(57)【要約】【課題】人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から網膜色素上皮細胞を作製するための高効率の方法を提供すること。【解決手段】ｉＰＳＣは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、例えば、胎児ＲＰＥ幹細胞を含む体細胞から作製される。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、マーカーに作動可能に連結されたチロシナーゼプロモーターを含む。処置などのためにＲＰＥ細胞を使用するための方法が、開示される。ＲＰＥの分化に影響する作用物質をスクリーニングするための方法も開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単層を横断する経上皮抵抗を計測することによって、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に分化したことを立証するための方法であって、１７０Ω・ｃｍ２以上の経上皮抵抗は、人工多能性幹細胞が網膜色素上皮細胞に分化したことを示す、方法。
【請求項２】
前記ｉＰＳＣ由来のＲＰＥ細胞が、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーの頂端バスおよび基底バスの中に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記経上皮抵抗が、リンガー液寒天橋と直列のカロメル電極対を用いて計測される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｉＰＳＣ由来のＲＰＥ単層を横断する前記経上皮抵抗が１７０〜２００Ω・ｃｍ２である、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
定常状態の前記ｉＰＳＣ由来のＲＰＥ細胞の細胞内カルシウム濃度が１２０ｎＭである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年２月１日に出願された米国特許出願第６１／７５９，９８８号の利益を請求し、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
本開示の分野
本開示は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の分野、詳細には、幹細胞からＲＰＥ細胞を作製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
網膜は、脊椎動物の眼の内側表面に位置する特殊化された感光性の神経組織の層である。角膜、水晶体および硝子体液を通過した後に網膜に到達した光は、神経インパルスの引き金を引く化学的事象および電気的事象に変換される。光をこれらの生物学的プロセスに変換するためのプロセスである伝達に関与する細胞は、光受容細胞と呼ばれる特殊化されたニューロンである。
【０００４】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）は、神経網膜と脈絡膜を隔てる、哺乳動物の眼の中の六角形の細胞が高密度に詰まった極性のある単層である。ＲＰＥにおける細胞は、色素顆粒を含む細胞であり、血液網膜関門を形成すること、および水晶体によって収束された網膜上の光エネルギーを吸収することによって光受容体と密接に相互作用して視覚機能を維持することによって、網膜の生理機能において重要な役割を果たす。これらの細胞はまた、網膜下腔から血液にイオン、水および代謝最終産物を輸送し、栄養分（例えば、グルコース、レチノールおよび脂肪酸）を血液から取り込み、これらの栄養分を光受容体に送達する。
【０００５】
ＲＰＥ細胞は、レチナールの視覚サイクルの一部でもある：光受容体は、光子吸収後に形成されるオールトランス−レチナールを１１−シス−レチナールに再度異性化して戻すことができないので、レチナールは、ＲＰＥに輸送されて、そこで１１−シス−レチナールに再度異性化され、光受容体に輸送し返される。
【０００６】
多くの眼疾患（例えば、（加齢）黄斑変性、黄斑ジストロフィー、例えば、シュタルガルト病およびシュタルガルト様疾患、ベスト病（卵黄様黄斑ジストロフィー）ならびに成人卵黄様ジストロフィーまたは網膜色素変性症のサブタイプ）は、網膜自体またはＲＰＥの退化または劣化に関連する。光受容体のレスキューおよび視覚機能の保存は、ＲＰＥ細胞の網膜下移植によって達成され得ることが、動物モデルにおいて実証された（Ｃｏｆｆｅｙら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２：５，５３−５６；Ｌｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１９９６：１５，１０６９−１０７７；Ｌｉｔｔｌｅら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．１９９６：３７，２０４−２１１；Ｓａｕｖｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２：１１４，３８９−４０１）。網膜変性疾患および網膜傷害の処置のために使用され得るＲＰＥ細胞をヒト幹細胞などから作製する方法を見出す必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｏｆｆｅｙら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２：５，５３−５６；Ｌｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１９９６：１５，１０６９−１０７７
【非特許文献２】Ｌｉｔｔｌｅら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．１９９６：３７，２０４−２１１
【非特許文献３】Ｓａｕｖｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２：１１４，３８９−４０１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
開示の要旨
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から網膜色素上皮細胞を作製するための高効率の方法が、本明細書中に開示される。ｉＰＳＣは、胎児網膜色素上皮幹細胞などの網膜色素上皮細胞を含む体細胞から作製される。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ヒト網膜色素上皮細胞を作製するための方法は、ヒト人工多能性幹細胞から胚様体を作製する工程を含む。その胚様体は、２つのＷｎｔ経路阻害剤および１つのＮｏｄａｌ経路阻害剤を含む第１の培地中で培養される。その胚様体は、第２の培地中の組織培養基材上にプレーティングされる。ある特定の実施形態において、第２の培地は、（ａ）塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含まず、（ｂ）塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）阻害剤、２つのＷｎｔ経路阻害剤および１つのＮｏｄａｌ経路阻害剤を含み；（ｃ）約２０〜約９０ｎｇのＮｏｇｇｉｎを含み；かつ（ｄ）約１〜約３％のノックアウト血清代替物を含むことにより、分化中の網膜色素上皮細胞が形成される。次いで、分化中の網膜色素上皮細胞は、ＡＣＴＩＶＡＮ  ＡおよびＷＮＴ３ａを含む第３の培地中で培養される。次いで、それらの細胞は、約５％胎児血清、カノニカルＷＮＴ阻害剤、非カノニカルＷＮＴ誘導物質ならびにＳｏｎｉｃ経路およびＦＧＦ経路の阻害剤を含む網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）培地中で培養されることにより、ヒト網膜色素上皮細胞が作製される。
【００１０】
追加の実施形態において、ＲＰＥ細胞を検出するためまたは細胞がＲＰＥ細胞であることを確かめるための方法が、開示される。なおも他の実施形態において、試験物質がｉＰＳＣからのＲＰＥ細胞の作製に影響するかを判定するための方法が、開示される。さらなる実施形態において、遺伝子発現を増加させ、治療薬として使用され得る試験物質を同定する方法が、提供される。なおも他の実施形態において、タンパク毒性傷害（ｐｒｏｔｅｏｔｏｘｉｃ  ｉｎｓｕｌｔ）またはストレスに応答してＲＰＥの生存を増加させる試験物質を同定する方法が、提供される。
【００１１】
本発明の前述および他の特徴および利点は、添付の図面を参照して進められるいくつかの実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるだろう。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒト網膜色素上皮細胞を作製するための方法であって、該方法は、
ヒト人工多能性幹細胞から胚様体を作製する工程；
２つのＷｎｔ経路阻害剤および１つのＮｏｄａｌ経路阻害剤を含む第１の培地中で該胚様体を培養する工程；
（ａ）ベータ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含まず、（ｂ）塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）阻害剤、該２つのＷｎｔ経路阻害剤および該１つのＮｏｄａｌ経路阻害剤を含み；（ｃ）約２０〜約９０ｎｇのＮｏｇｇｉｎを含み；かつ（ｄ）約１〜約３％のノックアウト血清代替物を含む第２の培地中の、マトリゲルがコーティングされた組織培養基材上に該胚様体をプレーティングすることにより、分化中の網膜色素上皮細胞を形成する工程；
ＡＣＴＩＶＡＮ  ＡおよびＷＮＴ３ａを含む第３の培地中で該分化中の網膜色素上皮細胞を培養する工程；
次いで、約５％の胎児血清、カノニカルＷＮＴ阻害剤、非カノニカルＷＮＴ誘導物質ならびにＳｏｎｉｃ経路およびＦＧＦ経路の阻害剤を含む網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞培地中で該細胞を培養する工程
を含み、それにより、ヒト網膜色素上皮細胞を作製する、方法。
（項目２）
前記Ｗｎｔ経路阻害剤のうちの１つが、Ｎ−（２−アミノエチル）−５−クロロイソキノリン−８−スルホンアミド（ＣＫ１−７）、３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（ＸＡＶ９３９）、分泌フリズルド関連タンパク質（ＳＦＲＰ）１、ＳＦＲＰ−２、ＳＦＲＰ−３、ＳＦＲＰ−４またはＳＦＲＰ−５である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第１の培地が、約３．５〜約９ｍＭのＣＫ１−７を含む、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記Ｎｏｄａｌ経路阻害剤が、４−（５−ベンゾール［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド水和物、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物、４−［４−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−５−（２−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物（ＳＢ−４３１５４２）、左右決定因子（Ｌｅｆｔｙ）または２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩水和物（ＳＢ−５０５１２４）である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記第１の培地が、約３．５〜約９ｍＭのＳＢ４３１５２を含む、項目１または項目４に記載の方法。
（項目６）
前記第１の培地が、血清の非存在下においてダルベッコ改変イーグル培地およびＦ１２を約１：１の比で含む網膜細胞誘導培地である、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
ｂＦＧＦの前記阻害剤が、Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ−［２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）尿素（ＰＤ１７３０７４）、２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン（ＰＤ９８０５９）、１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−［６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］尿素（ＰＤ１６１５７０）または６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−［２−（ジエチルアミノ）エトキシ］フェニル］アミノ］−８−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン二塩酸塩水和物（ＰＤ１６６２８５）を含む、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記第２の培地が、約０．５〜約２ｍＭのＰＤ０３２５９０１を含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記第１の培地が、約５０ｎｇ／ｍｌのＤｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ１）を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記第２の培地が、約３．５〜約９ｍＭのＣＫ１−７および約３．５〜約９ｍＭのＳＢ４３１５４２を含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記第３の培地が、約１００〜約２００ｎｇ／ｍｌのＡＣＴＩＶＩＮ  Ａを含む、項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記第３の培地が、約７５〜１５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａを含む、項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記カノニカルＷｎｔ阻害剤が、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ１）である、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記第３の培地が、約７５〜約１５０ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記非カノニカルＷｎｔ誘導物質が、ＷＮＴ５ａである、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記第４の培地が、約７５〜約１５０ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ５ａ、７５〜約１５０ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１、約５μＭシクロパミンおよび／または約１０μＭのＳＵ５４０２を含む、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
工程（ａ）が、約１．５％ノックアウト血清代替物の存在下において前記細胞を培養する工程を含む、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記基材が、トランスウェルである、項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
ヒト胎児網膜色素上皮細胞においてＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８およびＮａｎｏｇを発現させることにより、前記ヒト人工多能性幹細胞を作製する工程を含む、項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記ヒト人工多能性幹細胞が、網膜色素上皮細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されたマーカーをコードする核酸を含む、項目１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記網膜特異的プロモーターが、チロシナーゼプロモーターである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
目的の作用物質が、網膜色素上皮細胞の分化を増加させるかを判定するための方法であって、該方法は、
網膜色素上皮細胞特異的プロモーターに作動可能に連結された第１のマーカーをコードする核酸を含み、かつ構成的プロモーターに作動可能に連結された第２のマーカーを含む、ヒト人工多能性幹細胞から作製された胚様体を、２つのＷｎｔ経路阻害剤および１つのＮｏｄａｌ経路阻害剤を含む第１の培地中で培養する工程；
（ａ）ベータ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含まず、（ｂ）塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）阻害剤、該２つのＷｎｔ経路阻害剤および該１つのＮｏｄａｌ経路阻害剤を含み；かつ（ｃ）約２０〜約９０ｎｇのＮｏｇｇｉｎを含む第２の培地中の組織培養基材上に該胚様体をプレーティングすることにより、分化中の網膜色素上皮細胞を形成する工程；
ＡＣＴＩＶＡＮ  ＡおよびＷＮＴ３ａを含む第３の培地中で該分化中の網膜色素上皮細胞を培養する工程；
約５％胎児血清、カノニカルＷＮＴ阻害剤、非カノニカルＷＮＴ誘導物質ならびにＳｏｎｉｃ経路およびＦＧＦ経路の阻害剤を含む第４の網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）培地中で、該目的の作用物質の存在下において該細胞を培養し；それにより、ヒト網膜色素上皮細胞を作製する工程；および
該網膜色素上皮細胞における該第１のマーカーの発現を該第２のマーカーの発現と比べて評価する工程
を含み、ここで、該第２のマーカーと比較したときの該第１のマーカーの発現の増加は、該作用物質が、網膜色素上皮細胞の分化を増加させることを示す、方法。
（項目２３）
目的の細胞が網膜色素上皮細胞であることを立証するための方法であって、該方法は、該目的の細胞における、ＭＩＴＦ（ＮＭ＿０００２４８）、ＰＡＸ６（ＮＭ＿０００２８０）、ＬＨＸ２（ＮＭ＿００４７８９）、ＴＦＥＣ（ＮＭ＿０１２２５２）、ＣＤＨ１（ＮＭ＿００４３６０）、ＣＤＨ３（ＮＭ＿００１７９３）、ＣＬＤＮ１０（ＮＭ＿１８２８４８）、ＣＬＤＮ１６（ＮＭ＿００６５８０）、ＣＬＤＮ１９（ＮＭ＿１４８９６０）、ＢＥＳＴ１（ＮＭ＿００４１８３）、ＴＩＭＰ３（ＮＭ＿０００３６２）、ＴＲＰＭ１（ＮＭ＿００２４２０）、ＴＲＰＭ３（ＮＭ＿０２０９５２）、ＴＴＲ（ＮＭ＿０００３７１）、ＶＥＧＦＡ（ＮＭ＿００３３７６）、ＣＳＰＧ５（ＮＭ＿００６５７４）、ＤＣＴ（ＮＭ＿００１９２２）、ＴＹＲＰ１（ＮＭ＿０００５５０）、ＴＹＲ（ＮＭ＿０００３７２）、ＳＩＬＶ（ＮＭ＿００６９２８）、ＳＩＬ１（ＮＭ＿０２２４６４）、ＭＬＡＮＡ（ＮＭ＿００５５１１）、ＲＡＢ２７Ａ（ＮＭ＿１８３２３６）、ＯＣＡ２（ＮＭ＿０００２７５）、ＧＰＲ１４３（ＮＭ＿０００２７３）、ＧＰＮＭＢ（ＮＭ＿００２５１０）、ＭＹＯ６（ＮＭ＿００４９９９）、ＭＹＲＩＰ（ＮＭ＿０１５４６０）、ＲＰＥ６５（ＮＭ＿０００３２９）、ＲＢＰ１（ＮＭ＿００２８９９）、ＲＢＰ４（ＮＭ＿００６７４４）、ＲＤＨ５（ＮＭ＿００２９０５）、ＲＤＨ１１（ＮＭ＿０１６０２６）、ＲＬＢＰ１（ＮＭ＿０００３２６）、ＭＥＲＴＫ（ＮＭ＿００６３４３）、ＡＬＤＨ１Ａ３（ＮＭ＿０００６９３）、ＦＢＬＮ１（ＮＭ＿００１９９６）、ＳＬＣ１６Ａ１（ＮＭ＿００３０５１）、ＫＣＮＶ２（ＮＭ＿１３３４９７）、ＫＣＮＪ１３（ＮＭ＿００２２４２）、ＣＦＴＲ（ＮＭ＿０００４９２）を含むマーカーセットの発現をアッセイする工程；該目的の細胞におけるｍｉＲ２０４およびｍｉＲ２１１の発現をアッセイする工程；
該目的の細胞の分極をアッセイする工程；
パッチクランプ法を用いて該細胞の静止電位をアッセイする工程；および
該細胞の流体輸送速度を評価する工程
を含み、ここで、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、ＴＦＥＣ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＬＤＮ１０、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１９、ＢＥＳＴ１、ＴＩＭＰ３、ＴＲＰＭ１、ＴＲＰＭ３、ＴＴＲ、ＶＥＧＦＡ、ＣＳＰＧ５、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＴＹＲ、ＳＩＬＶ、ＳＩＬ１、ＭＬＡＮＡ、ＲＡＢ２７Ａ、ＯＣＡ２、ＧＰＲ１４３、ＧＰＮＭＢ、ＭＹＯ６、ＭＹＲＩＰ、ＲＰＥ６５、ＲＢＰ１、ＲＢＰ４、ＲＤＨ５、ＲＤＨ１１、ＲＬＢＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＦＢＬＮ１、ＳＬＣ１６Ａ１、ＫＣＮＶ２、ＫＣＮＪ１３、ＣＦＴＲの発現、ｍｉＲ２０４およびｍｉＲ２１１の発現、約−５０〜約−６０ｍＶの静止電位、ならびに約５〜約１０μｌｃｍ−２ｈ−１の流体輸送速度は、該細胞が、網膜色素上皮細胞であることを示す、方法。
（項目２４）
前記目的の細胞における、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、ＴＦＥＣ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＬＤＮ１０、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１９、ＢＥＳＴ１、ＴＩＭＰ３、ＴＲＰＭ１、ＴＲＰＭ３、ＴＴＲ、ＶＥＧＦＡ、ＣＳＰＧ５、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＴＹＲ、ＳＩＬＶ、ＳＩＬ１、ＭＬＡＮＡ、ＲＡＢ２７Ａ、ＯＣＡ２、ＧＰＲ１４３、ＧＰＮＭＢ、ＭＹＯ６、ＭＹＲＩＰ、ＲＰＥ６５、ＲＢＰ１、ＲＢＰ４、ＲＤＨ５、ＲＤＨ１１、ＲＬＢＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＦＢＬＮ１、ＳＬＣ１６Ａ１、ＫＣＮＶ２、ＫＣＮＪ１３、ＣＦＴＲの発現をアッセイする工程；
該目的の細胞におけるｍｉＲ２０４およびｍｉＲ２１１の発現をアッセイする工程；
該目的の細胞の分極をアッセイする工程；
パッチクランプ法を用いて該細胞の静止電位をアッセイする工程、および；
該細胞の流体輸送速度を評価する工程
をさらに含み、ここで、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、ＴＦＥＣ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＬＤＮ１０、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１９、ＢＥＳＴ１、ＴＩＭＰ３、ＴＲＰＭ１、ＴＲＰＭ３、ＴＴＲ、ＶＥＧＦＡ、ＣＳＰＧ５、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＴＹＲ、ＳＩＬＶ、ＳＩＬ１、ＭＬＡＮＡ、ＲＡＢ２７Ａ、ＯＣＡ２、ＧＰＲ１４３、ＧＰＮＭＢ、ＭＹＯ６、ＭＹＲＩＰ、ＲＰＥ６５、ＲＢＰ１、ＲＢＰ４、ＲＤＨ５、ＲＤＨ１１、ＲＬＢＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＦＢＬＮ１、ＳＬＣ１６Ａ１、ＫＣＮＶ２、ＫＣＮＪ１３、ＣＦＴＲの発現、ｍｉＲ２０４およびｍｉＲ２１１の発現、約−５０〜約−６０ｍＶの静止電位ならびに約５〜約１０μｌｃｍ−２ｈ−１の流体輸送速度は、該細胞が、網膜色素上皮細胞であることを示す、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記胚様体が、前記第１の培地中で約４８時間培養される、項目１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記胚様体が、前記第２の培地中で約１８〜約２４日間培養される、項目１〜２１または２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記胚様体が、前記第２の培地中で約３週間培養される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記分化中の網膜色素上皮細胞が、前記第３の培地中で約１８〜約２４日間、項目１〜２１または２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記分化中の網膜色素上皮細胞が、前記第３の培地中で約３週間、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記細胞が、前記網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）培地中で約１２〜約１６日間培養される、項目１〜２１または２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記細胞が、前記網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）培地中で約２週間培養される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記網膜色素上皮細胞を、約５％胎児血清を含む網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）培地中で維持する工程をさらに含む、項目１〜２１または２５〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞が、約５％胎児血清を含む網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）培地中で前記網膜色素上皮細胞を約６〜約８週間維持する工程を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
発現をアッセイする工程が、マルチプレックスアッセイの使用を含む、項目２３または２４に記載の方法。
（項目３５）
項目１〜２１または２５〜３４のいずれか１項に記載の方法によって作製された網膜色素上皮細胞。
（項目３６）
前記細胞が、ヒト細胞である、項目３５に記載の網膜色素上皮細胞。
（項目３７）
有効量の項目３５または項目３６に記載の網膜色素上皮細胞を含む薬学的組成物。
（項目３８）
医薬を製造するための、項目３７に記載の組成物。
（項目３９）
網膜変性疾患、網膜機能不全、網膜退化、網膜損傷または網膜色素上皮の喪失を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、治療有効量の項目３７に記載の薬学的組成物を該被験体に投与し、それにより、該被験体を処置する工程を含む、方法。
（項目４０）
前記網膜変性疾患が、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、緑内障、糖尿病性網膜症、レーバー先天性黒内障、後天性黄斑変性、遺伝性（ｈｅｒｉｄｉｔａｒｙ）黄斑変性、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮、コロイデレミア、パターンジストロフィーである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記網膜損傷が、レーザー傷害、炎症性傷害、感染性傷害、放射線傷害、新生血管傷害または外傷性傷害によって引き起こされる、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
前記網膜色素上皮細胞が、眼の網膜下腔、硝子体腔、網膜の内側もしくは外側、網膜周辺部または脈絡膜内に導入される、項目３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
前記網膜色素上皮細胞が、細胞懸濁物の形態で標的部位に導入される、項目３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
前記網膜色素上皮細胞が、細胞外マトリックス上に接着されている、項目３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４５）
前記網膜色素上皮細胞が、生分解性ポリマーなどの基材上に提供されている、項目３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、マーカー（例えば、赤色蛍光タンパク質，ＲＦＰ）に作動可能に連結された構成的プロモーターおよび第２のマーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質，ＧＦＰ）に作動可能に連結されたＲＰＥ特異的チロシナーゼプロモーターを含むＲＰＥ特異的構築物の模式図である。得られた結果のデジタル画像も示されている。ＲＰＥ特異的プロモーター／エンハンサー−ＧＦＰ構築物を、まず、トランスジェニックマウスにおいて試験した。ＲＰＥ特異的なＧＦＰ発現（左の画像）が得られた。次いで、この構築物を、構成的ＲＦＰと組み合わせ、ｉＰＳＣに形質導入した。ｉＰＳＣの段階では、ＲＦＰだけが発現される（右の画像）。この構築物は、ＲＰＥ特異的ＧＦＰを発現するｉＰＳＣ株を作製するために使用することができる。
【００１３】
【図２】図２は、ヒトｉＰＳＣからのＲＰＥの分化における工程の模式図である。他の系列を阻害しつつ、高効率でＲＰＥ細胞が得られるように、このプロトコルを最適化した。種々のステージ用のマーカーが示されている。
【００１４】
【図３】図３は、レポーターｉＰＳＣ株におけるＲＰＥ特異的ＧＦＰ発現の模式図およびデジタル画像である。ＧＦＰ陽性細胞は、細胞が、運命拘束された（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）ＲＰＥのステージ（分化開始の４週間後に始まる）に達したときに出現する。ＧＦＰ陽性細胞は、上皮の形質を獲得し、もう１週間で色が着き始める。培養の２８および３５日後のレポーターの発現が示されている。
【００１５】
【図４】図４は、ＦＡＣＳで精製されたＧＦＰ陽性細胞からの結果の表であり、それらの細胞が、初期ＲＰＥ遺伝子の発現が高められていることを示している。同じディッシュからのＧＦＰ陽性細胞および陰性細胞を、ＦＡＣＳによって精製し、ＲＰＥ特異的マーカーの発現を２つの集団において比較した。ＧＦＰ陽性細胞は、ＲＰＥ特異的遺伝子の発現が数倍高められている。
【００１６】
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、ＦＡＣＳで精製されたＧＦＰ陽性細胞が、有色素の（ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ）ＲＰＥ細胞に分化することを示しているデジタル画像のセットである。ＦＡＣＳで精製されたＧＦＰ陽性および陰性細胞を、培養プレート上に再度播種したとき、ＧＦＰ陽性細胞だけが成長して、均一な有色素培養物を形成した。これにより、ＧＦＰの発現が、このｉＰＳＣ株におけるＲＰＥの運命を真に表すことが実証された。
【００１７】
【図６】図６は、胚様体（ＥＢ）のサイズがＲＰＥの分化に影響することを示しているデジタル画像のセットである。様々なサイズのＥＢを使用して得られた有色素細胞の数の差異が示されている。
【００１８】
【図７】図７は、胚様体（ＥＢ）の数がＲＰＥ分化に影響することを示しているデジタル画像のセットである。ＦＡＣＳ解析は、分化プロセスの第６週のＧＦＰ陽性細胞の数を示している。培養プレートの１ウェルあたりにプレーティングされるＥＢの数が変化すると、ＧＦＰ陽性細胞の数も変化する。
【００１９】
【図８】図８〜１０は、種々の培養条件でのＰＡＸ６発現の変化倍率を示している表である。
【００２０】
【図９】図８〜１０は、種々の培養条件でのＰＡＸ６発現の変化倍率を示している表である。
【００２１】
【図１０】図８〜１０は、種々の培養条件でのＰＡＸ６発現の変化倍率を示している表である。
【００２２】
【図１１】図１１〜１３は、種々の培養条件を使用したときのＭＩＴＦ発現の変化倍率を示している表である。ＭＩＴＦの発現は、細胞が眼胞期に入る、分化の３週目あたりで増加し始めるはずである。
【００２３】
【図１２】図１１〜１３は、種々の培養条件を使用したときのＭＩＴＦ発現の変化倍率を示している表である。ＭＩＴＦの発現は、細胞が眼胞期に入る、分化の３週目あたりで増加し始めるはずである。
【００２４】
【図１３】図１１〜１３は、種々の培養条件を使用したときのＭＩＴＦ発現の変化倍率を示している表である。ＭＩＴＦの発現は、細胞が眼胞期に入る、分化の３週目あたりで増加し始めるはずである。
【００２５】
【図１４】図１４は、種々の培養条件を使用したときのパーセントＧＦＰ陽性細胞（ＲＰＥ運命の細胞に相当する）を示している表である。
【００２６】
【図１５】図１５は、ｉＰＳＣからＲＰＥへの分化を示しているデジタル画像のセットである。細胞を、実施例１に列挙される培地およびプロトコルを使用して培養した。これらの研究の場合、ＫＯ血清が、変動させた唯一の構成要素だった。
【００２７】
【図１６】図１６は、カノニカルＷＮＴおよびＷＮＴ３ａが、ｉＰＳＣからのＲＰＥの作製効率を改善することを示しているデジタル画像のセットである。ＷＮＴ３Ａは、カノニカルＷＮＴシグナル伝達制御因子である。これらのデジタル画像は、培養の８週間後の各ディッシュにおける有色素コロニーを示している。これらの実験の場合、培地２（ＦＧＦ２−０．５ｎｇ／ｍｌ）＋培地３（ＮＡまたはＮＡＷ）（ここで、ＮＡ＝ニコチンアミドおよびＡＣＴＩＶＩＮ、ＮＡＷ＝ニコチンアミド、ＡＣＴＩＶＩＮおよびＷＮＴ３ａ）。ｂＦＧＦ（ＦＧＦ２）を、０．５ｎｇ／ｍｌで培地２に含めた。
【００２８】
【図１７】図１７は、ＷＮＴ３ａが、分化中のｉＰＳＣ培養物におけるＧＦＰ陽性細胞の数を有意に増加させることを示しているデジタル画像およびプロットのセットである。上のパネルは、あるディッシュにおけるＧＦＰ陽性およびＲＦＰ陽性細胞を示している。下のパネルは、ＧＦＰシグナルについてのＦＡＣＳ解析を示している。これらの実験の場合、培地２（ＦＧＦ２−０．５ｎｇ／ｍｌ）＋培地３（ＮＡまたはＮＡＷ）（ここで、ＮＡ＝ニコチンアミドおよびＡＣＴＩＶＩＮ、ＮＡＷ＝ニコチンアミド、ＡＣＴＩＶＩＮおよびＷＮＴ３ａ）。
【００２９】
【図１８】図１８は、ＲＰＥ分化にｉＰＳＣを最適化するためのＧＦＰレポーターの使用を示しているデジタル画像およびプロットのセットである。ＧＦＰ発現および色素の産生によって証明されるように、第３の培地における培養は、６週間後にＲＰＥ細胞の作製を有意に改善した。培地２−ＦＧＦ２なし＋ＰＤ０３２５９０１（１０ｍＭ）＋Ｎｏｇｇｉｎ（５０ｎｇ／ｕｌ）＋ＤＫＫ１。培地３−Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ（１５０ｎｇ／ｍｌ）＋ＷＮＴ３ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）。培地４−下記の実施例の項を参照のこと。
【００３０】
【図１９】図１９は、ＷＮＴ３ａが、均一な色素沈着を有するＲＰＥ細胞をもたらすことを示しているデジタル画像である。これらのディッシュからの細胞をトリプシン処理し、Ｔ−２５フラスコに再度プレーティングした。これらの実験の場合、培地２（ＦＧＦ２−０．５ｎｇ／ｍｌ）＋培地３（ＮＡまたはＮＡＷ）（ここで、ＮＡ＝ニコチンアミドおよびＡＣＴＩＶＩＮ、ＮＡＷ＝ニコチンアミド、ＡＣＴＩＶＩＮおよびＷＮＴ３ａ］。
【００３１】
【図２０】図２０は、ＮＡＷで処理された、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥのデジタル画像である（９２％ＧＦＰ陽性）。より高い解像度では、これらの細胞は、ＲＰＥの形態、ＧＦＰ発現および色素沈着に関して、かなり均一に見える。
【００３２】
【図２１】図２１は、ｉＰＳＣ−ＲＰＥにおける内在性経路（ＷＮＴ、ＦＧＦ、ＳＯＮＩＣ）の阻害が、完全に成熟したＲＰＥ培養物をもたらすことを示している表である。培地＃４−５％ＲＰＥ培地＋ＷＮＴ、ＦＧＦ、ＳＯＮＩＣの阻害剤。ＷＮＴ阻害剤には、ＤＫＫ１および非カノニカルＷＮＴ（ＷＮＴ５ａ）、ＦＧＦ阻害剤ＳＵ５０４２およびＳＯＮＩＣ阻害剤シクロパミンが含まれる。
【００３３】
【図２２】図２２は、ＲＰＥ遺伝子発現がｉＰＳＣ−ＲＰＥであることを図示しているグラフおよびベン図のセットである。合計３８４個の遺伝子の発現を評価した（Ｓｔｒｕｎｎｉｋｏｖａら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２０１０  Ｊｕｎ  １５；１９（１２）：２４６８−８６）。上位３５０個の遺伝子（ｇｅｎｅｓｅ）を選択した；３４個の遺伝子は、コントロールだった。これらのすべての遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲによって解析するために、カスタム３８４ウェルプレートを開発した。このプレート／アレイは、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞を立証するために使用され得る。それらには、ＲＰＥ遺伝子シグネチャ、胎児ＲＰＥに豊富な遺伝子および成体ＲＰＥに豊富な遺伝子が含まれる。３つのｉＰＳＣ株由来ＲＰＥの間における約１００個の胎児ＲＰＥに豊富な遺伝子の比較が示されている。
【００３４】
【図２３】図２３は、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥの生理機能を証明している模式図およびグラフである。ＲＰＥ細胞の頂端表面の選択的なＣＯ２透過性は、示されている（Ａｄｉｊａｎｔｏら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００９  Ｊｕｎ；１３３（６）：６０３−２２）。光受容体は、ＲＰＥ細胞の頂端表面に向かってＣＯ２を分泌する。ゆえに、この表面は、進化的に、ＣＯ２を捕捉するように選択されてきた。この機能は、トランスウェルにおいて生育されているＲＰＥ細胞の頂端バスまたは基底バス内のＣＯ２濃度を変化させることによって、インビトロで計測され得る。ＲＰＥ細胞が、ＣＯ２を捕捉する場合、それらは、ｐＨの低下によって応答し、それは、レシオメトリック（ｒａｔｉｏ−ｍｅｔｒｉｃ）色素によって計測され得る。頂端側だけにおける差次的なＣＯ２取り込みに対する天然のＲＰＥと同様のｉＰＳＣ由来ＲＰＥの機能。
【００３５】
【図２４】図２４は、細胞外のイオン濃度の変化による、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞の電気生理学的特性の変化を示しているグラフのセットである。光が光受容体にあたると、それらは、カリウム（Ｋ）チャネルを閉鎖することによって脱分極する。これにより、光受容体とＲＰＥとの間（網膜下腔）のＫイオンの濃度が５ｍＭから１ｍＭに低下する。ＲＰＥ細胞は、過分極し、Ｋチャネルを開けることにより、網膜下のＫ濃度を５ｍＭに再上昇させることによって、この濃度の変化に応答する。
【００３６】
【図２５−１】図２５Ａ〜２５Ｄは、模式図、デジタル画像およびグラフである。（Ａ）ＲＰＥへのｉＰＳＣの分化、ＲＰＥ細胞の立証およびマルチプレックススクリーニングへのそれらの使用についての段階的なプロトコルの概略図。このプロセス全体にわたって使用される異なるタイプの培地およびプロセスのタイムラインが示されている。（Ｂ）スクリーニング用のＲＰＥを作製するために使用されたｉＰＳＣ株の特徴付け。完全にコンフルエントなｉＰＳＣを、示されている多能性マーカーに対する抗体で染色した。細胞は、これらの全マーカーを高レベルで発現している。明視野像は、ｉＰＳＣコロニーの形態を示している。（Ｃ）ＲＰＥ分化用に使用されたｉＰＳＣ株における多能性マーカーＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣおよびＫＬＦ４のｑＲＴ−ＰＣＲ解析。線維芽細胞および胚性幹細胞のＲＮＡを比較のために使用している。（Ｄ）ｂＦＧＦ中止後にインビトロにおいて自発的に分化したｉＰＳＣの免疫染色。ｉＰＳＣは、３つの胚葉（ＡＦＰ＝内胚葉；ＴＵＪ１＝外胚葉；ＳＭＡ＝中胚葉）の細胞を作製することができる。バーは、５０ミクロンを表す。ＫＳＲ−ノックアウト血清代替物含有培地、ＮＩＣ−ニコチンアミド。
【００３７】
【図２５−２】図２５Ａ〜２５Ｄは、模式図、デジタル画像およびグラフである。（Ａ）ＲＰＥへのｉＰＳＣの分化、ＲＰＥ細胞の立証およびマルチプレックススクリーニングへのそれらの使用についての段階的なプロトコルの概略図。このプロセス全体にわたって使用される異なるタイプの培地およびプロセスのタイムラインが示されている。（Ｂ）スクリーニング用のＲＰＥを作製するために使用されたｉＰＳＣ株の特徴付け。完全にコンフルエントなｉＰＳＣを、示されている多能性マーカーに対する抗体で染色した。細胞は、これらの全マーカーを高レベルで発現している。明視野像は、ｉＰＳＣコロニーの形態を示している。（Ｃ）ＲＰＥ分化用に使用されたｉＰＳＣ株における多能性マーカーＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣおよびＫＬＦ４のｑＲＴ−ＰＣＲ解析。線維芽細胞および胚性幹細胞のＲＮＡを比較のために使用している。（Ｄ）ｂＦＧＦ中止後にインビトロにおいて自発的に分化したｉＰＳＣの免疫染色。ｉＰＳＣは、３つの胚葉（ＡＦＰ＝内胚葉；ＴＵＪ１＝外胚葉；ＳＭＡ＝中胚葉）の細胞を作製することができる。バーは、５０ミクロンを表す。ＫＳＲ−ノックアウト血清代替物含有培地、ＮＩＣ−ニコチンアミド。
【００３８】
【図２６−１】図２６Ａ〜２６Ｄは、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥの立証を示している。ＲＰＥ細胞を、完全にコンフルエントになるまで半透性トランスウェル上で生育し、ＲＰＥマーカーに対する免疫染色（Ａ）、電子顕微鏡法（Ｂ）、細胞内カルシウム応答（Ｃ）、電気生理学的反応（Ｄ）によって特徴付けた。（Ａ）ＲＰＥ細胞を、ＥＺＲＩＮ、ＤＣＴ、ＳＬＣ１６Ａ１、ＣＬＣＮ２（灰色）およびＺＯ１（明るい線）に対する抗体で染色した。（Ｂ）半透性トランスウェル上で生育されているＲＰＥの切片の電子顕微鏡写真。細胞は、広範な頂端突起、頂端に局在化した有色素メラノソーム（ｍｅ）および隣接した細胞間のタイトジャンクション（ｔｊ）を含む、ＲＰＥに典型的ないくつかの特徴を示している。（Ｃ）初代胎児ＲＰＥ細胞と同様に、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥは、１１０ｎＭというベースラインカルシウム濃度を示す。頂端バスにＡＴＰを加えることにより、頂端Ｐ２Ｙ２レセプターが活性化し、細胞内カルシウム濃度が急上昇する。（Ｄ）頂端バス内のカリウム（Ｋ）濃度およびＡＴＰ濃度の変化に応答した頂端膜および基底膜の静止電位を計測した。ヒトＲＰＥの初代培養物と同様に、これらの細胞は、Ｋ濃度が１ｍＭまで低下すると過分極し、ＡＴＰが頂端バスに加えられると脱分極する。
【００３９】
【図２６−２】図２６Ａ〜２６Ｄは、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥの立証を示している。ＲＰＥ細胞を、完全にコンフルエントになるまで半透性トランスウェル上で生育し、ＲＰＥマーカーに対する免疫染色（Ａ）、電子顕微鏡法（Ｂ）、細胞内カルシウム応答（Ｃ）、電気生理学的反応（Ｄ）によって特徴付けた。（Ａ）ＲＰＥ細胞を、ＥＺＲＩＮ、ＤＣＴ、ＳＬＣ１６Ａ１、ＣＬＣＮ２（灰色）およびＺＯ１（明るい線）に対する抗体で染色した。（Ｂ）半透性トランスウェル上で生育されているＲＰＥの切片の電子顕微鏡写真。細胞は、広範な頂端突起、頂端に局在化した有色素メラノソーム（ｍｅ）および隣接した細胞間のタイトジャンクション（ｔｊ）を含む、ＲＰＥに典型的ないくつかの特徴を示している。（Ｃ）初代胎児ＲＰＥ細胞と同様に、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥは、１１０ｎＭというベースラインカルシウム濃度を示す。頂端バスにＡＴＰを加えることにより、頂端Ｐ２Ｙ２レセプターが活性化し、細胞内カルシウム濃度が急上昇する。（Ｄ）頂端バス内のカリウム（Ｋ）濃度およびＡＴＰ濃度の変化に応答した頂端膜および基底膜の静止電位を計測した。ヒトＲＰＥの初代培養物と同様に、これらの細胞は、Ｋ濃度が１ｍＭまで低下すると過分極し、ＡＴＰが頂端バスに加えられると脱分極する。
【００４０】
【図２７−１】図２７Ａ〜２７Ｃは、９６／３８４ウェルプレート形式において行われるマルチプレックスアッセイの概略図を示している。（Ａ）ｉＰＳＣ由来ＲＰＥを使用して行われたマルチプレックスアッセイについての簡単な要旨およびタイムライン。アッセイは、完全な自動化によって、１日半で行われ得る。（Ｂ）ユニークなフルオロフォアで標識された磁気ビーズは、捕捉プローブ（ＣＰ）と複数の捕捉エクステンダー（ＣＥ）とのアンチセンスオリゴヌクレオチド相互作用によって、特異的なｍＲＮＡを捕捉する。ＣＥは、分枝状のオリゴヌクレオチドであり；それの一方の側は、ＣＰに対してアンチセンスであり、他方の側は、特異的なｍＲＮＡに対してアンチセンスである可変配列を有する。標識エクステンダー（ＬＥ）もまた、ｍＲＮＡの異なる領域に結合して、アンチセンス相互作用によるプレアンプリファイア（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）オリゴおよびアンプリファイア（ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）オリゴの結合を可能にする、分枝状のオリゴヌクレオチドである。ビオチン含有標識プローブおよびストレプトアビジン結合体化フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）は、アンプリファイアオリゴに結合し、Ｌｕｍｉｎｅｘフローリーダーを使用して検出される。（Ｃ）表は、このアッセイにおいて検出されたｍＲＮＡ、それらのアクセッション番号、長さ、ならびに捕捉エクステンダーおよび標識エクステンダーが結合する領域を要約している。
【００４１】
【図２７−２】図２７Ａ〜２７Ｃは、９６／３８４ウェルプレート形式において行われるマルチプレックスアッセイの概略図を示している。（Ａ）ｉＰＳＣ由来ＲＰＥを使用して行われたマルチプレックスアッセイについての簡単な要旨およびタイムライン。アッセイは、完全な自動化によって、１日半で行われ得る。（Ｂ）ユニークなフルオロフォアで標識された磁気ビーズは、捕捉プローブ（ＣＰ）と複数の捕捉エクステンダー（ＣＥ）とのアンチセンスオリゴヌクレオチド相互作用によって、特異的なｍＲＮＡを捕捉する。ＣＥは、分枝状のオリゴヌクレオチドであり；それの一方の側は、ＣＰに対してアンチセンスであり、他方の側は、特異的なｍＲＮＡに対してアンチセンスである可変配列を有する。標識エクステンダー（ＬＥ）もまた、ｍＲＮＡの異なる領域に結合して、アンチセンス相互作用によるプレアンプリファイア（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）オリゴおよびアンプリファイア（ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）オリゴの結合を可能にする、分枝状のオリゴヌクレオチドである。ビオチン含有標識プローブおよびストレプトアビジン結合体化フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）は、アンプリファイアオリゴに結合し、Ｌｕｍｉｎｅｘフローリーダーを使用して検出される。（Ｃ）表は、このアッセイにおいて検出されたｍＲＮＡ、それらのアクセッション番号、長さ、ならびに捕捉エクステンダーおよび標識エクステンダーが結合する領域を要約している。
【００４２】
【図２８−１】図２８Ａ〜２８Ｇは、９６ウェルプレートにおけるマルチプレックス遺伝子発現アッセイに対する原理証明を示している。（Ａ〜Ｄ）９６ウェルプレートにおいて生育されたｉＰＳＣおよびＲＰＥ細胞の明視野像。（Ａ）ｉＰＳＣ。（２８Ｂ、Ｃ）２つの異なる細胞密度（２５，０００細胞／ウェルおよび５０，０００細胞／ウェル）で播種されたｉＰＳＣ由来ＲＰＥ。（Ｄ）初代ヒト胎児ＲＰＥ（５０，０００細胞／ウェル）。（Ｅ〜Ｈ）マルチプレックスアッセイにおいて得られた結果。（Ｅ、Ｇ）示されている遺伝子の発現を、ＨＰＲＴ１およびＢ２Ｍ遺伝子の幾何平均（ｇｅｏｍｅａｎ）に対して正規化した。結果は、未分化なｉＰＳＣ（２８Ｅ）または初代胎児ＲＰＥ（Ｇ）のいずれかに対して正規化された、より低い細胞密度で播種された（白色バー）およびより高い細胞密度で播種された（黒色バー）ｉＰＳＣ由来ＲＰＥにおける遺伝子発現の変化倍率として示されている。（Ｆ、Ｈ）ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイから得られた遺伝子発現の結果と、９６ウェルプレートにおいて行われたマルチプレックス遺伝子発現アッセイから得られた結果との間のピアソン相関分析。この相関関係は、ｉＰＳＣに対して有意であり（ｒ＝０．６８７）、初代ＲＰＥ細胞に対して高度に有意である（ｒ＝０．７５１）。
【００４３】
【図２８−２】図２８Ａ〜２８Ｇは、９６ウェルプレートにおけるマルチプレックス遺伝子発現アッセイに対する原理証明を示している。（Ａ〜Ｄ）９６ウェルプレートにおいて生育されたｉＰＳＣおよびＲＰＥ細胞の明視野像。（Ａ）ｉＰＳＣ。（２８Ｂ、Ｃ）２つの異なる細胞密度（２５，０００細胞／ウェルおよび５０，０００細胞／ウェル）で播種されたｉＰＳＣ由来ＲＰＥ。（Ｄ）初代ヒト胎児ＲＰＥ（５０，０００細胞／ウェル）。（Ｅ〜Ｈ）マルチプレックスアッセイにおいて得られた結果。（Ｅ、Ｇ）示されている遺伝子の発現を、ＨＰＲＴ１およびＢ２Ｍ遺伝子の幾何平均（ｇｅｏｍｅａｎ）に対して正規化した。結果は、未分化なｉＰＳＣ（２８Ｅ）または初代胎児ＲＰＥ（Ｇ）のいずれかに対して正規化された、より低い細胞密度で播種された（白色バー）およびより高い細胞密度で播種された（黒色バー）ｉＰＳＣ由来ＲＰＥにおける遺伝子発現の変化倍率として示されている。（Ｆ、Ｈ）ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイから得られた遺伝子発現の結果と、９６ウェルプレートにおいて行われたマルチプレックス遺伝子発現アッセイから得られた結果との間のピアソン相関分析。この相関関係は、ｉＰＳＣに対して有意であり（ｒ＝０．６８７）、初代ＲＰＥ細胞に対して高度に有意である（ｒ＝０．７５１）。
【００４４】
【図２８−３】図２８Ａ〜２８Ｇは、９６ウェルプレートにおけるマルチプレックス遺伝子発現アッセイに対する原理証明を示している。（Ａ〜Ｄ）９６ウェルプレートにおいて生育されたｉＰＳＣおよびＲＰＥ細胞の明視野像。（Ａ）ｉＰＳＣ。（２８Ｂ、Ｃ）２つの異なる細胞密度（２５，０００細胞／ウェルおよび５０，０００細胞／ウェル）で播種されたｉＰＳＣ由来ＲＰＥ。（Ｄ）初代ヒト胎児ＲＰＥ（５０，０００細胞／ウェル）。（Ｅ〜Ｈ）マルチプレックスアッセイにおいて得られた結果。（Ｅ、Ｇ）示されている遺伝子の発現を、ＨＰＲＴ１およびＢ２Ｍ遺伝子の幾何平均（ｇｅｏｍｅａｎ）に対して正規化した。結果は、未分化なｉＰＳＣ（２８Ｅ）または初代胎児ＲＰＥ（Ｇ）のいずれかに対して正規化された、より低い細胞密度で播種された（白色バー）およびより高い細胞密度で播種された（黒色バー）ｉＰＳＣ由来ＲＰＥにおける遺伝子発現の変化倍率として示されている。（Ｆ、Ｈ）ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイから得られた遺伝子発現の結果と、９６ウェルプレートにおいて行われたマルチプレックス遺伝子発現アッセイから得られた結果との間のピアソン相関分析。この相関関係は、ｉＰＳＣに対して有意であり（ｒ＝０．６８７）、初代ＲＰＥ細胞に対して高度に有意である（ｒ＝０．７５１）。
【００４５】
【図２９】図２９は、様々なタンパク毒性ストレッサーに対するｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞の感度を示している棒グラフである。レポーターｉＰＳ細胞株から分化したＲＰＥ細胞を、３８４ウェルプレート内で生育し、示されているストレッサー（濃度１０μＭ）で処理した。処理の４日後にＧＲＰシグナルを計測した。サプシガルジン、Ａ２３１８７および２−デオキシ−Ｄ−グルコースは、ＲＰＥ表現型に影響した。
【００４６】
【図３０】図３０は、アフィディコリン処理によって、極性のある網膜色素上皮細胞がもたらされることを示しているデジタル画像である。アフィディコリン処理で処理された網膜色素上皮細胞は、未処理細胞と比べて、より広範な頂端突起を有する。
【００４７】
【図３１】図３１は、アフィディコリン処理によって、ｉＰＳＣ由来の網膜色素上皮細胞の機能が改善されることを示しているグラフのセットである。アフィディコリンで処理されたＲＰＥ細胞は、より高い経上皮抵抗、膜電位を有し、低カリウム濃度または頂端側へのＡＴＰ適用に応答して過分極する能力などのより良い生理反応を示す。
【００４８】
【図３２】図３２Ａ〜３２Ｄは、アルギネートコーティングが、凍結保存中の細胞生存率を高め、細胞剥離を減少させることを示しているデジタル画像である。エチジウムホモダイマー−１染色（灰色）によって細胞死を評価した。（Ａ）ＣＲＹＯＳＴＯＲ（登録商標）ＣＳ１０溶液を使用して、アルギネート処理なしで凍結保存された単層。（Ｂ）ＣＲＹＯＳＴＯＲ（登録商標）ＣＳ１０溶液を使用して、アルギネートコーティングを用いて凍結保存された単層。（Ｃ）１０％ＤＭＳＯ培地を使用して、アルギネートコーティングなしで凍結保存された単層。（Ｄ）１０％ＤＭＳＯ培地を使用して、アルギネートコーティングを用いて凍結保存された単層。
【００４９】
【図３３】図３３Ａ〜３３Ｅは、ＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）システムを使用して、人工的な生分解性足場上でｉＰＳＣ由来ＲＰＥを生育するためのプロトコルを示しているデジタル画像のセットである。
【００５０】
【図３４】図３４Ａ〜３４Ｂは、分化プロトコルの最初の３週間にわたって、ＲＤＭにおける１０％（Ａ）または１．５％ＫＯＳＲ中でｉＰＳＣを培養した後の色素沈着を示している、培養の１６週間後に写真撮影されたデジタル画像である。
【００５１】
【図３５−１】図３５Ａ〜３５Ｇは、３８４ウェルプレートにおけるマルチプレックス遺伝子発現アッセイに対する原理証明を示している。３８４ウェルプレートにおいて生育された、２つの異なる細胞密度で播種されたｉＰＳＣ由来ＲＰＥ（Ａ、Ｂ）およびヒト胎児ＲＰＥ（Ｃ、Ｄ）の明視野像。（Ｅ、Ｇ）初代胎児ＲＰＥのより高い細胞密度に対して正規化された、より低い細胞密度で播種された（白色バー）およびより高い細胞密度で播種された（黒色バー）ｉＰＳＣ由来ＲＰＥにおける遺伝子発現の変化倍率。示されている遺伝子の発現をＨＰＲＴ１およびＢ２Ｍハウスキーピング遺伝子の幾何平均に対して正規化した。多いビーズ数（Ｅ）を用いたときと少ないビーズ数（Ｇ）を用いたときで、ほぼ同一の結果が得られた。ピアソン相関分析は、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイから得られた結果と３８４ウェルマルチプレックス遺伝子発現アッセイから得られた結果との間に非常に高い相関関係を示す。係数の値は、異なるビーズ数に対してそれぞれｒ＝０．９０８およびｒ＝０．８９１である。
【００５２】
【図３５−２】図３５Ａ〜３５Ｇは、３８４ウェルプレートにおけるマルチプレックス遺伝子発現アッセイに対する原理証明を示している。３８４ウェルプレートにおいて生育された、２つの異なる細胞密度で播種されたｉＰＳＣ由来ＲＰＥ（Ａ、Ｂ）およびヒト胎児ＲＰＥ（Ｃ、Ｄ）の明視野像。（Ｅ、Ｇ）初代胎児ＲＰＥのより高い細胞密度に対して正規化された、より低い細胞密度で播種された（白色バー）およびより高い細胞密度で播種された（黒色バー）ｉＰＳＣ由来ＲＰＥにおける遺伝子発現の変化倍率。示されている遺伝子の発現をＨＰＲＴ１およびＢ２Ｍハウスキーピング遺伝子の幾何平均に対して正規化した。多いビーズ数（Ｅ）を用いたときと少ないビーズ数（Ｇ）を用いたときで、ほぼ同一の結果が得られた。ピアソン相関分析は、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイから得られた結果と３８４ウェルマルチプレックス遺伝子発現アッセイから得られた結果との間に非常に高い相関関係を示す。係数の値は、異なるビーズ数に対してそれぞれｒ＝０．９０８およびｒ＝０．８９１である。
【００５３】
【図３５−３】図３５Ａ〜３５Ｇは、３８４ウェルプレートにおけるマルチプレックス遺伝子発現アッセイに対する原理証明を示している。３８４ウェルプレートにおいて生育された、２つの異なる細胞密度で播種されたｉＰＳＣ由来ＲＰＥ（Ａ、Ｂ）およびヒト胎児ＲＰＥ（Ｃ、Ｄ）の明視野像。（Ｅ、Ｇ）初代胎児ＲＰＥのより高い細胞密度に対して正規化された、より低い細胞密度で播種された（白色バー）およびより高い細胞密度で播種された（黒色バー）ｉＰＳＣ由来ＲＰＥにおける遺伝子発現の変化倍率。示されている遺伝子の発現をＨＰＲＴ１およびＢ２Ｍハウスキーピング遺伝子の幾何平均に対して正規化した。多いビーズ数（Ｅ）を用いたときと少ないビーズ数（Ｇ）を用いたときで、ほぼ同一の結果が得られた。ピアソン相関分析は、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイから得られた結果と３８４ウェルマルチプレックス遺伝子発現アッセイから得られた結果との間に非常に高い相関関係を示す。係数の値は、異なるビーズ数に対してそれぞれｒ＝０．９０８およびｒ＝０．８９１である。
【００５４】
【図３６】図３６Ａ〜３６Ｆは、マルチプレックスアッセイのために使用されたプローブの検出範囲を示している。（Ａ）精製されたヒトＲＰＥ、（Ｂ）ｉＰＳＣ、（Ｃ）ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ（低密度）、（Ｄ）ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ（高密度）、（Ｅ）初代胎児ＲＰＥ（低密度）および（Ｆ）初代胎児ＲＰＥ（高密度）の４倍段階希釈を使用して、マルチプレックスアッセイのために使用されたプローブセットの検出範囲を測定した。各プローブに対するＲ２値は、０．９より高かったことから、溶解産物の１６倍希釈にわたって線形の検出範囲が示唆される。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
配列
核酸配列およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されているように、ヌクレオチド塩基に対しては標準的な文字省略形、およびアミノ酸に対しては１文字または３文字コードを用いて示される。各核酸配列の一方の鎖だけが示されるが、表示されている鎖に対する任意の言及によって相補鎖も含められると理解される。
【００５６】
配列番号１は、例示的なヒトチロシナーゼエンハンサーの核酸配列である。
【００５７】
配列番号２は、例示的なプロモーター配列である。
いくつかの実施形態の詳細な説明
【００５８】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から網膜色素上皮細胞を作製するための高効率の方法が、本明細書中に開示される。それらのｉＰＳＣは、胎児網膜色素上皮幹細胞などの網膜色素上皮細胞を含む体細胞から作製される。いくつかの実施形態において、それらの細胞は、ヒトの細胞である。
【００５９】
本明細書中に開示される方法は、スクリーニングアッセイにおいて使用するための多数の分化したＲＰＥ細胞を作製するため、ＲＰＥの基礎生物学を研究するため、および治療薬として研究するために、使用される。それらのＲＰＥ細胞は、マーカーをコードする核酸に作動可能に連結されたチロシナーゼエンハンサーを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される方法を用いて作製されたＲＰＥ細胞は、網膜変性疾患を処置するために製剤化および使用され得る。したがって、ＲＰＥ細胞の実質的に精製された調製物を含むＲＰＥ細胞を含む組成物が、開示される。ＲＰＥ細胞の増殖を調節する作用物質および／またはＲＰＥ細胞の分化を変化させる作用物質を同定するためのスクリーニングアッセイもまた、開示される。そのようなスクリーニングアッセイを用いて同定された作用物質は、インビトロまたはインビボで使用され得る。
【００６０】
用語
別段述べられない限り、専門用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学における通常の用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓにより出版された、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，１９９４（ＩＳＢＮ０−１９−８５４２８７−９）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．により出版された、Ｋｅｎｄｒｅｗら（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）；およびＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により出版された、Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，１９９５（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）に見られることがある。
【００６１】
本開示の様々な実施形態の概説を容易にするために、特定の用語の以下の説明を提供する：
【００６２】
Ａｃｔｉｖｉｎ：細胞の分化および増殖を含むいくつかの生物学的プロセスの制御に関与する、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）スーパーファミリーのメンバー。Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａは、膜貫通レセプターセリン／トレオニンキナーゼの複合体を介してその生物学的作用を媒介し、特定のＡｃｔｉｖｉｎ  Ａレセプターに結合する、このファミリーのメンバーである。それは、２つのサブユニットから構成される二量体である。Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａは、ＰＯＵクラス５ホメオボックス１（Ｏｃｔ−３／４）、ｎａｎｏｇ、ｎｏｄａｌおよびｎｏｄａｌシグナル伝達制御因子、左右決定因子１および２（Ｌｅｆｔｙ−ＢおよびＬｅｆｔｙ−Ａ）のような多能性のマーカーのＳＭＡＤ依存性活性化転写を介して幹細胞維持の制御に関与する。Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａは、性腺刺激ホルモン放出ホルモンなどのいくつかのホルモンの転写も刺激する。Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａに対する例示的な配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２１９２に提供されている。
【００６３】
作用物質：目的の任意のタンパク質、核酸分子（化学的に改変された核酸を含む）、化合物、小分子、有機化合物、無機化合物または他の分子。作用物質には、治療薬、診断薬または医薬品が含まれ得る。治療薬または医薬品は、単独でまたは追加の化合物とともに、所望の応答を誘導する（例えば、被験体に投与されたときに治療的または予防的な作用を誘導する）ものである。
【００６４】
アゴニストまたは誘導物質：細胞のレセプターまたはそのようなレセプターのリガンドに結合して、天然に存在する物質の作用を模倣することが多い、その細胞による応答の引き金を引く作用物質。１つの実施形態において、フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）（Ｆｚｄ）アゴニストは、Ｆｚｄレセプターに結合して、Ｗｎｔ／ベータ−カテニンシグナル伝達経路を増強するかまたは亢進する。
【００６５】
変化する：有効量の目的の物質またはパラメータ（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは細胞の特性）の変化。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたは酵素の活性の変化は、細胞の生理学的特性（例えば、細胞の分化、増殖または老化）に影響し得る。その物質の量は、生成される物質の量の差異、所望の機能を有する物質の量の差異またはその物質の活性化の差異によって、変化し得る。その変化は、増加または減少であり得る。その変化は、インビボまたはインビトロにおけるものであり得る。いくつかの実施形態において、変化は、物質の有効量（レベル）、細胞の増殖および／もしくは生存、または酵素などのタンパク質の活性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の増加または減少である。
【００６６】
増幅：核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子）の増幅とは、サンプル中の核酸分子のコピー数を増加させる手法の使用のことを指す。増幅の例は、プライマーとサンプル中の核酸鋳型とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でオリゴヌクレオチドプライマー対とサンプルを接触させるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。それらのプライマーは、好適な条件下で伸長され、鋳型から解離され、再度アニールされ、伸長され、解離されることにより、その核酸のコピー数が増幅する。増幅産物は、標準的な手法を使用する、電気泳動、制限エンドヌクレアーゼ切断パターン、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションもしくはライゲーションおよび／または核酸配列決定法によって特徴付けられ得る。
【００６７】
増幅の他の例としては、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、米国特許第５，７４４，３１１号に開示されているような鎖置換増幅；米国特許第６，０３３，８８１号に開示されているような無転写等温増幅；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０１０６９に開示されているような修復連鎖反応増幅；欧州特許公報ＥＰ−Ａ−３２０，３０８に開示されているようなリガーゼ連鎖反応増幅；米国特許第５，４２７，９３０号に開示されているようなギャップ充填リガーゼ連鎖反応増幅；および米国特許第６，０２５，１３４号に開示されているようなＮＡＳＢＡ  ＲＮＡ無転写増幅が挙げられる。
【００６８】
動物：例えば、哺乳動物および鳥類を含むカテゴリーである、生存している多細胞脊椎動物生物。哺乳動物という用語は、ヒトと非ヒト哺乳動物の両方を含む。同様に、用語「被験体」は、ヒト被験体と動物被験体の両方、例えば、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、ブタ、マウス、ラットおよびウシを含む。
【００６９】
アンタゴニストまたは阻害剤：レセプターまたはレセプターのリガンドに結合すると、生化学的応答または生物学的応答を阻止するかまたは減衰させる作用物質。アンタゴニストは、レセプター相互作用を介して、アゴニストによって誘導される応答を妨げることによって効果を媒介する。１つの実施形態において、フリズルド（Ｆｚｄ）アンタゴニストは、ＦｚｄレセプターまたはＦｚｄリガンド（例えば、Ｗｎｔ）に結合して、Ｗｎｔ／ベータ−カテニンシグナル伝達経路を阻害する。
【００７０】
抗体：抗原のエピトープを特異的に認識して、それに結合する、少なくとも軽鎖免疫グロブリン可変領域または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンド。抗体は、重鎖および軽鎖から構成され、その重鎖および軽鎖の各々は、可変重鎖（ＶＨ）領域および可変軽鎖（ＶＬ）領域と呼ばれる可変領域を有する。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、一体となって、抗体によって認識される抗原への結合に関与する。
【００７１】
抗体には、インタクトな免疫グロブリン、ならびに当該分野で周知の抗体のバリアントおよび部分（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」））が含まれる。ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域および免疫グロブリンの重鎖可変領域がリンカーによって結合された融合タンパク質であり、一方、ｄｓＦｖでは、それらの鎖は、それらの鎖の会合を安定化させるジスルフィド結合を導入するように変異されている。この用語には、遺伝的に操作された形態（例えば、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ結合体抗体（例えば、二重特異性抗体））も含まれる。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７も参照のこと。
【００７２】
代表的には、天然に存在する免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。軽鎖には２つのタイプ、ラムダ（λ）およびカッパー（ｋ）がある。抗体分子の機能活性を決定する主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）が５つ存在する：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ。
【００７３】
分化：比較的特殊化されていない細胞（例えば、胚性幹細胞または他の幹細胞）が、成熟した細胞に特徴的な特殊化された構造的特徴および／または機能的特徴を獲得するプロセスのことを指す。同様に、「分化する」とは、このプロセスのことを指す。代表的には、分化している間、細胞構造は変化し、組織特異的タンパク質が出現する。
【００７４】
胚様体：多能性幹細胞の３次元凝集物。これらの細胞は、分化を起こして、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞になり得る。単層培養物とは対照的に、多能性幹細胞が凝集するときに形成される球状の構造のおかげで、バイオプロセスアプローチにとって有用な、懸濁物中でのＥＢの非接着性培養が可能になる。ＥＢ微小環境内での複雑な細胞接着の確立を含むこの３次元構造およびパラクリンシグナル伝達は、分化および形態形成を可能にする。
【００７５】
胚：それが雌に移植されたかは関係なく、接合体、または人工的に再プログラムされた核を有する活性化された卵母細胞の１回以上の分裂によって得られる細胞の塊。「桑実胚」は、通常、１２〜３２個の細胞（割球）から構成される、固形の塊になっている受精の３〜４日後の着床前胚である。「胚盤胞」とは、約３０〜１５０個の細胞の、有胎盤哺乳動物における着床前胚のことを指す（マウスでは受精の約３日後、ヒトでは受精の約５日後）。胚盤胞期は、桑実胚期の後に続き、そのユニークな形態によって識別され得る。胚盤胞は、通常、細胞層（栄養外胚葉）、流体で満たされた空洞（胞胚腔または胚盤胞腔）および内側の細胞群（内部細胞塊，ＩＣＭ）で構成された球である。未分化細胞からなるＩＣＭは、胚盤胞が子宮に移植された場合に胎児になる。
【００７６】
胚性幹細胞：必要に応じて細胞株として連続的に継代されている、胚盤胞または桑実胚の内部細胞塊に由来する胚性細胞。この用語には、好ましくは、胚の残りの部分を破壊せずに、その胚の１つ以上の割球から単離された細胞が含まれる。この用語には、体細胞核移植によって作製された細胞も含まれる。「ヒト胚性幹細胞」（ｈＥＳ細胞）は、必要に応じて細胞株として連続的に継代されている、ヒト胚盤胞または桑実胚の内部細胞塊に由来する胚性細胞を含む。ｈＥＳ細胞は、精子もしくはＤＮＡと卵細胞の受精、核移植、単為生殖によって得られてもよいし、ＨＬＡ領域がホモ接合であるｈＥＳ細胞を作製する手段によって得られてもよい。ヒトＥＳ細胞は、精子と卵細胞との融合、核移植、単為生殖、またはクロマチンの再プログラムおよびその後の再プログラムされたクロマチンが原形質膜に組み込まれることによって作製された、接合体、割球または胚盤胞期の哺乳動物胚から作製されるかまたは得られることにより、胚性細胞が作製され得る。ヒト胚性幹細胞としては、ＭＡＯ１、ＭＡＯ９、ＡＣＴ−４、Ｎｏ．３、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１４およびＡＣＴ３０胚性幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト胚性幹細胞は、その起源またはそれらを作製するために使用される特定の方法に関係なく、（ｉ）３つすべての胚葉の細胞に分化する能力、（ｉｉ）少なくともＯｃｔ−４およびアルカリホスファターゼの発現、ならびに（ｉｉｉ）免疫無防備状態の動物に移植されたときに奇形腫をつくる能力に基づいて同定され得る。
【００７７】
拡大する（Ｅｘｐａｎｄ）：細胞培養物中の細胞の数または量が、細胞分裂に起因して増加するプロセス。同様に、用語「拡大」または「拡大される」とは、このプロセスのことを指す。用語「増殖する」、「増殖」または「増殖される」は、語「拡大する」、「拡大」または「拡大される」と交換可能に使用されてもよい。代表的には、拡大期の間は、細胞は、分化して、成熟した細胞を形成することなく、分裂して、より多くの細胞を形成する。
【００７８】
発現：ある遺伝子のコードされた情報が、細胞の、活動の（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ）、非活動の、または構造の一部に変換されるプロセス（例えば、タンパク質の合成）。遺伝子発現は、外部シグナルによって影響され得る。例えば、細胞がホルモンに曝露されると、ホルモン誘導性遺伝子の発現が刺激され得る。異なるタイプの細胞は、同一のシグナルに異なって応答し得る。遺伝子の発現はまた、ＤＮＡからＲＮＡを経てタンパク質までの経路におけるいずれかの箇所で制御され得る。制御には、転写、翻訳、ＲＮＡの輸送およびプロセシング、ｍＲＮＡなどの中間分子の分解に対する調節、または産生された後の特定のタンパク質分子の活性化、不活性化、区画化もしくは分解を介した調節が含まれ得る。
【００７９】
フィーダー層：幹細胞の増殖を補助するために使用され得る非増殖細胞（例えば、照射を受けた細胞）。フィーダー層を作製するためのプロトコルは、当該分野で公知であり、インターネット（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）が保守しているＮａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅのウェブサイト）上で入手可能である。
【００８０】
胎児（胎仔）：誕生前の胎生期における発生中の哺乳動物。ヒトでは、出生前の発生の胎児期は、受精後９週目の初めから始まる。ヒトでは、眼およびＲＰＥは、受胎から４週間後にはすでに形成されている。ＲＰＥは、その次の数週間にわたって成熟し続ける。
【００８１】
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）：任意の動物に由来する任意の好適な線維芽細胞成長因子およびその機能的フラグメント（例えば、レセプターに結合して、そのレセプターの活性化に関連する生物学的作用を誘導するもの）。種々のＦＧＦが公知であり、それらとしては、ＦＧＦ−１（酸性線維芽細胞成長因子）、ＦＧＦ−２（塩基性線維芽細胞成長因子、ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−３（ｉｎｔ−２）、ＦＧＦ−４（ｈｓｔ／Ｋ−ＦＧＦ）、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−９８が挙げられるが、これらに限定されない。「ＦＧＦ」とは、線維芽細胞成長因子タンパク質（例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９またはＦＧＦ−９８）またはその生物学的に活性なフラグメントもしくは変異体のことを指す。ＦＧＦは、任意の動物種に由来し得る。１つの実施形態において、ＦＧＦは、げっ歯類、鳥類、イヌ、ウシ、ブタ、ウマおよびヒトを含むがこれらに限定されない哺乳動物のＦＧＦである。ＦＧＦのアミノ酸配列および多くのＦＧＦを作製するための方法は、当該分野で周知である。
【００８２】
ヒトｂＦＧＦのアミノ酸配列およびその組換え発現のための方法は、参照により本明細書中に援用される米国特許第５，４３９，８１８号に開示されている。ウシｂＦＧＦのアミノ酸配列およびその組換え発現のための様々な方法は、参照により本明細書中に援用される米国特許第５，１５５，２１４号に開示されている。これらの１４６個の残基の形態を比較すると、それらのアミノ酸配列は、２つの残基だけが異なり、ほぼ同一である。組換えｂＦＧＦ−２および他のＦＧＦは、米国特許第４，９５６，４５５号に詳細に記載されている手法を用いて、製薬品質（９８％以上の純度）に精製され得る。
【００８３】
ＦＧＦ誘導物質には、ＦＧＦの活性なフラグメントが含まれる。その最も単純な形態において、その活性なフラグメントは、メチオニンアミノペプチダーゼによる処理などの、Ｎ末端のメチオニンの除去に対する周知の手法を用いて、Ｎ末端のメチオニンを除去することによって作製される。２番目に望ましい切断型には、リーダー配列を有しないＦＧＦが含まれる。当業者は、リーダー配列のことを、細胞膜の通過を促進するが、活性にとって必要でなく、成熟タンパク質には見られない、タンパク質のＮ末端における一続きの疎水性残基として認識している。ヒトおよびマウスのｂＦＧＦは、商業的に入手可能である。
【００８４】
フリズルド（Ｆｚｄ）：Ｇタンパク質共役レセプターの特色を有し、リポ糖タンパク質、分泌フリズルド関連タンパク質（ｓＦＲＰ）、Ｒ−スポンジンおよびＮｏｒｒｉｎといったＷｎｔファミリーのタンパク質に結合し、下流のシグナル伝達を活性化する、７回膜貫通型哺乳動物タンパク質のファミリー。フリズルドタンパク質（フリズルドレセプターとも称される）は、その同族のリガンドに結合するシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）、カルボキシ末端のＰＤＺ（Ｐｓｄ−９５／ディスクラージ（ｄｉｓｃ  ｌａｒｇｅ）／ＺＯ−１相同性）結合ドメイン、ならびにセリン／トレオニンキナーゼおよびチロシンキナーゼに対する様々なコンセンサス部位を含む。アミノ酸ハイドロパシー解析から、フリズルドタンパク質が、１つの細胞外アミノ末端、３つの細胞外タンパク質ループ、３つの細胞内タンパク質ループおよび１つの細胞内カルボキシ末端を含むことが示唆されている。
【００８５】
フリズルドタンパク質は、胚発生中の重要な制御的役割を有し、ヒトおよび動物モデルにおいて、様々な癌、心肥大、家族性滲出性硝子体網膜症および精神分裂病を含むいくつかの疾患にも関連する。
【００８６】
少なくとも１０個の哺乳動物フリズルドタンパク質が存在し、その哺乳動物フリズルドタンパク質をコードする遺伝子は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのフリズルド遺伝子に関係する。ヒトフリズルドタンパク質には、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ１（Ｆｚｄ１；ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＡＢ０１７３６３）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２（Ｆｚｄ２；ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号Ｌ３７８８２／ＮＭ＿００１４６６）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３（Ｆｚｄ３；ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＡＪ２７２４２７）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４（Ｆｚｄ４；ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＡＢ０３２４１７）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ５（Ｆｚｄ５；ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号Ｕ４３３１８）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ６（Ｆｚｄ６；ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＡＢ０１２９１１）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７（Ｆｚｄ７；ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＡＢ０１０８８１）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ８（Ｆｚｄ８；ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＡＢ０４３７０３）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ９（Ｆｚｄ９；ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号Ｕ８２１６９／ＮＭ＿００３５０８）およびＦｒｉｚｚｌｅｄ１０（Ｆｚｄ１０；ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＡＢ０２７４６４）が含まれる。２０１３年１月１日に入手可能であるとおりのこれらのＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）エントリーのすべてが、参照により本明細書中に援用される。
【００８７】
成長因子：細胞の成長、生存および／または分化を促進する物質。成長因子には、成長刺激物質（マイトジェン）として機能する分子、細胞遊走を刺激する因子、走化性物質として機能するかまたは腫瘍細胞の細胞遊走もしくは侵入を阻害する因子、細胞の分化機能を調節する因子、アポトーシスに関与する因子、あるいは成長および分化に影響せずに細胞の生存を促進する因子が含まれる。成長因子の例は、線維芽細胞成長因子（例えば、ＦＧＦ−２）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）ならびにアクチビン（ａｃｔｖｉｎ）−Ａである。
【００８８】
成長培地または拡大培地：特定の細胞集団の成長（細胞増殖／拡大）を補助するために必要な栄養分を伴う培養条件の合成セット。１つの実施形態において、それらの細胞は、ｉＰＳＣなどの幹細胞である。成長培地は、通常、炭素源、窒素源、およびｐＨを維持する緩衝剤を含む。１つの実施形態において、成長培地は、幹細胞の成長を高める様々な栄養分が補充された、ＤＭＥＭなどの基礎培地を含む。さらに、基礎培地には、添加物（例えば、ウマ、子ウシまたはウシの胎仔血清）が補充され得る。
【００８９】
宿主細胞：ベクターを増やすことができ、そのＤＮＡを発現できる、細胞。その細胞は、原核生物細胞であっても真核生物細胞であってもよい。この用語は、対象の宿主細胞の任意の子孫も含む。複製中に生じる変異が存在し得るので、すべての子孫が、親細胞と同一でない可能性があることが理解される。しかしながら、用語「宿主細胞」が使用されるとき、そのような子孫も含められる。
【００９０】
単離された：その構成要素が天然に存在する環境（例えば、細胞）内の他の生物学的構成要素、すなわち、染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質およびオルガネラから実質的に分離されているかまたは精製されている、「単離された」生物学的構成要素、例えば、核酸、タンパク質またはオルガネラ。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語は、宿主細胞において組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸およびタンパク質も包含する。同様に、「単離された」細胞は、その細胞が天然に存在する生物の他の細胞から実質的に分離されているか、それらから離れて作製されたか、またはそれらから精製されている。単離された細胞は、例えば、少なくとも９９％、少なくとも（ａｔ  ｌｅａｔ）９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％または（ａｏｒ）少なくとも９０％純粋であり得る。
【００９１】
哺乳動物：この用語は、ヒトと非ヒト哺乳動物の両方を含む。哺乳動物の例としては、ヒトならびに家畜（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ）動物および実験動物（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウサギおよびマウス）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
マーカーまたは標識：例えば、ＥＬＩＳＡ、分光測定法、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光法、顕微鏡法、ノーザン解析またはサザン解析によって、検出が可能な作用物質。例えば、マーカーは、核酸分子またはタンパク質に付着され得、それにより、その核酸分子またはタンパク質の検出が可能になる。マーカーの例としては、放射性同位体、ニトロイミダゾール（ｎｉｔｏｒｉｍｉｄａｚｏｌｅ）、酵素基質、補助因子、リガンド、化学発光物質、フルオロフォア、ハプテン、酵素およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。標識するための方法および様々な目的に適切なマーカーの選択の指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら（Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８）に論じられている。
【００９３】
いくつかの実施形態において、マーカーは、フルオロフォア（「蛍光標識」）である。フルオロフォアは、特定の波長の光に曝露されることによって励起されたとき、例えば異なる波長の、光を発する（すなわち、蛍光を発する）、化学的化合物である。フルオロフォアは、その発光プロファイルすなわち「色」に関して記載され得る。緑色フルオロフォア、例えば、Ｃｙ３、ＦＩＴＣおよびオレゴングリーンは、通常、５１５〜５４０λの範囲の波長における発光によって特徴付けられる。赤色フルオロフォア、例えば、テキサスレッド、Ｃｙ５およびテトラメチルローダミンは、通常、５９０〜６９０λの範囲の波長における発光によって特徴付けられる。他の実施形態において、マーカーは、抗体によって認識されるタンパク質タグ、例えば、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグまたはｃ−Ｍｙｃタグである。
【００９４】
膜電位：外部のバス溶液などの環境に対する細胞の内部の電位。当業者は、従来のホールセル法などを使用することによって、細胞の膜電位を容易に評価し得る。膜電位は、多くのアプローチを使用して（例えば、従来のホールセルアクセスを使用して、または例えば、穿孔パッチホールセル構成およびセルアタッチト構成を使用して）評価され得る。
【００９５】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）：遺伝子発現を制御する一本鎖ＲＮＡ分子。ｍｉＲＮＡは、転写されるＤＮＡの遺伝子によってコードされるが、ｍｌＲＮＡはタンパク質に翻訳されず；その代わりに、一次転写産物（プリｍｉＲＮＡ）の各々は、プレｍｉＲＮＡと呼ばれる短いステムループ構造にプロセシングされ、最終的には、機能的ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。成熟したｍｉＲＮＡ分子は、１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子と完全にまたは部分的に相補的であり、それらの主要な機能は、遺伝子発現をダウンレギュレートすることである。マイクロＲＮＡは、独立した遺伝子によってコードされ得るが、イントロン、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ、長い非コードＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡおよびトランスポゾンを含む種々の異なるＲＮＡ種からプロセシングされることもある（酵素Ｄｉｃｅｒを介して）。本明細書中で使用されるとき、マイクロＲＮＡには、内因性の対応物と同じまたは実質的に同じ機能を有する、外から細胞内に導入されるマイクロＲＮＡのことを意味すると意図された「模倣」マイクロＲＮＡも含まれる。
【００９６】
Ｎｏｄａｌ：トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−ベータ）スーパーファミリーに属するＮＯＤＡＬ遺伝子によってコードされる分泌タンパク質。脊椎動物における内臓の器官の左右（ＬＲ）非対称は、胚発生の間に、ｎｏｄａｌシグナル伝達を介して確立される。Ｎｏｄａｌは、初期発生の生物の左側において発現され、新口動物の間で高度に保存されている。例示的なＮｏｄａｌ配列は、参照により本明細書中に援用される、２０１３年１月６日のＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０１８０５５．４およびＮＰ＿０６０５２５．３として見られ得る。
【００９７】
核酸：ホスホジエステル結合を介して連結されたヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの天然に存在する関連する構造的バリアントおよび天然に存在しない合成アナログ）、その天然に存在する関連する構造的バリアントおよび天然に存在しない合成アナログから構成されるポリマー。したがって、この用語には、ヌクレオチドおよびそれらの間の結合が、天然に存在しない合成アナログ（例えば、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）など）を含む、ヌクレオチドポリマーが含まれる。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を使用して、合成され得る。ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって表されるとき、これは、「Ｕ」が「Ｔ」に取って代わるＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含むことが理解されるだろう。
【００９８】
「ヌクレオチド」には、糖に連結された塩基（例えば、ピリミジン、プリンまたはそれらの合成アナログ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）におけるようなアミノ酸に連結された塩基を含むモノマーが含まれるが、これに限定されない。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドにおける１つのモノマーである。ヌクレオチド配列とは、ポリヌクレオチドにおける塩基の配列のことを指す。
【００９９】
ヌクレオチド配列を記載するために、従来の表示法が本明細書中で使用される：一本鎖ヌクレオチド配列の左側の末端が５’末端であり；二本鎖ヌクレオチド配列の左方向が、５’方向と称される。新生のＲＮＡ転写物にヌクレオチドが５’から３’に付加する方向は、転写方向と称される。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は、「コーディング鎖」と称され；ＤＮＡから転写され、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’に配置された、ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列は、「上流配列」と称され；ＲＮＡと同じ配列を有し、コードしているＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’であるＤＮＡ鎖上の配列は、「下流配列」と称される。
【０１００】
「ｃＤＮＡ」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態である、ｍＲＮＡと相補的または同一であるＤＮＡのことを指す。
【０１０１】
「コードする」とは、規定のヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または規定のアミノ酸配列およびそれらによって生じる生物学的特性を有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として働く、あるポリヌクレオチドにおける具体的なヌクレオチド配列（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）の固有の特性のことを指す。したがって、ある遺伝子によって生成されるｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生体系においてタンパク質を生成する場合、その遺伝子は、タンパク質をコードする。コーディング鎖（そのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常、配列表に提供されている）と遺伝子またはｃＤＮＡの転写用の鋳型として使用される非コーディング鎖との両方が、タンパク質またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の生成物をコードすると言及され得る。別段特定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであって、同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。いくつかの例において、核酸は、開示される抗原をコードする。
【０１０２】
Ｎｏｇｇｉｎ：ＮＯＧ遺伝子によってコードされるタンパク質。Ｎｏｇｇｉｎは、ＴＧＦ−βファミリーリガンドに結合して、それらが対応するレセプターに結合するのを妨げることによって、ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する。Ｎｏｇｇｉｎは、他のＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤（例えば、コーディンおよびフォリスタチン）とともに、ＢＭＰ４を阻害することによって、神経誘導において重要な役割を果たす。Ｎｏｇｇｉｎに対する例示的な配列は、参照により本明細書中に援用される、２０１３年１月１３日のＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＰ＿００５４４１．１およびＮＭ＿００５４５０．４である。
【０１０３】
Ｏｃｔ−４：Ｏｃｔ−４遺伝子の遺伝子産物である、ＰＯＵ５−Ｆ１またはＭＧＣ２２４８７またはＯＣＴ３またはＯＣＴ４またはＯＴＦ３またはＯＴＦ４としても知られるタンパク質。この用語には、任意の種または起源に由来するＯｃｔ−４が含まれ、ｉＰＳＣを作製するために使用される能力を保持しているＯｃｔ−４のアナログおよびフラグメントまたは一部が含まれる。Ｏｃｔ−４タンパク質は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）などの公的な供給源から入手できる、Ｏｃｔ−４に対する公知の公開された配列のいずれかを有し得る。そのような配列の例としては、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２７０１が挙げられるが、これに限定されない。
【０１０４】
作動可能に連結された：第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的関係性であるように配置されるとき、その第１の核酸配列は、その第２の核酸配列と作動可能に連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合、そのプロモーターは、そのコード配列に作動可能に連結されている。通常、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、連続的であり、２つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせる必要がある場合、同じ読み枠である。
【０１０５】
薬学的に許容され得るキャリア：従来の薬学的に許容され得るキャリアは、本明細書中に開示される方法を実施するためおよび本明細書中に開示される組成物を形成するために有用である。Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５には、本明細書中に開示される抗菌化合物の薬学的送達に適した組成物および製剤の例が記載されている。
【０１０６】
一般に、キャリアの性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的におよび生理的に許容され得る流体（例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなど）をビヒクルとして含む注射可能な流体を含む。固体の組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセルの形態）の場合、従来の無毒性の固体キャリアは、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを含み得る。投与される薬学的組成物は、生物学的に中性のキャリアに加えて、少量の無毒性の補助剤物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート）を含み得る。
【０１０７】
多能性幹細胞：（ａ）免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植されると奇形腫を誘導することができ；（ｂ）３つすべての胚葉の細胞型に分化することができ（例えば、外胚葉、中胚葉および内胚葉の細胞型に分化することができ）；（ｃ）胚性幹細胞の１つ以上のマーカーを発現する（例えば、Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３表面抗原、ＳＳＥＡ−４表面抗原、ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１などを発現する）が、胚および胚体外膜を形成できない（全能でない）、幹細胞。
【０１０８】
例示的な多能性幹細胞としては、胚盤胞期胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来する胚性幹細胞、ならびに卵割期胚または桑実胚期胚の１つ以上の割球に由来する（必要に応じて、その胚の残りの部分を破壊せずに）胚性幹細胞が挙げられる。これらの胚性幹細胞は、受精、または体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為生殖および雄性発生を含む無性生殖的手段によってもたらされた胚性物質から作製され得る。ＰＳＣは、すべての胚外組織（例えば、インビボにおける胎盤またはインビトロにおけるトロホブラスト）に寄与する能力を欠いているので、ＰＳＣ単独では、子宮に移植されても胎仔または成体の動物に成長できない。
【０１０９】
多能性幹細胞には、因子（本明細書中で再プログラム因子と称される）の組み合わせを発現させることまたはその発現を誘導することによって、体細胞を再プログラムすることにより作製される「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」も含まれる。ｉＰＳＣは、胎生期、出生後、新生児、若年期または成体の体細胞を使用して作製され得る。ある特定の実施形態において、体細胞を多能性幹細胞に再プログラムするために使用され得る因子としては、例えば、Ｏｃｔ４（時折、Ｏｃｔ３／４と称される）、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８が挙げられる。いくつかの実施形態において、体細胞は、体細胞を多能性幹細胞に再プログラムする、少なくとも２つの再プログラム因子、少なくとも３つの再プログラム因子または４つの再プログラム因子を発現させることによって再プログラムされる。ｉＰＳＣは、胚性幹細胞に特性が似ている。
【０１１０】
ポリペプチド：モノマーが、アミド結合を介して互いにつなぎ合わされたアミノ酸残基である、ポリマー。アミノ酸が、アルファ−アミノ酸であるとき、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体が、使用され得るが、Ｌ−異性体が、本質的に好ましい。ポリペプチドという用語は、天然に存在するタンパク質ならびに組換え的にまたは合成的に生成されたタンパク質を網羅すると明確に意図されている。
【０１１１】
本明細書中で使用される実質的に精製されたポリペプチドとは、それが天然に付随する他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の材料を実質的に含まないポリペプチドのことを指す。１つの実施形態において、ポリペプチドは、それが天然に付随する他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の材料を少なくとも５０％、例えば、少なくとも８０％含まない。別の実施形態において、ポリペプチドは、それが天然に付随する他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の材料を少なくとも９０％含まない。なおも別の実施形態において、ポリペプチドは、それが天然に付随する他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の材料を少なくとも９５％含まない。
【０１１２】
機能的に似ているアミノ酸を提供している保存的アミノ酸置換の表が、当業者に周知である。以下の６つの群は、互いに対して保存的置換であるとみなされるアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【０１１３】
非保存的アミノ酸置換は、（ａ）置換領域におけるアミノ酸骨格の構造；（ｂ）アミノ酸の電荷もしくは疎水性；または（ｃ）アミノ酸側鎖の嵩の変化に起因し得る。タンパク質の特性に最も大きな変化をもたらすと通常予想される置換は、（ａ）親水性残基が、疎水性残基の代わりに用いられる（または疎水性残基によって置換される）置換；（ｂ）プロリンが、他の任意の残基の代わりに用いられる（または他の任意の残基によって置換される）置換；（ｃ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有しない残基、例えば、グリシンの代わりに用いられる（または側鎖を有しない残基によって置換される）置換；または（ｄ）正に帯電した側鎖を有する残基、例えば、リジル、アルギニルまたはヒスチジル（ｈｉｓｔａｄｙｌ）が負に帯電した残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルの代わりに用いられる（または負に帯電した残基によって置換される）置換である。
【０１１４】
バリアントアミノ酸配列は、天然のアミノ酸配列と例えば、８０、９０またはなおも９５または９８％同一であり得る。パーセンテージ同一性を測定するためのプログラムおよびアルゴリズムは、ＮＣＢＩウェブサイトに見られ得る。
【０１１５】
出生前：誕生前に存在していることまたは生じていること。同様に、「出生後」は、誕生後に存在していることまたは生じていることである。
【０１１６】
プライマー：短い核酸分子であって、例えば、１０〜１００ヌクレオチド長（例えば、約１５、２０、２５、３０または５０ヌクレオチド長またはそれ以上）のＤＮＡオリゴヌクレオチド。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによって、相補的な標的ＤＮＡ鎖（例えば、表１もしくは表Ａに列挙される遺伝子または表２に列挙されるｍｉＲＮＡ）にアニールされることにより、そのプライマーと標的ＤＮＡ鎖との間でハイブリッドが形成され得る。プライマー対は、ＰＣＲまたは当該分野で公知の他の核酸増幅方法などによる、核酸配列の増幅のために使用され得る。
【０１１７】
核酸プライマーを調製するためおよび使用するための方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄ．）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８）およびＩｎｎｉｓら（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）に記載されている。ＰＣＲプライマー対は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ０．５，（著作権）１９９１，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）などのその目的を対象にしたコンピュータプログラムを使用することによって、公知の配列から得ることができる。当業者は、特定のプライマーの特異性が、プライマーが長くなるにつれて高まることを認識するだろう。したがって、例えば、３０個連続したヌクレオチドの分子を含むプライマーは、たった１５ヌクレオチドの対応するプライマーよりも高い特異性で、標的配列（例えば、指定の分子の別のホモログ）にアニールし得る。したがって、より高い特異性を得るために、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個またはそれ以上連続したヌクレオチドの目的の核酸配列を含むプライマーが、選択され得る。
【０１１８】
プライマー対：例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他のインビトロ核酸増幅方法による核酸配列の増幅のために使用され得る２つのプライマー（一方が「順方向」で、もう一方が「逆方向」）。プライマー対の順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、標的核酸配列上の重複する相補的な配列にハイブリダイズしない。
【０１１９】
精製された：用語「精製された」は、絶対的な純度を要求しない；むしろ、それは、相対的な用語と意図される。したがって、例えば、精製されたタンパク質調製物は、言及されているタンパク質が、細胞内のその天然の環境におけるタンパク質よりも純粋である、タンパク質調製物である。例えば、タンパク質の調製物は、そのタンパク質が、その調製物の全タンパク質含有量の少なくとも５０％に相当するように、精製される。同様に、精製されたオリゴヌクレオチド調製物は、オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの複合混合物を含む環境における場合よりも純粋である調製物である。精製された細胞集団は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超、もしくは１００％純粋であるか、または他の細胞型を含まない。
【０１２０】
組換え：組換え核酸分子または組換えポリペプチド分子は、天然に存在しない配列を有する分子、または別途切り離された２つの配列セグメントを人工的に組み合わせることによって作製された配列を有する分子である。この人工的な組み合わせは、ポリペプチドもしくは核酸分子の化学合成、または遺伝子操作法などによる、単離された核酸分子セグメントの人工的な操作によって達成され得る。
【０１２１】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞：ＲＰＥ細胞は、色素沈着、上皮の形態、および頂端−基底の極性のある細胞に基づいて認識され得る。ＲＰＥ細胞は、ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方において、以下のうちの１つ以上を発現する：Ｐａｘ６、ＭＩＴＦ、ＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、ＰＥＤＦ、Ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎおよび／またはＯｔｘ２。ある特定の他の実施形態において、ＲＰＥ細胞は、ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方において、Ｐａｘ−６、ＭｉｔＦおよびチロシナーゼのうちの１つ以上を発現する。ＲＰＥ細胞は、胚性幹細胞マーカーであるＯｃｔ−４、ｎａｎｏｇまたはＲｅｘ−１を（いかなる検出可能なレベルでも）発現しない。詳細には、これらの遺伝子の発現は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価されるとき、ＥＳ細胞またはｉＰＳＣ細胞よりもＲＰＥ細胞において、およそ１００〜１０００倍低い。分化したＲＰＥ細胞は、その敷石状（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）の形態および色素の最初の出現によって、視覚的にも認識され得る。さらに、分化したＲＰＥ細胞は、単層を横断する経上皮抵抗／ＴＥＲおよび経上皮電位／ＴＥＰを有し（ＴＥＲ＞１００オーム．ｃｍ２；ＴＥＰ＞２ｍＶ）、頂端側から基底側に流体およびＣＯ２を輸送し、極性のあるサイトカイン分泌を制御する。
【０１２２】
用語「ＲＰＥ細胞」および「分化したＲＰＥ細胞」および「ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞」および「ヒトＲＰＥ細胞」は、本明細書中に開示される方法を用いてヒトｉＰＳＣから分化したＲＰＥ細胞のことを指すために、全体にわたって交換可能に使用される。この用語は、分化したＲＰＥ細胞のことを指すために広く使用される。
【０１２３】
網膜色素上皮：基底をなす脈絡膜に付着した感覚神経網膜（ｎｅｕｒｏｓｅｎｓｏｒｙ
ｒｅｔｉｎａｌ）のすぐ外側に、哺乳動物においてインビボで存在する六角形の細胞の有色素の層。これらの細胞は、色素顆粒が高密度に詰まっており、入射光から網膜を保護する。網膜色素上皮は、血液によって運ばれる脈絡膜の物質に対して堅固なバリアを残しつつ、小分子（例えば、アミノ酸、アスコルビン酸およびＤ−グルコース）を供給することによって網膜環境を維持する輸送制限因子としても働く。
【０１２４】
分泌フリズルド関連タンパク質（ｓＦＲＰ）：ｓＦＲＰファミリーのタンパク質は、Ｗｎｔシグナル伝達のアンタゴニストとして同定されたおよそ３２〜４０ｋＤａの糖タンパク質である（Ｒａｔｔｎｅｒら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：２８５９−６３；Ｍｅｌｋｏｎｙａｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１３６３６−４１；Ｆｉｎｃｈら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：６７７０−５；Ｕｒｅｎら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：４３７４−８２；Ｋａｗａｎｏら（２００３）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１６：２６２７−３４）。哺乳動物には、５つのｓＦＲＰが存在する。ヒトｓＦＲＰには、２０１３年１月１日に入手可能であるとおりの、ｓＦＲＰ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＡＦ００１９００．１）、ｓＦＲＰ２（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００３０１３．２）、ｓＦＲＰ３（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号Ｕ９１９０３．１）、ｓＦＲＰ４（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００３０１４．３）およびｓＦＲＰ５（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００３０１５．３）が含まれる。
【０１２５】
ｓＦＲＰは、３つの構造単位：アミノ末端のシグナルペプチド、フリズルド型のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）およびカルボキシ末端のネトリン（ＮＴＲ）ドメインを含む。ＣＲＤは、およそ１２０アミノ酸に及び、１０個の保存されたシステイン残基を含み、ＦｚｄレセプターのＣＲＤに対して３０〜５０％の配列類似性を有する。ネトリンドメインは、６つのシステイン残基、および疎水性残基のいくつかの保存されたセグメント、および二次構造によって定義される。ｓＦＲＰの生物学的活性は、Ｗｎｔ機能の制御因子としての役割に広く起因する。
【０１２６】
配列同一性：２つの核酸配列間または２つのアミノ酸配列間の類似性は、それらの配列の間で共有される配列同一性のレベルに関して表現される。配列同一性は、代表的には、パーセンテージ同一性に関して表現され；パーセンテージが高くなるほど、２つの配列は類似している。
【０１２７】
比較するために配列をアラインメントするための方法は、当該分野で周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：１０８８１−１０８９０，１９８８；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８：１５５−１６５，１９９２；Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４：３０７−３３１，１９９４；Ｔａｔｉａｎａら（１９９９），ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４：２４７−２５０，１９９９に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌらは、配列のアラインメント法および相同性の計算に関する詳細な考慮すべき点を提示している（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。
【０１２８】
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のベーシックローカルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴ（商標），Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を含むいくつかの供給源から入手可能であり、インターネット上で利用可能である。このプログラムを使用して配列同一性を測定する方法の説明は、インターネット上でＢＬＡＳＴ（商標）に対するヘルプの項のもとに入手可能である。
【０１２９】
ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）：ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａヘッジホッグシグナル伝達分子の３つの哺乳動物ホモログのうちの１つであり、発生中の胚の脊索および底板において高レベルで発現される。ＳＨＨは、神経管のパターン形成（Ｅｃｈｅｒｌａｒｄら、Ｃｅｌｌ  ７５：１４１７−３０，１９９３）、肢、体節、肺および皮膚の発生において重要な役割を果たすと知られている。さらに、ＳＨＨの過剰発現は、基底細胞癌に見られる。ＳＨＨの例示的なアミノ酸配列は、米国特許第６，２７７，８２０号に示されている。ヒトソニックに対する例示的な配列は、参照により本明細書中に援用されるＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＧ＿００７５０４．１（２０１３年１月１日）として示されている。
【０１３０】
被験体：処置、観察または実験に供される動物またはヒト。
【０１３１】
全能または全能性：インビボにおいて、分裂して、最終的にすべての胚外組織を含む生物全体をもたらす細胞の能力。１つの態様において、用語「全能」とは、細胞が、インビトロにおいて、一連の分裂を通じて胚盤胞に進む能力のことを指す。胚盤胞は、内部細胞塊（ＩＣＭ）および栄養外胚葉を含む。ＩＣＭに見られる細胞は、無限に増殖する能力を有するか、または適切に誘導された場合、生物に寄与するすべての細胞型に分化する能力を有する、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を生じる。栄養外胚葉細胞は、胎盤および羊膜を含む胚外組織をもたらす。
【０１３２】
処置：診断された病的症状または障害を治癒させる、遅らせる、その徴候を和らげる、および／またはその進行を停止する、治療的な措置。ある特定の実施形態において、網膜障害を有する被験体の処置は、網膜の劣化の減少；網膜色素上皮細胞の数の増加、視力の改善、またはいくつか効果の組み合わせがもたらされる。
【０１３３】
チロシナーゼ：酸化によるチロシンからのメラニンおよび他の色素の生成を触媒する銅含有オキシダーゼ。この酵素は、メラニンの生成を調節するための律速酵素である。チロシナーゼは、モノフェノールのヒドロキシル化およびｏ−ジフェノールから対応するｏ−キノンへの変換において作用する。ｏ−キノンは、いくつかの反応を起こして、最終的にメラニンを形成する。ヒトでは、チロシナーゼ酵素は、ＴＹＲ遺伝子によってコードされる。例示的なアミノ酸配列および核酸配列は、参照により本明細書中に援用される、２０１３年１月５日の、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００３７２．４（ヒト）およびＮＭ＿０１１６６１．４（マウス）に示されている。
【０１３４】
未分化な：胚起源または成体起源の分化細胞と識別する、未分化細胞の特徴的なマーカーおよび形態学的特色を示す細胞。したがって、いくつかの実施形態において、未分化細胞は、ＲＰＥマーカーを含むがこれに限定されない細胞系譜特異的マーカーを発現しない。
【０１３５】
ベクター：宿主細胞に導入されたとき、それによって形質転換された宿主細胞をもたらす核酸分子。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞においてその複製を可能にする核酸配列を含み得る。ベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子および当該分野で公知の他の遺伝的エレメントも含み得る。ベクターは、所望のタンパク質産物の単離を容易にするアミノ酸モチーフをコードする配列（例えば、マルトース結合タンパク質、ｃ−ｍｙｃまたはＧＳＴをコードする配列）も含み得る。
【０１３６】
Ｗｎｔ：細胞間相互作用を制御し、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのセグメント極性遺伝子であるウィングレスに関係する、高度に保存された分泌シグナル伝達分子のファミリー。ヒトでは、Ｗｎｔファミリーの遺伝子は、３８〜４３ｋＤａのシステインリッチ糖タンパク質をコードする。Ｗｎｔタンパク質は、疎水性シグナル配列、保存されたアスパラギン連結型オリゴ糖コンセンサス配列（例えば、Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  ８：１３４９−１３５８（１９９７）を参照のこと）および２２個の保存されたシステイン残基を有する。細胞質のベータ−カテニンの安定化を促進する能力が理由で、Ｗｎｔタンパク質は、転写活性化因子として作用し得、アポトーシスを阻害し得る。特定のＷｎｔタンパク質の過剰発現は、ある特定の癌に関連すると示されている。
【０１３７】
Ｗｎｔファミリーは、少なくとも１９個の哺乳動物メンバーを含む。例示的なＷｎｔタンパク質としては、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ−３、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ−６、Ｗｎｔ−７ａ、Ｗｎｔ−７ｂ、Ｗｎｔ−８ａ、Ｗｎｔ−８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ−１０ｂ、Ｗｎｔ−１１およびＷｎｔ１６が挙げられる。これらの分泌リガンドは、少なくとも３つの異なるシグナル伝達経路を活性化する。カノニカル（またはＷｎｔ／ベータ−カテニン）Ｗｎｔシグナル伝達経路において、Ｗｎｔは、フリズルド（Ｆｚｄ）レセプターファミリーメンバーおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプター関連タンパク質５または６（ＬＲＰ５／６）からなるレセプター複合体を活性化する。Ｆｚｄリガンドに結合するレセプター複合体を形成するために、Ｆｚｄレセプターは、６つのＹＷＴＤアミノ酸リピートによって分断された４つの細胞外のＥＧＦ様ドメインを有する１回膜貫通タンパク質であるＬＲＰ５／６と相互作用する（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００４，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓ．１９：１７４９）。レセプター結合の際に活性化されるカノニカルＷｎｔシグナル伝達経路は、Ｆｚｄレセプターと直接相互作用する細胞質タンパク質Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｖｌ）によって媒介され、細胞質の安定化およびベータ−カテニンの蓄積をもたらす。Ｗｎｔシグナルの非存在下において、ベータ−カテニンは、腫瘍抑制因子タンパク質である大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）およびＡｘｉｎを含む細胞質破壊複合体に局在化する。これらのタンパク質は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）−３ベータがベータ−カテニンに結合してリン酸化することを可能にする極めて重要な骨格として機能し、ユビキチン／プロテアソーム経路を介する分解に対してそれをマークする。Ｄｖｌの活性化は、破壊複合体の解離をもたらす。次いで、蓄積された細胞質のベータ−カテニンは、核に輸送され、核でＴＣＦ／ＬＥＦファミリーのＤＮＡ結合タンパク質と相互作用することにより、転写が活性化される。
【０１３８】
非カノニカルＷＮＴ経路は、これらのＷＮＴリガンドのうちの３つ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５ａおよびＷＮＴ１１によって制御される。これらのリガンドは、コレセプター（ＬＲＰ５／６）の非存在下においてＷＮＴレセプターであるフリズルドに結合する。これにより、細胞質のベータ−カテニンを活性化せずに、ＲＨＯ  ＧＴＰアーゼおよびＲＯＣＫキナーゼが活性化される。ＲＯＣＫは、細胞骨格を制御して、細胞の頂端−基底極性を制御する。同じレセプターに対する競合のせいで、非カノニカルＷＮＴリガンドは、カノニカルＷＮＴシグナル伝達も阻害する。
【０１３９】
別段説明されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、語「または」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、「および」を含むと意図される。すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および核酸またはポリペプチドに対して与えられるすべての分子量または分子質量の値は、近似値であり、説明のために提供されているとさらに理解されるべきである。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得るが、好適な方法および材料が、下に記載される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により援用される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および例は、単なる例証であって、限定していると意図されない。
体細胞を再プログラムしてＲＰＥ細胞を作製するための方法
【０１４０】
人工多能性幹細胞が再プログラムされて網膜色素上皮細胞になる方法が、本明細書中に提供される。幹細胞は、インビトロにおいて未分化な状態で無限に維持され得るが、実質的に任意の細胞型に分化することもできる。神経細胞系列である網膜色素上皮（ＲＰＥ）における特殊化された細胞へのヒトｉＰＳＣの分化を誘導する方法が、本明細書中に開示される。
【０１４１】
ＲＰＥは、血流と網膜との間のバリアの一部として働く、脈絡膜と神経網膜との間の濃い有色素の上皮の単層である。ＲＰＥの機能としては、脱落した桿体外節および錐体外節のファゴサイトーシス、迷光の吸収、ビタミンＡの代謝、レチノイドの再生ならびに組織修復が挙げられる。ＲＰＥは、敷石状の細胞形態の黒色の有色素細胞を有し、マーカー（例えば、細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）；ＲＰＥ６５、Ｂｅｓｔ卵黄様黄斑ジストロフィー遺伝子（ＶＭＤ２）および色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ））を発現すると知られている。ＲＰＥは、光受容体の維持において役割を果たし、インビボにおける様々なＲＰＥ機能不全は、光受容体の損傷および失明をもたらし得る、視力を変化させるいくつかの病気（例えば、ＲＰＥ剥離、異形成、萎縮、網膜症、網膜色素変性症、黄斑ジストロフィーまたは加齢黄斑変性を含む変性）に関連する。ＲＰＥは、その創傷治癒能力を理由に、移植治療のために広範に研究された；ＲＰＥ移植は、視力回復のために使用され得る。さらに、ＲＰＥは、ドーパミンを分泌するので、ＲＰＥは、パーキンソン病の処置のためにも使用され得る。
【０１４２】
出発体細胞は、目的の任意の細胞であってよい。哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラットなど）起源の生殖細胞以外の任意の細胞が、ｉＰＳＣ作製のための出発物質として使用され得る。例としては、とりわけ、角化上皮細胞、粘膜上皮細胞、外分泌腺上皮細胞、内分泌細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、筋細胞、血液および免疫系の細胞、神経細胞およびグリア細胞を含む神経系の細胞、色素細胞、ならびに造血幹細胞を含む前駆細胞が挙げられる。細胞分化の程度、細胞が回収される動物の齢などに制限はなく；未分化な前駆細胞（体性幹細胞を含む）および最終的に分化した成熟した細胞さえも、本発明における体細胞の起源として同様に使用され得る。１つの実施形態において、その体細胞自体が、ヒトＲＰＥ細胞などのＲＰＥ細胞である。そのＲＰＥ細胞は、成体または胎児のＲＰＥ細胞であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、体細胞は、妊娠約第９週〜約第３８週（例えば、妊娠約第９週〜約第１６週、妊娠約第１７週〜第２５週、約第１６〜約第１９週または妊娠約第２６週〜約第３８週）のヒト胎児から得られる胎児ヒトＲＰＥ細胞である。この文脈において、「約」は、２日以内を意味する。
【０１４３】
体細胞の起源としての哺乳動物個体の選択は、特に限定されない。同種の細胞が、使用され得る。したがって、いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、ＭＨＣ（例えば、ＨＬＡ）が一致しない。いくつかの実施形態において、得られたｉＰＳＣが、ヒトにおける再生医学のために使用されるとき、細胞は、処置される被験体由来またはその患者と同じもしくは実質的に同じＨＬＡ型を有する別の被験体由来の体細胞から回収され得る。「実質的に同じＨＬＡ型」は、ドナーの体細胞に由来するｉＰＳＣの分化を誘導することによって得られた移植細胞が、患者に移植されたときに生着し得る程度に、ドナーのＨＬＡ型がその患者のＨＬＡ型と一致することを示唆する。その患者は、必要に応じて免疫抑制剤で処置され得る。１つの例において、それは、主要なＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲという３つの主要な遺伝子座、ＨＬＡ−Ｃｗをさらに含む４つの主要な遺伝子座）が同一であるＨＬＡ型を含む。
【０１４４】
哺乳動物から単離された体細胞は、細胞の選択に従ってその培養に適していると知られている培地を使用して前培養され、その後、核の再プログラムの工程に供され得る。そのような培地の具体的で非限定的な例としては、約５〜２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む基礎培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地などが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、ヒトなどの哺乳動物から特定の細胞型を増やすために適切な組織培養条件を容易に確認できる。いくつかの実施形態において、完全にゼノフリーなヒトｉＰＳＣを得るために、培地は、非ヒト動物に由来する成分、例えば、ＦＣＳを排除し得る。様々な体細胞の培養に適したヒト由来成分（特に、組換えヒトタンパク質、例えば、成長因子）、可欠アミノ酸、ビタミンなどが補充された基本培地を含む培地は、商業的に入手可能であり；当業者は、体細胞の起源に従って適切なゼノフリー培地を選択することができる。ゼノフリー培地を使用して前培養された体細胞は、適切なゼノフリー細胞解離液を使用して培養容器から解離され、回収された後、核再プログラム物質と接触される。
【０１４５】
下記で別段具体的に示されない限り、一般に、細胞は、約３５〜３８℃、通常、３７℃、約４〜６％ＣＯ２、一般に、５％ＣＯ２において培養される。
【０１４６】
体細胞は、当業者に公知の方法を用いて人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製するために再プログラムされ得る。当業者は、人工多能性幹細胞を容易に作製し得る。例えば、米国特許出願公開番号２００９０２４６８７５、米国特許出願公開番号２０１０／０２１００１４；米国特許出願公開番号２０１２０２７６６３６；米国特許第８，０５８，０６５号；米国特許第８，１２９，１８７号；米国特許第８，２７８，６２０号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／０６９６６６Ａ１および米国特許第８，２６８，６２０号（これらは参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。一般に、核再プログラム因子を使用して、体細胞から多能性幹細胞が作製される。いくつかの実施形態において、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のうちの少なくとも３つまたは少なくとも４つが、使用される。他の実施形態において、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４が、使用される。
【０１４７】
細胞は、体細胞からｉＰＳＣを誘導することができる通常１つ以上の因子またはこれらの物質をコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）である核再プログラム物質で処理される。その核再プログラム物質は、通常、少なくともＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２、またはこれらの分子をコードする核酸を含む。ｐ５３の機能阻害剤であるＬ−ｍｙｃまたはＬ−ｍｙｃをコードする核酸、およびＬｉｎ２８もしくはＬｉｎ２８ｂまたはＬｉｎ２８もしくはＬｉｎ２８ｂをコードする核酸が、追加の核再プログラム物質として使用され得る。Ｎａｎｏｇもまた、核再プログラムのために使用され得る。米国特許出願公開番号２０１２０１９６３６０に開示されているように、ｉＰＳＣを作製するための例示的な再プログラム因子としては、（１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ（Ｓｏｘ２は、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７またはＳｏｘ１８で置き換えられ得；Ｋｌｆ４は、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２またはＫｌｆ５で置き換え可能である）；（２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＳＶ４０ＬＴ）；（３）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６  Ｅ６；（４）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６  Ｅ７（５）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７；（６）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、Ｂｍｉ１；（７）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８；（８）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ＳＶ４０ＬＴ；（９）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（１０）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、ＳＶ４０ＬＴ；（１１）Ｏｃｔ３／４、Ｅｓｒｒｂ、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ（Ｅｓｒｒｂは、Ｅｓｒｒｇで置き換え可能である）；（１２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２；（１３）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（１４）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６  Ｅ６；（１５）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６  Ｅ７；（１６）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７；（１７）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、Ｂｍｉ１；（１８）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８（１９）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、ＳＶ４０ＬＴ；（２０）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（２１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＳＶ４０ＬＴ；または（２２）Ｏｃｔ３／４、Ｅｓｒｒｂ、Ｓｏｘ２（Ｅｓｒｒｂは、Ｅｓｒｒｇで置き換え可能である）が挙げられる。１つの非限定的な例において、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃが、使用される。他の実施形態において、Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２が、使用される。例えば、参照により本明細書中に援用される米国特許第７，６８２，８２��号を参照のこと。これらの因子には、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２が含まれるが、これらに限定されない。他の例において、因子には、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびＭｙｃが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの非限定的な例において、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭｙｃおよびＳｏｘ２が、使用される。他の非限定的な例において、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびＳａｌ４が、使用される。
【０１４８】
これらの核再プログラム物質のマウスおよびヒトｃＤＮＡ配列は、参照により本明細書中に援用されるＷＯ２００７／０６９６６６において言及されているＮＣＢＩアクセッション番号を参照して入手可能である。１つ以上の再プログラム物質またはこれらの再プログラム（ｒｅｐｏｒｇｒａｍｉｎｇ）物質をコードする核酸を導入するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許出願公開番号２０１２／０１９６３６０および米国特許第８，０７１，３６９号（両方が参照により本明細書中に援用される）に開示されている。
【０１４９】
核再プログラム物質とともに培養した後、細胞は、例えば、ＥＳ細胞の培養に適した条件下で培養され得る。マウス細胞の場合、その培養は、通常の培地に白血病抑制因子（ＬＩＦ）を分化抑制因子として添加して行われる。ヒト細胞の場合、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が、ＬＩＦの代わりに添加されることが望ましい。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、細胞は、フィーダー細胞として、細胞分裂を終了させるために放射線または抗生物質で処理されたマウス胎仔線維芽細胞の共存下において培養される。フィーダーとしての通常の使用におけるマウス胎仔線維芽細胞には、ＳＴＯ細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５０３）などが含まれ；ｉＰＳＣの誘導の場合、有用な細胞は、ＳＴＯ細胞などにネオマイシン耐性遺伝子およびＬＩＦ遺伝子を安定に組み込むことによって作製され得る（ＳＮＬ７６／７ＳＴＯ細胞；ＥＣＡＣＣ０７０３２８０１）（ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．＆  Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．Ｃｅｌｌ  ６２，１０７３−１０８５，１９９０）が使用され得る。マイトマイシンＣで処理されたＭＥＦは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから商業的に入手可能である。ガンマ線照射されたＭＥＦは、Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｔｅｍから商業的に入手可能である。一般に、体細胞は、ＭＥＦの非存在下において再プログラム因子を形質導入される。いくつかの実施形態において、形質導入の約７〜８日後に、それらの細胞は、ＭＥＦ上に再度播種される。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、外来性核酸を発現するように（例えば、プロモーターおよび第１のマーカーをコードする核酸配列に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｙ）連結されたチロシナーゼエンハンサーを含むように）改変され得る。チロシナーゼ遺伝子は、例えば、２０１３年１月１日に入手可能であるとおりのＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号２２１７３に開示されている。この配列は、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスの７番染色体の位置５２８６９７１−５２９１６９１（反転方向）に整列している。４７２１塩基対の配列は、ＲＰＥ細胞における発現にとって十分である。参照により本明細書中に援用されるＭｕｒｉｓｉｅｒら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０３：８３８−８４７，２００７を参照のこと。この構築物は、網膜色素上皮細胞において発現される。いくつかの実施形態において、チロシナーゼエンハンサー配列は、以下の核酸配列を含むかまたは以下の核酸配列からなる：
【化１】
2019017394.tif 000002
【化２】
2019017394.tif 000003
【０１５２】
このエンハンサーを含むチロシナーゼ遺伝子の上流領域のより長いフラグメント（例えば、５ｋｂ、６Ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂなど）もまた、使用され得る。
【０１５３】
Ｈｓｐ７０  １ａプロモーター（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＴ＿０３９６４９．８を含むがこれに限定されない任意のプロモーターが、使用され得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは、
【化３】
2019017394.tif 000004
を含むかまたはそれからなる。
【０１５４】
配列番号１および／または配列番号２の活性に影響せずに、小さい欠失、付加および置換（例えば、多くとも１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１塩基）が、行われ得る。
【０１５５】
他のエンハンサーも使用され得る。他のＲＰＥ特異的エンハンサーとしては、Ｄ−ＭＩＴＦ、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＲＰＥ６５、ＶＭＤ２、ＭＥＲＴＫ、ＭＹＲＩＰ、ＲＡＢ２７Ａが挙げられる。好適なプロモーターとしては、チロシナーゼプロモーターを含む、網膜色素上皮細胞において発現される任意のプロモーターが挙げられるが、これに限定されない。上記構築物は、他のエレメント（例えば、翻訳開始のためのリボソーム結合部位（内部リボソーム結合配列）および転写／翻訳ターミネーター）も含み得る。
【０１５６】
一般に、上記構築物で細胞をトランスフェクトすることが有益である。安定したトランスフェクションにとって好適なベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびセンダイウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５７】
プラスミドは、いくつかの目標（例えば、制御された高コピー数を達成すること、および細菌におけるプラスミドの不安定性の潜在的原因を回避すること、およびヒト細胞を含む哺乳動物細胞における使用に適合するプラスミドを選択するための手段を提供すること）を念頭において、デザインされてきた。ヒト細胞において使用するためのプラスミドの二要件に対して、特に注意が払われてきた。第１に、大量のＤＮＡが生成され得、精製され得るように、それらのプラスミドは、大腸菌における維持および発酵に適している。第２に、それらのプラスミドは、安全であり、ヒト患者および動物における使用に適している。第１の要件は、細菌の発酵中に比較的容易に選択され得、安定に維持され得る、高コピー数のプラスミドを要求する。第２の要件は、選択マーカーおよび他のコード配列などのエレメントに対する注意を要求する。いくつかの実施形態において、マーカーをコードするプラスミドは、（１）高コピー数の複製起点、（２）選択マーカー（例えば、カナマイシンによる抗生物質選択のためのｎｅｏ遺伝子であるがこれに限定されない）、（３）チロシナーゼエンハンサーを含む転写終結配列、および（４）様々な核酸カセットを組み込むためのマルチクローニング部位；および（５）チロシナーゼプロモーターに作動可能に連結されたマーカーをコードする核酸配列から構成される。タンパク質をコードする核酸を導入するための当該分野で公知のプラスミドベクターは、数多く存在する。これらとしては、参照により本明細書中に援用される、米国特許第６，１０３，４７０号；米国特許第７，５９８，３６４号；米国特許第７，９８９，４２５号；および米国特許第６，４１６，９９８号に開示されているベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５８】
核酸を導入するために、ウイルスベクターが使用され得、そのウイルスベクターとしては、ポリオーマ、ＳＶ４０（Ｍａｄｚａｋら、１９９２，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：１５３３１５３６）、アデノウイルス（Ｂｅｒｋｎｅｒ，１９９２，Ｃｕｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：３９−６；Ｂｅｒｌｉｎｅｒら、１９８８，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６１６−６２９；Ｇｏｒｚｉｇｌｉａら、１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：４４０７−４４１２；Ｑｕａｎｔｉｎら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：２５８１−２５８４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２，Ｃｅｌｌ，６８：１４３−１５５；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：２２３３−２２３９；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１：２４１−２５６）、ワクシニアウイルス（Ｍａｃｋｅｔｔら、１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４：４９５−４９９）、アデノ随伴ウイルス（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９１−１２３；Ｏｎら、１９９０，Ｇｅｎｅ，８９：２７９−２８２）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：６７−９０；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：２９５２２９６５；Ｆｉｎｋら、１９９２，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１１−１９；Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄら、１９８７，Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１：３３７−３７１；Ｆｒｅｓｓｅら、１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４０：２１８９−２１９９）、シンドビスウイルス（Ｈ．Ｈｅｒｗｅｉｊｅｒら、１９９５，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１１６１−１１６７；米国特許第５，０９１，３０９号および同第５，２２１７，８７９号）、アルファウイルス（Ｓ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，１９９３，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１８−２２；Ｉ．Ｆｒｏｌｏｖら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１３７１−１１３７７）、ヒトヘルペスウイルスベクター（ＨＨＶ）（例えば、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７）、ならびに鳥類起源のレトロウイルス（Ｂｒａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、１９８４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，４：７４９−７５４；Ｐｅｔｒｏｐｏｕｐｌｏｓら、１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：３３９１−３３９７）、マウス（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：１−２４；Ｍｉｌｌｅｒら、１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：４３１−４３７；Ｓｏｒｇｅら、１９８４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，４：１７３０−１７３７；Ｍａｎｎら、１９８５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５４：４０１−４０７）およびヒト起源のレトロウイルス（Ｐａｇｅら、１９９０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４：５３７０−５２７６；Ｂｕｃｈｓｃｈａｌｃｈｅｒら、１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：２７３１−２７３９）が挙げられる。バキュロウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多核多角体病ウイルス；ＡｃＭＮＰＶ）ベクターも使用され得る。ベクターは、商業的供給源（例えば、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｒｉｄｅｎ，Ｃｏｎｎ．；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）から入手され得る。好適なベクターは、例えば、参照により本明細書中に援用される米国公開特許出願番号２０１０／０２４７４８６に開示されている。具体的で非限定的な例において、ベクターは、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、麻疹ウイルスベクター、アルファウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、アデノウイルスおよびポリオウイルスベクターである。
【０１５９】
リン酸カルシウム共沈殿のようなＤＮＡのトランスフェクション方法、従来の機械的方法（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームに包まれたプラスミドの挿入またはウイルスベクター）が、使用され得る。真核細胞はまた、抗体、標識された抗体またはそれらの機能的フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列、および選択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子）で同時に形質転換され得る。
【０１６０】
ウイルス遺伝子送達系は、ＲＮＡベースまたはＤＮＡベースのウイルスベクターであり得る。エピソーム遺伝子送達系は、プラスミド、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ベースのエピソームベクター、酵母ベースのベクター、アデノウイルスベースのベクター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）ベースのエピソームベクター、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）ベースのベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。
【０１６１】
マーカーとしては、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼまたはホタル／ウミシイタケルシフェラーゼまたはｎａｎｏｌｕｃ）または他のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。マーカーは、タンパク質（分泌タンパク質、細胞表面タンパク質または内部タンパク質を含み；細胞によって合成されるかまたは取り込まれる）；核酸（例えば、ｍＲＮＡまたは酵素的に活性な核酸分子）または多糖であり得る。目的の細胞型のマーカーに特異的な、抗体、レクチン、プローブまたは核酸増幅反応によって検出可能な任意のそのような細胞構成要素の決定因子が含められる。それらのマーカーは、生化学的アッセイもしくは酵素アッセイ、または遺伝子産物の機能に応じた生物学的応答によっても識別され得る。これらのマーカーをコードする核酸配列は、チロシナーゼエンハンサーに作動可能に連結され得る。さらに、他の遺伝子（例えば、ＲＰＥの分化またはＲＰＥの機能もしくは生理機能または病態について幹細胞に影響し得る遺伝子）も含められ得る。したがって、いくつかの実施形態において、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、ＴＦＥＣ、ＯＴＸ２、ＬＨＸ２、ＶＭＤ２、ＣＦＴＲ、ＲＰＥ６５、ＭＦＲＰ、ＣＴＲＰ５、ＣＦＨ、Ｃ３、Ｃ２Ｂ、ＡＰＯＥ、ＡＰＯＢ、ｍＴＯＲ、ＦＯＸＯ、ＡＭＰＫ、ＳＩＲＴ１−６、ＨＴＲＰ１、ＡＢＣＡ４、ＴＩＭＰ３、ＶＥＧＦＡ、ＣＦＩ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＡＰＰ、ＣＤ４６、ＢＡＣＥ１、ＥＬＯＬＶ４、ＡＤＡＭ１０、ＣＤ５５、ＣＤ５９およびＡＲＭＳ２のうちの１つ以上をコードする核酸が、含められる。
【０１６２】
マーカーに作動可能に連結されたチロシナーゼプロモーターを必要に応じて含むｉＰＳＣは、胚様体（ＥＢ）が形成されるような条件下で培養される。ＥＢを作製するための方法は、当該分野で公知である。いくつかの実施形態において、ＥＢは、懸濁培養において作製される：未分化なｉＰＳＣを、短時間のコラゲナーゼ消化によって回収し、クラスターに解離し、非接着性細胞培養プレートにおいて培養する。ＥＢは、約３６〜約７２時間（例えば、約４８時間）培養され、次いで、プレーティングされる。いくつかの例において、培地は、この期間中、交換されない。
【０１６３】
理論に拘束されるものではないが、ＥＢは、未分化な幹細胞上で高度に発現されるＣａ２＋依存性接着分子Ｅ−カドヘリンの同種親和性結合によって形成される。ｉＰＳＣは、特定の条件下で単一細胞として培養されるとき、自発的に凝集して、ＥＢを形成する。そのような自発的な形成は、大量懸濁培養において生じることが多く、それにより、ディッシュを、寒天または親水性ポリマーなどの非接着性材料でコーティングすることが、培養基材への接着ではなく単一細胞間の優先的な接着を促進する。単一細胞への解離を回避するために、接着コロニー（またはコロニーの領域）を手作業で分離し、続いて、懸濁培養することにより、ＥＢが、ｉＰＳＣから形成され得る。懸濁物中でのＥＢの形成は、多量のＥＢの形成に適しているが、得られる凝集物のサイズの調節がそれほどできず、不揃いな形の大きなＥＢになることが多い。代替法として、ｉＰＳＣが、大量の懸濁物に接種されるとき、混合培養プラットフォームにおいて付与される流体力が、ＥＢサイズの均一性を高める。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、約１５０〜約６００個の細胞（例えば、約２００〜約５００個の細胞、例えば、約２００〜約５００個の細胞）を含むＥＢが、選択される。追加の実施形態において、ＥＢは、約５００個未満の細胞（例えば、約４５０個未満の細胞または約４００個未満の細胞）を含む。さらなる実施形態において、ＥＢは、５００個未満の細胞（例えば、４５０個未満の細胞または４００個未満の細胞）を含む。他の実施形態において、約２００〜約４００個のＥＢ（例えば、約１００〜約２００個のＥＢ、例えば、約１００〜約１５０個のＥＢ）が、標準的な６ウェル組織培養プレートの各ウェルにプレーティングされる。この文脈において、「約」は、２０個以内の細胞または胚様体を意味する。
【０１６５】
次いで、ＥＢは、２つのＷｎｔ経路阻害剤および１つのＮｏｄａｌ経路阻害剤を含む第１の培地中で培養される。Ｗｎｔ経路阻害剤およびＮｏｄａｌ経路阻害剤を含む第１の培地は、網膜細胞誘導培地であり得る。例示的で非限定的な培地は、血清の非存在下における、約１：１の比のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびＦ１２である。ノックアウトＤＭＥＭなどの他の組織培養液もまた使用され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、約３６〜約５０時間、例えば、約４８時間培養される。追加の例示的な培地は、実施例の項に開示される。
【０１６６】
Ｗｎｔ経路阻害剤は、例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）−５−クロロイソキノリン−８−スルホンアミド（ＣＫ１−７）、３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（ＸＡＶ９３９）、分泌フリズルド関連タンパク質（ＳＦＲＰ）１、ｓＦＲＰ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＡＦ００１９００．１）、ｓＦＲＰ２（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００３０１３．２）、ｓＦＲＰ３（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号Ｕ９１９０３．１）、ｓＦＲＰ４（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００３０１４．３）およびｓＦＲＰ５（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００３０１５．３，）、ＳＦＲＰ−３、ＳＦＲＰ−４またはＳＦＲＰ−５であり得る。２０１３年１月１日に入手可能であるとおりのこれらのＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）配列は、参照により本明細書中に援用される。ＳＦＲＰは、約５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ（例えば、約（ａ  ｏｕｔ）１０ｎｇ／ｍｌ〜約９０ｍｇ／ｍｌ、例えば、約２０ｎｇ／ｍｌ〜約８０ｎｇ／ｍｌ）の濃度で含められ得る。いくつかの実施形態において、第１の培地は、約３〜約１０ｍＭのＣＫ１−７二塩化物（ｄｉｃｌｏｒｉｄｅ）（Ｎ−（２−アミノエチル）−５−クロロイソキノリン−８−スルホンアミド二塩酸塩）、例えば、約３．５〜約９ｍＭのＣＫ１−７または約４〜約８ｍＭのＣＫ１−７を含む。
【０１６７】
Ｎｏｄａｌ経路阻害剤は、例えば、４−（５−ベンゾール［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン（ｐｙｒｌｄｉｎ）−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド水和物、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物、４−［４−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−５−（２−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物（ＳＢ−４３１５４２）、左右決定因子（Ｌｅｆｔｙ）または２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩水和物（ＳＢ−５０５１２４）であり得る。いくつかの実施形態において、第１の培地は、約３〜約１０ｍＭのＳＢ４３１５２、例えば、約３．５〜約９ｍＭのＳＢ４３１５２または約４〜約８ｍＭのＳＢ４３１５２を含む。
【０１６８】
細胞は、第１の培地中で、約３６〜７２時間、例えば、約４８時間培養される。例えば、約３６〜約７２時間、例えば、約４８時間にわたる第１の培地中での培養の後、ＥＢは、第２の培地中の組織培養基材上にプレーティングされる。いくつかの実施形態において、組織培養基材は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーティングされる。第２の培地は、外来性のベータ線維芽細胞成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔ）（ｂＦＧＦ）を含まない。第２の培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）阻害剤、２つのＷｎｔ経路阻害剤および１つのＮｏｄａｌ経路阻害剤も含む。例示的な培地は、実施例の項に開示される。
【０１６９】
好適なＷｎｔ経路阻害剤およびＮｏｄａｌ阻害剤は、上に開示されている。好適なｂＦＧＦ阻害剤としては、Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ−［２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）尿素（ＰＤ１７３０７４）、２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン（ＰＤ９８０５９）、１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−［６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］尿素（ＰＤ１６１５７０）または６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−［２−（ジエチルアミノ）エトキシ］フェニル］アミノ］−８−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン二塩酸塩水和物（ＰＤ１６６２８５）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、第２の培地は、約０．２〜約２．５ｍＭのＰＤ０３２５９０１（例えば、約０．５〜約２ｍＭのＰＤ０３２５９０１、例えば、約１〜約２ｍＭのＰＤ０３２５９０１）を含む。１つの具体的で非限定的な例において、第２の培地は、約３．５〜約９ｍＭのＣＫ１−７および約３．５〜約９ｍＭのＳＢ４３１５４２（例えば、約５ｍＭのＳＢ４３１５４２）を含む。
【０１７０】
第２の培地は、約２０〜約９０ｎｇのＮｏｇｇｉｎ（例えば、約３０〜約９０ｎｇのＮｏｇｇｉｎ、例えば、約４０〜約８０ｎｇのＮｏｇｇｉｎ、例えば、約５０ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎ）を含み得る。
【０１７１】
第２の培地は、形成のために、約０．５％〜約３．５％、例えば、約１〜約３％、例えば、約２〜約３％のＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物も含み得る。ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物は、例えば、米国特許出願公開番号２００２／０７６７４７およびＰＣＴ公開番号９８／８３０６７９（両方が、参照により本明細書中に援用される）に開示されており、分化中の網膜色素上皮細胞を作製するために、ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（商標）から商業的に入手可能である。
【０１７２】
塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２としても知られるｂＦＧＦ）の阻害剤としては、Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ−［２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）尿素（ＰＤ１７３０７４）、２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン（ＰＤ９８０５９）、１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−［６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］尿素（ＰＤ１６１５７０）または６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−［２−（ジエチルアミノ）エトキシ］フェニル］アミノ］−８−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン二塩酸塩水和物（ＰＤ１６６２８５）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、第２の培地は、約０．５〜約２ｍＭのＰＤ０３２５９０１（例えば、約１〜約２ｍＭのＰＤ０３２５９０１、例えば、約１．５〜約２ｍＭのＰＤ０３２５９０１、例えば、約１ｍＭのＰＤ０３２５９０１）を含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、細胞は、約１８〜約２４日間（例えば、約２０〜約２２日間、例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４日間）、第２の培地中で培養される。他の実施形態において、細胞は、約１４日間から約４週間の期間にわたって、例えば、約１４日間〜約３週間、例えば、約２週間、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０または約２１日間、第２の培地中で培養される。具体的で非限定的な例は、１４日間から３週間、１週間から２週間、１週間から１０日間、１週間から３週間、または１週間、２週間もしくは３週間である。この文脈において、「約」は、列挙された時間の１日以内を示唆する。
【０１７４】
ＰＤ３２５９０１、Ｎｏｇｇｉｎおよび／またはＤＫＫ１の例示的な濃度の具体的で非限定的な例は、図８〜１０に示される。いくつかの実施形態において、上記方法は、第２の培地中で約１〜約２週間培養された細胞におけるＰａｘ６の発現を、最初の細胞集団と比べて増加させる。ある特定の実施形態において、細胞は、ｂＦＧＦ阻害剤の非存在下および存在下、ならびにＮｏｇｇｉｎの存在下において培養される。非限定的な例としては、約１０ｍＭ  ＰＤ０３２５９０１および約５０〜約１００ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎが挙げられる。追加の例は、図８に示される。必要に応じて、培地は、約５０〜１００ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１（例えば、約７５ｍ  ８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１）を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｐａｘ６の発現は、１週間培養した後に、出発細胞と比べて、少なくとも１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０倍増加する。他の実施形態において、Ｐａｘ６の発現は、１〜２週間培養した後に、出発細胞における発現と比べて、少なくとも４００、４５０、５００または６００倍増加する。なおも他の実施形態において、Ｐａｘ６の発現は、１〜３週間培養した後に、出発細胞における培養前の細胞（例えば、培養の０日目の胚様体）における発現と比べて、少なくとも５００、６００、７００、８００または９００倍増加する。
【０１７５】
なおも他の実施形態において、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ，２０１３年１月１日に入手可能であるとおりのＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＧ＿０１１６３１．１，参照により本明細書中に援用される）の発現は、１週間培養した後に、第２の培地中で培養する前の細胞における発現と比べて、少なくとも４、５、６、７、８、９または１０倍増加する。他の実施形態において、ＭＩＴＦの発現は、１〜２週間培養した後に、第２の培地中で培養する前の細胞における発現と比べて、少なくとも３、４、５、６、７、８、９または１０倍増加する。なおも他の実施形態において、ＭＩＴＦの発現は、１〜３週間培養した後に、出発細胞（例えば、培養の０日目の胚様体）における発現と比べて、少なくとも６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、４５または５０倍増加する。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、チロシナーゼエンハンサープロモーターからの発現は、増加する。したがって、いくつかの実施形態において、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｎｓｅ）エンハンサーに作動可能に連結されたマーカーをコードする核酸の発現が、増加する。例えば、マーカーの発現は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％増加し得る。
【０１７７】
次いで、得られた分化中のＲＰＥ細胞は、第３の培地に移される。いくつかの実施形態において、第３の培地は、約５０〜約３００ｎｇ／ｍｌのＡＣＴＩＶＩＮ  Ａ（例えば、約１００〜約２００ｎｇ／ｍｌのＡＣＴＩＶＩＮ  Ａ、例えば、約１５０〜約２００ｎｇ／ｍｌのＡＣＴＩＶＩＮ  Ａ、例えば、約１５０ｎｇ／ｍｌのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ）を含む。さらなる実施形態において、第３の培地は、約７５〜１５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ（例えば、約１００〜１５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ、例えば、約１１０〜１４０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ）を含む。この文脈において、約は、２ｎｇ／ｍｌ以内を意味する。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、細胞は、約１８〜約２４日間（例えば、約２０〜約２２日間、例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４日間）、第３の培地中で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、約１４日間から約４週間の期間にわたって、例えば、約１４日間〜約３週間、例えば、約２週間、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０または約２１日間、第３の培地中で培養される。具体的で非限定的な例は、１４日間から３週間、１週間から２週間、１週間から１０日間、１週間から３週間、または１週間、２週間もしくは３週間である。この文脈において、「約」は、列挙された時間の１日以内を示唆する。
【０１７９】
第３の培地中での培養の後、細胞は、約３〜約６パーセントの血清、例えば、約５パーセントの血清を含む第４の培地中で培養される。いくつかの実施形態において、その血清は、ウシ胎仔血清である。他の実施形態において、その血清は、ヒト血清である。ＲＰＥ培地は、分化したＲＰＥ細胞を作製するために、カノニカルＷＮＴ阻害剤、非カノニカルＷＮＴ誘導物質ならびにＳｏｎｉｃ経路およびＦＧＦ経路の阻害剤を含む。
【０１８０】
この培地は、カノニカルＷＮＴ阻害剤、非カノニカルＷＮＴ誘導物質ならびにＳｏｎｉｃ経路およびＦＧＦ経路の阻害剤も含む。さらなる実施形態において、カノニカルＷＮＴ阻害剤は、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質である。いくつかの例において、この培地は、約５０〜約２００ｎｇ／ｍｌのＤｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ１）、例えば、約５０〜約１００ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１、例えば、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または１００ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１を含む。いくつかの実施形態において、非カノニカルＷＮＴ誘導物質（ｉｎｄｕｃｅ）は、Ｗａｎｔ５ａである。１つの例において、第４の培地は、約５０〜約２００ｎｇ／ｍｌの非カノニカル（ｎｏｎ−ｃａｎｎｏｎｉｃａｌ）ＷＮＴ誘導物質、例えば、ＷＮＴ５ａ、例えば、約５０〜約１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または１００ｎｇ／ｍｌを含む。別の例において、第４の培地は、約５〜約２０μＭシクロパミン（Ｃｙｃｏｌｏｐａｍｉｎｅ）（例えば、約５〜１０μＭシクロパミン、例えば、約５、６、７、８、９または１０μＭシクロパミン）を含む。なおも別の（ａｏｔｈｅｒ）実施形態において、第４の培地（ｍｅｄｉｃｕｍ）は、約５〜約２０μＭ  ＳＵ５４０２（例えば、約５〜１０μＭ  ＳＵ５４０２、例えば、約５、６、７、８、９または１０μＭ  ＳＵ５４０２）を含む。
【０１８１】
細胞は、約１０〜約２０日間（例えば、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８もしくは１９日間、例えば、約２週間、または約１２〜約１６日間）、第４の培地中で培養され得る。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、細胞は、３〜約６％血清（例えば、約３％〜約６％ヒト血清またはウシ胎仔血清、例えば、約３％、４％、５％もしくは６％ウシ胎仔血清）を含む第４の培地中でも培養される。
【０１８３】
本明細書中に開示される方法によって作製される網膜色素上皮細胞は、アフィディコリンを含む第４の培地中で６〜８週間、培養される。いくつかの実施形態において、網膜色素上皮細胞は、例えば、約３μＭ〜約１０μＭの濃度のアフィディコリンを含む組織培養液中で培養される。追加の実施形態において、網膜色素上皮細胞は、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭまたは約１０μＭアフィディコリンを含む組織培養液中で培養される。網膜色素上皮細胞は、アフィディコリンを含む組織培養液中で約４〜約６週間（例えば、約４週間、約５週間または約６週間）、培養され得る。いくつかの実施形態において、アフィディコリンの使用は、網膜色素上皮細胞の分極（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を高めるために十分である。
【０１８４】
本明細書中に開示される方法は、ＲＰＥ細胞を効率的に作製する。したがって、本明細書中に開示される方法を用いるとき、得られる細胞の少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が、ＲＰＥ細胞である。いくつかの実施形態において、蛍光タンパク質などのマーカーに作動可能に連結されたチロシナーゼエンハンサーを含む構築物が、ｉＰＳＣに含められる。本明細書中に開示される方法を用いるとき、細胞の少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が、このマーカーを発現する。
【０１８５】
第４の培地中での培養の後、ＲＰＥ細胞は、培養液中で維持され得る。いくつかの実施形態において、ＲＰＥ細胞は、約３〜約６％血清（例えば、約３％、約４％、約５％または約６％血清）を含む含むＲＰＥ培地（上記を参照のこと）中で維持される。その血清は、胎児血清であり得る。いくつかの非限定的な例において、血清は、ウシ胎仔血清である。他の実施形態において、血清は、ヒト血清である。ＲＰＥ細胞は、約３％〜約６％血清（例えば、約５％血清、例えば、約５％胎児血清）を含むＲＰＥ培地中で約６〜約８週間、維持され得る。いくつかの実施形態において、ＲＰＥ細胞は、６ウェル、１２ウェル、２４ウェルまたは１０ｃｍプレートなどにおけるトランスウェルにおいて生育される。網膜色素上皮細胞は、約５％胎児血清を含む網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）培地中で、約４〜約１０週間（例えば、約６〜約８週間、例えば、６、７または８週間）、維持され得る。
【０１８６】
上記方法は、得られた細胞がＲＰＥ細胞であることを確かめる工程も含み得る。この確かめるための方法は、下記に開示される。
ＲＰＥ細胞の薬学的組成物および使用
【０１８７】
ヒトＲＰＥ細胞を含む薬学的組成物などの組成物が、本明細書中に開示される。ある特定の実施形態において、その調製物は、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞（例えば、胎仔ＲＰＥ細胞（例えば、ヒト胎児ＲＰＥ細胞）から作製されたｉＰＳＣに由来するＲＰＥ細胞であるがこれに限定されない）の調製物である。ある特定の実施形態において、これらの組成物は、本明細書中に開示される方法によって作製された分化したＲＰＥ細胞を含む実質的に精製された（非ＲＰＥ細胞に対して）調製物である。これらの実質的に精製された集団は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはなおも９９％超のＲＰＥ細胞を含む組成物である。したがって、その組成物は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満または１％未満の、ＲＰＥ細胞でない細胞を含む。ある特定の実施形態において、組成物は、少なくとも約１×１０３個のＲＰＥ細胞、約１×１０４個のＲＰＥ細胞、約１×１０５個のＲＰＥ細胞、約１×１０６個のＲＰＥ細胞、約１×１０７個のＲＰＥ細胞、約１×１０８個のＲＰＥ細胞または約１×１０９個のＲＰＥ細胞を含む。
【０１８８】
ある特定の実施形態において、上記細胞は、下記の表１に列挙される遺伝子の１つ以上を発現する。
【表１−１】
2019017394.tif 000005
【表１−２】
2019017394.tif 000006
【表１−３】
2019017394.tif 000007
【表１−４】
2019017394.tif 000008
【表１−５】
2019017394.tif 000009
【表１−６】
2019017394.tif 000010
【表１−７】
2019017394.tif 000011
【０１８９】
上記細胞は、これらの遺伝子のうちの少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、３６０、３７０個またはすべてを発現し得る。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＭＩＴＦ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００２４８）、ＰＡＸ６（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００２８０）、ＬＨＸ２（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００４７８９）、ＴＦＥＣ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０１２２５２）、ＣＤＨ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００４３６０）、ＣＤＨ３（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００１７９３）、ＣＬＤＮ１０（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿１８２８４８）、ＣＬＤＮ１６（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００６５８０）、ＣＬＤＮ１９（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿１４８９６０）、ＢＥＳＴ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００４１８３）、ＴＩＭＰ３（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００３６２）、ＴＲＰＭ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２４２０）、ＴＲＰＭ３（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０２０９５２）、ＴＴＲ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００３７１）、ＶＥＧＦＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００３３７６）、ＣＳＰＧ５（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００６５７４）、ＤＣＴ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００１９２２）、ＴＹＲＰ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００５５０）、ＴＹＲ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００３７２）、ＳＩＬＶ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００６９２８）、ＳＩＬ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０２２４６４）、ＭＬＡＮＡ（ＮＭ＿００５５１１）、ＲＡＢ２７Ａ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿１８３２３６）、ＯＣＡ２（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００２７５）、ＧＰＲ１４３（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００２７３）、ＧＰＮＭＢ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２５１０）、ＭＹＯ６（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００４９９９）、ＭＹＲＩＰ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０１５４６０）、ＲＰＥ６５（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００３２９）、ＲＢＰ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２８９９）、ＲＢＰ４（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００６７４４）、ＲＤＨ５（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２９０５）、ＲＤＨ１１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０１６０２６）、ＲＬＢＰ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００３２６）、ＭＥＲＴＫ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００６３４３）、ＡＬＤＨ１Ａ３（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００６９３）、ＦＢＬＮ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００１９９６）、ＳＬＣ１６Ａ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００３０５１）、ＫＣＮＶ２（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿１３３４９７）、ＫＣＮＪ１３（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２２４２）およびＣＦＴＲ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００４９２）を発現する。他の実施形態において、ＲＰＥ細胞は、これらのタンパク質のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３８、３９、４０個またはすべてを発現する。２０１３年１月３１日に入手可能であるとおりのＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）の開示が、参照により本明細書中に援用される。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、ＲＰＥ細胞は、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、ＴＦＥＣ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＬＤＮ１０、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１９、ＢＥＳＴ１、ＴＩＭＰ３、ＴＲＰＭ１、ＴＲＰＭ３、ＴＴＲ、ＶＥＧＦＡ、ＣＳＰＧ５、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＴＹＲ、ＳＩＬＶ、ＳＩＬ１、ＭＬＡＮＡ、ＲＡＢ２７Ａ、ＯＣＡ２、ＧＰＲ１４３、ＧＰＮＭＢ、ＭＹＯ６、ＭＹＲＩＰ、ＲＰＥ６５、ＲＢＰ１、ＲＢＰ４、ＲＤＨ５、ＲＤＨ１１、ＲＬＢＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＦＢＬＮ１、ＳＬＣ１６Ａ１、ＫＣＮＶ２、ＫＣＮＪ１３およびＣＦＴＲを発現する。
【０１９１】
さらなる実施形態において、ＲＰＥ細胞は、１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｃｉｒｏＲＮＡｓ）も発現する。具体的で非限定的な例において、それらの細胞は、表２に列挙されるマイクロＲＮＡ（ｍｉｒｃｏｒＲＮＡｓ）のうちの１つ以上を発現する。
【表２−１】
2019017394.tif 000012
【表２−２】
2019017394.tif 000013
【表２−３】
2019017394.tif 000014
【０１９２】
したがって、いくつかの実施形態において、上記細胞は、表２に列挙されたｍｉＲＮＡのうちの少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５個または９６個すべてを発現する。１つの具体的で非限定的な例において、上記細胞は、ｍｉＲ２０４およびｍｉＲ２１１を発現する。
【０１９３】
コントロール遺伝子としては、下記の表３に列挙される遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【表３】
2019017394.tif 000015
【０１９４】
これらの遺伝子は、ＲＰＥ細胞およびコントロール細胞において発現される。したがって、いくつかの実施形態において、ＲＰＥ細胞は、これらのマーカーのうちの１つ以上を発現する。ＲＰＥ細胞は、これらのマーカーのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはすべてを発現し得る。
【０１９５】
なおも他の実施形態において、ＲＰＥ細胞は、約−５０〜約−６０ｍＶの静止電位および約５〜約１０μｌｃｍ−２ｈ−１の流体輸送速度を有する。追加の実施形態において、ＲＰＥ細胞は、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、ＴＦＥＣ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＬＤＮ１０、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１９、ＢＥＳＴ１、ＴＩＭＰ３、ＴＲＰＭ１、ＴＲＰＭ３、ＴＴＲ、ＶＥＧＦＡ、ＣＳＰＧ５、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＴＹＲ、ＳＩＬＶ、ＳＩＬ１、ＭＬＡＮＡ、ＲＡＢ２７Ａ、ＯＣＡ２、ＧＰＲ１４３、ＧＰＮＭＢ、ＭＹＯ６、ＭＹＲＩＰ、ＲＰＥ６５、ＲＢＰ１、ＲＢＰ４、ＲＤＨ５、ＲＤＨ１１、ＲＬＢＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＦＢＬＮ１、ＳＬＣ１６Ａ１、ＫＣＮＶ２、ＫＣＮＪ１３およびＣＦＴＲを発現し、ｍｉＲ２０４およびｍｉＲ２１１を発現し、約−５０〜約−６０ｍＶの静止電位を有し、約５〜約１０μｌｃｍ−２ｈ−１の流体輸送速度を有する。
【０１９６】
重合体キャリアおよび／または細胞外マトリックスなどの足場ならびに有効量の本明細書中に開示されるＲＰＥ細胞を含む組成物もまた提供される。その細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｕｌｌａｒ）マトリックスは、ヒト細胞外マトリックスであり得る。その重合体粒子は、微小粒子であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、単層として提供される。
【０１９７】
種々の生物学的なまたは合成の固体マトリックス材（すなわち、固体支持マトリックス、生物学的接着剤または包帯材、および生物学的／医療用足場）が、使用に適している。マトリックス材は、通常、生理的に許容され得るものであり、インビボ用途での使用に適している。そのような生理的に（ｐｈｙｓｉｏｌｇｏｃｉａｌｌｙ）許容され得る材料の非限定的な例としては、吸収性および／または非吸収性の固体マトリックス材（例えば、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、例えば、ブタ由来（および他のＳＩＳ起源））；架橋されたまたは架橋されていないアルギネート、親水コロイド、フォーム、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）メッシュ、ポリグラクチン（ＰＧＬ）メッシュ、フリースおよび生体接着剤（例えば、フィブリン糊およびフィブリンゲル）が挙げられるが、これらに限定されない。上記ポリマーは、ポリ（ＤＬ）−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）であり得る（Ｌｕら、Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ．９（１１）：１１８７−２０５，１９９８を参照のこと）。他の実施形態において、マトリックス（ｍａｔｒｉｃ）は、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）およびポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）（例えば、約９０：１０、７５：２５、５０：５０、２５：７５、１０：９０（ＰＬＬＡ：ＰＬＧＡ）というコポリマー比を有するもの）を含む（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ．Ａ  ９５：１２３３−４２，２０１０を参照のこと）。
【０１９８】
好適な重合体キャリアには、合成または天然のポリマーから形成された多孔性のメッシュまたはスポンジ、ならびにポリマー溶液も含まれる。マトリックスの１つの非限定的な形態は、重合体のメッシュまたはスポンジである。別の非限定的な例は、高分子ヒドロゲルである。使用され得る天然ポリマーには、タンパク質（例えば、コラーゲン、アルブミンおよびフィブリン）；および多糖類（例えば、アルギネートおよびヒアルロン酸のポリマー）が含まれる。合成ポリマーには、生分解性ポリマーと非生分解性ポリマーの両方が含まれる。生分解性ポリマーの例としては、ヒドロキシ酸（例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ））のポリマー、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼンおよびそれらの組み合わせが挙げられる。非生分解性ポリマーとしては、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、エチレンビニルアセテートおよびポリビニルアルコールが挙げられる。
【０１９９】
展性である、イオン性のヒドロゲルまたは共有結合的に架橋されたヒドロゲルを形成し得るポリマーが、使用され得る。ヒドロゲルは、有機ポリマー（天然または合成）が、共有結合、イオン結合または水素結合を介して架橋されることにより、水分子を捕捉してゲルを形成する３次元の開いた格子構造をもたらすときに形成される物質である。ヒドロゲルを形成するために使用され得る材料の例としては、イオンで架橋される多糖類（例えば、アルギネート、ポリホスファジンおよびポリアクリレート）、またはブロックコポリマー（例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはＴＥＴＲＯＮＩＣＳ（商標））、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマー（これらはそれぞれ温度またはｐＨによって架橋される）が挙げられる。他の材料としては、フィブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどのポリマー、ヒアルロン酸およびコラーゲンが挙げられる。
【０２００】
通常、これらのポリマーは、水溶液（例えば、水、緩衝塩溶液または荷電側基を有するアルコール水溶液）に少なくとも部分的に可溶性であるか、またはその一価イオン塩である。陽イオンと反応し得る酸性側基を有するポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）およびスルホン化ポリマー（例えば、スルホン化ポリスチレン）である。アクリル酸またはメタクリル酸およびビニルエーテルのモノマーまたはポリマーの反応によって形成される酸性側基を有するコポリマーもまた、使用され得る。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくは、フッ素化）アルコール基、フェノールＯＨ基および酸性ＯＨ基である。陰イオンと反応し得る塩基性側基を有するポリマーの例は、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルイミダゾール）およびいくつかのイミノ置換ポリホスファゼンである。それらのポリマーのアンモニウム塩または第４級塩は、骨格の窒素またはペンダントイミノ基からも形成され得る。塩基性側基の例は、アミノ基およびイミノ基である。
【０２０１】
上記基材に適した材料の非限定的な例としては、パリレンポリプロピレン、ポリイミド、ガラス、ニチノール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、コラーゲン、化学的に処理されたコラーゲン、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリ（グリセロール−セバシン酸）ＰＧＳ、ポリ（スチレン−イソブチル−スチレン）、ポリウレタン、酢酸ビニルエチル（ＥＶＡ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、Ｋｙｎａｒ（ポリフッ化ビニリデン；ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、Ｐｅｂａｘ、アクリル（ａｃｒｙｌｉｃ）、ポリオレフィン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）および他のシリコーンエラストマー、ポリプロピレン、ヒドロキシアパタイト（ｈｙｄｒｏｘｙａｐｅｔｉｔｅ）、チタン、金、銀、白金、他の金属および合金、セラミックス、プラスチックならびにそれらの混合物または組み合わせが挙げられる。ある特定の実施形態の基材を構築するために使用される追加の好適な材料としては、ポリ−パラ−キシリレン（例えば、パリレンＡ、パリレンＡＭ、パリレンＣ、アンモニア処理パリレン、ポリドーパミンで処理されたパリレンＣを含むがこれらに限定されないパリレン）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリエチレン−酢酸ビニル、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、コラーゲン、ヘパリン処理されたコラーゲン、変性コラーゲン、修飾コラーゲン（例えば、ゼラチンを伴うシリコーン）、他の細胞成長マトリックス（例えば、ＳＹＮＴＨＥＭＡＸ（商標））、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（グリコール酸）、および／あるいは他のポリマー、コポリマーもしくはブロックコポリマー、環状のアルギニン−グリシン−アスパラギンを含むポリ（カプロラクトン）、環状もしくは直鎖状のアルギニン−グリシン−アスパラギン酸、ポリカプロラクトンとポリエチレングリコールとの混和物（ＰＣＬ−ＰＥＧ）、熱可塑性ポリウレタン、シリコーン修飾ポリエーテルウレタン、ポリ（カーボネートウレタン）またはポリイミドが挙げられるが、これらに限定されない。熱可塑性ポリウレタンは、脂肪族ポリウレタン、芳香族ポリウレタン、ポリウレタンヒドロゲル形成材料、親水性ポリウレタンまたはそれらの組み合わせを含み得るポリマーまたはコポリマーである。非限定的な例としては、エラスタン（ｅｌａｓｔｈａｎｅ）（ポリ（エーテルウレタン））、例えば、ＥＬＡＳＴＨＡＮＥ（商標）８０Ａ、Ｌｕｂｒｉｚｏｌ、ＴＥＣＯＰＨＩＬＩＣ（商標）、ＰＥＬＬＥＴＨＡＮＥ（商標）、ＣＡＲＢＯＴＨＡＮＥ（商標）、ＴＥＣＯＴＨＡＮＥ（商標）、ＴＥＣＯＰＬＡＳＴ（商標）およびＥＳＴＡＮＥ（商標）が挙げられる。シリコーン修飾ポリエーテルウレタンには、ＣＡＲＢＯＳＩＬ（商標）２０またはＰＵＲＳＩＬ（商標）２０  ８０Ａなどが含まれ得る。ポリ（カーボネートウレタン）には、ＢＩＯＮＡＴＥ（商標）８０Ａまたは同様のポリマーが含まれ得る。さらに、いくつかの実施形態において、基材（および／または細胞）は、基材および細胞の凍結保存（および解凍）によって影響されない、イン���イチュで基材の可視化を可能にする材料（または化学物質）を含む。
【０２０２】
本明細書中に開示される方法によって作製される網膜色素上皮細胞は、凍結保存され得る。例えば、参照により本明細書中に援用されるＰＣＴ公開番号２０１２／１４９４８４Ａ２を参照のこと。それらの細胞は、基材ありまたはなしで凍結保存され得る。いくつかの実施形態において、貯蔵温度は、約−５０℃〜約−６０℃、約−６００℃〜約−７０℃、約−７０℃〜約−８０℃、約−８０℃〜約−９０℃、約−９０℃〜約−１００℃およびその重複する範囲に及ぶ。いくつかの実施形態において、より低い温度が、凍結保存された細胞の貯蔵（例えば、維持）のために使用される。いくつかの実施形態において、液体窒素（または他の類似の冷却液）が、細胞を貯蔵するために使用される。さらなる実施形態において、細胞は、約６時間超、貯蔵される。さらなる実施形態において、細胞は、約７２時間貯蔵される。いくつかの実施形態において、細胞は、４８時間〜約１週間貯蔵される。なおも他の実施形態において、細胞は、約１、２、３、４、５、６、７または８週間貯蔵される。さらなる実施形態において、細胞は、１、２、３、４、５、６７、８、９、１０、１１または１２ヶ月間貯蔵される。細胞は、それより長い時間にわたっても貯蔵され得る。細胞は、別々にまたは本明細書中に開示される任意の基材などの基材上で凍結保存され得る。
【０２０３】
任意の細胞型（例えば、ｉＰＳＣを含む幹細胞および網膜色素上皮細胞などの分化した細胞）の凍結保存のために使用され得る、細胞を凍結保存する一般的な方法が、本明細書中に開示される。その方法は、アルギネートの使用を含む。「アルギネート」（または「アルギン酸」または「アルギン」）とは、褐藻類の細胞壁に広く分布している陰イオン性の多糖のことを指す。アルギネートは、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウム）、アンモニウム、および低級アミン（例えば、メチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミン）から得られる置換アンモニウム陽イオンと水溶性の塩を形成する。アルギネートには、アルギン酸カルシウム、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレン−グリコールおよびアルギン酸カリウムが含まれる。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、開示される網膜色素上皮細胞などの細胞を、有効量のアルギネートと接触させる。それらの細胞を、アルギネートと接触させ、次いで、二価の陽イオン（例えば、カルシウム、バリウム、銅、亜鉛またはストロンチウム）に曝露し、それにより、細胞／液体アルギネート懸濁物中にアルギネートポリマーの架橋がもたらされる（例えば、参照により本明細書中に援用される米国公開特許出願番号２０１２／０１７１２９５を参照のこと）。ある特定の実施形態において、細胞／液体アルギネート溶液中でアルギネートを架橋するために使用される二価の陽イオンは、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化バリウム（ＢａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ｓｔｒｏｍｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＳｒＣｌ２）、塩化銅（ＣｕＣｌ２）または塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）である。具体的な実施形態において、細胞／液体アルギネート溶液中でアルギネートを架橋するために使用される二価の陽イオンは、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）である。ある特定の実施形態において、二価の陽イオンの溶液は、約０．５％、約０．７５％、約１．０％、約１．２５％、約１．５％、約１．７５％または約２．０％の二価の陽イオンを含む。具体的な実施形態において、二価の陽イオンの溶液は、１．５％の二価の陽イオン、例えば、ＣａＣｌ２を含む。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、追加の凍結保護物質が、使用され得る。例えば、細胞は、１つ以上の凍結保護物質（例えば、ＤＭＳＯ、血清アルブミン、例えば、ヒトまたはウシの血清アルブミン）を含む凍結保存溶液中に凍結保存され得る。ある特定の実施形態において、その溶液は、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％または約１０％ＤＭＳＯを含む。他の実施形態において、その溶液は、約１％〜約３％、約２％〜約４％、約３％〜約５％、約４％〜約６％、約５％〜約７％、約６％〜約８％、約７％〜約９％または約８％〜約１０％のＤＭＳＯまたはアルブミンを含む。具体的な実施形態において、その溶液は、２．５％ＤＭＳＯを含む。別の具体的な実施形態において、その溶液は、１０％ＤＭＳＯを含む。
【０２０６】
細胞は、小さい容器（例えば、アンプル）；凍結保存に適したバッグ；または凍結保存用の他の任意の好適な容器の中で凍結保存され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、商業的に入手可能な凍結保存媒質中で凍結保存される。細胞は、細胞を貯蔵する際に使用するための１つ以上の溶液を含む凍結保存溶液中で凍結保存され得る。凍結保存溶液には、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０（登録商標）およびＨＹＰＯＴＨＥＲＭＯＳＯｌ（登録商標）（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．））が含まれた。ある特定の実施形態において、その溶液は、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％または約７０％ＨＹＰＯＴＨＥＲＭＯＳＯＬ（登録商標）を含む。他の実施形態において、その溶液は、約２５％〜約５０％、約４０％〜約６０％、約５０％〜約６０％、約５０％〜約７０％または約６０％〜約７０％ＨＹＰＯＴＨＥＲＭＯＳＯＬ（登録商標）を含む。具体的な実施形態において、その溶液は、５５％ＨＹＰＯＴＨＥＲＭＯＳＯＬ（登録商標）を含む。別の具体的な実施形態において、その溶液は、５７．５％ＨＹＰＯＴＨＥＲＭＯＳＯＬ（登録商標）を含む。さらなる実施形態において、凍結保存溶液は、１つ以上の賦形剤（例えば、デキストラン、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、シリカゲル、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレンおよび／またはグリコール）を含み得る。凍結保存溶液は、本明細書中に開示される培地などの培地を含み得る。追加の実施形態において、その培地は、リン酸緩衝食塩水またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）であり得る。
【０２０７】
細胞は、凍結保存中に、例えば、約１℃／分で冷却され得る。いくつかの実施形態において、凍結保存温度は、約−８０℃〜約−１８０℃または約−１２５℃〜約−１４０℃である。いくつかの実施形態において、細胞は、４℃に冷却された後、約１℃／分で冷却される。凍結保存された細胞は、使用するために解凍する前に、液体窒素の気相に移され得る。いくつかの実施形態において、例えば、細胞が、約−８０℃に達したら、それらは、液体窒素貯蔵区域に移される。凍結保存は、速度制御冷凍庫を使用しても行われ得る。凍結保存された細胞は、例えば、約２５℃〜約４０℃の温度、代表的には、約３７℃の温度で解凍され得る。
【０２０８】
本明細書中に記載されるヒトＲＰＥ細胞またはこれらの細胞を含む薬学的組成物は、ある症状を処置する必要のある患者においてそのような処置を行うための医薬の製造のために使用され得る。それらのＲＰＥ細胞は、予め凍結保存され得る。開示されるＲＰＥ細胞は、ｉＰＳＣに由来し、ゆえに、眼疾患を有する患者に「個別化医療」を提供するために使用され得る。いくつかの実施形態において、患者から得られた体細胞は、疾患を引き起こす変異を訂正するように遺伝的に操作され、ＲＰＥに分化され、ＲＰＥ組織を形成するように操作され得る。このＲＰＥ組織は、同じ患者の内在性の変性したＲＰＥを置き換えるために使用され得る。あるいは、ｉＰＳＣは、健常ドナーまたはＨＬＡがホモ接合性の「スーパードナー」から作製され得、使用され得る。ＲＰＥ細胞は、インビトロにおいて、ある特定の因子（例えば、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−ベータおよび／またはレチノイン酸）で処理されることにより、インビボにおける抗炎症性および免疫抑制性の環境がもたらされ得る。
【０２０９】
様々な眼の症状が、本明細書中に開示される方法を用いて得られるＲＰＥ細胞の導入によって処置され得るかまたは予防され得る。その症状には、網膜の機能不全もしくは退化、網膜傷害および／または網膜色素上皮の喪失に通常関連する網膜の疾患または障害が含まれる。処置され得る症状としては、網膜の変性疾患（例えば、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性症、黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性）、緑内障および糖尿病性網膜症）が挙げられるがこれらに限定されない。追加の症状としては、レーバー先天性黒内障、遺伝性または後天性黄斑変性、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮、コロイデレミア、パターンジストロフィー（ｐａｔｔｅｒｎ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、ＲＰＥの他のジストロフィー、ならびに光傷害、レーザー傷害、炎症性傷害、感染性傷害、放射線傷害、新生血管傷害または外傷性傷害のいずれか１つによって引き起こされた損傷に起因するＲＰＥおよび網膜の損傷が挙げられる。ある特定の実施形態において、網膜の変性を特徴とする症状を処置するためまたは予防するための方法が提供され、その方法は、それを必要とする被験体に、ＲＰＥ細胞を含む有効量の組成物を投与する工程を含む。これらの方法は、これらの症状の１つ以上を有する被験体を選択する工程、ならびにその症状を処置するためおよび／またはその症状の徴候を回復させるために十分な治療有効量のＲＰＥ細胞を投与する工程を含み得る。ＲＰＥ細胞は、様々な形式で移植され得る。例えば、ＲＰＥ細胞は、細胞懸濁物の形態で、またはマトリックス上、細胞外マトリックス上もしくは基材上、例えば、生分解性ポリマー上に、単層として接着された形態で、あるいはその組み合わせで、標的部位に導入され得る。ＲＰＥ細胞はまた、光受容体などの他の網膜細胞とともに移植され得る（同時移植）。いくつかの実施形態において、ＲＰＥ細胞は、処置される被験体由来のｉＰＳＣから作製され、ゆえに、自家性である。他の実施形態において、ＲＰＥ細胞は、ＭＨＣ一致ドナーから作製される。
【０２１０】
ＲＰＥ細胞は、被験体の眼の中の様々な標的部位に導入され得る。いくつかの実施形態において、ＲＰＥ細胞は、哺乳動物におけるＲＰＥの解剖学的な位置（光受容体外節と脈絡膜との間）である眼の網膜下腔に移植などによって導入される。さらに、それらの細胞の遊走能および／または正のパラクリン作用に応じて、眼のさらなる区画（例えば、硝子体腔、網膜の内側または外側、網膜周辺部および脈絡膜内）への導入が、考えられ得る。
【０２１１】
上記細胞は、当該分野で公知の様々な手法によって導入され得る。ＲＰＥ移植を行うための方法は、例えば、米国特許第５，９６２，０２７号、米国特許第６，０４５，７９１号および米国特許第５，９４１，２５０号；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｆｅｂ．２４，２０００；２６８（３）：８４２−６；およびＯｐｔｈａｌｍｉｃ  Ｓｕｒｇ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９９１；２２（２）：１０２−８）に開示されている。角膜移植を行うための方法は、例えば、米国特許第５，７５５，７８５号；Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ａｕｇｕｓｔ  １９９２；３（４）：４７３−８１；Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｓｕｒｇ  Ｌａｓｅｒｓ  Ａｐｒｉｌ  １９９８；２９（４）：３０５−８；およびＯｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  Ａｐｒｉｌ  ２０００；１０７（４）：７１９−２４に記載されている。いくつかの実施形態において、移植は、経毛様体扁平部（ｐａｒｓ  ｐａｎａ）硝子体切除術の後、小さな網膜開口部を通じて網膜下腔に、または直接的な注射によって、ＲＰＥ細胞を送達することによって、行われる。あるいは、ＲＰＥ細胞は、経強膜的、経脈絡膜的アプローチを介して網膜下腔に送達され得る。さらに、硝子体腔（ｖｉｔｒｅａｌ  ｓｐａｃｅ）への直接的な経強膜注射または毛様体に近接した前側の網膜周辺部（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ）への送達が、行われ得る。
【０２１２】
上記細胞はまた、送達デバイスに組み込まれ得る。主にパラクリン作用が用いられるべきである場合、細胞は、宿主免疫系に対するその細胞の曝露を減少させる半透性の容器内に被包された状態で眼に送達され、維持され得る（Ｎｅｕｒｏｔｅｃｈ  ＵＳＡ  ＣＮＴＦ送達系；ＰＮＡＳ．１０３（１０）３８９６−３９０１，２００６）。
【０２１３】
ＲＰＥ細胞は、細胞懸濁物の形態で、細胞外マトリックスなどのマトリックス上に接着された形態で、または生分解性ポリマーなどの基材上に提供された形態で、標的部位に導入され得る。ＲＰＥ細胞はまた、光受容体を有する網膜細胞などの他の細胞とともに移植され得る（同時移植）。したがって、本明細書中に開示される方法によって得られたＲＰＥ細胞を含む組成物が、提供される。いくつかの実施形態において、これらのＲＰＥ細胞は、プロモーターおよびマーカーをコードする核酸に作動可能に連結されたチロシナーゼエンハンサーを含む。他の実施形態において、ＲＰＥ細胞は、第２のマーカーをコードする核酸に作動可能に連結された第２の構成的プロモーターも含む。
【０２１４】
スクリーニング方法およびＲＰＥ細胞の識別
ＲＰＥ細胞を識別するためおよび／またはある細胞がＲＰＥ細胞であることを確かめるための方法も提供される。それらの細胞は、本明細書中に開示される方法を用いて作製され得る。
【０２１５】
ＲＰＥ細胞の分化および／または増殖を変化させる作用物質を同定するための方法が、本明細書中に提供される。いくつかの実施形態において、ＲＰＥ細胞の増殖を変化させる作用物質を同定するための方法が、提供される。それらの方法は、ＲＰＥ細胞を有効量の目的の作用物質と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態において、ＲＰＥの分化を増加させる作用物質を同定するための方法が、提供される。
【０２１６】
追加の実施形態において、ＲＰＥ細胞の生存に影響する作用物質および／またはＲＰＥ細胞における遺伝子の内因性の発現を変化させる作用物質を同定するための方法が、提供される。疾患を処置するための治療薬が、これらの方法を用いて同定され得る。いくつかの実施形態において、ＲＰＥ細胞の上皮の表現型に影響する作用物質を同定するための方法が、提供される。その方法は、ｉＰＳＣ、ＲＰＥまたは胚様体を目的の作用物質と接触させる工程、ならびにＲＰＥ細胞の作製および／または生存および／または表現型をアッセイする工程を含む。その作用物質は、本明細書中に開示される方法の任意の工程に導入され得る。
【０２１７】
本明細書中に開示される方法を用いて作製されたＲＰＥ細胞または他のＲＰＥ細胞もまた、ある作用物質と接触させられ、下記に開示される方法を用いて評価され得る。これらの方法は、遺伝子の発現に影響する作用物質を同定するため、またはＲＰＥ細胞の生存に影響する作用物質を同定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、ＲＰＥ細胞は、ストレッサー（例えば、サプシガルジン、Ａ２３１８７、ＤＬ−ジチオトレイトールまたは２−デオキシ−Ｄ−グルコース）で処理される。
【０２１８】
試験化合物は、化学的化合物、小分子、ポリペプチド、成長因子、サイトカインまたは他の生物学的作用物質（例えば、抗体）を含む、関心のある任意の化合物であり得る。いくつかの例では、潜在的な神経栄養物質のパネルが、スクリーニングされる。他の実施形態では、ポリペプチドバリアントのパネルが、スクリーニングされる。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、目的の作用物質が網膜色素上皮細胞の分化を増加させるかを判定するための方法が、提供される。その方法は、上で開示されたような、網膜色素上皮細胞特異的プロモーターに作動可能に連結された第１のマーカーをコードする核酸を含み、かつ構成的プロモーターに作動可能に連結された第２のマーカーを含む、ヒト人工多能性幹細胞から作製された胚様体を、２つのＷｎｔ経路阻害剤および１つのＮｏｄａｌ経路阻害剤を含む第１の培地中で培養する工程を含む。それらの胚様体は、（ａ）ベータ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含まず、（ｂ）塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）阻害剤、２つのＷｎｔ経路阻害剤および１つのＮｏｄａｌ経路阻害剤を含み；（ｃ）約２０〜約９０ｎｇのＮｏｇｇｉｎを含む第２の培地中の組織培養基材上にプレーティングされることにより、分化中の網膜色素上皮細胞が形成される。それらの分化中の網膜色素上皮細胞は、ＡＣＴＩＶＡＮ  ＡおよびＷＮＴ３ａを含む第３の培地中で培養される。次いで、それらの細胞は、約５％胎児血清、カノニカルＷＮＴ阻害剤、非カノニカルＷＮＴ誘導物質ならびにＳｏｎｉｃ経路およびＦＧＦ経路の阻害剤を含む第４の網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）培地中で培養されることにより、ヒト網膜色素上皮細胞が作製される。好適な方法が、本明細書中に開示される。
【０２２０】
これらの工程のうちの１つ、いくつかまたはすべてが、目的の作用物質の存在下において行われる。網膜色素上皮細胞における第１のマーカーの発現が、第２のマーカーの発現と比較され、ここで、第２のマーカーと比べて、第１のマーカーの発現の増加は、その作用物質が、網膜色素上皮細胞の分化を増加させることを示す。
【０２２１】
所望の活性について試験することができる分子のコンビナトリアルライブラリーを調製するための方法は、当該分野で周知であり、それらとしては、例えば、拘束されたペプチドであり得るペプチドのファージディスプレイライブラリー（例えば、米国特許第５，６２２，６９９号；米国特許第５，２０６，３４７号；Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０，１９９２；Ｍａｒｋｌａｎｄら、Ｇｅｎｅ  １０９：１３−１９，１９９１を参照のこと）、ペプチドライブラリー（米国特許第５，２６４，５６３号）；ＦＤＡに承認された薬物ライブラリー（例えば、Ｈｕａｎｇ，Ｅ；Ｓｏｕｔｈａｌｌ，Ｎ；Ｗａｎｇ，Ｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：１−１２を参照のこと）；ペプチド模倣物ライブラリー（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１４：８３−９２，１９９５）；核酸ライブラリー（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９３：５８８３−５８８７，１９９６；Ｔｕｅｒｋ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５０５−５１０，１９９０；Ｇｏｌｄら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：７６３−７９７，１９９５）；オリゴ糖ライブラリー（Ｙｏｒｋら、Ｃａｒｂ．Ｒｅｓ．２８５：９９−１２８，１９９６；Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１５２０−１５２２，１９９６；Ｄｉｎｇら、Ａｄｖ．Ｅｘｐｔ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３７６：２６１−２６９，１９９５）；リポタンパク質ライブラリー（ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３  ９９：２３  ２−２３  ６，１９９６）；糖タンパク質ライブラリーもしくは糖脂質ライブラリー（Ｋａｒａｏｇｌｕら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３０．５６７−５７７，１９９５）；または例えば薬物もしくは他の医薬品を含む化学物質ライブラリー（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７．１３８５−１４０１，１９９４；Ｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｒｏｏｋｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３５１−３６０，１９９５）を作製する方法が挙げられる。細胞のポリペプチドを含む細胞の標的に対して結合特異性を有する核酸分子が、天然に存在し、そのような特異性を有する合成分子は、容易に調製および同定され得るので、ポリヌクレオチドは、細胞（例えば、ｉＰＳＣ、胚様体およびＲＰＥ細胞であるがこれらに限定されない）の機能を変化させ得る作用物質として特に有用であり得る（例えば、米国特許第５，７５０，３４２号を参照のこと）。
【０２２２】
１つの実施形態において、ハイスループットの形式の場合、ｉＰＳＣ、胚様体またはＲＰＥ前駆体は、マルチウェルプレートまたはスライドガラスまたはマイクロチップのウェルに導入され得、試験物質と接触され得る。一般に、細胞および溶液を操るため、ならびに幹細胞または前駆細胞を、特に、調べている機能に関して、モニターするために、ロボット工学を都合よく使用できるように、それらの細胞は、整列させて、特に、アドレス可能に整列させて、配置される。ハイスループットの形式を使用する利点は、いくつかの試験物質を並行して調べることができる点、および所望であれば、コントロール反応を試験条件と同一の条件下で行うこともできる点である。したがって、本明細書中に開示される方法は、細胞の機能を変化させ得る作用物質、例えば、細胞が所望の細胞型に分化するように誘導する作用物質、または分化、生存および／もしくは細胞増殖に影響する作用物質を同定するために、１つ、数個または多数の試験物質をスクリーニングする手段を提供する。表現型および生存を評価するために、ハイスループットスクリーニングが使用され得る。これらのスクリーニングは、ＲＰＥの表現型および生存に影響し得る薬物を同定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、ＲＰＥの表現型は、蛍光シグナルの喪失／獲得によってアッセイされ、生存は、（例えば、ＡＴＰベースの細胞力価グローアッセイ（ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏｗ  ａｓｓａｙ）によって）アッセイされる。
【０２２３】
これらの方法は、表１、表Ａまたは図２７Ｃに列挙されている遺伝子のうちの１つ以上の発現を評価する工程を含み得る。いくつかの実施形態において、表１に列挙されている遺伝子のうちの５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、３６０、３７０個またはすべての発現が、評価され得る。これらのいずれの方法の場合も、ＭＩＴＦ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００２４８）、ＰＡＸ６（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００２８０）、ＬＨＸ２（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００４７８９）、ＴＦＥＣ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０１２２５２）、ＣＤＨ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００４３６０）、ＣＤＨ３（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００１７９３）、ＣＬＤＮ１０（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿１８２８４８）、ＣＬＤＮ１６（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００６５８０）、ＣＬＤＮ１９（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿１４８９６０）、ＢＥＳＴ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００４１８３）、ＴＩＭＰ３（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００３６２）、ＴＲＰＭ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２４２０）、ＴＲＰＭ３（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０２０９５２）、ＴＴＲ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００３７１）、ＶＥＧＦＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００３３７６）、ＣＳＰＧ５（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００６５７４）、ＤＣＴ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００１９２２）、ＴＹＲＰ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００５５０）、ＴＹＲ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００３７２）、ＳＩＬＶ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００６９２８）、ＳＩＬ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０２２４６４）、ＭＬＡＮＡ（ＮＭ＿００５５１１）、ＲＡＢ２７Ａ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿１８３２３６）、ＯＣＡ２（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００２７５）、ＧＰＲ１４３（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００２７３）、ＧＰＮＭＢ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２５１０）、ＭＹＯ６（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００４９９９）、ＭＹＲＩＰ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０１５４６０）、ＲＰＥ６５（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００３２９）、ＲＢＰ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２８９９）、ＲＢＰ４（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００６７４４）、ＲＤＨ５（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２９０５）、ＲＤＨ１１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０１６０２６）、ＲＬＢＰ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００３２６）、ＭＥＲＴＫ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００６３４３）、ＡＬＤＨ１Ａ３（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００６９３）、ＦＢＬＮ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００１９９６）、ＳＬＣ１６Ａ１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００３０５１）、ＫＣＮＶ２（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿１３３４９７）、ＫＣＮＪ１３（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２２４２）およびＣＦＴＲ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００４９２）のＲＮＡまたはタンパク質のうちの１つ以上の発現が、評価される。２０１３年１月３１日に入手可能であるとおりのＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）の開示が、参照により本明細書中に援用される。上記作用物質と接触していないｉＰＳＣまたは胚様体と比べたときの、上記作用物質に曝露した後の１つ以上のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の増加は、その作用物質が、ＲＰＥ細胞の分化、生存および／または増殖に影響すること、詳細には、ＲＰＥ細胞の分化、生存および／または増殖を増加させることを示唆する。上記作用物質と接触していないｉＰＳＣまたは胚様体と比べたときの、上記作用物質に曝露した後の１つ以上のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の減少は、その作用物質が、ＲＰＥ細胞の分化、生存および／または増殖に影響すること、詳細には、ＲＰＥ細胞の分化、生存および／または増殖を減少させることを示唆する。
【０２２４】
他の実施形態において、これらのｍＲＮＡまたはタンパク質のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３８、３９、４０個またはすべてが、評価される。これらのｍＲＮＡまたはタンパク質のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３８、３９、４０個またはすべての発現の増加は、その作用物質が、ＲＰＥ細胞の分化、生存および／または増殖を増加させることを示唆する。これらのｍＲＮＡまたはタンパク質のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３８、３９、４０個またはすべての発現の減少は、その作用物質が、ＲＰＥ細胞の分化、生存および／または増殖を減少させることを示唆する。
【０２２５】
いくつかの実施形態において、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、ＴＦＥＣ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＬＤＮ１０、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１９、ＢＥＳＴ１、ＴＩＭＰ３、ＴＲＰＭ１、ＴＲＰＭ３、ＴＴＲ、ＶＥＧＦＡ、ＣＳＰＧ５、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＴＹＲ、ＳＩＬＶ、ＳＩＬ１、ＭＬＡＮＡ、ＲＡＢ２７Ａ、ＯＣＡ２、ＧＰＲ１４３、ＧＰＮＭＢ、ＭＹＯ６、ＭＹＲＩＰ、ＲＰＥ６５、ＲＢＰ１、ＲＢＰ４、ＲＤＨ５、ＲＤＨ１１、ＲＬＢＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＦＢＬＮ１、ＳＬＣ１６Ａ１、ＫＣＮＶ２、ＫＣＮＪ１３およびＣＦＴＲの発現が、評価される。発現の増加は、その作用物質が、ＲＰＥ細胞の分化、生存または増殖を増加させることを示唆する。発現の減少は、その作用物質が、ＲＰＥ細胞の分化、生存または増殖を減少させることを示唆する。これらのマーカーの１つまたは組み合わせの発現もまた、ある細胞がＲＰＥ細胞であることを確かめるために使用され得る。
【０２２６】
追加の実施形態において、表２に列挙されているｍｉＲＮＡのうちの少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５個または９６個すべての発現が、評価される。さらなる実施形態において、ｍｉＲ２０４（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＲ＿０２９６２１．１，２０１２年１２月９日，参照により本明細書中に援用される）および／またはｍｉＲ２１１（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＲ＿０２９６２４．１，２０１２年９月２３日，参照により本明細書中に援用される）の産生が、評価される。これらのマイクロＲＮＡの一方または両方の産生の増加は、その作用物質が、ＲＰＥ細胞の分化および／もしくは増殖に影響することを示唆するか、またはその細胞がＲＰＥであることを確証させる。発現の増加は、その作用物質が、ＲＰＥ細胞の分化、生存または増殖を増加させることを示唆する。発現の減少は、その作用物質が、ＲＰＥ細胞の分化、生存または増殖を減少させることを示唆する。これらのｍｉＲＮＡは、上に開示された核酸を検出するための例示的な方法を用いて、検出され得る。
【０２２７】
他の実施形態において、表３に列挙されている遺伝子のうちの１つ以上の発現もまた、評価される。これらの遺伝子の発現は、対照基準などのコントロールとして使用され得る。したがって、いくつかの実施形態において、これらの遺伝子の発現は、目的の作用物質の存在下でも変化しない。これらの遺伝子は、対照基準としても使用され得る。
【０２２８】
なおも他の実施形態において、図２７Ｃに列挙されている分子のうちの１つ以上の発現が、評価される。したがって、いくつかの実施形態において、図２７Ｃに列挙されている分子のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個が、評価される。追加の実施形態において、表Ａに列挙されている分子のうちの１つ以上の発現が、評価される。表Ａに列挙されている分子のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６または３７個の発現が、評価され得る。
【０２２９】
なおも他の実施形態において、ＳＯＸ２（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００３１０６）、ＰＡＸ６（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００１６０４）、ＲＰＥ６５（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００３２９）、ＲＤＨ５（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００３２９）、ＴＲＰＭ１（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２４２０）およびＢＥＳＴ１（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００４１８３）のうちの１つ以上の発現が、評価される（２０１３年１月３１日に入手可能であるとおりのＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション情報のすべてが、参照により援用される）。いくつかの実施形態において、未分化なｉＰＳＣと比べて、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥは、より低レベルの神経前駆体因子ＳＯＸ２、ならびにより高レベルのＲＰＥ特異的遺伝子ＰＡＸ６、ＲＰＥ６５、ＲＤＨ５、ＴＲＰＭ１およびＢＥＳＴ１を発現する。
【０２３０】
上記方法は、目的の作用物質が、ｉＰＳＣからＲＰＥ細胞への分化を増加させるかを判定する工程を含み得る。その作用物質が、ＲＰＥ細胞への分化を増加させる場合、コントロールと比べて、そのサンプルにおいて、ＳＯＸ２の発現は減少し、かつＰＡＸ６、ＲＰＥ６５、ＲＤＨ５、ＴＲＰＭ１およびＢＥＳＴ１の発現は増加する。別の実施形態において、コントロールと比べて、そのサンプルにおいて、ＳＯＸ２の発現は減少し、かつＰＡＸ６、ＲＰＥ６５、ＲＤＨ５、ＴＲＰＭ１およびＢＥＳＴ１のうちの２、３、４または５つの発現が、増加する。そのコントロールは、標準的な値であり得るか、またはＲＰＥ細胞への分化を増加させないと知られている作用物質と接触されたサンプルであり得る。それらの方法は、目的の作用物質が、ｉＰＳＣからＲＰＥ細胞への分化を減少させるがゆえに、そのｉＰＳＣを未分化な状態で維持するかを判定するも含み得る。その作用物質が、ＲＰＥ細胞への分化を減少させる場合、コントロールと比べて、ＳＯＸ２の発現は増加し、かつＰＡＸ６、ＲＰＥ６５、ＲＤＨ５、ＴＲＰＭ１およびＢＥＳＴ１の発現は減少する。別の実施形態において、その作用物質が、ＲＰＥ細胞への分化を減少させた場合、コントロール比べて、そのサンプルにおいて、ＳＯＸ２の発現は増加し、かつＰＡＸ６、ＲＰＥ６５、ＲＤＨ５、ＴＲＰＭ１およびＢＥＳＴ１のうちの２、３、４または５つの発現は減少する。そのコントロールは、標準的な値であり得るか、またはＲＰＥ細胞への分化を増加させると知られている作用物質と接触された（ｃｏｎｓｔｒｕｅｄ）サンプルであり得る。例示的な非限定的なアッセイが、実施例８に開示される。
【０２３１】
核酸は、当該分野で公知の任意の方法によって検出され得る。いくつかの例において、核酸は、検出の前に、単離されるか、増幅されるか、またはその両方が行われる。ある例において、細胞またはその画分（例えば、精製された核酸）が、１つ以上のｍＲＮＡの増幅を可能にするプライマーとともに、そのような産物の増幅を可能にするのに十分な条件下でインキュベートされ得る。例えば、生物学的サンプルは、開示される核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の１つ以上に結合し得るプライマーまたはプローブとともに、高ストリンジェンシー条件下でインキュベートされる。次いで、得られたハイブリダイゼーションは、当該分野で公知の方法を用いて検出され得る。
【０２３２】
核酸サンプルは、増幅され得る。定量的な結果が望まれる場合、増幅された核酸の相対的な頻度に対して維持するかまたは調節する方法が、用いられる。「定量的」増幅の方法は、当業者に周知である。例えば、定量的ＰＣＲは、同じプライマーを使用して、既知量のコントロール配列を同時に共増幅することを含む。これにより、そのＰＣＲ反応を較正するために使用され得る内標準が提供される。次いで、アレイは、増幅された核酸の定量のための内標準に特異的なプローブを含み得る。
【０２３３】
好適な増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０を参照のこと）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０，１９８９；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７，１９８８；およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら、Ｇｅｎｅ  ８９：１１７，１９９０を参照のこと）、転写増幅（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１１７３，１９８９）および自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１８７４，１９９０）が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、サンプルｍＲＮＡは、逆転写酵素ならびにオリゴｄＴおよびファージＴ７プロモーターをコードする配列からなるプライマーを用いて逆転写されることにより、一本鎖ＤＮＡ鋳型（「第１鎖（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ）」と呼ばれる）が提供される。第２のＤＮＡ鎖は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して重合される。二本鎖ｃＤＮＡの合成の後、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが加えられ、そのｃＤＮＡ鋳型からＲＮＡが転写される。単一の各ｃＤＮＡ鋳型からの連続した数回の転写によって、増幅されたＲＮＡがもたらされる。
【０２３４】
インビトロで重合する方法は、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出；Ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１６６３−１６６７，１９９０を参照のこと）。直接的な転写方法は、アンチセンス（ａＲＮＡ）プールを提供する。アンチセンスＲＮＡが、標的核酸として使用される場合、アレイとして提供されるオリゴヌクレオチドプローブは、そのアンチセンス核酸の部分配列に対して相補的であるように選択される。逆に、標的核酸プールが、センス核酸のプールである場合、そのオリゴヌクレオチドプローブは、そのセンス核酸の部分配列に対して相補的であるように選択される。最後に、核酸プールが、二本鎖である場合、プローブは、標的核酸がセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含むので、いずれかのセンスであってよい。
【０２３５】
１つの実施形態において、ハイブリダイズされた核酸は、サンプル核酸に付着された１つ以上の標識を検出することによって検出される。それらの標識は、いくつかの任意の方法によって組み込まれ得る。１つの例において、標識は、サンプル核酸の調製における増幅工程中に同時に組み込まれる。したがって、例えば、標識されたプライマーまたは標識されたヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標識された増幅産物を提供し得る。１つの実施形態において、標識されたヌクレオチド（例えば、フルオレセイン標識されたＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を使用する、上に記載されたような転写増幅は、転写された核酸に標識を組み込む。いくつかの実施形態において、マルチプレックスＰＣＲアッセイが、使用される。そのアッセイは、マルチプレックスアッセイであり得る。
【０２３６】
遺伝子発現の発現を評価するための例示的なアッセイが、図２７に示されている。このアッセイでは、第１の目的の遺伝子に特異的な第１のプローブが、第１の検出可能なビーズに付着されている。このアッセイが、マルチプレックスアッセイになるように、追加の（Ａｄｄｉｔｉｏｎ）プローブが、このアッセイに含められ得る。したがって、このアッセイは、第２の検出可能な標識に付着された第２の目的の遺伝子に特異的な第２のプローブ、第３の検出可能な標識に付着された第３の目的の遺伝子に特異的な第３のプローブなどを含み得る（ａｎ  ｉｎｃｌｕｄｅ）。いくつかの実施形態において、単一ウェルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のプローブを含み得、そのプローブの各々が、異なる目的の遺伝子に特異的であり、各々が、ユニークな検出可能な標識に付着される。この様式では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個の遺伝子の発現を、各アッセイにおいて評価することができる。例示的なプローブは、図２７Ｂに示されている。
【０２３７】
あるいは、標識は、元の核酸サンプル（例えば、ｍＲＮＡ、ポリＡ  ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）または増幅が完了した後の増幅産物に、直接付加され得る。核酸に標識を付着させる手段は、当業者に周知であり、それらとしては、例えば、ニックトランスレーションまたは核酸のリン酸化（ｋｉｎａｓｉｎｇ）による末端標識（例えば、標識されたＲＮＡを用いる）、およびそれに続く、サンプル核酸を標識（例えば、フルオロフォア）につなぎ合わせる核酸リンカーの付着（ライゲーション）が挙げられる。
【０２３８】
用途に適した検出可能な標識としては、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物が挙げられる。有用な標識としては、標識されたストレプトアビジン結合体で染色するためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡにおいて通常使用されるその他の酵素）および比色標識（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｌａｂｅｌｓ）（例えば、コロイド金または色ガラス）またはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズが挙げられる。そのような標識の使用を教示している特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；米国特許第３，８５０，７５２号；米国特許第３，９３９，３５０号；米国特許第３，９９６，３４５号；米国特許第４，２７７，４３７号；米国特許第４，２７５，１４９号；および米国特許第４，３６６，２４１号が挙げられる。
【０２３９】
そのような標識を検出するための手段もまた、周知である。したがって、例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出され得、蛍光マーカーは、放射光を検出する光検出器を用いて検出され得る。酵素標識は、代表的には、その酵素に基質を提供して、その基質に対する酵素の作用によって生成される反応産物を検出することによって検出され、比色標識は、単純に有色の標識を可視化することによって検出される。
【０２４０】
標識は、ハイブリダイゼーションの前または後に標的（サンプル）核酸に付加され得る。いわゆる「直接的な標識」は、ハイブリダイゼーションの前に標的（サンプル）核酸に直接付着されるまたは組み込まれる検出可能な標識である。対照的に、いわゆる「間接的な標識」は、ハイブリダイゼーション後にハイブリッド二重鎖につなぎ合わされる。しばしば、間接的な標識は、ハイブリダイゼーションの前に標的核酸に付着されている結合部分に付着される。したがって、例えば、標的核酸は、ハイブリダイゼーションの前にビオチン化され得る。ハイブリダイゼーション後に、アビジンに結合体化されたフルオロフォアが、ビオチンを有するハイブリッド二重鎖に結合して、容易に検出される標識がもたらされ得る（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９３を参照のこと）。
【０２４１】
核酸ハイブリダイゼーションは、単純に、プローブおよびその相補的な標的が、相補的な塩基対形成によって、安定したハイブリッド二重鎖を形成し得る条件下に、変性されたプローブおよび標的核酸を提供する工程を含む。次いで、ハイブリッド二重鎖を形成しない核酸が、洗浄除去されて、代表的には付着された検出可能な標識の検出によって検出されるハイブリダイズした核酸が残る。核酸は、温度を上げることによってまたはその核酸を含む緩衝液の塩濃度を下げることによって、変性されることが広く認識されている。低ストリンジェンシー条件下（例えば、低温および／または高塩）では、アニールした配列が完璧に相補的でない場合でさえ、ハイブリッド二重鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡまたはＲＮＡ：ＤＮＡ）が形成され得る。したがって、より低いストリンジェンシーでは、ハイブリダイゼーションの特異性は低下する。逆に、より高いストリンジェンシー（例えば、より高い温度またはより少ない塩）では、ハイブリダイゼーションの成功には、より少ないミスマッチが要求される。
【０２４２】
当業者は、ハイブリダイゼーション条件が、種々の程度のストリンジェンシーを提供するようにデザインされ得ることを認識するだろう。１つの実施形態において、ハイブリダイゼーションは、確実にハイブリダイゼーションが行われるために、低ストリンジェンシー、この場合、３７℃の６×ＳＳＰＥ−Ｔ（０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）において行われ、次いで、ミスマッチのハイブリッド二重鎖を排除するために、その後の洗浄が、より高いストリンジェンシー（例えば、３７℃の１×ＳＳＰＥ−Ｔ）において行われる。所望のレベルのハイブリダイゼーションの特異性が得られるまで、徐々にストリンジェンシーを高めながら（例えば、３７℃から５０℃において、０．２５×ＳＳＰＥ−Ｔもの低さにまで低下させて）、連続した洗浄が行われ得る。ストリンジェンシーは、ホルムアミドなどの作用物質を加えることによっても、高められ得る。ハイブリダイゼーションの特異性は、試験プローブへのハイブリダイゼーションと、存在し得る様々なコントロール（例えば、発現レベルコントロール、正規化コントロール、ミスマッチコントロールなど）へのハイブリダイゼーションとの比較によって評価され得る。
【０２４３】
一般に、ハイブリダイゼーションの特異性（ストリンジェンシー）とシグナル強度との間には、相反関係が存在する。したがって、１つの実施形態において、洗浄は、一貫した結果をもたらし、バックグラウンド強度のおよそ１０％より高いシグナル強度を提供する最も高いストリンジェンシーで行われる。したがって、ハイブリダイズされたアレイは、引き続いてより高いストリンジェンシー溶液で洗浄され得、各洗浄の間に読み出され得る。このようにして生成されたデータセットの解析は、ハイブリダイゼーションパターンが感知できるほど変化しない、目的の特定のオリゴヌクレオチドプローブに対して適切なシグナルを提供する、上記の洗浄のストリンジェンシーを明らかにするだろう。これらの工程は、商業的に入手可能なアレイシステムに対して標準化されている。
【０２４４】
ハイブリダイゼーションの結果を評価するための方法は、使用された特異的なプローブ核酸ならびに提供されたコントロールの性質によって変化する。１つの実施形態では、各プローブに対する蛍光強度の単純な定量が行われる。これは、アレイ上の（異なるプローブに相当する）各位置におけるプローブのシグナル強度を計測することによって単純に達成される（例えば、その標識が、蛍光標識である場合、アレイ上の各位置における規定の励起照度によってもたらされる蛍光（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）の量（強度）の検出）。「試験」サンプル由来（例えば、治療プロトコルで処置された患者由来）の核酸にハイブリダイズされたアレイの絶対強度と、「コントロール」サンプル（例えば、その治療プロトコルで処置される前の同じ患者由来）によって生成された強度との比較によって、各プローブにハイブリダイズする核酸の相対的な発現の尺度が提供される。
【０２４５】
例えば、これらの方法によって検出される発現の変化は、例えば、異なる治療に対して異なり得、その変化には、そのような核酸のレベル（量）もしくは機能活性、それらのタンパク質への発現もしくは翻訳、またはそれらの局在化もしくは安定性の増加または減少が含まれ得る。増加または減少は、例えば、特定の核酸の発現の約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍の変化（増加または減少）であり得る。
【０２４６】
いくつかの例において、ある作用物質の有効性、またはＲＰＥ細胞の作製、またはＲＰＥ細胞の識別は、単離された核酸分子をアレイに適用することによって行われ、ここで、その単離された核酸分子は、目的の作用物質で処理した後などに、ＲＰＥ細胞を含む生物学的サンプルから得られる。そのような例において、アレイは、上に開示された核酸に相補的なオリゴヌクレオチドを含む。
【０２４７】
ある例において、単離された核酸分子は、単離された核酸分子とオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な時間にわたって、上に開示された核酸分子に相補的なオリゴヌクレオチドを含むアレイとともにインキュベートされ、それにより、単離された核酸分子：オリゴヌクレオチド複合体が形成される。次いで、単離された核酸分子：オリゴヌクレオチド複合体を解析することにより、その単離された核酸分子の発現が変化しているかが判定される。そのような例では、ある作用物質を評価することにより、それが、コントロール（その作用物質と接触していないそのような細胞）または参照値と比べて、分子の発現に影響するかが調べられる。
【０２４８】
ＲＰＥ細胞を作製するためまたはＲＰＥ細胞を識別するための作用物質の有効性を識別するために使用され得る遺伝子発現プロファイルが、本明細書中に開示される。ある例では、その遺伝子発現プロファイルは、上に列挙された分子のうちの少なくとも２つ（例えば、列挙された分子のうちの少なくとも５つ、少なくとも７つ、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個またはすべて）を含む。いくつかの例において、遺伝子発現プロファイルは、少なくとも２つ、少なくとも５つ、少なくとも７つ、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個または少なくとも４０個の分子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個または４１個すべての分子）を含む。１つの具体的で非限定的な例において、遺伝子発現プロファイルは、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、ＴＦＥＣ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＬＤＮ１０、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１９、ＢＥＳＴ１、ＴＩＭＰ３、ＴＲＰＭ１、ＴＲＰＭ３、ＴＴＲ、ＶＥＧＦＡ、ＣＳＰＧ５、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＴＹＲ、ＳＩＬＶ、ＳＩＬ１、ＭＬＡＮＡ、ＲＡＢ２７Ａ、ＯＣＡ２、ＧＰＲ１４３、ＧＰＮＭＢ、ＭＹＯ６、ＭＹＲＩＰ、ＲＰＥ６５、ＲＢＰ１、ＲＢＰ４、ＲＤＨ５、ＲＤＨ１１、ＲＬＢＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＦＢＬＮ１、ＳＬＣ１６Ａ１、ＫＣＮＶ２、ＫＣＮＪ１３およびＣＦＴＲを含む。
【０２４９】
さらなる実施形態において、遺伝子発現プロファイルは、表２に列挙されているｍｉＲＮＡのうちの少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５個または９６個すべてを含む。１つの具体的で非限定的な例において、遺伝子発現プロファイルは、ｍｉＲ２０４およびｍｉＲ２１１を含む。さらなる実施形態において、遺伝子発現プロファイルは、表１および表２に列挙されているマーカーのうちの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５個またはすべてを含む。この発現プロファイルは、ＲＰＥ細胞を検出するため、および／またはある細胞がＲＰＥ細胞であることを確かめるために使用され得る。
【０２５０】
核酸の存在についてサンプルを解析するための代替案として、タンパク質の存在が、測定され得る。タンパク質は、当該分野で公知の任意の方法によって検出され得る。いくつかの例において、タンパク質は、検出前に精製される。例えば、発現を検出するために、ある作用物質の作用は、ｉＰＳＣ、胚様体またはＲＰＥ細胞などの細胞を、上に列挙された分子のうちの１つに特異的に結合する１つ以上の抗体とともに、免疫複合体を形成するのに十分な長さの時間にわたってインキュベートすることによって、測定され得る。１次抗体は、検出可能な標識を含み得る。例えば、１次抗体が、直接標識され得るか、またはその後に、サンプルが、標識された（例えば、蛍光標識で）二次抗体とともにインキュベートされ得る。次いで、その標識が、例えば、顕微鏡法、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｙ）または分光測定法によって、検出され得る。別の例において、生物学的サンプルは、ウエスタンブロッティングによって、特定の分子の存在または非存在について解析される。他の例では、生物学的サンプルは、質量分析によって、特定の分子の存在または非存在について解析される。他の例では、上に列挙された分子に特異的に結合する第１の抗体は、標識されず、第１の抗体に特異的に結合し得る第２の抗体または他の分子が、標識される。当業者に周知であるように、第１の抗体の特定の種およびクラスに特異的に結合することができる第２の抗体が、選択される。例えば、第１の抗体が、ヒトＩｇＧである場合、二次抗体は、抗ヒトＩｇＧであり得る。抗体に結合し得る他の分子としては、プロテインＡおよびプロテインＧ（これらの両方ともが商業的に入手可能である）が挙げられるがこれらに限定されない。二次抗体は、免疫複合体を形成するのに十分な時間にわたって、細胞とともにインキュベートされる。
【０２５１】
抗体または二次抗体にとって好適な標識としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、磁性物質および放射性材料が挙げられる。好適な酵素の非限定的な例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族複合体の非限定的な例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。好適な蛍光材料の非限定的な例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる。非限定的な例示的な発光材料は、ルミノールであり；非限定的な例示的な磁性物質は、ガドリニウムであり、非限定的な例示的な放射性標識としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０２５２】
代替の例において、生物学的サンプル中のタンパク質は、検出可能な物質、および所望の分子に特異的に結合する未標識の抗体で標識されたタンパク質標準物質（分子）を使用する競合イムノアッセイによってアッセイされ得る。このアッセイでは、細胞、標識された分子標準物質およびその分子に特異的に結合する抗体が、混和され、未標識の抗体に結合した標識された分子標準物質の量が、測定される。生物学的サンプル中の分子の量は、その分子に特異的に結合する抗体に結合した標識された分子標準物質の量に反比例する。
【０２５３】
なおも他の実施形態では、細胞の静止電位が評価される。いくつかの実施形態において、約−５０〜約−６０ｍＶの静止電位および約５〜約１０μｌｃｍ−２ｈ−１の流体輸送速度は、その細胞がＲＰＥ細胞であることを示す。追加の実施形態において、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、ＴＦＥＣ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＬＤＮ１０、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１９、ＢＥＳＴ１、ＴＩＭＰ３、ＴＲＰＭ１、ＴＲＰＭ３、ＴＴＲ、ＶＥＧＦＡ、ＣＳＰＧ５、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＴＹＲ、ＳＩＬＶ、ＳＩＬ１、ＭＬＡＮＡ、ＲＡＢ２７Ａ、ＯＣＡ２、ＧＰＲ１４３、ＧＰＮＭＢ、ＭＹＯ６、ＭＹＲＩＰ、ＲＰＥ６５、ＲＢＰ１、ＲＢＰ４、ＲＤＨ５、ＲＤＨ１１、ＲＬＢＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＦＢＬＮ１、ＳＬＣ１６Ａ１、ＫＣＮＶ２、ＫＣＮＪ１３およびＣＦＴＲを発現し、ｍｉＲ２０４およびｍｉＲ２１１を発現し、かつ約−５０〜約−６０ｍＶの静止電位を有する細胞の作製。ある特定の実施形態において、目的の作用物質との接触後の、これらの特徴を有する細胞の数の増加は、その作用物質が、ＲＰＥ細胞の増殖および／または分化を増加させることを示す。
【０２５４】
追加の実施形態において、細胞の流体輸送が、測定される。細胞の流体輸送は、静電容量計を使用して計測され得る。いくつかの実施形態において、単層組織として生育された細胞は、改変されたＵｓｓｉｎｇｓチャンバーにマウントされ、電気容量を計測する探針が、使用される。細胞層のいずれかの側の流体の体積が変化する場合、それらの探針の電気容量は、変化する。これは、体積の変化および流体の流れを計算するために使用され得る。いくつかの例において、約５〜約１０μｌｃｍ−２ｈ−１の流体輸送速度などの約５〜約１５μｌｃｍ−２ｈ−１の流体輸送速度は、その細胞がＲＰＥ細胞であることを示す。
【０２５５】
細胞が頂端側のＡＴＰ処理または基底側のＩＦＮガンマ処理によって流体の流れを可逆的に増加させる能力が、計測され得る。これらの応答の両方ともが、基底側上の塩素チャネルを阻害することによって阻害され得る。これらの特性は、その細胞がＲＰＥ細胞である（ａｓ）ことを判定するために使用され得る。
【０２５６】
さらなる例において、細胞の分極が、評価される。したがって、いくつかの実施形態において、ＲＰＥ細胞の頂端表面の選択的なＣＯ２透過性が、計測される。光受容体は、高濃度のＣＯ２を頂端表面に向かって分泌する（Ａｄｉｊａｎｔｏら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００９  Ｊｕｎ；１３３（６）：６０３−２２）。ゆえに、この表面は、ＣＯ２を捕捉するために進化的に選択されてきた。この機能は、ＲＰＥ細胞（例えば、トランスウェルにおいて成長しているＲＰＥ細胞）の頂端バスまたは基底バス内のＣＯ２濃度を変化させることによって、インビトロで計測され得る。ＲＰＥ細胞が、ＣＯ２を捕捉する場合、それらの細胞は、ｐＨの低下によって応答し、それは、レシオメトリック色素によって計測され得る。
【０２５７】
１つの具体的で非限定的な例では、多孔性のポリエステル膜上で生育されたＲＰＥ単層を、８μＭ  ＢＣＥＣＦ−ＡＭを含むリンガー液中でインキュベートする。ＢＣＥＣＦ−ＡＭとのインキュベーションの後、その組織を、コントロール（５％ＣＯ２）リンガー中でさらに３０分間インキュベートした後、改変Ｕｓｓｉｎｇチャンバーにマウントした。そのＵｓｓｉｎｇチャンバーは、２０×対物レンズを備えたａｘｉｏｖｅｒｔ−２００顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）のステージ上に載せられている。そのＲＰＥは、リンガー液（３６．５℃において５％ＣＯ２で平衡化されている）で連続的に灌流される。励起光子（４４０／４８０ｎｍ）を、キセノン光源によって生成し、モノクロメーター（Ｐｏｌｙｃｈｒｏｍｅ  ＩＶ；Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を用いて特定の波長を選択する。放射蛍光シグナルは、光電子増倍管（Ｔｈｏｒｎ  ＥＭＩ）で捕捉される。ｐＨｉの較正は、２０μＭナイジェリシンを含む高Ｋ較正溶液（ｐＨ６．８、７．２および７．６において）を両方の溶液バスに灌流することによって行われる。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、ＲＰＥ細胞の電気的特性の変化が、計測され得る。いくつかの具体的で非限定的な例において、ＲＰＥ細胞は、多孔性のポリエステル膜上で単層として生育される。経上皮電位は、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーの頂端バスおよび基底バスの中に配置されたリンガー液寒天（４％ｗｔ／ｖｏｌ）橋と直列のカロメル電極対を用いて計測される。そのＴＥＰの記録は、３秒の移動平均である。経上皮抵抗をオームの法則から計算した。
【数１】
2019017394.tif 000016
【０２５９】
光が、ＲＰＥ細胞における光受容体にあたると、その光受容体は、カリウム（Ｋ）チャネルを閉じることによって脱分極する（Ｍｉｌｌｅｒら（ｅｄ）．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｙｅ，ＥＬＳＥＶＩＥＲを参照のこと）。これにより、光受容体とＲＰＥとの間（網膜下腔）のＫイオンの濃度が５ｍＭから１ｍＭに低下する。ＲＰＥ細胞は、過分極してＫチャネルを開けることにより、網膜下のＫ濃度を５Ｍｍに再上昇させることによって、この濃度の変化に応答する。１〜５ｍＭの範囲は、その細胞がＲＰＥ細胞であることを示す。
【０２６０】
さらなる実施形態において、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、ＴＦＥＣ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＬＤＮ１０、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１９、ＢＥＳＴ１、ＴＩＭＰ３、ＴＲＰＭ１、ＴＲＰＭ３、ＴＴＲ、ＶＥＧＦＡ、ＣＳＰＧ５、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＴＹＲ、ＳＩＬＶ、ＳＩＬ１、ＭＬＡＮＡ、ＲＡＢ２７Ａ、ＯＣＡ２、ＧＰＲ１４３、ＧＰＮＭＢ、ＭＹＯ６、ＭＹＲＩＰ、ＲＰＥ６５、ＲＢＰ１、ＲＢＰ４、ＲＤＨ５、ＲＤＨ１１、ＲＬＢＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＦＢＬＮ１、ＳＬＣ１６Ａ１、ＫＣＮＶ２、ＫＣＮＪ１３およびＣＦＴＲを発現し、ｍｉＲ２０４およびｍｉＲ２１１を発現し、約−５０〜約−６０ｍＶの静止電位を有し、約５〜約１０μｌｃｍ−２ｈ−１ｉの流体輸送速度を有する細胞の作製。ある特定の実施形態において、目的の作用物質との接触後の、これらの特徴を有する細胞の数の増加は、その作用物質が、ＲＰＥ細胞の増殖および／または分化を増加させることを示す。
【０２６１】
本開示は、以下の非限定的な実施例によって例証される。
【実施例】
【０２６２】
実施例１
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）に分化させるための例示的な材料および方法
ｈｉＰＳＣの維持および継代
【０２６３】
・ｈｉＰＳＣを、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）培地＋塩基性線維芽細胞成長因子（添加したばかりのｂＦＧＦ）中のｇ線照射されたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上で生育する。
【０２６４】
・ｈｉＰＳＣに毎日、ｈＥＳ培地＋ｂＦＧＦ（添加したばかり）を、Ｐ６の１ウェルあたり１．５ｍｌという１０ｎｇ／ｍｌという最終濃度まで供給する。
【０２６５】
・ｈｉＰＳＣコロニーが、８０％コンフルエントになったら、継続した継代のために新しいＭＥＦ上に、それらを分割する（１：６）（例えば、６ウェルの１枚のＰ６プレートが、６枚のＰ６プレートに拡大される）。
ｈＥＳ培地を吸引する。
ＰＢＳで１回洗浄する。
１ｍｌのＣＴＫを加え、＋３７Ｃ恒温器内に１０分間置く（時間は、ｉＰＳＣ株によって変動する）。
ＣＴＫを吸引する（コロニーがなおもプレートに接着しているか確かめる）。
Ｃａ／Ｍｇを含まない２ｍｌのＰＢＳを加え、＋３７Ｃ恒温器内に５分間置く。
ＰＢＳを吸引し、さらに２ｍｌのＰＢＳを加え、＋３７Ｃ恒温器内に５分間置く。
ＰＢＳを吸引する（ＭＥＦが、ＰＢＳ中に優先的に引き上げられる）。
１ｍｌのｈＥＳ培地＋（１０ｎｇ／ｍｌ）ｂＦＧＦ（添加したばかり）＋（１０μＭ）Ｒｏｃｋ阻害剤（ＲＩ）（添加したばかり）をＰ６の各ウェルに加える。
１ｍｌピペットマンを使用して、静かに上下にピペット操作することにより、プレートからコロニーを取り出し（シングルセルとならないように努める）；細胞を清浄なチューブに移し；さらなる１ｍｌのｈＥＳ培地＋ｂＦＧＦ＋ＲＩを各ウェルに加え、プレートを回転させ、上下にピペット操作することにより、残っているコロニーをほぐし；細胞を同じチューブに移し；適切な体積のｈＥＳ＋ｂＦＧＦ＋ＲＩ培地を細胞に加える（６枚のＰ６プレートでは、５４ｍｌが必要である）。
ＭＥＦプレートからフィーダー培地を吸引する。
Ｐ６の１ウェルあたり１．５ｍｌの細胞を分配する。
（Ｒｅｈら、２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００１  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ）。
【０２６６】
・ｈｉＰＳＣコロニーが、７０％コンフルエントになったら、胚様体（ＥＢ）を調製する。
ｈＥＳ培地を吸引する。
ＰＢＳで１回洗浄する。
Ｐ６の１ウェルあたり１ｍｌの１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼを加え、＋３７Ｃ恒温器内に１５分間置く。
コラゲナーゼを吸引し、１ｍｌのＤＭＥＭを加える。
コロニーが壊れてシングルセルにならないように注意しながら、セルリフター（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３００８）を用いて静かにコロニーを掻き取る。
１ｍｌピペットマンを用いて、６つすべてのウェルの内容物を１本の１５ｍｌコニカルチューブに移す。
さらに１ｍｌのＤＭＥＭを各ウェルに加え、そのプレートを回転させ、セルリフターを用いて、残っているコロニーを静かに掻き取り；６つすべてのウェルの内容物を同じチューブに移す（約１２ｍｌのＤＭＥＭ／チューブ）。
細胞凝集物をチューブの底に沈ませる（約２〜５分間または培地が透明になるまで）。
上清（シングルセルおよびＭＥＦを含む）を吸引し、細胞凝集物を１０ｍｌのＤＭＥＭで洗浄し；凝集物が大きすぎる場合（開始時のｉＰＳＣコロニーのサイズに依存する）、１０ｍｌピペットで３〜５回上下にピペット操作することにより、凝集物を破壊し；それらをより小さい凝集塊に破壊する。２００〜５００個の細胞を含むより小さい細胞凝集塊は、より大きな凝集塊と比べて、より高効率でＲＰＥを作製する。より大きな凝集塊は、プレーティングされると、高効率でＲＰＥを形成しない３次元構造をとる。
その細胞凝集物を１５ｍｌコニカルチューブの底に沈ませる。
上清を吸引し、細胞凝集物を所望の体積の網膜誘導培地（ＲＩＭ）＋Ｒｏｃｋ阻害剤（１０μＭ）（通常、８ｍｌのＲＩＭ／１５ｍｌコニカルチューブ）に再懸濁する。
ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）の量を１０％から１．５％に減少させると、ＲＰＥの分化効率が上昇した。
ＲＩＭ＋ＲＩ中の凝集物を低接着ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３２６２１０ｃｍ低接着プレート）に移し、そこでそれらの凝集物は、２４時間以内にＥＢを形成する。
【０２６７】
・４８時間後、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーティングされたプレート上にＥＢを均等に分配する。６ウェルプレートの１ウェルあたり１５０〜２５０個のＥＢが、１ウェルあたり２５０個超のＥＢと比べて、より高効率でＲＰＥに分化する。より多数のＥＢは、培養物をコンフルエントにしすぎて、細胞が高効率でＲＰＥに分化しない。
ＥＢを１５ｍｌコニカルチューブに移し、静置させる（約２〜５分間）。
上清を吸引する。
適切な体積の網膜分化培地（ＲＤＭ）をＥＢに加える。
各ウェルからマトリゲルを吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。
等量のＥＢを各マトリゲルコートウェルに分配し、プレートを回旋させて、ウェルの表面上にＥＢを均一に分布させる（通常、Ｐ６プレートの１ウェルからのＥＢが、Ｐ６プレートの２ウェルにプレーティングされ得る）。
３週間にわたって、培地を１日おきに交換する（例えば、月曜日、水曜日、金曜日に）。
【０２６８】
このプロトコルは、ＲＰＥ運命の誘導に関与する遺伝子の発現を有意に増加させ、ＲＰＥの分化効率を高めた。この（ｔｉｓ）プロトコルの要素は、ＫＳＲの濃度が低いこと（１．５％）、ＦＧＦを含まないこと、ＤＫＫ１（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＰＤ０３２５９０１（０．１ｕＭ）を加えること、ＮＯＧＧＩＮを５０ｎｇ／ｍｌで使用することである。ＷＮＴ経路の阻害（ＤＫＫ１による）とＢＭＰ経路の阻害（ＮＯＧＧＩＮによる）の両方が、吻側神経外胚葉形成を促進し、それにより、眼細胞もつくられ得る。ＦＧＦシグナル伝達の阻害（ＰＤ０３２５９０１による）は、網膜の運命を抑制し、吻側化（ｒｏｓｔｒａｌｉｚｅｄ）神経外胚葉からのＲＰＥの運命を誘導する。
【０２６９】
・細胞を網膜培地（ＲＭ）＋ニコチンアミド、ＡｃｔｉｖｉｎおよびＷｎｔ３ａ（ＮＡＷ）に移す。３週間にわたって培地を１日おき（例えば、月曜日、水曜日および金曜日）に交換する。
【０２７０】
ＷＮＴ３ａの添加もまた、ＲＰＥの分化効率を有意に高めた。カノニカルＷＮＴシグナル伝達の活性化は、２つのＲＰＥ誘導転写因子であるＭＩＴＦおよびＰＡＸ６の発現を増加させ、ゆえに、ＲＰＥの分化効率を高める。
【０２７１】
・ＷＮＴ５ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＤＫＫ１（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＳＵ５４０２（１０ｕＭ）、シクロパミン（５ｕＭ）を含む５％網膜色素上皮（ＲＰＥ）培地に細胞を移す。ＷＮＴ５ａおよびＤＫＫ１は、カノニカルＷＮＴシグナル伝達を阻害し、それにより、ＰＡＸ６およびＭＩＴＦの発現が低下し、ＲＰＥ細胞が成熟する。ＳＵ５４０２は、ＦＧＦシグナル伝達を阻害し、シクロパミンは、Ｓｏｎｉｃシグナル伝達を阻害する。ＦＧＦシグナル伝達とＳｏｎｉｃシグナル伝達の両方が、網膜の誘導に関連する。ゆえに、これらの経路の阻害は、ＲＰＥの分化を促進する。１日おき（例えば：月曜日、水曜日および金曜日）に培地を交換する。１週間または２週間以内に、いくつかの有色素コロニーが出現する。この時点において、細胞は、機能解析のために、５％ＲＰＥ培地中のトランスウェル上に播種され得る。
【０２７２】
・細胞を、これらのトランスウェル上で８週間にわたって維持し、そこでそれらは成熟し続ける。８週間後に、トランスウェル上の完全に機能的な極性のある単層の細胞を、ＲＰＥシグネチャ遺伝子およびｍｉＲＮＡの発現のために回収する。ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて、遺伝子発現を計測する。
【０２７３】
ＭＥＦプレートを調製するために：
４枚のＰ６プレートを０．１％ゼラチンでコーティングし、室温において少なくとも１５分間、静置させる。
１本のバイアルのＭＥＦ（Ｍｔ．Ｓｉｎａｉ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ＃ＧＳＣ−６００１Ｇ；５００万個の細胞／バイアル）を解凍し、９ｍｌのフィーダー細胞培地に再懸濁する。細胞を１．２Ｋで５分間遠心し；上清を吸引し、ペレットを３６ｍｌのフィーダー細胞培地に再懸濁する。
ウェルからゼラチンを吸引し、Ｐ６の１ウェルあたり１．５ｍｌのＭＥＦを分配する。
〜ＭＥＦは、２週間にわたって良好であり、培地を交換する必要はない。
【０２７４】
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プレートを調製するために：
マトリゲル（ＢＤ＃３５６２３０）を＋４Ｃの氷上で一晩解凍させる。
翌日、氷上の解凍されたマトリゲルに等体積のＤＭＥＭを加え、十分に混合する。
＋４Ｃにおいて新しい氷上で一晩インキュベートする。
翌日に混合し、エッペンドルフチューブ１本あたり０．４ｍｌで等分し（＝１：２）、−８０Ｃで凍結する。
希釈された（１：２）マトリゲルのチューブを氷上で解凍し（またはそれを＋４Ｃで一晩解凍させ）；アリコートを、それらを扱っている間は、氷上で維持する。
マトリゲルを冷ＤＭＥＭ培地中に１：２５希釈する（１０ｍｌ培地＋０．４ｍｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：２））。
組織培養プレートをコーティングするために、マトリゲルをディッシュ上に置き、振盪することにより、均等に分配する（例えば、Ｐ６の１ウェルあたり１ｍｌ）。
そのプレートを、非常に静かに振盪しながら室温において１時間から一晩静置させ；そのプレートを使用するまで＋４Ｃで冷却する。
それらのプレートをすぐに使用しない場合、それらを箔に包んで、＋４Ｃで１〜２日間維持する。
【０２７５】
試薬
フィーダー細胞培地（５００ｍｌ）
ＤＭＥＭ（高グルコース）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１１９６０−０７７）  ４３５ｍｌ熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１００８２１４７）  ５０ｍｌＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０）                              ５ｍｌグルタミン（２００ｍＭ）（Ｇｉｂｃｏ＃２５０３０）                        ５ｍｌピルビン酸Ｎａ（１００ｍＭ）（Ｇｉｂｃｏ＃１１３６０）                    ５ｍｌ
培地を濾過する。
ｈＥＳ培地（５００ｍｌ）
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１１３２０−０３３）３８５ｍｌノックアウト血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１０８２８−０２８）    １００ｍｌ可欠アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ＃１１１４０）                                    ５ｍｌＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０）                              ５ｍｌグルタミン（２００ｍＭ）（Ｇｉｂｃｏ＃２５０３０）                        ５ｍｌｂ−メルカプトエタノール（ＰＢＳ中５５ｍＭ）（Ｇｉｂｃｏ＃２１９８５）０．５ｍｌ
培地を濾過する。
【０２７６】
ｂＦＧＦ（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃２３３−ＦＢ；１０ｎｇ／ｍｌという最終濃度；１０ｕｇ／ｍｌ原液を調製し、ｈＥＳにおいて１：１０００希釈する）をｈＥＳ培地に、使用の直前に加える。ｈｉＰＳＣを継代するとき、使用の直前にｈＥＳ培地にＲＩも加える。
【０２７７】
ＣＴＫ：
５ｍｌの０．２５％トリプシン＋５ｍｌの１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ＋０．５ｍｌの０．１Ｍ  ＣａＣｌ２＋１０ｍｌのＫＳＲ（ノックアウト血清）＋３０ｍｌのＤＭＥＭ−Ｆ１２を−２０Ｃで貯蔵する。
【０２７８】
ＥＭＤ製の溶液の形態のＲｏｃｋ阻害剤  Ｙ２７６３２  ｃａｔ＃６８８００１−１０ｍＭ原液
【０２７９】
網膜誘導培地（ＲＩＭ）（５００ｍｌ）
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１１３２０−０３３）５００ｍｌノックアウト血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１０８２８−０２８）    ７．５ｍｌ可欠アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ＃１１１４０）                                    ５ｍｌＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０）                              ５ｍｌピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）（Ｇｉｂｃｏ＃１１３６０）              ５ｍｌＮ２サプリメント１×（Ｇｉｂｃｏ＃１７５０２−０４８）                    ５ｍｌＢ２７サプリメント１×（Ｇｉｂｃｏ＃１７５０４−０４４）                １０ｍｌＣＫ１−７二塩酸塩（５ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ＃Ｃ０７４２）                  ５０ｕｌＳＢ４３１５４２水和物（５ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ＃Ｓ４３１７）              ５０ｕｌＮｏｇｇｉｎ（２５０ｕｇ／ｍｌ）（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃６０５７−ＮＧ）  ２ｕｌＩＧＦ−１（１００ｕｇ／ｍｌ）（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃２９１−Ｇ１）      ５ｕｌアスコルビン酸（５ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ＃Ａ４５４４−２５Ｇ）          ５ｍｌ
網膜分化培地（ＲＤＭ）（５００ｍｌ）
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１１３２０−０３３）５００ｍｌノックアウト血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１０８２８−０２８）    ７．５ｍｌ可欠アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ＃１１１４０）                                    ５ｍｌＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０）                              ５ｍｌピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）（Ｇｉｂｃｏ＃１１３６０）              ５ｍｌＮ２サプリメント１×（Ｇｉｂｃｏ＃１７５０２−０４８）                    ５ｍｌＢ２７サプリメント１×（Ｇｉｂｃｏ＃１７５０４−０４４）                １０ｍｌＣＫ１−７（５ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ＃Ｃ０７４２）                        ０．５ｍｌＤＫＫ１（１００ｕｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）                ０．５ｍｌＳＢ−４３１５４２（５ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ＃Ｓ４３１７）                ０．５ｍｌＮｏｇｇｉｎ（２５０ｕｇ／ｍｌ）（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃６０５７−ＮＧ）０．１ｍｌ
ＩＧＦ−１（１００ｕｇ／ｍｌ）（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃２９１−Ｇ１）    ５０ｕｌアスコルビン酸（５ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ＃Ａ４５４４−２５Ｇ）          ５ｍｌＰＤ０３２５９０１（１ｍＭ）（Ｔｏｃｒｉｓ＃４１９２）                ０．５ｍｌＦＧＦなし
網膜培地（ＲＭ）＋ニコチンアミド、ＡｃｔｉｖｉｎおよびＷｎｔ３ａ（ＮＡＷ）（５００ｍｌ）
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１１３２０−０３３）５００ｍｌノックアウト血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１０８２８−０２８）      ５０ｍｌ可欠アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ＃１１１４０）                                    ５ｍｌＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０）                              ５ｍｌピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）（Ｇｉｂｃｏ＃１１３６０）              ５ｍｌＮ２サプリメント１×（Ｇｉｂｃｏ＃１７５０２−０４８）                    ５ｍｌＢ２７サプリメント１×（Ｇｉｂｃｏ＃１７５０４−０４４）                １０ｍｌニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ＃Ｎ０６３６）（１Ｍ）                          ５ｍｌＡｃｔｉｖｉｎ（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃３３８−ＡＣ）（５０ｕｇ／ｍｌ）１．５ｍｌＷｎｔ３ａ（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃５０３６−ＷＮ）（２００ｕｇ／ｍｌ）２５０ｕｌＥＭＤ製の溶液の形態のＲｏｃｋ阻害剤  Ｙ２７６３２  ｃａｔ＃６８８００１
５％網膜色素上皮（ＲＰＥ）培地
改変ＭＥＭ（Ｍ−４５２６）                                    ５００ｍＬ
Ｎ１サプリメント（Ｎ−６５３０）                              ５ｍＬ
グルタマックス、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇ−１１４６）５ｍＬ
可欠アミノ酸（Ｍ−７１４５）                                  ５ｍＬ
タウリン（Ｔ−０６２５）                                      １２５ｍｇ
ヒドロコルチゾン（Ｈ−０３９６）                              １０ｕｇ
トリヨードチロニン（Ｔ−５５１６）                            ０．００６５ｕｇ
熱失活ウシ胎仔血清                                            １％または５％または１５％
【０２８０】
分化プロトコルの最初の３週間にわたって使用された培地中における種々の量のノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ）の使用を評価した。網膜分化培地（ＲＤＭ）は、細胞の色素沈着に対して差次的な作用を示した。高ＫＯＳＲ（１０％）中でインキュベートされたｉＰＳＣは、より少ない量のＫＯＳＲ（１．５％）を使用したときと比べて、より少数の有色素細胞を生じた。１０、５．２５または１．５％のＫＯＳＲ中での培養の後、細胞を、３週間にわたって１．５％ＫＯＳＲを含むＮＡＷに移し、１６週間後に写真撮影した（図３４Ａおよび図３４Ｂを参照のこと）。
【０２８１】
実施例２
レポーターｉＰＳＣ細胞株
上記プロトコルを、ｉＰＳＣからＲＰＥへの分化用に最適化するために、レポーターｉＰＳＣ株を作出した。このレポーター系統は、赤色蛍光タンパク質を恒常的に発現し、その発現は、ユビキチン遺伝子プロモーターによって調節される。このレポーターｉＰＳＣ株は、とりわけ、ＲＰＥ系列に分化したときに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）も発現する（図１〜３）。チロシナーゼ遺伝子のＲＰＥ特異的エンハンサーが、このｉＰＳＣ株においてＧＦＰの発現を調節する（図１）。第１の目標は、ＧＦＰの発現が、本当にＲＰＥ系列を表しているかを確かめることだった。これを達成するために、公開されている分化プロトコルを用いてｉＰＳＣ株を分化させ、分子アッセイおよび生理学的アッセイを用いて、それらの分化細胞を特徴づけた。これらのアッセイは、図２２〜２４に開示されている。図２は、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ分化の単純な模式図を描写している。レポーターｉＰＳＣが、ＲＰＥに分化すると（分化へおよそ２８日）、ＧＦＰ陽性細胞が存在する（図３Ａ）。これらの細胞は、進んでいくと、特徴的な多角形のＲＰＥの形態を有する上皮の単層を形成し、ＧＦＰを発現し続ける（図３Ｂ）。ＧＦＰ陽性細胞およびＧＦＰ陰性細胞をフローサイトメトリーによって選別し、いくつかのＲＰＥ特異的遺伝子の発現を解析し、図４に示した。これらの結果は、ＧＦＰ陽性細胞が、同じディッシュ由来のＧＦＰ陰性細胞と比べて一層高いレベルでＲＰＥ特異的マーカーを発現することを示している。
【０２８２】
次に、選別されたＧＦＰ陽性細胞およびＧＦＰ陰性細胞を、新しいディッシュに再度プレーティングした。ＧＦＰ陰性細胞は、生育されても、非常に少ない有色素コロニーしか形成しない（図５Ａ）。相対的に、ＧＦＰ陽性細胞は、完全にコンフルエントな純粋なＲＰＥ単層になる（図５Ｂ）。これにより、ＧＦＰの発現が、これらの細胞におけるＲＰＥ運命を本当に表すことが確かめられ、ＧＦＰのシグナルが、ＲＰＥ分化の信頼できる指標として使用され得ることが実証された。ｉＰＳＣからのＲＰＥの分化を最適化するために、参照プロトコルを確立した（Ｉｄｅｌｓｏｎら（２００９），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ５，３９６−４０８；Ｍｅｙｅｒら（２００９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０６，１６６９８−１６７０３；Ｏｓａｋａｄａら（２００９），Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．１２２，３１６９−３１７９を参照のこと。このプロトコルは、４つの段階、すなわち、分化の誘導、眼の領域／眼胞細胞への分化、ＲＰＥ分化の誘導、およびＲＰＥ細胞の成熟に分けられた。
【０２８３】
実施例３
分化の誘導
ｉＰＳＣの分化を誘導するために、コロニーを、穏やかなコラゲナーゼ処理（１ｍｇ／ｍｌ、１５分間）によってはずし、小さい細胞凝集物に解離した。これらの凝集物を、ＲＩＭ培地中で４８時間、非接着性の培養条件で培養した。２４時間以内に、その細胞凝集物は、胚様体（ＥＢ）に変化する。ＥＢのサイズ（細胞数／ＥＢ）が、ＲＰＥの分化に影響するかが判定され、２００〜４００個の細胞／ＥＢを有する比較的小さいＥＢＳが、より大きなＥＢと比べて、効率的にＲＰＥに分化することが見出された（図６）。
【０２８４】
網膜誘導培地（ＲＩＭ）（５００ｍｌ）
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１１３２０−０３３）５００ｍｌノックアウト血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１０８２８−０２８）    ７．５ｍｌ可欠アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ＃１１１４０）                                    ５ｍｌＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０）                              ５ｍｌピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）（Ｇｉｂｃｏ＃１１３６０）              ５ｍｌＮ２サプリメント１×（Ｇｉｂｃｏ＃１７５０２−０４８）                    ５ｍｌＢ２７サプリメント１×（Ｇｉｂｃｏ＃１７５０４−０４４）                １０ｍｌＣＫ１−７二塩酸塩（５ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ＃Ｃ０７４２）                  ５０ｕｌＳＢ４３１５４２水和物（５ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ＃Ｓ４３１７）              ５０ｕｌＮｏｇｇｉｎ（２５０ｕｇ／ｍｌ）（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃６０５７−ＮＧ）  ２ｕｌＩＧＦ−１（１００ｕｇ／ｍｌ）（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃２９１−Ｇ１）      ５ｕｌアスコルビン酸（５ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ＃Ａ４５４４−２５Ｇ）          ５ｍｌ
【０２８５】
実施例４
眼の領域／眼胞細胞への分化
浮遊ＥＢ培養の４８時間後に、それらを、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）でコーディングされたプレート上のＲＤＭ培地中にプレーティングする。１ウェルあたりのプレーティングされたＥＢの数が、ＲＰＥへのｉＰＳＣの分化に影響するかを調べた。その結果は、理想的な分化効率が、標準的な６ウェル組織培養プレートの１ウェルあたり１５０〜２５０個のＥＢをプレーティングすることによって達成されることを示した（図７）。毎週月曜日、水曜日および金曜日に、細胞上の培地を交換しながら、ＲＤＭ培地を３週間にわたって使用した。Ｎｏｄａｌ経路、ＢＭＰ経路およびＷＮＴ経路の阻害は、幹細胞を眼の領域の細胞に分化させるために重要であり得る。ｎｏｄａｌ経路を阻害するために、阻害剤ＳＢ４３１５４２を使用した。ＢＭＰ経路の活性を阻害するために、様々な濃度の、ＢＭＰ阻害剤であるＮｏｇｇｉｎを試験した。ＷＮＴ経路の阻害のために、生物学的Ｗｎｔ阻害剤であるＤＫＫ１とＷＮＴ経路の小分子阻害剤であるＣＫ１−７との組み合わせを使用した。
【０２８６】
結果は、ＦＧＦシグナル伝達の阻害がＲＰＥ発生にとって重要であることを示した。ゆえに、ＦＧＦシグナル伝達経路の活性は、その濃度を変更することまたは／およびＦＧＦ阻害剤（ＰＤ０３２５９０１）を培地に加えることによって調節された。それらの結果を、ＲＰＥ分化のマスター制御因子である２つの転写因子Ｐａｘ６およびＭｉｔｆの定量的な遺伝子発現の計測によって毎週スコア付けした（図８〜１３）。さらに、ＧＦＰの発現も、ＲＰＥ細胞の誘導の直接的な尺度として、６週間後にスコア付けした（図１４）。
【０２８７】
それらの結果は、ＷＮＴ経路の二重阻害、ＦＧＦ経路の阻害および５０ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎの使用が、３週間にわたってＰａｘ６およびＭｉｔｆの発現を有意かつ徐々に改善することを示したことから、それらの細胞が、第３週の終わりまでに眼胞の独自性を獲得したと示唆される。正常なＲＰＥ分化の終わりに計測されるＧＦＰシグナルは、これらの処理が、ｉＰＳＣからのＲＰＥの分化を有意に改善することを確証させる。
【０２８８】
次に、ＲＰＥの分化に対するノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）の濃度の影響を試験した。ＫＳＲを１．５％に低下させることにより、ＲＰＥから分化するとき、有色素のＲＰＥ細胞の数が増加した（図１５）。
【０２８９】
網膜分化培地（ＲＤＭ）（５００ｍｌ）
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１１３２０−０３３）５００ｍｌノックアウト血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１０８２８−０２８）    ７．５ｍｌ可欠アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ＃１１１４０）                                    ５ｍｌＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０）                              ５ｍｌピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）（Ｇｉｂｃｏ＃１１３６０）              ５ｍｌＮ２サプリメント１×（Ｇｉｂｃｏ＃１７５０２−０４８）                    ５ｍｌＢ２７サプリメント１×（Ｇｉｂｃｏ＃１７５０４−０４４）                １０ｍｌＣＫ１−７（５ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ＃Ｃ０７４２）                        ０．５ｍｌＤＫＫ１（１００ｕｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）                ０．５ｍｌＳＢ−４３１５４２（５ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ＃Ｓ４３１７）                ０．５ｍｌＮｏｇｇｉｎ（２５０ｕｇ／ｍｌ）（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃６０５７−ＮＧ）０．１ｍｌ
ＩＧＦ−１（１００ｕｇ／ｍｌ）（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃２９１−Ｇ１）    ５０ｕｌアスコルビン酸（５ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ＃Ａ４５４４−２５Ｇ）          ５ｍｌＰＤ０３２５９０１（１ｍＭ）（Ｔｏｃｒｉｓ＃４１９２）                ０．５ｍｌＦＧＦなし。
【０２９０】
実施例５
ＲＰＥ分化の誘導
Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａは、ＥＳ細胞からのＲＰＥ分化を誘導する。動物モデルでは、カノニカルＷＮＴ（ＷＮＴ３ａ）が、ＲＰＥ分化にとって重要である。アクチビンＡとＷＮＴ３ａと組み合わせが、ｉＰＳＣからのＲＰＥ分化の誘導にとって有効であり得ると仮定した。これらの２つの因子の組み合わせを眼胞期に試験した。細胞を、ＲＤＭ培地から、アクチビンＡ（ＮＡ）のみまたはアクチビンＡ＋ＷＮＴ３ａ（ＮＡＷ）を含む培地に移動させた。ＷＮＴ３ａの添加により、ディッシュ１枚あたりの有色素細胞の数が有意に増加した（図１６）。この分化プロセスは、レポーターｉＰＳＣ株から開始されたので、２つの処理間のＧＦＰシグナルを比較することによって、ＲＰＥ細胞の数の増加が確かめられた。ＮＡと比べて、ＮＡＷは、培養物中のＧＦＰ陽性細胞の数を増加させた（図１７，上パネル）。ＦＡＣＳ解析によって定量すると、ＮＡ処理は、２２％のＧＦＰ陽性細胞しかもたらさなかったのに対し、ＮＡＷ処理は、５２％のＧＦＰ陽性細胞をもたらした（図１７，下パネル）。この結果は、ＷＮＴシグナル伝達が、ＴＧＦ−ベータ（アクチビン）シグナル伝達のＲＰＥ分化能力を相乗的に高めることを示した。
【０２９１】
網膜培地（ＲＭ）＋ニコチンアミド、ＡｃｔｉｖｉｎおよびＷｎｔ３ａ（ＮＡＷ）（５００ｍｌ）
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１１３２０−０３３）５００ｍｌノックアウト血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１０８２８−０２８）    ７．５ｍｌ可欠アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ＃１１１４０）                                    ５ｍｌＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０）                              ５ｍｌピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）（Ｇｉｂｃｏ＃１１３６０）              ５ｍｌＮ２サプリメント１×（Ｇｉｂｃｏ＃１７５０２−０４８）                    ５ｍｌＢ２７サプリメント１×（Ｇｉｂｃｏ＃１７５０４−０４４）                １０ｍｌニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ＃Ｎ０６３６）（１Ｍ）                          ５ｍｌＡｃｔｉｖｉｎ（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃３３８−ＡＣ）（５０ｕｇ／ｍｌ）１．５ｍｌ
Ｗｎｔ３ａ（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃５０３６−ＷＮ）（２００ｕｇ／ｍｌ）２５０ｕｌ
【０２９２】
実施例６
ＲＰＥ細胞の成熟
ＲＰＥ細胞をさらに精製し、成熟させるために、これらの細胞をトリプシン処理し、半透性トランスウェル上の５％ＲＰＥ培地中で４週間培養した。これにより、ＲＰＥ色素に関してかなり均一に見える細胞が作製された（図１８，上パネル）。ＦＡＣＳ解析によるＧＦＰシグナルの定量は、４週間生育した培養物中に最大９２％のＧＦＰ陽性細胞をもたらした。これは、その５％ＲＰＥ培地が、ＲＰＥ細胞に富んでいることを示唆する。これらの細胞を、より長い期間にわたって培養したとき、ＮＡＷで処理された細胞は、ＮＡで処理された細胞と比べて、ＲＰＥ色素、ＲＰＥの形態およびＧＦＰ発現に関してより均一に見えた（図１９，図２０、ＮＡＷ細胞の場合のみ）。しかしながら、これらの細胞は、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、Ｔｆｅｃなどのような胎児特異的ＲＰＥ遺伝子を発現し続ける。
【０２９３】
分化中のＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ細胞の成熟に影響し得るカノニカルＷＮＴの産生を開始する。ゆえに、完全に成熟したＲＰＥ細胞を作製するため、および胎児遺伝子の発現を停止するために、これらの培養物を、カノニカルＷＮＴ経路の阻害剤で処理した。共にカノニカルＷＮＴ経路を阻害し、非カノニカルＷＮＴ経路を誘導するＷＮＴ５ａおよびＤＫＫ１を、これらの研究において使用した。後者（ｌａｔｅｒ）は、細胞の分極および成熟を誘導すると示されている。さらに、ＦＧＦ経路の阻害剤（ＳＵ５４０５２）およびソニックヘッジホッグ経路の阻害剤（シクロパミン）を使用して、ＲＰＥの成熟に影響し得る任意の内在性のＦＧＦシグナル伝達およびＳｏｎｉｃシグナル伝達を抑制した。これらの阻害剤を、２週間にわたって使用し、それらの細胞を処理の直後にアッセイした。いくつかの胎児ＲＰＥおよび成熟ＲＰＥに特異的な遺伝子の発現を計測した（図２１）。興味深いことに、これらの処理は、胎児ＲＰＥ特異的遺伝子（Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、Ｔｆｅｃ、Ｋｌｆ４、Ｓｎａｉｌ１／２）の発現をダウンレギュレートし、ＲＰＥ成熟関連遺伝子（ＴＹＲ、ＴＹＲＰ１、ＭＹＲＩＰ、カドヘリン１／３、ＴＲＰＭ１／３）の発現をアップレギュレートした。
【０２９４】
結論として、ｉＰＳＣからＲＰＥへの分化を有意に改善し、完全に分化した細胞も作製するプロトコルが開発された。このプロトコルは、適切な疾患モデルおよび有効な細胞ベース治療に役立つＲＰＥ細胞をｉＰＳＣから作製する上で非常に貴重である。
【０２９５】
５％網膜色素上皮（ＲＰＥ）培地
改変ＭＥＭ（Ｍ−４５２６）                                      ５００ｍＬ
Ｎ１サプリメント（Ｎ−６５３０）                                ５ｍＬ
グルタマックス，ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇ−１１４６）  ５ｍＬ
可欠アミノ酸（Ｍ−７１４５）                                    ５ｍＬ
タウリン（Ｔ−０６２５）                                        １２５ｍｇ
ヒドロコルチゾン（Ｈ−０３９６）                                １０ｕｇ
トリヨードチロニン（Ｔ−５５１６）                              ０．００６５ｕｇ熱失活ウシ胎仔血清                                              ５％
ＤＫＫ１（１００ｕｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）          ０．５ｍｌ
Ｗｎｔ５ａ（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１００ｕｇ／ｍｌ）          ２５０ｕｌ
ＳＵ５４０２（ｓｉｇｍａ）（１０ｕＭ）                          ０．５ｍｌ
シクロパミン（Ｓｉｇｍａ）（１０ｕＭ）                          ０．５ｍｌ
【０２９６】
実施例７
ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞の立証
このプロトコルを通じて得られた細胞を立証するために、それらの細胞を、分子アッセイと生理学的アッセイの両方によって試験した。シグネチャ遺伝子のセットを、以前に公開されたＲＰＥ遺伝子シグネチャ（Ｓｔｒｕｎｎｉｋｏｖａら（２０１０），Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２４６８−２４８６）から選択し、それらの遺伝子の発現を、初代ヒトＲＰＥと、本発明者らのプロトコルを使用してｉＰＳＣから得られたＲＰＥとを比較した。得られた細胞は、ＲＰＥ特異的遺伝子の発現に関して初代ヒトＲＰＥによく似ている（図２２）。
【０２９７】
同様に、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥが頂端バスおよび基底バスにおけるＣＯ２濃度の変化に応答する能力、ならびに頂端バスにおけるカリウム濃度の変化に応答して過分極する（ｈｙｅｒｐｏｌａｒｉｚｅ）能力を評価した（図２３、２４）。これらのすべてのアッセイにおいて、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞は、初代ヒトＲＰＥと同様に挙動する。したがって、開示されたプロトコルによって、完全に機能的なＲＰＥ細胞が作製される。これらの分子アッセイおよび生理学的アッセイは、完了したＲＰＥ分化に対する重要なバイオマーカーである。
【０２９８】
実施例８
マルチプレックスハイスループットスクリーニング
ｉＰＳＣ由来の網膜色素上皮（ＲＰＥ）において複数の発生マーカー、機能マーカーおよび疾患マーカーの内因性の発現を同時に検出するマルチプレックスハイスループットスクリーニングアプローチを開発した。プロトコルを、９６ウェルおよび３８４ウェルの形式でのハイスループットスクリーニングのためのｉＰＳＣ由来ＲＰＥの分化および成長に対して最適化した。原理証明として、ｉＰＳＣ、２つの分化段階におけるｉＰＳＣ由来ＲＰＥおよび初代ヒトＲＰＥ細胞における１０個の遺伝子の内因性の発現を、そのマルチプレックスアッセイを使用して比較した。このアッセイから得られたデータは、標準的なｑＲＴ−ＰＣＲに基づく計測値と有意に相関する。このアッセイは、ＲＰＥの機能、成熟を改善する化合物、および疾患経路を標的化する化合物をスクリーニングする根拠を提供し、ゆえに、いくつかの網膜変性疾患の効果的な処置に対する根拠が提供される。
【０２９９】
十分に立証されたｉＰＳＣ由来ＲＰＥをマルチプレックスハイスループットアッセイのために使用するプロトコルを開発した。このマルチプレックス遺伝子発現アッセイは、６つのＲＰＥ系列遺伝子、２つの幹細胞／前駆体細胞遺伝子および２つのハウスキーピング遺伝子について報告する。１）このアッセイが、９６ウェルおよび３８４ウェルのハイスループット様式で行われ得、２）このアッセイが、遺伝子発現のわずかな変化さえも計測でき、３）このマルチプレックスアッセイを用いて得られたデータが、ＲＴ−ｑＰＣＲデータと高度に相関するという、原理証明データが得られた。このアッセイによって、完全に成熟したＲＰＥ細胞に向かう分化プロトコルの効率をさらに高め得る小分子の同定が可能になる。さらに、このアッセイは、ハイスループット様式で追跡され得る発生バイオマーカーおよび機能バイオマーカーを提供する。これらの機能バイオマーカーおよび疾患バイオマーカーの発現を調節する小分子は、ＲＰＥ関連網膜変性疾患に対する潜在的な治療用薬物を提供し得る。
【０３００】
Ａ．材料および方法
ｉＰＳＣの起源、培養および分化：Ｃｏｒｉｅｌｌ（Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）から購入したヒト成人皮膚線維芽細胞（ＡＧ９３０９，女性，２１歳，足指のバイオプシー）を再プログラムした（１５）。ｉＰＳＣを、３つの胚葉またはＲＰＥに分化させた（１２，１５〜１７）。
【０３０１】
免疫染色、電子顕微鏡法およびｑＲＴ−ＰＣＲ解析：免疫染色およびｑＲＴ−ＰＣＲ解析を行った（Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９（３）：２６７−２７２，２０１１；Ｂｈａｒｔｉら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ８（７）：ｅ１００２７５７，２０１２）。以下の抗体を使用した：ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８−抗Ｔｒａ−１−６０（１：５０，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８−抗ＳＳＥＡ４（１：５０，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＯＣＴ４（１：４００，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）；ＮＡＮＯＧ（１：１００，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＳＯＸ２（１：１００，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）；ＫＬＦ４（１：５０，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）；ｃ−ＭＹＣ（１：５０，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）；ＡＦＰ（１：７５，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）；ＴＵＪ１（１：４００，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）；ａＳＭＡ（１：５００，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ＤＣＴ（１：１００，Ｂｉｏｗｏｒｌｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｔ．Ａｉｒｙ）；ＰＡＸ６（１：２００，Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）；およびＺＯ１（１：１００  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０３０２】
細胞内カルシウムの計測および電気生理学：ＲＰＥ細胞におけるカルシウムシグナル伝達を評価するために、ＡＴＰ（２００μＭ；Ｓｉｇｍａ）およびシクロピアゾン酸（ＣＰＡ；１０μＭ；ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；（Ｍａｍｉｎｉｓｈｋｉｓら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４７（８）：３６１２−３６２４，２００６）；Ｑｕｉｎｎら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３３（１３）：３５１３−３５２７，１９９２を参照のこと）。
【０３０３】
リンガー液および寒天橋と直列のカロメル電極を使用して、経上皮電位（ＴＥＰ）を計測した。細胞内微小電極からのシグナルを、基底バスに対して参照して、頂端および基底の膜電位ＶＡおよびＶＢを計測した（ここで、ＴＥＰ＝ＶＢ−ＶＡである）。組織を横断して２〜４μＡの電流パルス（ピーク・トゥ・ピーク）を通し、生じたＴＥＰ、ＶＡおよびＶＢの変化を計測することによって、経上皮抵抗全体（Ｒｔ）および頂端と側底膜との抵抗の比（ＲＡ／ＲＢ）を得た。詳細については、Ｍａｍｉｎｉｓｈｋｉｓら、前出およびＱｕｉｎｎら、前出を参照のこと。
【０３０４】
ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ  ＰＬＥＸ（登録商標）技術の原理：９６ウェルまたは３８４ウェルプレートにおいて生育された細胞を溶解し、溶解産物を、ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ  ＰＬＥＸ（登録商標）プローブおよびＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）ビーズセットを含むハイブリダイゼーションプレートに移す。各ビーズタイプを、異なる一本鎖ＤＮＡ捕捉プローブ（ＣＰ）でコーティングする。ｓｓＤＮＡオリゴも含むＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ（登録商標）プローブセットの他の構成要素としては、捕捉エクステンダー（Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒｓ）（ＣＥ）、標識エクステンダー（Ｌａｂｅｌ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒｓ）（ＬＥ）およびブロッキングプローブ（ＢＰ）が挙げられる。ＣＥオリゴの一部は、標的ｍＲＮＡ（２００〜６００塩基をカバーする）に相補的であり、一部は、ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）ビーズ上に結合されたＣＰに相補的である。この相互作用は、特定のＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）ビーズへの特定の標的ｍＲＮＡの捕捉を容易にする。ＬＥは、標的ｍＲＮＡ特異的配列、およびシグナル増幅のために使用される第１の構成要素であるプレアンプリファイアに対する結合部位を含む。ＢＰは、ＣＥおよびＬＥによって結合されない標的ｍＲＮＡ上の任意の配列に結合する。単一の標的ｍＲＮＡに対する代表的なプローブセットは、標的ｍＲＮＡ内の約５００塩基を通常カバーする４つ以上の異なるＣＥおよびＬＥのファミリーからなる。過剰なプローブおよび残っている細胞溶解産物を洗浄除去した後、プレアンプリファイア（ＰｒｅＡｍｐ）、アンプリファイア（Ａｍｐ）および標識プローブ（ＬＰ）からなるシグナル増幅試薬を、順次、ｍＲＮＡにハイブリダイズさせる。ＬＰは、ビオチン分子も含み、それは、最終的なシグナル増幅試薬であるＳＡＰＥ（ストレプトアビジン結合体化Ｒ−フィコエリトリン）に対する結合部位となる。各アンプリファイアは、最大４００個のＳＡＰＥに結合する。個々の捕捉ビーズに関連する得られた蛍光シグナルを、ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）機器において読み出す。シグナルは、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）として報告され、サンプル中に存在する標的ＲＮＡ分子の数に比例する。ＭＦＩは、１遺伝子あたり５０〜１００個のビーズ上のシグナルを計測することによって計算される。標的ＲＮＡを含まないバックグラウンドブランクウェルから得られたＭＦＩ値を、各標的の読み出しのＭＦＩから減算した。
【０３０５】
ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ  ＰＬＥＸ（登録商標）２．０試薬システム：９６ウェルアッセイプロトコル：ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ  ＰＬＥＸ（登録商標）９６ウェルアッセイを、製造者のマニュアル（ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ  ＰＬＥＸ（登録商標）２．０  Ａｓｓａｙ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）に記載されているように行った。１ウェルあたり２５，０００個および５０，０００個の細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２において１４日間培養する。細胞を、２００μＬのワーキング溶解混合物中で、５０℃において３０分間溶解した。８０μＬの細胞溶解産物を、すでに各ウェルに２０μＬのワーキングビーズ混合物（６．６μＬの溶解混合物、５．２μＬのヌクレアーゼフリー水、０．２μＬのプロテイナーゼＫ溶液、２μＬのブロッキング試薬、５μＬのプローブセット、１μＬのＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）磁気ビーズ；ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ  ＰＬＥＸ（登録商標）セット−パネル＃１１８２８）が入ったこのアッセイのハイブリダイゼーションプレート（９６ウェル透明ポリプロピレンプレートＡｂｇｅｎｅ＃ＡＢ０７９６，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）に移した。ハイブリダイゼーションを、６００ｒｐｍで振盪しながら５４℃±１℃において１８〜２２時間行った。次いで、そのハイブリダイゼーション混合物を９６ウェル磁気分離プレート（９６ウェル平底マイクロプレートＮｕｎｃ＃２６９６２０）に移した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ手持ち式磁気ビーズ洗浄機（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｐ／Ｎ  ＱＰ０７０２）を使用してビーズを洗浄し、ゆえに、未結合の材料のすべてが除去された。１００μＬの２．０プレアンプリファイアワーキング試薬（製造者によって提供されるＰｒｅＡｍｐ溶液＋Ａｍｐ希釈剤を使用して３：１０００希釈）を各アッセイウェルに加えた。その磁気分離プレートを、裏に接着剤が付いた箔で密封し、５０℃±１℃および６００ｒｐｍで１時間インキュベートした。手持ち式磁気洗浄機を使用して、未結合の２．０プレアンプリファイアを除去し、ビーズを１００μＬの洗浄緩衝液（製造者によって提供される）で３回洗浄した。これに続いて、２．０アンプリファイアワーキング試薬、続いて、標識プローブワーキング試薬、続いて最後に、ＳＡＰＥワーキング試薬（３つすべての溶液が、３：１０００希釈の１００μＬで、製造者によって提供される）とのインキュベーションを行った。インキュベーションおよび洗浄は、上に記載されたとおり行った。ビーズを１３０ｕｌのＳＡＰＥ洗浄緩衝液に再懸濁した後、ビーズからのシグナルを、ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）ＦＬＥＸＭＡＰ（登録商標）３Ｄ機器（ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）Ｃｏｒｐ．Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）で、５，０００〜２５，０００というｄｄゲートの設定を使用して、計測した。標的１つあたり５０〜１００個のビーズを、１００ｕｌのサンプル体積において計測した。
【０３０６】
ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ  ＰＬＥＸ（登録商標）３８４ウェルアッセイプロトコル：ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ  ＰＬＥＸ（登録商標）３８４ウェルアッセイを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘからの技術支援を用いて、および製造者によって提供される９６ウェルアッセイプロトコルを使用して、最適化した。３８４ウェルプレートの１ウェルあたり６，０００個および１２，０００個の細胞を播種した。比例した体積の試薬／ウェルを、３８４ウェルプレートに対して使用した。上に記載されたようにシグナルを計測した。
【０３０７】
Ｂ．結果
１．ｉＰＳＣ由来ＲＰＥの作製
幹細胞由来のＲＰＥの発生的および機能的な特徴を同時にモニターするハイコンテントスクリーニングアッセイを開発した。図２５Ａは、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥの純粋な培養物を得るための実験ストラテジーの概要を提供しており、それらの工程は、機能的立証のための細胞を調製するため、およびハイスループットスクリーニングにおいて使用するために必要である。ｉＰＳＣを、ＯＣＴ３／４、ｃ−ＭＹＣ、ＳＯＸ２およびＫＬＦ４を発現するレトロウイルスベクターを使用して、ヒト成人女性皮膚線維芽細胞から作製した。選択されたｉＰＳＣコロニーの多能性を、以下の３つの多能性検証アッセイを使用して測定した：（Ｉ）多能性マーカーＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０、ＯＣＴ３／４、ｃ−ＭＹＣ、ＳＯＸ２およびＫＬＦ４に対するポジティブ免疫染色（図２５Ｂ）；（ＩＩ）胚性幹細胞株と皮膚線維芽細胞とのＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ３／４、ｃ−ＭＹＣ、ＳＯＸ２およびＫＬＦ４のｍＲＮＡ発現の比較。形質導入されたウイルスベクターは、ＯＣＴ３／４、ｃ−ＭＹＣ、ＳＯＸ２およびＫＬＦ４も発現したので、特異的なプライマーセットを使用して、内在性遺伝子座からの発現と全発現（ウイルスベクター＋内在性）とを区別した（図２５Ｃ）。ｉＰＳＣにおける内在性遺伝子座からの多能性マーカーの発現は、皮膚線維芽細胞と比べて有意に高く、未分化なＥＳ細胞よりも比較的高いかまたは等しかった（図２５Ｃ）；（ＩＩＩ）ｉＰＳＣが３つすべての胚葉に分化する能力。図２５Ｄに示されているように、このｉＰＳＣ株は、３つすべての胚葉に分化する。
【０３０８】
ｉＰＳＣを、本明細書中に開示される方法を用いてＲＰＥに分化させた。ＲＰＥ様の敷石状の形態を有する有色素細胞クラスターを、手作業で拾い、Ｔ２５フラスコ内で拡大して、ＲＰＥ細胞の純粋な培養物を得た。精製されたＲＰＥ細胞を、トランスウェルフィルター上に再度播種することにより、およそ６〜８週間で、電気的にインタクトでコンフルエントな極性のあるＲＰＥ単層を得た。この段階において行われた上皮マーカーＺＯ１に対する免疫染色から、それらの細胞の典型的な上皮の形態が確認された（図２６Ａ）。ｉＰＳＣ由来ＲＰＥは、頂端突起局在化（ａｐｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）タンパク質であるＥＺＲＩＮ；ＲＰＥの色素沈着にとって重要な酵素であるＤＣＴ；ＲＰＥの体積制御にとって極めて重要な塩素チャネルであるＣＬＣＮ２；およびＲＰＥ単層を横断したラクテート輸送に必要であり、細胞内ｐＨの制御に関与する頂端膜モノカルボン酸トランスポーターであるＳＬＣ１６Ａ１も発現した。透過型電子顕微鏡像の解析から、これらの細胞におけるいくつかの典型的なＲＰＥの特徴（例えば、主に頂端に局在する葉巻形および卵形のメラノソーム（ｍｅ，矢頭）、隣接した細胞間のタイトジャンクション（ｔｊ）および頂端突起（矢印））が明らかになった（図２６Ｂ）。
【０３０９】
ヒトの天然のＲＰＥ細胞および培養ＲＰＥ細胞の多くの特徴的な生理反応は、インビトロで計測され得る。ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ単層培養物は、これらの特徴のうちのいくつかを示す。これらの細胞は、電気的にインタクトであり、１７０〜２００Ω・ｃｍ２という単層を横断する経上皮抵抗を示し（図２６Ｃおよび２６Ｄ）、それらの定常状態の細胞内カルシウム濃度は、約１２０ｎＭである。天然のＲＰＥと同様に、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥにおいても、ＡＴＰによって頂端膜Ｐ２Ｙ２レセプターを刺激すると、典型的な二相反応が生じ、最初の反応シグナルは、小胞体から細胞質への細胞内カルシウムの放出であり、第２の相は、細胞外のＣａ２＋の存在に依存する（Ｍａｍｉｎｉｓｈｋｉｓら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  ｖｉｓｕａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ４７（８）：３６１２−３６２４，２００６）。シクロピアゾン酸を適用すると、ＥＲ膜上に位置するＡＴＰ依存性カルシウム再取り込みチャネルである筋／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼが遮断され、定常状態のカルシウム増加に至り、ＡＴＰ応答が鈍る（図２６Ｃ）。電気生理学的には、頂端膜および基底膜の静止膜電位は、およそ−５５ｍＶであり（頂端側と比べて基底側がわずかにより脱分極している）、頂端側が正である約２．５ｍＶという単層を横断する経上皮電位（ＴＥＰ）となる（図２６Ｄ）。暗所から明所に移動した後のインビボでの網膜下腔Ｋ＋の変化を模倣する、頂端バスにおけるＫ＋濃度の５ｍＭから１ｍＭへの変化は、頂端膜を有意に１０〜２０ｍＶ過分極させるので、ＴＥＰが急に低下する（１７，２０）。頂端膜へのＡＴＰの適用は、細胞内ストアからのカルシウムの放出および側底膜Ｃａ２＋活性化型Ｃｌ−チャネルの活性化の後に、側底膜を有意に脱分極させる（Ｍａｍｉｎｉｓｈｋｉｓら、前出；Ｑｕｉｎｎら、前出；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら、Ｄｏｃｕｍｅｎｔａ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ６０（４）：３２７−３４６，１９８５）。
【０３１０】
未分化なｉＰＳＣ、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥおよび初代ヒト胎児ＲＰＥにおける多能性遺伝子およびＲＰＥシグネチャ遺伝子の発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して比較した（Ｌｉａｏら、Ｈｕｍａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９（２１）：４２２９−４２３８，２０１０；Ｓｔｒｕｎｎｉｋｏｖａら、Ｈｕｍａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９（１２）：２４６８−２４８，２０１０）。２つの主要な多能性遺伝子ＯＣＴ３／４（ＰＯＵ５Ｆ１とも呼ばれる）およびＳＯＸ２は、未分化なｉＰＳＣと比べて、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥにおいてダウンレギュレートされることから、多能性の状態の喪失が示唆される。しかしながら、他のいくつかのＲＰＥ特異的転写因子、色素沈着経路遺伝子、視覚サイクル遺伝子、構造タンパク質およびチャネルは、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥにおいて、未分化なｉＰＳＣと比べて有意に高いレベルで発現され、初代ＲＰＥと比べて、より低いレベルまたは同様のレベルで発現された（表Ａ）。
【表Ａ】
2019017394.tif 000017
【０３１１】
これらの結果は、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥが、ＲＰＥ様の表現型を獲得したが、完全に成熟した状態ではないことを示唆している。ｉＰＳＣ由来ＲＰＥが、より高いレベルの胎児遺伝子または前駆体遺伝子（ＳＯＸ２およびＫＬＦ４，表Ａを参照のこと）を発現するという事実にもかかわらず、これらの細胞の生理反応が有意に損なわれないことは、注目に値する。
立証されたｉＰＳＣ由来ＲＰＥを使用する、拡張可能なハイスループットマルチプレックス遺伝子発現アッセイの原理証明
【０３１２】
目標は、ＲＰＥに対する発生マーカー、機能マーカーおよび疾患マーカーを同時にモニターできるハイスループットスクリーニングアッセイを開発すること、ならびにそのアッセイの原理証明の解析を行うことだった。そのスクリーニングアッセイのプラットフォームを設計する際、２つの主な理由のために、マルチプレックス遺伝子発現アッセイを選択した：（１）それが、ＲＰＥの発生、分化、機能および病態に関わる遺伝子の同時検出を可能にするハイコンテントアッセイであること；（２）それが、標準的なスクリーニング装置を使用したハイスループットスクリーニングに対して容易に適用できること。異なる細胞プロセス−ＲＰＥの発生および分化（ＳＯＸ２およびＰＡＸ６）、ＲＰＥの機能（チロシナーゼ、ＲＰＥ６５、ＲＤＨ５、ＴＲＰＭ１、ＣＳＰＧ５およびＢＥＳＴ１）ならびにＲＰＥの病態（チロシナーゼ、ＲＰＥ６５、ＲＤＨ５、ＢＥＳＴ１）を計測する遺伝子を選択した。図２７Ａは、マルチプレックスアッセイの概要を要約しており、図２７Ｂは、アッセイの原理の概略図を示しており、図２７Ｃは、このマルチプレックスアッセイにおいて使用される遺伝子、それらのアクセッション番号、それらのｍＲＮＡのそれぞれの長さ、ならびに捕捉エクステンダーおよび標識エクステンダーがハイブリダイズする領域のリストを提供している。手短に言えば、マイクロタイタープレートにおいて調製された細胞溶解産物中の単離されたｍＲＮＡが、アンチセンスオリゴヌクレオチド技術を用いて、ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）ビーズに結合される。検出プローブ（ビオチン−ストレプトアビジン−フィコエリトリン）が、アンチセンスオリゴヌクレオチド技術を用いて特異的なｍＲＮＡにハイブリダイズされる。ｍＲＮＡの定量は、各ビーズ上の特異的な蛍光標識を認識してビーズ１つあたりのシグナル強度を計測するフローサイトメトリーベースの機器を使用して行われる。
【０３１３】
原理証明として、９６ウェルまたは３８４ウェルプレートのウェルにおいて、未分化なｉＰＳＣとｉＰＳＣ由来ＲＰＥと初代ヒト胎児ＲＰＥとの間で複数の遺伝子の差次的なレベルを同時に検出するマルチプレックス遺伝子発現アッセイの実行可能性を実証した。最適化のために合計９つの遺伝子を選択した。以前の研究によって、２つのハウスキーピング遺伝子であるＨＰＲＴ１およびＢ２Ｍの発現が、このアッセイにおいて使用される３つの細胞型の間で有意に異ならないことが示唆されたので（２２）、これらの２つの遺伝子をデータの正規化のために使用した。ＲＰＥの分化、機能および病態を解析するために、ＳＯＸ２、ＰＡＸ６、ＲＰＥ６５、ＲＤＨ５、ＣＳＰＧ５、ＴＲＰＭ１およびＢＥＳＴ１の発現をモニターした。インビトロ培養の場合、より高密度で播種された細胞は、より低い密度で播種された細胞と比べてより速く成熟する。ゆえに、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥと初代胎児ＲＰＥの両方を、２つの細胞密度、２５，０００細胞／ウェルまたは５０，０００細胞／ウェルで播種した（図２８Ｂ〜Ｄ）。未分化なｉＰＳＣを、追加のコントロールとして使用した（図２８Ａ）。ｉＰＳＣ由来ＲＰＥおよび初代ＲＰＥを、２週間培養することにより、コンフルエントな有色素の単層を得た。すべての細胞型に対して同時にアッセイを行うために、ｉＰＳＣを後で培養し、たった５日間でコンフルエンスに到達させた。精製されたＲＮＡ、ならびに未分化なｉＰＳＣ、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ（低および高細胞密度）および初代ＲＰＥ（低および高細胞密度）からの溶解産物を使用して、各プローブセットに対して、検出の線形範囲を計算した（図３６）。すべてのプローブが、１６倍の連続希釈にわたって、バックグラウンドより高いシグナルを検出した。この段階希釈から作成された線形回帰プロットは、すべての場合において０．９７を超える測定値の係数をもたらしたことから、それらのプローブが、広い範囲のｍＲＮＡ濃度にわたってシグナルを検出できることが示唆された。
【０３１４】
このアッセイの結果は、未分化なｉＰＳＣと比べて（図２８Ｅおよび２８Ｆ）および高細胞密度の初代胎児ＲＰＥと比べて（図２８Ｇおよび２８Ｈ）、２つの異なる細胞密度でのｉＰＳＣ由来ＲＰＥにおける遺伝子発現の変化倍率として表される。予想どおりに、未分化なｉＰＳＣと比べて、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥは、より低いレベルの神経前駆体因子ＳＯＸ２、ならびにより一層高いレベルのＲＰＥ特異的遺伝子ＰＡＸ６、ＲＰＥ６５、ＲＤＨ５、ＴＲＰＭ１およびＢＥＳＴ１を発現する。細胞外タンパク質であるＣＳＰＧ５は、それら２つの細胞型において同様のレベルで発現される。この最適化の重要な目標は、マルチプレックスアッセイから得られた結果を、標準的なｑＲＴ−ＰＣＲアッセイから得られた結果と比較することだった（表Ａ）。ゆえに、マルチプレックスアッセイから得られた遺伝子発現の変化倍率とｑＲＴ−ＰＣＲアッセイから得られた遺伝子発現の変化倍率との間のピアソン相関係数（ｒ）を決定した。これらの結果は、それら２つのアッセイが、有意に相関することを示している（ｒ値＝０．６９および０．７５）。これは、マルチプレックスアッセイが、関連性のある遺伝子発現の変化を計測し、ハイスループットスクリーニングのために使用され得るという信頼性を提供する。結論として、このハイコンテント遺伝子発現アッセイは、未分化なｉＰＳＣ、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥおよび初代ヒトＲＰＥに対してハイスループット形式において１日半で行われ得る。初代胎児ＲＰＥと比べたとき、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥは、より低いレベルの分化ＲＰＥマーカー（ＲＰＥ６５、ＲＤＨ５、ＣＳＰＧ５、ＢＥＳＴ１）およびより高いレベルの前駆体転写因子ＰＡＸ６およびＳＯＸ２を発現することから、これらの細胞の比較的未熟な状態が示唆される。しかしながら、マルチプレックスアッセイにおいて初代ＲＰＥとｉＰＳＣ由来ＲＰＥとを比較することによって得られた結果が、表Ａに表される標準的なｑＲＴ−ＰＣＲアッセイと強く相関することに注意することが重要である。
【０３１５】
検出限界の評価およびアッセイの処理量の向上
マルチプレックスアッセイのもう１つの重要な局面である、所与のアッセイウェルにおける各転写物に対する検出限界を試験した。９６ウェルプレートの１ウェルあたり１つの標的を解析するとき、マルチプレックス遺伝子発現アッセイに対して推奨される最小検出限界は、２００個以下の転写物である。以下の式を使用して、本発明者らのプローブセットの検出限界（ＬＯＤ）を計算した：ＬＯＤ＝４つのウェルの平均バックグラウンド値＋その平均バックグラウンド値の３×標準偏差（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，製造者マニュアル）。このアッセイは、記載された限界よりも有意に高感度であり、以下の検出値が得られた：ＳＯＸ２＝４１、ＰＡＸ６＝３２、ＲＰＥ６５＝２４、ＲＤＨ５＝１０、ＣＳＰＧ５＝１９、ＴＲＰＭ１＝２５、ＢＥＳＴ１＝１１、ＨＰＲＴ１＝５５およびＢ２Ｍ＝３０。これらの転写物の数を考慮して、スクリーニング処理量の増大のためならびに試薬コストおよびスクリーニングコストの低下のために、そのアッセイを３８４ウェル形式で試験した。
【０３１６】
シグナルの検出範囲の線形性を調べるために、３８４ウェルプレートにおいて２つの細胞密度、６，０００および１２，０００細胞／ウェルを用いてアッセイを行った。予想どおりに、３８４ウェルプレートで２週間培養した後、より低い細胞密度は、初代胎児ＲＰＥ細胞とｉＰＳＣ由来ＲＰＥの両方に対して、よりコンフルエントでなく、より少ない有色素の細胞層をもたらした（図３５Ａ〜３５Ｄ）。２つの異なるビーズ濃度−９６ウェルプレートの場合に推奨されるプローブ１つあたり７００ビーズ／ウェル、およびプローブ１つあたり３７５ビーズ／ウェルを試験した。ＲＰＥの成熟を表すチロシナーゼである追加のプローブを、このアッセイに含めた。図３５は、このアッセイが、両方のビーズ濃度を用いたとき、３８４ウェルプレートでも首尾よく最適化されたことを示している。このデータは、以下の３つの結論を支持する：（１）３８４ウェルプレートにおいて得られた結果は、９６ウェルプレートにおいて得られた結果と似ている。例えば、初代ＲＰＥと比べたとき、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥは、より高レベルのＳＯＸ２およびＰＡＸ６、ならびにより低いレベルのＲＰＥ分化／機能遺伝子を発現する；（２）２つのビーズ濃度は、３８４ウェルプレート形式においてほぼ同一の結果をもたらす；（３）３８４ウェルプレートにおけるマルチプレックスアッセイは、９６ウェルプレートアッセイと比べて、ｑＲＴ−ＰＣＲデータとよりよく相関する（多いビーズおよび少ないビーズに対してそれぞれ０．９１および０．８９というピアソン相関係数）。結論として、本結果は、最大１０個の異なる遺伝子の発現の変化が、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥの３８４ウェルプレートを用いて、同時に計測され得ることを実証した。
【０３１７】
ここに提示されたアプローチは、前駆体遺伝子の発現をダウンレギュレートし、分化遺伝子の発現をアップレギュレートするがゆえに、培養中の多能性幹細胞由来ＲＰＥの系統的な成熟を可能にする小分子を同定するための詳細に明らかにされた方法を提供する。このｉＰＳＣ由来ＲＰＥは、黄斑変性疾患の治療的介入においてより有効であり得、また、有効な疾患モデルとして働き得る。このスクリーニング方法は、疾患を引き起こす推定経路の活性を変化させる小分子を同定するため、および治療薬を発見するためにも使用され得る。
【０３１８】
実施例９
ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥＰＬＥＸ（登録商標）２．０試薬システム−９６ウェルアッセイプロトコル
ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ  ＰＬＥＸ（登録商標）９６ウェルアッセイを、以下のプロトコルを用いて行った。細胞を、９６ウェルプレートの１ウェルごとに播種し、１日おきに培地の交換を手作業で行って、それらのウェルを１０日間にわたって３７℃、５％ＣＯ２に調整した。次いで、個々のウェルからの細胞を、２００μＬのワーキング溶解混合物（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）中で５０℃において３０分間、溶解した。８０μＬの細胞溶解産物を、すでに各ウェルに２０μＬの使用ビーズ混合物が入ったこのアッセイのハイブリダイゼーションプレート（９６ウェル透明ポリプロピレンプレートＡｂｇｅｎｅ＃ＡＢ０７９６）に移した。各２０μＬのワーキングビーズ混合物は、６．６μＬの溶解混合物、５．２μＬのヌクレアーゼフリー水、０．２μＬのプロテイナーゼＫ溶液、２μＬのブロッキング試薬、５μＬのプローブセット、１μＬのＬｕｍｉｎｅｘ磁気ビーズ（１０００個のビーズ／遺伝子／ウェル）を含んだ。そのプローブセットおよびＬｕｍｉｎｅｘビーズは、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｐｌｅｘセット−パネル＃１１８２８に対応する。そのハイブリダイゼーションプレートを、圧力によって活性化される供給された透明のシールで密封し、加熱／振盪恒温器（ＬａｂＮｅｔ  ＶｏｒＴｅｍｐ  ５６  Ｐ／Ｎ  Ｓ−０２５６−Ｑ）内に置き、６００ｒｐｍで振盪しながら５４℃±１℃において１８〜２２時間インキュベートした。このマルチプレックスアッセイにおいて使用される各磁気ビーズは、プローブセットとともに働いて、異なるｍＲＮＡ標的を異なるビーズ上に捕捉する異なるｓｓＤＮＡ捕捉プローブを有する。次いで、一晩ハイブリダイゼーション混合物を９６ウェル磁気分離プレート（９６ウェル平底マイクロプレートＮｕｎｃ＃２６９６２０）に移した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ手持ち式磁気ビーズ洗浄機（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｐ／Ｎ  ＱＰ０７０２）を使用してビーズを洗浄し、ゆえに、すべての未結合材料が除去された。１００μＬの２．０プレアンプリファイアワーキング試薬（製造者によって提供されるＰｒｅＡｍｐ溶液＋Ａｍｐ希釈剤を使用して３：１０００希釈）を各アッセイウェルに加えた。その磁気分離プレートを、裏に接着剤が付いた箔で密封し、５０℃±１℃および６００ｒｐｍで１時間インキュベートした。未結合の２．０プレアンプリファイアを除去し、手持ち式磁気プレートを使用して、ビーズを１００μＬの洗浄緩衝液（製造者によって提供される）で３回洗浄した。１００μＬの２．０アンプリファイアワーキング試薬（製造者によって提供されるＡｍｐ溶液＋Ａｍｐ希釈剤を使用して３：１０００希釈）を各アッセイウェルに加えた。その磁気分離プレートを密封し、５０℃±１℃および６００ｒｐｍで１時間インキュベートした。未結合の２．０アンプリファイアを除去し、手持ち式磁気ビーズ洗浄機を使用して、ビーズを１００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μＬの標識プローブワーキング試薬（製造者によって提供される標識プローブ溶液＋標識プローブ希釈剤を使用して３：１０００希釈）を、各アッセイウェルに加えた。その磁気分離プレートを密封し、５０℃±１℃および６００ｒｐｍで１時間インキュベートした。未結合の標識プローブを除去し、手持ち式磁気ビーズ洗浄機を使用して、ビーズを１００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μＬのＳＡＰＥワーキング試薬（製造者によって提供されるＳＡＰＥ溶液＋ＳＡＰＥ希釈剤を使用して３：１０００希釈）を各アッセイウェルに加えた。その磁気分離プレートを密封し、アルミニウム箔で包み、ＲＴおよび６００ｒｐｍで３０分間インキュベートした。未結合のＳＡＰＥワーキング試薬を除去し、手持ち式磁気ビーズ洗浄機を使用して、ビーズを１００μＬのＳＡＰＥ希釈剤で３回洗浄した。まず、ビーズを１３０μＬのＳＡＰＥ希釈剤に再懸濁した後、ビーズからのシグナルを、５０〜１００ビーズ／メッセージ、５０μＬというサンプル体積および４５秒間のサンプルタイムアウトというＤＤゲートの設定を使用し、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｆｌｅｘ  Ｍａｐ  ３Ｄ機器を用いて計測した。
【０３１９】
実施例１０
アフィディコリン
アフィディコリンは、細胞周期をＳ期初期において阻止する真核生物の核ＤＮＡ複製の可逆的な阻害剤である。その構造は、四環式の小分子の構造である。人工的な膜／足場上で生育されているｉＰＳ細胞由来ＲＰＥに添加されるアフィディコリンは、ＲＰＥの表現型を改善する。それは、運命拘束されたＲＰＥ細胞を、さらに成熟させ、完全に分化して高度に分極した組織単層を形成させる（図３０〜３１を参照のこと）。アフィディコリンを第４の培地に溶解し、ＲＰＥ細胞をその中で６〜８週間培養した後、解析が行われる。
【０３２０】
完全に分化して分極した、足場上のＲＰＥ組織は、網膜変性疾患に対するより有効な治療をもたらし得、インビトロ疾患モデリングおよびハイスループットスクリーニングに対するより「天然の」モデルも提供し得る。アフィディコリン処理は、完全に成熟したタイトジャンクションおよびより成熟した生理反応を有する組織をもたらす。生分解性足場と組み合わされるとき、この化合物は、ＲＰＥ単層を刺激して、それ自体の細胞外マトリックスを分泌させ、真の組織に似た特徴を獲得する。
【０３２１】
実施例１１
アルギネートコーティングは、細胞生存率を高め、細胞剥離を減少させる
アルギネートによって増強される凍結保存プロトコルを、下記に提供する。結果は、図３２Ａ〜３２Ｄに示されている。
【０３２２】
１．１０ｍｍバイオプシーパンチ（ＡＣＣＵ−ＰＵＮＣＨ（登録商標），ＵＳＡ）を使用して、ｈｆＲＰＥのコンフルエントな単層を含むトランスウェル膜を切除する。
【０３２３】
２．サンプルを、オートクレーブ滅菌された０．７％アルギン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を溶解したｄｄＨ２Ｏに０．５秒間浸ける。
【０３２４】
３．サンプルを、ｄｄＨ２Ｏ中のオートクレーブ滅菌された２％ＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）に０．５秒間漬けることにより、アルギネートを重合させる。
【０３２５】
４．直ちに、サンプルを、１ｍＬのＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（登録商標），Ｃａｎａｄａ）または１０％ＤＭＳＯ凍結保存培地（５００μＬの５％ＲＰＥ、４００μＬのＦＢＳ、１００μＬのＤＭＳＯ）を含む２ｍＬクライオバイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）に入れる。
【０３２６】
５．クライオバイアルを氷上に３０分間置く。
【０３２７】
６．クライオバイアルを、４℃に予冷しておいたＭｒ．Ｆｒｏｓｔｙ凍結容器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）に移し、１℃／分の速度で−８０℃に冷却する。
【０３２８】
７．サンプルを３７℃のウォーターバス内で部分的に融解することによって、凍結保存された組織を回収する。
【０３２９】
８．１ｍＬの予め温めておいた５％ＲＰＥ培地をクライオバイアルに完全に融解するまで加える。
【０３３０】
９．サンプルを１ｍＬの５％ＲＰＥに移して、凍結保存培地の構成要素をすすぐ。
【０３３１】
１０．サンプルを１ｍＬの５％ＲＰＥ培地に移動させる。
【０３３２】
１１．培地を毎日交換して、３日間にわたって回収する。
【０３３３】
１２．エチジウムホモダイマー−１（２．５μＭ）を使用して、細胞生存率を試験する。
【０３３４】
ＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）（Ｃｏｓｔａｒ，ＵＳ）システムの準備（図３３Ａ〜３３Ｅ）。
１．ウェル底部からウェル上部を手作業で分離する（図２Ａ）。
【０３３５】
２．足場（Ｓｔｅｌｌｅｎｂｏｓｃｈ  Ｎａｎｏｆｉｂｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｐｔｙ）Ｌｔｄ．，Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ）をそれが平らに横たわるようにＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）底部の中心に置く（図２Ｂ）。
【０３３６】
３．Ｏリング（ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ），１２ｍｍ×１０．２５ｍｍ×１．２ｍｍ，Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｗａｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｇａｓｋｅｔ  Ｃｏｒｐ，ＵＳ）が足場を適所に保つように、そのＯリングを足場の上に置く。そのＯリングは、７０％エタノール中での２０分間の処理によって予め滅菌されていなければならない（図２Ｃ）。
【０３３７】
４．Ｏリングの上にＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）の上部を置き、適所に軽く圧入する（図２Ｄ）。
【０３３８】
細胞播種用の足場の調製
１．２００ｍＬの１×ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳ）を、足場を有するＳｎａｐＷｅｌｌ（商標）に分注する。室温で２時間放置する。
【０３３９】
２．ＰＢＳを吸引除去し、２００ｍＬのヒト細胞外マトリックス（ＥＣＭ）／フェノールレッド（ＰＲ）含有１×ＨＢＳＳ溶液を各ＳｎａｐＷｅｌｌ（商標）に加える（１バイアルＥＣＭ：２０ｍＬ  ＨＢＳＳ）。ヒトＥＣＭ（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳ
フェノールレッド含有１×ＨＢＳＳ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳ）。
【０３４０】
３．そのプレートを、蓋を開けてＵＶ光の下に２時間置く。
【０３４１】
４．２時間後、ＵＶを切る。細胞調製中に溶液が乾燥しきらないようにするために、２００ｍＬのヒトＥＣＭ／ＰＲ含有１×ＨＢＳＳ溶液に１００ｍＬのＰＲ非含有１×ＨＢＳＳ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳ）を加える。
【０３４２】
細胞の播種
１．３００ｍＬのヒトＥＣＭ／１×ＨＢＳＳ溶液を吸引除去する。
【０３４３】
２．５００ｍＬの細胞懸濁物（２５０，０００細胞／ｍＬという密度での５％ＲＰＥ培地中）を各ウェルに分注する。
【０３４４】
ＲＰＥを分化させるために人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞技術を使用することにより、眼球の変性を有する患者に対する自己細胞ベースまたは同種細胞ベースの治療が提供される。幹細胞に由来するＲＰＥ細胞は、網膜の変性を有する患者の眼に、細胞懸濁物として注入されてきている。生分解性足場の上で極性のあるコンフルエントな単層として生育されたｉＰＳＣ由来ＲＰＥからＲＰＥ組織が作製された。単一の単層組織を移植することによって、懸濁物に関連する問題を回避することができる。
【０３４５】
ＲＰＥ細胞は、パリレン−Ｃおよびポリイミドなどの生体適合性膜上で培養された（Ｄｉｎｉｚら、ＩＯＶＳ  ２０１３）。これらの膜は、時間が経過しても分解せず、眼の中に永久的な外来性の実体を残すことから、時間が経過すると、タンパク質性材料を詰まらせ得る。本明細書中に開示されるのは、ＲＰＥ層が成熟し、それ自体の外部環境を作り出したら、加水分解によって足場が除去される手法である。ゆえに、機能的かつ極性のあるＲＰＥ単層を足場上に作り出すための本発明者らの方法は、網膜変性疾患に対する治療を提供する実行可能な組織工学ストラテジーである。
【０３４６】
ＲＰＥ細胞を培養して、インビボモデルに移植されることにより網膜の（ｒｅｎｔａｌ）疾患に対抗することができる機能的な組織にするために、生分解性足場を利用するプロトコルを作成した。この方法の主な構成要素は、ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標）ＣＯＳＴＡＲ（登録商標）ＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）プレート、生体不活性Ｏリングおよび生分解性足場である。ＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）プレートは、生分解性足場に対して構造およびプラットフォームを提供する。頂端側および基底側を作り出す微多孔膜が、足場に支持を提供するため、ならびに極性のある細胞層の異なる側を隔離するために理想的である。ＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）インサートが膜を剥離する能力のおかげで、そのインサートの支持リングが足場用のアンカーとして使用されることが可能になる。しかしながら、支持リングと膜とを組み合わせた後も、支持リングの底の縁（ｂｏｔｔｏｍ  ｌｉｐ）と多孔性膜自体との間に狭い空隙が存在する。ゆえに、本発明者らは、生体不活性Ｏリングを利用して、完全に適合させ、その空隙を満たした。これにより、支持リング（ｓｕｐｐｏｒｔ  ｒｉｇ）は、膜の外縁の周りに均一に圧力をかけることにより、膜に対して足場を保持することができる。
【０３４７】
まず、ＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）装置を解体し、支持リングを底部の膜から除去した。次に、生分解性足場を、ＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）膜の内側の寸法にマッチするように予め切断し、その膜の底面に沿って平らに置いた。次いで、Ｏリングを、足場と膜の両方の上部のＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）インサートの膜の部分に直接置いた。次いで、ＳｎａｐＷｅｌｌ（商標）インサートを再度組み立てることにより、支持リングと多孔性膜との間に間隙が存在しないように、支持リングがＯリングの上を確実に押すようにした。
【０３４８】
培養デバイスにいずれの溶液を加える前も、足場を濡らし、エタノール処理および紫外線曝露などの手法を用いて滅菌した。次いで、この足場および膜構造は、足場の上に細胞を播種することによる、極性のある細胞の培養に適している。細胞が足場の上に置かれた後、組織が完全に発生し、機能的になるまで、追加の因子の適用を含む培養条件を維持した。次いで、その組織は、インビボモデルへの移植または他のインビトロ研究において使える状態になった。
【０３４９】
上記培養用組立品は、膜から支持リングをはずし、Ｏリングを膜リングから取り除いて解体することができる。組織もまた、直接穴が開けられ得るか、またはデバイスから切除され得る。多孔性膜に組織を化学的に保持するものは無いので、その組織は、切除された後は膜から持ち上げられ、取りはずされる。得られたＲＰＥ組織は、光受容体の死を予防することおよび光受容体の再生を促進することによって、分解中の領域を蘇らせるために、網膜の変性を有する患者の網膜下腔に単一の実体として移植され得る。
【０３５０】
本発明者の発明の原理が適用され得る多くの可能性のある実施形態を考慮すると、例証された実施形態は、本発明の単なる例であって、本発明の範囲に対する限定であると見なされるべきでないことが認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の請求項によって定義される。ゆえに、本発明者らは、これらの請求項の範囲および精神の中に入るすべてを本発明者らの発明として主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３５−３】
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【図３６】
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【配列表】
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