(57)【要約】      （修正有）【課題】３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物の生産方法の提供。【解決手段】下記式（Ｉ）の３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物の生産方法であって、2019017381.tif 000010下記式（ＩＩ）で表される３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を還元し得る乳酸菌を用い、嫌気条件にて培養する。2019017381.tif 000011（式（Ｉ）および（ＩＩ）中、Ｒは２位、３位、５位および６位の１または２以上が置換されていてもよく、置換基はそれぞれ独立にヒドロキシ基、など。）【選択図】図１
2019017381.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物の生産方法であって、
【化１】
2019017381.tif 000008
（式（Ｉ）中、Ｒは２位、３位、５位および６位の１または２以上が置換されていてもよいことを意味し、置換基はそれぞれ独立にヒドロキシ基、炭素数が１〜３のアルコキシ基、または炭素数が１〜３のアルキル基であり、Ｒ１は水素原子または炭素数が１〜３のアルキル基である。）
下記式（ＩＩ）で表される３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を還元し得る乳酸菌を、当該３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を含有する培地を用い、嫌気条件にて培養する工程を含むことを特徴とする生産方法。
【化２】
2019017381.tif 000009
（式（ＩＩ）中、Ｒは２位、３位、５位および６位の１または２以上が置換されていてもよいことを意味し、置換基はそれぞれ独立にヒドロキシ基、炭素数が１〜３のアルコキシ基、または炭素数が１〜３のアルキル基であり、Ｒ１は水素原子または炭素数が１〜３のアルキル基である。）
【請求項２】
前記培養する工程は、溶存酸素濃度が６ｍｇ／Ｌ以下である培地に、前記乳酸菌を植菌して培養する工程であることを特徴とする請求項１に記載の生産方法。
【請求項３】
前記乳酸菌が対数増殖期に移行する前に、前記３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を培地に含有させることを特徴とする請求項２に記載の生産方法。
【請求項４】
前記培養した乳酸菌を集菌する工程と、
前記集菌した前記乳酸菌の菌体と、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物とを、嫌気条件下にて反応させる工程と、
を備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項５】
前記培養した乳酸菌を集菌する工程と、
前記集菌した前記乳酸菌の菌体を破砕する工程と、
前記破砕した菌体と３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物とを反応させる工程と、
を備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項６】
前記３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物は、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸、３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパン酸、および３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸からなる群より選択される１種または２種以上であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項７】
前記乳酸菌は、ラクトバチルス科、ストレプトコッカス科、ロイコノストック科、エンテロコッカス科またはバチルス科に属する乳酸菌であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項８】
前記乳酸菌は、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ワイセラ属、オエノコッカス属、エンテロコッカス属またはバチルス属に属する乳酸菌であることを特徴とする請求項７に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物の生産方法に関するものであり、より詳細には、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を原料とし、乳酸菌を用いた還元反応により３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、飽食や運動不足等の生活習慣が原因となり、肥満、２型糖尿病、高血圧症、インスリン抵抗性等といった生活習慣病が大きな問題となっている。これら生活習慣病を改善するにあたり、医薬品による治療だけでなく、天然物由来あるいは食品由来の成分による予防・治療等も注目されている。
【０００３】
３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物は、かかる生活習慣病に関与する作用を有しているものと認められ、その機能性に関心が集まっている。例えば、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物の一つである３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸は、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性阻害作用等を有することが報告されている（特許文献１参照）。
【０００４】
３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物は、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を還元することで生成する。一部の乳酸菌においては、かかる還元反応を行い得ることが知られている（例えば非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１６−０７９１８６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Sci. Food Agric.，2012年，vol.92，pp.2291-2296
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、還元反応を行うことが知られている乳酸菌においても、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を還元する酵素は未同定であり、その実態は明らかになっていない。また、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物は、還元反応の他に、カルボキシル基の脱炭酸反応により代謝されることも知られており（上述した非特許文献１）、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物を収率よく生産する方法についての知見は未だ十分とはいえない。
【０００８】
本発明は、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物を簡便にかつ効率よく生産することのできる生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、乳酸菌を用いたときに、嫌気条件がトリガーとなり、乳酸菌における３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物の代謝経路が切り替わり、脱炭酸活性が抑制されるとともに還元活性が誘導され、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を効率よく還元することを見出した。
【００１０】
かかる発見に基づき完成された本発明は、以下のとおりである。
〔１〕  下記式（Ｉ）で表される３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物の生産方法であって、
【化１】
2019017381.tif 000003
（式（Ｉ）中、Ｒは２位、３位、５位および６位の１または２以上が置換されていてもよいことを意味し、置換基はそれぞれ独立にヒドロキシ基、炭素数が１〜３のアルコキシ基、または炭素数が１〜３のアルキル基であり、Ｒ１は水素原子または炭素数が１〜３のアルキル基である。）
下記式（ＩＩ）で表される３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を還元し得る乳酸菌を、当該３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を含有する培地を用い、嫌気条件にて培養する工程を含むことを特徴とする生産方法。
【化２】
2019017381.tif 000004
（式（ＩＩ）中、Ｒは２位、３位、５位および６位の１または２以上が置換されていてもよいことを意味し、置換基はそれぞれ独立にヒドロキシ基、炭素数が１〜３のアルコキシ基、または炭素数が１〜３のアルキル基であり、Ｒ１は水素原子または炭素数が１〜３のアルキル基である。）
〔２〕  前記培養する工程は、溶存酸素濃度が６ｍｇ／Ｌ以下である培地に、前記乳酸菌を植菌して培養する工程であることを特徴とする〔１〕に記載の生産方法。
〔３〕  前記乳酸菌が対数増殖期に移行する前に、前記３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を培地に含有させることを特徴とする〔２〕に記載の生産方法。
〔４〕  前記培養した乳酸菌を集菌する工程と、
前記集菌した前記乳酸菌の菌体と、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物とを、嫌気条件下にて反応させる工程と、
を備えることを特徴とする〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の生産方法。
〔５〕  前記培養した乳酸菌を集菌する工程と、
前記集菌した前記乳酸菌の菌体を破砕する工程と、
前記破砕した菌体と３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物とを反応させる工程と、
を備えることを特徴とする〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の生産方法。
〔６〕  前記３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物は、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸、３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパン酸、および３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸からなる群より選択される１種または２種以上であることを特徴とする〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の生産方法。
〔７〕  前記乳酸菌は、ラクトバチルス科、ストレプトコッカス科、ロイコノストック科、エンテロコッカス科またはバチルス科に属する乳酸菌であることを特徴とする〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載の生産方法。
〔８〕  前記乳酸菌は、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ワイセラ属、オエノコッカス属、エンテロコッカス属またはバチルス属に属する乳酸菌であることを特徴とする〔７〕に記載の生産方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の生産方法によれば、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物を簡便にかつ効率よく生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】試験例２において、好気条件および嫌気条件での３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸生産量を比較したグラフである。
【図２】試験例３において、好気条件および嫌気条件での溶存酸素濃度および３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸量の変化を比較したグラフである。
【図３】試験例４において、植菌時の溶存酸素濃度を制御して３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸の生成率を測定した結果を表すグラフである。
【図４】試験例５において、集菌した休止菌体を用いて３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸を反応させた結果を示すグラフである。
【図５】試験例６において、菌体破砕物を用いて３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸を反応させた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本実施形態に係る３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物の生産方法は、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を還元し得る乳酸菌を、当該３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を含有する培地を用い、嫌気条件にて培養する工程を含むものである。
【００１４】
１．生成化合物および誘導化合物
本実施形態において生産される化合物は、下記式（Ｉ）で表される３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物である。以下、かかる３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物を「生成化合物」と称することがある。
【００１５】
【化３】
2019017381.tif 000005
【００１６】
（式（Ｉ）中、Ｒは２位、３位、５位および６位の１または２以上が置換されていてもよいことを意味し、置換基はそれぞれ独立にヒドロキシ基、炭素数が１〜３のアルコキシ基、または炭素数が１〜３のアルキル基であり、Ｒ１は水素原子または炭素数が１〜３のアルキル基である。）
【００１７】
本実施形態の生産方法においては、上記式（Ｉ）で表される生成化合物のうち１種のみが生産されてもよく、また２種以上が同時に生産されてもよい。具体的な生成化合物としては、例えば、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸、３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロパン酸、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸等が挙げられ、中でも３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸の生産方法として本実施形態は好適である。
【００１８】
本実施形態においては、下記式（ＩＩ）で表される３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を培地に含有させる。
【００１９】
【化４】
2019017381.tif 000006
（式（ＩＩ）中、Ｒは２位、３位、５位および６位の１または２以上が置換されていてもよいことを意味し、置換基はそれぞれ独立にヒドロキシ基、炭素数が１〜３のアルコキシ基、または炭素数が１〜３のアルキル基であり、Ｒ１は水素原子または炭素数が１〜３のアルキル基である。）
【００２０】
本実施形態においては、後述する乳酸菌を、上記３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を含有した培地を用い、嫌気条件にて培養することで、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物の還元活性を誘導するものである。以下、培地に含有させる３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を「誘導化合物」と称することがある。
また、かかる還元活性が誘導された乳酸菌（その菌体および菌体破砕物を含む）を用い、上記３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を還元し、上記生成化合物を生産する。以下、還元反応に付す３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を「原料化合物」と称することがある。
【００２１】
ここで、乳酸菌の培養と原料化合物の還元反応とが同時に行われる場合（例えば、後述する方法（１））、誘導化合物と原料化合物とは同一となる。一方、乳酸菌の培養と原料化合物の還元反応とをそれぞれ別の工程として行う場合（例えば、後述する方法（２），（３））、誘導化合物は原料化合物と異なっていてもよいが、生成化合物の精製等が必要な場合にこれを容易にする観点から、誘導化合物と原料化合物とは同一であることが好ましい場合もある。
【００２２】
また、本明細書において、生成化合物における上記式（Ｉ）中のＲおよびＲ１が、それぞれ原料化合物における上記式（ＩＩ）中のＲおよびＲ１と同一である場合、かかる生成化合物と原料化合物とが「対応する」という。
【００２３】
本実施形態においては、原料化合物として、生成化合物に対応する化合物を選択することが好ましい。例えば、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸を生産する場合には、原料化合物として３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸を選択することが好ましい。上記式（Ｉ）で表される２種以上の化合物を生産する場合は、生成化合物に対応する２種以上の原料化合物を選択すればよい。
【００２４】
ただし、本実施形態で用いる乳酸菌の中には、上記式（Ｉ）中のＲ１が炭素数１〜３のアルキル基である原料化合物や、Ｒが炭素数１〜３のアルコキシ基である原料化合物を用いた場合に、当該Ｒ１やＲを加水分解する活性を有する菌株がある。このような乳酸菌を用いる場合には、かかる加水分解活性を考慮して原料化合物を選択してもよい。例えば、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸を生産する場合において、用いる乳酸菌が、Ｒ１が炭素数１〜３のアルキル基であるエステルの加水分解活性を有する場合には、原料化合物として、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸に加え、Ｒ１が置換されたエステルを用いてもよい。
【００２５】
本実施形態においては、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を還元し得る乳酸菌を、当該３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を含有する培地を用い、嫌気条件にて培養する。
本実施形態においては、還元反応において、微生物である乳酸菌を用いるため、簡便な実施が可能となる。ただし、乳酸菌は、原料化合物である３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を脱炭酸する活性を有することが分かっており、脱炭酸されると、生成化合物である３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物の収率が下がってしまう。
これに対し、本発明者らは、嫌気条件とすることがスイッチとなって３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物の代謝経路が切り替わり、脱炭酸活性が抑制されるとともに還元活性が誘導され、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を効率よく還元することを見出した。
【００２６】
２．乳酸菌
本実施形態で用いる乳酸菌は、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を還元し得る乳酸菌であれば特に限定されない。
ここで、本明細書において「乳酸菌」とは、消費したブドウ糖に対して５０％以上の乳酸を産生する細菌を意味する。
また、「３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を還元し得る乳酸菌」であるか否かを判定する方法としては、例えば、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を含有する培地にて乳酸菌を培養し（好ましくは嫌気条件下で培養し）、還元された化合物（３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物である）が所定量以上（例えば、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物の初期濃度の５mol％以上、好ましくは１０mol％以上）生成しているか否かをＨＰＬＣ等にて検出する方法が例示される。具体的な判定方法は後述する実施例にて示す。
【００２７】
本実施形態で用いられる乳酸菌は、上記要件を満たすものであれば由来は特に限定されず、植物性乳酸菌であっても動物性乳酸菌であってもよく、また乳酸菌の性質としても、耐熱性、耐酸性、耐糖性、耐塩性、有胞子性等であってもよい。
【００２８】
乳酸菌の具体例を挙げると、ラクトバチルス科（Lactobacillaceae）、ストレプトコッカス科（Streptococcaceae）、ロイコノストック科（Leuconostocaceae）、エンテロコッカス科（Enterococcaceae）、バチルス科（Bacillaceae）に属する以下の乳酸菌が例示され、これらは１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２９】
ラクトバチルス科に属する乳酸菌としては、ラクトバチルス属（Lactobacillus）やペディオコッカス属（Pediococcus）等に属する乳酸菌が挙げられる。
ラクトバチルス属に属する乳酸菌としては、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）、ラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）、ラクトバチルス・クリスパータス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・ガリナラム（Lactobacillus gallinarum）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・デルブレッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）、ラクトバチルス・カルバータス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバチルス・ロシアエ（Lactobacillus rossiae）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・キタサトニス（Lactobacillus kitasatonis）、ラクトバチルス・ロイテリー（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis）、ラクトバチルス・ファルシミナス（Lactobacillus farciminus）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）等が例示される。
ラクトバチルス・プランタラムを用いる場合、ラクトバチルス・プランタラム ２２Ａ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４０９）、ラクトバチルス・プランタラム ２２Ａ−３（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４１１）、またはラクトバチルス・プランタラム ２２Ｂ−２（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４１０）を用いてもよい。これらの３株は、本出願人により漬物から単離・同定された株であり、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。
ペディオコッカス属に属する乳酸菌としては、例えば、ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）、ペディオコッカス ハロフィラス（Pediococcus halophilus）、ペディオコッカス・パルブルス（Pediococcus parvulus）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）等が例示される。
【００３０】
ストレプトコッカス科に属する乳酸菌としては、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）等に属する乳酸菌が挙げられる。
ストレプトコッカス属に属する乳酸菌としては、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）等が例示される。
ラクトコッカス属に属する乳酸菌としては、例えば、ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）等が例示される。
【００３１】
ロイコノストック科に属する乳酸菌としては、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ワイセラ属（Weissella）、オエノコッカス属（Oenococcus）等に属する乳酸菌が挙げられる。
ロイコノストック属に属する乳酸菌としては、例えば、ロイコノストック・ラクティス（Leuconostoc lactis）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）等が例示される。
ワイセラ属に属する乳酸菌としては、例えば、ワイセラ・シバリア（Weissella cibaria）、ワイセラ・コンフューザ（Weissella confusa）等が例示される。
オエノコッカス属に属する乳酸菌としては、オエノコッカス・オエニ（Oenococcus oeni）等が例示される。
【００３２】
エンテロコッカス科に属する乳酸菌としては、エンテロコッカス属（Enterococcus）等に属する乳酸菌が挙げられ、エンテロコッカス属に属する乳酸菌としては、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）等が例示される。
【００３３】
バチルス科に属する乳酸菌としては、バチルス属（Bacillus）等に属する乳酸菌が挙げられ、バチルス属に属する乳酸菌としては、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）等が例示される。
バチルス・コアグランスを用いる場合、バチルス・コアグランス ＮＢＲＣ１２７１４を用いてもよい。本株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターにて保存され、分譲可能株としてＮＢＲＣカタログに収載されている。
【００３４】
本実施形態で用いる乳酸菌は、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物に対し耐性を示す菌株であることが好ましい。ここで、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物には抗菌作用があるところ、特に後述する方法（１）においては、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物は誘導化合物であるとともに原料化合物でもあるため、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物への耐性を示す乳酸菌を用いると、原料化合物の濃度を高くしても乳酸菌が十分に増殖することができ、生成化合物である３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物への還元反応を十分に進行させることができる。
ここで、「３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物に対し耐性を示す乳酸菌」であるか否かを確認する方法としては、例えば、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を所定濃度（例えば、１ｍＭ以上）含有する培地にて、嫌気条件下で培養し、増殖の有無を確認する方法が挙げられる。増殖の有無は、例えば、前培養液を濁度（測定波長：６１０ｎｍ）０．０５以下となるよう植菌し、２５〜３７℃で２４時間培養後の濁度が植菌時の濁度の１０倍以上となるか否かをもって判定することができる。かかる培養において増殖することが確認される乳酸菌は、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物に対し耐性を示す乳酸菌であると判断することができる。
【００３５】
３．培養条件
本実施形態においては、誘導化合物と、上記乳酸菌とを、嫌気条件にて培養することで、脱炭酸活性が抑制されかつ還元活性が誘導されるとともに、還元活性が安定化され、原料化合物の還元が効率的に進行し、生成化合物の収率が向上する。
本実施形態における「嫌気条件」とは、例えば、反応液（または液体培地）の溶存酸素濃度が飽和状態（例えば、２８℃においては８ｍｇ／Ｌ程度）よりも低い状態であれば良い。例えば、反応液または培養液における溶存酸素濃度が６ｍｇ／Ｌ以下であってよく、５ｍｇ／Ｌ以下であってよく、３ｍｇ／Ｌ以下であってよく、１ｍｇ／Ｌ以下であってよく、０．５ｍｇ／Ｌ以下であってよく、０．２ｍｇ／Ｌ以下であってよく、０．１ｍｇ／Ｌ以下であってよく、０．０５ｍｇ／Ｌ以下であってよい。
【００３６】
かかる嫌気条件を達成するための方法は特に限定されない。例えば、空気等の酸素に接しないように液体培地を（加圧）加熱殺菌して溶存酸素を追い出した後、直ちに密栓する等によりそのまま酸素に接しない状態を維持することで、溶存酸素濃度の低い培地を調製することができる。この他、嫌気ジャー法、嫌気バッグ法、窒素置換法、スチールウール法等の気相中の酸素濃度を低下させることで培地中の溶存酸素濃度を低下させる方法；脱酸素剤や抗酸化剤等の添加剤を液体培地に添加することで溶存酸素濃度を低下させる方法など、公知の方法を採用することができる。
また、培養中も上記嫌気条件を維持するため、培養中の培地は、気相と接触させないか、酸素濃度を空気よりも低く維持した気相に接触させることが好ましい。
ここで、本実施形態で用いる乳酸菌は好気条件でも培養可能であることから、乳酸菌において従来行われていた嫌気培養では、溶存酸素が十分に低下していない培地に植菌し、乳酸菌の増殖に伴う酸素の消費により培地中の溶存酸素濃度が低下した結果、嫌気条件が実現されていた。これに対し、特に後述する方法（１）においては、乳酸菌を植菌する時点において、溶存酸素濃度が６ｍｇ／Ｌ以下である培地に植菌することで、脱炭酸活性が抑制されかつ還元活性が誘導されるため、原料化合物の収率を高めることができる。
【００３７】
乳酸菌を培養するための培地は特に制限されず、乳酸菌の生育に好適な培地を用いることができ、例えば、ＭＲＳ培地、ＧＹＰ培地など通常用いる培地から、使用する乳酸菌の生育に適した培地を適宜選択して使用することができる。また、食品素材として利用可能な植物材料等を含む培地を用いてもよく、特に後述する方法（１）においては、得られた３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を含む組成物を食品素材等としてそのまま利用することができる。
【００３８】
本実施形態において、培地のｐＨは、２〜９であることが好ましく、３〜８であることがさらに好ましく、４〜７であることが特に好ましい。培地のｐＨがかかる範囲にあることで、乳酸菌の増殖および還元活性の誘導が効率的なものとなる。また、特に後述する方法（１）においては、培養（および還元活性の誘導）とともに原料化合物の還元反応が進行するところ、ｐＨが上記範囲にあることで、原料化合物の還元反応が進行しやすくなる。
【００３９】
また、培養温度は、２０〜４０℃であることが好ましく、２３〜３７℃であることがさらに好ましく、２５〜３２℃であることが特に好ましい。培養温度がかかる範囲にあることで、乳酸菌の増殖および還元活性の誘導が効率的なものとなり、また、特に後述する方法（１）においては、原料化合物の還元反応が進行しやすくなる。
【００４０】
４．反応方法
本実施形態においては、上記培養により還元活性を誘導した乳酸菌を用い、原料化合物を還元反応に付す。ここで、原料化合物と上記乳酸菌とを反応させる具体的な方法としては、例えば、（１）乳酸菌の培養とともに原料化合物を反応させる方法、（２）集菌した乳酸菌菌体と原料化合物とを反応させる方法、（３）乳酸菌の菌体破砕物と原料化合物とを反応させる方法、などが挙げられる。
【００４１】
（１）乳酸菌の培養とともに原料化合物を反応させる方法
この方法では、上記培養において、乳酸菌の還元活性を誘導するとともに、かかる乳酸菌が３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を還元して３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物（生成化合物）を生産する。この方法では、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物は誘導化合物であるとともに原料化合物でもある。
【００４２】
方法（１）においては、上記乳酸菌を、溶存酸素濃度が６ｍｇ／Ｌ以下である培地に植菌し、当該乳酸菌を培養することが好ましい。植菌する培地において、溶存酸素濃度を６ｍｇ／Ｌ以下とすることで、原料化合物に対する脱炭酸活性が抑制されるとともに、還元活性が誘導されやすく、その結果、生成化合物が収率よく生産される。
【００４３】
一般に、微生物の嫌気培養においては、脱酸素剤や窒素置換等により酸素濃度を低下させた空間において微生物の培養を行うものの、培地の溶存酸素については、偏性嫌気性菌を除き特段の注意が払われないことが多い。特に、上記乳酸菌は好気条件でも培養可能であることから、乳酸菌において従来行われていた嫌気培養では、溶存酸素が十分に低下していない培地に植菌し、乳酸菌の増殖に伴う酸素の消費により培地中の溶存酸素濃度が低下した結果、嫌気条件が実現されていた。しかし、本実施形態においては、植菌する段階で溶存酸素濃度が高いと、原料化合物に対する脱炭酸活性が抑制される前に原料化合物が脱炭酸されてしまい、生成化合物の収率が下がるおそれがある。
これに対し、植菌する段階で溶存酸素濃度が十分に低いと、脱炭酸活性が抑制され還元活性が優先する結果、生成化合物の高い収率が実現され、特に好ましい。後述する実施例で示すとおり、植菌する培地における溶存酸素濃度を６ｍｇ／Ｌ以下とすることで、脱炭酸活性が抑制され生成化合物の高い収率が実現される。
【００４４】
また、方法（１）においては、乳酸菌が対数増殖期に移行する前に、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を培地に含有させることが好ましい。この場合において、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を含有させるタイミングは、対数増殖期に移行する前であれば特に制限されないが、培地にあらかじめ３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を含有させて、当該培地に乳酸菌を植菌することが特に好ましい。
対数増殖期の前に３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を培地に含有させることで、当該化合物に対する還元活性が誘導されやすくなり、生成化合物が収率よく生産される。
さらに、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物には抗菌作用があり、本実施形態で用いる乳酸菌は当該抗菌作用に耐性を示すことが好ましいが、かかる耐性は対数増殖期には発現しにくい傾向があることを本発明者らは見出している。対数増殖期より前に３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を含有させることで、当該化合物の抗菌作用に対する耐性を発現し、乳酸菌が効率よく増殖する結果、還元反応が十分に進行し、生成化合物が収率よく生産される。
【００４５】
方法（１）において、培地中の３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物（原料化合物）の含有量は、０．５ｍＭ以上であってよく、さらに１０ｍＭ以上であってよく、さらにまた２５ｍＭ以上であってよい。原料化合物の濃度を高くすると、生成化合物を一度の反応で大量に生産することができ、経済性の観点から好ましい。なお、上述のとおり本実施形態の原料化合物は抗菌性を示すが、原料化合物を培地に含有させるタイミングを調整することで、一定程度の耐性を発現させることが可能となる。一方、原料化合物の含有量の上限は、使用する乳酸菌の原料化合物への耐性にも依存するが、１００ｍＭ以下であってよく、さらに５０ｍＭ以下であってよく、さらにまた３０ｍＭ以下であってよい。
【００４６】
（２）集菌した乳酸菌の菌体と原料化合物とを反応させる方法
この方法は、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物（誘導化合物）を含有する培地を用い嫌気条件にて上記乳酸菌を培養した後、培養した乳酸菌を集菌する工程と、得られた乳酸菌の菌体と３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物（原料化合物）とを嫌気条件下にて反応させる工程とを備える。
【００４７】
方法（２）における培養は、還元活性に優れた菌体を得ることが目的であるため、最終的に嫌気条件となればよく、植菌する段階における培地の溶存酸素濃度は特に制限されないが、例えば方法（１）にて上述したとおり、植菌する段階で溶存酸素濃度が十分に低いと、脱炭酸活性の抑制および還元活性の優先がより安定的に実現され、好ましい場合もある。
集菌する方法は特に制限されず、遠心分離、限外濾過等、公知の方法を採用することができる。
【００４８】
方法（２）においては、集菌した菌体と原料化合物とを、嫌気条件にて反応させることが好ましい。
ここで、後述する方法（３）および実施例などで説明するとおり、原料化合物の還元反応そのものは嫌気条件である必要はないが、菌体との反応を嫌気条件で行うことで、集菌した菌体内における還元力（ＮＡＤＨ等）の消費が抑制され、その還元力が、原料化合物の還元反応に効率的に利用されるものと推測される。
【００４９】
方法（２）での反応工程において、反応液の種類は特に制限されず、培養に用いた培地の他、酵素反応に使用し得る緩衝液なども使用することができる。
反応液のｐＨは、２〜９であることが好ましく、３〜８であることがさらに好ましく、４〜７であることが特に好ましい。反応液のｐＨがかかる範囲にあることで、原料化合物の還元反応が進行しやすくなる。
また、反応温度は、１５〜４０℃であることが好ましく、１８〜３７℃であることがさらに好ましく、２０〜３２℃であることが特に好ましい。反応温度がかかる範囲にあることで、原料化合物の還元反応が進行しやすくなる。
【００５０】
（３）乳酸菌の菌体破砕物と原料化合物とを反応させる方法
この方法では、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物（誘導化合物）を含有する培地を用い嫌気条件にて上記乳酸菌を培養した後、培養した乳酸菌を集菌する工程と、得られた乳酸菌の菌体を破砕する工程と、得られた菌体破砕物と３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物（原料化合物）とを反応させる工程とを備える。
【００５１】
方法（３）における培養は、還元活性に優れた菌体破砕物を得ることが目的であるため、最終的に嫌気条件となればよく、方法（２）と同様に、植菌する段階における培地の溶存酸素濃度は特に制限されないが、植菌する段階で溶存酸素濃度が十分に低いと、脱炭酸活性の抑制および還元活性の優先がより安定的に実現され、好ましい場合もある。
また、集菌する方法は、方法（２）と同様の方法が例示される。
菌体を破砕する方法も特に制限されず、例えば、超音波破砕、物理的破砕、酵素溶解処理、薬品処理等、公知の手法を採用することができる。
【００５２】
方法（３）において、菌体破砕物と原料化合物とを反応させる工程では、反応液の種類は特に制限されず、酵素反応に使用し得る一般的な緩衝液などを使用することができる。
反応液のｐＨは、２〜７であることが好ましく、３〜６であることがさらに好ましく、４〜５．５であることが特に好ましい。
また、反応温度は、１５〜４０℃であることが好ましく、１８〜３３℃であることがさらに好ましく、２０〜２８℃であることが特に好ましい。
反応液のｐＨおよび反応温度が上記範囲にあることで、原料化合物の還元反応が進行しやすくなる。
【００５３】
方法（３）の還元反応は、好気条件でも十分に進行するため、嫌気条件で行う必要はない。
一方で、還元反応を効率的に進行させるため、ＮＡＤＨ等の還元型の補酵素を反応液に添加することが好ましい。かかる還元型補酵素の添加量は、１ｍＭ以上とすることが好ましく、５ｍＭ以上とすることがさらに好ましく、１０ｍＭ以上とすることが特に好ましい。
【００５４】
以上のようにして、生成化合物である３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物は、反応液（または培養液）中に含まれた状態で得ることができる。また、得られた３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物は、乳酸菌によるさらなる代謝を受けずに蓄積されるものと認められる。
得られた生成化合物は、反応液（または培養液）に含まれた状態で、そのまま食品素材等として利用してもよく、また分画・精製等により３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物の濃度を高めた組成物としてもよい。分画・精製する方法は特に限定されず、公知のカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、再結晶等の手段を適宜採用することができる。
【００５５】
以上述べた３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物の生産方法によれば、上記乳酸菌を、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物を含有した培地を用い、嫌気条件にて培養することで、脱炭酸活性が抑制されかつ還元活性が誘導されるとともに、還元活性が安定化され、原料化合物の還元が効率的に進行し、高い収率で３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸類縁化合物を得ることができる。
【００５６】
以上説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするために記載されたものであって、本発明を限定するために記載されたものではない。したがって、上記実施形態に開示された各要素は、本発明の技術的範囲に属する全ての設計変更や均等の方法をも含む趣旨である。
【実施例】
【００５７】
以下、試験例等を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。なお、下記試験例においては、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン酸類縁化合物（原料化合物および誘導化合物）として、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸（和光純薬工業社製）を用い、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸を生産した。
【００５８】
〔試験例１〕３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸を還元する乳酸菌
乳酸菌として、ラクトバチルス・プランタラム ２２Ａ−３（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４１１）、バチルス・コアグランス ＮＢＲＣ１２７１４、およびサクラから分離されたロイコノストック・メセンテロイデス ＫＹ００１を、ＭＲＳ液体培地に植菌し、２８℃にて１日間培養を行った（前培養）。得られた前培養液３ｍＬを、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸１ｍＭを含むＭＲＳ液体培地３００ｍＬに添加し、嫌気条件下にて２８℃・１２０ｒｐｍにて２４時間振盪培養を行った（本培養）。前培養および本培養においては、メディウム瓶一杯まで培地で満たしてオートクレーブに付し、その後すぐに密栓することにより、溶存酸素を除去したＭＲＳ液体培地を用いた。なお、試験した３株とも、本培養後の培養液の濁度が植菌時の濁度の１０倍以上になっていることを確認した。
本培養の後、培養液上清に含まれる生成化合物３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸の量を、下記条件にてＨＰＬＣにて定量した。
結果を表１に示す。
【００５９】
＝ＨＰＬＣ条件＝
製品名：ＴＯＳＯＨ  ＨＰＬＣ
固定相：ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（ＴＯＳＯＨ ＢＩＯＳＣＩＥＣＥ社製）
カラム長：φ４．６ｍｍ  ×  ２５０ｍｍ
移動相：メタノール：水：酢酸＝３５：６４：１
移動相流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
検出：２８０ｎｍ
【００６０】
【表１】
2019017381.tif 000007
【００６１】
表１に示されるとおり、ラクトバチルス・プランタラム ２２Ａ−３およびバチルス・コアグランス ＮＢＲＣ１２７１４は、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸を０．０５ｍＭ以上（原料化合物である３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸の初期濃度１ｍＭの５ｍｏｌ％以上）生成しており、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸を還元して３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸を生成することのできる乳酸菌であった。
一方、ロイコノストック・メセンテロイデス ＫＹ００１は、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸の還元活性を有するとは認められなかった。
【００６２】
〔試験例２〕好気条件および嫌気条件での３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸生産量の比較
（嫌気条件）
ラクトバチルス・プランタラム ２２Ａ−３をＭＲＳ液体培地に植菌し、２８℃にて１日間培養を行った（前培養）。得られた前培養液３ｍＬを、メディウム瓶に入れたＭＲＳ液体培地３００ｍＬに添加した。ここで、かかるＭＲＳ液体培地は、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸１ｍＭを含み、また、試験例１と同様にして溶存酸素を除去したものを用いた。植菌したＭＲＳ液体培地を、試験例１と同様の方法による嫌気条件下において、２８℃で菌体が沈降しないように密栓状態で振盪培養（１２０ｒｐｍ）し（本培養）、所定時間ごとにサンプリングし、培養液の濁度（測定波長：６１０ｎｍ）を測定するとともに、原料化合物３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸および生成化合物３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸の濃度を、試験例１と同じＨＰＬＣ条件により定量した。
【００６３】
（好気条件）
嫌気条件と同様にして得られた前培養液１．５ｍＬを、三角フラスコに入れたＭＲＳ液体培地１５０ｍＬに添加した。ここで、かかるＭＲＳ液体培地は、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸１ｍＭを含むものを用いた。植菌したＭＲＳ液体培地を、好気条件下において、２８℃で通気性のあるキャップで栓をして振盪培養し（本培養）、所定時間ごとにサンプリングし、培養液の濁度（測定波長：６１０ｎｍ）を測定するとともに、原料化合物３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸および生成化合物３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸の濃度を、試験例１と同じＨＰＬＣ条件により定量した。
結果を図１に示す。
【００６４】
図１に示されるとおり、好気条件下では、原料化合物がほぼ全て消費されているにもかかわらず、生成化合物の生成率は原料に換算してわずか３０％前後であり、原料化合物の脱炭酸により生成化合物の生成率が減少したものと認められた。これに対し、嫌気条件下では生成率が９０％以上であり、嫌気条件とすることで脱炭酸活性が抑制されるとともに還元活性が誘導され、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸の収率が劇的に改善されることが明らかとなった。
【００６５】
〔試験例３〕好気条件および嫌気条件での溶存酸素濃度の変化
（嫌気条件）
試験例２における嫌気条件と同様にして、ラクトバチルス・プランタラム ２２Ａ−３の前培養と、ＭＲＳ液体培地（メディウム瓶入り，溶存酸素除去済み）３００ｍＬを用いた本培養とを行った。所定時間ごとにサンプリングし、溶存酸素濃度を溶存酸素計（ＯＭ−７１，堀場製作所社製）にて測定するとともに、試験例２と同様にして培養液の濁度、原料化合物および生成化合物の濃度を測定した。結果を図２Ａに示す。
【００６６】
（好気条件）
試験例２における好気条件と同様にして、ラクトバチルス・プランタラム ２２Ａ−３の前培養と、ＭＲＳ液体培地（三角フラスコ入り，通気性キャップにて栓）１５０ｍＬを用いた本培養とを行った。所定時間ごとにサンプリングし、溶存酸素濃度を溶存酸素計（ＯＭ−７１，堀場製作所社製）にて測定するとともに、試験例２と同様にして培養液の濁度、原料化合物および生成化合物の濃度を測定した。結果を図２Ｂに示す。
【００６７】
図２Ａに示されるとおり、嫌気条件では、培養開始時（０時間）および終了時（７５時間）のいずれにおいても溶存酸素濃度が０mg/Lに近い値を示していたが、図２Ｂに示されるとおり好気条件では、培養初期においては空気中の酸素が溶解した結果溶存酸素濃度が高い値であり、乳酸菌の増殖に伴い酸素が消費された結果、１０時間後には溶存酸素濃度が０．５mg/Lを下回っていた。
原料化合物および生成化合物を見ると、嫌気条件（図２Ａ）では原料化合物３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸の速やかな減少およびこれに応じた生成化合物３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸の増加が認められ、９０％以上の生成率であると認められたが、好気条件（図２Ｂ）では、乳酸菌の増殖（濁度の上昇）および溶存酸素濃度の低下に続いて原料化合物の減少および生成化合物の増加が認められ、溶存酸素濃度の低下がトリガーとなって原料化合物の還元活性が発現するものと認められた。
【００６８】
〔試験例４〕植菌時の溶存酸素濃度が生成率に及ぼす影響
３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸の生成率に及ぼす溶存酸素濃度の影響をより厳密に確認するため、ジャーファーメンターを用いて植菌時の溶存酸素濃度を制御した試験を行った。
【００６９】
ラクトバチルス・プランタラム ２２Ａ−３をＭＲＳ液体培地に植菌し、３０℃にて２４時間培養を行った（前培養）。
２Ｌジャーファーメンターを用い、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸２ｍＭを含有するＭＲＳ液体培地１Ｌを１２１℃１５分間滅菌処理し、その後３０℃に低下させ、空気、窒素またはその混合気体を０．５Ｌ／分で通気することにより、空気と窒素との混合比率を変えて溶存酸素を所定濃度（０mg/L，３mg/L，４mg/L，５mg/L，６mg/L，酸素飽和）に制御した。このようにして溶存酸素濃度を制御したＭＲＳ液体培地にラクトバチルス・プランタラム ２２Ａ−３の前培養液１０ｍＬを植菌し、植菌後直ちに通気を停止して、３０℃、攪拌回転数１００ｒｐｍにて２４時間培養を行った（本培養）。
植菌前の原料化合物３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸の濃度と、２４時間本培養後の生成化合物３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸の濃度とを、試験例１と同じＨＰＬＣ条件により定量し、下記式により、それぞれの培養条件ごとに生成率を算出した。
【００７０】
生成率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：植菌前の原料化合物３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸の濃度
Ｂ：本培養後の生成化合物３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸の濃度
結果を図３に示す。
【００７１】
図３に示されるとおり、植菌時の溶存酸素濃度を６mg/L以下とすることにより、生成率が改善した。
【００７２】
〔試験例５〕集菌した菌体を用いた反応
ラクトバチルス・プランタラム ２２Ａ−３を前培養し、前培養液３０ｍＬをＭＲＳ液体培地３００ｍＬ（メディウム瓶入り，溶存酸素除去済み）に植菌した。かかるＭＲＳ液体培地は、１ｍＭの３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸（誘導化合物）を含むものと含まないものとを用意した。これらを３０℃・１２０ｒｐｍにて１５時間培養し、培養終了後に遠心分離（４℃，７０００ｒｐｍ，１０分）により集菌した。得られた菌体を、５０ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁して濁度（測定波長：６１０ｎｍ）を３０に調整した。かかる菌体懸濁液に、原料化合物としての３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸を終濃度１ｍＭとなるように添加し（反応液：６ｍＬ）、好気条件および嫌気条件のそれぞれにおいて、８の字振盪にて３０℃・３時間反応させた。反応液について１時間ごとにサンプリングし、原料化合物３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸および生成化合物３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸の量を、上記ＨＰＬＣ条件にて測定した。
結果を図４に示す。ここで、図４Ａ〜Ｄの各図はそれぞれ以下の条件で培養・反応させたものである。
図４Ａ（培養：誘導化合物無添加，反応：嫌気条件）
図４Ｂ（培養：誘導化合物無添加，反応：好気条件）
図４Ｃ（培養：誘導化合物添加，反応：嫌気条件）
図４Ｄ（培養：誘導化合物添加，反応：好気条件）
【００７３】
図４に示されるとおり、誘導化合物を添加しない培地で培養した菌体は、その後の菌体反応において、原料化合物をほとんど還元できなかった（図４ＡおよびＢ）。一方、誘導化合物を添加した培地で培養した菌体は、その後の菌体反応においても嫌気条件下で行った場合は原料化合物が効率よく生成化合物へと還元されたが（図４Ｃ）、菌体反応を好気条件で行った場合は還元反応がわずかにしか進行しなかった（図４Ｄ）。
【００７４】
〔試験例６〕菌体破砕物を用いた反応
ラクトバチルス・プランタラム ２２Ａ−３について、試験例４と同様にして、１ｍＭの３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸（誘導化合物）を含有するＭＲＳ液体培地で嫌気条件にて培養し、遠心分離により集菌し、５０ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁して、濁度３０の菌体懸濁液を得た。さらに、かかる菌体懸濁液が１０％となるように、５０ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて懸濁し、超音波破砕機（久保田商事社製，製品名「Ｍｏｄｅｌ２０１Ｍ」）にて、１８０Ｗで１５分間破砕処理を行った。得られた菌体破砕物８００μＬ（タンパク質終濃度：１０．６８ｍｇ／ｍＬ）を用い、原料化合物として終濃度１ｍＭの３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロペン酸と、ＮＡＤＨ（終濃度：１０ｍＭ）とを用い、１０００μＬの反応系（ｐＨ５に調整）にて２５℃・２４時間反応させた。
結果を図５に示す。
【００７５】
図５に示すように、粗酵素（菌体破砕物）においては、嫌気条件にせずとも原料化合物の還元が進行した。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の生産方法は、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸を効率よく生産する方法として好適であり、様々な生理活性が報告されている３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）プロパン酸の利用が促進されるものと期待され、食品分野、医薬品分野、化粧品分野等に大きく貢献できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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