(57)【要約】【課題】本発明は、老化した体細胞を、化合物を用いて迅速かつ高効率に若返らせる方法の開発を課題とする。【解決手段】本発明者は、様々な化合物のスクリーニングを通じて、ポリアミンが体細胞のテロメアを伸長する効果に最も優れていることを発見した。しかし、本発明者は、ポリアミンを添加して培養すると、アポトーシスが誘発され細胞死を起こすという問題点があり、ポリアミン単独では効果が得られないことも、それと同時に見いだした。そこで、この問題を解決すべくさらに鋭意努力を進めた結果、テロメラーゼ遺伝子を活性化するのに適切な濃度でポリアミンを添加する際に、アポトーシスを阻害する化合物群を添加して培養すると、老化した体細胞が迅速に若返ることを発見し、本発明に至った。本発明の方法を利用して細胞を若返らせれば、病気の研究や治療などに有効利用することが可能であり、その応用範囲は極めて広い。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞死阻害物質を含む培地で細胞を培養する第１工程と、
ポリアミンを含む培地で細胞を培養する第２工程と、
を含む、若返り細胞の製造方法。
【請求項２】
前記第２工程の培地は、前記細胞死阻害物質を含む、請求項１に記載の若返り細胞の製造方法。
【請求項３】
前記細胞死阻害物質は、アポトーシス阻害剤およびＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項１または２に記載の若返り細胞の製造方法。
【請求項４】
前記ポリアミンは、スペルミン、プトレシン、スペルジンおよびこれらのアセチル化体、並びにこれらの２つ以上の重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の若返り細胞の製造方法。
【請求項５】
前記第２工程の培地中のポリアミンの量は、１０万個の細胞に対して５ｎｍｏｌ以上２．５μｍｏｌ以下である、請求項４に記載の若返り細胞の製造方法。
【請求項６】
前記第２工程の培地中のポリアミンの濃度は、１μＭ以上５００μＭ以下である、請求項４に記載の若返り細胞の製造方法。
【請求項７】
メニン抑制物質を含む培地で細胞を培養する第３工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の若返り細胞の製造方法。
【請求項８】
前記メニン抑制物質は、蜂の子粉末抽出物およびマムシ粉末抽出物からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項７に記載の若返り細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、若返り細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体細胞は、決められた回数分裂すると分裂を停止する。これは、Ｍ１期、あるいは「ヘイフリックの限界」と呼ばれる。ブラックバーンらは、染色体の末端に存在し繰り返し配列を有する「テロメア」が、細胞分裂ごとに短くなり、テロメア末端でＴ−ループ構造をとれなくなると、分裂寿命のＭ１期に到達することを発見した（非特許文献１：Ｃｅｌｌ、４３巻、４０５頁−４１３頁、１９８５年）。さらに、（１）テロメアは年齢に依存して短くなり、特に早老症の患者では非常に短いことや、（２）活発に活動するガン細胞ではテロメアが長いことから、テロメアの短縮の過程も細胞老化を決める要因のひとつと考えられている。つまり、細胞分裂に伴ってテロメアの長さが短くなることにより、細胞老化は少しずつ進行し、Ｍ１期において分裂を停止することで、老化の最終点に到達する。
【０００３】
テロメアの短縮が細胞老化を進行させることから、テロメアを伸長させることができれば、細胞老化は進行しないと考えられる。テロメアを伸長する酵素として「テロメラーゼ」があるが、ヒトの体細胞ではテロメラーゼの活性は非常に低い状態に制御されているため、細胞分裂ごとにテロメアは短くなっていく。すなわち、細胞を老化させないためには、テロメラーゼの活性を高めて、テロメアを伸長すればよい。
【０００４】
テロメラーゼ活性を高める方法として、テロメラーゼを構成するテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）遺伝子を細胞に導入する方法がある。ＴＥＲＴ遺伝子を細胞に導入した場合、テロメアは非常に長くなり、細胞分裂は加速する。例えばＴＥＲＴ遺伝子を導入したヒト繊維芽細胞ＯＵＭＳ−３６Ｔ−２（ＪＣＲＢ細胞バンク、ＪＣＲＢ１００６．２）は、倍加時間（細胞が分裂し、細胞数が２倍になる時間）が約１．３日であり、ＴＥＲＴ遺伝子を導入しない細胞に比べて、分裂速度が非常に早い。さらに、ＴＥＲＴ遺伝子を導入したノックインマウスでは、テロメラーゼの活性が向上することにより、マウスの血液成分が若返ることが知られている（非特許文献２：Ｎａｔｕｒｅ、４６９巻、１０２頁−１０６頁、２０１１年）。しかし、ＴＥＲＴ遺伝子を導入して得られた細胞を患者の治療に利用することは「遺伝子組換えを伴う治療」に該当するため、安全性の問題から、患者の治療方法としての実用化は難しい。
【０００５】
一方、テロメラーゼ活性を高める方法として、化合物を利用する方法もある。このような化合物としては、例えば生薬の黄耆から見つけ出したＴＡ−６５（特許文献１：米国特許第７８４６９０４号明細書）、ＴＡＭ−８１８（特許文献２：米国特許第４８７４７０５号明細書）、ニッケイ属植物由来の抽出物（特許文献３：特開２０１２−８７０６８号公報）等が報告されている。しかしながら、これらの化合物で処理した細胞は、ＴＥＲＴ遺伝子を導入した細胞と比較して、テロメラーゼの活性化が不十分であり、上記化合物のテロメアの伸長効果は十分ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第７８４６９０４号明細書
【特許文献２】米国特許第４８７４７０５号明細書
【特許文献３】特開２０１２−８７０６８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ、４３巻、４０５頁−４１３頁、１９８５年
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ、４６９巻、１０２頁−１０６頁、２０１１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＴＥＲＴ遺伝子を導入した細胞と同等なテロメラーゼ活性を有し、細胞分裂が加速した細胞を、遺伝子組換えを用いることなく製造できれば、安全性の問題を解決でき、医療分野への応用範囲は非常に広い。しかしながら、上述のとおり、このような細胞の製造方法は、これまで全く見出されていない。
【０００９】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、遺伝子組換えを用いずにテロメア長が伸長した細胞を得る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述のように、テロメアを伸長する既存の化合物では、十分なテロメア伸長効果が得られない。本発明者がその原因を研究した結果、テロメラーゼ活性を高める既存の化合物を細胞に与えると、細胞内の制御機構が働いて、テロメラーゼ活性を速やかに抑制し、テロメラーゼ活性を正常な低い状態に戻すためであることを突き止めた。つまり、テロメアを伸長するためには、テロメラーゼ活性を抑制する機構よりも強いテロメラーゼ活性化効果をもつ化合物を見つけ出す必要があることを発見した。
【００１１】
そこで、本発明者は、テロメアを伸長する働きの強い化合物を数多くの化合物や抽出物から探索した。本発明者の鋭意努力の結果、テロメラーゼ抑制機構よりも強いテロメラーゼ活性化効果がポリアミンにあり、テロメアを伸長できることを発見した。しかしながら、ポリアミンのみを添加すると細胞はアポトーシスを誘導するという問題があった。本発明者は、この問題を解決すべく、さらに鋭意努力を進めた。そこで、細胞死阻害物質の存在下で細胞を培養することで、安定して体細胞のテロメアを伸長できることを発見した。
【００１２】
また、細胞にはテロメラーゼ活性を最小限に抑制する機構が備わっているが、本発明者はこの制御機構を外すための研究も、鋭意努力を進めた。その結果、メニン遺伝子（ＭＥＮ１）の働きを抑制する化合物が、テロメラーゼ活性を最小限に抑制する機構を阻害し、テロメラーゼ活性が高まりやすくなることも見いだした。したがって、ポリアミンと細胞死阻害物質だけでなく、さらにメニン抑制物質を組み合わせて培養することで、アポトーシスを回避するだけでなく、テロメラーゼ遺伝子の抑制効果も解除でき、ポリアミンによるテロメア伸長効果が高まることを見いだした。
【００１３】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  細胞死阻害物質を含む培地で細胞を培養する第１工程と、
ポリアミンを含む培地で細胞を培養する第２工程と、
を含む、若返り細胞の製造方法。
［２］  第２工程の培地は、細胞死阻害物質を含む、［１］に記載の若返り細胞の製造方法。
［３］  細胞死阻害物質は、アポトーシス阻害剤およびＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１つである、［１］または［２］に記載の若返り細胞の製造方法。
［４］  前記ポリアミンは、スペルミン、プトレシン、スペルジンおよびこれらのアセチル化体、並びにこれらの２つ以上の重合体からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［１］〜［３］のいずれかに記載の若返り細胞の製造方法。
［５］  第２工程の培地中のポリアミンの量は、１０万個の細胞に対して５ｎｍｏｌ以上２．５μｍｏｌ以下である、［４］に記載の若返り細胞の製造方法。
［６］  第２工程の培地中のポリアミンの濃度は、１μＭ以上５００μＭ以下である、［４］に記載の若返り細胞の製造方法。
［７］  メニン抑制物質を含む培地で細胞を培養する第３工程を含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の若返り細胞の製造方法。
［８］  メニン抑制物質は、蜂の子粉末抽出物およびマムシ粉末抽出物からなる群より選ばれる少なくとも１つである、［７］に記載の若返り細胞の製造方法。
【００１４】
以下、本明細書において、本発明の若返り細胞の製造方法を「ポリアミン誘導法」と呼ぶことがある。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のポリアミン誘導法によれば、遺伝子組換え技術を用いずに、テロメア長が伸長した細胞を得ることができる。ポリアミンがテロメラーゼを活性化することおよびテロメアを伸長することに関する報告は、現在までなされていない。したがって、本発明のポリアミン誘導法は、テロメアの伸長に関する新たな知見に基づいており、本発明の特許性は極めて高い。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、分裂回数４８回の正常ヒト線維芽細胞ＴＩＧ−１−２０細胞を培養する培地に、細胞死阻害物質とスペルミンとを添加して得られた細胞のテロメア長を示す。＊＊はｐ値＜０．０１（有意水準５％で両側ｔ検定）を示す。
【図２】図２は、分裂回数４８回の正常ヒト線維芽細胞ＴＩＧ−１−２０細胞を培養する培地に、細胞死阻害物質とスペルミンとを添加して得られた細胞の倍加時間を示す。＊＊はｐ値＜０．０１（有意水準５％で両側ｔ検定）を示す。
【図３】図３は、複数の細胞のテロメア長を調べた結果を示す。ＴＩＧ、ＴＡ６５、Ｙｎｇ１、Ｔ２は、正常ヒト線維芽細胞ＴＩＧ−１−２０細胞（分裂回数４５回）、ＴＡ−６５溶液を添加してＴＩＧ−１−２０細胞（分裂回数４５回）を培養した細胞、ポリアミン誘導法を用いてＴＩＧ−１−２０（分裂回数４５回）から作製した若返り細胞ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１、ＴＥＲＴ遺伝子を導入したＯＵＭＳ−３６Ｔ−２細胞をそれぞれ示す。＊＊はｐ値＜０．０１（有意水準５％で両側ｔ検定）を示す。
【図４】図４は、複数の細胞の倍加時間を調べた結果を示す。ＴＩＧ、ＴＡ６５、Ｙｎｇ１、Ｔ２は、正常ヒト線維芽細胞ＴＩＧ−１−２０細胞（分裂回数４５回）、ＴＡ−６５溶液を添加してＴＩＧ−１−２０細胞（分裂回数４５回）を培養した細胞、ポリアミン誘導法を用いてＴＩＧ−１−２０（分裂回数４５回）から作製した若返り細胞ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１、ＴＥＲＴ遺伝子を導入したＯＵＭＳ−３６Ｔ−２細胞をそれぞれ示す。＊＊はｐ値＜０．０１（有意水準５％で両側ｔ検定）を示す。
【図５】図５は、若返り細胞ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１の明視野顕微鏡写真を示す。
【図６】図６は、若いヒト線維芽細胞の特徴的なタンパク質に対応する遺伝子の発現量を示す。横軸のＥＧＦ、ＩＧＦ、ＥＬＮ１、ＨＡＳ２は、ＥＧＦタンパク質、インスリン成長因子１、エラスチン１、ヒアルロン酸合成酵素２に対応する遺伝子を示す。縦軸は、ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１細胞でのＲＮＡ量が、ＴＩＧ−１−２０細胞（分裂回数４５回）の何倍になっているかを示す。＊＊はｐ値＜０．０１（有意水準５％で両側ｔ検定）を示す。
【図７】図７はＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１細胞を長期継代培養した時の細胞の分裂回数とテロメア長さの関係を示す。
【図８】図８はＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１細胞を長期継代培養した時の細胞の分裂回数と倍加時間の関係を示す。
【図９】ＴＩＧ−１０７細胞を蜂の子粉末抽出物およびマムシ粉末抽出物存在下で培養した時のＭＥＮ１、ｃ−Ｍｙｃ、ＴＧＦβのＲＮＡ量を定量ＰＣＲで調べた結果を示す。β−アクチンを基準遺伝子として用いた。＊＊はｐ値＜０．０１（有意水準５％で両側ｔ検定）を示す。
【図１０】ＴＩＧ−１０７細胞を蜂の子粉末抽出物およびマムシ粉末抽出物存在下で培養した時のＴＥＲＴのＲＮＡ量をリアルタイムＰＣＲで調べた結果を示す。β−アクチンをハウスキーピング遺伝子（基準遺伝子）として用いた。＊はｐ値＜０．０５（有意水準５％で両側ｔ検定）を示す。
【図１１】ＴＩＧ−１０７細胞をニワトリの精巣、蜂の子粉末抽出物、マムシ粉末抽出物存在下で培養した時のテロメア長を調べた結果を示す。＊はｐ値＜０．０５（有意水準５％で両側t検定）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、細胞死阻害物質を含む培地で細胞を培養する第１工程と、
ポリアミンを含む培地で細胞を培養する第２工程と、
を含む、若返り細胞の製造方法である。
【００１８】
本発明において、「若返り細胞」とは、元の細胞よりもテロメア長が伸長している細胞と定義し、「高度に若返った細胞」とは、テロメア長が１５ｋｂ以上である細胞と定義する。若返り細胞は、テロメア長が伸長することにより倍加時間も短縮している。高度に若返った細胞は、好ましくは細胞の倍加時間が２．０日以下である。細胞が若返り細胞または高度に若返った細胞であることは、以下のテロメア長の測定方法により確認できる。
【００１９】
細胞のテロメア長は、細胞からゲノムＤＮＡを抽出および精製したのち、サザンブロット、蛍光  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション、フローサイトメトリー等公知の方法によって求めることができる。本発明における細胞のテロメア長は、Ｃａｗｔｈｏｎの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２，３０，ｅ４７）に従ってリアルタイムＰＣＲを用いて算出した値に基づいている。具体的には、まず、約１万個の細胞からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  Ｔｉｓｓｕｅ  キット（タカラバイオ株式会社製）により、キットの手順に従って細胞のゲノムＤＮＡを抽出および精製する。リアルタイムＰＣＲのプライマーは、Ｃａｗｔｈｏｎの文献に記載されたテロメアのプライマーｔｅｌ１およびｔｅｌ２、３６Ｂ４遺伝子のプライマー３６Ｂ４ｕおよび３６Ｂｄを用い、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ（キアゲン社）により、１０μＬの反応液（２ｘサイバーグリーン溶液５μＬ、ゲノムＤＮＡ（約１０ｎｇ）１μＬ、１．２５μＭのプライマー４μＬ）を調整する。ＰＣＲの反応条件は、サイクル温度が９５℃で１５秒及び５８℃で２分、サイクル回数５０回〜８０回とし、キアゲン社のリアルタイムＰＣＲ装置（Ｒｏｔｏｒ−ＧｅｎｅＴＭ  ｄｅｖｉｃｅ）によってリアルタイムＰＣＲを行う。得られた結果は、閾値を０．１としてサイクル数を算出した後、３６Ｂ４遺伝子の長さに対するテロメア長の比（Ｔ／Ｓ比）を算出し、Ｙ＝１９１０．６Ｘ＋４１５７（Ｙ：テロメア長（ｂｐ）、Ｘ：Ｔ／Ｓ比）によりテロメア長さを算出する。実験は独立した３つ以上の繰り返し実験を行ってテロメア長を求め、その相加平均値をその細胞のテロメア長とした。もとの細胞のテロメア長よりも、ポリアミン誘導法により得られた細胞のテロメア長が大きいときに、テロメア長は伸長しているとする。
【００２０】
細胞の倍加時間は、例えば培養前（培養開始時）と培養後に、血球計算盤により細胞数を計算し、以下の式によって算出することができる。付着性細胞は、例えば２．５質量％のトリプシン溶液で細胞を培養容器の底面から剥がし、２ｍＬのＭＥＭ培地に懸濁し、細胞数を計数することができる。
Ｙ＝Ｔ／ｌｏｇ２Ｘ
（Ｙ：倍加時間（日）、Ｔ：培養時間（日）、Ｘ：培養後の細胞数／培養開始時の細胞数）
【００２１】
ヒトの体細胞の場合、テロメア長が１５ｋｂ程度または倍加時間が２．０日程度あれば胎児由来の体細胞と同等の性質を有しており、３０回程度の分裂が可能である。
【００２２】
また、細胞老化に伴って、個々の細胞で特異的な機能を発揮するための遺伝子発現が低下する。これらの細胞特異的な遺伝子の発現を調べれば、細胞の若返りを確認できる。例えば線維芽細胞の場合、老化により、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、エラスチン（ＥＬＮ１）、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）およびＩ型コラーゲン合成酵素の発現が低下する。リアルタイムＰＣＲまたはＥＬＩＳＡ等によってｍＲＮＡ量またはタンパク質量を定量し、これらの遺伝子やタンパク質の発現量の増加を確認することにより、細胞の若返りを確認できる。
【００２３】
本発明に使用する細胞は、特に限定されないが、体細胞であることが好ましい。ここで体細胞とは、生殖細胞以外の細胞のことをいう。体細胞は、染色体を有する体細胞であれば特に限定されないが、正常な２倍体細胞であることが好ましい。体細胞としては、例えば組織を作る細胞（線維芽細胞、表皮細胞、乳腺細胞、脂肪細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、肝細胞、心筋細胞、血管内皮細胞またはそれらの前駆細胞等）、免疫系の細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球系の細胞等）、神経細胞または幹細胞（多能性幹細胞、血球系幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞）等を使用できる。
【００２４】
本発明に用いる体細胞は、動物細胞であることが好ましい。ここで、動物はヒトを含み、好ましくは哺乳動物である。ヒト以外の哺乳動物としては、特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどが挙げられる。哺乳動物以外の動物としては、例えば、ショウジョウバエなどの昆虫類などが挙げられる。
【００２５】
ヒトの細胞は、例えばヒト正常細胞の分譲を行っている保存機関（ＡＴＣＣ、ＪＣＲＢなど）から分譲を受けるか、ヒト正常細胞の販売を行う市販のメーカーから購入するか、または、ヒトから細胞を取り出すことにより取得できる。例えば、ヒトなどの動物の組織から細胞を取り出して用いる場合は、組織検査の装置を用いた組織の一部のサンプリング、手術等による組織の部分的切除、脂肪吸引等の方法により組織を得た後、トリプシン等の酵素により細胞を分離し、適切な培地で培養する。
【００２６】
＜第１工程＞
第１工程では、細胞死阻害物質を含む培地で細胞を培養する。ポリアミンを高濃度で添加して細胞を培養した場合、細胞は異常が生じたと判断し、アポトーシスを誘導してしまう。しかし、細胞死阻害物質を添加すると、高濃度のポリアミンを添加した場合でも細胞死を起こすことなくテロメラーゼ活性を非常に高めることが可能であり、短時間でテロメアを伸長することができる。
【００２７】
細胞死阻害物質としては、細胞死を抑制できる物質であれば特に限定されないが、例えばアポトーシス阻害剤を用いることができる。アポトーシス阻害剤として、例えば、ｐ５３阻害剤やＢａｘ阻害剤、アポトーシス関連遺伝子の発現抑制剤などを利用できる。ｐ５３阻害剤として例えば、Ｃｙｃｌｉｃ  Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α  Ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ（ＣＡＳ登録番号５１１２９６−８８−１）、Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−μ（ＣＡＳ登録番号６４９８４−３１−２）などを利用でき、Ｂａｘ阻害剤として例えば、Ｂａｘ−Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｖ５（ＣＡＳ登録番号５７９４９２−８１−２）などを利用できる。アポトーシスをより起こしにくくするためには、これらの阻害剤を２つ以上組み合わせて使用することが望ましい。さらに、ポリアミンによる細胞への悪影響を最小限にするためには、Ｒｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤をアポトーシス阻害剤と同時に添加してもよい。Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤として、例えばＹ−２７６３２（ＣＡＳ登録番号１２９８３０−３８−２）、チアゾビビン（ＣＡＳ登録番号１２２６０５６−７１−８）などを利用できる。
【００２８】
細胞死阻害物質の適切な濃度は、ポリアミン誘導法に用いる体細胞により適宜設定することができるが、例えば細胞死阻害物質としてＹ−２７６３２を用いる場合、培地中の濃度は好ましくは約１μＭ以上であり、より好ましくは約１０μＭ以上約１００μＭ以下である。チアゾビビンを用いる場合は、培地中の濃度は好ましくは約１μＭ以上であり、より好ましくは約３μＭ以上約１００μＭ以下である。Ｂａｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｖ５を用いる場合は、培地中の濃度は好ましくは約１０μ/ｍＬ以上であり、より好ましくは約２０μｇ/ｍＬ以上２ｍｇ/ｍＬ以下である。ｃｙｃｌｉｃ  ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α−ｈｙｄｒｏｂｏｒｍｉｄｅを用いる場合は、培地中の濃度は好ましくは約５μＭ以上であり、より好ましくは約２０μＭ以上２ｍＭ以下である。
【００２９】
細胞は、一般に細胞培養に用いられている培養容器、例えばフラスコまたはディッシュで培養することができる。例えば２５ｃｍ２の培養フラスコの場合、５ｍＬ〜２０ｍＬの培地に１０万個程度の細胞を播種することが好ましい。浮遊性細胞の場合は播種と同時に培地に細胞死阻害物質を加え、第１工程を開始することができる。付着性細胞を用いる場合、細胞の播種と同時に細胞死阻害物質を添加した培地で培養して第１工程を開始してもよいし、細胞の通常の培養温度（３７℃程度）のＣＯ２インキュベーターで１６時間程度培養（前培養）することにより、細胞を培養容器の底面に付着させてから第１工程を開始してもよい。細胞死阻害物質は、前培養を行った培地に適切な濃度となるように添加してもよいし、適切な濃度の細胞死阻害物質を含む培地を準備してから前培養を行った培地と交換してもよい。
【００３０】
培養温度およびＣＯ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃であり、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば約１体積％から約１０体積％であり、好ましくは約５体積％である。培養時間は、例えば約０．５時間以上約４８時間以下、好ましくは約１時間以上約２４時間以下である。細胞を培養する培地は、それぞれの細胞に適した一般的な培地でよい。例えば、線維芽細胞等であれば、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）に１０体積％の牛血清を添加した培地を用いればよい。細胞種の性質を安定に保持するためには、それぞれの細胞に特異的な誘導因子を含む分化誘導培地で培養することもできる。
【００３１】
＜第２工程＞
第２工程では、ポリアミンを含む培地で細胞を培養する。本工程で使用するポリアミン（ｐｏｌｙａｍｉｎｅ）とは、直鎖脂肪族炭化水素に第一級アミノ基および第二級アミノ基の少なくともいずれかが合計で２つ以上結合した化合物を意味するが、好ましくは第一級アミノ基が２つ以上結合している。
【００３２】
ポリアミンとしては、例えばスペルミン（ＣＡＳ登録番号７１−４４−３）、プトレシン（ＣＡＳ登録番号１１０−６０−１）、スペルミジン（ＣＡＳ登録番号１２４−２０−９）、およびこれらのアセチル化体、並びにこれらの２つ以上の重合体が挙げられる。
【００３３】
ポリアミンのアセチル化体（アセチル化ポリアミン）としては、例えばＮ−アセチルプトレシン、Ｎ−アセチルスペルミジン、Ｎ−アセチルスペルミン、ジアセチルプトレシン、ジアセチルスペルミジン、ジアセチルスペルミンが挙げられる。なお、ポリアミンの２つ以上の重合体は、化学合成により得ることができる。
【００３４】
ポリアミンは、炭素鎖３〜４の間隔でアミノ基（−ＮＨ２基または−ＮＨ−基）が存在し、細胞分裂やタンパク質合成に関与している成長因子である。したがって、上記以外のポリアミン（生体内に存在する他のポリアミン、化学合成により得られた他のポリアミンなど）のうち、スペルミン、スペルミジン、プトレシン等と類似の構造を有する化合物も、本発明に用いることができる。なお、ポリアミンの遺伝子発現を誘導する能力は、スペルミン、スペルミジン、プトレシンの順に強く、直鎖分子の長さが長いほど、モル濃度当たりの遺伝子の発現を誘導する効果は大きい。
【００３５】
なお、ポリアミンは水溶性のため、１０〜１００ｍＭ程度の濃度のポリアミン水溶液を作製し、０．２μｍの濾過フィルターにより滅菌処理した後、適切な濃度になるように培地に添加して使用することができる。
【００３６】
本発明において、好ましいポリアミンの濃度は、ポリアミンの種類、細胞の種類および細胞の老化度により異なるため、予備実験によりその量を把握する必要がある。例えば２５ｃｍ２の培養フラスコに５ｍＬの培地を入れて１０万個の線維芽細胞を播種し、ポリアミンとしてスペルミンを用いた場合、培地中のスペルミンの濃度は、好ましくは約１μＭ（マイクロモル／リットル）以上約５００μＭ以下であり、より好ましくは約２０μＭ以上約２００μＭ以下である。また、培地へのスペルミンの添加量は、１０万個の細胞に対して、好ましくは約５ナノモル（ｎｍｏｌ）以上約２．５マイクロモル（μｍｏｌ）以下であり、より好ましくは約１００ナノモル（ｎｍｏｌ）以上約１．０マイクロモル（μｍｏｌ）以下である。スペルミン以外のポリアミンを用いた場合、上記濃度のスペルミンを用いた時と同程度のテロメア伸長効果を示す濃度で用いられることが好ましい。ポリアミンを低濃度で添加して細胞を培養すると細胞死は起こらないが、細胞内のポリアミン分解酵素によりポリアミンが分解され、ポリアミン濃度は速やかに正常値に戻されるため、テロメアの伸長は不十分となる。ポリアミンの量が多すぎると細胞の性質が変化してしまう虞がある。したがって、その中間の量を適量添加することが、本発明において望ましい。
【００３７】
細胞は、一般に細胞培養に用いられている培養容器、例えばフラスコまたはディッシュで培養することができる。例えば２５ｃｍ２の培養フラスコの場合、５ｍＬ〜２０ｍＬの培地に１０万個程度の細胞を播種することが好ましい。浮遊性細胞の場合は播種と同時に第２工程を開始することができる。付着性細胞の場合は、細胞の播種と同時に細胞の播種と同時にポリアミンを添加した培地で培養して第２工程を開始してもよいし、３７℃程度のＣＯ２インキュベーターで１６時間程度培養（前培養）することにより、細胞を培養容器の底面に付着させてから第２工程を開始してもよい。
【００３８】
第２工程は、第１工程と同時に開始してもよいし、第１工程を行ってから第２工程を開始してもよい。第１工程を行ってから第２工程を行う場合、第１工程または前培養により付着性細胞は培養容器の底面に付着させてから第２工程を行うことが好ましい。ポリアミンは、前培養または第１工程を行った培地に適切な濃度となるように添加してもよいし、適正な濃度のポリアミンを含む培地を準備してから前培養または第１工程の培地と交換してもよい。細胞死阻害の観点からは、第１工程を行ってから第２工程を開始することが好ましい。すなわち、細胞死阻害物質を含む培地で細胞を培養した後、細胞死阻害物質およびポリアミンを含む培地で細胞を培養することが好ましい。
【００３９】
第２工程の培地は、細胞死阻害物質を含むことが好ましい。細胞死阻害物質は、上記第１工程と同様の化合物を用いることができる。細胞を細胞死阻害物質を含む培地で培養する第１工程の後、培地にポリアミンを適切な濃度になるように添加してもよいし、ポリアミンおよび細胞死阻害物質を含む培地を準備して第１工程を行った培地と交換して第２工程を開始してもよい。
【００４０】
培養温度、ＣＯ２濃度、培地等の培養条件は第１工程と同様に適宜設定できる。第２工程の培養時間は、例えば約１２時間以上約７２時間以内であり、好ましくは約２４時間以上約４８時間以内である。これにより、テロメアが伸長した若返り細胞を、好ましくは高度に若返った細胞を得ることができる。
【００４１】
＜第３工程＞
本発明の若返り細胞の製造方法は、メニン抑制物質を含む培地で細胞を培養する第３工程を含むことが好ましい。
【００４２】
メニン抑制物質としては、メニン遺伝子の働きを抑制することができる物質であれば特に限定はなく、核酸、タンパク質、低分子化合物等のいずれであってもよい。このような物質としては、例えばメニン遺伝子（ＭＥＮ１）の発現を抑制する化合物（ＭＥＮ１遺伝子のｓｉＲＮＡなど）、メニンタンパク質の作用を阻害する物質を利用できる。このようなメニン抑制物質として、例えば蜂の子粉末抽出物、マムシ粉末抽出物等を用いることが好ましい。メニン抑制物質を含む培地で細胞を培養することで、細胞のテロメラーゼ活性を高め、テロメアの伸長効率を高めることができるため、メニン抑制物質を添加しない場合より低濃度のポリアミン処理によって、細胞の性質を変えることなく若返り細胞を、好ましくは高度に若返った細胞を得ることができる。例えば、２５ｃｍ２の培養フラスコに５ｍＬの培地を入れて１０万個の線維芽細胞を播種し、ポリアミンとしてスペルミンを用いた場合、培地中のスペルミンの濃度は、約１μＭ以上約５００μＭ以下であり、より好ましくは約２０μＭ以上約５０μＭ以下である。また、培地へのスペルミンの添加量は、１０万個の細胞に対して、好ましくは約５ナノモル（ｎｍｏｌ）以上約２．５マイクロモル（μｍｏｌ）以下であり、より好ましくは約１００ナノモル（ｎｍｏｌ）以上約０．２５マイクロモル（μｍｏｌ）以下である。
【００４３】
メニン抑制物質として、蜂の子粉末抽出物を使用する場合、蜂の子としてはミツバチ、スズメバチ、クロスズメバチ、アシナガバチ、クマバチなどの蜂の幼虫やサナギを用いることができる。これらの蜂の子を乾燥または凍結乾燥させ、粉末にする。蜂の子粉末は、蜂の子以外にも花粉や蜂蜜を含有していてもよい。市販されている蜂の子粉末として、例えば原料問屋えびやの蜂の子粉末を用いることができる。蜂の子粉末を培地に加えてもよいが、蜂の子粉末を例えば２００ｍｇ当たり１．０ｍＬの純水に懸濁し、１２０℃で１分間滅菌処理したものを、遠心分離することにより得られる上清を培地に添加して用いることができる。準備した蜂の子粉末抽出物は、例えば６ｍＬの培地に約１μＬ以上約２００μＬ以下、好ましくは約５μＬ以上約１００μＬ添加して用いることができる。
【００４４】
マムシ粉末抽出物は、マムシを乾燥または凍結乾燥させて粉末にしたものを用いることができる。赤マムシも分類学上はマムシと同じであるが、体色の赤い固体を指す。市販されているマムシ粉末として、例えばクラブスマイルの赤マムシ粉末を用いることができる。マムシ粉末を培地に加えてもよいが、好ましくはマムシ粉末を例えば２００ｍｇ当たり１．０ｍＬの純水に懸濁し、１２０℃で１分間滅菌処理したものを、遠心分離することにより得られる上清を培地に添加して用いることができる。準備したマムシ粉末抽出物は、例えば２５ｃｍ２の培養フラスコに６ｍＬの培地を入れて１０万個の線維芽細胞を播種した場合、約１μＬ以上約２００μＬ以下、好ましくは約５μＬ以上約１００μＬ添加して用いることができる。
【００４５】
第３工程は、第１工程または第２工程と同時に行ってもよいし、第１工程および第２工程と同時に行ってもよい。また、第１工程もしくは第２工程の前または第１工程もしくは第２工程の後に行ってもよい。例えば第３工程を第１工程または第２工程と同時に行う場合は、第１工程の培地または第２工程の培地に適切な濃度となるようにメニン抑制物質を添加し、第１工程または第２工程を開始する。メニン抑制物質は、細胞を培養している培地に、適切な濃度となるように添加してもよいし、適切な濃度となるように調製した培地を準備し、細胞を培養している培地と交換してもよい。第３工程は、テロメア伸長効果の観点からは好ましくは第１工程と同時に行う。すなわち、細胞死阻害物質およびメニン抑制物質を含む培地で細胞を培養する第１工程を行った後、細胞死阻害物質、メニン抑制物質およびポリアミンを含む培地で細胞を培養する第２工程を行うことが好ましい。
【００４６】
培養温度、ＣＯ２濃度、培地等の培養条件は第１工程と同様に適宜設定できる。第３工程の培養時間は、例えば約１２時間以上約７２時間以内であり、好ましくは約２４時間以上約４８時間以内である。
【００４７】
得られた若返り細胞および高度に若返った細胞は、細胞死阻害物質、ポリアミンおよびメニン抑制物質を含まない通常の培地で培養できる。
【００４８】
細胞周期の停止に近い非常に老化した細胞では、Ｍ１期に到達したためにテロメア同士が結合してしまい、テロメラーゼによりテロメアを伸長できない細胞が数多く含まれている。そのため、一度のポリアミン誘導法の操作により十分な若返り細胞が得られないことがある。その場合は、ポリアミン誘導法の操作を２回以上繰り返して若返り細胞の割合を少しずつ増やすことにより、若返り細胞および高度に若返った細胞を得ることができる。
【実施例】
【００４９】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。しかしながら、以下の実施例は本発明の例示であって、本発明を限定することを意図するものではない。
【００５０】
＜実施例１：ポリアミンが線維芽細胞のテロメアを伸長することの証明＞
この実験は、ポリアミンがテロメアを伸長し、細胞を若返らせる効果があることを確認するために実施した。
【００５１】
ヒト肺由来の線維芽細胞ＴＩＧ−１−２０株（ＪＣＲＢ０５０１）は、ＪＣＲＢ細胞バンクより入手した。Ｂａｘ阻害剤のＢａｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｖ５とｐ５３阻害剤のｃｙｃｌｉｃ  ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α−ｈｙｄｒｏｂｏｒｍｉｄｅとをアポトーシス阻害として、Ｙ−２７６３２とチアゾビビンとをＲＯＣＫ阻害剤として用いた。
【００５２】
実験には分裂回数４８回のヒト線維芽細胞ＴＩＧ−１−２０細胞を用いた。ＴＩＧ−１−２０細胞１０万個を６ｍＬのＭＥＭ（１０％牛血清を含む）に懸濁し、２５ｃｍ２の培養フラスコで１６時間培養し、細胞を底面に付着させた。培養フラスコ（１）および（２）は、何も添加せずにＣＯ２インキュベーターで１６時間培養し、培養フラスコ（３）および（４）には、２０ｍＭのＹ−２７６３２溶液を４μＬ、１０ｍＭのチアゾビビンＤＭＳＯ溶液を２μＬ、２ｍｇ／ｍＬのＢａｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｖ５水溶液を４０μＬ、６０ｍＭのｃｙｃｌｉｃ  ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α−ｈｙｄｒｏｂｏｒｍｉｄｅエタノール溶液を３μＬを培地に添加し、細胞に阻害剤を取り込ませた。その後、（２）〜（４）のフラスコに、２０ｍＭのスペルミン水溶液を６μＬ添加し、１日間培養した。フラスコ（３）は、さらに２日間培養した。フラスコ（４）には、２０ｍＭのスペルミン水溶液を１２μＬずつ添加する操作を１日毎に２度行い、２日間培養した。これにより、（１）何も添加せずに培養したＴＩＧ−１−２０細胞、（２）細胞死阻害物質を添加せず、最終濃度２０μＭのスペルミンを添加して培養した細胞、（３）細胞死阻害物質を添加し、最終濃度２０μＭのスペルミンを添加して培養した細胞、（４）細胞死阻害物質を添加し、最終濃度１００μＭのスペルミンを添加して培養した細胞の４種類の細胞を得た。得られた細胞は、１０万個の細胞（ｎ＝３）を、６ｍＬのＭＥＭ（１０％牛血清を含む）を用いて２５ｃｍ２の培養フラスコで５日間培養した。
【００５３】
その結果、細胞死阻害物質を添加せずに最終濃度２０μＭのスペルミンを添加した場合、すべての細胞が細胞死を起こした。細胞死阻害物質を添加し、最終濃度２０μＭまたは１００μＭのスペルミンを添加した細胞は、細胞死を起こさなかった。細胞死を起こさなかった細胞のテロメア長を上記に記載のＣａｗｔｈｏｎの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２，３０，ｅ４７）に従って測定した。結果を図１に示す。スペルミン処理をしていないＴＩＧ−１−２０細胞のテロメア長は約１０ｋｂであった。２０μＭのスペルミンを添加した場合、テロメラーゼ抑制機構によりテロメアの伸長は見られなかったが、１００μＭのスペルミンを添加した場合、テロメアは約４２ｋｂまで伸長した。
【００５４】
５日間の培養により得られた細胞を、２．５質量％のトリプシン溶液で剥がし、２ｍＬのＭＥＭ培地に懸濁し、血球計算盤を用いて細胞数を測定して培養容器中の細胞数を求めた。この操作を繰り返しながら、継代培養した。上記の倍加時間を求める式に基づき、倍加時間を算出した。実施例１で得られた細胞の倍加時間を図２に示す。スペルミン処理をしていないＴＩＧ−１−２０細胞の倍加時間は約３．１日であったのに対し、１００μＭのスペルミンと細胞死阻害物質とを添加して培養した場合、倍加時間は１．１３日であった。以上の結果より、ポリアミンと細胞死阻害物質とを含む培地中で体細胞を培養することにより、テロメアが伸長された若返り細胞を得ることができ、細胞の倍加時間も短縮されることが確認された。
【００５５】
＜実施例２：テロメアの伸長を助ける化合物の効果の証明＞
この実験は、メニン抑制物質がポリアミンのテロメア伸長効果を助けることを確認するために実施した。
【００５６】
ヒト肺由来の線維芽細胞ＴＩＧ−１−２０細胞（ＪＣＲＢ０５０１）とヒト線維芽細胞ＯＵＭＳ−３６Ｔ−２株（ＪＣＲＢ１００６．２）とを、ＪＣＲＢ細胞バンクより入手した。Ｂａｘ阻害剤のＢａｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｖ５とｐ５３阻害剤のｃｙｃｌｉｃ  ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α−ｈｙｄｒｏｂｏｒｍｉｄｅとをアポトーシス阻害として、Ｙ−２７６３２とチアゾビビンとをＲＯＣＫ阻害剤として用いた。また、メニン抑制物質として、蜂の子粉末抽出物を使用した。蜂の子粉末は、原料問屋えびやから購入した。２００ｍｇの蜂の子粉末当たり１．０ｍＬの純水を加えた後、蜂の子粉末を１２０℃で１分間滅菌処理することにより蜂の子粉末抽出物を作製した。ＴＡ−６５溶液は、ＴＡ−６５（Ｔ．Ａ．ＳＣＩＥＮＣＥＳ社製）１００ｍｇを１ｍＬのＤＭＳＯ溶液に溶解して使用した。
【００５７】
ＴＩＧ−１−２０細胞は分裂回数４５回の細胞を用いた。ＴＩＧ−１−２０細胞１０万個を６ｍＬのＭＥＭに懸濁し、２５ｃｍ２の培養フラスコで１６時間ＣＯ２インキュベーターで培養して細胞を底面に付着させた。培地には、２０ｍＭのＹ−２７６３２溶液を４μＬ、１０ｍＭのチアゾビビンＤＭＳＯ溶液を２μＬ、２ｍｇ／ｍＬのＢａｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｖ５水溶液を４０μＬ、６０ｍＭのｃｙｃｌｉｃ  ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α−ｈｙｄｒｏｂｏｒｍｉｄｅエタノール溶液を３μＬ、蜂の子粉末抽出物の上澄みを２０μＬを添加し、阻害剤を取り込ませた。その後、２０ｍＭのスペルミン水溶液を６μＬ添加し、２日間培養した。得られた細胞は、２．５質量％のトリプシン溶液で剥がして細胞を回収した後、６ｍＬのＭＥＭ（１０％牛血清を含む）を含む２５ｃｍ２のフラスコで３日間培養した。得られた若返り細胞を、「ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１」と呼ぶ。
【００５８】
ポジティブコントロールとして、ＴＥＲＴ遺伝子を導入したテロメアが非常に長いＯＵＭＳ−３６Ｔ−２細胞を使用した。１０万個のＯＵＭＳ−３６Ｔ−２細胞を２５ｃｍ２の培養フラスコで１２日間培養した後、２．５質量％のトリプシン溶液で剥がして、細胞を回収した。ネガティブコントロールとして、ＴＡ−６５を使用した。分裂回数４５回のヒト線維芽細胞ＴＩＧ−１−２０細胞１０万個を６ｍＬのＭＥＭ（１０％牛血清を含む）に懸濁し、２５ｃｍ２の培養フラスコで１６時間培養し、細胞を付着させた。その後、ＴＡ−６５溶液を２０μＬ添加し、２日間培養した。
【００５９】
若返り細胞ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１の一部は、１０万個ずつ６ｍＬのＭＥＭ（１０％牛血清を含む）に懸濁し、２５ｃｍ２の培養フラスコで３〜７日間培養した。得られた細胞は、実施例１と同様の方法によって、テロメア長および倍加時間を測定した。
【００６０】
各細胞のテロメア長を比較した結果を図３に示す。分裂回数４５回のヒト線維芽細胞ＴＩＧ−１−２０細胞（ＴＩＧ）のテロメア長は、約１０ｋｂであった。ＴＡ−６５溶液を添加した細胞（ＴＡ６５）のテロメア長は約１４ｋｂであり、約４ｋｂしかテロメアが伸長していなかった。これに対して、ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１株（Ｙｎｇ１）は、テロメア長が約４０ｋｂであり、ＴＩＧ−１−２０細胞に比べてテロメアが顕著に伸長していることを確認した。なお、遺伝子操作によりＴＥＲＴ遺伝子を導入したＯＵＭＳ−３６Ｔ−２細胞（Ｔ２）のテロメア長は、約８０ｋｂであった。
【００６１】
各細胞の倍加時間を図４に示す。ＴＩＧ−１−２０細胞（ＴＩＧ）の倍加時間は、ＴＡ−６５溶液で処理した細胞（ＴＡ６５）とほぼ同じで、それぞれ約２．４日と約２．３日であった。ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１株（Ｙｎｇ１）とＯＵＭＳ−３６Ｔ−２細胞（Ｔ２）の倍加時間は、はぼ同じでそれぞれ約１．２日と約１．３日であった。この分裂速度は、ヒト線維芽細胞が分裂できる最大の速度に該当し、ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１細胞の分裂速度がＴＩＧ−１−２０細胞の倍加速度と比べて速くなっていることを確認できた。蜂の子粉末抽出物を培地に添加することで、ポリアミンと細胞死抑制物質とを培地に添加して細胞を培養したときよりも、ポリアミンの濃度を低濃度にしてもテロメアを伸長させ、倍加時間を短縮させることができた。本発明によれば、他の化合物を用いるよりもテロメアの伸長を促進して、高度に若返った細胞を得ることができるため、本発明のポリアミン誘導法は、従来法と比較して進歩性は非常に高い。
【００６２】
＜実施例３：テロメアの伸長により細胞が若返っていることの証明＞
この実験は、ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１株が若返っているかどうかを確認するために実施した。
【００６３】
ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１細胞の顕微鏡写真を、図５に示す。ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１細胞は、細胞分裂が早いため小さく均一な繊維芽細胞の形態を示した。これは細胞分裂が円滑に進んでいる分裂回数の少ない若い細胞の特徴と一致する。
【００６４】
さらに、細胞が若返っているかを遺伝子の発現量により確認した。若いヒト線維芽細胞では、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、エラスチン（ＥＬＮ１）およびヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ２）の発現が活発であり、これらの遺伝子の発現は細胞の若返りの指標となる。若返り細胞ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１細胞およびポリアミン処理前のＴＩＧ−１−２０細胞において、これらの遺伝子の発現量を調べた。まず、細胞からキアゲン社のキット（ＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｋ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｋｉｔ）を用いてｍＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡを合成した。そして、キアゲン社のリアルタイムＰＣＲ装置（Ｒｏｔｏｒ−ＧｅｎｅＴＭ  ｄｅｖｉｃｅ）によりリアルタイムＰＣＲを行った。ハウスキーピング遺伝子(基準遺伝子）として、β−アクチンを用い、ΔΔＣｔ法によってＲＮＡ量を算出した。リアルタイムＰＣＲのプライマーは、キアゲン社のプライマー（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｋ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ）を用いた。
【００６５】
ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１細胞の上記遺伝子のＲＮＡ量が、分裂回数４５回時のＴＩＧ−１−２０細胞の何倍になっているかを調べた結果を図６に示す。ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１細胞のＥＧＦの発現量の増加は、ＴＩＧ−１−２０細胞の１．３倍程度にとどまったが、ＩＧＦ１は約３５倍、エラスチンは約８倍、ヒアルロン酸合成酵素２は約９倍と非常に高まっていた。遺伝子発現からも、ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１細胞は、もとの細胞のＴＩＧ−１−２０細胞よりも若返っていることを確認できた。
【００６６】
＜実施例４：若返りを長期に維持できることの証明＞
この実験は、若返り細胞が正常細胞と同様の性質を保持し、かつ、若返り細胞の特性を長期に維持できることを確認するために実施した。
【００６７】
若返り細胞ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１細胞を、１０万個ずつ６ｍＬのＭＥＭに懸濁し、２５ｃｍ２の培養フラスコで３〜７日間培養した。得られた細胞を、２．５質量％のトリプシン溶液で剥がし、２ｍＬのＭＥＭ培地に再懸濁し、血球計算盤を用いて細胞数を測定して、継代を繰り返した。分裂回数時における、細胞のテロメア長および倍加時間を実施例１と同様の方法で測定しながら、長期的に培養を行った。
【００６８】
ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１細胞を継代培養し、様々な分裂回数時におけるテロメア長を図７に、様々な分裂回数時における倍加時間を図８に示す。分裂回数は、４５回を最初の回数として計測した。ポリアミンを添加していない培地で培養したＴＩＧ−１−２０細胞は、分裂回数５０回で分裂を停止した。これに対して、図７に示すように、ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１細胞は５０回を超えて細胞分裂を継続することができ、テロメア長は、分裂に伴って次第に低下したものの、分裂回数１１０回の時点においても２０ｋｂ以上であった。また、図８に示すように、ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１細胞は、分裂回数１１０回の時点においても倍加時間を２．０日以下に維持できた。すなわち、ポリアミン誘導法によって得られた若返り細胞は、テロメアを４０ｋｂ近くまで伸長することにより、長期間に亘る細胞培養後にも、テロメア長が伸長され、倍加時間が短縮された状態が維持されていることを確認できた。
【００６９】
また、ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１細胞の細胞分裂に伴うテロメア長の変化の比較として、ヒト表皮細胞の細胞株であるＨａＣａＴ、ヒト肝がん細胞ＨｅｐＧ２を、１０万個ずつ６ｍＬのＭＥＭ（１０％牛血清を含む）に懸濁し、２５ｃｍ２の培養フラスコで３〜７日間培養した。得られた細胞のテロメア長を実施例１と同様にして測定した。
【００７０】
次に、ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１株のテロメア長をＨａＣａＴ細胞およびＨｅｐＧ２細胞のテロメアの特徴を比較した。細胞株ＨａＣａＴ細胞とがん細胞であるＨｅｐＧ２細胞のテロメア長さは、それぞれ約８ｋｂおよび約１０ｋｂと短い状態であり、ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１細胞は、これらの細胞株やがん細胞とは異なる性質を有する細胞であった。さらに、ＨａＣａＴ細胞およびＨｅｐＧ２細胞では、何世代培養してもテロメア長が一定に保持されたのに対して、ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１株は、正常細胞で特徴的な性質である「分裂に伴うテロメアの短縮」が起こった。これらの結果から、ＴＩＧ−Ｙｏｕｎｇ１株は、正常細胞であることを確認できた。
【００７１】
＜参考例：蜂の子粉末抽出物またはマムシ粉末抽出物のテロメア伸長効果の検証＞
蜂の子粉末抽出物またはマムシ粉末抽出物が細胞のテロメアを伸長する効果があることを検証した。老化が進んだ８１歳の女性のヒトの皮膚由来の繊維芽細胞ＴＩＧ−１０７細胞（ＪＣＲＢ０５３２）を６ｍＬのＭＥＭ（１０％牛血清を含む）に懸濁し、２５ｃｍ２フラスコで３７℃、５体積％ＣＯ２下で１６時間培養した。蜂の子粉末抽出物は、実施例２と同様に調製した。マムシ粉末抽出物は、クラブスマイルの赤マムシ粉末を用いた。２００ｍｇのマムシ粉末当たり１．０ｍＬの純水を加えた後、赤マムシ粉末を１２０℃で１分間滅菌処理することによりマムシ粉末抽出物を作製した。その後、蜂の子粉末抽出物の上澄みを２０μＬまたはマムシ粉末抽出物の上澄みを２０μＬ添加し、６日間培養した。得られた細胞から実施例２と同様の方法でｃＤＮＡを作製し、β−アクチンを基準遺伝子としてリアルタイムＰＣＲを行い、ＴＥＲＴ、ＭＥＮ１、ｃ−Ｍｙｃおよびｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  β（ＴＧＦβ）のＲＮＡ量を求めた。それぞれの遺伝子のプライマーは、キアゲン社のプライマー（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｋ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ）を用いた。
【００７２】
ＲＮＡの定量結果を図９および図１０に示す。蜂の子粉末抽出物またはマムシ粉末抽出物を添加して培養した細胞では、ｃ−ＭｙｃおよびＴＧＦβのＲＮＡ量は、これらの抽出物を添加せずに培養した細胞とほとんど変化はなかった。一方、ＴＥＲＴを抑制するＭＥＮ１の発現は、蜂の子粉末抽出物またはマムシ粉末抽出物の添加により低下していた（図９）。また、蜂の子粉末抽出物またはマムシ粉末抽出物の添加により、ＴＥＲＴのＲＮＡ量は増加していた（図１０）。
【００７３】
培養により得られた細胞のテロメア長を実施例１と同様の方法で求めた結果を図１１に示す。ニワトリの精巣抽出物を添加した細胞ではテロメア長にほとんど変化が見られなかったのに対し、蜂の子粉末抽出物またはマムシ粉末抽出物を添加して培養した細胞では、テロメアの伸長が確認された。蜂の子粉末およびマムシ粉末には、メニンを抑制することによりテロメラーゼを活性化し、テロメアの伸長を促進する効果があることがわかった。
【００７４】
今回開示された実施形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明のポリアミン誘導法を利用して得られる若返り細胞および高度に若返った細胞は、病気の解明や多くの患者の治療への応用が可能であり、本発明のポリアミン誘導法は、産業上の利用分野は極めて広く、現在の治療法を飛躍的に発展させる点で有効性は極めて高い。
【００７６】
本発明のポリアミン誘導法を利用して得られる若返り細胞および高度に若返った細胞の産業上の利用法の具体例を以下に例示する。ただし、以下の例示は、本発明の産業上の利用に関する例示であって、本発明を限定することを意図するものではない。
【００７７】
（１）患者の体から取り出した少量の正常体細胞は、分裂可能な回数が限られており、細胞を増やすことができないため、解析することが難しい。しかし、ポリアミン誘導法により、細胞を若返らせて細胞数を増やすという操作を繰り返せば、少量の細胞を解析が可能な数まで増やすことができる。そのため、難病患者から得られた細胞の特性解析が可能になり、病気の解明や治療薬の開発が進むと同時に、細胞を提供する難病の患者の負担を最小限にできる。
【００７８】
（２）市販の正常体細胞は、高価であり、数回分裂すると分裂を停止する。しかし、ポリアミン誘導法により、細胞を若返らせて細胞を増やすという操作を繰り返せば、分裂回数が増加した正常体細胞に変換でき、市販の正常体細胞を非常に安価に提供できる。そのため、医薬品の開発や検査など広く利用できる。
【００７９】
（３）ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ（ｉＰＳ）細胞などの多能性幹細胞から特定の細胞に分化させて増やした細胞群は、多能性幹細胞をそれぞれの体細胞に分化して増やす過程で、数十世代分裂を繰り返す必要があるため、テロメアの短い老化した状態になる。しかし、ポリアミン誘導法により、細胞を若返らせて細胞を増やすという操作を行えば、若い状態での再生組織を患者さんに提供できる。そのため、再生治療の治癒効果を上げることができる。
【００８０】
（４）やけどの際の皮膚の再生治療には、多量の皮膚組織が必要である。高齢では分裂可能な回数が少なく、皮膚のシートの作製は難しい。しかし、表皮や真皮細胞の微量な断片を取り出した後、ポリアミン法により細胞を迅速に増やすと同時に若返らせて皮膚シートを作製すれば、皮膚の再生治療の治療効果を高めることができる。
【００８１】
（５）免疫療法は、血球成分を取り出し、Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ（ＮＫ）細胞やＮａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ（ＮＫＴ）細胞などを活性化する治療法である。ポリアミン誘導法により、細胞を若返らせて細胞を増やすという操作を行えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞などを効率よく増やすと同時に、若い細胞を体内に戻すことになるので、体内での保持日数を非常に長くすることが可能であり、優れたがん免疫療法等の免疫療法が可能になる。
【００８２】
ポリアミン誘導法により細胞を若返らせる方法の利用範囲は、上記のシングルセルにのみ規定されるものではなく、ポリアミン誘導法で使われる化合物を、マイクロカプセルやシートとして成型して直接体内に埋め込みドラッグデリバリーを行うか、あるいは、錠剤に成型し、薬として経口投与すれば、以下の薬や臓器の再生への応用が期待できる。
（１）テロメアが短くなることで起こる早老症の等の病気の薬として利用できる。
（２）若返り薬として利用できる。
（３）老化により機能低下した心臓、神経、腎臓などの臓器あるいは血管などの組織にポリアミン誘導法で使用される化合物をマイクロカプセルやシートにしたものを、埋め込む、あるいは貼り付けることにより、臓器または組織機能を再生することができる。
【図１】
2019201576.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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