(57)【要約】【課題】本発明は，より細胞接着に適した接着性細胞を培養するための表面修飾方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は細胞担持面を有する非フッ素系樹脂を主成分とする細胞担持用基材の製造方法であって，加湿環境下，酸素及び／又はオゾン供給雰囲気中で，前記基材の細胞担持面にＵＶを照射するＵＶ照射工程，及び前記基材の細胞担持面にプラズマを照射するプラズマ照射工程を含む方法，及び当該方法に用いるための装置を提供する。また，本発明は，前記製造方法により得られた細胞担持用基材の細胞担持面上で細胞を培養することを含む培養方法を提供する。【選択図】図１１
2019017387.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞担持面を有する非フッ素系樹脂を主成分とする細胞担持用基材の製造方法であって，
加湿環境下，酸素及び／又はオゾン供給雰囲気中で，前記基材の細胞担持面にＵＶを照射するＵＶ照射工程，及び
前記基材の細胞担持面にプラズマを照射するプラズマ照射工程
を含む方法。
【請求項２】
前記非フッ素系樹脂が，ポリエチレン，アクリル樹脂，ＡＢＳ樹脂，ポリエチレンテレフタレート，ポリプロピレン，ポリカーボネート，及びポリスチレンからなる群から選択される少なくとも１種類の樹脂である，請求項１に記載の細胞担持用基材の製造方法。
【請求項３】
ＵＶ照射工程の後にプラズマ照射工程を行うことを特徴とする，請求項１又は請求項２に記載の細胞担持用基材の製造方法。
【請求項４】
プラズマ照射工程の後にＵＶ照射工程を行うことを特徴とする，請求項１又は請求項２に記載の細胞担持用基材の製造方法。
【請求項５】
ＵＶ照射工程とプラズマ照射工程を同時に行うことを特徴とする，請求項１又は請求項２に記載の細胞担持用基材の製造方法。
【請求項６】
前記ＵＶ照射が，平均波長１８４．９ｎｍ及び２５３．７ｎｍのＵＶを照射することにより行われることを特徴とする，請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の細胞担持用基材の製造方法。
【請求項７】
前記ＵＶ照射が，前記非フッ素系樹脂表面の水接触角が４０〜７０°となるまでの間行われることを特徴とする，請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の細胞担持用基材の製造方法。
【請求項８】
さらに，ＵＶ照射工程の前に，該細胞担持面にアンモニア溶液を塗布する工程を備える，請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
接着細胞の培養方法であって，請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の製造方法により得られた細胞担持用基材の細胞担持面上で細胞を培養することを含む培養方法。
【請求項１０】
前記接着細胞が幹細胞である，請求項９に記載の培養方法。
【請求項１１】
前記幹細胞が，マウスｉＰＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞である，請求項１０に記載の培養方法。
【請求項１２】
フィーダー細胞の非存在下で培養することを特徴とする，請求項１０又は請求項１１に記載の培養方法。
【請求項１３】
細胞担持面を有する非フッ素系樹脂を主成分とする細胞担持用基材を格納するための格納部と，該格納部に格納された前記細胞担持用基材に対して紫外線を照射可能な紫外線照射手段と，該格納部に格納された細胞担持用基材に対して窒素プラズマを照射可能なプラズマ照射手段と，前記細胞担持用基材格納部内の湿度を制御可能な加湿手段と，前記細胞担持用基材格納部内のオゾン濃度を制御可能な酸素又はオゾン供給手段を有する細胞担持用基材表面改質装置。
【請求項１４】
更に，前記細胞担持用基材の細胞担持面に対してアンモニア溶液を塗布可能なアンモニア溶液塗布手段を備える，請求項１３に記載の細胞担持用基材表面改質装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，細胞の担持，接着，保存，培養，及び／又は増殖に適した表面を有する細胞担持用基材の製造方法，及び製造装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
接着性細胞は，疎水性表面及び親水性が極めて高い表面に対してはほとんど接着しないのに対し，適切な親水性を有する表面には接着して進展した形態をとることが知られている。特に，水接触角４０〜７０°（非特許文献１）又は６０〜８０°（非特許文献２）の中程度の濡れ性を示す表面に細胞が良く接着することが知られている。よって，このような接着性細胞の接着性及び増殖性に優れる適度な親水性表面を得るための手段が開発されている。これまで，高分子材料表面を親水性とする手法として，コロナ放電処理（特許文献１）等の大気圧プラズマ処理（特許文献２），親水性骨格を含むポリマー鎖のグラフト（特許文献３），表面上にアミノプロピルエチレン無水マレイン酸を結合させて接触角を約１０〜３０°とした基体（特許文献４），及び，両親媒性物質の親水基を表面に提示させる方法（特許文献５）等の化合物修飾などが報告されている。また，表面の親水性の程度をコントロールする方法として，一度高い親水性とした表面を酸化処理及び／又は分解処理することにより，その親水性の程度を下げる方法や，親水性分子と表面とをリンカーを介して結合させ，リンカーの密度により親水性の程度を調節する方法が報告されている（特許文献６）。特にこれらの中でも，コロナ放電処理や大気圧プラズマ処理などの物理的方法は簡便であることから，親水性の細胞培養表面の改質において主要な方法となっている。
【０００３】
このような親水性表面においては，主に水酸基，カルボニル基，及びカルボキシ基などの酸素原子を有する基が親水性の発揮に寄与していると考えられている。しかし，コロナ放電により導入された酸素原子は急速に除去されるため，表面が劣化しやすいという問題があった。さらに，コロナ放電処理は，約２０％の表面酸素しか基材上に提供できないと考えられており，親水性の付与に限界があった。また，プラズマ放電は，コロナ放電よりも高い酸素レベルを達成できるが，基材を真空で処理することが必要であり，処理工程が複雑であった。更に，プラズマ処理は表面を傷つけやすいという問題があった。
【０００４】
高分子材料表面を親水性とするための別のアプローチとして，フッ素樹脂基板等への紫外線レーザー照射（特許文献４）やオゾンを発生させる波長の紫外線を照射する方法（非特許文献３及び４）が報告されている。これらの報告においても，細胞増殖には表面酸素原子の割合が中程度であることが望ましいこと（非特許文献４）が報告されている。また，このようなオゾン／紫外線を用いた方法を改良すべく，オゾン・紫外線処理と生体材料とを組み合わせること（非特許文献５），超高分子ポリエチレンへ酸素原子を導入すること（非特許文献６）などが検討されている。
【０００５】
また，特に，親水性表面を未分化細胞培養用の基材として利用する場合，未分化細胞である幹細胞は培養が難しく，フィーダー細胞，ＬＩＦなどのサイトカイン，又は，マトリゲル（登録商標）やコラーゲン等の細胞外基質タンパク質によるコーティング等の特殊な環境を必要としていた。しかし，これらの技術はいずれも生体由来材料に依存することから安定性が低くロット差による結果の違いを生じること，潜在的なコンタミネーションが生じ得ること，貯蔵における寿命が短いこと等が問題となっていた。
【０００６】
そこで，未分化細胞である幹細胞を培養可能な細胞培養表面をより安定的に化学的改質で作製することが試みられている。例えば，細胞培養表面に膨潤性（メタ）アクリレート層を形成させることにより，これらの問題を解決することが提案されている（特許文献７）。
【０００７】
また，本発明者らは，加湿，酸素又はオゾン供給下でＵＶ処理を行うことにより，ポリスチレン等の表面を接着細胞の培養に適した表面に加工できることを見出し，報告している（特許文献８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平６−９８７５６号公報
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ２０１２／１４４６２４号
【特許文献３】特開２００９−１７８０９号公報
【特許文献４】特表２０１２−５２７８９６号公報
【特許文献５】特開２０１２−１７５９８３号公報
【特許文献６】特表２０１１−５１０６５５号公報
【特許文献７】特開２０１０−６８７５５号公報
【特許文献８】国際公開公報ＷＯ２０１６／１３６２５１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】酒井康行及び民谷栄一監修，「動物実験代替のためのバイオマテリアルデバイス」シーエムシー出版，２０１４年，１３３〜１３４頁
【非特許文献２】Ｙａｓｕｓｈｉ  Ｔａｍａｄａら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２８：７８３−７８９（１９９４）
【非特許文献３】Ｄ．Ｏ．Ｈ．Ｔｅａｒｅら，Ｋａｎｂｍｕｉｒ；１６：２８１８−２８２４（２０００）
【非特許文献４】Ｓ．Ａ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ；２５：４０７９−４０８６（２００４）
【非特許文献５】Ｆａｂｉｏ  Ｆｏｒｍｏｓａら，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；７５：３３０−３４２（２００８）
【非特許文献６】Ａｌｅｘａｎｄｒａ  Ｈ．Ｃ．Ｐｏｕｌｓｓｏｎら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ；２５：３７１８−３７２７（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし，既存の処理方法ではまだ十分な細胞を担持及び培養させるための表面修飾が得られていない。よって，本発明は選りすぐれた細胞を担持及び培養させるための表面修飾の方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは，種々の方法を用いて樹脂基材表面を処理して細胞増殖との関係を調べた結果，加湿環境下，酸素及び／又はオゾン雰囲気中のＵＶ照射とプラズマ処理との両方の処理を行うことにより，細胞接着及び細胞増殖により適した表面が生成されることを見出し，本発明を完成させた。更に，本発明者らは，このような表面が，従来報告した加湿環境下，酸素及び／又はオゾン雰囲気中のＵＶ照射より優れることを見出し，本発明を完成させた。
【００１２】
よって，本発明は，以下の発明を含むものである：
（１）  細胞担持面を有する非フッ素系樹脂を主成分とする細胞担持用基材の製造方法であって，
加湿環境下，酸素及び／又はオゾン供給雰囲気中で，前記基材の細胞担持面にＵＶを照射するＵＶ照射工程，及び
前記基材の細胞担持面にプラズマを照射するプラズマ照射工程
を含む方法。
（２）  前記非フッ素系樹脂が，ポリエチレン，アクリル樹脂，ＡＢＳ樹脂，ポリエチレンテレフタレート，ポリプロピレン，ポリカーボネート，及びポリスチレンからなる群から選択される少なくとも１種類の樹脂である，（１）に記載の細胞担持用基材の製造方法。
（３）  ＵＶ照射工程の後にプラズマ照射工程を行うことを特徴とする，（１）又は（２）に記載の細胞担持用基材の製造方法。
（４）  プラズマ照射工程の後にＵＶ照射工程を行うことを特徴とする，（１）又は（２）に記載の細胞担持用基材の製造方法。
（５）  ＵＶ照射工程とプラズマ照射工程を同時に行うことを特徴とする，（１）又は（２）に記載の細胞担持用基材の製造方法。
（６）  前記ＵＶ照射が，平均波長１８４．９ｎｍ及び２５３．７ｎｍのＵＶを照射することにより行われることを特徴とする，（１）〜（５）のいずれか１項に記載の細胞担持用基材の製造方法。
（７）  前記ＵＶ照射が，前記非フッ素系樹脂表面の水接触角が４０〜７０°となるまでの間行われることを特徴とする，（１）〜（６）のいずれか１項に記載の細胞担持用基材の製造方法。
（８）  さらに，ＵＶ照射工程の前に，該細胞担持面にアンモニア溶液を塗布する工程を備える，（１）〜（７）のいずれか１項に記載の製造方法。
（９）  接着細胞の培養方法であって，（１）〜（８）のいずれか１項に記載の製造方法により得られた細胞担持用基材の細胞担持面上で細胞を培養することを含む培養方法。
（１０）  前記接着細胞が幹細胞である，（９）に記載の培養方法。
（１１）  前記幹細胞が，マウスｉＰＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞である，（１０）に記載の培養方法。
（１２）  フィーダー細胞の非存在下で培養することを特徴とする，（１０）又は（１１）に記載の培養方法。
（１３）  細胞担持面を有する非フッ素系樹脂を主成分とする細胞担持用基材を格納するための格納部と，該格納部に格納された前記細胞担持用基材に対して紫外線を照射可能な紫外線照射手段と，該格納部に格納された細胞担持用基材に対して窒素プラズマを照射可能なプラズマ照射手段と，前記細胞担持用基材格納部内の湿度を制御可能な加湿手段と，前記細胞担持用基材格納部内のオゾン濃度を制御可能な酸素又はオゾン供給手段を有する細胞担持用基材表面改質装置。
（１４）  更に，前記細胞担持用基材の細胞担持面に対してアンモニア溶液を塗布可能なアンモニア塗布手段を備える，（１３）に記載の細胞担持用基材表面改質装置。
【００１３】
本明細書において「細胞担持用基材」とは，細胞を表面上に担持させて用いられる基材のことであり，細胞の担持，接着，保存，培養，及び／又は増殖を目的とする基材であってもよい。例えば，細胞担持用基材は，細胞培養用基材（例えば，細胞培養用容器），細胞保存用基材，又はインプラント用基材などを含む。本明細書における細胞担持用基材が担持する細胞は，接着細胞であれば特に制限されるものではなく，例えば，平滑筋細胞，内皮細胞，線維芽細胞，骨芽細胞，幹細胞などの哺乳類細胞を含み，好ましくは，幹細胞である。本明細書において，幹細胞とは，ｉＰＳ細胞，ＥＳ細胞，間葉系幹細胞などを含み，マウス，ラット，ウサギ，イヌ，サル，及びヒトの細胞を含むが，好ましくは，マウスｉＰＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞である。また，本明細書における細胞担持用基材の形状は，その目的に応じて適宜選択することができ，例えば，プレート状，シート状，球状，ディッシュ状，チップ状，又は，所望の組織（例えば，人工骨又はその表面部分）の形状とすることができる。好ましくは，細胞担持用基材は，接着細胞培養用容器又は接着細胞保存用容器であり，より好ましくは，ｉＰＳ細胞培養用容器又はｉＰＳ細胞保存用容器である。
【００１４】
本明細書における細胞担持用基材は，主成分として非フッ素系樹脂を含有するが，必要に応じて「他の成分」を含有していても良い。例えば，必要に応じて，マトリゲル（登録商標），ラミニン，コラーゲン又はフィブロネクチンなどの他の細胞接着に寄与する物質を適宜含んでいても良い。例えば，本明細書における細胞担持用基材は，マトリゲルを２０〜８０μｇ／ｃｍ２，３０〜７０μｇ／ｃｍ２，又は４０〜６０μｇ／ｃｍ２含有する。また，例えば，本明細書における細胞担持用基材は，０．１〜１μｇ／ｃｍ２，０．３〜０．８μｇ／ｃｍ２，又は０．５μｇ／ｃｍ２の濃度で，ラミニンを含有していてもよい。
【００１５】
本明細書において，「非フッ素系樹脂」とは，フッ素を含有しない樹脂を意味し，例えば，ポリエチレン，超高分子ポリエチレン，ポリプロピレン，ポリスチレン，ポリ塩化ビニル，ポリビニルアルコール，アクリル樹脂，ポリエチレンテレフタレート，ポリアセタール，ポリカーボネート，ポリアミド，ポリイミド樹脂，フェノール樹脂，アミノ樹脂，エポキシ樹脂，ポリエステル，及びアクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合合成樹脂（ＡＢＳ樹脂）を挙げることができる。これらのうち，好ましくは，ポリスチレンである。ポリスチレンは立体規則性（タクティシティー，ｔａｃｔｉｃｉｔｙ）を有し，イソタクチック(アイソタクチック)型，シンジオタクチック型，アタクチック型が存在するが，本発明におけるポリスチレンの型は限定されるものではなく，これらのいずれの型，又はこれらのうち２種類以上の型の混合物であってもよく，通常はアタクチック型が汎用される。またポリスチレンは高分子化合物であるため種々の重合度（平均分子量）の製品が供給されているが，本発明においては限定されない。例えば，重合度が１０〜１００，０００，５０〜１０，０００とすることができる。従って各社が供給するポリスチレン製培養用ディッシュには材質・物性上の差異が存在し得るが本発明においては限定されず，いずれの製造元の培養用ディッシュを使用することができる。一例として，ＩＷＡＫＩ（登録商標）組織培養用ディッシュ（ＡＧＣテクノグラス株式会社）を挙げることができる。
【００１６】
本発明の細胞担持用基材は少なくともその一部に細胞担持面を有する。本明細書において，「細胞担持面」とは，細胞を担持，接着，保存，培養，及び／又は増殖させることができる表面を意味し，必ずしも当該表面上で細胞を培養し又は増殖させることを必要とするものではない。また，細胞担持面は，平面，曲面，波状面，球体表面等，いかなる形状であっても良い。
【００１７】
一態様において，本発明の細胞担持用基材の細胞担持面は，ケミカルシフトを生じたＣ−Ｃ結合及び／又はＣ−Ｈ結合を表面に有する。本明細書において「ケミカルシフトを生じたＣ−Ｃ結合及び／又はＣ−Ｈ結合」とは，ポリスチレンの分子構造に酸素原子が組み込まれたことによって結合状態が変化した構造であって，酸素原子を含まない構造である。即ち，ケミカルシフトを生じたＣ−Ｃ結合及び／又はＣ−Ｈ結合とは，ポリスチレンに含まれないＣ−Ｃ結合及び／又はＣ−Ｈを意味し，Ｃ−Ｈ，Ｃ−Ｃ及びＣ−Ｐｈ以外の構造を意味する。本発明の細胞担持面は，酸素原子の導入された基（ＯＨ，ＣＯＯＨ，Ｃ＝Ｏなど）が極めて少ないにもかかわらず，接触角が減少している。よって，この接触角の減少はケミカルシフトを生じたＣ−Ｃ結合及び／又はＣ−Ｈ結合によりもたらされたものと考えられる。
【００１８】
細胞培養表面上のカルボキシ基（ＣＯＯＨ基）は細胞にとって良くない影響を及ぼすと考えられている。本発明の細胞担持用基材の細胞担持面は，非加湿下の同条件においてＵＶ／オゾン処理された細胞担持用基材と比較して極めて少ない量のカルボキシ基しか有しない。よって，本発明の細胞担持用基材は，細胞担持面に実質的にカルボキシ基が存在しない。ここで，「実質的に存在しない」とは，全く存在しないことを意味するのではなく，細胞培養に影響を与える程度に存在しないことを意味し，好ましくは，非加湿下の同条件においてＵＶ／オゾン処理された細胞担持用基材と比較して極めて少ないことを意味し，より好ましくは，Ｃ（１ｓ）ナロースキャンＸＰＳスペクトルにおいてほとんど検出されないか，又は検出されないことを意味してもよい。
【００１９】
本発明の細胞担持用基材は，細胞担持面の水接触角が中程度であり，例えば，３０〜８０°，３０〜７０°，３０〜６０°，４０〜８０°，４０〜７０°，４０〜６０°である。好ましくは，前記水接触角は，４０〜６０°である。好ましくは，本明細書における接触角は，自動接触角計にて試料に１μＬの純水を滴下しθ／２法により測定される接触角である。また，本発明の細胞担持用基材は，細胞接着性表面の保存安定性に優れる。このため，本発明の細胞担持用基材は，好ましくは，ＵＶ照射から２４時間後及び１週間密閉保管の表面の水接触角がいずれも，前記接触角の範囲内であり，好ましくは，ＵＶ照射から２４時間後及び１ヶ月密閉保管の表面の水接触角がいずれも，前記接触角の範囲内である。即ち，本発明の細胞担持用基材は，好ましくは，ＵＶ照射から１週間密閉保管後又は１月密閉保管後においても，優れた細胞接着性を維持するものである。
【００２０】
一態様において，本発明の細胞担持用基材の細胞担持面は，フィーダー細胞（足場細胞）及び細胞外基質タンパク質コーティングの非存在下又はより低濃度の細胞外基質タンパク質コーティング存在下においても，幹細胞を未分化の状態で担持し又は増殖させることができる。例えば，本発明の細胞担持用基材の細胞担持面は，フィーダー細胞及び細胞外基質タンパク質コーティングがなくても，１２９／Ｏｌａ系統由来マウス胚性幹細胞であるＥＢ３細胞（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌ．（２００２）２２：１５２６−３６；Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ（２００４）９：４７１−７）が増殖することができる表面であってもよい。又は，前記細胞担持面は，表面未処理の前記非フッ素系樹脂を主成分とする基材において幹細胞を接着させるために必要なマトリゲル（登録商標）の濃度の０．２倍の濃度においても，幹細胞（例えば，ヒトｉＰＳ細胞又はマウスｉＰＳ細胞）が接着し又は増殖することができる表面であってもよい。あるいは，前記細胞担持面は，表面未処理の前記非フッ素系樹脂を主成分とする基材において幹細胞を接着させるために必要なラミニンの濃度の０．５倍の濃度においても，幹細胞（例えば，ヒトｉＰＳ細胞又はマウスｉＰＳ細胞）が接着し又は増殖することができる表面であってもよい。
【００２１】
具体的な態様において，本発明は，上記細胞担持用基材を備える，接着細胞用の細胞培養容器に関する。細胞培養容器としては，プレート状，シート状，球状，ディッシュ状，チップ状，繊維状，又はフラスコ状の培養容器を挙げることができる。
【００２２】
また，別の態様において，本発明は，前記方法を実現するための装置に関し，具体的には，細胞担持面を有する非フッ素系樹脂を主成分とする細胞担持用基材を格納するための格納部と，該格納部に格納された前記細胞担持用基材に対して紫外線を照射可能な紫外線照射手段と，該格納部に格納された細胞担持用基材に対して窒素プラズマを照射可能なプラズマ照射手段と，前記細胞担持用基材格納部内の湿度を制御可能な加湿手段と，前記細胞担持用基材格納部内のオゾン濃度を制御可能な酸素又はオゾン供給手段を有するように構成された細胞担持用基材表面改質装置に関する。このような構成において，紫外線照射手段は，紫外光（１００〜４００ｎｍの範囲の電磁波）を発生可能な光源，例えば，水銀ランプ又はＬＥＤを有する。好ましくは，紫外線照射手段は，本明細書に記載するＵＶ照射工程を実施可能な光源を有する。プラズマ照射手段は，チャンバー内に窒素ガス圧力を一定の減圧状態に保つ減圧部，電極間に印加した直流電圧，高周波電圧，マイクロ波などによる電界によって電子を加速する電子加速部，加速された電子とガス分子との衝突による電離を利用してプラズマを生成させるプラズマ生成部を有する。加湿手段は，水保持部を有し，必要に応じて水保持部から供給された水を加温して水蒸気を発生させる加温部を有していてもよい。酸素又はオゾン供給手段は，酸素ガス又はオゾンガスを格納部内に供給するものである。オゾンガスは，まず酸素ガスを供給して前記紫外線供給手段により紫外線を照射して発生させてもよいし，酸素ガスを放電式オゾン発生器によりオゾンに変換してから格納部に供給してもよい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の細胞担持用基材の製造方法は，より簡便な方法で安定的に細胞接着に適した親水性を付与することができる。また，本発明の細胞担持用基材は，生体由来材料を用いる必要が無いか，従来より少ない量で幹細胞を含む接着細胞を培養することができることから安定性が高くロット差による結果の違いを生じにくい他，より安価に培養することができる。また，動物由来成分を使用せず，又は使用量を減らすことができ得ることから潜在的なコンタミネーションの問題を減少させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＵＶ／オゾン表面改質装置の内部構造を示す図面である。
【図２】未処理ポリスチレンのワイドスキャンスペクトルを示すグラフである。縦軸は光電子強度を，横軸は結合エネルギー（ｅＶ）を表す（以下，図３〜図９においても同じ）。
【図３】未処理ポリスチレンのＣ１ｓのナロースキャンスペクトルを示すグラフである。
【図４】（Ａ）ＵＶ１ｍｉｎのＣ１ｓのナロースキャンスペクトルを示すグラフである。（Ｂ）ＵＶ３ｍｉｎのＣ１ｓのナロースキャンスペクトルを示すグラフである。（Ｃ）ＵＶ１０ｍｉｎのＣ１ｓのナロースキャンスペクトルを示すグラフである。
【図５】（Ａ）Ｐｌａｓｍａ５ｓのＣ１ｓのナロースキャンスペクトルを示すグラフである。（Ｂ）Ｐｌａｓｍａ４０ｓのＣ１ｓのナロースキャンスペクトルを示すグラフである。（Ｃ）Ｐｌａｓｍａ１６０ｓのＣ１ｓのナロースキャンスペクトルを示すグラフである。
【図６】Ｏ１ｓのナロースキャンスペクトルを示すグラフである。
【図７】Ｎ１ｓのナロースキャンスペクトルを示すグラフである。
【図８】（Ａ）ＵＶ／ｏｚｏｎｅ３ｍｉｎ→プラズマ４０ｓのＣ１ｓのナロースキャンスペクトルを示すグラフである。（Ｂ）プラズマ４０ｓ→ＵＶ／ｏｚｏｎｅ３ｍｉｎのＣ１ｓのナロースキャンスペクトルを表すグラフである。
【図９】（Ａ）ＵＶ／ｏｚｏｎｅ１０ｍｉｎ→プラズマ１６０ｓのＣ１ｓのナロースキャンスペクトルを表すグラフである。（Ｂ）プラズマ１６０ｓ→ＵＶ／ｏｚｏｎｅ１０ｍｉｎのＣ１ｓのナロースキャンスペクトルを表すグラフである。
【図１０】表面改質ポリスチレン製培養ディッシュ細胞上で培養したマウスＥＳ細胞（ＥＳ−Ｄ３株）の写真である。（ａ）未処理ディッシュ，（ｂ）ＵＶ／ｏｚｏｎｅ単独処理１０ｍｉｎ，（ｃ）大気圧プラズマ１０ｓ，（ｄ）大気圧プラズマ１０ｓ→ＵＶ／ｏｚｏｎｅ  １０ｍｉｎ，（ｅ）ＵＶ／ｏｚｏｎｅ  １０ｍｉｎ→大気圧プラズマ１０ｓ。
【図１１】未処理，ゼラチンコート，ＵＶ／ｏｚｏｎｅまたはプラズマ単独，ＵＶ／ｏｚｏｎｅ・プラズマ複合改質基材上で培養したマウスＥＳ細胞（ＥＳ−Ｂ３株）の総ＤＮＡ量を示すグラフである。
【図１２】表面改質ポリスチレン製培養ディッシュ細胞上で培養したマウスｉＰＳ細胞（ＡＰＳ０００１株）の写真である。右側は蛍光顕微鏡によるＧＦＰ発現の観察像を示す。（ａ）フィーダー細胞上の通常培養，（ｂ）ＵＶ／ｏｚｏｎｅ  ３ｍｉｎ→大気圧プラズマ４０ｓ，（ｃ）未処理ディッシュ。
【図１３】本発明にかかる細胞担持用基材表面改質装置の構成図である。
【図１４】マルチチャンバークラスターツールである細胞担持用基材表面改質装置の構成図である。
【図１５】図１４のマルチチャンバーの紫外線処理部の構成図である。
【図１６】図１４のマルチチャンバーのプラズマ処理部の構成図である。
【図１７】アンモニア処理表面改質ポリスチレン製培養ディッシュ細胞上で培養したヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ４株）の写真である。左から順に，推奨使用量（×１．０）マトリゲル添加群，推奨使用量の０．２倍（×０．２）のマトリゲル添加群，ＵＶ３０ｓ処理→大気圧プラズマ８０ｓ処理した×０．２マトリゲル添加群，アンモニウム塗布後にＵＶ３０ｓ処理→大気圧プラズマ８０ｓ処理した×０．２マトリゲル添加群を表す。スケールバーは２００μｍを表す。
【図１８】推奨使用量の０．２倍（×０．２）のマトリゲル添加群の細胞数をカウントしたグラフを表す。グラフは左から順に，表面改質なし，ＵＶ３０ｓ処理，ＵＶ３０ｓ処理→大気圧プラズマ８０ｓ処理，及びアンモニウム塗布後にＵＶ３０ｓ処理→大気圧プラズマ８０ｓ処理したディッシュの結果を表す。縦軸は，推奨使用量（×１．０）マトリゲル添加ディッシュで培養された細胞数を１．０としたときの相対的な細胞数を表す。星印はｐ＜０．０５ｖｓ（表面改質なしの細胞数）を表す。
【図１９】アンモニア処理表面改質ポリスチレン製培養ディッシュ細胞上で培養したヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ４株）の写真である。上段左から順に，推奨使用量（×１．０）ラミニン添加群，推奨使用量の０．３倍（×０．３）のラミニン添加群，ＵＶ３０ｓ処理した×０．３ラミニン添加群，下段左から順に，ＵＶ３０ｓ処理→大気圧プラズマ６０ｓ処理した×０．３ラミニン添加群，アンモニウム塗布後にＵＶ３０ｓ処理→大気圧プラズマ６０ｓ処理した×０．３ラミニン添加群を表す。スケールバーは４００μｍを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
１．細胞担持用基材の製造方法
本発明の細胞担持用基材の製造方法は，ＵＶ照射工程及びプラズマ照射工程の両方を含むことを特徴とする。
【００２６】
（１）ＵＶ照射工程
ＵＶ照射工程は，非フッ素系樹脂を主成分とする基材の周囲を加湿し，前記加湿中及び／又は加湿後，すなわち加湿環境化において，該基材を酸素及び／又はオゾン雰囲気中でＵＶを照射することにより行うことができる。
【００２７】
（加湿）
加湿は，非フッ素系樹脂を主成分とする基材の周囲に水蒸気を提供することができる方法であれば，いかなる方法を用いて行われても良い。加湿は，ＵＶを照射する基材表面が水蒸気に曝されるように行われる。すなわち，次のＵＶ照射工程は加湿環境下で行われる。また，必ずしも基材の全ての面が水蒸気に曝されることを必要としない。例えば，加湿は，前記樹脂を内包する外界とは遮断された一定容積を有する容器又は装置内において，水を加熱することにより行うことができる。加湿後の湿度（例えば，ＵＶ照射時の湿度）としては，例えば，２０〜６０％ＲＨとすることができ，好ましくは，３０℃では４０〜５０％ＲＨ，４０℃では２０〜３０％である。加湿は，ＵＶ照射時に基材の周囲に水蒸気が存在する環境，又は，ＵＶが照射される基材表面が水蒸気に曝される環境とすることができればよく，ＵＶ照射前及び／又はＵＶ照射中に行うことができるが，好ましくは，ＵＶ照射前及びＵＶ照射中に行う。
【００２８】
（ＵＶ照射）
ＵＶ照射は，酸素及び／又はオゾン雰囲気中で前記基材に対してＵＶを照射することにより行う。照射するＵＶは平均波長が１８４．９ｎｍ及び２５３．７ｎｍとすることができる。ＵＶの波長は分光放射計を用いて測定することができる。ＵＶは，例えば，ＵＶ照度として，２０００〜５０００μＷ／ｃｍ２，２５００〜４５００μＷ／ｃｍ２，３０００〜４０００μＷ／ｃｍ２，３２００〜３８００μＷ／ｃｍ２，又は３５００μＷ／ｃｍ２で行うことができる。ＵＶランプから各プレートまでの距離は，２〜６ｃｍ，３〜５ｃｍ，３．５〜４．５ｃｍ，３．６〜４．４ｃｍ，３．７〜４．３ｃｍ，３．８〜４．２ｃｍ，３．９〜４．１ｃｍ，又は４ｃｍとすることができる。ＵＶ照射時間は，非フッ素系樹脂表面の水接触角が，例えば，４０〜９０°，４０〜８０°，４０〜７０°，５０〜９０°，５０〜８０°，５０〜７０°，５５〜６５℃，６０〜９０°，６０〜８０°，６０〜７０°，７０〜９０°，又は７０〜８０°となるまでの間行うことができる。あるいは，ＵＶ照射時間は，１〜２０分間，１〜１５分間，１〜１０分間，３〜２０分間，３〜１５分間，３〜１０分間，５〜２０分間，５〜１５分間，又は５〜１０分間とすることができる。
【００２９】
酸素雰囲気とは，基材周辺の酸素濃度が８０％以上（好ましくは９０％以上）であることを意味する。酸素（例えば，９９％酸素）（例えば，乾燥酸素）を一定時間（例えば，５分間）基材を保持する環境に供給することにより酸素雰囲気とすることができる。また，オゾン雰囲気とは，オゾン濃度が４００ｐｐｍ以上（好ましくは４５０ｐｐｍ以上）であることを意味する。酸素を放電方式オゾン発生器に通気することにより，オゾンを発生させて基材を保持する環境に供給することにより，オゾン雰囲気とすることができる。酸素雰囲気中でもＵＶ照射によりオゾンは発生するが，オゾン雰囲気中でＵＶ照射することにより，基材表面上にケミカルシフトを生じたＣ−Ｃ結合及び／又はＣ−Ｈ結合が増加することから，好ましくは，オゾン雰囲気中（酸素及びオゾン雰囲気中を含む）でＵＶを照射する。
【００３０】
ＵＶ照射工程は，基材表面にケミカルシフトを生じたＣ−Ｃ結合及び／又はＣ−Ｈ結合を導入することに加え，基材表面の水接触角を減少させて親水性を付与する。また，カルボキシ基は，基材表面を親水性にするものの反応性が高いことから細胞培養には適さないが，本発明のＵＶ照射工程は基材表面にほとんどカルボキシ基を導入しないことから，細胞培養に適した親水性表面を提供する。
【００３１】
（２）プラズマ照射工程
プラズマ照射工程に用いられるプラズマ発生源としては，特に限定されるものではないが，水素，ヘリウム，希ガス，酸素，窒素，ハロゲン，アンモニア，二酸化炭素，水蒸気，又はこれらの任意の２種類以上のガスの混合ガスを挙げることができる。プラズマ照射は，１又は複数回行うことができる。供給ガスの圧力は，０．００１〜１０ＭＰａ，０．０１〜１ＭＰａ，０．０５〜０．１５ＭＰａ，又は０．１〜０．２ＭＰａとすることができる。プラズマ照射１回当りの供給ガス流量は，任意の流量とすることができるが，例えば，安定的にプラズマを発生させるために，２〜３０Ｌ／分，３〜２０Ｌ／分，５〜１５Ｌ／分，８〜１２Ｌ／分，又は１０Ｌ／分とすることができる。プラズマ照射口と基材表面との距離は，１〜３０ｍｍ，３〜２０ｍｍ，５〜１５ｍｍ，８〜１２ｍｍ，又は１０ｍｍとすることができる。また，プラズマ照射時間は，１〜５００秒であってもよく，例えば，２〜３００秒，３〜２００秒，又は５〜１６０秒とすることができる。
【００３２】
（３）アンモニア溶液塗布工程
本発明の製造方法は，ＵＶ照射前にアンモニア溶液を塗布する工程を含んでいてもよい。アンモニア溶液の塗布は，基材の細胞担持面にアンモニア（ＮＨ３）を含有する液体を接触させることにより行うことができる。アンモニアは水，ＰＢＳ，培地などの液体に溶解させて，アンモニア溶液として塗布することができる。アンモニア溶液の濃度は特に限定されるものではないが，１〜５０％，５〜４０％，１０〜３０％とすることができる。アンモニアは揮発性であるため，アンモニア塗布の後，速やかにＵＶ／プラズマ処理行うことが望ましい。
【００３３】
２．細胞担持用基材を用いた細胞培養方法
一態様において，本発明は接着性細胞の培養方法であって，上述の細胞培養容器の細胞担持面上で細胞を培養することを含む培養方法に関する。細胞の培養は，通常，細胞培養容器に培地を添加すること，当該培地中に所望の細胞を播種すること，及び，当該培地と細胞との混合物をインキュベータ（通常は，５％ＣＯ２，３７℃）内で静置することにより行うことができる。培養は，細胞が接着するまでの期間又は細胞が所望の数まで分裂するまでの期間行うことができ，例えば，数時間〜数週間行うことができる。培養が長期間の場合，必要に応じて培地交換することが望ましい。
【００３４】
本明細書における細胞の培養方法において，使用する「培地」は，当業者に知られた培地の中から使用する細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば，幹細胞（例えば，ｉＰＳ細胞）を培養する場合，間葉系細胞用ＤＭＥＭ，間葉系細胞用ＭＳＣＢＭ，ＥＣ細胞用培地，間葉系細胞用培地，ＥＳ細胞用培地，ｉＰＳ細胞用培地，幹細胞用の培地，ｉＳＴＥＭ，Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）  ＤＥＦ−ＣＳ  ５００  Ｘｅｎｏ−Ｆｒｅｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ，ＧＳ２−Ｍ（登録商標），ＧＳ１−Ｒ（登録商標）（以上，タカラバイオ株式会社），Ｐｏｗｅｒｅｄｂｙ１０，Ｐｌｕｓｏｉｄ−Ｍ，Ｇ０３１１０１，Ｍ０６１１０１，ＳＯＤＡＴＴ２０１（以上，株式会社グライコテクニカ），ＲｅｐｒｏＦＦ２，ＲｅｐｒｏＮａｉｖｅ，ＲＣＨＥＭＤ００１，ＲＣＨＥＭＤ００１Ａ，ＲＣＨＥＭＤ００１Ｂ，ＲｅｐｒｏＳｔｅｍ，ＲｅｐｒｏＸＦ，ＲｅｐｒｏＦＦ２，ＲｅｐｒｏＦＦ，ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（以上，株式会社リプロセル），ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ等のＳｔｅｍ  ｆｉｔ培地（ＡＪＩＮＯＭＯＴＯ）を使用することができる。
【００３５】
本明細書における細胞の培養方法において，培養する接着性細胞は特に限定されるものではないが，好ましくは幹細胞（ｉＰＳ細胞を含む）である。幹細胞は，本発明の培養方法を用いることにより，フィーダー細胞及び細胞外基質タンパク質コーティング（ラミニン，マトリゲル（登録商標）等）非存在下又は従来より低濃度の細胞外基質タンパク質コーティングにおいても培養することができることから，生体由来材料を用いることによる安定性の低下やロット差による結果の違い，又はコンタミネーションを生じにくい。また，本発明に細胞培養方法により幹細胞を培養する場合，幹細胞としての性質（分化能，及び自己増殖能）を維持することができる。よって，本発明の細胞培養方法は，生体由来材料を用いることなく，幹細胞を培養することができることから，より安定的に安全な再生医療材料を調製することができる。
【００３６】
例えば，本発明の培養方法は，上述の細胞培養容器の細胞担持面上で細胞を培養することを含む培養方法であって，フィーダー細胞の非存在下で培養することを特徴とする培養方法であってもよい。また，本発明の培養方法は，表面未処理の前記非フッ素系樹脂を主成分とする基材において幹細胞を接着させるために通常必要なマトリゲル（登録商標）の濃度の０．２倍以上１倍未満（例えば，０．２倍〜０．９倍，０．２倍〜０．８倍，０．２倍〜０．７倍，０．２倍〜０．６倍，０．２倍〜０．５倍，０．２倍〜０．４倍，０．２倍〜０．３倍，０．２倍，０．３倍〜０．９倍，０．３倍〜０．８倍，０．３倍〜０．７倍，０．３倍〜０．６倍，０．３倍〜０．５倍，０．３倍〜０．４倍，０．３倍，０．４倍〜０．９倍，０．４倍〜０．８倍，０．４倍〜０．７倍，０．４倍〜０．６倍，０．４倍〜０．５倍，０．４倍，０．５倍〜０．９倍，０．５倍〜０．８倍，０．５倍〜０．７倍，０．５倍〜０．６倍，又は０．５倍）の濃度のマトリゲル（登録商標）存在下で培養することを特徴とする，前記培養方法であってもよい。本明細書において，「表面未処理の前記非フッ素系樹脂を主成分とする基材」とは，表面が当該基材の主成分である前記非フッ素系樹脂のみからなる基材を意味する。また，本明細書において，表面未処理の前記非フッ素系樹脂を主成分とする基材において幹細胞を接着させるために通常必要なマトリゲル（登録商標）の濃度のマトリゲル（登録商標）（１倍）とは，マトリゲル（登録商標）Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｄｕｃｅｄ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）１７０μｌに対してＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１０ｍｌの割合でとかし，培養皿表面を常温１時間でコーティングしたものを意味する。
【００３７】
更に，本発明の培養方法は，表面未処理の前記非フッ素系樹脂を主成分とする基材において幹細胞を接着させるために通常必要なラミニンの濃度の０．２倍以上１倍未満（例えば，０．２倍〜０．９倍，０．２倍〜０．８倍，０．２倍〜０．７倍，０．２倍〜０．６倍，０．２倍〜０．５倍，０．２倍〜０．４倍，０．２倍〜０．３倍，０．２倍，０．３倍〜０．９倍，０．３倍〜０．８倍，０．３倍〜０．７倍，０．３倍〜０．６倍，０．３倍〜０．５倍，０．３倍〜０．４倍，０．３倍，０．４倍〜０．９倍，０．４倍〜０．８倍，０．４倍〜０．７倍，０．４倍〜０．６倍，０．４倍〜０．５倍，０．４倍，０．５倍〜０．９倍，０．５倍〜０．８倍，０．５倍〜０．７倍，０．５倍〜０．６倍，又は０．５倍）の濃度のラミニン存在下で培養することを特徴とする，前記培養方法であってもよい。本明細書において表面未処理の前記非フッ素系樹脂を主成分とする基材において幹細胞を接着させるために通常必要なラミニンの濃度（１倍）とは，最終的に０．５μｇ／ｃｍ２になるように，ｉＭａｔｒｉｘ（１μｇ／μｌ）をＰＢＳ希釈した後，３７℃，５％ＣＯ２インキュベータで１時間インキュベートしコートしたものを意味する。また，本明細書において，ラミニンは，代表的にはラミニン５１１Ｅ８である。
【００３８】
本発明にかかる細胞担持用基材表面改質装置の一実施例を添付図面に基づいて説明する。図１３は，一つの格納部８からなる本発明にかかる細胞担持用基材表面改質装置の構成図である。窒素ガス供給路１から供給された窒素ガスは，高周波電源４と接続した高周波コイル３を有するプラズマ発生部２によりプラズマに変換され，窒素プラズマとして細胞担持用基材９に照射される。一方，紫外線発生部６において発生した紫外線１１は，直接又は放物面ミラー５により反射して細胞担持用基材９に照射される。細胞担持用基材表面改質装置は更に，細胞担持用基材９を出し入れするバルブ７，及び酸素又はオゾンガス注入口１０を備える。また，図には示されていないが，本実施態様の細胞担持用基材表面改質装置は加湿手段を備える。バルブ７より挿入された細胞担持用基材は，プラズマ発生部２から照射されるプラズマ及び紫外線発生部６より照射される紫外線により表面が改質される。
【００３９】
図１４は，格納部１４，格納部１５，格納部１６，及び格納部１７の複数の格納部を有し，プラズマ処理及び紫外線処理がそれぞれ異なる格納部で行われる本発明にかかる細胞担持用基材表面改質装置の構成図である。細胞担持用基材設置部１８に設置された細胞担持用基材９は，基材輸送機構１２及び基材輸送機構１３により，格納部１４，格納部１５，格納部１６，格納部１７に輸送される。格納部１４，格納部１５，格納部１６，格納部１７は，それぞれ，図１５に記載の紫外線処理用の格納部，又は図１６に記載のプラズマ処理用の格納部のいずれかの構成を有する。なお，格納部１４，格納部１５，格納部１６，及び格納部１７のうち，少なくとも１つは紫外線処理用の格納部であり，少なくとも一つはプラズマ処理用の格納部である。格納部１４，格納部１５，格納部１６，格納部１７に輸送された細胞担持用基材９は，各格納部に設置された紫外線発生部からの紫外線照射又はプラズマ照射部によるプラズマ照射により，その表面が改質される。
【００４０】
図１５は，図１４に記載の細胞担持用基材表面改質装置における格納部のうち，紫外線処理用格納部１９の構成図である。紫外線発生部６において発生した紫外線は，直接又は放物面ミラー５により反射して細胞担持用基材９に照射される。紫外線処理用格納部１９は，細胞担持用基材９を出し入れするバルブ７，及び酸素又はオゾンガス注入口１０を備える。また，図には示されていないが，紫外線処理用格納部１９は加湿手段を備える。
【００４１】
図１６は，図１４に記載の細胞担持用基材表面改質装置における格納部のうち，プラズマ処理用格納部２０の構成図である。窒素ガス供給路１から供給された窒素ガスは，高周波電源４と接続した高周波コイル３を有するプラズマ発生部２によりプラズマに変換され，窒素プラズマとして細胞担持用基材９に照射される。一方，細胞担持用基材表面改質装置は更に，細胞担持用基材９を出し入れするバルブ７を備える。
【実施例】
【００４２】
以下，実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが，本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお，本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【００４３】
（実施例１）ＵＶ／ｏｚｏｎｅ・大気圧プラズマ複合改質処理
（１）ＵＶ／ｏｚｏｎｅ表面改質
ＵＶ／ｏｚｏｎｅ表面改質は，ｏｚｏｎｅ発生ＵＶ曝露装置（細胞アレイヤー，ＥＫＢＩＯ−１１００，荏原実業）を用いて実施した（図１）。装置内部には波長が１８５ｎｍ及び２５４ｎｍの２種類のＵＶを照射できる低圧水銀ランプが２本設置されている。また，本装置には酸素ボンベから装置内に酸素を充填する酸素パージが可能であり，ＵＶを照射する前に槽内の空気を除去して酸素で充たすことができる。酸素への紫外線の照射により，酸素分子が乖離し，培養基材表面にオゾン及び活性酸素が生成することで基材表面への酸素原子の導入が可能となる。本実施例では，酸素供給圧力０．１ＭＰａ，供給流量４Ｌ／ｍｉｎ，パージ時間５ｍｉｎによる酸素パージを実施，槽内の雰囲気温度及び加湿槽の水温は共に２５℃に設定している。また，ＵＶの照射距離は４０ｍｍで一定とした。
【００４４】
（２）大気圧プラズマ表面処理
大気圧プラズマ表面処理は，ペン型大気圧プラズマ装置を用いて実施した。プラズマ発生源として窒素ガス（Ｎ２）を用い，大気圧低温プラズマを生成することで処理対象物に対して熱，電荷ダメージを与えずに窒素原子を導入する表面改質を実施することができる。本実施例では，窒素ガス供給圧力０．１〜０．２ＭＰａ，供給流量１０Ｌ／ｍｉｎとし，照射距離は１０ｍｍで一定とした。
【００４５】
（３）ＵＶ／ｏｚｏｎｅ・大気圧プラズマ複合改質処理による培養基材の作製
本実施例では，直径６０ｍｍのポリスチレン製細胞用培養ディッシュ（４３０５８９，Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いた。表面改質はＵＶ／ｏｚｏｎｅ表面改質の単独改質処理ではＵＶを１分，３分，又は１０分間照射した試料を用意した。また，大気圧プラズマ処理の単独改質処理ではプラズマを５秒，４０秒，１６０秒間照射した試料を用意した。また，ｃｏｎｔｒｏｌ群として表面改質を施していない未処理の試料も用意した。ＵＶ／ｏｚｏｎｅ表面改質と大気圧プラズマ処理を複合プロセス化して施した試料として，上記のＵＶ照射時間のＵＶ／ｏｚｏｎｅ表面改質とプラズマ照射時間の大気圧プラズマ処理を，ＵＶ／ｏｚｏｎｅ表面改質と大気圧プラズマ処理の順番を前後で入れ替えて実施した。詳細な改質条件を表１に示す。
【００４６】
【表１】
2019017387.tif 000003
【００４７】
（実施例２）ＸＰＳ分析
実施例１において作製した試料について，ＸＰＳによる表面分子構造の分析を実施して，本発明による表面改質が表面性状の改質に与える効果を検討した。各ディッシュから８ｍｍ各のプレートを切り出して，光電子分光装置（日本電子株式会社，ＪＰＳ−９０１０）を用いて表面分析を行った。各試料を試料台に貼付し，試料台を準備室に入れて真空引きを行った後，試料台を測定室に挿入した。本分析で使用する試料はポリスチレン製であるため，構成元素は炭素及び酸素である（水素も構成元素ではあるが，水素は電子が１個しか存在しないので，ＸＰＳでは測定ができない）。従って，本分析では，ワイドスキャンは行わず，炭素の１ｓ軌道の電子のナロースキャンスペクトルを取得した。Ｘ線はＡｌＫａ線（１４８６．６ｅＶ）を用い，炭素のナロースキャンの測定範囲は２９４．０〜２８０．０ｅＶとした．また，ステップ幅は０．１ｅＶ，積算回数は１０回とした。スペクトルを取得後，ステップ数５でスムージングによるスペクトルの平滑化を行った。非弾性散乱した電子やノイズが原因で発生するスペクトルのバックグラウンドの除去は，シャーリーバックグラウンド除去を利用して行った。スペクトルの波形分離は，成分波形をガウス−ローレンツ関数の正規分布型の関数で近似して行った。
【００４８】
Ｃｏｎｔｒｏｌ群の試料のワイドスキャンスペクトルを図２に，Ｃ（１ｓ）のナロースキャンスペクトルを図３に示す。処理試料のＣ（１ｓ）のナロースキャンスペクトル及び波形分離を図４〜図６に示す。各表面改質処理を単独で施した試料群の分析におけるＯ（１ｓ）のナロースキャンスペクトルを図６に示す。また，大気圧プラズマ処理を単独で施した試料群の分析におけるＮ（１ｓ）のナロースキャンスペクトルを図７に示す。さらに，図８にＵＶ照射３ｍｉｎとプラズマ照射４０ｓの複合処理を施した試料のＣ（１ｓ）のナロースキャンスペクトルを，図９に，ＵＶ照射１０ｍｉｎとプラズマ照射１６０ｓの複合処理を施した試料のＣ（１ｓ）のナロースキャンスペクトルを示す。
【００４９】
ＵＶ／ｏｚｏｎｅ表面改質を施した試料ではＵＶの照射時間の増加に伴って酸素の発現量も増加した（図６）。また，ＵＶの照射時間が短いときはカルボキシ基（ＣＯＯＨ）のみが発現し，ＵＶの照射時間が長いときはＣＯＯＨに加えて炭素と酸素の単結合（Ｃ−Ｏ）が発現することが分かった（図４）。以上の結果より，ＵＶ／ｏｚｏｎｅ表面改質では，ＵＶ照射時間の増加に伴ってＣＯＯＨ，Ｃ−Ｏの順で官能基が導入されることが示された。
【００５０】
次に，大気圧プラズマ処理を施した試料ではｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して酸素の発現量が増加し，プラズマ照射時間の増加に伴い酸素の発現量の増加が認められた（図６）。また，プラズマ照射時間が増加すると窒素の発現量の増加も認められた（図７）。一方，プラズマ照射時間５ｓの試料からはポリスチレン由来の結合以外の結合状態は観測されなかったが，照射時間４０ｓの試料からは炭素と窒素の単結合（Ｃ−Ｎ）が，照射時間１６０ｓの試料からはＣ−Ｎ結合とカルボキシ基が観測された（図５Ｃ）。さらに，プラズマ照射時間の増加に伴ってＣ−Ｎ結合の発現量の増加が認められた（図５）。以上の結果より，大気圧プラズマ処理ではプラズマ照射時間が増加するとＣ−Ｎ結合の発現量が増加し，照射時間が長くなるとカルボキシ基が導入されることが示唆された。
【００５１】
最後に，ＵＶ／ｏｚｏｎｅ表面改質と大気圧プラズマ処理を複合プロセス化して施した試料群では，全ての処理条件で酸素を含む官能基として−ＣＯＯＨが認められた（図８及び図９）。一方，窒素を含む官能基については，ＵＶ／ｏｚｏｎｅ表面改質を先に施した試料からはイミノ基（Ｃ＝Ｎ）が，大気圧プラズマ処理を先に施した試料からはアミド結合（ＮＨ−Ｃ＝Ｏ）が認められた（図８，図９）。また，大気圧プラズマ処理を先に施した試料の方がＵＶ／ｏｚｏｎｅ表面改質を先に施した試料よりも窒素を含む官能基の発現量が多く，大気圧プラズマ処理を先に施した試料からはＣ＝ＮとＮＨ−Ｃ＝Ｏの両方が，ＵＶ／ｏｚｏｎｅ表面改質を先に施した試料からはＣ＝Ｎのみが認められた（図８，図９）。以上の結果より，ＵＶ／ｏｚｏｎｅ表面改質と大気圧プラズマ処理の複合処理において，ＵＶ照射を先に行った場合はＣ＝Ｎが形成されやすく，プラズマ照射を先に行った場合はＮＨ−Ｃ＝Ｏが形成されやすいことが示唆された。なお，イミド基，アミド基はＵＶ／ｏｚｏｎｅ単独，プラズマ単独では形成し得ず，本発明の実施によって初めて培養基材上に生成可能であった。
【００５２】
（実施例３）細胞培養
（１）細胞
細胞はマウスＥＳ細胞株２種，マウスｉＰＳ細胞株１種で実施した。マウスＥＳ細胞はＥＳ−Ｂ３株とＥＳ−Ｄ３株を用いた。ＥＳ−Ｂ３株は，培養にフィーダー細胞を必要としない株化細胞である。ＥＳ−Ｂ３株は，未分化状態を示すマーカーであるＯｃｔ３／４遺伝子の片方がｉｒｅｓ−ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  Ｓ耐性遺伝子と置換されているため，Ｏｃｔ３／４遺伝子の転写活性によってｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  Ｓ耐性遺伝子を発現する。このため，ヌクレオシド系抗生物質であるＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  Ｓ存在下で培養することで分化した細胞はＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  Ｓにより死滅し，未分化形態のＥＳ細胞のみを純化培養することが可能となる。ＥＳ−Ｄ３株は研究実施例が多く，多能性が分化誘導試験で十分に担保されているＥＳ細胞株である。ＥＳ−Ｄ３株は，培養にフィーダー細胞が必要である。多能性幹細胞としてマウスｉＰＳ細胞株での培養試験も実施するため，理研セルバンク提供のＡＰＳ０００１株を用いた。本細胞株は未分化マーカーであるＮａｎｏｇのプロモーターの制御下にＧＦＰ遺伝子が導入されており，未分化形態の細胞を蛍光顕微鏡で識別可能である。
【００５３】
（２）培養方法
マウスＥＳ細胞はＢ３株およびＤ３株を用いた。ＥＳ−Ｂ３株はグラスゴー最少必須培地（Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ，ＧＭＥＭ）に，濃度１０％仔ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ），１％抗菌−抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ），０．１ｍＭ必須アミノ酸（Ｎｏｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ，ＮＥＡＡ），１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ），，０．１ｍＭメルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，２ＭＥ）を添加した溶液を基礎培養液として，１０００μｇ／ｍｌ  ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  Ｓ，１０００Ｕ／ｍｌ白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ，ＬＩＦ）を添加した培地にて培養を行った。ＥＳ−Ｄ３株はダルベッコ変法イーグル培地（高グルコース）（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ：ＤＭＥＭ  ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）に，濃度１５％仔ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ），１％抗菌−抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ），０．１ｍＭ必須アミノ酸（Ｎｏｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ：ＮＥＡＡ），０．１ｍＭメルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ：２ＭＥ）を添加した溶液を基礎培養液として，１０００μｇ／ｍｌ  ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  Ｓ，１０００Ｕ／ｍｌ白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ，ＬＩＦ）を添加した培地にて培養を行った。マウスｉＰＳ細胞はｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−２０Ｄ−１７株（ＡＰＳ０００１理研セルバンク）を用い，ダルベッコ変法イーグル培地（高グルコース）（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ：ＤＭＥＭ  ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）に，濃度１５％仔ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ），１％抗菌−抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ），０．１ｍＭ  必須アミノ酸（Ｎｏｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ：ＮＥＡＡ），０．１ｍＭメルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ：２ＭＥ）を添加した溶液を基礎培養液として，１０００μｇ／ｍｌ  ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  Ｓ，１０００Ｕ／ｍｌ白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ，ＬＩＦ）を添加した培地にて培養を行った．培養基材は，ＥＳ−Ｂ３株では未処理のポリスチレン製培養ディッシュ（ｃｏｎｔｒｏｌ），ＵＶ／ｏｚｏｎｅ単独１０ｍｉｎ，プラズマ単独１０ｓ，４０ｓ，それぞれの改質処理を前後に順を変えて連続的に実施する複合プロセス処理を施したポリスチレン製培養ディッシュを用いた。ＥＳ−Ｄ３株では未処理の基材（ｃｏｎｔｒｏｌ），ＵＶ／ｏｚｏｎｅ単独１０ｍｉｎ，プラズマ単独１０ｓ，それぞれの改質処理を前後に順を変えて連続的に実施する複合プロセス処理を施したポリスチレン製培養ディッシュを用いた。
【００５４】
マウスｉＰＳ細胞の培養ではフィーダー細胞を播種したポリスチレン製培養ディッシュ，ＵＶ／ｏｚｏｎｅ  ３ｍ処理した後にプラズマ１４ｓを施したポリスチレン製培養ディッシュ，未処理のポリスチレン製培養ディッシュを用いた。培養期間は細胞播種後７２時間として，細胞の接着および増殖性の評価は倒立型位相差顕微鏡（ＣＫＸ４１，オリンパス社）に備え付けた顕微鏡用デジタルカメラ（ＤＰ７３，オリンパス社）にて倍率１００倍で顕微鏡像を撮像することで行った。マウスｉＰＳ細胞の培養ではＮａｎｏｇマーカーの発現を落射蛍光管を備えた倒立型位相差顕微鏡（ＣＫＸ４１，オリンパス社）でＢ励起の下で緑色蛍光を確認することで行った。また，細胞数は細胞播種７２時間後に接着細胞のすべてを０．２５％トリプシンではく離回収して，総ＤＮＡ量を定量することで行った。総ＤＮＡ量は細胞数と比例の関係があることから細胞数の定量評価が可能となる。回収した細胞懸濁液は，蛍光分光光度計（Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  社）および付属のＱｕｂｉｔ  Ｂｕｆｆｅｒ，Ｑｕｂｉｔ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて，試料内に含有される総ＤＮＡ量を定量した。
【００５５】
（３）結果
ＥＳ−Ｄ３株の培養ではｃｏｎｔｒｏｌおよび単独処理群と比較して，複合プロセスを施した群で高い細胞接着性を示した。特にＵＶ／ｏｚｏｎｅ改質を施した直後に窒素プラズマ処理を施す複合プロセスにおいて良好な細胞接着性を示した（図１０）。ＥＳ−Ｄ３株の培養では，プラズマ単独（１０ｓ，４０ｓ），ＵＶ単独改質処理基材上での培養と比較して，ＵＶ／ｏｚｏｎｅ改質を施した直後に窒素プラズマ処理を施す複合プロセスで，他の処理群と比較して良好な細胞接着性を示した。また，基材上の細胞数を示す指標である総ＤＮＡ含有量もＵＶ／ｏｚｏｎｅ改質を施した直後に窒素プラズマ処理を施した試料群が有意に細胞数が多いことが認められた（図１１）。マウスｉＰＳ細胞の培養においても，良好な複合プロセスにより細胞接着性が向上し，さらに未分化マーカーであるＮａｎｏｇをプロモーターとしてＧＦＰ発現が蛍光顕微鏡観察により認められた（図１２）ことから，本発明による改質処理が多能性幹細胞の多能性を維持することも示された。
【００５６】
（実施例４）複合表面改質アンモニウム処理
（１）表面改質処理
直径３５ｍｍのポリスチレン製組織培養用ディッシュ（＃３０００−０３５，ＡＧＣテクノグラス）を用いた。まず，培養機材を表面改質装置内に設置した後，２８％アンモニア水（＃０２５１１−０５，ナカライテスク）１８０μｌを基材中心に滴下した。次に，装置の扉を素早く閉め，直ちにＵＶランプとプラズマ発生装置の電源を入れ，表面改質を開始した。改質開始３０秒後にＵＶランプの電源を切り，改質開始６０秒後にプラズマ装置の電源を切って，表面改質を終了した。
【００５７】
（２）ヒトｉＰＳ細胞２５３Ｇ４株（Ｎａｋａｇａｗａ  Ｍら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１）：１０１−６（２００８））を（１）で調製したポリスチレンディッシュ中の，推奨使用量の０．２倍のマトリゲル又は推奨使用量の０．３倍のラミニンを添加したＳｔｅｍ  ｆｉｔ培地（ＡＪＩＮＯＭＯＴＯ）（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ４，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：  ３５９４  （２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０３５９４）（Ｙ２７３６４含有）に７．０×１０４細胞／ディッシュで播種した。３７℃，５％ＣＯ２，湿度１００％の条件下で，３日間培養した。コントロールとして，それぞれ，推奨使用量のマトリゲル又はラミニンを用いて表面改質していないディッシュで同様に培養を行った。培養後，非接着細胞を除去し，ＶｉＣｅｌｌにより細胞数をカウントすることにより接着細胞数を評価した。
【００５８】
（３）結果
結果を図１７〜１９に示す。ＵＶ／プラズマ表面処理前にアンモニア水を塗布することにより，推奨量の０．３倍のラミニン使用で，推奨量のラミニン濃度添加群と同等の細胞増殖が確認された。また，ＵＶ／プラズマ表面処理前にアンモニア水を塗布することにより，推奨量の０．２倍のマトリゲル濃度でも，推奨量のマトリゲル濃度添加群を超える細胞増殖が見られた。このアンモニア水塗布群の細胞増殖は，同量のラミニン／マトリゲルを添加したＵＶ／プラズマ表面処理群よりも更に亢進していた。これらの結果から，ＵＶ／プラズマ表面処理前のアンモニア水塗布は，ＵＶ／プラズマ表面によるｉＰＳ細胞増殖能の向上を更に高めることが示された。
【符号の説明】
【００５９】
１  窒素ガス供給路
２  プラズマ発生部
３  高周波コイル
４  高周波電源
５  放物面ミラー
６  紫外線発生部
７  バルブ
８  格納部
９  細胞担持用基材
１０  オゾンガス注入口
１１  紫外線
１２  基材輸送機構
１３  基材輸送機構
１４〜１７  格納部
１８  細胞担持用基材設置部
１９  紫外線処理用格納部
２０  プラズマ処理用格納部
【図１】
2019017387.tif 000004
【図２】
2019017387.tif 000005
【図３】
2019017387.tif 000006
【図４】
2019017387.tif 000007
【図５】
2019017387.tif 000008
【図６】
2019017387.tif 000009
【図７】
2019017387.tif 000010
【図８】
2019017387.tif 000011
【図９】
2019017387.tif 000012
【図１０】
2019017387.tif 000013
【図１１】
2019017387.tif 000014
【図１２】
2019017387.tif 000015
【図１３】
2019017387.tif 000016
【図１４】
2019017387.tif 000017
【図１５】
2019017387.tif 000018
【図１６】
2019017387.tif 000019
【図１７】
2019017387.tif 000020
【図１８】
2019017387.tif 000021
【図１９】
2019017387.tif 000022