(57)【要約】      （修正有）【課題】トコトリエノール及び他の化合物を含有する組成物の調製、その方法で製造する組成物並びに放射線の影響から防護する及び放射線の影響を緩和するのに効果的な用量での組成物の使用法の提供。【解決手段】２：１〜１０：１の比でδ−トコトリエノール及びγ−トコトリエノールを含む植物抽出物であって、全トコトリエノールが組成物の１５〜９５％を占め、トコフェロールが前記抽出物の１％未満であることを特徴とする、抽出物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２：１〜１０：１のδ−トコトリエノール対γ−トコトリエノール比を有するベニノキ種子抽出物の調製方法であって、
（ａ）ベニノキ種子から油を抽出してベニノキ種子油を製造する工程、及び、
（ｂ）クロマトグラフィにより前記ベニノキ種子油からトコトリエノールを濃縮する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記δ−トコトリエノール対γ−トコトリエノール比が、５：１〜９：１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クロマトグラフィ後、前記δ−トコトリエノール及びγ−トコトリエノールが合計で組成物の１５〜９５％を占める、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記油が、前記ベニノキ種子からヘキサン抽出される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記トコトリエノールが、ヘキサン：酢酸エチル溶媒を使用したクロマトグラフィにより分離される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ヘキサン：酢酸エチル溶媒が、９０：１０の比を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記トコトリエノールが、ヘキサン：イソプロパノール溶媒を使用したクロマトグラフィにより分離される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ヘキサン：イソプロパノール溶媒が、９８：２の比を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法により調製される組成物。
【請求項１０】
２：１〜１０：１の比でδ−トコトリエノール及びγ−トコトリエノールを含む植物抽出物。
【請求項１１】
前記δ−トコトリエノール対γ−トコトリエノール比が、５：１〜９：１である、請求項１０に記載の抽出物。
【請求項１２】
前記δ−トコトリエノール対γ−トコトリエノール比が、７：１〜９：１である、請求項１０に記載の抽出物。
【請求項１３】
全トコトリエノールが、組成物の１５〜９５％を占める、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項１４】
前記トコトリエノールが、組成物の３０％を超える、請求項１３に記載の抽出物。
【請求項１５】
前記トコトリエノールが、組成物の５０％を超える、請求項１３に記載の抽出物。
【請求項１６】
５％未満のトコフェロールを更に含む、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項１７】
前記トコフェロールが、前記抽出物の１％未満である、請求項１６に記載の抽出物。
【請求項１８】
前記抽出物が、実質的にトコフェロールを含有しない、請求項１７に記載の抽出物。
【請求項１９】
前記抽出物が、全トコトリエノールを少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ含む、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項２０】
前記抽出物が、全トコトリエノールを少なくとも５００ｍｇ／ｍＬ含む、請求項１９に記載の抽出物。
【請求項２１】
請求項９に記載の組成物又は請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の抽出物と、医薬的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２２】
剤形中に全トコトリエノールを少なくとも１ｇ含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
被験者の治療方法であって、請求項９に記載の組成物、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の抽出物、又は請求項２１、２２に記載の医薬組成物の有効量を、前記被験者に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
前記被験者が、放射線防護剤又は放射線被爆治療を必要としている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験者が、酸化防止剤、抗炎症剤、免疫調節剤、抗血栓剤、アテローム産生抑制剤、低コレステロール血症治療薬、又はＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤での治療を必要としている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記被験者が、放射線被爆、がん、冠動脈疾患を含むがこれに限定するものではない循環器疾患、高リポタンパク質レベル、高コレステロールレベル、高トリグリセリド、加齢性黄斑変性、白内障、緑内障、慢性疼痛、慢性疲労症候群、発熱、浮腫、糖尿病、老化現象、リウマチ様疾患、敗血症性ショック、及びアルツハイマー病から成る群から選択される状態を有する、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
放射線防護及び／又は放射線緩和のための、請求項９に記載の組成物又は請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の抽出物又は請求項２１、２２に記載の医薬組成物の使用であって、前記組成物又は抽出物を、それを必要としている被験者に投与する工程を含むことを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１３年９月１３日に出願の米国仮特許出願第６１／８７７６５５号（参照により全て本願に援用される）の優先権の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景技術及び発明の分野
ビタミンEは、８種の天然のトコールから構成される。そのうち４種はトコフェロールであり、飽和炭化水素テールを有し、４種はトコトリエノールであり、炭化水素テール中に３つのトランス二重結合を有する。栄養補助食品にした場合にトコールに有益な健康作用があることは知られている。トコフェロールでは見られない有益な健康作用をトコトリエノールは有することが近年、明らかになっている。
【０００３】
市販のトコトリエノールは、トコトリエノールとトコフェロールとの複雑な混合物として生じる天然油から精製される。これらの混合物から純粋なトコトリエノールを分離するのは非常に困難であるため、これらの化合物は極めて高価である。また、一部の用途での使用に十分な高い濃度でトコトリエノールを得るのは困難である。
【０００４】
本発明は、トコトリエノール及び他の化合物を含有する組成物の調製、その方法で製造する組成物並びに放射線の影響から防護する及び放射線の影響を緩和するのに効果的な用量での組成物の使用に関する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明で提供するのは、トコトリエノールを含有し且つトコフェロールの含有量が少ない又はトコフェロールを含有しない組成物の調製方法である。更に、毒性を伴うことなく効果的な放射線防護活性を示す用量が得られる精製、濃縮及び標準化方法について説明する。個々のトコトリエノール成分が発揮する効果を超えた相乗作用を示す組成物及びその組成物の使用方法も提供する。本発明の組成物は、２：１〜１０：１の比のδ−トコトリエノールとγ−トコトリエノールとの組み合わせを有する。まず、ベニノキ（ａｎｎａｔｔｏ）、イネ、ヤシ又はコムギ等のトコトリエノール含有植物から油を抽出する。次に、この抽出物からトコトリエノールをクロマトグラフィにより分離する。この方法で生成される組成物も提供する。
【０００６】
別の態様において、比２：１〜１０：１でδ−トコトリエノールとγ−トコトリエノールとを含む組成物を提供する。適切には、この組成物は５：１〜９：１の比を有する。適切には、抽出物は比７：１〜９：１を有する。組成物は適切にはγ−トコトリエノールより高いδ−トコトリエノール濃度を有する。組成物は、１５〜９５％の総トコトリエノール含有量を有する。適切には、組成物の少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％がトコトリエノールである。組成物は、全トコトリエノールを１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｇ／ｍＬ、６００ｍｇ／ｍＬ、７００ｍｇ／ｍＬ、８００ｍｇ／ｍＬ、９００ｍｇ／ｍＬ又は１ｇ／ｍＬを超えて含む。
【０００７】
更に別の態様において、ある状態又は疾患を抱えた被験者を治療する方法を提供する。本方法は、有効量の記載の組成物の少なくとも１種を被験者に投与することでその状態又は疾患を寛解させることを含む。被験者は、放射線防護剤での治療又は放射線被爆治療又は酸化防止剤、抗炎症剤、免疫調節剤、抗血栓剤、アテローム産生抑制剤（ａｎｔｉ−ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、低コレステロール血症治療薬若しくはＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を必要とし得る。被験者は、放射線被爆、がん、冠動脈疾患を含めた（ただしこれに限定するものではない）循環器疾患、高リポタンパク質レベル、高コレステロールレベル、高トリグリセリド、加齢性黄斑変性、白内障、緑内障、慢性疼痛、慢性疲労症候群、発熱、浮腫、糖尿病、老化現象、リウマチ様疾患、敗血症性ショック及びアルツハイマー病から選択される状態又は疾患を有し得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＤＧ−３と称される、δ−トコトリエノール及びγ−トコトリエノールを含むベニノキ抽出物を製造するための抽出手順を示す。
【図２】ベニノキ抽出物であるＤＧ−３の質量分析プロファイルを示す。図２Ａは粗抽出物のものであり、図２Ｂは標準化した抽出物のものである。
【図３】表示の処理を施した後の心筋細胞の写真である。Ｈ９Ｃ２心筋細胞を、５μＭのＤＴ３又は５μＭのＤＧ−３又はビヒクルコントロール（ＤＭＳＯ）で一晩処理した。次に、細胞をＨ2Ｏ2に４時間にわたって曝露した。形態学的変化を倒立顕微鏡下で記録した。
【図４】ＤＴ３（δ−トコトリエノール）及びＤＧ−３の、ウィスターラット肝ミクロソームにおけるＴＢＨＰ誘導脂質過酸化阻害能のグラフである。データは、３重の実験の平均±ＳＥＭである。
【図５】表示の処理を施した後の心筋細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）にＤＴ３及びＤＧ−３が及ぼす影響を示すグラフである。Ｈ９Ｃ２心筋細胞を、５μＭのＤＴ３又は５μＭのＤＧ−３又はビヒクルコントロール（ＤＭＳＯ）で一晩処理した。酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定し、細胞生体エネルギープロファイルを、ＸＦ９６シーホース細胞外フラックスアナライザを使用して求めた。
【図６】表示の処理を施した後の心筋細胞のＯＣＲに過酸化水素が及ぼす影響を示すグラフである。Ｈ９Ｃ２心筋細胞を５０又は１００μＭのＨ2Ｏ2に４時間にわたって曝露した。酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定し、細胞生体エネルギープロファイルを、ＸＦ９６シーホース細胞外フラックスアナライザを使用して求めた。
【図７】ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシドビヒクル）、ＤＴ３又はＤＧ−３での表示の前処理を施した後の心筋細胞のＯＣＲに５０μＭの過酸化水素が及ぼす影響を示すグラフである。細胞生体エネルギープロファイルを、ＸＦ９６シーホース細胞外フラックスアナライザを使用して求めた。
【図８】ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシドビヒクル）、ＤＴ３又はＤＧ−３での表示の前処理を施した後の心筋細胞のＯＣＲに１００μＭの過酸化水素が及ぼす影響を示すグラフである。細胞生体エネルギープロファイルを、ＸＦ９６シーホース細胞外フラックスアナライザを使用して求めた。
【図９】ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシドビヒクル）、ＤＴ３又はＤＧ−３での表示の前処理を施した後の心筋細胞のＯＣＲに６Ｇｙの電離放射線が及ぼす影響を示すグラフである。細胞生体エネルギープロファイルを、放射線被爆から１時間後にＸＦ９６シーホース細胞外フラックスアナライザを使用して求めた。
【図１０】ＤＭＳＯ、ＤＴ３又はＤＧ-３での前処理の後に３Ｇｙの電離放射線に曝露した心筋細胞の正規化生存率を示すグラフである。
【図１１】８．５Ｇｙの電離放射線に曝露したマウスが完全（１００％）に放射線から防護されることを示すカプラン・メイヤー生存曲線である。
【図１２】９．５Ｇｙの電離放射線に曝露したマウスが完全（１００％）に放射線から防護されることを示すカプラン・メイヤー生存曲線である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
がん患者の根治的管理及び緩和ケアで使用する放射線療法は、急性及び遅発性の放射線誘発性正常組織毒性をもたらすことが多い。福島原子炉等の核物質の不慮の放出による放射線被爆も問題であり、治療に選択肢は殆どない。従って、放射線療法を受ける又は放射線に曝露される患者の生活の質を改善するための安全且つ効果的な放射線防護剤が喫緊で必要とされている。
【００１０】
天然のビタミンＥ類似体の中でも、γ−トコトリエノール（ＧＴ３）及びδ−トコトリエノール（ＤＴ３）は、顕著な放射線防護能及び放射線緩和能を示した２種である。テトラヒドロビオプテリン利用能の調節を通じたｅＮＯＳ活性の強化並びにＭＴＯＲ生存経路の刺激を通じた造血幹細胞及び前駆細胞へのＤＮＡ損傷の防止を含めた、ＧＴ３及びＤＴ３がその放射線防護効果を発揮する多数のメカニズムが研究によって示唆されている。残念ながら、ＤＴ３及びＧＴ３は共に精製が困難且つ極めて高価であり、手に入る、トコトリエノール含有量が最も多い油はかなりの量のトコフェロールを含有するため、トコトリエノールのバイオアベイラビリティ及び生物活性を妨げる可能性がある。
【００１１】
本発明で提供するＤＧ−３は、ＤＴ３及びＧＴ３だけを含有する、ベニノキの種子由来の標準化抽出物である。放射線誘発性のミトコンドリアの損傷及び酸化ストレスは、ＤＮＡ損傷修復及び幹細胞の運命等の幾つかの極めて重要な生物学的パラメータに影響するため、この研究において、発明者らは、ＤＴ３、ＧＴ３及びＤＧ−３の効果を放射線誘発性のミトコンドリア機能不全及び酸化ストレスについて比較した。初期の結果は、５μＭのＤＴ３又はＤＧ−３での処理がＨ９Ｃ２ラット心筋細胞の総抗酸化能（銅還元当量で測定）を変化させなかったことを示している。更に、Ｈ2Ｏ2処理による酸化傷害が後に続いても、この同じ処理によって細胞生存能及びこれらの細胞におけるミトコンドリア呼吸は保たれた。ＤＧ−３の製造方法及びこれらの組成物の使用方法を本発明において提供する。
【００１２】
本発明で提供する、ＤＧ−３と称されるベニノキ種子抽出物を、図１に描いた方法で生成した。本方法は、ベニノキの種子を採取し、このベニノキ種子から油を抽出してベニノキ種子油を生成することから始まる。特に、イネ、ヤシ及びコムギも、本発明で提供するトコトリエノール組成物の原料になり得る。油は、実施例に記載しているようなヘキサン抽出等の熱溶媒又は冷溶媒抽出を用いて抽出し得る。脂肪種子から油を抽出する他の方法（押出機又は圧搾機によるコールドプレス又はホットプレス等）も利用し得る。これらの工程に備えて、当業者に公知の標準的な方法を用いてベニノキ種子を準備し得る。ベニノキ油を適切には使用時まで４℃で保管する。また、実施例に記載の方法又は当業者に公知の凝縮若しくは脱水法でもって濃縮し得る。
【００１３】
トコトリエノール組成物の調製は、順相又は逆固定相及び溶媒（アセトン、二塩化エチレン、ヘキサン、イソプロピルアルコール、プロピルアルコール、メチルアルコール、塩化メチレン、トリクロロエチレン及び水等）の混合物を使用したクロマトグラフィ技法によるさらなる濃縮及び精製を含む。実施例においては、ヘキサン：酢酸エチル溶媒（９０：１０）を使用したフラッシュクロマトグラフィとそれに続くヘキサン：イソプロパノール（９８：２）溶媒及びシリカゲル（７０〜２３０メッシュ）を使用した第２の分離を用いた。当業者ならば、精確なクロマトグラフィ法に変更を加えることで別々のトコトリエノール組成物が得られることがわかる。
【００１４】
次に、ベニノキ種子抽出物組成物をガスクロマトグラフィ質量分析で分析して図２のグラフを得た。図２Ｂに示すように、本発明で提供するＤＧ−３標準化抽出物はトコフェロール等の汚染物質を殆ど含有せず、δ−トコトリエノール及びγ-トコトリエノールが豊富である。最後に、抽出物組成物を、濃度が判明している２つの抽出物を適切な比で混合してターゲット組成（δ−トコトリエノールとγ−トコトリエノールとの比が７：１）を有する抽出物を得ることで標準化した。標準化にあたっては、一方の抽出物はターゲットより高い濃度を有し、もう一方の抽出物はターゲットより低い濃度を有する。標準化した組成を有する抽出物の製造は医薬品的見地から極めて重要であるが、これは精確な投薬には内容物の均一性が必要だからである。
【００１５】
本発明で提供するＤＧ−３ベニノキ種子抽出物は、約７：１のδ−トコトリエノール対γ−トコトリエノール比を有する。ＤＧ-３ベニノキ種子抽出物組成物は、２：１〜１０：１、適切には５：１〜９：１、適切には７：１〜９：１のδ-トコトリエノール対γ−トコトリエノール比を有し得る。δ−トコトリエノールが優勢な成分である。この組成物は、１５〜９５％の総トコトリエノール含有量を有する。適切には、組成物の少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％がトコトリエノールである。適切には、組成物が含有するトコフェロールは５％未満、適切には２％未満、１％未満、０．１％未満であり、あるいは検出可能なトコフェロールを全く含有しない。組成物は実質的にトコフェロール非含有になり得る。トコフェロールは、本明細書に記載の治療方法においてトコトリエノールの有効性を低下させる可能性がある。
【００１６】
本明細書に記載のＤＧ−３ベニノキ種子抽出物を含む医薬組成物も提供する。適切には、組成物は全トコトリエノールを、１００μＭ、２００μＭ、２５０μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ又は１Ｍ含有する。適切には、医薬組成物は全トコトリエノールを、１０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｇ／ｍＬ、６００ｍｇ／ｍＬ、７００ｍｇ／ｍＬ、８００ｍｇ／ｍＬ、９００ｍｇ／ｍＬ又は１ｇ／ｍＬ含有する。単一剤形は１用量あたり２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、５ｇ又は１０ｇ含有し得る。マウスでの実施例では、致死的放射線線量から防護するのに単回用量３００ｍｇ/ｋｇで効力が見られた。放射線の影響（がんの放射線療法におけるもの等）の治療では、より低用量で効力が得られると見込まれる。しかしながら、用量を複数回に分割すると血中レベルが時間の経過と共に上昇する。このため、２回以上に分割して投与するならば、低用量も有用になり得る。更に、トコトリエノールによって引き起こされる有益な生化学的変化も累積的になると見込まれる。
【００１７】
本明細書に記載の組成物は、被験者を治療する方法において使用し得る。本発明の組成物は、放射線防護剤、放射線緩和剤又は放射線被爆治療を必要としている被験者の治療に使用し得る。加えて、本発明の組成物は、酸化防止剤、抗炎症剤、免疫調節剤、抗血栓剤、アテローム産生抑制剤、低コレステロール血症治療薬又はＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤での治療を必要としている被験者の治療に使用し得る。治療方法は、有効量の本発明で提供する組成物を、そのような治療を必要とする被験者に投与することをベースとする。
【００１８】
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に使用し得る。上記の組成物及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。医薬的に許容可能な担体は、インビボ投与に適した任意の担体である。本発明の組成物での使用に適した医薬的に許容可能な担体の例には、以下に限定するものではないが、水、緩衝液、グルコース溶液、油性溶液又は細菌培養液が含まれる。組成物の追加成分には適切には、例えば、安定剤、保存料、希釈剤、乳化剤及び滑沢剤等の賦形剤が含まれる。医薬的に許容可能な担体又は希釈剤の例には、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコース、デキストラン）、アルブミン又はカゼイン等のタンパク質、ウシ血清又はスキムミルク等のタンパク質含有物質及び緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）等の安定剤が含まれる。特に、そのような安定剤を組成物に添加する場合、組成物は凍結乾燥又は噴霧乾燥に適している。組成物は乳化させてもよい。実施例においては、トコトリエノール、Ｔｗｅｅｎ８０及びポリエチレングリコール８０を含む医薬組成物を使用した。
【００１９】
本明細書に記載の組成物は、放射線被爆、がん、冠動脈疾患を含めた（ただしこれに限定するものではない）循環器疾患、高リポタンパク質レベル、高コレステロールレベル、高トリグリセリドレベル、アテローム性動脈硬化、虚血再灌流障害等、加齢性黄斑変性、白内障、緑内障、慢性疼痛、慢性疲労症候群、発熱、浮腫、糖尿病、老化現象、リウマチ様疾患、敗血症性ショック、炎症性疾患、自己免疫疾患又はアルツハイマー病から選択される状態を抱える被験者の治療に使用し得る。放射線被爆の場合は、考えられ得る放射線被爆に先立って本発明の組成物を放射線防護剤として被験者（放射線療法を受けている患者、放射線又は放射線流出若しくは漏れを取り扱う又はその浄化を行う人間等）に送達し得る。本発明の組成物は、放射線被爆後に（放射線の放出を伴う事故の後等）に放射線緩和剤として与えることもできる。
【００２０】
ある状態の治療には、以下に限定するものではないが、その状態の症状又は徴候の予防、疾患重症度の低下又は治療を受けていない被験者と比較しての疾患の進行における逆行、減少又は減速が含まれる。本明細書に記載の組成物は、放射線防護剤、酸化防止剤、抗炎症剤、免疫調節剤、抗血栓剤、アテローム産生抑制剤、低コレステロール血症治療薬又はＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤での治療を必要とする被験者の治療に使用し得る。公知の酸化防止剤、抗炎症剤又はＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤との併用療法は、その併用治療を、どちらかの組成物単独での治療より有効性の高いものにし得る。
【００２１】
本明細書に記載の組成物は当業者に公知のいずれの手段によっても投与し得て、以下に限定するものではないが、経口、局所、鼻腔内、腹腔内、非経口、静脈内、筋肉内又は皮下投与を含む。実施例においては、皮下注射を使用した。従って、本発明の組成物は、摂取、注射、局所投与用又は座薬製剤として製剤し得る。本発明の組成物は、リポソーム型又は徐放性のビヒクルに入れて送達することもできる。本発明による被験者への組成物の投与は、用量依存的な形で有益な効果を示すと考えられる。従って、広い範囲内で、多量の本発明の組成物を投与することで、少量を投与する場合より高い有益な生物学的効果が得られると期待される。更に、効力は、毒性が認められるレベルより少ない用量でも予期される。
【００２２】
当然のことながら、具体的な投与量は、いずれの状況であっても、当業者には周知のとおり、投与する組成物、治療又は阻止する疾患、被験者の状態及び組成物の活性又は被験者の反応を変化させ得る関連する他の医学的要因に応じて調節される。例えば、特定の被験者のための具体的な用量は、年齢、体重、全身の健康状態、食事、投与のタイミング及び方法、排出速度、併用する薬物並びに療法を適用する特定の障害の重症度に左右される。ある患者への投与量は通常の勘案事項を踏まえて決定することができ、例えば、本発明の組成物及びトコフェロール等の公知の物質の特異な活性の、例えば適当な従来の薬理学的又は予防的プロトコルによる慣用の比較により決定する。
【００２３】
ある被験者にとっての極量とは、望ましくない又は耐えられない副作用を引き起こさない最大投与量である。個々の予防又は治療レジメンに関わる変数の数は多く、用量の範囲はかなり広くなると予測される。投与経路も、投与要件に影響する。組成物の投与によりある状態の症状は治療前の症状又は治療しないままの場合の症状と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少すると予期される。医薬製剤及び組成物が治癒はもたらさないが疾患の症状を和らげ得る又は軽減し得ること、あるいは幾つかの実施形態において医薬製剤及び組成物を疾患又は障害の治癒に使用し得ることが具体的に予想される。
【００２４】
組成物を投与するための適切な有効投与量は当業者が決定し得るが、典型的には体重１ｋｇあたり約１μｇ〜約１０００ｍｇであり、ただし典型的には体重１ｋｇあたり約５００ｍｇ以下である。他のビタミンＥ化合物と同様に、治療効果を得るには大用量を必要とする場合があり、毒性は低くなる見込みである。幾つかの実施形態において、有効投与量は１回又は毎日又は毎週体重１キログラムあたり約１０〜約１０００ｍｇである。別の実施形態において、有効投与量は１回又は毎日又は毎週体重１ｋｇあたり約５０〜約５００ｍｇである。別の実施形態において、有効投与量は１回又は毎日又は毎週体重１ｋｇあたり約７５〜約３００ｍｇである。実施例においては、単回量３００ｍｇ/ｋｇでマウスが続く致死的又は亜致死的な放射線被爆から守られることが判明した。本明細書に記載の有効投与量とは投与総量であり、すなわち２種以上の組成物を投与する場合、有効投与量は総投与量に対応する。組成物は１回又は複数回に分けて投与することができる。例えば、組成物を、４時間、６時間、８時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、１週間、２週間又は３週間以上あけて２回以上投与し得る。
【００２５】
本開示は、本明細書に記載の構成、構成要素の配置又は方法ステップの具体的な詳細に限定されない。本明細書で開示の組成物及び方法は、後述の開示に照らして当業者に明白になる様々な形で形成、実施、使用、実行及び/又は生成可能である。本明細書で用いる言い回し及び学術用語は説明を目的としたものにすぎず、請求項の範囲を限定するとみなすべきではない。様々な構造又は方法ステップに言及する際に明細書本文及び請求項において使用する第１、第２、第３等の序数標識は、特定の構造若しくはステップ又はそのような構造若しくはステップに続く特定の順序又は相対的配置を示すと解釈されることを意図してはない。本明細書に記載の方法は全て、別段の定めがない限り又は文脈に明らかに反してしない限り、いずれの適切な順序でも実行することができる。本明細書で挙げる任意及び全ての例又は用いる例示を示す表現（例えば、「〜等」）は単に開示を円滑に進めるためのものであり、別段の定めがない限り、開示の範囲を限定することを含意してはいない。明細書本文にあるいかなる文言及び図面に示すいかなる構造も、請求していない要素が開示の主題の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。語句「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「有する（ｈａｖｉｎｇ）」及びその派生語の本明細書における使用は、その後に列挙する要素及びそれらの均等物を追加の要素と同様にその範囲に含むことを意図している。特定の要素を「含む」又は「有する」ものとして具陳される実施形態は、これらの特定の要素「から本質的に成る」及び「から成る」とも考えられる。
【００２６】
本明細書における数値範囲の具陳は、別段の定めがない限り、その範囲に含まれる別々の各値に個別に言及するための略記法としての役割を果たすことを意図したものにすぎず、別々の各値は、本明細書で個別に挙げたかのごとく明細書に組み込まれる。例えば、濃縮範囲を１〜５０％とするならば、２〜４０％、１０〜３０％又は１〜３％その他等の値が本明細書において明確に列記されたものとする。これらは具体的に意図したものの例にすぎず、列記した最小値と最大値との間又はこれらを含む考えられ得る全ての数値組み合わせが本開示において明確に述べられたとみなされたい。特定の量又は量の範囲を記載する際の「約」という語の使用は、記載の量に極めて近い値（製造上の公差、測定時の器差及びヒューマンエラーその他に起因すると考えられる又は当然考えられる値等）がその量に含まれることを示すためのものである。量を表す全ての百分率は、別段の定めがない限り、質量基準である。
【００２７】
本明細書で引用する非特許又は特許文献を含めた参考文献が先行技術を構成するとは自認しない。特に、別段の定めがない限り、本明細書において文献に言及しても、これらの文献のいずれかが米国又は他国において当該分野における共通一般知識の一部を構成すると発明者が自認することにはならないということが理解される。参考文献についての論考はその著者の主張を述べたものであって、出願人は本明細書で引用する全ての文献の正確さ及び妥当性に異議を申し立てる権利を留保する。別段の明示的な定めがない限り、本明細書で引用する全ての参考文献は参照により全て援用される。引用文献に見られる定義及び/又は記述間に相違がある場合は本開示に従う。
【００２８】
以下の実施例は説明のためのものにすぎず、本発明又は添付の請求項の範囲を限定することを意図してはいない。
【実施例】
【００２９】
ＤＧ−３ベニノキ抽出物の調製及び分析
粉砕したベニノキ種子２００ｇを４００ｍＬのヘキサンでの２４時間にわたる抽出に供した。抽出物を真空下で濾過し、得られた液体を減圧下で濃縮した。残留物を更に４００ｍＬのヘキサンでの抽出に供し、この工程を合計３回繰り返した。各抽出物を１０ｍＬのヘキサンに溶解させた。各試料につき１ｍＬの溶液を、ＧＣ／ＭＳによる分析に使用した。
【００３０】
あるいは、２００ｇのベニノキ種子を秤量し、水に３日間漬けることで種子の色を抜いた。水を廃棄し、種子を取り出し、破砕し、次に４００ｍＬのヘキサンに２４時間にわたって加え、続いて真空下で濾過した。得られた液体を減圧下で濃縮した。残留物を再度、４００ｍＬのヘキサンでの抽出に供し、この工程を合計３回繰り返した。
【００３１】
抽出物のトコトリエノール含有量を、固定相がシリカゲル（７０〜２３０メッシュ、グレード６０）で移動相がヘキサン：酢酸エチル（９０：１０）の混合物であるクロマトグラフィ系での溶出により更に上昇させた。抽出物を、ヘキサン：イソプロパノール（９８：２）を用いた追加のクロマトグラフィステップにより更に濃縮及び精製した。トコトリエノールの濃縮に加えて、これらのクロマトグラフィステップを用いてステロール等の望ましくないファイトケミカルを除去する。
【００３２】
ＧＣ／ＭＳ
定量化のために２μＬの試料をＧＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ５９７５  ＧＣ／ＭＳＤ）に注入することで測定を行った。ＧＣは３０ｍ  ＨＰ−５  ＭＳカラム（０．２５０ｍｍ  １０μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を備える。ヘリウムをキャリアガスとして、ヘッド圧２７．６４ｐｓｉ、スプリットレス、パージ流量５０ｍＬ／分（パージまで１分）で使用した。インジェクタ及びトランスファーラインをそれぞれ２７５℃及び２８５℃で維持した。カラム温度を２２０℃で２分間維持した後、２８５℃まで１０℃／分の勾配で上昇させ、この温度で５分間維持し、最後に２５℃／分の勾配で３００℃まで上昇させ、この温度で１０分間維持した。質量分析計条件は、シングルイオンモードで電子衝撃、イオン源温度２３０℃、ＭＳ四重極１５０℃、イオン化電圧７０ｅＶであった。図２を参照のこと。
【００３３】
較正及び直線性
分析用の５点較正曲線を、ピーク面積をＤＴ３スタンダードの濃度に対してプロットすることで得た。以下の濃度を較正曲線に用いた：２．０ｘ１０-5、８．０ｘ１０-5、１８．０ｘ１０-5、２７．０ｘ１０-5及び３８．０ｘ１０-5ｍｇ／ｍＬ。この濃度範囲で直線性が確立された：ｙ＝７４０８１ｘ−９２９０８（ｘはδ−トコトリエノールの濃度であり、ｙはピーク面積である）。適合度（ｒ2）は０．９９９であった。最低濃度０．５６ｘ１０-10μｇ／μＬの場合の変動係数（ＣＶ）は１６．９７％であった。これはＬＯＱ［２］の場合の許容可能な最大値２０％より低い。
【００３４】
δ−トコトリエノールの場合、分析用の５点較正曲線を、δ−トコトリエノール対α−トコトリエノールピーク面積比を公知のδ−トコトリエノール濃度に対してプロットすることで得た。３２ｎｇのα−トコトリエノールを全ての試料に内標準として添加した。濃度０．０４ｘ１０-10、０．１５ｘ１０-10、０．５８ｘ１０-10、２．２５ｘ１０-10及び９．００ｘ１０-10μｇ／μＬを較正曲線に使用した。この濃度範囲で直線性が確立された：ｙ＝１．７８８ｘ＋０．２８０（ｘはδ−トコトリエノールの濃度であり、ｙはピーク面積比である）。適合度（ｒ2）は０．９９９である。最低濃度２．０ｘ１０-5ｍｇ／ｍＬの場合の変動係数（ＣＶ）は１２％であった。これはＬＯＱ［２］の場合の許容可能な最大値２０％より低い。
【００３５】
残りの濃度全てについての変動係数は、許容される最大１５％より低かった。
【００３６】
下の表１は、２つの抽出手順の結果を示す。
【００３７】
【表１】
2019038819.tif 000003
【００３８】
モルホロジーアッセイ
Ｈ９ｃ２心筋細胞を５μＭのＤＴ３又は５μＭのＤＧ−３又はビヒクルコントロール（ＤＭＳＯ）で一晩処理した。次に、細胞を１００又は２００μＭのＨ2Ｏ2に４時間曝露した。形態学的変化を倒立顕微鏡下で記録した。図３に示すように、Ｈ2Ｏ2で処理していない細胞は、健康な細胞のコンフルエントな単層に見える。１００μＭのＨ2Ｏ2で処理した細胞は４時間後に若干の損傷を示すが、円形細胞及び細胞単層における裂け目で示されるように、ＤＴ３又はＤＧ−３での処理によりその損傷は限定される。２００μＭのＨ2Ｏ2での処理後、無処理の細胞では多数の円形細胞及び死にかけの細胞が見られ、ＤＴ３及びＤＧ−３で処理した細胞は依然として数個の円形細胞しかない単層を維持する。
【００３９】
ＤＧ−３の脂質過酸化阻害能
ビタミンＥ成分の最もよく知られた性質の１つは、その脂質過酸化防止能である。Ｔｒａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ５１（５）：１０００−１０１３を参照のこと。簡単に説明すると、ＴＢＨＰ（チオバルビツール酸反応性物質）での処理後に脂質過酸化の阻害を測定することで、ラットの肝ミクロソームにおいてＤＧ−３の抗酸化活性を評価した。ウィスターラット肝ミクロソーム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をリン酸緩衝液０．１Ｍ（ｐＨ７．４）中、最終タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌで希釈した。ミクロソームを異なるＤＧ−３又はＤＴ３（ＤＭＳＯで希釈）濃度で処理し、３７℃で１時間にわたってインキュベートしてから２００μＭのＴＢＨＰ（ＤＭＳＯ）での脂質過酸化を３０分間にわたって誘導した。２００μＭのＴＢＨＰで処理したラット肝ミクロソームの過酸化阻害に関するアッセイにおいて、δ−トコトリエノールは抗酸化力ＩＣ50＝２．５８μＭを示し、ＤＧ−３はより高い抗酸化力ＩＣ50＝１．１μＭ）を示した（図４）。これらの結果は、ＤＧ−３が、インビボで試験した場合に、強力な生物活性を有するという考えを裏付けている。
【００４０】
細胞生体エネルギー測定
過去に記載されたように、ＸＦ９６細胞外アナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して細胞酸素消費速度（ＯＣＲ）を３７℃で測定した（Ｆｅｒｒｉｃｋ  ＤＡ、Ｎｅｉｌｓｏｎ  Ａ及びＢｅｅｓｏｎ  ＣのＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｌｕｘ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  ２００８；１３：２６８−２７４）。簡単に説明すると、ウェル１つあたり１００００個のＨ９Ｃ２細胞をプレーティングした。細胞を、５μＭのＤＴ３又は５μＭのＤＧ−３又はビヒクルコントロール（ＤＭＳＯ）で一晩処理した。次に、細胞を、０、５０若しくは１００μＭのＨ2Ｏ2に４時間又は６Ｇｙの電離放射線（ＩＲ）に曝露した。ウェル内の培地を、４ｍＭのグルタメートを補充した非緩衝ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）と交換し、非ＣＯ2インキュベータ内で１時間にわたって３７℃でインキュベートした。３回分のベースライン測定値を得てからミトコンドリア阻害剤又は脱カップリング剤を注入した。オリゴマイシン（１０μＭ）、ＦＣＣＰ（１０μＭ）及びロテノン／アンチマイシンＡ（１０μＭ）を順次添加し、値を読み取った。ＯＣＲをシーホースＸＦ９６ソフトウェアで計算し、ＯＣＲは１２〜１６個の測定値の平均となる。図５は、５μＭのＤＴ３又はＤＧ−３での処理が心筋細胞の酸素消費速度に及ぼす影響を示す。ＤＴ３及びＤＧ−３は、コントロールと比較して、心筋細胞のＯＣＲを若干改善した。図６は、５０又は１００μＭのＨ2Ｏ2での処理の、心筋細胞の酸素消費速度への影響を示す。５０μＭ処理により細胞のＯＣＲははっきりと低下したが、１００μＭ処理で細胞のＯＣＲはほぼベースライン速度まで低下した。図７及び８でそれぞれ示すように、ＤＴ３又はＤＧ−３で細胞を前処理することで、細胞に対するＨ2Ｏ2処理の影響は排除され、また影響は有意に減少した。図９は、細胞を放射線被爆から防護するためのＤＴ３又はＤＧ−３での細胞の前処理の効果を示す。
【００４１】
クローン原性細胞生存アッセイ
細胞を、５ｍｌの完全培地が入った６０ｍｍシャーレにプレーティングし、３７℃で２４時間にわたって接着及びインキュベートした。細胞に３Ｇｙで放射線を照射した後、過去に記載されたように、トリプシン処理を施し、数を数え、クローン原性生存アッセイのためにプレーティングした（Ａｙｋｉｎ−Ｂｕｒｎｓ  Ｎ、Ａｈｍａｄ  ＩＭ、Ｚｈｕ  Ｙ、Ｏｂｅｒｌｅｙ  ＬＷ、Ｓｐｉｔｚ  ＤＲ）。上昇した超酸化物及びＨ2Ｏ2レベルが、グルコースの欠乏に対する感受性をがん細胞と正常な細胞とで異なるものにする（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２００９；４１８：２９−３７）。適切なプレーティング希釈度は、実験及びその電離放射線線量で予測される生存率により決定した。１０日後、コロニーを７０％エチルアルコールで固定し、クーマシーブルーで染色し、数を数えた。正規化生存率を、実験で処理した細胞のコロニー形成率を偽処理コントロール細胞のコロニー形成率で割ることで求めた。結果を図１０に示す。図１０から、ＤＧ−３が細胞をＤＴ３より良好に放射線から防護したことがわかる。
【００４２】
放射線防護度に関する研究
本研究の目的は、潜在的な放射線対応策の防護効果の査定に使用される一般的な動物モデルにおいてＤＧ−３組成物を試験することであった。これらの実験では、全身照射のマウスモデルを使用する。ＤＧ−３組成物を、マウスに皮下投与し、２つの異なる放射線レベル（８．５Ｇｙ及び９．５Ｇｙ）での照射後、処置を施した及び処置を施していないマウスを３０日間にわたってその生存についてモニタすることで、その固有の放射線防護活性について試験した。本研究の結果から、ＤＧ−３組成物が容認された動物モデルにおける効果的な放射線防護剤であることが判明した。
【００４３】
一般的な実験アプローチ
実験開始に先立って６〜８週齢のオスのＣＤ２Ｆ１マウスを１週間飼育し、食餌及び水を随意摂取させた。実験１週間前からマウスにビタミンＥ欠乏固形飼料（Ｈａｒｌａｎ  Ｃｏ．）を与えることで、試験組成物の放射線防護成分の吸収を妨げる可能性がある血中α−トコフェロールレベルを低下させた。ＣＤ２Ｆ１マウスは、他のマウス株より世代間での全身照射に対する反応における差が少ない。このマウスモデルを用いてＤＧ−３組成物が放射線障害及び致死性に及ぼす影響を査定し、投与は全身照射２４時間前に開始した。これは典型的な放射線防護プロトコルである。表２は実験手順をまとめたものである。
【００４４】
【表２】
2019038819.tif 000004
【００４５】
全身照射の２４時間前（−１日目）、マウスに、ビヒクル又は３００ｍｇ／ｋｇのトコトリエノール（γ及びδ）を含有するように標準化した実験組成物ＤＧ−３を皮下注射で投与した。次の日（０日目）、後述するように、マウスに１回の線量８．５又は９．５Ｇｙで全身照射を行った。これらの線量レベルは、このマウス株での公知の３０日ＬＤ５０（ＬＤ５０／３０）に近似するように選択された（８．５Ｇｙ）。３０日間生存率をこれらのマウスで査定した。コントロール（偽処置）グループのマウスにはＤＧ−３組成物（３００ｍｇ／ｋｇトコトリエノール当量）を投与したものの、照射には供さなかった。
【００４６】
毒性スクリーニング
表２において、２つのマウスグループには照射を行わなかった。一方のグループにはビヒクルのみを投与し、もう一方のグループにはＤＧ−３組成物（３００ｍｇ／ｋｇトコトリエノール当量）を皮下注射により投与した。カプラン・メイヤー曲線を用いてこれら２つのグループの３０日間生存率を比較することで、ＤＧ−３組成物に毒性がないことが判明した。
【００４７】
手順
全身照射
マウスに１回の線量が８．５又は９．５Ｇｙの全身照射をＭａｒｋ  Ｉモデル６８Ａセシウム１３７動物用放射線照射装置（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、サンフェルナンド、カリフォルニア）を使用して行った。無麻酔のマウスを、垂直の仕切板で８つ切りのケーキ様の区画に分割した換気が良い円筒形チャンバ（Ｊ．Ｌ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）に１チャンバに１匹ずつ入れ、マウスに動くのに十分な空間を与えた。チャンバを１分間に６回転するターンテーブル上に置くことで照射が均等に行われるようにした。マウスを放射線照射装置の第３位置に入れ、線量率１．０９Ｇｙ／分で照射を行った。従って、最大放射線線量にするには８．２７分の照射時間が必要となり、マウスのホルダ内滞在時間は１０分未満であった。
【００４８】
ＤＧ３組成物の投与
実験グループのマウスに、Ｔｗｅｅｎ８０（５％）、ＰＥＧ８０中のＤＧ３組成物エマルション３００ｍｇ／ｋｇを皮下注射した。モル基準では、これは０．７５６ｍｍｏｌ／ｋｇに等しい。ネガティブコントロールのマウスにはビヒクルのみを投与した。
【００４９】
結果
カプラン・メイヤー曲線（図１１及び１２）で表される実験結果は、単回量のＤＧ−３組成物を投与されたマウスの１００％が、ビヒクルのみを与えられたマウスにとって５０％（８．５Ｇｙ）及び１００％（９．５Ｇｙ）で致死的であった放射線線量を生き延びたことを示す。更に、ＤＧ−３はそれ自身の毒性を示さなかった。これらの結果はＤＧ−３のマウスにおける放射線防護活性の決定的な証拠となり、歴史的にヒトでの放射線防護活性を予測するものであることがわかっている。
【図１】
2019038819.tif 000005
【図２】
2019038819.tif 000006
【図３】
2019038819.tif 000007
【図４】
2019038819.tif 000008
【図５】
2019038819.tif 000009
【図６】
2019038819.tif 000010
【図７】
2019038819.tif 000011
【図８】
2019038819.tif 000012
【図９】
2019038819.tif 000013
【図１０】
2019038819.tif 000014
【図１１】
2019038819.tif 000015
【図１２】
2019038819.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月14日(2018.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２：１〜１０：１の比でδ−トコトリエノール及びγ−トコトリエノールを含む植物抽出物であって、全トコトリエノールが組成物の１５〜９５％を占め、トコフェロールが前記抽出物の１％未満であることを特徴とする、抽出物。
【請求項２】
前記δ−トコトリエノール対γ−トコトリエノール比が、７：１〜９：１である、請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
前記トコトリエノールが、組成物の５０％を超える、請求項１に記載の抽出物。
【請求項４】
前記抽出物が、実質的にトコフェロールを含有しない、請求項１に記載の抽出物。
【請求項５】
前記抽出物が、全トコトリエノールを少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項６】
前記抽出物が、全トコトリエノールを少なくとも５００ｍｇ／ｍＬ含む、請求項５に記載の抽出物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抽出物と、医薬的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項８】
剤形中に全トコトリエノールを少なくとも１ｇ含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
非ヒト被験者の治療方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抽出物又は請求項７若しくは８に記載の医薬組成物の有効量を、前記非ヒト被験者に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記非ヒト被験者が、放射線防護剤又は放射線被爆治療を必要としている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記非ヒト被験者が、酸化防止剤、抗炎症剤、免疫調節剤、抗血栓剤、アテローム産生抑制剤、低コレステロール血症治療薬、又はＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤での治療を必要としている、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記非ヒト被験者が、放射線被爆、がん、冠動脈疾患を含むがこれに限定するものではない循環器疾患、高リポタンパク質レベル、高コレステロールレベル、高トリグリセリド、加齢性黄斑変性、白内障、緑内障、慢性疼痛、慢性疲労症候群、発熱、浮腫、糖尿病、老化現象、リウマチ様疾患、敗血症性ショック、及びアルツハイマー病から成る群から選択される状態を有する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
結果
カプラン・メイヤー曲線（図１１及び１２）で表される実験結果は、単回量のＤＧ−３組成物を投与されたマウスの１００％が、ビヒクルのみを与えられたマウスにとって５０％（８．５Ｇｙ）及び１００％（９．５Ｇｙ）で致死的であった放射線線量を生き延びたことを示す。更に、ＤＧ−３はそれ自身の毒性を示さなかった。これらの結果はＤＧ−３のマウスにおける放射線防護活性の決定的な証拠となり、歴史的にヒトでの放射線防護活性を予測するものであることがわかっている。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕２：１〜１０：１のδ−トコトリエノール対γ−トコトリエノール比を有するベニノキ種子抽出物の調製方法であって、
（ａ）ベニノキ種子から油を抽出してベニノキ種子油を製造する工程、及び、
（ｂ）クロマトグラフィにより前記ベニノキ種子油からトコトリエノールを濃縮する工程を含むことを特徴とする方法。
〔２〕前記δ−トコトリエノール対γ−トコトリエノール比が、５：１〜９：１である、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記クロマトグラフィ後、前記δ−トコトリエノール及びγ−トコトリエノールが合計で組成物の１５〜９５％を占める、前記〔１〕に記載の方法。
〔４〕前記油が、前記ベニノキ種子からヘキサン抽出される、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５〕前記トコトリエノールが、ヘキサン：酢酸エチル溶媒を使用したクロマトグラフィにより分離される、前記〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６〕前記ヘキサン：酢酸エチル溶媒が、９０：１０の比を有する、前記〔５〕に記載の方法。
〔７〕前記トコトリエノールが、ヘキサン：イソプロパノール溶媒を使用したクロマトグラフィにより分離される、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８〕前記ヘキサン：イソプロパノール溶媒が、９８：２の比を有する、前記〔７〕に記載の方法。
〔９〕前記〔１〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の方法により調製される組成物。
〔１０〕２：１〜１０：１の比でδ−トコトリエノール及びγ−トコトリエノールを含む植物抽出物。
〔１１〕前記δ−トコトリエノール対γ−トコトリエノール比が、５：１〜９：１である、前記〔１０〕に記載の抽出物。
〔１２〕前記δ−トコトリエノール対γ−トコトリエノール比が、７：１〜９：１である、前記〔１０〕に記載の抽出物。
〔１３〕全トコトリエノールが、組成物の１５〜９５％を占める、前記〔１０〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載の抽出物。
〔１４〕前記トコトリエノールが、組成物の３０％を超える、前記〔１３〕に記載の抽出物。
〔１５〕前記トコトリエノールが、組成物の５０％を超える、前記〔１３〕に記載の抽出物。
〔１６〕５％未満のトコフェロールを更に含む、前記〔１０〕〜〔１５〕のいずれか一項に記載の抽出物。
〔１７〕前記トコフェロールが、前記抽出物の１％未満である、前記〔１６〕に記載の抽出物。
〔１８〕前記抽出物が、実質的にトコフェロールを含有しない、前記〔１７〕に記載の抽出物。
〔１９〕前記抽出物が、全トコトリエノールを少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ含む、前記〔１０〕〜〔１８〕のいずれか一項に記載の抽出物。
〔２０〕前記抽出物が、全トコトリエノールを少なくとも５００ｍｇ／ｍＬ含む、前記〔１９〕に記載の抽出物。
〔２１〕前記〔９〕に記載の組成物又は前記〔１０〕〜〔２０〕のいずれか一項に記載の抽出物と、医薬的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
〔２２〕剤形中に全トコトリエノールを少なくとも１ｇ含む、前記〔２１〕に記載の医薬組成物。
〔２３〕被験者の治療方法であって、前記〔９〕に記載の組成物、前記〔１０〕〜〔２０〕のいずれか一項に記載の抽出物、又は前記〔２１〕、〔２２〕に記載の医薬組成物の有効量を、前記被験者に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
〔２４〕前記被験者が、放射線防護剤又は放射線被爆治療を必要としている、前記〔２３〕に記載の方法。
〔２５〕前記被験者が、酸化防止剤、抗炎症剤、免疫調節剤、抗血栓剤、アテローム産生抑制剤、低コレステロール血症治療薬、又はＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤での治療を必要としている、前記〔２３〕に記載の方法。
〔２６〕前記被験者が、放射線被爆、がん、冠動脈疾患を含むがこれに限定するものではない循環器疾患、高リポタンパク質レベル、高コレステロールレベル、高トリグリセリド、加齢性黄斑変性、白内障、緑内障、慢性疼痛、慢性疲労症候群、発熱、浮腫、糖尿病、老化現象、リウマチ様疾患、敗血症性ショック、及びアルツハイマー病から成る群から選択される状態を有する、前記〔２３〕〜〔２５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２７〕放射線防護及び／又は放射線緩和のための、前記〔９〕に記載の組成物又は前記〔１０〕〜〔２０〕のいずれか一項に記載の抽出物又は前記〔２１〕、〔２２〕に記載の医薬組成物の使用であって、前記組成物又は抽出物を、それを必要としている被験者に投与する工程を含むことを特徴とする使用。
【外国語明細書】
2019038819000001.pdf