(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞内の外因性テロメラーゼ活性の一過性発現のための化合物及び組成物の提供。【解決手段】テロメラーゼ逆転写酵素をコードするリボ核酸を含む化合物、前記化合物とテロメラーゼＲＮＡ構成要素を含む組成物、および、前記化合物または前記組成物を動物細胞に投与する工程を含み、少なくとも１つのテロメアが前記細胞内で伸長する、テロメアを伸長させるための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年２月２２日に出願された米国仮出願第６１／７６８，０４７号の利益を主張し、当該開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
テロメアは、線状染色体の末端にあるＤＮＡ繰返し配列からなり、十分な長さがある場合には、染色体末端それぞれにループが形成され、末端が二本鎖または一本鎖ＤＮＡ切断として作用しないようにしている（Ａｒｔａｎｄｉ＆ＤｅＰｉｎｈｏ（２０１０）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ３１：９−１８）。テロメアは、酸化損傷及び不完全なＤＮＡ複製が一因で、時間の経過とともに短くなり、最終的には、保護ループの形成ができなくなるほど危機的に短いテロメア、染色体末端の露出、染色体と染色体の融合、ＤＮＡ損傷反応、及び細胞の老化、アポトーシスまたは腫瘍に至る（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ａｎｄ  Ｋａｒｌｓｅｄｅｒ（２０１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：１７１−１８１；Ｃａｌａｄｏ  ｅｌ  ａｌ．（２０１２）Ｌｅｕｋｅｍｉａ２６：７００−７０７；Ａｒｔａｎｄｉ  ａｎｄ  ＤｅＰｉｎｈｏ（２０１０）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ３１：９−１８）。
【０００３】
酵素複合体であるテロメラーゼは、テロメアを伸長させるものであり、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）と、テロメラーゼＲＮＡ構成要素（ＴＥＲＣ）として知られているＲＮＡ構成要素の２つの重要な要素からなる。テロメラーゼ複合体の他の構成要素には、タンパク質のＴＣＡＢ１、ジスケリン、Ｇａｒｌ、Ｎｈｐ２、Ｎｏｐ１０及びＲＨＡＵが含まれる（Ｂｒｏｕｉｌｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ２３：８４２−８４６）。ＴＥＲＴは、テロメラーゼ複合体の制限要素であり、そのため、ＴＥＲＴを増加させる処置によりテロメラーゼ活性を高めることができる。テロメラーゼ活性は通常、テロメア反復増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）法を用いて測定される。この方法では、細胞溶解物または他の試料が合成テロメア様ＤＮＡ配列を伸長させる能力を定量化する。
【０００４】
細胞老化及びアポトーシス、ならびに結果として生じる細胞障害の防止に関して、テロメア長維持の重要性から予想されるように、ＴＥＲＴ及びＴＥＲＣの遺伝子突然変異は、特発性肺線維症、先天性角化不全症及び再生不良性貧血の形態を含む、不十分なテロメア維持に由来する致死性遺伝疾患につながる。これらの疾患における短テロメアに起因した早期細胞老化及びアポトーシスの影響は、細胞において破壊的であり、癌リスクの上昇により一層悪化する場合がある（Ａｒｔａｎｄｉ  ａｎｄ  ＤｅＰｉｎｈｏ（２０１０）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ３１：９−１８；Ａｌｔｅｒ  ｅｌ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ１１３：６５４９−６５５７）。短テロメアと癌とを結びつける豊富な相関データ（Ｗｅｎｔｚｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．２０：１２３８−１２５０）に加え、再生不良性貧血では、ヒトにおいて、危機的に短いテロメアと、その結果生じる染色体の不安定性により、細胞が悪性形質転換を受けやすくなるという最初の直接証拠がいくつか示されている（Ｃａｌａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｌｅｕｋｅｍｉａ２６：７００−７０７）。短テロメアが筋ジストロフィーの致死性と非致死性の違いを生み（Ｓａｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ１４３：１０５９−１０７１）、テロメア伸長がアテローム性動脈硬化症、高血圧及び心臓疾患に関連する（Ｐｅｒｅｚ−Ｒｉｖｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１１４：３０９−３１７）内皮細胞老化を防ぐ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８９：７９３−７９８）という証拠がある。短テロメアはまた、これらの疾患及び他の疾患に関与していることに加え、細胞療法及び生体工学用途での細胞増幅を制限する（Ｍｏｈｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｃ．２０１２．０４．０４７４）。
【０００５】
自然生成物由来テロメラーゼ活性剤であるＴＡ−６５（登録商標）が栄養補助剤としてＴ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から商業的に販売されている（Ｈａｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１４：４５−５６）。この化合物は、内因性ｈＴＥＲＴ遺伝子を刺激することによって、生来のテロメラーゼの発現を活性化させると言われている。しかしながら、この処置が本来備わっているテロメラーゼ活性の正常な調節をどのように克服するのかは明確でない。
【０００６】
ヒトＴＥＲＴ（ｈＴＥＲＴ）をコードするベクターを、テロメラーゼ活性のほとんどないか、または全くないヒト細胞にトランスフェクトすることが行われている。たとえば、Ｂｏｄｎａｒ  ｅｌ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７９：３４９−３５２を参照されたい。トランスフェクト細胞では、テロメラーゼが不足している細胞と比較して、テロメラーゼの発現、テロメアの伸長、活発な分裂、及び老化の減少が見られたが、この処置から生じたゲノム変異はリスクを増加させるため、当該手法の有用性は限られる。
【０００７】
複製に限りがあるという能力は、大部分の通常細胞を定義する特徴の１つである。この限られた複製プロセスの最終点は、生存可能な状態を維持するものの、細胞がそれ以上分裂しない停止状態となる、老化である。多くの場合、老化細胞は、遺伝子発現パターンの変化、モルホロジーの変化、正常機能を果たす能力の低下または停止を特徴とする。
【０００８】
テロメアの短縮は、加齢に伴う動物組織の細胞老化に直接的な役割を果たしている。さらに、上述した疾患を含めた種々の疾患に短テロメアが関与しているという累積証拠がある。テロメア伸長による疾病予防への期待は、インビボ及び／またはインビトロで動物細胞のテロメアを伸長させる安全かつ効果的な処置に対する要求を後押しするものである。さらに、細胞療法、細胞組織工学及び再生医療における使用のために、細胞内でテロメアを安全にかつ迅速に伸長させることが必要とされている。
【０００９】
しかしながら、同時に、テロメラーゼ活性の恒常的活性化には危険がある。事実、細胞療法用途では、細胞不死化のリスクを回避することが何よりも重要である。この目的のために、特に、テロメラーゼ活性の上昇が短時間であるだけでなく、処置を継続的に繰り返す必要が生じないほど迅速にテロメアを伸長させられれば、恒常的ではない一過性のテロメラーゼ活性が安全上有益であり得る。現行のテロメア伸長方法には、誘導性プロモーター下でのＴＥＲＴのウイルス送達、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスに由来するベクターを用いたＴＥＲＴの送達、及びテロメラーゼの小分子活性剤が挙げられる。これらの方法には、挿入変異、テロメラーゼ活性の継続的上昇またはこの両方のリスクがある。
したがって、テロメアならびに他の症状及び疾患の潜在的な予防、遅延、改善または処置を行うために、安全にテロメアを伸長させる治療を開発し、加齢老化に伴う身体的外見及び機能ならびに精神機能の緩やかな減退に対して当該治療を実施し、細胞療法及び再生医療を可能にすべき強い誘因がある。こうした治療は、ヒト、ペット、家畜、動物園動物及び絶滅危惧種の各動物を含めたすべての動物の若返りに極めて有用であると言える。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａｒｔａｎｄｉ＆ＤｅＰｉｎｈｏ（２０１０）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ３１：９−１８
【非特許文献２】Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ａｎｄ  Ｋａｒｌｓｅｄｅｒ（２０１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：１７１−１８１
【非特許文献３】Ｃａｌａｄｏ  ｅｌ  ａｌ．（２０１２）Ｌｅｕｋｅｍｉａ２６：７００−７０７
【非特許文献４】Ｂｒｏｕｉｌｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ２３：８４２−８４６
【非特許文献５】Ａｌｔｅｒ  ｅｌ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ１１３：６５４９−６５５７
【非特許文献６】Ｗｅｎｔｚｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．２０：１２３８−１２５０
【非特許文献７】Ｓａｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ１４３：１０５９−１０７１
【非特許文献８】Ｐｅｒｅｚ−Ｒｉｖｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１１４：３０９−３１７
【非特許文献９】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８９：７９３−７９８
【非特許文献１０】Ｍｏｈｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｃ．２０１２．０４．０４７４
【非特許文献１１】Ｈａｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１４：４５−５６
【非特許文献１２】Ｂｏｄｎａｒ  ｅｌ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７９：３４９−３５２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ゲノム挿入変異のリスクがなく、かつ連続的または頻繁な処置さえ必要としないほどの迅速なテロメア伸長を兼ね備えた、テロメラーゼ活性の大幅な一過的上昇という利益をもたらす代替物を提供することにより、こうした問題及び他の問題に対処するものである。具体的には、本発明は、細胞中の外因性テロメラーゼ活性の一過的な翻訳によってテロメアを伸長させるための組成物、方法及びキットを提供する。
【００１２】
一態様において、本発明は、テロメア伸長のための化合物であって、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含有し、かつテロメラーゼ逆転写酵素をコードする合成リボ核酸を含み、当該化合物で処置した細胞内でテロメアが伸長する化合物を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、テロメラーゼ逆転写酵素は、哺乳類、鳥類、爬虫類もしくは魚類のテロメラーゼ逆転写酵素またはテロメラーゼ触媒活性を保持する変異型であり、特定の実施形態においては、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、リボ核酸は、５’キャップ、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域及びポリＡテールを含む。５’キャップは非免疫原性であってもよいし、５’キャップはホスファターゼで処理されていてもよい。
【００１５】
好ましい実施形態において、ポリＡテールは、リボ核酸の安定性を向上させる。
【００１６】
他の好ましい実施形態において、５’非翻訳領域もしくは３’非翻訳領域は、安定なｍＲＮＡもしくは効率的に翻訳されるｍＲＮＡに由来する配列を含むか、または両非翻訳領域が安定なｍＲＮＡもしくは効率的に翻訳されるｍＲＮＡに由来する配列を含む。
【００１７】
さらに他の好ましい実施形態において、５’キャップ、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域は、リボ核酸を安定させるか、リボ核酸の翻訳率を上げるか、リボ核酸の免疫原性を調節する。
【００１８】
極めて好ましい実施形態において、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドは、リボ核酸の免疫原性を調節する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、リボ核酸は、精製処理した合成リボ核酸である。
【００２０】
好ましい実施形態において、合成リボ核酸は、免疫原性成分を除去するために精製される。
【００２１】
いくつかの特定の実施形態において、リボ核酸は、ヒト、ネコ、イヌ、マウス、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、アフリカゾウ、ニワトリ、ラット、ゼブラフィッシュ、メダカもしくはチンパンジーのテロメラーゼ逆転写酵素、または当該テロメラーゼ逆転写酵素と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
【００２２】
別の態様において、本発明は、本発明の化合物とテロメラーゼＲＮＡ構成要素とを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、テロメラーゼＲＮＡ構成要素は、哺乳類、鳥類、爬虫類または魚類のテロメラーゼＲＮＡ構成要素である。より具体的な実施形態において、テロメラーゼＲＮＡ構成要素は、ヒトテロメラーゼＲＮＡ構成要素である。いくつかの実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、送達担体をさらに含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、送達担体は、エキソソーム、脂質ナノ粒子、高分子ナノ粒子、天然もしくは人工のリポタンパク質粒子、カチオン性脂質、タンパク質、タンパク質−核酸複合体、リポソーム、ビロソームまたはポリマーである。特定の実施形態において、送達担体は、カチオン性脂質である。
【００２４】
好ましい実施形態において、送達担体は、非免疫原性である。他の好ましい実施形態において、送達担体は、部分的に免疫原性である。特に、いくつかの状況において、ある程度の免疫原性を保持している担体が望ましい場合がある。
【００２５】
本発明の別の態様によれば、開示した化合物または組成物のいずれかを動物細胞に投与する工程を含み、少なくとも１つのテロメアが細胞内で伸長する、テロメアを伸長させるための方法を提供する。
【００２６】
いくつかの方法の実施形態において、細胞は、投与工程の前に、少なくとも１つの短縮したテロメアを有する。
【００２７】
いくつかの実施形態において、細胞は、加齢関連疾病、加齢関連症状もしくは加齢に伴う機能もしくは外見の減退を患っているか、またはこうしたリスクのある対象に由来する細胞または当該対象内の細胞である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、細胞は、癌、心臓疾患、脳卒中、糖尿病、糖尿病性潰瘍、アルツハイマー病、骨粗鬆症、身体的能力もしくは外見の減退、身体的外傷もしくは慢性的な身体的ストレス、心的外傷もしくは慢性的な精神的ストレス、免疫機能の低下、免疫老化、または黄斑変性症を患っているか、またはこうしたリスクのある対象に由来する細胞または当該対象内の細胞である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、細胞は、内胚葉系列、中胚葉系列もしくは外胚葉系列の体細胞、生殖細胞または胚性細胞である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、細胞は、人工多能性幹細胞、または人工多能性幹細胞の作製に使用される細胞である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、細胞は、分化転換した細胞、または分化転換した細胞の作製に使用される細胞である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、細胞は単離細胞であり、投与工程は４８時間以下継続する。他の実施形態において、細胞は単離細胞であり、投与工程は少なくとも２時間継続する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、細胞は単離細胞であり、投与工程は４回以下実施される。他の実施形態において、細胞は単離細胞であり、投与工程は少なくとも２回実施される。
【００３４】
いくつかの実施形態において、細胞は単離細胞であり、当該方法は細胞内のテロメラーゼ活性を測定する工程をさらに含む。特定の実施形態において、投与工程は、細胞内のテロメラーゼ活性を増加させる。さらにより具体的な実施形態において、テロメラーゼ活性は、少なくとも５％一過的に増加する。他の特定の実施形態において、増加したテロメラーゼ活性の半減期は、４８時間以下である。
【００３５】
いくつかの実施形態において、当該方法は、細胞内のテロメア長を測定する工程をさらに含む。特定の実施形態において、平均のテロメア長は、少なくとも０．１ｋｂ増加する。
【００３６】
いくつかの実施形態において、細胞は単離細胞であり、当該方法は細胞内の細胞集団倍加能を測定する工程をさらに含む。特定の実施形態において、細胞集団倍加能は、場合により、少なくとも１回の細胞集団倍加分増加する。
【００３７】
好ましい実施形態において、細胞は、哺乳類対象に由来する細胞または哺乳類対象内の細胞であり、さらにより好ましい実施形態において、細胞は、ヒト対象に由来する細胞またはヒト対象内の細胞である。
【００３８】
いくつかの実施形態において、細胞は単離細胞であり、他の実施形態において、細胞は単離細胞でない。いくつかの実施形態において、投与工程は、エレクトロポレーションを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのテロメアが細胞内で一過的に伸長する。
【００３９】
本発明のさらに別の態様によれば、動物細胞内のテロメアを伸長させるためのキットを提供する。キットは、上記の化合物または組成物のいずれかと、当該化合物または組成物を使用してテロメアを伸長させるための説明書とを含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、キットは、パッケージ材料をさらに含む。いくつかの特定の実施形態において、パッケージ材料は、気密性である。いくつかの特定の実施形態において、パッケージ材料は、金属箔容器を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態において、キットは、乾燥剤、培地またはＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む。
【００４２】
いくつかの実施形態において、組成物は、滅菌状態である。いくつかの実施形態において、キットは、本発明の化合物と、当該組成物を使用してテロメアを伸長させるための説明書と、テロメラーゼＲＮＡ構成要素、送達担体またはテロメラーゼＲＮＡ構成要素と送達担体の両方とを含む。
【００４３】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の化合物または組成物を、テロメア伸長を必要とする動物対象またはテロメア伸長の恩恵を受け得る動物対象に投与することを含む、処置の方法を提供する。いくつかの実施形態において、動物対象は、テロメア短縮に起因する疾患または症状を患っているか、そのリスクがある。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
テロメアの伸長のための化合物であって、
少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含有し、かつテロメラーゼ逆転写酵素をコードする合成リボ核酸を含み、
前記化合物で処置した細胞内でテロメアが伸長する、化合物。
（項目２）
前記テロメラーゼ逆転写酵素が、哺乳類、鳥類、爬虫類もしくは魚類のテロメラーゼ逆転写酵素またはテロメラーゼ触媒活性を保持する変異型である、項目１に記載の化合物。
（項目３）
前記テロメラーゼ逆転写酵素が、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素である、項目２に記載の化合物。
（項目４）
前記リボ核酸が、５’キャップ、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域及びポリＡテールを含む、項目１に記載の化合物。
（項目５）
前記５’キャップが非免疫原性である、項目４に記載の化合物。
（項目６）
前記５’キャップがホスファターゼで処理されている、項目４に記載の化合物。
（項目７）
前記ポリＡテールが、前記リボ核酸の安定性を向上させる、項目４に記載の化合物。
（項目８）
前記５’非翻訳領域または前記３’非翻訳領域が、安定なｍＲＮＡまたは効率的に翻訳されるｍＲＮＡに由来する配列を含む、項目４に記載の化合物。
（項目９）
前記５’非翻訳領域及び前記３’非翻訳領域が両方とも安定なｍＲＮＡまたは効率的に翻訳されるｍＲＮＡに由来する配列を含む、項目４に記載の化合物。
（項目１０）
前記５’キャップ、前記５’非翻訳領域、または前記３’非翻訳領域が、前記リボ核酸を安定させるか、前記リボ核酸の翻訳率を上げるか、前記リボ核酸の免疫原性を調節する、項目４に記載の化合物。
（項目１１）
前記少なくとも１つの修飾ヌクレオシドが、前記リボ核酸の免疫原性を調節する、項目１に記載の化合物。
（項目１２）
前記合成リボ核酸が、精製処理した合成リボ核酸である、項目１に記載の化合物。
（項目１３）
前記合成リボ核酸が、免疫原性成分を除去するために精製される、項目１２に記載の化合物。
（項目１４）
前記リボ核酸が、ヒト、ネコ、イヌ、マウス、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、アフリカゾウ、ニワトリ、ラット、ゼブラフィッシュ、メダカもしくはチンパンジーのテロメラーゼ逆転写酵素、または前記テロメラーゼ逆転写酵素と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、項目１に記載の化合物。
（項目１５）
項目１の化合物とテロメラーゼＲＮＡ構成要素とを含む組成物。
（項目１６）
前記テロメラーゼＲＮＡ構成要素が、哺乳類、鳥類、爬虫類または魚類のテロメラーゼＲＮＡ構成要素である、項目１５に記載の組成物。
（項目１７）
前記テロメラーゼＲＮＡ構成要素が、ヒトテロメラーゼＲＮＡ構成要素である、項目１６に記載の組成物。
（項目１８）
項目１〜１４のいずれか一項に記載の化合物または項目１５〜１７のいずれか一項に記載の組成物と、送達担体とを含む組成物。
（項目１９）
前記送達担体が、エキソソーム、脂質ナノ粒子、高分子ナノ粒子、天然もしくは人工のリポタンパク質粒子、カチオン性脂質、タンパク質、タンパク質−核酸複合体、リポソーム、ビロソームまたはポリマーである、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
前記送達担体が、カチオン性脂質である、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
前記送達担体が、非免疫原性である、項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
項目１〜１４のいずれか一項に記載の化合物または項目１５〜２１のいずれか一項に記載の組成物を動物細胞に投与する工程を含み、少なくとも１つのテロメアが前記細胞内で伸長する、テロメアを伸長させるための方法。
（項目２３）
前記細胞が、前記投与工程の前に、少なくとも１つの短縮したテロメアを有する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記細胞が、加齢関連疾病、加齢関連症状もしくは加齢に伴う機能もしくは外見の減退を患っているか、またはこうしたリスクのある対象に由来する細胞または当該対象内の細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記細胞が、癌、心臓疾患、脳卒中、糖尿病、糖尿病性潰瘍、アルツハイマー病、骨粗鬆症、身体的能力もしくは外見の減退、身体的外傷もしくは慢性的な身体的ストレス、心的外傷もしくは慢性的な精神的ストレス、免疫機能の低下、免疫老化、または黄斑変性症を患っているか、またはこうしたリスクのある対象に由来する細胞または当該対象内の細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
前記細胞が、内胚葉系列、中胚葉系列もしくは外胚葉系列の体細胞、または生殖細胞または胚性細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目２７）
前記細胞が、人工多能性幹細胞または人工多能性幹細胞の作製に使用される細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目２８）
前記細胞が、分化転換した細胞、または分化転換した細胞の作製に使用される細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目２９）
前記細胞が単離細胞であり、前記投与工程が４８時間以下継続する、項目２２に記載の方法。
（項目３０）
前記細胞が単離細胞であり、前記投与工程が少なくとも２時間継続する、項目２２に記載の方法。
（項目３１）
前記細胞が単離細胞であり、前記投与工程が４回以下実施される、項目２２に記載の方法。
（項目３２）
前記細胞が単離細胞であり、前記投与工程が少なくとも２回実施される、項目２２に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞が単離細胞であり、前記方法が前記細胞内のテロメラーゼ活性を測定する工程をさらに含む、項目２２に記載の方法。
（項目３４）
前記投与工程が、前記細胞内のテロメラーゼ活性を上昇させる、項目２２に記載の方法。
（項目３５）
前記テロメラーゼ活性が、少なくとも５％一過的に増加する、項目３４に記載の方法。（項目３６）
前記増加したテロメラーゼ活性の半減期が、４８時間以下である、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記増加したテロメラーゼ活性の半減期が、少なくとも２時間である、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
前記方法が、前記細胞内のテロメア長を測定する工程をさらに含む、項目２２に記載の方法。
（項目３９）
前記投与工程が、前記細胞内の平均テロメア長を増加させる、項目２２に記載の方法。
（項目４０）
前記細胞内の平均テロメア長が、少なくとも０．１ｋｂ増加する、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記細胞が単離細胞であり、前記方法が前記細胞内の細胞集団倍加能を測定する工程をさらに含む、項目２２に記載の方法。
（項目４２）
前記投与工程が、前記細胞内の細胞集団倍加能を増加させる、項目２２に記載の方法。
（項目４３）
前記細胞集団倍加能が、少なくとも１回の細胞集団倍加分増加する、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記細胞が、哺乳類対象に由来する細胞または哺乳類対象内の細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目４５）
前記細胞が、ヒト対象に由来する細胞またはヒト対象内の細胞である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記細胞が単離細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目４７）
前記細胞が単離細胞でない、項目２２に記載の方法。
（項目４８）
前記投与工程が、エレクトロポレーションを含む、項目２２に記載の方法。
（項目４９）
前記少なくとも１つのテロメアが、前記細胞内で一過的に伸長する、項目２２に記載の方法。
（項目５０）
項目１〜１４のいずれか一項に記載の化合物または項目１５〜２１のいずれか一項に記載の組成物と、
前記化合物または組成物を使用してテロメアを伸長させるための説明書とを含む、
動物細胞内のテロメアを伸長させるためのキット。
（項目５１）
パッケージ材料をさらに含む、項目５０に記載のキット。
（項目５２）
前記パッケージ材料が気密性である、項目５１に記載のキット。
（項目５３）
前記パッケージ材料が金属箔容器を含む、項目５１に記載のキット。
（項目５４）
乾燥剤をさらに含む、項目５０に記載のキット。
（項目５５）
培地をさらに含む、項目５０に記載のキット。
（項目５６）
ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、項目５０に記載のキット。
（項目５７）
前記化合物または組成物が滅菌状態である、項目５０に記載のキット。
（項目５８）
項目１〜１４のいずれか一項に記載の化合物と、
前記組成物を使用してテロメアを伸長させるための説明書と、テロメラーゼＲＮＡ構成要素、送達担体またはテロメラーゼＲＮＡ構成要素と送達担体の両方とを含む、
項目５０に記載のキット。
（項目５９）
項目１〜１４のいずれか一項に記載の化合物または項目１５〜２１のいずれか一項に記載の組成物を、テロメア伸長を必要とする動物対象またはテロメア伸長の恩恵を受け得る動物対象に投与することを含む、処置の方法。
（項目６０）
前記動物対象は、テロメア短縮に起因する疾患を患っているか、そのリスクのある、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記疾患がメタボリック症候群、糖尿病、糖尿病性潰瘍、心臓疾患、癌、血管性認知症、アルツハイマー病、脳卒中、加齢関連黄斑変性症、免疫老化、骨髄機能不全、胃腸潰瘍、肝硬変、ヘルニア、感染症、慢性感染症、中等度または重度の認知障害、運動障害、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、加齢関連の不安症、平衡障害、耳鳴り、ベル麻痺、白内障、慢性閉塞性肺疾患、角膜上皮剥離、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、結膜炎、霰粒腫、脱水症、鬱病、肺気腫、眼疾患、成長障害、流感、全般性不安障害、緑内障、聴力損失、味覚損失、食欲不振、股関節脱臼、記憶喪失、パーキンソン病、脊椎管狭窄症、尿失禁、及び脊椎骨折からなる群から選択される、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記動物対象が、加齢関連疾病、加齢関連症状、または加齢に伴う機能もしくは外見の減退を患っているか、そのリスクのある、項目５９に記載の方法。
（項目６３）
前記対象動物内の細胞または前記対象動物由来の細胞のテロメア長を測定する工程と、短縮されたテロメア長が検出された場合に前記化合物または前記組成物を投与する工程とをさらに含む、項目５９に記載の方法。
（項目６４）
前記測定工程及び前記投与工程が少なくとも１回繰り返される、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記対象動物の細胞内でテロメアが一過的に伸長する、項目５９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１ａ】ＭＲＣ−５細胞は、ＴＥＲＴをコードする修飾リボ核酸（ｍｏｄＲＮＡ）とのトランスフェクションにより、テロメラーゼ活性が一過的に増加するが、触媒不活性ＴＥＲＴ（ＣＩ  ＴＥＲＴ）では増加しない。（ａ）本研究で使用したｍｏｄＲＮＡ構築物及び方法の概略図。ｍｏｄＲＮＡ構築物は、ヒトＴＥＲＴをコードし、安定性を付与する５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ、たとえばβ−グロビンｍＲＮＡに由来するＵＴＲを有する。ＣＩ  ＴＥＲＴは１つの塩基対変異を有する。（ｂ）ＴＥＲＴまたはＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡのトランスフェクションにより、処置細胞内の外因性ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡレベルが内因性ＴＥＲＴ  ＲＮＡレベルを超えて上昇したが、無処置対照では上昇しない。（ｃ）抗ＴＥＲＴ抗体によって認識されたタンパク質レベルは、ＴＥＲＴまたはＣＩ  ＴＥＲＴをコードするｍｏｄＲＮＡとのトランスフェクションから２４時間後のＭＲＣ−５細胞におけるレベル（それぞれＰ＜０．０３またはＰ＜０．０１）のほうが、無処置細胞またはビヒクルのみ細胞におけるレベルよりも有意に高い。（ｄ）ＴＥＲＴをコードするｍｏｄＲＮＡによる処置は、ＭＲＣ−５細胞のテロメラーゼ活性に一過的な増加をもたらすが、ＣＩ  ＴＥＲＴでは増加しない。
【図１ｂ】ＭＲＣ−５細胞は、ＴＥＲＴをコードする修飾リボ核酸（ｍｏｄＲＮＡ）とのトランスフェクションにより、テロメラーゼ活性が一過的に増加するが、触媒不活性ＴＥＲＴ（ＣＩ  ＴＥＲＴ）では増加しない。（ａ）本研究で使用したｍｏｄＲＮＡ構築物及び方法の概略図。ｍｏｄＲＮＡ構築物は、ヒトＴＥＲＴをコードし、安定性を付与する５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ、たとえばβ−グロビンｍＲＮＡに由来するＵＴＲを有する。ＣＩ  ＴＥＲＴは１つの塩基対変異を有する。（ｂ）ＴＥＲＴまたはＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡのトランスフェクションにより、処置細胞内の外因性ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡレベルが内因性ＴＥＲＴ  ＲＮＡレベルを超えて上昇したが、無処置対照では上昇しない。（ｃ）抗ＴＥＲＴ抗体によって認識されたタンパク質レベルは、ＴＥＲＴまたはＣＩ  ＴＥＲＴをコードするｍｏｄＲＮＡとのトランスフェクションから２４時間後のＭＲＣ−５細胞におけるレベル（それぞれＰ＜０．０３またはＰ＜０．０１）のほうが、無処置細胞またはビヒクルのみ細胞におけるレベルよりも有意に高い。（ｄ）ＴＥＲＴをコードするｍｏｄＲＮＡによる処置は、ＭＲＣ−５細胞のテロメラーゼ活性に一過的な増加をもたらすが、ＣＩ  ＴＥＲＴでは増加しない。
【図１ｃ】ＭＲＣ−５細胞は、ＴＥＲＴをコードする修飾リボ核酸（ｍｏｄＲＮＡ）とのトランスフェクションにより、テロメラーゼ活性が一過的に増加するが、触媒不活性ＴＥＲＴ（ＣＩ  ＴＥＲＴ）では増加しない。（ａ）本研究で使用したｍｏｄＲＮＡ構築物及び方法の概略図。ｍｏｄＲＮＡ構築物は、ヒトＴＥＲＴをコードし、安定性を付与する５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ、たとえばβ−グロビンｍＲＮＡに由来するＵＴＲを有する。ＣＩ  ＴＥＲＴは１つの塩基対変異を有する。（ｂ）ＴＥＲＴまたはＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡのトランスフェクションにより、処置細胞内の外因性ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡレベルが内因性ＴＥＲＴ  ＲＮＡレベルを超えて上昇したが、無処置対照では上昇しない。（ｃ）抗ＴＥＲＴ抗体によって認識されたタンパク質レベルは、ＴＥＲＴまたはＣＩ  ＴＥＲＴをコードするｍｏｄＲＮＡとのトランスフェクションから２４時間後のＭＲＣ−５細胞におけるレベル（それぞれＰ＜０．０３またはＰ＜０．０１）のほうが、無処置細胞またはビヒクルのみ細胞におけるレベルよりも有意に高い。（ｄ）ＴＥＲＴをコードするｍｏｄＲＮＡによる処置は、ＭＲＣ−５細胞のテロメラーゼ活性に一過的な増加をもたらすが、ＣＩ  ＴＥＲＴでは増加しない。
【図１ｄ】ＭＲＣ−５細胞は、ＴＥＲＴをコードする修飾リボ核酸（ｍｏｄＲＮＡ）とのトランスフェクションにより、テロメラーゼ活性が一過的に増加するが、触媒不活性ＴＥＲＴ（ＣＩ  ＴＥＲＴ）では増加しない。（ａ）本研究で使用したｍｏｄＲＮＡ構築物及び方法の概略図。ｍｏｄＲＮＡ構築物は、ヒトＴＥＲＴをコードし、安定性を付与する５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ、たとえばβ−グロビンｍＲＮＡに由来するＵＴＲを有する。ＣＩ  ＴＥＲＴは１つの塩基対変異を有する。（ｂ）ＴＥＲＴまたはＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡのトランスフェクションにより、処置細胞内の外因性ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡレベルが内因性ＴＥＲＴ  ＲＮＡレベルを超えて上昇したが、無処置対照では上昇しない。（ｃ）抗ＴＥＲＴ抗体によって認識されたタンパク質レベルは、ＴＥＲＴまたはＣＩ  ＴＥＲＴをコードするｍｏｄＲＮＡとのトランスフェクションから２４時間後のＭＲＣ−５細胞におけるレベル（それぞれＰ＜０．０３またはＰ＜０．０１）のほうが、無処置細胞またはビヒクルのみ細胞におけるレベルよりも有意に高い。（ｄ）ＴＥＲＴをコードするｍｏｄＲＮＡによる処置は、ＭＲＣ−５細胞のテロメラーゼ活性に一過的な増加をもたらすが、ＣＩ  ＴＥＲＴでは増加しない。
【図２】リボ核酸治療法のための送達担体としてのエキソソームの使用。
【図３】細胞のテロメア伸長における複数の迅速かつ一過的なテロメラーゼ処置の使用の説明図。
【図４ａ】ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡによる処置は、ＭＲＣ−５細胞内のテロメアを迅速に伸長させる。（ａ）本研究で用いた処置及びアッセイスケジュール。処置は５時間継続した。（ｂ）ＴＲＦサザンブロット（挿入図）及びその定量化の図。化学発光信号は、テロメア長の単位当たりのプローブ数を考慮して標準化した。次に、各ゲルレーンのピクセル行それぞれの平均強度をテロメア長に対してプロットした（各処置の生物学的反復実験数ｎ＝３）。（ｃ）図４ｂのテロメア長分布の平均。ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置した細胞内のテロメアが、無処置またはビヒクルのみで処置した対照よりも有意に長い（Ｐ＜０．０１４）ことがわかる。（ｄ）任意の閾値（４．２ｋｂ）よりも長いテロメアの割合は、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置した細胞のほうが無処置及びビヒクルのみで処置した対照よりも大きい。（ｅ）テロメア長を比較するための定量的ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｑ−ＦＩＳＨ）に用いたＭＲＣ−５線維芽細胞の分裂中期スプレッドの代表的な蛍光顕微鏡写真。テロメアプローブ（発光、斑点）及びＤＮＡ（スムーズシェーディング）を示す。（ｆ）処置細胞及び対照細胞内のテロメア長のＱ−ＦＩＳＨ測定の定量化（各処置の２つの生物学的反復実験それぞれの細胞数ｎ＝１５）。処置細胞における迅速なテロメア伸長を示す（ＴＲＦは、テロメアＤＮＡとサブテロメアＤＮＡの両方の長さを測定するのに対し、Ｑ−ＦＩＳＨは、テロメアＤＮＡのみを測定することに留意されたい。これにより、Ｑ−ＦＩＳＨとＴＲＦの間の結果の違いが説明される）。（ｇ）（ｉ）１細胞当たりの平均総テロメアプローブ蛍光を定量化するためにＱ−ＦＩＳＨを用いて測定した場合のテロメア長に対する供給業者から受領した後のＭＲＣ−５細胞の累積細胞集団倍加の標準曲線。累積細胞集団倍加は、テロメア長に直線的に比例する。（ｇ）（ｉｉ）ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを用いて４８時間の間隔で３回処置したＭＲＣ−５細胞の１細胞当たりの平均テロメア長の定量化。Ｑ−ＦＩＳＨを用いた測定。
【図４ｂ】ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡによる処置は、ＭＲＣ−５細胞内のテロメアを迅速に伸長させる。（ａ）本研究で用いた処置及びアッセイスケジュール。処置は５時間継続した。（ｂ）ＴＲＦサザンブロット（挿入図）及びその定量化の図。化学発光信号は、テロメア長の単位当たりのプローブ数を考慮して標準化した。次に、各ゲルレーンのピクセル行それぞれの平均強度をテロメア長に対してプロットした（各処置の生物学的反復実験数ｎ＝３）。（ｃ）図４ｂのテロメア長分布の平均。ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置した細胞内のテロメアが、無処置またはビヒクルのみで処置した対照よりも有意に長い（Ｐ＜０．０１４）ことがわかる。（ｄ）任意の閾値（４．２ｋｂ）よりも長いテロメアの割合は、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置した細胞のほうが無処置及びビヒクルのみで処置した対照よりも大きい。（ｅ）テロメア長を比較するための定量的ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｑ−ＦＩＳＨ）に用いたＭＲＣ−５線維芽細胞の分裂中期スプレッドの代表的な蛍光顕微鏡写真。テロメアプローブ（発光、斑点）及びＤＮＡ（スムーズシェーディング）を示す。（ｆ）処置細胞及び対照細胞内のテロメア長のＱ−ＦＩＳＨ測定の定量化（各処置の２つの生物学的反復実験それぞれの細胞数ｎ＝１５）。処置細胞における迅速なテロメア伸長を示す（ＴＲＦは、テロメアＤＮＡとサブテロメアＤＮＡの両方の長さを測定するのに対し、Ｑ−ＦＩＳＨは、テロメアＤＮＡのみを測定することに留意されたい。これにより、Ｑ−ＦＩＳＨとＴＲＦの間の結果の違いが説明される）。（ｇ）（ｉ）１細胞当たりの平均総テロメアプローブ蛍光を定量化するためにＱ−ＦＩＳＨを用いて測定した場合のテロメア長に対する供給業者から受領した後のＭＲＣ−５細胞の累積細胞集団倍加の標準曲線。累積細胞集団倍加は、テロメア長に直線的に比例する。（ｇ）（ｉｉ）ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを用いて４８時間の間隔で３回処置したＭＲＣ−５細胞の１細胞当たりの平均テロメア長の定量化。Ｑ−ＦＩＳＨを用いた測定。
【図４ｃ】ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡによる処置は、ＭＲＣ−５細胞内のテロメアを迅速に伸長させる。（ａ）本研究で用いた処置及びアッセイスケジュール。処置は５時間継続した。（ｂ）ＴＲＦサザンブロット（挿入図）及びその定量化の図。化学発光信号は、テロメア長の単位当たりのプローブ数を考慮して標準化した。次に、各ゲルレーンのピクセル行それぞれの平均強度をテロメア長に対してプロットした（各処置の生物学的反復実験数ｎ＝３）。（ｃ）図４ｂのテロメア長分布の平均。ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置した細胞内のテロメアが、無処置またはビヒクルのみで処置した対照よりも有意に長い（Ｐ＜０．０１４）ことがわかる。（ｄ）任意の閾値（４．２ｋｂ）よりも長いテロメアの割合は、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置した細胞のほうが無処置及びビヒクルのみで処置した対照よりも大きい。（ｅ）テロメア長を比較するための定量的ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｑ−ＦＩＳＨ）に用いたＭＲＣ−５線維芽細胞の分裂中期スプレッドの代表的な蛍光顕微鏡写真。テロメアプローブ（発光、斑点）及びＤＮＡ（スムーズシェーディング）を示す。（ｆ）処置細胞及び対照細胞内のテロメア長のＱ−ＦＩＳＨ測定の定量化（各処置の２つの生物学的反復実験それぞれの細胞数ｎ＝１５）。処置細胞における迅速なテロメア伸長を示す（ＴＲＦは、テロメアＤＮＡとサブテロメアＤＮＡの両方の長さを測定するのに対し、Ｑ−ＦＩＳＨは、テロメアＤＮＡのみを測定することに留意されたい。これにより、Ｑ−ＦＩＳＨとＴＲＦの間の結果の違いが説明される）。（ｇ）（ｉ）１細胞当たりの平均総テロメアプローブ蛍光を定量化するためにＱ−ＦＩＳＨを用いて測定した場合のテロメア長に対する供給業者から受領した後のＭＲＣ−５細胞の累積細胞集団倍加の標準曲線。累積細胞集団倍加は、テロメア長に直線的に比例する。（ｇ）（ｉｉ）ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを用いて４８時間の間隔で３回処置したＭＲＣ−５細胞の１細胞当たりの平均テロメア長の定量化。Ｑ−ＦＩＳＨを用いた測定。
【図４ｄ】ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡによる処置は、ＭＲＣ−５細胞内のテロメアを迅速に伸長させる。（ａ）本研究で用いた処置及びアッセイスケジュール。処置は５時間継続した。（ｂ）ＴＲＦサザンブロット（挿入図）及びその定量化の図。化学発光信号は、テロメア長の単位当たりのプローブ数を考慮して標準化した。次に、各ゲルレーンのピクセル行それぞれの平均強度をテロメア長に対してプロットした（各処置の生物学的反復実験数ｎ＝３）。（ｃ）図４ｂのテロメア長分布の平均。ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置した細胞内のテロメアが、無処置またはビヒクルのみで処置した対照よりも有意に長い（Ｐ＜０．０１４）ことがわかる。（ｄ）任意の閾値（４．２ｋｂ）よりも長いテロメアの割合は、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置した細胞のほうが無処置及びビヒクルのみで処置した対照よりも大きい。（ｅ）テロメア長を比較するための定量的ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｑ−ＦＩＳＨ）に用いたＭＲＣ−５線維芽細胞の分裂中期スプレッドの代表的な蛍光顕微鏡写真。テロメアプローブ（発光、斑点）及びＤＮＡ（スムーズシェーディング）を示す。（ｆ）処置細胞及び対照細胞内のテロメア長のＱ−ＦＩＳＨ測定の定量化（各処置の２つの生物学的反復実験それぞれの細胞数ｎ＝１５）。処置細胞における迅速なテロメア伸長を示す（ＴＲＦは、テロメアＤＮＡとサブテロメアＤＮＡの両方の長さを測定するのに対し、Ｑ−ＦＩＳＨは、テロメアＤＮＡのみを測定することに留意されたい。これにより、Ｑ−ＦＩＳＨとＴＲＦの間の結果の違いが説明される）。（ｇ）（ｉ）１細胞当たりの平均総テロメアプローブ蛍光を定量化するためにＱ−ＦＩＳＨを用いて測定した場合のテロメア長に対する供給業者から受領した後のＭＲＣ−５細胞の累積細胞集団倍加の標準曲線。累積細胞集団倍加は、テロメア長に直線的に比例する。（ｇ）（ｉｉ）ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを用いて４８時間の間隔で３回処置したＭＲＣ−５細胞の１細胞当たりの平均テロメア長の定量化。Ｑ−ＦＩＳＨを用いた測定。
【図４ｅ】ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡによる処置は、ＭＲＣ−５細胞内のテロメアを迅速に伸長させる。（ａ）本研究で用いた処置及びアッセイスケジュール。処置は５時間継続した。（ｂ）ＴＲＦサザンブロット（挿入図）及びその定量化の図。化学発光信号は、テロメア長の単位当たりのプローブ数を考慮して標準化した。次に、各ゲルレーンのピクセル行それぞれの平均強度をテロメア長に対してプロットした（各処置の生物学的反復実験数ｎ＝３）。（ｃ）図４ｂのテロメア長分布の平均。ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置した細胞内のテロメアが、無処置またはビヒクルのみで処置した対照よりも有意に長い（Ｐ＜０．０１４）ことがわかる。（ｄ）任意の閾値（４．２ｋｂ）よりも長いテロメアの割合は、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置した細胞のほうが無処置及びビヒクルのみで処置した対照よりも大きい。（ｅ）テロメア長を比較するための定量的ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｑ−ＦＩＳＨ）に用いたＭＲＣ−５線維芽細胞の分裂中期スプレッドの代表的な蛍光顕微鏡写真。テロメアプローブ（発光、斑点）及びＤＮＡ（スムーズシェーディング）を示す。（ｆ）処置細胞及び対照細胞内のテロメア長のＱ−ＦＩＳＨ測定の定量化（各処置の２つの生物学的反復実験それぞれの細胞数ｎ＝１５）。処置細胞における迅速なテロメア伸長を示す（ＴＲＦは、テロメアＤＮＡとサブテロメアＤＮＡの両方の長さを測定するのに対し、Ｑ−ＦＩＳＨは、テロメアＤＮＡのみを測定することに留意されたい。これにより、Ｑ−ＦＩＳＨとＴＲＦの間の結果の違いが説明される）。（ｇ）（ｉ）１細胞当たりの平均総テロメアプローブ蛍光を定量化するためにＱ−ＦＩＳＨを用いて測定した場合のテロメア長に対する供給業者から受領した後のＭＲＣ−５細胞の累積細胞集団倍加の標準曲線。累積細胞集団倍加は、テロメア長に直線的に比例する。（ｇ）（ｉｉ）ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを用いて４８時間の間隔で３回処置したＭＲＣ−５細胞の１細胞当たりの平均テロメア長の定量化。Ｑ−ＦＩＳＨを用いた測定。
【図４ｆ】ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡによる処置は、ＭＲＣ−５細胞内のテロメアを迅速に伸長させる。（ａ）本研究で用いた処置及びアッセイスケジュール。処置は５時間継続した。（ｂ）ＴＲＦサザンブロット（挿入図）及びその定量化の図。化学発光信号は、テロメア長の単位当たりのプローブ数を考慮して標準化した。次に、各ゲルレーンのピクセル行それぞれの平均強度をテロメア長に対してプロットした（各処置の生物学的反復実験数ｎ＝３）。（ｃ）図４ｂのテロメア長分布の平均。ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置した細胞内のテロメアが、無処置またはビヒクルのみで処置した対照よりも有意に長い（Ｐ＜０．０１４）ことがわかる。（ｄ）任意の閾値（４．２ｋｂ）よりも長いテロメアの割合は、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置した細胞のほうが無処置及びビヒクルのみで処置した対照よりも大きい。（ｅ）テロメア長を比較するための定量的ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｑ−ＦＩＳＨ）に用いたＭＲＣ−５線維芽細胞の分裂中期スプレッドの代表的な蛍光顕微鏡写真。テロメアプローブ（発光、斑点）及びＤＮＡ（スムーズシェーディング）を示す。（ｆ）処置細胞及び対照細胞内のテロメア長のＱ−ＦＩＳＨ測定の定量化（各処置の２つの生物学的反復実験それぞれの細胞数ｎ＝１５）。処置細胞における迅速なテロメア伸長を示す（ＴＲＦは、テロメアＤＮＡとサブテロメアＤＮＡの両方の長さを測定するのに対し、Ｑ−ＦＩＳＨは、テロメアＤＮＡのみを測定することに留意されたい。これにより、Ｑ−ＦＩＳＨとＴＲＦの間の結果の違いが説明される）。（ｇ）（ｉ）１細胞当たりの平均総テロメアプローブ蛍光を定量化するためにＱ−ＦＩＳＨを用いて測定した場合のテロメア長に対する供給業者から受領した後のＭＲＣ−５細胞の累積細胞集団倍加の標準曲線。累積細胞集団倍加は、テロメア長に直線的に比例する。（ｇ）（ｉｉ）ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを用いて４８時間の間隔で３回処置したＭＲＣ−５細胞の１細胞当たりの平均テロメア長の定量化。Ｑ−ＦＩＳＨを用いた測定。
【図４ｇ】ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡによる処置は、ＭＲＣ−５細胞内のテロメアを迅速に伸長させる。（ａ）本研究で用いた処置及びアッセイスケジュール。処置は５時間継続した。（ｂ）ＴＲＦサザンブロット（挿入図）及びその定量化の図。化学発光信号は、テロメア長の単位当たりのプローブ数を考慮して標準化した。次に、各ゲルレーンのピクセル行それぞれの平均強度をテロメア長に対してプロットした（各処置の生物学的反復実験数ｎ＝３）。（ｃ）図４ｂのテロメア長分布の平均。ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置した細胞内のテロメアが、無処置またはビヒクルのみで処置した対照よりも有意に長い（Ｐ＜０．０１４）ことがわかる。（ｄ）任意の閾値（４．２ｋｂ）よりも長いテロメアの割合は、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置した細胞のほうが無処置及びビヒクルのみで処置した対照よりも大きい。（ｅ）テロメア長を比較するための定量的ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｑ−ＦＩＳＨ）に用いたＭＲＣ−５線維芽細胞の分裂中期スプレッドの代表的な蛍光顕微鏡写真。テロメアプローブ（発光、斑点）及びＤＮＡ（スムーズシェーディング）を示す。（ｆ）処置細胞及び対照細胞内のテロメア長のＱ−ＦＩＳＨ測定の定量化（各処置の２つの生物学的反復実験それぞれの細胞数ｎ＝１５）。処置細胞における迅速なテロメア伸長を示す（ＴＲＦは、テロメアＤＮＡとサブテロメアＤＮＡの両方の長さを測定するのに対し、Ｑ−ＦＩＳＨは、テロメアＤＮＡのみを測定することに留意されたい。これにより、Ｑ−ＦＩＳＨとＴＲＦの間の結果の違いが説明される）。（ｇ）（ｉ）１細胞当たりの平均総テロメアプローブ蛍光を定量化するためにＱ−ＦＩＳＨを用いて測定した場合のテロメア長に対する供給業者から受領した後のＭＲＣ−５細胞の累積細胞集団倍加の標準曲線。累積細胞集団倍加は、テロメア長に直線的に比例する。（ｇ）（ｉｉ）ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを用いて４８時間の間隔で３回処置したＭＲＣ−５細胞の１細胞当たりの平均テロメア長の定量化。Ｑ−ＦＩＳＨを用いた測定。
【図５ａ】ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡによる短時間の処置は、ＭＲＣ−５細胞の複製能を用量依存的に増加させるが、不死化はしない。（ａ）ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを用いて１回、２回もしくは３回処置した細胞、または３回目に続いて最初の処置から８週間後に追加の処置をした細胞の成長曲線。対照は、処置なし、ビヒクルのみまたはＣＩ  ＴＥＲＴを用いた４回の処置からなる（各処置ともｎ＝３）。（ｂ）ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ及びＴＥＲＣ  ＲＮＡをモル比１：５で用いて処置した細胞の成長曲線（ｎ＝３）。（ｃ）ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで１回、２回または３回処置すると、ＭＲＣ−５細胞に無処置細胞を上回る付加的な複製能が用量依存的に付与される。１回目の処置から４８時間後に送達した２回目及び３回目の処置によって付与された増殖能の漸次的増加は、１回目の処置によって付与された増殖能の増加ほど大きくない。しかしながら、最初の３回の処置から数週間後の追加の４回目の処置では、１回目の処置と同等の付加的な増殖能が付与される。これは、処置によって付与される増殖能の量を最適化するためには、処置のタイミングが重要であることを示している。ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡをＴＥＲＣ  ｍｏｄＲＮＡとともに１：５のモル比で用いた３回の処置では、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ単独による３回の処置よりも増殖能が大きくなる。ビヒクルのみまたはＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡによる処置は、付加的な複製能をもたらさない（ｎ＝３）。
【図５ｂ】ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡによる短時間の処置は、ＭＲＣ−５細胞の複製能を用量依存的に増加させるが、不死化はしない。（ａ）ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを用いて１回、２回もしくは３回処置した細胞、または３回目に続いて最初の処置から８週間後に追加の処置をした細胞の成長曲線。対照は、処置なし、ビヒクルのみまたはＣＩ  ＴＥＲＴを用いた４回の処置からなる（各処置ともｎ＝３）。（ｂ）ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ及びＴＥＲＣ  ＲＮＡをモル比１：５で用いて処置した細胞の成長曲線（ｎ＝３）。（ｃ）ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで１回、２回または３回処置すると、ＭＲＣ−５細胞に無処置細胞を上回る付加的な複製能が用量依存的に付与される。１回目の処置から４８時間後に送達した２回目及び３回目の処置によって付与された増殖能の漸次的増加は、１回目の処置によって付与された増殖能の増加ほど大きくない。しかしながら、最初の３回の処置から数週間後の追加の４回目の処置では、１回目の処置と同等の付加的な増殖能が付与される。これは、処置によって付与される増殖能の量を最適化するためには、処置のタイミングが重要であることを示している。ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡをＴＥＲＣ  ｍｏｄＲＮＡとともに１：５のモル比で用いた３回の処置では、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ単独による３回の処置よりも増殖能が大きくなる。ビヒクルのみまたはＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡによる処置は、付加的な複製能をもたらさない（ｎ＝３）。
【図５ｃ】ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡによる短時間の処置は、ＭＲＣ−５細胞の複製能を用量依存的に増加させるが、不死化はしない。（ａ）ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを用いて１回、２回もしくは３回処置した細胞、または３回目に続いて最初の処置から８週間後に追加の処置をした細胞の成長曲線。対照は、処置なし、ビヒクルのみまたはＣＩ  ＴＥＲＴを用いた４回の処置からなる（各処置ともｎ＝３）。（ｂ）ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ及びＴＥＲＣ  ＲＮＡをモル比１：５で用いて処置した細胞の成長曲線（ｎ＝３）。（ｃ）ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで１回、２回または３回処置すると、ＭＲＣ−５細胞に無処置細胞を上回る付加的な複製能が用量依存的に付与される。１回目の処置から４８時間後に送達した２回目及び３回目の処置によって付与された増殖能の漸次的増加は、１回目の処置によって付与された増殖能の増加ほど大きくない。しかしながら、最初の３回の処置から数週間後の追加の４回目の処置では、１回目の処置と同等の付加的な増殖能が付与される。これは、処置によって付与される増殖能の量を最適化するためには、処置のタイミングが重要であることを示している。ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡをＴＥＲＣ  ｍｏｄＲＮＡとともに１：５のモル比で用いた３回の処置では、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ単独による３回の処置よりも増殖能が大きくなる。ビヒクルのみまたはＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡによる処置は、付加的な複製能をもたらさない（ｎ＝３）。
【図６】核ＧＦＰ（ｎＧＦＰ）をコードするｍｏｄＲＮＡで処置したＭＲＣ−５細胞のトランスフェクション効率の高さ。（ａ）無処置細胞の平均から３以上のＳＤである蛍光を有する細胞の割合（ｎ＝１００００）。（ｂ）平均蛍光（ｎ＝１００００）。（ｃ）トランスフェクトしたＭＲＣ−５細胞におけるｎＧＦＰの蛍光顕微鏡写真。ＤＡＰＩで対比染色。
【図７】テロメラーゼ活性の用量反応。
【図８】ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ処置により、ＭＲＣ−５細胞の細胞膨張が遅くなる。（ａ）血球計算盤上に示されたＰＤ２及びＰＤ５３の無処置細胞の代表的な顕微鏡写真で示すように、初期継代のＭＲＣ−５細胞（左）は、後の継代の細胞（右）より数倍小さい面積である。（ｂ）血球計算盤上（１つの小さな四角が５０ミクロン幅）の目視で測定した場合の直径が２５ミクロンを超えるものを膨潤とした場合、初期（ＰＤ２）及び中期（ＰＤ３５）継代のＭＲＣ−５細胞がわずかな膨潤を示す一方、後期の継代（ＰＤ５３）細胞は極めて多くの部分が膨張する。対照的に、ＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡではなく、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置したＰＤ５３細胞は、ＰＤ４０でわずかな膨張を示した。
【図９】ヒト微小血管真皮内皮細胞（ＨＭＤＥＣ）の成長曲線。
【図１０】ＨＭＤＥＣの細胞数に対するＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ処置の作用。ＣＯ：対照処置、ｈＴＥＲＴ−ＣＩ：触媒不活性ｈＴＥＲＴ、ｈＴＥＲＴ−ＷＴ：野生型ｈＴＥＲＴ。
【図１１】ＨＭＤＥＣの成長に対するＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ処置の作用。ＵＴ：無処置、ＣＯ：対照処置、ＣＩ：触媒不活性ｈＴＥＲＴ、ＷＴ：野生型ｈＴＥＲＴ。
【図１２】ＨＭＤＥＣの老化に対するＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ処置の作用。ＮＴ：無処置、ｈＴＥＲＴ−ＣＩ：触媒不活性ｈＴＥＲＴ、ｈＴＥＲＴ−ＷＴ：野生型ｈＴＥＲＴ。
【図１３】修飾ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ送達後のＴＥＲＴ  タンパク質及びテロメラーゼ活性の増加。（Ａ）修飾ヌクレオチドプソイドウリジン及び５−メチルシチジンを使用して合成した、ＨＢＢの非翻訳領域（ＵＴＲ）及び１５１ｎｔポリＡテールで挟まれたＴＥＲＴの完全長機能型またはＴＥＲＴの触媒不活性（ＣＩ）型のコード配列を有する修飾ｍＲＮＡの概略図。（Ｂ）トランスフェクション２４時間後にフローサイトメトリーで測定した、ＧＦＰをコードする修飾ｍＲＮＡ０．８μｇ／ｍｌで処置した筋芽細胞（ｎ＝２，０００）のトランスフェクション効率は、９５％を上回った（図１６Ａの追加プロット）。（Ｃ）総ＴＥＲＴタンパク質レベルは、定量的ウエスタンブロットで測定した（パネルＣ左、図１７）。ＴＥＲＴまたはＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡのいずれか１μｇ／ｍｌを用いたトランスフェクション２４時間後のＴＥＲＴタンパク質レベルの定量化（ｎ＝３）。各種用量のｍＲＮＡに対応するＴＥＲＴタンパク質の定量化は、フローサイトメトリーによって単一細胞レベルで測定した（ｎ＝１０，０００）（パネルＣ、右）。無処置細胞と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。（Ｄ）修飾ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ１μｇ／ｍｌでトランスフェクトした線維芽細胞及び筋芽細胞におけるテロメラーゼ活性の検出。テロメア反復増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）を用いて測定。矢印は、ＰＣＲ効率の内部対照を示す。
【図１４】修飾ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）送達後のテロメア長及び増殖能の増加。（Ａ）無処置線維芽細胞の平均テロメア長は、ＭＭｑＰＣＲ及びＳｐｅｃｔｒａＣｅｌｌで測定した場合、培地中で経時的に減少した（相関係数０．９７、Ｐ＜０．００１）。実験は技術的反復実験をそれぞれ４回にして２回繰り返した。（Ｂ）１μｇ／ｍｌのＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ、ＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡまたはビヒクルのみを４８時間の間隔で１回、２回または３回連続してトランスフェクトした線維芽細胞における平均テロメア長。実験は技術的反復実験をそれぞれ４回にして２回繰り返した。ビヒクルのみで処置した細胞と比較して＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｃ）（Ｂ）と同様に処置した筋芽細胞における平均テロメア長。実験は技術的反復実験をそれぞれ４回にして２回繰り返した。ビヒクルのみで処置した細胞と比較して＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｄ）（Ｂ）と同様に処置した線維芽細胞の成長曲線。緑色の矢印は処置時を示す。成長曲線は、３試験で培養した各集団で２回繰り返した。複製能は、用量依存的に増加した（右パネル）。ビヒクルのみで処置した細胞と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｅ）（Ｂ）と同様に処置した筋芽細胞の増殖能（緑色の矢印）。成長曲線は、３試験で培養した各集団で２回繰り返した。すべてのデータは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．で表す。
【図１５】修飾ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ送達後の老化関連マーカの一過的減少。（Ａ）４８時間の間隔で３回連続した修飾ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡトランスフェクション（緑色の矢印）後のβ−ｇａｌ発現線維芽細胞の定量化。無処置、ビヒクルのみ及びＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ処置集団からなる対照細胞は、ＰＤ５３で増大が停止し、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ処置集団はＰＤ８０で増大が停止した。各実験は、１試料当たり５０個を超える細胞（手作業で評価）で２回実施した。β−ｇａｌ染色ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置した線維芽細胞のＰＤ５３（上）及びＰＤ８０（下）の代表的画像を示す。スケールバーの長さは２００ミクロンである。（Ｂ）（Ａ）と同様に処置した筋芽細胞におけるβ−ｇａｌ発現の定量化。対照は（Ａ）と同様である。対照及びＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ処置集団は、それぞれＰＤ８及びＰＤ１１で増大を停止した。各実験は、１試料当たり５０個を超える細胞（手作業で評価）で２回実施した。ＰＤ２の筋芽細胞（上）及びＰＤ１１のＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置した筋芽細胞（下）の代表的画像を示す。（Ｃ）修飾ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡで３回トランスフェクトした線維芽細胞における複製老化に関連した肥大化細胞の定量化。集団の停滞期は、（Ａ）と同様である。対照は、ビヒクルのみとＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ処置である。各実験は、１試料当たり５０個を超える細胞（手作業で評価）で２回実施した。無処置線維芽細胞のＰＤ２（上）及びＰＤ５３（下）の代表的画像を示す。すべてのデータは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．で表す。スケールバーの長さは２００ミクロンである。
【図１６】修飾ｍＲＮＡのヒト筋芽細胞へのトランスフェクション効率の高さ。（Ａ、Ｂ）ＧＦＰをコードする修飾ｍＲＮＡを０．１〜０．８μｇ／ｍｌでトランスフェクトしたＧＦＰ蛍光性筋芽細胞（ｎ＝２０００）の定量化。処置開始から２４時間後にフローサイトメトリーによって測定。（Ｃ）用量増加に対する修飾ＧＦＰ  ｍＲＮＡトランスフェクト筋芽細胞の平均蛍光。（Ｄ）１μｇ／ｍｌのＴＥＲＴまたはＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡによるトランスフェクションから２４時間後の線維芽細胞における外因性ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡの定量化。ＲＴ−ｑＰＣＲを用いた測定。ＴＥＲＴとＣＩ  ＴＥＲＴの比は、ＲＰＬ３７Ａ及びＧＡＰＤＨを参照遺伝子として、Ｐｆａｆｆｌ法を用いて算出した（ｎ＝３）。（Ｅ）１μｇ／ｍｌのＴＥＲＴまたはＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡによるトランスフェクションから２４時間後の線維芽細胞における内因性ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡの定量化。ｑＰＣＲを用いて測定し、（Ｄ）と同様に算出。すべてのデータは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．で表す。
【図１７】修飾ｍＲＮＡ送達後のＴＥＲＴの発現。ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ１μｇ／ｍｌによる処置の開始から２４時間後に採取した線維芽細胞におけるＴＥＲＴタンパク質発現を、多重赤外線ウエスタンブロットによって測定した。総タンパク質の連続希釈を使用して、対照に対するＴＥＲＴタンパク質の相対量を比較するために標準曲線を作成した。ここで用いたＴＥＲＴ抗体の特異性は、広範囲に試験されている（Ｗｕ，２００６）。
【図１８】１０ｕｌの細胞懸濁液とＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを含む１ｍｍキュベット中、２００Ｖ、２５ｕＦ、１０００Ｏｈｍの設定でＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを用いてエレクトロポレーションを行った単核球におけるテロメラーゼ活性の増加を示すＴＲＡＰゲル。熱処理した試料レーンには、ラダーの４番目の横棒の強いバンドで示されるように、本方法のプライマーダイマー人工産物が含まれる。
【図１９】ＧＦＰをコードするｍｏｄＲＮＡを用いたエレクトロポレーション後の単核球蛍光の顕微鏡画像。
【図２０】ＧＦＰ  ｍｏｄＲＮＡのヒト白血球（単核球）へのエレクトロポレーションは、高いトランスフェクション効率をもたらす。
【図２１】ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡの用量を増加させてエレクトロポレーションを実施した線維芽細胞におけるテロメラーゼ活性の増加を示すＴＲＡＰアッセイのゲル画像。
【図２２】ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて活性化し、ＧＦＰ  ｍｏｄＲＮＡを用いてエレクトロポレーションを実施したＣＤ８＋Ｔ細胞がＧＦＰ活性を発現することを示す蛍光顕微鏡写真。黒い点は、ＣＤ３／ＣＤ２８被覆ビーズである。
【図２３】ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを用いたヒト表皮角化細胞のエレクトロポレーションにより、テロメラーゼ活性の発現がもたらされる。
【図２４】げっ歯類へのインビボ送達後のルシフェラーゼｍｏｄＲＮＡの発現。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
テロメアは、染色体の末端にあるＤＮＡ配列であり、染色体の末端を保護しているが、時間の経過とともに短くなる。危機的に短いテロメアは、細胞の正しい機能の停止または死をもたらし得る。また、危機的に短いテロメアでは、染色体融合が生じ、癌に至ることもある。個別に診断された疾患がない場合であっても、短テロメアは、加齢による心身機能及び外見の緩やかな減退に関与している。
【００４６】
しかしながら、テロメア短縮は、同時に、癌、たとえば、正常細胞よりも早い増殖をもたらす変異を細胞が取得する状態に対して、保護的役割を担い得る。この場合、テロメア短縮は、細胞の無限増殖及び癌の発生を防ぐ。したがって、テロメアを継続的に伸長させることは、必ずしも有益ではない。
【００４７】
哺乳類のテロメアは、ＴＴＡＧＧＧの配列が直列に繰り返されており、鳥類、爬虫類及び魚類などの他の動物では、繰返し配列が異なる。これらの動物種別のすべてにおいて、テロメアは、多くのキロベース（ｋｂ）で二本鎖になっている。平均テロメア長は、表１に示す通り、種によって異なる。
【表１】
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【００４８】
ヒトにおけるテロメアの長さは、誕生前は１５〜２０ｋｂから出発し、誕生時は１２〜１５ｋｂである。テロメアは、幼少期に急速に短くなり、成人期では毎年平均０〜１００ｂｐ程度短くなる。この割合は、細胞種、精神的ストレスまたは酸化ストレスへの曝露及び他の要因に応じて異なる。
【００４９】
テロメアは、染色体の末端を保護するテロメア複合体の一部である。さらに、テロメア複合体は、総称してシェルタリンと呼ばれる一連のタンパク質からなる。テロメア複合体タンパク質には、ＰＯＴ１、ＴＰＰ１、ＡＴＭ、ＤＡＴ、ＴＲＦ１、ＴＲＦ２、Ｒａｐ１、Ｒｉｆ１、ＴＩＮ２、ＮＢＳ、ＭＲＥ１７及びＲＡＤ５０ならびに異なる哺乳類ではこれらのホモログが挙げられる（Ｐｏｄｌｅｖｓｋｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ（２０１２）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．７３０：３−１１）。多くの種において、テロメアは、３’が突出した一本鎖の末端となっており、その部分が二本鎖領域へ入り込み、テロメア複合体タンパク質とともに、テロメア複合体内でループを形成している。
【００５０】
テロメアは、酸化損傷及び姉妹染色分体交換によって、また、有糸分裂の際に染色体の末端が完全に複製されないという末端複製問題によって、時間の経過とともに短くなる。テロメアが危機的に短くなると、テロメア複合体はそれ以上染色体末端を保護することができなくなり、染色体末端が「キャップの外れた」状態になる。染色体末端のキャップが外れると、染色体と染色体の融合が生じ得、癌の原因となる場合がある（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ａｎｄ  Ｋａｒｌｓｅｄｅｒ（２０１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：１７１−１８１；Ｃａｌａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｌｅｕｋｅｍｉａ２６：７００−７０７；Ａｒｔａｎｄｉ  ａｎｄ  ＤｅＰｉｎｈｏ（２０１０）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ３１：９−１８）。また、キャップが外れると、その染色体末端が損傷ＤＮＡとみなされ、ＤＮＡ損傷反応が活性化し、細胞のアポトーシスまたは老化の引き金となる。老化は、生存可能な状態を維持するものの、細胞がそれ以上分裂しない停止状態であり、老化細胞は、一般的に、老化前の正常かつ有益な機能の実施を適切にまたは完全に停止する。したがって、テロメア短縮は、老化細胞の累積及びアポトーシスによる細胞の損失を原因の一端として、組織障害、身体能力及び若々しい外見の損失、知的能力の損失ならびに疾患を招く。事実、短テロメアを有する高齢者は、心筋梗塞（２００％）（ｖｏｎ  Ｚｇｌｉｎｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ；ａ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ８０：１７３９−１７４７）、血管性認知症（２００％）（Ｔｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２８：１３８８−１３９４）、合併症を伴う糖尿病（４００％）（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ３：３９４−４０２）、癌（Ｓｔｅｒｎ  ａｎｄ  Ｂｒｙａｎ（２００８）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１２２：２４３−２５４）、脳卒中、アルツハイマー病、感染症（７５０％）、特発性肺線維症及び他の疾患を発症する可能性が約２００〜７５０％高い。１つの組織内に短テロメアがある人は、他の組織の大部分でも短テロメアがある可能性がある。このため、短テロメアは、ある個人における多くの疾患のリスク上昇と相関関係がある（Ｔａｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｇｅｒｉａｔｒ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ  Ｉｎｔ．１０  Ｓｕｐｐｌ１：Ｓ１９７−２０６；ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１４４７−０５９４．２０１０．００６０５．ｘ）。短テロメアはまた、細胞の複製能を制限するため、細胞療法及び再生医療の範囲を狭めている。逆に言えば、ウイルスによる遺伝子工学法を用いて、短テロメアを有するマウスのテロメア長を増やすと、皮膚の厚み及び弾力、肝機能ならびに嗅覚を含めた複数のパラメータでマウスが若返る（Ｊａｓｋｅｌｉｏｆｆ（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ４６９：１０２−１０７）。
【００５１】
テロメラーゼがテロメアを伸長させるので、テロメアを伸長させる有用な方法は、細胞内のテロメラーゼ活性レベルを上げることである。表２に列挙する因子及び条件を含めた、細胞内のテロメラーゼ活性を上昇させる多くの因子及び条件が報告されている。
【表２】
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【００５２】
しかしながら、表２の処置例は、望ましくない効果がある。たとえば、成長因子、ホルモンまたはサイトカインを用いた処置は、副作用を生じ、複数のシグナル伝達経路を活性化し、不必要な細胞複製を生じ、免疫反応の引き金となる可能性があり、概して非特異的である。プラスミドまたはウイルスを用いる遺伝子治療は、挿入変異によるゲノム変異のリスク及び癌のリスクを伴う。未修飾ＲＮＡによるトランスフェクションは、強い免疫反応を引き起こし、テロメアの伸長が認められていない。理学的治療は、ゲノムＤＮＡに損傷を与え得る。植物由来小分子による治療は、一部の対象及び細胞のテロメアのみを伸長させるだけで、極めて緩慢なテロメア伸長しかなく、習慣的な送達を必要とし、そのため癌のリスクがあることがわかっている。
【００５３】
ｈＴＥＲＴ及びＴＥＲＣをコードする核酸配列の細胞内発現、ならびにこれらの構成要素の使用は、ヒト疾患の診断、予後及び治療に有用であることが提案されているが（たとえば、米国特許第５，５８３，０１６号及び同６，１６６，１７８号を参照）、迅速かつ一過性であって上記の理由に対して潜在的に安全であるテロメア伸長は、示されていない。Ｓａｅｂｅ−Ｌａｒｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２５９：１９１−２０３によれば、ｈＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡを用いた樹状細胞のトランスフェクションでは、当該細胞がテロメラーゼ活性を取得したが、この標準的なｍＲＮＡを用いたトランスフェクションでは、テロメア伸長よりもｈＴＥＲＴ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答が強く引き起こされたことが報告された。
【００５４】
さらに、すべての既存の小分子治療は、主に、テロメラーゼの触媒要素であり、翻訳後に大きな調節を受けるＴＥＲＴを介して作用するために、既存処置の効果を細胞のごく一部に限定するものであり、幹細胞及び前駆細胞などの中間期またはＧ０期にある細胞を除いて（Ｃｉｆｕｅｎｔｅｓ−Ｒｏｊａｓ  ａｎｄ  Ｓｈｉｐｐｅｎ（２０１２）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．７３０：２０−２７；ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｒｆｍｍｍ．２０１１．１０．００３；Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ６６：４０７−４２５）、概ね効果がなく、緩慢である（Ｈａｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１４：４５−５６）。この調節は、一部には、テロメラーゼ複合体の構成要素、テロメア複合体及び他の分子の間の相互作用によってもたらされている。たとえば、ＴＥＲＴは、複数のキナーゼ及びホスファターゼによって複数の部位でリン酸化または脱リン酸化され、いくつかの部位では、リン酸化反応によりテロメラーゼ活性が高められるが（たとえば、Ａｋｔによるリン酸化反応）、他の部位では、リン酸化反応によりテロメラーゼ活性が減少する（たとえば、Ｓｒｃ１またはｃＡｂ１によるリン酸化反応）。さらに、ＴＥＲＴは、特定の部位でユビキチン化または脱ユビキチン化される。ＴＥＲＴはまた、ＴＥＲＴの特定の部位で他のタンパク質と相互作用し、ＴＥＲＴの不活性化（たとえば、Ｐｉｎｘ１もしくはｃＡｂ１との相互作用）、またはＴＥＲＴの染色体からの輸送（たとえば、ＣＲＭ１及びＰｉｎｘ１との相互作用）が起こり得、テロメア伸長が回避されたり、鈍化が生じる。その上、一部のタンパク質がテロメアまたはテロメア複合体に結合し、ＴＥＲＴをブロックして（たとえば、ＰＯＴ１）、テロメア伸長を回避する。さらに、一部のタンパク質、たとえば、ヘリカーゼ及びＵＰＦ１は、テロメア伸長を間接的に促進する。調節機構に起因して、テロメラーゼ活性が細胞周期のＳ期中に最大になるため、迅速に分裂する細胞は、テロメラーゼ活性を上昇させる処置からより利益を得られる傾向がある。しかしながら、細胞を緩慢な分裂状態または非分裂状態に保持することが望ましいことも多く、たとえば、幹細胞または前駆細胞は、多くの場合、ゆっくり分裂するため、その時間の大部分を中間期またはＧ０期で過ごし得る。したがって、既存の処置は、概してほとんどの細胞種、ならびに中間期及びＧ０期のすべての細胞種では、緩慢であり、かつ効果がない。緩慢な処置は、長期間の処置を必要するので、安全性が低い。テロメア短縮は、暴走した細胞増殖、たとえば癌における細胞増殖に対して、保護安全機構を提供するため、テロメアを迅速に伸長させる処置が、短時間かつ低頻度で行うことができ、したがって正常なテロメア短縮安全機構を多くの時間有効な状態に維持することができるので、概してより安全である。したがって、短時間の処置中にテロメラーゼ調節を一過的に抑制し、テロメアを迅速に伸長させられる方法が求められている。
【００５５】
ＴＥＲＴは、表３に列挙するものを含め、数百の遺伝子を調節する。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【００５６】
多くの場合、表３の遺伝子または経路の調節は、細胞に不必要な変化をもたらし得るので、望ましくない。たとえば、ＴＥＲＴは、エピジェネティック制御因子を活性化し、細胞表現型を変更したり、治療目的のための細胞の再プログラムまたは分化転換への作用を阻害し得る。ＴＥＲＴは、成長促進因子を活性化するが、増殖が望ましくない場合も多い。たとえば、再生可能性の最も高い幹細胞は、多くの場合、ゆっくり分裂する細胞である。ＴＥＲＴは、細胞運命及び分化を調節し、特定の細胞種への細胞分化作用を阻害し得る。ＴＥＲＴはまた、癌原遺伝子を活性化し、癌を引き起こし得る。したがって、ＴＥＲＴを用いてテロメアを伸長させるあらゆる処置を含めて、ＴＥＲＴレベルを人工的に上昇させる間の時間数を最小限に抑えることが望ましい。したがって、テロメラーゼ活性レベルを一過的にのみ上昇させることでテロメアを伸長させる処置が必要である。
【００５７】
いくつかの細胞種では、ＴＥＲＴが他の遺伝子の発現に影響を与えることがわかっており（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１９９０４−１９９０８；Ｐｅｒｒａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３５：９２５−９３６）、場合によっては望ましくないこともある。そのため、ＴＥＲＴレベルを上昇させる間の時間数を最小限に抑える処置が必要である。
化合物
【００５８】
本発明は、一態様では、細胞内における外因性テロメラーゼの一過性発現のための新規化合物を提供することによって、これらの問題に対処するものである。当該化合物は、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含有し、かつテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードする合成リボ核酸を含み、当該化合物で処置した細胞内でテロメアが伸長するものである。
合成リボ核酸
【００５９】
本発明の種々の態様に係るＴＥＲＴの一過性発現にて使用されるリボ核酸は、ＴＥＲＴタンパク質をコードするリボ核酸を含む。リボ核酸は、一般に、細胞内でのリボ核酸の発現及び／または安定性に影響を与える配列をさらに含む。たとえば、図１ａに示すように、リボ核酸は、５’キャップならびにコード配列の５’及び／または３’側に非翻訳領域（ＵＴＲ）を有し得る。リボ核酸は、ポリＡテールなどの３’テールをさらに有し得る。ポリＡテールは、たとえば、リボ核酸の安定性を高め得る。いくつかの実施形態において、ポリＡテールは、少なくとも７５個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、１２５個のヌクレオチド、１５０個のヌクレオチドまたはさらに長いヌクレオチドである。
【００６０】
いくつかの実施形態において、リボ核酸の５’キャップは、非免疫原性のキャップである。いくつかの実施形態において、５’キャップは、リボ核酸の翻訳を増加し得る。いくつかの実施形態において、５’キャップは、ホスファターゼで処理して、リボ核酸の本来の免疫原性を調節してもよい。いくつかの実施形態において、５’キャップは、３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  ＲＮＡキャップ構造アナログなどの非逆方向キャップアナログ（「ＡＲＣＡ」）である。
【００６１】
当該技術分野にてよく知られているように、上記の特徴または他の特徴は、リボ核酸がコードするＴＥＲＴタンパク質の翻訳を増加し得、リボ核酸自体の安定性を改善し得、またはこの両方を可能にし得る。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、非常に安定なｍＲＮＡ及び／または迅速に翻訳されるｍＲＮＡ、たとえば、α−グロビンもしくはβ−グロビン、ｃ−ｆｏｓまたはタバコエッチ病ウイルスなどのｍＲＮＡを有する遺伝子に由来する。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、異なる遺伝子に由来するか、または当該組成物を送達しようとする種とは異なる種に由来する。ＵＴＲはまた、異なる遺伝子のｍＲＮＡから得たＵＴＲの部分の集合体であってよい。この場合、これらの部分は、安定性と翻訳効率の一定の組み合わせを達成するように選択される。
【００６２】
本発明のリボ核酸は、好ましくは、ヌクレオシド修飾ＲＮＡ（「ｍｏｄＲＮＡ」）である。真核細胞内のほとんどの成熟ＲＮＡ分子は、標準的な未修飾ＲＮＡヌクレオシドのアデニン、シチジン、グアノシン及びウリジンの修飾型であるヌクレオシドを含む。こうした修飾により、ＲＮＡが外来ＲＮＡとして認識されるのを防ぐことができる（Ｋａｒｉｋo  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２３：１６５−１７５）。特定のヌクレオシドを用いて作製した合成ＲＮＡ分子は、未修飾ＲＮＡよりも免疫原性がはるかに低い。免疫原性は、合成ｍｏｄＲＮＡを精製することによって、たとえば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して精製することで、さらに低減することができる。修飾ヌクレオシドは、たとえば、表４に示すヌクレオシドから選択することができる。ヌクレオシドは、いくつかの実施形態において、プソイドウリジン、２−チオウリジンまたは５−メチルシチジンである。いくつかの状況において、ある程度の免疫原性を保持する修飾ＲＮＡが望ましい場合がある。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【００６３】
理論に束縛されるものではないが、修飾ヌクレオシドが存在することで、ｍｏｄＲＮＡが、Ｔｏｌｌ様受容体及びＲＩＧ−１を含む各種受容体によってもたらされる免疫反応の活性化を受けないようにすることができる。マウスでは非免疫原性ｍｏｄＲＮＡが局所送達を介した治療薬として使用されている（Ｋｏｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２９：１５４−１５７）。ヌクレオチド修飾ｍＲＮＡの発見により、ＲＮＡまたはその変異体をコードする治療用タンパク質の送達、及び細胞内における当該タンパク質の発現が容易になる。
【００６４】
したがって、いくつかの実施形態において、本組成物リボ核酸は、プソイドウリジン、２−チオウリジン、５−メチルシチジンまたは表４のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、リボ核酸は、２つ以上の上記のヌクレオシドまたは上記のヌクレオシドの組み合わせを含む。極めて好ましい実施形態において、リボ核酸は、プソイドウリジン及び５−メチルシチジンを含む。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ｍｏｄＲＮＡに対する免疫反応が望ましい場合があり、最適レベルの先天性免疫を誘発するようにＲＮＡを修飾してよい。他の実施形態において、ｍｏｄＲＮＡに対する免疫反応が望ましくない場合があり、こうした反応を最小限に抑えるためにＲＮＡを修飾してよい。ＲＮＡはいずれの場合でも修飾され得る。
【００６６】
本発明のリボ核酸は、好ましくは合成リボ核酸である。「合成」という用語は、本明細書で使用する場合、リボ核酸が、いくつかの実施形態において、分子生物学用器具を使用して人の指揮下で、たとえば以下に記載されるように作製されることを意味する。合成リボ核酸は、たとえば、細胞抽出物または精製酵素及び核酸テンプレートを使用してインビトロ合成によって作製され得る。合成リボ核酸は、いくつかの実施形態において、部分的にまたは完全に化学合成によって作製され得る。代替としてまたは加えて、合成リボ核酸は、いくつかの実施形態において、細胞内の工学的発現、細胞の破壊及びリボ核酸の少なくとも部分的な精製によって作製され得る。一方、天然リボ核酸は、抽出も精製もなく、未改質細胞で発現されるので、合成リボ核酸は、天然リボ核酸ではない。
【００６７】
本発明のリボ核酸は、当業者であれば理解するであろう種々の標準的な技術を使用して作製してもよい。いくつかの実施形態において、たとえば、米国特許出願公開第２００９／０２８６８５２号及び同２０１１／０１４３３９７号に記載されているようなインビトロ合成でリボ核酸を作製してもよい。いくつかの実施形態において、化学合成によってリボ核酸を作製してもよい。いくつかの実施形態において、インビトロ合成と化学合成との組み合わせによってリボ核酸を作製してもよい。上記の通り、「合成」という用語は、化学合成、インビトロ合成、インビボ発現及び少なくとも部分的な精製、またはこれらの方法もしくは他の方法、化学的方法もしくは分子生物学的方法の組み合わせのいずれかによって作製されるリボ核酸を包含するように理解されるべきである。
【００６８】
本発明のリボ核酸は、いくつかの実施形態において、精製され得る。上記のように、精製により、リボ核酸の免疫原性が低減し得、ある場合には有利であり得る。米国特許出願公開第２０１１／０１４３３９７号も参照されたい。好ましい実施形態において、リボ核酸は、ＨＰＬＣまたはアフィニティーキャプチャー及び溶出により精製される。
【００６９】
ＴＥＲＴのタンパク質構造は、保存ドメイン及び非構造化リンカー領域を含むアミノ末端の長い伸長部（Ｎ末端伸長部、ＮＴＥ）と、７つの保存ＲＴモチーフを含む一次配列の中間にある触媒逆転写酵素ドメインと、カルボキシル末端の短い伸長部（Ｃ末端伸長部、ＣＴＥ）の少なくとも３つの個別ドメインを含む（Ａｕｔｅｘｉｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｅ（２００６）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７５：４９３−５１７）。いくつかの実施形態において、本発明のリボ核酸は、完全長ＴＥＲＴをコードする。いくつかの実施形態において、リボ核酸は、ＴＥＲＴの触媒逆転写酵素ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、リボ核酸は、ＴＥＲＴ活性を有するポリペプチドをコードする。
【００７０】
本開示のリボ核酸がコードするＴＥＲＴは、好ましくは、哺乳類、鳥類、爬虫類または魚類のＴＥＲＴである。より好ましくは、ＴＥＲＴは、ヒトＴＥＲＴなどの哺乳類のＴＥＲＴである（Ｍｅｙｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ９０：７８５−７９５；Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７：９５５−９５９；Ｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ２３２：９７−１０６）。２つのヒトＴＥＲＴアイソフォームのアミノ酸配列がＮＣＢＩのリファレンス配列（ＮＰ＿９３７９８３．２及びＮＰ＿００１１８０３０５．１）として入手可能である。本組成物のリボ核酸が有用にコードする他の非限定的な例示的アミノ酸配列には、ネコ（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＸＰ＿００３９８１６３６．１）、イヌ（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＰ＿００１０２６８００．１）、マウス（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＰ＿０３３３８０．１）、ウシ（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＰ＿００１０３９７０７．１）、ヒツジ（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＸＰ＿００４０１７２２０．１）、ブタ（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＰ＿００１２３１２２９．１）、アフリカゾウ（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＸＰ＿００３４０８１９１．１）、ニワトリ（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＰ＿００１０２６１７８．１）、ラット（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＰ＿４４５８７５．１）、ゼブラフィッシュ（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＰ＿００１０７７３３５．１）、メダカ（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＰ＿００１０９８２８６．１）及びチンパンジー（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＸＰ＿００３９５０５４３．１及びＸＰ＿００３９５０５４４．１）由来のＴＥＲＴが挙げられる。
【００７１】
本発明のリボ核酸は、上記で列挙したアミノ酸配列のいずれかの変異体、特に欠失変異体を含めたテロメラーゼ触媒活性を保持する変異体をコードし得ることを理解すべきである。いくつかの実施形態において、本組成物のリボ核酸は、上記で列挙したアミノ酸配列または当該配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列のうち１つをコードする。いくつかの実施形態において、本組成物の核酸は、上記で列挙したアミノ酸配列または当該配列と少なくとも９８％、９９％、９９．９％またはさらに高い割合の配列同一性を有する配列のうち１つをコードする。
【００７２】
また、本リボ核酸は、上記で列挙したＴＥＲＴタンパク質をコードする天然型遺伝子配列に相当し得るか、または当業者であれば理解するであろう遺伝子コードの冗長に起因して可能となる変異体に相当し得ることを理解すべきである。いくつかの実施形態において、コドン選択は、当業者によって知られているアルゴリズム及び方法を使用して、タンパク質発現を最適化するために最適化され得る（Ｆａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ６：３．）。
組成物
【００７３】
別の態様では、本発明は、細胞内におけるテロメア伸長のための組成物を提供する。当該組成物は、上述した本発明の化合物と、さらなる成分を含む。いくつかの実施形態において、当該組成物は、テロメラーゼＲＮＡ構成要素（ＴＥＲＣ）をさらに含む（以下の表６も参照のこと）。いくつかの実施形態において、当該組成物は、送達担体をさらに含む。
送達担体
【００７４】
今述べたように、本開示の組成物は、リボ核酸のための送達担体をさらに含み得る。送達担体は、場合により、当該組成物のリボ核酸の標的細胞へのターゲティング及び取込みを促進し得る。特に、本開示の組成物は、当該技術分野にて知られている任意の遺伝子送達担体、たとえば、ナノ粒子、リポソーム、遺伝子銃用弾丸粒子、ウイルス、カチオン性脂質、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘなどの市販品または他の担体を含み得る。いくつかの実施形態において、送達担体は、エキソソーム、脂質ナノ粒子、高分子ナノ粒子、天然もしくは人工のリポタンパク質粒子、カチオン性脂質、タンパク質、タンパク質−核酸複合体、リポソーム、ビロソームまたはポリマーである。いくつかの好ましい実施形態において、送達担体は、カチオン性脂質製剤である。しかしながら、ウイルス送達は、挿入変異をもたらし得るため、通常好ましくない。
【００７５】
いくつかの好ましい実施形態において、送達担体は、エキソソーム、脂質ナノ粒子または高分子ナノ粒子である。極めて好ましい実施形態において、送達担体は、エキソソームである。エキソソームは、直径４０〜１００ｎｍの天然脂質二重膜小胞である。エキソソームは、一連の特定タンパク質を含む。これらには、膜タンパク質Ｌａｍｐ−１及びＬａｍｐ−２が挙げられ、特に豊富である（Ｌａｋｈａｌ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ（２０１１）ＢｉｏＥｓｓａｙｓ：Ｎｅｗｓ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ３３：７３７−７４１）。２００７年、エキソソームは、１，３００種類を超えるｍＲＮＡ及び１２１種類の非コードｍｉｃｒｏＲＮＡを含む、ＲＮＡ及びタンパク質の天然キャリアであることが発見された。エキソソームはまた、種間でｍＲＮＡを伝達することができる。ヒト細胞がマウスｍＲＮＡを保持するマウスエキソソームに曝露すると、マウスｍＲＮＡの翻訳がヒト細胞で生じる。
【００７６】
ＲＮＡ、タンパク質またはＤＮＡの送達担体として、エキソソームは、他の代替担体に勝る多数の利点がある。特に、エキソソームは、患者自身の細胞から作製することができるため、非免疫原性にできる。したがって、抗体、補体、凝固因子またはオプソニンによって攻撃されることがない。さらに、エキソソームには、エレクトロポレーションによって核酸を搭載することができ、ヒト細胞間でｍＲＮＡ及びタンパク質を運ぶ天然担体となる。エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質の積荷を輸送の間保護し、その積荷は、直接サイトゾルに送達される。エキソソームは、血流から血管外組織へ溢出し、血液脳関門さえ通過して、ターゲット化され得る。さらに、エキソソームは、非標的臓器、たとえば肝臓などの臓器での蓄積を回避する。したがって、疾患処置における治療用ｍＲＮＡまたは他の積荷を送達するために、エキソソームを細胞由来の「リポソーム」として使用することができる（Ｍｉｚｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ２１：１０１−１０８；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１２．１６１）。エキソソームの細胞へのｍＲＮＡ送達に関する図を図２に示す。ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２９：３２５−３２６も参照されたい。
【００７７】
ほとんどの細胞種がエキソソームを産生することができると考えられており、血液、唾液、尿、脳脊髄液、母乳及び羊水を含む大部分の生物流体中にエキソソームがみられる。エキソソームは、存在量は異なるが、大部分の細胞種によって産生される。Ｔ細胞活性化因子を含まない豊富なエキソソームは、ヒト血液中に存在する未成熟樹状細胞に由来し得る（Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ８２：４８７−４９３）。エキソソームはまた、人工的に、たとえば組換えエキソソームタンパク質と、エキソソーム膜中にみられるような脂質及びリン脂質とを組み合わせることによって作製することもできる。あるいは、リポソームと一部のエキソソーム表面タンパク質のインビトロ自己集合によって、エキソソームを構築することもできる。
【００７８】
エキソソームの薬剤送達の可能性は、２０１１年に最初に実証された（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２９：３４１−３４５）。具体的には、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）由来の２８ａ．ａ標的リガンドを融合させたＬａｍｐ２Ｂ融合タンパク質を発現するように遺伝子操作された樹状細胞からエキソソームが採取され、ｓｉＲＮＡをエキソソームにエレクトロポレーションで挿入し、当該樹状細胞を取得したマウスと免疫適合性のあるマウスにこのエキソソームが注入された。したがって、このエキソソームは自己由来のものであり、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−αのレベルを測定したところ、免疫反応は引き起こされなかった。さらに、１ヶ月を超えた反復投与でも同様の反応が誘発され、適応免疫反応もないことが実証された。
【００７９】
上述の通り、エキソソームは、自己由来であり得、したがって免疫原性が低い。同じくｍｏｄＲＮＡも免疫原性が低いので、リボ核酸であるｍｏｄＲＮＡと、送達担体であるエキソソームとの組み合わせが、本開示の組成物において特に好ましい。したがって、これらの実施形態において、本開示は、ｍＲＮＡまたはｍｏｄＲＮＡをエキソソームを使用して細胞または組織に送達する新しい方法を提供する。こうした送達は、静脈内または局所注入によってエキソソームで送達されたＲＮＡを使用して、細胞内の任意のタンパク質のレベルをインビボで一時的に上昇させるのに有益な方法、特に、ＴＥＲＴをコードするＲＮＡの送達において有益な方法を提供する。したがって、好ましい実施形態において、本組成物の送達担体は、非免疫原性である。しかしながら、いくつかの状況において、ある程度の免疫原性を保持する担体が望ましい場合がある。
追加成分
【００８０】
本明細書にて開示される組成物は、当該組成物の標的細胞への送達を高めるか、細胞内でのテロメア伸長を高めるか、またはこの両方をもたらす追加成分をさらに含み得る。たとえば、当該組成物は、表２の化合物及び条件のうち１つ以上をさらに含み得る。当業者であれば理解するように、活性成分の組み合わせは、所望の活性、たとえば、細胞内における外因性テロメラーゼ活性の一過性発現などの活性に対して相乗効果を呈することが多く、こうした組み合わせも本発明の範囲内であることが理解される。本開示の組成物内に含めることができるタンパク質の追加例を表５に示す。当該組成物が、タンパク質自体、またはこれらのタンパク質もしくは列挙したタンパク質の活性を保持する配列同一性の高いタンパク質をコードする核酸配列（好ましくはＲＮＡもしくはｍｏｄＲＮＡ）を含み得ることを理解すべきである。
【表５−１】
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【表５−２】
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【００８１】
本開示の組成物内に有益に含めることができる因子の他の例を表６に示す。
【表６】
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【００８２】
細胞周期のある段階でＴＥＲＴが最も活発になるため、本開示の組成物はまた、ＴＥＲＴ処置の有効性を高めるために、１つ以上の細胞増殖の一過性活性物質を任意で含み得る。こうした物質には、たとえば、細胞内のＲｂまたはＰ１９／Ａｒｆなどの細胞周期阻害因子の量を一過的に低減させるＲＮＡｉ試薬を挙げることができる。当業者であれば理解するであろう、他の細胞増殖一過性活性物質も本組成物に有益に含めることができる。
テロメア伸長方法及び処置方法
【００８３】
別の態様では、本開示は、上記の化合物または組成物のいずれかを短縮テロメアを有する細胞に投与する工程を含み、当該細胞内でテロメアが伸長する、テロメアを伸長させるための方法を提供する。本開示はまた、上記の化合物または組成物のいずれかを、テロメア伸長を必要とする動物対象またはテロメア伸長の恩恵を受け得る動物対象に投与する工程を含む、処置方法を提供する。
【００８４】
好ましい実施形態において、当該化合物または組成物は、細胞に投与され、当該細胞は、単離細胞であるか、または細胞培養物、分離組織培養物、摘出臓器などの一部である（すなわち、投与がインビトロである）。
【００８５】
他の好ましい実施形態において、当該化合物または組成物は、対象から細胞、組織または臓器を取り出すことなく、投与される（すなわち、投与がインビボである）。これらの実施形態のいくつかにおいて、当該化合物または組成物は、対象体内のすべての細胞またはほとんどすべての細胞に送達される。いくつかの実施形態において、当該化合物または組成物は、対象体内の特定の細胞または組織に送達される。
【００８６】
いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物、鳥、魚または爬虫類動物である。好ましい実施形態において、対象は哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。他の好ましい実施形態において、対象は、愛玩動物、動物園の動物、畜産動物または絶滅危惧種の動物である。好ましい対象種の例を表７に示す。
【表７】
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【００８７】
インビトロ用途では、当該化合物または組成物は、細胞生物学の各分野の当業者であれば理解するであろう、細胞培養、組織培養、臓器培養などの任意の好適な技術を使用して、投与することができる。インビボ用途では、当該化合物または組成物は、注射、局所適用、吸入、または医療技術分野などの当業者であれば理解するであろう任意の他の好適な投与技術を使用して、有益に投与することができる。
【００８８】
上述の通り、本開示の方法に従って有益に処置される細胞には、テロメア伸長の恩恵を受け得る対象内の細胞（インビボ投与の場合）または当該対象由来の細胞（インビトロ投与）のいずれかが挙げられる。ほとんどの動物のほぼすべての細胞種に短テロメアが影響を与えるので、テロメア伸長は多くの動物にとって利益となり得る。一過性かつ短期間のテロメア伸長処置は、上記のように、安全であり得る。したがって、本明細書にて開示する一過性処置を用いたテロメア伸長は、たとえば短テロメアが関与する多くの疾患及び症状の予防もしくは発症遅延のための予防手段として、またはこれらの疾患及び症状のための治療として、すべての個人または大部分の個人にとって有用であり得る。当該処置は、加齢に関連する疾患もしくは症状のリスクがある対象、またはこれらの疾患に既に罹患している対象に利益をもたらし得、また、激しい運動もしくは肉体労働などの身体的外傷もしくは慢性的な身体的ストレス、または心的外傷もしくは慢性的な精神的ストレスはすべてテロメア短縮を招くので、すなわち、身体的ストレスまたは外傷は、生じた損傷を回復するために細胞分裂を必要とするためにテロメアが短くなり、またこれらの状態は、テロメアを同じく短くさせる酸化ストレスを引き起こし得るので、これらの状態を経験した対象、経験している対象、これらのリスクがある対象に利益をもたらし得る。このような疾患及び症状としては、たとえば、メタボリック症候群、糖尿病、糖尿病性潰瘍、心臓疾患、癌の多数の形態、血管性認知症、アルツハイマー病、脳卒中、加齢関連黄斑変性症、免疫老化、骨髄機能不全、胃腸潰瘍、肝硬変、ヘルニア、免疫機能不全に続く肺炎などの感染症、慢性感染症、中等度または重度の認知障害、運動障害、骨粗鬆症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、加齢関連の不安症、平衡障害、耳鳴り、ベル麻痺、白内障、ＣＯＰＤ、角膜上皮剥離、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、結膜炎、霰粒腫、脱水症、鬱病、肺気腫、各種眼疾患、成長障害、流感、全般性不安障害、緑内障、聴力損失、味覚損失、食欲不振、股関節脱臼、記憶喪失、パーキンソン病、脊椎管狭窄症、尿失禁、脊椎骨折、及びその他が挙げられる。
【００８９】
また、本方法に従って有益に処置される細胞には、加齢に関連する疾病もしくは症状を患っている対象内の細胞もしくは当該対象由来の細胞、またはかかる疾病もしくは症状に罹患するリスクのある対象内の細胞もしくは当該対象由来の細胞も挙げられる。このような加齢に関連する疾病及び症状には、テロメラーゼ複合体またはテロメア複合体の構成要素をコードする遺伝子が突然変異するために短テロメアを引き起こす遺伝子疾患が含まれ得る。かかる疾患には、たとえば、特発性肺線維症、先天性角化不全症及び再生不良性貧血が挙げられる。
【００９０】
したがって、遺伝子疾患の場合、当該組成物は、かかる疾患の影響を受ける遺伝子（たとえば、ＤＫＣ１、ＴＩＮＦ２、ＮＯＰ１０、ＮＨＰ２、ＴＥＲＣまたは他の遺伝子）の正常機能型であるコード配列などの別の核酸をさらに含み得る。かかる遺伝子の例を表８に示す。Ａｒｍａｎｉｏｓ（２００９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４５−６１も参照されたい。
【表８】
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【００９１】
さらに、当該処置は、短テロメアが一因となり得る、たとえば筋ジストロフィーなどの他の種類の遺伝子疾患を患っている対象、またはそのリスクのある対象に利益をもたらし得る。こうした疾患では、遺伝子突然変異によって生じた問題に対処するために細胞複製が必要とされることで、テロメアが通常よりも急速に短くなり、その結果、通常よりも急速なテロメア短縮が生じて、細胞の複製能が消耗し、組織障害、症状の悪化または増加、身体障害及び時には死をもたらす。さらに、本発明の化合物による処置によって、種々の癌を予防または遅延することができる。実際、危機的に短いテロメアによって引き起こされる染色体と染色体の融合が癌の一因であると考えられている。また、癌細胞のテロメアを伸ばさずに、個体の健全な細胞内のテロメアを選択的に伸ばすことができる。これは、本化合物、組成物及び方法を使用して、たとえば、免疫系のテロメアを伸長し、癌に対抗する能力を向上させることで可能となる。さらに、個体から免疫系細胞を採取し、本発明をエクスビボで用いて処置し、続いて個体に再導入してもよい。
【００９２】
いくつかの実施形態において、本方法に従って処置される細胞は、疾患状態がまだ現れていないが、短テロメアの関与する症状もしくは疾患のリスクがある対象、または細胞に短縮したテロメアを含む対象に由来するものである。いくつかの実施形態において、加齢関連疾病は、単なる老化である。本処置はさらに、加齢に関連した皮膚、髪、骨格、姿勢、目の透明度または加齢に伴って衰える他の特性の外見の衰えを予防、遅延または改善するための美容補助としても使用することができる。たとえば、トロメア伸長によって皮膚の弾力性、厚み、滑らかさ及び外見を改善することができるので、これらの特性を維持するのに役立てるために、当該処置を用いることができる。骨折または組織破壊、すなわち切傷もしくは熱傷などの身体的外傷の場合、外傷の治癒に関与する細胞内のテロメアの長さを増やし、その複製能を向上させるために、本発明を用いることができる。テロメア短縮を引き起こす慢性身体的ストレスの場合、本発明による処置で、影響を受けた細胞内のテロメアが伸び、その複製能及び組織損傷の回復能を向上させることができる。たとえば、ｈＴＲまたはｈＴＥＲＴなどのテロメラーゼ構成要素のハプロ不全を有するヒトでは、テロメア短縮が世代を超えて蓄積するので（Ａｒｍａｎｉｏｓ（２００９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４５−６１）、卵子、精子もしくはこれらの前駆体などの生殖細胞、または受精卵もしくは胚子に、たとえば体外受精の工程中に、本開示の処置を適用することができる。当該処置は、種々の疾患または症状の他の治療、たとえばインビボでの細胞の分化転換などを支援するのにも有用であり得る。当該処置法はまた、外科手術または化学療法または放射線治療の前またはその最中に、細胞の複製能を向上させ、これらの処置に起因する損傷を回復するのに有用であり得る。
【００９３】
当該方法はまた、自己由来細胞または異種由来細胞治療、生体工学、組織工学、人工臓器の培養、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の作製、及び細胞の分化、脱分化または分化転換を含めた各種用途のためにインビトロで細胞を処置するのに有用であり得る。これらの用途では、細胞が何度も分裂する必要があり、これによりテロメア長の損失が生じ得るため、当該用途の前、最中または後に本発明によってこの影響を相殺することができる。
【００９４】
さらに、様々な種類の癌を、特に癌細胞が短テロメアを含む場合、加齢関連疾病とみなすことができる。ある場合には、本方法に従って処置される細胞は、疾患状態がまだ現れていないが、細胞に短縮したテロメアを含む対象に由来するものである。いくつかの実施形態において、加齢関連疾病は、単に、ヒトの加齢老化に典型的に関連して変化した形態及び機能である。
【００９５】
本方法に従って本開示の化合物または組成物を有益に投与する細胞は、短縮テロメアの影響を受け得るか、細胞のテロメア伸長によりいずれの形態であれ恩恵を受け得る任意の組織または細胞種に由来する細胞を含む。細胞は、体細胞または生殖細胞のみならず、幹細胞及び他の前駆細胞ならびに／または未分化細胞を含み得る。細胞は、腫瘍細胞及び非腫瘍細胞を含み得る。
【００９６】
本方法に従って化合物または組成物を有益に投与する細胞の例は、内胚葉に主に由来する細胞、外胚葉に主に由来する細胞、及び中胚葉に主に由来する細胞を含む。内胚葉に主に由来する細胞には、たとえば、外分泌上皮細胞及びホルモン分泌細胞が挙げられる。外胚葉に主に由来する細胞には、たとえば、外皮系細胞（たとえば、角質化上皮細胞及び湿性重層バリア上皮細胞）ならびに神経系（たとえば、感覚変換細胞、自律神経細胞、感覚器官及び末梢ニューロン支持細胞、中枢神経系ニューロン及びグリア細胞、ならびにレンズ細胞）が挙げられる。中胚葉に主に由来する細胞には、たとえば、代謝及び貯蔵細胞、バリア機能細胞（たとえば、肺、消化管、外分泌腺及び泌尿生殖管の細胞）、細胞外マトリックス細胞、収縮性細胞、血液及び免疫系細胞、生殖細胞、ナース細胞、ならびに間質細胞が挙げられる。したがって、本方法のいくつかの実施形態において、当該組成物を投与する細胞は、内胚葉、中胚葉または外胚葉系列の体細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、生殖細胞または胚性細胞である。
【００９７】
本方法に従って化合物または組成物を投与し得る細胞の具体例には、たとえば、唾液腺粘液細胞、唾液腺漿液細胞、舌のフォンエブネル腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳の耳道腺細胞、エクリン汗腺暗細胞、エクリン汗腺明細胞、アポクリン汗腺細胞、眼瞼のモル腺細胞、皮脂腺細胞、鼻のボーマン腺細胞、十二指腸のブルンナー腺細胞、精嚢細胞、前立腺細胞、尿道球腺細胞、バルトリン腺細胞、リトレ腺細胞、子宮内膜細胞、気道及び消化管の単離杯細胞、胃壁粘液細胞、胃腺酵素原細胞、胃腺酸分泌細胞、膵腺房細胞、小腸のパネート細胞、肺のＩＩ型肺胞上皮細胞、肺のクララ細胞、下垂体前葉細胞（たとえば、成長ホルモン産生細胞、乳腺刺激ホルモン分泌細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、及び副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞）、下垂体中葉細胞（たとえば、メラノサイト刺激ホルモンを分泌する細胞）、巨細胞性神経分泌細胞（たとえば、オキシトシンまたはバソプレッシンを分泌する細胞）、腸管及び気道細胞（たとえば、セロトニン、エンドルフィン、ソマトスタチン、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、インスリン、グルカゴン、またはボンベシンを分泌する細胞）、甲状腺細胞（たとえば、甲状腺上皮細胞及び傍濾胞細胞）、副甲状腺細胞（たとえば、副甲状腺主細胞及び好酸性細胞）、副腎細胞（たとえば、クロム親和性細胞ならびにミネラルコルチコイド及びグルココルチコイドなどのステロイドホルモンを分泌する細胞）、精巣のライディッヒ細胞、卵胞の内卵胞膜細胞、破裂卵胞の黄体細胞、顆粒膜ルテイン細胞、卵胞膜ルテイン細胞、傍糸球体細胞、腎臓の緻密斑細胞、腎臓の周血管極細胞、腎臓のメサンギウム細胞、表皮角化細胞、表皮基底細胞、手の爪及び足の爪の表皮角化細胞、爪床基底細胞、毛髄質細胞、毛皮質細胞、毛小皮細胞、毛根鞘小皮細胞、ハックスレー層の毛根鞘細胞、ヘンレ層の毛根鞘細胞、外毛根鞘細胞、毛母細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道、及び膣の重層扁平上皮の表面上皮細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道、及び膣の上皮の基底細胞、尿管上皮細胞（たとえば、膀胱及び尿管の表層）、コルチ器の内有毛細胞、コルチ器の外有毛細胞、嗅上皮の基底細胞、低温感受性一次感覚神経細胞、高温感受性一次感覚神経細胞、表皮のメルケル細胞、嗅覚受容神経細胞、痛覚感受性一次感覚神経細胞、眼球網膜の光受容体細胞（たとえば、光受容体桿体細胞、光受容体青感受性錐体細胞、光受容体緑感受性錐体細胞、光受容体赤感受性錐体細胞）、固有受容性一次感覚神経細胞、触覚感受性一次感覚神経細胞、Ｉ型及びＩＩ型頸動脈小体細胞、耳の前庭器のＩ型及びＩＩ型有毛細胞、Ｉ型味蕾細胞、コリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞、ペプチド作動性神経細胞、コルチ器の内柱細胞及び外柱細胞、コルチ器の内支持細胞及び外支持細胞、コルチ器の境界細胞、コルチ器のヘンゼン細胞、前庭器支持細胞、味蕾支持細胞、嗅上皮支持細胞、シュワン細胞、サテライトグリア細胞、消化管グリア細胞、アストロサイト、ニューロン細胞、オリゴデンドロサイト、紡錘形神経細胞、前水晶体上皮細胞、クリスタリン含有水晶体線維細胞、肝細胞、脂肪細胞（たとえば、白色脂肪細胞及び褐色脂肪組織）、肝臓脂肪細胞、腎臓傍細胞、腎臓糸球体足細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレ係蹄細部細胞、腎臓遠位尿細管細胞、腎臓集合尿細管細胞、Ｉ型肺細胞、膵管細胞、平滑筋導管細胞（たとえば、主細胞及び間在細胞）、導管細胞（精嚢、前立腺など）、腸刷子縁細胞（微絨毛を有するもの）、外分泌腺線条導管細胞、胆嚢上皮細胞、精巣輸出管無線毛細胞、精巣上体主細胞、精巣上体基底細胞、エナメル芽上皮細胞、耳の前庭器の半月面上皮細胞、コルチ器歯間上皮細胞、疎性結合組織線維芽細胞、角膜線維芽細胞（角膜実質細胞）、腱線維芽細胞、骨髄細網組織線維芽細胞、他の非上皮性線維芽細胞、周皮細胞、椎間板の髄核細胞、セメント芽細胞／セメント細胞、象牙芽細胞／象牙細胞、硝子軟骨細胞、線維軟骨細胞、弾性軟骨細胞、骨芽細胞／骨細胞、骨前駆細胞、眼の硝子体の硝子質細胞、耳の外リンパ腔の星細胞、肝星細胞（伊東細胞）、膵星細胞、骨格筋細胞（たとえば、赤色骨格筋細胞（遅筋）及び白色骨格筋細胞（速筋））、中間骨格筋細胞、筋紡錘の核袋細胞、筋紡錘の核鎖細胞、筋衛星細胞、心筋細胞（たとえば、固有心筋細胞、結節心筋細胞、プルキンエ線維細胞、平滑筋細胞（各種型）、虹彩の筋上皮細胞、外分泌腺の筋上皮細胞、赤血球、巨核球、単球、結合組織マクロファージ（各種型）、表皮ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、ミクログリア細胞、好中性顆粒球、好酸性顆粒球、好塩基性顆粒、ハイブリドーマ細胞、マスト細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、網状赤血球、血液及び免疫系の幹細胞及び前駆細胞（各種型）、卵原細胞／卵母細胞、精細胞、精母細胞、精原細胞、精子、ナース細胞、卵胞細胞、セルトリ細胞、胸腺上皮細胞、ならびに腎臓間質細胞が挙げられる。
【００９８】
好ましい実施形態において、本方法に従って化合物または組成物を投与する細胞は、体の他の細胞の元となることから、幹細胞または前駆細胞である。別の好ましい実施形態において、処置を行う細胞は、テロメアが他の細胞種よりも急速に短くなる細胞、たとえば、内皮細胞、線維芽細胞、表皮角化細胞、免疫系細胞（甲状腺細胞、副甲状腺細胞及び白血球ならびにこれらの前駆体を含む）、腸細胞、肝臓細胞、粘膜細胞（たとえば食道及び結腸内の細胞）、ならびに歯茎及び歯髄の細胞である。
【００９９】
したがって、いくつかの実施形態において、細胞は、線維芽細胞、表皮角化細胞、内皮細胞、上皮細胞または血液細胞である。
【０１００】
投与工程は、所望するテロメア伸長の量に応じて、１回またはそれ以上行ってよい。本方法のいくつかの実施形態において、細胞は単離細胞であり、投与工程は、９６時間以下、７２時間以下、４８時間以下、３６時間以下、２４時間以下、１８時間以下、１２時間以下、８時間以下、４時間以下、またはさらに短い時間継続する。いくつかの実施形態において、投与工程は、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、またはさらに長い時間継続する。好ましい実施形態において、投与工程は、４８時間以下、９６時間以下、または１週間以下継続する。他の好ましい実施形態において、投与工程は、少なくとも２時間継続する。投与がトランスフェクションによる場合、投与時間は、細胞がトランスフェクション法から回復する時間を含むことを理解すべきである。
【０１０１】
本方法のいくつかの実施形態において、細胞は単離細胞であり、投与工程は、６回以下、５回以下、４回以下、３回以下、２回以下またはさらに１回のみ実施される。いくつかの実施形態において、投与工程は、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、６回以上、またはそれ以上多く実施される。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、投与工程は、テロメアを再伸長させるために比較的短期間にわたって１回または数回実施し、その後、テロメアを再度伸長させる必要が生じるまで長期間実施しない。この周期を無期限に繰り返してよい。このような処置計画により、投与工程と投与工程の間にテロメアが短縮する間隔を設けて、テロメアを定期的に再伸長させることが可能となる。所望に応じて、定期的な処置法をインビボ投与またはインビトロ投与のいずれでも行ってもよい。いくつかの実施形態において、こうした連続の投与工程は、６回以下、５回以下、４回以下、３回以下、２回以下またはさらに１回のみ実施される。いくつかの実施形態において、投与工程は、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、６回以上、またはそれ以上多く実施される。実施される投与工程の回数、及び使用する本発明の化合物または組成物の投与量を変化させることにより、テロメア伸長の達成量を調節することができる。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、細胞を特定の基質、好ましくは弾性基質で培養する工程をさらに含む。かかる基質は、他の基質では生理学的に弾性でない基質に起因して通常生じ得る細胞の不必要な変更を防げることが知られている。ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１２／００９６８２を参照されたい。当該文書は、その全体が参考により本明細書に組み込まれる。弾性基質により、さらに細胞生存率が向上し得る。
【０１０４】
本開示の化合物または組成物の投与は、細胞内においてテロメラーゼ活性の一過性発現をもたらす。活性上昇は、各種アッセイ、たとえば、テロメラーゼ活性の蛍光検出及び定量化を用いる高感度リアルタイムインビトロアッセイを提供するＴｒａｐｅｚｅ（登録商標）ＲＴテロメラーゼ検出キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）などによって容易に測定されるが、他の測定技術も可能である。いくつかの実施形態において、テロメラーゼ活性は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、またはそれ以上増加する。好ましい実施形態において、テロメラーゼ活性は少なくとも５％増加する。
【０１０５】
前述したように、本技術の利点の１つは、処置細胞におけるテロメラーゼ活性の発現が一過性である点である。特に、このような一過性発現は、テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子を細胞のゲノム配列に挿入するか、または標的細胞の遺伝子的素質を永続的に変更して、核酸配列の恒常的活性をもたらす従前の技術とは異なる。
【０１０６】
図３は、本明細書に開示する化合物、組成物及び方法の利点の一部を示している。特に、これらの化合物、組成物及び方法を用いて実現可能なテロメア伸長の速度は、極めて低頻度のＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ送達によるテロメア維持を可能にする。発現したテロメラーゼ活性は、元の状態に切り替わる前に、短期間で迅速にテロメアを伸長させるため、テロメア短縮の抗癌性保護機構は大部分の時間機能したままとなる。処置と処置の間には、通常のテロメラーゼ活性とテロメア短縮が存在し、したがって、制御の効かない増殖を防止するテロメア短縮の抗癌性安全機構を元の状態に維持したまま、短テロメア関連疾患のリスクを低く抑えられる。対照的に、テロメアを伸長させるための最善の既存の小分子治療は、習慣的な送達を必要とするため、慢性的な癌リスクがあり、さらに、テロメア長に対する作用が小さく安定しておらず、患者のおよそ半数では、テロメア長への作用が全く検出されていない。
【０１０７】
したがって、本方法のいくつかの実施形態において、テロメラーゼ逆転写酵素活性の発現、すなわち、テロメラーゼ活性の半減期は、４８時間以下、３６時間以下、２４時間以下、１８時間以下、１２時間以下、８時間以下、４時間以下、またはさらに短い時間継続する。いくつかの実施形態において、テロメラーゼ逆転写酵素活性の発現は、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、またはさらに長い時間継続する。好ましい実施形態において、テロメラーゼ逆転写酵素活性の発現は、４８時間以下継続する。他の好ましい実施形態において、テロメラーゼ逆転写酵素活性の発現は、少なくとも２時間継続する。
【０１０８】
本方法のいくつかの実施形態において、一過性発現は、細胞周期に依存しない。
【０１０９】
上述のように、テロメラーゼ逆転写酵素の一過性発現は、処置細胞において、短縮したテロメアの伸長をもたらす。テロメア長は、当業者であれば理解するであろう、末端制限断片（ＴＲＦ）長分析、ｑＰＣＲ、ＭＭｑＰＣＲ及びＱ−ＦＩＳＨなどの技術を使用して容易に測定できる。Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．５：１５９６−６０７；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１０．１２４を参照されたい。いくつかの実施形態において、本発明により、処置細胞内のテロメア長が少なくとも０．１ｋｂ、少なくとも０．２ｋｂ、少なくとも０．３ｋｂ、少なくとも０．４ｋｂ、少なくとも０．５ｋｂ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、またはそれ以上増加する。
【０１１０】
本化合物、組成物及び方法の利点の１つは、これらの技術によって達成されるテロメア伸長の迅速さである。当該技術により、短期間での処置が可能になるため、正常な保護的テロメア短縮機構が大部分の時間元の状態に維持されるため、安全な処置が可能となる。本明細書にて開示する化合物及び組成物を用いて処置を行うと、絶対ＲＴ−ｑＰＣＲで測定した場合で、１細胞当たり数十または数百というＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡのコピーの送達がもたらされる。これは、テロメラーゼ活性の高い細胞でみられる内因性ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの平均コピー数さえ大幅に超えるものである。通常、かかる細胞は、ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡのコピーが１細胞当たり１未満である（Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：４８１８−４８２５）。したがって、当該処置により、ＴＥＲＴをコードするｍｏｄＲＮＡの多数のコピーが細胞に導入され、迅速なテロメア伸長が生じる。理論に束縛されるものではないが、ＴＥＲＴをコードするｍｏｄＲＮＡの多数のコピーが、本明細書にて開示する化合物、組成物及び方法と同じ程度に迅速に、ＴＥＲＴ及びテロメア伸長の他の方法によるテロメアの伸長を通常であれば阻害する阻害調節機構を一過的に制圧し得る。
【０１１１】
テロメラーゼ逆転写酵素の一過性発現はまた、処置細胞内の複製能も向上させる。複製能の向上は、複製老化に近づきつつある細胞で、当該細胞内の付加的な細胞集団倍加を測定することによって、容易に観察される。老化細胞は、培地継代または血清を用いた処置によって刺激を加えても分裂しない。老化細胞は、多くの場合、ｐＨ依存βガラクトシダーゼ活性、細胞周期阻害因子ｐ５３及びｐ１９の発現、ならびに他の遺伝子発現のパターン変化、ならびに細胞サイズの肥大化をさらに特徴とする。本開示の化合物及び組成物を用いた処置を行わないと、ヒト肺線維芽細胞は概して５０〜６０倍に倍増する。一方、合計で数日間のみ継続する１セット１〜３回の処置を行うと、これらの細胞は、１６〜２８回の付加的な細胞集団倍加を達成する。数週間後に再度処置すると、付加的な増殖能が再び示される。周期的にテロメアを再伸長させるこの断続的な処置手順は、テロメア短縮の割合、細胞分裂の割合及び処置によってもたらされるテロメア伸長の量などの要因に応じて、さらなる回数を、処置と処置の間に間隔を持たせて、適用してもよい。同様に、高齢の個体から得たヒト微小血管真皮内皮細胞では、本組成物を用いた処置を行わないと、細胞集団倍加がたった１〜２回であるのに対し、処置細胞では、３、４回またはそれ以上の細胞集団倍加を達し得る。
【０１１２】
したがって、いくつかの実施形態において、本処置方法では、細胞集団倍加数が少なくとも１、２、４回またはそれ以上の細胞集団倍加数に増加する。いくつかの実施形態において、当該処置方法では、細胞集団倍加数が少なくとも５、１０、１５、２０回またはそれ以上の細胞集団倍加数に増加する。
【０１１３】
本方法のいくつかの実施形態において、本発明の化合物または組成物をエレクトロポレーションによって動物細胞に投与する。特定の実施形態において、本発明の化合物を、送達担体の不存在下で、エレクトロポレーションによって動物細胞に投与する。他の特定の実施形態において、本発明の化合物及びテロメラーゼＲＮＡ構成要素をエレクトロポレーションによって動物細胞に投与する。
キット
【０１１４】
別の態様において、本開示は、哺乳動物細胞においてテロメアを伸長させる際に使用するための、すぐに使用できるキットを提供する。キットは、上記化合物または組成物のいずれかを、使用に関する説明書とともに含む。いくつかの実施形態において、キットは、パッケージ材料をさらに含む。好ましい実施形態において、パッケージ材料は、気密性である。これらの実施形態において、パッケージ材料には、必要に応じて、たとえば、窒素、アルゴンなどの不活性ガスを充填してよい。いくつかの実施形態において、パッケージ材料は、たとえば、密閉アルミ袋などの金属箔容器を含む。このようなパッケージ材料は、当業者によく知られている。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、キットは、乾燥剤、培地、ＲＮａｓｅ阻害剤または他の同様の要素をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、これらの追加要素の２つ以上の組み合わせをさらに含み得る。キットのいくつかの実施形態において、キットの組成物は、滅菌状態である。
さらなる態様
【０１１６】
さらに別の態様において、本発明は、以下の付番した項に係る新規の化合物、組成物、キット及び方法を提供する。
１．テロメアの伸長のための組成物であって、
少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含有し、かつテロメラーゼ逆転写酵素をコードするリボ核酸と、
リボ核酸の送達担体とを含み、
当該組成物で処置した細胞内でテロメアが伸長する、組成物。
２．テロメラーゼ逆転写酵素が、哺乳類、鳥類、爬虫類もしくは魚類のテロメラーゼ逆転写酵素またはテロメラーゼ触媒活性を保持する変異型である、項１に記載の組成物。
３．テロメラーゼ逆転写酵素が、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素である、項２に記載の組成物。
４．リボ核酸が、５’キャップ、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域及びポリＡテールを含む、項１に記載の組成物。
５．ポリＡテールが、リボ核酸の安定性を向上させる、項４に記載の組成物。
６．５’非翻訳領域または３’非翻訳領域が、安定なｍＲＮＡまたは効率的に翻訳されるｍＲＮＡに由来する配列を含む、項４に記載の組成物。
７．５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域が両方とも安定なｍＲＮＡまたは効率的に翻訳されるｍＲＮＡに由来する配列を含む、項４に記載の組成物。
８．５’キャップ、５’非翻訳領域、または３’非翻訳領域が、リボ核酸を安定させるか、リボ核酸の翻訳率を上げるか、リボ核酸の免疫原性を低減する、項４に記載の組成物。９．少なくとも１つの修飾ヌクレオシドが、リボ核酸の免疫原性を低減する、項１に記載の組成物。
１０．リボ核酸が、合成リボ核酸である、項１に記載の組成物。
１１．合成リボ核酸が、精製処理した合成リボ核酸である、項１０に記載の組成物。
１２．合成リボ核酸が、免疫原性成分を除去するために精製される、項１１に記載の組成物。
１３．リボ核酸が、ヒト、ネコ、イヌ、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、アフリカゾウ、ニワトリ、ラット、ゼブラフィッシュ、メダカもしくはチンパンジーのテロメラーゼ逆転写酵素、または当該テロメラーゼ逆転写酵素と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、項１に記載の組成物。
１４．テロメラーゼＲＮＡ構成要素をさらに含む、項１に記載の組成物。
１５．テロメラーゼＲＮＡ構成要素が、哺乳類、鳥類、爬虫類または魚類のテロメラーゼＲＮＡ構成要素である、項１４に記載の組成物。
１６．テロメラーゼＲＮＡ構成要素が、ヒトテロメラーゼＲＮＡ構成要素である、項１５に記載の組成物。
１７．送達担体が、エキソソーム、脂質ナノ粒子、高分子ナノ粒子、天然もしくは人工のリポタンパク質粒子、カチオン性脂質、タンパク質、タンパク質−核酸複合体、リポソーム、ビロソームまたはポリマーである、項１に記載の組成物。
１８．送達担体が、カチオン性脂質である、項１７に記載の組成物。
１９．送達担体が、非免疫原性である、項１に記載の組成物。
２０．項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物を動物細胞に投与する工程を含み、少なくとも１つのテロメアが当該細胞内で伸長する、テロメアを伸長させるための方法。
２１．細胞が、投与工程の前に、少なくとも１つの短縮したテロメアを有する、項２０に記載の方法。
２２．細胞が、加齢関連疾病、加齢関連症状もしくは加齢に伴う機能もしくは外見の減退を患っているか、またはこうしたリスクのある対象に由来する細胞である、項２０に記載の方法。
２３．細胞が、癌、心臓疾患、脳卒中、糖尿病、アルツハイマー病、骨粗鬆症、身体的能力もしくは外見の減退、身体的外傷もしくは慢性的な身体的ストレス、心的外傷もしくは慢性的な精神的ストレスを患っているか、またはこうしたリスクのある対象に由来する細胞である、項２０に記載の方法。
２４．細胞が、内胚葉系列、中胚葉系列もしくは外胚葉系列の体細胞、または生殖細胞または胚性細胞である、項２０に記載の方法。
２５．細胞が、人工多能性幹細胞、または人工多能性幹細胞の作製に使用される細胞である、項２０に記載の方法。
２６．細胞が、分化転換した細胞、または分化転換した細胞の作製に使用される細胞である、項２０に記載の方法。
２７．細胞が単離細胞であり、投与工程が４８時間以下継続する、項２０に記載の方法。２８．細胞が単離細胞であり、投与工程が４回以下実施される、項２０に記載の方法。
２９．細胞が単離細胞であり、方法が細胞内のテロメラーゼ活性を測定する工程をさらに含む、項２０に記載の方法。
３０．投与工程が、細胞内のテロメラーゼ活性を上昇させる、項２９に記載の方法。
３１．テロメラーゼ活性が、少なくとも５％一過的に増加する、項３０に記載の方法。
３２．増加したテロメラーゼ活性の半減期が、４８時間以下継続する、項３０に記載の方法。
３３．細胞が単離細胞であり、方法が細胞内の平均テロメア長を測定する工程をさらに含む、項２０に記載の方法。
３４．平均テロメア長が、少なくとも０．１ｋｂ増加する、項３３に記載の方法。
３５．細胞が単離細胞であり、方法が細胞内の細胞集団倍加能を測定する工程をさらに含む、項２０に記載の方法。
３６．細胞集団倍加能が、少なくとも２５％増加する、項３５に記載の方法。
３７．細胞が、哺乳動物対象に由来する細胞である、項２０に記載の方法。
３８．細胞が、ヒト対象に由来する細胞である、項３７に記載の方法。
３９．細胞が単離細胞である、項２０に記載の方法。
４０．細胞が単離細胞でない、項２０に記載の方法。
４１．項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物と、
当該組成物を使用してテロメアを伸長させるための説明書とを含む、
動物細胞内のテロメアを伸長させるためのキット。
４２．パッケージ材料をさらに含む、項４１に記載のキット。
４３．パッケージ材料が、気密性である、項４２に記載のキット。
４４．パッケージ材料が、金属箔容器を含む、項４２に記載のキット。
４５．乾燥剤をさらに含む、項４１に記載のキット。
４６．培地をさらに含む、項４１に記載のキット。
４７．ＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、項４１に記載のキット。
４８．組成物が滅菌状態である、項４１に記載のキット。
【０１１７】
関連技術分野の当業者には、本明細書に記載する化合物、組成物、方法及びキットに対する他の好適な変更及び翻案が、本発明の範囲またはいずれの実施形態から逸脱することなく、実施され得ることが容易に明らかであろう。本発明を詳細に記載してきたが、本発明は、例示のみを目的として本明細書に記載され、かつ本発明を限定することを意図しない、以下の実施例を参照することによって、より明確に理解されるであろう。
【実施例】
【０１１８】
実施例１  テロメラーゼをコードする修飾ｍＲＮＡを用いたヒト細胞における高効率のテロメア伸長
テロメア長を十分に維持できない疾患、ならびに細胞療法及び生体工学用途のために細胞複製能を向上させる必要性は、テロメア伸長の安全な方法の開発を推し進めるものである（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ（Ｐｈｉｌａ）３：３９４−４０２；Ｃａｌａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｌｅｕｋｅｍｉａ２６：７００−７０７；Ａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ１１３：６５４９−６５５７；Ｍｏｈｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｃ．２０１２．０４．０４７）。ｍＲＮＡがコードするタンパク質の量を治療用途で一過的に上昇させるためのｍＲＮＡ送達は、免疫原性を低くし、かつ安定性を向上させた修飾ヌクレオシドの導入によって実現される（Ｋａｒｉｋo  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２３：１６５−１７５；Ｋａｒｉｋo  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９：ｅｌ４２；ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ６９５）。
【０１１９】
テロメア伸長処置は、治療的に有用であるように、理想的には非免疫原性であり、特異的であり、染色体の不安定性及び癌リスクの上昇をもたらす危機的に短い長さまでテロメアが短縮されるよりも前に開始可能であり（Ｗｅｎｔｚｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．２０：１２３８−１２５０；Ｃａｌａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｌｅｕｋｅｍｉａ２６：７００−７０７；Ａｒｔａｎｄｉ  ａｎｄ  ＤｅＰｉｎｈｏ（２０１０）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ３１：９−１８）、一過的かつ断続的であって、通常の抗癌性テロメア短縮機構をほぼ連続的に機能させ、一部の前駆細胞及び幹細胞集団などの分裂の緩やかな細胞にも効果的であり、非免疫原性担体を使用してインビトロでもインビボでも送達可能であり、限定的であり、テロメアを十分に維持できない疾患を潜在的に改善または予防するために、もしくは細胞療法または生体工学用途に十分な細胞増殖を促進するために必要なだけの付加的細胞分裂を可能とすることが望ましい。既存の処置は、小分子を使用する治療も含め、これらの基準のすべてを満たしていない（Ｈａｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．１４：４５−５６）。ＴＥＲＴのウイルス送達は、おそらく誘導性ではあるが、挿入変異のリスクがあるため、深刻な安全上の問題がある。危機的に短いテロメアと、結果として生じる染色体の不安定性（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ａｎｄ  Ｋａｒｌｓｅｄｅｒ（２０１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：１７１−１８１）または他の原因のいずれかに起因する発癌性変異を有する細胞内では、第２の変異または薬剤のいずれかによって恒常的なテロメラーゼ発現が起こり、制限のない増殖を可能にすることで悪性腫瘍を支援する場合があるので、連続的なテロメラーゼの過剰発現を伴う処置は、潜在的に安全でない（Ａｒｔａｎｄｉ  ａｎｄ  ＤｅＰｉｎｈｏ（２０１０）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ３１：９−１８；Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ１４８：８９６−９０７）。
【０１２０】
安全なテロメア伸長の基準は、ＲＮＡ中に存在する特定の天然ヌクレオシドが、細胞に送達される際の安定性を高め、外因性ＲＮＡの免疫原性を低減するという近年の発見によって可能となった、ＲＮＡを用いた方法によって満たされる（Ｋａｒｉｋo  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２３：１６５−１７５）。かかるヌクレオシドの例を表４に示す。理論に束縛されるものではないが、これらの標準型ヌクレオシドの修飾型により、先天性免疫系のＴｏｌｌ様受容体は内因性ｍｏｄＲＮＡとこれらのヌクレオチドを含有しない外来性ＲＮＡとを区別し得る。これらの非標準型ヌクレオシドを含有する、十分に精製された合成ｍｏｄＲＮＡの細胞への送達は、ｍｏｄＲＮＡの安定性を高め、免疫反応を低減または阻止しつつ、ｍｏｄＲＮＡのコードするタンパク質を一過的に上昇させる（Ｋａｒｉｋo  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９：ｅｌ４２；ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ６９５）。したがって、外因性ｍｏｄＲＮＡの送達は、一過的なタンパク質産生を必要とする用途に対して、前例のない機会を提供する。たとえば、生体模倣ｍｏｄＲＮＡを線維芽細胞にトランスフェクトし、これにより当該細胞の多能性幹細胞へのリプログラミングが行われている（Ｙａｋｕｂｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３９４：１８９−１９３）。また、マウスに生体模倣ｍｏｄＲＮＡを注入することで、肺サーファクタントタンパク質欠損モデルが回復し、エリスロポエチン及びヘマトクリット値が上昇している（Ｋｏｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：１５４−１５７）。上述の通り、本明細書で使用されるｍｏｄＲＮＡに用いられるヌクレオシドは、安定性の向上だけでなく、ＲＮＡの免疫原性を低減または阻害し、翻訳効率を上昇させることからも選択された。ｈＴＥＲＴをコードする未修飾ｍＲＮＡを使用した樹状細胞のトランスフェクションでは、細胞内でテロメラーゼ活性の上昇がもたらされたが、ｈＴＥＲＴに特異的な強い細胞傷害性Ｔリンパ球反応が引き起こされた（Ｓａｅｂｏｅ−Ｌａｒｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２５９：１９１−２０３）。したがって、未修飾ＲＮＡを用いる手法は、細胞内のテロメアを伸長させるには有効的でないと思われる。
【０１２１】
そのため、ＴＥＲＴタンパク質レベル及びテロメラーゼ活性を一過的に上昇させ、十分にテロメアを伸長させて、限られた量だけ複製能を上昇させるために、ＴＥＲＴをコードするｍｏｄＲＮＡの細胞への送達が用いられ得る。テロメラーゼ活性レベルの上昇は、短時間かつ低頻度のテロメア伸長処置を十分に実現できるほど迅速に生じる（図１ａ及び図３を参照）。
【０１２２】
当該手法を実証するために、標準型ヌクレオシドと、安定性、効率的な翻訳及び免疫原性の低減または阻害を付与する非標準型ヌクレオシドとを各比で用いて、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを合成した（Ｙａｋｕｂｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３９４：１８９−１９３；Ｋａｒｉｋo  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９：ｅｌ４２；ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ６９５）。合成ｍｏｄＲＮＡは、比較的半減期の長いβグロビンｍＲＮＡの５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含む。安定性をさらに高めるために、ｍｏｄＲＮＡは、長い１５１のヌクレオチドポリＡテールを有する。ＲＮＡを作製するためのインビトロ転写反応で用いる長いＴＥＲＴ  ＤＮＡテンプレートの忠実性を最大限にするために、ＰＣＲではなく、プラスミドを用いる方法を使用して、ＤＮＡテンプレートを作製した。
【０１２３】
真のテロメア伸長と、異種開始集団に由来する長いテロメアを有する細胞から選ばれたものとを区別するために、１つのＤ７１２Ａ残基変異を有する触媒不活性型のＴＥＲＴ（ＣＩ  ＴＥＲＴ）をコードする対照ｍｏｄＲＮＡを合成した。逆転写酵素ドメインの触媒部位にある金属配位アスパルテートの３残基のうち１つがアラニンで置換されており、ＣＩ  ＴＥＲＴの触媒活性を無効にしているが、鋳型ＤＮＡに結合できる程度に構造的には元の状態を残しており、ＴＥＲＴと同等に網赤血球溶解液中で安定である（Ｗｙａｔｔ（２００９）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ
Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ”Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｇａｒｙ，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ（ｈｔｔｐ：／／ｄｓｐａｃｅ．ｕｃａｌｇａｒｙ．ｃａ／ｂｉｔｓｔｒｅａｍ／１８８０／４７５１１／１／２００９＿Ｗｙａｔｔ＿ＰｈＤ．ｐｄｆ））。
【０１２４】
本実施例ではＭＲＣ−５ヒト胎児肺線維芽細胞を試験細胞に選択した。その理由は、これらの細胞及び他のヒト線維芽細胞株が、テロメア分野で数十年にわたって中心的な役割を担ってきた細胞であり、そのため、実験設計及び分析を形成するのに豊富なデータがあることによる。ＭＲＣ−５細胞はまた、内因性テロメラーゼ活性が比較的低く、テロメア短縮及び最終的な老化を呈している。酸化ストレスにより、ＭＲＣ−５細胞内のテロメア短縮の割合が増加し（ｖｏｎ  Ｚｇｌｉｎｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２８：６４−７４）、テロメアを伸長させられない細胞質にＴＥＲＴが局在化することになるので（Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１２１：１０４６−１０５３）、環境酸素ではなく５％で細胞を培養した。また、成功の見込みをさらに上げるために、ＭＲＣ−５細胞中のタンパク質産生を最適化した培地中で細胞を培養した（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４９：９５−１０７）。
【０１２５】
ｍｏｄＲＮＡを使用したテロメア伸長の効率は、トランスフェクションの効率、翻訳及び機能的テロメラーゼへの折り畳み、ならびにＭＲＣ−５細胞などの多くの細胞種におけるＴＥＲＴ及びテロメラーゼを阻害する翻訳後調節の包括的な機構から少なくとも一過的に逸脱する能力を含む、複数の要因に依存する。ＭＲＣ−５細胞にｎＧＦＰ（０．８ｋｂ）などの小さい種類のｍｏｄＲＮＡを用いたトランスフェクション効率は、ｍｏｄＲＮＡの濃度が低い場合であっても一般に９０％を超えるが（図６）、ＴＥＲＴのオープンリーディングフレームは比較的大きく（３３９９ｂｐ）、ｍｏｄＲＮＡ  ＴＥＲＴ構築物は、ＵＴＲ及びポリＡテールを含むため、構築物はさらに大きくなる（３７５１ｂｐ）。しかしながら、図１ｂに示すように、ＴＥＲＴもＣＩ  ＴＥＲＴもカチオン性脂質によってＭＲＣ−５細胞に効率的にトランスフェクトされた（１ｕｇ／ｍｌ  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを用いて５時間処置したＭＲＣ−５細胞から処置終了時点で採取したｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって測定した場合）。さらに、ＴＥＲＴまたはＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを送達すると、抗ＴＥＲＴ抗体によって認識される、ＴＥＲＴの推定サイズである１２７ｋＤａに近い約１２２ｋＤａの大きさを有するタンパク質の量が同等及び有意に上昇した（それぞれＰ＜０．０３及びＰ＜０．０１）（図１ｃ）（Ｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ２３２：９７−１０６）。タンパク質レベルは、定量的赤外蛍光ウエスタンブロットで測定した。ＴＥＲＴタンパク質レベルは、ＴＥＲＴを用いて処置した細胞と、ＣＩ  ＴＥＲＴで処置した細胞との間で有意な違いはない（ｎ＝３）。
【０１２６】
機能的テロメラーゼを形成するには、ＴＥＲＴが適切に折り畳まれ、少なくともＴＥＲＣとともに複合体を形成しなければならない。テロメラーゼはまた、細胞質局在性及び阻害性リン酸化反応などによって、強い翻訳後調節を受ける（Ｃｉｆｕｅｎｔｅｓ−Ｒｏｊａｓ  ａｎｄ  Ｓｈｉｐｐｅｎ（２０１２）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．７３０：２０−２７；ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｒｆｍｍｍ．２０１１．１０．００３）。実際、ＴＥＲＴを発現する細胞のすべてがテロメアを維持できるとは限らない（Ｃｏｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１４７２３−１４７２８）。ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを送達すると、テロメラーゼ活性が用量依存的に約０．６ｕｇ／ｍｌの濃度で最大限に上昇したので（図７参照）、後続の実験には１ｕｇ／ｍｌの濃度を用いた。テロメラーゼ活性レベルは、急速に上昇したが、約４８時間以内にベースラインレベルに戻った。ＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡではテロメラーゼ活性に変化はなかった（図１ｄ）。テロメラーゼ活性は、ＴＲＡＰｅｚｅ（登録商標）ＲＴアッセイで測定した（ｎ＝３）。
【０１２７】
ＴＥＲＴの翻訳後調節には、細胞周期依存的な細胞質隔離がある程度影響するので、処置細胞及び無処置細胞におけるＴＥＲＴの細胞内局在についても調べた（Ｃｉｆｕｅｎｔｅｓ−Ｒｏｊａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｒｆｍｍｍ．２０１１．１０．００３）。ウエスタンブロットの結果と一致して、免疫細胞化学では、無処置ＭＲＣ−５細胞内に、ＴＥＲＴ抗体によって認識された、豊富だが阻害されたと思われるタンパク質が示されたが、内因性ＴＥＲＴと外因性ＴＥＲＴとの区別が難しい（データ不図示）。
【０１２８】
複製老化を発症する細胞集団倍加（ＰＤ）が約１０回以内の細胞を使用して、テロメア長及び複製能に対するＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ処置の効果を測定した。当該細胞を用いる決定は、少なくとも２つの要因に基づいてなされた。第１に、この段階の細胞は、比較的短いテロメアを有しており、ＭＲＣ−５細胞を含め、テロメラーゼが優先的に短テロメアを伸長させるので、この段階の細胞の処置では、より大きな測定効果をより簡単に得られるはずである（Ｂｒｉｔｔ−Ｃｏｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８３：３０７６−３０８０）。第２に、この段階の細胞に処置を施すことで、複製能が向上したかどうかを判断するために必要な時間量が短くなる。本条件下で、複製老化は、ＭＲＣ−５細胞の供給元からの受領後ＰＤ約５０で開始するので（詳細に関しては方法を参照）、ＰＤ約４０で細胞を処置することにした。この段階のＭＲＣ−５細胞は、供給元から受領した際の培養履歴及びＰＤによるが、平均テロメア長が約５〜７ｋｂである（Ｓｉｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２４：８８５−８９３；ＭａｃＫｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５９：３３６−３５０）。
【０１２９】
処置計画（図４ａ）を設計するにあたって、複数の事項を勘案した。ＭＲＣ−５細胞へのＴＥＲＴウイルス導入を用いて得たテロメア伸長の割合は、様々であるが、１分裂当たり約０．２ｋｂのオーダーである（ＭａｃＫｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５９：３３６−３５０）。ＭＲＣ−５細胞におけるテロメア短縮の割合は、培養条件及び操作によって変化するが（Ｓｉｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２４：８８５−８９３；ｖｏｎ  Ｚｇｌｉｎｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２８：６４−７４）、環境酸素下で１ＰＤ当たり約０．１ｋｂである（Ｓｉｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２４：８８５−８９３）。ＭＲＣ−５細胞のテロメア短縮は、酸化条件を減じるとより緩やかに進むので、５％酸素で細胞を培養した（ｖｏｎ  Ｚｇｌｉｎｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２８：６４−７４）。ＰＤ４０のＭＲＣ−５細胞でのＰＤ時間は、約３３時間であることがわかった。これらのデータを考慮すれば、選択した方法であるテロメア長測定、テロメア制限断片（ＴＲＦ）分析及び定量的蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｑ−ＦＩＳＨ）の分解能の範囲内でテロメア伸長を検出するためには、複数の処置が必要であろうことが予期された。処置の間隔は、テロメラーゼ活性レベルが単回処置後から４８時間までにベースラインレベルに戻ることがわかったので、４８時間になるように選択した。
【０１３０】
図３（ｂ）〜（ｄ）に示すように、ｈＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを用いてＭＲＣ−５細胞を処置すると、無処置または送達担体のみで処置した細胞と比較して、当該細胞内のテロメア長が有意に上昇する。処置後の中期のＭＲＣ−５細胞の蛍光顕微鏡写真では、当該細胞内の染色体上のテロメアプローブの位置が示されている（図４（ｅ））。
【０１３１】
また、テロメア長に関する処置の効果は、分析能が比較的高く（０．３ｋｂ）、Ｑ−ＦＩＳＨテロメアプローブの蛍光がテロメア長に正比例するため、定量的蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｑ−ＦＩＳＨ）によっても測定した（図４（ｆ））（Ｌａｎｓｄｏｒｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：６８５−６９１；Ｍａｒｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１８：７６−８０）。複製能は、テロメア伸長の結果として上昇する、最も興味深い機能性パラメータであるので、ＭＲＣ−５細胞の細胞集団倍加数とＱ−ＦＩＳＨを用いて測定したテロメア長との関係を示す標準曲線を描いた（図４（ｇ）（ｉ））。ＰＤ４０のＭＲＣ−５をＴＥＲＴ  ｍＲＮＡを用いて４８時間の間隔で３回処置した後、１細胞当たりの平均総テロメア長が５６＋／−５％増加した（各処置の２つの生物学的反復実験それぞれの細胞数ｎ＝１５、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を示す）。処置済みＰＤ４０細胞のテロメア長は、無処置ＰＤ３細胞のテロメア長に類似した（図４（ｇ）（ｉｉ））（上部の破線）。したがって、当該処置で、当該細胞のテロメアが３７ＰＤにわたって短縮した分、テロメアが伸長した。標準培養条件におけるこの数のＰＤでは、ＭＲＣ−５のテロメアが１ｋｂを超えて短縮する（Ｓｉｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２４：８８５−８９３）。この点に一致して、観察された５６％のテロメア長の増加は、約０．６〜２．５ｋｂの平均テロメア長の増加に相当し、ＰＤ４０のＭＲＣ−５細胞の平均テロメア長が、テロメア長を約２．５〜４ｋｂ多く見積もるＴＲＦを用いた測定で約５〜７ｋｂであるという事実に基づくと（Ｓｉｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２４：８８５−８９３；ＭａｃＫｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５９：３３６−３５０）、ＰＤ４０のＭＲＣ−５細胞の実際の平均テロメア長は、１〜４．５ｋｂの範囲内である（Ａｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．７３０：５９−６７）。処置が合計１４４時間継続し、この時間における細胞の細胞集団倍加時間が約３３時間であるので、細胞は約４〜５ＰＤを経ている。したがって、テロメア伸長の速度は、１ＰＤ当たり約０．１〜０．６ｋｂであり、この上限は、ＴＥＲＴをコードするＤＮＡのウイルス形質導入によってこれまでに報告された最大速度に近似し、この下限は、ウイルス送達の使用でみられる一般的な速度に匹敵する。予想通り、無処置細胞のテロメア長は、標準曲線作成時のＰＤ４０細胞のテロメア長と同等である（図４（ｇ）の下の破線）。
【０１３２】
次に、細胞複製能に関するＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ処置の効果を調べた。予想通り、無処置細胞及びビヒクルのみの処置細胞は、ＰＤ５０〜６０の正常範囲内で老化した（図５ａ）。これとは極めて対照的に、ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡを用いて処置した細胞は、対照集団が用量依存的に複製老化に到達したＰＤを超えて増殖し続け、各追加処置により、大幅なＰＤの増加がもたらされた。
【０１３３】
ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡを用いた３回の処置により、複製能がＰＤ２８＋／−１．５の増加となった。この結果は、ＭＲＣ−５のテロメアが環境酸素（２０％）下で１ＰＤ当たり約０．１ｋｂ短くなり（Ｓｉｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２４：８８５−８９３）、テロメア短縮がより緩慢な５％酸素下で処置細胞を培養したため、テロメアが１ｋｂを超えて伸長したという推定に一致する。観察された処置細胞の複製能におけるＰＤ２８の増加は、正常な線維芽細胞に通常のヒトの加齢で１０年以上にわたって生じる複製能の損失に匹敵する（Ｔａｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｇｅｒｉａｔｒ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ  Ｉｎｔ．１０  Ｓｕｐｐｌ１：Ｓ１９７−２０６；ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１４４７−０５９４．２０１０．００６０５．ｘ．；Ａｌｌｓｏｐｐ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０１１４−１０１１８）。
【０１３４】
治療用途のために重要なのは、今日まで調査した処置細胞のすべてが最終的には老化し、予想された通り、類似のテロメア長を有する無処置細胞と比較して、処置細胞が何十もの付加的なＰＤを受けたために、テロメア以外のＤＮＡ損傷またはテロメア短縮の割合に影響を与え得るか、複製老化の導入を支援し得る他の損傷が累積し、同等のテロメア長を有する無処置細胞よりも少ないＰＤで実際に老化したことである。
【０１３５】
ＭＲＣ−５細胞は、複製老化に近接し、その段階に入ると、直径が初期継代の数倍に膨張する傾向があった（図８ａ）。複製老化と同様に、この変化は、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置した細胞では進行が遅かったが、ＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡまたはビヒクルのみを受ける細胞では遅くならなかった（図８ｂ）。
【０１３６】
ＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡがテロメラーゼ活性の増加を生じなかったという所見（図１ｄ）と一致して、ＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ処置では、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで生じたＴＥＲＴタンパク質レベルと同等の増加が生じたにもかかわらず（図１ｃ）、無処置細胞と比較してテロメア長分布が変わらず、同様にＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡでは複製能も向上しなかった。ＴＥＲＴとＣＩ  ＴＥＲＴの違いは、ヌクレオチドをテロメアに移送するＣＩ  ＴＥＲＴの能力を無効にする、１つの残基置換のみであるので、これらの結果は、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを用いて処置した細胞で観察されたテロメア長と複製能の増加が、より長いテロメアを有する既に存在した亜集団から選ばれたものではなく、少なくとも一部の処置細胞内における真のテロメア伸長に起因するものであるという仮説を強く裏付けるものである。
【０１３７】
本実施例の結果は、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡのヒト細胞への送達がテロメラーゼ活性を一過的に上昇させ、迅速にテロメアを伸長させ、複製能を限られた量だけ、したがって潜在的に安全な量だけ増加させることを示している。また、精製した生体模倣ｍｏｄＲＮＡは、低免疫原性である（Ｋａｒｉｋo  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９：ｅｌ４２；ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ６９５）。したがって、ｍｏｄＲＮＡ送達は、治療用テロメア伸長処置に関する複数の重要な基準を満たしており、特異性、標的送達及び翻訳後調節を克服する能力を含めた他の基準に関しても見込みがある。特異性に関しては、ＴＥＲＴ過剰発現は、Ｗｎｔなどの他の遺伝子にも影響を与え得るが（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ４６０：６６−７２）、こうした影響は、かかる非特異性影響をもたらす因子の結合部位を変異させたＴＥＲＴをコードするｍｏｄＲＮＡを送達することによって回避することができる。送達に関しては、ヒトにおいて、ｍｏｄＲＮＡがエキソソームで血液及び他の体液を介して細胞間輸送されるという近年の発見により、テロメア伸長及び他の用途のためにエキソソームを用いたｍｏｄＲＮＡ送達が可能である（Ｌａｋｈａｌ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ（２０１１）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ３３：７３７−７４１）。エキソソームは、生体模倣ｍｏｄＲＮＡをインビトロで細胞に送達するのに良好に使用されている（データ不図示）。翻訳後調節に関しては、ＴＥＲＴの細胞周期依存性及び非依存性の阻害性翻訳後調節は、核外移行配列などの活性をもたらす１つ以上の既知の部位を変異させたＴＥＲＴをコードするｍｏｄＲＮＡを送達することによって、またはテロメラーゼもしくはテロメラーゼ複合体の他の要素をコードするｍｏｄＲＮＡを一緒に送達することによって回避することができる。これらの手法により、分裂の緩慢な細胞または分裂しない細胞においてもテロメア伸長が可能となり、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ処置は、分裂が静止したまたは分裂の緩慢な幹細胞集団及び前駆細胞集団に適したものとなる。したがって、ｍｏｄＲＮＡを用いたテロメア伸長は、研究用、さらにテロメアを十分に維持できない疾患及び症状を扱う細胞療法、生体工学用途及びインビボ処置のために、細胞の複製能を増加させるのに、即時に使用される。
【０１３８】
要約すれば、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするｍｏｄＲＮＡをＭＲＣ−５ヒト肺線維芽細胞に９６時間にわたって３回送達した。処置細胞内のテロメアが１ｋｂを超えて伸長した。これは、線維芽細胞のテロメアが平均で１０年以上のヒトの加齢を経て短縮する量である（Ｔａｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｇｅｒｉａｔｒ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ  Ｉｎｔ．１０  Ｓｕｐｐｌ１：Ｓ１９７−２０６；ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１４４７−０５９４．２０１０．００６０５．ｘ）。テロメラーゼ活性は、４８時間以内に処置前のレベルに戻り、処置細胞における複製老化の発症が約３０回の細胞集団倍加まで用量依存的に遅くなった。したがって、修飾ヌクレオシドを含有するテロメラーゼＲＮＡの細胞への送達は、迅速かつ低免疫原性または非免疫原性であり、ＲＮＡは、多様な用途のためにテロメアを伸長させる有益な方法である。
方法
【０１３９】
ｍｏｄＲＮＡテンプレート作製及び合成。ｍｏｄＲＮＡ合成用のＤＮＡテンプレートを作製するために使用した野生型（ＷＴ）ヒトＴＥＲＴオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＮＣＢＩヒトＴＥＲＴ転写変異体１リファレンス配列ＮＭ＿１９８２５３．２と同一であり、ｐＢＡＢＥ−ｎｅｏ−ｈＴＥＲＴプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１７７４）のＯＲＦに修飾Ｇ５１６Ｄを施すことによって作製した。残基５１６は、ＴＥＲＴの多量体化及びＲＮＡ結合に関連するモチーフである、ＴＥＲＴのＮ末端伸長部のＱＦＰモチーフ内にある。触媒不活性ＴＥＲＴ（ＣＩ  ＴＥＲＴ）変異体は、変異Ｄ７１２Ａを導入することによって、ＷＴ  ＴＥＲＴ配列から作製した。ＷＴ及びＣＩのＴＥＲＴ  ＯＲＦを、Ｔ７プロモーター、ヒトβグロビン（ｈＢＢ）の５’ＵＴＲ、ＭＣＳ、ｈＢＢの３’ＵＴＲ、１５１ｂｐのポリＡ配列、及びクラスＩＩの酵素を用いた線状化のためのポリＡ配列に続く制限部位を含む開始プラスミドのＭＣＳに挿入した。忠実性を確保するために、得られた中間体プラスミドを少なくとも４試験で配列決定し、線状化し、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）のＲＮＡポリメラーゼ、ならびに標準型ヌクレオチド及び非標準型ヌクレオチドの特注ヌクレオチド混合物（ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（４０ｕｌ  ＩＶＴ反応物当たりの最終ヌクレオチド濃度は、アデノシン−５’−トリホスフェート（ＡＴＰ）、５−メチルシチジン−５’−トリホスフェート（ｍ５ｃ）及びプソイドウリジン−５’−トリホスフェート（Ψ）がそれぞれ７．５ｍＭ、グアノシン−５’−トリホスフェート（ＧＴＰ）が１．５ｍＭ、ならびにキャップアナログが６ｍＭ（ＡＲＣＡ，ＮＥＢ）、言い換えれば、ＡＴＰ：ｍ５Ｃ：Ψ：ＧＴＰ：ＡＲＣＡのモル比が１：１：１：０．２：０．８）を使用し、転写してキャップを有するＲＮＡとした。５’−３Ｐ保持断片（全体の約２０％）に関係するｍＲＮＡの潜在的な免疫原性をさらに低下させるために、ＩＶＴ産物をホスファターゼ（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＮＥＢ）で処理した。ｍｏｄＲＮＡ産物の大きさ及び完全性は、変性アガロースゲル電気泳動を用いて確認した。
【０１４０】
細胞及び細胞培養。ＭＲＣ−５ヒト胎児肺線維芽細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７１）をＡＴＣＣから継代１４（流通在庫の継代数）で入手した。ＡＴＣＣにはＰＤ数が示されていないので、本明細書に示すＰＤ値は、ＡＴＣＣから細胞を受領した後のＰＤ数を指し、ここではＰＤ０と定義する。テロメア伸長実験に備えてテロメアを短縮するために、ＡＴＣＣガイドラインを用いて、ＤＭＥＭ中で１０％ＦＢＳとともに環境酸素及び５％ＣＯ２下で細胞を培養した。ＡＴＣＣからの細胞受領後約ＰＤ４０でテロメア伸長処置を開始した。ｍｏｄＲＮＡ処置を開始する少なくとも４８時間前に、細胞を５％酸素ならびに２０％ＦＢＳ及びペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地に移した。細胞は、少なくとも播種から２４時間後及びトリプシン処理の２４時間前に処置した。
【０１４１】
ｍｏｄＲＮＡトランスフェクション。特に指定のない限り、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のカチオン性脂質を使用して、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ血清低減培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で４〜５時間、０．４ｎＭ  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ及び２．０ｎＭ  ＴＥＲＣ  ＲＮＡを細胞にトランスフェクトし、その後、細胞を通常培地に戻した。
【０１４２】
テロメラーゼ活性の測定。トランスフェクション期間の開始から２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、５００ｇで５分間ペレット化し、ＰＢＳで洗浄し、再ペレット化し、その後ＴＲＡＰｅｚｅ  ＲＴキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の説明書に従って溶解した。逆転写及びｑＰＣＲ工程をＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＩＩ及びＡＢＩ７９００ＨＴで実施した。各試料のテロメラーゼ活性を、キット付属の参照標準と常に比較した。倍増値は、おそらくＭＲＣ−５細胞中のテロメラーゼ活性が低いことにより、変動が大きい傾向にあることが認められた。
【０１４３】
免疫細胞化学。トランスフェクション期間の開始から２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、７．５％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中で１時間ブロックし、３回洗浄し、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の抗ＴＥＲＴ抗体（ＡＢＣＡＭ３２０２０、１：５０またはＲｏｃｋｌａｎｄ６００−４０１−２５２Ｓ、１：５００）で４℃にてロッカー上で一晩インキュベートし、３回洗浄し、二次抗体で１時間インキュベートし、２回、その後さらに２回、各回３分間シェーカー上で洗浄し、次に０．１ｕｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ中で３分間インキュベートし、ＰＢＳ中で４回洗浄した。
【０１４４】
フローサイトメトリー。０．５〜１．５ｕｇ／ｍｌのＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを用いて処置した細胞及び対照をトランスフェクションから２２時間後にトリプシン処理し、洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む７．５％ＢＳＡ中で２０分間透過処理し、ＰＢＳ中で３回洗浄し、７．４％ＢＳＡ中で１時間ブロックし、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の抗ＴＥＲＴ抗体（ＡＢＣＡＭ３２０２０を１：５０）でインキュベートし、３回洗浄し、ＰＢＳ中の二次抗体（１：２００）でインキュベートし、その後３回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中で再懸濁し、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。処置試料及び対照試料の全細胞の平均蛍光として、平均蛍光強度を算出した。データは、ＣＦｌｏｗ  Ｐｌｕｓソフトウェアを用いて分析した。
【０１４５】
ＲＴ−ＰＣＲ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してトータルＲＮＡを採取し、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡに変換した。以下のプライマーによるＰＣＲを用いてｃＤＮＡを増幅させた。
ｈＴＥＲＴ−Ｆ：５’−ＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡ（配列番号１）
３’−ｈＢＢ−Ｒ：５’−ＡＧＧＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＣＡ（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ−Ｆ：５’−ＧＴＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＧＴＣＴ（配列番号３）
ＧＡＰＤＨ−Ｒ：５’−ＧＧＡＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＴＣＧＣＴＧＴ（配列番号４）
【０１４６】
ウエスタンブロット。ＰＢＳで細胞を１回洗浄し、次にＲＩＰＡバッファー中で細胞を溶解することによって、タンパク質を採取した。タンパク質をＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ  Ｇｅｌｓ上で走らせ、２時間３５ＶでＰＶＤＦ膜に移し、次に、抗αチューブリン（Ｓｉｇｍａ、１：１０，０００）及び抗ＴＥＲＴ抗体（ＡＢＣＡＭ３２０２０、１：１０００またはＲｏｃｋｌａｎｄ６００−４０１−２５２Ｓ、１：５００）に一晩４℃でハイブリダイズした。赤外線（６８０ｎｍ及び８００ｎｍ）抗体（ＬＩ−ＣＯＲ）及びＯｄｙｓｓｅｙ  ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ）を用いて二次検出を実施した。画像は、ＩｍａｇｅＪを用いて分析した。
【０１４７】
Ｑ−ＦＩＳＨ。Ｌａｎｓｄｏｒｐら４１の手順に従って、細胞をコルセミド０．１ｕｇ／ｍｌ中で４時間インキュベートし、固定し、分裂中期スプレッドを作製した。次にスライドをＴｅｌｏｍｅｒｅ  ＰＮＡ  ＦＩＳＨ  Ｋｉｔ／ＦＩＴＣ  ｋｉｔ（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用い、キットプローブをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５標識テロメアプローブ（Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＵＳＡ）に代えて、染色した。ＳｏｆｔＷｏＲｘソフトウェアを用いるＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）顕微鏡で６０Ｘまたは１００Ｘの油浸対物レンズを用いて３ミクロンの範囲にわたって電動ステージを用いて０．２ミクロン間隔で各細胞を撮像した。カスタムソフトウェアを用いて、各テロメア点の焦点が合っている画像を特定し、その合焦画像中の強度を統一した。照度の一時的な変動は、各画像の照度を記録したＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎ光センサを用いて補正し、空間的強度及びＣＣＤ暗電流及び読み込みエラーの変動は、平坦視野画像と暗視野画像のそれぞれを取得することによって補正した。少なくとも１５個の分裂中期細胞を各試験に供し、各試料を少なくとも２つの個別実験によって少なくとも２試験で測定した。
【０１４８】
成長曲線。細胞を採取し、血球計算盤で細胞を計数した。自動計数器では、集団が複製老化段階に入ると集団が直径に関して不均質になり、正確な細胞計数ができなかった。細胞直径の測定ができるように画像を取得した。継代間の各培養期間の終了時と開始時の細胞数の比のｌｏｇ２としてＰＤを算出した。
【０１４９】
統計。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して統計分析を行った。エラーバーは、平均値の±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。Ｔ検定を用いてテロメア長を比較し、Ｐ＜０．０５（両側）の場合統計的に差異があるとみなした。
実施例２  ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ処置のヒト内皮細胞への効果
【０１５０】
ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ処置の効果は、線維芽細胞に限定されない。図９に示すように、ヒト微小血管真皮内皮細胞（「ＨＭＤＥＣ」）は、典型的な倍加曲線を示し、継代約１２回で老化の早期発症があり、継代１７回で細胞は完全に老化する。図１０に示すように、これらの継代１８回の細胞を野生型ｈＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡで処置すると（各群の右の棒）、老化が反転するが、対照処置（各群の左の棒）または変異ｈＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを用いた処置（各群の中央の棒）は、細胞老化に影響しなかった。
【０１５１】
図１１は、ＨＭＤＥＣの成長に対する種々の処置の効果を示す。具体的には、継代１０回と継代１１回の間に野生型ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ（ＷＴ）で３回処置した細胞は成長を続けたが、無処置細胞（ＵＴ）、担体のみ（ＣＯ）で処置した細胞及び触媒不活性ＴＥＲＴ（ＣＩ）で処置した細胞は、倍加が停止した。
【０１５２】
図１２は、ＷＴ及びＣＩ  ｍｏｄＲＮＡで処置した後の継代１４回におけるＨＭＤＥＣのβ−ガラクトシダーゼ（ｂＧＡＬ）染色の結果を示す。この染色は、老化前細胞、静止細胞または不死細胞にはみられない老化細胞の特性である、ｐＨ６におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を測定するものである（Ｄｉｍｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：９３６３−７を参照されたい）。
方法
【０１５３】
ＨＭＤＥＣ累積細胞集団倍加曲線を１２ウェルプレート形式を用いて作成した。各時点で約１０５のＨＭＤＥＣを３試験で再播種し、細胞計数を先の再播種から４日後に行った。図９に示すように、継代１２回がＨＭＤＥＣ老化の初期発症時点と特定された。
【０１５４】
図１０に示すように、担体のみ（ＣＯ、ＲＮｉＭＡＸ）対照を含め、ｈＴＥＲＴ−ＣＩ及びｈＴＥＲＴ−ＷＴをコードするｍｏｄＲＮＡ０．７５ｍｇを約１０５のＨＭＤＥＣに隔日２回トランスフェクトした。細胞計数を継代１９回、２０回及び２１回で各回とも再播種から５日後に行った。
【０１５５】
図１１に示す実験に関して、継代１０回と１１回間の期間に（上記の通り、継代１２回はＨＭＤＥＣ老化の早期発症に該当する）、７５ｃｍ３フラスコ１つ当たり約５×１０５のＨＭＤＥＣを、ＥＧＭ−２ＭＶ添加物を加えたＥＢＭ−２培地中で培養した（いずれもＬｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ  ＵＳＡ、カタログ番号はそれぞれＣＣ−３１５６及びＣＣ−４１７６）。無処置（ＵＴ）及び担体のみ（ＣＯ、ＲＮＡｉＭＡＸ）対照フラスコも含め、ｈＴＥＲＴ−ＷＴ（ＷＴ）及びｈＴＥＲＴ−ＣＩ（ＣＩ）をコードするｍｏｄＲＮＡ５μｇを微小血管細胞に隔日３回トランスフェクトした。各時点で、５×１０５の細胞を播種し、継代１１回から開始して、播種から５日後に血球計算盤を介して細胞計数を行った。各時点について、各実験条件を３試験で実施した。
【０１５６】
図１２に示す実験について、継代１４回のＮＴ、ｈＴＥＲＴ−ＣＩ及びｈＴＥＲＴ−ＷＴ  ＨＭＤＥＣをそれぞれ約１０５で図１０に記載の通り処置した。次に、細胞を、老化細胞組織化学染色キット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＣＳ００３０）用いて、ｐＨ６でのβ−ガラクトシダーゼ活性の組織化学的染色に基づいた老化細胞分析にかけた。スライドの左側は、無処置（ＮＴ）細胞及びｈＴＥＲＴ−ＣＩ（ＣＩ）またはｈＴＥＲＴ−ＷＴ（ＷＴ）ｍｏｄＲＮＡで処置した細胞の代表画像を示す。すべての画像は、同一の画像取得条件の下、取得した。各実験条件を３試験で実施し、各条件について、β−ガラクトシダーゼ活性が陽性である細胞の割合（チャート中に示す通り）を、ランダムに３回取得した領域の陽性細胞の平均として算出した。
実施例３  ヒト細胞に対するＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ処置の効果のさらなる特徴決定
【０１５７】
本実施例では、ｍＲＮＡを、カチオン性脂質を介して、増殖能に限界があることが知られている細胞である初代ヒト線維芽細胞及び筋芽細胞にトランスフェクトした（図１３Ａ）（Ｗｅｂｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｕ（１９９０）Ｓｏｍａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．１６：５５７−５６５；Ｈａｙｆｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｈｅａｄ（１９６１）Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５：５８５−６２１；Ｙａｋｕｂｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３９４：１８９−１９３）。トランスフェクション効率を、ＧＦＰ  ｍＲＮＡ送達後の蛍光のフローサイトメトリーの単一細胞定量化を用いて決定した。これにより修飾ｍＲＮＡの濃度が比較的低くても（０．１μｇ／ｍｌ）、細胞の大部分で（＞９０％）トランスフェクトが確認された（図１３Ｂ及び図１６Ａ〜Ｃ）。同じ濃度の外因性ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡまたはＴＥＲＴの触媒的不活性（ＣＩ）型をコードするｍＲＮＡでの細胞処置では、最初の処置から２４時間後にＲＴ−ｑＰＣＲで測定した場合、同量のｍＲＮＡの内部移行となった（図１６Ｄ）。ＣＩ  ＴＥＲＴは、ＴＥＲＴの逆転写酵素ドメインの触媒部位にある金属配位アスパルテートの３残基のうちの１つに置換変異を有している。この結果、ＣＩ  ＴＥＲＴは、テロメアにヌクレオチドを付加することはできないが、構造的には元の状態を残しており、鋳型ＤＮＡに結合でき、網赤血球溶解液中では野生型ＴＥＲＴと同等の安定性を示す（Ｗｙａｔｔ（２００９）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）。ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ処置もＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ処置も、ＲＴ−ｑＰＣＲで測定したところ、無処置細胞と比較して、内因性ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡのレベルに影響を与えなかった（図１６Ｅ）。ＴＥＲＴまたはＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ１μｇ／ｍｌのトランスフェクションでは、線維芽細胞中のＴＥＲＴタンパク質の量が同様に５０％の上昇となった（それぞれＰ＜０．０５及びＰ＜０．０１）（図１３Ｃ、左パネル）（Ｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ．２３２：９７−１０６；Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１２１：１０４６−１０５３）。内因性テロメラーゼ活性の少ない細胞中の内因性ＴＥＲＴタンパク質の存在は、他者が既に報告している通り、多くの細胞種におけるＴＥＲＴの不活性スプライスバリアントの相対存在量及びＴＥＲＴ活性の広範な翻訳後阻害性調節に一致する（Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：４８１８−４８２５；Ｃｉｆｕｅｎｔｅｓ−Ｒｏｊａｓ  ａｎｄ  Ｓｈｉｐｐｅｎ（２０１１）Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ．［印刷に先立ちオンラインにて公開：２０１１年１０月１８日］；ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｒｆｍｍｍ．２０１１．１０．００３）。ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの量を増やした処置では、フローサイトメトリーによる単一細胞アッセイで測定すると、ＴＥＲＴタンパク質発現が用量依存的に増加した（図１３Ｃ、右パネル）。
【０１５８】
テロメラーゼ活性は、一過的に上昇する。修飾ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ送達が機能性ＴＥＲＴタンパク質の産生をもたらすかどうかを調べるために、テロメラーゼ活性をゲルＴＲＡＰアッセイを使用して定量化した。線維芽細胞及び筋芽細胞において、試験したすべての用量のＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ（０．２５，０．５，１．０及び２．０μｇ／ｍｌ）でテロメラーゼ活性が検出され、無処置細胞、またはビヒクルのみもしくはＣＩ  ＴＥＲＴコードする修飾ｍＲＮＡで処置した細胞では、２．０μｇ／ｍｌの高い用量であっても、テロメラーゼ活性は検出されなかった（図１３Ｄ）。ＴＥＲＴには機能性テロメラーゼ複合体を形成するのにＴＥＲＣが必要であるが、ＴＥＲＴの送達だけでテロメラーゼ活性を上昇させるのに十分であった。これは、線維芽細胞を含む、テロメラーゼ活性の欠如した多くの細胞種でＴＥＲＣ  ＲＮＡコピー数が多いためであり、多くの場合ＴＥＲＴが制限的であるという先の知見と一致する（Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：４８１８−４８２５）。時間経過により、１回のトランスフェクション後２４時間でテロメラーゼ活性が最大になり、４８時間以内にベースラインに戻ることが明らかとなった。この時間枠は、ヒトＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ（２〜４時間）、ヒトβ−グロビンｍＲＮＡ（１７〜１８時間：本外因性ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡは両側をβ−グロビン５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲに挟まれている）及びタンパク質合成の阻害因子に曝された細胞におけるテロメラーゼ活性（細胞種に依存するが通常２４時間超）に関してこれまでに報告された半減期と一致する（Ｋａｂｎｉｃｋ  ａｎｄ  Ｈｏｕｓｍａｎ（１９８８）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：３２４４−３２５０；Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ＳｃｉＵＳＡ．９４：１０６８７−１０６９２；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．８０：１１５６−１１６１）。
【０１５９】
テロメアの伸長。無処置の線維芽細胞では、２つの異なる方法を用いて定量化すると、予想した通り（６２）、テロメア長が時間の経過（３ヶ月）とともに減少した（図１４Ａ）。単色マルチプレックスｑＰＣＲ法（ＭＭｑＰＣＲ）を用いて長さを評価し、ＳｐｅｃｔｒａＣｅｌｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．が実施したｑＰＣＲ法を用いて測定値を個別に検証した（相関係数０．９７、Ｐ＜０．００１）。ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡを線維芽細胞または筋芽細胞にそれぞれ細胞集団倍加（ＰＤ）２５と６から始めて４８時間の間隔で３回連続して送達すると、それぞれ０．９±０．１ｋｂ（２２±３％）と０．７±０．１ｋｂ（１２±２％）のテロメア伸長となった（図１４Ｂ、Ｃ）。ビヒクルのみまたはＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡによる処置では、無処置細胞と比べて、テロメア長に有意な効果はなかった。線維芽細胞におけるテロメア伸長の平均速度は、１３５±１５ｂｐ／ＰＤであった。
【０１６０】
細胞種に依存した増殖能の増加。修飾ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの送達及び結果として生じるテロメア伸長の細胞増殖能への効果を調べるために、ヒト線維芽細胞を１回、２回または３回連続してトランスフェクトした。各処置は４８時間の間隔で送達した。無処置、ビヒクルのみで処置、及びＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡで処置した線維芽細胞は、ＰＤ約５０〜６０後で細胞数が同じように横ばいとなったが、ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡで３回処置した細胞は、制限的に増分した２８±１．５ＰＤにわたって増殖を続け、細胞数の全体的な増加は、無処置細胞を上回る２．７×１０８となった（図１４Ｄ、左パネル）。この効果は、用量依存的であり、各追加処置はＰＤの増加をもたらした（図１４Ｄ、右パネル）。増殖能の漸次的な増加は、２回目または３回目の処置に比べて１回目の処置のほうが大きかった。４８時間毎に３回連続して処置したヒト筋芽細胞は、３．４±０．４ＰＤに達し、無処置またはビヒクル処置対照と比較した細胞数は１０倍に相当する増加となった（図１４Ｅ）。筋芽細胞のＰＤと線維芽細胞のＰＤのこのような差異は、これまでの研究で、少ないＰＤでのＴＥＲＴ過剰発現については、類似の限定的な効果が認められ、この限定が、線維芽細胞とは対照的にヒト筋芽細胞では、ｐ１６を介した成長停止に起因することが示されているので、予想外のことではない（Ｂｏｄｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７９：３４９−３５２；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ．６：５１５−５２３）。線維芽細胞でも筋芽細胞でも、ビヒクルのみまたはＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡは、無処置対照と比較して、増殖能に対する効果はなかった。これらのデータは、修飾ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの送達が培養物のＰＤを増加させるのに有効な方法であることを示している。重要なのは、調査した処置細胞のすべてが有意な細胞数の増加を示した一方で、最終的には成長曲線が横ばい状態に達し、不死化しないことを示すことである。
【０１６１】
老化マーカの一過的減少。線維芽細胞集団の成長が停止した時点で、当該細胞は、老化関連β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）染色及び肥大化などの老化マーカを呈示した（図１５Ａ〜Ｃ）（Ｃｒｉｓｔｏｆａｌｏ  ａｎｄ  Ｋｒｉｔｃｈｅｖｓｋｙ（１９６９）Ｍｅｄ  Ｅｘｐ  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９：３１３−３２０；Ｄｉｍｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９２：９３６３−９３６７；Ｃｒｉｓｔｏｆａｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ．１２５：８２７−８４８；Ｌａｗｌｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．４５：７７２−７７８）。これらの変化は、ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡで処置した線維芽細胞では、無処置細胞及びＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡまたはビヒクルのみを受ける細胞と比べて、一過的に減少した。他者による知見と一致して、成長停滞期に入った集団中のすべての細胞が検出可能なレベルでβ−ガラクトシダーゼを発現したわけではなかった（Ｌａｗｌｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．４５：７７２−７７８；Ｂｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６９：９１８３−９１９１）。しかしながら、ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡをトランスフェクトした線維芽細胞及び筋芽細胞は、２つの集団が成長停滞期に達した後、各種類の対照細胞と同じ程度にβ−ガラクトシダーゼを発現した。これらのデータは、ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡで処置した細胞が最終的にかつ予想通りに分裂を停止し、老化マーカを発現し、したがって癌化する可能性がないことを示している。
【０１６２】
この実施例は、修飾ヌクレオチドを含むＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの一過的送達がヒトテロメアを伸長し、細胞を不死化させることなく細胞増殖能を増加させることを実証している。１ＰＤ当たり１３５±１５ｂｐという本実施例で観察された線維芽細胞のテロメア伸長速度は、ウイルス方法を用いて報告された１ＰＤ当たり９４から１５０ｂｐ未満（２２，６９）の速度に匹敵する。修飾ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡは、数日間で線維芽細胞のテロメアを０．９±０．１ｋｂ伸長させた。線維芽細胞テロメア長は、ヒトの生涯にわたって平均で約１〜２ｋｂ短くなることが報告されている（Ａｌｌｓｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８９：１０１１４−１０１１８）。したがって、修飾ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡは効果的でありつつ、一過的かつ非組込み型であり、恒常的に発現するウイルスＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ送達の主要な限界を克服するものである。
【０１６３】
最大の関心対象であるヒト細胞は、実験または再生医療で使用するための幹細胞を含め、数に限りのあることが多い。この問題に対しては、現在、体細胞核移植、遺伝子送達のためのウイルス法及びテロメア短縮の速度を落とす培養条件の使用などの様々な方法による取組みがなされている（Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，［印刷に先立ちオンラインにて公開：２０１３年１１月１９日］；ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１３．１１．００５；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｅｎｓ（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．３３１：７９−９０；Ｍｏｈｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１１３：１１６９−１１７９）。本明細書に記載された修飾ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ処置は、これらの方法を有益に補完または代替するものであり、短時間であり、迅速にテロメアを伸長させ、挿入変異のリスクのないものである。ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ処置が短時間であることは、培養物内で経時的に生じ得る幹細胞表現型の損失を回避し（Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２９：１０７８−１０８１）、テロメアが伸長する期間であるｉＰＳＣ作製の再プログラム化後の段階を短縮し得る（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２２：７５７−７６８）点で、特に魅力的である。このようなテロメア伸長方法は、疾患のモデル化、改善薬のスクリーニング及び細胞療法における使用のための多様な細胞種の有用性を向上させる可能性がある。
【０１６４】
増殖能に対する効果の範囲は、試験した細胞種について観察され、筋芽細胞及び線維芽細胞の増殖能に対するＴＥＲＴ発現の異なる効果を示す従前の研究と一致した（Ｂｏｄｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７９：３４９−３５２；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ．６：５１５−５２３）。さらに、テロメア伸長の量は、増殖能と相関しなかった。したがって、細胞状況がＴＥＲＴ発現の増殖能への効果を決めるため、この限定を克服するには、この作用をもたらす要因の理解が重要である。ウイルスＴＥＲＴ過剰発現において筋芽細胞の増殖能の制限に関与している因子には、ｐ１６を介した成長停止、細胞種、細胞株及び培養条件が挙げられる（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ．６：５１５−５２３）。より一般的には、この作用は、テロメア以外のＤＮＡ損傷、年齢及びミトコンドリア完全性によってもたらされ得る（Ｓａｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ．４７０：３５９−３６５；Ｍｏｕｒｋｉｏｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：８９５−９０４；Ｌoｐｅｚ−Ｏｔiｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ．１５３：１１９４−１２１７）。ＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞においてテロメア長または細胞増殖能が増加しないことは、ヌクレオチドをテロメアに直接付加するＴＥＲＴの触媒部位を介した作用の処置と一致する。ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡで処置した細胞集団は、一定時間、数が指数的に増加し、最終的には増大が停止し、無処置集団と同程度の老化マーカを呈した。これは、不死化しないことと一致する。
【０１６５】
本実施例で観察された修飾ｍＲＮＡの一過的な非組込み型の性質及び増殖能の限定的な増加は、現在用いられているウイルスまたはＤＮＡベクターよりも安全なものである。さらに、当該方法は、テロメアを迅速に伸長させるので、処置が短時間でなされ得、処置後の保護的なテロメア短縮機構が元の状態のまま維持される。この方法は、免疫老化または骨髄機能不全の場合、造血幹細胞または前駆細胞などの、ある症状及び疾患をもたらす細胞種を処置するために、エクスビボで用いることができる。さらに、修飾ｍＲＮＡは、ある特定の組織にインビボで送達することもできる（Ｋｏｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：１５４−１５７）。要約すれば、本明細書に記載されたテロメアを迅速に伸長させるための迅速かつ安全な方法により、老化を遅らせ、ヒト細胞を不死化することなく、細胞増殖能を向上させられる。
方法
【０１６６】
ｍＲＮＡテンプレート作製及び合成。ＧＦＰ、ＴＥＲＴ及びＣＩ  ＴＥＲＴをコードする修飾ｍＲＮＡを作製するために、各々のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、Ｔ７プロモーター、ヒトβ−グロビン（ＨＢＢ）の５’ＵＴＲ、ＭＣＳ、ＨＢＢの３’ＵＴＲ、１５１ｂｐのポリＡ配列、及びクラスＩＩの酵素を用いた線状化のためのポリＡ配列に続く制限部位を含む開始プラスミドのＭＣＳに挿入した。得られた中間体プラスミドを配列決定し、線状化し、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）のバッファー及びＲＮＡポリメラーゼならびに標準型ヌクレオチド及び非標準型ヌクレオチドの特注混合物（ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ,Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）（４０μｌ  ＩＶＴ反応物当たりの最終ヌクレオチド濃度は、アデノシン−５’−トリホスフェート（ＡＴＰ）、５−メチルシチジン−５’−トリホスフェート（ｍ５ｃ）及びプソイドウリジン−５’−トリホスフェート（Ψ）のそれぞれが７．５ｍＭ、グアノシン−５’−トリホスフェート（ＧＴＰ）が１．５ｍＭ、ならびにキャップアナログが６ｍＭ（ＡＲＣＡ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、言い換えれば、ＡＴＰ：ｍ５Ｃ：Ψ：ＧＴＰ：ＡＲＣＡのモル比が１：１：１：０．２：０．８）を使用して、転写した。５’−３Ｐ保持断片に関係するｍＲＮＡの潜在的な免疫原性をさらに低下させるために、ＩＶＴ産物をＡｎｔａｒｃｔｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理した。ｍＲＮＡ産物の大きさ及び完全性は、変性アガロースゲル電気泳動を用いて確認した。ｍＲＮＡ合成用のＤＮＡテンプレートを作製するために使用した野生型ヒトＴＥＲＴ  ＯＲＦは、ＮＣＢＩヒトＴＥＲＴ転写変異体１（リファレンス配列ＮＭ＿１９８２５３．２）と同一である。ＯＲＦは、ｐＢＡＢＥ−ｎｅｏ−ｈＴＥＲＴプラスミドから作製した（Ｃｏｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９５：１４７２３−１４７２８）（ｐｌａｓｍｉｄ１７７４，Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）。ｐＢＡＢＥ−ｎｅｏ−ｈＴＥＲＴプラスミドは、多量体化及びＴＥＲＴとＴＥＲＣ  ＲＮＡの相互作用に関連するモチーフである、ＴＥＲＴのＱＦＰモチーフ内の残基５１６に非サイレント突然変異があったため、この突然変異による人為構造の可能性を回避するために、Ｇ５１６Ｄで置き換えて変異を修正することで、ＮＣＢＩリファレンス配列と同一の配列を作製した。ＣＩ  ＴＥＲＴ変異体は、Ｄ７１２Ａの変異を導入することによって、ＴＥＲＴ配列から作製した。
【０１６７】
細胞培養及び処置。継代１４回のヒト初代胎児肺ＭＲＣ５線維芽細胞をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から取得した。ＡＴＣＣにはＰＤ数が示されていないので、本明細書に示すＰＤ値は、ＡＴＣＣから細胞を受領した後のＰＤ数を指す。ＭＲＣ５細胞を２０％ＦＢＳ及びペニシリン−ストレプトマイシンとともにＤＭＥＭ中で培養した。ヒト３０歳初代骨格筋芽細胞（Ｌｏｎｚａ，Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）をＳｋＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ）中で供給業者の説明書に従って培養した。採取した細胞とその前の継代で播種した細胞との比の２を底とする対数として、細胞集団倍加を算出し、播種した細胞よりも採取した細胞が少ない場合は、ゼロとみなした。ＯｐｔｉＭＥＭ血清低減培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）中で調製したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて、本実施例に示す最終濃度に達するように、通常培地を用いて体積比１：５で細胞に加え、細胞に修飾ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡをトランスフェクトした。
【０１６８】
テロメラーゼ活性の測定。トランスフェクション期間の開始から２４時間後、細胞を採取し、ＣＨＡＰＳバッファー内で溶解した。ＴＲＡＰｅｚｅ  ｋｉｔ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）の改変版を用いて、ＴＲＡＰアッセイを実施した。改変版では、プライマー及びポリメラーゼを、人工テロメア基質が伸長する間の工程の前ではなく、後に加えた。ＰＣＲプログラムは、９４℃３０秒／５９℃３０秒／７２℃４５秒を３０サイクルとし、この産物を、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ核酸ゲル染色（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）で染色した０．５Ｘ  ＴＢＥ中１５％ポリアクリルアミドゲル上で走らせた。テロメラーゼ活性の時間経過は、ＴＲＡＰｅｚｅ  ＲＴ  ｋｉｔ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて実施した。
【０１６９】
ウエスタンブロット。ＰＢＳで細胞を１回洗浄し、次にＲＩＰＡバッファー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ  ＭＡ，ＵＳＡ）中で細胞を溶解することによって、タンパク質を採取した。タンパク質をＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ  Ｇｅｌｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）上で走らせ、２時間３５ＶでＰＶＤＦ膜に移し、次に、抗α−チューブリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ、１：１０，０００）及び抗ＴＥＲＴ抗体（ＡＢＣＡＭ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ，３２０２０、１：１０００またはＲｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ，ＵＳＡ，６００−４０１−２５２Ｓ、１：５００）にハイブリダイズし、一晩４℃でインキュベートした。赤外線（６８０  ｎｍ及び８００  ｎｍ）抗体（ＬＩ−ＣＯＲ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，ＵＳＡ）及びＯｄｙｓｓｅｙ  ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ）を用いて検出を実施した。各バンドの合計強度をＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて定量化した。各ＴＥＲＴバンドの強度は、チューブリンのバンドに対応する強度で標準化した。
【０１７０】
フローサイトメトリー。指定用量（図１６Ａ〜Ｃ）のＴＥＲＴ  ｍＲＮＡを用いたトランスフェクトから２４時間後に細胞を採取し、抗ＴＥＲＴ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ，ＵＳＡ；６００−４０１−２５２Ｓ）を１：５００で用いて染色した。
【０１７１】
ＳｐｅｃｔｒａＣｅｌｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．によるテロメア長の測定。ゲノムＤＮＡをフェノールクロロホルムを用いて抽出し、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて定量化した。テロメア長分析は、基本的にはＣａｗｔｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｗｔｈｏｎ（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（１０）：ｅ４７；Ｃａｗｔｈｏｎ（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７（３）：ｅ２１の記載に従って、ＣＬＩＡ認定高スループットｑＰＣＲアッセイを用いて、ＳｐｅｃｔｒａＣｅｌｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）で実施した。アッセイは、テロメア繰返しコピー数と単一遺伝子（３６Ｂ４）コピー数との比において、試料が参照ＤＮＡサンプルとどれだけ異なるかという因子を測定することによって、相対テロメア長を求めるものである。この比（Ｔ／Ｓ比）は、平均テロメア長に比例するものと考えられる。すべての試料を、少なくとも１つの陰性対照及び２つの異なる既知のテロメア長（長及び短）の２つの陽性対照を用いて、少なくとも２試験で行った。平均分散は最大８％であった。結果は、ｋｂ単位の平均テロメア長に相当するテロメアスコアとして報告された。
【０１７２】
ＭＭｑＰＣＲによるテロメア長の測定。Ｃａｗｔｈｏｎ（Ｃａｗｔｈｏｎ（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７（３）：ｅ２１）によって開発されたＭＭｑＰＣＲプロトコルの修正版を用いて、テロメア長を測定した。変更点を以下に示す。テロメア産物をより早く増幅させるために、追加のＰＣＲ増幅前サイクルを追加して、テロメア遺伝子シグナルと単一コピー遺伝子シグナルとの差異を広くし、２つのＴａｑポリメラーゼの混合物を実験的に測定して、それぞれ単独の場合よりも望ましいＰＣＲ反応効率を得るようにし、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ濃度を０．７５倍から０．５倍に低くすることでシグナルを早めた。ＰｕｒｅＧｅｎｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて、ＲＮａｓｅ消化によりゲノムＤＮＡを細胞から採取し、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて定量化し、１５μｌ当たり１０〜４０ｎｇを用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用し、４試験でｑＰＣＲ反応実施した。試料ＤＮＡ定量化に必要な標準曲線を作成するために、各アッセイには、１００ｎｇ／μｌから１．２３ｎｇ／μｌの５点に及ぶ参照ＤＮＡの連続希釈を含めた。各１５μｌのＰＣＲ反応における試薬の最終濃度は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．４  ２０ｍＭ、ＫＣｌ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ３ｍＭ、各ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、ＤＴＴ１ｍＭ、ベタイン１Ｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ０．５倍（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ０．１８７５Ｕ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）、Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ０．０６２５倍（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及び各プライマー９００ｎＭ（Ｃａｗｔｈｏｎ（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７（３）：ｅ２１で指定されたｔｅｌｇ、ｔｅｌｅ、ｈｂｇｕ及びｈｂｇｄプライマー配列）であった。サーマルサイクルプログラムは、９５℃で２分、次に、９５℃で１５秒、４９℃で１５秒の６サイクル、次に、９５℃で１５秒、６２℃で１０秒、７２℃で１５秒シグナル取得有、８４℃で１５秒、８８℃で１０秒シグナル取得有の４０サイクルとした。Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ソフトウェアを使用して標準曲線を作成し、各試料のテロメア及び単一コピー遺伝子のＤＮＡ濃度を算出した。各試料の反復試験についてＴ／Ｓ比を算出し、その結果を平均化し、試料Ｔ／Ｓ比を得て、上述したＳｐｅｃｔｒａＣｅｌｌに送付した参照細胞のブラインド反復試験の試料を用いて校正した。同じ試料についてＭＭｑＰＣＲとＳｐｅｃｔｒａＣｅｌｌとを用いて独立して取得したＴ／Ｓ比の相対値は、極めて一致した（相関係数＝０．９７、Ｐ＜０．００１）。
【０１７３】
逆転写ｑＰＣＲ。別の指定がない限り、プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｕｎｔｅｒｇａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４０：ｅ１１５）を用いて設計し、これを表９に示す。処置開始から２４時間後に細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）で細胞を採取した。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。内因性ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡは、ＴＥＲＴのオープンリーディングフレームにはフォワードプライマー、内因性ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにはリバースプライマーを用いて増幅した。外因性ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡは、ＴＥＲＴ  ｍＲＡのオープンリーディングフレームにはフォワードプライマー、外因性ＴＥＲＴ及びＣＩ  ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ中に存在するが内因性ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡには存在しないＨＢＢの３’ＵＴＲにはリバースプライマーを使用して増幅した。相対レベルをＰｆａｆｆｌ法を用いて算出した。参照遺伝子は、ＲＰＬ３７Ａ（  Ｇｒｅｂｅｒ  ｅｔ
ａｌ．（２０１１）ＥＭＢＯ  Ｊ．３０：４８７４−４８８４に記載のプライマーを使用）及びＧＡＰＤＨとし、いずれも対照細胞または処置細胞のＣｔ値に有意な変化は示さなかった。
【表９】
2019201651.tif 000015
【０１７４】
老化関連β−ガラクトシダーゼ染色及び細胞サイズの評価。Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ  ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してβ−ｇａｌ染色を実施した。１集団当たり少なくとも５０個の細胞を２試験で採点評価した。細胞直径は、トリプシン処理後に血球計算盤のグリッド上で手作業で採点した（Ｃｒｉｓｔｏｆａｌｏ  ａｎｄ  Ｋｒｉｔｃｈｅｖｓｋｙ（１９６９）Ｍｅｄ  Ｅｘｐ  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９：３１３−３２０）。
【０１７５】
統計。ステューデントのＴ検定及びピアソンの相関係数の計算は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して実施した。エラーバーは、平均値の±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
実施例４  エレクトロポレーションによるＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡの細胞への送達
【０１７６】
本発明のＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡ化合物は、図１８〜２０に示すように、所与の細胞種において最適なトランスフェクション効率及び生存率を達成するのに適したＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡの濃度、電圧波形及び電極形状などのエレクトロポレーションのパラメータを用いて、エレクトロポレーションによっても細胞に送達することができる。図２１は、エレクトロポレーションによって送達したＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡの用量に対するテロメラーゼ活性の依存性を示す。
実施例５  ｍｏｄＲＮＡのヒト血液細胞への送達
【０１７７】
ＣＤ８＋Ｔ細胞に以下の通りｍｏｄＲＮＡをトランスフェクトした。ヒト全血由来のバフィー層をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）密度勾配媒体で遠心分離し、単核球を取得し、これを２回洗浄してから、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ８  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて非ＣＤ８＋白血球を枯渇させた。ＣＤ８＋細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３．ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて刺激し、３０，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加したＯｐＴｉｍｉｚｅｒ  Ｔ細胞培地を用いて４日間培養した。次に、補助剤１を含有するＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｐ３溶液２０μｌの容量中５０μｇ／ｍｌの濃度で、核ＧＦＰ及びＴＥＲＴをコードするｍｏｄＲＮＡをＴ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、細胞を蛍光及び生存率のアッセイにかけた。トランスフェクションの結果を、図２２に示す。明るい蛍光は、コピー数が高多いことを示し、高い生存率を有する９０％を超えるトランスフェクション効率である。
実施例６  テロメラーゼｍｏｄＲＮＡを使用したヒト表皮角化細胞におけるテロメラーゼの発現
【０１７８】
図２３に示すように、ＴＥＲＴ  ｍｏｄＲＮＡを用いたヒト表皮角化細胞のエレクトロポレーションにより、細胞にテロメラーゼ活性の発現がもたらされる。ヒト初代表皮角化細胞（Ｌｏｎｚａ）を、３×１０７細胞／ｍｌの密度で、触媒不活性（ＣＩ）ＴＥＲＴまたは野生型ＴＥＲＴのいずれかをコードするｍｏｄＲＮＡ５０μｇ／ｍｌを含有するＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に懸濁させた。１０μｌの細胞懸濁液を１ｍｍギャップのキュベット内に入れ、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、２００Ｖ、１０００Ｏｈｍｓ及び２５マイクロファラッドでエレクトロポレーションを実施した。細胞を速やかにＫＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ）に戻し、２４時間インキュベートした後、ゲルを用いたＴＲＡＰｅｚｅアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用するテロメラーゼ活性の測定のために細胞を採取した。２５μｌの各ＴＲＡＰ反応物を全タンパク質１μｇを用いて２試験試料で、８５℃で１０分間加熱し、テロメラーゼを不活性化した。無処置、エレクトロポレーションのみ及びＣＩ  ＴＥＲＴの試料を陰性対照とし、２９３Ｔ細胞及びＴＳＲ８を陽性対照とした。
実施例６  インビボ送達によるｍｏｄＲＮＡコードタンパク質の発現
【０１７９】
インビボ送達したｍｏｄＲＮＡは、そのｍｏｄＲＮＡがコードする機能性タンパク質の発現をもたらすことができる（Ｋｏｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２９：１５４−１５７；Ｋａｒｉｋo  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ２０：９４８−９３）。この点は、ルシフェラーゼをコードするｍｏｄＲＮＡ２μｇとカチオン性脂質担体（ＴｒａｎｓＩＴ）との複合体を形成し、げっ歯類の尾部に５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で静脈注入することによって、確認されている。脾臓を摘出し、ルシフェリンで処置し、ＩＶＩＳ生物発光イメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いてルシフェラーゼ活性のアッセイを行った。図２４に示すように、ルシフェラーゼ活性が注入部位及び脾臓で検出された（矢印）。
【０１８０】
本明細書にて言及したすべての特許、特許公報及び他の公開文献は、各々が個別にかつ明確に本明細書に参照により組み込まれた場合と同様に、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【０１８１】
具体的な実施例を記載してきたが、上記の説明は例示であり、限定的なものではない。前述の実施形態の任意の１つ以上の特徴は、本発明の他の実施形態の１つ以上の特徴と任意の方法で組み合わせることができる。さらに、本明細書を検討すれば、本発明の多くの変形形態が当業者には明らかになるであろう。したがって、本発明の範囲は、等価物の全範囲も含め、添付する特許請求の範囲を参照することによって定められるべきである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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