(57)【要約】 【課題】本発明は、従来にない新たなアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用組成物、及び該組成物を含む食品、医薬品、飼料を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、κ−カゼイングリコマクロペプチド（ＧＭＰ）を有効成分とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物を提供する。また、ＧＭＰを有効成分とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飲食品、医薬品、飼料を提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
κ−カゼイングリコマクロペプチドを有効成分とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
【請求項２】
κ−カゼイングリコマクロペプチドを有効成分とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飲食品。
【請求項３】
κ−カゼイングリコマクロペプチドを有効成分とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用医薬品。
【請求項４】
κ−カゼイングリコマクロペプチドを有効成分とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、κ−カゼイングリコマクロペプチドを含むアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物、及び該組成物を含む飲食品、医薬品、飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、腸内細菌が宿主の代謝調節機能に重要な役割を担っていること、そして腸内細菌叢の破綻により宿主の代謝機能に異変が生じ、様々な疾患の原因となることが明らかにされつつある。したがって、健全な腸内細菌叢を保つことが宿主の健康維持に重要である。宿主によい効果をもたらす腸内細菌としては、ビフィドバクテリウム属菌やある種のラクトバチルス属菌などが知られており、それらをプロバイオティクスとして食品とともに摂取する、または腸内でそれらの増殖を促進する食品をプレバイオティクスとして摂取することが推奨されている。
【０００３】
一方、最近の腸内細菌研究からは、宿主の健康に寄与する新たな腸内細菌が報告されてきている。アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）は、ヒトの腸内細菌の１〜５％を占める細菌であり、宿主が消化管から分泌するムチンを分解・資化する特徴を有する（非特許文献１）。Clement K.らは、ヒト腸内におけるアッカーマンシア・ムシニフィラの量が、空腹時血糖値、血中インスリン値、およびウエスト周囲長と逆相関を示すことを報告している。すなわち、アッカーマンシア・ムシニフィラは、肥満、糖尿病、心疾患などの予防に効果的である可能性が示唆されている。また、マウスに高脂肪食を食べさせると肥満、腸管のバリア機能の低下、および脂肪組織の炎症マーカーが上昇、などの症状を呈するが、このとき盲腸内容物中のアッカーマンシア・ムシニフィラ量が低下することが報告されている。この高脂肪食のマウスに経口的に生きたアッカーマンシア・ムシニフィラを投与すると、脂肪量の増加、インスリン抵抗性、腸管バリア機能、脂肪組織の炎症などの代謝不全が改善された（非特許文献２）。
【０００４】
このように、腸管内でのアッカーマンシア・ムシニフィラ量が低下することは、腸の機能だけではなく全身の代謝機能を低下させることが明らかにされつつある。したがって現在では、腸内のアッカーマンシア・ムシニフィラを増加させるための様々な方法が検討されている。抗糖尿病薬として一般的に用いられているメトフォルミンの投与により、腸内のアッカーマンシア・ムシニフィラが増加することが報告され、アッカーマンシア・ムシニフィラ増加剤として期待されている。しかし、薬剤であることから既に糖尿病を発症している患者以外には適用することはできない。健康なヒト、または肥満気味なヒトなどが疾病予防を目的に食事として摂取できるアッカーマンシア・ムシニフィラ増加剤が期待されてきた。
【０００５】
κ−カゼイングリコマクロペプチド（以下、ＧＭＰと略記する）は糖ペプチドの一種で、牛乳タンパク質の８０〜８５％を占めるカゼインのうちで唯一の糖タンパク質であるκ−カゼインの糖鎖を含むＣ末端ペプチドであり、牛乳の場合κ−カゼインの１０６−１６９残基に相当し、分子量は、約７，０００である。また、ＧＭＰは、グルタミン酸残基を多く持つほか、糖鎖中にシアル酸残基を持つなど、カルボキシ基に富んでいる。
ＧＭＰはこれまでに、胃から出るホルモン（ＣＣＫ：満腹ホルモン）の分泌促進を介した食欲抑制作用（非特許文献３）、脂肪細胞への直接的な作用による脂肪蓄積抑制作用（非特許文献４）、ビフィズス菌の増殖促進作用（非特許文献５）、感染防御作用（特許文献１）、カルシウム吸収促進剤（特許文献２）などが報告されているが、アッカーマンシア・ムシニフィラに対する作用について記載や示唆のある文献等は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第２６３１４７０号公報
【特許文献２】特許第３５７５７２４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Derrien M.ら, App. Enviroment. Microbiol. 2008, 74:1646-1648
【非特許文献２】Everard A.ら, PNAS, 110:9066-9071, 2013
【非特許文献３】Beucher S.ら, J Nutr Biochem, 5:578-584,1994
【非特許文献４】Xu SP.ら, J Dairy Sci, 94(2):676-683, 2011
【非特許文献５】Idota T.ら, Biosci Biotech Biochem, 58(9):1720-1722, 1994
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、従来にない新たなアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用組成物、及び該組成物を含む食品、医薬品、飼料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、腸内のアッカーマンシア・ムシニフィラを増加させる素材を鋭意検討した結果、ＧＭＰにアッカーマンシア・ムシニフィラを増加させる作用があることを見出し、本発明を完成させるに至った。また、換言すればＧＭＰのこれまでに報告されていない新たな用途を見出したことに基づく発明である。
即ち本発明は以下の構成を有する。
（１）κ−カゼイングリコマクロペプチドを有効成分とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物。
（２）κ−カゼイングリコマクロペプチドを有効成分とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飲食品。
（３）κ−カゼイングリコマクロペプチドを有効成分とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用医薬品。
（４）κ−カゼイングリコマクロペプチドを有効成分とするアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飼料。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、従来にない新たなアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用組成物、及び該組成物を含むアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用飲食品、医薬品、飼料を提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＧＭＰ投与群とＣｏｎｔｒｏｌ群のマウス盲腸内容物の総菌量を示すグラフである。
【図２】ＧＭＰ投与群とＣｏｎｔｒｏｌ群のマウス盲腸内容物中のアッカーマンシア・ムシニフィラ量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のＧＭＰを有効成分として含むアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用組成物、及びＧＭＰを有効成分として含むアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用飲食品、医薬品、飼料について以下に詳細に説明する。
【００１３】
（κ−カゼイングリコマクロペプチド：ＧＭＰ）
本発明のＧＭＰについて説明する。本発明のＧＭＰはκ−カゼインにレンネットまたはペプシンを作用させた時に生成するシアル酸結合ペプチドであって、チーズホエイおよびレンネットカゼインホエイに含まれることが従来から知られている。
上記したとおり、本発明のＧＭＰは、κ−カゼインの糖鎖を含むＣ末端ペプチドであり、牛乳の場合κ−カゼインの１０６−１６９ 残基に相当し、分子量は、約７，０００である。
本発明のＧＭＰは、牛乳以外にもヤギやヒツジなどの獣乳由来のホエイ中から得られるものであればどのようなものでも用いることができる。
【００１４】
（ＧＭＰの製造方法）
本発明のＧＭＰの製造方法について説明する。
特許第２６７３８２８号、または特開平６−２５２９７公報に記載の方法により、本発明のＧＭＰを含む組成物を調製することができる。すなわち、ＧＭＰを含有する乳質原料物質、例えばチーズホエー、ホエー蛋白質濃縮物、除蛋白質チーズホエー等を、まずｐＨ４未満に調整した後、分画分子量１０，０００〜５０，０００の膜を用い、限外濾過処理をして透過液を得、好ましくは再度、該透過膜をｐＨ４以上に調整した後、分画分子量５０，０００以下の膜を用いて脱塩し濃縮することによりＧＭＰを調整する方法が挙げられる。また、乳質ホエーをｐＨ６．０以上に調整し４０〜７９℃で加熱処理したものを膜処理に付して乳清たんぱく質を除去し、ＧＭＰを濃縮液側に回収し、得られた濃縮液をｐＨ５．５以下にした後、再び膜処理に供してＧＭＰを透過液側に回収することによりＧＭＰ含有量の高い組成物を調製する方法を挙げることができる。
また、所望の製造量や組成物中のＧＭＰ含量により、以下の実施例に示した方法等でも調製することができる。
得られた組成物中のＧＭＰ量は、引用文献に記載の方法や、以下の実施例に示す方法により測定することができる。例えば、ＧＭＰ高含量の濃縮液中の純度は、特許文献２の実施例に示されるようなウレア−ＳＤＳ電気泳動法により分析することができる。または、ＧＭＰ高含量をゲルろ過カラムを装着したHPLCで分離・検出（210 nm）することで測定することができる。
【００１５】
（ＧＭＰのアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進作用の評価）
本発明のＧＭＰによるアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進作用は、ＧＭＰを投与した場合と非投与の場合における腸内または糞便中のアッカーマンシア・ムシニフィラの増加を比較し、非投与よりも投与の方が増加した場合に本発明の増加促進作用があると評価することができる。増加は増殖と同義で用いられる。アッカーマンシア・ムシニフィラの増加・増殖は菌の増加・増殖の評価に通常用いられる方法であればいずれでもよく、例えば、以下の実施例に記載した方法を挙げることができる。
【００１６】
（ＧＭＰを含む飲食品、医薬品、飼料）
本発明の上記製造方法により得られたＧＭＰ（あるいはＧＭＰを含む組成物）は、そのまま飲食品の原材料として用いることができ、ＧＭＰを含む組成物を添加すること以外は、各食品の定法により製造すれば良い。
したがって、本発明の有効量のＧＭＰはどのような飲食品に配合しても良く、飲食品の製造工程中に原料に添加しても良い。飲食品の例としては、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料、バター、マーガリンなどの乳製品、乳飲料、果汁飲料、清涼飲料などの飲料、ゼリー、キャンディー、プリン、マヨネーズなどの卵加工品、バターケーキなどの菓子・パン類、さらには、各種粉乳の他、乳幼児食品、栄養組成物などを挙げることができるが特に限定されるものではない。
このようにして製造された有効量のＧＭＰを含む飲食品は、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用飲食品として提供される。
【００１７】
本発明の上記製造方法により得られたＧＭＰ（あるいはＧＭＰを含む組成物）は、そのまま医薬品の原材料として用いることができ、ＧＭＰを含む組成物を添加すること以外は、錠剤、カプセル、粉末、シロップ等の定法により製造すれば良い。
したがって、本発明のＧＭＰを有効成分として含む医薬品の製剤化に際しては、製剤上許可されている賦型剤、安定剤、矯味剤などを適宜混合して製剤化するほか、ＧＭＰをそのまま乾燥して粉末剤、散剤として用いることもできる。また、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進作用を妨げない範囲で、賦型剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の薬剤を混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤などが可能である。
このようにして製造された有効量のＧＭＰを含む医薬品は、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用医薬品として提供される。
【００１８】
本発明の上記製造方法により得られたＧＭＰ（あるいはＧＭＰを含む組成物）は、そのまま飼料の原材料として用いることができ、ＧＭＰを含む組成物を添加すること以外は、飼料の定法により製造すれば良い。
したがって、本発明の有効量のＧＭＰは前記飲食品と同様にどのような飼料に配合しても良く、飼料の製造工程中に原料に添加しても良い。
このようにして製造された有効量のＧＭＰを含む飼料は、アッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用飼料として提供される。
【００１９】
（ＧＭＰの摂取量）
本発明のＧＭＰを飲食品、医薬品、飼料などの素材又はそれら素材の加工品に配合させてアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用組成物を製造する場合、配合割合は特に限定されず、製造の容易性や好ましい一日投与量にあわせて適宜調節すればよい。
一日投与量は、投与対象の症状、年齢などを考慮してそれぞれ個別に決定されるが、成人ヒトの場合、ＧＭＰを1日当り０．１ｇ以上を摂取すればよく、１ｇ以上が好ましく、１０ｇ以上がさらに好ましい。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
〔実施例１〕ＧＭＰの調製
ホエイタンパク質濃縮物（サンラクトＮ−２、太陽化学製）１ｋｇを５０℃の水５０Ｌに溶解し、濃塩酸によりｐＨ３．５に調整した。これを、分画分子量２０，０００の限外ろ過膜（ＧＲ６１ＰＰ、ＤＤＳ製）を用い、５０℃、圧力０．４ＭＰａ、平均透過液流速５２．４Ｌ／ｍ２・ｈにて限外ろ過を行なった。透過液量が４０Ｌに達した時点で濃縮液に５０℃の水４０Ｌを加え、連続して限外ろ過を行なった。以上の様にして連続運転を行い、透過液を１６０Ｌ得た。
得られた透過液に２５％苛性ソーダを加え、ｐＨ７．０とし、再度同じ条件、同じ限外ろ過膜で濃縮液が５Ｌになるまで限外ろ過を行い、脱塩濃縮した。続いて５０℃の水を加え、濃縮液量を常に１０Ｌに保ちながら、これまでと同じ条件、同じ限外ろ過膜でダイアフィルトレーションを行い、さらに脱塩した。このダイアフィルトレーションにより透過液量が８０Ｌに達した時点で濃縮液に水を加えるのをやめ、濃縮液量が２Ｌになるまで限外ろ過にて濃縮し、この濃縮液を乾燥し、ＧＭＰ５４ｇを得た。  
【００２２】
〔実施例２〕ＧＭＰの構成糖の分析
１．分析方法
実施例１で得られたＧＭＰの構成糖を分析した。
ＧＭＰを水に溶解し１％溶液（サンプル溶液）を調製した。
Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸量）を測定するために、ねじ口試験管に１００ μＬのサンプル溶液、８００μＬの水、および１００μＬの１Ｎ 硫酸溶液を添加し、ブロックヒーターを用いて８０℃で４５分間、加熱した。冷却後、等量の１００ｍＭの水酸化ナトリウムで中和した後、０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去した。
Ｎ−アセチルガラクトサミンとＮ−アセチルグルコサミンを測定するために、１ｍＬのサンプル溶液と１ｍＬの６Ｎ塩酸をねじ口試験管に入れた後、ブロックヒーターを用いて１００℃で3時間加熱した。冷却後、エバポレーターで反応液を乾固させた後に１ｍＬの水に再溶解し、０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去した。
ガラクトース、グルコース、マンノース、およびフコースを測定するために、１ｍＬのサンプル溶液と１ｍＬの２Ｎトリフルオロ酢酸をねじ口試験管に入れた後、ブロックヒーターを用いて１００℃で２．５時間加熱した。冷却後、エバポレーターで乾固させた後に１ｍＬの水に再溶解し、０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去した。
それぞれの反応液中の糖含量は、Carbopak PA1カラムを装着したDIONEX ICS-5000DPシステムを用いて測定した。
２．分析結果
結果を表１に示す。
ＧＭＰの構成糖は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）含量が６．０重量％であり、構成比率としては５６．１％と最も高く、次にＮ−アセチルガラクトサミン（２．４重量％、構成比率２２．４％）、ガラクトース（１．７重量％、構成比率１５．９％）の順に高かった。
【００２３】
〔試験例１〕
１．試験方法
マウスに通常餌（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＧＭＰを１０％添加した餌を３週間摂取させた。摂取期間終了後に盲腸内容物を採取し、ＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡから総菌量及びアッカーマンシア・ムシニフィラ量を測定するために、リボゾームＲＮＡ遺伝子をターゲットとした定量的ＰＣＲを行なった。ヒトにおける難消化性成分の主な発酵部位は大腸でありアッカーマンシア・ムシニフィラも大腸に存在するが、マウスでの主な発酵部位は盲腸であるため、この試験では盲腸内容物について測定した。したがって、実験結果は盲腸内容物中の総菌量、及びアッカーマンシア・ムシニフィラ量を示すが、これらの結果が盲腸での作用に限定するわけではなく、ヒトでの主な発酵部位である大腸における大腸内容物または糞便中の総菌量、及びアッカーマンシア・ムシニフィラ量に置き換えることができる。
２．試験結果
総菌量は、通常餌を摂取したＣｏｎｔｒｏｌ群に比べてＧＭＰを１０％添加した餌を摂取したＧＭＰ群で有意に増加した（図１）。
また、アッカーマンシア・ムシニフィラ量は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べて、ＧＭＰ群で顕著に増加しており、ＧＭＰ群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群よりも約１，０００倍多いアッカーマンシア・ムシニフィラが検出された。
これらの結果から、ＧＭＰは腸内のアッカーマンシア・ムシニフィラを増加させる作用を有していることが明らかとなった。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
〔実施例３〕サプリメントの製造
実施例１で得られたＧＭＰ粉末３０ｇに、ビタミンＣとクエン酸の等量混合物４０ｇ、グラニュー糖１００ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物６０ｇを加えて混合した。混合物をスティック状袋に詰め、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用サプリメントを製造した。
【００２６】
〔実施例４〕飲料の製造
表２に示した配合により原料を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用飲料を製造した。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
〔実施例５〕医薬品（カプセル剤）の製造
表３に示した配合により原料を混合し、造粒により顆粒状とした後、空カプセルに１０ｍｇずつ充填して、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用医薬品を含むカプセル剤を製造した。
【００２９】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明によれば、ＧＭＰを有効成分とする新たなアッカーマンシア・ムシニフィラ増加促進用組成物、及びＧＭＰを有効成分とするアッカーマンシア・ムシニフィラの増加促進用飲食品、医薬品、飼料を提供することが可能となった。
【図１】
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【図２】
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