(57)【要約】      （修正有）【課題】創傷、特に慢性創傷、より優先的には非治癒慢性創傷を治癒または処置するための新規な療法剤および方法の提供。【解決手段】ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を阻害する作用物質ならびに／またはＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＧＬＩ１、ＳＯＸ９からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を増強する作用物質を含む治療用化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
創傷、好ましくは慢性創傷の処置における使用のための、
−  ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を阻害する作用物質
ならびに／または
−  ＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＧＬＩ１、ＳＯＸ９、優先的にＦＯＸＳ１、ＥＧＲ２、ＳＯＸ９、ＴＣＦ４、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を増強する作用物質
を含む治療用化合物。
【請求項２】
−  ＰＰＡＲＧもしくはＰＰＡＲＧと少なくとも５０％の同一性を有するそのホモログの活性を阻害する作用物質
ならびに／または
−  ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を増強する作用物質
をさらに含む、請求項１に記載の使用のための治療用化合物。
【請求項３】
前記作用物質は裸のあるいはプラスミドまたはウイルスベクターの形態のアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＴＡＬＥＮＳまたはリボザイムからなる群から選択される、請求項１または２に記載の使用のための治療用化合物。
【請求項４】
前記作用物質はタンパク質機能の阻害剤またはエンハンサーである、請求項１または２に記載の使用のための治療用化合物。
【請求項５】
前記作用物質は、可逆的あるいは不可逆的に結合してタンパク質機能を阻害する結合剤、たとえば抗体もしくは合成アンタゴニスト；または前記タンパク質のシグナル伝達機構の上流もしくは下流で作用してタンパク質機能を阻害する作用物質からなる群から選択される、請求項４に記載の使用のための治療用化合物。
【請求項６】
前記作用物質はＭＥＯＸ２またはＳＩＸ２の活性を阻害するか；または前記作用物質はＳＯＸ９またはＧＬＩ１の活性を増強する、請求項４または５に記載の使用のための治療用化合物。
【請求項７】
前記作用物質はＳＯＸ９またはＧＬＩ１のアゴニストから選択される、請求項４、５または６に記載の使用のための治療用化合物。
【請求項８】
前記作用物質はトラメチニブ、ＡＭ５８０およびＧａｎｔ  ６１から選択される、請求項４〜７のいずれか一項に記載の使用のための治療用化合物。
【請求項９】
前記治療用化合物は哺乳動物の創傷を処置するためのものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための治療用化合物。
【請求項１０】
前記治療用化合物は慢性創傷、たとえば静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍または圧迫性潰瘍を処置するためのものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための治療用化合物。
【請求項１１】
前記治療用化合物はヒト創傷を処置するためのものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための治療用化合物。
【請求項１２】
前記治療用化合物は局所適用のためのものである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための治療用化合物。
【請求項１３】
前記治療用化合物は医療装置に施される、または医療装置の含浸のためのものである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のための治療用化合物。
【請求項１４】
薬学的に許容されるキャリアと共に請求項１〜１３のいずれか一項に記載の治療用化合物を含む医薬組成物。
【請求項１５】
前記治療用化合物を薬学的もしくは獣医学的に許容されるキャリアまたはビヒクルと併用するまたは会合させるステップを含む、請求項１３に記載の医薬組成物を調製するための方法。
【請求項１６】
哺乳動物の創傷を処置するための方法であって、前記創傷に、
−  ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を阻害する作用物質
ならびに／または
−  ＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＧＬＩ１、ＳＯＸ９、優先的にＦＯＸＳ１、ＥＧＲ２、ＳＯＸ９、ＴＣＦ４、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を増強する作用物質
を含む治療用化合物を投与するステップを含む方法。
【請求項１７】
創傷、好ましくは慢性創傷を処置するためのキットであって、
（ａ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの治療用化合物または請求項１４に記載の組成物；および
（ｂ）前記創傷に施すための少なくとも１つの包帯材
を含むキット。
【請求項１８】
ａ）ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を阻害する作用物質
ならびに／または
−  ＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＧＬＩ１、ＳＯＸ９、優先的にＦＯＸＳ１、ＥＧＲ２、ＳＯＸ９、ＴＣＦ４、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を増強する作用物質
と
ｂ）少なくとも１つのさらなる療法剤
を含む、創傷、好ましくは慢性創傷を処置するための併用療法剤。
【請求項１９】
創傷を処置するための、
ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を阻害する作用物質
ならびに／または
−  ＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＧＬＩ１、ＳＯＸ９、優先的にＦＯＸＳ１、ＥＧＲ２、ＳＯＸ９、ＴＣＦ４、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を増強する作用物質
の使用であって、
前記作用物質は線維芽細胞および筋線維芽細胞の分化および／または活性を調節する
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創傷、特に慢性創傷、より優先的には非治癒慢性創傷を治癒または処置するための少なくとも１つの分子標的に関する。さらに、本発明は、創傷を処置するための新規な療法剤、および創傷を処置するための前記分子標的を含む新規な遺伝子治療アプローチに関する。加えて、本発明は、前記療法剤または前記遺伝子治療を用いて創傷を処置するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然創傷治癒は、連続的な３つの段階に分けられる。それぞれの段階：炎症期、増殖期およびリモデリング期は、特定の細胞活動を特徴とする。
【０００３】
炎症期と呼ばれる最初の段階は、傷害の直後から始まる。血管破裂が、主にフィブリンおよびフィブロネクチンからなる血栓形成を誘発する。血餅が外傷の一部を塞ぎ、外傷内の炎症細胞の遊走を可能にする。炎症細胞がリクルートされて創傷を清浄化する。血小板は、創傷治癒に関係している細胞（好中球およびマクロファージなどの炎症細胞、線維芽細胞ならびに内皮細胞）のリクルートメントを誘導する増殖因子またはサイトカインなどの因子を分泌する。
【０００４】
第２の段階は増殖期と呼ばれ、肉芽組織の発生に対応する。線維芽細胞は創傷領域に遊走し、増殖して細胞外マトリックス（ＥＣＭ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）タンパク質を分泌することにより新たに仮の細胞外マトリックスを形成する。次いで内皮細胞が遊走して外傷の血管新生または血管形成を促進する。肉芽組織の内部では、線維芽細胞が活性化して筋線維芽細胞に分化し、そのα平滑筋アクチンの発現の結果、収縮性を示す（平滑筋細胞の平滑筋アクチンと同様）。筋線維芽細胞は、創傷の収縮を行うため創傷治癒において重要な役割を有する。最後に、ケラチノサイトが創縁から遊走し、増殖し、分化して表皮を再構成する。
【０００５】
創傷治癒過程の最終段階は、創傷閉鎖後に現れる。これは、肉芽組織のリモデリングに相当する。肉芽組織が再構築され、正常真皮は主にＩ型コラーゲンからなるため、ＩＩＩ型コラーゲンがＩ型コラーゲンで置き換えられる。この段階において、過剰な筋線維芽細胞はアポトーシスにより除去される。創傷治癒の最終段階は長時間にわたる。傷害から１年後、瘢痕が再構成され、赤みが引き、薄くなる。
【０００６】
しかしながら、この過程は複雑であるばかりでなく不安定であり、妨害または障害を受けて慢性または非治癒創傷の形成または異常瘢痕の形成を来しやすい。これを助長し得る因子には、疾患（糖尿病、静脈または動脈疾患など）、年齢、感染症または組織局在が挙げられる。
【０００７】
慢性または非治癒創傷
慢性創傷は、十分な処置方法がないこともあって世界的な健康問題である。２０１０年には、世界全体で７００万人を超える人が慢性創傷に罹患し、毎年少なくとも１０パーセント増加すると予測される。
【０００８】
慢性創傷は、非治癒創傷であることもある。慢性創傷の一般的な病型には、静脈性下腿潰瘍、糖尿病性足部潰瘍、褥瘡性潰瘍、動脈性下腿潰瘍、病因混合型（静脈性および動脈性）の潰瘍または病因不明の潰瘍があるが、これに限定されるものではない。さらに正しく治癒しないため慢性になる急性創傷も見られる。
【０００９】
非治癒創傷または慢性創傷は、患者、医療専門家および医療制度にとって課題である。非治癒創傷または慢性創傷は、数百万人の生活の質を著しく損ない、生産性および医療資金の損失の点から重荷となる。
【００１０】
創傷治癒は、組織の完全性および機能の回復をもたらすダイナミックな経路である。慢性創傷または非治癒創傷は、正常な修復過程が妨げられると発生する。創傷治癒の生物学を理解することにより適切な処置を選択することで、医師は創傷治癒を最適化することができる。
【００１１】
慢性または非治癒創傷では、自然治癒過程が変化し、そして治癒が長期化して不完全なものになり、創傷が閉鎖しないこともある。慢性創傷は、ある因子が正常な炎症期および増殖期の破壊を引き起こすときに起こる。したがって、創傷治癒に関与する因子を増強または操作することにより、この過程を修復することで、起こり得る慢性創傷の発生を抑えるまたはその後の修復を加速させることが可能になり得る。
【００１２】
創傷治癒における線維芽細胞の役割
線維芽細胞は創傷治癒の過程に関係しており、これには、静止線維芽細胞から動員線維芽細胞に分化し、これが筋線維芽細胞に形質転換して最終的にアポトーシスに移行するといういくつかのステップが含まれる。慢性または非治癒創傷では、この過程が誤調節され、線維芽細胞が筋線維芽細胞分化を行うことができず、創傷において偽老化線維芽細胞と呼ばれる非機能的線維芽細胞として認められる（非特許文献１）。本発明の目的は、この過程において活性化または不活性化される必要がある様々な遺伝子を全ゲノム規模でマッピングし、そして創傷の治癒過程を促進することである。
【００１３】
ヒト線維芽細胞は老化と呼ばれる生理的学過程に至る能力を有し、老化により複製の細胞周期が限定され、したがって遺伝情報の喪失を回避することができる。老化は通常、細胞が既に複数回の複製を行ったときに起こる（複製老化と呼ばれ、テロメアの長さに依存する）が、環境ストレスに応じて起こることもある（非特許文献２）。老化細胞は細胞周期において停止しているが、代謝活性を維持している（非特許文献１）。
【００１４】
慢性創傷の線維芽細胞は、機能性の一部を失っている、詳細には、その複製機能の一部または全部を失っている（非特許文献１）。創傷では、ヒト線維芽細胞は、マトリックスリモデリングを誘導するタンパク質、ＡＰＡ−１のアップレギュレーションにも関連していることから、偽老化線維芽細胞表現型はテロメアの短縮により誘導されなかったことが示される（非特許文献３）。したがって、慢性創傷における老化線維芽細胞は、より詳細にはテロメアの短小化よりも慢性炎症によって出現すると考えられる（非特許文献１）。
【００１５】
本発明は、治癒を積極的に促進するやり方で創傷を処置することにより患者の生活の質を改善することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】テルゲンホフ（Ｔｅｌｇｅｎｈｏｆｆ）Ｄ、シュルート（Ｓｈｒｏｏｔ）Ｂ著（２００５年）「慢性創傷の治癒における細胞老化機構（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ）」セルデスアンドディフェレンシエーション（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）１２巻：ｐ．６９５−６９８
【非特許文献２】ミューラー（Ｍｕｌｌｅｒ）Ｍ著（２００９年）「細胞老化：分子機構、生体内での意義、およびレドックス考察（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ，ａｎｄ  ｒｅｄｏｘ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ）」アンチオキシダンツアンドレドックスシグナリング（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ＆  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）１１巻：ｐ．５９−９８
【非特許文献３】ベナンティ（Ｂｅｎａｎｔｉ）ＪＡ、ウイリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ＤＫ、ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）ＫＬ、オッツァー（Ｏｚｅｒ）ＨＬ、ガロウェイ（Ｇａｌｌｏｗａｙ）ＤＡ著（２００２年）「老化関連タンパク質ＡＰＡ−１による細胞外マトリックス再構築遺伝子の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ−ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＰＡ−１）」モレキュラーアンドセルバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）２２巻：ｐ．７３８５−７３９７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、
創傷、好ましくは慢性創傷の処置における使用のための、
−  ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を阻害する作用物質
ならびに／または
−  ＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＧＬＩ１、ＳＯＸ９、優先的にＦＯＸＳ１、ＥＧＲ２、ＳＯＸ９、ＴＣＦ４、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を増強する作用物質
を含む治療用化合物に関する。
【００１８】
本発明はさらに、薬学的に許容されるキャリアと共に上記で定義した治療用化合物を含む医薬組成物に関する。
【００１９】
一態様では、本発明は、上記で定義した医薬組成物を調製するための方法であって、前記治療用化合物を薬学的もしくは獣医学的に許容されるキャリアまたはビヒクルと併用するまたは会合させることを含む方法に関する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、哺乳動物の創傷を処置するための方法であって、前記創傷に、
−  ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を阻害する作用物質
ならびに／または
−  ＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＧＬＩ１、ＳＯＸ９、優先的にＦＯＸＳ１、ＥＧＲ２、ＳＯＸ９、ＴＣＦ４、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を増強する作用物質
を含む治療用化合物を投与することを含む
方法に関する。
【００２１】
本発明はさらに、創傷、好ましくは慢性創傷を処置するためのキットであって、
（ａ）上記で定義した少なくとも１つの治療用化合物または医薬組成物；および
（ｂ）前記創傷に施すための少なくとも１つの包帯材
を含むキットに関する。
【００２２】
なお別の態様では、本発明は、
ａ）ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を阻害する作用物質
ならびに／または
−  ＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＧＬＩ１、ＳＯＸ９、優先的にＦＯＸＳ１、ＥＧＲ２、ＳＯＸ９、ＴＣＦ４、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を増強する作用物質
と
ｂ）少なくとも１つのさらなる療法剤
を含む、創傷、好ましくは慢性創傷を処置するための併用療法剤に関する。
【００２３】
本発明はさらに、
創傷、好ましくは慢性創傷を処置するための、
ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を阻害する作用物質
ならびに／または
−  ＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＧＬＩ１、ＳＯＸ９、優先的にＦＯＸＳ１、ＥＧＲ２、ＳＯＸ９、ＴＣＦ４、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を増強する作用物質
の使用であって、
前記作用物質は線維芽細胞および筋線維芽細胞の分化および／または活性を調節する
使用に関する。
【００２４】
以下は、各図の説明である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１ａは、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ：Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）に施した様々な処理を模式的に示す。図１ｂは、様々な処理を用いてＲＴ−ｑＰＣＲにより評価したαＳＭＡのｍＲＮＡレベルをグラフ表示する。
【図２ａ】ＲＴ−ｑＰＣＲにより評価したαＳＭＡのｍＲＮＡレベルをグラフ表示する。ＮＨＤＦを異なるｍＲＮＡ（ＥＧＲ２、ＳＲＦ、ＨＩＣ１、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＧＬＩ１、ＪＵＮ、ＩＲＦ７、Ｅ２Ｆ１、ＭＹＣ、ＣＲＥＢ５、ＦＯＸＳ１、ＳＯＸ９またはＳＴＡＴ１）に対するｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡあるいはｓｉＲＮＡで処理し、同時にＴＧＦβ１処理に付すかまたは付さなかった。ＲＴｑＰＣＲはＴＵＢＢで補正し、ｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡ処理（Ｔ−Ｅ−）状態を１に設定した。ＳＲＦ、ＨＩＣ１またはＳＴＡＴ４に対するｓｉＲＮＡでＮＨＤＦを処理すると大量の細胞死（＊）が起こるので、解析ができなかった。
【図２ｂ】ａ）に記載されているようなＮＨＤＦの処理後にαＳＭＡ陽性細胞の割合で評価した分化細胞の割合をグラフ表示する。ＳＲＦ、ＨＩＣ１またはＳＴＡＴ４に対するｓｉＲＮＡでＮＨＤＦを処理すると大量の細胞死（＊）が起こるので、解析ができなかった。
【図２ｃ】ＲＴ−ｑＰＣＲにより評価したαＳＭＡのｍＲＮＡレベルをグラフ表示する。初代ヒト皮膚線維芽細胞を、異なるｍＲＮＡ（ＰＰＡＲＧ、ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２、ＳＴＡＴ１またはＵＳＦ２）に対するｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡあるいはｓｉＲＮＡで処理した。ＲＴｑＰＣＲはＴＵＢＢで補正し、ｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡ処理（Ｔ−Ｅ−）状態を１に設定した。
【図２ｄ】ＲＴ−ｑＰＣＲにより評価したαＳＭＡのｍＲＮＡレベルをグラフ表示する。ＮＨＤＦを異なるｍＲＮＡ（ＰＰＡＲＧ、ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２、ＳＴＡＴ１またはＵＳＦ２）に対するｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡあるいはｓｉＲＮＡで処理し、同時にＣＷＦ１単独あるいはＴＧＦβ１と組み合わせて処理した。ＲＴ−ｑＰＣＲは、ＴＵＢＢでｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡ処理（Ｔ−Ｅ−）状態に対して補正した（１に設定したが、このグラフには示していない）。異なるｓｉＲＮＡの作用の解析に役立つため、細胞をｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡおよびＴＧＦβ１で処理した状態を加えて、正常分化の例とする（ｍｏｃｋヒストグラムの薄い灰色のバー）。
【図２ｅ】ＲＴ−ｑＰＣＲにより評価したαＳＭＡのｍＲＮＡレベルをグラフ表示する。ＮＨＤＦは、慢性創傷に罹患している別の患者の異なる滲出液（ＣＷＦ２）を用いて行った滲出液の処理以外は、ｄ）に示したように処理した。
【図３】ＥＧＲ２、ＦＯＸＳ１、ＳＯＸ９、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＭＹＣ、ＪＵＮ、ＩＲＦ７、Ｅ２Ｆ１、ＣＲＥＢ５およびＧＬＩ１についてＴＧＦβ１処理後の短時間および長時間を示す。ＲＴ−ｑＰＣＲにより評価した、ＴＧＦβによるＮＨＤＦ処理から経過時間後のｍＲＮＡレベルを因子ごとにグラフ表示する。
【図４】図４ａは、線維芽細胞の筋線維芽細胞分化の重要転写因子に関する。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの遺伝子ネットワーク解析の図解である。図４ｂは、線維芽細胞の筋線維芽細胞分化の重要転写因子に関する。バイオインフォマティクスおよびネットワーク解析により同定された様々な転写因子を示す表である。
【図５】ＰＰＡＲＧ、ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２およびＳＩＸ２についてＴＧＦβ１処理後の短時間および長時間を示す。ＲＴ−ｑＰＣＲにより評価した、ＴＧＦβによるＮＨＤＦ処理から経過時間後のｍＲＮＡレベルを因子ごとにグラフ表示する。
【図６】異なるＴＦ  ｍＲＮＡ（ＳＯＸ９、ＥＧＲ２、ＴＣＦ４またはＦＯＸＳ１）に対するｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡあるいはｓｉＲＮＡで４８時間（薄い灰色）または７２時間（濃い灰色）ＮＨＤＦ（ドナーＡ）を処理し、同時にＴＧＦ−βで処理した後のＴＣＦ４（ａ）、ＥＧＲ２（ｂ）、ＳＯＸ９（ｃ）、ＳＴＡＴ４（ｄ）、ＦＯＸＳ１（ｅ）、ＰＰＡＲＧ（ｆ）、ＭＡＦ（ｇ）、ＭＥＯＸ２（ｈ）およびＳＩＸ２（ｉ）のｍＲＮＡレベルをグラフ表示する。すべてのグラフにおいて、ＴＧＦ−βで処理したｍｏｃｋ  ｓｉＲＮＡ（Ｔ＋Ｅ）状態を各処理時間（４８時間および７２時間）の１００％に設定した。
【図７】滲出液（ｅｘｓｕｄａｔｅｓ）を用いて（ａ）または用いずに（ｂ）正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に施した薬剤による様々な処理を模式的に示す。
【図８ａ】トラメチニブで処理したＮＨＤＦのＲＴ−ｑＰＣＲにより評価したαＳＭＡのｍＲＮＡレベルをグラフ表示する。
【図８ｂ】滲出液（ｅｘｓｕｄａｔｅｓ）の存在下でトラメチニブにより処理したＮＨＤＦのＲＴ−ｑＰＣＲで評価したαＳＭＡ、ＰＩ１６およびＡＣＴＣ１のｍＲＮＡレベルをグラフ表示する。
【図９ａ】Ａｍ５８０で処理したＮＨＤＦのＲＴ−ｑＰＣＲにより評価したαＳＭＡのｍＲＮＡレベルをグラフ表示する。
【図９ｂ】滲出液（ｅｘｓｕｄａｔｅｓ）の存在下でＡｍ５８０により処理したＮＨＤＦのＲＴ−ｑＰＣＲで評価したαＳＭＡ、ＰＩ１６およびＡＣＴＣ１のｍＲＮＡレベルをグラフ表示する。
【図１０−１】Ｇａｎｔ  ６１で処理したＮＨＤＦのＲＴ−ｑＰＣＲで評価したαＳＭＡ、ＧＬＩ１、ＳＯＸ９およびＭＡＦのｍＲＮＡレベルをグラフ表示する。
【図１０−２】表１：創傷、非治癒または慢性創傷を処置するため、増加または減少する遺伝子を示す。
【図１０−３】表２：各標的遺伝子のｓｉＲＮＡの配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
したがって、本発明の一態様では、
創傷、好ましくは慢性創傷の処置における使用のための、
−  ＭＡＦ、ＭＥＯＸ２、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を阻害する作用物質
ならびに／または
−  ＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＧＬＩ１、ＳＯＸ９、優先的にＦＯＸＳ１、ＥＧＲ２、ＳＯＸ９、ＴＣＦ４、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を増強する作用物質
を含む治療用化合物を提供する。
【００２７】
好ましくは、前記作用物質はＭＡＦ、ＭＥＯＸ２およびＳＩＸ２から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を阻害する作用物質であるか；または前記作用物質はＳＯＸ９およびＧＬＩ１から選択される少なくとも１つの遺伝子の活性を増強する。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態では、前記治療用組成物は、少なくとも：
（ａ）−  ＰＰＡＲＧもしくはＰＰＡＲＧと少なくとも５０％の同一性を有するそのホモログの活性を阻害する作用物質
ならびに／または
（ｂ）−  ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を増強する作用物質
をさらに含む。
【００２９】
実際に、本発明者らは、これらの遺伝子が治癒過程に関与していること、およびそれらのダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションが創傷、特に慢性創傷の処置に有用であると考えられることを見出した。
【００３０】
このため、本発明は、新規な遺伝子治療アプローチおよび／または新規なタンパク質治療アプローチに関する。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「遺伝子の活性を阻害する作用物質」または「阻害剤」という表現は、前記遺伝子をダウンレギュレートできる作用物質をいう。この表現は、ある細胞に存在するタンパク質の量を減少させるあるいはタンパク質の活性を阻害することにより、遺伝子発現のレベルで作用する作用物質のほか、タンパク質のレベルで作用する作用物質を包含する。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「遺伝子の活性を増強する作用物質」または「エンハンサー」という表現は、前記遺伝子をアップレギュレートできる作用物質をいう。この表現は、ある細胞に存在するタンパク質の量を増加させるあるいはタンパク質の活性を増加させることにより、遺伝子発現のレベルで作用する作用物質のほか、タンパク質のレベルで作用する作用物質を包含する。この表現はさらに、シグナル伝達経路における前記遺伝子またはタンパク質の上流または下流で作用する作用物質を包含する。
【００３３】
本発明の一実施形態では、新規な療法剤は遺伝子発現の阻害剤またはエンハンサーを含み、この阻害剤またはエンハンサーは、裸のまたはプラスミドおよびウイルスベクターもしくは薬剤の形態のアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＴＡＬＥＮＳまたはリボザイムであってもよい。
【００３４】
好ましい実施形態では、前記治療用化合物は、配列番号１から配列番号８に記載された配列を有するｓｉＲＮＡからなる群から選択されるｓｉＲＮＡおよびそれらの混合物である。
【００３５】
典型的には、ＭＡＦ遺伝子の発現は、配列番号１および／または配列番号２に記載された配列を有するｓｉＲＮＡにより阻害することができる。
配列番号１：５’−ＵＵＣＧＡＵＣＵＧＡＵＧＡＡＧＵＵＵＧＡＡ
配列番号２：５’−ＣＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＵＧＧＣＡＵＣＡＧＡ
【００３６】
典型的には、ＭＥＯＸ２遺伝子の発現は、配列番号３および／または配列番号４に記載された配列を有するｓｉＲＮＡにより阻害することができる。
配列番号３：５’−ＡＧＣＡＵＧＣＧＣＡＣＵＵＡＵＧＡＵＡＵＡ
配列番号４：５’−ＣＣＣＧＣＣＣＧＵＣＣＵＧＵＧＣＵＣＣＡＡ
【００３７】
典型的には、ＰＰＡＲＧ遺伝子の発現は、配列番号５および／または配列番号６に記載された配列を有するｓｉＲＮＡにより阻害することができる。
配列番号５：５’−ＵＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＵＣＡＧＡＵＵＧＡ
配列番号６：５’−ＧＡＧＧＧＣＧＡＵＣＵＵＧＡＣＡＧＧＡＡＡ
【００３８】
典型的には、ＳＩＸ２遺伝子の発現は、配列番号７および／または配列番号８に記載された配列を有するｓｉＲＮＡにより阻害することができる。
配列番号７：５’−ＣＡＡＣＧＡＧＡＡＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＡＡ
配列番号８：５’−ＣＣＣＧＣＵＧＡＡＵＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡ
【００３９】
一実施形態では、遺伝子の活性を増強する作用はｃＤＮＡである。
【００４０】
典型的には、ＣＲＥＢ５遺伝子の発現はＣＲＥＢ５  ｃＤＮＡを投与することにより増強することができる。
【００４１】
同じことが、列挙された他のすべての遺伝子にも準用される。
【００４２】
ｃＤＮＡは、当業者に公知の任意の好適な形態で処置対象の創傷に投与または送達することができる。ｃＤＮＡは、裸のＤＮＡとして送達しても、プラスミドベクター、ウイルスベクターまたは他の任意の好適な手段を用いて送達してもよい。
【００４３】
別の実施形態では、新規な療法剤は、遺伝子機能によりコードされたタンパク質の阻害剤またはエンハンサーを含み、この阻害剤またはエンハンサーは、可逆的あるいは不可逆的に結合してタンパク質機能を阻害または増強する結合剤、たとえば抗体または公知のもしくは合成されたタンパク質アゴニストもしくはアンタゴニストであっても；あるいはタンパク質のシグナル伝達機構の上流または下流で作用してタンパク質のシグナル伝達を阻害または増強し、そして創傷組織におけるタンパク質の発現作用を無効にするまたは増強する作用物質であってもよい。
【００４４】
前記作用物質（阻害剤またはエンハンサー）は、ある分子標的に作用する、当該技術分野において公知のどのような作用物質であってもよい。
【００４５】
好ましくは、前記作用物質は小分子である。
【００４６】
好ましくは、ＭＡＦタンパク質の活性はその阻害のため標的化される。一層好ましくは、ＭＡＦタンパク質はトラメチニブのようなＭＡＦのアンタゴニストにより阻害される。トラメチニブは、Ｍｅｋｉｎｉｓｔ（登録商標）という商品名でグラクソスミスクライン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）により商品化されている化学物質分子である。
【００４７】
好ましくは、別の実施形態では、ＧＬＩ１タンパク質の活性は、その活性化のため標的化される。一層好ましくは、ＧＬＩ１のアゴニスト、一層好ましくはＧａｎｔ  ６１を使用する。前記化合物は、２，２’−［［ジヒドロ−２−（４−ピリジニル）−１，３（２Ｈ，４Ｈ）−ピリミジンジイル］ビス（メチレン）］ビス［Ｎ，Ｎ−ジメチルベンゼンアミンとも呼ばれる。別の実施形態では、好ましくは、ＳＯＸ９タンパク質の活性は、その活性化のため標的化される。一層好ましくは、ＳＯＸ９のアゴニスト、一層好ましくはＡＭ５８０を使用する。前記化合物は、４−［（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸とも呼ばれる。
【００４８】
典型的には、ＰＰＡＲＧのエンハンサーは、チアゾリジンジオン、たとえばロシグリタゾンおよびピオグリタゾンからなる群において選択することができる（カレントドラッグターゲッツ．カージオバスキュラーアンドヘマトロジカルディスオーダー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ＆  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、２００５年１０月；５巻（５）：ｐ．３７７〜８６、「前糖尿病患者および糖尿病患者の治療におけるＰＰＡＲガンマアゴニストチアゾリジンジオンの役割：心血管の観点から（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ  ｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｅ−ｄｉａｂｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ：ａ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ）」デュマシア（Ｄｕｍａｓｉａ）Ｒ、イーグル（Ｅａｇｌｅ）ＫＡ、クライン−ロジャース（Ｋｌｉｎｅ−Ｒｏｇｅｒｓ）Ｅ、メイ（Ｍａｙ）Ｎ、チョー（Ｃｈｏ）Ｌ、ムクハージー（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ）Ｄ著）。
【００４９】
典型的には、ＰＰＡＲＧの阻害剤は、Ｇ３３３５（ＣＡＳ  ３６０９９−９５−３）（ケムバイオケム（Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ）、２００６年；７巻（１）：ｐ．７４〜８２、「ジペプチドＨ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−ＯＨはＰＰＡＲガンマに対して高アンタゴニスト活性を示す：分子モデリングシミュレーションを用いたバイオアッセイ（Ｔｈｅ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  Ｈ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−ＯＨ  ｓｈｏｗｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ＰＰＡＲｇａｍｍａ：ｂｉｏａｓｓａｙ  ｗｉｔｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）」、イェー（Ｙｅ）Ｆ、ジャン（Ｚｈａｎｇ）ＺＳ、ルオ（Ｌｕｏ）ＨＢ、シェン（Ｓｈｅｎ）ＪＨ、チェン（Ｃｈｅｎ）ＫＸ、シェン（Ｓｈｅｎ）Ｘ、ジャン（Ｊｉａｎｇ）ＨＬ著。）であってもよい。
【００５０】
本発明の療法剤は、創傷、より理想的には慢性創傷、優先的には非治癒創傷の処置に使用される。これらの創傷は優先的には哺乳動物の創傷、より優先的にはヒト創傷である。好ましくは本発明を用いて処置される慢性創傷は、下腿潰瘍、糖尿病性足部潰瘍、圧迫性潰瘍である。
【００５１】
本発明に使用される抗体は、最も理想的にはモノクローナル抗体またはヒト化抗体である。
【００５２】
本発明の上記の態様および実施形態では、療法剤は局所適用のために製剤化されるが、さらに経口適用、皮膚適用、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ、ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用、静脈内適用または任意の公知の適用のために製剤化されてもよい。
【００５３】
あるいは、上記の本発明の態様では、療法剤は、包帯材への適用または包帯材の含浸のために製剤化される。
【００５４】
本発明の療法剤は、別の活性薬剤と一緒に投与してもよい。こうした活性薬剤は、抗生物質もしくは抗菌薬、消毒薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、鎮痛薬、抗炎症薬、創傷治癒剤、角質溶解薬、麻酔薬でもよい。こうした活性薬は、当業者によく知られている。
【００５５】
本発明の別の態様では、薬学的に（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）許容されるキャリアと一緒に本発明の療法剤を含む、創傷を処置するのに使用される医薬組成物を提供する。
【００５６】
医薬組成物には、処置対象の創傷に適切または望ましいと考えられ得る他の活性材料がさらに存在してもよい。
【００５７】
キャリア、または２種以上が存在する場合、各キャリアは、製剤の他の成分との適合性という意味で許容可能であり、レシピエントに有害でないものでなければならない。
【００５８】
製剤は、局所投与、経口投与、直腸投与、経鼻投与または公知の任意の投与に好適なものを含み、薬学の技術分野において周知の任意の方法により調製することができる。
【００５９】
組成物は、本発明の療法剤およびキャリアを会合させることにより調製することができる。一般に、製剤は、活性薬剤を液体キャリアと均一かつ均質に会合させる、または活性薬を液体キャリアもしくは微粉化した固体キャリアまたはそれらの両方と充分に会合させて、次いで必要に応じて生成物を成形することにより調製される。本発明は、本発明の療法剤を薬学的に許容されるキャリアまたはビヒクルとコンジュゲートさせるまたは会合させることを含む医薬組成物を調製するための方法まで及ぶ。
【００６０】
皮膚への局所適用の場合、通常使用の化合物は、クリーム、軟膏、ゲル、ゼリー、溶液または懸濁液等にしてもよい。本組成物に使用してもよいクリームまたは軟膏の製剤は、当該技術分野において周知の通常の製剤である。
【００６１】
本発明の経口投与のための製剤は、各々が所定量の活性薬剤を含むカプセル、サッシェもしくは錠剤として；粉末もしくは顆粒として；活性薬剤を水性液体もしくは非水性液体に溶かした溶液もしくは懸濁液として；または水中油型液体エマルジョンもしくは油中水型液体エマルジョンとして；または巨丸剤等として提供してもよい。
【００６２】
経口投与のための組成物（たとえば錠剤およびカプセル）の場合、「許容されるキャリア」という用語は、ビヒクル、たとえば一般的な賦形剤、たとえば結合剤、たとえばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガント、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースおよびデンプン；充填剤およびキャリア、たとえばコーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウムおよびアルギン酸；ならびに滑沢剤、たとえばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウムおよび他のステアリン酸金属塩、ステアリン酸グリセロール、ステアリン酸、シリコーン油、タルク、ワックス、油およびコロイド状シリカを含む。さらに着香料、たとえばペパーミント、ウィンターグリーン油、サクランボ香料および同種のものを使用してもよい。剤形を特定しやすくするように着色料を加えると望ましい場合がある。錠剤はまた、当該技術分野において周知の方法によりコーティングしてもよい。
【００６３】
これに加えて、あるいはこれとは別に、本発明のさらなる態様はさらに、またはあるいは、哺乳動物の創傷、典型的には慢性創傷を処置するための新規な方法であって、前記創傷に、
−  ＭＥＯＸ２、ＭＡＦ、ＳＩＸ２からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を阻害する作用物質
ならびに／または
−  ＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＦＯＸＳ１、ＧＬＩ１、ＳＯＸ９、優先的にＦＯＸＳ１、ＥＧＲ２、ＳＯＸ９、ＴＣＦ４、ＳＴＡＴ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を増強する作用物質
を投与することを含む方法を含む。
【００６４】
本発明はまた、哺乳動物の創傷、典型的には慢性創傷を処置するための新規な方法であって、前記創傷に、
−  ＰＰＡＲＧもしくはＰＰＡＲＧと少なくとも５０％の同一性を有するそのホモログの活性を阻害する作用物質
ならびに／または
−  ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子および前記遺伝子と少なくとも５０％の同一性を有するそれらのホモログの活性を増強する作用物質
を投与することをさらに含む方法を含む。
【００６５】
本発明のなおさらなる態様によれば、創傷、好ましくは慢性創傷を処置するためのキットであって、
（ａ）上記のような少なくとも１つの療法剤；および
（ｂ）前記創傷に施すための少なくとも１つの医療装置
を含むキットを提供する。
【００６６】
「医療装置」という用語は、機器、器具、インプラント、インビトロ試薬、または疾患もしくは他の状態を診断、予防または処置するが、体内または体表の化学作用によりその目的を達成しない（そうなると医療装置は薬剤になる）同様もしくは関連する物品を含む。医薬製品（医薬品ともいう）は薬理学的、代謝的または免疫学的手段によりその主作用を達成するのに対し、医療装置は、物理的、機械的または熱的手段のような他の手段により作用する。
【００６７】
本発明のなおさらなる態様によれば、ＭＥＯＸ２、ＭＡＦ、ＳＩＸ２の遺伝子発現の阻害剤またはＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＳＯＸ９、ＧＬＩ１、ＦＯＸＳ１、優先的にＦＯＸＳ１、ＥＧＲ２、ＳＯＸ９、ＴＣＦ４、ＳＴＡＴ４の遺伝子発現のエンハンサー、およびＭＥＯＸ２、ＭＡＦ、ＳＩＸ２のタンパク質活性の阻害剤またはＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＳＯＸ９、ＧＬＩ１、ＦＯＸＳ１、優先的にＦＯＸＳ１、ＥＧＲ２、ＳＯＸ９、ＴＣＦ４、ＳＴＡＴ４のタンパク質活性のエンハンサーを含む、創傷を処置するための併用療法剤を提供する。
【００６８】
本発明また、ＰＰＡＲＧの遺伝子発現の阻害剤またはＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４の遺伝子発現のエンハンサー、およびＰＰＡＲＧのタンパク質活性の阻害剤またはＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４のタンパク質活性のエンハンサーをさらに含む、創傷を処置するための併用療法剤を含む。
【００６９】
本発明のさらなる態様によれば、ＭＥＯＸ２、ＭＡＦ、ＰＰＡＲＧ、ＳＩＸ２タンパク質もしくはそれらのホモログの阻害剤またはＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＳＯＸ９、ＧＬＩ１、ＦＯＸＳ１、優先的にＦＯＸＳ１、ＥＧＲ２、ＳＯＸ９、ＴＣＦ４、ＳＴＡＴ４タンパク質もしくはそれらのホモログのエンハンサーを含む、創傷を処置するための療法剤を提供する。
【００７０】
本発明はまた、ＰＰＡＲＧタンパク質もしくはそれらのホモログの阻害剤またはＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４タンパク質もしくはそれらのホモログのエンハンサーを含む、創傷を処置するための療法剤をさらに含む。
【００７１】
本発明のさらなる態様によれば、創傷を処置するための薬物の製造における、ＭＥＯＸ２、ＭＡＦ、ＳＩＸ２タンパク質もしくはそれらのホモログの阻害剤の使用を提供する。本発明のさらなる態様によれば、創傷を処置するための、ＭＥＯＸ２、ＭＡＦ、ＳＩＸ２もしくはそれらのホモログの阻害剤の使用を提供する。
【００７２】
本発明はさらに、創傷を処置するための薬物の製造における、ＰＰＡＲＧタンパク質もしくはそのホモログの阻害剤の使用も提供する。本発明のさらなる態様によれば、創傷を処置するための、ＰＰＡＲＧまたはそのホモログの阻害剤の使用を提供する。
【００７３】
「ホモログ」という用語は、本明細書で使用する場合、ＭＥＯＸ２、ＭＡＦ、ＰＰＡＲＧ、ＳＩＸ２のアミノ酸配列と少なくとも５０％相同な配列を有し、かつＭＥＯＸ２、ＭＡＦ、ＰＰＡＲＧ、ＳＩＸ２の配列の生物活性を保持するアミノ酸配列をいう。ホモログはＭＥＯＸ２、ＥＴＳ１、ＭＡＦ、ＰＰＡＲＧ、ＳＩＸ２のペプチド配列と少なくとも７５％相同であり、優先順位を高くするとＭＥＯＸ２、ＭＡＦ、ＰＰＡＲＧ、ＳＩＸ２のペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同であることが好ましい。
【００７４】
本発明のさらなる態様によれば、創傷を処置するための薬物の製造における、ＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＳＯＸ９、ＧＬＩ１、ＦＯＸＳ１、優先的にＦＯＸＳ１、ＥＧＲ２、ＳＯＸ９、ＴＣＦ４、ＳＴＡＴ４タンパク質もしくはそれらのホモログのエンハンサーの使用を提供する。
【００７５】
本発明のさらなる態様によれば、創傷を処置するための、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４もしくはそれらのホモログのエンハンサーの使用を提供する。
【００７６】
「ホモログ」という用語は、本明細書で使用する場合、ＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＳＯＸ９、ＧＬＩ１、ＦＯＸＳ１のアミノ酸配列と少なくとも５０％相同な配列を有し、かつＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＳＯＸ９、ＧＬＩ１、ＦＯＸＳ１の配列の生物活性を保持するアミノ酸配列をいう。ホモログはＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＳＯＸ９、ＧＬＩ１、ＦＯＸＳ１のペプチド配列と少なくとも７５％相同であり、優先順位を高くするとＣＲＥＢ５、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＨＩＣ１、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、ＭＹＣ、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＲＦ、ＳＴＡＴ４、ＴＣＦ４、ＳＯＸ９、ＧＬＩ１、ＦＯＸＳ１のペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同であることが好ましい。
【００７７】
本明細書に記載の創傷の処置は、ヒトまたは獣医学上の使用に関する言及を含む。
【００７８】
後述される特許請求の範囲および本発明の前述の説明では、言語表現または当然の含意により文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という単語または「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、包括的意味で、すなわち本発明の種々の実施形態において記載された特徴の存在を明記するが、別の特徴の存在または付加を否定しないために、使用される。
【００７９】
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかと関連して記載した通りであってもよい。
【００８０】
本発明の他の特徴は、以下の例により明らかになるであろう。一般的に言えば、本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲および図面を含む）に開示された特徴の任意の新規なものまたは任意の新規な組み合わせまで及ぶ。したがって、本発明の特定の態様、実施形態または例に関連して記載された特徴、整数、特性、化合物または化学部分は、相容れない場合を除き、本明細書に記載の他の任意の態様、実施形態または例に適用可能であると理解される。
【００８１】
さらに、他に記載がない限り、本明細書に開示された任意の特徴は、同一または類似の目的を果たす代替の特徴で置き換えてもよい。
【００８２】
本発明による遺伝子の完全に同一なものは、ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で入手可能であるか、または当業者によく知られている。
【実施例】
【００８３】
線維芽細胞は外傷に反応して創傷部に遊走し、そこで収縮性の筋線維芽細胞に分化し、筋線維芽細胞はリモデリング期において最終的にアポトーシスに至る。この分化過程は、環境制御された組織培養条件においてエキソビボで試験することができ、したがって適時に制御された一連の様々な遺伝子発現パターンに対処することができる。
【００８４】
材料および方法
慢性創傷のエキソビボモデルの樹立
正常皮膚線維芽細胞の培養および滲出液採取
ヒト移植片から単離されたＮＨＤＦをプロモセル（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）から購入した。ＮＨＤＦは、１０％ＦＣＳ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５μｇ／ｍＬのインスリンおよび１ｎｇ／ｍＬのｂ−ＦＧＦ（プロモキネ（ＰｒｏｍｏＫｉｎｅ）））を補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２（インビトロジェン）中で培養した。
【００８５】
滲出液を採取するため、２例の混合性潰瘍の患者を募集した。患者の選択では、創傷の原因に関与している可能性がある他の任意の併存症因子：糖尿病、末梢動脈疾患、栄養不良を除外することとした。滲出液は、陰圧閉鎖療法から採取した。滲出液はすべて、１，５００×ｇで３分遠心して細胞残屑を除去した。上清を濾過し、使用時まで−８０℃で保存した。アリコートを使用してＢＣＡ法（シグマ（Ｓｉｇｍａ））に従いタンパク質濃度を判定した。
【００８６】
慢性創傷のエキソビボモデルの樹立
実験のため、細胞からインスリンおよびｂ−ＦＧＦを４８時間取り除いた。次いで、細胞を、１０％ＦＣＳ、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１（プロモセル）を補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２中、コラーゲンコート培養プレートで４日間培養した。線維芽細胞分化に対する滲出液の作用を評価するため、４項目：未処理細胞（Ｔ−Ｅ−）、ＴＧＦ−β１で処理した線維芽細胞（Ｔ＋Ｅ−）、滲出液で処理した細胞（Ｔ−Ｅ＋）、最後にＴＧＦ−β１および滲出液で同時に処理した線維芽細胞（Ｔ＋Ｅ＋）を試験した。
【００８７】
線維芽細胞分化の効率は、筋線維芽細胞マーカーα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の発現を解析することにより推定した。
【００８８】
ウエスタンブロットアッセイ
溶解緩衝液（トリス、ＮａＣｌ、ＮＰ４０、ＥＤＴＡ、ＩＭＤＴＴ）を用いて細胞をスクラッチして総タンパク質を抽出し、氷中で３０分インキュベートした。細胞残屑を除去するため、サンプルを１３，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、使用時まで−２０℃で保存した。タンパク質濃度は、ＢＣＡ法（シグマ）に従い判定した。等量の総タンパク質（２０μｇ）をＮｕＰＡＧＥ１０％ビス−トリスゲル（インビトロジェン）にロードし、１５０Ｖで泳動して分離し、ニトロセルロース膜（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ））に３０Ｖで１時間転写した。その後、膜をαＳＭＡ（アブカム（Ａｂｃａｍ））およびチューブリン（アブカム）に対して染色した。続いてそれぞれ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（プロメガ）とコンジュゲートされた二次抗体ヤギ抗ウサギＩｇＧおよびヤギ抗マウスＩｇＧによりインキュベーションを行った。信号は、ＵｐｔｉＬｉｇｈｔ  ＨＳ  ＷＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（アプティマ、インターキム（Ｕｐｔｉｍａ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ））を用いてＥＣＬ化学発光により検出した。バンドをスキャナでデジタル化し、同じブロットのすべてのバンド密度間の比をソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ  １．４３ｕ、６４ビット）により計算した。αＳＭＡの相対発現量は、それぞれのチューブリンの値に対して補正した。
【００８９】
全ＲＮＡサンプルの調製
実験の４日後、処理した線維芽細胞をＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン）で溶解し、−８０℃で保存した。次いでＲＮＡをクロロホルムを用いて精製し、イソプロパノールにより沈殿させた。全ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃ  分光光度計（サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で定量した。５００ｎｇの全ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ（インビトロジェン）およびＲＮＡｓｅ  ＯＵＴ（インビトロジェン）を用いてオリゴ（ｏｌｉｇｏｔ）ｄＴ（インビトロジェン）により行った。ｃＤＮＡは−２０℃で保存した。
【００９０】
リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ
リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）は、Ｍａｘｉｍａ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（フェルメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））を用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））で５μＬの１：２０希釈ｃＤＮＡにより行った。αＳＭＡのフォワードおよびリバースプライマーは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓにより設計され（ＭＷＧ、αＳＭＡフォワード：ＣＴＧＴＴＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＴＴＧＴＧ（配列番号９）、αＳＭＡリバース：ＣＣＡＴＧＴＴＣＴＡＴＣＧＧＧＴＡＣＴＴ（配列番号１０））、１００μＭのストックを−２０℃で保存した。ＲＴ−ｑＰＣＲ反応ごとにフォワードおよびリバースプライマーの対を使用した。サイクル条件は以下の通りであった：最初に９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒、５８℃で３０秒、７２℃で２０秒の４５サイクル。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ＳＷ  １．５を使用してＴＭ曲線を評価してＣｐを判定し、各増幅反応の相対濃度を概算した。
【００９１】
ｓｉＲＮＡの処理
α−平滑筋アクチン免疫蛍光法
コラーゲンコート培養皿で増殖させ、前述のように処理した細胞を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むＰＢＳで１５分間固定し、２．５％トリトンＸ−１００（ユーロメディックス（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）、２０００−Ｂ）を含むＰＢＳで３分間透過処理した。５％ＢＳＡを含むＰＢＳで飽和後、細胞をα−ＳＭＡ（アブカム、ａｂ５６９４）およびＤＮＡ（ＤＡＰＩ）に対して染色した。二次抗体として、ＣｙＴＭ３コンジュゲート抗ウサギ（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＰＡ４３００４）を使用した。サンプルは、Ｎｉｋｏｎ  ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ（株式会社ニコン）を用いて油浸対物レンズ（Ｐｌａｎ  Ｆｌｕｏｒ  ４０×油浸／１．３０、株式会社ニコン）で観察した。デジタル画像は、デジタルカメラ（Ｃｏｏｌ  ＳＮＡＰ  ＨＱ２、フォトメトリクス（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ））およびソフトウェア（ＭｅｔａＭｏｒｆ  ７．５．４．０）で撮影した。様々な処理による線維芽細胞分化の割合を推定するため、１視野当たりの細胞総数をＤＡＰＩにより判定し、筋線維芽細胞、分化した線維芽細胞をα−ＳＭＡ染色によりカウントした。次いで、スチューデント検定（ｔ検定）およびχ２検定を実施して、未処理線維芽細胞（Ｔ−Ｅ−）と処理した線維芽細胞との間のαＳＭＡの発現の差を評価した。
【００９２】
ｍＲＮＡ発現解析
全ＲＮＡサンプルの調製およびｃＤＮＡ合成
実験の４日後、処理した線維芽細胞をＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１５５９６−０１８）で剥離し、−８０℃で保存した。次いでＲＮＡをクロロホルムを用いて精製し、イソプロパノールにより沈殿させた。全ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃ  分光光度計（サーモサイエンティフィック）で定量し、その品質は、ＲＮＡ  Ｎａｎｏ  Ｃｈｉｐｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザ、Ａｇｉｌｅｎｔ（アジレント）、５０６７−１５１１）で評価した。５００ｎｇの全ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ（インビトロジェン（ライフテクノロジーズ））、１８０８０−０８５）およびＲＮＡｓｅ  ＯＵＴ（インビトロジェン（ライフテクノロジーズ））、１０７７７−０１９）を用いてオリゴ（ｏｌｉｇｏｔ）ｄＴ（インビトロジェン（ライフテクノロジーズ））、１８４１８−０２０）により行った。ｃＤＮＡは−２０℃で保存した。バイオアナライザのプロファイルが良好なサンプルのみをｑＰＣＲ解析に使用した。
【００９３】
ネットワーク解析
それぞれ異なる処理後の線維芽細胞の運命のマスターレギュレーターを明らかにするため、本発明者らは遺伝子ネットワーク解析を行い、Ｔ＋Ｅ−、Ｔ＋Ｅ＋およびＴ−Ｅ＋ｌの遺伝子プロファイルとＴ−Ｅ−の遺伝子プロファイルに関するｍＲＮＡ配列のディープシーケンシング解析後に判定した遺伝子発現リストを処理した。これらの解析では、相互に連結した遺伝子の減少または増加がＬｏｇ  ＦＣの有意性より有意性が強いという仮定に基づき、本発明者らは、それらのＰ値のみに基づき、それらのＬｏｇ  ＦＣの値に基づかずに選択した遺伝子のリストを使用した。本発明者らは、２つのタイプの解析、すなわちｉｎｇｅｎｕｉｔｙ「ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ解析」およびＤＩＲＥ（ｈｔｔｐ：／／ｄｉｒｅ．ｄｃｏｄｅ．ｏｒｇ／）解析を行った。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ「ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ解析」は、２つの条件間の遺伝子発現の特定のプロファイルを踏まえて、上流レギュレーター候補を選択するものである。ＤＩＲＥ解析は、進化における遺伝子間に共通の調節エレメントの保存を基にした、これらのエレメント候補の選択によるものである。これらの同定されたエレメントから、ＤＩＲＥは、同時調節される遺伝子リストのマスターレギュレーターリストを与えることができる。これら２つの解析から、解析されたリストごとに、本発明者らは、対象となるリストにおいて考慮された２つの条件の少なくとも１つで発現した転写因子（ＴＦ）を選択した（すなわち２つの条件の少なくとも１つのシーケンシングの数は２０を上回る（ｈｉｓ））。次いで、本発明者らは、この２組みの解析を徹底的に比較し、両方の解析に属する転写因子を「重要レギュレーターリスト」に保存することとした。これらの２つの解析に偏りの可能性があるため、本発明者らはさらに、一方の解析にのみ属し、他方に属さないが、一方のリストまたは他方で非常に興味深い標的遺伝子パターンを示す転写因子を救出することとした。全体として、これらの遺伝子ネットワーク解析により、一方または他方の線維芽細胞の運命の重要なレギュレーターであるＴＦのリストを提案することができた。
【００９４】
慢性または非治癒創傷モデルでは、慢性創傷の滲出液を細胞培養物に加えた（滲出液の総タンパク質５００μｇ／ｍＬ）。実施した実験を図１ａ）に図示する。すなわち細胞を処理しなかった（Ｔ−Ｅ−）、あるいはＴＧＦβ単独（Ｔ＋Ｅ−）、滲出液単独（Ｔ−Ｅ＋）またはＴＧＦ−βおよび滲出液（Ｔ＋Ｅ＋）で４日間処理した。前述のアッセイを使用して分化のレベルを評価した。慢性創傷の滲出液ではαＳＭＡの発現が減少した（ｍＲＮＡ、図１ｂ）。このことから、慢性創傷の滲出液により線維芽細胞の分化が明らかに阻害されることが示された。これは、慢性創傷に偽老化線維芽細胞とも呼ばれる非機能的線維芽細胞が存在するという事実と相関する。
【００９５】
線維芽細胞の筋線維芽細胞分化時の遺伝子発現経路
正常および病的条件下のヒト初代線維芽細胞の線維芽細胞分化に関係する主要な分子標的の同定
本発明者らは、前に定義された異なる遺伝子発現経路の推定上流レギュレーターを明らかにするためｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの遺伝子ネットワーク解析を行った。本発明者らは、包括的な遺伝子ネットワーク解析を使用して重要なレギュレーター候補を同定し、これらの因子を選択するためにそれらの発現の変化を考慮に入れなかったという意味で、このアプローチは独自のものであった。たとえば、本発明者らは、ＤＩＲＥプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｄｉｒｅ．ｄｃｏｄｅ．ｏｒｇ／）を使用して、異なる遺伝子リストにおいて進化的に保存された候補調節エレメントを同定したことで、これらのエレメントに結合する可能性があり、したがってこれらの遺伝子のセットを調節し得る転写因子を明らかにすることができた。この解析から２３の転写因子を選び出した。
【００９６】
様々な転写因子（ＴＦ）に関する広範囲に及ぶ研究に優先順位をつけるため、本発明者らは、様々な線維芽細胞の処理後にＴＦの時間反応研究を行った。本発明者らは、様々な処理後のそれらの発現の変化について短期（３０分〜８時間）解析および長期（８時間〜９６時間）解析を行った。
【００９７】
本発明者らは一方で、正常線維芽細胞の筋線維芽細胞分化経路における、他方で慢性滲出液依存性の非分化細胞の運命における、これらの様々な因子の役割を研究するため網羅的なｓｉＲＮＡを用いたアプローチを行った。
【００９８】
その中で同定された１４の重要転写因子候補のｓｉＲＮＡノックダウンは、ＴＧＦβおよびｓｉＲＮＡ処理ＮＨＤＦからのαＳＭＡの発現解析により評価したところ、線維芽細胞の筋線維芽細胞分化経路を阻害した。すなわちＧＬＩ１、ＨＩＣ１、ＴＣＦ４、ＳＯＸ９、ＳＴＡＴ４、ＭＹＣ、ＣＲＥＢ５、ＩＲＦ７、ＪＵＮ、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ２、ＳＲＦ、ＳＭＡＤ３、ＦＯＸＳ１は、それらのノックダウンとして、様々な程度に筋線維芽細胞の分化を阻害した（ｉｎｈｉｂｉｔｅｒ）（図２ａ−ｂ）。非常に興味深いことに、ＴＧＦβ処理時に発現が強力かつ急速にアップレギュレートされるＳＯＸ９、ＦＯＸＳ１およびＥＧＲ２を除くと、残りの因子のｍＲＮＡレベルは、ＴＧＦβ処理から１日ほどの間一定であり、全体として分化の４日間において変化がなかった（図３）。このことから、線維芽細胞の筋線維芽細胞分化に必要なのは、それらの発現の維持であり、それらの過剰発現でないことが示される。
【００９９】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析により同定された他の４つの重要転写因子候補（ＭＡＦ、ＳＩＸ２、ＭＥＯＸ２およびＰＰＡＲＧ）のｓｉＲＮＡノックダウンは、ＴＧＦβの非存在下で、ＴＧＦβにより処理したｍｏｃｋトランスフェクト細胞で得られたのと同程度に線維芽細胞の筋線維芽細胞分化を誘発するようであった。さらにより興味深いことに、筋線維芽細胞分化の誘導は、慢性創傷の滲出液の存在下でも当てはまり（ｏｌｄ  ｔｒｕｅ）、ｍｏｃｋトランスフェクト細胞のＴＧＦβのみの存在下で得られた分化と非常に類似していた。これらの因子の非存在下では、線維芽細胞は、筋線維芽細胞に分化するため滲出液の支配的な作用をバイパスできるようであった。本発明者らはまた、ＦＯＸＳ１を除くこれらすべての因子はＴＧＦβ処理時のダウンレギュレーションがやや強力すぎることを明らかできることから（図５）、それらのダウンレギュレーションが分化に必要であり得ることが裏付けられる。
【０１００】
全体としてこれらの結果から、本発明者らは、ノックダウンアプローチを用いて慢性創傷の状況でも線維芽細胞の筋線維芽細胞分化を抑制する、あるいはこの分化を誘発することができることが示された（表１）。
【０１０１】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ遺伝子ネットワーク解析により、筋線維芽細胞への分化においてあるいは慢性創傷の状況において線維芽細胞の運命の重要レギュレーター候補を同定することができた。本発明者らは、ノックダウンアプローチにより１９因子の分化に対する強い作用を見出した。我々の解析の強みは、様々な遺伝子リスト（ＤＩＲＥプログラムによる）において進化的に保存された共通のＤＮＡエレメントを見つけ出し、そこから転写因子の発現レベルの相違を検討するよりもむしろ推定上流転写調節因子を同定する、偏りのないアプローチに由来する。本発明者らは、発現の差のみを検討することで、それらの細胞運命のレギュレーターを見逃していた可能性が非常に高い。
【０１０２】
ノックダウンアプローチにより、我々は、正常線維芽細胞の筋線維芽細胞分化に必要な転写因子を同定した（図２）。本発明者らはαＳＭＡを使用して筋線維芽細胞分化を追跡した。αＳＭＡはその最良のエキソビボマーカーだからである。
【０１０３】
本発明者らはさらに、ノックダウンするとαＳＭＡ発現が一貫して見られるが、穏やかに減少するので、一定の役割を果たすが、前の段落に記載したものほど強力でないと思われる因子を同定した。これらの因子は、ＭＹＣ、ＪＵＮ、Ｅ２Ｆ１、ＩＲＦ７およびＣＲＥＢ５である。
【０１０４】
非常に興味深いことに、本発明者らは、一部の転写因子を不活性化すると、線維芽細胞分化それ自体が増加することを示した。これらの因子の一部を無効化すると、慢性創傷の状況でも線維芽細胞の筋線維芽細胞分化が増加し得る。
【０１０５】
ＰＰＡＲＧ  ｍＲＮＡをノックダウンすると、慢性滲出液の存在下でも線維芽細胞の筋線維芽細胞分化が増加する（図２ｃ〜ｄ）。
【０１０６】
ＦＯＸＳ１は、形態形成および分化などの発生過程に関与することが多い転写因子のフォークヘッドファミリーに属する。ＦＯＸＳ１は精巣の血管系の発生に最も重要であることが示されている。さらに、ＦＯＸＳ１は、初期感覚神経細胞マーカーとされた。本明細書で本発明者らは、ＦＯＸＳ１を不活性化すると、ＴＧＦβの非存在下で筋線維芽細胞の分化が増加することを示す。
【０１０７】
ＭＥＯＸ２は既に、ＴＧＦβ３ノックアウトマウスの口蓋裂発症の重要な因子として同定されたため、ＴＧＦβ経路に関係するといわれてきた。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の実験から、ＭＥＯＸ２は骨格筋の発生および分化にも重要であることが示された。本明細書で本発明者らは、ＭＥＯＸ２に対するｓｉＲＮＡにより、筋線維芽細胞に分化できる線維芽細胞が滲出液の影響をバイパスすることを示した。
【０１０８】
Ｔ細胞では、ＭＡＦがＴＧＦβの中和によるＩＬ２２発現の阻害に関わっていることが示されている。ＴＧＦβおよびＭＡＦは、ＣＤ４（＋）Ｔ細胞においてＩＬ２１発現に対してアンタゴニスト／逆作用を有する。同じ関係で本研究において本発明者らは、ｓｉＲＮＡによるＭＡＦの不活性化により筋線維芽細胞の分化が増加するため、ＭＡＦが滲出液の非存在または存在下で線維芽細胞の筋線維芽細胞分化の阻害剤として関係しているとした（図２ｃ〜ｄ）。一方、軟骨細胞分化において、長い形態のＭＡＦはＳＯＸ９と相互作用および協同して下流標的を活性化する。これは、筋線維芽細胞分化と軟骨細胞分化との間の相違の別の例である。
【０１０９】
ＳＩＸ２は、腎臓の多能性の維持に関与している。腎胚間充織細胞でＳＩＸ２は分化を抑制することができ、腎臓発生においては前駆細胞プールを維持する。本明細書では、皮膚線維芽細胞のＳＩＸ２を無効にすると、ＴＧＦβシグナル伝達に対する支配的な滲出液の影響がバイパスされる（図２ｃ〜ｄ）。
【０１１０】
線維芽細胞の筋線維芽細胞分化における重要転写因子間の調節相互作用
ＳＯＸ９、ＥＧＲ２またはＦＯＸＳ１のノックダウン後にＴＣＦ４  ｍＲＮＡの発現は改変されなかった（図６）ことから、ＴＣＦ４をこれらの因子間の調節相互作用ネットワークの最上流に置いた。一方、ＥＧＲ２の発現はＴＣＦ４およびＳＯＸ９に対するｓｉＲＮＡ処理時に大きく阻害されたが、ＦＯＸＳ１に対する処理時に変化がなかった（図６）ことから、ＥＧＲ２をネットワークにおいてＴＣＦ４およびＳＯＸ９の後だが、ＦＯＸＳ１の前に置いた。ＳＯＸ９  ｍＲＮＡは、ＴＣＦ４およびＦＯＸＳ１のノックダウン時に大きく変化しなかった。本発明者らは、ＦＯＸＳ１をＳＯＸ９の下流標的とした。一方、ＳＯＸ９は、ＥＧＲ２ノックダウン時にアップレギュレートされる（図６）。ＳＴＡＴ４  ｍＲＮＡは、ＴＣＦ４、ＳＯＸ９およびＥＧＲ２のノックダウンによりダウンレギュレートされる（図６）ことから、ＳＴＡＴ４をこれらのＴＦの下流標的とする一方、ＦＯＸＳ１のｓｉＲＮＡ処理時に変化がなかったことから、ＳＴＡＴ４を前に置いた。ＦＯＸＳ１  ｍＲＮＡは常にＴＣＦ４、ＳＯＸ９およびＥＧＲ２のｓｉＲＮＡ処理時にダウンレギュレートされる（図６）ことから、ＦＯＸＳ１をこのカスケードの最下流に置いた。全体的に、ＰＰＡＲＧ、ＭＡＦおよびＭＥＯＸ２のｍＲＮＡは、ＴＣＦ４、ＳＯＸ９、ＥＧＲ２およびＦＯＸＳ１に対するｓｉＲＮＡ処理時にアップレギュレートされており（図６）、線維芽細胞分化におけるアンタゴニストとしてのそれらの役割と整合的であった。ＳＩＸ２  ｍＲＮＡレベルは、ＥＧＲ２およびＦＯＸＳ１のノックダウン時に変化がなかったが（図６）、ＴＣＦ４およびＳＯＸ９により同じようにアップレギュレートされ、これらの２つのＴＦ間の密接な相互連結と整合的であり、分化アゴニストＳＯＸ９およびＴＣＦ４とアンタゴニストＳＩＸ２との間にシグナルのバランスが存在することが示唆された。
【０１１１】
慢性創傷の滲出液の作用をバイパスできる転写因子の同定は、下腿潰瘍などの慢性創傷の処置に使用できる標的に関連する新たな洞察を与えるので、慢性創傷の分野において非常に重要である。本研究では、本発明者らは線維芽細胞に焦点を当てることで、皮膚治癒過程における好中球およびマクロファージのような他の細胞の重要性を決して隠そうとしたのではなく、本発明者らはあえて、状況をより明確に描写するため生物学的文脈を単純化した。
【０１１２】
線維芽細胞分化に対する薬剤の作用
本発明者らは、細胞に対する作用を観察するため複数の濃度の薬剤を試験して少なくとも一定範囲の最適な濃度を規定した。本発明者らは、ＴＧＦ−βの非存在下および存在下で一部の薬剤について分化の増加あるいは分化の阻害を観察することを期待した。
【０１１３】
本試験では本発明者らは、滲出液（ｅｘｓｕｄａｔｅｓ）の存在下または非存在下で様々な遺伝子：αＳＭＡ、ＰＩ１６（国際公開第２０１３／１４４３４８号）およびＡＣＴＣ１（分化のマーカー、細胞線維芽細胞に対して筋線維芽細胞でアップレギュレートされる）の発現を評価した。
【０１１４】
トラメチニブ
非常に興味深いことに、本発明者らは、未処理線維芽細胞において１〜４ｎＭのトラメチニブの存在下でαＳＭＡの基準レベルの増加が観察されることを確認することができる（図８ａ）。
【０１１５】
興味深いことにトラメチニブは、滲出液の存在下でも筋線維芽細胞マーカーαＳＭＡのほか、ＰＩ１６およびＡＣＴＣ１の発現（分化時にアップレギュレートされることが示された他の２遺伝子）を増加させることができる（図８ｂ）。トラメチニブは、分化に対する滲出液の支配的なマイナス作用をバイパスさせることができる可能性があり、したがって非常に注目される療法剤であり得る。トラメチニブはＭＡＦアンタゴニスト遺伝子とされているため、これらの結果は、ＭＡＦ発現を阻害すると分化が始まり得るｓｉＲＮＡ実験と完全に一致する。
【０１１６】
Ａｍ５８０
ＴＧＦβの存在下で５ｎＭのＡｍ５８０を使用すると、分化を増加させることができる（図９ａ）。Ａｍ５８０は、線維芽細胞に対するＴＧＦβの作用を増強し、分化時にアップレギュレートされる３つのマーカー（αＳＭＡ、ＰＩ１６およびＡＣＴＣ１）で追跡されるように分化を増加させることができる。さらに滲出液の存在下でＡｍ５８０は、ＴＧＦβ（ＴＧＦβｂｅｔａ）、滲出液およびＡｍ５８０を細胞に加えた条件で、Ａｍ５８０を用いない同じ条件状態と対照的に、αＳＭＡおよびＰＩ１６の増加に示されるように分化に対する滲出液のマイナス作用を消すことができる。
【０１１７】
Ａｍ５８０は、ＳＯＸ９に対してアゴニスト作用を有することが示されている。これらの結果からｓｉＲＮＡ実験が証明された。ＳＯＸ９を阻害すると（ｓｉＲＮＡ処理により）分化が完全に阻害されることが示されるためである。本明細書では細胞をＳｏｘ９のアゴニストで処理すると逆の作用が得られることが示される。
【０１１８】
Ｇａｎｔ  ６１
４μＭでＧａｎｔ  ６１を使用すると、α−ＳＭＡのアップレギュレーションにより示されるように分化が増加する（図１０）。驚いたことに、Ｇａｎｔ  ６１はＧＬＩ１の発現をアップレギュレートできる一方で、Ｇａｎｔ６１がＧＬＩ１阻害剤であることが報告されている（スタントン（Ｓｔａｎｔｏｎ）、ベンジャミン（Ｂｅｎｊａｍｉｎ）Ｚ．ら著、２０１０年、「ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路の小分子モジュレータ（Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）」モレキュラーバイオシステムズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、６巻（１）：ｐ．４４−５４）。さらに、Ｇａｎｔ  ６１は、ＳＯＸ９  ｍＲＮＡの増加およびＭＡＦ  ｍＲＮＡの減少を誘導した。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
2019038847.tif 000013
【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【配列表】
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