(57)【要約】      （修正有）【課題】アラビアガム資化性を有する新規ビフィドバクテリウム属細菌、及びアラビアガム由来のＩＩ型アラビノガラクタンの修飾糖を分解し得る酵素の提供。【解決手段】ビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ０３００（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４９７）、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ１００４０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４９８）、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ１００８５（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４９９）、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ１０１２７（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５００）、及びビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ１０１３０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５０１）からなる群から選択されるビフィドバクテリウム属細菌。特定のアミノ酸配列を含むタンパク質において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、エンドグリコシダーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ０３００（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４９７）、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ１００４０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４９８）、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ１００８５（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４９９）、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ１０１２７（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５００）、及びビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ１０１３０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５０１）からなる群から選択されるビフィドバクテリウム属細菌。
【請求項２】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質。
（Ａ）配列番号２の少なくとも第３７〜１１３６位に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２の少なくとも第３７〜１１３６位に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、エンドグリコシダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡでコードされるタンパク質。
（ａ）配列番号１の少なくとも第１０９〜３４１１位に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号１の少なくとも第１０９〜３４１１位に示される塩基配列に相補的な塩基配列又は該相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、エンドグリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項１に記載のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は請求項２又は３に記載のタンパク質を含有する、飲食品組成物。
【請求項５】
アラビアガム分解促進用である、請求項４に記載の飲食品組成物。
【請求項６】
請求項１に記載のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は請求項２又は３に記載のタンパク質を含有する、ビフィズス菌増殖促進助剤。
【請求項７】
請求項１に記載のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は請求項２又は３に記載のタンパク質と、
ＩＩ型アラビノガラクタンを含む原料とを含有する、飲食品組成物。
【請求項８】
ビフィズス菌増殖促進用である、請求項７に記載の飲食品組成物。
【請求項９】
請求項１に記載のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は請求項２又は３に記載のタンパク質を、ＩＩ型アラビノガラクタンを含む原料に作用させる工程を含む、オリゴ糖の製造方法。
【請求項１０】
前記オリゴ糖がＧａｌ−α１，３−Ａｒａ、Ａｒａｆ−β１，３−Ａｒａ、及び／又はＡｒａｐ−β１，３−Ａｒａである、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は請求項２又は３に記載のタンパク質を動物に投与することを含む、ビフィズス菌増殖促進方法。
【請求項１２】
配列番号１の塩基配列のうちの連続する２〜８塩基の配列を３’末端側に含む、１５〜３０塩基のＤＮＡからなるプライマー、及び
配列番号１の塩基配列のうちの連続する２〜８塩基の配列に相補的な配列を３’末端側に含む、１５〜３０塩基のＤＮＡからなるプライマー
からなるＰＣＲ用プライマーセットを含むキット。
【請求項１３】
アラビアガム資化菌の検出用である、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載のキットを用いてＰＣＲを行う工程を含む、アラビアガム資化菌を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ビフィドバクテリウム属細菌、新規アラビアガム分解酵素、及びそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
アラビアガムは、アフリカ、ナイル地方原産のマメ科アカシア属アラビアゴムノキの樹皮の傷口からの分泌物を乾燥させたものである。日本では食品添加物指定されており、安全性も確認されている。乳化剤や安定剤として飲食品に広く用いられており、アイスクリームなどの菓子類や、ガムシロップが典型的な用途である。また医薬品の錠剤のコーティング剤や、絵具、インクなどの工業製品にも用いられている。
【０００３】
アラビアガムは、ペプチド鎖にＩＩ型アラビノガラクタン（以下、「ＩＩ型ＡＧ」とも記載する）及びβ−アラビノオリゴ糖の糖鎖が付加した糖タンパク質（アラビノガラクタン・プロテイン（ＡＧＰ））で構成される（図１）。ＩＩ型ＡＧは、ＡＧＰのペプチド鎖に結合するβ１，３−ガラクタン主鎖に、β１，６−ガラクタン側鎖が付加した構造であり、その末端はアラビノースやラムノースやグルクロン酸などで修飾されている。ＩＩ型ＡＧの修飾糖のバリエーションは多岐にわたり、例えばアラビノースではフラノース型又はピラノース型がα結合又はβ結合で結合している。このような修飾糖の複雑性のために、アラビアガムは難消化性食物繊維の一つとされている。また、アラビアガムの他にも種々の野菜や果物にもＩＩ型ＡＧは含まれている。
【０００４】
これまでに、ビフィドバクテリウム・ロンガムの一部の菌とビフィドバクテリウム・アドレセンティスの一部の菌のみが、アラビアガムを利用して生育できる資化性を有することが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、それらのビフィズス菌のアラビアガム分解のメカニズムは解明されていない。
【０００５】
また、ヒト試験において、アラビアガムは腸内ビフィズス菌を増やす作用があることが報告されている（非特許文献１）。ＩＩ型ＡＧは、前述のとおり難消化性であるため、これを含有する植物を摂取した場合、通常は糖鎖構造が維持されて腸内に供給される。一般に腸内ビフィズス菌はオリゴ糖により増殖するが、腸内でＩＩ型ＡＧが何らかの分解作用を受けて、ビフィズス菌増殖に寄与するものと考えられている。
【０００６】
本発明者らはこれまでに、ＩＩ型ＡＧの分解に必須な酵素群の機能解析と、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ１２１７におけるＩＩ型ＡＧ分解代謝経路を明らかにした（非特許文献３）。しかしながら、前記ビフィドバクテリウム属細菌が有する糖質分解酵素（エキソ−β−１，３−ガラクタナーゼ）は、修飾糖が少ないカラマツ由来のＩＩ型ＡＧを分解するが、複雑な修飾糖を持つアラビアガム由来のＩＩ型ＡＧに対しては分解性を示さない。
アラビアガム由来のＩＩ型ＡＧは、その修飾糖を弱酸分解により除去すると、エキソ−β−１，３−ガラクタナーゼによる分解活性が１１．３倍に増加することも確認されている（非特許文献３）。このことから、アラビアガム資化性にはアラビアガムのＩＩ型ＡＧの修飾糖の分解・除去が大きく関与することが推測される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】W. Calame, et al., Br. J. Nutr. 100:1269-1275 (2008)
【非特許文献２】F. Crociani, et al., Int. J. Food Microbiol. 24:199-210 (1994)
【非特許文献３】K. Fujita, et al., Appl. Environ. Microbiol. 80:4577-4584 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、アラビアガム資化性を有する新規なビフィドバクテリウム属細菌、及びアラビアガム由来のＩＩ型ＡＧの修飾糖を分解し得る酵素を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが鋭意研究を進めた結果、アラビアガム資化性を有する新規な５種のビフィドバクテリウム属細菌を見出した。また、かかる新規細菌が、アラビアガムから特定の二糖を遊離する分解活性を有する酵素を保持することを見出し、以下の本発明を完成させた。
【００１０】
本発明の第一の態様は、新規ビフィドバクテリウム属細菌であり、具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ０３００（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４９７）、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ１００４０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４９８）、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ１００８５（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４９９）、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ１０１２７（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５００）、及びビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ１０１３０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５０１）からなる群から選択されるビフィドバクテリウム属細菌である。
【００１１】
本発明の第二の態様は、新規糖質分解酵素であり、具体的には以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質である。
（Ａ）配列番号２の少なくとも第３７〜１１３６位に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２の少なくとも第３７〜１１３６位に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、エンドグリコシダーゼ活性を有するタンパク質
前記糖質分解酵素は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡでコードされるタンパク質でもある。
（ａ）配列番号１の少なくとも第１０９〜３４１１位に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号１の少なくとも第１０９〜３４１１位に示される塩基配列に相補的な塩基配列又は該相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、エンドグリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１２】
本発明の第三の態様は、本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素（第二の態様のタンパク質）を含有する、飲食品組成物である。本態様の飲食品組成物は、好ましくはアラビアガム分解促進用である。
【００１３】
本発明の第四の態様は、本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素（第二の態様のタンパク質）を含有する、ビフィズス菌増殖促進助剤である。
【００１４】
本発明の第五の態様は、本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素（第二の態様のタンパク質）と、アラビアガムとを含有する、飲食品組成物である。本態様の飲食品組成物は、好ましくはビフィズス菌増殖促進用である。
【００１５】
本発明の第六の態様は、本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前
記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素（第二の態様のタンパク質）を、ＩＩ型アラビノガラクタンを含む原料に作用させる工程を含む、オリゴ糖の製造方法である。本態様において、前記オリゴ糖は、好ましくはＧａｌ−α１，３−Ａｒａ、Ａｒａｆ−β１，３−Ａｒａ、及び／又はＡｒａｐ−β１，３−Ａｒａである。
【００１６】
本発明の第七の態様は、本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素（第二の態様のタンパク質）を動物に投与することを含む、ビフィズス菌増殖促進方法である。
【００１７】
本発明の第八の態様は、配列番号１の塩基配列のうちの連続する２〜８塩基の配列を３’末端側に含む、１５〜３０塩基のＤＮＡからなるプライマー、及び配列番号１の塩基配列のうちの連続する２〜８塩基の配列に相補的な配列を３’末端側に含む、１５〜３０塩基のＤＮＡからなるプライマーからなるＰＣＲ用プライマーセットを含むキットである。本態様のキットは、好ましくはアラビアガム資化菌の検出用である。
本態様のキットを用いてＰＣＲを行う工程を含む、アラビアガム資化菌を検出する方法も提供される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、アラビアガム資化性を有する新規ビフィドバクテリウム属細菌が提供される。また、本発明により、アラビアガム由来のＩＩ型ＡＧの修飾糖を分解することができる新規糖質分解酵素が提供される。前記ビフィドバクテリウム属細菌や前記糖質分解酵素は、飲食品組成物や剤に含有させることにより、アラビアガムの分解用途、オリゴ糖の製造、又はビフィズス菌増殖促進用途に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＩＩ型ＡＧの構造を示す図である。
【図２】ＩＩ型ＡＧエンド１，３−α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（ＥＡＦａｓｅ）の構造を示す概略図である。（ＳＰ：シグナルペプチド、Glycoside Hydrolase：糖加水分解酵素触媒領域、ＣＢＭ６:糖結合モジュール６、Ｂｉｇ２:バクテリア由来のＩｇ様ドメイン２、ＴＭ：膜貫通領域）
【図３】ＩＩ型ＡＧの糖側鎖に対するＥＡＦａｓｅの認識部位（網掛け部分）及び切断部位（ハサミ印）を示す図である。
【図４】試験例２のアラビアガム資化性ビフィドバクテリウム属細菌を反応させたアラビアガムからの遊離糖を解析したＨＰＡＥＣ−ＰＡＤチャートである。
【図５】試験例３の組み換えＥＡＦａｓｅを反応させたアラビアガム又はカラマツＩＩ型ＡＧからの遊離糖を解析したＨＰＡＥＣ−ＰＡＤチャートである。
【図６】試験例３の組み換えＥＡＦａｓｅを反応させたオリゴ糖からの遊離糖を解析したＨＰＡＥＣ−ＰＡＤチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
次に、本発明の実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができる。
【００２１】
＜ビフィドバクテリウム属細菌＞
本発明の第一の態様は、新規ビフィドバクテリウム属細菌である。具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ０３００（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４９７）、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ１００４０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４９８）、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ１００８５（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４９９）、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ１０１２７（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５００）、又はビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ１０１３０（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５０１）である。以下、上
記５種類の新規ビフィドバクテリウム属細菌を包括して「本発明のビフィドバクテリウム属細菌」と記載することがある。
【００２２】
本発明のビフィドバクテリウム属細菌は、アラビアガムを糖源として生育が可能であり、すなわちアラビアガム資化性を有する。本細菌は、アラビアガムのＩＩ型ＡＧの修飾糖から特定の二糖を遊離させることができる、後述の糖質分解酵素を保持するため、アラビアガムのＩＩ型ＡＧの修飾糖を分解し、その結果アラビアガムを資化することができるものである。
【００２３】
細菌がアラビアガム資化性を有するか否かは、例えば以下の方法により確認することができる。
すなわち、供試菌を、糖源をアラビアガムのみに変更したＭＲＳ（de Man-Rogosa-Sharpe）液体培地１０ｍＬに、１０８ＣＦＵ（Colony Forming Unit）を接種し、嫌気条件下で３７℃で２４時間培養したときの濁度（ＯＤ６００）が、０．３以上である場合、当該菌はアラビアガム資化性を有すると判断する。
【００２４】
本発明のビフィドバクテリウム属細菌の遺伝学的性質を調べるため、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を常法により同定した。さらに、各ビフィドバクテリウム属細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列について、米国立バイオテクノロジー情報センター（以下、「ＮＣＢＩ」とも記載する）のデータベースにて、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search
Tool）解析により前記塩基配列の相同性検索を行った。
その結果、本発明のビフィドバクテリウム属細菌５種は、表１に示す通りビフィドバクテリウム・ロンガムＫＣＴＣ ３１２８Ｔと前記塩基配列において９９％以上の相同性があり、ビフィドバクテリウム・ロンガムに属するビフィドバクテリウム属細菌であることが確認された。
本発明のビフィドバクテリウム属細菌５種は、平成２９年６月２２日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号：292-0818、住所：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に、ブダペスト条約に基づく国際寄託がなされ、表１に示す受託番号がそれぞれ付与されている。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
本発明のビフィドバクテリウム属細菌は、上記寄託菌に制限されず、同寄託菌と実質的に同等の細菌であってもよい。実質的に同等の細菌とは、本発明のビフィドバクテリウム属細菌と同種属の細菌であって、上記寄託菌と同程度の高いアラビアガム資化性を有する細菌をいう。また、実質的に同等の細菌は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、上記寄託菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９８％以上、好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％の相同性を有し、かつ、好ましくは上記寄託菌と同一の菌学的性質を有する。さらに、本発明のビフィドバクテリウム属細菌は、本発明の効果が損なわれない限り、寄託菌、又はそれと実質的に同等の細菌から、変異処理、遺伝子組換え、自然変異株の選択等によって育種された変異株であってもよい。
【００２７】
本発明のビフィドバクテリウム属細菌又は当該ビフィドバクテリウム属細菌の培養物は、常法により当該ビフィドバクテリウム属細菌を培養することにより容易に取得できる。培養する方法は、ビフィドバクテリウム属細菌が増殖できる限り特に限定されず、当該細菌の性質に応じた適当な条件下で培養を行うことができる。例えば、培養温度は２５〜５０℃でよく、３５〜４２℃であることが好ましい。また培養は嫌気条件下で行うことが好ましく、例えば、炭酸ガス等の嫌気ガスを通気しながら培養することができる。また、液体静置培養等の微好気条件下で培養してもよい。
【００２８】
本発明のビフィドバクテリウム属細菌を培養する培地としては、特に限定されず、ビフィドバクテリウム属細菌の培養に通常用いられる培地を用いることができる。すなわち、炭素源としては、アラビアガムの他に、例えば、グルコース、ガラクトース、ラクトース、アラビノース、マンノース、スクロース、デンプン、デンプン加水分解物、廃糖蜜等の糖類を資化性に応じて使用できる。窒素源としては、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩類や硝酸塩類を使用できる。また、無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、塩化マンガン、硫酸第一鉄等を用いることができる。また、ペプトン、大豆粉、脱脂大豆粕、肉エキス、酵母エキス等の有機成分を用いてもよい。
【００２９】
本発明のビフィドバクテリウム属細菌は、後述の飲食品組成物、ビフィズス菌増殖促進助剤（間接的にビフィズス菌の生育及び増殖を促進させる薬剤）、オリゴ糖の製造方法、又はビフィズス菌増殖方法の態様を含め、細菌そのもの、培養物、又は菌体処理物の形態で用いることができる。すなわち、培養した後、得られた培養物をそのまま用いてもよく、希釈又は濃縮して用いてもよく、培養物から回収した菌体を用いてもよい。また、本発明において用いられるビフィドバクテリウム属細菌は、生菌であっても死菌であってもよく、生菌と死菌との両方を含むものでもよい。さらに、ビフィドバクテリウム属細菌の菌体処理物であってもよく、菌体処理物としては、例えば、菌体をアクリルアミドやカラギーナン等で固定化した固定化菌体、ビフィドバクテリウム属細菌の菌体の細胞壁及び細胞膜が超音波処理やホモジナイザー処理等の常法により一部又は完全に破砕された細胞破砕物、その遠心分離上清（水溶性画分）、その上清を硫安処理等で部分精製した画分、又は前記上清を濃縮したもの等が挙げられる。
【００３０】
＜糖質分解酵素＞
本発明の第二の態様は、新規糖質分解酵素であり、具体的には、配列番号２の少なくとも第３７〜１１３６位に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【００３１】
また、本発明の糖質分解酵素は、後述するエンドグリコシダーゼ活性が損なわれない限り、配列番号２の少なくとも第３７〜１１３６位に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加の変異が加えられたアミノ酸配列であってもよい。
ここで、１個又は数個とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。
かかる変異としては、置換が好ましく、アミノ酸の種類を変更しない範囲での置換が望ましい。すなわち、前記配列におけるアミノ酸と、同アミノ酸を置換するアミノ酸は構造上の分類で類似種類のアミノ酸であることが望ましい。具体的には前記配列のアミノ酸が酸性アミノ酸又は酸性アミノ酸アミドである場合はアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、又はグルタミンのうちのいずれかとの置換、塩基性アミノ酸である場合はリジン、ヒスチジン、又はアルギニンのうちのいずれかとの置換、芳香族アミノ酸である場合
はフェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファンのうちのいずれかとの置換、脂肪族アミノ酸又はオキシアミノ酸である場合は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン又はスレオニンのうちのいずれかとの置換、及び前記以外のアミノ酸（システイン、メチオニン、プロリン等）の場合はエンドグリコシダーゼ活性を損なわない範囲で任意に置換することが望ましい。なお、本明細書において、アミノ酸はＬ体である。
【００３２】
本発明の糖質分解酵素は、配列番号１の少なくとも第１０９〜３４１１位に示される塩基配列を含むＤＮＡでコードされるタンパク質でもある。
【００３３】
また、本発明の糖質分解酵素は、後述するエンドグリコシダーゼ活性が損なわれない限り、配列番号１の少なくとも第１０９〜３４１１位に示される塩基配列に相補的な塩基配列又は該相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡでコードされるタンパク質であってもよい。
前記ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ（Saline Sodium Citrate Buffer）、０．１％のＳＤＳ（Sodium Dodecyl Sulfate）を含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましくは挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、配列番号１の少なくとも第１０９〜３４１１位に示される塩基配列の相補配列の一部であってもよい。例えば、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による５０℃での洗浄処理が挙げられる。
【００３４】
本発明の糖質分解酵素は、本発明のビフィドバクテリウム属細菌が共通してその遺伝子を保有する酵素である。
本発明者らは、本発明のビフィドバクテリウム属細菌のゲノム配列について、遺伝子予測ソフトであるProdigal（v2.50）（http://prodigal.ornl.gov/）を用いて遺伝子領域を推定した。そして、予測された遺伝子のアミノ酸配列について、ＮＣＢＩのタンパク質データベースnrを用いて相同性検索を行い、遺伝子の機能予測を行ったところ、本発明のビフィドバクテリウム属細菌に共通して保存された、アラビアガム分解代謝を担う遺伝子クラスターを見出した。さらに、前記遺伝子クラスター内には、糖質加水分解酵素ドメインを有するタンパク質が存在することが見出された。すなわち、本発明の糖質分解酵素である、ＩＩ型ＡＧエンド１，３−α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（以下、「ＥＡＦａｓｅ」とも記載する）である。
配列番号１は、ビフィドバクテリウム・ロンガムのＥＡＦａｓｅ遺伝子の塩基配列であり、配列番号２はそのアミノ酸配列である。
【００３５】
InterPro（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）を用いてドメイン検索を行ったところ、ＥＡＦａｓｅは、Ｎ末端側（配列番号２の第１〜３６位を含む）にシグナルペプチド（ＳＰ）を有することが予測された。また、Ｃ末端側に膜貫通領域（ＴＭ）を有し、菌体表
層に局在化する酵素であることが予測された（図２）。これにより、本発明のビフィドバクテリウム属細菌を細菌そのもの、培養物、又は菌体処理物の形態で用いる場合においても、後述のようにＥＡＦａｓｅの活性を発揮することができる。
さらに、Protein Homology/analogY Recognition Engine V 2.0（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）を用いて糖質加水分解酵素ドメインの構造予測を行ったところ、既存酵素との類似性が低いことが分かった。そのため、本発明の糖質分解酵素であるＥＡＦａｓｅは、新規の糖質加水分解酵素ファミリー（ＧＨファミリー）に属すると考えられる。
【００３６】
ＥＡＦａｓｅのアミノ酸配列について、ＮＣＢＩのタンパク質データベースnrを用いて相同性検索を行ったところ、１つのタンパク質を除き、ホモログは見つからなかった。ヒットしたタンパク質（ビフィドバクテリウム・ロンガムのhypothetical protein（WP_077381861.1））は、nrデータベースにアミノ酸配列が登録されているものの、機能については明らかにされていない。かかる登録アミノ酸配列は、遺伝子予測ソフトなどを用いて予測された遺伝子の塩基配列をアミノ酸配列に変換しただけのものと推測される。
したがって、ＥＡＦａｓｅは、配列及び機能が新たに見出された新規の糖質分解酵素である。また、ＥＡＦａｓｅは、ビフィドバクテリウム・ロンガム以外の細菌の既知のタンパク質中には見出されず、かつビフィドバクテリウム・ロンガムのうち特定の菌種のみが保有する酵素である。
【００３７】
本発明の糖質分解酵素であるＥＡＦａｓｅは、糖鎖内のＬ−Ａｒａｆと３位で結合したＡｒａｐ又はＧａｌｐの２位及び３位の構造を認識し、前記Ｌ−Ａｒａｆのα１，３構造を切断する、エンドグリコシダーゼ活性を有する。認識部位がＧａｌ−ＡｒａとＡｒａ−Ａｒａの二種あるのは、β−Ａｒａｐとα−Ｇａｌｐとが類似する構造であるからと考えられる。なお、β−Ａｒａｆに対しても、弱いながら認識することができる。
なお、本明細書において「Ａｒａ」はアラビノース、「Ｇａｌ」はガラクトースをそれぞれ表し、これらの後ろの「ｐ」はピラノース環構造、「ｆ」はフラノース環構造をそれぞれ表す。
【００３８】
図３を参照して説明すると、ＥＡＦａｓｅは、アラビアガムのＩＩ型ＡＧ中の糖側鎖においては、６，４分岐を持つＧａｌに付加された網掛け部分のＧａｌｐ−α１，３−Ａｒａｆ−α１，３−を認識し、Ｌ−Ａｒａｆ−α１，３構造を切断して、Ｇａｌｐ−α１，３−Ａｒａｆ（以下、「ＧＡ」とも記載する）を遊離する（図３（ａ）、（ｂ））。なお、アラビアガムのＩＩ型ＡＧ中の糖側鎖のバリエーションはこれに限らず多岐にわたって存在するが、ＥＡＦａｓｅは他に、６，４分岐を持つＧａｌに付加されたＡｒａｐ−β１，３−Ａｒａｆ−α１，３−を認識し、Ｌ−Ａｒａｆ−α１，３構造を切断して、Ａｒａｐ−β１，３−Ａｒａｆ（以下、「ＡＡ」とも記載する）を遊離することもできる。
なお、アラビアガムのＩＩ型ＡＧには、ＧＡとＡＡとが７：１（モル比）で含まれていることが知られている（C.A. Tischer et al., Carbohydr. Poly. 47: 151-158 (2002)）。ＥＡＦａｓｅは、これらの二糖をアラビアガムから切断し、遊離させることができる酵素であるともいえる。これまでにＧＡやＡＡを遊離させる酵素は知られていないため、ＥＡＦａｓｅは新規な機能を有する酵素である。
【００３９】
また、ＥＡＦａｓｅは、カラマツのＩＩ型ＡＧ中の糖側鎖の一例においては、Ａｒａｐ−β１，３−Ａｒａｆ−α１，３−を認識し、Ｌ−Ａｒａｆ−α１，３構造を切断して、ＡＡを遊離する（図３（ｃ））。ＥＡＦａｓｅは、イネのＩＩ型ＡＧ中の糖側鎖の一例においては、Ａｒａｆ−β１，３−Ａｒａｆ−α１，３−を認識し、Ｌ−Ａｒａｆ−α１，３構造を切断して、Ａｒａｆ−β１，３−Ａｒａｆを遊離する（図３（ｄ））。
【００４０】
本発明の糖質分解酵素がエンドグリコシダーゼ活性を発揮する条件は、特に限定されな
いが、例えば温度は３５〜５５℃が好ましく、４５〜５０℃がより好ましい。また、ｐＨは４．０〜７．０が好ましく、５．０〜６．０がより好ましい。
【００４１】
ここで、エンドグリコシダーゼ活性は、例えば以下の方法により確認することができる。
すなわち、Ｌ−Ａｒａｆと３位で結合したＡｒａｐ又はＧａｌｐの構造を有する糖鎖に本発明の糖質分解酵素を反応させて、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（High Performance Anion Exchange Chromatography-Pulsed Amperometric Detection）等のクロマトグラフィー法により生成した二糖を検出し、その量から酵素活性を算出すればよい。
【００４２】
本発明の糖質分解酵素は、本発明のビフィドバクテリウム属細菌から公知の方法により精製して製造することができる。
また、遺伝子工学的手法を用いて適当な宿主細菌に組換えタンパク質を産生させることにより製造してもよい。このとき、ＥＡＦａｓｅ遺伝子のシグナルペプチドのコード領域を含む全遺伝子配列を宿主に導入して発現させ、宿主内でのプロセッシングを経て本発明の糖質分解酵素の成熟タンパク質を取得してもよいし、ＥＡＦａｓｅ遺伝子のシグナルペプチドのコード領域を除いた遺伝子配列を宿主に発現させてもよい。
【００４３】
＜ビフィズス菌増殖促進助剤＞
本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素は、ビフィズス菌増殖促進助剤の有効成分として利用することができる。
前述の通り、本発明のビフィドバクテリウム属細菌は本発明の糖質分解酵素を保持し、本発明の糖質分解酵素はエンドグリコシダーゼ活性によりＩＩ型ＡＧの糖鎖からオリゴ糖を切り出し遊離することができる。
【００４４】
近年、ビフィズス菌に代表されるヒトにとって有用な細菌（プロバイオティクス）を増やす難消化性の食品素材が、プレバイオティクスとして注目されている。現在、９種類のオリゴ糖がビフィズス菌を増やす効果がある特定保健用食品として認められている。また、ラクト−Ｎ−ビオース（Ｇａｌ−１，３−ＧｌｃＮＡｃ（ＬＮＢ））が，乳幼児のビフィズス菌を選択的に増やす増殖因子であることが明らかにされている(T. Katayama, Biosci. Biotechnol. Biochem. 80:621-632 (2016)、M. Kitaoka., Adv. Nutr. 3:422S-429S (2012))。
アラビアガムやカラマツ等のＩＩ型ＡＧを含む原料からＥＡＦａｓｅによって切り出され遊離するオリゴ糖（Ｇａｌ−α１，３−Ａｒａ、Ａｒａｐ−β１，３−Ａｒａ、Ａｒａｆ−β１，３−Ａｒａ等）は、既知のプレバイオティクスオリゴ糖とは異なる構造を有する二糖である。これらの二糖は、ビフィズス菌、好ましくはＥＡＦａｓｅを保有するビフィズス菌の菌体内で該菌が保有するエキソグリコシダーゼ（α−ガラクトシダーゼ、β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ、又はβ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ）により単糖に分解され資化され得る。したがって、これらの二糖は、ビフィズス菌、特にビフィドバクテリウム・ロンガムやビフィドバクテリウム・アドレセンティスを選択的に増殖させ得る高選択性プレバイオティクスオリゴ糖として利用し得る。
また、これらの二糖が切り出された残余の糖鎖を含むＩＩ型ＡＧは、別の加水分解酵素（エキソグリコシダーゼ等）による分解を受けやすくなるため、ビフィズス菌に資化され得る。
したがって、本発明のビフィズス菌増殖促進助剤は、そのエンドグリコシダーゼ活性によって、間接的にビフィズス菌の生育及び増殖を促進させる作用を有する。
【００４５】
本発明のビフィズス菌増殖促進助剤は、経口投与及び非経口投与のいずれでもよく、投与方法に応じて、適宜所望の剤形に製剤化することができる。例えば、経口投与の場合、
散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。また、非経口投与の場合、座剤、軟膏剤又は点眼剤等に製剤化することができる。
【００４６】
また、製剤化に際しては、本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素の他に、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤等の成分を用いることができる。
加えて、製剤化は剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。
【００４７】
本発明のビフィズス菌増殖促進助剤の摂取量又は投与量は、剤形に合わせて適宜選択することができるが、例えば、体重１ｋｇあたりの１日の本発明のビフィドバクテリウム属細菌の摂取量又は投与量として、１×１０６〜１×１０１２ＣＦＵ／ｋｇ／日が好ましく、１×１０７〜１×１０１１ＣＦＵ／ｋｇ／日がより好ましく、１×１０８〜１×１０１０ＣＦＵ／ｋｇ／日がさらに好ましい。本発明のビフィドバクテリウム属細菌の培養物や前記細菌の菌体処理物を用いる場合のその摂取量又は投与量は、本発明のビフィドバクテリウム属細菌の摂取量又は投与量に換算された場合に上記摂取量又は投与量となることが好ましい。また、例えば、体重１ｋｇあたりの１日の本発明の糖質分解酵素の摂取量又は投与量として、１μｇ／ｋｇ／日が好ましく、１０μｇ／ｋｇ／日がより好ましく、１００μｇ／ｋｇ／日がさらに好ましい。
【００４８】
また、本発明のビフィズス菌増殖促進助剤中の本発明のビフィドバクテリウム属細菌の含有量は、前記摂取量に基づいて適宜選択することができるが、例えば、１×１０６〜１×１０１２ＣＦＵ／ｇ、好ましくは１×１０７〜１×１０１１ＣＦＵ／ｇ、より好ましくは１×１０８〜１×１０１０ＣＦＵ／ｇとすることができる。本発明のビフィドバクテリウム属細菌の培養物や前記細菌の菌体処理物を用いる場合のその含有量は、本発明のビフィドバクテリウム属細菌の含有量に換算された場合に上記含有量となることが好ましい。また、本発明のビフィズス菌増殖促進助剤中の本発明の糖質分解酵素の含有量は、例えば、１μｇ／ｇ、好ましくは１０μｇ／ｇ、より好ましくは１００μｇ／ｇとすることができる。
【００４９】
なお、前記単位のうちＣＦＵは、colony forming unitsの略であり、コロニー形成単位である。該細菌が死菌の場合、ＣＦＵは個細胞（cells）と置き換えることができる。
【００５０】
また、前記製剤担体としては、剤形に応じて、各種有機又は無機の担体を用いることができる。固形製剤の場合の担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
【００５１】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアガム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。
【００５２】
結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マクロゴール等が挙げられる。
【００５３】
崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
【００５４】
滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ピーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩類；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
【００５５】
安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。
【００５６】
矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
なお、経口投与用の液剤の場合に使用する担体としては、水等の溶剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
【００５７】
本発明のこの態様の別の側面は、ビフィズス菌増殖促進助剤の製造における、本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素の使用であるということもできる。
また、この態様の別の側面は、ビフィズス菌増殖促進における本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素の使用であるということもできる。
【００５８】
この態様の別の側面は、本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素を動物に投与することを含む、ビフィズス菌増殖促進方法であるともいえる。ここで、動物は、特に限定されないが、通常はヒトである。
【００５９】
＜飲食品組成物＞
本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素は、飲食品組成物に含有させることができる。
かかる飲食品組成物は、本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素を公知の飲食品に添加することによって製造してもよいし、本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素を飲食品の原料中に混合して新たな飲食品組成物として製造することもできる。
【００６０】
また、本発明飲食品組成物は、液状、ペースト状、固体、粉末等の形態を問わず、錠菓、流動食、飼料（ペット用を含む）等のほか、例えば、小麦粉製品、即席食品、農産加工品、水産加工品、畜産加工品、乳・乳製品、油脂類、基礎調味料、複合調味料・食品類、冷凍食品、菓子類、飲料、これら以外の市販品等が挙げられる。
【００６１】
本発明の飲食品組成物の摂取量は、適宜選択することができるが、例えば、体重１ｋｇあたりの１日の本発明のビフィドバクテリウム属細菌の摂取量として、１×１０６〜１×１０１２ＣＦＵ／ｋｇ／日が好ましく、１×１０７〜１×１０１１ＣＦＵ／ｋｇ／日がより好ましく、１×１０８〜１×１０１０ＣＦＵ／ｋｇ／日がさらに好ましい。本発明のビフィドバクテリウム属細菌の培養物や前記細菌の菌体処理物を用いる場合のその摂取量は
、本発明のビフィドバクテリウム属細菌の摂取量に換算された場合に上記摂取量又は投与量となることが好ましい。また、例えば、体重１ｋｇあたりの１日の本発明の糖質分解酵素の摂取量として、１μｇ／ｋｇ／日が好ましく、１０μｇ／ｋｇ／日がより好ましく、１００μｇ／ｋｇ／日がさらに好ましい。
【００６２】
また、本発明の飲食品組成物中の本発明のビフィドバクテリウム属細菌の含有量は、前記摂取量に基づいて適宜選択することができるが、例えば、１×１０６〜１×１０１２ＣＦＵ／ｇ、好ましくは１×１０７〜１×１０１１ＣＦＵ／ｇ、より好ましくは１×１０８〜１×１０１０ＣＦＵ／ｇとすることができる。本発明のビフィドバクテリウム属細菌の培養物や前記細菌の菌体処理物を用いる場合のその含有量は、本発明のビフィドバクテリウム属細菌の含有量に換算された場合に上記含有量となることが好ましい。また、本発明の飲食品組成物中の本発明の糖質分解酵素の含有量は、例えば、１μｇ／ｇ、好ましくは１０μｇ／ｇ、より好ましくは１００μｇ／ｇとすることができる。
【００６３】
前述の通り、本発明のビフィドバクテリウム属細菌は本発明の糖質分解酵素を保持し、本発明の糖質分解酵素はエンドグリコシダーゼ活性によりアラビアガムのＩＩ型ＡＧの糖鎖からオリゴ糖（ＧＡ及びＡＡ）を切り出し遊離することができる。かかる切り出しにより分解を受けた修飾糖の残余の糖鎖は、別の加水分解酵素（エキソグリコシダーゼ等）による分解を受けやすくなる。
そのため、本発明の飲食品組成物は、アラビアガム分解促進の用途に好ましく供することができる。
【００６４】
本発明のこの態様の別の側面は、アラビアガム分解促進用飲食品組成物の製造における、本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素の使用であるということもできる。
また、この態様の別の側面は、アラビアガム分解促進における本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素の使用であるということもできる。
この態様の別の側面は、本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素を動物に投与することを含む、アラビアガム分解促進方法であるともいえる。ここで、動物は、特に限定されないが、通常はヒトである。
【００６５】
本発明の飲食品組成物は、本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素に加えて、ＩＩ型ＡＧを含む原料をさらに含有させることができる。
ここで、前記原料はＩＩ型ＡＧを含むものであれば特に限定されず、例えばアラビアガム、カラマツ、イネ、ダイコン、サツマイモ、小麦、リンゴ、ブドウ、エンドウ、トウモロコシ、ニンジン等が挙げられる。特に、アラビアガムは、プレバイオティクス食物繊維として知られており、飲食用途での安全性も認められているため、好ましい。
前述の本発明のビフィズス菌増殖促進助剤で説明した通り、本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素は、ＩＩ型ＡＧの分解を介して、腸内のビフィズス菌の増殖を促進させることができる。
そのため、ＩＩ型ＡＧを含む原料を、本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素とともに含有する飲食品組成物は、ビフィズス菌増殖促進の用途に好ましく供することができる。
【００６６】
本発明のこの態様の別の側面は、ビフィズス菌増殖促進用飲食品組成物の製造における、本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及
び／又は本発明の糖質分解酵素と、ＩＩ型ＡＧを含む原料との使用であるということもできる。
また、この態様の別の側面は、ビフィズス菌増殖促進における本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素と、ＩＩ型ＡＧを含む原料との使用であるということもできる。
この態様の別の側面は、本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素と、ＩＩ型ＡＧを含む原料とを動物に投与することを含む、ビフィズス菌増殖促進方法であるともいえる。ここで、動物は、特に限定されないが、通常はヒトである。
【００６７】
また、本発明で定義される飲食品組成物は、アラビアガムの分解、ビフィズス菌の増殖、又はオリゴ糖が有効に作用する疾患の予防、疾患のリスク低減、疾患の症状緩和、及び／又は疾患の治療等の用途（保健用途を含む）が表示された飲食品として提供・販売されることが可能である。
「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、前記用途を想起・類推させ得るような表現であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、全て本発明の「表示」行為に該当する。
【００６８】
また、「表示」は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為等が挙げられる。
【００６９】
一方、表示内容としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示等）であることが好ましい。また、そのような表示内容を、包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ等の販売現場における宣伝材、その他の書類等へ付することが好ましい。
【００７０】
また、「表示」には、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、医薬用部外品等としての表示も挙げられる。この中でも特に、消費者庁によって認可される表示、例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、若しくは機能性表示食品に係る制度、又はこれらに類似する制度にて認可される表示等が挙げられる。具体的には、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク減少表示、科学的根拠に基づいた機能性の表示等を挙げることができ、より具体的には、健康増進法に規定する特別用途表示の許可等に関する内閣府令（平成二十一年八月三十一日内閣府令第五十七号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）及びこれに類する表示が典型的な例である。
【００７１】
＜オリゴ糖の製造方法＞
本発明のオリゴ糖の製造方法は、本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素を、ＩＩ型ＡＧを含む原料に作用させる工程を含む。
前述の通り、本発明のビフィドバクテリウム属細菌は本発明の糖質分解酵素を保持し、本発明の糖質分解酵素はエンドグリコシダーゼ活性によりＩＩ型ＡＧの糖鎖からオリゴ糖を切り出し遊離することができるため、オリゴ糖の製造が実現される。
本発明の製造方法により製造されるオリゴ糖は、特に限定されないが、通常はアラビノースの還元末端を有するオリゴ糖であり、例えばＧａｌ−１，３−ＡｒａもしくはＧａｌ
−１，３−Ａｒａ−Ｘ、又はＡｒａ−１，３−ＡｒａもしくはＡｒａ−１，３−Ａｒａ−Ｘである（Ｘは任意の単糖又は二糖〜五糖のオリゴ糖を表す）。
【００７２】
本発明のビフィドバクテリウム属細菌、前記細菌の培養物、前記細菌の菌体処理物、及び／又は本発明の糖質分解酵素を、ＩＩ型ＡＧを含む原料に作用させる工程を行う条件は、特に限定されないが、通常は本発明の糖質分解酵素がそのエンドグリコシダーゼ活性を発揮できる条件で行われる。なお、かかる条件は、前述の本発明の糖質分解酵素の説明に準じる。
【００７３】
原料に作用させる本発明のビフィドバクテリウム属細菌の量は、原料の種類や反応条件によって適宜定めることができるが、例えば、原料１ｇに対する量として、１×１０６〜１×１０１２ＣＦＵ／ｇ、好ましくは１×１０７〜１×１０１１ＣＦＵ／ｇ、より好ましくは１×１０８〜１×１０１０ＣＦＵ／ｇとすることができる。本発明のビフィドバクテリウム属細菌の培養物や前記細菌の菌体処理物を用いる場合の量は、本発明のビフィドバクテリウム属細菌の量に換算された場合に上記量となることが好ましい。
原料に作用させる本発明の糖質分解酵素の量は、例えば、原料１ｇに対する量として、１μｇ／ｇ、好ましくは１０μｇ／ｇ、より好ましくは１００μｇ／ｇとすることができる。
【００７４】
本発明の製造方法において、原料はＩＩ型ＡＧを含むものであれば特に限定されず、例えばアラビアガム、カラマツ、イネ、ダイコン、サツマイモ、小麦、リンゴ、ブドウ、エンドウ、トウモロコシ、ニンジン等が挙げられ、目的とするオリゴ糖の種類によって適宜選択すればよい。例えば、アラビアガムを原料としたときは、Ｇａｌ−α１，３−Ａｒａ（ＧＡ）、及びＡｒａｐ−β１，３−Ａｒａ（ＡＡ）を選択的に製造することができる。また、カラマツを原料としたときは、Ａｒａｐ−β１，３−Ａｒａ（ＡＡ）を選択的に製造することができる。また、イネを原料にしたときは、Ａｒａｐ−β１，３−Ａｒａｆ、及びＡｒａｆ−β１，３−Ａｒａを製造することができる。
【００７５】
製造されたオリゴ糖は、ビフィズス菌、特にビフィドバクテリウム・ロンガムやビフィドバクテリウム・アドレセンティスを選択的に増殖させ得る高選択性プレバイオティクスオリゴ糖として利用し得る。
【００７６】
従来、ＧＡやＡＡといったＩＩ型ＡＧ由来のオリゴ糖は、化学的手法（弱酸分解処理）で調製できることは知られていた。しかしながら、かかる手法では、単糖にまで分解しないように時間や温度等の反応条件を厳密にコントロールする必要があるうえ、不純物が多く含まれる点で、オリゴ糖の製造方法としては満足なものではなかった。
本発明の製造方法は、酵素学的手法であるため、高い選択性で効率的に目的のオリゴ糖を製造することができるため、非常に有用である。
【００７７】
＜アラビアガム資化菌の検出用キット＞
本発明はさらに、配列番号１の塩基配列のうちの連続する２〜８塩基の配列を３’末端側に含む、１５〜３０塩基のＤＮＡからなるプライマー、及び配列番号１の塩基配列のうちの連続する２〜８塩基の配列に相補的な配列を３’末端側に含む、１５〜３０塩基のＤＮＡからなるプライマーからなるＰＣＲ用プライマーセットを含むキットを提供する。
【００７８】
ＰＣＲ用プライマーセットは、通常のＰＣＲ条件で増幅可能であること、本発明の糖質分解酵素をコードするＤＮＡ配列の他の領域では増幅断片が生じない配列であること、増幅断片が定量的ＰＣＲにも適用可能なように８０〜５５０ｂｐの長さになるようにすること、かつ、Ｔｍ値が５５〜６５℃の範囲内になること、を満たすようにオリゴヌクレオチドを配列番号１に基づいて設計すればよい。
例えば、配列番号１の塩基配列の第１８１７〜１８２１位の配列を３’末端側に含む２０塩基程度のＤＮＡをフォワードプライマーとして、配列番号１の塩基配列の第１９３５〜１９３９位の配列に相補的な配列を３’末端側に含む２０塩基程度のＤＮＡをリバースプライマーとして、プライマーセットを構成することができる。
【００７９】
本発明のキットに含まれるＰＣＲプライマーセットは、被験試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲを行うことにより、本発明の糖質分解酵素をコードするＤＮＡ配列の一部を選択的に増幅し得る。また、かかるＰＣＲにより増幅されるＤＮＡ配列は、本発明の糖質分解酵素に固有の配列であり、他の遺伝子配列と区別される。
前述の通り、本発明の糖質分解酵素はアラビアガムの修飾糖を分解することができるため、該酵素を保有する細菌はアラビアガム資化性を有するといえる。したがって、本発明のキットは、アラビアガム資化菌の検出の用途に好ましく供することができる。
本発明により、さらに、本発明のキットを用いてＰＣＲを行う工程を含む、アラビアガム資化菌を検出する方法も提供される。
【００８０】
なお、ここで「検出」とは、アラビアガム資化菌の存在の有無を調べる定性的な検出の意味の他に、アラビアガム資化菌の存在量を定量的に調べるような定量的な検出（測定）の意味も含む。
【００８１】
本発明のキットを適用し得る被験試料としては、特に限定されないが、例えば、乳酸菌の混合培養物やヨーグルトやチーズなどの乳酸菌を含む飲食品、マウスやラットなどの実験動物やヒトの糞便・腸液などを挙げることができる。
これらの試料から核酸を抽出する方法は、例えば、Ｌｙｓｏｚｙｍｅなどの酵素やビーズなどで物理的に細胞を破壊して抽出する方法や、市販の核酸抽出キットを使用する方法等が挙げられ、特に限定されない。
【００８２】
本発明のキットには、前記ＰＣＲプライマーセットの他に、例えば、ＰＣＲ用試薬（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ）、緩衝液、説明書等を含めてもよい。また、アラビアガム資化菌の検出に必要な試薬や、他の株・種・属の細菌の検出に必要な試薬等も含めてもよい。
【実施例】
【００８３】
以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８４】
［試験例１］アラビアガム資化性試験
表２に記載の各供試菌を、糖源をアラビアガムのみに変更したＭＲＳ液体培地（表３）２００μＬに、１ｖ/ｖ％（約１×１０６ＣＦＵ）ずつ接種し、嫌気条件下で３７℃にて培養した。培養４８時間後に濁度（ＯＤ６００）を測定し、菌を接種しなかった培地を同様に培養したコントロールの濁度を差し引いた値を以下の基準に照らし、資化性の有無を判定した。
ＯＤ６００＜０．１５：資化性なし、ＯＤ６００≧０．１５：資化性あり
【００８５】
【表２−１】
2019017292.tif 000003
【００８６】
【表２−２】
2019017292.tif 000004
【００８７】
【表２−３】
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【００８８】
【表３】
2019017292.tif 000006
【００８９】
結果を表２に示す。全１１３種の供試菌のうち、Bifidobacterium longum ＭＣＣ０３００、ＭＣＣ１００４０、ＭＣＣ１００８５、ＭＣＣ１０１２７、及びＭＣＣ１０１３０の５種のみが、アラビアガム資化性を有することが認められた。
【００９０】
［試験例２］アラビアガム資化性ビフィドバクテリウム属細菌を反応させたアラビアガムからの遊離糖の解析
ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ１２１７及びビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ０３００を、試験例１と同様に糖源をアラビアガムのみに変更したＭＲＳ液体培地で、嫌気条件下で３７℃にて４８時間培養した。培養後に集菌し、５ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で洗菌し、冷凍した。冷凍菌体１０ｍｇ（洗菌菌体重量）を、表４に記載の２％（20μｇ／μＬ）アラビアガム溶液を含む混合溶液２ｍＬに加え、３７℃で３日間反応させた。
【００９１】
【表４】
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【００９２】
反応後の菌液上清をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤで解析した。測定条件を以下に記す。
クロマト機材：ICS-3000, Dionex Corp.
カラム：CarboPac PA-1
移動相：A (0.1 M NaOH) 、B (0.5 M sodium acetate and 0.1 M NaOH)
プログラム: 0-5 min, 100% eluent A (0.1 M NaOH); 5-30 min, 0%-100% eluent B (0
.5 M sodium acetate and 0.1 M NaOH); and 30-35 min, 100% eluent B.
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度：３０℃
検出器：ＰＡＤ
結果を図４に示す。アラビアガム資化性を有するビフィドバクテリウム・ロンガムＭＣＣ０３００は、アラビアガムからＧａｌ−α１，３−Ａｒａを遊離させたことが認められた。一方、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ１２１７では、二糖の遊離は認められなかった。
【００９３】
［試験例３］組み換えＥＡＦａｓｅを用いた解析
（１）組み換えＥＡＦａｓｅの作製
ＥＡＦａｓｅ遺伝子のシグナルペプチドをコードする部位を除いた配列（配列番号１の第１０９〜３４１１位の配列）を有するＤＮＡをＰＣＲで増幅し、定法によりｐＥＴ２３ｄベクターに組み込み、取得したプラスミドをｐＥＴ２３ｄ＿ＥＡＦａｓｅと名付けた。
定法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をｐＥＴ２３ｄ＿ＥＡＦａｓｅで形質転換し、Overnight_Express Autoinduction System（メルク株式会社製）を用いて酵素誘導産生した。BugBuster protein extraction reagent (Novagen)を用いて菌体内酵素を抽出した後、タンパク質のＣ末端に付加したHis-tagを利用して酵素精製を行い、組み換えＥＡＦａｓｅタンパク質を得た。
【００９４】
（２）組み換えＥＡＦａｓｅを反応させたアラビアガム又はカラマツＩＩ型ＡＧからの遊離糖の解析
（１）で取得した組み換えＥＡＦａｓｅの溶液（０．１７０μｇ／μＬ）１μＬを、１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）１０μＬ及び滅菌水１６９μＬ中で、アラビアガム又はカラマツＩＩ型ＡＧ４００μｇと３７℃にて４８時間反応させた。回収した反応液の上清を試験例２と同様にＨＰＡＥＣ−ＰＡＤで解析した。
結果を図５に示す。アラビアガムからは、主にＧａｌ−α１，３−Ａｒａ（ＧＡ）が、カラマツＩＩ型ＡＧからはＡｒａｐ−β１，３−Ａｒａ（ＡＡ）が、それぞれ遊離した。この結果は、アラビアガム由来ＩＩ型ＡＧの修飾糖のＧＡとＡＡのモル比が７：１であることや、カラマツＩＩ型ＡＧではＧＡの存在が報告されていないことと一致する。
【００９５】
（３）組み換えＥＡＦａｓｅのアラビアガム又はカラマツＩＩ型ＡＧに対する基質分解率の解析
表５に示す組成で、（１）で取得した組み換えＥＡＦａｓｅをアラビアガム又はカラマツＩＩ型ＡＧに３７℃にて４８時間反応させた。回収した反応液のうち１００μＬにエタノール４００μＬを加え、１〜２時間４℃で冷却した。４℃、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清についてSpeedVac遠心濃縮システム（ThermoFisher社）を使用して遠心濃縮した。濃縮後、濃縮物を滅菌水で１ｍＬに調整し、フェノール硫酸法で遊離糖の量を測定した。標準試料としては、ガラクトースの０、２０、４０、６０、８０及び１００μｇ/ｍＬ水溶液を用いた。
【００９６】
【表５】
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【００９７】
表６にガラクトース標準試料のＯＤ４９０値を、表７に測定試料のＯＤ４９０値及び換算糖濃度を、それぞれ示す。当初基質濃度と換算糖濃度とを用いて、数式（１）及び（２）の通り基質分解率を算出した。ＥＡＦａｓｅのアラビアガムに対する基質分解率は１４．３％と非常に高く、カラマツＩＩ型ＡＧに対する基質分解率は０．６０４％であった。
【００９８】
【表６】
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【００９９】
【表７】
2019017292.tif 000010
【０１００】
【数１】
2019017292.tif 000011
【０１０１】
（４）組み換えＥＡＦａｓｅの基質特異性の解析
（１）で取得した組み換えＥＡＦａｓｅの溶液（０．１７０μｇ／μＬ）１μＬを、１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）２μＬ及び滅菌水３２μＬ中で、オリゴ糖１μｇを基質として３７℃にて１２時間反応させた。回収した反応液の上清を試験例２と同様にＨＰＡＥＣ−ＰＡＤで解析した。なお、基質としたオリゴ糖は、Arap-β1,3-Araf-α1,3-Galp-β1,6-Galp-β1,6-Gal又はAraf-β1,3-Araf-α1,3-Galp-β1,6-Galであり、これらはそれ
ぞれ、カラマツＩＩ型ＡＧからexo-β1,3-galactanaseを用いた加水分解反応により取得したもの、及び穂ばらみ期のイネから（K. Kawaguchi et al., Plant. J. 9: 777-785 (1996)）抽出したものである。
結果を図６に示す。Arap-β1,3-Araf-α1,3-Galp-β1,6- Galp-β1,6-GalからはArap-β1,3-Araが、Araf-β1,3-Araf-α1,3- Galp-β1,6-GalからはAraf-β1,3-Araが、それぞれ遊離することが確認された。Araf-β1,3-Araf-α1,3-Galp-β1,6-Galについては、反応開始９６時間後もAraf-β1,3-Araf-α1,3-Galp-β1,6-Galのピークが残っていたため、ＥＡＦａｓｅは、Arap-β1,3-Araf-α1,3-Galp-β1,6-Galp-β1,6-Galには強く作用するが、Araf-β1,3-Araf-α1,3-Galp-β1,6-Galに対する作用は弱いものと推測される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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