(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝性腎疾患のアルポート症候群（ＡＳ）について、未だ特異的治療法の存在しないASの病態形成機構の解明と，既存の対症療法よりもさらに効果的な新規治療方法の提供。【解決手段】腎糸球体の代謝調整を行うことにより，アルポート症候群の治療を行うアルポート症候群治療薬。特に，これら腎糸球体の代謝調整を行う有効成分として，ビグアナイド系化合物もしくはその塩を用いることができ，さらに好ましくはメトホルミンないしその塩，最も好ましくはメトホルミン塩酸塩を用いる治療方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎糸球体の代謝調整を行うことにより，アルポート症候群の治療を行うことを特徴とするアルポート症候群治療薬
【請求項２】
腎糸球体の代謝調整が，ビグアナイド系化合物もしくはその塩を有効成分としてなされることを特徴とする請求項１に記載のアルポート症候群治療薬
【請求項３】
ビグアナイド系化合物が，メトホルミンないしその塩であることを特徴とする請求項２に記載のアルポート症候群治療薬
【請求項４】
メトホルミンないしその塩が，メトホルミン塩酸塩であることを特徴とする請求項３に記載のアルポート症候群治療薬
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，遺伝性腎疾患であるアルポート症候群の治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルポート症候群（AS）は，腎糸球体基底膜を構成するIV型コラーゲン遺伝子の変異によって生じる遺伝性の腎疾患であり，代表的な小児腎疾患である（特許文献１）。
ASは腎不全進行を予防する目的で，レニン・アンジオテンシン・アルドステロン阻害をメカニズムとする治療薬が用いられている。しかしながら，これらの治療薬は対症療法に過ぎず，ASの根治的な治療はない。このような事情もあって，AS患者の多くは，最終的に末期腎不全への移行を余儀なくされているのが現状である。
【０００３】
現在，AS患者は，日本には1200人ほど存在すると推計されている。また，欧米では，5千人から１万人に1人の割合で発症すると言われており，AS患者・患者家族を支援し，治療研究の助成を行うためのAlport Syndrome Foundationも存在している。
【０００４】
一方，メトホルミンは，1959年に国際誕生した経口糖尿病治療薬であり，日本においても，メトホルミン塩酸塩を有効成分として，多くの製薬メーカーから販売されている。メトホルミンは，肝臓での糖新生の抑制，グルコガンによる肝細胞でのグリコーゲン分解抑制・インスリン抵抗性の改善を通じて，血糖値の上昇抑制等の糖尿病治療効果を発揮する。ASにおけるメトホルミンの治療効果については，明らかとなっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０５８８８１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような状況から発明者らは，未だ特異的治療法の存在しないASの病態形成機構の解明と，既存の対症療法よりもさらに効果的な新規治療方法の開発について，研究を開始したものである。
上記事情を背景として本発明では，ASについて新規な治療方法の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは，鋭意研究の結果，ASモデルマウスの腎糸球体において，複数の分子が発現異常を起こしていることを明らかにした。加えて，これら分子について解析を行ったところ，複数の細胞内代謝経路が過剰に促進されていることを発明者らは見出したものである。
これらより発明者らは，ASにおいて，腎糸球体における細胞内代謝を改善させることでASの治療が行えることに想到し，細胞内代謝改善薬の一つとしてメトホルミンを用いたところ，ASモデルマウスにおいて治療効果がみられることを実験的に確認し，発明を完成させたものである。
【０００８】
本発明は，以下の構成からなる。
本発明の第一の構成は，腎糸球体の代謝調整を行うことにより，アルポート症候群の治療を行うことを特徴とするアルポート症候群治療薬である。
本発明の第二の構成は，腎糸球体の代謝調整が，ビグアナイド系化合物もしくはその塩を有効成分としてなされることを特徴とする第一の構成に記載のアルポート症候群治療薬である。
本発明の第三の構成は，ビグアナイド系化合物が，メトホルミンないしその塩であることを特徴とする第二の構成に記載のアルポート症候群治療薬である。
本発明の第四の構成は，メトホルミンないしその塩が，メトホルミン塩酸塩であることを特徴とする第三の構成に記載のアルポート症候群治療薬である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により，ASにおいて新規治療方法の提供が可能となった。すなわち，ASでは，腎糸球体における代謝異常を調整することにより，治療効果がもたらされることが明らかとなるとともに，そのような治療薬として，ビグアナイド系化合物もしくはその塩を用いればよいことが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ASモデルマウスの腎糸球体におけるプロテオミクス解析の結果を示したグラフ。
【図２】実験方法の概容を説明した図。
【図３】ASモデルマウスにおいて，メトホルミンが，腎機能に与える影響を調べた結果を示した図。
【図４】ASモデルマウスにおいて，メトホルミンが，腎組織障害に与える影響を調べた結果を示した図。
【図５】ASモデルマウスにおいて，メトホルミンが，各種炎症関連因子に与える影響を調べた結果を示した図。
【図６】ASモデルマウスにおいて，メトホルミンが，各種繊維化関連因子に与える影響を調べた結果を示した図。
【図７】ASモデルマウスにおいて，メトホルミンが，AS腎糸球体障害に与える影響を調べた結果を示した図。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ここでは，本発明のアルポート症候群治療薬（以下，「AS治療薬」と略する）について，説明を行う。
【００１２】
本発明におけるAS治療薬は，腎糸球体における代謝調整を行うことを特徴とする。
本発明において「代謝調整を行う」とは，広義には，腎糸球体における代謝を整えることとして定義され，狭義には，本発明で明らかとなった腎糸球体における代謝異常（Comlex I bigenesis，Respiratory electron transport，Respiratory electron transport, ATP synthesis by chemiosmotic，The citric acid（TCA） cycle and respiratory elctron transport）の過剰な促進を抑制することとして定義される。
【００１３】
本発明において腎糸球体における代謝調整は，ビグアナイド系化合物もしくはその塩を有効成分としてなされることが好ましい。すなわち，メトホルミンは，腎における代謝調整ならびにASにおいて治療効果を発揮する化合物として発明者らにより見出された化合物である。これより，メトホルミンをはじめとするビグアナイド系化合物は，メトホルミンと同様の薬理機序を有することから，腎糸球体において代謝調整を行うことにより，ASにおける治療効果を発揮することが期待できる。
このようなビグアナイド系化合物として，例えば，メトホルミン（1,1-Dimethylbiguanide），ブホルミン（1-Butylbiguanide）もしくはこれらの塩を用いることが好ましい。
【００１４】
ビグアナイド系化合物として，メトホルミンないしその塩を用いることが好ましく，このような化合物として，メトホルミン塩酸塩を用いることがさらに好ましい。
すなわち，メトホルミンは，古くから糖尿病治療薬として用いられており，その体内動態や安全性など医薬品性能に関する知見が十分に蓄積している化合物である。これより，メトホルミン塩酸塩をはじめとするメトホルミンないしその塩を，腎糸球体における代謝調整に用いることにより，医薬品としての開発を加速することができる効果を有する。
【００１５】
なお，本発明において，各種化合物ないしその塩（以下，これらを合わせて「有効成分化合物」という）を有効成分として用いる場合，有効成分化合物についてそのままの化学構造を保持した形で有効成分としてもよいし，本発明の趣旨に鑑み，生体内における代謝等を受けて化合物の構造を変化させ有効成分化合物として作用する，もしくは，血中半減期を長くするための化学的修飾を行うなどの，いわゆるDDS化された有効成分化合物を含むものとしてもよい。
【００１６】
本発明の薬剤の剤形について，特に限定する必要はなく，種々の剤形を用いることができる。典型的には，経口用錠剤が挙げられるが，これに限定する必要はなく，カプセル剤，散剤，経皮吸収型製剤，注射剤など種々の形態を採用することができる。
本発明において，「AS治療」とは，ASの根治を当然に意味するものではなく，その症状の改善や進行の抑制，予防を行うことを含む概念として定義される。
典型的には，AS患者に投与を行うことにより，尿たんぱくの減少や，腎組織繊維化等のASに生じる症状を抑制することなどがASの治療として挙げられる。
【実施例】
【００１７】
以下，実験例を示して，本発明について詳述する。
【００１８】
＜＜実験方法概略＞＞
＜マウス＞
各実験例で用いたX連鎖型Alport症候群モデルマウス（Col4a5 tm1Yseg G5X mutant）は，ジャクソンラボラトリーから購入した。検討には購入したAlport症候群マウスを繁殖させた仔マウスを用いた。また，同週齢のC57BL/6 マウス（日本チャールズリバーより購入）をWTマウスのコントロールとした。
これらのマウスを，図２の実験概容の条件にて用いた。
【００１９】
＜薬物投与＞
Losartan，Metformin，ともに自由飲水による投与を行った。
【００２０】
＜採尿＞
尿について，マウスが餌や水が自由に摂取・行動できる代謝ケージを用い，24時間で蓄積された尿を撹拌し回収した。回収された尿は，夾雑物を除くため，4℃，12,000rpmで5分間遠心し，-80℃で保存した。
【００２１】
＜尿中アルブミン測定＞
尿中のアルブミンは，ExocellのAlbumin定量ELISA kitであるAlbuwellを用い，製品プロトコールに従い測定を行った。得られた値は，尿中クレアチニン値で補正し，U-Albumin値として算出した。
【００２２】
＜タンパク尿スコア＞
タンパク尿スコアは，尿中総タンパク質濃度／尿中クレアチニン濃度の比で算出した。尿中総タンパク質濃度は，Bradford 法を用いて測定した。尿中クレアチニン値は，クレアチニン測定キットを用いプロトコールに従い測定を行った。
【００２３】
＜血清クレアチニン＞
血液は，ジエチルエーテル麻酔下でマウスの下大静脈より約500μLを採取した。その後，遠心（3,000 rpm，15分，4℃）を行い，得られた血清を-80℃で保存し，試料とした。Serum Creは富士ドライケムを用い，プロトコールに従い測定した。
【００２４】
＜パラフィン切片の作成＞
マウスより腎臓を摘出後，10%ホルマリン溶液中で3日間ローテートし，固定した（ホルマリンは24時間毎に新鮮なものに交換した）。ホルマリン固定後，PBS (-) により洗浄し，EtOH，JFCを用いて脱水した。次に，HISTOS5によってパラフィン置換を行い，Leica EG1160を用いてパラフィンブロックを作製した。パラフィンブロックは4℃で保存した。作製したパラフィンブロックはLeica RM2125RTを用いて薄切を行い，マスコートガラス（マツナミ）に乗せ12時間37℃で乾燥し，切片を作製した。
【００２５】
＜PAS染色＞
腎切片はキシレン用いて脱パラフィン操作を行い，その後エタノールを用いて脱キシレン操作を行った。PAS染色はPeriodic Acid Shiff stainingキットを用いて行い，ヘマトキシリン染色によって核染色を行った。PAS染色後，切片はエタノール，キシレンによって段階的に脱水，透徹を行い，カナダバルサムによって封入した。染色画像はKeyenceによって撮影した。
【００２６】
＜Masson’s Trichrome 染色＞
腎切片はキシレンを用いて脱パラフィン操作を行い，その後エタノールを用いて脱キシレン操作を行った。その後Bouin’s solutionにより，室温で14時間固定した。染色はMasson’s Trichrome 染色キットを用い，プロトコールに従って行った。核染色はヘマトキシリンを用いた。Masson’s trichrome染色後，切片は脱水，透徹を行い，カナダバルサムによって封入した。染色画像はBiorevo（Keyence）によって撮影した。
【００２７】
＜免疫化学染色 (WT1, F4/80, PCNA)＞
パラフィン切片を脱パラフィン，脱キシレン処理後，1% Triton in TBSに30分間浸し，クリーニングを行った。その後，抗原賦活化のためクエン酸緩衝液（pH 6.0）に浸し，98℃で20分間加熱した。その後20分間静置した後，切片を取り出し，内因性ペルオキシダーゼ除去のため，3% H2O2 in methanol溶液に浸し，15分間室温で反応させた。その後，湿潤箱内でBlocking solution（DAKO）を組織に乗せ，30分間室温でブロッキングを行った。TBS-tweenで洗浄後，F4/80，PCNA抗体を Antibody diluent（DAKO）で1:100に希釈し，一晩反応させた。TBS-tweenで洗浄後，その後2次抗体として，HRP-conjugated 抗体を0.3% Triton-X in PBSにより1:500に希釈し，40分間室温で反応させた。TBS-tweenで洗浄後，3,3’-Diaminobenzidine tetrahydrochloride（DAB）solution（DAB 10mg，0.05M Tris-Buffer（pH 7.6），30% H2O2 5μL）を10分間室温で反応させ呈色させた。カウンター染色にはヘマトキシリン（Gill3）を用いた。染色終了後，脱水，透徹，封入を行い，Biorevo（Keyence）によって撮影・解析を行った。
【００２８】
＜凍結切片＞
マウス腎凍結ブロックは解剖摘出後の新鮮なマウス腎臓を半割し，クリオモルド内でOCT compound（サクラファインテック）に浸し，液体窒素により急速凍結した。腎凍結ブロックはクライオスタットにより，4μmに薄切し，凍結切片とした。
【００２９】
＜免疫蛍光染色（Nephrin）＞
腎凍結切片は作成後すぐに氷冷したアセトン溶液に-20℃で5分間浸し，PBS洗浄後，更に4% Paraformaldehydeで10分間 4°Cでインキュベーションすることで固定した。その後，湿潤箱内で3 % BSA/PBSにより室温で1時間ブロッキングした。PBSによる洗浄後，3 % BSA/PBSで1:50に希釈した各1次抗体を室温で1時間反応させた。更にPBS洗浄後，PBSにより1:500に希釈した蛍光標識2次抗体（Alexa fluor antibody）を室温で45分間反応させた。その後，DAPI solutionにより核染色を行い，Vector shieldで封入し，Biorevo（Keyence）によって撮影・解析を行った。
【００３０】
＜マウスからのRNA回収＞
マウス組織はRNA安定性保持のため，RNA laterに浸し，4℃，12時間,ローテートを行った後，RNA laterを除き，-80℃で保存した。組織は解凍後，冷却したPBS（-）を用いて洗浄し，1.5 mL tubeに入れた。その後，RNA iso Plusを1mL加え，臓器を眼科ばさみにて細切後，ホモジナイザーによってホモジナイズを行った。室温に5分間静置し，クロロホルム 0.2 mLを加え，よく撹拌した。以下，培養細胞と同様にRNA回収を行った。RNA回収後RNA濃度を測定し，DNaseをプロトコールに従って処理，更にフェノール／クロロホルム法，エタノール沈殿法によってRNAのみを精製した。RNAペレットはDEPC処理水によって溶解し，その後の実験に用いた。
【００３１】
＜Real-time RT-PCR＞
マウス組織における各遺伝子の発現量を検討するためにReal-time RT-PCR（iQ5 リアルタイム PCR 解析システム）を行った。Real-time RT-PCRにはRT反応用にPrime Script RT reagent kitを，PCR反応用にSYBR Premix Ex Taq IIを用いた。概略を示すと，培養細胞およびマウス組織から抽出した total RNA 0.25gを鋳型とし，Oligo dT primerを用いて逆転写反応（37℃ 30分，85℃ 10秒）を行った。その後，各遺伝子mRNA 増幅用の5’-primer および 3’-primer を用いてPCR反応を（94℃ 2分 1サイクル，94℃ 30秒および 60℃ 30秒 40サイクル，72℃ 5分 1サイクル）を行った。なお，internal controlとして18S rRNAのPCR反応を同時に行った。標的PCR産物の定量は，Comparative CT法（CT法）により行った。
【００３２】
＜マウス組織からのタンパク質抽出＞
マウス組織は摘出後，液体窒素に入れ急速凍結し，-80℃で保存した。解凍後，組織に冷PBS（-）1mLを加え，眼科バサミによって細切し，ホモジナイザーによってホモジナイズした。その後，遠心分離（12,000rpm，4℃，5分間）により上清を除去し，RIPA buffer を400μL加え更にホモジナイズした。氷上で２時間静置し，遠心分離（15,000 rpm，4℃，10分間）を行い，上清をタンパク質溶液として回収した。タンパク質濃度は，BCA法によって定量した。
【００３３】
＜Western blotting＞
マウス腎組織から抽出した各タンパク質をサンプルとして用い，Western blotting 法を行った。まず，ポリアクリルアミドゲルを作製し，SDS-PAGE を行った後，PVDF膜への転写を250mAで2時間行った。転写の確認はponceau染色により行った。Ponceau染色の方法は，転写後のPVDF膜をponceau S 溶液に浸し，5分間 incubateし,滅菌水で2回 wash して確認する。その後，転写したPVDF膜は，0.1 % Tween 20-TBS（-）または 0.05% Tween 20-PBS（-）で希釈した 5% スキムミルクで1時間ブロッキングを行った。次に0.1 % Tween 20-TBS（-）または 0.05% Tween 20-PBS（-）で PVDF 膜を 3回洗浄し，1 次抗体反応（室温）を行った。1次抗体反応後，0.1 % Tween 20-TBS（-）または 0.05% Tween 20-PBS（-）で 3回洗浄し，2次抗体反応（室温）を行った。2 次抗体反応後，0.1 % Tween 20-TBS（-）または 0.05% Tween 20-PBS（-）で PVDF 膜を 3回洗浄し，Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate または，Immuno-star発光試薬を処理し，LAS-4000 mini（FUJIFILM）によって抗体反応を検出した。HRP 標識2 次抗体は全て Jackson Immuno Reserch Laboratoriesで購入した。
【００３４】
＜＜実験例１，ASモデルマウスにおける腎糸球体のプロテオミクス解析＞＞
ASモデルマウスの腎糸球体についてプロテオミクス解析を行い，各種分子の発現を調べることにより，ASにおける病態メカニズムの解明を目的に検討を行った。
【００３５】
１．結果を図１に示す。
(1)  LC-MS/MSの分析により，ASでは，WTと比較して，いくつかの代謝経路に関する分子が過剰に発現していることが分かった。
(2)  さらにパスウェイ解析により，ASでは，WTと比較して，いくつかの代謝経路が過剰に促進されていることが分かった（Complex I biogenesis，Respiratory electron transport，Respiratory electron transport, ATP synthesis by chemiosmotic，The citric acid（TCA） cycle and respiratory elctron transport）。
２．これより，ASの腎糸球体において，細胞内代謝関連分子の発現変動が引き起こされていることが分かった。
【００３６】
＜＜実験例２，メトホルミンによるAS腎機能への影響＞＞
腎糸球体における代謝調整を行う薬物の一つとしてメトホルミンを用い，AS腎機能にどのような影響を及ぼすかを調べることを目的に検討を行った。
【００３７】
１．結果を図３に示す。
(1)  タンパク尿について，メトホルミン投与群は，コントロールと比較して，尿中タンパク量は一貫して少なく，18週齢以降では，有意に少なかった（図３Ａ）。また，メトホルミン投与群は，ロサルタン投与群と比較すると，一貫して高い値であった。
(2)  尿中アルブミンについて，メトホルミン投与群は，ロサルタン投与群ほどではないものの，コントロールと比較して，有意に低い値であった（図３Ｂ）。
(3)  血清クレアチニンについて，メトホルミン投与群は，コントロールと比較して，有意に低い値であり，ロサルタン投与群ならびにWTと同等の値であった（図３Ｃ）。
２．これらの結果から，メトホルミンは，ASにおける腎機能低下を抑制することが分かった。
【００３８】
＜＜実験例３，メトホルミンによるAS腎組織障害への影響＞＞
メトホルミンがASにおける腎組織障害へどのような影響を及ぼすかを調べることを目的に検討を行った。
【００３９】
１．免疫染色の結果を，図４に示す。
(1)  PAM染色において，メトホルミン投与群では，コントロールと比較と比較して，強く染まっていた。また，メトホルミン投与群は，ロサルタン投与群と比較しても強く，WTと同程度，染まっていた。
(2)  マッソントリクローム染色において，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して，その染色は弱いものであった。また，メトホルミン投与群は，ロサルタン投与群と比較しても，その染色は弱いものであった。
(3)  マクロファージマーカーであるF4/80染色において，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して，ほとんど染まっていなかった。また，メトホルミン投与群は，ロサルタン投与群と比較して，同程度，染まっていた。
【００４０】
２．また，マクロファージ浸潤について，F4/80で染色された陽性領域を算出した結果，メトホルミン投与群は，コントロールと比較して有意に低い値を示し，ロサルタン投与群と同程度の値であった。
３．さらに，マッソントリクローム染色より陽性領域を繊維化スコアとして算出した結果，メトホルミン投与群は，コントロールと比較して有意に低い値を示し，ロサルタン投与群よりも低い値であった。
【００４１】
４．これらの結果から，メトホルミンは，ASの腎組織障害を抑制していることが分かった。
５．また，ASの腎組織障害抑制効果は，ロサルタンと同等程度と考えられ，パラメーターによっては，それ以上の効果を有することが分かった。
【００４２】
＜＜実験例４，メトホルミンによる各種炎症・繊維化関連遺伝子への影響＞＞
ASにおいて，メトホルミンが各種炎症・繊維化関連遺伝子の発現への影響を調べることを目的に検討を行った。
【００４３】
１．炎症性サイトカインに関する結果を図５に示す。
(1)  IL-6について，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して有意に低い値であり，ロサルタン投与群よりも低い値であった。
(2)  IL-1βについて，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して有意に低い値であり，ロサルタン投与群よりも低い値であった。
(3)  KC（IL-8）について，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して有意に低い値であり，ロサルタン投与群と同等の値であった。
【００４４】
２．繊維化関連分子に関する結果を図６に示す。
(1)  Mmp12について，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して有意に低い値であり，ロサルタン投与群と同等の値であった。
(2)  Mmp9について，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して有意に低い値であり，ロサルタン投与群よりも低い値であった。
(3)  Tgf-βについて，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して有意に低い値を示し，ロサルタン投与群と同程度の値であった。
(4)  α-Smaについて，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して有意に低い値を示し，ロサルタン投与群よりも低い値であった。
【００４５】
３．これらの結果より，メトホルミンは，ASにおいて変動する各種炎症・繊維化関連遺伝子の発現を抑制することが分かった。
４．また，メトホルミンの抑制効果は，ロサルタンと同等程度と考えられ，パラメーターによっては，ロサルタンを超える効果を示すことが分かった。
【００４６】
＜＜実験例５，メトホルミンによるAS腎糸球体障害への影響＞＞
メトホルミンがASにおける腎糸球体障害へどのような影響を及ぼすかを調べることを目的に検討を行った。
【００４７】
１．結果を図７に示す。
(1)  WT1染色において，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して強く染まっており，ロサルタン投与群と同程度，染まっていた。
(2)  Nephrin Nuclei染色において，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して強く染まっており，ロサルタン投与群と同程度，染まっていた。
(3)  PCNA染色において，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して，その染色は弱く，ロサルタン投与群と同程度であった。
【００４８】
２．また，WT1染色をもとに，糸球体当たりのポドサイト数の算出を行ったところ，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して，大きな値であり，ロサルタン投与群と同等の値であった。
３．さらに，PCNA染色をもとに，糸球体当たりの細胞増殖数の算出を行ったところ，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して小さな値であり，ロサルタン投与群と同等の値であった。
【００４９】
４．これらの結果から，メトホルミンは，ASにおいてポドサイト障害を抑制するとともに，糸球体細胞の増殖を抑制していることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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