(57)【要約】      （修正有）【課題】腸内細菌アッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用組成物、並びに該組成物を含む食品、医薬品、及び飼料の提供。【解決手段】スレオニン及び／又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合したシアリル糖ペプチド（ＳＧＰ）を含み、前記糖ペプチドの分子量が５００以上３，０００以下であり、前記糖鎖が前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、前記糖鎖の構成糖がシアル酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びガラクトースからなる群から選択される１つ以上である、アッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。ＳＧＰを有効成分とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飲食品、医薬品、及び飼料。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スレオニン及び／又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合したシアリル糖ペプチドを含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物であって、
前記糖ペプチドの分子量が５００以上３，０００以下であり、
前記糖鎖が前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、
前記糖鎖の構成糖がシアル酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びガラクトースからなる群から選択される１つ以上であることを特徴とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
【請求項２】
前記シアリル糖ペプチドの糖鎖がシアル酸及びガラクト−Ｎ−ビオースからなるものである請求項１に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
【請求項３】
前記シアル酸と前記ガラクト−Ｎ−ビオースのモル比が１：１〜２：１である請求項２に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
【請求項４】
前記シアリル糖ペプチドのペプチド鎖のアミノ酸残基数が１以上１３以下である請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
【請求項５】
スレオニン及び／又はセリン残基を有し当該残基の水酸基に糖鎖が結合したシアリル糖ペプチド、を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物であって、
前記糖鎖が、以下の（１）〜（５）からなる群から選ばれる１つ以上であることを特徴とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
（１）Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（２）Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（３）Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
（４）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-Ac-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（５）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-diAc-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
【請求項６】
前記糖鎖が、前記（１）及び前記（２）〜（５）からなる群から選ばれる１つ以上である請求項５に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
【請求項７】
シアリル糖ペプチドが乳由来であることを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれか1項に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飲食品。
【請求項９】
請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用医薬品。
【請求項１０】
請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シアリル糖ペプチドを含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物、及び該組成物を含む飲食品、医薬品、飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、腸内細菌が宿主の代謝調節機能に重要な役割を担っていること、そして腸内細菌叢の破綻により宿主の代謝機能に異変が生じ、様々な疾患の原因となることが明らかにされつつある。したがって、健全な腸内細菌叢を保つことが宿主の健康維持に重要である。宿主によい効果をもたらす腸内細菌としては、ビフィドバクテリウム属菌やある種のラクトバチルス属菌などが知られており、それらをプロバイオティクスとして食品とともに摂取する、または腸内でそれらの増殖を促進する食品をプレバイオティクスとして摂取することが推奨されている。
【０００３】
一方、最近の腸内細菌研究からは、宿主の健康に寄与する新たな腸内細菌が報告されてきている。アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）は、ヒトの腸内細菌の１〜５％を占める細菌であり、宿主が消化管から分泌するムチンを分解・資化する特徴を有する（非特許文献１）。Clement K.らは、ヒト腸内におけるアッカーマンシア・ムシニフィラの量が、空腹時血糖値、血中インスリン値、およびウエスト周囲長と逆相関を示すことを報告している。すなわち、アッカーマンシア・ムシニフィラは、肥満、糖尿病、心疾患などの予防に効果的である可能性が示唆されている。また、マウスに高脂肪食を食べさせると肥満、腸管のバリア機能の低下、および脂肪組織の炎症マーカーが上昇、などの症状を呈するが、このとき盲腸内容物中のアッカーマンシア・ムシニフィラ量が低下することが報告されている。この高脂肪食のマウスに経口的に生きたアッカーマンシア・ムシニフィラを投与すると、脂肪量の増加、インスリン抵抗性、腸管バリア機能、脂肪組織の炎症などの代謝不全が改善された（非特許文献２）。
【０００４】
このように、腸管内でのアッカーマンシア・ムシニフィラ量が低下することは、腸の機能だけではなく全身の代謝機能を低下させることが明らかにされつつある。したがって現在では、腸内のアッカーマンシア・ムシニフィラを増加させるための様々な方法が検討されている。抗糖尿病薬として一般的に用いられているメトフォルミンの投与により、腸内のアッカーマンシア・ムシニフィラが増加することが報告され、アッカーマンシア・ムシニフィラ増加剤として期待されている。しかし、薬剤であることから既に糖尿病を発症している患者以外には適用することはできない。健康なヒト、または肥満気味なヒトなどが疾病予防を目的に食事として摂取できるアッカーマンシア・ムシニフィラ増加剤が期待されてきた。
【０００５】
κ−カゼイングリコマクロペプチド（以下、ＧＭＰと略記する）は糖ペプチドの一種で、牛乳タンパク質の８０〜８５％を占めるカゼインのうちで唯一の糖タンパク質であるκ−カゼインの糖鎖を含むＣ末端ペプチドであり、κ−カゼインの１０６−１６９残基に相当し、分子量は、約７，０００である。また、ＧＭＰは、グルタミン酸残基を多く持つほか、糖鎖中にシアル酸残基を持つなど、カルボキシ基に富んでいる。
ＧＭＰはこれまでに、胃から出るホルモン（ＣＣＫ：満腹ホルモン）の分泌促進を介した食欲抑制作用（非特許文献３）、脂肪細胞への直接的な作用による脂肪蓄積抑制作用（非特許文献４）、ビフィズス菌の増殖促進作用（非特許文献５）、感染防御作用（特許文献１）、カルシウム吸収促進剤（特許文献２）などが報告されているが、アッカーマンシア・ムシニフィラに対する作用について記載や示唆のある文献等は知られていない。同様にＧＭＰ等を加水分解して得られるシアリル糖ペプチド（以下、ＳＧＰと略記する）も、アッカーマンシア・ムシニフィラに対する作用はなんら検討されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第２６３１４７０号公報
【特許文献２】特許第３５７５７２４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Derrien M.ら, App. Enviroment. Microbiol. 2008, 74:1646-1648
【非特許文献２】Everard A.ら, PNAS, 110:9066-9071, 2013
【非特許文献３】Beucher S.ら, J Nutr Biochem, 5:578-584,1994
【非特許文献４】Xu SP.ら, J Dairy Sci, 94(2):676-683, 2011
【非特許文献５】Idota T.ら, Biosci Biotech Biochem, 58(9):1720-1722, 1994
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、従来にない新たなアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用組成物、及び該組成物を含む食品、医薬品、飼料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、腸内のアッカーマンシア・ムシニフィラを増加させる素材を鋭意検討した結果、ＧＭＰの分解物であるＳＧＰにアッカーマンシア・ムシニフィラを増加させる作用があることを見出し、本発明を完成させるに至った。また、換言すればＳＧＰのこれまでに報告されていない新たな用途を見出したことに基づく発明である。即ち本発明は以下の構成を有する。
〔１〕スレオニン及び／又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合したシアリル糖ペプチドを含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物であって、
前記糖ペプチドの分子量が５００以上３，０００以下であり、
前記糖鎖が前記ペプチドのスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、
前記糖鎖の構成糖がシアル酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びガラクトースからなる群から選択される１つ以上であることを特徴とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
〔２〕前記シアリル糖ペプチドの糖鎖がシアル酸及びガラクト−Ｎ−ビオースからなるものである〔１〕に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
〔３〕前記シアル酸と前記ガラクト−Ｎ−ビオースのモル比が１：１〜２：１である〔２〕に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
〔４〕前記シアリル糖ペプチドのペプチド鎖のアミノ酸残基数が１以上１３以下である〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
〔５〕スレオニン及び／又はセリン残基を有し当該残基の水酸基に糖鎖が結合したシアリル糖ペプチド、を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物であって、
前記糖鎖が、以下の（１）〜（５）からなる群から選ばれる１つ以上であることを特徴とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
（１）Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（２）Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（３）Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
（４）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-Ac-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（５）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-diAc-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
〔６〕前記糖鎖が、前記（１）及び前記（２）〜（５）からなる群から選ばれる１つ以上である〔５〕に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
〔７〕シアリル糖ペプチドが乳由来であることを特徴とする〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
〔８〕〔１〕〜〔７〕のいずれか１つに記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飲食品。
〔９〕〔１〕〜〔７〕のいずれか１つに記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用医薬品。
〔１０〕〔１〕〜〔７〕のいずれか１つに記載のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飼料。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、従来にない新たなアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用組成物、及び該組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用飲食品、医薬品、飼料を提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＳＧＰのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析結果を示すチャートである。
【図２】ＳＧＰ投与群とコントロール群のマウス盲腸内容物の総菌量を示すグラフである。
【図３】ＳＧＰ投与群とコントロール群のマウス盲腸内容物中のアッカーマンシア・ムシニフィラ量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のＳＧＰを有効成分として含むアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用組成物、及びＳＧＰを有効成分として含むアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用飲食品、医薬品、飼料について以下に詳細に説明する。
本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用組成物、及び該組成物を含む飲食品、医薬品、飼料について以下に詳細に説明する。
【００１３】
（シアリル糖ペプチド：ＳＧＰ）
本発明のＳＧＰは、スレオニン及び／又はセリン残基を有するペプチドに糖鎖が結合した糖ペプチドであって、分子量が５００以上であり、糖鎖がスレオニン又はセリン残基の水酸基に結合し、糖鎖の構成糖がシアル酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースから選択される１つ以上であるものを用いることができる。
本発明のＳＧＰは、糖鎖がシアル酸、およびガラクト−Ｎ−ビオース(Galβ1-3GalNAc)から成るものが好ましく、シアル酸とガラクト−Ｎ−ビオースのモル比が１：１〜２：１であるものが更に好ましい。また、本発明のＳＰＧはペプチド鎖が１アミノ酸残基以上１３アミノ酸残基以下程度のものを用いることができる。さらに、本発明のＳＰＧはアセチル化したシアル酸を含むものも用いることができる。
【００１４】
本願発明のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物の一態様として、スレオニン及び／又はセリン残基を有し当該水酸基に糖鎖が結合したシアリル糖ペプチドであって、前記糖鎖が、以下の（１）〜（５）からなる群から選ばれる１つ以上であることを特徴とするシアリル糖ペプチドを含む組成物が挙げられる。
（１）Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（２）Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（３）Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
（４）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-Ac-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（５）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-diAc-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
【００１５】
また、本願発明のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物のもうひとつの態様として、前記糖鎖が、下記（１）及び下記（２）〜（５）からなる群から選ばれる１つ以上の組み合わせであることを特徴とするシアリル糖ペプチドを含む組成物が挙げられる。
（１）Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（２）Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（３）Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα1
（４）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-Ac-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
（５）Neu5Acα2-3Galβ1-3(O-diAc-Neu5Acα2-6)GalNAcα1
【００１６】
本発明のＳＧＰは、ＧＭＰ等を酵素等で加水分解することにより得ることができる。
ＧＭＰはκ−カゼインの糖鎖を含むＣ末端ペプチドであり、牛乳の場合κ−カゼインの１０６−１６９残基に相当し、分子量は、約７，０００である。本発明のＳＧＰの原料となるＧＭＰは、牛乳以外にもヤギやヒツジなどの獣乳由来のホエイ中から得られるものであればどのようなものでも用いることができる。
また、本発明のＳＧＰは、微生物、植物、動物の臓器の抽出物を酵素などで加水分解することにより調製することもできる。さらに、化学的に合成されたもの、もしくは遺伝子組換え体で調製したものでもよい。
【００１７】
（ＳＧＰの製造方法）
本発明のＳＧＰの製造方法についてその一態様を示し説明する。
本発明のＳＧＰは、例えばＧＭＰを加水分解することにより得られるため、まず、ＧＭＰの製造方法の一態様について説明する。
ＧＭＰを含む組成物は、特許第２６７３８２８号、または特開平６−２５２９７号公報に記載の方法により調製することができる。すなわち、ＧＭＰを含有する乳質原料物質、例えばチーズホエー、ホエー蛋白質濃縮物、除蛋白質チーズホエー等を、まずｐＨ４未満に調整した後、分画分子量１０，０００〜５０，０００の膜を用い、限外濾過処理をして透過液を得、好ましくは再度、該透過膜をｐＨ４以上に調整した後、分画分子量５０，０００以下の膜を用いて脱塩し濃縮することによりＧＭＰを調整する方法が挙げられる。また、乳質ホエーをｐＨ６．０以上に調整し４０〜７９℃で加熱処理したものを膜処理に付して乳清たんぱく質を除去し、ＧＭＰを濃縮液側に回収し、得られた濃縮液をｐＨ５．５以下にした後、再び膜処理に供してＧＭＰを透過液側に回収することによりＧＭＰ含有量の高い組成物を調製する方法を挙げることができる。
得られた組成物中のＧＭＰ量は、例えば、特許文献２の実施例に示されるようなウレア−ＳＤＳ電気泳動法により分析することができる。
次に、このようにして得られるＧＭＰをエンド型プロテアーゼまたはエキソ型プロテアーゼで処理する工程と、前記工程で得られた処理物を分画分子量５００以上３，０００以下の限外ろ過に供する処理工程を経ることにより本発明のＳＧＰを製造することができる。      
糖ペプチド製造に用いるプロテアーゼの種類は、ペプチド結合を加水分解し、上記（シアリル糖ペプチド：ＳＧＰ）で記載したような分子量と糖鎖を有する糖ペプチドを得ることができるものであれば特に限定されるものではなく、１種類、又は複数のエンド型プロテアーゼ、エキソ型プロテアーゼを用いることができる。好ましくは、食品や医薬品の製造に使用可能な酵素がよく、アクチナーゼＥ（科研ファルマ）、アクチナーゼＡＳ（科研ファルマ）、ヌクレイシン（ＨＢＩ）、オリエンターゼＡＹ（ＨＢＩ）、スミチームＦＰ（新日本化学工業）、スミチームＳＰＰ−Ｇ（新日本化学工業）、プロテアーゼＡ（天野エンザイム）、ペプチダーゼＲ（天野エンザイム）などを単独、あるいは組み合わせて使用することができる。
【００１８】
（ＳＧＰのアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進作用の評価）
本発明のＳＧＰによるアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進作用は、ＳＧＰを投与した場合と非投与の場合における腸内または糞便中のアッカーマンシア・ムシニフィラの増加を比較し、非投与よりも投与の方が増加した場合に本発明の増加促進作用があると評価することができる。増加は増殖と同義で用いられる。アッカーマンシア・ムシニフィラの増加・増殖は菌の増加・増殖の評価に通常用いられる方法であればいずれでもよく、例えば、以下の実施例に記載した方法を挙げることができる。
【００１９】
（ＳＧＰを含む飲食品、医薬品、飼料）
本発明の上記製造方法により得られたＳＧＰ（あるいはＳＧＰを含む組成物）は、そのまま飲食品の原材料として用いることができ、ＳＧＰを含む組成物を添加すること以外は、各食品の定法により製造すれば良い。
したがって、本発明の有効量のＳＧＰはどのような飲食品に配合しても良く、飲食品の製造工程中に原料に添加しても良い。飲食品の例としては、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料、バター、マーガリンなどの乳製品、乳飲料、果汁飲料、清涼飲料などの飲料、ゼリー、キャンディー、プリン、マヨネーズなどの卵加工品、バターケーキなどの菓子・パン類、さらには、各種粉乳の他、乳幼児食品、栄養組成物などを挙げることができるが特に限定されるものではない。
このようにして製造された有効量のＳＧＰを含む飲食品は、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用飲食品として提供される。
【００２０】
本発明の上記製造方法により得られたＳＧＰ（あるいはＳＧＰを含む組成物）は、そのまま医薬品の原材料として用いることができ、ＳＧＰを含む組成物を添加すること以外は、錠剤、カプセル、粉末、シロップ等の定法により製造すれば良い。
したがって、本発明のＳＧＰを有効成分として含む医薬品の製剤化に際しては、製剤上許可されている賦型剤、安定剤、矯味剤などを適宜混合して製剤化するほか、ＳＧＰをそのまま乾燥して粉末剤、散剤として用いることもできる。また、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進作用を妨げない範囲で、賦型剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の薬剤を混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤などが可能である。
このようにして製造された有効量のＳＧＰを含む医薬品は、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用医薬品として提供される。
【００２１】
本発明の上記製造方法により得られたＳＧＰ（あるいはＳＧＰを含む組成物）は、そのまま飼料の原材料として用いることができ、ＳＧＰを含む組成物を添加すること以外は、飼料の定法により製造すれば良い。
したがって、本発明の有効量のＳＧＰは前記飲食品と同様にどのような飼料に配合しても良く、飼料の製造工程中に原料に添加しても良い。
このようにして製造された有効量のＳＧＰを含む飼料は、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用飼料として提供される。
【００２２】
（ＳＧＰの摂取量）
本発明のＳＧＰを飲食品、医薬品、飼料などの素材又はそれら素材の加工品に配合させてアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用組成物を製造する場合、配合割合は特に限定されず、製造の容易性や好ましい一日投与量にあわせて適宜調節すればよい。
一日投与量は、投与対象の症状、年齢などを考慮してそれぞれ個別に決定されるが、成人ヒトの場合、ＳＧＰを1日当り０．１ｇ以上を摂取すればよく、１ｇ以上が好ましく、１０ｇ以上がさらに好ましい。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】
〔実施例１〕本発明のＳＧＰの調製方法  
１．ＧＭＰの製造方法
ホエイタンパク質濃縮物（サンラクトＮ−２、太陽化学製）１ｋｇを５０℃の水５０Ｌに溶解し、濃塩酸によりｐＨ３．５に調整した。これを、分画分子量２０，０００の限外ろ過膜（ＧＲ６１ＰＰ、ＤＤＳ製）を用い、５０℃、圧力０．４ＭＰａ、平均透過液流速５２．４Ｌ／ｍ２・ｈにて限外ろ過を行なった。透過液量が４０Ｌに達した時点で濃縮液に５０℃の水４０Ｌを加え、連続して限外ろ過を行なった。以上の様にして連続運転を行い、透過液を１６０Ｌ得た。
得られた透過液に２５％苛性ソーダを加え、ｐＨ７．０とし、再度同じ条件、同じ限外ろ過膜で濃縮液が５Ｌになるまで限外ろ過を行い、脱塩濃縮した。続いて５０℃の水を加え、濃縮液量を常に１０Ｌに保ちながら、これまでと同じ条件、同じ限外ろ過膜でダイアフィルトレーションを行い、さらに脱塩した。このダイアフィルトレーションにより透過液量が８０Ｌに達した時点で濃縮液に水を加えるのをやめ、濃縮液量が２Ｌになるまで限外ろ過にて濃縮し、この濃縮液を乾燥し、ＧＭＰ５４ｇを得た。
【００２５】
２．ＳＧＰの製造方法
上記１．で得られたＧＭＰを用い、３０Ｋｇの５％ＧＭＰ溶液を調製した。これをエンド型プロテアーゼ（アクチナーゼＡＳ、科研ファルマ製）を添加して５０℃で６時間反応させた。これを、分画分子量１，０００の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行なった。濃縮液に水を加えて連続して限外ろ過を行なうことでダイアフィルトレーションを行ない、５倍の加水濃縮を行なった後に濃縮液画分を得た。この濃縮液を乾燥し、ＳＧＰ（１）２７１．７ｇを得た。
３．２種類の酵素を組合わせたＳＧＰの製造方法
上記１．で得られたＧＭＰを用い、３０Ｋｇの５％ＧＭＰ溶液を調製した。これをエンド型プロテアーゼ（オリエンターゼＡＹ、ＨＢＩ製）を添加して５０℃で４時間反応させた後、エキソ型プロテアーゼ（ペプチダーゼＲ、天野エンザイム製）を添加して３７℃で２時間反応した。これを、分画分子量１，０００の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行なった。濃縮液に水を加えて連続して限外ろ過を行なうことでダイアフィルトレーションを行ない、５倍の加水濃縮を行なった後に濃縮液画分を得た。この濃縮液を乾燥し、ＳＧＰ（２）を３１２．６ｇ得た。
【００２６】
〔実施例２〕ＳＧＰのシアリダーゼ処理
実施例１で調製したＳＧＰ（１）を２ｍＭ塩化カルシウムを含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で２０ｍｇ／ｍＬに調製し、それにシアリダーゼ（Clostridium perfringens由来：Ｓｉｇｍａ，Ｎ２８７６−２５ＵＮ）を１０Ｕ／ｍＬとなるように加え、３７℃で２０時間反応させた。酵素添加なしのブランクは、酵素を添加せずに同条件で反応させた。反応後は５分間ボイルすることで、反応を停止させた。得られた反応液は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供した。ＳＥＣ分析には、２本のＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＰＷ（東ソー）を装着したＬ−２０００（ＨＩＴＡＣＨＩ）システムを用い、ＵＶ２１４ｎｍの吸収を検出した。移動相として０．１％トリフルオロ酢酸を含む４０％アセトニトリル溶液を用い、流速０．３ｍｌ／ｍｉｎで１２０分間室温でアイソクラチック（isocratic）に溶出した。
ＳＥＣ分析の結果を図１に示す。７０分付近に大きなピークが認められたが、このピークは、酵素反応に用いた酢酸緩衝液である。
ＳＧＰの主要なピークは５０分から６０分の間に認められたが、これらはシアリダーゼ処理することで全体的に低分子側にシフトした。このことから、調製したＳＧＰ（１）の主体は、シアル酸を含有する化合物であることが明らかとなった。
【００２７】
〔実施例３〕ＳＧＰのＬＣ／ＭＳを用いた構造解析
ＬＣ／ＭＳ分析には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ＰａｒａｄｉｇｍＭＳ２（Michrom Bioresources）に接続したイオントラップ型質量分析計ＬＴＱ  Ｖｅｌｏｓ（Thermofisher scientific）を用い（ＬＣ−ＥＳＩ−ＩＴ  ＭＳ）、分離カラムとしてＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８（φ０．２ｍｍ×１５０ｍｍ，ジーエルサイエンス）を装着した。移動相には、０．１％のギ酸を含んだ２％アセトニトリル溶液（Ａ液）、および０．１％ギ酸を含んだ９０％アセトニトリル溶液（Ｂ液）を用いた。各ＳＧＰを５０％アセトニトリル−０．１％ギ酸溶液で１００μｇ／ｍＬに調製し、２５μＬをＨＰＬＣに導入した。移動相は２μＬ／ｍｉｎで通液し、試料導入後０分から９０分の間にＢ液の割合を０％から４５％まで直線的に増加させた。質量分析計は、ＭＳ測定（ｍ／ｚ４００−２０００，ポジティブモード）とＭＳ／ＭＳ測定を行った。
ＭＳ／ＭＳ測定は、ＭＳのうち強度の高い順に５つのイオンを自動的にプレカーサーイオンとして選択し、コリジョンエネルギー３５Ｖで破壊して生じたプロダクトイオンのｍ／ｚを観測した。プレカーサーイオンとプロダクトイオンのｍ／ｚの差が２９２であるものをＮｅｕ５Ａｃ、３３４をＮ，Ｏ−ジアセチルノイラミン酸（O-Ac-Neu5Ac）、３７６をＮ，Ｏ，Ｏ−トリアセチルノイラミン酸（O,O-diAc-Neu5Ac）、２０３をＧａｌＮＡｃ、１６２をＧａｌと帰属し、プロダクトイオンのパターンから糖鎖構造を決定した。糖鎖が完全に解離したと思われるイオンのｍ／ｚをペプチドにプロトンが付加したイオンに由来すると推定し、そのｍ／ｚに相当するペプチド配列をＧＭＰの配列中から探索することで、糖ペプチドの構造を推定した。
実施例１で調製したＳＧＰ（１）について、ＬＣ／ＭＳ分析で得られたＭＳスペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルから、ＳＧＰに含まれる糖ペプチドの糖鎖構造を推定した。
表１に、ＬＣ／ＭＳ分析で検出した糖ペプチドの糖鎖構造を示す。その結果、検出したいずれの糖ペプチドもシアル酸を含む糖鎖が結合したペプチドであった。検出した多くの糖ペプチドがシアル酸を２分子結合したNeu5Acα1-3Galβ1-3(Neu5Acα1-6)GalNAcの糖鎖構造（Glycan type 3, 4, 5, 6, 7）を有していたが、シアル酸が１分子であるNeu5Acα1-3Galβ1-3GalNAc（Glycan type 1）やGalβ1-3(Neu5Acα1-6)GalNAc（Glycan type 2）も検出された。さらに、シアル酸のＯ−アセチル体であるＮ，Ｏ−ジアセチルノイラミン酸（O-Ac-Neu5Ac、Glycantype 4）、およびＮ，Ｏ，Ｏ−トリアセチルノイラミン酸（O- diAc-Neu5Ac、Glycan type 5）も検出された。、また、一つのペプチド鎖に2本の糖鎖が結合した糖ペプチド（Glycan type 6, 7）も検出された。
ＭＳ／ＭＳスペクトル解析から検出したペプチド鎖は、いずれもウシのグリコマクロペプチドに含まれるペプチド鎖であった。検出した全ての糖ペプチドにはセリンまたはスレオニン残基が1分子以上存在し、ペプチド鎖長は最も短いもので１残基、最も長いもので１３残基であった。また、検出したペプチド鎖の分子量は、７４５から２９２８の範囲であった。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
〔実施例４〕ＳＧＰの構成糖と存在比
ＳＧＰは糖鎖とペプチド鎖から成るが、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加作用にはＳＧＰ中の糖鎖の構成糖とその存在比率が重要と考えられる。
実施例３で示したように、ＳＧＰの糖鎖は、シアル酸、およびガラクト−Ｎ−ビオース（Galb1-3GalNAc）から成ることが明らかとなった。よって、次にＳＧＰ中のシアル酸とガラクト-Ｎ-ビオースのそれぞれの量を測定し、これらの存在比を調べた。
実施例１で調製したＳＧＰ中のシアル酸量は、以下に記載した方法で測定した。すなわち、シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）量を測定するために、ねじ口試験管に１００μＬのサンプル溶液、８００μＬの水、および１００μＬの１Ｎ硫酸溶液を添加し、ブロックヒーターを用いて８０℃で４５分間、加熱した。冷却後、等量の１００ｍＭの水酸化ナトリウムで中和した後、０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去した。得られた反応液中の糖含量は、Carbopak PA1カラムを装着したDIONEX ICS-5000DPシステムを用いて測定した。
実施例１で調製したＳＧＰからガラクト−Ｎ−ビオースを遊離させるために、まず実施例２に記載した方法でＳＧＰをシアリダーゼ処理した。シアリダーゼ処理後のＳＧＰは、引き続きＯ−グルカナーゼ（エンド−a−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ）処理することで、ＳＧＰからガラクト−Ｎ−ビオースを遊離させた。遊離したガラクト−Ｎ−ビオースは、Carbopak PA1カラムを装着したDIONEX ICS-5000DPシステムを用いて測定した。
シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）とガラクト−Ｎ−ビオースのモル比は、実施例１で調製したＳＧＰ（１）が１．８６：１、ＳＧＰ（２）が１．６７：１であった
【００３０】
〔試験例１〕
マウスに通常餌（コントロール）、実施例１で調製したＳＧＰ（１）を１０％添加した餌を３週間摂取させた。摂取期間終了後に盲腸内容物を採取し、ＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡから総菌量とアッカーマンシア・ムシニフィラ量を測定するために、リボゾームＲＮＡ遺伝子をターゲットとした定量的ＰＣＲを行なった。ヒトにおける難消化性成分の主な発酵部位は大腸でありアッカーマンシア・ムシニフィラも大腸に存在するが、マウスでの主な発酵部位は盲腸であるため、この試験では盲腸内容物について測定した。したがって、実験結果は盲腸内容物中の総菌量、及びアッカーマンシア・ムシニフィラ量を示すが、これらの結果が盲腸での作用に限定するわけではなく、ヒトでの主な発酵部位である大腸における大腸内容物または糞便中の総菌量、及びアッカーマンシア・ムシニフィラ量に置き換えることができる。
総菌量はＣｏｎｔｒｏｌ群に比べてＳＧＰを１０％添加した餌を摂取したＳＧＰ群で有意に増加した（図２）。
また、アッカーマンシア・ムシニフィラ量は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べて、ＳＧＰ群で顕著に増加した（図３）。ＳＧＰ群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群よりも約１，０００倍多いアッカーマンシア・ムシニフィラが検出された。
これらの結果から、ＳＧＰは腸内のアッカーマンシア・ムシニフィラが増加させる作用を有していることが明らかとなった。
【００３１】
〔実施例５〕サプリメントの製造
実施例１で得られたＳＧＰ粉末３０ｇに、ビタミンＣとクエン酸の等量混合物４０ｇ、グラニュー糖１００ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物６０ｇを加えて混合した。混合物をスティック状袋に詰め、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用サプリメントを製造した。
【００３２】
〔実施例６〕飲料の製造
表２に示した配合により原料を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飲料を製造した。
【００３３】
【表２】
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【００３４】
〔実施例７〕医薬品（カプセル剤）の製造
表３に示した配合により原料を混合し、造粒により顆粒状とした後、空カプセルに１０ｍｇずつ充填して、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用医薬品を含むカプセル剤を製造した。
【００３５】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明によれば、ＳＧＰを有効成分とする新たなアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物、及びＳＧＰを有効成分とするアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用飲食品、医薬品、飼料を提供することが可能となった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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