(57)【要約】      （修正有）【課題】細菌感染及びそれに伴う炎症を治療するためのペプチドの提供。【解決手段】ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、断片、塩、若しくはエステルであって、感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つの治療を必要とするヒト対象において、その感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つを治療する方法で用いるためのものであり、前記対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．０２５ｍｇ〜１．０ｍｇのペプチドという量で投与されるペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１によって示されているとともに、ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、断片、塩、若しくはエステルであって、感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つの治療を必要とするヒト対象において、その感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つを治療する方法で用いるためのものであり、前記対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．０２５ｍｇ〜１．０ｍｇのペプチドという量で投与されるペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、前記対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜０．７５ｍｇのペプチドという量で投与される、請求項１に記載の用途のためのペプチド
【請求項３】
前記ペプチドが、前記対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．２５ｍｇ〜０．５ｍｇのペプチドという量で投与される、請求項１に記載の用途のためのペプチド。
【請求項４】
前記誘導体が、配列番号２によって示されているとともに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとして示されているような（Ｄ−Ａ）ＳＰＭＬＶＡＹＤ（Ｄ−Ａ）というアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項５】
前記感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つが、グラム陽性菌、グラム陰性菌、多菌感染、細菌トキシン、及びその他の毒性細菌成分のうちの少なくとも１つによって誘発される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項６】
前記グラム陰性菌が、プロテオバクテリア、大腸菌、サルモネラ属、赤痢菌、腸内細菌、シュードモナス属、モラクセラ属、ヘリコバクター属、ブデロビブリオ属、ステノトロフォモナス属、酢酸菌、レジオネラ属、α−プロテオバクテリア、ボルバキア、グラム陰性球菌、ナイセリア種、淋菌、髄膜炎菌、モラクセラ・カタラーリス、グラム陰性桿菌、インフルエンザ菌、肺炎杆菌、レジオネラ・ニューモフィラ、緑膿菌、プロテウス・ミラビリス、エンテロバクター・クロアカエ、霊菌、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・ティフィ、アシネトバクター・バウマニ、野兎病菌、ビブリオ・バルニフィカス、コレラ菌、ビブリオ・フルビアリス、腸炎ビブリオ菌、ビブリオ・アルギノリチカス、フォトバクテリウム・ダムセラ、アエロモナス・ヒドロフィラ、ウェルシュ菌、ヒストリチクス菌、ポルフィロモナス／プレボテラ属種、プレボテラ・インターメディア、プレボテラ・ブッカエ、プレボテラ属種、バクテロイデス・ユニフォルミス、及びＮＤＭ−１菌株からなる群から選択され、前記グラム陽性菌が、Ａ群連鎖球菌、化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、エンテロコッカス・フェカリス、Ｄ群連鎖球菌、Ｇ群連鎖球菌、緑色連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミレリ、プロピオニバクテリウム属種、エンテロコッカス・フェシウム、ペプトストレプトコッカス属種、微好気性連鎖球菌、ラクトバチルス属種、スタフィロコッカス・エピデミデス、及びスタフィロコッカス・アウレウスからなる群から選択され、前記多菌感染が、グラム陽性菌、グラム陰性菌、又はこれらの組み合わせによって誘発され、前記毒性細菌成分が、エキソトキシン、エンドトキシン、スーパー抗原トキシン、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、ダメージ関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）、リポ多糖、ペプチドグリカン又はこれらの毒性成分、自然免疫系の細胞によって認識される病原体群と関連する分子、及びトール様受容体（ＴＬＲ）によって認識される病原体群と関連する分子からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項７】
配列番号１によって示されているとともに、ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、断片、塩、若しくはエステルであって、グラム陽性菌、グラム陰性菌、多菌感染、及び細菌トキシンのうちの少なくとも１つによって誘発される感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つに起因するか又はこれに伴う損傷の悪化を防ぐため、この損傷を抑止するため、及びこの損傷を改善するためのうちの少なくとも１つの方法を必要とするヒト対象において、その方法で用いるためのものであり、前記対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．０２５ｍｇ〜１．０ｍｇのペプチドという量で投与されるペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドが、前記対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜０．７５ｍｇのペプチドという量で投与される、請求項７に記載の用途のためのペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドが、前記対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．２５ｍｇ〜０．５ｍｇのペプチドという量で投与される、請求項７又は請求項８に記載の用途のためのペプチド。
【請求項１０】
前記誘導体が、配列番号２によって示されているとともに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとして示されているような（Ｄ−Ａ）ＳＰＭＬＶＡＹＤ（Ｄ−Ａ）というアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項７〜９〜のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項１１】
前記損傷が全身的損傷又は感染部位の損傷である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項１２】
前記損傷が、壊死性軟部組織感染症（ＮＳＴＩ）、腹腔内多菌感染、又は熱傷によって示され、前記損傷が、多臓器不全、セプシス、重症セプシス、化膿性関節炎、及び敗血症性ショックのうちの少なくとも１つをもたらすことがある、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項１３】
前記グラム陰性菌が、プロテオバクテリア、大腸菌、サルモネラ属、赤痢菌、腸内細菌、シュードモナス属、モラクセラ属、ヘリコバクター属、ブデロビブリオ属、ステノトロフォモナス属、酢酸菌、レジオネラ属、α−プロテオバクテリア、ボルバキア、グラム陰性球菌、ナイセリア種、淋菌、髄膜炎菌、モラクセラ・カタラーリス、グラム陰性桿菌、インフルエンザ菌、肺炎杆菌、レジオネラ・ニューモフィラ、緑膿菌、プロテウス・ミラビリス、エンテロバクター・クロアカエ、霊菌、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・ティフィ、アシネトバクター・バウマニ、野兎病菌、ビブリオ・バルニフィカス、コレラ菌、ビブリオ・フルビアリス、腸炎ビブリオ菌、ビブリオ・アルギノリチカス、フォトバクテリウム・ダムセラ、アエロモナス・ヒドロフィラ、ウェルシュ菌、ヒストリチクス菌、ポルフィロモナス／プレボテラ属種、プレボテラ・インターメディア、プレボテラ・ブッカエ、プレボテラ属種、バクテロイデス・ユニフォルミス、及びＮＤＭ−１菌株からなる群から選択され、前記グラム陽性菌が、Ａ群連鎖球菌、化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、エンテロコッカス・フェカリス、Ｄ群連鎖球菌、Ｇ群連鎖球菌、緑色連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミレリ、プロピオニバクテリウム属種、エンテロコッカス・フェシウム、ペプトストレプトコッカス属種、微好気性連鎖球菌、ラクトバチルス属種、スタフィロコッカス・エピデミデス、及びスタフィロコッカス・アウレウスからなる群から選択され、前記多菌感染が、グラム陽性菌、グラム陰性菌、又はこれらの組み合わせによって誘発され、前記毒性細菌成分が、エキソトキシン、エンドトキシン、スーパー抗原トキシン、病原体関連分子パターン（ＰＡＰＭ）、ダメージ関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）、リポ多糖、ペプチドグリカン又はこれらの毒性成分、自然免疫系の細胞によって認識される病原体群と関連する分子、トール様受容体（ＴＬＲ）によって認識される病原体群と関連する分子からなる群から選択される、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項１４】
前記投与が、経口投与、静脈内注射、筋内注射、腹腔内注射、髄腔内注射、皮下注射、直腸内投与、鼻腔内投与、眼局所投与、及び局所投与からなる群から選択した経路によるものである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項１５】
前記ペプチドが、前記感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つの発症から好適な時点に、具体的には、前記感染症若しくはそれに伴う急性炎症の前記発症の直後、前記発症から約３０分〜約７２時間以内に、又は前記発症から約３０分〜約７日以内に投与される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項１６】
前記方法が、前記対象に、少なくとも１つの追加の治療有効剤を治療有効量投与すること、及び標準的な支持療法を行うことのうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの追加の治療有効剤が、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗生剤、静菌剤、殺菌剤、ステロイド、及び抗微生物剤からなる群から選択される、請求項１６に記載の用途のためのペプチド。
【請求項１８】
前記標準的な支持療法が、換気、手術、創傷処置、高圧酸素療法、ＩＶＩＧ（静脈内免疫グロブリン）療法、コルチコステロイド療法、血漿交換療法、陰圧閉鎖療法（ＶＡＣ被覆材療法）、及び活性化プロテインＣ療法のうちの少なくとも１つである、請求項１６及び１７のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの追加の治療有効剤が、次善の用量又は治療用量のいずれかで投与される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチドと前記追加の治療有効剤が同時に投与される、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項２１】
前記ペプチドと前記少なくとも１つの追加の治療有効剤が、異なる時点に、異なる投与間隔で、異なる持続時間で、又は異なる順序で投与される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項２２】
前記ペプチドと前記追加の治療有効剤の前記投与間隔が０〜７２時間である、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項２３】
前記ペプチドが医薬組成物に含まれ、前記組成物が、生理学的に適合可能な添加剤、担体、希釈剤、及び賦形剤のうちの少なくとも１つを含む、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項２４】
配列番号１によって示されているとともに、ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、断片、塩、若しくはエステルであって、感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つの治療を必要とするヒト対象において、その感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つを治療する方法で用いるためのものであり、前記方法が、前記対象に、前記ペプチドを治療有効量、単回投与することを含むペプチド。
【請求項２５】
前記誘導体が、ペプチドｐ２ＴＡの両末端がＤ−アラニン残基と隣接したものであって、配列番号２によって示されているとともに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとして示されているような（Ｄ−Ａ）ＳＰＭＬＶＡＹＤ（Ｄ−Ａ）というアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項２４に記載の用途のためのペプチド。
【請求項２６】
前記感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つが、グラム陽性菌、グラム陰性菌、多菌感染、細菌トキシン、及びその他の毒性細菌成分のうちの少なくとも１つによって誘発される、請求項２４又は請求項２５に記載の用途のためのペプチド。
【請求項２７】
前記グラム陰性菌が、プロテオバクテリア、大腸菌、サルモネラ属、赤痢菌、腸内細菌、シュードモナス属、モラクセラ属、ヘリコバクター属、ブデロビブリオ属、ステノトロフォモナス属、酢酸菌、レジオネラ属、α−プロテオバクテリア、ボルバキア、グラム陰性球菌、ナイセリア種、淋菌、髄膜炎菌、モラクセラ・カタラーリス、グラム陰性桿菌、インフルエンザ菌、肺炎杆菌、レジオネラ・ニューモフィラ、緑膿菌、プロテウス・ミラビリス、エンテロバクター・クロアカエ、霊菌、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・ティフィ、アシネトバクター・バウマニ、野兎病菌、ビブリオ・バルニフィカス、コレラ菌、ビブリオ・フルビアリス、腸炎ビブリオ菌、ビブリオ・アルギノリチカス、フォトバクテリウム・ダムセラ、アエロモナス・ヒドロフィラ、ウェルシュ菌、ヒストリチクス菌、ポルフィロモナス／プレボテラ属種、プレボテラ・インターメディア、プレボテラ・ブッカエ、プレボテラ属種、バクテロイデス・ユニフォルミス、及びＮＤＭ−１菌株からなる群から選択され、前記グラム陽性菌が、Ａ群連鎖球菌、化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、エンテロコッカス・フェカリス、Ｄ群連鎖球菌、Ｇ群連鎖球菌、緑色連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミレリ、プロピオニバクテリウム属種、エンテロコッカス・フェシウム、ペプトストレプトコッカス属種、微好気性連鎖球菌、ラクトバチルス属種、スタフィロコッカス・エピデミデス、及びスタフィロコッカス・アウレウスからなる群から選択され、前記多菌感染が、グラム陽性菌、グラム陰性菌、又はこれらの組み合わせによって誘発され、前記毒性細菌成分が、エキソトキシン、エンドトキシン、スーパー抗原トキシン、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、ダメージ関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）、リポ多糖、ペプチドグリカン又はこれらの毒性成分、自然免疫系の細胞によって認識される病原体群と関連する分子、及びトール様受容体（ＴＬＲ）によって認識される病原体群と関連する分子からなる群から選択される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項２８】
配列番号１によって示されているとともに、ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、断片、塩、若しくはエステルであって、グラム陽性菌、グラム陰性菌、多菌感染、及び細菌トキシンのうちの少なくとも１つによって誘発される感染症又はそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つに起因するか又はこれに伴う損傷の悪化を防ぐため、この損傷を抑止するため、及びこの損傷を改善するためのうちの少なくとも１つの方法を必要とするヒト対象において、その方法で用いるためのものであり、前記方法が、前記対象に、前記ペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、機能的断片、塩、若しくはエステルを治療有効量、単回投与することを含むペプチド。
【請求項２９】
前記誘導体が、ペプチドｐ２ＴＡの両末端がＤ−アラニン残基と隣接したものであって、配列番号２によって示されているとともに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとして示されているような（Ｄ−Ａ）ＳＰＭＬＶＡＹＤ（Ｄ−Ａ）というアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項２８に記載の用途のためのペプチド。
【請求項３０】
前記損傷が全身的損傷又は感染部位の損傷である、請求項２８又は請求項２９に記載の用途のためのペプチド。
【請求項３１】
前記損傷が、壊死性軟部組織感染症（ＮＳＴＩ）、腹腔内多菌感染、又は熱傷によって示され、前記損傷が、多臓器不全、セプシス、重症セプシス、化膿性関節炎、又は敗血症性ショックをもたらすことがある、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項３２】
前記グラム陰性菌が、プロテオバクテリア、大腸菌、サルモネラ属、赤痢菌、腸内細菌、シュードモナス属、モラクセラ属、ヘリコバクター属、ブデロビブリオ属、ステノトロフォモナス属、酢酸菌、レジオネラ属、α−プロテオバクテリア、ボルバキア、グラム陰性球菌、ナイセリア種、淋菌、髄膜炎菌、モラクセラ・カタラーリス、グラム陰性桿菌、インフルエンザ菌、肺炎杆菌、レジオネラ・ニューモフィラ、緑膿菌、プロテウス・ミラビリス、エンテロバクター・クロアカエ、霊菌、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・ティフィ、アシネトバクター・バウマニ、野兎病菌、ビブリオ・バルニフィカス、コレラ菌、ビブリオ・フルビアリス、腸炎ビブリオ菌、ビブリオ・アルギノリチカス、フォトバクテリウム・ダムセラ、アエロモナス・ヒドロフィラ、ウェルシュ菌、ヒストリチクス菌、ポルフィロモナス／プレボテラ属種、プレボテラ・インターメディア、プレボテラ・ブッカエ、プレボテラ属種、バクテロイデス・ユニフォルミス、及びＮＤＭ−１菌株からなる群から選択され、前記グラム陽性菌が、Ａ群連鎖球菌、化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、エンテロコッカス・フェカリス、Ｄ群連鎖球菌、Ｇ群連鎖球菌、緑色連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミレリ、プロピオニバクテリウム属種、エンテロコッカス・フェシウム、ペプトストレプトコッカス属種、微好気性連鎖球菌、ラクトバチルス属種、スタフィロコッカス・エピデミデス、及びスタフィロコッカス・アウレウスからなる群から選択され、前記多菌感染が、グラム陽性菌、グラム陰性菌、又はこれらの組み合わせによって誘発され、前記毒性細菌成分が、エキソトキシン、エンドトキシン、スーパー抗原トキシン、病原体関連分子パターン（ＰＡＰＭ）、ダメージ関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）、リポ多糖、ペプチドグリカン、又はこれらの毒性成分、自然免疫系の細胞によって認識される病原体群と関連する分子、トール様受容体（ＴＬＲ）によって認識される病原体群と関連する分子からなる群から選択される、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項３３】
前記投与が、経口投与、静脈内注射、筋内注射、腹腔内注射、髄腔内注射、皮下注射、直腸内投与、鼻腔内投与、眼局所投与、及び局所投与からなる群から選択した経路のいずれかによるものである、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項３４】
前記治療有効量の前記ペプチドが、前記感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つの発症から好適な時点に投与される、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項３５】
前記治療有効量の前記ペプチドが、前記感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つの発症直後、前記発症から約３０分〜約７２時間以内、又は前記発症から約３０分〜約７日に投与される、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項３６】
前記方法が、前記対象に、少なくとも１つの追加の治療有効剤を治療有効量投与すること、及び標準的な支持療法を行うことのうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの追加の治療有効剤が、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗生剤、静菌剤、殺菌剤、ステロイド、及び抗微生物剤からなる群から選択され、前記標準的な支持療法が、換気、手術、創傷処置、高圧酸素療法、ＩＶＩＧ（静脈内免疫グロブリン）療法、コルチコステロイド療法、血漿交換療法、陰圧閉鎖療法（ＶＡＣ被覆材療法）、及び活性化プロテインＣ療法から選択される、請求項３６に記載の用途のためのペプチド。
【請求項３８】
前記追加の治療有効剤が、次善の用量又は治療用量のいずれかで投与される、請求項３６及び３７のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項３９】
前記ペプチドと前記追加の治療有効剤が同時に投与される、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項４０】
前記ペプチドと前記追加の治療有効剤が、異なる時点に、異なる投与間隔で、異なる持続時間で、又は異なる順序で投与される、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項４１】
前記ペプチドと前記追加の治療有効剤の前記投与間隔が０〜７２時間である、請求項４０に記載の用途のためのペプチド。
【請求項４２】
前記治療有効量が、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．０２５ｍｇ〜１．０ｍｇのペプチドである、請求項２４〜４１のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項４３】
前記治療有効量が、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜０．７５ｍｇのペプチドである、請求項２４〜４２のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項４４】
前記治療有効量が、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．２５ｍｇ〜０．５ｍｇのペプチドである、請求項２４〜４３のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【請求項４５】
前記ペプチドが医薬組成物に含まれ、前記組成物が、生理学的に適合可能な添加剤、担体、希釈剤、及び賦形剤のうちの少なくとも１つを含む、請求項２４〜４１のいずれか一項に記載の用途のためのペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明では、細菌感染を治療するためのペプチド及び方法を開示する。
【背景技術】
【０００２】
本願の全体を通じて、様々な刊行物を括弧内のアラビア数字によって参照する。これらの刊行物の列挙一覧は、本明細書の「従来技術」の項に見ることができる。
【０００３】
セプシスを含め、グラム陰性菌若しくはグラム陽性菌、又はこれらの混合物による重症の細菌感染は世界的に、強力な抗微生物剤の有用性と、支持療法の進歩にもかかわらず、主な罹患及び死亡原因である［１］。
【０００４】
ストレプトコッカス・ピオゲネス（化膿連鎖球菌）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．アウレウス）のようなグラム陽性菌による限局性感染は、発熱及び低血圧を含む全身毒性の徴候を併発することが多く、セプシス及び致死性の敗血症性ショック／トキシックショックに進行する場合がある。これらのタイプの細菌は、エキソトキシンタンパク質又はスーパー抗原（ＳＡｇ）を分泌することがあり、エキソトキシンタンパク質又はスーパー抗原としては、ブドウ球菌エンテロトキシンＳＥＡ〜ＳＥＥ、トキシックショック症候群トキシン１（ＴＳＳＴ−１）、並びに連鎖球菌発熱性エキソトキシンＳＰＥＡ及びＳＰＥＣ［２〜７］が挙げられ、これらは、過剰な細胞性免疫応答を引き起こすことがある。
【０００５】
例えば、壊死性軟部組織感染症（ＮＳＴＩ）は、浅在筋膜と皮下脂肪の両方に影響を与える急性かつ急速進行性の重症な皮膚感染であり、感染部位の痛みと、多臓器損傷を含む全身毒性によって特徴付けられる。この感染症は、自発的に、又は外傷に続いて起きることがある。このタイプの感染症は、抗生物質にあまり応答しないので、壊死組織を除去する積極的な外科的介入が必須である。治療にもかかわらず。死亡率は、現在のところ約１０〜２０％である。共通の原因菌はないが、Ｓ．アウレウス、クロストリジウム種、腸内細菌、及びクロストリジウム以外の嫌気性菌を含むいくつかの菌種が、特に頻繁に特定されているものであり、混合又は多病原体感染として特定されることもある。現在のところ、これを適応症とする入手可能な認証製剤はないので、効果的な療法に対する顕著なアンメットメディカルニーズが存在する。
【０００６】
その結果、重症感染の影響を改善できるとともに、死亡率を低下できる補助療法を開発するための一致した試みが行われてきた。細菌病原因子を中和すること、及び／又は宿主防御を高めることができる薬剤が利用可能になると、特に抗生物質療法と併用した場合に、重症感染の療法を改善することができる。
【０００７】
細菌トキシンによる炎症誘導性リンパ球アポトーシス又はピロトーシスは、実験的感染モデル、並びにエンドトキシン及びスーパー抗原誘導性トキシックショックモデルにおいて、免疫抑制及び致死性の主因であることが示されている。最近の証拠によって、実験的腹腔内セプシスにおいて、ＣＤ４０及び／又はＣＤ８０／８６を含む共刺激シグナルの遮断が、死亡率を低下させる得ることが示されている［８］。
【０００８】
本明細書に開示されているペプチドｐ２ＴＡは、ヒト末梢血単核球において、スーパー抗原の媒介による炎症性サイトカインの誘導をブロックするとともに、マウスにおいて、スーパー抗原の媒介による死をブロックすることがすでに報告されている［９、１０］。
【０００９】
従来技術
本明細書に開示されている主題に対する背景技術として関連があるとみなされる参照文献を下記に列挙する。
［１］Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，３６（１）：２９６−３２７
［２］Ｓｒｉｓｋａｎｄａｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，１７３：１３９９−１４０７
［３］Ｕｎｎｉｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６９：２５６１−２５６９
［４］Ｕｎｎｉｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐａｔｈｏｇ，３１：１０９−１１４
［５］Ａｒａｄ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ  Ｍｅｄ，６：４１４−４２１
［６］Ｌｙｎｓｋｅｙ，Ｎ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２４：１９６−２０２
［７］Ｌｌｅｗｅｌｙｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２：１５６−１６２
［８］Ｎｏｌａｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１７７：３０１−３０８
［９］国際公開第２００４／０８７１９６号
［１０］Ａｒａｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ，Ｓｅｐ；９（９）：ｅ１００１１４９
［１１］Ｃｈｕｎｇ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，１２：１１４３−１１５３
［１２］Ｃｈｕｎｇ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｈｏｃｋ，３４（２）：１５０−１６１
［１３］Ｋｕｒｕｐａｔｉ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７６（６）：１３８７−１３９７
［１４］Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｍ．Ｗ．（２０００）Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ，１３（２）：４７０−５１１
［１５］Ｂｒｅｍｅｌｌ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：２６１５−２６２３
［１６］Ｌｉｕ，Ｚ−Ｑ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．３：３７５−３８０
【００１０】
本明細書における上記参照文献の確認は、本明細書に開示されている主題の特許性と何らかの関連があるという意味として推測すべきではない。
【発明の概要】
【００１１】
本発明では、配列番号１によって示されているとともに、ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、断片、塩、若しくはエステルであって、感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つの治療を必要とするヒト対象において、その感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つを治療する方法で用いるためのものであり、前記ペプチドは、前記対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．０２５ｍｇ〜約１．０ｍｇのペプチドという量で投与するものを提供する。これに加えて、又はこの代わりに、前記ペプチドは、前記対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約０．７５ｍｇのペプチドという量で投与する。これに加えて、又はこの代わりに、前記ペプチドは、前記対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．２５ｍｇ〜約０．５ｍｇのペプチドという量で投与する。
【００１２】
開示されている主題の上記及びその他の実施形態では、前記誘導体は、配列番号２によって示されているとともに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとして示されているような（Ｄ−Ａ）ＳＰＭＬＶＡＹＤ（Ｄ−Ａ）というアミノ酸配列からなるペプチドであることができる。
【００１３】
本開示の第２の態様では、配列番号１によって示されているとともに、ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、断片、塩、若しくはエステルであって、グラム陽性菌、グラム陰性菌、多菌感染、及び細菌トキシンのうちの少なくとも１つによって誘発される感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つに起因するか又はこれに伴う損傷の悪化を防ぐため、この損傷を抑止するため、及びこの損傷を改善するためのうちの少なくとも１つの方法を必要とするヒト対象において、その方法で用いるためのものを提供し、前記ペプチドは、前記対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．０２５ｍｇ〜約１．０ｍｇのペプチドという量で投与するものを提供する。これに加えて、又はこの代わりに、前記ペプチドは、前記対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約０．７５ｍｇのペプチドという量で投与する。これに加えて、又はこの代わりに、前記ペプチドは、前記対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．２５ｍｇ〜約０．５ｍｇのペプチドという量で投与する。
【００１４】
開示されている主題の前記第２の態様の上記の別の実施形態では、前記誘導体は、配列番号２によって示されているとともに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとして示されているような（Ｄ−Ａ）ＳＰＭＬＶＡＹＤ（Ｄ−Ａ）というアミノ酸配列からなるペプチドであることができる。
【００１５】
開示されている主題の上記及びその他のあらゆる態様及び実施形態では、前記感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つは、グラム陽性菌、グラム陰性菌、多菌感染、細菌トキシン、及びその他の毒性細菌成分のうちの少なくとも１つによって誘発され得る。
【００１６】
開示されている主題の上記及びその他のあらゆる態様及び実施形態では、前記グラム陰性菌は、プロテオバクテリア、大腸菌、サルモネラ属、赤痢菌、腸内細菌、シュードモナス属、モラクセラ属、ヘリコバクター属、ブデロビブリオ属、ステノトロフォモナス属、酢酸菌、レジオネラ属、α−プロテオバクテリア、ボルバキア、グラム陰性球菌、ナイセリア種、淋菌、髄膜炎菌、モラクセラ・カタラーリス、グラム陰性桿菌、インフルエンザ菌、肺炎杆菌、レジオネラ・ニューモフィラ、緑膿菌、プロテウス・ミラビリス、エンテロバクター・クロアカエ、霊菌、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・ティフィ、アシネトバクター・バウマニ、野兎病菌、ビブリオ・バルニフィカス、コレラ菌、ビブリオ・フルビアリス、腸炎ビブリオ菌、ビブリオ・アルギノリチカス、フォトバクテリウム・ダムセラ、アエロモナス・ヒドロフィラ、ウェルシュ菌、ヒストリチクス菌、ポルフィロモナス／プレボテラ属種、プレボテラ・インターメディア、プレボテラ・ブッカエ、プレボテラ属種、バクテロイデス・ユニフォルミス、及びＮＤＭ−１菌株のうちのいずれか１つであることができ、前記グラム陽性菌は、Ａ群連鎖球菌、化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、エンテロコッカス・フェカリス、Ｄ群連鎖球菌、Ｇ群連鎖球菌、緑色連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミレリ、プロピオニバクテリウム属種、エンテロコッカス・フェシウム、ペプトストレプトコッカス属種、微好気性連鎖球菌、ラクトバチルス属種、スタフィロコッカス・エピデミデス、及びスタフィロコッカス・アウレウスのうちのいずれかの１つであることができ、前記多菌感染は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、又はこれらの組み合わせによって誘発され得、前記毒性細菌成分は、エキソトキシン、エンドトキシン、スーパー抗原トキシン、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、ダメージ関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）、リポ多糖、ペプチドグリカン、又はこれらの毒性成分、自然免疫系の細胞によって認識される病原体群と関連する分子、及びトール様受容体（ＴＬＲ）によって認識される病原体群と関連する分子のうちのいずれか１つであることができる。
【００１７】
本明細書で開示されている主題の上記及びその他のあらゆる実施形態及び態様では、前記損傷は、全身的損傷又は感染部位の損傷であることができるとともに、壊死性軟部組織感染症（ＮＳＴＩ）、腹腔内多菌感染、及び熱傷（これらに限らない）のうちのいずれか１つによって示すことができ、前記損傷は、多臓器不全、セプシス、重症セプシス、化膿性関節炎、及び敗血症性ショックのうちの少なくとも１つを引き起こし得る。
【００１８】
開示されている主題の上記及びその他のあらゆる態様及び実施形態では、前記投与は、経口投与、静脈内注射、筋内注射、腹腔内注射、髄腔内注射又は皮下注射、直腸内投与、鼻腔内投与、眼局所投与、及び局所投与（これらに限らない）のうちのいずれか１つであることができる。
【００１９】
開示されている主題の上記及びその他のあらゆる態様及び実施形態では、前記ペプチドは、前記感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つの発症からいずれかの好適な時点、例えば、前記感染症又はそれに伴う急性炎症の前記発症の直後、又は前記発症から約３０分〜約７２時間以内、若しくは前記発症から約３０分〜約７日以内（これらに限らない）に投与できる。
【００２０】
開示されている主題の上記及びその他のあらゆる態様及び実施形態では、前記方法は、前記対象に、少なくとも１つの追加の治療有効剤を治療有効量投与すること、及び／又は標準的な支持療法を行うことをさらに含むことができる。前記少なくとも１つの追加の治療有効剤は、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗生剤、静菌剤、殺菌剤、ステロイド、及び抗微生物剤のうちのいずれか１つであることができるとともに、好適な用量で投与でき、この用量は、次善の用量又は治療用量であることができる。前記標準的な支持療法は、換気、手術、創傷処置、高圧酸素療法、ＩＶＩＧ（静脈内免疫グロブリン）療法、コルチコステロイド療法、血漿交換療法、陰圧閉鎖療法（ＶＡＣ被覆材療法）、及び活性化プロテインＣ療法のうちの少なくとも１つである。前記ペプチドと前記追加の治療有効剤は、同時に投与することができる。この代わりに、かつこれに加えて、前記ペプチドと前記少なくとも１つの追加の治療有効剤は、異なる時点に、異なる投与間隔で、異なる持続時間で、及び／又は異なる順序で投与できる。前記ペプチドと前記追加の治療有効剤の前記投与間隔は、０〜７２時間であることができる。
【００２１】
開示されている主題の上記及びその他のあらゆる態様及び実施形態では、前記ペプチドは、医薬組成物に含めることができ、前記組成物は、生理学的に適合可能な添加剤、担体、希釈剤、及び賦形剤のうちの少なくとも１つを含む。
【００２２】
開示されている主題の上記の態様及び実施形態では、前記ペプチドは、単回投与できる。
【００２３】
第３の態様では、本開示は、配列番号１によって示されているとともに、ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、断片、塩、若しくはエステルであって、感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つの治療を必要とするヒト対象において、その感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つを治療する方法で用いるためのものを提供し、前記方法は、前記対象に、前記ペプチドを治療有効量単回投与することを含む。前記誘導体は、配列番号２によって示されているとともに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとして示されているような（Ｄ−Ａ）ＳＰＭＬＶＡＹＤ（Ｄ−Ａ）というアミノ酸配列からなるペプチドであることができるが、これに限らない。
【００２４】
第４の態様では、本開示は、配列番号１によって示されているとともに、ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、断片、塩、若しくはエステルであって、グラム陽性菌、グラム陰性菌、多菌感染、及び細菌トキシンのうちの少なくとも１つによって誘発される感染症又はそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つに起因するか又はこれに伴う損傷の悪化を防ぐため、この損傷を抑止するため、及びこの損傷を改善するためのうちの少なくとも１つの方法を必要とするヒト対象において、その方法で用いるためのものを提供し、前記方法は、前記対象に、前記ペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、機能的断片、塩、若しくはエステルを治療有効量単回投与することを含む。前記誘導体は、配列番号２によって示されているとともに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとして示されているような（Ｄ−Ａ）ＳＰＭＬＶＡＹＤ（Ｄ−Ａ）というアミノ酸配列からなるペプチドであることができるが、これに限らない。
【００２５】
前記第３及び第４の態様のすべての実施形態、並びに開示されている主題のその他の態様及び実施形態では、前記治療有効量は、体重１ｋｇ当たり約０．０２５ｍｇ〜約１．０ｍｇのペプチド、例えば体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約０．７５ｍｇのペプチド（前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．２５ｍｇ〜約０．５ｍｇのペプチドなど）であることができる。
【００２６】
開示されている主題のその他の態様及び実施形態は、説明が進むにつれ明らかになるであろう。
【００２７】
開示されている主題を理解し、その主題を実際に実施する方法を認識する目的で、以下では、単なる非限定例によって、下記の添付の図面を参照しながら、実施形態を説明していく。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる処置によって、生きたＳ．アウレウスへの感染（図１Ａ）、又はブドウ球菌のペプチドグリカンへの暴露（図１Ｂ）に起因する化膿性関節炎からマウスを防御できることを示すグラフを含む。略語：ＳＡは化膿性関節炎を示し、ＭＳＡはマウス血清アルブミンを示す。
【図２】Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる処置によって、感染から１時間及び５時間経過した時点で、成立済みの化膿連鎖球菌感染からマウスを防御できることを示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率プロットである。
【図３】感染から１時間経過した時点にＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを投与した場合における、化膿連鎖球菌軟部組織感染症のマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率プロット、用量反応である。
【図４】感染から３６時間後における、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡと抗生物質との相乗効果を示す、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率プロットである。
【図５】化膿連鎖球菌感染から２４時間後における、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの感染局所部位に対する作用を示す写真である。
【図６】化膿連鎖球菌感染から５時間後に、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを（５ｍｇ／ｋｇで）１回投与した場合と２回投与した場合の効能を示す、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率プロットである。
【図７】化膿連鎖球菌感染後に、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを（２．５ｍｇ／ｋｇで）１回投与した場合と２回投与した場合の効能を示す、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率プロットである。
【図８】図８Ａは、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを１回投与した場合と、異なる投与間隔（１２時間及び２４時間）で２回投与した場合の効能を示す、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率プロットである。図８Ｂは、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを１回投与した場合と、上記よりも長い異なる投与間隔（４８時間及び７２時間）で２回投与した場合の効能を示す、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率プロットである。
【図９】Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの分割投与が、化膿連鎖球菌に感染させたマウスの生存率に及ぼす作用を示す、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率プロットである。
【図１０】化膿連鎖球菌に感染させ、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置したマウスにおけるサイトカインレベルを示すグラフを含む。
【図１０Ａ】感染から１２時間後における血漿中Ｔｈ１サイトカインに対する作用を示すグラフを含む。図１０Ａ−１は、ＩＦＮ−γに対する作用を示すグラフであり、図１０Ａ−２は、ＩＬ−１７Ａに対する作用を示すグラフであり、図１０Ａ−３は、ＴＮＦ−αに対する作用を示すグラフであり、図１０Ａ−４は、ＩＬ−１βに対する作用を示すグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、感染から１２時間後における血漿中炎症性サイトカインに対する作用を示すグラフを含む。図１０Ｂ−１は、ＩＬ−８のマウスオルソログであるＫＣに対する作用を示すグラフであり、図１０Ｂ−２は、ＩＬ−６に対する作用を示すグラフであり、図１０Ｂ−３は、ＲＡＮＴＥＳに対する作用を示すグラフであり、図１０Ｂ−４は、ＭＣＰ−１に対する作用を示すグラフである。
【図１０Ｃ】感染から２４時間後における、血漿中Ｔｈ２サイトカインＩＬ−１０に対する作用を示すグラフである。
【図１１】化膿連鎖球菌に感染させたマウスにおける血清中サイトカインレベルのグラフ表示である。
【図１１Ａ】化膿連鎖球菌を筋内感染させ、さらなる治療をまったく行わなかったマウス、又は、化膿連鎖球菌を筋内感染させ、感染から１２時間後（図１１Ａ−１）、２４時間後（図１１Ａ−２）、４８時間後（図１１Ａ−３）、及び７２時間後（図１１Ａ−４）に、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置したマウスにおけるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の血清中レベルを示すグラフを含む。
【図１１Ｂ】化膿連鎖球菌を筋内感染させ、さらなる治療をまったく行わなかったマウス、又は、化膿連鎖球菌を筋内感染させ、感染から１２時間後（図１１Ｂ−１）、２４時間後（図１１Ｂ−２）、４８時間後（図１１Ｂ−３）、及び７２時間後（図１１Ｂ−４）にペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置したマウスにおけるＩＬ−１βの血清中レベルを示すグラフを含む。
【図１１Ｃ】化膿連鎖球菌を筋内感染させ、さらなる治療をまったく行わなかったマウス、又は化膿連鎖球菌を筋内感染させ、感染から１２時間後（図１１Ｃ−１）、２４時間後（図１１Ｃ−２）、４８時間後（図１１Ｃ−３）、及び７２時間後（図１１Ｃ−４）にペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置したマウスにおけるＩＬ−６の血清中レベルを示すグラフを含む。
【図１１Ｄ】化膿連鎖球菌に感染させ、Ｄ−ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置したマウスにおける血清中サイトカインレベルの平均値を示すグラフを含む。図１１Ｄ−１は、感染から４８時間後におけるサイトカインのレベルを示すグラフであり、図１１Ｄ−２は、感染から７２時間後におけるサイトカインのレベルを示すグラフである。
【図１２】化膿連鎖球菌に感染させ、感染から２４時間後（図Ａ、図Ｃ）及び４８時間後（図Ｂ、図Ｄ）にＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置したマウスの筋肉（図１２Ａ及び図１２Ｂ）並びに脾臓（図１２Ｃ及び図１２Ｄ）内の細菌数を示すグラフを含む。
【図１３】図１３Ａは、７２時間後における、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ処置マウスと未処置マウスの筋肉内の化膿連鎖球菌の菌量を示すグラフである。図１３Ｂは、７２時間後における、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ処置マウスと未処置マウスの肝臓内の化膿連鎖球菌の菌量を示すグラフである。図１３Ｃは、７２時間後における、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ処置マウスと未処置マウスの脾臓内の化膿連鎖球菌の菌量を示すグラフである。
【図１４】化膿連鎖球菌感染から４８時間後（図１４Ａ及び図１４Ｂ）並びに７２時間後（図１４Ｃ、図１４Ｄ）におけるマウスの染色筋肉切片の顕微鏡写真を含む。図１４Ａ及び図１４Ｃは、化膿連鎖球菌感染後にペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置したマウスの染色筋肉切片の顕微鏡写真である。図１４Ｂ及び図１４Ｄは、化膿連鎖球菌感染後に処置しなかったマウスの染色筋肉切片の顕微鏡写真である。
【図１５】ＳＰＥＡ、ＳＰＥＢ、及びＳＰＥＣに対する血清抗体価のグラフ表示である。連鎖球菌発熱性エキソトキシンＡ、Ｂ、及びＣに対する抗体価は、化膿連鎖球菌に筋内感染させてから５日後（Ａ〜Ｃ、ｎ＝５）及び１４日後（Ｄ〜Ｆ、ｎ＝２０）に測定した。感染させた未処置マウスの中には、５日を超えて生存したマウスは存在しなかった。図１５Ａは、感染から５日後における、ＳＰＥＡに対する血清抗体価を示すグラフであり、図１５Ｂは、感染から５日後における、ＳＰＥＢに対する血清抗体価を示すグラフであり、図１５Ｃは、感染から５日後における、ＳＰＥＣに対する血清抗体価を示すグラフであり、図１５Ｄは、感染から１４日後における、ＳＰＥＡに対する血清抗体価を示すグラフであり、図１５Ｅは、感染から１４日後における、ＳＰＥＢに対する血清抗体価を示すグラフであり、図１５Ｆは、感染から１４日後における、ＳＰＥＣに対する血清抗体価を示すグラフである。
【図１６】混合リンパ球反応のグラフ表示である。個別のマウス３頭から採取した樹状細胞（ＤＣ）を、３頭の追加のドナーから採取した同種末梢血単核球（ＰＢＭＣ）とともに、３日間、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの用量を増やしながら培養した。
【図１７】肺炎連鎖球菌感染後におけるＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡと抗生物質との併用処置の作用を示す生存率グラフであり、処置は、感染から２４時間後に行った。
【図１８】肺炎連鎖球菌に感染させたマウスに、感染から２４時間後に投与したＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ（抗生物質と併用）の単回投与の効能を示す生存率グラフ、用量反応である。
【図１９】抗生物質とＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとの併用治療（Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる治療は感染時に開始し、抗生物質は、感染から４時間後に投与した）によって、細菌性腹膜炎（大腸菌への致死感染によって誘発される）からマウスを防御する作用を示すグラフである。
【図２０】（１回で全量を投与する場合と比較して）Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの分割投与が、大腸菌に感染したマウスの生存率に及ぼす作用を示すグラフであり、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる処置は、感染時に開始した。抗生物質は、感染から４時間後に投与した。
【図２１】ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの単回投与が、ＣＬＰ後の死亡数を減少させる効能を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率プロットである。Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、抗生物質とともに、手術の２時間後に投与した。
【図２２】ＣＬＰの１２時間後又は２４時間後に投与した場合のＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡと抗生物質との相乗効果を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率プロットである。
【図２３】ＣＬＰモデルにおいて、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの単回投与と複数回投与が死亡数を減少させる効能を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率プロットである。
【図２４】ＣＬＰモデルにおいて、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡが死亡数を減少させる効能を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率プロット、用量反応である。
【図２５】ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後における、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ（ＣＬＰの２時間後に、抗生物質なしに投与）の血漿中（血中−左側パネルＡ〜Ｃ）及び腹水中（右側パネルＤ〜Ｆ）のサイトカインレベルに対する作用を示すグラフを含む。図２５Ａは、ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後における血中ＴＮＦ−αレベルを示すグラフであり、図２５Ｂは、ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後における腹水中ＴＮＦ−αレベルを示すグラフであり、図２５Ｃは、ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後における血中ＲＡＮＴＥＳレベルを示すグラフであり、図２５Ｄは、ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後における腹水中ＲＡＮＴＥＳレベルを示すグラフであり、図２５Ｅは、ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後における血中ＫＣ（ＩＬ−８）レベルを示すグラフであり、図２５Ｆは、ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後における腹水中ＫＣ（ＩＬ−８）レベルを示すグラフである。
【図２６】Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ（ＣＬＰの２時間後に、抗生物質なしに投与）が、ＣＬＰ動物の組織及び臓器からの細菌の除去（ＣＦＵによって測定）を促すことを示すグラフを含む。図２６Ａは、ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後に、血液で測定した１ミリリットル当たりのＣＦＵを示すグラフであり、図２６Ｂは、ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後に、腹水で測定した１ミリリットル当たりのＣＦＵ（×１０４）を示すグラフであり、図２６Ｃは、ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後に、脾臓で測定した組織１グラム当たりのＣＦＵを示すグラフであり、図２６Ｄは、ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後に、肝臓で測定した組織１グラム当たりのＣＦＵであり、図２６Ｅは、ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後に、腎臓で測定した組織１グラム当たりのＣＦＵを示すグラフである。
【図２７】ＣＬＰ後に、多形核細胞（ＰＭＮ）の重要臓器への浸潤（ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後に、ＭＰＯ活性によって測定）が低減したことを示すグラフを含む。Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、ＣＬＰの２時間後に、抗生物質なしに投与した。図２７Ａは、ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後における脾臓中のＭＰＯ活性を示すグラフであり、図２７Ｂは、ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後における肝臓中のＭＰＯ活性を示すグラフであり、図２７Ｃは、ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後における腎臓中のＭＰＯ活性を示すグラフである。
【図２８】Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの単回投与（ＣＬＰの２時間後に、抗生物質なしに投与）が、ＰＭＮの肝臓への浸潤（ＣＬＰの２４時間後に直接計数によって測定）に及ぼす作用を示すグラフである。肝臓切片に存在する好中球（エステラーゼ陽性染色細胞）の数を顕微鏡によって４００倍で、ランダムにスクリーニングした（５〜７領域／サンプル）。グラフ中の単位は、ＰＭＮの数である。
【図２９】ＣＬＰ後に、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡが、ＣＤ２８の発現に及ぼす作用を示すグラフを含む。フローサイトメトリーによって評価したＣＤ２８の表面発現により、ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後に、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡペプチドによる処置の有無にかかわらず、脾臓（図２９Ａ）及び血液（図２９Ｃ）のＣＤ３＋Ｔリンパ球上のレベルが有意に低下したことが示された。脾臓（図２９Ｂ）及び血液（図２９Ｄ）のＧｒ１＋骨髄性細胞では、ＣＬＰ後に発現の増大が示され、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡペプチドによる処置の作用は観察されなかった。＊は、シャムに対してＰ＜０．０５であり、平均値±ＳＥＭが示されており、ｎ＝５〜８頭のマウス／群である。
【図３０】ＣＬＰの２４時間後の腎臓及び脾臓におけるアポトーシスレベルが、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる処置（ＣＬＰの２時間後に、抗生物質なしに投与）後に低下したことを示すグラフである。＊は、シャムに対してＰ＜０．０５であり、＃は、Ｃ５７ＢＬ／６ＣＬＰ群に対してＰ＜０．０５であり、＊は、シャムに対してＰ＜０．０５であり、＃は、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡペプチドで処置したＣＬＰ群に対してＰ＜０．０５であり、平均値±ＳＥＭが示されており、ｎ＝４〜６頭のマウス／群である。
【図３１】ＣＬＰの２４時間後の脾臓におけるアポトーシスの低下を（ＴＵＮＥＬ染色によって）示す顕微鏡写真である。Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、ＣＬＰの２時間後に、抗生物質なしに投与した。図３１Ａは、シャムにおける染色を示す顕微鏡写真であり、図３１Ｂは、未処置のＣＬＰ群における染色を示す顕微鏡写真であり、図３１Ｃは、ＣＬＰ後にＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置した群の染色を示す顕微鏡写真である。
【図３２】組織切片における代表的な免疫組織学的ＴＵＮＥＬ染色顕微鏡写真を含む。Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる処置は、ＴＵＮＥＬ染色によると、ＣＬＰの２４時間後において、脾臓及び腎臓組織のアポトーシスを低減した。シャムマウスは、脾臓（図３２Ａ）及び腎臓（図３２Ｂ）において、ＴＵＮＥＬ染色をまったく又はわずかにしか示さなかった。シャム手術マウスと比べて、ＣＬＰマウスは、広範なＴＵＮＥＬ染色を示した（図３２Ｃ脾臓、図３２Ｄ腎臓）が、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置したＣＬＰマウスは、ＴＵＮＥＬ染色が有意に少なかった（図３２Ｅ脾臓、図３２Ｆ腎臓）。元の倍率は１００倍である。
【図３３】本発明で用いた細菌感染の様々なモデルにおけるＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの効能の概要を示す棒グラフである。
【図３４】ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡのバリン残基を［バリン−１４Ｃ］によって置換したペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）を雄ＢＡＬＢ／ｃマウスに単回静脈内投与後の組織中濃度−時間曲線を示すグラフを含む。ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡのレベルは、全身投与後の最初の１時間にわたって、リンパ節（図３４Ａ）及び血漿（図３４Ｂ）におけるものが示されている。
【図３５】ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡのバリン残基を［バリン−１４Ｃ］によって置換したペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）を雄ＢＡＬＢ／ｃマウスに単回静脈内投与後の、組織の血漿に対する比率（平均値±ＳＤ）を示すグラフを含む。図３５Ａは、全身投与後の最初の２時間における、リンパ節の血漿に対する比率であり、図３５Ｂは、全身投与後の最初の２時間における、脾臓の血漿に対する比率である。
【図３６】ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡのバリン残基を［バリン−１４Ｃ］によって置換したペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）が、マウスへの注射から２分後（図３６Ａ）、１０分後（図３６Ｂ）、及び２０分後（図３６Ｃ）において、マウスの様々な組織において分布している様子を示すグラフを含む。
【図３７】０．５ｍｇ／ｋｇ又は０．２５ｍｇ／ｋｇのいずれかのＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡペプチドの単回投与によって処置した壊死性軟部組織感染症（ＮＳＴＩ）患者の集中治療室（ＩＣＵ）での平均入院期間（±ＳＤ）をプラセボと比べて示す。別の対照として、すべての積極的治療群をまとめて、プラセボとともに比較した。ＩＣＵでの日数は、２４時間制に基づき、薬物投与時間を起点にして計算した。
【図３８】図３８Ａは、各治療群（０．５ｍｇ／ｋｇ及び０．２５ｍｇ／ｋｇ）において行った壊死組織切除の平均総数（±ＳＤ）をプラセボと比べて示す。図３８Ｂは、（各治療群において）感染からの回復のために壊死組織切除を１回しか必要としなかった患者の比率と、回復のために壊死組織切除を４回以上必要とした患者の比率を示す。
【図３９】各治療群において、臓器機能不全（ＳＯＦＡスコアが≧３であるものとして定義する）を有する患者の経時的な比率を示す（１日目〜１４日目）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
定義
「感染」という用語は、本明細書で使用する場合、宿主生物が細菌病原体を保菌することを意味するものとし、この細菌病原体は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、又はグラム陽性菌とグラム陰性菌との混合物、及びこれらの毒性成分のうちの少なくとも１つであってよい。
【００３０】
「多菌感染」という用語は、本明細書で使用する場合、数種の細菌からなり／数種の細菌によって誘発される感染を意味するものとする。多菌感染は、グラム陽性菌の混合物、グラム陰性菌の混合物、又はグラム陽性菌とグラム陰性菌との混合物によるものであってよい。多菌感染は、好気性細菌の混合物、嫌気性細菌の混合物、又は好気性細菌と嫌気性細菌との混合物によるものであることもできる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、感染又は急性炎症状態は、グラム陰性菌によって誘発される。感染は、細菌のみならず、毒性細菌成分によっても誘発され得る。グラム陰性菌としては、大腸菌及びその他のヘリコバクター属、ステノトロフォモナス属、ブデロビブリオ属、レジオネラ、並びにα−プロテオバクテリアが挙げられるが、これらに限らない。より具体的には、特殊な医学的関連性があるグラム陰性菌としては、淋菌（性感染症を引き起こす）及び髄膜炎菌（髄膜炎を引き起こす）、さらには呼吸器症状を引き起こすモラクセラ・カタラーリスのようなナイセリア種などの球菌が挙げられるが、これらに限らない。グラム陰性菌としては、主に呼吸の問題を引き起こす種（インフルエンザ菌、肺炎杆菌、レジオネラ・ニューモフィラ、緑膿菌）、泌尿器の問題を引き起こす種（大腸菌、プロテウス・ミラビリス、エンテロバクター・クロアカエ、霊菌）、及び胃腸の問題を引き起こす種（ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・ティフィ）が挙げられる。院内感染と関連するグラム陰性菌としては、病院施設の集中治療室で菌血症、続発性髄膜炎、及び人工呼吸器関連肺炎を引き起こすアシネトバクター・バウマニが挙げられる。その他の細菌としては、致死呼吸器感染を引き起こし得る野兎病菌、ビブリオ・バルニフィカス、コレラ菌、ビブリオ・フルビアリス、腸炎ビブリオ菌、ビブリオ・アルギノリチカス、及びビブリオ・ダムセラ（フォトバクテリウム・ダムセラ）を含むビブリオ種、アエロモナス・ヒドロフィラ、ウェルシュ菌、又は抗生物質耐性の高いＮＤＭ−１菌株のいずれかが挙げられる。この群としては、ポルフィロモナス／プレボテラ属種、ヒストリチクス菌、プレボテラ・インターメディア、プレボテラ・ブッカエ、プレボテラ属種、及びバクテロイデス・ユニフォルミスも挙げられる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、感染又は急性炎症状態は、プロテオバクテリア、大腸菌、サルモネラ属、赤痢菌、腸内細菌、シュードモナス属、モラクセラ属、ヘリコバクター属、ブデロビブリオ属、ステノトロフォモナス属、酢酸菌、レジオネラ属、α−プロテオバクテリア、ボルバキア、グラム陰性球菌、ナイセリア種、淋菌、髄膜炎菌、モラクセラ・カタラーリス、グラム陰性桿菌、インフルエンザ菌、肺炎杆菌、レジオネラ・ニューモフィラ、緑膿菌、プロテウス・ミラビリス、エンテロバクター・クロアカエ、霊菌、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・ティフィ、アシネトバクター・バウマニ、野兎病菌、ビブリオ・バルニフィカス、コレラ菌、ビブリオ・フルビアリス、腸炎ビブリオ菌、ビブリオ・アルギノリチカス、フォトバクテリウム・ダムセラ、アエロモナス・ヒドロフィラ、ウェルシュ菌、ヒストリチクス菌、ポルフィロモナス／プレボテラ属種、プレボテラ・インターメディア、プレボテラ・ブッカエ、プレボテラ属種、バクテロイデス・ユニフォルミス、及びＮＤＭ−１菌株からなる群から選択したグラム陰性菌によって誘発される。
【００３３】
細菌病原体としては、Ａ群連鎖球菌（化膿連鎖球菌など）、肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、エンテロコッカス・フェカリス（Ｄ群連鎖球菌）、Ｇ群連鎖球菌、緑色連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミレリ、プロピオニバクテリウム属種、エンテロコッカス・フェシウム、ペプトストレプトコッカス属種、微好気性連鎖球菌、ラクトバチルス属種、スタフィロコッカス・エピデミデス、及びスタフィロコッカス・アウレウス（これらに限らない）のようなグラム陽性菌も挙げられる。
【００３４】
細菌感染は、単一の菌種ではなく、数種の細菌病原体によって起きることもある。これらの感染は、複合感染、複雑性感染、混合感染、二重感染、二次感染、相乗感染、同時感染、複数菌感染、重感染としても知られている（これらの例の一部は、本明細書において、腹腔内感染のモデルで示されている）。
【００３５】
毒性細菌成分としては、エキソトキシン及びエンドトキシンのような細菌トキシンが挙げられる。概してグラム陽性菌と関連する細菌エキソトキシンの例は、タンパク質様ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、トキシックショック症候群トキシン１（ＴＳＳＴ−１）などである。その他の毒性成分は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、自然免疫系の細胞、特にトール様受容体（ＴＬＲ）によって認識される病原体群と関連する分子に属する。ＰＡＭＰの例は、グラム陰性菌と関連するエンドトキシン（ＬＰＳ（リポ多糖）など）、又はその毒性成分（単一若しくは複数）（脂質Ａなど）である。その他の毒性成分は、非感染性の炎症反応において免疫応答を開始及び持続させることができる分子であるダメージ関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）であってよい。ＤＡＭＰの例は、グラム陽性菌と関連するペプチドグリカン、ヒートショックタンパク質及びそれらの断片、ヒアルロン酸断片、プリン代謝産物などである。
【００３６】
いくつかの実施形態では、毒性細菌成分は、エキソトキシン、エンドトキシン、スーパー抗原トキシン、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、ダメージ関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）、ペプチドグリカン、リポ多糖又はこれらの毒性成分、自然免疫系の細胞によって認識される病原体群と関連する分子、及びトール様受容体（ＴＬＲ）によって認識される病原体群と関連する分子からなる群から選択する。
【００３７】
感染状態としては、本明細書に示されているように、化膿性関節炎を引き起こすＳ．アウレウス感染症が挙げられるが、これに限らない。細菌性関節炎（又は化膿性関節炎）は、ヒトにおける急速進行性かつ高破壊性関節疾患である。化膿性関節炎の臨床症状としては、関節の発赤、腫脹、熱感、痛み、及び機能不全［１５、１６］が挙げられる。化膿性関節炎は、細菌が血流を通じて関節まで広がると発現し、損傷により、又は手術中に、関節が微生物に直接感染したときにも発症することがある。このタイプの感染症で最も一般的な部位は、膝及び股関節である。このような感染症の関連する実験的モデルは、マウスにおけるＳ．アウレウス膝関節感染症である。
【００３８】
その他の感染状態としては、壊死性軟部組織感染症（ＮＳＴＩ）が挙げられるが、これに限らない。ＮＳＴＩは、皮膚、皮膚構造、及び軟部組織に関連する最も重篤なタイプの感染症を表す様々な特有の臨床診断を含む説明的な用語であることを理解されたい。Ａ群連鎖球菌への感染又はＡ群以外の連鎖球菌への感染、細菌共動性壊疽、クロストリジウム性ガス壊疽、フルニエ壊疽、及び溶血連鎖球菌性壊疽による壊死性筋膜炎は、局所組織壊死、全身性毒血症、及び菌血症を含め、臨床的特徴を共有する明確な臨床単位の非限定例であり、多臓器不全により、高い死亡率を有する。非限定例の１つは、本明細書に示されている化膿連鎖球菌感染である。このような感染症の関連する実験的モデルは、マウスにおける化膿連鎖球菌大腿感染症である。
【００３９】
手術、糖尿病、肥満、静注薬の使用、末梢血管疾患、及び免疫抑制は、ＮＳＴＩの危険因子として挙げられることが多いが、ＮＳＴＩの素因的理由がない症例の比率が高い。重要な臨床的特徴は、皮下筋膜組織に限られた壊死の存在であり、深在筋膜層、脂肪、神経、動脈、及び静脈で見られることも多く、身体診察又は撮像検査によって常に明らかになるわけではないが、身体診察又は撮像検査によって、即時の外科的診査及び壊死組織切除を必要とする患者を確認する。
【００４０】
理論に束縛されるわけではないが、ＮＳＴＩの病因は、細菌トキシン及び炎症性サイトカインの過剰な局所放出に関連していると考えられている。過剰な局所炎症反応が体循環に広がり、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を引き起こし、難治性ショック及び多臓器不全に至る可能性がある。
【００４１】
感染状態としては、（例えば肺炎連鎖球菌による）呼吸器（肺）感染症、並びに（例えば、盲腸結紮穿刺法（ＣＬＰ）モデル及び大腸菌性腹膜炎モデルの両方における下記の実施例に示されているような）腹腔内（又は重症腹腔内感染症も挙げてよい。
【００４２】
「それに伴う急性炎症」という用語は、本明細書で使用する場合、本開示による細菌病原体及び／又はその成分への感染のような有害な刺激に対する生物の複合的な急性生体反応の一部を意味する。
【００４３】
本発明に包含される追加の状態であって、自然免疫応答の活性化と関連する追加の状態は、死細胞によって放出される細胞内タンパク質を受容体が検出することによって細胞レベルで認識される（最初は感染と関連していない）外傷又は外傷性損傷、及びその関連組織ダメージである。これらの成分は、非感染性の炎症反応における免疫応答を開始及び持続させることができるダメージ関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）という。これらは、炎症反応の開始と持続を促す病原体関連分子パターン分子（ＰＡＭＰ）と同様の「シグナル０」として機能する。ＤＡＭＰの例としては、一定の細胞内機能を有する核又はサイトゾルタンパク質であって、組織損傷後に細胞外に放出されるか、又は細胞の表面に露出されると、還元環境から酸化環境に移り、その結果、機能を変化させる核又はサイトゾルタンパク質が挙げられる。
【００４４】
特定の実施形態では、細菌によって誘発される状態は、セプシス（全身炎症状態（ＳＩＲＳともいう）と、既知の感染症又は感染症の疑いの存在とによって特徴付けられる重篤な状態）である。身体は、血液、尿、肺、皮膚、又はその他の組織における細菌の存在に対して、免疫系によって、この炎症反応を発現させることがある。セプシスは、血液中毒又は敗血症として一般に知られている。重症セプシスは、全身性炎症反応に、感染症と少なくとも１つの臓器機能不全の存在が加わったものである。敗血症（菌血症という場合もある）は、血流に病原性生物が存在することを指し、セプシスに至る。
【００４５】
感染状態としては、Ａ群連鎖球菌のようなヒト食いバクテリアによって誘発されるか、又はこれに関連する状態、及び関連する合併症、例えば、化膿性関節炎（関節の炎症及び破壊）に至るＳ．アウレウスによる無能力（嘔吐、悪心）又は壊疽なども挙げられる。
【００４６】
「単回投与」という用語は、本明細書で使用する場合、特定の時点に１回投与する薬物投与を指す。
【００４７】
「治療有効剤」という用語は、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗生剤、静菌剤、殺菌剤、ステロイド、及び抗微生物剤を含むが、これらに限らない。
【００４８】
「抗生剤」という用語は、抗生物質、抗菌剤、静菌剤、殺菌剤、抗微生物剤を含め、細菌感染に有効ないずれかの治療剤であって、天然物、半合成物、又は合成物であってよいいずれかの治療剤を意味するものとする。例示的かつ非限定的な抗生剤は、モキシフロキサシン又はセフトリアキソンである。
【００４９】
本明細書に開示されている主題の実施形態は、単独療法か、又は少なくとも１つの追加の治療剤及び／若しくは標準的なケア治療との併用かを問わず、本明細書に定義されているようなペプチドｐ２ＴＡ、又はその機能的誘導体を治療有効量投与したところ、感染及び／又はそれに伴う急性炎症の治療を必要とするヒト対象において、その感染及び／又はそれに伴う急性炎症の治療に有効であったという所見に基づいている。
【００５０】
本発明でｐ２ＴＡと称するペプチドは、配列番号１によって示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなる。前記ペプチドの機能的誘導体も本開示内に包含される。
【００５１】
非限定例として、このペプチドの誘導体は、ＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列を含むペプチドｐ２ＴＡの両末端がＤ−アラニン残基に隣接したものである。得られる誘導体は、配列番号２によって示されているような（Ｄ−Ａ）ＳＰＭＬＶＡＹＤ（Ｄ−Ａ）というアミノ酸配列からなるペプチド（本明細書では、「Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ」とも称される）である。
【００５２】
理論に縛られるものではないが、両末端にＤ−アラニン残基を付加すると、上記ペプチドのプロテアーゼ抵抗性が向上する。ｐ２ＴＡのその他の誘導体は、下に詳述されているように、本発明の範囲内で考えられる。したがって、ｐ２ＴＡという用語は、本明細書で使用する場合、配列番号１のペプチドと、その誘導体、例えば、配列番号２によって示される誘導体Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ（これに限らない）とを含む。
【００５３】
したがって、本明細書に開示されているのは、配列番号１によって示されているとともに、ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、断片、塩、若しくはエステルであって、感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つの治療を必要とするヒト対象において、その感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つを治療する方法で用いるためのものであり、前記ペプチドは、前記対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．０２５ｍｇ〜約１．０ｍｇのペプチドという量で投与する。
【００５４】
「ペプチド」という用語は、その断片、誘導体、及び機能的誘導体も意味するものとする。したがって、例えば、誘導体、例えばＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡペプチドも、「本発明のペプチド」と称してよい。
【００５５】
「断片」、「誘導体」、及び「機能的誘導体」という用語は、本明細書で使用する場合、配列番号１又は２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドであって、そのペプチドに対する挿入、欠失、置換、及び修飾のうち、本明細書に説明されているように、細菌感染及びその他の感染、並びにそれらに関連する炎症にペプチドが治療的作用をもたらす能力を損なわないいずれかの挿入、欠失、置換、及び修飾を有するペプチドを意味する。誘導体は、前記配列番号１に対する最低限の相同性、例えば９５％、９０％、８０％、７０％、６０％などを保持しなければならない。
【００５６】
「挿入」という用語は、本明細書で使用する場合、本発明のペプチドに、少なくとも１つのアミノ酸残基、最大で２０個のアミノ酸残基、例えば２０〜１個のアミノ酸残基、より具体的には１〜１０個のアミノ酸残基、例えば１個、２個、３個、４個、又は５個のアミノ酸残基をいずれかに付加することを意味する。
【００５７】
本明細書に開示されているペプチドは、そのＮ末端を介してラウリル−システイン（ＬＣ）残基に、及び／又はそのＣ末端を介してシステイン（Ｃ）残基に結合できる。
【００５８】
本発明のペプチドはすべて、正電荷を持っていても、負電荷を持っていても、又は中性であってもよい。加えて、本発明のペプチドは、二量体の形態、多量体の形態、又は拘束された立体構造（内部架橋、短距離環化、伸長、又はその他の化学修飾によって実現できる）であってよい。
【００５９】
さらに、本発明のペプチドは、そのＮ末端及び／又はＣ末端で、様々な同一又は異なるアミノ酸残基によって伸長させてよい。このような伸長の例として、本発明のペプチドは、そのＮ末端及び／又はＣ末端で、天然又は合成アミノ酸残基であってよい同一又は異なる疎水性アミノ酸残基（単一又は複数）によって伸長させてよい。具体的な合成アミノ酸残基はＤ−アラニンである。このような伸長の追加の例は、そのＮ末端及び／又はＣ末端の両方でシステイン残基によって伸長させたペプチドによってもたらしてよい。当然ながら、このような伸長は、ジスルフィド結合の形成に起因するＣｙｓ−Ｃｙｓ環化により、拘束された立体構造を導き得る。別の例は、Ｎ末端のリシル−パルミトイルテールの組み込みであってよく、このリシンはリンカーとして機能し、パルミチン酸は疎水性アンカーとして機能する。加えて、本発明のペプチドは、天然又は合成アミノ酸残基であってよい芳香族アミノ酸残基（単一若しくは複数）によって伸長させてもよい。例えば、具体的な芳香族アミノ酸残基はトリプトファンであってよい。本発明のペプチドは、そのＮ末端及び／又はＣ末端で、天然又は合成アミノ酸である様々な同一又は異なる有機部分によって伸長させてよい。このような伸長の例として、本発明のペプチドは、そのＮ及び／又はＣ末端で、Ｎ−アセチル基によって伸長させてよい。本発明で用いられているとともに本明細書に開示されているすべてのペプチド配列に関しては、本発明は、ペプチド鎖の方向が逆になっているとともに、すべてのアミノ酸がＤ体に属する対応のレトロインベルソ配列を含む。基本エピトープ配列が、配列番号１によって示されているようなアミノ酸配列の一部又はすべてを含むか、両末端がＤ−Ａｌａ残基と隣接している（配列番号２、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡともいう）か、又はその他の誘導体である、さらに長いペプチドも、本明細書に開示されている主題の範囲内で考えられる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているのは、配列番号２によって示されているとともに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとして示されているような（Ｄ−Ａ）ＳＰＭＬＶＡＹＤ（Ｄ−Ａ）というアミノ酸配列からなるペプチドであって、感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つの治療を必要とするヒト対象において、その感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つを治療する方法で用いるためのものであり、前記ペプチドは、前記対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．０２５ｍｇ〜約１．０ｍｇのペプチドという量で投与する。
【００６１】
本明細書に定義されている目的における本発明のペプチドの治療有効量（単一又は複数）は、病状を治癒させるか、少なくとも抑止するか、又は少なくとも軽減する目的で、当該技術分野において既知であるような検討事項によって決定する。本開示によれば、本発明によるペプチドは、前記対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．０２５ｍｇ〜約１．０ｍｇのペプチドという量で投与する。
【００６２】
本発明によるペプチドは、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．０２５ｍｇ〜１．０ｍｇのペプチド、例えば０．０５ｍｇ〜１．０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１．０ｍｇ、０．２ｍｇ〜１．０ｍｇ、０．３ｍｇ〜１．０ｍｇ、０．４〜１．０ｍｇ、０．５〜１．０ｍｇ、０．６ｍｇ〜１．０ｍｇ、０．７ｍｇ〜１．０ｍｇ、０．８ｍｇ〜１．０ｍｇ、０．９ｍｇ〜１．０ｍｇ、０．０５ｍｇ〜０．７ｍｇ、０．１ｍｇ〜０．７ｍｇ、０．２ｍｇ〜０．７ｍｇ、０．３ｍｇ〜０．７ｍｇ、０．４ｍｇ〜０．７ｍｇ、０．５ｍｇ〜０．７ｍｇ、０．６ｍｇ〜０．７ｍｇ、０．０５ｍｇ〜０．４ｍｇ、０．０５ｍｇ〜０．３ｍｇ、０．０５ｍｇ〜０．２ｍｇの量で投与してよい。具体的には、治療有効量は、体重１ｋｇ当たり０．０２５ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．０７５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．１５ｍｇ、０．１７５ｍｇ、０．２ｍｇ、０．２２５ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．２７５ｍｇ、０．３ｍｇ、０．３２５ｍｇ、０．３５ｍｇ、０．３７５ｍｇ、０．４ｍｇ、０．４２５ｍｇ、０．４５ｍｇ、０．４７５ｍｇ、０．５ｍｇ、０．５２５ｍｇ、０．５５ｍｇ、０．５７５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．６２５ｍｇ、０．６５ｍｇ、０．６７５ｍｇ、０．７ｍｇ、０．７２５ｍｇ、０．７５ｍｇ、０．７７５ｍｇ、０．８ｍｇ、０．８２５ｍｇ、０．８５ｍｇ、０．８７５ｍｇ、０．９ｍｇ、０．９２５ｍｇ、０．９５ｍｇ、０．９７５ｍｇ、１．０ｍｇのペプチドのうちのいずれか１つであってよい。
【００６３】
開示されている主題の上記及びその他の実施形態では、本開示によるペプチドは、前記ヒト対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約０．７５ｍｇのペプチドという量で投与する。
【００６４】
開示されている主題の上記及びその他の実施形態では、本開示によるペプチドは、前記ヒト対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．２５ｍｇ〜約０．５ｍｇのペプチドという量で投与する。
【００６５】
投与するペプチドの量は、具体的なペプチドの分子量及びその他の特徴を考慮して、約５〜２５％変動し得ることに留意されたい。
【００６６】
開示されている主題の上記及びその他の実施形態では、前記感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つは、グラム陽性菌、グラム陰性菌、多菌感染、細菌トキシン、及びその他の毒性細菌成分のうちの少なくとも１つによって誘発される。
【００６７】
開示されている主題の上記及びその他の実施形態では、グラム陰性菌は、プロテオバクテリア、大腸菌、サルモネラ属、赤痢菌、腸内細菌、シュードモナス属、モラクセラ属、ヘリコバクター属、ブデロビブリオ属、ステノトロフォモナス属、酢酸菌、レジオネラ属、α−プロテオバクテリア、ボルバキア、グラム陰性球菌、ナイセリア種、淋菌、髄膜炎菌、モラクセラ・カタラーリス、グラム陰性桿菌、インフルエンザ菌、肺炎杆菌、レジオネラ・ニューモフィラ、緑膿菌、プロテウス・ミラビリス、エンテロバクター・クロアカエ、霊菌、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・ティフィ、アシネトバクター・バウマニ、野兎病菌、ビブリオ・バルニフィカス、コレラ菌、ビブリオ・フルビアリス、腸炎ビブリオ菌、ビブリオ・アルギノリチカス、フォトバクテリウム・ダムセラ、アエロモナス・ヒドロフィラ、ウェルシュ菌、ヒストリチクス菌、ポルフィロモナス／プレボテラ属種、プレボテラ・インターメディア、プレボテラ・ブッカエ、プレボテラ属種、バクテロイデス・ユニフォルミス、及びＮＤＭ−１菌株からなる群から選択し、前記グラム陽性菌は、Ａ群連鎖球菌、化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、エンテロコッカス・フェカリス、Ｄ群連鎖球菌、Ｇ群連鎖球菌、緑色連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミレリ、プロピオニバクテリウム属種、エンテロコッカス・フェシウム、ペプトストレプトコッカス属種、微好気性連鎖球菌、ラクトバチルス属種、スタフィロコッカス・エピデミデス、及びスタフィロコッカス・アウレウスからなる群から選択し、前記多菌感染は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、又はこれらの組み合わせによって誘発され、前記毒性細菌成分は、エキソトキシン、エンドトキシン、スーパー抗原トキシン、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、ダメージ関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）、リポ多糖、又はこれらの毒性成分、自然免疫系の細胞によって認識される病原体群と関連する分子、及びトール様受容体（ＴＬＲ）によって認識される病原体群と関連する分子からなる群から選択する。
【００６８】
その態様の別の態様では、本開示は、配列番号１によって示されているとともに、ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、断片、塩、若しくはエステルであって、グラム陽性菌、グラム陰性菌、多菌感染、及び細菌トキシンのうちの少なくとも１つによって誘発される感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つに起因するか又はこれに伴う損傷の悪化を防ぐため、この損傷を抑止するため、及びこの損傷を改善するためのうちの少なくとも１つの方法を必要とするヒト対象において、その方法で用いるためのものであり、前記ペプチドを前記対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．０２５ｍｇ〜約１．０ｍｇのペプチドという量で投与するものを提供する。
【００６９】
開示されている主題の上記及びその他の実施形態では、グラム陽性菌、グラム陰性菌、多菌感染、及び細菌トキシンのうちの少なくとも１つによって誘発される感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つに起因するか又はこれに伴う損傷の悪化を防ぐため、この損傷を抑止するため、及びこの損傷を改善するためのうちの少なくとも１つの方法を必要とするヒト対象において、その方法で用いるためのペプチドは、配列番号２によって示されているとともに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとして示されているような（Ｄ−Ａ）ＳＰＭＬＶＡＹＤ（Ｄ−Ａ）というアミノ酸配列からなる。
【００７０】
開示されている主題の上記及びその他の実施形態では、前記損傷は、全身的損傷又は感染部位の損傷である。開示されている主題の上記及びその他の実施形態では、前記損傷は、壊死性軟部組織感染症（ＮＳＴＩ）、腹腔内多菌感染、又は熱傷によって示され、前記損傷は、多臓器不全、セプシス、重症セプシス、化膿性関節炎、及び敗血症性ショックのうちの少なくとも１つをもたらすことがある。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「〜を必要とするヒト対象」という用語は、本明細書で定義されているような感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つを罹患したヒトを意味するものとする。
【００７２】
「治療」という用語、又は本明細書に定義されているようなその形態は、患者の疾患若しくは状態の悪化を防ぐか、又は患者の疾患若しくは状態を抑止するか、軽減するか、若しくは治癒させることを意味する。
【００７３】
開示されている主題の上記及びその他の実施形態では、投与は、経口投与、静脈内注射、筋内注射、腹腔内注射、髄腔内注射、皮下注射、直腸内投与、鼻腔内投与、眼局所投与、又は局所投与という経路のうちのいずれかによって行ってよい。静脈内投与は、持続投与、具体的には、約１０分〜約３０分の期間にわたる持続投与であってよい。あるいは、静脈内投与は、注射投与であってもよい。
【００７４】
開示されている主題の上記及びその他の実施形態では、本開示による用途用のペプチドは、前記感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つの発症から好適な時点に投与してよい。この代わりに、又はこれに加えて、本開示による用途用のペプチドは、前記感染症又はそれに伴う急性炎症の発症直後に投与してよい。さらに、この代わりに、又はこれに加えて、本開示による用途用のペプチドは、前記感染症又はそれに伴う急性炎症の前記発症から約３０分〜約７２時間以内に投与してよい。さらに、この代わりに、又はこれに加えて、本開示による用途用のペプチドは、前記感染症又はそれに伴う急性炎症の前記発症から約３０分〜約７日以内に投与してよい。
【００７５】
「発症」という用語は、前記ヒト対象の感染時、前記感染に伴うか若しくは起因する臨床症状の開始時、又は急性炎症の発現時と、熟練した担当医師によって、いずれかの感染及び炎症が診断された時、又は診断中若しくは本開示による治療が、専門家によって前記対象に行われている診断後のいずれかの時との間のいずれかの時点を指す。
【００７６】
開示されている主題の上記及びその他の実施形態では、前記その他の治療有効剤は、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗生剤、静菌剤、殺菌剤、ステロイド、及び抗微生物剤のうちのいずれか１つであることができ、これらは、次善の用量又は治療用量のいずれかで投与できる。
【００７７】
開示されている主題の上記及びその他の実施形態では、前記標準的なケア治療としては、換気、手術、創傷処置、高圧酸素療法、ＩＶＩＧ（静脈内免疫グロブリン）療法、コルチコステロイド療法、血漿交換療法、陰圧閉鎖療法（ＶＡＣ被覆材療法）、及び活性化プロテインＣ療法のうちの少なくとも１つを挙げることができるが、これらに限らない。
【００７８】
開示されている主題の上記及びその他の実施形態では、前記ペプチドと前記追加のその他の治療有効剤は、同時に投与する。この代わりに、又はこれに加えて、前記ペプチドと前記追加のその他の治療有効剤は、異なる時点に、異なる投与間隔で、異なる持続時間で、又は異なる順序で投与する。前記ペプチドと前記追加のその他の治療有効剤の前記投与間隔は、０〜７２時間であってよい。
【００７９】
例えば、治療は、前記ペプチドと前記追加薬剤の両方の投与によって開始してよく、追加薬剤の投与は、前記ペプチドの投与前又は投与後に中止してもよい。
【００８０】
開示されている主題の上記及びその他の実施形態では、本明細書に開示されている主題のペプチドは、医薬組成物に含まれ、前記組成物は、生理学的に適合可能な添加剤、担体、希釈剤、及び賦形剤のうちの少なくとも１つを含む。
【００８１】
本明細書に開示されている主題の医薬組成物は概して、緩衝剤、その浸透圧を調節する作用剤、並びに任意に応じて、当該技術分野において知られているような１つ以上の製薬学的に許容可能な担体、賦形剤、及び／又は添加剤を含む。補助的な活性成分も、この組成物に組み込むことができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤を用いること、分散液の場合、所要の粒径を保つことによって、及び、界面活性剤を用いることによって保持できる。これらの担体、添加剤、賦形剤、及び／又は希釈剤は、本発明のペプチドの活性を損なわない。
【００８２】
本明細書で定義されているような「塩」という用語は、製薬学的に許容可能な塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩、アンモニウム塩、及びプロタミン亜鉛塩を含め、製薬業界で広く使われている無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、及びアンモニウム塩を指し、これらは、当該技術分野において既知の周知の方法によって調製する。この用語は、無毒性酸付加塩も含み、無毒性酸付加塩は概して、本発明で用いる活性化合物を好適な有機又は無機酸と反応させることによって調製する。
【００８３】
本明細書で定義されているような「エステル」という用語は、製薬学的に許容可能なエステル、例えば、エステル結合の加水分解時に、そのカルボン酸又はアルコールの生物学的な効果と特性を持つとともに、生物学的又はその他の面で望ましくないものではないエステルを指す。概して、エステルの形成は、従来の合成技法によって行うことができる。
【００８４】
具体的な実施形態では、前記医薬組成物は、持続放出形態若しくは放出制御形態、又は持続放出と放出制御の組み合わせ、及び即放形態であることができる。
【００８５】
開示されている主題の上記及びその他の実施形態では、本発明のペプチドは、製薬的単位剤形に含まれていてよく、前記剤形は任意に応じて、生理学的に適合可能な添加剤、担体、ペプチド安定剤、希釈剤、及び賦形剤のうちの少なくとも１つをさらに含む。例えば、前記剤形は任意に応じて、プロテアーゼ阻害剤をさらに含んでもよい。
【００８６】
ペプチドｐ２ＴＡ、及びその誘導体（例えば、これに限らないが、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ）は、マウス及びブタのような実験動物の血漿中、並びに、健常人で行った第１相試験で示されているように、ヒトの血漿中における半減期が非常に短いことが示されている。これらのすべての種における実証済みの半減期は、１〜２．６分の範囲であった。この短い半減期にもかかわらず、本発明のペプチドは、その有効な用量を単回投与したのみで、顕著かつ持続的な作用を示した。
【００８７】
本開示のさらなる態様では、配列番号１によって示されているとともに、ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、断片、塩、若しくはエステルであって、感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つの治療を必要とするヒト対象において、その感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つを治療する方法で用いるためのものが開示されており、前記方法は、前記対象に前記ペプチドを治療有効量、単回投与することを含む。
【００８８】
「単回投与」という用語は、本明細書で使用する場合、特定の時点に１回投与する薬物投与を指す。
【００８９】
本明細書に開示されている主題の上記及びその他の実施形態では、前記誘導体は、ＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列（配列番号１）を含むペプチドの両末端がＤ−アラニン残基に隣接したもの、すなわち、配列番号２によって示されているとともに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとして示されているような（Ｄ−Ａ）ＳＰＭＬＶＡＹＤ（Ｄ−Ａ）というアミノ酸配列からなるペプチドであることができる。
【００９０】
本開示のさらなる態様では、本明細書に開示されているのは、配列番号１によって示されているとともに、ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又は、そのいずれかの機能的誘導体、断片、塩、若しくはエステル（配列番号２によって示されているように、誘導体Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡが挙げられるが、これらに限らない）であって、グラム陽性菌、グラム陰性菌、多菌感染、及び細菌トキシンのうちの少なくとも１つによって誘発される感染症又はそれに伴う急性炎症に起因するか又はこれに伴う損傷の悪化を防ぐため、この損傷を抑止するため、及びこの損傷を改善するためのうちの少なくとも１つの方法を必要とするヒト対象において、その方法で用いるためのものであり、前記方法は、前記対象に、前記ペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、機能的断片、塩、若しくはエステルを治療有効量、単回投与することを含む。
【００９１】
また、本明細書に開示されている主題のこれらの態様のうち、上記及びその他の実施形態におけるように、治療が、前記ペプチド、又はその機能的断片及びその誘導体を単回投与することを含む態様では、前記治療有効量は、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．０２５ｍｇ〜約１．０ｍｇのペプチドであることができる。したがって、この量は、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．０２５ｍｇ〜１．０ｍｇのペプチド、例えば、０．０５ｍｇ〜１．０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１．０ｍｇ、０．２ｍｇ〜１．０ｍｇ、０．３ｍｇ〜１．０ｍｇ、０．４ｍｇ〜１．０ｍｇ、０．５ｍｇ〜１．０ｍｇ、０．６ｍｇ〜１．０ｍｇ、０．７ｍｇ〜１．０ｍｇ、０．８ｍｇ〜１．０ｍｇ、０．９ｍｇ〜１．０ｍｇ、０．０５ｍｇ〜０．７ｍｇ、０．１ｍｇ〜０．７ｍｇ、０．２ｍｇ〜０．７ｍｇ、０．３ｍｇ〜０．７ｍｇ、０．４ｍｇ〜０．７ｍｇ、０．５ｍｇ〜０．７ｍｇ、０．６ｍｇ〜０．７ｍｇ、０．０５ｍｇ〜０．４ｍｇ、０．０５ｍｇ〜０．３ｍｇ、０．０５ｍｇ〜０．２ｍｇのペプチドであることができる。具体的には、治療有効量は、体重１ｋｇ当たり０．０２５ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．０７５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．１５ｍｇ、０．１７５ｍｇ、０．２ｍｇ、０．２２５ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．２７５ｍｇ、０．３ｍｇ、０．３２５ｍｇ、０．３５ｍｇ、０．３７５ｍｇ、０．４ｍｇ、０．４２５ｍｇ、０．４５ｍｇ、０．４７５ｍｇ、０．５ｍｇ、０．５２５ｍｇ、０．５５ｍｇ、０．５７５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．６２５ｍｇ、０．６５ｍｇ、０．６７５ｍｇ、０．７ｍｇ、０．７２５ｍｇ、０．７５ｍｇ、０．７７５ｍｇ、０．８ｍｇ、０．８２５ｍｇ、０．８５ｍｇ、０．８７５ｍｇ、０．９ｍｇ、０．９２５ｍｇ、０．９５ｍｇ、０．９７５ｍｇ、又は１．０ｍｇのペプチドのうちのいずれか１つであってよい。この代わりに、又はこれに加えて、本開示によるペプチドは、前記ヒト対象に、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約０．７５ｍｇのペプチドの量、又は前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．２５ｍｇ〜約０．５ｍｇのペプチドという量で投与する。下記の実施例に示されているように、上記よりも狭い範囲の用量でも、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる治療は、広範な条件下において至適であることを本発明者は発見した。
【００９２】
また、本明細書に開示されている主題のこれらの態様のうち、上記及びその他の実施形態におけるように、治療が、前記ペプチド、又はその機能的断片及び誘導体を単回投与することを含む態様では、前記感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つは、グラム陽性菌、グラム陰性菌、多菌感染、細菌トキシン、及びその他の毒性細菌成分（いずれも、上で定義されているように、必要に応じて変更を加えられる）のうちの少なくとも１つによって誘発される。
【００９３】
また、本明細書に開示されている主題のこれらの態様のうち、上記及びその他の実施形態におけるように、治療が、前記ペプチド、又はその機能的断片及び誘導体を単回投与することを含む態様では、前記損傷は、全身的損傷又は感染部位の損傷（必要に応じて変更を加えられる）である。前記損傷は、壊死性軟部組織感染症（ＮＳＴＩ）、腹腔内多菌感染、又は熱傷によって示すことができ、前記損傷は、多臓器不全、重症セプシス、化膿性関節炎、又は敗血症性ショックをもたらすことがある。
【００９４】
また、本明細書に開示されている主題のこれらの態様のうち、上記及びその他の実施形態におけるように、治療が、前記ペプチド、又はその機能的断片及び誘導体を単回投与することを含む態様では、前記投与には、経口投与、静脈内注射、筋内注射、腹腔内注射、髄腔内注射、皮下注射、直腸内投与、鼻腔内投与、眼局所投与、及び局所投与からなる群から選択した経路（必要に応じて変更を加えられる）のいずれかによるものである。投与時点は、開示されている主題の上記及びその他の実施形態で定義されているとおりであることができる。
【００９５】
また、本明細書に開示されている主題のこれらの態様のうち、上記及びその他の実施形態におけるように、治療が、前記ペプチド、又はその機能的断片及び誘導体を単回投与することを含む態様では、前記方法は、上に定義されているように、前記対象に、少なくとも１つの追加の治療有効剤を治療有効量投与すること、及び標準的な支持療法を行うことの少なくとも１つをさらに含むことができる（必要に応じて変更を加えられる）。
【００９６】
したがって、前記少なくとも１つの追加の治療有効剤は、次善の用量又は治療用量のいずれかで投与される抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗生剤、静菌剤、殺菌剤、ステロイド、及び抗微生物剤からなる群から選択し、前記標準的な支持療法は、換気、手術、創傷処置、高圧酸素療法、ＩＶＩＧ（静脈内免疫グロブリン）療法、コルチコステロイド療法、血漿交換療法、陰圧閉鎖療法（ＶＡＣ被覆材療法）、及び活性化プロテインＣ療法から選択する。開示されているペプチドと前記追加の治療有効剤は、同時に、又は異なる時点に、異なる投与間隔で、異なる持続時間で、若しくは異なる順序で投与する。前記ペプチドと前記追加の治療有効剤の前記投与間隔は、０〜７２時間である。
【００９７】
また、本明細書に開示されているのは、感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つの治療を必要とするヒト対象において、その感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つを治療するための方法であって、前記方法が、配列番号１によって示されているとともに、ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、断片、塩、若しくはエステルを治療有効量、前記対象に投与することを含み、前記治療有効量が、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．０２５ｍｇ〜約１．０ｍｇのペプチドである方法である。前記誘導体は、配列番号２によって示されているとともに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとして示されているような（Ｄ−Ａ）ＳＰＭＬＶＡＹＤ（Ｄ−Ａ）というアミノ酸配列からなるペプチドであることができるが、これに限らない。
【００９８】
加えて、本明細書に開示されているのは、グラム陽性菌、グラム陰性菌、多菌感染、及び細菌トキシンのうちの少なくとも１つによって誘発される感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つに起因するか又はこれに伴う損傷の悪化を防ぐため、この損傷を抑止するため、及びこの損傷を改善するためのうちの少なくとも１つの方法を必要とするヒト対象において、この損傷の悪化を防ぐため、この損傷を抑止するため、及びこの損傷を改善するためのうちの少なくとも１つの方法であって、前記方法が、配列番号１によって示されているとともに、ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、断片、塩、若しくはエステルを治療有効量投与することを含み、前記治療有効量が、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．０２５ｍｇ〜約１．０ｍｇのペプチドである方法である。前記誘導体は、配列番号２によって示されているとともに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとして示されているような（Ｄ−Ａ）ＳＰＭＬＶＡＹＤ（Ｄ−Ａ）というアミノ酸配列からなるペプチドであることができるが、これに限らない。
【００９９】
また、本明細書に開示されているのは、感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つの治療を必要とするヒト対象において、その感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つを治療するための方法であって、前記方法が、配列番号１によって示されているとともに、ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、断片、塩、若しくはエステルを投与することを含み、前記方法が、前記対象に、前記ペプチドを治療有効量、単回投与することを含む方法である。前記誘導体は、配列番号２によって示されているとともに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡと示されているような（Ｄ−Ａ）ＳＰＭＬＶＡＹＤ（Ｄ−Ａ）というアミノ酸配列からなるペプチドであることができるが、これに限らない。
【０１００】
さらに、本明細書に開示されているのは、グラム陽性菌、グラム陰性菌、多菌感染、及び細菌トキシンのうちの少なくとも１つによって誘発される感染症又はそれに伴う急性炎症に起因するか又はこれに伴う損傷の悪化を防ぐため、この損傷を抑止するため、及びこの損傷を改善するためのうちの少なくとも１つの方法を必要とするヒト対象において、この損傷の悪化を防ぐため、この損傷を抑止するため、及びこの損傷を改善するためのうちの少なくとも１つの方法であって、前記方法が、前記対象に、配列番号１によって示されているとともに、ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのいずれかの機能的誘導体、断片、塩、若しくはエステルを治療有効量、単回投与することを含む方法である。前記誘導体は、配列番号２によって示されているとともに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡと示されているような（Ｄ−Ａ）ＳＰＭＬＶＡＹＤ（Ｄ−Ａ）というアミノ酸配列からなるペプチドであることができるが、これに限らない。
【０１０１】
上述のように、前記損傷は、全身的損傷又は感染部位の損傷であることができる。下記の実施例に示されているように、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、投与後の早い時点ですでに、リンパ節及び胸腺のようなリンパ臓器（Ｔ細胞を含む臓器）内への蓄積を示した。理論に束縛されるわけではないが、このことは、その標的部位におけるペプチドのコンパートメント化と保持を示していると思われる。
【０１０２】
上記及びその他の実施形態の説明は、必要に応じて変更を加えて、本明細書に開示されている治療法にも適用される。
【０１０３】
下記の実施例は、本明細書に開示されている主題の態様を実施するために用いる技法を代表するものである。当然のことながら、これらの技法は、開示されている実施形態を例示するものであり、当業者は、本開示に照らせば、本開示の意図する範囲から逸脱せずに、多くの修正を行えることを認識するであろう。
【実施例】
【０１０４】
実験手順
試薬
別段の定めのない限り、すべての化学試薬は、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から入手した。すべてのスーパー抗原及びトキシンは、Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（フロリダ州サラソータ）から購入した。
【０１０５】
細菌
大腸菌リポ多糖（ＬＰＳ）０１１１：Ｂ４は、Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州キャンベル）から入手した。
【０１０６】
大腸菌株Ｏ１８：Ｋ１：Ｈ７（臨床的に意義のあるグラム陰性菌の単離菌）を腹膜炎試験に用いた。
【０１０７】
ブドウ球菌のペプチドグリカン［１６］は、Ｄｒ．Ａｎｄｒｚｅｊ  Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ（スウェーデンのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ）によって高度精製されたものであり、スタフィロコッカス・アウレウス株ＬＳ−１群（グラム陽性菌の単離菌）［１５］は、Ｄｒ．Ａｎｄｒｚｅｊ  Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ（スウェーデンのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ）によるものであった。
【０１０８】
Ａ群連鎖球菌（ＧＡＳ）ストレプトコッカス・ピオゲネス（化膿連鎖球菌）株（猩紅熱血清型Ｍ１Ｔ１）は、Ｄｒ．Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｃｏｈｅｎ（英国ロンドンのＨａｍｍｅｒｓｍｉｔｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）から寄贈された臨床単離菌である。この株は、複数のスーパー抗原エキソトキシンを産生させることが以前示された。この株をＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中で３７℃にて、好気状態で培養した。この株を中間対数期まで増殖させた。この培養物を遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄した。続いて、さらなる使用のために、所望の数の細菌をＰＢＳに再懸濁させた。
【０１０９】
動物
特定病原体に未感染の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜１２週）と、ＣＤ１非近交系マウス（６〜８週）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州ウィルミントン）から入手した。いずれの動物実験も、実験の開始前に、Ｂｒｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ（ＩＡＣＵＣ）から承認を得た。ＩＡＣＵＣから承認を得た設備に、ＢＳＬ−２安全条件下で、これらの動物を入れ、Ｂｒｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄの獣医スタッフによってモニタリングを行った。
【０１１０】
実施例１では、雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週）をＡＬＡＢ（スウェーデン、ストックホルム）から入手した。いずれの動物実験も、実験の開始前に、Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＩＡＣＵＣから承認を得た。ＩＡＣＵＣから承認を得た設備に、ＢＳＬ−２安全条件下で、上記の動物を入れ、Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの獣医スタッフによってモニタリングを行った。
【０１１１】
臓器内の細菌数
感染マウスを安楽死させた後、局所感染部位（大腿筋肉組織）、脾臓、及び肝臓を各マウスから摘出した。これらの臓器の重量を測定してから、滅菌ＰＢＳの入ったチューブに、それらの臓器を入れた。ホモジナイザーＯｍｎｉ  ＴＨを用いて、これらの組織サンプルをホモジナイズしてから、ＰＢＳに段階希釈した。それぞれに異なる希釈液を５％羊血寒天平板に播き、各試験群において、各組織のＣＦＵ／ｍｇを割り出した。
【０１１２】
スーパー抗原に対する抗体
様々なスーパー抗原に対する免疫グロブリン抗体のレベルを割り出すために、ＧＡＳチャレンジ後に生き残ったＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡペプチド処理マウスを安楽死させた。心血を採取し、血清を分離した。ｐＨ９．６の炭酸−重炭酸緩衝液に、１０μｇ／ｍｌの濃度で溶解させた組換え連鎖球菌発熱性エキソトキシンＡ（ＳＰＥＡ）、連鎖球菌発熱性エキソトキシンＢ（ＳＰＥＢ）、プロテアーゼ、及び連鎖球菌病原因子、又は連鎖球菌発熱性エキソトキシンＣ（ＳＰＥＣ）を用いて、酵素結合免疫吸着法のための９６ウェルマイクロタイタープレートをコーティングした。ＰＢＳ中の５０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）によって、非特異的結合部位をブロックした。プレートを０．５％ＦＣＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（マサチューセッツ州ピッツバーグのＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で洗浄した。１％ＦＣＳに１：１００で希釈した血清をウェルにアプライした。マウスに対するアルカリホスファターゼ結合ヒツジＩｇＧ抗体、又はマウスに対するヤギＩｇＭ抗体（Ｓｉｇｍａ）を１％ＦＣＳに１：１０，０００で希釈したものをアプライしてから、基質のｐ−ニトロフェニルリン酸を加え、４０５ｎｍにおける吸光度を割り出した。
【０１１３】
免疫組織化学
筋肉サンプルを切り出し、５μｍで包埋及び固定し、ｐＨ６．０の１０ｍＭクエン酸緩衝液に入れ、１０分加熱した。切片を１５分、メタノール中の３％過酸化水素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）においてインキュベートし、蒸留水及びＰＢＳでそれぞれ５分ずつ洗浄し、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）にて１５分、及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０にて５分透過処理し、ＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清にて１時間、室温（ＲＴ）でブロックしてから、一次抗体−切断カスパーゼ−３（Ａｓｐ１７５）（マサチューセッツ州ボストンのＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とともに、オーバーナイトで４℃にてインキュベートした。洗浄後、切片を結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（カリフォルニア州バーリンゲームのＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに１時間、ＲＴでインキュベートしてから、５分間、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０によって２回処置することによって透過処理し、洗浄し、１時間ＲＴで、Ｒ．Ｔ．Ｕ．Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに、メーカーのプロトコールに従ってインキュベートした。洗浄後、その切片をジアミノベンジジン基質キット３，３’−ジアミノベンジジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で発色させ、茶色〜灰色／黒色を得た。スライドを順次エタノール及びキシレン溶液中で脱水し、恒久的にマウントした。顕微鏡Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１を用いて、画像を１００倍の倍率でデジタルキャプチャーした。組織切片ごとに、複数のランダムな顕微鏡領域における陽性細胞を計数することによって、切断カスパーゼ−３染色の定量化を盲検様式で行った。
【０１１４】
表現型及びアポトーシスの評価
以下のように、フローサイトメトリー分析を行った。脾細胞を、表現型用のＰＥ標識抗ＣＤ２８（クローン：３７．５１、ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）、又はアポトーシス用のアネキシンＶ（カリフォルニア州サンディエゴのＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と組み合わせて、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗ＣＤ３（クローン：１４５−２Ｃ１１、カリフォルニア州サンディエゴのＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ標識抗Ｆ４／８０（クローン：ＢＭ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ標識抗ＣＤ４（クローン：ＧＫ１．５、カリフォルニア州サンディエゴのｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８（クローン：５３−６．７、ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）、ＡＰＣ標識抗Ｂ２２０（クローン：ＲＡ３−６Ｂ２、ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）、又はＡＰＣ標識抗Ｇｒ−１（クローン：ＲＢ６−８Ｃ５、ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）で染色した。血液細胞は、表現型用の抗ＣＤ２８、又はアポトーシス用のアネキシンＶと組み合わせて、抗ＣＤ３又は抗Ｇｒ−１で染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（商標）  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによって分析した［１１］。
【０１１５】
ペプチド合成
ペプチドｐ２ＴＡは、配列番号１によって示されるＳＰＭＬＶＡＹＤという配列を有する。ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、安定性とプロテアーゼ抵抗性を高めるためにＮ末端とＣ末端の両方に付加されたＤ−アラニン残基を有する（Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、配列番号２によっても示される）。このペプチドは、フルオレニル−メトキシカルボニルの化学的性質を用いて合成した［１０］。コントロールのスクラブルペプチド（Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ、配列番号３によっても示される）を上記のように調製した。
【０１１６】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１ｍｌ当たり１ｍｇのペプチドを溶解させた新しいストック溶液を調製し、さらに、所望の作業濃度までＰＢＳで希釈した。溶解させたら、ペプチドを即座に使用した。
【０１１７】
血清の化学的性質
クレアチニン、ＢＵＮ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、アルカリＰＯ４、及びビリルビンを用いて、未感染マウス、又は感染の５日後にＰＢＳ又はペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡのいずれかで処置した感染マウスから採取した血清の血液化学性を分析した。血清サンプルは、ＡＮＴＥＣＨ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（メリーランド州ロックビル）によって分析した。
【０１１８】
同種異系混合リンパ球反応
市販のネガティブ選択キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、健常な個体から採取した単球をＰＢＭＣから精製し、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦと２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（いずれもＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）が添加されたｃＲＰＭＩ中で３日培養して、未熟な単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）を生成した。ｍｏＤＣを培養液から回収し、ｃＲＰＭＩ中で２回洗浄し、Ｕ底の９６ウェル培養プレート（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）の３つのウェルに、ウェル当たり２×１０４、２×１０３、及び２×１０２細胞で播いた。同種異系レスポンダーＰＢＭＣを各ウェルに、２×１０５細胞／ウェルで、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、又は１０μｇ／ｍｌのペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの非存在下及び存在下で、最終量２００μｌにて加えた。これらの細胞を３日間、３７℃で、５％ＣＯ２中でインキュベートし、１．０μＣｉのトリチウム化チミジン（マサチューセッツ州ボストンのＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で１６時間（ｈｒｓ又はｈｒともいう）パルスし、自動マルチウェルハーベスター（コネチカット州オレンジのＴｏｍｔｅｃ）を用いて回収した。レスポンダー細胞に組み込むトリチウム化チミジンの量は、液体シンチレーションカウンターＭｉｃｒｏＢｅｔａ  ＴｒｉＬｕｘ（フィンランド、トゥルクのＷａｌｌａｃ）を用いて測定した。
【０１１９】
化膿性関節炎のマウスモデル
化膿性関節炎のマウスモデル［１５、１６］を用いて、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡが、生きたＳ．アウレウスに感染したマウスに及ぼす作用を評価した。マウスに、生きたＳ．アウレウスＬＳ−１を１回関節内注射した（８００コロニー形成単位／膝関節）。６時間後、１２時間後、及び２４時間後に、マウスに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ（２００ｎｇ／マウス）又はマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）（２００ｎｇ／マウス）のいずれかを腹腔内注射した。あるいは、マウスに、精製ブドウ球菌のペプチドグリカン（２５マイクログラム／膝関節）をＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ（２００ｎｇ／膝関節）又はＭＳＡ（２００ｎｇ／膝関節）とともに１回関節内注射し、６時間後、１２時間後、及び２４時間に、マウスに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ（２００ｎｇ／マウス）又はＭＳＡ（２００ｎｇ／マウス）のいずれかを腹腔内注射した。すべてのマウスを実験開始（すなわち関節内注射）の７２時間後に殺処分した。すべての関節切片の関節炎及び関節の破壊の重症度をブラインド評価した。
【０１２０】
リンパ球増殖アッセイ
リンパ球増殖アッセイにおいて、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによって処置したか又は未処置のシャムマウス又はＣＬＰマウスから採取した単離脾細胞をエキソビボで試験した。脾細胞を抗ＣＤ３のみ、又は抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８抗体で刺激し、７２時間培養した。続いて、ＣｙＱｕａｎｔアッセイを用いて細胞増殖を評価した。増殖係数を抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８による刺激の際の吸光度／抗ＣＤ３のみによる刺激の際の吸光度として計算した。
【０１２１】
サイトカイン分析
１６−マルチプレックス免疫測定（ユタ州ローガンのＱｕａｎｓｙｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、マウスのサイトカインレベルを血漿及び腹水中で測定した。「サンドイッチ酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）」技法によって、先述のようにモノクローナル抗体対及びマウスサイトカインスタンダードを用いて［１２］、ＫＣ、Ｒａｎｔｅｓ（いずれもミネソタ州ミネアポリスのＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）、ＩＬ−３（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＩＬ−１７Ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）のレベルを血漿、腹水、又は組織ホモジネートにおいて測定した。
【０１２２】
統計
いずれの値も、平均±標準偏差として表されている。群間の差は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用バージョン４．０３、カリフォルニア州サンディエゴのＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）によって、スチューデントｔ−検定を用いて分析した。差は、Ｐ＜０．０５において有意とみなす。
【０１２３】
実施例１  化膿性関節炎のマウスモデル
１．１  ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、Ｓ．アウレウス感染によって誘発された化膿性関節炎を軽減する。
ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、グラム陽性化膿性関節炎の代表的モデルとみなされているＳ．アウレウス膝関節感染のモデルにおいて広範に研究されてきた［１５］。このモデルを用いて、Ｓ．アウレウス感染の病因を調べる。生きた細菌であるＳ．アウレウスＬＳ−１群を膝関節に関節内注射し、その６時間後、１２時間後、及び２４時間後に、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを腹腔内注射した。関節内注射の７２時間後に、すべての関節切片の関節炎及び関節の破壊の重症度をブラインド評価した。図１Ａに示されているように、コントロール群では、マウス血清アルブミンで処置したすべてのマウス（７／７）は、化膿性関節炎の明らかな徴候を示した。これに対して、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置した８頭のマウスのうち、３頭のみ（３８％）が、化膿性関節炎の徴候を示した（＊はｐ＜０．０５である）。
【０１２４】
１．２  ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、ブドウ球菌のペプチドグリカンによって誘発された化膿性関節炎を軽減する。
ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、高度精製ブドウ球菌のペプチドグリカンによって誘発された膝関節感染のモデル（グラム陽性化膿性関節炎の代表的モデルとみなされている）において広範に研究されてきた［１６］。ブドウ球菌のペプチドグリカンをＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ又はＭＳＡとともに膝関節に関節内注射し、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ又はマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）を６時間後、１２時間後、及び２４時間に腹腔内注射した。関節内注射の７２時間後、すべての関節切片の関節炎及び関節の破壊の重症度をブラインド評価した。図１Ｂに示されているように、コントロール群では、ＭＳＡで腹腔内処置したすべてのマウス（１０／１０）は、化膿性関節炎の明らかな徴候を示し、この群の重症度係数は１３であった。これに対して、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置した１０頭のマウスのうち、４頭（４０％）のみが、化膿性関節炎の徴候を示し、関節の破壊の累積重症度スコアは、１３から４．５に低下した（３５％）（＊は、ｐ＜０．０５である）。
【０１２５】
実施例２  軟部組織感染症のモデル
ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、グラム陽性軟部組織感染症のモデル（壊死性軟部組織感染症（ＮＳＴＩ）の代表的モデルとみなされている）において広範に研究されてきた［１３、１４］。これは、大腿の化膿連鎖球菌感染のモデルであり、その病因を調べる目的で広く用いられている。化膿連鎖球菌は、感染部位で素早く広がる能力と、全身に広がる能力を有し、壊死性筋膜炎を含む様々な侵襲性感染症を引き起こす。一般に壊死性筋膜炎に伴う強いショックの全身的特徴の多くは、細菌による、スーパー抗原を含むエキソトキシンの放出に起因する。
【０１２６】
ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを単独で単回投与したとき、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡが、侵襲性グラム陽性致死細菌感染（化膿連鎖球菌）の存在下で、全生存率を向上させる能力を評価した。５％羊血を添加したトリプチケースソイ寒天に、凍結化膿連鎖球菌を播き、オーバーナイトで３７℃にて、５％ＣＯ２下でインキュベートした。０．５％酵母抽出物を添加したＴｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔ  ｂｒｏｔｈ（ＴＨＹＥ）で、オーバーナイトプレートを慎重に洗浄して、プレート増殖物を懸濁させた。再懸濁液は、ＴＨＹＥ中に約１０９ＣＦＵ／ｍｌ（Ａ６００ｎｍ＝１．０）の濃度に調節した。マウスに投与前に、１ｍＬのオーバーナイト懸濁液を９ｍＬのＴＨＹＥに希釈させて、１０倍希釈液（約１．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を作ることによって、感染接種菌液を生成した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週）の片方の後肢の右大腿筋肉に、１〜１．５×１０７ＣＦＵの化膿連鎖球菌を０．１ｍｌの量で筋内注射した。
【０１２７】
２．１．遅延治療時における細菌感染からの防御
ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡが、成立済みの急性細菌感染に及ぼす作用をまず評価するために、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを５ｍｇ／ｋｇ、１５頭の感染マウス群に、感染から１時間又は５時間後に単回静脈内投与した。図２に示されているように、これらの投与により、それぞれ８０％及び５０％の生存率が得られた。統計的分析により、各治療群において、コントロール未処置群と比べると、ｐ＜０．０５であることが示された。これらの結果から、細菌感染後、少なくとも５時間のタイムフレームがあり、この間、いずれの追加の抗生物質治療を行わずに、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを単回投与することが有益であり得ることが示されている。重要なことに、５ｍｇ／ｋｇという同様の用量は、感染時点に投与するか、感染から１時間後又は５時間後に遅延治療として投与するかにかかわらず、有効な用量であった。
【０１２８】
２．２．遅延治療条件下における用量反応
遅延治療として投与したときに、マウスを致死化膿連鎖球菌感染から防御する様々な用量の効能を評価するために、２０頭のマウスの群にペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを２．５〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で、感染から１時間後に静脈内に単回投与した。図３に示されているように、感染から８日間、生存率を追跡した。
【０１２９】
傾向に関して、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン５）で、ログランク検定によって生存率曲線分析を行い、生存期間間の差を割り出した。傾向の差が検出されたら、コントロールと処置群に対してログランク検定を行って、処置群が、そのコホートと異なるか否かを割り出した。ｐ値＜０．０５が有意な結果の閾値である。
【０１３０】
いずれの処置も行わなかったところ、２〜４日目に死亡が生じ、最終生存率は２０％となった。２．５ｍｇ／ｋｇの投与が最も有効で、生存率は、コントロールの未処置マウスと比べて３．２５倍有意に上昇し、６５％の全生存率が得られ、コントロールに対してｐ＜０．００５であった。このレジメンの生存期間の中央値は、２．５ｍｇ／ｋｇでは＞８日、感染コントロール、５ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇでは３日であった。５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの用量は、あまり有効ではなく、生存率はそれぞれ４５％及び３０％に上昇し（２．５ｍｇ／ｋｇに対してｐ＜０．０５）、このことから、遅延治療条件下では、２．５ｍｇ／ｋｇの用量での処置が最適であることが示唆された。
【０１３１】
２．３．ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、成立済みの化膿連鎖球菌感染を治療するための抗生物質の治療可能期間を延長させる。
１日後にすでに死亡し始める条件で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０頭の群）を化膿連鎖球菌に感染させたところ、７日後に全生存率は５７％となった。図４に示されているように、感染から時間が経過した時点（３６時間後）に、この成立済みの感染を抗生物質のみ（セフトリアキソン、０．２５ｍｇ／ｋｇ）で処置すると、死亡は遅れ、３日目に開始され、このような処置は、部分的な防御をもたらすことができ、生存率は７０％となった。しかしながら、感染から３６時間後に、抗生物質とペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの両方を併用投与したところ、生存率が上昇した。抗生物質と２．５ｍｇ／ｋｇのペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる併用処置により、生存率は８６％に上昇し、抗生物質と５ｍｇ／ｋｇの併用処置により、１００％の防御が実現し、マウスは１頭も死亡しなかった。これらの結果により、標準的な抗生物質処置にペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの単回投与を加えると、抗生物質の既存の治療可能期間を延長でき、致死感染からの十分な防御をもたらすことができることが示されている。このような特徴は潜在的に、成立済みの感染に抗生物質処置を行うことが多い臨床現場で重要となり得る。
【０１３２】
２．４  感染の局所部位における感染徴候の改善
軟部組織感染症の主な特徴は、感染部位における炎症及び壊死の急速な進行であり、これは、トキシン及び酵素のような細菌病原因子と、サイトカインの放出に起因する。ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる処置に、感染の局所部位に対する直接的な作用があるかを評価するために、感染から早い時点に、感染部位をモニタリングした。ＢＡＬＢ／ｃマウスの左後肢の大腿を化膿連鎖球菌に感染させ、感染から１時間後に、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを遅延治療として投与した。図５で見られるように、感染から２４時間後に、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置しなかった感染マウスのフットパッドまでにも及ぶかなりの壊死性病変を検出できる（中央のマウスを参照）。しかしながら、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置したマウスは、炎症及び壊死の徴候を示さず、生理的食塩水を注射したコントロールの健常マウス（左側のマウス）のフットパッドと同様、フットパッドはきれいなようである（右側のマウスを参照）。
【０１３３】
これらの結果から、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、感染部位において局所的にも、全身的にも、疾患症状を改善でき、生存率を上昇させることが示されている。したがって、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、単回致死量のスーパー抗原によるチャレンジによって生じるトキシックショックをブロックするのみならず［４、５］、様々なスーパー抗原を産生する生きた複製型化膿連鎖球菌からも、マウスを防御する。
【０１３４】
２．５．投与レジメン
最も有益な治療作用をもたらすことになる単回療法として投与するときのペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの最適の投与レジメンを明らかにするために、実験を行って、最も有利な治療に必要な投与回数、投与間隔、及び各用量をもっと少ない用量に分割する選択肢を追跡した。これらのレジメンは、化膿連鎖球菌に感染させて、感染から時間が経過した時点で処置したＢＡＬＢ／ｃマウスで調査した。
【０１３５】
単回投与と複数回投与の比較
用量５ｍｇ／ｋｇのペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによるマウス（ｎ＝５）の処置（静脈内投与）を感染から５時間後に開始したときの単回投与の作用（２回投与との比較）を調べた。２回目の投与は、該当する場合、感染から２４時間後に行った。結果は図６に示されており、この結果により、いずれの処置も行わなかった場合、マウスは３日目に死亡し始め、５日目までに１００％の死亡が明らかであったことが示されている。ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの単回投与による処置により、６０％の生存率が得られ、１日に２回の投与による処置では、単回投与と比べて作用はかなり低下し、７日目にすべてのマウスが死亡し、処置しなかった感染マウスの死亡速度よりも死亡速度は遅かった（いずれかの治療群とコントロールとの間のＰ値は＜０．０５）。
【０１３６】
２回投与との比較における単回投与の作用は、図７に示されているように、処置の１回目の投与を感染から１時間後に開始し、投与間隔が１２時間である条件下でも調べた。２．５ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇという２種類の用量を評価した。コントロールの未処置マウス（ｎ＝２０）は２０％の生存率を示した。（ｎ＝２０の群における）２．５ｍｇ／ｋｇの単回投与による処置では、６０％の生存率が得られ、２．５ｍｇ／ｋｇの２回投与は３０％の生存率に過ぎなかったので、２．５ｍｇ／ｋｇの単回投与による処置が、試験した実験条件下における最適の効能であることが分かった（ログランク検定を用いて、処置群とコントロール群間で計算したところ、ｐ＜０．００５であった）。
【０１３７】
ｎ＝１０頭の群に５ｍｇ／ｋｇの用量を投与したケースにおいても、同様の作用が観察され、単回投与では、４５％の生存率が検出され、２回投与では、３０％の防御に過ぎなかった。２回超の投与（３回又は４回投与）を加えても、２回投与の結果は改善されず、単回投与よりも有効性は低かった。
【０１３８】
投与間隔
単回投与との比較における２回投与の作用（１回目の投与は感染から１時間後に行った）も、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇのうちのいずれかの様々な投与強度を用いて、投与時間間隔の関数として測定した。図８Ａに示されているように、投与を１２時間の間隔で行ったか、２４時間の間隔で行ったかにかかわらず、単回投与は２回投与よりも優れており、又は、図８Ｂに示されているように、投与を４８時間の間隔又は７２時間の間隔で行ったときでも、単回投与は２回投与よりも優れていた。これらのデータは、試験したすべての用量（２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇ）にわたって成り立っていた。試験したすべての用量のうち、２．５ｍｇ／ｋｇの治療効果が一番高く、単回投与したときに、９０％の生存率が得られた（コントロールに対してｐ＝０．００４３であり、２回投与に対してｐ＝０．００５７であった）。
【０１３９】
２．５ｍｇ／ｋｇの単回投与の優位性のさらなる裏付けは、生存期間の中央値の計算によって得ることができ、生存期間の中央値は、２．５ｍｇ／ｋｇを単回投与した群（生存期間の中央値は＞８日であった）を除き、上記のすべての処置群及びコントロールの未処置群においては３日であることがわかった。これらの結果は、下記の表１にまとめられている。
【表１】
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【０１４０】
分割投与：
体重１ｋｇ当たり２．５ｍｇという有効総用量のペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの投与を化膿連鎖球菌感染（ｎ＝１０）において、単回投与として投与した場合と、１．２５ｍｇ／ｋｇにて２回に分けて（５分の投与間隔で）投与した場合について調べた。図９に見ることができるように、単回投与では８５％の生存率が得られ、累積用量が１回投与の場合と同じである分割投与の場合（５０％の生存率しか得られなかった）よりも効能も高かった。分割投与の間隔がもっと長かった（４〜１２時間）ときでも、同様の結果が得られた。これらのデータにより、防御をもたらすには、マウスを有効な用量に最初に暴露させることが重要であり得るとともに、有効な用量を少ない用量に分割すると、効能が低下することを示すことができる。
【０１４１】
２．６  Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡペプチドのサイトカイン産生に対する作用
化膿連鎖球菌によるグラム陽性菌感染の条件下において、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡがサイトカイン産生に及ぼす作用を調べた。
【０１４２】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０頭が処置群、１０頭がコントロール）を化膿連鎖球菌に感染させ、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを（５ｍｇ／ｋｇで）感染から１時間後に投与した。感染未処置マウスに、ＰＢＳを注射し、コントロールとした。感染から１２時間後、マウスを安楽死させ、マルチプレックス免疫測定を用いて血漿中のサイトカイン及びケモカインを測定するために、血液を採取した。
【０１４３】
全体的に、９つのサイトカイン及びケモカインを評価し、それらとしては、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７Ａ）、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−１０）、及び炎症性サイトカイン／ケモカイン（ＩＬ−６、ＫＣ（マウスＩＬ−８）、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１）が挙げられる。結果は図１０Ａ及び図１０Ｂに示されている。試験したすべてのサイトカイン／ケモカイン、すなわち、図１０Ａ−１に示されているようにＩＦＮ−γ、図１０Ａ−２に示されているようにＩＬ−１７Ａ、図１０Ａ−３に示されているようにＴＮＦ−α、図１０Ａ−４に示されているようにＩＬ−１β、図１０Ｂ−１に示されているようにＩＬ−８、図１０Ｂ−２に示されているようにＩＬ−６、図１０Ｂ−３に示されているようにＲＡＮＴＥＳ、及び図１０Ｂ−４に示されているようにＭＣＰ−１に関して、サイトカインレベルの低下が観察され、すでに感染後の早い時点において、複数のサイトカインのレベルが低下することが示されており、このことは、得られたインビトロでの結果、及び予想される作用機徐と整合している。複数のサイトカインの低下の作用は相乗的であり、したがって、各サイトカインレベルの影響は、炎症反応の大幅な低下である相乗効果の点で増幅することになる。
【０１４４】
興味深いことに、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−１０のレベルは上昇を示し、感染から２４時間後に頂点（ピーク）に達した（図１０Ｃに示されている）。２４時間後にＩＬ−１０のレベルが上昇したことにより、細菌感染のより適切な管理に寄与し得る抗炎症性サイトカインＴｈ２の上昇に続いて、炎症誘発性サイトカインＴｈ１のレベルが最初に低下することが示唆されている。
【０１４５】
感染マウスにおける炎症誘発性サイトカイン産生の減少は、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによって拡大する。
ＡＰＣのＭＨＣ  ＩＩ分子とＴ細胞のＴＣＲとが「架橋」すると、スーパー抗原（ＳＡｇ）が、Ｔ細胞の＞２０％を活性化し、炎症誘発性サイトカインが大量に放出され、それに続いて致死的ショックに至る。
【０１４６】
ＧＡＳに感染させ、感染から１時間後にペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ又はＰＢＳ（コントロール）のいずれかでで処置したマウスから採取したサンプルにおいて、感染から１２時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に採取した血清サンプルのサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、及びＩＬ−１０）とケモカイン（ＫＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１）を試験した。実際、未処置のコントロールと比べて、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡａで処置したマウスでは、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの投与から１２時間後というという早期に、いくつかの炎症誘発性サイトカインのレベルの有意な低下が観察され、この結果は、インビトロでのデータと整合している。
【表２】
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【０１４７】
未処置マウスと比べて、ペプチド処置マウスにおけるＩＦＮ−γ、ＩＬ１−β、及びＩＬ−６のレベルは、４つのすべての時点において有意に低下した。４８時間後及び７２時間後におけるサイトカイン／ケモカインレベルは、上記の表２に示されている。
【０１４８】
このマウス群において、同時に生存率分析を行ったところ、１０頭の未処置マウスのうち５頭のみが、感染から４８時間生存したとともに、１０頭の未処置マウスのうち２頭が７２時間生存したのに対し、１０頭のＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡペプチド処置マウスのうちの１０頭が、細菌チャレンジに７２時間耐えたことが示された。
【０１４９】
すべての時点における各サイトカインの中央値は、以下のように、図１１Ａ〜Ｄに示されている。図１１Ａ−１は、感染から１２時間後に、ＩＦＮ−γについて得られた結果を示しており、２４時間後にＩＦＮ−γについて得られた結果は図１１Ａ−２に示されており、４８時間後にＩＦＮ−γについて得られた結果は図１１Ａ−３に示されており、７２時間後にＩＦＮ−γについて得られた結果は図１１Ａ−４に示されている。図１１Ｂ−１は、感染から１２時間後にＩＬ−１βについて得られた結果を示しており、２４時間後にＩＬ−１βについて得られた結果は図１１Ｂ−２に示されており、４８時間後にＩＬ−１βについて得られた結果は図１１Ｂ−３に示されており、７２時間後にＩＬ−１βについて得られた結果は図１１Ｂ−４に示されている。同様に、図１１Ｃ−１は、感染から１２時間後にＩＬ−６について得られた結果を示しており、２４時間後にＩＬ−６について得られた結果は図１１Ｃ−２に示されており、４８時間後にＩＬ−６について得られた結果は図１１Ｃ−３に示されており、７２時間後にＩＬ−６について得られた結果は図１１Ｃ−４に示されている。図１１Ｄは、感染から４８時間後（図１１Ｄ−１）及び７２時間後（図１１Ｄ−２）における８つのサイトカイン、すなわち、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＫＣ（マウスＩＬ−８）、ＭＣＰ−１、及びＲＡＮＴＥＳに関して、表２に示されている結果のグラフ表示を示している。
【０１５０】
２．７．化膿連鎖球菌への感染後における、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの細菌量に対する作用
細菌に感染後、細菌は、局所感染部位から、脾臓、肝臓、及び腎臓のような重要臓器に広がり、これらの臓器で、細菌は毒性成分を分泌し続け、それにより、臓器損傷の一因となる。化膿連鎖球菌に感染させたマウスを抗生物質で処置しなかったが、これらのマウスは、感染後に生き残った。このため、抗菌特性を持たないペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡが、感染部位又は重要臓器における細菌量に間接的に影響を及ぼし得るかを調べた。
【０１５１】
５頭のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を化膿連鎖球菌に感染させ、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ又はＰＢＳのいずれかで処置した。未処置マウスを感染コントロールとした。マウスを感染から２４時間後及び４８時間後に安楽死させ、感染大腿と脾臓から採取した組織サンプルを集め、ホモジナイズした。段階希釈後、ホモジネートを播いて、各群について組織のＣＦＵ／ｍｇのレベルを割り出した。結果は図１２に示されており、この結果により、抗生物質を投与せず、かつ、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置すると、感染部位及び遠隔臓器の両方における播種細菌のレベルの低下は、２４時間後にすでに認められ（筋肉については図１２Ａ、脾臓については図１２Ｃを参照）、４８時間後まで持続している（筋肉については図１２Ｂ、脾臓については図１２Ｄを参照）ことが示されている。細菌量が減少したマウスは、細菌トキシンに対する抗体を産生でき得るので、細菌トキシンの有害な毒性が中和される。
【０１５２】
ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、感染から最大で７２時間、菌量を減少させる。
注目すべきことに、筋肉組織において、未処置マウスとＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ処置マウスとの間で、感染から最大で７２時間、細菌数の有意差が観察された（図１３Ａ）。
【０１５３】
感染から３日後には、感染マウスにおいて、感染部位の遠隔部位、すなわち、肺、腎臓、肝臓、又は全身血液への病原体の大規模な播種は、観察されなかった。しかしながら、脾臓及び肝臓において、低レベルの細菌は検出され、処置群と未処置群との間で、わずかな差が見られた（図１３Ｂ〜Ｃ）。これらのデータにより、マウスがＧＡＳに感染する過程において、致死的な結果をもたらす顕著な作用は、トキシン及び酵素のような細菌病原因子、並びに、遠隔で作用するサイトカインの放出に起因し得ることが示唆されている。
【０１５４】
ペプチドアンタゴニストは、筋肉組織における筋炎を有効に軽減する。
未処置マウスにおいて、感染から２４時間後という早期に、壊死性筋膜炎の発症が観察された。組織の病理を調べるために、医学診断で広く用いられている染色法であるＨ＆Ｅ（ヘマトキシリン・エオシン）染色法で筋肉切片を染色した。感染から４８時間後までに、筋肉切片は、主に筋膜において、重度の急性炎症性浸潤を示した。Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡペプチド処理マウスから採取した筋肉切片は、未処置のコントロールよりも軽度な浸潤を示した（図１４Ａ〜Ｂ）。７２時間後に未処置のコントロールから採取した筋肉切片では、主に好中球からなる、筋肉細胞の明らかな重篤な壊死が見られたのに対し、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ処理マウスでは、壊死は、コントロールよりも有意に軽度であった（図１４Ｃ〜Ｄ）。
【０１５５】
上記の組織データは、これらの時点で観察されたサイトカインプロファイル（上記の表２に示されているようなもの）、及び図５に示されている組織ダメージ（壊死）の軽減と整合している。未処置マウスにおける炎症性細胞の感染部位への重度の浸潤は、感染未処置動物におけるケモカインレベルの有意な上昇、及びＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ処置後のケモカイン（特にＫＣ）のレベルの低下と相関する。
【０１５６】
感染部位で観察された病変と対照的に、組織の病理調査では、肝臓及び腎臓のような遠隔臓器において、処置群と未処置群との間で差は観察されなかった。これはさらに、（下記の表３に示されているように）マウスから採取した血清のクレアチニン、ＡＬＴ、ＡＳＴ、アルカリＰＯ４、及びビリルビンを調べたところ腎臓及び肝臓機能において、これらの２つの群の間に、観察可能な差又は異常がなかったことによって裏付けられている。
【表３】
2019038838.tif 000004
【０１５７】
ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、マウスにおいて毒血症を軽減する。
次に、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置して、Ａ群化膿連鎖球菌でチャレンジしたマウスが、連鎖球菌発熱性エキソトキシンＡ若しくはＣ、又は連鎖球菌病原因子Ｂに対する抗体を産生できるかを調べた。感染から５日後（未処置マウスが概して瀕死であった時点）と、感染から１４日後に、抗体価を評価した。
【０１５８】
図１５に示されているように、５日という早い時点に、３つのすべてのエキソトキシンに対する抗体価が観察された（図１５Ｄ、Ｅ、及びＦ）。感染から２週間後においても、大半のマウス（１７／２０）が依然として、調査した連鎖球菌スーパー抗原／病原因子分子のうちの少なくとも１つ又は２つに対して抗体価を示しており（図１５Ａ、Ｂ、及びＣ）、それらのレベルは、５日目の抗体価よりも高かった。
【０１５９】
生き残ったマウスのうちの３頭のみが、ＳＰＥＡ、ＳＰＥＢ、及びＳＰＥＣのいずれに対する抗体も産生しなかった（図１５Ａ〜Ｃ）。これらのマウスはＧＡＳトキシンに対する抗体を産生しなかったか、又は、この実験では評価しなかった連鎖球菌マイトジェンエキソトキシンＺ若しくは連鎖球菌発熱性エキソトキシンＪのようなその他の連鎖球菌トキシンに対するアンチトキシン力価を示していた可能性がある。累積的に、これらのデータから、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡが、菌血症ではなく毒血症を軽減することによって、ＧＡＳチャレンジからマウスを防御することが示唆されている。
【０１６０】
ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による、Ｔ細胞増殖の同時刺激の誘発を妨げない。
感染後に投与したＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、スーパー抗原及び化膿連鎖球菌の両方によるチャレンジの後、マウスの生存を有効に促すとともに、（上記の表２に示されているように）これらのチャレンジは、サイトカイン反応を誘発するので、このペプチドの細胞増殖に対する潜在的作用も試験した。この目的のために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）モデルを用い、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの存在下及び非存在下において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）がＣＤ−２８／ＴＣＲの同時刺激を通じてＴ細胞増殖を誘発する能力を測定した。このモデルは、Ｔ細胞を刺激するための感染体を必要としないので、様々な用量のペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを用いて、ペプチドの抑制作用（混合リンパ球反応をブロックする作用）が観察されなかったことが示された（図１６）。
【０１６１】
実施例３  肺感染のモデル
３〜５日以内に１００％死亡する結果となる条件下で、グラム陽性菌ストレプトコッカス・ニューモニエに（１０７ＣＦＵ／マウスで）感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、肺感染モデルを樹立した。抗生物質による処置に、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる処置を付随させ、感染がすでに成立したら、時間が経過した時点で処置を行った。
【０１６２】
３．１  致死肺感染からの防御
（処置群当たり１０頭を用いて）肺炎連鎖球菌に感染させたマウスのうち、処置を行わなかったマウスは、死亡過程を示し、感染から３日後に死亡し始め、その２日後（５日後）に、すべてのマウスが死亡するという非常に速い進行を見せた。感染から２４時間後に、マウスにセフトリアキソンのみをＬＤ２５（１ｍｇ／ｋｇ）の次善の用量で腹腔内（ｉ．ｐ．）投与したところ、生存率は２０％に上昇した。しかしながら、感染から２４時間後に、抗生物質と併せて、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを（５ｍｇ／ｋｇで）投与したところ、生存率が５０％までかなり上昇したことが検出された（図１７を参照）。
【０１６３】
３．２  致死肺感染からの防御：用量反応
感染から２４時間後に、肺炎連鎖球菌感染動物（ｎ＝１０）に、固定用量の抗生物質（セフトリアキソン、１ｍｇ／ｋｇの次善の用量を腹腔内投与）と、様々な用量のペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ（抗生物質処置後の２分後に投与）との組み合わせを接種した場合における、生存率の面での利点と様々な用量のペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとの相関性を調べた。これらの実験条件下では（図１８を参照）、未処置マウスは急速に死亡し、２日目に死亡し始め、３日目までには、すべてのマウスがすでに死亡していた。抗生物質による処置のみでは、生存率の変化はわずかで、２０％となった。５ｍｇ／ｋｇのペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとの併用処置では、生存率はかなり上昇し（５０％）、２．５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇでは、抗生物質のみの作用を上回るほどのマウス生存率への寄与は見られなかったので、５ｍｇ／ｋｇのペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとの併用処置が最も有効であることが分かった。
【０１６４】
実施例４  グラム陰性菌感染のモデル：腹膜炎大腸菌
抗生物質セフェピムを投与したときに、侵襲性グラム陰性菌感染（大腸菌性腹膜炎）の存在下で、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡが全生存率を上昇させる能力を評価した。
【０１６５】
ＢＡＬＢ／ｃマウスへの大腸菌株０１８：Ｋ１（侵襲性病原性大腸菌単離体）による腹腔内チャレンジによって、急性細菌性腹膜炎を誘発させた。このチャレンジ株をＴＳＢ中で中間対数期まで増殖させてから、生理的食塩水中で洗浄し、段階希釈し、マウスに投与した。予備的実験では、チャレンジから４時間後に投与したときに、筋内（ｉ．ｍ．）で５ｍｇ／ｋｇとなるように抑制用量以下の抗生物質セフェピム（Ｅｌａｎ）を定めた（通常の有効な用量の２５％を再現した）。
【０１６６】
加えて、予備的実験を行って、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける大腸菌のＬＤ５０を定め、腹腔内チャレンジ後に１０７個のコロニー形成単位（ＣＦＵ）とした。このＬＤ５０値は、抑制濃度以下のセフェピムの存在下で繰り返した場合も同様であった。続いて、この次善の抗微生物療法の存在下で、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ（０．５〜５．０ｍｇ／ｋｇ、静脈内）が、大腸菌性腹膜炎誘発後のマウスをさらに防御する能力を下記のように試験した。
【０１６７】
大腸菌性腹膜炎の誘発後、感染時点に、次善の用量のセフェピムと併せて、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡをマウスに静脈内投与した。マウスの生存率を７日間にわたってモニタリングした。スクラブルペプチド（同じアミノ酸組成を有するが、配列が異なる）で処置したマウスの生存率は、生理的食塩水で処置したコントロールと同様であった。
【０１６８】
図１９に示されているように、いずれの処置も行わなかった場合、大半の感染マウスは、すぐに死亡し（２４時間以内）、１５％のマウスのみが生き残った。マウスをセフェピムのみで処置したところ、最終的な結果は改善されず、全生存率は２０％であったが、死亡するまでの期間はわずかに延長された。大腸菌に感染させたが、次善の用量のセフェピムとペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇの用量）との組み合わせで処置したマウスは、７日間追跡したところ、全生存率の統計的に有意な改善を示した（０．５ｍｇ／ｋｇの場合において９０％、５ｍｇ／ｋｇの場合において１００％）。スクラブルペプチド（同じアミノ酸組成を有するが、配列が異なる）で処置したマウスの生存率は、生理的食塩水で処置したコントロールと同様であった。
【０１６９】
４．１．ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの分割投与が、感染マウスの治療効能に及ぼす作用
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、急性細菌性腹膜炎を誘発させた。ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ（感染時点に投与）の最適の用量であって、マウスを大腸菌感染から１００％防御することが明らかになった用量は、５ｍｇ／ｋｇであった。２４時間以内にマウス生存率が２０％まで急激に低下した感染コントロールと比べて、セフェピムのみの投与（感染から４時間後、ＬＤ２５で投与）は、マウスの死に影響を及ぼさず、依然として生存率は２０％であったが、死亡までの速度は遅くなった。十分に有効な用量のペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを５ｍｇ／ｋｇで単回投与した場合の治療効果を、用量を１．２５ｍｇ／ｋｇに４等分して１２時間の間隔で投与した場合と比較したところ、図２０に示されているように、分割投与は単回投与よりも有効性が低く、７０％の生存率であったことが示された。
【０１７０】
実施例５  多菌感染のモデル：盲腸結紮穿刺法（ＣＬＰ）
多菌感染について調べ、治療剤の腹腔内感染又はセプシスに対する作用を追跡するには、マウスの盲腸結紮穿刺法（ＣＬＰ）モデルが、臨床的に意義のあるモデルである。マウスを拮抗薬としての塩酸アチパメゾール５ｍｇ／ｋｇとともに麻酔した（ケタミン７５ｍｇ／ｋｇ及びデクスメデトミジン１ｍｇ／ｋｇ）。１．５ｃｍの正中切開によって盲腸を取り出し、その長さの９０％の位置であって、回盲接合部から末梢側の位置を５−０ナイロンモノフィラメント縫合糸で結紮した。続いて、盲腸の腸間膜の反対側に沿って、２３ゲージのニードルを用いて盲腸を２回穿刺した。穿刺部位を通じて少量の管腔内容物を絞り出して、開通性を確認した。盲腸を腹腔に戻し、筋膜及び皮膚を閉じ、局所リドカイン及びバシトラシンを施術部位にアプライした。各マウスに、２０ｍｇ／ｋｇ（ＬＤ２５の次善の用量を表す）のモキシフロキサシン筋内接種し、１ｍｌの生理的食塩水を皮下ボーラス注射した。完全に意識が戻るまでマウスを復温してから、ケージに戻した。
【０１７１】
静脈内（ｉ．ｖ．）投与したときのペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの効能を試験し、合わせて７日間、マウスのセプシスの明らかな徴候と生存を毎日追跡した。瀕死のマウス（＜３０℃の低体温であり、正常な体位を保持できないマウスとして定義する）を安楽死させ、致死感染マウスとして評点した。７日目の最後に、生存マウスを安楽死させた。マウスの臓器組織（血液、腹膜、肝臓、肺、及び脾臓）の定量的微生物を調べた。
【０１７２】
５．１．ＣＬＰ後にペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを単回投与するタイミング
ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、グラム陽性菌感染の場合、単回投与したときに最も有効であることが示されたので、多菌感染モデルにおいてもその単回投与を評価した（図２１）。すべてのマウスに、手術の最後に次善の用量のモキシフロキサシンを（ＬＤ２５で）接種したところ、この処置は、マウスの生存に寄与せず、生存率は５％に過ぎなかった。しかしながら、ＣＬＰから２時間後に、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ（５ｍｇ／ｋｇ）をマウスに単回投与したところ、生存率は、９０％まで劇的に上昇した（ｐ＜０．００１）。これらのデータから、マウスを多菌感染に暴露してから２時間後に単回投与することが、高レベルの防御をもたらすのに十分であることが示唆されている。
【０１７３】
５．２．ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの単回投与による遅延処置のタイミング
感染から時間が経過した（又は遅延した）時点に投与される治療剤で高い効能が得られることはすでに確立されており、このことは、臨床現場での課題である。ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを単回投与できるうえに、動物を致死感染から救える、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの潜在的タイミングの調査を行った（図２２を参照）。ＣＬＰを行い、未処置のままにした（８５％）マウスの大半（８５％）は、３〜６日以内に死亡した。マウスを有効性の高い用量の抗生物質（モキシフロキサシン、ＬＤ９０）によって処置したことろ（ＣＬＰから１２時間後に投与）、生存率はあまり変化せず、２２％に上昇したに過ぎず、この時点では、抗生物質のみの投与は、その最も有効な用量で使用しても、有用ではないことが示された。これに対し、マウスを高用量の抗生物質と５ｍｇ／ｋｇのペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの単回投与との組み合わせで処置したところ（いずれも、ＣＬＰから１２時間後に投与）、１００％の生存率が得られた。ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる処置をもっと遅い時点、すなわち、ＣＬＰから２４時間後に行った場合（抗生物質はＣＬＰから１２時間後に行った）、マウスの生存率は６５％であり、これは、抗生物質のみによる処置後の生存率よりもかなり高い。これらの結果から、抗生物質のみによる処置が生存率に寄与しない条件下では、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを加えると、生存率が劇的に上昇したことが示されている。
【０１７４】
５．３．ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの単回投与と複数回投与の作用の比較
ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの４回投与よりも単回投与の方が治療上明らかに優れていることから、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの単回投与と、１回目の投与をＣＬＰから２時間後に行った場合の２回投与及び３回投与との比較を行った（図２３）。５ｍｇ／ｋｇの単回投与は、２回投与又は４回投与のいずれよりも優れることが明らかとなり、４０％及び６０％の防御（コントロールの未処置マウスに対するｐ値はそれぞれ０．０００２と０．０００７）に対して、９０％の防御（コントロールに対してｐ＝０．００１）であった。４回投与は、２回投与よりも有効であったようであるが、２回投与と４回投与との間の生存率の差は、統計的に有意ではなかった。
【０１７５】
５．４．ＣＬＰモデルにおけるペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの単回投与の用量反応
ＣＬＰを行ったマウスに単回投与した場合のペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの用量反応関係を調べた。手術から２時間後に、マウスにペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを１．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ単回投与した（ｎ＝８頭）。次善の用量のモキシフロキサシン（ＬＤ２５）を０時間時点に投与したところ、２０％の生存率しか得られなかった。結果は図２４に示されている。図２４に示されているように、２．５ｍｇ／ｋｇの単回投与が、より優れていたようであり、９０％の生存率が得られた（コントロールの未処置マウスに対してｐ＝０．００６）。１．２５ｍｇ／ｋｇの用量では、４０％の生存率が得られ、５ｍｇ／ｋｇの用量では、６５％の生存率が得られ（コントロールに対してｐ＝０．０１）、１０ｍｇ／ｋｇの用量では、７５％の生存率が得られた（コントロールに対してｐ＝０．０５４）。２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇの用量間では、統計的有意性は得られなかった。これらのデータから、治療効果をもたらす最適の用量は２．５ｍｇ／ｋｇであり、２．５〜１０ｍｇ／ｋｇの用量範囲によって同様の作用が示されることが示唆されている。しかしながら、１．２５ｍｇ／ｋｇの用量は有効性に劣ることが分かった。
【０１７６】
５．５．ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる処置後のサイトカイン反応
ＣＬＰ後において、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡがサイトカイン及びケモカインの産生に及ぼす潜在的作用をさらに調べた。
【０１７７】
ＣＬＰを行ったＢＡＬＢ／ｃマウスに、抗生物質のいずれの投与なしに、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ（５ｍｇ／ｋｇ）を単回投与し、この投与は、手術から２時間に開始した。マウス（６〜８頭の処置マウス、６〜８頭のコントロール未処置マウス、２頭のシャム手術マウス（追加のコントロールとした））を手術から１２時間後及び２４時間後に安楽死させ、血液をヘパリン処理シリンジに心臓穿刺によって採取した。続いて、血漿を遠心分離によって得て、分析まで−７０℃で保管した。腹水を洗浄によってマウスから採取し、遠心分離によって浄化し、分析まで−７０℃で保管した。Ｔｈ１サイトカインの代表的なものとして、ＴＮＦ−αのレベルを測定し、炎症誘発反応に伴うケモカインの代表的なものとして、ＲＡＮＴＥＳ及びＫＣのレベルを測定した。Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡペプチド処理マウスの血液（血漿）及び局所感染部位（腹水）のいずれにおいても、低下が検出された（図２５Ａ〜Ｆ）。最大の作用は、２４時間の時点に、血漿及び腹水の両方のＴＮＦ−α（図２５Ａ及びＢを参照）及びＲＡＮＴＥＳ（図２５Ｃ及びＤ）、並びに血液のＫＣ（図２５Ｅを参照）において観察された。これらの結果から、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる処置が、炎症性サイトカイン／ケモカイン反応の低下と関連していることが示唆され、このことは、サイトカイン反応調節因子としてのｐ２ＴＡの予想される役割と整合している。統計的分析は、一方向ＡＮＯＶＡを用いて行った。記号＊は、シャムに対してＰ＜０．０５であることを示しており、記号＃は、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡに対してＰ＜０．０６であることを示している。
【０１７８】
ＣＬＰ後の腹膜及び血液における追加のサイトカイン／ケモカインのレベルを評価した。下記の表４に、ＣＬＰから１２時間後又は２４時間後に採取した腹水及び血漿におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１０、Ｒａｎｔｅｓ、ＭＣＰ−１、及びＫＣのレベルがまとめられている。試験したいずれのサイトカイン／ケモカインも、セプシスの誘発後に増大した。ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる処置により、ＣＬＰから１２時間後及び２４時間後の腹膜及び血漿におけるＴＮＦ−α、Ｒａｎｔｅｓ、ＫＣ、及びＩＬ−１７Ａのレベルが概して低下し、ビヒクルで処置したコントロールマウスと比べて、差は、腹膜において、２４時間後のＴＮＦ−α及びＲａｎｔｅｓ、並びに１２時間後のＫＣにおいてのみ有意であった。しかしながら、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡには、いずれの時点に測定した腹水又は血液のいずれにおけるＣＬＰ誘発性のＩＬ−６、ＩＬ−１０、及びＭＣＰ−１レベルに対する作用はなかった。
【表４】
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【０１７９】
５．６．ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡが、ＣＬＰを行ったマウスにおける菌量に及ぼす作用
ＣＬＰを行ったマウスは、血液及び腹水において高い細菌量を示す。細菌は通常、腹水から血液に侵入し、まず、マクロファージ表面に結合した細菌要素を認識する循環多形核細胞（ＰＭＮ）によって、第二に、常在マクロファージ自体によって死滅される。細菌は、血液から、肝臓及び脾臓（細菌を体循環から除去するための主な部位である）に移動し、肝臓及び脾臓で、常在マクロファージによって捕獲される。ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの細菌量に対する潜在的作用を調べるために、これらの組織／臓器での細菌の播種を測定した。ＣＬＰを行ったマウスを３つの群（各群においてｎ＝６〜８）に分け、ＣＬＰから２時間後にペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ（５ｍｇ／ｋｇ）によって処置するか、ＰＢＳを注射してコントロールとするか、又はシャム手術群とした。いずれのマウスにも、抗生物質は接種しなかった。手術から１２時間後及び２４時間にマウスを安楽死させ、組織サンプルを各マウスの血液、腹水、肝臓、腎臓、及び脾臓から採取した。細菌のレベルをコロニー数によって測定し、処置群とコントロール群を比較した。
【０１８０】
図２６Ａ〜Ｅに示されているように、すべての組織／臓器から増殖した細菌のレベルは、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを接種した群の方が、ＰＢＳコントロール群よりも低かった。血液サンプルでは（図２６Ａ）、１２時間後にすでに、かなりかつ統計的に有意な低下が検出された。局所感染部位（腹水）では、低下は、２４時間後においても持続していた。その他の重要臓器では、細菌数の最大の低下は、ＣＬＰから２４時間後に検出された。これらの結果から、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる処置が、腹膜及び血液における感染部位、並びにマクロファージの豊富なその他の臓器からの細菌の除去率の増加と関連していることが示唆されている。統計的分析は、一方向ＡＮＯＶＡを用いて行った。記号＊は、シャムに対してＰ＜０．０５であることを示しており、記号＃は、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡに対してＰ＜０．０６であることを示している。
【０１８１】
５．７．ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡが、白血球の重要臓器への浸潤に及ぼす作用
セプシスにおける全身性炎症の発症の重要プロセスとされており、臓器機能不全を引き起こす標的臓器への多形核細胞（ＰＭＮ）の動員及び蓄積を担う重要な成分であるケラチノサイトケモカイン（ＫＣ）のレベルをペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡが低下させることが示された。
【０１８２】
したがって、ＣＬＰ後のマウスの脾臓、肝臓、及び腎臓においてＰＭＮのレベルを評価し、ＰＭＮ活性と関連する重要酵素であり、好中球の存在に関する間接的マーカーとして機能するミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の活性によって測定した。ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後に、ホモジナイズした組織においてＭＰＯ活性を測定した。測定は、分光光度法で４６０ｎｍにおいて１０分間、１分間隔で行った。ＭＰＯ活性は、（Ｕｎｉｔｓ／ｍｉｎ／ｍｇ）＝Ａ４６０×１３．５／ｇで表されており、このＡ４６０は吸光度の変化速度である。結果は図２７Ａ〜Ｃに示されており、この結果から、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる処置後、ＣＬＰから早い時点（１２時間後）に、ＭＰＯ活性のかなりかつ統計的に有意な低下を検出できるとともに、活性の低下が少なくとも２４時間後まで維持されることが示されている。統計的分析は一方向ＡＮＯＶＡを用いて行った。記号＊は、シャムに対してＰ＜０．０５であることを示しており、記号＃は、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡに対してＰ＜０．０６であることを示している。
【０１８３】
好中球流入の評価のために免疫組織学的染色した後、ＣＬＰ後のマウスの特定の組織から得た組織スライドにおけるＰＭＮの直接計数によって、重要臓器におけるＰＭＮレベルの低下のさらなる裏付けを例示した。ＣＬＰから２４時間後にＣＬＰマウスから得たホルマリン固定パラフィン切片をナフトールＡＳ−Ｄクロロアセテートエステラーゼ（白血球特異的エステラーゼ）で染色し、ギルヘマトキシリン溶液で対比染色し、カバースリップで覆った。肝臓切片に存在する好中球（エステラーゼ陽性染色細胞）の数を顕微鏡によって、４００倍でランダムにスクリーニングした（５〜７領域／サンプル）。
【０１８４】
例として、肝臓切片におけるＰＭＮの数の低下が図２８に示されている。統計的分析は一方向ＡＮＯＶＡを用いて行った。記号＊は、シャムに対してＰ＜０．０５であることを示しており、記号＃は、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡに対してＰ＜０．０６であることを示している。
【０１８５】
ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡには、ＣＬＰ後のＣＤ２８の発現又はリンパ球増殖に対する作用はない。
ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる処置が、免疫エフェクター細胞上でのＣＤ２８の発現に影響を及ぼしたかを割り出すために、手術から１２時間後及び２４時間後に、末梢血液細胞と脾細胞を調べた。その結果から、ＣＤ３＋血液Ｔリンパ球上、及びＣＤ４又はＣＤ８のいずれかの細胞を発現している脾臓Ｔ細胞上でのＣＤ２８の発現が少しダウンレギュレーションしたことが示された。しかしながら、試験したすべての細胞集団上でのＣＤ２８の発現に関しては、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ処置群とビヒクル処理群との間で、有意な変化は観察されなかった（図２９Ａ〜Ｄ）。フローサイトメトリーによって評価したＣＤ２８の表面発現は、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡペプチドによる処置の有無にかかわらず、ＣＬＰの１２時間後及び２４時間後の脾臓（図２９Ａ）及び血液（図２９Ｃ）のＣＤ３＋Ｔリンパ球においてレベルの有意な低下を示した。脾臓（図２９Ｂ）及び血液（図２９Ｄ）のＧｒ１＋骨髄性細胞は、ＣＬＰ後に発現の増大を示したが、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡペプチドによる処置によって、作用は観察されなかった。
【０１８６】
ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの細胞増殖に対する作用を試験するために、シャム、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置したか又は処置しなかったＣＬＰマウスから採取した単離脾細胞であって、抗ＣＤ３のみ又は抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８抗体で刺激して、７２時間培養した単離脾細胞を用いて、エキソビボ実験を行った。脾細胞増殖係数は、ＣＬＰから１２時間後及び２４時間後の双方において、シャムマウスから採取した細胞よりも低下した。ＣＬＰから２４時間後では、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる処置により、未処置群よりも増殖係数が低下したが、それらの差は統計的に有意ではなかった。
【０１８７】
５．８．ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡが、重要臓器（腎臓及び脾臓）におけるアポトーシスに及ぼす作用
腎臓、肝臓、及び脾臓のような重要臓器におけるアポトーシスプロセスの増大は、セプシスの転帰において、決定的な病因的役割を果たし、臓器不全に寄与する。したがって、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる処置が、ＣＬＰを行ったマウスにおける腎臓及び脾臓のアポトーシスに及ぼす潜在的作用を調べた（ｎ＝６〜８頭／群）。ＴＵＮＥＬ染色を用いて、ＣＬＰから２４時間後にマウスから採取した組織スライドにおいてアポトーシスを割り出した。アポトーシスのエビデンスのために、スライドを蛍光顕微鏡で調べた。その結果は図３０に示されている。アポトーシスの程度の低下は、両方の臓器で示されている。ＣＬＰから２４時間後の脾臓の組織切片におけるＴＵＮＥＬ染色の代表的な顕微鏡検査結果（２００倍）は、図３１Ａ〜Ｃに示されている（シャムマウス（図３１Ａ）、ＣＬＰマウス（図３１Ｂ）、及びＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置したＣＬＰマウス）。ＣＬＰ後、脾臓では、かなりのアポトーシスプロセスが明白であるが、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる単回処置（ＣＬＰから２時間後）は、このレベルを大幅に低下できたので、臓器損傷の低下をもたらし、これは、腎臓及び脾臓への低レベルのＰＭＮ動員とも整合している。
【０１８８】
Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ処理マウスとビヒクル処理マウス間で、ＣＬＰ後のセプシス誘発性アポトーシスの程度を比較するために、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、Ｇｒ−１）と組み合わせて、初期アポトーシスマーカーのアネキシＶで単離脾細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１８９】
図３２（Ａ〜Ｆ）に示されているように、ＣＬＰから１２時間後及び２４時間後にシャムと比べたとき、ＣＬＰ後の単離脾細胞のアポトーシスの頻度がわずかに増加したが、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡによる処置は、アネキシンＶ染色によって評価したところ、ＣＬＰ誘発性アポトーシスの程度を変化させなかった。図３２Ａ〜Ｆに示されている画像の定量化を行って、ソフトウェアｉＶｉｓｉｏｎを用いて分析した（図３０に示されている）。閾値処理を通じて陽性染色を定義し、得られた画像を分析し、データを総面積に対する染色面積の割合（染色面積比率（％））として表した。
【０１９０】
５．９．ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡが、ＣＬＰを行ったマウスに及ぼす作用のまとめ
複数菌腹腔内感染のモデルを用いて、ＣＬＰから１２時間後及び２４時間後という遅いタイミングに投与したとき、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの単回投与により、生存率が上昇することが示された。ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの投与が、例えば下記のような有意な作用と関連することも示された。
・血液、感染部位（腹膜）、及び重要臓器（脾臓、肝臓、腎臓）における細菌量の減少
・血液及び腹水におけるサイトカイン／ケモカインレベル（ＴＮＦ−α、Ｒａｎｔｅｓ、ＫＣ）の低下
・腎臓及び脾臓の両方におけるアポトーシスの低下
・脾臓、肝臓、及び腎臓における好中球ＰＭＮ活性の低下
・肝臓への好中球動員の減少（ＰＭＮ数を直接測定）
【０１９１】
したがって、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡが、セプシスの治療のための実現可能な治療的アプローチであり得ることが示唆されている。
【０１９２】
実施例６  細菌感染のモデルにおけるペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの効能のまとめ
６．１  様々な感染源による感染に対する広範な活性
グラム陽性菌感染（化膿連鎖球菌及び肺炎連鎖球菌によるもの）、グラム陰性菌感染（大腸菌）、及び混合感染（ＣＬＰ後の腹腔内多菌感染）を含むいくつかの細菌感染モデルにおいて、単回投与したペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの効能を調べた。すべての感染において、単独処置（化膿連鎖球菌）又は次善の用量の抗生物質との併用処置のいずれかとして試験した。これらのすべてのケースにおいて、かなりかつ高い治療効果が検出され（図３３に示されている）、宿主免疫応答を減弱させるように機能する免疫調節剤としてのペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、特定のタイプの感染に特異的なものではなく、様々な感染源による感染に対する広範な活性を有することが示されている。
【０１９３】
６．２．様々なモデルにおけるペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの有効な用量のまとめ
ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを単回投与した細菌感染の様々なモデルで、用量反応調査を行った。興味深いことに、結果から、本発明で用いたすべてのモデルにおいて、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを単回療法として投与したか、抗生物質と併用したかに関わらず、最も高い効能をもたらす最適の用量が２．５〜５ｍｇ／ｋｇという同じ範囲内であったことが示された。同様の用量は、（ｉ）グラム陰性菌感染、グラム陽性菌感染、又は混合感染による感染症の治療のために投与したとき、（ｉｉ）ＣＬＰモデルにおいて、治療用量以下又は十分な治療用量の抗生物質とともに投与したとき、（ｉｉｉ）化膿連鎖球菌モデルにおけるように、抗生物質をまったく投与せずに投与したとき、（ｉｖ）抗生物質治療の投与に対して異なる時点に投与したとき、（ｖ）化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、大腸菌、及びＣＬＰモデルのケースにおいて、遅延治療として、感染から異なる時点に投与したときにも有効であった。このように、すべてのモデルにわたって用量が均一であることから、実際に、本発明のペプチドの免疫調節作用が、細菌感染のタイプ及び負荷とは無関係に、宿主免疫応答を標的にしていることが示唆されている。これらの調査は、下記の表５にまとめられている。
【表５】
2019038838.tif 000006
【０１９４】
６．３．様々なモデルにおける投与レジメンのまとめ
本発明で用いた様々な感染モデルにおいて、投与レジメン（投与回数及び投与間隔）を調べた。いずれのケースでも、４〜２４時間の範囲の様々な投与間隔で行った複数回投与（２回投与、３回投与、及び４回投与）と、単回投与（感染後の異なる時点に投与）を比較した。重要なことに、調べたすべてのモデルにおいて、（感染時点に投与したか、感染から時間が経過してから投与したかにかかわらず、かつ、単剤療法として行ったか、抗生物質と併用したかにかかわらず）単回投与が複数回投与よりも優れていたことが分かった。しかしながら、興味深いことに、いずれのケースでも、複数回投与には、コントロールの未処置マウスよりも優れた作用があった。これらの比較結果のまとめは、下記の表に示されている。これらの結果から、その効能を維持させるタイミングの範囲内で行うｐ２ＴＡの単回投与が、動物を細菌感染から防御するのに十分であることと、追加投与はあまり有用ではない可能性があることが示唆されている。
【０１９５】
健常動物又は罹患動物のいずれかに対して行った複数回投与は、いずれの毒性の徴候とも関連していなかったので、複数回投与による処置時の効能の低下は、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ投与の毒性作用によるものではなかった（表６に示されている）。
【表６】
2019038838.tif 000007
【０１９６】
マウスとブタで行った毒性に関する調査（５ｍｇ／ｋｇのペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの１日に１４回の投与を含んでいた）では、毒性作用は示されなかった。
【０１９７】
実施例７  ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの動物及びヒト血漿における薬物動態
ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを動物及びヒトに全身投与したところ、ペプチドの血漿からの明らかな排泄は迅速であった。マウス、ブタ、及びヒトにおいて、マウス及びブタの双方においては５ｍｇ／ｋｇの用量、ヒトにおいては、０．４５ｍｇ／ｋｇの等価の用量を用いて、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの薬物動態を調べた。結果から、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの薬物動態パラメーターが、種にわたって一貫性があるとともに、予測可能であることが示され、マウス、ブタ、及びヒトにおいて、全身クリアランス（ＣＬ）値により、関連する除去プロセスが、能力が高く、速度も速いものであることが示されている（表７）。
【表７】
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【０１９８】
動物に関する上記データ（表７）は、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ（３つの用量レベル）をマウス及びブタの群に静脈内投与した後に得たとともに、血漿は、投与前と、投与後の複数の時点に採取した。
【０１９９】
ヒトに関する上記データ（表７）は、「Ｐｈａｓｅ  １，Ｄｏｕｂｌｅ  Ｂｌｉｎｄ，Ｐｌａｃｅｂｏ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，Ｄｏｓｅ  Ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ，Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ，ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ」という表題の、健常人における臨床実験で明らかになったものである。
【０２００】
この試験では、下記の表８に示されているように、２５人の健常人に、４種類の用量レベルのペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを投与した。
【表８】
2019038838.tif 000009
【０２０１】
各被検者に、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ又はプラセボコントロールを単回静脈内注入した。ＰＫのために、注入後の異なる時点に血液を採取した。すべてのコホートにおけるペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの血漿中濃度は、注入終了近くにピークに達し、１分を少し上回るＴ１／２で、急激に低下する。Ｔ１／２は、すべての用量レベルにわたって非常に似通っていた。Ｃｍａｘ及びＡＵＣによって測定したような、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡへの全身暴露は、用量に比例するようである。この結果、ＡＵＣと用量から導かれる血漿中クリアランス（ＣＬ）は、すべての用量において同程度である。
【０２０２】
持続注入及びワンコンパートメント排出のＰＫモデルが、データの説明に最も適していることが分かった。このモデルによって評価したヒト（健常人）におけるペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡのＰＫパラメーターは、ヒトに投与した最高用量（０．４５ｍｇ／ｋｇ）に関して、表７に示されており、この用量は、マウスに投与した有効な用量の、ヒトにおける等価用量である。これらのデータによると、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの血漿における半減期は非常に短く、細菌に感染させた動物に薬物を単回投与したときに観察された、長く持続する生物学的作用と相関していない。それどころか、動物に、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを複数回投与しても（複数回投与により、薬物の血漿中レベルが向上し得る）、効能は向上せず、これにより、実際の血漿中レベルは、薬物作用と直接相関はしていないことが示されている。
【０２０３】
加えて、約２００ｍＬ／ｋｇの見掛け分布容積は、血漿量よりもかなり大きく、これは、このアッセイで測定した血漿コンパートメント外の部位への潜在的分布と整合している。したがって、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、コンパートメント化による血漿から、ペプチドを安定化できるその他の成分に排泄されると思われる。
【０２０４】
実施例８  ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの組織体内分布
動物に静脈内注射した場合のペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの体内分布を調べるために、ペプチドの内部アミノ酸のうちの１つ（バリン）を１４Ｃで放射線標識した。その生成物［バリン−１４Ｃ］−Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡ、すなわちＨ−Ｄ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−［Ｕ−１４Ｃ］Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ）をＨＰＬＣによって、９７．７％の化学的純度及び９８％の放射化学的純度まで精製したところ、２６０ｍＣｉ／ｍｍｏｌの比活性を有し、この生成物を雄ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける一連の体内分布実験で用いた。マウスに、体重１ｋｇ当たり５ｍｇの塩基当量／１０００μＣｉで単回静脈内注射した。
【０２０５】
３６頭のマウスの群に、放射線標識したペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを上記の用量で、異なる時点（２分、４分、６分、８分、１０分、２０分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、及び２４時間）に注射し、３頭のマウスの群を安楽死させた。ＣＯ２による麻酔下にて心臓穿刺によって、血液サンプル（各時点に３頭のマウスから１ｍＬ）をＫ３ＥＤＴＡの入ったシリンジに採取した。放射活性を割り出すために、すべての血液サンプル及び血漿サンプルの両方を採取した。最後の血液サンプルを取った後、肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺、脳、小腸、大腸、胃壁、骨格筋、精巣、膵臓、骨、胸腺、甲状腺、副腎、膀胱、胆嚢壁、リンパ節、大動脈、及び大静脈という組織を摘出した。各組織を秤量し、分析まで−２０℃で保管した。
【０２０６】
続いて、組織を以下のように処理した。骨（刻んで混合したもの）、胸腺（刻んで混合したもの）、甲状腺、副腎、膀胱、胆嚢壁、脾臓、腎臓、心臓、肺、精巣、膵臓、リンパ節、大動脈、及び大静脈は、燃焼ボートの上に直接置き、フード内に置いて乾燥させ、続いて、Ｈａｒｖｅｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｏｘｉｄｉｚｅｒを用いて燃焼させてから、液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ）によって測定した。肝臓、脳、小腸、大腸、胃壁、及び骨格筋のようなその他の組織はホモジナイズし、アリコートを取り、上記のように処理した。
【０２０７】
早い時点における分布パターンは、［１４Ｃ］−Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの複数の組織、特に高灌流組織及び臓器への動態と整合している。興味深いことに、図３４Ａ〜Ｂに示されているように、血漿からのクリアランス（図３４Ｂ）よりも、リンパ節（図３４Ａ）及び胸腺（図示なし）のようなリンパ臓器において、早い時点におけるかなりの蓄積が明らかである。蓄積は、注射から４分後に始まり、２０分にピークに到達する。その後、放射活性レベルは徐々に低下するが、注射から数時間は、依然として、血漿中におけるよりも高いままである。
【０２０８】
［１４Ｃ］−Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡのリンパ臓器（リンパ節及び脾臓）への蓄積は、組織の血漿に対する比率として最も良く説明される（図３５Ａ〜Ｂに示されている）。注入から４分後にすでに、リンパ節の血漿に対する［１４Ｃ］−Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの比率は１よりも大きく、この臓器における放射活性の増大が示されている。２０分時点では、リンパ節におけるレベルは、血漿におけるよりも２２倍高く、投与から２時間後、さらには、興味深いことに２４時間後にも、５倍超を維持しており、この比率は３倍超である（図３５Ａ）。脾臓でも、程度は小さいが、同様の蓄積プロセスが生じ、注射から２０分後において、脾臓における放射活性の比率は、血漿と比べて６倍高く、注射から２４時間後では、その比率は３倍高い（図３５Ｂ）。
【０２０９】
その他の組織及び臓器と比べて、リンパ節では比較的高いレベルが図３６Ａ〜Ｃに示されており、注射から１０分後（図３６Ｂ）及び２０分後（図３６Ｃ）にすでに、その他の臓器におけるレベルは、２分後（図３６Ａ）に見られたレベルから徐々に低下しているのに対し、リンパ節におけるレベルが上昇している。
【０２１０】
潜在的に、リンパ臓器由来のＴ細胞が再循環すれば、結合した薬物をリンパ臓器から体循環に再分布させることができるので、そのアベイラビリティは、その血漿中半減期を上回る。薬物は全身で働くので、体循環に広がる重症の細菌感染の場合に、効果を示すことができる。
【０２１１】
実施例９  第ＩＩ相臨床試験
ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの安全性と薬物動態を評価し、このペプチドの臨床作用を示し、用量選択の指針を示すために、壊死性軟部組織感染症（ＮＳＴＩ）を罹患したヒト患者における第ＩＩ相試験を以下のように行った。
【０２１２】
ＮＳＴＩを罹患したという診断に主に基づき、患者を選定した（プレスクリーニングした３４３人の患者のうち、無作為に選んだ４３人の患者を選定し、その中から、４０人の患者を効能分析の対象にした）。無作為に選んだ上記の４０人の患者のうち、１０人の患者にプラセボを投与し、１５人の患者を１回、０．２５ｍｇ／ｋｇのＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡペプチドで処置し、１５人の患者を１回０．５ｍｇ／ｋｇのＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡペプチドで処置した）。患者には、臨床診断の６時間以内にペプチドを単回投与した。
【０２１３】
加えて、すべての患者に、広範な抗生物質治療、壊死組織切除処置、集中治療室（ＩＣＵ）における支持療法（換気の有無を問わない）を含む標準的なケア治療も施した。壊死組織切除処置は、かなりの量の壊死組織を除去する目的で、手術室で行われる外科的介入である。包帯の交換のような処置に加えて、縁を整えるなどの最小限の処置は、本分析の目的における壊死組織切除処置とみなさなかった。患者は、２８日間フォローした。
【０２１４】
細菌学的分析
感染の細菌学的分析により、ＮＳＴＩに、グラム陰性菌（例えばプロテウス種、大腸菌など）、及びグラム陽性菌（例えばスタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ａ又はＢ群）、緑色連鎖球菌など）を含む様々な細菌病原体が関与していたことが明らかになった。病原体は、好気性又は嫌気性のいずれかであり、感染は、単一の病原体又は混合病原体のいずれかによるものであった。
【０２１５】
集中治療室（ＩＣＵ）での入院期間
臨床試験の結果には、明らかな治療効果が示されている。例えば、図３７に示されているように、集中治療室（ＩＣＵ）での入院期間は、低用量（０．２５ｍｇ／ｋｇ）又は高用量（０．５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかのＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡペプチドによる１回の処置により、約２倍短縮した。日にちは、２４時間制に基づき、ＩＣＵへの入院開始時を起点にして計算した。同様に、人工呼吸器装着の日数と病院入院期間も、２倍短縮した。
【０２１６】
必要な壊死組織切除処置
興味深いことに、臨床試験のタイムフレーム内（２８日）で、患者の標準的なケア治療として必要であった壊死組織切除処置（上に定義されているようなもの）の回数は、有意に減少した。図３８Ａ及び図３８Ｂに示されているように、プラセボを投与した患者では、２．８回の壊死組織切除処置が必要であったのに対して、低用量のペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを投与した患者では、２．３回、高用量のペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡを投与した患者では、２．２回の壊死組織切除処置しか必要なかった。
【０２１７】
興味深いことに、プラセボ群と比べて、本発明のペプチドで処置した患者の方が、１回しか壊死組織切除を行わなかった比率が高かった（図３８Ｂ）。０．５ｍｇ／ｋｇの用量を投与した患者では、３３％が、治癒のために１回しか壊死組織切除を必要としなかったのに対し、プラセボ群では、壊死組織切除が１回だったのは２０％であった。
【０２１８】
一貫して、４回以上の壊死組織切除を必要とした患者の比率は、プラセボ群では、０．５ｍｇ／ｋｇの用量を投与した群（１３％）よりも高く、３０％であった。これらのデータから、本発明のペプチドによる処置により、感染の局所コントロールの改善が得られることが示唆されている。
【０２１９】
臓器機能不全（ＳＯＦＡ）の経時的な消散
上記の結果に加えて、図３９に示されているように、臓器不全を有する患者の比率は、本発明のペプチド（０．２５ｍｇ／ｋｇ又は０．５ｍｇ／ｋｇの用量）で処置した患者の方が、プラセボで処置した患者よりも低かった。０．５ｍｇ／ｋｇを投与した場合、１４日目では、患者の６．７％が臓器不全（臓器不全は、ＳＯＦＡスコア≧３として定義した）を有していたが、これに対して、プラセボ群では５０％であった。ＳＯＦＡスコアの変化は、１日目から１４日目にわたって評価し、この期間において、臓器消散及び臓器不全を有する患者の経時的な比率と、臓器機能不全／不全の消散までの時間を分析した。
【０２２０】
全身バイオマーカーの分析
ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置した患者において、プラセボを投与した患者と比べて、全身バイオマーカーの経時的変化も分析した。
【０２２１】
薬物の投与前及び後（最大７２時間）に、サイトカインレベルの調査のための血漿を採取し、１０種類のサイトカイン（炎症誘発性、抗炎症性、及びケモカイン）を調べた。サイトカインレベルをベースライン（薬物投与の直前）からの変化として、４時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に分析した。５つのサイトカインに関するこの分析の結果は、下記の表９に示されている。これらの結果から、０．５ｍｇ／ｋｇの用量で処置した患者のサイトカインレベルが、プラセボ群よりも低下していること、及び、このような低下が、処置から２４時間後にすでに現れていたのに対し、プラセボ群で低下したとしても、これよりも遅い時点（４８〜７２時間後）に現れたことが示されている。さらに、サイトカインレベルの変化は、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１−β、又はＩＬ３のような炎症誘発性サイトカインのみで検出され、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０では観察されなかった。このことは、明示されているような予想ＭＯＡ［９］と整合している。
【０２２２】
処置に対する患者の反応のまとめは、下記の表１０に示されている。
【表９】
2019038838.tif 000010
【表１０】
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【０２２３】
結論として、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡは、複数のエンドポイントにわたって、一貫した治療効果を示し、臨床的に意味のある疾患関連パラメーターに影響を及ぼし、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡで処置した患者では、プラセボ群よりも高い比率で、臨床応答が示された。０．５ｍｇ／ｋｇの用量の優位性が確認され、これは、前臨床モデルにおける見地（等価の動物用量（０．５ｍｇ／ｋｇ）が最適の用量であることが示唆されている）と整合している。加えて、１回しか投与しなくても、上で詳述した作用は、薬物投与直後に現れ、長時間持続し、本明細書において上で詳述したように、これは、ペプチドＤ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡの想定的な作用機序と整合している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
2019038838.tif 000021
【図１０Ｂ】
2019038838.tif 000022
【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年12月5日(2018.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１によって示されているとともに、ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号２によって示されているとともに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとして示されているような（Ｄ−Ａ）ＳＰＭＬＶＡＹＤ（Ｄ−Ａ）というアミノ酸配列からなるペプチド、又はその製薬学的に許容可能な塩若しくはエステルの、細菌感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つの治療を必要とするヒト対象において、その細菌感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つを治療するための医薬組成物の製造における使用であって、前記組成物が、前記ペプチド又はその塩若しくはエステルの治療有効量の前記少なくとも１つの細菌感染症及びそれに伴う急性炎症の発症後における前記対象への単回投与用に設計され、前記治療有効量が、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．０２５ｍｇ〜１．０ｍｇのペプチドである、使用。
【請求項２】
前記細菌感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つが、グラム陽性菌、グラム陰性菌、多菌感染、細菌トキシン、及びその他の毒性細菌成分のうちの少なくとも１つによって誘発される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記グラム陰性菌が、プロテオバクテリア、大腸菌、サルモネラ属、赤痢菌、腸内細菌、シュードモナス属、モラクセラ属、ヘリコバクター属、ブデロビブリオ属、ステノトロフォモナス属、酢酸菌、レジオネラ属、α−プロテオバクテリア、ボルバキア、グラム陰性球菌、ナイセリア種、淋菌、髄膜炎菌、モラクセラ・カタラーリス、グラム陰性桿菌、インフルエンザ菌、肺炎杆菌、レジオネラ・ニューモフィラ、緑膿菌、プロテウス・ミラビリス、エンテロバクター・クロアカエ、霊菌、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・ティフィ、アシネトバクター・バウマニ、野兎病菌、ビブリオ・バルニフィカス、コレラ菌、ビブリオ・フルビアリス、腸炎ビブリオ菌、ビブリオ・アルギノリチカス、フォトバクテリウム・ダムセラ、アエロモナス・ヒドロフィラ、ウェルシュ菌、ヒストリチクス菌、ポルフィロモナス／プレボテラ属種、プレボテラ・インターメディア、プレボテラ・ブッカエ、プレボテラ属種、バクテロイデス・ユニフォルミス、及びＮＤＭ−１菌株からなる群から選択され、前記グラム陽性菌が、Ａ群連鎖球菌、化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、エンテロコッカス・フェカリス、Ｄ群連鎖球菌、Ｇ群連鎖球菌、緑色連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミレリ、プロピオニバクテリウム属種、エンテロコッカス・フェシウム、ペプトストレプトコッカス属種、微好気性連鎖球菌、ラクトバチルス属種、スタフィロコッカス・エピデミデス、及びスタフィロコッカス・アウレウスからなる群から選択され、前記多菌感染が、グラム陽性菌、グラム陰性菌、又はこれらの組み合わせによって誘発され、前記毒性細菌成分が、エキソトキシン、エンドトキシン、スーパー抗原トキシン、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、ダメージ関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）、リポ多糖、ペプチドグリカン又はこれらの毒性成分、自然免疫系の細胞によって認識される病原体群と関連する分子、及びトール様受容体（ＴＬＲ）によって認識される病原体群と関連する分子からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
配列番号１によって示されているとともに、ｐ２ＴＡとして示されているようなＳＰＭＬＶＡＹＤというアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号２によって示されているとともに、Ｄ−Ａｌａ−ｐ２ＴＡとして示されているような（Ｄ−Ａ）ＳＰＭＬＶＡＹＤ（Ｄ−Ａ）というアミノ酸配列からなるペプチド、又はその製薬学的に許容可能な塩若しくはエステルの、以下のことを必要とするヒト対象において、グラム陽性菌、グラム陰性菌、多菌感染、及び細菌トキシンのうちの少なくとも１つによって誘発される細菌感染症又はそれに伴う急性炎症に起因するか又はこれに伴う損傷の悪化を防ぐこと、この損傷を抑止すること、及びこの損傷を改善することのうちの少なくとも１つのための医薬組成物の製造における使用であって、前記組成物が、前記ペプチド又はその塩若しくはエステルの治療有効量の前記少なくとも１つの細菌感染症及びそれに伴う急性炎症の発症後における前記対象への単回投与用に設計されている、上記使用。
【請求項５】
前記損傷が全身的損傷又は感染部位の損傷である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記損傷が、壊死性軟部組織感染症（ＮＳＴＩ）、腹腔内多菌感染、又は熱傷によって示され、前記損傷が、多臓器不全、セプシス、重症セプシス、化膿性関節炎、又は敗血症性ショックをもたらすことがある、請求項４又は５に記載の使用。
【請求項７】
前記グラム陰性菌が、プロテオバクテリア、大腸菌、サルモネラ属、赤痢菌、腸内細菌、シュードモナス属、モラクセラ属、ヘリコバクター属、ブデロビブリオ属、ステノトロフォモナス属、酢酸菌、レジオネラ属、α−プロテオバクテリア、ボルバキア、グラム陰性球菌、ナイセリア種、淋菌、髄膜炎菌、モラクセラ・カタラーリス、グラム陰性桿菌、インフルエンザ菌、肺炎杆菌、レジオネラ・ニューモフィラ、緑膿菌、プロテウス・ミラビリス、エンテロバクター・クロアカエ、霊菌、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・ティフィ、アシネトバクター・バウマニ、野兎病菌、ビブリオ・バルニフィカス、コレラ菌、ビブリオ・フルビアリス、腸炎ビブリオ菌、ビブリオ・アルギノリチカス、フォトバクテリウム・ダムセラ、アエロモナス・ヒドロフィラ、ウェルシュ菌、ヒストリチクス菌、ポルフィロモナス／プレボテラ属種、プレボテラ・インターメディア、プレボテラ・ブッカエ、プレボテラ属種、バクテロイデス・ユニフォルミス、及びＮＤＭ−１菌株からなる群から選択され、前記グラム陽性菌が、Ａ群連鎖球菌、化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、エンテロコッカス・フェカリス、Ｄ群連鎖球菌、Ｇ群連鎖球菌、緑色連鎖球菌、ストレプトコッカス・ミレリ、プロピオニバクテリウム属種、エンテロコッカス・フェシウム、ペプトストレプトコッカス属種、微好気性連鎖球菌、ラクトバチルス属種、スタフィロコッカス・エピデミデス、及びスタフィロコッカス・アウレウスからなる群から選択され、前記多菌感染が、グラム陽性菌、グラム陰性菌、又はこれらの組み合わせによって誘発され、前記毒性細菌成分が、エキソトキシン、エンドトキシン、スーパー抗原トキシン、病原体関連分子パターン（ＰＡＰＭ）、ダメージ関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）、リポ多糖、ペプチドグリカン、又はこれらの毒性成分、自然免疫系の細胞によって認識される病原体群と関連する分子、トール様受容体（ＴＬＲ）によって認識される病原体群と関連する分子からなる群から選択される、請求項５又は６に記載の使用。
【請求項８】
前記組成物が、経口投与、静脈内注射、筋内注射、腹腔内注射、髄腔内注射、皮下注射、直腸内投与、鼻腔内投与、眼局所投与、及び局所投与からなる群から選択したいずれかの経路によって投与するように設計されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記組成物が、前記細菌感染症及びそれに伴う急性炎症のうちの少なくとも１つの発症直後、前記発症から約３０分〜約７２時間以内、又は前記発症から約３０分〜約７日以内に投与するように設計されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記組成物が、前記対象に、少なくとも１つの追加の治療有効剤を治療有効量投与すること、及び標準的な支持療法を行うことのうちの少なくとも１つとともに投与するように設計されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの追加の治療有効剤が、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗生剤、静菌剤、殺菌剤、ステロイド、及び抗微生物剤からなる群から選択され、前記標準的な支持療法が、換気、手術、創傷処置、高圧酸素療法、ＩＶＩＧ（静脈内免疫グロブリン）療法、コルチコステロイド療法、血漿交換療法、陰圧閉鎖療法（ＶＡＣ被覆材療法）、及び活性化プロテインＣ療法から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記追加の治療有効剤が、次善の用量又は治療用量のいずれかで投与される、請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記組成物と前記追加の治療有効剤が、同時に投与されるように設計されている、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記組成物と前記追加の治療有効剤が、異なる時点に、異なる投与間隔で、異なる持続時間で、又は異なる順序で投与されるように設計されている、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記組成物と前記追加の治療有効剤の前記投与間隔が０〜７２時間である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記治療有効量が、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜０．７５ｍｇのペプチドである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記治療有効量が、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．２５ｍｇ〜０．５ｍｇのペプチドである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記組成物が、生理学的に適合可能な添加剤、担体、希釈剤、及び賦形剤のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【外国語明細書】
2019038838000001.pdf