(57)【要約】【課題】酸味および渋味の不調和感が抑えられた好ましい香味を呈する発酵液を生産する醸造酵母を得ることができる、醸造酵母の馴化方法の提供。【解決手段】醸造酵母を馴化する方法であって、醸造酵母細胞液を、好気条件下、糖、窒素源、ミネラル源およびビタミン源の存在下においてインキュベートすることを含んでなり、該醸造酵母細胞液中の糖濃度が０．０１〜５０°Ｐの範囲内に維持される、馴化方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
醸造酵母を馴化する方法であって、
醸造酵母細胞液を、好気条件下、糖、窒素源、ミネラル源およびビタミン源の存在下においてインキュベートすることを含んでなり、
該醸造酵母細胞液中の糖濃度が０．０１〜５０°Ｐの範囲内に維持される、方法。
【請求項２】
前記醸造酵母細胞液が好気条件下における流加培養法によって得られたものであり、かつ、前記醸造酵母細胞液の馴化開始時の細胞濃度が３×１０８細胞／ｍｌ以上１０×１０８細胞／ｍｌ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
インキュベートの温度条件が、醸造酵母細胞液を調製する際の培養温度を上限とし、発酵アルコール飲料を製造する際の発酵温度よりも２℃低い温度を下限とする範囲内である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
インキュベートの温度条件が５℃〜３０℃である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
インキュベート時間が１６時間以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記醸造酵母細胞液中の醸造酵母の細胞濃度が１．０５倍以上に増加することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって馴化された、醸造酵母。
【請求項８】
発酵アルコール飲料の醸造に適した醸造酵母を製造する方法であって、
醸造酵母細胞液を、好気条件下において、糖、窒素源、ミネラル源およびビタミン源の存在下においてインキュベートすることを含んでなり、
該醸造酵母細胞液中の糖濃度が０．０１〜５０°Ｐの範囲内に維持される、方法。
【請求項９】
請求項７に記載の醸造酵母を用いて発酵前液を発酵させる工程を含んでなる、発酵アルコール飲料の製造方法。
【請求項１０】
前記醸造酵母がビール酵母であり、製造される発酵アルコール飲料がビールテイスト発酵アルコール飲料である、請求項９に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流加培養で得られた醸造酵母の香味特性改善のための馴化技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
パン酵母の培養で一般に利用される流加培養法をビール酵母培養に適用することで、既存のビール酵母培養法である麦汁を用いた回分培養法よりも高効率で、かつ麦汁を必要としない醸造酵母の培養が可能であることが知られている（特許文献１、非特許文献１）。
【０００３】
一方、パン酵母の流加培養においては、通気を継続しながら培養終盤に糖供給を極度に制限し出芽率を下げることで保存耐性を改善する方法が知られている（非特許文献２および非特許文献３）。また、酵母細胞株を高濃度のグルコースを含む馴化工程に置くことにより、その酵母細胞株のグルコース耐性を高めることができることが知られている（非特許文献４）。
【０００４】
さらに、流加培養により得られた醸造酵母細胞液を、嫌気条件下において、糖および酵母エキスの存在下でインキュベートすることを含んでなる、醸造酵母の馴化方法が知られている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−２１６８８８号公報
【特許文献２】特開２０１６−１３１５１２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hiroki Fujiwara et al., MBAA Annual Conference 2014 "Development of the Fed-batch Culture of Brewing Yeast" Master Brewers Association of the Americas
【非特許文献２】Gerald Reed et al., Yeast Technology, p.283
【非特許文献３】A. H. Rose et al., The Yeast, p.387
【非特許文献４】William D. Gray, Journal of Bacteriology, vol.52, pp.703-709, 1946
【発明の概要】
【０００７】
しかしながら、流加培養した醸造酵母を用いてビール等の発酵をおこなった場合の初回発酵液は、発酵タンクから回収した醸造酵母（連用酵母）による発酵液と比較して、酸味および渋味が強いという特徴がみられる。このような特徴は、官能評価において酸味および渋味の不調和感として認識され、連用酵母と比較して好ましくない香味を呈している。したがって、本発明は、酸味および渋味の不調和感が抑えられた好ましい香味を呈する発酵液を生産する醸造酵母を得ることができる、醸造酵母の馴化方法を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明者らは、流加培養により得られた醸造酵母細胞液を、糖、窒素源、ミネラル源およびビタミン源の存在下においてインキュベートするにあたり、醸造酵母細胞液中の糖濃度を０．０１〜５０°Ｐの範囲内に維持するとともに、好気条件下においてインキュベートすることにより、酸味および渋味の不調和感が抑えられ、好ましい香味を呈する発酵液を生産する醸造酵母が得られることを見いだした。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００９】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）醸造酵母を馴化する方法であって、醸造酵母細胞液を、好気条件下、糖、窒素源、ミネラル源およびビタミン源の存在下においてインキュベートすることを含んでなり、該醸造酵母細胞液中の糖濃度が０．０１〜５０°Ｐの範囲内に維持される、方法。
（２）前記醸造酵母細胞液が好気条件下における流加培養法によって得られたものであり、かつ、前記醸造酵母細胞液の馴化開始時の細胞濃度が３×１０８細胞／ｍｌ以上１０×１０８細胞／ｍｌ以下である、（１）に記載の方法。
（３）インキュベートの温度条件が、醸造酵母細胞液を調製する際の培養温度を上限とし、発酵アルコール飲料を製造する際の発酵温度よりも２℃低い温度を下限とする範囲内である、（１）または（２）に記載の方法。
（４）インキュベートの温度条件が５℃〜３０℃である、（１）または（２）に記載の方法。
（５）インキュベート時間が１６時間以上である、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記醸造酵母細胞液中の醸造酵母の細胞濃度が１．０５倍以上に増加することを特徴とする、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の方法によって馴化された、醸造酵母。
（８）発酵アルコール飲料の醸造に適した醸造酵母を製造する方法であって、醸造酵母細胞液を、好気条件下において、糖、窒素源、ミネラル源およびビタミン源の存在下においてインキュベートすることを含んでなり、該醸造酵母細胞液中の糖濃度が０．０１〜５０°Ｐの範囲内に維持される、方法。
（９）（７）に記載の醸造酵母を用いて発酵前液を発酵させる工程を含んでなる、発酵アルコール飲料の製造方法。
（１０）前記醸造酵母がビール酵母であり、製造される発酵アルコール飲料がビールテイスト発酵アルコール飲料である、（９）に記載の製造方法。
【００１０】
本発明による流加培養により得られた醸造酵母の馴化方法は、その酵母による初回の発酵液において酸味および渋味の不調和感が抑えられ、好ましい香味を呈するビール等の発酵飲料の製造を可能とする酵母を提供できる点で有利である。また、醸造酵母の流加培養法とあいまって、多品種小規模醸造における醸造酵母の効率的な調製を可能にする点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、連用酵母、馴化無し、および半好気馴化後（馴化開始時の細胞濃度＝８.３７×１０８細胞／ｍｌ）の３種の醸造酵母を用いて小スケール発酵試験を行った際の初回発酵液のコハク酸濃度（ｍｇ／ｌ）を示す。
【図２】図２は、連用酵母、馴化無し、および半好気馴化後（馴化開始時の細胞濃度＝８.３７×１０８細胞／ｍｌ）の３種の醸造酵母を用いて小スケール発酵試験を行った際の初回発酵液の糖消費量あたりのコハク酸生成量［（ｍｇ／ｌ）／°Ｐ］を示す。
【図３】図３は、連用酵母、馴化無し、および半好気馴化後（馴化開始時の細胞濃度＝５.１２×１０８細胞／ｍｌ）の３種の醸造酵母を用いて小スケール発酵試験を行った際の初回発酵液のコハク酸濃度（ｍｇ／ｌ）を示す。
【図４】図４は、連用酵母、馴化無し、および半好気馴化後（馴化開始時の細胞濃度＝５.１２×１０８細胞／ｍｌ）の３種の醸造酵母を用いて小スケール発酵試験を行った際の初回発酵液の糖消費量あたりのコハク酸生成量［（ｍｇ／ｌ）／°Ｐ］を示す。
【図５】図５は、連用酵母、馴化無し、および半好気馴化後（馴化開始時の細胞濃度＝８.３７×１０８細胞／ｍｌ）の３種の醸造酵母を用いてミニプラント発酵試験を行った際の初回発酵液のコハク酸濃度（ｍｇ／ｌ）を示す。
【図６】図６は、連用酵母、馴化無し、および半好気馴化後（馴化開始時の細胞濃度＝８.３７×１０８細胞／ｍｌ）の３種の醸造酵母を用いてミニプラント発酵試験を行った際の初回発酵液の糖消費量あたりのコハク酸生成量［（ｍｇ／ｌ）／°Ｐ］を示す。
【発明の具体的説明】
【００１２】
定義
本発明において「醸造酵母」とは、発酵を利用した発酵アルコール飲料や液体調味料の製造に用いられる酵母をいう。それぞれの発酵アルコール飲料の製造工程において発酵前液の発酵に用いられる様々な酵母が知られており、本発明の馴化方法で調製することができる。醸造酵母としては、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ウイスキー酵母およびビール酵母などが挙げられ、本発明の馴化方法で調製することができる。「ビール酵母」とは、醸造酵母の一種であり、ビールなどのビールテイスト発酵アルコール飲料の製造に用いられる酵母をいう。ビール酵母は、サッカロミセス属に属する上面発酵酵母（Saccharomyces cerevisiae）または下面発酵酵母（Saccharomyces pastorianus）であり、アルコール生成能などを指標に選択され、育種されてきた酵母である。
【００１３】
本発明において「馴化」とは、異なる環境に移した結果、次第になれて、その環境に適応した性質を持つようになることをいう。
【００１４】
本発明において、糖濃度の単位として使用する「°Ｐ」は、°Ｐｌａｔｏ（プラトー）とも記載され、液中のエキス分をショ糖に換算した場合の重量（ｗ／ｗ）％である。細胞培養液の糖濃度（°Ｐ）は、例えば振動式密度計やサッカロメーター（浮標式糖度計）により測定することができる。
【００１５】
醸造酵母の馴化方法
本発明における馴化処理は、醸造酵母細胞液を、好気条件において、糖、窒素源、ミネラル源およびビタミン源の存在下においてインキュベートすることを含んでなり、該醸造酵母細胞液中の糖濃度を０．０１〜５０°Ｐの範囲内に維持することを特徴とする。この特徴により、本発明の馴化方法で処理された醸造酵母による初回発酵液は、酸味および渋味の不調和感が抑えられ、好ましい香味を呈する。
【００１６】
本発明における醸造酵母は、公知・市販のものを利用することができる。醸造酵母は好ましくはビール酵母である。
【００１７】
本発明における醸造酵母細胞液は、公知の醸造酵母を好気条件の下で公知の流加培養法などを用いて調製することができる。ここで、「流加培養」とは、半回分培養ともよばれ、培養系に培地成分を供給しながら細胞を培養することをいう。醸造酵母を調製する際の培養温度は、好ましくは２０℃〜３０℃である。馴化処理に用いる醸造酵母細胞液の馴化開始時の細胞濃度は当業者が自由に設定できるものであるが、好ましくは３×１０８細胞／ｍｌ以上１０×１０８細胞／ｍｌ以下の細胞濃度において、より好ましくは３×１０８細胞／ｍｌ以上８×１０８細胞／ｍｌ以下の細胞濃度において、さらに好ましくは５×１０８細胞／ｍｌ以上８×１０８細胞／ｍｌ以下の細胞濃度において、期待される馴化の効果が得られる。
【００１８】
本発明の馴化方法における好気条件とは、醸造酵母細胞液中の溶存酸素が０ｍｇ／ｌよりも高い濃度に維持される条件をいう。かかる好気条件は、醸造酵母細胞液へ適度に通気を行い、および／または醸造酵母細胞液を適度に攪拌することによって達成できる。好ましくは、流加培養法により調製した醸造酵母細胞液をジャーファーメンター内で通気量１〜２ｖｖｍ、攪拌速度８００ｒｐｍの条件でインキュベートすることにより達成できる。
【００１９】
本発明の馴化方法における糖としては、酵母が資化しうる糖類、例えばぶどう糖、果糖、麦芽糖、およびこれらの混合物などを用いることができ、好ましくはぶどう糖と果糖の混合物が用いられる。これらの糖は、固体であっても、液体（液糖）であってもよい。
【００２０】
本発明の馴化方法においては、好気条件下において醸造酵母の細胞増殖が起るように、醸造酵母細胞液中の糖濃度は０．０１〜５０°Ｐの範囲内に維持されるが、好ましくは０．０５〜４０°Ｐ、より好ましくは０．０７５〜３０°Ｐ、さらに好ましくは０．１〜２５°Ｐ、さらに好ましくは２〜１５°Ｐ、さらに好ましくは３〜１０°Ｐ、さらに好ましくは４〜６°Ｐ、最も好ましくは５°Ｐ付近に維持される。醸造酵母細胞液中の糖濃度を一定範囲に維持するためには、当業者にとって周知の手法、例えば、該醸造酵母細胞液を経時的にサンプリングし、その糖濃度（°Ｐ）を測定し、その測定結果に基づいて、糖の流加速度を調節することにより達成できる。
【００２１】
以上のように、本発明の馴化方法は、醸造酵母を、好気条件の下で、高糖濃度を維持しながらインキュベーションを行うため、本明細書において半好気馴化と表現することもある。
【００２２】
本発明の馴化方法における窒素源としては、酵母が資化しうる含窒素化合物（含窒素組成物）、例えば、酵母エキス、ペプトン、ポテトエキスおよびこれらの混合物などを用いることができ、好ましくは酵母エキスが用いられる。これらは、食品製造に適しているものであればいずれも使用することができる。その形態も、水性溶媒に容易に溶解するものであればよく、液状、粉末状、固形状などのいかなる形態のものであってもよい。
【００２３】
窒素源として酵母エキスを用いる場合は、市販のものを利用することができる。酵母エキスとしては、ビール酵母由来のもの、パン酵母由来のもののいずれも好ましく用いることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、酵母エキスの添加量は１〜８％（ｗ／ｖ）、すなわち、インキュベートされる醸造酵母細胞液の全量に対して１〜８％（ｗ／ｖ）とされる。酵母エキスの添加手順には、一度に必要全量を添加する一括添加と複数回に分けて添加する分割添加の双方があるが、上述の酵母エキスの添加量を満足する限りにおいてはどちらの添加方法でもよい。
【００２４】
本発明の馴化方法におけるミネラル源、ビタミン源としては、当業者の技術常識に従い、酵母の細胞増殖に必要なミネラル類、ビタミン類であって、食品製造に適しているものであれば使用することができる。また、前述の窒素源（例えば、酵母エキス）に含有されているミネラル類、ビタミン類を適宜用いることもできる。
【００２５】
本発明の馴化方法におけるインキュベートとは、対象物を所定の温度に保つことをいう。本発明においてインキュベートの温度条件（馴化温度）は、好ましくは醸造酵母細胞液を調製する際の培養温度を上限とし、発酵アルコール飲料を製造する際の発酵温度より２℃低い温度を下限とした範囲内であり、より好ましくは５℃〜３０℃、さらに好ましくは１０℃〜２０℃である。
【００２６】
本発明の馴化方法においてインキュベート時間（馴化時間）は、処理中の酵母の性状、特に細胞増殖の状況を定期的に確認することにより決定することができる。具体的な時間は特に限定されないが、好ましくは１６時間以上、より好ましくは２２時間以上である。また、インキュベート時間の上限は特に限定されないが、好ましくは４８時間とされる。
【００２７】
本発明の馴化方法により得られた醸造酵母細胞液中の醸造酵母の細胞濃度は、馴化処理前と比較して、１．０５倍以上増加することが好ましく、１．０８倍以上に増加することがより好ましく、１．１０倍以上に増加することがさらにより好ましい。
【００２８】
本発明は、発酵アルコール飲料の製造工程における発酵前液の発酵に用いる醸造酵母を得るための醸造酵母の馴化方法に関するものである。醸造酵母は、例えば、ビール酵母、ワイン酵母、焼酎酵母、またはウイスキー酵母とすることができる。
【００２９】
本発明の馴化方法によれば、発酵アルコール飲料の醸造に適した酵母を製造することができる。従って、本発明の他の態様によれば、上述の馴化方法の工程を含む、発酵アルコール飲料の醸造に適した醸造酵母の製造方法が提供される。
【００３０】
本発明の馴化方法により馴化された醸造酵母は、発酵アルコール飲料の製造に好適に用いられる。よって、本発明の他の態様によれば、本発明の馴化方法により馴化された醸造酵母を用いて発酵前液を発酵させる工程を含んでなる、発酵アルコール飲料の製造方法が提供される。この方法は、好ましくは本発明の馴化方法により醸造酵母を調製する工程をさらに含む。また、この方法により製造される発酵アルコール飲料もまた、本発明の一つの態様をなす。ここで「発酵アルコール飲料」とは、酒類を意味し、日本酒、焼酎、みりん、ビールテイスト発酵アルコール飲料、ワインなどの果実酒類、ウイスキー類、スピリッツ類およびリキュール類などが挙げられる。本発明において発酵アルコール飲料は、炭素源、窒素源、および水などを原料として酵母により発酵させて得たアルコールを含むアルコール飲料である。発酵アルコール飲料の製造方法は当業者に周知であり、公知の製法に従って製造することができる。この発酵アルコール飲料を製造する際の発酵温度は、好ましくは５℃〜３０℃であり、より好ましくは１０℃〜２０℃である。
【００３１】
本発明の好ましい実施態様によれば、上記の発酵アルコール飲料の製造方法において、醸造酵母はビール酵母とされ、製造される発酵アルコール飲料はビールテイスト発酵アルコール飲料とされる。よって、本発明の他の態様によれば、本発明の馴化方法により馴化されたビール酵母を用いて発酵前液を発酵させる工程を含んでなる、ビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法が提供される。この方法は、好ましくは本発明の馴化方法によりビール酵母を調製する工程をさらに含む。また、この方法により製造されるビールテイスト発酵アルコール飲料もまた、本発明の一つの態様をなす。本発明において「ビールテイスト発酵アルコール飲料」とは、炭素源、窒素源、および水などを原料として酵母により発酵させた飲料であって、ビール風味を有するアルコール飲料を意味する。「ビールテイスト発酵アルコール飲料」としては、原料として麦および麦芽を使用しないビールテイスト発酵飲料（例えば、酒税法上、「その他の醸造酒（発泡性）（１）」に分類される飲料）や、原料として麦芽を使用するビール、発泡酒、リキュール（例えば、酒税法上、「リキュール（発泡性）（１）」に分類される飲料）が挙げられる。
【００３２】
ビールテイスト発酵アルコール飲料の製造方法は当業者に周知であり、公知の製法に従って実施することができる。例えば、麦および麦芽を原料として使用しないビールテイスト発酵アルコール飲料は、少なくとも水および液糖から調製された発酵前液を発酵させることにより製造することができる。すなわち、水および液糖から調製された発酵前液（仕込液）に本発明の馴化方法により得られた発酵用ビール酵母を添加して発酵を行い、得られた発酵液（酒下し液）を、所望により低温にて貯蔵した後、ろ過工程により酵母を除去することにより、ビールテイスト発酵アルコール飲料を製造することができる。また、麦芽を原料として使用するビールテイスト発酵アルコール飲料は、少なくとも水および麦芽から調製された発酵前液（麦汁）を発酵させることにより製造することができる。すなわち、水および麦芽から調製された発酵前液（麦汁）に本発明の馴化方法により得られた発酵用ビール酵母を添加して発酵を行い、得られた発酵液（酒下し液）を、所望により低温にて貯蔵した後、ろ過工程により酵母を除去することにより、ビールテイスト発酵アルコール飲料を製造することができる。いずれの製造方法においても、酒税法等の規定に従って、炭素源および窒素源として麦、米、とうもろこし、でんぷん等の副原料を添加することができる。また、同様に、ホップ、香料、着色料（カラメル）、水質調整剤、発酵助成剤等のその他の添加物等を添加することができる。このビールテイスト発酵アルコール飲料を製造する際の発酵温度は、好ましくは１０℃〜２０℃である。
【実施例】
【００３３】
以下の例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００３４】
参考例１．流加培養酵母による初回発酵液の香味評価
（１）流加培養による醸造酵母細胞液の調製
特開２０１５−２１６８８８号公報に記載された方法により、流加培養による醸造酵母細胞液の調製を行った。
【００３５】
（２）発酵試験
（１）で得られた醸造酵母、および連用酵母を用いて、発酵試験は、麦汁に対して酵母細胞濃度が１０×１０６細胞／ｍｌとなるように添加し、温度を１２℃一定にて実施した。初回発酵液をサンプリングした。
【００３６】
（３）官能評価
（２）で得られた初回発酵液の官能評価を行った。官能評価の評価項目として、苦味不調和、酸味不調和、甘味不調和、渋味不調和、後味不調和、その他異味の６つの項目を設定した。それぞれの評価項目について、３：とても気になる２：気になる、１：やや気になる、０：気にならない、の４段階で評価した。官能評価は、訓練された１１名のパネルによって実施した。
【００３７】
（４）結果
表１に（３）の官能評価の結果を示す。表中の点数は、各パネラーの評点の合計をパネラー数で除した値である。
【００３８】
【表１】
2019103470.tif 000002
【００３９】
表１に示された通り、流加培養酵母による初回発酵液は連用酵母と比較して酸味と渋味の不調和を強く感じるとの結果が得られた。
【００４０】
（５）指標物質の設定
酸味と渋味の不調和の指標となる物質を探索するために、醸造酵母３株の連用酵母と流加培養酵母を用いて発酵試験を行った。発酵試験は、麦汁に対して酵母細胞濃度が１０×１０６細胞／ｍｌとなるように添加し、温度を１２℃一定にて実施した。各株とも初回発酵液の酒下し分析値を比較したところ、以下の表２に示すとおり、流加培養酵母サンプルは３株全てにおいて、連用酵母と比較してコハク酸濃度が高いことが明らかになった。一方、渋みに関わることが知られているポリフェノール、タンノイド等を含むその他の分析値項目については３株に共通した差異が見られなかった。そこで、コハク酸を渋味の指標物質として設定し、以下の検討に用いた。
【００４１】
【表２】
2019103470.tif 000003
【００４２】
実施例１：半好気馴化による初回発酵液の分析値への影響（その１：小スケール発酵試験）
（１）流加培養による醸造酵母細胞液の調製
初発培地および流加培地を、それぞれ以下の表３に従って調製した。
【００４３】
【表３】
2019103470.tif 000004
【００４４】
なお、異性化液糖としては、日本食品化工社製の異性化液糖フジフラクトＦ-１００を用い、パン酵母エキスとしては、ＭＣフードスペシャリティーズ社製の酵母エキスを用いた。各培地は、塩酸水を用いてｐＨを４．２に調整した。また、培養中の培養液については、該培養液のｐＨのモニタリング結果に基づき、１２．５％のアンモニア水を用いてｐＨを４．２に調節し維持した。
【００４５】
まず、ジャー中の初発培地に醸造酵母として醸造酵母Ａ株を接種し、培養は、２０℃、攪拌（８００ｒｐｍ）および通気（１〜２ｖｖｍ）の条件下で行なった。また、流加培養は、連続流加培養とし、醸造酵母Ａ株に固有の比増殖速度および対糖収率を実験的に求め、株式会社丸菱バイオエンジニアリング社製のＦｅｒｍＥｘｐｅｒｔを用いて、酵母増殖に必要十分量の資化性糖を指数的に流加した。
【００４６】
（２）醸造酵母の半好気馴化
（１）で得られた醸造酵母細胞液を、ジャーファーメンター内で通気量を１〜２ｖｖｍに設定し、８００ｒｐｍにて攪拌しながら、初発濃度として４％（ｗ／ｖ）となるようにパン酵母エキスを添加し、初発濃度として５°Ｐとなるように異性化液糖Ｆ−１００を添加した。その後、当該細胞液中の糖濃度が５°Ｐを維持するように糖の流加速度を調整しながら、添加した異性化液糖の積算総量が馴化開始時の醸造酵母１０６細胞あたり０．２５ｍｇに到達するまで、異性化液糖Ｆ−１００を連続的に流加した。その間、ジャーファーメンターを２０℃に維持して、１６時間インキュベーションした。馴化開始時点における当該細胞液中の醸造酵母Ａ株の細胞濃度は８.３７×１０８細胞／ｍｌであったが、馴化中に細胞増殖が認められ、馴化終了時には９.２２×１０８細胞／ｍｌとなった。その後、遠心分離機で酵母細胞液から培養上清を取り除き、醸造酵母を回収した。
【００４７】
（３）小スケール発酵試験
発酵試験は、（１）および（２）で得られた醸造酵母、連用酵母を用いて、麦汁（５００ｍｌ）に対して酵母Ａ株の細胞濃度が１０×１０６細胞／ｍｌとなるように添加し、温度を１２℃一定にて実施した。
【００４８】
（４）発酵液の分析
（３）の発酵試験の初回発酵液をサンプリングし、コハク酸濃度を測定した。
【００４９】
（５）結果
小スケール発酵試験で得られた初回発酵液の分析試験の結果は図１および図２に示される通りであった。本発明の半好気馴化の初回発酵液（（２）で得られた醸造酵母を使用）は、馴化無しの初回発酵液（（１）で得られた醸造酵母を使用）と比較して、酒下しコハク酸濃度が低下しており（図１）、糖消費あたりコハク酸生成量が低下している（図２）ことから、醸造酵母Ａ株のコハク酸生成能を低減できていることが明らかとなった。さらに、この事象は、馴化中に細胞増殖が起こることに起因するものと考えられた。とすると、細胞濃度が高過ぎると酵母の細胞増殖が制限されるため、一定の範囲の細胞濃度での馴化が望ましいと考えられた。また、馴化により糖消費速度も改善しており（データ未掲載）、酵母活性も向上していることが明らかとなった。
【００５０】
実施例２：半好気馴化による初回発酵液の分析値への影響（その２：馴化開始時における醸造酵母の細胞濃度の影響の検討）
（１）醸造酵母の半好気馴化
実施例１（１）で得られた醸造酵母細胞液を、ジャーファーメンター内で通気量を２ｖｖｍに設定し、８００ｒｐｍにて攪拌しながら、初発濃度として６％（ｗ／ｖ）となるようにパン酵母エキスを添加し、初発濃度として５°Ｐとなるように異性化液糖Ｆ−１００を添加した。その後、当該細胞液中の糖濃度が５°Ｐを維持するように糖の流加速度を調整しながら、添加した異性化液糖の積算総量が馴化開始時の醸造酵母１０６細胞あたり０．３７ｍｇに到達するまで、異性化液糖Ｆ−１００を連続的に流加した。その間、ジャーファーメンターを２０℃に維持して、１６時間インキュベーションした。馴化開始時点における当該細胞液中の醸造酵母Ａ株の細胞濃度は５.１２×１０８細胞／ｍｌであったが、馴化中に細胞増殖が認められ、馴化終了時には５.８１×１０８細胞／ｍｌとなった。その後、遠心分離機で酵母細胞液から培養上清を取り除き、醸造酵母を回収した。
【００５１】
（２）小スケール発酵試験
発酵試験は、実施例１（１）および実施例２（１）で得られた醸造酵母、並びに連用酵母を用いて、麦汁（５００ｍｌ）に対して酵母Ａ株の細胞濃度が１２×１０６細胞／ｍｌとなるように添加し、温度を１２℃一定にて実施した。
【００５２】
（３）発酵液の分析
（２）の発酵試験の初回発酵液をサンプリングし、コハク酸濃度を測定した。
【００５３】
（４）結果
小スケール発酵試験で得られた初回発酵液の分析試験の結果は図３および図４に示される通りであった。馴化開始時の細胞濃度が８.３７×１０８細胞／ｍｌの場合の結果（実施例１（５））と同様に、本発明の半好気馴化の初回発酵液（実施例２（１）で得られた醸造酵母を使用）は、馴化無しの初回発酵液（実施例１（１）で得られた醸造酵母を使用）と比較して、酒下しコハク酸濃度が低下しており（図３）、糖消費あたりコハク酸生成量が低下している（図４）ことから、醸造酵母Ａ株のコハク酸生成能を低減できていることが明らかとなった。さらに、実施例１（５）の結果および考察とあわせると、細胞濃度が３×１０８細胞／ｍｌ以上１０×１０８細胞／ｍｌ以下の範囲での馴化が望ましいと考えられた。
【００５４】
実施例３：半好気馴化による初回発酵液の分析値および香味評価への影響（その３：ミニプラント発酵試験）
（１）醸造酵母の半好気馴化
インキュベーション温度を１５℃とした以外は、実施例１（２）の方法に従って、実施例１（１）で得られた醸造酵母細胞液の半好気馴化を行った。
【００５５】
（２）ミニプラント発酵試験
発酵試験は、実施例１（１）および実施例３（１）で得られた醸造酵母、並びに連用酵母を用いて、ミニプラントに仕込まれた麦汁（２００Ｌ）に対して酵母細胞Ａ株の細胞濃度が１０×１０６細胞／ｍｌとなるように添加し、温度を１２℃一定にて実施した。
【００５６】
（３）発酵液の分析
（２）の発酵試験の初回発酵液をサンプリングし、コハク酸濃度を測定した。
【００５７】
（４）発酵液の官能評価
（２）の発酵試験の初回発酵液をサンプリングし、官能評価に供した。官能評価の手法は、参考例１の「（３）官能評価」に記載された方法に従って実施した。
【００５８】
（５）結果
ミニプラント発酵試験で得られた初回発酵液の分析試験の結果は図５および図６に示される通りであった。小スケール発酵試験結果と同様に、ミニプラント発酵試験においても、本発明の半好気馴化の初回発酵液（実施例３（１）で得られた醸造酵母を使用）は、馴化無しの初回発酵液（実施例１（１）で得られた醸造酵母を使用）と比較して、酒下しコハク酸濃度が低下しており（図５）、糖消費あたりコハク酸生成量が低下している（図６）ことから、醸造酵母Ａ株のコハク酸生成能を低減できていることが明らかとなった。
【００５９】
ミニプラント発酵試験で得られた初回発酵液の官能評価の結果は、以下の表４の通りであった。
【００６０】
【表４】
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【００６１】
表４に示される通り、馴化無しの流加培養酵母による試醸品において指摘のあった酸味不調和・渋味不調和の評価は、半好気馴化を行った醸造酵母による試醸品（実施例３（１）で得られた醸造酵母を使用）ではほとんど指摘が無く、コントロールとして試験した連用酵母と同等の評価であった。したがって、半好気馴化を行うことで、馴化無しの流加培養酵母による初回発酵液の特徴であった「酸味、渋みの不調和感」を改善できることが明らかとなった。さらに、本試醸品を試飲評価した結果、全体の香味バランスにおいても、連用酵母とほぼ同等であると評価された。
【００６２】
これらの事より、半好気馴化を行うことで、流加培養酵母のコハク酸生成能を低減し、製品の酸味、渋味の不調和を低減することができることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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