(57)【要約】      （修正有）【課題】肥満を解消できる剤の提供。【解決手段】シノビオリンの活性阻害作用を有する黄杞葉又は黄杞葉抽出物を有効成分として含有し，更に、ウコン又はウコン抽出物，ブラックジンジャー又はブラックジンジャー抽出物，マンゴジンジャー又はマンゴジンジャー抽出物，及びヒハツＴｉｅ２又はヒハツＴｉｅ２抽出物のいずれか１つ又は２つ以上を含有することにより、脂肪細胞の発現を抑制する能力や、肥満を解消する能力に優れる剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄杞葉又は黄杞葉抽出物を有効成分として含む，シノビオリンの活性阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載の剤であって，脂肪の産生を抑制するための剤。
【請求項３】
請求項１に記載の剤であって，抗肥満剤である剤。
【請求項４】
請求項１に記載の剤であって， 
（１）ウコン又はウコン抽出物，（２）ブラックジンジャー又はブラックジンジャー抽出物，（３）マンゴージンジャー又はマンゴージンジャー抽出物，及び（４）ヒハツ又はヒハツ抽出物のいずれか１つ又は２つ以上を更に含む剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，黄杞葉又は黄杞葉抽出物を有効成分として含む，シノビオリンの活性阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は現代病のひとつであり，肥満を解消できる医薬が望まれる。
国際公開ＷＯ２０１２−１７６８６０号パンフレットには，シノビオリンノックアウトマウスにおいては白色脂肪組織及び褐色脂肪組織の減少が認められたこと，よってシノビオリンの活性を阻害することで，脂肪細胞の発現を抑制し，肥満の解消に繋がることが記載されている。
【０００３】
一方，特許３３５１５７１号公報には，黄杞葉抽出物を有効成分とする抗炎症剤が開示されている。黄杞葉は，中国南部で古くから甘茶の一種として利用され，茶に配合されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１２−１７６８６０号パンフレット
【特許文献２】特許３３５１５７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は，肥満を解消できる剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は，基本的には，黄杞葉又は黄杞葉抽出物が，シノビオリンの活性を阻害する作用があるという知見に基づくものである。
【０００７】
本発明の第１の側面は，黄杞葉又は黄杞葉抽出物を有効成分として含むシノビオリンの活性阻害剤に関する。この剤は，脂肪の産生を抑制する剤や，抗肥満薬として好ましく用いられる。
【０００８】
この剤の好ましい側面は，（１）ウコン又はウコン抽出物，（２）ブラックジンジャー又はブラックジンジャー抽出物，（３）マンゴジンジャー又はマンゴジンジャー抽出物，及び（４）ヒハツＴｉｅ２又はヒハツＴｉｅ２抽出物のいずれか１つ又は２つ以上を更に含む剤である。実施例により示されたとおり，これらの成分を更に含む剤は，黄杞葉又は黄杞葉抽出物と相乗効果を発揮し，シノオリンの活性を阻害する。このため，この好ましい剤は，脂肪の産生を抑制する能力や，抗肥満能に優れる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば，脂肪の産生を抑制し，肥満を解消できる剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は，黄杞葉を含む抽出物を添加し，シノビオリンとＰＧＣ−１βの結合に対する阻害活性を示すウェスタンブロットを示す図面に替る写真である。
【図２】図２は，図１に示されるウェスタンブロットに基づいて定量した図面に替るグラフである。
【図３】図３は，黄杞葉を含む抽出物を添加し，シノビオリンとＰＧＣ−１βの結合に対する阻害活性を示すウェスタンブロットを示す図面に替る写真である。
【図４】図４は，図３に示されるウェスタンブロットに基づいて定量した図面に替るグラフである。
【図５】図５は，ノワセラ，アンチノビンと同様の配分の混合物によるシノビオリンとＰＧＣ−１βの結合に対する阻害活性を示すウェスタンブロットを示す図面に替る写真である。
【図６】図６は，図５に基づいて，シノビオリンとＰＧＣ−１βの結合の強さを定量したグラフである。
【図７】図７は，ノワセラ，アンチノビンと同様の配分の混合物によるシノビオリンによるＰＧＣ−１βユビキチン化阻害活性を示すウェスタンブロットを示す図面に替る写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下，図面を用いて本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。
【００１２】
黄杞葉は，クルミ科に属する常緑高木である黄杞の葉である。黄杞葉は特にアスチルビン類の含有率が高い抽出物を与える。アスチルビン類の例は，アスチルビン，ネオアスチルビン，イソアスチルビン及びネオイソアスチルビンである。これらは互いに立体異性体の関係にあるジヒドロフラボノール配糖体である。
【００１３】
黄杞葉からアスチルビン類を抽出する方法は公知である。すなわち，たとえば，水，酢酸エチル，アセトン，プロピレングリコール，メタノール，エタノールといった溶媒を用いて，常温または加熱下に可溶性成分を溶出させることで，黄杞葉からアスチルビン類を抽出できる。
【００１４】
（１）ウコン又はウコン抽出物
ウコン（ショウガ科ウコン，Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ  ＬＩＮＮＥ）は東南アジアを中心に，世界中の熱帯・亜熱帯地域で栽培されるショウガ科ウコン属の薬用植物である。たとえば，特開２００９−２６３６３８号公報には，ウコン色素の水中での分散性と体内での吸収性を高めるために，ガティガムと平均粒子径が１μｍ以下のウコン色素とを含有するウコン色素組成物が開示されている。そしてこのウコン色素組成物を配合して，ウコン色素（クルクミン）含量が０．３質量％（１５００ｍｇ／５００ｍｌ）の飲料組成物を配合することが開示されている。ウコン色素以外に，他のウコン抽出物（例えばウコンの水，熱水，又は，親水性有機溶媒（例えばエタノール）と水と混合溶媒による抽出物）が含まれてもよい。親水性有機溶媒と水との混合溶媒の混合比は特に限定されない。親水性有機溶媒と水との混合溶媒の混合比は，例えば重量比で１０：９０〜９０：１０の範囲が好ましく，２０：８０〜５０：５０の範囲がより好ましい。ウコン抽出物の上記と別の例は，ビサクロンである（特許第５５４３６５６号）。
【００１５】
（２）ブラックジンジャー又はブラックジンジャー抽出物
ブラックジンジャーは，黒生姜や黒ショウガともよばれる。特許第５５６９８４８号公報に記載されるように，黒ショウガは，学名をケンプフェリア・パルビフローラ（Ｋａｅｍｐｆｅｒｉａ  ｐａｒｖｉｆｌｏｒａ）といい，黒ウコンあるいはクラチャイダムの別名を有する。黒ショウガは，東南アジアに分布し，ショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ）ケンプフェリア（Ｋａｅｍｐｆｅｒｉａ）属の植物の一種である。タイやラオス等の伝承医学においては健康食品として知られており，精力増進，滋養強壮等の効果があると言われている。 黒ショウガに含まれる有効成分（ブラックジンジャー抽出物）としては，セレン，アミノ酸のほか，例えば，クルクミンやポリフェノールがあり，これらが抗ガン作用や活性酸素除去作用を有するため，動脈硬化等を抑制する効果があると言われている。さらに，ポリフェノールの一種であるアントシアニンやアントシアニジンが豊富に含まれていることから，疲れ目，視力低下，眼精疲労等の低減にも効果があるとの報告や，同じくポリフェノールの一種のメトキシフラボノイドが，痛風や高尿酸血症の原因となる尿酸産生を抑える等の働きがあるとの報告がある（特開２０１１−２３６１３３号公報）。ブラックジンジャー抽出物は，黒ショウガを上記した水，アルコール等で抽出した物であってもよい。
【００１６】
（３）マンゴージンジャー又はマンゴージンジャー抽出物
マンゴージンジャー（Curcuma amada ROXB.）はショウガ科ウコン属に属する植物で，インドの野生に分布または栽培される一年草本である。マンゴージンジャー（C. amada）は生のままでも乾燥したものでも使用することができるが，使用性，製剤化等の点から乾燥粉末あるいは溶媒抽出物として用いることが好ましい。マンゴージンジャーの使用部位としては，全草，葉，塊根，花，種子等，任意に用いられ得る。中でも塊根部が好ましく用いられる。
マンゴージンジャーの抽出物は常法より得ることができ，例えば，マンゴージンジャーを必要により乾燥した後，抽出溶媒に一定期間浸漬するか，あるいは加熱還流している抽出溶媒と接触させ，次いで濾過し，濃縮して得ることができる。抽出溶媒としては，通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ，例えば，水，メタノール，エタノール，プロピレングリコール，１，３−ブチレングリコール，グリセリン等のアルコール類，クロロホルム，ジクロルエタン，四塩化炭素，アセトン，酢酸エチル等の有機溶媒を，それぞれ単独あるいは組み合わせて用いることができる。上記溶媒で抽出して得た抽出液をそのまま，あるいは濃縮したエキスを用いるか，あるいはこれらエキスを吸着法，例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや，ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ−２）のカラムにて吸着させた後，メタノールまたはエタノールで溶出し，濃縮したものも使用することができる。また分配法，例えば水／酢酸エチルで抽出した抽出物等も用いられる。このようにして得たマンゴージンジャー抽出物は，安全性が高く，優れたTie2（tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain-2）活性化作用を有する。マンゴージンジャーについては，特開2010-222313などで，ヒアルロン酸産生促進効果が知られているが，マンゴージンジャーおよびその抽出物にTie2活性化作用があることはこれまで全く知られておらず，本発明者によってこれら作用をもつことが初めて確認されたものである。マンゴージンジャー抽出物は，例えば「マンゴージンジャー乾燥エキスＦ」（丸善製薬（株））等として市販されており，これら市販品を用いてもよい。
【００１７】
（４）ヒハツＴｉｅ２又はヒハツＴｉｅ２抽出物
特開２０１３−２４１３５６号公報には，ヒハツ抽出物であるピペルノナリンを含有するＴｉｅ２活性化剤が開示されている。ヒハツは，コショウ科コショウ属の蔓性の常緑木本であり，学名は，Ｐｉｐｅｒ ｌｏｎｇｕｍである。ヒハツは，東南アジアの地域から容易に入手可能である。ヒハツの果穂は，多肉質の円筒状であり，乾燥物は，香辛料として広く用いられている。
前記植物抽出物は，植物の抽出に一般に用いられる方法を利用することによって，容易に得ることができる。なお，前記植物抽出物には，前記植物の抽出液，該抽出液の希釈液若しくは濃縮液，該抽出液の乾燥物，又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１８】
各植物は，公知の方法に従って抽出し，抽出物を得ればよい。植物の抽出部位としては，特に制限はなく，目的に応じて適宜選択することができ，例えば，前記植物の果穂部，葉部，茎部，花部，根部などが挙げられる。これらの中でも，果穂部が好ましい。 前記植物の抽出部位の調製方法としては，各部位を乾燥させた後，そのまま又は粗砕機を用い粉砕して溶媒抽出に供することにより得ることができる。前記乾燥は，天日で行ってもよいし，通常使用されている乾燥機を用いて行ってもよい。前記植物を抽出する方法としては，特に制限はなく，目的に応じて適宜選択することができ，例えば，室温又は還流加熱下で，任意の抽出装置を用いて抽出する方法などが挙げられ，具体例としては，抽出溶媒を満たした処理槽内に，抽出原料としてのヒハツを投入し，更に必要に応じて時々攪拌しながら，３０分間〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後，ろ過して固形物を除去し，得られた抽出液から抽出溶媒を留去し，乾燥することにより抽出する方法などが挙げられる。
【００１９】
前記植物の抽出に用いる溶媒としては，特に制限はなく，目的に応じて適宜選択することができ，例えば，水，親水性有機溶媒，又はこれらの混合溶媒などが挙げられる
【００２０】
前記植物の抽出溶媒として使用し得る水としては，特に制限はなく，目的に応じて適宜選択することができ，例えば，純水，水道水，井戸水，鉱泉水，鉱水，温泉水，湧水，淡水等の他，これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては，例えば，精製，加熱，殺菌，ろ過，イオン交換，浸透圧の調整，緩衝化等が含まれる。なお，前記抽出溶媒として使用し得る水には，精製水，熱水，イオン交換水，生理食塩水，リン酸緩衝液，リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００２１】
前記植物の抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては，特に制限はなく，目的に応じて適宜選択することができ，例えば，メタノール，エタノール，プロピルアルコール，イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン，メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール，プロピレングリコール，グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ，これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒なども用いることができる。なお，前記水と前記親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する際には，低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部，低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１質量部〜４０質量部を混合したものを使用することが好ましい。また，多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部を混合したものを使用することが好ましい。
【００２２】
前記植物の抽出条件としては，特に制限はなく，目的に応じて適宜選択することができるが，抽出溶媒量としては，抽出原料の５倍量〜１５倍量（質量比）が好ましく，抽出溶媒として水を用いた場合には，５０℃〜９５℃で１時間〜４時間程度で抽出することが好ましく，抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には，４０℃〜９０℃で３０分間〜４時間程度で抽出することが好ましい。
【００２３】
前記植物抽出物の精製方法としては，特に制限はなく，目的に応じて適宜選択することができ，例えば，液−液分配抽出，各種クロマトグラフィー，膜分離などの精製方法が挙げられる。
【００２４】
黄杞葉を有効成分として用いる場合，黄杞葉を乾燥させ，裁断する，粉末状に加工する，といった加工を行えばよい。この場合，たとえば，錠剤又はカプセル剤といった公知の剤型とすることができる。錠剤は，有効成分を混合し，適宜担体とともに打錠機により打錠することで製造できる。有効成分以外の成分（賦形剤，結合剤，崩壊剤，滑沢剤，安定剤，矯味・矯臭剤）は公知である。カプセル剤は，有効成分や公知の素材（ｐＨ調整剤など）をカプセルに封入することで製造できる。黄杞葉を有効成分として用いる場合，年齢や体重によって適宜調整すればよいが，黄杞葉の投与量は，たとえば１０ｍｇ以上１ｇ以下である。
【００２５】
（１）ウコン又はウコン抽出物，（２）ブラックジンジャー又はブラックジンジャー抽出物，（３）マンゴージンジャー又はマンゴージンジャー抽出物，及び（４）ヒハツ又はヒハツ抽出物のいずれか１つ又は２つ以上を更に含む場合，これらの量は，黄杞葉の投与量の１０分の１以上１０倍が好ましく，２分の１以上２倍いかでもよい。
【００２６】
黄杞葉の抽出物（例：アスチルビン類）を有効成分として用いる場合，錠剤，カプセル剤，トローチ剤，散剤，液剤，シロップ剤等，任意の剤型を採用できる。黄杞葉の抽出物を有効成分として用いる場合，年齢や体重によって適宜調整すればよいが，黄杞葉の抽出物の投与量は，たとえば，１ｍｇ以上１ｇ以下であり，注射剤においては，たとえば，０．５ｍｇ以上５００ｍｇ以下である。
【００２７】
（１）ウコン又はウコン抽出物，（２）ブラックジンジャー又はブラックジンジャー抽出物，（３）マンゴージンジャー又はマンゴージンジャー抽出物，及び（４）ヒハツ又はヒハツ抽出物のいずれか１つ又は２つ以上を更に含む場合，これらの量は，黄杞葉の投与量の１０分の１以上１０倍が好ましく，２分の１以上２倍いかでもよい。
【実施例】
【００２８】
以下実施例を用いて本発明を具体的に説明する。本発明は，以下の実施例に限定されるものではなく，公知の要素を適宜取り込むことができる。
【００２９】
試薬
黄杞葉エキスパウダー，ブラックジンジャー抽出物，マンゴージンジャー乾燥エキス，Ｔｉｅ２ ヒハツエキスパウダー，ギムネマエキス粉末，及びウコン乾燥エキスを，それぞれ ＤＭＳＯ に溶解した。
サプリメント (ノワセラ，アンチノビン) に関しては，各抽出成分を ＤＭＳＯ に溶解しサプリメント製品１錠又は１ 瓶に含まれる割合で混合した。
その組成は，以下の表のとおりである。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ
2 μg MBP-PGC-1β-His (1-367 aa)，2 μg GST-SYVN1 ΔTM に各抽出物添加しBuffer (20 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl，1 mM EDTA，0.1 % NP-40，5% Glycrol，Protease Inhibitor) 内で 12 時間結合させた。Glutathione Sepharose で精製し，抗 GST 抗体で SYVN1 ΔTM を検出した。それぞれの抽出物単剤に関しては 1 μg/ml になるように添加した。
混合液はそれぞれ製品の 1/200000，1/100000，1/10000 量 (mg) 含まれるように添加した。
【００３２】
Ubiquitination Assay
E1-His 125 ng，UbcH5C 150 ng，MBP-SYVN1 Δ TM-His 150 ng，GST- PGC-1β (1-367 aa) ，HA-Ubiquitin 750 ng を Buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5，5 mM MgCl2，0.6 mM DTT，2 mM ATP) 中で 30 ℃ 2 時間反応させユビキチン化した。反応 30 μl に混合液をそれぞれ製品の 1/100000，1/10000 量 (mg) 含まれるよう添加した。 PGC-1β をGlutathione Sepharose を用いて GST wash Buffer (50 mM Tris-HCl pH7.5，0.5 M NaCl，1 % Triton X，1 mM EDTA，1 mM DTT，Protease Inhibitor) 中で結合させ精製した。GST wash Buffer で wash 後，抗 PGC-1β 抗体および抗 HA 抗体を用いたウェスタンブロッティングにより PGC-1β のユビキチン化を検出した。
【００３３】
図１は，黄杞葉を含む抽出物を添加し，シノビオリンとＰＧＣ−１βの結合に対する阻害活性を示すウェスタンブロットを示す図面に替る写真である。図２は，図１に示されるウェスタンブロットに基づいて定量した図面に替るグラフである。図３は，黄杞葉を含む抽出物を添加し，シノビオリンとＰＧＣ−１βの結合に対する阻害活性を示すウェスタンブロットを示す図面に替る写真である。図４は，図３に示されるウェスタンブロットに基づいて定量した図面に替るグラフである。図１〜図４より，単剤よりも混合物で，特に黄杞葉およびヒハツを含む場合，効果が大きいことがわかった。
【００３４】
図５は，ノワセラ，アンチノビンと同様の配分の混合物によるシノビオリンとＰＧＣ−１βの結合に対する阻害活性を示すウェスタンブロットを示す図面に替る写真である。図６は，図５に基づいて，シノビオリンとＰＧＣ−１βの結合の強さを定量したグラフである。図５及び図６から，サプリメントの配合が強い結合阻害活性を有することがわかる。
【００３５】
図７は，ノワセラ，アンチノビンと同様の配分の混合物によるシノビオリンによるＰＧＣ−１βユビキチン化阻害活性を示すウェスタンブロットを示す図面に替る写真である。図７から，この混合物（サプリメント）は，ユビキチン化阻害活性が高いことがわかる。
【００３６】
モニター試験
20〜40 代健康な男女 20 人にノワセラを 1 日 4 錠，1 ヶ月服用してもらった。試験前後で体重測定，採血を行い一般血清・生化学検査を行った。試験期間中食事，運動など特別な指導は行っていない。その結果を表２に示す。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
表２から，サプリメント１ヶ月服用で過半数 (13/20) の被験者で体重 (BMI) の減少が認められた。
【００３９】
表3 は服用前後の血液検査の結果である。肝機能，腎機能，ヘモグロビン値の値に異常は見られなかった。また検体 １−６，１２−１４において中性脂肪の低下，検体３，４，８−１２，１７，１９，２０において LDL コレステロールの低下が認められた。検体 7, 8 ,12, 13 において HbA1c の値が低下した。表3 からサプリメント服用による有害事象は認められず，また中性脂肪，コレステロール，血糖値を低下させる効果があることが示された。 
【００４０】
【表３−１】
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【表３−２】
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【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は，栄養補助食品，サプリメント，及び医薬産業において利用されうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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