(57)【要約】【課題】窒素固定効率を向上させ、ひいてはアンモニア生産効率を向上させるため、ニトロゲナーゼの活性が向上した糸状性藍藻を得ること。【解決手段】ＨｅｔＲ遺伝子にアミノ酸変異を有する糸状性藍藻であって、糸状体におけるヘテロシストが、野生株に比べて高頻度で存在し、且つヘテロシストとその隣のヘテロシストとの間に存在する細胞の数（ヘテロシスト間隔細胞数）の平均（期待値）が、野生株のヘテロシスト間隔細胞数の平均（期待値）よりも小さい、糸状性藍藻。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨｅｔＲ遺伝子にアミノ酸変異を有する糸状性藍藻であって、
糸状体におけるヘテロシストが、野生株に比べて高頻度で存在し、且つ
ヘテロシストとその隣のヘテロシストとの間に存在する細胞の数（ヘテロシスト間隔細胞数）の平均（期待値）が、野生株のヘテロシスト間隔細胞数の平均（期待値）よりも小さい、
糸状性藍藻。
【請求項２】
細胞がヘテロシストである割合が１１％以上である、請求項１に記載の糸状性藍藻。
【請求項３】
ヘテロシスト間隔細胞数の平均（期待値）が９以下である、請求項１又は２に記載の糸状性藍藻。
【請求項４】
ニトロゲナーゼ活性が野生株に比べて高い、請求項１〜３のいずれかに記載の糸状性藍藻。
【請求項５】
ＨｅｔＲ遺伝子の２００〜２９９番目の１個又は複数個のアミノ酸に変異が存在する、糸状性藍藻。
【請求項６】
Ａ４９Ｖ、Ａ２１６Ｖ、Ａ２１８Ｔ、及びＩ２７２Ｆからなる群より選択される、１つ以上のアミノ酸置換変異がＨｅｔＲ遺伝子に存在する、糸状性藍藻。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の変異糸状性藍藻を、窒素ガスを含む気相下で培養する工程を含む、窒素化合物を製造する方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の変異糸状性藍藻を、二酸化炭素ガスを含む気相下で培養する工程を含む、水素製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異糸状性藍藻等に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状性藍藻の一部は、ニトロゲナーゼの働きにより大気中の窒素ガスをアンモニアへ変換（窒素固定）し、その副反応で水素を発生する。ニトロゲナーゼは酸素に極めて弱いため、通常の光合成を行う栄養細胞が１０〜２０個に一つの割合（５〜１０％の頻度）で窒素固定を専門に行う異型細胞ヘテロシストへ分化し、その内部の酸素濃度を下げることで、酵素を酸素から保護できる。このために、ヘテロシスト形成する藍藻を利用したアンモニア生産は、酸素が存在する空気下でも可能である。
【０００３】
以上のことから、例えば遺伝子変異等により、ヘテロシストの形成頻度を増加させれば、窒素固定効率を向上でき、そしてアンモニア生産効率を向上できると考えられ、研究がなされてきた。ところが、従来の遺伝子変異等によるヘテロシスト頻度増加は、ほとんどの場合、ヘテロシストが２個以上連続して形成され、ニトロゲナーゼの活性増大につながらないという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−２５８５６３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍａｓｕｋａｗａ，  Ｈ．，  Ｓａｋｕｒａｉ，  Ｈ．，  Ｈａｕｓｉｎｇｅｒ，  Ｒ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２０１７）  １０１：  ２１７７．
【非特許文献２】Ｙｏｕｎｇ−Ｒｏｂｂｉｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１０）．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９２（１８）：  ４７３２−４７４０．
【非特許文献３】Ｒｉｓｓｅｒ  ＤＤ，  Ｃａｌｌａｈａｎ  ＳＭ  （２００９）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６（４７）：１９８８４-１９８８８．
【非特許文献４】Ｍａｓｕｋａｗａ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  Ｅｎｅｒｇ  ３９（３４）：  １９４４４−１９４５１．
【非特許文献５】Ｍａｓｕｋａｗａ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５８（５）：  ６１８−６２４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、遺伝子変異等により、ヘテロシスト頻度を増加させたとしても、ヘテロシストが２個以上連続して形成され、ニトロゲナーゼの活性増大につながらない。この原因について次のように考えられた。すなわち、ニトロゲナーゼの反応には、相当量の還元力（電子）が必要であるが、その還元力源となるのは、栄養細胞で合成されヘテロシストへ供給される糖質である。そのため、ヘテロシストが連続して形成されると、栄養細胞が隣接しないためヘテロシストへ供給される糠質量が低下し、その結果、ニトロゲナーゼの活性増大につながらないのではないかと考えられた。したがって、ヘテロシストは連続せず一定間隔をおいたパターンで、高頻度で形成されることがニトロゲナーゼの活性増大には重要であると考えられる。
【０００７】
そのようなパターンで高頻度なヘテロシストを形成する遺伝子変異が報告されている。例えば、ｐａｔＮ遺伝子破壊株（非特許文献１）及びｐａｔＡ過剰発現株（非特許文献２）。しかし、これらの例では、細胞分化及びニトロゲナーゼに関わる遺伝子の発現レベルが低下し、分化の開始が遅れるなどの異常が見られ、ニトロゲナーゼの活性は向上しない。
【０００８】
本発明は、窒素固定効率を向上させ、ひいてはアンモニア生産効率を向上させるため、ニトロゲナーゼの活性が向上した糸状性藍藻を得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＨｅｔＲ遺伝子に変異を有する糸状性藍藻が、優れたニトロゲナーゼ活性を示し得ることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
【００１０】
本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
ＨｅｔＲ遺伝子にアミノ酸変異を有する糸状性藍藻であって、
糸状体におけるヘテロシストが、野生株に比べて高頻度で存在し、且つ
ヘテロシストとその隣のヘテロシストとの間に存在する細胞の数（ヘテロシスト間隔細胞数）の平均（期待値）が、野生株のヘテロシスト間隔細胞数の平均（期待値）よりも小さい、
糸状性藍藻。
項２．
細胞がヘテロシストである割合が１１％以上である、項１に記載の糸状性藍藻。
項３．
ヘテロシスト間隔細胞数の平均（期待値）が９以下である、項１又は２に記載の糸状性藍藻。
項４．
ニトロゲナーゼ活性が野生株に比べて高い、項１〜３のいずれかに記載の糸状性藍藻。
項５．
ＨｅｔＲ遺伝子の２００〜２９９番目の１個又は複数個のアミノ酸に変異が存在する、糸状性藍藻。
項６．
Ａ４９Ｖ、Ａ２１６Ｖ、Ａ２１８Ｔ、及びＩ２７２Ｆからなる群より選択される、１つ以上のアミノ酸置換変異がＨｅｔＲ遺伝子に存在する、糸状性藍藻。
項７．
項１〜６のいずれかに記載の変異糸状性藍藻を、窒素ガスを含む気相下で培養する工程を含む、窒素化合物を製造する方法。
項８．
項１〜６のいずれかに記載の変異糸状性藍藻を、二酸化炭素ガスを含む気相下で培養する工程を含む、水素製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る変異糸状性藍藻は、優れたニトロゲナーゼ活性を示すため、窒素固定効率を向上させ、ひいてはアンモニア生産効率を向上させることができる。さらには、これらに加えて、水素産生効率をも向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】糸状性藍藻を用いた水素、アンモニア増産戦略（特にヘテロシスト高頻度化）の概要を示す。
【図２】ΔＨｕｐ（親株）とその変異株における、窒素欠乏条件後（すなわちヘテロシスト形成の誘導後）、１日目と２日目のヘテロシスト形成頻度を示す。
【図３】ΔＨｕｐ（親株）とその変異株におけるヘテロシスト間隔細胞数（ヘテロシスト間の栄養細胞数）の分布を示す。窒素欠乏条件後、１日目と２日目の分布を示す。培養条件は、図１の実験と同じである。
【図４ａ】ΔＨｕｐ（親株）とその変異株の最大活性時（培養１日目）の水素生産活性を示す。
【図４ｂ】ΔＨｕｐ（親株）とその変異株の最大活性時（培養１日目）のニトロゲナーゼ活性を示す。
【図５】ΔＨｕｐ（親株）とその変異株の累積水素生産量を示す。気相は１−２日毎（図中の▲で示す日）に初期気相に更新した。
【図６】アナベナ野生株とその変異株における窒素欠乏条件後（すなわちヘテロシスト形成の誘導後）２日目、３日目のヘテロシスト形成頻度を示す。
【図７】アナベナ野生株（親株）とその変異株におけるヘテロシスト間隔細胞数（ヘテロシスト間の栄養細胞数）の分布を示す。窒素欠乏条件後（すなわちヘテロシスト形成の誘導後）、２日目と３日目の分布を示す。培養条件は、図６と同じである。
【図８】アナベナ野生株（親株）とその変異株の、窒素ガス／１０％  ＣＯ２気相下におけるアンモニア生産性を示す。
【図９】アナベナ野生株（親株）とその変異株の窒素ガス／１０％  ＣＯ２／１０％  Ｈ２気相下におけるアンモニア生産性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の各実施形態について、さらに詳細に説明する。
【００１４】
本発明に包含される糸状性藍藻は、ＨｅｔＲ遺伝子にアミノ酸変異を有する糸状性藍藻（変異糸状性藍藻）であって、糸状体におけるヘテロシストが、野生株に比べて高頻度で存在し、且つ、ヘテロシストとその隣のヘテロシストとの間に存在する細胞（栄養細胞）の数（ヘテロシスト間隔細胞数）の平均（期待値）が、野生株のヘテロシスト間隔細胞数の平均（期待値）よりも小さい。
【００１５】
糸状性藍藻は、糸状性であってヘテロシストを形成する藍藻であれば、特に制限はされない。ネンジュモ目の藍藻が好ましく、ネンジュモ科の藍藻がより好ましく、アナベナ属の藍藻がさらに好ましい。また、糸状体に沿って複数の細胞（例えば数細胞〜数十細胞おき）に１個ヘテロシストへ分化する藍藻が好ましい。このような藍藻の代表的な一例として、Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０が挙げられる。なお、ヘテロシストは、主として窒素欠乏条件で分化する細胞であり、酸素感受性の高いニトロゲナーゼを酸素から保護して窒素固定を行う細胞であると考えられている。
【００１６】
ＨｅｔＲはヘテロシスト分化の主要な制御因子（転写因子）として、ヘテロシスト分化を活性化すると言われている。ＨｅｔＲ遺伝子は、全長２９９アミノ酸のタンパク質をコードする遺伝子であり、そのアクセッションＮｏ．はＡＣＭ４８２５２（あるいはＢＡＢ７４０３８、ＡＡＡ２１９９８又はＰ２７７０９）である。ＨｅｔＲタンパク質のアミノ酸配列（２９９アミノ酸）を配列番号１に示す。
【００１７】
ＨｅｔＲ遺伝子におけるアミノ酸変異（ＨｅｔＲタンパク質においてアミノ酸変異が生じる原因となるＨｅｔＲ遺伝子におけるヌクレオチド変異）は、ＨｅｔＲタンパク質のアミノ酸が１個又は複数個、置換、欠失、又は付加されるよう変異していることが好ましい。ここでの複数個としては、好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜４０個、さらに好ましくは２〜３０個、よりさらに好ましくは２〜２０個、特に好ましくは２〜１０個（２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個）が挙げられる。また、当該アミノ酸の置換、欠失、及び付加からなる群より選択される１種以上の変異がＨｅｔＲ遺伝子に生じて
いる場合には、当該変異アミノ酸の個数は、最も変異数が少なくなるように数え上げた場合の数を示す。また、特に制限されないが、変異として少なくとも置換が存在することが好ましく、変異は置換のみであることがより好ましい。変異が置換のみである場合において、変異アミノ酸数は１〜１０個であることが好ましく、１、２、３、４、又は５個であることがより好ましい。
【００１８】
なお、特に制限されないが、変異がアミノ酸置換である場合には、置換後のアミノ酸がバリン（Ｖ）、チロシン（Ｔ）、又はフェニルアラニン（Ｆ）であることが好ましい。また、置換前のアミノ酸がアラニン（Ａ）又はイソロイシン（Ｉ）であることが好ましい。
【００１９】
また、アミノ酸変異が存在する部位は、ＨｅｔＲタンパク質アミノ酸全長のいずれの部位であってもよいが、２００〜２９９番目の１個又は複数個のアミノ酸に変異が存在することが好ましく、２０５〜２８０番目の１個又は複数個のアミノ酸に変異が存在することがより好ましく、２１０〜２４０番目の１個又は複数個のアミノ酸に変異が存在することがさらに好ましく、２１０〜２３０番目の１個又は複数個のアミノ酸に変異が存在することがよりさらに好ましく、２１１〜２２５番目の１個又は複数個のアミノ酸に変異が存在することが特に好ましい。また、当該範囲のアミノ酸のうち、アラニン（Ａ）又はイソロイシン（Ｉ）が変異（特に置換）していることが好ましい。特に、当該範囲に存在する１個又は複数個のアラニン（Ａ）又はイソロイシン（Ｉ）がバリン（Ｖ）、チロシン（Ｔ）、又はフェニルアラニン（Ｆ）に置換されていることが、より好ましい。
【００２０】
具体的な変異としては、例えば変異が置換である場合には、例えばＡ４９Ｖ、Ａ２１６Ｖ、Ａ２１８Ｔ、Ｉ２７２Ｆ、等が好ましく挙げられる。
【００２１】
このようなＨｅｔＲタンパク質のアミノ酸変異が起こる原因となる、ＨｅｔＲ遺伝子におけるヌクレオチド変異については、当該アミノ酸変異が起こるのであれば特に制限はされない。例えば、１個のアミノ酸が置換される変異においては、１、２、又は３個のヌクレオチドが置換されていてもよい。なお、アミノ酸が欠失する変異においては、１個のアミノ酸欠失につき、リーディングフレーム内で３個のヌクレオチドが欠失することが好ましい。また、アミノ酸が付加される変異においては、１個のアミノ酸付加につき、リーディングフレーム内で３個のヌクレオチドが付加されることが好ましい。このようなヌクレオチドの変異については、コドン表を参照して適宜設計することができる。
【００２２】
このような、ＨｅｔＲタンパク質アミノ酸に変異を有する糸状性藍藻は、公知の方法か、又は公知の方法から容易に想到する方法によって、簡単に製造することができる。例えば、遺伝子工学的手法によって製造することができる。より具体的には、例えば、プラスミドにＨｅｔＲ遺伝子を導入し、これを鋳型として変異導入用に設計したプライマーセットを用いてＰＣＲ法によりＨｅｔＲ遺伝子内部に部位特異的に変異が導入されたプラスミドを得ることができる。この部位特異的変異を持つＨｅｔＲ遺伝子をさらに自殺ベクターにクローニングする。このベクターを藍藻に組み込み、相同組換えによって上記変異糸状性藍藻を得ることができる。
【００２３】
また、本発明に係る変異糸状性藍藻は、ニトロゲナーゼ活性を有する。ニトロゲナーゼ活性が野生株と同等以上であることが好ましく、野生株より高い（優れている）ことがより好ましい。ニトロゲナーゼ活性については、アセチレン還元法（すなわち、アセチレンからエチレンへの還元活性の測定）によって求める。より詳細には、野生株と変異株とを窒素欠乏条件に置いて培養１日後に、それぞれの培養液から適当量の細胞を採り、密閉容器内でアセチレンを含む気相下で培養し、２〜３時間のエチレン産生量をガスクロマトグラフィーで測定することで求めることができる。
【００２４】
糸状体は、藍藻の細胞が数珠繋がりになって形成される（図１の顕微鏡観察図参照）。フィラメントと呼ぶこともできる。本発明に包含される変異糸状性藍藻は、その野生株に比べて高頻度で糸状体においてヘテロシストが存在する。ヘテロシストを特異的に染色する試薬（例えば、ヘテロシストの細胞壁を特異的に染色するＡｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ）により染色を行うことで、ヘテロシストを観察しやすくすることができる。
【００２５】
野生株に比べて高頻度でヘテロシストが存在するかは、次のようにして確認する。すなわち、野生株と変異株（ＨｅｔＲ遺伝子にアミノ酸変異を有する株）とについて、それぞれランダムに約３００個又はそれ以上の細胞について栄養細胞かヘテロシストかを検討し（但し、野生株と変異株とで、検討細胞数は同数とする）、細胞がヘテロシストである割合（％）を算出し、これを比較することで、野生株に比べて高頻度でヘテロシストが存在するか確認することができる。
【００２６】
本発明に係る変異糸状性藍藻の、細胞がヘテロシストである割合（％）は、野生株に比べて大きければ特に制限はされない。例えば、１１、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４、１１．５、１１．６、１１．７、１１．８、又は１１．９％以上が好ましく、１２、１２．１、１２．２、１２．３、１２．４、１２．５、１２．６、１２．７、１２．８、又は１２．９％以上がより好ましく、１３、１３．１、１３．２、１３．３、１３．４、１３．５、１３．６、１３．７、１３．８、又は１３．９％以上がさらに好ましく、１４、１４．１、１４．２、１４．３、１４．４、１４．５、１４．６、１４．７、１４．８、又は１４．９％以上がよりさらに好ましく、１５、１５．１、１５．２、１５．３、１５．４、１５．５、１５．６、１５．７、１５．８、又は１５．９％以上がなお好ましく、１６、１６．１、１６．２、１６．３、１６．４、１６．５、１６．６、１６．７、１６．８、又は１６．９％以上が特に好ましい。なお、これらの値は、ヘテロシスト形成を窒素欠乏条件下におくことで誘導した後、培養１日目又は２日目に確認される値であることが好ましい。
【００２７】
また、本発明に包含される変異糸状性藍藻は、ヘテロシスト間隔細胞数（ヘテロシストとその隣のヘテロシストとの間に存在する細胞（栄養細胞）の数をいう）の平均（期待値）が、野生株のヘテロシスト間隔細胞数の平均（期待値）よりも小さい。ヘテロシスト間隔細胞数の平均（期待値）は次のようにして求めることができる。すなわち、野生株と変異株（ＨｅｔＲ遺伝子にアミノ酸変異を有する株）とについて、それぞれランダムに約３００個又はそれ以上の細胞について栄養細胞かヘテロシストかを検討し（但し、野生株と変異株とで、検討細胞数は同数とする）、ヘテロシストとその隣のヘテロシストとの間（ヘテロシスト間隔）に存在する栄養細胞の数を記録し、各ヘテロシスト間隔細胞数の存在頻度（図３及び図７に示される）を求める。各ヘテロシスト間隔細胞数とその存在頻度の積の合計として平均（期待値）を求める。例えば、ヘテロシスト間隔の細胞数が１０個の部分が１０カ所、２０個の部分が５カ所、２５個の部分が５カ所あった場合、ヘテロシスト間隔細胞数１０の存在頻度は５０％、ヘテロシスト間隔細胞数２０の存在頻度は２５％、ヘテロシスト間隔細胞数２５の存在頻度は２５％、になる。従って、ヘテロシスト間隔細胞数の平均（期待値）は、１６．２５（＝１０×０．５＋２０×０．２５＋２５×０．２５）である。
【００２８】
本発明に係る変異糸状性藍藻のヘテロシスト間隔細胞数の平均（期待値）は、野生株のヘテロシスト間隔細胞数の平均（期待値）よりも小さければ特に制限されない。例えば、９以下が好ましく、８．９、８．８、８．７，８．６、８．５、８．４、８．３、８．２、８．１又は８以下がより好ましく、７．９、７．８、７．７，７．６、７．５、７．４、７．３、７．２、７．１又は７以下がさらに好ましく、６．９、６．８、６．７，６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１又は６以下がよりさらに好ましく、５．９、５．８、５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２、５．１又は５以下が特に
好ましい。なお、これらの値は、ヘテロシスト形成を窒素欠乏条件下におくことで誘導した後、培養１日目に確認される値であることが好ましい。
【００２９】
また、ＨｅｔＲ遺伝子にアミノ酸変異を有する糸状性藍藻であって、糸状体におけるヘテロシストが、ΔＨｕｐ株に比べて高頻度で存在し、且つヘテロシストとその隣のヘテロシストとの間に存在する細胞（栄養細胞）の数（ヘテロシスト間隔細胞数）の平均（期待値）が、ΔＨｕｐ株のヘテロシスト間隔細胞数の平均（期待値）よりも小さい、糸状性藍藻も、本願発明に包含される。
【００３０】
なお、ΔＨｕｐ株は、水素を吸収する取込み型ヒドロゲナーゼ（Ｈｕｐ）の大サブユニットをコードする遺伝子（ｈｕｐＬ）が不活性化された株である。ｈｕｐＬ遺伝子の不活性化の手法は特に限定されない。例えばＲＮＡｉ、遺伝子破壊等の手法が例示でき、特にｈｕｐＬ遺伝子破壊株が好ましい。このようなｈｕｐＬ遺伝子破壊糸状性藍藻は公知の手法により調製することができる。例えば、Ｍａｓｕｋａｗａ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５８（５）：  ６１８−６２４．に記載の手法に準じて調製することができる。なお、ｈｕｐＬ遺伝子のアクセションＮｏはＵ０８０１３である。
【００３１】
ＨｅｔＲ遺伝子にアミノ酸変異を有する糸状性藍藻であって、糸状体におけるヘテロシストが、ΔＨｕｐ株に比べて高頻度で存在し、且つヘテロシストとその隣のヘテロシストとの間に存在する細胞（栄養細胞）の数（ヘテロシスト間隔細胞数）の平均（期待値）が、ΔＨｕｐ株のヘテロシスト間隔細胞数の平均（期待値）よりも小さい、糸状性藍藻は、特にｈｕｐＬ遺伝子が不活性化されており、且つＨｅｔＲ遺伝子にアミノ酸変異を有する糸状性藍藻であることが特に好ましい。当該糸状性藍藻についての、ＨｅｔＲ遺伝子に存在するアミノ酸変異、ΔＨｕｐ株とのヘテロシスト頻度の比較、並びに、ΔＨｕｐ株とのヘテロシスト間隔細胞数の平均（期待値）の比較、等の各要件については、上記と同様である。
【００３２】
なお、窒素固定反応（ニトロゲナーゼ反応）では、大気中の窒素をアンモニアに変換する際に、副反応として水素を必ず発生する。一般的な反応式：Ｎ２＋８ｅ−＋８Ｈ＋＋１６ＡＴＰ→Ｈ２＋２ＮＨ３＋１６（ＡＤＰ＋Ｐｉ）。この水素は拡散してしまえば、エネルギーの損失になるため、窒素固定のためのエネルギー変換効率を下げる原因となる。しかし、多くの窒素固定藍藻は水素を吸収する取込み型ヒドロゲナーゼ（Ｈｕｐ）を持っているため、この水素を直ちに再吸収してエネルギー源として再利用できるのである。また、Ｈｕｐは水素から得られた還元力（電子）を使って細胞内の酸素を除去できると考えられる。従って、ΔＨｕｐ株は、水素産生のためには好適である一方で、窒素産生のためには不適当であるとも考えられる。しかし、ヘテロシストを形成する糸状性窒素固定藍藻では、Ｈｕｐの不活性化によるニトロゲナーゼに対する悪影響は見られない。これは、ヘテロシスト内部は酸素濃度が低く維持されているため、単細胞性藍藻の場合と異なり、Ｈｕｐ欠損による影響が小さいためと考えられる。
【００３３】
本発明は、上記の変異糸状性藍藻を用いて窒素化合物を製造する方法、並びに、上記の変異糸状性藍藻を用いて窒素固定を行う方法も包含する。より具体的には、上記の変異糸状性藍藻を用いて、例えばアンモニア及び／又はグルタミンを製造する方法をも包含する。上記窒素化合物製造方法においては、アンモニアやグルタミン等、窒素固定後に藍藻内で合成される化合物が当該窒素化合物の例として好ましく挙げられる。
【００３４】
具体的には、これらの方法は、上記変異糸状性藍藻を窒素ガスを含む気相下で培養する工程を含む。ここで、当該気相は、さらに水素ガスを含むことが好ましい。また、必要に応じて二酸化炭素ガスを含むこともできる。これら気相に含まれるガスの濃度については
、上記変異糸状性藍藻により窒素固定が行われる範囲であれば特に制限されない。例えば、窒素ガスについては、濃度が高い程好ましい。例えば、大気中窒素濃度は約８０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）と高く、好ましい。また例えば、窒素ガス５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）あるいはこれらの値以上の窒素ガスを含む気相下であり得る。また例えば、当該気相が水素ガスを含む場合、水素ガスは５〜２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）程度含まれることが好ましく、５〜１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）程度含まれることがより好ましい。また例えば、当該気相が二酸化炭素ガスを含む場合、二酸化炭素ガスは５〜２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）程度含まれることが好ましく、５〜１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）程度含まれることがより好ましい。また、当該培養には、光照射条件下で行うことが好ましい。また、液体培地（特に水を含む培地）を用いることが好ましい。
【００３５】
また本発明は、上記の変異糸状性藍藻を用いて水素を製造する方法も包含する。具体的には、当該方法は、上記変異糸状性藍藻を二酸化炭素ガスを含む気相下で培養する工程を含む。当該二酸化炭素ガスの濃度については、上記変異糸状性藍藻により水素生産が行われる範囲であれば特に制限されないが、例えば、１〜１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）程度、、又は１〜８％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）程度、であり得る。また、当該気相中には、窒素が含まれることがより好ましい。窒素を含む場合、その濃度は例えば、１〜５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）程度、２〜４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）程度、又は３〜４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）程度であり得る。また、当該培養には、光照射条件下で行うことが好ましい。また、液体培地（特に水を含む培地）を用いることが好ましい。
【００３６】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本明細書に提示される文献に記載された内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
方法と材料
＜藍藻及び大腸菌の培養方法＞
糸状性のヘテロシスト形成する窒素固定藍藻Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０（以下、アナベナと呼ぶことがある）の野生株は、パスツールカルチャーコレクション（ＰＣＣ）より入手した。当該藍藻の外観（肉眼観察図及び光学顕微鏡観察図）を図１に示す。図において、ヘテロシストは＜印で指し示される。
【００３８】
当該藍藻の野生株、及び野生株から作成した取込み型ヒドロゲナーゼの大サブユニットをコードする遺伝子ｈｕｐＬ破壊株（ΔＨｕｐ株）を親株として、さらなる変異株の作成を試みた。なお、当該ΔＨｕｐ株は、Ｍａｓｕｋａｗａ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５８（５）：  ６１８−６２４．に記載の方法で調整したものである。
【００３９】
当該野生株及びΔＨｕｐ株は、室温２８℃、光強度５０又は９０−１００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２  ｓ−１  （ＰＡＲ）の条件下で、１００−５００ｍｌの８倍希釈したＡｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ａｒｎｏｎ（ＡＡ）液体培地中、希釈しないＡＡ寒天培地上、またはＢＧ１１液体培地中で培養した。液体培地では、空気または１％  ＣＯ２を含む空気をバブリングし、培養を行った。窒素源として、ＡＡ／８液体培地には５ｍＭ  ＮａＮＯ３または２ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌを加え、ＡＡ寒天培地には２ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌを加えた。ＢＧ１１液体培地は、窒素源として１７．６ｍＭ  ＮａＮＯ３を含む。窒素固定条件では
、これらの窒素化合物を加えないＡＡ／８液体培地、ＡＡ寒天培地またはＢＧ１１０液体培地中で培養した。藍藻の形質転換体の選抜及び培養のために、次の抗生物質（最終濃度）を使用した。エリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）、ネオマイシン（２５μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（２μｇ／ｍｌ）、スペクチノマイシン（２μｇ／ｍｌ）。
大腸菌は、３７℃でｌｙｓｏｇｅｎｙ  ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）液体培地中で振とう培養、または寒天培地上で培養した。形質転換体の選抜及び培養のために、次の抗生物質（最終濃度）を使用した。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）、エリスロマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）。
【００４０】
＜ヘテロシスト高頻度株の作製の検討＞
アナベナにおける、栄養細胞（通常の光合成を行う）からヘテロシスト（窒素固定に特化）への分化の制御には、多くのタンパク質が関与することが知られている。その中で、ＨｅｔＲはヘテロシスト分化の主要な制御因子（転写因子）として、ヘテロシスト分化を活性化する。一方、ＰａｔＳと呼ばれる１５−１７アミノ酸残基からなる短いペプチドは、ＨｅｔＲに結合し、分化を阻害する。ＰａｔＳのアクセッションＮｏ．はＡＡＣ０３１０３（あるいはＢＡＢ７４０００又はＯ５２７４８である。近年の研究から、そのＨｅｔＲ（活性化因子）とＰａｔＳ（抑制因子）の相互作用が、ヘテロシスト分化の制御だけでなく、ヘテロシストが一定の間隔をおいて分化するパターン形成にも重要な役割を持つというモデルが提案されている（引用文献Ｒｉｓｓｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｌａｈａｎ  ２００９）。ＨｅｔＲとＰａｔＳとの相互作用が弱くなれば、ＨｅｔＲはＰａｔＳによる阻害を受けにくくなり、その結果、分化が活性化され、ヘテロシスト形成頻度が増加する可能性が考えられた。さらに、ＨｅｔＲ−ＰａｔＳ間の相互作用は維持されながら、その強さが変化することで、ヘテロシストの間隔をおいたパターン形成は維持され、その間隔が短くなると期待された。ＰａｔＳとの相互作用が弱く、それによる阻害を受けにくい変異ＨｅｔＲを作製するために、ＰａｔＳの過剰発現による強い阻害条件下でもヘテロシスト分化を誘導する変異ＨｅｔＲの単離を試み、ランダム変異法によるスクリーニングを次の手順で行った。（１）ｈｅｔＲ遺伝子の全長を欠損させた変異株ΔｈｅｔＲの作成、（２）ＰａｔＳ過剰発現条件下でｈｅｔＲのランダム変異株の選抜を行うために、ｐａｔＳ遺伝子とｈｅｔＲ遺伝子の共発現ベクターの作成、（３）共発現ベクターを用いたランダム変異ライブラリーの作成とアナベナΔＨｕｐ株（親株）への導入、（４）アナベナ形質転換体の選抜とｈｅｔＲ変異の同定、（５）同定した変異を持つｈｅｔＲ遺伝子に置換したアナベナ変異株の作成。
【００４１】
（１）ｈｅｔＲ遺伝子の全長を欠損させた変異株ΔｈｅｔＲの作成
作成したプラスミド及び使用したプライマーを表１に示す。３，４９４−ｂｐのｈｅｔＲ
（ａｌｒ２３３９）領域の増幅をアナベナのゲノムＤＮＡを鋳型として、ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ  法により以下のように行った。野生型ｈｅｔＲの変異型ｈｅｔＲへの置換を効率的に行うために、ｈｅｔＲ開始コドンから４８−５２  ｂｐ上流配列ＧＴＡＴＡＣをＧＴＣＧＡＣへ変更することで制限酵素ＳａｌＩの認識配列を新たに導入した。ｈｅｔＲ上流に導入するＳａｌＩ部位より上流領域の１，２７２−ｂｐ断片とそのＳａｌＩ部位より下流領域の２，２６６−ｂｐ断片（ｈｅｔＲ配列を含む）の増幅をそれぞれプライマーペアーｈｅｔＲ−Ｆ１／ｈｅｔＲ−Ｒｅｖ４とｈｅｔＲ−Ｆ４／ｈｅｔＲ−Ｒ１、及びＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）を用いてＰＣＲにより行った。これらの２つのＰＣＲ断片をメガプライマーとしてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物を鋳型として、プライマーペアーｈｅｔＲ−Ｆ１／ｈｅｔＲ−Ｒ１を用いて、同様にＰＣＲを行い、ｈｅｔＲ配列の上流及び下流領域（ａｌｒ２３３８（３’）−ＳａｌＩ−ｈｅｔＲ−ａｌｌ２３４０（３’））を含む３，４９４−ｂｐ長のＰＣＲ断片を増幅した。このＰＣＲ産物をｐＵＣ１９のＨｉｎｃＩＩ部位にクローニングし、プレスミドｐＨＲ１を作成
した。ｐＨＲ１内のｈｅｔＲを含む０．９８−ｋｂ  ＳａｌＩ−ＳｐｅＩ断片を切り出して除去し、ｐＵＣ４Ｋ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）由来のＫｍ／Ｎｍ耐性を付与するｎｐｔ  （ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子を含む１．３−ｋｂ  ＳａｌＩ−ＳｐｅＩ断片をｐＨＲ２ｂ（表１）から切り出して、ｐＨＲ１内の０．９８−ｋｂ  ＳａｌＩ−ＳｐｅＩ断片と置き換え、ｐＨＲ３を作成した。ｐＨＲ３の３．８−ｋｂ  ＳａｃＩ−ＳｐｈＩ断片を自殺ベクターｐＲＬ２７１（表１）のＳａｃＩ−ＳｐｈＩ部位にクローニングし、ｐＨＲ４を作成した。ｐＨＲ４を大腸菌内でメチル化するため、メチル化酵素遺伝子ａｖａＩ，  ａｖａＩＩ，  ａｖａＩＩＩを持つヘルパープラスミドｐＲＬ６２３（表１）を保持する大腸菌ＨＢ１０１（ｐＲＬ６２３）へ、ｐＨＲ４を形質転換した。ｐＲＬ６２３とｐＨＲ４を保持する大腸菌ＨＢ１０１（ｐＲＬ６２３，  ｐＨＲ４）と接合プラスミドＲＰ４を保持する大腸菌Ｊ５３（ＲＰ４）と親株であるアナベナ野生株またはΔＨｕｐ株を混合し、ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ  ｍａｔｉｎｇ（接合）法によりｐＨＲ４をアナベナ細胞内へ導入した。その大腸菌と藍藻の混合液を５μｇ／ｍｌエリスロマイシンと２ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌを含むＡＡ寒天培地上に広げ、藍藻の染色体内にプラスミドｐＨＲ４が相同的組換え（一点交差）により組み込まれた形質転換体を選抜した。一点交差株では、ｈｅｔＲを含む領域だけでなくプラスミド配列の全長も染色体上に組み込まれているため、プラスミド配列を除去し、ｈｅｔＲ遺伝子がｎｐｔ遺伝子に完全置換された二点交差株を得る必要がある。二点交差株の選抜は、スクロース含有培地で致死性を付与するｓｕｃＢ遺伝子を利用して次のように行った。単離した一点交差株を２ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌと２５μｇ／ｍｌネオマイシンを含むＡＡ／８液体培地で約一週間培養し、その培養液の一部を採り、５％スクロース、２ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌと２５μｇ／ｍｌネオマイシンを含むＡＡ寒天培地に薄く広げて、光強度５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ
ｍ−２  ｓ−１  （ＰＡＲ）の条件下で３週間培養した。二点交差による相同的組換えにより、プラスミド配列内のｓｕｃＢ遺伝子が除去されると、スクロース含有培地上で生育できるようになり、二点交差株を単離できる。その二点交差株がスクロース耐性、ネオマイシン耐性、エリスロマイシン感受性であることを寒天培地上で確認した。さらにｈｅｔＲ領域の３，４９４−ｂｐ  ＰＣＲ増幅配列の外側の領域にアニーリングするプライマーペアーｈｅｔＲ−Ｆ６／ｈｅｔＲ−Ｒ６を用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ｈｅｔＲ配列の欠損とｎｐｔ遺伝子への完全置換を増幅サイズの違いにより確認した（親株では３．８−ｋｂ、ｈｅｔＲ欠損株では４．１−ｋｂ）。アナベナ野生株とΔＨｕｐ株を親株として作成した二点交差によるｈｅｔＲ欠損株をそれぞれΔｈｅｔＲとΔｈｅｔＲΔＨｕｐと呼ぶ。
【００４２】
（２）ｐａｔＳ遺伝子とｈｅｔＲ遺伝子の共発現ベクターの作成
ｐａｔＳ遺伝子のクローニングを以下のように行った。１，０４５−ｂｐのｐａｔＳ  （ａｓｌ２３０１）遺伝子を含む領域をアナベナのゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーペアーｐａｔＳ−Ｆ１／ｐａｔＳ−Ｒ１及びＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＨｉｎｃＩＩ部位にクローニングし、プレスミドｐＰＳ１を作成した。一方、ｈｅｔＲに関しては、ｐＨＲ１  のａｌｒ２３３８（３’）−ＳａｌＩ−ｈｅｔＲ  を含む２．３９−ｋｂ  ＳａｃＩ−ＰｓｈＡＩ  断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）内のＳａｃＩ−ＳｍａＩ部位にクローニングし、ｐＨＲ５を作成した。ｐＨＲ５のａｌｒ２３３８（３’）−ＳａｌＩ−ｈｅｔＲ  を含む２．４−ｋｂ  ＳａｃＩ−ＸｈｏＩ  断片をｐＳＦＩ  （表１）内のＳａｃＩ−ＳａｌＩ部位にクローニングし、ｐＨＲ６を作成した。ｈｅｔＲ自身のプロモーターは強力すぎるので、それより弱く窒素欠乏条件下で誘導される亜硝酸還元酵素遺伝子ｎｉｒＡのプロモーターＰｎｉｒＡによりｈｅｔＲ転写が制御されるようにするため、ｐＰｎｉｒＡ（表１）  のプロモーターＰｎｉｒＡを含む  ０．６６−ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片をｐＨＲ６内のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位に挿入し、ｐＨＲ７を作成した。次に、ｐＰＳ１のｐａｔＳ  を含む１．０−ｋｂ  ＳａｃＩ−ＫｐｎＩ断片
をｐＨＲ７内のＰｎｉｒＡ−ＳａｌＩ−ｈｅｔＲ上流の  ＳａｃＩ−ＫｐｎＩ部位に挿入し、ｐＨＲ８を作成した。ｐＨＲ８内の  ｐａｔＳ−ＰｎｉｒＡ−ＳａｌＩ−ｈｅｔＲ  を含む２．８−ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片を切り出して、ｐＲＬ２５Ｃ−ＣｍＥｍ（表１）内のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ部位に挿入し、ｐａｔＳとｈｅｔＲの共発現ベクターｐＰＳＨＲａを作成した。ｐＰＳＨＲａでは、ｐａｔＳとｈｅｔＲは同じ向きに共転写されるが、プラスミドｐＲＬ２５Ｃ−ＣｍＥｍ  はアナベナ内で多コピー存在するので、ｐａｔＳとｈｅｔＲは過剰発現される。また、ｐａｔＳとｈｅｔＲの転写の向きが反対の別の共発現ベクターｐＰＳＨＲｂを以下のように作成した。ｐＨＲ７のＰｎｉｒＡ−ＳａｌＩ−ｈｅｔＲ  を含む１．７６−ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）内のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位にクローニングし、ｐＨＲ９を作成した。ｐＨＲ９内のＰｎｉｒＡ−ＳａｌＩ−ｈｅｔＲ  を含む１．７６−ｋｂ  ＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ断片を切り出して、ｐＰＳＨＲａ内のＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ部位に挿入し、ｐＰＳＨＲｂを作成した。共発現ベクターｐＰＳＨＲａまたはｐＰＳＨＲｂをΔｈｅｔＲΔＨｕｐ株に接合法により導入し、５μｇ／ｍｌエリスロマイシンと２  ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌを含むＡＡ寒天培地上で、アナベナ形質転換体を単離した。この形質転換体は、ｐａｔＳの過剰発現によりヘテロシスト形成できず、そのため窒素欠乏条件下で窒素固定生育できないことを確認した。
【００４３】
（３）共発現ベクターを用いたランダム変異ライブラリーの作成とアナベナΔＨｕｐ株への導入
これらのｐａｔＳ−ｈｅｔＲ共発現ベクター（ｐＰＳＨＲａ、ｐＰＳＨＲｂ）にランダム変異を導入し、変異ｈｅｔＲライブラリーを作成した。変異ＨｅｔＲのＰａｔＳに対する感受性が低下すれば、変異ＨｅｔＲを持つ形質転換体は、ｐａｔＳ過剰発現による強い阻害条件下でもヘテロシスト形成でき、窒素固定生育できるコロニーを単離できることが期待された。ｐａｔＳ−ｈｅｔＲ共発現ベクターへのランダム変異導入は、以下のように行った。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社の大腸菌ＸＬ１−Ｒｅｄ株へｐａｔＳ−ｈｅｔＲ共発現ベクターを形質転換し、得られた株をＬＢ液体培地で３−９日間にわたり毎日植え継ぎ、培養を行った。３−９日後に、この大腸菌懸濁液からプラスミドを抽出し、ｈｅｔＲランダム変異ライブラリーを得た。次に、このプラスミドを大腸菌ＨＢ１０１（ｐＲＬ６２３）へ形質転換し、メチル化修飾した。これら２種類のプラスミド（ｈｅｔＲランダム変異を持つプラスミドとｐＲＬ６２３）を保持する大腸菌と接合プラスミドＲＰ４を保持する大腸菌Ｊ５３（ＲＰ４）とアナベナΔｈｅｔＲΔＨｕｐ株を混合し、ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ  ｍａｔｉｎｇ（接合）法によりｈｅｔＲランダム変異ライブラリーをアナベナ細胞内へ導入した。
【００４４】
（４）アナベナ形質転換体の選抜とｈｅｔＲ変異の同定
形質転換体の選抜は、窒素化合物を含まないＡＡ寒天培地上に大腸菌と藍藻の混合液を広げ、約３週間培養することで行った（一次選抜）。次に、窒素固定で生育してきたコロニーの二次選抜を以下のように行った。ＰａｔＳの活性部位は、そのカルボキシル末端（Ｃ末端）の５アミノ酸残基ＲＧＳＧＲであることが知られており、それを人工的に合成したＲＧＳＧＲペプチド（ＰａｔＳ−５）はヘテロシスト分化を抑制する働きをする。このＰａｔＳ−５を最終濃度２μＭまたは４μＭ含むＡＡ寒天培地上で、一次選抜で得られた形質転換体を培養し、ＰａｔＳ−５による阻害条件下でもヘテロシスト形成及び窒素固定生育できる株を選抜した。二次選抜で得られた株からプラスミド抽出によりｐａｔＳ−ｈｅｔＲ共発現ベクターを回収し、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）へ形質転換した。ｐａｔＳ−ｈｅｔＲ共発現ベクター内のｐａｔＳとｈｅｔＲ遺伝子配列をそれぞれプライマーｐａｔＳ−Ｒ１とｈｅｔＲ−Ｆ３を用いて解析し、変異を同定した。その結果、ｈｅｔＲ内に１５種類の変異（Ｐ１３Ｌ，  Ａ４９Ｖ，  Ｌ９１Ｐ，  Ｐ１０７Ｌ，  Ｓ１９３Ｆ，  Ａ２１６Ｖ，  Ａ２１８Ｔ，  Ｒ２２３Ｗ，  Ｅ２２９Ｋ，  Ｍ２４９Ｉ，  Ｄ２５６Ｇ，  Ｄ２５６Ｅ，  Ｉ２７２Ｆ，  Ｒ２７４Ｈ，  Ａ
４２Ｖ  Ｐ２１７Ｌ）を同定した。その内、同じベクター上で変異Ａ２１８Ｔ（残基番号２１８のアラニンがスレオニンへ変異）はｐａｔＳ内の変異Ｒ１７Ｋ（残基番号１７のアルギニンがリシンへ変異）と、変異Ａ４９Ｖ（残基番号４９のアラニンがバリンへ変異）はｐａｔＳ内の変異Ｒ１３Ｃ（残基番号１３のアルギニンがシステインへ変異）と同時に同定された。
【００４５】
（５）同定した変異を持つｈｅｔＲ遺伝子に置換したアナベナ変異株の作成
アナベナの野生型ｈｅｔＲ遺伝子を変異ｈｅｔＲ遺伝子に置換した変異株を作成するために、共発現ベクターの変異ｈｅｔＲを含む１．１−ｋｂ  ＳａｌＩ−ＰｓｔＩ断片を切り出して、ｐＨＲ３内のＳａｌＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入することでｎｐｔ遺伝子と置換し、ｐＨＲ１０−ｘｘｘを作成した。ｘｘｘは上記のアミノ酸残基変異を表し、同様に野生型ｈｅｔＲから野生型ｈｅｔＲに置換したプラスミドは、ｐＨＲ１０と表す。ｐＨＲ１０及びｐＨＲ１０−ｘｘｘのａｌｒ２３３８（３’）−ＳａｌＩ−ｈｅｔＲ−ａｌｌ２３４０（３’）  を含む３．５−ｋｂ  ＳａｃＩ−ＳｐｈＩ断片を切り出し、自殺ベクターｐＲＬ２７１内のＳａｃＩ−ＳｐｈＩ部位に挿入し、それぞれｐＨＲ１１及びｐＨＲ１１−ｘｘｘを作成した。これらのベクターを上記と同様にｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ  ｍａｔｉｎｇ（接合）法により、アナベナΔｈｅｔＲまたはΔｈｅｔＲΔＨｕｐ株へ導入した。ΔｈｅｔＲ株へは、ｐＨＲ１１−Ａ２１８ＴとｐＨＲ１１−Ｉ２７２Ｆの２種類のみ導入した。ベクターが藍藻の染色体内に一点交差による相同的組換えにより組み込まれた形質転換体は、大腸菌と藍藻の混合液を５μｇ／ｍｌエリスロマイシンと２ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌを含むＡＡ寒天培地上に広げて、約３週間培養を行い選抜した（一点交差株）。次に、ベクター配列を除去し、ΔｈｅｔＲまたはΔｈｅｔＲΔＨｕｐゲノム上のｎｐｔ遺伝子が変異ｈｅｔＲ遺伝子に完全置換された二点交差株を得るため、ｓｕｃＢ遺伝子を利用した選抜を次のように行った。窒素化合物を含まないＡＡ／８液体培地で、単離した一点交差株を約一週間培養し、その培養液の一部を採り、５％スクロースを含みＡＡ寒天培地上（窒素化合物を含まない）に薄く広げて、光強度５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２  ｓ−１
（ＰＡＲ）の条件下で培養した。二点交差による相同的組換えにより、ｓｕｃＢを含むベクター配列が除去され、ｎｐｔ遺伝子が変異ｈｅｔＲ遺伝子に完全置換され、ヘテロシスト形成及び窒素固定生育できる株を選抜した。その二点交差株がスクロース耐性、ネオマイシン感受性、エリスロマイシン感受性であることを寒天培地上で確認した。さらにΔｈｅｔＲ、ΔｈｅｔＲΔＨｕｐ株のゲノムの確認と同様に、プライマーペアーｈｅｔＲ−Ｆ６／ｈｅｔＲ−Ｒ６を用いたＰＣＲにより、ｎｐｔ遺伝子が変異ｈｅｔＲ遺伝子に完全置換されたことを確認した。以上の方法でアナベナ野生株からは、２種類のｈｅｔＲ変異株（Ａ２１８Ｔ、Ｉ２７２Ｆ）を作成し、それぞれＷＴ−Ａ２１８Ｔ、ＷＴ−Ｉ２７２Ｆと呼ぶ。ΔＨｕｐ株からは、４種類のｈｅｔＲ変異株（Ａ４９Ｖ、Ａ２１６Ｖ、Ａ２１８Ｔ、Ｉ２７２Ｆ）を作成し、それぞれＡ４９Ｖ、Ａ２１６Ｖ、Ａ２１８Ｔ、Ｉ２７２Ｆと呼ぶ。
【００４６】
【表１】
2019017368.tif 000002
2019017368.tif 000003
【００４７】
＜ΔＨｕｐ株及びその変異株のヘテロシスト形成頻度、水素生産活性、及びニトロゲナーゼ活性の測定＞
アナベナは、室温２８℃、植物育成灯（Ｔｙｐｅ  ＦＬ  ４０  ＳＢＲ−Ａ，  ＮＥＣライティング株式会社）を用いた光照射条件下（光強度９０−１００  μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２  ｓ−１  （ＰＡＲ））で、５ｍＭ  ＮａＮＯ３を含む５００ｍｌのＡＡ／８液体培地中で、空気を通気しながら２−３日培養し、その後、１％  ＣＯ２を含む空気を通気しながら培養した。この培養液から細胞を遠心（４，０００×ｇ、２−３  ｍｉ
ｎ）により回収し、窒素化合物を含まないＡＡ／８液体培地で２回洗った後、同じ培地に懸濁した。メタノール抽出によりクロロフィルａ  （Ｃｈｌ  ａ）濃度を定量し、５００ｍｌ  のＡＡ／８液体培地に０．３  ｍｇ  Ｃｈｌ  ａ／ｌで接種した。空気を通気しながら同じ光照射条件下で培養を続けた。
【００４８】
ヘテロシスト形成頻度の計測は次のように行った。親株ΔＨｕｐ及びその変異株のヘテロシスト形成を、窒素欠乏条件下におくことで誘導した。ヘテロシストの多糖類からなる細胞壁をＡｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ  （Ｓｉｇｍａ）により特異的に染色し、栄養細胞と区別した。その後、顕微鏡下で細胞３００個以上を観察し（但し親株と変異株とで観察細胞数は同数とした）、観察細胞数あたりのテロシスト数の割合を算出し、これをヘテロシスト頻度とした。ヘテロシスト頻度はニトロゲナーゼ活性と並行して、培養１日目で最大値に達し、次第に低下していった。変異株の最大ヘテロシスト頻度（すなわち、培養１日目のヘテロシスト頻度）は、親株ΔＨｕｐ（最大頻度１２％）より増加した。特にＡ２１８Ｔ株では最大頻度が２０％に達し、ΔＨｕｐより１．７倍増加した（図２）。
【００４９】
ヘテロシスト間隔細胞数の分布を表したヒストグラムでは、２個以上連続したヘテロシストが変異株において一定の割合見られるが、ほとんどのヘテロシストは間隔をおいて形成されていた（図３）。また、変異株のヘテロシスト間隔細胞数は、親株と比べて短くなっていた（図３）。なお、図３（及び下述する図７）において、Ｘ軸はヘテロシストと隣のヘテロシストとの間に存在する栄養細胞の数（ヘテロシスト間隔細胞数）を表し、Ｙ軸は各ヘテロシスト間隔細胞数の存在頻度を表す。この「各ヘテロシスト間隔細胞数の存在頻度」とは、計測細胞数（３００個以上）の細胞を観察した際の、（各ヘテロシスト間隔細胞数／ヘテロシスト間隔の数の合計）を表している。例えば、ヘテロシスト間隔細胞数が１０の部分が１０カ所、２０の部分が５カ所、２５の部分が５カ所あった場合（数えた栄養細胞数は、１０×１０＋２０×５＋２５×５）、ヘテロシスト間隔細胞数１０の存在頻度は５０％、ヘテロシスト間隔細胞数２０の存在頻度は２５％、ヘテロシスト間隔細胞数２５の存在頻度は２５％、になる。
【００５０】
また、各株のヘテロシスト間隔細胞数の平均（期待値）は、次の通りであった。
株, 平均値±標準偏差（1日目、2日目）の順に、
ΔＨｕｐ,（7.1±0.6, 9.4±1.4）
A49V,（5.6±0.6, 7.0±1.3）
A216V,（6.7±0.7, 8.4±1.5）
A218T,（3.9±0.2, 4.7±0.8）
I272F,（5.3±0.7, 6.7±0.6）
【００５１】
また、各変異株のヘテロシスト間隔が親株ΔＨｕｐと比べて、統計的に有意に短いかどうかを表すt検定を行ったときのp値は、以下の通りであった。
ΔＨｕｐ  vs 株: p値（1日目、2日目）の順に、
ΔＨｕｐ  vs A49V: p値（p < 0.01、p < 0.03）
ΔＨｕｐ  vs A216V: p値（not significant、not significant）
ΔＨｕｐ  vs A218T: p値（p < 0.01、p < 0.01）
ΔＨｕｐ  vs I272F: p値（p < 0.01、p < 0.01）
【００５２】
各変異株のヘテロシスト頻度の最大値（1日目）が親株ΔＨｕｐと比べて、統計的に有
意に増加したかどうかの解析結果は、以下の通りであった。
ΔＨｕｐ  vs 株: p値
ΔＨｕｐ  vs A49V: p < 0.01
ΔＨｕｐ  vs A216V: not significant
ΔＨｕｐ  vs A218T: p < 0.01
ΔＨｕｐ  vs I272F: p < 0.01
【００５３】
これらのことから、変異株のヘテロシストは、高頻度で間隔をおいたパターンを保持して形成されていることがわかった。また、ヘテロシスト間隔細胞数の平均（期待値）も小さくなっていることがわかった。
【００５４】
水素生産活性とニトロゲナーゼ活性の測定は次のように行った。各培養日数の経過した培養液から遠心（４，０００×ｇ、２−３  ｍｉｎ）により回収した細胞をＡＡ／８液体培地で２−６  μｇ  Ｃｈｌ  ａ／ｍｌに調整した。その懸濁液１ｍｌを内容積７．５ｍｌのガスクロバイアル（日電理化硝子株式会社）に入れ、ブチルゴム栓で密閉し、同じ光照射条件下でロータリーシェーカー上で懸濁しながら１時間プレインキュベートした。水素発生量の測定のためには、気相をアルゴンガスで置換し、ブチルゴム栓で密閉後、ロータリーシェーカー上で懸濁しながらインキュベートした。同時にアセチレン還元法によるニトロゲナーゼ活性（アセチレンからエチレンへの還元活性）の測定も行うため、別のサンプルの気相をアルゴンガスで置換後、アセチレンを最終濃度１５％になるように気相中に加えて、ブチルゴム栓で密閉後、同様にインキュベートした。２時間後、それぞれのガスクロバイアルの気相から２００μｌのガスをガスタイトシリンジで抜き取り、水素またはエチレン生成量の測定のために、それぞれガスクロマトグラフィーＳｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ−２０１０  Ｐｌｕｓ  （ｅｑｕｉｐｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ａ  Ｒｔ−Ｍｓｉｅｖｅ  ５Ａ  ＰＬＯＴ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｃｏｌｕｍｎ  （Ｉ．Ｄ．  ０．５３  ｍｍ  ×  ５０  ｍ，  Ｒｅｓｔｅｋ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．，  ＵＳＡ））  またはＳｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ−８Ａ  （ｅｑｕｉｐｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｌａｍｅ−ｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ
ａｎｄ  ａ  Ｐｏｒａｐａｋ  Ｎ−ｐａｃｋｅｄ  ｃｏｌｕｍｎ  （８０／１００  ｍｅｓｈ，  ２  ｍ  ｂｙ  １／８  ｉｎ．））に注入した。ニトロゲナーゼの活性は、窒素欠乏条件後に誘導され、培養１日目で最大活性値に達し、その後ニトロゲナーゼが合成するアンモニアにより自身の活性が阻害され、急速に低下する。培養１日目の最大活性時において、ΔＨｕｐから作成した各変異株は、親株ΔＨｕｐよりも高い水素生産活性（図４ａ）とニトロゲナーゼ活性（図４ｂ）を示し、Ａ２１８Ｔ株ではＣｈｌ  ａ当たりの活性評価で１．８倍増加が認められた。また、ヘテロシスト頻度が増加するに従い、最大活性時の水素生産活性とニトロゲナーゼ活性は増加する相関関係が認められた。これらの変異株において、ヘテロシスト分化過程の異常や窒素固定成長への悪影響は見られなかった。
【００５５】
＜ΔＨｕｐ株及びその変異株の累積水素生産性の評価＞
親株ΔＨｕｐの変異株からＡ２１８ＴとＩ２７２Ｆ株を選び、累積水素生産性を評価した。アナベナは、光照射条件下（光強度９０−１００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２
ｓ−１  （ＰＡＲ））、５ｍＭ  ＮａＮＯ３を含むＡＡ／８液体培地中で、空気を通気しながら２−３日培養し、その後、１％  ＣＯ２を含む空気を通気しながら培養した。この培養液から細胞を遠心（４，０００×ｇ、２−３  ｍｉｎ）により回収し、窒素化合物を含まないＡＡ／８液体培地で２回洗った後、同じ培地に懸濁した。その懸濁液を用いて、３０μｇ  Ｃｈｌ  ａを含む８ｍｌの懸濁液を調整し、内容積２５ｍｌのガスクロバイアルに入れ、ブチルゴム栓で密閉した。気相をアルゴンガスで置換後、ＣＯ２を最終濃度５％、窒素ガスを最終濃度２−３％になるように気相中に加えて、ブチルゴム栓で密閉後、同じ光照射条件下でロータリーシェーカー上で懸濁しながら培養した。窒素ガスを含まない気相下では、水素生産は４−５日しか持続しないが、少量（２−３％）の窒素ガスを供給することで、アナベナはニトロゲナーゼ活性が阻害されない程度に窒素固定により窒素を補え、細胞活性を持続できるようになり、ニトロゲナーゼの活性も数週間に亘って持続できる（引用文献Ｍａｓｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４；上記非特許文献３）。持続的な水素生産において、気相中に蓄積した水素を経時的にガスクロマトグラフィーに
より測定した。気相は１−２日毎に初期気相に更新し、更新後に再び生産された水素量は累積して評価した。９日までの持続的な水素生産において、変異株の累積水素生産量は、親株ΔＨｕｐよりも約１．３倍増加した（図５）。この結果から、変異株の水素生産性向上は一時的ではなく、持続的なものであり、ヘテロシスト形成頻度の増大に起因することがわかった。そして、これらＨｅｔＲ変異株は、アンモニア固定効率のみならず、水素生産効率も向上することがわかった。
【００５６】
＜アナベナ野生株及びその変異株のヘテロシスト形成頻度とアンモニア生産性の測定＞
アナベナ野生株及びその変異株ＷＴ−Ａ２１８ＴとＷＴ−Ｉ２７２Ｆは、光照射条件下（光強度９０−１００  μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２  ｓ−１  （ＰＡＲ））で、５００ｍｌのＢＧ１１液体培地中（１７．６ｍＭ  ＮａＮＯ３を含む）で、空気を通気しながら２−３日培養した。この培養液から細胞を遠心（４，０００×ｇ、２−３  ｍｉｎ）により回収し、窒素化合物を含まないＢＧ１１０液体培地で２回洗った後、同じ培地に懸濁した。その懸濁液を同じ５００ｍｌのＢＧ１１０液体培地に移し、空気を通気しながら培養して、ヘテロシスト形成頻度を測定した。アナベナ野生株では、窒素欠乏後１日目のヘテロシストは形成途中の未成熟なものがあったため、ヘテロシスト形成頻度は、窒素欠乏後２日目と３日目に上記と同様にして測定した。変異株ＷＴ−Ａ２１８ＴとＷＴ−Ｉ２７２Ｆのヘテロシスト形成頻度は、２、３日目ともに野生株より増大し、最大値となる２日目では、それぞれ１．４倍、１．９倍増大した（図６）。また、ヘテロシスト間隔の分布を表したヒストグラムでは、２個以上連続したヘテロシストが野生株でも約２０％の割合で見られ、変異株においても一定の割合（約３０−４０％）見られるが、ほとんどのヘテロシストは間隔をおいて形成されていた（図７）。
【００５７】
なお、当該実験における、各株のヘテロシスト間隔細胞数の平均値±標準偏差（１日目，２日目）は次の通りであった。
野生株：（１０．２±１．１，  １３．３±１．４）
ＷＴ−Ａ２１８Ｔ：（６．８±０．９，  ８．２±１．４）
ＷＴ−Ｉ２７２Ｆ：（４．９±０．５，  ５．８±１．３）
また、各変異株のヘテロシスト間隔細胞数の平均（期待値）が野生株（親株）と比べて、統計的に有意に短いかどうかを表すｔ検定を行ったときのｐ値は、すべてｐ＜０．０１であり、統計的に有意であった。また各変異株のヘテロシスト頻度の最大値（２日目）が野生株（親株）と比べて、統計的に有意に増加したかどうかの解析結果は、すべてｐ＜０．０１であり、統計的に有意であった。
【００５８】
アンモニア生産性の測定は以下のように行った。上記のＢＧ１１０液体培地で２回洗った後の懸濁液を用いて、５０μｇ  Ｃｈｌ  ａを含む１５ｍｌの懸濁液を調整し、内容積６５ｍｌのガスクロバイアルに入れ、ブチルゴム栓で密閉した。気相をアルゴンガスで置換後、ＣＯ２を最終濃度１０％になるように気相中に加えて、ブチルゴム栓で密閉後、同じ光照射条件下でロータリーシェーカー上で懸濁しながら培養した。この最初の１日間において、アルゴン気相下（窒素ガスを含まない気相下）で厳しい窒素欠乏条件にすることにより、ヘテロシスト形成とニトロゲナーゼ活性の発現を強く誘導した。
【００５９】
窒素欠乏後１日目に、窒素固定により合成されたアンモニアをグルタミンとして固定するグルタミン合成酵素の阻害剤であるＭｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ（ＭＳＸ）を最終濃度２０μＭになるように懸濁液に加え、ニトロゲナーゼにより生産されたアンモニアが培地中に排出されるようにした。気相を窒素ガスで置換後、ＣＯ２を最終濃度１０％になるように加えて、ブチルゴム栓で密閉後、同じ光照射条件下でロータリーシェーカー上で培養を続けた。また必要に応じて、窒素ガス／１０％  ＣＯ２気相に、水素を最終濃度１０％になるように加えた。１日ごとに、ガスクロバイアル内の懸濁液から５００μｌ回収し、遠心（８，０００×ｇ、２−３  ｍｉｎ）により上清（液体培地）と
沈殿（細胞）に分離し、上清をアンモニア定量に、沈殿をＣｈｌ  ａ定量に用いた。アンモニア定量は、アンモニア−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて行った。懸濁液を回収後、気相を初期気相である窒素ガス／１０％  ＣＯ２または窒素ガス／１０％
ＣＯ２／１０％  Ｈ２に更新し、培養を続けた。水素を含まない窒素ガス／１０％  ＣＯ２気相下では、変異株のアンモニア生産性は、野生株より約１．６倍向上（最初の１日間）した。また、培養２日目以降、生産性がやや低下する傾向が見られたが、依然として野生株に比べ高いアンモニア生産性を示した（図８）。一方、水素を含む窒素ガス／１０％  ＣＯ２／１０％  Ｈ２気相下では、水素は窒素固定反応の補助的な還元力源として使われるので、培養２日目以降も高いアンモニア生産性が持続し、その結果、２種類の変異株の生産性は野生株と比べて、培養４日目（３日間の生産）で約１．６倍増加した（図９）。また、培養４日目までの懸濁液のＣｈｌ  ａ濃度は、野生株と変異株で差が見られなかった。これらの結果から、ヘテロシスト形成頻度が増加したことにより、変異株のアンモニア生産性は向上した。水素生産性向上の結果も合わせて考えると、ｈｅｔＲ変異株は、ヘテロシストが一定間隔をおいたパターンを維持しながら、その形成頻度を増加させることができ、その性質により、ニトロゲナーゼによる水素生産及びアンモニア生産の持続的な増産が可能であると結論される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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