(57)【要約】      （修正有）【課題】異なる疾患に対して同時に免疫化するための多価組換型ヘルペスウイルスを提供する。【解決手段】少なくとも２つの組換型ヌクレオチド配列を含み、各組換型ヌクレオチド配列は、別個の抗原ペプチドをコードする組換型鳥ヘルペスウイルスを開示する。前記の少なくとも２つの組換型ヌクレオチド配列は、ＵＬ４４とＵＬ４５との間に位置する領域、ＵＬ４５とＵＬ４６との間に位置する領域、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間に位置する領域、ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間に位置する領域から選択される、ウイルスゲノムの別個の非コード領域に挿入される。【選択図】図１
2019080571.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換型鳥ヘルペスウイルスであって、
（i）ＵＬ４５とＵＬ４６との間のウイルスゲノムの非コード領域に挿入され、Ｐｅｃプロモーターの制御下にあり、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）のＦタンパク質又はその免疫原性断片をコードする組換型ヌクレオチド配列と、
（ii）ＵＬ４４とＵＬ４５との間のウイルスゲノムの非コード領域に挿入され、ｍＣＭＶＩＥ１プロモーターの制御下にあり、伝染性ファブリキウス病ウイルス（ＩＢＤＶ）のＶＰ２タンパク質又はその免疫原性断片をコードする組換型ヌクレオチド配列とを含む、組換型鳥ヘルペスウイルス。
【請求項２】
請求項１の組換型鳥ヘルペスウイルスにおいて、
ＵＬ４５とＵＬ４６との間のウイルスゲノムの非コード領域に挿入された前記組換型ヌクレオチド配列は、ＵＬ４５の転写方向とは反対のＵＬ４６と同じ転写方向にある組換型鳥ヘルペスウイルス。
【請求項３】
請求項１に記載の組換型鳥ヘルペスウイルスにおいて、
前記Ｐｅｃプロモーターは、配列番号２の配列を含む組換型鳥ヘルペスウイルス。
【請求項４】
請求項１に記載の組換型鳥ヘルペスウイルスにおいて、
前記ｍＣＭＶ ＩＥ１プロモーターは、配列番号１９の配列を含む組換型鳥ヘルペスウイルス。
【請求項５】
請求項１に記載の組換型鳥ヘルペスウイルスにおいて、
七面鳥の組換型ヘルペスウイルス（ｒＨＶＴ）である組換型鳥ヘルペスウイルス。
【請求項６】
請求項５に記載の組換型鳥ヘルペスウイルスにおいて、
前記ＵＬ４４とＵＬ４５との間の非コード領域は、ＦＣ１２６ ＨＶＴ株の配列を基準としてウイルスゲノムのヌクレオチド９４２４３番〜ヌクレオチド９４６８３番の間に位置する組換型鳥ヘルペスウイルス。
【請求項７】
請求項５に記載の組換型鳥ヘルペスウイルスにおいて、
前記ＵＬ４５とＵＬ４６との間の非コード領域は、ＦＣ１２６ ＨＶＴ株の配列を基準としてウイルスゲノムのヌクレオチド９５３２３番〜ヌクレオチド９５４４３番の間に位置する組換型鳥ヘルペスウイルス。
【請求項８】
有効免疫量の請求項１に記載の組換型鳥ヘルペスウイルスを含む多価ワクチン。
【請求項９】
鳥にニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）及び伝染性ファブリキウス病ウイルス（ＩＢＤＶ）に対するワクチン接種をするための方法であって、
請求項８に記載の多価ワクチンを前記鳥に投与することを含む方法。
【請求項１０】
鳥類を免疫化するためのワクチン接種キットであって、
請求項８に記載の有効量のワクチンと、
前記鳥類に前記ワクチンの成分を投与するための手段とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、ワクチン製剤の分野に関する。本発明は、具体的に、少なくとも２つの外来遺伝子が挿入された多価組換型ヘルペスウイルス、及び複数の鳥疾患に対する防御免疫を同時に誘発するためのこれらウイルスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
鶏肉及び卵は、重要な食料源であり、この食料源の消費は、人口の増加と食糧源の大きな品質価格比率とによって連続的に増加している。最近の鳥インフルエンザの流行により、世論は食品の安全及び安心と同様に家禽の衛生にも注目した。家禽ワクチン技術は、世界的な関心事となった。
【０００３】
病原体タンパク質を発現するウイルスベクターは、対象病原体に対する家禽ワクチンとして一般的には使用される。このようなウイルスベクターを含むワクチンは、感染細胞内に外来病原体タンパク質の発現を誘発し、これにより対応するＴ細胞免疫を誘発する。
【０００４】
七面鳥のヘルペスウイルス（ＨＶＴ）及びマレック病ウイルス（ＭＤＶ）を含む全てのヘルペスウイルスは、潜伏又は持続感染の状態における患畜の体内で永遠に生き延びることができるということはよく知られている。このため、病原体に由来する外来遺伝子が統合された組換型ヘルペスウイルスは、免疫の持続期間を増大するウイルスベクターを用いたワクチンとして免疫動物に対して使用するために開発された。
【０００５】
ＨＶＴは、そのゲノム構造、ＭＤＶに対するワクチンとしてのその幅広い利用能、及びニワトリにおいて持続性のままであるというその能力により、組換型家禽ワクチンを製造するための魅力的なベクターである。
【０００６】
ワクチン製剤は、外来抗原をコードする遺伝子を取り込む組換型ヘルペスウイルスを用いて、鳥ワクチン接種を有効にするために開発された。このようなワクチン製剤により、挿入された外来ＤＮＡ配列を通して、ＭＤＶ（前記ベクター）及び他の鳥疾患の双方に対してワクチン接種することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このようなワクチン製剤は、多くの致命的な疾患に対して鳥類にワクチン接種するために効果的な結果を提供するが、異なる外来抗原遺伝子をそれぞれ有する２つ以上の組換型ヘルペスウイルスを鳥に注射すると、病原体間の競合及び免疫抑制が起こり得る。したがって、異なる疾患に対して同時に免疫化するための多価組換型ヘルペスウイルス（すなわち、少なくとも２つの異なる抗原遺伝子を有する）が特に研究されるであろう。しかしながら、これまでのところ、複数の外来遺伝子を発現する組換型ＨＶＴ（ｒＨＶＴ）は不安定であり、外来遺伝子の全て又は一部は、培養細胞において繰り返し継代している間に削除されるということが分かっている。それゆえ、このような不安定な多価ウイルスベクターを効率的なワクチンとして使用することはできない。
【０００８】
したがって、感染細胞において外来遺伝子を共発現させる、安定した多価組換型ウイルスベクターが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
出願人によって行われた作業は、ヘルペスウイルスゲノムにおける１セットの特定挿入部位を、２つ以上の抗原遺伝子を安定して挿入し且つ発現するために使用することで、鳥ワクチン接種のための効率的な多価ウイルスベクターを提供できるという驚くべき発見につながった。より具体的には、出願人は、少数の挿入部位を、異なる抗原遺伝子を取り込むために同時に使用することで、安定した多価組換型ウイルスベクターを提供できるということを発見した。
【００１０】
したがって、本発明は、少なくとも２つの組換型ヌクレオチド配列を含む組換型鳥ヘルペスウイルスであって、各組換型ヌクレオチド配列は、鳥類の細胞において抗原ペプチドをコードし且つ発現する多価組換体鳥ヘルペスウイルスに関する。なお、前記少なくとも２つの組換型ヌクレオチド配列は、ＵＬ４４とＵＬ４５との間に位置する領域、ＵＬ４５とＵＬ４６との間に位置する領域、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間に位置する領域、及びＳＯＲＦ３とＵＳ２との間に位置する領域から選択されたウイルスゲノムの特定の非コード領域へ挿入される。
【００１１】
好ましい一形態では、１つの組換型ヌクレオチド配列がＵＬ４５とＵＬ４６との間に位置する領域に挿入され、１つの組換型ヌクレオチド配列がＵＬ４４とＵＬ４５との間、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間、又はＳＯＲＦ３とＵＳ２との間に位置する領域に挿入される。本願に記載のように、このような組換型鳥ヘルペスウイルス作成物は、２つの対応する抗原ペプチドを、感染した鳥細胞において特に安定的な且つ効率的に発現する。
【００１２】
特に、上記２つ以上の組換型ヌクレオチド配列は、１０回以上継代した後でさえ、また、特に１５回継代した後でさえ、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において共発現されることが有利である。
【００１３】
本発明によると、前記組換型ヌクレオチド配列は、特定のプロモーターの支配下で有利である。前記プロモーターは、ニワトリベータアクチン（Ｂａｃ）プロモーター、Ｐｅｃプロモーター、ネズミサイトメガロウイルス（Ｍｃｍｖ）中間‐初期（ｉｅ）１プロモーター、ヒトメガロウイルス（Ｈｃｍｖ）プロモーター、サルウイルス（ＳＶ）４０プロモーター、及びラウスサルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーターから優先的に選択されるか、又はプロモーターの活性を保持するこれらの断片である。特に、各組換型ヌクレオチド配列は、特定のプロモーターの支配下にある。
【００１４】
本発明によると、前記外来遺伝子は、鳥パラミクソウイルス１型の抗原ペプチド、そして特にニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）のＦタンパク質、ガンボロ病ウイルスの抗原ペプチド、特に伝染性ファブリキウス病ウイルス（ＩＢＤＶ）のＶＰ２タンパク質、感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）の抗原ペプチド、特にｇＢタンパク質、マイコプラズマ・ガリセプチカムの抗原ペプチド、特に４０Ｋタンパク質、及び鳥インフルエンザウイルスの抗原ペプチド、特に表面タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）から選択されることが有利である。
【００１５】
好ましい一形態において、前記組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＬ４４とＵＬ４５との間に位置する非コード領域に挿入された第１抗原ペプチドをコードする第１組換型ヌクレオチド配列、及びＵＬ４５とＵＬ４６との間、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間、又はＳＯＲＦ３とＵＳ２との間に位置する非コード領域に挿入された第２抗原ペプチドをコードする第２組換型ヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
他の好ましい形態において、前記組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＬ４５とＵＬ４６との間に位置する非コード領域に挿入された第１抗原ペプチドをコードする第１組換型ヌクレオチド配列、及びＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間、又はＳＯＲＦ３とＵＳ２との間に位置する非コード領域に挿入された第２抗原ペプチドをコードする第２組換型ヌクレオチド配列を含む。
【００１７】
さらに好ましい形態において、前記組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間に位置する非コード領域に挿入された第１抗原ペプチドをコードする第１組換型ヌクレオチド配列、及びＳＯＲＦ３とＵＳ２との間に位置する非コード領域に挿入された第２抗原ペプチドをコードする第２組換型ヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
本発明の更なる目的は、有効免疫量の本発明の組換型鳥ヘルペスウイルスを含む、鳥類（例えば、家禽）を免疫化するための多価ワクチンに関する。このワクチンを、鳥類（例えば、家禽）を免疫化するために使用することができる。
【００１９】
本発明の更なる目的は、鳥ヘルペスウイルスに対抗する抗血清に関し、この抗血清は、有効量の本発明の組換型鳥ヘルペスウイルスによって鳥類を免疫化し、その鳥を放血して抗血清を回収することで得られる。
【００２０】
さらに、本発明は、鳥を免疫化するための方法に関し、この方法は、有効免疫量の本発明のワクチンを前記鳥に投与することを含む。
【００２１】
さらに、本発明は、有効量の本発明のワクチンを含む、鳥類を免疫化するためのワクチン接種キット、及び前記鳥類に対して前記成分を投与するための手段に関する。
【００２２】
本発明は、任意の鳥病原体に対するワクチン接種のために、任意の鳥において使用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ＨＶＴゲノムの概略図である。ユニークロング（ＵＬ）４４、ＵＬ４５及びＵＬ４６の位置、並びに、ユニークショート（ＵＳ）１０、ＳＯＲＦ３、及びＵＳ２の位置がマークされている。組換型ヌクレオチド配列は、ＵＬ４４とＵＬ４５との間、及び／又はＵＬ４５とＵＬ４６との間、及び／又はＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間、及び／又はＳＯＲＦ３とＵＳ２との間のＰＣＲ法で生成されたＳｆｉＩ部位に挿入され得る。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、本発明の特定の実施形態に基づく、ヌクレオチド配列及びプロモーターの異なる集合体を統合するＨＶＴゲノムの概略図である。
【図３】図３は、ＮＤＶ−Ｆ及びＩＢＤＶ−ＶＰ２（ｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＢＤ感染細胞）を共発現する、本発明の実施形態に係る二重組換型ＨＶＴ（ＦＷ１２９及びＦＷ１４１）に感染したＣＥＰの免疫蛍光染色を示す図である。タンパク質ＶＰ２の発現は、抗ＶＰ２Ｍａｂ（Ｒ６３）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５４６によって検出された。タンパク質Ｆの発現は、抗Ｆ＃３５ウサギ血清及びＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８によって検出された。これらの結果は、ＦＷ１２９又はＦＷ１４１に感染した両細胞は、挿入されたＮＤＶ−Ｆタンパク質と挿入されたＩＢＤＶ−ＶＰ２タンパク質との双方を発現するということを示す。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、本発明のｒＨＶＴに感染したＣＥＦ細胞におけるＶＰ２タンパク質及び／又はＦタンパク質の発現を示すウエスタンブロッティング分析を示す図である。図４Ａに示すように、６０キロダルトン（ｋＤａ）のタンパク質バンドは、ｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＢＤ感染細胞を有するレーンにおいてのみ観察され、Ｆタンパク質の予期したサイズであった（→）。ｒＨＶＴ／４４−４５ＢａｃＶＰ２（ＦＷ１２３）のレーンにおいてバンドは無かった。図４Ｂに示すように、ＶＰ２タンパク質は、３８キロダルトン（ｋｄ）において各ｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＢＤのレーンにおいて観察された（⇒）。対照的に、ｒＨＶＴ／４５−４６ＰｅｃＦ（ＦＷ０２９）のレーンにはバンドは無かった。３８ｋｄは、成熟ＶＰ２タンパク質である（A. A. Azad et al., 1987、 Virol. 161:145-152,K. J., Fahey et al., 1985 J. Gen.Virol. 66:1479-1488）。本発明の二重ｒＨＶＴｓは、ＮＤＶ−Ｆ及びＩＢＤＶ−ＶＰ２の双方を発現した。
【図５】図５Ａ〜図５Ｄは、精製されたＦＷ１２９（ｒＨＶＴ／４５−４６ ｐｅｃＦ／４４−４５ Ｒｓｖ ＶＰ２）のゲノム構造チェックのためのサザンブロッティング分析の結果を示し、本発明の二重組換型ＨＶＴ／ＮＤ／ＩＢＤが予期したゲノム構造を有していたことを示している。より正確には、サザンブロッティングの結果は、以下のことを示した。２０７７−ｂｐ断片が、各二重組換型ＨＶＴＦＷ１２９からのＤＮＡにおいてＶＰ２プローブとハイブリダイズした（図５Ａの列１、２、及び３）。対照的に、ｐ４５／４６ ＰｅｃＦにおいてバンドは検出されなかった（図５Ａ）。２７４４−ｂｐ断片が、各二重組換型ＨＶＴ ＦＷ１２９からのＤＮＡにおてＦプローブとハイブリダイズした（図５Ｃの列１、２、及び３）。ｐ４５／４６ＳｆｉＩにおいてバンドは検出されなかった。２０７７−ｂｐ及び１２２８−ｂｐ断片が、各二重組換型ＨＶＴＦＷ１２９からのＤＮＡにおいてＩＳ４４／４５プローブとハイブリダイズした（図５Ｂの列１、２、及び３）。分子マーカーラムダＨｉｎｄＩＩＩ消化物についてバンドは検出されなかった（図５Ｂの列Ｍ）。２７４４−ｂｐ及び７７０−ｂｐ断片が、各二重組換型ＨＶＴＦＷ１２９からのＤＮＡにおいてＩＳ４５／４６プローブとハイブリダイズした（図５Ｄの列１、２、及び３）。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂは、連続した継代における組換型ＨＶＴ ＦＷ１２９の安定性チェックのためのウエスタンブロッティング分析の結果を示し、１５回継代した後、Ｆタンパク質及びＶＰ２タンパク質が、本発明のｒＨＶＴＦＷ１２９に感染したＣＥＦにおいて安定して発現されたことを示す。
【図７】図７Ａ〜図７Ｄは、１５回継代した後の組換型ＨＶＴの安定性チェックのためのサザンブロッティング分析の結果を示す。（図７Ａ）サザンブロッティングの結果は、２０７７−ｂｐ断片がＦＷ１２９からのＤＮＡにおいてＶＰ２プローブとハイブリダイズしたことを示す。２３３４−ｂｐ断片は、ＦＷ１３０からのＤＮＡにおいてＶＰ２プローブとハイブリダイズした。対照的に、ｐ４５／４６ＰｅｃＦにおいてバンドは検出されなかった。（図７Ｃ）サザンブロッティングの結果は、２７４４−ｂｐ断片が二重組換型ＨＶＴ ＦＷ１２９及びＦＷ１３０の各々からのＤＮＡにおいてＦプローブとハイブリダイズしたことを示す。ｐ４５／４６ＳｆｉＩにおいてバンドは検出されなかった。（図７Ｂ）サザンブロッティングの結果は、２０７７−ｂｐ及び１２２８−ｂｐ断片がＦＷ１２９からのＤＮＡにおいてＩＳ４４／４５プローブとハイブリダイズし、２３３４−ｂｐ及び１０２２−ｂｐ断片がＦＷ１３０からのＤＮＡにおいてＩＳ４４／４５プローブとハイブリダイズしたことを示す。１３５０−ｂｐ断片は、ＩＳ４４／４５部位に遺伝子を含まないｐ４５／４６ＰｅｃＦにおいてＩＳ４４／４５プローブとハイブリダイズした。（図７Ｄ）サザンブロッティングの結果は、２７４４−ｂｐ及び７７０−ｂｐ断片が二重組換型ＨＶＴ ＦＷ１２９及びＦＷ１３０の各々からのＤＮＡにおいてＩＳ４５／４６プローブとハイブリダイズしたことを示す。４４／４５プローブ及び４５／４６プローブによるサザンブロットは、それぞれＦＷ１２９及びＦＷ１３０における挿入部位４４／４５又は４５／４６において安定して維持されたＶＰ２遺伝子又はＦ遺伝子を示した。これらの結果は、１５回継代後、本発明のｒＨＶＴＦＷ１２９に感染したＣＥＦにおいて、Ｆタンパク質及びＶＰ２タンパク質が安定して発現されたということを示す。
【図８】図８Ａ及び図８Ｂは、二重組換型ＨＶＴ（ＦＷ１２２、ＦＷ１３７、ＦＷ１２９、ＦＷ１３０、ＦＷ１３５）を接種したニワトリから得られた抗ＮＤＶ力価（図８Ａ）及び抗ＩＢＤＶ力価（図８Ｂ）を単一組換型ＨＶＴ（それぞれＦＷ０２９及びＦＷ０２３）を接種したニワトリから得られた力価と比べた比較結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、概して、多価組換型ヘルペスウイルス、及び少なくとも２つの疾患に対して鳥類に同時に免疫化するためのこのウイルスの使用に関する。本発明によると、外来ＤＮＡ配列をｒＨＶゲノムの範囲内における特定の挿入部位に挿入して、ワクチン組成物又はワクチン方法における使用に適した安定した、且つ、効率的な作成物を提供する。
【００２５】
本開示は、以下の定義を参照して最もよく理解されるであろう。
【００２６】
定義
本発明の文脈において、配列に関する「再構成」又は「組換型」という用語は、天然に存在しない、及び／又は組換型ＤＮＡ技術（遺伝子クローン化又は分子クローン化とも称される）を用いて作成された配列、核酸、又は単位を指す。
【００２７】
ヘルペスウイルスに関する「組換型」という用語は、ゲノムが少なくとも１つの異種核酸、すなわち、ヘルペスウイルスのゲノムにおいて天然に見出されない、又は前記ゲノムにおいて天然に見出されるが、異なる形態である、又は異なる位置にある核酸（例えば、ＤＮＡ）の挿入により改変されたヘルペスウイルスを指す。前記組換型ヘルペスウイルスは、様々な方法で製造でき、一旦製造されたら、更なる組換型ＤＮＡ技術を用いることなく再生され得ると理解されるであろう。したがって、「組換型ヘルペスウイルス」の構造は、ＤＮＡ挿入に関して説明される。
【００２８】
本説明において、「核酸」「核酸配列」及び「ヌクレオチド配列」は、同義的に使用され、決められた配列を有する核酸分子を指し、決められた配列は、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドの配列でもよい。前記ヌクレオチド配列は、例えば、まず、組換、酵素的、及び／又は化学的技術によって用意され、続いて、宿主細胞又はインビトロのシステムにおいて重複培養されてもよい。ヌクレオチド配列は、ペプチドをコードするオープンリーディングフレームを優先的に含んでいる。このヌクレオチド配列は、転写ターミネーター、シグナルペプチド、ＩＲＥＳ、イントロンなどの追加配列を含んでいてもよい。組換型核酸におけるオープンリーディングフレームは、イントロンを含んでいないことが好ましい。
【００２９】
本願で使用される「非翻訳領域」という用語は、ＯＲＦを有していないヌクレオチドの領域を指し、翻訳により発現されるタンパク質のアミノ酸配列、又はＯＲＦが転写、翻訳、若しくはタンパク質発現のいずれかに関連しないヌクレオチドの領域を定義するものではない。
【００３０】
「鳥類」という用語は、鳥網の鳥、すなわち、羽のある、翼のある、二足歩行の、内温性の、産卵する脊椎動物などの全種類の鳥を包含するものとする。本発明の文脈においては、鳥、又は鳥類は、より具体的に、家禽（例えば、ニワトリ及び七面鳥）、水鳥家禽（例えば、カモ及び雌ガチョウ）、及び装飾的な鳥（例えば、白鳥及びオウム）などの経済的及び／又は農学的な利益を有する鳥を指す。
【００３１】
「ワクチン」という用語は、本願では、生体における免疫応答を引き起こす、促進する、又は増幅するために使用してもよい作因を指す。
【００３２】
ウイルス
本発明において使用されるウイルスは、一般的には、鳥ヘルペスウイルスの属に属するウイルスである。
【００３３】
例えば、本発明において使用される鳥ヘルペスウイルスは、七面鳥のヘルペスウイルス（ＨＶＴ）、血清２型マレック病ウイルス、好ましくは血清２型マレック病ウイルスのＳＢ１菌種、又は血清１型マレック病ウイルス、好ましくは血清１型マレック病ウイルスのＣＶＩ９８８／リスペンス菌種を含むがこれに限定されない。本発明の好ましいヘルペスウイルスは、対象鳥類に対して非病原性である血清型又は菌種に由来する。
【００３４】
多価組換型鳥ヘルペスウイルス
本発明の目的は、継代を通して向上した安定性を有する、少なくとも２つの疾患に対して鳥類を免疫化するために適した組換型鳥ヘルペスウイルスに関する。特定の挿入部位は、発明者らによって同定され、これらは、組み合せによって、外来抗原遺伝子に向上した安定性をもたらす。
【００３５】
したがって、本発明の目的は、別個の抗原ペプチドをそれぞれコードする少なくとも２つの組換型ヌクレオチド配列を含む組換型鳥ヘルペスウイルスに関する。なお、前記少なくとも２つの組換型ヌクレオチド配列は、ＵＬ４４とＵＬ４５との間に位置する領域、ＵＬ４５とＵＬ４６との間に位置する領域、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間に位置する領域、及びＳＯＲＦ３とＵＳ２との間に位置する領域から選択される、ウイルスゲノムの別個の非コード領域に挿入される。
【００３６】
前記非コード領域の場所は、当技術分野において知られており、例えば、Ｋｉｎｇｈａｍ他(「The genom of herpesvirus of turkeys: comparative analysis with Marek’s disease virus」 - Journal of GeneralVirology (2001) 82, 1123-1135）に記載されている。
例えば、ＦＣ１２６全ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ２９１８６６．１）を参照すると、ＵＬ４４とＵＬ４５との間に位置する領域はＨＶＴゲノムのヌクレオチド９４２４３−９４６８３に対応し、ＵＬ４５とＵＬ４６との間に位置する領域はＨＶＴゲノムのヌクレオチド９５３２３−９５４４３に対応し、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間に位置する領域はＨＶＴゲノムのヌクレオチド１３８６８８−１３８８２５に対応し、ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間に位置する領域はＨＶＴゲノムのヌクレオチド１３９８６７−１４００６４に対応する。
【００３７】
ヘルペスウイルスのゲノムへの挿入対象核酸は、ヘルペスウイルスと同種又は異種であってもよい。前記核酸は、一般的には、病原体からの抗原をコードし、鳥類における感染症を引き起こす能力のある任意の病原微生物に由来してくもよく、又は取得されてもよい。一般的には、前記クローン核酸は、家禽産業に経済的打撃を与える疾患を引き起こす病原体に由来する。鳥において感染症を引き起こす病原体の例は、ウイルス、バクテリア、菌類、原虫などを含む。
【００３８】
したがって、ウイルスゲノムへ挿入するための前記同種又は異種ヌクレオチド配列は、鳥病原因子の抗原ペプチドをコードする任意の配列であってもよい。本発明に係る前記核酸配列は、例えば、ウイルス性の、原核生物の、成熟核の、又は合成の任意の供与源に由来し得る。一般的には、前記ヌクレオチド配列は、病原体の免疫原性ペプチドをコードし、好ましくは、前記病原体の表面タンパク質、分泌タンパク質、又は構造タンパク質、又はこれらの断片を表す。
【００３９】
前記ヌクレオチド配列は、鳥類又は球虫類に感染する鳥インフルエンザウイルス、鳥パラミクソウイルス１型（ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）とも称される）、鳥メタニューモウイルス、マレック病ウイルス、ガンボロ病ウイルス（伝染性ファブリキウス病ウイルス（ＩＢＤＶ）とも称される）、感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＶＴ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、大腸菌、サルモネラ属細菌、動物パスツレラ症病原菌、リエメレラアナティペステイファー、オルニソバクテリウム・ライノトラキア、マイコプラズマ・ガリセプチカム、マイコプラズマ・シノヴィエ、マイコプラズマ微生物に由来の例えば抗原ペプチドをコードしてもよい。
【００４０】
特に、前記ウイルスゲノムに挿入されるヌクレオチド配列は、ＮＤＶのＦタンパク質、ＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質、ＩＬＴＶのｇＢタンパク質、マイコプラズマ・ガリセプチカムの４０Ｋタンパク質、及び鳥インフルエンザウイルスの表面タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）から選択される。
【００４１】
鳥の種類、飼育国、飼育条件などの様々な要因に応じて、様々な組合せの抗原ペプチドに対する関心は高い。
【００４２】
例えば、一形態において、本発明の多価組換型鳥ヘルペスウイルスは、そのゲノムに、ＮＤＶのＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及びＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を取り込んでいる。
【００４３】
特別な一形態によると、３つ以上のヌクレオチド配列がウイルスゲノムに挿入されていてもよい。
【００４４】
本発明の組換型ヘルペスウイルスは、同じ病原体から２つ以上の抗原を発現し得る。
【００４５】
関心が持たれている抗原をコードする同種又は異種ヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に結合され、さらにウイルスゲノムに挿入されていてもよい。使用される前記プロモーターは、合成又は天然の、内因性又は異種のプロモーターでもよい。
【００４６】
前記プロモーターは、ｒＨＶＴに感染した鳥の細胞において有効に機能し得る限り、限定されない。したがって、プロモーターの選択肢は、ｒＨＶＴに感染した鳥細胞における遺伝子転写を指揮することのできる任意の成熟核の、原核生物の、又はウイルス性のプロモーターに広がる。
【００４７】
特に、前記プロモーターは、ニワトリベータアクチン（Ｂａｃ）プロモーター、Ｐｅｃプロモーター、ネズミサイトメガロウイルス（Ｍｃｍｖ）ｉｅ１プロモーター、ヒトメガロウイルス（Ｈｃｍｖ）プロモーター、サルウイルス（ＳＶ）４０プロモーター、及びラウスサルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーターから選択されるか、又はプロモーター活性を保持するこれらの任意の断片である。
【００４８】
ニワトリＢａｃプロモーターの前記核酸配列は、配列番号：１で示され、Ｐｅｃプロモーターの配列は、配列番号：２で示され、Ｍｃｍｖｉｅ１プロモーターの配列は、配列番号：３で示され、Ｈｃｍｖプロモーターの配列は、配列番号：４で示され、ＳＶ４０プロモーターの配列は、配列番号：５で示され、ＲＳＶプロモーターの配列は、配列番号：６で示される。
【００４９】
なお、機能性プロモーターをコードするこのような配列の変種は、周知であり、及び／又は本発明において使用するために当業者によって設計／試験され得る。
【００５０】
本発明の好ましい組換型ヘルペスウイルスにおいて、核酸の少なくとも１つは、抗原ペプチドの発現を駆動するためにＰｅｃプロモーター又はＢａｃプロモーターを含む。
【００５１】
多価構造
遺伝子クローニング及びプラスミド構造は、当業者に周知であり、標準的な分子生物学技術（MolecularCloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Woodbury, N.Y. 2001）によって実質的に実施されてもよい。
【００５２】
本発明の多価組換型ヘルペスウイルスを作成するためには、まず、ヘルペスウイルスを適切な宿主細胞において繁殖させ、次に、ゲノムＤＮＡを得る。宿主とウイルスを繁殖させるための条件を適切に選択する。宿主細胞としては、ニワトリ由来の細胞が好ましく、ＣＥＦ（ニワトリ胚繊維芽細胞）、ニワトリ腎臓細胞などを使用することができる。細胞は、イーグルＭＥＭ、レイボヴィツ−Ｌ−１５／マッコイ５Ａ（１：１混合物）培地などの培地において約３７℃で３〜４日間培養されてもよい。
【００５３】
ＤＮＡは、従来の方法により上記のように培養されたウイルス感染細胞から抽出される。タンパク質を溶菌緩衝液において変性させた後、取り出し、ＤＮＡをフェノール及びエタノールによって抽出する。
【００５４】
一般的には、前記組換型ウイルスは、ウイルスゲノムと、再結合できるように挿入部位からのヌクレオチドにより隣接された、挿入される核酸を含む作成物（例えば、プラスミド）との間の同種再結合により用意されてもよい。
【００５５】
挿入部位配列を有するプラスミド
本発明のウイルスゲノムの非翻訳領域の１つに外来遺伝子を挿入するための１つの可能性としては、目標非翻訳領域を含む配列をプラスミドに、又は他の適切なベクターにまずクローン化することである。本発明によると、このような配列は、ＵＬ４４とＵＬ４５との間に位置する領域の配列、ＵＬ４５とＵＬ４６との間に位置する領域の配列、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間に位置する領域の配列、及びＳＯＲＦ３とＵＳ２との間に位置する領域の配列から選択される。
【００５６】
プラスミドの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、及びｐＵＣ９が挙げられ、ファージの例としては、ラムダファージ及びＭ１３ファージが挙げられ、コスミドの例としてはｐＨＣ７９が挙げられる。
【００５７】
前記非翻訳領域配列は、従来のクローン化方法によってプラスミドへ統合される。前記挿入領域配列は、核酸の挿入時に核酸に隣接する配列がウイルスゲノムとインビボで同種再結合できるように適切な長さとなるように、十分な長さであることが好ましい。好ましくは、隣接配列の長さは、少なくとも約５０ヌクレオチドとする。
【００５８】
１つ以上の外来配列を非翻訳領域へ挿入するために、非翻訳領域の特定部位において突然変異を行って制限酵素用の新しい切断部位を作成してもよい。突然変異を行う方法は、従来の方法でもよく、インビトロでの変異誘発及びＰＣＲなどの当業者により一般に使用される方法を使用することができる。したがって、ＰＣＲ法では、ＰＣＲプライマーにおける１〜２個のヌクレオチドの削除、置換、又は付加などの突然変異が行われ、次に、プライマーを使用して突然変異を起こす。
【００５９】
１つ以上の目標外来ヌクレオチド配列をさらに含むプラスミド
ウイルスへの挿入のための前記ヌクレオチド及びプロモーター配列は、プラスミドにおけるウイルスゲノムの挿入領域へさらに挿入される。
【００６０】
より正確には、前記ヌクレオチド及びプロモーター配列は、プラスミドにおいてサブクローン化された、挿入領域配列を含むゲノムヘルペスウイルスＤＮＡの断片に挿入される。
【００６１】
必要に応じて、例えば、同じ又は異なる病原体に由来する２つ以上の外来核酸配列を含むプラスミドを調製することができ、前記配列には、本願に記載のように挿入領域配列が隣接している。
【００６２】
挿入部位における外来ヌクレオチド配列を含むウイルスゲノム
上記のようにして得られた非翻訳領域に少なくとも１つのヌクレオチド配列が挿入されたプラスミドは、電気穿孔法、カルシウムリン酸塩、リポフェクチンベースの方法などによって、ＨＶＴ感染細胞又はＨＶＴゲノムトランスフェクト細胞に導入されてもよい。導入されるプラスミドの量が、０．１μｇ〜１０００μｇの範囲である場合、ＨＶＴ−ＤＮＡ及びプラスミドの同種領域の間の再結合により、組換型ウイルスの生成の効率が細胞において高まる。
【００６３】
多価組換型ヘルペスウイルスの製造
本発明の多価組換型ヘルペスウイルスは、同じ細胞培養において、プラスミド及び組換型ヘルペスウイルスを同時トランスフェクトすることによって取得されてもよい。なお、プラスミドは、上述のとおり、外来ヌクレオチド配列が統合された挿入部位配列を含み、組換型ヘルペスウイルスは、上述のとおり、外来ヌクレオチド配列を有していない同じ挿入部位と、別個の外来ヌクレオチド配列が統合された第２挿入部位とを含む。この同時トランスフェクションにより、プラスミドＤＮＡがウイルスゲノムに再結合することになる。
【００６４】
それ以外の場合、本発明の多価組換型ヘルペスウイルスは、同じ細胞培養において、２つのプラスミド、及びヘルペスウイルスを同時トランスフェクトすることによって取得されてもよい。なお、プラスミドは、別個の外来ヌクレオチド配列が統合された別個の挿入部位配列をそれぞれ有し、ヘルペスウイルスは、上述のとおり、外来ヌクレオチド配列を含まない同じ挿入部位を含む。この同時トランスフェクションにより、両プラスミドＤＮＡがウイルスゲノムに再結合することになる。
【００６５】
結果として生じる多価組換型ウイルスは、組換型核酸配列と一緒に共同統合された遺伝子によってコードされた酵素活性を検出する、又は組換型ヘルペスウイルスにより免疫的に発現された抗原ペプチドを検出する、例えば、ハイブリダイゼーションといった既知の選択技術を用いて、遺伝子型又は表現型によって選択されてもよい。選択された組換型ヘルペスウイルスを、細胞培養において大規模に培養することができる。その後、ペプチドを含む組換型ヘルペスウイルスを収集することができる。
【００６６】
好ましい多価構造
本発明の目的は、少なくとも２つの外来ヌクレオチド配列を提供する多価組換型ヘルペスウイルスを提案することであり、各外来ヌクレオチド配列は、鳥細胞において対応する抗原ペプチドをコードし且つ発現するための適した方法で特定の挿入部位に挿入されている。
【００６７】
目標挿入部位と、好ましい組換型ヌクレオチド配列と、任意で好ましいプロモーターとの組合せに基づく複数の可能な実施形態において、出願人は、驚くべきことに、特定の組合せが、向上した多価ワクチンを調製するためのそれらの使用を可能にする、高いレベルの安定性を提供するということを見出した。
【００６８】
この発見に基づき、本発明の目的は、高い安定性を有する特定の多価組換型鳥ヘルペスウイルスを提案することである。
【００６９】
本発明の好ましい多価組換型鳥ヘルペスウイルスは、２つの組換型ヌクレオチド配列を含み、各組換型ヌクレオチド配列は、別個の抗原ペプチドをコードし、ＵＬ４４とＵＬ４５との間に位置する領域、ＵＬ４５とＵＬ４６との間に位置する領域、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間に位置する領域、及びＳＯＲＦ３とＵＳ２との間に位置する領域から選択されるウイルスゲノムの別個の非コード領域に挿入されている。
【００７０】
本発明の好ましい抗原ペプチドは、ＮＤＶのＦタンパク質、ＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質、ＩＬＴＶのｇＢタンパク質、マイコプラズマ・ガリセプチカムの４０Ｋタンパク、及び鳥インフルエンザウイルスの表面タンパク質ＨＡから選択される。
【００７１】
ＵＬ４４とＵＬ４５との間の挿入部位に挿入されたヌクレオチド配列と共に使用されるプロモーターは、Ｐｅｃプロモーター、Ｍｃｍｖｉｅ１プロモーター、Ｈｃｍｖプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、及びＲＳＶプロモーターから選択されるか、又はプロモーター活性を保持するこれらの任意の断片であることが有利である。実際、出願人は、驚くべきことに、ＵＬ４４とＵＬ４５との間に挿入されたＢａｃプロモーターは、外来遺伝子を安定して発現させないということを見出した。しかしながら、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の領域に挿入されたＢａｃプロモーターは、安定した発現を可能にする。
【００７２】
第１実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＬ４５とＵＬ４６との間に挿入された、特にＰｅｃプロモーターの支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＵＬ４４とＵＬ４５との間に挿入された、特にＳＶ４０プロモーター（ＦＷ１３０）の支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００７３】
第２実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の挿入部位において、特にＰｅｃプロモーターの支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＵＬ４４とＵＬ４５との間の挿入部位において、特にＲＳＶプロモーター（ＦＷ１２９）の支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００７４】
第３実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の挿入部位において、特にＰｅｃプロモーターの支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＵＬ４４とＵＬ４５との間の挿入部位において、特にＭｃｍｖｉｅ１プロモーター（ＦＷ１４１）の支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパ
ク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００７５】
第４実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の挿入部位において、特にＰｅｃプロモーターの支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の挿入部位において、特にＭｃｍｖｉｅ１プロモーター（ＦＷ１４４）の支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパ
ク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００７６】
第５実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の挿入部位において、特にＰｅｃプロモーターの支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の挿入部位において、特にＢａｃプロモーター（ＦＷ１４６）の支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００７７】
第６実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＬ４４とＵＬ４５との間の挿入部位において、特にＰｅｃプロモーターの支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の挿入部位において、特にＭｃｍｖｉｅ１プロモーター（ＦＷ１４３）の支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパ
ク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００７８】
第７実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＬ４４とＵＬ４５との間の挿入部位において、特にＭｃｍｖ ｉｅ１プロモーターの支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の挿入部位において、特にＢａｃプロモーター（ＦＷ１４２）の支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００７９】
第８実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の挿入部位において、特にＰｅｃプロモーターの支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の挿入部位において、特にＢａｃプロモーター（ＦＷ１４７）の支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００８０】
第９実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の挿入部位において、特にＢａｃプロモーターの支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の挿入部位において、特にＭｃｍｖｉｅ１プロモーター（ＦＷ１４５）の支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００８１】
第１０実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の挿入部位において、特にＢａｃプロモーターの支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の挿入部位において、特にＳＶ４０プロモーター（ＦＷ１４９）の支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００８２】
第１１実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の挿入部位において、特にＳＶ４０プロモーターの支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の挿入部位において、特にＢａｃプロモーター（ＦＷ１４８）の支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００８３】
第１２実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の挿入部位において、特にＰｅｃプロモーターの支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の挿入部位において、特にＭｃｍｖｉｅ１プロモーター（ＦＷ１５３）の支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００８４】
第１３実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の挿入部位において、特にＰｅｃプロモーターの支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の挿入部位において、特にＢａｃプロモーター（ＦＷ１５４）の支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００８５】
第１４実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の挿入部位において、特にＢａｃプロモーターの支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の挿入部位において、特にＭｃｍｖｉｅ１プロモーター（ＦＷ１５５）の支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００８６】
第１５実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の挿入部位において、特にＢａｃプロモーターの支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の挿入部位において、特にＰｅｃプロモーター（ＦＷ１５６）の支配下でにＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００８７】
第１６実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の挿入部位において、特にＰｅｃプロモーターの支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の挿入部位において、特にＭｃｍｖｉｅ１プロモーター（ＦＷ１５７）の支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００８８】
第１７実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の挿入部位において、特にＭｃｍｖ ｉｅ１プロモーターの支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の挿入部位において、特にＢａｃプロモーター（ＦＷ１５８）の支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００８９】
第１８実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の挿入部位において、特にＢａｃプロモーターの支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の挿入部位において、特にＭｃｍｖｉｅ１プロモーター（ＦＷ１５９）の支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００９０】
第１９実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の挿入部位において、特にＭｃｍｖ ｉｅ１プロモーターの支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の挿入部位において、特にＰｅｃプロモーター（ＦＷ１６０）の支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００９１】
第２０実施形態によると、組換型鳥ヘルペスウイルスは、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の挿入部位において、特にＭｃｍｖ ｉｅ１プロモーターの支配下でＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片と、ＵＳ１０とＳＯＲＦ３との間の挿入部位において、特にＰｅｃプロモーター（ＦＷ１６１）の支配下でＮＤＶのＦタンパク質をコードする組換型ヌクレオチド配列又はその断片とを含む。
【００９２】
細胞培養物
本発明により生じる組換型ウイルスは、前記組換型ウイルスが繁殖し且つ成長することのできる細胞培養物において繁殖されてもよい。ウイルスの必要な成長が行われた後、細胞は、スクレーパーを用いて、又はトリプシンによってウェルから剥離されてもよく、感染細胞は、遠心沈殿法によって上澄液から分離されてもよい。
【００９３】
本発明の好ましい実施形態において、ＣＥＦ、孵化鶏卵、ニワトリ腎臓細胞等は、組換型ヘルペスウイルスの繁殖のための宿主細胞として使用されてもよい。本発明の多価組換型ウイルスは、イーグルＭＥＭ、レイボヴィッツ−Ｌ−１５／マッコイ５Ａ（１：１混合物）培地などの培地において、約３７℃で３〜４日間培養されてもよい。こうして得られた感染細胞は、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する培地において懸濁され、液体窒素で凍結して保存される。
【００９４】
本発明の組換型多価ヘルペスウイルスは、継代を通して高いレベルの安定性を示すことが有利であり、このことは、１０回以上の継代した後でさえ、鳥類の細胞において組換型ヌクレオチド配列が共発現するということに対応する。本発明の文脈において、「継代」又は「細胞継代」は、成長させ、９０％〜１００％融合性になるまで生き続けさせるための適切な条件における細胞の培養を意味する。継代工程は、先の融合性培養物の少数の細胞を新しい培地へ移植することである。少数の細胞を含む分割量の先の融合性培養物を大きな体積の新鮮媒体によって希釈してもよい。接着培養物の場合、新しい培地に播種するために少数の剥離細胞を使用する前に、トリプシンとＥＤＴＡ又は任意の適切な酵素との混合物を用いて細胞をまず剥離してもよい。
【００９５】
本発明の好ましい実施形態によると、本発明の組換型鳥ヘルペスウイルスでトランスフェクトされたＣＥＦ細胞は、少なくとも１０回継代した後、対応する抗原ペプチドを依然として共発現する。言い換えると、本発明の組換型鳥ヘルペスウイルスによってトランスフェクトされたＣＥＦ細胞を１０回以上、特に、１５回継代した結果生じるＣＥＦ細胞は、初期細胞トランスフェクションに使用された組換型鳥ヘルペスウイルスの外来ヌクレオチド配列を依然として含み、少なくとも２つの対応する抗原ペプチドを発現する。本発明の文脈において、前記継代の細胞は、産生レベルが第１回目の継代の産生レベルの８０％、特に８５％を上回るならば、依然として抗原ペプチドを発現するとみなす。
【００９６】
多価ワクチン組成物
本発明は、家禽などの鳥類を免疫化するための、有効免疫量の本発明の多価組換型鳥ヘルペスウイルスを含む多価ワクチンにも関する。
【００９７】
特に、本発明のワクチンは、鳥パラミクソウイルス１型、ガンボロ病ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス、マイコプラズマ・ガリセプチカム、及び鳥インフルエンザウイルスから選択される少なくとも２つの病原体に対して免疫性を引き起こす、促進する、又は増幅することができる。
【００９８】
本発明のワクチンは、薬学的に許容可能なビヒクル中に、上述のような免疫的に有効量の多価組換型ヘルペスウイルスを含んでいる。
【００９９】
本発明の多価組換型ヘルペスウイルスは、不活化ワクチン又は弱毒化ワクチンのような他の代替形態も当業者の技術範囲内であるが、好ましくは生ワクチンとして使用されてもよい。
【０１００】
本発明のワクチンは、例えば、水性緩衝液又はリン酸塩緩衝液などの適切な溶媒をさらに含んでいてもよい。ワクチンは、添加物も含んでいることが好ましい。本発明の添加物は、多数の供与源のいずれかから取得されてもよい。なお、多数の供与源には、免疫応答を向上させるために十分な量でワクチンと共に投与される、動物由来の様々なタンパク質及びペプチド（例えば、ホルモン、サイトカイン、共同期因子）、並びに、ウイルス由来の新しい核酸及び他の供与源（例えば、２本鎖のＲＮＡ、ＣｐＧ）などが含まれる。さらに、上記物質の任意の数の組合せは、免疫強化効果を提供することがあり、したがって、本発明の免疫強化物質を形成することができる。
【０１０１】
本発明のワクチンは、等張性、生理ｐＨ、及び安定性を維持するために、例えば、生理食塩水（０．８５％）、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＳ）、トリス緩衝食塩水などの緩衝液、又は抗生物質（例えば、ネオマイシン又はストレプトマイシンなど）といった１つ以上のさらなる添加物によってさらに調整されてもよい。
【０１０２】
投与の経路は、経口投与、点眼投与（例えば、目薬による）、エアロゾルを用いる眼鼻投与、鼻腔内投与、混餌による総排泄腔への投与、水中投与若しくはスプレーによる投与、卵内投与、局所投与、又は（例えば、静脈、皮下、筋肉、眼窩内、眼内、皮内、及び／若しくは腹腔内）注射によるワクチン接種を含むいずれの経路でもよい。当業者は、ワクチン組成物の製剤を各種投与経路に簡単に適応させるであろう。
【０１０３】
各ワクチン投与量は、鳥類における保護免疫応答を誘導するのに十分な適切な投与量を含んでいてもよい。このような投与量の最適化は、当分野において周知である。投与量当たりの抗原の量は、抗原／抗体反応を用いる周知の方法、例えばＥＬＩＳＡ法によって決定されてもよい。
【０１０４】
本発明のワクチンは、ワクチン接種プロトコルに応じて、一回量又は繰り返し投与量として投与され得る。
【０１０５】
本発明のワクチンは、ワクチン接種の３週間後に目標鳥病原体に対して最大８０％の保護を鳥類に与える、という点においてさらに有利である。
【０１０６】
さらに、本発明は、家禽などの鳥類を免疫化するための上述のようなワクチンの使用、及び免疫有効量の本発明のワクチンを投与することにより鳥類を免疫化する方法に関する。ワクチンは、有利には、皮内、皮下、筋肉、経口、卵内、粘膜からの投与又は眼鼻経由で投与されてもよい。
【０１０７】
さらに、本発明は、鳥類を免疫化するための、上述のような有効量の多価ワクチンを含むワクチン接種キット、及び前記成分を前記鳥類に投与するための手段に関する。例えば、このようなキットは、本発明の多価ワクチンが充填された注射器、及び皮内、皮下、筋肉、又は卵内の注射のための指示書とを含む。あるいは、このキットは、本発明の多価ワクチンが充填されたスプレー／エアロゾル又は点眼器と、眼鼻投与、経口又は粘膜からの投与のための指示書とを含む。
【０１０８】
次に、以下の実験及び実施例を参照して、本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これらの実験及び実施例によって限定されないものと理解される。
【０１０９】
実験
実験において、以下のように（ＨＶＴ／第１挿入部位−第１外来遺伝子／第２挿入部位−第２外来遺伝子）指定される、（一価又は本発明の多価の）複数の組換型ヘルペスウイルスを使用した：
ＦＷ１２２： ＨＶＴ／４５−４６ Ｈｃｍｖ ＶＰ２ Ｂａｃ Ｆ
ＦＷ１２３： ＨＶＴ／４４−４５ Ｂａｃ ＶＰ２、
ＦＷ１２５： ＨＶＴ／４５−４６ Ｂａｃ Ｆ／４４−４５ Ｈｃｍｖ ＶＰ２
ＦＷ１２９： ＨＶＴ／４５−４６ ＰｅｃＦ／４４−４５ Ｒｓｖ ＶＰ２
ＦＷ１３０： ＨＶＴ／４５−４６ ＰｅｃＦ／４４−４５ ＳＶ４０ ＶＰ２
ＦＷ１３５： ＨＶＴ／４５−４６ ｓｖ４０ Ｆ／４４−４５ Ｂａｃ ＶＰ２
ＦＷ１３７： ＨＶＴ／４５−４６ ＰｅｃＦ ｓｖ４０ ＶＰ２
ＦＷ１４１： ＨＶＴ／４５−４６ ＰｅｃＦ／４４−４５ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ＶＰ２
ＦＷ１４２： ＨＶＴ／４５−４６ Ｂａｃ ＶＰ２／４４−４５ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｆ
ＦＷ１４４： ＨＶＴ／４５−４６ ＰｅｃＦ／８７−８８ Ｍｃｍｖｉｅ１ＶＰ２
ＦＷ１４５： ＨＶＴ／４５−４６ Ｂａｃ ＶＰ２／８７−８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｆ
ＦＷ０２３： ＨＶＴ／４５−４６ Ｂａｃ ＶＰ２
ＦＷ０２９： ＨＶＴ／４５−４６ ＰｅｃＦ
実験１：相同性ベクターの作成
プラスミド作成を、標準的な分子生物学技術（Molecular Cloning: ALaboratory Manual. 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, N.Y. 2001）によって実質的に行った。ＤＮＡ制限断片を、アガロースゲルにおいて電気泳動し、Ｐｌａｓｍｉｄｐｌｕｓ ＭｉｄｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、Ｃａｔ＃１２９４５）を用いて精製した。
【０１１０】
ｐ４４／４５ｄ４６Ｓｆｉの作成
ＭＤＶ血清１型のｇＣ相同体（ｇＣｈ）遺伝子の情報（Coussens et al., J.Virol. 62:2373-2379, 1988）と、その隣接するＢａｍＨＩ−Ｂ断片（特開平０６−２９２５８３）とに基づいて、２つのＯＲＦ、すなわち、ＵＬ４４ｈとＵＬ４５ｈとの間にＳｆｉＩ部位を有するＤＮＡ断片を、ＰＣＲにより調製し、ｐＵＣ１８にクローン化した。まず、Ｌｅｅ他（J. Gen. Virol., 51 : 245-253, 1980）の方法に基づいてＨＶＴＦＣ１２６菌種を感染させたＣＥＦ細胞からＨＶＴ  ＤＮＡを調製した。得られたＨＶＴＤＮＡをテンプレートとして使用して、２対のプライマーと共にＰＣＲを行った。
第１対は配列番号：７（５’−ＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＴＴＴＣＣ−３’）及び配列番号：８（５’−ＣＧＣＧＧＧＣＣＡＡＴＡＡＧＧＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＧＡＣＧＴＡＣＡＴＣ−３’）であった。
第２対は、配列番号：９（５’−ＧＣＧＣＧＧＣＣＴＴＡＴＴＧＧＣＣＴＴＡＡＡＴＡＣＣＧＣＧＴＴＴＧＧＡＧ−３’）及び配列番号：１０（５’−ＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＧＴＧＡＴＡＣＴＧＣＧＴＧＡ−３’）であった。
【０１１１】
得られた２つのＰＣＲ生成物の混合物をテンプレートとして使用し、配列番号７及び配列番号１０と共に別のＰＣＲを実施して２つのＯＲＦ、すなわち、ＵＬ４４ｈとＵＬ４５ｈとの間にＳｆｉＩ部位を有する断片を生成した。
【０１１２】
結果として生じた断片を、次に、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、ｐＵＣ１８に結合した。ｐＵＣ１８は、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによる消化によって得られたものである。得られたプラスミドがｐ４４／４５Ｓｆｉであった。
【０１１３】
２つの遺伝子がそれぞれＵＬ４４／４５及びＵＬ４５／４６に挿入された二重組換型ＨＶＴを作成するため、ＵＬ４６遺伝子をｐ４４／４５Ｓｆｉから削除した。ＥｃｏＲＩ及びＳｆｉＩによって消化されたｐ４５／４６Ｓｆｉ（ＵＳ７５６９３６５）を、ｄＳｆｉＩ−ＥｃｏＲＩリンカーと結合し、プラスミドｐ４４／４５ｄ４６が得られた。ＳｐｈＩ及びＰｓｔＩにて切断されたｐ４４／４５Ｓｆｉを、同じ酵素にて切断されたｐ４４／４５ｄ４６と結合し、プラスミドｐ４４／４５ｄ４６Ｓｆｉを得た。
【０１１４】
ｐＨＶＴ８７−８８の作成
Ｌｅｅ他（J. Gen. Virol., 51:245-253, 1980）の方法に従ってＨＶＴＦＣ１２６菌種に感染させたＣＥＦ細胞からＨＶＴＤＮＡを調製した。得られたＨＶＴ ＤＮＡをテンプレートとして使用して、２対のプライマーと共にＰＣＲを行った。各プライマーを、Ｇｅｎｂａｎｋ Ｘ６８６５３．１の情報に基づいて設計した。２つのＯＲＦ、すなわち、Ｕ
Ｓ２（ＨＶＴ０８８）とＳＯＲＦ３（ＨＶＴ０８７）との間にＳｆｉＩ部位を有するＤＮＡ断片を、ＰＣＲにより調製し、ｐＵＣ１８にクローン化した。
第１対は、配列番号１１（５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＡＡＧＡＧＣＣＣＣＣＧＣＧＧＡＣＧＣＡＴＧ−３’）及び配列番号１２（５’−ＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＴＴＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧ−３’）であった。
第２対は、配列番号１３（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＴＴＡＴＴＧＧＣＣＧＴＡＧＣＡＴＡＡＡＧＡＣＧＣＡＧＧ−３’）及び配列番号１４（５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＧＡＣ−３’）であった。
【０１１５】
結果として生じた第１の断片を、ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩによって消化した。結果として生じた第２の断片を、ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって消化した。これらの切断された断片を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにて切断されたｐＵＣ１８に統合し、プラスミドｐＨＶＴ８７−８８を得た。
【０１１６】
ｐＨＶＴ８６−８７の作成
Ｌｅｅ他（J. Gen. Virol., 51 : 245-253, 1980）の方法に基づきＨＶＴＦＣ１２６菌種に感染したＣＥＦ細胞からＨＶＴＤＮＡを調製した。得られたＨＶＴ ＤＮＡをテンプレートとして使用し、２対のプライマーと共にＰＣＲを行った。各プライマーを、Ｇｅｎｂａｎｋ Ｘ６８６５３．１の情報に基づいて設計した。２つのＯＲＦ、すなわち、ＵＳ
１０（ＨＶＴ０８６）とＳＯＲＦ３（ＨＶＴ０８７）との間にＳｆｉＩ部位を有するＤＮＡ断片を、ＰＣＲにより調製し、ｐＵＣ１８にクローン化した。
第１対は、配列番号１５（５’−ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＴＣＣＣＡＴＣＴＡＡＣＡＧＴＴＡＴＡＴＡＣＧ−３’）及び配列番号１６（５’−ＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＡＣＡＡＣＣＴＴＡＣ−３’）であった。
第２対は、配列番号１７（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＴＴＡＴＴＧＧＣＣ
ＧＴＴＴＡＴＴＣＴＡＴＧＴＡＡＧＡＣ−３’）及び配列番号１８（５’−ＣＣＣＡＡ
ＧＣＴＴＡＡＧＴＴＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧ−3’）であった。
【０１１７】
結果として生じた第１の断片を、ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩによって消化した。結果として生じた第２の断片を、ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって消化した。これらの切断された断片を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにて切断されたｐＵＣ１８に統合し、プラスミドｐＨＶＴ８６−８７を得た。
【０１１８】
相同性ベクターの作成
化学合成されたＭｃｍｖ ｉｅ１プロモーター
Ｍｃｍｖ ｉｅ１プロモーター（配列番号１９）を、Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ， Ｕ．Ｈ．により報告されたＧｅｎｅＢａｎｋＬ０６８１６．１における４１９１−４７３１ｂｐの情報に基づいて合成した。合成したＭｃｍｖｉｅ１プロモーターを、ＢｇｌＩ−ＰｓｔＩ部位をその先頭に追加し、ＸｂａＩ−ＮｏｔＩ部位をその末尾に付加して設計した。配列番号１９：ＧＧＣＣＡＡＴＡＡＧ ＧＣＴＧＣＡＧＴＡＣＴＧＡＧＴＣＡＴＴＡ ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ ＡＡＴＧＧＧＴＴＴＴ ＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡ ＴＡＡＧＧＴＣＡＡＴ ＡＧＧＧＧＴＧＡＡＴ ＣＡＡＣＡＧＧＡＡＡ ＧＴＣＣＣＡＴＴＧＧＡＧＣＣＡＡＧＴＡＣ ＡＣＴＧＡＧＴＣＡＡ ＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴ ＣＣＡＴＴＧＧＧＴＴ ＴＴＧＣＣＣＡＧＴＡ ＣＡＡＡＡＧＧＴＣＡ ＡＴＡＧＧＧＧＧＴＧ ＡＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＴＴＴＴＣＣＣＡＴ ＴＡＴＴＧＧＣＡＣＧ ＴＡＣＡＴＡＡＧＧＴ ＣＡＡＴＡＧＧＧＧＴ ＧＡＧＴＣＡＴＴＧＧ ＧＴＴＴＴＴＣＣＡＧ ＣＣＡＡＴＴＴＡＡＴ ＴＡＡＡＡＣＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＴＴＣＣ ＣＡＣＣＡＴＴＧＡＣ ＧＴＣＡＡＴＧＧＧＣ ＴＡＴＴＧＡＡＡＣＴ ＡＡＴＧＣＡＡＣＧＴ ＧＡＣＣＴＴＴＡＡＡ ＣＧＧＴＡＣＴＴＴＣ ＣＣＡＴＡＧＣＴＧＡＴＴＡＡＴＧＧＧＡＡ ＡＧＴＡＣＣＧＴＴＣ ＴＣＧＡＧＣＣＡＡＴ ＡＣＡＣＧＴＣＡＡＴ ＧＧＧＡＡＧＴＧＡＡ ＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡ ＡＡＡＣＧＴＡＡＣＡ ＣＣＧＣＣＣＣＧＧＴＴＴＴＣＣＣＣＴＧＧ ＡＡＡＴＴＣＣＡＴＡ ＴＴＧＧＣＡＣＧＣＡ ＴＴＣＴＡＴＴＧＧＣ ＴＧＡＧＣＴＧＣＧＴ ＴＣＴＡＣＧＴＧＧＧ ＴＡＴＡＡＧＡＧＧＣ ＧＣＧＡＣＣＡＧＣＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＴ ＣＧＣＡＧＴＣＴＴＣ ＧＧＴＣＴＧＡＣＣＡ ＣＣＧＴＡＧＡＡＣＧ ＣＡＧＡＧＣＴＣＣＴ ＣＧＣＴＧＣＡＧＧＣ ＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡ ＧＡ
ｐ４４／４５Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ＶＰ２ ＳＰＡの作成
ＳｆｉＩにて切断されたｐ４４−４５ｄ４６Ｓｆｉを、アルカリホスファターゼシュワネラ由来Ｓ１Ｂ１組換体（ＰＡＰ）（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ社＃ＤＥ１１０）を用いて脱リン酸化した。断片を、ＢｇｌＩにて切断されたｐ４５／４６ＢａｃＶＰ２と結合し、プラスミド、ｐ４４／４５ｄ４６ＢａｃＶＰ２を得た。合成されたＭｃｍｖ ｉｅ１プロモーター（ＢｇｌＩ／ＸｂａＩ）を、ＥｃｏＲＶ及びＸｂａＩにて切断されたｐ４４／４５ｄ４６ ＢａｃＶＰ２と、ＥｃｏＲＶ及びＢｇｌＩにて切断されたｐ４４／４５ｄ４６Ｂａｃ ＶＰ２とに結合し、ｐ４４／４５ｄ４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ＶＰ２を得た。合成された短いポリＡシグナル（ＳＰＡ：配列番号２０ＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＣＣＡＡＴＡＡＧＧＣＣ）を、ＳａｌＩ及びＳｆｉＩにて切断されたｐ４４／４５ｄ４６Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ＶＰ２に統合し、相同性プラスミド、ｐ４４／４５ｄ４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ＶＰ２ ＳＰＡを得た。
【０１１９】
実験２：各トランスファーベクターによってトランスフェクトされたＣＥＦにおける組換型ＨＶＴの精製
ＨＶＴ野生型のウイルスＤＮＡ、ＦＣ１２６菌種（ｗｔ−ＨＶＴ）をＭｏｒｇａｎ他（AvianDiseases, 34:345-351, 1990）の記載に従って調製した。ＦＷ０２９（ｒＨＶＴ／４５−４６ＰｅｃＦ）及びＦＷ０２３（ｒＨＶＴ／４５−４６ＢａｃＶＰ２）のウイルスＤＮＡを同様の方法で調製した。第１の二重ｒＨＶＴパターンは、ＣＥＦ細胞に調製したｗｔ−ＨＶＴＤＮＡ及びｐ４５／４６ｓｖ４０ＶＰ２ ＰｅｃＦをトランスフェクトした（例：ＦＷ１３７）ものであった。第２のパターンは、ＣＥＦ細胞に調製したＦＷ０２９ＤＮＡ及びｐ４４／４５Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ＶＰ２をトランスフェクトしたものであった（例：ＦＷ１４１）。第３のパターンは、ＣＥＦ細胞に、調製したＦＷ０２３ ＤＮＡ及
びｐ４４／４５ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｆをトランスフェクトしたものであった（例：ＦＷ１
４２）。第４のパターンは、ＣＥＦに、調製したＦＷ０２９ ＤＮＡ及びｐＨＶＴ８７−
８８Ｂａｃ ＶＰをトランスフェクトしたものであった（例：ＦＷ１４４）。第５のパタ
ーンは、ＣＥＦに、調製したＦＷ０２３及びｐＨＶＴ８７−８８Ｐｅｃ Ｆをトランスフ
ェクトしたものであった（例：ＦＷ１４５）。結果として得られるこれらの組換型ウイルスは、抗ＮＤＶ−Ｆ抗体及び抗ＩＢＤＶ−ＶＰ２抗体により染色プラークによって精製されたプラークであった。
【０１２０】
簡単に言えば、１０７一次ＣＥＦ細胞を１００μｌのＭＥＦ−１（Ｌｏｎｚａ社、ＬＮＪＶＤ−１００４）において懸濁し、１μｇの相同性ベクター（例えば、ｐ４４／４５
Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｆ及びｐＨＶＴ Ｂａｃ ＶＰ２）と、２μｇのＨＶＴ ＤＮＡ（例えば
、ＦＣ１２６、ＦＷ０２９及びＦＷ０２３）とを電気穿孔法により同時トランスフェクトした。電気穿孔法をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭＩＩによって行った。トランスフェ
クト細胞を２０ｍｌのレイボヴィッツのＬ−１５（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｃａｔ．＃４１
３００−３９）、マッコイの５Ａ媒体（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｃａｔ．＃２１５００−０
６１）（１：１）、及び４％の子ウシ血清（溶液ＬＭ（＋）媒体と称する）において希釈し、９６ウェルプレートにウェル当たり１００ｕｌで塗布した。
【０１２１】
プラークが見えるようになるまで５％のＣＯ２において３７℃でインキュベートし、細胞を、トリプシン処理によってプレートから剥離し、新たに調製した二次ＣＥＦ細胞において希釈し、２つの９６ウェルプレートへ同じ様に移動し、３日間インキュベートしてプラークを可視化した。次に、２つのプレートの１つを、一次抗体としての抗ＶＰ２モノクローナル抗体Ｒ６３（ＡＴＣＣ＃：ＨＢ−９４９０）によって染色した。染色された組換型プラークを含むウェルを検出した後、他方のプレートの対応するウェルから細胞を回収し、新たな二次性のＣＥＦ細胞において希釈し、２つの９６ウェルプレートへ同じ様に移動して第１ラウンドの精製を完了した。この精製手続きを、全ての得られたプラークがモノクローナル抗体Ｒ６３により陽性に染色されるまで繰り返した。その後、前記二重ｒＨＶＴ候補を、抗ＮＤＶ−Ｆ抗体３−１Ｇ／５（Morrison, T.G., Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 84: 1020-1024, 1987）又は抗Ｆウサギ血清により染色した。最終的に、候補ｒＨＶＴの全てのプラークのタンパク質の発現が、デュアルＩＦＡ染色により確認された。各ｒＨＶＴに感染したＣＥＦを、冷アセトン−メタノール（２：１）で固定し、ＰＢＳで洗浄し、抗体混合物（１：１０００で希釈された抗Ｆウサギ血清＃３５及び抗ＶＰ２マウスＭａｂＲ６３）と３７℃で６０分間反応させた。ＰＢＳによって３回洗浄した後、細胞を、蛍光性抗体混合物（１：１０００で希釈された、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により提供される抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８及び抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）と３７℃で６０分間反応させた。ＰＢＳによって３回洗浄した後、細胞を拡大率４００倍の蛍光顕微鏡で観察する。
【０１２２】
タンパク質ＶＰ２の発現を、抗ＶＰ２ Ｍａｂ（Ｒ６３）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５４６によって検出した。タンパク質Ｆの発現を、抗Ｆ＃３５ウサギ血清及びＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ ４８８によって検出した。全てのプラークがＦ及びＶＰ２の双方を発現した場合、精製が完了したと結論する。図３にデュアルＩＦＡのいくつかの例を示す。
【０１２３】
精製された組換型ＨＶＴをｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＢＤとした。
【０１２４】
以下の表１は、異なるｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＢＤから得られたＶＰ２及びタンパク質Ｆの発現を示す。菌種ＦＷ０２３（ＨＶＴ／４５−４６Ｂａｃ ＶＰ２）は、ＶＰ２発現のためのコントロールとして使用される一価組換型ヘルペスウイルスに対応し、ＦＷ０２９（ＨＶＴ／４５−４６ ＰｅｃＦ）は、タンパク質Ｆ発現のためのコントロールとして使用される一価組換型ヘルペスウイルスに対応する。
【０１２５】
【表１】
2019080571.tif 000003
【０１２６】
実験３：二重組換型ＨＶＴに感染したＣＥＦにおける２つのタンパク質の共発現
２×１０５のＣＥＦを含む２ｍｌの細胞を、組換型ＨＶＴに感染させ、３７℃で５％のＣＯ２において３日間インキュベートした。
【０１２７】
次に、この培養物を３００ｇで３分間遠心分離し、沈降した細胞を１００ｕｌにおいて再懸濁した。Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（１００ｕｌ）を細胞懸濁液に添加した。結果として得られる混合物を、次に、５分間煮沸し、混合物のうちの５ｕｌに対して１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法を行った。電気泳動したタンパク質をＳＤＳゲルからＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）へ移動し、ＰＢＳ中１％ｗ／ｖの脱脂粉乳を用いて室温で１時間ブロックした。
【０１２８】
Ｆを検出するために（図４Ａ）、前記処理した膜を、次に、５００倍に希釈した抗Ｆウサギ抗血清＃３５と室温で１時間反応させ、ＰＢＳで３回洗浄し、ビオチン化抗ウサギヤギ抗血清で１時間インキュベートした。
【０１２９】
ＶＰ２を検出するために（図４Ｂ）、前記処理した膜を、次に、５００倍に希釈した抗ＶＰ２ ＭａｂＲ６３と室温で１時間反応させ、ＰＢＳで３回洗浄し、ビオチン化抗マウスヤギ抗血清で１時間インキュベートした。
【０１３０】
ＰＢＳで３回洗浄した後、前記膜を、アビジン−アルカリホスファターゼ錯体で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回、そして、ＴＢＳ（トリス緩衝食塩水）で１回洗浄し、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ（アルカリホスファターゼの基質）と反応させた。図４Ａに示すように、６０キロダルトン（ｋＤａ）のタンパク質バンドは、ｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＢＤ感染細胞を有するレーンにおいてのみ観察され、Ｆタンパク質の予期されたサイズであった（→）。ｒＨＶＴ／４４−４５ＢａｃＶＰ２（ＦＷ１２３）のレーンにバンドは無かった。
【０１３１】
図４Ｂに示すＶＰ２タンパク質を、３８キロダルトン（ｋｄ）で各ｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＢＤのレーンにおいて観察した（⇒）。対照的に、ｒＨＶＴ／ＰｅｃＦ（ＦＷ０２９）のレーンにおいてバンドは無かった（図１Ｂ）。３８ｋｄは、成熟ＶＰ２タンパク質である（A. A. Azad et al., 1987, Virol. 161:145-152, K. J., Fahey et al.,1985 J. Gen.Virol. 66:1479-1488）。
【０１３２】
本発明の二重組換型ＨＶＴは、ＮＤＶ−Ｆ及びＩＢＤＶＶＰ２の双方を発現した。
【０１３３】
実験４：ゲノム構造の検証
サザンブロッティング分析
精製したｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＢＤを１つの２５ｃｍ２フラスコのＣＥＦ細胞で増殖させて、融合性プラークを得た。細胞を、擦過により皿から回収し、ファルコンチューブへ移動させ、３００ｘｇで５分間遠心沈殿法を行った。回収した細胞をＰＢＳで洗浄し、０．６ｍｌのＰＢＳ及び０．４ｍｌの溶菌緩衝液（ＰＢＳ中の１．２５％のトリトンＸ−１００、２５０ｍＭの２−ＭＥ、及び５０ｍＭのＥＤＴＡ）において再懸濁し、３分間ボルテックス法を行って溶解した。次に、この溶菌液を、６００ｘｇで５分間、室温で遠心分離し、上澄液を、１５ｍｌファルコンチューブへ移動した。ウイルスを、２０，４００ｘｇで２０分間の遠心沈殿法により収集した。結果として生じるペレットを、次に、０．３３ｍｌのヌクレアーゼ溶液（１２．５ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ、及び１μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａ）において懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートし、８３μｌのＳＤＳ−プロテアーゼ溶液（５０ｍＭのＥＤＴＡ、５％のＳＤＳ、０．５ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＫ、及び２８．５ｍＭの２−メルカプトエタノール）で５５℃で３０分間インキュベートすることによって破壊した。得られた混合物を、フェノール−クロロホルムで２回処理し、ＮａＣｌを、水相へ添加して、最終的に０．２Ｍの濃度にした。ウイルスＤＮＡを、２．５体積の氷冷エタノールを添加することにより沈降させ、７０％のエタノールで洗浄し、２０，４００ｘｇで２０分間４℃で遠心沈殿法を行った。風乾後、ペレットを、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶かした。
【０１３４】
ＴＥ緩衝液中のウイルスＤＮＡを、ＸｈｏＩ、ＳｐｈＩ及びＳｍａＩによって消化し、０．８％のアガロースゲル電気泳動法を行った。単一ゲルにおける電気泳動したＤＮＡ断片を、２枚のナイロン膜へ同時に移動した（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition, 6.35,Sambrook, J., and Russell, D.W. Cold Spring Harbor Laboratory）。ベーキングによりＤＮＡを固定した後、固定したＤＮＡを、ＰＣＲＤＩＧプローブ合成キット（ＲＯＣＨＥ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ社、Ｃａｔ．＃１６３６０９０）により調製された、ＤＩＧによりラベルされたプローブ、「ＶＰ２プローブ」、又は「ＩＳ４４／４５プローブ」でハイブリダイズした。さらに、ＴＥ緩衝液中のウイルスＤＮＡを、ＸｈｏＩ及びＳｐｈＩで消化し、ＤＩＧによりラベルされたプローブ、「Ｆプローブ」、「ＩＳ４５／４６プローブ」で上記と同じ手順でハイブリダイズした。ＶＰ２プローブは、プライマーとしてのＶＰ２ＳＴＣ−Ｆ（配列番号２１）及びＶＰ２ ＳＴＣ−Ｒ（配列番号２２）と、テンプレートとしてのｐ４５／４６ｂａｃＶＰ２−ＳＴＣとにより調製された。Ｆプローブは、プライマーとしてのＦ−Ｆ（配列番号２３）及びＦ−Ｒ（配列番号２４）と、テンプレートとしてのｐ４５／４６ＰｅｃＦとにより調製された。ＩＳ４５／４６プローブは、プライマーとしての４５／４６−Ｆ（配列番号２５）及び４５／４６−Ｒ（配列番号２６）と、テンプレートとしてのｐＮＺ４５／４６Ｓｆｉとにより調製された。ＩＳ４４／４５プローブは、プライマーとしての４４／４５−Ｆ（配列番号２７）及び４４／４５−Ｒ（配列番号２８）と、テンプレートとしてのｐＮＺ４４／４５ｄ４６Ｓｆｉとにより調製された。
ＶＰ２ＳＴＣ−Ｆ（配列番号２１）５’−ＣＡＣＣＧＴＣＣＴＣＡＧＣＴＴＡＣＣＣＡＣＡＴＣ−３’
ＶＰ２ＳＴＣ−Ｒ（配列番号２２）５’−ＡＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＧＣＣＡＣＴＣＴ−３’
ＮＤＶ−Ｆ−Ｆ（配列番号２３）５’−ＣＴＡＧＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＴＧＧＧＡＡＧＡＴ−３’
ＮＤＶ−Ｆ−Ｒ（配列番号２４）５’−ＧＴＴＡＡＧＧＣＡＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＴＴＴＧＴ−３’
４５／４６−Ｆ（配列番号２５）５’−ＧＧＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＴＡＡＧＧＧＡＣ−３’
４５／４６−Ｒ（配列番号２６）５’−ＧＧＴＧＣＡＡＴＴＣＧＴＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧ−３’
４４／４５−Ｆ（配列番号２７）５’−ＧＴＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＧＴＧＴＴＣＣ−３’４４／４５−Ｒ（配列番号２８）５’−ＧＴＡＴＣＣＡＡＣＧＣＣＴＣＡＡＧＡＴＣ−３’
サザンブロッティングの結果は、２０７７−ｂｐ断片がＦＷ１２９からのＤＮＡにおいてＶＰ２プローブとハイブリダイズしたということを示した（図５Ａ〜図５Ｄ）。対照的に、ｐ４５／４６ＰｅｃＦにおいてバンドは検出されなかった。
【０１３５】
さらに、２７４４−ｂｐ断片は、各二重組換型ＨＶＴからのＤＮＡにおいてＦプローブとハイブリダイズした。ｐ４５／４６ ＳｆｉＩにおいてバンドは検出されなかった。
【０１３６】
２０７７−ｂｐ及び１２２８−ｂｐ断片は、ＦＷ１２９からのＤＮＡにおいてＩＳ４４／４５プローブとハイブリダイズした。１３５０−ｂｐ断片は、ＩＳ４４／４５部位において遺伝子が挿入されていないｐ４５／４６ＰｅｃＦにおけるＩＳ４４／４５プローブとハイブリダイズした。
【０１３７】
２７４４−ｂｐ及び７７０−ｂｐ断片は、各二重組換型ＨＶＴからのＤＮＡにおけるＩＳ４５／４６プローブとハイブリダイズした。図５Ａ〜図５Ｄは、得られた二重組換型ＨＶＴ／ＮＤ／ＩＢＤが予期したゲノム構造を有するということを示した。
【０１３８】
実験５：継代における組換型ＨＶＴの安定性
ウエスタンブロッティング分析
二重組換型ＨＶＴを、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において連続して（最大１５回）継代した。次に、細胞溶菌液を、ウエスタンブロット分析に適用した。第１パネルにおいて（図６Ａ）、ブロットを抗Ｆウサギ血清（＃３５）と反応させた。第２パネルにおいて（図６Ｂ）、ブロットを抗ＶＰ２Ｍａｂ（Ｒ６３）と反応させた。模擬：未感染ＣＥＦ。Ｍ：プレシジョンＰｌｕｓプロテインスタンダード、Ｂｉｏ Ｒａｄ社、＃１６１−０３７４。
１５回継代した後、二重組換型ＨＶＴに感染したＣＥＦにおいて、Ｆ及びＶＰ２が安定して発現された。しかしながら、ＦＷ１３７は、１５継代後、Ｆ及びＶＰ２抗原の信号を発現せず、単一部位に２つの遺伝子を有する組換型ＨＶＴは不安定であることを示した。
【０１３９】
サザンブロッティング分析
Ｍ：分子マーカーラムダＨｉｎｄＩＩＩ消化
ＴＰ−２４：トランスファープラスミドｐ４４−４５ｄ４６ＳＶ４０ＶＰ２
ＴＰ−２５：トランスファープラスミドｐ４４−４５ｄ４６ＲｓｖＶＰ２
各ｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＢＤをＣＥＦ細胞において１５回継代し、実験４に記載のようにサザンブロット分析を行った。結果は、実験４において得られたのと同様であり、１５回継代した後でも組換型ウイルスが安定していることを示した。
【０１４０】
図７Ａにおいて、サザンブロッティングの結果は２０７７−ｂｐ断片がＦＷ１２９からのＤＮＡにおいてＶＰ２プローブとハイブリダイズしたことを示している。２３３４−ｂｐ断片は、ＦＷ１３０からのＤＮＡにおいてＶＰ２プローブとハイブリダイズした。対照的に、ｐ４５／４６ＰｅｃＦにおいてバンドは検出されなかった。
【０１４１】
図７Ｃは、２７４４−ｂｐ断片は、各二重組換型ＨＶＴからのＤＮＡにおいてＦプローブとハイブリダイズしたということを示す。ｐ４５／４６ＳｆｉＩにおいてバンドは検出されなかった。
【０１４２】
図７Ｂは、２０７７−ｂｐ及び１２２８−ｂｐ断片がＦＷ１２９からのＤＮＡにおけるＩＳ４４／４５プローブとハイブリダイズし、２３３４−ｂｐ及び１０２２−ｂｐ断片がＦＷ１３０からのＤＮＡにおけるＩＳ４４／４５プローブとハイブリダイズしたことを示す。１３５０−ｂｐ断片は、ＩＳ４４／４５部位において遺伝子を含んでいないｐ４５／４６ＰｅｃＦにおけるＩＳ４４／４５プローブとハイブリダイズした。
【０１４３】
図７Ｄは、２７４４−ｂｐ及び７７０−ｂｐ断片が各二重組換型ＨＶＴからのＤＮＡにおいてＩＳ４５／４６プローブとハイブリダイズしたことを示す。
４４／４５プローブ及び４５／４６プローブによるサザンブロットは、ＦＷ１２９及びＦＷ１３０における各挿入部位４４／４５又は４５／４６において安定して維持されたＶＰ２遺伝子又はＦ遺伝子を示した。
【０１４４】
実験６：二重組換型ＨＶＴが接種されたニワトリにおける抗ＮＤＶ及びＩＢＤＶのＥＬＩＳＡ力価
１羽当たり３，０００ＰＦＵ／２００μｌの各ｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＢＤを生後１日のニワトリ（ＬｉｎｅＭ、Ｊａｐａｎ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）１０羽の背中に２０ゲージシリンジを用いて皮下接種した。ワクチン接種後３週間以降に、ワクチン接種した鳥から血清を収集した。抗ＮＤＶ抗体力価を、市販のＥＬＩＳＡキット（ＩＤＥＸＸ、ニューカッスル病を診断するためのＥＬＩＳＡキット）を用いて測定した。抗ＩＢＤＶ抗体を、市販のＥＬＩＳＡキット、ＦｌｏｃｋＣｈｅｃｋ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＢｕｒｓａｌＤｉｓｅａｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｓｔキット（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｉｎｃ．社）を用いて滴定した。陰性の対照群（非免疫）のニワトリにはワクチンを投与しなかった。
【０１４５】
図８Ａは、抗ＮＤＶ力価の変化を示す。図８Ｂは、抗ＩＢＤＶ力価の変化を示す。
【０１４６】
２つの部位を使用する二重組換型ＨＶＴは、抗ＮＤＶ力価及び抗ＩＢＤＶ力価の双方を安定して誘発した。
【０１４７】
実験７：ＮＤＶに対するＳＰＦニワトリにおけるｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＢＤの有効性
ＮＤワクチンとしてのｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＢＤ（ＦＷ１３０、ＦＷ１３５、ＦＷ１３７、ＦＷ１２９）の有効性を、ニューカッスル病ワクチンとしての有効性試験を用いて評価した。
【０１４８】
１羽当たり３，０００ＰＦＵ／２００μｌのｒＨＶＴ／ＮＤを生後１日のニワトリ（ＬｉｎｅＭ、Ｊａｐａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）１０羽の背中に２０ゲージシリンジを用いて皮下接種した。ワクチン接種後３週間以降に、ワクチン接種した鳥から血清を収集した。抗ＮＤＶ抗体力価を、市販のＥＬＩＳＡキット（ＩＤＥＸＸ、ニューカッスル病を診断するためのＥＬＩＳＡキット）を用いて測定した。
【０１４９】
陽性の対照群のニワトリに、生後１４日で販売者の推薦に従って市販のＮＤＶ生ワクチンをワクチン接種した。陰性の対照群のニワトリには何のワクチンも投与しなかった。
【０１５０】
生後４３日（ワクチン接種後４２日）で、全ての７グループのニワトリに１０３ＥＩＤ５０のＮＤＶ−ＴｅｘａｓＧＢ（合衆国における標準的な抗原投与菌種）を大腿部に筋肉内投与した。抗原投与されたニワトリを、死亡率をチェックし、ニューカッスル病の何等かの症状を検出するために毎日観察した。
【０１５１】
【表２】
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【０１５２】
表２に示すように、本発明のｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＢＤがワクチン接種されたニワトリは、何の臨床兆候も示さず、抗原投与の日のＥＬＩＳＡ力価は顕著に上昇した。予期したとおり、ＦＷ１３７（２つの組換型ヌクレオチド配列が同じ挿入部位に挿入されている）又はＦＷ１３５（ＢａｃプロモーターがＵＬ４４とＵＬ４５との間に挿入されている）をワクチン接種したニワトリの双方は、臨床兆候を示し、ＥＬＩＳＡ力価は弱かった。
【０１５３】
実験８：ＩＢＤＶに対するＳＰＦニワトリにおけるｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＢＤの有効性
ＩＢＤワクチンとしてのＦＷ１２９及びＦＷ１４１（ＨＶＴ／４５−４６ ＰｅｃＦ／４４−４５ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ＶＰ２）の有効性をＩＢＤＶＳＴＣを抗原投与することにより評価した。
【０１５４】
まず、２，０００ｐｆｕのｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＢＤを、１８日目のＳＰＦ孵化鶏卵に、又は生後１日のＳＰＦニワトリの背中の皮下に接種した。生後３週間で、ワクチン接種したニワトリに、１羽当たり１０３．５ＥＩＤ５０のＩＢＤＶＳＴＣを経口で抗原投与した。１週間後、全てのニワトリを体重測定し、剖検してファブリキウス嚢を回収し、伝染性ファブリキウス嚢病により引き起こされる何等かの病巣について観察した。
【０１５５】
以下の２つの条件によって保護を評価した。（１）体に対する粘液嚢の重量比（Ｂ／Ｂ率）は、未ワクチン接種、未抗原投与のニワトリの重量比とは統計的に異なっていなかった。（２）浮腫化、出血、黄みを帯びた分泌物、変色、萎縮、又はゼリー状分泌物などのファブリキウス嚢の形成異常は検出されなかった。結果を表３にまとめた。
【０１５６】
【表３】
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【０１５７】
全てのワクチン接種されたニワトリの８０％を上回るニワトリが、ＩＢＤＶ  ＳＴＣ菌種の抗原投与に対して保護されていた。このことは、ｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＢＤが有毒なＩＢＤＶに対してニワトリにおける防御免疫を誘発することを示している。
【０１５８】
実験９：ＭＤＡ＋ニワトリにおける８週間でのＩＢＤＶ抗原投与試験
グループ：
Ｇ１：ＮＩＮＣ（ワクチン接種されておらず、抗原投与されていない）
Ｇ２：ＮＩＣＣ（ワクチン接種されておらず、抗原投与された）
Ｇ３：ＦＷ１４１
Ｇ４：ＦＷ１４４
Ｇ５：ＦＷ０２３（陽性の対照）
雛鳥
ＭＤＡ＋鳥（産卵鶏）、各グループにつき１６〜１７羽
３，０００ｐｆｕのワクチンを、生後１日の１７羽のＭＤＡ＋ニワトリの背中の皮下に接種した。生後８週間で、１羽につき１０３ＴＣＩＤ５０のＩＢＤＶ  ＳＴＣを経口で抗原投与した。１週間後、全てのニワトリを体重測定し、剖検してファブリキウス嚢を回収し、伝染性ファブリキウス嚢病により引き起こされる何等かの病巣について観察した。
【０１５９】
以下の２つの条件によって保護を評価した。（１）体に対する粘液嚢の重量比（Ｂ／Ｂ率）；（２）浮腫化、出血、黄味を帯びた分泌物、変色、萎縮、又はゼリー状分泌物などのファブリキウス嚢の形成異常が検出されなかった。結果を以下の表にまとめる。
【０１６０】
【表４】
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【０１６１】
これらの結果は、本発明の多価ワクチンはＩＢＤＶに対してインビボで有効な保護を行う、ということを示す。
【０１６２】
実験１０：ＭＤＡ＋ニワトリにおける８週間でのＮＤＶ抗原投与試験
グループ
Ｇ１：抗原投与対照
Ｇ２：ＦＷ１４１
Ｇ３：ＦＷ１４４
Ｇ４：ＦＷ１４５
Ｇ５：ＦＷ０２９（陽性の対照）
雛鳥
ＭＤＡ＋鳥（産卵鶏）、各グループにつき１７羽
３，０００ＰＦＵのワクチンを、生後１日の１７羽のＭＤＡ＋ニワトリの背中の皮下に接種した。生後８週間で、ワクチン接種されたニワトリに、１０３ＥＩＤ５０のＮＤＶ−ＴｅｘａｓＧＢ（合衆国における標準的な抗原投与菌種）を大腿部の筋肉内に抗原投与した。抗原投与されたニワトリを、死亡率をチェックするため、及びニューカッスル病の何等かの症状を検出するために毎日観察した。結果を以下に示す。
【０１６３】
【表５】
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【０１６４】
これらの結果は、本発明の多価ワクチンは、ＮＤＶ及びＩＢＤＶに対して、インビボでの有効な保護を行う、ということを示す。保護は、強く、且つ、安定している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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