(57)【要約】【課題】生体臓器の機能障害による疾患の予防または進行の遅延に有用である日常的に摂取可能な食品組成物であり、その作用機序の一部が明らかである食品組成物を提供することを目的とする。【解決手段】ラクトバチルス属の少なくとも１種の乳酸菌およびラクトコッカス属の少なくとも１種の乳酸菌を含む乳酸菌群；ならびにサッカロミセス属の少なくとも１種の酵母およびクルイベロミセス属の少なくとも１種の酵母を含む酵母群；を含む微生物群の大豆由来発酵産物を含み、前記大豆由来発酵産物がエクオール、γ−アミノ酸、および抗菌物質を含有する、食品組成物を提供する。【選択図】図３
2019118281.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス属の少なくとも１種の乳酸菌およびラクトコッカス属の少なくとも１種の乳酸菌を含む乳酸菌群；ならびにサッカロミセス属の少なくとも１種の酵母およびクルイベロミセス属の少なくとも１種の酵母を含む酵母群；を含む微生物群の大豆由来発酵産物を含み、前記大豆由来発酵産物がエクオール、γ−アミノ酪酸、および抗菌物質を含有する、食品組成物
【請求項２】
乳酸菌群が、偏性ホモ型（グループＩ）の少なくとも１種、通性ヘテロ型（グループＩＩ）の少なくとも１種、および偏性ヘテロ型（グループＩＩＩ）の少なくとも１種のラクトバチルス属の乳酸菌を含む、請求項１に記載の食品組成物。
【請求項３】
乳酸菌群が、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・カゼイ  カゼイ亜種、ラクトバチルスケフィリ、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルスファーメンタム、ラクトコッカス・ラクティス  ラクティス亜種、ラクトコッカス・ラクティス  クレモリス亜種、およびストレプトコッカス・サーモフィルスを含む、請求項１または２に記載の食品組成物。
【請求項４】
酵母群が、サッカロミセス・セルビシエ、カザフスタニア・チュリセンシス、カザフスタニア・ユニスポラ、およびクルイベロミセス・マルキシアヌスを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の食品組成物。
【請求項５】
大豆由来発酵産物が豆乳発酵産物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の食品組成物。
【請求項６】
抗菌物質がバクテリオシンではない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の食品組成物。
【請求項７】
生体臓器の機能障害による疾患の予防または進行の遅延に用いるための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の食品組成物。
【請求項８】
生体臓器の機能障害による疾患が腎臓の機能障害による疾患、肝臓の機能障害による疾患、または脳の機能障害による疾患である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の食品組成物。
【請求項９】
固形である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の食品組成物。
【請求項１０】
液体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌群および酵母群を含む微生物群の大豆由来発酵産物を含む食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケフィアは有史前より東ヨーロッパ（黒海周辺）で飲用されており、現在ではロシアを中心に東ヨーロッパで日常的に飲用されている。古来よりケフィアは種々の薬理作用を有することが経験的に知られている。このような薬理作用を示す物質として、牛乳ケフィアにおいて、発酵スターター（種菌）であるケフィア粒が産生する粘性多糖類およびその中に含まれているペプチドが報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
牛乳ケフィアにおけるそのような薬理作用としては、本発明者により、（１）大腸菌、ウエルシュ菌、黄色ブドウ球菌に対する抗菌作用（非特許文献２）、（２）抗ストレス作用（非特許文献３）が報告されている。
【０００４】
その他のケフィアに関する従来の研究は、ケフィア粒構成菌の同定や発酵産物の経口投与による癌、動脈硬化、高血圧、関節炎等の酸化障害系の病理学的役割に関するもの（非特許文献４および５）および整腸作用（非特許文献６）が主であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ohishi H., et al.; Jpn. J. Dairy and Food Sci., 37(6), A-291-A-293 (1988)
【非特許文献２】谷久典、他；日本農芸化学会２０１０年度大会講演要旨集、p173 (2010)
【非特許文献３】谷久典、他；日本農芸化学会２０００年度大会講演要旨集、p77 (2000)
【非特許文献４】Halliwell B. and Gutterige J.M.C.; Biochem J., 219, 1-4, (1984)
【非特許文献５】Frenkel K.; Pharmacol Ther., 53, 127-166, (1992)
【非特許文献６】Liu J., et al.; J. Sci. Food Agric., 86, 2527-2533, (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
加齢や生活習慣病に伴う変化とされている、生体臓器の機能障害による疾患の予防または進行の遅延に有用である日常的に摂取可能な食品はほとんど例がなく、そのような効能を謳う食品が稀にあるとしてもその作用機序は明らかとされていない。ケフィアに関しても、発酵産物中に含有される有用成分の役割については従来あまり検討されて来なかった。本発明は、生体臓器の機能障害による疾患の予防または進行の遅延に有用である日常的に摂取可能な食品組成物であり、その作用機序の一部が明らかである食品組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、果汁や牛乳を含む種々の食品原料を発酵スターター（種菌）であるケフィア粒で発酵させ、有用成分について鋭意研究したところ、大豆由来発酵産物中にイソフラボンの代謝物であるエクオール、グルタミンの代謝物であるγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、ならびに、いわゆる悪玉菌であるクロストリウム属の細菌、大腸菌群（ｃｏｌｉｆｏｒｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、およびスタフィロコッカス属の細菌に対する強い抗菌作用を示し、いわゆる善玉菌である乳酸菌（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、酪酸菌（ｂｕｔｙｌａｔｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、およびビフィズス菌（ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）などに対しては抗菌作用を示さない抗菌物質が含有されることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本明細書は以下の発明の開示を包含する。
［１］ラクトバチルス属の少なくとも１種の乳酸菌およびラクトコッカス属の少なくとも１種の乳酸菌を含む乳酸菌群；ならびにサッカロミセス属の少なくとも１種の酵母およびクルイベロミセス属の少なくとも１種の酵母を含む酵母群；を含む微生物群の大豆由来発酵産物を含み、前記大豆由来発酵産物がエクオール、γ−アミノ酪酸、および抗菌物質を含有する、食品組成物
［２］乳酸菌群が、偏性ホモ型（グループＩ）の少なくとも１種、通性ヘテロ型（グループＩＩ）の少なくとも１種、および偏性ヘテロ型（グループＩＩＩ）の少なくとも１種のラクトバチルス属の乳酸菌を含む、［１］に記載の食品組成物。
【０００９】
［３］乳酸菌群が、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・カゼイ  カゼイ亜種、ラクトバチルスケフィリ、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルスファーメンタム、ラクトコッカス・ラクティス  ラクティス亜種、ラクトコッカス・ラクティス  クレモリス亜種、およびストレプトコッカス・サーモフィルスを含む、［１］または［２］に記載の食品組成物。
【００１０】
［４］酵母群が、サッカロミセス・セルビシエ、カザフスタニア・チュリセンシス、カザフスタニア・ユニスポラ、およびクルイベロミセス・マルキシアヌスを含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の食品組成物。
【００１１】
［５］大豆由来発酵産物が豆乳発酵産物である、［１］〜［４］のいずれかに記載の食品組成物。
［６］抗菌物質がバクテリオシンではない、［１］〜［５］のいずれかに記載の食品組成物。
【００１２】
［７］生体臓器の機能障害による疾患の予防または進行の遅延に用いるための、［１］〜［６］のいずれかに記載の食品組成物。
［８］生体臓器の機能障害による疾患が腎臓の機能障害による疾患、肝臓の機能障害による疾患、または脳の機能障害による疾患である、［１］〜［７］のいずれかに記載の食品組成物。
【００１３】
［９］固形である、［１］〜［８］のいずれかに記載の食品組成物。
［１０］液体である、［１］〜［８］のいずれかに記載の食品組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の食品組成物は、腸内において大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）やウエルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）などの悪玉菌の占有率を低下させることができる。悪玉菌はインドールなどの代謝物を産生する。そして、宿主の腸管から吸収されたインドールが宿主の肝臓においてシトクロームＰ４５０による酸化および硫酸転移酵素による硫酸抱合を受けてインドキシル硫酸を生成し、宿主の血中インドキシル硫酸濃度を増加させる（Niwa T., et. al., Am. J. Nephrol., 14(3), 207-212, 1994）。したがって、本発明の食品組成物は、悪玉菌の産生するインドールなどの代謝物を減少させ、宿主の体内でインドールから生成するインドキシル硫酸を減少させ、宿主の血中インドキシル硫酸濃度を減少させることができる。インドキシル硫酸は尿毒素として知られていることから、本発明の食品組成物は、これらの悪玉菌が腸内で増殖することにより引き起こされる、生体臓器の機能障害による疾患の予防または進行の遅延に有用である。これらの疾患は、加齢や生活習慣病に伴う変化とされていたことから、本発明の食品組成物は、いわゆる高齢化社会において健康長寿を全うする上での一助となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】標準品のエクオールのクロマトグラムである。
【図１−２】実施例１で得られた豆乳ケフィア由来の試料のクロマトグラムである。
【図２−１】標準品のγ−アミノ酪酸のクロマトグラムである。
【図２−２】実施例１で得られた豆乳ケフィア由来の試料のクロマトグラムである。
【図３】実施例１で得られた豆乳ケフィアを摂取させた、ヒト糞便移植ラットの糞便中の大腸菌およびウエルシュ菌の数を示すグラフである。試験開始時（０日）、１５日目、および３０日目の糞便の測定結果を示す。
【図４−１】標準品のインドキシル硫酸カリウムのクロマトグラムである。
【図４−２】実施例１で得られた豆乳ケフィアを摂取させた、ヒト糞便移植ラットの血清のクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、非限定的に本発明の態様を説明する。
本発明の食品組成物は、乳酸菌群および酵母群を含む微生物群の大豆由来発酵産物を含む食品組成物である。
【００１７】
本明細書において、「乳酸菌群」とは、ラクトバチルス属の少なくとも１種の乳酸菌およびラクトコッカス属の少なくとも１種の乳酸菌を含む乳酸菌群であり、好ましくは偏性ホモ型（グループＩ）の少なくとも１種、通性ヘテロ型（グループＩＩ）の少なくとも１種、および偏性ヘテロ型（グループＩＩＩ）の少なくとも１種のラクトバチルス属の乳酸菌を含み、さらに好ましくはストレプトコッカス属の少なくとも１種の乳酸菌も含む。
【００１８】
ラクトバチルス属の乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルスケフィリ、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルスファーメンタム、ラクトバチルス・ラムノサスなどが挙げられ、好ましくはラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルスケフィリ、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ブフネリ、ラクトバチルスファーメンタムが挙げられる。また、ラクトバチルス・カゼイとしては、例えば、ラクトバチルス・カゼイ  カゼイ亜種、ラクトバチルス・カゼイ  アラクトサス亜種などが挙げられ、好ましくはラクトバチルス・カゼイ  カゼイ亜種が挙げられる。
【００１９】
ラクトコッカス属の乳酸菌としては、例えば、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・プランタームなどが挙げられ、好ましくはラクトコッカス・ラクティスが挙げられる。また、ラクトコッカス・ラクティスとしては、例えば、ラクトコッカス・ラクティス  ラクティス亜種、ラクトコッカス・ラクティス  クレモリス亜種、ラクトコッカス・ラクティス  デアセチラクティス亜種などが挙げられ、好ましくはラクトコッカス・ラクティス  ラクティス亜種、ラクトコッカス・ラクティス  クレモリス亜種が挙げられる。
【００２０】
ストレプトコッカス属の乳酸菌としては、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス・クリセツウスなどが挙げられ、好ましくはストレプトコッカス・サーモフィルスが挙げられる。
【００２１】
本明細書において、「酵母菌群」とは、サッカロミセス属の少なくとも１種の酵母およびクルイベロミセス属の少なくとも１種の酵母を含む酵母群であり、好ましくはカザフスタニア属の少なくとも１種の酵母も含む。
【００２２】
サッカロミセス属の酵母としては、例えば、サッカロミセス・セルビシエ、サッカロミセス・パストリアヌスなどが挙げられ、好ましくはサッカロミセス・セルビシエが挙げられる。
【００２３】
クルイベロミセス属の酵母としては、例えば、クルイベロミセス・マルキシアヌス、クルイベロミセス・ラクチスなどが挙げられ、好ましくはクルイベロミセス・マルキシアヌスが挙げられる。
【００２４】
カザフスタニア属の酵母としては、例えば、カザフスタニア・チュリセンシス、カザフスタニア・ユニスポラ、カザフスタニア・テルリスなどが挙げられ、好ましくはカザフスタニア・チュリセンシス、カザフスタニア・ユニスポラが挙げられる。
【００２５】
一態様において、上記微生物群は、ケフィア粒などの保存されている発酵スターター（種菌）を構成するものであってもよく、種菌による発酵産物または該発酵産物を１回以上継代した発酵産物に含まれるものであってもよい。
【００２６】
本明細書において、「大豆由来発酵産物」とは、発酵基材である大豆原料または大豆加工品の上記微生物群による発酵産物であり、大豆原料としては、丸大豆、脱脂加工大豆、大豆全粒粉、大豆胚芽などが挙げられ、好ましくは大豆全粒粉、大豆胚芽などが挙げられる。大豆加工品としては、豆乳（成分調整および成分無調整）、豆腐、ゆば、おから、枝豆、大豆もやし、きな粉などが挙げられ、好ましくは豆乳などが挙げられる。また、大豆の品種はいずれの品種でもよい。
【００２７】
発酵基材である大豆原料または大豆加工品は、加熱殺菌されているものが好ましい。加熱殺菌は、例えば、６０〜１２０℃で、好ましくは８０〜１００℃で、例えば、０．５〜２．０時間、好ましくは０．５〜１．０時間加熱することにより行う。加熱殺菌は、加圧して行ってもよい。
【００２８】
本発明において、発酵は発酵基材と上記微生物群を混ぜ、例えば２２〜５５℃、好ましくは２５〜４５℃、より好ましくは３０〜４０℃、さらに好ましくは３０〜３７℃、最も好ましくは３５℃で、例えば２０〜１００時間、好ましくは２４〜７５時間、より好ましくは３０〜５０時間、さらに好ましくは３２〜４０時間、最も好ましくは３６時間、例えば静置して、通気しながら撹拌して、撹拌して、好ましくは静置して行う。
【００２９】
本発明において、上記大豆由来発酵産物は、液体（例えば、発酵濾液）であってもよく、固体（例えば、発酵濾液の凍結乾燥物）であってもよい。
本発明において、上記大豆由来発酵産物は、エクオール、γ−アミノ酪酸、抗菌物質などの有用成分を含有する。エクオールは、上記大豆由来発酵産物、好ましくは固体の上記大豆由来発酵産物中に、例えば、０．５〜２．０％（ｗ／ｗ）、好ましくは１．５〜２．０％（ｗ／ｗ）含有される。γ−アミノ酪酸は、上記大豆由来発酵産物、好ましくは固体の上記大豆由来発酵産物中に、例えば、０．５〜２．０％（ｗ／ｗ）、好ましくは１．５〜２．０％（ｗ／ｗ）含有される。抗菌物質は、液体の上記大豆由来発酵産物の希釈液を、大腸菌を１０６個含む培養液に１／２０の体積で添加して培養した場合に、５０％の増殖抑制率を示す希釈倍数が、例えば５倍以下、１０倍以下、２０倍以下、４０倍以下、８０倍以下、１６０倍以下、好ましくは２０倍以下、４０倍以下、８０倍以下、１６０倍以下、より好ましくは８０倍以下、１６０倍以下、最も好ましくは１６０倍以下となる程度に、１ｍｇ／ｍｌの固体の上記大豆由来発酵産物の溶液の希釈液を、大腸菌を１０６個含む培養液に１／２０の体積で添加して培養した場合に、５０％の増殖抑制率を示す希釈倍数が、例えば５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、４０倍以上、８０倍以上、１６０倍以上、好ましくは２０倍以上、４０倍以上、８０倍以上、１６０倍以上、より好ましくは８０倍以上、１６０倍以上、最も好ましくは１６０倍以上となる程度に含有される。
【００３０】
本発明の食品組成物は、上記大豆由来発酵産物のみからなるものであってもよいし、上記大豆由来発酵産物以外の食品成分などを含むものであってもよい。そのような食品成分としては、例えば、ビタミン類、ミネラル類が挙げられる。
【００３１】
本発明の食品組成物は、１日あたり、液体の上記大豆由来発酵産物の量に換算して、例えば、１〜１０ｇ、好ましくは２〜８ｇ、より好ましくは３〜５ｇ、固体の上記大豆由来発酵産物の量に換算して、例えば、１０〜５００ｍｇ、好ましくは５０〜３００ｍｇ、より好ましくは１００〜２００ｍｇの量を、例えば、７日以上、好ましくは１５日以上、より好ましくは３０日以上連続して摂取することで、腸内の大腸菌およびウエルシュ菌などの悪玉菌の数を、摂取前の例えば、１０％程度、好ましくは２５％程度、より好ましくは５０％程度減少することができる。また、糞便中のインドール含量を、摂取前の例えば、２％程度、好ましくは５％程度、より好ましくは１０％程度減少することができる。さらには、血中のインドキシル硫酸含量を、摂取前の例えば、２％程度、好ましくは５％程度、より好ましくは１０％程度減少することができる。
【００３２】
本発明の食品組成物は、健康食品、サプリメントなどとして使用することができる。例えば、錠剤、カプセル剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤）、顆粒剤（ドライシロップを含む）、散剤（粉末剤）、細粒剤、丸剤などの固形の製剤、水性または非水性の内服用液（液剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）などの液体の製剤として使用することができる。
【００３３】
上記の各種製剤は、本発明の食品組成物と、健康食品、サプリメントなどで通常許容され得る添加剤を混和して、周知の方法で製造することができる。そのような添加剤としては、例えば、賦形剤、滑沢剤（コーティング剤）、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、基剤、分散剤、希釈剤、界面活性剤、乳化剤、経皮吸収促進剤、ｐＨ調整剤、保存剤、着色剤、油分（油脂、鉱物油など）、保湿剤、アルコール、増粘剤、ポリマー、皮膜形成剤、紫外線吸収剤、細胞賦活剤、酸化防止剤、防腐剤、清涼剤、消臭剤、顔料、染料、香料、糖類、アミノ酸類、ビタミン類、有機酸、有機アミン、植物抽出物などがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
一態様として、本発明の食品組成物は、血中インドキル硫酸の蓄積によって引き起こされると考えられる、生体臓器の機能障害による疾患、例えば、腎臓、肝臓、脳、心臓の機能障害による疾患、好ましくは腎臓、肝臓の機能障害による疾患、より好ましくは腎臓の機能障害による疾患の予防または進行の遅延に用いることができる。
【００３５】
腎臓の機能障害による疾患としては、例えば、慢性腎不全（ＣＤＫ）、腎血管疾患が挙げられる。
肝臓の機能障害による疾患としては、例えば、肝硬変、肝性脳症が挙げられる。
【００３６】
脳の機能障害による疾患としては、例えば、脳血管障害、認知症が挙げられる。
心臓の機能障害による疾患としては、例えば、心血管疾患（ＣＶＤ）が挙げられる。
さらなる一態様として、本発明の食品組成物は、口腔内の環境の改善、虫歯の予防または進行の遅延に用いることができる。
【００３７】
さらなる一態様として、本発明の食品組成物は、精神ストレスの低減に用いることができる。
さらなる一態様として、本発明の食品組成物は、発がんリスクの低減に用いることができる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明の具体的態様を実施例として説明する。
実施例１  豆乳ケフィアの製造
まず、発酵スターター（種菌）の調製のため、ケフィア粒（５０g）に１０倍量の市販成分無調整牛乳を加え、２５℃で７２時間静置培養して発酵させた。ケフィア粒に含まれる、同定されている微生物は以下の表１に示すとおりである。
【００３９】
【表１】
2019118281.tif 000003
【００４０】
発酵後、網やザル等を用いて発酵産物をケフィア粒から分離し、分離した発酵産物を種菌とした。なお、発酵産物を分離した後のケフィア粒に再度牛乳を加えて継代培養することにより、さらに発酵産物を得ることができた。
【００４１】
次に、豆乳ケフィアの製造のため、全粒大豆粉末（５００ｇ、株式会社ペリカンより入手）、大豆胚芽（１０ｇ、株式会社ペリカンより入手）、市販の砂糖（２５ｇ）を水道水に混釈し、１，０００ｍｌにした。そして、９５℃で１時間加熱殺菌した後、２５℃に冷却し、上記方法にて得られた種菌を５０ｇ添加し、２５℃で３６時間静置して発酵させ、豆乳ケフィアを得た。また、比較対照として、市販成分無調整牛乳５００ｍｌを同様に種菌で発酵させ、牛乳ケフィアを製造した。
【００４２】
実施例２  豆乳ケフィア中の成分の分析
１．イソフラボン類の配糖体、エクオール、およびγ−アミノ酪酸の分析
実施例１の豆乳ケフィアおよび比較対照の牛乳ケフィアについて、発酵前および発酵後のものをそれぞれ１５ｇ用い、５０％（ｖ／ｖ）エチルアルコール５００ｍｌを加え、室温下で振盪抽出した。この抽出液を試料として、試料中のイソフラボン類の配糖体、エクオール、およびγ−アミノ酪酸について、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）により分析した。
【００４３】
（１）イソフラボン類の配糖体の分析
イソフラボン類の配糖体の分析に用いた条件は、以下のとおりである。
ＨＰＬＣシステム：ＬＣ−８０２０（東ソー株式会社製）
カラム：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＨｙＰｕｒｉｔｙ  Ｃ１８（内径２．１ｍｍ×長さ１００ｍｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）
カラム温度：４０℃
移動相：アセトニトリル：水（７５：２５）
流速：０．２ｍｌ／分
試料注入量：１０μｌ
検出器：紫外可視検出器（ＵＶ−８０２０、東ソー株式会社製）
検出波長：２５４ｎｍ
標準品のダイジン、ゲニステイン、およびグリシチン（いずれも和光純薬工業株式会社より入手、製品番号：３０９−０５１６１、０７９−０５５３３、およびＧ６３５４１０）の分析結果との比較により、クロマトグラム上で試料中のイソフラボン類の配糖体のピークを同定した。
【００４４】
（２）エクオールの分析
エクオールの分析に用いた条件は、以下のとおりである。
ＨＰＬＣシステム：ＬＣ−８０２０（東ソー株式会社製）
カラム：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＨｙＰｕｒｉｔｙ  Ｃ１８（内径２．１ｍｍ×長さ１００ｍｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ株式会社製）
カラム温度：４０℃
移動相：アセトニトリル：水（７５：２５）
流速：０．２０ｍｌ／分
試料注入量：１０μｌ
検出器：紫外可視検出器（ＵＶ−８０２０、東ソー株式会社製）
検出波長：２５４ｎｍ
標準品のエクオール（和光純薬工業株式会社より入手、製品番号：３８０−０４９９１）の分析結果との比較により、クロマトグラム上で試料中のエクオールのピークを同定した。標準品および豆乳ケフィア由来の試料より得られたクロマトグラムを、図１−１および図１−２にそれぞれ示す。
【００４５】
（３）γ−アミノ酪酸の分析
ＧＡＢＡの分析に用いた条件は、以下のとおりである。
ＨＰＬＣシステム：ＬＣ−８０２０（東ソー株式会社製）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）（東ソー株式会社製）
カラム温度：４０℃
移動相：アセトニトリル：１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（５０：５）
流量：１．００ｍｌ／分
試料注入量：１０μｌ
誘導体化試薬：ニンヒドリン（プレカラム法）
検出器：紫外可視検出器（ＵＶ−８０２０、東ソー株式会社製）
検出波長：５７０ｎｍ
標準品のγ−アミノ酪酸（和光純薬工業株式会社より入手、製品番号：０１０−０２４４１）の分析結果との比較により、クロマトグラム上で試料中のγ−アミノ酪酸のピークを同定した。標準品および豆乳ケフィアより由来の試料より得られたクロマトグラムを、図２−１および図２−２にそれぞれ示す。
【００４６】
２．抗菌活性の分析
実施例１の豆乳ケフィアおよび比較対照の牛乳ケフィアについて、発酵前および発酵後のものからそれぞれ遠心分離により固形分を除去した液体部分を抗菌活性測定用試料とし、ディスク法で抗菌活性を測定することにより分析した。具体的には、ヒト糞便より調製した微生物にプレートカウントアガー培地（Ｍｅｒｃｋ社製）を加えて作製したプレート中央に、上記抗菌活性測定用試料をペーパーディスク（直径８ｍｍ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）に５０μｌ吸収させたものを載せ、３５℃で２４時間培養を行い、プレート上でペーパーディスクの周囲に形成された微生物の生育が阻止されている範囲（阻止円）の直径を観察した。
【００４７】
上記「１．イソフラボン類の配糖体、エクオール、およびγ−アミノ酪酸の分析」および「２．抗菌活性の分析」により、実施例１の豆乳ケフィアおよび比較対照の牛乳ケフィアについて、イソフラボン類の配糖体、エクオール、およびγ−アミノ酪酸の含量、ならびに抗菌活性を分析した結果を、表２にまとめて示す。
【００４８】
【表２】
2019118281.tif 000004
【００４９】
抗菌活性において、−は陰性、＋は偽陽性（輪郭が不明瞭な阻止円を形成）、＋＋は弱陽性（輪郭が明瞭な阻止円を形成し、阻止円の直径が１０ｍｍ以下）、＋＋＋は中陽性（輪郭が明瞭な阻止円を形成し、阻止円の直径が１０〜１５ｍｍ）、および＋＋＋＋は強陽性（輪郭が明瞭な阻止円を形成し、阻止円のφが１５ｍｍ以上）をそれぞれ表す。
【００５０】
実施例１の豆乳ケフィアは、発酵後にエクオールを２．０％（ｗ／ｗ）、γ−アミノ酪酸を２．０％（ｗ／ｗ）含有しており、抗菌活性も極めて高かったのに対し、牛乳ケフィアでは、発酵後にエクオールは検出されず、γ−アミノ酪酸の含有量も０．４％（ｗ／ｗ）であり、豆乳ケフィアと比較して低かった。また、豆乳ケフィアと比較して抗菌活性も低かった。このことから、実施例１で製造した豆乳ケフィアでは、発酵によりエクオール、γ−アミノ酪酸、および抗菌物質が効率良く産生されていることが示唆された。なお、エクオールは発酵基材である豆乳に含まれるイソフラボン類から、γ−アミノ酪酸は発酵基材である豆乳に含まれるグルタミン酸から産生されたものと考えられた。エクオールは発がんリスクを低減させる作用が、γ−アミノ酪酸は精神ストレスを低減させる作用があるとされている（Beg A. A., Jorgensen E. M., Nat. Neurosci., 6(11), 1145-1152, 2003）。
【００５１】
また、牛乳ケフィアでは、１０８ＣＦＵ／ｇ程度で乳酸菌の増殖が停止したのに対し、豆乳ケフィアでは１０１１ＣＦＵ／ｇ程度まで乳酸菌が増殖したことから、実施例１で製造した豆乳ケフィアと牛乳ケフィアのγ−アミノ酪酸の含有量の差は、発酵基材に含まれているグルタミン酸の量の差に加えて、増殖した乳酸菌の数の差によるものと考えられた。
【００５２】
実施例３  豆乳ケフィアの抗菌活性の測定
実施例２で観察された豆乳ケフィアの抗菌活性について、以下の方法で測定することにより、さらに分析した。
【００５３】
試験材料
実施例１で得られた豆乳ケフィアから遠心分離または珪藻土濾過により固形分を除去した発酵濾液を凍結乾燥させたものを、抗菌活性の測定用の試験材料とした。また、牛乳ケフィアの発酵濾液を凍結乾燥させたものを比較対照とした。
【００５４】
豆乳ケフィアの抗菌活性の濃度スクリーニング
液体培地における大腸菌の増殖抑制率を指標に、豆乳ケフィア由来の試験材料が抗菌活性を示す濃度について、スクリーニングを行った。まず、ＣＡＳＯ培地（Ｍｅｒｃｋ社より入手、製品番号：１．００５２５．５０００）２ｍｌに、大腸菌を１ｍｌあたり１０６個になるように添加した。豆乳ケフィア由来の試験材料を滅菌した生理食塩水で１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したものを基準試料とし、さらに滅菌した生理食塩水で２０〜６４０倍に段階希釈したものを希釈試料とした。
【００５５】
基準試料および希釈試料をそれぞれ、上記の大腸菌を含むＣＡＳＯ培地に１００μｌずつ添加した。３７℃で６時間培養したものを各測定試料とし、６００ｎｍの波長における濁度（ＯＤ６００）を測定した。ＯＤ６００の測定結果、ならびに算出された大腸菌の増殖率（％）および増殖抑制率（％）を表３に示す。基準試料または希釈試料を添加せずに滅菌した生理食塩水１００μｌを添加して培養したものをコントロールとし、ＣＡＳＯ培地のみのものをブランクとした。大腸菌の増殖率（％）は、それぞれのＯＤ６００の値を基に、以下の式１で算出した。また、増殖抑制率（％）は、コントロールの増殖率１００％との差で算出した。なお、基準試料を添加した測定試料のＯＤ６００はブランクよりも低くなったため、増殖率を０％とした。
【００５６】
式１
大腸菌の増殖率（％）＝
｛（各測定試料−ブランク）／（コントロール−ブランク）｝×１００
【００５７】
【表３】
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【００５８】
表３より、豆乳ケフィアの大腸菌の増殖に対する５０％阻害濃度は、豆乳ケフィア由来の試験材料濃度で６．２５μｇ／ｍｌ（１６０倍希釈試料を添加した測定試料）程度であると考えられた。
【００５９】
豆乳ケフィアの抗菌活性スペクトルの分析
大腸菌、クロストリジウム属菌のウエルシュ菌、リステリア属菌のリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびサルモネラ属菌の腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）に対する、実施例１で得られた豆乳ケフィアの抗菌活性を以下の方法で試験した。
【００６０】
大腸菌の増殖に対する５０％阻害濃度を参考にして、１０μｇ／ｍｌの濃度の豆乳ケフィア由来の試験材料の脱イオン水溶液を調製し、その５０μｌを直径８ｍｍのペーパーディスク（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、製品番号：４９００５０１０）に含浸させ、１０ｍｌのプレートカウントアガー培地（Ｍｅｒｃｋ社製）の上に置いて、試験する細菌とともに培養した。大腸菌、クロストリジウム属菌、およびサルモネラ属菌は３７℃で２４時間、リステリア属菌および緑膿菌は３７℃で４８時間培養した。なお、クロストリジウム属菌は嫌気条件下で培養した。ディスクの周囲に形成された阻止円の直径を測定し、抗菌活性の程度を調べた。阻止円の直径が大きいほど、抗菌活性の程度が高いと考えられる。また、比較対照として、牛乳ケフィア由来の試験材料についても同様に試験した。結果を表４に示す。
【００６１】
【表４】
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【００６２】
その結果、試験した細菌の全てに対して明瞭な阻止円が形成され、実施例１で得られた豆乳ケフィアはこれらの細菌の全てに対して抗菌活性を示すことが明らかとなった。また、これらの細菌の全てで、実施例１で得られた豆乳ケフィアの抗菌活性は牛乳ケフィアの抗菌活性よりも高かった。阻止円の直径の値の比で計算すると、実施例１で得られた豆乳ケフィアは牛乳ケフィアに比して、大腸菌で約１．７倍、クロストリジウム属菌で約１．５倍、リステリア属菌で約１．７倍、緑膿菌で約１．５倍、サルモネラ属菌で約３．３倍の抗菌活性を有することが示唆された。
【００６３】
このように、実施例１で得られた豆乳ケフィアの抗菌活性スペクトルは非常に広いことが明らかとなったが、乳酸菌などの細菌が産生する類縁の細菌に対する抗菌物質であるバクテリオシンの抗菌活性スペクトルが狭いことを考えると、実施例１で得られた豆乳ケフィアは、バクテリオシンとは異なる抗菌物質を含有することが示唆された。また、実施例１で得られた豆乳ケフィアの抗菌活性により生じた阻止円を生理食塩水で洗浄してから再度培養しても、試験した細菌の生育が一切認められなかったことから、この抗菌物質による作用は静菌作用ではなく、殺菌作用であることが示唆された。さらに、実施例１で得られた豆乳ケフィアにおいてケフィア粒が増殖したことから、この抗菌物質は、ケフィア粒にも含まれている乳酸菌やビフィズス菌などの有用細菌（いわゆる善玉菌）に対する抗菌活性を示さず、いわゆる悪玉菌に選択的に作用し得ると推定された。このような悪玉菌に対する選択的な抗菌作用は、日常生活における健康増進に大いに寄与することが期待できる。
【００６４】
なお、実施例１で得られた豆乳ケフィアの抗菌活性は、分子量１ｋＤａのカットオフ透析チューブの透析外液において認められ、トヨパールＨＷ−４０Ｓ（東ソー株式会社製）を用いたゲルろ過クロマトグラフィー（溶出液：７０％エタノール溶液）により、分子量４５０Ｄａおよび５００Ｄａ近傍に２つのピークで溶出されたことから、抗菌活性を有する抗菌物質は、分子量約４５０Ｄａおよび約５００Ｄａのグリセロール誘導体であることが推定された。
【００６５】
実施例４  豆乳ケフィア摂取の糞便中悪玉菌数および総インドール含量、ならびに血中インドキシル硫酸濃度に対する影響の評価
いわゆる悪玉菌である大腸菌群やクロストリジウム属菌は、トリプトファンを代謝してインドールを産生する。インドールはこれらの悪玉菌の宿主の肝臓で代謝され、インドキシル硫酸へと変換される。インドキシル硫酸は代表的な尿毒素であり、活性酸素を経由して転写因子である核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）を活性化させ、細胞老化マーカー遺伝子であるｐ５３とｐ２１を発現させて細胞の老化や繊維化を引き起こし、その結果、腎臓、肝臓、脳、心臓などの生体臓器の機能障害を来すと考えられている（Niwa T., et. al., Am. J. Nephrol., 14(3), 207-212, 1994; Niwa T. and Ise M., J. Lab. Clin. Med., 124(1), 96-104, 1994）。インドキシル硫酸は、血中でアルブミンと結合して、尿中に排泄されずに血中に蓄積されることにより、腎機能を始め、生体内の全ての臓器に悪影響を及ぼすと考えられる。例えば、血中インドキシル硫酸濃度は健常者で１０μＭ以下であるが、末期の慢性腎不全患者では最大で５５０μＭ、平均で２５０μＭ前後にまで達する（Niwa T. and Ise M., J. Lab. Clin. Med., 124(1), 96-104, 1994）。
【００６６】
また、上記悪玉菌は、タンパク質を分解し、インドール、スカトール、フェノール、アンモニアなどの有害物質を産生して腸管内をアルカリ性にしている。そのため、腸内環境を乱し、腸管内抗菌物質であるディフェンシンを無効化させるなどの悪影響を及ぼす（廣川  勝いく、漢方と最新治療、21（3）、235-242、2012）。さらに、「超悪玉菌」とされているウエルシュ菌は分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇ−Ａ）や腸管のバリアーであるムチン層を分解する酵素を分泌し、種々の疾患の要因にもなっている。
【００６７】
そこで、実施例１で得られた豆乳ケフィアが、糞便中の悪玉菌数、悪玉菌が産生するインドールの量、および血中のインドキシル硫酸の量にどのような影響を与えるかということについて、以下の方法で評価した。
【００６８】
糞便中悪玉菌数に対する影響の評価
Ｗｉｓｔａｒ／ＳＴラット（６週齢、オス）を用い、２０ｍｇ／ｍｌに調製した塩化マグネシウムを胃ゾンデで強制的に投与して下痢を発症させ、消化管細菌を減少させた。便秘傾向のヒト大便を生理的食塩水に懸濁し、上記ラットに移植したものをヒト糞便移植ラットとした。そして、１００ｇの粉末飼料（ＣＥ-２、日本クレア株式会社製）に、加熱殺菌して凍結乾燥した豆乳ケフィア６ｍｇを混合した飼料を、ヒト糞便移植ラット１匹あたり１０ｇ摂取させた（豆乳ケフィア乾燥物として３．３ｍｇ／ｋｇ体重を投与）。ヒト糞便移植ラットの体重は１８０ｇとして計算した。比較対照として市販のプレーンヨーグルト（明治ブルガリアヨーグルト）を滅菌して凍結乾燥した後、同様の方法でヨーグルト乾燥物として３．３ｍｇ／ｋｇ体重を、ヒト糞便移植ラットに投与した。試験開始時、１５日目、および３０日目に糞便を集め、大腸菌、およびウエルシュ菌の数を、選択培地を用いて測定した。具体的には以下のとおりである：１ｇの糞便に滅菌した生理食塩水を９ｍｌ加えて１０倍希釈の原液を作製し、これに滅菌した生理食塩水を用いて１０倍の段階希釈を１０４倍まで行った希釈液を作製した。大腸菌用選択培地としてデソオキシコーレイト寒天培地（Ｍｅｒｃｋ社製）を、ウエルシュ菌用選択培地としてカナマイシン含有ＣＷ寒天基礎培地（ニッスイ社製）に５０％卵黄液を１０％添加したものを用い、各段階希釈液１ｍｌに選択培地を１５ｍｌ加えて混釈し、３７℃で４８時間培養した（各段階希釈液につきｎ=５で培養）。そして、各選択培地において生じたコロニー数から大腸菌およびウエルシュ菌の糞便中の数を算出した。なお、ウエルシュ菌は嫌気条件下で培養した。結果を図３に示す。豆乳ケフィア摂取により、大腸菌およびウエルシュ菌の数は、１５日目には摂取前の５０％程度まで減少した。
【００６９】
糞便中総インドール含量に対する影響の評価
糞便中の総インドールは、ヒト糞便移植ラット５匹より集めた糞便１ｇを破砕し、Ｂａｃｔｏ（商標）  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈ（ベクトン・ディッキンソン社製）培地に入れ、３７℃で培養し、培地中のインドール量を保田らの方法（保田正人ら、ｐ−ヂメチルアミノベンズアルデヒドによるインドール定量法の変法−ＩＩ、インドールの簡易定量法、Bulletin of the Faculty of Fisheries, Nagasaki University, No.7, pp.101-107, 1958）に従って定量した。すなわち、培養後の上記培地５０ｍｌに硫酸０．５ｍｌを加え、２０ｍｌの石油エーテルを加え、ボルテックスで激しく振盪して抽出した。石油エーテル層に呈色試薬として４０ｍｇのｐ−ヂメチルアミノベンズアルデヒドを加え、室温下で振盪しながら発色させた。遠心分離（１，０００ｒｐｍ、１０分）により呈色層を得て、その５６５ｎｍの吸光度を測定した。そして、標準品のインドール（和光純薬工業社製、製品番号：０９４−００１６１）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように脱イオン水に溶解した標準溶液を上記培地に添加して希釈したものについて、同様の測定を行って、吸光度とインドール量の検量線を作成し、作成した検量線から、上記糞便を培養した後の培地中のインドール量を定量し、糞便中の総インドール含量を算出した。結果を表５に示す。
【００７０】
【表５】
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【００７１】
ヒト糞便移植ラットの糞便中総インドール含量は８３．２μｇ／ｍｌで、比較対照の市販ヨーグルト摂取群は７６．２μｇ／ｍｌであり、１０％未満程度の減少であったが、豆乳ケフィア摂取群では８．８μｇ／ｍｌであり、９０％程度も減少していた。
【００７２】
血中総インドキシル硫酸濃度に対する影響の評価
血中総インドキシル硫酸は、ＨＰＬＣを用いた丹羽らの方法（丹羽俊充ら、透析患者におけるインドキシル硫酸の動態、透析学会誌21(10):951-956, 1988）に従って定量した。糞便についての上記試験終了時に採決を行い、定法で血清を分離し、ＨＰＬＣによりインドキシル硫酸を分析した。ＨＰＬＣの分析条件は以下のとおりである。
【００７３】
ＨＰＬＣシステム：ＬＣ−８０２０（東ソー株式会社製）
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  ＭＧＩＩ（内径２．０ｍｍ×長さ１００ｍｍ）（株式会社資生堂製）
カラム温度：４０℃
移動相：０．２Ｍ酢酸／トリエチルアミン（ｐＨ６．５）：イソプロパノール：テトラヒドロフラン（８４：１０：６，ｖ／ｖ）
流量：０．２０ｍｌ／分
試料注入量：１０μｌ
検出器：紫外可視検出器（ＵＶ−８０２０、東ソー株式会社製）
検出波長：２７０ｎｍ
標準品のインドキシル硫酸カリウム（ナカライテスク株式会社より入手、製品番号：１９２０８−０４）の分析結果との比較により、クロマトグラム上で血液試料中のピークを同定した。標準品および豆乳ケフィアより由来の試料より得られたクロマトグラムを、図２−１および図２−２にそれぞれ示す。
【００７４】
得られたクロマトグラムを図４−１および図４−２に示す。また、血中の総インドキシル硫酸濃度（ｎ＝５）を表６に示す。
【００７５】
【表６】
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【００７６】
インドキル硫酸は、図４−１および図４−３のクロマトグラム上において約８．３分に溶出しており、ヒト糞便移植ラットの血中総インドキシル硫酸濃度は３２．６μｇ／ｍｌ（約１５３．０μＭ）であった。比較対照の市販ヨーグルト摂取群では３５．７μｇ／ｍｌ（約１６７．６μＭ）であり、影響がみられなかったのに対し、豆乳ケフィア摂取群では４．２μｇ／ｍｌ（約１９．７μＭ）であり、約８７％も減少していた。
【００７７】
以上の結果から、実施例１で得られた豆乳ケフィアを摂取することにより、大腸菌やウエルシュ菌などの悪玉菌数が減少し、これらの菌が宿主の腸内において産生するインドールが減少することが確認された。そして、腎臓、肝臓、脳、心臓などの生体臓器の機能障害の原因となる宿主の体内でのインドールからのインドキシル硫酸の生成が、実施例１で得られた豆乳ケフィアの摂取により減少することが確認された。
【００７８】
また、大腸菌やウエルシュ菌などの悪玉菌数が減少したことから、実施例１で得られた豆乳ケフィアの摂取により、これらの悪玉菌が引き起こすその他の種々の疾患の予防も可能であることが示唆された。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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