(57)【要約】      （修正有）【課題】直接電子伝達型酵素電極に使用可能なグルコースオキシダーゼの提供。【解決手段】グルコースオキシダーゼの活性中心であるＦＡＤ結合サイトに近いアミノ酸残基に対し、リジン残基へと置換した変異型グルコースオキシダーゼを用い、反応性官能基を有するアミノ酸残基を介して電子受容体を結合させた、電子受容体修飾グルコースオキシダーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列の４８９位のイソロイシンまたは３３５位のアルギニンに相当するアミノ酸残基が側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸残基に置換された、変異型グルコースオキシダーゼ。
【請求項２】
側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸残基がリジン残基である、請求項１に記載の変異型グルコースオキシダーゼ。
【請求項３】
配列番号１〜８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の変異型グルコースオキシダーゼ。
【請求項４】
アスペルギルス・ニガー由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異型グルコースオキシダーゼ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異型グルコースオキシダーゼにおいて、前記側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸残基を介して電子受容体が結合した、電子受容体修飾グルコースオキシダーゼ。
【請求項６】
電子受容体がフェナジニウム化合物である、請求項５に記載の電子受容体修飾グルコースオキシダーゼ。
【請求項７】
フェナジニウム化合物が下記式で表される、請求項６に記載の電子受容体修飾グルコースオキシダーゼ。
【化１】
2019201637.tif 000011
R1は炭化水素基を示し、R2はリンカーを示す。
【請求項８】
基材と、該基材上に結合した請求項５〜７のいずれか一項に記載の電子受容体修飾グルコースオキシダーゼを含む、酵素電極。
【請求項９】
請求項８に記載の酵素電極を含む、バイオセンサ。
【請求項１０】
電子受容体修飾グルコースオキシダーゼの製造方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異型グルコースオキシダーゼにおいて、前記側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸残基を介して電子受容体を導入することを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースオキシダーゼに部位特異的変異を導入することで新たな機能を付与する方法及び変異が導入されたグルコースオキシダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースオキシダーゼ（GOX）を用いたバイオセンサとしては古くから開発がなされて
いる。まず、非特許文献1に代表されるようないわゆる第1世代型と呼ばれる、系中のグルコースの酸化反応に伴い起こる副反応O2→H2O2の生成物を白金電極などで酸化することでグルコース濃度を測定する方法が開発された。その後、この不安定なO2やH2O2に依存せずに電子受容体（メディエータ）を系中に加えてGOXと電極間の電子伝達を媒介させる第2世代型が開発された（非特許文献2）。さらに、非特許文献3では、グラフェンなどのカーボンナノ粒子と組み合わせることで電子受容体を加えなくても、グルコース酸化反応による電子を検出できることを示している。
また、発明者らは、非特許文献4および特許文献１において第2.5世代型と称して、グルコース脱水素酵素（GDH）などに対して、分子表面に電子受容体を化学修飾することで直接
電子伝達を観測できることを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO2018／062542
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Clin Chem 1978, 24 (1) 150-152
【非特許文献２】Biosensors 1989, 4 (2) 109-119
【非特許文献３】Mater Sci Eng C Mater Biol Apple 2017 Jul1; 76, 398-405
【非特許文献４】Bioelectrochemistry 2018 Jun, 121: 185-190
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
グルコースオキシダーゼはGDHに比べ、その熱安定性や基質特異性における優位な点があ
るため、グルコースオキシダーゼ分子自体を改変することで、遊離型の電子受容体を反応系に添加することなく電極の電子伝達を容易にすることができれば安定した精度の高いバイオセンサの作製に有用と考えられる。
しかし、グルコースオキシダーゼのグルコースセンサへの適用は容易ではない。すなわち、第1世代型のセンサでは高電圧印加が必要であり、第2世代型では電子受容体の検出を行う系ではあるが、検体の溶存酸素濃度による干渉影響があり、第3世代型の直接電子伝達
型センサでも電極を酵素の活性部位にアクセスし易くするために設計する必要があり、電極作製が非常に複雑で制御が難しくなるという問題があった。
また、非特許文献４や特許文献１には、GDHへの電子受容体の化学修飾が開示されている
が、この技術をグルコースオキシダーゼに適用するのは容易ではなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、グルコースオキシダーゼを直接電子伝達可能な酵素とするため、電子受容体の化学修飾を検討した。その検討において、グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列中に存在する側鎖アミノ基をランダムに電子受容体で修飾した場合には、直接電子伝達が行われないという結果を得たため、グルコースオキシダーゼの立体構造やGDHとの構造類似
性等から電子受容体で修飾すべきアミノ酸について詳細な検討を行い、グルコースオキシ
ダーゼに変異導入を行った。
その結果、グルコースオキシダーゼの活性中心であるFAD結合サイトに近いアミノ酸残基
（配列番号１に記載のアミノ酸配列の４８９位のイソロイシンまたは３３５位のアルギニンに相当するアミノ酸残基）に対し、電子受容体で修飾するためにリジン残基へと置換し、変異型グルコースオキシダーゼを得た。そして、得られた変異型グルコースオキシダーゼの導入リジン残基の側鎖のアミノ基と電子受容体を化学修飾により共有結合させることで得られた修飾グルコースオキシダーゼ変異体は、野生型グルコースオキシダーゼでは持ち得ない特異的な電子伝達能を有することが明らかとなり、当該酵素を使用した酵素電極は外部から遊離の電子受容体を添加することなくグルコースに対する応答を示すセンサに適用できることが分かった。以上のような発見に基づき、本発明を完成させた。
【０００７】
本発明の要旨は以下のとおりである。
［１］配列番号１に記載のアミノ酸配列の４８９位のイソロイシンまたは３３５位のアルギニンに相当するアミノ酸残基が側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸残基に置換された、変異型グルコースオキシダーゼ。
［２］側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸残基がリジン残基である、［１］に記載の変異型グルコースオキシダーゼ。
［３］配列番号１〜８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、［１］または［２］に記載の変異型グルコースオキシダーゼ。
［４］アスペルギルス・ニガー由来である、［１］〜［３］のいずれかに記載の変異型グルコースオキシダーゼ。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の変異型グルコースオキシダーゼにおいて、前記側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸残基を介して電子受容体が結合した、電子受容体修飾グルコースオキシダーゼ。
［６］電子受容体がフェナジニウム化合物である、［５］に記載の電子受容体修飾グルコースオキシダーゼ。
［７］フェナジニウム化合物が下記式で表される、［６］に記載の電子受容体修飾グルコースオキシダーゼ。
【化１】
2019201637.tif 000002
R1は炭化水素基を示し、R2はリンカーを示す。
［８］基材と、該基材上に結合した［５］〜［７］のいずれかに記載の電子受容体修飾グルコースオキシダーゼを含む、酵素電極。
［９］［８］に記載の酵素電極を含む、バイオセンサ。
［１０］電子受容体修飾グルコースオキシダーゼの製造方法であって、［１］〜［４］のいずれかに記載の変異型グルコースオキシダーゼにおいて、前記側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸残基を介して電子受容体を導入することを特徴とする、方法。
【発明の効果】
【０００８】
従来、グルコースオキシダーゼはグルコース測定の素子としては、GDHに対して熱安定性
や基質特異性のメリットがある一方で、電極でシグナルを検出するためには外部から電子受容体を電子受容体として添加する必要があったが、本発明による変異酵素を用いること
で、外部から電子受容体を添加せずに酵素と電極のみの最小限の構成でセンサ構築が可能となることが分かった。本発明によって得られる電子受容体修飾グルコースオキシダーゼを用いることにより、安定かつ基質特異性の高いバイオセンサを簡便に作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】野生型GOXをPESで修飾して得られたPES修飾酵素を含むセンサを用いたアンペロメトリー測定の結果を示すグラフ。
【図２】I489K変異型GOXをPESで修飾して得られたPES修飾酵素を含むセンサを用いたアンペロメトリー測定の結果を示すグラフ。
【図３】図１および図２のアンペロメトリー測定に基づく、グルコース濃度と電流値の関係を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜変異型グルコースオキシダーゼ＞
本発明の変異型グルコースオキシダーゼにおいては、配列番号１に記載のアミノ酸配列の４８９位のイソロイシンまたは３３５位のアルギニンに相当するアミノ酸残基が側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸残基に置換されている。
【００１１】
これらのアミノ酸残基はグルコースオキシダーゼの立体構造において、補酵素であるFAD
の結合サイトおよび基質ポケットの近傍に位置するため、これらのアミノ酸残基を介して後述のような電子受容体で修飾することにより、グルコースオキシダーゼが直接電子伝達型酸化還元酵素として機能することができる。
【００１２】
側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸残基としては、側鎖にアミノ基を有するリジン、側鎖にカルボキシル基を有するグルタミン酸及びアスパラギン酸、側鎖にチオール基を有するシステインなどが挙げられる。
【００１３】
配列番号１はAspergillus niger NRRL3株由来のグルコースオキシダーゼのアミノ酸配列
（成熟型）であり、本発明の変異型グルコースオキシダーゼの一態様としては、配列番号１のアミノ酸配列において、４８９位のイソロイシンまたは３３５位のアルギニンがリジンなどの側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸残基に置換された変異型グルコースオキシダーゼが挙げられる。
しかし、本発明の変異型グルコースオキシダーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の４８９位のイソロイシンまたは３３５位のアルギニンがリジン等の側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸残基に置換されており、グルコースオキシダーゼ活性を有している限りにおいて、配列番号１における４８９位および３３５位以外のアミノ酸は配列番号１のとおりである必要はなく、１〜数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加等を有してもよい。ここで、１〜数個とは、例えば、１〜５０個、１〜２０個、１〜１０個、又は１〜５個である（以下、同様とする）。
また、本発明の変異型グルコースオキシダーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の４８９位のイソロイシンまたは３３５位のアルギニンがリジン等の側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸残基に置換されており、グルコースオキシダーゼ活性を有している限りにおいて、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上、９５％以上、または９８％以上の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。ここで、アミノ酸配列の同一性は、２つのアミノ酸を一致するアミノ酸の数が最大になるように必要に応じてギャップを加えてアラインメントし、アラインメントした部分の全アミノ酸の数における一致するアミノ酸の数の割合で定義することができる（以下、同様とする）。
【００１４】
また、本発明の変異型グルコースオキシダーゼは、他の生物由来のグルコースオキシダー
ゼのアミノ酸配列において、配列番号１に記載のアミノ酸配列の４８９位のイソロイシンまたは３３５位のアルギニンに相当するアミノ酸残基が側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸残基に置換されたものでもよい。
他のアミノ酸配列としては、グルコースオキシダーゼタンパク質のアミノ酸配列であり、配列番号１に記載のアミノ酸配列の４８９位のイソロイシン（I489）または３３５位のアルギニン（R335）に相当するアミノ酸残基を有するものであれば特に制限されないが、例えば、下記の表１に記載の配列番号２〜８のいずれかのアミノ酸配列が挙げられる。表１においては、各アミノ酸配列における、I489およびR335に相当するアミノ酸残基を示した。
【００１５】
したがって、本発明の変異型グルコースオキシダーゼの他の態様としては、配列番号２〜８のいずれかのアミノ酸配列において、配列番号１に記載のアミノ酸配列の４８９位のイソロイシンまたは３３５位のアルギニンに相当するアミノ酸残基が側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸残基に置換されたタンパク質が挙げられる。
さらに、本発明の変異型グルコースオキシダーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列の４８９位のイソロイシンまたは３３５位のアルギニンに相当するアミノ酸残基がリジン残基に置換されており、グルコースオキシダーゼ活性を有していれば、配列番号２〜８のいずれかのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加等を有するアミノ酸配列や、配列番号２〜８のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上、９５％以上、または９８％以上の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。
【００１６】
【表１】
2019201637.tif 000003
【００１７】
なお、「配列番号１に記載のアミノ酸配列の４８９位のイソロイシンまたは３３５位のアルギニンに相当するアミノ酸残基」としては、配列番号１のアミノ酸配列と対象アミノ酸配列のアラインメントにより、特定することができる。
【００１８】
アラインメントの一例を表２および３に示す。
その中で矢印がそれぞれ、「配列番号１に記載のアミノ酸配列の４８９位のイソロイシンに相当するアミノ酸残基」、「配列番号１に記載のアミノ酸配列の３３５位のアルギニンに相当するアミノ酸残基」を示す。
なお、これらの表において、P13006.1は1CF3の前駆体の配列であり、AAD01493.1は1GPEの前駆体の配列である。
【００１９】
配列番号１に記載のアミノ酸配列の４８９位のイソロイシンに相当するアミノ酸残基は下記のアミノ酸配列モチーフにおけるX2に相当するアミノ酸であり、対象アミノ酸配列におけるこのモチーフの存在からも特定できる。
Glu-X1-X2-Pro-Gly
具体的には、配列番号２においてはV511であり、配列番号３においてはT517であり、配列番号４においてはI512であり、配列番号５においてはL493であり、配列番号６においてはI512であり、配列番号７においてはI509であり、配列番号８においてはI510である。
【００２０】
【表２】
2019201637.tif 000004
【００２１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列の３３５位のアルギニンに相当するアミノ酸残基は下記のアミノ酸配列モチーフにおけるXに相当するアミノ酸であり、対象アミノ酸配列におけ
るこのモチーフの存在からも特定できる。
TT(A/T)TVXS(R/A)(I/A)(T/S)
具体的には、配列番号２においてはR357であり、配列番号３においてはA363であり、配列番号４においてはR358であり、配列番号５においてはS339であり、配列番号６においてはR358であり、配列番号７においてはR355であり、配列番号８においてはR357である。
【００２２】
【表３】
2019201637.tif 000005
【００２３】
本発明の変異型グルコースオキシダーゼは、グルコースオキシダーゼ活性が維持されてい
る。
ここで、「グルコースオキシダーゼ活性」とは、酸素を電子受容体として使用することにより、グルコースの酸化を触媒して、グルコノラクトンを生成させる酵素活性である。グルコースオキシダーゼ活性は、例えば、後述の実施例のように、基質のグルコースと酸素の代わりにMTT及びPMSなどの電子受容体を用いて測定することもできる。
なお、グルコースオキシダーゼ活性を維持するとは、例えば、変異型グルコースオキシダーゼのグルコースオキシダーゼ活性が野生型の１０％以上、２０％以上または５０％以上であること、と定義することができる。
【００２４】
本発明の変異型グルコースオキシダーゼは部位特異的変異導入法など、公知の遺伝子組み換え法により作製することができる。すなわち、グルコースオキシダーゼをコードするDNAを取得し、変異導入用プライマーなどを用いて部位特異的に変異を導入し、得られたDNAを適当な宿主において発現させることにより、変異型グルコースオキシダーゼを産生させ、必要に応じて精製することにより得ることができる。
【００２５】
グルコースオキシダーゼをコードするDNAは、例えば、Aspergillus nigerなど所望の遺伝子源からPCRなどの方法により取得することができる。PCR用プライマーは、公知の塩基配列に基づいて化学合成することによって調製することができる。また、公知の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、取得することもできる。
【００２６】
本発明の変異型グルコースオキシダーゼをコードする遺伝子（変異型GOX遺伝子）として
は、上記変異型グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列に対応した塩基配列を有するものであればよいが、具体例としては、配列番号９の塩基配列において上記アミノ酸置換に対応するコドン置換を有する塩基配列を含むDNAが挙げられる。また、変異型GOX遺伝子は、配列番号９の塩基配列を有するDNA、又はこの配列から調製され得るプローブとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルコースオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
【００２７】
前記ストリンジェントな条件としては、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の同一性を有するDNA同士がハイブリダイズする条件、具体的には、0.1×SSC、0.1％SDS、60℃で洗浄する条件が挙げられる。
【００２８】
得られたDNAを宿主細胞で機能しうるベクターに組み込み、該ベクターで宿主細胞を形質
転換し、DNAを発現させることで、変異型グルコースオキシダーゼを生産することができ
る。
【００２９】
グルコースオキシダーゼ遺伝子の取得、変異の導入、遺伝子の発現等に用いるベクターは宿主に応じて適宜選択できるが、例えばエシェリヒア属細菌で機能するベクターとして具体的にはpTrc99A、pBR322、pUC18、pUC118、pUC19、pUC119、pACYC184、pBBR122、pET等
が挙げられる。遺伝子の発現に用いるプロモーターも宿主に応じて適宜選択できるが、例えばエシェリヒア属細菌で機能するプロモーターとしてlac、trp、tac、trc、PL、tet等
が挙げられる。
【００３０】
組換えベクターで宿主細胞を形質転換するには、例えば、カルシウム処理によるコンピテントセル法、リポフェクション法、プロトプラスト法又はエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３１】
宿主細胞としては、エシェリヒア属細菌等の腸内細菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌、サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌
、哺乳動物細胞、昆虫細胞などが挙げられるが、これらに限られず、異種タンパク質生産に適した宿主細胞であれば用いることができる。
【００３２】
宿主細胞を適当な条件で培養し、変異型グルコースオキシダーゼを組み換えタンパク質として生産することができる。変異型グルコースオキシダーゼの精製は、カラムクロマトグラフィーなど公知の手法で行うことができる。また、変異型グルコースオキシダーゼが精製用のタグ配列を含む場合は、当該タグに対するアフィニティクロマトグラフィーなどで精製することも可能である。
【００３３】
＜電子受容体による修飾＞
本発明の電子受容体修飾グルコースオキシダーゼは、上記変異型グルコースオキシダーゼにおいて、前記側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸残基を介して電子受容体が結合したものである。
【００３４】
ここで、電子受容体とは、酸化還元酵素から電子を受け取って還元され、電極で再酸化される、触媒作用のない化合物であればよいが、例えば、フェナジニウム化合物、フェロセン、キノン化合物（例えば、1,4-Naphthoquinone、2-methyl-1,4-naphtoquinone、9,10-Phenanthrenequinone、1,2-Naphthoquinone、p-Xyloquinone、Methylbenzoquinone、2,6-Dimethylbenzoquinone、Sodium 1,2-Naphthoquinone-4-sulfonate、1,4-Anthraquinone、9,10-Anthraquinone、Tetramethylbenzoquinone、Thymoquinone）、フェニレンジアミン化合物（例えば、N,N-Dimethyl-1,4-phenylenediamine、N,N,N’,N’-tetramethyl-1, 4-phenylenediamine dihydrochloride）、Coenzyme Q0、AZURE A Chloride、Phenosafranin、6-Aminoquinoxaline、Toluidine Blue、Tetrathiafulvalene等が挙げられる。
【００３５】
フェナジニウム化合物は、例えば、以下で表される化合物が挙げられ、具体的には、5-methylphenaziniumや5-ethylphenazinium）が例示される。
【化２】
2019201637.tif 000006
R1は炭化水素基を示し、飽和炭化水素基でも不飽和炭化水素基でも芳香族炭化水素基でもよい。炭化水素基の炭素数は例えば、１〜１０である。
R2は、フェナジニウム骨格とグルコースオキシダーゼの側鎖をつなぐリンカーを示し、例えば、主鎖や側鎖に酸素原子や硫黄原子や窒素原子などのヘテロ原子を含んでもよいアルキレン基やアルケニレン基が例示される。リンカーの主鎖の原子数は例えば、１〜２０、または１〜１０である。なお、リンカーはグルコースオキシダーゼの側鎖と結合した場合の残基を末端に含む。
【００３６】
本発明は、前記変異型グルコースオキシダーゼにおいて、前記側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸残基を介して電子受容体を導入することを特徴とする、電子受容体修飾グルコースオキシダーゼの製造方法を提供する。これにより、電子受容体をグルコースオキシダーゼに結合させ、修飾酵素を得ることができる。
グルコースオキシダーゼを電子受容体で修飾するためには、例えば、上記のような電子受容体にスクシンイミドなどの官能基を導入し、変異型グルコースオキシダーゼに導入されたリジン残基の側鎖アミノ基と反応させて修飾する方法が例示される。
また、上記のような電子受容体にマレイミドなどの官能基を導入し、変異型グルコースオキシダーゼに導入されたシステイン残基の側鎖チオール基と反応させて修飾する方法が例示される。
さらに、上記のような電子受容体にオキサゾリンなどの官能基を導入し、変異型グルコースオキシダーゼに導入されたグルタミン酸やアスパラギン酸残基の側鎖カルボキシル基と反応させて修飾する方法が例示される。
なお、別途架橋剤を使用することも可能である。
【００３７】
例えば、ＰＥＳで修飾する場合、下記のようなＰＥＳにＮＨＳ基が導入された化合物を変異型グルコースオキシダーゼに導入されたリジン残基の側鎖アミノ基と反応させて修飾する方法が例示される。
例えば、酵素と電子受容体の割合を１：５００〜１：１００００として修飾反応を行うことができる。
【００３８】
【化３】
2019201637.tif 000007
【００３９】
なお、野生型グルコースオキシダーゼが、配列番号１に記載のアミノ酸配列の４８９位のイソロイシンまたは３３５位のアルギニンに相当するアミノ酸残基として、側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸残基を本来的に有している場合は、変異を導入することなく、電子受容体で修飾することが可能である。
【００４０】
＜バイオセンサ＞
本発明の電子受容体修飾グルコースオキシダーゼを電極基材に結合させることにより、直接電子伝達型の酵素電極を得ることができ、そのような酵素電極はグルコースセンサなどのバイオセンサの構成要素として用いることができる。
電極基材としては、金属電極や炭素電極を使用することができ、これらは絶縁性基板の表面に金属層や炭素層を設けることで作成されてもよい。
【００４１】
ここで、直接電子伝達型の酵素電極とは、遊離の電子受容体を使用することなく、酵素反応によって生じた電子を電極に伝達できる電極を意味する。
【００４２】
本発明の電子受容体修飾グルコースオキシダーゼを結合させた酵素電極は、公知の方法で作製することができ、一例としては、以下のようにして作製される。
まず、絶縁性基板の片面に、電極として機能する金属層を形成する。例えば、所定の厚さ（例えば１００μｍ程度）のフィルム状の絶縁性基板の片面に、金属材料を物理蒸着（ＰＶＤ，例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜することによって、所望の厚さ（例えば３０ｎｍ程度）を有する金属層が形成される。金属層の代わりに、炭素材料で形成された電極層を形成することもできる。
このようにして得られた電極層の表面に電子受容体修飾グルコースオキシダーゼの溶液を塗布し、乾燥させることにより、電極表面に電子受容体修飾グルコースオキシダーゼを結
合させることができる。
【００４３】
また、本発明の電子受容体修飾グルコースオキシダーゼを電極表面に固定化してもよい。電子受容体修飾グルコースオキシダーゼを電極表面に固定化する方法は特に制限されないが、導電性ポリマーや架橋剤を使用する方法や単分子膜形成分子を用いる方法が例示される。
例えば、単分子膜形成分子を用いる場合、特開2017−211383に開示されたように、まず、電極上に単分子膜形成分子を結合させる。そして、単分子膜形成分子の反応性官能基と、グルコースオキシダーゼのアミノ基やカルボキシル基等を反応させて、単分子膜形成分子を介してグルコースオキシダーゼを電極上に固定化することができる。
また、導電性ポリマーや架橋剤を利用して酵素を電極上に固定化する場合は、例えば、WO2014／002999または特開2016-121989などに記載されたように、電極上にグルコースオキ
シダーゼと導電性ポリマーや架橋剤などの試薬を添加することにより、酵素電極を作製することができる。
【００４４】
グルコースセンサとしては、作用極として、上記のような本発明の電子受容体修飾グルコースオキシダーゼが電極表面に結合させた酵素電極を用いるグルコースセンサが挙げられる。センサは、目的とする被検物質の濃度を電気化学的に測定する測定系をいい、通常は、作用極（酵素電極）、対極（白金等）、および参照極（Ａｇ／ＡｇＣｌ等）の３電極を含む。あるいは、慣用の簡易血糖値システムにおいて用いられているような、作用極と対極とから構成される２電極系でもよい。センサはさらに、緩衝液および被検試料を入れる恒温セル、作用極に電圧を印加する電源、電流計、記録計等を含むことが好ましい。センサは、バッチ型であってもフロー型であってもよい。特にフロー型のセンサとしては、血糖値を連続で計測できるセンサであってもよい。すなわち、連続的に供給される血液試料、あるいは同透析試料、あるいは血液中あるいは細胞間質液中に本発明の電子受容体修飾グルコースオキシダーゼを結合させた二電極系あるいは三電極系を挿入して計測するセンサであってもよい。このような酵素センサの構造は、当該技術分野においてよく知られており、例えばBiosensors-Fundamental and Applications-Anthony P．F．Turner，Isao Karube and Geroge S． Wilson，Oxford University Press 1987に記載されている。
【００４５】
グルコースの濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。センサの恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。作用電極として本発明の電子受容体修飾グルコースオキシダーゼを結合させた酵素電極を用い、対極としては例えば白金電極を、参照電極としては例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いる。作用極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、恒温セルにグルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００４６】
本発明の電子受容体修飾グルコースオキシダーゼは、グルコースアッセイキットの構成要素として用いることもできる。グルコースアッセイキットには、本発明の電子受容体修飾グルコースオキシダーゼ以外に、発色又は発光試薬、希釈用緩衝液、標準物質、使用説明書などが含まれてよい。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００４８】
［変異導入］
人工合成した野生型Aspergillus niger 1CF3の構造遺伝子をpET30cベクターに挿入し、野生型1CF3発現ベクターであるpET30c 1CF3 WTを構築した。これを鋳型とし、489位のイソ
ロイシンがリジンに置換されるよう、部位特異的変異導入を行った。具体的には、市販の部位特異的変異導入キット（Stratagene社、QuikChangeII Site-Directed Mutagenesis Kit）を用いて、前記pET30c 1CF3 WTに含まれる1CF3構造遺伝子において、489位のイソロ
イシンがリジンに置換されるようコドン改変を行った。このようにして構築したpET30c 1CF3 I489KおよびpET30c 1CF3 WTでそれぞれ大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、変異型1CF3または野生型1CF3発現大腸菌を得た。
【００４９】
[変異酵素の作成方法]
1. 大腸菌BL21(DE3)/pET30c 1CF3 WT, I489Kを3 mLのLB培地(カナマイシン終濃度50μg/mL)で37℃、12時間好気条件で前培養し、100 mLの同培地に植菌した後OD660=0.6に達した
時点でIPTG誘導(終濃度0.5 mM)を行い、20℃で24時間振盪培養した。集菌後、湿菌体を20
mM P.P.B(pH7.0)に再懸濁し、超音波破砕し、遠心分離(10000 g, 4℃, 20 min)により水溶性画分及び不溶性画分を得た。
2. 不溶性画分を1 mLの洗浄バッファー１(100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% TritonX; 20 mM Tris-HCl (pH8.0))で懸濁し、1500 rpm、4℃で1時間インキュベートした後、遠心分離(10000 g, 4℃, 10 min)した。
3.  得られた不溶性画分に対して、続けて同様の操作を洗浄バッファー２(100 mM NaCl, 1 mM EDTA; 20 mM Tris-HCl (pH8.0))、洗浄バッファー３(2M Urea; 20 mM Tris-HCl (pH
8.0))を用いて行った。
4.  サンプルを0.75 mLの可溶化バッファー(8M Urea, 30 mM dithiothreitol; 20 mM Tris-HCl)で懸濁し、1500 rpm、4℃で4時間インキュベートした後、遠心分離(10000 g, 4℃,
10 min)し、得られた可溶化封入体画分をリフォールディングバッファー(1 mM reduced glutathione, 1 mM oxidized glutathione, flavin adenine dinucleotide, 10% glycerol; 20mM P.P.B (pH7.5))で終濃度0.05 mg/mLになるよう希釈し、10℃で96時間静置した。5.  サンプルをAmicon Ultra 30 K（MerkMillipore）を用いて限外濾過による濃縮(約100倍濃縮)を行った。濃縮後試料を20 mM 酢酸Na(pH5.0)で12時間、20 mM P.P.B(pH7.0)で24時間透析した後、遠心分離(20000 g, 4℃, 5 min)し、上清を精製酵素とした。
【００５０】
[電子受容体の化学修飾]
arPES修飾は、50 mM Tricine(pH8.3)をバッファーとして用いて、精製酵素（変異型I489Kまたは野生型WT）とarPESのモル比が1:500, 1:1000, 1:5000, 1:10000の4種類の反応溶液を調製し、1200 rpm, 25℃で2時間振盪した。バッファー交換のため、各サンプルをAmicon Ultra 30 Kを用いて限外濾過(14000 g, 4℃, 5 min)し、濃縮されたサンプルを20 mM P.P.Bで希釈する操作を10回繰り返した。変異型は、489位およびそれ以外の天然側鎖アミ
ノ基を介してPESが修飾されるのに対し、野生型は天然側鎖アミノ基を介してPESが修飾される。
【化４】
2019201637.tif 000008
【００５１】
［酵素活性測定］
酵素活性評価は修飾酵素及び未修飾酵素に対し、PMS存在下または非存在下にて行った。
MTTのarPESまたはPMSによる還元反応を、565 nmにおける吸光度の経時変化を観測するこ
とで測定した。反応条件は断りの無い限り以下の条件で行った。
酵素溶液を含む反応溶液(200μL;  20 mM PPB (pH7.0)＋1.0 mM MTT、濃度は全て終濃度)に基質を加えることで反応を開始し、565 nmの吸光度変化を測定した。(PMSを加えた場合、終濃度は0.6 mMとした) 基質は終濃度100 mMグルコースを用い、1μmolのMTTを還元さ
せる酵素量を1 Unitとし、以下の式より活性値を算出した。MTTのpH 7.0におけるモル吸
光係数は20 mM-1cm-1とした。
【数１】
2019201637.tif 000009
*1：MTTのpH 7.0 におけるモル吸光定数
*2：反応溶液中の酵素溶液の希釈倍率
【００５２】
結果を表４に示す。
野生型の修飾後サンプルにおいて、MTT系での脱水素酵素活性は観察されなかったことか
ら、野生型では修飾されたarPESが電子授受を行っていないことが示された。一方で変異
体修飾後は、いずれの濃度比のサンプルもMTT系にて活性がみられたため、修飾されたarPESが電子授受していることが示された。修飾の際の濃度比は活性が最も高かった1:1000が最適であることが示された。以上より、グルコースオキシダーゼでは489番目に置換され
たリジン残基に修飾されたarPESが電子伝達を担うことが示唆された。
【００５３】
【表４】
2019201637.tif 000010
【００５４】
［センサ作成とグルコース濃度測定］
1. 酵素インクを作製（0.78mg/ml GOX、0.4% KJB  stock（導電性カーボンブラック：ラ
イオンスペシャリティケミカルズ）、3% Epocros（オキサゾリン基含有水溶性ポリマー：日本触媒）、0.5% トレハロース）。
なお、酵素としては、野生型GOX（1CF3WT）、変異型GOX（1CFI489K）、arPES修飾野生型GOX（arPES-WT）、arPES修飾変異型GOX（arPES-I489K）のそれぞれを用いた。
2.上記混合インクをカーボン印刷電極上に160nLスポットし乾燥、100℃2h熱処理する。
3. センサは3電極系（WE: SPCE/酵素インク、CE： カーボン印刷、RE: Ag/AgCl）とし、0
mV vs. Ag/AgCl、25℃において、Glu0, 50, 100, 300, 600 mg/dLでアンペロメトリー測
定を行った。
【００５５】
結果を図１〜３に示す。
図１の野生型1CF3にPESを修飾（arPES-WT）した電極を有するセンサではグルコース濃度
に依存した電流は検出できなかったが、図２の変異型1CF3にPESを修飾（arPES-I489K）した電極を有するセンサではグルコース濃度依存的な電流を検出することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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