(57)【要約】【課題】アネキシンＡ５の新たな用途を提供する。【解決手段】アネキシンＡ５タンパク質の産生促進剤、アネキシンＡ５タンパク質又はアネキシンＡ５タンパク質誘導体を有効成分として含有するインスリン分泌刺激剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アネキシンＡ５タンパク質の産生促進剤、アネキシンＡ５タンパク質又はアネキシンＡ５タンパク質誘導体を有効成分として含有するインスリン分泌刺激剤。
【請求項２】
アネキシンＡ５タンパク質の発現ベクター又はアネキシンＡ５タンパク質誘導体の発現ベクターを有効成分として含有するインスリン分泌刺激剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン分泌刺激剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アネキシンは、カルシウムを結合することによってリン脂質への結合性を示す一群のタンパク質の総称であり、現在までに植物からほ乳類まで２０種類以上が見出されている。アネキシンは、分子量３０，０００〜４０，０００（アネキシンＡ６のみ約６６，０００）のタンパク質であり、アミノ末端側に各アネキシンに固有のアミノ酸配列（１１〜１９６残基）を有しており、カルボキシ末端側にアネキシンファミリー内でよく保存された約６０アミノ酸残基からなるαヘリックスを含む相同性の高い４回（アネキシンＡ６のみ８回）の繰り返し構造を有している。カルシウム結合部位やリン脂質結合部位はカルボキシ末端側に存在する。
【０００３】
アネキシンＡ５は、アネキシンファミリーに属する約３６ｋＤａのタンパク質であり、下垂体、卵巣、乳腺等に発現していることが知られている。例えば非特許文献１では、アネキシンＡ５が下垂体前葉で発現し、ホルモンの一種であるプロラクチンと結合することが報告されている。
【０００４】
ところで、インスリンは、膵臓ランゲルハンス島（以下、「膵島」という場合がある。）のβ細胞が分泌するペプチドホルモンである。インスリンは、糖、アミノ酸、脂肪酸の同化作用を広く促進するが、細胞へのグルコース取り込み促進作用は特に重要である。
【０００５】
インスリン分泌が何らかの原因で阻害された場合には、若年からでも糖尿病となる（Ｉ型糖尿病）。また、糖尿病は、遺伝的要因、生活習慣、妊娠等の要因で誘起されるインスリン感受性の低下やインスリン分泌阻害によっても発症する（ＩＩ型糖尿病）。
【０００６】
糖尿病の治療には、インスリン感受性を高める薬剤、インスリン分泌を促進する薬剤、インクレチン等のホルモン製剤、組換えインスリン等、様々な薬剤が開発されてきた。しかしながら、それぞれに問題があり、未だに新たな糖尿病治療剤の開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kawaminami M., et al., Association of annexin V with prolactin in the rat anterior pituitary gland., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186 (2), 894-899, 1992.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
アネキシンの生理作用には未だ不明な点が多い。本発明は、アネキシンＡ５の新たな生理作用を解明し、アネキシンＡ５の新たな用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下の態様を含む。
［１］アネキシンＡ５タンパク質の産生促進剤、アネキシンＡ５タンパク質又はアネキシンＡ５タンパク質誘導体を有効成分として含有するインスリン分泌刺激剤。
［２］アネキシンＡ５タンパク質の発現ベクター又はアネキシンＡ５タンパク質誘導体の発現ベクターを有効成分として含有するインスリン分泌刺激剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、アネキシンＡ５の新たな用途が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（ａ）〜（ｄ）は、実験例１において、野生型マウス及びｈｐｇマウスの膵臓の組織切片を免疫染色した結果を示す写真である。
【図２】（ａ）〜（ｄ）は、実験例２において、野生型マウス及びｈｐｇマウスの膵臓の組織切片を免疫染色し、アネキシンＡ５タンパク質を検出した結果を示す写真である。
【図３】（ａ）〜（ｄ）は、実験例２において、野生型マウス及びｈｐｇマウスの膵臓の組織切片を免疫染色し、インスリンを検出した結果を示す写真である。
【図４】実験例３において、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、インスリンｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図５】実験例４において、培地中に放出されたインスリンを定量した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１実施形態において、本発明は、アネキシンＡ５タンパク質の産生促進剤、アネキシンＡ５タンパク質又はアネキシンＡ５タンパク質誘導体を有効成分として含有するインスリン分泌刺激剤を提供する。
【００１３】
実施例において後述するように、発明者らは、膵島における、インスリンのｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルの発現にアネキシンＡ５の存在が必須であることを明らかにした。発明者らはまた、アネキシンＡ５タンパク質を投与することにより、膵島β細胞におけるインスリンの放出量を有意に増加させることができることを明らかにした。
【００１４】
したがって、生体におけるアネキシンＡ５タンパク質の存在量を増加させる物質は、インスリン分泌刺激剤として利用することができる。すなわち、本発明は、アネキシンＡ５の新たな用途を提供するものである。
【００１５】
インスリン分泌刺激剤は、インスリン発現上昇剤、インスリン放出剤等といいかえることもできる。また、本実施形態のインスリン分泌刺激剤は、糖尿病治療剤であるということもできる。
【００１６】
本明細書において、インスリンの分泌を上昇させるとは、膵島β細胞からのインスリンの放出量を増加させることを意味する。すなわち、インスリンの分泌を上昇させるとは、インスリンのｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルの発現量を増加させることだけではなく、膵島β細胞からのインスリンの放出量を増加させることを意味する。
【００１７】
インスリンの分泌は、他の多くのホルモンの分泌と同様に、複雑な機構により制御されている。このため、ある物質が、インスリンｍＲＮＡの発現量やインスリンタンパク質の発現量を増加させたとしても、当該物質にインスリンの膵島β細胞からの放出量を増加させる活性があるとは限らない。
【００１８】
これに対し、実施例において後述するように、発明者らは、アネキシンＡ５タンパク質が膵島β細胞からのインスリンの放出量を有意に増加させることを実証した。
【００１９】
アネキシンＡ５タンパク質は、本来生体内に存在する物質であるため、生体に投与しても安全性が高いことが期待できる。
【００２０】
本実施形態のインスリン分泌刺激剤は、アネキシンＡ５タンパク質の産生促進剤であってもよく、アネキシンＡ５タンパク質そのものであってもよく、アネキシンＡ５タンパク質誘導体であってもよい。
【００２１】
アネキシンＡ５タンパク質の産生促進剤としては、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、以下、「ＧｎＲＨ」という場合がある。）、ＧｎＲＨ作動薬等が挙げられる。ＧｎＲＨ作動薬としては、酢酸フェルチレリン、リュープロレリン、ブセレリン、ナファレリン、ヒストレリン、ゴセレリン、デスロレリン、トリプトレリン等が挙げられる。
【００２２】
アネキシンＡ５タンパク質は、投与対象の種由来のものであることが好ましい。例えばヒトに投与する場合には、ヒトアネキシンＡ５タンパク質であることが好ましい。ヒトアネキシンＡ５タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００２３】
アネキシンＡ５タンパク質誘導体としては、例えば、アネキシンＡ５タンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ投与対象の種の膵島β細胞からのインスリンの分泌を刺激する活性を有するタンパク質（以下、「アネキシンＡ５タンパク質の変異体」という場合がある。）；アネキシンＡ５タンパク質又はその変異体の部分断片であって、かつ投与対象の種の膵島β細胞からのインスリンの分泌を刺激する活性を有するタンパク質；アネキシンＡ５タンパク質若しくはその変異体又はそれらの部分断片に、例えばポリエチレングリコール等の化合物が結合したもの等が挙げられる。ポリエチレングリコールを結合することにより、例えば血中安定性を高めること等が可能になる。ここで、１若しくは数個とは、例えば１〜２０個、例えば１〜１５個、例えば１〜１０個、例えば１〜５個、例えば１〜３個を意味する。
【００２４】
本実施形態のインスリン分泌刺激剤は、アネキシンＡ５タンパク質の発現ベクターを有効成分として含有するものであってもよく、アネキシンＡ５タンパク質誘導体の発現ベクターを有効成分として含有するものであってもよい。
【００２５】
発現ベクターとしては、投与対象の種の細胞中でアネキシンＡ５タンパク質又はその誘導体を発現可能なものであれば特に限定されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来ベクター；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
【００２６】
発現ベクターにおいて、アネキシンＡ５タンパク質又はその誘導体の発現用プロモーターとしては特に限定されず、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ｔｋプロモーター等が挙げられる。
【００２７】
発現ベクターは、更に、マルチクローニングサイト、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等を有していてもよい。
【００２８】
本実施形態のインスリン分泌刺激剤において、発現ベクターは、投与対象の種由来のアネキシンＡ５タンパク質又はその誘導体をコードする遺伝子を含むことが好ましい。ヒトアネキシンＡ５タンパク質をコードする遺伝子（ヒトアネキシンＡ５遺伝子）の塩基配列を配列番号２に示す。
【００２９】
本実施形態のインスリン分泌刺激剤が、アネキシンＡ５タンパク質誘導体の発現ベクターを有効成分として含有するものである場合、アネキシンＡ５タンパク質誘導体としては、例えば上述したアネキシンＡ５タンパク質の変異体；アネキシンＡ５タンパク質又はその変異体の部分断片であって、かつ投与対象の種の膵島β細胞からのインスリンの分泌を刺激する活性を有するタンパク質等が挙げられる。
【００３０】
アネキシンＡ５タンパク質誘導体の発現ベクターが含む遺伝子としては、例えば、投与対象の種のアネキシンＡ５タンパク質をコードする塩基配列に対して、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ投与対象の種の膵島β細胞からのインスリンの分泌を刺激する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００３１】
ここで、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の塩基数を算出し、下記式（１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致した塩基数／対象塩基配列の総塩基数×１００  （１）
【００３２】
上述したインスリン分泌刺激剤は、それ自体、すなわち、アネキシンＡ５タンパク質の産生促進剤、アネキシンＡ５タンパク質若しくはその誘導体、又はアネキシンＡ５タンパク質若しくはその誘導体の発現ベクターを投与するものであってもよい。あるいは、インスリン分泌刺激剤は、上記の有効成分を、薬学的に許容される担体と混合した医薬組成物として製剤化したものを投与するものであってもよい。
【００３３】
医薬組成物は、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよく、例えば注射剤、軟膏、貼付剤等の非経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよい。
【００３４】
薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水、生理食塩水等の溶媒；ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。
【００３５】
医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノールの安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤；界面活性剤；乳化剤等が挙げられる。
【００３６】
医薬組成物は、上記の担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【００３７】
医薬組成物が注射剤である場合、注射剤用の溶媒としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液が挙げられる。注射剤用の溶媒は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ−５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。
【００３８】
本実施形態のインスリン分泌刺激剤の患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。
【００３９】
本実施形態のインスリン分泌刺激剤の投与量は、投与対象、症状、投与方法によっても異なるが、当業者であれば適切な投与量を適宜選択することが可能である。例えば、インスリン分泌刺激剤がＧｎＲＨ作動薬である場合、通常成人（体重６０ｋｇ）において、１回あたり例えば０．１〜１０ｍｇ、例えば０．５〜５ｍｇ、例えば１〜２ｍｇ程度を皮下投与又は静脈内投与することが挙げられる。
【００４０】
また、例えば、インスリン分泌刺激剤がアネキシンＡ５タンパク質である場合、通常成人（体重６０ｋｇ）において、１回あたり例えば０．５〜５０ｍｇ、例えば０．５〜１０ｍｇ、例えば２〜１０ｍｇ程度を皮下投与又は静脈内投与することが挙げられる。
【００４１】
（その他の実施形態）
１実施形態において、本発明は、アネキシンＡ５タンパク質の産生促進剤、アネキシンＡ５タンパク質、アネキシンＡ５タンパク質誘導体、アネキシンＡ５タンパク質の発現ベクター又はアネキシンＡ５タンパク質誘導体の発現ベクターの有効量を、治療を必要とする患者又は患畜に投与する工程を備える糖尿病の治療方法を提供する。
【００４２】
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療のための、アネキシンＡ５タンパク質の産生促進剤、アネキシンＡ５タンパク質、アネキシンＡ５タンパク質誘導体、アネキシンＡ５タンパク質の発現ベクター又はアネキシンＡ５タンパク質誘導体の発現ベクターを提供する。
【００４３】
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療剤を製造するための、アネキシンＡ５タンパク質の産生促進剤、アネキシンＡ５タンパク質、アネキシンＡ５タンパク質誘導体、アネキシンＡ５タンパク質の発現ベクター又はアネキシンＡ５タンパク質誘導体の発現ベクターの使用を提供する。
【００４４】
これらの実施形態において、アネキシンＡ５タンパク質の産生促進剤、アネキシンＡ５タンパク質、アネキシンＡ５タンパク質誘導体、アネキシンＡ５タンパク質の発現ベクター、アネキシンＡ５タンパク質誘導体の発現ベクターとしては、上述したものと同様のものが挙げられる。
【実施例】
【００４５】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００４６】
［実験例１］
（ｈｐｇマウスでは膵島におけるアネキシンＡ５及びインスリンの発現が低下していた）
発明者らは、以前に、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）がアネキシンＡ５の発現を促進することを見出した。すなわち、アネキシンＡ５は、末梢組織でのＧｎＲＨの作用を検索するバイオマーカーとして利用することができる。
【００４７】
そこで、遺伝的にＧｎＲＨを欠損しているｈｐｇマウスを用い、アネキシンＡ５の体内分布を網羅的に調べた。
【００４８】
その結果、発明者らは、ｈｐｇマウスの膵島でアネキシンＡ５の発現が低下していることを見出した。さらに、発明者らは、ｈｐｇマウスの膵島では、インスリンの発現も低下していることを明らかにした。
【００４９】
図１（ａ）〜（ｄ）は、野生型マウス及びｈｐｇマウスの膵臓の組織切片を免疫染色した結果を示す写真である。スケールバーは１００μｍを示す。図１（ａ）及び（ｂ）は野生型マウスの組織切片の写真であり、図１（ｃ）及び（ｄ）はｈｐｇマウスの組織切片の写真である。また、図１（ａ）及び（ｃ）は、免疫染色によりアネキシンＡ５タンパク質を検出した結果を示し、図１（ｂ）及び（ｄ）は、免疫染色によりインスリンを検出した結果を示す。
【００５０】
図１（ａ）〜（ｄ）の結果から、ｈｐｇマウスの膵島では、アネキシンＡ５及びインスリンの発現が低下していることが明らかとなった。この結果は、ＧｎＲＨの欠損とインスリンの発現低下が関連していることを示す。
【００５１】
［実験例２］
（ＧｎＲＨ作動薬を投与するとｈｐｇマウスの膵島でアネキシンＡ５及びインスリンの発現が上昇した）
続いて、野生型マウス及びｈｐｇマウスにＧｎＲＨ作動薬を投与し、膵島におけるアネキシンＡ５及びインスリンの発現に与える影響を検討した。ＧｎＲＨ作動薬としては酢酸フェルチレリンを使用した。ＧｎＲＨ作動薬は、各マウスに１日１回、１回あたり１μｇ／匹で腹腔内投与し、７日間投与を継続した後実験を行った。また、対照として、ＧｎＲＨ作動薬の代わりに生理食塩水を投与した群を用意した。
【００５２】
図２（ａ）〜（ｄ）は、野生型マウス及びｈｐｇマウスの膵臓の組織切片を免疫染色し、アネキシンＡ５タンパク質を検出した結果を示す写真である。スケールバーは５０μｍを示す。図２（ａ）及び（ｂ）は対照群のマウスの組織切片の写真であり、図２（ｃ）及び（ｄ）はＧｎＲＨ作動薬投与群のマウスの組織切片の写真である。また、図２（ａ）及び（ｃ）は、野生型マウスの結果を示し、図２（ｂ）及び（ｄ）は、ｈｐｇマウスの結果を示す。
【００５３】
その結果、ＧｎＲＨ作動薬を投与することにより、ｈｐｇマウスの膵島におけるアネキシンＡ５の発現が上昇することが明らかとなった。
【００５４】
また、図３（ａ）〜（ｄ）は、野生型マウス及びｈｐｇマウスの膵臓の組織切片を免疫染色し、インスリンを検出した結果を示す写真である。スケールバーは５０μｍを示す。図３（ａ）及び（ｂ）は対照群のマウスの組織切片の写真であり、図３（ｃ）及び（ｄ）はＧｎＲＨ作動薬投与群のマウスの組織切片の写真である。また、図３（ａ）及び（ｃ）は、野生型マウスの結果を示し、図３（ｂ）及び（ｄ）は、ｈｐｇマウスの結果を示す。
【００５５】
その結果、ＧｎＲＨ作動薬を投与することにより、ｈｐｇマウスの膵島におけるインスリンの発現が顕著に上昇することが明らかとなった。
【００５６】
以上の結果から、ＧｎＲＨ作動薬を投与すると、ｈｐｇマウスの膵島でアネキシンＡ５及びインスリンの発現が上昇することが明らかとなった。
【００５７】
［実験例３］
（膵島におけるインスリンの発現上昇にはアネキシンＡ５が必要であった）
続いて、アネキシンＡ５の発現とインスリンの発現との関連を検討するために、アネキシンＡ５ノックアウトマウスを用いた検討を行った。
【００５８】
アネキシンＡ５ノックアウトマウス及び野生型マウスに、実験例２と同様にしてＧｎＲＨ作動薬をそれぞれ投与した。また、対照として、ＧｎＲＨ作動薬の代わりに生理食塩水を投与した群を用意した。続いて、各マウスから膵臓を摘出してＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりインスリンｍＲＮＡの発現量を測定した。
【００５９】
図４はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。その結果、野生型マウスでは、ＧｎＲＨ作動薬を投与することによりインスリンｍＲＮＡの発現が上昇した。これに対し、アネキシンＡ５ノックアウトマウスでは、ＧｎＲＨ作動薬を投与してもインスリンｍＲＮＡの発現の上昇が認められなかった。
【００６０】
この結果から、ＧｎＲＨ作動薬の投与によるインスリンの発現上昇には、アネキシンＡ５の存在が必要であることが明らかとなった。すなわち、ＧｎＲＨの作用によりアネキシンＡ５の発現が上昇し、アネキシンＡ５の作用によりインスリンの発現が上昇するという関係があることが明らかとなった。
【００６１】
［実験例４］
（アネキシンＡ５タンパク質は膵島におけるインスリンの放出を促進した）
以上の実験では、インスリンの発現上昇を検討してきたが、膵島からのインスリンの放出は確認していなかった。そこで、膵臓ランゲルハンス島β細胞の株化細胞であるＭＩＮ６細胞を用いて、アネキシンＡ５タンパク質がインスリンの放出に与える影響を検討した。
【００６２】
具体的には、ＭＩＮ６細胞の培地に、アネキシンＡ５タンパク質を終濃度０．１μｇ／ｍＬで添加し、培地中に放出されたインスリンを測定した。
【００６３】
アネキシンＡ５タンパク質としては、ラット組換えアネキシンＡ５タンパク質（Takehara K., et al., Secretion of recombinant rat annexin 5 by insect cells in a baculovirus expression system., Biochem. Biophys. Res. Commun. 200 (3), 1421-1427, 1994.を参照。）を使用した。
【００６４】
また、対照として、培地にアネキシンＡ５タンパク質を添加しなかったＭＩＮ６細胞を用意した。インスリンの測定には市販のＥＬＩＳＡキット（マウスインスリン測定キット、森永生科学研究所）を使用した。
【００６５】
図５は、アネキシンＡ５タンパク質を培地に添加してから１時間後及び３時間後に培地中に放出されたインスリンを定量した結果を示すグラフである。
【００６６】
その結果、アネキシンＡ５タンパク質を培地に添加することにより、培地中に放出されたインスリンが有意に増加したことが明らかとなった。この結果は、アネキシンＡ５タンパク質を投与することにより、インスリンの発現上昇だけでなく、インスリンの放出も促進することができることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明により、アネキシンＡ５の新たな用途が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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