(57)【要約】      （修正有）【課題】インスリン依存性糖尿病を治療するための組成物及び方法の提供。【解決手段】ヒトプロインスリン（ｈＩＮＳ）をコード及び発現する自己ベクター（ＢＨＴ-３０２１）の核酸配列と９５％以上同一である自己ベクター、及びエンドトキシンフリーであり薬学的に許容される担体としてアジュバント及び自己ベクターを含む組成物、及び自己ベクターを筋肉内投与する工程を含むインスリン依存性糖尿病を治療又は予防するための方法の提供。【選択図】図１
2019080574.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:1(BHT-3021)と少なくとも95％同一である核酸配列を有する自己ベクター。
【請求項２】
SEQ ID NO:1(BHT-3021)である、請求項1記載の自己ベクター。
【請求項３】
薬学的に許容される担体および請求項1または請求項2記載の自己ベクターを含む、組成物。
【請求項４】
エンドトキシンフリーである、請求項3記載の組成物。
【請求項５】
薬学的に許容される担体がアジュバントを含む、請求項3または請求項4記載の組成物。
【請求項６】
対象におけるインスリン依存性糖尿病(IDDM)を治療または予防する方法であって、SEQ ID NO:1(BHT-3021)と少なくとも95％同一である核酸配列を有する自己ベクターを対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項７】
自己ベクターがSEQ ID NO:1(BHT-3021)である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
自己ベクターが筋肉内投与される、請求項6または請求項7記載の方法。
【請求項９】
対象がIDDMを有する、請求項6記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2013年5月2日に出願された米国特許仮出願第61/818,671号に係る優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、対象においてインスリン依存性糖尿病を治療するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
1型糖尿病(T1D)の顕著な特徴の1つは、膵島炎と呼ばれるプロセスである、最終的に膵臓β細胞を破壊する炎症応答である。T1D個体の血中および膵島内において、プレプロインスリン(PPI)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)、チロシンホスファターゼ様インスリノーマ抗原(IA2。ICA512とも呼ばれる)、亜鉛輸送体ZnT8、および膵島特異的グルコース-6-ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質(IGRP)を含む様々な膵島抗原に対して向けられたCD8 T細胞が検出されている(1-3)。従って、非経口投与インスリンおよび経鼻投与インスリンを含む、抗原特異的療法を用いてT1Dを遅らせようという試みがなされてきた(4-6)。しかしながら、経口インスリン治験はT1Dを遅らせることができなかったが、高レベルのインスリン自己抗体をもつ患者サブセットでは遅延の証拠があった(6,7)。ミョウバンと共にGADを標的化する他の臨床試験は第3相においてβ細胞機能のC-ペプチド-aマーカーの消失を低減することに失敗した。これは、おそらく、T1Dマウスモデルにおいて効力を示さなかったアジュバントを使用したことが原因である(8)。対照的に、最近の熱ショックペプチド(DiaPep277)第3相治験から、C-ペプチド保存、インスリン利用、およびHgbA1cについて首尾良いアウトカムが報告された(9)。重要なことに、自己分子注射を伴う、これらの治験は安全性を証明しており、重篤な有害事象が現在まで報告されていない。
【０００４】
T1Dマウスモデルでの前臨床実験において成功したアプローチの1つは、C-ペプチド、インスリンA鎖およびB鎖を含むプロインスリン分子全体をコードする操作されたDNAワクチンを使用するアプローチであった(10-12)。広範に研究されているT1Dマウスモデルである高血糖性非肥満糖尿病(NOD)マウスでは、プロインスリンに対する寛容化によって活動性膵島炎が阻止および逆転された(12)。
【０００５】
膵島関連抗原に対する適応免疫応答がT1Dにおいて特定されている。T1D患者から得られた膵臓標本から、主にCD8+T細胞で構成される膵島内リンパ球浸潤と、アップレギュレートされたHLAクラスI分子が明らかになった(1,14)。これらの発見から、T1Dにおける細胞傷害性Tリンパ球の重要な病態生理学的役割が示唆された。CD4+T細胞もT1D発病に関与している可能性が高い。これは、T1Dにおける罹患性と、ある特定のHLAクラスIIハプロタイプとの強い結びつきによって、さらに裏付けられた(14)。最後に、圧倒的多数のT1D患者およびこの疾患が発症する遺伝的リスクをもつ人において膵島抗原に対する自己抗体が発見されている。前糖尿病患者または新規発症T1D患者の95％において、GAD、IA2、またはインスリンに対する抗体が存在する。患者の80％はこれらの抗体の2つ以上について陽性であり、25％が3つ全ての抗体について陽性である。まれに、健常対照対象の血清中に複数種のT1D関連自己抗体が存在する(3)。
【０００６】
インスリンは主なβ細胞特異的自己抗原であり、インスリン自己抗体は、通常、T1Dをもつ若年児において現れる最初の自己抗体である(3,15)。さらに、T1D患者の膵臓流入領域リンパ節から単離されたT細胞の半分はインスリンA鎖のエピトープを認識するのに対して、このエピトープを認識する健常対象由来T細胞は観察されていない(16)。最後に、T1D患者由来インスリン反応性T細胞が活性化炎症性Th1細胞表現型を示すのに対して、健常対照由来インスリン反応性T細胞は防御性T調節表現型を示すことが証明されている(17)。
【０００７】
1種または複数種の自己抗原をコードする核酸を投与することによって自己免疫疾患を治療するための方法は、例えば、国際特許出願番号WO00/53019（特許文献1）、WO2003/045316（特許文献2）、およびWO2004/047734（特許文献3）に記載されている。これらの方法は成功したが、さらなる改善が依然として必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO00/53019
【特許文献２】WO2003/045316
【特許文献３】WO2004/047734
【発明の概要】
【０００９】
発明の簡単な概要
本発明は、ヒトプロインスリンをコードし、かつ発現することができる自己ベクターを投与する工程を含む、対象においてインスリン依存性糖尿病を治療するための組成物および方法を提供する。
【００１０】
従って、一局面において、本発明は、SEQ ID NO:1(BHT-3021)の自己ベクターを提供する。
【００１１】
一部の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1(BHT-3021)の自己ベクターおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物を提供する。
【００１２】
関連する局面において、本発明は、対象においてインスリン依存性糖尿病(IDDM)を治療する、予防する、その重篤度を軽減する、および/またはその症状を寛解させる方法であって、SEQ ID NO:1(BHT-3021)の自己ベクターを対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【００１３】
一部の態様において、自己ベクターは、薬学的に許容される担体または賦形剤に入れて投与される。
【００１４】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および図面から当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】BHT-3021の構造図である。BHT-3021は、ヒトプロインスリン(hINS)遺伝子のコード配列を含有する3.3Kb細菌プラスミド発現ベクターである。BHT-3021の重要な機能特徴および制御特徴には、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)最初期遺伝子プロモーター/エンハンサー、ウシ成長ホルモン遺伝子ポリアデニル化シグナル、カナマイシン耐性遺伝子、および大腸菌においてベクターを増殖させるためのpUC複製起点が含まれる。BHT-3021バックボーンは、免疫賦活性CpG配列の数を減らし、免疫抑制配列を代用するように改変されている。
【図２】治験デザインの模式図を示す。80人の対象が本試験に登録した。4種類の用量レベル:0.3mg、1.0mg、3.0mg、および6.0mgのBHT-3021を評価した。本試験の用量設定期(用量段階的増加期)が終了した後に、追加の安全性データおよび効力データを得るために、追加対象を登録して、選ばれた用量コホートを拡張した(拡張期)。本試験の用量段階的増加部分では、対象を1mgコホート、次いで3mgコホートに連続して登録させた(活性:プラセボ2:1に無作為化した)。次いで、0.3mg用量レベルおよび6mg用量レベルのコホートを同時に登録した。用量段階的増加登録が終了した後に、対象を拡張コホートに無作為化して(活性:プラセボ2:1)、0.3mg、1mg、もしくは3mgの用量のBHT-3021、またはBHT-プラセボを与えた。
【図３】ベースラインからのC-ペプチドのパーセント変化の平均を示す。12回の毎週投薬中およびその後に、このβ細胞機能尺度が急激に低下しなかったかどうか確かめるために、C-ペプチドを評価した。C-ペプチドを方法に記載のように測定した(18-20)。0.3mg用量についてはN=14；1.0mg用量についてはn=15；3.0mg用量についてはn=13；6.0mg用量についてはn=8；プラセボについてはn=23。ベースラインからのパーセント変化の平均+/-CIを示した。Wは、時間0で12回の毎週投薬を開始した後の週を指したのに対して、Mは、時間0で12回の毎週投薬を開始した後の月を指す。
【図４】様々な抗原21-24が充填されたクラスI HLA多量体を用いたQdot-多量体技術によって、抗原特異的CD8 T細胞が数え上げられたことを示す。抗原およびHLAハプロタイプを各パネルに示した。CTL頻度は抗原特異的CD8 T細胞のパーセントと定義した。15週目までのベースラインからのCTL変化をy軸に示し、15週目でのベースラインからのC-ペプチドの％変化をx軸に示した。15週目の値からベースライン値を差し引くことによってCTL変化を計算した。HLA-A2、-A3、および/または-B7(A)、ならびに対照抗原(B)に対して陽性であった全ての治療患者(0.3mg:ダイアモンド、1mg:三角、3mg:四角、6mg:丸)およびプラセボ患者に対して分析を行った。統計は線形回帰分析を用いて行った。
【図５】図5(A)は、24ヶ月にわたるベースラインからのC-ペプチドのパーセント変化の平均を示す。C-ペプチドを方法に記載のように測定した(18-20)。12ヶ月までは、0.3mg用量についてはN=14；1.0mg用量についてはn=15；3.0mg用量についてはn=13；6.0mg用量についてはn=8；プラセボについてはn=23。0.3mgについてはM18でN=14、M24でN=7；1.0mgについてはM18でN=13、24ヶ月目でN=7；3mgについてはM18でN=12、M24でN=9；6.0 mgについてはM18でN=7、M24でN=6；プラセボについてはM18でn=3、M24でN=1。ベースラインからのパーセント変化の平均+/-CIを示した。図5(B)は、15週時における全投薬での患者一人一人のC-ペプチドレベル変化の平均を視覚化した散布図である。
【図６】様々な用量のBHT-3021対BHT-プラセボにおけるHgbA1cおよび平均全インスリン利用を示す。(A)ヘモグロビンA1Cをy軸に示し、月(M)単位の時間をx軸に示した。(B)IU/mg/kg単位での平均全インスリン利用をy軸に示し、週単位での時間をx軸に示した。104週目のデータは統計的に有意でなく、今から本文でこのことについて言及する。図5Aの図の説明文において述べたように、104週目にさらなるN=3。
【図７】ワクチン関連エピトープおよびウイルス関連エピトープに対する抗原特異的T細胞の経時変化を示す。ワクチン関連エピトープ(プロインスリンおよびインスリン)ならびにウイルス特異的エピトープ(EBV、CMV、および麻疹)に対する抗原特異的CD8 T細胞；または(B)プロインスリン単独に対する抗原特異的CD8 T細胞を、ベースライン時ならびに8週時、15週時、24週時、36週時、および52週時にペプチド-HLA多量体によって計数した。Δは、各時点の値からベースライン値を差し引くことによって計算した。
【図８】0週時での治療(黒丸)患者およびプラセボ(白丸)患者における抗原特異的CD8 T細胞の頻度を示す。様々な抗原21-24が充填されたクラスI HLA多量体を用いたQdot-多量体技術によって、抗原特異的CD8 T細胞を計数した。CTL頻度は抗原特異的CD8 T細胞のパーセントと定義した。PI:プロインスリン；Ins: インスリン；PPI:プレプロインスリン。
【図９】4つの異なる抗原特異的T細胞亜群を対象にした、ベースラインと比較したIL-10陽性エリスポットおよびインターフェロン-γ陽性エリスポットの数を示す。BHT-プラセボ治療対象およびBHT-3021治療対象の両方について、0週目と15週目との間の変化を比較して、IL-10(A)に特異的なスポットおよびインターフェロンγ(B)に特異的なスポットの数の変化をy軸に測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
1型糖尿病には、インスリンが産生および放出される部位である膵臓ランゲルハンス島にあるβ細胞を破壊する激しい炎症応答がある。プロインスリンは1型糖尿病(T1D)における適応免疫応答の主な標的である。本発明は、インスリン特異的CD8 T細胞を減らすことによってT1D患者におけるβ細胞機能を保存する、プロインスリンをコードする操作されたDNAプラスミド(BHT-3021)を提供する。BHT-3021は、T1Dにおけるプロインスリンに対する抗原特異的自己免疫応答を弱めるように設計されている。このプラスミドは、CpGモチーフと呼ばれる炎症促進性ヘキサヌクレオチドモチーフの数が少なくなるように操作された。CpGヘキサヌクレオチド配列は、Toll様受容体9(TLR9)および他のDNAセンサーに結合することによって自然免疫応答を活性化する(13)。必須でないCpGモチーフを全て、CpGモチーフと競合するGpGモチーフと交換した。この抗原特異的プラスミドワクチンアプローチには、免疫系の損なわれていない他の重要な望ましい生理学的な役割、例えば、プロインスリンに対する免疫調節応答、腫瘍に対する免疫監視機構、および感染因子に対する免疫応答を残しながら、自己免疫応答を弱めるという理論上の利点がある。
【００１７】
本発明は、ヒトプロインスリンをコードし、かつ発現することができる自己ベクターを投与することによって、インスリン依存性糖尿病(IDDM)を治療、軽減、予防、および阻害する組成物および方法を提供する。前記のように、IDDMでは顕性糖尿病が発症する前に長い前駆症状期間があり、この間に膵臓β細胞機能が段々と失われる。評価することができるマーカーには、膵臓β細胞機能を示すC-ペプチドの血中レベルまたは血清中レベル、膵臓における膵島炎の存在、膵島細胞抗体のレベルおよび頻度、膵島細胞表面抗体、IDDMにおいて標的となる自己抗原に対する自己抗体の存在および濃度、膵臓β細胞上にあるクラスII MHC分子の異常発現、血中グルコース濃度、ならびにインスリン血漿中濃度が含まれるが、これに限定されない。膵臓におけるTリンパ球の数、膵島細胞抗体、および血糖の増加は前記疾患を示し、同様にインスリン濃度の減少も前記疾患を示す。
【００１８】
非肥満糖尿病(NOD)マウスは、ヒトIDDMと同様の多くの臨床的特徴、免疫学的特徴、および病理組織学的特徴をもつ動物モデルである。NODマウスは膵島炎症およびβ細胞破壊を自然発症し、その結果として高血糖および顕性糖尿病が生じる。糖尿病が発症するにはCD4+T細胞およびCD8+T細胞がどちらも必要であるが、それぞれの役割は依然としてはっきりしていない。NODマウスの寛容条件下でタンパク質であるインスリンまたはGADが投与されると、疾患が阻止され、他の自己抗原に対する応答がダウンレギュレートされることが分かっている。
【００１９】
様々な特異性をもつ自己抗体からなる組み合わせが血清中に存在することは、ヒトI型糖尿病に対する高い感度および特異性を示している。例えば、GADおよび/またはIA-2に対する自己抗体が存在することは、対照血清からI型糖尿病を特定するための約98％の感度および99％の特異性を示している。I型糖尿病患者の非糖尿病第1度近親者において、GAD、インスリン、およびIA-2を含む3つの自己抗原のうちの2つに特異的な自己抗体が存在することは、5年以内にIDM型が発症するプラスの予測値が>90％であることを示唆する。
【００２０】
ヒトインスリン依存性糖尿病において標的となる自己抗原には、例えば、インスリン、インスリンB鎖、プロインスリン、およびプレプロインスリンを含むインスリン自己抗原；チロシンホスファターゼIA-2；IA-2β；グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)の65kDa型および67kDa型の両方；カルボキシペプチダーゼH；熱ショックタンパク質(HSP)；グリマ(glima)38；膵島細胞抗原69KDa(ICA69)；p52；2種類のガングリオシド抗原(GT3およびGM2-1)；膵島特異的グルコース-6-ホスファターゼ関連タンパク質(IGRP)；ならびに膵島細胞グルコース輸送体(GLUT2)が含まれる。
【００２１】
従って、本発明は、ヒトプロインスリンをコードし、かつ発現することができる改変された自己ベクター、特に、自己ベクターBHT-3021(SEQ ID NO:1)を投与する工程を含む、対象において、例えばIDDMの症状または重篤度を治療する、予防する、軽減する、阻害する、および/または遅らせるための組成物および方法を提供する。治療的または予防的に有効な量の改変された自己ベクターが対象に投与されると、IDDMに関連した自己抗原に対する免疫応答の抑制が誘発され、それによって、疾患が治療または予防される。自己ベクターは、生理学的濃度より高い濃度で存在する1種類または複数種の二価カチオンと同時投与されてもよく、同時処方されてもよい。驚いたことに、自己ベクターと、生理学的レベルより高い総濃度の1種類または複数種の二価カチオンが同時投与されると、生理学的レベルに等しい、または生理学的レベルより低い総濃度の1種類または複数種の二価カチオンの存在下での自己ベクターの同時投与と比較して、トランスフェクション効率、コードされている自己抗原の発現(すなわち、転写および翻訳)、ならびに望ましくない免疫応答の治療的抑制の1つまたは複数が改善する。
【００２２】
II.定義
特に定めのない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。以下の参考文献:Hale and Margham, The Harper Collins Dictionary of Biology (HarperPerennial, 1991)； King and Stansfield, A Dictionary of Genetics (Oxford University Press, 4th ed. 1990)； Stedman's Medical Dictionary (Lippincott Williams & Wilkins, 27th ed. 2000)；およびHawley's Condensed Chemical Dictionary (John Wiley & Sons, 13th ed. 1997)は、本明細書において用いられる用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する。本明細書で使用する以下の用語および句は、特に定めのない限り、これらの用語および句のものとされる意味を有する。
【００２３】
本明細書で使用する「イントロン」または「イントロン配列」という用語は、遺伝子内にある介在ポリヌクレオチド配列、すなわち、RNAプロセシング中に保持され、ほとんどの場合、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である「エキソン」の上流に位置するか、または「エキソン」の間に位置する、自己ベクターに存在する遺伝子の一部を指す。イントロンは、タンパク質合成のコーティングにおいて機能せず、タンパク質に翻訳される前にスプライシングによりRNAから取り除かれる。
【００２４】
「エンハンサー」は、プロモーターからの転写を増強するようにプロモーターに働く約10〜300塩基対のシス作用ポリヌクレオチド領域を指す。エンハンサーは比較的、方向および位置に依存せず、転写単位の5'側もしくは3'側にあってもよく、イントロン内にあってもよく、コード配列そのものの中にあってもよい。
【００２５】
「DNAワクチン接種」、「DNA免疫化」、および「ポリヌクレオチド療法」という用語は本明細書において同義に用いられ、免疫応答を調節する目的で対象にポリヌクレオチドを投与することを指す。外来微生物抗原を発現するプラスミドを用いた「DNAワクチン接種」は、抗ウイルス性または抗菌性の防御免疫を誘導するための周知の方法である。本発明の目的では、「DNAワクチン接種」、「DNA免疫化」、または「ポリヌクレオチド療法」は、疾患に関連した1種または複数種の自己抗原エピトープを含む1種または複数種の自己ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与を指す。「DNAワクチン接種」は、自己免疫疾患を治療または予防するために、進行中の免疫応答を調節して自己免疫破壊を抑制するという目的にかなう。「DNAワクチン接種」に応答した免疫応答の調節は、自己反応性リンパ球をTh1型応答からTh2型応答にシフトすることを含んでもよい。免疫応答の調節は全身に発生してもよく、局所にのみ、自己免疫攻撃を受けている標的器官において発生してもよい。
【００２６】
「自己ベクター」とは、まとめると、1種または複数種の自己タンパク質、自己ポリペプチド、自己ペプチド、例えば1種または複数種の自己抗原をコードするDNAまたはRNAのいずれかのポリヌクレオチドを含む、1種または複数種のベクターを意味する。本明細書で使用するポリヌクレオチドは、本発明の自己タンパク質、自己ポリペプチド、または自己ペプチドをコードする、一連の、DNAを含むデオキシリボ核酸またはRNAを含むリボ核酸およびこれらの誘導体である。自己タンパク質、自己ポリペプチド、または自己ペプチドのコード配列は適切なプラスミド発現自己カセットに挿入される。ひとたび自己タンパク質、自己ポリペプチド、または自己ペプチドをコードするポリヌクレオチドが発現自己カセットに挿入されると、このベクターは「自己ベクター」と呼ばれる。複数の自己タンパク質、自己ポリペプチド、または自己ペプチドをコードするポリヌクレオチドが投与される場合、1個の自己ベクターが複数の別々の自己タンパク質、自己ポリペプチド、または自己ペプチドをコードしてもよい。一態様において、内部リボソーム再進入配列(internal ribosomal re-entry sequence)(IRES)、または1個のDNA分子から複数のタンパク質を発現させる他の方法を用いて、いくつかの自己タンパク質、自己ポリペプチド、または自己ペプチドをコードするDNAが1個の自己プラスミドの中に連続してコードされる。自己タンパク質、自己ポリペプチド、または自己ペプチドをコードするDNA発現自己ベクターは、プラスミドDNAを単離するための市販の技法、例えば、Qiagen Corporationから市販されている技法を用いて調製および単離される。DNAは、治療剤としてヒトに送達するために細菌エンドトキシンを含まないように精製される。または、それぞれの自己タンパク質、自己ポリペプチド、または自己ペプチドは別々のDNA発現ベクター上にコードされる。
【００２７】
「ベクターバックボーン」という用語は、自己抗原、自己タンパク質、自己ポリペプチド、または自己ペプチドをコードする配列以外のプラスミドベクター部分を指す。
【００２８】
本明細書で使用する「自己抗原」とは、病原性免疫応答を誘発する内因性分子、典型的にはタンパク質またはその断片を指す。「自己免疫疾患に関連している」と自己抗原またはそのエピトープを言う場合、自己抗原またはエピトープは、病態生理(すなわち、疾患の原因に関連する)を誘導することによって、病態生理学的プロセスを媒介もしくは促進することによって、および/または病態生理学的プロセスの標的になることによって疾患の病態生理に関与することを意味すると理解される。例えば、自己免疫疾患では免疫系は異常な程度で自己抗原を標的とし、その結果として、自己抗原が発現しているおよび/または存在する細胞および組織の損傷および機能不全が起こる。正常な生理学的条件下では、「免疫寛容」と呼ばれるプロセスによって、自己抗原を認識する能力をもつ免疫細胞が排除される、不活性化される、または自己抗原を認識する能力をもつ免疫細胞の活性化が無くなることで、宿主免疫系は自己抗原を無視するようになる。
【００２９】
本明細書で使用する「エピトープ」という用語は、動物免疫系のB細胞またはT細胞のいずれかによって認識される特定の形状または構造を有するポリペプチド部分を意味すると理解される。「自己抗原エピトープ」または「病原性エピトープ」とは、病原性免疫応答を誘発する自己抗原エピトープを指す。
【００３０】
「自己タンパク質」、「自己ポリペプチド」、「自己ペプチド」、または「自己抗原」は本明細書において同義に用いられ、動物ゲノム内にコードされ、動物において産生および生成され、動物が生きている間、ある時期に翻訳後修飾されてもよく、非生理学的に動物に存在する、任意のタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチド、またはその断片もしくは誘導体を指す。
【００３１】
本明細書で使用する「〜の調節」、「調節する」、または「免疫応答を変える」とは、自己ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与した結果として発生する、例えば、核酸、脂質、リン脂質、炭水化物、自己ポリペプチド、タンパク質複合体、またはリボ核タンパク質複合体を含む自己分子に対する既存の免疫応答または起こり得る免疫応答の任意の変化を指す。このような調節には、免疫応答に関与する、または免疫応答に関与することができる任意の免疫細胞の存在、能力、または機能の任意の変化が含まれる。免疫細胞には、B細胞、T細胞、NK細胞、NK T細胞、プロフェッショナル抗原提示細胞、非プロフェッショナル抗原提示細胞、炎症細胞、または免疫応答に関与することができる、もしくは免疫応答に影響を及ぼすことができる他の任意の細胞が含まれる。「調節」には、既存の免疫応答、発達中の免疫応答、起こり得る免疫応答、または免疫応答を誘導する能力、免疫応答を調整する能力、免疫応答に影響を及ぼす能力、もしくは免疫応答に応答する能力に付与される任意の変化が含まれる。調節には、免疫応答の一部として、免疫細胞にある遺伝子、タンパク質、および/または他の分子の発現および/または機能の任意の変化が含まれる。
【００３２】
「免疫応答の調節」には、例えば、免疫細胞の排除、欠失、または隔離；自己反応性リンパ球、抗原提示細胞(APC)、または炎症細胞などの他の細胞の機能的能力を調節することができる免疫細胞の誘導または生成；免疫細胞における非応答状況の誘導(すなわち、アネルギー)；免疫細胞が発現するタンパク質パターンの変化を含むが、これに限定されない、免疫細胞の活性もしくは機能または免疫細胞の活性もしくは機能を行う能力の増加、減少、または変化が含まれる。例には、ある特定のクラスの分子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、転写因子、キナーゼ、補助刺激分子、または他の細胞表面受容体の産生および/もしくは分泌の変化；またはこれらの調節事象の任意の組み合わせが含まれる。
【００３３】
「対象」とは、任意の動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、またはウサギを意味するものとする。
【００３４】
疾患または障害の「治療する」、「治療」、または「療法」とは、自己ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単独で、または本明細書に記載の別の化合物と組み合わせて投与することによって、臨床症状または診断症状のいずれかの減少、停止、もしくは排除によって証明されるように疾患の進行を遅くする、止める、または逆転させることを意味するものとする。「治療する」、「治療」、または「療法」はまた、急性もしくは慢性の疾患もしくは障害における症状の重篤度の減少、または、例えば、再発型もしくは寛解型自己免疫疾患経過の場合のように再発率の減少、または自己免疫疾患の炎症局面の場合では炎症の減少も意味する。一部の態様において、疾患を治療するとは、理想的には疾患そのものを無くす程度まで、疾患の進行を逆転させる、または止める、または緩和することを意味する。本明細書で使用するとき、疾患を寛解させることと疾患を治療することは同意義である。
【００３５】
本発明の文脈において用いられる、疾患または障害の「予防する」、「予防法」、または「予防」とは、疾患もしくは障害の発生もしくは発症または疾患もしくは障害の症状の一部もしくは全てを予防するために、あるいは疾患もしくは障害の発症の可能性を小さくするために、自己ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単独でまたは本明細書に記載の別の化合物と組み合わせて投与することを指す。
【００３６】
自己ベクターの「治療的または予防的に有効な量」とは、例えば、疾患の症状および/または原因を寛解させる、または無くすことによって、疾患を治療または予防するのに十分な自己ベクターの量を指す。例えば、治療的有効量は広い範囲内に収まり、臨床試験によって確かめられ、ある特定の患者の場合、例えば、疾患の重篤度、患者の体重、年齢、および他の要因を含む当業者に公知の要因に基づいて確かめられる。
【００３７】
「エンドトキシンフリー」という句は、エンドトキシンを実質的に含まない、例えば、エンドトキシン汚染が検出可能なレベルより少ない、本発明のベクターまたは組成物を指す。エンドトキシンフリーのベクターまたは組成物は、当技術分野において公知のLimulus Amebocyte Lysate(LAL)ゲルクロットアッセイを用いて測定されたときに、検出可能なエンドトキシンの閾値濃度の点で説明することができる。閾値濃度を基準にして、汚染エンドトキシン量が検出限界より少なければ(例えば、約0.10エンドトキシンユニット/mlまたはEU/ml未満)、ベクターまたは組成物はエンドトキシンフリーである。エンドトキシンを検出することができる程度まで、汚染エンドトキシン量が約2.5EU/mlより少なければ、ベクターまたは組成物は実質的にエンドトキシンフリーである。例えば、Nelson Laboratories, Salt Lake City, UT； Boehringer Ingelheim, Austria； MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA； NovaTX, Conroe, TX；およびAssociates of Cape Cod, Inc., East Falmouth, MAを含む、非常に多くの会社が、調製物中のエンドトキシンレベルを求める商業的に利用可能な検査サービスを提供している。LALゲルクロット検出キットも、例えば、Lonzaからlonza.comのワールドワイドウェブで、およびCharles River Laboratoriesからcriver.comのワールドワイドウェブで購入可能である。
【００３８】
III.態様の説明
A.BHT-3021自己ベクター
一部の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1(BHT-3021)の自己ベクターを提供する。自己ベクターBHT-3021は、BHT-1発現ベクターバックボーンおよびヒトプロインスリンをコードするポリヌクレオチドを含む。自己ベクターBHT-3021はまた、ヒトプロインスリンを発現させるCMVプロモーター；ウシ成長ホルモン終結配列およびポリA配列；ならびにpUC複製起点およびカナマイシン耐性遺伝子(Kanr)も含む。pUC複製起点およびカナマイシン耐性遺伝子(Kanr)はそれぞれベクターの増殖および選択を成し遂げる。
【００３９】
BHT-3021ベクターのバックボーンは、式5'-プリン-ピリミジン-C-G-ピリミジン-ピリミジン-3'の1つまたは複数のCpGジヌクレオチドが、CpGジヌクレオチドのシトシンを非シトシンヌクレオチドで置換することによって変異された改変pVAX1ベクターである。pVAX1ベクターは当技術分野において公知であり、Invitrogen(Carlsbad, CA)から市販されている。例示的な一態様において、改変pVAX1ベクターは、以下の、CpGモチーフ内でのシトシンから非シトシンへの置換を有する:ヌクレオチド784、1161、1218、および1966でのシトシン→グアニン；ヌクレオチド1264、1337、1829、1874、1940、および1997でのシトシン→アデニン；ならびにヌクレオチド1158、1963、および1987でのシトシン→チミンと、ヌクレオチド1831、1876、1942、および1999での、さらなるシトシン→グアニン変異。(前記に示したヌクレオチド番号の指定は、Invitrogenにより提供されるpVAX1のナンバリングシステムに従う。)
【００４０】
本発明は、例えば、プロインスリンを発現させかつ自己免疫応答を阻害するためのBHT-3021ベクターの機能を変えないヌクレオチド付加、ヌクレオチド欠失、またはヌクレオチド置換のあるBHT-3021ベクターを意図する。従って、本発明は、標準的なパラメータを用いて設定された、当技術分野において公知のアルゴリズム、例えば、BLASTまたはALIGNを用いて測定されたときに、SEQ ID NO:1と少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％、98％、または99％の核酸配列同一性を有するヒトプロインスリンコードポリヌクレオチドを含む自己ベクターを意図する。配列同一性は、例えば、BHTバックボーンの完全長、プロインスリン自己抗原の完全長、またはBHT-3021ベクターの完全長を基準にして求めることができる。
【００４１】
ベクター構築および細胞トランスフェクションのための技法は当技術分野において周知であり、当業者は、特定の条件および手順について説明している標準的な情報源資料に精通している。自己ベクターBHT-3021は、核酸を単離するための一般に入手可能な技法を用いて調製および単離される。ベクターは、治療剤としてヒトに送達するために、細菌エンドトキシンを含まずに精製される。
【００４２】
本発明の改変自己ベクターは、薬として使用するためにポリヌクレオチド塩として処方されてもよい。ポリヌクレオチド塩は無毒の無機塩基または有機塩基を用いて調製されてもよい。無機塩基塩には、ナトリウム、カリウム、亜鉛、カルシウム、アルミニウム、マグネシウムなどが含まれる。無毒の有機塩基には、一級アミン、二級アミン、および三級アミンなどの塩が含まれる。このような自己DNAポリヌクレオチド塩は、例えば、滅菌水または塩溶液を用いて送達前に再構成するために凍結乾燥した形で処方されてもよい。あるいは、自己DNAポリヌクレオチド塩は、送達のために水ベースのビヒクルまたは油ベースのビヒクルを含む、溶液、懸濁液、またはエマルジョンの形で処方されてもよい。一態様において、DNAは、生理学的レベルのカルシウム(0.9mM)を含むリン酸緩衝生理食塩水に溶解して凍結乾燥され、次いで、投与前に滅菌水を用いて再構成される。あるいは、DNAは、1mM〜2Mのさらに多量のCa++を含有する溶液の形で処方される。DNAはまた特定のイオン種の非存在下で処方されてもよい。
【００４３】
B.組成物
一部の態様において、本発明は、SEQ ID NO:1(BHT-3021)の自己ベクターを含む組成物を提供する。前記組成物は、薬学的に許容される担体中に処方することもできる。一部の態様において、薬学的組成物は、生理学的レベル(例えば、約0.9mM)にほぼ等しい濃度のカルシウムを含む。一部の態様において、薬学的組成物は、生理学的レベルより高い濃度の二価カチオンをさらに含む。一部の態様において、二価カチオンはカルシウムである。一部の態様において、自己ベクターは、約0.9mM(1x)〜約2Mの濃度のカルシウムを用いて処方される。一部の態様において、カルシウム濃度は約2mM〜約8.1mM(9x)である。一部の態様において、カルシウム濃度は約2mM〜約5.4mM(6x)である。一部の態様において、薬学的組成物はエンドトキシンフリーである。
【００４４】
一部の態様において、自己ベクターは、動物の宿主T細胞により取り込まれるために動物に注射する場合、生理学的レベルより高い総濃度の1種類または複数種の二価カチオンを用いて処方される。一部の態様において、1種類または複数種の生理学的に許容される二価カチオン、例えば、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Al2+、Cu2+、Ni2+、Ba2+、Sr2+、もしくはその他、およびその混合物が用いられてもよい。一部の態様において、マグネシウム、カルシウム、またはその混合物は、それぞれ、約1.5mMおよび1mMで細胞外に存在してもよい。約0.9mM、2mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、12mM、15mM、20mM、45mM、65mM、90mM、130mM、170mM、220mM、280mM、320mM、350mM、500mM、750mM、1000mM、1500mMなど、および約2Mまでの総濃度に達する、2種類以上の二価カチオンの混合物が組み合わされて用いられてもよい。
【００４５】
ある特定の好ましい態様において、対イオンは、PO4、Cl、OH、CO2、またはその混合物を含んでもよい。他の態様において、前記製剤は、DNAに、平均サイズまたは80％の粒子が約0.1、0.3、0.5、1、3、5、8、15、20、35、50、70、または100マイクロメートルを超えるサイズ分布を有する粒子または沈殿物を形成させ得る。このような粒子のサイズは、遠心分離、フローサイトメトリー分析、ヨウ化プロピジウムもしくは類似の色素標識、または動的光散乱によって評価されてもよい。
【００４６】
BHT-3021を含む薬学的組成物は、治療的投与のために様々な製剤に組み込まれてもよい。より具体的には、本発明の組み合わせは、一緒に、または別々に、適切な薬学的に許容される担体または希釈剤を用いて処方することによって薬学的組成物に処方されてもよく、錠剤、カプセル、丸剤、散剤、顆粒剤、糖衣錠、ゲル、スラリー、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤、およびエアゾール剤などの固体、半固体、液体、または気体の形で調製物に処方されてもよい。従って、経口、頬側、非経口、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、直腸内、膣内などの投与を含む様々なやり方でBHT-3021は投与されてもよい。さらに、前記化合物は、全身ではなく局所に、例えば、デポーまたは持効性製剤に入れて投与されてもよい。
【００４７】
本発明における使用に適した製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins (2005)において見られる。本明細書に記載の薬学的組成物は、当業者に公知のやり方で、すなわち、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、湿式粉砕(levigating)、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。以下の方法および賦形剤は単なる例示的であり、決して限定をするものではない。
【００４８】
一部の態様において、自己ベクターは、注射による、例えば、大量瞬時投与または持続注入による筋肉内投与、皮下投与、または非経口投与のために処方されてもよい。注射の場合、BHT-3021は、水性溶媒または非水性溶媒、例えば、植物油または他の同様の油、合成脂肪族系酸グリセリド、高級脂肪族系酸またはプロピレングリコールのエステルに、所望であれば、従来の添加物、例えば、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、および防腐剤と共に、溶解、懸濁、または乳化することによって調製物に処方されてもよい。一部の態様において、自己ベクターは、水溶液、例えば、生理学的に適合性する緩衝液、例えば、ハンクス液、リンガー液、または生理食塩水緩衝液に溶解して処方されてもよい。注射用の製剤は、添加防腐剤と共に、単位剤形で、例えば、アンプルまたはマルチドーズ容器に入れられて提供することができる。前記組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルに溶解して懸濁液、溶液、またはエマルジョンなどの形をとってもよく、懸濁剤、安定化剤、および/または分散剤などの処方用の剤(formulatory agent)を含有してもよい。
【００４９】
経口投与の場合、BHT-3021は、阻害剤を当技術分野において周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって、容易に処方されてもよい。このような担体を用いると、治療される患者が経口摂取するために、化合物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、エマルジョン、親油性懸濁液および親水性懸濁液、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方することが可能になる。経口使用のための薬学的調製物は、錠剤または糖衣錠コアを得るために、化合物を固体賦形剤と混合し、任意で、結果として生じた混合物を粉砕し、所望であれば適切な補助剤を添加した後に、顆粒混合物を処理することによって得ることができる。適切な賦形剤は、特に、増量剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、イネデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドン(PVP)である。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を添加することができる。
【００５０】
C.投与方法
一部の態様において、本発明は、例えば、対象におけるIDDMの重篤度およびまたは症状を治療する、軽減する、予防する、阻害する方法であって、SEQ ID NO:1(BHT-3021)の自己ベクターを対象に投与する工程を含む方法を提供する。自己ベクターは薬学的に許容される担体に入れて投与されてもよい。一部の態様において、自己ベクターBHT-3021は、生理学的レベルにほぼ等しい濃度(例えば、約0.9mM)のカルシウムを含む薬学的に許容される担体または賦形剤に入れて投与される。一部の態様において、自己ベクターBHT-3021は、生理学的レベルより高い濃度の二価カチオンを含む薬学的に許容される担体または賦形剤に入れて投与される。一部の態様において、二価カチオンはカルシウムである。一部の態様において、カルシウムは、約2mMより高い濃度である。一部の態様において、カルシウムは約5.4mMの濃度である。一部の態様において、自己ベクターBHT-3021はエンドトキシンフリーである。一部の態様において、自己ベクターBHT-3021は筋肉内投与される。
【００５１】
本明細書において定義されたように、ポリヌクレオチドを対象に送達するための多種多様な方法が存在する。例えば、自己ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、カチオン性リポソームを含むカチオン性ポリマーを用いて処方されてもよい。他のリポソームもまた、自己ポリヌクレオチドを処方および送達するための有効な手段である。または、DNAは、薬理学的送達のためにウイルスベクター、ウイルス粒子、または細菌の中に組み込まれてもよい。ウイルスベクターは感染能力があってもよく、弱毒型でもよく(疾患を誘導する能力を減らす変異をもつ)、複製欠損性でもよい。病原性自己タンパク質の沈着、蓄積、または活性を阻止するためにDNAを利用する方法は、コードされている自己タンパク質に対する体液性応答を増大させるウイルスベクターまたは他の送達系を使用することによって強化されてもよい。他の態様において、DNAは、パーティクルボンバードメント(衝撃による送達)によって注射、吸入、または送達することができる、金粒子、多糖ベースの支持体、または他の粒子もしくはビーズを含む固体支持体と結合体化されてもよい。核酸調製物を送達するための方法は当技術分野において公知である。
【００５２】
哺乳動物細胞に導入するための多数のウイルスに基づく系が開発されている。例えば、レトロウイルス系が述べられている。多数のアデノウイルスベクターも述べられている。核酸送達のためのアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター系も開発されている。AAVベクターは当技術分野において周知の技法を用いて容易に構築することができる。
【００５３】
本発明のポリヌクレオチドはまたウイルスベクターなしで送達することもできる。例えば、前記分子は対象に送達する前にリポソームの中に入れられてもよい。脂質カプセル化は、一般的に、核酸に安定に結合するか、または核酸を封入し、保持することができるリポソームを用いて成し遂げられる。核酸を送達するための担体としてのリポソームの使用の総説については。
【００５４】
自己ベクターの治療的有効量は約0.001mg〜約1gの範囲にある。自己ベクターの治療量は約10ng〜約10mgの範囲である。例えば、自己ベクターの治療量は約0.025mg〜6mgの範囲である。ある特定の態様において、自己ベクターは6〜12ヶ月にわたって毎月投与され、次いで、維持量として3〜12ヶ月ごとに投与される。代替の治療レジメンが開発されてもよく、疾患の重篤度、患者の年齢、投与されている自己ポリペプチド、および治療を行っている通常の医師により考慮されるような他の要因に応じて、毎日から毎週まで、1ヶ月おきまで、毎年まで、一回までの投与の範囲で変動してもよい。
【００５５】
一態様において、前記ポリヌクレオチドは筋肉内注射によって送達される。他のバリエーションでは、前記ポリヌクレオチドは、鼻腔内に、経口的に、皮下に、皮内に、静脈内に、粘膜に、皮膚を通過するように押しつけられて、または真皮に送達されるかもしくは真皮を通過するように金粒子に取り付けられて送達される(例えば、WO97/46253を参照されたい)。あるいは、核酸は、リポソームまたは荷電した脂質を用いてまたは用いずに局所適用することによって皮膚細胞に送達されてもよい(例えば、米国特許第6,087,341号を参照されたい)。さらに別の代案は、吸入剤として核酸を送達することである。前記ポリヌクレオチドは、生理学的レベルのカルシウム(0.9mM)を含むリン酸緩衝生理食塩水に溶解して処方される。または、前記ポリヌクレオチドは、例えば、1mM〜2Mのさらに多量のCa++を含有する溶液の形で処方される。前記ポリヌクレオチドは、他のカチオン、例えば、亜鉛、アルミニウム、およびその他を用いて処方されてもよい。または、もしくはさらに、前記ポリヌクレオチドは、カチオン性ポリマー、カチオン性リポソーム形成化合物を用いて、または非カチオン性リポソームの中に入れて処方されてもよい。DNAを送達するためのカチオン性リポソームの例には、1,2-bis(オレオイルオキシ)-3-(トリメチルアミオニオ)プロパン(DOTAP)および他のこのような分子を用いて作製されたリポソームが含まれる。
【００５６】
ポリヌクレオチドを送達する前に、送達部位は、ブピビカン(bupivicane)、心臓毒、またはポリヌクレオチドを後で送達するのを強化し得る別の薬剤で処置することで前もって整えることができる。このような前もって整えるレジメンは、一般的に、治療用ポリヌクレオチドを送達する12〜96時間前に、さらに頻繁には治療用ポリヌクレオチドを送達する24〜48時間前に送達される。または、ポリヌクレオチド療法前に、前もって整える処置はなされない。
【００５７】
自己ベクターは、例えば、薬理学的薬剤、アジュバント、サイトカイン、またはサイトカインをコードするベクターなどの他の物質と組み合わせて投与されてもよい。さらに、サイトカイン同時送達を用いたときに、不必要な抗自己サイトカイン応答を誘発する可能性を避けるために、活性型ビタミンD3などの化学的免疫調節剤も使用することができる。この点に関して、1,25-ジヒドロキシビタミンD3が、筋肉内DNA免疫化を介したアジュバント効果を発揮することが示されている。
【実施例】
【００５８】
1型糖尿病には、インスリンが産生および放出される部位である膵臓ランゲルハンス島にあるβ細胞を破壊する激しい炎症応答がある。プロインスリンは1型糖尿病(T1D)における適応免疫応答の主な標的である。本発明は、インスリン特異的CD8 T細胞を減らすことによってT1D患者においてβ細胞機能を保存する、プロインスリンをコードする操作されたDNAプラスミド(BHT-3021)を提供する。本発明者らは、過去5年以内にT1Dと診断された18歳以上の対象80人を試験した。12週間にわたって毎週、BHT3021を筋肉内注射する対象またはBHT-プラセボを筋肉内注射する対象を2:1に無作為化し、次いで、安全性および免疫応答について盲検方式でモニタリングした。4種類の用量レベル:0.3mg、1.0mg、3.0mg、および6.0mgのBHT-3021を評価した。Cペプチドを、探索的な効力尺度および安全性尺度として使用した。膵臓に由来するペプチドおよび無関係の抗原が充填された単量体HLAクラスI分子からなる多量体を用いて、膵島特異的なCD8 T細胞頻度を評価した。BHT-3021に関係する重篤な有害事象は観察されなかった。C-ペプチドレベルは、15週の時点において1mgを与えた全投薬でプラセボと比べて改善した(+19.5％BHT-3021対-8.8％BHT-プラセボ、p<0.026)。BHT-3021アームにおいてプロインスリン反応性CD8 T細胞は低下したが、無関係の膵島分子に対するT細胞も外来分子に対するT細胞も低下しなかった(p<0.006)。CD4 T細胞におけるインターフェロン-γ産生でもIL-4産生でもIL-10産生でも有意な変化は認められなかった。従って、本発明者らは、プロインスリンをコードするプラスミドが、投薬中にC-ペプチドを保存しながらプロインスリン反応性CD8 T細胞の頻度を減らすことを証明する。
【００５９】
以下の実施例は本発明を例示する目的で示したが、本発明を限定する目的で示さない。
【００６０】
方法
プラスミド構築
BHT-3021は、ヒトプロインスリン(hINS)遺伝子のコード配列を含有する3.3Kb細菌プラスミド発現ベクターである。ヒトサイトメガロウイルス(CMV)最初期遺伝子プロモーター/エンハンサー、ウシ成長ホルモン遺伝子ポリアデニル化シグナル、カナマイシン耐性遺伝子、および大腸菌においてベクターを増殖させるためのpUC複製起点を含む、BHT-3021の重要な機能特徴および制御特徴を操作して最終構築物にした。BHT-3021のバックボーンを、免疫賦活性CpG配列の数を減らすように改変した。次いで、必須でないCpGモチーフを全て、GpG配列として知られる免疫調節性配列によって置換した(13)。図1はBHT-3021の主要な構造特徴を示す。BHT-3021を、筋肉内(IM)注射用滅菌溶液としてリン酸緩衝生理食塩水に溶解して2.0mg DNA/mLの濃度で処方した。プラセボ患者にはリン酸緩衝生理食塩水を与えた。
【００６１】
登録およびリクルートメント
本試験は、全対象からインフォームドコンセントを得て、各施設の治験審査委員会(IRB)により承認されたプロトコール下で行った。臨床試験を開始する前に、新薬治験開始申請(IND)が米食品医薬品局(FDA)に申請および受理され、NIH組換えDNA諮問委員会からの承認を得た。本試験のために合計144人の対象をスクリーニングした。80人の対象(用量段階的増加コホートに48人の対象、拡張コホートに32人の対象)を無作為化した。
【００６２】
組み入れ規準は、次の通りであった：1)米国糖尿病学会(ADA)基準に基づいて1a型糖尿病と診断されたこと；2)18〜40歳であること；3)5年以内にT1Dと診断されたこと；4)空腹時C-ペプチドが検出可能なこと；5)混合食事負荷試験(MITT)中にC-ペプチドが増加し、最小刺激値が≧0.2pmol/mLであること；6)以下の抗原: インスリン、GAD65、またはIA2のうち少なくとも1つに対する抗体が存在すること。インスリン抗体だけが陽性である場合、インスリンを開始して2週間以内に判定を完了しなければならない；7)<7.0％のHbA1cを目標にして糖尿病の集中的な管理に同意していること；8)女性の場合は、対象が、(a)外科的に生殖不能だったこと、(b)閉経後であったこと、または(c)生殖能力がある場合は、治療期間が終了して3ヶ月後まで、医学的に許容される受胎調節(例えば、女性ホルモン避妊、バリアー法、もしくは不妊手術)を用いる意思が必ずあること；9)男性で、かつ生殖能力がある場合、女性パートナーが閉経後でない限り、または外科的に生殖不能でない限り、対象が、治療期間が終了して3ヶ月後まで、医学的に許容される受胎調節を用いる意思が必ずあること；10)血清中クレアチニン≦1.5x基準値上限(ULN)であること；11)AST＜基準値上限の2倍であること；12)白血球(WBC)≧3x109/L；血小板≧100x109/L；およびヘモグロビン≧10.0g/dLであること。対象は、次の場合に除外された：1)試験プロトコールの要求に従うことができないか、または従うことに異議がある；2)ボディマス指数(BMI)が>30kg/m2である；3)登録前、30日以内に、重篤な低血糖(他人の補助を必要とする低血糖)の1つまたは複数のエピソードと定義される、不安定な血糖コントロールがある；4)T1Dに対する免疫療法が以前にあった；5)メディカルモニターにより承認された場合を除いて、どの時点においてもT1D用の実験的薬剤が投与された、またはスクリーニング前、30日以内にT1D用の実験的装置が使用された；6)膵島細胞移植を含む任意の臓器移植歴があること；7)メディカルモニターにより承認された場合を除いて、T1D以外の活動性自己免疫または免疫不全障害(例えば、類肉腫症、慢性関節リウマチ)がある；8)スクリーニング時に>300mgの24時間尿中アルブミン排泄がある；9)スクリーニング時に管理されていない、または治療されていない網膜症がある；10)安定した良性状態(例えば、ジルベール症候群)に起因する異常値をもつ対象を除いて、>ULNの血清ビリルビンがある；11)継続して甲状腺ホルモン補充療法を受けている対象を除いて、スクリーニング時に正常範囲外の甲状腺刺激ホルモン(TSH)がある；12)HIV陽性またはハイリスク反応の証拠が分かっている；13)活動性肝炎Bまたは活動性肝炎Cに感染している；および14)妊娠中または授乳中の女性である。
【００６３】
治験デザイン
全試験デザインを図2に示した。無作為化の前、6週間以内に、対象が適格かどうかスクリーニングした。対象をBHT-3021またはBHT-プラセボに2:1比で無作為化し、BHT-3021またはBHT-プラセボを12週間(0週〜11週)にわたって毎週、筋肉内(IM)投与する盲検治療期間に進めた。BHT-3021またはBHT-プラセボを最後に投与した4週間後に(15週目)、対象は、安全性、β細胞機能、および抗インスリン応答についての徹底的な評価を受けた。BHT-3021またはBHT-プラセボを最初に投薬して12ヶ月後まで、対象を安全性および免疫応答について盲検方式でモニタリングした(盲検評価期間)。次いで、各対象の治療割り当てを盲検解除した。BHT-3021が与えられた対象は12ヶ月間の長期フォローアップ(LTFU)期間に進んだ。この間、BHT-3021が与えられた対象を、遅れた有害事象、膵臓機能、および免疫応答についてモニタリングした。BHT-プラセボが与えられた対象は、非盲検方式でBHT-3021治療を12週間受けるクロスオーバーに適格であった。
【００６４】
80人の対象が本試験に登録した。4種類の用量レベル:0.3mg、1.0mg、3.0mg、および6.0mgのBHT-3021を評価した。最初の9人の対象を非盲検コホートに登録した。本試験の用量設定期(用量段階的増加期)が終了した後に、追加の安全性データおよび効力データを得るために、追加対象を登録して、1つまたは複数の用量コホートを拡張した(拡張期)。
【００６５】
臨床主要評価項目および副次的評価項目
主要目的は、12週間にわたって毎週注射されたBHT-3021の安全性を評価することであった。副次的目的は、糖尿病関連抗原(インスリン、GAD65、およびIA2)に対する抗体およびT細胞応答に及ぼすBHT-3021の影響を評価すること、BHT-3021治療後の膵臓β細胞機能の変化について説明すること、ならびにBHT-3021治療後のインスリン必要量および血糖値の変化について説明することであった。
【００６６】
主要評価項目
対象の安全性およびモニタリング
本研究において評価した安全性パラメータは、有害事象および重篤な有害事象；理学的検査；生命徴候；臨床検査(血液学的検査、化学的検査、尿検査)；眼科検査；12誘導心電図；24時間尿中タンパク質；刺激C-ペプチドレベル；妊娠検査；ならびにグルコース測定(夜間血糖および自己測定血糖)であった。
【００６７】
副次的評価項目
BHT-3021治療によって膵臓機能の激減が観察されないことを確実なものにするために、探索的な効力尺度および安全性尺度としてCペプチドを使用した。代謝調節マーカーには、HbA1cおよび空腹時血糖値が含まれた。全インスリン1日量をベースライン時および本試験中に評価した。本試験において評価した薬力学的パラメータは、a)インスリン、GAD65、およびIA2に対する抗体、ならびに膵臓抗原に対するT細胞応答によって測定される膵臓抗原に対する免疫応答；ならびにb)免疫活性化の血液マーカーであった。
【００６８】
膵臓抗原に対する抗体
インスリンに対する初期免疫応答を確かめるために、ラジオイムノアッセイをベースライン試料に対して行った。BHT-3021治療に起因した可能性のある応答のいかなる変化も評価するために、後の時点での分析を用いた。膵島抗原に対する自己免疫応答を全体的に示すものとして、GAD65およびIA2に対する反応性の分析も使用した。GAD65、IA2、およびインスリン(IAA)に対する抗体をスクリーニング時に測定した。これらは組み入れ基準の一部であった。T1D関連抗体を検出する方法は以前に述べられている(3,26)。
【００６９】
抗原特異的CD8 T細胞の頻度を測定するための量子ドットHLA-ペプチド多量体
以前に述べられたように、多量体HLA-A2-ペプチド複合体を調製した(21)。簡単に述べると、組換えHLA-A2およびヒトβ2-ミクログロブリンを尿素の中で可溶化し、それぞれの合成ペプチドと共に、100mmol/l Tris(pH8.0)、400mmol/lアルギニン、2mmol/l EDTA、5mmol/l還元型グルタチオン、および0.5mmol/l酸化型グルタチオンからなるリフォールディング緩衝液に注入した。リフォールディングされた複合体を、BirA酵素(Avidity, Denver, CO)と30℃で2時間インキュベートすることによってビオチン化した。ビオチン化複合体をSuperdex75カラム(Amersham Pharmacia Biotech)でのゲル濾過によって精製した。1:20ストレプトアビジン-Qdot/ビオチン化HLAクラスI比となるように、ストレプトアビジン結合量子ドット(21)(Qdots；Invitrogen)を添加することによって多量体HLA-ペプチド複合体を作製した。Qdot-585、-605、-655、-705、および-800を使用した。9個の糖尿病関連エピトープを含有する混合物、HLA-A2において発現しているHLA-A2エピトープ、およびウイルス抗原の混合物を用いて、HLA-A2/A3/B7陽性対象からの試料を染色した(表6)。
【００７０】
Qdot標識多量体複合体による細胞染色
末梢血単核球(PBMC)(2x106個)を、0.5％BSAを添加したPBS 60μlに溶解した全Qdot標識多量体(特定の多量体1つにつき0.1μg)によって同時染色し、37℃で15分間インキュベートした。その後、10μlのアロフィコシアニン(APC)標識抗CD8(ストック1:10)、ならびに10μlのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識抗CD4、-CD14、-CD16、-CD20、および-CD40抗体(Becton Dickinson)を4℃で30分間、添加した。2回洗浄した後に、死細胞を取り除くために、7-アミノアクチマイシンD(7-AAD；eBioscience)を含有するPBS/0.5％BSAに細胞を再懸濁し、LSRII(Becton Dickinson)を用いて分析した。
【００７１】
データ分析および統計手法
HLAクラスI A2型、A3型、またはB7型を有する患者を、対応する多量体を用いて染色した。データは、それぞれの多量体に特異的な(または結合した)CD8 T細胞のパーセントとして報告した。抗原特異的T細胞パーセントの変化は、後の各時点の値からベースライン値を差し引くことによって計算した。
【００７２】
膵島特異的免疫応答の分析は、この薬剤に特異的でない応答とは別個に、BHT-3021特異的応答を評価することによって行った。例えば、患者一人一人を対象にして、それぞれの適切な多量体(インスリンB10-18、PPI76-84、およびPPI79-88)についてワクチン特異的変化を計算した。ペプチドPPI15-24、PPI4-13、GAD65、IA2、IGRP、およびppIAPPについて膵島特異的非ワクチン応答の評価を計算した。この場合、1人の患者は6つのデータポイントを持つことができた。特に、量子ドット組み合わせ(combinatorial)方法では、膵島エピトープについて、10.8％(HLA-A2ペプチド)、34.9％(ウイルスミックス)；15.9％(InsB)、0.0％(IA-2)；0.0％(IGRP)、6.3％(PPI)、4.5％(GAD65)、および6.9％(ppIAPP)の変動係数が求められた21。
【００７３】
CTL変化は、15週目の値からベースライン値を差し引くことによって計算した。分析は、HLA-A2、-A3、および/または-B7に対して陽性の治療患者(全投薬)およびプラセボ患者全てに対して行った。統計は線形回帰分析を用いて行った。
【００７４】
エリスポット
エリスポットを、本試験の用量段階的増加期に登録した最初の48人の患者に対して行った。エリスポットを、Barbara Davis Center for Childhood Diabetes(Aurora, CO)において行った。これらの48人の患者からのエリスポットデータは低いシグナル・ノイズ比のために示していない。最終的な32人の患者を拡張期に含め、これらの個体に対してエリスポットをCROであるCellular Technologies Limited(CTL)において行った。オーストラリア/ニュージーランド出身の患者に由来するPBMCをCROであるCancer Trials Australia, Melbourneにおいて調製した。米国人患者に由来するPBMCをCTLにおいて調製した。凍結したPBMCをCTAから、アッセイが行われたCTLに一括で発送した。IL-10およびIFN-ガンマ(IFN-γ)抗原に特異的な免疫応答を評価した。膵島抗原に対する進行中の自己免疫応答を示すものとしてインスリンおよびGAD65に対する自己免疫応答を測定した。1パネルのウイルスペプチド(CEF)に対する免疫応答を用いて、無関係なCD8(T1Dに関係しない)免疫応答をモニタリングした。蚊抗原に対する免疫応答を用いて、抗原特異的であるが、糖尿病に関連しないCD4 T細胞応答をモニタリングした。
【００７５】
クロスオーバー期
BHT-プラセボが与えられた対象は、非盲検方式でBHT-3021によって12週間治療されるクロスオーバーに適格であった。非盲検クロスオーバー期間中のBHT-3021用量は、利用可能な安全性、免疫応答、および効力のデータの評価に基づく「最良の用量」であった。この「最良の用量」は、許容される安全性プロファイルを有するとデータ安全性モニタリング委員会(DSMB)が認め、安全性、生物学的活性(免疫応答)、および/または効力のバランスが最も良くとれているとクロスオーバー時にスポンサーが決定した、臨床試験において既に投与されたことのある用量であると定義された。全ての用量が同等の安全性プロファイルおよび効力プロファイルを示す限り、複数の用量が「最良の用量」と指定されていてもよい。投薬期間の終了時(15週目)にクロスオーバー対象を十分に評価した。この後、クロスオーバー対象を、BHT-3021初回投与の12ヶ月後まで続く非盲検評価期間に進めた。最後に、対象を12ヶ月と長期のフォローアップ期間に進めた。
【００７６】
結果
治療企図(Intent to Treat)集団のベースライン特徴
表1は、治療企図(ITT)集団のベースライン特徴が、対照に無作為化されたものと有意差がないことを示す。
【００７７】
予め規定した効力評価項目
C-ペプチド
C-ペプチド分泌は、膵臓のインスリン分泌を評価するための重要な代用マーカーとみなされている(18-20)。混合食事負荷試験(MMTT)に対するC-ペプチド応答(本明細書において「C-ペプチド」と呼ばれる)の曲線下面積は、内因性インスリン分泌を評価する検証された方法である。T1D対象は、MMTTに対して、静脈内グルコース応答およびグルカゴン応答が無いときでもC-ペプチド応答がある(19,20)。
【００７８】
スクリーニング時に残存C-ペプチド(C-ペプチド>33pmol/L)があった1型糖尿病個体に、BHT-3021(図1)を12週間にわたって筋肉内経路を介して投薬した(図2)。プラセボには同量の生理食塩水を与えた。15週間で、1.0mg BHT-3021用量対BHT-プラセボの場合、ベースラインからの平均C-ペプチドのパーセント変化は、+19.5％(-1.95％信頼レベル下限、41.0％信頼レベル上限)であり、これに対して、プラセボの場合、-8.8％(-25.34％信頼レベル下限、+7.66信頼レベル上限)であり、p<0.026であった(図3、図5A)。1.0mgアームおよび3.0mgアームにいる対象のC-ペプチドレベルは15週目でスクリーニング値を上回った。図5Bは、15週時での全投薬およびプラセボの散布図に、ベースラインからのC-ペプチドのパーセント変化を示す。対照的に、もっと高い値で開始したプラセボ群は、同じ6ヶ月の期間にわたって急激なC-ペプチド減少を示した。一つの考えられる注意事項は、プラセボ(41.1ヶ月)と比較して1mg群の診断からの時間の平均(mean time from diagnosis)が長かった(59.7ヶ月)ことであったが、この差は統計的に有意でなかった(表1)。これらのデータは、12週間の投薬期間中、および投薬を止めた後さらに最大3ヶ月まで(6ヶ月時点)、BHT-3021がβ細胞の量および/または機能を保存し得ることを示唆している。療法が中止した後、この効果は最終的に失われる。表2は、BHT-3021治療が大幅なCペプチド低減と関係しないことを示す。
【００７９】
平均HbA1c、インスリン必要量、および血糖値
HbA1cはヘモグロビンのグリコシル化を反映し、従って、過去数ヶ月にわたる血漿中グルコースからの圧倒的な寄与をもつ血漿中グルコース状況を反映するので、HbA1cを用いると、長い区分にわたってグルコースホメオスタシスの変化を測定することが可能になる。一般的に、53mmol/mol(7.0％)を上回るHbA1cレベルは糖尿病とみなされ、ガイドラインを決定する組織によって基準は変化する。図6は、MITT集団の治療群による平均HbA1cを示す。群間のベースラインHbA1cに差が認められた。これは、エントリー時の血糖コントロールレベルが異なることを反映している。平均HbA1cはエントリー時および15週時に比較的安定しており、次いで、全群において6ヶ月で投薬を止めた後に増加したが、差は統計的に有意でなかった。注目すべきことに、15週目を過ぎると来院日は少なくなり、モニタリングは減少した。図6Bは、治療群による全インスリン利用の平均を示す。本試験の最初の6〜9ヶ月にわたる治療群の全インスリン利用は安定し、次いで、その後に増加した。1mg用量の平均インスリン利用は投薬期間中に低下した。インスリン利用の全体的な増加は高HbA1cと同時に発生した。特に、治験薬を投薬する期間にわたって、各治療群において、ベースラインと比較したときにインスリン利用は安定していたが、プラセボとの差は統計的に有意でなかった。
【００８０】
免疫学的研究
療法中の抗原特異的CD8 T細胞の計数
BHT-3021治療前および後の膵島特異的CD8 T細胞の変化を定量するために、予め規定した免疫学的研究をデザインした。全患者のHLA型を決定した。64人の患者には、多量体が利用可能なHLAクラスI型があった。64人の患者のうち21人はベースライン時の細胞が少なすぎて経時的に比較を行うことができなかった。2個の患者試料は集められなかった。従って、ベースライン時および治療後少なくとも1つの時点で、80人の患者のうち合計41人を評価した。本発明者らは、組み合わせ量子ドット(Qdot)法(21)を用いて、9個の異なるβ細胞由来抗原に特異的なCD8+T細胞と、非膵島抗原に対する応答を測定することを目的としてウイルスエピトープの一群(cadre)に特異的なCD8+T細胞を同時に検出した(21)。
【００８１】
本発明者らは、試験した各エピトープについて、ならびにHLA-A2、HLA-A3、およびHLA-B7について、プラセボと比較した活性薬物治療患者におけるベースラインからのCD8膵島自己反応性の変化と関連してΔ(刺激)C-ペプチドを分析した。次いで、本発明者らは、BHT DNAワクチンに存在するエピトープ(すなわち、プロインスリンであり、PPIにあるリーダーペプチドでない)を、他の膵島自己抗原(GAD、IA2、PPIリーダー配列、IAPP、およびIGRP)と区別した。最後に、本発明者らは1つのインスリンエピトープ(insB10-18)を説明した。これも、本試験での全患者におけるインスリン補充療法に使用した注射インスリンに存在する(22)。注射インスリンに対する免疫応答はインスリン療法開始後に発症し得ることが知られているので、インスリン補充は、BHT-3021によって誘導される変化に関する交絡因子として働き得る。従って、このエピトープに対するCD8 T細胞応答は、BHT-3021に存在する他の2つのエピトープと分けられる。最後に、本発明者らは、どんな時でも、信頼性をもって検出可能な応答がない場合にT細胞応答の変化がないことと(Δ=0)、t=0およびt=15週間で頻度が同じであった場合にT細胞応答の変化がないことを区別した。
【００８２】
プロインスリンに対するCD8リンパ球の頻度の変化を平均C-ペプチドのパーセント変化と比較したとき、負の相関関係がプロインスリンにはあったが、インスリン、またはプレプロインスリン、IA2、IGRP、GAD65、もしくはppIAPPを含む他のβ細胞抗原にはなかった(図4、HLA-A3プロインスリン治療対プラセボについてはp=0.006。線形回帰分析を使用した。それぞれ、n=12およびn=8；他の全てのエピトープについてはp>0.05)。これらの結果から、BHT-3021は、プロインスリン反応性CD8細胞の抗原特異的低減を誘導したが、他の抗原に対して反応性があるCD8細胞の抗原特異的低減を誘導せず、低減の大きさはC-ペプチドの改善と逆相関したことが分かる。
【００８３】
経時的にウイルス特異的CD8 T細胞の頻度を分析しても、治療対象とプラセボとの間に差は示されなかった。プラセボにおけるワクチンエピトープに対するCTL頻度は治療患者と比較して経時的に有意に増加した(p=0.003。15週目で片側マンホイットニー検定を使用した。プラセボの場合n=16、治療の場合n=30。図7Aを参照されたい)。プロインスリンHLA-A3特異的CD8 T細胞の場合、プラセボ対治療の差が15週目で最も顕著であり、療法を止めた後に差は縮まった(プラセボの場合n=8、治療の場合n=16。p=0.0142。15週目でマンホイットニー検定を使用した。図7B)。
【００８４】
ベースラインCD8膵島自己反応性の基準を得るために治療アームを均一に分配し、15週時でのBHT-3021に対するT細胞応答の変化が、時間0で見られた選択不均衡によるものであるという可能性を排除した(図8)。
【００８５】
インスリンB9-23および他の膵島細胞抗原に特異的なCD4 T細胞におけるサイトカイン産生のエリスポット分析
IFN-γが主要なTh1サイトカインであり、IL-10が、調節性T細胞により産生される重要なサイトカインであるので、本発明者らはIFN-γおよびIL-10を測定することに決めた。15週時で、BHT-3021に含まれる膵島エピトープならびにBHT-3021とは無関係の膵島エピトープを含めて、いかなる膵島エピトープに対してもIL-10免疫応答の首尾一貫した変化はなく(図9A)、免疫優性インスリンエピトープに対するIFN-γ応答の変化もなかった(図9B)。対応する時点で、同じ患者について、エリスポット分析とCD8多量体分析を相関付けるために利用可能な十分なデータはなかった。
【００８６】
膵臓抗原に対する自己抗体
試料が入手可能な全対象において、ベースライン時および15週目(最後にBHT-3021を投与して3週間後)に膵臓抗原に対する自己抗体を測定した。概して、ベースライン時に特定の抗体が陽性であった個体が15週目に陽性を維持し、それとは反対に、ベースライン時に陰性であった場合に15週目に陰性のままであったように、15週目で抗体状況の変化はほとんどなかった(表S2)。いくつかの例外が存在した。具体的には、1人のプラセボ対象がGAD65陰性から陽性に変わり、4人の対象(2人が活性、2人がプラセボ)がインスリン抗体(IA)陰性から陽性に変わった。IA2陰性から陽性に変わった対象はいなかった。
【００８７】
プラスミドDNA BHT-3021はプロインスリンタンパク質をコードするので、インスリンに対する免疫応答の変化は特に興味深かった。これらの4人の対象におけるIA状況の変化が任意の臨床アウトカムと相関関係があったかどうか確かめるために、IA陰性からIA陽性に変わった対象の5週目、15週目、および6ヶ月目でのCペプチド変化から、インスリン抗体の誘導と相関関係があった首尾一貫したC-ペプチド変化はなかったことが確かめられた。興味深いことに、IAが最も多く誘導された対象は、経時的にCペプチドが最も良く保存された。本発明者らは、IA誘導が、これらの対象における望ましくない急激なCペプチド低下と相関関係がなかったと結論づけている。
【００８８】
本発明者らはまた、薬物の全投薬がプラセボに対してプールされ、11週間の時点でモニタリングされ、時間0と比較されたときに(投薬は12週間にわたった)、プラセボと比べてヘモグロビンA1c(HgbA1c)が改善したことも認めた。ヘモグロビンA1cは、6〜12週間の期間にわたる血糖コントロールの平均を示す。HgbA1cは-0.22％低下したのに対して、プラセボでは0.0045％増加した(表5)。
【００８９】
安全性
治療下で発現した有害事象(TEAE)
独立データ安全性
モニタリング委員会は、本治験薬と関係するように思われる、治療に関連する有害事象はなかったと判断した。全TEAEの詳細な説明を表4に示した。統計値をまとめたものは、有害事象の要約、リスト、グラフ、および統計解析を全て計算するためのSAS(登録商標)統計ソフトウェアパッケージバージョン9.1.3を用いて計算した、カテゴリー尺度(categorical measure)については対象の数およびパーセント、ならびに連続尺度(continuous measure)については平均、中央値、標準偏差、ならびに最小値および最大値からなった。
【００９０】
TEAEは、0.3mgのBHT-3021で治療した14人の対象のうち12人(85.7％)；1.0mgで治療した18人の対象のうち18人(100％)；3.0mgで治療した14人の対象のうち11人(78.6％)；6.0mgで治療した8人の対象のうち7人(87.5％)；およびBHT-プラセボで治療した26人の対象のうち25人(96.2％)において報告された。グレード3またはこれより高いTEAEは、1.0mgのBHT-3021で治療した14人の対象のうち4(28.6％)；3.0mgで治療した14人の対象のうち2人(28.6％)；6.0mgで治療した8人の対象のうち3人(37.5％)；およびBHT-プラセボで治療した26人の対象のうち4人(15.4％)において報告された。どれも本治験薬と関係しない様々なタイプのTEAEを表4にまとめた。治験薬におそらく関係するとみなされたTEAEは、0.3mgのBHT-3021で治療した14人の対象のうち5人(35.7％)；1.0mgで治療した18人の対象のうち6人(33.3％)；3.0mgで治療した14人の対象のうち6人(42.9％)；6.0mgで治療した8人の対象のうち4人(50.0％)；およびBHT-プラセボで治療した26人の対象のうち6人(23.1％)において報告された。これらの事象の大部分は、試験責任者によってグレード1であると認められ、いくつかがグレード2事象であった。重篤なTEAEが、0.3mgのBHT-3021で治療した14人の対象のうち1人(7.1％)、1.0mgで治療した18人の対象のうち1人(5.6％)、およびBHT-プラセボで治療した26人の対象のうち4人(15.4％)において報告された。これらの事象はいずれも治験薬に関係するとみなされなかった。
【００９１】
中止
3.0mg BHT-3021で治療した2人の対象が、治験薬と無関係であると試験責任者が確信できなかったTEAEにより治験薬治療を中止した。1人の対象はグレード2の頭痛を報告し、1人の対象はグレード1の腟カンジダ症を発症した。全患者の治験およびデータのレビューが終了したときに、これらの特定の有害事象または他の任意の有害事象と治験薬との統計的関連性はなかった。本試験において死亡はなかった。本発明者らは、大きな毒性が認められず、BHT-3021が安全性について主要評価項目を満たしたと結論づけている。
【００９２】
考察
T1Dを治療するための承認された免疫療法はない。治療の主体は、90年以上前に発見された、命を救う飛躍的発展であるインスリン補充である。疾患の主な病因を標的とする治療剤が長い間求められてきた。
【００９３】
T1Dにおける主な自己免疫応答はインスリンに向けられたものである(1-3,5,6)。本研究において、本発明者らは、プロインスリンをコードする操作されたDNAワクチンを用いて、プロインスリンに対する適応免疫応答を抗原特異的に調節しようと試みた。このワクチンは、自然免疫応答を刺激するCpG六量体モチーフを、自然免疫を調節することが知られているGpG六量体ヌクレオチド配列で置換することによって、コードされているプロインスリンの免疫原性を減らすように操作したものである(13)。本明細書において、本発明者らは、このアプローチがC-ペプチドを調節し、投薬期間中に2回の投与で、このβ細胞機能マーカーが実際に上昇したことを示す。本発明者らはまた、C-ペプチドが増加するとプロインスリン反応性CD8 T細胞が除去されるが、他の抗原特異的T細胞応答に及ぼす影響はないことも証明する。これは、抗原特異的調節が起こったことをしっかりと示すものである。
【００９４】
BHT-3021に関連する有害事象の増加も重篤な有害事象の増加も無かった(表4)。最終的にBHT-3021を試験する必要がある小児および若年成人においてT1Dがよく観察されるので、これは特に重要な成果である。
【００９５】
本発明者らは、このワクチンが望ましくない急激なC-ペプチド低下の原因となる可能性があるかどうか確かめるためにC-ペプチドを評価した。だがそれにもかかわらず、本発明者らは投薬期間中に有意なC-ペプチド改善を観察した。1mg用量はプラセボと比較して最も効果があった、p<0.026(図3)。1.0および3.0のBHT-3021による治療は、15週目に、スクリーニング値を上回るC-ペプチドレベルにつながった。従って、これらのデータは投薬期間中にC-ペプチドが保存された証拠を提供する。この効果は、抗原をコードするワクチンに対象がもはや曝露されなくなった時に失われる。本治験は効力アウトカムを測定する力が与えられておらず、5年までの疾患期間をもち、その分だけ、最近発症した糖尿病対象において観察されるものよりβ細胞量が少なく、おそらく、末期免疫応答が多い成人において行われたので、この結果は驚くべき、かつ予想もしなかった結果である。
【００９６】
HgbA1cは、プラセボと比較して、DNAプラスミドが投薬されている間、良好に管理された(図6A)。平均HbA1cは、最初、BHT-3021により治療して15週間まで比較的安定し、次いで、全群において6ヶ月目に増加した。各治療群において、ベースラインと比較したときにインスリン利用は全体的に比較的安定しているようにみえた(図6B)。104週目からのデータは統計的に有意でなかった（N=3）。HbA1cもインスリン利用データも、どの用量でも対照と有意差はなかった。
【００９７】
CD8 T細胞はT1D発病において重要である(1-3,5,6)。フローサイトメトリーによって抗原特異的T細胞の頻度の計数を可能にする技術であるHLAクラスI多量体を用いて、プロインスリン、他の膵島細胞抗原、およびウイルス抗原に特異的なCD8 T細胞を評価した(21,23)。本発明者らは、プロインスリン反応性CD8細胞が抗原特異的に低減したが、他の抗原に反応性のCD8細胞は低減せず、低減の大きさがC-ペプチド改善と逆相関したことを証明する(図4)。
【００９８】
本発明者らの試験において使用した同じHLA単量体を用いて、プロインスリン特異的CD8 T細胞がT1D患者の膵島において検出されている(1)。本試験における、このようなCD8 T細胞の頻度の低下は投薬期間中のC-ペプチド増加と相関関係があった(s1 4)。本発明者らは、プロインスリン特異的CD8 T細胞が、抗原提示細胞によって供給される補助刺激シグナルの非存在下でコグネイトT細胞受容体を介してシグナルを受け取ったためにアポトーシスによって失われたか、または調節性T細胞によって活発に抑制され、膵島から、および本発明者らがプロインスリン特異的CD8 T細胞を検出しようと試みた末梢循環から隔離されたと推測する。
【００９９】
多量体を用いた分析において使用した特定のHLA型およびエピトープはT1Dの病態生理と関係がある。本論文において使用した量子ドット多量体ではなく四量体を用いているが、BHT3021を対象にした本実験において使用したものと同じHLA分子および膵島エピトープを用いた最近の研究において、末梢血中に同様のCD8 T細胞が検出され、同じT1D患者の炎症した膵臓でも認められた(24)。従って、循環中に見出された、これらの末梢CD8 T細胞は炎症した膵島にあることが分かっている(24)。別の最近の研究から、末梢血からクローニングされ、本論文において使用した多量体試験におけるエピトープの1つに対して反応性のあるCD8 T細胞には病原性があることが明らかになった(25)。これらのCD8クローンはヒト化(HLA-A2トランスジェニック)マウスに注射されると膵島炎およびβ細胞破壊を引き起こした。これは、本臨床試験の本発明者らのアッセイにおいて検出された、これらの特定の循環膵島自己反応性ヒトCD8 T細胞に発糖尿病性(diabetogenicity)があることを証明している(25)。従って、本臨床試験において調べられている、これらのT細胞には、病気を起こす点で本当にT1Dと関係があるかもしれない(24,25)。
【０１００】
まとめると、BHT-3021投薬期間中のC-ペプチド保存と、MHCクラスI多量体を用いた免疫学的研究から、BHT-3021はプロインスリンに対する免疫応答の抗原特異的調節を誘導するが、他の抗原に対する免疫応答の抗原特異的調節を誘導しないことが分かる。自己免疫疾患における療法の長い間求められてきた目標は、病態に寄与する不必要な自己免疫応答を低減するか、または無くすことである。主なβ細胞特異的抗原であるインスリンに対する免疫がT1D病態生理の基礎をなす根本的側面の1つだという強力な証拠がある。プロインスリンをコードする操作されたDNAプラスミドを用いた、この12週間治験の結果から、投薬期間中に、プロインスリンに対する免疫が抗原特異的に抑制されたことが分かる。プロインスリンに対する免疫の低減および好ましい安全性プロファイルを考えると、BHT-3021を用いたさらに長期の治験が正当化される。
【０１０１】
本明細書に記載の実施例および態様は例示目的にすぎず、本明細書に記載の実施例および態様を考慮して様々な変更および変化が当業者に示唆され、本願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の中に含まれることが理解される。本明細書において引用された刊行物、特許、および特許出願は全て、その全体が全ての目的のために、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０２】
（表１）個体群統計学およびベースライン特徴(ITT集団)
2019080574.tif 000003
【０１０３】
（表２）急激なCペプチド低下*の発生率
2019080574.tif 000004
*Cペプチドの≧75％の減少
【０１０４】
（表３）15週時での抗体状況の変化
2019080574.tif 000005
1GAD65 - ポジティブカットオフとして>0.032の指標値を用いたRIAによって測定した。
2IAA - ポジティブカットオフとして>0.01の指標値を用いたRIAによって測定した。
【０１０５】
（表４）治療群(ITT集団)による治療下で発現した有害事象
2019080574.tif 000006
【０１０６】
（表５）Qドット標識HLA-A2、A3、およびB7多量体の組み合わせ
2019080574.tif 000007
CMV、サイトメガロウイルス；EBV、エプスタイン-バーウイルス。
*:組み合わされるHLA-A3エピトープまたはHLA-A2エピトープいずれかとのミックスによる。
【０１０７】
（表６）
2019080574.tif 000008
【０１０８】
参考文献および注釈
2019080574.tif 000009
2019080574.tif 000010
【０１０９】
2019080574.tif 000011
【図１】
2019080574.tif 000012
【図２】
2019080574.tif 000013
【図３】
2019080574.tif 000014
【図４】
2019080574.tif 000015
【図５】
2019080574.tif 000016
【図６】
2019080574.tif 000017
【図７】
2019080574.tif 000018
【図８】
2019080574.tif 000019
【図９】
2019080574.tif 000020
【配列表】
2019080574000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月4日(2019.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に本願の明細書本文に記載し且つ図面に示した通りの自己ベクター。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
SEQ ID NO:1(BHT-3021)と少なくとも95％同一である核酸配列を有する自己ベクター。
［２］
SEQ ID NO:1(BHT-3021)である、［1］記載の自己ベクター。
［３］
薬学的に許容される担体および［1］または［2］記載の自己ベクターを含む、組成物。
［４］
エンドトキシンフリーである、［3］記載の組成物。
［５］
薬学的に許容される担体がアジュバントを含む、［3］または［4］記載の組成物。
［６］
対象におけるインスリン依存性糖尿病(IDDM)を治療または予防する方法であって、SEQ ID NO:1(BHT-3021)と少なくとも95％同一である核酸配列を有する自己ベクターを対象に投与する工程を含む、方法。
［７］
自己ベクターがSEQ ID NO:1(BHT-3021)である、［6］記載の方法。
［８］
自己ベクターが筋肉内投与される、［6］または［7］記載の方法。
［９］
対象がIDDMを有する、［6］記載の方法。
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および図面から当業者に明らかであろう。