(57)【要約】【課題】  ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞を他家移植する免疫細胞療法における、免疫細胞療法用Ｔ細胞の誘導方法を提供する。【解決手段】  （１）ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞を提供する工程、および（２）工程（１）の多能性幹細胞からＴ前駆細胞あるいは成熟Ｔ細胞を誘導する工程を含む、免疫細胞療法用Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞は、好ましくはヒトから単離あるいは誘導されたＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞からｉＰＳ細胞を誘導し（Ｔ−ｉＰＳ）、Ｔ−ｉＰＳ細胞からＴ細胞を再生することによって調製される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞を提供する工程、および
（２）工程（１）の多能性幹細胞からＴ前駆細胞あるいは成熟Ｔ細胞を誘導する工程
を含む、免疫細胞療法用Ｔ細胞を誘導する方法。
【請求項２】
ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞が、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的ヒトＴ細胞から多能性幹細胞を誘導することによって得られる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的ヒトＴ細胞が、免疫細胞療法対象者ではなく、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原を発現するがんに罹患しているあるいは同疾患の既往のあるヒトから得られたＴ細胞である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的ヒトＴ細胞が、免疫細胞療法対象者ではなく、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原を発現するがんに罹患したことのないヒトから得られたＴ細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞へＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子を導入することによって得られた多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞が、Ｒａｇ２あるいはＲａｇ２遺伝子を欠失したものである、請求項１〜５いずれかに記載の方法。
【請求項７】
抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞が、免疫細胞療法対象者のＨＬＡ型に完全に一致あるいは一部が一致するＨＬＡ型を有するヒト由来の多能性幹細胞である、請求項１〜６いずれかに記載の方法。
【請求項８】
抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するヒト多能性幹細胞が、免疫細胞療法対象者のＨＬＡの何れか一方のハプロタイプをホモで有しているハプロタイプホモ接合型のＨＬＡを有しているヒトから得られたＴ細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ヒト多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である請求項１〜８何れかに記載の方法。
【請求項１０】
免疫細胞療法が、がんを治療するためのものである、請求項１〜９いずれかに記載の方法。
【請求項１１】
がんがＮＹ−ＥＳＯ１遺伝子を発現するがんである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
がんが、メラノーマ、食道癌、多発性骨髄腫、成人Ｔ細胞性白血病（ＡＴＬ）からなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体が、ＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性にペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣを認識するものである、請求項１〜１２いずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体が、抗原認識部位のアミノ酸配列として、ＴＣＲα鎖においてＣＡＶＮＴＤＳＮＹＱＬＩＷ、ＴＣＲβ鎖においてＣＡＳＳＶＡＡＧＥＱＦＦを有するものである、請求項１〜１３いずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有する免疫細胞療法用ｉＰＳ細胞。
【請求項１６】
ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体が、ＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性にペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣを認識するものである、請求項１５記載の免疫細胞療法用ｉＰＳ細胞。
【請求項１７】
ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体が、抗原認識部位のアミノ酸配列として、ＴＣＲα鎖においてＣＡＶＮＴＤＳＮＹＱＬＩＷ、ＴＣＲβ鎖においてＣＡＳＳＶＡＡＧＥＱＦＦを有するものである請求項１５記載の免疫細胞療法用ｉＰＳ細胞。
【請求項１８】
同一のＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体を有するＴ細胞を９０％以上含む、免疫細胞療法用Ｔ細胞培養物。
【請求項１９】
ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体が、ＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性にペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣを認識するものである、請求項１８記載の免疫細胞療法用Ｔ細胞培養物。
【請求項２０】
ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体が、抗原認識部位のアミノ酸配列として、ＴＣＲα鎖においてＣＡＶＮＴＤＳＮＹＱＬＩＷ、ＴＣＲβ鎖においてＣＡＳＳＶＡＡＧＥＱＦＦを有するものである請求項１８記載の免疫細胞療法用Ｔ細胞培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は免疫細胞療法用Ｔ細胞の誘導方法に関する。本願は特に、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞を他家移植する免疫細胞療法における、免疫細胞療法用Ｔ細胞の誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
個々のＴ細胞は異なる特異性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現している。感染症が生じた時、特定の特異性の細胞が増殖し、細胞集団（クローン）を形成して病原体の対処にあたる。これが獲得免疫系の基本型である。特定の特異性のＴ細胞を人為的に増殖（クローニングという）できれば治療に用いることができることが期待される。実際に、特定の特異性を示すＴ細胞を患者から採取し、増やして患者に戻す（自家移植）方法は臨床応用されている。ただしこのような試みの殆どはクローニングというほど純化されていないし、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで何代も継代培養するうちに、がん細胞を殺す活性が低下するという問題もあった。
【０００３】
Ｔ細胞を不死化することにより無限に増やす方法も提案されている。１つの細胞を不死化して増殖させ、クローニングする。細胞の不死化はがん細胞との融合による方法と、ＴＣＲ刺激とサイトカインの刺激による長期間培養などの方法が挙げられる。しかしながら、こうして不死化したＴ細胞は、いわばがん細胞であり、患者本人に戻す自家移植は危険である。また、クローニング工程において機能が低下するという問題もあった。
【０００４】
ＮＹ−ＥＳＯ１はメラノーマ、食道癌、多発性骨髄腫、成人Ｔ細胞性白血病（ＡＴＬ）の一部で発現が認められるが、正常組織では精巣以外には発現しない、がん・精巣抗原である。ＮＹ−ＥＳＯ１抗原はがん抗原として最も臨床的に注目され研究が進められている抗原の一つである。ＮＹ−ＥＳＯ１抗原ペプチドを用いた癌ワクチン療法について、臨床試験が行われている。
【０００５】
ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ＝T cell receptor）遺伝子が単離されている。ＴＣＲ遺伝子を患者の正常Ｔ細胞（多くのクローンの集合体）に発現させて患者の体内に戻す（自家移植）遺伝子治療について臨床試験が実施されており、特定のがん種で有効であると報告されている。(非特許文献１〜３）。ＴＣＲを発現させる際には、患者の正常Ｔ細胞がもともと発現しているＴＣＲをｓｉＲＮＡ等により抑制することが行われている。
る。
【０００６】
このＴＣＲ遺伝子療法には、少なくとも以下の３つの問題がある。１）レトロウイルスベクターを用いてＴＣＲ遺伝子の導入が行われるが、これはすなわち遺伝子治療であり、導入を受けた患者のＴ細胞ががん化する可能性がある。２）ｓｉＲＮＡによる内因性ＴＣＲの抑制は完全ではなく、多様な内因性ＴＣＲａ鎖やＴＣＲｂ鎖と導入したＴＣＲａ鎖やＴＣＲｂ鎖とのスワッピング等により、患者の組織を攻撃するような想定外の反応性が出現する危険性がある。３）患者ごとにＴ細胞の回収、遺伝子改変、投与を行う必要があり、事前準備ができず治療に時間がかかる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／０９６４８２
【特許文献２】ＷＯ２０１６／０１０１５３
【特許文献３】ＷＯ２０１６／０１０１５４
【特許文献４】ＷＯ２０１６／０１０１５５
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Robbins PF et al., J Clin Oncol. 2011; 29(7): 917-924
【非特許文献２】Robbins PF et al., Clin Cancer Res. 2015; 21(5): 1019-1027
【非特許文献３】Chapuis et al, Sci Transl Med, 5:174ra27, 2013
【非特許文献４】Vizcardo et al., Cell Stem Cell. 12: 31-36. 2013.
【非特許文献５】Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-673 (2006)
【非特許文献６】Takahashi et al., Cell 131, 861-872(2007)
【非特許文献７】Grskovic et al., Nat. Rev. Drug Dscov. 10,915-929(2011)
【非特許文献８】Anticancer Research 32(12); 5201-5209, 2012
【非特許文献９】Jurgens et al, Journal of Clinical Investigation, 26:22, 2006
【非特許文献１０】Morgan R.A. et al, Science, 314:126. 2006
【非特許文献１１】Timmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879-6888
【非特許文献１２】Blood 111:1318(2008)
【非特許文献１３】Nature Immunology 11: 585(2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本願は、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞を他家移植する免疫細胞療法における、免疫細胞療法用Ｔ細胞の誘導方法を提供することを目的とする。本願はさらに、当該多能性幹細胞から誘導されたＴ細胞を用いる免疫細胞療法を提供することを目的とする。
【００１０】
本願はまた、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原に特異的なＴ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願は（１）ＮＹ−ＥＳＯ１抗原に特異的なＴ細胞受容体遺伝子を有するヒト多能性幹細胞を提供する工程、および
（２）工程（１）の多能性幹細胞からＴ細胞を誘導する工程
を含む、免疫細胞療法用Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。
【００１２】
本願の第１の態様において、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原に特異的なＴ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞は提供者からＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞を単離または誘導し、当該Ｔ細胞から多能性幹細胞を誘導する。多能性幹細胞としてｉＰＳ細胞を誘導する場合、Ｔ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞をＴ−ｉＰＳ細胞という。ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞の提供者は健常人であっても、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原を有する健常人あるいは癌患者であってもよい。
【００１３】
本願の第２の態様において、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原に特異的なＴ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞は、多能性幹細胞へＮＹ−ＥＳＯ１抗原に特異的なＴ細胞受容体遺伝子を導入することによって得ることができる。
【００１４】
得られたＮＹ−ＥＳＯ１抗原に特異的なＴ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞、Ｔ−ｉＰＳ細胞からＴ前駆細胞または成熟Ｔ細胞であるＴ細胞を誘導し、これを免疫細胞療法に用いる。
【発明の効果】
【００１５】
本願の方法で得られるＴ前駆細胞または成熟Ｔ細胞は、細胞免疫療法に用いることができる。細胞免疫療法においては、本願の成熟Ｔ細胞は自家移植のみならず、ＨＬＡが一定以上一致した他人への他家移植による治療において特に好適に用いることができる。
【００１６】
他人由来のＴ細胞を移植するというアイデアは、従来よく知られている免疫細胞療法の常識に反するものでる。例えば血液系の悪性腫瘍（白血病など）では、造血幹細胞を移植する骨髄移植が行われるが、ドナーの骨髄がレシピエントによって拒絶されないように、通常はレシピエントと一致したＨＬＡ型のドナーから移植される。しかしながら他人間においては、ＨＬＡ以外の多くのタンパク分子においてアミノ酸配列が不一致であり、ドナーＴ細胞はこれらの不一致を攻撃対象と認識し得る。その結果、移植したドナーＴ細胞の一部がレシピエントの体の細胞を攻撃する反応であるいわゆる移植片対宿主反応が生じる。ＨＬＡが一致していない場合は、この移植片対宿主反応はさらに強く起こる。これらは実際に骨髄移植後に高頻度に認められている。そのような背景から、医療関係者の間では「他人のＴ細胞を移植するのは危険」というのは常識である。
【００１７】
しかるに本願の発明により得られる特定の抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞から誘導されたＴ細胞を用いることにより、従来の技術認識における問題を予想外にも解決することができる。
【００１８】
すなわち、本願の第１の態様であるＴ−ｉＰＳ細胞法は遺伝子治療ではないので、遺伝子導入に起因する細胞癌化の危険性は生じない。またｉＰＳ細胞から再生されるＣＴＬでは内在性のＴＣＲの再構成が抑制され導入したＴＣＲしか発現しないので、想定外の危険が生じる危険が少ない。また、ｉＰＳ段階で内在性ＴＣＲ遺伝子の発現を制御すればより安全である。ＴＣＲ−ｉＰＳ細胞はクローンとして扱えるので、遺伝子挿入箇所を同定して安全なクローンを確定して用いることで遺伝子を傷つける危険性を回避できる。
【００１９】
さらに、本願の第２の態様ではＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子（ＴＣＲ遺伝子）を多能性幹細胞に導入する工程を含む方法にて得られることから、下記の効果が得られる：
１）効果並びに安全性が保障されたＴＣＲの遺伝子を導入することにより、得られる移植用Ｔ細胞の品質が保証される。
２）ＴＣＲ遺伝子挿入箇所を同定し、安全なクローンを確定して用いることができ、移植細胞のがん化の問題を予め回避できる。
３）多能性幹細胞へＴＣＲ遺伝子挿入して得られる多能性幹細胞をＴ細胞へ分化させる場合、分化過程で導入ＴＣＲが先に発現することから細胞が元々もっている（以下内因性と表記）ＴＣＲが再構成されず、想定外の反応が出現することがほとんどない。
【００２０】
本願においては、特定の抗原特異的Ｔ細胞受容体を有する多能性幹細胞をつくり、当該多能性幹細胞からＴ前駆細胞または成熟Ｔ細胞を誘導してこれを細胞免疫療法に用いる。かかる方法を採ることにより移植する細胞は単一の特異性を有するＴ細胞になるために移植片対宿主反応を起こす心配がなく、自家移植のみならず他家移植が可能になることを初めて見出した。すなわち、本願によってはじめて「Ｔ細胞を他人に移植する」ことが可能となる。
【００２１】
今まで提案されている種々のｉＰＳ細胞から分化誘導させたＴ細胞以外の細胞や組織を移植する治療法では、当該細胞が一生涯生着し続けることが期待されている。従って、他家移植を前提とするｉＰＳ細胞ストック事業においてｉＰＳ細胞から分化誘導される細胞を移植する際には、患者は免疫抑制剤を飲み続ける必要がある。この点は、自家ｉＰＳ細胞と比して不利な点である。しかるに、本願におけるＴ−ｉＰＳまたはＴＣＲ−ｉＰＳ細胞由来Ｔ細胞の場合、一定期間後に拒絶される。すなわちドナーとレシピエント間でＨＬＡが一定以上一致するとはいえ、他人間ではマイナー組織適合抗原が一致しないのでいずれは拒絶される。この点で、ｉＰＳ細胞を用いた他の細胞の他家移植とは全く異なり予想外の優れた効果が示される。
【００２２】
Ｔ−ｉＰＳ細胞、ＴＣＲ−ｉＰＳ細胞ともに患者ごとにつくる必要はなく、あらかじめ多くの種類のＴ−ｉＰＳ細胞やＴＣＲ−ｉＰＳ細胞をつくっておくことができる。よってＴ−ｉＰＳ細胞、ＴＣＲ−ｉＰＳ細胞レベル、またはかかる細胞から誘導したＴ前駆細胞もしくはＴ細胞レベルでバンク化することが可能である。すなわち、本願によってはじめて「Ｔ細胞を他人に移植する」を施行する体制の構築が大幅に加速されることになった。また、治療までの時間が短縮できるだけでなく、移植する前に移植細胞の品質の確認ができるというメリットもある。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例１において健常人ボランティア由来Ｔ細胞からＮＹ−ＥＳＯ１テトラマー陽性、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が誘導されたことを示すＦＡＣＳ解析結果。
【図２】ＮＹ−ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞コロニーの写真。
【図３】ＮＹ−ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞を、Ｔ細胞へ分化誘導した。得られた細胞のＦＡＣＳ解析により、ＮＹ−ＥＯＳ１テトラマー陽性、ＣＤ３陽性細胞であることが確認された。
【図４】図３のＮＹ−ＥＳＯ１テトラマー陽性ＣＤ３陽性細胞がＣＤ８シングルポジティブ細胞であること（左側）およびＣＤ８α＋ＣＤ８β＋の表面形質を持っていること（右側）が確認された。
【図５】ＮＹ−ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）のＬＣＬに対するペプチド特異的細胞傷害活性を示す。
【図６Ａ】Ａ０２０１陽性健常人のＮＹ−ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、Ａ０２０１陽性かつＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する成人Ｔ細胞性白血病株ＴＬ−Ｏｍ１に対する細胞傷害活性を有すること、並びにかかる活性が抗ＨＬＡ抗体で抑制されること（点線）を確認した。
【図６Ｂ】Ａ０２０１陽性健常人のＮＹ−ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、Ａ０２０１を発現しないＮＹ−ＥＳＯ−１陽性の成人Ｔ細胞性白血病株ＡＴＮ−１に対する細胞傷害活性を有していないことが確認された。
【図６Ｃ】Ａ０２０１陽性健常人のＮＹ−ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、Ａ０２０１を発現しないＮＹ−ＥＳＯ−１陽性の成人Ｔ細胞性白血病株ＴＬ−Ｓｕに対する細胞傷害活性を有していないことが確認された。
【図７Ａ】Ａ０２０１陽性健常人のＮＹ−ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、Ａ０２０１陽性かつＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６に対する細胞傷害活性を有すること、並びにかかる活性が抗ＨＬＡ抗体で抑制されること（点線）を確認した。
【図７Ｂ】Ａ０２０１陽性健常人のＮＹ−ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、Ａ０２０１を発現しないＮＹ−ＥＳＯ−１陽性の多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６に対する細胞傷害活性を有していないことが確認された。
【図７Ｃ】Ａ０２０１陽性健常人のＮＹ−ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、Ａ０２０１を発現しないＮＹ−ＥＳＯ−１陽性の多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ２８ＢＭに対する細胞傷害活性を有していないことが確認された。
【図８】Ａ０２０１陽性健常人のＮＹ−ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、Ａ０２０１陽性かつＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する成人Ｔ細胞性白血病株ＴＬ−Ｏｍ１を移植したマウスの生存を延長した。
【図９】Ａ０２０１陽性健常人のＮＹ−ＥＳＯ１抗原ペプチド特異的Ｔ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞から再生した成熟Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、Ａ０２０１陽性かつＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６を移植したマウスの生存を延長した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書ならびに請求の範囲において「多能性幹細胞」とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、自己増殖能を併せもつ幹細胞である。多能性幹細胞には、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）などが例示される。多能性幹細胞は、好ましくは哺乳動物の多能性幹細胞であり、より好ましくはヒト多能性幹細胞である。特定のHLAを有するヒト由来の細胞を用いて、治療法の細胞バンクを製造することを考慮すると、iPS細胞を用いるのが好ましい。
【００２５】
本願明細書および請求の範囲において、「Ｔ細胞」とは表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と賞される抗原受容体を発現している細胞を意味する。Ｔ細胞からｉＰＳ細胞を誘導してもＴＣＲが維持されることは、例えばＷＯ２０１１／０９６４８２およびVizcardo et al., Cell Stem Cell 12, 31-36 2013に報告されている。
【００２６】
本願の第１の態様においては、所望の抗原特異的Ｔ細胞からｉＰＳ細胞を得る。ｉＰＳ細胞へと誘導されるＴ細胞としては、好ましくはＣＤ３を発現しており、且つＣＤ４及びＣＤ８からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているＴ細胞である。このようなヒトＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４陽性細胞であるヘルパー／制御性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性細胞である細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−細胞）、及びターミナルエフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ−細胞）が挙げられる。
【００２７】
ヒトＴ細胞は、ヒトの組織から公知の手法により単離することができる。ヒトの組織としては、前記Ｔ細胞を含む組織であれば特に制限はないが、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血、病変部組織が挙げられる。これらの中では、ヒトに対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点から、末梢血、臍帯血が好ましい。ヒトＴ細胞を単離するための公知の手法としては、例えば、後述の実施例に示すようなＣＤ４等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。また、サイトカインの分泌や機能性分子の発現を指標に、所望のＴ細胞を単離することも出来る。かかる場合、例えば、Ｔ細胞は、Ｔｈ１タイプかＴｈ２タイプかで分泌されるサイトカインが異なるので、そのようなサイトカインを指標に選別して、所望のＴｈタイプを有するＴ細胞を単離することができる。また、グランザイムやパーフォリンなどの分泌又は産生を指標として、細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞を単離することが出来る。
【００２８】
ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的な細胞障害性Ｔ細胞は、ヒトより常法により取得したリンパ球、例えば末梢血単核球を、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原またはそのエピトープペプチドにて刺激して得ることができる。ＮＹ−ＥＳＯ１抗原のエピトープペプチドは複数が同定されており、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞を誘導する方法も良く知られている。または、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原を発現するがん細胞を用いてリンパ球を刺激してもよい。
【００２９】
ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞は、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原を発現する癌に罹患している患者またはかかる癌の既往のある対象の細胞から誘導しても、健常人から誘導してもよい。健常人のＴ細胞から得たＴ−ｉＰＳ細胞を用いる場合には、下記の効果が得られる：
１）健常人の細胞から種々の抗原特異的Ｔ細胞を誘導することができるため、予め多くの種類のＴＣＲ遺伝子を有するＴ−ｉＰＳ細胞をつくっておくことができる。
２）健常人を対象とするので、Ｔ−ｉＰＳバンクを作製にあたってドナーを集めやすい。
【００３０】
一般に抗原特異的なＴ細胞は感染症やがんの患者本人から採取することが考えられている。それは、抗原特異的Ｔ細胞は感染症やがん患者の体内で増幅されており、特定の反応性のＴ細胞を検出／採取しやすいと考えられているからである。本願ではそのように疾病を有する患者から疾病に関連する抗原に特異的なＴ細胞を採取し、それを他家移植用のＴ−ｉＰＳ細胞の材料にする方法を提供する。
【００３１】
特定の抗原特異的ヒトＴ細胞を単離する場合、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞を含むヒト培養細胞またはヒトの組織より、目的の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法を採用することができる。また、所望の抗原を結合させたＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）を４量体化させたもの（いわゆる「ＭＨＣテトラマー」）を用いて、ヒトの組織より特定の抗原特異性、例えばＮＹ−ＥＳＯ１抗原に特異性を有するＴ細胞を精製する方法も採用することができる。
【００３２】
上記のごとく得られるＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的なＴ細胞から多能性幹細胞を誘導する。Ｔ細胞から多能性幹細胞細胞を得るには、例えばVizcardo et al., Cell Stem Cell 12, 31-36 2013に記載の方法を持いてもよい。例えば治療対象とする疾患に対する免疫を獲得した対象から所望の抗原特異的Ｔ細胞を得、この細胞へヤマナカ因子を導入してＴ−ｉＰＳ細胞を得ることができる(Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-673 (2006), Takahashi et al., Cell 131, 861-872(2007)および Grskovic et al., Nat. Rev. Drug Dscov. 10,915-929(2011))。
【００３３】
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、特定の初期化因子を、体細胞に作用させることによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性を有する体細胞由来の人工の幹細胞である(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ  ＲＮＡまたはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する）
【００３４】
初期化因子は、その形態に応じた公知の方法にて体細胞へ接触、または体細胞内へ導入すればよい。
【００３５】
タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
【００３６】
ＤＮＡの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター（Science, 322, 945-949, 2008）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Science, 322:949-953, 2008）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞へ一旦導入して作用させた後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する）
【００３７】
初期化因子がＲＮＡの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良い。分解を抑制するため、５−メチルシチジンおよびpseudouridine(TriLink Biotechnologies)を取り込ませたＲＮＡを初期化因子として用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する）
【００３８】
ｉＰＳ細胞誘導のための培養液は、例えば、１０〜１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥ培養液（これらの培養液にはさらに、ＬＩＦ、penicillin/streptomycin、puromycin、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液［例えば、マウスＥＳ細胞培養用培養液（ＴＸ−ＷＥＳ培養液、トロンボＸ社）、霊長類ＥＳ細胞培養用培養液（霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR,Stemcell Technology社）］などが例示される。
【００３９】
ｉＰＳ細胞誘導の例としては、たとえば、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約４〜７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培養液で培養することによって、該接触から約３０〜約４５日又はそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。
【００４０】
あるいは、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、フィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で体細胞と初期化因子を接触させて培養し、約２５〜約３０日又はそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Ｌａｍｉｎｉｎ−５（WO2009/123349）、Ｌａｍｉｎｉｎ−１０（US2008/0213885）、その断片（WO2011/043405）およびマトリゲル（ＢＤ社））を用いる方法が例示される。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する）
【００４１】
この他にも、血清を含有しない培地を用いてｉＰＳ細胞を樹立する方法も例示される(Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725)。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（０．１％以上、１５％以下の酸素濃度）によりｉＰＳ細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al.(2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845)。（本段落に記載の文献は引用により本願の一部を構成する）
【００４２】
ｉＰＳ細胞の樹立効率を高めるための成分として、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、HDAC1 siRNA Smartpool(TM)（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、HuSH29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、ＳＬ３２７およびＰＤ０３２５９０１）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、ＢｉｏおよびＣＨＩＲ９９０２１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＢＩＸ−０１２９４等の低分子阻害剤、Ｓｕｖ３９ｈｌ、Ｓｕｖ３９ｈ２、ＳｅｔＤＢｌおよびＧ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist（例えばＢａｙｋ８６４４）、酪酸、ＴＧＦβ阻害剤またはＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、６１６４５３およびＡ−８３−０１）、ｐ５３阻害剤（例えばｐ５３に対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ＡＲＩＤ３Ａ阻害剤（例えば、ＡＲＩＤ３Ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５およびｍｉｒ−３０２などのｍｉＲＮＡ、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドＹ、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンＥ２およびプロスタグランジンＪ２）、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、ＵＴＦ１、ＩＲＸ６、ＧＬＩＳｌ、ＰＩＴＸ２、ＤＭＲＴＢｌ等が知られている。ｉＰＳ細胞の樹立の際にはかかる樹立効率の改善目的にて用いられる成分を添加した培養液を用いてもよい。
【００４３】
上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培養液と培養液交換を行う。核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ２あたり約５×１０３〜約５×１０６細胞の範囲である。
【００４４】
ｉＰＳ細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入し、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したｉＰＳ細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子として蛍光タンパク質遺伝子を導入し、蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、ｉＰＳ細胞を選択することができる。誘導されたｉＰＳ細胞（Ｔ−ｉＰＳ細胞）は由来するＴ細胞のＴ細胞受容体遺伝子を維持する。
【００４５】
本願の第２の態様においては、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的ＴＣＲの遺伝子を多能性幹細胞へ導入する。
種々のがんについてＮＹ−ＥＳＯ１抗原多能幹細胞の段階でＲａｇ１あるいはＲａｇ２遺伝子をゲノム編集技術等により破壊し、その後にＴ細胞への分化誘導をＴＣＲ遺伝子が報告されている。ＴＣＲ遺伝子はまた、所望の抗原特異的Ｔ細胞をがん患者から単離し、あるいは健常人より誘導し、当該Ｔ細胞からＴＣＲの遺伝子を単離してもよい。本願においては、所望の抗原特異的ＴＣＲ遺伝子をドナー細胞から誘導された多能性幹細胞、例えばｉＰＳ細胞へ導入する。ＴＣＲ遺伝子のｉＰＳ細胞への導入は常套の方法で行えばよく、例えばMorgan R.A. et al, Science, 314:126. 2006に記載の方法に準じて行えば良い。具体的にはＴＣＲ遺伝子を適当なベクターに載せてｉＰＳ細胞へ導入すればよい。例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる。ベクターには、ＴＣＲが発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。
【００４６】
所望のＴＣＲ遺伝子を有している多能性幹細胞を、Ｔ前駆細胞または成熟Ｔ細胞へと分化誘導する。多能性幹細胞からＴ細胞への分化誘導方法としては、例えばTimmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879-6888に記載の方法が挙げられる。また、多能性幹細胞からＴ細胞を誘導する前に、ＴＣＲ遺伝子の再構成が起こらないようにするために、ＷＯ２０１６／０１０１４８に記載されている技術等を用いて、多能幹細胞の段階でＲａｇ１あるいはＲａｇ２遺伝子をゲノム編集技術等により破壊し、その後にＴ細胞への分化誘導を開始してもよい。
【００４７】
本明細書ならびに請求の範囲において「Ｔ前駆細胞」とは、造血細胞の中の最も未分化な細胞である造血幹細胞に相当する段階から、正の選択／負の選択を受ける直前の細胞の段階に相当するまでを含む。Ｔ細胞の分化についてはBlood 111:1318(2008)およびNature Immunology 11: 585(2010)に説明されている。
【００４８】
Ｔ細胞には大きく分けてαβＴ細胞とγδＴ細胞があり、αβＴ細胞にはキラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞が含まれる。本願は全てのＴ細胞を対象とする。Ｔ細胞はＴ前駆細胞およびＴ成熟細胞のいずれをも含むものとし、好ましくはＣＤ３を発現しており、且つＣＤ４及びＣＤ８からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているＴ細胞を言うものとする。好ましくはＣＴＬ活性を有するＴ細胞であり、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性細胞である。ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的ＴＣＲを有する多能性幹細胞をＴ細胞へ分化誘導し、ＦＡＣＳ等を用いて適宜ソートすることによって、同一のＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的ＴＣＲを含むＴ細胞（再生Ｔ細胞）から構成される細胞集団を得ることができる。多能幹細胞の段階でＲａｇ１あるいはＲａｇ２遺伝子をゲノム編集技術等により破壊し、その後にＴ細胞への分化誘導を行うことにより、より細胞集団の純度を上げることができる。例えばＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的ＴＣＲを有するｉＰＳ細胞をＴ細胞へ分化誘導することによって、培養物に含まれる９０％以上、好ましくは９５％以上のＴ細胞が同一のＮＹ−ＥＯＳ１特異的ＴＣＲを有するＴ細胞培養物を得ることができる。
【００４９】
いろいろな種類の固形がんや血液系のがんで高率にＮＹ−ＥＳＯ１抗原の発現が確認されている。本願は、かかるＮＹ−ＥＳＯ１抗原を発現する癌の免疫細胞療法へ応用することができる。
【００５０】
本願によって、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原をターゲットとするＴ細胞製剤が提供される。具体例として、健常人からＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的Ｔ細胞を誘導し、かかる細胞からＴ−ｉＰＳ細胞を作製し、そのＴ−ｉＰＳ細胞から作製したＴ細胞を用いることができる。Ｔ−ｉＰＳ細胞が由来する健常人の細胞を用いてそのＴ−ｉＰＳ細胞から再生されたＴ細胞の機能を確認した上で、そのＴ−ｉＰＳ細胞をバンク化して保存しておく。
治療対象とするＮＹ−ＥＳＯ１抗原を発現するがんに罹った患者のＨＬＡを調べ、バンク化したＴ−ｉＰＳ細胞から適合するＨＬＡ由来の細胞を選択し、当該Ｔ−ｉＰＳ細胞から作製したＴ細胞を用いて細胞免疫治療が可能である。Ｔ−ｉＰＳ細胞を予めＴ細胞まで分化誘導させた上で凍結保存しておけば、より多くの患者により迅速に投与できる。また投与した細胞はいずれ拒絶されるので投与細胞のがん化のリスクは考えなくてよい。
【００５１】
本願の免疫細胞療法においては、誘導されたＴ細胞を適当な媒体、例えば生理的食塩水やＰＢＳに懸濁してＨＬＡが一定以上一致する対象とする患者へ投与する。ドナーと患者とのＨＬＡ型は、完全に一致する場合、ドナーがＨＬＡハプロタイプホモの場合には、少なくともその一方のＨＬＡハプロタイプが一致する場合が例示される。患者への投与は経静脈的に行えばよい。投与量は限定的ではないが、成熟Ｔ細胞とする場合には１０６−１０７細胞／ｋｇで、１回ないし複数回、患者へ経静脈投与する。Ｔ前駆細胞とする場合には、その１０分の１−１０００分の１程度の投与量でよい。
【００５２】
投与細胞数は特に限定されず、患者の年齢、性別、身長、体重、対象疾患、症状等に応じて適宜定めればよい。最適な投与細胞数は臨床試験により適宜決定すればよい。
Ｔ細胞は多様な抗原を攻撃対象とすることができ、本願の方法はがん、感染症、自己免疫疾患、アレルギーなどいろいろな疾患を対象とした免疫細胞療法への応用が可能である。
【００５３】
ＮＹ−ＥＳＯ１遺伝子はメラノーマ、食道癌、多発性骨髄腫、成人Ｔ細胞性白血病（ＡＴＬ）などにおいて高発現しており、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的なＴ−ｉＰＳ細胞またはＴＣＲ−ｉＰＳ細胞からＣＴＬ細胞を分化誘導した細胞を用いる場合には、ＮＹ−ＥＳＯ１遺伝子を発現するこれら種々の癌の免疫細胞療法への応用が可能である。
【実施例１】
【００５４】
ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）からのｉＰＳ細胞の作製（ＮＹ−ＥＳＯ１−Ｔ−ｉＰＳ）と、ＮＹ−ＥＳＯ１−Ｔ−ｉＰＳからのＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的ＣＴＬの再生
【００５５】
１）ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的ＣＴＬの誘導並びに増幅
健常人由来のリンパ芽球細胞株ＬＣＬ（Lymphoblastoid cell line）を用い、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原特異的ＣＴＬを誘導し、これを増幅した。用いた材料を以下に示す。
ｉ）培地
【表１】
2019080491.tif 000002
【００５６】
ｉｉ）  ＮＹ−ＥＳＯ１ペプチド
ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１）
Jaeger E et al. J.Exp.Med.187:265-270(1998)
【００５７】
ｉｉｉ）  ＬＣＬ（Lymphoblastoid cell line）
京都大学病院血液腫瘍内科（日本国京都府京都市）にてＨＬＡ−Ａ０２０１陽性健常人ボランティアから採取されたＬＣＬを用いた。
【００５８】
Ａ．  ヒト末梢血からのＴ細胞の単離とペプチドによる刺激
１．  健常人ボランティアの末梢血より単核球をＦｉｃｏｌｌによって精製し、Ｔ細胞培地で懸濁した。
２．  ９６穴Ｕ底プレートに１穴あたり２．５ｘ１０５／ｍＬとなるように細胞を播種し、ペプチドを１００ｎＭとなるように添加した。
３．  ３日目にＩＬ−２（最終濃度１２．５Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−７（最終濃度５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１５（最終濃度１ｎｇ／ｍＬ）を加え、１週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら２週間培養を行った。
【００５９】
Ｂ．  ＬＣＬへのペプチド添加
１．  ＬＣＬを回収し、３５Ｇｙの放射線照射を行った。
２．  Ｔ細胞用培地に浮遊させ、５×１０５／ｍＬとなるように調整した。
３．  ペプチドを１００ｎＭとなるよう添加し２時間培養した。
４．  ＬＣＬを回収し、Ｔ細胞用培地で洗浄後、２×１０５／ｍＬとなるように調整した。
【００６０】
Ｃ．  ペプチドをパルスしたＬＣＬとＴ細胞との共培養
１．  ペプチド刺激を加えた後、２週間培養したＴ細胞を回収し、洗浄後にＴ細胞用培地に懸濁し、２×１０６／ｍＬに調整した。この時一部の細胞をフローサイトメトリー解析のために取り分けた。
２．  ２４穴プレートに、ペプチドを加えて培養したＬＣＬの浮遊液（２×１０５／ｍＬ）を０．５ｍＬ／ｗｅｌｌ、Ｔ細胞浮遊液（２×１０５／ｍＬ）を０．５ｍＬ／ｗｅｌｌとなるように加えた（ＬＣＬ：Ｔ＝１×１０５／ｗｅｌｌ：１×１０６／ｗｅｌｌ＝１：１０）。
３．  ３日目にＩＬ−２（最終濃度１２．５Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−７（最終濃度５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１５（最終濃度１ｎｇ／ｍＬ）を加えた。１週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら２週間培養を行った。（ＬＣＬによるペプチド刺激１クール目）
４．  再度１００ｎＭのペプチドと加えた培地でＬＣＬを２時間培養し、ここにＣＴＬを加えた。
５．  ３日目にＩＬ−２（最終濃度１２．５Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−７（最終濃度５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１５（最終濃度１ｎｇ／ｍＬ）を加えた。１週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら２週間培養を行った。（ＬＣＬによるペプチド刺激２クール目）
６．  再度１００ｎＭのペプチドと加えた培地でＬＣＬを２時間培養し、ここにＣＴＬを加えた。
７．  ３日目にＩＬ−２（最終濃度１２．５Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−７（最終濃度５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１５（最終濃度１ｎｇ／ｍＬ）を加えた。１週間ごとにサイトカインを添加したＴ細胞用培地で培地交換しながら２週間培養を行った。（ＬＣＬによるペプチド刺激３クール目）
８．  フローサイトメトリー解析により、ＣＤ８陽性ＮＹ−ＥＳＯ１テトラマー陽性分画がＣＤ８陽性Ｔ細胞中に約１０％の割合で検出されることを確認した。結果を図１に示す。
【００６１】
２）  ＮＹ−ＥＳＯ１−Ｔ−ｉＰＳ細胞の樹立
Ａ．  センダイウィルスによる山中４因子とＳＶ４０の導入
１．  FACS AriaによりＮＹ−ＥＳＯ１テトラマー陽性ＣＤ８陽性細胞をソートした。ソートしたＮＹ−ＥＳＯ１特異的ＣＴＬをＴ細胞用培地に浮遊させ、山中４因子とＳＶ４０が組み込まれたセンダイウィルスを培地中に添加し、そのまま２日間培養した。
２。Ｔ細胞用培地で洗浄し、さらにＩＬ−２（最終濃度１２．５Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−７（最終濃度５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１５（最終濃度１ｎｇ／ｍＬ）を加えたＴ細胞用培地で２日間培養した。
３．  全ての細胞を回収後、サイトカインを含まないＴ細胞用培地でＴ細胞を懸濁し、フィーダー細胞上に播種した。
４．  ２日目にｉＰＳ細胞用培地に半量交換し、翌日から毎日ｉＰＳ細胞用培地への半量交換を行い続け、培養を続けた。
【００６２】
Ｂ．  ｉＰＳ細胞コロニーのピックアップ
１．３週間後にｉＰＳ細胞コロニーを目視により確認した。
２．  ２００ｕｌチップによりコロニーを物理的に拾い上げた。
３．  各クローンを個別にｉＰＳ細胞として樹立した。得られたクローンの写真を図２に示す。
【００６３】
３）  ＮＹ−ＥＳＯ１−Ｔ−ｉＰＳ細胞からＴ細胞への分化誘導
使用した培地は下記である。
【表２】
2019080491.tif 000003
＊ペニシリン／ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン１００００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００００μｇ／ｍＬからなり、それぞれの最終濃度を１００Ｕ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬとした。
【００６４】
【表３】
2019080491.tif 000004
＊ペニシリン／ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン１００００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００００μｇ／ｍＬからなり、それぞれの最終濃度を１００Ｕ／ｍＬおよび  １００μｇ／ｍＬとした。
【００６５】
ＯＰ９細胞の準備
０．１％  ゼラチン／ＰＢＳ溶液６ｍｌを１０ｃｍ培養ディッシュに入れ、３７℃で３０分以上静置した。コンフルエントになったＯＰ９細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で剥がし、１／４相当量をゼラチンコートした１０ｃｍ培養ディッシュに播種した。培地はmedium Aを１０ｍｌとなるように加えた。
４日後に播種したＯＰ９細胞培養ディッシュに新たにmedium Aを１０ｍｌ加え、全量が２０ｍｌとなるようにした。
【００６６】
ｉＰＳ細胞からの血球前駆細胞誘導
共培養に使用するＯＰ９細胞の培地を吸引し、新しいmedium Aに交換した。またｉＰＳ細胞培養ディッシュの培地も同様に吸引し、新しいmedium Aを１０ｍｌ加えた。EZ-passageローラーでｉＰＳ細胞塊を切った。カットしたｉＰＳ細胞塊を２００ｕｌピペットマンでピペッティングすることで浮遊させ、目視でおおよそ６００個のｉＰＳ細胞塊をＯＰ９細胞上に播種した。
【００６７】
ｉＰＳ細胞１クローンあたり３枚以上のディッシュを用い、継代するときには細胞を一度一つに合わせてから同じ枚数に再分配することでディッシュ間のばらつきを減らした。
【００６８】
Ｄａｙ  １  （培地交換）
ｉＰＳ細胞塊が接着し分化し始めているかどうかを確認し、培地を新しいmedium A  ２０ｍｌに交換した。
Ｄａｙ  ５  （培地半量交換）
半量分の培地を新しいmedium A  １０ｍｌに交換した。
Ｄａｙ  ９    （培地交換）
半量分の培地を新しいmedium A  １０ｍｌに交換した。
Ｄａｙ  １３  （誘導した中胚葉細胞をＯＰ９細胞上からＯＰ９／ＤＬＬ１細胞上へ移しかえる）
培地を吸引し、ＨＢＳＳ（＋Ｍｇ＋Ｃａ）で細胞表面上の培地を洗い流した。その後２５０Ｕ  collagenase IV/HBSS(+Mg+Ca)溶液１０ｍｌを加え、３７℃で４５分間培養した。
Collagenase溶液を吸引し、ＰＢＳ（−）１０ｍｌで洗い流した。その後５ｍｌの０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃で２０分培養した。培養後、細胞が膜状に剥がれてくるので、ピペッティングにより物理的に細かくし、接着細胞同士を離した。
【００６９】
ここに新しいmedium Aを２０ｍｌ加え、さらに３７℃で４５分間培養した。培養後、浮遊細胞を含む上清を、１００μｍのメッシュを通して回収した。４℃、１２００ｒｐｍで７分間遠心し、ペレットを１０ｍｌのmedium Bに懸濁させた。このうち１／１０をＦＡＣＳ解析用にとりわけ、残りの細胞を新たに用意したＯＰ９／ＤＬＬ１細胞上に播種した。複数枚のディッシュから得た細胞をプールした場合、元々の枚数と同じ枚数になるように再分配して細胞を播き直した。
【００７０】
得られた細胞に造血前駆細胞が含まれているかどうかを確かめるために抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ４３抗体を用いてＦＡＣＳ解析した。ＣＤ３４ｌｏｗＣＤ４３＋細胞分画に十分な細胞数が確認できたことから、造血前駆細胞が誘導されていると確認した。
【００７１】
Ｃ．  血球前駆細胞からのＴ細胞分化誘導
次いで細胞をＯＰ９／ＤＬＬ１細胞上に播種した。この工程において、ＣＤ３４ｌｏｗＣＤ４３＋細胞分画の細胞のソーティングは行わなかった。この分画をソーティングした場合、得られる細胞数が減少してしまうことやソーティングによる細胞へのダメージから、ソーティングしなかった場合に比べてＴ細胞への分化誘導効率が落ちることがある。
【００７２】
培養期間中に分化段階を確認するためにＦＡＣＳ解析を行うが、全ての期間において培養中に死細胞が多くみられる。そのためＦＡＣＳ解析時にはＰＩ（Propidium Iodide）、７−ＡＡＤなどを用い、死細胞除去したうえで解析を行った。
【００７３】
Ｄａｙ  １６  （細胞の継代）
ＯＰ９細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、１００μｍのメッシュを通して５０ｍｌコニカルチューブに回収した。４℃、１２００ｒｐｍで７分間遠心し、ペレットを１０ｍｌのmedium Bに懸濁させた。これらの細胞を新たに用意したＯＰ９／ＤＬＬ１細胞上に播種した。
【００７４】
Ｄａｙ  ２３  （細胞の継代）：  血液細胞コロニーが見え始めた。
ＯＰ９細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、１００μｍのメッシュを通して５０ｍｌコニカルチューブに回収した。４℃、１２００ｒｐｍで７分間遠心し、ペレットを１０ｍｌのmedium Bに懸濁させた。
【００７５】
Ｄａｙ  ３６  ：  ＮＹ−ＥＳＯ１テトラマー陽性Ｔ細胞の確認。
ＮＹ−ＥＳＯ１特異的Ｔ細胞が誘導されているかどうかを確かめるために抗ＣＤ３抗体、ＮＹ−ＥＳＯ１テトラマーを用いてＦＡＣＳ解析した。  Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３＋細胞がみられるようになり、大部分の細胞はＣＤ３＋ＮＹ−ＥＳＯ１テトラマー＋にまで分化していることが確認された。ＦＡＣＳ解析結果を図３に示す。
また、同じ細胞を抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４抗体を用いてさらにＦＡＣＳ解析したところこれらの細胞はＣＤ４−ＣＤ８＋細胞であることが確認された（図４左）。また、抗ＣＤ８α抗体および抗ＣＤ８β抗体により解析したところ、ＣＤ８α＋ＣＤ８β＋の表面形質を持っていることが確認された（図４右）。
【００７６】
さらにNY-ESO-1のＴＣＲα鎖およびβ鎖の配列を常法により決定した。
【表４】
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【実施例２】
【００７７】
実施例１で得られた再生ＣＴＬの機能をin vitroで評価した。
Ａ  ペプチド特異的細胞傷害活性の評価
得られた再生ＣＴＬがin vitroでＮＹ−ＥＳＯ１ペプチド特異的ＣＴＬ活性を持つかどうかを、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド抗原を自家のＬＣＬと反応させた細胞を標的として、細胞障害活性を評価した。
自家ＬＣＬをＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド（１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭおよびペプチドなし（０ｎＭ））と２時間反応させた。ＬＣＬを回収し、再生ＣＴＬとＬＣＬを１：３、１：１、３：１、９：１の割合で混合後、３７℃５％ＣＯ２の環境下で５時間培養を行った。その後、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ陽性細胞の割合で、細胞障害活性を評価した。結果を図５に示す。その結果、ペプチド濃度および細胞数依存的に細胞障害活性が高まっていることが示され、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原特異的な細胞障害活性を持つことが裏付けられた。
【００７８】
Ｂ  Ａ０２０１陽性かつＮＹ−ＥＳＯ１を発現する細胞株に対する細胞障害活性の評価
Ａ０２０１を有しかつＮＹ−ＥＳＯ−１を発現している成人Ｔ細胞性白血病株ＴＬ−Ｏｍ１および多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６に対する、得られた再生ＣＴＬの細胞障害活性を評価した。陰性コントロールにはＡ０２０１を発現しないＮＹ−ＥＳＯ−１陽性の成人Ｔ細胞性白血病株（ＡＴＮ−１、ＴＬ−Ｓｕ）および多発性骨髄腫株（ＲＰＭＩ８２２６、ＫＭＳ２８ＢＭ）を使用した。結果を図６Ａ〜Ｃ並びに図７Ａ〜Ｃに示す。
再生ＣＴＬはＡ０２０１陽性かつＮＹ−ＥＳＯ１を発現する細胞株であるＴＬ−Ｏｍ１（図６Ａ  実線）およびＵ２６６（図７Ａ  実線）を細胞数依存的に障害することが分かった。またこのＴＬ−Ｏｍ１およびＵ２６６に対する細胞障害活性は抗ＨＬＡ抗体を投与することにより抑制されることから（図６Ａ破線、図７Ａ破線）抗原特異的な細胞障害活性であることが示された。即ち、得られた再生ＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性にＮＹ−ＥＳＯ１を認識し、キラー活性を発揮する。
【００７９】
実施例１で得られた再生ＣＴＬの機能をin vivoで評価した。
実施例２の細胞障害活性がin vivoでも同様に認められるかどうかを検討した。
免疫不全ＮＯＧマウスに１×１０７個のＴＬ−Ｏｍ−１細胞を腹腔内投与した。次に一方のマウスにはＰＢＳを、もう一方のマウスには１×１０７個の再生したＣＴＬを第１、２、４、７、９、１１病日に投与し、その生存を解析した。結果を図８に示す。実施例２で得た再生ＣＴＬを投与した群では有意に生存の延長が認められた。
【００８０】
マウスに１×１０７個のＵ２６６細胞を腹腔内投与した。次に一方のマウスにはＰＢＳを、もう一方のマウスには１×１０７個の再生したＣＴＬを第１、３、５、８、１５、２２病日に投与し、その生存を解析した。結果を図９に示す。再生したＣＴＬを投与した群では有意に生存の延長が認められた（図９）。以上より再生ＣＴＬはin vivoでもＮＹ−ＥＯＳ１を発現するがん細胞に対する細胞傷害活性を有することが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年3月24日(2016.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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