(57)【要約】      （修正有）【課題】化学調製品を使用しないスキンケア製品として、プロバイオティクス組成物、それを用いたスキンケアエッセンス、及びマスクの提供。【解決手段】ラクトバチルス・プランタルムＰ-８（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｐ-８）、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ(Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｚｈａｎｇ)、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｖ９）、ラクトバチルス・プランタルムＣ２（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ２）、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ３）及びラクトバチルス・プランタルムＬＰ４（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ４）を含むプロバイオティクス組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロバイオティクス組成物であって、
ラクトバチルス・プランタルムＰ-８（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｐ-８）、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ(Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｚｈａｎｇ)、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｖ９）、ラクトバチルス・プランタルムＣ２（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ２）、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ３）及びラクトバチルス・プランタルムＬＰ４（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ４）を含み、
ここで、ラクトバチルス・プランタルムＣ２の微生物寄託番号はＣＧＭＣＣＮｏ.１４５３２であり、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３の微生物寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ.１４５３１であり、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ４の微生物寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ.１４５３３であることを特徴とするプロバイオティクス組成物。
【請求項２】
前記プロバイオティクス組成物中の各菌株の生菌数の比例は、ラクトバチルス・プランタルムＰ-８（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｐ-８）：ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ(Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｚｈａｎｇ)：ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｖ９）：ラクトバチルス・プランタルムＣ２（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ２）：ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ３）：ラクトバチルス・プランタルムＬＰ４（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ４）＝（０.５〜１.５）:（１.５〜２.５）:（１.５〜２.５）:（０.５〜１.５）:（０.５〜１.５）:（０.５〜１.５）であり、及び/または
前記プロバイオティクス組成物中の総生菌数は１００億ＣＦＵ/ｇであることを特徴とする
請求項１に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のプロバイオティクス組成物のスキンケアにおける応用。
【請求項４】
請求項２に記載のプロバイオティクス組成物の製造方法であって、
活性化されたラクトバチルス・プランタルムＰ-８、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９、ラクトバチルス・プランタルムＣ２、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３及びラクトバチルス・プランタルムＬＰ４を培地に接種し、発酵して、混合プロバイオティク乳酸菌発酵ブロスを得るステップ１-１と、  
ステップ１-１で得られた混合プロバイオティク乳酸菌発酵ブロス中の上清液を抽し、選択的に、抽出された上清液に対して殺菌処理し、前記上清液はプロバイオティクス組成物であるステップ１-２とを含むことを特徴とする、請求項２に記載のプロバイオティクス組成物の製造方法。
【請求項５】
ステップ１-１において、ラクトバチルス・プランタルムＰ-８、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９、ラクトバチルス・プランタルムＣ２、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３及びラクトバチルス・プランタルムＬＰ４の生菌数の比例は、（０.５〜１.５）:（１〜３）: （１〜３）: （０.５〜１.５）: （０.５〜１.５）: （０.５〜１.５）であり、好ましくは、１:２:２:１:１:１であることを特徴とする
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項1に記載のプロバイオティクス組成物を用いて製造されたスキンケアエッセンスであって、
前記スキンケアエッセンスは、下記のような重量含有量の成分を含み、
プロバイオティクス組成物  ５〜３０ｗｔ％、
保湿剤                    １〜５ｗｔ％、
増粘剤                    ０.１〜１ｗｔ％、
可溶化剤                  ０.１〜０.５ｗｔ％、
精製水                    残量、
各成分の重量含有量は、前記スキンケアエッセンスの総重量に基づいて、各成分の重量で計算して得られた重量パーセンテージであり、前記プロバイオティクス組成物の重量は、その中の全てのプロバイオティクスの重量の合計として計算することを特徴とする、前記請求項1に記載のプロバイオティクス組成物を用いて製造されたスキンケアエッセンス。
【請求項７】
前記保湿剤は、プロピレングリコール、ブタンジオール及びグリセリンから選択された１種または複数種であり、及び/または
前記増粘剤は、ヒドロキシエチルセルロース及びキサンタンガムから選択された１種または複数種であり、及び/または
前記可溶化剤は、水素化ひまし油及びスパン６０から選択された１種または複数種であることを特徴とする
請求項６に記載のスキンケアエッセンス。
【請求項８】
請求項６または７に記載のスキンケアエッセンスの製造方法であって、保湿剤と増粘剤を混合させるステップ２-１と、
ステップ２-１で製造された系を精製水と混合させるステップ２-２と、
ステップ２-２で製造された系を可溶化剤と混合させるステップ２-３と、
ステップ２-３で製造された系をプロバイオティクス組成物と混合させるス
テップ２-４と、
ステップ２-４で製造された系中の固形物をろ過して除去するステップ２-５とを含むことを特徴とする、請求項６または７に記載のスキンケアエッセンスの製造方法。
【請求項９】
マスクであって、
前記マスクには、請求項1に記載のプロバイオティクス組成物を用いて製造されたスキンケアエッセンスを含むことを特徴とするマスク。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、生物技術領域に関し、特に、プロバイオティクス組成物、当該プロバイオティクス組成物を用いて製造されたスキンケアエッセンスとマスク及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のスキンケア製品は、通常、化学調製品を主成分としているが、化学調製品はしばしば様々な皮膚の問題を引き起こし、化学調製品を主成分とするスキンケア製品を長期間使用すると、最終的に皮膚損傷を引き起こす。皮膚にやさしい天然なスキンケア製品の需要がますます高まってくる現在、植物抽出物を主成分とするスキンケア製品が存在する。しかし、植物抽出物は通常、助剤として化学調製品で抽出されたものであるが、化学調製品が残留することは避けられず、微量の化学調製品の残留物であっても皮膚の問題を引き起こすことがあり、さらに皮膚から血液にまで浸透して病気を引き起こす可能性もある。
【０００３】
したがって、化学調製品を含有しないスキンケア製品を開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本出願は、ラクトバチルス・プランタルムＰ-８（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＰ-８）、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ(Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｚｈａｎｇ)、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｖ９）、ラクトバチルス・プランタルムＣ２（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ２）、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ３）及びラクトバチルス・プランタルムＬＰ４（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ４）を含むプロバイオティクス組成物を提供することを目的とする。前記菌株は、中国微生物菌種寄託管理委員会の一般微生物菌種寄託センターに寄託され、ここで、ラクトバチルス・プランタルムＰ-８の微生物寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ.６３１２であり、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇの微生物寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ.５４６９であり、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９の微生物寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ.５４７０であり、ラクトバチルス・プランタルムＣ２の微生物寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ.１４５３２であり、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３の微生物寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ.１４５３１であり、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ４の微生物寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ.１４５３３である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ある実現可能な様態において、前記プロバイオティクス組成物中の各菌株の生菌数の比例は、ラクトバチルス・プランタルムＰ-８（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｐ-８）：ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ(Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｚｈａｎｇ)：ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｖ９）：ラクトバチルス・プランタルムＣ２（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ２）：ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ３）：ラクトバチルス・プランタルムＬＰ４（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ４）＝（０.５〜１.５）:（１.５〜２.５）:（１.５〜２.５）:（０.５〜１.５）:（０.５〜１.５）:（０.５〜１.５）であり、前記プロバイオティクス組成物中の総生菌
数は１００億ＣＦＵ/ｇである。
【０００６】
ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ２、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ２）は、天然発酵された四川省からのキムチの試料を殺菌水で適度に希釈してから、選択的ＭＲＳ固体培地に塗り、３７℃で７２時間嫌気培養を行う方法から選別されて得られた。典型的なコロニーを選んでグラム染色顕微鏡検査の選別を行った後、次いでＭＲＳ固体培地に２〜３回再採点し培養して純粋なコロニーを得た。生理学的および生化学的同定によって、１６ｓ ｒＲＮＡ分子と組み合わせて、１株のラクトバチルスプランタルムとして同定され、ラクトバチルスプランタルムＣ２（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ２）と命名され、２０１７年８月１８日に中国微生物菌種寄託管理委員会の一般微生物菌種寄託センターに寄託された。本出願は、当該菌株を特許に承認された寄託機関に提出して寄託し、その微生物寄託番号は、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１４５３２であり、分類名は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）と命名し、寄託機構は、中国微生物菌種寄託管理委員会の一般微生物菌種寄託センター（国家特許局指定の特許微生物寄託センター）に寄託し、寄託時間は、２０１７年８月１８日であり、寄託住所は、中国・北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所である。
【０００７】
本出願で単離されたラクトバチルス・プランタルム菌株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ２）は、以下のような生物学的な特徴を有する：菌種は、グラム陽性菌であり、直棒状で、単一で、時には一対になるかまたは鎖状である。ＭＲＳ固体培地上のコロニーは、直径が１-３ｍｍであり、乳白色で、凸状で、円形で、表面が滑らかである。最適増殖温度は、３０〜３７℃であり、嫌気性または通性嫌気性であり、最適ｐＨは６．５程度であり、ＭＲＳ液体培地で濁度が増加する。
【０００８】
本出願で単離されたラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ２）は、スキンケアに用いられることができる。それは、皮膚において大量の有机酸を生成することにより、皮膚環境のｐＨを下げ、病原菌の成長と増殖を抑制するとともに、体の免疫機能を改善し、マクロファージを活性化させ、局所的な抗感染力を維持することができる。さらに、前記ラクトバチルス・プランタルムは、皮膚で過酸化水素、抗菌性ペプチド及びバクテリオシン等の生成物を生成することができ、これらの生成物は、病原菌に対して有意な阻害作用を有する。なお、前記ラクトバチルス・プランタルムは、皮膚でスーパーオキシドジスムターゼ、ヒアルロン酸等のような様々なスキンケア活性因子を皮膚で代謝して生産するため、スキンケアの機能をすることができる。
【０００９】
ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ３、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ３）は、天然発酵された四川省からのキムチの試料を殺菌水で適度に希釈してから、選択的ＭＲＳ固体培地に塗り、３７℃で７２時間嫌気培養を行う方法から選別されて得られた。典型的なコロニーを選んでグラム染色顕微鏡検査の選別を行った後、次いでＭＲＳ固体培地に２〜３回再採点し培養して純粋なコロニーを得た。生理学的および生化学的同定によって、１６ｓ ｒＲＮＡ分子と組み合わせて、１株のラクトバチルス・プランタルムとして同定され、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ
３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ３）と命名し、当該菌株は、既に２０１７年８月１８日に中国微生物菌種寄託管理委員会の一般微生物菌種寄託センターに寄託され、その微生物寄託番号は、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ.１４５３１であり、分類名は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）とし、寄託住所は、中国・北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所である。
【００１０】
本出願で単離されたラクトバチルス・プランタルム菌株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ３）は、以下のような生物学的な特徴を有する：菌種は、グラム陽性菌であり、直棒状で、単一で、時には一対になるかまたは鎖状である。ＭＲＳ固体培地上のコロニーは、直径が１-３ｍｍであり、乳白色で、凸状で、円形で、表面が滑らかである。最適増殖温度は、３０
〜３７℃であり、嫌気性または通性嫌気性であり、最適ｐＨは６.５程度であり、ＭＲＳ液体培地で濁度が増加する。
【００１１】
ラクトバチルス・プランタルムＬＰ４（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ４）は、伝統的なキムチから単離されたプロバイオティクスの特性を潜在的に有するプロバイオティクスであり、当該菌株は、既に中国微生物菌種寄託管理委員会の一般微生物菌種寄託センターに寄託され、寄託番号は、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ.１４５３３であり、分類名は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ４）とし、寄託時間は、２０１７年８月１８日であり、寄託住所は、中国北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所である。
【００１２】
本出願で単離されたラクトバチルス・プランタルムＬＰ４（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ４）は、以下のような生物学的な特徴を有する：菌種は、グラム陽性菌であり、直棒状で、単一で、時には一対になるかまたは鎖状である。ＭＲＳ固体培地上のコロニーは、直径が１-３ｍｍであり、乳白色で、凸状で、円形で、表面が滑らかである。最適増殖温度は、３０〜３７℃であり、嫌気性または通性嫌気性であり、最適ｐＨは６.５程度であり、ＭＲＳ液体培地で濁度が増加する。
【００１３】
プロバイオティクス組成物であって、ラクトバチルス・プランタルムＰ-８（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｐ-８）、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ(Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｚｈａｎｇ)、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｖ９）、ラクトバチルス・プランタルムＣ２（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ２）、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ３）及びラクトバチルス・プランタルムＬＰ４（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ４）を含み、ここで、ラクトバチルス・プランタルムＣ２の微生物寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ.１４５３２であり、ラクトバチルス・プランタ
ルムＬＰ３の微生物寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ.１４５３１であり、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ４の微生物寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ.１４５３３であることを特徴とする。
【００１４】
本出願は、前記プロバイオティクス組成物をスキンケアに使用するための用途をさらに提供する。前記プロバイオティクス組成物の使用方法は、皮膚の洗浄後に前記プロバイオティクス組成物を皮膚に塗る。
【００１５】
本出願は、
活性化されたラクトバチルス・プランタルムＰ-８、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９、ラクトバチルス・プランタルムＣ２、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３及びラクトバチルス・プランタルムＬＰ４を培地に接種し、発酵して、混合プロバイオティク乳酸菌の発酵ブロス（ｂｒｏｔｈ）を得るステップ１-１と、ステップ１-１で得られた混合プロバイオティク乳酸菌発酵ブロス中の上清液を抽出し、前記上清液は前記プロバイオティクス組成物であり、選択的に、抽出された上清液に対して殺菌処理するステップ１-２とを含む、請求項1に記載のプロバイオティクス組成物の製造方法をさらに提供する。
【００１６】
ある実現可能な様態において、ステップ１-１において、ラクトバチルス・プランタルムＰ-８、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９、ラクトバチルス・プランタルムＣ２、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３及びラクトバチルス・プランタルムＬＰ４の生菌数の比例は、（０.５〜１.５）:（１〜３）: （１〜３）: （０.５〜１.５）: （０.５〜１.５）: （０.５〜１.５）であり、好ましくは、１:２:２:１:１:１である。
【００１７】
本出願は、請求項1に記載のプロバイオティクス組成物を用いて製造されたスキンケアエッセンスをさらに提供し、前記スキンケアエッセンスは、下記のような重量含有量の成分を含み、
プロバイオティクス組成物  ５〜３０ｗｔ％、
保湿剤                    １〜５ｗｔ％、
増粘剤                    ０.１〜１ｗｔ％、
可溶化剤                  ０.１〜０.５ｗｔ％、
精製水                    残量、
各成分の重量含有量は、前記スキンケアエッセンスの総重量に基づいて、各成分の重量で計算して得られた重量パーセンテージであり、前記プロバイオティクス組成物の重量は、その中の全てのプロバイオティクスの重量の合計として計算する。
【００１８】
ある実現可能な様態において、前記保湿剤は、プロピレングリコール、 ブタンジオール及びグリセリンから選択された１種または複数種であり、前記増粘剤は、ヒドロキシエチルセルロース及びキサンタンガムから選択された１種または複数種であり、前記可溶化剤は、水素化ひまし油及びスパン６０から選択された１種または複数種である。
【００１９】
本出願は、
保湿剤と増粘剤を混合させるステップ２-１と、
ステップ２-１で製造された系を精製水と混合させるステップ２-２と、
ステップ２-２で製造された系を可溶化剤と混合させるステップ２-３と、
ステップ２-３で製造された系をプロバイオティクス組成物と混合させるス
テップ２-４と、
ステップ２-４で製造された系中の固形物をろ過して除去するステップ２-５
とを含む、前記スキンケアエッセンスの製造方法をさらに提供する。
【００２０】
本出願は、前記プロバイオティクス組成物を用いて製造されたスキンケアエッセンスを含むマスクをさらに提供する。
【発明の効果】
【００２１】
有益な効果として、本出願で提供されたプロバイオティクス組成物は、通常の植物性抽出物または化学類調剤品とは異なり、生物発酵技術によって得られた顔面の皮膚を改善するための有益な微生物及び活性因子を含む微生物剤であることにより、皮膚への化学薬剤の使用を減少させ、顔面の皮膚の健康と美しさを上昇させる。
【００２２】
本出願で提供されたスキンケアエッセンス及びマスクは、前記プロバイオティクス組成物で製造されて、前記スキンケアエッセンスは、例えば、細胞外多糖、スーパーオキシドジスムターゼ、フェニル乳酸、ヒアルロン酸、ペプチド及びアミノ酸のような活性プロバイオティク因子を多く含み、前記スキンケアエッセンス及びマスクは、皮膚の有害な菌を抑制し、皮膚のミクロ生態を改善し、水分補給、抗酸化、美白及び引き締めの機能を持ち、効果的に皮膚の潤い、輝き、引き締めの状態を改善する効果を実現することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本出願は、ラクトバチルス・プランタルムＰ-８（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＰ-８）、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ(Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｚｈａｎｇ)、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｖ９）、ラクトバチルス・プランタルムＣ２（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ２）、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ３）及びラクトバチルス・プランタルムＬＰ４（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ４）を含むプロバイオティクス組成物を提供する。前記菌株は、中国微生物菌種寄託管理委員会の一般微生物菌種寄託センターに寄託され、ここで、ラクトバチルス・プランタルムＣ２の微生物寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ.１４５３２であり、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３の微生物寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ.１４５３１であり、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ４の微生物寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ.１４５３３である。ここで、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｐ-８菌株、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｖ９菌株及びＬ．ｃａｓｅｉ Ｚｈａｎｇ菌株は、中国特許ＣＮ１０５８０２８７６Ａに開示されているように、先行技術において開示されている菌株である。
【００２４】
具体的に、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ(Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｚｈａｎｇ)は、２００１年に内モンゴルのシリンゴール盟の正藍旗草原の天然発酵酸馬乳（Ｋｏｍｉｓｓ）から単離された一株の優れたプロバイオティクス特性を有するラクトバチルス・カゼイである。現在、当該菌種は、中国一般微生物菌種寄託中心（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、寄託番号は、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ.５４６９である。
【００２５】
ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｖ９）は、２００５年に内モンゴル草原の健康なモンゴル族の子供の腸から単離された一株の優れたプロバイオティクス特性を有するビフィドバクテリウム・ラクティスである。現在、当該菌種は、中国一般微生物菌種寄託中心（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、寄託番号は、ＣＧＭＣＣＮ ｏ.５４７０である。
【００２６】
ラクトバチルス・プランタルムＰ-８は、２００３年に内モンゴル自治区の牧畜家庭の天然発酵酸牛乳から単離され、スクリーニングされた一株の優れたプロバイオティクス特性を有する乳酸菌株であり、現在、当該菌種は、中国一般微生物菌種寄託中心（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、寄託番号は、ＣＧＭＣＣＮｏ．５４６８である。
【００２７】
本発明者らは、本出願で提供されたプロバイオティクス組成物が、ヒトの皮膚の粘膜表面の特定部位に粘着して増殖し、天然の細菌膜を形成して、外来の病原菌からの皮膚への侵入を抵抗するように助けることを見出した。プロバイオティクス群の生長は、ヒトの皮膚に対して複数の役割を果たす。まず、プロバイオティクス群は、皮膚の皮脂腺の代謝に関与して、乳化脂質膜(遊離脂肪酸)を形成することができ、皮膚に付着されたアルカリ性物質を中和して、一時的な細菌および真菌のような病原微生物の定植、生長及び増殖を阻害することができて、スキンセルフクリーニングに対して重要な役割を果たす。次に、皮膚に定植されたプロバイオティクス群は、ほかの菌群と相互作用して、皮膚の免疫機能を改善し、体の健康を保護する生物膜を形成する。三番目として、皮膚表面のプロバイオティクス生長は、分解してリン脂質、ステロール類、ケラチン等成分を生成して、皮膚細胞に吸収され、皮膚細胞の生長を促進し、老化を遅延させ、しわの生成を減少させる。
【００２８】
十分なプロバイオティクス及びそれが生成した抗菌物質等の代謝生成物は、悪い細菌の生長及び増殖を阻害することができる。皮膚表面にプロバイオティクスが覆われていると、汚染物が皮膚に直接に接触されることができない。プロバイオティクスは、フリーラジカルの攻撃に耐えることもできる。正常な皮膚表面は、酸性に近づき、そのｐＨは約５.５-７.０であり、このような弱酸性は、細菌、真菌が皮膚表面に侵入することを防止し、抗菌及び殺菌の効果を有する。プロバイオティクスは、酢酸と乳酸を生成して、皮膚表面の弱酸性の環境を維持する。プロバイオティクス代謝によって生成するスーパーオキシドジスムターゼは、化粧品に広く使われて、酸素フリーラジカルを効果的に除去し、コラーゲンやエラスチンの破壊を避け、皮膚の潤いと弾性を保ち、メラニンの沈着を減少させる。なお、乾燥した皮膚は、外来の異物の浸潤を可能にし、炎症の刺激物とアレルゲンへの扉を開く可能性がある。しかし、プロバイオティクス代謝によって生成されるヒアルロン酸は、皮膚の栄養代謝を改善し、皮膚を柔らかく滑らかにし、しわをなくし、弾力性を高め、老化を予防し、保湿とともに良好な経皮吸収を促進する理想的天然保湿因子である。
【００２９】
フェイシャルプロバイオティクス及びそのスキンケア活性因子によって顔面皮膚の表面のプロバイオティクスを向上させ、顔面皮膚の微生物環境を改善し、化学薬剤の使用を減らし、顔面皮膚の健康と美しさを高める。
【００３０】
好ましくは、前記プロバイオティクス組成物中の各菌株の生菌数の比例は、ラクトバチルス・プランタルムＰ-８（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｐ-８）：ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ(Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｚｈａｎｇ)：ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｖ９）：ラクトバチルス・プランタルムＣ２（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ２）：ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ３）：ラクトバチルス・プランタルムＬＰ４（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ４）＝（０.５〜１.５）:（１.５〜２.５）:（１.５〜２.５）:（０.５〜１.５）:（０.５〜１.５）:（０.５〜１.５）、好ましくは、１:２:２:１:１:１であり、前記プロバイオティクス組成物中の総生菌数は１００億ＣＦＵ/ｇである。
【００３１】
本発明者らは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｐ-８、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｚｈａｎｇ、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｖ９、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ２、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ３及びＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ４の６株菌の間の比例は、混合発酵の生菌の含有量及びその代謝生成物に顕著な影響を及ぼし、生菌比例が、１:２:２:１:１:１である時、発酵ブロス中の生菌含有量がピークに達し、発酵過程中に蓄積した活性プロバイオティクス因子（例えば、細胞外多糖、スーパーオキシドジスムターゼ、フェニル乳酸、ヒアルロン酸、ペプチド等）の含有量も最高になることを見出した。
【００３２】
本出願は、前記プロバイオティクス組成物がスキンケアに用いられる応用をさらに提供する。
【００３３】
本出願は、前述プロバイオティクス組成物の製造方法をさらに提供し、前記方法は、ステップ１-１と、ステップ１-２とを含み、ここで、ステップ１-１において、活性化されたラクトバチルス・プランタルムＰ-８、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９、ラクトバチルス・プランタルムＣ２、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３及びラクトバチルス・プランタルムＬＰ４を培地に接種し、発酵させる。
【００３４】
ある実現可能な様態において、ラクトバチルス・プランタルムＰ-８、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９、ラクトバチルス・プランタルムＣ２、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３及びラクトバチルス・プランタルムＬＰ４の生菌数の比例は、（０.５〜１.５）:（１〜３）: （１〜３）: （０.５〜１.５）: （０.５〜１.５）: （０.５〜１.５）であり、好ましくは、１:２:２:１:１:１である。
【００３５】
培地の総重量に基づいて、全ての菌株の生菌数の合計で計算すると、前記プロバイオティクス組成物の総接種量は２％である。前記培地は、（１１０〜１３０）℃で、例えば、１２１℃で、１０ｍｉｎ〜３０ｍｉｎにおける滅菌処理の無菌処理の培地である。ここで、培地の調製処方は、大豆単離タンパク質粉末/脱脂大豆粉末２０〜６０ｇ、コラーゲン粉末５〜２０ｇ、乳清タンパク質粉末５〜２０ｇ、酵母タンパク質粉末５〜２０ｇ、スクロース４０〜８０ｇ、蒸留水１Ｌ、初期ｐＨ＝７.０である。
【００３６】
ある実現可能な様態において、発酵条件は、１０ｍｏｌ/ＬのＮａＯＨ溶液を流れて加え、発酵過程のｐＨは、４.５〜５.５であり、例えば、５.０であり、２０℃〜４０℃で２０〜４０ｈ発酵することである。
【００３７】
ステップ１-２において、ステップ１-１で得られた混合プロバイオティク乳酸菌発酵ブロス中の上清液を抽出し、前記上清液は前記プロバイオティクス組成物であり、選択的に、抽出された上清液に対して殺菌処理する。
【００３８】
ある実現可能な様態において、発酵完了の混合プロバイオティク乳酸菌発酵ブロスを、高速遠心分離して上清液を抽出し、抽出された上清液を８０〜１００℃、例えば、９５℃条件で、１〜１０ｍｉｎ低温殺菌し、例えば、５ｍｉｎ処理する。
【００３９】
選択的に、前記菌株は、下記のような方法で活性化を行う、即ち、ラクトバチルス・プランタルムＰ-８、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ、ラクトバチルス・プランタルムＣ２、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３及びラクトバチルス・プランタルムＬＰ４の菌種をそれぞれＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で１８ｈ恒温培養し、２回継代した。
【００４０】
本出願は、前述前記プロバイオティクス組成物を用いて製造されたスキンケアエッセンスをさらに提供し、前記スキンケアエッセンスは、下記のような重量含有量の成分を含み、
プロバイオティクス組成物  ５〜３０ｗｔ％、
保湿剤                    １〜５ｗｔ％、
増粘剤                    ０.１〜１ｗｔ％、
可溶化剤                  ０.１〜０.５ｗｔ％、
精製水                    残量、
好ましくは、
プロバイオティクス組成物  ５〜３０ｗｔ％、
保湿剤                    １〜５ｗｔ％、
増粘剤                    ０.１〜１ｗｔ％、
可溶化剤                  ０.１〜０.５ｗｔ％、
精製水                    残量、
ここで、各成分の重量含有量は、前記スキンケアエッセンスの総重量に基づいて、各成分の重量で計算して得られた重量パーセンテージであり、特に、プロバイオティクス組成物の重量は、前記プロバイオティクス組成物中の各プロバイオティクスの重量の合計で計算した。
【００４１】
ここで、前記プロバイオティクス組成物は、上記したプロバイオティクス組成物であり、具体的に、前記プロバイオティクス組成物は、ラクトバチルス・プランタルムＰ-８（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｐ-８）、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ(Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｚｈａｎｇ)、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｖ９）、ラクトバチルス・プランタルムＣ２（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ２）、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ３）及びラクトバチルス・プランタルムＬＰ４（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ４）を含み、好ましくは、前記プロバイオティクス組成物中の各菌株の生菌数の比例は、ラクトバチルス・プランタルムＰ
-８（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｐ-８）：ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ(Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｚｈａｎｇ)：ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｖ９）：ラクトバチルス・プランタルムＣ２（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｃ２）：ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ３）：ラクトバチルス・プランタルムＬＰ４（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＬＰ４）＝（０.５〜１.５）:（１.５〜２.５）:（１.５〜２.５）:（０.５〜１.５）:（０.５〜１.５）:（０.５〜１.５）であり、好ましくは、１:２:２:１:１:１であり、前記プロバイオティクス組成物中の総生菌数は１００億ＣＦＵ/ｇである。
【００４２】
本出願において、前記保湿剤は、皮膚の保湿に用いられ、プロピレングリコール、 ブタンジオール及びグリセリン中から選択された１種または複数種であり、好ましくは、 ブタンジオール重量:グリセリン重量＝１:１の組成物である。本発明者らは、当該重量の保湿剤は、ケラチンギャップに完全に満たすことができて、保湿機能を達成することができることを見出した。
【００４３】
本出願において、前記増粘剤は、ヒドロキシエチルセルロース及びキサンタンガムから選択された１種または複数種であり、好ましくは、ヒドロキシエチルセルロースの重量:キサンタンガムの重量＝２:１の組成物である。本発明者らは、当該重量の増粘剤がスキンケアエッセンスの粘度を高め、スキンケアエッセンス中の水分を保ち、またスキンケアエッセンスのコロイド安定性を維持できることを見出した。
【００４４】
本出願において、前記可溶化剤は、潤滑と可溶化のために用いられ、水素化ひまし油及びスパン６０から選択された１種または複数種であり、好ましくは、水素化ひまし油である。本発明者らは、当該重量比の可溶化剤は、特に、水素化ひまし油は、皮膚を滑らかにし、潤いを保ち、肌荒れを改善できることを見出した。
【００４５】
前記スキンケアエッセンスは、例えば、細胞外多糖、スーパーオキシドジスムターゼ、フェニル乳酸、ヒアルロン酸、ペプチド及びアミノ酸のような活性プロバイオティク因子を多く含み、皮膚の有害な菌を抑制し、皮膚のミクロ生態を改善し、水分補給、抗酸化、美白及び引き締めの効果を実現することができる。
【００４６】
本出願は、前記スキンケアエッセンスの製造方法をさらに提供し、前記方法は、ステップ２-１と、ステップ２-２と、ステップ２-３と、ステップ２-４と、ステップ２-５とを含む。
【００４７】
ステップ２-１において、保湿剤と増粘剤を混合させる。
【００４８】
本出願のステップ２-１において、液相物質を固体微粒子と均一に混合するための先行技術のいずれか一つの方法を使用することができる。選択的に、保湿剤を均質乳化ポットに加えてから、増粘剤を保湿剤に添加することができ、均一に均質化攪拌し、均質時間は１０〜３０ｍｉｎであり、例えば、２５ｍｉｎであり、回転速度は３０-４０ｒ/ｍｉｎである。
【００４９】
ステップ２-２において、ステップ２-１で製造された系を精製水と混合させる。
【００５０】
本出願のステップ２-２において、二種の液相物質を均一に混合するための先行技術中のいずれか一つの方法を使用することができる。選択的に、ステップ２-１の系に精製水を加え、乳化ポットに、各成分を均一に攪拌し、均質時間は６０-９０ｍｉｎであり、回転速度は３０-４０ｒ/ｍｉｎである。
【００５１】
ステップ２-３において、ステップ２-２で製造された系を可溶化剤と混合させる。
【００５２】
ある実現可能な様態において、可溶化剤を加熱しながら攪拌して均一になった後、ステップ２-２で製造された系に加え、例えば、ステップ２-２で製造された系を盛る乳化ポットに加え、均一に均質化攪拌し、均質時間は１０〜４０ｍｉｎであり、例えば、２５ｍｉｎであり、回転速度は３０-４０ｒ/ｍｉｎである。
【００５３】
選択的に、ステップ２-３で製造された系の温度を４０〜４５℃の条件で攪拌するように調整し、本発明者らは、この温度範囲内で、プロバイオティクス組成物中の活性物質が活性を維持しやすいことを見出した。
【００５４】
ステップ２-４において、ステップ２-３で製造された系とプロバイオティクス組成物を混合させる。
【００５５】
ある実現可能な様態において、前記プロバイオティクス組成物をステップ２-３で製造された系に加え、例えば、前記プロバイオティクス組成物をステップ２-４で製造された系を盛る乳化ポットに加え、均一に均質化攪拌し、均質時間は１０〜３０ｍｉｎであり、例えば、２０ｍｉｎであり、回転速度は３０-４０ｒ/ｍｉｎである。
【００５６】
ステップ２-５において、ステップ２-４で製造された系中の固形物をろ過して除去する。
【００５７】
ある実現可能な様態において、ステップ２-４で製造された系を、静置タンクに移し、３ｈ〜５ｈ静置し、２００〜４００メッシュ、例えば、３００メッシュのスクリーンでろ過する。不純物と大きな粒子状物質を除去することにより、製造されたマスクが滑らかで繊細である。
【００５８】
保湿剤は、増粘剤を十分に溶解し、水への分散性を高めることができるため、可溶化剤は、ほかの成分とプロバイオティクス組成物の溶解を促進して、均一な分散系を形成することができるため、本出願における材料を添加する手順は、保湿剤、増粘剤及び可溶化剤である。
【００５９】
本発明は、前記プロバイオティクス組成物を用いて製造された前記スキンケアエッセンスを含むマスクをさらに提供し、前記マスクは、例えば、細胞外多糖、スーパーオキシドジスムターゼ、フェニル乳酸、ヒアルロン酸、ペプチド及びアミノ酸のような活性プロバイオティク因子を多く含み、前記マスクは皮膚の有害な菌を抑制し、皮膚の微生物生態を改善し、水分補給、抗酸化、美白及び引き締めの効果を実現する。
【００６０】
前記マスクは、マスクベースが前記スキンケアエッセンスを十分に吸収するように、前記スキンケアエッセンスをマスクモールドに注入し、１５℃〜３０℃に冷却して、０.５時間〜３時間維持するステップを含む方法によって製造される。
実施例
【００６１】
本実施例において、前記試薬の市販情報は以下の通りである。
【００６２】
ＭＲＳ液体培地：広東環凱微生物科学技術有限会社、微生物検出用。
【００６３】
（一）菌株の活性化
ラクトバチルス・プランタルムＰ-８、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ、ラクトバチルス・プランタルムＣ２、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３及びラクトバチルス・プランタルムＬＰ４の菌種をそれぞれにＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で１８ｈ恒温培養し、２回継代し、ここで、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９を嫌気培養する。
【００６４】
実施例１  プロバイオティクス組成物の製造
ステップ１-１において、活性化されたラクトバチルス・プランタルムＰ-８、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９、ラクトバチルス・プランタルムＣ２、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３及びラクトバチルス・プランタルムＬＰ４を、２％（１:２:２:１:１:１）で、１２１℃、２０ｍｉｎ無菌処理した培地に接種した。１０ｍｏｌ/ＬのＮａＯＨ溶液を流して加えることにより、発酵過程のｐＨを５.０に制御し、３０℃で３０ｈ発酵した。培地の調製処方は、大豆単離タンパク質粉末/脱脂大豆粉末２０〜６０ｇ、コラーゲン粉末５〜２０ｇ、乳清タンパク質粉末５〜２
０ｇ、酵母タンパク質粉末５〜２０ｇ、スクロース４０〜８０ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ＝７.０である。
【００６５】
ステップ１-２において、発酵完了した混合プロバイオティク乳酸菌発酵ブロスを高速遠心分離で上清液を抽出し、上清液は、低温殺菌（９５℃、５ｍｉｎ）処理した。
【００６６】
実施例２  プロバイオティクス組成物を含むスキンケアエッセンスの製造
（１）プロピレングリコールを均質乳化ポットに加えてから、ヒドロキシエチルセルロースを順次にポットに入れて、均一に均質化攪拌し、均質時間は２５ｍｉｎであり、回転速度は３０-４０ｒ/ｍｉｎであり、
（２）精製水を乳化ポットに加え、各成分を均一に攪拌し、均質時間は６０-９０ｍｉｎであり、回転速度は３０-４０ｒ/ｍｉｎである。
【００６７】
（３）水素化ひまし油を均一に加熱攪拌した後、乳化ポットに加え、均一に均質化攪拌し、均質時間は２５ｍｉｎであり、回転速度は３０-４０ｒ/ｍｉｎである。
【００６８】
（４）プロバイオティク乳酸菌の菌液を乳化ポットに加え、均一に均質化攪拌し、均質時間は２０ｍｉｎであり、回転速度は３０-４０ｒ/ｍｉｎである。
【００６９】
（５）検出に合格した後、混合物を静置タンクにで送り込み、３００メッシュのスクリーンでろ過する。
【００７０】
実施例３  プロバイオティクス組成物を含むマスクの製造
実施例２で製造されたスキンケアエッセンスを、マスクモールドに入れて、２０℃に冷却し、１.５時間を維持することでマスク完成品を製造した。
【００７１】
本発明は、本発明の方法を用いて得られたプロバイオティック乳酸菌マスクにも関し、活性プロバイオティク因子（細胞外多糖、スーパーオキシドジスムターゼ、フェニル乳酸、ヒアルロン酸、ペプチド及びアミノ酸）を多く含むことを特徴し、皮膚の有害な菌を抑制し、皮膚のミクロ生態を改善し、水分補給、抗酸化、美白及び引き締めの効果を実現する。
実験例
【００７２】
実験例１  プロバイオティクス組成物の抗菌特性
実施例１で製造されたプロバイオティクス組成物の抗菌特性を測定し、測定方法は、ＱＢ/Ｔ２７３８-２０１２に従って実施し、その結果は、表１に示したようである。
【００７３】
【表１】
2019118346.tif 000002
備考：大腸菌陽性コントロールの平均生長コロニー数は、２.３×１０4ＣＦＵ/ｍＬであり、黄色ブドウ球菌陽性コントロールの平均生長コロニー数は、２.５×１０4ＣＦＵ/ｍＬであり、カンジダ・アルビカンス陽性コントロールの平均生長コロニー数は、２.１×１０4ＣＦＵ/ｍＬであり、陰性コントロールは、コロニーの生長がない。
【００７４】
表１から分かるように、ラクトバチルス・プランタルムＰ-８、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９、ラクトバチルス・プランタルムＣ２、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３及びラクトバチルス・プランタルムＬＰ４の混合発酵によって製造されたプロバイオティクス組成物は、皮膚の有害菌を阻害する優れた効能を有し、また作用時間の延長とともに抗菌効果も顕著に増加する。
【００７５】
実験例２  プロバイオティクス組成物中の活性物質の含有量
実施例１で製造されたプロバイオティクス組成物中の活性物質の含有量を測定し、測定方法としは、
１．スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の測定は、中国規制基準ＧＢ/Ｔ ５００９.１７１-２００３に従って実施した。
【００７６】
２．ヒアルロン酸（ＨＡ）の含有量の測定
２-１．ＨＡ標準物質を秤量し、それぞれ１００μｇ/ｍＬ、１２０μｇ/ｍＬ、１４０μｇ/ｍＬ、１６０μｇ/ｍＬ、１８０μｇ/ｍＬ及び２００μｇ/ｍＬの濃度のＨＡ標準試料を調製し、
２-２．ＮａＣｌを秤量し、希釈して０.２μｇ/ｍＬの濃度のＮａＣｌ溶液を調製した。１００ｍＬ試料液を取ってからそれに２.５ｇのＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ））を加えて、２５ｍｇ/ｍＬのＣＴＡＢ溶液を調製し、
２-３．１０μＬの相違な濃度の標準試料を取って、それぞれ２０μＬのＣＴＡＢ溶液を加えて、十分に混合し、反応１０ｍｉｎ後、ＣＴＡＢ溶液をブランクとし、ＯＤ４００値（４００ｎｍにおいて測定した光学密度）を正確に測定して、標準曲線を描き、
２-４．発酵ブロスを取って、４２００ｒ/ｍｉｎで１５ｍｉｎ遠心分離し、菌体を除去して上清液を取って、２.５倍の無水エタノールを添加し、４℃で１ｈ放置し、遠心分離して沈殿させ、上清液の適当な倍数の容量の脱イオン水を加え、溶液を振とうして溶解させて、試料液を調製し、１０μＬを取って遠心管に添加し、２０μＬのＣＴＡＢを遠心管に加えて混合し、反応１０ｍｉｎ後にＯＤ４００値を測定し、試料中のＨＡ含有量を計算した。
【００７７】
３．フェニル乳酸（ＰＬＡ）の含有量の測定
３.１  一定量の発酵ブロスと１ｍｏｌ/Ｌの塩酸を１:４の体積比で遠心管に加え、９０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、１０ｍｌの上清液を吸引して、０.２２μｍフィルターを通して、ろ過後に試験試料とする。
【００７８】
３.２  フェニル乳酸、4-ヒドロキシフェニル乳酸（４-ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）のクロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラムＷａｔｅｒｓ ＨＳＳ Ｔ３、カラム温度は３０℃であり、移動相は、それぞれに、（Ａ）０.１％ギ酸（Ｂ）ギ酸アセトニトリル（Ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）溶液、勾配溶出条件（０〜２ｍｉｎ、２０％〜５０％Ｂ、２.１〜３ｍｉｎ、５０％〜９５％Ｂ、３〜３.１ｍｉｎ、９５％〜５％Ｂ、実行時間３.１ｍｉｎ）、流速０.４ｍＬ/ｍｉｎ、注入量５.０μＬ。質量分析は、ＥＳI陽イオンモード、毛細管電圧２.５ｋｖ、コーン電圧４０ｖ、イオン源温度１００℃、脱溶媒ガス温度６００℃、コーンガス流速６００Ｌ/ｈ、脱溶媒ガス流速０Ｌ/ｈ、及びロイシン - エンケファリン
（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）[Ｍ-Ｈ＝５５４.２６１５]を質量補正軸の基準となる。
【００７９】
４．細胞外多糖の含有量の測定
４.１  試料１.０００ｇを、５０ｍＬ栓付き遠心分離管内に秤量した。５ｍＬ水で試料を浸透させ、２０ｍＬ無水エタノールをゆっくり加え、同時にボルテックスシェーカーで振とうすることにより、均一に混合するようにし、超音波抽出器で３０ｍｉｎ超音波抽出を行った。抽出終了後、４０００ｒ/ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液を捨てた。不溶性物質を１０ｍＬの８０％エノール溶液で洗浄し、遠心分離した。水で前記不溶物を丸底フラスコに移し、５０ｍＬを加え、１２０Ｗで３０ｍｉｎ超音波抽出を行った。室温に冷却し、濾過し、上清液を２００ｍＬのメスフラスコに移し、残渣を２-３回洗浄し、洗浄溶液をメスフラスコに移し、水を容量に加えて定容した。
【００８０】
４.２  相違な体積の標準グルコース測定溶液を２０ｍＬの栓付き試験管に入れ、蒸留水で１.０ｍＬにした。試験溶液に１.０ｍＬフェノール溶液加えた後、速やかに５.０ｍＬに硫酸を加えて１０ｍｉｎ放置した。ボルテックスシェーカーで反応液をよく混合させた後、試験管を３０℃水槽に２０ｍｉｎ放置し、水槽で反応させ、吸光度を４９０ｎｍで測定した。グルコース質量濃度を横軸とし、吸光度を縦軸とすることによって標準曲線を確立する。
【００８１】
４.３  １.００ｍＬ試料測定液を吸引して２０ｍｌの栓付き試験管に入れ、ステップ４.２の操作に従って吸光度を測定し、試料に多糖類の含有量を計算する。
【００８２】
５．ペプチドの含有量の測定
５.１  ５％のＴＣＡで順次に相違な濃度のＧｌｙ-Ｇｌｙ-Ｔｙｒ-Ａｒｇのテトラペプチド標準溶液を調製してから、それぞれ６.０ｍｌの標準溶液を取って、４.０ｍｌのビウレット試薬を添加し、ボルテックスミキサーで均一に混合させ、１０ｍｉｎ間放置し、２０００ｒ/ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液を取って５４０ｎｍでＯＤ値(第１のチューブをブランク対照とする)を測定し、標準曲線を確立する。
【００８３】
５.２  ２．５ｍｌの試料溶液取って、２.５ｍｌの１０％(Ｗ/Ｖ)のトリクロロ酢酸(ＴＣＡ)水溶液を加えて、ボルテックスミキサーで均一に混合させ、１０ｍｉｎ放置してから、４０００ｒ/ｍｉｎで１５ｍｉｎ遠心分離し、上清液を全部５０ｍｌのメスフラスコに移し、５％のＴＣＡでマークまで定容してから、よく振る。
【００８４】
検出結果は、表２に示したようである。
【００８５】
【表２】
2019118346.tif 000003
表２から分かるように、ラクトバチルス・プランタルムＰ-８、ラクトバチルス・カゼイＺｈａｎｇ、ビフィドバクテリウム・ラクティスＶ９、ラクトバチルス・プランタルムＣ２、ラクトバチルス・プランタルムＬＰ３及びラクトバチルス・プランタルムＬＰ４の混合発酵で製造されたプロバイオティクス組成物には、菌株の代謝によって生成された複数種の活性成分が含まれている。その中、スーパーオキシドジスムターゼは、抗酸化の機能を有し、皮膚の老化を防止し、フレークル、しわ防止に有効であり、ヒアルロン酸は、皮膚の栄養代謝を改善することができ、皮膚を柔らかく、滑らかにし、しわを減らし、弾
力性を増加させ、老化を予防し、保湿とともに良好な経皮吸収を促進し、フェニル乳酸は、乳酸菌の生成した天然抗菌物質であり、ヒト細胞と動物細胞に対して無毒であり、抗菌範囲が広く、安定性が高く、複数種の病原性細菌腐敗菌に対して阻害作用を有し、細胞外多糖は、保湿、抗酸化、免疫力の増加、皮膚組織の修復、皮膚の血液循環の促進、抗アクネ等作用を有し、ペプチドは、細胞分裂および分化を促進し、表皮治癒を促進する作用を有する。
【００８６】
実験例３  プロバイオティック乳酸菌マスクの使用効果
実施例３で製造されたマスクの効果を測定し、その測定方法は、ボランティアの顔をきれいにした後、テスト用マスク（右側の半分）を右側の顔に敷いて、手で軽く押して皮膚にきっちり当てるようにしてから、１５ｍｉｎ後に取り外し、左側と右側の顔の皮膚状態を比較して観察し、使用効果を記録する。各ボランティアは、一日１回マスクを使用し、５日間連続使用して測定した後、３００名のボランティアの使用効果をまとめた結果を表３に示した。
【００８７】
【表３】
2019118346.tif 000004
備考：３００名のボランティアが左側の顔には何のスキン
ケア品も使用せず、右側の顔にプロバイオティク乳酸菌マスクを敷く方法を採用した。
【００８８】
表３から分かるように、プロバイオティク乳酸菌マスクは、水分補給、抗酸化、美白、輝き及び引き締めの機能がある。
【００８９】
以上は、具体的な実施形態と凡例性の具現例に合わせて、本出願について詳細に説明したが、これらの説明は、本出願に対する限定と理解してはいけない。当業者であれば、本出願の精神および範囲を逸脱しない状況で、本出願の技術方案及びその実施形態に対して様々な均等なとりかえ、修正および改良を行うことができ、これらは本出願の範囲内に属することを理解できる。本出願の保護範囲は、添付の請求の範囲に従う。
【外国語明細書】
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