(57)【要約】      （修正有）【課題】抗酸菌由来のＬＡＭもしくはＡＧのＤ−アラビナン部位を分解しうる酵素を提供することを課題とする。【解決手段】特定のアミノ酸配列の全部又は少なくともシグナル配列部分を除いた部分を含む一部からなり、且つ、エンド−Ｄ−アラビナーゼ活性を有する組換えタンパク質。又、特定のアミノ酸配列の全部又は一部からなり、且つ、エキソ−α−Ｄ−アラビノフラノシダーゼ活性を有する組換えタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）、（b）又は（c）の組換えタンパク質
（a）配列番号２に記載のアミノ酸配列の全部又は少なくともシグナル配列部分を除いた部分を含む一部からなる組換えタンパク質。
（b）配列番号２に記載のアミノ酸配列（a）において１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エンド−D−アラビナーゼ活性を有する組換えタンパク質。
（c）配列番号２に記載のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エンド−D−アラビナーゼ活性を有する組換えタンパク質。
【請求項２】
以下の（a）、（b）又は（c）の組換えDNA
（a）配列番号１に記載の塩基配列の全部又は少なくともシグナル配列部分を除いた部分を含む一部からなる組換えDNA。
（b）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、エンド−D−アラビナーゼ活性を有する組換えタンパク質をコードする組換えDNA。
（c）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、エンド−D−アラビナーゼ活性を有する組換えタンパク質をコードする組換えDNA。
【請求項３】
以下の（a）、（b）又は（c）の組換えタンパク質
（a）配列番号４に記載のアミノ酸配列の全部又は少なくともシグナル配列部分を除いた部分を含む一部からなる組換えタンパク質。
（b）配列番号４に記載のアミノ酸配列（a）において１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エンド−D−アラビナーゼ活性を有する組換えタンパク質。
（c）配列番号４に記載のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エンド−D−アラビナーゼ活性を有する組換えタンパク質。
【請求項４】
以下の（a）、（b）又は（c）の組換えDNA
（a）配列番号３に記載の塩基配列の全部又は少なくともシグナル配列部分を除いた部分を含む一部からなる組換えDNA。
（b）配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、エンド−D−アラビナーゼ活性を有する組換えタンパク質をコードする組換えDNA。
（c）配列番号３に記載の塩基配列と少なくとも８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、エンド−D−アラビナーゼ活性を有する組換えタンパク質をコードする組換えDNA。
【請求項５】
以下の（a）、（b）又は（c）の組換えタンパク質
（a）配列番号６に記載のアミノ酸配列の全部又は一部からなる組換えタンパク質。
（b）配列番号６に記載のアミノ酸配列（a）において１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ活性を有する組換えタンパク質。
（c）配列番号６に記載のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
以下の（a）、（b）又は（c）の組換えDNA
（a）配列番号５に記載の塩基配列の全部又は一部からなる組換えDNA。
（b）配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、エキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ活性を有する組換えタンパク質をコードする組換えDNA。
（c）配列番号５に記載の塩基配列と少なくとも８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、エキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ活性を有する組換えタンパク質をコードする組換えDNA。
【請求項７】
請求項１又は３又は５に記載の組換えタンパク質を単独でもしくは複数組み合わせて抗酸菌由来のリポアラビノマンナンやアラビノガラクタンを含む原料に作用させる工程を含む、Ｄ-アラビノースで構成されたＤ−アラビノオリゴ糖及びリポマンナン及びガラクタンの製造方法。
【請求項８】
請求項１又は３又は５に記載の組換えタンパク質を単独でもしくは複数組み合わせて抗酸菌由来のリポアラビノマンナンやアラビノガラクタンを含む原料に作用させる工程を含む、リポアラビノマンナンやアラビノガラクタンの解析又は検出方法。
【請求項９】
請求項２又は４又は６に記載の組換えDNAを含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換体を用いることを特徴とする、請求項１又は３又は５に記載の組換えタンパク質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規Ｄ−アラビナン分解酵素であるエンド−Ｄ−アラビナーゼ及びエキソ−α−Ｄ−アラビノフラノシダーゼ、及びそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
結核は、ストレプトマイシンやリファンピシリンなどの抗結核薬の登場とＢＣＧ接種の普及により制圧できると考えられてきた。しかし、発展途上国において多剤耐性結核菌の感染が増加し、日本でも２万人を超える感染者が確認されている。このため、より強力な抗結核薬を求めて、新たに、細胞壁合成・タンパク質合成・ＤＮＡ合成・ＡＴＰ合成阻害剤の開発が進められている。この中で、ヒトが持たない結核菌細胞壁成分の中で、特にリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）と呼ばれる糖脂質が創薬の重要なターゲットの一つとし注目され、ＬＡＭの生合成経路の解明とその生合成を阻害する抗結核薬の開発が進められている。
【０００３】
ＬＡＭは、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）がマンナン鎖によって修飾された糖脂質であるリポマンナン（ＬＭ）に、Ｄ−アラビナン鎖と呼ばれるアラビノースによって修飾された構造を有する（図１）。なお、ＬＡＭに修飾されているアラビノースは、植物に見られるＬ体では無く、結核菌やらい菌などの抗酸菌特有のＤ体のフラノース型である。Ｄ−アラビナン鎖は、α１，５−結合のＤ−アラビノフラノース（Ｄ−Ａｒａｆ）で構成されたα１，５−D−アラビナン主鎖にα１，３−結合で分岐した枝分かれ構造を有している。さらにその非還元末端はβ１，２−結合のＤ−Ａｒａｆとマンノースで修飾されている。また、抗酸菌の細胞壁を構成するアラビノガラクタン鎖(ＡＧ)もＬＡＭと同様のD−アラビナン鎖で修飾されていることが知られている。なお、本明細書において「Ara」はアラビノースを表し、「f」はフラノース環構造を表す。
【０００４】
エンド−D−アラビナーゼとは、LAMやAGのD-アラビナン鎖に対してエンド型に作用しD−アラビノオリゴ糖を遊離させるとともに、LAMをLMに分解する酵素である。エンド−D−アラビナーゼに関する報告は、オーレオバクテリウム（Aureobacterium）に属するM２株（現在Microbacterium arabinogalactanolyticum NBRC14344として寄託されている）が分泌する天然型酵素（nＥｎｄｏ−ＭＡ）の存在が報告されている（非特許文献１）。また、その精製に関する報告が行われている（非特許文献２）。さらに、放線菌Cellulomonas属細菌からの精製に関するもの（非特許文献３）及び、非結核性抗酸菌Mycobacterium Smegmatisに菌体内酵素として存在していることを確認したものがある（非特許文献４）。しかしながら、現在までこれらのエンド−D−アラビナーゼのクローニング及び異種遺伝子発現に関する報告は行われていない。
一方、エキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼとは、エンド−D−アラビナーゼによって遊離されたα−D−アラビノオリゴ糖に対してエキソ型に作用しD-Araを遊離する酵素である。本酵素に関してはオーレオバクテリウムM２株が生産する酵素の精製に関する報告がある（非特許文献５）。しかし、現在までエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼのクローニング及び異種遺伝子発現に関する報告は行われていない。なお、本明細書において酵素名の前に記載された「ｒ」は組換えタンパク質であることを表し、「ｎ」は天然型タンパク質であることを表す。
【０００５】
さらに、抗体作成の際に用いられる完全フロイトアジュバント(CFA：免疫動物内で抗原の放出を穏やかにすることで，強力でかつ長期間に渡り持続的な免疫応答を促進する薬剤)には加熱死菌の結核菌の類縁菌Mycobacterium butyricumが使用されている。CFAは免疫動物に炎症を引き起こす欠点があり、その代替品が必要とされている。既にLAMには免疫を活性化する能力があることが報告されており、LAMの免疫賦活能力を維持したまま低分子化することによる体内動態の最適化の可能性も指摘されている（非特許文献６）。また、ＬＭにも免疫賦活能力があることが報告されている（非特許文献７）。エンド−D−アラビナーゼとエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼはこの低分子化及びＬＡＭのＬＭへ分解を行うことができる酵素である。しかし、先行技術文献のうち精製工程が記載されているのは非特許文献２と３と５があるが、ここに記載の方法では精製工程も煩雑であり、夾雑物を含まない精製酵素の大量調製は困難であるという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】S. Kotani, et al. Biken J., 14, 379-387 (1971).
【非特許文献２】澤井未視等， 日本生物工学会大会講演要旨集， 67, 105(2015).
【非特許文献３】M.Z. Sun, et al. Protein J, 31, 51-58 (2012).
【非特許文献４】Y. Xin, et al. Biochim. Biophys. Acta, 1473, 267-271 (1999).
【非特許文献５】小前幸三等，日本農芸化学会大会講演要旨集， 665(1986).
【非特許文献６】A. Yonekawa, et al.  Immunity, 41, 402-413 (2014)
【非特許文献７】D.N. Dao, et al.  Infect. Immun., 72, 2067-2074 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、ＬＡＭまたはＡＧのD-アラビナン部位を分解する糖質分解酵素であるエンド−D−アラビナーゼ及びエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼの遺伝子をクローニングすることにより、該酵素の効率的な発現生産に寄与することである。オーレオバクテリウムM２株からのエンド−D−アラビナーゼの酵素生産を行うためには、抗酸菌細胞壁抽出液を誘導物質として添加する必要があり長時間の培養を要する上、精製工程も煩雑で単一精製を行うことが極めて困難という問題があった。組換え酵素の発現生産系の確立により、該酵素の効率的な発現生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らが鋭意研究を進めた結果、オーレオバクテリウムM２株にコードされたエンド−D−アラビナーゼ遺伝子と、エキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ遺伝子の同定に成功した。また、これらの組換え酵素がD-アラビナン分解活性を有することを見いだし、以下の本発明を完成させた。
【０００９】
請求項１に記載の本発明は、新規糖質分解酵素の組換えエンド−D−アラビナーゼ１（ｒＥｎｄｏ−ＭＡ１）であり、以下の（a）、（b）又は（c）の組換えタンパク質である。
（a）  配列番号２に記載のアミノ酸配列の全部又は少なくともシグナル配列部分を除いた部分を含む一部からなる組換えタンパク質。
（b）  配列番号２に記載のアミノ酸配列（a）において１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エンド−D−アラビナーゼ活性を有する組換えタンパク質。
（c）  配列番号２に記載のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エンド−D−アラビナーゼ活性を有する組換えタンパク質。
前記ｒＥｎｄｏ−ＭＡ１は、請求項２に記載の以下の(A)、（B）又は（C）の組換えDNAでコードされる組換えタンパク質でもある。
（A）  配列番号１に記載の塩基配列の全部又は少なくともシグナル配列部分を除いた部分を含む一部からなる組換えDNA。
（B）  配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、エンド−D−アラビナーゼ活性を有する組換えタンパク質をコードする組換えDNA。
（C）  配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、エンド−D−アラビナーゼ活性を有する組換えタンパク質をコードする組換えDNA。
【００１０】
請求項３に記載の本発明は、新規糖質分解酵素の組換えエンド−D−アラビナーゼ２（ｒＥｎｄｏ−ＭＡ２）であり、以下の（a）、（b）又は（c）の組換えタンパク質である。
（a）  配列番号４に記載のアミノ酸配列の全部又は少なくともシグナル配列部分を除いた部分を含む一部からなる組換えタンパク質。
（b）  配列番号４に記載のアミノ酸配列（a）において１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エンド−D−アラビナーゼ活性を有する組換えタンパク質。
（c）  配列番号４に記載のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エンド−D−アラビナーゼ活性を有する組換えタンパク質。
前記ｒＥｎｄｏ−ＭＡ２は、請求項４に記載の以下の(A)、（B）又は（C）の組換えDNAでコードされる組換えタンパク質でもある。
（A）  配列番号３に記載の塩基配列の全部又は少なくともシグナル配列部分を除いた部分を含む一部からなる組換えDNA。
（B）  配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、エンド−D−アラビナーゼ活性を有する組換えタンパク質をコードする組換えDNA。
（C）  配列番号３に記載の塩基配列と少なくとも８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、エンド−D−アラビナーゼ活性を有する組換えタンパク質をコードする組換えDNA。
【００１１】
請求項５に記載の本発明は、新規糖質分解酵素の組換えエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ１（ｒＥｘｏ−ＭＡ１）であり、以下の（a）、（b）又は（c）の組換えタンパク質である。
（a）  配列番号６に記載のアミノ酸配列の全部又は一部からなる組換えタンパク質。
（b）  配列番号６に記載のアミノ酸配列（a）において１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ活性を有する組換えタンパク質。
（c）  配列番号６に記載のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ活性を有する組換えタンパク質。
前記ｒＥｘｏ−ＭＡ１は、請求項６に記載の以下の(A)、（B）又は（C）の組換えDNAでコードされる組換えタンパク質でもある。
（A）  配列番号５に記載の塩基配列の全部又は一部からなる組換えDNA。
（B）  配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、エキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ活性を有する組換えタンパク質をコードする組換えDNA。
（C）  配列番号５に記載の塩基配列と少なくとも８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、エキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ活性を有する組換えタンパク質をコードする組換えDNA。
【００１２】
請求項７に記載の本発明は、請求項１又は３又は５に記載の組換えタンパク質を単独でもしくは複数組み合わせて抗酸菌由来のリポアラビノマンナンやアラビノガラクタンを含む原料に作用させる工程を含む、Ｄ-アラビノースで構成されたＤ−アラビノオリゴ糖及びリポマンナン及びガラクタンの製造方法である。
【００１３】
請求項８に記載の本発明は、請求項１又は３又は５に記載の組換えタンパク質を単独でもしくは複数組み合わせて抗酸菌由来のリポアラビノマンナンやアラビノガラクタンを含む原料に作用させる工程を含む、リポアラビノマンナンやアラビノガラクタンの解析又は検出方法である。
【００１４】
請求項９に記載の本発明は、 請求項２又は４又は６に記載の組換えDNAを含むベクターである。
【００１５】
請求項１０に記載の本発明は、請求項９に記載のベクターにより形質転換された形質転換体である。
【００１６】
請求項１１に記載の本発明は、請求項１０に記載の形質転換体を用いることを特徴とする、請求項１又は３又は５に記載の組換えタンパク質を製造する方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、新規D-アラビナン分解酵素である組換えエンド−D−アラビナーゼ及びその組換えタンパク質をコードする組換えDNAが提供される。また、新規D-アラビナン分解酵素である組換えエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ及びその組換えタンパク質をコードする組換えDNAが提供される。本発明により、該酵素の効率的な発現生産方法を提供することができ、結核菌などの抗酸菌に存在するLAMやAGからD-アラビナンが除去されたLM又はガラクタン又はD-アラビノオリゴ糖を製造するための有益なツールとしての活用が期待される。さらに、LAMやAGのD-アラビナン構造を解析するためのツールとしての活用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＬＡＭ(A)とＡＧ(B)の構造を示す図である。
【図２】新規D-アラビナン分解酵素であるエンド−D−アラビナーゼ(A)及びエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ(B)のアミノ酸配列に含まれるドメイン構造を示す概略図である。
【図３】LAMに対するエンド−D−アラビナーゼ及びエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼの切断部位（ハサミで表す）を示す図である。
【図４】試験例１により調製した組換えエンド−D−アラビナーゼであるrＥｎｄｏ−ＭＡ１(A)、rＥｎｄｏ−ＭＡ２(Ｂ)及び、組換えエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼであるrＥｘｏ−ＭＡ１(C)の精製酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した図である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは10％ポリアクリルアミドゲルを用い、染色はCoomassie Brilliant Blueを用いた。両端のレーンはサイズマーカーを表す。
【図５】結核菌由来のLAMに対して試験例１により調製したエンド−D−アラビナーゼを作用させた時の反応産物をSDS-PAGE(A)、及びHPAEC-PAD(B)により解析した結果である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは15％ポリアクリルアミドゲルを用い、染色はシルバーPASを用いた。HPAEC-PADのピークA1はD-Ara、A2はD-Araf-α1,5-D-Ara (D-Ara2)、A3はD-Araf-α1,5- D-Araf-α1,5-D-Ara (D-Ara3)で構成される。なお、A4-A20は、詳細な構造は未同定であるが溶出時間から4糖から20糖のD-Araで構成されたオリゴ糖であることが予想される領域を表す。
【図６】結核菌由来のLAMに対して試験例１により調製したエンド−D−アラビナーゼとエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼを単独もしくは共同で作用させた時の反応産物をHPAEC-PADにより解析した結果である。
【図７】非結核性好酸菌由来のLAMに対して試験例１により調製したエンド−D−アラビナーゼを作用させた時の反応産物をSDS-PAGE(A)、及びHPAEC-PAD(B)により解析した結果である。
【図８】糖誘導体Methyl-α-D-arabinofuranoside（図中ではＡ−Ｍｅと略す）に対して試験例１により調製したエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ及びエンド−D−アラビナーゼを作用させた時の反応産物をTLCにより解析した結果である。
【図９】非結核性好酸菌由来のAGに対して試験例１により調製したエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ及びエンド−D−アラビナーゼを作用させた時の反応産物をTLC(A)、及びHPAEC-PAD(B)により解析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の実施の形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができる。
【００２０】
［エンド−D−アラビナーゼ及びエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ遺伝子をコードする微生物］
エンド−D−アラビナーゼ及びエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ遺伝子をコードする微生物であるオーレオバクテリウムM２株は1984年にIFO14344として寄託された後、基準株としてMicrobacterium arabinogalactanolyticumの学名で登録されている。今回クローニングに用いたオーレオバクテリウムM２株は寄託機関から分譲されたものではないため、その同一性を担保する目的で、１６SリボソーマルRNA遺伝子の塩基配列を定法により同定した。次に、Microbacterium arabinogalactanolyticum NBRC14344の16ｓrRNA遺伝子塩基配列(http://www.nbrc.nite.go.jp/NBRC2/SequencSearchServlet?ID=NBRC&CAT=00014344&DNA=2)と比較したところ１００％の塩基配列が同一であった。このため、本発明のために用いたオーレオバクテリウムM２株と寄託機関に保存されたMicrobacterium arabinogalactanolyticum NBRC14344は同一の菌株であると考えられる。
【００２１】
［エンド−D−アラビナーゼ］
本発明の組換えエンド−D−アラビナーゼであるｒＥｎｄｏ−ＭＡ１とは、具体的には配列番号２に記載のアミノ酸配列の全部又は少なくともシグナル配列部分を除いた部分を含む一部からなる組換えタンパク質である。また、ｒＥｎｄｏ−ＭＡ２とは、具体的には配列番号４に記載のアミノ酸配列の全部又は少なくともシグナル配列部分を除いた部分を含む一部からなる組換えタンパク質である。
【００２２】
また、本発明のｒＥｎｄｏ−ＭＡ１及びｒＥｎｄｏ−ＭＡ２は、後述する組換えエンド−D−アラビナーゼ活性が損なわれない限り、配列番号２及び４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加及び/又は挿入の変異が加えられたアミノ酸配列であってもよい。ここで、１若しくは数個とは、好ましくは1〜３０個、より好ましくは1〜１０個、特に好ましくは1〜５個である。
かかる変異としては、アミノ酸置換が好ましく、電荷、極性（もしくは疎水性）又は側鎖の構造が類似種類のアミノ酸であることが望ましい。類似種類のアミノ酸とは、例えば塩基性アミノ酸（リシン、ヒスチジン、アルギニン）、酸性アミノ酸(アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性アミノ酸（グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン）、無極性アミノ酸（アラニン、バリンロイシン、イソロイシン、プロリン）、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンチロシン)などに分けることができる。
【００２３】
本発明のｒＥｎｄｏ−ＭＡ１及びｒＥｎｄｏ−ＭＡ２は、配列番号１及び３に記載の塩基配列の全部又は少なくともシグナル配列部分を除いた部分を含む一部からなる組換えDNAでコードされる組換えタンパク質でもある。
【００２４】
また、本発明のｒＥｎｄｏ−ＭＡ１及びｒＥｎｄｏ−ＭＡ２は、後述する組換えエンド−D−アラビナーゼ活性が損なわれない限り、配列番号１及び３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする組換えDNAでコードされる組換えタンパク質であってもよい。
【００２５】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。
【００２６】
また、本発明のｒＥｎｄｏ−ＭＡ１及びｒＥｎｄｏ−ＭＡ２は、後述する組換えエンド−D−アラビナーゼ活性が損なわれない限り、 配列番号１及び３に記載の塩基配列と少なくとも８０％以上の同一性を有する塩基配列でコードされる組換えタンパク質であってもよい。
【００２７】
InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/)を用いてドメイン検索を行ったところ、Ｅｎｄｏ−ＭＡ１は、N−末端側（配列番号２の第１〜３２位を含む）にシグナルペプチド(SP)を有することが予想された（図２Ａ）。また、Ｅｎｄｏ−ＭＡ１は、配列番号２の第４９〜３５３位にＤＵＦ４１８５ドメインを有することが予想された。ＤＵＦドメインは、いくつかのタンパク質によって共有された機能未知のドメインである。さらに、C−末端側（配列番号２の第３３８〜５１１位を含む）にガラクトース結合領域様ドメイン (Galactose-bd-like)を有することが予想された。また、Ｅｎｄｏ−ＭＡ２は、N−末端側（配列番号４の第１〜３８位を含む）にシグナルペプチド(SP)を有することが予想された（図２Ａ）。また、Ｅｎｄｏ−ＭＡ２は、配列番号４の第５７〜３５９位にＤＵＦ４１８５ドメインを有することが予想された。
【００２８】
前述した様に、DUFドメインはＰｆａｍデータベース（http://pfam.xfam.org）に登録された機能未知ドメインを表すため、DUFドメインに登録されている時点で機能が明らかにされているタンパク質は存在していないと考えることができる。さらに、ｒＥｎｄｏ−ＭＡ１及びｒＥｎｄｏ−ＭＡ２のアミノ酸配列についてNCBI BLASTPデータベース(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)を用いて相同性検索を行ったところ、エンド−D−アラビナーゼを含め既知酵素は見つからなかった。このため、ｒＥｎｄｏ−ＭＡ１及びｒＥｎｄｏ−ＭＡ２はアミノ酸配列の新規性が高い酵素であり、CAZyデータベース(http://www.cazy.org)における新規の糖質分解酵素ファミリー(GHファミリー)に該当すると考えられる。また、ｒＥｎｄｏ−ＭＡ１のＤＵＦ４１８５ドメイン（配列番号２の第５７〜３４８位を含む）とｒＥｎｄｏ−ＭＡ２のＤＵＦ４１８５ドメイン（配列番号４の第６１〜３５４位を含む）間は、アミノ酸同一性２７％、アミノ酸相同性４２％であり、その類似性は低い。これは、Ｐｆａｍデータベースに登録されたＤＵＦ４１８５ドメインを有する遺伝子の多くがエンド−D−アラビナーゼをコードする可能性が高いことを意味している。
【００２９】
［エキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ］
本発明の組換えエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼであるｒＥｘｏ−ＭＡ１とは、具体的には配列番号６に記載のアミノ酸配列の全部又は一部からなる組換えタンパク質である。
【００３０】
また、本発明のｒＥｘｏ−ＭＡ１は、後述する組換えエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ活性が損なわれない限り、配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加及び/又は挿入の変異が加えられたアミノ酸配列であってもよい。ここで、１若しくは数個とは、好ましくは1〜３０個、より好ましくは1〜１０個、特に好ましくは1〜５個である。
かかる変異としては、アミノ酸置換が好ましく、電荷、極性（もしくは疎水性）又は側鎖の構造が類似種類のアミノ酸であることが望ましい。類似種類のアミノ酸とは、例えば塩基性アミノ酸（リシン、ヒスチジン、アルギニン）、酸性アミノ酸(アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性アミノ酸（グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン）、無極性アミノ酸（アラニン、バリンロイシン、イソロイシン、プロリン）、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンチロシン)などに分けることができる。
【００３１】
本発明のｒＥｘｏ−ＭＡ１は、配列番号５に記載の塩基配列の全部又は一部からなる組換えDNAでコードされる組換えタンパク質でもある。
【００３２】
また、本発明のｒＥｘｏ−ＭＡ１は、後述するエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ活性が損なわれない限り、配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする組換えDNAでコードされる組換えタンパク質であってもよい。
【００３３】
また、本発明のｒＥｘｏ−ＭＡ１は、後述するエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ活性が損なわれない限り、配列番号５に記載の塩基配列と少なくとも８０％以上の同一性を有する塩基配列でコードされる組換えタンパク質であってもよい。
【００３４】
InterProを用いてドメイン検索を行ったところ、ｒＥｘｏ−ＭＡ１は、配列番号６の第８６〜３３４位にＤＵＦ２９６１ドメインを有することが予想された。なお、Ｅｘｏ−ＭＡ１は、シグナルペプチドを持たないことが予想されたため、菌体内酵素であると考えられる。
【００３５】
ｒＥｘｏ−ＭＡ１のアミノ酸配列についてNCBI BLASTPデータベースを用いて相同性検索を行ったところ、エキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼを含め既知酵素は見つからなかった。このため、ｒＥｘｏ−ＭＡ１はアミノ酸配列の新規性が高い酵素であり、CAZyデータベースにおける新規のGHファミリーに該当すると考えられる。また、Ｐｆａｍデータベースに登録されたＤＵＦ２９６１ドメインを有する遺伝子の多くがエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼをコードする可能性が高い。
【００３６】
［LAMとAGの構造］
図１に示すように、LAMは脂質部分のフォスファチジルイノシトールにマンナン鎖が結合したリポマンナン（LM）にD体のＡｒａｆで構成されたD-アラビナン鎖が付加したものである。また、D-アラビナン鎖の構造は抗酸菌の細胞壁を構成するAGと類似した構造をとることが知られている(L. Shi et al., J. Biol. Chem., 281, 19512-19526 (2006))。また、LAMの構造は非結核性抗酸菌と結核菌で異なっており、結核菌ではD-アラビナン鎖の非還元末端がマンノースで修飾されるなどの違いがある(Y. Guerardel et al., J. Biol. Chem., 277, 30635-30648 (2002))。
【００３７】
［ｒＥｎｄｏ−ＭＡ１及びｒＥｎｄｏ−ＭＡ２及びｒＥｘｏ−ＭＡ１の基質特異性］
本発明のｒＥｎｄｏ−ＭＡ１及びｒＥｎｄｏ−ＭＡ２は、LAM及び類似のD-アラビナン構造を有するAGのD-アラビナン領域のα1,5鎖をエンド型に認識して切断するエンド−D−アラビナーゼである。なお、この分解活性は結核菌由来のLAM（図５)と非結核性抗酸菌由来のLAM(図７)及びＡＧ(図９)で確認できる。また、本発明のｒＥｘｏ−ＭＡ１は、α結合を有するD-Ａｒａｆで構成された糖誘導体またはα−Ｄ−アラビノオリゴ糖をエキソ型に認識して切断するエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼである(図８)。図３を参照して説明すると、(A)ＬＡＭに対して組換えエンド−D−アラビナーゼであるｒＥｎｄｏ−ＭＡ１及びｒＥｎｄｏ−ＭＡ２が作用し、LAMのD-アラビナン領域のα1,5鎖をエンド型に認識して切断することにより、LAMからＤ−アラビノオリゴ糖とLMを生成する(図５)。 (B)エンド−D−アラビナーゼ処理後に組換えエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼであるｒＥｘｏ−ＭＡ１を作用させた場合、α-Ｄ−Ａｒａｆを非還元末端にもつD-アラビノオリゴ糖もしくは、LMの非還元末端のα-Ｄ−Ａｒａｆに対してエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼが作用してＤ−Ａｒａを遊離する(図６)。(C) 結果的に、α-Ｄ−Ａｒａｆを非還元末端にもつD-アラビノオリゴ糖やLMの非還元末端に残されたα-Ｄ−Ａｒａｆは除去されるが、Ｄ−Ａｒａｆが除去されたLMや非還元末端側にβ-Ｄ−Ａｒａｆが付加されたD-アラビノオリゴ糖は分解されずに残る。なお、図１及び図３に示すようにLAMやAGの非還元末端はβ結合のＤ−Ａｒａｆにより修飾されているため、ｒＥｘｏ−ＭＡ１はＬＡＭやＡＧに単独で作用させても分解活性を示すことはなく、エンド−D−アラビナーゼにより遊離された非還元末端にα結合を有するD-Arafで構成されたα−Ｄ−アラビノオリゴ糖に対してのみ分解活性を示すことができる(図６)。このため、本発明のエンド−D−アラビナーゼとエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼを組み合わせてLAM及びAGに対して作用させることにより、非還元末端側にβ-Ｄ−Ａｒａｆが付加されたD-アラビノオリゴ糖及び、D-アラビナン部位を完全除去したLM及びガラクタンを調製することが可能になる。
【００３８】
［ｒＥｎｄｏ−ＭＡ１及びｒＥｎｄｏ−ＭＡ２及びｒＥｘｏ−ＭＡ１の酵素反応条件］
本発明のｒＥｎｄｏ−ＭＡ１及びｒＥｎｄｏ−ＭＡ２及びｒＥｘｏ−ＭＡ１の酵素反応条件は、特に限定されないが、例えば温度は２５℃〜６０℃が好ましく、３５℃〜５０℃がより好ましい。また、ｐＨは４．０〜７．５が好ましく、５．５〜７．０がより好ましい。
【００３９】
［ｒＥｎｄｏ−ＭＡ１及びｒＥｎｄｏ−ＭＡ２の酵素活性の確認方法］
ここで、エンド−D−アラビナーゼ活性は、例えば以下の方法により確認することができる。すなわち、本発明のｒＥｎｄｏ−ＭＡ１及びｒＥｎｄｏ−ＭＡ２を、ＬＡＭと反応させて、SDS-PAGEとシルバーＰＡＳ染色を組み合わせた方法によりLAMからＬＭへの分解を定性的に評価できるし、AGと反応させてＤ−アラビナンを分解させた後、TLCを用いて分離したオリゴ糖をオルシノール硫酸のような発色剤を用いて検出することもできる。また、HPAEC-PAD (High performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection)等のクロマトグラフィー法により生成したオリゴ糖を検出し、そのピークの溶出時間から遊離糖のサイズを評価できる。さらに、ソモジーネルソン法のような切断により生ずる還元糖量を評価することにより、酵素活性を定量的に評価することができる。
【００４０】
［ｒＥｘｏ−ＭＡ１の酵素活性の確認方法］
また、エキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼ活性は、例えば以下の方法により確認することができる。すなわち、本発明のｒＥｘｏ−ＭＡ１をｐ‐ニトロフェニル‐α‐Ｄ‐アラビノフラノシドを基質として反応させ、遊離するｐ‐ニトロフェノールの量を４００ｎｍの吸光度により測定する方法を用いることもできる。また、メチル‐α‐Ｄ‐アラビノフラノシドを基質として反応させ、TLCを用いて分離したオリゴ糖をオルシノール硫酸のような発色剤を用いて検出することもできる。さらに、本発明のｒＥｎｄｏ−ＭＡ１及びｒＥｎｄｏ−ＭＡ２によりＬＡＭやＡＧから遊離させたα−Ｄ−アラビノオリゴ糖を基質として反応させ、HPAEC-PAD等のクロマトグラフィー法により生成したオリゴ糖を検出し、そのピークから遊離糖のサイズを評価することもできる。
【００４１】
［ｒＥｎｄｏ−ＭＡ１及びｒＥｎｄｏ−ＭＡ２及びｒＥｘｏ−ＭＡ１の製造方法］
本発明のｒＥｎｄｏ−ＭＡ１及びｒＥｎｄｏ−ＭＡ２及びｒＥｘｏ−ＭＡ１は、遺伝子工学的手法を用いて適当な宿主細胞に組換えタンパク質を産生させることにより製造できる。  
【実施例１】
【００４２】
本発明について、実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４３】
［試験例１］組換え酵素及び天然型酵素の作製
Ｅｎｄｏ−ＭＡ１遺伝子のシグナルペプチドをコードする部位を除いた配列（配列番号１の第９７〜１５３３位）及びＥｎｄｏ−ＭＡ２遺伝子のシグナルペプチドをコードする部位を除いた配列（配列番号３の第１１５〜１１０７位）及びＥｘｏ−ＭＡ１のストップコドンをコードする部位を除いた配列（配列番号５の第１〜１１００位）を有するDNAをPCRで増幅し、定法によりｐＥＴ２３ｄベクターに組み込み、取得したプラスミドをｐＥＴ２３ｄ_Ｅｎｄｏ−ＭＡ１及びｐＥＴ２３ｄ_Ｅｎｄｏ−ＭＡ２及びｐＥＴ２３ｄ_Ｅｘｏ−ＭＡ１と名付けた。
定法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をｐＥＴ２３ｄ_Ｅｎｄｏ−ＭＡ１もしくはｐＥＴ２３ｄ_Ｅｎｄｏ−ＭＡ２もしくはｐＥＴ２３ｄ_Ｅｘｏ−ＭＡ１で形質転換し、Overnight Express Autoinduction System（メルク社製）を用いて酵素を誘導生産した。BugBuster protein extraction reagent (メルク社製)を用いて菌体内酵素を抽出した後、タンパク質のC末端に付加したHis-tagを利用して酵素精製を行い、ｒＥｎｄｏ−ＭＡ１及びｒＥｎｄｏ−ＭＡ２及びｒＥｘｏ−ＭＡ１を得た。各組換え酵素はSDS-PAGEでシングルバンドになっていることを確認した（図４）。また、各アミノ酸配列からの予測されるタンパク質分子量である53.6kDa (ｒＥｎｄｏ−ＭＡ１)、36.9kDa(ｒＥｎｄｏ−ＭＡ２)、42.1kDa(ｒＥｘｏ−ＭＡ１)付近にバンドが確認された。なお、天然型酵素nＥｎｄｏ−ＭＡは非特許文献２の方法に従って調製した。
【００４４】
［試験例２］エンド−D−アラビナーゼの結核菌由来のLAMに対する分解活性の確認
１ｍｇ／ｍｌの結核菌青山B株由来のLAM（ナカライテスク社製）水溶液10μlに、１M酢酸バッファー(pH6.0) 1μl、及び滅菌水８μl中に、（１）で取得したnＥｎｄｏ−ＭＡもしくはｒＥｎｄｏ−ＭＡ１もしくはｒＥｎｄｏ−ＭＡ２溶液(0.1μg/μl)1μlを加え、３７℃にて１８時間反応させた。回収した反応液10μlをSDS-PAGEに供し、シルベストステイン-ネオ（ナカライテスク社製）を用いたシルバーPAS染色を行った（図５Ａ）。また、同反応液をHPAEC-PADでも解析した（図５Ｂ）。なお、HPAEC-PADを行った機材はICS-3000 (Dionex 社製)、カラムはCarboPac PA-1、移動相は溶離液A (0.1 M NaOH) 、溶離液B (0.5 M sodium acetate 及び 0.1 M NaOH)、プログラムは 0−5 min, 100% 溶離液 A; 5−45 min, 0%−80% 溶離液 B; 45−50 min, 100% 溶離液B。流速1.0 mL/min。温度は30℃。検出器はPADである。
その結果、図５ＡのSDS-PAGE解析において、ｒＥｎｄｏ−ＭＡ１処理及びｒＥｎｄｏ−ＭＡ２処理の両方にて、天然型酵素ｎＥｎｄｏ−ＭＡと同様にLAMのLMへの分解が確認された。また、図５ＢのHPAEC-PAD解析により単糖から２０糖程度のＤ−アラビノオリゴ糖の遊離が確認できた。さらに、ｒＥｎｄｏ−ＭＡ２がｎＥｎｄｏ−ＭＡと類似した切断様式であるのに対して、ｒＥｎｄｏ−ＭＡ１は単糖から３糖の遊離割合が高いことから、基質特異性が一部異なると考えられる。
【００４５】
［試験例３］エキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼとエンド−D−アラビナーゼを組み合わせた時の結核菌由来のLAMに対する分解活性の確認
１ｍｇ／ｍｌの結核菌青山B株由来のLAM水溶液10μlに、１M酢酸バッファー(pH6.0) 1μl、及び滅菌水８μl中に、（１）で取得したｒＥｘｏ−ＭＡ１溶液(0.1μg/μl)1μlを単独もしくは、エンド−D−アラビナーゼ（nＥｎｄｏ−ＭＡもしくはｒＥｎｄｏ−ＭＡ１もしくはｒＥｎｄｏ−ＭＡ２）溶液(0.1μg/μl)1μlと同時に反応させて、３７℃にて１８時間反応させた。回収した反応液10μlをHPAEC-PADにより解析した（図６）。
その結果、ｒＥｘｏ−ＭＡ１単独ではＤ−Ａｒａの遊離は僅かであるのに対して、エンド−D−アラビナーゼと同時に反応させた場合はＤ−Ａｒａの遊離が確認された。また、エンド−D−アラビナーゼ処理により遊離していた２糖から３糖のα−Ｄ−アラビノオリゴ糖がｒＥｘｏ−ＭＡ１との組み合わせにより、単糖に分解されることが確認された。
【００４６】
［試験例４］エンド−D−アラビナーゼの非結核性抗酸菌由来のLAMに対する分解活性の確認
既知の方法(B. Hamasur et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol., 24, 11-17 (1999))で調製した非結核性抗酸菌Mycobacterium smegmatis由来のLAM水溶液10μl、１M酢酸バッファー(pH6.0) 1μl、及び滅菌水８μl中に、（１）で取得したｒＥｎｄｏ−ＭＡ１もしくはnＥｎｄｏ−ＭＡ溶液(0.1μg/μl)1μlを加え、３７℃にて１８時間反応させた。回収した反応液10μlをSDS-PAGEに供し、シルバーPAS染色によって解析した（図７Ａ）。また、同反応液をHPAEC-PADでも解析した（図７Ｂ）。
その結果、rＥｎｄｏ−ＭＡ１処理において、ｎＥｎｄｏ−ＭＡと同様にLAMがLMに分解していることが確認された（図７Ａ）。また、その酵素処理によって単糖から２０糖程度のα−Ｄ−アラビノオリゴ糖が遊離していることが確認された（図７Ｂ）。
【００４７】
［試験例５］エキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼの糖誘導体Methyl-α-D-arabinofuranosideに対する分解活性の確認
１ｍｇ／ｍｌの糖誘導体Methyl-α-D-arabinofuranoside（Carbosynth社製）水溶液10μlに、１M酢酸バッファー(pH6.0) 1μl、及び滅菌水８μl中に、（１）で取得したｒＥｘｏ−ＭＡ１もしくはnＥｎｄｏ−ＭＡもしくはｒＥｎｄｏ−ＭＡ１もしくはｒＥｎｄｏ−ＭＡ２溶液(0.1μg/μl)1μlを加え、３７℃にて１８時間反応させた。回収した反応液1μlをTLCプレート（メルク社製）に供し、ｎ-プロパノール/エタノール/水 =７/１/２にて展開した。オリゴ糖はオルシノール硫酸によって発色させた。
その結果、ｒＥｘｏ−ＭＡ１反応液においてMethyl-α-D-arabinofuranosideのD-Araへの分解が確認された(図８)。一方、エンド−D−アラビナーゼ反応液では分解活性が確認できなかった。
【００４８】
［試験例６］エンド−D−アラビナーゼの非結核性抗酸菌由来のアラビノガラクタン（AG）に対する分解活性の確認
既知の方法(A. Misaki et al., J. Biochem., 76, 15-27 (1974).)で調製した非結核性抗酸菌Mycobacterium smegmatis由来のAG水溶液(１ｍｇ／ｍｌ) 10μl、１M酢酸バッファー(pH6.0) 1μl、及び滅菌水８μl中に、（１）で取得したｒＥｘｏ−ＭＡ１もしくはnＥｎｄｏ−ＭＡもしくはｒＥｎｄｏ−ＭＡ１もしくはｒＥｎｄｏ−ＭＡ２溶液(0.1μg/μl)1μlを加え、３７℃にて１８時間反応させた。回収した反応液1μlをTLCプレートに供し、ｎ-プロパノール/エタノール/水 =７/１/２にて展開した。オリゴ糖はオルシノール硫酸によって発色させた（図９Ａ）。また、同反応液をHPAEC-PADでも解析した（図９Ｂ）。
その結果、TLCを用いることで、エンド−D−アラビナーゼ処理を行ったレーンのみに遊離糖のスポットを確認することができた（図９Ａ）。これは、ＴＬＣによりエンド−D−アラビナーゼ活性の有無を簡便に確認できることを示している。また、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより単糖から２０糖程度のＤ−アラビノオリゴ糖が遊離していることが確認された（図９Ｂ）。遊離糖のパターンは図７に示したMycobacterium smegmatis由来のＬＡＭの遊離糖のパターンと類似しており、ＬＡＭ及びＡＧのアラビナン構造の類似性を示すものでもある。
一方、エキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼの反応液では分解活性が確認できなかった。これもＬＡＭと同様に非還元末端側にβ-Ｄ−Ａｒａｆが付加されていることによりエキソ−α−D−アラビノフラノシダーゼが作用できなかったためであると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、結核菌などの抗酸菌に存在するリポアラビノマンナンやアラビノガラクタンの解析又は検出して利用する産業で利用される。また、抗酸菌由来のリポアラビノマンナンやアラビノガラクタンを分解し、Ｄ-アラビノースで構成されたＤ−アラビノオリゴ糖及びリポマンナン及びガラクタンを製造して利用する産業で利用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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