(57)【要約】【課題】枯草菌を環境中から単離する簡易、迅速及び安価な方法及び同方法により単離された新規枯草菌菌株の提供。【解決手段】（Ａ）枯草菌を含むサンプルを芽胞菌が残存するように殺菌する工程、（Ｂ）レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液を実質的に含まない第１の培地を使用して前記殺菌済みサンプル中の細菌を培養し、培養細菌の中からバチルス属細菌を取得する第１培養工程、及び（Ｃ）レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液の少なくとも１種を含み、前記糖が含まれる場合はｐＨ指示薬を更に含む第２の培地を使用して第１培養工程からのバチルス属細菌を培養し、培養細菌の中から枯草菌を取得する第２培養工程、を含む枯草菌の単離方法。同方法により活性汚泥から単離された新規枯草菌菌株。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境中から採取された枯草菌を含むサンプルから前記枯草菌を単離する方法であって、
（Ａ）前記サンプルを、前記サンプル中に含まれる芽胞菌が残存するように殺菌する殺菌工程、
（Ｂ）レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液を実質的に含まない第１の培地を使用して、前記殺菌されたサンプルに含まれる細菌を培養し、培養された細菌の中から枯草菌を含むバチルス属細菌を取得する第１培養工程、及び
（Ｃ）レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、および血液のうちの少なくとも１種を含み、前記枯草菌によって分解されて酸を生成する糖が含まれる場合はｐＨ指示薬を更に含む第２の培地を使用して、第１培養工程から取得された枯草菌を含むバチルス属細菌を培養し、培養された細菌の中から枯草菌を取得する第２培養工程、
を含む枯草菌の単離方法。
【請求項２】
前記殺菌工程は前記サンプルを加熱することにより行う、請求項１に記載の単離方法。
【請求項３】
前記第１の培地が、水１Ｌに対して、ペプトン１〜１０ｇ、酵母エキス１〜５ｇ、グルコース０．１〜５ｇ、及び寒天５〜３０ｇを含み、
前記第２の培地が、水１Ｌに対して、肉エキス０．１〜５ｇ、ペプトン１〜２０ｇ、Ｄ−マンニトール０．５〜２０ｇ、塩化ナトリウム１〜２０ｇ、フェノールレッド０．０１〜０．１ｇ、寒天５〜３０ｇ、卵黄液（５０％）１〜１００ｍＬ、ポリミキシンＢ１０，０００〜５００，０００単位を含む、請求項１または２に記載の単離方法。
【請求項４】
前記環境中から採取された枯草菌を含むサンプルが、活性汚泥である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離方法。
【請求項５】
第１培養工程及び第２培養工程を平板培養法で行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離方法により単離された枯草菌。
【請求項７】
請求項６に記載の枯草菌を含む微生物製剤。
【請求項８】
レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、および血液を実質的に含まないバチルス属細菌培養用の第１の培地と、レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、および血液のうちの少なくとも１種を含み、前記枯草菌によって分解されて酸を生成する糖が含まれる場合はｐＨ指示薬を更に含む枯草菌培養用の第２の培地と、を含む、枯草菌単離用培地セット。
【請求項９】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７９５で寄託されているバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ−１−２株である枯草菌。
【請求項１０】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７９６で寄託されているバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ−６−１株である枯草菌。
【請求項１１】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７９７で寄託されているバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ−１０−１株である枯草菌。
【請求項１２】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７９８で寄託されているバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ−１１−３株である枯草菌。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載の枯草菌を含む微生物製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性汚泥、土壌、植物体、動物体、水域などの環境中から取得した微生物分離源を用い、迅速・簡便・低コストで安全性の高い枯草菌を単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、排水を処理するために様々な薬品が使用されている。そのような薬品の一つとして、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌を用いた微生物製剤がある。バチルス属細菌は、プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）やリパーゼ（油脂分解酵素）などを多量に分泌するため、高濃度のタンパク質や油脂が曝気槽に流入した際、バチルス属細菌を含有する微生物製剤を添加することで、これらの負荷が低減される。
【０００３】
また、バチルス属細菌はｐＨ変動、温度変化、溶存酸素低下、毒物混入、栄養源枯渇などの環境変化の際に芽胞の形態を取り、死滅することなく環境変化に耐えることが可能であるため、微生物製剤に適していると考えられている。
【０００４】
特許文献１では、バチルス属細菌の単離に関する技術ではないが、多くの細菌の中から所定の細菌を単離する方法として記載された方法が開示されている。特許文献２では、微生物を顕微鏡により拡大観察し、増殖パターンから判断してマニュピレーターによりバチルス属などの微生物を単離する手法が開示されている。
【０００５】
また、微生物種の同定に関する従来技術として、例えば環境中から取得されたサンプルを標準寒天培地上に塗抹して単一コロニーを釣菌し、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）装置による１６ＳリボソームＤＮＡの増幅、シークエンサーによる遺伝子配列の解析、国際塩基配列データベース等での相同性検索を順次行う方法があり、これにより、微生物種（例えばバチルス属であれば、枯草菌、炭疽菌、セレウス菌など）が同定されることが知られている。
【０００６】
一方、活性汚泥、土壌、植物体、動物体、水域、し尿、発酵食品などの環境中にはバチルス属細菌が存在する。バチルス属細菌は約３００種が知られており、代表的な種としては、納豆などの発酵食品の製造に使用され、病原性を有さない点で安全性が確立している枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−２７１７８６号公報
【特許文献２】特開平１０−１３６９７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前述した微生物種を同定する手法では、機器・試薬が極めて高額であり、また作業手順も煩雑で試験日数も長期間となる。さらに、環境中にはバチルス属細菌以外の雑菌が圧倒的多数を占めており、加熱処理等でバチルス属細菌に絞り込んだとしても、３００種ものバチルス属が存在する中で相同性検索後に枯草菌に的中する確率は決して高くはない。
【０００９】
一方で、病原性を有するバチルス属細菌の種もいくつか存在し、例えば病原性を有する炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）やセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）などが該当する。このため、バチルス属細菌に属する３００種の全ての種が病原性に対し安全であるとは言えない。
【００１０】
また、炭疽菌やセレウス菌はあくまでヒトに対する病原性が証明された種であって、今後、ヒト以外の動植物に病原性を示す菌種が新たに提言される可能性が無いとは言い難く、そのような危険性を孕む可能性のある菌種を微生物製剤として水処理工程に使用し、環境中に放出することは好ましくない。
【００１１】
上記の経緯により、病原性に対し安全性が確立された枯草菌を環境中から単離する手法を開発することが可能となれば、微生物製剤のみならず発酵食品などにも広く応用可能である。
【００１２】
前述した特許文献１の方法では、単離のために集積培養を行う手順が必要とされるが、集積培養では培養に長期間（３〜４週間）を有する手間と時間がかかる問題があるため、さらなる簡素化が求められていた。
【００１３】
前述した特許文献２の方法では、顕微鏡、マニュピレーター、温度制御装置、コンピューター、画像処理装置など高額な機器を多数必要とするため、単離には設備投資が必要であり、コストのかかるものであった。
【００１４】
また、この方法は、バチルス属細菌の中でも枯草菌を選択的に単離することが出来ない手法であり、大掛かりな設備機器を必要とせず、簡単な手法で、枯草菌を選択的に単離できる手法が望まれていた。
【００１５】
従って、本発明の目的は、簡易、迅速及び安価な方法で、病原性に対し安全性の高い枯草菌を環境中から単離する方法を提供することにある。また、本発明の目的は、その単離方法により単離された安全性の高い枯草菌を提供することにある。さらに、本発明の目的は、その枯草菌を使用した安全性の高い微生物製剤を提供することにある。
【００１６】
また更に本発明の目的は、枯草菌を単離するための枯草菌単離用培地セットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題を解決するために、本発明は以下の構成とすることができる。
（１）環境中から採取された枯草菌を含むサンプルから前記枯草菌を単離する方法であって、
（Ａ）前記サンプルを、前記サンプル中に含まれる芽胞菌が残存するように殺菌する殺菌工程、
（Ｂ）レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液を実質的に含まない第１の培地を使用して、前記殺菌されたサンプルに含まれる細菌を培養し、培養された細菌の中から枯草菌を含むバチルス属細菌を取得する第１培養工程、及び
（Ｃ）レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液のうちの少なくとも１種を含み、前記枯草菌によって分解されて酸を生成する糖が含まれる場合はｐＨ指示薬を更に含む第２の培地を使用して、第１培養工程から取得された枯草菌を含むバチルス属細菌を培養し、培養された細菌の中から枯草菌を取得する第２培養工程、
を含む。
（２）前記殺菌工程は前記サンプルを加熱することにより行う。
（３）前記第１の培地が、水１Ｌに対して、ペプトン１〜１０ｇ、酵母エキス１〜５ｇ、グルコース０．１〜５ｇ、及び寒天５〜３０ｇを含み、前記第２の培地が、水１Ｌに対して、肉エキス０．１〜５ｇ、ペプトン１〜２０ｇ、Ｄ−マンニトール０．５〜２０ｇ、塩化ナトリウム１〜２０ｇ、フェノールレッド０．０１〜０．１ｇ、寒天５〜３０ｇ、卵黄液（５０％）１〜１００ｍＬ、ポリミキシンＢ１０，０００〜５００，０００単位を含む。
（４）前記環境中から採取された枯草菌を含むサンプルが、活性汚泥である。
（５）第１培養工程及び第２培養工程を平板培養法で行う。
（６）上記の単離方法により単離された枯草菌。
（７）その枯草菌を含む微生物製剤。
（８）レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液を実質的に含まないバチルス属細菌培養用の第１の培地と、レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液のうちの少なくとも１種を含み、前記枯草菌によって分解されて酸を生成する糖が含まれる場合はｐＨ指示薬を更に含む枯草菌培養用の第２の培地と、を含む、枯草菌単離用培地セット。
（９）受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７９５で寄託されているバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ−１−２株である枯草菌。
（１０）受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７９６で寄託されているバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ−６−１株である枯草菌。
（１１）受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７９７で寄託されているバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ−１０−１株である枯草菌。
（１２）受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７９８で寄託されているバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ−１１−３株である枯草菌。
（１３）（９）〜（１２）のいずれか１項に記載の枯草菌を含む微生物製剤。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、簡易で、迅速及び安価な方法で、病原性に対し安全性の高い枯草菌を環境中から単離することができる。
また、本発明の手法を用いて活性汚泥より分離した枯草菌から、有機物（デンプン、タンパク質、及び油脂）の高い分解活性を有する新規菌株であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｂ−１−２株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７９５）、Ｂ−６−１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７９６）、Ｂ−１０−１株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７９７）、Ｂ−１１−３株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７９８）をそれぞれ単離した。これら新規菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに２０１８年１０月１６日付けで寄託した。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の方法の概要を示している。
【図２】実施例における各工程を示している。
【図３】工程（Ｂ）において培養されたバチルス属細菌の不定形コロニーを示す写真である。
【図４】工程（Ｃ）において培養された枯草菌のコロニーを示す写真である。
【図５】工程（Ｃ）において培養された枯草菌以外の細菌のコロニーを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を具体的に説明する。図１は、本発明の方法の概要を示す図である。
上述したように、本発明の単離方法は、環境中から採取された枯草菌を含むサンプルから前記枯草菌を単離する方法であって、
（Ａ）前記サンプルを、前記サンプル中に含まれる芽胞菌が残存するように殺菌する殺菌工程、
（Ｂ）レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液を実質的に含まない第１の培地を使用して、前記殺菌されたサンプルに含まれる細菌を培養し、培養された細菌の中から枯草菌を含むバチルス属細菌を取得する第１培養工程、及び
（Ｃ）レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液のうちの少なくとも１種を含み、前記枯草菌によって分解されて酸を生成する糖が含まれる場合はｐＨ指示薬を更に含む第２の培地を使用して、第１培養工程から取得された枯草菌を含むバチルス属細菌を培養し、培養された細菌の中から枯草菌を取得する第２培養工程、
を含む。
【００２１】
枯草菌は芽胞を形成し、様々なストレスに対して耐性を有することから、土壌や植物など環境中のあらゆる場所に普遍的に存在する。本発明は、環境中から採取された枯草菌を含むサンプルから枯草菌を単離するためのものである。以下、各工程について詳細に説明する。
【００２２】
［工程（Ａ）（殺菌工程）］
工程（Ａ）では、環境中から採取されたサンプルを、そのサンプル中に含まれる芽胞菌が残存するように殺菌する。ここで、環境とは、自然的環境及び人工的環境の両方を含む。具体的には、例えば、自然界の土壌（土、腐葉土、砂礫、コンポストなど）、植物体（草本、木本、花卉、枯れ草、枯れ葉、苔など）、動物体（表皮、臓器、排泄物など）、水域（河川水、湖沼水、海水など）、及び大気や、人為的な介入を経た環境下にある活性汚泥、発酵食品、台所や配管などのヌメリ（バイオフィルム）、ヒトし尿など、枯草菌が生息し得る全ての環境が挙げられる。本発明では、環境中から採取された枯草菌を含むサンプル（以下、「環境サンプル」とも称する）を使用する。
【００２３】
環境サンプル中には、枯草菌だけでなく、枯草菌以外の雑菌も極めて多く含まれる。殺菌するための方法としては、環境サンプルに含まれる芽胞菌が残るように殺菌することができればどのような手法でもよいが、好ましい殺菌方法として、加熱や酸処理や塩基処理、アルコール処理、次亜塩素酸ナトリウムなどの消毒剤処理、ＵＶ照射、乾燥、嫌気状態などが挙げられる。特に加熱が好ましい。
【００２４】
加熱の条件は、芽胞菌が残存し、耐熱性のない細菌を除外することができればどのような条件でもよい。加熱温度は、例えば、６０℃〜１００℃、好ましくは７０℃〜９０℃である。加熱時間は、例えば、１分〜３時間、好ましくは２０分〜２時間、より好ましくは３０分〜９０分である。加熱時の圧力は、例えば、０．８〜１．２気圧、好ましくは大気圧下及びこれに近い圧力下（例えば、０．９〜１．１気圧）で行うことが好ましい。
【００２５】
酸処理に使用される酸としては、塩酸や硫酸などの無機酸や有機酸が挙げられる。塩基処理に使用される塩基としては、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどが挙げられる。これらの酸及び塩の使用については、芽胞菌が残存し、それ以外の殺菌を除去することができる条件が当業者により適宜選択される。
【００２６】
［工程（Ｂ）（第１培養工程）］
工程（Ｂ）では、レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液を実質的に含まない第１の培地を使用して、工程（Ａ）で殺菌されたサンプルに含まれる細菌を培養し、培養された細菌の中から枯草菌を含むバチルス属細菌を取得する。
【００２７】
第１の培地は、枯草菌を含むバチルス属細菌を培養することができるものである。したがって、第１の培地は、通常、少なくともゲル化剤及びアミノ酸源を含む。
ゲル化剤の例としては、特に限定されないが、例えば、寒天、ゲランガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ポリビニルアルコール、アルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、及びヒドロキシアルキルセルロースなどが挙げられる。特に寒天が好ましい。
【００２８】
アミノ酸源としては、ペプトンやトリプトン、エキス類などが挙げられる。ペプトンとしては、例えば、カゼイン製ペプトン、大豆製ペプトンなどが挙げられる。エキス類の例としては、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ポテトエキスなどが挙げられる。
【００２９】
第１の培地は、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、糖類、エキス類（ビタミンやミネラル等の供給のため）、塩化ナトリウムなどが挙げられる。糖類の例としては、グルコース、スクロースなどが挙げられる。エキス類の例としては、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ポテトエキスなどが挙げられる。
【００３０】
第１の培地の各種成分の含有量は、バチルス属細菌を培養することができれば特に限定されないが、例えば、ゲル化剤は１〜３０ｇ、アミノ酸源は１〜１０ｇ、エキス類は１〜５ｇ、糖類は１〜５ｇ、塩化ナトリウムは１〜１０ｇである（これらの含有量は精製水１Ｌに対するものである）。
【００３１】
第１の培地のｐＨは７．０±０．１であることが好ましい。
好ましい第１の培地の具体的な組成は、水（精製水など）１Ｌに対して、カゼイン−膵ペプトン１〜１０ｇ、好ましくは３〜７ｇ、酵母エキス１〜５ｇ、好ましくは１．５〜４ｇ、グルコース０．１〜５ｇ、好ましくは０．５〜３ｇ、及び、寒天５〜３０ｇ、好ましくは１０〜２０ｇのものであり、ｐＨは７．０±０．１である。
【００３２】
特に好ましい第１の培地としては、例えば、標準寒天培地を使用することができる。標準寒天培地とは、一般細菌の培養に使用可能な非選択培地であって、例えば、水道法関連省令、日本薬局方等で定義、利用されている。
【００３３】
上述したように、第１の培地は、レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液を実質的に含まない。「実質的に含まない」とは、レシチン含有物質または血液の場合、第１の培地において、レシチン含有物質または血液の含有量が精製水１Ｌに対して、０．５ｍＬ未満であることを意味し、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖の場合、第１の培地において、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖の含有量が、精製水１Ｌに対して、０．５ｇ未満であることを意味する。
【００３４】
第１の培地は抗生物質を実質的に含まないことが好ましい。抗生物質を実質的に含まないとは、第１の培地において、抗生物質の含有量が、精製水１Ｌに対して、１単位未満のことをいう。
【００３５】
工程（Ｂ）の培養は、通常、好気条件下において平板培養法で行う。培養温度は、例えば、２０〜４０℃である。培養時間は、例えば、１２〜７２時間である。
工程（Ｂ）において第１の培養工程を行うと、バチルス属細菌のコロニーの他、バチルス属以外の芽胞菌のコロニーや、工程（Ａ）の殺菌工程において生き残った雑菌のコロニーが一定数培養される。これらの中から、バチルス属細菌に特有の粗大・不定形コロニーを釣菌することにより、バチルス属細菌（枯草菌を含む）を取得することができる。
【００３６】
［工程（Ｃ）（第２培養工程）］
工程（Ｃ）では、レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液のうちの少なくとも１種を含み、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖が含まれる場合はｐＨ指示薬を更に含む第２の培地を使用して、第１培養工程から取得された枯草菌を含むバチルス属細菌を培養し、培養された細菌の中から枯草菌を取得する。
【００３７】
レシチン含有物質としては、卵黄、大豆レシチン、魚類レシチンが挙げられる。卵黄が好ましい。枯草菌によって分解されて酸を生成する糖としては、マンニトール、アラビノース、キシロースなどが挙げられる。マンニトールが好ましい。血液としては、ヒツジ血液、ウマ血液、ヒト血液などが挙げられる。血液は脱繊維の形態であることが好ましい。ｐＨ指示薬の例としては、フェノールレッドやブロムクレゾールパープルが挙げられる。
【００３８】
第２の培地は、枯草菌を培養することができるものである。したがって、第２の培地は、上記のレシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液のうちの１種の他に、通常、少なくともゲル化剤及びアミノ酸源を含む。
【００３９】
ゲル化剤及びアミノ酸源は、第１の培地について上述したものと同様のものを使用することができる。
第２の培地は、他の成分を更に含んでいてもよい。他の成分としては、糖類、エキス類、塩化ナトリウム、抗生物質などが挙げられる。糖類、エキス類は第１の培地について上述したものと同様のものを使用することができる。抗生物質としては、枯草菌が非感受性の抗生物質、例えば、ポリミキシンＢが挙げられる。なお、本発明において、第１の培地および第２の培地において、列挙した成分は１種を単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせてしてもよい。
【００４０】
第２の培地の各種成分の含有量は、例えば、レシチン含有物質は０．５〜５０ｍＬ、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖は０．５〜２０ｇ、血液は０．５〜１００ｍＬ、ゲル化剤は１〜３０ｇ、アミノ酸源は１〜１０ｇ、エキス類は１〜５ｇ、糖類は１〜５ｇ、塩化ナトリウムは１〜１０ｇである（これらの含有量は精製水１Ｌに対するものである）。
【００４１】
第２の培地のｐＨは７．０〜７．４の範囲が好ましく、特に７．１〜７．３の範囲が好ましい。
好ましい第２の培地の具体的な組成は、水（精製水など）１Ｌに対して、肉エキス０．１〜５ｇ、好ましくは０．５〜２ｇ、ペプトン１〜２０ｇ、好ましくは５〜１５ｇ、Ｄ−マンニトール０．５〜２０ｇ、好ましくは５〜１５ｇ、塩化ナトリウム１〜２０ｇ、好ましくは５〜１５ｇ、フェノールレッド０．０１〜０．１ｇ、好ましくは０．０２〜０．０５ｇ、寒天５〜３０ｇ、好ましくは１０〜２０ｇ、卵黄液（５０％）１〜１００ｍＬ、好ましくは１〜８０ｍＬ、更に好ましくは１０ｍＬ〜７０ｍＬ、ポリミキシンＢ１０，０００〜５００，０００単位、好ましくは５０，０００〜２００，０００単位のものであり、ｐＨは７．０〜７．４である。
【００４２】
工程（Ｃ）の培養は、通常、好気条件下において平板培養法で行う。培養温度は、例えば、２０〜４０℃である。培養時間は、例えば、１２〜７２時間である。
第２の培地に枯草菌によって分解されて酸を生成する糖及びｐＨ指示薬としてのフェノールレッドが含まれる場合、枯草菌はその糖を分解して酸を発生し、ｐＨ指示薬が酸性を示す（すなわち、コロニーは黄色を呈する）。一方で、他のバチルス属細菌（セレウス菌、炭疽菌など）はその糖を分解せず、そのコロニーは黄色を呈さない。したがって、工程（Ｃ）において培養を終えた後、黄色を呈するコロニーが枯草菌のコロニーであると判別することができる。
【００４３】
一方、第２の培地にレシチン含有物質が含まれる場合、枯草菌はレシチン含有物質と反応しない一方で、他のバチルス属細菌、特に病原性バチルス属細菌（セレウス菌、炭疽菌など）はレシチン含有物質とレシチナーゼ反応を起こす。レシチナーゼ反応を起こしたコロニーはその周りに不透明帯を呈することから、不透明帯を有するコロニーは枯草菌以外のバチルス属細菌であり、不透明帯を有しないコロニーが枯草菌のコロニーであると判別することができる。
【００４４】
第２の培地は枯草菌によって分解されて酸を生成する糖（及びｐＨ指示薬）ならびにレシチン含有物質の両方を含んでいてもよく、この場合、不透明帯を有しない黄色コロニーが枯草菌のコロニーであると判別することができる。なお、本手法により、環境サンプル中から極めて高い確率で枯草菌を単離可能となるが、枯草菌ではない菌株を単離してしまう可能性もゼロではないと推測されるため、適宜遺伝子解析等のクロスチェックを行うことが望ましい。
【００４５】
また、第２の培地に血液が含まれる場合（血液寒天培地）は、溶血性の有無の観点から培養された菌の中から枯草菌を判別可能である。枯草菌では溶血性が認められるので、培養されたコロニーは同心円状の溶血帯を有するコロニーとなる。
【００４６】
［枯草菌、微生物製剤、培地セット］
本発明は、本発明の単離方法により得られた枯草菌も提供する。また、本発明は、本発明の枯草菌を含む微生物製剤も提供する。さらに、本発明は、上記の第１の培地と第２の培地とを含む枯草菌単離用培地セットを提供する。
【００４７】
上述したように、本発明によれば、簡易、迅速及び安価な方法で、病原性に対し安全性の高い枯草菌を環境中から単離することができる。単離された枯草菌は、水処理工程などで用いられる微生物製剤はもとより、土壌改良剤、コンポスト発酵促進剤、微生物農薬、消臭剤、納豆などの発酵食品、酵素製造、サプリメント、ラボ試験、菌株コレクションなどに適宜使用可能である。以下、本発明を実施例により説明する。
【実施例】
【００４８】
［１］実施例１
実施例１は図２に示す通りの順序で行った。まず、環境（土壌、枯れ葉、枯れ草、苔、活性汚泥）中から採取されたサンプル９０ｍｇを９ｍｌの滅菌水に懸濁させた。懸濁後のサンプルについて、まず段階希釈を行い、下水試験方法に順じて標準寒天培地（ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス２．５ｇ／Ｌ、グルコース１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０±０．１）により混釈を行った。
【００４９】
次に、３５℃で２４時間静置培養した後、一般細菌数を算出した（参考値、下記表１）。この一般細菌数は、サンプル中に含まれる一般細菌（標準寒天培地上で生育する全ての中温性好気性細菌）を示し、例えば土壌の１２５，０００ＣＦＵ／ｍｌとは、懸濁後の滅菌水１ｍｌ中に１２５，０００個の生きた細菌が存在することを示している。
【００５０】
その後、懸濁液を８０℃のウォーターバスに容器ごと浸漬し、１時間の加熱処理を行った（工程（Ａ））。これにより、芽胞菌（バチルス属細菌など）以外の雑菌を殺菌した。
次に、殺菌後の懸濁液を段階希釈した後、第１の培地としての標準寒天培地（ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス２．５ｇ／Ｌ、グルコース１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０±０．１）に塗抹し３０℃で２４時間静置して平板培養を行った。培養後、芽胞菌及び工程（Ａ）の加熱殺菌で生き残った微生物の中からバチルス属細菌に特有の粗大・不定形コロニー（図３の矢印で示すコロニー）を取得した（工程（Ｂ））。
【００５１】
表１の通り、土壌より２株、枯れ葉より１株、枯れ草より３株、苔より５株、活性汚泥より１６株のバチルス属細菌のコロニーを取得した。
取得したバチルス属細菌のコロニーについて、それぞれを第２の培地としてのＭＹＰ寒天培地（肉エキス１ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、Ｄ−マンニトール１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、フェノールレッド０．０２５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、卵黄液（５０％）５０ｍｌ／Ｌ、ポリミキシンＢ１００，０００ｕｎｉｔｓ／Ｌ、ｐＨ７．２±０．１）に画線塗抹し、３０℃で２４時間静置培養した後、培養されたバチルス属細菌の中から不透明帯の無い黄色コロニー（図４）を枯草菌と判別し、取得した（工程（Ｃ））。
【００５２】
表１の通り、土壌より１株、枯れ草より１株、活性汚泥より４株の枯草菌が取得された。これら計６株について、遺伝子解析により相同性検索を実施したところ、いずれも既知の枯草菌配列と１００％一致した。土壌、枯れ葉、枯れ草、苔、活性汚泥のうち、活性汚泥から最も効率良く単離することが可能であった。なお、図５に示すように、黄色を呈さず不透明帯を有するコロニーは枯草菌以外のバチルス属細菌である。
【００５３】
本実施例で用いた標準寒天培地とＭＹＰ寒天培地を培地セットとして構成し、塗抹用の白金耳や滅菌希釈水などを付属品として同梱することで、特段大掛かりな設備が無くても、場所を問わず、誰でも簡単且つ迅速に、枯草菌を単離することが可能となる。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
［２］比較例１
比較例１として、実施例１と同様に環境サンプルの懸濁液を調製した後、１．加熱（実施例と同じ条件）による環境サンプルの殺菌工程の後に上記のＭＹＰ寒天培地で殺菌されたサンプルを培養（３０℃で２４時間）した場合、２．殺菌工程を行わずに最初から上記の標準寒天培地で環境サンプルを培養（３０℃で２４時間）した場合、３．殺菌工程を行わずに最初から上記のＭＹＰ寒天培地で環境サンプルを培養（３０℃で２４時間）した場合の結果を表２〜４に示す。いずれの場合も雑菌が旺盛に繁殖してしまい、次の工程に進むことが出来ず枯草菌を単離することができなかった。
【００５６】
【表２】
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【００５７】
【表３】
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【００５８】
【表４】
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【００５９】
［３］実施例２
実施例１と同様にして、複数の活性汚泥源から、４０株程度の枯草菌菌株を単離した。これらの枯草菌菌株について、それぞれの菌株を栄養培地（ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物１ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）にて培養し、菌体を洗浄・遠心回収したのち、保持担体と共に凍結乾燥機にて粉末化し、微生物製剤を製造した。この微生物製剤を用い、有機物（デンプン、タンパク質、及び油脂）の分解活性を評価した。また。取得菌株の他に、対照区として他社の枯草菌含有微生物製剤（他社品Ａ）も同様の試験に供することとした。なお、製造した微生物製剤および他社品Ａの枯草菌菌数は、どちらも１０８ＣＦＵ／ｇであった。
【００６０】
デンプン分解活性の評価は、以下の手法により実施した。２００ｍＬ三角フラスコに模擬排水（酵母エキス０．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二アンモニウム０．５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）を１００ｍＬ張り、オートクレーブ滅菌した。オートクレーブ後、０．２２μｍフィルタで別滅菌済みのデンプン水溶液を加え、デンプン終濃度として０．２ｇ／Ｌとなるよう調整した。調整後の培地に微生物製剤を１００ｍｇ／Ｌ添加し、１５０ｒｐｍ、３０℃で往復振盪を行った。培養０ｈ及び４８ｈでサンプリングし、デンプン測定キット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製、Ｋ−ＴＳＴＡ−１００Ａ）によりデンプンの定量を行い、以下の式によりデンプン分解率を算出した：
（培養０ｈ−培養４８ｈ）÷ 培養０ｈ × １００＝デンプン分解率（％）。
【００６１】
タンパク質分解活性の評価は、以下の手法により実施した。２００ｍＬ三角フラスコに前述の模擬排水を１００ｍＬ張り、オートクレーブ滅菌した。オートクレーブ後、０．２２μｍフィルタで別滅菌済みのカゼインＮａ水溶液を加え、カゼインＮａ終濃度として２ｇ／Ｌとなるよう調整した。調整後の培地に微生物製剤を１００ｍｇ／Ｌ添加し、１５０ｒｐｍ、３０℃で往復振盪を行った。培養０ｈ及び６ｈでサンプリングし、タンパク質測定キット（富士フィルム和光純薬株式会社製、プロテインアッセイラピッドキットワコーII）によりタンパク質の定量を行い、以下の式によりタンパク質分解率を算出した：
（培養０ｈ−培養６ｈ）÷ 培養０ｈ × １００＝タンパク質分解率（％）。
【００６２】
油脂分解活性の評価は、以下の手法により実施した。２００ｍＬ三角フラスコに前述の模擬排水を１００ｍＬ張り、オートクレーブ滅菌した。オートクレーブ後、０．２２μｍフィルタで別滅菌済みのラード（ベル食品社製、純正ラード）を加え、ラード終濃度として１ｇ／Ｌとなるよう調整した。調整後の培地に微生物製剤を１００ｍｇ／Ｌ添加し、１５０ｒｐｍ、３０℃で往復振盪を行った。培養０ｈ及び４８ｈでサンプリングし、サンプル４ｍＬに対してリパーゼ製剤（水ｉｎｇ社製、ユーサワー１２０）を３０ｍｇ添加したのち、４０℃で６０分間酵素反応させてグリセリンを遊離させた。その後、Ｆ−キット（ＪＫインターナショナル社製、Ｆ−キットグリセロール）にて残存グリセリンを測定することで、油脂量の測定を行った。なおリパーゼ製剤による酵素反応前に存在していたグリセリンは、バチルス属細菌によって速やかに資化されることを事前確認済みである。得られた油脂量について、以下の式により油脂分解率を算出した：
（培養０ｈ−培養４８ｈ）÷ 培養０ｈ × １００＝油脂分解率（％）。
【００６３】
試験の結果を表５に示す。活性汚泥より取得された複数の菌株について試験を実施したが、その中でも特に分解活性の高かった４株の結果を示す。これら４株は、他社品Ａと比較し有機物の分解活性が顕著に高い傾向にあった。
【００６４】
【表５】
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【００６５】
上記Ｂ−１−２株、Ｂ−６−１株、Ｂ−１０−１株、Ｂ−１１−３株と名付けた各菌株について、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列（約１，５００ｂｐ）を解析し、国際塩基配列データベース（ＢＬＡＳＴ）による相同性検索を行った結果、いずれの菌株も既知の枯草菌（Ｂａｓｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ)の配列と９９．９％一致した。相同性検索及び形態観察の結果から、これら菌株は、枯草菌（Ｂａｓｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ)に帰属することが確認された。これら菌株は自然界（活性汚泥）より独自に単離した新規菌株である。これら新規菌株は、公知の菌株（他社品Ａ）と比較し、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼを高生産し、顕著に高いデンプン、タンパク質、及び油脂分解活性を有する。これら菌株のそれぞれを、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに２０１８年１０月１６日付けで寄託した（受託番号は、それぞれ、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７９５、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７９６、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７９７、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７９８）。
【００６６】
これら新規菌株の特徴は以下の通りである。
分離源：使用済み活性汚泥貯留槽から分離（採取地:日本）
単離方法：上記実施例１に記載の方法
細胞：桿状、周毛を持つ、運動性を有する
コロニー：クリーム色、粗大、不定形
培養方法：通常の枯草菌の培養方法と同様の方法で培養可能
特徴：アミラーゼ、プロテアーゼ、及びリパーゼを高生産し、表５に示す通り、既存の枯草菌菌株に比べて、顕著に高いデンプン、タンパク質、及び油脂分解活性を有する。
【００６７】
単離した枯草菌は、例えば、そのままで、あるいは任意の慣用される担体または栄養成分等と混合し、また、任意に慣用される方法で粉末化または顆粒化等するなどして、製剤化し、微生物製剤として用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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