(57)【要約】【課題】リボソームと結合しているｔＲＮＡに着目した、タンパク質合成を解析する新規な手法を提供すること。【解決手段】本発明の一態様に係る方法は、リボソームが関与するタンパク質合成を解析する方法であって、（ａ）ｔＲＮＡと１つまたは複数個のリボソームとを含む試料から、リボソームと結合しているｔＲＮＡを回収する工程と、（ｂ）上記（ａ）の工程で回収されたｔＲＮＡの構造を決定する工程と、（ｃ）上記（ｂ）の工程で構造が決定されたｔＲＮＡのうち、着目する構造を持つｔＲＮＡの量が、所定の範囲内にあるか否かを決定する工程と、を含む。【選択図】図１
2019103402.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボソームが関与するタンパク質合成を解析する方法であって、
（ａ）ｔＲＮＡと１つまたは複数個のリボソームとを含む試料から、リボソームと結合しているｔＲＮＡを回収する工程と、
（ｂ）上記（ａ）の工程で回収されたｔＲＮＡの構造を決定する工程と、
（ｃ）上記（ｂ）の工程で構造が決定されたｔＲＮＡのうち、着目する構造を持つｔＲＮＡの量が、所定の範囲内にあるか否かを決定する工程と、を含む、方法。
【請求項２】
上記（ｂ）の工程において、ｔＲＮＡの構造は、当該ｔＲＮＡに結合可能なアミノ酸の種類、当該ｔＲＮＡの部分又は全長の塩基配列、及び、当該ｔＲＮＡの立体構造、からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｔＲＮＡの部分又は全長の塩基配列は、当該ｔＲＮＡのアンチコドンの塩基配列を含んでいる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
着目する構造を持つ上記ｔＲＮＡが、翻訳開始メチオニンに結合可能なｔＲＮＡである、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
上記（ｂ）の工程において構造が決定される上記ｔＲＮＡとして、上記（ａ）の工程においてリボソームのＰサイトに結合していたｔＲＮＡを選択的に対象とする、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
上記試料は、一つ以上の細胞に由来する、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
一つ以上の上記細胞は、所定の処理を受けている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
リボソームが関与するタンパク質合成の阻害の有無及び／又はメカニズムを評価する方法であって、
一つ以上の細胞に由来する試料において、翻訳開始メチオニンに結合可能でかつリボソームと結合しているｔＲＮＡの量を決定する工程と、
決定された上記ｔＲＮＡの量が、所定の範囲内にあるか否かを決定する工程と、を含む、方法。
【請求項９】
リボソームが関与するタンパク質合成の阻害剤をスクリーニングする方法または阻害剤の影響を調べる方法であって、
タンパク質合成の阻害剤の候補物質又はタンパク質合成の阻害剤で処理をした一つ以上の細胞を準備する工程と、
翻訳開始メチオニンに結合可能でかつリボソームと結合しているｔＲＮＡの量を、上記処理をした細胞に由来する試料で決定する工程と、
決定された上記ｔＲＮＡの量が、所定の範囲内にあるか否かを決定する工程と、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リボソームが関与するタンパク質合成を解析する方法、当該タンパク質合成の阻害を評価する方法、並びに、タンパク質合成の阻害剤をスクリーニングする方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現は、例えば、疾患の状態や発達段階における変化等を含む、細胞生理学に関する様々な重要な側面を反映している。
【０００３】
遺伝子の発現を網羅的に解析する技術として、例えば、マイクロアレイ技術がある。マイクロアレイ技術は、例えば数千種類の遺伝子の発現レベルを同時に測定することができ、ｍＲＮＡの存在量をモニタリングすることによって、定量的かつゲノムワイドな遺伝子発現の測定を可能にする。
【０００４】
また、マイクロアレイ技術に代替する技術として、次世代シーケンサーを用いたディープシーケンシングの技術がある。ディープシーケンシングの技術は、次世代シーケンサーを用いて、ゲノムＤＮＡ又はトランスクリプトーム（ＲＮＡ）の部分配列を大量かつ高速に読むことによって、シーケンシング情報に深さ情報（複数回の読み重ねの情報）を付与し、定量的かつゲノムワイドな遺伝子発現の測定等を可能にする。
【０００５】
しかし、上述のマイクロアレイ技術やディープシーケンシングの技術は、細胞内で生じているタンパク質合成の実態を表すものではなく、当該タンパク質合成の間接的な指標となるに過ぎない。タンパク質合成には、遺伝子の様々な転写調節及び転写後調節が複雑に関与する上、ｍＲＮＡが翻訳される際にも様々な調節が複雑に関与しているためである。すなわち、タンパク質合成の実態を解明するためには、遺伝子発現をタンパク質合成レベルで解析する、より直接的な手法が求められてきている。
【０００６】
リボソームプロファイリングは、細胞における翻訳を包括的に解析可能な技術として、近年、注目を集めている。この技術は、標的ｍＲＮＡに結合した活性型リボソームの位置を同定する技術であり、ヌクレアーゼを用いて、ｍＲＮＡにおけるリボソームと結合していない部分を消化し、消化されずに残ったｍＲＮＡの部分配列の情報から、リボソームの位置と翻訳されたｍＲＮＡとを正確かつ直接的に決定することができる（例えば、特許文献１等を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第８４８６８６５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したリボソームプロファイリングでは、細胞における翻訳へのｔＲＮＡの関わり合いが考慮されていない。翻訳は、概略的には、ｍＲＮＡを鋳型とし、このｍＲＮＡにリボソームが結合することで進行する。従って、これまでは、リボソームフットプリンティングにおけるように、ｍＲＮＡとリボソームとの関係を解析すれば、翻訳の概略的な全容は解明できると考えられてきた。
【０００９】
しかし、本願発明者らは、リボソームに結合しているｔＲＮＡと、リボソームに結合していないｔＲＮＡとの間で、その存在量等に興味深い相違があることを見出し、特にｔＲＮＡに着目した翻訳の解析が、数多くの新たな知見をもたらす可能性に着目するに至った。
【００１０】
本発明は、前記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、特にリボソームと結合しているｔＲＮＡに着目した、タンパク質合成を解析する新規な手法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を解決するために、本発明は以下の何れかの構成を備えている。
（１）  リボソームが関与するタンパク質合成を解析する方法であって、（ａ）ｔＲＮＡと１つ（モノソーム）または複数個のリボソーム（ポリソーム）とを含む試料から、リボソームと結合しているｔＲＮＡを回収する工程と、（ｂ）上記（ａ）の工程で回収されたｔＲＮＡの構造を決定する工程と、（ｃ）上記（ｂ）の工程で構造が決定されたｔＲＮＡのうち、着目する構造を持つｔＲＮＡの量が、所定の範囲内にあるか否かを決定する工程と、を含む、方法。
（２）  上記（ｂ）の工程において、ｔＲＮＡの構造は、当該ｔＲＮＡに結合可能なアミノ酸の種類、当該ｔＲＮＡの部分又は全長の塩基配列、及び、当該ｔＲＮＡの立体構造、からなる群より選択される少なくとも一つである、（１）に記載の方法。
（３）  ｔＲＮＡの部分又は全長の塩基配列は、当該ｔＲＮＡのアンチコドンの塩基配列を含んでいる、（２）に記載の方法。
（４）  着目する構造を持つ上記ｔＲＮＡが、翻訳開始メチオニンに結合可能なｔＲＮＡである、（１）から（３）の何れかに記載の方法。
（５）  上記（ｂ）の工程において構造が決定される上記ｔＲＮＡは、上記（ａ）の工程において、主に、リボソームのＰサイトに結合していたｔＲＮＡである、（１）から（４）の何れかに記載の方法。
（６）  上記試料は、一つ以上の細胞に由来する、（１）から（５）の何れかに記載の方法。
（７）  一つ以上の上記細胞は、所定の処理を受けている、（６）に記載の方法。
（８）  リボソームが関与するタンパク質合成の阻害の有無及び／又はメカニズムを評価する方法であって、一つ以上の細胞に由来する試料において、翻訳開始メチオニンに結合可能でかつリボソームと結合しているｔＲＮＡの量を決定する工程と、決定された上記ｔＲＮＡの量が、所定の範囲内にあるか否かを決定する工程と、を含む、方法。
（９）リボソームが関与するタンパク質合成の阻害剤のスクリーニングや阻害剤の影響を調べる方法であって、タンパク質合成の阻害剤の候補物質又はタンパク質合成の阻害剤で処理をした一つ以上の細胞を準備する工程と、翻訳開始メチオニンに結合可能でかつリボソームと結合しているｔＲＮＡの量を、上記処理をした細胞に由来する試料で決定する工程と、決定された上記ｔＲＮＡの量が、所定の範囲内にあるか否かを決定する工程と、を含む、方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、特にｔＲＮＡに着目して翻訳を解析することによって、翻訳に纏わる多くの新たな知見をもたらすことが出来るという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施例に関する図であり、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑ技術の展開を説明している。(a)ｔＲＮＡリボソームとｍＲＮＡリボソームの同時プロファイリングのスキーム。酵母細胞をシクロヘキサミドで処理し、急速に凍結した。細胞ライセートをRNase Iで処理し、得られたモノソームをスクロース勾配で精製した。全ＲＮＡ(ｔＲＮＡ−ｓｅｑ及びｍＲＮＡ−ｓｅｑ)、並びに、リボソームに結合したｔＲＮＡとｍＲＮＡ(それぞれＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑ, Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑ)とを、ライブラリの調製に用いた。独立した重複実験(ｎ＞３)において、(b)すなわちｔＲＮＡ−ｓｅｑのシーケンスデータと、(c)すなわちＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑのシーケンスデータとは、非常に再現性が高かった（Ｒ２＞０．８５）。酵母ｔＲＮＡ種の数は４７種である。(d)Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑ中のｔＲＮＡコドンは、主にＲｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑ中のＰサイトのｍＲＮＡコドンと相関していた。ｒ値はピアソン相関係数を表す。(e)ｔＲＮＡ−ｓｅｑ及びＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑは、一つのｔＲＮＡ遺伝子中において、様々なｔＲＮＡ修飾を検出した。一例として、逆転写反応の終了又はミスマッチは、Ala-tRNA-AGCにおけるＭ１Ｇ９, Ｍ２２Ｇ２６, Ｉ３４及びＭ１Ｉ３７の修飾の検出に寄与する。(f)ｔＲＮＡにおけるＴｒｍ１−媒介型のＭ２２Ｇ２６修飾の欠損は、Ｍ２２Ｇ２６を含むｔＲＮＡの量を減少させた(Ｒ２＝０．６６, ｎ＝２６)が、Ｍ２２Ｇ２６を欠くｔＲＮＡ(Ｒ２＝０．９３, ｎ＝１９)の量は減少させなかった。対照的に、翻訳中のリボソーム内のｔＲＮＡ種の存在量は、Ｔｒｍ１の欠損による影響を受けず、このことは、翻訳におけるｔＲＮＡの使用に関し、Ｍ２２Ｇ２６修飾を欠くことは重大な影響を及ぼさないことを示唆している。
【図２】本発明の一実施例に関する図であり、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑは、ｉＭｅｔ／１８Ｓ比が、翻訳の阻害メカニズムのバイオマーカーとなることを明らかにする。(a)コントロール細胞とストレス誘導細胞との間での、全ｔＲＮＡ及びリボソーム結合ｔＲＮＡの存在量の相違を示し、それぞれｔＲＮＡ−ｓｅｑまたはＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑによって明らかにされた。色の勾配は、コントロール細胞のものと比較した、ストレス誘導細胞におけるｔＲＮＡの相対量を示す。赤色の勾配（図中でＧｌｎ−ＵＵＧ１以外の勾配）ははｔＲＮＡの存在量が上方制御されたことを、緑色の勾配（図中でＧｌｎ−ＵＵＧ１のみ）はｔＲＮＡの存在量が下方制御されたことを示す。Cold, Heat, Strvation, Sorbitol, Copper, H2O2 はそれぞれ、０℃低温ショック処理、４２℃熱ショック処理、アミノ酸飢餓処理、１Ｍのソルビトール処理、５ｍＭのＣｕＳＯ４処理、０．５ｍＭのＨ２Ｏ２処理を示す。変動指数(V. Index)は、６種類のストレス下におかれたそれぞれの細胞における平均ｔＲＮＡ量からの、ｔＲＮＡ存在量の偏差を示す。n≧3である。(b)アミノ酸飢餓下において、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑではｉＭｅｔ−ｔＲＮＡレベルの相対比は非常に高かったが、ｔＲＮＡ−ｓｅｑではその傾向になかった。(c)アミノ酸飢餓下において、Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑは、ＰサイトにおけるＡＴＧ ｍＲＮＡコドン及びＣＴＧ ｍＲＮＡコドンの頻度に増加が見られた。白抜きバー及び黒抜きバーはそれぞれ、通常の状態下とアミノ酸飢餓状態下とでのｍＲＮＡコドンの相対的な占有率を示す。(d) Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑ及びｔＲＮＡ−ｓｅｑから計算したｉＭｅｔ／１８Ｓ比は、翻訳の阻害メカニズムを明らかにしている。開始阻害剤４ＥＧＩ−１はｉＭｅｔ／１８Ｓ比を減少させ、翻訳開始の阻害を表している。対照的にアミノ酸飢餓処理、低温ショック処理、及びＨ２Ｏ２処理は、ｉＭｅｔ／１８Ｓ比を増加させ、このことは不完全なペプチド鎖伸長を示唆している。破線（すなわちｉＭｅｔ／１８Ｓ比＝１)は、開始欠陥と伸長欠陥との境界を示す。エラーバーは平均＋S.E.Mを示す。Ｎ≧３である。***Ｐ＜０．００１及び *Ｐ＜０．０５である（two-tailed Student's t-testによる）。
【図３】本発明の一実施例に関する図である。Ｈ２Ｏ２によって部分的に３’ＣＣＡテイルが分解されたｔＲＮＡは、リボソームに組み込まれて翻訳を停止させる。(a)ｔＲＮＡ−ｓｅｑによって、熱ショックではなく低温ショックが、ｔＲＮＡにおける３’ＣＣＡテイルの部分的な分解を誘導することが明らかとなった。(b)ＣＣＡテイルの部分的な分解の頻度は、低温ショック誘導細胞における全４７のｔＲＮＡ種から平均化されたものである。ｔＲＮＡ−ｓｅｑでは、低温ショックは、平均すると、ｔＲＮＡにおけるＣＣＡテイルの部分的な分解の平均を約６％誘導したが、リボソーム結合ｔＲＮＡｓでは、ＣＣＡテイルの有意な分解は観察されなかった。ｎ≧３である。(c)ｔＲＮＡ−ｓｅｑ及びＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑは、全ｔＲＮＡ及びリボソーム結合ｔＲＮＡにおける３’ＣＣＡテイルの分解の頻度が、Ｈ２Ｏ２の濃度に依存することを明らかにした。特に、０．５ｍＭ及び２ｍＭのＨ２Ｏ２下において、リボソーム内のｔＲＮＡでＣＣＡテイルの有意な分解が検出された。***Ｐ＜０．００１（two-tailed Student’s ttestによる）である。(d)各ｔＲＮＡ種は、異なるＨ２Ｏ２濃度において、３’ＣＣＡテイルの分解への異なる感受性を示した。ｔＲＮＡ−ｓｅｑは、２ｍＭのＨ２Ｏ２において、多くのｔＲＮＡ種で６０％以上のＣＣＡテイルが部分的に分解されたことを示している。Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑもまた、Arg-tRNA-CCG、 Pro-tRNA-AGG/TGG、 Ser-tRNA-AGA及びThr-tRNA-TGT1において、３’ＣＣＡテイルの有意な部分分解を同定した。特に注目すべきは、ｉＭｅｔにおいて分解が見られなかった点である。(e)Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑは、コントロールの細胞と２ｍＭのＨ２Ｏ２で処理された細胞との間で、ＰサイトのｍＲＮＡコドンの相関（Ｒ２＝０．６９）と比較して、ＡサイトのｍＲＮＡコドンのより低い相関(Ｒ２＝０．４０)を示した。特に、２ｍＭのＨ２Ｏ２によって、ＡサイトのｍＲＮＡコドンとしてのＣＣＧ, ＡＣＧ, ＴＣＣ, ＣＧＡ及びＴＣＴのコドン頻度が有意に増加した。(f) ２ｍＭのＨ２Ｏ２によって、ゆらぎ塩基対の規則が、ＡサイトのｍＲＮＡコドンと、リボソームに結合している、ＣＣＡテイルが分解されたｔＲＮＡコドンとの相関性を増大させた。ｍＲＮＡ−ｔＲＮＡコドン間のワトソンクリック塩基対及びゆらぎ塩基対はそれぞれ赤色、及び緑色で示している。(g) Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑにおいて、アミノ酸のレベルでの（ｎ＝２０)、ｔＲＮＡにおけるＣＣＡテイルの分解の頻度と、リボソーム内のｔＲＮＡの占有率との積は、ＰサイトのｍＲＮＡコドン（ｒ＝０．３８）よりも、ＡサイトのｍＲＮＡコドン（ｒ＝０．６２）の方がより高い相関を示した。
【図４】本発明の一実施例に関する図である。本図は、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑ用のリボソーム結合ｔＲＮＡのライブラリの調製を示している。(a) 酵母細胞ライセートのスクロース勾配分画。左はＲＮａｓｅ Ｉ処理無し、右はＲＮａｓｅ Ｉ処理有り。(b) SYBR Gold染色したゲルイメージは、最上層の分画に含まれる、７０−１００ヌクレオチドのサイズ領域にあるｔＲＮＡは、ＲＮａｓｅ Ｉ処理によってほぼ消化されていたことを示す。一方で、モノソーム分画中に含まれる、７０−１００ヌクレオチドのサイズ領域にあるｔＲＮＡは、ＲＮａｓｅ Ｉ処理から保護されていた。モノソーム分画中に含まれる、二つの異なるサイズ領域（２５−４０ヌクレオチドのサイズ領域、及び、６０−１１０ヌクレオチドのサイズ領域）由来のＲＮＡを抽出及びリサイクルし、それぞれＲｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑのディープシーケンシング用、及びＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑのディープシーケンシング用のライブラリの調製に用いた。(c) ウエスタンブロットの結果は、RNase I処理したモノソームが、リン酸化されたＳ６でラベルされた、翻訳活性のあるリボソームを含んでいるが、ｅＥＦ１タンパク質を含んでいないことを示す。
【図５】本発明の一実施例に関する図であり、本実施例におけるｔＲＮＡ−ｓｅｑデータと、以前に公表された酵母のｔＲＮＡのマイクロアレイデータとの比較を示す。例示として、Arg-, Gly-, Leu-, Ser- 及びVal-ｔＲＮＡを含む、５種類のｔＲＮＡアイソアクセプタファミリーの定量は、何れのアイソアクセプターにおいても、本実施例におけるｔＲＮＡ−ｓｅｑと、以前に公表されたマイクロアレイデータとの間で同様の占有率を示した。
【図６】本発明の一実施例に関する図であり、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑ中のｔＲＮＡのコドンは、Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑ中のＰサイトのｍＲＮＡコドンと高い相関を示した。(a)無処理(黒色のバー) とシクロヘキサミド処理(白色のバー)との間での、Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑリード由来のヌクレオチド断片長の比較。シクロヘキサミド処理によって、より長い断片（＞３０ヌクレオチド）又はより短い断片（＜２６ヌクレオチド）の占有率が減少する一方で、２８ヌクレオチド及び２９ヌクレオチドの断片の占有率が増加した。(b）ｔＲＮＡコドンと、Ｅ− , Ｐ−またはＡ−サイトのｍＲＮＡコドンとの間の相関を解析した。比較のために、ｔＲＮＡコドン及びｍＲＮＡコドンの双方をアミノ酸に翻訳した。Ｒ値及びＰ値は、ｔＲＮＡコドンとｍＲＮＡコドンとの間のピアソン相関係数を表す。
【図７】本発明の一実施例に関する図である。ｔＲＮＡ−ｓｅｑ及びＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑによって、１０種のｔＲＮＡ修飾が同定された。ｔＲＮＡ−ｓｅｑ及びＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑによって、ｔＲＮＡ修飾の存在に起因する、ＲＴ反応における反応の終了及びヌクレオチドの置換が明らかとなった。これらの変化が生じたポイントの位置は、ｔＲＮＡ修飾データベースへ言及された。このｔＲＮＡ修飾が媒介するＲＴ反応の変化は、酵母の欠損株(a) Δtｒｍ１, (b) Δtｒｍ１０及び(c) Δabp１４０によって再発見（recover）された。(d) 本実施例において、ｔＲＮＡ−ｓｅｑ及びＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑを用いて同定された１０種のｔＲＮＡ修飾のサマリー。非必須なＴＲＭ１, ＴＲＭ１０及びＡＢＰ１４０の欠損によって確認された３種のｔＲＮＡ修飾は黒色で示し、他のｔＲＮＡ修飾（赤色で示す）は、ｔＲＮＡデータベースと、修飾を受けた部分(moiety)は逆転写反応に必要なワトソン−クリック水素結合に関与しているという事実とに基づいて同定した。詳細は、表１を参照のこと。
【図８】本発明の一実施例に関する図である。ｔＲＮＡ−ｓｅｑにおける各ｔＲＮＡ種の存在量は、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑにおける各ｔＲＮＡ種の存在量と異なっている。ｔＲＮＡ−ｓｅｑとＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑとの間の低い相関（Ｒ２＝０．４９）は、リボソーム結合ｔＲＮＡが、ｍＲＮＡコドンの情報に従って選択されていることを示す。各点は、各ｔＲＮＡ種（ｎ＝４７）を表す。
【図９】本発明の一実施例に関する図である。Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑは、アミノ酸飢餓によるペプチド鎖伸長の欠陥を明らかにする。(a)アミノ酸飢餓は、５’ＵＴＲ領域内及びＣＤＳの最初の２００コドン内(−１５０〜２００ヌクレオチド)におけるリボソームの蓄積を引き起こす。Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑについて、コントロールとアミノ酸飢餓の場合とを比較することで、コントロールと比較して、整列されたシーケンスリードをより持つ少なくとも一つの領域を備えた（≧２ｘ）、２２３６個の遺伝子が回収された。２２３６個の遺伝子のうち１５３２個（〜６９％）は、−１５０〜２００ヌクレオチドの上記領域に位置した。(b) ピーク領域からの距離、すなわち、各遺伝子の翻訳開始サイト（ＡＵＧ）からＣＤＳに沿って最も高い数のリードを持つ領域までの距離を計算しプロットした(Ｘ軸)。ＡＵＧから−１５０〜２００ヌクレオチドの間にthe peak locationを持つ１５３２の遺伝子を示した。実線は、Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑにおいて、遺伝子の数と、当該遺伝子におけるAUGサイトからの距離との関係性を表しており、破線は、ｍＲＮＡ−ｓｅｑにおいて同じ計算をした結果を示す。(c)ＣＤＳの中央部及び３’領域でのリボソームの位置は、アミノ酸飢餓による影響を受けなかった。一例として、酵母のＴＥＦ２遺伝子においては、ＣＤＳの５’領域においてリボソームの顕著な蓄積が検出されたが、ＣＤＳの中央部及び３’領域ではそのようなリボソームの蓄積は検出されなかった。
【図１０】本発明の一実施例に関する図である。低温ショックは、ｔＲＮＡにおける３’ＣＣＡテイルの部分的な分解を誘導し、かつ、細胞内のＲＯＳレベルを増加させる。コントロールの酵母細胞、低温ショック誘導の酵母細胞、又は熱ショック誘導の酵母細胞におけるＲＯＳレベルは、細胞内でＲＯＳと反応する蛍光色素であるpermeable 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate（DCFH-DA）を用いて解析した。propidium iodide (PI)の蛍光強度をコントロールとして用いた。ｎ≧３である。エラーバーは平均+S.E.M.で示す。 ***Ｐ＜０．００１（two-tailed Student’s t testによる）である。
【図１１】本発明の一実施例に関する図である。苛烈な酸化ストレスは、ＣＤＳにおけるリボソームの停止を引き起こす。(a)２ｍＭのＨ２Ｏ２処理に関し、特定の２９ヌクレオチドの断片の過剰な蓄積によって、ＴＥＦ２遺伝子においてリボソームの停止(red box)が引き起こされていることを、Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑは明らかにした。特定の２９ヌクレオチドの断片において、ＡサイトのｍＲＮＡコドンはＴＣＴであり、これは高度に３’ＣＣＡが分解された Ser-tRNA-AGAコドンに対応する。(b) ＲＮＡ−ｓｅｑ及びＲｉｂｏ−ＲＮＡ−ｓｅｑを用いた、ＴＥＦ２遺伝子全体の全てのシーケンスリードにおける、特定の２９ヌクレオチド断片 (red box)の頻度。
【図１２】本発明の一実施例に関する図である。ＣＣＡ-テイルが分解されたｔＲＮＡは、不安定化したリボソームを検出するセンサーとして機能し得る。(a)通常の条件下で、ｔＲＮＡｓは、アミノ酸をチャージした状態と非チャージの状態とを効率的に繰り返す。(b)アミノ酸飢餓は、細胞のアミノ酸レベルを低下させ、これによってチャージｔＲＮＡの量が減少し、結果としてペプチド鎖の伸長が害される。(c)低温ショックのような緩和なストレス下では、ｔＲＮＡにおける３’ＣＣＡテイルは部分的に分解され、チャージｔＲＮＡの分画を減少させ、ダメージを受けたｔＲＮＡ種が関与するペプチド鎖伸長が害される。しかし、非チャージｔＲＮＡはリボソーム内に取り込まれ得ないようである。(d)２ｍＭのＨ２Ｏ２のような苛烈なストレス条件下では、ｔＲＮＡの３’ＣＣＡテイルが重度に分解されるだけでなく、リボソームの不安定化も生じ、結果として翻訳の忠実度が減少する。損傷したリボソームは、ＣＣＡ-が分解され、しかるに非チャージｔＲＮＡをも受け入れ可能であり、この結果、ペプチド鎖伸長が停止する。換言すれば、部分的に分解されたｔＲＮＡは、翻訳の厳密さの維持のため、不安定化したリボソームの検出において役割を果たし得る。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００１５】
〔１．タンパク質合成を解析する方法〕
（概要）
本発明に係る、リボソームが関与するタンパク質合成を解析する方法は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含んでなる方法である。
工程（ａ）：ｔＲＮＡと１つ（モノソーム）または複数個のリボソーム（ポリソーム）とを含む試料から、リボソームと結合しているｔＲＮＡを回収する工程（「リボソーム結合ｔＲＮＡの回収工程」と称する場合もある）、
工程（ｂ）：上記（ａ）の工程で回収されたｔＲＮＡの構造を決定する工程（「ｔＲＮＡの構造決定工程」と称する場合もある）、及び、
工程（ｃ）：上記（ｂ）の工程で構造が決定されたｔＲＮＡのうち、着目する構造を持つｔＲＮＡの量が、所定の範囲内にあるか否かを決定する工程（「ｔＲＮＡ量の決定工程」と称する場合もある）。
【００１６】
（工程（ａ）：リボソーム結合ｔＲＮＡの回収工程）
本工程は、ｔＲＮＡと１つまたは複数個のリボソームとを含む試料から、リボソームと結合しているｔＲＮＡ（「リボソーム結合ｔＲＮＡ」）を回収する工程である。
【００１７】
＝  試料  ＝
ｔＲＮＡと１つ（モノソーム）または複数個のリボソーム（ポリソーム）とを含む試料は、無細胞系であっても細胞系であってもよいが、好ましくは一つ又は複数の細胞を含んでなる試料である。細胞は、任意の適切な細胞であればよく、細菌細胞または真核細胞が含まれ、特に限定されないが、動物細胞、真菌細胞および植物細胞が含まれる。ある実施形態において、細胞は、ヒト細胞、または、飼育動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマなど）由来の細胞、または家畜動物（例えば、ブタ、ウシなど）由来の細胞などの哺乳動物細胞であってもよい。細胞は、複数の細胞が互いに独立した状態で含まれるもの（例えば、単細胞生物の群又は培養細胞）や培養細胞塊であってもよいが、ある実施形態において、細胞は、組織、器官または生物の一部を形成していてもよい。
【００１８】
細胞はまた、疾患状態の特性を評価するために、罹患した生物から得たものであってもよい。したがって、ある実施形態において、細胞は、ウイルスに感染した履歴がある細胞か、ウイルスに感染している細胞であってもよい。他の実施形態において、細胞は、疾患（例えば、ガン、精神疾患、発達障害、糖尿病、心臓病、アルツハイマー病など）を有する生物に由来していてもよい。
【００１９】
細胞はまた、所定の処理を受けた場合の影響を評価するために、所定の処理を受けている細胞であってもよい。所定の処理の種類は特に限定されないが、例えば、温度変化（熱ショック、低温ショック等）、化学物質を用いた処理、電気的刺激の付与等が挙げられる。
【００２０】
＝  リボソーム結合ｔＲＮＡの回収と、その他のＲＮＡの回収  ＝
ｔＲＮＡと複数個のリボソームとを含む上記の試料からリボソーム結合ｔＲＮＡを回収する方法は特に限定されない。試料が細胞を含んでなる場合、典型的には、細胞を溶解した後に、既知のＲＮＡ精製技術を用いてＲＮＡ分子を回収する工程を含む。
【００２１】
ＲＮＡ分子の回収は、回収対象となるＲＮＡ分子の種類に応じた方法を適宜選択すればよい。例えば、
１）必要に応じてｍＲＮＡ分子を選択的に回収する場合、典型的には、トータルＲＮＡ分子を抽出する既知の試薬を用いて抽出を行った後に、ポリＡテイル（３’ポリアデニル化テイル）を有するＲＮＡ分子を既知のｍＲＮＡ精製キットで精製すればよく、さらに必要に応じて、精製したＲＮＡ分子をアルカリ処理等で断片化してもよい。なお、トータルＲＮＡ分子を抽出する工程を省略して、細胞を溶解した後に、ポリＡテイルを有するＲＮＡ分子を直接的に精製してもよい。なお、ここで回収されるｍＲＮＡ分子の大部分は、リボソームと結合していないｍＲＮＡ分子に相当し、後述するｍＲＮＡ−ｓｅｑ解析用に用いられるものである。以下、「ｍＲＮＡ−ｓｅｑ用回収物」と称する場合もある。
２）必要に応じてｔＲＮＡ分子を選択的に回収する場合、典型的には、トータルＲＮＡ分子を抽出する既知の試薬を用いて抽出を行った後に、既知の方法に従ってトータルＲＮＡ分子からｒＲＮＡ分子を除去すればよく、さらに必要に応じて、ポリＡテイルを有するＲＮＡ分子を既知の方法に従って除去すればよい。なお、ここで回収されるｔＲＮＡ分子の大部分は、リボソームと結合していないｔＲＮＡ分子に相当し、後述するｔＲＮＡ−ｓｅｑ解析用に用いられるものである。以下、「ｔＲＮＡ−ｓｅｑ用回収物」と称する場合もある。
３）リボソーム結合ｔＲＮＡと、必要に応じてリボソーム結合ｍＲＮＡとを選択的に回収する場合、典型的には、トータルＲＮＡ分子を抽出する既知の試薬を用いて抽出を行った後に、ＲＮＡ分子の分解を行う。ＲＮＡ分子のうちリボソームと結合している部分は、リボソームと結合していない部分と比較して分解に対する耐性がより高いことを利用して、リボソームと結合しているＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子の部分を選択的に回収することができる。ここで回収される試料は、後述するＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑ解析用、及び、Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑ解析用に用いられるものである。
【００２２】
ここで、ＲＮＡ分子の分解は、例えば、酵素的分解、又は、非酵素的な化学的分解によって行うことができ、好ましくは酵素的分解である。酵素的分解とは、分解前より長さが短くなるようにＲＮＡ分子を修飾することができる酵素（例えば、化学反応を触媒する、タンパク質又は核酸のような生体分子）を用いて、ＲＮＡ分子の分解を行うことを指す。ある実施形態では、酵素は、エンドリボヌクレアーゼまたはエキソリボヌクレアーゼなどのリボヌクレアーゼ（ＲＮＡ分解酵素）である。用いるＲＮＡ分解酵素のタイプは、基質特異性及び必要な補因子の種類など、所望の特性に応じて選択すればよい。ある実施形態では、ＲＮＡ分解酵素は、ＲＮase Ｉである。他の有用な酵素としては、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴ１など、またはそれらの組み合わせが挙げられる。一方、化学的分解とは、分解前より長さが短くなるようにＲＮＡ分子を修飾することができる化合物（酵素は含まれない）を用いて、ＲＮＡ分子の分解を行うことを指す。化学的分解に有用な化合物としては、例えば、チオール切断試薬、Ｎ−ホスホリルヒスチジン、ジアゾニウム塩、Ｚｎ（II）、水酸化物イオン（アルカリ性条件下）等が挙げられる。
【００２３】
そして、リボソームと結合しているＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子の部分を選択的に回収した後に、リボソーム結合ｔＲＮＡと、リボソーム結合ｍＲＮＡ（部分配列）とを、例えば両者のサイズの相違に基づいて分離することができる。リボソーム結合ｍＲＮＡ（部分配列）は、例えば、２０〜４０ヌクレオチド程度の長さの核酸に相当し、リボソーム結合ｔＲＮＡは、例えば、５５〜１２０ヌクレオチド程度の長さの核酸に相当する。以下、分離によって得られたそれぞれを「Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑ用回収物」及び「Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑ用回収物」と称する場合もある。なお、リボソームと結合しているＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子の部分を選択的に回収する方法は特に限定されないが、例えば実施例に示すようにスクロース濃度勾配を用いて、モノソーム分画を回収する方法等が挙げられる。
【００２４】
上記３）の場合において、ＲＮＡ分子の分解を行った後、リボソーム結合ｔＲＮＡ及び／又はリボソーム結合ｍＲＮＡを回収する際に、必要に応じて、ｒＲＮＡ由来の断片を選択的に取り除く操作を行う。この操作は、例えば、ｒＲＮＡ由来の断片に相補的なオリゴを用いたサブトラクティブハイブリダイゼーションによって容易に実施することができる。
【００２５】
なお、上記１）〜３）の場合の何れにおいても、上述の特許文献１（米国特許第８４８６８６５号明細書）等の記載も適宜参照することができる。
【００２６】
＝ライブラリの調製＝
選択的に回収されたＲＮＡ分子から、必要に応じてライブラリの調製を行う。ライブラリの調製方法は、用いるライブラリ調製キットの仕様に応じて適宜選択されればよいが、典型的には、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに逆転写をし、得られた逆転写産物を、適切な核酸増幅法を用いて増幅する工程を含んでいる。なお、ここで「（核酸を）増幅する」とは、当該核酸のコピーの数を増加させる（例えば、指数的に増加させる）目的で、当該核酸を、少なくとも１ラウンドの伸長、複製または転写に供するプロセスを指す。核酸のコピーは当該核酸の相補的なコピーであってもよい。また、このプロセスでは、伸長、複製または転写を複数ラウンド行うことがより好ましい。なお、核酸増幅法は特に限定されないが、例えば、ＰＣＲ増幅またはローリングサークル増幅等が挙げられる。
ただし、工程（ｂ）において、例えば、ＤＲＳＴＭ（single molecule Direct RNA Sequencing）技術やその変法等を用いて、直接的にＲＮＡをシーケンシングする場合等には、ライブラリの調製は必須ではない。
【００２７】
なお、ライブラリの調製においても、上述の特許文献１（米国特許第８４８６８６５号明細書）等の記載も適宜参照することができる。
【００２８】
（工程（ｂ）：リボソーム結合ｔＲＮＡの構造決定工程）
工程（ｂ）では、工程（ａ）で得られた「Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑ用回収物」を用いて、リボソームと結合しているｔＲＮＡの構造を決定する。工程（ｂ）は、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑ解析の工程にも相当する。このｔＲＮＡの構造決定は、工程（ａ）で記載の通り、必要に応じて調製されたライブラリに含まれる増幅産物を用いて行ってもよい。
【００２９】
工程（ｂ）で決定されるｔＲＮＡの構造とは、対象となるｔＲＮＡを特徴づけることが出来る（すなわち他のｔＲＮＡと区別をすることが出来る）如何なる情報であってもよく、例えば、その化学的構造や物理的構造が挙げられる。ｔＲＮＡの構造として、より具体的には例えば、１）ｔＲＮＡに結合可能なアミノ酸の種類、２）ｔＲＮＡの部分又は全長の塩基配列、３）ｔＲＮＡの立体構造、又は４）ｔＲＮＡを構成する塩基における化学的修飾や変異、等が挙げられる。工程（ｂ）で決定されるｔＲＮＡの構造は一種類であってもよく、複数種類であってもよい。前記したｔＲＮＡの構造の中では、１）ｔＲＮＡに結合可能なアミノ酸の種類、２）ｔＲＮＡの部分又は全長の塩基配列、及び、４）ｔＲＮＡを構成する塩基における化学的修飾や変異からなる群より選択される少なくとも一つを決定することがより好ましい。なお、ｔＲＮＡの部分又は全長の塩基配列を決定することは、しばしば、ｔＲＮＡに結合可能なアミノ酸の種類を決定することに繋がる。特に、ｔＲＮＡの部分又は全長の塩基配列に当該ｔＲＮＡのアンチコドンの塩基配列が含まれている場合は、ｔＲＮＡに結合可能なアミノ酸の種類を決定することに繋がる。
【００３０】
また、上記したｔＲＮＡの構造の中では、当該ｔＲＮＡが開始メチオニンに結合可能なものである、当該ｔＲＮＡにおいてアミノ酸をチャージするための配列に欠失が生じている（例えば、ＣＣＡテイルの分解等）、或いは、塩基に特定の化学的修飾が生じている（実施例も参照）ものが、着目する構造としては特に好ましい。
【００３１】
ｔＲＮＡの構造の決定方法は、決定すべき構造に応じた適切な方法に従って適宜行うことができる。例えば、ｔＲＮＡの構造として、２）ｔＲＮＡの部分又は全長の塩基配列、或いは、４）ｔＲＮＡを構成する塩基における化学的修飾や変異を決定する場合は、配列決定を行うための公知のシーケンシング技術等に従って行うことが出来る。なお、当業者によく知られている通り、シーケンシングを行う際に、配列決定とあわせて、決定された配列に対応する各ｔＲＮＡ種の定量的な評価もあわせて行うことが出来る。
【００３２】
ある実施形態では、配列決定を行うためのシーケンシング技術として、いわゆる次世代シーケンサを用いる方法を採用してもよい。次世代シーケンサの種類は特に限定されないが、例えば、HiSeq2000（Illumina社）、Genome Analyzer IIx（Illumina社）、及び、Genome Sequencer-FLX（Roche社）等が挙げられる。
【００３３】
ある実施形態では、ｔＲＮＡ（核酸）の配列決定は、例えば、フローセル上またはマイクロアレイ上に、核酸を固定化する工程を含んでいる。配列決定のプロセスにおいて、ブリッジ増幅（特にブリッジＰＣＲ）が、核酸がその上に固定化されたフローセル内、または、核酸がその中に固定されたマイクロアレイ内で発生しうる。
【００３４】
ある実施形態では、ｔＲＮＡ（核酸）の配列決定は、「sequencing by synthesis (ＳＢＳ)」技術を用いて達成される。ここで、ＳＢＳ技術とは、対象となる核酸の相補鎖を合成することによって当該核酸の配列決定を行う技術を指す。ＳＢＳ技術は、「ピロシーケンシング」、「ライゲーションによるシーケンシング」、及び、「伸長によるシーケンシング」からなる群より選択されてもよい。「ピロシーケンシング」は、ヌクレオチドの取り込みに際して生じるピロリン酸を検出することで配列決定を行う方法を指す。「ライゲーションによるシーケンシング」は、核酸配列内の指定された位置に存在するヌクレオチドを同定するために、リガーゼを使用して核酸配列を決定する方法を指す。「伸長によるシーケンシング」は、プライマーが、既知の又は検出可能なヌクレオチドを伴って伸長される核酸配列決定法を指す。
【００３５】
ある実施形態では、配列決定を行うためのシーケンシング技術として、「ディープシーケンシング」を採用してもよい。「ディープシーケンシング」は、並行して複数の核酸を配列決定する方法を指す（参考文献：Bentleyら、Nature 2008、456：53-59）。典型的な、「ディープシーケンシング」を用いた配列決定プロトコルでは、核酸（例えば、ＤＮＡ断片）は、反応プラットホーム（例えば、フローセルやマイクロアレイ等）の表面に取り付けられる。取り付けられた核酸は、in situで増幅され、検出可能な標識（例えば、蛍光可逆的ターミネーターデオキシリボヌクレオチド）を用いた合成的シーケンシング（例えばＳＢＳ）のためのテンプレートとして使用することができる。代表的な可逆的ターミネーターデオキシリボヌクレオチドには、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンそれぞれの３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシヌクレオシド三リン酸が含まれ得、これらはそれぞれ、リンカーを介して、互いに認識可能でかつ取り外し可能なフルオロフォアでさらに標識されていてもよい。配列決定は、シングルリード法で行うこともでき、ペアエンド法で行うこともできる。
【００３６】
ある実施形態では、ｔＲＮＡ（核酸）の配列決定は、例えば、ＤＲＳＴＭ技術やその変法等を用いて、直接的に核酸をシーケンシングするものであってもよい。
【００３７】
上記（ｂ）の工程において構造が決定されるｔＲＮＡは、リボソームのＡサイトに結合しているｔＲＮＡ及びＰサイトに結合しているｔＲＮＡの双方であってもよいが、リボソームのＡサイトに結合しているｔＲＮＡ又はＰサイトに結合しているｔＲＮＡの一方を選択的に解析の対象とすることがより好ましい。なお、ここで「選択的に解析の対象とする」とは、解析の対象となるｔＲＮＡに占める、リボソームのＡサイトに結合しているｔＲＮＡの割合が、５５％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上という条件を満たしている。或いは、解析の対象となるｔＲＮＡに占める、リボソームのＰサイトに結合しているｔＲＮＡの割合が、５５％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上という条件を満たしている。例えば、実施例に示すように、工程（ａ）において、ｔＲＮＡと複数個のリボソームとを含む試料としての細胞をシクロヘキサミドで予め処理しておけば、リボソームのＰサイトに結合していたｔＲＮＡを高度に選択的に回収して、解析の対象とすることが出来る。
【００３８】
なお、上記１）〜３）の場合の何れにおいても、上述の特許文献１（米国特許第８４８６８６５号明細書）等の記載も適宜参照することができる。
【００３９】
（工程（ｂ１）：必要に応じて行われる、ｍＲＮＡ及びｔＲＮＡの構造決定工程）
必要であれば、さらに、工程（ａ）で得られた「Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑ用回収物」を用いて、リボソームと結合しているｍＲＮＡの構造を決定してもよい。同様に、工程（ａ）で得られた「ｍＲＮＡ−ｓｅｑ用回収物」を用いて、リボソームと結合していないｍＲＮＡの構造を決定してもよい。同様に、工程（ａ）で得られた「ｔＲＮＡ−ｓｅｑ用回収物」を用いて、リボソームと結合していないｔＲＮＡの構造を決定してもよい。必要に応じて行われる、これらｍＲＮＡ及びｔＲＮＡの構造決定工程は、上述した工程（ｂ）にて記載した方法と同様に行うことができる。
【００４０】
なお、リボソームと結合していないｔＲＮＡの構造としては、上述したリボソームと結合している結合ｔＲＮＡの構造と同様のものが挙げられる。リボソームと結合しているか結合していないｍＲＮＡの構造としては、例えば、ｍＲＮＡの部分又は全長の塩基配列が挙げられる。なお、シーケンシングを行う際に、配列決定とあわせて、決定された配列に対応する各ｔＲＮＡ種及び各ｍＲＮＡ種の定量的な評価も行うことが出来る。
【００４１】
（工程（ｂ２）：必要に応じて行われるゲノムリファレンスへの整列）
工程（ｂ）及び工程（ｂ１）において、ｍＲＮＡ及びｔＲＮＡの塩基配列を決定した場合には、必要に応じて、これらｍＲＮＡ及びｔＲＮＡのシーケンスリードを、適切なゲノムリファレンス（一般的には、これらｍＲＮＡ及びｔＲＮＡが由来する生物用のゲノムリファレンス）上にアラインする。
【００４２】
リボソームと結合しているｔＲＮＡをゲノムリファレンス上に適切にアラインすることで、多重整列リードの割合を減少させて、解析の精度をより向上させることができる。リボソームと結合していないｔＲＮＡをゲノムリファレンス上にアラインし、リボソームと結合しているｔＲＮＡの結果と比較することで、どのｔＲＮＡがどれだけ翻訳に使われているか（＝リボソームの中に入っているか）を明らかにできる。
【００４３】
リボソームと結合しているｍＲＮＡをゲノムリファレンス上にアラインすることで、翻訳に関与しているｍＲＮＡのゲノム上の位置を決定することができる。また、リボソームと結合していないｍＲＮＡをゲノムリファレンス上にアラインすることで、転写はされているが翻訳には関与していないｍＲＮＡのゲノム上の位置を決定することができる。
【００４４】
（工程（ｃ）：リボソーム結合ｔＲＮＡ量の決定工程）
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で構造が決定された、リボソームと結合しているｔＲＮＡにおいて、着目する構造を持つｔＲＮＡの量が、所定の範囲内にあるか否かを決定する。
【００４５】
ここで、リボソームと結合している「着目する構造を持つｔＲＮＡ（「着目ｔＲＮＡ」と称する場合もある）の量」とは、着目ｔＲＮＡの絶対量であっても相対量であってもよい。ここで、着目ｔＲＮＡの相対量とは、何らかの対象に対する着目ｔＲＮＡの量を表す値を広く指すが、例えば、以下のものが挙げられる。
１）同じ試料（前出の「ｔＲＮＡと複数のリボソームとを含む試料」を指す）中に含まれる、リボソーム結合ｔＲＮＡの総量に占める、リボソーム結合着目ｔＲＮＡ量の割合、
２）同じ試料中に含まれる、リボソーム結合着目ｔＲＮＡ量と、リボソームと結合していない着目ｔＲＮＡ量との割合、
３）同じ試料中に含まれる、ｔＲＮＡの総量（すなわちリボソーム結合ｔＲＮＡとリボソームと結合していないｔＲＮＡとの合計）に占める、リボソーム結合着目ｔＲＮＡ量の割合、
４）リボソーム１個当たりの、リボソーム結合着目ｔＲＮＡ量：これは、リボソーム結合着目ｔＲＮＡ量をリボソームの個数で除算するか、リボソーム結合着目ｔＲＮＡ量を１８Ｓ  ｒＲＮＡの数量で除算することで得られる。なお、真核生物において、リボソームの数と１８Ｓ  ｒＲＮＡの量と相関するとみなされている。
【００４６】
リボソーム結合着目ｔＲＮＡの量が、所定の範囲内にあるか否かの決定は、基準値との比較によって行われる。特に限定されないが、基準値とは、例えば、コントロールとなる試料において得られたリボソーム結合着目ｔＲＮＡの量を採用することが出来る。
【００４７】
ある実施形態において、「コントロールとなる試料」とは、好ましくは、前出の「ｔＲＮＡと１つまたは複数のリボソームとを含む試料（試験試料）」と同種の試料である。試験試料が細胞を含んでなる場合、「コントロールとなる試料」は、好ましくは、同種の生物由来の細胞を含むものである。試験試料が、生物の疾患状態の特性を評価するために用いられる場合、「コントロールとなる試料」は、好ましくは、特定の疾患に罹患していない、同種の生物由来の細胞を含むものである。試験試料が、細胞に対する所定の処理の影響を評価するために用いられる場合、「コントロールとなる試料」は、好ましくは、所定の処理を受けていない、同種の生物由来の細胞を含むものである。
【００４８】
本発明の実施形態において「生物の疾患状態」とは、ｔＲＮＡ量の変化、ｔＲＮＡの発現増減、またはｔＲＮＡ変異が影響する疾患状態などが挙げられる。当該疾患としては、例えば、転移性の癌、自閉症等の精神疾患、神経変性疾患が挙げられる（Goodarzi H, Nguyen HC, Zhang S, Dill BD, Molina H, Tavazoie SF. Cell. 2016 Jun 2;165(6):1416-27。；Richter JD, Bassell GJ, Klann E. Nat Rev Neurosci. 2015 Oct;16(10):595-605.；Ishimura R, Nagy G, Dotu I, Zhou H, Yang XL, Schimmel P, Senju S, Nishimura Y, Chuang JH, Ackerman SL. Science. 2014 Jul 25;345(6195):455-9. ）
着目ｔＲＮＡの種類は特に限定されないが、開始メチオニンに結合可能なｔＲＮＡ（ｉＭｅｔ−ｔＲＮＡ）、アミノ酸をチャージするための配列に欠失が生じているｔＲＮＡ（例えば、ＣＣＡテイルが分解されているｔＲＮＡ等）、或いは、塩基に特定の化学的修飾が生じているｔＲＮＡ（実施例も参照）が好ましく、開始メチオニンに結合可能なｔＲＮＡ、或いは、アミノ酸をチャージするための配列に欠失が生じているｔＲＮＡがより好ましく、開始メチオニンに結合可能なｔＲＮＡがさらに好ましい。これらの着目ｔＲＮＡは、試験試料において翻訳阻害（タンパク質合成の阻害）が生じているか否かのマーカーとして使用可能である。
【００４９】
着目ｔＲＮＡのマーカーとしての利用に関して、ある実施形態では、リボソームと結合している、アミノ酸をチャージするための配列に欠失が生じているｔＲＮＡの量を、試験試料とコントロールとなる試料とで比較して、翻訳阻害が生じているか否かの指標とする（一例として、図３のｄも参照のこと）。この場合、着目ｔＲＮＡは、例えば、リボソームと結合している、ＣＣＡテイルが分解されている総ｔＲＮＡでもよく、ＣＣＡテイルが分解されているｔＲＮＡ種のうちコントロールとの差の把握が容易な特定のｔＲＮＡ種でもよい。一例では、リボソームと結合している、アミノ酸をチャージするための配列に欠失が生じているｔＲＮＡの量が、コントロールと比較して有意に増加している場合に、翻訳阻害が生じていると判断し得る。なお、リボソームと結合していない、アミノ酸をチャージするための配列に欠失が生じているｔＲＮＡの量も、翻訳阻害が生じるに先立ち変動し得るが、リボソームと結合していないｔＲＮＡのみに着目する場合には、翻訳阻害の前兆を翻訳阻害と誤認識する虞がある。
【００５０】
着目ｔＲＮＡのマーカーとしての利用に関して、ある実施形態では、リボソームと結合しているｉＭｅｔ−ｔＲＮＡの量を、試験試料とコントロールとなる試料とで比較して、翻訳阻害が生じているか否かの指標とする。或いは、同じ試験試料における、リボソームと結合しているｉＭｅｔ−ｔＲＮＡの量と、リボソームと結合していないｉＭｅｔ−ｔＲＮＡの量とを比較することによって、翻訳阻害が生じているか否か、また、その阻害メカニズムを知るための指標とする。
【００５１】
着目ｔＲＮＡのマーカーとしての利用に関して、ある実施形態では、リボソームと結合しているｉＭｅｔ−ｔＲＮＡの量を、試験試料とコントロールとなる試料とで比較して、翻訳阻害が、翻訳開始の阻害であるかペプチド鎖伸長の阻害であるかを区別する指標とする。或いは、同じ試験試料における、リボソームと結合しているｉＭｅｔ−ｔＲＮＡの量と、リボソームと結合していないｉＭｅｔ−ｔＲＮＡの量とを比較することによって、翻訳阻害が、翻訳開始の阻害であるかペプチド鎖伸長の阻害であるかを区別する指標とする。
【００５２】
〔２．その他の態様〕
（１）ｉＭｅｔ−ｔＲＮＡを指標として用いた、タンパク質合成の阻害の有無及び／又は阻害のメカニズムを評価する方法：
上述の通り、リボソームと結合しているｉＭｅｔ−ｔＲＮＡは、試験試料において翻訳阻害（タンパク質合成の阻害）が生じているか否かのマーカーとして使用可能である。
【００５３】
本発明に係るある実施形態では、
工程（ｂ１）：一つ以上の細胞に由来する試料において、翻訳開始メチオニンに結合可能でかつリボソームと結合しているｔＲＮＡの量を決定する工程と、
工程（ｃ１）：決定された上記ｔＲＮＡの量が、所定の範囲内にあるか否かを決定する工程と、を含む、リボソームが関与するタンパク質合成の阻害の有無及び／又は阻害のメカニズムを評価する方法、を提供する。
【００５４】
なお、工程（ｂ１）は、上述した工程（ａ）〜工程（ｃ）に記載の方法に従って、工程（ｃ１）は、上述した工程（ｃ）に記載の方法に従ってそれぞれ行うことができる。
【００５５】
（２）ｉＭｅｔ−ｔＲＮＡを指標として用いた、タンパク質合成の阻害剤をスクリーニングする方法：
本発明に係るある実施形態では、
工程（ａ２）：タンパク質合成の阻害剤の候補物質で処理をした一つ以上の細胞を準備する工程と、
工程（ｂ２）：翻訳開始メチオニンに結合可能でかつリボソームと結合しているｔＲＮＡの量を、上記処理をした細胞に由来する試料で決定する工程と、
工程（ｃ２）：決定された上記ｔＲＮＡの量が、所定の範囲内にあるか否かを決定する工程と、を含む、リボソームが関与するタンパク質合成の阻害剤をスクリーニングする方法、を提供する。
【００５６】
工程（ａ２）〜（ｂ２）は、上述した工程（ａ）〜工程（ｃ）に記載の方法に従って、工程（ｃ２）は、上述した工程（ｃ）に記載の方法に従ってそれぞれ行うことができる。なお、工程（ａ２）は、例えば、培養液中において、試料（上記細胞を含む）と阻害剤の候補物質とを、所定の時間共存させることによって容易に行うことが出来る。また、工程（ｃ２）は、例えば、タンパク質合成の阻害剤の候補物質で処理をしない一つ以上の細胞を準備し、次いで、この細胞に由来する試料において、リボソームと結合しているｉＭｅｔ−ｔＲＮＡの量を決定した上で、阻害剤の候補物質で処理をした細胞に由来する試料と、この処理をしない細胞に由来する試料とのそれぞれで決定された、リボソームと結合しているｉＭｅｔ−ｔＲＮＡの量を比較することによって行うこともできる。
【００５７】
なお、上記工程（ａ２）において、タンパク質合成の阻害剤の候補物質の代わりにタンパク質合成の阻害剤を用いて細胞を処理してもよく、これによれば、リボソームが関与するタンパク質合成の阻害剤の影響を調べることができる。
【００５８】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００５９】
〔材料及び実験方法〕
（酵母株、培養条件、及びストレス誘導）
本実施例で用いた酵母株は表２にリストしている。酵母細胞は、ＹＰＤ培地（１％酵母エキストラクト, ２％ペプトン, ２％ グルコース／デキストロース）中において、３０℃で、１５０ｒｐｍで回転させながら培養した。単一の酵母コロニーを選択し、一晩培養した。一晩培養した酵母細胞の培養物を、ＯＤ６００が０．０４となるように希釈し、処理前にＯＤ６００が０．５となるまで培養した。アミノ酸飢餓として、細胞を、ＳＤ−ｍｉｎ（ＳＤ最少）培地中において、３０℃で、２０分間培養した。その他のストレス条件については、ストレス付与のための化学物質をそれぞれ含むＹＰＤ培地において、細胞を、３０℃で１時間培養した。ストレス付与のための化学物質の終濃度は以下の通りである：５ｍＭのＣｕＳＯ４ (Nacalai Tesque)、１Ｍのｄ−ソルビトール (Nacalai Tesque)、１Ｍの塩化ナトリウム(Nacalai Tesque)、並びに、１００μＭ, ５００μＭ 及び２ｍＭの過酸化水素(Wako)。低温ショック及び熱ショックはそれぞれ、０℃で１時間、４２℃で１時間の条件で行った。
【００６０】
（酵母の回収とＲＮＡの調製）
ストレスによる誘導を行った後、シクロヘキサミド(Sigma)を培地に加えて(終濃度は１００μｇ／ｍｌ)、さらに２分間培養した。０．４５μｍのＰＶＤＦ膜を備えた真空フィルター装置(Thermo Scientific)を用いて、処理した細胞を速やかに回収した。回収した細胞を膜から速やかにこそぎ取り、予冷したpolysome lysis buffer（文献２８）を用いて再懸濁し、液体窒素を用いて少なくとも５分凍結した。凍結条件下で、凍結した細胞をビーズショッカー(２７００ｒｐｍ, １０秒; Yasui-Kikai)を用いて破砕した。Sepasol-RNA I Super G (Nacalai Tesque)を用いてＲＮＡを精製した。
【００６１】
（Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑ及びｔＲＮＡ−ｓｅｑ用のライブラリの調製）
Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑ用に、RNase If (NEB) (１Ｕ／μｇトータルＲＮＡ)を用いて、酵母細胞のライセートを２５℃で４０分間処理した。消化したＲＮＡを３００μｇまで又は体積にして２００μｌまで、１０−５０％スクロース勾配超遠心管(Seton)の上層にロードした。この遠心管を、４０，０００ｒｐｍ,  ４℃で、２時間、遠心にかけた(Beckman Optima XL-100K, SW41Ti)。Gradient Station (Biocomp)を用いて、モノソーム分画を分離し、回収した。細胞ライセートからのトータルＲＮＡ(ｔＲＮＡ−ｓｅｑ用)又はモノソーム分画中のＲＮＡ(Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑ用)を、Sepasol-RNA I Super G (Nacalai Tesque)を用いて精製し、タンパク質及びペプチジルｔＲＮＡを取り除いた。得られたＲＮＡを１×ＴＢＵローディングバッファ（ｐＨ ８．２）中に再懸濁し、１５％ＴＢＵゲル(Invitrogen)を用いて分離した。
【００６２】
ｔＲＮＡの脱アミノアシル化の変化が、後続するリンカーのライゲーションの効率並びにディープシーケンシングの結果に影響を与えないようにする目的で、１Ｍ Tris-HCl (ｐＨ７．５)を用いて、このＲＮＡのインキュベーションを３７℃で１時間行った。
６０〜１１０ヌクレオチドのＲＮＡ断片（すなわち１２０ヌクレオチドの５Ｓ  ＲＮＡは除かれる）を、既報（文献２８）に従ってリサイクルした。このＲＮＡは、トランケート体Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２(M0242L, NEB)を用いて、Ｌｉｎｋｅｒ−１(表３)とライゲーションされた。ライゲーションで生じたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを１０％ＴＢＵゲル(Invitrogen)を用いて分離した。１ｍＭのｄＮＴＰの存在下、３７℃で３０分間行われる、oCW-RTv2オリゴ(表３)を用いた、ReverTra Ace (Toyobo)による逆転写反応のために、７０〜１５０ヌクレオチドの長さのＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドをリサイクルした。逆転写産物（RT product）を１０％ＴＢＵゲル(Invitrogen)を用いて分離し、ＰＣＲ鋳型として用いるために、８５〜２００ヌクレオチドのＤＮＡをリサイクル及び環状化した(CircLigase-II, Epicentre)。PrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara), oNTI231及びインデクスト・オリゴ (表３) の存在下、２段階反応によるＰＣＲを行った。９８℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を２サイクル、次いで、９８℃で１０秒、６５℃で１０秒、７２℃で１０秒を８サイクルである。
【００６３】
ＰＣＲ産物は５−２０％ＰＡＧＥ(E-R520L, ATTO)を用いて分離し、１５０〜３００ヌクレオチド長の断片（すなわち、１４０ヌクレオチド長の産物は含まれない）を、ｔＲＮＡ−ｓｅｑ(トータルＲＮＡ由来)用のライブラリ、又は、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑ(RNase I処理した、リボソーム結合ｔＲＮＡ由来)用のライブラリと定義づけた。
【００６４】
KAPA Library Quantification Kits (Illumina)を用いてこれらシーケンスライブラリを定量した。シーケンシング反応を行う前に、PhiX Sequencing Control (Illumina)をこれらライブラリに添加した（全量に対する５％）。MiSeq (Illumina)又はHiSeq2500 (Illumina)を用いて１３５サイクル、ディープシーケンンシングを行った。
【００６５】
（ｍＲＮＡ−ｓｅｑ用及びＲｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑ用のライブラリの調製）
１００μｇのトータルＲＮＡから、ポリＡテイルＲＮＡを、Oligotex-dT30<Super> mRNA Purification Kit(Takara)を用いて精製した。得られたｍＲＮＡをアルカリ加水分解によって部分的に断片化し、２５〜４０ヌクレオチドの長さの断片を、ｍＲＮＡ−ｓｅｑ用のライブラリを製造するために回収した。４０〜６０ヌクレオチド長の産物、９０〜１５０ヌクレオチド長の産物、１６０〜２００ヌクレオチド長の産物を、それぞれＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、ＲＴ産物、及びＰＣＲ産物として、リサイクルした。Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑ用に、細胞ライセートを、RNase If (NEB) (１Ｕ／μｇ トータルRNA)を用いて、２５℃で４０分処理した。ＲＮＡのサイズによるセレクションを行う前に、モノソーム分画を、１０−５０％スクロース勾配を用いて回収した。モノソーム分画に由来する、２０〜４０ヌクレオチド長のＲＮＡ断片を、Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑ用のライブラリ製造のために回収した。ビオチンとコンジュゲートしたオリゴ(表３)を用いてｒＲＮＡを除去した。ｔＲＮＡ−ｓｅｑ用のライブラリの調製において行ったのと同様にＲＴ反応、及び、ＰＣＲ反応を行った点を除いて、方法の詳細は、既報（文献２８）のプロトコールに従った。
【００６６】
（ライブラリの製造に用いた抗体及びオリゴ）
抗-eEF1α (clone CBP-KK1)抗体(Merck Millipore) 及び抗-phospho-S6 リボソームタンパク質(Ser235/236)抗体(Cell Signaling)を、ウエスタンブロッティングに用いた。本実施例のライブラリの製造に用いたオリゴは表３に纏めた。
【００６７】
（ｔＲＮＡの配列アラインメント）
酵母の個々のｔＲＮＡ種の配列は、GtRNAdb (http://gtrnadb.ucsc.edu/)及びModomics (http://modomics.genesilico.pl/)のウェブサイトの両方から取得（fetched）した。２７５個のｔＲＮＡ配列を、全ｔＲＮＡ遺伝子における２ヌクレオチド以下の相違を考慮して、クラスター化した。クラスター化された各ｔＲＮＡ遺伝子の３’末端に、ＣＣＡ及びＬｉｎｋｅｒ−１の最初の５ヌクレオチド配列であるCTGTAを付加した。個々のｔＲＮＡ遺伝子は、スペーサとしての５０Ａ（５０個の連続するアデニン）によって連結された。ｔＲＮＡリファレンス(tRNA-ref)として、疑似ｔＲＮＡゲノムを定義した。Galaxy (https://usegalaxy.org/)を用いて、Ｌｉｎｋｅｒ−１ (GGCACCATCAAT)の６番目のヌクレオチドから、１３５ヌクレオチドのシーケンシングリードにおける３’アダプター配列を切り取った。ｔＲＮＡのアラインメントのために、長さが１５ヌクレオチドを超えるもののみ、切り取ったリードを回収した。ｔＲＮＡのアラインメントのために、基準として、少なくとも８０%の類似性、少なくとも１５ヌクレオチドの同一性、及び、３つまでのヌクレオチドのミスマッチを許容した。ｔＲＮＡのアラインメントのために、基準として、少なくとも９０％の類似性、少なくとも２１ヌクレオチドの同一性、及び、ただ１つのみのヌクレオチドのミスマッチを許容した。ディープシーケンシングのリードもまた、Galaxyウェブサイト (http://galaxyproject.org/)、及びStrand NGS ソフトウェア (Strand Life Sciences Private Limited)によって処理及びアラインメントを行った。
【００６８】
（Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑによる、Ｅ−、Ａ−、及びＰサイトのｍＲＮＡコドンの同定）
Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑのリードからの２８ヌクレオチド及び２９ヌクレオチドの断片の両方は、Galaxy (https://usegalaxy.org/)によって別々に取得された。２８ヌクレオチドの断片において、Ｅ−, Ｐ− 及びＡ−サイトのｍＲＮＡコドンはそれぞれ、当該断片の１０〜１２番目のヌクレオチド、１３〜１５番目のヌクレオチド、１６〜１８番目のヌクレオチドによってそれぞれ定義づけられた。２９ヌクレオチドの断片においては、既報（文献１０）にあるようにＥ−, Ｐ− 及びＡ−サイトのｍＲＮＡコドンはそれぞれ、当該断片の１１〜１３番目のヌクレオチド、１４〜１６番目のヌクレオチド、１７〜１９番目のヌクレオチドによって定義づけられた。
【００６９】
（ストレス誘導細胞における各ｔＲＮＡ種の占有率の解析）
個々のｔＲＮＡの存在量は、ｔＲＮＡリファレンスにおいて、一つのｔＲＮＡ遺伝子に関する整列リード（aligned read）の数を、トータルｔＲＮＡ遺伝子の全整列リードの数で除算することでスコア化することによって計算した。ストレス誘導細胞におけるｔＲＮＡの存在量を解析するために、ストレス下における各ｔＲＮＡの量を、コントロール細胞における各ｔＲＮＡの存在量でノーマライズした。６種類のストレス条件下のサンプルからの、ストレス誘導細胞とコントロール細胞との間のｔＲＮＡ存在量における偏差の絶対値の平均は、偏差インデックス(V.Index)として定義した。
【００７０】
【数１】
2019103402.tif 000003
【００７１】
（Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑ及びｔＲＮＡ−ｓｅｑからのｉＭｅｔ／１８Ｓ比の解析）
iMet-tRNA-CAUの存在量は、iMet-tRNA-CAU遺伝子に関するリード数を、ｔＲＮＡリファレンスにおける全リード数で除算して求めた。１８Ｓ ｒＲＮＡの存在量は、酵母１８Ｓ ｒＲＮＡリファレンスにおけるリード数を、全配列のリード数で除算して求めた。ｉＭｅｔ／１８Ｓ値は、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑ 及びｔＲＮＡ−ｓｅｑにおける、ノーマライズされたiMet-tRNA-CAUの存在量によって計算され、ｉＭｅｔ／１８Ｓ比は、ストレス誘導細胞とコントロール細胞との間の比較によって得られた。
【００７２】
【数２】
2019103402.tif 000004
【００７３】
（ｔＲＮＡにおける３’ＣＣＡテイルの分解の頻度解析）
ｔＲＮＡにおける３’ＣＣＡ-テイルの分解の頻度は、ｔＲＮＡ遺伝子の全リードに対する、３’Ｃ−又はＣＡ−テイルを含んでいるｔＲＮＡのリード数によって計算した。ストレス誘導細胞における３’ＣＣＡテイルの分解の相対頻度は、コントロール細胞における３’ＣＣＡテイルの分解の相対頻度によってノーマライズした。
【００７４】
（統計）
two-tailored Student’s t-test, Pearson's correlation coefficient testに関する統計学的解析は、OpenOffice (Apache), Excel (Microsoft)、及びSocial Science Statistics (http://www.socscistatistics.com/Default.aspx)によって行った。
【００７５】
〔結果〕
（ｔＲＮＡリボソームプロファイリング技術の確立）
酵母細胞を翻訳阻害剤であるシクロヘキサミドにより短時間処理した直後、翻訳中のリボソーム内のｔＲＮＡを回収し、ｔＲＮＡリボソームプロファイリング技術を確立した。ＲＮａｓｅＩ（文献６）を用いて処理をした酵母細胞ライセートと、当該処理をしていない酵母細胞ライセートとを使用し、スクロース勾配法を実施し、様々な状態のリボソームを分画し、ＲＮＡを解析した。ＲＮａｓｅＩを用いた処理をしていない場合、７０〜１１０塩基の範囲の大きさのｔＲＮＡが、最上分画、モノソーム分画およびポリソーム分画に確認された（図４のａ−ｂ）。一方ＲＮａｓｅＩを用いた処理をした場合、最上分画においては保護されていないｔＲＮＡは完全に消化される一方、モノソーム中の、リボソームと結合したｔＲＮＡ（「リボソーム結合ｔＲＮＡ」と称する場合もある）は消化されず残っていた（図４のａ−ｂ）。したがって、ほとんどの細胞内ｔＲＮＡはＲＮａｓｅＩで消化される一方、リボソームと結合したｔＲＮＡは、リボソームと結合したｍＲＮＡにおいて報告される（文献６）のと同様にＲＮａｓｅＩ処理に抵抗性である（図４のｂ）。
【００７６】
重要なことに、ｔＲＮＡリッチなモノソーム分画は、ｔＲＮＡをリボソームへ輸送する伸長因子（ＥＦ）−１を含有せず（図４のｃ）、ｔＲＮＡがＥＦ−１からではなく翻訳中の８０Ｓリボソームから回収されたことを示している。リボソームのプロファイリングのための、リボソーム結合ｍＲＮＡのライブラリ生産の方法（文献６）を使用することで、それぞれＲＮａｓｅ処理を行わずに、または行った、全分画の、またはモノソーム分画のシーケンスライブラリを作成し、ディープシーケンス解析を実施した；以下、ＲＮａｓｅ処理を行った方をｔＲＮＡリボソームプロファイル（Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑ）、ＲＮａｓｅ処理を行っていない方をｔＲＮＡプロファイル（ｔＲＮＡ−ｓｅｑ）とする（図１のａ）。
【００７７】
リボソーム結合ｔＲＮＡおよび全ｔＲＮＡのディープシーケンスリードを、酵母のゲノムリファレンス(http://www.yeastgenome.org/; S288C SerCer3)にアラインした。ｔＲＮＡの定量的アラインメントの効率を向上させるため、２８６のｔＲＮＡ種から４７の異なるｔＲＮＡ配列をリアセンブルし、ｔＲＮＡ−ｓｅｑおよびＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑの両方のリファレンスとしてＳ２８８Ｃ酵母の疑似ｔＲＮＡゲノム（ｔＲＮＡ−ｒｅｆ）を作成した。このｔＲＮＡ−ｒｅｆに対するシーケンスのアライメントによって、多重整列リードのフラクション（＞２）は３％以下に減少した。
【００７８】
反復した実験において、ｔＲＮＡ−ｓｅｑおよびＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑの両方のデータは高度に再現性を有するものであり（Ｒ２＞０．８５、ｎ＝４７、図１のｂ、ｃ）、以前に公開されたマイクロアレイデータと同等のものであるが（図５）（文献７）、ｔＲＮＡコドンの定量および分類においてはより優れている。シクロヘキサミド処理は、ペプチド転移の完了後にリボソームのトランスロケーションを阻害し、リボソームＡサイトにおいてペプチジルｔＲＮＡを、リボソームＰサイトにおいてアミノ酸をチャージしないｔＲＮＡ（以下「非チャージｔＲＮＡ」）を生成するため（文献８）、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑにおけるｔＲＮＡコドンは、Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑにおけるｍＲＮＡのＰサイトのコドンに対応すると考えられた。
【００７９】
この仮説を検証するため、ｔＲＮＡ−ｓｅｑおよびＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑのライブラリに加え、同時に、同一のモノソーム分画から全ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ−ｓｅｑ）（文献９）およびリボソーム結合ｍＲＮＡ（Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑ）（文献６）のシーケンスライブラリを作成し、ディープシーケンス解析を実施した（図１のａ）。次に、Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑ中の２８ヌクレオチドの断片と２９ヌクレオチドの断片とについて、Ｅサイト、Ｐサイト、Ａサイト、ならびに疑似ＰサイトにおけるｍＲＮＡコドンを計算した。ここで、疑似Ｐサイトは、２８ヌクレオチド断片の１３〜１５番目、２９ヌクレオチド断片の１４〜１６番目とそれぞれ決定した（文献１０）（図６のａ、ｂ）。リボソーム内にあるｔＲＮＡのどのサイトがＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑのライブラリにおいて収集されたのかを調べるため、ｍＲＮＡコドン（Ｅ、ＰまたはＡサイト）とリボソーム内にあるｔＲＮＡコドンとの相関を、Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑおよびＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑデータを使用して解析した。予想通り、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑデータにおけるｔＲＮＡコドンは、Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑデータにおけるｍＲＮＡのＰサイトのコドンとより高い相関を示した（ｒ＝０．７１, Ｐ＜０．００１）（図１のｄおよび図６のｂ）。さらに、フェノール／クロロホルム精製したＲＮＡを、塩基性バッファを用いｐＨ７．５でのインキュベーション（文献７）を１時間行っても、シーケンスライブラリの質にもＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑの結果にも影響を与えなかった（データなし）。この結果は仮説として考えた「アミノ酸をチャージしたｔＲＮＡ（「チャージｔＲＮＡ」と称する場合もある）の塩基性バッファを用いた脱アミノアシル化を行わずとも、シクロヘキサミド処理された細胞において、リボソームのＰサイトのｔＲＮＡは既にアミノ酸のチャージが外れており（文献８）、結果として脱アミノアシル化したｔＲＮＡの３’末端におけるヒドロキシ基は高効率でライブラリ調製におけるリンカーと結合する」と一致する。この結果は、構築されたＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑライブラリは、主にリボソームのＰサイトから収集されたことを支持する。
【００８０】
（２）Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑおよびｔＲＮＡ−ｓｅｑによるｔＲＮＡ修飾の検出
ｔＲＮＡ修飾はｔＲＮＡの安定性、ひいてはｍＲＮＡの翻訳において重要な役割を演ずる可能性がある。しかしその生物学的な意義はほとんど理解されていない。ディープシーケンスのためのライブラリ作成に必要である、逆転写（ＲＴ）反応は、以前に報告されたように（文献１１）、ｔＲＮＡの修飾箇所における、逆転写反応の終了またはミスマッチヌクレオチドの組み込みによって、修飾の検出が可能であることが発見された。ｔＲＮＡ修飾の存在を確認するため、非必須ｔＲＮＡ修飾因子（ＴＲＭ１、ＴＲＭ１０およびＡＢＰ１４０）欠損株の酵母のｔＲＮＡ−ｓｅｑを実施し、結果をｔＲＮＡ修飾データベース（文献１２）と比較した。ｔＲＮＡ−ｓｅｑおよびＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑにより１０か所のｔＲＮＡ修飾をモニターすることが可能であることを発見し（図１のｅおよび図７）、さらに、構築されたｔＲＮＡ−ｓｅｑと、バイオインフォマティックスによる予想（文献１２）との間で、ｔＲＮＡ修飾に顕著な差があることが判明した（詳細は表１参照）。例えば、ｔＲＮＡのＤループにおける新規な可能性のある２つの修飾である、Ｌｅｕ−ｔＲＮＡ−ＵＡＧおよびＴｙｒ−ｔＲＮＡ−ＧＵＡの存在を示唆する（表１）。最後に、ｔＲＮＡ−ｓｅｑとＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑとの間で、ｔＲＮＡ修飾のレベルに差を見出されなかった（図１のｅ）。
【００８１】
次に、ｔＲＮＡの二次構造の安定性に関わるｔＲＮＡ修飾が、翻訳に際してのリボソームによるｔＲＮＡの選択に寄与するか否かを調査した。主要なｔＲＮＡ修飾の１つである、ｔＲＮＡ（ｍ（２，２）Ｇ２６）ジメチルトランスフェラーゼ（Ｔｒｍ１）による、ｔＲＮＡのＧ２６における二重メチル化（Ｍ２２Ｇ２６修飾）に注目した。全４７のｔＲＮＡ種の約半分がＭ２２Ｇ２６修飾を有するため（表１）、この修飾はＭ２２Ｇ２６のｔＲＮＡにおける存在が翻訳に影響を与えるか否かに取り組むための理想的なプラットホームを提供する。ｔＲＮＡ−ｓｅｑは、Ｍ２２Ｇ２６を欠くｔＲＮＡではなく、Ｍ２２Ｇ２６を有するｔＲＮＡの量が、ＴＲＭ１の欠損により減少したことを明らかにしている（図１のｆ）が、この現象は、おそらくはＭ２２Ｇ２６を欠くｔＲＮＡの不安定化およびそれに続く分解による。この結果は、Ｍ２２Ｇ２６がｔＲＮＡの二次構造を安定化するという以前の報告（文献１３）と一致する。興味深いことに、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑは、ＴＲＭ１の欠損が、リボソームに結合した、Ｍ２２Ｇ２６を有するｔＲＮＡの存在量に変化を与えないことを示した（図１のｆ）。したがって、ｔＲＮＡの安定性の減少は翻訳の効率に影響を与えるとする以前の報告（文献１４）とは対照的に、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑは、少なくともＭ２２Ｇ２６で修飾されたｔＲＮＡに関して、リボソームは、厳密な翻訳をなすため、Ｍ２２Ｇ２６で修飾されたｔＲＮＡの減少に耐えることを明らかにした。
【００８２】
（リボソーム結合ｔＲＮＡの集団は環境ストレスに敏感である）
Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑにより明らかになった、リボソームに結合した各ｔＲＮＡ種の存在量は、ｔＲＮＡ−ｓｅｑによるものとは全く異なる（Ｒ２＝０．４９  図８）。この結果は、ｍＲＮＡのコドンに基づく翻訳のためにｔＲＮＡの選択が生じていることが理由であると予期された。したがってＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑは、全体の翻訳の状態をｔＲＮＡ−ｓｅｑよりも正確に表していると考えられる。ゆえに、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑはｔＲＮＡ−ｓｅｑよりも細胞培養の状態に対し敏感であるという仮説を立てられた。この仮説を検証するため、酵母細胞を様々な環境ストレス、例えば温度変化、アミノ酸飢餓および酸化ストレスの対象とし、その翻訳への影響をＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑおよびｔＲＮＡ−ｓｅｑにより調査した。その結果、全ｔＲＮＡはストレスにより大きな変化を受けない一方、ストレスの、リボソーム結合ｔＲＮＡへの影響は様々であることが発見された。例えばGly-tRNA-UCC, Ile-tRNA-UAU, Met-tRNA-CAU1（開始メチオニンｔＲＮＡ）, Pro-tRNA-AGGおよびThr-tRNA-UGUは、他のｔＲＮＡより高いストレスへの感受性を示した（図２のａ）。
【００８３】
様々な環境ストレスに応答して、細胞は特定の遺伝子の発現を誘導および／または阻害することで翻訳の状態を変更する（文献２、１５、１６）。アミノ酸枯渇は、リボソームを翻訳開始サイトの近傍に停止させ（文献６）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）は、短い上流ＯＲＦ（ｕＯＲＦ)および５’コード開始領域へのリボソームの蓄積を誘導する（文献１７）。にもかかわらず、ｍＲＮＡの翻訳の阻害のメカニズムは（特に、環境ストレスが翻訳開始とペプチド鎖伸長とのどちらを主に阻害するか）、完全には理解されていない。ｔＲＮＡ／ｍＲＮＡリボソームの同時プロファイリングは、環境ストレスにより引き起こされる未解明の阻害のメカニズムを明らかにする手がかりを提供する可能性がある。
【００８４】
アミノ酸飢餓の翻訳への影響を調査した。以前の報告（文献６）のとおり、２０分のアミノ酸枯渇により、翻訳開始サイト周辺へのリボソームの占有が顕著に増加したが、リボソームの蓄積は開始コドンの直後において際立っていることが明らかになった（図９のａ、ｂ）。対照的に、ＣＤＳ領域に沿ったリボソームの分布はほとんど影響を受けなかった（図９のｃ）。興味深いことに、ｔＲＮＡ−ｓｅｑではなくＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑを使用することで、アミノ酸飢餓によるリボソーム結合開始メチオニンｔＲＮＡ（ｉＭｅｔ−ｔＲＮＡ）の相対的な量の増加を確認した（図２のｂ）。重要なことに、同一のモノソーム分画由来のＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑからも、ＡＴＧおよびＣＴＧ（２番目に多い非ＡＴＧ開始コドン）の頻度がリボソームＰサイトにおいて増加していることが明らかになった。アミノ酸供給の欠乏はｔＲＮＡのアミノアシル化の減少を引き起こすため（文献１８）、これらの結果はアミノ酸飢餓において、アミノ酸をチャージしたアミノアシル化ｔＲＮＡの不足により、翻訳はペプチド鎖伸長の非常に早い段階で阻害されることを示唆する。この結果は、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑにより、ｉＭｅｔ−ｔＲＮＡが、翻訳阻害のメカニズムのバイオマーカーとして働き得ることを示唆する。
【００８５】
リボソーム内のｉＭｅｔ−ｔＲＮＡのより定量的な知見を得るため、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑにおいて、ｉＭｅｔ−ｔＲＮＡの量を、リボソームの数とほぼ同じである１８Ｓ  ｒＲＮＡの量と比較し、同じ細胞からｔＲＮＡ−ｓｅｑにより得られた値により標準化した。この標準化されたｉＭｅｔ／１８Ｓ比は、翻訳におけるｉＭｅｔ−ｔＲＮＡ使用の効率を表し、翻訳阻害のメカニズムを推定するための定量的な指標を提供し得る。この仮説の検証のため、酵母細胞を、翻訳開始のサプレッサとして知られる４ＥＧＩ−１（文献１９）により処理し、コントロールと４ＥＧＩ−１処理された細胞との間でｉＭｅｔ／１８Ｓ比を比較した。予想の通り、４ＥＧＩ−１処理された細胞のｉＭｅｔ／１８Ｓ比は１より小さく（図２のｄ）、ｉＭｅｔ／１８Ｓ比は翻訳開始の阻害の検出が可能であることを示す。一方、ペプチド鎖伸長を阻害し、翻訳開始には大きな影響を与えないＨ２Ｏ２処理（文献２０）はｉＭｅｔ／１８Ｓ比の増加を示した。全体として、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑの技術は、ｉＭｅｔ／１８Ｓ比が、翻訳において開始またはペプチド鎖伸長のどちらの阻害かを予測する新規のバイオマーカーとして働くことを明らかにした。
【００８６】
低温ショックは翻訳を阻害する最も一般的な環境ストレスであるが（文献２１、２２）、そのメカニズムはほとんど未解明である。その解明のため、酵母細胞に低温ショックを加え、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑおよびｔＲＮＡ−ｓｅｑの両方を実施し、ｉＭｅｔ／１８Ｓ比を計算した。ｉＭｅｔ／１８Ｓ比はコントロールより大きく（図２のｄ）、低温ショックはペプチド鎖伸長を阻害することを示している。
【００８７】
（環境ストレスによるｔＲＮＡにおける３’ＣＣＡテイルの部分的分解）
低温ショックによるペプチド鎖伸長の阻害の考えられるメカニズムについての機構上の知見を得るため、ｔＲＮＡ−ｓｅｑおよびＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑのデータをさらに解析した（図１のａ）。驚くべきことに、ｔＲＮＡの３’ＣＣＡテイルの一部（ほとんどがＡ、より少ない程度でＣＡ）が、低温ショックによりわずかに、しかし有意に分解されることを、ｔＲＮＡ−ｓｅｑによって発見された（図３のａ、図３のｂ）。対照的に、リボソーム結合ｔＲＮＡにおいては３’ＣＣＡテイルの分解は検出されなかった（図３のｂ）。この結果はＣＣＡが部分的に分解されたｔＲＮＡはリボソームに容易に結合しないことを示唆する。
【００８８】
低温ショックによるＣＣＡテイルの部分的な分解のメカニズムを調査するため、細胞ライセートに低温ショックを加えたものの、ＣＣＡテイルの分解は確認されなかった（データなし）。この結果は、ＣＣＡテイルは低温ショックを加えられた細胞内で分解されることを示唆する。最近の研究により、酸化剤の１つである亜ヒ酸塩によりｔＲＮＡにおいて部分的なＣＣＡテイル分解が引き起こされることが示された（文献２３）。そのため、低温ショックにより細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）レベルが増加するかを調査した。意外なことに、ＲＯＳ（ＲＥＦ）と反応する２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ−ＤＡ）の蛍光強度は、低温ショックにより有意に増加したが、熱ショックでは増加しなかった（図１０）。この結果は、少なくとも部分的にはｔＲＮＡのＣＣＡテイルの分解に関わるという、ＲＯＳの誘導における低温ショックの意外な役割を明らかにした。〔因果関係を明らかにするため、低温ショック下でビタミン／グリセロール処理した細胞のｔＲＮＡ−ｓｅｑを含んでもよい。〕
Ｈ２Ｏ２は主要なＲＯＳの１つであり、翻訳においてペプチド鎖伸長を減弱する（文献２０）（図２のｄ）が、その阻害メカニズムは明らかになっていない。そのため、ｔＲＮＡの３’ＣＣＡの分解におけるＨ２Ｏ２の効果を調査した。酵母細胞を異なる濃度のＨ２Ｏ２で処理し、シーケンスライブラリを作成し、ｔＲＮＡ−ｓｅｑおよびＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑを実施した。ｔＲＮＡ−ｓｅｑにより、ＣＣＡテイルは、Ｈ２Ｏ２の濃度依存的に、部分的に分解していることが明らかになった（図３のｃ、図３のｄ）。特に、酵母細胞ライセートを２ｍＭのＨ２Ｏ２で直接処理してもＣＣＡテイルの分解は起こらず（データなし）、最近、原核生物において明らかになったように（文献２０）、Ｈ２Ｏ２自体ではなく、Ｈ２Ｏ２ストレスによって引き起こされる生物学的な経路がＣＣＡテイルの分解に寄与することが示唆された。次に、各ｔＲＮＡ種においてＨ２Ｏ２に誘導された部分的なＣＣＡテイル分解の頻度を調査した。ｔＲＮＡ−ｓｅｑによって、各ｔＲＮＡ種はＨ２Ｏ２に対し異なる感受性を有することが明らかになった（図３のｄ）。興味深いことに、ｉＭｅｔ−ｔＲＮＡのみが、２ｍＭのＨ２Ｏ２においてもＣＣＡ分解を全く示さないことが明らかであり、ｉＭｅｔ−ｔＲＮＡの維持のための細胞保護機構を示唆している。
【００８９】
驚くべきことに、Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑは、特に２ｍＭのＨ２Ｏ２で処理された細胞内の、リボソーム内のｔＲＮＡのＣＣＡテイルの部分的分解をよく検出する（図３のｃ、図３のｄ）。この結果は、ＣＣＡが分解されたｔＲＮＡがＲｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑで観察されなかった低温ショック細胞の結果と好対照である。以前の報告は、高濃度のＨ２Ｏ２は、ｒＲＮＡおよびリボソームタンパク質の酸化によりリボソームの構造を不安定化することを示唆するので（文献２４）、２ｍＭのＨ２Ｏ２により起こり得るリボソームの構造の完全性へのダメージによって、ＣＣＡの分解されたｔＲＮＡがこのリボソームに入りやすくなった可能性がある。
【００９０】
一方、ＣＣＡが分解されたｔＲＮＡは、未だ解明されていない機構で非特異的にリボソームに結合することも考えられる。もし、ＣＣＡテイルの分解による、特定のチャージｔＲＮＡのみの欠乏が生じる低温ショック細胞の場合（図１０のａ）とは対照的に、２ｍＭのＨ２Ｏ２で処理された細胞において、チャージｔＲＮＡの欠乏に加えて、ＣＣＡが分解された（すなわち非チャージの）ｔＲＮＡのリボソームへの入り込みが、リボソームの停止を誘導すること、かつ、ＣＣＡが重度に分解されたｔＲＮＡのコドンに対応するｍＲＮＡのコドンの特定の場所で、翻訳の停止が起こっているとの仮説を立てられた。
【００９１】
この仮説を実証するために、同時のＲｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑ/Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑを採用した。まず、Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑを用いて、コントロールの細胞（０ｍＭのＨ２Ｏ２）と、２ｍＭのＨ２Ｏ２で処理された細胞とのそれぞれにおいて、リボソームのＡサイトまたはＰサイトにおける、ｍＲＮＡコドンの頻度を調べた。２ｍＭのＨ２Ｏ２に起因するＣＣＡの部分的な分解を伴う、特定のｔＲＮＡ種が、リボソームのＡサイトに入り込み、リボソームの停止を誘導する場合は、コントロール(０ｍＭ）と２ｍＭのＨ２Ｏ２処理細胞との間における、ＡサイトのｍＲＮＡコドンの相関は、ＰサイトのｍＲＮＡコドンの相関より低いことが期待される。
【００９２】
実際、コントロールの細胞と２ｍＭのＨ２Ｏ２処理をした細胞との間における、ＡサイトにおけるｍＲＮＡコドンの相関(Ｒ２＝０．４０)は、Ｐサイトにおける相関(Ｒ２＝０．６９)と比較して低かった（図３のｅ）。さらに、２ｍＭのＨ２Ｏ２で処理した細胞において、ＡサイトにおけるＣＧＡ、ＣＣＧ、ＴＣＣ／ＴおよびＡＣＧのｍＲＮＡコドンの頻度に重大な増加を見出し（図３のｅ）、これは、対応するｔＲＮＡコドンにおけるＣＣＡテイルの分解が高頻度であることとよく相関していた（図３のｄ）。重要なこととして、ゆらぎ塩基対（wobble pairing)は、リボソームに結合したｔＲＮＡコドンと、リボソームに結合したｍＲＮＡコドンとの間でより高い相関を示す傾向にあることを示し（図３のｆ）、このことは、ｍＲＮＡ−ｔＲＮＡ間のコドン対のゆらぎは、ワトソン−クリックコドン対よりもより頻繁に、ペプチド鎖伸長の阻害に関与していることを示唆している。
【００９３】
部分的なＣＣＡテイルの分解を有するｔＲＮＡを原因とするリボソームの停止の頻度は、二つのファクターによって決定される。一つは、ｔＲＮＡにおけるＣＣＡテイルの分解の存在量であり、他の一つはリボソーム内のｔＲＮＡの占有率である。次に、これら二つのファクターの積が、ＡサイトのｍＲＮＡコドン（またはＰサイトのｍＲＮＡコドン）に相関するかを調べた。この目的で直接比較を行うためにｍＲＮＡコドン及びｔＲＮＡコドンの双方をアミノ酸に翻訳した。Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑ/Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑから明らかとなったことは、Ｐサイトにおけるものではなく、ＡサイトのｍＲＮＡコドンに対応するアミノ酸が、リボソームに結合したｔＲＮＡに由来する上記二つのファクターの積とより高い相関を示した(ｒ＝０．６２, ｎ＝２０)。一方で、ＡサイトのｍＲＮＡコドンに対応するアミノ酸は、全ｔＲＮＡに由来する上記二つのファクターの積との相関はさほど高くなかった（ｒ＝０．５１, ｎ＝２０）（図３のｇ）。
【００９４】
さらに、一例として、リボソームのＡサイトにおいて重篤なＣＣＡテイルの分解を示すSer-tRNA-AGA（図３のｄ）に対応する、ＴＣＴコドンを含んだ２９ヌクレオチドからなる特定のｍＲＮＡ断片を含んでいる、非常に特異的なリボソームの停止が、ＴＥＦ２遺伝子において検出された（図１１）。これらのことは、２ｍＭのＨ２Ｏ２のような苛烈なストレスは、ｔＲＮＡの３’ＣＣＡテイルにダメージを付与するだけではなく、リボソームの構造自体にもダメージを付与し、その結果として生じる不安定化したリボソームへ、ＣＣＡが分解された非チャージｔＲＮＡが組み込まれることによって、ペプチド鎖の伸長が阻害され、翻訳の停止になるという仮説とよく一致している。これらを合わせると、同時Ｒｉｂｏ−ｍＲＮＡ−ｓｅｑ/Ｒｉｂｏ−ｔＲＮＡ−ｓｅｑは、ＣＣＡテイルが分解されたｔＲＮＡが不安定化したリボソームに入り込むことが関与している、翻訳の新たな阻害メカニズムを明らかにした。
【００９５】
〔文献一覧〕
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【００９６】
【表１】
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【００９７】
【表２】
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【００９８】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明は、例えば、タンパク質合成の解析、及びタンパク質合成阻害剤のスクリーニング等に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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