(57)【要約】      （修正有）【課題】酵素生産性微生物の培養物から酵素を簡便かつ高収率で回収する方法の提供。【解決手段】酵素生産性微生物の培養物にポリリジンを添加後濾過する酵素の製造法。好ましくは、ポリリジン添加後、酵素の失活しない条件下で撹判し、凝集を促すことにより、濾過容易化する、方法。濾過後の濾液を回収後、常法で処理し、酵素を精製する、酵素の製造方法。酵素がプロテアーゼであり、添加ポリリジン濃度が０．０００１〜１０質量％であり、酵素生産性微生物がバチルス属又はバチルス類縁属に属する酵素生産菌である酵素の生産方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素生産性微生物の培養物にポリリジンを添加後濾過することを特徴とする酵素の製造法。
【請求項２】
濾過後濾液を採取する請求項１記載の製造法。
【請求項３】
酵素がプロテアーゼである請求項１又は２記載の製造法。
【請求項４】
添加ポリリジン濃度が０．０００１〜１０質量％である請求項１〜３のいずれか１項記載の製造法。
【請求項５】
酵素生産性微生物がバチルス属又はバチルス類縁属に属する酵素生産菌である請求項１〜４のいずれか１項記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養物から酵素の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は、微生物が産生するものの他、動物及び植物の体内でも生産されているが、その工業的生産技術は微生物の培養手段によっている。例えば、バチルス属及びその類縁属細菌等は、酵素をその細胞外に分泌するため、酵素生産微生物として広く利用されている。これらの微生物を培養した後は、培養物中の微生物と酵素とを効率的に分離する必要があるが、これらの微生物は酵素以外に高分子成分を産生することがあり、それに起因する培養液の粘性上昇が酵素と微生物との分離に問題を生じることが多い。例えば、高粘性の培養液は、一般的な細胞分離方法である遠心分離を行った時に微生物の沈降性を低下させる。このため、珪藻土を用いた濾過に代えて、中空糸を用いた精密濾過等が提案されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平６−９８７６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、中空糸を用いる精密濾過は、高粘性の培養液の濾過には採用できず、また酵素の大量生産には不向きである。
従って、本発明の課題は、簡便な操作で効率的に微生物培養物から酵素を分離する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、酵素及び微生物を含む培養物から酵素を失活させることなく効率良く分離する手段について検討したところ、全く意外にも、培養物にポリリジンを添加すれば、微生物と粘性上昇成分とが同時に凝集沈殿し、酵素は失活せず上清中に存在することから、濾過性が格段に向上し、酵素を通常の濾過手段で濾過するのみで効率良く分離できることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
従って、本発明は、次の〔１〕〜〔５〕を提供するものである。
【０００７】
〔１〕酵素生産性微生物の培養物にポリリジンを添加後濾過することを特徴とする酵素の製造法。
〔２〕濾過後濾液を採取する〔１〕記載の製造法。
〔３〕酵素がプロテアーゼである〔１〕又は〔２〕記載の製造法。
〔４〕添加ポリリジン濃度が０．０００１〜１０質量％である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の製造法。
〔５〕酵素生産性微生物がバチルス属又はバチルス類縁属に属する酵素生産菌である〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の製造法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、酵素生産性微生物の培養物から、通常の濾過手段により、酵素を失活させることなく、簡便かつ効率的に酵素を分離することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の酵素の製造方法は、酵素生産性微生物の培養物にポリリジンを添加後濾過することを特徴とする。
【００１０】
酵素生産性微生物としては、酵素生産することが知られている微生物であれば特に制限されないが、例えば、以下の微生物が挙げられる。
【００１１】
酵素名：アガラーゼ
微生物名：担子菌（Coliolus）又は細菌（Bacillus, Pseudomonas）
酵素名：アシラーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus ochraceus, Aspergillus melleus）
酵素名：α−アセトラクタートデカルボキシラーゼ（リアーゼ）
微生物名：細菌（Bacillus subtilis, Serratia）
酵素名：アミノペプチダーゼ
微生物名：細菌（Aeromonas caviae, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis）
酵素名：α−アミラーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus aureus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae）、細菌（Alcaligenes latus, Arthrobacter, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Sulfolobus solfataricus）若しくは放線菌（Thermomonospora viridis）
【００１２】
酵素名：β−アミラーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus oryzae）、放線菌（Streptomyces）若しくは細菌（Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis）
酵素名：アルギン酸リアーゼ
微生物名：細菌（Alteromonas macleodii, Flavobacterium maltivolum, Pseudomonas, Xanthomonas）
酵素名：アントシアナーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Penicillium decumbens）
酵素名：イソアミラーゼ
微生物名：細菌（Bacillus, Flavobacterium odoratum, Pseudomonas amyloderamosa）
酵素名：イソマルトデキストラナーゼ
微生物名：細菌（Arthrobacter）
【００１３】
酵素名：イヌリナーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Aspergillus phoenicis, Penicillium purpurogenum, Trichoderma）
酵素名：インベルターゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus niger）、細菌（Arthrobacter, Bacillus）又は酵母（Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae）
酵素名：ウレアーゼ
微生物名：乳酸菌（Lactobacillus fermentum）又は細菌（Arthrobacter）
酵素名：エキソマルトテトラオヒドラーゼ
微生物名：細菌(Pseudomonas stutzeri)
【００１４】
酵素名：エステラーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus）、細菌（Pseudomonas）若しくは酵母（Candida, Torulopsis）
酵素名：カタラーゼ（オキシダーゼ）
微生物名：糸状菌（Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus niger, Aspergillus phoenicis, Penicillium amagasakiense ）細菌（Micrococcus lyzodeikticus）若しくは酵母（Saccharomyces）
酵素名：α−ガラクトシダーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Aspergillus phoenicis, Mortierella）又は細菌（Bacillus stearothermophilus）
酵素名：β−ガラクトシダーゼ（ラクターゼ）
微生物名：糸状菌（Aspergillus oryzae, Penicillium multicolor, Rhizopus oryzae）、細菌（Bacillus circulans, Streptococcus）若しくは酵母（Kluyveromyces fragillus, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces）
【００１５】
酵素名：カルボキシペプチダーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus）若しくは酵母（Saccharomyces cerevisiae）
酵素名：キシラナーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum reesei, Trichoderma viride）
酵素名：キチナーゼ
微生物名：糸状菌（Trichoderma harzianum, Trichoderma reesei）、放線菌（Amycolatopsis orientalis, Streptomyces）又は細菌（Aeromonas）
酵素名：キトサナーゼ
微生物名：細菌（Aeromonas, Bacillus）又は糸状菌（Aspergillus niger, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Verticillium）
【００１６】
酵素名：グルカナーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Humicola insolens, Rhizopus delemar, Trichoderma harzianum, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma viride）、担子菌（Pycnoporus coccineus）、細菌（Arthrobacter, Bacillus subtilis, Pseudomonas paucimobilis）若しくは酵母（Saccharomyces）
酵素名：グルコアミラーゼ
微生物名：糸状菌（Acremonium, Aspergillus, Humicola grisea, Rhizopus delemar, Rhizopus niveus）、担子菌（Corticium rolfsii）、細菌（Bacillus, Pseudomonas）又は酵母（Saccharomyces）
【００１７】
酵素名：α−グルコシダーゼ
微生物名：糸状菌（Absidia, Acremonium, Aspergillus）、細菌（Bacillus, Pseudomonas）若しくは酵母（Saccharomyces）
酵素名：β−グルコシダーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Aspergillus pulverulentus, Penicillium decumbens, Trichoderma harzianum, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei）若しくは細菌（Bacillus）
酵素名：α−グルコシルトランスフェラーゼ
微生物名：細菌（Agrobacterium radiobacter, Arthrobacter, Bacillus, Erwinia, Pimelobacter, Protaminobacter, Pseudomonas, Serratia, Thermus）
酵素名：グルコースイソメラーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus）、放線菌（Actinoplanes missouriensis, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces murinus, Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces rubiginosus）又は細菌（Bacillus coagulans）
酵素名：グルコースオキシダーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Penicillium）
【００１８】
酵素名：グルタミナーゼ
微生物名：枯草菌（Bacillus subtilis）、糸状菌（Aspergillus）又は酵母（Candida）
酵素名：酸性ホスファターゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus niger, Aspergillus oryzae）
酵素名：シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（トランスフェラーゼ）
微生物名：細菌（Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium）
【００１９】
酵素名：セルラーゼ
微生物名：糸状菌（Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Humicola insolens, Trichoderma harzianum, Trichoderma insolens, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride）、担子菌（Corticium, Irpex, Pycnoporus coccineus）、放線菌（Actinomyces, Streptomyces）若しくは細菌（Bacillus circulans, Bacillus subtillis）
酵素名：タンナーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus oryzae）
酵素名：５’−デアミナーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus melleus, Aspergillus oryzae）
【００２０】
酵素名：デキストラナーゼ
微生物名：糸状菌（Chaetomium erraticum, Chaetomium gracile, Penicillium lilacinum）
酵素名：トランスグルコシダーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus niger, Aspergillus usamii）、細菌（Sulfolobus solfataricus）
酵素名：トランスグルタミナーゼ
微生物名：放線菌（Streptomyces, Streptoverticillium mobaraense）若しくは細菌（Bacillus）
酵素名：トレハロースホスホリラーゼ
微生物名：細菌（Plesiomonas）
酵素名：ナリンジナーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus usamii, Penicillium decumbens）
【００２１】
酵素名：パーオキシダーゼ（ペルオキシダーゼ）
微生物名：糸状菌（Alternaria, Aspergillus oryzae, Coprinus cinereus, Oidiodendron）若しくは細菌（Bacillus）
酵素名：フィターゼ（ホスホヒドロラーゼ）
微生物名：糸状菌（Aspergillus niger）
酵素名：フルクトシルトランスフェラーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus, Penicillium roqueforti）又は細菌（Arthrobacter, Bacillus）
酵素名：プルラナーゼ
微生物名：細菌（Bacillus, Klebsiella, Sulfolobus solfataricus）
【００２２】
酵素名：プロテアーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus melleus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus saitoi, Aspergillus, sojae, Monascus pilosus, Monascus purpureus, Mucor circinelloides, Mucor javanicus, Mucor miehei, Mucor rouxii, Penicillium citrinum, Penicillium duponti, Rhizomucor miehei, Rhizopus chinensis, Rhizopus delemar, Rhizopus niveus, Rhizopus oryzae）、担子菌 (Pycnoporus coccineus)、放線菌 (Streptomyces)、細菌 (Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans J4, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus polymixa, Bacillusstearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus, Pseudomonas paucimobilis)若しくは酵母(Saccharomyces)
【００２３】
酵素名：ペクチナーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus aculeatus, Aspergillus alliaceus, Aspergillus awamori, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger, Aspergillus pulverulentus, Aspergillus usamii, Rhizopus oryzae, Trichoderma）、細菌（Bacillus subtilis）、担子菌（Corticium）若しくは酵母（Trichosporon）
酵素名：ヘスペリジナーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus, Penicillium decumbens）
【００２４】
酵素名：ペプチダーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Rhizopus oryzae）若しくは細菌（Bacillus, Lactococcus lactis）
酵素名：ヘミセルラーゼ
微生物名：枯草菌（Bacillus subtilis）、糸状菌（Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus usamii, Humicola insolens, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma viride）若しくは担子菌（Corticium, Pycnoporus coccineus）
酵素名：ホスホジエステラーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus niger, Penicillium citrinum）
酵素名：ホスホリパーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus oryzae, Aspergillus niger）、担子菌（Corticium）、放線菌（Actinomadura, Nocardiopsis）若しくは細菌（Bacillus）
【００２５】
酵素名：ポリフェノールオキシダーゼ
微生物名：糸状菌（Alternaria, Aspergillus niger, Coriolus）若しくは担子菌（Cyathus, Polyporus cinereus, Pycnoporus coccineus, Polyporus versicolor, Trametes）
酵素名：マルトースホスホリラーゼ
微生物名：細菌（Plesiomonas）
酵素名：マルトトリオヒドロラーゼ
微生物名：糸状菌（Penicillium）又は細菌（ Bacillus subtilis，Microbacterium）
酵素名：ムラミダーゼ
微生物名：放線菌（Actinomyces, Streptomyces）又は細菌（Bacillus）
【００２６】
酵素名：リパーゼ
微生物名：糸状菌（Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Aspergillus usamii, Geotrichum candidum, Humicola, Mucor javanicus, Mucor miehei, Penicillium camembertii, Penicillium chrysogenum, Penicillium roquefortii, Rhizomucor miehei, Rhizopus delemar, Rhizopus japonicus, Rhizopus miehei, Rhizopus niveus, Rhizopus oryzae）、放線菌（Streptomyces）、細菌（Alcaligenes, Arthrobactor, Chromobacterium viscosum, Pseudomonas, Serratia marcescens）又は酵母（Candida）
酵素名：リポキシゲナーゼ
微生物名：糸状菌（Rhizopus）
酵素名：レンネット
微生物名：酵母菌（Kluyveromyces lactis）、糸状菌（Mucor miehei, Mucor pusillus LINDT, Mucor spp., Rhizomucor miehei）、担子菌（Irpex lacteus）若しくは細菌（Bacillus cereus, Crypnohectria parasitica, Escherichia coli K-12等）
【００２７】
これらの酵素のうち、プロテアーゼが好ましく、プロテアーゼ生産微生物としては糸状菌、担子菌、放線菌、細菌、酵母が挙げられるが、酵素を細胞外に分泌する微生物、特にバチルス属又はバチルス類縁属に属する細菌がより好ましい。ここで、バチルス類縁属としては、ジオバチルス、パエニバチルス、アリシクロバチルス、ブレビバチルス、オセアノバチルス等が挙げられる。
【００２８】
酵素生産性微生物の培養物とは、酵素生産性微生物を酵素が生産される条件で培養した培養物であり、酵素及び微生物を含む混合物である。例えば、バチルス属又はバチルス類縁属に属する微生物をプロテアーゼが生産される条件で培養した培養物が挙げられる。また、培養物としては、液体培養物が好ましい。
【００２９】
前記培養物にポリリジンを添加する。ポリリジンは、通常ｐＨ調整剤や静菌剤として使用されているが、微生物と酵素との分離に利用できることは全く知られていない。
ポリリジンとしては、ε−ポリ−Ｌ−リジン、α−ポリ−Ｌ−リジンが挙げられるが、食品用として用いられているε−ポリ−Ｌ−リジンが安全性の点で特に好ましい。
【００３０】
ポリリジンの添加量は、微生物の凝集性及び酵素の選択性の点から、添加後の濃度として、０．０００１質量％以上１０質量％以下が好ましく、０．０００５質量％以上５質量％以下がより好ましく、０．００１質量％以上１質量％以下がさらに好ましく、０．００５質量％以上０．５質量％以下がよりさらに好ましい。
【００３１】
ポリリジンの添加により、微生物及び粘性上昇成分が凝集して濾過性が顕著に向上するが、通常用いられている濾過助剤を併用してもよい。濾過助剤としては、珪藻土、パーライト、セルロース等が挙げられるが、珪藻土、パーライトがより好ましい。濾過助剤の使用量は、培養物１００質量部に対して０．０１〜１００質量部が好ましく０．０５〜５０質量部がより好ましく、０．１〜２０質量部がさらに好ましい。なお、濾過助剤は、培養物に添加するだけでもよいが、濾過フィルターにプレコートしておいてもよい。
【００３２】
ポリリジン添加後の培養物は、酵素が失活しない条件（例えば常温（５〜３５℃））で、撹拌（好ましくは１０分〜３時間）するのが好ましい。また、必要に応じて遠心分離処理してもよい。
【００３３】
その後、ポリリジン添加後の培養物を濾過すれば、容易に沈澱部と上清部が分離でき、濾液として酵素含有液が得られる。ここで、濾過に用いるフィルターとしては、ろ紙、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリアミド（ナイロン）、ポリエステル（テトロン）、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニリデン、ＰＶＤＦ、ＰＴＦＥ、ＰＡＮ、ＰＥＳ等が挙げられる。また濾過手段としては、加圧式でも吸引式でも良く、工業用のフィルタープレス装置等を用いることができる。得られた濾液の粘性は、顕著に低下している。
【００３４】
得られた酵素含有濾液は、常法、例えば硫酸アンモニウム、有機溶媒（アセトン、エタノール等）による沈殿処理、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー等の手段により精製することができる。
【実施例】
【００３５】
次に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。実施例において、％は特に記載のない場合、質量％を示す。
【００３６】
実施例１
Bacillus属類縁菌の培養液へのポリリジン処理の効果
Bacillus subtilis var. natto（ＮＢＲＣ１３１６９）、Bacillus amyloliquefaciens（ＮＢＲＣ１５５３５)、Geobacillus thermoglucosidasius（ＮＣＩＭＢ１１９５）を、２４ｍｍ試験管を用いて、グリセリン３％、大豆ペプトン２％、酵母エキス０．３％からなる培地（ｐＨ７．２）で３０℃、２４時間の振盪により前培養した。次に、５００ｍＬの三角フラスコを用いて、グリセリン４％、大豆ペプトン１％、酵母エキス０．５％からなる培地（ｐＨ７．２）に前培養液を１％接種し、３０℃、４８時間の振盪により培養した。培養後の培養液をｐＨ７．５付近に調整し、２５％ポリリジン（ＪＮＣ社製）を終濃度０．０２％となるよう添加し、室温で３０分間撹拌した。その後、プレコートとしてラヂオライト＃１００（昭和化学工業社製）をＮｏ．２のろ紙（アドバンテック社製）に敷き、ボディフィードとして１％ラヂオライト＃１００の条件で吸引濾過を行い、濾液を得た。各培養液と濾液の清澄度（ＯＤ600）の結果を表１に示す。また、各培養液と濾液のプロテアーゼ活性を測定した。培養液のプロテアーゼ活性を１００％としたときの濾液のプロテアーゼ活性を表２に示す。
【００３７】
【表１】
2019017355.tif 000002
【００３８】
【表２】
2019017355.tif 000003
【００３９】
表１に示すとおり、いずれの培養液においても、ポリリジンを添加することにより清澄度を５％以下にすることができた。また、表２に示すとおり、いずれの濾液においても、プロテアーゼを９０％以上の高収率で回収することができた。
【００４０】
実施例２
Bacillus subtilis var. natto培養液におけるポリリジン処理濃度の影響
Bacillus subtilis var. natto（ＮＢＲＣ１３１６９）を、２４ｍｍ試験管を用いて、グリセリン３％、大豆ペプトン２％、酵母エキス０．３％からなる培地（ｐＨ７．２）で３０℃、２４時間の振盪により前培養した。次に、５００ｍＬの三角フラスコを用いて、グリセリン４％、大豆ペプトン１％、酵母エキス０．５％からなる培地（ｐＨ７．２）に前培養液を１％接種し、３０℃、４８時間の振盪により培養した。培養後の培養液をｐＨ７．５付近に調整し、２５％ポリリジン（ＪＮＣ社製）を終濃度０．０２％〜０．１％となるよう添加し、室温で３０分間撹拌した。その後、プレコートとしてラヂオライト＃１００（昭和化学工業社製）をＮｏ．２のろ紙（アドバンテック社製）に敷き、ボディフィードとして１％ラヂオライト＃１００の条件で吸引濾過を行い、濾液を得た。培養液と各濾液のプロテアーゼ活性を測定した。培養液のプロテアーゼ活性を１００％としたときの濾液のプロテアーゼ活性を表３に示す。
【００４１】
【表３】
2019017355.tif 000004
【００４２】
表３に示すとおり、いずれの濾液においても、プロテアーゼを９０％以上の高収率で回収することができた。
【００４３】
上記のプロテアーゼ活性は、以下の方法に定義される酵素量１．０ＰＵに基づいて溶液当たりの酵素活性として算出できる。０．６％カゼイン水溶液（ｐＨ７．５、２ｍＭ酢酸カリウム含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液）に酵素希釈液１ｍＬを添加し、３０℃で１０分間反応後、トリクロロ酢酸試薬（ｐＨ４．０、８％無水酢酸ナトリウム、１．８％トリクロロ酢酸、１．９８％酢酸）５ｍＬを加えて反応を停止し、更に３０℃で３０分静置し、濾過後、２７５ｎｍの吸光度を測定する。この条件下で１分間に１μｇのチロシンに相当するアミノ酸を遊離する酵素量を１ＰＵ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｕｎｉｔ）と定義する。