(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞増殖状態を反映する組織再生マーカーを提供する。【解決手段】組織再生状態の判定方法に関し、被検体から採取された体液中のOpioidGrowthFactorReceptor-like 1(OGFRL1)を測定する工程、並びにOGFRL1測定値と基準値とを比較する工程と、前記OGFRL1測定値が前記基準値以上の場合、前記被検体において組織の再生が亢進していることを示唆する工程と、を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体から採取された体液中のOpioid growth factor receptor-like 1 (OGFRL1)を測定する工程と、
OGFRL1測定値と基準値とを比較する工程と、
前記OGFRL1測定値が前記基準値以上の場合、前記被検体において組織の再生が亢進していることを示唆する工程と、
を含む、組織再生状態の判定方法。
【請求項２】
前記示唆工程において、前記組織の再生が亢進していることが示唆された場合に、さらに、前記被検体が前記組織の障害からの回復期にあることを示唆する、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組織は、非腫瘍性疾患が存在する器官における組織である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記器官は、肝臓である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記肝臓に存在する非腫瘍性疾患は、肝障害を呈する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記被検体は、肝臓に悪性腫瘍を有さない個体である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記測定工程において、血清中のOGFRL1、血漿中のOGFRL1、又は体液に存在する細胞外小胞中のOGFRL1が検出される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
被検体から採取された体液中のOpioid growth factor receptor-like 1 (OGFRL1)を検出する工程を含む方法であって、前記OGFRL1の検出により前記被検体の組織の再生の亢進が示唆されることを特徴とする方法。
【請求項９】
前記組織は、非腫瘍性疾患が存在する器官における組織である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記器官は、肝臓である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記肝臓に存在する非腫瘍性疾患は、肝障害である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記被検体は、肝臓に悪性腫瘍を有さない個体である、請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出工程において、血清中のOGFRL1、血漿中のOGFRL1、又は体液に存在する細胞外小胞中のOGFRL1が検出される、請求項８から１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織再生状態の判定方法に関する。また、本発明は、被検体から採取された体液中のOpioid growth factor receptor-like 1 (OGFRL1)を検出する工程を含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織が傷害を受けたり欠損を生じたりした場合には、傷害又は欠損組織の残存細胞が増殖して、再生と修復がもたらされる。また、それが不充分な場合には、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）由来の組織細胞を移植して、その増殖による傷害又は欠損組織の再生・修復治療が試みられている。傷害又は欠損組織における細胞増殖の度合いは該組織の再生状態を反映し、治療効果を判定したり患者の予後を予測したりするための重要な判断材料となりうる。
【０００３】
組織再生を評価するマーカーの１例として、非特許文献１には、αフェトプロテイン（AFP）の産生がD-ガラクトサミン投与によるラットの急性肝障害からの回復期に増加することが示されている。臨床的にも、血清AFP値が急性の重症肝障害からの回復期（非特許文献２）や慢性肝障害の終末像である肝硬変（非特許文献３）において増加することも知られている。
OGFRL1については、その発現が癌幹細胞分画で亢進していること（特許文献１、及び特許文献２）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１２２１４０号
【特許文献２】特開２０１５−１０７９１８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】野口武英「D-Galactosamine ラット急性肝障害回復期におけるα-Fetoprotein 産生細胞の研究−酵素抗体法とAutoradiography法の併用−」日本消化器病学会雑誌 75: 1972-1982, 1978
【非特許文献２】Kakisaka K, et al. “Alpha-fetoprotein: A biomarker for the recruitment of progenitor cells in the liver in patients with acute liver injury or failure.” Hepatology Research 45: E12-E20, 2015
【非特許文献３】Liu YR, et al. “Alpha-fetoprotein level as a biomarker of liver fibrosis status: a cross-sectional study of 619 consecutive patients with chronic hepatitis B.” BMC Gastroenterol 14: 145, 2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記AFPの発現は肝癌細胞において高頻度かつ顕著に増加することから、血清AFP値の上昇が、重症肝障害からの回復によるものなのか、肝癌細胞による産生なのか判別がつかない。そのため、AFPは非腫瘍細胞の増殖判定マーカーとしては不向きであり、現状は専ら腫瘍マーカーとして使用されている。このように、急性あるいは慢性の傷害を受けた肝臓の再生や修復状態を評価する特異的マーカーは存在せず、重症肝障害患者に対する治療効果判定や予後予測は困難な状況にある。したがって、腫瘍細胞の増殖と判別可能な組織再生マーカーの開発が望まれてきた。
【０００７】
また、これまで組織再生における細胞増殖状態の判定は、患者の身体から固形組織を採取して検査する方法（組織生検）が行われてきた。しかしながら、組織生検は侵襲性が高く疼痛を伴い、時に大量出血等の重症の合併症を伴うといった問題点がある。このため、侵襲性の低い細胞増殖の評価方法が熱望されている。
【０００８】
このような問題に鑑み、本発明は、細胞増殖状態を反映する組織再生マーカーを提供することを一課題とする。また、腫瘍細胞の増殖の影響を受けず、かつ低侵襲で評価可能な、組織再生マーカーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の実施態様は、組織再生状態の判定方法に関する。前記方法は、被検体から採取された体液中のOpioid growth factor receptor-like 1 (OGFRL1)を測定する工程と、OGFRL1測定値と基準値とを比較する工程と、前記OGFRL1測定値が前記基準値以上の場合、前記被検体において組織の再生が亢進していることを示唆する工程と、を含む。
本態様によれば、体液中のOGFRL1を測定することにより、細胞増殖を指標として組織の再生状態を判定することができる。
【００１０】
本発明の第２の態様は、被検体から採取された体液中のOpioid growth factor receptor-like 1 (OGFRL1)を検出する工程を含む方法であって、前記OGFRL1の検出により前記被検体の組織の再生の亢進が示唆されることを特徴とする方法に関する。
本態様によれば、体液中のOGFRL1を検出することにより、組織の再生の亢進を示唆することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、組織再生マーカーを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Aは、四塩化炭素投与マウス及びジエチルニトロサミン(DEN)投与マウスの血清中に存在するOGFRL1のウェスタンブロッティング像を示す。Bは、Aで検出したOGFRL1の相対発現比を表す発光強度のグラフを示す。図中「−」は、四塩化炭素を投与していないマウス、又はDENを投与するも肝癌が発生しなかったマウスを示す。「＋」は、四塩化炭素を投与したマウス、又はDEN投与により肝癌が発生したマウスを示す。
【図２】Aは、四塩化炭素投与マウスの血清中エクソソーム又は肝臓組織中に存在するOGFRL1のウェスタンブロッティング像を示す。Bは、Aで検出したOGFRL1の相対発現比を表す発光強度のグラフを示す。図中「−」は、四塩化炭素を投与していないマウスを示す。「＋」は、四塩化炭素を投与したマウスを示す。
【図３】Aは、異なる濃度の四塩化炭素を投与したマウスの血清中エクソソームに存在するOGFRL1のウェスタンブロッティング像を示す。Bは、Aで検出したOGFRL1の相対発現比を表す発光強度のグラフを示す。図中の番号は、各マウスの個体番号を示す。
【図４】抗OGFRL1(344-362)抗体と抗CD9抗体を用いた血清OGFRL1のサンドイッチEnzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)法による測定を行った際の発光強度を示す。図中「−」は、四塩化炭素を投与していないマウスを示す。「＋」は、四塩化炭素を投与したマウスを示す。図中の番号は、各マウスの個体番号を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．第１の実施態様
本発明の第１の実施態様は、被検体から採取された体液中のOpioid growth factor receptor-like 1 (OGFRL1)を測定する工程を含む。
【００１４】
Opioid growth factor receptor-like 1 (OGFRL1)は、ヒトの場合、The National Center for Biotechnology Informationより提供されるGenBankにアクセッション番号Q5TC84.1で登録されるタンパク質、及びそのアイソフォームを挙げることができる。また、マウスの場合、GenBankにアクセッション番号Q8VE52.2で登録されるタンパク質、及びそのアイソフォームを挙げることができる。また本発明においてOGFRL1には、前記アクセッション番号で登録されるタンパク質のバリアント、及びオーソログが含まれる。  
【００１５】
被検体は、組織の再生の状態を評価される個体である。前記個体は、特に制限されず、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類等が挙げられる。好ましくはヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等の哺乳動物であり、より好ましくはヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、又はネコ等であり、さらに好ましくはヒト、サル、マウス、又はラットであり、最も好ましくはヒトである。また、前記個体の年齢、性別（雄又は雌）は問わない。
【００１６】
前記被検体には、疾患を有する個体と有さない個体の両方が含まれうる。前記被検体は、好ましくは腫瘍を有さない、より好ましくは悪性腫瘍を有さない、さらに好ましくは肝臓に悪性腫瘍を有さない個体である。また、前記被検体は、非腫瘍性疾患を有することが好ましい。前記非腫瘍性疾患は、腫瘍以外の疾患である限り制限されない。例えば、前記非腫瘍性疾患は、肝障害を呈する疾患であり、肝障害の種類としては急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、脂肪性肝疾患、等を挙げることができる。また、肝障害の原因としてはウイルス性、アルコール性、薬剤性、自己免疫性、糖代謝異常、脂質代謝異常、アミノ酸代謝異常、金属代謝異常、胆汁うっ滞、肝血流障害、等を挙げることができる。
【００１７】
体液は、被検体から採取可能であり、OGFRL1を検出できる限り制限されない。例えば、体液として、血液試料、腹水、胸水、心嚢水、脳脊髄液、間質液、リンパ液、尿等を挙げることができる。血液試料には、全血の他、血清、及び血漿が含まれる。体液として、より好ましくは、血清又は血漿である。
【００１８】
また、前記体液は細胞外小胞を含むことが好ましい。前記細胞外小胞は、細胞外分泌小胞とも呼ばれ、エクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小体等が含まれる。細胞外小胞の回収は、例えばExoQuick (System Biosciences)等の市販のエクソソーム沈殿試薬を使用して行うことができる。
【００１９】
組織は、被検体の体内に存在する限り制限されない。好ましくは、前記非腫瘍性疾患が存在する器官の組織である。より好ましくは、前記器官は肝臓である。
【００２０】
組織の再生とは、傷害を受けたり欠損を生じたりした組織が、量的かつ機能的に元の状態に戻る過程、又は元に戻った状態を指す。量的かつ機能的に元の状態に戻るためには、該組織を構成する残存細胞、又は移植された細胞が増殖して臓器としての大きさを回復させるとともに、該組織に特異的な機能を発現して損なわれた機能を回復させることが望ましい。
【００２１】
組織の再生が亢進しているとは、前記の傷害を受けたり欠損を生じたりした組織において、該組織を構成する残存細胞、又は移植された細胞が増殖して、量的かつ機能的に元の状態に戻そうとする生体反応が活発な状態にあることを示しており、組織の修復が順調に進んでいること、すなわち前記被検体が組織障害からの回復期にあることを意味する。
【００２２】
OGFRL1の測定方法は、OGFRL1の測定値を取得できる限り制限されない。ここで、OGFRL1の測定値とは、OGFRL1の量又は濃度を反映する値である。例えば、OGFRL1の測定値を取得するために、OGFRL1タンパク質に特異的に結合可能な抗体、すなわち抗OGFRL1抗体を用いることができる。抗OGFRL1抗体によるOGFRL1タンパク質の測定値の取得方法は、ELISA法や、ウェスタンブロッティング法を挙げることができる。
【００２３】
例えば、ELISA法でOGFRL1の測定値を取得する場合、体液、又は体液から回収した細胞外小胞と、抗OGFRL1抗体とを混合する順序は特に限定されず、これらを実質的に同時に混合してもよいし、逐次混合してもよい。以下、体液中のOGFRL1タンパク質を検出する方法を例として、本実施態様を説明する。
【００２４】
本実施態様では、先に抗OGFRL1抗体と体液中のOGFRL1タンパク質との複合体を形成させてから前記複合体を固相上に固定化するか、又は予め抗OGFRL1抗体を固相上に固定化し、固定化された抗OGFRL1抗体と体液中のOGFRL1タンパク質との複合体を形成させることができる。より好ましくは、先に前記複合体を形成させてから前記複合体を固相上に固定化する態様である。そして、固相上に固定化された前記複合体又は固相上で形成された複合体を、前記技術において公知の方法で検出することにより、体液に含まれるOGFRL1タンパク質の測定値を取得することができる。
【００２５】
先に抗OGFRL1抗体と体液中のOGFRL1タンパク質との複合体を形成させてから前記複合体を固相上に固定化する場合、ビオチン等で修飾した抗OGFRL1抗体を、体液中のOGFRL1タンパク質と接触させて複合体を形成させる。別途固相にアビジン又はストレプトアビジン（以下、「アビジン類」ともいう）をあらかじめ結合させておくことにより、ビオチンとアビジン類との結合を介して、前記複合体を固相に固定化することができる。
【００２６】
また、予め抗OGFRL1抗体を固相に固定する場合、抗OGFRL1抗体の固相への固定の態様は、特に限定されない。例えば、抗OGFRL1抗体と固相とを直接結合させてもよいし、抗OGFRL1抗体と固相との間を別の物質を介して間接的に結合させてもよい。直接の結合としては、例えば、物理的吸着などが挙げられる。間接的な結合としては、例えば、アビジン類との組み合わせを介した結合が挙げられる。この場合、抗OGFRL1抗体を予めビオチンで修飾し、固相にアビジン類を予め結合させておくことにより、ビオチンとアビジン類との結合を介して、抗OGFRL1抗体と固相とを間接的に結合させることができる。本実施態様においては、抗OGFRL1抗体と固相との結合は、ビオチンとアビジン類を介した間接的な結合であることが好ましい。
【００２７】
固相の素材は特に限定されず、例えば、有機高分子化合物、無機化合物、生体高分子などから選択できる。有機高分子化合物としては、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。無機化合物としては、磁性体（酸化鉄、酸化クロム及びフェライトなど）、シリカ、アルミナ、ガラスなどが挙げられる。生体高分子としては、不溶性アガロース、不溶性デキストラン、ゼラチン、セルロースなどが挙げられる。これらのうちの２種以上を組み合わせて用いてもよい。固相の形状は特に限定されず、例えば、粒子、膜、マイクロプレート、マイクロチューブ、試験管などが挙げられる。それらの中でも粒子が好ましく、磁性粒子が特に好ましい。
【００２８】
本実施態様においては、複合体の形成後、好ましくは複合体形成後であって標識物質の検出前に、複合体を形成していない未反応の遊離成分を除去するBound/Free (B/F)分離を行ってもよい。未反応の遊離成分とは、複合体を構成しない成分をいう。例えば、OGFRL1タンパク質と結合しなかった抗OGFRL1抗体などが挙げられる。B/F分離の手段は特に限定されないが、固相が粒子であれば、遠心分離により、複合体を捕捉した固相だけを回収することによりB/F分離ができる。固相がマイクロプレートやマイクロチューブなどの容器であれば、未反応の遊離成分を含む液を除去することによりB/F分離ができる。また、固相が磁性粒子の場合は、磁石で磁性粒子を磁気的に拘束した状態でノズルによって未反応の遊離成分を含む液を吸引除去することによりB/F分離ができる。前記方法は、自動化の観点で好ましい。未反応の遊離成分を除去した後、複合体を捕捉した固相をリン酸緩衝食塩水(PBS)などの適切な水性媒体で洗浄してもよい。
【００２９】
本実施態様において、前記複合体の検出は、標識物質で標識された抗OGFRL1抗体を使用して行うか、未標識の抗OGFRL1抗体と前記未標識の抗OGFRL1抗体と結合することができる標識物質で標識された抗イムノグロブリン抗体等を使用して行うことができるが、標識された抗OGFRL1抗体を使用することが好ましい。また、標識された抗OGFRL1抗体のOGFRL1タンパク質におけるエピトープと、固相に結合する抗OGFRL1抗体のOGFRL1タンパク質におけるエピトープとは、異なることが好ましい。
【００３０】
標識抗OGFRL1抗体又は標識抗イムノグロブリン抗体に用いられる標識物質は、検出可能なシグナルが生じるかぎり、特に限定されない。例えば、それ自体がシグナルを発生する物質（以下、「シグナル発生物質」ともいう）であってもよいし、他の物質の反応を触媒してシグナルを発生させる物質であってもよい。シグナル発生物質としては、例えば、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。他の物質の反応を触媒して検出可能なシグナルを発生させる物質としては、例えば、酵素が挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ(ALP)、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、Alexa Fluor（登録商標）などの蛍光色素、Enhanced green fluorescent protein (EGFP)などの蛍光タンパク質などが挙げられる。放射性同位元素としては、１２５Ｉ、１４Ｃ、３２Ｐなどが挙げられる。それらの中でも、標識物質として、酵素が好ましく、ALPが特に好ましい。
【００３１】
標識抗OGFRL1抗体は、免疫測定技術分野において公知の標識方法により、抗OGFRL1抗体を上記の標識物質で標識して得られる。また、市販のラベリングキットなどを用いて標識してもよい。また、標識イムノグロブリン抗体は、抗OGFRL1抗体の標識と同じ手法を用いてもよいし、市販のものを使用してもよい。
【００３２】
本実施態様では、複合体に含まれる標識抗OGFRL1抗体の標識物質により生じるシグナルを検出することにより、体液に含まれるOGFRL1の測定値を取得できる。ここで、「シグナルを検出する」とは、シグナルの有無を定性的に検出すること、シグナル強度を定量すること、及び、シグナルの強度を半定量的に検出することを含む。半定量的な検出とは、シグナルの強度を、「シグナル発生せず」、「弱」、「中」、「強」などのように段階的に示すことをいう。
【００３３】
シグナルを検出する方法自体は、免疫測定技術分野において公知である。本実施態様では、上記の標識物質に由来するシグナルの種類に応じた測定方法を適宜選択すればよい。例えば、標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を反応させることによって発生する光、色などのシグナルを、ルミノメーター、分光光度計などの公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。
【００３４】
酵素の基質は、該酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択できる。例えば、酵素としてALPを用いる場合、基質として、CDP-Star（登録商標）（４−クロロ−３−（メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリクシロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、CSPD（登録商標）（３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）などの化学発光基質、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸(BCIP)、５−ブロモ−６−クロロ−インドリルリン酸２ナトリウム、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの発色基質が挙げられる。特に好ましくは、CDP-Star（登録商標）である。前記基質の発光は、ルミノメーターで検出することが好ましい。
【００３５】
標識物質が放射性同位体である場合は、シグナルとしての放射線を、シンチレーションカウンターなどの公知の装置を用いて測定できる。また、標識物質が蛍光物質である場合は、シグナルとしての蛍光を、蛍光マイクロプレートリーダーなどの公知の装置を用いて測定できる。なお、励起波長及び蛍光波長は、用いた蛍光物質の種類に応じて適宜決定できる。
【００３６】
シグナルの検出結果は、OGFRL1タンパク質の測定値として用いることができる。例えば、シグナルの強度を定量的に検出する場合は、シグナル強度の測定値自体又は該シグナル強度の測定値から算出される値を、OGFRL1タンパク質の測定値として用いることができる。シグナル強度の測定値から算出される値としては、例えば、該シグナル強度の測定値から陰性対照試料のシグナル強度の測定値を差し引いた値、該シグナル強度の測定値を陽性対照試料のシグナル強度の測定値で除した値、及びそれらの組み合わせなどが挙げられる。陰性対照試料としては、健常個体の体液等が挙げられる。陽性対照試料としては、OGFRL1タンパク質を所定の濃度で含む体液が挙げられる。
【００３７】
また、体液中のOGFRL1タンパク質の測定値は、既知濃度のOGFRL1タンパク質を含む陽性対照のシグナル強度の測定値から検量線を作成し、その検量線に体液中のOGFRL1タンパク質のシグナルの強度の測定値を当てはめることにより算出することができる。また、検量線を作成せず、既知濃度のOGFRL1タンパク質を含む陽性対照のシグナル強度の測定値から回帰式を求め、その回帰式に体液中のOGFRL1タンパク質のシグナルの強度の測定値を当てはめることにより、体液中のOGFRL1タンパク質の測定値を算出することができる。
前記測定値を濃度で表す場合は、モル濃度であっても生体試料の一定容量あたりの質量の割合（質量／容量）であってもよい。
【００３８】
前記抗OGFRL1抗体は、前記OGFRL1タンパク質と特異的に結合する限り制限はなく、OGFRL1タンパク質又はその一部を抗原としてヒト以外の動物に免疫して得られたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びそれらの断片（例えば、Fab、F(ab)2等）のいずれも用いることができる。また、免疫グロブリンのクラス及びサブクラスは特に制限されない。また、キメラ抗体であってもよい。さらに、scFv等であってもよい。
【００３９】
抗OGFRL1抗体を作製するために用いられる抗原としては、ヒトの場合はアクセッション番号Q5TC84.1として、マウスの場合はアクセッション番号Q8VE52.2としてそれぞれGenBankに登録されているOGFRL1タンパク質を挙げることができる。例えば、前記アクセッション番号Q8VE52.2で表されるマウスOGFRL1のアミノ酸配列上の344番目から362番目までの19アミノ酸からなるペプチドを抗原として用いることができる。前記ペプチドは、公知の方法によって合成することができる。
【００４０】
また、本実施態様においては、体液中OGFRL1と結合する抗体又は標識抗OGFRL1抗体のどちらか一方を、細胞外小胞に存在するタンパク質等に結合する抗体に置き換えてもよい。細胞外小胞に存在するタンパク質としては、例えばCD9等を挙げることができる。
本態様は、さらに前記測定値と基準値とを比較する工程を含む。
【００４１】
前記基準値は、予め設定しておくことができる。例えば、腫瘍以外の組織において再生が亢進している個体から採取した体液群を陽性対照群とし、健常個体から採取された体液群を陰性対照群とする。そして、前記陽性対照群と陰性対照群を最も精度よく分類できる値を基準値として採用することができる。ここで、「最も精度よく分類できる値」は、検査の目的によって感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などの指標に基づいて適宜設定することができる。さらに、ROC曲線（Receiver Operatorating Characteristic curve、受信者動作特性曲線）、判別分析法、モード法、Kittler法、3σ法、p‐tile法等により、基準値を決定することもできる。基準値は、体液毎に設定することが好ましい。
【００４２】
本態様においては、前記測定値が前記基準値以上の場合、前記被検体において組織の再生が亢進していることを示唆する。ここで被検体において組織の再生が亢進していることを示唆するとは、被検体において組織の再生が亢進していると判定することを含む。
【００４３】
さらに、本態様は、被検体において組織の再生が亢進していることが示唆された場合に、前記被検体が前記組織の障害からの回復期にあることを示唆してもよい。ここで被検体が前記組織の障害からの回復期にあることを示唆するとは、被検体が前記組織の障害からの回復期にあると判定することを含む。
２．第２の実施態様
【００４４】
本発明の第２の実施態様は、被検体から採取された体液中のOpioid growth factor receptor-like 1 (OGFRL1)を検出する工程を含む方法に関する。上記第１の実施態様で述べた方法によって、体液中のOGFRL1を検出することが可能である。ここで、検出には、第１の実施態様で述べた、体液中のOGFRL1の測定値を取得する方法の他、第１の実施態様で述べた方法によって、体液中にOGFRL1があるかないか定性的に判定することを含む。
【００４５】
本態様おいて、被検体の体液からOGFRL1が検出された場合には、前記被検体の組織の再生の亢進が示唆される。ここで被検体において組織の再生が亢進していることを示唆するとは、被検体において組織の再生が亢進していると判定することを含む。
【００４６】
さらに、本態様は、被検体において組織の再生が亢進していることが示唆された場合に、前記被検体が前記組織の障害からの回復期にあることを示唆してもよい。ここで被検体が前記組織の障害からの回復期にあることを示唆するとは、被検体が前記組織の障害からの回復期にあると判定することを含む。
第２の実施態様で使用される用語については、第１の実施態様における説明を援用する。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例を用いて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は実施例に限定して解釈されるものではない。
【００４８】
１．実施例１
OGFRL1が腫瘍以外の細胞増殖状態を判定するマーカーとして使用できることを検証するため、四塩化炭素投与による肝障害マウスと、肝発癌物質であるDENを投与したマウスを使って、血清中のOGFRL1の検出を行った。
【００４９】
１−１．抗OGFRL1抗体の作製
全長464アミノ酸からなるマウスOGFRL1タンパク質のうち、344番目から362番目までの19アミノ酸からなるペプチドを合成し、この合成ペプチドを家兎に免疫し、84日後に得られた血清の抗体価をELISAにて確認した。免疫原として用いた合成ペプチドを用いて、上記のウサギ血清をカラム精製した。
【００５０】
１−２．四塩化炭素投与肝障害マウスの作製
四塩化炭素を、３倍液量のオリーブ油と混和して希釈し、25 %四塩化炭素溶液を作製した。調製した四塩化炭素溶液を用いて、体重20〜25 gのC57BL/6J雄性マウス（日本クレア）に対して、体重1 kgあたり1 mLの四塩化炭素をイソフルラン吸入麻酔下で皮下注射した。四塩化炭素非投与マウス、及び四塩化炭素投与24時間後のマウス（各3匹）から、イソフルラン吸入麻酔下で肝組織を採取した。
【００５１】
１−３．DEN投与による肝癌の誘発
生後3週のC57BL/6J雄性マウスに、体重1 kgあたり10μgのDENを腹腔内に単回投与した。DEN投与10ヶ月後に、イソフルラン麻酔下で開腹し、肝表面における腫瘍の存在を肉眼的に観察した。摘出した肝臓について、組織学的にも肝癌発生の有無を確認し、DEN投与マウスを腫瘍非発生・発生の２群に分けた。
【００５２】
１−４．血清採取
血清を採取するため、マウスをイソフルラン麻酔下で開腹し、下大静脈から採血した。採取した血液を室温で30分以上静置した後、1,200×g、20分間の遠心により血清と血餅を分離し、得られた血清を、使用時まで-20℃で保存した。
【００５３】
１−５．ウェスタンブロッティング
血清にhomogenization buffer（終濃度: 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 60 mM beta-glycerophosphate, 10 mM ethylene glycol tetraacetic acid, 10 mM magnesium chloride, 10 mM sodium fluoride, 2 mM dithiothreitol, 1.0 % NP-40, 1 mM sodium orthovanadate, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1× proteinase inhibitor cocktail [Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin A]）を加えて混和した上で、4℃、13,500 rpm、 10分間遠心した。得られた上清に等量の2× Laemmli sample buffer（終濃度: 32.9 mM Tris-HCl pH 6.8, 1.05 % SDS, 2.5 % 2-mercaptoethanol, 13.15 % glycerol, 0.005 % bromophenol blue）を加えて混和した上で、98℃で5分間加熱した。タンパク質 50 μg相当のサンプルを、10% polyacrylamide/SDSゲルに注入し、電気泳動を行った後に、PVDFメンブレンに転写した。同メンブレンをblocking buffer（3 %ウシ血清アルブミン[BSA]/PBS）中で1 時間、室温にて振とうし、3,000倍に希釈した抗OGFRL1(344-362)抗体を加え、4℃で16時間反応させた。メンブレンを洗浄後、10,000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識二次抗体を加え、室温で45分間反応させた。メンブレンを洗浄後、Immobilon Western化学発光HRP試薬（メルク-ミリポア)と反応させ、OGFRL1タンパク質を示すバンドの検出を行った。
【００５４】
１−６．結果
四塩化炭素非投与マウス及び四塩化炭素投与24時間後のマウス（各3匹）、及びDEN投与10ヶ月の肝癌非発生マウス及び肝癌発生マウス（各3匹）から得た血清のウェスタンブロッティングの結果を図１に示す。図１から明らかなように、四塩化炭素非投与マウスの血清中にOGFRL1は検出されないが、四塩化炭素投与により血清中のOGFRL1は増加した。これに対して、DEN誘発肝癌マウスの血清中に、OGFRL1は検出されなかった。このことから、血清中に検出されるOGFRL1は、腫瘍以外の細胞増殖状態を判定するマーカーとして利用できることが示唆された。
【００５５】
２．実施例２
四塩化炭素投与マウスにおける、肝組織ならびに血清エクソソーム中OGFRL1の検出を行った。
【００５６】
２−１．肝組織からのタンパク質の抽出
採取した肝組織を、実施例１に記載のhomogenization buffer中で均質化し、2× Laemmli sample bufferを加えて加熱処理を行った。
【００５７】
２−２．血清中エクソソームの採取とOGFRL1の検出  
上記実施例１に記載の方法に従って、四塩化炭素投与マウスを作製した。前記マウスの血清から、エクソソーム沈殿試薬(ExoQuick [System Biosciences])を使用して、添付のプロトコールに従って、エクソソームを回収した。具体的には、予め生細胞や細胞片を遠心により除いた血清をExoQuick試薬と混和し、4℃で30分間反応させた。1,500×g、30分間遠心し、エクソソームを含む沈殿を得た。沈殿に、実施例１に記載のhomogenization bufferを加えて沈殿を溶解し、等量の2× Laemmli sample bufferを加えた後に、98℃で5分間加熱した。
【００５８】
２−３．ウェスタンブロッティング
実施例１に記載の方法に従って、ウェスタンブロッティングを行った。
【００５９】
２−４．結果
結果を図２に示す。図２から明らかなように、四塩化炭素投与24時間後の血清エクソソーム中には、OGFRL1が顕著に増加していた。この際の肝組織中のOGFRL1タンパク質量を単位肝重量あたりで検証すると、四塩化炭素非投与の肝組織に比べ、四塩化炭素投与24時間後の肝組織でむしろ減少していた。このことから、肝組織中のOGFRL1含量よりも、血清あるいは血清エクソソーム中のOGFRL1濃度の増加が細胞の増殖状態をより反映することが示唆された。
【００６０】
３．実施例３
異なる量の四塩化炭素をマウスに投与し、それぞれのマウスにおける血清中のエクソソーム中のOGFRL1量を比較した。
【００６１】
３−１．マウスへの四塩化炭素投与と血清エクソソーム中OGFRL1の検出
実施例１と同様に調製した四塩化炭素溶液を用いて、中等度の肝障害を惹起するように体重1 kgあたり1 mLの四塩化炭素を投与した群の他、その半量となる0.5 mL/kg体重、あるいは倍量となる2 mL/kg体重の四塩化炭素を投与した群を設定した。投与後24時間における、各群マウスの血清エクソソーム中のOGFRL1量を、実施例１及び実施例２に記載の方法に従ってウェスタンブロッティングで検出した。
【００６２】
ここで、他のマウスを用いた検討により、0.5又は1 mL/kg体重の四塩化炭素の投与ではマウスは全例が生存・回復するのに対して、2 mL/kg体重の四塩化炭素の投与では多くのマウスが重症の肝障害に陥り死亡する。すなわち、2 mL/kg体重の四塩化炭素投与の場合には充分な組織再生が起こらず、肝障害から回復できない。
【００６３】
３−２．結果
結果を図３に示す。図３より、四塩化炭素投与量が0.5 mLないし1.0 ml/kg体重のマウスにおいては、血清エクソソーム中のOGFRL1濃度が顕著に増加しているのに対して、2.0 mL/kg体重の四塩化炭素を投与されたマウスの血清エクソソーム中のOGFRL1濃度には増加がみられないことが判明した。すなわち、細胞増殖により肝障害からの回復が可能なマウスでは血清中のOGFRL1濃度が増加し、逆に肝障害からの回復が不可能なマウスでは血清中のOGFRL1濃度は増加しないことが示された。このことから、血清エクソソーム中のOGFRL1濃度を測定することにより、肝障害を有する被検体における治療効果の判定や予後の予測が可能となることが示唆された。
【００６４】
４．実施例４
四塩化炭素非投与マウス（2匹）、及び四塩化炭素を投与されたマウス（3匹）の血清中OGFRL1を、サンドイッチELISA法で検出した。捕捉抗体には抗OGFRL1(344-362)抗体を使用し、検出抗体には、エクソソームに存在することが知られているCD9を検出する抗CD9抗体（BioLegend #312102）を使用した。
【００６５】
４−１．検出抗体のALP標識
検出抗体をALP標識するために、Alkaline Phosphatase Labeling Kit - NH2（Dojindo kit #LK12）を使用した。標識方法は、キットに添付のプロトコールに従った。標識した抗体は、キットに添付のstorage bufferを添加し、4℃で保存した。
【００６６】
４−２．捕捉抗体の精製
Amicon ultra 50kDaにPBSを500 μL添加して、14000×g、5分間遠心した。再度500 μLのPBSを添加して上記の遠心を繰り返し、合計5回カラムの洗浄を行った。カラムを逆さにして、1000×g、10分間遠心した。捕捉抗体として抗OGFRL1 (344-362) 抗体22.4 μgをカラムに浸透させ、炭酸bufferを492 μL添加した。14000 ×g、5分間遠心後に、400 μLの 炭酸bufferを添加して再度遠心した。この操作を2回繰り返した。カラムを逆さにして、1000×g、10分間遠心し、精製された抗体を回収した。精製された抗体のタンパク濃度をNanodrop (Thermo Fisher Scientific) で吸光度を測定して確認した。結果は、以下の通りであった。
濃度： 0.5154 μg/μL（5回測定の平均）
収量： 33 μL
総タンパク質量： 17.0082 μg
【００６７】
４−３．捕捉抗体の固相への固定
ELISAプレートに、捕捉抗体として抗OGFRL1 (344-362)抗体を炭酸bufferで5 μg/mLに調整し、90 μL/wellとなるように各ウェルに添加した。4℃で15時間静置した後、0.05 %(w/v) Tween 20含有PBS (PBS-T) 300μL/wellを用いて3回洗浄した。
【００６８】
４−４．ELISA測定
４−３．で作製した捕捉抗体固相プレートに、1 % BSA含有PBS-Tを200 μL/wellとなるように添加し、室温で1.5時間ブロッキングした後、PBS-T 300μL/wellで、３回洗浄した。
【００６９】
血清50μLに対して、PBSを5μL添加し、vortexにて軽く撹拌した後、5分間静置した。このサンプルに3倍量の1 % BSA/PBSを添加し、血清を希釈した。希釈サンプル50 μLを捕捉抗体固相プレートに添加し、37℃で2時間400 rpmにて振とうした。反応後、プレートをPBS-T 300μL/wellで、3回洗浄した。
【００７０】
各ウェルにALP標識した検出抗体を1 % BSA/PBSで2400倍希釈して50μLずつ添加し、37℃で1.5時間400 rpmにて振とうした。反応後、プレートをPBS-Tで300 μL/well で、3回洗浄した。
CDP-star 100μL/wellをプレートに添加して、室温で10分間反応させ、発光強度を測定した。
【００７１】
４−５．結果
測定結果を図４に示す。図４から明らかなように、血清中のOGFRL1濃度は、四塩化炭素を投与されたマウスにおいて顕著な増加を示すことが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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