(57)【要約】【課題】本発明は、体内、特に筋肉内の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）量の増加を促進するための組成物を提供する。【解決手段】本発明の組成物は、ホエイタンパク質加水分解物を有効成分とする体内のＢＤＮＦ量増加促進用組成物であって、当該ホエイタンパク質加水分解物がＩｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドを含有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホエイタンパク質加水分解物を有効成分とする体内の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）量増加促進用組成物であって、当該ホエイタンパク質加水分解物がＩｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドを含有するものであるか、またはＩｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドに加えて、Ｉｌｅ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、及びＬｅｕ−Ｉｌｅからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドを含有するものである、ＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
【請求項２】
上記ホエイタンパク質加水分解物が、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕのジペプチドを含有するものであるか、またはＩｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕのジペプチドに加えて、Ｉｌｅ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、及びＬｅｕ−Ｉｌｅのジペプチドを含有するものである、ＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
【請求項３】
運動前または運動中のヒトを含む哺乳動物に経口投与または摂取されるものである、請求項１または２に記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
【請求項４】
運動中または運動後の筋肉内ＢＤＮＦ量の増加を促進する、請求項３に記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
【請求項５】
非運動状態のヒトを含む哺乳動物に経口投与または摂取されるものである、請求項１または２に記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
【請求項６】
認知機能低下者、またはその予備群に経口投与または摂取されるものである、請求項１〜５のいずれかに記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
【請求項７】
認知機能の低下抑制または改善用組成物である、請求項６に記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
【請求項８】
肥満者または／および糖代謝低下者、またはこれらの予備群に経口投与または摂取されるものである、請求項１〜７のいずれかに記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
【請求項９】
肥満抑制若しくは改善用組成物、または／および糖代謝低下抑制若しくは改善用組成物である、請求項８に記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
【請求項１０】
飲食物である、請求項１〜９のいずれかに記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
【請求項１１】
被験者の体内のＢＤＮＦ量増加促進のために使用される組成物であって、当該組成物は、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドを含有するホエイタンパク質加水分解物、またはＩｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドに加えて、Ｉｌｅ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、及びＬｅｕ−Ｉｌｅからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドを含有するホエイタンパク質加水分解物を、有効成分とするものである、上記組成物。
【請求項１２】
前記ＢＤＮＦ量増加促進用組成物が、認知機能の低下を抑制するか、若しくは改善するために使用される組成物、または肥満を抑制または改善するか若しくは／および糖代謝低下を抑制または改善するために使用される組成物である、請求項１１に記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
【請求項１３】
Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドを含有するホエイタンパク質加水分解物、またはＩｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドに加えて、さらにＩｌｅ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、及びＬｅｕ−Ｉｌｅからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドを含有するホエイタンパク質加水分解物を含む組成物を被験者に投与するかまたは摂取させて、当該被験者の認知機能の低下を抑制若しくは改善するか、記憶若しくは学習のパフォーマンスを増進するか、または肥満を抑制若しくは改善するか、または／および糖代謝低下を抑制若しくは改善する方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は体内の脳由来神経栄養因子（Brain Derived Neurotrophic Factor：BDNF）（以下、本発明では単に「ＢＤＮＦ」と称する）の量の増加を促進する作用を有する組成物に関する。より詳細には、本発明は、運動の有無に関わらず、体内、特に筋肉内のＢＤＮＦ量の増加を促進することができる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、日本では、うつや認知症（アルツハイマー型認知症や血管性認知症などを含む）などの精神疾患の増加が社会問題となっている。認知症高齢者数は、2002年の149万人から10年間で倍増し、2012年には300万人以上となったとされている。また日本国厚生労働省研究班による発表（2012年）によると、認知症の発症予備群として注目される軽度認知症の高齢者は約400万人と推計されており、65歳以上の４人に１人が認知症ないし認知症予備群になる計算になる。認知症は一旦発症すると治療しても進行を抑えるだけで根治できないのが現状である。このため、認知症を一旦発症すると、患者の人生が大きく変わるだけでなく、介護する家族にも過大な負担がかかり介護を理由に離職せざるを得ない等、人生設計の変更が余儀なくされる。こうした離職による働き世代の労働力損失が国経済に及ぼす影響は決して無視できるものではない。
【０００３】
これらのことから、認知症を発症しないように予防コントロールすることは、個人のみならず現代社会においても喫緊の課題である。
【０００４】
こうした認知症の予防に、従来より牛乳や乳製品の摂取が有用であるとされている。具体的には、牛乳や乳製品に多く含まれているカルシウムやマグネシウムに認知症に対する予防効果があること（非特許文献１）、また牛乳や乳製品に含まれるホエイには、アルツハイマー型認知症の危険因子であるインスリン抵抗性を改善させることが報告ないし示唆されている（非特許文献２）。
【０００５】
一方で、運動すると、神経細胞の発生、成長、維持または再生に関わる神経栄養因子の一つであるＢＤＮＦが有意に増加するとともに、記憶や学習などのパフォーマンスが高まることが知られている（非特許文献３）。また多くの疫学研究や実験により、運動により高齢者の認知機能の低下が抑制できることが知られている（非特許文献４〜６）。また最近、動物実験により、一過性の電気刺激を介した強制運動負荷により、海馬ＢＤＮＦが増加することが確認されている（非特許文献７）。さらに、脳におけるＢＤＮＦの発現量が、うつ病やアルツハイマー型認知症の患者では減少していることが報告されている（非特許文献８、非特許文献９）。
【０００６】
このように、運動によって増加するＢＤＮＦが、うつ病や認知症などの精神疾患の予防に有効であることが示唆されている。
【０００７】
また、ＢＤＮＦは、脳室内、皮下または腹腔内に投与することによって、体重の増加が抑制され、糖代謝が改善することも報告されている（非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J Am Geriatr Soc. 2012, 60(8):1515-1520.
【非特許文献２】Nutrition. 2014, 30(9):1076-1080．
【非特許文献３】Neeper SA et al. Brain Res, 726:49-56(1996)．
【非特許文献４】Trends Neurosci. 2002, 25(6):295-301．
【非特許文献５】Nature. 1999, 29;400(6743):418-419．
【非特許文献６】Cell Mol Neurobiol. 2010, 30(4):493-503．
【非特許文献７】第31 回若手研究者のための健康科学研究助成成果報告書2014年度、pp.104-109．
【非特許文献８】Chen B et al, Biol Psychiatry. 50:260-265(2001).
【非特許文献９】Phillips HS et al. Neuron. 7:695-702(1991).
【非特許文献１０】Nakagawa T et al, Diabetes, 49:436-444(2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述するように、運動と認知機能に関する研究は盛んであり、運動による認知機能改善にＢＤＮＦが関係することを示唆する結果が示されているものの、ＢＤＮＦに対する飲食物摂取の影響、特に運動と飲食物摂取の組み合わせによる効果については未解明な部分が多い。このため、本発明は、ＢＤＮＦに対する飲食物摂取の効果、特に運動と飲食物摂取による効果に着目したものである。具体的には、本発明は、認知機能や糖代謝の改善に関わる体内のＢＤＮＦの量を、飲食物摂取、または運動と飲食物摂取とを併用することで効率的に増大させることを課題として開発したものである。
【００１０】
つまり、本発明は、体内、特に筋肉内におけるＢＤＮＦ量の増加を促進するために使用される組成物、言い換えれば体内、特に筋肉内のＢＤＮＦ量増加促進用組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、体内、特に筋肉内におけるＢＤＮＦ量の増加を促進するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討をしていたところ、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドを含むホエイタンパク質加水分解物を摂取することで、筋肉内のＢＤＮＦ量が顕著に増加することを見出した。かかる効果は、加水分解する前のホエイタンパク質では有意に認められないことから、ホエイタンパク質には含まれないホエイタンパク質加水分解物固有の成分であるジペプチドが寄与していると考えられる。前述するように、ＢＤＮＦはうつ病や認知症などの精神疾患の予防、並びに認知機能改善に有効であることが示唆されており、また体重増加の抑制や糖代謝低下の改善に有効であることも報告されている。このため、前記ジペプチドを含むホエイタンパク質加水分解物は、うつ病や認知症などの精神疾患の予防、認知機能改善、体重増加の抑制、または／及び糖代謝低下の改善に有用であると考えられる
【００１２】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施形態を有するものである。なお、以下、本明細書において、ホエイタンパク質加水分解物（Whey Protein Hydrolysate）は、単に「ＷＰＨ」と略称する。またジペプチドは、当該ジペプチドを構成するアミノ酸配列を、アミノ酸の三文字記号を用いて「Xxx-Yyy」として記載する。
【００１３】
（Ｉ）体内のＢＤＮＦ量増加促進用組成物
（Ｉ−１）ＷＰＨを有効成分とする体内、好ましくは筋肉内のＢＤＮＦ量増加促進用組成物であって、
当該ＷＰＨがＩｌｅ−Ｌｅｕ（イソロイシル−ロイシン）、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（ロイシル−ロイシン）、及びＶａｌ−Ｌｅｕ（バリル−ロイシン）からなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドを含有するものである、ＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
（Ｉ−２）上記ＷＰＨがＩｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕを含有するものである、（Ｉ−１）に記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
（Ｉ−３）上記ＷＰＨが、さらにＩｌｅ−Ｖａｌ（イソロイシル−バリン）、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ（イソロイシル−イソロイシン）、Ｌｅｕ−Ｖａｌ（ロイシル−バリン）、及びＬｅｕ−Ｉｌｅ（ロイシル−イソロイシン）からなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドを含有するものである、（Ｉ−１）または（Ｉ−２）に記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
（Ｉ−４）上記ＷＰＨが、さらにＩｌｅ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、及びＬｅｕ−Ｉｌｅからなるジペプチドを含有するものである、（Ｉ−１）または（Ｉ−２）に記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
（Ｉ−５）運動前または運動中のヒトを含む哺乳動物に経口投与または摂取されるものである、（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）のいずれかに記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
（Ｉ−６）運動中または運動後の筋肉内ＢＤＮＦ量の増加を促進する、（Ｉ−５）に記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
（Ｉ−７）非運動状態のヒトを含む哺乳動物に経口投与または摂取されるものである、（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）のいずれかに記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
（Ｉ−８）認知機能低下者、またはその予備群に経口投与または摂取されるものである、（Ｉ−１）〜（Ｉ−７）のいずれかに記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
（Ｉ−９）認知機能の低下抑制または改善用組成物である、（Ｉ−８）に記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
（Ｉ−１０）肥満者または／および糖代謝低下者、またはこれらの予備群に経口投与または摂取されるものである、（Ｉ−１）〜（Ｉ−７）のいずれかに記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
（Ｉ−１１）肥満抑制若しくは改善用組成物、または／および糖代謝低下抑制若しくは改善用組成物である、（Ｉ−１０）に記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
（Ｉ−１２）一回投与（摂取）あたりの単位包装形態からなり、該単位包装形態中に上記ＷＰＨを一回投与量（摂取量）として総タンパク質換算で０．１〜４０ｇ含む、（Ｉ−１）〜（Ｉ−１１）のいずれかに記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
（Ｉ−１３）飲食物である（Ｉ−１）〜（Ｉ−１２）のいずれかに記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
（Ｉ−１４）健康食品、機能性食品、栄養補助食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品、乳幼児用調製粉乳、妊産婦若しくは授乳婦用粉乳、または運動による体内ＢＤＮＦ量の増加を促進するために用いられる旨の表記を付した飲食物である、（Ｉ−１３）に記載するＢＤＮＦ量増加促進用組成物。
【００１４】
（II）体内ＢＤＮＦ量の増加方法
（II−１）Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドを含有するＷＰＨを含む組成物を被験者に投与するかまたは摂取させて、当該被験者の体内、好ましくは筋肉内におけるＢＤＮＦ量を増加する方法。
（II−２）上記ＷＰＨがＩｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕを含有するものである、（II−１）に記載する方法。
（II−３）上記ＷＰＨが、さらにＩｌｅ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、及びＬｅｕ−Ｉｌｅからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドを含有するものである、（II−１）または（II−２）に記載する方法。
（II−４）上記ＷＰＨが、さらにＩｌｅ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、及びＬｅｕ−Ｉｌｅからなるジペプチドを含有するものである、（II−１）または（II−２）に記載する方法。
（II−５）前記被験者が運動前または運動中のヒトを含む哺乳動物である、（II−１）〜（II−４）のいずれかに記載する方法。
（II−６）運動中または運動後の筋肉内ＢＤＮＦ量を増加する方法である、（II−５）に記載する方法。
（II−７）前記被験者が非運動状態のヒトを含む哺乳動物である、（II−１）〜（II−４）のいずれかに記載する方法。
（II−８）前記被験者が認知機能低下者、またはその予備群である、（II−１）〜（II−７）のいずれかに記載する方法。
（II−９）前記被験者の認知機能の低下を抑制するか、または改善する方法である、（II−８）に記載する方法。
（II−１０）ヒトを含む哺乳動物の記憶または学習のパフォーマンスを増進する方法である、（II−１）〜（II−８）のいずれかに記載する方法。
（II−１１）前記被験者が肥満者または／および糖代謝低下者、またはこれらの予備群である、（II−１）〜（II−７）のいずれかに記載する方法。
（II−１２）前記被験者の肥満を抑制または改善するか、または／および糖代謝低下を抑制または改善する方法である、（II−１１）に記載する方法。
（II−１３）前記組成物が、一回投与（摂取）あたりの単位包装形態からなり、該単位包装形態中にＷＰＨを一回投与量（摂取量）として総タンパク質換算で０．１〜４０ｇ含むものである、（II−１）〜（II−１２）のいずれかに記載する方法。
（II−１４）前記組成物が飲食物、好ましくは健康食品、機能性食品、栄養補助食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品、乳幼児用調製粉乳、妊産婦若しくは授乳婦用粉乳、または運動による体内ＢＤＮＦ量の増加を促進するために用いられる旨の表記を付した飲食物である（II−１）〜（II−１３）のいずれかに記載する方法。
【００１５】
（III）体内のＢＤＮＦ量増加促進のために使用されるＷＰＨ
（III−１）被験者の体内、好ましくは筋肉内のＢＤＮＦ量増加促進のために使用される組成物であって、
当該組成物は、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドを含有するＷＰＨを有効成分とするものである、上記組成物。
（III−２）上記ＷＰＨがＩｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕを含有するものである、（III−１）に記載する組成物。
（III−３）上記ＷＰＨが、さらにＩｌｅ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、及びＬｅｕ−Ｉｌｅからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドを含有するものである、（III−１）または（III−２）に記載する組成物。
（III−４）上記ＷＰＨが、さらにＩｌｅ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、及びＬｅｕ−Ｉｌｅからなるジペプチドを含有するものである、（III−１）または（III−２）に記載する組成物。
（III−５）前記被験者が運動前または運動中のヒトを含む哺乳動物である、（III−１）〜（III−４）のいずれかに記載する組成物。
（III−６）運動中または運動後の筋肉内ＢＤＮＦ量の増加を促進するために用いられる、（III−５）に記載する組成物。
（III−７）前記被験者が非運動状態のヒトを含む哺乳動物である、（III−１）〜（III−４）のいずれかに記載する組成物。
（III−８）前記被験者が認知機能低下者、またはその予備群である、（III−１）〜（III−７）のいずれかに記載する組成物。
（III−９）認知機能の低下を抑制するか、または改善するために使用される、（III−８）に記載する組成物。
（III−１０）前記被験者が肥満者または／および糖代謝低下者、またはこれらの予備群である、（III−１）〜（III−７）のいずれかに記載する組成物。
（III−１１）肥満を抑制または改善するか、または／および糖代謝低下を抑制または改善するために使用される、（III−１０）に記載する組成物。
（III−１２）一回投与（摂取）あたりの単位包装形態からなり、該単位包装形態中に上記ＷＰＨを一回投与量（摂取量）として総タンパク質換算で０．１〜４０ｇ含む組成物である、（III−１）〜（III−１１）のいずれかに記載する組成物。
（III−１３）飲食物、好ましくは健康食品、機能性食品、栄養補助食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品、乳幼児用調製粉乳、妊産婦若しくは授乳婦用粉乳、または運動による体内ＢＤＮＦ量の増加を促進するために用いられる旨の表記を付した飲食物である（III−１）〜（III−１２）のいずれかに記載する組成物。
【００１６】
（IV）体内ＢＤＮＦ量増加促進用組成物製造のためのＷＰＨの使用
（IV−１）被験者の体内、好ましくは筋肉内のＢＤＮＦ量増加促進用組成物を製造するためのＷＰＨの使用であって、当該ＷＰＨは、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドを含有するものである、上記使用。
（IV−２）上記ＷＰＨがＩｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕを含有するものである、（IV−１）に記載する使用。
（IV−３）上記ＷＰＨが、さらにＩｌｅ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、及びＬｅｕ−Ｉｌｅからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドを含有するものである、（IV−１）または（IV−２）に記載する使用。
（IV−４）上記ＷＰＨが、さらにＩｌｅ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、及びＬｅｕ−Ｉｌｅからなるジペプチドを含有するものである、（IV−１）または（IV−２）に記載する使用。
（IV−５）前記被験者が運動前または運動中のヒトを含む哺乳動物である、（IV−１）〜（IV−４）のいずれかに記載する使用。
（IV−６）前記組成物が被験者の運動中または運動後の筋肉内ＢＤＮＦ量の増加を促進するためのものである、（IV−５）に記載する使用。
（IV−７）前記被験者が非運動状態のヒトを含む哺乳動物である、（IV−１）〜（IV−４）のいずれかに記載する使用。
（IV−８）前記被験者が認知機能低下者、またはその予備群である、（IV−１）〜（IV−７）のいずれかに記載する使用。
（IV−９）前記組成物が認知機能の低下を抑制するか、または改善するためのものである、（IV−８）に記載する使用。
（IV−１０）前記被験者が肥満者または／および糖代謝低下者、またはこれらの予備群である、（IV−１）〜（IV−７）のいずれかに記載する使用。
（IV−１１）前記組成物が肥満を抑制または改善するか、または／および糖代謝低下を抑制または改善するためのものである、（IV−１０）に記載する使用。
（IV−１２）前記組成物が一回投与（摂取）あたりの単位包装形態からなり、該単位包装形態中に上記ＷＰＨを一回投与量（摂取量）として総タンパク質換算で０．１〜４０ｇ含む組成物である、（IV−１）〜（IV−１１）のいずれかに記載する使用。
（IV−１３）前記組成物が、飲食物、好ましくは健康食品、機能性食品、栄養補助食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品、乳幼児用調製粉乳、妊産婦若しくは授乳婦用粉乳、または運動による体内ＢＤＮＦ量の増加を促進するために用いられる旨の表記を付した飲食物である（IV−１）〜（IV−１２）のいずれかに記載する使用。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ＷＰＨを有効成分とする体内、特に筋肉内ＢＤＮＦ量増加促進用組成物（以下、単に「本発明の組成物」と称する場合がある）が提供される。
【００１８】
本発明の組成物を摂取した後に運動をするか、または運動中に本発明の組成物を摂取することで、運動による体内、特に筋肉内ＢＤＮＦ量の増加を促進することができ、その結果、筋肉内のＢＤＮＦ量を効率よく増加させることができる（試験例１参照）。前述するように、従来から運動によって高齢者の認知機能の低下が抑制できることが知られており、またＢＤＮＦは記憶や学習などのパフォーマンスを高め、うつ病や認知症などの精神疾患の予防にも有効であることが示唆されている。このことから、運動に際して本発明の組成物を摂取することで上記効果をより高めることが可能である。
【００１９】
また、ＢＤＮＦの増加は、ＷＰＨを摂取して運動する場合のみならず運動しない場合であっても有意に認められる（試験例２参照）。このことから、ＢＤＮＦ量の増加は、運動の有無に関わらず、ＷＰＨを摂取することによって得られる特有の効果であると考えられる。また、こうした効果は、加水分解する前のＷＰＨでは有意には認められないことから、ホエイタンパク質には含まれない（含まれていても微量である）ＷＰＨ固有の成分であるジペプチドが寄与していると考えられる。
【００２０】
またＢＤＮＦには体重増加の抑制作用や糖代謝の改善作用があることが報告されている。このため、本発明によれば、本発明の組成物を摂取することで当該効果を期待することができる。
【００２１】
なお、本発明の組成物に含まれるＷＰＨは、長年食品の原料として用いられていきた乳タンパク質を利用するものである。このため、本発明の組成物は、長期間にわたって継続的に服用しても副作用の懸念がなく、安全性が高い点において有利である。また、ホエイタンパク質は、通常、ナチュラルチーズの製造過程のうち、原料乳の凝乳過程の後に排出され、廃棄されて産業廃棄物となるものである。本発明の組成物に有効成分として含まれるＷＰＨは、この産業廃棄物となるホエイを再利用して原料とすることができることから、環境面や経済面においても本発明は有用であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】被験動物（雄性ＳＤラット）を（ａ）「ジペプチド非投与／非運動群」、（ｂ）「ジペプチド非投与／運動群」、及び（ｃ）「ジペプチド投与／運動群」に分け、（ａ）にＷＰＨを摂取させずに運動負荷も与えない場合の筋肉中のＢＤＮＦ量（ng/g）（平均値±標準誤差、以下同じ）を、（ｂ）にＷＰＨを摂取させることなく運動負荷を与えた場合の同ＢＤＮＦ量、及び（ｃ）にＷＰＨを摂取させて運動負荷を与えた後の同ＢＤＮＦ量を、比較した結果を示す。図中、＊は、Dunnett検定により（ａ）に対してｐ＜０．０５の有意差があることを意味する。
【図２】被験動物（雄性ＳＤラット）を（1）「水投与／運動群」、（2）「ＷＰＣ投与／運動群」、及び（3）「ＷＰＨ投与／運動群」に分け、（1）に水を摂取させて運動負荷を与えた後の筋肉中のＢＤＮＦ量（ng/g）（平均値±標準誤差、以下同じ）、（2）にＷＰＣ（ホエイタンパク質濃縮物）を摂取させて運動負荷を与えた後の同ＢＤＮＦ量、及び（3）にＷＰＨを摂取させて運動負荷させた後の同ＢＤＮＦ量を測定した結果をそれぞれ示す。図中、＊は、Dunnett検定により（1）に対してｐ＜０．０５の有意差があることを意味する。
【図３】被験動物（雄性ＳＤラット）を（i）「水投与／非運動群」、（ii）「ＷＰＣ投与／非運動群」、及び（iii）「ＷＰＨ投与／非運動群」に分け、いずれも運動負荷を与えることなく（i）に水を摂取させた後のＢＤＮＦ量（ng/g）（平均値±標準誤差、以下同じ）、（ii）にＷＰＣを摂取させた後の同ＢＤＮＦ量、及び（iii）にＷＰＨを摂取させた後の同ＢＤＮＦ量を測定した結果をそれぞれ示す。図中、＊は、Dunnett検定により（i）に対してｐ＜０．０５の有意差があることを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明が対象とする体内ＢＤＮＦ量増加促進用組成物（本発明の組成物）は、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドを含有するＷＰＨ（以下、「本発明のＷＰＨ」ということがある）を有効成分として含むことを特徴とする。
【００２４】
一般にＷＰＨは、ホエイタンパク質を原料としてその全部又は一部を加水分解して得られるものであり、乳清ペプチドとも称される。
【００２５】
ホエイタンパク質は、乳からカゼインや脂肪を取り除いた液体部分である乳清（ホエイ）に含まれる球状タンパク質の混合物であり、α−ラクトアルブミン（α−Ｌａ）、β−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ）、免疫グロブリン、ラクトフェリン、ウシ血清アルブミン等のタンパク質が含まれている。本発明において、ＷＰＨの調製に原料として用いられるホエイタンパク質は、乳やホエイから精製されたホエイタンパク質であってもよいし、また乳やホエイから分離された粗精製のホエイタンパク質（ホエイタンパク質含有物）であってもよい。さらにホエイタンパク質を含む飲食品やその原料（例えば、乳タンパク質以外に他成分を含む組成物など）を用いることもできる。当該飲食品やその原料はホエイタンパク質に加えてカゼインを含むものであってもよい。
【００２６】
上記精製ホエイタンパク質としては、α−ラクトアルブミン（α−Ｌａ）、β−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ）、免疫グロブリン、ラクトフェリン、及びこれらを少なくとも一つ含むタンパク質の混合物、並びにホエイタンパク質精製物（ＷＰＩ）等を挙げることができる。また上記精製のホエイタンパク質（ホエイタンパク質含有物）としては、牛乳から調製される、例えばホエイの原液（甘性ホエイ、酸ホエイなど）、その濃縮物、その乾燥物（ホエイ粉など）、その凍結物、及びこれらの還元物などを挙げることができる。また、これらには脱塩ホエイ、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、及びこれらの還元物を含めることができる。また、ホエイタンパク質を含む飲食品またはその原料としては、例えば、生乳、殺菌乳（牛乳など）、脱脂乳、成分調整牛乳、加工乳、乳製品（濃縮乳、粉乳、練乳、発酵乳（ヨーグルトなど）、乳酸菌飲料、プロセスチーズ類、アイスクリーム類、クリーム類）及び乳タンパク質濃縮物（ＭＰＣ）、並びにそれらの濃縮物、それらの乾燥物、それらの凍結物などを挙げることができる。このとき、前記のホエイタンパク質を含んでいる原料や飲食品は、市販品を入手して用いてもよいし、自ら調製して用いてもよい。
【００２７】
本発明のＷＰＨは、上述するホエイタンパク質を１回以上加水分解することによって調製することができる。その手段及び／又は方法は特に制限されるものではない。例えば、乳またはホエイからホエイタンパク質を分離または精製する工程中において、ホエイタンパク質を部分的に加水分解し、その後、さらに別の加水分解を行って調製してもよい。加水分解は、公知の加水分解方法により実施することができるが、好ましくは、タンパク質分解酵素による加水分解方法を用いることができる。
【００２８】
タンパク質分解酵素は、ホエイタンパク質を加水分解して本発明の効果を発揮するＷＰＨを生成するものであれば、特に限定されるものではない。例えば国際公開第２００７／１２３２００号などの記載を参考にして、その種類や反応条件などは任意に設定することができる。例えば、バシラス属（Bacillus）又はアスペルギルス属（Aspergillus）に属する微生物由来のタンパク質分解酵素；パパイヤ由来のパパイン、パイナップル由来のブロメライン、キウイ由来のアクチニダインなどの植物由来のタンパク質分解酵素；パンクレアチン、トリプシン、ペプシン、キモトリプシンなどの動物由来のタンパク質分解酵素が挙げられる。これらは１種単独で、又は２種以上を任意に組み合わせて使用することができる。また、これらのタンパク質分解酵素は、市販品を用いることができる。市販品のタンパク質分解酵素は、例えば、プロテアーゼＭアマノ（アマノエンザイム社）、プロテアーゼＮアマノ（アマノエンザイム社）、プロテアーゼＰアマノ（アマノエンザイム社）、プロテアーゼＡアマノ（アマノエンザイム社）、トリプシン（ノボ社）、ペプシン（和光純薬社）、ウマミザイム（アマノエンザイム社）、フレーバザイム（ノボ社）などがあるが、これに制限されない。本発明の好ましい態様によれば、ホエイタンパク質を加水分解するために用いられるタンパク質分解酵素は、バシラス属由来タンパク質分解酵素、アスペルギルス属由来タンパク質分解酵素、トリプシン、ペプシン及びフレーバザイム（ノボ社）からなる群から選択される一種又は二種以上である。
【００２９】
本発明のＷＰＨは、ホエイタンパク質を加水分解するタンパク質分解酵素を用いることにより、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕからなる群より選択される少なくとも一つのジペプチドが豊富に含まれる加水分解物として調製することができる。例えば、ホエイタンパク質を加水分解してＩｌｅ−Ｌｅｕのジペプチドを生成するには、ホエイタンパク質をバシラス属由来のプロテアーゼ及びアスペルギルス属由来のプロテアーゼを組み合わせて加水分解を行うことが好ましい。またホエイタンパク質を加水分解してＬｅｕ−Ｌｅｕのジペプチドを生成するには、ホエイタンパク質をペプシンで反応後、アスペルギルス属由来のプロテアーゼで反応させることが好ましい。なお、当該方法によればホエイタンパク質が加水分解されてＬｅｕ−ＶａｌやＧｌｙ−Ｌｅｕのジペプチドも生成される場合がある。さらに、ホエイタンパク質を加水分解してＶａｌ−Ｌｅｕのジペプチドを生成するには、ホエイタンパク質をアスペルギルス属由来のプロテアーゼを用いて加水分解することが好ましい。当該方法によればホエイタンパク質が加水分解されてＩｌｅ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、及びＬｅｕ−Ｉｌｅのジペプチドも生成される場合がある。また、その他、ホエイタンパク質を加水分解してＡｌａ−Ｌｅｕのジペプチドを生成させるには、ホエイタンパク質をトリプシンで反応させた後、バシラス属由来のプロテアーゼで反応させることが好ましい。
【００３０】
タンパク質分解酵素によりホエイタンパク質を加水分解し、所望のジペプチドを生成するための反応温度は、好ましくは２０〜８０℃、より好ましくは２５〜７５℃、さらに好ましくは３０〜７０℃、さらに好ましくは３５〜６５℃、さらに好ましくは４０〜６０℃、特に好ましくは４５〜５５℃である。反応温度が２０℃以上であれば、タンパク質分解酵素により、ホエイタンパク質を効率よく加水分解することができる。また、反応温度が８０℃以下であれば、タンパク質分解酵素の変性による失活を抑制することができる。当該反応温度は、使用するタンパク質加水分解酵素の至適温度に鑑み、一定の温度（１段階）に設定してもよいし、また２以上の異なる温度（２段階以上）に設定することもできる。２段階以上の反応温度を設定する場合には、その順番は任意である。
【００３１】
タンパク質加水分解酵素によりホエイタンパク質を加水分解し、所望のジペプチドを生成するための反応時間は、制限されないものの、好ましくは２〜４８時間、より好ましくは２〜３６時間、さらに好ましくは２〜２４時間、さらに好ましくは２〜１８時間、さらに好ましくは２〜１４時間、さらに好ましくは４〜１２時間、さらに好ましくは６〜１０時間、特に好ましくは７〜９時間である。タンパク質分解酵素の反応時間を２時間以上とすることで、より多くのホエイタンパク質を加水分解することができる。ホエイタンパク質を効率よく加水分解するうえでは、反応時間は４８時間以内に収めることが好ましい。なお、反応温度を２段階以上で設定する場合には、当該反応時間の範囲において、任意に２段階以上の反応温度を設定することができる。
【００３２】
タンパク質分解酵素によりホエイタンパク質を加水分解し、所望のジペプチドを生成するためのタンパク質分解酵素の添加量は、本発明の効果を発揮するＷＰＨを生成することができれば、特に制限されない。例えば、ホエイタンパク質１００ｇに対して、好ましくは０．５〜１０ｇ、より好ましくは０．７〜５ｇ、さらに好ましくは０．８〜４ｇ、特に好ましくは１〜２ｇを挙げることができる。
【００３３】
タンパク質分解酵素によりホエイタンパク質を加水分解し、所望のジペプチドを生成するための反応ｐＨは、使用するタンパク質分解酵素が反応するｐＨ範囲であることが望ましく、より好適にはその至適ｐＨまたはその近傍を挙げることができる。例えば、バシラス属由来のタンパク質分解酵素及びアスペルギルス属由来のタンパク質分解酵素を併用する場合には、好ましくはｐＨ５〜９、より好ましくはｐＨ５．５〜８．５、さらに好ましくはｐＨ６〜８、特に好ましくはｐＨ６．５〜７．５である。
【００３４】
当該反応ｐＨは、使用するタンパク質加水分解酵素の至適ｐＨに鑑み、一定のｐＨ条件（１段階）に設定してもよいし、また２以上の異なるｐＨ条件（２段階以上）に設定することもできる。２段階以上のｐＨ条件を設定する場合には、その順番は任意である。
【００３５】
本発明のＷＰＨは、前述するように、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕからなる群から選択される少なくとも１種のジペプチドを含むことを特徴とする。好ましくはこれらのジペプチドを２種以上含むものであり、より好ましくはこれらのジペプチドを３種含むものである。２種以上含む場合の組み合わせの態様としては、Ｉｌｅ−ＬｅｕとＬｅｕ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−ＬｅｕとＶａｌ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−ＬｅｕとＶａｌ−Ｌｅｕ、またはＩｌｅ−ＬｅｕとＬｅｕ−ＬｅｕとＶａｌ−Ｌｅｕを例示することができる。本発明のＷＰＨは、上記特定のジペプチドを含むことを指標とすることができる。
【００３６】
本発明のＷＰＨに含まれるこれらのジペプチドは、ＬＣ／ＭＳやＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより測定することができる。具体的には、後述する製造例１に記載する方法で測定することができる。これらのジペプチドを含む本発明のＷＰＨは、前記のような加水分解反応条件に加えて、後記製造例１〜１１に記載された例を参照することにより製造することができる。
【００３７】
これらのジペプチドの、ＷＰＨ  １ｇ当たりの含有量（ｍｇ）は以下のように設定することができる。
Ｉｌｅ−Ｌｅｕ：０．１〜２５ｍｇ／ｇＷＰＨ、好適には０．５〜１５ｍｇ／ｇＷＰＨ、より好適には１〜１０ｍｇ／ｇＷＰＨ。
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ：０．５〜５０ｍｇ／ｇＷＰＨ、好適には１〜２５ｍｇ／ｇＷＰＨ、より好適には２〜１０ｍｇ／ｇＷＰＨ。
Ｖａｌ−Ｌｅｕ：０．５〜５０ｍｇ／ｇＷＰＨ、好適には１〜２５ｍｇ／ｇＷＰＨ、より好適には２〜１０ｍｇ／ｇＷＰＨ。
【００３８】
本発明のＷＰＨは、上記ジペプチドの少なくとも１種を、下記に示すＷＰＨのタンパク質含量１ｇあたりの割合で含むものであってもよい。
Ｉｌｅ−Ｌｅｕ：０．０９〜２２．５ｍｇ／ｇタンパク質、好適には０．４５〜１３．５ｍｇ／ｇタンパク質、より好適には０．９〜９ｍｇ／ｇタンパク質。
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ：０．４５〜４５ｍｇ／ｇタンパク質、好適には０．９〜２２．５ｍｇ／ｇタンパク質、より好適には１．８〜９ｍｇ／ｇタンパク質。
Ｖａｌ−Ｌｅｕ：０．４５〜４５ｍｇ／ｇタンパク質、好適には０．９〜２２．５ｍｇ／ｇタンパク質、より好適には１．８〜９ｍｇ／ｇタンパク質。
【００３９】
ここで、「ＷＰＨのタンパク質含量」とは、ＷＰＨに含まれるアミノ酸、並びにＷＰＨに含まれるタンパク質及びペプチドを構成するアミノ酸の総量を意味する。かかるタンパク質含量は、ケルダール法によって測定して算出することができる。実際に、ケルダール法の場合には、対象とするＷＰＨに含まれる窒素を測定し、その値に、窒素−タンパク質換算係数（通常６．２５）を乗じて算出することができる。例えば、本発明のＷＰＨは、ホエイタンパク質を加水分解することにより得られたものであることから、上記方法によって算出されるＷＰＨのタンパク質含量は、加水分解前のホエイタンパク質のタンパク質含量と理論上は同一になる。
【００４０】
さらに本発明のＷＰＨは、前述するＩｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕからなる群から選択される少なくとも１種、好ましくは２種以上、より好ましくは３種のジペプチドを含むことに加えて、さらにＩｌｅ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、及びＬｅｕ−Ｉｌｅからなる群より選択される少なくとも１種のジペプチドを含むものであってもよい。好ましくはこれらのジペプチドを２種以上含むものであり、より好ましくはこれらのジペプチドを３種以上含むものであり、さらに好ましくはこれらのジペプチドを４種含むものである。２種以上含む場合の組み合わせの態様としては、Ｉｌｅ−ＶａｌとＩｌｅ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−ＶａｌとＬｅｕ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−ＶａｌとＬｅｕ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−ＩｌｅとＬｅｕ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−ＩｌｅとＬｅｕ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−ＶａｌとＬｅｕ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−ＶａｌとＩｌｅ−ＩｌｅとＬｅｕ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−ＶａｌとＩｌｅ−ＩｌｅとＬｅｕ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−ＩｌｅとＬｅｕ−ＶａｌとＬｅｕ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−ＶａｌとＩｌｅ−ＩｌｅとＬｅｕ−ＶａｌとＬｅｕ−Ｉｌｅを挙げることができる。かかる本発明のＷＰＨは、上記特定のジペプチドを含むことを指標とすることができる。
【００４１】
本発明のＷＰＨに含まれるこれらのジペプチドもＬＣ／ＭＳやＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより測定することができる。これらのジペプチドのＷＰＨ当たりの含有量は以下のように設定することができる。
Ｉｌｅ−Ｖａｌ：０．１〜１０ｍｇ／ｇＷＰＨ、好適には０．２〜５ｍｇ／ｇＷＰＨ、より好適には０．５〜１．５ｍｇ／ｇＷＰＨ、
Ｉｌｅ−Ｉｌｅ：０．０５〜１０ｍｇ／ｇＷＰＨ、好適には０．１〜５ｍｇ／ｇＷＰＨ、より好適には０．２〜１ｍｇ／ｇＷＰＨ
Ｌｅｕ−Ｖａｌ：０．１〜１０ｍｇ／ｇＷＰＨ、好適には０．２〜５ｍｇ／ｇＷＰＨ、より好適には０．５〜１．５ｍｇ／ｇＷＰＨ
Ｌｅｕ−Ｉｌｅ：０．０１〜１０ｍｇ／ｇＷＰＨ、好適には０．０２〜５ｍｇ／ｇＷＰＨ、より好適には０．０５〜０．２ｍｇ／ｇＷＰＨ。
【００４２】
本発明のＷＰＨは、上記ジペプチドの少なくとも１種を、下記に示すＷＰＨのタンパク質含量１ｇあたりの割合で含むものであってもよい。「ＷＰＨのタンパク質含量」の意味は前述の通りである。
Ｉｌｅ−Ｖａｌ：０．０９〜９ｍｇ／ｇタンパク質、好適には０．１８〜４．５ｍｇ／ｇタンパク質、より好適には０．４５〜１．３５ｍｇ／ｇタンパク質
Ｉｌｅ−Ｉｌｅ：０．０４５〜９ｍｇ／ｇタンパク質、好適には０．０９〜４．５ｍｇ／ｇタンパク質、より好適には０．１８〜０．９ｍｇ／ｇタンパク質
Ｌｅｕ−Ｖａｌ：０．０９〜９ｍｇ／ｇタンパク質、好適には０．１８〜４．５ｍｇ／ｇタンパク質、より好適には０．４５〜１．３５ｍｇ／ｇタンパク質
Ｌｅｕ−Ｉｌｅ：０．００９〜９ｍｇ／ｇタンパク質、好適には０．０１８〜４．５ｍｇ／ｇタンパク質、より好適には０．０４５〜０．２ｍｇ／ｇタンパク質。
【００４３】
本発明のＷＰＨとしては、Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、及びＶａｌ−Ｌｅｕのジペプチドの総量として、ＷＰＨ  １ｇ当たり、１．１〜１２５ｍｇ／ｇＷＰＨ、好ましくは２．５〜６５ｍｇ／ｇＷＰＨ、より好ましくは５〜３０ｍｇ／ｇＷＰＨの割合で含むものを挙げることができる。当該ＷＰＨに含まれるこれらジペプチドの総量は、ＷＰＨのタンパク質含量１ｇあたりの割合に換算すると、０．９９〜１１２．５ｍｇ／ｇタンパク質、好ましくは２．２５〜５８．５ｍｇ／ｇタンパク質、より好ましくは４．５〜２７ｍｇ／ｇタンパク質であることができる。
【００４４】
さらに本発明のＷＰＨは、Ｉｌｅ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、及びＬｅｕ−Ｉｌｅのジペプチドの総量として、ＷＰＨ  １ｇ当たり、０．２６〜４０ｍｇ／ｇＷＰＨ、好ましくは０．５２〜２０ｍｇ／ｇＷＰＨ、より好ましくは１．２５〜４．２ｍｇ／ｇＷＰＨの割合で含むものを挙げることができる。当該ＷＰＨに含まれるこれらジペプチドは、ＷＰＨのタンパク質含量１ｇあたりの割合に換算すると、０．２３４〜３６ｍｇ／ｇタンパク質、好ましくは０．４６８〜１８ｍｇ／ｇタンパク質、より好ましくは１．１２５〜３．８ｍｇ／ｇタンパク質であることができる。
【００４５】
本発明のＷＰＨは、調製直後は、液状であるものの、その保存性を高めるために、凍結保存、乾燥（噴霧乾燥、凍結乾燥）、濃縮、加熱殺菌（プレート式加熱殺菌、チューブ式加熱殺菌、バッチ式加熱殺菌、通電加熱殺菌、マイクロウエーブ波による加熱殺菌、レトルト加熱などの間接加熱殺菌、スチームインジェクション、スチームインフュージョンなどの直接加熱殺菌）、または非加熱殺菌（光照射殺菌、放射線照射殺菌、高電圧パルス殺菌）をすることができる。中でも、保存安定性と取扱いの容易さから、ＷＰＨに調製した後に乾燥（噴霧乾燥、凍結乾燥）処理して、乾燥固体形態としておくことが好ましい。
【００４６】
後記試験例１及び２に示されるように、ＷＰＨを含有する本発明の組成物は、哺乳動物（ヒト及び非ヒト動物が含まれる）に投与または摂取させて運動負荷することで、体内、特に筋肉内のＢＤＮＦ量を増加させることができる（図１及び２参照）。またその増加量は、哺乳動物に本発明の組成物を投与または摂取させることなく運動負荷した場合に増加する体内、特に筋肉内のＢＤＮＦ量よりも高い。従って、当該ＷＰＨを含む本発明の組成物は、体内、特に筋肉内のＢＤＮＦ量の増加を促進するための組成物（体内、特に筋肉内のＢＤＮＦ量増加促進用組成物）として有用である。なお、当該ＢＤＮＦ量増加促進用組成物は、好適には哺乳動物が運動する前または運動中に、当該哺乳動物に投与または摂取させることで、運動後の体内、特に筋肉内ＢＤＮＦ量を高めるために用いることができる。ここで、「ＢＤＮＦ量の増加促進」とは、本発明の組成物を哺乳動物が運動する前または運動中に当該哺乳動物に投与（摂取）した場合における運動後の体内、特に筋肉内のＢＤＮＦ量を、本発明の組成物を投与（摂取）しない場合における当該量と比較して、高くすることを意味する。ここで「本発明の組成物を投与（摂取）しない場合」には、本発明の組成物の投与（摂取）も運動負荷もしない場合と、本発明の組成物を投与（摂取）しないで運動負荷した場合の両方が含まれる。より具体的には、本発明の組成物を運動前または運動中に投与（摂取）することで、本発明の組成物を投与（摂取）することなく運動負荷した場合における筋肉内ＢＤＮＦ量の増加を促進し、筋肉内のＢＤＮＦ量を、本発明の組成物を投与（摂取）することなく運動負荷した場合の増加量よりも多くすることを意味する。
【００４７】
なお、本発明において「運動」とは骨格筋の収縮によって、安静時よりも多くのエネルギー消費を伴う、すなわち筋肉に負荷をかけるものであればよい。この限りにおいて特に制限されないものの、具体的には体力を維持増進させるために行うもの、歩行、速足、ジョギング、ランニング、ダンス、水中運動、スケート、サイクリング、体操、ヨガ、ストレッチング、ウェイトトレーニング、加圧トレーニング、水泳、登山、クライミング、各種スポーツ(例えば、球技、バトミントン、バレエなど)を例示することができる。
【００４８】
また後記試験例２に示されるように、ＷＰＨを含有する本発明の組成物は、運動負荷しない場合でも、哺乳動物に投与または摂取させることで、体内、特に筋肉内のＢＤＮＦ量を増加させることができる（図３参照）。この場合の「ＢＤＮＦ量の増加」とは、運動負荷なく本発明の組成物を哺乳動物に投与（摂取）した場合における体内、特に筋肉内のＢＤＮＦ量が、運動負荷なく本発明の組成物を投与（摂取）しない場合における当該量と比較して高いことを意味する。従って、当該ＷＰＨを含む本発明の組成物は、運動負荷をしない場合でも、体内に摂取するだけで、体内、特に筋肉内のＢＤＮＦ量の増加を促進する組成物として有用である。
【００４９】
ここで「投与または摂取」には、哺乳動物（ヒト及び非ヒト動物が含まれる）の体内に入れる方法であればよく、制限されないものの、好ましくは経口投与または摂取、経腸投与、及び胃ろうなど、腸内で消化吸収される態様を例示することができ、対象とする哺乳動物の状態や用途により、適宜選択することができる。好ましくは経口摂取である。このため、本発明の組成物は、経口投与用または摂取用の形態、経腸投与用の形態、及び胃ろう用の形態を有しており、当該形態に調製することができる。
【００５０】
ＢＤＮＦは、前述するように、神経細胞の発生や成長、維持や再生に関わる神経栄養因子の一つであり、記憶や学習のパフォーマンスを高めること知られている（非特許文献３）。このことから、本発明の組成物は、記憶または学習のパフォーマンス向上を補助するための組成物として、記憶力、学習能力または学習効率を上げることが必要な者（例えば、受験生、記憶力・学習能力・学習効率の低下が気になる者など）に摂取させるか、または投与することができる。
【００５１】
またうつ病やアルツハイマー型認知症の患者では、脳におけるＢＤＮＦの発現量が減少することが知られている（非特許文献８及び９）。このことから、本発明の組成物は、認知機能改善用、認知機能低下抑制用、または認知機能向上用の組成物として、認知症、特にアルツハイマー型認知症患者、またはその予備群に摂取させるか、または投与することができる。ここで「認知機能」とは、ものごとを正しく理解して適切に実行するための機能を意味し、記憶力、言語能力、判断力（見当識、注意力を含む）、計算力、および／または遂行力が含まれる。また認知症の予備群には、軽度認知障害者も含まれる。また６５歳以上の高齢者は４人に１人が認知症または軽度認知障害を有するとされていることから、本発明において６５歳以上の高齢者も認知症の予備群に含まれ得る。また本発明の組成物は、うつ病改善用組成物として、うつ病（新型うつ病を含む）患者、またはうつ状態またはうつ傾向にある予備群に摂取させるか、または投与することができる。
【００５２】
さらにＢＤＮＦは、脳室内、皮下または腹腔内に投与することによって、体重の増加が抑制され、糖代謝が改善されることが報告されている（非特許文献１０）。このことから、本発明の組成物は、肥満を抑制または改善するための組成物として、肥満者、肥満傾向にある者、またはその予備群に摂取させるか、または投与することができる。また、本発明の組成物は、糖代謝低下抑制用または糖代謝改善用の組成物として、糖尿病患者、境界型糖尿病患者、またはこれらの予備群に摂取させるか、または投与することもできる。
【００５３】
本発明の組成物は、本発明の効果を発揮することができることを限度として、本発明のＷＰＨに加えて、その他の食品原料及び／又は食品添加物原料を添加することができる。例えば、本発明の組成物に嗜好性を付与するために、甘味料（砂糖類、液糖類、果糖、麦芽糖、三温糖など）、糖アルコール（エリスリトールなど）、高感度甘味料（ステビア、アスパルテーム、スクラロース、アセスルファムカリウムなど）、酸味料、香料、果汁、野菜汁、増粘多糖類、乳化剤、矯味剤、矯臭剤などを添加することができる。また、本発明の組成物に追加の機能付与（栄養機能、生理機能）を目的に、ミネラル類（カルシウム、鉄、マンガン、マグネシウム、亜鉛など）、ビタミン類、機能性素材、プロバイオティクス乳酸菌などを添加して、本発明の組成物とすることもできる。
【００５４】
本発明の組成物は、市場での提供を目的として、容器入りの形態にすることができる。容器入りの形態としては、本発明の組成物を固体状に調製し容器に充填した態様を挙げることができる。かかる固体状の形態としては、粉末及び顆粒を挙げることができる。この場合の容器としては紙、袋、箱、缶、ビンなど、公知のものを使用することができる。このときの容器の内容量は、特に制限はなく、例えば、１〜５０００ｇ、２〜４０００ｇ、３〜３０００ｇ、４〜２０００ｇ、４〜１０００ｇ、４〜５００ｇ、４〜２５０ｇ、４〜２００ｇ、４〜１００ｇ、４〜５０ｇ、４〜３０ｇである。中でも、ファミリーサイズ（複数服用）の場合には、例えば、３００〜５０００ｇ、３００〜４０００ｇ、３００〜３０００ｇ、３００〜２０００ｇ、３００〜１５００ｇ、３００〜１４００ｇ、３００〜１３００ｇ、３００〜１２００ｇ、３００〜１１００ｇであり、パーソナルサイズ（個別服用）の場合、１〜５００ｇ、２〜２５０ｇ、３〜２００ｇ、４〜１００ｇ、４〜５０ｇ、４〜４０ｇ、４〜３０ｇ、５〜３０ｇ、１０〜３０ｇ、１５〜３０ｇである。
【００５５】
また本発明の組成物は、市場での提供を目的として、容器入り飲料の形態にすることができる。ここで容器は、飲料が充填されてそのまま飲用することができる容器であればよく、紙容器、ソフトバック、ペットボトル、缶、ビンなど、公知のものを使用することができる。当該飲料は、上記粉末または顆粒を飲用水に分散溶解して調製することができる。容器の内容量は、特に制限はなく、例えば、１〜５０００ｇ、２〜４０００ｇ、３〜３０００ｇ、４〜２０００ｇ、５〜１０００ｇ、６〜８００ｇ、７〜１３００ｇ、８０〜１２００ｇ、９０〜１１００ｇである。中でも、ファミリーサイズ（複数飲用）の場合には、例えば、３００〜５０００ｇ、３００〜４０００ｇ、３００〜３０００ｇ、３００〜２０００ｇ、３００〜１５００ｇ、３００〜１４００ｇ、３００〜１３００ｇ、３００〜１２００ｇ、３００〜１１００ｇであり、パーソナルサイズ（個別飲用）の場合、１０〜５００ｇ、２０〜５００ｇ、３０〜５００ｇ、４０〜５００ｇ、５０〜５００ｇ、６０〜５００ｇ、７０〜５００ｇ、８０〜５００ｇ、９０〜５００ｇである。
【００５６】
本発明の一つの実施態様によれば、例えば、本発明の組成物では、ＷＰＨの総タンパク質含量が一回投与（摂取）あたり、０．１ｇ以上（好ましくは１ｇ以上）となるように摂取（投与）させてもよい。好ましくは一回投与（摂取）あたりの総タンパク質含量が０．１〜４０ｇであり、より好ましくは０．１〜３０ｇ、さらに好ましくは１〜３０ｇとなるように摂取（投与）させることができる。
【００５７】
「一回投与（摂取）量」とは、体内ＢＤＮＦ量増加促進を必要とする状態の一回ごとの量を意味する。例えば、１日の所定時間に一連の運動を行う場合、その運動前またはその運動中に、投与または摂取する総量を意味し、一口で（一度に）摂取せず、数回に分けて摂取する場合は、これら数回で投与（摂取）する量をトータルして「１回投与（摂取）」とする。
【００５８】
本発明の組成物を体内、特に筋肉内のＢＤＮＦ量の増加を必要とする被験者（哺乳動物）に投与する（摂取させる）時期は、運動によるＢＤＮＦ量の増加を促進する観点からは、運動の前または運動中である。好ましくは運動前１５分〜２４０分、より好ましくは運動前３０分〜１８０分、さらに好ましくは運動前４５分〜１３５分に摂取させることができる。また運動をしない場合は、任意の時期に投与する（摂取させる）ことができるが、食前や食間などの比較的空腹なときに投与（摂取）するほうが吸収されやすいため、より高い効果を得ることができる。
【００５９】
本発明の別の実施態様によれば、例えば、本発明の組成物は、一回投与（摂取）あたりの単位包装形態で提供してもよい。当該単位包装形態を有する本発明の組成物は、当該単位中に、前記ＷＰＨを、一回投与（摂取）量として総タンパク質含量換算で０．１ｇ以上（好ましくは１ｇ以上）に調製したものが望ましく、また、一回投与（摂取）量として総タンパク質含量換算で４０ｇ以下（好ましくは３０ｇ以下）に調製したものが望ましい。つまり、単位包装当たりの本発明のＷＰＨの含有量は、一回投与（摂取）量として総タンパク質含量換算で、０．１〜４０ｇ、好ましくは０．１〜３０ｇ、より好ましくは１〜３０ｇとすることができる。ここで、「一回投与（摂取）あたりの単位包装形態」からなるとは、一回投与（摂取）あたりの量があらかじめ定められた形態のものであり、例えば、特定量を経口摂取し得る飲食品として、一般食品のみならず、飲料（ドリンク剤など）、健康補助食品、保健機能食品、サプリメントなどの形態を意味する。「一回投与（摂取）あたりの単位包装形態」では、例えば、液状の飲料、ゲル状・糊状・ペースト状のゼリー、粉末状・顆粒状・カプセル状・ブロック状の固体状の食品などの場合には、金属缶、ガラスビン（ボトルなど）、プラスチック容器（ペットボトルなど）、パック、パウチ、フィルム容器、紙箱などの包装容器で特定量（用量）を規定できる形態、あるいは、一投与（摂取）あたりの量（用法、用量）を包装容器やホームページなどに表示することで特定量を規定できる形態が挙げられる。本発明の組成物は、ＷＰＨを有効成分として用いるため、ホエイタンパク質と比較して、加熱によるゲル化が少なく、従って、飲料、ゼリー等の製造工程において適した物性を維持することができる。また、本発明の組成物は、少量の摂取であっても本発明の効果を奏するため、一口サイズのブロック状や、一飲みで摂取できるミニ缶飲料など、どのような形態であっても、摂取・嚥下が容易であり、子供や高齢者にとっての利便性を向上することができる。
【００６０】
本発明の組成物は、複数の成分が配合された組成物の形態で提供することができる。本発明の組成物の形態は、本発明の効果を奏する限り特に限定されるものではないが、例えば、固体状（粉末状、顆粒状、カプセル状、ブロック状など）、液状、ゲル状、糊状、ペースト状などの形態をとることができ、好ましくは粉末状である。組成物には、食品組成物及び医薬組成物が包含される。
【００６１】
本発明の好ましい態様によれば、ＷＰＨを有効成分として含む、ＢＤＮＦ量増加促進用飲食品が提供される。本発明において、食品の形態は、溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、固体成形物など、経口摂取可能な形態であればよく特に限定されない。具体的には、例えば、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品などの即席食品類；清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、アルコール飲料などの飲料類；パン、パスタ、麺、ケーキミックス、パン粉などの小麦粉製品；飴、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、デザート菓子などの菓子類；ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素類などの調味料；加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズなどの油脂類；乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、アイスクリーム類、クリーム類などの乳製品；農産缶詰、ジャム・マーマレード類、シリアルなどの農産加工品；冷凍食品などが挙げられる。好ましくは、飲食品は、乳製品であり、より好ましくは乳飲料、乳酸菌飲料である。
【００６２】
また、飲食品には、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品、乳幼児用調整粉乳、妊産婦もしくは授乳婦用粉乳のような分類のものも包含される。
【００６３】
本発明の飲食品には「体内のＢＤＮＦ量を増加する」、「体内のＢＤＮＦ量の増加を促進する」、「体内のＢＤＮＦ量の増加を助ける」などの旨の表示が付されてもよい。なお、上記「体内」という用語には「筋肉内」という意味も含まれる。
【００６４】
本発明の別の面によれば、ＷＰＨを哺乳動物（ヒト又は非ヒト動物が含まれる）に摂取させるか、あるいは投与することを含んでなる、体内、特に筋肉内のＢＤＮＦ量の増加促進方法が提供される。本発明のＢＤＮＦ量の増加促進方法は本発明の組成物についての記載内容に従って実施することができる
【００６５】
ここで、本発明のＢＤＮＦ量の増加促進方法においては、哺乳動物並びにこれらに由来する試料（筋肉組織、筋肉細胞）における使用であってもよく、治療的使用と非治療的使用のいずれもが意図される。ここで、「非治療的」とはヒトを手術、治療又は診断する行為（すなわち、ヒトに対する医療行為）を含まないことを意味し、具体的には、医師又は医師の指示を受けた者がヒトに対して手術、治療又は診断を行う方法を含まないことを意味する。
【実施例】
【００６６】
以下、製造例及び実験例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。但し、これらの製造例および実験例は、本発明の理解を容易するための説明に利用した一例であり、本発明はこれらによって何ら制限されるものではない。なお、特に言及しない限り、下記の製造例及び実験例は、室温（25±5℃）及び大気圧の条件で行った。また、被験試料中に含まれるタンパク質含量は、ケルダール法を用いて測定した。
【００６７】
製造例１
（１）ホエイタンパク質加水分解物（乾燥粉末物）の製造
市販のホエイタンパク質濃縮物（以下、単に「ＷＰＣ」と称する。）５０ｇを水１Ｌに溶解してＷＰＣ水溶液を調製し、これをｐＨ調整剤でｐＨ７に調整した。これに、バシラス属由来のプロテアーゼ（プロテアーゼＭアマノ、アマノエンザイム社）５００ｍｇ及びアスペルギルス属由来のプロテアーゼ（プロテアーゼＮアマノ、アマノエンザイム社）５００ｍｇを加えて、５０℃で８時間処理することで、ホエイタンパク質を加水分解した。これを加熱してプロテアーゼを失活させた後、凍結乾燥処理に供して粉末化し、これをホエイタンパク質加水分解物（ＷＰＨ）（乾燥粉末物）とした。
【００６８】
（２）成分分析
上記で得られたホエイタンパク質加水分解物（乾燥粉末物）を、０．１（ｗ／ｗ）％濃度のトリフルオロ酢酸水溶液で１０００倍（体積比）に希釈溶解し、下記の条件のＬＣ／ＭＳ／ＭＳに供して、ＷＰＨ中に含まれるジペプチド（Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ、Ａｌａ−Ｌｅｕ、及びＬｙｓ−Ｉｌｅ）の量（単位はｍｇ／ｇタンパク質：固形物換算、以下同じ。）を測定した。
【００６９】
［ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの分析条件］
カラム：ACQUITY UPLC BEH C18 Column、130Å、1.7μｍ、2.1×50mm（Waters）
移動相：Ａ液：０．１（ｗ／ｗ）％トリフルオロ酢酸含有水溶液
Ｂ液：０．１（ｗ／ｗ）％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液
移動相中のＡ液及びＢ液の割合
移動相の通液開始→0分：Ａ液100v/v％（Ｂ液0v/v%）
0分→9分：Ａ液100v/v％  →  Ａ液60 v/v%−Ｂ液40 v/v%
9分→10分：Ａ液60 v/v%−Ｂ液40 v/v%  →  Ａ液20 v/v%−Ｂ液80 v/v%
10→11分：Ａ液20 v/v%−Ｂ液80 v/v%  →  Ａ液100v/v％（Ｂ液0v/v%）
カラム温度：４０℃
流速：０．３ｍＬ／分。
【００７０】
［ＭＳ／ＭＳ条件］
ＥＳＩポジティブモード
キャピラリー電圧：３０００Ｖ
ソース温度：１２０℃
脱溶媒温度：４００℃
脱溶媒ガス流速：８５０Ｌ／時間
コーンガス流速：５０Ｌ／時間
コーン電圧：２５Ｖ
コリジョン電圧：１５ｍＶ。
【００７１】
上記製造例１で調製したＷＰＨ（乾燥粉末物）に含まれるジペプチドの含有量を表１に示す。
【表１】
2019043956.tif 000002
【００７２】
製造例２
市販のＷＰＣ（製造例１で使用したＷＰＣと同じ）５０ｇを水１Ｌに溶解してＷＰＣ水溶液を調製し、これをｐＨ調整剤でｐＨ７に調整した。これにバシラス属由来のプロテアーゼ（プロテアーゼＭアマノ、アマノエンザイム社）５００ｍｇを加え、５０℃で８時間処理して、ＷＰＣ水溶液中のホエイタンパク質を加水分解した。次いでこれを加熱してプロテアーゼを失活させた後、凍結乾燥処理に供して粉末化し、これを製造例２のＷＰＨ（乾燥粉末物）とした。
【００７３】
製造例１の（２）の欄に記載する分析方法に従って、上記で調製したＷＰＨ（乾燥粉末物）に含まれるジペプチドの量を測定した。結果を表２に記載する。
【表２】
2019043956.tif 000003
【００７４】
製造例３
市販のＷＰＣ（製造例１で使用したＷＰＣと同じ）５０ｇを水１Ｌに溶解してＷＰＣ水溶液を調製し、これをｐＨ調整剤でｐＨ７に調整した。これにアスペルギルス属由来のプロテアーゼ（プロテアーゼＮアマノ、アマノエンザイム社）５００ｍｇを加え、５０℃で８時間処理して、ＷＰＣ水溶液中のホエイタンパク質を加水分解した。次いでこれを加熱してプロテアーゼを失活させた後、凍結乾燥処理に供して粉末化し、これを製造例３のＷＰＨ（乾燥粉末物）とした。
【００７５】
製造例１の（２）の欄に記載する分析方法に従って、上記で調製したＷＰＨ（乾燥粉末物）に含まれるジペプチドの量を測定した。結果を表３に記載する。
【表３】
2019043956.tif 000004
【００７６】
製造例４
市販のＷＰＣ（製造例１で使用したＷＰＣと同じ）５０ｇを水１Ｌに溶解してＷＰＣ水溶液を調製し、これをｐＨ調整剤でｐＨ７に調整した。これにトリプシン（ノボ社）５００ｍｇを加え、３７℃で４時間反応した後、バシラス属由来のプロテアーゼ（プロテアーゼＭアマノ、アマノエンザイム社）５００ｍｇを加え、さらに５０℃で４時間反応させて、ＷＰＣ水溶液中のホエイタンパク質を加水分解した。次いでこれを加熱してプロテアーゼを失活させた後、凍結乾燥処理に供して粉末化し、これを製造例４のＷＰＨ（乾燥粉末物）とした。
【００７７】
製造例１の（２）の欄に記載する分析方法に従って、上記で調製したＷＰＨ（乾燥粉末物）に含まれるジペプチドの量を測定した。結果を表４に記載する。
【表４】
2019043956.tif 000005
【００７８】
製造例５
市販のＷＰＣ（製造例１で使用したＷＰＣと同じ）５０ｇを水１Ｌに溶解してＷＰＣ水溶液を調製し、これをｐＨ調整剤でｐＨ７に調整した。これにトリプシン（ノボ社）５００ｍｇを加え、３７℃で４時間反応後、アスペルギルス属由来のプロテアーゼ（プロテアーゼＮアマノ、アマノエンザイム社）５００ｍｇを加え、さらに５０℃で４時間反応させて、ＷＰＣ水溶液中のホエイタンパク質を加水分解した。次いでこれを加熱してプロテアーゼを失活させた後、凍結乾燥処理に供して粉末化し、これを製造例５のＷＰＨ（乾燥粉末物）とした。
【００７９】
製造例１の（２）の欄に記載する分析方法に従って、上記で調製したＷＰＨ（乾燥粉末物）に含まれるジペプチドの量を測定した。結果を表５に記載する。
【表５】
2019043956.tif 000006
【００８０】
製造例６
市販のＷＰＣ（製造例１で使用したＷＰＣと同じ）５０ｇを水１Ｌに溶解してＷＰＣ水溶液を調製し、これをｐＨ調整剤でｐＨ７に調整した。これにペプシン（和光純薬社）５００ｍｇを加えて、３７℃で４時間反応させた後、バシラス属由来のプロテアーゼ（プロテアーゼＭアマノ、アマノエンザイム社）５００ｍｇを加え、さらに５０℃で４時間反応させて、ＷＰＣ水溶液中のホエイタンパク質を加水分解した。次いでこれを加熱してプロテアーゼを失活させた後、凍結乾燥処理に供して粉末化し、これを製造例６のＷＰＨ（乾燥粉末物）とした。
【００８１】
製造例１の（２）の欄に記載する分析方法に従って、上記で調製したＷＰＨ（乾燥粉末物）に含まれるジペプチドの量を測定した。結果を表６に記載する。
【表６】
2019043956.tif 000007
【００８２】
製造例７
市販のＷＰＣ（製造例１で使用したＷＰＣと同じ）５０ｇを水１Ｌに溶解してＷＰＣ水溶液を調製し、これをｐＨ調整剤でｐＨ７に調整した。これにペプシン（和光純薬社）５００ｍｇを加え、３７℃で４時間反応させた後、アスペルギルス属由来のプロテアーゼ（プロテアーゼＮアマノ、アマノエンザイム社）５００ｍｇを加えて、さらに５０℃で４時間反応させて、ホエイタンパク質水溶液中のホエイタンパク質を加水分解した。次いでこれを加熱してプロテアーゼを失活させた後、凍結乾燥処理に供して粉末化し、これを製造例７のＷＰＨ（乾燥粉末物）とした。
【００８３】
製造例１の（２）の欄に記載する分析方法に従って、上記で調製したＷＰＨ（乾燥粉末物）に含まれるジペプチドの量を測定した。結果を表７に記載する。
【表７】
2019043956.tif 000008
【００８４】
製造例８
市販のＷＰＣ（製造例１で使用したＷＰＣと同じ）５０ｇを水１Ｌに溶解してＷＰＣ水溶液を調製し、これをｐＨ調整剤でｐＨ７に調整した。これにフレーバザイム（ノボ社）５００ｍｇを加えて、５０℃で６時間反応させて、ホエイタンパク質水溶液中のホエイタンパク質を加水分解した。次いでこれを加熱してプロテアーゼを失活させた後、凍結乾燥処理に供して粉末化し、これを製造例８のＷＰＨ（乾燥粉末物）とした。
【００８５】
製造例１の（２）の欄に記載する分析方法に従って、上記で調製したＷＰＨ（乾燥粉末物）に含まれるジペプチドの量を測定した。結果を表８に記載する。
【表８】
2019043956.tif 000009
【００８６】
製造例９
市販のＷＰＣ（製造例１で使用したＷＰＣと同じ）５０ｇを水１Ｌに溶解してＷＰＣ水溶液を調製し、これをｐＨ調整剤でｐＨ７に調整した。これにアスペルギルス属由来のプロテアーゼ（ウマミザイム、アマノエンザイム社）５００ｍｇを加え、５０℃で６時間反応させて、ＷＰＣ水溶液中のホエイタンパク質を加水分解した。次いでこれを加熱してプロテアーゼを失活させた後、凍結乾燥処理に供して粉末化し、これを製造例９のＷＰＨ（乾燥粉末物）とした。
【００８７】
製造例１の（２）の欄に記載する分析方法に従って、上記で調製したＷＰＨ（乾燥粉末物）に含まれるジペプチドの量を測定した。結果を表９に記載する。
【表９】
2019043956.tif 000010
【００８８】
製造例１０
市販のＷＰＣ（製造例１で使用したＷＰＣと同じ）５０ｇを水１Ｌに溶解してＷＰＣ水溶液を調製し、これをｐＨ調整剤でｐＨ７に調整した。これにアスペルギルス属由来のプロテアーゼ（プロテアーゼＡアマノ、アマノエンザイム社）５００ｍｇを加えて、５０℃で６時間反応させて、ＷＰＣ水溶液中のホエイタンパク質を加水分解した。次いでこれを加熱してプロテアーゼを失活させた後、凍結乾燥処理に供して粉末化し、これを製造例１０のＷＰＨ（乾燥粉末物）とした。
【００８９】
製造例１の（２）の欄に記載する分析方法に従って、上記で調製したＷＰＨ（乾燥粉末物）に含まれるジペプチドの量を測定した。結果を表１０に記載する。
【表１０】
2019043956.tif 000011
【００９０】
製造例１１
市販のＷＰＣ（製造例１で使用したＷＰＣと同じ）５０ｇを水１Ｌに溶解してＷＰＣ水溶液を調製し、これをｐＨ調整剤でｐＨ７に調整した。これにアスペルギルス属由来のプロテアーゼ（プロテアーゼＰアマノ、アマノエンザイム社）５００ｍｇを加え、５０℃で６時間反応させて、ホエイタンパク質水溶液中のホエイタンパク質を加水分解した。次いでこれを加熱してプロテアーゼを失活させた後、凍結乾燥処理に供して粉末化し、これを製造例１１のＷＰＨ（乾燥粉末物）とした。
【００９１】
製造例１の（２）の欄に記載する分析方法に従って、上記で調製したＷＰＨ（乾燥粉末物）に含まれるジペプチドの量を測定した。結果を表１１に記載する。
【表１１】
2019043956.tif 000012
【００９２】
試験例１
本試験は、乳素材であるホエイタンパク質の加水分解物の摂取と運動とを組み合わせることによる認知機能に及ぼす影響を、筋肉中のBDNF濃度を指標として評価するために行った。試験は、ラットを用いて、ホエイタンパク質加水分解物を摂取させて運動負荷した場合、ＷＰＨを摂取させずに運動負荷した場合、及びホエイタンパク質加水分解物の摂取も運動負荷もしない場合とで、骨格筋中に含まれるＢＤＮＦ濃度を測定し比較した。
【００９３】
（１）試験方法
（1-1）被験試料（試験食）の調製
試験例１の試験食には、市販のＷＰＣ（製造例１で使用したＷＰＣと同じ）をプロテアーゼにより加水分解して得られたＷＰＨ（乾燥粉末物）を用いた。なお、当該ＷＰＨには、固形分１００質量％当たり約８９．３質量％のタンパク質が含まれている。当該ＷＰＨを、固形分濃度が１０ｗ／ｖ％になるように蒸留水に溶解して、これを被験試料（試験食）とした。
【００９４】
製造例１の（２）の欄に記載する分析方法に従って、上記で調製したＷＰＨ（乾燥粉末物）に含まれるジペプチドの量（ｍｇ／ｇＷＰＨ、ｍｇ／ｇタンパク質）を測定した。結果を表１２に記載する。
【表１２】
2019043956.tif 000013
【００９５】
（1-2）被験動物の調製
被験動物として、８週齢の雄性ＳＤラットを用いた。予め４〜５日間の予備飼育を行い、予備飼育終了後、試験前日までにイソフルラン麻酔下で右下腿部を除毛した。また試験前日から１６時間の絶食を行った。
【００９６】
試験当日、体重が均等（約２９０〜３２０ｇ）になるように、下記に従って群分けを行った。
［試験群（全３群）］
（ａ）「ジペプチド非投与／非運動群」（ｎ＝６）：運動負荷を与えない、被験試料非投与
（ｂ）「ジペプチド非投与／運動群」（ｎ＝６）：運動負荷５０回、被験試料非投与
（ｃ）「ジペプチド投与／運動群」（ｎ＝３）：運動負荷５０回、被験試料投与。
【００９７】
（１−３）試験
上記各群の被験動物のうち、「ジペプチド投与／運動群」の被験動物に対して、上記で調製した被験試料（試験食）を１０ｍｌ／ｋｇ体重（ジペプチドを含有するＷＰＨ  １．０ｇ／ｋｇ体重）を単回経口投与した。投与から３０分後にイソフルラン麻酔下で右後肢に強制的に電気刺激による運動負荷（詳細は後述）を与えた。また、「ジペプチド非投与／運動群」の被験動物に対しては、被験試料（試験食）に代えて蒸留水を１０ｍｌ／ｋｇ体重の割合で単回経口投与し、投与から３０分後に上記と同様にイソフルラン麻酔下で右後肢に強制的に電気刺激による運動負荷を与えた。さらに、「ジペプチド非投与／非運動群」の被験動物に対しては、被験試料（試験食）に代えて蒸留水を１０ｍｌ／ｋｇ体重の割合で単回経口投与した後、イソフルラン麻酔下で安静にさせた。
【００９８】
「ジペプチド投与／運動群」及び「ジペプチド非投与／運動群」の被験動物については運動負荷終了３時間後、また、「ジペプチド非投与／非運動群」の被験動物については蒸留水投与後３時間３０分後に、イソフルラン麻酔下で腹部下行大静脈から全採血し、屠殺した。
【００９９】
その後、速やかに下肢骨格筋を採取し秤量した。採取した骨格筋を用いて、認知機能の評価指標であるＢＤＮＦ濃度（ｎｇ／ｇ）を測定した。
【０１００】
［運動負荷方法］
イソフルラン麻酔下でラットを、電気刺激により運動負荷を与える装置の専用固定台上にうつ伏せに固定した。右後肢の膝を圧迫固定し、足関節をフットプレートに固定した。ふくらはぎに皮膚電極を貼り、電気刺激により強制的に運動させた。強制的な運動負荷は８秒に１回の電気刺激のペースで、これを計５回繰り返すことを１セットとし、運動群には１０セット（計５０回の電気刺激）行った。尚、運動負荷様式は、アイソメトリック収縮負荷（ＩＳＯ）とした。
【０１０１】
（２）結果
結果を図１に示す。図１において（ｂ）「ジペプチド非投与／運動群」と（ａ）「ジペプチド非投与／非運動群」との比較から、運動することで筋肉中のＢＤＮＦ濃度が上昇することが確認された。また、（ｂ）「ジペプチド非投与／運動群」と（ｃ）「ジペプチド投与／運動群」との比較から、運動に加えて被験試料（ＷＰＨ）を摂取することで、運動だけの場合と比べて、筋肉中のＢＤＮＦ濃度がより一層上昇することが確認された。さらに、（ａ）「ジペプチド非投与／非運動群」と（ｃ）「ジペプチド投与／運動群」との比較から、被験試料を摂取して運動することで、摂取及び運動のいずれもしない場合と比べて、筋肉中のＢＤＮＦ濃度が格段に高く上昇することが確認された（スチューデントのｔ検定：Ｐ＜０．０５）。
【０１０２】
このことから、本発明が対象とするジペプチドを含有するＷＰＨは、その内服と運動とを組み合わせることで、骨格筋におけるＢＤＮＦ産生を促進する効果を発揮することが示された。なお、ＢＤＮＦは、血液脳関門を通過することが知られている（Pardridge WM et al. Pharm Res. 11(5):738-46（1994）。よって、筋肉内で産生されたＢＤＮＦは血液脳関門を通じて脳内に移行し、認知機能低下の抑制に寄与すると考えられる。つまり、本発明のホエイタンパク質加水分解物を摂取して運動することで、認知機能の低下が抑制できる効果を期待することができる。
【０１０３】
試験例２
本試験は、ＷＰＨ摂取の認知機能に及ぼす影響を、筋肉中のＢＤＮＦ濃度を指標として評価するために行った。試験は、ラットを用いて、ＷＰＨを摂取させた場合、ホエイタンパク質加水分解物に代えて水または加水分解物前のホエイタンパク質を摂取させた場合とで、骨格筋中に含まれるＢＤＮＦ濃度を測定し比較した。また、同様に、ＷＰＨを摂取させて運動負荷した場合、ＷＰＨに代えて水または加水分解物前のホエイタンパク質を摂取させて運動負荷した場合とで、骨格筋中に含まれるＢＤＮＦ濃度を測定し比較し、運動との併用による影響についても確認した。
【０１０４】
（１）試験方法
（１−１）被験試料（試験食、比較試験食）の調製
試験例２の試験食には、試験例１と同様に、市販のＷＰＣ（製造例１で使用したＷＰＣと同じ）をプロテアーゼにより加水分解して得られたＷＰＨ（乾燥粉末物）を用いた（表１２参照）。当該ＷＰＨを、固形分濃度が１０ｗ／ｖ％になるように蒸留水に溶解して、これを被験試料（試験食）とした。一方、比較試験食として、加水分解前のホエイタンパク質（市販のＷＰＣ、製造例１で使用したＷＰＣと同じ）を使用した。なお、試験食（ＷＰＨ）及び比較試験食（ホエイタンパク質）は、いずれもタンパク質含量に換算した投与量が１．０ｇタンパク質／体重ｋｇになるように、投与量を揃えた。
【０１０５】
（1-2）被験動物の調製
被験動物として、８週齢の雄性ＳＤラットを用いた。予め４〜５日間の予備飼育を行い、予備飼育終了後、試験前日までにイソフルラン麻酔下で右下腿部を除毛した。また試験前日から１６時間の絶食を行った。
【０１０６】
試験当日、体重が均等（約２９０〜３１０ｇ）になるように、下記に従って群分けを行った。
［試験群（全６群）］
＜運動群＞
（１）「水投与／運動群」（ｎ＝５）：運動負荷負荷５０回、水投与
（２）「ＷＰＣ投与／運動群」（ｎ＝５）：運動負荷５０回、比較試験食（ホエイタンパク質）を１．０ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／体重ｋｇ投与
（３）「ＷＰＨ投与／運動群」（ｎ＝５）：運動負荷５０回、試験食（ＷＰＨ）を１．０ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／体重ｋｇ投与。
＜非運動群＞
（ｉ）「水投与／非運動群」（ｎ＝５）：運動負荷なし、水投与
（ｉｉ）「ＷＰＣ投与／非運動群」（ｎ＝５）：運動負荷なし、比較試験食（ホエイタンパク質）を１．０ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／体重ｋｇ投与
（ｉｉｉ）「ＷＰＨ投与／非運動群」（ｎ＝５）：運動負荷なし、試験食（ＷＰＨ）を１．０ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／体重ｋｇ投与。
【０１０７】
（１−３）試験
上記運動群の被験動物には、水または被験試料を単回経口投与してから、１５分後にイソフルラン麻酔下で右下肢に強制的に電気刺激による運動負荷を与えた。運動負荷方法は試験例１に記載した通りである。非運動群の被験動物には、水または被験試料を単回経口投与してから、１５分後に前記運動群と同じ時間イソフルラン麻酔をかけた。運動群については運動負荷終了から１８０分後、非運動群については麻酔終了から１８０分後に、イソフルラン麻酔下で腹部下行大静脈から全採血し、屠殺した。その後、速やかに下肢骨格筋を採取し秤量した。採取した骨格筋を用いて、認知機能の評価指標であるＢＤＮＦ濃度（ｎｇ／ｇ）を測定した。
【０１０８】
（２）結果
運動群及び非運動群の結果をそれぞれ図２及び３に示す。図２に示すように（１）「水投与／運動群」の被験動物と比較して、（２）「ＷＰＣ投与／運動群」の被験動物は、筋中ＢＤＮＦ濃度がやや上昇するものの、有意差は認められなかった。これに対して、（３）「ＷＰＨ投与／運動群」の被験動物は、（１）「水投与／運動群」の被験動物と比較して、筋中ＢＤＮＦ濃度が有意に上昇することが確認された。また、図３に示すように非運動群も同様であり、（ｉ）「水投与／非運動群」の被験動物と比較して、（ｉｉ）「ＷＰＣ投与／非運動群」の被験動物は、筋中ＢＤＮＦ濃度が上昇するものの、有意差は認められなかったのに対して、（ｉｉｉ）「ＷＰＨ投与／非運動群」の被験動物は、（ｉ）「水投与／非運動群」の被験動物と比較して、筋中ＢＤＮＦ濃度が有意に上昇することが確認された。
【０１０９】
以上の試験例１及び２の結果から、被験試料（ジペプチド含有ＷＰＨ）の摂取による筋中ＢＤＮＦ濃度の有意な上昇は、運動の有無に関わらず、引き起こされることが確認された。こうした顕著な効果は、ジペプチド（Ｉｌｅ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ、Ｌｅｕ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ、Ａｌａ−Ｌｅｕ、または／及びＬｙｓ−Ｉｌｅ）を含有するＷＰＨ摂取によって特有に認められ、これらのジペプチドを含有しないホエイタンパク質の摂取では認められなかった。つまり、本発明のジペプチド含有ＷＰＨを、運動と組み合わせて摂取するか（例えば、運動前または運動中の摂取）、または運動と併用することなく摂取することで（非運動下での摂取）、骨格筋内でのＢＤＮＦ産生が促進され、ＢＤＮＦの体内含有量が増加することが確認された。前述するように、ＢＤＮＦは、認知機能低下の抑制、記憶や学習のパフォーマンスの向上、肥満抑制、または糖代謝低下抑制等に効果があることが示唆されている。従って、本発明のジペプチド含有ＷＰＨは、体内でのＢＤＮＦ産生を促進する作用を通じて、認知機能低下の抑制、記憶や学習のパフォーマンス向上、肥満抑制、または糖代謝低下抑制に奏功すると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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