(57)【要約】      （修正有）【課題】オピオイド系製剤の長期使用による鎮痛耐性、身体依存性、及び嗜癖性などの問題を減少させる又は改善することが可能な製剤又は組み合わせ製剤を提供する。【解決手段】オピオイドを、ＡＣ１阻害剤ＮＢ００１である５−（（２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エチル）アミノ）ペンタン−１−オール、ＡＣ１＆８混合阻害剤ＮＢ０１０である６−アミノ−９−（２−パラトリルオキシ−エチル）−９Ｈ−プリン−８−チオール及びＮＢ０１１である４−（９Ｈ−プリン−６−イル）モルホリンのうちの少なくとも１種と組み合わせて使用する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
オピオイド系薬物と、
ＮＢ００１、ＮＢ０１０、及びＮＢ０１１からなる群から選択される少なくとも１種と、を含む疼痛を治療するための薬用組成物であって、
前記ＮＢ００１は、５−（（２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エチル）アミノ）ペンタン−１−オールであり、
前記ＮＢ０１０は、６−アミノ−９−（２−パラトリルオキシ−エチル）−９Ｈ−プリン−８−チオールであり、
前記ＮＢ０１１は、４−（９Ｈ−プリン−６−イル）モルホリン（６−モルホリン−４−イル−７Ｈ−プリンとも称する）であることを特徴とする薬用組成物。
【請求項２】
前記オピオイド系薬物はモルヒネである、ことを特徴とする請求項１に記載の薬用組成物。
【請求項３】
前記ＮＢ００１、前記ＮＢ０１０及び前記ＮＢ０１１は、製薬上許容される塩又は溶媒和物をさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載の薬用組成物。
【請求項４】
疼痛を治療する薬物の調製のための薬用組成物の使用であって、前記薬用組成物は、
オピオイド系薬物と、
ＮＢ００１、ＮＢ０１０、及びＮＢ０１１からなる群から選択される少なくとも１種と、を含み、
前記ＮＢ００１は、５−（（２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エチル）アミノ）ペンタン−１−オールであり、
前記ＮＢ０１０は、６−アミノ−９−（２−パラトリルオキシ−エチル）−９Ｈ−プリン−８−チオールであり、
前記ＮＢ０１１は、４−（９Ｈ−プリン−６−イル）モルホリン（６−モルホリン−４−イル−７Ｈ−プリンとも称する）、であることを特徴とする使用。
【請求項５】
前記オピオイド系薬物はモルヒネである、ことを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記ＮＢ００１、前記ＮＢ０１０及び前記ＮＢ０１１は、製薬上許容される塩又は溶媒和物をさらに含む、ことを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項７】
オピオイド系薬物の使用に基づいて、ＮＢ００１、ＮＢ０１０、及びＮＢ０１１からなる群から選択される少なくとも１種と、
ＮＢ００１、ＮＢ０１０及びＮＢ０１１に、製薬上許容される塩及び溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１種と、を併用した疼痛を治療する方法であって、
前記ＮＢ００１は、５−（（２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エチル）アミノ）ペンタン−１−オールであり、前記ＮＢ０１０は、６−アミノ−９−（２−パラトリルオキシ−エチル）−９Ｈ−プリン−８−チオールであり、
前記ＮＢ０１１は、４−（９Ｈ−プリン−６−イル）モルホリン（６−モルホリン−４−イル−７Ｈ−プリンとも称する）である、ことを特徴とする方法。
【請求項８】
神経因性疼痛による不安及び他の疾患に関連する不安や憂鬱を治療するための薬用組成物であって、前記薬用組成物は、ＮＢ００１、ＮＢ０１０、及びＮＢ０１１のうちの少なくとも１種を含む、ことを特徴とする薬用組成物。
【請求項９】
前記ＮＢ００１、前記ＮＢ０１０及び前記ＮＢ０１１は、製薬上許容される塩又は溶媒和物をさらに含む、ことを特徴とする請求項８に記載の薬用組成物。
【請求項１０】
ＮＢ００１、ＮＢ０１０、及びＮＢ０１１のうちの少なくとも１種を含む、ことを特徴とする慢性内臓痛並びにそれに関連する不安及び憂鬱を治療するための薬用組成物。
【請求項１１】
ＮＢ００１、ＮＢ０１０、及びＮＢ０１１のうち少なくとも１種を含む、ことを特徴とするモルヒネの慢性的な使用による掻痒反応を治療するための薬用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬用組成物に関し、さらに詳しくは、オピオイド系製剤の長期使用による鎮痛耐性、身体依存性、及び嗜癖性などの問題を減少させる又は改善することが可能な薬用組成物に関する。
さらに、オピオイドと、ＡＣ１阻害剤ＮＢ００１である５−（（２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エチル）アミノ）ペンタン−１−オール、ＡＣ１＆８混合阻害剤ＮＢ０１０である６−アミノ−９−（２−パラトリルオキシ−エチル）−９Ｈ−プリン−８−チオール及びＮＢ０１１である４−（９Ｈ−プリン−６−イル）モルホリンの少なくとも１種を組み合わせた使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
「阿片製剤（ｏｐｉａｔｅ）」は、例えば、モルヒネ(Morphine)、コデイン、及びモルヒネの多くの半合成類似物などの阿片（ｏｐｉｕｍ）由来の薬理学的に活性なアルカロイド類を指す用語として使用されている。モルヒネ様作用を有するペプチド化合物の単離後、オピオイド（ｏｐｉｏｉｄ）という用語が導入され、一般にモルヒネ様作用を有する全ての薬物を指すようになった。オピオイドには、エンドルフィン、エンケファリン、及びダイノルフィンのようなモルヒネ様活性を表す様々なペプチドが含まれる。しかしながら、初期の資料には、一般的な意味を有する「阿片製剤」という用語が使用されていることもある。この場合、阿片製剤とオピオイドとは同義である。さらに、オピオイドという用語は、モルヒネ様薬物の拮抗剤を指し、このような薬物と組み合わされた受容体又は結合部位を同定するために使用されている。
【０００３】
オピオイドは通常鎮痛薬として使用され、モルヒネは通常絶痛を軽減するために使用されているが、モルヒネの臨床応用は、鎮痛耐性、身体依存性、及び嗜癖の発達によって制限される。モルヒネの長期投与によりヒト及び動物の耐性が誘発されるが、μ−受容体が減感できないことは知られている。逆に、モルヒネの長時間使用は、オピオイド耐性及び依存性を助長するアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）の過敏化を引き起こす（Ｎｅｓｔｌｅｒ，  １９９７；  ２００１ａ，ｂ；  ２００２）。例えば、中脳腹側被蓋野（ＶＴＡ）及び側坐核（ＮＡｃ）領域（両方の領域が阿片薬物増強に重要である）、並びに青斑核及び背核（阿片の禁断には重要である）のようないくつかの脳領域におけるアデニル酸シクラーゼ活性の長期変化が報告されている。（Ｎｅｓｔｌｅｒ及びＡｇｈａｊａｎｉａｎ、１９９７；  Ｊｏｌａｓら、２０００；  Ｗｉｌｌｉａｍｓら、２００１；  Ｃｈａｏ及びＮｅｓｔｌｅｒ、２００４）。
【０００４】
ＡＣｓはオピオイド系物質の作用を調節することができることが示唆されているが、異なるＡＣアイソザイムの作用を定義するための特異的阻害剤の欠如は、研究の遅れにつながった。今まで、１０種類のＡＣｓの遺伝子がクローン化されており、それぞれが中枢神経系及び末梢感覚神経系において異なる発現パターンを有する（Ｘｉａ及びＳｔｏｒｍ、１９９７）。そのうち、ＡＣ１及びＡＣ８は、脳内においてＣａ２＋／カルモジュリンによって特異的に刺激される。ＡＣ１及びＡＣ８は、ＶＴＡ、ＮＡｃ、青斑核、及び背側縫線核を含む異なる脳領域に広く分布している（Ｚｈｕｏ、２０１２）。
【０００５】
さらに、多くの研究が薬物嗜癖におけるＣＲＥＢに関連している（Ｇｕｉｔａｒｔら、１９９２；  Ｈｙｍａｎ、１９９６；  Ｍａｌｄｏｎａｄｏら、１９９６；  Ｗａｌｔｅｒｓら、２００１）。ウエスタンブロット解析は、モルヒネ耐性動物におけるＣＲＥＢ又はリン酸化ＣＲＥＢ（ｐＣＲＥＢ）の発現の増加を示した（Ｌｉら、１９９９；  Ｇａｏら、２００４）。ＣＲＥＢ突然変異マウスは、モルヒネ治療を停止した後、禁断症状は軽減された（  Ｍａｌｄｏｎａｄｏら、１９９６）。さらに、主にモルヒネ生理作用を媒介するＧタンパク質共役受容体Ｍｕオピオイド系物質受容体（ＭＯＲ）は、ＣＲＥ要素を含み、ＣＲＥＢにより媒介された経路は活性化されることが示されている。
（Ｍｉｎら、１９９４；  Ｎｅｓｔｌｅｒ  、１９９７；  Ｌｅｅら、２００３）。中枢神経系において、ＡＣ１及びＡＣ８は、ニューロンにおけるＣＲＥＢを調節するために、上流の重要なシグナルタンパク質に作用することが知られている（Ｗｅｉら、２００２；  Ｚｈｕｏ、２０１２）。ＡＣ１及びＡＣ８シングルノックアウト（ＫＯ）マウス及びＤＫＯマウスを使用することにより、ＡＣ１又はＡＣ８遺伝子シングルノックアウトマウス、又はＤＫＯマウス及び野生型マウスに対して、短時間ではモルヒネの鎮痛効果には差が生じないことが報告されている（Ｌｉら、２００６）。ＡＣ１＆８ＤＫＯマウス及びＡＣ８シングルノックアウトマウスは、モルヒネ（１０ｍｇ／ｋｇ体重）注射を毎日行うことにより、耐性の低下が継続的に誘発された。モルヒネで継続的に治療されたＤＫＯマウスは、禁断挙動が顕著に減少した（Ｌｉ  ら、２００６）。ＡＣ１阻害剤ＳＴ０３４０３７を用いた最近の研究により、ＡＣ１活性がＭＯＲ慢性的な活性化によって誘発されたＡＣ感作を必要とすることが発見された。それは、ＡＣ１阻害が慢性的なモルヒネの使用により誘発された耐性及び他の反応を克服するのに有益であることを示唆している（Ｂｒｕｓｔら、２０１７）。
【０００６】
オピオイド系薬物による疼痛の治療において、治療効果の低下は、薬理学的耐性メカニズム（又は元の状態の悪化）によってしばしば解釈され、元の効果を維持するためには用量を増加させる必要がある。最近の研究では、鎮痛作用の発生に加えて、オピオイド系薬物では身体の傷害促進のメカニズムを活性化する可能性があり、それにより、身体の疼痛に対する感受性が増加すること（即ち、オピオイド誘発性痛覚過敏（ｏｐｉｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ  ，ＯＩＨ））が確認されている。痛覚過敏症状の出現は、オピオイド禁断反応初期に観察されている。最新の証拠によれば、痛覚過敏はオピオイド治療中にも起こることが示唆されている。つまり、オピオイドの使用の停止及びオピオイドの持続投与は共に、疼痛感受性を増加させており、これは明らかに矛盾した結果である。それ故、オピオイド鎮痛効果の低下は、薬理学的耐性メカニズムだけでなく、ＯＩＨ（傷害促進のメカニズム）の作用によるものである可能性が高い。それらメカニズムの間で、感作プロセスと脱感作プロセスの両方が起こる。ＯＩＨは、内因性ダイノルフィン、グルタミン酸作動性系及び下行性促進のメカニズムに関与する独特な細胞メカニズムを有する。興味深いことに、ＯＩＨのメカニズムは、神経障害性疼痛及びオピオイド耐性のメカニズムと広く重複する。例えば、末梢神経損傷及び反復オピオイド投与は、同じグルタミン酸作動性細胞経路を活性化することができる。
【０００７】
オピオイド治療中の薬物の鎮痛効力の低下は、薬理学的耐性現象又は既存の疼痛状態の悪化であると考えられる。したがって、薬物用量を増加させることが、薬物効力を維持するための唯一の選択肢と考えられる。しかしながら、オピオイド誘発性疼痛に関する臨床的及び実験的研究によって示された証拠の矛盾から、本発明者はこの現象の解釈を見直さなければならないと考えた。オピオイドの治療効果の低下が薬物耐性のメカニズムに関連する場合には、明らかに薬物の用量を増加させることが妥当である。一方、ＯＩＨが原因となる場合、用量を盲目的に増加させると、単に体内の傷害促進プロセスを強化し、疼痛及び耐性を悪化させることになる。
【０００８】
したがって、オピオイド系薬物の鎮痛時間を延長し、臨床応用における鎮痛耐性、身体依存性、及び嗜癖性を克服するための、新たな薬物又は組み合わせ製剤の開発は非常に重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
Ｂｒｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ  （２０１７）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  １  ａｄｅｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ａｎａｌｇｅｓｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  １０．
【特許文献】
【００１０】
米国特許公報第ＵＳ２０１１／００９８２９５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記のオピオイド系薬物の鎮痛耐性、身体依存性、及び嗜癖性などの問題に鑑みて、本発明の目的は、オピオイド系薬物の長期使用による鎮痛耐性、身体依存性、及び嗜癖性などの問題を減少又は改善し、モルヒネ及び他のオピオイド系薬物の長期使用による付加的反応を減少することのできる、新たな薬用組成物を提供することである。
【００１２】
オピオイドは細胞内でｃＡＭＰ産生を活性化し、その長期使用はアデニリル酵素の過敏症を引き起こすことが知られている。また、ｃＡＭＰ依存性シグナル伝達経路は、耐性、依存性及び他の因子を含む長期のオピオイドの効果に重大な影響を及ぼす（Ｌｉら、２００６；  Ｂｒｕｓｔら、２０１７を参照）。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、研究の過程において、本発明で開示するＮＢ００１、ＮＢ０１０及びＮＢ０１１の３つの化合物が、オピオイド系薬物の長期使用による付加的反応を減少するために使用できるという驚くべき発見をして、本発明を完成させた。
【００１４】
本発明のＮＢ００１、即ち、５−（（２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エチル）アミノ）ペンタン−１−オールは、以下の構造を有する。
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【００１５】
本発明のＮＢ０１０、即ち、６−アミノ−９−（２−パラトリルオキシ−エチル）−９Ｈ−プリン−８−チオールは、以下の化学構造を有する。
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【００１６】
本発明のＮＢ０１１、即ち、４−（９Ｈ−プリン−６−イル）モルホリン（６−モルホリン−４−イル−７Ｈ−プリンとも称する）は、以下の化学構造を有する。
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【００１７】
本発明では、以下の薬用組成物を提供する。すなわち、
（１）オピオイド系薬物と、
ＮＢ００１、ＮＢ０１０、及びＮＢ０１１からなる群から選択される少なくとも１種と、を含む疼痛を治療するための薬用組成物であって、
上記ＮＢ００１は、５−（（２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エチル）アミノ）ペンタン−１−オールであり、
上記ＮＢ０１０は、６−アミノ−９−（２−パラトリルオキシ−エチル）−９Ｈ−プリン−８−チオールであり、
上記ＮＢ０１１は、４−（９Ｈ−プリン−６−イル）モルホリン（６−モルホリン−４−イル−７Ｈ−プリンとも称する）である、ことを特徴とする薬用組成物である。
【００１８】
（２）上記オピオイド系薬物はモルヒネである、ことが好ましい。
【００１９】
（３）上記ＮＢ００１、上記ＮＢ０１０、及び上記ＮＢ０１１は、製薬上許容される塩又は溶媒和物をさらに含む、ことができる。
【００２０】
また、本発明では、疼痛を治療する薬物の調製のため以下の薬用組成物を使用する。すなわち、
（４）疼痛を治療する薬物の調製のための薬用組成物の使用であって、上記薬用組成物は、
オピオイド系薬物と、
ＮＢ００１、ＮＢ０１０、及びＮＢ０１１からなる群から選択される少なくとも１種と、を含み、
上記ＮＢ００１は、５−（（２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エチル）アミノ）ペンタン−１−オールであり、以下の構造を有し、
上記ＮＢ０１０は、６−アミノ−９−（２−パラトリルオキシ−エチル）−９Ｈ−プリン−８−チオールであり、
上記ＮＢ０１１は、４−（９Ｈ−プリン−６−イル）モルホリン（６−モルホリン−４−イル−７Ｈ−プリンとも称する）であることを特徴とする使用である。
【００２１】
（５）上記オピオイド系薬物はモルヒネである、ことが好ましい。
【００２２】
（６）上記ＮＢ００１、上記ＮＢ０１０、及び上記ＮＢ０１１は、製薬上許容される塩又は溶媒和物をさらに含んでもよい。
【００２３】
さらに、本発明では、以下の方法を提供する。すなわち、
（７）オピオイド系薬物の使用に基づいて疼痛を治療する方法であって、ＮＢ００１、ＮＢ０１０、及びＮＢ０１１のうちの少なくとの１種と、それら化合物に製薬上許容される塩又は溶媒和物からなる群から選択される少なくとも１種を併用し、
上記ＮＢ００１は、５−（（２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エチル）アミノ）ペンタン−１−オールであり、上記ＮＢ０１０は、６−アミノ−９−（２−パラトリルオキシ−エチル）−９Ｈ−プリン−８−チオールであり、
上記ＮＢ０１１は、４−（９Ｈ−プリン−６−イル）モルホリン（６−モルホリン−４−イル−７Ｈ−プリンとも称する）である、ことを特徴とする。
【００２４】
（８）上記オピオイド系薬物はモルヒネである、ことが好ましい。
【００２５】
本発明では、以下の薬用組成物をさらに提供する。すなわち、
（９）神経因性疼痛による不安及び他の疾患に関連する不安や憂鬱を治療する薬用組成物であって、上記薬用組成物は、ＮＢ００１、ＮＢ０１０、及びＮＢ０１１ののうちの少なくとも１種を含む薬用組成物である。
【００２６】
（１０）上記ＮＢ００１、上記ＮＢ０１０、及び上記ＮＢ０１１は、その化合物が製薬上許容される塩又は溶媒和物をさらに含むことができる。
【００２７】
さらに、本発明では、以下の薬用組成物を提供する。
（１１）慢性内臓痛及びそれに関連する不安や憂鬱を治療する薬用組成物であって、上記薬用組成物は、ＮＢ００１、ＮＢ０１０、及びＮＢ０１１のうちの少なくとも１種を含む、ことを特徴とする薬用組成物。
【００２８】
（１２）モルヒネの慢性的な使用による掻痒反応を治療するための薬用組成物であって、上記薬物組成物は、ＮＢ００１、ＮＢ０１０、及びＮＢ０１１のうちの少なくとも１種を含む、ことを特徴とする薬用組成物。
【００２９】
本発明によれば、ＮＢ００１は、モルヒネ又は他のオピオイド剤化合物を慢性的に用いた時の鎮痛効果を増強し、耐性を減少させることができる。モルヒネと併用することにより、同レベルの鎮痛効果を得るのに必要なモルヒネの用量を低減することができる。
【００３０】
本発明の治療法は、モルヒネで治療される患者におけるモルヒネの鎮痛効果を増強し、及び／又はモルヒネ耐性を低下させるために使用することもできる。患者が長時間モルヒネを使用すると、モルヒネ耐性（モルヒネ鎮痛作用の喪失）が起こることがある。数日間又は数週間、ヒト及び動物におけるモルヒネの反復使用は、鎮痛効果を低下させる可能性がある。
【００３１】
本発明の他の態様は、ＡＣ１＆８阻害剤としての新規化合物ＮＢ０１０及びＮＢ０１１に関する。ＡＣ１及びＡＣ８の双方の活性がオピオイド誘発性感作のキーポイントとなる点において、極めて重要な発明といえる。すなわち、ＡＣ１及びＡＣ８の活性阻害効果は、阿片により誘発された耐性、嗜癖及び他の作用を低減するために理想的な効果である。本発明において、ＮＢ００１、ＮＢ０１０及びＮＢ０１１の作用原理は、ＡＣ１及びＡＣ８の活性が効果的に阻害されることであるが、ＡＣ１及びＡＣ８の活性を阻害する全ての化合物が本発明の効果を有するわけではない。
【００３２】
ＮＢ０１０及びＮＢ０１１は、モルヒネ又は他のオピオイド剤化合物を慢性的に用いた場合の鎮痛作用を増強させて、耐性を減少させるために使用することができる。モルヒネとの併用によって、同レベルの鎮痛効果を生じるために必要なモルヒネの用量を低減することができる。
【００３３】
本発明はまた、ＡＣ１又はＡＣ１＆８活性を抑制するのに有効な量の化合物をヒトに投与することにより、ヒトにおけるモルヒネ耐性を治療することにも使用できる。モルヒネによる慢性疼痛の治療において、通常、モルヒネの慢性使用者は、モルヒネ耐性が形成されている。ＮＢ０１０／ＮＢ０１１は、モルヒネ及び他の阿片剤の長期使用による付加的な反応を抑制するために使用することができる。
【００３４】
神経因性疼痛や癌性疼痛などの慢性疼痛の治療において、疼痛治療薬物は多くの副作用をもたらす可能性がある。モルヒネ治療による副作用として掻痒が起こる可能性もある。ＮＢ０１０／ＮＢ０１１は、モルヒネの慢性的な使用による掻痒反応を軽減するために使用することができる。
【００３５】
ＮＢ０１０／ＮＢ０１１は、傷害による不安／憂鬱を軽減するために使用することができる。ＮＢ０１０及びＮＢ０１１は、オピオイド剤（例えばモルヒネ）の慢性的な使用又は損傷による掻痒を軽減するために使用することができる。本発明は、掻痒防止のためのＮＢ０１０及びＮＢ０１１の一般的な使用を網羅することができる。
【００３６】
ＡＣ１及びＡＣ８ともエタノール誘発性感受性に関与することが知られている（Ｍａａｓら、２００５）。このため、ＮＢ０１０とＮＢ０１１は、エタノール関連嗜癖、感受性などの症状を治療するために使用することができる。
【００３７】
ＡＣ１及びＡＣ８はコカイン感作に関与することが報告されている（ＤｉＲｏｃｃｏら、２００９）。このため、本発明者は、ＮＢ０１０及びＮＢ０１１を用いてコカインの慢性的な使用に関連する嗜癖などの行動を治療することを提案した。
【００３８】
本発明の化合物は、薬学的に許容される塩の形態で存在してもよい。薬物として使用する場合、本発明の化合物の塩は、非毒性の「薬学的に許容される塩」を指す（Ｒｅｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１９８６、３３、２０１−２１７；Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９７（Ｊａｎ）、６６、１、１）。しかしながら、当該分野で周知の他の塩を用いて、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩を調製することもできる。代表的な有機又は無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、過塩素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、イセチオン酸、ベンゼンスルホン酸、シュウ酸、パモ酸、２−ナフタレンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、サッカリン酸及びトリフルオロ酢酸が挙げられる。しかし、それらに限定されるものではない。代表的な有機又は無機塩基は、ベンザチン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、プロカイン、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛などの塩基性塩又はカチオン塩を含むが、それらに限定されるものではない。
【００３９】
本発明の技術的範囲には、本発明の化合物のプロドラッグも含まれる。一般に、そのようなプロドラッグは、インビボで容易に所望の化合物に変換される上記化合物の機能的誘導体である。したがって、本発明の治療方法において、「投与」という用語は、具体的に開示された化合物又は具体的に開示されていないが、患者への投与後にインビボで特定の化合物に変換されて様々な疾患を治療する化合物の投与を含む。
【００４０】
本発明に係る薬用組成物は、非経口、経口、直腸、置換又は経皮投与の形態で使用することができる。
【００４１】
そのため、それらは、通常の若しくはコーティングされた錠剤、糖衣錠、ウエハーカプセル、ゲルカプセル、丸薬、カシェ剤、粉剤、坐薬又は直腸カプセルの形態や、注射可能な溶液又は懸濁液又は複数回投与バイアルとしても提供される。溶液又は懸濁液は、極性溶媒中で経皮使用するために、又は固定使用するために使用される。
【００４２】
上記投与に適した賦形剤としては、セルロース又は微結晶セルロース誘導体、アルカリ土類金属炭酸塩、リン酸マグネシウム、澱粉、改質澱粉及び固体形態の乳糖が挙げられる。
【００４３】
直腸使用のための賦形剤としては、ココアバター又はポリエチレングリコールステアレートが好ましい。
【００４４】
非経口的使用のための担体としては、水、水溶液、生理食塩水及び等張溶液が好ましい。
本発明の活性化合物又はその医薬用組成物の治療上有効な用量が、所望する効果により変化することは、当業者には明白である。そして、投与される最適な用量が容易に決定される。その用量は、使用される特定の化合物、投与形態、製剤の強さ、及び疾患の進行により変化する。さらに、患者の年齢、体重、飲食物、及び投与時間等、治療される特定の患者に関連する因子に応じて、適切な治療レベルの用量への調節が必要となる。したがって、本明細書に記載される用量は一般的な例である。当然のことながら、個々の状況に応じ、より多い又は少ない用量としてもよく、それは、本発明の技術的範囲に含まれる。
【００４５】
本発明の化合物を必要とする患者に鎮痛薬として使用されるたびに、上記の組成物及び用量計画、又は当技術分野で確立された組成物及び用量計画に基づいて投与することができる。
【００４６】
また、本発明では、１つ又は複数の本発明の医薬用組成物及び獣医学的組成物である成分を含有する１つ又は複数の容器を含む、医薬用又は獣医学的パッケージ又はキットを提供する。人用の薬剤の製造、使用又は販売を管理する部門によって承認された、薬物又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を管理する政府機関によって発行された通知が、任意で上記容器に添付されてもよい。
【００４７】
本発明の化合物は、鎮痛有効量を投与することにより、ヒトなどの恒温動物における軽度から重度の疼痛を治療するために使用することができる。通常のヒト（７０ｋｇ）で、１日当たり１〜４回の投与する場合、用量範囲は活性成分が、約０．１ｍｇ〜約１５，０００ｍｇとなることが好ましく、約５０ｍｇ〜約３５００ｍｇとなることがより好ましく、約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇとなることが特に好ましい。しかしながら、本発明の活性化合物の治療有効量が、治療する疼痛のタイプによって変化することは、当業者には明白である。
【００４８】
経口投与の場合、０．０１、１０．０、５０．０、１００、１５０、２００、２５０及び５００ｍｇの活性成分を含む錠剤の形態で医薬用組成物を提供することが好ましく、症状により治療する患者への用量が調節される。
【００４９】
本発明における疼痛の例としては、炎症性疼痛、中枢性疼痛、末梢性疼痛、内臓痛、構造的又は軟部組織損傷関連疼痛、進行性疾患関連疼痛、神経因性疼痛、急性疼痛（急性損傷、外傷、又は手術によるもの）及び慢性疼痛（頭痛及び神経性疾患、脳卒中後の疾患、癌、片頭痛に起因する頭痛など）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５０】
本発明の化合物は、また、免疫抑制剤、抗炎症剤、神経及び精神疾患（例えば、鬱病やパーキンソン病）の治療及び予防のための薬物、泌尿生殖器疾患（尿失禁及び早漏など）の治療ための薬物、薬物乱用及びアルコール依存症の治療のための薬物、胃炎及び下痢の治療のための薬物、心血管薬物及び心臓保護剤、並びに呼吸器系疾患の治療のための薬物として使用することができる。
【００５１】
本発明の化合物は、以下の疾患による疼痛を治療するために使用することもできる。上記疾患は、骨関節炎、リウマトイド関節炎、線維筋痛、片頭痛、頭痛、歯痛、火傷、日焼け、蛇咬傷（特に、毒蛇咬傷）、クモ咬傷、昆虫刺傷、神経因性膀胱、良性前立腺肥大、間質性膀胱炎、鼻炎、接触性皮膚炎／過敏症、掻痒、湿疹、咽頭炎、粘膜炎、腸炎、蜂巣炎、灼熱痛、坐骨神経痛、下顎関節神経痛、末梢神経炎、多発性神経炎、残肢痛、幻肢痛、術後腸閉塞、胆嚢炎、乳房切除後疼痛症候群、口腔神経因性疼痛、シャルコー（Ｃｈａｒｃｏｔ）痛、反射性交感神経性ジストロフィー、ギラン・バレー症候群、知覚異常性大腿神経痛、口腔灼熱症候群、ヘルペス後神経痛、三叉神経痛、群発頭痛、片頭痛、末梢神経障害、両側末梢神経障害、糖尿病性神経障害、帯状疱疹後神経痛、三叉神経痛、視神経炎、発熱後神経炎、遊走性神経炎、分節性神経炎、ゴンバウルト（Ｇｏｍｂａｕｌｔ）神経炎、ニューロン炎、頸腕神経痛、脳神経痛、膝状節神経痛、舌咽神経痛、片頭痛様神経痛、特発性神経痛、肋間神経痛、乳房神経痛、モートン（Ｍｏｒｔｏｎ）神経痛、鼻毛様体神経痛、後頭部神経痛、肢端紅痛症、スルーダー神経痛、翼口蓋（ｓｐｌｅｎｏｐａｌａｔｉｎｅ）神経痛、眼窩上神経痛、ヴィディアン神経痛、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、副鼻腔炎性頭痛、緊張性頭痛、出産痛、分娩痛、月経痛、及び癌を含む。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ＡＣ１＆８阻害剤ＮＢ０１０を使用したときのＡＣＣにおけるプレＬＴＰ及びポストＬＴＰの阻害効果を示す図である。
【図２】各種薬剤を用いたときのＡＣＣにおけるプレＬＴＰに対するＡＣ１＆８の阻害効果を示す図である。
【図３】ＡＣ１阻害剤ＮＢ００１（５ｍｇ／ｋｇ）を使用したモルヒネ（１０ｍｇ／ｋｇ）の反復注射により誘発されたモルヒネ耐性の低下を示す図である。
【図４】各種試料のモルヒネ耐性を示す図である。
【図５】モルヒネの条件づけ場所嗜好性試験結果を示す図である。
【図６】神経損傷による不安に対する各種薬剤の効果を示す図である。
【図７】掻痒反応試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
ＮＢ００１は、５−（（２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エチル）アミノ）ペンタン−１−オール（英語名は５−（（２−（６−ａｍｉｎｏ）−９Ｈ−ｐｕｒｉｎ−９−ｙｌ）ｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｐｅｎｔａｎ−１−ｏｌ）であり、分子式はＣ１２Ｈ２０Ｎ６Ｏであり、分子量は２６４．３３（単位）である。市販品としては、シグマ社の６８６３０１−４８−４号が挙げられる。
【００５４】
ＮＢ０１０、即ち、６−アミノ−９−（２−パラトリルオキシ−エチル）−９Ｈ−プリン−８−チオールは、以下の化学構造を有する。
2019052094.tif 000006
市販品としては、アシネックス（Ａｓｉｎｅｘ  ＬＴＤ）社のＢＡＳ０３３８４号が挙げられる。
【００５５】
ＮＢ０１１、即ち、４−（９Ｈ−プリン−６−イル）モルホリン（６−モルホリン−４−イル−７Ｈ−プリンとも称する）は、以下の化学構造を有する。
2019052094.tif 000007
市販品としては、メイブリッジ（Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ）社のＪＦＤ０２７９３号が挙げられる。
【００５６】
本発明において、示された化学式を有する化合物の薬学的に許容される塩は、化合物Ａ及び化合物Ｂの定義に含まれる。
〈実施例１〉ＡＣ１＆８混合阻害剤のスクリーニング
【００５７】
潜在的なＡＣ１及びＡＣ８共阻害剤（又は、ＡＣ１及び８阻害剤）を選別するために、一連の生化学的スクリーニング試験を行った。ＡＣ１及びＡＣ８に作用する潜在的化合物Ａ及びＢをスクリーングするために、ＡＣ１又はＡＣ８が発現する細胞系において、ｃＡＭＰアッセイ、遺伝子活性化（ｐＣＲＥＢ）アッセイ、及び包括的な生理的試験を行った。その結果、ＮＢ０１０及びＮＢ０１１とも、１００μＭでＡＣ１及びＡＣ８の活性を顕著に阻害することが発見された（表１参照）。試験方法については、Ｗａｎｇ，  Ｈ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｄｅｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｐａｉｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２０１１．  ３（６５）を参照した。
2019052094.tif 000008
〈実施例２〉不安関連皮質ＬＴＰに対するＮＢ０１０及びＮＢ０１１の影響評価
【００５８】
既存の研究では、反復刺激によって誘発されたシナプスＬＴＰがＡＣ１及びＡＣ８の活性を必要とすることが示されている（Ｚｈｕｏ、２０１６）。ニューロンＡＣ１及びＡＣ８の活性に対するＮＢ０１０及びＮＢ０１１の影響を評価するために、本発明者は、成体マウスのＡＣＣ皮質切片に２つの形態のＬＴＰを記録した。
【００５９】
θ刺激は、少なくとも４０分間持続したシナプス反応の増強を刺激し誘発した（図１Ａ、ｎ＝８個の切片）。ＮＢ０１０（２５μＭ）を用いて前処理を行うことによって、ＡＣＣ  ＬＴＰの誘発を遮断することができる（図１Ａ、ｎ＝５片）ことがわかった。また、ＮＢ０１１を用いた前処理によっても、同様の結果が得られた（図２を参照、ｎ＝６個の切片）。同じ用量（２５μＭ）の非選択性ＡＣ阻害剤ＳＱ２２３５６では、プレＬＴＰの顕著な減少は認められなかった（図２、ｎ＝５）。また、ＧＡＢＡｐｅｎｔｉｏｎ（２５  ｕＭ）を使用してもプレＬＴＰ（ｎ＝５）を遮断しないことがわかった。最近のＡＣＣ報告（Ｃｈｅｎら、２０１４）では、ＧＡＢＡｐｅｎｔｉｏｎがＡＣＣ  ＬＴＰに影響を与えないことが記載されている。興味深いことに、ホルスコリン（１０ｕＭ）では、プレＬＴＰにわずかな増加が生じた（図２）。このことはＡＣの活性化がプレＬＴＰにとって重要であることを示している。上記結果より、ＮＢ０１０及びＮＢ０１１とも、成体マウスのニューロンにおけるＡＣ１及びＡＣ８の活性を阻害できることを示している。このことから、ＮＢ０１０及びＮＢ０１１が損傷による不安の治療に使用できることが立証された。
【００６０】
最近の研究では、損傷による不安はプレＬＴＰに関連する可能性があることが示されている（Ｋｏｇａら、２０１５；  Ｚｈｕｏ、２０１６）。そのため、発明者は、プレＬＴＰに対するＮＢ０１０及びＮＢ０１１の影響を測定することとした。その結果、２種の化合物はプレＬＴＰを阻害できることが判明した（図１）。具体的な試験プロセスについては、Ｋｏｇａ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ＬＴＰ  ｉｎ  ＡＣＣ  Ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ａｎｘｉｅｔｙ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｐａｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｎ，  ２０１５．  ８５（２）：  ｐ．  ３７７−３８９を参照した。
【００６１】
図１は、ＡＣ１＆８阻害剤ＮＢ０１０を使用したときのＡＣＣにおけるプレＬＴＰ及びポストＬＴＰの阻害効果を示す。（Ａ）より、対照切片においてポストＬＴＰが誘発され（黒丸；ｎ＝８）、ＮＢ０１０（２５μＭ）溶液の使用によりポストＬＴＰの誘発が遮断されたことが確認された（ｎ＝５）。（Ｂ）より、対照切片においてプレＬＴＰが誘発され（黒丸；ｎ＝８）、ＮＢ０１０（２５μＭ）溶液の使用によりプレＬＴＰの誘発が遮断されたことが確認された（ｎ＝５）。
【００６２】
図２は、各種試薬を用いたときのＡＣＣにおけるプレＬＴＰに対する、ＡＣ１＆８の阻害効果を示す。データにより、プレＬＴＰが４５分間誘発されたとき、最後の５分間で増強されたことが認められた。＊は、対照群と比較して顕著な差があることを示す（ＮＢ０１０及びＮＢ０１１では減少が生じ、ホルスコリンでは増加が生じた）。
〈実施例３〉モルヒネ耐性に対するＡＣ１及びＡＣ１＆８阻害剤の行動影響
【００６３】
ＡＣ１ノックアウトマウスがモルヒネの反復注射によりモルヒネ耐性に影響を生じるか否かを検査した。本発明者の以前の報告では、モルヒネ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）を７日間毎日注射して、モルヒネによる耐性を測定した。ＡＣ１ノックアウトマウスでは、食塩水で処理された野生型マウス（ｎ＝５〜８匹のマウス：７日目：対照マウス、ＭＰＥ１８±６％、ＡＣ１ＫＯ、４０±８％）と比較して、モルヒネにより明らかに大きな鎮痛作用を生じる（Ｐ  ＜０．０５）ことを見出した。これらの結果から、ＡＣ１活性の阻害がモルヒネ耐性の低下に有益であり得ることを示している。次に、選択的ＡＣ１阻害剤ＮＢ００１（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を用いて、野生型マウスをモルヒネで処理した。侵害受容器及び尾部反応遅延を記録した。ＮＢ００１との併用により、慢性的なモルヒネ治療の後の反応潜時に顕著な影響が生じる（ｐ  ＜０．００５）（図３）ことが認められた。
【００６４】
ＡＣ１及びＡＣ８ダブルノックアウトマウスに対する以前の研究では、モルヒネ耐性の顕著な低下が発見された（Ｌｉら、２００６）。ＡＣ１＆８阻害剤がモルヒネ耐性を低下させる有益な効果を有すると考えられる。モルヒネ注射の７日後、ＮＢ０１０又はＮＢ０１１（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を用いた前処理（ｎ＝５〜８匹のマウス、それぞれの対照処理と比較してｐ＜０．０５）を行うことにより、いずれにおいても明らかに大きな鎮痛作用を生じた。具体的な試験方法については、Ｌｉ，  Ｓ．，  Ｌｅｅ，  Ｍ．  Ｌ．，  Ｂｒｕｃｈａｓ，  Ｍ．  Ｒ．，  Ｃｈａｎ，  Ｇ．  Ｃ．，  Ｓｔｏｒｍ，  Ｄ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｃｈａｖｋｉｎ，  Ｃ．  （２００６）．  Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ａｄｅｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｍｏｒｐｈｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７０，  １７４２−１７４９を参照した。
【００６５】
図３は、ＡＣ１阻害剤ＮＢ００１（５ｍｇ／ｋｇ）を使用したモルヒネ（１０ｍｇ／ｋｇ）の反復注射により誘発されたモルヒネ耐性の低下を示す図である。図３より、ＡＣ１阻害剤ＮＢ００１（５ｍｇ／ｋｇ）の使用によりモルヒネ耐性を低下できることがわかった。
【００６６】
以上の結果から、ＡＣ１阻害剤ＮＢ００１、ＡＣ１＆８阻害剤ＮＢ０１０及びＮＢ０１１はいずれもモルヒネ鎮痛効果の増強のために使用され、モルヒネの反復使用を可能にすると考えられる。
【００６７】
図４より、モルヒネ（１０ｍｇ／ｋｇ）注射後、ＮＢ０１０及びＮＢ０１１は、７日間（ｎ＝５〜７匹のマウス）モルヒネ耐性を逆転させる顕著な効果を有することが確認された。対照的に、１００ｍｇ／ｋｇのガバペンチン（ＧＡＢＡｐｅｎｔｉｎ）は、顕著な効果を有しなかった（ｎ＝６匹のマウス）。さらに、非選択的ＡＣ阻害剤ＳＱ２２３５６でも試験を行ったが、同じ用量では大きな効果は認められないことがわかった。以上の結果、ＡＣ１／ＡＣ８の選択的阻害が重要であることが確認された。
【００６８】
モルヒネ耐性におけるＡＣ１／ＡＣ８の作用をさらに試験するために、ＡＣ活性化剤ホルスコリンを使用した。その結果、モルヒネの反復使用の３日後に、マウス（ｎ＝３匹のマウス）がより迅速に耐性を有することが認められた。
【００６９】
ＡＣ１阻害剤ＮＢ００１（５ｍｇ／ｋｇ）、ＡＣ１／ＡＣ８阻害剤ＮＢ０１０及びＮＢ０１１（５ｍｇ／ｋｇ）では、モルヒネの反復注射の７日後に、モルヒネ（１０ｍｇ／ｋｇ）の反復注射によって誘発されたモルヒネ耐性が低下することわかった。ガバペンチン（１００ｍｇ／ｋｇ）及びＳＱ２２３５６（５ｍｇ／ｋｇ）では、顕著な効果が得られなかった。
【００７０】
効果を実現可能な用量を確認するために、ＮＢ化合物を１ｍｇ／ｋｇより少ない用量で使用した。その結果、ＮＢ００１、ＮＢ０１０及びＮＢ０１１とも顕著な効果が得られないことがわかった。これにより、用量に応じて効果が得られることが確認された。
〈実施例４〉モルヒネの条件付け場所嗜好性試験（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  Ｐｌａｃｅ  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＣＰＰ）
【００７１】
条件付け場所嗜好性試験（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  Ｐｌａｃｅ  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  ＣＰＰ）により、ＣＲＥＢ突然変異マウスでモルヒネの有益効果に対する反応が低下することが確認されている（Ｗａｌｔｅｒｓ及びＢｌｅｎｄｙ、２００１）。食塩水で処理したマウス及び阻害剤で治療したマウスにおいて、モルヒネＣＰＰを誘発した。食塩水で処理したマウスと比較して、ＮＢ００１（５ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）で処理したマウスでは、チャンバーのモルヒネに適合した側を探索する時間が著しく短く、ＡＣ１がモルヒネの増強された特性に影響を及ぼすことが示唆された（ｐ＜０．０５）。上記マウスでは、部屋の両側の初期の嗜好に大きな違いはなかった。具体的な試験方法については、Ｗａｌｔｅｒｓ  ＣＬ，  Ｂｌｅｎｄｙ  ＪＡ  （２００１）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｉｎｆｏｒｃｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ａｂｕｓｅ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２１：９４３８−９４４４を参照した。
【００７２】
モルヒネの条件付け場所嗜好性試験に関連して、本発明者は、ＮＢ００１がモルヒネにより誘発された嗜好性を顕著に減少させることを発見した。ＮＢ０１０及びＮＢ０１１（５ｍｇ／ｋｇ）も、ＮＢ００１と同様の効果を有する（図５を参照）。一方、同じ用量の非選択的ＡＣ阻害剤ＳＱ２２３５６は阻害作用を生じなかった（図５を参照）。これにより、ＡＣ１／ＡＣ８の阻害は選択的であることが示される。また、１００ｍｇ／ｋｇのＧＡＢＡｐｅｎｔｉｏｎの作用についても評価した。図５に示されるように、９日後にモルヒネ（１０ｍｇ／ｋｇ）を反復使用して場所嗜好行動を誘発し、ＡＣ１阻害剤ＮＢ００１、ＡＣ１／８阻害剤ＮＢ０１０及びＮＢ０１１（５ｍｇ／ｋｇ）の使用による効果が顕著に認められた。ガバペンチン（１００ｍｇ／ｋｇ）又はＳＱ２２３５６（５ｍｇ／ｋｇ）では、顕著な効果は認められなかった。
【００７３】
さらに、図示しない試験結果により、ＮＢ００１、ＮＢ０１０及びＮＢ０１１の用量を１ｍｇ／ｋｇに低減すると、期待される効果が得られないことがわかった。この結果、ＮＢ００１、ＮＢ０１０及びＮＢ０１１の作用は用量依存性があることが確認された（ｎ＝３〜５匹のマウス）。
【００７４】
ホルスコリン（５ｍｇ／ｋｇ）では阻害効果は生じず、選択時間がわずかに増加した（ｎ＝３匹のマウス）。
〈実施例５〉不安行動試験
【００７５】
上述したように、本発明者は、神経損傷がＥＰＭ試験において不安行動を引き起こすことを発見した（Ｋｏｇａら、２０１５；図６を参照）。ＮＢ０１０及びＮＢ０１１のいずれの阻害剤も不安に関連するプレＬＴＰを阻害するため、ＮＢ０１０又はＮＢ０１１が不安などの行動を減少できるか否かを確認した。予想通り、ＮＢ０１０及びＮＢ０１１（５ｍｇ／ｋｇ）は、神経損傷による不安反応を顕著に軽減することがわかった（いずれの場合もＰ＜０．０５、いずれも試薬ｎ＝６匹のマウス）（図６を参照）。
【００７６】
より低い用量（１ｍｇ／ｋｇ）においては、ＮＢ０１０（図６を参照）による顕著な軽減は認められなかった。１ｍｇ／ｋｇのＮＢ０１１でも同様の結果が得られた。ガバペンチン（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）及びＳＱ２２３５６（５ｍｇ／ｋｇ）では、行動的不安に顕著な軽減は認められなかった（図６）。ホルスコリン（５ｍｇ／ｋｇ）を使用しても、不安がさらに増強されることはなかった。これは、飽和効果の生成に起因する可能性が考えられる（図６）。
実験方法については、Ｋｏｇａ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ＬＴＰ  ｉｎ  ＡＣＣ  Ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ａｎｘｉｅｔｙ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｐａｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｎ，  ２０１５．  ８５（２）：  ｐ．  ３７７−３８９を参照した。
【００７７】
図６は、神経損傷による不安に対する各種薬剤の影響を示す。ＡＣ１＆８阻害剤ＮＢ０１０及びＮＢ０１１（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を使用することにより、神経損傷による不安状態が減少した（損傷の７日後）。１ｍｇ／ｋｇの少ない用量では、ＮＢ０１０及びＮＢ０１１のいずれも不安に対する効果が認められなかった。ガバペンチン（１００ｍｇ／ｋｇ）及びＳＱ２２３５６（５ｍｇ／ｋｇ）の使用では、顕著な治療効果は認められなかった。本実施例では、ＥＰＭ試験により不安状態を評価した。
掻痒の反応
【００７８】
掻痒は、オピオイド系物質の慢性的な使用を含む様々な疾患により引き起こされることがよく知られている。ＡＣ１及びＡＣ８の阻害が掻痒反応を減少することを確認するために、化合物Ａの注射による行動的掻痒反応に対するＮＢ０１０及びＮＢ０１１の効果を評価した。具体的な試験方法は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１００９８２９５  Ａ１を参照されたい。化合物４８／８０（１００μｇ／５０μｌ）の皮内注射によって誘発された全体的なスクラッチ反応の結果を示す。野生型マウス（ｎ＝７）と比較して、ＮＢ０１０及びＮＢ０１１で前処理した（ｎ＝６匹のマウス）注射をしたマウスでは、全体的にスクラッチ反応が顕著に減少することが認められた（図７）。ＧＡＢＡｐｅｎｔｉｏｎ（１００ｍｇ／ｋｇ）の使用では、掻痒反応に顕著な減少は認められなかった（図７）。この用量（５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）では、ＳＱ２２３５６による顕著な減少も認められなかった。対照的に、ホルスコリン（５ｍｇ／ｋｇ）の使用により、行動的掻痒反応は顕著に増強した（図７）。
【００７９】
図７は、ｃＡＭＰ経路に影響を及ぼす各種試薬のマウスの行動的掻痒反応に及ぼす影響を示す図である。ＮＢ０１０及びＮＢ０１１の使用により、成体マウスにおいてヒスタミン放出化合物４０／８０により引き起こされる掻痒反応が顕著に減少した。対照的に、ガバペンチン及びＳＱ２２３５６では顕著な効果は得られなかった。ホルスコリンはＡＣ活性化剤であり、掻痒反応を著しく増強した。対照と比較して、Ｐ＜０．０５である結果に＊を付した。
試験動物
【００８０】
ＡＣ１及びＡＣ８  ＫＯマウスについては、Ｗｅｉ  Ｆ，  Ｑｕｉ  ＣＳ，  Ｋｉｍ  ＳＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ａｄｅｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅｓ．  Ｎｅｕｒｏｎ．  ２００２；  ３６（４）：  ７１３−７２６を参照した。Ｃ５７Ｂ１／６バックグラウンドで数世代（Ｆ８〜Ｆ１２）が繁殖された。対照野生型（ＷＴ）マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒの成体雄性（８〜１２週齢）Ｃ５７Ｂ１／６マウスであった。実験の最後に、動物を過量の吸入麻酔薬（ハロタン）で処置した。動物を１２時間：１２時間の明暗サイクルで飼育し、食物及び水を日常的に提供した。
ＡＣ８及びＡＣ１の新規阻害剤の生化学的スクリーニング試験
【００８１】
ＡＣ８発現ベクターｐｃＤＮＡ３−ＡＣ１のトランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３細胞を、６０ｍｍ直径の培養皿上に１プレートあたり１×１０  ６の密度でプレートし、一晩増殖させ、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってｐｃＤＮＡ３−ＡＣ１をトランスフェクトした（１錠あたり０．８μｇのＤＮＡ）。安定なトランスフェクトクローンを、０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を含有する培地中で選択し、培地中に保持した。ＨＥＫ２９３細胞における他のＡＣアイソフォームの一過性発現のために、ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェル組織培養皿に播種し、ＡＣ５プラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に試験を行った。
【００８２】
ＡＣｓを発現するＨＥＫ２９３細胞を採取し、異なる処理の後に０．１ＭのＨＣｌ水溶液中に溶解した。ダイレクトｃＡＭＰ酵素イムノアッセイキット（アッセイデザイン、ＭＩ）を用いてダイレクトｃＡＭＰアッセイを行い、マイクロプレートリーダーによって４０５ｎｍで光学濃度値を測定した。１ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）を培養物に添加することによって、ホスホジエステラーゼを阻害した。
ＣＲＥルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
【００８３】
ＨＥＫ２９３細胞を抗生物質の非存在下で９６ウェルプレートに継代培養し、一晩増殖し、ｐＧＬ３−ＣＲＥホタルルシフェラーゼ及びｐＧＬ３−ＣＭＶ−アドレナリンルシフェラーゼ構築物（１ウェルあたり０．２５μｇのＤＮＡ）を用いてリポフェクタミン２０００試薬でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を一晩インキュベートし、培地を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭに交換した。４８時間後、各化学物質の濃度で、１０μＭのホルスコリン、１０μＭのＡ２３１８７及び２ｍＭの  ＣａＣｌ２又は１０μＭのホルスコリン、１０μＭのＡ２３１８７及び２ｍＭのＣａＣｌ２の組み合わせで細胞を処理した。６時間後に、培養細胞を採取し、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりルシフェラーゼ活性を測定した。ＳＩＲＩＵＳルミノメーターを用いて相対的光ユニットを測定した。
全細胞パッチクランプ記録
【００８４】
標準的な方法を用いてＡＣＣレベルの冠状断脳切片（３００μｍ）を調製した（Ｗｕら、２００５）。切片を、酸素（９５％のＯ２及び５％のＣＯ２）を含む人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）（人工脳脊髄液は、ｍＭで、１２４  ＮａＣｌ、２．５  ＫＣｌ，２  ＣａＣｌ２、１  ＭｇＳＯ４、２５  ＮａＨＣＯ３、１  ＮａＨ２ＰＯ４、１０  グルコースを含む）に浸漬後、回収チャンバーに移し、室温で少なくとも１時間放置した。視覚化するための赤外線ＤＩＣ光学系を備えたＢＸ５１Ｗ１顕微鏡のステージ上の記録チャンバー内で実験を行った。Ａｘｏｎ  ２００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ）を用いてＩＩ  ／  ＩＩＩニューロンから興奮性シナプス後電流（ＥＰＳＣ）を記録し、ＡＣＣ層Ｖに配置された双極タングステン刺激電極を介して刺激を送達した。α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチルイソキサゾール−４−プロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体により媒介されるＥＰＳＣを０．０５Ｈｚで繰り返し刺激することにより誘発し、ＡＰ５（５０μＭ）の存在下でニューロン電圧を−７０ｍＶでクランプした。記録用ピペット（３〜５ＭΩ）に充填した内部溶液は、（ｍＭで）１４５  Ｋ−グルコン酸塩、５  ＮａＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、０．２  ＥＧＴＡ、１０  ＨＥＰＥＳ、２  Ｍｇ−ＡＴＰ、０．１  Ｎａ３−ＧＴＰ、１０  クレアチンリン酸二ナトリウムの溶液であり、ＫＯＨでｐＨを７に調節した。内溶液（ｍＭ：１４０  セシウムメタンスルホン酸ナトリウム、５  ＮａＣｌ、０．５  ＥＧＴＡ、１０  ＨＥＰＥＳ、２  ＭｇＡＴＰ、０．１  Ｎａ３−ＧＴＰ、０．１  ノイリジン、２  ＱＸ−３１４臭化物及び１０  クレアチンリン酸二ナトリウム（ＣｓＯＨでｐＨを７．２に調節した））を使用してＡＭＰＡ受容体媒介の送達試験を整流した。マイクロＥＰＳＣ（ｍＥＰＳＣ）記録のために、０．５μＭのＴＴＸを灌流溶液に添加した。すべての実験において、ＧＡＢＡＡ受容体媒介の抑制性シナプス電流を遮断するように、微量の毒素（１００μＭ）を常に存在させた。経路の抵抗は１５〜３０ＭΩであり、実験を通してそれを監視した。実験中、経路の抵抗が１５％以上変化した場合には、データを破棄した。データを１ｋＨｚでフィルタリングし、１０ｋＨｚでデジタル化した。
条件付け場所嗜好性試験
【００８５】
２つの異なる環境（異なる壁、床及び匂い）を有する部屋（ＭＥＤ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｔ．  Ａｌｂａｎｓ、ＶＴ）を使用した。試験の最初の日に、動物は、自由に３０分間チャンバーの両側を探索させ、データを用いてほぼ等しい偏りのグループに分けた。次の８日間、チャンバーの異なる側の動物それぞれに、１日おきに、１０ｍｇ／ｋｇのモルヒネ又は等体積の食塩水を与えた。動物を３０分間チャンバーの特定の側に閉じ込めた。調節後、全ての動物に生理食塩水を注射して、３０分間チャンバーの両側を自由に探索させた。場所嗜好性は、試験前と比較したときの、調節後のモルヒネのペアリング側での時間の増加量で評価した。
神経因性疼痛モデル
【００８６】
上記のように、総腓骨神経（ＣＰＮ）を接続することによって神経因性疼痛モデルを誘導した（Ｌｉら、２０１０）。ケタミン（０．１６ｍｇ／ｋｇ；Ｂｉｍｅｄａ−ＭＴＣ）とキシラジン（０．０１ｍｇ／ｋｇ；Ｂａｙｅｒ）の混合食塩水の腹腔内注射によりマウスに麻酔した。ＣＰＮは、ほぼ横方向に走る筋肉の前群と後群との間で観察される。慢性ＣＰＮを、足の背屈筋の収縮がデジタルとして見える痙攣になるまで、クロム腸線縫合糸５−０（Ｅｔｈｉｃｏｎ）にゆっくりと接続した。手術後３日目、７日目、１４日目に機械的異痛の検査を行った。盲検試験を行い、異なる人が手術及びマウスの機械的感受性の測定を担当した。
機械的異痛の試験
【００８７】
マウスを円形の容器に入れ、試験前に３０分間順応させた。Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメント（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）の屈曲点への適用に対する後肢の応答性に基づいて、機械的異痛を評価した。ポジティブな反応は、舐めること、噛むこと、後肢を突然引くことを含む。閾値刺激を特徴付けるために実験を行った。ナイーブマウスにおいて、１．６５フィラメントからの機械的圧力（力、０．００８ｇ）は無害であることが判明した。その後、このフィラメントを用いて機械的異痛を試験した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【外国語明細書】
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