(57)【要約】【課題】日本動脈硬化学会の動脈硬化性心筋梗塞予防のガイドライン（２０１７年版）に基づいてＬＤＬコレステロール値を下げても心筋梗塞の発症を防げない人がいる。本願発明は、心筋梗塞や脳梗塞を起こしやすい人、起こしにくい人を簡単な血液検査でスクリーニングし、心筋梗塞や脳梗塞のリスクが高いと判定する方法を提供することが課題である。【解決手段】本願発明は、採取した血清・血漿をそのまま、またはチォール基阻害剤を添加しまたは添加しない検体をそれぞれ一定温度に加熱（インキュベ−ション）し、加熱前後の小粒子ＬＤＬ、小粒子ＬＤＬコレステロールまたはｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬコレステロール（ｓＬＤＬｃ）をそれぞれ測定し、結果をそれぞれ比較し増加する増加量が優位例えば１．５倍または増加率が優位例えば５０％以上あることにより粥状動脈硬化による心筋梗塞や脳梗塞のリスクがより高いと判断する間接的な易酸化性ＶＬＤＬや易酸化性ＬＤＬの測定方法および測定試薬とその装置を提供する。【選択図】図２
2019174432.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
食前または食後、患者から採取した血液を血清や血漿に分離したのち、小粒子ＬＤＬや小粒子様ＬＤＬまたは小粒子や小粒子様ＬＤＬコレステロールまたはｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬ  コレステロールを測定し、かつ当該同一検体の血清や血漿を一定温度に一定時間加温（インキュベーション）し、再び小粒子ＬＤＬや小粒子様ＬＤＬの出現を確認または小粒子や小粒子様ＬＤＬコレステロールやｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬ  コレステロールを測定し、インキュベーション後に、より多く出現したことおよび優位な増加量例えば１．５倍または優位な増加率例えば５０％以上になった時、粥状動脈硬化による心筋梗塞や脳梗塞のリスクが高いと判定する易酸化性ＶＬＤＬおよび易酸化性ＬＤＬの簡便な当該測定方法および当該測定試薬と当該測定装置
【請求項２】
食前または食後、患者から採取した検体を血清や血漿に分離したのち、２分割し、その一方に予めレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼなどの酵素活性を阻害するチオール基阻害剤を一定量加えるか、あるいは２分割せずあらかじめチオール基阻害剤を一定量加えた、および加えない真空採血管を用いてそれぞれ採取し血清や血漿にした検体を、それぞれ一定温度に一定時間加温（インキュベーション）しまたは、３日から１週間程度室温で保管した後、それぞれ小粒子ＬＤＬや小粒子様ＬＤＬまたは小粒子ＬＤＬコレステロールまたはｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬ  コレステロールを測定し、測定結果をそれぞれ比較しチオール基阻害剤を入れない方の検体の測定結果に、小粒子ＬＤＬが出現したことおよび優位な増加量例えば１．５倍または優位な増加率例えば５０％以上になった時、粥状動脈硬化による心筋梗塞や脳梗塞のリスクが高いと判定する易酸化性ＶＬＤＬおよび易酸化性ＬＤＬの簡便な当該測定方法および当該測定試薬と当該測定装置
【請求項３】
被験検体を一定温度にインキュベーションする温度は、３０℃から４０℃で、インキュベーションする時間は３０分から４時間程度とすることを特徴とする請求項１、請求項２の粥状動脈硬化による心筋梗塞や脳梗塞のリスクが高いと判定する易酸化性ＶＬＤＬおよび易酸化性ＬＤＬの簡便な当該測定方法および当該測定試薬と当該測定装置
【請求項４】
小粒子ＬＤＬや小粒子様ＬＤＬの出現の有無を確認する方法、または小粒子ＬＤＬコレステロールまたはｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬ  コレステロールを測定する方法、または、ＬＤＬの酸化変性等により陰性荷電が増大したため小粒子様ＬＤＬが出現したとする変性ＬＤＬ測定方法を含む下記のいずれかまたは複数個含む請求項１から請求項３の粥状動脈硬化による心筋梗塞や脳梗塞のリスクが高いと判定する易酸化性ＶＬＤＬおよび易酸化性ＬＤＬの簡便な当該測定方法および当該測定試薬と当該測定装置
１    ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動（ＰＡＧＥ）法
２    高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法
３    ＰＡＧＥ法およびＨＰＬＣ法などで得られた濃度図にガウス波形近似を施し、小粒子ＬＤＬの出現または小粒子ＬＤＬコレステロールまたはｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬ  コレステロールを測定する方法
４  イオンモビリティスペクトロメトリ分析（Ｉｏｎ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＩＭＳ）法
５  動的光散乱粒度分布測定（ＤＬＳ）法
６  リポ蛋白質の一部を沈殿または分離させる試薬とコレステロールを測定する試薬を使用し小粒子ＬＤＬまたはｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬコレステロールを測をするコレステロール直接測定法
７  アガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）法
８  濃度勾配型グラジュエントゲル電気泳動（ＧＧＥ）法
９  超遠心分離装置で小粒子ＬＤＬを分離分取した後、コレステロールを測定する方法
１０  核磁気共鳴装置で小粒子ＬＤＬ粒子径を測定する方法
【請求項５】
血清や血漿をそのまままたは血清や血漿にチォール基阻害剤を一定量加えたものと加えないものを被験検体として３０℃から４０℃に３０分から４時間インキュベーションする前と後に、小粒子ＬＤＬや小粒子様ＬＤＬ小粒子またはＬＤＬコレステロールまたはｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬ  コレステロールをそれぞれ個別にまたは自動的に測定し、インキュベーションする前と後またはチォール基阻害剤を入れたもの入れないものについて、両者の濃度図や溶出パターンまたは測定値を比較し、インキュベーション後またはチオール基阻害剤を入れない方に小粒子ＬＤＬや小粒子様ＬＤＬが出現したことまたは小粒子や小粒子様ＬＤＬコレステロールまたはｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬ  コレステロールが出現したことまたは優位な増加量例えば１．５倍または優位な増加率例えば５０％以上になったことを個別的または自動的に検出する請求項１から４の粥状動脈硬化による心筋梗塞や脳梗塞のリスクが高いと判定する易酸化性ＶＬＤＬおよび易酸化性ＬＤＬの簡便な当該測定方法および当該測定試薬と当該測定装置
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】動脈硬化や心筋梗塞の危険因子を検出し、心筋梗塞や脳梗塞の予防や治療に活用できる簡便なリポ蛋白質の検査法およびリポ蛋白質の機能の検査法に関する分野。
【背景技術】
【０００２】血液中に存在するリポ蛋白質は、カイロマイクロン（ＣＭ）、超低比重リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、中間比重リポ蛋白質（ＩＤＬ）、低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）、小粒子低比重リポ蛋白質ＬＤＬ（ｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬ、ｓｍａｌｌ  ｓｉｚｅ  ＬＤＬ  、ｓｍａｌｌ  ＬＤＬ）および高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）であり、特にＬＤＬ中のコレステロールは悪玉コレステロール（以後ＬＤＬｃと言う）として良く知られている。中でもＩＤＬや小粒子ＬＤＬ中のコレステロールまたはｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬ  コレステロール（以後ｓＬＤＬｃという）は、超悪玉コレステロールとも言われ動脈硬化や心筋梗塞の原因物質と言われていた。【０００３】総コレステロール（ＴＣ）やリン脂質は細胞膜の構成成分でかつホルモンや生体内酵素の原料であり、中性脂肪（ＴＧ）は直接的なエネルギーとして使われる他、脂肪として脂肪細胞に備蓄され、共に生体にとって不可欠な物質である。
ＴＣやＴＧおよびリン脂質は、脂質のまま血流中に存在することができないので、リポ蛋白質のＣＭ、ＶＬＤＬ、ＬＤＬなどに格納され血流を介して隅々の細胞に搬送される。従って、個々の細胞がＴＣやＴＧ、リン脂質を必要とするときまたは代謝を促進するため当該細胞は、細胞膜表面に係留して存在するリポ蛋白リパーゼ（ＬＰＬ）や肝性リパーゼ（ＨＴＧＬ）を分泌し、ＣＭやＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ中のＴＧを加水分解し、現われたアポＢ１００（ａｐｏＢ１００）やアポＥを認識しＢ／Ｅ受容体（アポＢ／アポＥレセプター）を介して直ちに細胞（Ｃｅｌｌｓ）中に取込まれる。細胞内でＶＬＤＬまたはＩＤＬ、ＬＤＬ、ｓＬＤＬは、脂肪酸（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ）とグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）などにそれぞれ分解されエネルギーとして消費される他、脂肪として蓄積または酵素や細胞膜の原料またはホルモンや新たに生成するＶＬＤＬやＬＤＬの原料として再利用される。【０００４】ＬＰＬやＨＴＧＬは、リポ蛋白質を細胞に届けるために分泌される酵素群であり、ＣＭは主に肝臓に、ＶＬＤＬやＬＤＬは肥満細胞や肝臓を含むいろいろな細胞群に脂質を供給する機能を担っている。【０００５】従来、ＩＤＬや小粒子ＬＤＬが動脈硬化による心筋梗塞や脳梗塞を起こす原因物質であることを前提として、超悪玉ＬＤＬまたは超悪玉コレステロールと言われ、小粒子ＬＤＬ中のコレステロールやｓＬＤＬｃの測定に注目があつまり、既にいろいろな診断薬メーカが競ってｓＬＤＬｃの測定法を開発している（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６）。これらの測定法は、ｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬとそれ以外のＬＤＬを特殊な試薬または界面活性剤などで分別した後、ｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬ中のコレステロールを測定している（以後この方法を総称してｓＬＤＬｃ直接定量法という）。
特に特許文献３は、ｓＬＤＬｃの出現において４０ｍｇ／ｄＬ以上であれば、家族性複合型高脂血症（ＦＣＨＬ）と診断する方法であるが、臨床において、一時的にｓＬＤＬｃの増加はよくあることであり、例えば腎透析時または心臓カテーテル術実施時におけるヘパリン投与で、大量の小粒子ＬＤＬやｓＬＤＬｃが一時的に血中に出現することから、小粒子ＬＤＬやｓＬＤＬｃの存在や増加だけをもってＦＣＨＬと診断することができないし、小粒子ＬＤＬやｓＬＤＬｃの出現そのものが、心筋梗塞や脳梗塞の原因物質と断定することもできない。【０００６】また液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）は、リポ蛋白質をイオン交換樹脂や溶出液を選択することによりＬＤＬやＬＤＬｃまたはｓＬＤＬｃを測定している（特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０）。特に特許文献９は、ＬＤＬのサブクラス（ｓＬＤＬｃ測定を含む）の測定を行っている。また特許文献１０は、ガウス波形近似法によってＬＤＬのサブクラスであるｓＬＤＬｃの測定が試みられている。【０００７】一方３％ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動法（ＰＡＧＥ法）（非特許文献８）は、元々リポ蛋白質を粒子径の大きさ（ｓｉｚｅ）の順番に分析していると言われていたが、この方法で粒子径を特定したとする報告はなかった。最近、ＬＤＬ粒子マーカ（特許文献１１）の出現により、ＬＤＬの相対移動度（ＲＭ）と粒子径の検量線から、粒子径が測定できるようになり、ＰＡＧＥの濃度図をガウス波形近似法（特許文献１２）でＩＤＬ、ＬＤＬや小粒子ＬＤＬ、ｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬまたはｓｍａｌｌ  ｓｉｚｅ  ＬＤＬおよびそれらの粒子径およびそれぞれのコレステロールが間接的ではあるが測定できるようになってきた。【０００８】またガスクロマトグラフィーを用いるイオンモビリティスペクトロメトリー法（Ｉｏｎ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＩＭＳ法）（非特許文献２）でも、ＬＤＬの粒子径や小粒子ＬＤＬ量、ｓＬＤＬｃが測定できるとされている。【０００９】その他、古くから使われている電気泳動法で例えば濃度勾配型グラジュエントゲル電気泳動像法（ＧＧＥ法）（非特許文献３）やアガロースゲル電気泳動法（ＡＧＥ法）（特許文献１３）がある。ＧＧＥ法ではパターンＢが小粒子ＬＤＬであると報告している。またＡＧＥ法で、変性したリポ蛋白質を測定すると記載されているが、小粒子ＬＤＬまたは小粒子様ＬＤＬの測定を意図しているかもしれない。【００１０】さらにＬＤＬ粒子の密度の違いにより分析する超遠心分離法（非特許文献４）や動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定する方法（特許文献１４）（非特許文献５）なども小粒子ＬＤＬ、ｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬまたはｓＬＤＬｃが測定できるとされている。また最近核磁気共鳴装置でＬＤＬや小粒子ＬＤＬの粒子径を測定する方法（非特許文献１０）を使用し計算で心筋梗塞のリスクを予測する方法（特許文献２０）が出現した。【００１１】最近個人の健康管理を目的とした検診検査、例えば郵便検診などが普及してきた。中でも個人が自宅で採血し血清分離できる簡易採血器具（特許文献１８）が出現してから、測定項目も多くなりコレステロールやｓＬＤＬｃの測定が可能になってきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００７−３０４０１２号公報
【特許文献２】国際公開番号ＷＯ２００４／１０５３５００
【特許文献３】国際公開番号ＷＯ２００７／１２６０９９
【特許文献４】国際公開番号ＷＯ２００８／０５０６３６
【特許文献５】特開２０１０−１４８５２６号公報
【特許文献６】特開２０１２−１６５７６１号公報
【特許文献７】特開２００１−３２４４８８号公報
【特許文献８】特開２００４−２３２２号公報
【特許文献９】特開２００２−１３９５０１号公報
【特許文献１０】特開Ｈ９−１５２２５号公報
【特許文献１１】特開２０１３−２０５４１１号公報
【特許文献１２】特開２０１１−１２３０３９号公報
【特許文献１３】特開２０００−３５６６４１号公報。
【特許文献１４】特開２０１０−４８７０３号公報
【特許文献１５】特開２００５−１２１６１９号公報
【特許文献１６】特開２００４−２５８０１４号公報
【特許文献１７】特開２００１−１９２４００号公報
【特許文献１８】特開２００３−２７０２３９号公報
【特許文献１９】特表２０１４−５１６９５３号公報
【特許文献２０】国際公開番号ＷＯ２００５／０４３１７１
【００１３】
【非特許文献１】Ｍａｓａｔｓｕｎｅ  Ｏｇｕｒａ，Ｍｉｋａ  Ｈｏｒｉ，Ｍａｒｉｋｏ  Ｈａｒａｄａ−Ｓｈｉｂａ：Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓ  Ｂｉｏｌ，１８１−１８８，Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１６
【非特許文献２】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５４−８，１３０７−１３１６（２００８）
【非特許文献３】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｖｏｌ．８２，Ｎｏ．２，Ａｕｇｕｓｔ  ４９５−５０６，１９９０
【非特許文献４】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２３，２０８９（１９７７）．
【非特許文献５】Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ  ４７，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，４７６−４８１，２０１０
【非特許文献６】保健科学研究誌，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｓｅ，Ｎｏ．１０：１９−２４，２０１３
【非特許文献７】動脈硬化、Ｖｏｌ．２３（７−８），３９７−４０２、１９９６
【非特許文献８】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２３，２０８９（１９７７）．
【非特許文献９】脂質栄養学８  （１）、１１−２４、１９９９
【非特許文献１０】Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌｉｐｉｄｏｌ．Ａｕｔｈｏｒ  ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ；ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｉｎ  ＰＭＣ  ２０１２  Ｍａｒｃｈ  １．
【非特許文献１１】日本医事新報、第四五二七号２０１１年１月２９日発行、ｐ．５１−５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】心筋梗塞や脳梗塞を発症する前に予測できる簡単な血液検査法があれば人類にとって最も価値ある発見であるが、残念ながらそんな検査法はない。
しかし動脈硬化巣において起こっている現象は概ね解明されリポ蛋白質の酸化が最も怪しいということになっている。中でも小粒子ＬＤＬが不安定で酸化されやすいと記載した先行技術は、たくさんあるが、酸化されやすいことと小粒子ＬＤＬの出現に関わる関連を明確に説明した先行技術がない。すなわち小粒子ＬＤＬが心筋梗塞の原因物質であるという主張は、小粒子ＬＤＬが殆どないＦＨ患者やＩＩ  ａ型脂質異常症またはＬＤＬｃ値が健常域で小粒子ＬＤＬがない脂質健常者にも粥状動脈硬化による心筋梗塞が出現しており、ＬＤＬｃや小粒子ＬＤＬそのものの存在が心筋梗塞の直接的原因物質と断言できる根拠に対する説明ではなかった。
また、脳梗塞発症の患者は、小粒子ＬＤＬが無いまたは少ない人も多く、ＩＩ  ａ型脂質異常症またはＬＤＬｃが健常域で小粒子ＬＤＬがない脂質健常者群とＰＡＧＥの濃度図が酷似していた。
そこで発明者たちは、ＩＤＬや小粒子ＬＤＬが酸化されやすいという説明を補強する必要があると考え研究を続けた。【００１５】インビボにおいて小粒子ＬＤＬが出現する機序について。
ヒトの各細胞は、食後ＣＭやＶＬＤＬを取り込むとき、アポＣをＬＰＬの活性化因子としてＬＰＬやＨＴＧＬを分泌し、ＣＭやＶＬＤＬ、ＬＤＬ粒子中のＴＧを加水分解して粗くなった直後の粒子中のアポＢ１００やアポＥを認識し、細胞表面にあるアポＢレセプターやアポＥレセプター（Ｂ／Ｅレセプター、総称してＬＤＬレセプターということもある）により、ＣＭやＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬをそれぞれ細胞に取り込む。【００１６】この時点でＣＭのほぼ全て（特定疾患を除く）とＶＬＤＬの大部分（ＷＨＯ分類Ｖ型等の疾患を除く）とＬＤＬの一部が消滅する。ＣＭは加水分解された直後直ちに肝臓や他の細胞のＢ／Ｅレセプターに取り込まれ消滅する（一部疾患を除く）、そしてＶＬＤＬの大部分も消滅（一部疾患を除く）し、これによりＣＭレムナントおよびＩＤＬおよび少しではあるが小粒子ＬＤＬまたは小粒子様ＬＤＬが出現する。（以後、小粒子ＬＤＬに小粒子様ＬＤＬを含むものとして記載する。）
しかしＬＤＬ中のＴＧ含有比は１０％と低く（表１）細胞に取り込まれなかったＬＤＬは大部分残っており、これが血中のホスホリパーゼ等によりリン脂質（レシチン）の脂肪酸が加水分解された場合に、小粒子ＬＤＬが出現すると発明者たちは考えた。ＬＤＬ中のフリーコレステロール（ＦＣ）がＨＤＬに付属して存在するレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ、非特許文献７）により抜き取られただけで小粒子ＬＤＬが出現するという解釈は成り立たない。【００１７】ＬＤＬや小粒子ＬＤＬは、既にアポＣを失っており容易にＬＤＬレセプターに結合することができないため血液中に滞留したと考えられる。
なお小粒子ＬＤＬの出現が、ＬＰＬやＨＴＧＬによるＴＧの加水分解だけでないことは、最近発売されたＰＣＳＫ９阻害薬（特許文献１９）を投与すると劇的にＬＤＬや小粒子ＬＤＬが減少することにより証明される。【００１８】非特許文献１に、粥状動脈硬化の原因が、酸化されたＬＤＬがマクロファージに貪食され、それが粥状動脈硬化巣に集まった結果であると説明されている。
ならばどこでＬＤＬが酸化されたかについては明らかにされていない。
そこで我々発明者たちは、ＶＬＤＬやＬＤＬが、ＬＰＬやＨＴＧＬによりＴＧが加水分解を受けた直後、Ｂ／Ｅレセプターに取り込まれなかったＶＬＤＬ、ＬＤＬが酸化されると考え、それらを、酸化されやすいＶＬＤＬ（易酸化性ＶＬＤＬ、ＶＬＤＬ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）および酸化されやすいＬＤＬ（易酸化性ＬＤＬ、ＬＤＬ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）と呼ぶことにした。【００１９】生体内（インビボ）では、易酸化性ＶＬＤＬや易酸化性ＬＤＬ中のアポＢ１００（主にＣ末端）やアポＥを酸化させようとする活性酸素などが数多く存在しており、血中を循環している間に運悪く酸化またはアセチル化された場合は、Ｂ／ＥレセプターやＬＣＡＴ（非特許文献７）に認識されず白血球の一種であるマクロファージに取り込まれることになる。
マクロファージに取り込まれた酸化またはアセチル化されたＬＤＬは、血管壁特に動脈硬化巣に吸収され、粥状動脈硬化を促進する（非特許文献１）。また脳梗塞は、粥状動脈硬化が脳血管に起こった場合や他の動脈硬化巣から剥がれた血栓や細胞の一部が、脳動脈を閉塞させた場合に発生する。
すなわち血中に現れた、ＩＤＬや小粒子ＬＤＬは、加水分解された直後の易酸化性ＶＬＤＬまたは易酸化性ＬＤＬが存在していた事を示す証拠だったということになる。なお酸化またはアセチル化されたＶＬＤＬやＬＤＬを単に変性ＶＬＤＬまたは変性ＬＤＬと呼ぶこともある。【００２０】インビトロにおいて小粒子ＬＤＬが出現する機序。
採血後の血清や血漿を３７℃２時間加熱（以後インキュベーションという）後、出現した小粒子ＬＤＬは、脂質を必要とする細胞に直接触れることがないため、それらが細胞に吸収されることはない。その上ＬＤＬ中のＴＧの含有比率が１０％程度（表１）であることから、ＴＧが加水分解されただけで小粒子ＬＤＬが出現したと結論付けるには、出現した小粒子ＬＤＬが多すぎる。
したがって我々発明者たちは、加水分解された直後のＶＬＤＬまたはＬＤＬが何らかの要因でホスホリパーゼ（ホスホリパーゼの１種であるＬＣＡＴを含む）が活性化されリン脂質の脂肪酸を加水分解した結果、小粒子ＬＤＬが出現したと推定する以外にないことを発見した。
言い替えると、インビトロにおいて、３７℃２時間のインキュベーションで出現した小粒子ＬＤＬは、ＶＬＤＬまたはＬＤＬ内のＦＣとリン脂質の脂肪酸がＨＤＬ粒子に転送されたものを含むが、インキュベーションにより増加したＨＤＬコレステロール量は微量であり（表３）、小粒子ＬＤＬすべてがＬＣＡＴによりＨＤＬに転送されたものであるということはできないからである。【００２１】検体を３７℃２時間インキュベーションする前後の検体を、本願特許請求項４の測定法で測定し新しくできたまたは増加した小粒子ＬＤＬは、結果的に易酸化性ＶＬＤＬや易酸化性ＬＤＬが存在していた証であると言うことができる。【００２２】家族性高コレステロール血症（ＦＨ）患者は、遺伝的に心筋梗塞を発症するリスクが高いと言われている疾患群である。この患者のＰＡＧＥディスク電気泳動像は、脂質健常者群よりＴＣ値がやや高いだけで、ＩＤＬや小粒子ＬＤＬが少ないＩＩ  ａ型のＷＨＯ表現型（ＩＩ  ａ型脂質異常症または高脂血症）を呈することが知られている。したがって以前から、小粒子ＬＤＬの出現が心筋梗塞の原因物質でないという疑問が絶えなかった。【００２３】我々発明者たちは、脂質健常者の血清を用いて採血後の検体を３７℃２時間インキュベーション後ＰＡＧＥ法で泳動を行ったところ、ほとんどの検体で小粒子ＬＤＬは出現しなかったが、ＦＨ患者や陳旧性心筋梗塞患者の検体では小粒子ＬＤＬが新しく出現するか増加した。
インビトロにおいて、３７℃２時間インキュベーション後、ＦＨ患者や陳旧性心筋梗塞患者の検体に出現した小粒子ＬＤＬは、血清または血漿中に存在する残余のＬＰＬやＨＴＧＬさらにホスホリパーゼなどがかなりあって、ＬＤＬ中のＴＧやリン脂質が加水分解され出現したものと考えられる。しかし３７℃２時間インキュベーション後、ＨＤＬが極端に増えているわけではない（表３）からＬＣＡＴとＨＤＬの作用のみにより小粒子ＬＤＬが出現したと言うこともできない。そこで発明者たちは、ＦＨ患者や陳旧性心筋梗塞患者の検体に、チォール基（Ｒ−ＳＨ）阻害剤（非特許文献６）を加え、３７℃２時間インキュベーションした後、ＰＡＧＥ法でリポ蛋白質を泳動した結果、新たな小粒子ＬＤＬが現れなかったことから、小粒子ＬＤＬの出現にはホスホリパーゼ（ＬＣＡＴを含む）が関与していると推定した。【００２４】以上の実験結果により、小粒子ＬＤＬが殆どない脂質健常者と過去心筋梗塞を起こした患者（ＦＨおよび陳旧性心筋梗塞患者を含む）の血清検体を、３７℃で２時間インキュベーションを行ったのち、ＰＡＧＥ法で小粒子ＬＤＬを測定することにより粥状動脈硬化性の心筋梗塞や脳梗塞になりやすい人とそうでない人を区別することができるのではないかと予測し研究を続けた。【００２５】発明者たちは、短時間のインキュベーションで出現または増加する小粒子ＬＤＬ、ｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬまたはｓＬＤＬｃは、ごく少量であり、これらを正確に測定する方法を開発する必要に迫られた。
【課題を解決するための手段】
【００２６】採血後遠心分離して得られた血清や血漿（インビトロ）は、血管壁や脂肪組織を含む細胞群やマクロファージに直接触れることがないため、易酸化性ＶＬＤＬや易酸化性ＬＤＬが各細胞へ取り込まれたり、酸化やアセチル化されたＬＤＬがマクロファージに取り込まれることがない。
したがってインビトロで、３７℃２時間インキュベーション後出現したまたは増加したＩＤＬや小粒子ＬＤＬは、ＬＤＬ中のＴＧがＬＰＬやＨＴＧＬにより加水分解されただけでなく、ホスホリパーゼにより加水分解されたリン脂質の脂肪酸が抜けたものであるということができる。
すなわちＬＤＬ中のＴＧの含有比率が８〜１１％程度（表１）であり、３７℃２時間のインキュベーションで、ＬＤＬ中のＴＧが残余のＬＰＬやＨＴＧＬにより加水分解されたとしてもその量は、限られている。したがってＬＰＬやＨＴＧＬによってすべてのＩＤＬや小粒子ＬＤＬが産生されたと言い切れず、かつＬＣＡＴによりリン脂質の脂肪酸とＦＣがＨＤＬに抜き取られたため全ての小粒子ＬＤＬが出現したとも言い切れない（インキュベーション後ＨＤＬｃがそれほど増加していないことによる。表３）。
したがってＬＤＬが小粒子化されたのは、ＬＤＬ中のホスホリパーゼが何らかの要因により活性化されリン脂質が水解され小粒子ＬＤＬが出現したと考えるのが妥当である。【００２７】
【表１】
2019174432.tif 000003
2019174432.tif 000004
【００２８】脂質健常者のＣＭおよびＶＬＤＬやＬＤＬの一部は、インビボにおいて、細胞が分泌したＬＰＬやＨＴＧＬによりＴＧが加水分解され、粗くなったＶＬＤＬやＬＤＬ粒子上でアポＢ１００、アポＥがアポＣの存在下により当該細胞のＢ／Ｅレセプターに取り込まれ直ちに消滅したものと考えられる。
したがって元々脂質健常者には、ＬＣＡＴやＨＤＬが働くまでもなく易酸化性ＶＬＤＬや易酸化性ＬＤＬが殆ど存在しない上に、例え残っていたとしてもその量は僅かで、それはＬＣＡＴとＨＤＬの作用により酸化される前に小粒子ＬＤＬになっていると思われるが、この小粒子ＬＤＬは、極微量で検出できる量でなかったと言える。【００２９】ＦＨ患者群においても、ＣＭおよびＶＬＤＬやＬＤＬ中のＴＧは、脂質健常者群と同様にＬＰＬやＨＴＧＬなどにより加水分解され、易酸化性ＶＬＤＬや易酸化性ＬＤＬがすぐ細胞のＢ／Ｅレセプターに捉えられ直ちに消滅することは同様であるが、心筋梗塞を起こした患者やＦＨ患者群では、Ｂ／Ｅレセプター機能が低下しており、ＬＰＬやＨＴＧＬが多く分泌されている（表２）にも関わらず、易酸化性ＶＬＤＬや易酸化性ＬＤＬが細胞に取り込まれず残っている状態とみることができる。このことは心筋梗塞で緊急入院した患者（ＦＨ患者に限らない）のヘパリン投与前（ｐｒｅｈｅｐａｒｉｎ）のＬＰＬやＨＴＧＬが健常者より多いことにより確認できる（表２）。【００３０】
【表２】
2019174432.tif 000005
【００３１】ＬＰＬやＨＴＧＬは、細胞膜に係留する酵素であり、ヘパリンを投与しないと測定できないとされている酵素群である。したがってＬＰＬの健常値として、検査用のヘパリンを注射した後の測定値が一般的に使用されている。ヘパリンを投与しない脂質健常者の空腹時のＬＰＬ値は、健常値そのものが定着していないが、一般的に、０〜２０ｎｇ／ｍＬとされている。しかし粥状動脈硬化による心筋梗塞を発症した患者（ＦＨやＩＩ  ａ型に限らず）のヘパリン投与前のＬＰＬ測定値は、表２に示すように、個人差はあるものの健常値の２〜５倍を超えていることが特徴的であった。このことはＶＬＤＬ値が低いことでも確認できる。【００３２】ＦＨやＩＩ  ａ型脂質異常症の患者またはＴＣやＴＧが健常域にあるにも関わらず粥状動脈硬化による心筋梗塞を起こした患者（表２の一部）は、元々ＣＭやＶＬＤＬが低くかつＩＤＬや小粒子ＬＤＬも少ない患者群であり、ＬＰＬやＨＴ
2019174432.tif 000006
による心筋梗塞を起こした患者（ＦＨやＩＩ  ａ型脂質異常症の患者に限らず）のＬＤＬ粒子内は、ＴＧが少ない状態である。そして大量のヘパリンを投与してもＬＤＬ自体が消滅することがないことからＬＰＬやＨＴＧＬの作用だけで小粒子ＬＤＬが出現したと説明することができない。【００３３】以上から、ＦＨ患者やＩＩ  ａ型の患者など粥状動脈硬化により心筋梗塞を起こした患者群の小粒子ＬＤＬは、個人差はあるもののＬＰＬ過剰の状態にあり（表２）、易酸化性ＶＬＤＬや易酸化性ＬＤＬが、日常的に産生されているとしても直ちに細胞のＢ／Ｅレセプターに捉えられ消滅し、もし残っているものがあったとしてもその量は極めて僅かで、直ちにＬＣＡＴ（非特許文献７）によりＨＤＬに転送されるため、検出できる程の小粒子ＬＤＬは出現していないと考えられる。
しかし易酸化性ＶＬＤＬや易酸化性ＬＤＬを取り込むべき細胞（レセプター）がないインビトロで、被検検体（血清または血漿）を３７℃で２時間インキュベーションすると、脂質健常者に出現しない小粒子ＬＤＬが、ＦＨ患者や粥状動脈硬化により心筋梗塞を起こした患者群（ＩＩ  ａ型に限らない）に出現したことは（表３）、ＬＤＬ中のホスホリパーゼがリン脂質の脂肪酸を加水分解したため出現したと見ることができる。【００３４】別の見方をすれば、ＦＨ患者や粥状動脈硬化による心筋梗塞を起こした患者群は、空腹時においてもＬＰＬやＨＴＧＬが高く、易酸化性ＶＬＤＬ、易酸化性ＬＤＬが血中を循環する確率が高く、それぞれ微量ではあるがアポＢ１００（Ｃ末端）やアポＥが活性酸素などにより酸化またはアセチル化されたことにより細胞のＢ／Ｅレセプターに取り込まれず、マクロファージに取りこまれ、徐々に動脈壁に蓄積し粥状動脈硬化を促進させ、結果として心筋梗塞を発症させているとみることができる。なお酸化またはアセチル化されたＶＬＤＬやＬＤＬを変性ＶＬＤＬや変性ＬＤＬと呼ぶことがある。【００３５】逆にＦＨやＩＩ  ａ型の脂質異常症でないＩＩ  ｂ型やＩＶ型の脂質異常症群は、元々ＶＬＤＬが高い患者群で、インスリン抵抗性などのためＩＤＬや小粒子ＬＤＬも多くなっており、易酸化性ＶＬＤＬや易酸化性ＬＤＬが多く存在していることが十分疑われる。
その治療法として採られているＩＤＬや小粒子ＬＤＬ低下療法（非特許文献１１）は、易酸化性ＶＬＤＬまたは易酸化性ＬＤＬが酸化される前に無くそうとする治療法であり論理的に非常に有効である事が証明されている。
すなわち非特許文献１１による治療法は、易酸化性ＶＬＤＬまたは易酸化性ＬＤＬが血中を循環している間に酸化修飾を受けることを予め防止し、マクロファージに取り込まれることを事前になくそうとする治療法であったことが解る。
しかし、この治療法も本願発明の３７℃２時間インキュベーション前後の小粒子ＬＤＬの出現または増加を確認して行えばさらに心筋梗塞や脳梗塞の予防に役立つと思われる。【００３６】インビトロにおいて、ヘテロＦＨ患者群３５例の血清を３７℃に２時間インキュベーションした後の各脂質の測定と小粒子ＬＤＬをポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動法（特許文献１６）とガウス波形近似法（特許文献１２）で分析したところ、小粒子ＬＤＬ以外は、ほとんど差はなかったが、小粒子ＬＤＬｃだけは、ほぼ倍の増加率を示した（表３）。脂質健常者群において、３７℃インキュベーション後に小粒子ＬＤＬの出現や増加が殆どないからこの差は、心筋梗塞を発症する患者に特有のものと思われる。【００３７】
【表３】
2019174432.tif 000007
【００３８】以上の結果からインビトロにおいて脂質健常者と粥状動脈硬化性心筋梗塞を起こした患者の被験検体を、３７℃２時間インキュベーションする前に較べ後の小粒子ＬＤＬの出現は、明らかに異なることがわかった。すなわち発明者たちは、インビトロで血清・血漿を３７℃２時間インキュベーションを行いインキュベーション後に小粒子ＬＤＬが出現するまたは優位な増加量が例えば１．５倍または優位な増加率が例えば５０％以上あれば、粥状動脈硬化性心筋梗塞を起こしやすい人と判断できることを発見した。
単に小粒子ＬＤＬまたは小粒子ＬＤＬコレステロール、ｓＬＤＬｃの存在や出現だけでなく、インキュベーション後の小粒子ＬＤＬの増加量または増加率を調べることによって、より正確に心筋梗塞や脳梗塞のリスクの存在を知ることができる。
本願発明の検査法による心筋梗塞や脳梗塞のリスクは、インキュベーション後の小粒子ＬＤＬまたはｓＬＤＬｃの増加量が１．５倍以上または増加率が５０％以上であると限定するものではなく、増加量や増加率を適時選択することができる。しかも増加量が２倍を超えたり増加率が１００％をこえた時には、さらに心筋梗塞や脳梗塞のリスクが高まっていると判断できる。なお、診断の判断基準であるカットオフ値は、小粒子ＬＤＬまたはｓＬＤＬｃ測定法など特許請求項４記載の測定法別に、心筋梗塞や脳梗塞のリスクとして、それぞれ設定することが必要である。【００３９】小粒子ＬＤＬが出現する患者群は、大きく分けて２種類あり１つは３７℃２時間のインキュベーションにより新しく出現するＩＩ  ａ型を代表とする患者群の小粒子ＬＤＬ（ＴＣやＴＧが健常値の心筋梗塞患者を含む）と、ＩＩ  ｂやＩＶ型脂質異常症群（糖尿病の患者を含む）のようにすでに小粒子ＬＤＬが存在しており、３７℃２時間のインキュベーションによりさらに増加する小粒子ＬＤＬがある群に大別することができ、これにより今までなぜＦＨやＩＩ  ａおよび小粒子ＬＤＬがない群に心筋梗塞が発生しているかを明確に説明できる。【００４０】ところで、健常なＬＤＬと小粒子ＬＤＬ（ｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬ）の粒子径の差は、わずか１〜２ｎｍであり、かつ３７℃２時間のインキュベーション後に出現または増加する小粒子ＬＤＬやｓＬＤＬｃの量はおよそ５〜１００ｍｇ／ｄＬ程度であり、小粒子ＬＤＬをどのように特定しかつ当該分量の測定をどのように行うかが大きな課題となった。既に現在ｓＬＤＬｃの直接定量法が研究用試薬として販売されて（特許文献１〜特許文献６）いるが、当該ｓＬＤＬｃ直接定量法は、界面活性剤などによる分別もしくは分離剤に反応するリポ蛋白質である事は分かるが、小粒子ＬＤＬまたはｓＬＤＬｃである根拠が抽象的で、ＦＨなど小粒子ＬＤＬが無い群に対する説明がされていなかった。しかしこのｓＬＤＬｃ直接定量法でも、３７℃２時間インキュベーションした前後の測定値の増加量または増加率の差（小粒子ＬＤＬであるかどうかに関わらず）を調べることは可能である。【００４１】ＰＡＧＥ法は、小粒子ＬＤＬが測定できると言われているが、現在臨床検査に使われているＰＡＧＥ法で、出現した小粒子ＬＤＬの粒子径またはｓＬＤＬｃの量はわからなかった。そこで我々発明者たちは、現在臨床検査に使われているＰＡＧＥ法で得られたリポ蛋白質の検体検査方法（特許文献１５、非特許文献８）および画像から濃度図を求める「画像からの濃度測定法」（特許文献１６）を利用して作成した濃度図に、ガウス波形近似（特許文献１２）を施しリポ蛋白質を元の濃度図とほぼ９５％一致する８種類に分割するガウス波形群を作成し、各波形中央位置（ピーク）の相対移動度（ＶＬＤＬ１の波形のピークを「０」とし、ＨＤＬ波形のピークを「１」とし、その他の各波形のピークを比率で表した値：相対移動度：ＲＭ）で表した波形群を、陰極からＶＬＤＬ１、ＶＬＤＬ２、ＩＤＬ、ｌａｇｅ−ＬＤＬ（Ｌ・ＬＤＬ）、ｍｅｄｉｕｍ  ＬＤＬ（Ｍ・ＬＤＬ）、ｓｍａｌｌ  ＬＤＬ（ｓＬＤＬ）、ｖｅｒｙ  ｓｍａｌｌ  ＬＤＬ（ｖｓ・ＬＤＬ）と命名した。
ただし、各分画の種類や名称は、上記に限定されるものではなく、たとえばｓＬＤＬとｖｓ・ＬＤＬを統合して小粒子ＬＤＬと称することもできる。【００４２】さらにＰＡＧＥ法で分析した各ＬＤＬ粒子の直径を物理的な手法により証明するため、金コロイド粒子に牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標識しゲル濾過法で精製したものを被検体として、ＰＡＧＥ法で電気泳動を行い、ＩＤＬ、ｌａｇｅ−ＬＤＬ（Ｌ・ＬＤＬ）、ｍｅｄｉｕｍ  ＬＤＬ（Ｍ・ＬＤＬ）、ｓｍａｌｌ  ＬＤＬ（ｓＬＤＬ）を相対移動度（ＲＭ）でゲルを切り出し抽出し、電子顕微鏡と光散乱粒度分布（ＤＬＳ）法で粒子径を求め、粒子径とＲＭ値の検量線から、ＲＭ値で粒子径を特定するＬＤＬ粒子マーカ（特許文献１１）により、リポ蛋白質の粒子径測定ができるようにした上でガウス波形に近似する濃度図（特許文献１２）からＩＤＬ、Ｌ・ＬＤＬ、Ｍ・ＬＤＬ、ｓＬＤＬ、ｖｓ・ＬＤＬの合計の面積比をＬＤＬｃ直接定量値またはｆｒｉｅｌｄｅ  ｗａｌｄのＬＤＬｃ計算式（Ｆ−ＬＤＬｃ＝ＴＣ−ＨＤＬｃ−ＴＧ／５）により得られたＬＤＬｃ値に配分してＩＤＬ、Ｌ・ＬＤＬ、Ｍ・ＬＤＬ、ｓＬＤＬ、ｖｓ・ＬＤＬの各コレステロール値を算出する方法を実用化した。その結果は、従来から言われていた小粒子ＬＤＬの粒子径が２５．５ｎｍ以下であることに一致した。ここでは小粒子ＬＤＬ＝ｓ・ＬＤＬ＋ｖｓ・ＬＤＬとした。【００４３】なお今まで述べてきた小粒子ＬＤＬや小粒子ＬＤＬコレステロールまたはｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬコレステロールは、今後の技術革新により、ＬＤＬ粒子の陰性荷電の増大、例えばＬＤＬの酸化またはアセチル化などにより小粒子様状態になった変性ＬＤＬとして捉えられる可能性もあるが、本願はそれらを含有する。【００４４】なお、脂質健常者の、空腹時ＬＰＬやＨＴＧＬまたはホスホリパーゼは、元々少ないため、被験検体を３７℃２時間程度のインキュベーションでは、検出できる程の小粒子ＬＤＬの出現がなかった。しかし心筋梗塞を発症した患者（ＦＨやＩＩ  ａ型かどうかに関わらず）には、新たに小粒子ＬＤＬの出現がありまたは増加していた。
以上により、心筋梗塞患者または心筋梗塞を起こす恐れのある患者と脂質健常者を識別できることがわかった。
最適インキュベーション温度と時間は、３７℃２時間であるが、請求項４の測定法の測定感度により、３０℃から４０℃で、３０分から４時間としても測定可能である。またはインキュベーションをする代わりに数日間室温保存した検体と冷蔵保存した検体の小粒子の増加量または増加率を調べることも可能である。【００４５】図１は、陳旧性心筋梗塞患者のインキュベーション前のＰＡＧＥ濃度図と生化学（脂質）データであり、図２は、同一の陳旧性心筋梗塞患者における３７℃２時間インキュベーション後のＰＡＧＥ濃度図と生化学（脂質）データである。両者の生化学（脂質）データを比較すると、唯一小粒子ＬＤＬ（ｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬ、ｓ・ＬＤＬ＋ｖｓ・ＬＤＬ）に有意な差が出現した事がわかる。
図１と図２を比較すると３７℃２時間インキュベーション後明らかに小粒子ＬＤＬの増加があり、かつその増加率が２倍以上あった。【００４６】被験検体を直接インキュベーションする方法ではなく、採取した血清・血漿を一定量分割し、一方にチォール基阻害剤を入れ、共に３７℃２時間のインキュベーションをした後、それぞれ小粒子ＬＤＬまたは小粒子ＬＤＬコレステロールまたはｓＬＤＬｃを測定し、チォール基阻害剤を入れない方に、小粒子ＬＤＬが出現すれば、心筋梗塞や脳梗塞を起こすリスクが高いと判断できる。なおインキュベーション温度や時間は、固定するものではなく、例えば検体を室温に２〜３日放置した後、特許請求項４の測定法で小粒子ＬＤＬやｓＬＤＬｃなどを測定しても心筋梗塞や脳梗塞のリスクの判断は可能である。
なおチォール基阻害剤を予め真空採血管に入れておくことで、血清・血漿を分割したりする作業を簡略化することもできる。【００４７】コレステロールエステル転送蛋白（ＣＥＴＰ）の欠損症では、ＨＤＬコレステロール値が高いにも関わらず心筋梗塞患者がいることが知られている。この患者ではＨＤＬ中にコレステロールエステルが充満しているが、ＣＥＴＰの欠如により、ＶＬＤＬやＬＤＬまたは肝臓にＨＤＬを転送できず、ＨＤＬ中にエステル型コレステロールが飽和しており、さらなるＦＣを回収できなくなったとき、血液中で余った易酸化性ＶＬＤＬまたは易酸化性ＬＤＬが、酸化変性を受け、マクロファージに取り込まれた結果粥状動脈硬化が進展し心筋梗塞が発生する。【００４８】ＷＨＯのＩＩＩ型脂質異常症は、ＬＤＬが低値にも関わらず心筋梗塞を発症する疾患群である。この患者は遺伝的にアポＥ２／２を持つ疾患群であり、ＩＤＬが肝臓のアポＥレセプターに取り込まれずＬＤＬに移行できない疾患群である。
すなわちＶＬＤＬやＩＤＬが異常に蓄積することにより易酸化性ＶＬＤＬやＩＤＬが酸化され、マクロファージにとらえられた結果、粥状動脈硬化が進み心筋梗塞を発症する疾患群である。ただし、ＩＩＩ型脂質異常症群は元々ＬＤＬが異常に低く小粒子ＬＤＬもほとんど認められない場合がある。したがって３７℃インキュベーションで出現する小粒子ＬＤＬが少ない場合もあり得るが、インキュベーション前後の増加率が例えば２倍を超えていれば、ＩＩＩ型脂質異常症を考慮して、本願測定法によるリスク判定を行うことができる。したがって見逃されやすいＷＨＯのＩＩＩ型脂質異常症の判定を正確に行う必要性がある。【００４９】Ｖ型脂質異常症では、ＶＬＤＬが異常に高くＬＤＬが殆んどない疾患群である。
しかし、ＶＬＤＬ中のＴＧがＬＰＬやＨＴＧＬにより加水分解され、易酸化性ＶＬＤＬが酸化等の変性を受けた場合、マクロファージにとらえられ動脈壁に蓄積し粥状動脈硬化を惹起させる。ただしまれに代謝不良でＩＶ型の患者が一時的にＶ型の病態を呈する場合があり、ＷＨＯの型判定が欠かせない。
ただし、本症例のようにＬＤＬや小粒子ＬＤＬが少なくても、ＩＩＩ型脂質異常症群と同様に、インキュベーション前後の増加率が例えば１．５倍を超えていれば、Ｖ型脂質異常症を考慮して、本願測定法によるリスク判定を行うことができる。
ただしインキュベーション前後の増加率は、Ｖ型脂質異常症の場合に、例えば２．０倍を超えていたとき、リスクがあると判断することもできる。
したがって見逃されやすいＷＨＯのＶ型脂質異常症の判定を正確に行う必要性がある。【００５０】また稀にＰＡＧＥ法で、ＬＤＬの粒子径が大きい分画（Ｌ・ＬＤＬ分画、ＬＤＬの相対移動度が小さい分画）を持ちかつ３７℃２時間のインキュベーション後の小粒子ＬＤＬの出現が少ない心筋梗塞患者がいる。
なぜ脂質健常人のＬＤＬ分画より移動度が遅いＬＤＬ分画を持つ患者がいるのか現在のところ不明であるが、本願測定法によるリスクの判定法は、採血後の血清や血漿中にＬＰＬやＨＴＧＬおよびホスホリパーゼが残存していることが前提であり、何らかの理由でＬＰＬなどが少ない場合には、本願測定法によるリスク判定法の例外となる。
したがってこの種の検体は、食後の検体で検査することも選択肢となる。
なお、小粒子ＬＤＬ量が少なくても、ＬＤＬの移動度が遅い検体の場合は、インキュベーション前に較べ後の増加率が、１．５倍を超えている場合、心筋梗塞のリスクが高いと判断することができる。
ただし、この疾患群の中に、粥状動脈硬化が直接的な原因とならない疾患、例えば高血圧症、冠攣縮、心不全患者などが含まれるので、これらとの鑑別は必要である。
【発明の効果】
【００５１】心筋梗塞を起こす原因が、ＬＤＬｃやｓＬＤＬｃ値が高いという理由だけで説明がつかないことはよく知られている。すなわち粥状動脈硬化巣にコレステロールエステルが多いからと言うだけで、ＬＤＬｃやｓＬＤＬｃの存在が悪玉であると言われているが、その根拠は明確ではなかった。本願発明は世界で初めて、小粒子ＬＤＬが出現する機序を明らかにし、間接的ではあるが酸化など変性を受けやすいＬＤＬ粒子が存在することを予測しそれを易酸化性ＶＬＤＬまたは易酸化性ＬＤＬと命名した。
本願発明は、小粒子ＬＤＬが出現する機序が２通りあることを提言した。
その１つはＩＩ  ａ型脂質異常症に代表される血清や血漿に元々小粒子ＬＤＬが殆んどない群と、他方ＩＩ  ｂやＩＶ型脂質異常症に代表される血清や血漿に日常的に小粒子ＬＤＬが見られる群を区別し、双方とも本願発明を実施することにより、粥状動脈硬化による心筋梗塞や脳梗塞になる可能性を、その発症前に知ることができ、予防や治療に利用できる簡便な方法となる。【００５２】日本動脈硬化学会は、「動脈硬化性疾患予防ガイドライン２０１７年版」で、ｆｒｉｅｌｄｅ  ｗａｌｄ  のＬＤＬｃ値を診断基準や脂質管理目標値として設定している。
ＬＤＬｃが１４０ｍｇ／ｄＬ以上がこの基準に当てはまる。しかし、この基準により治療すれば、心筋梗塞などが予防できるというものではない。見方を変えればこの診断基準を守れば心筋梗塞は予防できるというものでもない。
本願発明は、心筋梗塞や脳梗塞発症のメカニズムの一端を明らかにしたものであり、心筋梗塞や脳梗塞のリスクがある人とない人を簡単な検査で区別しょうとするもので、ＴＣやＬＤＬｃまたはｓＬＤＬｃ量の大小で判断する従来の方法とは異なる検査方法である。
従って本願発明の効果は、今まで不完全であった心筋梗塞や脳梗塞の予防をさらに前進させる効果を持つ。例えば本願発明で心筋梗塞や脳梗塞のリスクの大きい人には、発症前から易酸化性ＶＬＤＬや易酸化性ＬＤＬの酸化防止剤等の投与や治療薬の選択または新たな治療薬の開発、さらに酸化等防止を目的とした食品の開発、マクロファージの免疫学的療法などの開発が促進され、新しい治療薬・予防法・治療法の開発が進展し、心筋梗塞や脳梗塞を予防ができることになり、社会的にも経済的にも非常に大きな効果が期待できる。【００５３】特許文献１８によれば、自己検診、郵便検診用にランセットで採血後血液を稀釈し血清を分離するシステムが実用化されている。このシステムを利用し本願発明の請求項２を使用することで、自宅に居ながら手軽に心筋梗塞や脳梗塞のリスクを調べることができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】陳旧性心筋梗塞患者のインキュベーション前の小粒子ＬＤＬを測定したＰＡＧＥ濃度図と生化学（脂質）測定結果
【図２】図１と同一陳旧性心筋梗塞患者のインキュベーション後の小粒子ＬＤＬを測定したＰＡＧＥ濃度図と生化学（脂質）測定結果
【発明を実施するための形態】
【００５５】簡便な血液検査により、心筋梗塞や粥状動脈硬化のリスクが高いと判定する易酸化性ＶＬＤＬや易酸化性ＬＤＬの測定法や測定装置の実施例を下記に示す。
【実施例１】
【００５６】最良の実施例としては、易酸化性ＶＬＤＬ、易酸化性ＬＤＬが直接測定できれば良いがそのような測定法はない。したがって患者から採取した血清・血漿に何も添加せずかつ多大な物理的な重力や圧力をかけることなく測定できる小粒子ＬＤＬや小粒子ＬＤＬコレステロールまたはｓＬＤＬｃなどを測定できる方法が理想的である。現在のところそんな理想的な測定法はないが、ＰＡＧＥ法がその条件に最も近い。【００５７】ＰＡＧＥ法は、患者から採取した血清・血漿に脂質の染色液であるズダンブラックを加え、電気泳動を行い分画した濃度図からＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ等を分析するオーソドックスな検査法（非特許文献８）である。この検査法は直接ＬＤＬのサブクラスである小粒子ＬＤＬや小粒子ＬＤＬコレステロールまたはｓＬＤＬｃを測定しているわけではないが、発明者たちによりなされた濃度図のガウス波形近似法（特許文献１２）で、各ＬＤＬ粒子の中央位置（ＲＭ値）と粒子マーカ（特許文献１１）との検量線からそれぞれＬＤＬの粒子径と、コレステロール量が測定できるようにしたうえで、本願発明に関わる３７℃２時間のインキュベーション前後の小粒子ＬＤＬを測定した結果、脂質健常者と陳旧性心筋梗塞患者（ＦＨ）のｓＬＤＬｃは明らかな差がでた。図１と図２は陳旧性心筋梗塞患者（ＦＨ）の３７℃インキュベーション前後の濃度図、測定値の比較である。インキュベーション前の小粒子ＬＤＬコレステロールが１１．１ｍｇ／ｄＬ「図１の（７）」であったのに対し、インキュベーション後の小粒子ＬＤＬコレステロールが、２５．３ｍｇ／ｄＬ「図２の（１１）」のように２倍を超す増加を確認した。増加するｓＬＤＬｃなどのカットオフ値は、１０ｍｇ／ｄＬ以上が適当であるが、限定するものではない。なおインキュベーション後の小粒子ＬＤＬの優位な増加量は、適時決めることができるが、インキュベーション前の２倍を越えた時などはより心筋梗塞や脳梗塞のリスクが高いと判断することもできる。本実施例（図２）は、その増加率が２．２倍であった。【００５８】最適なインキュベーション時間は３７℃２時間であったが、３０℃から４０℃の範囲で適時決めることができる。また小粒子ＬＤＬコレステロールの測定感度が得られるならインキュベーション時間はもっと短くても良いかもしれない。
ただあまり長時間インキュベーションすると脂質健常者にもｓＬＤＬｃが出現するので注意が必要である。
【実施例２】
【００５９】実施例１は、ガウス波形近似法（特許文献１２）でｓＬＤＬｃの濃度値を求めたが、特許文献１５のように、小粒子ＬＤＬを一定の相対移動度（ＲＭ値）で分画し、小粒子ＬＤＬの出現を、分画％値の差またはその増加率として分析する方法も定性的であるが使用できる。カットオフ値は測定の感度により適宜選択することができる。
【実施例３】
【００６０】アガロースゲル電気泳動像（特許文献１３）をコレステロール染色したものやＧＧＥ電気泳動法（非特許文献３）でも、インキュベーション前後の測定値の差を小粒子ＬＤＬの出現の差と仮定すれば、分画％値や濃度値の差が小粒子ＬＤＬの出現または増加率が上昇したと確認することが可能で、心筋梗塞や脳梗塞のリスクが高いと判断でもすることは可能である。本実施例においてもカットオフ値は測定の感度により適時選択することができる。
【実施例４】
【００６１】ＨＰＬＣ法（特許文献７〜１０）で、インキュベーション前後の検体についてそれぞれ小粒子ＬＤＬまたはｓＬＤＬｃを測定して、小粒子ＬＤＬまたはｓＬＤＬｃが出現したとしてそれが優位に増加例えば１．５倍または増加率が例えば５０％を超えたとき、心筋梗塞発症や脳梗塞のリスクがより高まったと判断することができる。
【実施例５】
【００６２】リポ蛋白質の比重差によりｓｍａｌｌ  ｄｅｎｃｅ  ＬＤＬや粒子ＬＤＬを個別に分取してそれぞれのコレステロールを測定する超遠心分離法（非特許文献４）も、インキュベーション前後の測定値の比較から小粒子ＬＤＬまたはｓＬＤＬｃが出現または増加率が増えたとして捉えることができる。
【実施例６】
【００６３】その他、リポ蛋白質の粒子径を測定する分析法として動的光散乱分析法（ＤＬＳ、特許文献１４、非特許文献５）やイオンモビリティスペクトロメトリー法（非特許文献２）、核磁気共鳴装置で小粒子ＬＤＬ粒子径を測定する方法（非特許文献１０）やインビボの小粒子ＬＤＬを推定する方法（特許文献２０）などにおいても、インキュベーション前後の測定値の比較から小粒子ＬＤＬや小粒子ＬＤＬコレステロールまたはｓＬＤＬｃの出現や増加および増加率が高くなったとして、それを捉えることができる。
【実施例７】
【００６４】生化学の自動分析装置を使用するｓＬＤＬｃ直接定量法の測定試薬が発売（特許文献１〜６）（ｓＬＤＬｃ直接定量法）されている。被試験検体に界面活性剤や脂質分別分離剤または酵素試薬等を添加してｓＬＤＬｃを測定する方法である。
測定法としては、被験検体に何種類もの試薬を添加する方法で、本当に小粒子ＬＤＬを測定しているかどうかは別として、インキュベーション前後の測定値の差を小粒子ＬＤＬが出現した、または増加した、または増加率が優位であったとして、心筋梗塞発症や脳梗塞のリスクが高まったと判断することができる。
ただ本直接定量法は、測定の最終段において、コレステロールオキシダーゼ等酵素試薬を使用している関係で、測定時被験検体と試薬を３７℃にインキュベーションする行程が含まれているのでインキュベーション前の検体も、この測定行程で少しＬＤＬが小粒子化している可能性があるが、インキュベーション前後の測定値の差（増加率を含む）を見る検査として、心筋梗塞や脳梗塞発症のリスクの有無を調べることはできる。本実施例においてもカットオフ値は適
2019174432.tif 000008
【実施例８】
【００６５】実施例１から７までの実施例と少し異なるが、被験検体を２つに分け片方にチオール基阻害薬を適量入れ、例えばＮＥＭ（Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｄｅ）２ｍｍｏｌ／Ｌ（非特許文献６）を入れ双方３７℃で２時間インキュベーションした後、請求項４の測定法でそれぞれ小粒子ＬＤＬまたは小粒子ＬＤＬコレステロールまたはｓＬＤＬｃを測定し、ＮＥＭを入れない方により多くの小粒子ＬＤＬの出現があることまたはｓＬＤＬｃ値が増加したことまたはその増加率が高まったことをもって心筋梗塞や脳梗塞の発症リスクが高いと判断することもできる。
なお、チォール基阻害薬として下記の試薬も使用できる（非特許文献６）。
ＨＭＣＳ  （Ｎ−［６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｉｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ］ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ，ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）やＧＭＢＳ  （Ｎ−４［Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ］ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ，ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）、ＥＭＣＳ（Ｎ−［６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ］ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ，ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）、ＳＩＡＢ（Ｎ−ＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌＳｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ｛４−ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ）、ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ６−［３’｛２−ｐｙｒｉｄｙｙｌｄｉｔｈｉｏ｝−ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ｝−ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）。
【実施例９】
【００６６】特許文献１８のようにランセット等簡易採血器を用いて血清や血漿を得る希釈液入り検診用採血器具で血清や血漿を採取したものと、当該簡易採血器具内の希釈液に予めチォール基阻害剤や防腐剤を一定量含有させたものを用いて得られた血清や血漿とを３日から１週間程度室温で放置した後、それぞれ請求項４記載の方法を用いて小粒子ＬＤＬまたはｓＬＤＬｃを測定し、測定結果を比較しチォール基阻害剤を入れない方の検体の測定結果に、小粒子ＬＤＬがより多く出現または増加していることまたは増加率が高まったことを確認するか、または小粒子ＬＤＬコレステロールまたはｓＬＤＬｃの測定値が増加していることまたは増加率が高まったことを確認することで、心筋梗塞や脳梗塞のリスクがあると判定することができる。
【実施例１０】
【００６７】自動化されたＰＡＧＥ電気泳動法やＨＰＬＣ法の濃度図に、請求項４の第３項が指摘するガウス波形近似法のプログラムを搭載して３７℃２時間インキュベーション前後の被験検体のＩＤＬや小粒子ＬＤＬを測定し、その増加量や増加率を自動的に測定する装置により、小粒子ＬＤＬがより多く出現または増加していることまたは増加率が高まったことを測定するか、または小粒子ＬＤＬコレステロールまたはｓＬＤＬｃの測定値が増加していることまたは増加率が高まったことを確認することで、心筋梗塞や脳梗塞のリスクがあると判定することができる。
なお小粒子ＬＤＬを検出する装置として、必ずしもガウス波形近似法を使用しなければならないと特定するものではなく、一定の相対移動度（ＲＭ値）で分画して小粒子ＬＤＬが出現したとして検出することも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６８】本願発明が実用化されれば、今まで分からなかった心筋梗塞の発症前に簡単な血液検査で、そのリスクの有無が分かるようになるため、健康診断や、心筋梗塞の予防や治療の他治療薬の開発などに使用できる。【００６９】２０１６年、プロ蛋白転換酵素サブチリシン／ケキシン９型等阻害剤（ＰＣＳＫ９）が、劇的にＬＤＬｃ（小粒子ＬＤＬを含む）を低下させる治療薬として発売された（特許文献１９）。ＰＣＳＫ９阻害薬は、細胞のＬＤＬレセプターの活性を阻害する酵素を阻害する治療薬であり、遺伝的にＬＤＬレセプターが欠如しているホモのＦＨ患者には、その治療効果はないことが知られている。しかしその他の疾患群では、ＰＣＳＫ９阻害薬を投与すると劇的にＬＤＬｃや小粒子ＬＤＬが低下しておりＬＤＬが細胞に取り込まれたことを示している。
ＰＣＳＫ９阻害薬は、ＬＤＬを、細胞に転送するレセプターを阻害する酵素を疎害するため、ＬＤＬを急激に減少させることができる。
しかし、ＰＣＳＫ９阻害薬の使用は、ＬＤＬｃが高く心筋梗塞発症のリスクが高い患者に限り（ホモのＦＨ患者を除く）使用が認められているが、現在、どういう患者が心筋梗塞の発症リスクが高いのか明確に特定されていない。本検査法は、ＰＣＳＫ９阻害薬投与する条件の一つとして利用することができる。
【符号の説明】
【００７０】（１）被験検体の濃度図
（２）ガウス波形近似のグラフ
（３）標準検体の濃度図（実線）
（４）グラフの横軸（ｎｍ）
（５）インキュベーション前の患者の生化学データ
（６）インキュベーション前の患者のＬＤＬ粒子径
（７）インキュベーション前の小粒子ＬＤＬコレステロール値
（８）濃度図の縦軸（吸光度）
（９）インキュベーション後の患者の生化学データ
（１０）インキュベーション後のＬＤＬ粒子径
（１１）インキュベーション後の小粒子ＬＤＬコレステロール値
【図１】
2019174432.tif 000009
【図２】
2019174432.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月2日(2018.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
食前または食後、患者から採取した血液を血清や血漿に分離したのち、小粒子ＬＤＬや小粒子様ＬＤＬまたは小粒子ＬＤＬコレステロールや小粒子様ＬＤＬコレステロールまたはｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬコレステロールを測定し、かつ当該同一検体の血清や血漿を一定温度に一定時間加温（インキュベーション）し、再び小粒子ＬＤＬや小粒子様ＬＤＬの出現を確認または小粒子ＬＤＬコレステロールや小粒子様ＬＤＬコレステロールまたはｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬコレステロールを測定し、インキュベーション後に、優位な増加量である１．５倍または優位な増加率である５０％以上になった時、粥状動脈硬化による心筋梗塞および脳梗塞にかかりやすいとする測定方法。
【請求項２】
食前または食後、患者から採取した検体を血清や血漿に分離したのち、２分割し、その一方に予めレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼの酵素活性を阻害するチオール基阻害剤を一定量加えるか、あるいは２分割せずあらかじめチォール基阻害剤を一定量加えた、または加えない真空採血管を用いてそれぞれ採取し血清や血漿にした検体を、それぞれ一定温度に一定時間加温（インキュベーション）しまたは、３日から１週間室温で保管した後、それぞれ小粒子ＬＤＬや小粒子様ＬＤＬまたは小粒子コレステロールや小粒子様ＬＤＬコレステロールまたはｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬコレステロールを測定し、測定結果をそれぞれ比較しチオール基阻害剤を入れない方の検体の測定結果に、小粒子ＬＤＬや小粒子様ＬＤＬまたは小粒子コレステロールや小粒子様ＬＤＬコレステロールまたはｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬコレステロールの優位な増加量である１．５倍または優位な増加率である５０％以上になった時、粥状動脈硬化による心筋梗塞および脳梗塞にかかりやすいとする測定方法。
【請求項３】
被験検体を一定温度にインキュベーションする温度は、３０℃から４０℃で、インキュベーションする時間は３０分から４時間とすることを特徴とする請求項１、請求項２の粥状動脈硬化による心筋梗塞および脳梗塞にかかりやすいとする測定方法。
【請求項４】
請求項１、請求項２、請求項３の測定方法が、下記のいずれかまたは複数個含む測定方法。
１    ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動（ＰＡＧＥ）法
２    高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法
３    ＰＡＧＥ法およびＨＰＬＣ法で得られた濃度図にガウス波形近似を施し、小粒子ＬＤＬの出現または小粒子ＬＤＬコレステロールまたはｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬコレステロールを測定する方法
４    イオンモビリティスペクトロメトリ分析（Ｉｏｎ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＩＭＳ）法
５    動的光散乱粒度分布測定（ＤＬＳ）法
６    リポ蛋白質の一部を沈殿または分離させる試薬とコレステロールを測定する試薬を使用し小粒子ＬＤＬまたはｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬコレステロールを測定するコレステロール直接測定法
７    アガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）法
８    濃度勾配型グラジュエントゲル電気泳動（ＧＧＥ）法
９    超遠心分離装置で小粒子ＬＤＬを分離分取した後、コレステロールを測定する方法