(57)【要約】【課題】ヒトの触覚に起因する快感情向上剤、ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善剤又は肌の質感改善剤を効率良く探索する方法を提供する。【解決手段】（Ｉ）試験物質の存在下、ＭｒｇｐｒＢ４発現細胞に刺激を付与する工程、及び（ＩＩ）前記刺激に対するＭｒｇｐｒＢ４の応答を測定する工程、を含むヒトの触覚に起因する快感情向上剤、ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善剤又は肌の質感改善剤の評価又は探索方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｉ）試験物質の存在下、ＭｒｇｐｒＢ４発現細胞に刺激を付与する工程、及び（ＩＩ）前記刺激に対するＭｒｇｐｒＢ４の応答を測定する工程、を含むヒトの触覚に起因する快感情向上剤、ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善剤又は肌の質感改善剤の評価又は探索方法。
【請求項２】
以下の工程（Ａ）〜（Ｅ）を含む、請求項１記載の方法。
（Ａ）ＭｒｇｐｒＢ４発現細胞を膨張させる工程
（Ｂ）試験物質の存在下、膨張した細胞を収縮させる工程
（Ｃ）細胞収縮に対するＭｒｇｐｒＢ４の応答を測定する工程
（Ｄ）測定された応答に基づいてＭｒｇｐｒＢ４の応答を低下させる試験物質を同定する工程、
（Ｅ）同定された試験物質を、１）触覚に起因する快感情向上剤として評価又は選択する工程、２）ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善剤として評価又は選択する工程、又は３）肌の質感改善剤として評価又は選択する工程
【請求項３】
工程（Ａ）における細胞の膨張が、細胞に浸透圧濃度２０〜３０ｍＯｓｍ／Ｌの緩衝液とインキュベートすることにより行われる請求項２記載の方法。
【請求項４】
工程（Ｂ）における細胞の収縮が、膨張した細胞に浸透圧濃度３０〜７０ｍＯｓｍ／Ｌの緩衝液とインキュベートすることにより行われる請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
細胞がＨＥＫ２９３細胞である請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
触覚に起因する快感情が、皮膚外用剤を肌に馴染ませる際に生じる快感情である請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトの触覚によって喚起される快感情を向上させる快感情向上剤、ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善剤、又は肌の質感改善剤の評価又は探索方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肌は、乾燥や紫外線等の外的要因によるダメージや、ストレスのような内的要因によるダメージを受け易く、斯かるダメージが蓄積し、皮膚内側の水分量や皮膚バリア機能が低下し、ハリ、つや、キメ、うるおい、透明感といった見た目の肌状態(肌の質感)が低下する。一方、化粧品などの日用品を使用するとき、ヒトは多様な感情を経験している。特に、化粧品を使用した際の感触によって、幸福・満足感、贅沢感、リラックス、リフレッシュ、不満、落胆等の感情が喚起される。
したがって、化粧品開発には、ドライスキン若しくは皮膚バリア機能の改善や肌の質感の向上等の機能的価値だけでなく、心地良さや幸福感・満足感といった快感情を発揮する情緒的価値が求められ、斯かる価値を付与できる素材の開発が進められている。
【０００３】
近年、触覚によって喚起される快感情は、Ａβ線維やＡδ線維とは異なる、Ｃ触覚線維と呼ばれるＣ線維によって脳に伝わることが報告されている。斯かるＣ触覚線維の興奮は、刺激の強度と速度が重要であり、筆などのブラシ部材で、秒速１〜１０ｃｍ、２０〜４０ｇで皮膚を撫でた時に最も強く興奮することが知られている（非特許文献１）。また、マッサージによりアトピー性皮膚炎の臨床指標である苔癬、鱗屑、擦過傷等が改善されることが報告されている（非特許文献４）。
【０００４】
最近、Ｃ触覚線維に相当する神経線維にＧタンパク共役型受容体のＭｒｇｐｒＢ４（Mas-related G-protein coupled receptor member B4）がマウスで発現し、ＭｒｇｐｒＢ４を発現する神経線維を活性化することにより、触覚に起因した快感情が喚起されることが報告された（非特許文献２）。ＭｒｇｐｒＢ４が発現する神経線維は、親和行動、母性行動などの社会行動としてなされる触覚刺激時や自己グルーミングのような自己刺激時に、活性化されると考えられている。またＭｒｇｐｒＢ４が発現する細胞の応答は、マウスの後根神経節由来の初代培養細胞を用いて、細胞を膨張させる浸透圧刺激によって、活性を測定できることが知られている(非特許文献３)。
【０００５】
従来、ＭｒｇｐｒＢ４が発現する神経の活性化で触覚に起因する快感情が喚起されることが知られているが、ＭｒｇｐｒＢ４陽性線維に発現する複数の分子の中でＭｒｇｐｒＢ４を活性化することで、その快感情が喚起されることは明らかにされていなかった。さらにＭｒｇｐｒＢ４のヒトオルソログが同定されていないことから、ヒトにおける触覚によって喚起される快感情を科学的、定量的に把握する手段は知られておらず、触覚によって喚起される快感情を向上させる素材を効率的に探索する有効な手段はこれまでに知られていなかった。また、ＭｒｇｐｒＢ４と皮膚の機能や肌の質感との関係も全く知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Loken et al., NATURE NEUROSCIENCE, Vol. 12, p547-548, 2009
【非特許文献２】Vrontou et al., NATURE, Vol. 493, p669-673, 2013
【非特許文献３】Yamaguchi and Otsuguro, NEUROSCIENCE LETTERS, Vol. 653, p139-145, 2017
【非特許文献４】Schachner et al., Pharmacology and Therapeutics, 1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒトの触覚に起因する快感情向上剤、ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善剤、又は肌の質感改善剤を効率良く探索する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、ＭｒｇｐｒＢ４の活性を指標に、ヒトの触覚に起因する快感情の向上剤、ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善剤、又は肌の質感改善剤を評価・探索できることを明らかにした。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下に係るものである。
（Ｉ）試験物質の存在下、ＭｒｇｐｒＢ４発現細胞に刺激を付与する工程、及び（ＩＩ）前記刺激に対するＭｒｇｐｒＢ４の応答を測定する工程、を含むヒトの触覚に起因する快感情向上剤、ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善剤又は肌の質感改善剤の評価又は探索方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ヒトの触覚によって喚起される快感情を向上させる快感情向上剤、ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善剤又は肌の質感改善剤を簡易且つ効率よく評価又は探索することができる。快感情向上剤は、化粧品等の皮膚外用剤の情緒的価値を高める素材として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】細胞膨張後の収縮刺激によるＭｒｇｐｒＢ４の応答活性。
【図２】ポリオキシエチレンメチルグルコシドが相対ＭｒｇｐｒＢ４活性に及ぼす影響。
【図３】ポリオキシエチレンメチルグルコシドが塗布後の触覚刺激による快感情に与える影響。
【図４】継続的触覚刺激試験のスケジュール概要。
【図５】継続的触覚刺激による角層中の炎症性サイトカイン量の変化。
【図６】継続的触覚刺激による肌の質感の変化。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において「ヒトの触覚に起因する快感情」とは、ヒトにおいて、触覚によって喚起される快感情を意味する。快感情には、心地良さ、幸福・満足感、豪華さ、爽快感などが包含される(門地ら、JOURNAL OF SOCIETY OF COSMETIC CHEMICALS OF JAPAN, Vol. 43, p10-18, 2009)。
ヒトに快感情を喚起するような触覚刺激としては、Ｃ触覚線維を興奮させる刺激が挙げられ、例えば、スキンケアのための化粧品（乳液やクリーム等）を肌に馴染ませる行為、ボディケアのためのクリームやローション等を肌に馴染ませる行為、タオルなどのファブリック製品で肌を穏やかに拭く(撫でる)行為等が挙げられる。
尚、筆などのブラシ部材で、秒速１〜１０ｃｍ、２０〜４０ｇで皮膚を撫でた時に、Ｃ触覚線維が最も強く興奮することが知られている（前記非特許文献１）。
【００１３】
本発明において、「ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善」とは、皮膚内側の水分低下又は皮膚表面の鱗屑若しくは粗さの上昇（ドライスキン）、又は皮膚バリア機能（皮膚の内側からの水分の蒸散を防ぐ機能及び外界から皮膚への物質の侵入を防ぐ機能）の低下、を抑制すること又は改善させることを意味する。
【００１４】
本発明において、「肌の質感」とは、ハリ、つや、透明感、色ムラ、キメの整い感及び肌表面のなめらかさから選ばれる肌の質感を意味し、好ましくはハリ、つや、透明感及び色ムラから選ばれる肌の質感を意味する。
【００１５】
本発明者らは、ＭｒｇｐｒＢ４を発現させた細胞を作製し、当該細胞に刺激を付与した場合、それに応じてＭｒｇｐｒＢ４の応答が変化することを見出した。
具体的には、当該ＭｒｇｐｒＢ４発現細胞を一旦膨張させ、その後収縮させる刺激を与えた場合に、ＭｒｇｐｒＢ４の応答を低下させる素材が、ヒトのＣ触覚線維の興奮により喚起される快感情を向上させることを明らかにした（後記実施例）。
これらの結果は、ＭｒｇｐｒＢ４の応答が簡易且つ効率的に測定でき、ＭｒｇｐｒＢ４の応答を指標にして、ヒトの触覚に起因する快感情向上剤の評価、探索が可能であることを示すものである。
さらに、快感情を喚起する触覚刺激、すなわちＣ触覚線維を興奮させる刺激は、皮膚角層水分量の低下を抑制し、鱗屑や皮膚表面の粗さを改善し、皮膚の炎症を緩和することから、ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善効果を齎すこと（実施例２）、また顔肌の肌表面のなめらかさを向上させ、肌の質感改善効果を齎すことが確認された（実施例３）。
したがって、ＭｒｇｐｒＢ４の応答を指標にして、ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善剤、肌の質感改善剤の評価、探索も可能であると云える。
【００１６】
本発明のヒトの触覚に起因する快感情向上剤、ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善剤又は肌の質感改善剤の評価又は探索方法は、（Ｉ）試験物質の存在下、ＭｒｇｐｒＢ４発現細胞に刺激を付与する工程、及び（ＩＩ）前記刺激に対するＭｒｇｐｒＢ４の応答を測定する工程、を含むものである。
具体的には、以下の工程（Ａ）〜（Ｅ）により行われる。
（Ａ）ＭｒｇｐｒＢ４発現細胞を膨張させる工程
（Ｂ）試験物質の存在下、膨張した細胞を収縮させる工程
（Ｃ）細胞収縮に対するＭｒｇｐｒＢ４の応答を測定する工程
（Ｄ）測定された応答に基づいてＭｒｇｐｒＢ４の応答を低下させる試験物質を同定する工程、
（Ｅ）同定された試験物質を、１）触覚に起因する快感情向上剤として評価又は選択する工程、２）ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善剤として評価又は選択する工程、又は３）肌の質感改善剤として評価又は選択する工程
【００１７】
ＭｒｇｐｒＢ４（Mas-related G-protein coupled receptor member B4）は、ＮＣＢＩにＩＤ：２３３２３０として登録されている。マウスＭｒｇｐｒＢ４は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００１８】
本発明の方法において、ＭｒｇｐｒＢ４発現細胞としては、生体から単離されたＭｒｇｐｒＢ４陽性後根神経節神経等の天然にＭｒｇｐｒＢ４を発現する組織や細胞、又はそれらの培養物；ＭｒｇｐｒＢ４を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞又はその培養物等が挙げられる。
【００１９】
ＭｒｇｐｒＢ４を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞は、ＭｒｇｐｒＢ４をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞であり、ＭｒｇｐｒＢ４をコードする核酸が、染色体外要素として当該核酸が複製可能となるように導入されている細胞、又は当該核酸が染色体組み込みにより当該核酸が複製可能となるように導入されている細胞が挙げられる。ここで、核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡの何れでも良い。
当該ＭｒｇｐｒＢ４をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞は、前記ＭｒｇｐｒＢ４をコードする核酸と、用いられる宿主細胞におけるＭｒｇｐｒＢ４の発現に適したベクターとを連結させることにより得られたＭｒｇｐｒＢ４発現ベクターを宿主細胞に導入することにより得ることができる。宿主細胞へのＭｒｇｐｒＢ４をコードする核酸の導入は、例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載された形質転換、トランスフェクション等の方法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、パーティクルガン法、ウイルスを利用した方法等に準じて行なうことができる。
【００２０】
前記ＭｒｇｐｒＢ４をコードする核酸は、ＭｒｇｐｒＢ４をコードする核酸に対応する既知の塩基配列の情報、例えば、マウスＭｒｇｐｒＢ４をコードする核酸に対応する既知の塩基配列の情報（配列番号１）等に基づき、前記塩基配列から作製した適切なプライマー対を用いたＰＣＲ法及び／又は前記塩基配列から作製した適切なプローブとｃＤＮＡライブラリーとを用いたハイブリダイゼーション法等により得ることができる。
【００２１】
前記ＭｒｇｐｒＢ４をコードする核酸は、細胞への導入後に、前記核酸によりコードされるポリペプチドが、Ｇタンパク共役型受容体としての機能を発現するものであれば、その塩基配列において１又は数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入を有していてもよい。前記ＭｒｇｐｒＢ４をコードする核酸としては、例えば、１）配列番号１に示される塩基配列からなる核酸、２）配列番号１に示される塩基配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつそれによりコードされるポリペプチドがＧタンパク共役型受容体としての機能を有するポリペプチドである核酸、３）配列番号１に示される塩基配列からなる核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつそれによりコードされるポリペプチドがＧタンパク共役型受容体としての機能を有するポリペプチドである核酸、等が挙げられる。前記２）又は３）の核酸は、マウス由来の核酸であってもよく、ラットなどの他の動物に由来する核酸であってもよい。
【００２２】
ここで、塩基配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Lipman,DJ.,Pearson.WR.:Science,1985,227:1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ  Ｖｅｒ.１１（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
また、塩基配列におけるヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」の「数個」とは、例えば、対象となるヌクレオチド配列の総ヌクレオチド数の２０％以下の最大整数、好ましくは同じく１０％以下の最大整数、より好ましくは同じく５％以下の最大整数、さらに好ましくは同じく４％以下の最大整数、さらに好ましくは同じく３％以下の最大整数、さらに好ましくは同じく２％以下の最大整数、さらにより好ましくは同じく１％以下の最大整数を意味する。また本明細書において、ヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は数個のヌクレオチドの付加が含まれる。
【００２３】
また、ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな条件」とは、配列同一性が約８０％以上若しくは約９０％以上の塩基配列を有する遺伝子の確認を可能にする条件である。「ストリンジェントな条件」としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Joseph Sambrook,David W.Russell,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001）記載の条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションの当業者は、プローブのヌクレオチド配列や濃度、長さ等に応じて、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより、ストリンジェントな条件を適切に作り出すことができる。一例を示せば、上記「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション条件としては、５×ＳＳＣ、７０℃以上が好ましく、５×ＳＳＣ、８５℃以上がより好ましく、洗浄条件としては、１×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、１×ＳＳＣ、７３℃以上がより好ましい。上記ＳＳＣ及び温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素を適宜組み合わせることにより、適切なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２４】
前記ＭｒｇｐｒＢ４発現ベクターは、前記ＭｒｇｐｒＢ４をコードする核酸と、用いられる宿主細胞におけるＭｒｇｐｒＢ４の発現に適したベクターとを連結させることにより得られる。前記ベクターは、調製が容易であり、用いられる宿主細胞に効率よく導入でき、当該宿主細胞においてＭｒｇｐｒＢ４を発現させることができるベクターであればよく、好ましくは、大腸菌のプラスミド、酵母のプラスミド、レトロウイルスベクター等の動物ウイルスベクターが望ましい。
【００２５】
また、前記宿主細胞としては、前記ＭｒｇｐｒＢ４ポリペプチドをコードする核酸が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、特に限定されないが、例えば、ＨＥＫ２９３細胞等のｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ（ＨＥＫ）細胞、Ｓｆ−９  ｉｎｓｅｃｔ細胞、アフリカツメガエル卵母細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）等が挙げられる。
【００２６】
本発明の方法に使用される前記ＭｒｇｐｒＢ４をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞は、例えば、当該細胞におけるＭｒｇｐｒＢ４の機能の発現、タンパク質レベルでの発現、蛍光物質の導入等を指標として選択することができる。前記ＭｒｇｐｒＢ４をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞の選択には、適切な選択培地等を用いることができる。
【００２７】
ＭｒｇｐｒＢ４発現細胞の培養に用いられる培地としては、当該ＭｒｇｐｒＢ４を発現する細胞が生育するのに適した成分、例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質）、血清（例えば、ＦＢＳ、ＦＣＳ等）、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等を成分とする培地であればよい。前記培地は、市販されている培地であってもよい。ＭｒｇｐｒＢ４を発現する細胞の培養に用いられる培地としては、かかる細胞に適した培地であればよく、特に限定されないが、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等が挙げられる。
【００２８】
ＭｒｇｐｒＢ４発現細胞の播種時の細胞濃度は、９６Ｗｅｌｌプレートを使用した場合、１０，０００〜５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとするのが好ましく、２０，０００〜４０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとするのがより好ましい。
【００２９】
工程（Ｉ）において、ＭｒｇｐｒＢ４発現細胞に付与する刺激としては、当該細胞を膨張及び／又は収縮する刺激、機械刺激が挙げられ、具体的には、浸透圧刺激、極細のガラス管で細胞を押す、動かす等の刺激、細胞が浸漬している溶液の対流刺激等が挙げられ、好ましくは浸透圧刺激である。
【００３０】
工程（Ａ）における、ＭｒｇｐｒＢ４発現細胞の膨張は、例えば、細胞を低張緩衝液中に置く（インキュベート）ことにより行われる。
低張緩衝液としては、浸透圧濃度が、１０〜４０ｍＯｓｍ／Ｌ、好ましくは２０〜３０ｍＯｓｍ／Ｌの低張緩衝液が挙げられる。
斯かる低張緩衝液としては、少なくともＣａ２＋、ＨＥＰＥＳを含む緩衝液、例えば２０ｍＯｓｍ／Ｌ緩衝液；５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４等が挙げられる。
細胞膨張は、ＭｒｇｐｒＢ４発現細胞に、上記の低張緩衝液を、室温（２５℃）〜３７℃で、通常５〜６０分間、インキュベートすることにより行われる。
【００３１】
工程（Ｂ）における、膨張したＭｒｇｐｒＢ４発現細胞は、被験物質の存在下、収縮される。
細胞収縮は、当該細胞を工程（Ａ）で用いた低張緩衝液より高い浸透圧濃度を有する緩衝液中に置くことにより行われる。
ここで用いられる緩衝液としては、浸透圧濃度が、２０〜９０ｍＯｓｍ／Ｌ、好ましくは３０〜７０ｍＯｓｍ／Ｌの緩衝液が挙げられる。
斯かる低張緩衝液としては、少なくともＣａ２＋、ＨＥＰＥＳ、Ｄ-マンニトールを含む緩衝液、例えば３５ｍＯｓｍ／Ｌの緩衝液；１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５７ｍＭ  ＣｓＣｌ、７．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．７１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１４．３ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、８．６ｍＭ  Ｄ−マンニトール、１．０ｍＭ  グルコース、ｐＨ７．４等が挙げられる。
細胞収縮は、膨張したＭｒｇｐｒＢ４発現細胞に、上記の低張緩衝液を、室温（２５℃）〜３７℃で、通常５〜６０分間、インキュベートすることにより行われる。
ＭｒｇｐｒＢ４発現細胞は、膨張刺激によりＭｒｇｐｒＢ４の応答をより高くするが、浸透圧刺激による細胞膨張後の収縮刺激に対してより高い感受性を示すことから、その応答活性の評価は、膨張された細胞に収縮刺激を与えた場合のＭｒｇｐｒＢ４由来の応答の低下の程度をもって評価することが好適である。
【００３２】
本発明の方法に使用される試験物質は、ヒトの触覚に起因する快感情向上剤、ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善剤又は肌の質感改善剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。
本発明の方法において、試験物質の添加は、細胞の収縮刺激と同時、または刺激前に行われてもよい。好適には、試験物質を所定の濃度になるように前記の浸透圧緩衝液中に添加した後、当該緩衝液を細胞とインキュベートすることが挙げられる。
試験物質の添加濃度は、溶液中の浸透圧に影響を及ぼさない濃度とし、０．００１〜０．０３質量％（固形残分）とするのが好ましく、０．００３〜０．０１質量％（固形残分）とするのがより好ましい。
【００３３】
試験物質とＭｒｇｐｒＢ４発現細胞の接触は、室温（２５℃）〜３７℃で通常０．１時間〜４時間程度、好ましくは０．５〜２時間程度、インキュベートするのが好ましい。
【００３４】
次いで、細胞収縮に対するＭｒｇｐｒＢ４の応答が測定される（工程（Ｃ））。
測定は、Ｇタンパク共役型受容体の応答を測定する方法として当該分野で知られている任意の方法、例えば、カルシウムイメージング法、ｃＡＭＰアッセイ、ＴＧＦ-α切断アッセイ（ＴＧＦ−α  ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）等によって行えばよい。このうち、ＴＧＦ-α切断アッセイは、高精度、且つ高感度に受容体の活性を測定する方法として２０１２年に開発された手法であり（Inoue et al., Nature Methods, 9, 1021-1029 (2012)）、ＭｒｇｐｒＢ４の応答の測定に好適である。ＴＧＦ-α切断アッセイでは、細胞外ドメインをアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識したＴＧＦ−α（ＡＰ−ＴＧＦ−α）を、目的の受容体と共に発現させた細胞が用意される。刺激を受けて受容体が活性化すると、培養上清にＡＰ−ＴＧＦ−αの細胞外ドメインが切断されて遊離し、この培養上清のＡＰ活性を、基質ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＮｐｐ）との発色反応に基づいて検出することにより、受容体応答が測定される。
本発明の方法において、ＴＧＦ-α切断アッセイ系を用いる場合は、ＭｒｇｐｒＢ４発現細胞は、ＨＥＫ２９３細胞にＭｒｇｐｒＢ４の発現プラスミドベクターとＡＰ−ＴＧＦ-αの発現プラスミドベクターを遺伝子導入した細胞が使用される。
【００３５】
次いで、測定されたＭｒｇｐｒＢ４の応答に基づいて、当該受容体の応答に対する試験物質の効果が評価され、当該受容体応答を低下させる試験物質が同定される（工程（Ｄ））。
効果の評価は、例えば、異なる濃度の試験物質を添加した場合に測定された細胞収縮に対するＭｒｇｐｒＢ４の応答活性（細胞膨張時の応答を基準とした低下量）を比較することによって行うことができる。より具体的な例としては、より高濃度の試験物質添加群とより低濃度の試験物質添加群との間；試験物質添加群と非添加群との間；又は試験物質添加前後で、細胞収縮に対するＭｒｇｐｒＢ４の応答を比較する。試験物質添加により、又はより高濃度の試験物質の添加によりＭｒｇｐｒＢ４の応答をより低下させる場合、当該試験物質を、当該ＭｒｇｐｒＢ４の応答を低下させる物質として同定することができる。
【００３６】
例えば、試験物質添加群におけるＭｒｇｐｒＢ４の応答が対照群と比較して５０％以下、好ましくは８０％以下に低下していれば、当該試験物質を、ＭｒｇｐｒＢ４の応答を低下させる物質として同定することができる。
【００３７】
斯くして、同定されたＭｒｇｐｒＢ４の応答を低下させる試験物質は、後記実施例に示すとおり、ヒト皮膚をチークブラシで刺激（３−５ｃｍ／ｓｅｃ、３０−５０Ｇ）した場合に喚起される快感情を向上させた。したがって、ＭｒｇｐｒＢ４の応答を低下させる試験物質はヒトの触覚に起因する快感情向上剤として評価又は選択することができる。
また、快感情を喚起する触覚刺激は、皮膚角層水分量の低下を抑制し、鱗屑や皮膚表面の粗さを改善し、皮膚の炎症を緩和することから、ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善効果を齎す（実施例２）。また、快感情を喚起する触覚刺激は、顔肌の肌表面のなめらかさを向上させ、肌の質感改善効果を齎す（実施例３）。したがって、ＭｒｇｐｒＢ４の応答を低下させる試験物質は、ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善剤として、又は肌の質感改善剤として評価又は選択することができる。
【００３８】
このようにして選択されたヒトの触覚に起因する快感情向上剤、ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善剤又は肌の質感改善剤は皮膚外用剤として、或いはヒトの触覚に起因する快感情を向上するため、ドライスキン若しくは皮膚バリア機能を改善するため、又は肌の質感を改善するための素材又は製剤として皮膚外用剤に配合して使用することができ、それの情緒的価値又は機能的価値を高めることが可能である。また、快感情向上剤は、食品として、或いは食品に配合して使用することにより、例えば食品摂取後に化粧品（乳液やクリーム等）を肌に馴染ませた時の快感情を向上させ、化粧品の情緒的価値を高めることが可能である。
【００３９】
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞（Ｉ）試験物質の存在下、ＭｒｇｐｒＢ４発現細胞に刺激を付与する工程、及び（ＩＩ）前記刺激に対するＭｒｇｐｒＢ４の応答を測定する工程、を含むヒトの触覚に起因する快感情向上剤、ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善剤又は肌の質感改善剤の評価又は探索方法。
＜２＞以下の工程（Ａ）〜（Ｅ）を含む、＜１＞の方法。
（Ａ）ＭｒｇｐｒＢ４発現細胞を膨張させる工程
（Ｂ）試験物質の存在下、膨張した細胞を収縮させる工程
（Ｃ）細胞収縮に対するＭｒｇｐｒＢ４の応答を測定する工程
（Ｄ）測定された応答に基づいてＭｒｇｐｒＢ４の応答を低下させる試験物質を同定する工程、
（Ｅ）同定された試験物質を、１）触覚に起因する快感情向上剤、２）ドライスキン若しくは皮膚バリア機能改善剤として評価又は選択する工程、又は３）肌の質感改善剤として評価又は選択する工程として評価又は選択する工程
＜３＞工程（Ａ）における細胞の膨張が、細胞に浸透圧濃度２０〜３０ｍＯｓｍ／Ｌの緩衝液とインキュベートすることにより行われる＜２＞の方法。
＜４＞工程（Ｂ）における細胞の収縮が、膨張した細胞に浸透圧濃度３０〜７０ｍＯｓｍ／Ｌの緩衝液とインキュベートすることにより行われる＜２＞又は＜３＞の方法。
＜５＞細胞がＨＥＫ２９３細胞である＜１＞〜＜４＞のいずれかの方法。
＜６＞触覚に起因する快感情が、皮膚外用剤を肌に馴染ませる際に生じる快感情である＜１＞〜＜５＞のいずれかの方法。
＜７＞快感情が心地良さ、幸福・満足感、豪華さ又は爽快感である＜１＞〜＜６＞のいずれかの方法
＜８＞細胞に付与する刺激が、細胞を膨張、又は膨張及び収縮する刺激である、＜１＞の方法。
【実施例】
【００４０】
試験例１
（１）ＭｒｇｐｒＢ４一過性発現細胞の作製
細胞はＡＴＣＣから購入したヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３を使用した。培地はＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、１０％の血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）を含む培地で培養した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養を行った。ＭｒｇｐｒＢ４はマウスのＤｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎｓから、ＭｒｇｐｒＸ１はＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞からｐｃＤＮＡ３．１（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングしてプラスミドを作製し、ＴｒａｎｓＩＴ−２９３（Ｍｉｒｕｓ）を用いてプラスミドをＨＥＫ２９３に遺伝子導入して一過性発現細胞を作製した。
【００４１】
（２）ＴＧＦ−α切断アッセイによるＭｒｇｐｒＢ４由来活性の検出
既報に則り(Inoue et al., Nat Methods., 10, 1021-1029, 2012)、測定を実施した。ＨＥＫ２９３に（ＴＧＦ−α−ＡＰ）−ｐＲｃプラスミドとＭｒｇｐｒＢ４−、またはＭｒｇｐｒＸ１−ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドをＴｒａｎｓＩＴ−２９３で遺伝子導入した。その後でＰｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅコートされたＢｌａｃｋ−ｗａｌｌｅｄ  ｃｌｅａｒ−ｂａｓｅ  ９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに細胞を播種して、培養した。プレートから培養液を除き、等張緩衝液（膨張刺激時の場合、３２０ｍＯｓｍ／Ｌ；１０５ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  ＣｓＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、９０ｍＭ  Ｄ−Ｍａｎｎｉｔｏｌ、１０ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．４）、または低張緩衝液（収縮刺激時の場合、２０ｍＯｓｍ／Ｌ；５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加し、５分後に緩衝液を除き、各種浸透圧緩衝液（３５ｍＯｓｍ／Ｌ；５．８ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３ｍＭ  ＣｓＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  Ｄ−Ｍａｎｎｉｔｏｌ、０．５ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．４、５０ｍＯｓｍ／Ｌ：１１．７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．７ｍＭ  ＣｓＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  Ｄ−Ｍａｎｎｉｔｏｌ、１．１ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．４、２４５ｍＯｓｍ／Ｌ；７９ｍＭ  ＮａＣｌ、４．５ｍＭ  ＣｓＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、６７．５ｍＭ  Ｄ−Ｍａｎｎｉｔｏｌ、７．５ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．４、２７０ｍＯｓｍ／Ｌ；８７．２ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣｓＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、７４．７ｍＭ  Ｄ−Ｍａｎｎｉｔｏｌ、８．３ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．４）を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加して、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１時間インキュベートした。プレートを１，０００ｒｐｍで１分間遠心して、細胞と培養上清を分離し、上清を新しい９６  ｗｅｌｌプレートに移し、ｐＮｐｐ  ｔａｂｌｅｔ（Ｃａｙｍａｎ）を溶解したＡＰ  Ｂｕｆｆｅｒ  （４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．５、１  ｔａｂｌｅｔ／２０ｍＬ）を、培養プレートと上清を移したプレートに、１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で５、３０分間インキュベート後に吸光度（４０５ｎｍ、ＯＤ４０５）を測定した。
ｐＮＰＰを溶解したＡＰ  Ｂｕｆｆｅｒ添加５分後に測定したＯＤ４０５を、３０分後に測定した値からｗｅｌｌごとに減算した値を、それぞれΔＯＤ４０５（Ｃｅｌｌ）、ΔＯＤ４０５（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ，ＣＭ）とした。細胞に発現させたＡＰ−ＴＧＦ−α総量のうち、細胞外に遊離した量を算出するため、各ｗｅｌｌでΔＯＤ４０５（ＣＭ）／（ΔＯＤ４０５（Ｃｅｌｌ）＋ΔＯＤ４０５（ＣＭ））の値を求め、ＡＰ−ＴＧＦ−α遊離割合（％）とした。
【００４２】
（３）結果
ＴＧＦ−α  ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ａｓｓａｙによるＭｒｇｐｒＢ４由来の活性の検出
３２０ｍＯｓｍ／Ｌの等張緩衝液から、細胞を膨張させる２４５、２７０ｍＯｓｍ／Ｌの緩衝液による刺激で、ＭＯＣＫと比較して、ＭｒｇｐｒＢ４一過性発現細胞でＡＰ−ＴＧＦ−α遊離割合が上昇する傾向が示されたが、再現性に乏しかった。これに対し、２０ｍＯｓｍ／Ｌの低張緩衝液で細胞を膨張させた後に、３５、または５０ｍＯｓｍ／Ｌの緩衝液で、細胞を収縮させる浸透圧刺激を与えた時の応答を測定した。２０ｍＯｓｍ／Ｌの低張緩衝液で刺激した時の応答を基準としたＡＰ−ＴＧＦ−α遊離割合の変化の結果を、図１ａ、ｂに示す。その結果、細胞膨張後の細胞収縮刺激によって、ＭＯＣＫと比較して、ＭｒｇｐｒＢ４一過性発現細胞で再現性良くＡＰ−ＴＧＦ−α遊離割合が低下した。さらに図１ｂに示すように、同じファミリーに属するＭｒｇｐｒＸ１一過性発現細胞ではＭＯＣＫと変わらない応答だったことから、細胞収縮によるＡＰ−ＴＧＦ−α遊離割合の低下はＭｒｇｐｒＢ４一過性発現細胞特異的であることが明らかになった。このことからＭｒｇｐｒＢ４を発現させた細胞は、浸透圧刺激による細胞膨張後の収縮刺激に対して、高い感受性を示すことが明らかになり、細胞収縮刺激によるＡＰ-ＴＧＦ-α遊離割合をより低下させる素材がＭｒｇｐｒＢ４の活性を低下させると考えられた。
【００４３】
実施例１  ＭｒｇｐｒＢ４応答活性低下素材の探索と触覚刺激による評価
（１）方法
ＨＥＫ２９３でＭｒｇｐｒＢ４安定発現細胞を作製した。ＭｒｇｐｒＢ４安定発現細胞、またはＨＥＫ２９３に（ＴＧＦ−α−ＡＰ）−ｐＲｃプラスミドをＴｒａｎｓＩＴ−２９３で遺伝子導入した。その後でＰｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅコートされたＢｌａｃｋ−ｗａｌｌｅｄ  ｃｌｅａｒ−ｂａｓｅ  ９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに細胞を播種して、培養した。プレートから培養液を除き、低張緩衝液を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加し、５分後に緩衝液を除き、５０ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５７ｍＭ  ＣｓＣｌ、７．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．７１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１４．３ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、８．６ｍＭ  Ｄ−Ｍａｎｎｉｔｏｌ、１．０ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．４）を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加して、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１時間インキュベートすることで細胞を収縮させた。またコントロールとして、２０ｍＯｓｍ／Ｌの低張緩衝液でインキュベートしたものを用いた。その後の活性の検出は試験例１（２）と同様にＡＰ−ＴＧＦ−α遊離割合を算出し、コントロールである２０ｍＯｓｍ／Ｌの低張緩衝液で刺激した時のＡＰ−ＴＧＦ−α遊離割合を基準として減算し、５０ｍＯｓｍ／Ｌの緩衝液で細胞を収縮させた時の変化量を算出した。
ＭｒｇｐｒＢ４応答活性低下素材のスクリーニングは、５０ｍＯｓｍ／Ｌの緩衝液に素材を添加して細胞を刺激し、相対ＭｒｇｐｒＢ４活性を下記式により算出し、相対ＭｒｇｐｒＢ４活性を低下させる素材を探索した。
【００４４】
【数１】
2019118340.tif 000002
【００４５】
（２）触覚刺激による快感情の評価
２０−３０代の健常男性５名を対象に評価を行った。１００μＬの生理食塩水を前腕伸側に塗布した３０秒後に、自身で同前腕をチークブラシで秒速３−５ｃｍ、３０−５０ｇの荷重で１０回撫で、快感情をＶｉｓｕａｌ  Ａｎａｌｏｇ  Ｓｃａｌｅ  （ＶＡＳ; 主観的な感情の程度を直線状(左が特に何も感じない、右が非常に快)で評価する方法）で評価した。その直後に、同前腕に１００μＬの生理食塩水または（１）で選択されたＭｒｇｐｒＢ４応答活性低下素材を塗布し、３０秒後に同様にチークブラシで同前腕を１０回撫で、快感情をＶＡＳで評価した。そして最初の生理食塩水塗布後のチークブラシ刺激時の心地良さのＶＡＳ値からの変化率を、同前腕への生理食塩水、または素材塗布後のチークブラシ刺激時の心地良さＶＡＳ値から、それぞれ算出した。生理食塩水と素材塗布前後の触覚の快感情の評価は、それぞれ別日に行った。チークブラシによる刺激は、快感情を喚起する触覚刺激を受容するＣ線維を活性化する約３−５ｃｍ／ｓｅｃ、３０−５０ｇの荷重で行った（前記非特許文献１）。
【００４６】
（３）結果
ｉ）約６０種の化粧品原料から、ＭｒｇｐｒＢ４応答を低下させる物質を探索した結果、ポリオキシエチレンメチルグルコシド（エチレンオキシド付加モル数２０、ＧＬＵＣＡＭ  Ｅ−２０；ルーブリゾール社製）を見出した。ポリオキシエチレンメチルグルコシドは、図２に示すようにポリオキシエチレンメチルグルコシドが濃度依存的に相対ＭｒｇｐｒＢ４活性を低下させ、０．０１％で効果が最大となった。
【００４７】
ｉｉ）図３に示すように、０．０１％ポリオキシエチレンメチルグルコシドの塗布前後の快感情ＶＡＳ値の変化率が、生理食塩水の塗布前後の変化率に比べて有意に高いことが明らかになった。
【００４８】
実施例２  継続的触覚刺激による皮膚機能改善効果
（１）方法
ｉ）試験プロトコール
２０−３０代の健常男性６名を対象に、図４に示すスケジュールで試験を実施した。すなわち、チークブラシで前腕を刺激する１週間前から、石鹸で両前腕の伸側部を２回／日洗浄した。その後、同様の２回／日の洗浄の直後に、４週間に渡り、チークブラシで２回／日、３分間／回、片方の前腕の伸側部を自身で撫でた（右利きの人は左腕前腕を撫でた。）。反対の前腕は洗浄以外、刺激を与えなかった。チークブラシ刺激は快感情を喚起する触覚刺激を受容するＣ線維を活性化する、約３−５ｃｍ／ｓｅｃの速さ、約３０−５０ｇの荷重で行った（Loken et al., NATURE NEUROSCIENCE, Vol. 12, p547-548, 2009）。石鹸による長期間の洗浄による強い肌荒れの懸念から、試験開始３週間後（チークブラシ刺激開始２週間後）に石鹸から、洗顔料による洗浄に変更した。
試験開始１、５週時に角層水分量をＣｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ  ＣＭ８２５（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ）で、皮膚表面をＶｉｓｉｏｓｃａｎ  ＶＣ９８  ＵＳＢ（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ）で測定した。データは１週時の測定値を基準とした変化率として示した。また試験開始５週時に、両前腕伸側部の角層をテープストリッピングにより採取した。
【００４９】
ｉｉ）角層タンパク質の抽出、角層中サイトカインの定量
角層テープ３枚からタンパク質を抽出した。メスでテープを細かく切り分け、ＰＢＳ／０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液中（ｖ／ｖ）に浸漬（テープ１枚分を５００μｌ中に浸漬）し、氷上で３０分間静置した。その後、冷水中で１０分間の超音波破砕を行い、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ，２ｍｉｎ  ４℃）後、上清を採取した。上清中のタンパク質量をＭｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、ウシ血清アルブミンで作成した検量線を基に定量後、上清に終濃度０．５％（ｖ／ｖ）になるようにＢＳＡを添加し、ＩＬ−１Ａｌｐｈａ  Ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（ＲａｙＢｉｏ）、ＩＬ−１ｒａ  Ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  （ＲａｙＢｉｏ）、ＩＬ−１Ｂｅｔａ  Ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  （ＲａｙＢｉｏ）を用いて、炎症性サイトカイン量を定量した。
【００５０】
（２）結果
ｉ）皮膚機能/性状の変化解析
洗浄の影響と思われる前腕伸側の角層水分量（キャパシタンス値）の低下が、チークブラシ刺激で緩和する傾向（ｐ＝０．０６７）が示された。さらに皮膚表面解析により、ＳＥＳＣ（鱗屑指標）、ＳＥＲ（粗さ指標）の洗浄による低下が、チークブラシ刺激によって有意に改善した。これらのことから、チークブラシ刺激は洗浄によるドライスキンの発症、皮膚機能（皮膚バリア機能）の低下を緩和又は改善することが明らかになった。
【００５１】
【表１】
2019118340.tif 000003
【００５２】
ｉｉ）角層中サイトカイン量の変化
試験開始５週時に両前腕伸側部の角層をテープストリッピングにより採取し、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１ＲＡ／ＩＬ−１α、ＩＬ−１β）量を測定した。その結果、チークブラシ刺激により、前腕伸側におけるＩＬ−１ＲＡ／ＩＬ−１αが有意に低下、ＩＬ−１βが低下傾向を示した（図５）。したがって、チークブラシ刺激は洗浄により起こる皮膚の炎症を緩和することが明らかになった。これらのことから、チークブラシ刺激は洗浄による皮膚機能の低下を改善することが明らかになった。
【００５３】
実施例３  継続的触覚刺激による肌の質感スコアの向上
（１）方法
ｉ）２０−４０代の健常女性２２名を対象に実施した。
ｉｉ）触覚刺激
チークブラシで２回／日（朝と晩）、３分間、前腕の伸側部を自身で、４週間撫でた。チークブラシ刺激は快感情を喚起する触覚刺激を受容するＣ線維を活性化する約３−５ｃｍ／ｓｅｃの速さ、３０−５０ｇの荷重で行った（Loken et al., NATURE NEUROSCIENCE, Vol. 12, p547-548, 2009）。
ｉｉｉ）肌の質感の目視評価
肌の質感の目視評価は、文献(中村ら、JOURNAL OF SOCIETY OF COSMETIC CHEMICALS OF JAPAN, Vo. 45, p306-314, 2011)記載の方法に則り、一定の評価基準で客観的な目視評価のトレーニングをした専門家にて実施した。評価は「ない（−３）」「ある（３）」の７段階尺度法を用いた。
【００５４】
（２）結果
チークブラシで前腕を撫でる刺激を４週間継続することにより、図６に示すように顔肌の肌表面のなめらかさのスコア値が向上する傾向を示すことが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2019118340.tif 000008
【図６】
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【配列表】
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