(57)【要約】      （修正有）【課題】無毒性神経毒誘導体を用いる治療方法。【解決手段】クロストリジウム神経毒の、単離された、生理学的に活性な無毒誘導体を対象に接触させる段階を含み、クロストリジウム神経毒の誘導体が、そのＮ末端にカーゴ付着ペプチド配列を持たないという条件で、接触させる段階が対象を治療するために実行される、治療方法。神経毒誘導体が、クロストリジウムボツリナム（Clostridium botulinum）神経毒誘導体である。クロストリジウムボツリナム神経毒誘導体が、クロストリジウムボツリナムセロタイプＡ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＢ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＣ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＤ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＥ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＦ、及びクロストリジウムボツリナムセロタイプＧからなる群より選択されるセロタイプを持つ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム神経毒の、単離された、生理学的に活性な無毒誘導体を対象に接触させる段階を含み、クロストリジウム神経毒の前記誘導体が、そのＮ末端にカーゴ付着ペプチド配列を持たないという条件で、前記接触させる段階が、前記対象を治療するために実行される、治療方法。
【請求項２】
前記神経毒誘導体が、クロストリジウムボツリナム（Clostridium botulinum）神経毒誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
クロストリジウムボツリナム神経毒誘導体が、クロストリジウムボツリナムセロタイプＡ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＢ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＣ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＤ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＥ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＦ、及びクロストリジウムボツリナムセロタイプＧからなる群より選択されるセロタイプを持つ、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記神経毒誘導体が、メタロプロテアーゼ無効化変異を持つ、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記神経毒誘導体が、組換えタンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記対象が、しわ、肥大性咬筋、及び局所多汗症からなる群より選択される皮膚科的あるいは美容的な状態に対して治療される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記対象が、食道運動障害、咽頭食道痙攣、及び裂肛からなる群より選択される胃腸病学的な状態に対して治療される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が、尿路神経原性機能障害、過活動膀胱、及び切迫性尿失禁の神経調節からなる群より選択される尿生殖器学的な状態に対して治療される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記対象が、トゥーレット症候群、局所の筋痙縮またはジストニア、痙性斜頚、原発性眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、痙攣性発声障害、顔面神経障害、ラスムッセン症候群、切断痛、声の震え、ワニの涙症候群、辺縁性下顎神経麻痺、疼痛、食道由来の胸痛、頭痛、脳性麻痺、多発性硬化症の臀部内転筋機能障害、神経痛及び炎症、関節炎、医原性耳下腺唾液腺粘液腫、ならびに慢性ＴＭＪ疼痛及び転位からなる群より選択される神経学的な状態に対して治療される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記神経毒誘導体が、野生型クロストリジウム神経毒のＬＤ５０よりも少なくとも１，０００倍高いＬＤ５０を持つ、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記神経毒誘導体が、神経細胞の細胞質ゾル内に、野生型クロストリジウム神経毒に比べ、より多量に蓄積する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
クロストリジウム神経毒の前記誘導体が、以下のプロペプチドを切断することによって生成される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法であって：
前記プロペプチドが、
軽鎖領域と、
重鎖領域と
前記軽鎖及び重鎖領域を結合し、高度に特異的なプロテアーゼ切断部位を含む中間領域と
を含み、
前記軽鎖及び重鎖領域がジスルフィド結合によって連結され、
前記高度に特異的なプロテアーゼ切断部位が、切断を可能にするために、高度に特異的なプロテアーゼによって認識される三つ以上の特異的近接アミノ酸残基を持つ、方法。
【請求項１３】
前記高度に特異的なプロテアーゼ切断部位が、エンテロキナーゼ切断部位及びタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ認識（ＴＥＶ）配列から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロペプチドが、前記中間領域内に低度に特異的なプロテアーゼ切断部位を持たず、前記低度に特異的なプロテアーゼ切断部位が、切断を許容するために、プロテアーゼによって認識される二つ以下の近接アミノ酸残基を持つ、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記軽鎖及び重鎖領域が切断されていない、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記プロペプチドが、前記軽鎖領域に結合されたシグナルペプチドをさらに含み、前記シグナルペプチドが、真核細胞から培地への前記神経毒プロペプチドの分泌を可能にするのに適切である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記シグナルペプチドが、ｇｐ６４シグナルペプチドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロペプチドが、前記シグナルペプチドと前記軽鎖領域との間に位置する親和性タグをさらに含む、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記親和性タグが配列番号１０の配列を持つ、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記重鎖がトリプシン感受性の認識配列を持たない、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体が本明細書に援用される２０１３年１月２８日に出願のＵ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．６１／７５７，４７８の利益を主張する。
【０００２】
本出願の研究は、米国政府の国立衛生研究所助成金Ｒ０１  ＡＩ０９３５０４の支援を受けて行われたものである。米国政府は特定の権利を持つ。
【０００３】
発明の分野
本発明は、無毒性神経毒誘導体を用いる治療方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
クロストリジウム神経毒は、シナプス小胞の開口分泌のための神経細胞の仕組みを標的とする、構造的に類似のタンパク質の群である。クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属の嫌気性細菌によって生成されたボツリヌス神経毒（「ＢｏＮＴ」、７種の免疫学的に異なる亜型、Ａ〜Ｇ）及び破傷風神経毒（「ＴｅＮＴ」）は、静脈あるいは筋肉注入で投与されると、０．５〜２．５ｎｇ／ｋｇの範囲内でＬＤ５０を有する、重量当たり最も毒性の強い物質であることが知られている（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ，  "Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ（Ｒ−ＴＥＣＳ），"  Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ（１９９６）（非特許文献１））。ＢｏＮＴは、神経筋接合部のコリン作動性神経を標的とし、アセチルコリン放出を阻害し、そして末梢神経筋遮断を引き起こす（Ｓｉｍｐｓｏｎ，  "Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ｓｔｅｐｓ  ｉｎ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ａｃｔｉｏｎ，"  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４４：１６７−１９３（２００４）（非特許文献２））。
【０００５】
クロストリジウム毒素遺伝子に基づく治療薬の合理的なデザインを可能にする遺伝子工学の基盤は、Ｉｃｈｔｃｈｅｎｋｏ及びＢａｎｄ  米国特許Ｎｏ．７，７８５，６０６（特許文献１）で説明された。遺伝子工学スキームは、二段階アプローチに基づいていた。遺伝子構築物、発現系及び精製スキームは、生理学的に活性な組換えクロストリジウム神経毒誘導体を生成するように設計された。組換え毒素誘導体は、候補治療薬または有用な生物学的試薬を開発するための重要な構造的特徴を保持していた。このパラダイムによって開発された遺伝子の構築物及び発現系を用いることで、その後、選択的点突然変異が、組換え無毒性クロストリジウム神経毒誘導体を作製するために導入された。
【０００６】
単離された生理学的に活性な有毒性クロストリジウム神経毒誘導体を患者に接触させることを伴う治療方法が、Ｂａｎｄ及びＩｃｈｔｃｈｅｎｋｏ  米国特許Ｎｏ．７，７８５，６０６（特許文献１）に説明されている。また、Ｓｆｐホスホパンテテイン転移酵素を用いるカーゴの部位特異的付着を可能にするための、タンパク質のＮ末端に融合させたＳ６ペプチド配列を持つ、単離された生理学的に活性な、有毒性及び無毒性クロストリジウムボツリナム神経毒誘導体が、治療に適切であると説明されている（Ｉｃｈｔｃｈｅｎｋｏ及びＢａｎｄ  米国特許出願公開Ｎｏ．２０１１／０２０６６１６（特許文献２））。しかし、そのＮ末端にカーゴ付着配列を欠き、且つクロストリジウム神経毒または野生型クロストリジウム神経毒の有毒性誘導体よりも非常に高いＬＤ５０を持つクロストリジウム神経毒の無毒性誘導体での治療を伴う方法は、説明されていなかった。
【０００７】
本発明の目的は、本技術分野におけるこの課題及び他の限界を克服することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許Ｎｏ．７，７８５，６０６
【特許文献２】米国特許出願公開Ｎｏ．２０１１／０２０６６１６
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ，  "Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ（Ｒ−ＴＥＣＳ），"  Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ（１９９６）
【非特許文献２】Ｓｉｍｐｓｏｎ，  "Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ｓｔｅｐｓ  ｉｎ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ａｃｔｉｏｎ，"  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４４：１６７−１９３（２００４）
【発明の概要】
【００１０】
本発明は治療方法に関する。この方法は、クロストリジウム神経毒の単離された生理学的に活性な無毒誘導体を対象に接触させることを伴う。この接触は、神経毒誘導体が、そのＮ末端にカーゴ付着ペプチド配列を持たないという条件で、対象を治療するために実行される。
【００１１】
本明細書に説明する遺伝子構築物及び発現系は、野生型ＢｏＮＴ毒素に類似の構造的及び輸送的性質を有して、組換えＢｏＮＴ誘導体の群を生成することが示されている。クロストリジウム神経毒のこれらの誘導体は、野生型毒素の毒性に相当するような有毒な形態で、または毒性の原因となるメタロプロテアーゼ活性を減少させる変異を持たせて（すなわち、無毒性誘導体）生成できる。無毒性神経毒誘導体のＬＤ５０は、野生型毒素のそれよりも非常に高い。
【００１２】
本明細書で説明するように、無毒性神経毒誘導体（参照によりその全体が本明細書に援用されるＩｃｈｔｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．７，７８５，６０６を参照）は、予想外に、薬学的目的で使用される野生型神経毒に類似のインビボ活性を有する。しかも、本明細書に説明する無毒性神経毒誘導体は、培養によって生成される野生型神経毒の現在の薬学的調整物を超える有意な治療的利益を提供する。特に、本明細書に説明する無毒性誘導体は、より安全である。また、医療用途及び生成あるいは製造において、特異な利点を提供する。改善された治療指数は、安全性への懸念から野生型神経毒の毒性の適用が制限される状況にも適用を可能にする。
[本発明1001]
クロストリジウム神経毒の、単離された、生理学的に活性な無毒誘導体を対象に接触させる段階を含み、クロストリジウム神経毒の前記誘導体が、そのＮ末端にカーゴ付着ペプチド配列を持たないという条件で、前記接触させる段階が、前記対象を治療するために実行される、治療方法。
[本発明1002]
前記神経毒誘導体が、クロストリジウムボツリナム（Clostridium botulinum）神経毒誘導体である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
クロストリジウムボツリナム神経毒誘導体が、クロストリジウムボツリナムセロタイプＡ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＢ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＣ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＤ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＥ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＦ、及びクロストリジウムボツリナムセロタイプＧからなる群より選択されるセロタイプを持つ、本発明1001または本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記神経毒誘導体が、メタロプロテアーゼ無効化変異を持つ、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記神経毒誘導体が、組換えタンパク質である、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記対象が、しわ、肥大性咬筋、及び局所多汗症からなる群より選択される皮膚科的あるいは美容的な状態に対して治療される、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記対象が、食道運動障害、咽頭食道痙攣、及び裂肛からなる群より選択される胃腸病学的な状態に対して治療される、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記対象が、尿路神経原性機能障害、過活動膀胱、及び切迫性尿失禁の神経調節からなる群より選択される尿生殖器学的な状態に対して治療される、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記対象が、トゥーレット症候群、局所の筋痙縮またはジストニア、痙性斜頚、原発性眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、痙攣性発声障害、顔面神経障害、ラスムッセン症候群、切断痛、声の震え、ワニの涙症候群、辺縁性下顎神経麻痺、疼痛、食道由来の胸痛、頭痛、脳性麻痺、多発性硬化症の臀部内転筋機能障害、神経痛及び炎症、関節炎、医原性耳下腺唾液腺粘液腫、ならびに慢性ＴＭＪ疼痛及び転位からなる群より選択される神経学的な状態に対して治療される、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記神経毒誘導体が、野生型クロストリジウム神経毒のＬＤ50よりも少なくとも1，000倍高いＬＤ50を持つ、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記神経毒誘導体が、神経細胞の細胞質ゾル内に、野生型クロストリジウム神経毒に比べ、より多量に蓄積する、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
クロストリジウム神経毒の前記誘導体が、以下のプロペプチドを切断することによって生成される、本発明1001〜1011のいずれかの方法であって：
前記プロペプチドが、
軽鎖領域と、
重鎖領域と
前記軽鎖及び重鎖領域を結合し、高度に特異的なプロテアーゼ切断部位を含む中間領域と
を含み、
前記軽鎖及び重鎖領域がジスルフィド結合によって連結され、
前記高度に特異的なプロテアーゼ切断部位が、切断を可能にするために、高度に特異的なプロテアーゼによって認識される三つ以上の特異的近接アミノ酸残基を持つ、方法。
[本発明1013]
前記高度に特異的なプロテアーゼ切断部位が、エンテロキナーゼ切断部位及びタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ認識（ＴＥＶ）配列から選択される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記プロペプチドが、前記中間領域内に低度に特異的なプロテアーゼ切断部位を持たず、前記低度に特異的なプロテアーゼ切断部位が、切断を許容するために、プロテアーゼによって認識される二つ以下の近接アミノ酸残基を持つ、本発明1012または本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記軽鎖及び重鎖領域が切断されていない、本発明1012〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記プロペプチドが、前記軽鎖領域に結合されたシグナルペプチドをさらに含み、前記シグナルペプチドが、真核細胞から培地への前記神経毒プロペプチドの分泌を可能にするのに適切である、本発明1012〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記シグナルペプチドが、ｇｐ64シグナルペプチドである、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記プロペプチドが、前記シグナルペプチドと前記軽鎖領域との間に位置する親和性タグをさらに含む、本発明1016または本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記親和性タグが配列番号10の配列を持つ、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記重鎖がトリプシン感受性の認識配列を持たない、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、７つの野生型、ボツリヌス神経毒セロタイプのアミノ酸配列を比較配置したものであり、以下のものを含む。クロストリジウムボツリナムセロタイプＡ（ｗｔ  ＢｏＮＴ  Ａ）（配列番号：１）、クロストリジウムボツリナムセロタイプＢ（ｗｔ  ＢｏＮＴ  Ｂ）（配列番号：２）、クロストリジウムボツリナムセロタイプＣ（ｗｔ  ＢｏＮＴ  Ｃ）（配列番号：３）、クロストリジウムボツリナムセロタイプＤ（ｗｔ  ＢｏＮＴ  Ｄ）（配列番号：４）、クロストリジウムボツリナムセロタイプＥ（ｗｔ  ＢｏＮＴ  Ｅ）（配列番号：５）、クロストリジウムボツリナムセロタイプＦ（ｗｔ  ＢｏＮＴ  Ｆ）（配列番号：６）、及びクロストリジウムボツリナムセロタイプＧ（ｗｔ  ＢｏＮＴ  Ｇ）（配列番号：７）。相同性を最大にするためにギャップが導入されている。比較配列の５０%以上が同一であるアミノ酸は、黒枠で示されている。メタロプロテアーゼの触媒ドメインの活性部位を構成するアミノ酸を、星印で示している。軽鎖及び重鎖の神経毒システイン残基間のジスルフィド架橋を、長い横書きの括弧で示している。軽鎖の最小触媒ドメインを構成するアミノ酸残基には、網掛けが施されている。タンパク重鎖（ＢｏＮＴ  ＡのＮ８７２）のＣ末端部の第一のアミノ酸は、受容体結合ドメインを構成すると考えられる第一のアミノ酸と同様、白い矢印で示している。成熟二本鎖（ｄｉｃｈａｉｎ）ＢｏＮＴ  Ａ分子に不在のアミノ酸は、他のＢｏＮＴセロタイプの位置合わせされたアミノ酸と一緒に、四角で囲んでいる。神経毒軽鎖の第一のアミノ酸にも白い矢印を記している。
【図１Ｂ】図１Ａの続きを示す図である。
【図１Ｃ】図１Ｂの続きを示す図である。
【図２】３μｌの０．９%ＮａＣｌ内に０．５μｇ／マウスのＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０（実験）を含めたもので側面腓腹筋への筋肉内注射を行うか、またはＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０を含まない３μｌの０．９%ＮａＣｌ（対照標準）を注入することによって実行されたインビボ試験の結果を示す写真である。筋肉麻痺及び指の外転が、４８時間後に記録された。２枚の上パネル写真が対照標準マウスを示す。右上写真内の矢印が注入部位を示している。３枚の下パネル写真が実験マウスを示す。指の外転筋肉麻痺は、ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０が注入されたマウスでのみ観察された。実験、ｎ＝１０。対照標準、ｎ＝５。３枚の下パネル写真内に代表的結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は治療方法に関する。本方法は、対象に、クロストリジウム神経毒の、単離された生理学的に活性な無毒誘導体を接触させることを伴う。この接触は、神経毒誘導体がそのＮ末端にカーゴ付着ペプチド配列を持ないという条件で、対象を治療するために実行される。
【００１５】
一つの実施形態によれば、本発明のクロストリジウム神経毒の誘導体は、クロストリジウムボツリナム神経毒の誘導体である。クロストリジウムボツリナムは、複数のセロタイプ（Ａ〜Ｇ）を持つ。クロストリジウム神経毒の適切な誘導体は、クロストリジウムボツリナムセロタイプの、いずれの誘導体でもよい。加えて、本発明のクロストリジウム神経毒の適切な誘導体は、複数のクロストリジウムボツリナムセロタイプの誘導体でもよい。例えば、クロストリジウム神経毒の誘導体を、一つのクロストリジウムボツリナムセロタイプ（例えば、セロタイプＡ、ＢｏＮＴ  Ａ）からの軽鎖（ＬＣ）領域と、別のクロストリジウムボツリナムセロタイプ（例えば、セロタイプＢ、ＢｏＮＴ  Ｂ）からの重鎖（ＨＣ）領域で構築することが望まれることもある。また、本発明のクロストリジウム神経毒の適切な誘導体は、癌細胞へのＬＣ送達のために、他の受容体リガンド、例えば上皮細胞成長因子（「ＥＧＦ」）を用いるキメラを含む（参照によりその全体が本明細書に援用されるＦｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０１２／００６４０５９を参照）。
【００１６】
「誘導体」は、クロストリジウム神経毒が、野生型毒素とかなり類似しているが、本明細書で説明するように僅かに改変されていることを意味する。例えば、誘導体は、野生型神経毒に少なくとも６０%、７０%、８０%、８５%、９０%、９５%、９６%、９７%、９８%または９９%同一であるクロストリジウム神経毒を含む。
【００１７】
クロストリジウム神経毒の単離された誘導体は、生理学的に活性である。この生理活性は、毒素免疫原性、細胞間輸送及び細胞内輸送、細胞認識及び細胞標的及び麻痺作用を含むが、これらに限定されるものではない。一つの実施形態において、クロストリジウム神経毒の誘導体は、全長クロストリジウム神経毒の誘導体である。
【００１８】
呼称「ａｄ−０」を用いて本明細書中で示すクロストリジウム神経毒の無毒性誘導体は、参照によりその全体が本明細書に援用されるＩｃｔｈｔｃｈｅｎｋｏ及びＢａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０１１／０２０６６１６に説明されているように、神経毒誘導体のＮ末端に融合されるＳ６ペプチド配列を含まない。
【００１９】
クロストリジウム神経毒の細胞結合及び細胞内移行のメカニズムは、まだ完全には理解されていない。すべてのクロストリジウム神経毒の重鎖のＣ末端部は、Ｇ１ｂシリーズのガングリオシドに対する選択性を持ち、ガングリオシド（シアル酸を含む糖脂質）に結合する（Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，"  Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８：４２３−４７２（１９９５）、Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ，"Ｈｏｗ  Ｄｏ  Ｔｅｔａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎｓ  Ｂｉｎｄ  ｔｏ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ？"  ＴＩＢＳ１１：３１４−３１７（１９８６）及びＶａｎ  Ｈｅｙｎｉｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｉｎ  ｂｙ  Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ，"  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２４：１０７−１１９（１９６１）、これらは、参照によりその全体が援用される）。ガングリオシド結合の原因となる配列は、構造的に類似のＴｅＮＴ分子に関して確認されており、その重鎖のＣ末端アミノ酸３４残基以内に位置する。ＢｏＮＴ  Ａ、ＢｏＮＴ  Ｂ、ＢｏＮＴ  Ｃ、ＢｏＮＴ  Ｅ及びＢｏＮＴ  Ｆは、この領域（図１）内のＴｅＮＴと高度な相同性を共有する（Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｉｎ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  Ｐｈｏｔｏａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ，"  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３０３８０−３０３８６（１９９７）、これは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。複数の種類の証拠は、クロストリジウム神経毒を神経細胞膜に結合する際に伴う、少なくとも一つの追加成分の存在を示唆する（Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，"  Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８：４２３−４７２（１９９５）、Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ，"Ｈｏｗ  Ｄｏ  Ｔｅｔａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎｓ  Ｂｉｎｄ  ｔｏ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ？"  ＴＩＢＳ１１：３１４−３１７（１９８６）、これらは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。二つのレポート（Ｎｉｓｈｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｙｐｅ  Ｂ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｔｏ  Ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ  II  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ  ＧＴ１ｂ／ＧＤ１ａ，"  ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３７８：２５３−２５７（１９９６）、Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎｓ  Ｉ  ａｎｄ  II  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｅｎｔｒｙ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ  ｉｎｔｏ  Ｃｅｌｌｓ，"  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６２：１２９３−１３０３（２００３）、これらは、参照によりその全体が本明細書に援用される）に、シナプトタ���ミンは、補助的ＢｏＮＴ  Ｂ受容体のための可能な候補と特定され、シナプトタグミンＩ及びIIは、ＢｏＮＴ  Ｇのための神経細胞受容体として関連づけされた（Ｒｕｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎｓ  Ｉ  ａｎｄ  II  Ａｃｔ  ａｓ  Ｎｅｒｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｇ，"  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：３０８６５−３０８７０（２００４）、これは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。参照によりその全体が本明細書に援用されるＤｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，"ＳＶ２  ｉｓ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ａ，"  Ｓｃｉｅｎｃｅ３１２：５９２−５９６（２００６）は、ＢｏＮＴ  Ａが、シナプス小胞タンパク質ＳＶ２（イソ型Ａ、Ｂ及びＣ）に結合することによって神経細胞に入ることを示した。しかし、クロストリジウム神経毒の推定受容体結合ドメインにおける構造類似性にもかかわらず、他の毒素亜型は、ＳＶ２への親和性を全く示さず、その代わりに、シナプトタグミンまたはシナプトタグミン関連分子を標的とするのかも知れない。脂質ラフトは、ＴｅＮＴ結合と神経細胞内への内部移行に関わる特定のドメインとして関連づけられた（Ｈｅｒｒｅｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｌｉｐｉｄ  Ｒａｆｔｓ  Ａｃｔ  ａｓ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  Ｎｅｕｒｏｎｓ，"  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：２９４７−２９６０（２００１）、これは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。しかし、これらのドメインは、複数の細胞型に広く分布しているため、神経細胞に対する毒素の高度な特異性を単純に説明することはできない。
【００２０】
クロストリジウム神経毒は、シナプス前膜を通して、エネルギー依存メカニズムによって内在化され（Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，"  Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８：４２３−４７２（１９９５）、Ｍａｔｔｅｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｖｅｓｉｃｌｅ  Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｅｎｔｒｙ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｉｎｔｏ  Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  Ｎｅｕｒｏｎｓ，"  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１３３１０−１３３１５（１９９６）及びＭｕｋｈｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，"  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７７：７５９−８０３（１９９７）、これらは、参照によりその全体が本明細書に援用される）、そして小胞内に急速に現れる。そこでは、変質から少なくとも部分的に保護される（Ｄｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｃｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｓｉｄｅ  ｏｎ  Ｍｏｔｏｒ  Ｎｅｒｖｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｉｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ，"  Ｎａｔｕｒｅ３０７：４５７−４６０（１９８４）、Ｃｒｉｔｃｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｆａｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｉｎ  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ，"  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１００：１４９９−１５０７（１９８５）、これらは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。軽鎖及び重鎖のＢｏＮＴ複合体は、シャペロンのような様式で細胞内小胞膜と相互作用するので、凝集を阻止し、滑面小胞体、ミトコンドリア及び葉緑体のチャネルを導くあるいは移行させるタンパク質に類似の様式で軽鎖の移行を促進する（Ｋｏｒｉａｚｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ  Ｃｈａｎｎｅｌ，"  Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：１３−１８（２００３）、これは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。エンドソームの酸性化は、小孔形成を誘起すると思われる。そのことが、鎖間ジスルフィド結合の減少時に、軽鎖のサイトゾルへの移行を許容する（Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｈａｎｎｅｌｓ  Ｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ，Ｔｅｔａｎｕｓ，ａｎｄ  Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎａｒ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ：Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｃｒｏｓｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，"  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１６９２−１６９６（１９８５）、これは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。サイトゾル内において、軽鎖は、シナプス小胞の開口分泌機構のタンパク質成分に特有の亜鉛エンドペプチダーゼ活性を示す。ＴｅＮＴ及びＢｏＮＴ  Ｂ、Ｂ��ＮＴ  Ｄ、ＢｏＮＴ  Ｆ及びＢｏＮＴ  Ｇは、ＶＡＭＰ／シナプトブレビンを認識する。シナプス小胞膜のこの細胞膜内タンパクは、単一のペプチド結合で切断される。これは、各神経毒に対して異なる。ＢｏＮＴ  Ａ、ＢｏＮＴ  Ｃ及びＢｏＮＴ  Ｅは、カルボキシル末端セグメント内の異なる部位でシナプス前膜のタンパク質であるＳＮＡＰ−２５を認識して切断する。ＢｏＮＴ  Ｃも、神経終末形質膜の別のタンパク質であるシンタキシンを切断する（Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，"  Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８：４２３−４７２（１９９５）、Ｓｕｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ＳＮＡＲＥ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｔ  ２．４ÅＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，"  Ｎａｔｕｒｅ３９５：３４７−３５３（１９９８）、これらは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。シナプスリリース機構のそのような成分の切断は、運動神経におけるアセチルコリン放出の抑制という結果になり、最終的に神経筋麻痺に至る。
【００２１】
本発明の方法に用いられるクロストリジウム神経毒の単離された誘導体は、生理学的に活性で無毒である。クロストリジウム神経毒の毒性の原因となるエンドペプチダーゼ活性は、メタロプロテアーゼ（図１Ａから１Ｃ）に特有の、軽鎖内におけるＨＥｘｘＨｘｘＨ（配列番号：８）モチーフの存在に関係すると思われる。ＢｏＮＴ  Ａ軽鎖の突然変異発生の後、カリフォルニアアメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）のシナプス前コリン作動性神経内へ、対応するｍＲＮＡを微量注入することにより、毒性の原因となる最小必須ドメインの確認が可能となった（Ｋｕｒａｚｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｓｐｅｃｉｆｙｉｎｇ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎｓ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｉｎ  ａｎｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ，"  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４７２１−１４７２９（１９９２）、これは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。ＢｏＮＴ  Ａ軽鎖の特定部位突然変異誘発は、Ｚｎ２＋配位に関わるアミノ酸残基と、ＳＮＡＰ−２５を切断する活性メタロエンドプロテアーゼコアの形成とを特定した（Ｒｉｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  Ａｃｔｉｖｅ−Ｓｉｔｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ，"  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８８：１２３１−１２３７（２００１）、これは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。クロストリジウム神経毒及びそれらの誘導体の三次元構造は、突然変異の結果を確証するものであり、タンパク質ドメインの空間的構成が詳述された。ＢｏＮＴ  Ａホロ毒素に対しては、３．３Åの解像度で結晶構造が取得された（Ｌａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ  ａｎｄ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ，"  Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：８９８−９０２（１９９８）、これは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。ＢｏＮＴ  Ｂホロ毒素結晶構造は、１．８及び２．６Åの解像度で測定された（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ，"  Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：６９３−６９９（２０００）、これは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。近年、ＢｏＮＴ  Ｅ触媒ドメインの結晶構造が、２．１Åの解像度で測定された（Ａｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ｅ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｇｌｕ２１２＞Ｇｌｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈｅ  Ｐｉｖｏｔａｌ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｌｕ２１２  Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃａ���ａｌｙｔｉｃ  Ｐａｔｈｗａｙ，"Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：６６３７−６６４４（２００４）、これは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。後の研究は、複数の興味深い構造詳細を提供し、ＢｏＮＴ  Ｅ  ＬＣ  Ｅ２１２＞Ｑ変異体内のメタロエンドタンパク分解活性の完全な消失を説明する助けとなっている。クロストリジウム毒素のアミノ酸配列と生物学的活性度との関係についての、この詳細な情報の利用は、治療目的に向けて具体的に性質を変化させる改変毒素遺伝子のデザインを可能とする。
【００２２】
したがって、一つの実施形態においては、クロストリジウム神経毒の生理学的に活性であって無毒性の誘導体は、メタロプロテアーゼ無効化変異を持つ。特定のメタロプロテアーゼ無効化変異は、参照によりその全体が本明細書に援用されるＩｃｈｔｈｃｈｅｎｋｏ及びＢａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．７，７８５，６０６に説明されている。無毒性誘導体の特徴をさらに改変するために、追加の点突然変異の導入が可能である。そのいくつかは、参照によりその全体が本明細書に援用されるＩｃｈｔｈｃｈｅｎｋｏ及びＢａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．７，７８５，６０６にも説明されている。
【００２３】
クロストリジウム神経毒の、生理学的に活性であって無毒性の誘導体はまた、軽鎖領域内に、有毒なクロストリジウム神経毒内の軽鎖メタロプロテアーゼ活性を不活性化可能な、さもなければ誘導体の作用を改変可能な、外来のモチーフ（例えば、ＳＮＡＲＥモチーフ）を含んでもよい。アルファヘリックスドメインを置換させてもよい９つの外来のモチーフの配列は、参照によりその全体が本明細書に援用されるＩｃｈｔｈｃｈｅｎｋｏ及びＢａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．７，７８５，６０６に説明されている。他の細胞受容体を標的とするための配列を統合させた無毒性誘導体も可能である（例えば、ＥＧＦまたは癌細胞）（Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０１２／００６４０５９を参照、これは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００２４】
一つの実施形態においては、クロストリジウム神経毒の、生理学的に活性であって無毒性の誘導体は、野生型クロストリジウム神経毒のＬＤ５０よりも少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、７，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００または５００，０００倍高いＬＤ５０を持つ。特定の投与モードは、クロストリジウム神経毒の誘導体のＬＤ５０に影響を及ぼしてもよい。
【００２５】
一つの実施形態においては、本発明のクロストリジウム神経毒の誘導体は、プロペプチドを切断することによって生成される。プロペプチドは、軽鎖及び重鎖を各々約５０ｋＤ及び１００ｋＤの分子量で形成するよう、高度に特異的なプロテアーゼ切断部位で切断される。軽鎖及び重鎖領域は、ジスルフィド結合によって連結される。
【００２６】
一つの実施形態において、プロペプチドを、本発明のプロペプチドの中間領域での切断を可能にするのに有効な条件の下で、高度に特異的なプロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼまたはＴＥＶプロテアーゼ）と接触させる。発現したプロペプチドは、一つ以上のジスルフィド架橋を持つことが好ましい。
【００２７】
以下に考察するように、本明細書に説明するクロストリジウム神経毒及びそれらの誘導体は、特定のタンパク質分解切断事象によって後に活性化される単鎖プロペプチドとして合成され、ジスルフィド結合によって結合されたダイマーを生じる。これらの構造的特徴は、一例としてＢｏＮＴ  Ａを用いて説明可能であり、通常、すべてのクロストリジウムボツリナムセロタイプに適用可能である。成熟ＢｏＮＴ  Ａは、Ｍｒ約５０，０００の三つの機能ドメインからなる。そこでは、毒性の原因となる触媒機能が、軽鎖（残基１〜４３７）に限定され、移行活性が、重鎖（残基４４８〜８７２）のＮ末端側の半分と関係しており、細胞結合がそのＣ末端側の半分（残基８７３〜１，２９５）に関連している（Ｊｏｈｎｓｏｎ，"Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ａｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ：Ｂｅｎｅｆｉｔｓ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒｅ'ｓ  Ｍｏｓｔ  Ｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：５５１−５７５（１９９９）、Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，"  Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８：４２３−４７２（１９９５）、これらは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００２８】
天然で生理学的に活性な状態のＢｏＮＴセロタイプのための組換え神経毒の最適化された発現及び回収は、以下に考察するように、ＢｏＮＴプロペプチドをコードしているヌクレオチド配列への、一つ以上の改変の導入によって達成される。これらの変異は、天然の毒素の構造と生物学的活性を保持しながら、クロストリジウム神経毒の組換え誘導体の収率を最大にするようデザインされる。
【００２９】
野生型クロストリジウムボツリナム神経毒プロペプチドの一般的な構造的特徴を、図１Ａ〜１Ｃに示す。これらの構造的特徴を、一例としてｗｔ  ＢｏＮＴ  Ａプロペプチドを用いて説明するが、すべてのクロストリジウムボツリナムセロタイプ間に共通するものである。ｗｔ  ＢｏＮＴ  Ａプロペプチドは、二本の鎖、すなわちＭｒ約５０，０００の軽鎖（"ＬＣ"）及びＭｒ約１００，０００の重鎖（"ＨＣ"）を持ち、これらは、Ｃｙｓ４２９及びＣｙｓ４５３間で、ジスルフィド結合によって連結されている。図１Ａ〜１Ｃに図示するように、全７つのＢｏＮＴセロタイププロペプチドは、ジスルフィド結合によって連結された軽鎖領域及び重鎖領域を持つ。二つの必須Ｃｙｓ残基、すなわち軽鎖のＣ末端に隣接した一つと重鎖のＮ末端に隣接したもう一つが、全７つのＢｏＮＴセロタイプ内に存在する。これらの二つのＣｙｓ残基は、成熟神経毒内にＨＣ及びＬＣポリペチドを一緒に保持する単一のジスルフィド結合を形成する。このジスルフィド結合は、ＨＣ及びＬＣが協調して各々の生物学的役割を果たすことによって、成熟神経毒が、その天然生理活性を達成できるようにする。全７つのセロタイプのＨＣ及びＬＣポリペチド間のジスルフィド結合は、関与するＣｙｓ残基を結ぶ実線によって、図１Ａに図示されている。図１Ａの枠線内は、ｗｔ  ＢｏＮＴ  Ａのアミノ酸残基Ｌｙｓ４３８〜Ｌｙｓ４４８によって定義される中間領域を示す。この中間領域は、ｗｔ  ＢｏＮＴ  Ａの成熟中に除去されたアミノ酸を特定しており、宿主微生物に内在するプロテアーゼによって切除されると思われる。以下に説明するこの切断事象は、生物活性ＢｏＮＴ  ＨＣ−ＬＣダイマーを生じる。図１Ａ〜１Ｃにおいて枠線で示されたアミノ酸残基は、全７つのＢｏＮＴセロタイプに関する約４２０〜４５０の範囲内にあるアミノ酸残基を表すもので、毒素の生理活性に「非必須な」領域と考えられるため、全７つのＢｏＮＴセロタイプの定方向突然変異誘発の標的となる。
【００３０】
本明細書で言及する全７つのｗｔ  ＢｏＮＴセロタイプは、図１Ａに枠線で区画した中間領域内にＬｙｓまたはＡｒｇ残基を含む。それらが、プロペプチドの、トリプシンによる活性化を受けやすくする。若い細菌培養から回収した天然のＢｏＮＴ  Ａプロペプチドは、トリプシン分解によって活性化でき、無傷の、Ｓ−Ｓ結合した軽鎖及び重鎖の生成を伴う。他に複数の、トリプシン感受性部位がプロペプチド内には存在するが、それらには、天然毒素分子内における空間位置に起因する、タンパク質分解に対する抵抗性がある（Ｄｅｋｌｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｉｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｙｐｅ  Ａ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｂｙ  ａｎ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ，"  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６２：７６７−７７２（１９８９）、Ｌａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ  ａｎｄ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ，"  Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：８９８−９０２（１９９８）、これらは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。複数のＢｏＮＴセロタイプの天然プロペプチド内の第二の部位は、より高い酵素濃度またはインキュベーション時間を与えると、トリプシン切断されやすくなる（Ｃｈａｄｄｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ，Ｎｏｎ−Ｔｏｘｉｃ  Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ，"  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２５：２１９−２２８（２００２）、これは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。このトリプシン感受性部位は、毒素受容体結合ドメインに隣接する領域内に位置する。三次元結晶構造に関して情報が利用可能であるＢｏＮＴセロタイプにおいて、ＨＣペプチドのこの領域は溶媒にさらされることが発見されている（Ｌａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ  ａｎｄ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ，"  Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：８９８−９０２（１９９８）、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ，"  Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：６９３−６９９（２０００）、これらは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００３１】
一つの実施形態において、プロペプチドは、高度に特異的なプロテアーゼ切断部位を持つが、低度に特異的なプロテアーゼ切断部位を全く持たない、軽鎖及び重鎖領域を結合する中間領域を含む。本発明の目的のために、高度に特異的なプロテアーゼ切断部位は、切断を可能にするために高度に特異的なプロテアーゼによって認識される三つ以上の特異的な近接するアミノ酸残基を持つ（例えば、エンテロキナーゼ切断部位またはＴＥＶ認識配列）。対照的に、低度に特異的なプロテアーゼ切断部位は、切断可能とするためにプロテアーゼによって認識される二つ以下の近接するアミノ酸残基を持つ（例えば、トリプシン切断部位）。
【００３２】
全７つのＢｏＮＴセロタイプにおける重鎖のＮ末端に先行するアミノ酸は、トリプシンでのタンパク質分解を受けやすいＬｙｓまたはＡｒｇ残基である。このトリプシン感受性部位は、重鎖のＮ末端の上流域で、５つのアミノ酸エンテロキナーゼ切断部位（すなわち、ＤＤＤＤＫ（配列番号：９））で置き換えることができる。代わりに、トリプシン感受性部位は、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ認識（"ＴＥＶ"）配列で置き換えることもできる。ＴＥＶ配列の使用は、ワンステップヘテロ二量体形成切断事象を可能にする。Ｉｃｈｔｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０１１／０２０６６１６を参照。これは、参照によりその全体が本明細書に援用される。これらの改変のいずれも、特定酵素での標準化された活性化を可能にする。セロタイプＡ及びＣにおいては、この領域内の追加のＬｙｓ残基を、ＧｌｎまたはＨｉｓのいずれかに変異させてもよい。それによって、追加のトリプシン感受性部位を除く。トリプシン感受性認識配列は、セロタイプＡ、Ｅ及びＦ内の重鎖の受容体結合ドメインの上流にも現れる。タンパク質分解に対するこの領域の感受性は、Ｘ線結晶分析が示すように、毒素の三次元構造において、この領域が溶媒に曝されることと一致している。したがって、セロタイプＡ、Ｅ及びＦにおいて、感受性残基はＡｓｎに変更される。これらの改変は、エンテロキナーゼまたはＴＥＶのいずれでも標準化された活性化を可能にする。
【００３３】
分泌及び回収を可能にし、また、切断された変異体を除くために、シグナルペプチド及びＮ末端の親和性タグも、必要に応じて導入されることが好ましい。親和性タグは、重鎖及び軽鎖の切断に使用したものと同じ特異的プロテアーゼを用いる切断によって、神経毒のＮ末端及びＣ末端から切り離すことができる。
【００３４】
一つの実施形態においては、クロストリジウム神経毒の誘導体は、メタロプロテアーゼ無効化変異を持つプロペプチドからのものである。プロペプチドの軽鎖の最小触媒ドメインを構成するアミノ酸残基は、図１Ａに網掛けで示されている。メタロプロテアーゼの触媒ドメインの活性部位を構成する特異的アミノ酸残基は、図１Ａに星印で示す。
【００３５】
種々のクロストリジウム神経毒プロペプチドを、表面アルファヘリックスドメインの代わりに外来のモチーフ（例えば、ＳＮＡＲＥモチーフペプチド）を含む軽鎖領域を持つよう作製することも可能である。これらの外来のモチーフを含むプロペプチドは、プロペプチドをコードしている核酸のヌクレオチド配列を変えることによって生成される。
【００３６】
一つの実施形態において、プロペプチドの軽鎖及び重鎖は、切断されていない。
【００３７】
一つの実施形態において、プロペプチドは、軽鎖領域に結合されたシグナルペプチドをさらに含み、ここでシグナルペプチドは、真核細胞から培地へのプロペプチドの分泌を可能にするのに適切である。適切なシグナルペプチドは、参照によりその全体が本明細書に援用されるＩｃｈｔｃｈｅｎｋｏ及びＢａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．７，７８５，６０６に説明されている。適切なシグナルペプチドは、ｇｐ６４シグナルペプチドである。
【００３８】
プロペプチドはまた、シグナルペプチドと軽鎖領域の間に、及び／またはプロペプチドのＣ末端に、親和性タグを持ってもよい。適切な親和性タグは、ヘキサヒスチジン親和性タグ
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である。カーゴ付着ペプチド配列を持つ適切なクロストリジウム神経毒プロペプチドの構造バリエーションは、参照によりその全体を本明細書に援用するＩｃｈｔｃｈｅｎｋｏ及びＢａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０１１／０２０６６１６に説明されている。本発明の方法に用いるのに適切なクロストリジウム神経毒の無毒性誘導体をコードするプロペプチドは、Ｎ末端でのカーゴ付着ペプチド配列以外の、参照によりその全体を本明細書に援用するＩｃｈｔｃｈｅｎｋｏ及びＢａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０１１／０２０６６１６に説明があるプロペプチドの構造的特徴のいずれを含んでもよい。参照によりその全体を本明細書に援用するＩｃｈｔｃｈｅｎｋｏ及びＢａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０１１／０２０６６１６で説明されているように、親和性タグの活性化及び除去のために、単一のプロテアーゼ切断ステップを用いることができる。
【００３９】
本発明の方法に用いるのに適切なクロストリジウム神経毒の無毒性誘導体をコードする単離された核酸分子は、参照によりその全体を本明細書に援用するＩｃｈｔｃｈｅｎｋｏ及びＢａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．７，７８５，６０６に説明されている。
【００４０】
一つの実施形態において、核酸分子は、上述のように、メタロプロテアーゼ無効化変異を持つ。
【００４１】
一つの実施形態においては、クロストリジウム神経毒の誘導体は、組換えタンパク質である。異種ベクター内におけるクロストリジウム神経毒の単離された生理学的に活性な無毒誘導体をコードする核酸分子を持つ発現系、及びクロストリジウム神経毒の単離された生理学的に活性な無毒誘導体をコードする異種核酸分子を持つ宿主細胞は、参照によりその全体が本明細書に援用されるＩｃｈｔｃｈｅｎｋｏ及びＢａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．７，７８５，６０６に説明されている。
【００４２】
クロストリジウム神経毒の組換え型生理活性無毒誘導体の発現は、本明細書で説明するように、プロペプチドをコードする核酸分子を持つ核酸構築物を提供することによって実行される。核酸構築物は、核酸分子に機能的に連結した異種プロモーター及びその核酸分子に機能的に連結した３'制御領域を持つ。それから、核酸構築物は、クロストリジウム神経毒の生理学的に活性な無毒誘導体を発現するのに有効な条件下で、宿主細胞に導入される。
【００４３】
一つの実施形態においては、発現した神経毒誘導体を、中間領域での切断に有効な条件下で、高度に特異的なプロテアーゼに接触させる。プロペプチドの中間領域は、発現系または宿主細胞に内在するプロテアーゼによって切断されないことが好ましい。
【００４４】
クロストリジウム神経毒の誘導体の発現は、従来の組換技術を用いて、選択発現系内へ、プロペプチドをコードする核酸分子を導入することによって実行可能である。一般に、これは、発現系内へ（通常は存在しない）異種分子である核酸分子を挿入することを伴う。哺乳類の宿主内への特定の外来あるいは天然遺伝子の導入は、最初に、遺伝子配列を適切な核酸ベクター内へ導入することで促進される。本明細書中で用いる「ベクター」は、適切な制御要素と関わらせると複製可能な、かつ細胞間で遺伝子配列を伝達可能な、遺伝因子を意味する。例えば、プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、コスミド、クロモソーム、ウイルス、ウイルス粒子等である。したがって、この用語は、クローニングベクター及び発現ベクターだけでなく、ウイルスベクターも含む。異種核酸分子は、適切なセンス（５'→３'）方向及び正しい読み枠で発現系またはベクター内へ挿入される。ベクターは、挿入されたクロストリジウム神経毒プロペプチドコード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含む。
【００４５】
参照によりその全体が本明細書に援用されるＣｏｈｅｎ及びＢｏｙｅｒ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，２３７，２２４は、制限酵素切断とＤＮＡリガーゼでのライゲーションを用いての、組換えプラスミドの形態での発現系の生成を説明する。これらの組換えプラスミドは、それから形質転換によって導入され、培養で成長させた原核生物および真核細胞を含む単細胞培養物において複製される。
【００４６】
組換え遺伝子が、ウイルスに導入されてもよい。これらのウイルスは、ワクシニアウイルス、アデノウイルス及びレトロウイルス、及びレンチウイルスを含む。組換えウイルスは、ウイルスに感染した細胞内への、プラスミドの形質移入によって生成できる。
【００４７】
適切なベクターは、次のウイルスベクターを含むが、これらに限定されるものではない。例えば、ラムダベクター系ｇｔ１１、ｇｔ  ＷＥＳ．ｔＢ、Ｃｈａｒｏｎ４、また、プラスミドベクター、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫＣ３７、ｐＫＣ１０１、ＳＶ４０、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＳＫ±またはＫＳ±（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡのカタログ"Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ"（１９９３）を参照、これは、参照によりその全体が本明細書に援用される）、ｐＱＥ、ｐＩＨ８２１、ｐＧＥＸ、ｐＦａｓｔＢａｃシリーズ（インヴィトロゲン）、ｐＥＴシリーズ（Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，"Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｔｏ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ，"  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８５（１９９０）を参照、これは、参照によりその全体が本明細書に援用される）、及び、それらの誘導体。組換え分子は、形質転換、特にトランスダクション、接合、可動化またはエレクトロポーレーションを介して細胞に導入できる。ＤＮＡ配列は、参照によりその全体が本明細書に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）に説明されているように、本技術分野における標準クローニング手技を用いて、ベクター内へクローニングする。
【００４８】
プロペプチドをコードする配列を細胞内で発現させるために、種々の宿主-ベクター系を利用してもよい。第一に、ベクター系は、使用宿主細胞との互換性がなければならない。宿主-ベクター系は、以下を含むが、これらに限定されるものではない。バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換させたバクテリア。酵母ベクターを含むイースト等の微生物。ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等）を感染させた哺乳類の細胞系。ウイルス（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫の細胞系。及び、バクテリアを感染させた植物細胞。これらベクターの発現要素は、それらの強さと特異性において異なる。利用する宿主-ベクター系次第で、多数の適切な転写及び翻訳要素のいずれをも使用可能である。
【００４９】
異なる遺伝子シグナル及びプロセシング事象は、多くのレベルの遺伝子発現（例えば、ＤＮＡ転写及びメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）翻訳）をコントロールする。
【００５０】
ＤＮＡの転写は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指示することによってｍＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列であるプロモーターの存在に依存する。真核生物プロモーターのＤＮＡ配列は、原核生物プロモーターのものとは異なる。さらに、真核生物プロモーターと付随する遺伝子シグナルは、原核生物系内では認識されない、あるいは原核生物系内では機能しない可能性がある。そして、さらに、原核生物プロモーターは、真核細胞内では認識されず機能しない。
【００５１】
同様に、原核生物におけるｍＲＮＡの翻訳は、真核生物のそれとは異なる適切な原核生物シグナルの存在に依存する。原核生物内でのｍＲＮＡの効率的な翻訳には、そのｍＲＮＡ上に、シャインダルガーノ（「ＳＤ」）配列と呼ばれるリボソーム結合部位が必要である。この配列は、タンパク質のアミノ末端メチオニンをコードする通常ＡＵＧである開始コドンの前に位置する、ｍＲＮＡの短いヌクレオチド配列である。ＳＤ配列は、１６ＳのｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）の３'−末端と相補的であり、おそらく、リボソームの正しい位置決めを可能にするよう、ｒＲＮＡとの二本鎖形成によってｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進する。遺伝子発現を最大にすることに関する概説は、参照によりその全体が本明細書に援用されるＲｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｌａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６８：４７３（１９７９）を参照されたい。
【００５２】
プロモーターは、それらの「強さ」（すなわち、転写を促進する能力）が異なる。クローニングした遺伝子を発現させるために、遺伝子の高レベルの転写、ゆえに発現を達成するためには、強いプロモーターを用いることが望ましい。利用宿主細胞系に応じて、多数の適切なプロモーターのいずれを用いてもよい。例えば、大腸菌、そのバクテリオファージまたはプラスミドにおいてクローニングする場合は、例えば、ＰＨプロモーター、Ｔ７ファージプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、コリファージラムダ及び、ｌａｃＵＶ５、ｏｍｐＦ、ｂｌａ、ｌｐｐ等（これらに限定されない）を含む他のＰＲ及びＰＬプロモーターなどのプロモーターを、近接ＤＮＡセグメントの高レベルの転写を促すために用いてもよい。加えて、組換えＤＮＡまたは他の合成ＤＮＡ技術によって生成したハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５（ｔａｃ）プロモーターあるいは他の大腸菌プロモーターを、挿入遺伝子の転写を提供するために用いてもよい。
【００５３】
特に誘導されない限りプロモーターの作用が抑制される細菌性宿主細胞株及び発現ベクターを選択してもよい。特定のオペロンでは、挿入ＤＮＡの効率的な転写のために、特異的インデューサーの付加が必要である。例えば、ラックオペロンは、乳糖またはＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−ベータ−Ｄ−ガラクトシド）の付加によって誘導される。種々の他のオペロン、例えばｔｒｐ、ｐｒｏ等は、異なるコントロールの下にある。
【００５４】
原核細胞内における効率的な遺伝子転写及び翻訳のためには、特異的開始シグナルも必要である。これらの転写及び翻訳開始信号は、遺伝子特異的なメッセンジャーＲＮＡと合成されるタンパク質との各々の量によって測定される「強さ」が異なってもよい。プロモーターを含むＤＮＡ発現ベクターは、種々の「強さ」の、転写及び／または翻訳開始シグナルのどの組合せを含んでもよい。例えば、大腸菌の効率的な翻訳には、リボソーム結合部位を提供するために、開始コドン（ＡＴＧ）に対して約７〜９塩基５'側にシャインダルガーノ（「ＳＤ」）配列が必要である。したがって、宿主細胞リボソームによって利用可能な、どんなＳＤ−ＡＴＧの組合せを使用してもよい。そのような組合せは、ｃｒｏ遺伝子またはコリファージラムダのＮ遺伝子からの、あるいは大腸菌トリプトファンＥ、Ｄ、Ｃ、ＢまたはＡ遺伝子からのＳＤ−ＡＴＧの組合せを含むが、それに限定されるものではない。加えて、組換えＤＮＡによって生成した、または合成ヌクレオチドの組み込みを伴う他の技術によって生成したＳＤ−ＡＴＧのどのような組合せを用いてもよい。
【００５５】
利用ベクター系及び宿主に応じて、構成、誘導、抑制プロモーターを含む適切な転写及び／または翻訳要素を幾つ用いてもよい。また、最小の５'プロモーター要素を用いてもよい。
【００５６】
本技術分野において既知である標準クローニング手技を用いて、核酸構築物を準備するために、核酸、選択プロモーター分子、適切な３'制御領域、及び必要に応じて、レポーター遺伝子が、選択ベクター発現系内へ組み込まれる。標準クローニング手技は、例えば、参照によりその全体が本明細書に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）に説明されている。
【００５７】
読み取り枠が、選択プロモーターの制御下でのコードされたプロペプチドの発現のために適切な向きに置かれるように、クロストリジウム神経毒の誘導体をコードする核酸分子は、センス方向（すなわち、５'→３'）でベクターに挿入される。核酸構築物を準備するために、適切なプロモーターの制御下で、このようにして、単一のあるいは複数の核酸が、適切なベクター内へ連結されてもよい。
【００５８】
プロペプチドをコードする単離された核酸分子が発現ベクター内に挿入されたならば、宿主細胞内へ取り込む準備が整う。組換え分子は、形質転換を介して、特にトランスダクション、接合、リポフェクション、プロトプラスト融合、可動化、微粒子銃またはエレクトロポーレーションを介して細胞内へ導入できる。ＤＮＡ配列は、本技術分野において既知である標準クローニング手技を用いて、宿主細胞内へ取り込まれる。標準クローニング手技は、例えば、参照によりその全体が本明細書に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）に説明されている。適切な宿主は、バクテリア、ウイルス、酵母、真菌、哺乳類の細胞、昆虫細胞、植物細胞などを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の好適宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、昆虫細胞及びピキア・パストリス(Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ)細胞を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
典型的に、形質転換細胞のみの選択的増殖に有用な抗生物質または他の化合物を、培地への補助剤として加える。使用すべき化合物は、宿主細胞が形質転換されたプラスミド内に存在する選択可能なマーカー要素によって決定される。適切な遺伝子は、ゲンタマイシン、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール等への抵抗力を授けるものである。同様に、特定可能な化合物の生成のために提供される酵素をコードする「レポーター遺伝子」、または遺伝子送達の結果に関して関連情報を示す他のマーカーも適切である。例えば、異種遺伝子の存在が視覚的に確かめられるよう、種々の発光性または蛍光性レポーター遺伝子も適切である。
【００６０】
本発明の方法を実行する際には、クロストリジウム神経毒の、単離された生理学的に活性な無毒誘導体を対象に接触させることを実行できる。例えば、吸入によって、あるいは皮下注入、静注、筋注、腹膜内注入などの非経口的に、鼻腔内滴下によって、または例えば、鼻、喉及び気管支の粘膜への適用によって、クロストリジウム神経毒の単離された誘導体を対象に投与する。神経毒誘導体は、単独で、あるいは適切な薬学的担体と共に投与されてもよい。また、例えば、錠剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁液またはエマルジョン等の、固体または液体状態であってもよい。
【００６１】
神経毒誘導体は、例えば、不活性希釈剤と一緒に、または吸収可能な食用担体と一緒に、経口投与してもよい。または、堅いあるいは柔らかいシェルカプセルに封じ込めてもよい。あるいは、与圧して錠剤にしてもよい。または、食事の食物に直接入れてもよい。治療的経口投与のために、神経毒誘導体は、賦形剤と統合されてもよく、錠剤、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ等の形態で用いてもよい。一つの実施形態において、調合物は、胃腸管内で神経毒を保護するために、クロストリジウム属が生成するものに類似のヘマグルチニンタンパク質を含む。そのような組成物及び製剤は、少なくとも０．１%の活性化合物を含むべきである。それら組成物の化合物パーセンテージは、もちろん、変化に富んでもよく、単位重量につき簡便には約２%から約６０%でもよい。そのような治療的に有用な組成物の活性化合物の量は、適切な投薬量が得られるものである。
【００６２】
錠剤、カプセル等は、例えばトラガカントガム、アカシア、トウモロコシ澱粉またはゼラチン等の結合剤、リン酸二カルシウム等の賦形剤、例えばトウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、アルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、及び例えばショ糖、乳糖またはサッカリン等の甘味料を含んでもよい。単位投与形態がカプセルである場合は、上記タイプの物質に加えて、例えば脂肪油などの液体担体を含んでもよい。
【００６３】
他の様々な物質をコーティングとして、または投与単位の物理的形状を改変するために存在させてもよい。例えば、錠剤は、シェラック、砂糖、またはこれらの両方で被覆してもよい。シロップは、活性成分に加えて、甘味料としてショ糖、防腐剤としてメチル及びプロピルパラベン、色素、及び例えばサクランボまたはオレンジ味などの香料を含んでもよい。
【００６４】
神経毒誘導体は、非経口的に投与されてもよい。例えばヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤を水に適切に混ぜ合わせて、溶液または懸濁液を調製できる。また、グリセリン、液体ポリエチレングリコール及び油中でのそれらの混合物においてディスパージョンも調製できる。油の例としては、石油、動物、植物または合成起源のものがあり、例えば、ピーナッツ油、大豆油または鉱物油もある。概して、水、食塩水、水性デキストロース及び関連糖溶液、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のグリコールは、特に注射可能な溶液のための好適な液体担体である。通常の貯蔵及び使用条件下では、これらの製剤は、微生物の成長を阻止する防腐剤を含む。
【００６５】
注射使用に適切な薬学的形態は、無菌の注射可能な溶液またはディスパージョンの即座の製剤のための、滅菌水性溶液またはディスパージョン及び無菌粉末を含む。すべてのケースにおいて、その形態は、無菌でなければならない。また、注射可能である程度までの流体でなければならない。それは、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならない。また、例えばバクテリア及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存が可能である。担体は、例えば、水、エチルアルコール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）、植物油、ヒアルロン酸及びそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい。
【００６６】
神経毒誘導体はまた、エアロゾルの形態で、気道に直接投与してもよい。エアロゾルとしての用途のために、溶液または懸濁液の神経毒誘導体は、従来の補助剤と共に、適切な噴霧剤、例えば、プロパン、ブタンまたはイソブタン等の炭化水素噴霧剤と一緒に、加圧エアロゾル容器内に収納されてもよい。神経毒誘導体は、また、例えば、ネブライザーまたはアトマイザーを用いて非加圧形態でも投与できる。
【００６７】
ＢｏＮＴは、破壊されることなく、あるいは局所毒性を生じることなく上皮表面を通過する。この上皮通過は、特異的結合及び経細胞輸送によって生ずると考えられる。無傷のＢｏＮＴ  Ａが肺上皮を通過しタンパク分解性不活化に抵抗する能力は、ラット初代肺胞上皮細胞で、また、不死化ヒト肺腺癌（Ｃａｌｕ−３）細胞で実証された。輸送の速度は、基底側から頂端への方向よりも頂端から基底側への方向で大きく、また、セロタイプ特異性毒素抗体によって妨げられた（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ  ｂｙ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  ａｎｄ  Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｉｔｓ  Ｈｅａｖｙ−Ｃｈａｉｎ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，"  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：１１４７−１１５４（２００３）、これは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００６８】
ＣＮＳを対象とする場合は、髄腔内または心室内投与が必要な場合がある。投与は、直接ＣＮＳに実行してもよい。代わりに、ＣＮＳへの投与は、周縁神経細胞（運動神経、侵害受容体）から脊髄神経節への逆行性輸送が関与してもよい（Ｃａｌｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  Ｒｅａｐｐｒａｉｓａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ：Ｂｙ  Ｗｈａｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ？"  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０９：１５−２４（２００９）、これは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００６９】
本発明のクロストリジウム神経毒の誘導体は、野生型クロストリジウム神経毒（例えば、ＢＯＴＯＸ（登録商標））の内在性薬学的活性を増大させるために、例えば併用療法として使用できる。
【００７０】
クロストリジウム神経毒の誘導体は、薬学的に許容可能な水溶性ポリマー部分とのコンジュゲートとして投与できる。実施例として、ポリエチレングリコールコンジュゲートは、治療化合物の循環中の半減期を増加させ、その分子の免疫原性を減少させるのに有用である。特異的ＰＥＧコンジュゲートは、参照によりその全体が本明細書に援用されるＤａｕｇｓ  ｅｔ  ａｌ．,  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．２００６／００７４２００に説明されている。他のコンジュゲートは、各々のその全体が参照により本明細書に援用されるＴａｙｌｏｒ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．７，８７９，３４１及びＢｌａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．,  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０１２／０１４１５３２に説明されているＨＡを含む。液体形態は、リポソームカプセル剤を含み、注射可能な溶液及び懸濁液として説明される。代表的な固体形態は、カプセル、錠剤及び制御放出剤形、例えばミニ浸透圧ポンプまたはインプラント等を含む。他の剤形は、例えば、各々のその全体が参照により本明細書に援用されるＡｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｐｏｐｏｖｉｃｈ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ&Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０）、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９５）及びＲａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６）に示されているように、当業者が考案できる。
【００７１】
一つの実施形態によれば、治療は、皮膚科的または美容的な処置（例えば、参照によりその全体が本明細書に援用されるＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｉｄ  ａｎｄ  Ｌｏｗｅｒ  Ｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｎｅｃｋ，"  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｃｌｉｎ．２２：１５１−１５８（２００４）、Ｌａｎｇ，"Ｈｉｓｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  ＢＯＴＯＸ（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ），"  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔｓ  Ｃａｓｅ  Ｍａｎａｇ．９：１０９−１１２（２００４）、Ｎａｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ：Ａ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ｍｅｔａ−Ａｎａｌｙｓｉｓ，"  Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｏｐｉｎ．２０：９８１−９９０（２００４）、Ｖａｒｔａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｆａｃｉａｌ  Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ａ：Ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ｕｐｄａｔｅｓ，"  Ｆａｃｉａｌ  Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．２０：１１−１９（２００４）を参照）ならびに治療的な処置（例えば、Ｂｅｎｔｓｉａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｏｎｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ，"  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２２：８２−８８（２００４）、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｏｔｏｘ：Ｂｅｙｏｎｄ  Ｗｒｉｎｋｌｅｓ，"  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２２：８９−９３（２００４）、Ｊａｎｋｏｖｉｃ，"Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，"  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ７５：９５１−９５７（２００４）、Ｋｌｅｉｎ，"Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ，"  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｕｒｇ．３０：４５２−４５５（２００４）、Ｓｃｈｕｒｃｈ，"Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，"  Ｄｒｕｇｓ  Ｔｏｄａｙ（Ｂａｒｃ）４０：２０５−２１２（２００４）を参照）を意味する。
【００７２】
本発明の方法に従う治療の対象は、ヒト及びヒト以外の霊長類、または他の動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギまたは齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
本発明の好適な治療方法は、皮膚科的あるいは美容的な治療、胃腸科的治療、生殖器泌尿器科的治療、神経学的治療、腫瘍学的治療及び／またはシナプス病理学によって診断可能な症状の治療を含むが、これらに限定されない（例えば、参照によりその全体が本明細書に援用されるＢｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｙｎａｐｔｏｐａｔｈｉｅｓ：Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，"  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３８：４４３−４４４（２０１０）、Ｙｕ&Ｌｕ，"Ｓｙｎａｐｓｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｓｐｉｎｅｓ  ａｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｒｉｍｅｒ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，"  Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ２０１２：１−８（２０１２）、Ｓｉｓｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ｏｆ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｖａｒｉｃｏｓｉｔｉｅｓ  Ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ｏｆ  Ｐｒｉｏｎ−Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｍｉｃｅ，"  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３８：４７１−４７５（２０１０）、Ｗａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｏｒｓｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ＤＹＴ１  Ｄｙｓｔｏｎｉａ：Ａ  Ｓｙｎａｐｔｏｐａｔｈｙ？"  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３８：４５２−４５６（２０１０）、Ｒｏｚａｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，"  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３８：４８８−４９２（２０１０）、及びＪｏｎｅｓ，"Ｅｒｒａｎｔ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅｓ：Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ，"  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３８：５１６−５２１（２０１０）を参照）。シナプス病理学によって診断可能な症状の治療は、神経毒誘導体によるシナプスの神経調節を伴ってもよい。
【００７４】
皮膚科的あるいは美容的な治療は、ライタイド（Ｒｈｙｔｉｄｅ、しわ）の治療（参照によりその全体が本明細書に援用されるＳａｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆａｃｉａｌ  Ｒｈｙｔｉｄｅｓ，"  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｃｌｉｎ．２２：２２１−２２６（２００４））を含むが、これに限定されない。しわの治療は眉間（参照によりその全体が本明細書に援用されるＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  ｔｙｐｅ  Ａ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｌａｂｅｌｌａｒ  Ｒｈｙｔｉｄｅｓ，"  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｃｌｉｎ．２２：１３７−１４４（２００４）、Ｏｚｓｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｗｏ−Ｐｌａｎｅ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｅｘｏｔｏｘｉｎ  Ａ  ｉｎ  Ｇｌａｂｅｌｌａｒ  Ｆｒｏｗｎ  Ｌｉｎｅｓ，"  Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ  Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．２８：１１４−１１５（２００４））、首筋（参照によりその全体が本明細書に援用されるＢｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｃｋ  Ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｎｅｃｋ  Ｂａｎｄｓ，"  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｃｌｉｎ．２２：１５９−１６６（２００４））、目じりの小じわ（参照によりその全体が本明細書に援用されるＬｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ａ：Ａ９−Ｍｏｎｔｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ３Ｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｐｒｏｆｉｌｏｍｅｔｒｉｃ  Ｃｒｏｗ'ｓ  Ｆｅｅｔ  Ｗｒｉｎｋｌｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ，"  Ｊ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｌａｓｅｒ  Ｔｈｅｒ．６：１６−２０（２００４））、及び額輪郭（参照によりその全体が本明細書に援用されるＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｌｔｅｒｉｎｇ  Ｂｒｏｗ  Ｃｏｎｔｏｕｒ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ，"  Ｆａｃｉａｌ  Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．１１：４５７−４６４（２００３））を含む。他の皮膚科的治療は、肥大性咀嚼筋（参照によりその全体が本明細書に援用されるＡｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓｅｔｅｒ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｓｉａｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ，"  Ａｒｃｈ．Ｆａｃｉａｌ  Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．６：１８８−１９１（２００４））、局所多汗症（参照によりその全体が本明細書に援用されるＧｌｏｇａｕ，"Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｈｉｄｒｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ，"  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｃｌｉｎ．２２：１７７−１８５，vii（２００４））に対する治療を含む。局所多汗症は、腋の下（参照によりその全体が本明細書に援用される"Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ（Ｂｏｔｏｘ）ｆｏｒ  Ａｘｉｌｌａｒｙ  Ｈｙｐｅｒｈｉｄｒｏｓｉｓ，"  Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔ．Ｄｒｕｇｓ  Ｔｈｅｒ．４６：７６（２００４））及び生殖器（参照によりその全体が本明細書に援用されるＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  Ｃａｓｅ  ｏｆ  Ｆｏｕｌ  Ｇｅｎｉｔａｌ  Ｏｄｏｒ  Ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ａ，"  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｕｒｇ．���０：１２３３−１２３５（２００４））を含む。
【００７５】
胃腸科的治療は、食道運動障害（参照によりその全体が本明細書に援用されるＡｃｈｅｍ，"Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｐａｓｔｉｃ  Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，"  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．３３：１０７−１２４（２００４））、咽頭食道痙攣（参照によりその全体が本明細書に援用されるＢａｙｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｏｉｃｅ−Ｌｉｍｉｔｉｎｇ  Ｐｈａｒｙｎｇｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  Ｓｐａｓｍ，"  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．３７：５４７−５５８（２００４）、Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｈａｒｙｎｇｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  Ｓｐａｓｍ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｔｏｘ，"  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．３７：５５９−５６６（２００４））、及び裂肛（参照によりその全体が本明細書に援用されるＢｒｉｓｉｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｔｏ  Ｔｒｅａｔ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ａｎａｌ  Ｆｉｓｓｕｒｅ：Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  'Ｂｏｔｏｘ  ｖｓ．Ｄｙｓｐｏｒｔ'  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｔｒｉａｌ，"  Ａｉｌｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９：６９５−７０１（２００４）、Ｊｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ａ  ｉｎ  Ａｎａｌ  Ｆｉｓｓｕｒｅ：Ｗｈｙ  Ｄｏｅｓ  ｉｔ  Ｗｏｒｋ？"  Ｄｉｓ．Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ４７：２５７−２５８（２００４））の治療を含むが、これらに限定されない。
【００７６】
生殖器泌尿器科的治療は、尿路の神経性機能障害（参照によりその全体が本明細書に援用される"Ｂｏｔｕｌｉｎｉｃ  Ｔｏｘｉｎ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｏｗｅｒ  Ｕｒｉｎａｒｙ  Ｔｒａｃｔｓ，"  Ｕｒｏｌｏｇｉａ  Ｊｕｌ−Ａｕｇ：４４−４８（２００４）、Ｇｉａｎｎａｎｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｉｎｉｆｅｒａｔｏｘｉｎ  Ｖｅｒｓｕｓ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ−Ａ  Ｔｏｘｉｎ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  Ｄｅｔｒｕｓｏｒ  Ｏｖｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ：Ａ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｓｔｕｄｙ，"  Ｊ．Ｕｒｏｌ．１７２：２４０−２４３（２００４）、Ｒｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｏｐｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  Ｄｅｔｒｕｓｏｒ  Ｏｖｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ，"  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  ４２：２６７−２７２（２００４））、過活動膀胱（参照によりその全体が本明細書に援用されるＣｒｕｚ，"Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｎｅｗ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｏｖｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｂｌａｄｄｅｒ，"  Ｕｒｏｌｏｇｙ  ６３：６５−７３（２００４））、及び切迫性尿失禁の神経調節（参照によりその全体が本明細書に援用されるＡｂｒａｍｓ，"Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｕｒｉｎａｒｙ  Ｕｒｇｅ  Ｉｎｃｏｎｔｉｎｅｎｃｅ，"  ＢＪＵ  Ｉｎｔ．９３：１１１６（２００４））のための治療を含むが、これらに限定されない。
【００７７】
神経学的治療は、トゥーレット症候群（参照によりその全体が本明細書に援用されるＰｏｒｔａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｈｏｎｉｃ  Ｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｏｕｒｅｔｔｅ'ｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ，"  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．２４：４２０−４２３（２００４））及び局所の筋肉痙縮またはジストニア（参照によりその全体が本明細書に援用されるＭａｃＫｉｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｏｒｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ  Ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ  Ａｃｃｏｍｐａｎｙｉｎｇ  Ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  Ｗｒｉｓｔ  Ｍｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｄｙｓｔｏｎｉａ，"  Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．１９：２７３−２８４（２００４））の治療を含むが、これらに限定されない。筋肉痙縮またはジストニアの治療は、痙性斜頚（参照によりその全体が本明細書に援用されるＨａｕｓｓｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｆｏｌｌｏｗ−Ｕｐ  ｏｆ  Ｃｅｒｖｉｃａｌ  Ｄｙｓｔｏｎｉａ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ａ，"  Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．１９：３０３−３０８（２００４））、原発性眼瞼痙攣（参照によりその全体が本明細書に援用されるＤｅｆａｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｂｌｅｐｈａｒｏｓｐａｓｍ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，"  Ｄｒｕｇｓ  ６４：２３７−２４４（２００４））、片側顔面痙攣、脳卒中後（参照によりその全体が本明細書に援用されるＢａｋｈｅｉｔ，"Ｏｐｔｉｍｉｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｏｓｔ−Ｓｔｒｏｋｅ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ，"  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ７５：６６５−６６６（２００４））、痙攣性発声障害（参照によりその全体が本明細書に援用されるＢｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｐｅｅｃｈ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｉｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｅｖｅｒｅ  Ａｄｄｕｃｔｏｒ  Ｓｐａｓｍｏｄｉｃ  Ｄｙｓｐｈｏｎｉａ，"  Ｊ．Ｓｐｅｅｃｈ  Ｌａｎｇ．Ｈｅａｒ  Ｒｅｓ．４７：２１−３２（２００４））、顔面神経障害（参照によりその全体が本明細書に援用されるＦｉｎｎ，"Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ：Ｆｉｎｅ−Ｔｕｎｉｎｇ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆａｃｉａｌ  Ｎｅｒｖｅ  Ｉｎｊｕｒｙ，"  Ｊ．Ｄｒｕｇｓ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．３：１３３−１３７（２００４））、及びラスムッセン症候群（参照によりその全体が本明細書に援用されるＬｏｚｓａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ａ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｉｎｖｏｌｕｎｔａｒｙ  Ｌｉｍｂ  Ｍｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，"  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６２：１２３３−１２３４（２００４））の治療を含むが、これらに限定されない。他の神経学的治療は、切断痛（参照によりその全体が本明細書に援用されるＫｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ｂ  ｏｎ  Ｓｔｕｍｐ  Ｐａｉｎ  ａｎｄ  Ｉｎｖｏｌｕｎｔａｒｙ  Ｍｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｍｐ，"  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｈａｂｉｌ．８３：３９６−３９９（２００４））、声の震え（参照によりその全体が本明細書に援用されるＡｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｖｏｉｃｅ  Ｔｒｅｍｏｒ，"  Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６１：１４１６−１４２０（２００４））、ワニの涙症候群（参照によりその全体が本明細書に援用されるＫｙｒｍｉｚａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｒｅｙ  ａｎｄ  Ｃｒｏｃｏｄｉｌｅ  Ｔｅａｒｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，"  Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ．Ｓｕｒｇ．６２：８４０−８４４（２００４））、辺縁性下顎神経麻痺、疼痛管理及び抗痛覚効果（参照によりその全体が本明細書に援用されるＣｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ａ  Ｒｅｄｕｃｅｓ  Ｆｏｒｍａｌｉｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐａｉｎ，"  Ｐａｉｎ  １０７：１２５−１３３（２００４）及びＦｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．,  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０１２／００６４０５９）の治療を含む。疼痛管理は、乳房切除術後の疼痛（参照によりその全体が本明細書に援用されるＬａｙｅｅｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐａｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ａｆｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｃｔｏｍｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，"  Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２４０：６０８−６１３（２００４））及び食道由来の胸痛（参照によりその全体が本明細書に援用されるＳｃｈｕｍｕｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｅｓｔ  Ｐａｉｎ  ｏｆ  Ｐｒｅｓｕｍｅｄ  Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  Ｏｒｉｇｉｎ，"  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．３３：９３−１０５（２００４））の管理を含むが、これらに限らない。本発明の方法が有効な別の神経学的治療には、頭痛がある（参照によりその全体が本明細書に援用されるＢｌｕｍｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｇｒａｉｎｅ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｈｅａｄａｃｈｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，"  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｃｌｉｎ．２２：１６７−１７５（２００４））。
【００７８】
本発明の方法は、脳性麻痺（参照によりその全体が本明細書に援用されるＢａｌｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｐａｌｓｙ，"  Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ａｄｖ．１３：７６−８０（２００４）、Ｂｅｒｗｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  ｉｎ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ（Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｐａｌｓｙ），"  Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．１９：Ｓ１６２−Ｓ１６７（２００４）、Ｐｉｄｃｏｃｋ，"Ｔｈｅ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｐａｌｓｙ，"  Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１４５：Ｓ３３−Ｓ３５（２００４））、多発性硬化症における臀部内転筋機能障害（参照によりその全体が本明細書に援用されるＷｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｉｐ  Ａｄｄｕｃｔｏｒ  Ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，"  Ｗｉｅｎ  Ｋｌｉｎ  Ｗｏｃｈｅｓｎｃｈｒ  ４：２０−２４（２００１））、関節炎、医原性耳下腺唾液腺粘液腫を含む神経痛及び炎症（参照によりその全体が本明細書に援用されるＣａｐａｃｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉａｔｒｏｇｅｎｉｃ  Ｐａｒｏｔｉｄ  Ｓｉａｌｏｃｅｌｅ，"  Ａｎｎ．Ｏｔｏｌ．Ｒｈｉｎｏｌ．Ｌａｒｙｎｇｏｌ．１１３：５６２−５６４（２００４））、ならびに慢性ＴＭＪの疼痛及び転位（参照によりその全体が本明細書に援用されるＡｑｕｉｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｂｉｌａｔｅｒａｌ  Ｔｅｍｐｏｒｏｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  Ｊｏｉｎｔ  Ｄｉｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｔｅｒｍａｘｉｌｌａｒｙ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ａ，"Ｂｒ．Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ．Ｓｕｒｇ．４２：２７２−２７３（２００４））の治療にも適切である。薬学的に活性な神経毒誘導体の局所制御送達によって治療できる他の症状は、関節炎の治療のための関節内投与（参照によりその全体が本明細書に援用されるＭａｈｏｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａ−Ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ＢｏＮＴ  Ａ  ｆｏｒ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｊｏｉｎｔ  Ｐａｉｎ，"  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（２００４））、及び関節拘縮の治療のための局所投与（参照によりその全体が本明細書に援用されるＲｕｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｐａｌｓｙ：Ａ  Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ａ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  ｉｎ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，"  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ  Ｓｕｐｐｌ．６：Ｓ１８１−Ｓ１９３（１９９７）、Ｐｕｃｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｏｔｕｌｉｎｉｃ  Ｔｏｘｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｆｉｘｅｄ−Ｆｌｅｘｉｏｎ  Ｋｎｅｅ  Ｄｅｆｏｒｍｉｔｙ，"  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２００４））を含む。本発明の方法は、また、参照によりその全体が本明細書に援用される以下の文献に説明されるように、侵害受容体及び関連臨床症候群の増感によって特徴づけられる種々の状態に関わる痛みの治療に適切である。Ｂａｃｈ−Ｒｏｊｅｃｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｎｔｉｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ  Ｉｎ  Ｒａｔ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ  ａｎｄ  Ｃａｐｓａｉｃｉｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐａｉｎ，"  Ｃｒｏａｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．４６：２０１−２０８（２００５）、Ａｏｋｉ，"Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ  ｉｎ  Ｐａｉｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，"  Ｈｅａｄａｃｈｅ  ４３  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ９−１５（２００３）、Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ａ  Ｒｅｄｕｃｅｓ  Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  Ｆｌａｒｅ  Ｂｕｔ  Ｈａｓ  Ａｌｍｏｓｔ  Ｎｏ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  Ｐａｉｎ  ａｎｄ  Ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｉｎ，"  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５０：１８８−１９３（２００３）、Ｂｌｅｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ：Ａ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ，Ｄｏｕｂｌｅ−Ｂｌｉｎｄ，Ｐｌａｃｅｂｏ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｓｔｕｄｙ，"  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．２０５：５９−６３（２００２）。
【００７９】
神経毒誘導体は、治療性能を最適化するためにカスタマイズされてもよい（参照によりその全体が本明細書に援用される、例えば、Ｃｈａｄｄｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，ａｎｄ  Ａｎｔｉｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｐａｉｎ，"  Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．８：Ｓ４２−Ｓ４７（２００４）、Ｆｉｎｎ，"Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ：Ｆｉｎｅ−Ｔｕｎｉｎｇ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆａｃｉａｌ  Ｎｅｒｖｅ  Ｉｎｊｕｒｙ，"  Ｊ．Ｄｒｕｇｓ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．３：１３３−１３７（２００４）、Ｅｌｅｏｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ，"  Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．８：Ｓ５３−Ｓ５９（２００４）、Ｆｌｙｎｎ，"Ｍｙｏｂｌｏｃ，"  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｃｌｉｎ．２２：２０７−２１１（２００４）、及びＳａｍｐａｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｒａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｋｅｔｅｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ，"  Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．８：Ｓ１２９−Ｓ１３６（２００４）を参照）。
【００８０】
クロストリジウム神経毒の誘導体は、シナプス構造内の活性依存変化によって影響を受ける病気（例えば、シナプス病）またはシナプス形成器官の活動過多（例えば、チューブリン重合）、及び微小管の増殖に関連する症状を治療するのに、本発明の治療方法に従って用いてもよい。例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病及び（神経及び神経膠由来の）神経細胞癌。本発明の方法によって治療可能な他の症状は、シナプス複合体が病気の標的である症状を含む。
【００８１】
一つの実施形態においては、本発明の神経毒誘導体は、神経細胞の細胞質ゾル内に、野生型クロストリジウム神経毒に比べ、より多量に貯まる。
【実施例】
【００８２】
実施例１  ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０に関するインビボでの薬学的活性実験
物質及び方法
（参照によりその全体を本明細書に援用する）Ｉｃｈｔｃｈｅｎｋｏ及びＢａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．７，７８５，６０６に説明のクロストリジウムボツリナムセロタイプＡ（「ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ」）の無毒性誘導体を、説明に従い、発現させた。この神経毒誘導体は無毒であり、そのＮ末端にカーゴ付着ペプチド配列を有しないため、「ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０」と呼ぶことにした。この場合、本明細書で説明するように、「ａｄ−０」は、カーゴ部位なし（０）の無毒性誘導体を意味する。ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０は、参照によりその全体を本明細書に援用するＢａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ａ  Ｅｎｇｉｎｇｅｅｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，"  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ&Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ７１：６２（２０１０）に説明されているように、電気泳動で均一になるよう精製し、特異的プロテアーゼ切断によって活性化させた。精製タンパク質は、安定化のための４０%グリセリンを含むＰＢＳ内に１０ｍｇ／ｍｌの濃度のストックとして調製した。下記に説明の試験は、組換え分子の毒性と薬理学的活性を評価するものである。
【００８３】
動物
マウス：雌のＢａｌｂ／Ｃマウス、５〜７週齢、体重約１９±３グラム。
【００８４】
指外転評価（ＤＡＳ）アッセイ
筋肉虚弱効果によって測定される、筋肉における局所薬理学的活性を測定するために、古典的なマウス指外転評価（「ＤＡＳ」）アッセイの改変を、参照によりその全体が本明細書に援用されるＡｏｋｉ，"Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ＢＯＴＯＸ（登録商標）（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ）−Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｏｔｈｅｒ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，"  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９９）に説明されているように用いた。ＤＡＳアッセイにおいては、特徴的驚愕反応を引き出すために短時間、マウスは尾でつるされる。その反応では、マウスは後足を伸ばして後指を外転させる。ＤＡＳアッセイは、異なるＢｏＮＴ製剤の筋肉虚弱効果を比較するために、特に有用である（参照によりその全体が本明細書に援用されるＡｏｋｉ，"Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ＢＯＴＯＸ（登録商標）（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ）−Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｏｔｈｅｒ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，"  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９９）及びＡｏｋｉ，"Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｍａｒｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  Ａ，Ｂ，ａｎｄ  Ｆ  Ｉｎ  Ｍｉｃｅ，"  Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３９：１８１５−１８２０（２００１））。
【００８５】
このテストは、マウスにおけるＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０の薬理活性を定義するために利用した。マウスは、注入された脚のすべての指を完全に伸ばすことができない場合、陽性のＤＡＳ反応を持つとスコア付けされた。注入されていない脚と同じ程度に注入された脚の足指を広げるマウスには、陰性スコアが付与された。
【００８６】
雌のＢａｌｂ／Ｃマウスには、２５μｌハミルトンシリンジを使って、３μｌ量の０．９%ＮａＣｌを、説明された濃度で、片側の腓腹筋に筋肉内注射を行った。注入後１日目から５日目まで、特徴的驚愕反応を引き出すためにマウスをつるし、そして注入された脚の足指が注入されていない脚に比べ広がっているかどうかを観察することによって、筋力低下を評価した。
【００８７】
麻痺の測定
明確な麻痺を、二つの独立変数を使って表す。第一は、歩くのに注入された脚を使うことができない（麻痺）。第二は、注入された脚の足指を広げること（指の外転）ができない。
【００８８】
結果：毒性、ＬＤ５０
上記説明のＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０製剤は、次の毒性試験のために使用した。試験は、野生型ＢｏＮＴ  Ａ（「ｗｔ  ＢｏＮＴ  Ａ」）のための標準的なマウスＬＤ５０テストに近似するようデザインされた。
【００８９】
この試験には、合計３０匹の雌のマウスを使用した。各マウスの腹膜内に、２００μｌのＰＢＳ中のＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０を、示した用量（表１）で注射し、２４時間観察した。
【００９０】
参照によりその全体が本明細書に援用されるＰｅｌｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｔｏｘｉｃ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ａ，"  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ４０５（４）：６７３−６７７（２０１１）に公表されたＬＤ５０に基づき、０．５μｇ／マウス〜２μｇ／マウスの範囲の用量で、ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ（１．２μｇ／マウス、すなわち５０μｇ／ｋｇ体重）を使用した。ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０に関するＬＤ５０は、ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄに関するものと非常に類似していることが分かった（表１）。簡潔に述べれば、５０μｇ／ｋｇ体重の用量が注入された１０匹のマウスの５０%、すなわち５匹は、３６時間までにボツリヌス菌中毒症状を示した。約８３．３μｇ／ｋｇ体重である２μｇの用量が注入されたすべてのマウスは、４８時間以内に息絶えた。この試験からの結論は、５０μｇ／ｋｇ体重が、ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０のおよそのＬＤ５０である。
【００９１】
（表１）ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０に関する毒性（ＬＤ５０）試験の結果
2019214575.tif 000003
【００９２】
ｗｔ  ＢｏＮＴ  ＡのＬＤ５０は、約０．５ｎｇ／ｋｇである（参照によりその全体が本明細書に援用されるＡｏｋｉ，"Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｍａｒｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  Ａ，Ｂ，ａｎｄ  Ｆ  Ｉｎ  Ｍｉｃｅ，"  Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３９：１８１５−１８２０（２００１））、すなわちＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０のそれよりも１００，０００倍の低さである。この毒性、非常に低い用量でのｗｔ  ＢｏＮＴ  Ａの効果、及び野生型細菌源から生成したＢｏＮＴの効力の不均一性のために、ｗｔ  ＢｏＮＴ  Ａの薬理学的用量は、一般に、用語「活性単位」で明記され、ｗｔ  ＢｏＮＴ  Ａのマウスでの１ＬＤ５０が、１活性単位、すなわち約０．５ｎｇ／ｋｇのｗｔ  ＢｏＮＴ  Ａであると見なされている（参照によりその全体が本明細書に援用されるＡｏｋｉ，"Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｍａｒｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  Ａ，Ｂ，ａｎｄ  Ｆ  Ｉｎ  Ｍｉｃｅ，"  Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３９：１８１５−１８２０（２００１））。これは、製剤及びメーカ間での活性毒素レベルにおける濃度変動を考慮している。生産者間で同意した標準規格は、未決定のままである。これは、製造法の違い及びバッチ間変動の両方に原因があるが、マーケティング上の主張にも関連する。最終的な薬学的調整物は、アルブミン（ＢＯＴＯＸ（登録商標））及び／または乳糖（Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標））で調製される。本明細書で説明するＬＤ５０結果からの結論は、ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０の１ＬＤ５０単位（１Ｕ）は、約５０μｇ／ｋｇ、すなわちマウス1匹あたり約１．２μｇの用量に一致する。
【００９３】
結果：インビボ薬理学的活性に関する筋肉麻痺試験／ＤＡＳアッセイ
ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０が、そのＬＤ５０をかなり下回る用量で薬理活性を持つかどうか、また、典型的な用量反応活性を示すかどうかを判定するために、上記説明のＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０を、マウスＤＡＳでテストした。マウスの腓腹筋に、２５μｌハミルトンシリンジを使用して、３μｌの、ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０を含む０．９%ＮａＣｌを注入した。投与用量は、マウスにつき投与されるμｇ、あるいはマウスにつき投与されるＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０活性の単位で表す（表２）。
【００９４】
ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０の投与によって誘起される筋肉麻痺に陽性であるとしてマウスを分類するために、二つの観察点に注目する。第一は、マウスが注入された脚を歩くことに使えない（筋肉麻痺）。第二は、注入された脚の指が虚脱したように見える（指の外転）かどうかを観察。明確な筋肉麻痺が、初期投与の２４時間後に初めて観察され、記録された。明確な筋肉麻痺について、最高５日間、マウスを毎日評価した。
【００９５】
ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０のこの薬理学的試験の結果を、表２及び図２に示す。０．００８ＬＤ５０単位（０．０１μｇ）〜０．４２ＬＤ５０単位（０．５μｇ）の範囲の用量でＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０を投与したマウスは、致命的な症状が現れずに、明確な筋肉麻痺及び指の外転を示した（図２及び表２）。実際、０．０１μｇが注入された５匹の動物のうちの４匹は、筋肉麻痺と、ある程度の指の外転を呈した（表２）。このことは、ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０に関するＥＤ５０、すなわち、注入動物の５０%が目的の薬理学的活性を現す最低用量が、０．０１μｇ以下であることを示す。これは、０．００８ＬＤ５０単位以下に当たる。１日目に麻痺を提示したすべてのマウスは、試験の終わり（５日目）まで麻痺を提示し続けた。全身毒性の痕跡は、どのマウスにも、この試験では全く観察されなかった。
【００９６】
これらのデータは、用量反応プロフィール、有意に増加した安全な治療的活性の範囲、それ故の改善された治療指数、及び改善された安全域と共にではあるが、ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０が、ｗｔ  ＢｏＮＴ  Ａに類似の薬学的性質を持つことを確証する。ｗｔ  ＢｏＮＴの薬学的調整物に関するＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０のこの比較を表３に示し、参照によりその全体が本明細書に援用されるＡｏｋｉ，"Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｍａｒｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  Ａ，Ｂ，ａｎｄ  Ｆ  Ｉｎ  Ｍｉｃｅ，"  Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３９：１８１５−１８２０（２００１）で報告されているデータに対比させている。例えば、参照によりその全体が本明細書に援用されるＡｏｋｉ，"Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｍａｒｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  Ａ，Ｂ，ａｎｄ  Ｆ  Ｉｎ  Ｍｉｃｅ，"  Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３９：１８１５−１８２０（２００１）は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）の安全域が、約１３．９±１．７であり、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）の安全域が、７．６±０．９であると報告している。本明細書は、試験したＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０の最低用量、０．０１μｇで、明確な麻痺が、４／５のマウスに観察されたことを示す。この用量は、ＥＤ５０の控え目な推定と考察できる。したがって、ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０にとっての安全域は、約１２０である。別の表現をすれば、ＢＯＴＯＸ（登録商標）またはＤｙｓｐｏｒｔ（登録商標）のものよりも約１０倍も良い（表３）。
【００９７】
（表２）ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０の薬理学的試験の結果
2019214575.tif 000004
ナイーブマウスの左腓腹筋内に、筋肉内注射により、ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０を、示した量または単位のＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０を含む３μｌで投与した。
【００９８】
（表３）ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０のＬＤ５０及びＥＤ５０
2019214575.tif 000005
【００９９】
単位として表した場合、ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０のＥＤ５０は、０．００８ＬＤ５０単位以下である。
【０１００】
先行研究及び結論との比較
先行研究は、組換えＢｏＮＴ  Ａ／ａｄの軽鎖に導入された変異（参照によりその全体が本明細書に援用されるＩｃｈｔｃｈｅｎｋｏ及びＢａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２０１１／０２０６６１６に説明されたカーゴ付着ペプチドを含む分子）が、毒素のＬＤ５０を１００，０００倍上昇させることを発見した。特に、各動物に繰り返し用量投与を行う２ヵ月前に、（治療薬を含まない）ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄの０．５μｇ（ｎ＝２５）または１μｇ（ｎ＝１５）を、脛骨筋に注射した。示した量のＢｏＮＴ  Ａ／ａｄを含む３μｌからなる繰り返し用量、１μｇ（ｎ＝１８）または２μｇ（ｎ＝２０）を、脛骨筋に同じように注入した。これらのデータ（表４及び表５）は、繰り返し治療でＢｏＮＴ  Ａ／ａｄへの免疫耐性が発達しないことを示唆する。
【０１０１】
（表４）ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄは麻痺を誘起する
2019214575.tif 000006
１．２μｇが、この実験から推定されるＢｏＮＴ  Ａ／ａｄの筋肉内注射に関する明白なＬＤ５０である。
【０１０２】
（表５）ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄの再注入後の麻痺効果
2019214575.tif 000007
【０１０３】
今回の試験で、ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄと同一の毒素不活化変異があるＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０のＬＤ５０は、同様に、ｗｔ  ＢｏＮＴ  Ａに比べ、約１００，０００倍に上昇することが発見された。しかし、驚くべきことに、ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０が、それでも、ｗｔ  ＢｏＮＴ  Ａで観察されるものと類似の薬理学的活性を持つこと、及び治療的効果を生じさせるために、治療薬を、ＢｏＮＴ／Ａ  ａｄのカーゴ部位を介して送達する必要がないことが観察された。ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０の用量反応を、ｗｔ  ＢｏＮＴ  Ａの薬学的調整物に対して報告されているものと比較すると、ＢｏＮＴ  Ａ／ａｄ−０は、薬学的治療に、ｗｔ  ＢｏＮＴと同様に使用できるが、全身毒性の危険性を有意に減少させるため、臨床使用の安全性が有意に改善されるという利益を得る、と結論できる。
【０１０４】
説明目的で、本発明を詳述したが、そのような詳細は、単にその目的のためであるということは明らかである。それに対して当業者は、次の請求項によって定義される発明の主旨及び範囲から逸脱することなく、変更を加えることができる。
【図１Ａ】
2019214575.tif 000008
【図１Ｂ】
2019214575.tif 000009
【図１Ｃ】
2019214575.tif 000010
【図２】
2019214575.tif 000011
【配列表】
2019214575000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月6日(2019.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型クロストリジウムボツリナム（Clostridium botulinum）神経毒の単離され生理学的に活性な誘導体を含む、対象を治療するための薬学的組成物であって、該治療が、筋肉麻痺の誘導を含み、該クロストリジウムボツリナム神経毒誘導体が、野生型クロストリジウムボツリナム神経毒の毒性の原因となるメタロプロテアーゼ活性を減少させる、野生型クロストリジウムボツリナム神経毒に対する1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、該神経毒誘導体が軽鎖領域と重鎖領域を含み、該軽鎖領域と重鎖領域がジスルフィド結合によって連結され、該軽鎖と重鎖が切断されておらず、該神経毒誘導体が、そのＮ末端にカーゴ付着ペプチド配列を持たず、且つ該対象が該治療のために該組成物に接触される、前記薬学的組成物。
【請求項２】
前記クロストリジウムボツリナム神経毒誘導体が、クロストリジウムボツリナムセロタイプＡ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＢ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＣ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＤ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＥ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＦ、及びクロストリジウムボツリナムセロタイプＧからなる群より選択されるセロタイプを持つ、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記神経毒誘導体が、組換えタンパク質である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
しわ、肥大性咬筋、及び局所多汗症からなる群より選択される皮膚科的または美容的な状態を治療するための、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
食道運動障害、咽頭食道痙攣、及び裂肛からなる群より選択される胃腸病学的な状態を治療するための、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
尿路神経原性機能障害、過活動膀胱、及び切迫性尿失禁の神経調節からなる群より選択される尿生殖器学的な状態を治療するための、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
トゥーレット症候群、局所の筋痙縮またはジストニア、痙性斜頚、原発性眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、痙攣性発声障害、顔面神経障害、ラスムッセン症候群、切断痛、声の震え、ワニの涙症候群、辺縁性下顎神経麻痺、疼痛、食道由来の胸痛、頭痛、脳性麻痺、多発性硬化症の臀部内転筋機能障害、神経痛及び炎症、関節炎、医原性耳下腺唾液腺粘液腫、ならびに慢性ＴＭＪ疼痛及び転位からなる群より選択される神経学的な状態を治療するための、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記神経毒誘導体が、対応する野生型クロストリジウムボツリナム神経毒のＬＤ５０よりも少なくとも１，０００倍高いＬＤ５０を持つ、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記神経毒誘導体が、プロペプチドを切断することによって生成され、
該プロペプチドが、
軽鎖領域と、
重鎖領域と、
該軽鎖領域及び重鎖領域を結合し、高度に特異的なプロテアーゼ切断部位を含む中間領域と
を含み、
該軽鎖領域及び重鎖領域がジスルフィド結合によって連結され、該高度に特異的なプロテアーゼ切断部位が、切断を可能にするために、高度に特異的なプロテアーゼによって認識される三つ以上の特異的近接アミノ酸残基を持つ、
請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
（ａ）前記高度に特異的なプロテアーゼ切断部位が、エンテロキナーゼ切断部位及びタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ認識（ＴＥＶ）配列から選択される；または
（ｂ）前記プロペプチドが、前記中間領域内に低度に特異的なプロテアーゼ切断部位を持たず、該低度に特異的なプロテアーゼ切断部位が、切断を許容するために、プロテアーゼによって認識される二つ以下の近接アミノ酸残基を持つ；または
（ｃ）前記軽鎖領域及び重鎖領域が切断されていない；または
（ｄ）前記プロペプチドが、前記軽鎖領域に結合されたシグナルペプチドをさらに含み、該シグナルペプチドが、真核細胞から培地への前記神経毒プロペプチドの分泌を可能にするのに適切であり、任意で、
（ｉ）該シグナルペプチドが、ｇｐ６４シグナルペプチドである；または
（ｉｉ）該プロペプチドが、該シグナルペプチドと該軽鎖領域との間に位置する親和性タグをさらに含み、任意で、該親和性タグが配列番号：１０の配列を持つ、
請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記重鎖がトリプシン感受性の認識配列を持たない、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
対象を治療するための医薬の製造における、野生型クロストリジウムボツリナム神経毒の単離され生理学的に活性な誘導体の使用であって、該治療が、筋肉麻痺の誘導を含み、該クロストリジウムボツリナム神経毒誘導体が、野生型クロストリジウムボツリナム神経毒の毒性の原因となるメタロプロテアーゼ活性を減少させる、野生型クロストリジウムボツリナム神経毒に対する1つまたは複数のアミノ酸置換を含み、該神経毒誘導体が軽鎖領域と重鎖領域を含み、該軽鎖領域と重鎖領域がジスルフィド結合によって連結され、該軽鎖と重鎖が切断されておらず、該神経毒誘導体が、そのＮ末端にカーゴ付着ペプチド配列を持たず、且つ該対象が該治療のために該医薬に接触される、前記使用。
【請求項１３】
前記クロストリジウムボツリナム神経毒誘導体が、クロストリジウムボツリナムセロタイプＡ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＢ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＣ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＤ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＥ、クロストリジウムボツリナムセロタイプＦ、及びクロストリジウムボツリナムセロタイプＧからなる群より選択されるセロタイプを持つ、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記神経毒誘導体が、組換えタンパク質である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
前記医薬が、しわ、肥大性咬筋、及び局所多汗症からなる群より選択される皮膚科的または美容的な状態を治療するためのものである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬が、食道運動障害、咽頭食道痙攣、及び裂肛からなる群より選択される胃腸病学的な状態を治療するためのものである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１７】
前記医薬が、尿路神経原性機能障害、過活動膀胱、及び切迫性尿失禁の神経調節からなる群より選択される尿生殖器学的な状態を治療するためのものである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１８】
前記医薬が、トゥーレット症候群、局所の筋痙縮またはジストニア、痙性斜頚、原発性眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、痙攣性発声障害、顔面神経障害、ラスムッセン症候群、切断痛、声の震え、ワニの涙症候群、辺縁性下顎神経麻痺、疼痛、食道由来の胸痛、頭痛、脳性麻痺、多発性硬化症の臀部内転筋機能障害、神経痛及び炎症、関節炎、医原性耳下腺唾液腺粘液腫、ならびに慢性ＴＭＪ疼痛及び転位からなる群より選択される神経学的な状態を治療するためのものである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１９】
前記神経毒誘導体が、対応する野生型クロストリジウムボツリナム神経毒のＬＤ５０よりも少なくとも１，０００倍高いＬＤ５０を持つ、請求項１２に記載の使用。
【請求項２０】
前記神経毒誘導体が、プロペプチドを切断することによって生成され、
該プロペプチドが、
軽鎖領域と、
重鎖領域と、
該軽鎖領域及び重鎖領域を結合し、高度に特異的なプロテアーゼ切断部位を含む中間領域と
を含み、
該軽鎖領域及び重鎖領域がジスルフィド結合によって連結され、該高度に特異的なプロテアーゼ切断部位が、切断を可能にするために、高度に特異的なプロテアーゼによって認識される三つ以上の特異的近接アミノ酸残基を持つ、
請求項１２に記載の使用。
【請求項２１】
（ａ）前記高度に特異的なプロテアーゼ切断部位が、エンテロキナーゼ切断部位及びタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ認識（ＴＥＶ）配列から選択される；または
（ｂ）前記プロペプチドが、前記中間領域内に低度に特異的なプロテアーゼ切断部位を持たず、該低度に特異的なプロテアーゼ切断部位が、切断を許容するために、プロテアーゼによって認識される二つ以下の近接アミノ酸残基を持つ；または
（ｃ）前記軽鎖領域及び重鎖領域が切断されていない；または
（ｄ）前記プロペプチドが、前記軽鎖領域に結合されたシグナルペプチドをさらに含み、該シグナルペプチドが、真核細胞から培地への前記神経毒プロペプチドの分泌を可能にするのに適切であり、任意で、
（ｉ）該シグナルペプチドが、ｇｐ６４シグナルペプチドである；または
（ｉｉ）該プロペプチドが、該シグナルペプチドと該軽鎖領域との間に位置する親和性タグをさらに含み、任意で、該親和性タグが配列番号：１０の配列を持つ、
請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記重鎖がトリプシン感受性の認識配列を持たない、請求項１２に記載の使用。
【請求項２３】
前記クロストリジウムボツリナム神経毒誘導体が、野生型クロストリジウムボツリナムセロタイプＡ神経毒のアミノ酸配列（配列番号：１）に対して点突然変異Ｅ２２４＞Ａを含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記クロストリジウムボツリナム神経毒誘導体が、野生型クロストリジウムボツリナムセロタイプＡ神経毒のアミノ酸配列（配列番号：１）に対して点突然変異Ｅ２２４＞Ａを含むアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項２５】
前記クロストリジウムボツリナム神経毒誘導体が、野生型クロストリジウムボツリナムセロタイプＡ神経毒のアミノ酸配列（配列番号：１）に対して点突然変異を含むアミノ酸配列を含み、該点突然変異が、アミノ酸２２３、２２４、２２６、２６２、３６６、またはその組み合わせの置換である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記クロストリジウムボツリナム神経毒誘導体が、野生型クロストリジウムボツリナムセロタイプＡ神経毒のアミノ酸配列（配列番号：１）に対して点突然変異を含むアミノ酸配列を含み、該点突然変異が、アミノ酸２２３、２２４、２２６、２６２、３６６、またはその組み合わせの置換である、請求項１２に記載の使用。
【請求項２７】
前記クロストリジウムボツリナム神経毒誘導体が、野生型クロストリジウムボツリナムセロタイプＡ神経毒のアミノ酸配列（配列番号：１）に対して点突然変異Ｙ３３６＞Ｆを含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
前記クロストリジウムボツリナム神経毒誘導体が、野生型クロストリジウムボツリナムセロタイプＡ神経毒のアミノ酸配列（配列番号：１）に対して点突然変異Ｙ３３６＞Ｆを含むアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の使用。