(57)【要約】【課題】抗体を簡便に修飾できる抗体修飾剤を提供する。【解決手段】ポルフィリン又はポルフィリン誘導体を含有することを特徴とする抗体修飾剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポルフィリン又はポルフィリン誘導体を含有することを特徴とする抗体修飾剤。
【請求項２】
前記ポルフィリン又はポルフィリン誘導体は、プロトポルフィリン又はプロトポルフィリン誘導体である請求項１に記載の抗体修飾剤。
【請求項３】
抗体と、請求項１又は２に記載の抗体修飾剤と、からなることを特徴とする抗体−抗体修飾剤複合体。
【請求項４】
ポルフィリン又はポルフィリン誘導体を備えることを特徴とする抗体結合性担体。
【請求項５】
前記ポルフィリン又はポルフィリン誘導体は、プロトポルフィリン又はプロトポルフィリン誘導体である請求項４に記載の抗体結合性担体。
【請求項６】
抗体を含む試料を請求項４又は５に記載の抗体結合性担体に接触させ、抗体−抗体結合性担体複合体を形成させることを特徴とする抗体の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体修飾剤、抗体−抗体修飾剤複合体、抗体結合性担体、及び抗体の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、基礎研究、診断薬、医薬等の分野で広く利用されている。抗体の修飾技術は、抗体に薬物等を結合させたり、抗体を投与した場合の薬物動態を最適化したりするうえで重要である。
【０００３】
従来、抗体の修飾は、抗体に天然に存在するリジン残基、抗体に天然に存在するジスルフィド結合の還元により形成したシステイン残基、抗体の遺伝子改変により導入した単一のシステイン残基等を利用して行われている（例えば、特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１５−５１０８７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これらの方法は煩雑であり、抗体の失活、不均一な修飾、凝集体の生成等が生じる場合がある。そこで、本発明は、抗体を簡便に修飾できる抗体修飾剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の態様を含む。
［１］ポルフィリン又はポルフィリン誘導体を含有することを特徴とする抗体修飾剤。
［２］前記ポルフィリン又はポルフィリン誘導体は、プロトポルフィリン又はプロトポルフィリン誘導体である［１］に記載の抗体修飾剤。
［３］抗体と、［１］又は［２］に記載の抗体修飾剤と、からなることを特徴とする抗体−抗体修飾剤複合体。
［４］ポルフィリン又はポルフィリン誘導体を備えることを特徴とする抗体結合性担体。
［５］前記ポルフィリン又はポルフィリン誘導体は、プロトポルフィリン又はプロトポルフィリン誘導体である［４］に記載の抗体結合性担体。
［６］抗体を含む試料を［４］又は［５］に記載の抗体結合性担体に接触させ、抗体−抗体結合性担体複合体を形成させることを特徴とする抗体の精製方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、抗体を簡便に修飾できる抗体修飾剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実験例１における吸光度の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［抗体修飾剤］
１実施形態において、本発明は、ポルフィリン又はポルフィリン誘導体を含有することを特徴とする抗体修飾剤を提供する。
【００１０】
実施例において後述するように、ポルフィリン又はポルフィリン誘導体を抗体と接触させることにより、容易に抗体に結合させることができる。したがって、ポルフィリン又はポルフィリン誘導体を抗体修飾剤として利用することができる。
【００１１】
ポルフィリンとは、環状テトラピロールであり、４個のピロールが、４個のメチン基により結合閉環したポルフィンの誘導体の総称である。ポルフィリンとしては、ウロポルフィリン、コプロポルフィリン、プロトポルフィリン、ヘマトポルフィリン等が挙げられ、プロトポルフィリンが好ましい。
【００１２】
ポルフィリン誘導体としては、ポルフィリンに特定の機能を有する分子を結合させたものが挙げられる。特定の機能を有する分子をポルフィリンに結合させることにより、修飾される抗体に間接的にその機能を付与することができる。ポルフィリン誘導体としては、プロトポルフィリン誘導体が好ましい。
【００１３】
特定の機能を有する分子としては、例えば、生理活性物質、標識物質、生体適合性ポリマー等が挙げられる。
【００１４】
生理活性物質としては、医薬化合物、サイトカイン等のタンパク質、生理活性を有するペプチド、ｍｉＲＮＡ等の核酸、金属原子等が挙げられる。
【００１５】
医薬化合物としては、特に限定されず、例えば抗癌剤等が挙げられる。抗癌剤としては、例えば、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、５−フルオロウラシル、ドセタキセル等が挙げられる。
【００１６】
生理活性を有するペプチドとしては、例えば、細胞接着活性を示すＲＧＤモチーフを有するペプチド等が挙げられる。
【００１７】
金属原子としては、例えば鉄が挙げられる。２価の鉄原子とポルフィリンが錯体を形成したものはヘムと呼ばれる。
【００１８】
標識物質としては、造影剤、ビオチン、アビジン、蛍光色素、安定同位体、放射性同位体等が挙げられる。造影剤としては、硫酸バリウム、次炭酸ビスマス、酸化ビスマス、酸化ジルコニウム、フッ化イッテルビウム、ヨードホルム、バリウムアパタイト、チタン酸バリウム、ランタンガラス、バリウムガラス、ストロンチウムガラス等のＸ線造影剤；ヨード造影剤等のＣｏｍｐｕｔｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＣＴ）用造影剤；ガドリニウム製剤、超常磁性酸化鉄製剤（Ｓｕｐｅｒ  Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｉｒｏｎ  Ｏｘｉｄｅ、ＳＰＩＯ）等のＭＲＩ用造影剤；テクネチウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）、モリブデン９９（９９Ｍｏ）等のＳｉｎｇｌｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＳＰＥＣＴ）用放射性同位体等が挙げられる。
【００１９】
生体適合性ポリマーとは、生体に投与した場合に、強い炎症反応等の悪影響を及ぼしにくいポリマーを意味する。生体適合性ポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアミノ酸、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、ポリエステル、ポリウレタン、多糖類、これらのコポリマー等が挙げられる。
【００２０】
生体適合性ポリマーを結合したポルフィリンで抗体を修飾することにより、抗体を成体に投与した場合の薬物動態を制御することができる。
【００２１】
特定の機能を有する分子をポルフィリンに結合させる方法としては、架橋剤を用いる方法が好適である。架橋剤としては、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等を結合するものを適宜用いることができる。例えば、プロトポルフィリンのカルボキシル基等と、特定の機能を有する分子が有するアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等を架橋剤で結合すればよい。
【００２２】
ポルフィリンと特定の機能を有する分子との間にはリンカーが存在していてもよい。リンカーとしては上述した生体適合性ポリマーと同様のものを利用することができ、例えばポリエチレングリコール等を利用することができる。
【００２３】
具体的な架橋剤としては、特に限定されず、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミド  エステル（ＡＭＡＳ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）等が挙げられる。
【００２４】
［抗体−抗体修飾剤複合体］
１実施形態において、本発明は、抗体と、上述した抗体修飾剤と、からなることを特徴とする抗体−抗体修飾剤複合体を提供する。
【００２５】
抗体修飾剤は、上述したポルフィリン誘導体であることが好ましい。抗体修飾剤がポルフィリン誘導体であることにより、本実施形態の抗体−抗体修飾剤複合体は、特定の機能が付与されたものとなる。
【００２６】
例えば、抗体が癌細胞に特異的な抗原に対するものであり、抗体修飾剤が抗癌剤を結合したものである場合、抗体−抗体修飾剤複合体は、癌細胞を標的とする薬物送達システムとして利用することができる。
【００２７】
［抗体結合性担体］
１実施形態において、本発明は、ポルフィリン又はポルフィリン誘導体を備えることを特徴とする抗体結合性担体を提供する。本実施形態の抗体結合性担体を用いることにより、例えば後述する抗体の精製等を行うことができる。
【００２８】
本実施形態の抗体結合性担体は、ポルフィリン又はポルフィリン誘導体と固相とを備える。固相の材質としては、活性炭、シリカ、アルミナ、ゲル等が挙げられる。固相の形状としては、粒子状、膜状等が挙げられる。
【００２９】
本実施形態の抗体結合性担体において、ポルフィリン又はポルフィリン誘導体は、固相に結合していることが好ましい。ポルフィリン又はポルフィリン誘導体を固相に結合させる方法としては、架橋剤を用いる方法が好適である。架橋剤としては上述したものと同様のものを利用することができる。
【００３０】
ポルフィリンと固相との間にはリンカーが存在していてもよい。リンカーとしては上述した生体適合性ポリマーと同様のものが挙げられる。
【００３１】
本実施形態の抗体結合性担体において、ポルフィリンとしてはプロトポルフィリンが好ましい。また、ポルフィリン誘導体としては、プロトポルフィリン誘導体が好ましい。
【００３２】
［抗体の精製方法］
１実施形態において、本発明は、抗体を含む試料を上述した抗体結合性担体に接触させ、抗体−抗体結合性担体複合体を形成させることを特徴とする抗体の精製方法を提供する。
【００３３】
本実施形態の精製方法により、例えば、免疫した動物から採取した血液から、ポリクローナル抗体を容易に精製することができる。動物としては、ウサギ、ヤギ、ロバ、ウマ、ラット、マウス等が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマの培養上清、組換え抗体を発現させた細胞の培養上清等から、モノクローナル抗体を容易に精製することができる。
【００３４】
血液から抗体を精製する場合には、まず、血液から血漿又は血清を分離することが好ましい。血液に抗凝固剤を添加して遠心分離した場合、主に赤血球を含む沈澱と、血小板及び白血球を含む中間層と上清が得られる。この上清が血漿である。また、血液に抗凝固剤を添加せずに放置した場合、血餅と上清に分離する。この上清が血清である。抗凝固剤としては、ＥＤＴＡ−２Ｋ、フッ化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ヘパリン等が挙げられる。
【００３５】
続いて、上記の血漿、血清、培養上清等を上述した抗体結合性担体に接触させる。抗体結合性担体は、カラムに充填して用いてもよい。この結果、抗体結合性担体を構成するポルフィリン又はポルフィリン誘導体が、血漿又は血清中の抗体と結合する。この結果、抗体−抗体結合性担体複合体が形成され、抗体が固相に捕捉される。
【００３６】
続いて、洗浄液で洗浄し、抗体以外の夾雑物を洗浄除去する。続いて、溶出液で抗体結合性担体に結合した抗体を溶出することにより、精製された抗体を回収することができる。溶出液としては、例えば高塩濃度の緩衝液、ポルフィリン又はポルフィリン誘導体を含む緩衝液等を用いることができる。
【実施例】
【００３７】
［実験例１］
（プロトポルフィリンの抗体への結合性の検討１）
《ビオチン化プロトポルフィリンの調製》
まず、プロトポルフィリンにビオチンを結合させ、ビオチン化プロトポルフィリンを調製した。具体的には、プロトポルフィリンのカルボキシル基と、一端にビオチンが結合し多端にアミノ基が結合したポリエチレングリコール（型式「ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ａｍｉｎｅ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔｉｎ」、サーモフィッシャーサイエンティフッィック社）のアミノ基を、架橋剤である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いて結合させ、ビオチン化プロトポルフィリンを得た。
【００３８】
《ビオチン化プロトポルフィリンと抗体との反応》
１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに、ヒトＩｇＧ（インビトロジェン社）を２５μｇ含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸、ｐＨ７．２）１ｍＬを入れ、更に、上述したビオチン化プロトポルフィリンを終濃度が１．５μＭになるように添加し、４℃で１時間反応させた。
【００３９】
また、比較のために、ヒトＩｇＧを含まないＰＢＳ  １ｍＬに上述したビオチン化プロトポルフィリンを終濃度が１．５μＭになるように添加し、４℃で１時間反応させた試料も用意した。
【００４０】
《抗体とビーズとの結合》
続いて、上記の各反応液に、５０％（ｖ／ｖ）亜鉛イオン固定化ビーズ（型式「Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ」、ＧＥヘルスケア社、正味２５μＬゲル）を懸濁して添加した。
【００４１】
また、比較のために、亜鉛イオン固定化ビーズの代わりにセファロースビーズ（型式「Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ」、ＧＥヘルスケア社、以下、「コントロールビーズ」という。）を用いた以外は同様の操作を行った試料も用意した。
【００４２】
各ビーズを添加して４℃で２時間反応後、未反応のビオチン化プロトポルフィリン及びヒトＩｇＧを遠心洗浄した。遠心条件は、１６，０００×ｇ、４℃、３分間とした。遠心後の上清を捨て、沈殿を０．５Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ  １ｍＬで懸濁し再度遠心することを３回繰り返し、最後にＰＢＳ  １ｍＬで更に１回洗浄した。
【００４３】
《ビオチン化プロトポルフィリンへのアルカリフォスファターゼの結合》
続いて、遠心洗浄後の各ビーズにアルカリフォスファターゼ標識アビジンを反応させた。具体的には、アルカリフォスファターゼ標識アビジン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）をＰＢＳで２，０００倍希釈した溶液１ｍＬで各ビーズを再懸濁し、試験管に移した。ここで、試験管として、ガラス製のスピッツ管を使用した。また、スピッツ管は予めリン酸緩衝液で溶解した０．１％（ｗ／ｖ）ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）を適当量加え、４℃で１時間以上放置してマスキングを行った後に使用した。
【００４４】
続いて、室温で１時間反応後、遠心洗浄した。遠心条件は、１，６００×ｇ、４℃、５分間とした。遠心後の上清を捨て、沈殿を０．５Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ  １ｍＬで懸濁し再度遠心することを２回繰り返し、最後にＰＢＳ  １ｍＬで更に１回洗浄した。
【００４５】
《アルカリフォスファターゼの検出》
続いて、遠心洗浄後の各ビーズに結合したアルカリフォスファターゼを検出した。具体的には、各ビーズにアルカリフォスファターゼ基質溶液（３０ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルリン酸、グリシン緩衝液、ｐＨ１０．０）を１ｍＬ添加して懸濁後、室温で反応させた。続いて、適当な時間の経過後に２００ｍＭ  ＥＤＴＡを２５０μＬ添加して反応を停止させた。
【００４６】
反応停止後、各試料を遠心して上清を回収し、各上清の吸光度を波長４０５ｎｍで測定した。図１は、吸光度の測定結果を示すグラフである。データは平均値±標準偏差を示す（ｎ＝３）。図１中、「−」は試料にＩｇＧを添加しなかったことを示し、「＋」は試料にＩｇＧを添加したことを示す。また、「＊」はＩｇＧ非存在下でのコントロールビーズの結果に対してｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。
【００４７】
その結果、図１に示すように、試料にＩｇＧを添加し、かつ亜鉛イオン固定化ビーズを添加した場合にアルカリフォスファターゼの存在が検出された。この結果は、亜鉛イオン固定化ビーズ−ヒトＩｇＧ−ビオチン化プロトポルフィリンの複合体が形成されたことを示す。この結果から、ヒトＩｇＧとプロトポルフィリンが結合することが明らかとなった。
【００４８】
また、この結果から、抗体は亜鉛イオンとの結合部位とは異なる部位でプロトポルフィリンと結合することが明らかとなった。
【００４９】
［実験例２］
（プロトポルフィリンの抗体への結合性の検討２）
まず、ＩｇＧを亜鉛イオン固定化ビーズに結合させた後、ビオチン化プロトポルフィリンを反応させ、ＩｇＧとプロトポルフィリンが結合するか否かを検討した。その結果、亜鉛イオン固定化ビーズに結合させたＩｇＧは、プロトポルフィリンと結合しないことが明らかとなった。この結果から、亜鉛イオン固定化ビーズ、ＩｇＧ及びプロトポルフィリンを結合させるためには、反応順序が重要であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明によれば、抗体を簡便に修飾できる抗体修飾剤を提供することができる。
【図１】
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