(57)【要約】【課題】個々の細胞毎にインキュベータを割り当て、細胞を培養しながら観察したいという要望がある。従来の細胞培養観察装置は、培養空間の外側に観察装置を配置していたので、装置自体が嵩高くまた高価であり、そのような装置を多数用意するのは現実的ではなかった。【解決手段】撮像素子と照明ユニットを制御し、断熱層で囲まれた統合制御部を有する細胞観察ユニットと、  透明培養皿と、  前記細胞観察ユニットと前記透明培養皿を収納する恒温槽を有する細胞培養観察装置は、小型の細胞観察ユニットに透明培養皿を配置し、細胞観察ユニット毎に恒温槽に収納したので、一つ（若しくは一種類）毎の細胞を培養しながら観察することができる。【選択図】図３
2019017340.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
撮像素子と照明ユニットを制御し、断熱層で囲まれた統合制御部を有する細胞観察ユニットと、
透明培養皿と、
前記細胞観察ユニットと前記透明培養皿を収納する恒温槽を有する細胞培養観察装置。
【請求項２】
前記細胞観察ユニットは、
箱状の筐体と、
透明窓部が設けられ前記筐体を液密に密閉する蓋体と、
前記蓋体の外側で前記透明窓部上方から光を照射する照明ユニットと、
一端に対物レンズを有する鏡筒と、
前記鏡筒の他端に配置された前記撮像素子および前記統合制御部と、
前記鏡筒を前記対物レンズが前記透明窓部に臨んだ状態で、前記蓋体の裏面および前記筐体の内部底面から離して固定する固定具を有する請求項１に記載された細胞培養観察装置。
【請求項３】
前記照明ユニットは、
発光源と拡散板を有する請求項１または２の何れかの請求項に記載された細胞培養観察装置。
【請求項４】
前記透明窓部に前記透明培養皿が設けられた請求項１乃至３の何れか一の請求項に記載された細胞培養観察装置。
【請求項５】
箱状の筐体と、
透明窓部が設けられ前記筐体を液密に密閉する蓋体と、
前記蓋体の外側で前記透明窓部上方から光を照射する照明ユニットと、
一端に対物レンズを有する鏡筒と、
撮像素子と共に前記鏡筒の他端に配置され、前記撮像素子および前記照明ユニットを制御し、断熱層で囲まれた統合制御部と、
前記鏡筒を前記対物レンズが前記透明窓部に臨んだ状態で、前記蓋体の裏面および前記筐体の内部底面から離して固定する固定具を有する細胞観察ユニット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞を培養しながらリアルタイムで観察することができる細胞培養観察装置と、それに用いる細胞観察ユニットに係るものである。
【背景技術】
【０００２】
近年ライフサイエンス分野の研究および実用が進んでいる。細胞培養はこの分野の基礎である。例えば、研究フェーズとしては、細胞自体のメカニズムの研究や、薬剤の評価、ウイルスの研究といった分野がある。一方、実用面としては、再生医療のための細胞培養や治療成績のための試験といった分野がある。
【０００３】
特に少子化対策の一環として、中小規模不妊治療施設の治療成績の向上のため、胚（受精卵）を培養し、その卵割過程を観察・評価することが求められている。胚培養に代表される上記の如き要求を満たすためには、所定の培養環境で細胞を培養しつつ、観察を行うための装置が必要である。
【０００４】
そのような装置として、従来、インキュベータ内に培養細胞観察装置を配置して、所定の培養環境を維持して細胞を培養しながら、同時に細胞観察装置による観察を行う方法が検討されていた。しかし、細胞の死滅をもたらす培養環境の変動を回避することは容易ではなかった。
【０００５】
例えば、特許文献１では、培養空間とは別に緩衝空間を設け、外部の環境変化による影響を緩和することにより、培養細胞へのダメージを軽減する方法が提案されている。
【０００６】
また、特許文献２では、モータや照明光源の動作による温度状態の変化を推定して、その推定変化量分の温度変化を相殺するように温度制御する方法が提案されている。
【０００７】
このように、従来技術では、緩衝空間を設けたり、温度状態の変化の推定やその推定変化量分を相殺するための温度制御を行ったりするなど、極めて複雑で高価な装置となってしまっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−０２５７８９号公報
【特許文献２】特開２００７−００６８４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１は、細胞を培養している空間を完全に密閉しており、培養環境は安定しているといえる。しかし、装置自体が嵩高く、高額であるため、多くの細胞を培養し観察するには妥当な方法とはいえない。
【００１０】
一方、特許文献２は、多くの細胞培養皿を１つの装置内で培養し、所望の培養皿を随時観察できるようにしたものである。したがって、多くの細胞を培養観察することは可能である。しかしながら、受精卵という極めて個人的な細胞を取り扱う場合は、他の細胞との取り違えや、なんらかの原因による培養中の汚染が全細胞に影響を及ぼさないように、個々の細胞を個別に培養観察する必要がある。
【００１１】
そのような要求においては、特許文献２の場合、多くの細胞を１つの恒温室内で培養しているため、培養皿の取り違えが生じたり、恒温室内の汚染が全ての細胞に及んだりするといった課題がある。
【００１２】
また、培養環境に培養皿の移動のためのモータが配置されており、温度変化を予測しつつ環境条件を制御するとしても、温度に敏感な細胞に影響を与えなくするのは容易ではないという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は上記の課題に鑑みて想到されたものであり、１つの恒温槽中に細胞培養皿と細胞観察ユニットを収納したものである。
【００１４】
より具体的には本発明に係る細胞培養観察装置は、
撮像素子と照明ユニットを制御し、断熱層で囲まれた統合制御部を有する細胞観察ユニットと、
透明培養皿と、
前記細胞観察ユニットと前記透明培養皿を収納する恒温槽を有することを特徴とする。
【００１５】
また、本発明に係る細胞観察ユニットは、
箱状の筐体と、
透明窓部が設けられ前記筐体を液密に密閉する蓋体と、
前記蓋体の外側で前記透明窓部上方から光を照射する照明ユニットと、
一端に対物レンズを有する鏡筒と、
撮像素子と共に前記鏡筒の他端に配置され、前記撮像素子および前記照明ユニットを制御し、断熱層で囲まれた統合制御部と、
前記鏡筒を前記対物レンズが前記透明窓部に臨んだ状態で、前記蓋体の裏面および前記筐体の内部底面から離して固定する固定具を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
従来の細胞培養観察装置が細胞を培養する培養空間の外側に観察装置を配置するという構成であるのに対して、本発明に係る細胞培養観察装置は、観察装置自体を培養空間に収めてしまうというものである。
【００１７】
したがって、１つの恒温槽内で１つ若しくは１種類の細胞を培養し、同時に観察することができるので、細胞同士の取り違えや、恒温槽中の環境の汚染による全細胞の死滅といったリスクを回避することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明に係る細胞培養観察装置の構成を示す図である。
【図２】細胞観察ユニットの外観を示す斜視図である。
【図３】細胞観察ユニットの側面の一部断面図である。
【図４】蓋体を裏面側から見た図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に本発明に係る細胞培養観察装置について図面および実施例を示し説明を行う。なお、以下の説明は、本発明の一実施形態および一実施例を例示するものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。以下の説明は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で改変することができる。
【００２０】
図１に本発明に係る細胞培養観察装置１の構成を示す。細胞培養観察装置１は、恒温槽１０と、細胞観察ユニット１２と、透明培養皿１４を有する。また、外部制御装置６０が接続される。そして、細胞観察ユニット１２と透明培養皿１４は、恒温槽１０中に収納される。このような構成では、恒温槽１０中に発熱源を収納することとなるので、恒温槽１０中の環境条件の変化が問題となる。つまり、発熱源となる細胞観察ユニット１２を恒温槽１０中に収納することで、恒温槽１０中の温度が変化し、その影響で細胞が死滅することが想定される。細胞の培養では、管理温度に対して±０．５℃程度の精度で温度制御が必要とされているからである。
【００２１】
そこで、本発明に係る細胞培養観察装置１において、細胞観察ユニット１２は、必要最低限の発熱源を備え、発熱源の周囲に断熱層を設ける。結果、細胞観察ユニット１２の外側の環境に及ぼす影響を非常に小さくすることができる。以下順次詳細を説明する。
【００２２】
恒温槽１０は、温湿度および二酸化炭素濃度を一定に維持することができれば特に制限はない。通常細胞の培養は温度３７℃、湿度９０％、二酸化炭素濃度３〜８％程度の環境が必要である。したがって、このような環境を維持することができる恒温槽１０が好適に利用される。恒温槽１０の床面１０ａは熱伝導性の高い材質のものであるのが望ましい。後述するように、細胞観察ユニット１２からの熱の逃げ道となるからである。
【００２３】
恒温槽１０の大きさは、透明培養皿１４と細胞観察ユニット１２が収納できればよい。透明培養皿１４は細胞観察ユニット１２上に載置される。細胞観察ユニット１２の外形は、幅１５０ｍｍ、長さ３００ｍｍ、高さ１５０ｍｍ程度に構成することができるので、少なくとも内部がこの程度の大きさがあればよい。
【００２４】
図２に細胞観察ユニット１２の外観斜視図を示す。細胞観察ユニット１２は、箱状の筐体２０と、筐体２０の蓋となる蓋体２２が嵌合して、略直方体形状を呈する。蓋体２２の一端に近い部分の上面２２ａには、透明窓部２４が形成されている。透明窓部２４には、透明培養皿１４が載置される。したがって、少なくとも透明窓部２４の部分は平坦に形成されている。
【００２５】
また、筐体２０は、熱伝導性の高い材料が好適である。後述するように細胞観察ユニット１２は内部に断熱層３８（図３参照）が設けられる。しかし、細胞観察ユニット１２の内壁全面を断熱処理してしまったのでは、内部で発生する熱の逃げ場がない。筐体２０の熱伝導性が高ければ、内部で生じた熱は筐体２０を伝わり、恒温槽１０の床面１０ａ（図１参照）に逃げる、若しくは筐体２０の側面、蓋体２２からの放射、対流によって逃げるからである。
【００２６】
蓋体２２の透明窓部２４から離れた位置に照明ユニット２６が配置されている。照明ユニット２６の一端２６ａは蓋体２２を貫通して筐体２０内と連通している。なお、照明ユニット２６の一端２６ａと蓋体２２との接続部は液密に構成されている。筐体２０内に外気が浸入しないようにするためである。照明ユニット２６の他端２６ｂは、透明窓部２４の上方に位置し、透明窓部２４に対して鉛直上方から光を照射することができる。
【００２７】
筐体２０の透明窓部２４が配置されたのと反対側には通信線２８が配置されている。通信線２８は筐体２０内部と通電できていればどのような構成であってもよい。例えば、筐体２０に貫通孔を設け、そこに通信線２８を通し、貫通孔を液密に封止するといった構成が考えられる。また、筐体２０内のコネクタ端子を筐体２０の外部に露出させるようにしておき、通信線２８は、そのコネクタ端子と連結することで、筐体２０内部と電気的に導通するようにしてもよい。なお、通信線２８は、信号だけでなく、電力を供給できるようにしてもよい。
【００２８】
なお、通信線２８は外部制御装置６０（図１参照）に連結される。図１を参照して、外部制御装置６０は通常のコンピュータを好適に利用できる。また外部制御装置６０には、表示装置６２ｄとキーボードといった入力装置６２ｋを有する入出力装置６２が接続される。
【００２９】
図３に細胞観察ユニット１２の側面の一部断面図を示す。なお、恒温槽１０は点線で表した。蓋体２２の裏面２２ｂには、鏡筒３０が固定具３２ａと固定具３２ｂによって懸架されている。鏡筒３０の一端３０ａには、統合制御部３４が配置されている。統合制御部３４は、撮像素子３６と照明ユニット２６を制御する。
【００３０】
統合制御部３４は、外部制御装置６０からの指示によって撮像素子３６からの画像信号Ｓａを外部制御装置６０に出力する。また統合制御部３４は、外部制御装置６０からの指示によって照明ユニット２６を動作させる。
【００３１】
統合制御部３４は、細胞観察ユニット１２の中で主たる発熱源となる。そこで、統合制御部３４の周囲には断熱層３８材が配置される。図３では、断熱層３８を紗のかかった点線長四角で表した。断熱層３８は比熱が大きい若しくは熱容量が大きいものが好適に利用できる。例えば、水、アンモニアといった高比熱材料を密封したものを統合制御部３４の周囲に配置することで、断熱層３８は構成することができる。また、統合制御部３４の周囲に空間を配置し、空気を断熱層３８として用いることもできる。
【００３２】
断熱層３８は、恒温槽１０の中で細胞観察ユニット１２を稼働させた際に、細胞観察ユニット１２が透明培養皿１４中の細胞の培養に影響を与えない程度の温度上昇に抑えることができればよい。したがって、統合制御部３４の消費電力が小さい場合は空気の層で十分に断熱層３８を構成することができる。
【００３３】
図４を参照する。図４は蓋体２２を裏面２２ｂ側から見た図であり、統合制御部３４の周囲に配置する断熱層３８の位置を示す。断熱層３８は、少なくとも統合制御部３４の蓋体２２の裏面２２ｂに配置する断熱層３８ｂと、蓋体２２の左右の側壁面に配置する断熱層３８ｃ、３８ｄおよび、統合制御部３４の後方側に配置する断熱層３８ａがあればよい。
【００３４】
図４には、その他の部分にも断熱層３８を配置した状態を示しているが、好ましくはその他の部分にも配置するのがよい。
【００３５】
再び図３を参照して、統合制御部３４の消費電力が大きい場合は、より熱容量の大きな断熱層３８を形成しなければ細胞観察ユニット１２自体が透明培養皿１４中の細胞に影響を与えてしまい、所定の培養ができなくなる。
【００３６】
図３では、発熱源である統合制御部３４は、撮像素子３６と共に、鏡筒３０の一端３０ａに固定されている。その鏡筒３０は、固定具３２ａ、固定具３２ｂによって筐体２０内部で懸架固定されている。したがって、統合制御部３４の周囲には空気の層が配置されている。この構成であっても断熱層３８となる。もちろん、高比熱材料を密封したものをさらに配置し、断熱性を高めてもよい。
【００３７】
また、蓋体２２を高比熱若しくは高熱容量に構成してもよい。蓋体２２の上面２２ａへの熱伝導を抑制するためである。例えば、蓋体２２を二重構造として中身を真空にする構造や、蓋体２２の肉厚を厚くする等であってもよい。このような構成にすることで、細胞観察ユニット１２が内部に発熱源を持っていたとしても、細胞観察ユニット１２の表面温度が周囲環境に対して上昇することを抑制することができる。結果、透明培養皿１４中の細胞に対しては、ほとんど温度負荷をかけない。
【００３８】
一方、筐体２０の内部底面２０ｂは、断熱層３８は配置しない。細胞観察ユニット１２の全内壁に断熱層３８を配置すると、内部で発生した熱の逃げ場がなくなるからである。培養される細胞は蓋体２２の上面２２ａに載置されるので、蓋体２２の上面２２ａの温度上昇が抑制できればよい。したがって、筐体２０の内部底面２０ｂからは熱が逃げるようにするのが望ましい。
【００３９】
なお、筐体２０の外部底面２０ａは、恒温槽１０の床面１０ａ（図１参照）との間で熱伝導性がよく、両面をよく密着させることのできる密着層３９を別途設けてもよい。
【００４０】
また、統合制御部３４の発熱量をできるだけ抑制するように設計することで、統合制御部３４の周囲の断熱層３８を空気とし、透明培養皿１４付近の温度上昇を管理温度から０．１℃の範囲に抑えることもできる。このような場合は、結局細胞観察ユニット１２の内部は空気だけになるが、本発明はそのような構成も含む。
【００４１】
また、筐体２０内部には、乾燥剤（図示せず）を配置してもよい。細胞観察ユニット１２は、細胞を培養している間は、恒温槽１０中に収納したままになる。したがって、光学系が結露によって曇ると観察できない状態になる。細胞培養の場合は、恒温槽１０中の環境は室内より高温となっているので、筐体２０内部を外部に対して液密にしておけば、筐体２０の内部温度が上昇すると相対湿度は低くなり、結露が生じる可能性は低い。しかし、さらに乾燥剤を配置することで、結露のおそれを著しく抑制することができる。
【００４２】
鏡筒３０の他端３０ｂには、屈折用プリズム４２を介して対物レンズ４４が配置されている。また鏡筒３０には、光学系を形成するレンズ（ここでは光学レンズ群４６と呼ぶ。）が適宜配置される。なお、撮像素子３６の直前に配置される接眼レンズもこの光学レンズ群４６に含まれる。鏡筒３０および対物レンズ４４を含む光学レンズ群４６で顕微鏡が構成されている。
【００４３】
対物レンズ４４は、蓋体２２の透明窓部２４に臨むように配置される。透明窓部２４には、透明培養皿１４が載置される。その中の細胞に焦点が合う位置に予め配置される。具体的には、固定具３２ａおよび固定具３２ｂの長さで調節すればよい。なお、対物レンズ４４の装着部分に焦点調節用の鏡筒ネジが形成されていてもよい。
【００４４】
対物レンズ４４を含んで光学レンズ群４６で形成される光学系は、倍率は大きくなくてもよい。むしろ焦点深度が深いものが好適である。本発明に係る細胞培養観察装置１では、細胞観察ユニット１２に顕微鏡の焦点を外部から調整する手段を搭載していない。透明培養皿１４と対物レンズ４４の距離を調節するモータが最も大きな発熱源となるからである。つまり、細胞を培養している間はほとんど画像の焦点調節を行うことはできない。したがって、焦点深度の深い光学系を搭載し、焦点調節が必要ない状態にしておくのがよい。
【００４５】
鏡筒３０が、固定具３２ａ、固定具３２ｂによって蓋体２２の裏面２２ｂに固定されるのは上述した通りである。この時、鏡筒３０は、蓋体２２および筐体２０で形成される内部空間の中央付近に固定される。統合制御部３４の周囲に断熱層３８を形成する空間を形成するためである。
【００４６】
なお、鏡筒３０は蓋体２２の裏面２２ｂに固定すれば、透明培養皿１４に焦点を合わせる作業が容易になるので、好ましい。しかし、鏡筒３０を筐体２０側に固定することを排除しない。蓋体２２および筐体２０のどちら側で支持したとしても、鏡筒３０は、蓋体２２および筐体２０から離れて固定される。
【００４７】
照明ユニット２６は、発光源２６Ｌと、ライトガイド、ロッドインテグレータ、９０°反射プリズム、拡散板を兼ねたアクリルロッド２６Ｒで構成されている。発光源２６Ｌは、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）ライトを好適に利用することができる。寿命が長く、消費電力当たりの照度が高いからである。照明ユニット２６は、拡散板若しくは拡散板と同様の効果を奏する物を用いるのが好適である。観察対象となる細胞に発光源２６Ｌからの光を集中して照射すると、細胞にとっては光毒となるからである。
【００４８】
また、比較的低倍率で広視野の顕微鏡にとっては、集中された照明ユニット２６からの光は、焦点以外の部分が暗くなり観察がしにくくなるからである。一方、拡散板を通した光は、顕微鏡の視野全体に広がり、照度も緩和され光毒となりにくい。
【００４９】
蓋体２２の裏面２２ｂには、照明ユニット２６の一端２６ａが貫設されている。この部分は、照明ユニット２６の発光源２６Ｌに繋がる導線２７が筐体２０内に引き込まれている。つまり、照明ユニット２６の一端２６ａは、発光源２６Ｌの電力線ポートを形成している。なお、発光源２６Ｌの電力線ポートは、照明ユニット２６の一端２６ａ以外の部分に形成されていてもよい。
【００５０】
照明ユニット２６の他端２６ｂは９０°反射プリズムが配置されている。発光源２６Ｌからの光を透明培養皿１４に向けるためである。ここでは、アクリルロッド２６Ｒの端部を４５°にカットしたもので代用している。
【００５１】
透明培養皿１４は、底面が平面であるものが望ましい。下方（蓋体２２内側の対物レンズ４４）から見た時に、透明培養皿１４内の細胞の映像が歪まないようにするためである。また、透明培養皿１４は、複数のディップ（凹み）を有するものであってもよい。本発明に係る細胞培養観察装置１は、ヒトの受精卵だけでなく、汚染の危険性をあまり注意する必要のない動物の受精卵の観察にも使用することができるからである。そのような場合であれば、顕微鏡の視野内に複数の細胞を配置して観察することができる。
【００５２】
また、透明培養皿１４は、蓋体２２の透明窓部２４と一体に形成されてもよい。透明培養皿１４と透明窓部２４が一体に形成されていると、透明培養皿１４の載置位置および載置角度によって顕微鏡での見え方が細胞観察ユニット１２毎に違うというバラツキが少なくなる。このような場合、透明窓部２４に透明培養皿１４が設けられていると言ってよい。
【００５３】
以上の構成に加え、透明培養皿１４の周辺および筐体２０の内部の温度・湿度を測定する環境センサ５４ｏおよび環境センサ５４ｉを備えてもよい。これらの環境センサからの信号は、統合制御部３４を経由せず、直接外部制御装置６０に送られてもよい。なお、図３では、これらの環境センサからの信号線は省略した。
【００５４】
以上の構成を有する細胞培養観察装置１の使用方法について説明する。細胞観察ユニット１２は、筐体２０と蓋体２２を嵌合させ固定する。これで、筐体２０内は外部から気体の侵入は遮断される。
【００５５】
透明培養皿１４には、培養液と観察対象となる細胞を導入する。その後、透明培養皿１４は細胞観察ユニット１２の透明窓部２４上に配置される。この状態で細胞観察ユニット１２は、恒温槽１０に収納される。透明培養皿１４が載置されるまでに、細胞観察ユニット１２は予め恒温槽１０内に収納され、恒温槽１０内の環境になじませておくとより好ましい。
【００５６】
使用者は、所定時間毎に、照明ユニット２６で透明培養皿１４の上方から光を当てる。そして、顕微鏡を使って画像信号Ｓａを取得する。その後連続して観察を継続してもよいし、撮像素子３６および照明ユニット２６の電源を切って、培養を継続してもよい。
【００５７】
以上のように、本発明に係る細胞培養観察装置１は、細胞観察ユニット１２を恒温槽１０中に透明培養皿１４と共に収納したので、小型で廉価な細胞培養観察装置１を構築することができる。このような細胞培養観察装置１は、細胞毎若しくはコロニー毎の培養・観察が可能となり、サンプルの取り違えや、汚染による全サンプルの死滅といったリスクを回避させることができる。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明は細胞を培養しながら観察する細胞培養観察装置として好適に利用することができる。
【符号の説明】
【００５９】
１  細胞培養観察装置
１０  恒温槽
１０ａ  床面
１２  細胞観察ユニット
１４  透明培養皿
２０  筐体
２０ａ  外部底面
２０ｂ  内部底面
２２  蓋体
２２ａ  上面
２２ｂ  裏面
２４  透明窓部
２６  照明ユニット
２６ａ  一端
２６ｂ  他端
２６Ｌ  発光源
２６Ｒ  アクリルロッド
２７  導線
２８  通信線
３０  鏡筒
３０ａ  一端
３０ｂ  他端
３２ａ  固定具
３２ｂ  固定具
３４  統合制御部
３６  撮像素子
３８  断熱層
３９  密着層
４２  屈折用プリズム
４４  対物レンズ
４６  光学レンズ群
５４ｏ  環境センサ
５４ｉ  環境センサ
６０  外部制御装置
６２ｄ  表示装置
６２ｋ  入力装置
６２  入出力装置
Ｓａ  画像信号
【図１】
2019017340.tif 000003
【図２】
2019017340.tif 000004
【図３】
2019017340.tif 000005
【図４】
2019017340.tif 000006