(57)【要約】【課題】神経細胞に特異的な機能を有する大量の神経細胞を簡便に、且つ、効率よく製造可能な、哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法を提供する。【解決手段】哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法であって、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）と、レチノイン酸と、神経分化誘導剤と、エピジェネティクス阻害剤と、を含む培地を用いて、哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞を培養する工程を備える方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法であって、
塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）と、レチノイン酸と、神経分化誘導剤と、エピジェネティクス阻害剤と、を含む培地を用いて、哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞を培養する工程を備える製造方法。
【請求項２】
前記神経分化誘導剤がＩＳＸ９である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記エピジェネティクス阻害剤がＩＢＥＴ−１５１である請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記神経分化誘導剤の濃度が５０μＭ未満である請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記哺乳動物がヒトである請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞への分化誘導用キットであって、
神経細胞を培養するための培地と、
ｂＦＧＦと、
レチノイン酸と、
神経分化誘導剤と、
エピジェネティクス阻害剤と、
を備えるキット。
【請求項７】
前記神経分化誘導剤がＩＳＸ９である請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記エピジェネティクス阻害剤がＩＢＥＴ−１５１である請求項６又は７に記載のキット。
【請求項９】
前記哺乳動物がヒトである請求項６〜８のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法及び哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞への分化誘導用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経組織は、一般的に回復する能力が低く、一度損傷してしまうと自律的に機能再生することはない。そのため、脊髄損傷やパーキンソン病等の重度の中枢神経疾患に多くの患者が苦しめられている。
【０００３】
これらの疾患に対して、ヒトｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞やダイレクトリプログラミング技術によって作成した神経細胞（例えば、特許文献１等参照）を移植する神経再生医療が試みられている。神経再生医療を行うためには、元になる細胞を生体外で神経細胞へと分化誘導する基礎技術が必要である。しかし、ヒトｉＰＳ細胞やダイレクトリプログラミング技術は、神経細胞の作出のために遺伝子導入を行う必要がある。そのため、細胞の腫瘍化、予期せぬ遺伝子変異、過剰な免疫応答といった危険性を排除しきれない。したがって、神経再生医療を実現するために、遺伝子導入を行わずに生体外で神経細胞へと分化誘導する方法とそれに適した細胞源が求められている。
【０００４】
一方、本発明者らはこれまで、動物の脂肪組織由来の成熟脂肪細胞を脱分化させた脱分化脂肪細胞の製造方法を開発してきた（例えば、特許文献２及び３等参照）。また、特許文献３には、この脱分化脂肪細胞を神経細胞へと分化するために、１〜１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いる方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１４０６９８号
【特許文献２】特許第５９９１６８７号公報
【特許文献３】特許第５０５５６１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献３に記載の方法により得られた神経細胞は、その外観上の形質により神経細胞であることが確認されているが、活動電位、神経伝達物質への感受性等、神経細胞に特異的な機能については検討されていない。よって、簡便且つ大量に、効率よく神経細胞に特異的な機能を有する神経細胞を製造できる方法が求められていた。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、神経細胞に特異的な機能を有する大量の神経細胞を簡便に、且つ、効率よく製造可能な、哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法及び哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞への分化誘導用キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）と、レチノイン酸と、神経分化誘導剤と、エピジェネティクス阻害剤と、を含む培地を用いて、哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞を培養する工程を備える製造方法である。
【０００９】
上記第１態様に係る製造方法において、前記神経分化誘導剤がＩＳＸ９であってもよい。
【００１０】
上記第１態様に係る製造方法において、前記エピジェネティクス阻害剤がＩＢＥＴ−１５１であってもよい。
【００１１】
上記第１態様に係る製造方法において、前記神経分化誘導剤の濃度が５０μＭ未満であってもよい。
【００１２】
上記第１態様に係る製造方法において、前記哺乳動物がヒトであってもよい。
【００１３】
本発明の第２態様に係る哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞への分化誘導用キットは、神経細胞を培養するための培地と、ｂＦＧＦと、レチノイン酸と、神経分化誘導剤と、エピジェネティクス阻害剤と、を備える。
【００１４】
上記第２態様に係るキットにおいて、前記神経分化誘導剤がＩＳＸ９であってもよい。
【００１５】
上記第２態様に係るキットにおいて、前記エピジェネティクス阻害剤がＩＢＥＴ−１５１であってもよい。
【００１６】
上記第２態様に係るキットにおいて、前記哺乳動物がヒトであってもよい。
【発明の効果】
【００１７】
上記態様の製造方法及びキットによれば、神経細胞に特異的な機能を有する大量の神経細胞を簡便に、且つ、効率よく製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１における神経細胞分化誘導培地を用いて培養した細胞での神経細胞の各種マーカー（ＭＡＰ２、ＮＦ−Ｌ及びＡｓｃｌ１）のｍＲＮＡの発現量の相対比の経時的な変化を示すグラフである。
【図２】実施例１における神経細胞分化誘導培地を用いて培養した細胞（培養２１日目）の活動電位を示すグラフである。
【図３Ａ】実施例１における神経細胞分化誘導培地を用いて培養した細胞（培養２１日目）での脱分極刺激前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化を示す画像である。
【図３Ｂ】実施例１における神経細胞分化誘導培地を用いて培養した細胞（培養２１日目）でのアセチルコリン刺激前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化を示す画像である。
【図３Ｃ】実施例１における神経細胞分化誘導培地を用いて培養した細胞（培養２１日目）でのドーパミン刺激前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化を示す画像である。
【図４】実施例２における各種低分子化合物を含む培地を用いて培養した細胞（培養１４日目）での神経細胞マーカー（ＮＦ−Ｌ）のｍＲＮＡの発現量の相対比を比較したグラフである。
【図５】実施例３における異なる濃度のＩＳＸ９を含む神経細胞分化誘導培地を用いて培養した細胞（培養２１日目）の細胞生存率を比較したグラフである。
【図６】実施例３における異なる濃度のＩＳＸ９を含む神経細胞分化誘導培地を用いて培養した細胞（培養１４日目）での神経細胞の各種マーカー（ＮＦ−Ｌ及びＭＡＰ２）のｍＲＮＡの発現量の相対比を比較したグラフである。
【図７Ａ】試験例１におけるアトロピン（ムスカリン受容体アンタゴニスト）処理及び未処理の実施例１で得られた神経細胞でのアセチルコリン刺激による細胞内カルシウムイオン濃度の経時的な変化を比較したグラフである。
【図７Ｂ】試験例１におけるＤ１受容体アンタゴニスト処理及び未処理の実施例１で得られた神経細胞でのドーパミン刺激による細胞内カルシウムイオン濃度の経時的な変化を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
≪哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法≫
本実施形態の哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法は、以下に示す（ａ）〜（ｄ）の成分を含む培地（以下、「神経細胞への分化誘導培地」と称する場合がある）を用いて、哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞を培養する工程（以下、「培養工程」と称する場合がある）を備える製造方法である。
（ａ）塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）；
（ｂ）レチノイン酸；
（ｃ）神経分化誘導剤；
（ｄ）エピジェネティクス阻害剤
【００２０】
本実施形態の製造方法によれば、上記構成の培地を用いることで、神経細胞に特異的な機能を有する大量の神経細胞を簡便に、且つ、効率よく製造できる。
【００２１】
なお、本明細書において、「神経細胞に特異的な機能」とは、神経細胞マーカー（例えば、ＭＡＰ２、ＮＦ−Ｌ、Ａｓｃｌ１等）のｍＲＮＡが発現していること、活動電位を有すること、及び、神経伝達物質（アセチルコリン、ドーパミン等）への感受性を有することを意味する。
【００２２】
後述する実施例に示すとおり、本実施形態の製造方法によって得られる神経細胞は、上記例示した神経細胞に特異的な機能を有することが確認されている。なお、ニコチン感受性を有さないため、本実施形態の製造方法によって得られる神経細胞は、中枢系の神経細胞であると考えられる。そのため、得られた神経細胞は、中枢系の神経細胞に有効な薬剤のスクリーニングに使用することができる。また、個人の脂肪細胞を由来として、大量の分化脂肪細胞を製造し、更に、大量の神経細胞を製造できる。そのため、中枢神経組織の疾患（例えば、脊髄損傷やパーキンソン病等）へのオーダーメイド再生医療の細胞源としても使用できる。
【００２３】
＜培養工程＞
培養工程は、神経細胞への分化誘導培地を用いて、脱分化脂肪細胞を培養する工程である。
【００２４】
培養温度としては、例えば２５℃以上４０℃以下とすることができ、例えば３０℃以上３７℃以下とすることができる。
【００２５】
培養時間としては、例えば１０日以上３０日以下とすることができ、例えば、１４日以上２８日以下とすることができる。
【００２６】
培養工程でのＣＯ２濃度としては、例えば５％ＣＯ２下とすることができる。
【００２７】
［脱分化脂肪細胞］
培養工程に用いられる脱分化脂肪細胞は、本発明者らが開発した公知の方法（例えば、特許文献２及び３参照）を用いて、成熟脂肪細胞を脱分化することで得られる。具体的には、まず、脂肪組織からコラゲナーゼ処理等により成熟脂肪細胞を単離する。次いで、単離された成熟脂肪細胞を天井培養法によって培養することで脱分化脂肪細胞が得られる。
【００２８】
また、本実施形態の製造方法において用いられる脱分化脂肪細胞は、哺乳動物に由来するものであればよい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等が挙げられる。中でも、哺乳動物としては、ヒトが好ましい。
【００２９】
また、培養工程に用いられる脱分化脂肪細胞は、予め低栄養の培地を用いて培養して飢餓状態としておいてもよい。低栄養の培地として具体的には、例えば、２％のＢ−２７  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）−Ａ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）等が挙げられる。これにより、高効率で、神経細胞へ分化誘導することができる。
【００３０】
［神経細胞への分化誘導培地］
培養工程に用いられる神経細胞への分化誘導培地は、上記（ａ）〜（ｄ）の成分を含む培地である。各構成成分について、以下に詳細を説明する。
【００３１】
（（ａ）塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ））
一般に、「塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）」は、ＦＧＦ２とも呼ばれ、低分子量型（ＬＷＬ）と高分子量型（ＨＷＬ）との２つのアイソフォームを持つ。低分子量型ＦＧＦ２は主に細胞質に存在し自己分泌(オートクリン)で作用する。一方、高分子量型ＦＧＦ２は核内にあり、細胞内で作用するイントラクリン機構で活性を示す。培地に含まれるｂＦＧＦとしては、低分子量型であってもよく、高分子量型であってもよい。
【００３２】
ｂＦＧＦは、脱分化脂肪細胞の由来となる哺乳動物と同じ種の動物に由来するものであってもよく、異なる種の動物に由来するものであってもよいが、脱分化脂肪細胞の由来となる哺乳動物と同じ種の動物に由来するものであることが好ましい。例えば、ヒト由来の脱分化脂肪細胞を用いる場合は、ｂＦＧＦもヒト由来のものを用いることが好ましい。
【００３３】
培地に含まれるｂＦＧＦの濃度は、１０μｇ／ｍＬ以上５００μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、３０μｇ／ｍＬ以上３００μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、５０μｇ／ｍＬ以上１５０μｇ／ｍＬ以下であることが更に好ましい。
【００３４】
（（ｂ）レチノイン酸）
一般に、「レチノイン酸」は、ビタミンＡ（レチノール）の代謝物質であり、成長や発達に必要なビタミンＡの機能を媒介することが知られている。
【００３５】
レチノイン酸は、シス体であってもよく、トランス体であってもよい。中でも、レチノイン酸は、二重結合がすべてトランス型をとった、オール・トランス異性体（すなわち、トレチノイン）であることが好ましい。
【００３６】
培地に含まれるレチノイン酸の濃度は、１μＭ以上１００μＭ以下であることが好ましく、３μＭ以上５０μＭ以下がより好ましく、５μＭ以上１５μＭ以下が更に好ましい。
【００３７】
（（ｃ）神経分化誘導剤）
神経分化誘導剤としては、特別な限定はないが、神経分化誘導能を有するイソキサゾール環を有する低分子化合物であることが好ましい。
【００３８】
ここでいう「神経分化誘導能」とは、脱分化脂肪細胞を上述する機能を有する神経細胞に分化誘導させる性質を意味する。
【００３９】
このような低分子化合物として具体的には、例えば、ＩＳＸ９及びその誘導体が挙げられる。
【００４０】
中でも、神経分化誘導剤としては、ＩＳＸ９が好ましい。
【００４１】
培地に含まれる神経分化誘導剤の濃度としては、５０μＭ未満であることが好ましく、５μＭ以上５０μＭ未満であることがより好ましく、１０μＭ以上２０μＭ以下であることが更に好ましく、２０μＭであることが特に好ましい。
【００４２】
特に、培地に含まれる神経分化誘導剤の濃度が５０μＭ未満であることにより、細胞生存率をより高く保ちながら、脱分化脂肪細胞を効率よく神経細胞へ誘導することができる。
【００４３】
（（ｄ）エピジェネティクス阻害剤）
エピジェネティクス阻害剤としては、特別な限定はないが、エピジェネティクス阻害能を有するイソキサゾール環を有する低分子化合物であることが好ましい。
【００４４】
ここでいう、「エピジェネティクス阻害能」とは、ＤＮＡのメチル化、ヒストンのアセチル化及びメチル化等のＤＮＡ及びヒストンの化学修飾を阻害する、又は、それら化学修飾を認識するタンパク質を阻害する性質を意味する。具体的には、例えば、ＤＮＡメチル基転移酵素（ＤＮＭＴ）を阻害すること、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質を阻害すること、ヒストンアセチル基転移酵素（ＨＡＴ）を阻害すること、ヒストン脱アセチル化酵素を促進すること、ブロモドメインタンパク質（ＢＲＤ）を阻害すること、ヒストンのリシンメチル基転移酵素（ＫＭＴ）を阻害すること、ヒストンのリシン脱メチル化酵素を促進すること、メチル化リシン結合タンパク質（ＭＫＢＰ）を阻害すること等が挙げられる。
【００４５】
このような低分子化合物として具体的には、例えば、ＤＮＭＴ阻害薬、ＨＡＴ阻害薬、ＢＲＤ阻害薬、ＫＭＴ阻害薬、ＭＫＢＰ阻害薬等が挙げられる。
【００４６】
ＤＮＭＴ阻害薬としては、例えば、アザシチジン、デシタビン及びそれらの誘導体等が挙げられる。
【００４７】
ＨＡＴ阻害薬としては、例えば、Ｃ６４６、アセチルＣｏＡアナログ及びそれらの誘導体等が挙げられる。
【００４８】
ＢＲＤ阻害薬としては、例えば、ＩＢＥＴ−１５１、ＩＢＥＴ−７６２及びそれらの誘導体等が挙げられる。
【００４９】
ＫＭＴ阻害薬としては、例えば、ＤＯＴ１Ｌ、ＥＺＨ２及びそれらの誘導体等が挙げられる。
【００５０】
ＭＫＢＰ阻害薬としては、例えば、ＵＮＣ１２１５及びその誘導体等が挙げられる。
【００５１】
中でも、エピジェネティクス阻害剤としては、ＩＢＥＴ−１５１であることが好ましい。
【００５２】
培地に含まれるエピジェネティクス阻害剤の濃度は、０．１μＭ以上１０μＭ以下であることが好ましく、０．３μＭ以上５μＭ以下であることがより好ましく、０．５μＭ以上３μＭ以下であることが更に好ましく、２μＭであることが特に好ましい。
【００５３】
（（ｅ）その他構成成分）
培地は、上記（ａ）〜（ｄ）の成分に加えて、更に、（ｅ）その他構成成分を含有していてもよい。
【００５４】
その他構成成分としては、特別な限定はなく、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等が挙げられる。
【００５５】
培地に含まれる無機塩は、細胞の浸透圧平衡の維持を助けるために、及び、膜電位の調節を助けるためのものである。
【００５６】
無機塩としては、特別な限定はなく、例えば、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛等の塩が挙げられる。塩は、通常、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、及び重炭酸塩の形で用いられる。
【００５７】
一般的に、培地の重量オスモル濃度は、例えば２００ｍＯｓｍ／ｋｇ以上４００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下とすることができ、例えば２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下とすることができ、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３００ｍＯｓｍ／ｋｇ未満（具体的には、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ）とすることができる。
【００５８】
炭水化物としては、特別な限定はなく、例えば、グルコース、ガラクトース、マルトース、フルクトース等が挙げられる。
【００５９】
一般的に、培地中の炭水化物（好ましくは、Ｄ−グルコース）の濃度としては、０．５ｇ／Ｌ以上２ｇ／Ｌであることが好ましい。
【００６０】
アミノ酸としては、特別な限定はなく、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、及びその組み合わせ等が挙げられる。
【００６１】
一般的に、培地に含まれるグルタミンの濃度は０．０５ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下（通常、０．１ｇ／Ｌ以上０．７５ｇ／Ｌ以下)である。培地に含まれるグルタミン以外の各アミノ酸は、０．００１ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ(通常、０．０１ｇ／Ｌ以上０．１５ｇ／Ｌ以下)である。アミノ酸は合成由来でもよい。
【００６２】
ビタミンとしては、特別な限定はなく、例えば、チアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ナイアシンアミド（ビタミンＢ３）、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、（ビタミンＢ５）、ピリドキサール／ピリドキサミン／ピリドキシン（ビタミンＢ６）、葉酸（ビタミンＢ９）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、カルシフェロール（ビタミンＤ２）、ＤＬ−αトコフェロール（ビタミンＥ）、ビオチン（ビタミンＨ）、メナジオン（ビタミンＫ）、塩化コリン、ｍｙｏ−イノシトール等が挙げられる。
【００６３】
培地は、更に抗生物質、血清又はホルモン等を含んでいてもよい。
【００６４】
抗生物質としては、例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシン、アンピシリン、ミノマイシン、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタシン、タイロシン、オーレオマイシン等、通常の動物細胞の培養に用いられるものが挙げられる。これらの抗生物質を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
【００６５】
一般的に、培地に含まれる抗生物質の濃度は、特別な限定はなく、例えば０．１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下とすることができる。
【００６６】
血清としては、例えば、ＦＢＳ／ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ／Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ＮＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）、ＣＳ（Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ＨＳ（Ｈｏｒｓｅ  Ｓｅｒｕｍ）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００６７】
一般的に、培地に含まれる血清の濃度は、例えば２質量％以上１０質量％以下とすることができる。
【００６８】
ホルモンとしては、例えば、インスリン、グルカゴン、トリヨードチロニン、副腎皮質ホルモン（ハイドロコーチゾン等）等が挙げられる。これらのホルモンを単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
【００６９】
一般的に、培地に含まれるホルモンの濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下とすることができる。
【００７０】
また、ホルモンを含む培地添加剤として、ウシ脳下垂体抽出物（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ：ＢＰＥ）を用いてもよい。
【００７１】
培養工程に用いられる神経細胞への分化誘導培地は、上記各種構成成分を混合して調製してもよく、通常、神経細胞を培養するための培地に上記（ａ）〜（ｄ）の成分、及び、必要に応じて、上記（ｅ）の成分等を添加して調製してもよい。
【００７２】
神経細胞を培養するための培地としては、例えば、Ｂ−２７  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）−Ａ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）等が挙げられる。
【００７３】
≪哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞への分化誘導用キット≫
本実施形態の哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞への分化誘導用キットは、神経細胞を培養するための培地と、ｂＦＧＦと、レチノイン酸と、神経分化誘導剤と、エピジェネティクス阻害剤と、を備える。
【００７４】
本実施形態のキットによれば、神経細胞に特異的な機能を有する大量の神経細胞を簡便、且つ、効率よく製造できる。
【００７５】
本実施形態のキットの各構成について、以下に詳細を説明する。
【００７６】
＜神経細胞を培養するための培地＞
本実施形態のキットに含まれる神経細胞を培養するための培地としては、上記「哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００７７】
＜ｂＦＧＦ＞
本実施形態のキットに含まれるｂＦＧＦとしては、上記「哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００７８】
＜レチノイン酸＞
本実施形態のキットに含まれるレチノイン酸としては、上記「哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、レチノイン酸は、二重結合がすべてトランス型をとった、オール・トランス異性体（すなわち、トレチノイン）であることが好ましい。
【００７９】
＜神経分化誘導剤＞
本実施形態のキットに含まれる神経分化誘導剤としては、上記「哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、神経分化誘導剤としては、ＩＳＸ９が好ましい。
【００８０】
＜エピジェネティクス阻害剤＞
本実施形態のキットに含まれるエピジェネティクス阻害剤としては、上記「哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、エピジェネティクス阻害剤としては、ＩＢＥＴ−１５１であることが好ましい。
【００８１】
＜その他構成＞
本実施形態のキットは、上記構成に加えて、更に、その他構成を備えていてもよい。
【００８２】
本実施形態のキットに含まれるその他構成としては、上記「哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法」において、「その他構成成分」として例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００８３】
本実施形態のキットに含まれる上記構成を、各構成中の各成分が上記「哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法」において説明した濃度となるように混合することで、神経細胞への分化誘導培地が調製できる。この分化誘導培地を用いることで、脱分化脂肪細胞から神経細胞に特異的な機能を有する大量の神経細胞を簡便、且つ、効率よく製造できる。
【００８４】
本実施形態のキットを用いて培養する脱分化脂肪細胞としては、上記「哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、脱分化脂肪細胞はヒト由来であることが好ましい。
【００８５】
また、本実施形態のキットを用いて得られる神経細胞は、上記例示した神経細胞に特異的な機能を有することが確認されている。なお、ニコチン感受性を有さないため、本実施形態のキットを用いて得られる神経細胞は、中枢系の神経細胞であると考えられる。そのため、得られた神経細胞は、中枢系の神経細胞に有効な薬剤のスクリーニングに使用することができる。また、個人の脂肪細胞を由来として、大量の分化脂肪細胞を製造し、更に、大量の神経細胞を製造できる。そのため、中枢神経組織の疾患（例えば、脊髄損傷やパーキンソン病等）へのオーダーメイド再生医療の細胞源としても使用できる。
【実施例】
【００８６】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８７】
［実施例１］
１．脱分化脂肪細胞の作製
まず、公知の方法（例えば、特許文献２等参照）を用いて、ヒト成熟脂肪細胞からヒト脱分化脂肪細胞を作製した。具体的には、まず、ヒト頬粘膜下に位置する頬脂肪体より採取した脂肪組織５ｇを、終濃度が０．０２ｗ／ｖ％となるようにコラゲナーゼ（ＴｙｐｅＩＩ）（ＳＩＧＭＡ社製）を添加したＮａＨＣＯ３含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＳＩＧＭＡ社製）に入れ、コラゲナーゼ処理を行った。コラゲナーゼ処理を行った後、ナイロンメッシュにて濾過し、細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液を１分間、７００Ｇで遠心分離し、上層に分離される単胞性脂肪画分を新鮮な１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭに加え、１分間、７００Ｇの遠心分離を３回繰り返すことで、単胞性脂肪細胞として成熟脂肪細胞を得た。
【００８８】
次いで、得られた単胞性脂肪細胞を組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ，３１０７）に移し、２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭでフラスコ内を完全に満たし、３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の気相に調節した炭酸ガス培養装置内にフラスコ底面が上となるように静置して７日間培養した。
【００８９】
培養４日後には大部分の細胞がフラスコ天井面にしっかりと接着し、大型の脂肪滴の周辺に種々の大きさの脂肪滴を有する多胞性脂肪細胞へと形態変化した。培養６日後には脂肪滴が更に小さくなり、脂肪滴をまったく持たない線維芽細胞様の形態に変化する細胞が多数観察された。
【００９０】
培養７日後にフラスコ内の培地を２０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭに交換し、細胞接着面が底面になるようにして炭酸ガス培養装置内で１０日間培養を続けた。培地交換は４日毎に行った。脂肪滴を持たない細胞は活発に増殖し、培養１０日後にはフラスコ内の細胞は線維芽細胞様の細胞のみとなり、コンフルエントに達した。
【００９１】
この線維芽細胞様の細胞は、活発な増殖能を有し、またＤＥＸ、ＩＮＳ、ＩＢＭＸ等の
分化誘導剤により、脂肪滴を有する脂肪細胞に再分化する分化能を有することから、単胞
性脂肪細胞由来の脱分化脂肪細胞として作出された。
【００９２】
次いで、１％ペニシリン及びストレプトマイシン並びに２０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ（高濃度グルコース）を用いて、作出された脱分化脂肪細胞を、１×１０６ｃｅｌｌｓ／５ｍＬ／７５−ｃｍ２  ｆｌａｓｋの濃度となるように添加して培養した。培地交換は２〜３日に１度行った。
【００９３】
１週間に一度継代し、４回継代培養した。次いで、４回目の継代培養後、５ｍＬのＰＢＳで洗浄した。次いで、２ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡを用いて、３７℃で２分間処理した。次いで、処理後の細胞を回収して、３００ｇで１分間室温にて遠心した。次いで、１×１０６ｃｅｌｌｓ／５ｍＬ／７５−ｃｍ２  ｆｌａｓｋの濃度となるように細胞を播種して、培養した。
【００９４】
２．分化誘導培地の作製
次いで、以下の表１に示す組成となるように、各成分を混合し、神経細胞への分化誘導培地を調製した。
【００９５】
【表１】
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【００９６】
３．脱分化脂肪細胞から神経細胞への分化誘導
次いで、「１．」で準備した脱分化脂肪細胞を５ｍＬのＰＢＳで洗浄した。次いで、２ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡを用いて、３７℃で２分間処理した。次いで、処理後の細胞を回収して、３００ｇで１分間室温にて遠心した。次いで、３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／１ウェルとなるように、６ウェルプレートに播種して、２４時間培養した。
【００９７】
次いで、１ｍＬのＰＢＳで洗浄した。次いで、１ｍＬの２％Ｂ２７含有Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）−Ａ培地（以下、「ＮＡ培地」と略記する場合がある）を用いて、細胞を飢餓状態で２４時間培養した。
【００９８】
次いで、１ｍＬのＰＢＳで洗浄した。次いで、「２．」で作製した分化誘導培地１ｍＬを用いて、２１日間培養した。培地交換は、１週間に１回行った。
【００９９】
４．神経細胞マーカーのｍＲＮＡ発現の確認
次いで、「３．」で分化誘導培地を用いて培養した細胞（培養０、７、１４及び２１日目）について、１ｍＬのトリゾールを用いて、全ＲＮＡを回収した。次いで、以下の表２に示すプライマーを用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、神経細胞の各種マーカー（ＭＡＰ２、ＮＦ−Ｌ及びＡｓｃｌ１）のｍＲＮＡの発現を確認した。結果を図１に示す。なお、対照としてＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。図１では、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量に対する神経細胞の各種マーカー（ＭＡＰ２、ＮＦ−Ｌ及びＡｓｃｌ１）のｍＲＮＡの発現量を相対比で示している。
【０１００】
【表２】
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【０１０１】
図１から、培養１４日目には、神経細胞の各種マーカーのｍＲＮＡの発現が顕著に増加していた。
【０１０２】
５．活動電位の確認
次いで、「３．」で分化誘導培地を用いて培養した細胞（培養２１日目）について、パッチクランプ法により、活動電位を計測した。結果を図２に示す。
【０１０３】
図２から、培養２１日目の細胞において、活動電位が観察された。
【０１０４】
６．外部刺激に対する細胞内Ｃａ２＋濃度変化の確認
次いで、「３．」で分化誘導培地を用いて培養した細胞（培養２１日目）について、カルシウムイメージング法を用いて、脱分極刺激、アセチルコリン刺激及びドーパミン刺激の前後での細胞内Ｃａ２＋濃度変化を観察した。結果を図３Ａ（脱分極刺激）、図３Ｂ（アセチルコリン刺激）及び図３Ｃ（ドーパミン刺激）に示す。
【０１０５】
図３Ａ〜図３Ｃから、脱分極刺激、アセチルコリン刺激及びドーパミン刺激の全てにおいて、刺激後の細胞では、細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が観察された。
【０１０６】
以上のことから、上記分化誘導培地を用いて培養した細胞は、培養１４日目には、神経細胞の各種マーカーが発現しており、培養２１日目には、神経細胞に特異的な機能を有することが確かめられた。
【０１０７】
［実施例２］
次いで、神経分化誘導剤として、ＩＳＸ９以外の低分子化合物を用いて、神経細胞への分化誘導可能かを確認した。
【０１０８】
１．脱分化脂肪細胞の作製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、脱分化脂肪細胞を準備した。
【０１０９】
２．分化誘導培地の作製
ＩＳＸ９の代わりに、以下に示す低分子化合物を用いて、その他の成分については、実施例１の「２．」と同様の組成となるように培地を調製した。また、コントロールとして、神経分化誘導剤を含まない培地、及び、２０μＭのＩＳＸ９を含む培地を準備した。
・ＳＰ６００１２５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・ＳＵ５４０２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・ＦＩＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・ＳＵ６６５６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・ＹＭ２５４８９０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・ＭＫ２２０６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・ＧＳＫ５２５７６２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・ＪＷ６７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・ＳＫＦ８６００２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・ＳＢ２３９０６３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・ＦＲ１８０２０４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・Ｕ０１２６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
【０１１０】
３．脱分化脂肪細胞から神経細胞への分化誘導
各種低分子化合物を含む培地を用いた以外は、実施例１の「３．」と同様の方法を用いて、脱分化脂肪細胞を培養して、神経細胞への分化誘導を試みた。
【０１１１】
４．神経細胞マーカー（ＮＦ−Ｌ）のｍＲＮＡ発現の確認
次いで、実施例１の「４．」と同様の方法を用いて、各種低分子化合物を含む培地で培養した細胞（培養１４日目）について、神経細胞マーカーであるＮＦ−ＬのｍＲＮＡの発現を確認した。結果を図４に示す。
【０１１２】
図４から、ＩＳＸ９以外の低分子化合物を含む培地を用いて培養した細胞において、ＮＦ−ＬのｍＲＮＡの発現を確認できたものはなかった。
【０１１３】
［実施例３］
次いで、神経細胞へ分化誘導するためのＩＳＸ９の最適濃度を検討した。
【０１１４】
１．脱分化脂肪細胞の作製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、脱分化脂肪細胞を準備した。
【０１１５】
２．分化誘導培地の作製
ＩＳＸ９の最終濃度を０、１、３、５、５、１０、２０、５０、１００及び２００μＭとふって、その他の成分については、実施例１の「２．」と同様の組成となるように培地を調製した。
【０１１６】
３．脱分化脂肪細胞から神経細胞への分化誘導
異なる濃度のＩＳＸ９を含む培地を用いた以外は、実施例１の「３．」と同様の方法を用いて、脱分化脂肪細胞を培養して、神経細胞への分化誘導を試みた。
【０１１７】
４．細胞生存率の確認
次いで、実施例１の「４．」と同様の方法を用いて、異なる濃度（０、２０、５０、１００及び２００μＭ）のＩＳＸ９を含む培地で培養した細胞（培養２１日目）について、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）細胞生存率キットを用いて細胞を染色し、生細胞及び死細胞を計測して、細胞生存率を算出した。結果を図５に示す。
【０１１８】
図５から、ＩＳＸ９の濃度が５０μＭ以上では、細胞死が引き起こされ、細胞生存率が低下することが明らかとなった。
【０１１９】
５．神経細胞マーカー（ＮＦ−Ｌ及びＭＡＰ２）のｍＲＮＡ発現の確認
次いで、実施例１の「４．」と同様の方法を用いて、異なる濃度（０、１、３、５、５、１０及び２０μＭ）のＩＳＸ９を含む培地で培養した細胞（培養１４日目）について、神経細胞マーカーであるＮＦ−Ｌ及びＭＡＰ２のｍＲＮＡの発現を確認した。結果を図６に示す。
【０１２０】
図６から、神経細胞マーカーであるＮＦ−Ｌ及びＭＡＰ２のｍＲＮＡの発現量は、ＩＳＸ９の濃度依存的に上昇することが明らかとなった。
【０１２１】
［試験例１］
神経細胞を用いて、アセチルコリン又はドーパミン刺激に対する各種アンタゴニストの影響を試験した。
【０１２２】
具体的には、実施例１で得られた神経細胞に、アトロピン（ムスカリン受容体アンタゴニスト）又はＤ１受容体アンタゴニストを添加して、１０分間培養した。また、コントロールとして、各種アンタゴニストを添加せずに培養した細胞も準備した。次いで、カルシウムイメージング法を用いて、ムスカリン受容体アンタゴニストを添加した細胞には、アセチルコリン刺激を、Ｄ１受容体アンタゴニストを添加した細胞には、ドーパミン刺激を加えて、経時的な細胞内カルシウムイオン濃度の変化を測定した。結果を図７Ａ（アトロピン（ムスカリン受容体アンタゴニスト）添加）及び図７Ｂ（Ｄ１受容体アンタゴニスト添加）に示す。
【０１２３】
図７Ａ及び図７Ｂから、アトロピン（ムスカリン受容体アンタゴニスト）又はＤ１受容体アンタゴニストを添加した細胞では、アセチルコリン刺激又はドーパミン刺激による細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が抑制されることが確かめられた。
【０１２４】
以上のことから、上記分化誘導培地を用いて培養して得られた神経細胞は、薬剤のスクリーニングへ応用できる可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本実施形態の製造方法及びキットによれば、神経細胞に特異的な機能を有する大量の神経細胞を簡便、且つ、効率よく製造できる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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