(57)【要約】      （修正有）【課題】アピコンプレクサ属原虫に対して作用する一方で宿主細胞への毒性が低い薬剤の提供。【解決手段】式（Ｉ）で表される化合物、その異性体、薬学的に許容されるそれらの塩又はこれらの混合物を有効成分とする抗アピコンプレクサ属原虫感染症の治療及び／又は予防のための薬剤。2019038749.tif 000007【効果】前記抗アピコンプレクサ属原虫剤はトキソプラズマ症、マラリア症、クリプトスポリジウム症の予防及び／又は治療に利用することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される化合物ヌルスクリプト、その異性体、薬学的に許容されるそれらの塩又はこれらの混合物を有効成分とするアピコンプレクサ属原虫感染症の治療及び/又は予防のための薬剤。
【化１】
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【請求項２】
アピコンプレクサ属原虫がクリプトスポリジウムである、請求項１記載の治療及び／又は予防のための薬剤。
【請求項３】
アピコンプレクサ属原虫がマラリアである、請求項１に記載の治療及び／又は予防のための薬剤。
【請求項４】
アピコンプレクサ属原虫がトキソプラズマ原虫である、請求項１に記載の治療及び／又は予防のための薬剤
【請求項５】
請求項２に記載の抗クリプトスポリジウム剤を含む、クリプトスポリジウム症の治療及び／又は予防のための医薬。
【請求項６】
請求項３に記載の抗マラリア剤を含む、マラリア症の治療及び／又は予防のための医薬。
【請求項７】
請求項４に記載の抗トキソプラズマ剤を含む、トキソプラズマ原虫症の治療及び／又は予防のための医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるスクリプタイドのアナログ化合物として公知のヌルスクリプトを有効成分とする抗原虫剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アピコンプレクサに属する、マラリア原虫、トキソプラズマ、クリプトスポリジウムは、世界に甚大な被害をもたらしている原虫である。
【０００３】
世界三大感染症の一つである熱帯熱マラリア （Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）では、従来から使用されてきた薬剤クロロキンに対する耐性株の出現が問題となっている。近年では東南アジアにおいて第一選択薬であるアルテミシニン耐性株の出現が確認され、これらが流行地域に出現・拡散するとマラリアコントロールに大きく影響すると考えられ、新規の薬剤が求められている。
【０００４】
トキソプラズマ症は、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）が潜伏感染した家畜の肉を加熱調理が不十分な状態で食べることや、終宿主である猫に感染した原虫が猫の糞便中に形成する虫卵の経口摂取で引き起こされる原虫感染症である。全世界人口の約３割が潜伏感染状態と推定されているが、健常人の場合、その症状は軽微である。しかしながら免疫抑制状態にある患者では重症化して死に至る場合もあり、妊娠中に初めて感染した場合には胎児の脳発育不全や失明リスクが問題となる。
【０００５】
クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）は、重篤な下痢症を引き起こす人獣共通の寄生原虫である。糞便から排出される大量のオーシストは塩素耐性を持つため、しばしば大規模な集団感染を引き起こす。しかし、日本国内で認可された薬剤は存在しない。また、米国で認可され抗原虫薬として使用されているサリチルアニリド誘導体であるニタゾキサニドは免疫不全マウスを用いたクリプトスポリジウム感染動物試験でニタゾキサニド１００ｍｇ／ｋｇの投与は効果がない（非特許文献１）。免疫不全患者へのニタゾキサニドの投与効果も立証されていないことから免疫不全の患者では致死的となる。また、本原虫症に感染した仔牛は生産性の低下、斃死を引き起こす。以上のことから、本原虫症は畜産・公衆衛生上重大な問題となっている。
【０００６】
アピコンプレクサ原虫は、複雑な生活環を持つため、そのステージ変換において、ＤＮＡの変化を伴わない遺伝子やヒストンの修飾が重要な働きをすることが知られている。従って、原虫のエピジェネティクスに着目した薬剤、例えばヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の阻害剤が注目されているが、宿主にも毒性を示してしまうものが多いといわれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｈｅｏｄｏｓ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９８，４２（８）：１９５９−１９６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、抗原虫剤として利用可能な薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、実験の結果、ＨＤＡＣ阻害剤、スクリプタイドの関連化合物であるヌルスクリプト（化１）が宿主への毒性が低く、かつ原虫に対する薬効を有していることを見出した。なおヌルスクリプトはスクリプタイドの不活性型アナログであり、スクリプタイドのネガティブコントロールとして用いられており、宿主のＨＤＡＣを阻害しない。
【００１０】
（１）式（Ｉ）で表される化合物ヌルスクリプト、その異性体、薬学的に許容されるそれらの塩又はこれらの混合物を有効成分とするアピコンプレクサ属原虫感染症の治療及び/又は予防のための薬剤。
（２）アピコンプレクサ属原虫がクリプトスポリジウムである、（１）記載の治療及び／又は予防のための薬剤。
（３）アピコンプレクサ属原虫がマラリアである、（１）に記載の治療及び／又は予防のための薬剤。
（４）アピコンプレクサ属原虫がトキソプラズマ原虫である、（１）に記載の治療及び／又は予防のための薬剤
（５）（２）に記載の抗クリプトスポリジウム剤を含む、クリプトスポリジウム症の治療及び／又は予防のための医薬。
（６）（３）に記載の抗マラリア剤を含む、マラリア症の治療及び／又は予防のための医薬。
（７）（４）に記載の抗トキソプラズマ剤を含む、トキソプラズマ原虫症の治療及び／又は予防のための医薬。
【化１】
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【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、宿主に対して安全性が高い抗クリプトスポリジウム剤、抗トキソプラズマ剤、抗マラリア剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌｉｂｒａｒｙ４３化合物の抗トキソプラズマ活性と宿主細胞への毒性評価を示す。
【図２】ヌルスクリプト存在、非存在下でのトキソプラズマの宿主細胞への侵入率を示す。
【図３】ヌルスクリプト存在、非存在下でのトキソプラズマ感染２４時間後の宿主細胞内の原虫分裂数を示す。
【図４】ヌルスクリプト存在、非存在下でのトキソプラズマ感染２４時間後、１つのトキソプラズマの虫体内での娘虫体の分裂個数を示す。
【図５】５週齢の免疫不全(ＳＣＩＤ)マウスに、クリプトスポリジウムを経口投与により感染させた上で、ヌルスクリプトを経口投与し、糞便中に排泄されるクリプトスポリジウムのオーシストの個数を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。さらに、本発明に関連して使用される科学技術の用語およびフレーズは、当業者に一般に理解される意味を持つものとする。
【００１４】
本発明の第一の態様は、下記式（Ｉ）で表される化合物、その異性体、薬学的に許容されるそれらの塩又はこれらの混合物を有効成分とする抗クリプトスポリジウム剤、抗マラリア剤、抗トキソプラズマ剤に関する。
【化２】
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【００１５】
式（Ｉ）で表される化合物は、一般的な有機化学的手法により合成することができる。
【００１６】
「異性体」は式（Ｉ）で表される化合物において存在し得るエナンチオマー、ジアステレオマー（シス−トランス異性体を含む）、配座異性体、二重結合におけるシス−トランス異性体などを意味する。
【００１７】
式（Ｉ）で表される化合物の薬学的に許容される塩としては、ナトリウム及びカリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウム及びマグネシウムなどのアルカリ土類金属塩との塩；アンモニウム塩；並びにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、１−エフェナミン及びＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩などを挙げることができる。
【００１８】
本発明との関連で抗クリプトスポリジウム剤、抗マラリア剤、抗トキソプラズマ剤とは、クリプトスポリジウム、マラリア原虫、トキソプラズマの増殖抑制及び殺滅、宿主細胞への感染阻害、宿主組織からの各原虫の駆除など、各原虫の数及び／又はその活動の抑制、低減、停止などのために用いられる剤をいう。
【００１９】
式（Ｉ）で表される化合物は、そのまま抗クリプトスポリジウム剤、抗マラリア剤、抗トキソプラズマ剤として利用してもよく、さらに賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、固結・付着防止剤、滑沢剤、吸収・吸着担体、溶剤、増量剤、等張化剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤、増粘剤、被覆剤、吸収促進剤、ゲル化・凝固促進剤、光安定化剤、保存剤、防湿剤、乳化・懸濁・分散安定化剤、着色防止剤、脱酸素・酸化防止剤、矯味・矯臭剤、着色剤、起泡剤、消泡剤、無痛化剤、帯電防止剤、緩衝・ｐＨ調節剤などの各種添加物を配合して抗クリプトスポリジウム剤、抗マラリア剤、抗トキソプラズマ剤又はこれを含む医薬若しくは医薬組成物として利用してもよい。
【００２０】
本発明の第二の態様は、第一の態様の抗クリプトスポリジウム剤、抗マラリア剤、抗トキソプラズマ剤を含む、クリプトスポリジウム症、マラリア症、トキソプラズマ症の治療及び／又は予防のための医薬に関する。
【００２１】
本発明との関連でクリプトスポリジウム症とは、クリプトスポリジウムの感染、又は感染により引き起こされるあらゆる症状若しくは状態をいう。本発明の医薬は、かかる感染又はこれに伴う症状若しくは状態の治癒、寛解、改善、予防のために恒温動物に投与することで使用される。
【００２２】
本発明との関連でマラリア症とは、マラリア原虫の感染、又は感染により引き起こされるあらゆる症状若しくは状態をいう。本発明の医薬は、かかる感染又はこれに伴う症状若しくは状態の治癒、寛解、改善、予防のために恒温動物に投与することで使用される。
【００２３】
本発明との関連でトキソプラズマ症とは、トキソプラズマ原虫の感染、又は感染により引き起こされるあらゆる症状若しくは状態をいう。本発明の医薬は、かかる感染又はこれに伴う症状若しくは状態の治癒、寛解、改善、予防のために恒温動物に投与することで使用される。
【００２４】
本発明の医薬は、クリプトスポリジウム、マラリア原虫、トキソプラズマに感染し得る全ての恒温動物を対象として適用することができる。そのような恒温動物の例としては、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、アヒルなどの鳥類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、サルその他の非ヒト哺乳動物及びヒトを挙げることができる。
【００２５】
本発明の医薬の剤形としては、経口剤（錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤など）、注射剤、坐剤、外用剤（軟膏剤、貼付剤など）、エアゾ−ル剤などを挙げることができる。
【００２６】
錠剤、散剤、顆粒剤などの経口用固形製剤は、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロ−ス、無水第二リン酸カルシウム、部分アルファ化デンプン、コ−ンスタ−チ及びアルギン酸などの賦形剤；単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコ−ル、ポリビニルエ−テル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロ−ス、セラック、メチルセルロ−ス、エチルセルロ−ス、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルメチルセルロ−ス、ヒドロキシプロピルセルロ−ス、水及びエタノ−ルなどの結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸、寒天末、デンプン、架橋ポリビニルピロリドン、架橋カルボキシメチルセルロ−スナトリウム、カルボキシメチルセルロ−スカルシウム及びデンプングリコ−ル酸ナトリウムなどの崩壊剤；ステアリルアルコ−ル、ステアリン酸、カカオバタ−及び水素添加油などの崩壊抑制剤；ケイ酸アルミニウム、リン酸水素カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、無水ケイ酸などの固結防止・付着防止剤；カルナバロウ、軽質無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム、硬化油、硬化植物油誘導体、胡麻油、サラシミツロウ、酸化チタン、乾燥水酸化アルミニウムゲル、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、リン酸水素カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びポリエチレングリコ−ルなどの滑沢剤；第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム、尿素及び酵素などの吸収促進剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、無水ケイ酸、含水二酸化ケイ素、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム及びコロイド状ケイ酸などの吸収・吸着担体といった固形製剤化医薬用添加物を用い、常法に従い調製すればよい。
【００２７】
さらに錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、胃溶性被覆錠、腸溶性被覆錠及び水溶性フィルムコ−ティング錠とすることができる。
【００２８】
カプセル剤は、上記で例示した各種の医薬を、硬質ゼラチンカプセル及び軟質カプセルなどに充填して調製される。
【００２９】
また、溶剤、増量剤、等張化剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤、増粘剤などの上記した各種の液体製剤化用添加物を用い、常法に従い調製して、水性又は油性の懸濁液、溶液、シロップ及びエリキシル剤とすることもできる。
【００３０】
注射剤は、例えば、水、エチルアルコ−ル、マクロゴ−ル、プロピレングリコ−ル、クエン酸、酢酸、リン酸、乳酸、乳酸ナトリウム、硫酸及び水酸化ナトリウムなどの希釈剤；クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムなどのｐＨ調整剤及び緩衝剤；ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコ−ル酸及びチオ乳酸などの安定化剤；食塩、ブドウ糖、マンニト−ル又はグリセリンなどの等張化剤；カルボキシメチルセルロ−スナトリウム、プロピレングリコ−ル、安息香酸ナトリウム、安息香酸ベンジル、ウレタン、エタノ−ルアミン、グリセリンなどの溶解補助剤；グルコン酸カルシウム、クロロブタノ−ル、ブドウ糖、ベンジルアルコ−ルなどの無痛化剤；及び局所麻酔剤などの液体製剤化用の医薬品添加物を用い、常法に従い調製すればよい
【００３１】
本発明の医薬の投与方法は特に限定されないが、製剤の形態に応じて適宜決定される。例えば、非経口製剤である場合は、血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与などを挙げることができる。好ましい実施形態の一つにおいて、本発明の抗クリプトスポリジウム剤、抗マラリア剤、抗トキソプラズマ剤は、経口投与、静脈内投与により生体に投与される。
【００３２】
本発明の医薬の投与量は、投与された対象において治療及び／又は予防効果を奏する量、すなわち有効量であればよい。有効量は対象となる動物の種類、症状の程度、ヒトにあっては患者の年齢、性別、疾患の形態その他の条件などに応じて適宜選択されるが、通常成人に対して体重１ｋｇあたり１０μｇ〜２０００μｇ、好ましくは５０μｇ〜１０００μｇ、より好ましくは１００μｇ〜５００μｇであり、これを１日に１回若しくは複数回に分けて、又は間歇的に投与することができる。
【００３３】
本発明の第三の態様は、第二の態様の医薬の有効量を対象に投与することを含む、クリプトスポリジウム症、マラリア症、トキソプラズマ症を治療及び／又は予防する方法に関する。
【００３４】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３５】
＜実験材料＞
（１）化合物
Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌｉｂｒａｒｙ（ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤４３化合物）は金沢大学がん進展制御研究所から、ニタゾキサニド（Ｎｉｔａｚｏｘａｎｉｄｅ）は東京化成工業株式会社から、それぞれ提供、購入しＤＭＳＯに溶解して以下の実験に使用した。
【００３６】
（２）宿主細胞
ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ細胞）及びヒト大腸がん由来細胞（ＨＣＴ−８）はＡＴＣＣから、それぞれ入手して使用した。ＨＦＦ細胞及びＨＣＴ−８細胞は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭおよびＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。
【００３７】
（３）トキソプラズマ
潜伏感染型虫体に分化する能力が低く、バクテリア型β−ガラクトシダ−ゼを高発現する組換えＲＨ／２Ｆ株（ＡＴＣＣ５０８３９）を抗トキソプラズマ活性スクリーニング、ＩＣ５０確認、宿主細胞への侵入および分裂阻害確認に用い、Ｓｕｇｉら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１４，４６４，９−１１）に記載の方法に従って維持し、タキゾイトを調製した。
【００３８】
（４）マラリア原虫
熱帯熱マラリア原虫３Ｄ７株を増殖効果抑制試験等に用いた。
【００３９】
（５）クリプトスポリジウム
クリプトスポリジウムＨＮＪ−１株を増殖効果抑制試験、及びマウスを用いた投与実験に用いた。
【００４０】
＜実施例１＞抗原虫活性のスクリーニング評価
（１）抗トキソプラズマ活性の評価
ＨＦＦ細胞を９６ｗｅｌｌプレートにコンフルエントになるよう播種する。培地を吸引除去し、２．５μＭの終濃度となるように被験物質およびＤＭＳＯを溶かした培地を入れる。その後、１×１０の３乗個のタキゾイトを接種し、４８時間、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。培養後、Ｂｅｔａ−Ｇｌｏ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて溶媒対照であるＤＭＳＯ群と比較した際のβ−ガラクトシダーゼ活性の減少をルミノメーターを用いて測定した。
【００４１】
（２）抗クリプトスポリジウム活性の評価
ＨＣＴ−８細胞を９６ｗｅｌｌプレートにコンフルエントになるよう播種する。細胞の培地を吸引除去し、１０μＭの終濃度となるように被験物質およびＤＭＳＯを溶かした培地を入れる。その後、１×１０の４乗個のクリプトスポリジウムのスポロゾイトを接種し、４８時間、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。培養後、ｓｐｏｒｏ−ｇｌｏ（クリプトスポリジウムに対するポリクローナル抗体）を用いて、細胞中の原虫数をカウントした。
【００４２】
(3)宿主細胞に対する毒性の評価
ＨＦＦ細胞またはＨＣＴ−８細胞を９６ｗｅｌｌプレートにコンフルエントになるよう播種する。細胞の培地を吸引除去し、＜１００μＭの範囲の濃度の被験物質およびＤＭＳＯを溶かした培地を入れて４８時間、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、内在性のＡＴＰを定量し、生存する細胞数を測定した。
【００４３】
抗原虫活性の評価した結果、４３化合物のうちスクリプタイドのアナログであるヌルスクリプトが原虫増殖を抑制し、かつ宿主細胞への毒性が低いことを確認した。
【００４４】
＜実施例２＞ヌルスクリプトの各原虫に対するＩＣ５０の測定
（１）トキソプラズマに対するＩＣ５０の測定
ＨＦＦ細胞を９６ｗｅｌｌプレートにコンフルエントになるよう播種する。細胞の培地を吸引除去し、希釈系列を作成したヌルスクリプトおよびＤＭＳＯを溶かした培地を入れる。その後、１×１０の３乗個のタキゾイトを接種し、４８時間、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。培養後、Ｂｅｔａ−Ｇｌｏ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて溶媒対照であるＤＭＳＯ群と比較した際のβ−ガラクトシダーゼ活性の減少をルミノメーターを用いて測定し、ＩＣ５０の測定を行った。
【００４５】
（２）マラリア原虫に対するＩＣ５０の測定
マラリア原虫を感染させた赤血球をを薬剤と共に９６時間培養し、溶媒対照であるＤＭＳＯ群と比較した際の原虫数の減少を、ギムザ染色を用いた計数によって測定した。
【００４６】
（３）クリプトスポリジウムに対するＩＣ５０の測定
ＨＣＴ−８細胞を８ｗｅｌｌチャンバープレートにコンフルエントになるよう播種する。細胞の培地を吸引除去し、１〜１０μＭの濃度で薬剤およびＤＭＳＯを溶かした培地を入れる。その後、１×１０の５乗個のクリプトスポリジウムのスポロゾイトを接種し、４８時間、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。培養後、ｓｐｏｒｏ−ｇｌｏ（クリプトスポリジウムに対するポリクローナル抗体）を用いて、細胞中の原虫数をカウントした。
【００４７】
ヌルスクリプトの原虫および宿主に対する５０％阻害濃度を表１にまとめた。ヌルスクリプトは３種の原虫に抗原虫活性を持っていたが、特にトキソプラズマ、クリプトスポリジウムの増殖を低濃度で抑えた。クリプトスポリジウムに対しては、現在用いられているニタゾキサニドと比べて、宿主細胞に対する毒性が低いことが確認された。また、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるスクリプタイドは、宿主に対する毒性が強すぎるため、原虫の５０％阻害濃度を求めることができなかった。
【表１】
2019038749.tif 000005
【００４８】
＜実施例３＞ヌルスクリプトのトキソプラズマに対する宿主細胞侵入及び宿主細胞内増殖抑制効果の評価
（1）侵入抑制効果
ＨＦＦ細胞をｇｌａｓｓ  ｃｏｖｅｒｓｌｉｐにコンフルエントになるよう培養する。その後、トキソプラズマをＭＯＩ５となるようヌルスクリプト（２μＭ）またはＤＭＳＯ（対照群）に懸濁して宿主細胞に接種し、同時に１時間培養後、ＩＭＣ７抗体を用いたカウントによって原虫の相対的な侵入率を測定し、侵入阻害の効果を確認した。
【００４９】
（２）宿主細胞内増殖抑制効果
ＨＦＦ細胞をｇｌａｓｓ  ｃｏｖｅｒｓｌｉｐにコンフルエントになるよう培養する。ヌルスクリプト２μＭ存在下、非存在下（ＤＭＳＯ）で、トキソプラズマをＭＯＩ５となるよう感染させ、感染２４時間後の１つの虫体内での娘虫体の分裂個数（ｐａｒａｓｉｔｅ  ｎｕｍｂｅｒ／ＰＶ）を測定した。
【００５０】
その結果、ヌルスクリプト２μＭの存在下では非存在下と比較して、トキソプラズマの宿主細胞への侵入率の低下が確認された（図２）。また感染２４時間後の原虫の分裂数は著しく低下しており、（図３）、１つのトキソプラズマの虫体内での娘虫体の分裂個数は低下していた（図４）。従って、ヌルスクリプトはトキソプラズマの侵入阻止に効果を示すだけでなく、主に宿主細胞内の原虫の分裂阻止にも働くことが明らかとなった。
【００５１】
＜実施例４＞ＳＣＩＤマウスを用いた投与試験
５週齢の免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（雌）に、クリプトスポリジウムを１ｘ１０の５乗個および、ヌルスクリプト１０ｍｇ／ｋｇ経口投与した。比較対照としてクリプトスポリジウムを１ｘ１０の５乗個およびＤＭＳＯを経口投与した。マウスは各群６匹、計１２匹を実験に用いた。原虫投与後は、ヌルスクリプトを１０ｍｇ／ｋｇ／日、比較対象群においてはＤＭＳＯを経口投与した。原虫接種後９日目まで毎日糞便回収を行い、ショ糖浮遊法を用いてオーシスト排出数の測定を行った。その結果、ヌルスクリプト投与区は、比較対照であるＤＭＳＯ投与区と比較し、オーシストの排出が一日遅延し、オーシストの排出量が有意に減少した（図５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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