(57)【要約】【課題】以下を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供すること：（ｉ）増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）の少なくとも一部を含む、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメイン；（ｉｉ）スペーサードメイン（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；および（ｉｖ）細胞内Ｔ細胞シグナリングドメイン。【解決手段】本発明は、多発性骨髄腫などの形質細胞媒介性疾患の処置においてそのようなＣＡＲを発現する、そのようなＴ細胞の使用も提供する。多発性骨髄腫（骨髄腫）は、形質細胞の骨髄悪性腫瘍である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関係する。そのようなＣＡＲを発現するＴ細胞は、多発性骨髄腫などの形質細胞疾患の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
多発性骨髄腫
多発性骨髄腫（骨髄腫）は、形質細胞の骨髄悪性腫瘍である。異常な形質細胞の集団が骨髄に凝集し、そこでそれらは正常な血液細胞の産生を妨げる。骨髄腫は、米国において２番目に一般的な血液悪性腫瘍であり（非ホジキンリンパ腫の次）、血液悪性腫瘍の１３％を、および全てのがんの１％に相当する。この疾患は、死の前に病的骨折、感染への感受性、腎臓そして骨髄の機能不全を引き起こすことから、苦痛と医療出費の点で負担となる。
【０００３】
多くのリンパ腫と異なり、骨髄腫は現在不治である。リンパ腫に用いられる標準的な化学療法薬は、大部分が骨髄腫には効果的でない。加えて、形質細胞ではＣＤ２０の発現が消失しているため、この疾患に対してリツキシマブを使用することはできない。ボルテゾミブやレナリドミドなどの新しい薬剤は部分的に効果的だが、長期にわたる寛解を導くことはできない。
【０００４】
そのため、上昇した効果および改善した長期間の効果を有する、骨髄腫の治療のための代替の薬剤への必要性が存在する。
【０００５】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体は、通常の形式において、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性を、Ｔ細胞のエフェクター効果へ移植したタンパク質である。その通常の形式は、抗原認識アミノ末端、スペーサー、膜貫通ドメインが全て、Ｔ細胞生存および活性化シグナルを伝達する混成エンドドメインに連結した、Ｉ型膜貫通ドメインタンパク質の形式である（図３を参照）。
【０００６】
これら分子の最も一般的な形式は、標的抗原を認識するために、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を使用する。ｓｃＦｖは、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナリングエンドドメインに融合される。そのような分子は、ｓｃＦｖによるそれらの標的の認識に応答してＴ細胞の活性化をもたらす。Ｔ細胞がそのようなＣＡＲを発現するとき、それらは標的抗原を発現する標的細胞を認識し、かつ殺傷する。腫瘍関連抗原に対する数種のＣＡＲが開発されており、そのようなＣＡＲを発現するＴ細胞を使用する養子移植アプローチは、現在広範ながんの処置のための臨床試験にある。Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら（２０１３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９（８）
２０４８−６０）は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に対するｓｃＦｖを組み込むＣＡＲを記述している。
【０００７】
ＢＣＭＡは、成熟リンパ球、すなわち記憶Ｂ細胞、形質芽細胞、および骨髄形質細胞において優先的に発現している膜貫通タンパク質である。ＢＣＭＡは多発性骨髄腫細胞でもまた発現している。
【０００８】
Ｃａｒｐｅｎｔｅｒらは、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するように形質導入されたＴ細胞は、骨髄腫患者の形質細胞腫由来骨髄腫細胞を特異的に殺傷する能力を有することを実証している。
【０００９】
抗ＢＣＭＡ抗体を使用するＣＡＲアプローチは見込みを示すが、この抗原を標的とするときの特有の検討事項は、例えばリンパ腫細胞上のＣＤ１９と比較すると、骨髄腫細胞上のＢＣＭＡの特に低い密度である。そのため、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の標的細胞認識の感受性を上昇させる必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （２０１３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９（８）  ２０４８−６０）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
Ｂ細胞膜抗原（ＢＣＭＡ）は、ほとんど全ての多発性骨髄腫（ＭＭ）で発現する表面タンパク質である。ＢＣＭＡは形質細胞でない限り発現していないため、この抗原を標的とすることは、骨髄腫の効果的な処置となり得る。しかしながらＢＣＭＡの低レベルな発現（図２を参照）は、この抗原を標的とするときの検討事項である。
【００１２】
本発明者らは、ＣＡＲ型分子において、ＢＣＭＡ結合抗体よりもむしろ増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に基づく結合ドメインを使用する場合に、そのようなＣＡＲを発現するＴ細胞が、低レベルな発現の標的細胞であっても、ＢＣＭＡを発現する標的細胞の非常に効果的な殺傷を引き起こすことを、驚いたことに発見した。
【００１３】
理論に拘束されることを望むわけではないが、本発明者らは、これはＢＣＭＡとＡＰＲＩＬとの結合に固有の３回対称性のためであると予想している。これは、ＣＡＲとＢＣＭＡとの間のそれぞれの相互作用は３つのＣＡＲを巻き込むことを意味し、これはＴ細胞表面で３つのエンドドメインを近接させる。Ｔ細胞活性化は、免疫シナプスにおけるシグナリングエンドドメインの密接な近接によって引き起こされるため、本発明のＣＡＲデザインは高度に感度がよく、かつ特異的である。ＢＣＭＡは、初代骨髄腫細胞において非常に低密度で発現するため（図２および７を参照）、この受容体デザインはこの標的に対して特に適している。
【００１４】
そのため、本発明の第一の態様において、以下を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する：
（ｉ）増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）の少なくとも一部を含むＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメイン；
（ｉｉ）スペーサードメイン
（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；および
（ｉｖ）細胞内Ｔ細胞シグナリングドメイン。
【００１５】
ＢＣＭＡ結合ドメインは、ＢＣＭＡ結合部位を含むが、プロテオグリカン結合に寄与するＡＰＲＩＬのアミノ末端部分を欠失した、短縮型ＡＰＲＩＬを含み得る。そのような分子は配列番号１４に示される配列を含み得る。代替的にその分子は、ＢＣＭＡと結合する、少なくとも８０％の配列同一性を有する、その配列のバリアントを含み得る。
【００１６】
膜貫通および細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインは、配列番号７に示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有する、そのバリアントを含み得る。
【００１７】
ＢＣＭＡ結合ドメインおよび膜貫通ドメインは、スペーサーによって連結され得る。スペーサーは、以下の１つを含み得る：ヒトＩｇＧ１スペーサー；ＩｇＧ１ヒンジ；またはＣＤ８の柄（ｓｔａｌｋ）。
【００１８】
本発明の第一の態様のＣＡＲは、配列番号１，２，３，４，５、もしくは６に示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するが、ｉ）ＢＣＭＡへの結合能、およびｉｉ）Ｔ細胞シグナリングを誘導する能力を保持する、それらのバリアントを含み得る。
【００１９】
本発明の第一の態様のＣＡＲは、三量体としてＢＣＭＡに結合し得る。
【００２０】
第二の態様において、本発明は前述のいずれかの請求項に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を提供する。
【００２１】
核酸配列は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０、または少なくとも８０％の配列同一性を有するそれらのバリアントを含み得る。
【００２２】
第三の態様において、本発明は、本発明の第二の態様に記載の核酸配列を含むベクターを提供する。
【００２３】
第四の態様において、本発明は、本発明の第一の態様に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞を提供する。
【００２４】
第五の態様において、本発明は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に本発明の第二の態様に記載の核酸配列を導入する工程を含む、本発明の第四の態様に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞を作製する方法を提供する。
【００２５】
第六の態様において、本発明は、本発明の第三の態様に記載のベクター、または本発明の第四の態様に記載のＴ細胞／ＮＫ細胞と、薬学的に許容できるキャリア、希釈剤、または添加物とを一緒に含む薬学的組成物を提供する。
【００２６】
第七の態様において、本発明は、本発明の第三の態様に記載のベクター、または本発明の第四の態様に記載のＴ細胞／ＮＫ細胞を被験体へ投与する工程を含む、形質細胞障害を処置する方法を提供する。
【００２７】
形質細胞障害は、形質細胞腫、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ワルデンストレーム型マクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、骨硬化性ミエローマ、Ｈ鎖病、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症および無症候性骨髄腫から選択され得る。
【００２８】
形質細胞障害は、多発性骨髄腫であり得る。
【００２９】
第八の態様において、本発明は、形質細胞障害の処置における使用のための、本発明の第三の態様に記載のベクター、または本発明の第四の態様に記載のＴ細胞／ＮＫ細胞を提供する。
【００３０】
第九の態様において、本発明は、形質細胞障害を処置するための医薬品の製造における、本発明の第三の態様に記載のベクター、または本発明の第四の態様に記載のＴ細胞／ＮＫ細胞の使用を提供する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
以下を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）：
（ｉ）  増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）の少なくとも一部を含む、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメイン；
（ｉｉ）  スペーサードメイン；および
（ｉｉ）  膜貫通ドメイン；および
（ｉｉｉ）  細胞内Ｔ細胞シグナリングドメイン。
（項目２）
前記ＢＣＭＡ結合ドメインは、短縮型ＡＰＲＩＬを含み、該短縮型ＡＰＲＩＬは、ＢＣＭＡ結合部位を含むが、プロテオグリカン結合に寄与するＡＰＲＩＬのアミノ末端部を欠失する、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目３）
配列番号１４に示す配列、またはＢＣＭＡに結合し、少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、項目２に記載のＣＡＲ。
（項目４）
前記膜貫通および細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインは、配列番号７に示す配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、前述のいずれかの項目に記載のＣＡＲ。
（項目５）
前記スペーサーは、以下の１つを含む、前述のいずれかの項目に記載のＣＡＲ：ヒトＩｇＧ１スペーサー；ＩｇＧ１ヒンジ；またはＣＤ８の柄。
（項目６）
前記スペーサーは、ＣＤ８の柄を含む、項目５に記載のＣＡＲ。
（項目７）
配列番号１、２、３、４、５、もしくは６に示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するが、ｉ）ＢＣＭＡへの結合能、およびｉｉ）Ｔ細胞シグナリングを誘導する能力を保持する、それらのバリアントを含む、前述のいずれかの項目に記載のＣＡＲ。
（項目８）
前述のいずれかの項目に記載のＣＡＲをコードする核酸配列。
（項目９）
配列番号１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０に示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するそれらのバリアントを含む、項目８に記載の核酸配列。（項目１０）
項目８または９に記載の核酸配列を含むベクター。
（項目１１）
項目１から７のいずれかに記載のＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞。
（項目１２）
Ｔ細胞またはＮＫ細胞に、項目８または９に記載の核酸配列を導入する工程を含む、項目１１に記載のＴ細胞またはＮＫ細胞を作製する方法。
（項目１３）
項目１０に記載のベクター、または項目１１に記載のＴ細胞／ＮＫ細胞を、薬学的に許容できるキャリア、希釈剤、もしくは添加剤と一緒に含む薬学的組成物。
（項目１４）
項目１０に記載のベクター、または項目１１に記載のＴ細胞／ＮＫ細胞を、被験体に投与する工程を含む、形質細胞障害を処置する方法。
（項目１５）
前記形質細胞障害は、形質細胞腫、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ワルデンストレーム型マクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、骨硬化性ミエローマ、Ｈ鎖病、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、および無症候性骨髄腫より選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記形質細胞障害は、多発性骨髄腫である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
形質細胞障害の処置における使用のための、項目１０に記載のベクター、または項目１１に記載のＴ細胞／ＮＫ細胞。
（項目１８）
形質細胞障害を処置するための医薬の製造における、項目１０に記載のベクター、または項目１１に記載のＴ細胞／ＮＫ細胞の使用。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦのリガンド特異性と機能割り当て  Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）は、ＢＡＦＦ−Ｒ（ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、Ｂ細胞膜抗原（ＢＣＭＡ、ＴＮＦＲＳＦ１７）、ならびに膜貫通型活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）と相互作用する一方、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ、ＴＮＦＳＦ１３）は、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、およびプロテオグリカンと相互作用する。ＢＡＦＦ−Ｒ活性化は、末梢Ｂ細胞生存に影響を及ぼす一方、ＢＣＭＡは形質細胞生存に影響を及ぼし得る。ＡＰＲＩＬのプロテオグリカンとの相互作用は、ＡＰＲＩＬのアミノ末端を含む酸性硫酸化グルコサミノグリカン側鎖に関係する。
【図２】骨髄腫でのＢＣＭＡの発現データ  ３９人の多発性骨髄腫患者由来の骨髄サンプルから骨髄腫細胞を、ＣＤ１３８＋磁気ビーズ選択により単離した。これら細胞を、ＰＥと結合化された抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体Ｊ６ＭＯ（ＧＳＫ）により染色した。抗原のコピー数は、ＰＥ  Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ  ｂｅａｄｓ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を使用し、製造者の指示通りに定量した。抗原コピー数の箱ひげ図が、プロットされた範囲、四分位数、および中央値と共に提示する。我々は、その範囲が、細胞あたり３４８．７〜４２６８．４のＢＣＭＡコピーであり、平均値が１１８１、中央値が１０８４．９であることを見出した。
【図３】キメラ抗原受容体の標準的なデザイン  キメラ抗原受容体の典型的な形式を示す。これらはＩ型膜貫通タンパク質である。エクトドメインは抗原を認識する。これは、スペーサードメインに接続された一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に由来する抗体からなる。これは今度は、膜において分子を固定するように働く、膜貫通ドメインに連結される。最後に、これは細胞に細胞内シグナルを伝達するように働くエンドドメインに連結される。これは１つまたは複数のシグナリングドメインからなる。
【図４】生成された異なるＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲのデザイン。  図３に示されるＣＡＲデザインは、ｓｃＦｖが、抗原結合ドメインとしてはたらけるように、ＡＰＲＩＬの修飾形式に置換されるように修飾された：ＡＰＲＩＬは、プロテオグリカン結合アミノ末端が欠失されるように短縮化された。次いでシグナルペプチドが、タンパク質を細胞表面へ指向させるように、短縮型ＡＰＲＩＬアミノ末端に接続された。３つのＣＡＲが、このＡＰＲＩＬに基づく結合ドメインを用いて生成された：Ａ．第一のＣＡＲにおいて、ヒトＣＤ８柄ドメインがスペーサードメインとして使用された。Ｂ．第二のＣＡＲにおいて、ＩｇＧ１由来のヒンジがスペーサードメインとして使用された。Ｃ．第三のＣＡＲにおいて、Ｆｃ受容体結合を減少するために、Ｈｏｍｂａｃｈら（２０１０  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １７：１２０６−１２１３）によって記載されたｐｖａ／ａ変異を用いて修飾された、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインがスペーサーとして使用された（以後Ｆｃ−ｐｖａａとして参照される）。全てのＣＡＲにおいて、これらのスペーサーはＣＤ２８の膜貫通ドメイン、そして次いでＣＤ２８、ＯＸ４０およびＣＤ３ゼータエンドドメインの融合物を含む三者のエンドドメインに連結される（Ｐｕｌｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ、２００５年：１２巻；５号；９３３−４１頁）。
【図５】上記３つのＡＰＲＩＬ−ＣＡＲのアノテーションされたアミノ酸配列  Ａ：は、ＣＤ８の柄ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲのアノテーションされたアミノ酸配列を示す；  Ｂ：は、ＡＰＲＩＬ  ＩｇＧ１ヒンジに基づくＣＡＲのアノテーションされたアミノ酸配列を示す；  Ｃ：は、ＡＰＲＩＬ  Ｆｃ−ｐｖａａに基づくＣＡＲのアノテーションされたアミノ酸を示す。
【図６Ａ】異なるＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲの発現およびリガンド結合  Ａ．受容体を、レトロウイルス遺伝子ベクターにおいて、マーカー遺伝子短縮型ＣＤ３４と共発現した。形質導入細胞でのマーカー遺伝子の発現は、形質導入の確認を可能にする。  Ｂ．Ｔ細胞に、ＣＤ８柄のスペーサー、ＩｇＧ１ヒンジ、またはＦｃスペーサーのいずれかを有するＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲを形質導入した。これらの受容体を細胞表面において安定に発現させることができたか否かを試験するために、次いでＴ細胞を抗ＡＰＲＩＬ−ビオチン／ストレプトアビジンＡＰＣおよび抗ＣＤ３４によって染色した。フローサイトメトリー解析を行った。ＡＰＲＩＬは、３つのＣＡＲにおいて細胞表面で同等に検出され、これはそれらが同等に安定して発現されることを示唆する。  Ｃ．次に、ＣＡＲのＴＡＣＩおよびＢＣＭＡ認識能を決定した。形質導入されたＴ細胞を、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃに融合させたリコンビナントＢＣＭＡまたはＴＡＣＩ融合物のいずれかと一緒に、抗マウス二次および抗ＣＤ３４によって染色した。３つの受容体の形式は全て、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩの両方への結合を示した。驚くべき発見は、ＢＣＭＡへの結合が、ＴＡＣＩへの結合よりも大きいように見えることであった。更に驚くべき発見は、３つのＣＡＲが全て同等に発現したが、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを認識するという点で、Ｆｃスペーサーを有するＣＡＲよりもＣＤ８柄およびＩｇＧ１ヒンジＣＡＲが良好であることであった。
【図６Ｂ】同上
【図７】異なるＣＡＲコンストラクトの機能  ３つの異なるＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲの機能分析を行った。何も形質導入していない（ＮＴ）、または異なるＣＡＲを発現するように形質導入した、いずれかの正常ドナー末梢血Ｔ細胞。形質導入は、同等のタイター上清を使用して行った。次いで、非特異的なＮＫ活性を除去するために、これらのＴ細胞よりＣＤ５６を枯渇させ、そしてエフェクターとして使用した。何も形質導入していない（ＮＴ）、またはＢＣＭＡもしくはＴＡＣＩを発現するように形質導入した、いずれかのＳｕｐＴ１細胞を標的として使用した。示されるデータは、５回の独立した実験からの平均値および標準偏差である。  Ａ．ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを発現するＴ細胞の特異的な殺傷を、クロム放出を使用して決定した。  Ｂ．インターフェロンγ放出も決定した。標的およびエフェクターを１：１の比率で共培養した。２４時間後、上清中のインターフェロンγをＥＬＩＳＡによって分析した。  Ｃ．ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖／生存も、更に６日間インキュベートした同じ共培養中のＣＡＲ  Ｔ細胞の数を計数することによって決定した。３つのＣＡＲは全て、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを発現する標的に対する応答を指向した。ＢＣＭＡへの応答は、ＴＡＣＩよりも大きかった。
【図８】ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞による初代骨髄腫細胞の殺傷  ほとんどの初代骨髄腫細胞は、それらの表面に少数のＢＣＭＡ分子を発現するため、低密度発現にも拘らず初代骨髄腫細胞の殺傷が生じるか否かを検証した。図２において記載されたＢＣＭＡ発現の範囲に相当する３症例を選択した：第一は不明瞭な発現を有する（平均より低い）；第二の症例は中間的な発現を有する（ほぼ平均の発現）そして第三は明瞭な発現を有した（平均の発現より上）。３症例全てについてのアイソタイプ対照に対するＢＣＭＡ染色のヒストグラムは、左に示される。この分析においては、ＣＤ８の柄およびヒンジのＡＰＲＩＬ  ＣＡＲのみを試験した。左に、開始数と比較した骨髄腫細胞の生存が、骨髄腫細胞とＣＡＲ  Ｔ細胞との１：１共培養後３日目および６日目で示される。６日目までに、不明瞭なＢＣＭＡ発現を有する骨髄腫細胞を含む、９５％超の骨髄腫細胞が排除された。
【図９】ＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲと短縮型ＣＤ３４を共発現するベクター  スクリーニングのために使用したベクターを発現する細胞株を、ＢＣＭＡ−ＦｃまたはＴＡＣＩ−Ｆｃのいずれかとインキュベートし、そして抗ＣＤ３４および抗ヒトＦｃ  ＰＥの両方、ならびにＦＩＴＣを付与したｍＡｂによって染色した。次いで細胞をフローサイトメトリーによって研究した。これは、マーカー遺伝子ＣＤ３４に関するＢＣＭＡおよびＴＡＣＩの結合の典型的なパターンを示す。
【図１０Ａ】古典的なＣＡＲを説明する模式図  Ｂ：生成された異なるＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲのデザイン。  シグナルペプチドを短縮型ＡＰＲＩＬアミノ末端に接続した。これを異なるスペーサー：Ｆｃ受容体結合を減少させるために、Ｈｏｍｂａｃｈら（２０１０  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １７：１２０６−１２１３）によって記載されたｐｖａａ変異を用いて修飾されたヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン；ヒトＣＤ８αの柄；ならびにＩｇＧ１のヒンジのいずれかに融合した。これらスペーサーを、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＯＸ４０エンドドメイン、およびＣＤ３ゼータエンドドメインを含有する三者のエンドドメインに連結した。
【図１１】異なるＣＡＲの発現  受容体を、ＩＲＥＳ配列を使用して高感度青色蛍光タンパク質２（ｅＢＦＰ２）と共発現させた。初代ヒトＴ細胞に形質導入し、抗ＡＰＲＩＬ−ビオチン／ストレプトアビジンＡＰＣによって染色した。フローサイトメトリー解析を行った。ｅＢＦＰ２シグナルは、ＡＰＲＩＬ検出に対して示される。３つのＣＡＲは全て安定に発現した（３つの異なる正常ドナーＴ細胞を使用して行われた３回の独立実験の代表的な実験）。
【図１２】クロム放出分析  エフェクターとして、何も形質導入していない（ＮＴ）か、または異なるスペーサーのＣＡＲを発現するように形質導入したかの、いずれかの正常ドナー末梢血Ｔ細胞、および標的として、何も形質導入していない（ＮＴ）か、またはＢＣＭＡもしくはＴＡＣＩを発現するように形質導入したかのいずれかのＳｕｐＴ１細胞を使用。Ｔ細胞は、ＮＫ活性を減少させるためにＣＤ５６を枯渇させた。これは３回の独立した実験の代表であり、そして一例として示される。累積の殺傷データは、図７Ａに示される。ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを発現するＴ細胞の特異的な殺傷が、陰性標的細胞に対する無活性と一緒に観察される。
【図１３】インターフェロンガンマ放出  エフェクターと標的の１：１共培養由来を、ＥＬＩＳＡによって計測した。ＣＤ８柄のコンストラクトは、最高の特異性を有するようである一方で、ヒンジコンストラクトは、最多のインターフェロン放出をもたらし、これらはいくらかの非特異的活性を実証する。これは、３回の独立した実験の代表であり、一例として示される。累積のインターフェロンガンマ放出データは、図７Ｂに示される。
【図１４】初代骨髄腫上のＢＣＭＡ発現の例  ラット抗ヒトＢＣＭＡ  ｍＡｂ  Ｖｉｃｋｙ１によって染色した、骨髄腫サンプルの４例を示す。第一のパネルは、形質細胞性白血病（骨髄腫の異常であり、進行した、かつ侵襲性の形態）の患者における、明瞭なＢＣＭＡ染色を示す。他３症例は、医学的かつ形態的に典型的な骨髄腫である。それらは典型的に見られる、中間的または不明瞭な染色を示す。アイソタイプ対照（灰色）での染色を重ねた。これらは、図２に示される累積のＢＣＭＡ発現データの例である。
【図１５】Ｖ５エピトープタグを有するＡＰＲＩＬ−ＣＡＲのアミノ酸配列。  Ａ：ｄＡＰＲＩＬ−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−ＣＤ２８ＯＸＺ  Ｂ：ｄＡＰＲＩＬ−ＣＤ８ＳＴＫ−ＣＤ２８ＯＸＺ  Ｃ：ｄＡＰＲＩＬ−ＨＮＧ−ＣＤ２８ＯＸＺ  この図における配列は、異なるシグナルペプチドを有し、かつＶ５タグを有さない点で、図５における配列とは異なる。
【図１６Ａ】ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ機能の実証  尾静脈注射を介して１×１０７  ＭＭ１．ｓ．ＦＬｕｃ細胞を受容した、６匹の３ヶ月齢メスＮＳＧマウス。マウスは、８日目および１３日目に生物発光によってイメージングした。１３日目でのイメージングの後に、４匹のマウスは尾静脈注射を介して５×１０６  ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を受容した。マウスは１３日目および１８日目にイメージングした。ＣＡＲ  Ｔ細胞を受容したマウスは、（＊）により示される。骨髄腫の寛解は、処置したマウスの全てにおいて１８日目までに観察されたが、一方で無処置マウスにおける疾患は進行した。
【図１６Ｂ】同上
【発明を実施するための形態】
【００３２】
詳細な説明
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体、およびキメラ免疫受容体としても公知）は、免疫エフェクター細胞上に任意の特異性を移植する、改変された受容体である。古典的なＣＡＲ（図３）において、モノクローナル抗体の特異性は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞上に移植される。ＣＡＲをコードする核酸配列は、例えばレトロウイルスベクターを使用して、Ｔ細胞またはＮＫ細胞中に導入され得る。このようにして、多数のがん特異的Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、養子細胞移入のために生成させることができる。このアプローチの早期医学的研究は、最初にＢ細胞悪性腫瘍を処置するために全Ｂ細胞抗原ＣＤ１９を標的としたときに、いくつかのがんにおける有効性を示した。
【００３３】
ＣＡＲの標的抗原結合ドメインは、一般的にスペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナリングエンドドメインに融合される。ＣＡＲが標的抗原に結合するとき、これは標的抗原が発現されるＴ細胞へ活性化シグナルの伝達をもたらす。
【００３４】
本発明のＣＡＲは、以下を含む：
（ｉ）以下でより詳細に議論される、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）の少なくとも一部を含むＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメイン；
（ｉｉ）スペーサー
（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；および
（ｉｖ）細胞内Ｔ細胞シグナリングドメイン
【００３５】
本発明のＣＡＲは、以下のアミノ酸配列の１つを含み得る：
【化１】
2019052190.tif 000002
【化２】
2019052190.tif 000003
【化３】
2019052190.tif 000004
【化４】
2019052190.tif 000005
【化５】
2019052190.tif 000006
【化６−１】
2019052190.tif 000007
【化６−２】
2019052190.tif 000008
【００３６】
本発明の分子は、配列番号１、２、３、４、５、または６に示される配列のバリアントを含み得、バリアントは、バリアント配列が本発明の第一の態様で規定される分子、すなわち：
（ｉ）  ＢＣＭＡ結合ドメイン；
（ｉｉ）  スペーサードメイン
（ｉｉｉ）  膜貫通ドメイン；および
（ｉｖ）  細胞内Ｔ細胞シグナリングドメイン
を含むＣＡＲである限り、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、もしくは９９％の配列同一性を有する。
【００３７】
２つのポリペプチド配列間の同一性パーセンテージは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．において自由に入手できるＢＬＡＳＴなどのプログラムによって容易に決定され得る。
【００３８】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜に跨がる（ｓｐａｎ）ＣＡＲの配列である。それは、疎水性アルファヘリックスを含み得る。膜貫通ドメインは、良好な受容体安定性をもたらす、ＣＤ２８に由来し得る。膜貫通ドメインは、任意のＩ型膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通ドメインは、疎水性ヘリックスを形成することが予測される合成配列であり得る。
【００３９】
細胞内Ｔ細胞シグナリングドメイン（エンドドメイン）
エンドドメインは、ＣＡＲのシグナル伝達部である。抗原認識の後に、受容体は集合し、そしてシグナルは細胞へ伝達される。最も一般的に使用されるエンドドメイン構成要素は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３ゼータのエンドドメイン構成要素である。これは、抗原が結合した後に、Ｔ細胞に活性化シグナルを伝達する。ＣＤ３ゼータは、完全に反応力を有する活性化シグナルを提供しないことがあり、そして追加の共刺激性シグナリングが必要となり得る。例えば、キメラのＣＤ２８およびＯＸ４０は、増殖／生存シグナルを伝達するために、ＣＤ３ゼータと使用することができ、または３つ全てを一緒に使用することができる（Ｐｕｌｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ、２００５年：１２巻；５号；９３３−４１頁）。ＣＡＲエンドドメインは、効果的なＣＡＲ療法のためにＣＡＲが適切なシグナルを伝達するように、天然に見出されたシグナリングタンパク質、または当業者によってコンストラクトされた人工的なシグナルタンパク質に由来する、個別または組み合わせのいずれかで、他のシグナリングドメインにも由来し得る。
【００４０】
本発明のＣＡＲのエンドドメインは、ＣＤ２８エンドドメインおよびＯＸ４０およびＣＤ３ゼータエンドドメインを含み得る。
【００４１】
本発明のＣＡＲの膜貫通および細胞内Ｔ細胞シグナリングドメイン（エンドドメイン）は、配列番号７に示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。
【化７】
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【００４２】
バリアント配列は、その配列が効果的な膜貫通ドメインおよび効果的な細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインを提供する限り、配列番号７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得る。
【００４３】
シグナルペプチド
本発明のＣＡＲは、ＣＡＲがＴ細胞などの細胞の中で発現されたときに、新生タンパク質が小胞体へと、そしてそれに続きそれが発現される細胞表面へと指向されるように、シグナルペプチドを含み得る。
【００４４】
シグナルペプチドのコアは、単一のアルファヘリックスを形成する傾向を有する、疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。シグナルペプチドは、移行の間にポリペプチドの適切なトポロジーに強制することを補助する、アミノ酸の短い正に荷電されたストレッチより開始し得る。シグナルペプチドの端部には、典型的にシグナルペプチダーゼによって認識され、かつ切断されるアミノ酸のストレッチがある。シグナルペプチダーゼは、移行間または完了の後のいずれかに切断し、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで遊離シグナルペプチドは、特異的なプロテアーゼによって消化される。
【００４５】
シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあり得る。
【００４６】
本発明のＣＡＲは、以下の一般式を有し得る：
シグナルペプチド−ＢＣＭＡ結合ドメイン−スペーサードメイン−膜貫通ドメイン−細胞内Ｔ細胞シグナリングドメイン。
【００４７】
シグナルペプチドは、配列番号８もしくは９、またはシグナルペプチドが、依然としてＣＡＲの細胞表面発現を引き起こすよう機能する限り、５、４、３、２、もしくは１つのアミノ酸変異（挿入、置換、または付加）を有するそれらのバリアントを含み得る。
【化８】
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【化９】
2019052190.tif 000011
【００４８】
配列番号８および配列番号９のシグナルペプチドは、コンパクトであり、かつ高度に効果的である。それは、末端グリシン後に約９５％の切断を生じさせると予測され、これがシグナルペプチダーゼによる効果的な除去を生じさせる。
【００４９】
スペーサー
本発明のＣＡＲは、ＢＣＭＡ結合ドメインと膜貫通ドメインとを連結させ、かつＢＣＭＡ結合ドメインをエンドドメインから空間的に離すための、スペーサー配列を有し得る。柔軟なスペーサーは、ＢＣＭＡ結合を可能にするために、ＢＣＭＡ結合ドメインを異なる角度に配向させる。
【００５０】
スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８の柄を含み得る。リンカーは、代替的にＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８の柄と同様の長さおよび／またはドメイン配置特性を有する代替的なリンカー配列を含み得る。
【００５１】
スペーサーは、短いスペーサー（例えば１００未満、８０未満、６０未満、または４５未満のアミノ酸を含むスペーサー）であり得る。スペーサーは、ＩｇＧ１ヒンジもしくはＣＤ８の柄、またはそれらの修飾された形態であるか、またはそれらを含み得る。
【００５２】
ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合モチーフを除去するように改変され得る。
【００５３】
これらスペーサーのためのアミノ酸配列の例が以下に挙げられる：
【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【００５４】
Ｂ細胞膜抗原（ＢＣＭＡ）
本発明の第一の態様のＣＡＲは、ＢＣＭＡに結合するドメインを含み得る。
【００５５】
ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７としても公知）、専らＢ系列造血細胞または樹状細胞において発現する、形質細胞特異的表面抗原である。これはＴＮＦ受容体ファミリーの一員である。ＢＣＭＡはナイーブＢ細胞では発現されないが、形質細胞芽へのＢ細胞分化の間にはアップレギュレートされ、記憶Ｂ細胞、形質細胞芽、および骨髄形質細胞では明瞭に発現される。ＢＣＭＡは、初代骨髄腫細胞の大部分においても発現される。ＣＤ１９などの他のＣＡＲ標的とは異なり、ＢＣＭＡは低密度で発現される（図２）。
【００５６】
ＢＣＭＡは、図１で模式的に示される相互接続したリガンドと受容体とのネットワーク内で機能する。２つの他のＴＮＦ受容体は、活性化Ｔ細胞および全てのＢ細胞で見出されるＢＣＭＡ−ＴＡＣＩ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）、ならびにＢリンパ球で優先的に発現するＢＡＦＦ−Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）と、リガンドＡＰＲＩＬおよびＢＣＭＡを共有する。多発性骨髄腫細胞は、いくつかの症例においてはＴＡＣＩを、そしてほとんどの症例においてはＢＣＭＡを発現するが、ＢＡＦＦ−Ｒは全く発現しない。
【００５７】
ＡＰＲＩＬ
本発明のＣＡＲのＢＣＭＡ結合ドメインは、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）の少なくとも一部を含む。ＡＰＲＩＬはＴＮＦＳＦ１３としても公知である。
【００５８】
ＡＰＲＩＬの野生型配列は、ＵＮＩＰＲＯＴ／Ｏ７５８８８で入手でき、以下に示される（配列番号１３）。これはシグナルペプチドを有さないという点で古典的な分泌タンパク質ではない。これはフーリン切断部位”ＫＱＫＫＱＫ”（配列番号１３において下線を引かれている）を有する。アミノ末端はプロテオグリカン結合に関係する。
【００５９】
ＢＣＭＡ結合ドメインは、ＡＰＲＩＬのＢＣＭＡ結合部位を含み得る。ＢＣＭＡ結合ドメインは、ＢＣＭＡ結合部位を含むＡＰＲＩＬの断片を含み得る。
【００６０】
ＢＣＭＡ結合ドメインは、分子のアミノ末端を欠失した、短縮型ＡＰＲＩＬを含み得る。短縮型ＡＰＲＩＬは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ結合を保持するが、プロテオグリカン結合は失い得る。短縮型ＡＰＲＩＬは、フーリン切断部位、またはその直後で切断され得る。短縮型ＡＰＲＩＬは、配列番号１３に示される野生型ＡＰＲＩＬ分子からアミノ末端１１６アミノ酸を欠失し得る。短縮型ＡＰＲＩＬは、配列番号１４に示される配列（太字で示される配列番号１３の一部に対応する）、またはそのバリアントを含み得る。これは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ結合に必要とされる分子の一部に対応する。
【化１３】
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【化１４】
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【００６１】
本発明のＣＡＲは、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ同等または改良されたＢＣＭＡ結合能を有する、配列番号１４に示される短縮型ＡＰＲＩＬのバリアントを含み得る。そのバリアント配列は、配列番号１４に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得る。
【００６２】
核酸配列
本発明の第二の態様は、本発明の第一の態様のＣＡＲをコードする核酸配列に関する。
【００６３】
核酸配列は、以下の配列の１つであるか、またはそれを含み得る：
【化１５−１】
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【化１５−２】
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【化１６】
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【化１７−１】
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【化１７−２】
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【化１８−１】
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【化１８−２】
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【化１９】
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【化２０−１】
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【化２０−２】
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【００６４】
核酸配列は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、または２０によってコードされるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードし得るが、遺伝暗号の縮重に起因して、異なる核酸配列を有し得る。核酸配列は、本発明の第一の態様で定義されるＣＡＲをコードする限り、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、または２０に示される配列と、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の同一性を有し得る。
【００６５】
ベクター
本発明は、本発明に記載の核酸配列を含むベクターも提供する。そのようなベクターは、本発明の第一の態様に記載の分子を発現し、かつ産生するよう、宿主細胞に核酸配列を導入するために使用され得る。
【００６６】
ベクターは、例えばプラスミドもしくは合成ｍＲＮＡ、またはレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターであり得る。
【００６７】
ベクターは、エフェクター細胞にトランスフェクションまたは形質導入する能力を有し得る。
【００６８】
宿主細胞
本発明は、本発明に記載の核酸を含む宿主細胞も提供する。宿主細胞は、本発明の第一の態様に記載のＣＡＲを発現する能力を有し得る。
【００６９】
宿主細胞は、ヒトＴ細胞またはヒトＮＫ細胞であり得る。
【００７０】
本発明に記載のＣＡＲを発現する能力を有するＴ細胞は、Ｔ細胞にＣＡＲをコードする核酸を形質導入またはトランスフェクションすることにより作製され得る。
【００７１】
Ｔ細胞は、エキソビボＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）サンプル由来であり得る。Ｔ細胞は、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いた処理によって、ＣＡＲをコードする核酸を形質導入される前に活性化、および／または増加され得る。
【００７２】
薬学的組成物
本発明は、本発明のベクターまたはＣＡＲ発現Ｔ細胞を、薬学的に許容されるキャリア、希釈液、もしくは添加物、および任意に１つまたは複数の更に薬学的に有効なポリペプチド、および／もしくは化合物を一緒に含む薬学的組成物にも関する。そのような製剤は、例えば、静脈注入に適した形式であり得る。
【００７３】
処置の方法
本発明のＣＡＲ分子を発現するＴ細胞は、多発性骨髄腫細胞などのがん細胞を殺傷する能力を有する。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、患者自身の末梢血由来（第一当事者）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状態において（第二当事者）、またはつながりのないドナーからの末梢血（第三当事者）のいずれかの由来から、エキソビボで創出され得る。代替的に、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のＴ細胞へのエキソビボ分化に由来し得る。これらの例として、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ウイルスベクターを用いた形質導入、ＤＮＡもしくはＲＮＡを用いたトランスフェクションを含む多くの方法の１つにより、ＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成される。
【００７４】
本発明のＣＡＲ分子を発現するＴ細胞は、がん性の疾患、特に亢進したＢＣＭＡ発現に関連する形質細胞障害またはＢ細胞障害の治療のために使用され得る。
【００７５】
形質細胞障害は、形質細胞腫、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ワルデンストレーム型マクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、骨硬化性ミエローマ（ＰＯＥＭＳ症候群）、およびＨ鎖病と意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症／無症候性骨髄腫を含む。
【００７６】
その疾患は、多発性骨髄腫であり得る。
【００７７】
上昇したＢＣＭＡ発現レベルに相関するＢ細胞障害の例は、ＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。本発明の二重特異性結合薬剤は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、および関節リウマチ（ＲＡ）のような自己免疫疾患の治療においても使用され得る。
【００７８】
本発明の方法は、がん性の疾患、特に亢進したＢＣＭＡ発現に相関する形質細胞障害またはＢ細胞障害の治療のためであり得る。
【００７９】
疾患の処置のための方法は、本発明のベクターまたはＴ細胞の治療上の使用に関係する。この点で、ベクターまたはＴ細胞は疾患に付随する少なくとも１つの症状を小さくする、減少する、もしくは改善する、および／または疾患の進行を遅延する、減少する、もしくは阻止するために、既存の疾患または状態を有する被験体に投与され得る。本発明の方法は、形質細胞などのＢＣＭＡ発現細胞のＴ細胞媒介性の殺傷を引き起こすか、または促進し得る。
【００８０】
ここで本発明がさらに実施例によって記載されるが、これは本発明の実施において当業者を支援することに役立つことを意図しており、本発明の範囲を制限することを何ら意図しない。
【実施例】
【００８１】
実施例１  骨髄腫への標的としてのＢＣＭＡの特性評価
初代骨髄腫細胞を、明らかに疾患を有することが知られている多発性骨髄腫患者由来の、新鮮な骨髄サンプルでのＣＤ１３８免疫磁気的選択を行うことによって単離した。これら細胞は、ＰＥと結合体化されたＢＣＭＡ特異的Ｊ６ＭＯ  ｍＡｂ  （ＧＳＫ）により染色した。同時に、既知の数の結合部位を有するビーズの標準が、ＰＥ  Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ  ｂｅａｄ  ｋｉｔ  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を使用して、製造者の指示通りに生成した。骨髄腫細胞でのＢＣＭＡコピー数は、骨髄腫細胞からの平均蛍光強度と、ビーズより得られた標準曲線とを相関させることによって得ることができた。骨髄腫細胞表面でのＢＣＭＡコピー数の範囲は低く：細胞あたり３４８．７〜４２６８．４
ＢＣＭＡコピーであり、平均値が１１８１、中間値が１０８４．９（図２）であることが見出された。これは、ＣＡＲへの古典的な標的である、例えばＣＤ１９およびＧＤ２などより相当低い。初代骨髄腫細胞でのＢＣＭＡ発現の存在は、Ｖｉｃｋｙ−１抗体（Ａｂｃａｍ  Ａｂ１７３２３）によっても確認され、この例は図１４に示される。
【００８２】
実施例２  ＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲのデザインおよび構築
天然形態におけるＡＰＲＩＬは、分泌型ＩＩ型タンパク質である。ＣＡＲのためのＢＣＭＡ結合ドメインとしてのＡＰＲＩＬの使用、およびこのタンパク質を安定に、かつこの形態でのＢＣＭＡへの結合を保持するためには、このＩＩ型分泌タンパク質のＩ型膜結合タンパク質への転換を必要とする。候補分子を生成するために、ＡＰＲＩＬの先端のアミノ末端を欠失させて、プロテオグリカンへの結合を除去した。次に、新生タンパク質を小胞体へ、そしてそこから細胞表面へと指向させるために、シグナルペプチドを付加した。また、使用したスペーサーの性質が、ＣＡＲの機能を変化させ得るため、３つの異なるスペーサードメインを試験した：（ｉ）Ｆｃ結合モチーフを除去するために変化させたヒトＩｇＧ１スペーサー；（ｉｉ）ＣＤ８の柄；および（ｉｉｉ）ＩｇＧ１ヒンジ単独、を含むＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲが生成された（図４に漫画および図５にアミノ酸配列、ならびに図１９にも異なるシグナルペプチドおよびＶ５エピトープタグを有する点で、図５に示される配列とは異なるアミノ酸配列）。これらＣＡＲは、マーカータンパク質（短縮型ＣＤ３４）が、便利なマーカー遺伝子として共発現できるように、バイシストロニックなレトロウイルスベクター（図６Ａ）に発現させた。
【００８３】
実施例３  ＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲの発現および機能
本研究の目的は、構築されたＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲが、細胞表面に発現するか否か、およびＡＰＲＩＬが本来のタンパク質を形成するようにフォールディングされるか否かを試験することであった。Ｔ細胞にこれらの異なるＣＡＲコンストラクトを形質導入し、そして市販の抗ＡＰＲＩＬ  ｍＡｂを使用した染色と同時にマーカー遺伝子についての染色を行い、そしてフローサイトメトリーによって解析した。この実験の結果は、図６Ｂに示され、ここでＡＰＲＩＬ結合は、マーカー遺伝子の蛍光に対してプロットしている。これらデータは、この形式においてＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲは細胞表面に発現しており、かつＡＰＲＩＬは、抗ＡＰＲＩＬ  ｍＡｂにより認識されるのに十分にフォールディングされることを示す。
【００８４】
次に、この形式のＡＰＲＩＬは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを認識できるか否かを決定した。リコンビナントＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを、マウスＩｇＧ２ａ−Ｆｃとの融合物として生成した。これらリコンビナントタンパク質を、形質導入されたＴ細胞とインキュベートした。この後に、細胞を洗浄し、そして抗マウスの蛍光物質と結合体化された抗体、および異なる蛍光物質と結合体化された、マーカー遺伝子を検出するための抗体によって染色した。細胞をフローサイトメトリーにより解析し、その結果は図６Ｃに提示される。異なるＣＡＲは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩの両方に結合することができた。驚くべきことに、ＣＡＲはＴＡＣＩよりも良好にＢＣＭＡに結合することができた。また驚くべきことに、ＣＤ８の柄またはＩｇＧ１ヒンジスペーサーを有するＣＡＲは、Ｆｃスペーサーを有するＣＡＲよりも良好に、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩに結合することができた。
【００８５】
実施例４  ＡＰＲＩＬに基づくキメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡ発現細胞に対して活性的である
正常ドナー由来Ｔ細胞に、異なるＡＰＲＩＬ  ＣＡＲを形質導入し、そして野生型、またはＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを発現するように改変した、いずれかのＳｕｐＴ１細胞に対して試験した。機能を決定するために、数種の異なる分析を使用した。古典的なクロム放出分析を行った。ここで、標的細胞（ＳｕｐＴ１細胞）を、５１Ｃｒを用いて標識し、そしてエフェクター（形質導入されたＴ細胞）と、異なる比率で混合した。標的細胞の溶解は、共培養上清中の５１Ｃｒを計数することにより、決定した（図６Ａは累積のデータを示し、異なるエフェクター：標的比での単独の分析からのデータ例は、図１２に示される）。
【００８６】
加えて、ＳｕｐＴ１細胞と１：１で培養したＴ細胞由来上清を、インターフェロンガンマについてＥＬＩＳＡによって分析した（図６Ｂは累積のデータを示し、単独の分析からのデータ例は図１３に示される）。ＳｕｐＴ１細胞との共培養の１週間後でのＴ細胞増加量の計測も行った（図６Ｃ）。Ｔ細胞は、計数ビーズを用いて調整したフローサイトメトリーによって計数した。これら実験データは、ＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲが、ＢＣＭＡを発現する標的を殺傷することができることを示す。更にこれらデータは、ＣＤ８の柄またはＩｇＧ１ヒンジに基づくＣＡＲが、Ｆｃ−ｐｖａａに基づくＣＡＲよりも良好に挙動したことを示す。
【００８７】
実施例５  ＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲは、初代骨髄腫細胞を殺傷することができる
上記データは、原理的にはＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲを作製することができることを実証しているため、励まされる。しかしながら、ほとんどの初代骨髄腫細胞は、その表面において少数のＢＣＭＡ分子を発現するため、そのようなＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲが、特に低密度発現の症例において、初代骨髄腫細胞の殺傷を引き起こすか否かについて調べた。図２において記載されたＢＣＭＡ発現の範囲に相当する３症例を選択した：第一は不明瞭な発現を有する（平均より低い）；第二の症例は中間的な発現を有する（ほぼ平均の発現）、そして第三は明瞭な発現を有した（平均の発現よりも上）。図８は、ＢＣＭＡ発現を説明するために、左に３症例全てについてのアイソタイプ対照に対するＢＣＭＡ染色のヒストグラムを示す。異なるスペーサーを有するＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲを比較したときに、ＣＤ８の柄スペーサーおよびＩｇＧ１ヒンジスペーサーを有するＣＡＲが、Ｆｃ−ｐｖａａで間隔を開けられたＣＡＲよりも良好に挙動することが決定されたため、この分析においてはＣＤ８の柄およびヒンジのＡＰＲＩＬ  ＣＡＲのみを試験した。左に、骨髄腫細胞とＣＡＲ  Ｔ細胞の１：１共培養後３日および６日での、開始数と比較した骨髄腫細胞の生存を示す。６日までに、不明瞭なＢＣＭＡ発現を有する骨髄腫細胞を含む、９５％超の骨髄腫細胞が排除された。不明瞭にＢＣＭＡを発現する骨髄腫細胞は、高度に発現するものよりも殺傷の速度は遅いが、ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲによって標的とされ得る。
【００８８】
実施例６  Ｆｃスペーサーに融合された分泌型および短縮型のＡＰＲＩＬは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを認識する
ＣＡＲ形式（すなわち、膜貫通ドメインに融合し、そして細胞膜に固定した）における短縮型ＡＰＲＩＬが、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩに結合できるか否か調べるために、基本的なＣＡＲを、自己切断する口蹄疫２Ａペプチドを用いて、便利なマーカー遺伝子としての短縮型ＣＤ３４と共に、インフレームで改変した。このコンストラクトを発現する安定なＳＵＰＴ１細胞株を樹立した。ヒト（および他種、示されない）Ｉｇ  Ｆｃドメインに融合した分泌型の短縮型ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩもまた生成し、そしてリコンビナントタンパク質を産生した。ＢＣＭＡ−ＦｃとＴＡＣＩ−Ｆｃとの両方が、改変されたＳＵＰＴ１細胞株に結合することが示された。ＣＤ３４マーカー遺伝子を発現する細胞のみが、ＢＣＭＡ−ＦｃおよびＴＡＣＩ−Ｆｃに結合することが見出された（図９）。
【００８９】
実施例７  ＡＰＲＩＬに基づくキメラ抗原受容体は、Ｔ細胞の表面で安定に発現される
ＣＡＲスペーサードメインは、感度および特異性を変化させ得る。３つのスペーサードメインを有する、３つの型のＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲが生成された：（ｉ）Ｆｃ結合モチーフを除去するために改変したヒトＩｇＧ１スペーサー；（ｉｉ）ＣＤ８の柄；および（ｉｉｉ）ＩｇＧ１ヒンジ単独（図１０Ｂ）。初代ヒトＴ細胞にこれらの異なるＣＡＲを形質導入し、そして市販の抗ＡＰＲＩＬ  ｍＡｂを使用して染色した（図１１）。
【００９０】
実施例８  ＡＰＲＩＬに基づくキメラ抗原受容体は、同種の標的を発現する細胞に対して活性的である
通常ドナー由来Ｔ細胞に、異なるＡＰＲＩＬ  ＣＡＲを形質導入し、そして野生型、またはＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを発現するように改変したＳｕｐＴ１細胞に対して試験した。機能を決定するために、数種の異なる分析を使用した。古典的なクロム放出分析を行った。ここで、標的細胞（ＳｕｐＴ１細胞）は５１Ｃｒを用いて標識し、そして異なる比率でエフェクター（形質導入されたＴ細胞）と混合した。標的細胞の溶解は、共培養上清中の５１Ｃｒを計数することによって決定した（図１２）。
【００９１】
加えて、ＳｕｐＴ１細胞と１：１で培養したＴ細胞由来上清を、インターフェロンガンマについてＥＬＩＳＡによって分析した（図１３）。
【００９２】
ＳｕｐＴ１細胞との共培養の１週間後のＴ細胞増加量の計測もまた行った。Ｔ細胞は、計数ビーズにより調整されたフローサイトメトリーによって計数した。最初のデータ（示されない）は、ＣＤ８の柄に基づくコンストラクトが、他のコンストラクトよりも多いＴ細胞増殖を引き起こすことを示すようである。
【００９３】
実施例９  ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ機能の実証
インビボでのＡＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞機能を実証するために、ヒト／マウスキメラモデルにおいてＡＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を試験した。ＭＭ１．ｓ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２９７４）は、中間的なレベルのＢＣＭＡを発現するヒト骨髄腫細胞株である。本発明者らは、細胞株ＭＭ１．ｓ．ＦＬｕｃを得るために、この細胞株をホタルルシフェラーゼを発現するように改変した。
【００９４】
ＮＯＤ  ｓｃｉｄ  ｇａｍｍａ（ＮＳＧ：  ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚJ）マウスは、いくつかのヒト細胞株およびヒト末梢血リンパ
球を移植することのできる、重度免疫不全マウスである。３ヶ月齢メスＮＳＧマウスに、いずれの予備治療もなしに、尾静脈注射を介して１×１０７のＭＭ１．ｓ．ＦＬｕｃ細胞を与えた。移植は、一連の生物発光イメージングによって決定した（図１６）。全てのマウスにおいて、強固であり、かつ増加する髄内移植が観察された。１３日目に、５×１０６のＡＰＲＩＬ−ＨＮＧ−ＣＤ２８ＯＸＺ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、尾静脈注射により投与した。一連の生物発光を行い、これは全ての処置されたマウスにおいて、ＭＭ１．ｓ負荷量における急速な減少から完全な寛解を示した。このＣＡＲ治療への応答は、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学によって確認した。
【００９５】
上記の明細書の中で言及されている全ての刊行物は、本明細書中に参照により援用される。記載された方法の種々の改変および変化、ならびに本発明のシステムは、本発明の範囲および主旨から逸脱することなく、当事者に明白であろう。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連して記載したが、特許請求の範囲に記載の発明は、そのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際に、記載された手法についての発明を遂行するための、分子生物学、細胞免疫学、または関連する分野の当事者にとって明らかな、本発明を実施するための記載された態様の種々の改変は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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