(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫調節作用を有する単球の出現機構を明らかとすることを目的とし、より具体的には免疫調節作用を有する単球を同定するための方法、当該単球において特異的に発現する遺伝子を同定すること、また、単離された免疫調節作用を有する単球自体の提供。【解決手段】Ｌｙ６Ｃ遺伝子と共にＹｍ１遺伝子を発現する単球が炎症の解消および組織修復に寄与する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する、免疫調節作用を有する単球。
【請求項２】
前記免疫調節作用は、炎症抑制作用または創傷治癒促進作用である、請求項１に記載の単球。
【請求項３】
免疫調節作用を有する単球集団を製造する方法であって、
単球集団から、Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する細胞を選択することを含む、前記方法。
【請求項４】
単球集団のなかから免疫調節作用を有する単球を検出する用途に用いられる判定用マーカーであって、
抗Ｙｍ１タンパク質またはそのホモログに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、前記マーカー。
【請求項５】
Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を解析するための実験動物であって、Ｙｍ１タンパク質またはそのホモログタンパク質と標識タンパク質が融合した融合タンパク質をコードする遺伝子を有することにより、単球におけるＹｍ１タンパク質またはそのホモログタンパク質の発現を検出することが可能となっている前記実験動物。
【請求項６】
Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を解析するための実験動物であって、Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する細胞を除去し得るように改変されたゲノムを有する前記実験動物。
【請求項７】
単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を調節する化合物をスクリーニングする方法であって
（１）請求項１に記載の単球を含む単球集団に、候補化合物を投与する工程
（２）前記単球集団においてＹｍ１遺伝子を発現する細胞の割合を測定する工程
（３）前記候補化合物が、前記Ｙｍ１遺伝子を発現する細胞の割合を変化させた場合に、前記候補化合物を単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を調節する化合物として同定する工程、
を含む前記方法。
【請求項８】
単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を調節する化合物をスクリーニングする方法であって
（１）単球前駆細胞集団に、候補化合物を投与する工程
（２）前記単球前駆細胞集団から単球集団を分化させる工程
（３）前記分化した単球集団においてＹｍ１遺伝子を発現する細胞の割合を測定する工程
（４）前記候補化合物が、前記Ｙｍ１遺伝子を発現する細胞の割合を変化させた場合に、前記候補化合物を単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を調節する化合物として同定する工程、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する、免疫調節作用を有する単球およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
単球−マクロファージ細胞系列は高い可塑性を有し、環境からのシグナルに応じてその表現型を様々に変化させることが知られている（非特許文献１〜３）。このような単球−マクロファージ細胞系列の性質のために、組織損傷または創傷からの回復において、様々な表現型を有するマクロファージが出現すると考えられている。単球は創傷の急性期において創傷組織に移動し、炎症を誘導する一方、創傷の原因が除去された後は、単球から由来するマクロファージが炎症の消散および組織回復に寄与すると考えられている。
【０００３】
しかしながら、そのメカニズムについては完全に理解されていない。例えば、上記創傷からの回復段階における免疫調節性マクロファージの出現機構は、炎症部位における環境シグナルによる炎症性単球の再配向であることが示唆されている（非特許文献４〜７）。一方、その機構は、骨髄において新規に出現する免疫調節性マクロファージの炎症部位への補充であるとも考えられている。
【０００４】
このような創傷からの回復機構を理解することは、正常な創傷回復を促進させる医薬または治療法を提供するための基礎となる情報を提供するものであり、その理解を深めることは極めて重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ，２０１４年，Ｖｏｌ．１５７，ｐｐ．８３２−８４４
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ，２０１６年，Ｖｏｌ．１６５，ｐｐ．６６８−６７８
【非特許文献３】Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１６年，Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．１８−２５
【非特許文献４】Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，２０１２年，Ｖｏｌ．１２２，ｐｐ．７８７−７９５
【非特許文献５】Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１１年，Ｖｏｌ．１１，ｐｐ．７２３−７３７
【非特許文献６】Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１６年，Ｖｏｌ．４４，ｐｐ．４５０−４６２
【非特許文献７】Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１６年，Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．３４−４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、免疫調節作用を有する単球の出現機構を明らかとすることを目的とし、より具体的には免疫調節作用を有する単球を同定するための方法、当該単球において特異的に発現する遺伝子を同定すること、また、単離された免疫調節作用を有する単球自体を提供することを目的とする。
【０００７】
さらに、このように単離された免疫調節作用を有する単球を同定するためのマーカー、および生体内で当該免疫調節作用を有する単球を同定することが可能なように遺伝子修飾をされた実験動物を提供することを目的とする。
【０００８】
また、当該免疫調節作用を有する単球の性質に影響を与える化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題について本発明者らが鋭意研究を進めたところ、Ｌｙ６Ｃ遺伝子を高発現する単球（Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ単球）の一部が、炎症の解消および組織修復に寄与していることを発見した。更なる研究の結果、当該単球は、Ｌｙ６Ｃ遺伝子と共にＹｍ１遺伝子を発現していることが判明した。より詳細な解析の結果、炎症過程において骨髄において大幅に増加したＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ単球は、損傷部位に浸潤し、免疫調節機能および組織回復機能を発揮する。反対に、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ単球を生体内から減少させると、炎症からの回復が遅延することが明らかとなった。これらの結果は、免疫調節機能および組織回復機能を有するように新たに誘導された単球の一部が、骨髄において産生されることを裏付けている。
【００１０】
これら知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は一態様において以下のものを提供する。
【００１２】
［１］Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する、免疫調節作用を有する単球。
【００１３】
［２］前記免疫調節作用は、炎症抑制作用または創傷治癒促進作用である、前記［１］に記載の単球。
【００１４】
［３］免疫調節作用を有する単球集団を製造する方法であって、
単球集団から、Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する細胞を選択することを含む、前記方法。
【００１５】
［４］単球集団のなかから免疫調節作用を有する単球を検出する用途に用いられる判定用マーカーであって、
抗Ｙｍ１タンパク質またはそのホモログに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、前記マーカー。
【００１６】
［５］Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を解析するための実験動物であって、Ｙｍ１タンパク質またはそのホモログタンパク質と標識タンパク質が融合した融合タンパク質をコードする遺伝子を有することにより、単球におけるＹｍ１タンパク質またはそのホモログタンパク質の発現を検出することが可能となっている前記実験動物。
【００１７】
［６］Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を解析するための実験動物であって、Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する細胞を除去し得るように改変されたゲノムを有する前記実験動物。
【００１８】
［７］単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を調節する化合物をスクリーニングする方法であって
（１）前記［１］に記載の単球を含む単球集団に、候補化合物を投与する工程
（２）前記単球集団においてＹｍ１遺伝子を発現する細胞の割合を測定する工程
（３）前記候補化合物が、前記Ｙｍ１遺伝子を発現する細胞の割合を変化させた場合に、前記候補化合物を単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を調節する化合物として同定する工程、
を含む前記方法。
【００１９】
［８］単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を調節する化合物をスクリーニングする方法であって
（１）単球前駆細胞集団に、候補化合物を投与する工程
（２）前記単球前駆細胞集団から単球集団を分化させる工程
（３）前記分化した単球集団においてＹｍ１遺伝子を発現する細胞の割合を測定する工程
（４）前記候補化合物が、前記Ｙｍ１遺伝子を発現する細胞の割合を変化させた場合に、前記候補化合物を単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を調節する化合物として同定する工程、
を含む前記方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、免疫調節作用を有する単球を同定、分離することが可能になり、当該免疫調節作用を有する単球の機能、性質、誘導方法等についてさらなる研究を行うことが可能となる。
【００２１】
また、免疫調節作用を有する単球を同定するために利用できるマーカーの探索、生体内で当該免疫調節作用を有する単球を同定することが可能なように遺伝子修飾をされた実験動物を提供することも可能となる。
【００２２】
さらに、当該免疫調節作用を有する単球を使用し、上記マーカーなどを利用することにより、免疫調節作用を有する単球の機能、性質、誘導に影響を与える化合物のスクリーニング方法等を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】炎症後期におけるＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球亜群の増加を示す。リポ多糖類（ＬＰＳ）刺激後（１００μｇ／マウス）の各時間において、Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓマウスにおける末梢血白血球を解析した。ヒストグラム中の数字は、各画分中のＹｍ１−Ｖｅｎｕｓ陽性細胞のパーセンテージを示す。薄い色の領域がＹｍ１−Ｖｅｎｕｓ陽性マウス、濃い色の領域が野生型マウスのデータを示す。少なくとも２回の独立して行われた実験結果の代表例を示す。図中「Ｍｏ」は単球、「Ｎｅｕ」は好中球を意味する（図１Ｂ〜１Ｅにて同じ）。
【図１Ｂ】炎症後期におけるＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球亜群の増加を示す。各時間におけるＬｙ６Ｃｈｉ血液単球中のＹｍ１−Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の動態を示す。データは平均±標準偏差を示す。＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊＊はＰ＜０．０００１、ｎ．ｓ．は有意でないないことを示す。一方向ＡＮＯＶＡ解析。ｎ＝３。
【図１Ｃ】炎症後期におけるＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球亜群の増加を示す。脾臓由来の白血球中のＹｍ１−Ｖｅｎｕｓの発現を示す。
【図１Ｄ】炎症後期におけるＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球亜群の増加を示す。骨髄由来の白血球中のＹｍ１−Ｖｅｎｕｓの発現を示す。
【図１Ｅ】炎症後期におけるＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球亜群の増加を示す。骨髄由来の白血球中のＹｍ１−Ｖｅｎｕｓの発現を示す。
【図２Ａ】Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球が免疫調節表現型を有することを示す。脾臓から分画された単球をエクスビボでＬＰＳにより刺激した（１μｇ／ｍｌ）。培養上清中の各サイトカインの濃度を測定した。ｎ＝３。データは平均±標準偏差を示す。＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１、＊＊＊＊はＰ＜０．０００１、ｎ．ｓ．は有意でないないことを示す。スチューデントＴテスト。少なくとも２回の独立して行われた実験結果の代表例を示す（図２Ｂも同様）。
【図２Ｂ】Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球が免疫調節表現型を有することを示す。骨髄から分画された単球（４ｘ１０５個）を、ＬＰＳ（１０μｇ／マウス）を注入した野生型マウスに養子性移入した。４８時間後に、血清サイトカイン濃度を測定した。ｎ＝４。
【図３Ａ】Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球亜群は結腸炎からの回復において、重要な役割を担うことを示す。結腸におけるＹｍ１−Ｖｅｎｕｓ＋Ｌｙ６ＣｈｉまたはＹｍ１−Ｖｅｎｕｓ−Ｌｙ６Ｃｈｉ単球での、各遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを示す。ｎ＝５〜７。グラフ中それぞれの記号は各動物を示す。データは平均±平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を示す。＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１、ｎ．ｓ．は有意でないないことを示す。少なくとも２回の独立して行われた実験結果の代表例を示す（図３Ｂ〜Ｄも同様）。
【図３Ｂ】Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球亜群は結腸炎からの回復において、重要な役割を担うことを示す。デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）投与から８日および１０日の時点でＤＴを腹腔内投与した。各時点における平均体重を平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）と共に示す。野生型マウスはｎ＝７、ＹＭ１−ＤＴＲマウスはｎ＝８。多重比較を伴う双方向ＡＮＯＶＡ。
【図３Ｃ】Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球亜群は結腸炎からの回復において、重要な役割を担うことを示す。ＤＳＳ投与から１２日の時点での直腸の顕微鏡観察結果を示す。野生型マウス（ＷＴ）（左）およびＹｍ１−ＤＴＲマウス（右）からのヘマトキシリンおよびエオシン染色の結果を示す。スケールバーは１００μｍ。オリジナルの倍率は、１０倍（上パネル）および２０倍(下パネル)。６匹のマウスから得た画像の代表例を示す。
【図３Ｄ】Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球亜群は結腸炎からの回復において、重要な役割を担うことを示す。直腸組織におけるｍＲＮＡ発現レベル（ＤＳＳ投与から１０日の時点）。ＤＳＳ投与から８日および１０日の時点でジフテリア毒素（ＤＴ）を腹腔内投与した。ｎ＝３／遺伝子型。スチューデントＴテスト。
【図４Ａ】骨髄中のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球の由来を示す図である。骨髄に対するＬＰＳ全身注入後４８時間の時点におけるＹｍ１−Ｖｅｎｕｓ発現を示す。少なくとも２回の独立して行われた実験結果の代表例を示す。ヒストグラム中の数字は、各分画中のＹｍ１−Ｖｅｎｕｓ陽性細胞のパーセンテージを示す。図中「Ｍｏ」は単球、「Ｎｅｕ」は好中球を意味する（図４Ｂ〜４Ｅにて同じ）。
【図４Ｂ】骨髄中のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球の由来を示す図である。Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓマウス（ＣＤ４５．２＋）の骨髄由来の４ｘ１０４の顆粒球前駆細胞（ＧＰ）または１．７ｘ１０５の共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）をＬＰＳ（１０μｇ／マウス）を注入されたマウスＣＤ４５．１＋野生型コンジェニックマウスに養子性移入した。４８時間後に、ＣＤ４５．２＋末梢血白血球におけるＹｍ１−Ｖｅｎｕｓの発現を解析した。薄い色の領域がＹｍ１−Ｖｅｎｕｓ陽性マウス、濃い色の領域が野生型マウスのデータを示す。
【図４Ｃ】骨髄中のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球の由来を示す図である。ナイーブＹｍ１−Ｖｅｎｕｓマウスの骨髄由来のＣＤ４５．１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球（５ｘ１０５個）を、ＬＰＳ（１０μｇ／マウス）を注入されたマウスＣＤ４５．１＋野生型コンジェニックマウスに移入した。移入後の１４〜４８時間後に、ＣＤ４５．２＋末梢血球におけるＹｍ１−Ｖｅｎｕｓの発現を解析した。
【図４Ｄ】骨髄中のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球の由来を示す図である。Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓマウス由来の分画されたｃＭｏＰを各サイトカインの存在下で培養した。７２時間後に、培養された細胞をフローサイトメトリーで解析した。
【図４Ｅ】骨髄中のＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉ単球の由来を示す図である。全培養細胞の平均（上パネル）およびＹｍ１−Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の平均を標準偏差と共に示す。ｎ＝４．
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の実施形態について説明する。以下の説明は単なる例示であり、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００２５】
（定義）
本明細書において、複数の数値の範囲が示された場合、それら複数の範囲の任意の下限値および上限値の組み合わせからなる範囲も同様に意味する。
【００２６】
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。本明細書においては、「同定」、「分離」、「単離」、「純化」といった用語も、同様の意味で使用されることがある。
【００２７】
本明細書において、「創傷」とは、外的な暴力、機械的作用または感染性疾患に起因して、代表的には組織の分裂または膜（例えば皮膚）の断裂を伴う器官または組織の傷害、損傷、および感染性、あるいは非感染性炎症の結果、正常な組織構造を喪失した状態等を広範に指す。「創傷」は、裂創、擦過創、裂離、切り傷、銃創、透過創傷、穿刺創、挫傷、血腫、裂傷および／または挫滅創を含むが、これらに限定されない。
【００２８】
当該器官または組織は、例えば、皮膚および／またはその下にある組織、粘膜、または他の上皮、例えば、角膜上皮であってもよい。皮膚は、例えば、表皮、真皮および皮下組織、例えば、口腔粘膜であってもよい。
【００２９】
創傷は、開放創および閉鎖創に分類され得る。
【００３０】
開放創とは、組織、例えば、皮膚または粘膜が裂けたか、切れたかまたは刺された創傷のタイプのことを指す。開放創は、その創傷を引き起こした物体に従ってさらに分類され得る。開放創のタイプとしては、例えば、清浄な鋭い刃をした物体（例えば、メス、剃刀またはガラス破片）によって引き起こされる切開または切創；いくらか鈍い外傷によって引き起こされる変則的な裂傷様の創傷である裂傷；粗面に滑り落ちることによって引き起こされることが多い、皮膚の最上層（表皮）がこすり落ちた表層性の創傷である擦過創（擦過傷）；皮膚または粘膜を穿刺する物体（例えば、爪または針）によって引き起こされる刺創；皮膚または粘膜に突き刺され、抜き出されるメスなどの物体によって引き起こされる貫通創；銃弾、または身体に向かって衝突するかもしくは身体を通過する同様の発射体によって引き起こされる銃創（例えば、進入部位におけるものおよび脱出部位におけるもの）が挙げられる。
【００３１】
閉鎖創とは、例えば、鈍力外傷によって引き起こされた、組織（例えば、皮膚または粘膜）が破壊されない創傷のタイプのことを指す。閉鎖創のタイプとしては、例えば、皮膚または粘膜の下の組織を損傷する鈍力外傷が原因の挫傷または打撲傷；血液を皮膚下または粘膜下に集める、血管に対する損傷が原因の血腫または血液腫瘍；長時間にわたって多大なまたは極端な量の力がかかったことが原因の挫滅傷；組織を破壊する外傷の結果である急性または外傷性の創傷；およびしばしば、組織の循環または他の全身的なサポートが不十分であることによってその組織が機能しなくなり崩壊するとき、創傷に至る比較的緩徐なプロセスが原因の慢性創傷（例えば、圧迫潰瘍、静脈性潰瘍、口腔潰瘍、消化性潰瘍または糖尿病性潰瘍）が挙げられる。そして、感染は、創傷部位を制し得、慢性膿瘍になる。その感染が臨界点を超えると、その感染は、局所的に広がり得るか、または全身性（敗血症）になり得る。
【００３２】
本発明に関する具体的な創傷として、以下の多様な種類の創傷が挙げられるが、これらに限定されない：外科的創傷；外傷性創傷；放射線損傷性創傷；毒物による上皮壊死性創傷；感染性創傷；腫瘍性創傷；全層創傷；一部の層の創傷；および熱傷性創傷、ならびに、多様な型の潰瘍から生じる創傷、例えば、皮膚潰瘍、角膜潰瘍、動脈閉塞性潰瘍、連続的な圧力により誘導される褥瘡および糖尿病性潰瘍、熱傷性潰瘍、傷害性潰瘍、放射線性潰瘍、薬物により誘導される潰瘍、手術後潰瘍、炎症性潰瘍、胃腸管の潰瘍、単純潰瘍および他の型の血管障害性潰瘍、ならびに慢性（難治性）潰瘍。
【００３３】
本明細書において、「創傷治癒」は組織、例えば、皮膚または粘膜が損傷後にそれ自体を修復する過程を意味する。正常な皮膚では、表皮および真皮は、外部環境に対して防護壁を形成して、定常状態の平衡で存在する。その防護壁が破壊されると、創傷治癒の生理学的プロセスが直ちに発動する。本明細書において、「創傷の治癒」、「創傷修復」、「創傷の修復」という用語は、「創傷治癒」と同様の意味で用いられる。
【００３４】
創傷治癒は、当業者に公知の方法で評価、測定することが可能であり、例えば、創傷の面積の収縮、創傷の閉鎖率、閉鎖速度および／または血管の浸潤などのパラメーターを評価することにより測定することができる。
【００３５】
本明細書において、「免疫調節」および「免疫調節作用」とは、免疫系の活性レベルにおける変化を意味する。好ましくは、本願発明の免疫調節作用を有する単球は、炎症反応を解消するように免疫系の活性レベルを変化させる。
【００３６】
単球の免疫調節作用は、公知の方法で確認することができる。例えば、免疫細胞の分泌する炎症性（例えばＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦα）または抗炎症性サイトカイン（例えばＩＬ−１０）の分泌に与える影響を調べることで確認することができる。また、炎症モデル動物に対して当該単球を移入することで生じる生理学的反応、例えば、体重変化や組織の外観変化などに基づいて確認することもできる。
【００３７】
本明細書において、特定の遺伝子の「ホモログ」は、該特定の遺伝子のヌクレオチド配列、または該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列と特定の相同性を有する実体を意味する。ここで、「相同性」という用語は、「同一性」と同じように用いられ、より具体的には、当業者に周知のアラインメントアルゴリズムを用いて２つの遺伝子のヌクレオチド配列またはこれらのコードするタンパク質のアミノ酸配列を整列させた後に、これら２つの配列間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合をいう。
【００３８】
特定の遺伝子の「ホモログ」は、当該遺伝子のコードするタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも７５、８０、８１、８５または９０％の相同性を有し、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％の相同性を有する。相同性はまた、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基の観点から考慮してもよい。
【００３９】
上記アライメントには、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １  ｐ３８７）、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、第１８章）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３〜４１０）、ＤＮＡＳＩＳＴＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）等のコンピュータプログラムを使用できるが、これらに限定されない。
【００４０】
本明細書において、抗体とある化合物が「結合する」、「反応する」、「反応性を示す」、「反応性を有する」、あるいは抗体がある化合物を「認識する」と表現する場合、本発明の分野で通常使用される意味を含み、いずれも同義で用いる。抗体とある化合物とが「結合する」か否かの確認は、当業者に周知の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などにより行うことができるほか、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の原理を利用した方法（ＳＰＲ法）などにより行うことができる。ＳＰＲ法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の名称で市販されている、装置、センサー、試薬類を使用して行うことができる。
【００４１】
本明細書において、本発明の抗体と、ある化合物が「反応しない」とは、本発明の抗体とある化合物とが実質的に反応しないことをいう。「実質的に反応しない」とは、例えば、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法において、当該化合物の添加によって、抗体と固相化抗原の結合が実質的に影響を受けないことを意味する。上記抗原固相化ＥＬＩＳＡ法以外の当業者に周知の方法・手段によっても「実質的に反応しない」ことを確認できる。
【００４２】
本明細書において、抗体が「特異的に反応する」ことは、抗体が検出可能に抗原上に提示されたエピトープに反応する能力であって、一方でその他の抗原との検出可能な反応性が比較的小さいか実質的に反応性が検出されないことをいう。例えば、抗体が特定の抗原に「特異的に反応する」場合、当該抗体は当該抗原に反応する一方、他の抗原には反応しない。好ましい態様において、抗体が特定の抗原に「特異的に反応する」場合、例えば抗原固相化ＥＬＩＳＡ法において固定化された当該抗原と当該抗体の相互作用が遊離の当該抗原によって阻害される一方で、他の遊離抗原によっては阻害されない。例えば、上記抗原固相化ＥＬＩＳＡ法による阻害を遊離抗原のＩＣ５０で表した場合、当該特異的な抗原のＩＣ５０に対して、非特異的な抗原のＩＣ５０は、１０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、１００００倍であってもよい。
【００４３】
本明細書において、「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合で相互に連結された２つの重鎖（Ｈ）と２つの軽鎖（Ｌ）を含む免疫グロブリン分子を意味する。各重鎖は、重鎖の変更可能領域（「ＨＣＶＲ」又は「ＶＨ」）及び重鎖の定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む）を含む。各軽鎖は、軽鎖の変更可能領域（「ＬＣＶＲ」又は「ＶＬ」）及び軽鎖の定常領域（ＣＬ）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、更に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と命名される超変異性の領域に分割され、フレームワーク（ＦＲ）と命名される多く保存できる領域に散在され得る。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲを含み、アミン末端からカルボキシ末端に次の順で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の変更可能領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。用語「抗体」は、また、抗体の全ての遺伝子組替え体、例えば、原核生物で発現する抗体、グリコシル化されていない抗体を含む。
【００４４】
また、Ｐａｄｌａｎ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９９５，Ｖｏｌ．９，ｐｐ．１３３−１３９、Ｖａｊｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ．，２００２，Ｖｏｌ．３２０，ｐｐ．４１５−４２８に示されるように、実際にはＣＤＲ残基の一部のみが抗原に接触することが知られており、抗原に接触しないＣＤＲ残基は、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの外側に存在するＫａｂａｔのＣＤＲの領域から、分子モデリングにより、または経験的に特定できる。ＣＤＲ又はその一つ又は複数の残基が除去される場合、それは、普通は、別のヒト抗体配列又はそのような配列のコンセンサスにおいて対応する位置を占めるアミノ酸で置換される。ＣＤＲ及びアミノ酸内で置換する位置は、また、経験的に選択できる。経験的置換は保存的又は非保存的置換であってもよい。
【００４５】
本明細書において、抗体の「抗原結合フラグメント」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ又はそれ以上のフラグメントを意味する。抗体の「抗原結合フラグメント」内に包含される結合フラグメントの非限定的な例は：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨドメインより成る１価のフラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド橋により結合された２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメントである、Ｆ（ａｂ′）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨドメインより成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインより成るＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインより成るｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４１，ｐｐ．５４４−５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；及び（ｖｉｉ）合成リンカーで、場合により、結合されてもよい２つ又はそれ以上の単離されたＣＤＲの組合せ；を含む。また、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られるように、遺伝子組み換え法を用いて、合成リンカーによりＶＬ及びＶＨ領域を対に形成する単一タンパク質鎖として作ることもできる（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，Ｖｏｌ．２４２，ｐｐ．４２３−４２６、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８５，ｐｐ．５８７９−５８８３）。また、「抗原結合フラグメント」は、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合された結合ドメインポリペプチド；（ｉｉ）ヒンジ領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域；を含む結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質であってもよい。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて得られる。
【００４６】
本発明に使用可能な抗体又はその抗原結合フラグメントは、鳥、哺乳類を含むいかなる動物起源であってもよい。好ましくは、抗体又はフラグメントは、ヒト、チンパンジ、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、又はウサギ）、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ、又はイヌ起源である。本発明の抗体は、ある種から誘導された抗体の定常領域が、他種から誘導された抗原結合サイトと組み合わされたキメラ分子を含む。更に、本発明の抗体は、非ヒト種（例えば、マウス起源）から誘導された抗体の抗原結合サイトと、ヒト起源の定常領域とフレームワーク領域を組合せたヒト化分子を含む。
【００４７】
本発明の抗体は、当該抗体を発現するハイブリドーマ、または、遺伝子組み換えにより当該抗体を発現するホスト細胞から得ることができる。ホスト細胞として、例えば、ＣＨＯ細胞、リンパ球細胞、大腸菌などの細菌細胞、及び酵母などの真菌細胞を用いることができる。
【００４８】
また、本発明の抗体は、遺伝子組み換え技術を用いて遺伝子導入された非ヒト動物又は植物において製造することができる。
【００４９】
（Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する免疫調節作用を有する単球）
Ｙｍ１は、骨髄細胞系列（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎａｇｅ）
において発現することが知られており、代替的活性化Ｍ２マクロファージのマーカーとして一般的に使用されている（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，Ｖｏｌ．３，ｐｐ．２３−３５）。
【００５０】
Ｙｍ１遺伝子のホモログは、Ｙｍ１遺伝子のコードするタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも７５、８０、８１、８５または９０％の相同性を有するものであってよい。当該ホモログは、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％の相同性を有する。当該ホモログはまた、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基の観点から考慮され得る。
【００５１】
本発明における免疫調節作用を有する単球は、ヒトおよび非ヒト動物を含む様々な動物、特に哺乳動物由来の単球であり得る。当該非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等のげっ歯類であってもよく、好ましくはマウスである。
【００５２】
単球が免疫調節作用を有することは、公知の方法、例えば、免疫細胞の分泌する炎症性（例えばＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦα）または抗炎症性サイトカイン（例えばＩＬ−１０）の分泌に与える影響を調べることや、炎症モデル動物に対して当該単球を移入することで生じる生理学的反応、例えば、体重の変化や組織の外観変化などに基づいて確認することができる。
【００５３】
（免疫調節作用を有する単球集団を製造する方法）
本発明において、免疫調節作用を有する単球集団を製造する際には、Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する細胞を選択する。ここで、Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する細胞を選択する際には、例えば当該遺伝子のコードするタンパク質と、標識タンパク質を融合した融合タンパク質をコードする遺伝子を利用することができる。当該遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムなどの公知のシステムを利用することにより、ゲノム上の当該遺伝子を置換することで単球細胞または単球前駆体細胞に導入することができる。当該標識を確認することでＹｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する細胞を選択し得る。
【００５４】
当該標識としては、様々な蛍光タンパク質の遺伝子が利用可能であり、例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰの改変体、例えばＥＧＦＰ、ｈｒＧＦＰ（アジレント社）、ｍＣｈｅｒｒｙ（クロンテック社）、ｍＫａｔｅ２（Ｗａｋｏ）、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＡｓＲｅｄｐ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＣＦＰ−、ｍＹＦＰ、ｍＲＦＰ、ｍＢＦＰ、ｍＰｌｕｍ、Ｖｅｎｕｓ等を含むが、これらに限定されない。複数の標識タンパク質を使用することができ、その数は適宜調節することができる。
【００５５】
上記Ｙｍ１を標識化された単球を選択する方法を、Ｙｍ１を標識化されていない単球に適用することにより、標識化されていない、Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する細胞を選択し、免疫調節作用を有する単球集団を製造する方法に使用することができる。
【００５６】
（単球集団のなかから免疫調節作用を有する単球を検出する用途に用いられる判定用マーカー）
本発明の単球集団のなかから免疫調節作用を有する単球を検出する用途に用いられる判定用マーカーは、抗Ｙｍ１タンパク質またはそのホモログに特異的に結合する抗体を含む。
【００５７】
当該抗体は、これを検出できるようにするために結合される標識をさらに含みうる。当該標識としては当業者に公知のものを使用することができ、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であってもよい。これらの標識は、当業者に公知の方法で抗体に結合される。
【００５８】
（Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を解析するための実験動物）
本発明のＹｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を解析するための実験動物として、例えばＹｍ１遺伝子に、標識タンパク質をコードする遺伝子を融合した融合遺伝子を導入した動物を用いることができる。
【００５９】
当該遺伝子改変動物は、当業者においては一般的に公知の遺伝子工学技術により作製することができる。例えば、上記融合遺伝子をＥＳ細胞株に導入し、相同組み換えを生じた細胞株を選抜し、得られたＥＳ細胞株をマウス胚盤葉にインジェクションしキメラマウスを得たのち、このキメラマウスを交配させることで、上記融合遺伝子を含む細胞からなる遺伝子改変動物を得ることができる。また、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムなどの公知のシステムを利用することにより、発生過程の細胞または成体動物の造血幹細胞などのゲノム上の遺伝子を置換することで、一部に上記融合遺伝子を含む細胞を含む遺伝子改変動物を得ることもできる。
【００６０】
（Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する細胞を除去し得るように改変されたゲノムを有する前記実験動物）
上述の遺伝子改変実験動物は、さらにＹｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する細胞を除去し得るように改変されていてもよい。
【００６１】
このために、特定の薬剤に対して感受性をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を、遺伝子改変実験動物のゲノム上のＹｍ１遺伝子またはそのホモログに融合させることにより、当該薬物を用いて遺伝子改変実験動物からＹｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する細胞を除去することが可能となる。
【００６２】
例えば、ゲノム上のＹｍ１遺伝子またはそのホモログがジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）をコードする遺伝子と融合するように改変された遺伝子改変実験動物に対して、ジフテリア毒素（ＤＴ）を投与することにより、Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する細胞を実験動物から除去することが可能となる（蛋白質・核酸・酵素、２００９年、Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．５，ｐｐ．６１４−６２０）。
【００６３】
また、上記遺伝子改変には、テトラサイクリン等の薬剤とＣｒｅ／ｌｏｘＰを用いたシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムなど、他の当業者に公知のシステムを用いることができる。
【００６４】
また、上記遺伝子改変は、薬剤によって除去されるように改変される他、当該細胞内の他の遺伝子の発現に伴って除去されるように改変されていてもよい。例えば、特定の組織、細胞種、発生段階において特異的に発現する遺伝子の発現に伴って除去されるように改変することで、これらの組織、細胞種、発生段階において特異的にＹｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する細胞を除去することが可能となる。このような目的のために、例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムにおいて、Ｃｒｅ遺伝子を発現するような改変を組み合わせることができる。
【００６５】
（単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を調節する化合物をスクリーニングする方法）
本発明の単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を調節する化合物をスクリーニングする方法は、ある実施態様において、（１）Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する、免疫調節作用を有する単球集団に、候補化合物を投与し、（２）前記単球集団においてＹｍ１遺伝子を発現する細胞の割合を測定し、（３）前記候補化合物が、前記Ｙｍ１遺伝子を発現する細胞の割合を変化させた場合に、前記候補化合物を単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を調節する化合物として同定する工程を含む。
【００６６】
Ｙｍ１遺伝子またはそのホモログを発現する、免疫調節作用を有する単球集団は、上述の免疫調節作用を有する単球集団を製造する方法により取得することができる。
【００６７】
候補化合物としては、低分子化合物、タンパク質、核酸、その他のポリマー、金属その他の無機化合物等、特に限定されず様々なものを用いることができる。候補化合物として、細胞の断片や細胞自体を用いてもよい。
【００６８】
単球集団においてＹｍ１遺伝子を発現する細胞の割合を測定する際には、公知の方法を使用することができ、例えば、フローサイトメトリーなどを用いることができる。
【００６９】
前記Ｙｍ１遺伝子を発現する細胞の割合の変化を評価する際には、例えば、前記Ｙｍ１遺伝子を発現する細胞の割合を１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上増加または減少させた場合に、当該候補化合物を単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を調節する化合物として同定することができる。Ｙｍ１遺伝子を発現する細胞の割合を増加させる化合物は、単球の炎症抑制作用を抑制する化合物、または創傷治癒促進作用を促進する化合物として同定され得る。
【００７０】
この際、当該変化について統計学的有意性を検討することが望ましい。このような統計学的有意性の検討に際しては、当業者に公知の方法を利用することができる。
【００７１】
本発明の単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を調節する化合物をスクリーニングする方法は、別の実施態様において、（１）単球前駆細胞集団に、候補化合物を投与し、（２）前記単球前駆細胞集団から単球集団を分化させ、（３）前記分化した単球集団においてＹｍ１遺伝子を発現する細胞の割合を測定し、（４）前記候補化合物が、前記Ｙｍ１遺伝子を発現する細胞の割合を変化させた場合に、前記候補化合物を単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を調節する化合物として同定する工程を含む。
【００７２】
上記単球前駆細胞集団は、公知の方法により、骨髄組織等から得ることができる。例えば、上記単球前駆細胞集団として、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）を用いることができるが、これに限定されない。このような単球前駆細胞集団は、細胞表面マーカーなどを利用して、公知の方法により取得することができる。
【００７３】
前記単球前駆細胞集団から単球集団を分化させる際には、公知の方法を利用することができ、例えば、単球前駆細胞集団をＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３等のサイトカインの組み合わせの存在下で一定期間培養することにより、単球集団を分化させることができる。
【００７４】
前記候補化合物は、単球前駆細胞集団から単球集団を分化させる工程の前に投与されてもよいし、分化させる工程の途中で投与されてもよい。
【００７５】
前記分化した単球集団においてＹｍ１遺伝子を発現する細胞の割合の変化を評価する際には、例えば、前記分化した単球集団においてＹｍ１遺伝子を発現する細胞の割合を１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上増加または減少させた場合に、当該候補化合物を単球の炎症抑制作用または創傷治癒促進作用を調節する化合物として同定することができる。分化した単球集団においてＹｍ１遺伝子を発現する細胞の割合を増加させる化合物は、単球の炎症抑制作用を抑制する化合物、または創傷治癒促進作用を促進する化合物として同定され得る。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００７７】
（試薬）
リポ多糖類（ＬＰＳ；大腸菌、Ｏ１１１：Ｂ４）は、Ｓｉｇｍａから購入した。７−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ（７−ＡＡＤ）、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５  ストレプトアビジン、ブリリアントバイオレット４２１ストレプトアビジン、およびＦＯＸＰ３  フィックス／パーマ用緩衝液セットはＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）はＤｏｊｉｎｄｏから購入した。Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ染色セットはシスメックスから購入した。エチジウムモノアジドブロマイド（ＥＭＡ）はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
【００７８】
（抗体）
下記の市販されている抗体を使用した。
2019201561.tif 000002
また、後述する方法で作成した抗Ｙｍ１抗体、クローン４−４Ｄ７を用いた。
【００７９】
（マウス）
ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ、Ｉｎｃ．からＣ５７ＢＬ／６Ｊ（７〜１２週齢）マウスを得た。全てのマウスを特定の病原体のない条件下（ＳＰＦ）で飼育した。
【００８０】
（磁気選別とセルソーターを用いた細胞分離）
単球単離のために、Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓマウス由来の骨髄細胞を、抗ＣＤ１６／３２抗体とインキュベートした後、ビオチン化抗Ｌｉｎ（ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１、Ｂ２２０、およびｔｅｒ１１９）抗体カクテルとインキュベートし、その後、抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｇｅｒｍａｎｙ）とインキュベートした。
【００８１】
Ｌｉｎ＋細胞は、磁気選別（ＡｕｔｏＭＡＣＳ  Ｐｒｏ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によって枯渇された。Ｌｉｎ−細胞を抗ＣＤ１１５抗体および抗Ｌｙ６Ｃ抗体で染色し、次いでセルソーター（ＳＨ８００、ＳＯＮＹ、日本）により分画化した。
【００８２】
ＧＰおよびｃＭｏＰ単離は、Ｂｌｏｏｄ，２０１５，Ｖｏｌ．１２５，ｐｐ．１４５２−１４５９に記載される確立された方法にわずかな変更を加えて実施した。Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓマウス由来の骨髄細胞を、ビオチン化抗Ｌｉｎ抗体（ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１、Ｂ２２０、Ｔｅｒ１１９、Ｓｃａ−１、ＣＤ１１ｂ、およびＧｒ−１）カクテル、続いて抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共にインキュベートした。Ｌｉｎ＋細胞を磁気ソーティング（ＡｕｔｏＭＡＣＳ  Ｐｒｏ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によって枯渇した。Ｌｉｎ−細胞を抗ｃ−Ｋｉｔで染色し、抗ＣＤ１６／３２、抗Ｌｙ６Ｃ、および抗ＣＤ１１５抗体とブリリアントバイオレット４２１ストレプトアビジンにより染色し、セルソーター（ＳＨ８００、ソニー、日本）により分画した。ＧＰ；Ｌｉｎ−ｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ１６／３２＋Ｌｙ６Ｃ＋ＣＤ１１５−、ＭＰ；Ｌｉｎ−ｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ１６／３２＋Ｌｙ６Ｃ＋ＣＤ１１５＋。
【００８３】
（定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）およびＲＮＡ−Ｓｅｑのための全ＲＮＡ抽出）
選別された細胞からの全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎｉまたはＭｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｔｈｅ
Ｎｅｄｅｒｌａｎｄｓ）、ＦａｖｏｒＰｒｅｐ全ＲＮＡ抽出カラム（Ｆａｖｒｇｅｎ、Ｔａｉｗａｎ）またはＴＲＩｚｏｌ  ＬＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州）を用いて、製造者のプロトコールに従って行った。
【００８４】
ｑＲＴ−ＰＣＲのために、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ、Ｊａｐａｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した。ｑＲＴ−ＰＣＲＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ、Ｊａｐａｎ）を用いてｃＤＮＡ上で実施した。発現レベルを１８ｓリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に対して正規化した。
【００８５】
（ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析）
選別した細胞を溶解し、それらの全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ  ＬＳ試薬で抽出した。全ＲＮＡの４０ナノグラムを、イルミナ多重シーケンシングのためのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｓｔｒａｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）を用いたＲＮＡ−Ｓｅｑ分析のためのＤＮＡライブラリー調製に供した。配列決定は、ＨｉＳｅｑ  １５００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により５０ｂｐのシングルエンド読み出しモードにて行った。読み取り配列のマッピング後のさらなる解析には、百万分読み出しあたりのエキソン１キロベースあたりのフラグメント数（ＦＰＫＭ）を使用した。
【００８６】
（インビトロ単球刺激）
選別された単球を、ＬＰＳ（大腸菌、Ｏ１１１：Ｂ４，１μｇ／  ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）によって２４時間刺激した。培地中のＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、およびＹｍ１の濃度を、ＥＬＩＳＡ  ＭＡＸ標準キット（ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、およびＩＬ−１０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＣＡ）または発明者が常法に従って準備したＥＬＩＳＡシステム（Ｙｍ１）で定量した。
【００８７】
（インビトロ単球刺激）
選別された単球を、ＬＰＳ（大腸菌、Ｏ１１１：Ｂ４，１μｇ／  ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）によって２４時間刺激した。培地中のＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、およびＹｍ１の濃度を、ＥＬＩＳＡ  ＭＡＸ標準キット（ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、およびＩＬ−１０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＣＡ）または発明者が常法に従って準備したＥＬＩＳＡシステム（Ｙｍ１）で定量した。
【００８８】
（デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎）
マウスに２．０％ＤＳＳ（ＭＷ  ３６，０００−５０，０００、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＣＡ）を飲料水に加えて５日間経口投与し、その後の通常の飲料水を与えた。ＤＳＳの投与から１２日間毎日または隔日で体重をモニターした。いくつかの実験では、ＤＳＳ投与の８日後および１０日後に、ＤＴの２５ｎｇ／ｇ体重のジフテリア毒素（ＤＴ）を腹腔内注射した。好中球の枯渇のために、５０μｇの抗Ｌｙ６Ｇ抗体（クローン１Ａ８、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ、ＮＨ）を、８および１０日目に静脈注射した。
【００８９】
（抗Ｙｍ１モノクローナル抗体の作製）
抗Ｙｍ１抗体を作製するために、アルメニアのハムスター（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ）に対して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で産生され、ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ、ＧＡ）中で乳化した組換えＹｍ１−ＦＬＡＧタンパク質を足底に皮下投与して免疫した。リンパ節細胞を、ＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＮＳＯｂｃｌ２骨髄腫細胞（ＰＮＡＳ，１９９４，  Ｖｏｌ．９１，ｐｐ．５５４８−５５５１）に融合した。ハイブリドーマ細胞を、１０％ＦＢＳ、ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）および１％ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むＤ−ＭＥＭ中で選択した。ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡにかけ、組換えＹｍ１−ＦＬＡＧタンパク質を特異的に検出するハイブリドーマを選択した。ハイブリドーマ培地中のハムスターＩｇＧをｎＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐａｈｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。
【００９０】
（マウスＹｍ１  ＥＬＩＳＡの確立）
９６ウェルのハーフ・エリア・プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌのハムスター抗Ｙｍ１抗体（上述の方法により作成されたクローン１０Ｇ１０−１）により４℃で一晩被覆した。ブロッキング緩衝液（５％スキムミルク（ＭＥＧＭＩＬＫ  ＳＮＯＷ  ＢＲＡＮＤ、日本）および０．２％Ｔｗｅｅｎ（Ｗａｋｏ、Ｊａｐａｎ）を含むＰＢＳ）で１時間ブロッキングした後、ブロッキング緩衝液で１０倍に希釈した単球培養液を各ウェルに加え、室温で２時間インキュベーションを行った。次いで、プレートを２５μｇ／ｍＬのビオチニル化されたハムスターＩｇＧ抗Ｙｍ１抗体（本発明者らの実験室で生成されたクローン７Ｄ４）で２．５時間インキュベートし、ＨＲＰ−ストレプトアビジンで３０分間インキュベーションした。最後に、基質溶液（ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，  ＫＰＬ，  ＭＤ）を各ウェルに添加して、３０分過酸化を誘導した。２Ｍ硫酸で反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ、ＣＡ）で４５０ｎｍでの光学密度を測定した。
【００９１】
（共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）分化のアッセイ）
ナイーブＹｍ１−Ｖｅｎｕｓマウスの骨髄由来の選別されたｃＭｏＰ（９６ウェルプレート中３０００細胞／ウェル）を様々なサイトカインの組み合わせ（１０％Ｍ−ＣＳＦ（ＣＭＧ１４−１２培地）、５０ｎｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦ（Ｃｈｕｇａｉ、Ｊａｐａｎ）、２０ｎｇ／ｍｌ組換えマウスＧＭ−ＣＳＦ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＣＡ）または１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＮＪ））により培養した。細胞を１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｗａｋｏ）、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ添加したＤ−ＭＥＭ中で培養した。７２時間培養した後、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。
【００９２】
（統計分析）
データは、分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続く多重比較、または、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＣＡ）を用いた、対応のある、または、対応のないｔ検定によって解析された。Ｐ値＜０．０５の場合に有意であると考えた。
【実施例１】
【００９３】
Ｙｍ１−ＤＴＲマウスの作製
【００９４】
Ｙｍ１−ＤＴＲノックインマウスの作製は、基本的にＪ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，２００７年，Ｖｏｌ．１１７，ｐｐ．２２６８−２２７８およびＮａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１年，Ｖｏｌ．１９，ｐｐ．７４６−７５０に記載されている方法に従って実施した。簡単に説明すると、ターゲティングベクターを生成するために、Ｃｈｉｌ３遺伝子の−４．０〜＋５．０ｋｂｐの領域転写開始部位をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングした。次に、エキソン１に内因性ＡＴＧ開始部位を含む１５ｂｐ断片を、ポリＡ尾部を有するヒトＤＴＲ（ＨＢ−ＥＧＦ）ｃＤＮＡに置き換えた。相同組換え体の選択を可能にするために、ヒトＤＴＲ遺伝子の下流に、ＦＲＴに隣接するＮｅｏカセットをクローニングした。ランダムな組込み体に対して選択するために、５’アームの上流にチミジンキナーゼ遺伝子を挿入した。
【００９５】
Ｙｍ１−ＤＴＲマウスを作製するために、Ｂ６ＪＮ／１ＥＳ細胞に対して、線状化ターゲティングベクターをエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。Ｇ−４１８およびガンシクロビル耐性クローンを、サザンブロット分析により相同組換えについてスクリーニングし、ここで、ターゲティングベクターの外側に位置する２８４塩基のＤＩＧ標識化ＤＮＡプローブを用いた。当該スクリーニングに、ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキットおよび検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。
【００９６】
次に、生殖系列キメラマウスを凝集法により作製した。高いＥＳ細胞寄与を有するキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させて、＋／Ｙｍ１ＤＴＲマウスを作製した。作成した＋／Ｙｍ１ＤＴＲマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと５世代以上戻し交配し、野生型（＋／＋）およびヘテロ接合Ｙｍ１−ＤＴＲ（＋／Ｙｍ１ＤＴＲ）同腹仔を解析に使用した。
【００９７】
全身性Ｙｍ１＋細胞枯渇のために、Ｙｍ１−ＤＴＲマウスに５ｎｇ／ｇ体のジフテリア毒素（ＤＴ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を腹腔内注射した。
【実施例２】
【００９８】
Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓマウスの作製
【００９９】
Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓターゲティングベクターを作製するために、ＧｅｎｅＡｒｔシームレスＰＬＵＳクローニングおよびアセンブリキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｙｍ１−ＤＴＲターゲティングベクターのヒトＤＴＲ断片をＶｅｎｕｓ遺伝子で置換した。Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓマウスを作製するために、Ｂ６Ｊ  ＥＳ細胞にターゲティングベクターをエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。相同組換え効率を改善するためにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介遺伝子ノックイン戦略を使用した。Ｇ−４１８およびガンシクロビル耐性クローンを、サザンブロット分析により相同組換えについてスクリーニングし、ここで、ターゲティングベクターの外側に位置する２８４塩基のＤＩＧ標識化ＤＮＡプローブを用いた。当該スクリーニングに、ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキットおよび検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。
次に、生殖系列キメラマウスをインジェクション法により作製した。高いＥＳ細胞寄与を有するキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させて、＋／Ｙｍ１Ｖｉｎｕｓマウスを作製した。作成した＋／Ｙｍ１  ＶｉｎｕｓマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと５世代以上戻し交配し、野生型（＋／＋）およびヘテロ接合Ｙｍ１−Ｖｉｎｕｓ（＋／Ｙｍ１Ｖｉｎｕｓ）同腹仔を解析に使用した。
【実施例３】
【０１００】
単球、マクロファージおよび樹状細胞の調製
【０１０１】
リンパ節から単細胞懸濁液を調製するために、腋窩および膝窩リンパ節を取り出して１０μｇ／ｍＬ  ＤＮＡ分解酵素Ｉ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＪ）および７５０μｇ／  ｍｌコラゲナーゼＩＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したＨＢＳＳ中にて、３０分間３７℃でインキュベートした。消化された組織を１３３μｍ細孔ナイロンメッシュ（ＡＳ  ＯＮＥ、Ｊａｐａｎ）で濾過した。
【０１０２】
大腸固有層（ＬＰ）の消化は、Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  ２００７年，  Ｖｏｌ．  ２，  ｐｐ．２３０７−２３１１に記載される確立された方法を一部変更した方法で行った。
【０１０３】
大腸全体を取り出し、ＰＢＳで数回洗い流して糞便を除去し、縦に開けた。２〜３ｃｍ片の結腸断片を、２％ＦＢＳおよび２０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加した、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＨＢＳＳ、ｐＨ７．２中にて、１５分間３７℃でインキュベートした。組織をＰＢＳで洗浄してＥＤＴＡを洗い流し、スパチュラを滑らせることで、残った上皮層を穏やかに除去した。組織を５ｍｍ長の断片に裁断し、２％ＦＢＳ、０．５ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩ（Ｗａｋｏ、Ｊａｐａｎ）、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＤＮＡ分解酵素Ｉ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＪ）、１％Ｄｉｓｐａｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）および１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ナカライ、ジャパン）を添加したＲＰＭＩ中にて、４０分間３７℃でインキュベートした。消化された断片を７０μｍのセルストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）を通して濾過した。
【０１０４】
肝細胞の消化は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９７６年，Ｖｏｌ．１３，ｐｐ２９−８３に記載される確立された方法に従って実施した。
【０１０５】
肝臓灌流培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いて３ｍＬ／分の流速で肝臓を８分間灌流した。次いで、肝臓を、５ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ（Ｇｉｂｃｏ）を添加した基本灌流溶液（１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭＫＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ  ２、０．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ３２Ｈ２Ｏ、０．４２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ３１２Ｈ  ２Ｏ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５ｍＭグルコース、および４．２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３）によって３ｍｌ／分の流速で８分間還流した。消化された肝臓を非被覆の１０ｃｍのディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に入れ、高グルコースＤ−ＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地；Ｗａｋｏ）中で外科用ナイフを用いて小片に細断した。ピペッティングにより分散化した細胞を、７０μｍのセルストレーナーに通過させた。１００ｘｇ２分間の遠心の後、上清を新しいチューブに移し、細胞ペレットが目視できなくなるまで遠心を繰り返した。最終上清を３００×ｇで５分間遠心した。ペレット中の赤血球（ＲＢＣ）を２ｍＬのＢＤ  Ｐｈａｒｍ  Ｌｙｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ）で溶解し、室温で８０秒間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳ）で希釈した。
【０１０６】
脾臓から単細胞浮遊液を調製するために、脾臓を１００ｍＵ／ｍＬのコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で洗浄し、細かい鉗子でかき混ぜて分離し、４００ｍＵ／ｍＬコラゲナーゼＤにて、４５分間３７℃でインキュベートして消化した。
【０１０７】
肺細胞懸濁液の調製のために、肺を取り出し、１ｍｍの長さに細かく刻み、０．２Ｕ／ｍＬのＬｉｂｅｒａｓｅ  ＴＬ（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０μｇ／ｍＬ  ＤＮＡ分解酵素Ｉ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＪ）を添加したＨＢＳＳ中にて、２５分間３７℃でインキュベートした。
【０１０８】
骨髄から単細胞懸濁液を調製するために、両側脛骨および大腿骨を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。細胞を１３３μｍのナイロンメッシュ（ＡＳ  ＯＮＥ、Ｊａｐａｎ）または７０μｍセルストレーナーを通して濾過した。ＲＢＣを２ｍＬのＢＤ  Ｐｈａｒｍ  Ｌｙｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ）を用いて、室温で８０秒間インキュベートし、次いでＦＡＣＳ緩衝液で希釈した。Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１３，Ｖｏｌ．１４，ｐｐ．８２１−８３０およびＮａｔｕｒｅ，２０００，Ｖｏｌ．４０４，ｐｐ．１９３−１９７に記載される確立された基準により、骨髄の前駆細胞を、ＦＡＣＳによって解析した。
【０１０９】
末梢血単核細胞の分析のために、末梢血を２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中に懸濁した。次に、ＲＢＣを１０ｍＬのＢＤ  Ｐｈａｒｍ  Ｌｙｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ）により、室温で８０秒間インキュベートすることで溶解した。
【実施例４】
【０１１０】
ＬＰＳ誘導炎症におけるＬｙ６Ｃｈｉｇｈ単球中のＹｍ１−Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の動態
ＬＰＳ注射は炎症性サイトカインの血清濃度を増加させた。注目すべきことに、炎症の後記において、Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓ＋Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ単球亜群が劇的に増加することが見いだされた（図１Ａ〜Ｃ）。Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ単球におけるＹｍ１−Ｖｅｎｕｓ＋単球亜群は、ＬＰＳ投与後、２４時間の時点において１０％増加し、４８時間の時点において約５０％増加した。この末梢血および脾臓で観察された結果と符合して、骨髄中のＬｙ６Ｃｈｉｇｈ単球におけるＹｍ１−Ｖｅｎｕｓ＋単球亜群も劇的に増加した（図１Ｄ）。これらのＹｍ１−Ｖｅｎｕｓ＋Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ単球は、Ｆｌｔ３−ＣＤ１１ｃ−単球亜群に属し、ナイーブマウスの骨髄でも同様のことが観察された（図１Ｅ）。
定量ＰＣＲ解析により、Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓ＋Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ単球におけるＹｍ１のｍＲＮＡ発現量増加が確認された。
【実施例５】
【０１１１】
Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓ陽性単球の機能
Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓ陽性単球およびＹｍ１−Ｖｅｎｕｓ陰性単球の機能的な差異を確認するために、ＬＰＳで刺激されたマウスの骨髄から生成された各単球群を、エクスビボでＬＰＳにより再刺激した。図２Ａ（Ｇ）に示すように、Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓ陽性単球は、Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓ陰性単球よりも低い炎症誘発性サイトカインのレベルを示す一方で、より高いレベルの抗炎症性サイトカインＩＬ−１０を産生する。単球はエクスビボで再刺激されない限り、検出可能なレベルのサイトカインを産生しなかった。マウスにＹｍ１−Ｖｅｎｕｓ＋Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ単球を移植すると、ＬＰＳ注入後の血清ＩＬ−６濃度が減少したことから、Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓ＋Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ単球が免疫調節表現型を有していることが示された（図２Ｂ（Ｈ））。
【０１１２】
また、Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ単球は、大腸炎の大腸に浸潤後にのみ炎症性徴候を示すことが報告されている。我々は、Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓ陽性単球は、炎症性結腸において、Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓ陰性と比較して低レベルのＩＬ−６および高レベルのＩＬ−１０を発現することを確認した（図３Ａ（Ｆ））。我々はまた、Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓ陽性単球は炎症反応の解消および組織修復に重要な役割を担うことが報告されている（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１１，Ｖｏｌ．３５，ｐｐ．２２３−２３５）Ｓｌｐｉ遺伝子を高発現していることを発見した（図３Ａ（Ｆ））。
【実施例６】
【０１１３】
Ｙｍ１−ＤＴＲマウスを用いた機能解析
炎症結腸におけるＹｍ１−Ｖｅｎｕｓ陽性単球の増殖時期と遺伝子発現プロファイルに基づいて、我々は炎症結腸においてこれらの細胞が炎症の解消および組織再生に関与していると考えた。
【０１１４】
これを証明するために、我々はＹｍ１遺伝子座にＤＴＲ遺伝子を有するマウスを（Ｙｍ１−ＤＴＲマウス）を作製した。ナイーブマウスへのジフテリア毒素（ＤＴ）の投与は、好中球のみを除去し、単球を除去しなかった。しかしながら、ＬＰＳの投与から４８時間後にＤＴを投与すると、単球の割合が４％から２％に減少し、Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓ＋Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ単球が除去されたことが示唆された。
【０１１５】
驚くべきことに、腸炎症からの回復期においてＹｍ１＋細胞が消失すると、体重回復が遅延した（図３Ｂ（Ｇ））。組織学的検査によっても、Ｙｍ１陽性細胞が無い場合、炎症反応が長引き、組織修復が遅延することが確認された（図３Ｃ（Ｈ））。組織における炎症性サイトカインレベルも、Ｙｍ１陽性細胞の除去により増加した（図３Ｄ（Ｉ））。
【０１１６】
上記修復遅延が好中球の除去に起因する可能性を排除するために、別途抗Ｌｙ６Ｇ抗体を用いて好中球を選択的に除去したが、結腸炎症からの回復にはイ影響がなかった。
これらの結果は、Ｙｍ１陽性細胞がマウス結腸炎症モデルにおいて、炎症の解消および損傷組織の回復に寄与することを証明している。
【実施例７】
【０１１７】
Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ単球の由来
我々は次に、Ｙｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ単球が由来する前駆細胞の種類を探索した。我々は、ＬＰＳ投与マウスの骨髄中において、ｃＭｏＰの少数の集団がＹｍ１−Ｖｅｎｕｓを発現することを見出した（Ｒ２画分の６％、図４Ａ）。このことは、Ｙｍ１＋細胞がｃＭｏＰに由来することを示唆している。ＣＤ４５＋ナイーブＹｍ１−Ｖｅｎｕｓマウス骨髄から、ｃＭｏＰあるいはＧＰを、ＬＰＳ投与を受けたＤ４５．１＋コンジェニックマウスに移入し、４８時間後にレシピエントマウスの血液細胞を解析した。図４Ｂに示すように、ｃＭｏＰの移入はＹｍ１＋Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ単球の発生を誘導したのに対して、ＧＰの移入はこれを誘導しなかった。
【０１１８】
また、Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓ陰性単球を、ＬＰＳ投与を受けたマウスに移入しても、Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓ＋Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ単球は生じないことも発見した（図４Ｃ）。このことは、Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓ＋Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ単球はＹｍ１−Ｖｅｎｕｓ陰性単球に由来するのではなく、Ｙｍ１−Ｖｅｎｕｓ陰性単球となるようにプログラムされた単球前駆細胞に由来することを示唆している（図４Ｃ）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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