(57)【要約】      （修正有）【課題】迅速診断が可能なイムノクロマト診断キットの製造に用いることができる着色セルロース微粒子の提供。【解決手段】平均粒子径が５０〜５００ｎｍであり、発色強度が０．２〜１．０であり、かつ、親水度が５．０〜５０．０であることを特徴とする着色セルロース微粒子。セルロースにカルボキシル基が導入されている、着色セルロース微粒子。カルボキシル基の導入量が０．０１〜１．００ｍｍｏｌ／ｇである、着色セルロース微粒子。着色セルロース微粒子にリガンドが物理吸着している、着色セルロース微粒子。カルボキシル基を介してリガンドが化学結合している、着色セルロース微粒子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒子径が５０〜５００ｎｍであり、発色強度が０．２〜１．０であり、かつ、親水度が５．０〜５０．０であることを特徴とする着色セルロース微粒子。
【請求項２】
セルロースにカルボキシル基が導入されている、請求項１に記載の着色セルロース微粒子。
【請求項３】
前記カルボキシル基の導入量が０．０１〜１．００ｍｍｏｌ／ｇである、請求項２に記載の着色セルロース微粒子。
【請求項４】
前記着色セルロース微粒子にリガンドが物理吸着している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の着色セルロース微粒子。
【請求項５】
前記カルボキシル基を介してリガンドが化学結合している、請求項２又は３に記載の着色セルロース微粒子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の着色セルロース微粒子を含むイムノクロマト診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、着色セルロース微粒子、及びそれを用いたイムノクロマト診断キットに関する。より詳しくは、本発明は、懸濁性に優れ、迅速診断が可能なイムノクロマト診断キットの製造に用いることができる着色セルロース微粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
高分子からなる微粒子は、粒径、機械的強度、粒径の分布、形状、凝集程度の制御のし易さから、様々な分野に利用されており、例えば、トナー、包装材のブロッキング防止材、絶縁フィラー、結晶核剤、クロマトグラフィー用充填剤、研磨剤等が挙げられる。近年では、免疫診断試薬用担体、液晶ディスプレーのスペーサー、分析機器の校正用標準粒子、多孔膜の検定用標準粒子等の用途にも応用されている。
高分子からなる微粒子は、とりわけ免疫診断薬用担体用途において使用量が増大している。中でもイムノクロマトグラフ方法を用いた診断（以下、「イムノクロマト診断キット」という。）は、妊娠検査薬のように、医薬部外品として医療関係者以外の一般人も利用できるキットが多数発売され、それ以外でもアデノ、ロタ、ノロ等の各種ウィルス、Ｂ型、Ｃ型各種の肝炎検査、Ｏ−１５７等の病原性菌群といった様々な検査のＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ―Ｏｆ―Ｃａｒｅ―Ｔｅｓｔｉｎｇ：患者近傍で医師又は他の医療担当者が検査を実施し迅速に結果を得ること）の手段として、需要が高まっている。
【０００３】
イムノクロマト診断キットでは、金属コロイドやポリスチレン由来の着色ラテックスからなる発色微粒子で標識した抗体又は抗原を、クロマト基材上で抗原又は抗体と免疫反応を起こさせ、複合体を形成させつつ展開させ、次いで、予めクロマト基材上の所定の検出位置に、抗体又は抗原を担持させておき（以下、ＴＬともいう。）、展開した複合体を補足することにより顕色させる。これにより得られるシグナル、例えば、目視可能な線や、専用の分析装置で読み取り可能な蛍光により、診断を行う。これまで種々の検討がなされ、簡便な検査方法として確立しているが、医療現場ではＰＯＣＴにおける医療従事者の負担を減少させる必要から、診断の迅速化が望まれている。
【０００４】
通常、イムノクロマト診断キットにおける迅速化に関しては、シグナルを如何に速く得るかが議論される。一般的なイムノクロマト診断キットにおいては、発色微粒子で標識した抗体又は抗原は、乾燥された状態で保存されており、そこに液体である検体が加わることで液体中に再懸濁し、クロマト基材上を、時間をかけて流れていく。一般的な迅速化の手法としては、検体を迅速に吸収しクロマト基材に速く展開させる、クロマト基材の孔径を大きくして展開を速くする、吸収を速くして展開を速くする、などが挙げられる。
しかしながら、一般的なイムノクロマト診断キットではシグナルは一定の時間をかけて増大していくため、所定の検査時間（例えば、１５分後）にシグナルの読み取りを行い、シグナルが確認されない、すなわち陰性と判断しても、一定時間経過後（例えば、３０分後）にはシグナルが現れてしまう場合がある。このような現象はしばしば医療現場に混乱をもたらすため、所定の検査時間後はシグナルの変化がないことが好ましい。
【０００５】
以下の特許文献１では、色が濃い有機着色微粒子を用いることで検出感度を上げることで、検査の迅速化を達成している。しかしながら、特許文献１には、上記のような経時的なシグナル変化は言及されていない。
【０００６】
以下の特許文献２では、所定の時間でシグナルを測定し、その結果からシグナル増加率を算出することで迅速診断を達成している。特許文献２の図２には経時的なシグナル変化が記載されているが、かかる図２を見れば明らかなように２０分前後までシグナルが伸び続けている。機械を用いれば、検査時間後のシグナル変化は問題にならないかもしれないが、かかる機械は高価であり、また、同時に何人もの診断を行うことは難しいという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第５７８８３３０号公報
【特許文献２】特開２０１５−６８７６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記した技術の現状に鑑み、本発明が解決しようとする課題は、迅速診断が可能なイムノクロマト診断キットの製造に用いることができる着色セルロース微粒子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討し実験を重ねた結果、所定の粒子サイズ、所定の色の濃さ、所定の親水度、及び好ましくは所定のカルボキシル含有量を有する着色セルロース微粒子であって、抗体で標識された乾燥状態にあるものの液体検体への懸濁が驚くほど速くなることを発見し、かかる着色セルロース微粒子をイムノクロマト診断キットに適応したところ、シグナルの経時変化がより速くプラトーに達し、イムノクロマト診断キットの迅速化を達成できることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りのものである。
［１］平均粒子径が５０〜５００ｎｍであり、発色強度が０．２〜１．０であり、かつ、親水度が５．０〜５０．０であることを特徴とする着色セルロース微粒子。
［２］セルロースにカルボキシル基が導入されている、前記［１］に記載の着色セルロース微粒子。
［３］前記カルボキシル基の導入量が０．０１〜１．００ｍｍｏｌ／ｇである、前記［２］に記載の着色セルロース微粒子。
［４］前記着色セルロース微粒子にリガンドが物理吸着している、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の着色セルロース微粒子。
［５］前記カルボキシル基を介してリガンドが化学結合している、前記［２］又は［３］に記載の着色セルロース微粒子。
［６］前記［１］〜［５］のいずれかに記載の着色セルロース微粒子を含むイムノクロマト診断キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の着色微粒子では、着色セルロース微粒子の平均粒子径、発色強度、微粒子表面の親水度、及び好ましくはカルボキシル基含有量を緻密に制御することで、抗体で標識された乾燥状態にある着色微粒子の懸濁が驚くほど速くなる結果、イムノクロマト診断キットの診断時間を短縮できる。
本発明の着色セルロース微粒子では、微粒子表面に染料が多量に存在するために、セルロースの水酸基同士の水素結合の発生を抑制でき、その結果、乾燥状態からの懸濁が驚くほど速くなる。また、本発明の着色セルロース微粒子は、特許文献１に記載の微粒子よりも発色強度が小さいにも拘わらず、微粒子表面に多量に染料が存在することで、抗体を十分に担持することができ、発色微粒子として用いた際にイムノクロマト診断キットの検出感度を維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】イムノクロマト診断キットの、０〜１０の１１段階の目視グレードを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本実施形態の着色セルロース微粒子の「平均粒子径」とは、動的光散乱法で測定した場合の体積平均メジアン径を指し、平均粒子径が５０〜５００ｎｍの範囲にある。平均粒子径がこの範囲にあると、微粒子の表面積が大きいためにイムノクロマト診断キットとして用いる場合にテストラインがより濃くなる、すなわち検出感度が高くなる。平均粒子径が５０ｎｍ未満であると、表面積が小さくなるため、微粒子一個あたりの発色強度が低下し、その結果、検出感度が下がる場合があり、また、微粒子の凝集が起こる場合もある。以上の点から平均粒子径の下限は７０ｎｍが好ましく、より好ましくは８０ｎｍである。他方、微粒子径が５００ｎｍより大きくなると、微粒子が凝集した際にメンブレンの孔に詰まりやすくなってしまう。その結果、プラトーに達する時間が長くかかったり、検査後にメンブレン表面が着色し検査結果の判断に悪影響を及ぼしたり、検出感度が悪くなったりする場合がある。以上の点から平均粒子径の上限は４５０ｎｍが好ましく、より好ましくは４００ｎｍである。尚、ここで述べている平均粒子径はあくまで平均値であり、粒子径分布の一部が上記範囲から外れていても構わない。
【００１４】
粒子径の評価に体積平均を用いる理由は、イムノクロマト診断キットにおいてあまりに大きな微粒子はメンブレン中に詰まってしまうが、体積平均であれば大きい微粒子ほど影響が大きくなるので大きい微粒子が僅かに存在するだけでもその影響が反映されるためである。粒子径の評価方法としては体積平均以外にも、数平均、面積平均など様々な表し方がある。当然ながら表し方が異なると粒子径の値も変わってくるが、本明細書では、体積平均を採用する。
【００１５】
本明細書中、「発色強度」とは、微粒子の色の濃さを定義した値であり、本実施形態の着色セルロース微粒子では、発色強度は０．２〜１．０の範囲にある。発色強度が、この範囲にあるとバックグラウンドがきれいになる時間が短いため、シグナルがプラトーに達する時間が速くなる。発色強度が０．２未満であると、発色強度が低すぎて検出感度が低下してしい、また、微粒子表面のセルロース量が多くなるために、セルロース同士の水素結合が多くなり懸濁が遅くなってしまうため、プラトーに達する時間が長くなってしまう。以上の点から発色強度の下限は０．３が好ましく、より好ましくは０．４である。他方、発色強度が１．０より大きくなると疎水性が強くなり、ニトロセルロースのメンブレン中の移動に時間がかかるためにプラトーに達する時間が長くなってしまう。以上の点から、発色強度の上限は０．９０が好ましく、より好ましくは０．８０である。
【００１６】
発色強度の測定方法は、濃度既知の微粒子の純水分散液を調製し、光路長１０ｍｍとして、４００〜８００ｎｍの範囲で積分球を用いた可視吸光度測定を行い、得られた吸光度曲線のピーク値（ＡＢＳ）を測定し、得られた値を発色微粒子の重量パーセントで割り返し、発色微粒子０．０１ｗｔ％辺りの吸光度に換算した値として測定するものである。例えば、調製した微粒子の濃度が０．００４５ｗｔ％であり、吸光度曲線のピーク値が１．０であるとき、その発色強度は（１×０．０１）÷０．００４５＝２．２となる。
本実施形態において、微粒子の色の濃さの測定に、積分球を用いた可視吸光度測定を行う理由は、液体に分散した状態の微粒子の色の濃さを最も正確に測定できるためである。微粒子の色の濃さを測る方法としては、微粒子を乾燥させて得られた固体を測色計などで測定する方法もあるが、このような方法では微粒子の色の濃さを正確に測定できない。例えば、金属コロイドなどは粒子径に応じて色調や最大波長が異なり、乾燥した凝集状態は、液体に分散した状態の色の濃さを正確に反映できない。また、液体中に同じ粒子濃度で分散させても凝集が発生すると色の濃さは薄くなる。更に、可視吸光度測定を行う際に積分球を用いる理由は、粒子自体の散乱による影響を除去するためである。通常の可視吸光度測定は透過光を測定する方法であり、入射光に対し着色成分による吸収だけでなく微粒子自体の散乱による影響も反映されてしまう。例えば、イムノクロマト診断キットに一般的に使われる金コロイドは、粒子径が４０ｎｍ〜６０ｎｍ、時には１００ｎｍのものが用いられる場合もあるが、いずれも粒子径が小さいため散乱光の影響はほとんどない。それに対しラテックス粒子は粒子径が大きく明らかに散乱光の影響が大きい。上記のような理由から、粒子径や粒子素材が違う場合に微粒子自体の色の濃さをより正確に反映するために、積分球を用いた可視吸光度測定を本実施形態では採用する。
【００１７】
本実施形態では、着色セルロース微粒子の疎水性親水性の程度を表す指標として、「親水度」を測定した。本明細書中、「親水度」とは、微粒子表面の濡れやすさ、すなわち水との親和性を表す指標である。この値が大きいほど親水性である。
本実施形態の着色セルロース微粒子の「親水度」は、５．０〜５０．０の範囲である。この範囲にあると、抗体を十分担持でき、かつセルロース同士の水素結合も抑制できるため、検出感度を維持しつつ、液体検体への懸濁が速くプラトーに達する時間も速くなる。親水度が５．０未満であると、疎水性が強すぎて微粒子同士が凝集しやすくなり、懸濁が遅くなってしまうため、プラトーに達する時間も遅くなってしまう。以上の点から親水度の下限は８．０であることが好ましく、より好ましくは１０．０である。親水度が３０．０より大きいと、セルロース同士の水素結合が生じやすくなり、懸濁が遅くなってしまうためプラトーに達する時間も遅くなってしまう。以上の点から親水度の上限は４５．０が好ましく、より好ましくは４０．０である。
【００１８】
本明細書中、「微粒子」とは、長径（Ｌ）と短径（Ｄ）の長さが近く形状が球に近い構造体を指す。具体的にはＬ÷Ｄで表されるＬ／Ｄ比が１．０〜３．０である構造体を指す。Ｌ／Ｄがこの範囲にあるとイムノクロマト診断キットとして用いる場合に目詰まりを起こしにくくなり、プラトーに達する時間が速くなり、より好ましくは１．０〜２．０、更に好ましくは１．０〜１．５、最も好ましくは１．０〜１．３である。測定方法としては、粒子の電子顕微鏡画像を撮影し、１００個の粒子の長径（Ｌ）と短径（Ｄ）を測定し、その１００個の平均値を算出する。
【００１９】
本明細書中、「カルボキシル基の導入量」とは、着色セルロース微粒子１ｇあたりに導入されたカルボキシル基の量のことである。かかる導入量は０．０１〜１．００ｍｍｏｌ／ｇであることが好ましい。この範囲にあることで、抗体やブロッキング剤に用いるタンパク質などが微粒子と化学的に強固にかつ多量に結合可能となるため、高感度化を維持しつつ迅速化も可能となる。導入量が０．０１ｍｍｏｌ／ｇ未満であると、抗体などのタンパク質の結合量が十分でないため、検出感度が低下するおそれがある。以上の点からカルボキシル基の導入量の下限は０．１０ｍｍｏｌ／ｇが好ましく、より好ましくは０．２０ｍｍｏｌ／ｇである。他方、カルボキシル基の導入量が１．００ｍｍｏｌ／ｇを超えると、微粒子上の抗体量が多すぎて、抗体間での水素結合などによって微粒子が凝集し、懸濁性、分散性が悪くなる結果、プラトーに達する時間も長くなってしまう。以上の点からカルボキシル基の導入量の上限は０．９０ｍｍｏｌ／ｇが好ましく、より好ましくは０．８０ｍｍｏｌ／ｇである。
【００２０】
カルボキシル基の導入量は、蛍光測定法、中和滴定法、赤外分光法などにより算出することができる。本実施形態では、抗体やタンパク質と反応可能なカルボキシル基の量を正確に測定するために、主に蛍光測定法を使用する。カルボキシル基と反応した場合のみ発光する蛍光試薬を使用する。まず、カルボキシル基量が既知のサンプルで、カルボキシル基の量と発光強度との関係について検量線を作成する。その後、蛍光試薬を微粒子に反応させる。その微粒子の蛍光強度を測定し、発光強度を得る。得られた発光強度を検量線に代入して、カルボキシル基の量を算出する。
【００２１】
カルボキシル基を導入する際のカルボキシル化剤としては、特に限定されるものではないが、具体例としては以下のものが挙げられる：２−ブロモ酢酸、３−ブロモプロピオン酸、４−ブロモ酪酸、５−ブロモペンタン酸、６−ブロモヘキサン酸、７−ブロモヘプタン酸、８−ブロモオクタン酸、１１−ブロモウンデカン酸、１８−ブロモステアリン酸、１６−ヘプタデセン酸、５−ヘキセン酸、エピクロロヒドリン、４−アミノ酪酸、３−アミノプロピオン酸、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸、アジピン酸、エイコサン二酸、１，８−オクタンジカルボン酸、１，４−ブタンジカルボン酸、１，６−ヘキサンジカルボン酸、２−クロロ酢酸、３−クロロプロピオン酸、４−クロロ酪酸、５−クロロペンタン酸、６−クロロヘキサン酸、７−クロロヘプタン酸、８−クロロオクタン酸、１１−クロロウンデカン酸、１８−クロロステアリン酸、アミノ−ＰＥＧ１２−プロピオン酸、アミノ−ＰＥＧ８−プロピオン酸、アミノ−ＰＥＧ４−プロピオン酸、α，ｗ−ビス≪２−〔（３−カルボキシ−１−オキソプロピル）アミノ〕エチル≫ポリエチレングリコール、ＨＯ−ＰＥＧ１２−ＣＯＯＨ，ＨＯ−ＰＥＧ１２−プロピオン酸、ＨＯ−ＰＥＧ８−プロピオン酸、Ｏ−（２−カルボキシエチル）ポリエチレングリコール、ＣＯＯＨ−ＰＥＧ１２−ＣＯＯＨ、ポリ（エチレングリコール）ビス（カルボキシメチル）エーテル、プロピオン酸―ＰＥＧ１２−プロピオン酸、プロピオン酸―ＰＥＧ８−プロピオン酸、プロピオン酸―ＰＥＧ４−プロピオン酸。この中で好ましくは、３−ブロモプロピオン酸、４−ブロモ酪酸、５−ブロモペンタン酸、６−ブロモヘキサン酸、７−ブロモヘプタン酸、８−ブロモオクタン酸、１１−ブロモウンデカン酸、１８−ブロモステアリン酸、アジピン酸、エイコサン二酸、１，８−オクタンジカルボン酸、１，４−ブタンジカルボン酸、１，６―ヘキサンジカルボン酸であり、より好ましくは８−ブロモオクタン酸、１１−ブロモウンデカン酸、１８−ブロモステアリン酸、アジピン酸、エイコサン二酸、１，８−オクタンジカルボン酸。
【００２２】
本実施形態の着色セルロース微粒子において、微粒子表面に染料が局在化していることを表す指標として「表面セルロースの残存率」を測定した。「表面セルロースの残存率」とは、染色前のセルロース微粒子の表面のセルロース量を１００とし、着色後にセルロース成分がどの程度表面に残っているかを示すものである。
「表面セルロース残存率」は１５％以下であることが好ましい。この範囲にあることで、セルロース同士の水素結合が起こりにくくなるために、懸濁が速くプラトーに達する時間も短くなる。他方、表面セルロース残存率が１５％より大きいと、セルロース同士の水素結合が起こりやすくなり、懸濁に時間がかかるために、プラトーに達する時間も長くなってしまう。以上の点から「表面セルロース残存率」の上限は１２％が好ましく、より好ましくは１０％である。
【００２３】
本実施形態の「着色セルロース微粒子の製造方法」は、特に限定されない。微粒子をまず成形し、色素、染料などの着色成分を担持させる方法、微粒子を成形し、金属コロイドや顔料などのより小さい発色微粒子を担持させる方法、微粒子の成形時に色素、染料、顔料、金属コロイドなどの着色成分も一緒に加えて成形する方法などが挙げられる。中でも粒子径の調整、色の濃さの調整、色の種類の調整、微粒子表面状態の調整などの微粒子の特徴の調整のしやすさから、微粒子をまず成形し、色素、染料などの着色成分を担持させる方法が好ましい。また、担持させる着色成分としては、担持の容易さから染料が好ましい。
【００２４】
着色成分に染料を用いる場合、「染料の種類」は特に限定されない。反応染料、直接染料、含金染料、酸性染料、塩基性染料、分散染料、硫化染料、植物染料、ナフトール染料、蛍光染料などの染料を用いることができる。もちろん任意の染料を組み合わせても構わない。中でもセルロースの水酸基と共有結合で結合する反応性染料が、大量に染料を保持できる点や安定性の面から特に好ましい。
【００２５】
セルロース微粒子をまず成形し、その後に着色成分を担持させる場合、「セルロース微粒子の成形方法」は特に限定されない。天然のセルロースをボールミルや高圧ホモジナイザーで物理的に微細化する方法、酸やアルカリなどで化学的に処理し微細化する方法、セルロースをその良溶媒に一度溶解させ粒子状に成形する方法などが挙げられる。また、誘導体化されたセルロースを溶解、粒子状に成形し、誘導体化された置換基を水酸基に戻しセルロース微粒子を調製してもよい。更にそれらの成形方法を組み合わせてもよい。また「セルロースの種類」も特に限定されるものではなく、再生セルロース、精製セルロース、天然セルロース、誘導体化された置換基を水酸基に戻したセルロースなどを用いることができる。中でも粒子径の調整、粒子形状の調整などの点から良溶媒に一度溶解させ粒子状に成形する方法が好ましく、セルロースの種類としては再生セルロースが好ましい。
【００２６】
セルロースをその良溶媒に一度溶解させ粒子状に成形する場合、「セルロースを溶解させる良溶媒の種類」も特に限定されるものではなく、銅アンモニア溶液、ビスコース溶液、Ｎ−メチルモルホリン、各種のイオン性液体などセルロースを溶解することのできる様々な良溶媒を用いることができる。中でも粒子径の調整、粒子形状の調整などの点から銅アンモニア溶液が好ましい。また、溶解させたセルロースを粒子に成形する方法も特に限定されるものではない。本実施形態では相分離による方法を選択した。
【００２７】
本明細書中、「リガンド」とは、特定の検査対象物質に選択的かつ特異的に結合する性質をもつ物質である。その種類は特に限定されるものではないが、例えば、抗体、酵素、遺伝子、ホルモン、核酸、ペプチド、タンパク質などが挙げられる。
着色セルロース微粒子は、抗体などの被検出物に特異的に結合する物質を担持する必要があるが、その担持方法は特に限定されない。例えば、物理的な吸着による担持、共有結合による担持、それらの組み合わせによる担持などが挙げられる。担持する物質の種類や量も特に限定されない。担持する物質の種類としては抗体が最も一般的であり好ましい。また、担持する方法としては、容易さの観点からは物理的な吸着による担持が、安定性や性能などの観点からは共有結合による担持が好ましい。
【００２８】
本実施形態の「イムノクロマト診断キット」とは、様々な検体中の検査対象物質の有無を簡便に検出するものである。当該診断キットの種類としては、ラテラルフロー式やフロースルー式が挙げられる。発色微粒子やサンプルパッドを用いるものであれば特に限定されないが、好ましくはラテラルフロー式である。また、ラテラルフロー式の中でも、ディップスティックタイプとカセットタイプがあるが、それらのタイプは特に限定されない。診断キットの構成は、特に限定されるものではなく、当該分野で一般的に用いられる構成であればいずれでも構わない。発色微粒子とサンプルパッド以外の部材の種類は、当該分野で用いられるものであれば特に限定されず、例えば、コンジュゲートパッド（抗体感作発色微粒子を含む）、ニトロセルロース等のメンブレン、吸収パッド、及び台紙が挙げられる。また、必要に応じそれら部材を一部省いても構わない。また、本実施形態の着色セルロース微粒子は、イムノクロマト診断キット以外にも、ラテックス凝集法の微粒子としても使用可能である。
【００２９】
イムノクロマト診断キットを使用する診断方法には、イムノクロマト診断キットを用いて行われる様々な診断がある。診断対象は特に限定されるものではなく、人用、動物用、食品用、植物用、その他環境検査など様々な診断対象の検査に用いることができる。一般的な診断の手順では、検査対象から検体試料を採取し、必要であればそれを抽出やろ過などの前処理を行い、サンプルパッドに滴下し、検査開始から所定時間待ち、検査対象物質の有無によって異なる発色より診断結果を判断する。もちろんこの手順に限定されず、同じような手順、原理の診断にも用いることができる。好ましいのは、検体試料を予めろ過しておくことで余分な異物や夾雑物を除去でき、それによりより一層の診断時間の短縮化や、診断精度の向上が期待できる。
【００３０】
イムノクロマト診断キットで診断できる対象は特に限定されるものではないが、具体例としては以下のものが挙げられる：癌マーカー、ホルモン、感染症、自己免疫、血漿蛋白、ＴＤＭ、凝固・線溶、アミノ酸、ペプチド、蛋白、遺伝子、細胞、などが挙げられる。より具体的には、ＣＥＡ、ＡＦＰ、フェリチリン、β２マイクロ、ＰＳＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＢＦＰ、エラスターゼ１、ペプシノーゲン１・２、便潜血、尿中β２マイクロ、ＰＩＶＫＡ−２、尿中ＢＴＡ、インスリン、Ｅ３、ＨＣＧ、ＨＰＬ、ＬＨ、ＨＣＶ抗原、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体、ＨＴＬＶ−１抗体、ＨＩＶ抗体、トキソプラズマ抗体、梅毒、ＡＳＯ、Ａ型インフルエンザ抗原、Ａ型インフルエンザ抗体、Ｂ型インフルエンザ抗原、Ｂ型インフルエンザ抗体、ロタ抗原、アデノウィルス抗原、ロタ・アデノウィルス抗原、Ａ群レンサ球菌、Ｂ群レンサ球菌、カンジダ抗原、ＣＤ菌、クリプトロッカス抗原、コレラ菌、髄膜炎菌抗原、顆粒菌エラスターゼ、ヘリコバクターピロリ抗体、Ｏ１５７抗体、Ｏ１５７抗原、レプトスピラ抗体、アスペルギルス抗原、ＭＲＳＡ、ＲＦ、総ＩｇＥ、ＬＥテスト、ＣＲＰ、ＩｇＧ，Ａ，Ｍ、ＩｇＤ、トランスフェリン、尿中アルブミン、尿中トランスフェリン、ミオグロビン、Ｃ３・Ｃ４、ＳＡＡ、ＬＰ（ａ）、α１−ＡＣ、α１−Ｍ、ハプトグロビン、マイクロトランスフェリン、ＡＰＲスコア、ＦＤＰ、Ｄダイマー、プラスミノーゲン、ＡＴ３、α２ＰＩ、ＰＩＣ、ＰＡＩ−１、プロテインＣ、凝固第Ｘ３因子、ＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸、ＧＨｂＡ１ｃ、その他の各種抗原、各種抗体、各種ウィルス、各種菌、各種アミノ酸、各種ペプチド、各種蛋白質、各種ＤＮＡ、各種細胞、各種アレルゲン、各種残留農薬、各種有害物。
【００３１】
以下、セルロース微粒子の作製方法、セルロース微粒子の着色方法、カルボキシル基の導入方法、イムノクロマト診断キットの作製方法などの一例を記載する、もちろん、本実施形態はそれらによって何ら限定されるべきではない。
【００３２】
〔セルロース微粒子の作製方法〕
セルロースリンターをセルロースの良溶媒に溶解させる。本実施形態では良溶媒として公知の方法で調製した銅アンモニア溶液を用いる。そして凝固液としては有機溶媒＋水＋アンモニア混合系を主に用いる。この凝固液を攪拌しながら、調製しておいた銅アンモニアセルロ−ス溶液を加えて凝固を行う。さらに硫酸を加え中和、再生を行うことで、目的のセルロ−ス微粒子を含有したスラリーを得ることができる。この際スラリーは再生に用いた酸の残留により酸性であり、さらに中和で発生したアンモニウム塩などの不純物を含んでいるため、セルロース微粒子と媒体からなるセルロース分散液へと精製する操作が必要となる。本実施形態では、この精製操作として遠心分離−デカンテーション−分散媒液体による希釈の処理の繰り返しを用いる。得られたセルロース微粒子分散液中のセルロース微粒子は、精製操作の過程において凝集する場合もあるので、この場合は剪断などによる分散処理を行うことができる。本実施形態では、剪断を与える手段としては高圧ホモジナイザーを用いる。
【００３３】
〔セルロース微粒子の着色方法〕
得られたセルロース微粒子の水分散体に対し、硫酸ナトリウム、反応性染料を加え、マグネティックスターラーで撹拌しながら恒温槽で適温に昇温する。昇温後にアルカリとして炭酸ナトリウムを加え染色を開始する。所定時間経過後に目的の着色セルロース微粒子を含有したスラリーを得ることができる。この際スラリーはアルカリ性であり、さらに硫酸ナトリウム、未反応の染料などを含んでいるため、着色セルロース微粒子と媒体からなる着色セルロース微粒子分散液へと精製する操作が必要となる。前記同様に遠心分離による精製を行い、着色セルロース微粒子分散液を得る。得られた着色セルロース微粒子分散液中の着色セルロース微粒子は、精製操作の過程において凝集する場合もあるので、この場合は剪断などによる分散処理を行うことができる。本実施形態では、剪断を与える手段としては高圧ホモジナイザーを用いる。特許文献１では、染色後に毎回水酸化ナトリウムで洗浄を行っていた。これにより微粒子表面の染料が脱離するうえに、セルロース微粒子自身も膨潤してしまう。その結果、表面セルロース残存率が大きくなるために、セルロース同士の水素結合が起こりやすくなってしまっていた。本実施形態では、以上の理由から微粒子の膨潤を起こすことなく微粒子表面にのみ染料を存在させるために水酸化ナトリウム洗浄を行わずに微粒子を染色する方法を採用した。これにより、狙い通り表面のセルロース残存率が低下し、セルロース同士の水素結合の発生が抑制されたために、イムノクロマト診断キットがプラトーに達する時間が速くなった。また、この反応の際の炭酸ナトリウムの量と染料の量のバランスにより親水度を制御できることも判明した。これにより、本実施形態では、過度に粒子が疎水性になることで起こる粒子同士の凝集を抑制しつつ、抗体はしっかり担持できる親水度を保つことが可能となった。
【００３４】
〔着色セルロース微粒子へのカルボキシル基の導入方法〕
得られた着色セルロース微粒子の水分散体に対し、有機溶媒、塩基を加え、マグネティックスターラーで撹拌しながら恒温槽で適温に昇温する。昇温後にカルボキシル基を有する反応剤を加え反応を開始する。所定時間経過後に目的のカルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子を含有したスラリーを得ることができる。この際スラリーは、有機溶媒、塩基、未反応の反応剤などを含んでいるため、カルボキシル基導入着色セルロース微粒子と媒体からなるカルボキシル基導入着色セルロース微粒子分散液へと精製する操作が必要となる。前記同様に遠心分離による精製を行い、カルボキシル基導入着色セルロース微粒子分散液を得る。得られたカルボキシル基導入着色セルロース微粒子分散液中のカルボキシル基導入着色セルロース微粒子は、精製操作の過程において凝集する場合もあるので、この場合は剪断などによる分散処理を行うことができる。本実施形態では、剪断を与える手段としては高圧ホモジナイザーを用いる。
【００３５】
〔イムノクロマト診断キットの作製方法〕
所定の濃度に調整した着色セルロース微粒子の分散液を準備し、緩衝液、抗体を加え、温度調整を行いながら一定時間撹拌し、着色セルロース微粒子に抗体を結合させる。一定時間撹拌後、更にブロッキング剤を加え温度調整を行いながら一定時間撹拌することで、着色セルロース微粒子のブロッキングを行う。ブロッキング剤としては、検査対象物質や検体又はそれを希釈する溶液の組成などに応じ様々なブロッキング剤を用いることができる。本実施形態で用いたカゼインは、着色セルロース微粒子のブロッキングに特に好ましい。抗体結合及びブロッキング後の着色セルロース微粒子を洗浄するため、遠心分離を行い、余剰な抗体とブロッキング剤が含まれた上澄み液と沈降した微粒子を分離し、上澄み液をデカンテーションにて除去する。沈降した微粒子に緩衝液などの液体を加え、必要に応じ超音波などで分散処理を行う。この遠心分離による沈降、上澄みの除去、液体の添加という一連の操作による洗浄を必要回数行い、抗体吸着＆ブロッキングを行った微粒子を所定の濃度含有した分散液を調製する。この分散液に必要に応じタンパク質、界面活性剤、スクロースやトレハロースなどの糖を加え、得られた溶液をガラス繊維製のコンジュゲートパッドに一定量塗布し、乾燥させ、検出試薬含有部を調製する。また、再生セルロース連続長繊維不織布に必要に応じ緩衝液、界面活性剤、タンパク、検体試料中の夾雑物をトラップする試薬、防腐剤、抗菌剤、酸化防止剤、吸湿剤、などを塗布し、乾燥させ、サンプルパッドを調製する。更に所定の位置に抗体を固定化したニトロセルロース多孔膜製のメンブレン、検体を吸収するためのセルロース濾紙製の吸収パッドを調製する。それらをバッキングシートと呼ばれる接着部位を有するシートに固定化し、所定のサイズに裁断することでイムノクロマト診断キットを作製する。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。また、特に記載のない全ての操作は温度２３℃、相対湿度５５％ＲＨの環境下で行った。
まず、実施例、比較例で用いた測定方法等を以下に説明する。
【００３７】
〔微粒子の平均粒子径〕
装置としては日機装社製のナノトラック粒度分布測定装置ＵＰＡ−ＥＸ１５０（動的光散乱式）を用いた。測定サンプルとして、微粒子０．０１ｗｔ％、純水９９．９９ｗｔ％のサンプルを用いた。測定条件としては積算回数を３０回、１測定辺りの測定時間を３０秒とし、体積平均の粒子径分布を用いそのメジアン径を平均粒子径とした。
【００３８】
〔微粒子の発色強度〕
装置としては日本分光社製の紫外可視近赤外分光光度計ＪＡＳＣＯ  Ｖ−６５０に同社製の積分球ユニットＩＳＶ−７２２を取り付けた装置を用いた。測定するサンプルとして微粒子０．０１ｗｔ％、純水９９．９９ｗｔ％のサンプルを用い、光路長１０ｍｍの石英セルにサンプルを入れ測定した。得られた吸光度ピークのうち、４００〜８００ｎｍ可視光範囲での最大値（ＡＢＳ）を発色強度とした。
【００３９】
〔微粒子の親水度〕
微粒子分散液を濃度１％（ｗｔ／ｖｏｌ）に調整し、試料溶液とした。試料溶液を撹拌後、０．５ｍＬを外径１０ｍｍのガラス製ＮＭＲ管に移し、３０℃に設定されたパルスＮＭＲ装置に設置した。パルスＮＭＲ装置はブルカー社製のＭｉｎｉｓｐｅｃ  ｍｑ２０装置を用いた。各種パラメータを以下の通りに設定し測定した。
・観測核：１Ｈ
・測定する緩和時間：横緩和時間Ｔ２（ｍｓ）
・測定モード：ＣＰＭＧ法
・積算回数：３２回
・Ｒｅｃｙｃｌｅ  Ｄｅｌａｙ：１０（ｓ）
・９０°−１８０°Ｐｕｌｓｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ（τ）：２（ｍｓ）
得られた磁化減衰曲線（磁化強度の経時変化を示す曲線）を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌの指数近似機能を用いて最小二乗法により下記式（１）：
Ｍ（ｔ）＝Ｍ０・ｅｘｐ（−ｔ／Ｔ２）    ・・・式（１）
｛式中、Ｍ（ｔ）：ある時間ｔにおける信号強度、０：信号強度の初期値、Ｔ２：緩和時間である。｝にフィッティングした。
次に、縦軸に緩和時間の変化割合（Ｒｓｐ値）を、横軸に微粒子の総表面積値（ＴＳＡ値）をプロットしたグラフを作成した。最小二乗法により近似直線を作成し、その傾きを親水化度と定義し、微粒子の親水化度を比較した。Ｒｓｐ値とＴＳＡ値の計算方法は以下のとおりである。
・Ｒｓｐ値の計算方法
計算式  Ｒｓｐ値＝Ｒａｖ÷Ｒｂ−１
Ｒａｖ：平均緩和時定数（試料の緩和時間逆数）
Ｒｂ：バルク水分子の緩和時定数（ブランク水の緩和時間逆数）
・ＴＳＡ値（ｍ２）の計算方法
計算式  ＴＳＡ値＝ＳＡ×Ｖ×Ψｐ×ρ
ＳＡ：微粒子の比表面積（ｍ２／ｇ）
ＳＡ＝６÷（ρ×ｄ）
ρ：微粒子密度（ｇ／ｃｍ３）
微粒子密度：１．４ｇ／ｃｍ３
ラテックス粒子密度：１．０ｇ／ｃｍ３
金コロイド粒子密度：１９．３ｇ／ｃｍ３
ｄ：微粒子直径（μｍ）
Ｖ：ラジオ波が照射される部分のＮＭＲ管体積（ｃｍ３）（≒試料量）
Ψｐ：微粒子体積比
Ψｐ（微粒子体積比）＝微粒子体積÷水の体積
微粒子体積＝微粒子濃度（ｗｔ％）÷１００÷微粒子密度
水の体積＝（１−微粒子体積）÷水の密度（０．９９７ｇ／ｃｍ３）
【００４０】
〔微粒子のＬ／Ｄ比測定〕
装置としては日本電子社製の走査型電子顕微鏡ＪＳＭ-６７００を用いた。微粒子０．０１ｗｔ％、純水９９．９９ｗｔ％のサンプルを雲母板に滴下し、１０秒経過させることで微粒子を雲母板上に吸着させ、キムワイプで余分な液体を吸い取り乾燥させた。得られた雲母板をプラチナでコーティングし、電子顕微鏡測定用のサンプルを調製した。加速電圧１．６ｋＶ、測定倍率５万倍で観測を行い、微粒子画像が１００個以上になるように必要枚数の画像を撮影し、それぞれの微粒子の長径（Ｌ）と短径（Ｄ）を測定し、微粒子１００個のＬ／Ｄの平均値を算出した。
【００４１】
〔微粒子の表面セルロースの残存率測定〕
装置としてはサーモフィッシャー社製のＸＰＳ分光装置ＥＳＣＡＬＡＢ２５０を用いた。微粒子０．０１ｗｔ％、純水９９．９９ｗｔ％のサンプルを測定部に滴下し、１０秒経過させることで微粒子を吸着させ、余分な液体を吸い取った。その後、２ｍｍΦのマスキングを行ってＸＰＳ測定に供した。Ｓｕｒｖｅｙ  Ｓｃａｎを１００ｅＶ、Ｎａｒｒｏｗ  Ｓｃａｎを２０ｅＶで行い相対元素濃度を求めた。下記式：
表面セルロース残存率  ＝  染色後の酸素原子濃度  ／  染色前の酸素原子濃度  ×  １００
により「表面セルロースの残存率」を算出した。
例えば、染色前の酸素原子濃度が４５ａｔｏｍ％、染色後の酸素原子濃度が２８ａｔｏｍ％の場合、表面セルロース残存率は６２％となる。
【００４２】
〔微粒子のタンパク質担持量測定〕
装置としては日本分光社製の紫外可視近赤外分光光度計ＪＡＳＣＯ  Ｖ−６５０を用いた。タンパク質の一例として牛血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ）という、シグマアルドリッチ社製、Ａ７９０６）の吸着量の算出方法を示す。吸着量を測定したい微粒子の１．０ｗｔ％分散液を３０．０μＬ、ｐＨ＝５．０  濃度１００ｍＭのリン酸緩衝液（キシダ化学社製）２７０．０μＬ、１．０ｗｔ％のＢＳＡ溶液３．０μＬを３７℃で２時間反応させ、その後遠心分離により上澄み液を採取する。この上澄み液を市販のＢＣＡ試薬（和光純薬社製、２９７−７３１０１）と反応させ、Ｖ−６５０により５６２ｎｍの吸光度を測定し、上澄み液中のＢＳＡ量を算出する。その後仕込んだＢＳＡ量から上澄み液中のＢＳＡ量を引き、使用した微粒子量を除してどれだけ吸着したかを算出した。
【００４３】
〔コンジュゲートパッドへの抗体感作着色セルロース微粒子の含浸、乾燥〕
ポリエチレン製コンジュゲートパッド（Ｐａｌｌ社製、６６１３）を大過剰の０．０５重量％のＴｗｅｅｎ−２０（登録商標、シグマアルドリッチ社製、Ｔ２７００）に浸漬し、余分な液を取り除いた後に５０℃で６０分乾燥させた。続いて高さ１０ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットした。続いてマイクロピペットを用い０．０３８重量％の抗体感作着色セルロース粒子分散液７８０μＬを均等に塗布し、５０℃で６０分乾燥させた。
【００４４】
〔サンプルパッドの前処理〕
再生セルロース連続長繊維不織布を、大過剰の２．０ｗｔ％のＢＳＡ（シグマアルドリッチ社製、Ａ７９０６）と２．０ｗｔ％のＴｗｅｅｎ−２０（登録商標）を含有するＰＢＳ緩衝液（６６ｍＭ、ＰＨ７．４）に含浸し、余分な液を取り除いた後に５０℃で６０分乾燥させた。続いて高さ２０ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットした。
【００４５】
〔捕捉抗体塗布メンブレンの調製〕
ニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＳＨＦ０９００４２５）を幅２５ｍｍ、長さ３００ｍｍの形状にカットした。液体塗布装置（武蔵エンジニアリング社製、３００ＤＳ）を用い、０．１ｗｔ％抗ｈＣＧ−βマウス抗体（ＭｅｄｉｘＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製、６６０１）を含むＰＢＳ溶液（６６ｍＭ、ＰＨ７．４）を０．１μＬ／ｍｍの割合で高さ１２ｍｍの部分に塗布した（テストライン、以下ＴＬ）。それと同時に、０．０５ｗｔ％抗マウス抗体（Ｄａｋｏ社製、Ｚ０２５９）を含むＰＢＳ溶液（６６ｍＭ、ＰＨ７．４）を０．１μＬ／ｍｍの割合で高さ１６ｍｍの部分に塗布した（コントロールライン、以下ＣＬ）。続いて、３７℃で３０分間乾燥させた。
【００４６】
〔イムノクロマト診断キットの調製〕
バッキングカード（Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅｒｃｈ社製、ＡＲ９０２０）に、調整した捕捉抗体塗布メンブレン、吸収パッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃ０８３）、検出試薬を含有したコンジュゲートパッド、サンプルパッドを張り合わせた。続いて裁断機にて５ｍｍの幅にカットし、幅５ｍｍ、高さ６０ｍｍのイムノクロマト診断キットを得た。
【００４７】
〔イムノクロマト診断キットのＣＬプラトー到達時間〕
５ｍｍ幅にカットしたイムノクロマト診断キットをプラスチックのハウジングに入れた。得られたハウジング入りの診断キットを、図１に示す０−１０の１１段階の目視グレードで判定した。１．０ｗｔ％のＢＳＡを含む６６ｍＭ、ＰＨ７．４のリン酸緩衝液（以下「ＰＢＳ」という）１２０．０μＬを診断キットのサンプル滴下部に滴下し、以降２０秒毎に目視で測定を行い、ＣＬの経時変化を測定した。目視グレードＣＬの発色強度が変化しなくなった時間を測定した。この測定を５回行い、平均の時間をＣＬプラトー到達時間とした。懸濁が速い微粒子ほどこのプラトー到達時間が短くなる。
【００４８】
〔イムノクロマト診断キットの発色時間〕
５ｍｍ幅にカットしたイムノクロマト診断キットをプラスチックのハウジングに入れた。得られたハウジング入りの診断キットを、図１に示す０−１０の１１段階の目視グレードで判定した。検査対象物質には抗ｈＣＧ−βマウス抗体を用いた。前記ｈＣＧ抗体を１．０ｗｔ％のＢＳＡを含む６６ｍＭ、ＰＨ７．４のリン酸緩衝液（以下「ＰＢＳ」という）で希釈し、前記ｈＣＧ抗体が１０．０ｍＩＵ／ｍＬの陽性検体を調製した。この陽性検体１２０．０μＬを診断キットのサンプル滴下部に滴下し、以降２０秒毎に目視で測定を行い、ＴＬの経時変化を測定した。目視グレードが１．０以上になった時間を測定した。ここで１．０以上とした理由は、個人差もあるが１．０以上になればＴＬの存在を確認できるからである。この測定を５回行い、平均の時間を発色時間とした。
【００４９】
〔イムノクロマト診断キットのプラトー到達時間〕
５ｍｍ幅にカットしたイムノクロマト診断キットをプラスチックのハウジングに入れた。得られたハウジング入りの診断キットを、図１に示す０−１０の１１段階の目視グレードで判定した。検査対象物質には抗ｈＣＧ−βマウス抗体を用いた。前記ｈＣＧ抗体を１．０ｗｔ％のＢＳＡを含む６６ｍＭ、ＰＨ７．４のリン酸緩衝液（以下「ＰＢＳ」という）で希釈し、前記ｈＣＧ抗体が１０．０ｍＩＵ／ｍＬの陽性検体を調製した。この陽性検体１２０．０μＬを診断キットのサンプル滴下部に滴下し、以降２０秒毎に目視で測定を行い、ＴＬの経時変化を測定した。目視グレードでＴＬの発色強度が変化しなくなった時間を測定した。この測定を５回行い、平均の時間をプラトー到達時間とした。
【００５０】
〔イムノクロマト診断キットの１．６ｍＩＵ／ｍｌの感度〕
５ｍｍ幅にカットしたイムノクロマト診断キットをプラスチックのハウジングに入れた。得られたハウジング入りの診断キットを、図１に示す０−１０の１１段階の目視グレードで判定した。検査対象物質には抗ｈＣＧ−βマウス抗体を用いた。前記ｈＣＧ抗体を１．０ｗｔ％のＢＳＡを含む６６ｍＭ、ＰＨ７．４のリン酸緩衝液（以下「ＰＢＳ」という）で希釈し、前記ｈＣＧ抗体が１．６ｍＩＵ／ｍＬの陽性検体を調製した。この陽性検体１２０．０μＬを診断キットのサンプル滴下部に滴下し、５分後に目視で測定を行い、ＴＬの濃さを測定した。この測定を５回行い、平均の目視グレードを感度とした。
【００５１】
〔実施例１〕
従来公知の方法で、セルロース濃度０．３７ｗｔ％、銅濃度０．１３ｗｔ％、アンモニア濃度１．００ｗｔ％の銅アンモニアセルロース溶液を調製した。さらにテトラヒドロフラン濃度８９．００ｗｔ％、水濃度１１．００ｗｔ％、の凝固液を調製した。
マグネティックスターラーを用い凝固液５０００ｇをゆっくり攪拌しながら、調製しておいた銅アンモニアセルロース溶液５００ｇを添加した。５秒程度攪拌を継続したのちに１０ｗｔ％の硫酸１０００ｇを加え中和、再生を行い、セルロース微粒子を含有したスラリー６５００ｇを得た。
得られたスラリーを１００００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した。沈殿物をデカンテーションにより取り出し、脱イオン水を注入して攪拌し、再び遠心分離した。ＰＨが６．０〜７．０になるまでこの操作を数回繰り返し、その後高圧ホモジナイザーによる分散処理を行い、セルロース微粒子分散液１５０ｇを得た。得られたセルロース微粒子の平均粒子径を測定した結果、２６１ｎｍであった。
【００５２】
次に、前記のようにして調製したセルロース微粒子の染色を行った。微粒子濃度を１．００ｗｔ％に調整したセルロース微粒子分散体１００ｇに対し、硫酸ナトリウム３０ｇ、反応性染料（例えば、ダイスター株式会社製Ｌｅｖａｆｉｘ Ｒｅｄ ＣＡ ＧＲ．（登録商標））１．００ｇ、を加え攪拌させながら恒温槽を用いて６０℃まで昇温した。６０℃に昇温後に炭酸ナトリウム４ｇを加え、２時間染色を行った。遠心分離で回収、純水にて水洗した後遠心分離で回収するという一連の操作を１サイクルとし、同様の操作を計２サイクルまで実施し、着色セルロース微粒子を得た。
【００５３】
上記の方法で調製した１．０重量％の着色セルロース微粒子  ６０μｌを１５ｍｌの遠心管に入れ、更にトリス緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）を５４０μｌ、０．１％の抗ｈＣＧ-αマウス抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製、１０-Ｃ２５Ｃ）を６０μｌ加え、ボルテックスで１０秒撹拌した。続いて３７℃に調整した乾燥機内に入れ１２０分間静置した。続いて１．０重量％のカゼイン（和光純薬工業社製、０３０−０１５０５）を含有するブロッキング液（１００ｍＭホウ酸、ｐＨ８．５）を７．２ｍｌ加え、更に３７℃の乾燥機内で６０分間静置した。続いて遠心分離機（クボタ商事社製、６２００）と遠心分離ローター（クボタ商事社製、ＡＦ−５００８Ｃ）を用い、１０，０００ｇの遠心を１５分間行い、感作粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。続いてホウ酸緩衝液（５０ｍＭホウ酸、ｐＨ１０．０）を７．２ｍｌ加え、超音波分散機（エスエムテー社製、ＵＨ−５０）で１０秒間処理した。続いて１０，０００ｇの遠心を１５分間行い、感作粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。また、別途スクロース（和光純薬工業社製、１９６−０００１５）１．８ｇと１．０重量％のカゼインブロッキング液２．４ｇを、ホウ酸緩衝液（５０ｍＭホウ酸、ＰＨ１０．０）７．２ｍｌに溶解させて得た緩衝液を用いて、感作粒子の分散液の重量を１．５８ｇに調整し、０．０３８重量％の抗体感作着色セルロース粒子分散液を調整し、超音波分散機で１０秒間処理した。狙い通り、微粒子間での水素結合などが起こりにくいために微粒子の分散性が非常によく約５分でＴＬがプラトーに達することができた。
【００５４】
〔実施例２〕
染色の際に反応性染料（例えば、ダイスター株式会社製Ｌｅｖａｆｉｘ Ｒｅｄ ＣＡ ＧＲ．（登録商標））を０．３０ｇに変更したこと以外は実施例１と同様の方法で微粒子を作製した。微粒子間での水素結合などが起こりにくいために微粒子の分散性が非常によく約５分でＴＬがプラトーに達することができた。
【００５５】
〔実施例３〕
セルロースの凝固反応の際に、銅アンモニアセルロース溶液中のアンモニア濃度を８．５０ｗｔ％に変更したこと以外は実施例１と同様の方法で微粒子を作製した。微粒子間での水素結合などが起こりにくいために微粒子の分散性が非常によく約６分でＴＬがプラトーに達することができた。
【００５６】
〔実施例４〕
セルロースの凝固反応の際に、銅アンモニアセルロース溶液中のアンモニア濃度を８．５０ｗｔ％、染色の際に反応性染料（例えば、ダイスター株式会社製Ｌｅｖａｆｉｘ Ｒｅｄ ＣＡ ＧＲ．（登録商標））を０．３０ｇに変更したこと以外は実施例１と同様の方法で微粒子を作製した。微粒子間での水素結合などが起こりにくいために微粒子の分散性が非常によく約５分でＴＬがプラトーに達することができた。
【００５７】
〔実施例５〕
セルロースの凝固反応の際に、凝固液をアセトン濃度２７．０ｗｔ％、水濃度０．２ｗｔ％、アンモニア濃度７２．８ｗｔ％に変更したこと以外は実施例１と同様の方法で微粒子を作製した。微粒子間での水素結合などが起こりにくいために微粒子の分散性が非常によく、かつ平均粒子径も小さいために微粒子が速やかにニトロセルロース膜上を移動し約４分でＴＬがプラトーに達することができた。
【００５８】
〔実施例６〕
セルロースの凝固反応の際に、凝固液をアセトン濃度２７．０ｗｔ％、水濃度０．２ｗｔ％、アンモニア濃度７２．８ｗｔ％、染色の際に反応性染料（例えば、ダイスター株式会社製Ｌｅｖａｆｉｘ Ｒｅｄ ＣＡ ＧＲ．（登録商標））を０．３０ｇに変更したこと以外は実施例１と同様の方法で微粒子を作製した。微粒子間での水素結合などが起こりにくいために微粒子の分散性が非常によく、かつ平均粒子径も小さいために微粒子が速やかにニトロセルロース膜上を移動し約４分でＴＬがプラトーに達することができた。
【００５９】
〔実施例７〕
セルロースの凝固反応の際に、凝固液をジメチルスルホキシド濃度５０．０ｗｔ％、水濃度５０．０ｗｔ％に変更したこと以外は実施例１と同様の方法で微粒子を作製した。微粒子間での水素結合などが起こりにくいために微粒子の分散性が非常によく、かつ平均粒子径も小さいために微粒子が速やかにニトロセルロース膜上を移動し約４分でＴＬがプラトーに達することができた。
【００６０】
〔実施例８〕
セルロースの凝固反応の際に、凝固液をジメチルスルホキシド濃度５０．０ｗｔ％、水濃度５０．０ｗｔ％に、染色の際に反応性染料（例えば、ダイスター株式会社製Ｌｅｖａｆｉｘ Ｒｅｄ ＣＡ ＧＲ．（登録商標））を０．３０ｇに変更したこと以外は実施例１と同様の方法で微粒子を作製した。微粒子間での水素結合などが起こりにくいために微粒子の分散性が非常によく、かつ平均粒子径も小さいために微粒子が速やかにニトロセルロース膜上を移動し約３．５分でＴＬがプラトーに達することができた。
【００６１】
〔実施例９〕
実施例１と同様の方法で染色反応を行った後、着色セルロース微粒子へのカルボキシル基導入反応を行った。５．０ｗｔ％に調整した着色セルロース微粒子分散液１０．０ｍＬに対して、反応剤として６−ブロモヘキサン酸（東京化成社製，Ｂ１２９０）０．３ｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（東京化成社製、Ｄ０９３９）を５０．０ｍＬ、塩基として炭酸ナトリウム（キシダ化学社製，０００−７１２４５）０．１ｇを加え、撹拌させながら恒温槽を用いて５０℃まで昇温し、６時間反応させた。反応後、遠心分離で回収、２−プロパノール（東京化成社製、Ｉ０２７７）にて３回遠心分離による洗浄後、純水にて３回遠心分離による洗浄を行い、カルボキシル基導入着色セルロース微粒子を得た。得られた微粒子はカルボン酸ナトリウム型なので、０．１Ｍ  ＨＣｌ溶液（和光純薬社製、０８３−０１１１５）を１５．０ｍＬ、純水を３５．０ｍＬ添加し、室温で２時間反応させる。その後遠心分離で回収、純水にて水洗した後遠心分離で回収した。ｐＨが４．０以上になるまで水洗を実施し、カルボキシル基導入着色セルロース微粒子分散液を得た。
【００６２】
得られたカルボキシル基導入着色セルロース微粒子分散液に以下の方法で抗体を結合させた。２−モルホリノエタンスルホン酸（以下、「ＭＥＳ」という、東京化成社製、Ｍ０６０６）、苛性ソーダ、純水を用いてｐＨ＝６．０、濃度が１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液を調整した。調整したＭＥＳ緩衝液を６３．０μＬ、カルボキシル基導入親水化着色セルロース微粒子１．０ｗｔ％分散液を７．０μＬ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、「ＥＤＣ」という、東京化成社製、Ｄ１６０１）の１．０ｗｔ％溶液を３．５μＬ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（以下、「ＮＨＳ」という、東京化成社製、Ｂ０２４９）の１．０ｗｔ％溶液を７．０μＬ入れ、室温で１５分間した。その後遠心分離により上澄み液を捨てて未反応のＥＤＣ、ＮＨＳを除去した。ＭＥＳ緩衝液を７０．０μＬ入れ、微粒子を分散させた後、カルボキシル基導入着色セルロース微粒子に対して１０．０ｗｔ％となるように抗ｈＣＧ抗体（Ｆｉｔｚｇｅｌａｒｄｈ製、♯５０１４）をスピッツ管に添加し、３７℃で２時間反応させた。その後、１．０ｗｔ％カゼイン（和光純薬工業社製、０３０−０１５０５）を含有するブロッキング溶液（１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液、ＰＨ＝８．５）を８４０．０μＬスピッツ管に添加し、３７℃の乾燥機内で１時間静置した。１時間後、遠心分離機（クボタ商事社製、６２００）と遠心分離ローター（クボタ商事社製、ＡＦ−５００８Ｃ）を用い、１４０００ｇの遠心を３０分間行い、抗体結合カルボキシル基導入着色セルロース微粒子を沈降させた後に、上澄み液を廃棄した。次いで、ホウ酸緩衝液（５０ｍＭ、ＰＨ＝１０．０）を８４０．０μＬスピッツ管に加え、超音波分散機（エスエムテー社製、ＵＨ−５０）で１０秒間処理し、抗体結合カルボキシル基導入着色セルロース微粒子を分散させた。十分に分散させたのち、１４０００ｇの遠心を２０分間行い、上澄み液を廃棄した。抗体結合カルボキシル基導入着色セルロース微粒子の濃度が０．０４ｗｔ％となるようにホウ酸緩衝液（５０ｍＭ、ＰＨ＝１０．０）を添加し、超音波分散機により十分に分散させた。以上の方法により、抗体結合カルボキシル基導入着色セルロース微粒子を得た。微粒子間での水素結合などが起こりにくいために微粒子の分散性が非常によく、約５分でＴＬがプラトーに達することができた。
【００６３】
〔実施例１０〕
カルボキシル化反応の際に、反応剤として６−ブロモヘキサン酸（東京化成社製，Ｂ１２９０）３．０ｇに変更したこと以外は実施例９と同様の方法で微粒子を作製した。微粒子間での水素結合などが起こりにくいために微粒子の再分散性が非常によく、かつ多量の抗体が微粒子に結合しているために、約３分でＴＬがプラトーに達し、感度も高い結果となった。
【００６４】
〔実施例１１〕
カルボキシル化反応の際に、反応剤として６−ブロモヘキサン酸（東京化成社製，Ｂ１２９０）５．０ｇに変更したこと以外は実施例９と同様の方法で微粒子を作製した。微粒子間での水素結合などが起こりにくいために微粒子の分散性が非常によく、かつ多量の抗体が微粒子に結合しているために、約４分でＴＬがプラトーに達し、感度も高い結果となった。
【００６５】
〔比較例１〕
染色の際に反応性染料（例えば、ダイスター株式会社製Ｌｅｖａｆｉｘ Ｒｅｄ ＣＡ ＧＲ．（登録商標））を４．００ｇに変更したこと以外は実施例１と同様の方法で微粒子を作製した。発色強度が高すぎるためにＴＬがプラトーに達する時間が８分かかってしまった。
【００６６】
〔比較例２〕
染色の際に反応性染料（例えば、ダイスター株式会社製Ｌｅｖａｆｉｘ Ｒｅｄ ＣＡ ＧＲ．（登録商標））を０．０５ｇに変更したこと以外は実施例１と同様の方法で微粒子を作製した。発色強度が低すぎ、親水度が高すぎるためにＴＬがプラトーに達する時間が８分かかってしまった。また、表面に染料が少ないため、抗体が吸着しにくく感度も低下した。
【００６７】
〔比較例３〕
セルロースの凝固反応において、凝固液をテトラヒドロフラン濃度９７．０ｗｔ％、水濃度３．０ｗｔ％に変更したこと以外は実施例１と同様の方法で微粒子を作製した。微粒子が大きすぎるために展開に時間がかかり、ＴＬがプラトーに達するまでに約１０分かかってしまった。
【００６８】
〔比較例４〕
微粒子の染色方法を次のように変更した。微粒子濃度を１．００ｗｔ％に調整したセルロース微粒子分散体１００ｇに対し、硫酸ナトリウム３０ｇ、反応性染料（例えば、ダイスター株式会社製Ｌｅｖａｆｉｘ Ｒｅｄ ＣＡ ＧＲ．（登録商標））１．００ｇ、を加え攪拌させながら恒温槽を用いて６０℃まで昇温した。６０℃に昇温後に炭酸ナトリウム４ｇを加え、２時間染色を行った。続いて得られた粗着色微粒子を水酸化ナトリウム５％水溶液で洗浄し、遠心分離で回収、純水にて水洗した後遠心分離で回収するという一連の操作を１サイクルとし、同様の操作を計２サイクルまで実施し、着色セルロース微粒子を得た。それ以外は実施例１と同様の方法で微粒子を作製した。水酸化ナトリウムによる洗浄を加えたことで親水度、及び表面残存セルロース量が増加し、セルロース同士の水素結合が起こりやすくなったために、懸濁に時間がかかりＴＬがプラトーに達するまでに約８分かかってしまった。
【００６９】
〔比較例５、６〕
発色微粒子として、ラテックス（比較例６）、金コロイド（比較例７）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で、イムノクロマト診断キットを調製し、その性能を評価した。どちらの粒子も疎水性が高く、懸濁に時間がかかったために、ＴＬがプラトーに達するまでに約８分かかってしまった。
【００７０】
実施例１〜１１、比較例１〜６の粒子物性、粒子性能、イムノクロマト性能を以下の表１にまとめて示す。
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の着色セルロース微粒子は、微粒子表面に染料が多量に存在するために、セルロースの水酸基同士の水素結合の発生を抑制できるため、乾燥状態からの懸濁が驚くほど速くなり、また、微粒子表面に多量に染料が存在することで、抗体を十分に担持することができ、発色微粒子として用いた際にイムノクロマト診断キットの検出感度を維持することができる。それゆえ、本発明の着色セルロース微粒子は、イムノクロマト診断キットに好適に利用可能である。
【図１】
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