(57)【要約】【課題】単球系統以外の細胞には分化せず、かつ増殖能を有する、単離されたヒト単球前駆細胞を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、臍帯血試料または骨髄試料から、Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｉｎｔ／−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１３５＋ＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｈｉの細胞を単離することにより、単球分化に限局した前駆細胞を得ることに関する。【選択図】図１６
2019103391.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球系統以外の細胞には分化せず、かつ増殖能を有する、単離されたヒト単球前駆細胞。
【請求項２】
ＣＬＥＣ１２ＡおよびＣＤ６４を発現していることを特徴とする、請求項１記載の単離されたヒト単球前駆細胞。
【請求項３】
ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｉｎｔ／−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１３５＋ＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｈｉの表現型を有することを特徴とする、請求項１または２記載の単離されたヒト単球前駆細胞。
【請求項４】
臍帯血または骨髄由来の細胞である、請求項１〜３のいずれか一項記載の単離されたヒト単球前駆細胞。
【請求項５】
ヒト単球前駆細胞の単離方法であって、
単離された臍帯血試料または骨髄試料から、Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｉｎｔ／−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１３５＋ＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｈｉの細胞を単離する工程
を含み、該前駆細胞は単球系統以外の細胞には分化せず、かつ該前駆細胞は増殖能を有する、方法。
【請求項６】
単離された臍帯血試料または骨髄試料から、単核細胞（ＭＮＣ）を単離する工程、および／または、単離された単核細胞から、Ｌｉｎ−の細胞を単離する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
単離がフローサイトメトリーを用いて行われる、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）を死滅させる物質、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）の増殖もしくは分化を阻害する物質、または単球もしくはマクロファージの生成を阻害する物質を有効成分として含む、マクロファージ関連疾患の治療に用いるための医薬組成物。
【請求項９】
有効成分が、低分子、核酸、ポリペプチド、または抗体である、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体および／または抗ＣＤ６４抗体を有効成分として含む、マクロファージ関連疾患の治療に用いるための医薬組成物。
【請求項１１】
疾患が、癌、骨関連疾患、動脈硬化、線維症、炎症性腸疾患およびメタボリック症候群から成る群より選択される、請求項８〜１０のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１２】
抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体および／または抗ＣＤ６４抗体を有効成分として含む、癌の治療に用いるための医薬組成物。
【請求項１３】
他の薬剤と組み合わせて使用するための、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体および／または抗ＣＤ６４抗体を含む、ヒト共通単球前駆体細胞（ｃＭｏＰ）の標識または単離に使用するためのキット。
【請求項１５】
単球の生成を阻害する物質のスクリーニング方法であって、
試験物質を含む単球分化培地中でヒトｃＭｏＰを培養する工程、および
試験物質が単球の生成を阻害するか否かを評価する工程
を含む、方法。
【請求項１６】
破骨細胞の生成を阻害する物質のスクリーニング方法であって、
試験物質を含む破骨細胞分化培地中でヒトｃＭｏＰを培養する工程、および
試験物質が破骨細胞の生成を阻害するか否かを評価する工程
を含む、方法。
【請求項１７】
ヒトｃＭｏＰの分化、増殖または生存に影響する物質のスクリーニング方法であって、
試験物質を含む培地中でヒトｃＭｏＰを培養する工程、および
試験物質がヒトｃＭｏＰの分化、増殖または生存に影響するか否かを評価する工程
を含む、方法。
【請求項１８】
ヒトｃＭｏＰの分化、増殖または生存に影響する抗体のスクリーニング方法であって、
ヒトｃＭｏＰの細胞表面に発現する分子を同定する工程、
該細胞表面分子に特異的な抗体を取得する工程、
該抗体を含む培地中でヒトｃＭｏＰを培養する工程、および
該抗体がヒトｃＭｏＰの分化、増殖または生存に影響するか否かを評価する工程
を含む、方法。
【請求項１９】
ヒト単球を有するマウスの作製方法であって、
免疫不全マウスの骨髄にヒトｃＭｏＰを移植する工程
を含む、方法。
【請求項２０】
ヒトＦｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＭ−ＣＳＦをマウスに投与する工程、および／または、ヒト腫瘍細胞をマウスに移植する工程をさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ヒトｃＭｏＰが遺伝子改変されていることを特徴とする、請求項１９〜２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
ヒト単球を有し、ヒト顆粒球は有さないマウス。
【請求項２３】
ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｉｎｔ／−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１３５＋ＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｈｉの表現型を有するヒト単球前駆細胞を７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上含む、単離された細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト単球前駆細胞、その単離方法、およびその使用方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
単球、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）を含む単核系貪食細胞（ＭＰ）は、組織恒常性や免疫反応において中心的な役割を担っている。正常組織に常在するマクロファージの大部分は胎生期の前駆細胞に由来するものであるが、腸管、心臓、肺、乳腺、真皮および骨におけるマクロファージの一部は単球に由来する。
【０００３】
さらに、炎症は、組織に浸潤した単球の単球由来マクロファージや樹状細胞への分化を促進し、それらは恒常的生体防御反応や炎症性疾患に関与する。マウス単球は、古典的Ｌｙ６ｃｈｉ単球と非古典的Ｌｙ６ｃｌｏ単球に分類される。Ｌｙ６ｃｌｏ単球は血中のみに存在するが、Ｌｙ６ｃｈｉ単球は血液および他の組織にも存在し、そこでマクロファージや樹状細胞に分化する。また、ほとんどのＬｙ６ｃｌｏ単球はＬｙ６ｃｈｉ単球に由来すると考えられている。ヒト単球は、古典的ＣＤ１４＋ＣＤ１６−単球、中間型ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球、そして非古典的ＣＤ１４ｌｏ／−ＣＤ１６＋単球に分類される。機能的解析や遺伝子発現解析によって、ヒトＣＤ１４＋ＣＤ１６−単球とＣＤ１４ｌｏ／−ＣＤ１６＋単球のカウンターパートはそれぞれマウスＬｙ６ｃｈｉ単球とＬｙ６ｃｌｏ単球であることが示されている。
【０００４】
単球は、骨髄（ＢＭ）中で造血幹細胞（ＨＳＣ）から連続的な中間前駆細胞を経て分化する。単球系細胞に限局した分化能を有する共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）がマウスにおいて同定された（非特許文献１）。これらｃＭｏＰは単球−樹状細胞前駆細胞（ＭＤＰ）に由来すると考えられている（非特許文献２）。ヒトでは、ＩＬ−３受容体（ＣＤ１２３）、Ｆｌｔ３（ＣＤ１３５）、およびＣＤ４５ＲＡの発現パターンの違いを指標にして、共通ミエロイド前駆細胞（ＣＭＰ）、赤芽球系前駆細胞（ＭＥＰ）、および顆粒球−単球前駆細胞（ＧＭＰ）が同定された。また最近、ヒトＭＤＰがＧＭＰ分画中に同定された（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hettinger, J. et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat. Immunol. 14, 821-830 (2013).
【非特許文献２】Fogg, D. K. et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science 311, 83-87 (2006).
【非特許文献３】Lee, J. et al. Restricted dendritic cell and monocyte progenitors in human cord blood and bone marrow. J. Exp. Med. 212, 385-399 (2015).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ヒトのＧＭＰおよびＭＤＰが存在することから、単球系統の細胞のみに分化し他のいかなる造血系細胞にも分化しないヒトｃＭｏＰが下流に存在すると考えられていたが、これまでヒトｃＭｏＰは単離されていなかった。一方、メタボリックシンドロームや癌などの疾患病態形成および維持を担うマクロファージの多くは骨髄単球由来であることが知られており、これら疾患の治療薬および治療方法等の開発のためにも、単球系統のみに分化するヒトｃＭｏＰの単離と同定が強く求められていた。
【０００７】
Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｌｏＣＤ１３５＋ＣＤ４５ＲＡ＋の細胞として定義される従来型ヒト顆粒球−単球前駆細胞（以下、ｃＧＭＰ）は、顆粒球−単球前駆細胞を含むが、Ｔ細胞等のリンパ系に分化できる細胞も一部含んでいる。また、単球−ＤＣ系統のみに分化する前駆細胞であるヒトＭＤＰが、ｃＧＭＰ分画中に同定されている（非特許文献３）。すなわち、ｃＧＭＰは、実際には真のＧＭＰと他の前駆細胞との混合集団であるといえる。そこで、本発明は、真のＧＭＰを同定し、さらに、単球系統にのみ分化するｃＭｏＰを提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の態様は以下の事項に関する。
１．単球系統以外の細胞には分化せず、かつ増殖能を有する、単離されたヒト単球前駆細胞。
２．ＣＬＥＣ１２ＡおよびＣＤ６４を発現していることを特徴とする、上記１記載の単離されたヒト単球前駆細胞。
３．ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｉｎｔ／−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１３５＋ＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｈｉの表現型を有することを特徴とする、上記１または２記載の単離されたヒト単球前駆細胞。
４．臍帯血または骨髄由来の細胞である、上記１〜３のいずれか一項記載の単離されたヒト単球前駆細胞。
５．ヒト単球前駆細胞の単離方法であって、
単離された臍帯血試料または骨髄試料から、Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｉｎｔ／−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１３５＋ＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｈｉの細胞を単離する工程
を含み、該前駆細胞は単球系統以外の細胞には分化せず、かつ該前駆細胞は増殖能を有する、方法。
６．単離された臍帯血試料または骨髄試料から、単核細胞（ＭＮＣ）を単離する工程、および／または、単離された単核細胞から、Ｌｉｎ−の細胞を単離する工程を含む、上記５に記載の方法。
７．単離がフローサイトメトリーを用いて行われる、上記５または６記載の方法。
８．共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）を死滅させる物質、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）の増殖もしくは分化を阻害する物質、または単球もしくはマクロファージの生成を阻害する物質を有効成分として含む、マクロファージ関連疾患の治療に用いるための医薬組成物。
９．有効成分が、低分子、核酸、ポリペプチド、または抗体である、上記８記載の医薬組成物。
１０．抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体および／または抗ＣＤ６４抗体を有効成分として含む、マクロファージ関連疾患の治療に用いるための医薬組成物。
１１．疾患が、癌、骨関連疾患、動脈硬化、線維症、炎症性腸疾患およびメタボリック症候群から成る群より選択される、上記８〜１０のいずれか記載の医薬組成物。
１２．抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体および／または抗ＣＤ６４抗体を有効成分として含む、癌の治療に用いるための医薬組成物。
１３．他の薬剤と組み合わせて使用するための、上記１２記載の医薬組成物。
１４．抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体および／または抗ＣＤ６４抗体を含む、ヒト共通単球前駆体細胞（ｃＭｏＰ）の標識または単離に使用するためのキット。
１５．単球の生成を阻害する物質のスクリーニング方法であって、
試験物質を含む単球分化培地中でヒトｃＭｏＰを培養する工程、および
試験物質が単球の生成を阻害するか否かを評価する工程
を含む、方法。
１６．破骨細胞の生成を阻害する物質のスクリーニング方法であって、
試験物質を含む破骨細胞分化培地中でヒトｃＭｏＰを培養する工程、および
試験物質が破骨細胞の生成を阻害するか否かを評価する工程
を含む、方法。
１７．ヒトｃＭｏＰの分化、増殖または生存に影響する物質のスクリーニング方法であって、
試験物質を含む培地中でヒトｃＭｏＰを培養する工程、および
試験物質がヒトｃＭｏＰの分化、増殖または生存に影響するか否かを評価する工程
を含む、方法。
１８．ヒトｃＭｏＰの分化、増殖または生存に影響する抗体のスクリーニング方法であって、
ヒトｃＭｏＰの細胞表面に発現する分子を同定する工程、
該細胞表面分子に特異的な抗体を取得する工程、
該抗体を含む培地中でヒトｃＭｏＰを培養する工程、および
該抗体がヒトｃＭｏＰの分化、増殖または生存に影響するか否かを評価する工程
を含む、方法。
１９．ヒト単球を有するマウスの作製方法であって、
免疫不全マウスの骨髄にヒトｃＭｏＰを移植する工程
を含む、方法。
２０．ヒトＦｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＭ−ＣＳＦをマウスに静脈内投与する工程、および／または、ヒト腫瘍細胞をマウスに移植する工程をさらに含む、上記１９記載の方法。
２１．ヒトｃＭｏＰが遺伝子改変されていることを特徴とする、上記１９〜２０のいずれか一項記載の方法。
２２．ヒト単球を有し、ヒト顆粒球は有さないマウス。
２３．ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｉｎｔ／−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１３５＋ＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｈｉの表現型を有するヒト単球前駆細胞を７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上含む、単離された細胞集団。
２４．ヒト患者におけるマクロファージ関連疾患の治療方法であって、該ヒト患者に対して共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）を死滅させる物質、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）の増殖もしくは分化を阻害する物質、または単球もしくはマクロファージの生成を阻害する物質を有効成分として含む組成物を投与する工程を含む、治療方法。
２５．有効成分が、低分子、核酸、ポリペプチド、または抗体である、上記２４記載の治療方法。
２６．ヒト患者におけるマクロファージ関連疾患の治療方法であって、該ヒト患者に対して抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体および／または抗ＣＤ６４抗体を投与する工程を含む、治療方法。
２７．疾患が、癌、骨関連疾患、動脈硬化、線維症、炎症性腸疾患およびメタボリック症候群から成る群より選択される、上記２４〜２６のいずれか記載の治療方法。
２８．ヒト患者における癌の治療方法であって、該ヒト患者に対して抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体および／または抗ＣＤ６４抗体を投与する工程を含む、治療方法。
２９．併用剤として他の薬剤を投与する工程を含む、上記２８記載の治療方法。
３０．マクロファージ関連疾患の治療に用いるための医薬の製造における、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）を死滅させる物質、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）の増殖もしくは分化を阻害する物質、または単球もしくはマクロファージの生成を阻害する物質の使用。
３１．前記物質が、低分子、核酸、ポリペプチド、または抗体である、上記３０記載の使用。
３２．マクロファージ関連疾患の治療に用いるための医薬の製造における、抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体および／または抗ＣＤ６４抗体の使用。
３３．疾患が、癌、骨関連疾患、動脈硬化、線維症、炎症性腸疾患およびメタボリック症候群から成る群より選択される、上記３０〜３２のいずれか記載の使用。
３４．癌の治療に用いるための医薬の製造における、抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体および／または抗ＣＤ６４抗体の使用。
３５．前記医薬が他の薬剤と組み合わせて用いるためのものである、上記３４記載の使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の一態様によると、単球系統以外の細胞に分化せずかつ増殖能を有する、単離されたヒト単球前駆細胞（ヒトｃＭｏＰ）を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】従来型ヒトＧＭＰ（ｃＧＭＰ）のサブセットを示す（後述の＜例１＞参照）。（ａ）ヒトのＵＣＢからのＬｉｎ−ＭＮＣをＦＣＭによって解析した結果を示す。（ｂ）ＢＭおよびＰＢからのＬｉｎ−ＭＮＣをＦＣＭによって解析した結果を示す。（ｃ）各ＵＣＢ亜集団のミエロイドコロニー形成能を示す。（ｄ）各ＵＣＢ前駆細胞のＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ染色の結果を表す。
【図２】ｃＧＭＰ亜集団のミエロイド系およびリンパ球系細胞への分化能を示す（＜例２＞参照）。（ａ）ｅｘ  ｖｉｖｏにおける、Ｒ１〜Ｒ５分画からの単球およびＤＣ分化を表す。（ｂ）各分画における細胞の種類の割合を示す。（ｃ）各分画のｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞への分化能を表す。（ｄ）各分画のｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＮＫ細胞への分化能を表す。
【図３】単一細胞レベルでのヒトｃＭｏＰおよびｒＧＭＰの解析結果を示す（＜例３＞参照）。（ａ）ｃＭｏＰ由来の代表的なコロニーのＦＣＭプロファイルを示す。（ｂ）ｒＧＭＰ由来の代表的なコロニーのＦＣＭプロファイルを示す。（ｃ）ＦＣＭによって検出された単球および／または顆粒球コロニーの比率を表す。（ｄ）ｃＭｏＰの限界希釈解析の結果を表す。（ｅ）ｒＧＭＰの限界希釈解析の結果を表す。
【図４】ヒトｃＭｏＰおよびｒＧＭＰの増殖能を示す図である（＜例４参照＞）。（ａ）ＣＳＦＥで標識した各分画の細胞の増殖能を示す図である。（ｂ）ＣＦＳＥ標識せずに（ａ）と同様にして培養し、各細胞から回収された細胞数を表す。（ｃ）「単離後間もない」各細胞集団におけるＫｉ６７発現のＦＣＭプロファイルを示す。
【図５】ヒトｃＭｏＰとｒＧＭＰのｉｎ  ｖｉｖｏにおける分化能の評価結果を示す（＜例５＞参照）。（ａ）Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｃＭｏＰとｒＧＭＰの分化能を評価するためのアッセイ系を示す。（ｂ）骨髄における子孫細胞のＦＣＭプロファイルを示す。（ｃ）ｃＭｏＰとｒＧＭＰの分化後の細胞種の割合を示す。（ｄ）ｃＭｏＰ由来の単球およびｒＧＭＰ由来の、単球および顆粒球をＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ染色した結果を示す。
【図６】プレ単球、ｃＭｏＰおよびｒＧＭＰの分化関係を示す（＜例６＞参照）。（ａ）数字はソーティングしたｃＭｏＰとｒＧＭＰの純度を示す。（ｂ）ソーティングしたｒＧＭＰと（ｃ）ｃＭｏＰの発生段階を解析した。
【図７】ＣＭＰ、ｒＧＭＰ、ｃＭｏＰ、プレ単球、ｃＭｏＰ由来単球、およびＰＢ単球の転写解析の結果を示す（＜例７＞参照）。（ａ）表示の細胞における単球特異的遺伝子のＲＮＡ発現のヒートマップ（ｌｏｇ２）を表す。（ｂ）表示の細胞集団における単球の分化に関与する転写因子の相対的ｍＲＮＡレベルを示す。（ｃ）細胞遊走に関与するケモカイン受容体の相対的ｍＲＮＡレベルを示す。（ｄ）表示の細胞集団における規準化された遺伝子発現プロファイルの主成分分析の結果を示す。（ｅ）ｃＭｏＰ−ＭｏまたはＰＢ−Ｍｏからの表示の細胞集団のユークリッド距離を表す。（ｆ）各細胞集団におけるヒト血液単球シグネチャの比較を示す図である。
【図８】Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３分画のＦＣＭによる分析の結果を示す（＜例１＞参照）。
【図９】顆粒球、単球、および樹状細胞のサブセットを検出するためのゲーティング戦略を示す（＜例２＞参照）。
【図１０】Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３分画から生じる単球由来樹状細胞への分化の様子を表す（＜例２＞参照）。
【図１１】Ｒ４およびＲ５分画のリンパ球系分化能を示す図である（＜例２＞参照）。
【図１２】Ｒ１〜Ｒ５分画のサイトカイン受容体の発現パターンを示す図である（＜例２＞参照）。
【図１３】マウスのｃＭｏＰとＧＭＰ上のＣＬＥＣ１２ＡとＣＤ６４の発現パターンを示す図である（＜例２＞参照）。
【図１４】ＭＤＰとＲ２〜Ｒ５分画との表現型の比較を示す図である（＜例２＞参照）。
【図１５】各前駆細胞におけるＤＣ特異的遺伝子のＲＮＡ発現のヒートマップ（ｌｏｇ２）を示す図である（＜例７＞参照）。
【図１６】改訂版のヒトのミエロイド系細胞分化経路を模式的に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
まず、本明細書において用いた略語とその意味を以下に記載する。また、明示的な記載がない場合は、下記の組織や細胞等はヒトのものを表すものとする。
ＢＭ：骨髄（bone marrow）
ｃＤＣ：従来型樹状細胞（conventional dendritic cell）
ＣＤＰ：共通ＤＣ前駆細胞（common DC progenitor）
ＣＭＰ：共通骨髄系前駆細胞（common myeloid progenitor）
ｃＧＭＰ：従来型顆粒球-単球前駆細胞(conventional granulocyte-monocyte progenitors)
ｃＭＯＰ：共通単球前駆細胞(common monocyte progenitor)
ＤＣ：樹状細胞(dendritic cell)
Ｅ：赤芽球（erythrocyte）
ＦＣＭ：多重染色フローサイトメトリー（multi-color flow cytometry）
Ｇ：顆粒球（granulocyte）
ＧＥＭＭ：顆粒球−赤芽球−マクロファージ−巨核球（granulocyte-erythrocyte-macrophage-megakaryocyte）
ＧＭ：顆粒球-マクロファージ（granulocyte-macrophage）
ＧＭＤＰ：顆粒球-単球-DC前駆細胞（granulocyte-monocyte-DC progenitor）
ＭＤＰ：単球−ＤＣ前駆細胞(monocyte-DC progenitor)
ＭＬＰ：多能リンパ球前駆細胞（multi-lymphoid progenitor）
ＭＮＣ：単核細胞(mononuclear cell)
ｍｏＤＣ：単球由来樹状細胞（monocyte-derived dendritic cell）
ＭＰ：単核食細胞(Mononuclear phagocytes）
ＰＢ：末梢血（peripheral blood）
ｐＤＣ：形質細胞様樹状細胞（plasmacytoid dendritic cell）
ｐｒｅＭｏ、ｐｒｅ−Ｍｏｎｏ：プレ単球（pre-monocyte）
ｒＧＭＰ：修正型ＧＭＰ集団（revised GMP population）
ＴＰＯ：トロンボポエチン（thrombopoietin）
ＵＣＢ：臍帯血（umbilical-cord blood）
【００１２】
＜ヒト単球前駆細胞＞
本発明の単離されたヒト単球前駆細胞（単に「ｃＭｏＰ」とも記載する）は、単球系統以外の細胞には分化せず、かつ増殖能を有する。ここで、「単球系統以外の細胞には分化しない」とは、顆粒球、樹状細胞、リンパ球には直接的に分化せず、単球系統の細胞（例えば、プレ単球、単球、マクロファージ、単球由来樹状細胞）にのみ分化する細胞であることを意味する。すなわち、本発明の単離されたヒト単球前駆細胞は、ＧＭＰとは異なり、顆粒球への分化能は有していない。また、「増殖能を有する」とは、ｃＭｏＰが細胞分裂を行い、細胞の数を増やすことができることを意味する。なお、細胞数が全体として増加を続ける限り、ｃＭｏＰの一部が、プレ単球、単球、マクロファージ等に分化してもよい。よって、別の言い方をすれば、本発明の単離されたヒト単球前駆細胞は、顆粒球への分化能を有さず、かつ増殖能を有する、単球の前駆細胞である。
【００１３】
上述のとおり、従来型ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）は、Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｌｏＣＤ１３５＋ＣＤ４５ＲＡ＋の細胞として定義されるが、これは真のＧＭＰと他の前駆細胞との混合集団であると考えられる。
【００１４】
本発明者らは、ヒトのｃＧＭＰ集団を細分化してｃＭｏＰを同定するために、Ｃ型レクチンファミリー（ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＤＣ−ＳＩＧＮなど）、サイトカイン受容体（ＣＤ１１５、ＣＤ１１６など）、ケモカイン受容体（ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ４など）、およびその他（ＣＤ６４など）を含む、ヒトの単球、マクロファージ、およびＤＣ上に発現している様々な細胞表面マーカーをスクリーニングした。細分化した集団のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養結果と組み合わせて、本発明者らは、ｃＧＭＰを細分化してｃＧＭＰ中のｃＭｏＰ分画を同定するために有用なマーカーとしてＣＤ６４とＣＬＥＣ１２Ａを同定した。
【００１５】
より詳細には、本発明者らは、ヒトのｃＭｏＰを同定するため、単球とマクロファージにおいて発現しているＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）とＣ型レクチンＣＬＥＣ１２Ａの発現に焦点を絞り、これらのマーカーを使用して、従来型ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）を細分化して詳細に検討し、４つの亜集団に分割した。各亜集団について詳細な検討を行った結果、ＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｈｉ亜集団（ＣＬＥＣ１２ＡとＣＤ６４を高く発現している集団）をｃＭｏＰとして同定した。また、ｃＧＭＰに含まれるＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｉｎｔ細胞のサブセットを、修正型（真の）ヒトＧＭＰ（ｒＧＭＰ）として再定義した。後述の実施例で示すとおり、ｒＧＭＰは顆粒球と単球を生じるが、ＤＣまたはリンパ球には分化しない。ｃＧＭＰ集団のＣＤ６４−分画のみが、ＤＣとリンパ球への分化能を有する。本発明者は、マイクロアレイデータを用いた複数の遺伝子の発現分析により、ｒＧＭＰからｃＭｏＰ、プレ単球、そして単球が連続的に生じるが、おそらく、この過程はＭＤＰとは無関係であることを明らかにした。本発明者らにより同定されたヒトｃＭｏＰと真のＧＭＰ（ｒＧＭＰ）およびこれらに関する分析は、ヒト骨髄系細胞分化経路に関する新たな知見をもたらすものである。
【００１６】
本発明のｃＭｏＰは、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｉｎｔ／−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１３５＋ＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｈｉの表現型を有する。また、本発明のヒトのｃＭｏＰはヒトの臍帯血中および骨髄中に存在するが、末梢血中には検出されない。
【００１７】
実施例で詳細に示すように、本発明者らは、ヒトｃＭｏＰとｒＧＭＰを同定し、さらにこれらの特性等を詳細に調べ、ミエロイド系細胞発生経路を見直した（図１６）。この見直された経路では、ｒＧＭＰが顆粒球とｃＭｏＰとに分化し、ｃＭｏＰがプレ単球を介して全ての単球サブセットを生成する。
【００１８】
上述のとおり、本発明のｃＭｏＰは、単球系統のみに分化する前駆細胞であり、かつ増殖能を有する。また、ｃＭｏＰはヒトの臍帯血中および骨髄中に存在するが、末梢血中には検出されない。最近のマウスを用いた研究から、組織に常在し恒常性維持を担うマクロファージの大部分は胎生期（卵黄嚢・肝）由来であるが、メタボリックシンドロームや癌などの疾患病態形成および維持を担うマクロファージの多くは骨髄単球由来であることが明らかになっている。例えば、動脈硬化の原因である血管内プラーク形成を担うマクロファージ、肥満脂肪組織形成に関わるマクロファージ、炎症性骨破壊を担う破骨細胞、癌組織内に存在する免疫抑制性マクロファージ（Ｔｕｍｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，ＴＡＭ）などは骨髄単球由来である。よって、本発明のｃＭｏＰは単球の源になる前駆細胞であることから、ｃＭｏＰ特異的マーカーを標的とした上記疾患の治療法開発に使用できる。また、細胞分化系譜上、ｃＭｏＰを標的としたり除去したりしたとしても樹状細胞分化には影響を与えないことから、易感染性などの懸念事項も極めて限定的にすることができる。
【００１９】
＜ヒト単球前駆細胞の単離方法＞
本発明の一態様は、ヒト共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）の単離方法に関する。該単離方法は、単離された臍帯血試料または骨髄試料から、ＣＬＥＣ１２ＡおよびＣＤ６４を高発現している細胞を単離する工程を含み、特にＬｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｉｎｔ／−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１３５＋ＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｈｉの細胞を単離する工程を含むことが好ましい。なお、細胞表面マーカーの発現の有無（陽性／陰性）および量（強度）の高低を表す記号（＋／−／ｈｉ／ｉｎｔ／ｌｏ等）の意味は、当該技術分野において公知であり、当業者であれば、フローサイトメトリー等の機器を適切に設定して、目的とする細胞を単離することが可能である。例えば、ＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｈｉの細胞は、図１ａに示されるように、ｃＧＭＰ中の他の亜集団と比較して最も高いＣＬＥＣ１２ＡとＣＤ６４の発現を有する分画である。このような分画は、例えば、フローサイトメーターとしてＢＤバイオサイエンス社製のＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）ＩＩＩセルソーターを使用し、ゲート条件を「Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｉｎｔ／−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１３５＋ＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｈｉ」と設定することで、ｃＧＭＰ集団から単離可能である。なお、ゲート条件は、必要とする細胞の数、純度に応じて適当に調整することもできる。該単離方法は、さらに、単離された臍帯血試料または骨髄試料から単核細胞（ＭＮＣ）を単離する工程、および／または、単離された単核細胞から、Ｌｉｎ−の細胞を単離する工程を含むことがより好ましい。
【００２０】
本発明のヒト単球前駆細胞の単離方法は、一態様として、
（工程１）：単離された臍帯血試料または骨髄試料から、単核細胞（ＭＮＣ）を単離する工程と、
（工程２）：工程１で単離された単核細胞から、Ｌｉｎ−の細胞を単離する工程と、
（工程３）：工程２で単離されたＬｉｎ−の細胞からＬｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｉｎｔ／−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１３５＋ＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｈｉの細胞を単離する工程のうち、少なくとも１つの工程を含むのが好ましく、２つ以上の工程を含むのがより好ましく、すべての工程を含むのがさらに好ましい。工程１〜工程３のうち、少なくとも工程３を含むのが好ましい。
【００２１】
細胞の単離は、例えば、磁気分離またはフローサイトメトリーを用いて行うことができる。
【００２２】
臍帯血試料または骨髄試料から、単核細胞（ＭＮＣ）を単離する方法としては、例えば、リンパ球分離溶液を使用した密度勾配遠心による方法等が挙げられる。
【００２３】
「Ｌｉｎ−」とは、分化抗原が陰性であることを意味し、既知の成熟血液系細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ミエロイド系細胞、赤芽球系細胞など）で発現している特定の表面抗原を有していないこと、すなわち該表面抗原を細胞表面に発現していないことをいい、本発明においては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６およびＣＤ２３５ａｂが陰性であることをいう。Ｌｉｎ−の細胞を単離する方法としては、実施例に記載の方法を挙げることができる。
【００２４】
Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｉｎｔ／−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１３５＋ＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｈｉの細胞を単離することにより、単球系統以外の細胞には分化せず、かつ増殖能を有するヒトｃＭｏＰを得ることができる。なお、本発明に係るヒトｃＭｏＰは、必ずしも１００％の純度で単離されている必要はなく、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｉｎｔ／−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１３５＋ＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｈｉの表現型を有するヒト単球前駆細胞を７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上含む細胞集団もまた、本発明の対象に含まれる。
【００２５】
＜ヒトｃＭｏＰの増殖方法＞
本発明のヒト単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）は、増殖能を有する。ヒトｃＭｏＰの増殖方法としては、特に限定されないが、例えば、サイトカインカクテルの存在下で、培地中で培養することが好ましい。サイトカインカクテルに含まれるサイトカインとしては、例えば、ｈＦｌｔ３Ｌ、ｈＴＰＯ、ｈＳＣＦ、Ｍ−ＣＳＦ等が挙げられる。培地としては、例えば、メチルセルロース、血清、イスコフ改変ダルベッコ培地、ＲＰＭＩ−１６４０等を含むことが好ましい。ｃＭｏＰの播種濃度は、培地中、１×１０４個／ｍＬ〜４×１０４個／ｍＬが好ましく、１×１０４個／ｍＬ〜２×１０４個／ｍＬがより好ましい。サイトカインカクテルの濃度は、例えば、２５〜１００ｎｇ／ｍＬ程度であることが好ましい。培養温度は、例えば、好ましくは３０〜４０℃、より好ましくは３６〜３８℃、さらに好ましくは３７℃である。また、細胞をより好適に維持または増幅する観点から、培地交換を適当な時期に行うことが好ましい。培地交換の頻度としては、細胞を維持または増幅し得る限り特に制限されないが、例えば１〜５日間経過毎、好ましくは３日間経過毎としてもよい。培地交換においては、培地の全部を交換してもよいし、一部のみを交換してもよい。また、ｃＭｏＰの培養においては必要により継代を行ってもよく、継代の頻度としては、細胞を維持または増幅し得る限り特に制限されず、細胞の集団が大きくなってきたタイミングで適宜行うことができ、例えば、４〜１２日間経過毎、好ましくは６〜１０日間経過毎とすることができる。
【００２６】
＜ヒトｃＭｏＰの分化誘導方法＞
本発明のヒト単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）は、下流の単球細胞への分化能を有している。単球細胞への分化を誘導する際には、例えば、前駆細胞を１０％のＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、およびサイトカインカクテルを含むイスコフ改変ダルベッコ培地中で培養する。ここで、サイトカインカクテルとしては、ｈＦｌｔ３Ｌ、ｈＴＰＯ、およびｈＳＣＦ（ＦＴＳ）が使用されうる。単球由来ＤＣを誘導するためには、ＦＴＳに加えて、ＧＭ−ＣＳＦを補充した培地中で細胞を培養することができる。
【００２７】
＜医薬組成物＞
本発明の一態様は、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）を死滅させる物質、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）の増殖もしくは分化を阻害する物質、または単球もしくはマクロファージの生成を阻害する物質を有効成分として含む、マクロファージ関連疾患の治療に用いるための医薬組成物に関する。このような医薬組成物は、有効成分として低分子、核酸（アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム等）、ポリペプチド、または抗体を含むことができる。また、医薬組成物は、薬学的に許容される担体、安定剤、または賦形剤を含むことができ、その投与経路については、使用する薬剤の種類、投与する対象に応じて、適宜決定することができる。
【００２８】
本発明の一態様は、抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体および／または抗ＣＤ６４抗体を有効成分として含む、医薬組成物に関する。上述のとおりｃＭｏＰは、ＣＬＥＣ１２ＡとＣＤ６４を発現していることから、これらの抗体を有効成分として含む医薬組成物は、ｃＭｏＰ特異的マーカーを標的にできるため、単球由来のマクロファージ関連疾患の治療に用いることができる。Ｃｌｅｃ１２Ａ（Gene Bank accession No.NM_001207010）は、Ｃ型レクチンであり死細胞由来の尿酸結晶に結合する。また、細胞内にＩＴＩＭモチーフを持つ。ＣＤ６４（Gene Bank accession No.NM_000566、別名ＦｃγＲＩＡ）は、糖タンパク質であり、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３に結合する。
【００２９】
抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体および／または抗ＣＤ６４抗体を有効成分として含む医薬組成物は、抗癌剤として用いることができる。単球や腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の寿命は通常、数日から３週間程度と考えられており、本発明の医薬組成物を用いてｃＭｏＰを部分的または完全に除去することにより、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）も部分的または完全に除去され得ることが当業者には理解される。また、本発明に係る医薬組成物は、併用剤として、他の抗癌剤などの薬物と組み合わせて用いることもできる。
【００３０】
「抗体」は、ポリクローナルまたはモノクローナルであることができ、任意の適当な生物学的供給源、例えば、マウス、ラット、ヒツジ、およびイヌ科動物から単離することができる。また、抗体は、モノクローナル抗体の消化断片またはその特定部分であってもよい。また、抗体または抗体の断片は、ファージディスプレイ法等によるスクリーニングによって同定されたペプチド配列を含むものであってもよい。
【００３１】
抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれかでありうる。これらの抗体の作製方法は、当業者には既知である。ヒト抗体の作製には、例えば、ＫＭマウス（協和発酵キリン）やＸｅｎｏＭｏｕｓｅＩＩ（Ａｍｇｅｎ）を使用することができる。抗体のクラス、サブクラスは特に限定はされないが、好ましくはＩｇＧクラスである。抗体は、好適には、ヒト抗体の定常領域、特にヒトＦｃ領域を有する抗体である。
【００３２】
上述の抗体は、好適には、中和活性、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）活性、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する抗体であることができる。抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性を増減させることができる。また、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）等のように、抗体に抗癌剤、放射性物質や細胞毒性物質などを結合させることもでき、さらに、異なる活性または補助機能を与えるために、１つ以上の追加ドメインが結合しているキメラ抗体または融合抗体を作製してもよい。また、上述の抗体は、２種類の抗原を認識する二重特異性抗体であってもよい。
【００３３】
また、本発明の一態様は、ＣＬＥＣ１２Ａおよび／またはＣＤ６４の発現を減少または増加させることができる、低分子、核酸（アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム等）、またはポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物に関する。例えば、ＣＬＥＣ１２Ａおよび／またはＣＤ６４の発現を減少させることができる有効成分を含む医薬組成物は、単球由来のマクロファージ関連疾患の治療に用いることができ好ましい。
【００３４】
本明細書において、マクロファージ関連疾患とは、マクロファージの望ましくない活性により引き起こされる（または悪性化する、もしくは難治性となる）疾患を指す。マクロファージ関連疾患としては、特に限定されないが、例えば、癌（免疫抑制、血管新生、転移）、骨関連疾患、神経変性（ＡＬＳ、ＭＳ）、アルツハイマー病、レット症候群、動脈硬化、脂質代謝異常、肺胞蛋白症、喘息、線維症、リウマチ、ループス腎炎、乾癬、炎症性腸疾患、クローン病、糖尿病、肥満およびメタボリック症候群等が挙げられる。癌としては、例えば、血液癌、乳癌、子宮体癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、胃癌、非小細胞肺癌、頭頚部扁平上皮癌、食道癌、膀胱癌、メラノーマ、大腸癌、腎細胞癌、非ホジキンリンパ腫等が挙げられる。骨関連疾患としては、例えば、骨粗鬆症、大理石骨病、癌の骨転移、変形性関節症、関節リウマチ、高カルシウム血症、骨折、ベーチェット病等が挙げられる。線維症としては、例えば、肺線維症、肝線維症、腎線維症、心筋線維症、皮膚線維症等が挙げられる。炎症性腸疾患としては、例えば、クローン病や潰瘍性、肉芽腫性、虚血性、放射性、感染性結腸炎等の大腸炎が挙げられる。
【００３５】
＜治療方法および医薬の製造における使用＞
本発明の一態様は、ヒト患者におけるマクロファージ関連疾患の治療方法に関する。このような方法は、ヒト患者に対して共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）を死滅させる物質、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）の増殖もしくは分化を阻害する物質、または単球もしくはマクロファージの生成を阻害する物質を有効成分として含む組成物を投与する工程を含みうる。有効成分は低分子、核酸、ポリペプチド、または抗体でありうるが、限定はされない。本発明に係る方法は、好ましくは、ヒト患者に対して抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体および／または抗ＣＤ６４抗体を投与する工程を含ものである。マクロファージ関連疾患は、癌、骨関連疾患、動脈硬化、線維症、炎症性腸疾患、またはメタボリック症候群でありうるが、限定はされない。
【００３６】
本発明の一態様は、ヒト患者における癌の治療方法に関する。このような方法は、ヒト患者に対して抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体および／または抗ＣＤ６４抗体を投与する工程を含みうる。また、本発明に係る方法は、併用剤として、抗癌剤などの他の薬剤を投与する工程を含むこともできる。
【００３７】
本発明の一態様は、マクロファージ関連疾患の治療に用いるための医薬の製造における、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）を死滅させる物質、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）の増殖もしくは分化を阻害する物質、または単球もしくはマクロファージの生成を阻害する物質の使用に関する。用いられる物質は低分子、核酸、ポリペプチド、または抗体でありうるが限定はされない。本発明に係る使用は、好ましくは、マクロファージ関連疾患の治療に用いるための医薬の製造における、抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体および／または抗ＣＤ６４抗体の使用である。マクロファージ関連疾患は、癌、骨関連疾患、動脈硬化、線維症、炎症性腸疾患、またはメタボリック症候群でありうるが、限定はされない。
【００３８】
本発明の一態様は、癌の治療に用いるための医薬の製造における、抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体および／または抗ＣＤ６４抗体の使用に関する。また、製造される医薬は、併用剤として、抗癌剤などの他の薬剤と組み合わせて用いるためのものであってもよい。
【００３９】
＜キット＞
本発明の一態様は、抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体および／または抗ＣＤ６４抗体を含む、ヒト共通単球前駆体細胞（ｃＭｏＰ）の標識または単離に使用するためのキットに関する。キットは、さらに、標識物、試薬、反応容器、取扱説明書等を含んでもよい。
【００４０】
＜ヒト単球前駆細胞の使用＞
本発明のｃＭｏＰは単球由来マクロファージに関連する疾患の治療方法等の開発において、スクリーニング等に用いることができる。ｃＭｏＰの使用方法について、例えば下記の態様が挙げられる。なお、下記のスクリーニング等において、ｃＭｏＰの分化および増殖の促進または抑制、単球の生成の促進または抑制、腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）への分化・機能の阻害等については、当業者に公知の任意の手法により評価することができる。
【００４１】
（ａ）ヒトｃＭｏＰを単離してマイクロアレイ解析を行い、ｃＭｏＰに発現する細胞表面分子を抽出して、同分子に対する抗体を作成する。同抗体を用いて、ｃＭｏＰ、単球、腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）への分化・機能を阻害するものを同定する。
【００４２】
具体的には、例えば、
ヒトｃＭｏＰの細胞表面に発現する分子を同定する工程、
該細胞表面分子に特異的な抗体を取得する工程、
該抗体を含む培地中でヒトｃＭｏＰを培養する工程、および
該抗体がヒトｃＭｏＰの分化、増殖または生存に影響するか否かを評価する工程
を含む、ヒトｃＭｏＰの分化、増殖または生存に影響する抗体のスクリーニング方法が挙げられる。
【００４３】
ここで、ヒトｃＭｏＰの分化、増殖または生存に「影響する」とは、ヒトｃＭｏＰの分化、増殖もしくは生存を促進する、または抑制することを指す。ヒトｃＭｏＰの分化、増殖または生存を促進すること、または抑制することは、当業者に公知の任意の手法により評価することができる。  
【００４４】
また、別の態様として、
試験物質を含む培地中でヒトｃＭｏＰを培養する工程、および
試験物質がヒトｃＭｏＰの分化、増殖または生存に影響するか否かを評価する工程
を含む、ヒトｃＭｏＰの分化、増殖または生存に影響する物質のスクリーニング方法も挙げられる。試験物質としては、各種サイトカイン、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、低分子化合物などが使用されうる。
【００４５】
（ｂ）ヒトｃＭｏＰを単離して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単球に分化誘導する培養系を用いて、ｃＭｏＰから単球への分化機構を解明する。さらに、同培養系に各種サイトカイン、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、低分子化合物などの試験物質を添加して、単球への分化を阻害または促進するものをスクリーニングする。
【００４６】
具体的には、
試験物質を含む単球分化培地中でヒトｃＭｏＰを培養する工程、および
試験物質が単球の生成を阻害するか否かを評価する工程
を含む、単球の生成を阻害する物質のスクリーニング方法が挙げられる。
【００４７】
（ｃ）ヒトｃＭｏＰを単離して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで破骨細胞に分化誘導する培養系に各種サイトカイン、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、低分子化合物などの試験物質を添加して、破骨細胞への分化を阻害または促進するものをスクリーニングする。
【００４８】
具体的には、
試験物質を含む破骨細胞分化培地中でヒトｃＭｏＰを培養する工程、および
試験物質が破骨細胞の生成を阻害するか否かを評価する工程
を含む、破骨細胞の生成を阻害する物質のスクリーニング方法が挙げられる。破骨細胞の生成を阻害するか否かは、当業者に公知の任意の手法により評価することができる。
【００４９】
（ｄ）上記（ｂ）または（ｃ）のスクリーニングにより選択されたサイトカイン、抗体、低分子化合物等を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価系で解析を行う。
【００５０】
具体的には、臍帯血またはヒトｃＭｏＰを、免疫不全動物（ＮＳＧマウス、ＮＯＧマウス、ＢＲＧＳマウス、ＭＩＳＴＲＧマウスなど）に移植して、造血系をヒト由来の細胞に置換した「ヒト化マウス」に、上記抗体や低分子化合物等を投与して、ｉｎ  ｖｉｖｏで単球やマクロファージへの分化能を阻害または促進するものをスクリーニングする。さらにヒト腫瘍細胞株を移植して、腫瘍内に浸潤してくる単球、同単球からＴＡＭへの分化、腫瘍の増大などを指標にして、抗体や低分子化合物等の効果を検討する。
【００５１】
（ｅ）上記（ｂ）または（ｃ）のスクリーニングにより選択されたサイトカイン、抗体、低分子化合物等について、担癌マウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ評価系で解析を行う。上記抗体や低分子化合物のマウス対応物を用いて、マウスｃＭｏＰ、単球、ＴＡＭを標的として解析する。
【００５２】
（ｆ）ヒトｃＭｏＰを単離して、ＭＳ（質量分析）などを用いて代謝解析を行い、ｃＭｏＰに特徴的な代謝経路を同定し、同経路を遮断または活性化する、すなわち、ｃＭｏＰの機能を阻害または促進する低分子薬物の探索を行う。
【００５３】
（ｇ）ヒトｃＭｏＰを単離してマイクロアレイ解析を行い、ｃＭｏＰに特徴的なマスター調節遺伝子を同定、同遺伝子を用いてｉＰＳからｃＭｏＰを誘導し、各種疾患治療に応用する。
【００５４】
（ｈ）ヒトｃＭｏＰを単離して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭ２マクロファージへの分化を促進するサイトカインや低分子化合物のスクリーニングを行い、炎症性疾患へ治療応用する。
【００５５】
（ｉ）ヒトｃＭｏＰを単離して、単球由来樹状細胞への分化を促進するサイトカインや低分子化合物の探索と各種疾患治療へ応用する。
【００５６】
（ｊ）ヒトｃＭｏＰを単離して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９などのゲノム編集技術を用いて特定のケモカイン受容体や接着分子遺伝子を削除する。増殖・分化した単球は特定のケモカイン受容体や接着分子遺伝子を発現しないため、特定組織への移入集積のみを抑制することができる。
【００５７】
（ｋ）また、本発明の一態様は、免疫不全マウス、好ましくは超免疫不全マウス（例えば、ＮＳＧマウス、ＮＯＧマウス、ＢＲＧＳマウス、ＭＩＳＴＲＧマウスなど）の骨髄にヒトｃＭｏＰを移植する工程を含む、ヒト単球を有するマウスの作製方法に関する。この作製方法により、ヒト単球を有し、ヒト顆粒球は有さないマウスが得られる。さらに、このようなマウスの作製方法は、ヒトＦｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＭ−ＣＳＦをマウスに投与する工程、および／または、ヒト腫瘍細胞をマウスに移植する工程を含んでもよい。該マウスの作製方法に用いられるｃＭｏＰは当業者に公知の技術により遺伝子改変されていてもよく、特に、上記（ｊ）に記載のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９などの技法により遺伝子改変されたものであってもよい。よって、本発明に係るヒト単球を有するマウスは、遺伝子改変されたヒト単球およびそれに由来する細胞を有しうる。作製されたヒト化マウスは、例えば、上記（ｄ）に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ評価系等に用いることができる。
【００５８】
＜ヒト単球前駆細胞の細胞医薬としての使用＞
単離したヒトｃＭｏＰをｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた後、単球系統の細胞の補充を必要とする患者に移植しても良い。その際、ｅｘ  ｖｉｖｏでｃＭｏＰに遺伝子改変を施してから、患者に移植することもできる。よって、本発明は、ヒトｃＭｏＰを含有する医薬組成物も対象としている。単球系統の細胞の補充を必要とする患者の治療方法は、具体的には、例えば、患者からｃＭｏＰを単離する工程、場合によりｃＭｏＰに遺伝子改変を施す工程、および、移植に必要な量が得られるようにｃＭｏＰを培養する工程、を含むことができる。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例を示して本実施形態を詳細に説明するが、本実施形態は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６０】
まず、実施例で用いた試料、培養方法および分析方法等について以下説明する。
＜試料＞
ヒトの臍帯血試料は日本赤十字社関東甲信越臍帯血バンクから提供され、ヒトＢＭ試料はＡｌｌＣｅｌｌｓから入手した。
【００６１】
＜細胞の単離、ソーティング、およびフローサイトメトリー分析＞
リンパ球分離溶液（ｄ＝１．０７７、ナカライテスク）を使用した密度遠心によって、ＵＣＢ由来の新鮮な単核細胞（ＭＮＣ）を単離した。次にＭＮＣをＣＤ２（ＲＰＡ−２．１０）、ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）、ＣＤ１１ｂ（ＩＣＲＦ４４）、ＣＤ１６（３Ｇ８）、ＣＤ１９（ＨＩＢ１９）、ＣＤ５６（ＨＣＤ５６）、ＣＤ２３５ａｂ（ＨＩＲ２）（すべてＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製）、およびＣＤ１４（ＲＭＯ５２）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ製）を含む細胞系マーカーに対するＰＥ−Ｃｙ５標識抗体（Ａｂ）と反応させ、さらに抗Ｃｙ５マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と反応させた。ａｕｔｏＭＡＣＳ  Ｐｒｏ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の「ｄｅｐｌｅｔｅ」プログラムを用いて、細胞系マーカーを事前に発現していない細胞（Ｌｉｎ−）を粗精製した。Ｌｉｎ−細胞をＣＤ３４（５８１；  ＡＰＣ−Ｃｙ７）、ＣＤ１０（ＨＩ１０ａ；  ＢＶ４１２）、ＣＤ１２３（６Ｈ６；  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）、ＣＤ４５ＲＡ（ＨＩ１００、ＢＶ５１０）、ＣＤ１３５（ＢＶ１０Ａ４Ｈ２；ＰＥ）、ＣＬＥＣ１２Ａ（５０Ｃ１；  ＦＩＴＣ）、ＣＤ６４（１０．１；  ＡＰＣ）（すべてＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、およびＣＤ３８（ＨＢ７；  ＰＥ−Ｃｙ７）（ＢＤ）に対する抗体と反応させた。各前駆細胞におけるサイトカイン受容体の発現を評価するために、Ｌｉｎ−細胞をＣＤ３４（ＡＰＣ−Ｃｙ７）、ＣＤ１０（ＢＶ４１２）、ＣＤ１２３（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）、ＣＤ４５ＲＡ（ＢＶ５１０）、ＣＬＥＣ１２Ａ（ＦＩＴＣ）、ＣＤ６４（ＡＰＣ）に対する抗体と、サイトカイン受容体であるＣＤ１１５（９−４Ｄ２−１Ｅ４；ＰＥ）、ＣＤ１１６（４Ｈ１；  ＰＥ）、ＣＤ１１７（１０４Ｄ２；ＰＥ）（すべてＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、またはＣＤ１１０（ＲＥＡ２５０；ＰＥ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に対する抗体と反応させた。Ｒ１〜Ｒ５とＭＤＰを比べるために、Ｌｉｎ−細胞をＣＤ３４（ＡＰＣ−Ｃｙ７）、ＣＤ１０（ＢＶ４１２）、ＣＤ１２３（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）、ＣＤ４５ＲＡ（ＢＶ７１１）、ＣＬＥＣ１２Ａ（ＦＩＴＣ）、ＣＤ６４（ＡＰＣ）、ＣＤ１１５（ＰＥ）、ＣＤ１１６（ビオチン）、およびストレプトアビジン（ＢＶ５１０）に対する抗体と反応させた。各前駆細胞の細胞周期状態を評価するために、Ｌｉｎ−細胞を転写因子染色バッファーセット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により固定し、ＣＤ３４（ＡＰＣ−Ｃｙ７）、ＣＤ１０（ＢＶ４１２）、ＣＤ１２３（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）、ＣＤ４５ＲＡ（ＢＶ５１０）、ＣＬＥＣ１２Ａ（ＰＥ）、ＣＤ６４（ＡＰＣ）（すべてＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製）、ＣＤ３８（ＰＥ−Ｃｙ７）、およびＫｉ６７（Ｂ５６；ＦＩＴＣ）（すべてＢＤ製）に対する抗体で染色した。
【００６２】
＜ミエロイド系細胞コロニー形成能アッセイ＞
ソーティングした前駆細胞各２００個を２００μｌのイスコフ改変ダルベッコ培地中に懸濁し、２μｌの１０ｎｇ／ｍｌ  ｈＴＰＯ（協和醗酵キリン）を加えた２ｍｌのメチルセルロース培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４４３５  Ｅｎｒｉｃｈｅｄ）と混合した。細胞懸濁液１ｍｌを１２ウェルプレート（二重の実験）の１つのウェルに加え、１０日間培養し、そしてマクロファージ（Ｍ）、顆粒球/マクロファージ（ＧＭ）、顆粒球（Ｇ）、顆粒球/赤芽球/マクロファージ/巨核球（ＧＥＭＭ）、または赤芽球（Ｅ）の分類に基づいてコロニーを計数した。
【００６３】
＜形態学的解析＞
形態学的解析のために、ソーティングした前駆細胞各１，０００個をスライドガラス上に、７００ｒｐｍで５分間遠心し密着させた（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｃｙｔｏｓｐｉｎ４）。Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ染色キットを使用し、メーカー推奨の手順（Ｓｙｓｍｅｘ）に従って、細胞を染色した。画像は１００倍の倍率で取得した（Ｌｅｉｃａ製ＤＭ４５００Ｂ）。
【００６４】
＜細胞の培養と分析＞
ミエロイド系細胞分化アッセイのために、２×１０３個の前駆細胞を１０％のＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（ナカライテスク）、およびサイトカインカクテルを含む５０μｌのＩＭＤＭ（Ｓｉｇｍａ）中で培養した。ここで、本明細書において、サイトカインカクテルとしては、５０ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３Ｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、５０ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ（協和醗酵キリン）、および１００ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（ＦＴＳ条件）が使用されうる。単球由来ＤＣを誘導するため、ＦＴＳと５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）とを加えた培地中で細胞を培養した。ミエロイド系細胞を検出するために、分化してきた細胞をＣＤ６６ｂ（Ｇ１０Ｆ５；ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）、ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３；ＢＶ５１０）、ＣＤ１４（Ｍ５Ｅ２；ＢＶ４１２）、ＣＤ１６（３Ｇ１；ＰＥ−Ｃｙ５）、ＣＤ１２３（６Ｈ６；ＦＩＴＣ）、ＣＤ１ｃ（Ｌ１６１；ＰＥ−Ｃｙ７）、ストレプトアビジン（ＡＰＣ−Ｃｙ７）（すべてＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製）、ＢＤＣＡ−２（ＡＣ１４４；ビオチン）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、およびＣＤ１１ｃ（Ｂ−ｌｙ６；ＡＰＣ）（ＢＤ）に対する抗体によって染色した。
【００６５】
Ｔ細胞およびＢ−ＮＫ細胞分化能を評価するために、Ｔｓｔ４／Ｄｌｌ４およびＴｓｔ４ストローマ細胞を１０％のＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（ナカライテスク）、１％の非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、および１％のピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）を含む１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）（完全ＲＰＭＩ−１６４０培地）を用いて９６ウェルプレート中で培養した。２日後、各前駆細胞からの細胞１０個をストローマ細胞培養プレートに加え、４週間培養し、培地の半分を毎週交換した。培地には、Ｔ細胞を誘導するために５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌと５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加えた。Ｂ−ＮＫ細胞を誘導するために１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７、５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加えた。さらに、２週間の培養の後、細胞を４０μｍ孔径のＮｉｔｅｘメッシュ（日本理化学器械）に通し、適切なサイトカインカクテルを含む完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中の新鮮なストローマ細胞上に移した。４週間の培養後、細胞を回収し、Ｔ細胞を検出するためにｈＣＤ４５およびＣＤ３に対する抗体で染色するか、Ｂ−ＮＫ細胞を検出するためにｈＣＤ４５、ＣＤ３３、ＣＤ１９、およびＣＤ５６に対する抗体で染色した。
【００６６】
ｃＭｏＰおよびｒＧＭＰの増殖能を評価するために、それぞれの前駆細胞１×１０３個をソーティングし、ＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識し、２ｍｌのメチルセルロース培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４４３５−Ｅｎｒｉｃｈｅｄ）を用いて７日間培養した。
【００６７】
ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩまたはＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ）とＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて、細胞を解析した。
【００６８】
＜単一細胞解析＞
１０ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯと１０ｎｇ／ｍｌのｈＦｌｔ３Ｌを加えた２ｍｌのメチルセルロース培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４４３５−Ｅｎｒｉｃｈｅｄ）を用いて、１００個のｃＭｏＰまたはｒＧＭＰをそれぞれ５日および８日間、培養した。単一のコロニーをＰ２０ピペットを用いてピックアップし、丸底９６ウェルプレート中で２００μｌのＰＢＳに懸濁し、上下に十分にピペッティングした。細胞懸濁液を２，０００ｒｐｍでスピンダウンし、ミエロイド系細胞の検出のために上述の抗体と反応させた。ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩとＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて、細胞を解析した。
【００６９】
＜Ｉｎ  ｖｉｖｏ再構築アッセイ＞
ＢＲＧＳマウスにエックス線（０．５Ｇｙ）（Ｆａｘｉｔｒｏｎ）を照射した。翌日、ソーティングしたｃＭｏＰまたはＣＤ６４ｉｎｔ  ＧＭＰ（５×１０３〜３×１０４）を１０μｌのＰＢＳ中に懸濁し、カスタマイズしたＩｔｏマイクロシリンジ（Ｉｔｏ  Ｃｏｒｐ．）を使用して、ＢＲＧＳマウスの骨髄腔に直接注入した。同じ日に、ヒト組換え体タンパク質Ｆｌｔ３Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＴＰＯ（協和醗酵キリン）、ＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、およびＭ−ＣＳＦ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）（各８μｇ）を静脈内投与し、これを連続４日間続けた。移植後５日目と７日目にｃＭｏＰとｒＧＭＰ由来の細胞をそれぞれ解析した。
【００７０】
＜マイクロアレイ解析とバイオインフォマティクス＞
少なくとも２０人のボランテイアの臍帯血からｃＭｏＰ、ｒＧＭＰ、およびＣＭＰをソーティングし、プールした。Ｏｖａｔｉｏｎ（登録商標）  Ｐｉｃｏ  ＷＴＡ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２（ＮｕＧＥＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、６．６２２ｎｇの総ＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、増幅させた。増幅したｃＤＮＡの収量をＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。ＳｕｒｅＴａｇ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、Ｃｙａｎｉｎｅ−３（Ｃｙ３）標識ｃＤＮＡを２．０μｇのｃＤＮＡから調製し、その後、ＤＮＡの精製および濃縮のためにＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ遠心フィルター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濾過した。色素の取り込みとｃＤＮＡの収量をＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−２０００分光光度計を用いてチェックした。２μｇのＣｙ３標識ｃＤＮＡを１×Ａｇｉｌｅｎｔブロッキング試薬と１×Ａｇｉｌｅｎｔハイブリダイゼーションバッファーで５０μｌに調整し、回転Ａｇｉｌｅｎｔハイブリダイゼーションオーブン中、６５℃で１７時間、ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ＧＥ  ８×６０Ｋ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｖｅｒ２．０（Ａｇｉｌｅｎｔ）にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイをＧＥ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  １（Ａｇｉｌｅｎｔ）により室温で１分間洗浄し、そしてＧＥ  Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  ２（Ａｇｉｌｅｎｔ）により３７℃で１分間洗浄し、その後、短い遠心により直ちに乾燥させた。８×６０ｋアレイスライド用の単色スキャン設定を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｃａｎマイクロアレイスキャナ（Ｇ２６００Ｄ）上で洗浄の直後にスライドをスキャンした（スキャン面積：６１×２１．６ｍｍ、スキャン解像度：３μｍ、色素チャネルの設定：緑色、ＰＭＴの設定：１００％）。バックグラウンドを減算し、空間的な傾きを除去した加工シグナル強度を得るために、デフォルトのパラメーターを使用し、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  １１．５．１．１（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、スキャンした画像を解析した。複数の発現データを抽出するための操作は全て、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃが行った。生データはＳｕｂｉｏ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（ｖｅｒ１．１８．４６６７、Ｓｕｂｉｏ  Ｉｎｃ．）を用いて解析した。遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）はＧＳＥＡ（ｖ．２．２．０  Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて実施した。ヒトの血液単球シグネチャは、公表されているマイクロアレイデータ（ＧＳＥ３５４５９）から抽出した。ｃＭｏＰ、ｒＧＭＰ、およびＣＭＰ用の遺伝子セットは、上述のように、マイクロアレイデータから抽出した。
【００７１】
＜例１：従来型ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）の細分化＞
上述のとおり、ｃＧＭＰは、Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｌｏＣＤ１３５＋ＣＤ４５ＲＡ＋の細胞として定義され、主に顆粒球−単球前駆細胞を含むが、Ｔ細胞への分化能をもつ細胞も一部含んでいる。加えて、単球−ＤＣ系統に限局した前駆細胞であるＭＤＰが最近、ｃＧＭＰ分画中に同定された。そこで、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、およびその他をスクリーニングした結果、本発明者は、ヒトのｃＧＭＰサブセットについて調べるためのマーカーとしてＣ型レクチンＣＬＥＣ１２ＡとＦｃγＲ（ＣＤ６４）を選択した（図１）。いずれのマーカーも、マウスおよびヒトの単球において高発現している。
【００７２】
図１ａはヒトのＵＣＢからのＬｉｎ−ＭＮＣ、図１ｂはヒトのＢＭおよびＰＢ由来のＬｉｎ−ＭＮＣを、フローサイトメーターにより解析した結果をそれぞれ示す。ゲート領域内またはその付近に記載の数値は、各亜集団の頻度を示している。ｃＧＭＰ、ＣＭＰ、およびＭＬＰは、それぞれＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１２３ｌｏＣＤ１０−ＣＤ１３５＋ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１２３ｌｏＣＤ１０−ＣＤ１３５＋ＣＤ４５ＲＡ−、およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１０＋であった。
【００７３】
さらに、ＣＬＥＣ１２ＡとＣＤ６４の発現に基づき、多色フローサイトメトリー（ＦＣＭ）を用いて、ヒト臍帯血（ＵＣＢ）由来のｃＧＭＰをＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｈｉ（Ｒ２）、ＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｉｎｔ（Ｒ３）、ＣＤ６４−ＣＬＥＣ１２Ａ＋（Ｒ４）およびＣＤ６４−ＣＬＥＣ１２Ａ−（Ｒ５）という４つの分画に細分化した（図１ａ）。また、Ｌｉｎ−ＣＤ３４−ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｌｏＣＤ１３５＋ＣＤ４５ＲＡ＋分画中のＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｈｉ分画も定義に加えた（Ｒ１）。Ｒ１とＲ２の表現型は、Ｒ２細胞がＣＤ３４を発現し、Ｒ１細胞ではその発現が無い点を除き、同一であった。
【００７４】
ｃＧＭＰを細分化した集団の詳細な表現型は、以下の通りであった：ＣＤ３４−ＣＤ３８＋ＣＤ１２３ｌｏＣＤ１０−ＣＤ６４ｈｉＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ１３５＋ＣＤ４５ＲＡｈｉ（Ｒ１）、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｉｎｔ／−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１３５＋ＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｈｉ（Ｒ２）、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｉｎｔ／−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１３５＋ＣＬＥＣ１２ＡｈｉＣＤ６４ｉｎｔ（Ｒ３）、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｉｎｔ／−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１３５＋ＣＤ６４−ＣＬＥＣ１２Ａ＋  ＧＭＰ（Ｒ４）、およびＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１０−ＣＤ１２３ｉｎｔ／−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１３５＋ＣＤ６４−ＣＬＥＣ１２Ａ−（Ｒ５）。
【００７５】
これら５つの分画（Ｒ１〜Ｒ５）をヒト骨髄（ＢＭ）中にも検出した（図１ｂ上段）。一方、ヒト末梢血（ＰＢ）においては、それらはほとんど検出されなかった（図１ｂ下段）。
【００７６】
Ｒ１〜Ｒ５分画のミエロイド系−赤芽球系分化能を評価するため、上述のミエロイド系細胞コロニー形成能アッセイの方法に基づき、コロニー形成単位（ＣＦＵ）をｅｘ  ｖｉｖｏでアッセイした。ソーティングした各前駆細胞（１×１０２）をサイトカインカクテルを含むメチルセルロース培地中で培養し、１０日後にコロニーをカウントした。比較対照として、Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１０＋の多能リンパ球前駆細胞（ＭＬＰ）とＬｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１２３ｌｏＣＤ１０−ＣＤ１３５＋ＣＤ４５ＲＡ−の共通ミエロイド系前駆細胞（ＣＭＰ）も同様にアッセイした（図１ａ参照）。図１ｃに、各ＵＣＢ亜集団の骨髄コロニー形成能を示す。各バーは、培養した細胞（１×１０２）あたりのコロニーの平均数を表し、図中の略号の意味は次のとおりである。Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、Ｇ：顆粒球、Ｅ：赤芽球、ＧＥＭＭ：顆粒球−赤芽球−マクロファージ−巨核球。Ｒ３分画とＲ４分画は、マクロファージ（Ｍ）、顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）、および顆粒球（Ｇ）コロニーを生じたが、Ｒ３分画よりも多くのマクロファージコロニーがＲ４分画から生じた。興味深いことに、Ｒ２分画とＲ５分画はＭコロニーのみを形成し、Ｒ１分画はミエロイド系コロニーをわずかに形成した。以前のｃＧＭＰの報告から予想されたように、いずれの分画もＥあるいはＧＥＭＭコロニーを形成しなかった（図１ｃ）。図１ｄは、各ＵＣＢ前駆細胞のＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ染色の結果を表す。元の倍率は１００倍であり、スケールバーは１０μｍを表す。
【００７７】
図８は、Ｒ１〜Ｒ３分画のＦＣＭによる分析結果を表す。本発明者らは、Ｒ１〜Ｒ３分画を再び、ＣＤ３４／ＣＤ３８と細胞系マーカー（Ｌｉｎ）／ＣＤ３４プロファイルについてゲーティングした。図８は、３種の色でそれぞれＲ１〜Ｒ３分画を表しており、濃い灰色がＲ１分画、薄い灰色がＲ２分画、黒がＲ３分画を表す。注目すべきことに、Ｒ１〜Ｒ３分画のミエロイド系分化能は、それらのＣＤ３４／ＣＤ３８発現レベル、細胞の大きさ（図８ａ〜ｃ）、および形態（図１ｄ）と相関関係があった。
【００７８】
Ｒ１〜Ｒ３分画の、ＣＤ３４／ＣＤ３８およびリネージ（Ｌｉｎ）／ＣＤ３４プロファイルを解析したところ、Ｒ３分画の細胞はＣＤ３４＋ＣＤ３８＋であり、Ｒ２分画の細胞はダウンレギュレートされたＣＤ３４の発現を示し（ＣＤ３４ｉｎｔＣＤ３８＋）、Ｒ１はＣＤ３４をほぼ完全に失っていた（ＣＤ３４−ＣＤ３８＋）（図８ａ、ｂ）。細胞質の体積はＲ３からＲ１にかけて徐々に増加していた。これは、それらのＣＤ６４発現レベルおよびミエロイド系コロニー形成能とそれぞれ正および負に相関していた（図１ｂ，ｃおよび図８ｃ）。細胞の形態に関しては、Ｒ２〜Ｒ５分画は核が丸く、拡張しており、細胞質の体積が比較的小さいという典型的な前駆細胞の形態を有していた（図１ｄ）。
【００７９】
なお、図１の各データは、ａについては少なくとも２０回、ｂにおいて、ＢＭは４回、ＰＢは３回、ｃおよびｄは３回の独立した実験を行った。図８の各データは、３回の独立した実験に基づくものである。
【００８０】
これらの結果により、ｃＧＭＰは、異なるミエロイド系細胞分化能を有する４つの独立の亜集団に分画できることが示された。
【００８１】
＜例２：ヒトのｃＭｏＰおよびｒＧＭＰの同定＞
例１のとおり、Ｒ１〜Ｒ５分画は、異なるミエロイド系細胞分化能を有していたため、上記のゲーティング戦略を用いて、顆粒球、単球およびＤＣのサブセットを検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系を立ち上げた（図９ａ）。ＵＣＢからソーティングした各分画（１×１０３）をＦｍｓ様チロシンキナーゼ受容体３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）（５０ｎｇ／ｍＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）（５０ｎｇ／ｍＬ）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下（ＦＴＳ条件）で、２日間（Ｒ１）、４日間（Ｒ２）または８〜１０日間（Ｒ３〜Ｒ５）培養し、顆粒球（ＣＤ６６ｂ＋）、単球（ＣＤ１４＋ＣＤ１６−、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋およびＣＤ１４−ＣＤ１６＋）、ｐＤＣ（ＣＤ１２３＋ＢＤＣＡ−２＋）およびｃＤＣ（ＣＤ１４１ｈｉＣＤ１１ｃ−およびＣＤ１ｃ＋ＣＤ１１ｃ＋）について分析した。図２ａは、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける、Ｒ１〜Ｒ５分画からの単球およびＤＣ分化を表し、図２ｂは、分画における細胞の種類の割合を示す。図２中、ＣＤ１４＋ＣＤ１６−単球はＣＤ１４＋ｍｏｎｏと記載し、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋およびＣＤ１４−ＣＤ１６＋単球はＣＤ１６＋ｍｏｎｏと記載する。ゲート領域内またはその上の数字は、各分画の割合を示している。Ｒ３分画とＲ４分画はｉｎ  ｖｉｔｒｏコロニー形成アッセイ（図１ｃ）の結果と一致して顆粒球への分化能を示したが、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ５分画は顆粒球への分化能を示さなかった（図２ａ，２ｂ）。なお、Ｒ１〜Ｒ３分画は、古典的なＣＤ１４＋ＣＤ１６−単球、中間型ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球、および非古典的なＣＤ１４ｌｏ／−ＣＤ１６＋単球などの単球サブセットを産生したが、ｐＤＣ、ＣＤ１４１ｈｉｃＤＣまたはＣＤ１ｃ＋ｃＤＣを含むＤＣサブセットは全く産生しなかった（図２ａ，２ｂ）。これらの前駆細胞に由来する主たる単球サブセットは、古典的なＣＤ１４＋ＣＤ１６−単球ではなく、中間型ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋細胞であり、これは最近の報告結果とも一致している。
【００８２】
さらに、図１０は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３分画から産生される単球由来の樹状細胞への分化の様子を表している。図１０ａは、Ｒ１〜Ｒ３分画をＦＴＳＧＭ（ＦＴＳおよび単球由来ＤＣを誘導する代表的なサイトカインであるＧＭ−ＣＳＦ）５０ｎｇ／ｍＬと共に培養すると、ＣＤ１４＋ＣＤ１ｃ＋単球由来ＤＣが生じることを表している。また、ＦＴＳＭ（ＦＴＳおよびＭ−ＣＳＦ）と共に培養すると、Ｒ１〜Ｒ３分画のＣＤ１４＋ＣＤ１６＋とＣＤ１４ｌｏ／−ＣＤ１６＋単球（すなわちＣＤ１６＋単球）への分化がわずかに亢進することを確認した（図１０ｂ，ｃ）。これに関連して、Ｒ１分画の単球生成のピークが２日目で、少なくとも４日間を要するＲ２のピークよりも早かった（データ示さず）。この所見は、Ｒ１およびＲ２サブセットの両者が、単球分化に特化した前駆細胞であり、Ｒ１がＲ２の下流の前駆細胞であることを示唆している。一方、どちらもＣＤ６４−であるＲ４およびＲ５分画は、すべての単球およびＤＣサブセットを生み出した（図２ａ，２ｂ）。Ｒ４およびＲ５分画に由来するＣＤ１４１ｈｉｃＤＣは、ＣＬＥＣ９Ａを発現していた（図９ｂ）。Ｒ１〜Ｒ３分画はＤＣへの分化能を、ほとんど示さなかったため、これらの結果から、Ｒ４とＲ５分画がｃＧＭＰにおけるＤＣの主要な源であることが示唆された。
【００８３】
次に、Ｒ１〜Ｒ５分画のリンパ球系分化能を調べた。図２ｃは、Ｄｌｌ４＋Ｔｓｔ４ストローマ細胞、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）、およびＦｌｔ３Ｌ（５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、図２ｄは、Ｔｓｔ４ストローマ細胞、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−７（４０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、各分画の細胞１０個を９６ウェルプレートの４８個のウェル中において１ヶ月間、培養した。各ウェルをＣＤ３＋Ｔ細胞（図２ｃ）またはＣＤ１９＋Ｂ細胞およびＣＤ５６＋ＮＫ細胞（図２ｄ）について分析した。図中の各バーはＣＤ３＋Ｔ細胞（図２ｃ）ならびにＣＤ１９＋Ｂ細胞および／またはＣＤ５６＋ＮＫ細胞（図２ｄ）について陽性のウェルの割合を表し、ＮＤは検出されなかったことを表す。図２ｃは、Ｔ細胞分化能を評価するため、Ｔ細胞の分化に不可欠なＮｏｔｃｈリガンドであるデルタ様リガンド４（Ｄｌｌ４）を発現しているＴｓｔ４ストローマ細胞上において、該Ｆｌｔ３ＬとＩＬ−７の存在下で、各分画の細胞１０個を培養した結果を示す。比較対照として、ＭＬＰを用いた。Ｒ１〜Ｒ３分画はＴ細胞への分化能を全く有していなかった一方、Ｒ４およびＲ５分画は著しい数のＴ細胞を産生した。図２ｄは、Ｔｓｔ４ストローマ細胞上において、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−２、およびＩＬ−７の存在下で各分画の細胞１０個を培養することにより、Ｂ−ＮＫへの分化能を評価した結果を示す。比較対照として、Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１２３ｉｎｔＣＤ１０＋ＣＤ４５ＲＡ＋の細胞として定義されるＢ−ＮＫ前駆細胞を用いた。Ｂ細胞とＮＫ細胞は、それぞれ、ＣＤ３３−ＣＤ１９＋およびＣＤ３３−ＣＤ５６＋の細胞と定義した。
【００８４】
図１１は、Ｒ４およびＲ５分画のリンパ系分化能を示す。図１１ａは、ＭＬＰ、Ｒ４分画、Ｒ５分画に由来するＣＤ３＋Ｔ細胞のＦＣＭによる分析結果を示す。細胞は図２ｂと同様の方法で培養した。図１１ｂは、Ｂ−ＮＫ前駆細胞、Ｒ４分画またはＲ５分画に由来するＢ細胞、Ｂ−ＮＫ細胞およびＮＫ細胞のＦＣＭによる分析結果を示す。細胞は図２ｃと同様の方法で培養した。ＮＤは検出されなかったことを示す。
【００８５】
興味深いことに、Ｒ１〜Ｒ５サブセットのリンパ系分化能は、ＣＬＥＣ１２Ａの発現が増加するにつれて減少する傾向が見られ、ＣＤ６４をさらに獲得することにより完全に失われた（図２ｃ，２ｄおよび図１１ａ，ｂ）。Ｒ４およびＲ５のリンパ系分化能は、ｃＧＭＰ中に残存するＴ細胞への分化能を示唆する。
【００８６】
なお、図２、図１０および図１１のデータはいずれも３回の独立した実験によるものである。
【００８７】
ヒト及びマウスのｃＧＭＰはどちらも顆粒球と単球に加えて、ＤＣへも分化する。これらの前駆細胞は、ミエロイド系細胞分化能に加えて、明らかなリンパ球細胞への分化能を有している。例えば、マウスのｃＧＭＰは、リンパ系遺伝子を高レベルに発現し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞とＢ細胞の両方を生じさせる。また、ヒトのＵＣＢ由来のｃＧＭＰも、Ｔ細胞に分化する能力を有している。本発明者は、上述のとおり、前駆細胞のリンパ球系分化能を評価するために、最適化された方法であるＴｓｔ４ストローマ細胞／Ｄｌｌ４およびＴｓｔ４ストローマ細胞と複数のサイトカインカクテルとを組み合わせて培養し、ヒトのｒＧＭＰにはリンパ球系細胞への分化能がないことを明らかにした。また、ｒＧＭＰはＤＣへの分化能はなく、ＤＣ分化能はＣＤ６４−ｃＧＭＰ（Ｒ４およびＲ５分画）に保存されていた。Ｒ４とＲ５は、単球およびＤＣへの分化能に加えて、顆粒球および／またはリンパ球への分化能も備えていた。Ｒ５が多分化能を有しており、また、ヒトのＭＬＰ様細胞群が赤芽球系への分化能を欠いていることから、上記実施例のデータは、赤芽球系統への分岐がＬｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８−多分化能前駆細胞の段階でおこるというモデルに合致する。
【００８８】
さらに、Ｒ１〜Ｒ５分画について、ＣＤ１１０（ＴＰＯ受容体）、ＣＤ１１５（Ｍ−ＣＳＦ受容体）、ＣＤ１１６（ＧＭ−ＣＳＦ受容体）、ＣＤ１１７（ＳＣＦ受容体）、およびＣＤ１２３（ＩＬ３受容体α）などの、他のサイトカイン受容体の発現特性を調べた結果を図１２に示す。図１２中、黒塗り部分が、各受容体の発現パターンを表す。Ｒ１分画におけるサイトカイン受容体の発現パターンは、プレ単球について既に報告されたもの（Breton, G. et al. Circulating precursors of human CD1c+ and CD114+ dendritic cells. J. Exp. Med. 212, 401-413 (2015).）と酷似しており、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、およびＣＤ１１７を検出可能なレベルで発現していた。一方、Ｒ２とＲ３分画において観察された発現パターンは、これまで全く報告されていないものであった。
【００８９】
これらの表現型と発生分析に基づき、Ｒ１が最近定義されたプレ単球と同じプレ単球分画であり、Ｒ２がｃＭｏＰであり、Ｒ３が真のＧＭＰ（修正型ＧＭＰ、ｒＧＭＰ）であると結論した（表１）。
【００９０】
（ヒトのｃＭｏＰ等とマウスのｃＭｏＰ等との比較）
図１３に、マウスのｃＭｏＰとＧＭＰ上のＣＬＥＣ１２ＡとＣＤ６４の発現パターンを示す。ゲート領域内またはその付近に記載の数値は、各亜集団の頻度を示している。ＣＬＥＣ１２ＡとＣＤ６４は、ヒトのｃＭｏＰとｒＧＭＰで見られるように、マウスのｃＭｏＰとＧＭＰでも発現されていた。
【００９１】
マウスとヒトのｃＭｏＰは単一細胞レベルで単球のみを産生する前駆細胞であり、どちらもＣＤ６４、ＣＬＥＣ１２ＡおよびＣＤ１１７を発現している。一方、ヒトのｃＭｏＰはＣＤ１３５を発現しているが、マウスｃＭｏＰはＣＤ１３５を発現していない。マウスのｃＭｏＰの分化起源はＭＤＰに由来するが、ヒトのｃＭｏＰはｒＧＭＰに由来しており、おそらくＭＤＰを介さずに分化してくる（ｒＧＭＰがＤＣ分化能を有していないため）。この相違は、単にマウスとヒトの間のミエロイド系細胞分化経路の違いを反映している可能性がある。あるいは、マウスのｃＧＭＰはｒＧＭＰを含んでいる可能性も考えられる。ＤＣ分化能を持たないｒＧＭＰの存在は、分化経路において単球由来ＤＣがｃＤＣとｐＤＣとは異なる分化起源から由来することと一致しており、この単球由来ＤＣとＤＣサブセットの分岐がｒＧＭＰの上流で起きていることを示唆している。
【００９２】
最近、ヒトのＵＣＢおよびＢＭ中のｃＧＭＰにおいて、顆粒球−単球−ＤＣ前駆細胞（ＧＭＤＰ）、ＭＤＰ、およびＤＣ分化に制限されたＤＣ共通前駆細胞（ＣＤＰ）が同定されたことから、本発明者らは、ＣＤＰ、ＭＤＰ、ｃＭｏＰ、およびｒＧＭＰの表現型を比較した。図１４に、ＭＤＰとＲ２〜Ｒ５分画との表現型の比較を示す。ＣＤＰはＣＤ１２３ｈｉ分画（図１ａの上の２番目のパネル）として現れ、ｃＧＭＰには含まれていない。図１４ａは、ＣＬＥＣ１２ＡおよびＣＤ６４の発現により、ＭＤＰがＣＤ６４ｉｎｔとＣＤ６４−の亜集団に分割されることを示している。図１４ｂは、ＭＤＰがｃＧＭＰと重なることを示している。図１４ｃは、ＭＤＰ中の各分画の割合を示す。ＭＤＰはＲ３（ｒＧＭＰ）とＲ４中に確認されたが、Ｒ２（ｃＭｏＰ）およびＲ５中には確認されなかった。これは、ＭＤＰがＣＤ６４ｉｎｔとＣＤ６４−の亜集団に分割されうることを示しており（図１４ａ〜ｃ）、ＭＤＰが顆粒球分化能をいくらか有する不均一な集団であることを示唆している。ＣＤ６４ｉｎｔＭＤＰは、ｒＧＭＰの１４．４±５．０％を占めていた。
【００９３】
次に、ＣＤ６４ｉｎｔとＣＤ６４−ＭＤＰのミエロイドコロニー形成能を調べた。図１４ｄおよび１４ｅは、ミエロイドコロニー形成能を示す。比較対照としてＧＭＤＰを用いた。ソーティングされた各前駆体細胞（１×１０２個）をサイトカインカクテルを含むメチルセルロース培地中で培養し、１０日後にコロニー数を数えた。図１４ｄは、培養した１×１０２個中の各細胞の割合を示す。図１４ｅは、ＦＣＭによる解析結果を表す。図１４中の略号は次のとおりである。Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球−マクロファージ、Ｇ：顆粒球。
【００９４】
重複する表現型から予想されるように、ＣＤ６４ｉｎｔおよびＣＤ６４−ＭＤＰは、ミエロイドコロニー形成能を示したが、赤芽球系細胞形成能は示さず、まさしくＲ３（ｒＧＭＰ）およびＲ４のように、培養において単球と顆粒球をそれぞれ生じた（図１ｃ，図１４ｄ，１４ｅ）。ＣＤ６４−ＭＤＰのみが、ＦＴＳ条件下でＤＣを生じた（データ示さず）。以上より、ＭＤＰが不均一な集団であり、ＣＤ６４ｉｎｔＭＤＰはｒＧＭＰとして定義されるべきであると結論づけた。
【００９５】
なお、図１２〜１４の各データは３回の独立した実験によるものである。
【００９６】
＜例３：ヒトｃＭｏＰとｒＧＭＰのクローナル解析＞
さらに、単一の細胞レベルでｃＭｏＰとｒＧＭＰ細胞の特性を評価した。ｃＭｏＰとＧＭＰをソーティングし、サイトカインカクテルを含むメチルセルロース培地中で、それぞれ、５日間と８日間培養し、ＦＣＭ分析のために単一のコロニーをピックアップした（上述の「単一細胞解析」を参照）。顆粒球と単球について、代表的なコロニーの細胞を分析した。図３は単一細胞レベルでのヒトｃＭｏＰおよびｒＧＭＰの特性を表す。図３ａは１００個のｃＭｏＰ由来、図３ｂは１００個のｒＧＭＰ由来の代表的なコロニーのＦＣＭプロファイルを示す。ゲート領域中の数字は各集団の割合を示す。図３ｃは、ＦＣＭによって検出された単球および／または顆粒球コロニーの比率を表す。図３中の略号の意味は次のとおりである。ＮＤ：コロニー検出されず、Ｍｏｎｏ：単球、Ｇｒａ：顆粒球、ｕｎｄｉｆｆ．：未分化細胞。
【００９７】
注目すべきことに、ｃＭｏＰ由来のすべての単一コロニーは１００％が単球から成っていた（図３ａ，３ｃ）。ｒＧＭＰ由来の一部の単一コロニーは単球のみを含んでいたが（３３．２±３．５％）、残りは、単球と顆粒球の両方（２１．７±２．８％）、顆粒球のみ（３７．６±１．９％）、または未分化細胞（６．６±２．３％）を含んでいた（図３ｂ，３ｃ）。単一細胞レベルで二つの細胞系列への分化能をもつ前駆細胞の頻度は、ヒトＭＤＰ（１２．５％）のそれより高く、マウスＣＤＰ（１８．０％）に匹敵していた。
【００９８】
さらに、図３ｄにｃＭｏＰの限界希釈解析の結果を示し、図３ｅにｒＧＭＰの限界希釈解析の結果を示す。細胞を、サイトカインカクテルを含むメチルセルロース培地中で７日間培養した。（ｄ）、（ｅ）においては、縦軸がコロニー陰性ウェルの割合を表し、横軸が培養した細胞の数を表し、点線が予想されるクローン原性頻度での３７％検出失敗を表す。また、括弧内の数字は、（ｄ）ｃＭｏＰおよび（ｅ）ｒＧＭＰの平均のクローン頻度を、それぞれ表す。
【００９９】
限界希釈解析によりコロニー形成能を推定したところ、同じ培養条件下において、６．８５個のｃＭｏＰのうち１個、１．０４個のｒＧＭＰのうち１個の頻度で各々コロニーを形成した（図３ｄ，３ｅ）。このヒトｃＭｏＰの前駆細胞頻度は、ヒトｐｒｅＤＣ（１／７．８４）、マウスＣＤＰ（１／７．１〜８．６）、およびマウスｃＭｏＰ（１／３．９〜９．２）について報告されたものと同等であった。これらの結果により、ヒトｃＭｏＰが、マウスｃＭｏＰについて報告されたように単一分化能性の前駆細胞であり、また、ｒＧＭＰが単一細胞レベルで単球と顆粒球を生成できる二分化能性の前駆細胞を含むことが示された。
【０１００】
なお、図３のデータは、３回（ａ〜ｃ）および４回（ｄ，ｅ）の独立した実験によるものである。
【０１０１】
＜例４：ヒトｃＭｏＰおよびｒＧＭＰの増殖能＞
前駆細胞は分裂を伴って分化することから、本発明者は、ＣＦＳＥ希釈アッセイにより単球、プレ単球（ｐｒｅＭｏ）、ｃＭｏＰ、およびｒＧＭＰがもつ増殖能を評価した。図４ａは、これらの集団をＣＦＳＥで標識し、各分画の細胞１×１０３個を適切なサイトカインカクテルを含むメチルセルロース培地中で７日間培養し、分化してきた細胞をＦＣＭによって解析した結果を示す。ＣＦＳＥ希釈による評価によって、単球とプレ単球では細胞分裂が確認されなかったが、ｃＭｏＰとｒＧＭＰは大きな増殖能を示した。
【０１０２】
図４ｂは、ＣＦＳＥ標識せずに図４ａと同様にして培養して各細胞を回収した結果を示す。図４ａの観察と一致して、１０３個のプレ単球の培養７日後には細胞は全く回収されなかったが、同じ培養条件下で１０３個のｃＭｏＰからは３１，０００±３，８７５個の細胞が得られた（図４ｂ）。
【０１０３】
図４ｃは、「単離後間もない」各細胞におけるＫｉ６７発現のＦＣＭプロファイルを示す。「単離後間もない」プレ単球は、増殖能を示さなかったが（図４ｃ）、それらはＫｉ６７＋であった（図４ａ，４ｂ）。Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、およびＭ期の細胞はすべてＫｉ６７＋であるため、この標識はｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｃＭｏＰとして増殖した後の最後のＧ２期およびＭ期の細胞を反映しているのかもしれない。これらの結果から、ｒＧＭＰ、ｃＭｏＰおよびプレ単球の間における増殖能（一般的に利用されている前駆細胞の指標）の明らかな違いが示された。
【０１０４】
なお、図４の各データは少なくとも３回の独立した実験に基づくものである。
【０１０５】
＜例５：Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｃＭｏＰとｒＧＭＰの分化能＞
Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｃＭｏＰとｒＧＭＰの分化能を評価するために、発明者は、新たなアッセイ系を開発した（図５ａ）。本発明者は、ＮＯＤ型Ｓｉｒｐａを有するＢ６．Ｒａｇ２−／−Ｉｌ２ｒｇ−／−マウス（ＢＲＧＳマウス）に０．５Ｇｙの照射を行い、ｃＭｏＰまたはｒＧＭＰ（５×１０３〜３×１０４個の細胞）を該マウスのＢＭに直接移植した。同日に、ヒト組換え体タンパク質Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＭ−ＣＳＦの該マウスへの静脈内投与を開始し、それを連続４日間続けた。図５ｂに、５日目（ｃＭｏＰ）および７日目（ｒＧＭＰ）に移植したｃＭｏＰまたはｒＧＭＰのＢＭ子孫細胞をＦＣＭによって、分析した結果を示す。図５ｃでは、ｃＭｏＰは単球のみを生成したが、これはＣＤ１４＋ＣＤ１６−単球（ＣＤ１４＋ｍｏｎｏ，２６．３±５．３％）とＣＤ１４＋ＣＤ１６＋およびＣＤ１４−ＣＤ１６＋単球（ＣＤ１６＋ｍｏｎｏ，５４．２±７．０７％）から成っていた。ｒＧＭＰは、単球（ＣＤ１４＋ｍｏｎｏ，３０．４±８．７％；ＣＤ１６＋ｍｏｎｏ，１１．４±５．０３％）と顆粒球（１５．２±２．３４％）の両方を生じさせた（図５ｂ，５ｃ）。これに関連して、ｃＭｏＰとｒＧＭＰに由来する単球と顆粒球の細胞形態をＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ染色によって確認した（図５ｄ）。図５ｄにおいて、元の倍率は１００倍であり、スケールバーは１０μｍを表す。これらの結果から、ｃＭｏＰがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて単球分化に特化した前駆細胞であり、ｒＧＭＰが単球−顆粒球前駆細胞であることが示された。
【０１０６】
なお、図５のデータは少なくとも３回の独立した実験に基づくものである。
【０１０７】
前述のとおり、ヒトの単球は、古典的なＣＤ１４＋ＣＤ１６−単球、中間型ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球、そして、非古典的なＣＤ１４ｌｏ／−ＣＤ１６＋単球という３つのサブセットに細分化される。機能的解析およびトランスクリプトーム解析から、ヒトの古典的ＣＤ１４＋ＣＤ１６−と非古典的ＣＤ１４ｌｏ／−ＣＤ１６＋単球が、おそらくマウスのＬｙ６ｃｈｉとＬｙ６ｃｌｏ単球にそれぞれ対応するものであることが明らかになっている。これに関連して、マウスＬｙ６ｃｈｉ単球は、血液中で自然にＬｙ６ｃｌｏ単球へと分化するが、これは、一定の条件下では、ヒトの単球の場合にもあてはまると考えられる。定常状態では、ヒト単球の主要分画はＣＤ１４＋ＣＤ１６−である。しかしながら、Ｍ−ＣＳＦで処理すると、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球の数が増加し、ＣＤ１４ｌｏ／−ＣＤ１６＋単球が徐々に拡大する。これはＣＤ１４＋ＣＤ１６−、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋、そしてＣＤ１４ｌｏ／−ＣＤ１６＋単球という、段階的な分化経路を示唆している。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した場合、あるいはｃＭｏＰおよびｒＧＭＰのｉｎ  ｖｉｖｏ移植後にそれらから産生される主要な単球サブセットの１つは、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球であった。これに関連して、ヒト胎児肝臓ＣＤ３４＋前駆細胞を移植したＭＩＳＴＧマウスおよびＭＩＳＴＲＧマウスの血液、脾臓、肺、および肝臓では、ＣＤ１４＋ＣＤ１６−単球よりもむしろＣＤ１４＋ＣＤ１６＋細胞が主な単球サブセットであった。
【０１０８】
＜例６：ｒＧＭＰ、ｃＭｏＰおよびプレ単球の連続的な分化＞
次に、ｒＧＭＰ、ｃＭｏＰおよびプレ単球の間における分化経路の上下関係を調べた。ｒＧＭＰは顆粒球と単球に分化できたことから、本発明者らは、ｒＧＭＰがその顆粒球分化能を失うことによってｃＭｏＰに分化し、さらにプレ単球に分化すると仮定した。１００％の純度でｒＧＭＰをソーティングし、ＦＴＳ条件下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで２日間、細胞を培養した（図６ａ）。図６ａ中の数字はソーティングしたｃＭｏＰとｒＧＭＰの純度を示す。図６に、ソーティングした（ｂ）ｒＧＭＰと（ｃ）ｃＭｏＰを、それぞれ、ＦＴＳ条件下で２４時間培養し、それらの発生段階を分析した結果を示す。ｒＧＭＰからの子孫細胞が、ｃＭｏＰとプレ単球に極めて似た集団を含んでおり（図６ｂ）、ｃＭｏＰからの子孫細胞はプレ単球に酷似していることを見出した（図６ｃ）。ｃＭｏＰがｒＧＭＰを生じることは全くなかった。これらの結果から、ｒＧＭＰがｃＭｏＰとプレ単球に連続して分化することが強く示唆された。
【０１０９】
なお、図６のデータは少なくとも３回の独立した実験に基づく。
【０１１０】
＜例７：ｃＭｏＰがもつ単球シグネチャ＞
ｃＭｏＰが単球シグネチャを有するか否か（すなわち、それらが単球分化に適した遺伝子を発現しているか否か）を調べるため、ソーティングして精製したｒＧＭＰ、ｃＭｏＰ、プレ単球（ｐｒｅＭｏ）、ｃＭｏＰ由来のＣＤ１４＋単球（ｃＭｏＰ−Ｍｏ）、および末梢血ＣＤ１４＋単球（ＰＢ−Ｍｏ）の網羅的遺伝子発現解析を行った結果を図７に示す。比較対照として、複数のミエロイド系細胞への分化能を有しており、単球分化に限局していないＣＭＰを含めた。単球特異的遺伝子の発現レベルは、単球分化に伴い徐々に増加し、前駆細胞の中では、ＣＭＰで単球特異的遺伝子の発現レベルが最も低く、ｒＧＭＰでは弱く、ｃＭｏＰで最も高くなっていた（図７ａ）。この傾向は、ＤＣ特異的な遺伝子発現については観察されなかった（図１５）。図７ｂに、単球の分化に関与する転写因子の相対的ｍＲＮＡレベルを示し、図７ｃに遊走に関与するケモカイン受容体の相対的ｍＲＮＡレベルを示す。図７ｂ及び７ｃにおいて、データはＣＭＰに対する相対値として記載している。単球の発生に重要な転写因子であるＰＵ．１、ＩＲＦ８、ＣＥＢＰＢ、およびＫＬＦ４の発現レベルは、ｃＭｏＰで横ばい状態になっており（図７ｂ）、単球の遊走に必要なケモカイン受容体であるＣＸ３ＣＲ１、およびＣＣＲ２の発現レベルは、プレ単球、ｃＭｏＰ由来のＣＤ１４＋単球、および末梢血ＣＤ１４＋単球のステージでさらに増加していた（図７ｃ）。図７ｄに、表示の細胞における規準化された遺伝子発現プロファイルの主成分分析の結果を示す。主成分（ＰＣ）分析に基づく各集団のプロットフロー（点の位置）は、連続的な単球の分化過程に合致しており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける所見と相関していた。これに関連して、集団間の分化ステージの距離を表すユークリッド距離も計算した（図７ｅ）。ｃＭｏＰ−ＭｏまたはＰＢ−Ｍｏからの距離は、ＣＭＰからプレ単球へと徐々に減少していた。さらに、遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）を使い、ヒト血液中のＣＤ１４＋単球において濃縮されていることが知られている遺伝子セットの発現レベル（ヒト単球シグネチャ）をｃＭｏＰ由来のＣＤ１４＋単球、プレ単球、ｃＭｏＰ、ｒＧＭＰ、およびＣＭＰの間で比較した（図７ｆ）。具体的には、ヒト血液単球シグネチャをヒト血液ＣＤ１４＋単球（ＧＳＥ３５４５９）の上位２００遺伝子から作成し、遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）をｃＭｏＰ対ｒＧＭＰ、ｒＧＭＰ対ＣＭＰ、ｃＭｏＰ対プレ単球、プレ単球対ｃＭｏＰ−Ｍｏにおいて濃縮されている遺伝子を比較するために実施した。図７ｆにおいて、ｐは正規ｐ値、ＮＥＳは遺伝子濃縮スコアを表す。データは、プールされた２０個の試料から取得した。ヒト単球シグネチャは、単球に向かう分化の程度と共に有意に増加しており（すなわち、ｃＭｏＰ由来の単球＞プレ単球＞ｃＭｏＰ＞ｒＧＭＰ＞ＣＭＰ）、これは、各前駆細胞における単球への分化レベルを裏付けている。これらの結果から、単球に限局した分化能をもつ前駆細胞としてｃＭｏＰが同定され、ｒＧＭＰからｃＭｏＰそして単球への連続経路が強く裏付けられた。
【０１１１】
【表１】
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【０１１２】
本明細書には、本発明の好ましい実施態様を示してあるが、そのような実施態様が単に例示の目的で提供されていることは、当業者には明らかであり、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、様々な変形、変更、置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が、本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。また、本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む、全ての刊行物に記載の内容は、その引用によって、本明細書中に明記された内容と同様に取り込まれていると解釈すべきである。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明により、ヒトｃＭｏＰが同定され、さらに、骨髄系細胞分化経路の詳細を明らかになった。単球および単球由来のマクロファージが、メタボリック症候群を含むさまざまな炎症性疾患や、腫瘍の成長を引き起こすことから、本発明は、ｃＭｏＰおよび単球を標的とした上記疾患の治療方法及び予防方法への応用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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