(57)【要約】【課題】本発明の課題は、中性付近に至適ｐＨを有し、５０℃程度の温度で熱処理すると失活し、かつ、キレート剤の存在下においてプロテアーゼ活性を十分に維持するという特徴を備えたプロテアーゼ及びこのプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物を提供することにある。【解決手段】上記課題を解決するために、至適ｐＨが４．０〜８．５であるプロテアーゼであって、１０ｍＭのクエン酸に対する残存活性が５０％以上であり、５０℃で３０分間処理した後の残存活性が５％以下であることを特徴とする、プロテアーゼ及びこのプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
至適ｐＨが４．０〜８．５であるプロテアーゼであって、
１０ｍＭのクエン酸に対する残存活性が５０％以上であり、
５０℃で３０分間処理した後の残存活性が５％以下であることを特徴とする、プロテアーゼ。
【請求項２】
前記プロテアーゼは、至適温度が２０〜４０℃であることを特徴とする、請求項１に記載のプロテアーゼ。
【請求項３】
前記プロテアーゼは、フラボバクテリウム・フリジダリウムＦＦ−Ｎｏ．２６株又はその変異株の微生物により産生されることを特徴とする、請求項１又は２に記載のプロテアーゼ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロテアーゼを含有することを特徴とする、洗浄剤組成物。
【請求項５】
前記洗浄剤組成物は、ｐＨが５．０〜９．０であることを特徴とする、請求項４に記載の洗浄剤組成物。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の洗浄剤組成物を使用して洗浄対象物を洗浄することを特徴とする、洗浄方法。
【請求項７】
５０℃で３０分間処理した後の残存活性が５％以下であるプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物を使用して洗浄対象物を洗浄することを特徴とする、洗浄方法。
【請求項８】
前記洗浄対象物を洗浄した後に、前記洗浄対象物を５０℃以上に加熱処理することを特徴とする、請求項６又は７に記載の洗浄方法。
【請求項９】
前記洗浄対象物は、食品製造用の装置又は設備であることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一項に記載の洗浄方法。
【請求項１０】
前記洗浄対象物は、樹脂製品であることを特徴とする、請求項６〜９のいずれか一項に記載の洗浄方法。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載のプロテアーゼを産生することを特徴とする、微生物。
【請求項１２】
プロテアーゼ産生能を有するフラボバクテリウム・フリジダリウムＦＦ−Ｎｏ．２６株又はその変異株である微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キレート剤の存在下において高い残存活性を有するプロテアーゼ及びこのプロテアーゼを産生する微生物に関する。また、本発明は、キレート剤の存在下において高い残存活性を有するプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物及びこの洗浄剤組成物を用いる洗浄方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品工場では、細菌等の微生物が増殖しないように、日々洗浄を行って衛生状態を維持している。食品製造用の装置や設備にタンパク質が付着すると、中性洗剤では洗い落とすことが困難である。そのため、高濃度のアルカリ洗剤などでタンパク質を分解して洗い落としている。
【０００３】
また、タンパク質の分解活性を有する低温性プロテアーゼを添加した洗剤が知られている。例えば、特許文献１には、至適ｐＨが７．５であり、５０℃で約１５分間処理すると失活する低温性プロテアーゼの発明が開示されており、その利用例として、衣類用洗剤組成物に添加することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平８−２１４８７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
食品製造用の装置や設備に付着したタンパク質を高濃度のアルカリ洗剤で洗浄すると、例えば、ポリウレタンのような樹脂の劣化が進みやすいという問題がある。そこで、洗浄剤組成物のｐＨを低下し、プロテアーゼによりタンパク質を分解することを検討した。
【０００６】
食品製造用の装置や設備の洗浄に使用する洗浄剤組成物にプロテアーゼを添加する場合、洗浄後の装置等にプロテアーゼが残存しないように留意する必要がある。洗浄後の装置等にプロテアーゼが残存すると、加工食品等にプロテアーゼが混入し、保存期間中に食品のタンパク質が分解され、食感や味が変わるという問題があるからである。よって、プロテアーゼの特性として、５０℃程度の温度で熱処理することにより完全に失活するという特性が求められる。
【０００７】
また、洗浄剤組成物には、除菌や抗菌、界面活性剤の洗浄効果を高める等の目的でクエン酸やＥＤＴＡ等のキレート剤が含まれている。従来のプロテアーゼは、キレート剤の存在下では活性が著しく低下するため、洗浄剤組成物に添加すると、十分なプロテアーゼ活性が得られないという問題がある。
【０００８】
そこで、本発明の課題は、中性付近に至適ｐＨを有し、５０℃程度の温度で熱処理すると失活し、かつ、キレート剤の存在下においてプロテアーゼ活性を十分に維持するという特徴を備えたプロテアーゼ及びこのプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物を提供することにある。
【０００９】
また、本発明の課題は、洗浄後にプロテアーゼ活性が残存しない洗浄方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、種々の微生物により産生されたプロテアーゼの中から、５０℃で失活し、キレート剤の存在下においてプロテアーゼ活性を十分に維持できるものを選別することにより、フラボバクテリウム属の微生物の産生するプロテアーゼが、５０℃で失活し、キレート剤の存在下においてプロテアーゼ活性を十分に維持できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下のプロテアーゼ、洗浄剤組成物、洗浄方法、微生物である。
【００１１】
上記課題を解決するための本発明のプロテアーゼは、至適ｐＨが４．０〜８．５であるプロテアーゼであって、１０ｍＭのクエン酸に対する残存活性が５０％以上であり、５０℃で３０分間処理した後の残存活性が５％以下であることを特徴とする。
このプロテアーゼによれば、キレート剤としてクエン酸の存在下であっても十分なプロテアーゼ活性を維持することができるため、キレート剤を含む洗浄剤組成物に添加することが可能となる。また、５０℃で３０分間処理することにより失活するため、簡単な熱処理を行うことによりプロテアーゼの作用を停止することができる。
【００１２】
更に、本発明のプロテアーゼの一実施態様によれば、プロテアーゼは、至適温度が２０〜４０℃であるという特徴を有する。
この特徴によれば、２０〜４０℃でプロテアーゼ活性を十分に発揮することができるため、常温でも優れた洗浄作用が認められる。また、本発明のプロテアーゼを食品の改質に利用する場合に、低温で改質処理を行うことができるため、改質処理中の食品の変質等を抑制することができる。
【００１３】
更に、本発明のプロテアーゼの一実施態様によれば、プロテアーゼは、フラボバクテリウム・フリジダリウムＦＦ−Ｎｏ．２６株又はその変異株の微生物により産生されるという特徴を有する。
この特徴によれば、微生物を培養することにより、本発明の特性を有するプロテアーゼを簡単に得ることができる。
【００１４】
上記課題を解決するための本発明の洗浄剤組成物は、上記の本発明のプロテアーゼを含有することを特徴とする。
この洗浄剤組成物によれば、タンパク質の分解作用に優れた洗浄剤組成物を提供することができる。また、５０℃で３０分間処理することによりプロテアーゼを失活させることができるため、簡単な熱処理でプロテアーゼの作用を停止させることができる。
【００１５】
更に、本発明の洗浄剤組成物の一実施態様によれば、洗浄剤組成物は、ｐＨが５．０〜９．０であるという特徴を有する。
この特徴によれば、洗浄剤組成物のｐＨが中性付近であることから、ポリウレタンのような樹脂製品の洗浄において、樹脂製品の劣化を抑制することができる。また、洗浄剤組成物のｐＨが本発明のプロテアーゼの至適ｐＨと重複することから、プロテアーゼ活性がより発揮される。
【００１６】
上記課題を解決するための本発明の洗浄方法は、本発明の洗浄剤組成物を使用して洗浄対象物を洗浄することを特徴とする。
この洗浄方法によれば、洗浄剤組成物によりタンパク質が分解されるため、洗浄対象物に付着したタンパク質を洗い落とすことができる。
【００１７】
上記課題を解決するための本発明の洗浄方法は、５０℃で３０分間処理した後の残存活性が５％以下であるプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物を使用して洗浄対象物を洗浄することを特徴とする。
この洗浄方法によれば、洗浄剤組成物によりタンパク質が分解されるため、洗浄対象物に付着したタンパク質を洗い落とすことができる。
【００１８】
更に、本発明の洗浄方法の一実施態様によれば、洗浄対象物を洗浄した後に、洗浄対象物を５０℃以上に加熱処理するという特徴を有する。
この特徴によれば、洗浄対象物を洗浄した後に、洗浄対象物を５０℃以上に加熱処理するため、洗浄対象物に残っているプロテアーゼの活性を低下することができる。
【００１９】
更に、本発明の洗浄方法の一実施態様によれば、洗浄対象物は、食品製造用の装置又は設備であるという特徴を有する。
食品等へプロテアーゼが混入すると、食品の保存中に品質が低下（例えば、意図しない肉の軟化などによる味や食感の変化）するという問題がある。本発明の洗浄剤組成物は、５０℃で加熱処理することによりプロテアーゼ活性が低下するため、洗浄対象物にプロテアーゼが残っている場合でも、洗浄対象物に対して簡単な加熱処理を行うことにより洗浄対象物に残っているプロテアーゼの活性を低下することができる。そのため、食品製造用の装置等に適用した場合でも、食品等へのプロテアーゼの影響を抑制することができる。また、食品にプロテアーゼが混入した場合でも、食品に対して簡単な加熱処理を行うことによりプロテアーゼの作用を停止することができる。このような観点から、本発明の洗浄方法は、食品製造用の装置又は設備の洗浄に好適に利用することができる。
【００２０】
更に、本発明の洗浄方法の一実施態様によれば、洗浄対象物は、樹脂製品であるという特徴を有する。
本発明の洗浄剤組成物は、中性付近であってもプロテアーゼによりタンパク質が分解されるため、アルカリ等で劣化しやすい樹脂製品の洗浄に好適に利用することができる。
【００２１】
上記課題を解決するための本発明の微生物は、本発明のプロテアーゼを産生することを特徴とする。
この微生物によれば、微生物を培養することにより簡単に本発明のプロテアーゼを製造することができる。
【００２２】
上記課題を解決するための本発明の微生物は、プロテアーゼ産生能を有するフラボバクテリウム・フリジダリウムＦＦ−Ｎｏ．２６株又はその変異株である。
この微生物によれば、微生物を培養することにより簡単に本発明のプロテアーゼを製造することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、中性付近に至適ｐＨを有し、５０℃程度の温度で熱処理すると失活し、かつ、キレート剤の存在下においてプロテアーゼ活性を十分に維持するという特徴を備えたプロテアーゼ及びこのプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明の実施例のプロテアーゼの至適温度を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例のプロテアーゼの熱処理に対する残存活性を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例のプロテアーゼの至適ｐＨを示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例のプロテアーゼ試料による洗浄試験の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例のプロテアーゼ試料を含有する洗浄剤組成物による洗浄試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
［プロテアーゼ］
本発明のプロテアーゼは、至適ｐＨが４．０〜８．５であるプロテアーゼであって、１０ｍＭのクエン酸に対する残存活性が５０％以上であり、５０℃で３０分間処理した後の残存活性が５％以下であることを特徴とするものである。
【００２６】
（プロテアーゼの活性測定）
なお、本発明におけるプロテアーゼの活性の測定方法は、特に断りがない限り、次のアゾカゼイン法に従って行った。
＜アゾカゼイン法：アゾカゼインによるタンパク質の分解活性＞
１％（Ｗ/Ｖ）アゾカゼインを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.０）１５０μＬに対して、試料酵素液３０μＬ加え、３０℃で２時間静置反応した。反応液に１５％トリクロロ酢酸１２０μＬを加え反応を停止させた後、遠心分離を１,０００×ｇ、４℃で１０分間行った。その上清を分光光度計にて４４０ｎｍの吸光値を測定した。その吸光値から各サンプル間の相対値を求め、タンパク質の分解活性を評価した。
【００２７】
（至適ｐＨ）
本発明のプロテアーゼは、至適ｐＨが４．０〜８．５である。下限として、好ましくは５．０以上であり、より好ましくは５．５以上であり、更に好ましくは６．０以上であり、特に好ましくは６．５以上である。上限として、好ましくは８．０以下であり、より好ましくは７．８以下であり、特に好ましくは７．５以下である。これにより、アルカリ剤を利用しなくてもタンパク質を分解することができる。
なお、至適ｐＨの決定方法は、反応液の緩衝液の組成として、それぞれ１００ｍＭの、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４.０−５.０）、りん酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.０−８．０）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ１０．０）、りん酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．０−１２．０）を用いて基質溶液のｐＨを調整し、これにプロテアーゼを添加後、プロテアーゼの活性を測定する。そして、種々のｐＨ条件についてプロテアーゼ活性を測定し、最もプロテアーゼ活性の高いｐＨの条件を、至適ｐＨとした。
【００２８】
（キレート剤に対する安定性）
本発明のプロテアーゼは、１０ｍＭのクエン酸に対する残存活性が５０％以上である。１０ｍＭのクエン酸に対する残存活性は、好ましくは５５％以上であり、より好ましくは６０％以上であり、特に好ましくは６５％以上である。これにより、クエン酸を含有する洗浄剤組成物や加工食品等に添加した場合でも、十分にプロテアーゼ活性を維持することができる。
なお、１０ｍＭのクエン酸に対する残存活性の測定方法は、プロテアーゼの溶液にクエン酸の終濃度を１０ｍＭとなるように加え、２０℃で６０分間保持した後、残存するプロテアーゼの活性を測定する。残存活性（％）は、クエン酸無添加の場合のプロテアーゼ活性に対する、クエン酸添加の場合のプロテアーゼ活性の割合を百分率で表したものである。
【００２９】
また、本発明のプロテアーゼは、他のキレート剤に対する安定性にも優れていることが好ましい。例えば、１０ｍＭのＥＤＴＡに対する残存活性が、好ましくは１５％以上であり、より好ましくは２０％以上である。
なお、ＥＤＴＡに対する残存活性の測定方法は、上記クエン酸をＥＤＴＡに置き換えたものである。
【００３０】
（熱に対する安定性）
本発明のプロテアーゼは、５０℃で３０分間処理した後の残存活性が５％以下である。残存活性が５％以下の場合、プロテアーゼが失活していると認められる。プロテアーゼの作用をより低下させるという観点から、５０℃で３０分間処理した後の残存活性は、好ましくは３％以下の場合であり、更に好ましくは１％以下の場合であり、特に好ましくは０．５％以下の場合である。これにより、簡単な加熱処理によってプロテアーゼの作用を停止することができる。
また、プロテアーゼをより簡単な加熱処理によって失活させるという観点から、５０℃で加熱処理する時間としては、好ましくは２０分間であり、特に好ましくは１５分間である。
なお、５０℃で熱処理した後の残存活性の測定方法は、プロテアーゼの溶液を５０℃で所定時間保持した後、残存するプロテアーゼの活性を測定した。残存活性（％）は、加熱処理前のプロテアーゼ活性に対する、加熱処理後のプロテアーゼ活性の割合を百分率で表したものである。
【００３１】
（至適温度）
本発明のプロテアーゼの至適温度は、特に制限されないが、好ましくは２０〜４０℃である。下限として、より好ましくは２５℃以上であり、上限として、より好ましくは３５℃以下である。これにより、２０〜４０℃でプロテアーゼ活性を十分に発揮することができるため、常温でも優れた洗浄作用が認められる。また、本発明のプロテアーゼを食品の改質に利用する場合に、低温で改質処理を行うことができるため、改質処理中の食品の腐敗を抑制することができる。
なお、至適温度の決定方法は、基質溶液の温度を調整し、これにプロテアーゼを添加後、プロテアーゼの活性を測定する。そして、種々の温度条件についてプロテアーゼ活性を測定し、最もプロテアーゼ活性の高い温度を、至適温度とした。
【００３２】
［プロテアーゼの製造方法］
本発明のプロテアーゼの製造方法は、特に制限されないが、例えば、自然の微生物や動物、人工的に変異させた微生物や動物等に産生させる方法や、アミノ酸を合成して製造する方法等が挙げられる。簡単に大量に得られるという観点から、自然の微生物又は人工的に変異させた微生物に産生させる方法が好ましい。より好ましくは、フラボバクテリウム属の微生物により産生させる方法であり、特に好ましくは、フラボバクテリウム・フリジダリウムＦＦ−Ｎｏ．２６株又はその変異株の微生物により産生させる方法である。
【００３３】
（微生物）
本発明における微生物は、スキムミルクを基質とした寒天培地（スキムミルク加標準寒天培地）で培養後（１０℃で５日間）、スキムミルクの分解によってコロニーの周囲にクリアゾーンを形成するものである。更に、その微生物を培養した培養液の上清を５０℃で１５分間加熱処理した後にプロテアーゼ活性が検出されず、かつ、１０ｍＭのＥＤＴＡの存在下においてプロテアーゼ活性を有する微生物である。ここで、５０℃で１５分間加熱処理した後にプロテアーゼ活性が検出されないとは、下記実施例の「（１）加熱処理試験」において、「−」と判定されることを意味する。また、１０ｍＭのＥＤＴＡの存在下においてプロテアーゼ活性を有するとは、下記実施例の「（２）耐キレート剤試験」において、「＋−」又は「＋」と判定されることを意味し、好ましくは「＋」と判定される微生物である。
【００３４】
更に、プロテアーゼ分解能に優れるという観点から、下記実施例の「（３）プロテアーゼ活性試験」において、「＋」と判定される微生物が好ましく、「＋＋」と判定される微生物が特に好ましい。
【００３５】
（フラボバクテリウム・フリジダリウムＦＦ−Ｎｏ．２６株又はその変異株）
本発明における微生物は、好ましくはフラボバクテリウム属の微生物であり、特に好ましくは、フラボバクテリウム・フリジダリウム（Flavobacterium frigidarium）ＦＦ−Ｎｏ．２６株の微生物である。このフラボバクテリウム・フリジダリウムＦＦ−Ｎｏ．２６株は、至適ｐＨが４．０〜８．５であり、１０ｍＭのクエン酸に対する残存活性が５０％以上であり、５０℃で３０分間処理した後の残存活性が５％以下であり、至適温度が２０〜４０℃であるプロテアーゼを産生することができる。なお、フラボバクテリウム・フリジダリウムＦＦ−Ｎｏ．２６株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許生物寄託センターに寄託されている（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５５５）。
【００３６】
また、フラボバクテリウム・フリジダリウムＦＦ−Ｎｏ．２６株の変異株の微生物とは、フラボバクテリウム・フリジダリウムＦＦ−Ｎｏ．２６株に対して変異が導入された微生物であり、例えば、自然突然変異や、公知の人為的突然変異により作製することができる。
【００３７】
自然の微生物又は人工的に変異させた微生物（以下、単に「微生物」という。）に産生させる方法としては、微生物を培養した培養液をプロテアーゼ溶液として調製することができる。好ましくは、遠心分離やろ過等により微生物を除去した培養液であり、特に好ましくは、ろ過により微生物を除去した培養液である。微生物を確実に除去できるという観点から、ろ過の目開きの上限としては、好ましくは１μｍ以下であり、より好ましくは０．５μｍ以下であり、特に好ましくは０．３μｍ以下である。ろ過処理量を高めるという観点から、ろ過の目開きの下限としては、好ましくは０．０１μｍ以上であり、特に好ましくは０．１μｍ以上である。ろ過の方式としては、例えば、培養液の全量をろ過する全量ろ過方式や、培養液を膜面に対して平行に流しながらろ過するクロスフロー方式等がある。
【００３８】
培養液として得られたプロテアーゼ溶液は、濃縮することが好ましい。濃縮する方法としては、５０℃以上に加熱しない方法であれば特に制限されないが、例えば、硫安沈殿や、減圧濃縮などの方法が挙げられる。簡単な操作で濃縮できるという観点から、硫安沈殿による濃縮方法が好ましい。また、乾燥して固形物としてもよい。
【００３９】
［洗浄剤組成物］
本発明の洗浄剤組成物は、至適ｐＨが４．０〜８．５であるプロテアーゼであって、１０ｍＭのクエン酸に対する残存活性が５０％以上であり、５０℃で３０分間処理した後の残存活性が５％以下であるプロテアーゼを含有することを特徴とするものである。
【００４０】
本発明の洗浄剤組成物のｐＨは、特に制限されないが、好ましくは５．０〜９．０である。下限としては、より好ましくは５．５以上であり、更に好ましくは６．０以上であり、特に好ましくは６．５以上である。上限としては、より好ましくは８．５以下であり、更に好ましくは８．０以下であり、特に好ましくは７．５以下である。これにより、洗浄剤組成物のｐＨが本発明のプロテアーゼの至適ｐＨと重複することから、プロテアーゼ活性がより発揮される。また、ポリウレタンのような樹脂製品の洗浄において、樹脂製品の劣化を抑制することができる。
【００４１】
洗浄剤組成物の形態は、特に制限されないが、例えば、液状、ジェル状、固形状、粉末状などが挙げられる。また、ポンプフォーマー等の起泡装置により泡状としてもよい。
【００４２】
［洗浄方法］
本発明の洗浄方法は、上記洗浄剤組成物を使用して洗浄対象物を洗浄することを特徴とするものである。
また、本発明の洗浄方法は、５０℃で３０分間処理した後の残存活性が５％以下であるプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物を使用して洗浄対象物を洗浄することを特徴とするものである。
【００４３】
洗浄対象物は、特に制限されないが、例えば、樹脂製品、金属製品、ガラス製品、陶器製品、繊維製品等が挙げられる。本発明の洗浄方法は、ｐＨが中性付近でタンパク質分解能を有することから、アルカリ性の洗浄剤組成物に対して劣化しやすい樹脂製品の洗浄に好適に利用することができる。樹脂製品の材質は、特に制限されないが、例えば、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネート、天然ゴム、シリコーンゴム、塩化ビニール、ナイロン等が挙げられる。本発明の洗浄方法は、アルカリ性の洗浄剤組成物に対して劣化しやすいという観点から、ポリウレタン製の樹脂製品の洗浄に適する。
【００４４】
また、本発明の洗浄剤組成物は、簡単な加熱処理によりプロテアーゼを失活させることができることから、食品製造用の装置や設備等の洗浄に好適に使用することができる。食品製造用の装置としては、例えば、仕込みタンク、混合装置、ろ過装置等がある。ろ過装置のろ過フィルターは、微細な孔にプロテアーゼが残存しやすいため、簡単な加熱によりプロテアーゼが失活する本発明の洗浄方法を好適に利用できる。また、食品製造用の設備としては、パレットやコンベアベルト等が挙げられる。
【００４５】
本発明の洗浄方法は、例えば、以下の工程を備えた洗浄方法である。
工程１：洗浄対象物を本発明の洗浄剤組成物で洗浄する工程。
工程２：洗浄対象物を５０℃以上で熱処理する工程。
工程３：洗浄対象物をすすぎ、洗浄剤組成物を洗い落とす工程。
【００４６】
上記工程１は、洗浄対象物を本発明の洗浄剤組成物で洗浄する操作であれば、特に制限されないが、例えば、洗浄剤組成物又はその希釈液に洗浄対象物を漬け置く操作（漬け置き洗い）、洗浄剤組成物を付着した洗浄用具（ブラシ、スポンジ等）で擦り洗いする操作等が挙げられる。
【００４７】
漬け置き洗いにおける漬け置き時間は、特に制限されないが、例えば、１分〜２４時間である。プロテアーゼの分解作用を勘案すると、下限値としては、好ましくは５分以上であり、特に好ましくは１０分以上である。一方、作業時間等を勘案すると、上限値としては、好ましくは１時間以下であり、特に好ましくは３０分以下である。また、温度は、５０℃以下であれば特に制限されないが、プロテアーゼの至適温度を鑑みれば、好ましくは２０〜４０℃である。
【００４８】
上記工程２は、洗浄対象物を５０℃以上の温度で熱処理する操作であれば、特に制限されない。この熱処理する操作とは、例えば、洗浄対象物を５０℃以上の温水に浸漬する操作、洗浄対象物に５０℃以上の温水を掛け流す操作、洗浄対象物に１００℃以上のスチームを吹き付ける操作等が挙げられる。なお、洗浄対象物を５０℃以上の温水に浸漬する操作において、浸漬時間は、特に制限されないが、プロテアーゼを失活させるという観点から、好ましくは５分以上であり、より好ましくは１０分以上であり、特に好ましくは１５分以上である。
【実施例】
【００４９】
［菌株のスクリーニング］
カレイ、ホヤ、ぶり、エビ等の水生生物、冷蔵庫の汚れ、ひき肉、用水路の水等から採取した各試料を滅菌生理食塩水にて４倍に希釈後、ストマッカーで３０秒間破砕を行った。スキムミルクを基質とした寒天培地（スキムミルク加標準寒天培地）に各試料液を一白金耳画線し、１０℃で５日間培養した。培養後、出現したコロニーのうちスキムミルクの分解によってコロニーの周囲にクリアゾーンを示した１０３株の細菌を分離した。スキムミルク加標準寒天培地の作成方法は以下に示す。表１に分離した菌株を示す。
【００５０】
（スキムミルク加標準寒天培地）
標準寒天培地（日水製薬（株））を通常の二倍濃度で調整し、１２１℃で１５分間の滅菌を行った。また、蒸留水にスキムミルクが２．０％となるように添加し、１２１℃で１５分間の滅菌を行った。二倍濃度の標準寒天培地と２．０％スキムミルク溶液を等量ずつ加え撹拌し、滅菌シャーレに分注して固化させた。
【００５１】
次に、表１に示す分離菌株をトリプトソーヤブイヨン（日水製薬（株））に接種し、１０℃で１５日間培養した。培養後、遠心分離を行い（９,０００×ｇ、４℃、１０分間）、回収した上清を０．２２μｍのシリンジフィルター（メルクミリポア（株））にてろ過滅菌し、培養液上清とした。得られた培養液上清について、以下の（１）加熱処理試験、（２）耐キレート剤試験、（３）プロテアーゼ活性試験、により段階的にスクリーニングを行った。なお、（１）加熱処理試験、（２）耐キレート剤試験、（３）プロテアーゼ活性試験では、以下のプレートアッセイ法により、プロテアーゼ活性を評価した。
【００５２】
＜プレートアッセイ法：スキムミルク加標準寒天培地によるタンパク質の分解活性＞
スキムミルク加標準寒天培地に直径６．５ｍｍのウェルを無菌的にあけ、培養液上清をそのウェルにそれぞれ３０μＬ注入し、２０℃で４８時間静置反応した。反応後、ウェル周辺に出来たクリアゾーンの直径を測定し、各サンプル間の相対値を求め、プロテアーゼ活性を評価した。
【００５３】
（１）加熱処理試験
得られた培養液の上清を５０℃で１５分間加熱処理後、上記のプレートアッセイ法によりプロテアーゼ活性を測定した。
クリアゾーンの大きさが６．５ｍｍ未満のものを「−」、クリアゾーンの大きさが６．５ｍｍ以上のものを「＋」で評価し、表１に示した。加熱処理試験の結果から、５０℃で１５分間加熱処理することによりプロテアーゼ活性の低下した５株（表１の「＊」印を付した菌株）を選抜し、次の（２）耐キレート剤試験、（３）プロテアーゼ活性試験に供した。
【００５４】
（２）耐キレート剤試験
選抜した５菌株の培養液の上清に対して、終濃度１０ｍＭとなるようにＥＤＴＡを添加し、２０℃で６０分間保管後、上記のプレートアッセイ法によりプロテアーゼ活性を測定した。
クリアゾーンの大きさが６．５ｍｍ未満のものを「−」、クリアゾーンの大きさが６．５ｍｍ以上１０ｍｍ未満のものを「＋−」、クリアゾーンの大きさが１０ｍｍ以上のものを「＋」で評価し、表２に示した。
【００５５】
（３）プロテアーゼ活性試験
選抜した５菌株の培養液の上清を、上記のプレートアッセイ法によりプロテアーゼ活性を測定した。
クリアゾーンの大きさが６．５ｍｍ未満を「−」、６．５ｍｍ以上１０ｍｍ未満を「＋−」、１０ｍｍ以上１３ｍｍ未満を「＋」、１３ｍｍ以上を「＋＋」で評価し、表２に示した。
【００５６】
（２）耐キレート剤試験及び（３）プロテアーゼ活性試験の結果から、いずれの試験においても良好な結果を示した１株（Ｎｏ．２６株、表２の「＊」印を付した菌株）を選抜した。
【００５７】
【表１】
2019080493.tif 000002
【００５８】
【表２】
2019080493.tif 000003
【００５９】
［菌株の同定］
Ｎｏ．２６株について、常法に従い形態学的および生理学的性質調査を行った。また、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列の相同性から種の判別を行った結果、フラボバクテリウム・フリジダリウム（Flavobacterium frigidarium）と同定された。それら結果を表３に示した。１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を配列表に記載する（配列番号１）。Ｎｏ．２６株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８号１２２号室）に、フラボバクテリウム・フリジダリウムＦＦ−Ｎｏ．２６株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２５５５）として寄託した。
【００６０】
【表３】
2019080493.tif 000004
【００６１】
［フラボバクテリウム・フリジダリウムＦＦ−Ｎｏ．２６株のプロテアーゼの特性評価］
フラボバクテリウム・フリジダリウムＦＦ−Ｎｏ．２６株により産生されるプロテアーゼついて、クエン酸及びＥＤＴＡに対する残存活性、至適温度、熱処理に対する残存活性、至適ｐＨに関する特性について評価した。
（プロテアーゼ試料の調製）
フラボバクテリウム・フリジダリウムＦＦ−Ｎｏ．２６株を１０℃で１５日間培養を行った。培養後、遠心分離を行い（９,０００×ｇ、４℃、１０分間）、回収した培養上清を０．２２μｍのシリンジフィルター（メルクミリポア（株））にてろ過滅菌した後、培養液上清に、培養液上清と等量の飽和硫酸アンモニウム溶液を攪拌しながら加えた後、室温で３０分間静置し、遠心分離を行った（９,０００×ｇ、４℃、２０分間）。その後上清を除きペレットを０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて任意の濃縮度になるよう溶解した。
【００６２】
（特性評価１：キレート剤に対する残存活性）
上記プロテアーゼ試料に、キレート剤として、終濃度１０ｍＭとなるようにクエン酸を、又は、終濃度１ｍＭ若しくは１０ｍＭとなるようにＥＤＴＡを添加し、２０℃で６０分間保管後、アゾカゼイン法によりプロテアーゼ活性を測定した。キレート剤を添加しない場合を１００％とし、相対活性を算出した。結果を表４に示す。
【００６３】
【表４】
2019080493.tif 000005
【００６４】
表４を見ると、フラボバクテリウム・フリジダリウムＦＦ−Ｎｏ．２６株により産生されるプロテアーゼは、１０ｍＭクエン酸に対する残存活性が７０％であり、クエン酸と併用した場合でも十分にプロテアーゼ活性を有することがわかる。
また、フラボバクテリウム・フリジダリウムＦＦ−Ｎｏ．２６株により産生されるプロテアーゼは、１ｍＭＥＤＴＡに対する残存活性が３２％、１０ｍＭＥＤＴＡに対する残存活性が２０％であり、ＥＤＴＡと併用した場合でも十分にプロテアーゼ活性を有することがわかる。
【００６５】
（特性評価２：至適温度）
上記プロテアーゼ試料をアゾカゼイン法に供し、各温度（１０〜５０℃）におけるプロテアーゼ活性を測定した。結果を図１に示す。図１を見ると、フラボバクテリウム・フリジダリウムＦＦ−Ｎｏ．２６株により産生されるプロテアーゼは、至適温度が３０℃であることがわかる。
【００６６】
（特性評価３：熱処理に対する残存活性）
上記プロテアーゼ試料を各温度（４０℃、５０℃、６０℃）で一定の時間（１５分間、３０分間、６０分間）の加熱処理を行い、その後、アゾカゼイン法によりプロテアーゼ活性を測定した。結果を図２に示す（図２における白三角は、６０℃の結果であり、白四角は、５０℃の結果であり、白丸は、４０℃の結果である。）。図２を見ると、フラボバクテリウム・フリジダリウムＦＦ−Ｎｏ．２６株により産生されるプロテアーゼは、５０℃以上で１５分間以上の加熱処理をすると、プロテアーゼが完全に失活することがわかる。また、４０℃で３０分間の加熱処理をすると、残存活性が約２０％程度まで低下することがわかる。
【００６７】
（特性評価４：至適ｐＨ）
上記プロテアーゼ試料をアゾカゼイン法に供し、各ｐＨ（４〜１０）におけるプロテアーゼ活性を測定した。結果を図３に示す。図３を見ると、フラボバクテリウム・フリジダリウムＮｏ．２６株により産生されるプロテアーゼは、至適ｐＨが７であることがわかる。
【００６８】
［洗浄試験］
上記プロテアーゼ試料及び上記プロテアーゼ試料を含む洗浄剤組成物を用いて、洗浄試験を行った。洗浄対象物としては、ウレタン含浸加工をされたコンベアベルト（フォルボ・シークリング・ジャパン（株））の四辺に厚さ約５ｍｍのゴム板を張り、コンベアベルトに載せた試料液が外に漏れないようにした後、ソーセージの塩漬肉１．５ｇをコンベアベルトの中央に載せ、均一に広げ、６℃で１０分間静置したものを用いた。
また、上記プロテアーゼ試料による洗浄試験後の洗浄液を用いて加熱処理に対する残存活性を測定した。
【００６９】
（洗浄試験１：プロテアーゼ試料による洗浄）
各２ｍＬの上記プロテアーゼ試料、市販のプロテアーゼ（プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ、アマノエンザイム（株））及び蒸留水を、それぞれ上記洗浄対象物に添加し、２０℃で５時間静置した後にすすぎ、残った塩漬肉の乾燥重量を測定した。結果を図４に示す。図４のグラフは、蒸留水で洗浄した後に残った塩漬肉の乾燥重量を１００％とした際の相対比を示した。
図４を見ると、本発明のプロテアーゼは、市販のプロテアーゼより優れた洗浄効果が認められた。
【００７０】
（洗浄試験２：プロテアーゼ試料を含有する洗浄剤組成物による洗浄）
各２ｍＬの上記プロテアーゼ試料を含有する中性洗剤及び中性洗剤に、それぞれ上記洗浄対象物に添加し、２０℃で５時間静置した後にすすぎ、残った塩漬肉の乾燥重量を測定した。結果を図５に示す。図５のグラフは、中性洗剤で洗浄した後に残った塩漬肉の乾燥重量を１００％とした際の相対比を示した。
図５を見ると、本発明のプロテアーゼを含有する中性洗剤は、中性洗剤より優れた洗浄効果が認められた。
【００７１】
（洗浄試験３：洗浄試験後の洗浄液の加熱処理に対する残存活性）
上記プロテアーゼ試料及び市販のプロテアーゼで洗浄対象物を洗浄した後の各洗浄液に対して、５０℃で３０分間加熱処理した後のプロテアーゼ活性を測定した。プロテアーゼ活性は、上記「（３）プロテアーゼ活性試験」の方法により評価した。結果を表５に示す。
【００７２】
【表５】
2019080493.tif 000006
【００７３】
表５を見ると、本発明のプロテアーゼの洗浄液は、５０℃で３０分間加熱処理することにより完全に失活するのに対して、市販のプロテアーゼの洗浄液は、５０℃で３０分間加熱処理してもプロテアーゼ活性が低下しないことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明のプロテアーゼは、中性領域であり、キレート剤を含む条件においてタンパク質を分解する処理に好適に利用することができる。また、簡単な加熱処理によりプロテアーゼ活性をほぼ完全に失活させることができるため、食品等のようにプロテアーゼが残存すると品質低下などの問題が生じるような場合に好適に利用することができる。具体的には、食肉の軟化処理等の食品製造用の添加物や、食品製造用の装置や設備の洗浄剤組成物として好適に利用することができる。
【００７５】
また、本発明のプロテアーゼは、中性洗剤にタンパク質分解能を付与することができる。そのため、アルカリ洗剤で洗浄すると劣化しやすい樹脂製品用の洗浄剤組成物に好適に利用することができる。
【図１】
2019080493.tif 000007
【図２】
2019080493.tif 000008
【図３】
2019080493.tif 000009
【図４】
2019080493.tif 000010
【図５】
2019080493.tif 000011
【配列表】
2019080493000001.app