸化剤などである。電気化学的信号を生ずる標識物質は、例えば、フェリシアン化物イオン、フェロシアン化物イオン、鉄錯イオン、ルテニウム錯イオン、コバルト錯イオンなどである。これらの標識物質は、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、鉄錯体、ルテニウム錯体、コバルト錯体を反応液に溶解することにより得られる。
【０１２０】
例えば、第１の標識物質としてフェリシアン化物イオン（Ｆｅ（ＣＮ）６４−）を用いた場合には、Ｆｅ（ＣＮ）６４−がＦｅ（ＣＮ）６３−になる酸化反応により電子が放出される。これらは、負の電荷を有する増幅産物と反発して増幅産物から遠ざかるため、付近に増幅産物が存在する電極においては、増幅産物の増加に伴って、検出される電流（電気化学的信号）が減少する。
【０１２１】
或いは、電気化学的信号を生ずる標識物質はレドックスプローブであってもよい。レドックスプローブは、例えば、−０．５Ｖ〜０．５Ｖの酸化還元電位を有する物質であり、反応液中で増幅産物と静電気的に結合する。電極に電圧をかけることによって、増幅産物と結合したレドックスプローブが酸化又は還元され、その反応によって電子が放出される。そのため、例えば、増幅産物が存在する位置に配置されている電極においては、増幅産物の増加に伴って検出される電流（電気化学的信号）が増加するか、或いは検出される酸化還元電位のピーク電位が負方向へシフトする。従って、電気化学的信号に加えて更に酸化還元電位のピーク電位を検出することによって、より精度の高い測定を行うことも可能である。
【０１２２】
レドックスプローブは、例えば、金属錯体である。レドックスプローブとして使用される金属錯体において、中心金属は、例えば、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、白金（Ｐｔ）、コバルト（Ｃｏ）、クロム（Ｃｒ）、カドミウム（Ｃｄ）、ニッケル（Ｎｉ）、亜鉛（Ｚｎ）、銅（Ｃｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、鉄（Ｆｅ）又は銀（Ａｇ）などである。当該金属錯体は、例えば、アンミン錯体、シアノ錯体、ハロゲン錯体、ヒドロキシ錯体、シクロペンタジエニル錯体、フェナントロリン錯体及びビピリジン錯体などである。また、メチレンブルー、ナイルブルー、クリスタルバイオレット等のレドックスプローブも使用することができる。
【０１２３】
例えば、電気化学的信号を生ずる標識物質は、ルテニウムヘキサンアミン（ＲｕＨｅｘ）である。その場合、増幅産物が存在する場合、増幅産物と結合したＲｕＨｅｘ３＋が、電極に電圧をかけることによってＲｕＨｅｘ２＋に還元され、電子が放出される。この電子が電極に流れることによって、増幅産物を検出することがきできる。
【０１２４】
電気化学検出用デバイスは、チップを含む。チップは、１つの面上に少なくとも１個の電極を備える基板を具備する。電極は、例えば、基板上に円形、四角形などの所望の形状の金属パターンを形成することによって得ることができる。金属は、例えば金であることが感度が良好であるため好ましい。増幅反応液を前記１つの面上に持ち込むと電極が増幅反応液に接し、増幅反応液中の標識物質からの電気化学的信号を検出することができる。基板は、更にパットを備えていてもよい。パットは、電極と電気的に接続されており、そこから電極で得られた電気化学的信号に関する情報を取り出すことができる。また、基板は、更に参照電極及び対極を備えていてもよい。
【０１２５】
電気化学検出用デバイスは、チップの電極からの検出信号を受信する測定手段、測定手段を制御し、検出された信号から測定データを生成し、測定データをメモリに格納する制御手段、測定データに基づいて試料中の標的短鎖核酸を定量する定量手段、制御手段による制御により増幅反応液をチップに送り及び出しを行う送液手段、及び／又は制御手段による制御によりチップの温度を制御する温度制御手段などを備えていてもよい。これらの手段は、コンピュータであってもよい。
【０１２６】
以上に説明した濁度、光学的信号及び電気化学的信号などの検出は、増幅反応の開始から特定の時点で行われてもよいし、経時的に行われてもよい。経時的とは、連続的であってもよいし、間欠的、即ち所望の時間間隔で複数の時点で検出することであってもよい。このような検出において、試料中に存在する標的短鎖核酸の存在量が多いほど、より短い時間で信号の変化の立ち上がりが観察される。例えば、以下のようにして立ち上がり時間から標的短鎖核酸を検出又は定量することができる。異なる既知の濃度で短鎖核酸を含む複数の標準試料を用いて、短鎖核酸の存在量に対する検出信号の立ち上がり時間の検量線を作成し、この検量線と、標的短鎖核酸における立ち上がり時間の測定結果とを比較する。それによって、試料中の標的短鎖核酸の存在量を算出することができる。
【０１２７】
短鎖核酸検出方法の更なる実施形態において、増幅産物を特定の制限酵素によって断片化することによって、第１’の配列及びその相補配列を他の配列と分離し、第１’の配列及びその相補配列を検出してもよい。その場合、増幅産物が特定の制限酵素で切断できる配列を含むように、第１の伸長用プライマー、第２の伸長用プライマー及び伸長産物に結合するプライマーセットが設計される。その場合、増幅反応の後、増幅産物を対応する制限酵素で処理し、例えば、電気泳動する。電気泳動によって、試料中に標的短鎖核酸が存在し、増幅産物中に第１’の配列及びその相補配列を含む配列が存在する場合、それらの産物は、特定の位置に一つのバンドとして現れる。それによって、試料中における標的短鎖核酸の有無をより明確に判断することができる。
【０１２８】
以上に説明した実施形態の短鎖核酸検出方法によれば、試料中の標的短鎖核酸をより特異的かつ効率的に伸長し、得られた伸長産物をより早く安定的に増幅することができるため、高精度かつ特異的に標的短鎖核酸を検出することができる。
【０１２９】
また、標的短鎖核酸が、例えば、特定の疾患に罹患した細胞において発現する或いは発現量が増加又は減少する短鎖核酸である場合、実施形態の検出方法で標的短鎖核酸を検出することによって、試料の採取元である生体が特定の疾患に罹患しているか否かをより高精度かつ特異的に判断することができる。特定の疾患は、例えば、乳癌、大腸癌又は肺癌等の癌、又は他の疾患等である。また例えば、標的短鎖核酸が特定の細菌又はウイルスにおいて発現する或いは発現量が増加又は減少する短鎖核酸である場合、実施形態の検出方法で標的短鎖核酸を検出することによって、試料の特定の細菌又はウイルスなどの存在、又は試料の採取元である生体が特定の細菌又はウイルスに感染しているか否かなどをより高精度かつ特異的に判断することができる。
【０１３０】
更なる実施形態によれば、１種類の試料に含まれる、塩基配列の異なる複数種類の標的短鎖核酸を検出する方法が提供される。その場合、第１〜第ｎの短鎖核酸検出用プライマーセットが使用される。第１〜第ｎの短鎖核酸検出用プライマーセットはそれぞれ、第１〜第ｎの標的短鎖核酸にそれぞれ含まれる第１１〜第１ｎの配列をそれぞれ伸長するための第１〜第ｎの短鎖核酸伸長用プライマーセットと、第１〜第ｎの短鎖核酸伸長用プライマーセットを用いてそれぞれ得られる第１〜第ｎの伸長産物をそれぞれ増幅するための第１〜第ｎのＬＡＭＰ増幅用プライマーセットとをそれぞれ含む。ここで、ｎは２以上の整数である。
【０１３１】
例えば、上記短鎖核酸伸長方法において、ｎ種類の伸長産物をそれぞれ含むｎ種類の反応液を作成した場合、それぞれにおいて、第１〜第ｎのＬＡＭＰ増幅用プライマーセットを用いて第１〜第ｎの増幅産物を得て、各増幅産物の存在量を検出すればｎ種類の標的配列を区別して検出することができる。
【０１３２】
或いは、上記短鎖核酸伸長方法において、ｎ種類の伸長産物を含む１つの反応液を作成した場合、例えば、電気化学検出用デバイスを用いてｎ種類の伸長産物を区別して検出することができる。電気化学検出用デバイスは、１つの面上に少なくともｎ個の電極を備える基板を備えるチップを含む。各電極の付近の前記１つの面上には、それぞれ第１〜第ｎのＬＡＭＰ増幅用プライマーセットが遊離可能に固定されている。前記ｎ種類の伸長産物を含む１つの反応液に、上述の何れかの電気化学的信号を生じる標識物質を添加し、この反応液を基板の前記１つの面上に持ち込み、反応液を等温増幅条件で維持することによって、各電極において、それぞれ第１〜第ｎのＬＡＭＰ増幅用プライマーセットによる対応した伸長産物の増幅反応が行われる。従って、各電極の電気化学的信号の立ち上がり時間を測定することによって、ｎ種類の標的短鎖核酸を区別して検出及び定量することができる。
【０１３３】
このような方法によれば、複数種類の標的短鎖核酸を高精度かつ特異的に検出及び定量することができる。
【０１３４】
・アッセイキット
更なる実施形態によれば、短鎖核酸を検出するためのアッセイキットが提供される。キットは、短鎖核酸検出用プライマーセットと、核酸伸長用試薬と、ＬＡＭＰ増幅用試薬とを含む。
【０１３５】
当該アッセイキットに含まれる短鎖核酸検出用プライマーセットは、上述の何れかの短鎖核酸検出用プライマーセットである。短鎖核酸検出用プライマーセットに含まれる短鎖核酸伸長用プライマーセットとＬＡＭＰ増幅用プライマーセットとは、別々の容器に収容されていてもよい。
【０１３６】
核酸伸長用試薬は、第１のＤＮＡポリメラーゼ及び第２のＤＮＡポリメラーゼを含む。核酸伸長用試薬は、これらの成分に加えて、上述の第１の伸長反応及び第２の伸長反応に必要なその他の成分、例えば、塩、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などの基質、反応試薬としての増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤、アニーリング特異性を増大するイオン、及び／又は逆転写酵素の補因子となるイオンなどを更に含んでいてもよい。
【０１３７】
ＬＡＭＰ増幅用試薬は、上述の何れかの鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを含む。ＬＡＭＰ増幅用試薬は、上述の等温増幅反応に必要なその他の成分、例えば、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などの基質、適切な増幅環境を維持するための塩類などを更に含んでいてもよい。
【０１３８】
アッセイキットは、増幅産物の増加に伴って変化する電気的信号を生じる標識物質と、電気的信号を検出するための電気化学検出用デバイスとを更に含んでいてもよい。標識物質及び電気化学検出用デバイスとして、例えば、上述したものを使用することができる。
【０１３９】
更なる実施形態によれば、アッセイキットは、塩基配列の異なる複数種類の標的短鎖核酸を検出するためのものであってもよい。例えば、塩基配列の異なるｎ種類の標的短鎖核酸を検出するためのアッセイキットである場合、当該アッセイキットは、第１〜第ｎの短鎖核酸検出用プライマーセットを含む。第１〜第ｎの短鎖核酸検出用プライマーセットはそれぞれ、第１〜第ｎの標的短鎖核酸にそれぞれ含まれる第１１〜第１ｎの配列をそれぞれ伸長するための第１〜第ｎの短鎖核酸伸長用プライマーセットと、第１〜第ｎのＬＡＭＰ増幅用プライマーセットとをそれぞれ含む。ここで、ｎは自然数である。
【０１４０】
上の例において、第１〜第ｎの短鎖核酸伸長用プライマーセット及び第１〜第ｎのＬＡＭＰ増幅用プライマーセットのそれぞれは、別の容器に収容されていてもよい。
【０１４１】
このようなアッセイキットは、１つの面上に少なくともｎ個の電極を備える基板を備えるチップを含み、各電極の付近の前記１つの面上に、それぞれ第１〜第ｎのＬＡＭＰ増幅用プライマーセットが遊離可能に固定されている上述の電気化学検出用デバイスを含んでいてもよい。
【０１４２】
このようなアッセイキットによれば、標的短鎖核酸を高精度かつ特異的に検出及び定量することができる。
【０１４３】
（第２の実施形態）
更なる実施形態において、第１の伸長化プライマーは、第５の配列を含まなくともよい。そのような短鎖核酸伸長用プライマーセット、それを用いて生成される伸長産物、及び伸長産物を増幅するためのＬＡＭＰ増幅用プライマーセットの一例を図１２Ａ〜１３Ｂに示す。
【０１４４】
図１２Ａの例において、伸長産物（ｉｉ）は、一方の鎖が５’から３’方向に向かって順に第２の配列、第３の配列、第４の配列、第１’の配列の相補配列及び第６の配列を含む。他方の鎖は、前記一方の鎖の相補配列であり、３’から５’方向に向かって順に第２の配列の相補配列、第３の配列の相補配列、第４の配列の相補配列、第１’の配列及び第６の配列の相補配列を含む。この例においては、第１’の配列の相補配列はループプライマー配列である。
【０１４５】
短鎖核酸伸長用プライマーセットは、第１の伸長用プライマー（ｉｉｉ）及び第２の伸長用プライマー（ｉｖ）を含む。第１の伸長用プライマー（ｉｉｉ）は、第１の伸長用プライマー配列及び第６の配列の相補配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。第２の伸長用プライマー（ｉｖ）は、第２の伸長用プライマー配列、第４の配列、第３の配列及び第２の配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。
【０１４６】
ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットは、ＦＩＰプライマー（ｖ）、ＢＩＰプライマー（ｖｉ）、ループプライマー（ｖｉｉ）を含む。ＦＩＰプライマー（ｖ）は、第２の配列及び第３の配列の相補配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ＢＩＰプライマー（ｖｉ）は、第６の配列の相補配列及び第４の配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ループプライマー（ｖｉｉ）は、第１’の配列の相補配列を含む。
【０１４７】
ここで、上記第２の配列、第３の配列、第４の配列、第１’の配列の相補配列及び第６の配列として、第１の実施形態において説明したものと同様のものを用いることができる。また各プライマー及び伸長産物は、第１の実施形態と同様に、前記各配列以外の配列、例えば、スペーサー配列を含んでもよい。
【０１４８】
図１２Ａの例における上記各配列が、ＬＡＭＰ増幅用プライマーが結合するための認識配列である例を図１２Ｂに示す。この例において、第２の配列はＦ２配列であり、第３の配列はＦ１配列であり、第４の配列はＢ１ｃ配列であり、第６の配列はＢ２ｃ配列である。
【０１４９】
したがって、伸長産物（ｉｉ）は、一方の鎖がＦ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、第１’の配列の相補配列及びＢ２ｃ配列を５’から３’方向に向かってこの順番で含み、他方の鎖がＦ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、第１’の配列及びＢ２配列３’から５’方向に向かってこの順番で含む。第１の伸長用プライマー（ｉｉｉ）は、第１の伸長用プライマー配列及びＢ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。第２の伸長用プライマー（ｉｖ）は、第２の伸長用プライマー配列、Ｂ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。
【０１５０】
ＦＩＰプライマー（ｖ）は、Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ＢＩＰプライマー（ｖｉ）は、Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ループプライマー（ｖｉｉ）は、第１’の配列の相補配列を含む。
【０１５１】
図１３Ａには、伸長産物（ｉｉ）、第１の伸長用プライマー（ｉｉｉ）及び第２の伸長用プライマー（ｉｖ）の各配列の並ぶ順番は図１２Ａに示すものと同じであるが、第３の配列がループプライマー認識配列である例を示す。
【０１５２】
ＦＩＰプライマー（ｖ）は、第２の配列及び第４の配列の相補配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ＢＩＰプライマー（ｖｉ）は、第６の配列の相補配列及び第１’の配列の相補配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ループプライマー（ｖｉｉ）は、第３の配列の相補配列を含む。
【０１５３】
図１３Ｂは、図１３Ａの例における上記各配列が、ＬＡＭＰ増幅用プライマーが結合するための認識配列である例を示す。この例において、第２の配列はＦ２配列であり、第３の配列はＬＦｃ配列であり、第４の配列はＦ１配列であり、第６の配列はＢ２ｃ配列である。
【０１５４】
したがって、伸長産物（ｉｉ）は、一方の鎖がＦ２配列、ＬＦｃ配列、Ｆ１配列、第１’の配列の相補配列及びＢ２ｃ配列を５’から３’方向に向かってこの順番で含み、他方の鎖がＦ２ｃ配列、ＬＦ配列、Ｆ１ｃ配列、第１’の配列及びＢ２配列３’から５’方向に向かってこの順番で含む。第１の伸長用プライマー（ｉｉｉ）は、第１の伸長用プライマー配列及びＢ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。第２の伸長用プライマー（ｉｖ）は、第２の伸長用プライマー配列、Ｆ１配列、ＬＦｃ配列及びＦ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。
【０１５５】
ＦＩＰプライマー（ｖ）は、Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ＢＩＰプライマー（ｖｉ）は、Ｂ２配列及び第１’の配列の相補配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ループプライマー（ｖｉｉ）は、ＬＦ配列を含む。この例において、第１’の配列の相補配列はＢ１ｃ配列として機能する。
【０１５６】
第２の実施形態によれば、以上に説明した第５配列を含まない短鎖核酸伸長用プライマーセットと、更に上記ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットを含む短鎖核酸検出用プライマーセットとが提供される。更に、当該短鎖核酸検出用プライマーセットを含む、第１の実施形態で説明したアッセイキットも提供される。また、第２の実施形態に従う短鎖核酸伸長用プライマーセット及び短鎖核酸検出用プライマーセットは、第１の実施形態で説明した短鎖核酸伸長方法、短鎖核酸増幅方法及び短鎖核酸検出方法に同様に用いることができる。
【０１５７】
第２の実施形態によれば、第１の伸長用プライマーは、２つの配列を有する。このように、第１の伸長用プライマーが更に短いことから、短鎖核酸伸長方法に用いる場合、第１の伸長用プライマーや伸長中間産物が高次構造化することが更に防止され得る。また、第１の伸長用プライマーの製造コストがより低減される。
【０１５８】
加えて、第２の実施形態の短鎖核酸伸長用プライマーセットを用いて生成される伸長産物は、第１の実施形態のものと同様に、従来のＬＡＭＰ増幅用の伸長産物よりもプライマー認識配列が少ないが、ループプライマー配列又はループプライマー認識領域を１つ含む。そのため、短鎖核酸増幅方法及び短鎖核酸検出方法に用いれば、伸長産物が早く、安定して増幅されることが可能である。加えて、短鎖核酸の存在量が少なくても効率的に増幅される。従って、第２の実施形態の短鎖核酸検出用プライマーセットを用いれば、短鎖核酸をより精度よく検出又は定量することが可能である。
【０１５９】
第２の実施形態に従う第１及び第２の伸長用プライマーは、図１２Ａ、１２Ｂに示すような第１’の配列の相補配列をループプライマー認識配列とする構成であれば、伸長産物が生成した場合に、第１’の配列にループプライマーがハイブリダイズして増幅産物が生成するため、非特異的な伸長産物が増幅されにくい。従って、短鎖核酸を更に特異的に増幅することが可能である。また、この構成の場合、両伸長用プライマーの設計がより容易であるため好ましい。
【０１６０】
第２の実施形態に従う第１及び第２の伸長用プライマーは、図１３Ａ、１３Ｂに示すような第１’の配列の相補配列をＢ１ｃ配列とする構成であれば、伸長産物が生成した場合に、第１’の配列にＢＩＰプライマーがハイブリダイズして増幅産物が生成するため、非特異的な伸長産物が増幅されにくい。従って、短鎖核酸を特異的に増幅することが可能である。
【０１６１】
（第３の実施形態）
更なる実施形態において、第２の伸長化プライマーは、第４の配列を含まなくともよい。そのような短鎖核酸伸長用プライマーセット、それを用いて生成される伸長産物、及び伸長産物を増幅するためのＬＡＭＰ増幅用プライマーセットの一例を図１４Ａ〜１５Ｂに示す。
【０１６２】
図１４Ａの例において、伸長産物（ｉｉ）は、一方の鎖が５’から３’方向に向かって順に第２の配列、第３の配列、第１’の配列の相補配列、第５の配列及び第６の配列を含む。他方の鎖は、前記一方の鎖の相補配列であり、３’から５’方向に向かって順に第２の配列の相補配列、第３の配列の相補配列、第１’の配列、第５の配列の相補配列及び第６の配列の相補配列を含む。この例においては、第５の配列はループプライマー配列である。
【０１６３】
第１の伸長用プライマー（ｉｉｉ）は、第１の伸長用プライマー配列、第５の配列の相補配列及び第６の配列の相補配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。第２の伸長用プライマー（ｉｖ）は、第２の伸長用プライマー配列、第３の配列及び第２の配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。
【０１６４】
ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットは、ＦＩＰプライマー（ｖ）、ＢＩＰプライマー（ｖｉ）、ループプライマー（ｖｉｉ）を含む。ＦＩＰプライマー（ｖ）は、第２の配列及び第３の配列の相補配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ＢＩＰプライマー（ｖｉ）は、第６の配列の相補配列及び第１’の配列の相補配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ループプライマー（ｖｉｉ）は、第５の配列を含む。
【０１６５】
ここで、上記第２の配列、第３の配列、第１’の配列の相補配列、第５の配列及び第６の配列として、第１の実施形態において説明したものと同様のものを用いることができる。また各プライマー及び伸長産物は、第１の実施形態と同様に、前記各配列以外の配列、例えば、スペーサー配列を含んでもよい。
【０１６６】
図１４Ａの例における上記各配列が、ＬＡＭＰ増幅用プライマーが結合するための認識配列である例を図１４Ｂに示す。この例において、第２の配列はＦ２配列であり、第３の配列はＦ１配列であり、第５の配列はＬＢ配列であり、第６の配列はＢ２ｃ配列である。
【０１６７】
したがって、伸長産物（ｉｉ）は、一方の鎖がＦ２配列、Ｆ１配列、第１’の配列の相補配列、ＬＢ配列及びＢ２ｃ配列を５’から３’方向に向かってこの順番で含み、他方の鎖がＦ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、第１’の配列、ＬＢｃ配列及びＢ２配列３’から５’方向に向かってこの順番で含む。第１の伸長用プライマー（ｉｉｉ）は、第１の伸長用プライマー配列、ＬＢｃ配列及びＢ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。第２の伸長用プライマー（ｉｖ）は、第２の伸長用プライマー配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。
【０１６８】
ＦＩＰプライマー（ｖ）は、Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ＢＩＰプライマー（ｖｉ）は、Ｂ２配列及び第１’の配列の相補配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ループプライマー（ｖｉｉ）は、第５の配列を含む。この例において、第１’の配列の相補配列はＢ１ｃ配列として機能する。
【０１６９】
図１５Ａには、伸長産物（ｉｉ）、第１の伸長用プライマー（ｉｉｉ）及び第２の伸長用プライマー（ｉｖ）の各配列の並ぶ順番は図１４Ａに示すものと同じであるが、第３の配列がループプライマー認識配列である例を示す。
【０１７０】
ＦＩＰプライマー（ｖ）は、第２の配列及び第１’の配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ＢＩＰプライマー（ｖｉ）は、第６の配列の相補配列及び第５の配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ループプライマー（ｖｉｉ）は、第３の配列の相補配列を含む。
【０１７１】
図１５Ｂは、図１５Ａの例における上記各配列がＬＡＭＰ増幅用プライマーが結合するための認識配列である例を示す。この例において、第２の配列はＦ２配列であり、第３の配列はＬＦｃ配列であり、第５の配列はＢ１ｃ配列であり、第６の配列はＢ２ｃ配列である。
【０１７２】
したがって、伸長産物（ｉｉ）は、一方の鎖がＦ２配列、ＬＦｃ配列、第１’の配列の相補配列、Ｂ１ｃ配列及びＢ２ｃ配列を５’から３’方向に向かってこの順番で含み、他方の鎖がＦ２ｃ配列、ＬＦ配列、第１’の配列、Ｂ１配列及びＢ２配列３’から５’方向に向かってこの順番で含む。第１の伸長用プライマー（ｉｉｉ）は、第１の伸長用プライマー配列、Ｂ１配列及びＢ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。第２の伸長用プライマー（ｉｖ）は、第２の伸長用プライマー配列、ＬＦｃ配列及びＦ２配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。
【０１７３】
ＦＩＰプライマー（ｖ）は、Ｆ２配列及び第１’の配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ＢＩＰプライマー（ｖｉ）は、Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を３’から５’方向に向かってこの順番で含む。ループプライマー（ｖｉｉ）は、ＬＦ配列を含む。この例において、第１’の配列の相補配列はＦ１配列として機能する。
【０１７４】
第３の実施形態によれば、以上に説明した第４配列を含まない短鎖核酸伸長用プライマーセットと、更に上記ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットを含む短鎖核酸検出用プライマーセットとが提供される。更に、当該短鎖核酸検出用プライマーセットを含む、第１の実施形態で説明したアッセイキットも提供される。また、第３の実施形態に従う短鎖核酸伸長用プライマーセット及び短鎖核酸検出用プライマーセットは、第１の実施形態で説明した短鎖核酸伸長方法、短鎖核酸増幅方法及び短鎖核酸検出方法に同様に用いることができる。
【０１７５】
第３の実施形態によれば、第２の伸長用プライマーは３つの配列を有する。このように第２の伸長用プライマーが更に短いことから、短鎖核酸伸長方法に用いる場合、第２の伸長用プライマー、伸長中間産物が高次構造化することが更に防止され得る。加えて、第２の伸長用プライマーの製造コストがより低減される。
【０１７６】
また、第３の実施形態の短鎖核酸伸長用プライマーセットを用いて生成される伸長産物は、第１の実施形態のものと同様に、従来のＬＡＭＰ増幅用の伸長産物よりもプライマー認識配列が少ないが、ループプライマー配列又はループプライマー認識領域を１つ含む。そのため、短鎖核酸増幅方法及び短鎖核酸検出方法に用いれば、伸長産物が早く、安定して増幅されることが可能である。加えて、短鎖核酸の存在量が少なくても効率的に増幅される。従って、第３の実施形態の短鎖核酸検出用プライマーセットを用いれば、短鎖核酸をより精度よく検出又は定量することが可能である。
【０１７７】
第３の実施形態に従う第１及び第２の伸長用プライマーは、図１４Ａ、１４Ｂに示すような第１’の配列の相補配列をＢ１ｃ配列とする構成であれば、伸長産物が生成した場合に、第１’の配列にＢＩＰプライマーがハイブリダイズして増幅産物が生成するため、非特異的な伸長産物が増幅されにくい。従って、短鎖核酸を更に特異的に増幅することが可能である。
【０１７８】
第３の実施形態に従う第１及び第２の伸長用プライマーは、図１５Ａ、１５Ｂに示すような第１’の配列の相補配列をＦ１配列とする構成であれば、伸長産物が生成した場合に、第１’の配列の相補配列にＦＩＰプライマーがハイブリダイズして増幅産物が生成するため、非特異的な伸長産物が増幅されにくい。従って、短鎖核酸を特異的に増幅することが可能である。
【０１７９】
［例］
例１
実施形態の短鎖核酸検出用プライマーセットによってｍｉＲＮＡを伸長し、ＬＡＭＰ増幅し、定量の可否及び特異性を評価した例を以下に示す。
【０１８０】
・短鎖核酸検出用プライマーセットＩ（実施例）の作製
ｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７−ａ（表１、配列番号１）を伸長及び増幅するための図１６に示す構成を有する短鎖核酸検出用プライマーセットＩを作製した。図中、「Ｒ」は、ｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７−ａ（配列番号１）に対応するＤＮＡであり、「Ｒｃ」はその相補配列である。第１の伸長用プライマーは、第１の伸長用プライマー配列、ＬＢｃ配列及びＢ２配列を含む。第２の伸長用プライマーは、第２の伸長用プライマー配列、Ｂ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含む。このプライマーセットによって得られる伸長産物は、一方の鎖がＦ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、Ｒ配列、ＬＢ配列及びＢ２ｃ配列を含む。ＦＩＰプライマーはＦ２配列及びＦ１ｃ配列を含み、ＢＩＰプライマーはＢ２配列及びＢ１ｃ配列を含み、ループプライマーはＬＢ配列を含む。
【０１８１】
このような短鎖核酸検出用プライマーセットの設計において、まずＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ループプライマー（ＬＢプライマー）の配列を、それぞれ表１に示す配列番号２、３、４に決定し、その配列に基づいて、第１の伸長用プライマー（配列番号５）と第２の伸長用プライマー（配列番号６）の配列を設計した。
【０１８２】
【表１】
2019017383.tif 000003
【０１８３】
・伸長反応
コピー数１０５、１０４、１０３、１０２又は０の合成ＲＮＡ ｌｅｔ７−ａ、終濃度５ｎＭの第１の伸長用プライマー（配列番号５）、６７Ｕ／２０μＬの逆転転写酵素（ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、終濃度２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、各１．４ｍＭのｄＮＴＰ、１ｍＭのＤＴＴ及び４Ｕ／２０μＬのＲＮａｓｅ ＯＵＴを含む、反応体積２０μＬの反応液を用いて、１６℃３０分、４２℃３０分、８５℃５分の条件で逆転写反応を行った。
【０１８４】
・増幅反応
反応終了後、反応液に終濃度４．４５ｎＭ分の第２の伸長用プライマー（配列番号６）及び０．４ＵのＤｅｅｐＶｅｎｔ（ｅｘｏ−） ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（併せて２μＬ）を添加し、９５℃２分後、９５℃２０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒の３条件を３５サイクル、その後７２℃５分の条件で伸長反応を行った。
【０１８５】
得られた反応液１μＬを、終濃度１．６μＭのＦＩＰプライマー（配列番号２）、１．６μＭのＢＩＰプライマー（配列番号３）、０．８μＭのＬＢプライマー（配列番号４）、８Ｕ／２５μＬのＴｉｎ ｅｘｏ− ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、各１．４ｍＭのｄＮＴＰ、０．８Ｍのベタイン混合液２４μＬを含む溶液に添加して、６５℃で９０分の条件でＬＡＭＰ増幅した。増幅はエンドポイント濁度測定装置（ＬＴ−１６、ニッポンジーン製）を用いて行い、濁度の立ち上がり時間を計測した。
【０１８６】
ポジティブコントロール（以下、ＰＣ）として、第１及び第２の伸長用プライマーを用いてｍｉＲＮＡを逆転写及び伸長して得られるべき伸長産物を人工合成したもの（配列番号７）を前記溶液に１０７コピー添加した増幅反応液を用いて、同様に増幅反応を行った。また、鋳型を添加しないネガティブコントロール（以下、ＮＣ）には、ＴＥ１μＬを添加して同様に処理した。実験は、２連で行った。
【０１８７】
結果を図１７に示した。１０６〜１０２コピーにおいて、ｍｉＲＮＡの存在量と濁度立ち上がり時間に相関があり、ｍｉＲＮＡの存在量が少ないほど立ち上がり時間が長かった。従って、実施形態のプライマーセットによれば、伸長産物が安定して増幅され、ｍｉＲＮＡを定量できることが示された。
【０１８８】
また、ｍｉＲＮＡを含まないサンプル（図中「０」）では、２連の結果のうちの片方が６７．３分で濁度が立ち上ったが、他方は増幅しなかった。前者は非特異的増幅であることが予想されるが、その立ち上がり時間は、１０２コピー（特異的増幅）における立ち上がり時間（４１．２分、４４．８分）より２２分以上遅かった。従って、実施形態のプライマーセットによれば、１０２コピー特異的増幅と非特異的増幅との間に明確な差があり、ｍｉＲＮＡの存在量が少ない場合（１０２コピー）であってもｍｉＲＮＡを定量できることが明らかとなった。従って、実施形態のプライマーセット及び方法によれば、従来よりも精度よくｍｉＲＮＡを検出できることが示された。
【０１８９】
例２  ６つの配列を含む伸長産物を得るための構成の異なるプライマーセットを用いてｍｉＲＮＡを伸長し、ＬＡＭＰ増幅し、定量の可否及び特異性を比較した例を以下に示す。
【０１９０】
・短鎖核酸検出用プライマーセットＩＩ（実施例）の作製
ｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７−ａ（表２、配列番号１）を伸長及び増幅するための短鎖核酸検出用プライマーセットＩＩを作製した。短鎖核酸検出用プライマーセットＩＩは、図１６に示すものと同じ構成を有するが、各配列の塩基配列は短鎖核酸検出用プライマーセットＩとは異なり、表２に示す塩基配列を有する。即ち、ＦＩＰプライマーは配列番号８の塩基配列を有し、ＢＩＰプライマーは配列番号９の塩基配列を有し、ループプライマー（ＬＢプライマー）は配列番号１０の塩基配列を有し、第１の伸長用プライマーは配列番号１１の塩基配列を有し、第２の伸長用プライマーは配列番号１２の塩基配列を有する。
【０１９１】
【表２】
2019017383.tif 000004
【０１９２】
・短鎖核酸検出用プライマーセットＩＩＩ（比較例）の作製
ｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７−ａ（表３、配列番号１）を伸長及び増幅するための図１８に示す構成を有する短鎖核酸検出用プライマーセットＩＩＩを作製した。第１の伸長用プライマーは、第１の伸長用プライマー配列、Ｂ２配列を含む。第２の伸長用プライマーは、第２の伸長用プライマー配列、ＬＢ配列、Ｂ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含む。このプライマーセットによって得られる伸長産物は、一方の鎖がＦ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、ＬＢ配列、Ｒ配列及びＢ２ｃ配列を含む。ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー及びループプライマーは短鎖核酸検出用プライマーセットＩＩのものと同じである。
【０１９３】
短鎖核酸検出用プライマーセットＩＩＩの各々のプライマーは、表３に示す塩基配列を有する。即ち、ＦＩＰプライマーは配列番号８塩基配列を有し、ＢＩＰプライマーは配列番号９の塩基配列を有し、ループプライマー（ＬＢプライマー）は配列番号１０の塩基配列を有し、第１の伸長用プライマーは配列番号１４塩基配列を有し、第２の伸長用プライマーは配列番号１５の塩基配列を有する。
【０１９４】
【表３】
2019017383.tif 000005
【０１９５】
・伸長反応及び増幅反応
短鎖核酸検出用プライマーセットＩＩ及びＩＩＩを用いて、例１と同様に伸長反応及び増幅反応を行った。ポジティブコントロールとして、伸長産物を人工合成したもの（それぞれ配列番号１３及び１６）を用いた。結果を図１９に示した。短鎖核酸検出用プライマーセットＩＩでは、１０２コピーで２連のうちの片方が増幅していないものの、概ねｍｉＲＮＡのコピー数と立ち上がり時間とに相関があった。対して、短鎖核酸検出用プライマーセットＩＩＩでは、ｍｉＲＮＡを含まないものを含む全てのサンプルにおいて、立ち上がり時間が４０分前後であった。従って、短鎖核酸検出用プライマーセットＩＩＩではｍｉＲＮＡを定量できないことが示された。この結果から、第１の伸長用プライマーと第２の伸長用プライマーが、６つの配列を含む伸長産物が得られるような構成であっても、第１の伸長用プライマーが２つの配列を含み、第２の伸長用プライマーが５つの配列を含む場合では、ｍｉＲＮＡを定量することができないことがわかった。
【０１９６】
例３  ダミー配列を含むプライマーセットを用いてｍｉＲＮＡを伸長し、ＬＡＭＰ増幅し、定量の可否及び特異性を評価した例を以下に示す。
【０１９７】
・短鎖核酸検出用プライマーセットＩＶの作製
ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１３０７−３ｐ）（表４、配列番号１７）を伸長及び増幅するための短鎖核酸検出用プライマーセットＩＶを作製した。短鎖核酸検出用プライマーセットＩＶは、図１６に示すものと同じ構成を有するが、各配列の塩基配列は短鎖核酸検出用プライマーセットＩとは異なり、表４に示す塩基配列を有する。即ち、ＦＩＰプライマーは配列番号１８の塩基配列を有し、ＢＩＰプライマーは配列番号１９の塩基配列を有し、ループプライマー（ＬＢプライマー）は配列番号２０の塩基配列を有し、第１の伸長用プライマーは配列番号２１の塩基配列を有し、第２の伸長用プライマーは配列番号２２の塩基配列を有する。
【０１９８】
【表４】
2019017383.tif 000006
【０１９９】
・短鎖核酸検出用プライマーセットＶの作製
ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１３０７−３ｐ）（表５、配列番号１７）を伸長及び増幅するための図２０に示す構成を有する短鎖核酸検出用プライマーセットＶを作製した。第１の伸長用プライマーは、第１の伸長用プライマー配列、ダミー配列、Ｂ２配列を含む。第２の伸長用プライマーは、第２の伸長用プライマー配列、Ｂ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含む。このプライマーセットによって得られる伸長産物は、一方の鎖がＦ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、Ｒ配列、ダミー配列及びＢ２ｃ配列を含む。ＦＩＰプライマーはＦ２配列及びＦ１ｃ配列を含み、ＢＩＰプライマーはＢ２配列及びＢ１ｃ配列を含み、ループプライマーは、Ｒ配列を含む。
【０２００】
短鎖核酸検出用プライマーセットＶの各々のプライマーは、表５に示す塩基配列を有する。即ち、ＦＩＰプライマーは配列番号１８の塩基配列を有し、ＢＩＰプライマーは配列番号１９の塩基配列を有し、ループプライマーは配列番号２４の塩基配列を有し、第１の伸長用プライマーは配列番号２１塩基配列を有し、第２の伸長用プライマーは配列番号２２の塩基配列を有する。ポジティブコントロールとして用いた伸長産物は配列番号２３の塩基配列を有する。
【０２０１】
【表５】
2019017383.tif 000007
【０２０２】
・伸長反応及び増幅反応
短鎖核酸検出用プライマーセットＩＶ及びＶを用いて、コピー数１０６、１０５、１０４、１０３又は０の合成ＲＮＡ ｍｉＲ−１３０７−３ｐを例１と同様に伸長及び増幅した。ポジティブコントロールとして、伸長産物を人工合成したもの（配列番号２３）を用いた。結果を図２１に示した。短鎖核酸検出用プライマーセットＩＶ及びＶ両方において、ｍｉＲＮＡのコピー数と立ち上がり時間との間に相関がみられ、これらのプライマーセットを用いてｍｉＲＮＡを感度よく定量できることが示された。また、短鎖核酸検出用プライマーセットＩＶでは、１０６〜１０３コピーにおける立ち上がり時間の増加の傾きの絶対値が３．０８であるのに対し、短鎖核酸検出用プライマーセットＶでは、４．８０であった。従って、短鎖核酸検出用プライマーセットＩＶは、より精度よくｍｉＲＮＡを定量できることが明らかとなった。また、短鎖核酸検出用プライマーセットＶでは、ｍｉＲＮＡを含まない非特異増幅における立ち上がり時間が平均３８．５分から６６．３分と大幅に遅かった。従って、短鎖核酸検出用プライマーセットＶによれば、より特異性の高い検出が可能であることが示された。
【０２０３】
例４  ダミー配列を含まないプライマーセットを用いてｍｉＲＮＡを伸長し、ＬＡＭＰ増幅し、定量の可否及び特異性を評価した例を以下に示す。
【０２０４】
・短鎖核酸検出用プライマーセットＶＩ（実施例）及びＶＩＩ（実施例）の作製
ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−４２３−５ｐ）（表６、配列番号２５）を伸長及び増幅するための短鎖核酸検出用プライマーセットＶＩ及びＶＩＩを作製した。
【０２０５】
短鎖核酸検出用プライマーセットＶＩの各プライマーの構成は図２０に示すものと同じであるが、その塩基配列は、表６に示すものを有する。即ち、ＦＩＰプライマーは配列番号２６、ＢＩＰプライマーは配列番号２７、ループプライマー（ＬＢ配列）は配列番号２８、第１の伸長用プライマーは配列番号２９、第２のプライマーは配列番号３０を有し、ポジティブコントロールの伸長産物は配列番号３１の塩基配列を有する。
【０２０６】
短鎖核酸検出用プライマーセットＶＩＩは、図２２に示す構成を有し、表６に示す塩基配列を有する。即ち、第１の伸長用プライマーは、第１の伸長用プライマー配列、Ｂ２配列を含み、配列番号３２の塩基配列を有する。第２の伸長用プライマーは、第２の伸長用プライマー配列、Ｂ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含み、配列番号３０の塩基配列を有する。ポジティブコントロールとして用いられる伸長産物は、一方の鎖がＦ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、Ｒ配列（ＬＢ配列）及びＢ２ｃ配列を含み、配列番号３３の塩基配列を有する。
【０２０７】
ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ループプライマーは、短鎖核酸検出用プライマーセットＶＩに含まれるものと同じものである。
【０２０８】
【表６】
2019017383.tif 000008
【０２０９】
・伸長反応
短鎖核酸検出用プライマーセットＶＩ及びＶＩＩを用いて、コピー数１０６、１０５、１０４、１０３又は０の合成ＲＮＡ ｍｉＲ−４２３−５ｐを伸長及び増幅した。終濃度１０ｎＭの第１の伸長用プライマー（配列番号２９、３２）、６７Ｕ／２０μＬの逆転転写酵素（ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、Ｈｉｇｈｔ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ中のＲＴ  ｂｕｆｆｅｒ（１ｘ）、終濃度０．１ｍＭのｄＮＴＰｓ、及び４Ｕ／２０μＬのＲＮａｓｅ ＯＵＴを含む、反応体積２０μＬの反応液を用いて、１６℃１０分、４２℃５分、８５℃５分の条件で逆転写反応を行った。
【０２１０】
・増幅反応
反応終了後、反応液に終濃度１０ｎＭ分の第２の増幅用プライマー（配列番号３０）及び０．４ＵのＤｅｅｐＶｅｎｔ（ｅｘｏ−） ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（併せて５μＬ）を添加し、９５℃２分後、９５℃２０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒の３条件を２０サイクル、その後７２℃５分の条件で伸長反応を行った。
【０２１１】
得られた反応液１μＬを、終濃度１．６μＭのＦＩＰプライマー（配列番号２６）、１．６μＭのＢＩＰプライマー（配列番号２７）、０．８μＭのＬＢプライマー（配列番号２８）、８Ｕ／２５μＬのＴｉｎ ｅｘｏ− ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、各１．４ｍＭのｄＮＴＰ、０．８Ｍのベタイン混合液２４μＬを含む溶液に添加して、６５℃で９０分の条件でＬＡＭＰ増幅した。増幅はエンドポイント濁度測定装置（ＬＴ−１６、ニッポンジーン製）を用いて行い、濁度の立ち上がり時間を計測した。ポジティブコントロールとして、伸長産物を人工合成したもの（配列番号３１、３３）を用いた。
【０２１２】
結果を図２３に示した。短鎖核酸検出用プライマーセットＶＩ及びＶＩＩ両方において、ｍｉＲＮＡのコピー数と立ち上がり時間との間に相関がみられた。短鎖核酸検出用プライマーセットＶＩＩでは、ｍｉＲＮＡを含まない非特異増幅が２連のうちの１つで観察されたが、特異増幅より十分遅いため問題とならず、ダミー配列を含まないプライマーセットＶＩＩを用いてもｍｉＲＮＡを感度よく定量できることが示された。
【符号の説明】
【０２１３】
１…標的短鎖核酸  ２…第１の配列  ３…第１の伸長用プライマー
４…第１の伸長用プライマー配列  ５…第１’の配列  ６…伸長中間産物
８…第２の伸長用プライマー  ９…第２の伸長用プライマー配列
１０…第１’の配列の相補配列  １１…伸長産物
【図１】
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【図２Ａ】
2019017383.tif 000010
【図２Ｂ】
2019017383.tif 000011
【図３】
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【図４】
2019017383.tif 000013
【図５】
2019017383.tif 000014
【図６】
2019017383.tif 000015
【図７Ａ】
2019017383.tif 000016
【図７Ｂ】
2019017383.tif 000017
【図８Ａ】
2019017383.tif 000018
【図８Ｂ】
2019017383.tif 000019
【図９Ａ】
2019017383.tif 000020
【図９Ｂ】
2019017383.tif 000021
【図１０】
2019017383.tif 000022
【図１１】
2019017383.tif 000023
【図１２Ａ】
2019017383.tif 000024
【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
2019017383.tif 000026
【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
2019017383.tif 000028
【図１４Ｂ】
2019017383.tif 000029
【図１５Ａ】
2019017383.tif 000030
【図１５Ｂ】
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【図１６】
2019017383.tif 000032
【図１７】
2019017383.tif 000033
【図１８】
2019017383.tif 000034
【図１９】
2019017383.tif 000035
【図２０】
2019017383.tif 000036
【図２１】
2019017383.tif 000037
【図２２】
2019017383.tif 000038
【図２３】
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【配列表】
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