(57)【要約】【課題】本発明はオキサロ酢酸またはその塩の簡便且つ効率的な製造方法の提供を課題とする。【解決手段】後記の工程１、工程２、及び工程３を含む、オキサロ酢酸又はその塩の製造方法；（１）（ａ）有機炭素源、及び（ｂ）総量で０．２Ｍ〜２．５Ｍの濃度のＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、及びＮａＣｌからなる無機塩Ａを含有する液体培地を用意する工程１（２）ハロモナス属に属する好塩菌を、工程１で用意した前記液体培地を用いて培養する工程２、（３）前記工程２によって得られた培養液中から、オキサロ酢酸又はその塩を回収する工程３。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
後記の工程１、工程２、及び工程３を含む、オキサロ酢酸又はその塩の製造方法；
（１）（ａ）有機炭素源、及び（ｂ）総量で０．２Ｍ〜２．５Ｍの濃度のＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、及びＮａＣｌからなる無機塩Ａを含有する液体培地を用意する工程１
（２）ハロモナス属に属する好塩菌を、工程１で用意した前記液体培地を用いて培養する工程２、
（３）前記工程２によって得られた培養液中から、オキサロ酢酸又はその塩を回収する工程３。
【請求項２】
前記工程２において、前記好塩菌の増殖状態が誘導期又は対数期である時に、無機塩Ｂを前記液体培地中に添加する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記無機塩Ｂの添加を、前記培養液のＯＤ６００値が５以上であるときに実施する、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記無機塩Ｂが、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＣｌ、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、及びＫＣｌからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２又は３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記無機塩Ｂと、前記無機塩Ａとの濃度の総量が、０．２Ｍ〜２．５Ｍの範囲内である、請求項２〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
培養温度が３０℃〜４０℃である、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記工程２において、培養液中に窒素源を添加する、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
前記好塩菌が、ハロモナス・エスピーＫＭ−１株、ハロモナス・パンテラリエンシス、ハロモナス・カンピサリス、ハロモナス・ニトリトフィルス、ハロモナス・アリメンタリア、又はハロモナス・メリディアナのいずれかである、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はハロモナス菌を用いたオキサロ酢酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、エネルギーのみならず、ケミカル・リファイナリーのバイオベース化が課題となっている。
【０００３】
オキサロ酢酸は、生体内では、解糖系に続く好気呼吸のクエン酸回路の構成成分であり、リンゴ酸がリンゴ酸デヒドロゲナーゼによって酸化されて生成し、さらに、オキサロ酢酸は、クエン酸シンターゼによってアセチルCoAと反応してクエン酸を生成する重要な化合物である。また、オキサロ酢酸は、ホスホエノールピルビン酸を経由して糖新生にも利用される。
【０００４】
オキサロ酢酸は、工業的には、ほとんど生産されていないが、上記するような生理的な効果などから、今後の利用価値に注目されている化合物である。
【０００５】
ハロモナス属に属する好塩菌を用いたオキサロ酢酸以外の物質の生産に関しては、特許文献１には、ハロモナス属に属する好塩菌を用いた３−ヒドロキシブチレート（３ーＨＢ）の製造方法が開示され、並びに特許文献２、及び３には、ハロモナス属に属する好塩菌を用いたピルビン酸の製造方法が開示されている。また、特許文献４には、グラム陽性菌を用いたオキサロ酢酸及びオキサロ誘導体の製造方法が記載されているが、オキサロ酢酸の生産量についての記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際特許公報２０１３／０５１４９９
【特許文献２】特開２０１５−２０４７６９
【特許文献３】特開２０１６−２０２０９３
【特許文献４】特開２００６−９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般に、物質を、微生物を用いて工業的に生産する際に、多くの場合には、用いられている菌株には人為的な変異等による形質の付与がなされているので、斯かる形質の維持、又はその確認を行うために、多大な労力がかかる点で、問題がある。
【０００８】
また、微生物を発酵生産に用いるためには、該微生物に遺伝子改変がなされているかどうかに関わらず、一般に、培地への抗生物質の投入、及び培地のオートクレーブ処理等の、他の菌による汚染を防ぐための対策を取る必要があり、手間もコストもかかる。
【０００９】
前記のように、特許文献１には、野生型のハロモナス菌を用いた、簡便且つ効率的な３−ＨＢ製造方法が開示され、また、特許文献２、及び３には、それぞれ、特許文献１と同じ野生型ハロモナス菌を用いた、簡便且つ効率的なピルビン酸の製造方法が開示されている。しかしながら、前記の特許文献１〜３に、オキサロ酢酸又はその塩の生産については何ら言及されておらず、その製造方法についての記載も示唆もない。
【００１０】
このような背景のもと、簡便且つ効率的であり、及び工業的な大量生産に応用し得るオキサロ酢酸又はその塩の製造方法の開発が望まれている。
【００１１】
よって、本発明はオキサロ酢酸又はその塩を簡便且つ効率的に製造する方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、このような課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ハロモナス属に属する好塩菌を、特定の無機塩を所定濃度にて含有する培地を用いて培養した結果、優れた効率でオキサロ酢酸又はその塩を生産できることを見出した。
【００１３】
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す広い態様の発明を包含するものである。
【００１４】
〔項１〕  後記の工程１、工程２、及び工程３を含む、オキサロ酢酸又はその塩の製造方法；
（１）（ａ）有機炭素源、及び（ｂ）総量で０．２Ｍ〜２．５Ｍの濃度のＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、及びＮａＣｌからなる無機塩Ａを含有する液体培地を用意する工程１
（２）ハロモナス属に属する好塩菌を、工程１で用意した前記液体培地を用いて培養する工程２、
（３）前記工程２によって得られた培養液中から、オキサロ酢酸又はその塩を回収する工程３。
【００１５】
〔項２〕  前記工程２において、前記好塩菌の増殖状態が誘導期又は対数期である時に、無機塩Ｂを前記液体培地中に添加する、項１に記載の製造方法。
【００１６】
〔項３〕  前記無機塩Ｂの添加を、前記培養液のＯＤ６００値が５以上であるときに実施する、項２に記載の製造方法。
【００１７】
〔項４〕  前記無機塩Ｂが、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＣｌ、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、及びＫＣｌからなる群より選択される少なくとも１種である、前記項２又は３に記載の製造方法。
【００１８】
〔項５〕  前記無機塩Ｂと、前記無機塩Ａとの濃度の総量が、０．２Ｍ〜２．５Ｍの範囲内である、項２〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【００１９】
〔項６〕  培養温度が３０℃〜４０℃である、項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【００２０】
〔項７〕  前記工程２において、培養液中に窒素源を添加する、項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【００２１】
〔項８〕  前記好塩菌が、ハロモナス・エスピーＫＭ−１株、ハロモナス・パンテラリエンシス、ハロモナス・カンピサリス、ハロモナス・ニトリトフィルス、ハロモナス・アリメンタリア、又はハロモナス・メリディアナのいずれかである、項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、オキサロ酢酸又はその塩の簡便且つ効率的な製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】試験例１の実験結果を示すグラフ。図中のグラフの縦軸は培養液中のオキサロ酢酸の濃度（ｇ／Ｌ）を示し、横軸は培養開始からの時間（ｈ）を示す。
【図２】試験例２の実験結果を示すグラフ。図中のグラフの縦軸は培養液中のオキサロ酢酸の濃度（ｇ／Ｌ）を示し、横軸は培養開始からの時間（ｈ）を示す。
【図３】試験例３の実験結果を示すグラフ。図中のグラフの縦軸は培養液中のオキサロ酢酸の濃度（ｇ／Ｌ）を示し、横軸は培養開始からの時間（ｈ）を示す。
【図４】試験例４の実験結果を示すグラフ。図中のグラフの縦軸は培養液中のオキサロ酢酸の濃度（ｇ／Ｌ）を示し、横軸は培養開始からの時間（ｈ）を示す。
【図５】試験例５の実験結果を示すグラフ。図中のグラフの縦軸は培養液中の吸光度（６００ｎｍ：ＯＤ６００値）を示し、横軸は培養開始からの時間（ｈ）を示す。
【図６】試験例５の実験結果を示すグラフ。図中のグラフの縦軸は培養液中のオキサロ酢酸の濃度（ｇ／Ｌ）を示し、横軸は培養開始からの時間（ｈ）を示す。
【図７】試験例６の実験結果を示すグラフ。図中のグラフの縦軸は培養液中のオキサロ酢酸の濃度（ｇ／Ｌ）を示し、横軸は培養開始からの時間（ｈ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明のオキサロ酢酸又はその塩の製造方法は、以下の工程１、工程２、及び工程３を含む。
（１）（ａ）有機炭素源、及び（ｂ）総量で０．２Ｍ〜２．５Ｍの濃度のＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、及びＮａＣｌからなる無機塩Ａを含有する液体培地を用意する工程１
（２）ハロモナス属に属する好塩菌を、前記液体培地を用いて培養する工程２。
（３）工程２によって得られる培養液中から、オキサロ酢酸又はその塩を回収する工程３。
【００２５】
工程１
本発明の製造方法の工程１は、（ａ）有機炭素源、及び（ｂ）総量で０．２５Ｍ〜２．０Ｍの濃度のＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、及びＮａＣｌからなる無機塩Ａを含有する液体培地を用意する工程である。
【００２６】
当該液体培地は、商業的に利用可能な物質を慣用の方法で混合することにより、容易に用意できる。
【００２７】
当該液体培地の用意のため、商業的に利用可能な液体培地を利用してもよい。
【００２８】
当該培地、及びこれが含有する当該無機塩、及び当該有機炭素源については、後記する＜Ｂ：液体培地＞の欄にて説明する。
【００２９】
工程２
本発明の製造方法の工程２は、ハロモナス属に属する好塩菌を、前記液体培地を用いて培養する工程である。
【００３０】
＜Ａ：好塩菌＞
工程２にて用いる好塩菌はハロモナス属に属する好塩菌である。当該好塩菌としては、後記の（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれかに示す好塩菌を用いることができる。
【００３１】
（ｉ）無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源を含む固体培地にて増殖し、オキサロ酢酸又はその塩を菌体外の培地中に生産させることを特徴とする好塩菌。
（ｉｉ）無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源を含む液体培地にて増殖した後、オキサロ酢酸又はその塩を菌体外の培養液に分泌産生することを特徴とする好塩菌。
【００３２】
当該好塩菌は、酸化的代謝と嫌気的代謝とを使い分けることができ、培地中の遊離酸素の存在の有無にかかわらず生存が可能で、且つ、遊離酸素の存在下のほうが生育し易い傾向を有する、いわゆる、通性嫌気性菌の性質を有する菌体である。
【００３３】
当該好塩菌は、０．２Ｍ〜２．５Ｍ程度の範囲内の塩濃度が生育至適塩濃度である好塩性を有し、時には塩を含まない培地においても生育できる細菌である。当該好塩菌は、通常はｐＨ５〜ｐＨ１２程度の範囲内の培地中で生育する。
【００３４】
当該好塩菌として、例えば、ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＭ−１株が挙げられる。ハロモナス・エスピーＫＭ−１株は、平成１９年７月１０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３１６として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９９５である。当該ハロモナス・エスピーＫＭ−１株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、ＤＤＢＪにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ４７７０１５として登録されている。
【００３５】
生育特性等に鑑みて、工程２にて用いる好適な好塩菌としては、ハロモナス・エスピーＫＭ−１株以外に、ハロモナス・パンテラリエンシス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｐａｎｔｅｌｌｅｒｉｅｎｓｉｓ：ＡＴＣＣ  ７００２７３）、ハロモナス・カンピサリス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｉｓａｌｉｓ：ＡＴＣＣ  ７００５９７）、ハロモナス・メリディアナ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｒｉｄｉａｎａ：ＮＢＲＣ１５６０８）等も挙げることができる。
【００３６】
さらに、１６ＳリボゾームＲＮＡ配列による分析から、前述のハロモナス属に属する好塩菌に限らず、ハロモナス・ニトリトフィルス、ハロモナス・アリメンタリア、ハロモナス・メリディアナ等も、工程２にて用いるハロモナス属に属する好塩菌として採用してもよい。
【００３７】
前記好塩菌の中でも、ハロモナス・エスピーＫＭ−１株、ハロモナス・パンテラリエンシス、又はハロモナス・メリディアナを用いることが好ましく、ハロモナス・エスピーＫＭ−１株又はハロモナス・パンテラリエンシスを用いることが更に好ましい。
【００３８】
なお、前記ハロモナス属に属する好塩菌は、人為的及び偶発的を問わず、遺伝子導入、及び変異導入等の処理がされていない野生型株であることが好ましいが、適宜これらの導入がされていてもよい。導入される遺伝子及び／又は変異は、本発明の製造方法において、オキサロ酢酸又はその塩の生産効率等を向上させる機能を発現させるものであれば特に限定されない。例えば、オキサロ酢酸の産生に寄与する触媒活性を有する酵素をコードする遺伝子、オキサロ酢酸の該菌体外への分泌を上昇させる機能を発揮するタンパク質をコードする遺伝子、及びこれらの遺伝子の発現を増大させる遺伝子等が挙げられる。これらの遺伝子の当該菌体への導入方法は、一般的な方法を採用することができる。
【００３９】
＜Ｂ：液体培地＞
前記工程２にて用いる液体培地は、（ａ）有機炭素源、及び（ｂ）総量で０．２Ｍ〜２．５Ｍの濃度のＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、及びＮａＣｌからなる無機塩Ａを含有する。
【００４０】
工程２にて用いる液体培地は、前記無機塩Ａ、及び所望によるその他の無機塩を含有する。
【００４１】
工程２にて用いる液体培地が含有する無機塩は、少なくとも無機塩Ａを含有している限り、特に制限されない。
【００４２】
工程２にて用いる液体培地が含有する無機塩としては、具体的には、例えば、リン酸塩；硝酸塩；炭酸塩；硫酸塩；並びにナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、及びコバルト等の金属塩等を採用することができる。
【００４３】
例えば、ナトリウム塩又はカリウム塩を無機塩として採用する場合であれば、ＮａＣｌ、ＫＮＯ３、ＫＮＯ２、ＮａＮＯ３、ＮａＮＯ２、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、及びＫＨ２ＰＯ４等の化合物を用いることができる。
【００４４】
これらの無機塩は、前記好塩菌が、窒素源、又はリン源等として利用できるものが好ましい。
【００４５】
窒素源としては、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム塩、及び尿素等を用いればよく、特に限定はされない。例えば、ＮａＮＯ３、ＮａＮＯ２、ＮＨ４Ｃｌ、及び尿素等の化合物を用いることができる。好ましくは、硝酸塩、及び亜硝酸塩等である。
【００４６】
窒素源の使用量は、オキサロ酢酸又はその塩を生産する目的が達成される範囲において適宜設定することができる。具体的には、培養初期（特に培養開始時）の液体培地１００ｍＬ当たり、通常であれば硝酸塩として５００ｍｇ程度以上とすればよく、より好ましくは１０００ｍｇ程度以上、更に好ましくは１２５０ｍｇ程度以上である。
【００４７】
リン源としては、リン酸塩、リン酸一水素塩、及びリン酸二水素塩等を用いればよく、特に限定はされない。具体的には、例えば、Ｎａ３ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｋ３ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、及びＫＨ２ＰＯ４等の化合物を用いることができる。
【００４８】
リン源の使用量も、前記の窒素源の使用量と同様の観点から適宜設定することができる。具体的には、リン酸二水素塩として、培養初期（特に培養開始時）の液体培地１００ｍＬ当たり、通常は５０ｍｇ〜４００ｍｇ程度の範囲内とすればよく、より好ましくは１００ｍｇ〜２００ｍｇ程度である。
【００４９】
これらの無機塩は単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５０】
前記の無機塩のうち、無機塩Ａ（すなわち、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、及びＮａＣｌ）は、本発明の工程２にて用いる培地に含まれる。工程１で用意される液体培地が含有する無機塩Ａの濃度（すなわち、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、及びＮａＣｌの総量の濃度）は、０．２Ｍ〜２．５Ｍ、好ましくは０．５Ｍ〜２．５Ｍ程度、より好ましくは０．８Ｍ〜１．５Ｍ程度である。  その他の無機塩は、総量で通常は０．１Ｍ〜２．５Ｍ程度の範囲内となる濃度で用いればよく、好ましくは０．９Ｍ〜２．０Ｍ程度、より好ましくは０．９Ｍ〜１．２Ｍ程度である。  当業者が通常理解する通り、無機塩Ａの濃度は、前記液体培地の用意に用いられるＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、及びＮａＣｌの各量のみならず、その他のナトリウム塩、炭酸水素塩、炭酸塩、及びクロロ塩等の量も考慮して決定される。
【００５１】
これらの濃度は、工程２の進行に伴い、変化し得る。
【００５２】
工程１で用意され、及び工程２にて用いられる液体培地に使用する有機炭素源は、特に限定はされない。例えばトリプトン、イーストエキストラクト、可溶性デンプン、エタノール、ｎ−プロパノール、酢酸、酢酸ナトリウム、プロピオン酸、廃グリセロール、廃蜜糖、木材糖化液、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース等の六炭糖；リブロース、キシルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、デオキシリボース等の五炭糖；スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等の二糖；エリスリトール、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられる。
【００５３】
本発明で用いられる液体培地のｐＨは特に限定されない。例えば、前記好塩菌の生育条件を満たすｐＨであることが好ましく、具体的には、少なくとも培養系への導入時において、ｐＨ５〜ｐＨ１２程度の範囲内にすることができる。より好ましくはｐＨ８．８〜ｐＨ１２程度である。アルカリ性の培地を用いれば、ハロモナス属に属する好塩菌以外の、他の菌の混入をより効果的に防止することができる。また、ハロモナス属に属する好塩菌から分泌されたオキサロ酢酸又はその塩によって生じるｐＨの大幅な低下を抑制するのでアルカリ性の培地を用いることは好ましい。
【００５４】
本発明の製造方法では、塩濃度が比較的高い条件の液体培地で、ハロモナス属に属する好塩菌を好適に培養できるので、他の菌体の混入、増殖の恐れ等をほとんど排除できる。したがって、前述の液体培地に対して滅菌処理等を行わずに、簡便な設備で培養することが可能である。
【００５５】
本明細書中、用語「培養液」、及び用語「液体培地」は、文脈により相互互換的に用いられ得る。
【００５６】
ここで、用語「液体培地」とは、原則的に菌を培養するための基質を意味しする。また、用語「培養液」は、培地、及び培養生成物を含有する液体を意味することを意図して用いられ、通常は、菌体を含有しないことを意図して用いられるが、文脈により、菌体を含有することを意図して用いられ得る。
【００５７】
＜Ｃ：培養方法＞
前記工程２における前記ハロモナス属に属する好塩菌の培養方法は、当該菌に培養液中にオキサロ酢酸を分泌生産させながら培養する方法である。
【００５８】
具体的な培養方法の一例を以下に示す。先ず、５ｍＬ程度の適当な培地に前記好塩菌を植菌し、１２０ｒｐｍ〜１８０ｒｐｍ程度の攪拌速度で所定の温度にて、１晩振盪しながら前培養を行う。続いて前培養して得られた菌体を、三角フラスコ、発酵槽、又はジャーファーメンター等に入った前記液体培地中に１００倍程度に希釈し本培養（本明細書での培養に相当する。）する。
【００５９】
前記の本培養の培養温度は、通常は２０℃〜４５℃程度の範囲内で設定することができる。オキサロ酢酸を効率よく分泌生産することに鑑みて、培養温度は、通常は３０℃〜４０℃程度の範囲内とすることが好ましい。より好ましくは３１℃〜３９℃程度、更に好ましくは３２℃〜３８℃程度であり、３３℃〜３７℃程度が最も好ましい。
【００６０】
工程２での培養の方法としては、回分培養、半回分培養（流加培養）、連続培養等の培養方法が挙げられ、特に限定はされない。本発明の方法では他の菌が混入、及び増殖の危険性が極めて低いので、長期の連続培養も採用可能である。この方法では、オキサロ酢酸又はその塩を効率よく製造できる点で好ましい。
【００６１】
工程２には、培養液中の好塩菌の増殖状態が静止期に移行する前の時期、すなわち誘導期又は対数期である時期に、培養液中に無機塩を追加する工程を含んでいてもよい。
【００６２】
前記の対数期とは、培養液中の好塩菌の濃度を、吸光度を指標として経時的に測定した場合に、これが対数的に増大することが観察される時期である。このような対数期には、減速増殖期も包含される。また、前記の誘導期は、培養開始後から前記の対数期に至る前の時期である。このような誘導期には、加速期も包含される。
【００６３】
前記の追加の無機塩Ｂを培養液中に添加する時期は、前記のように前記好塩菌の増殖状態が誘導期又は対数期である時期である限り、特に限定されない。例えば、培養液中のＯＤ６００値が、５程度以上に達した時を、無機塩Ｂを培養液中に添加するタイミングとして採用できる。無機塩Ｂの培養液中への添加は、例えば、好ましくは、培養液中のＯＤ６００値が、通常５以上であるとき、好ましくは５〜３０程度の範囲内、より好ましくは５〜２５程度の範囲内、及び更に好ましくは５〜２０程度の範囲内の時期に実施できる。
【００６４】
当該添加は、連続的、又は非連続的であることができる。
【００６５】
当該添加の回数は、１回、又はそれ以上であることができる。
【００６６】
前記の培養液に追加する無機塩Ｂは、特に限定されず、例えば、前記＜Ｂ：培地＞にて詳述した無機塩から適宜選択することができる。これらの無機塩の中でも、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＣｌ、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、及びＫＣｌを挙げることができる。中でも、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、及びＮａＣｌが好ましい。これらの培養液に追加する無機塩は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６７】
前記の培養液に追加する無機塩Ｂは、例えば、培養開始時に用いる前記無機塩Ａの量、及び当該無機塩Ｂの量の合計が、通常添加後の溶液濃度で０．２Ｍ〜２．５Ｍの範囲内、好ましくは、０．２２Ｍ〜２．０Ｍ程度の範囲内、より好ましくは０．２３Ｍ〜１．８Ｍ程度の範囲内、更に好ましくは０．２４Ｍ〜１．５Ｍ程度の範囲内、及びより更に好ましくは０．２５Ｍ〜１．３Ｍ程度の範囲になる量で、添加され得る。
【００６８】
なお、半回分培養及び連続培養の際には、培養培地液を変更する時に結果として系内に存在する好塩菌の濃度が下がるので、その際に前記の無機塩を追加してもよい。
【００６９】
前記工程２では、培養液中に窒素源を追加することもできる。具体的な窒素源は、前記の＜Ｂ：液体培地＞にて説明したものを適宜採用することができ、特に限定はされず、例えば、硝酸塩を培養液に追加することが好ましい。
【００７０】
培養液に窒素源を追加する時期は特に限定はされず、例えば、好塩菌の増殖状態が誘導期から静止期の何れの状態であってもよい。培養液に窒素源を追加する回数は特に限定はされず、通常は１回〜１０回程度を挙げることができる。複数回に渡って培養液に窒素源を追加するときの追加間隔は適基決定すればよい。例えば、培養液中の好塩菌の生育状態に合わせて追加してもよく、単に培養期間中の、経時的に適当な時期に追加してもよい。
【００７１】
また、培養液に追加する窒素源の量も特に限定はされず、例えば、追加する窒素源の総量として、通常は添加後の溶液濃度が０．１Ｍ〜０．２Ｍ程度の範囲、より好ましくは０．１２Ｍ〜０．１８Ｍ程度の範囲、更に好ましくは０．１３Ｍ〜０．１７Ｍ程度の範囲、及び特に好ましくは０．１４Ｍ〜０．１６Ｍ程度の範囲である。
【００７２】
工程２は、ｐＨを制御せずに好適に実施することができるが、ｐＨを制御することを排除されない。ｐＨの制御は、慣用の方法に従い、酸性物質（例：塩酸）、及び／又はアルカリ性物質（例：水酸化ナトリウム）を培養系に添加することにより実施できる。
【００７３】
ｐＨの制御は、例えば、培養液のｐＨが、前記液体培地について説明したｐＨと同様のｐＨとなるように実施することができる。
【００７４】
工程３
本発明の製造方法の工程３は、前記工程２によって得られた培養液から、オキサロ酢酸又はその塩を回収する工程である。
【００７５】
当該回収としては、慣用の方法を用いればよい。具体的には、回分培養等の場合、前記工程２によって得られる培養液中にオキサロ酢酸又はその塩が存在している時に工程２の培養を停止し、必要に応じてオキサロ酢酸又はその塩を含む培養液と前記好塩菌体とを分離手段に供し、その培養液を得ることで回収できる。
【００７６】
なお、分離した菌体内からは、特許文献１等に記載の手法に従い、バイオポリマーＰＨＢ、及び３−ヒドロキシ酪酸等を回収することも可能である。
【００７７】
前記の培養停止方法は特に限定はされず、例えば、前記工程２によって得られるハロモナス属に属する好塩菌を加熱、又は酸処理等の方法によって殺菌する方法を挙げることができる。また、遠心分離操作、濾過、及び膜分離等の公知の固液分離の手段を適宜組み合わせながら、培養液と前記好塩菌体とを分離して培養を停止する方法を採用してもよい。
【００７８】
培養液中のオキサロ酢酸又はその塩の存在を確認する方法は、菌種、培地成分、及び培養条件等により変わり得るものであり、これらの要素を考慮して適宜決定する。例えば、継時的に培養液を採取し、これをＨＰＬＣ、及び分析キット等による分析方法に供して、培養を停止するのに好ましい時期を決定することもできる。
【００７９】
また、オキサロ酢酸は酸性を示す化合物であることから、培養液のｐＨを継時的にモニタリングしながら、培養の際の培地のｐＨの低下を指標にして、オキサロ酢酸の存在を確認してもよい。
【００８０】
なお、回収されるオキサロ酢酸の塩は、培養液中に含まれる無機塩に由来するナトリウム、及びカルシウム等のアルカリ金属、又はアルカリ土類金属等の陽イオンと反応した金属塩として回収されることがある。したがって、オキサロ酢酸を製造するためには、回収した培養液を塩析等の常法に供してもよい。
【００８１】
また、回収した培養液を適切なカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製工程に供してもよい。これら以外の方法として、回収した培養液のｐＨを適宜変更して、所望のオキサロ酢酸又はその塩のいずれかを精製工程に供することもできる。
【００８２】
本発明の製造方法では、コンタミネーションへの配慮も、培養環境を滅菌状態に保つための配慮もほとんど必要ないため、低コストで簡便にオキサロ酢酸又はその塩を得ることができる。
【実施例】
【００８３】
以下に、本発明をより詳細に説明するための実験例を示す。なお、本発明が後記に示す実験例に限定されないのは言うまでもない。
【００８４】
＜培地＞
後記の試験例にて用いるＳＯＴ改５培地は、特許文献１に記載されたものである。具体的な培地組成は、表１に示すとおりである。なお、以下の試験例にて用いる培地はオートクレーブを行わないで使用した。
【００８５】
【表１】
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＜オキサロ酢酸又はその塩の測定＞
本実験例における培養液にて生産されるピルビン酸又はその塩の測定は、ＢＩＯ−ＲＡＤ社Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈに添付に記載された分析条件に準拠して実施し、検出には島津製作所ＲＩＤ−１０Ａ示差屈折率検出器を用いた方法にて行った。
【００８６】
まず、後記の実験にて得られる培養液を遠心分離した。得られたその上清の５０μＬを採取し、これに４５０μＬの水を加えて測定用サンプルを作製した。この測定用サンプルを前記ＨＰＬＣにて分析し、オキサロ酢酸の標品と比較した。
【００８７】
＜ハロモナス属に属する好塩菌の前培養＞
ハロモナス属に属する好塩菌を、５ｍＬの前記ＳＯＴ５改培地（この場合、炭素源として１ｗ／ｖ％グルコース等を含むものを用いた）を含む１６．５ｍｍ径の試験管にプレート培養から加え、その後３７℃で１晩振盪培養した。
【００８８】
＜ハロモナス属に属する各種好塩菌の培養・各種サンプルの回収とその同定＞
後記に、ハロモナス属に属する好塩菌を用いたオキサロ酢酸を製造することを確認する各種実験例を示す。
【００８９】
実験例１
前記の前培養した各種ハロモナス属に属する０．２ｍＬのＨａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＫＭ−１株を、２００ｍＬ容の三角フラスコに入れた２０ｍＬの前記ＳＯＴ改５培地に混合して植菌し、シリコセンをした。これを、３３℃で撹拌速度を２００ｒｐｍとなる条件にて振盪培養し、培養開始の１２時間後から、およそ６時間又は１２時間おきに培養液を０．２５ｍＬずつ回収して、培養上清中のオキサロ酢酸又はその塩（以下、オキサロ酢酸とする。）の分泌量をそれぞれ測定した。
【００９０】
培養当初は、撹拌速度を２００ｒｐｍと好気的な条件で培養し、培養液は、サンプリング後、再度シリコセンをし、３３℃で振盪培養を継続し、半回分培養した。
【００９１】
培養開始時に、ＳＯＴ改培地にグルコースを２０ｗｔ％の濃度で添加して用いた。窒素源として、前記のＳＯＴ改５培地組成に示すように、培養当初に１２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムを用いるが、培養開始から１８時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、及び６０時間後に、それぞれ２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムを培養液中に追加した。
【００９２】
前記のＳＯＴ改５培地組成には、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、及びＮａＣｌを合わせて、およそ０．２Ｍ程度の無機塩が含まれている。ここで、培養液中にＮａＨＣＯ３を追加しなかったもの（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、対数期に相当する培養開始から１８時間後に１．０ＭのＮａＨＣＯ３を培養液中に追加したもの、また培養開始から１８時間後及び２４時間後（培養開始から２４時間後も対数期に相当する）に、それぞれ１．０ＭのＮａＨＣＯ３を培養液中に追加したものの、合計３つの培養パターンでのオキサロ酢酸の分泌量について比較した。この結果を図１に示す。
【００９３】
図１に示すように培養開始から２４時間後以降にオキサロ酢酸の分泌が確認された。特に培養開始から１８時間後にのみＮａＨＣＯ３を培養液中に追加した場合には、培養開始から４２時間後及び４８時間後に２０ｇ／Ｌものオキサロ酢酸の分泌量が確認された。また、培養開始から１８時間後及び２４時間後のそれぞれに１．０ＭのＮａＨＣＯ３を培養液中に追加したものは、１０ｇ／Ｌ程度のオキサロ酢酸の分泌量であった。
【００９４】
以上の結果から、好気培養中の対数期の適当な時期に、ＮａＨＣＯ３を培養液中に追加することで、オキサロ酢酸の培養液中での産生量を増大させることが明らかとなった。
【００９５】
実験例２
前培養した各種ハロモナス属に属するＨａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＫＭ−１株菌体の０．２ｍＬを、２００ｍＬ容の三角フラスコに入れた前記ＳＯＴ改５培地２０ｍＬに混合して植菌し、シリコセンをした。これを、３３℃で撹拌速度を２００ｒｐｍとなる条件にて振盪培養し、培養開始の１２時間後から、およそ１２時間又は６時間おきに培養液を０．２５ｍＬずつ回収して、培養上清中のオキサロ酢酸又はその塩（以下、オキサロ酢酸とする）の分泌量をそれぞれ測定した。
【００９６】
培養当初は、撹拌速度を２００ｒｐｍと好気的な条件で培養し、培養液は、サンプリング後、再度シリコセンをし、３３℃で振盪培養を継続し、半回分培養した。
【００９７】
培養開始時に、ＳＯＴ改培地にグルコースを２０ｗｔ％の濃度で添加して用いた。窒素源として、前記のＳＯＴ改５培地組成に示すように、培養当初に１２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムを用いるが、培養開始から１８時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、及び６０時間後に、それぞれ２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムを培養液中に追加した。
【００９８】
前記のＳＯＴ改５培地組成には、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、及びＮａＣｌをあわせて、およそ０．２Ｍの塩が含まれている。ここで、追加の無機塩を加えなかったもの（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、対数期に相当する培養開始から１８時間後に０．８ＭのＮａＨＣＯ３を培養液中に追加したもの、また培養開始から１８時間後に０．８ＭのＮａＣｌを培養液中に追加したものの、合計３つの培養パターンでのオキサロ酢酸の分泌量について比較した。この結果を図２に示す。
【００９９】
図２に示すように培養開始から２４時間後以降に、著量のオキサロ酢酸が分泌され、培養開始から１８時間後にのみＮａＨＣＯ３を培養液に添加した場合には、培養開始から３６時間後に分泌量の極大値として１４ｇ／Ｌに達した。また、培養開始から１８時間後にのみＮａＣｌを培養液に添加した場合には、培養開始から４８時間後に分泌量の極大値として２０ｇ／Ｌに達した。
【０１００】
以上の結果から、好気培養中の対数期の適当な時期に、ＮａＣｌ又はＮａＨＣＯ３を添加することで、オキサロ酢酸の培養液中での産生量を増大させることが明らかとなった。
【０１０１】
実験例３
前培養した各種ハロモナス属に属するＨａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＫＭ−１株菌体の０．２ｍＬを、２００ｍＬ容の三角フラスコに入れた前記ＳＯＴ改５培地２０ｍＬに混合して植菌し、シリコセンをした。これを、３０℃、３３℃、３７℃、及び４０℃の各種温度とし、撹拌速度を２００ｒｐｍとなる条件にて振盪培養し、培養開始の１２時間後から、およそ１２時間又は６時間おきに培養液を０．２５ｍＬずつ回収して、培養上清中のオキサロ酢酸又はその塩（以下、オキサロ酢酸とする）の分泌量を測定した。
【０１０２】
培養当初は、撹拌速度を２００ｒｐｍと好気的な条件で培養し、培養液は、サンプリング後、再度シリコセンをし、同じ温度で振盪培養を継続し、半回分培養した。
【０１０３】
培養開始時に、ＳＯＴ改培地にグルコースを２０ｗｔ％の濃度で添加して用いた。窒素源として、前記のＳＯＴ改５及び培地組成に示すように、培養当初に１２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムを用いるが、培養開始から１８時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後に、それぞれ２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムを培養液中に追加した。
【０１０４】
前記のＳＯＴ改５培地組成には、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、及びＮａＣｌをあわせて、およそ０．２Ｍの塩が含まれている。ここで、培養開始から１８時間後に０．８ＭのＮａＨＣＯ３を培養液中に追加したものと、これを追加しないものの、合計８つの温度条件での培養パターンでのオキサロ酢酸の分泌量について比較した。この結果を図３に示す。
【０１０５】
図３に示すように培養開始から１８時間後にＮａＨＣＯ３を培養液に追加した場合は、いずれの場合も培養開始から２４時間後以降にオキサロ酢酸の分泌が見られ、特に３７℃及び４０℃で培養した場合には、培養開始から４２時間後に分泌量の極大値２５．７ｇ／Ｌに達した。
【０１０６】
以上の結果から、好気培養中の対数期の適当な時期に、ＮａＨＣＯ３を添加することで、３０℃〜４０℃のどのような温度条件下であっても、オキサロ酢酸の培養液中での産生量を増大させることが明らかとなった。特に、３７℃又は４０℃での培養が顕著にオキサロ酢酸の産生量が増大することが明らかとなった。
【０１０７】
実験例４
前培養した各種ハロモナス属に属するＨａｌｏｍｏｎｓ  ｓｐ．ＫＭ−１株、Ｈａｌｏｍｏｎｓ  ｐａｎｔｅｌｌｅｒｉｅｎｓｉｓ：ＡＴＣＣ７００２７３、及びＨａｌｏｍｏｎｓ  ｍｅｒｉｄｉａｎ：ＮＢＲＣ１５６０８の菌体のそれぞれ０．２ｍＬを、２００ｍＬ容の三角フラスコに入れた前記ＳＯＴ改５培地２０ｍＬに混合して植菌し、シリコセンをした。これを、３７℃で撹拌速度を２００ｒｐｍとなる条件にて振盪培養し、培養開始から１２時間後の、およそ１２時間又は６時間おきに培養液を０．２５ｍＬずつ回収して、培養上清中のオキサロ酢酸又はその塩以下、オキサロ酢酸とする）分泌量をそれぞれ測定した。
【０１０８】
培養当初は、撹拌速度を２００ｒｐｍと好気的な条件で培養し、培養液は、サンプリング後、再度シリコセンをし、同じ温度で振盪培養を継続し、半回分培養した。
【０１０９】
培養開始時に、ＳＯＴ改培地にグルコースを２０ｗｔ％の濃度で添加して用いた。窒素源として、前記のＳＯＴ改５培地組成に示すように、培養当初に１２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムを用いるが、培養開始から１８時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、及び６０時間後に、それぞれ２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムを培養液中に追加した。
【０１１０】
前記のＳＯＴ改５培地組成には、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、及びＮａＣｌをあわせて、およそ０．２Ｍの塩が含まれている。ここで、培養開始から１８時間後に０．８ＭのＮａＨＣＯ３を培養液中に追加したものと、これをこれを追加しないものの、合計６つの菌体条件での培養パターンでのオキサロ酢酸の分泌量について比較した。この結果を図４に示す。
【０１１１】
図４に示すようにＫＭ−１株、ＢＲＣ１５６０８株を用いた場合、０．８ＭのＮａＨＣＯ３を培養液中に追加すると、培養開始から２４時間後以降にオキサロ酢酸の分泌が見られ、培養開始から４８時間後には、それぞれ２３．５ｇ／Ｌを超える極大値を示した。一方で、０．８ＭのＮａＨＣＯ３を加えなかった場合には、ほとんどオキサロ酢酸の分泌が見られなかった。また、ＡＴＣＣ７００２７３の場合のオキサロ酢酸の分泌量は最大９．１ｇ／Ｌと少ないがＫＭ−１株、ＢＲＣ１５６０８株と同様の傾向が示された。
【０１１２】
以上の結果から、ハロモナス属に属する好塩菌として、ＫＭ−１株又はＢＲＣ１５６０８株がオキサロ酢酸の分泌生産により適していることが示唆された。
【０１１３】
実験例５
前培養した各種ハロモナス属に属するＨａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＫＭ−１株菌体の０．２ｍＬを、２００ｍＬ容の三角フラスコに入れた前記ＳＯＴ改５培地２０ｍＬに混合して植菌し、シリコセンをした。これを、３７℃で撹拌速度を２００ｒｐｍとなる条件にて振盪培養し、培養開始の１２時間後から、およそ１２時間又は６時間おきに培養液を０．２５ｍＬずつ回収して、培養上清中のオキサロ酢酸又はその塩（以下、オキサロ酢酸とする。）の分泌量を測定した。
【０１１４】
培養当初は、撹拌速度を２００ｒｐｍと好気的な条件で培養し、培養液は、サンプリング後、再度シリコセンをし、同じ温度で振盪培養を継続し、半回分培養した。
【０１１５】
培養開始時に、ＳＯＴ改培地にグルコースを２０ｗｔ％の濃度で添加して用いた。窒素源として、前記のＳＯＴ改５培地組成に示すように、培養当初に１２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムを用いるが、培養開始から１８時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、及び６０時間後に、それぞれ２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムを培養液中に追加した。
【０１１６】
前記のＳＯＴ改５培地組成には、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、及びＮａＣｌをあわせて、およそ０．２Ｍの塩が含まれている。培養開始時又は、培養開始から１８時間後に０．８ＭのＮａＨＣＯ３を培養液中に追加したものと、これを追加しなかった（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、合計３つの培養パターンでのオキサロ酢酸の分泌量を比較した。この結果を図６に示す。
【０１１７】
図５はＨａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＫＭ−１株菌体の増殖状態を示すＯＤ６００値（ＯＤ６００）である。培養開始から１８時間後に前記のＳＯＴ５改培地のみを用いたコントロールはＯＤ６００値が１８程度となり、培養開始から１８時間後はその時期的前後のＯＤ値の変化から、培地中の好塩菌は誘導期から対数期であることが分かる。また、培養開始時にＮａＨＣＯ３を前記のＳＯＴ５改培地中に追加したものは、ＯＤ６００値が９程度と成長が抑制されているが、こちらも前記と同様に好塩菌が誘導期又は対数期であることが分かる。
【０１１８】
図６に示すように培養開始から２４時間後以降で、オキサロ酢酸の分泌が見られた。培養開始時に前記のＳＯＴ５改培地に０．８ＭのＮａＨＣＯ３を追加したものは、培養開始から４２時間後に１４．８ｇ／Ｌ以上のオキサロ酢酸分泌量の最大値を示した。また、培養開始から１８時間後に０．８ＭのＮａＨＣＯ３を培養液中に追加したものは、.培養開始から１８時間後に、１３．４ｇ／Ｌのオキサロ酢酸分泌量の最大値を示した。
【０１１９】
以上の結果から、ハロモナス菌の対数期に培養液中に無機塩を添加しなくとも、培養開始時に用いる無機塩の濃度を濃くすることによって、オキサロ酢酸を効率よく分泌生産することができることが明らかとなった。
【０１２０】
実験例６
前培養した各種ハロモナス属に属するＨａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＫＭ−１株菌体の０．２ｍＬを、２００ｍＬ容の三角フラスコに入れた前記ＳＯＴ改５培地２０ｍＬに混合して植菌し、シリコセンをした。これを、３７℃で撹拌速度を２００ｒｐｍとなる条件にて振盪培養し、培養開始の１２時間後から、およそ１２時間又は６時間おきに培養液を０．２５ｍＬずつ回収して、培養上清中のオキサロ酢酸又はその塩（以下、オキサロ酢酸とする）の分泌量を測定した。
【０１２１】
培養当初は、撹拌速度を２００ｒｐｍと好気的な条件で培養し、培養液は、サンプリング後、再度シリコセンをし、同じ温度で振盪培養を継続し、半回分培養した。
【０１２２】
培養開始時に、ＳＯＴ改培地にグルコースを２０ｗｔ％の濃度で添加して用いた。窒素源として、前記のＳＯＴ改５培地組成に示すように、培養当初に１２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウムを用いるが、培養開始から１８時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、及び６０時間後に、それぞれ２．５ｇ／Ｌの硝酸ナトリウム加えた。
【０１２３】
ＳＯＴ改５培地組成には、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、及びＮａＣｌをあわせて、およそ０．２Ｍの塩が含まれている。ここで、０．３ＭのＮａＨＣＯ３を加えたもの（最終塩濃度０．５Ｍ相当）、０．８ＭのＮａＨＣＯ３を加えたもの（最終塩濃度１．０Ｍ相当）、及び１．３ＭのＮａＨＣＯ３を加えたもの（最終塩濃度１．５Ｍ相当）の、合計３つの培養パターンでのオキサロ酢酸の分泌量について検討した。
【０１２４】
図７に示すようにコントロールを除いて、培養開始時の培地中に０．３ＭのＮａＨＣＯ３を加えたもの、０．８ＭのＮａＨＣＯ３を加えたもの、及び１．３ＭのＮａＨＣＯ３を加えたものの順でオキサロ酢酸の分泌の最大時間が培養後期に移動する傾向が見られ、いずれも８ｇ／Ｌ以上のオキサロ酢酸を分泌した。
【０１２５】
以上の結果から、ハロモナス菌の対数期に培養液中に無機塩を添加しなくとも、培養開始時に用いる無機塩の濃度を濃くすることによって、オキサロ酢酸を効率よく分泌生産することができることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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