(57)【要約】【課題】三次元被検物の表面のみならず、内部における変位を高精度で、かつ容易に評価することができる三次元被検物評価方法の提供。【解決手段】三次元被検物に対して、少なくとも２つの異なる時刻において、光を照射して前記三次元被検物からの後方散乱光の情報を取得する後方散乱光情報取得工程と、前記少なくとも２つの異なる時刻における前記後方散乱光の情報に基づき、前記三次元被検物の変位を評価する変位評価工程と、を含む三次元被検物評価方法である。【選択図】図３
2019052922.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
三次元被検物に対して、少なくとも２つの異なる時刻において、光を照射して前記三次元被検物からの後方散乱光の情報を取得する後方散乱光情報取得工程と、
前記少なくとも２つの異なる時刻における前記後方散乱光の情報に基づき、前記三次元被検物の変位を評価する変位評価工程と、を含むことを特徴とする三次元被検物評価方法。
【請求項２】
前記後方散乱光情報取得工程において、前記三次元被検物に対して照射する際、照射する光を測定光と参照光とに分割し、前記測定光を前記三次元被検物に照射して前記三次元被検物からの前記後方散乱光の情報を得ると共に、前記後方散乱光と前記参照光との干渉光の情報を取得し、
前記変位評価工程において、前記干渉光に基づく干渉信号から断層画像を得て、前記少なくとも２つの異なる時刻における、複数の前記断層画像を比較して前記三次元被検物の変位を評価する請求項１に記載の三次元被検物評価方法。
【請求項３】
前記変位評価工程において、複数の前記断層画像の比較が、前記三次元被検物における、一の断面に係る断層画像について行われるだけでなく、前記一の断面と交差する方向における他の断面に係る断層画像についても行われる請求項２に記載の三次元被検物評価方法。
【請求項４】
前記変位評価工程において、前記断層画像が、複数の画素により表されたスペックル画像であり、複数の前記断層画像の比較が、複数の前記スペックル画像どうしの相互相関関数を算出することにより行われる請求項２から３のいずれかに記載の三次元被検物評価方法。
【請求項５】
前記変位評価工程において、複数の前記スペックル画像どうしの相互相関関数の算出が、前記スペックル画像における特定画素毎に行われる請求項４に記載の三次元被検物評価方法。
【請求項６】
前記三次元被検物が細胞塊である請求項１から５のいずれかに記載の三次元被検物評価方法。
【請求項７】
前記少なくとも２つの異なる時刻が、前記三次元被検物に対して試薬を投与する前後の時刻である請求項１から６のいずれかに記載の三次元被検物評価方法。
【請求項８】
三次元被検物に対して、少なくとも２つの異なる時刻において、光を照射して前記三次元被検物からの後方散乱光の情報を取得する後方散乱光情報取得手段と、
前記少なくとも２つの異なる時刻における前記後方散乱光の情報に基づき、前記三次元被検物の変位を評価する変位評価手段と、を有することを特徴とする三次元被検物評価装置。
【請求項９】
前記後方散乱光情報取得手段が、前記三次元被検物に対して照射する際、照射する光を測定光と参照光とに分割し、前記測定光を前記三次元被検物に照射して前記三次元被検物からの前記後方散乱光の情報を得ると共に、前記後方散乱光と前記参照光との干渉光の情報を取得し、
前記変位評価手段が、前記干渉光に基づく干渉信号から断層画像を得て、前記少なくとも２つの異なる時刻における、複数の前記断層画像を比較して前記三次元被検物の変位を評価する請求項８に記載の三次元被検物評価装置。
【請求項１０】
前記変位評価手段が、複数の前記断層画像の比較が、前記三次元被検物における、一の断面に係る断層画像について行われるだけでなく、前記一の断面と交差する方向における他の断面に係る断層画像についても行われる請求項９に記載の三次元被検物評価装置。
【請求項１１】
前記変位評価手段が、前記断層画像が、複数の画素により表されたスペックル画像であり、複数の前記断層画像の比較が、複数の前記スペックル画像どうしの相互相関関数を算出することにより行われる請求項９から１０のいずれかに記載の三次元被検物評価装置。
【請求項１２】
前記変位評価手段が、複数の前記スペックル画像どうしの相互相関関数の算出が、前記スペックル画像における特定画素毎に行われる請求項１１に記載の三次元被検物評価装置。
【請求項１３】
前記三次元被検物が細胞塊である請求項８から１２のいずれかに記載の三次元被検物評価装置。
【請求項１４】
前記少なくとも２つの異なる時刻が、前記三次元被検物に対して試薬を投与する前後の時刻である請求項８から１３のいずれかに記載の三次元被検物評価装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、三次元被検物評価方法、及び三次元被検物評価装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、実験用動物の心臓臓器から心筋細胞を分離及び摘出し、心筋細胞をシャーレ等において培養した初代培養細胞を作製し、この初代培養細胞を用いて心筋細胞の評価を行っていた。
【０００３】
初代培養細胞は、一定期間培養すると、細胞が単層の状態（シート状）にて水平方向に増殖し、各心筋細胞が同期して拍動（収縮及び弛緩）をするようになることが知られている。
【０００４】
このような心筋細胞を用いて、薬剤等の心筋細胞に対する影響を測定するためにも、各心筋細胞が同期して拍動（収縮及び弛緩）する状態を観察することができる方法が望まれている。
【０００５】
そこで、三次元的な動きをする塊状細胞を評価することを目的として、前方散乱光を用いた、塊状細胞の動きを評価する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
また、照明光学系から被検物に検出光を照射することにより生ずるスペックルパターンを光センサで撮像し、その撮像結果からスペックルの径と同程度のサイズを有する複数の画素により表される画像パターンを取得し、異なる時刻に得られた２つの画像パターンの相互相関関数を解析装置で解析して、複数の画素のピッチ単位の第１変位とピッチ単位以下の第２変位とを求め、異なる時刻間の被検物の変位を複数の画素のピッチ単位以下で求める方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、三次元被検物の表面のみならず、内部における変位を高精度で、かつ容易に評価することができる三次元被検物評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するための手段としての本発明の三次元被検物評価方法は、三次元被検物に対して、少なくとも２つの異なる時刻において、光を照射して前記三次元被検物からの後方散乱光の情報を取得する後方散乱光情報取得工程と、前記少なくとも２つの異なる時刻における前記後方散乱光の情報に基づき、前記三次元被検物の変位を評価する変位評価工程と、を含む。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、三次元被検物の表面のみならず、内部における変位を高精度で、かつ容易に評価することができる三次元被検物評価方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の三次元被検物評価方法における後方散乱光情報取得工程の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、従来の塊状細胞の動きを評価する方法の一例を示す模式図である。
【図３】図３は、フーリエドメイン方式の三次元被検物評価装置の一例を示す模式図である。
【図４】図４は、本発明の三次元被検物評価方法により得られる相互相関関数の一例を表すグラフである。
【図５】図５は、一の断面と交差する方向における他の断面に係る断層画像の一例を示す模式図である。
【図６Ａ】図６Ａは、実施例１における評価開始から１．０７５秒間後のマウスの心筋細胞の変位量分布を示す光干渉断層撮影画像である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例１における評価開始から１．１１８秒間後のマウスの心筋細胞の変位量分布を示す光干渉断層撮影画像である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、実施例１における評価開始から１．１６１秒間後のマウスの心筋細胞の変位量分布を示す光干渉断層撮影画像である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、実施例１における評価開始から１．１２０４秒間後のマウスの心筋細胞の変位量分布を示す光干渉断層撮影画像である。
【図６Ｅ】図６Ｅは、実施例１における評価開始から１．１２４７秒間後のマウスの心筋細胞の変位量分布を示す光干渉断層撮影画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（三次元被検物評価方法、及び三次元被検物評価装置）
本発明の三次元被検物評価方法は、三次元被検物に対して、少なくとも２つの異なる時刻において、光を照射して前記三次元被検物からの後方散乱光の情報を取得する後方散乱光情報取得工程と、前記少なくとも２つの異なる時刻における前記後方散乱光の情報に基づき、前記三次元被検物の変位を評価する変位評価工程と、を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
本発明の三次元被検物評価方法は、従来の塊状細胞の動きの評価では、塊状細胞を通過した前方散乱光によるスペックル像を用いて、表面イメージング像から、二次元的な動きをするシート状細胞を評価しており、三次元的な動き（変位）をする細胞集合体を評価することは困難であるという問題があるという知見に基づくものである。細胞集合体は、各部位における細胞が、同一の変位（動き）をしているわけではなく、細胞集合体の表層、内部、及び下層では異なる方向、かつ異なる変位量で変位（動き）をしている。また、細胞集合体の同一の層中においても、異なる方向、かつ異なる変位量で変位している。細胞集合体の変位を各部位ごとに正確に評価することにより、細胞集合体の機能、及び状態をより正確に把握することができるため、各部位における細胞の変位を測定することは重要である。
【００１１】
本発明の三次元被検物評価装置は、三次元被検物に対して、少なくとも２つの異なる時刻において、光を照射して前記三次元被検物からの後方散乱光の情報を取得する後方散乱光情報取得手段と、前記少なくとも２つの異なる時刻における前記後方散乱光の情報に基づき、前記三次元被検物の変位を評価する変位評価手段と、を有し、更に必要に応じてその他の手段を有する。
後方散乱光情報取得手段とは、後方散乱光の情報を取得するための手段を意味する。
三次元被検物評価装置とは、三次元被検物を評価するための装置を意味する。
なお、光の情報とは、例えば、光の強度を意味し、分光検出器においては、周波数毎の光の強度情報である。
【００１２】
本発明の三次元被検物評価方法は、本発明の三次元被検物評価装置を用いて好適に実施することができる。
【００１３】
＜後方散乱光情報取得工程、及び後方散乱光情報取得手段＞
後方散乱光情報取得工程は、三次元被検物に対して、少なくとも２つの異なる時刻において、光を照射して前記三次元被検物からの後方散乱光の情報を取得する工程である。
後方散乱光情報取得手段は、三次元被検物に対して、少なくとも２つの異なる時刻において、光を照射して前記三次元被検物からの後方散乱光の情報を取得する手段である。
後方散乱光情報取得工程は、後方散乱光情報取得手段を用いて好適に実施することができる。
【００１４】
図１は、本発明の三次元被検物評価方法における後方散乱光情報取得工程の一例を示す模式図である。図１に示すように、後方散乱光情報取得工程においては、基材１上の三次元被検物２に対して、測定光４を照射する。測定光４は、三次元被検物２内で、多重散乱光、多重前方散乱光、多重後方散乱光、単一前方散乱光、後方散乱光などにより、波面が乱れた状態で反射される。本発明の三次元被検物評価方法においては、後方散乱光５を用いて、三次元被検物の変位３を評価する。
図２は、従来の塊状細胞の動きを評価する方法の一例を示す模式図である。図２に示すように、従来の塊状細胞の動きを評価する方法では、基材１１上における塊状細胞１２の上部から測定光１４を塊状細胞１２に照射する。照射により得られる前方散乱光１５を用いて、塊状細胞の動き１３を評価している。しかし、従来の塊状細胞の動きを評価する方法では、前方散乱光を用いており、細胞集合体全体としての一つの動き（変位）を評価することはできるが、細胞集合体の各部位ごとの三次元的な動き（変位）を評価することは困難である。
【００１５】
少なくとも２つの異なる時刻としては、例えば、時系列で時刻Δｔ〜ｎΔｔのｎ時の時点における時刻などが挙げられる。少なくとも２つの異なる時刻としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、多いほうが、三次元被検物の変位量をより詳細に評価することができるため好ましい。時刻Δｔ〜ｎΔｔにおいて、複数の後方散乱光の情報を取得することにより、三次元被検物の変位量をより詳細に評価することができる。
【００１６】
後方散乱光情報取得工程、及び後方散乱光情報取得手段において、前記三次元被検物に対して光を照射する際、照射する光を測定光と参照光とに分割し、測定光を三次元被検物に照射して三次元被検物からの後方散乱光の情報を得ると共に、後方散乱光と参照光との干渉光の情報を取得することが好ましい。
光としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、９００ｎｍ、９３０ｎｍ、１，３００ｎｍ、又は１，３２５ｎｍの中心波長で動作するスーパールミネッセンスダイオード、中心波長１，０６０ｎｍ、１，３１０ｎｍ、又は１，５５０ｎｍで動作する波長掃引型のレーザーなどが挙げられる。
後方散乱光とは、三次元被検物中で前進する光に対して後方に反射して戻る光を意味する。
測定光とは、三次元被検物を測定するための光を意味する。
参照光とは、光束を２つに分割し、一方の波面（光路）に対して、他方の波面（光路）がどれだけ違っているかを調べるための基準となる波面を意味する。
干渉光とは、後方散乱光と参照光との重畳光を意味する。
【００１７】
後方散乱光の取得としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、光干渉断層撮影（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＯＣＴ）装置を用いることができる。
光干渉断層撮影（ＯＣＴ）装置は、非侵襲、及び非接触にて測定できることから、眼科における生体組織の高解像度な断層画像を取得する方法として広く使用されている。
光干渉断層撮影においては、一次元の深さ方向の測定データをＡスキャンデータ、二次元画像をＢスキャン像、及び三次元画像をＣスキャン像と呼ぶ。
【００１８】
光干渉断層撮影（ＯＣＴ）装置においては、例えば、タイムドメイン方式、フーリエドメイン方式などが挙げられる。これらの中でも、フーリエドメイン方式が好ましい。
タイムドメイン方式としては、例えば、タイムドメインＯＣＴなどが挙げられる。
フーリエドメイン方式としては、例えば、スペクトルドメインＯＣＴ、光周波数掃引ＯＣＴなどが挙げられる。
タイムドメインＯＣＴとしては、ミラーを動かして参照光の光路長を機械的に変化させながら参照光を得、参照光と後方散乱光を重畳して干渉光を得て断層画像取得を行う。
スペクトルドメインＯＣＴとしては、分光・検出器を用いてスペクトル情報を検出して断層画像取得を行う。
光周波数掃引ＯＣＴとしては、波長走査光源を用いてスペクトル干渉信号を検出して断層画像取得を行う。
干渉信号とは、周波数と時間との要素を持つ三次元的な情報を意味する。
断層画像とは、任意の断面層だけを明瞭に撮影した画像を意味する。
【００１９】
フーリエドメイン方式のＯＣＴとしては、取得するスペクトル干渉信号をフーリエ変換して深さ情報（透過光又は反射光の強度信号）を得るため、タイムドメイン方式のようにＯＣＴ撮影時にはミラーを動かして参照光の光路長変化する（これを通常Ａスキャンという）操作を必要としない。これにより、タイムドメイン方式のＯＣＴに比べて格段に速い速度で断層画像を取得することができる。そのため、近年は、主に、フーリエドメイン方式のＯＣＴが採用されるようになっている。
【００２０】
図３は、フーリエドメイン方式の三次元被検物評価装置の一例を示す模式図である。図３に示すように、フーリエドメイン方式のＯＣＴの原理に従った三次元被検物評価装置１００は、光線束１０２を生成する光源１０１と、マイケルソン干渉計装置と、レンズによって絞られた測定光１０６を、三次元被検物内を空間的に走査するためのビーム偏向装置１５０と、測定光１０６を、調査する三次元形状を有する三次元被検物１４０に向け照射し、測定光１０６を集光するレンズ１６０と、を有する。
測定光１０６は、三次元被検物に照射されると、多重散乱光１１１、多重前方散乱光１１３、後方散乱光１１２に分かれる。
マイケルソン干渉計装置は、光線束１０２のビームを、参照光１０４と、測定光１０６と、に分離することができる。さらに、マイケルソン干渉計装置は、ミラー１３０により逆方向に偏向された参照光１０４と、レンズ１６０を通して反射波面１２８を形成する三次元被検物から反射する後方散乱光１１２と、を重ね合わせて干渉光（重畳光）１０８を形成する装置（ビームスプリッタ）１２０を有する。
三次元被検物評価装置１００は、さらに回折格子とアレイディテクタからなる分光・検出器１７０を有し、参照光１０４と三次元被検物１４０で反射して戻ってきた後方散乱光１１２を合波して形成された干渉波面１１８を形成する干渉光１０８を干渉信号として検出し、得られた分光スペクトルをフーリエ変換することにより三次元被検物１４０の深さ情報を得ることができる。
【００２１】
光干渉断層撮影（ＯＣＴ）における奥行き分解能としては、光の時間遅延の測定分解能によって決まる。
低コヒーレンス干渉における奥行き分解能としては、光の電界の自己相関関数の幅によって与えられる。自己相関関数は、光源の波長スペクトル幅の逆数に比例する。ガウス型のスペクトルの場合、奥行き分解能は、下記式（１）によって求めることができる（空気中）。
【００２２】
【数１】
2019052922.tif 000003
式（１）中、Δｚは自己相関関数の半値全幅を表し、Δλは波長パワースペクトルの半値全幅を表し、λｃは光源の中心波長を表す。
【００２３】
横方向の分解能としては、使用するレンズの開口数（ＮＡ）と、光源の中心波長（λ）で決まり、レンズで集光した際のスポットサイズｗ０は、下記式（２）によって求めることができる（空気中）。
【００２４】
【数２】
2019052922.tif 000004
三次元被検物１４０に、照射された測定光１０６は、三次元被検物１４０内で、多重散乱光１１１や、多重前方散乱光１１３、多重後方散乱光、単一前方散乱光、後方散乱光１１２などにより、波面が乱れた状態で反射される。反射された後方散乱光１１２と、参照光１０４とを合波して得られた干渉信号はスペックル像となって検出される。このスペックル像は、三次元被検物などが変位することにより、前記スペックル像も三次元被検物の変位に応じて変位（移動）する。
【００２５】
光源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、波長９３０ｎｍのスーパールミネッセンスダイオードなどが挙げられる。
【００２６】
三次元被検物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、時刻により変位するものが好ましく、細胞塊、樹脂からなる三次元成型部品、セラッミックフィルタ、コンクリート構造物などがより好ましい。
【００２７】
細胞塊における細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、心筋細胞が好ましい。
【００２８】
少なくとも２つの異なる時刻としては、三次元被検物に対して試薬を投与する前後の時刻であることが好ましい。三次元被検物に対して試薬を投与する前後の時刻で、断層画像を取得することにより、三次元形状を有する三次元被検物の動きの評価結果に基づいて、薬剤が三次元形状を有する三次元被検物に与える影響を評価することができる。
試薬を投与する前後の時刻とは、試薬を投与する前の時刻、及び試薬を投与した後の時刻を意味する。
【００２９】
試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬効の評価を行う試薬、毒性の評価を行う試薬などが挙げられる。
【００３０】
薬効の評価を行う試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、オキサゾロン、ベンゾキノン、２，４−ジニトロコロベンジン、４−フェニレンジアミン、グルタルアルデヒド、ベンゾイルペルオキシド、４−メチルアミノフェノール硫酸塩、ホルムアルデヒド、シンナムアルデヒド、エチレンジアミン、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、イソオイゲノール、硫酸ニッケル（ＩＩ）、ベンジリデンアセトン、２−ノニン酸メチル、サリチル酸ベンジル、ジエチレントリアミン、チオグリセロール、２−メルカプトベンゾチアゾール、フェニルアセトアルデヒド、ヘキシルシンナムアルデヒド、ジヒドロオイゲノール、ベンゾイソチアゾリオーネ、シトラール、レゾルシノール、安息香酸フェニル、オイゲノール、アビエチン酸、アミノ安息香酸エチル、ベンジルシンナメート、シンナミルアルコール、ヒドロキシシトロネラール、イミダゾリジニル尿素、ブチルグリシジルエーテル、エチレングリコールジメタクリラート、グリオキサール、４−ニトロベンジルブロミドなどが挙げられる。
毒性の評価を行う試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化亜鉛、１−ブタノール、安息香酸、エチルバニリン、４−ヒドロキシ安息香酸、スルファニル酸、酒石酸、サリチル酸メチル、サリチル酸、ラウリル硫酸ナトリウム、乳酸、ベンジルアルコール、デキストラン、ジエチルフタレート、グリセロール、プロピルパラベン、Ｔｗｅｅｎ８０、ジメチルイソフタレート、フェノール、クロロベンゼン、スルファニルアミド、オクタン酸などが挙げられる。
【００３１】
＜変位評価工程、及び変位評価手段＞
変位評価工程は、少なくとも２つの異なる時刻における後方散乱光の情報に基づき、三次元被検物の変位を評価する工程である。
変位評価手段は、少なくとも２つの異なる時刻における後方散乱光の情報に基づき、三次元被検物の変位を評価する手段である。
変位評価工程は、変位評価手段を用いて好適に実施することができる。
【００３２】
変位評価工程、及び変位評価手段は、前記干渉光に基づく干渉信号から断層画像を得て、前記少なくとも２つの異なる時刻における、複数の断層画像を比較して前記三次元被検物の変位を評価することが好ましい。
複数の断層画像を比較とは、複数の断層画像を用いて、断面画像同士を比べることを意味する。
変位を評価するとは、三次元被検物の動きを見定めることを意味する。
変位評価手段とは、変位を評価するための手段を意味する。
【００３３】
変位評価工程、及び変位評価手段において、断層画像が、複数の画素により表された三次元形状を有する三次元被検物のスペックルパターンの撮像（以下、「スペックル画像」とも称することがある）であり、複数の断層画像の比較が、複数のスペックル画像どうしの相互相関関数（以下、「相関パターン」とも称することがある）を算出することにより行われることが好ましい。
複数の画素とは、元の画像から相関を計算する領域を切り出した部分の画素を意味する。
また、変位評価工程、及び変位評価手段において、複数のスペックル画像どうしの相互相関関数の算出が、前記スペックル画像における特定画素毎に行われることが好ましい。
相互相関関数の算出とは、信号を一定時間ずらしたときに、元の信号とどの程度関係があるかを計算して結果の値を出すことを意味する。
特定画素毎に行われるとは、特定の画素において行うことを意味する。
【００３４】
スペックル画像を連続するフレーム間で相関演算して、スペックル画像のパターンの経時的変化から、三次元被検物の変位（移動）を求めることができる。なお、求められた変位を積算することにより総変位を求めることができる。また、求められた変位をフレームレートで割ることにより三次元被検物の変位（移動）の移動速度及び加速度を求めることができる。時刻ｔ＝ｎΔｔに測定したスペックルパターンの撮像結果（以下、「画像パターン」とも称することがある）をｆ（ｎ）（＝ｆ（ｎ）ｉｊ）と表記する。ただし、添え字ｉ，ｊは、それぞれ、検出したスペックル画像の画素の位置を表す。例えば、ｆ（３）２３は、時刻ｔ＝３Δｔにおいて、ｉ方向に２つ目、その直交方向であるｊ方向に３つ目の画素の画素値を意味する。なお、特に断らない限り、画像パターンをｆ（ｎ）と表記する。特定の画素ｉ，ｊの画素値を意味する場合、画像パターンをｆ（ｎ）ｉｊと表記する。
画像パターンｆ（ｎ）を受信すると、その画像パターンｆ（ｎ）とその前に受信した画像パターンｆ（ｎ−１）とを用いて、下記式（３）から相互相関関数を求める。
ｆ（ｎ）★ｆ（ｎ−１）≡Ｆ−１［ＬＣＦ［ｆ（ｎ）］Ｆ［ｆ（ｎ−１）］＊］  ・・・式（３）
ただし、記号“★”は相互相関演算子、関数ＬＣは低周波数除去パターン、関数Ｆ［ｆ］は関数ｆの離散フーリエ変換、関数Ｆ−１［ｆ］は関数ｆの逆離散フーリエ変換、記号Ｆ＊はＦの複素共役である。式（３）によれば、離散フーリエ変換を用いることで相互相関関数の高速演算が可能になる。
【００３５】
低周波数除去パターンとしては、１２８×３２画素のうちの中心画素及びその周囲の３×３画素の画素値をゼロ、その他の画素値を１とするパターンである。式（３）において、低周波数除去パターンＬＣとの積を取ることにより、画像パターンの背景除去処理が施される。なお、低周波数除去パターンＬＣは、予め実験等により、背景分布（バックグラウンド）を良好に除去できるように定めることとする。これにより、三次元被検物の変位を高精度で求めることができる。
【００３６】
図４は、本発明の三次元被検物評価方法により得られる相互相関関数の一例を表すグラフである。低周波除去を行わない相関パターンでは、緩やかな山状の分布の中にスペックルパターンに由来する鋭いピークの先端が僅かに現れるにすぎないが、これに対して、図４に示すように、相関パターンでは、緩やかな山状の分布は現れず、振幅の小さいノイズの中にスペックルパターンに由来する鋭いピークのほぼ全体が現れている。このように、画像パターンの背景除去処理を施すことにより、相関パターンにおいて背景分布（バックグラウンド）が除去されてスペックルパターンに由来するピークがはっきりと現れ、その結果、ピークの位置を高精度で求めることができる。
【００３７】
相互相関関数を解析して前記複数の画素のピッチ単位の第１変位と、前記ピッチ単位以下の第２変位と、を求めることにより、前記異なる時刻間の前記三次元被検物の変位を求めることができる。変位は、スペックルパターンに由来する最大の画素値を有する画素の位置（ピーク位置）からピクセルピッチ単位により求めることができる。さらに、ピクセルピッチ以下の変位は、次のサブピクセル処理により求めることができる。これらＯＣＴ画像の画素ピッチを加味することにより、三次元形状を有する三次元被検物の変位を求めることができる。
【００３８】
サブピクセル処理では、折れ線近似（一次と零次の二項式近似）、放物線近似（二次と零次の二項式近似）、折れ線と放物線の和による近似（二次から零次の三項式近似）等を適用して相互相関関数ｆ（ｎ）★ｆ（ｎ−１）を補間することにより、ピクセルピッチ以下の変位を求める。ここで、相互相関関数ｆ（ｎ）★ｆ（ｎ−１）のうちの最大の画素値Ｐ（０）を有する画素ｉ０とし、画素ｉ０からｍ隣の画素ｉ＝ｉ０＋ｍの画素値をＰ（ｍ（＝ｉ−ｉ０））とする。折れ線近似では、Ｐ（０）近傍で画素値を一次と零次の二項式を用いてＰ（ｉ−ｉ０）＝ａ｜ｉ−ｉ０｜＋Ｐ０と近似する。それにより、ピクセルピッチ以下の変位ｘは、下記式（４ａ）、又は下記式（４ｂ）により求めることができる。
ｘ＝｛Ｐ（−１）−Ｐ（１）｝／｛２Ｐ（−１）−２Ｐ（０）｝  ・・・  式（４ａ）
ただし、式（４ａ）において、Ｐ（−１）≧Ｐ（１）である。
ｘ＝−｛Ｐ（１）−Ｐ（−１）｝／｛２Ｐ（１）−２Ｐ（０）｝  ・・・  式（４ｂ）
ただし、前記式（４ｂ）において、Ｐ（−１）＜Ｐ（１）である。
【００３９】
放物線近似では、Ｐ（０）近傍で画素値を二次と零次の二項式を用いて、Ｐ（ｉ−ｉ０）＝ｂ（ｉ−ｉ０）２＋Ｐ０と近似する。それにより、変位ｘは、下記式（５）により求めることができる。
ｘ＝−｛Ｐ（１）−Ｐ（−１）｝／｛２Ｐ（−１）−４Ｐ（０）＋２Ｐ（１）｝  ・・・  式（５）
【００４０】
折れ線と放物線の和による近似では、Ｐ（０）近傍で画素値を２次多項式を用いてＰ（ｉ−ｉ０）＝ｂ（ｉ−ｉ０）２＋ａ｜ｉ−ｉ０｜＋Ｐ０と近似する。それにより、変位ｘは、下記式（６ａ）、又は下記式（６ｂ）により求めることができる。
ｘ＝｛Ｐ（−１）−Ｐ（１）｝／｛Ｐ（−１）−Ｐ（０）−Ｐ（１）＋Ｐ（２）｝  ・・・  式（６ａ）
ただし、式（６ａ）において、Ｐ（−１）≧Ｐ（１）である。
ｘ＝｛Ｐ（１）−Ｐ（−１）｝／｛Ｐ（−２）−Ｐ（−１）−Ｐ（０）＋Ｐ（１）｝  ・・・  式（６ｂ）
ただし、前記式（６ｂ）において、Ｐ（−１）＜Ｐ（１）である。
【００４１】
求めた変位を積算することにより、三次元形状を有する三次元被検物の総変位を求めることができる。なお、本実施形態では、サブピクセル処理において折れ線と放物線との和による近似を採用して相互相関関数を補間することとしたが、三次多項式等、より高次の近似を採用して補間することとしてもよい。
【００４２】
本発明の三次元被検物評価方法では、変位評価工程において、各時刻ｎΔｔのスペックル画像を、複数画素で構成される複数の区画画像に区画化し、各区画画像に対して、変位値ｘを算出することが好ましい。この場合、各区画画像に対して、相互相関関数、変位量、及び速さを算出して、これらのパラメータの二次元マッピング画像を得て、三次元形状を有する三次元被検物の動きを評価することになる。
【００４３】
変位評価工程、及び変位評価手段において、複数の断層画像の比較が、三次元被検物における、一の断面に係る断層画像について行われるだけでなく、一の断面と交差する方向における他の断面に係る断層画像についても行われることが好ましい。
図５は、一の断面と交差する方向における他の断面に係る断層画像の一例を示す模式図である。図５に示すように、三次元被検物３００において、一の断面と交差する方向における他の断面の断層画像３０１においても変位評価を行うことにより、三次元被検物の変位をより詳細に評価することができる。
一の断面と交差する方向における他の断面とは、一の断面と一部が交差し、かつ一の断面とは平面方向に対して異なる断面であることを意味する。
【実施例】
【００４４】
（三次元被検物の調製例）
＜心筋細胞の調製＞
マウス胎児の心臓から大部分の非心筋細胞を取り除いた細胞群を凍結保存した心筋細胞を使用する心筋細胞培養キット（商品名：Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｋｉｔ（Ｍｏｕｓｅ、Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  Ｃｅｌｌ）、コスモ・バイオ株式会社製、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＣＭＣ１２）を用いた。培養面をフィブロネクチンでコーティングした培養容器を使用した。２４ｗｅｌｌプレートに予め解凍したフィブロネクチン溶液を１ｗｅｌｌあたり０．５ｍＬずつ入れ、３７℃インキュベーター内で一晩静置した後、使用直前にｗｅｌｌ内のフィブロネクチン溶液を除去し、さらにｗｅｌｌ内に減菌水１ｍＬを入れ、２回洗浄した後に使用した。凍結心筋細胞を３７℃の温水に浸け、１分１５秒間で解凍した。解凍した細胞液は、予め用意した１５ｍＬ遠心チューブ（培養メディウム４．５ｍＬを含む）に移し、細胞を浮遊させて細胞浮遊液（２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／５ｍＬ）とした。２４ｗｅｌｌプレート（フィブロネクチンコート済み）に１ｗｅｌｌあたり細胞浮遊液１ｍＬずつ播種し、５％ＣＯ２存在下の３７℃インキュベーターで、７２時間培養した。
【００４５】
三次元被検物評価装置として、スペクトルドメインＯＣＴ装置（装置名：ＯＣＴＰ−９００、ＣＡＬ１１０、ＯＣＴ−ＬＫ３−ＢＢ、ソーラボ社製）を用いた。光源としては、波長９３０ｎｍのスーパールミネッセンスダイオードを用いた。
培養した心筋細胞に測定光を照射した際のスポット径は８μｍ、深さ方向の分解能は５．５μｍ、取得した画像のフレームレートは、３６ｆｐｓであった。取得したマウスの心筋細胞のＯＣＴ画像と、算出した変位量分布の時間変化を図６Ａ〜図６Ｅに示す。変位量分布は、複数画素で構成される複数の区画画像に区画化（５０×１０画素）して算出した。図６Ａは、実施例１における評価開始から１．０７５秒間後のマウスの心筋細胞の変位量分布を示す光干渉断層撮影画像である。図６Ｂは、実施例１における評価開始から１．１１８秒間後のマウスの心筋細胞の変位量分布を示す光干渉断層撮影画像である。図６Ｃは、実施例１における評価開始から１．１６１秒間後のマウスの心筋細胞の変位量分布を示す光干渉断層撮影画像である。図６Ｄは、実施例１における評価開始から１．１２０４秒間後のマウスの心筋細胞の変位量分布を示す光干渉断層撮影画像である。図６Ｅは、実施例１における評価開始から１．１２４７秒間後のマウスの心筋細胞の変位量分布を示す光干渉断層撮影画像である。なお、図６Ａ〜図６Ｅ中の矢印は、心筋細胞の変位量、及び変位方向を示す。
【００４６】
図６Ａ〜図６Ｅの結果から、マウス由来心筋細胞組織のＯＣＴ画像から、三次元組織の断面構造、及び、心筋細胞拍動時における断面方向の三次元的な心筋拍動変位量、変位速度の定量化、移動量分布の可視化が可能であることが分かる。また、マウス由来心筋細胞組織は、細胞組織の表面と、内部とでは変位（動き）のベクトル（方向、大きさ）が異なることが分かる。
本実施例では、スペクトルドメインＯＣＴで得られた画像を用いたが、これに限らず、タイムドメインＯＣＴ、光周波数掃引ＯＣＴで得られた画像を用いることもできる。
【００４７】
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  三次元被検物に対して、少なくとも２つの異なる時刻において、光を照射して前記三次元被検物からの後方散乱光の情報を取得する後方散乱光情報取得工程と、
前記少なくとも２つの異なる時刻における前記後方散乱光の情報に基づき、前記三次元被検物の変位を評価する変位評価工程と、を含むことを特徴とする三次元被検物評価方法である。
＜２＞  前記後方散乱光情報取得工程において、前記三次元被検物に対して照射する際、照射する光を測定光と参照光とに分割し、前記測定光を前記三次元被検物に照射して前記三次元被検物からの前記後方散乱光の情報を得ると共に、前記後方散乱光と前記参照光との干渉光の情報を取得し、
前記変位評価工程において、前記干渉光に基づく干渉信号から断層画像を得て、前記少なくとも２つの異なる時刻における、複数の前記断層画像を比較して前記三次元被検物の変位を評価する前記＜１＞に記載の三次元被検物評価方法である。
＜３＞  前記変位評価工程において、複数の前記断層画像の比較が、前記三次元被検物における、一の断面に係る断層画像について行われるだけでなく、前記一の断面と交差する方向における他の断面に係る断層画像についても行われる前記＜２＞に記載の三次元被検物評価方法である。
＜４＞  前記変位評価工程において、前記断層画像が、複数の画素により表されたスペックル画像であり、複数の前記断層画像の比較が、複数の前記スペックル画像どうしの相互相関関数を算出することにより行われる前記＜２＞から＜３＞のいずれかに記載の三次元被検物評価方法である。
＜５＞  前記変位評価工程において、複数の前記スペックル画像どうしの相互相関関数の算出が、前記スペックル画像における特定画素毎に行われる前記＜４＞に記載の三次元被検物評価方法である。
＜６＞  前記三次元被検物が細胞塊である前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の三次元被検物評価方法である。
＜７＞  前記細胞塊における細胞が、心筋細胞である前記＜６＞に記載の三次元被検物評価方法である。
＜８＞  前記少なくとも２つの異なる時間が、前記三次元被検物に対して試薬を投与する前後の時間である前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の三次元被検物評価方法である。
＜９＞  前記変位評価工程において、前記複数の画素を区画画像に区画化し、各区画画像において変位値を算出する前記＜４＞から＜８＞のいずれかに記載の三次元被検物評価方法である。
＜１０＞  前記変位評価工程において、前記相互相関関数Ｐ（ｉ−ｉ０）の最大の画素値を有する画素ｉ０の近傍の画素ｉの画素値を用いて、前記第２変位ｘを下記式（６ａ）又は下記式（６ｂ）より求める前記＜９＞に記載の三次元被検物評価方法である。
ｘ＝｛Ｐ（−１）−Ｐ（１）｝／｛Ｐ（−１）−Ｐ（０）−Ｐ（１）＋Ｐ（２）｝・・・式（６ａ）
ただし、前記式（６ａ）において、Ｐ（−１）≧Ｐ（１）である。
ｘ＝｛Ｐ（１）−Ｐ（−１）｝／｛Ｐ（−２）−Ｐ（−１）−Ｐ（０）＋Ｐ（１）｝・・・式（６ｂ）
ただし、前記式（６ｂ）において、Ｐ（−１）＜Ｐ（１）である。
＜１１＞  三次元被検物に対して、少なくとも２つの異なる時刻において、光を照射して前記三次元被検物からの後方散乱光の情報を取得する後方散乱光情報取得手段と、
前記少なくとも２つの異なる時刻における前記後方散乱光の情報に基づき、前記三次元被検物の変位を評価する変位評価手段と、を有することを特徴とする三次元被検物評価装置である。
＜１２＞  前記後方散乱光情報取得手段が、前記三次元被検物に対して照射する際、照射する光を測定光と参照光とに分割し、前記測定光を前記三次元被検物に照射して前記三次元被検物からの前記後方散乱光の情報を得ると共に、前記後方散乱光と前記参照光との干渉光の情報を取得し、
前記変位評価手段が、前記干渉光に基づく干渉信号から断層画像を得て、前記少なくとも２つの異なる時刻における、複数の前記断層画像を比較して前記三次元被検物の変位を評価する前記＜１１＞に記載の三次元被検物評価装置である。
＜１３＞  前記変位評価手段が、複数の前記断層画像の比較が、前記三次元被検物における、一の断面に係る断層画像について行われるだけでなく、前記一の断面と交差する方向における他の断面に係る断層画像についても行われる前記＜１１＞から＜１２＞のいずれかに記載の三次元被検物評価装置である。
＜１４＞  前記変位評価手段が、前記断層画像が、複数の画素により表されたスペックル画像であり、複数の前記断層画像の比較が、複数の前記スペックル画像どうしの相互相関関数を算出することにより行われる前記＜１１＞から＜１３＞のいずれかに記載の三次元被検物評価装置である。
＜１５＞  前記変位評価手段が、複数の前記スペックル画像どうしの相互相関関数の算出が、前記スペックル画像における特定画素毎に行われる前記＜１４＞に記載の三次元被検物評価装置である。
＜１６＞  前記三次元被検物が細胞塊である前記＜１１＞から＜１５＞のいずれかに記載の三次元被検物評価装置である。
＜１７＞  前記細胞塊における細胞が、心筋細胞である前記＜１６＞に記載の三次元被検物評価装置である。
＜１８＞  前記少なくとも２つの異なる時間が、前記三次元被検物に対して試薬を投与する前後の時間である前記＜１１＞から＜１７＞のいずれかに記載の三次元被検物評価装置である。
＜１９＞  前記変位評価手段が、前記複数の画素を区画画像に区画化し、各区画画像において変位値を算出する前記＜１４＞から＜１８＞のいずれかに記載の三次元被検物評価装置である。
＜２０＞  前記変位評価手段が、前記相互相関関数Ｐ（ｉ−ｉ０）の最大の画素値を有する画素ｉ０の近傍の画素ｉの画素値を用いて、前記第２変位ｘを下記式（６ａ）又は下記式（６ｂ）より求める前記＜１９＞に記載の三次元被検物評価装置である。
ｘ＝｛Ｐ（−１）−Ｐ（１）｝／｛Ｐ（−１）−Ｐ（０）−Ｐ（１）＋Ｐ（２）｝・・・式（６ａ）
ただし、前記式（６ａ）において、Ｐ（−１）≧Ｐ（１）である。
ｘ＝｛Ｐ（１）−Ｐ（−１）｝／｛Ｐ（−２）−Ｐ（−１）−Ｐ（０）＋Ｐ（１）｝・・・式（６ｂ）
ただし、前記式（６ｂ）において、Ｐ（−１）＜Ｐ（１）である。
【００４８】
前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の三次元被検物評価方法、及び前記＜１１＞から＜２０＞のいずれかに記載の三次元被検物評価装置は、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００４９】
【特許文献１】特許第６０７６１１１号公報
【特許文献２】特開２０１５−０６８８０９号公報
【符号の説明】
【００５０】
２、１４０、３００      三次元被検物
４、１０６      測定光
１０４      参照光
１０８      干渉光
５、１１２      後方散乱光
３０１      断層画像
【図１】
2019052922.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2019052922.tif 000011
【図６Ｃ】
2019052922.tif 000012
【図６Ｄ】
2019052922.tif 000013
【図６Ｅ】
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