(57)【要約】      （修正有）【課題】極少量の抽出ＤＮＡから、数多くのＳＴＲおよびＳＮＰを正確に検査できる方法を提供する。【解決手段】極少量のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を用いて，短鎖繰り返し多型（ＳＴＲ）あるいは一塩基多型（ＳＮＰ）の型検査を行う際に、事前に調製されたプライマー混合液（プライマーミックス）を複数混ぜ合わせて、一度にＰＣＲ（混合ＰＣＲと称する）することで、数多くの多型部位を同時に増幅し、得られた増幅産物を希釈後に、それぞれのプライマーミックスを用いて，再ＰＣＲ（分離ＰＣＲと称する）したものを分析することで，数多くのＳＴＲおよびＳＮＰを正確に型判定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を用いた遺伝子型検査において，事前に調製されたプライマー混合液（プライマーミックス）を複数混ぜ合わせて，一度にＰＣＲ（混合ＰＣＲと称する）を行うことで，数多くの多型部位を同時に増幅し，得られた増幅産物を希釈後に，それぞれのプライマーミックスを用いて，再ＰＣＲ（分離ＰＣＲと称する）することで，極少量のＤＮＡから正確な型判定を可能にする検査方法．
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  この発明は，極少量のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）から，多数の短鎖繰り返し多型（ＳＴＲ）及び一塩基多型（ＳＮＰ）を検査する手法に関するものである．
【背景技術】
【０００２】  生物のゲノムには，２塩基から６塩基の短い塩基配列が数回から数十回繰り返し現れる箇所が存在しており，この特徴的な配列パターンのことをマイクロサテライトと呼んでいる．ゲノム上に現れるマイクロサテライトは，その繰り返し回数が個体によって異なることがあり，短鎖繰り返し多型（ＳＴＲ）と呼ばれ，個体識別に用いられている．【０００３】  ＳＴＲを用いた個体識別は，これらの部位を含む一対のプライマーを用いてＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動法で分離し，サイズマーカーと比較してＤＮＡ断片の長さ（繰り返し数）を決定するもので，蛍光標識プライマーを用いたマルチプレックスＳＴＲ検査キットが市販され，広く利用されている．
【非特許文献１】
2019201621.tif 000002
【０００４】  また，生物のゲノムには個体によって異なる塩基置換部位や塩基の欠損・挿入部位が存在しており，この違いを一塩基多型（ＳＮＰ）と呼んでいる．ＳＮＰには２つ（極くまれに３つ以上）の対立遺伝子しか存在しないため個体識別力は低いが，身体的特徴や疾病に関与するＳＮＰが数多く報告されている．【０００５】  ＳＮＰを用いた個体識別は，塩基の挿入・欠損を含む多型部位をＰＣＲ増幅して得られたＤＮＡ断片を電気泳動法で分離し，サイズマーカーと比較してＤＮＡ断片の長さを決定するもので，蛍光標識プライマーを用いたマルチプレックスＳＮＰ検査キットが市販され，広く利用されている．
【非特許文献２】
2019201621.tif 000003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  蛍光標識プライマーを用いたマルチプレックスＳＴＲ検査キットやＳＮＰ検査キットは，４色または５色の蛍光色素で標識されたプライマーセットを用いて，複数の多型部位を同時分析可能だが，蛍光色素の数は限られているため，より多くの多型部位を検査するには，増幅サイズが重ならないように鎖長を長くする必要がある．しかし，陳旧資料から得られるＤＮＡは分解しており，この様な断片化ＤＮＡを検査する場合は，増幅産物の鎖長を出来るだけ短くする必要がある．【０００７】  鎖長の短い増幅産物からなる検査キットは市販され，広く利用されているが，一度に検査出来る多型部位は限られており個人識別精度は低い．
【非特許文献３】
2019201621.tif 000004
【０００８】  鎖長の短い増幅産物からなる検査キットを多数用いて，複数回検査を行うことで，個人識別精度を上げることが出来るが，適正なＰＣＲに必要な鋳型ＤＮＡ量は決まっており，極少量のＤＮＡで複数の検査を行うことは困難である．【０００９】  本発明の課題は，断片化した極少量のＤＮＡから，出来るだけ多くの多型部位を正確に検査出来る方法を提供することである．
【課題を解決するための手段】
【００１０】  この発明は，鎖長の短い増幅産物からなるマルチプレックスＳＴＲ検査またはＳＮＰ検査用に，予め調製されたプライマー混合液（プライマーミックス）を複数（２〜１０セット）混ぜ合わせて，一度にＰＣＲする（混合ＰＣＲと称する）ことで，数多くの多型部位を同時に増幅し，得られた増幅産物を希釈後に，それぞれのプライマーミックスを用いて，再ＰＣＲする（分離ＰＣＲと称する）ことで，極少量のＤＮＡから正確な型判定を可能にする検査手法である．
【発明の効果】
【００１１】  通常，極少量のＤＮＡを分割して用いると，確率的変動による鋳型ＤＮＡの分取不均衡が生じるため，正確な検査を行うことは困難であるが，本発明によれば，抽出ＤＮＡを分割せずに全量用いてＰＣＲすることが出来るため，より正確な型判定が可能となる．【００１２】  また，本発明によれば，サイズが同じＰＣＲ増幅産物も，分離ＰＣＲによって別々に分けて検査出来るため，鎖長を調整する必要がない．更に，非蛍光プライマーを用いたマルチプレックスＳＴＲ検査またはＳＮＰ検査が可能である．
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】  以下，本発明を実施するための最良の形態について説明する．【００１４】  陳旧資料からＤＮＡを抽出する．得られたＤＮＡを鋳型として，マルチプレックスＳＴＲ検査またはＳＮＰ検査用に調製されたプライマー混合液（プライマーミックス）を複数（２〜１０セット）混ぜ合わせてＰＣＲを行う．得られた増幅産物を滅菌水で希釈し，その一部を鋳型として，それぞれのプライマーミックスを用いて再ＰＣＲを行う．この時ＰＣＲサイクル１回につき２倍の増幅産物が得られるため，希釈倍率に従ってＰＣＲサイクル数を決定する．得られたＰＣＲ産物を電気泳動法で分離し型判定を行う．【００１５】  事前に調製するプライマー混合液（プライマーミックス）は，市販の検査キットに添付のものを用いるか新たに作製する．新たに作製する場合は，各プライマーミックスのアニーリング温度を出来るだけ揃えて，増幅不均衡や非特異ピークが生じないようにする．混合ＰＣＲの反応条件は，市販の検査キットのプロトコルに従って行うことが出来る．【００１６】  混合ＰＣＲで得られた増幅産物を滅菌水で希釈するとき，希釈倍率が１００倍以下だと混合した各プライマーの影響が出ることがあり，１００万倍以上だと各増幅産物の分取不均衡が生じる危険性があるため，希釈倍率は２００倍から１０万倍の範囲内にする．
【実施例】
【００１７】  サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のマルチプレックスＳＴＲ検査キットであるＡｍｐＦｌＳＴＲ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ  Ｐｌｕｓ  ｋｉｔ（以下ＩＤＰとする）とＡｍｐＦｌＳＴＲ  Ｙｆｉｌｅｒ  ｋｉｔ（以下ＹＦとする）とＡｍｐＦｌＳＴＲ  Ｍｉｎｉｆｉｌｅｒ  ｋｉｔ（以下ＭＦとする）の各プライマーミックスを等量混合した液５マイクロリットルと，ＩＤＰに添付のＰＣＲマスターミックス１０マイクロリットルを混ぜ合わせ，型既知の鋳型ＤＮＡ約０．５ナノグラムを用いて混合ＰＣＲを行った．【００１８】  得られたＰＣＲ産物を滅菌水で約６００倍に希釈した液１マイクロリットルを鋳型としてＩＤＰとＹＦとＭＦによる分離ＰＣＲを行った．ＰＣＲ条件は各キットのプロトコルに従って１４サイクルで行った．【００１９】  分離ＰＣＲで得られた増幅産物の一部をホルムアミドに加えて加熱・冷却した後，サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のフラグメントアナライザーＭｏｄｅｌ  ３１３０Ｘｌを用いたキャピラリー電気泳動を行い，ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒａ  ＩＤ  Ｓｏｆｔｗａｒｅで解析を行った．【００２０】  解析の結果，各キットの全てのＳＴＲにおいて正しい型が得られ，少量の鋳型ＤＮＡを用いて３種類のマルチプレックスＳＴＲ検査を正確に行うことが出来た．