(57)【要約】【課題】肝細胞系譜細胞の製造方法、該製造方法で得られた肝細胞系譜細胞又は培養物、並びに肝細胞分化誘導培地を提供すること。【解決手段】乳酸又はその塩を従来の肝細胞分化誘導培地に添加することにより、効率的にiPS細胞から肝細胞系譜細胞へ分化誘導することを見出し、本発明を完成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を乳酸又はその塩を含む肝細胞分化誘導培地で培養することを含む、肝細胞系譜細胞（Hepatocyte lineage cells）の製造方法。
【請求項２】
前記乳酸又はその塩が乳酸カルシウム、乳酸ナトリウム、又は乳酸である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞が人工多能性幹（iPS）細胞である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記肝細胞系譜細胞が肝芽細胞である、請求項１〜３のいずれか１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記培地中の乳酸又はその塩の濃度が1μM〜100mMである、請求項１〜４のいずれか１に記載の製造方法。
【請求項６】
前記培地中の乳酸又はその塩が、5μM〜65mMの乳酸カルシウムである、請求項１〜５のいずれか１に記載の製造方法。
【請求項７】
前記培地中の乳酸又はその塩が、300μM〜30mMの乳酸カルシウムである、請求項１〜５のいずれか１に記載の製造方法。
【請求項８】
前記培地中の乳酸又はその塩が、5μM〜2mMの乳酸カルシウムである、請求項１〜５のいずれか１に記載の製造方法。
【請求項９】
前記培地中の乳酸又はその塩が、300μM〜2mMの乳酸カルシウムである、請求項１〜５のいずれか１に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記培地中の乳酸又はその塩が、1μM〜50mMの乳酸ナトリウムである、請求項１〜５のいずれか１に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記培地中の乳酸又はその塩が、1μM〜100mMの乳酸である、請求項１〜５のいずれか１に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記培地中にピルビン酸又はその塩を含む、請求項１〜１１のいずれか１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記培地中のピルビン酸濃度は1μM〜20mMである、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法により製造された肝細胞系譜細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法により製造された細胞培養物。
【請求項１６】
乳酸又はその塩が下記の表１に記載の組成を含む培地に1μM〜100mM乳酸濃度になるように含まれている肝細胞分化誘導培地。
【表１】
2019080551.tif 000009
【請求項１７】
乳酸又はその塩が下記の表２に記載の組成を含む培地に1μM〜100mM乳酸濃度になるように含まれている肝細胞分化誘導培地。
【表２】
2019080551.tif 000010
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞系譜細胞（Hepatocytelineage cells）の製造方法、該製造方法で得られた肝細胞系譜細胞又は培養物、並びに肝細胞分化誘導培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトiPS細胞から肝臓を得る方法が報告されている（非特許文献1）。この方法はin vitroで肝細胞への分化を促進し、血管内皮細胞、間葉系幹細胞と混合しマウスに移植して肝臓を作製するものである。非特許文献1では、非特許文献2に記載の方法に従って肝細胞への分化を誘導する。なお、非特許文献2の方法は、数週間を要し、成熟した肝細胞は得られない（非特許文献2）。
【０００３】
本発明者は、ヒトiPS細胞とヒト初代培養肝細胞との共培養より、ヒトiPS細胞が死滅しヒト初代培養肝細胞のみを回収する方法を開発している（非特許文献3）。
【０００４】
iPS細胞が長期間生存する条件の検討を行った結果、アポトーシス阻害剤等の低分子化合物、oncostatin M（オンコスタチンM）を添加すると7日まで少数ながら細胞が生存することが判明している（非特許文献4）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】タケベ（Takebe T）ら、「Vascularized and functional human liver from a iPSC-derived organ bud transplantation」、ネイチャー（Nature）、2013年、第499巻、p.481-489。
【非特許文献２】シ−タイエブ（Si-Tayeb K）ら、「Highly efficient generation of human hepaotcyte-like cells from induced pluripotent stem cells」、ヘパトロジー（Hepatology）、2010年、第51巻、p.297-305。
【非特許文献３】トミザワ（Tomizawa M）ら、「Survival of primary human hepatocytes and death of induced pluripotent stem cells in media lacking glucose and arginine」、プロス  ワン（PLoS One）、2013年、第8巻、e71897。
【非特許文献４】トミザワ（Tomizawa M）ら、「 An optimal mediumsupplementation regimen for initiation of hepatocyte differentiation in humaninduced pluripotent stem cells」、ジャーナル  オブ  セルラー  バイオケミストリー（Journal of cellular biochemistry）、2015年、第116巻、第8号、p.1479-1489。
【非特許文献５】カキヌマ（Kakinuma S）ら、「Analyses of cell surface molecules onhepatic stem/progenitor cells in mouse fetal liver」、ジャーナル  オブ  ヘパトロジー（Journal of Hepatology）、2009年、第51巻、第1号、p.127-138。
【非特許文献６】サンガン（Sangan C B）ら、「Hepatic progenitor cells」、セル   アンド  ティッシュー  リサーチ（Cell and TissueResearch）、2010年、第342巻、第2号、p.131-137。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、肝細胞系譜細胞の製造方法、該製造方法で得られた肝細胞系譜細胞又は培養物、並びに肝細胞分化誘導培地を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題を解決すべく、多能性幹細胞であるiPS細胞の肝細胞への分化を開始するための要因（特に、不足した栄養源）を鋭意検討した。その結果、乳酸又はその塩を従来の肝細胞分化誘導培地に添加することにより、効率的にiPS細胞から肝細胞系譜細胞へ分化誘導することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下を含む。
【０００８】
１．多能性幹細胞を乳酸又はその塩を含む肝細胞分化誘導培地で培養することを含む、肝細胞系譜細胞（Hepatocyte lineage cells）の製造方法。
２．前記乳酸又はその塩が乳酸カルシウム、乳酸ナトリウム、又は乳酸である、前項１に記載の製造方法。
３．前記多能性幹細胞が人工多能性幹（iPS）細胞である、前項１又は２に記載の製造方法。
４．前記肝細胞系譜細胞が肝芽細胞である、前項１〜３のいずれか１に記載の製造方法。
５．前記培地中の乳酸又はその塩の濃度が1μM〜100mMである、前項１〜４のいずれか１に記載の製造方法。
６．前記培地中の乳酸又はその塩が、5μM〜65mMの乳酸カルシウムである、前項１〜５のいずれか１に記載の製造方法。
７．前記培地中の乳酸又はその塩が、300μM〜30mMの乳酸カルシウムである、前項１〜５のいずれか１に記載の製造方法。
８．前記培地中の乳酸又はその塩が、5μM〜2mMの乳酸カルシウムである、前項１〜５のいずれか１に記載の製造方法。
９．前記培地中の乳酸又はその塩が、300μM〜2mMの乳酸カルシウムである、前項１〜５のいずれか１に記載の製造方法。
１０．前記培地中の乳酸又はその塩が、1μM〜50mMの乳酸ナトリウムである、前項１〜５のいずれか１に記載の製造方法。
１１．前記培地中の乳酸又はその塩が、1μM〜100mMの乳酸である、前項１〜５のいずれか１に記載の製造方法。
１２．前記培地中にピルビン酸又はその塩を含む、前項１〜１１のいずれか１に記載の製造方法。
１３．前記培地中のピルビン酸濃度は1μM〜20mMである、前項１２に記載の製造方法。
１４．前項１〜１３のいずれか１項に記載の方法により製造された肝細胞系譜細胞。
１５．前項１〜１３のいずれか１項に記載の方法により製造された細胞培養物。
１６．乳酸又はその塩が下記の表１に記載の組成を含む培地に1μM〜100mM乳酸濃度になるように含まれている肝細胞分化誘導培地。
【表１】
2019080551.tif 000002
１７．乳酸又はその塩が下記の表２に記載の組成を含む培地に1μM〜100mM乳酸濃度になるように含まれている肝細胞分化誘導培地。
【表２】
2019080551.tif 000003
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、多能性幹細胞、例えばiPS細胞から肝細胞系譜細胞を効率的に製造する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１のヒューマン・メタボローム解析のうち、代表的な代謝産物の定量結果の培地別の平均値を代謝経路中に示した。図1中、棒グラフの左側のバーは対照（ReproFF）の結果、右側のバーはHDIの結果を示す。
【図２】実施例２の乳酸添加したHSMでの培養における細胞増殖率（％）を示す。未分化維持培地であるReproFFを100%とした。図中のFFはReproFF、Aは乳酸カルシウム添加したHSM、Bは乳酸ナトリウム添加したHSM、Cは乳酸添加したHSMの結果を示す。
【図３】実施例３の光学顕微鏡観察結果を示す（Originalmagnification: ×200, scale bar: 50 mm.）。Aは乳酸ナトリウム3 mMの結果（矢印は沈殿を示す）、Bは乳酸カルシウム1 mMの結果(矢尻は生存細胞を示す)を示す。
【図４】実施例４のAFPおよびアルブミンの発現の結果を示す。AはAFPの結果、Bはアルブミンの結果を示す。
【図５】実施例5の光学顕微鏡観察結果を示す（Originalmagnification: ×400, scale bar: 25 μm.）。Aは乳酸カルシウムで培養した細胞、Bは乳酸ナトリウムで培養した細胞、Cは乳酸で培養した細胞を示す。A〜Cにおける矢尻は生存細胞を示す。
【図６】実施例６の免疫染色の結果を示す（Original magnification: ×400, scale bar: 50mm.）。Aは乳酸を添加したHSMで7日培養した結果、BはReproFFで7日培養し、抗AFP抗体を添加しない陰性コントロールの結果を示す。
【図７】実施例７のピルビン酸添加したHSMでの培養の結果を示す。図中のFFはReproFF、Pはピルビン酸添加したHSM培地を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、肝細胞系譜細胞の製造方法、該製造方法で得られた肝細胞系譜細胞又は培養物、並びに肝細胞分化誘導培地に関する。以下で詳細に説明する。
【００１２】
（多能性幹細胞）
本発明では、任意の好適な多能性幹細胞を使用できる。多能性幹細胞とは、所定の培養条件下において長期に自己複製能を有し、所定の分化誘導条件下において多種の細胞への多分化能を有する幹細胞をいう。多能性幹細胞は、自分自身を複製する自己複製能と多分化能を共に有する細胞である限りにおいて、いずれの細胞も使用できる。具体的には、iPS細胞やES細胞を例示でき、好ましくは人工多能性幹細胞が推奨される。
多能性幹細胞は、脊椎動物細胞由来であり得る。多能性幹細胞は、哺乳動物細胞、例えば、げっ歯類細胞、マウス細胞、霊長類細胞、又はヒト細胞由来であり得る。
【００１３】
（人工多能性幹細胞）
人工多能性幹細胞（iPS細胞）は、ヒト線維芽細胞などの体細胞から遺伝子組換え技術により誘導される多能性幹細胞である。iPS細胞は、哺乳動物、例えばヒトやマウスの体細胞から製造されたものであれば、いずれの種に由来するものであってもよいが、移植などの再生医療に使用する場合は、再生医療の対象となる種由来の体細胞から製造されたものが好ましく、該対象個体から採取された体細胞から製造されたものがより好ましい。
iPS細胞は通常用いられる方法のいずれの方法で調製してもよい。また、iPS細胞は、未分化の状態のまま維持培養する公知の方法を用いて継代培養することができる。
例えば、多能性幹細胞は、iPS細胞、iPS細胞である201B7細胞等を例示できる。
【００１４】
（肝細胞系譜細胞）
本発明の肝細胞系譜細胞とは、多能性幹細胞から肝細胞への分化が決定づけられた細胞から未熟肝細胞を経て成熟肝細胞に分化する過程の全ての段階の細胞を意味する。分化は部分的又は完全なものであり得る。例えば、肝細胞、肝前駆細胞（hepatic progenitor cell）、成熟肝細胞、肝芽細胞等を例示することができる。
肝細胞系譜細胞は、好ましくは肝細胞に特有の細胞表面マーカーの少なくとも１つを発現するものであり得る。肝細胞系譜細胞は、より好ましくはα−フェトプロテイン（AFP）、アルブミン、又はその両方を発現するものであり得る。また、不死の細胞であり得る。また、中間細胞とは、多能性幹細胞から成熟肝細胞への分化途上にある細胞を意味する。
【００１５】
（肝細胞）
肝細胞は、肝前駆細胞や成熟肝細胞など、肝細胞への分化が決定された全ての分化段階の細胞を含む意味として使用される。
肝前駆細胞は、胎生期にみられる活発に増殖し、肝細胞と胆管上皮に分化する能力を有する細胞とする報告（非特許文献５）と、肝臓が再生する過程で生じる小型で円形の細胞（oval cell）とする報告（非特許文献６）があり、増殖能および肝細胞と胆管上皮細胞に分化する能力を有する。肝前駆細胞は成熟した肝細胞よりも増殖能が高く、胆管上皮も形成するので肝臓に移植した場合、速やかに既存の肝構築を形成し、肝細胞のみを移植するよりも効果的に失われた肝臓を再現することが期待できる。
成熟肝細胞は、成熟肝実質細胞ともいい、多種多様な肝特異的機能、例えばコレステロール合成能、アミノ酸輸送活性、グルコース-6-ホスファターゼ（glucose-6-phosphatase）活性などの機能を発現する最終分化細胞であるが、一方、肝再生現象でよく知られるように活発な増殖能力を有する。
【００１６】
（肝芽細胞）
肝芽細胞（hepatoblast）は、前腸内胚葉由来の組織幹細胞であり、肝組織発生に必須の細胞である。肝芽細胞は、胎児肝における組織幹細胞として位置づけられており、成熟肝における存在は極めて少ない。成熟肝に存在する肝芽細胞は、肝傷害に伴い活性化され、肝修復に重要な役割を果たすと考えられる。肝芽細胞の肝細胞への分化には、多くの転写因子や非実質細胞が産生する種々の細胞外基質、たとえば肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor、HGF）やトランスフォーミング増殖因子β（Transforming growth factor β、TGFβ）などの関与が報告されている。肝芽細胞はin vitroで培養が可能であり、適当な培養条件下で培養することにより肝実質細胞や胆管上皮細胞に分化することができる。
肝芽細胞は、α−フェトプロテイン（AFP）、アルブミン、又はその両方を発現するものであり得る。
【００１７】
（肝細胞分化誘導培地）
本発明の肝細胞分化誘導培地は、培地中に乳酸が含まれており、かつ多能性幹細胞を肝細胞系譜細胞へ分化することができれば特に限定されず、自体公知の肝細胞分化誘導培地に、乳酸又はその塩を添加することにより製造可能である。
例えば、以下を例示することができる。
本発明の肝細胞分化誘導培地は、HSM（hepatocyte selection medium）（非特許文献３）や、HDI（hepatocyte differentiation inducer）（非特許文献４）に乳酸又はその塩を添加して製造できる。
HDIは、肝細胞分化誘導物質（hepatocyte differentiation inducer）であり、HSMにオンコスタチンM、肝細胞機能性増殖誘導物質1（hepatocyte functional proliferation inducer 1；FPH1）、M50054、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ニコチンアミド、およびL-グルタミンを添加して作製された培養培地である。なお、HSMにはL-グルタミンが含まれるが、L-グルタミンは速やかに分解されてしまうため、HDI調製時にL-グルタミンを添加する。
【００１８】
HSMとして、具体的には、下記表３に示す組成で示される培地を例示できる。
【００１９】
【表３】
2019080551.tif 000004
【００２０】
HDIは、血清又は血清代替物質、好ましくは血清代替物質を添加して使用することが好ましい。血清は、多能性幹細胞、肝芽細胞、および肝細胞の培養に一般的に使用されているものであればいずれも使用できる。血清を使用する場合、培養する細胞の種と同種の生物由来の血清を使用することが好ましい。例えば、培養する細胞がヒト細胞である場合、ヒト由来の血清を使用することが好ましい。血清代替物質は、血清の代わりに細胞の維持や生育に使用される物質であり、化学的組成が明らかな組成物を意味する。血清代替物質は、多能性幹細胞、肝芽細胞、および肝細胞の培養に一般的に使用されているものであればいずれも使用でき、例えばノックアウト商標セラムリプレースメント（Life Technologies社製）、CDM-HD血清代替物（FiberCell Systems社製）、StemSure血清代替品（和光純薬工業株式会社製）、Nu-Serum商標（Becton Dickinson社製）を例示できる。血清又は血清代替物質の用量は簡単な繰り返し実験によって決定することができる。
【００２１】
HDIとして、具体的には、下記表４に示す組成で示される培地を例示できる。HDIは、表３に示す組成にインスリン、デキサメタゾン、およびアプロチニンを添加した組成からなる培地であってもよい。培地へのインスリン、デキサメタゾン、およびアプロチニン添加の有無は、iPS細胞からの肝芽細胞の分化誘導効果にはほとんど影響しない。インスリンは、最終濃度が10−8 M〜10−10 M、好ましくは10−9 M〜10−10 M、より好ましくは10−9 Mとなるように添加すればよい。デキサメタゾンの添加濃度は、最終濃度が10−8 M〜10−10 M、好ましくは10−9 M〜10−10 M、より好ましくは10−9 Mとなるように添加すればよい。アプロチニンは、最終濃度が10 U/ml〜300 U/ml、好ましくは30 U/ml〜200 U/ml、より好ましくは50 U/ml〜100 U/ml、さらに好ましくは50 U/mlとなるように添加すればよい。インスリン、デキサメタゾン、およびアプロチニンの添加量はこれら例示した濃度に限定されず、人工多能性幹細胞から肝芽細胞を分化誘導することができる限りにおいていずれの濃度であってもよく、簡単な繰り返し実験により容易に決定できる。
【００２２】
【表４】
2019080551.tif 000005
【００２３】
表４に示す組成で示される培地において、MEMビタミン溶液を構成する成分の濃度は、最終濃度として、塩化ナトリウム0.085 g、塩化コリン0.001 g、葉酸0.001 g、myo-イノシトール0.001 g、ナイアシンアミド0.001 g、D-パントテン酸1/2 Ca 0.001 g、ピリドキサールHCl 0.001 g、リボフラビン0.0001 g、およびチアミンHCl 0.001 gである。
【００２４】
また、本発明に係る方法は、HSMおよびHDI以外の培養培地で多能性幹細胞を前培養し、その後、培養培地をHSMおよび／又はHDIに変更して、さらに少なくとも2日以上、好ましくは2日〜7日、さらに好ましくは2日〜4日、より好ましくは2日培養する方法であり得る。前培養に使用する培養培地として、リーボビッツ-15ｂ培地（Leibovitz's-15 medium）、ウィリアムE培地（William's Emedium）、およびダルベッコ改変イーグル培地／ハムF-12混合培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12）を例示でき、リーボビッツ-15（Leibovitz's-15）をより好ましく例示できる。
これら培養培地は、血清又は血清代替物質、好ましくは血清代替物質を添加して使用することが好ましい。また、これら培養培地には、所望の細胞の生育に効果のある化合物や試薬、例えばプロリンやニコチンアミドを、その有効量を添加して使用することができる。前培養の期間は、少なくとも2日以上であることが好ましく、7日であることがより好ましい。前培養の培養条件は、通常の培養条件、好ましくは多能性幹細胞の培養や、多能性幹細胞から肝芽細胞や肝細胞を分化誘導する培養で使用されている公知の条件をいずれも使用することができる。具体的には、95% 空気、5% CO2の雰囲気下にて、35〜40℃、好ましくは37℃で行う培養条件を例示できる。HSMおよびHDI以外の培養培地で多能性幹細胞を前培養した後にHSMおよび／又はHDIで培養することにより、前培養をしない場合と比較して、細胞の生存率が増加し、その結果、得られる肝芽細胞数が増加する場合がある。
【００２５】
（乳酸又はその塩）
本発明に使用できる乳酸又はその塩は、特に限定されないが、例えば乳酸カルシウム、乳酸ナトリウム、乳酸、乳酸カリウム等が挙げられる。
本発明の肝細胞分化誘導培地における乳酸又はその塩の含有濃度は、多能性幹細胞を肝細胞系譜細胞へ分化できれば、特に限定されないが、1 μM〜1000 mMであってもよく、3 μＭ〜50 mMが好ましく、10 μＭ〜30 mMがより好ましく、100 μＭ〜1 mMがさらに好ましい。
より詳しくは、実施例の結果を考慮して、乳酸カルシウム添加した場合には、5μM〜65mMの範囲、好ましくは10μM〜30mMの範囲、より好ましくは300μM〜30mMの範囲である。乳酸ナトリウム添加した場合には、1μM〜50mMの範囲、好ましくは3μM〜30mMの範囲である。乳酸添加した場合には、1μM〜100mMの範囲、好ましくは3μM〜100mMの範囲である。
加えて、沈殿防止の抑制を考慮すれば、肝細胞分化誘導培地における乳酸又はその塩の含有濃度は2mM以下、特に1mM以下の範囲が好ましい。すなわち、乳酸カルシウム添加した場合には、5μM〜2mM（又は、5μM〜1mM）の範囲、好ましくは10μM〜2mM（又は、10μM〜1mM）の範囲、より好ましくは300μM〜2mM（又は、300μM〜1mM）の範囲である。乳酸ナトリウム添加した場合には、1μM〜2mM（又は、1μM〜1mM）の範囲、好ましくは3μM〜2mM（又は、3μM〜1mM）の範囲である。乳酸添加した場合には、1μM〜2mM（又は、1μM〜1mM）の範囲、好ましくは3μM〜2mM（又は、3μM〜1mM）の範囲である。
さらに、実施例５及び実施例６の結果を考慮すると、本発明の肝細胞分化誘導培地における乳酸又はその塩は乳酸カルシウムが好ましい。
以上を考慮すると、最も好ましい条件は、300μM〜2mM又は300μM〜1mMの範囲の乳酸カルシウムを肝細胞分化誘導培地に含有することである。
【００２６】
（ピルビン酸又はその塩）
本発明に使用できるピルビン酸又はその塩は、特に限定されないが、例えばピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸等が挙げられ、ピルビン酸ナトリウムが特に好ましい。
本発明の肝細胞分化誘導培地におけるピルビン酸又はその塩の含有濃度は、特に限定されないが、1 μM〜20 mMであってもよく、3 μM〜10 mMが好ましい。
【００２７】
（培養）
本発明の培養条件は、多能性幹細胞を肝細胞系譜細胞へ分化することができれば特に限定されず、任意の適当な時間行うことができる。例えば、該細胞の培養は、少なくとも５分間、少なくとも１５分間、少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも５時間、少なくとも１２時間、少なくとも１日間、少なくとも３日間、少なくとも７日間（１週間）、少なくとも８日間、少なくとも１０日間、少なくとも１２日間、少なくとも１５日間、少なくとも２０日間、少なくとも２８日間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも６週間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１年間、５分間以下、１年以上、又は任意の合間の期間、行うことができる。該細胞の培養は、例えば、およそ４日間から１２日間まで行うことができる。該細胞の培養は、例えば、少なくとも７日間又は７日間以上行うことができるが、好ましくは少なくとも３日以上、より好ましくは３日間〜１２日間、さらに好ましくは３日間〜７日間、特に好ましくは７日間行う。
培養期間とは、該細胞を培養する期間の合計あるいは、その一部分又は一時期を意味し得る。例えば、該期間は、肝細胞分化誘導培地内で、分化が完了する前の期間、又は分化後の期間、細胞を培養することを意味し得る。該細胞は、肝細胞系譜細胞に特有のマーカーの少なくとも１つの発現が、認識される閾値を超えるまで培養できる。該マーカーは、未熟肝細胞、成熟肝細胞、および両方に関連するものであり得る。該細胞は、元の細胞のマーカーの発現が、認識される閾値を下回るまで培養できる。該細胞は、肝細胞系譜細胞および／又は肝細胞の形態を有するまで培養できる。
【００２８】
本発明の培養において、インビボ、インビトロ、又はそれら両方で実施され得る。培養環境は、液体培地、固形支持体、又はそれら両方を含み得る。例えば、培養環境が、肝組織、肝臓の一部分、又は完全な肝臓の形成に貢献し得る。分化した細胞は、哺乳動物レシピエント、例えばマウスなどのげっ歯動物やヒトなどの霊長目動物に移植され得る。
【００２９】
（本発明の方法により得られる肝細胞系譜細胞）
本発明の方法により取得された肝細胞系譜細胞は、不死の細胞であり得るし、又は、限られた数の複製サイクルを有するものであり得る。本肝細胞系譜細胞は、液体、固体、又は液体／個体の支持体内での細胞培養における細胞という形態のものであり得る。本肝細胞系譜細胞は、生物への移植に好適な組織又は器官、例えば肝臓、という形態のものであり得る。本肝細胞系譜細胞は、より好ましくはα−フェトプロテイン、アルブミン、又はその両方を発現するものであり得る。
【００３０】
（本発明の方法により得られる細胞培養物）
本発明の方法により得られる細胞培養物は、肝細胞系譜細胞、特に肝芽細胞を含む細胞培養物である。「細胞培養物」とは、細胞を培養した後に得られる細胞群をいう。本細胞培養物には、未分化能を有する細胞は実質的に含有されていない。「実質的に含有されていない」とは、肝芽細胞と未分化能を有する細胞との比（肝芽細胞：未分化能を有する細胞）が1,000：1以下、好ましくは10,000：1以下、さらに好ましくは100,000：1以下であることをいう。また、本細胞培養物には、肝芽細胞の他、肝芽細胞からさらに分化した細胞が含まれていることがある。
さらに、本発明の方法により得られる細胞培養物は、例えば、劇症肝炎、部分肝切除術後、又は肝硬変の自然経過中に生じる肝不全などの肝疾患の移植治療を含む再生医療に医薬として用いることができる。本細胞培養物を有効成分として含有する医薬は、薬理学的に許容される生理食塩水、添加剤、又は、培地などを含んでもよいが、異種血清やウィルスなどの不純物の混入のないものが好ましい。
本発明の方法により得られる細胞培養物は、invitroで適当な培養条件下で培養することにより、肝実質細胞や胆管上皮細胞に分化させることができる。例えば、肝芽細胞の肝細胞への分化には、多くの転写因子や、非実質細胞が産生するHGFおよびTGFβなどの種々の細胞外基質の関与が報告されており、これら物質を利用して肝芽細胞から肝細胞への分化誘導をin vitroで実施できる。
【００３１】
（多能性幹細胞からの肝細胞系譜細胞の製造用試薬および試薬キット）
本発明は、多能性幹細胞からの肝細胞系譜細胞の製造用試薬および試薬キットに関する。該試薬および試薬キットには、少なくとも、乳酸又はその塩、必要に応じて、ピルビン酸又はその塩を含む。
また、本発明の試薬及び試薬キットは、乳酸又はその塩が自体公知の肝細胞分化誘導培地に3μM〜100mM乳酸濃度になるように含まれている培地、乳酸又はその塩が表３に記載の組成を含む培地に3μM〜100mM乳酸濃度になるように含まれている培地、又は、乳酸又はその塩が表４に記載の組成を含む培地に3μM〜100mM乳酸濃度になるように含まれている培地を例示することができる。
【００３２】
（分化誘導の確認方法）
本発明により、多能性幹細胞から肝細胞系譜細胞に分化誘導されたことは、肝芽細胞や肝細胞の公知マーカーの発現を検出することにより確認することができる。このようなマーカーとして、肝芽細胞のマーカーであるAFPやDLK-1、および肝細胞に特徴的に発現している酵素、たとえば薬物代謝に関連するCYP3A4やアルコール代謝に関連するALDH2を例示できる。また、肝細胞のマーカーとしてアルブミンを例示できる。
肝芽細胞や肝細胞のマーカーの検出は、細胞内の対象タンパク質のmRNAを逆転写後、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）、又はリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応などの公知の遺伝子工学的手法によって測定するか、さらに、被検タンパク質に対する抗体を用いる酵素免疫測定法（ELISA法）や免疫染色法によっても確認できるが、これら方法に限定されず、公知の方法をいずれも使用することができる。
【００３３】
本発明に係る方法により得られた培養細胞では、多能性幹細胞や初期胚に特異的に発現しているNanogの発現がほぼ消失しており、このことから該細胞は未分化能を失っていると考えることができる。従って、かかる培養細胞は、肝疾患治療のための移植に使用した場合に腫瘍を形成する可能性は極めて低いと考えられる。
【実施例】
【００３４】
以下に具体例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。
【実施例１】
【００３５】
（ヒューマン・メタボローム解析）
iPS細胞を以前本発明者らが開発した肝細胞分化誘導培地であるHDI培地での培養後に生じる細胞内での代謝の変化を解析するため、メタボローム解析を行った。
【００３６】
（材料と方法）
１．細胞および培地等の準備
iPS細胞として201B7細胞（理化学研究所バイオリソースセンター（BRC）より入手）を使用した。
HSM（hepatocyte selection medium）は、下記表５の組成で調製した。HDI（hepatocyte differentiation inducer）は、下記表６の組成で調製した。
ReproFF（未分化維持培地）は、株式会社リプロセルより入手した。
細胞洗浄液は、マンニトール3gをミリQ水に添加して総量60mlとした。
内部標準液は、内部標準液原液40mL(ヒューマンメタボロームより提供)をミリQ水に添加して50mL。
２．培養
マトリゲルコーティングした10 cm培養皿にて、培養皿3枚は一枚あたり3 mlのHDI、培養皿1枚は10 mlのReproFFを使用して、201B7細胞を48時間培養し、100%コンフルエントの状態（ReproFFでは10 cm培養皿一枚あたり1.0×107個、HDIでは10cm培養皿一枚あたり2.1×106個）にした。
３．メタボローム解析用サンプル調製
48時間培養後、細胞培養液を吸引除去し、細胞洗浄液10 mlで培養皿表面を洗浄した。細胞洗浄液を除去した後、再度細胞洗浄液2 mlで洗浄した。
前記細胞洗浄液を完全に吸引後、メタノール800 μLを培養皿に添加し、メタノールが培養皿表面全体を覆うように振盪を繰り返した。
前記振盪終了後、培養皿を30秒放置してから、内部標準液550 μLを添加し、混合液が表面全体を覆うように振盪を繰り返した。
前記振盪終了後、培養皿を30秒放置してから、混合液1000 μLを1.5mLエッペンドルフチューブに移し、次の操作まで氷上に放置した。
抽出液（２層分離した水層）を回収し、遠心分離（2300×g、4℃、5分間）した。
上澄みを350 μLずつ2本の限界濾過ユニット(ヒューマンメタボロームテクノロジーズ株式会社より提供)のフィルターカップに移す。
フィルターカップの液がなくなるまで限界濾過ユニットを遠心分離(9100×g、4℃、2.5時間)した。
遠心分離後のサンプルについて、ヒューマンメタボロームテクノロジーズ株式会社に発送するまでフィルターカップを外し、蓋をきつく閉めた後に−80℃以下で保管した。
４．メタボローム解析
上記の通り、iPS細胞をHDI培地又は未分化維持培地であるReproFFで培養し調製したサンプルについて、メタボローム解析により細胞内代謝の変化を比較した。メタボローム解析は、ヒューマンメタボロームテクノロジーズ株式会社に委託して行った。
【００３７】
【表５】
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【００３８】
【表６】
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【００３９】
（結果）
定量の結果を表７に示す。表７中、「3846FF-1」〜「3846FF-3」はReproFFで培養した細胞の結果、「3846HDI-1」〜「3846HDI-3」はHDIで培養した細胞の結果を示す。
図１は、代表的な代謝産物の定量結果の培地別の平均値を代謝経路中に示した。図１の代謝経路は、解糖系−ピルビン酸−クエン酸回路、乳酸の部分を抜粋したものである。
表７及び図１から明らかなように、乳酸はHDIで培養した群は、対照(ReproFF)に比して1/40に低下した。
図１から明らかなように、ピルビン酸に関し、HDIで培養した群は、対照(ReproFF)と比較して、低下した。
本発明者は、HDIではブドウ糖がないのでガラクトースを解糖系を介してエネルギーを産生すると想定していた。なお、ガラクトースはガラクトース-1-リン酸に変換して解糖系に入る。
本実験例の結果より、HDIで培養するとガラクトース-1-リン酸は1000倍に増量することが判明した。よって、ガラクトースは予想通りガラクトース-1-リン酸に変換され解糖系を介してエネルギー産生に利用されることが証明された。
また、メタボローム解析では乳酸が1/40に低下していることが判明した。乳酸は解糖系の最終産物である。したがって、ガラクトースが解糖系で利用されているものの細胞生存のエネルギーには不十分であると考えた。すなわち、多能性幹細胞をHDIで培養した場合に乳酸の産生が不足すると考えらえる。
【００４０】
【表７】
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【実施例２】
【００４１】
（乳酸添加したHSMでの培養）
実施例1の結果より、多能性幹細胞をHDIで培養した場合に乳酸の産生が不足することを確認した。HDIはHSMに薬品等を添加したものである。HDIにて添加した薬剤の影響を除くため、iPS細胞を乳酸添加したHSMで培養して、肝細胞の誘導効率を検討した。
【００４２】
（材料と方法）
１．細胞および培地等の調製
iPS細胞は、実施例１と同様に201B7細胞を使用した。
HSM培地は、実施例1と同様に調製した。
乳酸源として、乳酸カルシウム（和光純薬工業株式会社製）、乳酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）、乳酸(小堺製薬株式会社製)を使用した。
２．培養
マトリゲルコーティングした96孔プレートに5×104個の201B7細胞を播いた。翌日HSMに乳酸カルシウム、乳酸ナトリウム、乳酸をそれぞれ3 μM、10 μM、30 μM、100 μM、300 μM、1 mM、3 mM、10 mM、30 mM又は100 mM添加して3日間培養した。対照の細胞は、ReproFF又はHSMで培養した。
３．MTSアッセイ
培養開始3日後、MTSアッセイ(CellTiter 96（日本登録商標） AQueous One Solution、Promega社製)を行い、細胞増殖を検討した。
【００４３】
（結果）
図２に細胞増殖の結果を示す。
乳酸カルシウム添加したHSMでは、HSMのみと比較した場合には、10μM〜30mMの範囲で細胞増殖効果を確認した。
乳酸ナトリウム添加したHSMでは、HSMのみと比較した場合には、3μM〜30mMの範囲で細胞増殖効果を確認した。
乳酸添加したHSMでは、HSMのみと比較した場合には、3μM〜100mMの範囲で細胞増殖効果を確認した。
さらに、300μM〜30mMの範囲の乳酸カルシウム添加したHSMが高い細胞増殖効果を有することを確認した。
【実施例３】
【００４４】
（光学顕微鏡観察１）
上記実施例では、培養皿に沈殿が形成されることがあった。沈殿の形成は、細胞と培地の接触を阻害し、長期生存に悪影響を与える。これにより、当該沈殿が形成されない条件を検討した。
【００４５】
（材料と方法）
１．細胞および培地などの調製
201B7細胞、ReproFF、HSM及び乳酸カルシウムは実施例２と同様に準備した。
２．培養
マトリゲルコーティングした96孔プレートに5×104個の201B7細胞を播いた。翌日HSMに乳酸カルシウムを3 μM、10 μM、30 μM、100 μM、300 μM、1 mM、3 mM、10 mM、30 mM又は100 mM添加して７日間培養した。
7日培養した細胞を光学顕微鏡(CKX41N-31PHP; Olympus, Tokyo, Japan)で観察した。
【００４６】
（結果）
代表的な結果を図3に示す。
乳酸カルシウムで7日培養した細胞を光学顕微鏡で観察したところ、3 mM以上では沈殿がみられた（図3Aの矢印）。一方、1 mM以下では沈殿はみられなかった(図３Bの矢尻)。
また、乳酸カルシウム1 mMでは細胞が生存していた。HSMには重炭酸ナトリウムが、インキュベーターの5%炭酸ガスとともに培地のpHを緩衝して7.4程度に保つように添加されている。乳酸ナトリウム3mM以上では重炭酸ナトリウムと反応して沈殿を形成する可能性が考えられた。
したがって、以下の実施例では、乳酸カルシウム、乳酸ナトリウム、乳酸をそれぞれ1mMの濃度に設定した。
【実施例４】
【００４７】
（AFPおよびアルブミンの発現）
iPS細胞を、乳酸を添加してHSMで培養して、該培養細胞のAFPおよびアルブミンの発現を調べた。
【００４８】
（材料と方法）
１．細胞および培地などの調製
201B7細胞、ReproFF、HSM、乳酸カルシウム及び乳酸ナトリウムは実施例２と同様に準備した。
２．培養
201B7細胞をマトリゲルコーティングした6孔プレートに播き、100%コンフルエントで培地を1mM乳酸カルシウム(Ca-lactate)、1mM乳酸ナトリウム(Na-lactate)、1mM乳酸(Lactate)に交換し7日培養した。対照の細胞は、ReproFFで培養した。
３．ｑPCR
RNAを抽出しリアルタイム定量PCRにてAFPおよびアルブミンの発現量を解析した。
【００４９】
（結果）
図4に結果を示す。乳酸カルシウム及び乳酸ナトリウムでは、AFP(図４A)及びアルブミン(図４B)ともに未分化な状態に比して発現が亢進していた。
よって、乳酸カルシウム又は乳酸ナトリウム添加したHSMでの培養により、肝芽細胞マーカーであるAFPおよびアルブミンの発現が亢進されたため、肝芽細胞の分化誘導が促進されたことを確認した。
【実施例５】
【００５０】
（光学顕微鏡観察２）
iPS細胞を、乳酸を添加してHSMで培養して、該培養細胞の状態を確認した。
【００５１】
（材料と方法）
１．細胞および培地などの調製
201B7細胞、HSM、乳酸カルシウム、乳酸ナトリウム及び乳酸は実施例２と同様に準備した。
２．培養
201B7細胞をマトリゲルコーティングした6孔プレートに播き、100%コンフルエントで培地を1mM乳酸カルシウム、1mM乳酸ナトリウム、1mM乳酸に交換し7日培養した。
7日間培養した細胞を光学顕微鏡(CKX41N-31PHP; Olympus, Tokyo, Japan)で観察した。
【００５２】
（結果）
結果を図5に示す。
乳酸ナトリウム(図５B)と乳酸(図５C)で培養した細胞は、乳酸カルシウム(図５A)で培養した細胞(図５中、矢尻)と比較して、虚脱傾向、すなわち細胞質の面積が小さい傾向がみられた。
【実施例６】
【００５３】
（免疫染色）
iPS細胞を、乳酸を添加してHSMで培養して、該培養細胞のAFP発現を抗AFP抗体を用いて調べた。
【００５４】
（材料と方法）
１．細胞および培地などの調製
201B7細胞、HSM、ReproFF、乳酸カルシウムは実施例２と同様に準備した。
２．培養
8well chamber slideに201B7細胞を播種して培養し、100%コンフルエントに到達してからHSMに1mM乳酸カルシウムを添加し7日培養した。対照としてReproFFにて7日培養した。
３．免疫染色
4%パラホルムアルデヒドにて固定し、リン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffered saline, PBS)にて洗浄した。0.3%過酸化水素水を添加した100%メタノールにて30分4℃にてインキュベートし内因性ペルオキシダーゼを失活させた。PBSにて3回洗浄した。2%fetal bovine serumを添加したPBS(wash buffer)にて30分間4℃にてインキュベートした。
マウス抗ヒトalpha-feto protein(AFP)抗体(タカラバイオ株式会社製、製品コードM225)をwash bufferで1000倍希釈し添加、4℃で一晩インキュベートした。PBSで3回洗浄した。Horse-radish peroxidaseでラベルした抗マウスIgG抗体(GE Healthcare社製)をwash bufferで1000倍に希釈し、3時間4℃でインキュベートした。PBSで3回洗浄した。3, 3-diaminobenzidine (DAKO, K3467)で発色し、ヘマトキシリンにて核染し、封入した。
【００５５】
（結果）
結果を図6に示す。図6Aは乳酸を添加したHSMで7日培養した結果、図6BはReproFFで7日培養した結果を示す。
乳酸を添加したHSMで7日培養した細胞は、ReproFFで7日培養した細胞と比較してAFP発現を亢進することを確認した。
よって、乳酸添加したHSMでのiPS細胞の培養により、肝芽細胞マーカーであるAFPおよびアルブミンの発現が亢進されたため、肝芽細胞の分化誘導が促進されたことを確認した。
【実施例７】
【００５６】
（ピルビン酸添加したHSMでの培養）
実施例1の結果から多能性幹細胞をHDIで培養した場合にピルビン酸の産生が不足することを確認した。HDIはHSMに薬品等を添加したものである。HDIにて添加した薬剤の影響を除くため、iPS細胞をピルビン酸添加したHSMで培養して、iPS細胞から肝細胞の誘導効率を検討した。
【００５７】
（材料と方法）
１．細胞および培地等の調製
iPS細胞は、実施例１と同様に201B7細胞を使用した。
HSM培地は、実施例1と同様に調製した。
ピルビン酸源として、ピルビン酸ナトリウム（Thermo Scientific社製）を使用した。
２．培養
マトリゲルコーティングした96孔プレートに5×104個の201B7細胞を播いた。翌日HSMに乳酸カルシウム、乳酸ナトリウム、乳酸をそれぞれ3 μM、10 μM、30 μM、100 μM、300 μM、1 mM、3 mM、10 mM、30 mM又は100 mM添加して３日間培養した。対照の細胞は、ReproFF又はHSMで培養した。
３．MTSアッセイ
培養開始3日後、MTSアッセイ(CellTiter 96（日本登録商標） AQueous One Solution、Promega社製)を行い、細胞増殖を検討した。
【００５８】
（結果）
図７に細胞増殖の結果を示す。
図７から明らかなように、ピルビン酸添加したHSMでは、HSMのみと比較した場合には、3μM〜10mMの範囲で細胞増殖効果を確認した。
【００５９】
（総論）
以上の結果より、乳酸をHSMに添加してiPS細胞を培養したところ、予想外なことに7日後でも細胞が生存することが明らかになった。さらに、驚くべきことにHSMに乳酸を添加してiPS細胞を培養するとAFP、アルブミンの発現が亢進することが明らかになった。すなわち、乳酸はHSMにおけるiPS細胞の生存を促すだけでなく、肝細胞への分化を促進すると考えられる。
本発明者は、以下のように考えている。
ヒトはブドウ糖から解糖系、クエン酸回路を介してエネルギーを産生する。激しい運動をすると筋肉は解糖系を介してエネルギーを産生する。ブドウ糖は解糖系を経由すると最終的に乳酸が産生される。肝細胞はCori回路によって乳酸をブドウ糖に変換する。即ち筋肉で産生された乳酸は血中を流れて肝細胞へ到達し、肝細胞によりブドウ糖に変換されて、ふたたび血中に放出される。HSMに乳酸を添加するとCori回路が活性化されてブドウ糖を産生するものと考えられる。Cori回路が活性化される過程で肝細胞への分化が促進される可能性がある。よって、多能性幹細胞を、乳酸を添加したHSMで培養すると短期間に肝細胞の製造が可能になると考えている。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
ヒトの人工多能性幹（iPS）細胞から肝細胞を分化誘導させることができれば、肝不全症例に対する移植療法、薬剤の毒性試験等に応用することが可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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