(57)【要約】      （修正有）【課題】うつ及び／又は不安症の状態を知るためのバイオマーカー等を提供すること。【解決手段】2H-テトラゾール，2-アセチル-（2H-Tetrazole,2-acetyl-）、ジメチルスルホン（Dimethylsulfone）、ベンゼン，（2-イソチオシアネートエチル）-（Benzene,(2-isothicyanatoethyl)-）、ヘキサン酸（Hexanoic acid）及びプロパン酸，2-メチル，3-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチルペンチルエステル（Propanoicacid,2-methyl,3-hydroxy-2,2,4-trimethylpentyl ester(Texanol)）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物をうつ及び／又は不安症の非侵襲性バイオマーカーとして検出する。【選択図】図３
2019082367.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2H-テトラゾール，2-アセチル-（2H-Tetrazole, 2-acetyl-）、ジメチルスルホン（Dimethyl sulfone）、ベンゼン，（2-イソチオシアネートエチル）-（Benzene, (2-isothicyanatoethyl)-）、ヘキサン酸（Hexanoic acid）及びプロパン酸，2-メチル，3-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチルペンチルエステル（Propanoic acid, 2-methyl,3-hydroxy-2,2,4-trimethylpentyl ester (Texanol)）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含むことを特徴とするうつ及び／又は不安症の非侵襲性バイオマーカー。
【請求項２】
（１）被験者由来の尿検体を採取する採取ステップ、（２）前記尿献体から、2H-テトラゾール，2-アセチル-（2H-Tetrazole, 2-acetyl-）、ジメチルスルホン（Dimethyl sulfone）、ベンゼン，（2-イソチオシアネートエチル）-（Benzene, (2-isothicyanatoethyl)-）、ヘキサン酸（Hexanoic acid）及びプロパン酸，2-メチル，3-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチルペンチルエステル（Propanoic acid, 2-methyl,3-hydroxy-2,2,4-trimethylpentyl ester (Texanol)）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を検出する検出ステップを備えるうつ及び／又は不安症の非侵襲性検査方法。
【請求項３】
更に、（３）前記検出ステップの結果に基づき、前記被験者について、うつ及び／又は不安症の症状を判定する判定ステップを設けた請求項２に記載のうつ及び／又は不安症の非侵襲性検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト尿中におけるうつ、不安症バイオマーカーなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
WHOのニュースによれば、うつ病や不安症は毎年１兆ドルの経済的損失を生んでおり、これらの疾患の予防や治療法開発に投資することにより4倍の経済的リターンが得られると言われている。更に、WHOの調査によると、世界で2100万人以上が罹患する統合失調症患者は、心疾患・代謝・感染症による死亡率が2〜2.5倍高いと示している。また、厚生労働省による2014年の患者調査によると、総患者数に対する神経精神疾患患者数の割合が8%と高く、高脂血症、心疾患、悪性新生物、呼吸器疾患、脳血管疾患を追い抜き、糖尿病に次いで第2位である。以上のことから、うつ病、不安症、統合失調症を対象とした創薬の開発、及び簡便な創薬のin vivoスクリーニングに利用できる非侵襲性バイオマーカーは重要な課題となっている。そのような研究開発として、例えば特許文献１〜特許文献３に示すものがある（先行技術文献については、末尾にまとめて示す）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、上記研究開発は、十分なものとは言えず、更なる研究の余地が残されていた。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、うつ、不安症の非侵襲性バイオマーカー等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、鋭意努力の結果、高齢者ヒト尿中の揮発性有機化合物（VOC）を検索したところ、所定の化合物が認められる場合には、うつ及び／又は不安症に罹患する可能性が有意性を伴って高まることを見出し、基本的には本発明を完成するに至った。
こうして、上記目的を達成するための発明に係るうつ及び／又は不安症の非侵襲性バイオマーカーは、2H-テトラゾール，2-アセチル-（2H-Tetrazole, 2-acetyl-。以下、「化合物Ａ」ということあり。化学式１）、ジメチルスルホン（Dimethyl sulfone。以下、「化合物Ｂ」ということあり。化学式２）、ベンゼン，（2-イソチオシアネートエチル）-（Benzene, (2-isothicyanatoethyl)-。以下、「化合物Ｃ」ということあり。化学式３）、ヘキサン酸（Hexanoic acid。以下、「化合物Ｄ」ということあり。化学式４）及びプロパン酸，2-メチル，3-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチルペンチルエステル（Propanoic acid, 2-methyl,3-hydroxy-2,2,4-trimethylpentyl ester (Texanol)）。以下、「化合物Ｅ」ということあり。化学式５）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含むことを特徴とする。
【０００５】
【化１】
2019082367.tif 000003
【０００６】
【化２】
2019082367.tif 000004
【０００７】
【化３】
2019082367.tif 000005
【０００８】
【化４】
2019082367.tif 000006
【０００９】
【化５】
2019082367.tif 000007
【００１０】
また、別の発明に係るうつ及び／又は不安症の非侵襲性検査方法は、（１）被験者由来の尿検体を採取する採取ステップ、（２）前記尿献体から、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ及び化合物Ｅからなる群から選択される少なくとも一つの化合物を検出する検出ステップを備えることを特徴とする。このとき更に、（３）前記検出ステップの結果に基づき、前記被験者について、うつ及び／又は不安症の症状を判定する判定ステップを設けることが好ましい。
上記化合物のうち、化合物Ｅは、フレイル期のごく初期の抑うつ状態のスクリーニングに特に有効である。また、化合物Ｂ及び化合物Ｄは、うつに悩む者の深刻度を数値的に評価できる。
なお、上記（２）検出ステップで得られた結果に基づいて行われる（３）判定ステップについては、検出ステップで得られたデータを参考として、医師等の有資格者の判断を加えて、総合的に判定することが好ましい。
本発明において、不安とは、一般的に安心できず、気がかりな状態を意味し、不安症とは、過剰な不安を有するいくつかの異なる種類の精神障害を含んだ総称を意味する。広場恐怖症は、不安症に含まれる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、うつ及び／又は不安症の状態を知るためのバイオマーカーを提供できる。被験者から得た尿中のバイオマーカーを検出することにより、被験者の病態を確認したり、バイオマーカーの量を判断基準として、創薬スクリーニングに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒト尿中のVOCの全イオン電流（TIC）を解析したときの代表的なGC-MSクロマトグラムである。  （ａ）は，うつ，不安症を罹患していないヒトの尿中のVOCを，（ｂ）は罹患しているヒトの尿中のVOCを示した典型的な図である。図中のピークに付した番号１〜３２は，それぞれ同じ化合物を示している。
【図２】2群間において、尿中VOC量が異なる受信者動作特性（ROC）曲線を示すグラフである。Ａ．化合物Ａ、Ｂ．化合物Ｂ、Ｃ．化合物Ｃ、Ｄ．化合物Ｄ及びＥ．化合物Ｅを意味する。ROC曲線の曲線下面積（AUC）は、パラメータが、２つの群（うつ病群／健常者群）間において、どの程度の違いを評価できるかを示す。ROC曲線においては、真の陽性率（100%感度）は、偽陽性率（100%特異度）の関数としてプロットされている。化合物Ｅは、バイオマーカーとして最も有効であり、化合物Ｃと化合物Ｄは、次に有効なバイオマーカーであった。表５には、化合物Ｃ及び化合物Ｅについては、偽陰性が認められなかったことを示した。
【図３】VOCと相関計数の絶対値が0.6より大きな（｜r｜＞0.6）コホートアセスメントに関するピアソン相関を示すグラフである。  XY軸に関し、VOCの絶対的m/z値とコホート項目との相関をうつ病及び／又は広場恐怖症を持つ者と持たない者とについて、ピアソンr及びマン・ホイットニーＵ検定によって分析した結果を示す。（X，Y）として、Ａは、HAMDについての化合物Ａ；Ｂは、SDSについての化合物Ｂ；Ｃは、HAMDについての化合物Ｂ；Ｄは、自己レポートによるDSBCについての化合物Ｄ；Ｅは、HAMDについての化合物Ｄ；Ｆは、CL基本についての化合物Ｅ；Ｇは、HAMDについての化合物Ｅをそれぞれ示している。Ａ，Ｃ及びＥでは、14番（青）を含む8名か否か（黒）の9名のうつ，不安症を及び，健常者9名の被験者について、ピアソンr、p値及び線形回帰式を示した。14番を含んだ回帰式（A : Y=37195*X+733666, C : Y=144580*X+1152000, E : Y=-12693*X+456291）では、含まない回帰式に比べ、相関係数rはいずれも小さかった。
【図４】二次判別関数による分析によって、高齢者の大うつに関連するVOCを群分けした後に、うつ病群と健常者群との間で比較を行った結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。
【００１４】
＜試験方法＞
１．被験者集団
コホート研究において、尿が保存された症例試験の対象者を被験者集団とした。コホートは、東京都板橋区内に在住の女性（374名）と男性（265名）を含む639名の集団からなり、年齢は66歳〜88歳であった。コホートの対象は、東京都健康長寿医療センターにおいて、2015年10月1日〜同7日にかけて「お達者検診」として行われた。この検診は、身体的検診・心理的検査及びアンケートを含んでおり、フレイル（虚弱：frailty）の分類として実施された。評価には、基本チェックリストスコア（CLスコア）（非特許文献１：Kera et al., 2017）、老研スコア（非特許文献２：古谷野ら 1986, 非特許文献３：Shibata et al., 2000）、JST老研スコア（非特許文献４：Iwasa et al., 2015）、うつ病スケール基本チェックリスト（DSBC）（非特許文献５：Fujisawa et al., 2005）及びツァン自己評価式抑うつ性尺度（非特許文献６：Zung Self-Rating Depression Scale；Zung, 1965）を用いた。本研究は、東京都健康長寿医療センター、京都産業大学及び東邦大学によって実施された。
【００１５】
２．フレイル及び抑うつの評価
基本チェックリストは、フレイルの進展を評価するための標準的なアンケートであり、自己によるレポートを含む（非特許文献７：Satake et al., 2016）。基本チェックリストには、生活習慣・体力・栄養及び食生活を含む25項目のアンケートと5項目の抑うつのサブドメインで構成されている。参加者は、各項目について「はい」または「いいえ」と回答する。ここで、基本チェックでは、潜在的なフレイルの可能性を示す回答を推測できないので、予防的なケアを受ける。基本チェックリストのCLスコアは、抑うつに関する5個のサブドメインの質問を除外した（非特許文献２０：Kera et al., 2017）。一方、基本チェックリスト中の抑うつのサブドメインは、自己報告と他者による報告による評価方法を用いたDSBCによって分析した（非特許文献５：Fujisawa et al,.2005）。老研スコアは、フレイルの進展を評価するためのものであり、他者による報告を含むアンケート形式となっており、世界中で受け入れられている（非特許文献２：Koyano et al., 1986, 非特許文献３：Shibata et al., 2000）。
【００１６】
老研スコアは、自信・知性・社会参加を含む13項目のアンケートで構成されている。参加者は、「はい」または「いいえ」と答えることにより回答し、予防的ケアは受診しない。10未満のスコアは、生命機能の低下を示す。JST老研スコアは、フレイルの進展を評価するためのアンケートであり、他者によるレポートを含み、最近の生活環境や生活様式の変化に応じた項目を含む老研スコアを修飾したものである（非特許文献４：Iwasa et al et al., 2015）。JST老研スコアは、16項目のアンケートからなり、新しい装置の使用・知性・人生管理に関する設問と、社会参加に関する4項目のサブドメインを含む。参加者は、「はい」または「いいえ」と答えることにより回答し、質問に対して予防的ケアは受診しない。
【００１７】
ツァン自己評価式抑うつ性尺度（SDS）は、20項目のアンケート形式であり、各項目は4点満点で評価される。更に、質問に対しては、潜在的な必要性を示す回答を推測することができないので、予防的ケアを受診する（非特許文献６：Zung, 1965）。50を超えるスコアについては、一般に抑うつの傾向を示す。一方、Berryらは、高齢者は体格の項目を尺度に含めるため、若者よりも高いスコアを取る傾向があると報告している（非特許文献２１：Berry et al., 1984）。フレイルを評価するための上記報告は、うつ病の可能性を持つ候補者を抽出する結果となった。9人の被験者について、基礎的な精神医学的方法によって、神経精神医学的な状態を調べた。
【００１８】
より詳細には、2名は大うつと広場恐怖症の両方に苦しんでおり、5名は大うつの障害に、もう1名は広場恐怖症に苦しんでいる。更に、9名の陽性者について、21項目のハミルトン抑うつ評価尺度（GRID-Hamilton Rating Scale for Depression (HAMD)）を用いて再度評価した。この尺度は、抑うつの重篤度を評価するための標準的なものである（非特許文献８，９：Hamilton, 1960, 非特許文献２２：Tabuse et al., 2007：非特許文献１０：Edelstein et al., 2010）。行動的に連結された各質問項目のそれぞれは、0〜3点で評価され、総スコアが計算される。総スコアは0〜63点の範囲となり、高いスコアの場合は、重度の大うつを示す。加えて、陰性対照として、9名の被験者（健常者）を抽出した。
【００１９】
３．尿の保存
被験者から尿を採取し、尿比重（アタゴ・ポケット屈折計PAL-09S）と10種のデータ（グルコース、タンパク質、ビリルビン、ウロビリノーゲン、pH、血液、ケトン、亜硝酸塩、白血球、クレアチニン及び色）をマルチ・パラメトリック・テスト・ストリップ（アークレイ株式会社製、AUTIONスティック10PA）を用いて計測し、ポケット・ケム（アークレイ株式会社製）によりデジタルデータとして保存した。尿を収集後30分以内に液体窒素下で凍結した。尿中クレアチニン濃度は、ヤッフェ法（Jaffe法、非特許文献１１：Bonsnes and Taussky, 1945）に基づくラボ・アッセイ・クレアチニン・比色定量キット（和光純薬工業株式会社）により測定した。
【００２０】
４．固相マイクロ抽出による揮発性有機化合物（VOC）の抽出
尿は氷上において、2mLガラスバイアル中に200μLずつに分注した上で、磁気金シール（ブラック・ビトン・セプタム厚さ1mmデュロメータ（シグマアルドリッチ社製）により封印し、65℃で15分間消毒した。尿処理用の固相マイクロ抽出（SPME）繊維として、花井ら（非特許文献１２）が報告しているものと同じタイプのもの（2cm 50／30μM DVB／CAR／PDMS（ジビニルベンゼン／カルボキセン／ポリジメチルシロキサン。米国スペルコ社製）を用いた。次いで、18個の尿サンプル（患者9名分、健常者9名分）を分析した。バイアル中の尿中VOCをヘッドスペースSPME法で抽出した。このとき、SPME繊維を240℃で20分間前処理し、尿を含むバイアルのヘッドスペースに挿入し、ヘッドスペース中のVOCをSPME繊維により45℃で60分間抽出した。
【００２１】
５．ガスクロマトグラフィ及びマススペクトロメトリ（GC-MS）
VOCをガスクロマトグラフィ・四重極マススペクトロメトリ（GC-MS：QP-2010Ultra（島津社製））によって解析した。VOCを含むSPME線維をGCの注入口に挿入し、240℃にて30分間脱着させた。注入口は240℃の一定温度とし、スプリットレス注入法にて3分間パルスした。GC-MS装置には30メートルのHR-20Mカラム（カラム内直径0.32mm、フィルム厚さ0.5μm（信和化工株式会社製））を使用した。質量分析装置の前に用いたクロマトグラフィ分析条件は、次の通りであった。40℃にて10分間保持し、1分間あたり5℃の昇温条件で240℃まで熱を掛けた後、240℃にて10分間保持した。ヘリウムガスを60cm／秒の定速で流した。質量分析装置の処理パラメータは次の通りであった。イオン源温度200℃、インターフェース温度240℃、イオン化エネルギー70eV、スキャン頻度は35m/z〜300m/zまでを1回あたり0.2秒とした。ピークの特定は、NIST14標準参照データベース（NIST／EPA／NIHマス・スペクトル・ライブラリ（Wiley10））を用いて、標品の保持時間との比較によって行い、VOCの標準品によって確認した。
【００２２】
６．化合物
標準化合物として、次のものを用いた。すなわち、ジメチルスルホン（dimethyl sulfone。定量NMRのための99.9％純品、カタログ番号41867（シグマ社））；ベンゼン-2-イソチオシアネートエチル（benzene 2-isothiocyanatoethyl。純度97％以上、カタログ番号P0986（東京化成工業株式会社））；1-ブテン4-イソチオシアネート（1-butene 4-isothiocyanate。純度96％以上、カタログ番号I0443（東京化成工業株式会社製））；ヘキサン酸（hexanoic acid。純度98％以上、カタログ番号H0105（東京化成工業株式会社））；プロパン酸（propanoic acid）、2-メチル-（2-methyl-）、3-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチルペンチルエステル（3-hydroxy-2,2,4-trimethylpentyl ester。テキサノール（texanol）、カタログ番号40366（アルファ・アエサル社）；N-アルカン（n-alkane、C9-C40：50μg／mL； C10, 20, 30および40： 100μg／mL、カタログ番号1021-58321（ジーエルサイエンス社））であった。
７．その他
血中クレアチニン（mg/dL）は、ヤッフェ法（非特許文献１１）によって測定した。
【００２３】
８．統計
統計データは、平均±標準誤差（mean±SEM）として示した。危険率5％以下（p≦0.05）を統計的に有意とみなした。うつ病及び／又は広場恐怖症の症状を持つ者を健常者から分離する目的で各VOCの正確性を求めるために、Excel及びGraphPad Prism 6（有限会社エムデーエフ）を用いて、受信者動作特性曲線（Receiver Operating Characteristic（ROC））分析を行った。分析結果を図２に示した。XY表について、尿VOC量とコホート分析の結果との相関を、Excel及びGraphPad Prism 6を用いて、ピアソンｒ（Pearsonr）及びマンホイットニーU検定（Mann-Whitney U-検定）（ExcelおよびPrism 6）によって分析した。結果を図３に示した。
【００２４】
うつ病ではない者と比較して、うつ病患者を最も上手く予測できるVOCを分類するために、ExcelとKyPlot 5.0（株式会社カイエンス）を用いて、判別関数分析を行った。まず、表１に示す5個のVOCについて、線形判別関数による分類を行ったところ、共分散行列の等価性についてのボックスM検定では、共分散が有意に異なっていた。
【００２５】
＜試験結果＞
お達者検診に参加した639名の高齢者のうち、うつ病及び／または広場恐怖症を罹患する9名の患者を認めた。また、お達者検診に参加した者から、9名の健常者を選択した。各被験者の尿から揮発性有機成分（VOC）を抽出し、活動指標・抑うつ関連評価及び腎臓関連検査を行った結果、高齢者のうつ病に関連するVOCを決定した。
【００２６】
１．フレイル及びうつ病の評価
フレイルの分類に関する活動指標のうちで、2倍以上の活動増加を示した基本チェックリスト（CL）スコアのみが、うつ病及び／又は広場恐怖症と関連した。一方、老研スコアとJST老研スコアは、うつ病及び／又は広場恐怖症と関連しなかった（表１）。
【００２７】
【表１】
2019082367.tif 000008
【００２８】
老研スコアとJST老研スコアは社会的な生活に関連する傾向がある一方、CLスコアは個人的な生活に関連するので、CLスコアの方が、抑うつ症状に関連する可能性が高いのかも知れない。更に、個人的に抑うつ症状に悩み、活動性が低下することで、フレイルが進展し、CLスコアが上昇する可能性がある。抑うつ症状及び／又は広場恐怖症に悩む者は、他者によるレポートDSBCでは2.7倍の増加を、自己レポートによるDSBCでは5.3倍の増加を示すとの報告がある。他者によるレポートは、状況やインタビュアーに依って被験者の活動態様に影響を与えるように見えることがあるため、他者によるレポートを使用する場合には、スコア感度が低下することがある（非特許文献１０：Edelstein, et al., 2010）。うつ病及び／又は広場恐怖症の有無にかかわらず、自己評価尺度（SDS）については、ほとんど差違はなかった。一般に高齢者は身体的にも弱っており、高齢者のSDSは若年者のSDSよりも高い傾向があることから、健康な高齢者においてもSDSが高い傾向を示したのかも知れない（非特許文献２１：Berry et al., 1984）。
【００２９】
うつ病及び／又は広場恐怖症の有無にかかわらず、参加者中の血中及び尿中クレアチニン値又は尿比重には殆ど差がなかった（表１）。これに対し、尿中クレアチニン排泄量は代謝による産生量とほぼ等しいが、クレアチニン・クリアランスは、食品の副作用、発熱及び運動などによって高くなる傾向がある（非特許文献１３：Boron and Boulpaep, 2008）。クレアチニン・クリアランスは、（一回の尿量ではなく）一日に採取される尿量によって決定される。しかしながら，今回は健診であるため、一度しか採取できなかった。それゆえ、一回の尿に含まれるクレアチニン量を体重で割った値を暫定的に計算した。その結果、うつ病及び／又は広場恐怖症の有無にかかわらず、体重あたりの尿中クレアチニン量について、差違はなかった。このデータは、VOCを測定する元となる尿は、糸球体濾過率に差のないヒトからの採取した尿であることを示している。
【００３０】
２．うつ病及び／又は広場恐怖症を持つ者と健常者との間の尿中揮発性有機成分（VOC）の比較
うつ病及び／又は広場恐怖症を持つ9名の患者と9名の健常者を含む18名から得られた尿をSPMEで処理した後、GC-MSによって解析した。全イオンクロマトグラム（TIC）を測定し（図１）、各TICについて、NIST14標準参照データベースを用いることで、m/zのピークを特定した。18名の尿から157個のVOCが特定された。自動波形処理と、マニュアルでの波形修正を組み合わせて、各TICの面積を算出した。次いで、次の(1)〜(3)の手順に従って、うつ病及び／又は広場恐怖症の患者と健常者との間で相違する領域でのTICを抽出した。(1)うつ病及び／又は不安者、又は健常者の尿から得られたピークについて、100,000以上の面積を持つTIC、(2)うつ病及び／又は不安者については、少なくとも3名以上の尿から抽出されたTICを特定した、(3)うつ病及び／又は不安を抱えた者の尿から得られたTIC面積の平均は、健常者のものと比較して、1.5倍以上又は0.7倍未満の面積として測定された。
【００３１】
健常者の尿と、うつ病及び／又は不安を抱えた者の尿とから抽出されたTICにおいて、面積の相違が認められたVOCを選択し、各TICについてm/zを計算したところ、うつ病及び／又は不安を持つ者の尿中の化合物Ａ、化合物Ｂ及び化合物Ｃは、健常者の尿に比べて、それぞれ1.3倍（片側マン・ホイットニーＵ検定において、p=0.0470）、2.0倍（片側検定において、p=0.0385）及び11.2倍（両側検定において、p=0.0078）であった（表２及び表３）。更に、うつ病及び／又は不安を示す者の尿と健常者の尿との間の差分m/zを抽出するために、非線形のリテンションタイム・アラインメント、マッチト・フィルタリング、ピーク検出及びピークマッチングを組み込んだRコマンド（Smith et all, 2006）を用いてxcmsを導入した結果、ヘキサン酸（hexanoic acid）及びプロパン酸・2-メチル・3-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチルペンチルエステル（propanoic acid, 2-methyl,3-hydroxy-2,2,4-trimethylpentyl ester：texanol）が重要な相違を示した。
次いで、これらのVOCのm/zの面積を計算したところ、ヘキサン酸はうつ病及び／または不安を抱える者の尿中では1.4倍に減少し（両側マン・ホイットニーＵ検定でp=0.0106）、texanolはうつ病及び／または不安を抱える者の尿中では1.2倍（両側検定でp＜0.0001）に増加した（表２及び表３）。
【００３２】
【表２】
2019082367.tif 000009
【００３３】
【表３】
2019082367.tif 000010
【００３４】
上記第００３０段落における(1)〜(3)の手順は、尿中2,2,4-Trimethyl-1,3-pentanediol diisobutyrate (TXIB; CAS NO.6846-50-0, hydroarbon)については、使用できなかったため、当初，うつ病及び／又は広場恐怖症の患者と健常者との間の尿中TXIBの相違は調べていなかった。そこで，うつ病及び／又は広場恐怖症の患者と健常者との間の尿中TXIBについて，再度詳細に調べた。患者尿中のTXIB(平均+標準誤差=409732+12109)は、健常者の尿中TXIB(平均+標準誤差=345878+10438)に比べて、有意差を持って(**p = 0.0040 in two-tailed)、1.18倍に増加していた。テキサノールとTXIBの構造は非常に類似しており，うつ病を持つマウスとヒトの尿中で増加していることがわかったことから、マウスとヒトでは，テキサノールとTXIBを処理するある種の代謝系が共に存在すると考えられる。
標準品を用いることにより、TICに基づき4個のVOCを確定した。m/z値の平均を表２に尿中濃度（ng/ml, 平均 ± 標準誤差）として示した。化合物Ｂについて4.667 ± 0.996 ng/ml（健常者）及び9.389 ± 2.052 ng/ml（うつ病及び／又は不安）、化合物Ｃについて0.139 ± 0.040 ng/ml 及び 1.569 ± 0.805 ng/ml、化合物Ｄについて8.742 ± 0.664 ng/ml及び6.128 ± 0.630 ng/ml、化合物Ｅについて1.400 ± 0.037 ng/ml 及び1.696 ± 0.048 ng/mlであった。しかしながら、化合物Ａについては、標準品がなかったため，NISTライブラリー中で最も類似度の高い（92%）として物質名を特定した。
【００３５】
クレアチニン（CR）の調整は、１回の尿検体データに基づき、24時間の排尿の評価をするために広く使用されている（非特許文献１４：Fraser and Worth、2004; 非特許文献１５：Ohiraら、2008）。そこで、CRあたりのVOCの平均値を計算した（表４）。化合物Ｂ（片側検定において、p=0.0470）及び化合物Ｄ（両側検定においてp=0.0142）の比は、うつ病及び／又は不安を持つ者の尿と健常者の尿との間で、有意に異なっていたことから、これらのVOCの排出は尿中の濃度に関連していることが分かった。これに対し、化合物Ａ、化合物Ｄ及び化合物Ｅについては、両群間で濃度の相違は認められなかったことから、これらのVOCの排出は尿中の濃度に依らないことが分かった。揮発性脂肪酸及びその誘導体は、ヒト尿中クレアチニン・クリアランスの異なる系によって排泄される。これは，ヒトにおける揮発性脂肪酸のクリアランス及び再吸収についての諸論文より異なることが知られている（非特許文献１６：Maltby and Millington, 1986; 非特許文献１７：Morrison et al., 2004）。
【００３６】
【表４】
2019082367.tif 000011
【００３７】
３．抑うつ症状の有無に依らずに、尿中VOCによって高齢者を分類すること
もし、高齢者について、非侵襲的に簡便かつ客観的な診断によって、将来的にうつ病を発症する傾向があるかどうかを評価することができれば、うつ病の早期診断が可能となり、うつ病に基づく様々な症状の進展を評価することにより、フレイル期に楽しい生活を送ることができるようになる。表２に示す尿中VOCを評価用バイオマーカーとして使用することの可否を評価した。
まず、フィッティング可能性をROC曲線で視覚化し、曲線下面積（AUC）の値に基づく評価によって、将来的なうつ病の発症傾向を予測できるか否かについて、ROC曲線分析を行った（AUC＞0.7及び実測値＞0.7）。特に、化合物Ｃ、化合物Ｄ及び化合物Ｅについては、高度に予測可能であることが分かった（それぞれ、0.8642, 0.8519及び0.9877。図２）。更に、化合物Ｃ及び化合物Ｅについては、偽陰性（false negative）が認められなかった（表５）ことから、これらのVOCは、抑うつ状態のファースト・スクリーニング用バイオマーカーとして、非常に有用であることが分かった。
【００３８】
【表５】
2019082367.tif 000012
【００３９】
次に、VOCの絶対的なm/z値と、うつ病及び／又は広場恐怖症の有無に関する質問に対する回答との関係を調べた（表６）。関連性は、エヴァンズのガイドライン（非特許文献１８）に従って求めた。このガイドラインに依れば、相関係数の絶対値｜r｜が、0.40〜0.59では中程度、0.60〜0.79では高度、0.80〜1.00では非常に高度となっている。基本CLスコアでは、化合物Ｂはr=0.41、化合物Ｄはr=-0.46の中程度の相関、化合物Ｅはr=0.60の高度の相関を示した。老研スコアでは、化合物Ｂはr=-0.48の中程度の相関であった。JST老研スコアでは、関連性は認められなかった。各者の生活様式を評価するCLスコアは、集団に属するときの各者の生活様式を評価する老研スコアやJST老研スコアに比べて、VOCとの関連がより強いと考えられた（非特許文献７：Satake et al., 2016; 非特許文献３：Shibata et al., 2000;非特許文献４：Iwasa et al., 2015）。お達者検診において、抑うつ状態を評価するためのDSBCとSDSを用いた。他者報告によるDSBCでは、化合物Ｃがr=0.46の中程度の相関、自己報告によるDSBCでは、化合物Ａがr=0.41、化合物Ｂがr=0.44の中程度の相関、化合物Ｄがr=-0.59、化合物Ｅがr=0.66の高度の相関であった。
【００４０】
【表６】
2019082367.tif 000013
【００４１】
これに対し、自己報告によるDSBCでは、他者報告によるDSBCに比べ、うつ病及び／又は広場恐怖症について、より強くVOCとの相関を示した（表１）。他者による質問票では、状況や面接者に応じて、被験者の行動様式に影響を与える傾向があるのかも知れない（非特許文献１０：Edelstein, et al., 2010）。SDSでは、化合物Ｂがr=0.58の中程度の相関を示し、その他のVOCには殆ど相関が認められなかった。SDSの質問票には身体的な活動に関するものが含まれているので（非特許文献２１：Berry et al., 1984）、高齢者では、若年者に比べ、SDSが高くなる傾向があると指摘されている。今回の研究結果では、うつ病及び／又は広場恐怖症の有無によって、SDSは相違しなかった（表１）。これらの見解を総合すると、SDSは高齢者のフレイル期に関する症状を評価するためには、それほど効果的ではないかも知れない。
【００４２】
うつ病及び／又は広場恐怖症に悩む候補者として挙げられた9名について、HAMDを調べた結果（表１）、化合物Ｄがr=-0.63の高い相関を示した（表６）。9名の候補者について、広場恐怖症のみに悩む1名については、うつ病及び／又は広場恐怖症に悩む候補者から外して評価したところ、HAMDでは、化合物Ａがr=0.65、化合物Ｄがr=-0.76の高い相関を示し、化合物Ｂがr=0.81の非常に高い相関を示した。上記の結果により、今回特定されたVOCは、うつ病の程度を数値的に評価できることが分かった。化合物Ｅは、フレイル期のごく初期の抑うつ状態のスクリーニングに有効であった（図３E）。一方、化合物Ｂ及び化合物Ｄは、うつ病に悩む者の深刻度を数値的に評価できることが分かった（図３C及び図３E）。
【００４３】
４．二次判別関数による判別関数解析
次に、二次判別関数による判別関数解析を実施した。うつ症状を検出するためのVOCを分類するために、広場恐怖症を持つが、うつ症状を持たない者（No.14）を除いて、解析を行った。5個のVOCを用いた二次判別関数式の一例を以下に示した。更に、VOCの絶対的な質量電荷比（m/z）値、二次項（b1〜b5）、一次項（a1〜a5）及び定数項（a0）を示し、この関数式を用いて計算した数値を表７に示した。
【００４４】
【表７】
2019082367.tif 000014
【００４５】
5個のVOCを用いて定式化を行ったところ、以下の通りであった(式中のa0〜a5、b1〜b5については、表７の数字を使う）。
X = a0 + 化合物Ａ*{a1 + (b1*b1*化合物Ａ + b1*b2*化合物Ｂ + b1*b3*化合物Ｃ + b1*b4*化合物Ｄ + b1*b5*化合物Ｅ}+ 化合物Ｂ*{a2 + (b2*b1*化合物Ａ + b2*b2*化合物Ｂ + b2*b3*化合物Ｃ + b2*b4*化合物Ｄ + b2*b5*化合物Ｅ} + 化合物Ｃ* {a3 + (b3*b1*化合物Ａ + b3*b2*化合物Ｂ + b3*b3*化合物Ｃ + b3*b4*化合物Ｄ + b3*b5*化合物Ｅ} +化合物Ｄ* {a4 + (b4*b1*化合物Ａ + b4*b2*化合物Ｂ + b4*b3*化合物Ｃ + b4*b4*化合物Ｄ + b4*b5*化合物Ｅ} + 化合物Ｅ*{a5 + (b5*b1*化合物Ａ + b5*b2*化合物Ｂ + b5*b3*化合物Ｃ + b5*b4*化合物Ｄ + b5*b5*化合物Ｅ}
但し、式中、化合物Ａ：2H-Tetrazole, 2-acetyl-、化合物Ｂ：dimethyl sulfone、化合物Ｃ：benzene, 2-isothiocyanatoethyl-、化合物Ｄ：hexanoic acid、化合物Ｅ：propanoic acid, 2-methyl-, 3-hydroxy-2,2,4-trimethylpentyl ester（texanol）を意味する。
【００４６】
次に、二次判別関数による分析によって、高齢者のうつ病に関連するVOCを群分けした（表８及び図４）。二次判別関数式について、次の二つの条件を導入した。(1)うつ病に焦点を絞るために、広場恐怖症のみを煩う者（No.14。うつ病を煩っていない者）を除き、(2)XY図（図３E）によれば、化合物ＤはHAMDスコアの増加に従って非常に高い相関で（r=-0.76）減少することが示されたので、化合物Ｄについては、絶対的なm/z値の逆数を導入した。
【００４７】
【表８】
2019082367.tif 000015
【００４８】
こうして、5個のVOC全てを含む群と、（化合物Ａを除く）4個のVOCを含む群が、高齢者において、誤差なしに（ほぼ0%）各者の評価を行えることが分かった（図４A,B）。また、化合物Ｂ、化合物Ｃ及び化合物Ｅの3個を含むVOC群では、5.88%の誤差で、うつ病と強く関連することが分かった（図４C）。更に、化合物Ｃ、化合物Ｄ及び化合物Ｅの3個を含むVOC群では、11.76%の誤差で、うつ病と強く関連することが分かった（図４D）。
このように、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ及び化合物Ｅの4個のVOCについて、各化合物のm/z値を標準品と比較することによって、高齢者のうつ病を評価できることが分かった。
【００４９】
このように本実施形態によれば、うつ及び／又は不安症の状態を知るためのバイオマーカーを提供できた。被験者から得た尿中のバイオマーカーを検出することにより、被験者の病態を確認した。また、本実施形態のバイオマーカーの量を判断基準として、創薬スクリーニングに利用できることが分かった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００５０】
【特許文献１】特開２０１４−２２４７５９号公報
【特許文献２】特開２０１４−  １３２５７号公報
【特許文献３】特開２０１２−  １３４１５号公報
【非特許文献】
【００５１】
【非特許文献１】Kera, T., Kawai, H., Yoshida, H., Hirano, H., Kojima, M., Fujiwara, Y., et al. (2017). Classification of frailty using the Kihon checklist: A cluster analysis of older adults in urban areas. Geriatrics ＆ Gerontology International, 17(1), 69-77.
【非特許文献２】古谷野亘,柴田博,中里克治,芳賀博,須山靖男:地域老人における活動能力の測定をめざして、社会老年学、 23、35-43、1986.
【非特許文献３】Shibata H, Suzuki T, and Shimonaka, Y (2000) An overview of the Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology-longitudinal interdisciplinary study on aging (TMIG-LISA, 1991-2001). J Aging and Physical activity 8:98-108.
【非特許文献４】Iwasa, H., Masui, Y., Inagaki, H., Yoshida, Y., Shimada, H., Otsuka, R., et al. (2015). Development of the Japan Science and Technology Agency Index of Competence to Assess Functional Capacity in Older Adults. Gerontology and Geriatric Medicine, 1, 233372141560949.
【非特許文献５】Fujisawa, D., Tanaka, E., Sakamoto, S., Neichi, K., Nakagawa, A., ＆ Ono, Y. (2005). The development of a brief screening instrument for depression and suicidal ideation for elderly: the Depression and Suicide Screen. Psychiatry and Clinical Neurosciences, 59(6), 634-638.
【非特許文献６】Zung WA., Self-rating depression scale, Arch. Gen. Psychiatry 12 (1965) 63e70.
【非特許文献７】Satake, S., Senda, K., Hong, Y.-J., Miura, H., Endo, H., Sakurai, T., et al. (2016). Validity of the Kihon Checklist for assessing frailty status. Geriatrics ＆ Gerontology International, 16(6), 709-715.
【非特許文献８】Hamilton, M. (1960). A rating scale for depression. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry, 23, 56e62.
【非特許文献９】Hamilton, M. (1967). Development of a rating scale for primary depressive illness. British Journal of Social and Clinical Psychology, 6, 278e296.
【非特許文献１０】Edelstein, BA., Drozdick, LW., Ciliberti, CM. (2010) Chapter 1 - Assessment of Depression and Bereavement, in Older Adults in Handbook of Assessment in Clinical Gerontology (Second edition), ed.
【非特許文献１１】Bonsnes RW, Taussky HH. (1945) On the colorimetric determination of creatinine by the Jaffe reaction.  J. Biol. Chem., 158, 581-91.
【非特許文献１２】HANAI, Y., Shimono, K., Matsumura, K., Vachani, A., Albelda, S., Yamazaki, K., et al. (2012). Urinary volatile compounds as biomarkers for lung cancer. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 76(4), 679-684.
【非特許文献１３】Boron WF, Emile L. Boulpaep EL, (2008) Medical Physiology, Saunders.
【非特許文献１４】Fraser, A. D., ＆ Worth, D. (2004). Urinary excretion profiles of 11-nor-9-carboxy-delta9-tetrahydrocannabinol and 11-hydroxy-delta9-THC: cannabinoid metabolites to creatinine ratio study IV. Forensic Science International, 143(2-3), 147-152.
【非特許文献１５】Ohira, S.-I., Kirk, A. B., Dyke, J. V., ＆ Dasgupta, P. K. (2008). Creatinine adjustment of spot urine samples and 24 h excretion of iodine, selenium, perchlorate, and thiocyanate. Environmental Science ＆ Technology, 42(24), 9419-9423.
【非特許文献１６】Maltby, D. A., ＆ Millington, D. S. (1986). Analysis of volatile free fatty acids in human urine by capillary column gas chromatography/mass spectrometry. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry, 155(2), 167-172.
【非特許文献１７】Morrison, D. J., Cooper, K., Waldron, S., Slater, C., Weaver, L. T., ＆ Preston, T. (2004). A streamlined approach to the analysis of volatile fatty acids and its application to the measurement of whole-body flux. Rapid Communications in Mass Spectrometry : RCM, 18(21), 2593-2600.
【非特許文献１８】Evans, BT, Zayatz L., and d Slanta, J. (1996), Using Noise For Disclosure Limitation of Establishment Tabular Data,”Proceedings of the 1996 Annual Research Conference, Washington, DC: U.S. Bureau of the Census.
【非特許文献１９】Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., ＆ Siuzdak, G. (2006). XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry, 78(3), 779-787.
【非特許文献２０】Takeshi Kera et al., Classification of frailty using the Kihon checklist: A cluster analysis of older adults in urban areas. Geriatr Gerontol Int 2017; 17: 69-77
【非特許文献２１】Berry, J. M., Storandt, M., ＆ Coyne, A. (1984). Age and sex differences in somatic complaints associated with depression. Journal of Gerontology, 39(4), 465-467.
【非特許文献２２】Tabuse H, Kalali A, Azuma H, Ozaki N, Iwata N, Naitoh H et al. The new GRID Hamilton rating scale for depression demonstrates excellent inter-rater reliability for inexperienced and experienced raters before and after training. Psychiatry Res 2007; 153: 61-67
【図１】
2019082367.tif 000016
【図２】
2019082367.tif 000017
【図３】
2019082367.tif 000018
【図４】
2019082367.tif 000019