(57)【要約】      （修正有）【課題】本発明は、胃腸管内の様々なｐＨ環境に適応し、酸と塩基にわたる環境下（ｐＨ５〜８）でウレアーゼの活性を抑制し、ｐＨ６.８〜７.３でウレアーゼの活性を有意に抑制することができる多重ｐＨ値の緩衝剤組成物を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、ウレアーゼの活性を抑制するための組成物を提供する。前記組成物は、有機酸、リン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの酸成分と、有機塩、リン酸塩及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの塩成分と、アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるウレアーゼ活性抑制剤とを含み、前記少なくとも一つの酸成分及び前記少なくとも一つの塩成分は、互いに共役して緩衝剤を形成する。【選択図】図１
2019214549.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト若しくは動物の体内又は土壌中のウレアーゼ活性を抑制するための組成物の使用であって、前記組成物は、
有機酸、リン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの酸成分と、
有機塩、リン酸塩及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの塩成分と、
アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるウレアーゼ活性抑制剤と、を含み、
前記少なくとも一つの酸成分及び前記少なくとも一つの塩成分は、互いに共役して緩衝剤を形成することを特徴とする、前記組成物の使用。
【請求項２】
前記緩衝剤が、ｐＨ５〜８を保持することを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項３】
前記緩衝剤が、ｐＨ＞４の時にアスコルビン酸の活性を持続させることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項４】
ウレアーゼの活性を抑制するための組成物であって、
有機酸、リン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの酸成分と、
有機塩、リン酸塩及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの塩成分と、
アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるウレアーゼ活性抑制剤と、を含み、
前記少なくとも一つの酸成分及び前記少なくとも一つの塩成分は、互いに共役して緩衝剤を形成することを特徴とする、前記組成物。
【請求項５】
前記組成物が、調製粉乳及び動物飼料のいずれかである栄養補助食品又は飲み物に添加されることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記有機酸が、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、リンゴ酸、フマル酸、乳酸及びクエン酸からなる群から選択される一つであり、
前記有機塩及び前記リン酸塩のいずれかが、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩のいずれかであることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも一つの酸成分が、リン酸及びクエン酸のいずれかであり、
前記リン酸塩が、リン酸水素二カリウム及びリン酸水素二ナトリウムのいずれかであり、
前記有機塩が、クエン酸ナトリウム及びクエン酸カリウムのいずれかであることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記緩衝剤が、前記ウレアーゼ活性抑制剤と均一に混合されていることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
前記緩衝剤が、ｐＨ５〜８を保持することを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アスコルビン酸が、１２０ｐｐｍ〜４８０ｐｐｍの濃度範囲であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項１１】
前記アスコルビン酸の塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩及びそれらの組み合わせからなる群から選択される一つであることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、ｐＨ５〜８の環境においてウレアーゼの活性を阻害することを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、ｐＨ６．８〜７．３の環境においてウレアーゼの活性を阻害することを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、粉末、粒子、錠剤、ミクロン粒子、液体及びカプセルからなる群から選択される一つとして製造されることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項１５】
アスコルビン酸が、Ｌ-アスコルビン酸であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト若しくは動物の体内又は土壌中のウレアーゼ活性を抑制するための組成物に関する。特に、本発明は、酸と塩基にわたる範囲でウレアーゼ活性を抑制するための組成物及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウレアーゼは、異なる細菌間で高度の相同性を有し、尿素をアンモニア及び二酸化炭素に加水分解することができる。ウレアーゼは、ヒト及び動物の胃腸管における細菌感染症において一般的に見られ、ヒト及び動物における病原体の病原性因子である。
【０００３】
ウレアーゼは、細胞質ウレアーゼ及び表面ウレアーゼという二つのクラスに分類することができる。両方のウレアーゼを同時に有する病原体は、より強い耐酸性を有し、一方、細胞質ウレアーゼを有するだけの病原体は、より弱い耐酸性を有する（Helicobacter pylori：Physiology and Genetics（2001））。
【０００４】
ヘリコバクター・ピロリは、ヒトの消化管の寄生細菌であり、通常は胃粘膜上皮に存在しているが、口腔内で増殖することもある。ヘリコバクター・ピロリが産生するウレアーゼは、尿素を速やかにアンモニアと二酸化炭素に分解するので、ヘリコバクター・ピロリが胃での胃酸からの影響を受けにくい。
【０００５】
尿素は、約４６％の窒素を含む主要な窒素肥料である。尿素肥料が土壌に投与されると、ウレアーゼは、尿素の急速な加水分解を促進して揮発性アンモニア（すなわち環境汚染源）を生成する。
【０００６】
ウレアーゼによって引き起こされる上述の問題を考慮して、出願人は、ヒト、動物または土壌におけるウレアーゼの活性を抑制するための非薬物抑制剤を開発し、この非薬物抑制剤は、環境に優しく、現在の製品の欠点を補うことができる。本発明の要旨を以下に説明する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Helicobacter pylori：Physiology and Genetics（2001）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の主な目的は、ヒト若しくはヒト以外の動物の胃腸管内又は土壌中のウレアーゼの活性を抑制するための組成物を提供することである。本発明は、胃腸管の通常の生理機能を乱さないように、多重ｐＨ値の緩衝剤組成物を提出し、消化管の異なるｐＨ条件下で最適に機能することによってウレアーゼの活性が抑制される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の多重ｐＨ値の緩衝剤組成物は、胃腸管内の様々なｐＨ環境に適応し、酸と塩基にわたる環境下（ｐＨ５〜８）でウレアーゼの活性を抑制し、ｐＨ６.８〜７.３でウレアーゼの活性を有意に抑制することができる。上記の効果を達成するために、本発明の多重ｐＨ値の緩衝剤組成物は、有機酸、リン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの酸成分と、有機塩、リン酸塩及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの塩成分と、アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるウレアーゼ活性抑制剤と、を含む。前記酸成分及び前記塩成分は、緩衝剤を形成し、ウレアーゼ活性阻害剤を前記緩衝剤中で安定した高い活性を示す。
【００１０】
本発明は、ウレアーゼの活性を阻害するための組成物を提供する。前記組成物は、有機酸、リン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの酸成分と、有機塩、リン酸塩及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの塩成分と、アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるウレアーゼ活性抑制剤と、を含み、前記少なくとも一つの酸成分及び前記少なくとも一つの塩成分は、互いに共役して緩衝剤を形成する。前記緩衝剤は、ウレアーゼ活性阻害剤の活性を安定化させるためのものである。
【００１１】
本発明の上記の目的及び利点は、以下の詳細な説明及び添付の図面から、当業者にとっって明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】リン酸緩衝液における対照群（ウレアーゼを含む）及び種々の濃度（１２０ｐｐｍ、２４０ｐｐｍ及び４８０ｐｐｍ）のアスコルビン酸を含む実験群がｐＨ５、６、６.８、７.０、７.３と８という環境下で測定された尿素加水分解抑制率を示すヒストグラムである。
【図２】クエン酸緩衝液における対照群（ウレアーゼを含む）及び種々の濃度（１２０ｐｐｍ、２４０ｐｐｍ及び４８０ｐｐｍ）のアスコルビン酸を含む実験群がｐＨ６.８、７.０と７.３という環境下で測定された尿素加水分解抑制率を示すヒストグラムである。
【図３】ヘリコバクター・ピロリ試験（ＶｉｔＣ又はＩｓｏ−ＶｉｔＣ＝０／４８０／９６０ｐｐｍ）に対する本発明のアスコルビン酸の酸緩衝組成物の生菌数を示す図である。
【図４】ヘリコバクター・ピロリ試験（ＶｉｔＣ又はＩｓｏ−ＶｉｔＣ＝０／１５００／３０００／６０００ｐｐｍ）に対する本発明のアスコルビン酸の酸緩衝組成物の生菌数を示す図である。
【図５】ヘリコバクター・ピロリ試験（ＶｉｔＣ＝６０００ｐｐｍ；リン酸（Ｐ）又はクエン酸（Ｃ）緩衝液）に対する本発明のアスコルビン酸の酸緩衝組成物の生菌数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に提供される緩衝剤組成物は、少なくとも一つの酸成分、少なくとも一つの塩成分、及びウレアーゼ活性抑制剤を含む。本発明の緩衝剤組成物は、ヒト若しくは動物の栄養補助食品又は動物飼料に添加することができる。更に、本発明の緩衝剤組成物は、アンモニア排出を減らし、ウレアーゼの急速な酵素加水分解によって引き起こされる尿素肥料の損失を減らすことを助けるために、土壌または尿素肥料に添加することができる。従って、緩衝剤組成物に使用される成分は、生物に対して無毒で環境に優しいものを必要とする。本発明における酸成分は、好ましくは有機酸であり、塩成分は、好ましくは有機塩であり、ウレアーゼ活性抑制剤は、アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩又はそれらの組み合わせである。また、リン酸及びリン酸塩は、食品添加物として広く使用されているので、それらも本発明の酸成分及び塩成分の範囲に包含される。
【００１４】
酸成分は、塩基成分と共役関係を有して（例えば有機酸とその共役塩、または有機塩とその共役酸）、緩衝剤を形成する。緩衝剤のｐＨ値は、酸成分の解離定数（ｐＫａ）及び塩成分に対する酸成分の比によって決定される。一般に、ｐＨ値は±１ｐＫａの範囲内にある。一般的な有機酸、リン酸、アスコルビン酸のpKa値は、表１に示される（Lab Manual for Zumdahl/Zumdahl’s Chemistry 6th Edition参照）。これらの酸成分の中で、より高いｐＫａ値を有するリン酸は、アルカリ性環境で作用することができ、本発明の緩衝剤における酸成分のための最良の選択である。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
適切な酸成分及び塩基成分によって形成される緩衝剤は多重ｐＨ値を保持することができるので、胃腸管の環境における変化に適応してウレアーゼ活性抑制剤を胃腸管においてよく機能させることができる。
【００１７】
本発明に用いられる酸成分としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、リンゴ酸、フマル酸、乳酸、クエン酸又はリン酸が挙げられる。好ましい実施形態では、酸成分はリン酸又はクエン酸である。本発明で使用される塩成分は有機塩又はリン酸塩であり、好ましくは、有機塩又はリン酸塩は、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩を指す。好ましい実施形態では、リン酸塩は、リン酸水素二カリウム又はリン酸水素二ナトリウムであり、有機塩は、クエン酸ナトリウム又はクエン酸カリウムである。
【００１８】
本発明の緩衝剤は、複数の有機酸とそれらの共役塩、または複数の有機塩とそれらの共役酸を更に含んでもよい。有機酸は、リン酸と組み合わせて、本発明の緩衝剤における酸成分としてもよい。有機塩もリン酸と組み合わせて、本発明の緩衝剤における塩成分としてもよい。胃腸管のｐＨ値条件に適しているとされ得る任意の緩衝剤は、本発明の範囲内にある。
【００１９】
本発明で使用されるウレアーゼ活性抑制剤は、アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩又はそれらの組み合わせである。好ましくは、アスコルビン酸の塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩又はそれらの組み合わせのうちの一つである。
【００２０】
ビタミンＣとしても知られるアスコルビン酸（L-アスコルビン酸）は、水溶性で吸収しやすい化合物である。アスコルビン酸は、水溶液中に単独で存在する場合、ｐＨが４を超える環境で容易に分解される。本発明の緩衝剤は、４より高いｐＨで、アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩、又はそれらの組み合わせの活性を確実に維持させて、ウレアーゼの活性を抑制するという目的を達成することができる。特に、ヒト又は動物の胃腸管内の酸と塩基にわたる環境、土壌中のウレアーゼ活性を抑制するという目的を達成することができる。
【００２１】
別の態様において、本発明の組成物は、ウレアーゼの活性を抑制するための組成物として使用することができる。例えば、本発明の組成物は、調製粉乳、動物飼料又は肥料などの栄養補助食品用の添加剤であってもよく、飲料として直接製造してもよい。本発明の組成物は、ｐＨ５〜８で環境中のウレアーゼの活性を抑制してもよく、好ましくはｐＨ６．８〜７．３で環境中のウレアーゼの活性を抑制してもよい。
【００２２】
本発明によれば、上記組成物は、少なくとも一つの酸成分、少なくとも一つの塩成分及びウレアーゼ活性抑制剤を含む。少なくとも一つの酸成分及び少なくとも一つの塩成分は、緩衝剤を形成する。前記緩衝剤は、ウレアーゼ活性抑制剤が酸と塩基にわたる環境において活性を確実に維持することを可能にする。一つの実施形態において、ウレアーゼ活性抑制剤は、前記緩衝剤中に分配されている。別の実施形態において、前記緩衝剤はウレアーゼ活性抑制剤と均一に混合されている。
【００２３】
本発明において、ウレアーゼ活性抑制剤はアスコルビン酸、そのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩又はそれらの組み合わせである。好ましい態様において、ウレアーゼ活性抑制剤はアスコルビン酸、特にＬ−アスコルビン酸である。アスコルビン酸の濃度は、好ましくは１２０ｐｐｍ〜４８０ｐｐｍ、より好ましくは４８０ｐｐｍである。もちろん、本発明のアスコルビン酸の濃度は、人体に対して推奨される１日の摂取量を満たす限り、より高くなってもよい（１日当たり約２ｇまで）。
【００２４】
本発明によれば、上記組成物の剤形は、粉末、粒子、錠剤、ミクロン粒子、液体、カプセル又はスプレーを含む。上記剤形は、遅延若しくは持続放出錠剤、遅延若しくは持続放出ミクロン粒子、又は遅延若しくは持続放出カプセルなどの遅延若しくは持続放出製剤として設計してもよく、ヒト又は動物用の飲料として製造すること、ヒト又は動物用の飲料水中に添加すること、又は土壌中で使用される肥料スプレーとして製造してもよい。
【００２５】
有機酸の静菌法及び殺菌法は、分子状態（非解離状態）で細胞内に拡散して水素イオンを放出し、環境のｐＨを低下させることにより、細胞内液が酸性化され、さらに細胞内のさまざまな酵素や生化学反応機能を破壊し、細菌を死滅させる（Ｄ１の４／１１頁右欄８〜２０行目参照）。 
【００２６】
ヘリコバクター・ピロリは強力なウレアーゼを持つグラム陰性菌である。有機酸分子が細胞に入って放出された水素イオンは、ウレアーゼ加水分解尿素によって生成されたアンモニアによって即座に中和されるので、自体の強力なウレアーゼを有するヘリコバクター・ピロリだけが極めて酸性の胃で生き残ることができる。
【００２７】
本発明の抗ヘリコバクター・ピロリ組成物の抗菌と殺菌装置は以下の通りである。
ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼとその活性については、1998年の消化器疾患専門誌GUTに特別調査報告書が掲載されている（Ｄ２）。細胞の外部ウレアーゼ（external urease）は、ウレアーゼの約５％を占め、最適ｐＨは約７.５〜８.０である。細胞の内部ウレアーゼ（internal urease）は、ウレアーゼの約９５％を占め、最適ｐＨは、約３.０〜５.５である。細胞の外部ウレアーゼの活性が比較的低い環境ｐＨは約４.５〜５.０であり、環境ｐＨが４.５より低い場合、細胞の外部ウレアーゼはほとんど活性を示さない（Ｄ２の第Ｓ５８頁と図１参照）。ヘリコバクター・ピロリの生存、分裂及び繁殖に有利に働く細胞間質ｐＨは６〜８である。周辺微小環境ｐＨ＝７.４の場合、細胞の外部ウレアーゼはほぼ最高の活性であり、外部の酸（水素イオン）を除去するのに役立ち得る（Ｄ３の第１８頁の図６参照）ので、本発明の緩衝組成物による殺菌には役立たない。ヘリコバクター・ピロリの細胞間質ｐＨは４〜６であり、生存に有益ですが、分割して増殖させることはできないので、本発明の緩衝組成物による殺菌には役立つ。
【００２８】
上記のヘリコバクター・ピロリの生存条件から判断すると、本発明の緩衝組成物の殺菌効率が最も良く発揮されるｐＨは、約４.０〜６.０である。ｐＨ＝５の緩衝液にアスコルビン酸を添加した後、ｐＨが４.５に近いので、ヘリコバクター・ピロリの細胞の外部ウレアーゼはｐＨ＜４.５でほぼ不活性である。このとき、本発明の緩衝組成物が拡散によって細胞間質に急速に入ることが有利である（Ｄ１の４／１１頁右欄８〜２０行目参照）。「至適ｐＨを有する緩衝微小環境」において、有機酸（アスコルビン酸を含む）分子状態が示す拡散効果は、ヘリコバクター・ピロリを効果的に排除することができる。本発明の緩衝剤組成物のｐＨは、有機酸が分子状態（解離していない状態）でヘリコバクター・ピロリ細胞内に拡散しているため、無期に低下させることができない。リン酸のＫａｌが２.１２、クエン酸のＫａｌが３.１３、アスコルビン酸のＫａｌが４.１である。したがって、この場合の緩衝組成物の適切なｐＨ範囲は４〜６である。ヘリコバクター・ピロリは、ｐＨ４〜６で分裂及び増殖しないので、本発明の緩衝組成物によるｐＨ４〜６での殺菌には役立つ。
【００２９】
ヘリコバクター・ピロリの細胞間物質のｐＨは約６.１〜６.２であるので（Ｄ３の第１８頁の図６参照）、本発明の緩衝剤組成物は、ｐＨが６より少ないとき、分子状態が小分子である有機酸（例えばクエン酸、アスコルビン酸）が拡散によって細胞間質に入って解離し、水素イオンを生成することが有利である（Ｄ１の４／１１頁右欄８〜２０行目参照）。ヘリコバクター・ピロリの殺菌に使用されるほとんどの抗生物質は、ヘリコバクター・ピロリが繁殖して分裂するときのメカニズムを破壊するので、殺菌効果を得るために胃内で制酸剤（PPI=プロトンポンプ阻害剤）を組み合わせる必要がある（Ｄ２の第Ｓ５9頁右欄「Strategies for eradication」及び図３参照）。本発明の緩衝組成物の殺菌効果は、ヘリコバクター・ピロリが分裂現象を有さない場合、ｐＨ４〜６の環境でより効果的に殺菌することができる。本発明の緩衝剤組成物について、ｐＨ＝４〜６が好ましい殺菌環境である。
【００３０】
胃は、ヘリコバクター・ピロリの寄生環境（ｐＨ３〜６）に適し（Ｄ２の第Ｓ５９頁左欄“The ecological niche of H pylori”)、胃前庭は、最も適した寄生環境である（胃前庭粘膜のｐＨが約４.５〜５.５、Ｄ４の第1880頁の図4参照）。本発明の緩衝組成物は、酸性環境で殺菌されているので、環境ｐＨの上昇を導くためにＰＰＩを使用する必要はない（Ｄ２の第Ｓ５９頁の図３と第Ｓ５９頁右欄“Strategies for eradication”参照）。
【００３１】
同時に、胃腸粘膜は親水性であり、一定の粘度を有し、より大きな分子量の物質（薬物又は毒性もしくは疎水性物質等を含む）を排除するために、サイズ排除フィルター及び内部作用を有する（Ｄ５の第１８１頁の右側にある”The mucus barriers”と第１８２頁の図２参照）。
【００３２】
本発明の緩衝組成物は、拡散によって粘膜を通して上皮に達することができる小分子物質である。
【００３３】
［実施例］
Ｉ．実験方法
１.ウレアーゼの活性抑制実験（リン酸塩緩衝溶液、ｐＨ５.０）
１．１対照群
２０μLの緩衝溶液及び２５μLの５０ｐｐｍウレアーゼ（U7752、Sigma-Aldrich）を取って９６ウェルプレートに置き、混合物を３７℃で５分間反応させた後、４０μＬの２０ｍＭ尿素溶液を混合物に添加した。３７℃で１０分間反応させた後、各ウェルに５５μLのベルテロ（Berthelot）試薬Ａ（５ｇのフェノールと２５ｍｇのニトロプルシドナトリウムを混合し、純水で５００ｍＬにする）及び６０μＬのベルテロ（Berthelot）試薬Ｂ（２．５ｇの水酸化ナトリウムと４．２ｍＬの次亜塩素酸ナトリウムを混合し、純水で５００ｍＬにする）を加えた。混合物を３７℃で３０分間暗所に放置した後、吸光度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により波長６２５ｎｍで測定した。各サンプルは少なくとも３回測定した。
１．２アスコルビン酸基サンプル群
１０μLの緩衝溶液、１０μLのアスコルビン酸溶液及び２５μLの５０ｐｐｍウレアーゼを取って９６ウェルプレートに置き、混合物を３７℃で５分間反応させた後、４０μＬの２０ｍＭ尿素溶液を混合物に添加し、アスコルビン酸の最終濃度をそれぞれ１２０ｐｐｍ、２４０ｐｐ及び４８０ｐｐｍとした。３７℃で１０分間反応させた後、各ウェルに５５μLのベルテロ試薬Ａ及び６０μＬのベルテロ試薬Ｂを加えた。混合物を３７℃で３０分間暗所に放置した後、吸光度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により波長６２５ｎｍで測定した。各サンプルは少なくとも３回測定した。ウレアーゼの活性の抑制率（Inhibitory％）＝１００−（（サンプルの吸光度／対照群の吸光度）×１００）。
【００３４】
２.ウレアーゼの活性抑制実験（リン酸塩緩衝溶液、ｐＨ６.０）
２．１対照群
２０μLの緩衝溶液及び２５μLの５０ｐｐｍウレアーゼを取って９６ウェルプレートに置き、混合物を３７℃で５分間反応させた後、４０μＬの２０ｍＭ尿素溶液を混合物に添加した。３７℃で１０分間反応させた後、各ウェルに５５μLのベルテロ試薬Ａ及び６０μＬのベルテロ試薬Ｂを加えた。混合物を３７℃で３０分間暗所に放置した後、吸光度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により波長６２５ｎｍで測定した。各サンプルは少なくとも３回測定した。
２．２アスコルビン酸基サンプル群
１０μLの緩衝溶液、１０μLのアスコルビン酸溶液及び２５μLの５０ｐｐｍウレアーゼを取って９６ウェルプレートに置き、混合物を３７℃で５分間反応させた後、４０μＬの２０ｍＭ尿素溶液を混合物に添加し、アスコルビン酸の最終濃度をそれぞれ１２０ｐｐｍ、２４０ｐｐ及び４８０ｐｐｍとした。３７℃で１０分間反応させた後、各ウェルに５５μLのベルテロ試薬Ａ及び６０μＬのベルテロ試薬Ｂを加えた。混合物を３７℃で３０分間暗所に放置した後、吸光度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により波長６２５ｎｍで測定した。各サンプルは少なくとも３回測定した。ウレアーゼの活性の抑制率（Inhibitory％）＝１００−（（サンプルの吸光度／対照群の吸光度）×１００）。
【００３５】
３.ウレアーゼの活性抑制実験（リン酸塩緩衝溶液、ｐＨ６.８）
３．１対照群
２０μLの緩衝溶液及び２５μLの５０ｐｐｍウレアーゼを取って９６ウェルプレートに置き、混合物を３７℃で５分間反応させた後、４０μＬの２０ｍＭ尿素溶液を混合物に添加した。３７℃で１０分間反応させた後、各ウェルに５５μLのベルテロ試薬Ａ及び６０μＬのベルテロ試薬Ｂを加えた。混合物を３７℃で３０分間暗所に放置した後、吸光度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により波長６２５ｎｍで測定した。各サンプルは少なくとも３回測定した。
３．２アスコルビン酸基サンプル群
１０μLの緩衝溶液、１０μLのアスコルビン酸溶液及び２５μLの５０ｐｐｍウレアーゼを取って９６ウェルプレートに置き、混合物を３７℃で５分間反応させた後、４０μＬの２０ｍＭ尿素溶液を混合物に添加し、アスコルビン酸の最終濃度をそれぞれ１２０ｐｐｍ、２４０ｐｐ及び４８０ｐｐｍとした。３７℃で１０分間反応させた後、各ウェルに５５μLのベルテロ試薬Ａ及び６０μＬのベルテロ試薬Ｂを加えた。混合物を３７℃で３０分間暗所に放置した後、吸光度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により波長６２５ｎｍで測定した。各サンプルは少なくとも３回測定した。ウレアーゼの活性の抑制率（Inhibitory％）＝１００−（（サンプルの吸光度／対照群の吸光度）×１００）。
【００３６】
４.ウレアーゼの活性抑制実験（リン酸塩緩衝溶液、ｐＨ７.０）
４．１対照群
２０μLの緩衝溶液及び２５μLの５０ｐｐｍウレアーゼを取って９６ウェルプレートに置き、混合物を３７℃で５分間反応させた後、４０μＬの２０ｍＭ尿素溶液を混合物に添加した。３７℃で１０分間反応させた後、各ウェルに５５μLのベルテロ試薬Ａ及び６０μＬのベルテロ試薬Ｂを加えた。混合物を３７℃で３０分間暗所に放置した後、吸光度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により波長６２５ｎｍで測定した。各サンプルは少なくとも３回測定した。
４．２アスコルビン酸基サンプル群
１０μLの緩衝溶液、１０μLのアスコルビン酸溶液及び２５μLの５０ｐｐｍウレアーゼを取って９６ウェルプレートに置き、混合物を３７℃で５分間反応させた後、４０μＬの２０ｍＭ尿素溶液を混合物に添加し、アスコルビン酸の最終濃度をそれぞれ１２０ｐｐｍ、２４０ｐｐ及び４８０ｐｐｍとした。３７℃で１０分間反応させた後、各ウェルに５５μLのベルテロ試薬Ａ及び６０μＬのベルテロ試薬Ｂを加えた。混合物を３７℃で３０分間暗所に放置した後、吸光度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により波長６２５ｎｍで測定した。各サンプルは少なくとも３回測定した。ウレアーゼの活性の抑制率（Inhibitory％）＝１００−（（サンプルの吸光度／対照群の吸光度）×１００）。
【００３７】
５.ウレアーゼの活性抑制実験（リン酸塩緩衝溶液、ｐＨ７.３）
５．１対照群
２０μLの緩衝溶液及び２５μLの５０ｐｐｍウレアーゼを取って９６ウェルプレートに置き、混合物を３７℃で５分間反応させた後、４０μＬの２０ｍＭ尿素溶液を混合物に添加した。３７℃で１０分間反応させた後、各ウェルに５５μLのベルテロ試薬Ａ及び６０μＬのベルテロ試薬Ｂを加えた。混合物を３７℃で３０分間暗所に放置した後、吸光度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により波長６２５ｎｍで測定した。各サンプルは少なくとも３回測定した。
５．２アスコルビン酸基サンプル群
１０μLの緩衝溶液、１０μLのアスコルビン酸溶液及び２５μLの５０ｐｐｍウレアーゼを取って９６ウェルプレートに置き、混合物を３７℃で５分間反応させた後、４０μＬの２０ｍＭ尿素溶液を混合物に添加し、アスコルビン酸の最終濃度をそれぞれ１２０ｐｐｍ、２４０ｐｐ及び４８０ｐｐｍとした。３７℃で１０分間反応させた後、各ウェルに５５μLのベルテロ試薬Ａ及び６０μＬのベルテロ試薬Ｂを加えた。混合物を３７℃で３０分間暗所に放置した後、吸光度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により波長６２５ｎｍで測定した。各サンプルは少なくとも３回測定した。ウレアーゼの活性の抑制率（Inhibitory％）＝１００−（（サンプルの吸光度／対照群の吸光度）×１００）。
【００３８】
６.ウレアーゼの活性抑制実験（リン酸塩緩衝溶液、ｐＨ８.０）
６．１対照群
２０μLの緩衝溶液及び２５μLの５０ｐｐｍウレアーゼを取って９６ウェルプレートに置き、混合物を３７℃で５分間反応させた後、４０μＬの２０ｍＭ尿素溶液を混合物に添加した。３７℃で１０分間反応させた後、各ウェルに５５μLのベルテロ試薬Ａ及び６０μＬのベルテロ試薬Ｂを加えた。混合物を３７℃で３０分間暗所に放置した後、吸光度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により波長６２５ｎｍで測定した。各サンプルは少なくとも３回測定した。
６．２アスコルビン酸基サンプル群
１０μLの緩衝溶液、１０μLのアスコルビン酸溶液及び２５μLの５０ｐｐｍウレアーゼを取って９６ウェルプレートに置き、混合物を３７℃で５分間反応させた後、４０μＬの２０ｍＭ尿素溶液を混合物に添加し、アスコルビン酸の最終濃度をそれぞれ１２０ｐｐｍ、２４０ｐｐ及び４８０ｐｐｍとした。３７℃で１０分間反応させた後、各ウェルに５５μLのベルテロ試薬Ａ及び６０μＬのベルテロ試薬Ｂを加えた。混合物を３７℃で３０分間暗所に放置した後、吸光度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により波長６２５ｎｍで測定した。各サンプルは少なくとも３回測定した。ウレアーゼの活性の抑制率（Inhibitory％）＝１００−（（サンプルの吸光度／対照群の吸光度）×１００）。
【００３９】
７.ウレアーゼの活性抑制実験（クエン酸塩緩衝溶液、ｐＨ６.８）
７．１対照群
２０μLの緩衝溶液及び２５μLの５０ｐｐｍウレアーゼを取って９６ウェルプレートに置き、混合物を３７℃で５分間反応させた後、４０μＬの２０ｍＭ尿素溶液を混合物に添加した。３７℃で１０分間反応させた後、各ウェルに５５μLのベルテロ試薬Ａ及び６０μＬのベルテロ試薬Ｂを加えた。混合物を３７℃で３０分間暗所に放置した後、吸光度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により波長６２５ｎｍで測定した。各サンプルは少なくとも３回測定した。
７．２アスコルビン酸基サンプル群
１０μLの緩衝溶液、１０μLのアスコルビン酸溶液及び２５μLの５０ｐｐｍウレアーゼを取って９６ウェルプレートに置き、混合物を３７℃で５分間反応させた後、４０μＬの２０ｍＭ尿素溶液を混合物に添加し、アスコルビン酸の最終濃度をそれぞれ１２０ｐｐｍ、２４０ｐｐ及び４８０ｐｐｍとした。３７℃で１０分間反応させた後、各ウェルに５５μLのベルテロ試薬Ａ及び６０μＬのベルテロ試薬Ｂを加えた。混合物を３７℃で３０分間暗所に放置した後、吸光度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により波長６２５ｎｍで測定した。各サンプルは少なくとも３回測定した。ウレアーゼの活性の抑制率（Inhibitory％）＝１００−（（サンプルの吸光度／対照群の吸光度）×１００）。
【００４０】
８.ウレアーゼの活性抑制実験（クエン酸塩緩衝溶液、ｐＨ７.０）
８．１対照群
２０μLの緩衝溶液及び２５μLの５０ｐｐｍウレアーゼを取って９６ウェルプレートに置き、混合物を３７℃で５分間反応させた後、４０μＬの２０ｍＭ尿素溶液を混合物に添加した。３７℃で１０分間反応させた後、各ウェルに５５μLのベルテロ試薬Ａ及び６０μＬのベルテロ試薬Ｂを加えた。混合物を３７℃で３０分間暗所に放置した後、吸光度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により波長６２５ｎｍで測定した。各サンプルは少なくとも３回測定した。
８．２アスコルビン酸基サンプル群
１０μLの緩衝溶液、１０μLのアスコルビン酸溶液及び２５μLの５０ｐｐｍウレアーゼを取って９６ウェルプレートに置き、混合物を３７℃で５分間反応させた後、４０μＬの２０ｍＭ尿素溶液を混合物に添加し、アスコルビン酸の最終濃度をそれぞれ１２０ｐｐｍ、２４０ｐｐ及び４８０ｐｐｍとした。３７℃で１０分間反応させた後、各ウェルに５５μLのベルテロ試薬Ａ及び６０μＬのベルテロ試薬Ｂを加えた。混合物を３７℃で３０分間暗所に放置した後、吸光度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により波長６２５ｎｍで測定した。各サンプルは少なくとも３回測定した。ウレアーゼの活性の抑制率（Inhibitory％）＝１００−（（サンプルの吸光度／対照群の吸光度）×１００）。
【００４１】
９.ウレアーゼの活性抑制実験（クエン酸塩緩衝溶液、ｐＨ７.３）
９．１対照群
２０μLの緩衝溶液及び２５μLの５０ｐｐｍウレアーゼを取って９６ウェルプレートに置き、混合物を３７℃で５分間反応させた後、４０μＬの２０ｍＭ尿素溶液を混合物に添加した。３７℃で１０分間反応させた後、各ウェルに５５μLのベルテロ試薬Ａ及び６０μＬのベルテロ試薬Ｂを加えた。混合物を３７℃で３０分間暗所に放置した後、吸光度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により波長６２５ｎｍで測定した。各サンプルは少なくとも３回測定した。
９．２アスコルビン酸基サンプル群
１０μLの緩衝溶液、１０μLのアスコルビン酸溶液及び２５μLの５０ｐｐｍウレアーゼを取って９６ウェルプレートに置き、混合物を３７℃で５分間反応させた後、４０μＬの２０ｍＭ尿素溶液を混合物に添加し、アスコルビン酸の最終濃度をそれぞれ１２０ｐｐｍ、２４０ｐｐ及び４８０ｐｐｍとした。３７℃で１０分間反応させた後、各ウェルに５５μLのベルテロ試薬Ａ及び６０μＬのベルテロ試薬Ｂを加えた。混合物を３７℃で３０分間暗所に放置した後、吸光度を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により波長６２５ｎｍで測定した。各サンプルは少なくとも３回測定した。ウレアーゼの活性の抑制率（Inhibitory％）＝１００−（（サンプルの吸光度／対照群の吸光度）×１００）。
【００４２】
ＩＩ．実験結果
１．実験例１
この実施形態において、リン酸とリン酸塩を利用してリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）を形成し、さまざまな濃度を有するアスコルビン酸（１２０ｐｐｍ、２４０ｐｐ及び４８０ｐｐｍ）と共に用意し、各群におけるウレアーゼ活性の抑制率を異なるｐＨ条件下で測定した。
【００４３】
表２と図１を参照し、対照群（ウレアーゼを含む）及び種々の濃度（１２０ｐｐｍ、２４０ｐｐｍ及び４８０ｐｐｍ）を含むアスコルビン酸の実験群のウレアーゼ加水分解の抑制率を示す。表２の結果から、尿素加水分解の抑制率はアスコルビン酸の濃度と正の相関があることが観察できる。５０％抑制率を比較指標として、４８０ｐｐｍのアスコルビン酸を含む群は、ｐＨ６.０〜８.０での抑制率が５０％より高く、ｐＨ６.８〜７.３での抑制率が９３％より高い。これは、４８０ｐｐｍのアスコルビン酸を含有する群が、対照群に対して有意な抑制効果を有することを示す。
【００４４】
【表２】
2019214549.tif 000004
【００４５】
２．実験例２
この実施形態において、クエン酸とクエン酸塩リン酸とリン酸塩を利用してクエン酸塩緩衝溶液（ＣＢＳ）を形成し、さまざまな濃度を有するアスコルビン酸（１２０ｐｐｍ、２４０ｐｐ及び４８０ｐｐｍ）と共に用意し、各群におけるウレアーゼ活性の抑制率を異なるｐＨ条件下で測定した。
【００４６】
表３と図２を参照し、対照群（ウレアーゼを含む）及び種々の濃度（１２０ｐｐｍ、２４０ｐｐｍ及び４８０ｐｐｍ）を含むアスコルビン酸の実験群のウレアーゼ加水分解の抑制率を示す。表３と図２の結果から、尿素加水分解の抑制率はアスコルビン酸の濃度と正の相関があることが観察できる。５０％抑制率を比較指標として、４８０ｐｐｍのアスコルビン酸を含む群は、ｐＨ６.８〜７.３での抑制率が５０％より高く、ｐＨ６.８〜７.０での抑制率が９０％より高い。これは、４８０ｐｐｍのアスコルビン酸を含有する群が、対照群に対して有意な抑制効果を有することを示す。
【００４７】
【表３】
2019214549.tif 000005
【００４８】
各ｐＨ環境における光学濃度（ＯＤ）値に比較してみて、光学濃度値がより高くなると、測定されたアンモニア濃度がより高くなることを示す。ｐＨ５〜８の環境では、対照群の光学濃度値を比較指標として使用した。アスコルビン酸はｐＨ５〜８の環境においてウレアーゼ加水分解に対して抑制効果を有し、特にｐＨ６.８〜７.３の環境において抑制率が９０％を超えることが観察された。
【００４９】
本発明の組成物は薬物成分も含有しないので、薬物耐性及び食品安全性に対する懸念において疑いなく使用することができる。本発明の組成物がヒトまたは動物の栄養補助食品の添加剤として使用されるとき、ウレアーゼ活性を抑制する効果を有する。
【００５０】
フェーズ１：ヘリコバクター・ピロリに対するアスコルビン酸の酸緩衝組成物（VitC又はIso-VitC=0/480/960ppm）
（一）実験方法：
１．菌種及び培養方法
実験はヘリコバクター・ピロリ 26695（ATCC700392）で、ブルセラ固形培地（ブルセラ培養液（Brucella broth）２８ｇ／Ｌ、寒天15ｇ／Ｌ及び１０％（ｖ/ｖ）ウマ血清（Horse serum）、ｐＨ７.０）を用いて継代培養し、線画法で植菌した後、湿式嫌気槽において微好気性袋（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を用いて３７℃、７２時間静置培養した。
【００５１】
２．ヘリコバクター・ピロリ抑制試験（３７℃；ｐＨ＝７.４；尿素添加なし；検出時間：０／２４時間）
０.２２μｍインジェクションフィルターでろ過した培養液を７２時間継代培養したヘリコバクター・ピロリに添加し、細菌濃度を106-107 ＣＦＵ／ｍＬに調整し、湿式嫌気槽に入れて微好気性袋（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を用いて３７℃で２４時間静置培養した。
【００５２】
各培養液は以下の通りです。
第一組：N0 (Brucella broth 28g/L and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第二組：NVc480 (Brucella broth 28g/L , 480mg/L Vitamin C and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第三組：NVc960 (Brucella broth 28g/L , 960mg/L Vitamin C and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第四組：NIc480 (Brucella broth 28g/L , 480mg/L Isoascorbic acid and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第五組：NIc960 (Brucella broth 28g/L , 960mg/L Isoascorbic acid and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第六組：P0 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Phosphate buffered saline (PBS) and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第七組：PVc480 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Phosphate buffered saline (PBS), 480mg/L Vitamin C and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第八組：PVc960 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Phosphate buffered saline (PBS), 960mg/L Vitamin C and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第九組：PIc480 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Phosphate buffered saline (PBS), 480mg/L Isoascorbic acid and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第十組：PIc960 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Phosphate buffered saline (PBS), 960mg/L Isoascorbic acid and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第十一組：C0 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Citrate buffer and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第十二組：CVc480 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Citrate buffer, 480mg/L Vitamin C and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第十三組：CVc960 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Citrate buffer, 960mg/L Vitamin C and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第十四組：CIc480 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Citrate buffer, 480mg/L Isoascorbic acid and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第十五組：CIc960 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Citrate buffer, 960mg/L Isoascorbic acid and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
【００５３】
２４時間培養後の各培養液を生理食塩水で１０倍に連続希釈した後、各倍に希釈した培養液をプレートコート法でブルセラ固形培地に塗布し、湿式嫌気槽内で微好気性袋（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を用いて３７℃で７２時間静置培養し、最終的に各培養液の生菌数を算出した。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
（二）実験結果の説明
図３から、水、水とアスコルビン酸、又は純粋な緩衝液が抗ヘリコバクター・ピロリ効果を示すことができず、「アスコルビン酸」と「抗ヘリコバクター・ピロリ」とは確かに「用量関係」があるが、完全に殺菌できないことが観察された。  
【００５６】
フェーズ２：ヘリコバクター・ピロリに対するアスコルビン酸の酸緩衝組成物（VitC又はIso-VitC=0/1500/3000/6000ppm）
（一）実験方法：
１．菌種及び培養方法
実験はヘリコバクター・ピロリ 26695（ATCC700392）で、ブルセラ固形培地（ブルセラ培養液２８ｇ／Ｌ、寒天15ｇ／Ｌ及び１０％（ｖ/ｖ）ウマ血清、ｐＨ７.０）を用いて継代培養し、線画法で植菌した後、湿式嫌気槽において微好気性袋（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を用いて３７℃、７２時間静置培養した。    
【００５７】
２．ヘリコバクター・ピロリ抑制試験（３７℃；ｐＨ＝７.４；尿素添加なし；検出時間：０／６／２４時間）
０.２２μｍインジェクションフィルターでろ過した培養液を７２時間継代培養したヘリコバクター・ピロリに添加し、細菌濃度を106-107 ＣＦＵ／ｍＬに調整し、湿式嫌気槽に入れて微好気性袋（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を用いて３７℃で２４時間静置培養した。
【００５８】
各培養液は以下の通りです。
第一組：P0 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Phosphate buffered saline (PBS) and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第二組：PVc1500 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Phosphate buffered saline (PBS), 1500mg/L Vitamin C and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第三組：PVc3000 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Phosphate buffered saline (PBS), 3000mg/L Vitamin C and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第四組：PVc6000 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Phosphate buffered saline (PBS), 6000mg/L Vitamin C and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第五組：PIc3000 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Phosphate buffered saline (PBS), 3000mg/L Isoascorbic acid and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第六組：PIc6000 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Phosphate buffered saline (PBS), 6000mg/L Isoascorbic acid and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第七組：C0 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Citrate buffer and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第八組：CVc 1500 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Citrate buffer, 1500mg/L Vitamin C and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第九組：CVc 3000 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Citrate buffer, 3000mg/L Vitamin C and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第十組：CVc 6000 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Citrate buffer, 6000mg/L Vitamin C and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第十一組：CIc 3000 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Citrate buffer, 3000mg/L Isoascorbic acid and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第十二組：CIc 6000 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Citrate buffer, 6000mg/L Isoascorbic acid and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。    
【００５９】
６と２４時間培養後の各培養液を生理食塩水で１０倍に連続希釈した後、各倍に希釈した培養液をプレートコート法でブルセラ固形培地に塗布し、湿式嫌気槽内で微好気性袋（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を用いて３７℃で７２時間静置培養し、最終的に各培養液の生菌数を算出した。
【００６０】
【表５】
2019214549.tif 000007
【００６１】
（二）実験結果の説明
図４から、純粋な緩衝液が抗ヘリコバクター・ピロリ効果を示すことができず、「アスコルビン酸」と「抗ヘリコバクター・ピロリ」とは確かに「用量関係」があるが、完全に殺菌できないことが観察された。
【００６２】
フェーズ３：ヘリコバクター・ピロリに対するアスコルビン酸の酸緩衝組成物（VitC = ６０００ｐｐｍ;リン酸（P）又はクエン酸（C）緩衝液）
（一）実験方法：
１．菌種及び培養方法
実験はヘリコバクター・ピロリ 26695（ATCC700392）で、ブルセラ固形培地（ブルセラ培養液２８ｇ／Ｌ、寒天15ｇ／Ｌ及び１０％（ｖ/ｖ）ウマ血清、ｐＨ７.０）を用いて継代培養し、線画法で植菌した後、湿式嫌気槽において微好気性袋（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を用いて３７℃、７２時間静置培養した。
【００６３】
２．ヘリコバクター・ピロリ抑制試験（３７℃；ｐＨ＝５.０；尿素添加なし；検出時間：０／６／２４時間）
０.２２μｍインジェクションフィルターでろ過した培養液を７２時間継代培養したヘリコバクター・ピロリに添加し、細菌濃度を106-107 ＣＦＵ／ｍＬに調整し、湿式嫌気槽に入れて微好気性袋（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を用いて３７℃で２４時間静置培養した。
【００６４】
各培養液は以下の通りです。
第一組：P0 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Phosphate buffered saline (PBS) and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第二組：PVc6000 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Phosphate buffered saline (PBS), 6000mg/L Vitamin C and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第三組：C0 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Citrate buffer and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
第四組：CVc 6000 (Brucella broth 28g/L, 0.1M Citrate buffer, 6000mg/L Vitamin C and 10% (v/v) Horse serum, pH7.4)。
【００６５】
６と２４時間培養後の各培養液を生理食塩水で１０倍に連続希釈した後、各倍に希釈した培養液をプレートコート法でブルセラ固形培地に塗布し、湿式嫌気槽内で微好気性袋（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を用いて３７℃で７２時間静置培養し、最終的に各培養液の生菌数を算出した。
【００６６】
【表６】
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【００６７】
（二）実験結果の説明
図５から見れば、ｐＨ＝５での二種類の緩衝組成物においてアスコルビン酸が依然として抗菌効果を示す。しかしながら、純粋な緩衝の組み合わせ（アスコルビン酸を含まない）は、有機酸の拡散効果のため、抗菌効果を示す。「至適ｐＨを有する緩衝微小環境」において、有機酸（アスコルビン酸を含む）分子状態が示す拡散効果は、ヘリコバクター・ピロリを効果的に排除することができる。総合的な抗菌効果の評価から、「アスコルビン酸を添加した二種類の緩衝組成物」は「純粋な緩衝の組み合わせ」より優れている。
【００６８】
本発明の緩衝組成物（PVc6000とCVc6000）は、２５０ｍｌ当たり１.５ｇのアスコルビン酸を含むものに相当する。本発明の緩衝組成物（PVc6000とCVc6000）は６時間目に完全に殺菌された。Ｄ６と比較すると、ｐＨ７.４／６.０／５.５で、ＩＣ９０濃度を滅菌するのに必要な時間（＞１２時間）について、通常、人体内でこの効果を達成することはできない（Ｄ６の第１８９９頁の図１と第１９０１頁３７〜４１行目参照）。
【００６９】
以上の説明によると、当業者であれば本発明の技術思想を逸脱しない範囲で、多様な変更及び修正が可能であることが分かる。従って、本発明の技術的な範囲は、明細書の詳細な説明に記載された内容に限らず、特許請求の範囲によって定めなければならない。
【００７０】
［参考文献］
Ｄ１: A review of the effects of dietary organic acids fed to swine Suiryanrayna and Ramana Journal of Animal Science and Biotechnology (2015).
Ｄ２: The life and death of Helicobacter pylori(1998).
Ｄ３:The role of ExbD in periplasmic pH homeostasis in Helicobacter Pylori(2013)
Ｄ４: pH of the Microclimate Lining Human Gastric and Duodenal Mucosa In Vivo (1987)
Ｄ５:Mucus as a Barrier to Drug Delivery - Understanding and Mimicking the Barrier Properties(2014)
Ｄ６: Vitamin C Inhibits the Growth of a Bacterial Risk Factor for Gastric Carcinoma: Helicobacter pylori(1997)
【図１】
2019214549.tif 000009
【図２】
2019214549.tif 000010
【図３】
2019214549.tif 000011
【図４】
2019214549.tif 000012
【図５】
2019214549.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月12日(2019.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの胃腸管におけるウレアーゼ活性を抑制するための組成物を調製するための、有機酸である少なくとも一つの酸成分；有機塩である少なくとも一つの塩成分；並びにアスコルビン酸、アスコルビン酸の塩及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるウレアーゼ活性抑制剤；の使用であって、
前記少なくとも一つの酸成分及び前記少なくとも一つの塩成分は、互いに共役して緩衝剤を形成することを特徴とする、前記使用。
【請求項２】
前記緩衝剤が、ｐＨ５〜８を保持することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記緩衝剤が、ｐＨ＞４の時にアスコルビン酸の活性を持続させることを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
ウレアーゼの活性を抑制するための組成物であって、
有機酸である少なくとも一つの酸成分と、
有機塩である少なくとも一つの塩成分と、
アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるウレアーゼ活性抑制剤と、を含み、
前記少なくとも一つの酸成分及び前記少なくとも一つの塩成分は、互いに共役して緩衝剤を形成することを特徴とする、前記組成物。
【請求項５】
前記組成物が、調製粉乳及び動物飼料のいずれかである栄養補助食品又は飲み物に添加されることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記有機酸が、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、リンゴ酸、フマル酸、乳酸及びクエン酸からなる群から選択される一つであり、
前記有機塩が、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩のいずれかであることを特徴とする、請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項７】
前記有機酸が、クエン酸であり、
前記有機塩が、クエン酸ナトリウム及びクエン酸カリウムのいずれかであることを特徴とする、請求項４〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記緩衝剤が、前記ウレアーゼ活性抑制剤と均一に混合されていることを特徴とする、請求項４〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記緩衝剤が、ｐＨ５〜８を保持することを特徴とする、請求項４〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記アスコルビン酸が、１２０ｐｐｍ〜４８０ｐｐｍの濃度範囲であることを特徴とする、請求項４〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記アスコルビン酸の塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩及びそれらの組み合わせからなる群から選択される一つであることを特徴とする、請求項４〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、ｐＨ５〜８の環境においてウレアーゼの活性を阻害することを特徴とする、請求項４〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、ｐＨ６．８〜７．３の環境においてウレアーゼの活性を阻害することを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、粉末、粒子、錠剤、ミクロン粒子、液体及びカプセルからなる群から選択される一つとして製造されることを特徴とする、請求項４〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
アスコルビン酸が、Ｌ-アスコルビン酸であることを特徴とする、請求項４〜１４のいずれかに記載の組成物。
【外国語明細書】
2019214549000001.pdf