(57)【要約】  【課題】糖尿病予防又は治療剤を簡便且つ効率的にスクリーニングできる方法を提供すること。  【解決手段】多能性幹細胞から分化誘導された肝細胞であって、ＰＩＫ３遺伝子不活性変異を有する肝細胞、あるいは多能性幹細胞から分化誘導されたインスリン反応性の肝細胞に、被験物質を適用する工程、及び、被験物質が適用された当該肝細胞のインスリン抵抗性の程度を測定する工程、を含む、糖尿病予防又は治療剤をスクリーニングする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞から分化誘導された肝細胞であって、
ＰＩＫ３遺伝子不活性変異を有する肝細胞。
【請求項２】
前記多能性幹細胞が、ＰＩＫ３遺伝子不活性変異を有する多能性幹細胞である、請求項１に記載の肝細胞。
【請求項３】
前記多能性幹細胞が、ＰＩＫ３遺伝子不活性変異を有する対象由来細胞から調製された多能性幹細胞である、請求項１又は２に記載の肝細胞。
【請求項４】
ＰＩＫ３遺伝子不活性変異がＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５α）遺伝子不活性変異である、請求項１〜３のいずれかに記載の肝細胞。
【請求項５】
ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５α）遺伝子不活性変異が、ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５α）遺伝子における１又は２以上の塩基の欠失、置換、若しくは挿入による不活性変異である、請求項１〜４のいずれかに記載の肝細胞。
【請求項６】
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、請求項１〜５のいずれかに記載の肝細胞。
【請求項７】
多能性幹細胞から分化誘導された、Ｇ６Ｐ（グルコース−６−ホスファターゼ）が発現しているインスリン反応性の肝細胞。
【請求項８】
インスリンにより
リン酸化Ａｋｔの発現が向上し、及び／又は、
Ｇ６Ｐ（グルコース−６−ホスファターゼ）の発現が低下する、
請求項７に記載の肝細胞。
【請求項９】
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、請求項７又は８に記載の肝細胞。
【請求項１０】
（Ａ）請求項１〜９のいずれかに記載の肝細胞に被験物質を適用する工程、及び
（Ｂ）被験物質が適用された当該肝細胞のインスリン抵抗性の程度を測定する工程
を含む、
糖尿病予防又は治療剤をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
（Ｂ）工程が、被験物質が適用された当該肝細胞のグルコース輸送体、リン酸化Ａｋｔ、Ｇ６Ｐ（グルコース−６−ホスファターゼ）、ＰＥＰＣＫ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ）、及び脂肪酸合成酵素から選択される少なくとも１種の発現の程度を測定する工程である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病予防又は治療剤スクリーニング方法、及び当該方法に用いる細胞等に関する。なお、本明細書に記載される全ての文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、血糖値を下げるホルモンであるインスリンの作用不足による高血糖状態が伴う疾患である。その根本病態の一つとして、インスリン抵抗性が挙げられる。しかし、インスリン抵抗性を示す糖尿病患者に対する治療剤の創生を目指す上において、インスリン抵抗性を細胞レベルで評価するために適した系が未だ確立されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Salvatore Iovino, et.al., Diabetes 2014;63:4130-4142
【非特許文献２】Salvatore Iovino, et.al., PNAS February 16, 2016 vol. 113 no. 7 1889-1894
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、糖尿病予防又は治療剤を簡便且つ効率的にスクリーニングできる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ＰＩＫ３遺伝子不活性変異を有する糖尿病患者由来細胞からｉＰＳ細胞を作製し、これを肝細胞へと分化誘導することによって、インスリン抵抗性肝細胞を調製できることを見出した。また、これまで作製が難しかった、インスリン反応性肝細胞を調製する方法を見出した。これらの知見に基づき、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００６】
本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
多能性幹細胞から分化誘導された肝細胞であって、
ＰＩＫ３遺伝子不活性変異を有する肝細胞。
項２．
前記多能性幹細胞が、ＰＩＫ３遺伝子不活性変異を有する多能性幹細胞である、項１に記載の肝細胞。
項３．
前記多能性幹細胞が、ＰＩＫ３遺伝子不活性変異を有する対象由来細胞から調製された多能性幹細胞である、項１又は２に記載の肝細胞。
項４．
ＰＩＫ３遺伝子不活性変異がＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５α）遺伝子不活性変異である、項１〜３のいずれかに記載の肝細胞。
項５．
ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５α）遺伝子不活性変異が、ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５α）遺伝子における１又は２以上の塩基の欠失、置換、若しくは挿入による不活性変異である、項１〜４のいずれかに記載の肝細胞。
項６．
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、項１〜５のいずれかに記載の肝細胞。
項７．
多能性幹細胞から分化誘導された、Ｇ６Ｐ（グルコース−６−ホスファターゼ）が発現しているインスリン反応性の肝細胞。
項８．
インスリンにより
リン酸化Ａｋｔの発現が向上し（好ましくは１．５倍以上に向上し）、及び／又は、
Ｇ６Ｐ（グルコース−６−ホスファターゼ）の発現が低下する、
項７に記載の肝細胞。
項９．
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、項７又は８に記載の肝細胞。
項１０．
（Ａ）請求項１〜９のいずれかに記載の肝細胞に被験物質を適用する工程、及び
（Ｂ）被験物質が適用された当該肝細胞のインスリン抵抗性の程度（糖新生抑制の程度若しくは脂肪酸合成促進の程度等）を測定する工程
を含む、
糖尿病予防又は治療剤をスクリーニングする方法。
項１１．
（Ｂ）工程が、被験物質が適用された当該肝細胞のグルコース輸送体、リン酸化Ａｋｔ、Ｇ６Ｐ（グルコース−６−ホスファターゼ）、ＰＥＰＣＫ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ）、及び脂肪酸合成酵素から選択される少なくとも１種の発現の程度を測定する工程である、項１０に記載の方法。
項Ａ−１．
ＰＩＫ３遺伝子不活性変異を有する多能性幹細胞。
項Ａ−２．
肝細胞への分化誘導用である、項Ａ−１に記載の多能性幹細胞。
項Ａ−３．
ｉＰＳ細胞である、項Ａ−１又は項Ａ−２に記載の多能性幹細胞。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、糖尿病予防又は治療剤を簡便且つ効率的にスクリーニングできる方法、及び当該方法に用いるのに好適なインスリン抵抗性肝細胞及びインスリン反応性肝細胞等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１ａ】ｉＰＳ細胞の樹立方法の概要を示す。
【図１ｂ】ＰＩＫ３Ｒ１変異を有する患者の細胞から作製したｉＰＳ細胞の形態（光学顕微鏡写真）を示す。
【図１ｃ】作製されたｉＰＳ細胞において、未分化マーカーとして利用される各遺伝子が発現しているかをＲＴ−ＰＣＲにより検討した結果を示す。
【図１ｄ】内胚葉系、中胚葉系、又は外胚葉系に分化させた当該ｉＰＳ細胞において、分化マーカーとして利用される各遺伝子が発現しているかをＲＴ−ＰＣＲにより検討した結果、並びに、各胚葉の分化マーカータンパク質を認識する抗体を用いて免疫染色を行った結果を示す。
【図２ａ】ｉＰＳ細胞の肝細胞への分化誘導方法についての概要を示す。
【図２ｂ】図２ａにおけるＧ６ＰＣ発現誘導方法の詳細を示す。
【図２ｃ】健常者ｉＰＳ細胞から分化誘導した肝細胞（Ｇ６ＰＣ発現誘導あり又はなし）からの回収ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す。
【図３ａ】患者ｉＰＳ細胞から分化誘導した肝細胞（インスリンの添加あり又はなし）からの回収ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す。
【図３ｂ】上記患者由来細胞若しくは健常者由来細胞から調製したｉＰＳ細胞について肝細胞への分化誘導及びＧ６ＰＣ誘導を行って回収したタンパク質を用いて、ウエスタンブロット解析を行い、リン酸化Ａｋｔの発現の亢進を検討した結果を示す。
【図３ｃ】図３ｂにおいて検出された酸化Ａｋｔのバンドの濃さをグラフにして示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の各実施形態について、さらに詳細に説明する。
【００１０】
本発明に包含される糖尿病予防又は治療剤をスクリーニングする方法は、（Ａ）特定の肝細胞に被験物質を適用する工程、及び（Ｂ）被験物質が適用された当該肝細胞のインスリン抵抗性の程度（例えば、糖新生抑制の程度若しくは脂肪酸合成促進の程度等）を測定する工程を含む。なお、当該スクリーニング方法を「本発明のスクリーニング方法」と呼ぶことがある。また、前記各工程をそれぞれ（Ａ）工程、（Ｂ）工程、と呼ぶことがある。
【００１１】
本発明のスクリーニング方法に用いられる特定の肝細胞としては、（ｉ）多能性幹細胞から分化誘導された肝細胞であって、ＰＩＫ３遺伝子不活性変異を有する肝細胞、及び（ｉｉ）多能性幹細胞から分化誘導されたインスリン反応性の肝細胞が挙げられる。以下、これらの肝細胞を、肝細胞（ｉ）、肝細胞（ｉｉ）、とそれぞれ呼ぶことがある。
【００１２】
肝細胞（ｉ）は、多能性幹細胞から分化誘導された肝細胞である。ここでの多能性幹細胞は、公知の多能性幹細胞であれば特に制限はされず、種々の公知多能性幹細胞を用いることができるが、例えばＥＳ（embryonic stem）細胞やｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞が挙げられ、中でもｉＰＳ細胞が好ましい。多能性幹細胞の調製も、公知の方法又は公知の方法から容易に想到できる方法により行うことができる。例えば、ｉＰＳ細胞の調製（樹立）は、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びｃ−ＭＹＣをベクターにより細胞（例えば線維芽細胞、末梢血単核細胞（PBMC）等）に導入することで行うことができるが、特に当該方法に限定されない。また、ベクターとしても、レトロウイルスベクターやセンダイウイルスベクターなど、ｉＰＳ細胞を調製するために有用であることが知られているベクターを適宜選択して用いることができる。なお、ｉＰＳ細胞作製に供される細胞の採取対象は、ヒトのみならず、他の哺乳類（例えばマウス、ラット、サル、イヌ等）であってもよい。ｉＰＳ細胞を調製方法としては、公知の方法が多く知られており、それら公知の方法により行ってもよい。例えば、次の文献に記載の方法により行うことができる。
・Takahashi K., and Yamanaka S. Cell 126, 663-67
・Takahashi K, et al.Cell 131, 861-872
・Nakagawa M,et al. A novel efficient feeder‐free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep 2015;4:3594
・Nishimura K,et al. J Biol Chem. 2011 Feb 11;286(6):4760-71
また例えば、CiRA（Center for iPS Cell Research and Application）のウェブページ内のiPS細胞樹立のプロトコールに記載の方法により行うことができる。
【００１３】
肝細胞（ｉ）の調製における、多能性幹細胞の肝細胞への分化誘導は、多能性幹細胞を肝細胞へと分化誘導できる公知の方法又は当該方法から容易に想到できる方法により行うことができる。例えば、Kajiwara M, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences. Jul 2012, 109 (31) 12538-12543に記載の方法、若しくは実施例に記載の方法等により調製することができる。
【００１４】
肝細胞（ｉ）は、上記のとおりＰＩＫ３遺伝子不活性変異を有する。ＰＩＫ３はＰｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−３  ｋｉｎａｓｅ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）の略であり、ＰＩ３Ｋとも表記される。ＰＩＫ３は調節サブユニットと触媒サブユニットからなり、当該調節サブユニットはｐ８５α、ｐ５５α、ｐ５０α、ｐ８５β、及びｐ５５γの各タンパク質からなり、当該触媒サブユニットはｐ１１０α、及びｐ１１０βの各タンパク質からなる、とされている。なお、より詳細には、調節サブユニットは３つの異なる遺伝子（ＰＩＫ３Ｒ１，ＰＩＫ３Ｒ２，ＰＩＫ３Ｒ３）によってコードされ，ＰＩＫ３Ｒ１遺伝子によって規定されるｐ８５α（ＰＩＫ３Ｒ１ともいうこともある）及びそのスプライシングバリアントであるｐ５５α，ｐ５０α，また，ＰＩＫ３Ｒ２遺伝子によって規定されるｐ８５βなどによって構成されている。ヒトＰＩＫ３Ｒ１，ＰＩＫ３Ｒ２，及びＰＩＫ３Ｒ３のアクセッション番号（ＮＣＢＩ）は、それぞれ、NM_181523、NM_005027、NM_003629であり、これらのｃＤＮＡ配列をそれぞれ配列１、２、３として配列表に示す。
【００１５】
ＰＩＫ３遺伝子不活性変異としては、前記各タンパク質をコードするいずれの遺伝子が不活性化される変異であってもよく、なかでもＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５α）が不活性化される変異が好ましい。また変異の種類としては、ＰＩＫ３遺伝子が不活性化されるのであれば、どのような変異であってもよい。例えば、塩基配列における１又は２以上（例えば２〜１５００の範囲に存在するいずれかの自然数であり、より具体的には例えば２〜１００、２〜５０、２〜２０、又は２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０）の塩基の変異が好ましい。この場合の変異としては、欠失、置換、若しくは挿入であってよく、読み枠内の欠失、置換、若しくは挿入がより好ましい。特に、ＰＩＫ３遺伝子不活性変異としてはとしては、ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５α）遺伝子における（好ましくは読み枠内の）１又は２塩基以上の欠失、置換、若しくは挿入が好ましい。好適な一例として、ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５α）遺伝子における一塩基置換（ｃ.１９４５ｃ＞Ｔ［ｐ．Ａｒｇ６４９Ｔｒｐ］）が挙げられる。
【００１６】
また、肝細胞（ｉ）におけるＰＩＫ３遺伝子不活性変異は、肝細胞（ｉ）の作製過程のいずれの段階で導入されたものであってもよい。例えば、当該変異を有する対象（ヒト又はその他の哺乳類）から採取した細胞を用いてｉＰＳ細胞作製をおこなってもよいし、ｉＰＳ細胞作製に供される前の細胞に当該変異が導入されていてもよいし、ｉＰＳ細胞作製時若しくはｉＰＳ細胞から肝細胞への分化誘導時に当該変異が導入されてもよいし、肝細胞への分化誘導後に当該変異が導入されてもよい。細胞への変異導入は、公知の変異導入方法又は公知の変異導入方法から容易に想到できる方法により行うことができる。例えばＰＣＲやゲノム編集技術（好ましくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム）等を用いて行うことができる。
【００１７】
なお、当該変異を有する対象から採取した細胞を用いて作製したｉＰＳ細胞、ｉＰＳ細胞作製に供される前の細胞に当該変異を導入してから作製したｉＰＳ細胞、あるいは、ｉＰＳ細胞作製時に当該変異を導入して作製したｉＰＳ細胞は、いずれも、ＰＩＫ３遺伝子不活性変異を有する。そして、ｉＰＳ細胞は多能性幹細胞の好ましい一例である。このため、本発明は、ＰＩＫ３遺伝子不活性変異を有する多能性幹細胞（好ましくはｉＰＳ細胞）をも包含する。また、当該多能性幹細胞は、特に肝細胞へと分化誘導させることにより、ＰＩＫ３遺伝子が不活性である（より好ましくは、ＩＲＳ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路が不活性である）糖尿病の予防及び／又は治療剤をスクリーニングするために好ましく用いることができることから、当該多能性幹細胞は、肝細胞への分化誘導用として用いることがより好ましい。
【００１８】
肝細胞（ｉｉ）も、多能性幹細胞から分化誘導された肝細胞である。当該多能性幹細胞については、上記の肝細胞（ｉ）について記載したものと同様の多能性幹細胞を用いることができる。また、多能性幹細胞から肝細胞への分化誘導方法についても、基本的に上記の肝細胞（ｉ）について記載したものと同様の分化誘導方法を用いることができる。ただし、インスリン反応性を肝細胞に付与するためには、上記肝細胞（ｉ）について記載した分化誘導方法後に、さらに特定の工程をさらに備えることを要する。当該特定の工程とは、培地及びウォッシュ液としてＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）培地を用いて、多能性幹細胞から分化誘導された肝細胞をさらに培養する工程である。ウォッシュ液としては通常ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いることが多く、ウォッシュ液として培地であるＤＭＥＭを用いることはありそうで中々ない。また、培地及びウォッシュ液として用いるＤＭＥＭ培地は、グルコースフリーであることが好ましい。
【００１９】
また、培地として用いるＤＭＥＭは、ステロイド化合物を含むこと（言い換えればステロイド化合物を添加すること）が好ましい。具体的には、例えば、デキサメタゾンを含むことが好ましい。ステロイド化合物の含有濃度は、例えば０．０５〜０．２μＭ程度が挙げられる。また、培養に用いるＤＭＥＭは、ｃＡＭＰ（サイクリックＡＭＰ）を含むこと（言い換えれば、ｃＡＭＰを添加すること）が好ましい。ｃＡＭＰの含有濃度は、例えば０．１〜１ｍＭ程度が挙げられる。また、インスリンの反応性を確認するために、当該ＤＭＥＭ培地はインスリンを含有していてもよい。インスリンの濃度としては、例えば、１０〜２００ｎＭが挙げられる。
【００２０】
またさらに、当該特定の工程は、前記ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培地１とよぶことがある）で培養した後、さらに当該ＤＭＥＭ培地とは組成の異なり得る（つまり、ＤＭＥＭ培地への添加物が異なり得る）ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培地２とよぶことがある）へと培地交換して培養する工程を包含する。但し、ＤＭＥＭ培地１とＤＭＥＭ培地２の組成が同じことを妨げるわけではなく、ＤＭＥＭ培地１とＤＭＥＭ培地２の組成は同一であっても異なっていてもよい。ＤＭＥＭ培地２は、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン酸、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、デキサメタゾン、及びｃＡＭＰからなる群より選択される少なくとも１種の成分が添加されていることが好ましく、当該全成分が添加されていることが特に好ましい。なお、ＤＭＥＭ培地２におけるデキサメタゾン及びｃＡＭＰの含有濃度はＤＭＥＭ培地１において記載したものと同様であり、その他の前記成分の含有濃度については、例えば次の範囲が挙げられる。ピルビン酸ナトリウム：１０〜４０ｍＭ程度（好ましくは１５〜２５ｍＭ程度）、Ｌ−グルタミン酸：０．５〜２ｍＭ程度、ＨＥＰＥＳ：５〜２５ｍＭ程度（好ましくは１０〜２０ｍＭ程度）。また、インスリンの反応性を確認するために、当該ＤＭＥＭ培地２はインスリンを含有していてもよい。インスリンの濃度としては、例えば、１０〜２００ｎＭが挙げられる。
【００２１】
なお、ＤＭＥＭ培地１からＤＭＥＭ培地２へ培地交換する際は、上記の通り、ウォッシュは（好ましくはグルコースフリーの）ＤＭＥＭ培地で行う。
【００２２】
当該特定の工程を経ることにより、多能性幹細胞から分化誘導された肝細胞をインスリン反応性とすることができる。なお、インスリン反応性が有るとは、インスリンを適用することにより、ＩＲＳ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路が活性化されることを通常いう。本発明では当該経路が活性化されたか否か（すなわち、インスリン反応性があるか否か）は、例えばインスリンを適用した際に適用前に比べてＡｋｔのリン酸化程度が向上したか否かで判断できる。当該リン酸化程度が向上すれば、インスリン反応性があると判断できる。Ａｋｔのリン酸化程度は、例えば免疫学的手法（ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等）により行うことができる。好ましくは、インスリンを適用した際に適用前に比べてリン酸化Ａｋｔの発現が１．５倍以上になる場合にインスリン反応性があると判断できる。また、本発明では、インスリン反応性があるか否かは、例えばインスリンを適用した際に適用前と比べて肝糖新生酵素Ｇ６Ｐ（グルコース−６−ホスファターゼ）の発現が向上するか否かで判断することもできる。Ｇ６Ｐの発現が低下すればインスリン反応性があると判断できる。Ｇ６Ｐの発現の検討は、例えばＲＴ−ＰＣＲ及び／又は免疫学的手法（ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等）により行うことができる。なお、特に制限はされないが、Ｇ６ＰにおけるＧ６ＰＣ（グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット）の発現を検討することが好ましい。ヒトＧ６ＰＣのアクセッション番号（ＮＣＢＩ）はNM_000151である。なお、肝細胞（ｉｉ）は、Ｇ６Ｐが発現したインスリン反応性の肝細胞であることが特に好ましい。公知の方法により幹細胞から分化誘導された肝細胞では、Ｇ６Ｐの発現がみられず、よってＧ６Ｐの発現が低下するか否かによってインスリン反応性の程度を測定することが困難であった。
【００２３】
（Ａ）工程において用いられる被験物質は、特に制限はされない。例えば、化合物及び組成物であり得る。化合物としては、例えば低分子化合物や、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ等）やタンパク質（例えば抗体又はその一部等）、ポリマー等の高分子化合物であってよい。組成物としても、生物（例えば動物、植物、微生物等）から得た抽出物等であってもよく、化合物を２種以上組み合わせたものであってもよい。
【００２４】
被験物質の適用方法についても特に制限されるものではなく、例えば、上記肝細胞（肝細胞（ｉ）又は肝細胞（ｉｉ））の培地に添加する方法（好ましくは添加して培養する方法）が挙げられる。
【００２５】
（Ｂ）工程においては、被験物質が適用された上記肝細胞のインスリン抵抗性の程度を測定する。当該肝細胞のインスリン抵抗性の程度が、被験物質適用前と比べて、改善（すなわち、低減）されていれば、適用された被験物質は糖尿病予防又は治療剤（の有効成分）として有用であるとして選抜（スクリーニング）できる。
【００２６】
なお、肝細胞（ｉ）はＰＩＫ３遺伝子不活性変異を有するためインスリン抵抗性である。肝細胞（ｉ）に被験物質を適用することにより、肝細胞（ｉ）のインスリン抵抗性の程度が改善すれば、当該被験物質はインスリンシグナルの異常（特にＰＩＫ３の作用不全に起因するインスリンシグナルの異常）があってもインスリン作用を発揮させることができる効果を有するため、好ましい。また、肝細胞（ｉｉ）はインスリン反応性であるため、被験物質によるインスリン抵抗性の改善をより高感度に検出することができ、好ましい。
【００２７】
インスリン抵抗性の程度の測定は、例えば、糖新生抑制の程度及び脂肪酸合成促進の程度等の測定により行うことができる。より具体的には、インスリンにより生じることが知られている公知の事象（インスリンにより生じる細胞の変化）を測定することにより行うことができる。このような事象としては、公知であって測定が可能であるものであれば特に制限はされず、例えば、インスリンにより発現が向上若しくは低下することが知られている遺伝子若しくはタンパク質、あるいはインスリンにより合成が促進される若しくは抑制される化合物等について、その量を測定することによりインスリン抵抗性の程度を測定することができる。さらに具体的には、例えば、肝細胞中のグルコース輸送体（glucose transporter：ＧＬＵＴ）、リン酸化Ａｋｔ、Ｇ６Ｐ（特にＧ６ＰＣ）、ＰＥＰＣＫ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ）、又は脂肪酸合成酵素の発現を挙げることができる。グルコース輸送体（中でも好ましくはグルコース輸送体４：ＧＬＵＴ４）の発現が向上すれば、インスリン抵抗性が低減したと判断できる。リン酸化Ａｋｔの発現が向上すれば、インスリン抵抗性が低減したと判断できる。Ｇ６Ｐの発現が低下すれば、インスリン抵抗性が低減したと判断できる。ＰＥＰＣＫは糖新生に係る酵素であり、この発現が低下すれば、インスリン抵抗性が低減したと判断できる。脂肪酸合成酵素は解糖系に関わる酵素であり、この発現が向上すれば、インスリン抵抗性が低減したと判断できる。
【００２８】
これらの発現の増減の測定のため、公知の方法又は公知の方法から容易に想到できる方法を用いることができる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲやウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
発現を測定するこれらの事象は、単独又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３０】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本発明は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。
【００３１】
また、上述した本発明の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本発明に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本発明には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、ｉＰＳ細胞の樹立に関しては、公知の方法、例えば、CiRA（Center for iPS Cell Research and Application）のウェブページ内のiPS細胞樹立のプロトコールを適宜参考にすることができる。
【００３３】
（ＰＩＫ３Ｒ１変異を有する患者細胞又は健常者細胞からのｉＰＳ細胞の樹立）
インスリン受容体（ＩＲ）遺伝子には異常を認めないが、出生直後から高インスリン結晶を呈し、インスリン抵抗性である患者について、当該患者及び当該患者の両親及び子供のエクソーム解析を行い、見出されたアミノ酸変化が予測された変異についてタンパク質機能変化予測解析を行ったところ、ＰＩ３キナーゼの調節サブユニットであるｐ８５α遺伝子のみにアミノ酸変化による機能変化が予測された。具体的には、当該遺伝子においてｃ．１９４５Ｃ＞Ｔ［ｐ．Ａｒｇ６４９Ｔｒｐ］変異が認められた。
【００３４】
当該患者から末梢血単核細胞（PBMC）を採取し、これを用いてｉＰＳ細胞を作製した。まず、血球培地１（X vivo-10(Lonza) 15ml、10μg/ml IL-2 15μL、Dynabeads CD3/CD28 50μL）で５日間当該細胞を培養した後、センダイウイルスベクター（ＳｅＶ）を用いてＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、及びｃ−ＭＹＣ遺伝子を導入した（MOI (Multiplicity of infection)＝２）。その後、ｉＰＳ用の培地に交換して培養を続けた。遺伝子導入後、最初の８日間はｂＦＧＦ添加なしで培養し、その後はｂＦＧＦを添加して培養を続けた。２０〜３０日目にヒトES細胞様コロニーを単離し、株化した。以上のＰＩＫ３Ｒ１変異を有する患者細胞からのｉＰＳ細胞の樹立方法の概要を、図１ａに示す。図１ａ中、CD3/28は抗CD3/CD28抗体(Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28,Life Technologies)、IL-2はrecombinant human IL-2(Pepro Tech)を示しており、これらは培地内へ添加されている。センダイウイルスは活性化しているＴ細胞に導入されやすいことから、抗CD3/28抗体とIL-2により末梢血中のＴ細胞を活性化するためである。なお、健常者からも末梢血単核細胞（PBMC）を採取し、同様にしてｉＰＳ細胞を作製した。また、作製されたｉＰＳ細胞の形態（光学顕微鏡写真）を図１ｂに示す。
【００３５】
また、作製されたｉＰＳ細胞からＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡを回収し、未分化マーカーとして利用される各遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにより検討した。結果を図１ｃに示す。未分化マーカーであるＯＣＴ３／４及びＮＡＮＯＧの発現が確認された。（センダイウイルスベクターは検出されず、また逆転写酵素（ＲＴ）を用いないネガティブコントロールでも増幅は検出されなかった。）
【００３６】
さらに、ＰＩＫ３Ｒ１変異を有する患者細胞から得られたｉＰＳの多分化能を確認すべく、胚様体形成法にて三胚葉への分化が可能であるかを検討した。
【００３７】
内胚葉系、中胚葉系、又は外胚葉系に分化させた当該ｉＰＳ細胞から上記と同様にしてＲＮＡを回収し、分化マーカーとして利用される各遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにより検討した。また、各胚葉の分化マーカータンパク質を認識する抗体を用いて免疫染色を行った。結果を図１ｄに示す。各胚葉に分化したｉＰＳ細胞が、各胚葉の分化マーカーを発現していることが確認できた。よって、ＰＩＫ３Ｒ１変異を有する患者細胞から得られたｉＰＳは多能性であることが分かった。
【００３８】
（ｉＰＳ細胞の肝細胞への誘導）
以下のようにして、各ｉＰＳ細胞を肝細胞へ分化誘導した。
培地（ＡＫ０２Ｎ：ヒトｉＰＳ細胞用フィーダーレス培地；味の素）を除去しＰＢＳ  ｗａｓｈ  し０．５ｘＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（トリプシン代替物）を３００μＬ添加し３７℃で４分インキュベートした。ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔを除去しＰＢＳ  ｗａｓｈしＡＫ０２Ｎを１ｍＬ加えた。セルスクレーパーで細胞を剥離し１０回ピペッティングしシングルセルとした。トリパンブルーで染色し細胞数をカウントした。１ウェルあたり３．８ｘ１０５個となるようにして８００ｒｐｍ，５分遠心し、上清を除去した。ＲＰＭＩ１６４０（標準的細胞培養培地；ＧＩＢＣＯ）、１ｘＢ２７（血清代替物）、１００ｎｇ／ｍｌ  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、２μＭ  ＣＨＩＲ−９９０２１、２ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅにＹ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤でありｉＰＳ細胞の細胞分散時に細胞死を抑制する）を加えた培地を１ウェルあたり１ｍＬ加えて細胞を懸濁し、ラミニンコート済み１２ウェルプレートに播種した（Ｄａｙ０）。Ｄａｙ１にＹ−２７６３２を抜きＮａＢ（酪酸ナトリウム；アセチル化酵素阻害剤）を加えた培地に変更した。その後、Ｄａｙ６まで毎日培地交換した。Ｄａｙ７に、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ、２０％  ＫＳＲ（KnockOutTM Serum Replacement；血清代替物）、１％  ＤＭＳＯ、１％  ｎｏｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、１ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１００μＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌによる培地へ変更し、以後ｄａｙ１３まで毎日培地交換した。Ｄａｙ１４にＨＣＭ、２０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬ  ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍによる培地に交換し、以後ｄａｙ２１まで毎日培地交換した。
【００３９】
（Ｇ６ＰＣ（グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット）発現誘導）
ｄａｙ２１に培地を除去し、ＤＭＥＭで１回ｗａｓｈし、ＤＭＥＭ（マウス初代肝細胞を使用した報告〔Hong S,et al. Nat Med. 2015;21(8):887-94〕ではＷｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ  ｍｅｄｉｕｍを使用しているが、本実施例ではＤＭＥＭへ変更した）、０．１μＭ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、０．５ｍＭ  ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ（＋／−  １００ｎＭ  ｉｎｓｕｌｉｎ）へ変更した。１８時間後に培地を除去し、ｇｌｕｃｏｓｅ  ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭで１回ｗａｓｈし（通常は培地交換時のｗａｓｈはＰＢＳで行われるが、本実施例ではｇｌｕｃｏｓｅ  ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭを使用した）、ｇｌｕｃｏｓｅ  ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ、２０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、２ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１μＭ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、０．５ｍＭ  ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ（＋／−  １００ｎＭ  ｉｎｓｕｌｉｎ）へ交換した。６時間後にＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、得られた肝細胞からＲＮＡを回収した。
【００４０】
以上の、ｉＰＳ細胞の肝細胞への分化誘導方法についての概要を図２ａに示す。また、図２ａにおけるＧ６ＰＣ発現誘導方法の詳細について図２ｂに示す。
【００４１】
また、健常者由来細胞から調製したｉＰＳ細胞について肝細胞への分化誘導及びＧ６ＰＣ誘導を行って回収したＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行い、アルブミン（ＡＬＢ）及びα-フェトプロテイン（ＡＦＰ）の発現、並びにＧ６ＰＣの発現の有無を検討した。アルブミンは肝細胞マーカーであり、α−フェトプロテインは肝腫瘍マーカーである。結果を図２ｃに示す。なお図２ｃにおける「発現誘導」の有無はＧ６ＰＣの発現誘導の有無を意味する。また、Ｇ６ＰＣの発現を確認したＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーの配列は次の通りである。フォワードプライマー：gggaaagataaagccgacctac、リバースプライマー：gaggaaaatgagcagcaagg。
【００４２】
また、上記患者由来細胞から調製したｉＰＳ細胞について肝細胞への分化誘導及びＧ６ＰＣ誘導を行って回収したＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行い、アルブミン（ＡＬＢ）及びα-フェトプロテイン（ＡＦＰ）の発現、並びにＧ６ＰＣの発現の有無を検討した。結果を図３ａに示す。
【００４３】
さらにまた、上記患者由来細胞若しくは健常者由来細胞から調製したｉＰＳ細胞について、上記ｄａｙ２１後にＧ６ＰＣ誘導発現誘導は行わず、単に培地をＤＭＥＭ（グルコース含）に変更して18時間後に蛋白質を回収した。ただし、タンパク質回収の３０分前にＬＹ２９４００２（公知のＰＩＫ３阻害剤）  ５０μＭを添加し（又は添加せず）、また回収する１０分前にインスリン １００ｎＭを添加した（又は添加しなかった）。なお、タンパク質回収はM-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific)を用いて行った。
【００４４】
得られたタンパク質を用いて、ウエスタンブロット解析を行い、リン酸化Ａｋｔの発現の亢進を検討した。ウエスタンブロット解析は、具体的には次のようにして行った。M-PER Mammalian Protein Extraction Reagentで細胞を溶解した。ＢＣＡアッセイによってこの細胞溶解物の蛋白質濃度を測定した。同量の蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動を行った後、ＰＶＤＦ膜へ転写した。その後、5% skim milk in TBS-Tでブロッキング（室温で1時間）し、ＴＢＳ−Ｔで３回ｗａｓｈした後に１次抗体反応を行った（４℃、オーバーナイト）。その後ＴＢＳ−Ｔで３回ｗａｓｈした後に２次抗体反応を行い（室温、１時間）、ＴＢＳ−Ｔで３回ｗａｓｈした後にImmobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate（Merck Millipore） を反応させ、Amersham Imager 600で撮影した。用いた抗体を以下に示す。
1次抗体：rabbit抗リン酸化Akt抗体(＃9271,Cell Signaling technology)、rabbit抗Akt抗体(＃9272,Cell Signaling technology)、ｍouse抗β-アクチン抗体（A5441, Sigma）
2次抗体：Anti-Rabbit IgG HRP Conjugate(W401B,Promega)、Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody （#7076, Cell Signaling technology）
【００４５】
結果を図３ｂに示す。また、検出されたリン酸化Ａｋｔのバンドの濃さを、それぞれのサンプルで検出されたＡｋｔのバンドの濃さを１としたときの相対値としてグラフに示したものを、図３ｃに示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【配列表】
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