(57)【要約】【課題】本発明の目的は、安価で、検体間の核酸、タンパク質、又はペプチド等の持ち込みのないエレクトロポレーション用チャンバーを提供することである。【解決手段】前記課題は、本発明の透明基板上に平行に配置された２つの電極を有するエレクトロポレーション用チャンバーであって、前記電極は非導電体又は導電体に、導電体が積層された構造であり、前記積層された導電体が電力供給端子と接触することによって、電力が供給される構造であるエレクトロポレーション用チャンバー、によって解決することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明基板上に平行に配置された２つの電極を有するエレクトロポレーション用チャンバーであって、前記電極は非導電体又は導電体に、導電体が積層された構造であり、前記積層された導電体が電力供給端子と接触することによって、電力が供給される構造であるエレクトロポレーション用チャンバー。
【請求項２】
前記積層導電体が、金、白金、ニッケル、又はカーボンであり、メッキ又は印刷により積層されている、請求項１に記載のエレクトロポレーション用チャンバー。
【請求項３】
ディスポーザブルである、請求項１又は２に記載のエレクトロポレーション用チャンバー。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のエレクトロポレーション用チャンバーに電力を供給するためのチャンバーホルダーであって、スリットを有する基板、及び電極と接触することによって電力を供給するための２つの電力供給端子を有する前記チャンバーホルダー。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のエレクトロポレーション用チャンバー、及び請求項４に記載のチャンバーホルダーを含む、エレクトロポレーション用デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エレクトロポレーション用チャンバー及びチャンバーホルダーに関する。本発明のエレクトロポレーション用チャンバーによれば、核酸、タンパク質、又はペプチド等の他の検体への持ち込みを防止できる。
【背景技術】
【０００２】
ＺＥＮ、ＴＡＬＥＮ、及びＣＲＩＳＰＲなどの部位特異的なヌクレアーゼを用いて標的遺伝子を改変するゲノム編集技術は、従来の遺伝子改変技術と比較して自在に遺伝子を改変できる。そのため、様々な遺伝子編集の研究に応用されてきている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】「進化するゲノム編集技術」真下知士、城石俊彦監修、２０１５年１０月１２日発行、株式会社エヌ・ティー・エス
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前記のゲノム編集技術を用いた受精卵への分子導入には、従来スライドグラスに電極を貼り付けたプレート電極が用いられていた。しかしながら、プレート電極は高価であり、ディスポーザブルタイプにできなかった。そのため、実験ごとに十分に洗浄を行っても、エレクトロポレーションに用いる核酸、タンパク質、又はペプチド等の持ち込みがあり、実験の精度が充分担保できなかった。
【０００５】
本発明の目的は、安価で、検体間の核酸、タンパク質、又はペプチド等の持ち込みのないエレクトロポレーション用チャンバーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、検体間の核酸、タンパク質、又はペプチド等の持ち込みのないエレクトロポレーション用チャンバーについて、鋭意研究した結果、驚くべきことに、エレクトロポレーション用チャンバーと、それに電力を供給するチャンバーホルダーを分離し、チャンバーホルダーから電力をエレクトロポレーション用チャンバーに供給する構造とすることにより、エレクトロポレーション用チャンバーを使い捨てにすることが可能になり、検体間の核酸、タンパク質、又はペプチドの持ち込みを防止できることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］透明基板上に平行に配置された２つの電極を有するエレクトロポレーション用チャンバーであって、前記電極は非導電体又は導電体に、導電体が積層された構造であり、前記積層された導電体が電力供給端子と接触することによって、電力が供給される構造であるエレクトロポレーション用チャンバー、
［２］前記積層導電体が、金、白金、ニッケル、又はカーボンであり、メッキ又は印刷により積層されている、［１］に記載のエレクトロポレーション用チャンバー、
［３］ディスポーザブルである、［１］又は［２］に記載のエレクトロポレーション用チャンバー、
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載のエレクトロポレーション用チャンバーに電力を供給するためのチャンバーホルダーであって、スリットを有する基板、及び電極と接触することによって電力を供給するための２つの電力供給端子を有する前記チャンバーホルダー、及び
［５］［１］〜［３］のいずれかに記載のエレクトロポレーション用チャンバー、及び［４］に記載のチャンバーホルダーを含む、エレクトロポレーション用デバイス、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のエレクトロポレーション用チャンバーによれば、ゲノム編集技術を用いた受精卵等への分子導入において、検体間の核酸等の持ち込みを防止できる。また、本発明のエレクトロポレーション用チャンバー及びチャンバーホルダーを用いれば、チャンバーホルダーにエレクトロポレーション用チャンバーを装着した状態で、受精卵などの細胞を顕微鏡で観察できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明のエレクトロポレーション用チャンバーの２つの実施態様を示した図である。
【図２】本発明のチャンバーホルダーの１つの実施態様を示した図である。
【図３】本発明のチャンバーホルダーの１つの実施態様を示した図である。
【図４】本発明のエレクトロポレーション用チャンバーとチャンバーホルダーとの組み合わせを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［１］エレクトロポレーション用チャンバー
本発明のエレクトロポレーション用チャンバーは、透明基板上に平行に配置された２つの電極を有するエレクトロポレーション用チャンバーである。前記電極は非導電体又は導電体に導電体が積層された構造であり、積層された導電体が電力供給端子と接触することによって、電力が供給される構造である。
【００１０】
《透明基板》
透明基板の材質は、顕微鏡によって細胞が観察できる限りにおいて、特に限定されるものではないが、ガラス、又はポリカーボ、アクリル、塩ビ若しくはポリマセタールなどの硬質透明樹脂が挙げられる。
透明基板の厚さは、特に限定されるものではないが、０．１〜５ｍｍ程度であり、好ましくは０．１〜３ｍｍであり、より好ましくは１〜２．５ｍｍである。
透明基板の形状も、チャンバーホルダーに設置できる限りにおいて、特に限定されるものではない。従って、自由な形状にすることが出来るが、チャンバーホルダーに設置しやすい形状としては長方形が挙げられる。
例えば長方形の透明基板の場合、縦の長さは、限定されるものではないが、例えば２〜１０ｃｍであり、好ましくは２．５〜８ｃｍであり、より好ましくは３〜７ｃｍであり最も好ましくは３〜６ｃｍである。横の長さも限定されるものではないが、例えば０．５〜４ｃｍであり、好ましくは０．８〜３ｃｍであり、更に好ましくは１〜１．５ｃｍである。
【００１１】
《電極》
本発明のエレクトロポレーション用チャンバーは、透明基板上に２つの電極が平行に配置されている。この２つの電極を平行電極と称することがある。また、この電極と電極との間のスリット（以下、電極スリットと称することがある）に、核酸等を含むバッファーを満たし、受精卵などの細胞を置き、エレクトロポレーションを行う。従って、２つの電極の間隔は、電極と電極とのどの位置においても等間隔であることが好ましい。そのため、それぞれの電極の対向する面は、好ましくは直線である。
【００１２】
本発明のエレクトロポレーション用チャンバーの１つの実施態様について、図１（Ａ）に従って、説明する。エレクトロポレーション用チャンバー（１）は、透明基板（２）の上に、２つの電極（３）が平行に設けられている。この２つの電極（３）の間は電極スリット（４）となっており、この電極スリットに受精卵などの細胞を置き、エレクトロポレーションを行うことができる。図１（Ｂ）に記載の実施態様は、更にチャンバーの端に、突起（５）を有するものであり、この突起を有することにより、チャンバーホルダーからのエレクトロポレーション用チャンバーの着脱を容易に行うことができる。
【００１３】
電極と電極との間隔（電極スリットの幅）は、エレクトロポレーションが実施できる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば、０．１〜４ｍｍであり、好ましくは０．６〜３ｍｍであり、より好ましくは０．７〜２ｍｍであり、最も好ましくは０．８〜１．５ｍｍである。電極スリットの長さも限定されるものではないが、０．７〜１．８ｃｍであり、好ましくは１〜１．５ｃｍである。
電極と電極との間にバッファー容量も特に限定されるものではないが、好ましくは１〜５０μＬであり、より好ましくは３〜１５μＬであり、最も好ましくは５〜１０μＬである。
【００１４】
前記電極は、非導電体又は導電体に導電体が積層された構造である。
導電体が積層される基板の非導電体（以下、基板非導電体と称することがある）としては、導電体が積層できる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば、ガラスエポキシ、コンポジット、又はテフロン（登録商標）を挙げられ、好ましくはガラスエポキシである。非導電体に導電体を積層する場合、図１に示すように、例えば非導電体に電極スリットを作製し、電極スリットの両側に導電体の積層された電極を作製することができる。なお、積層する導電体を積層導電体と称することがある。電極スリットは、エレクトロポレーション用のバッファーを蓄えるための一定の容量を有するように１つの非導電体の中央に作製することが好ましい。
電極の縦の長さは、特に限定されるものではないが、例えば０．５〜３ｃｍであり、好ましくは０．８〜１．５ｃｍである。電極の横の長さも特に限定されるものではないが、例えば０．２〜１ｃｍであり、好ましくは０．３〜０．７ｃｍである。電極の縦及び横の長さは、上部から見たそれぞれの積層導電体の縦及び横の長さを意味する。
基板非導電体の縦の長さは、特に限定されるものではないが、例えば０．８〜４ｃｍであり、好ましくは１〜２ｃｍである。基板非導電体の横の長さは特に限定されるものではないが、０．４１〜２．４ｃｍであり、より好ましくは１〜１．５ｃｍである。
また、電極の厚さは、特に限定されるものではないが、０．２〜２ｍｍであり、好ましくは０．５〜１．５ｍｍである。電極の厚さは、基板非導電体及び積層導電体の合計の厚さを電極の厚さとする。
また、導電体が積層される基板の導電体（以下、基板導電体と称しすることがある）としては、例えば金、白金、ニッケル、又はカーボンを挙げられ、好ましくは金、白金、又はカーボンである。基板導電体に積層導電体を積層する場合も、図１に示すように基板導電体の間に電極スリットを作製するが、非導電体のように、２つの積層導電体を接触させてはいけないので、１つの基板導電体の中央に電極スリットを作製することはできず、２つの基板導電体に、積層導電体を積層する。そして２つの基板導電体の間に電極スリットを作製し、２つの基板導電体が接触しない様に電極スリットの上下に非導電体などを配置して電極スリットを形成することが好ましい。
電極の縦の長さ及び横の長さは、基板非導電体に積層導電体を積層する場合と同じであり、電極の縦及び横の長さは、上部から見たそれぞれの積層導電体の縦及び横の長さを意味する。また、電極の厚さも基板非導電体に積層導電体を積層する場合と同じであり、電極の厚さは、基板導電体及び積層導電体の合計の厚さを電極の厚さとする。
一方、２つの基板導電体の縦の長さは、特に限定されるものではないが、例えば０．８〜４ｃｍであり、好ましくは１〜２ｃｍである。基板非導電体の横の長さは特に限定されるものではないが、０．２〜１．２ｃｍであり、より好ましくは０．５〜０．７５ｃｍである。
積層導電体も、限定されるものではないが、金属又はカーボンを挙げることができる。
【００１５】
非導電体又は導電体（以下、非導電体等と称することがある）における積層導電体の積層面は、エレクトロポレーションが実施できる限りにおいて、限定されるものではないが、少なくともそれぞれの電極の対向する面に積層する。電極の対向する面に積層することにより、それぞれの電極の間で通電が起こり、エレクトロポレーションを実施できる。
また、前記電極の対向する面の積層面に連続して、非導電体等の上面及び／又は下面に積層導電体を積層することが好ましい。上面又は下面の積層面をチャンバーホルダーの電力供給端子に接触させることによって、エレクトロポレーションのための電力を供給できるからである。上面及び／又は下面の積層面は、電力供給端子への接触部分を有する限りにおいて、その全面に積層してもよく、上面又は下面の一部に積層してもよい。
更に、上面又は下面の積層面に連続して非導電体等の外側面（電極の対向する面の反対側の面）を積層導電体で積層してもよい。外側面の積層面を、チャンバーホルダーの電力供給端子に接触させることによって、エレクトロポレーションのための電力を供給してもよいからである。
また、電極（非導電体等）の対向する面の積層導電体の積層面に連続して、チャンバー自体の上面、下面、又は外側面に積層導電体を積層してもよい。チャンバー自体の上面、下面、又は外側面の積層面をチャンバーホルダーの電力供給端子に接触させることによって、エレクトロポレーションのための電力を供給できるからである。
【００１６】
前記積層導電体としては、特に限定されるものではないが、金、白金、若しくはニッケルなどの金属、又はカーボンを挙げられ、好ましくは金、又は白金である。
導電体の積層の方法も特に限定されるものではないが、メッキ法又は印刷法が挙げられる。メッキ法としては、湿式メッキ法又は乾式メッキ法を挙げることができる。湿式メッキ法としては、電解メッキ法又は無電解メッキ法を挙げられ、乾式メッキ法としては、真空蒸着法、スパッタリング法、又はメタリコン法が挙げられる。電解メッキ法は、メッキする金属を含む電解溶液に、導電体を陰極として、直流電流を流すことにより、導電体の表面で、電気的に金属を還元、析出させて層を形成させる方法である。一方、無電解メッキ法は、メッキする金属を含む溶液に含まれる還元剤の酸化によって放出される電子により、導電体又は非導電体の表面上で、電気的に金属を還元、析出させて層を形成させるものである。無電解メッキ法は、メッキされる非メッキ体が、導電性を有さないものであっても、メッキすることができる。
印刷法としては、シルク印刷、スクリーン印刷、スプレー印刷、インクジェット印刷、凸版印刷、凹版印刷、又は平版印刷が挙げられる。これらの印刷法を金属又非印刷体に合わせて、選択することができる。
更に、積層の方法として、積層導電体の薄い膜を作製し、非導電体又は導電体に張り合わせることもできる。
【００１７】
積層導電体の層の厚さとしては、電極として機能する限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば０．１μｍ〜１ｍｍ、好ましくは１０μｍ〜１００μｍ、より好ましくは１０μｍ〜５０μｍである。積層された層が厚すぎる場合は、製造コストが高うなることがある。また、積層された層の厚さが薄すぎる場合は、良好な電極として機能しない可能性があるからである。
【００１８】
［２］チャンバーホルダー
本発明のチャンバーホルダーは、前記エレクトロポレーション用チャンバーに電力を供給するためのチャンバーホルダーであり、スリットを有する基板、及び電極と接触することによって電力を供給するための２つの電力供給端子を有する。
【００１９】
《基板》
本発明のチャンバーホルダーの基板の材質は、特に限定されるものではないが、ポリカーボ、アクリル、塩ビ、ＡＢＳ樹脂若しくはポリアセタールなどの樹脂が挙げられるが、好ましくは、ポリアセタール、又はＡＢＳ樹脂である。
基板の形状は、前記エレクトロポレーション用チャンバーを固定できる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば長方形、正方形、円形、又は楕円形が挙げられるが、好ましくは長方形又は正方形である。
【００２０】
基板のスリット（以下、基板スリットと称することがある）は、前記エレクトロポレーション用チャンバーをチャンバーホルダーに固定した状態で、電極と電極との間に置いた細胞を顕微鏡で観察するために設けるものである。
従って、基板スリットの位置は、エレクトロポレーション用チャンバーをチャンバーホルダーに固定した場合に、チャンバーの電極と電極との間の電極スリットが、上下方向から基板によって隠れないように設定すればよい。
基板スリットの幅も、電極スリットより広い限りにおいて、特に限定されないが、例えば０．１〜６ｍｍであり、好ましくは０．５〜４ｍｍであり、より好ましくは１〜３ｍｍである。
【００２１】
《電力供給端子》
２つの電力供給端子は、前記エレクトロポレーション用チャンバーのそれぞれの２つの電極と接触し、電力を供給する端子である。すなわち、電極の上面、下面、及び外側面、又はチャンバー自体の上面、下面、又は外側面の積層された導電体の面の１つ以上と接触できる限りにおいて、その位置、大きさ等は特に限定されるものではない。例えば、電極の上面、又はチャンバーの上面と接触する場合は、電力供給端子は、チャンバーの上部に設置すればよい。また、電極の下面、又はチャンバーの下面と接触する場合は、電力供給端子は、チャンバーの下部に設置すればよい。更に、電極の外側面、又はチャンバーの外側面に接触する場合は、電力供給端子は、チャンバーの外側部に設置すればよい。
電力供給端子の材質は、導電体である限りにおいて、特に限定されるものではないが、金属、又はカーボンが挙げられる。金属としては、銅、ステンレス、ニッケル、アルミニウム、白金、又はリン青銅が挙げられる。
【００２２】
本発明のチャンバーホルダー（１１）の１つの実施態様について、図２に従って説明する。本実施態様は、基板が比較的短いものである。基板（１２）は、その中央部分にエレクトロポレーション用チャンバーが挿入される方向にそって、基板スリット（１３）が形成されている。また、本態様においては、上部基板（１５）が、ネジによって基板（１２）に設置されている。この上部基板のスリットの両側の下部側に電力供給端子（１４）が設けられている。
図３は、本発明のチャンバーホルダー（１１）の別の実施態様であるが、基板が比較的長いタイプのものである。基板の長さを除けば、図２の実施態様のものと基本的に同じ構造であるが、基板が長いことによって、エレクトロポレーション用チャンバーを安定して保持することができる。
【００２３】
図４は、エレクトロポレーション用チャンバーとチャンバーホルダーとの組み合わせを示した図である。エレクトロポレーション用チャンバー（１）を白い矢印の方向に、チャンバーホルダー（１１）に挿入する。それによってエレクトロポレーション用チャンバーの電極と、チャンバーホルダーの電力供給端子が接触する。電源から電力を供給することによって、電極スリット中に置かれた細胞にエレクトロポレーションにより、核酸等を導入することができる。
また、電極スリットと基板スリットとが、重なる構造となっており、電極スリット中の細胞を、組み合わせたままで顕微鏡によって観察することができる。
【００２４】
［３］エレクトロポレーション用デバイス
本発明のエレクトロポレーション用デバイスは前記エレクトロポレーション用チャンバー及び前記チャンバーホルダーを含む。
本発明のエレクトロポレーション用デバイスの１つの実施態様について、図４に従って説明する。チャンバーの上面に電力供給端子との接触面を有するチャンバーを用いる場合、チャンバーホルダーのチャンバーの上面と接触する部分に、電力供給端子が設置されている。図４に示すように、チャンバーをチャンバーホルダーにセットし、電力を供給することによって、エレクトロポレーションを実施することができる。
【００２５】
《エレクトロポレーション》
エレクトロポレーション（電気穿孔法）は、前記エレクトロポレーション用チャンバーの電極と電極との間の電極スリットに導入する分子を含むバッファーを満たし、そのバッファー中に細胞を入れ、電圧を印加することによって行う。
電極スリットの電極と電極との中間部に細胞を置き、チャンバーホルダーの端子に電源を接続し、電気パルスを印加することによって、分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質）が細胞内に導入される。
【００２６】
エレクトロポレーションにおける電圧、パルス時間、パルス数及び極性の切替は特に限定されるものではなく適宜決定することができる。
電圧は、例えば１００Ｖｃｍ−１〜５０００Ｖｃｍ−１で行うことができ、好ましくは、１００〜１０００Ｖｃｍ−１であり、より好ましくは１００〜４００Ｖｃｍ−１である。
パルス時間は、例えば１０μｓｅｃ〜２０ｍｓｅｃで行うことができ、好ましくは、１００μｓｅｃ〜１０ｍｓｅｃであり、より好ましくは１ｍｓｅｃ〜５ｍｓｅｃである。
パルス数も、特に限定されるものではないが、１〜１０００回で行うことができ、好ましくは、１〜１００回であり、より好ましくは、１〜３０回である。
【００２７】
（導入分子）
本発明の分子導入法により、導入される分子は、細胞に導入できる分子であれば、限定されるものではないが、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、薬剤、ペプチド、タンパク質、又はマイクロ・ナノ微粒子を挙げることができる。薬剤としては、特に限定されるものではないが、例えば細胞染色剤、又は皮膚疾患等に対する経皮導入薬剤を挙げることができる。導入分子の分子量も、特に限定されるものではないが、例えば１００〜２０００万ｇ／ｍｏｌが好ましく、１００〜１０００万ｇ／ｍｏｌが好ましい。
エレクトロポレーション時の導入分子液の濃度は特に限定されるものではないが、例えばＤＮＡであれば、１〜５０００μｇ／ｍＬで用いることが可能であり、好ましくは１０〜２０００μｇ／ｍＬであり、より好ましくは１００〜２０００μｇ／ｍＬである。
導入分子液の量は、限定されるものではないが、１〜１００μＬである。
【００２８】
エレクトロポレーションに用いられる細胞は、特に限定されるものではないが、例えば受精卵、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、プライマリ細胞、又は株化細胞が挙げられる。
【００２９】
本発明のエレクトロポレーション用デバイスは、２細胞期胚の電気融合に用いることができる。例えば、マウス等の動物の卵管から２細胞期胚を回収する。回収した２細胞期胚をbufferで洗浄し、エレクトロポレーション用チャンバーの電極スリットに移す。この２細胞期胚に交流の電圧を付与し、次に直流の電圧を付与することにより、２細胞期胚の電気融合を行うことができる。具体的には、５Ｖで２秒の交流電圧を付与することにより、電極スリット間の２細胞期胚が電極間で整列する。そして１００Ｖで４０マイクロ秒の直流電圧を付与することにより、２細胞期胚を融合させることができる。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明のエレクトロポレーション用チャンバー及びチャンバーホルダーは、ゲノム編集技術を用いた受精卵への遺伝子導入および改変に利用することができる。
【符号の説明】
【００３１】
１・・・エレクトロポレーション用チャンバー；
２・・・透明基板；
３・・・電極；
４・・・電極スリット；
５・・・突起；
１１・・・チャンバーホルダー；
１２・・・基板；
１３・・・基板スリット；
１４・・・電力供給端子；
１５・・・上部基板；
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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