(57)【要約】      （修正有）【課題】所与のタンパク質の正確に折り畳まれた立体構造を不正確に折り畳まれた立体構造から分離するための混合モードクロマトグラフィー方法を提供する。【解決手段】正確に折り畳まれたエタネルセプトを、不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離するための混合モードクロマトグラフィー方法であって、エタネルセプトの両方の立体構造を含むエタネルセプト含有タンパク質混合物を、イオン交換部分及び疎水性部分の両方を有する混合クロマトグラフィー樹脂に結合させるステップと、正確に折り畳まれたエタネルセプトを、混合樹脂から溶出するステップとを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
正確に折り畳まれたタンパク質を、不正確に折り畳まれたタンパク質から分離するための混合モードクロマトグラフィー方法であって、
（ａ）所与のタンパク質の正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれた両方の立体構造を含む第１のタンパク質混合物を、イオン交換部分および疎水性部分の両方を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させるステップ；
（ｂ）正確に折り畳まれたタンパク質を、混合モード樹脂から溶出し、第１のタンパク質混合物より高い割合の正確に折り畳まれたタンパク質を含む第２のタンパク質混合物を得るステップ
を含む方法。
【請求項２】
混合モードクロマトグラフィー樹脂が、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ混合モードクロマトグラフィー樹脂である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
混合モードクロマトグラフィー樹脂が、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ混合モードクロマトグラフィー樹脂である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたタンパク質の立体構造が、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
不正確に折り畳まれたエタネルセプトが、ステップ（ｂ）において得られた溶出液の約１０重量％未満、好ましくは約５重量％未満を構成し、正確に折り畳まれたエタネルセプトが、ステップ（ｂ）において得られた溶出液の約９０重量％より多く、好ましくは約９５重量％より多くを構成し、ならびに正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの総量が、ステップ（ｂ）において得られた溶出液の少なくとも約９５重量％、好ましくは少なくとも約９８重量％を構成する、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
混合モード樹脂が、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣであり、ステップ（ａ）および（ｂ）が、約４．５から約７．５の間のｐＨにおいて実施され、ならびに溶出ステップ（ｂ）が、混合モード樹脂を塩溶液と接触させることによって実施される、方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、
混合モード樹脂が、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅであり、ステップ（ａ）および（ｂ）が、約４．５から約８．５の間のｐＨにおいて実施され、溶出ステップ（ｂ）が、混合モード樹脂を塩溶液と接触させることによって実施され、ならびに前記溶液が場合によりアルギニンをさらに含む、方法。
【請求項８】
塩溶液が、ステップ（ｂ）において勾配により適用され、これによって塩濃度が徐々に上昇する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）の塩濃度勾配が、約０から約１Ｍの塩濃度で上昇する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
塩が、塩化ナトリウムおよび硫酸ナトリウムから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）の間に、ステップ（ｂ）において樹脂に接触させる溶液のｐＨが徐々に変化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）の溶出液中に得られた正確に折り畳まれたタンパク質の量が、ステップ（ａ）において樹脂に導入されたタンパク質混合物中に存在するタンパク質の量の少なくとも約６０重量％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
正確に折り畳まれたタンパク質の量が、ステップ（ａ）において樹脂に導入されたタンパク質混合物中に存在するタンパク質の量の少なくとも約７０重量％である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、
少なくとも９０重量％の正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび好ましくは約５重量％未満の不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質混合物が、
（１）好ましくはプロテインＡクロマトグラフィー精製ステップを含む、１以上の精製ステップであって、該ステップがエタネルセプト系タンパク質を含有する回収細胞培養流体を精製するために用いられ、該精製ステップが、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトから明確に分離しない、１以上の精製ステップ、
（２）請求項１に記載の混合モードクロマトグラフィーステップ（ａ）および（ｂ）；ならびに
（３）単に分析目的で実施されるＳＥＣ、ＨＩＣまたは他の分析的クロマトグラフィーステップ、
以外の、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離するための如何なるクロマトグラフィー分離または精製ステップも実施せずに、または実施の必要なく得られる、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、
ステップ（ｂ）の溶出液中に存在するタンパク質の量が、Ａ２８０におけるＵＶ吸光度により決定され、ステップ（ｂ）の溶出液中の正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより決定され、ならびにステップ（ｂ）の溶出液中に存在する、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの総量が、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定される、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法であって、
第１の混合モード分離（分離番号１）を、ステップ（ａ）および（ｂ）を実施することによって実行し、次に、
第２の混合モード分離（分離番号２）を、ステップ（ａ）および（ｂ）を再度実施することにより実行し、
分離番号１のステップ（ｂ）において得られた溶出液を、分離番号２のステップ（ａ）において、タンパク質混合物を含有する溶液として使用する
方法を２回以上実行する、方法。
【請求項１７】
分離番号１において使用される混合モード樹脂が、分離番号２において使用される混合モード樹脂と同じである、または異なる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、
分離番号１および分離番号２が、下記の組み合わせ：
分離番号１がＣＡＰＴＯ  ＭＭＣを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、
分離番号２がＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する；
分離番号１がＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、
分離番号２がＣＡＰＴＯ  ＭＭＣを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する；
分離番号１がＣＡＰＴＯ  ＭＭＣを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、
分離番号２がＣＡＰＴＯ  ＭＭＣを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する；または
分離番号１がＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、
分離番号２がＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する；
から選択される方法で実施される、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、
分離番号１および分離番号２が、下記：
分離番号１が、ＣＡＰＴＯ  ＭＭＣを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、分離番号２が、ＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する、
方法において実施される、方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法により得られる、エタネルセプト含有タンパク質混合物または前記混合物を含む医薬として許容される製剤であって、
前記タンパク質混合物が、正確に折り畳まれたエタネルセプトをタンパク質混合物の約９０重量％より多くを構成する量で含み、不正確に折り畳まれたエタネルセプトをタンパク質混合物の約５重量％未満を構成する量で含み、タンパク質混合物が、エタネルセプト含有タンパク質混合物の少なくとも約９５、好ましくは少なくとも約９８重量％を構成する、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの総量を有する、
エタネルセプト含有タンパク質混合物または前記混合物を含む医薬として許容される製剤。
【請求項２１】
ＴＮＦアルファ媒介性病態の治療を必要とする対象への投与に適切な、高純度のエタネルセプトを含む医薬として許容される製剤であって、
主要量の正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび微量の不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質混合物を含有し、
（ｉ）不正確に折り畳まれたエタネルセプトが、タンパク質混合物の約１０重量％未満、好ましくは約８重量％未満、最も好ましくは約５重量％未満を構成し；
（ｉｉ）正確に折り畳まれたエタネルセプトが、タンパク質混合物の９０重量％より多く、好ましくは約９２重量％より多く、好ましくは約９５重量％より多くを構成し、ならびに
（ｉｉｉ）正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの合計量（これらの凝集体は含まない。）が、タンパク質混合物の少なくとも９５、好ましくは少なくとも９８重量％を構成し、
対象への投与に適切である、医薬として許容される不活性成分、賦形剤またはキャリアをさらに含む、
製剤。
【請求項２２】
請求項２１に記載の製剤であって、
エタネルセプト調製物が、製剤の約２５から約７５ｍｇ／ｍｌを構成し、該製剤が、スクロース、塩化ナトリウム、Ｌ−塩酸アルギニンおよびリン酸ナトリウムをさらに含む、製剤。
【請求項２３】
正確に折り畳まれたエタネルセプト対不正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が高純度で存在するエタネルセプト含有タンパク質混合物を生産する方法であって、
（１）エタネルセプトを哺乳動物発現系において発現させ、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの両方を含むエタネルセプト含有タンパク質混合物を含有する回収細胞培養流体を得るステップ；
（２）ステップ１において得られた回収細胞培養流体を精製工程に供し、これによってステップ（１）において生産された回収細胞培養流体中に存在する望ましくない不純物の量が減少した、または実質的に不純物を含まないエタネルセプト含有タンパク質混合物を得るステップ；
（３）ステップ（２）において得られたエタネルセプト含有タンパク質混合物を、イオン交換部分および疎水性相互作用部分の両方を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂と、混合物中に含有されるタンパク質を樹脂に固定するために１回以上接触させるステップ；ならびに
（４）ステップ３によりこの上に結合されたタンパク質を有する樹脂と、正確に折り畳まれたエタネルセプトを混合モード樹脂から溶出する溶液とを接触させ、ステップ３において樹脂に導入されたエタネルセプト含有混合物よりも、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトに対して高い割合で有する、エタネルセプト含有タンパク質混合物を含む溶出液を得るステップ；
を含み、ここで；
（ｉ）ステップ２の精製により得られたエタネルセプト含有タンパク質混合物中に存在するタンパク質の量が、ステップ１において得られた回収細胞培養流体中に存在するエタネルセプト系タンパク質混合物の量の少なくとも約８０重量％であり；
（ｉｉ）ステップ４において溶出されたタンパク質混合物中に存在する、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトタンパク質の総量が、ステップ２により得られたタンパク質混合物中に存在するこれらの量の少なくとも約６０重量％であり；
（ｉｉｉ）ステップ４の溶出液中に存在する正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が、ステップ１において得られた回収細胞培養流体中に存在するエタネルセプト含有タンパク質混合物の量の少なくとも約３０重量％、好ましくは少なくとも約３５重量％であり、ならびに
（ｉｖ）前記正確に折り畳まれたエタネルセプトが、ステップ４において得られた溶出液の少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％を構成する、
方法。
【請求項２４】
混合モード樹脂が、ＣＡＰＴＯ  ＭＭＣおよびＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、
下記の追加ステップ：
ステップ（５）：ステップ４の溶出液中に得られたタンパク質混合物を、イオン交換部分および疎水性相互作用部分の両方を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂と接触させ、混合物中に含有されるタンパク質を樹脂に固定するステップ、ならびに次に、
ステップ（６）：前記樹脂を、正確に折り畳まれたエタネルセプトをそれから溶出する溶液と接触させ、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトに対して高い割合で有するタンパク質混合物を含む溶出液を得るステップ、
を含み、
前記追加ステップ５および６に使用される混合モード樹脂が、ステップ３および４に使用される混合モード樹脂と同じである、または異なる、
方法。
【請求項２６】
ステップ（３）および（４）において使用される混合モード樹脂が、ＣＡＰＴＯ  ＭＭＣであり、ステップ（５）および（６）において使用される樹脂が、ＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の方法であって、
単に分析目的で実施する場合を除き、正確に折り畳まれたエタネルセプトを、不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離する手段として単一モード疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用を排除する、方法。
【請求項２８】
ＴＮＦ媒介性疾患を患う対象を治療する方法であって、
前記対象に、正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質混合物を含有する医薬製剤を投与するステップを含み、タンパク質混合物中の不正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が、前記混合物の約５重量％未満である、方法。
【請求項２９】
タンパク質混合物中の不正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が、前記混合物の約３重量％未満であり、混合物中の正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が前記混合物の約９５重量％より多い、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
正確に折り畳まれたエタネルセプトを、不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離するための方法であって、
分離を達成するためにクロマトグラフィー手段が使用され、該クロマトグラフィー手段が、混合モードクロマトグラフィー単独からなり、または基本的に混合モードクロマトグラフィーからなり、該混合モードクロマトグラフィーにおいて、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含む混合物を、イオン交換部分および疎水性部分を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂と接触させ、そこから溶出し、少なくとも約８５、好ましくは少なくとも約９０、最も好ましくは少なくとも約９５重量％の正確に折り畳まれたエタネルセプトを含む溶出液を得る、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、
混合モード樹脂が、ＣＡＰＴＯ  ＭＭＣおよびＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥから選択され、溶出が、塩溶液により実施され、場合により漸増塩濃度勾配が使用され、塩溶液のｐＨが、約４から約８．５の範囲であり、場合により、ｐＨが徐々に上昇または低下する勾配で適用され、溶出液が、一定期間かけて樹脂から得られ、前記期間中の早期に収集された溶出液が、不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含まない、または基本的に含まない、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、組換え発現タンパク質を精製するためのクロマトグラフ分離方法、およびこのような方法から得られた産物に関する。より具体的には、本発明は、例えば、適切に折り畳まれたタンパク質と併せて望まれない量の不正確に折り畳まれた、および／または凝集されたタンパク質を含み得る融合タンパク質を含む、組換えタンパク質発現産物を精製する混合モードクロマトグラフィーの使用に関する。本発明の混合モードクロマトグラフィー方法は、正確に折り畳まれたエタネルセプトを、（本明細書において定義される）不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離するために特に有用である。本発明はまた、供給されたエタネルセプトが、開示の方法を使用して高収量および高純度で生産された、エタネルセプト調製物および医薬製剤に関する。本発明はさらに、著しく低いレベルの異常に折り畳まれた／凝集されたタンパク質により特徴付けられる、高度に精製されたエタネルセプトを用いるＴＮＦ状態の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）、Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造）は、ヒト免疫グロブリンＧ（「ＩｇＧ１」）のＦｃ受容体［断片、結晶性］領域に連結された７５キロダルトン（ｐ７５）のヒト腫瘍壊死因子受容体（「ＴＮＦＲ」）の細胞外リガンド結合部分からなる二量体融合ポリペプチドである。エタネルセプトは、９３４アミノ酸からなり、およそ１５０キロダルトンの見かけ分子量を有する（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，２００２，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．）。エタネルセプトのＦｃ成分は、定常重鎖２（ＣＨ２）ドメイン、定常重鎖３（ＣＨ３）ドメインおよびヒンジ領域を含有するが、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインは含有しない。Ｆｃドメインは、上記のドメインの１つまたはすべてを含有することができる。
【０００３】
幾つかのタイプの炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、若年性特発性関節炎および強直性脊椎炎を患う人々は、腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）を過剰に産生する免疫系を有する。エタネルセプトは、デコイ受容体としてＴＮＦに結合することによって、対象において活性型のＴＮＦのレベルを低下させ得るので、エタネルセプトの投与は、幾つかの炎症性疾患の治療に有効であることが見出されている。
【０００４】
エタネルセプトは、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）哺乳動物細胞発現系において組換えＤＮＡ技術により、公知の様式で作製可能である。不運なことに、ＣＨＯ細胞により産生された産物は、大量の不正確、または異常に折り畳まれた、および／または凝集されたエタネルセプトを含有する。不正確に折り畳まれた／凝集されたタンパク質は、正確に折り畳まれたタンパク質と同じ治療有効性を有さないと思われ、実際には患者に有害であり得るので、医薬としての使用のために、不正確に折り畳まれた、および凝集されたタンパク質を比較的含まないエタネルセプトを提供することが望ましい。
【０００５】
異常な折り畳みおよび凝集は、組換えタンパク質の産生の間にしばしば起こり、従って、正確に折り畳まれたタンパク質を異常に折り畳まれた、または凝集されたタンパク質から分離可能な下流工程で処理されなければならない。異常な折り畳みは、タンパク質の治療効果を低下または除外する。凝集は、２以上のエタネルセプトホモ二量体の非共有結合性会合を引き起こし、非常に高い分子量種を形成すると一般的に理解され、治療効果の同様の喪失をもたらし、異常に折り畳まれたタンパク質を含むタンパク質が蓄積され、一塊になった場合に起こる。上記のように、このような異常に折り畳まれたタンパク質およびタンパク質凝集体は、治療的に無効であるだけでなく、患者にとって有害となり得る。従って、エタネルセプトを含有するタンパク質発現産物を、適切に折り畳まれたエタネルセプトが、異常に折り畳まれた、および／または凝集されたエタネルセプトから分離されるように精製する能力は、可能な限り最も高い医薬的許容性を提供するエタネルセプトを得るために重要である。
【０００６】
異常に折り畳まれた、および凝集されたタンパク質の産生は、エタネルセプトに特有の問題ではない。異常な折り畳みが問題となり得る治療用タンパク質は数多く存在する。例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）封入体由来組換えタンパク質の再折り畳みの間のジスルフィド含有タンパク質の異常な折り畳みは回避することが困難であるが、高分解能の逆相クロマトグラフィーにより有効に分離することができる。しかし、逆相クロマトグラフィーにおける低ｐＨおよび有機溶媒の使用は、タンパク質を変性させる可能性があり、クロマトグラフィーの間に精製されたタンパク質の凝集を引き起こし得る。
【０００７】
例えば、哺乳動物の分泌性発現の場合の、医薬タンパク質の産生の際異常な折り畳みが無視できるほどであると考えられるとしても、凝集およびいくらかの異常な折り畳みは依然として起こり得る（例えば、Ｃｈｉ，Ｅ．Ｙ．，Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．，Ｒａｎｄｏｌｐｈ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄ  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｆ．，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｒｉｖｉｎｇ  Ｆｏｒｃｅｓ  ｉｎ  Ｎｏｎｎａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，２０，１３２５−１３３６（２００３）；Ｋｉｅｓｅ，Ｓ．，Ｐａｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ａ．，Ｆｒｉｅｓｓ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｍａｈｌｅｒ，Ｈ．Ｃ．，Ｓｈａｋｅｎ，Ｎｏｔ  Ｓｔｉｒｒｅｄ：Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ＩｇＧ１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，９７，４３４７−４３６６（２００８）を参照されたい。）。研究者は、非天然の、異常に折り畳まれたタンパク質を非変性条件下で、イオン交換（「ＩＥＣ」）（例えば、Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．Ｊ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｂｙ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３３６，２２２−２２８（２００８）；Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，５７−８７（１９９６）；Ｓｈｕｋｌａ，Ａ．Ａ．，ａｎｄ  Ｙｉｇｚａｗ，Ｙ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｓｈｕｋｌａ，Ａ．，Ｅｔｚｅｌ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｇａｄａｍ，Ｓ．，ｅｄｓ．，１７９−２２７，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（２００７）；Ｓｔａｂｙ，Ａ．，Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｒ．Ｇ．，Ｂｒｕｕｓ，Ｕ．Ｋ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｉ．Ｈ．，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｒｅｓｉｎｓ．Ｖ．Ｓｔｒｏｎｇ  ａｎｄ  Ｗｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｒｅｓｉｎｓ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１１１８，１６８−１７９（２００６）；Ｓｈｕｋｌａ，Ａ．Ａ．，Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｂ．，Ｔｒｅｓｓｅｌ，Ｔ．，Ｇｕｈａｎ，Ｓ．，Ｌｏｗ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，８４８，２８−３９（２００７）；Ｓｈｉｈａｒａ，Ｔ．，Ｋａｄｏｙａ，Ｔ．Ｊ．，Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ  Ｔｉｍｅ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ：Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｃａｓｅ  Ｓｔｕｄ��  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１１７６，１４９−１５６（２００７）；Ｆａｈｒｎｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｋｎｕｄｓｅｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｂａｓｅｙ，Ｃ．Ｄ．，Ｇａｌａｎ，Ｗ．，Ｆｅｕｅｒｈｅｌｍ，Ｄ．，Ｖａｎｄｅｒｌａａｎ，Ｍ．，Ｂｌａｎｋ，Ｇ．Ｓ．，Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．，１８，３０１−２７（２００１）；およびＹｉｇｚａｗ，Ｙ．，Ｈｉｎｃｋｌｅｙ，Ｐ．，Ｈｅｗｉｇ，Ａ．ａｎｄ  Ｖｅｄａｎｔｈａｍ，Ｇ．，Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１０，４２１−４２６（２００９）を参照されたい。）、疎水性相互作用（「ＨＩＣ」）（例えば、Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｔｅｔｒａｕｌｔ，Ｊ．，Ｌｅｙ，Ａ．，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｒｅｓｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，１１７７，２７２−８１（２００８）；Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｇｒｕｎｄ，Ｅ．，Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｐａｒｔ４：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ，ＢｉｏＰｈａｒｍ，９，５４−６４（１９９６）；およびＬｕ，Ｙ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｒ．，Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｉｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１０，４２７−３３（２００９）を参照されたい。）ならびにヒドロキシアパタイト（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｄｅ）（「ＨＡ」）クロマトグラフィー（例えば、Ａｏｙａｍａ，Ｋ．，Ｃｈｉｂａ，Ｊ．，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ａｎｄ  ＩｇＭ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｎ  Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｂｅａｄｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６２，２０１−２１０（１９９３）；Ｌｕｅｌｌａｕ，Ｅ．，Ｍａｒｉｓｏｎ，Ｗ．，ｖｏｎ  Ｓｔｏｃｋａｒ，Ｕ．，Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘａｐａｔｉｔｅ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＩｇＡ  Ｍｏｎｏｃｏｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｒｏｎｄｏ，Ｍ．，ｅｄ．，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，２６５−２６９（１９９７）；Ｌｕｅｌｌａｕ，Ｅ．，ｖｏｎ  Ｓｔｏｃｋａｒ，Ｕ．，Ｖｏｇｔ，Ｓ．，Ｆｒｅｉｔａｇ，Ｒ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ  Ｍｏｎｏｍｅｒ，Ｄｉｍｅｒｓ，ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ，Ｊ．Ｃｈｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，７９６，１６５−１７５（１９９８）；Ｙａｍａｋａｗａ，Ｙ．，Ｃｈｉｂａ，Ｊ．，Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｎ  Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｂｅａｄｓ，Ｊ．Ｌｉｑｕｉｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１１，６６５−６８１（１９９８）；Ｃｏｐｐｏｌａ，Ｇ．，Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ，Ｊ．，Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．，Ｈｅａｒｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＸＣＩＩＩ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｍ  Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，４７６，２６９−２９０（１９８９）；Ｊｏｓｉｃｓ，Ｄ．，Ｌｏｓｔｅｒ，Ｋ．，Ｋｕｈｌ，Ｒ．，Ｎｏｌｌ，Ｆ．，Ｒｅｕｓｃｈ，Ｊ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅ  ＨＰＬＣ  ａｎｄ  Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ＨＰＬＣ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌａｒｓ，３７２，１４９−１５６（１９９１）；Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｂｅａｍ，Ｋ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｂｙ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００８）を参照されたい。）を用いる水性クロマトグラフィーを使用して、分離することに成功している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，２００２，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．
【非特許文献２】Ｃｈｉ，Ｅ．Ｙ．，Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．，Ｒａｎｄｏｌｐｈ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄ  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｆ．，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｒｉｖｉｎｇ  Ｆｏｒｃｅｓ  ｉｎ  Ｎｏｎｎａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，２０，１３２５−１３３６（２００３）
【非特許文献３】Ｋｉｅｓｅ，Ｓ．，Ｐａｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ａ．，Ｆｒｉｅｓｓ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｍａｈｌｅｒ，Ｈ．Ｃ．，Ｓｈａｋｅｎ，Ｎｏｔ  Ｓｔｉｒｒｅｄ：Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ＩｇＧ１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，９７，４３４７−４３６６（２００８）
【非特許文献４】Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．Ｊ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｂｙ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３３６，２２２−２２８（２００８）
【非特許文献５】Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，５７−８７（１９９６）；
【非特許文献６】Ｓｈｕｋｌａ，Ａ．Ａ．，ａｎｄ  Ｙｉｇｚａｗ，Ｙ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｓｈｕｋｌａ，Ａ．，Ｅｔｚｅｌ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｇａｄａｍ，Ｓ．，ｅｄｓ．，１７９−２２７，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（２００７）
【非特許文献７】Ｓｔａｂｙ，Ａ．，Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｒ．Ｇ．，Ｂｒｕｕｓ，Ｕ．Ｋ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｉ．Ｈ．，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｒｅｓｉｎｓ．Ｖ．Ｓｔｒｏｎｇ  ａｎｄ  Ｗｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｒｅｓｉｎｓ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１１１８，１６８−１７９（２００６）
【非特許文献８】Ｓｈｕｋｌａ，Ａ．Ａ．，Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｂ．，Ｔｒｅｓｓｅｌ，Ｔ．，Ｇｕｈａｎ，Ｓ．，Ｌｏｗ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，８４８，２８−３９（２００７）
【非特許文献９】Ｓｈｉｈａｒａ，Ｔ．，Ｋａｄｏｙａ，Ｔ．Ｊ．，Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ  Ｔｉｍｅ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ：Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｃａｓｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１１７６，１４９−１５６（２００７）
【非特許文献１０】Ｆａｈｒｎｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｋｎｕｄｓｅｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｂａｓｅｙ，Ｃ．Ｄ．，Ｇａｌａｎ，Ｗ．，Ｆｅｕｅｒｈｅｌｍ，Ｄ．，Ｖａｎｄｅｒｌａａｎ，Ｍ．，Ｂｌａｎｋ，Ｇ．Ｓ．，Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．，１８，３０１−２７（２００１）
【非特許文献１１】Ｙｉｇｚａｗ，Ｙ．，Ｈｉｎｃｋｌｅｙ，Ｐ．，Ｈｅｗｉｇ，Ａ．ａｎｄ  Ｖｅｄａｎｔｈａｍ，Ｇ．，Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１０，４２１−４２６（２００９）
【非特許文献１２】Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｔｅｔｒａｕｌｔ，Ｊ．，Ｌｅｙ，Ａ．，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｒｅｓｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，１１７７，２７２−８１（２００８）
【非特許文献１３】Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｇｒｕｎｄ，Ｅ．，Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｐａｒｔ４：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ，ＢｉｏＰｈａｒｍ，９，５４−６４（１９９６）
【非特許文献１４】Ｌｕ，Ｙ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｒ．，Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｉｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１０，４２７−３３（２００９）
【非特許文献１５】Ａｏｙａｍａ，Ｋ．，Ｃｈｉｂａ，Ｊ．，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ａｎｄ  ＩｇＭ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｎ  Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｂｅａｄｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６２，２０１−２１０（１９９３）
【非特許文献１６】Ｌｕｅｌｌａｕ，Ｅ．，Ｍａｒｉｓｏｎ，Ｗ．，ｖｏｎ  Ｓｔｏｃｋａｒ，Ｕ．，Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘａｐａｔｉｔｅ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＩｇＡ  Ｍｏｎｏｃｏｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｒｏｎｄｏ，Ｍ．，ｅｄ．，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，２６５−２６９（１９９７）
【非特許文献１７】Ｌｕｅｌｌａｕ，Ｅ．，ｖｏｎ  Ｓｔｏｃｋａｒ，Ｕ．，Ｖｏｇｔ，Ｓ．，Ｆｒｅｉｔａｇ，Ｒ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ  Ｍｏｎｏｍｅｒ，Ｄｉｍｅｒｓ，ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ，Ｊ．Ｃｈｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，７９６，１６５−１７５（１９９８）
【非特許文献１８】Ｙａｍａｋａｗａ，Ｙ．，Ｃｈｉｂａ，Ｊ．，Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｎ  Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｂｅａｄｓ，Ｊ．Ｌｉｑｕｉｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１１，６６５−６８１（１９９８）
【非特許文献１９】Ｃｏｐｐｏｌａ，Ｇ．，Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ，Ｊ．，Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．，Ｈｅａｒｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＸＣＩＩＩ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｍ  Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．，４７６，２６９−２９０（１９８９）
【非特許文献２０】Ｊｏｓｉｃｓ，Ｄ．，Ｌｏｓｔｅｒ，Ｋ．，Ｋｕｈｌ，Ｒ．，Ｎｏｌｌ，Ｆ．，Ｒｅｕｓｃｈ，Ｊ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅ  ＨＰＬＣ  ａｎｄ  Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ＨＰＬＣ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌａｒｓ，３７２，１４９−１５６（１９９１）
【非特許文献２１】Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｂｅａｍ，Ｋ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｂｙ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のような先行する教示は、これらが定性的および／または定量的に十分な試料を提供できないという点で、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離する用途にとって有用であることは証明されていない。従って、非常に高純度（即ち、不正確に折り畳まれたエタネルセプトが不在であるか、または非常に低レベルで存在するかのいずれかである。）および商業的に魅力的な生産収率でエタネルセプト調製物を提供できる、ＣＨＯ細胞により産生されたエタネルセプトを使用するための、有効で効率的な分離技術が当分野において必要である。
【００１０】
本発明は、いわゆる「混合モード」クロマトグラフィーを用いる。組換え発現タンパク質を精製するためのクロマトグラフィー方法は、少なくとも２つの異なる力を利用してタンパク質を結合し、所望のタンパク質産物を、所望のタンパク質と一緒に望まない不純物を含有する比較的不純な発現産物中に存在すると思われる望まない材料から分離する場合、一般に混合モードと呼ばれる。これらの力としては、例えば、静電力および疎水性力が挙げられる。
【００１１】
混合モードクロマトグラフィーは、固定相および移動相が存在するという点で、より伝統的なクロマトグラフィー技術と同様の様式で働く。固定相は、普通は不溶性の樹脂またはゲルであり、通常クロマトグラフィー樹脂と称され、これは分離のための基材を提供する。樹脂は、液体を通過させ樹脂と接触させるカラムに含有される。所望の材料を望まない材料から分離するクロマトグラフィー樹脂の能力は、樹脂に共役された、選択された化学的な基または部分の存在によって可能になる。通常リガンドと呼ばれるこれらの共役基は、樹脂に必要な親和特性（即ち、リガンドに存在するイオン交換部分からもたらされる静電引力特性およびリガンドに存在する疎水性部分からもたらされる疎水性引力特性）を与え、これによって、不純試料を含有する溶液を、クロマトグラフィーカラム中を樹脂に接触して貫流させた場合、樹脂が、不純試料中の幾つかのタンパク質材料と結合し、他とは結合しないことを可能にする。
【００１２】
これらの親和性基を有する樹脂を含有するクロマトグラフィーカラムの固定相は、通常強固な円筒形容器であるクロマトグラフィーカラムの内部に充填され、カラム内において一方の端において流体を導入し、樹脂に接触させ、その後反対の端においてカラムから出すことができる。精製されるタンパク質を含有する溶液は、タンパク質産物を適切な溶液内に配置させ、移動相と呼ばれるこの溶液を、カラム内を移動させることによってカラムに導入され得る（従って貫流させ得る。）。精製されるタンパク質産物（被検体と呼ばれる。）が、移動相中でカラムに提示される場合、被検体はカラムと移動相の間で平衡状態に達し、タンパク質溶液中の材料の幾つかが、カラム樹脂上の親和性基に付着、結合または親和性基に固定または捕捉され、一方、産物中の材料の残りはカラムに付着しないが、この代わりにカラムを貫流し、流出し、分析、さらなる処理のために収集されてもよく、または廃棄されてもよい。
【００１３】
ひとたびタンパク質被検体が上記の様式でカラムに結合されたら、通常溶出ステップと呼ばれる洗浄ステップがその後使用され、結合された被検体はカラムから溶出または放出される。被検体をカラムに結合するための樹脂上に存在する親和性リガンドのタイプ（例えば、電荷に基づく部分もしくは疎水性部分またはこれらの組み合わせなど）に依存して、被検体をカラムから溶出または放出するために使用される溶液は、樹脂に対する被検体の親和性または引力に打ち勝つことができる、被検体および／またはリガンドに対する親和性または引力（例えば、電荷特性、疎水性特性、ｐＨ特性、塩濃度など）を有さなければならず、これによって、被検体の樹脂（上記の固定相）から溶出媒体（移動相）への放出を引き起こす。ひとたび移動相へ放出または溶出されたら、その後被検体は、最終的な収集、分析などのため、またはさらなる精製方法またはろ過ステップへ移るために、クロマトグラフィーカラムを貫流し、流出することができる。被検体とクロマトグラフィー樹脂との結合を引き起こす引力または親和性の特性がどのようなものであっても、（例えば、電荷特性または疎水性特性）、次いで被検体の溶出または放出に使用される移動相溶液は、その後被検体が、カラム樹脂上に捕捉されたままであるより、溶出媒体中に存在することを「好む」ような、競合する特性のセットを有さなければならないことは理解されると思われる。
【００１４】
他の単一モードクロマトグラフィー技術と比較して、いわゆる混合モードクロマトグラフィーは、さまざまな結合および溶出因子が相互依存的であり得、互いに対抗し得るという点で特有である。例えば、伝統的な単一モードイオン交換クロマトグラフィーの移動相のイオン強度を上げることにより、被検体の荷電特徴が、カラム樹脂の引力と比べて溶出媒体に対してより強力な引力（好み）を有する場合、樹脂に結合された被検体の溶出または放出を駆動することができる。しかし、クロマトグラフィー樹脂が、被検体を結合するために静電引力および疎水性引力の両方を使用する混合モードクロマトグラフィー方法において、移動（溶出）相のイオン強度を上げることにより、試料材料の電荷特性に基づくカラムからこの材料の放出を駆動でき、一方同時に、電荷に基づく溶出媒体の存在下でこのような疎水性タンパク質材料は、溶出媒体の荷電環境と比べてカラムの疎水性リガンドへの結合に対してより強力な引力または好みを有する傾向があるので、被検体中の疎水性材料の結合を駆動または増強できる。従って、移動相中の荷電イオンが、固定相の結合部位に対してタンパク質と競合する場合、塩濃度の増加は、荷電タンパク質材料を固定相から移動させる傾向を実際に駆動することができ、高度の疎水特性を示し得る被検体産物混合物のこれらの部分が、混合モードクロマトグラフィーカラムの疎水性部分に結合されたままである傾向を強化できる。任意の所与のタンパク質分離に関連するこれらの現象を活用する能力は、ほとんど予測不可能であると思われる。
【００１５】
混合モード樹脂の２つの例は、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣおよびＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能）である。Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣは、（そのカルボン酸基による）カチオン交換、水素結合および疎水性相互作用により被検体と相互作用し得る、固体支持マトリックスに付着されたリガンドを利用する。Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣのリガンドを下記に例示する：
【００１６】
【化１】
2019038817.tif 000003
【００１７】
Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅは、これもまた、固体支持マトリックスに付着されたリガンドを用いるという点でＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣと同様である。リガンドであるＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンもまた、アニオン交換、水素結合および疎水性相互作用により被検体と相互作用する。Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅのリガンドを下記に例示する：
【００１８】
【化２】
2019038817.tif 000004
【００１９】
両方のリガンドにおいて、疎水性相互作用は弱いと予想される。従って、これらのリガンドが疎水性部分（電荷なし）だけを有する場合、これらのリガンドは、タンパク質結合に関して塩析（タンパク質沈殿）条件を必要とする可能性が最も高い。しかし、静電相互作用を有することにより、このような弱い疎水性相互作用を、さらなる結合力を提供するために十分にすることが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣおよびＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する混合モードクロマトグラフィーを、正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたタンパク質の混合物、例えば、正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質混合物を含む被検体を精製するために用い、これによって、正確に折り畳まれたタンパク質が、高効率の様式および優れた生産収率で、不正確または異常に折り畳まれたタンパク質から効率的に分離することができ、所望の正確に折り畳まれたタンパク質に非常に富んだタンパク質調製物を得ることができるという発見を前提とする。さらに、本発明は、所望であれば、不正確に折り畳まれた産物を含み得ない、または基本的に含み得ない、クロマトグラフ分離による溶出産物を得るような様式で、本明細書に記載の混合モードクロマトグラフ分離を実践する能力を包含するが、収率と純度とのバランスを取る目的のため、非常に低レベル（例えば、５重量％未満、好ましくは３重量％未満）の不正確に折り畳まれた産物を含むことが、所望の程度に収率を最大化するために許容可能であることを認めてもよいことは理解されると思われる。
【００２１】
従って、第１の実施形態において、本発明は、正確に折り畳まれたタンパク質を不正確に折り畳まれたタンパク質から分離するための混合モードクロマトグラフィー方法であり、（ａ）所与のタンパク質の正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれた両方の立体構造を含む第１のタンパク質混合物を、イオン交換部分および疎水性部分の両方を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させるステップ；（ｂ）正確に折り畳まれたタンパク質を混合モード樹脂から溶出し、第１のタンパク質混合物より高い割合の正確に折り畳まれたタンパク質を含む第２のタンパク質混合物を得るステップを含む方法である。「より高い割合」という用語は、ステップ（ｂ）の溶出液中の、正確に折り畳まれたタンパク質対不正確に折り畳まれたタンパク質の比が、少なくとも１：１より大きく、最も好ましくは約８：２より大きく、好ましくは約９：１より大きいことを意味する。第２のタンパク質混合物は、最も好ましくは、正確に折り畳まれたタンパク質を、第２のタンパク質混合物の少なくとも約９５重量％を構成する量で含有する。
【００２２】
第２の実施形態において、本方法は、タンパク質混合物中に存在する正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離するために、前記混合物を精製する混合モードクロマトグラフィー方法であり、この方法は、（ａ）疎水性部分およびイオン交換部分を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂を、正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質混合物を含む溶液と、正確に、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトの両方が、混合モードクロマトグラフィー樹脂に固定、結合または捕捉されるように接触させるステップ；ならびに（ｂ）混合モード樹脂を、エタネルセプトタンパク質を混合モードクロマトグラフィー樹脂から溶出できる溶液と接触させ、正確に折り畳まれたエタネルセプト対不正確に折り畳まれたエタネルセプトの量の比が、ステップ（ａ）において樹脂に導入されたタンパク質混合物の比より大きい、好ましくは非常に大きい溶出液を得るステップ、を含む方法に関する。
【００２３】
第３の実施形態において、本発明は、上記の方法実施形態に従って得られるエタネルセプト含有タンパク質混合物、または前記混合物を含む医薬として許容される製剤であり、前記タンパク質混合物が、正確に折り畳まれたエタネルセプトを、タンパク質混合物の約９０重量％より多くを構成する量で含み、不正確に折り畳まれたエタネルセプトを、タンパク質混合物の約５重量％未満を構成する量で含み、タンパク質混合物が、エタネルセプト含有タンパク質混合物の少なくとも約９５、好ましくは少なくとも約９８重量％を構成する、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの総量を有する、エタネルセプト含有タンパク質混合物、または前記混合物を含む医薬として許容される製剤に関する。正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトの量は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（単一モード）を使用して決定することができる。正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの総量は、サイズ排除クロマトグラフィー（「ＳＥＣ」）を使用して決定することができる。本明細書において使用する場合、「エタネルセプト系タンパク質混合物」または「エタネルセプト含有タンパク質混合物」または「エタネルセプト調製物」または「エタネルセプト系材料」などの用語は、同意語として読み取るべきであり、主要成分が正確に折り畳まれたエタネルセプトを含み、微量成分がクリップされたエタネルセプト、不正確に折り畳まれたエタネルセプト、凝集されたエタネルセプト（このような凝集体は、正確に、および／または不正確に折り畳まれたエタネルセプトで構成される。）またはエタネルセプトの断片を含み得るタンパク質混合物を表すという意味である。本発明は、これまでに達成されているよりも大きな程度に、正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が最大化され、一方不正確に折り畳まれた（凝集を含む。）エタネルセプトの量が最小化されることが望ましい、医薬製剤中の活性成分としての使用のための、エタネルセプト系タンパク質混合物（またはエタネルセプト調製物）を生産する能力を提供する。
【００２４】
第４の実施形態において、本発明は、ＴＮＦ媒介性病態の治療を必要とする対象への投与に適切な高純度のエタネルセプトを含む医薬として許容される製剤に関するものであり、前記製剤は、主要量の正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび微量の不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質混合物を含有し、（ｉ）不正確に折り畳まれたエタネルセプトが、タンパク質混合物の約１０重量％未満、好ましくは約８重量％未満、最も好ましくは約５重量％未満を構成し；（ｉｉ）正確に折り畳まれたエタネルセプトが、タンパク質混合物の９０重量％より多く、好ましくは約９２重量％より多く、最も好ましくは約９５重量％より多くを構成し、（ｉｉｉ）正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの合計量（これらの凝集体は含まない。）が、タンパク質混合物の少なくとも９５重量％、好ましくは少なくとも９８重量％を構成し、該製剤は、対象への投与に適切である、医薬として許容される不活性成分、賦形剤またはキャリアをさらに含む。
【００２５】
第５の実施形態において、本発明は、正確に折り畳まれたエタネルセプト対不正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が高純度で存在するエタネルセプト含有タンパク質混合物を生産する方法であって、前記方法は、（１）エタネルセプトを哺乳動物発現系において発現させ、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの両方を含むエタネルセプト含有タンパク質混合物を含有する回収細胞培養流体を得るステップ；（２）ステップ１において得られた回収細胞培養流体を精製工程に供し、これによってステップ（１）において生産された回収細胞培養流体中に存在する望ましくない不純物（即ち、非エタネルセプト系タンパク質）の量が減少した、または実質的に不純物を含まないエタネルセプト含有タンパク質混合物を得るステップ；（３）ステップ（２）において得られたエタネルセプト含有タンパク質混合物と、イオン交換部分および疎水性相互作用部分の両方を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂とを、混合物中に含有されるタンパク質を樹脂に固定するために１回以上接触させるステップ；ならびに（４）ステップ３によりこの上に結合されたタンパク質を有する混合モード樹脂と、正確に折り畳まれたエタネルセプトを混合モード樹脂から溶出できる溶液とを接触させ、ステップ３において樹脂に導入されたエタネルセプト含有混合物よりも、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトに対して高い割合で有する、エタネルセプト含有タンパク質混合物を含む溶出液を得るステップ、を含み；（ｉ）ステップ２の精製により得られたエタネルセプト含有タンパク質混合物中に存在するタンパク質量は、ステップ１において得られた回収細胞培養流体中に存在するエタネルセプト系タンパク質混合物の量の少なくとも約８０重量％、最も好ましくは少なくとも約８５重量％であり；（ｉｉ）ステップ４において溶出されたタンパク質混合物中に存在する正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトタンパク質の総量は、ステップ２から得られたタンパク質混合物中に存在するこれらの量の少なくとも約６０重量％であり；（ｉｉｉ）ステップ４の溶出液中に存在する正確に折り畳まれたエタネルセプトの量は、ステップ１において得られた回収細胞培養流体中に存在するエタネルセプト含有タンパク質混合物の少なくとも約３０重量％、好ましくは少なくとも約３４重量％であり、ならびに（ｉｖ）前記正確に折り畳まれたエタネルセプトは、ステップ４において得られた溶出液の少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％を構成する。
【００２６】
第６の実施形態において、本発明は、ＴＮＦ媒介性疾患を患う対象を治療する方法であり、対象個体に、正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質混合物を含有する医薬製剤を投与し、前記混合物が上記の方法のいずれかにより得られ、タンパク質混合物中の不正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が、前記混合物の約１０重量％未満、好ましくは約５重量％未満であるステップを含む方法に関する。
【００２７】
第７の実施形態において、本発明は、ＴＮＦ媒介性疾患を患う対象を治療する方法であり、対象個体に、正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質混合物を含有する医薬製剤を投与し、タンパク質混合物中の不正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が、前記混合物の約１０重量％未満、好ましくは約５重量％未満であるステップを含む方法に関する。
【００２８】
第８の実施形態において、本発明は、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離する方法であり、前記方法においてクロマトグラフィー手段を使用して前記分離を達成し、該クロマトグラフィー手段が、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含む混合物を、イオン交換部分および疎水性部分を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂と接触させ、次に、そこから溶出させ、少なくとも約８５、好ましくは少なくとも約９０、最も好ましくは少なくとも約９５重量％の正確に折り畳まれたエタネルセプトを含む溶出液を得る、混合モードクロマトグラフィーだけからなる方法に関する。この実施形態に関連して、本明細書において「クロマトグラフィー手段が混合クロマトグラフィーだけからなる」と述べた場合、単に分析目的で使用する場合、このような表現がさまざまなクロマトグラフィー手段（例えば、ＨＩＣ、ＳＥＣなど）の任意選択による使用を排除しないと理解すべきである。この実施形態は、本明細書に記載の混合モード方法以外の、正確に折り畳まれたタンパク質を不正確に折り畳まれたタンパク質から分割するための分離方法の使用を必要としないという点で有利である。
【００２９】
さらなる態様において、エタネルセプトに適用される上記の方法を２回以上実施して、高純度のエタネルセプト調製物を、下記の様式：第１の混合モード分離（分離番号１）を、例えば、上記の実施形態１および２に記載のステップ（ａ）および（ｂ）を行うことにより実施し、その後ステップ（ａ）および（ｂ）を再度行うことにより第２の混合モード分離（分離番号２）を実施することにより得ることができ、分離番号１のステップ（ｂ）において得られた溶出液がその後分離番号２のステップ（ａ）のための被検体（即ち、タンパク質混合物を含有する溶液）として使用される。分離番号１および分離番号２に使用される混合モード樹脂は、同じであっても、または異なっていてもよい。この態様の特に好ましい実施において、分離番号１は、ＣＡＰＴＯ  ＭＭＣ混合モード樹脂により実施され、分離番号２は、ＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥ混合モード樹脂により実施される。
【００３０】
場合により、本発明の方法から得られたエタネルセプト調製物または上記の調製物、製剤もしくは治療実施形態に提供されたエタネルセプト調製物は、所望であれば、不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含まなくてもよいまたは基本的に含まなくてもよいが、本明細書において、著しく低いレベルの不正確に折り畳まれたエタネルセプトを、製剤中に存在するエタネルセプト系タンパク質混合物の合計量の好ましくは約１０重量％未満、最も好ましくは約５重量％未満を有するエタネルセプト調製物を提供できることは、ＨＩＣ分析に基づいて、この混合物中の不正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が、このような製剤に見出されるエタネルセプト系タンパク質の約１０％より多くあり得るエタネルセプト系混合物を含有する市販品として現在利用可能な医薬製剤を越える有意な進歩を表すことが理解される。
【００３１】
本発明における使用に好ましい混合モード樹脂は、ＣＡＰＴＯ  ＭＭＣおよびＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥであるが、イオン交換部分および疎水性部分の両方により官能化された任意の混合モード樹脂が、本発明における使用に企図されることを理解すべきである。
【００３２】
いずれの特定の理論にも縛られることを望むものではないが、適切に折り畳まれたタンパク質種の、不正確に折り畳まれたおよび／または凝集された種からの高度に効率的な分離を開発するために、これら２つの親和性タイプを用いる混合モードクロマトグラフィーにおいて電荷特徴と疎水性特徴との間の相互依存的な対抗する作用を活用可能であることは、まったく予想できないにしても、可能であると考えられた。驚くべきことに、本発明の混合モード方法は、正確に折り畳まれたタンパク質を不正確に折り畳まれたタンパク質から、優れた収率および高純度で分割するための任意の他の分離戦略との組み合わせ、またはこれによる補填を必要としない。例えば、追加のＨＩＣステップを用いて、正確に折り畳まれたタンパク質の、不正確に折り畳まれたタンパク質からのこのような分離をさらに達成する必要はない。
【００３３】
エタネルセプトに適用する場合、本発明に従った混合モードクロマトグラフィー方法は、現象の下記の一般的連鎖の発生を伴う：第１に、不純なエタネルセプト含有試料（即ち、正確に折り畳まれたもの、不正確に折り畳まれたものおよび他の不純物を含む試料）、例えば、エタネルセプトのＣＨＯ発現から得られたものなどの不純なエタネルセプト含有試料の混合モード樹脂への導入において、本発明の方法は、エタネルセプト（正確におよび不正確に折り畳まれたものの両方）を、混合モード樹脂に結合させる。第２に、後続の（例えば、好ましくは漸増濃度の勾配で適用された塩勾配を使用する）溶出または洗浄ステップの間に、本発明は、エタネルセプト系混合物を樹脂から放出（即ち溶出）させ、含有されるエタネルセプトは主に正確に折り畳まれたものであり、一方、不正確に折り畳まれたエタネルセプトを、実質的に混合モード樹脂に結合または捕捉されたままにし；これによって、樹脂から溶出された材料中に、（最初に樹脂に導入された、または結合されたエタネルセプト含有タンパク質試料中に存在する、適切に折り畳まれたエタネルセプトのより低い割合と比較して）非常に高い割合の適切に折り畳まれたエタネルセプトを得ることができる。本発明の混合モードクロマトグラフィーの物理的操作に関して、混合モード樹脂は、樹脂を含有できる強固な円柱状の格納手段または容器内に含有（即ち充填）され得、これは流体溶液をカラムの一端に進入させ、流れ込んで樹脂と接触し、その後、容器の反対端から、さらなる分析もしくは処理のために収集される、または廃棄されるために出て行くための入口手段および出口手段を有する。
【００３４】
上記の方法のステップ（ａ）において使用される、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトのタンパク質混合物を含有する溶液は、公知の方法で、哺乳動物細胞培養、例えばＣＨＯ細胞におけるエタネルセプトタンパク質の発現から得ることができる。本発明の混合モードクロマトグラフィー精製の前に、哺乳動物発現から回収されたタンパク質（回収細胞培養流体）を、初期精製ステップ、例えば、プロテインＡ親和性精製に供して、不純物を除去してもよい。このようなステップは、非エタネルセプト系不純物の除去には望ましいと思われるが、この精製は、正確に折り畳まれたエタネルセプトの、不正確に折り畳まれたエタネルセプトからの明らかな分離（即ち分割）は一般的にもたらさない。従って、プロテインＡによるプールは、その後本発明の混合モード方法論に供され、このような分離が達成される。
【００３５】
本発明の方法は、正確に折り畳まれたエタネルセプトの商業的に有用な回収（収率）を提供する。例えば、本方法のステップ（ａ）に使用される正確に、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトのエタネルセプト系タンパク質溶液が、エタネルセプトの哺乳動物発現産物をプロテインＡカラムにおいて精製することによって得られる、プロテインＡクロマトグラフィー産出物の形態で好ましく提供される場合、プロテインＡ精製ステップにおいて回収される材料の量は、プロテインＡカラムに導入される回収細胞培養液中に存在するエタネルセプト系発現産物の、好ましくは少なくとも約８０重量％、および好ましくは少なくとも約８５重量％である（回収細胞培養液中に存在するエタネルセプト系タンパク質の量はＦｃ  Ｅｌｉｓａにより決定することができ、プロテインＡ溶出プールにおいて得られるエタネルセプト系タンパク質の量は、Ａ２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度により決定することができる。）。続いて、本発明の混合モードクロマトグラフィーが、上記のプロテインＡにより精製された材料を使用して実施される場合、本発明のステップ（ｂ）の溶出において得られるエタネルセプト系タンパク質材料の量は、本発明のステップ（ａ）において混合モード樹脂に導入されるエタネルセプト系材料の量の、好ましくは少なくとも約６０重量％、および好ましくは少なくとも約７０重量％である。
【００３６】
従って、正確に折り畳まれたエタネルセプトに非常に富んだ（即ち、溶出液の重量に対して１０重量％以下、および好ましくは約５重量％以下の異常に折り畳まれた材料を含有する）、本明細書のステップ（ｂ）の混合モード溶出液中の高純度のエタネルセプト混合物の全収率は、これらの精製（例えば、プロテインＡ精製）前に回収細胞培養流体中にもともと存在するエタネルセプト系混合物の約３０から約５０重量％ほどであってよい。
【００３７】
回収細胞培養流体の精製はまた、他のクロマトグラフィー手段、例えば、イオン交換部分および疎水性相互作用部分の両方を有するクロマトグラフィー樹脂を使用する混合モードクロマトグラフィーにより達成することができる。
【００３８】
本発明の方法の実施において、追加のろ過ステップ（例えば、ウイルスろ過およびタンジェンシャルフローろ過）を公知の様式で行い、上記の混合モードクロマトグラフィー方法のステップ（ｂ）において生産された溶出液をさらに処理することができる。
【００３９】
本発明は、所与のタンパク質の正確に折り畳まれた立体構造を不正確に折り畳まれた立体構造（凝集体を含む。）から分離する、特に、エタネルセプト系種の高度に異種性の混合物を含む、哺乳動物細胞培養回収物から得られる、適切に折り畳まれたエタネルセプトを異常に折り畳まれた（および凝集された）エタネルセプトから分割するための大幅に改善された分離方法を利用可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣおよびＣａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅの混合モード樹脂の化学構造を示す。
【図２Ａ】図２Ａ（プロテインＡによる溶出プロファイル）は、正確に折り畳まれた、および異常に折り畳まれたエタネルセプトタンパク質の両方を含むＣＨＯ回収培養液の、１Ｍアルギニンを含有する表示ｐＨの０．１Ｍシトレートによる溶出を使用する、プロテインＡによる溶出プロファイルを示す。実線の曲線はＵＶ吸光度であり、点線の曲線は伝導率である（以下の図においても同じ）。
【図２Ｂ】図２Ｂ（プロテインＡからプロファイルされた溶出）は、プロテインＡから溶出された試料のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ結果を示し、レーン１は標準（市販のＥｎｂｒｅｌ）であり；レーン２は負荷であり；レーン３はＦＴ（フロースルー）であり；レーン４、ｐＨ６．０；レーン５、ｐＨ４．２；レーン６、ｐＨ３．７；レーン７、ｐＨ３．０である。
【図３Ａ】図３Ａ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣによるプロテインＡプールの溶出プロファイル）は、１０ｍＭ  ホスフェート、ｐＨ７．５中のＮａＣｌまたはアルギニンによる溶出のＣＡＰＴＯ  ＭＭＣクロマトグラムを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣによるプロテインＡプールの溶出プロファイル）は、溶出された試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび  ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを示し、レーン０、標準；レーン１、負荷；レーン２、ＦＴ；レーン３、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ；レーン−４、０．３Ｍ  ＮａＣｌ；レーン−５、１Ｍ  アルギニンである。
【図４Ａ】図４Ａ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣによるプロテインＡプールの溶出プロファイル）は、ｐＨ７．５において０−０．５Ｍ  ＮａＣｌ勾配による溶出のクロマトグラムを示す。カラムは、１０ｍＭ  ホスフェート、ｐＨ７．５により勾配溶出の前に平衡化された。
【図４Ｂ】図４Ｂ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣによるプロテインＡプールの溶出プロファイル）は、溶出された試料のｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを示す；レーン０、標準；レーン１、負荷；レーン２からレーン８、溶出分画；レーン９、１Ｍ  アルギニン。
【図４Ｃ】図４Ｃ（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣによるプロテインＡプールの溶出プロファイル）は、異なるプロテインＡプールに関して溶出された試料のＳＤＳ−ＰＡＴＥおよびｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを示す；レーン０、標準；レーン１、負荷、レーン２、ＦＴ；レーン３からレーン８、溶出分画；レーン９、１Ｍ  アルギニン。
【図５Ａ】図５Ａ（Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣによるプロテインＡプールの溶出プロファイル）は、ｐＨ７．５において０−０．４Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４勾配により溶出されたクロマトグラムを示す。カラムは、１０ｍＭ  ホスフェート、ｐＨ７．５により勾配溶出の前に平衡化された。
【図５Ｂ】図５Ｂ（Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣによるプロテインＡプールの溶出プロファイル）は、溶出された試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを示す；レーン−１、負荷；レーン−２、ＦＴ；レーン３、バッファーによる洗浄；レーン４からレーン９、溶出分画；レーン１０、１Ｍ  アルギニン。
【図６】図６は、Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣにより溶出された分画のＨＩＣ分析を示す。
【図７Ａ】図７Ａ（Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣによるプロテインＡプールの溶出プロファイル）は、ｐＨおよび塩勾配による溶出のクロマトグラムを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂ（Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣによるプロテインＡプールの溶出プロファイル）は、溶出された試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを示す；レーン０、標準；レーン１、負荷；レーン２および３、ＦＴ；レーン４からレーン８、溶出分画；レーン９、１Ｍ  アルギニン。
【図８Ａ】図８Ａ（Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣによるプロテインＡプールの溶出プロファイル）は、ｐＨおよびＮａ２ＳＯ４勾配による溶出のクロマトグラムを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂ（Ｃａｐｔｏ−ＭＭＣによるプロテインＡプールの溶出プロファイル）は、溶出された試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを示す；レーン０、標準；レーン１、負荷；レーン２、ＦＴ；レーン３からレーン５、溶出分画；レーン６、１Ｍ  アルギニン。
【図９】図９は、Ｃａｐｔｏ−ＡｄｈｅｒｅによるプロテインＡプールのＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを示す；レーン０、標準；レーン１、負荷；レーン２、５ｍＭ  シトレート（ｐＨ４，５）；レーン３および４、０．１Ｍ  アルギニン（ｐＨ４．５）；レーン５、０．５Ｍ  アルギニン。観察された低分子量種を四角で囲んである。
【図１０Ａ】図１０Ａ（Ｃａｐｔｏ−ＡｄｈｅｒｅによるプロテインＡプールの溶出プロファイル）は、ｐＨおよびアルギニンの勾配による溶出のクロマトグラムを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂ（Ｃａｐｔｏ−ＡｄｈｅｒｅによるプロテインＡプールの溶出プロファイル）は、溶出された試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを示す；レーン０、標準；レーン１、負荷；レーン２からレーン４、ＦＴ；レーン５からレーン７、溶出分画；レーン８、０．５Ｍ  アルギニン。
【図１１Ａ】図１１Ａ（Ｃａｐｔｏ−ＡｄｈｅｒｅによるプロテインＡプールの溶出プロファイル）は、ｐＨおよびアルギニンの勾配による溶出のクロマトグラムを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂ（Ｃａｐｔｏ−ＡｄｈｅｒｅによるプロテインＡプールの溶出プロファイル）は、溶出された試料のｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを示す；レーン０、標準；レーン１、負荷；レーン２、ＦＴ；レーン３からレーン５、溶出分画；レーン６、１Ｍ  アルギニン。
【図１２】図１２は、実施例１２のステップ３Ｂにおいて得られたＣａｐｔｏ−Ａｄｈｅｒｅ混合モード樹脂溶出分画のＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）分析の概略図であり、負荷試料は実施例１２のステップ３Ａにおいて得られた材料である。正確に折り畳まれたエタネルセプトの百分率を縦軸に示し、継時的塩勾配の適用を横軸に表している。勾配の早期に得られた溶出分画は、１００％正確に折り畳まれたエタネルセプトを含有する。
【図１３】図１３（Ｃａｐｔｏ−ＡｄｈｅｒｅによるＣａｐｔｏ−ＭＭＣプールの溶出プロファイル）は、溶出された試料のＳＤＳおよびＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを示す。溶出は、ｐＨ７．５においてアルギニン勾配により行った：レーン０、標準；レーン１、負荷；レーン２および３、ＦＴ；レーン４からレーン７、溶出分画；レーン８、１Ｍ  アルギニン。
【図１４】図１４は、Ｃａｐｔｏ−ＡｄｈｅｒｅによるＣａｐｔｏ−ＭＭＣプールの溶出クロマトグラムである。溶出は、ｐＨ７．５においてＮａＣｌ勾配により行った。
【図１５Ａ】図１５Ａ（Ｃａｐｔｏ−ＡｄｈｅｒｅによるＣａｐｔｏ−ＭＭＣプールの溶出プロファイル）は、ｐＨ７．５における塩／アルギニン勾配による溶出のクロマトグラムを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂ（Ｃａｐｔｏ−ＡｄｈｅｒｅによるＣａｐｔｏ−ＭＭＣプールの溶出プロファイル）は、溶出された試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを示す：レーン０、標準；レーン１、負荷；レーン２、ＦＴ；レーン３からレーン６、溶出分画；レーン７、１Ｍ  アルギニン。
【図１６】図１６は、実施例１２において生産されたエタネルセプト材料に対応するＨＩＣクロマトグラムであり、第２のより小さいピーク（異常に折り畳まれた材料）を基本的に示さないプロットは、本発明（実施例１２）に従って生産された材料に対応し、比較の目的で提供された、市販のエタネルセプトに対応する図中の追加の曲線は、異常に折り畳まれたおよび／または凝集された材料を表す第２の小さいピークを示すことが見てわかる。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、イオン交換および疎水性引力の両方の原理を使用する混合モード樹脂、例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣおよびＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅを使用して、所与のタンパク質被検体の不正確に折り畳まれた立体構造および正確に折り畳まれた立体構造に結合、その後不正確に折り畳まれた立体構造に比べて正確に折り畳まれた立体構造を優先的に（即ち、選択的に）溶出できるという発見を前提とする。前述の混合モード樹脂は両方とも、タンパク質被検体を引き付け、結合するための２つの異なるモード、即ち、イオン交換引力および疎水性相互作用を提供する部分（即ち、化学基）を有するリガンドを含む。
【００４２】
定義
この明細書において使用される用語は、本発明に関連して、および各用語が使用される具体的文脈において、概して当分野におけるこれらの普通の意味を有する。本発明を記載するために使用される特定の用語を、下記または本明細書の他のところで述べ、本発明の記載に関して施術者にさらなるガイダンスを提供する。特定の用語に関して同意語が提供される。１以上の同意語の説明部分は、他の同意語の使用を排除するものではない。本明細書に述べる任意の用語の例を含む、本明細書のいずれにおいても例の使用は、単なる例示であり、本発明またはいずれの例示的用語の範囲および意味を限定するものでは決してない。本発明は、本明細書に提供されるさまざまな実施形態に限定されない。
【００４３】
特に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾が生じた場合、定義を含む本文書が支配する。
【００４４】
「ほぼ」、「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の２０％以内、１０％以内、５、４、３、２または１％以内を意味する。数量は近似値であり、「ほぼ」、「約」または「およそ」という用語が明確に述べられていなくても、これらが暗示され得ることを意味する。
【００４５】
本明細書において使用される場合「エタネルセプト」という用語は、市販の製剤Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）に含有される活性成分、即ち、ヒト免疫グロブリンＧ（「ＩｇＧ１」）のＦｃ部分［断片、結晶性］に連結された７５キロダルトン（ｐ７５）のヒト腫瘍壊死因子受容体（「ＴＮＦＲ」）の細胞外リガンド結合部分からなる融合ポリペプチドのホモ二量体である。エタネルセプトは、上記の７５キロダルトンＴＮＦＲ：Ｆｃ分子の２本鎖が、Ｆｃ部分のヒンジ領域においてジスルフィド結合により連結されるという点でホモ二量体である。エタネルセプトは９３４アミノ酸からなり、見かけ分子量およそ１５０キロダルトンを有し、これらのＦｃ成分は、定常重鎖２（ＣＨ２）ドメイン、定常重鎖３（ＣＨ３）ドメインおよびヒンジ領域を含有するが、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインは含有しない。本出願の目的のために、「エタネルセプト」という用語は、上記のポリペプチドの機能に有意な影響を与えない、アミノ酸構造のわずかな改変（アミノ酸の欠失、付加および／または置換を含む。）を有するエタネルセプトもまた包含してよい。エタネルセプトという用語はまた、いわゆるエタネルセプトのバイオシミラーまたはバイオベター変異体であることが意図される、またはみなされるタンパク質を含むと理解されるべきである。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「正確に折り畳まれたエタネルセプト」という用語は、Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）中の活性成分の立体構造および生物学的活性と同じ、または実質的に同じである、ＴＮＦの阻害に関する生物学的活性および立体構造を有する（上記の）エタネルセプトホモ二量体の折り畳み立体構造を表すことが意図される。
【００４７】
本明細書において使用する場合、「不正確に折り畳まれたエタネルセプト」という用語は、（ｉ）（上記の）エタネルセプトと同じ、または基本的に同じアミノ酸配列を有するが正確に折り畳まれたエタネルセプトの立体構造とは異なる立体構造を有し、前記異なる立体構造が、タンパク質にＴＮＦ阻害剤の生物学的活性の欠如、または実質的欠如をもたらすホモ二量体タンパク質；および／または（ｉｉ）２以上の正確に、および／または不正確に折り畳まれたエタネルセプトホモ二量体が、正確に折り畳まれたエタネルセプトより高い分子量を有する種を形成するような様式で会合した（即ち、凝集された、または塊となった）凝集体、；および／または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の混合；および／または（ｉｖ）正確に折り畳まれたエタネルセプトと同じ、または基本的に同じ配列、またはこれらの部分を含むが、正確に折り畳まれたエタネルと比較してＨＩＣカラムにおいて（より大きな疎水性のため）より低い溶出位置を示す凝集された、即ち、塊となったタンパク質組成物、を包含することが意図される。
【００４８】
「治療」という用語は、哺乳動物における疾患に対する治療の任意の投与または適用を指し、疾患の予防、その進行停止、（例えば、逆行を起こす、または喪失、欠損もしくは不全となった機能の復元もしくは修復を引き起こすことによる）疾患の軽減または非効率的過程の刺激を含む。この用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ること、および哺乳動物において病態または障害の任意の治療を包含することを含む。この効果は、これらの障害または症状を、完全にまたは部分的に予防するという点で予防的であっても、ならびに／または障害および／もしくは障害に起因する有害な影響の部分的または完全な治癒という点で治療的であってもよい。この効果は、（１）障害に係りやすいと思われるが、まだ症候性ではない対象における発生もしくは再発から障害を予防すること、（２）障害の阻害、例えばその進行の停止、（３）宿主がもはや障害もしくはその症状に悩まされないような、障害もしくは少なくともその付随する症状の停止もしくは終了、例えば、喪失、欠損もしくは不全となった機能の復元もしくは修復を引き起こすことにより、障害またはその症状の逆行を起こすこと、または（４）障害もしくはこれに伴う症状を軽減、緩和または改善すること、を含み、改善は広い意味で使用され、パラメーター、たとえ炎症、痛みおよび／または腫瘍サイズなどの大きさの低減を指す。
【００４９】
「医薬として許容されるキャリア」という用語は、非毒性の固体、半固体または液体の、任意の既存のタイプの充填剤、希釈剤、カプセル化材料、製剤補助剤または賦形剤を指す。医薬として許容されるキャリアは、用いる投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、製剤の他の原料と適合性である。
【００５０】
「組成物」または「製剤」という用語は、キャリア、例えば、当分野において既存であり、治療的、診断的または予防的目的で対象への投与に適切である、医薬として許容されるキャリアまたは賦形剤を普通含有する混合物を指す。「組成物」または「製剤」という用語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが細胞または培養培地中に存在する細胞培養物を含むことができる。例えば、経口投与用組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、持続放出製剤、口腔リンスまたは散剤を形成することができる。
【００５１】
本発明は、所与のタンパク質の正確に折り畳まれた立体構造を不正確に折り畳まれた立体構造から分離することに適切である。本発明の方法に従って処理できるタンパク質の例としては、再折り畳みを必要する任意のジスルフィド含有タンパク質、例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＧＦ、インスリン、成長ホルモンなど、ならびに遺伝子操作された抗体、例えば一本鎖可変ドメインの抗体断片が挙げられる。
【００５２】
本発明の混合モードクロマトグラフィー方法に従った精製に適切なエタネルセプトは、抗体の場合、例えばハイブリドーマなどのエタネルセプトを発現する生きた宿主細胞により、または融合ポリペプチドまたは抗体の場合、ポリペプチドを産生するように遺伝子操作された宿主細胞により産生させることができる。細胞を、ポリペプチドを産生するように遺伝子操作する方法は、当分野において周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。このような方法は、ポリペプチドをコードし、発現させる核酸を、生きた宿主細胞内に導入するステップを含む。これらの宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、または好ましくは培養で成長させた動物細胞であってよい。細菌細胞としては、限定するものではないが、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞が挙げられる。適切なＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の例としては、ＨＢ１０１、ＤＨ５．ａｌｐｈａ、ＧＭ２９２９、ＪＭ１０９、ＫＷ２５１、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９および外来性ＤＮＡを切断できない任意のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が挙げられる。使用可能な真菌宿主細胞としては、限定するものではないが、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の細胞が挙げられる。使用可能な動物細胞系の幾つかの例は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３およびＷ１３８である。新しい動物細胞系が、当業者に周知の方法（例えば、形質転換、ウイルス感染および／または選択）を使用して確立されてもよい。場合により、エタネルセプトは宿主細胞により培地内に分泌されてもよい。
【００５３】
正確に折り畳まれたエタネルセプトの、異常に折り畳まれたエタネルセプトからの混合モードクロマトグラフ分離の前に、発現されたエタネルセプトの精製が、任意の標準的方法により実施されてもよい。エタネルセプトが細胞内に産生される場合、微粒子状残屑が、例えば遠心分離または限外ろ過により除去される。エタネルセプトが培地内に分泌される場合、このような発現系からの上清が、標準的ポリペプチド濃縮フィルターを使用してまず濃縮され得る。プロテアーゼ阻害剤を加えて、タンパク質分解を阻害することもでき、抗生物質を含ませて、微生物の成長を防止することもできる。
【００５４】
エタネルセプトは、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーならびに公知の、もしくは現在は発見されていない精製技術の任意の組み合わせを使用して精製することができ、このような組み合わせは、限定するものではないが、プロテインＡクロマトグラフィー、イオン交換カラムにおける分取、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴ（Ｒ）によるクロマトグラフィー、アニオンもしくはカチオン交換樹脂クロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラムなど）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿を含む。
【００５５】
おおまかに言えば、エタネルセプト（これらの限定するものではないが）に適用する場合、本発明は、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの両方を有するエタネルセプト系タンパク質混合物を含有する溶液を、イオン交換部分および疎水性部分により官能化された混合モードクロマトグラフィー樹脂に、正確に、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトを該樹脂に結合させ得る条件下で導入するステップ；およびその後、（ｂ）得られた溶出液が、正確に折り畳まれたエタネルセプトをステップ（ａ）において導入されるタンパク質溶液より高い割合で有するように、正確に折り畳まれたエタネルセプトを樹脂から溶出可能な溶出媒体で樹脂を洗浄するステップ、を含むタンパク質分離方法を提供する。
【００５６】
場合により、本方法は、エタネルセプトを哺乳動物細胞培養物、例えばＣＨＯ細胞培養物中で発現させる予備ステップ、およびその後、発現産物を、例えばプロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製し、プロテインＡ産物産出物が本発明のステップ（ａ）に使用されるタンパク質溶液となるステップ、をさらに含んでもよい。本発明の方法は、哺乳動物発現および本発明のステップ（ａ）に使用するための出発溶液を生じさせるプロテインＡステップが、所与の製造所において第１の実体により実施可能であり、一方、本発明の混合モード分離の方法は、同じまたは異なる実体により、同じまたは異なる製造所において実施可能であるような様式で実施できることを理解するべきである。
【００５７】
ステップ（ａ）の条件−ＣＡＰＴＯ  ＭＭＣ混合モード樹脂への結合
本発明のステップ（ａ）において、正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質溶液は、ＣＡＰＴＯ  ＭＭＣ混合モード樹脂に導入され、約４から約８のｐＨ、好ましくは約４から約６のｐＨにおいてこれらに結合しなければならない。または、ＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥ混合モード樹脂が使用される場合、正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むステップ（ａ）のタンパク質溶液は、約６から約８．５のｐＨ、好ましくは約７から約８のｐＨにおいてＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥ混合モード樹脂に導入され、これらに結合しなければならない。
【００５８】
ステップ（ｂ）の条件−混合モード樹脂からの溶出。
ステップ（ｂ）において、溶出媒体は、所定の濃度の塩を含み、正確に折り畳まれたエタネルセプトタンパク質の、不正確に折り畳まれたエタネルセプトに比べて優先的な溶出に有効な所定の様式でカラムに適用される。一般的に言って、溶出液は、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトより高い比率で含有しなければならないが、塩溶液およびこれらの樹脂に適用する様式は、ステップ（ｂ）の溶出液中に、正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が不正確に折り畳まれたエタネルセプトの量をはるかに超えるように選択されることが好ましい。早期溶出分画は、基本的に１００％の正確に折り畳まれたタンパク質を含有し得る。塩溶液溶出ステップは、塩溶液のモル濃度を、勾配などを通して変化（上昇）させることによって達成することができる。勾配は段階的に達成できるが、連続して線形であることが好ましい。好ましい実施形態において、塩溶液は塩化ナトリウム（「ＮａＣｌ」）を含有する。ＮａＣｌ線形勾配は、約０から約１Ｍであってよい。
【００５９】
代替の実施形態において、塩溶液は、硫酸ナトリウム（「Ｎａ２ＳＯ４」）を含有してもよい。Ｎａ２ＳＯ４溶液もまた、段階または線形勾配で、好ましくは線形で、最も好ましくは約０から約１モルの濃度勾配で適用されてよい。
【００６０】
エタネルセプトは、ＣＨＯ細胞を培養することによって得ることができる。
【００６１】
好ましい実施形態において、塩溶液はＮａＣｌを含む。
【００６２】
下記の手順に、発現、発現産物の精製および本発明の混合モードクロマトグラフィー方法により得られたエタネルセプト含有溶出液の分析のために従った。
【００６３】
エタネルセプトの発現。
エタネルセプトは、ヒトＦｃにＣ末端において融合されたヒトＴＮＦＲ細胞外ドメインをコードする遺伝子をトランスフェクトされた組換えＣＨＯ細胞の馴化培地（「ＣＭ」）において発現させる。エタネルセプトの哺乳動物発現に関する当分野における例は、下記の米国特許に見出すことができこれらは参照により本明細書に組み込まれる：ＲＥ３６７５５；米国特許第５，６０５，６９０号明細書；ＥＰ４６４，５３３；ＥＰ４１７，５６３；米国特許第８．０６３，１８２号明細書；および米国特許第７，２９４，４８１号明細書。
【００６４】
プロテインＡクロマトグラフィー。
上で得られたＣＭをプロテインＡカラムおよび１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ｒプロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能）を使用して、１０ｍＭ  ホスフェート、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０溶液により平衡化して、処理する。カラムを、１Ｍ  塩酸アルギニン（「アルギニン」）、０．１Ｍ  シトレート、ｐＨ６．０溶液で洗浄後、結合されたタンパク質を、ｐＨ４．２、３．７および３．０の１Ｍアルギニンおよび０．１Ｍシトレート含有溶液により段階的に溶出する。またはカラムは、アルギニン非含有の漸減ｐＨの０．１Ｍシトレート含有溶液により処理することができる。アルギニンの不在下で、大部分のエタネルセプトが、３．８５のｐＨで溶出され、これより低いｐＨで溶出される、混入物質および不正確に折り畳まれたエタネルセプト、エタネルセプトの断片、エタネルセプトの凝集体などを含む溶出液が提供された。プロテインＡの溶出液をその後、実施例において下記のようにＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能）において、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣまたはＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅに供する。
【００６５】
プロテインＡの溶出液の分析。
上で得られたプロテインＡの溶出液の分析を、図２Ａおよび２Ｂに示す。図２Ａは、１Ｍ  アルギニンを含有する低ｐＨバッファーによるプロテインＡからの溶出プロファイルを示す。大きなＵＶ吸光度ピークが、ｐＨ６．０（６．０とマークされたピーク）において観察され、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ（レーン１）により検査された市販のエタネルセプトに対応するバンドは含有されず（図２Ｂ、レーン４）：エタネルセプトがプロテインＡカラムを貫流しなかったことに留意されたい（レーン２および３と比較）。タンパク質のバンドはｐＨ６．０において観察されなかったが（レーン４）、観察された大きなＵＶ吸光度は顔料の溶出を示している。ベースライン吸光度に到達後（図２Ａ）、その後、カラムを０．１Ｍ  アルギニン、０．１Ｍ  シトレート、ｐＨ４．２で溶出し、鋭い溶出ピークを得た（図２Ａ、４．２のマーク）。このピークのｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ分析により、エタネルセプトの強いバンドと不鮮明な低移動度のバンドとが一緒に示された（レーン５）。溶出タンパク質のＨＩＣ分析により２つのピークが示され、第１のピークは市販のエタネルセプトの主要ピークに対応し、第２のピークもまた市販のエタネルセプト中に存在する微量種に対応する。第２のピークの本質は明らかではないが、第２のピークはプロテインＡに結合され、従ってＦｃドメインを含有するはずなので、エタネルセプトの異常に折り畳まれた種であると思われる。残りの結合タンパク質をｐＨ３．７およびその後３．０で溶出し、両方とも１Ｍ  アルギニンを含有した。これらの低ｐＨ溶媒は、図２Ａ（３．７および３．０）に示す小さいピークの溶出をもたらした。ｐＨ３．７のピークは少量のエタネルセプト（レーン６）を含有したが、ｐＨ３．０のピークは主に、異常に折り畳まれた種および凝集していると思われる種に対応する低移動度種を含有した（レーン７）。同様の溶出パターンが、アルギニンの不在下において観察された。比較的低いｐＨ、例えばｐＨ３．８５がエタネルセプトの溶出に必要であり、さらなるｐＨの低下が低移動度種の溶出をもたらした。これらの低移動度種がプロテインＡに結合したという事実は、これらもまたＦｃ融合タンパク質であったということを意味する。これらの種はエタネルセプトより低いｐＨにおいて溶出されたので、これらの種はプロテインＡにより強固に結合されていた。これらの分析により、組換えＣＨＯ細胞におけるエタネルセプトの発現が、分析ＨＩＣにより分析した場合、正確に折り畳まれた種に対応する天然（正確に折り畳まれた）エタネルセプトと、不正確に、異常に折り畳まれた種に対応する低移動度種との両方をもたらすことが確認された。異常に折り畳まれた種はＨＩＣにおいて後期に溶出されたので、異常に折り畳まれた種は天然のエタネルセプトより疎水性であるはずである。ＣＨＯクローンおよび発酵条件に依存して、正確に折り畳まれた種の量は、プロテインＡ溶出液の４０から６０重量５で変動した。下記の実施例において、混合モードクロマトグラフィーの、折り畳まれた種を異常に折り畳まれた種から分離する能力を評価する。
【００６６】
分析方法
プロテインＡ、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣおよびＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ組成物から溶出された分画は、当分野において周知のさまざまな技術、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、変性ＳＥＣ（ｄＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥなどを使用して分析可能である。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーの技術は、Ｈａｗｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０１１，２８：２３０２および／またはｖａｎ  Ｍａｒｒｓｃｈａｌｋｅｒｗｅｅｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２０１１，７８：２１３に記載されている。
【００６７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
例えば、プロテインＡ、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣおよびＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅから溶出された分画は、ドデシル硫酸ナトリウムまたはｎａｔｉｖｅポリアクリルアミドゲル電気泳動（それぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）により分析可能である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥは両方とも、６％  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能）を使用して実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ジスルフィド結合凝集体が観察できるように、非還元条件下で行った。
【００６８】
サイズ排除クロマトグラフィー。
本発明の混合モードクロマトグラフィー方法を使用して得られた溶出液分画は、周知の技術である、被検体がサイズにより分離されるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）法（Ｒｏｇｎｅｒ，Ｍ．（２０００）．Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｍ．Ｋａｓｔｎｅｒ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．６１：８９−１４５を参照されたい。）を使用して分析することができる。例えば、限定するものではないが、移動相バッファーは、５０ｍＭのリン酸一ナトリウム一水和物および１５０ｍＭ  アルギニンを含有するように調製してよい。ｐＨは、１Ｍ  ＨＣｌを使用して６．５に調整する。分離は、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  ＳＷｘｌ  ６ｍｍ×４ｃｍガードカラム（カタログ番号８５４３）を、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ４０００  ＳＷｘｌ  ７．８ｍｍ×３０ｃｍ（カタログ番号８５４２）に直線的に取り付けて使用して実施することができる。分離の実施のために、カラムを室温（２３℃）にし、移動相で流速０．５ｍＬ／分において平衡化する。５マイクロリットルの５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトを含む溶液を、オートサンプラーを使用してカラムに注入する。分離は、流速約０．５ｍＬ／分において約３０分かけて達成することができる。カラム溶出剤を、波長２８０ｎｍにおいてこの時間の間モニターした。積分は、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェア（Ｄｉｏｎｅｘ）を使用して実施可能である。積分の前に、エタネルセプトを含有しないバッファーに関するＳＥＣクロマトグラムを、すべてのクロマトグラムから差し引く。すべての積分は、１２分から２６分の保持時間の間に実施可能である。幾つかのパラメーターを使用してピークを定義する。検出ピークの最小面積を０．０５ｍＡｕ＊分に設定する。ピーク検出の２次元感受性を０．０１ｍＡｕおよび７５秒に設定する。ピークショルダーを、手動積分ツールを使用して手動で加える。すべての検出ピークを２段階で、手動で調整する。第１に、ピークのベースライン（ピークの底部境界）を水平に調整する。第２に、ピークベースラインの垂直位置を、クロマトグラムのベースラインの垂直位置に調整する。クロマトグラムベースライン値を、被検体不在下のシグナルとして定義する。被検体不在下のシグナルを、１２分の保持時間におけるｍＡｕの吸光度として定義する。
【００６９】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）分析は、１．８から０Ｍの硫酸アンモニウム勾配を使用して、Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｒ）において実施することができる。ＨＩＣクロマトグラフィーは、米国特許第７，２９４，４８１号明細書（１９列、４９−５５行を参照されたい。）に記載の様式で実施することもできる。米国特許第７，１５７，５５７号明細書；Ｃｈｅｎ  Ｊ，Ｔｅｔｒａｕｌｔ  Ｊ，Ｌｅｙ  Ａ．（２００８）Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．１１７７，２７２−８１；Ｇａｇｎｏｎ  Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｕｎｄ  Ｅ．（１９９６）ＢｉｏＰｈａｒｍ，９，５４−６４；およびＬｕ，Ｙ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｒ．Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｉｎ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈもまた参照されたい。
【００７０】
本発明の混合モードクロマトグラフィー方法に従って生産されたエタネルセプト調製物のＨＩＣ分析に関して、本明細書に参照により組み込まれた米国特許第７，２９４，４８１号明細書の図４が、３つのピークが存在するエタネルセプト調製物のＨＩＣクロマトグラムを含有し、このうちの（４８１特許において「ピーク２」と認定された）最も大きいピークは、適切に折り畳まれたエタネルセプト融合タンパク質を表すピークとして開示され；（４８１特許において「ピーク３」と認定された）より小さいピークは、特許所有者により「ごちゃまぜの（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）」（即ち、本考察において不正確に折り畳まれたと同意語であると考えられる）エタネルセプトならびに凝集されたエタネルセプトを含有すると仮定される（米国特許第７，２９４，４８１号明細書の２２列、１３−６６行およびこれらの図５を参照されたい。）ことに留意されたい。本発明の有意な有利性は、並外れて高純度なエタネルセプト含有調製物を、商業的に魅力的な収率で、「４８１特許」の図４および図５に示され、不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むと考えられるＨＩＣクロマトグラムの「ピーク３」が、実質的に低下または基本的に排除可能に提供する能力である。
【００７１】
本発明は、医薬製剤に使用するための高純度のエタネルセプトが、本発明の方法を使用して得られる、エタネルセプトの医薬製剤をさらに対象とする。本発明の製剤は、バッファー、張度調節剤、賦形剤、医薬として許容されるキャリアおよび医薬組成物の活性成分に一般的に使用される他の成分もまた含むことができる。分かりやすくするために、本出願の後部でさらに十分に述べる。
【００７２】
バッファーは、ｐＨを所望の範囲に維持する。適切なバッファーとしては、ヒスチジン、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウムまたはクエン酸カリウム、マレイン酸、酢酸アンモニウム、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（トリス）、アセテートおよびジエタノールアミンのさまざまな形態が挙げられる。製剤中のバッファーの濃度は、好ましくは約１ｍＭから約１Ｍの間、より好ましくは約１０ｍＭから約２００ｍＭの間である。バッファーは当分野において周知であり、公知の方法により製造され、商業的供給業者から入手可能である。
【００７３】
適切なバッファーの例としては、ホスフェート、ヒスチジン、シトレート、マレート、タータレート、スクシネート、アセテート、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（トリス）、ビカーボネートが挙げられる。
【００７４】
好ましい実施形態において、バッファーはリン酸ナトリウムである。
【００７５】
好ましい実施形態において、医薬組成物のｐＨは、生理学的レベルまたはこれに近い。従って、好ましくは、提供される組成物のｐＨは、約５．８から約８．４の間であり、さらにより好ましくは約６．２から約７．４の間である。当業者は、特定の製剤におけるエタネルセプトの安定性および溶解度を最大化するために必要であれば、ｐＨが調整されてもよいことを理解するものと思われる。従って、生理学的範囲外のｐＨのエタネルセプト製剤であっても、患者にとって容認できれば本発明の範囲内である。
【００７６】
張度調節剤は、溶液の浸透圧に寄与する分子である。医薬製剤の浸透圧は、好ましくは、活性成分の安定性を最大化および／または患者に対する投与の不快感の最小化のために調整される。医薬組成物が血清と等張である、即ち、同じまたは同様の浸透圧を有することが一般的に好ましく、これは張度調節剤の添加により達成される。
【００７７】
好ましい実施形態において、提供される製剤の浸透圧は、約１８０から約４２０ｍＯｓＭである。しかし、浸透圧は、特定の条件が必要とされる場合、より高くても、またはより低くても、どちらでもよいことは理解されるべきである。
【００７８】
浸透圧の調節に適切な張度調節剤としては、限定するものではないが、アミノ酸（アルギニンは含まない。）（例えば、システイン、ヒスチジンおよびグリシン）、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよびクエン酸ナトリウム）および／または糖類／ポリオール（例えば、スクロース、グルコースおよびマンニトール）が挙げられる。
【００７９】
好ましい張度調節剤は、グリシン、アラニン、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび硫酸ナトリウムである。
【００８０】
好ましい実施形態において、製剤中の張度調節剤の濃度は、好ましくは約１ｍＭから約１Ｍの間、より好ましくは約１０ｍＭから約２００ｍＭの間である。張度調節剤は当分野において周知であり、公知の方法により製造され、商業的供給業者から入手可能である。
【００８１】
化学的添加剤、共溶質または共溶媒とも称される、溶液（乾燥または凍結形態においても）中でポリペプチドを安定化させる賦形剤もまた、医薬組成物に添加可能である。賦形剤は当分野において周知であり、公知の方法により製造され、商業的供給業者から入手可能である。
【００８２】
適切な賦形剤の例としては、限定するものではないが、糖類／ポリオール、例えばスクロース、ラクトース、グリセロール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルトース、イノシトール、トレハロース、グルコース；ポリマー、例えば、血清アルブミン（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒトＳＡまたは組換えＨＡ）、デキストラン、ポリ（ビニルアルコール）ＰＶＡ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレンイミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）；非水性溶媒、例えばＰＥＧならびにグリセロールおよびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）；アミノ酸、例えば、プロリン、Ｌ−セリン、グルタミン酸ナトリウム、アラニン、グリシン、塩酸リジン、サルコシンおよびガンマ−アミノ酪酸；界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）−８０（ポリソルベート８０）、Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）−２０（ポリソルベート２０）、ＳＤＳ、ポリソルベート、ポロキサマー；ならびに種々雑多な賦形剤、例えば、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、トリメチルアミンＮ−オキシド、ベタイン、金属イオン（例えば、亜鉛、カルシウムおよびマグネシウム）、ＣＨＡＰＳ、モノラウレート、２−Ｏ−ベータ−マンノグリセレートまたは上記の任意の組み合わせが挙げられる。
【００８３】
好ましい賦形剤は、スクロース、ラクトース、グリセロール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルトース、イノシトール、トレハロース、グルコース、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えアルブミン、デキストラン、ＰＶＡ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレンイミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ＰＥＧ、エチレングリコール、グリセロール、アラニン、グリシン、塩酸リジン、サルコシン、ＳＤＳ、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、トリメチルアミンＮ−オキシド、ベタイン、亜鉛イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ＣＨＡＰＳ、スクロースモノラウレートおよび２−Ｏ−ベータ−マンノグリセレートである。
【００８４】
本発明の製剤中の１以上の賦形剤の濃度は、好ましくは約０．００１から５重量％の間、より好ましくは約０．１から２重量％の間である。
【００８５】
所望であれば、本発明に従って調製されるエタネルセプト調製物は、現在市販のＥｎｂｒｅｌが供給されている同じ製剤に使用でき、このような製剤は、約２５から約７５ｍｇ／ｍｌ製剤を含み、スクロース、塩化ナトリウム、Ｌ−塩酸アルギニンおよびリン酸ナトリウムをさらに含む。
【００８６】
または、本発明に従って得られるエタネルセプト調製物は、アルギニンを含有しない医薬製剤；例えば、Ｍａｎｎｉｎｇ  ｅｔ ａｌ．仮出願ＵＳＳＮ６１／５４８，５１８および６１／６６９４８０それぞれ２０１１年１０月１８日および２０１２年７月９日出願に記載の非アルギニン製剤のいずれかに供給することもでき、当該特許は両方とも参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００８７】
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物を治療する方法であり、本発明の医薬組成物の治療有効量を哺乳動物に投与するステップを含み、該哺乳動物が、エタネルセプトにより有益に治療され得る疾患または障害を有する方法を提供する。
【００８８】
好ましい実施形態において、エタネルセプトは、組成物により治療される哺乳動物と同じ哺乳動物種に由来する。
【００８９】
好ましい実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００９０】
提供される組成物により治療可能な疾患または障害としては、限定するものではないが、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、ウェゲナー病（肉芽腫症）、クローン病（または炎症性腸疾患）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、Ｃ型肝炎、子宮内膜症、ぜんそく、悪液質、乾癬およびアトピー性皮膚炎が挙げられる。本発明の組成物により治療可能な追加の疾患または障害としては、ＷＯ００／６２７９０、ＷＯ０１／６２２７２、米国特許出願第２００１／００２１３８０号明細書、および米国特許第７，６４８，７０２号明細書に記載の疾患または障害が挙げられ、当該特許の関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９１】
提供される医薬組成物は、治療を必要とする対象に全身的注射により、例えば静脈内注射により；または関連部位への注射または適用により、例えば、直接注射または部位が手術において露出される場合、部位に直接適用により；または局所適用により投与することができる。
【００９２】
一実施形態において、本発明は、関節リウマチの治療および／または予防の方法であり、これらを必要とする哺乳動物に、提供されるエタネルセプト組成物の１つの治療有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【００９３】
提供される組成物中のエタネルセプトの治療有効量は、治療される病態、病態の重症度、先行する療法ならびに患者の臨床歴および治療薬への応答に依存するものと思われる。適切な用量は、主治医の判断に従って調整することができ、患者に一回で投与しても、または連続する投与にわたってもよい。
【００９４】
一実施形態において、有効なエタネルセプト量／成人用量は、１−５００ｍｇ／ｍ２、または約１−２００ｍｇ／ｍ２、または約１−４０ｍｇ／ｍ２または約５−２５ｍｇ／ｍ２である。
【００９５】
または、固定用量を投与してもよく、この量は、２−５００ｍｇ／用量、２−１００ｍｇ／用量または約１０−８０ｍｇ／用量の範囲であってよい。
【００９６】
用量が週に複数回投与されるべき場合、例示的用量範囲は、前述の用量範囲と同じであるかこれより低く、１回あたりの用量範囲が２５−１００ｍｇ／用量で、週に２回以上投与されることが好ましい。
【００９７】
別の実施形態において、注射による投与のための許容される用量は、８０−１００ｍｇ／用量を含有し、または８０ｍｇ／用量を含有する。
【００９８】
用量は、毎週、隔週、または数週間（例えば２から８）に分けて投与することができる。
【００９９】
一実施形態において、エタネルセプトは２５から７５ｍｇ／ｍｌで、単回皮下（ＳＣ）注射により投与される。
【０１００】
場合により患者の病態の改善が、約１００ｍｇまでの医薬組成物用量を１から３回／週で少なくとも３週の期間にわたって投与することによって得られると思われる。より長期の治療が、所望の程度の改善を誘導するために必要と思われる。不治の慢性病態に関して、レジメンを無期限に続けることができる。小児科患者（年齢４−１７）に関しては、適切なレジメンは、０．４ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇのエタネルセプトの用量を、１回または複数回／週投与することを伴うことができる。
【０１０１】
別の実施形態において、本発明の医薬製剤はバルク製剤で調製することができ、従って医薬組成物の成分は、投与に必要な量より高く調整され、投与の前に適切に希釈される。
【０１０２】
医薬組成物は、単独療法として、または必要に応じて追加の療法と組み合わせて投与することができる。従って、一実施形態において、治療および／または予防の提供される方法は治療有効量の別の活性薬剤の投与と組み合わせて使用される。他の活性薬剤は、本発明の医薬組成物の投与の前、この間または後に投与することができる。別の活性薬剤は、提供される組成物の一部、または別々の製剤としてのどちらで投与されてもよい。
【０１０３】
提供される医薬組成物の投与は、非経口、経口、バッカル、経鼻、直腸、腹腔内、皮内、経皮、皮下、静脈内、動脈内、心臓内、心室内、頭蓋内、気管内、髄腔内投与、筋肉内注射、硝子体内注射および局所適用を含む、さまざまな方法で達成可能である。
【０１０４】
本発明の医薬組成物は、非経口投与、即ち、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、脳脊髄内、関節内、関節滑液嚢内および／または、髄腔内に特に有用である。非経口投与は、ボーラス注射または連続注入によるものであってよい。注射用医薬組成物は、単位投薬形態、例えばアンプルまたは複数回投与容器で、保存料を添加して提供することができる。加えて、数多くの最近の薬剤送達の取り組みが開発されており、本発明の医薬組成物は、これらの新しい方法、例えばＩｎｊｅｃｔ−ｅａｓｅ（Ｒ）、Ｇｅｎｊｅｃｔ（Ｒ）、注射器ペン、例えばＧｅｎＰｅｎ（Ｒ）ならびに無針装置、例えばＭｅｄｉＪｅｃｔｏｒ（Ｒ）およびＢｉｏＪｅｃｔｏｒ（Ｒ）を使用する投与に適切である。本発明の医薬組成物は、現在は発見されていない投与方法にも適合可能である。さらにＬａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１５２７−１５３３を参照されたい。
【０１０５】
提供される医薬組成物は、デポー製剤としても製剤化可能である。このような長期作用製剤は、埋め込み（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与することができる。従って、例えば製剤は、適切なポリマー材料または疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョン）により、またはイオン交換樹脂、もしくは難溶性誘導体、例えば難溶性塩として改変されてもよい。
【０１０６】
医薬組成物は、所望であれば、活性成分を含有する１以上の単位投薬形態を含有できるバイアル、パックまたはディスペンサー装置で提供されてもよい。一実施形態において、ディスペンサー装置は、即時注射の単回用量の液体製剤を有する注射器を含み得る。注射器は、投与のための取り扱い説明書を伴ってよい。
【０１０７】
別の実施形態において、本発明は、本発明の水性医薬組成物を含有するキットまたは容器に関する。水性医薬組成物中のポリペプチドの濃度は、広範囲にわたって変動し得るが、一般的に、約０．０５から約２０，０００マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）の水性製剤の範囲内である。キットもまた、使用のための取り扱い説明書を伴ってよい。
【０１０８】
本発明を、下記の実施例においてより具体的に記載するが、この中の数多くの改変および変形が当業者には明らかであると思われるので、下記の実施例は単に例示の意図である。添付書類Ａは、本発明のさらなる代表的実施形態を提供する。
【実施例】
【０１０９】
［実施例１］
ＮａＣｌ溶出を使用するＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ混合モード精製
この実施例において、上記のように得られたプロテインＡ溶出液をＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィーに供する。Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムを、５ｍＭシトレート、ｐＨ４．５溶液により平衡化する。５ｍＭシトレートによるプロテインＡ溶出液の適切な希釈（例えば、プロテインＡステップの溶出バッファーに依存して３から６倍希釈）が、カラムへの完全な結合をもたらす。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で示されたように、負荷試料（ｐＨ４．２、プロテインＡ溶出液）は高度に異種性であり、タンパク質はＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムを貫流しない。結合されたタンパク質をその後、１０ｍＭ  ホスフェート中０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５溶液で溶出し、これによりｐＨ（４．５から７．５）およびＮａＣｌ濃度（０から０．１５Ｍ）の同時変化をもたらす。正確に折り畳まれたエタネルセプトを含有する鋭い溶出ピークが、溶出液の分析から観察された。しかし、回収は約４０−５０％であった。このような溶出ステップの後で、残りの結合タンパク質材料を含有する樹脂を、１０ｍＭ  ホスフェート中０．３Ｍ  ＮａＣｌおよび１Ｍ  アルギニン、ｐＨ７．５溶液と接触させ、これにより主に異常に折り畳まれた種およびジスルフィド結合凝集体を含有する溶出がもたらされる。この実施例は、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣが、異常に折り畳まれた種を正確に折り畳まれた種から分離するために有効であることを実証している。異常に折り畳まれた種が、より高い塩濃度（０．３Ｍ対０．１Ｍ）において溶出されるという事実は、これらがより強い静電相互作用をカラムとの間に有することを意味する。加えて、１Ｍ  アルギニンは、異常に折り畳まれた、およびさらに凝集されたタンパク質の溶出をさらに増加させ、これらのタンパク質が静電相互作用だけでなく、疎水性相互作用によってもＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣに結合されていること、およびアルギニンが静電相互作用および疎水性相互作用の両方の崩壊を強化することを示している。この実施例において得られた溶出液分画の分析を、図３Ａおよび３Ｂに提示する。
【０１１０】
［実施例２］
ＮａＣｌを使用するＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ混合モード精製
ｐＨ７．５に平衡化された樹脂
前述の実施例において、正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質溶液を、まずｐＨ４．５においてＣＡＰＴＯ  ＭＭＣ樹脂と接触させた。この実施例において、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムをまず、１０ｍＭ  ホスフェート、ｐＨ７．５溶液で平衡化させ、その後ＮａＣｌ、次いでアルギニンにより溶出した場合、実施例１において観察された溶出と同様の溶出が観察される。具体的には、このｐＨ平衡化の間にエタネルセプトは溶出されない。エタネルセプトはｐＨ７．５において負に帯電しており、エタネルセプトのｐＩは、重度のグリコシル化のため４．９から５．４の範囲なので、この結果は予想外である。従って、ｐＨ４．５以下において、エタネルセプトは正に帯電し、負に帯電したＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣリガンドに結合するはずであるが、疎水性相互作用が結合に寄与可能である。ｐＨ７．５において、負に帯電したエタネルセプトは負に帯電したＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣから解離しなければならないが、これが起こらないことが見出される。これは、負に帯電したカラムとエタネルセプトとの間の静電反発力を圧倒する、エタネルセプトとＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣとの間の疎水性相互作用により説明することができる。または、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣは、タンパク質部分の局所正電荷（タンパク質部分のｐＩは約８．１である。）に結合することによって、結合タンパク質を保持することができる。
【０１１１】
［実施例３］
溶出のためにＮａＣｌ勾配を使用するＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ混合モード精製
この実施例において、ＮａＣｌ濃度勾配を使用する溶出の達成が成功した。具体的には、１０ｍＭ  ホスフェート、ｐＨ７．５溶液によりカラムを洗浄後、結合タンパク質は、０から０．５Ｍの線形塩勾配により溶出された。負荷試料（ｐＨ４．２プロテインＡ溶出液）は、先の場合と同様に極めて異種性であり（正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトの両方を含有する。）、結合タンパク質は、ＮａＣｌ勾配の漸増イオン強度により溶出される。１８０分後、勾配は終了し、塩濃度は０．５Ｍに至り、これによりタンパク質溶出はわずかに強化された。後続の分析により決定されるように、低塩分画はより多くの正確に折り畳まれたエタネルセプトを含有し、高塩分画は低移動度（異常に折り畳まれた、および凝集された）種に富んでいた。最終的に、残りのタンパク質は１Ｍ  アルギニン、１０ｍＭ  ホスフェート、ｐＨ７．５溶液で溶出される。この分画はエタネルセプトを含有せず、完全に低移動度（異常に折り畳まれた／凝集された）種を含有する。樹脂の予備平衡と組み合わせた、異なるプロテインＡ溶出液についてのＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣのＮａＣｌ勾配溶出の使用は、正確に折り畳まれたエタネルセプトに関してより純粋な溶出液をもたらす。溶出媒体中低ＮａＣｌ濃度において、溶出された試料は折り畳まれたエタネルセプトに富んでいる。異常に折り畳まれた種は、上記の塩勾配が樹脂に適用されると、溶出液中に徐々に増加する。塩勾配の完了後、樹脂を１Ｍ  アルギニン溶液と接触させ、これによりもたらされた溶出液分画が、その後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で明らかなように、異常に折り畳まれた種（異常に折り畳まれただけでなく凝集された種も含む。）を含有することが見出される。低移動度種の幾つかは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて不正確に折り畳まれた（しかし凝集されていない）エタネルセプトであると考えられ、異常に折り畳まれた種の一部が、正確に折り畳まれたエタネルセプトホモ二量体よりｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにおいて遅い移動度を有する、異常に折り畳まれたエタネルセプトホモ二量体として移動することを示している。この実施例において得られた溶出液分画の分析を、図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃに提供する。
【０１１２】
［実施例４］
溶出のためにＮａ２ＳＯ４勾配を使用するＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ混合モード精製
この実施例において、混合モード樹脂からの正確に折り畳まれたエタネルセプト溶出のための塩勾配として、ＮａＣｌの代わりにＮａ２ＳＯ４勾配を使用する。ＮａＣｌはＩＥＣにおいてタンパク質を溶出するために、概して排他的に使用されるが、さまざまな塩が、さまざまな程度の塩析（タンパク質の沈殿）効果を有することが一般に公知である。ＮａＣｌは、ＭｇＣｌ２などの塩溶塩とＮａ２ＳＯ４などの塩析塩との中間物である。ＮａＣｌは、エタネルセプトとＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣとの間の静電相互作用を弱めるために有効であると思われるが、疎水性相互作用を弱めるためには中立であり得る。Ｎａ２ＳＯ４もまた、静電相互作用を弱めるために有効であるが、Ｎａ２ＳＯ４は強力な塩析塩として公知なので、疎水性相互作用も強化するはずであると本明細書において考えられた。従って、上記のように低移動度種が疎水性相互作用によりカラムに結合されている場合、これらの溶出は、Ｎａ２ＳＯ４により抑制することができる。このことを、正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含有するタンパク質溶液を、１０ｍＭ  ホスフェート、ｐＨ７．５溶液によるＣＡＰＴＯ  ＭＭＣ樹脂カラムのｐＨ平衡化の後で、０から０．４Ｍの間のＮａ２ＳＯ４勾配により溶出することによって試験する。タンパク質のＮａ２ＳＯ４勾配溶出が完了後、カラムを、１Ｍ  アルギニン、ｐＨ７．５溶液で洗浄する。図５Ａは、溶出クロマトグラムを示すが、図５Ｂは、溶出分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを示す。正確に折り畳まれたエタネルセプトの比較的鋭いバンドが、低Ｎａ２ＳＯ４分画において観察され（レーン６および７、図５Ｂ）、これらの分画の純度は負荷（レーン１）より高い。より高いＮａ２ＳＯ４濃度により、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにおいて低移動度種の溶出がもたらされる（レーン８および９、図５Ｂ）。最終のｐＨ７．５における１Ｍ  アルギニン溶出は、低移動度（異常に折り畳まれた／凝集された）種の溶出をもたらす。この分画中にエタネルセプトがいくらか存在すると思われ（レーン１０、図５Ｂ）、Ｎａ２ＳＯ４もまた、天然のエタネルセプトの溶出を抑制可能であることを示している。Ｎａ２ＳＯ４は、折り畳まれた種を異常に折り畳まれた種から分離するために、少なくとも同等に有効であるが、天然のエタネルセプトの保持を引き起こし得る（レーン１０）と結論付けることができる。
【０１１３】
［実施例５］
ＮａＣｌおよびｐＨ勾配による溶出を使用するＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ混合モード精製
先行する実施例において、ｐＨ平衡化ステップ、即ち４．５（５ｍＭシトレート）から７．５（１０ｍＭ  ホスフェート）へのｐＨ変化の間にタンパク質の溶出は観察されない。タンパク質負荷量が１０ｍｇ／１ｍｌカラムを超えて増加される場合は、もはや当てはまらない。ｐＨ変化の間のタンパク質溶出の増加は、負荷量の増加において起こるが、この観察の理由は明らかではない。この溶出試料の純度は、負荷試料より高いが、低塩分画よりはるかに低い。例えば、負荷試料（プロテインＡ溶出液）がわずか５１％の正確に折り畳まれたエタネルセプト種を含有する場合、ｐＨ平衡化の間に起こる溶出はわずか６５％純粋であり、負荷よりは高いが、低塩分画よりはるかに低く、一方、上記の実施例における塩溶出は、分析的ＨＩＣにより決定した場合、塩勾配の開始時に９６％の純度を得ることができる（図６）。図６にプロットしたように、溶出分画の純度は、塩濃度の上昇とともに、９６％から２０％に徐々に低下し、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ（図３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ）に関するｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果と一致する。１Ｍ  アルギニン分画の（正確に折り畳まれたエタネルセプトに関する）純度は低く（わずか１１％）、これもまたｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ分析と一致した（図４Ｂ、レーン９および図５Ｂ、レーン１０を参照されたい。）。前述の観察を考慮し、本明細書において具体化された発見に関連して、より大きなタンパク質負荷のためのカラムｐＨ平衡の間、任意の正確に折り畳まれた種の潜在的喪失に対抗するために、ｐＨ勾配と塩勾配との組み合わせが有益であり得ると仮定する。従って、この実施例５の以下において、本方法の上で定義されたステップ（ｂ）を実施する場合、ｐＨ勾配を塩勾配と組み合わせる。この実施例において、少量の適切に折り畳まれたエタネルセプトは、混合モード樹脂カラムの初期のｐＨ平衡の間に不必要に溶出され得る可能性は、ｐＨ変化と塩勾配とを組み合わせることによって相殺される。具体的には、結合タンパク質は、ｐＨおよびＮａＣｌ濃度両方の同時勾配、即ち、カラムを、ＮａＣｌを含有する、５ｍＭ  シトレート、ｐＨ４．５溶液から１０ｍＭ  ホスフェート、ｐＨ７．５溶液で展開することにより溶出される、これにより、ｐＨおよび塩濃度の両方の同時変化がもたらされ、両方が、結合タンパク質の溶出を引き起こす。これは、低移動度種が、後期分画（即ち、より高いｐＨおよび塩濃度）および最終１Ｍ  アルギニン、ｐＨ７．５による洗浄で溶出されたという点で、ｐＨ平衡が観察された後の塩溶出プロファイルと同様である。例えば、プロテインＡ溶出液（２４ｍｇ）は、ｐＨ４．５においてカラムに結合され、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する、５ｍＭ  シトレート、ｐＨ４．５から１０ｍＭ  ホスフェート、ｐＨ７．５への勾配により溶出される。ｐＨ平衡によるこの大量の負荷は、ｐＨ移行の間に結合タンパク質の溶出をもたらし得ると仮定される。ｐＨおよび塩勾配の間の溶出プロファイルは、実際に、勾配の開始時に小型のピークを示し、勾配の中間において、主要なピーク（所望の正確に折り畳まれたエタネルセプト）を示す。観察された小型のピークは、ｐＨ平衡が最初にｐＨ／塩勾配なしで実施された場合、観察された溶出に対��すると思われる。ＮａＣｌ／ｐＨ勾配溶出が完了後、その後、カラムを、低移動度種に対応する最終の鋭いピークをもたらす、１Ｍ  アルギニン溶液によるさらなる溶出に供する。早期溶出の低塩および低ｐＨ分画はエタネルセプトに富んでおり、一方、高塩および高ｐＨ分画は、低移動度種の溶出を示し、ｐＨは４．５から７．５、例えば、塩濃度の中間においてｐＨ４．１−５．１および勾配の終わりにはｐＨ６．６に徐々に上昇した。１Ｍ  アルギニン、ｐＨ７．５溶液による最終洗浄は、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにおいて不鮮明なバンドを示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて複数のバンドを示し、１０ｍＭ  ホスフェート、ｐＨ７．５洗浄による、ｐＨ移行を引き起こす初期カラム平衡化後にもたらされる溶出と、基本的に同一である。プール中の適切に折り畳まれたエタネルセプトの回収は約７０％であった。同様の結果が、溶出を、１０ｍＭ  ホスフェート、ｐＨ７．５溶液までの同じｐＨ／塩勾配であるが、０．２５Ｍ  ＮａＣｌを含有するより低い塩において終了して実施した場合に得られる。より低い塩濃度を使用するこの勾配は、収率約５０％のエタネルセプトの不完全な溶出をもたらす。先行する実施例のように、大きなピークが１Ｍ  アルギニン洗浄により観察され、低移動度（異常に折り畳まれた／凝集された）エタネルセプト種に対応する。この実施例において得られた溶出液の分析を、図７Ａおよび７Ｂに提示する。
【０１１４】
［実施例６］
溶出のために、Ｎａ２ＳＯ４／ｐＨ勾配を使用するＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ混合モード精製
上記の実施例５に使用した手順と同様の手順で、ｐＨ／塩勾配溶出を、最終溶媒として０．５Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４溶液を使用して実施したが、これは、折り畳まれた種の、異常に折り畳まれたから種からの分割を改善すると考えられる。プール中のエタネルセプトの回収は約５０％であり、回収の低さは、０．５Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４による疎水性相互作用の強化のためと考えられ、１Ｍ  アルギニン洗浄において主に溶出される異常に折り畳まれた種の保持だけでなく、エタネルセプトの保持ももたらし、エタネルセプトは、１Ｍ  アルギニン洗浄においても出現した。従って、Ｎａ２ＳＯ４の使用は、異常に折り畳まれた種の、正確に折り畳まれた種からの分離（即ち、分割）を強化できるが、さらに、エタネルセプトの回収を低下させもする。この実施例の溶出液の分析のために、図８Ａおよび８Ｂを参照されたい。
【０１１５】
［実施例７］
Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ；ｐＨ７．５およびｐＨ４．５におけるＮａＣｌによる溶出
この実施例において、正確に、および不正確に折り畳まれたエタネルセプト種の両方を含むプロテインＡ溶出液を、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅを混合モード樹脂として使用する混合モードクロマトグラフィーに供する。正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたエタネルセプト種を含むタンパク質溶液の結合を、ｐＨ７．５において実施した。ｐＨ７．５においてエタネルセプトは負に帯電し、従って、正に帯電したＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅのリガンドに結合するはずである。ｐＨ４．２のプロテインＡ溶出液を１０ｍＭ  ホスフェート、ｐＨ７．５溶液に対して透析した場合、タンパク質の結合は完了するが、塩単独（ｐＨ７．５において）による溶出は、無効であることが見出されており、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅは大幅に疎水性であることを示唆している。従って、エタネルセプトのｐＩは４．９−５．４であるので、より低い溶出ｐＨ、おそらくｐＨ４．５において、エタネルセプト種は正に帯電しており、従って、ｐＨ４．５において正に帯電しているＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ樹脂に反発することが考えられる。この可能性を、エタネルセプト種の、ｐＨ４．５におけるＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅからの溶出を実施することにより調査する。ｐＨ４．２の（ｐＨ７．５に対して透析されている）プロテインＡ溶出液を、１０ｍＭホスフェート、ｐＨ７．５溶液で平衡化されたＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅに結合させる。タンパク質の負荷後、カラムを、同じバッファー中の０および０．２Ｍ  ＮａＣｌで洗浄し、これらの洗浄においてタンパク質は溶出していない。
【０１１６】
［実施例８］
Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ；ｐＨ４．５における、アルギニンを使用する／使用しない溶出
実施例７の結果を考慮すると、その後、結合タンパク質はアルギニンを含む、および含まない５ｍＭ  シトレート、ｐＨ４．５溶液で溶出される。この実施例において、ＮａＣｌの代わりにアルギニンを使用して、より多くの疎水性種（アルギニン）が溶出に影響を与える様式を、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅリガンドの疎水性特質を考慮して調査する。低移動度（異常に折り畳まれた／凝集された）種と一緒に正確に折り畳まれたエタネルセプトが、５ｍＭ  シトレート、ｐＨ４．５洗浄溶液（アルギニンを含有しない。）により溶出されることが見出されている。この分画中の低移動度種の溶出は、この分画の測定ｐＨは３．０であったので、突然のｐＨ変化による可能性がある。このステップを、５ｍＭ  シトレート、ｐＨ４．５中０．１および０．２Ｍ  アルギニン溶液により反復する場合、正確に折り畳まれたエタネルセプトは取るに足らない量だけが観察される。正確に折り畳まれたエタネルセプトの完全な溶出には０．５Ｍ  アルギニンが必要とされるが、この溶出液は、望ましくない量の低移動度種を含む。従って、ｐＨ４．５であっても、低濃度のアルギニンは無効であり、より高いアルギニン濃度においても、折り畳まれた、および異常に折り畳まれた種の間の十分な分割はもたらされないことが見出される。この実施例において得られた溶出液の分析に関して図９を参照されたい。
【０１１７】
［実施例９］
Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ；２種のアルギニン勾配および７．５から４．５のｐＨ勾配による溶出
次いで、ｐＨ／アルギニン勾配の組み合わせが、適切に折り畳まれた、および異常に折り畳まれた種の間のより優れた分割をもたらし得ると仮定する。ＣＡＰＴＯ  ＭＭＣに関する先行する実施例に見られるように、５ｍＭ  シトレートを使用する７．５から４．５へのｐＨ平衡の間のｐＨ降下は、ｐＨの同時勾配を適用することによって防止でき、ｐＨの同時勾配はその後、アルギニン濃度勾配と併用することが可能である（例えば、１０ｍＭ  ホスフェート、ｐＨ７．５からアルギニンを含有する５ｍＭ  シトレート、ｐＨ４．５への勾配）。２種のアルギニン勾配を、このｐＨ勾配により調査した。０．２５Ｍ  アルギニンへのアルギニン勾配の場合（図１０Ａおよび１０Ｂ）、最終の０．５Ｍ  アルギニン洗浄により、低移動度種およびエタネルセプトの両方の溶出がもたらされることが見出され、わずか０．２５Ｍ  アルギニンのアルギニン濃度への勾配の使用は、正確に折り畳まれたエタネルセプトの完全な溶出には不十分であることを示している。従って、０−０．５Ｍのアルギニン勾配（上記の７．５から４．５へのｐＨ勾配と併用）を調査した（図１１Ａおよび１１Ｂ）。その後のｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ分析により、相対的ピーク高さが最終１Ｍ  アルギニン洗浄より低く、アルギニン勾配が、先行する０．２５Ｍ  アルギニン勾配より大きいことが明らかである。第２のピークは観察されず、分割が損なわれたことを示唆している。ｐＨ勾配は、溶出分画のｐＨが７．５から６．０、５．７、５．２および最終的に４．５に徐々に低下するものである。０．５Ｍ  アルギニンおよびｐＨ勾配に関しては、主要な溶出ピークの２つの分画が正確に折り畳まれたエタネルセプトに富んでおり、タンパク質の回収は約６５％である。勾配の後期は、エタネルセプトを含有する不鮮明なバンドを示した。従って、０．５Ｍ  アルギニン勾配と一緒にｐＨ勾配が、結合されたエタネルセプトの溶出を強化したが、正確に折り畳まれたエタネルセプトは、アルギニン／ｐＨ勾配の後期に異常に折り畳まれた種と共溶出された。最終１Ｍ  アルギニン洗浄は、不鮮明なバンドだけを示した。
【０１１８】
［実施例１０］
Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ；アルギニン勾配および７．５から４．５へのｐＨ勾配による溶出
アルギニン勾配による溶出を、ｐＨ７．５においてＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣプールを使用して実施する。結合タンパク質を、１０ｍＭ  ホスフェート、ｐＨ７．５から０．６Ｍ  アルギニン、１０ｍＭ  ホスフェート、ｐＨ７．５への勾配により溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥプロファイルにより、中間の分画（０．２−０．４Ｍ  アルギニン）において正確に折り畳まれたエタネルセプトの溶出が示される（図１３）。両方のゲルにおいて見られるように、低移動度種が後期分画および最終１Ｍ  アルギニンｐＨ７．０洗浄において観察される。比較のため、ｐＨ７．５の勾配溶出において０．６Ｍ  アルギニンを０．５Ｍ  ＮａＣｌと置き換えた場合、エタネルセプトの溶出は大幅に減少した。図１４は、０．５Ｍ  ＮａＣｌへの塩勾配の間のｐＨ７．５における溶出プロファイルを示す。勾配の間に２つのピークが観察され、主にエタネルセプトを含有したが、収率は低かった。大量のエタネルセプトが、最終１Ｍ  アルギニン洗浄において溶出し、０．５Ｍ  ＮａＣｌの塩濃度とｐＨ７．５との併用は、正確に折り畳まれたエタネルセプトの、異常に折り畳まれた／凝集された材料からの分離には最適ではなかったことが示された。上記のように、１Ｍ  アルギニンは、正確に折り畳まれたエタネルセプトの溶出に非常に有効であるが、低移動度種の存在を伴った。塩溶出勾配を改変して、約０から約１Ｍ  ＮａＣａｌの勾配に適用して、ｐＨ８において溶出を実施することは、実施例１２に示すように、このような勾配の早期溶出産物において正確に折り畳まれたエタネルセプトを、高い低移動度（異常に折り畳まれた／凝集された）種に対して非常に良く分割することに留意されたい。Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅに結合するエタネルセプトの疎水性基寄与は、ｐＨ８．０において減少し、ＮａＣｌ単独による正確に折り畳まれたエタネルセプトの有効な溶出をもたらすと思われる。
【０１１９】
［実施例１１］
Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ；ｐＨ７．５におけるアルギニン／Ｎａｃｌ勾配による溶出
この実施例において、ＮａＣｌ／アルギニン勾配の組み合わせをｐＨ７．５において調査した。２種のこのような勾配を調査した：溶出媒体に関して調査される第１の勾配は、最終ＮａＣｌおよびアルギニン濃度がそれぞれ０．４および０．２である。最終ＮａＣｌおよびアルギニン濃度が、それぞれ、０．２５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．５Ｍ  アルギニンである第２の勾配を、その後調査する。両方の場合において、勾配は、１０ｍＭ  ホスフェート、ｐＨ７．５溶液に適用される。第１の勾配は疎水性相互作用を低下させるためにはまだ弱く、従って、エタネルセプトを溶出できなかった。最終１Ｍ  アルギニン洗浄におけるより小さいピークにより示されるように、第２の勾配はより有効であった。特に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認されたように、エタネルセプトの溶出は、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  アルギニンまでの第２の被験勾配の全体を通して起こり、高分子量（低移動度／異常に折り畳まれた／凝集された）種は含まれない。この高分子量種はその後、最終１Ｍ  アルギニン洗浄において溶出される。ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにおいて、大部分の天然の正確に折り畳まれたエタネルセプトが、中間分画に溶出されたことが示される。不鮮明なバンドが、１Ｍ  アルギニン洗浄により観察された。従って、アルギニンおよびＮａＣｌの組み合わせが、エタネルセプトの溶出および異常に折り畳まれた種に対応する低移動度および高分子量の種の分離をもたらし得ることが明らかである。Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣプール（６０−８０％純粋）に関するＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ分画のＨＩＣ分析は、勾配の間に溶出された分画（尾部分画を除き）が、通常９５％を超える純度を得ることを示している。この実施例において得られた溶出液の分析を、図１５Ａおよび１５Ｂに提示する。
【０１２０】
［実施例１２］
Ｃａｐｔｏ（商標）ＡｄｈｅｒｅおよびＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ
この実施例において、正確に折り畳まれた、および異常に折り畳まれたエタネルセプトを含むプロテインＡ溶出液を、上記のプロテインＡ方法と同様の方法により得た。次いで、溶出液をＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣｅカラムに適用し、産物プールをその後Ｃａｐｔｏ（商標）ＡＤＨＥＲＥカラムに適用して、定量的および定性的両方において優れたエタネルセプト産物を提供した。
【０１２１】
ステップ１。細胞増殖（Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｏｎ）。
当分野において公知の様式で生産バイオリアクターへの植菌に十分な数の細胞を産生するために必要な細胞増殖を、エタネルセプト融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞のクローンを使用して実施する。この発現工程の産物（回収細胞培養流体）は、正確に折り畳まれたエタネルセプトならびに不正確に折り畳まれた、および／または凝集されたエタネルセプトを追加の不純物と併せた混合物をもたらす。このようなタンパク質混合を含む回収細胞培養流体を、洗浄剤ウイルス不活性化に供する。
【０１２２】
ステップ２。
アフィニティークロマトグラフィー。アフィニティークロマトグラフィーを、上記のステップ１において得られた回収細胞培養液に対して、従来のプロテインＡアフィニティーカラムを使用して周知の様式で実施する。産物の回収はおよそ８５％である。得られた産物は、正確に折り畳まれたエタネルセプト、不正確に折り畳まれたエタネルセプトならびに／または正確に、および／もしくは不正確に折り畳まれたエタネルセプトの凝集体またはタンパク質断片を含む複合タンパク質混合物である。このプロテインＡアフィニティーカラム精製ステップから得られた産物をｐＨ３．５に調整し、次いで、ウイルス不活性化ステップに供した。ウイルス不活性化後、産物をｐＨ５．５に調整し、その後さらに公知の様式で市販のカプセルフィルターを使用して清澄化する。
【０１２３】
ステップ３Ａ。
混合モードカチオン交換クロマトグラフィー。３１．８Ｌ（直径４５ｃｍ×ベッド高さ２０ｃｍ）の充填済みベッドＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣクロマトグラフィーカラムを使用して、上記のステップ２において得られた産物を精製する。使用前に、カラムを、２ＣＶの２５ｍＭ  アセテート  ｐＨ５．５で平衡化し、２ＣＶの０．１Ｎ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＣｌで衛生化し、２ＣＶの２５ｍＭアセテート、０．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５で中和する。次いでこのカラムを、８−１０ＣＶの２５ｍＭ  アセテート  ｐＨ５．５で、流出液がｐＨ５．５および３．５ｍＳ／ｃｍになるまで平衡化する。上記のステップ２によるプロテインＡプールを、≦６ｍＳ／ｃｍにＷＦＩで希釈し、各サイクルに関してカラム負荷１５ｇ／Ｌ媒体まで適用する。カラムを２００ｃｍ／時の線速度で操作して、滞留時間を６分にする。負荷後、カラムを、２ＣＶの２５ｍＭ  アセテート  ｐＨ５．５で洗浄する。産物をその後、８．５ＣＶ、１５％から８５％の勾配の２５ｍＭ  アセテート  ｐＨ５．５から２５ｍＭ  アセテート、０．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５で溶出する。産物の収集を、０．１５ＯＤ（Ａ２８０、路程１．０ｃｍ）において開始して、収集を最大ピークの５０％において終了する。溶出液体積はおよそ５ＣＶである。残留産物および混入物は、２ＣＶの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  １Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０でカラムから取り除き、廃棄する。混合モードカラムにより得られた産物は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｃａｐ  ＸＬ１０、０．２２μｍ  Ｄｕｒａｐｏｒｅカプセルフィルター（０．６９ｍ２）を使用してろ過する。このステップにより得られた産物は、ステップ２で得られたプロテインＡ材料の約７０％の回収を表す。
【０１２４】
ステップ３Ｂ。
混合モードアニオン交換クロマトグラフィー。２７．０Ｌ（直径４５ｃｍ×ベッド高さ１７ｃｍ）の充填済みベッドＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーカラムを使用して、上記のステップ３Ａで得られた産物をさらに精製する。使用前に、カラムを、２ＣＶの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で平衡化し、２ＣＶの０．１Ｎ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＣｌで衛生化し、２ＣＶの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で中和および平衡化する。産物の負荷前に、カラムを、３ＣＶの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で平衡化する。上記のステップ３ＡによるＣａｐｔｏ  ＭＭＣプールを、約０．０４５ｋｇの１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３／ｋｇプールでｐＨ８．１に調整する。上のステップ３Ａによる産物を、ＷＦＩによりインラインで１：３．８に希釈し、伝導率を１２．０ｍＳ／ｃｍおよびｐＨ８．０に調整した。得られた材料を、その後１５ｇ／Ｌ媒体までのカラム負荷に適用する。カラムを、線速度１７０ｃｍ／時で操作して、滞留時間を６分にする。負荷後、カラムを、２ＣＶの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で洗浄する。次いで、産物を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０の１０ＣＶ勾配（２０％から９０％）から１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０で溶出する。産物の収集を０．１５ＯＤ（Ａ２８０、路程１．０ｃｍ）において開始し、収集をピーク最大値の２５％で終了する。溶出液体積は４−６ＣＶである。溶出産物を、市販のカプセルフィルターを使用してろ過し、その後、公知の様式でウイルスろ過およびタンジェンシャルフローろ過ステップに供する。ステップ３Ｂ（最終のウイルスろ過およびタンジェンシャルフローろ過ステップを含む。）による全産物回収は、およそ６８％であった。ろ過ステップ前に測定された産物回収は約７５％であった。このステップから溶出分画において得られたＨＩＣデータの概略図を、図１２に表す。
【０１２５】
分析：
この実施例において得られた最終ろ過産物は、ＨＩＣにより決定した場合、約９０重量％を超える正確に折り畳まれたエタネルセプト；ＨＩＣにより決定した場合、５重量％未満の不正確に折り畳まれたエタネルセプト種；ＨＩＣ分析により約３重量％未満のクリップされた材料（これらのＴＮＦＲ部分が切断されている、エタネルセプトの断片であると考えられる。）およびサイズ排除クロマトグラフィーにより決定して９５重量％を超える正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの総量を有することが見出されている。
【０１２６】
タンパク質結合が塩析条件の存在下で起こったという事実は、疎水性相互作用が、エタネルセプトとＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣおよびＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅとの結合に関係しない可能性を示唆しており、ＨＩＣと疎水性タンパク質との結合は、通常強力な塩析を必要とすると考えられる。しかし、疎水性相互作用は、タンパク質とこれらの混合モード樹脂との間の静電相互作用の存在下で容易になると思われる。従って、いずれの特定の理論にも縛られることを望むものではないが、エタネルセプトと混合モード樹脂との結合は、塩析条件の不在下であっても、静電および疎水性相互作用両方のモードを介して媒介され得る。分析的ＨＩＣは、低濃度の硫酸アンモニウムにおいて溶出される、異常に折り畳まれた種が、折り畳まれた種より疎水性であることを明確に示している。折り畳まれた、および異常に折り畳まれた種は両方とも、同一の静電特性を有し、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣまたはＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅリガンドの荷電基と同等に良く結合すると推測され、異常に折り畳まれた種のより強力な疎水性寄与が、これらを混合モード樹脂に強固に結合させる可能性があり、従って、先行する実施例において観察されるように、異常に折り畳まれた種に対してより強力な溶出条件を必要とする。Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣに関しては、これはより高い塩濃度において達成可能であるが、これは疎水性相互作用を有意に強化するためには十分ではないが、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣと、正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれた種両方との間のさらなる静電相互作用を破壊するためには十分であると思われる。対照的に、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅは、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣより疎水性であると思われ、アルギニン、またはより高い塩濃度およびより高いｐＨを、正確に折り畳まれた種を溶出するために必要とする。より高いアルギニン濃度またはより厳しい条件が異常に折り畳まれた種を溶出するために必要である。
【０１２７】
本発明は、「異常に折り畳まれた」または「不正確に折り畳まれた」または「不適切に折り畳まれた」という用語を同じ意味で使用するが、混合モード樹脂が、異常に折り畳まれた種を含有することが見出されている、同じ溶出分画中の凝集された種の除去に有効であることが見出されているという点で、これらの用語は、凝集された種もまた包含することを意図される。実際には、エタネルセプトは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて見られるように、ジスルフィド結合オリゴマーを形成する。このようなオリゴマーは、１Ｍ  アルギニン洗浄で大部分が溶出され、樹脂とのこれらのより強力な疎水性相互作用を示している。従って、エタネルセプトに関しては、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣおよびＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅの両方が、異常に折り畳まれた、および凝集された種の同時除去をもたらし得ると思われる。異常に折り畳まれた材料および凝集体の除去は、共有結合性であっても、または非共有結合性であっても、（正確に折り畳まれていても、または不正確に折り畳まれたていても）凝集体材料の免疫原性の可能性のため、より安全なバイオ医薬品を提供するために非常に望ましい。
【０１２８】
先行する実施例におけるアルギニンの効果に関して、アルギニン（塩酸アルギニン）が、塩として機能するだけではなく、疎水性相互作用を弱めるために機能することが明白である。アルギニンは、タンパク質の凝集および表面吸着を抑制することが当分野において公知である。加えて、アルギニンは、芳香族基と相互作用し、これによってタンパク質間、またはタンパク質と表面との間の、芳香族−芳香族または芳香族−カチオンの相互作用に干渉する。Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣおよびＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅは両方とも芳香族基を保有し、この芳香族基がタンパク質結合に寄与できる。このようなモードの結合が、アルギニンにより有効に崩壊できるが、ＮａＣｌでは崩壊できないことは予測鎖不可能であった。アルギニンはまた、脂肪酸間の相互作用を弱め、芳香族基により媒介されない疎水性相互作用を崩壊できることを示唆している。機序として明確に理解されていないが、アルギニンの疎水性特質は、従って、タンパク質−タンパク質相互作用および表面吸着の調節ならびに混合モード樹脂からのタンパク質溶出において重要な役割を果たし得る。しかし、上の実施例１２に示すように、本発明を実施して、極めて高純度なエタネルセプト調製物を提供するために、アルギニンの使用は必ずしも必要ではない。これはおそらく、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣおよびＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ樹脂の、タンパク質結合に対する弱い疎水性寄与のためである。にもかかわらず、ＮａＣｌと組み合わせたアルギニンの使用は、タンパク質に対する混合モードクロマトグラフィーの回収および分割を改善することができる。
【０１２９】
添付書類Ａ
さらなる代表的実施形態
（優先出願ＵＳＳＮ６１／６９９，５５２に開示）
Ａ．正確に折り畳まれたタンパク質を、不正確に折り畳まれたタンパク質から分離するための混合モードクロマトグラフィー方法であって、
（ａ）所与のタンパク質の正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれた立体構造両方を含む第１のタンパク質混合物を、イオン交換部分および疎水性部分の両方を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させるステップ；
（ｂ）正確に折り畳まれたタンパク質を混合モード樹脂から溶出し、第１のタンパク質混合物より高い割合の正確に折り畳まれたタンパク質を含む第２のタンパク質混合物を得るステップ、
を含む方法。
【０１３０】
Ｂ．混合モードクロマトグラフィー樹脂がＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ混合モードクロマトグラフィー樹脂である、実施形態Ａの方法。
【０１３１】
Ｃ．混合モードクロマトグラフィー樹脂がＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ混合モードクロマトグラフィー樹脂である、実施形態Ａの方法。
【０１３２】
Ｄ．正確に、および不正確に折り畳まれたタンパク質の立体構造が、正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含む、実施形態Ａ−Ｃのいずれかの方法。
【０１３３】
Ｅ．不正確に折り畳まれたエタネルセプトが、ステップ（ｂ）において得られた溶出液の約１０重量％未満、好ましくは約５重量％未満を構成し、正確に折り畳まれたエタネルセプトが、ステップ（ｂ）において得られた溶出液の約９０重量％より多く、好ましくは約９５重量％より多くを構成し、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの総量が、ステップ（ｂ）において得られた溶出液の少なくとも約９５重量％、好ましくは少なくとも約９８重量％を構成する、実施形態Ｄの方法。
【０１３４】
Ｆ．混合モード樹脂が、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣであり、本方法のステップ（ａ）および（ｂ）が、約４．５から約７．５の間のｐＨにおいて実施され、溶出ステップ（ｂ）が、混合モード樹脂を塩溶液と接触させることによって実施される、実施形態ＡからＥの方法。
【０１３５】
Ｇ．混合モード樹脂がＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅであり、ステップ（ａ）および（ｂ）が、約４．５から約８．５の間のｐＨにおいて実施され、溶出ステップ（ｂ）が混合モード樹脂を塩溶液と接触させることによって実施され、前記溶液が場合によりアルギニンをさらに含む、実施形態ＡからＥのいずれかの方法。
【０１３６】
Ｈ．塩溶液が、ステップ（ｂ）において勾配により適用され、これによって塩濃度が徐々に上昇する、実施形態ＦまたはＧの方法。
【０１３７】
Ｉ．ステップ（ｂ）の塩濃度勾配が、約０から約１Ｍの塩濃度で上昇する、実施形態Ｈの方法。
【０１３８】
Ｊ．塩が、塩化ナトリウムおよび硫酸ナトリウムから選択される、実施形態ＦからＩのいずれかの方法。
【０１３９】
Ｋ．ステップ（ｂ）の間に、ステップ（ｂ）において樹脂に接触させる溶液のｐＨが徐々に変化する、実施形態ＡからＪのいずれかの方法。
【０１４０】
Ｌ．ｐＨが徐々に上昇する、実施形態Ｋの方法。
【０１４１】
Ｍ．ｐＨが徐々に低下する、実施形態Ｋの方法。
【０１４２】
Ｎ．ステップ（ｂ）の溶出液中に得られた正確に折り畳まれたタンパク質の量が、ステップ（ａ）において樹脂に導入されたタンパク質混合物中に存在するタンパク質の量の少なくとも約６０重量％である、実施形態ＡからＭのいずれかの方法。
【０１４３】
Ｏ．正確に折り畳まれたタンパク質の量が、ステップ（ａ）において樹脂に導入されたタンパク質混合物中に存在するタンパク質の量の少なくとも約７０重量％である、実施形態Ｎの方法。
【０１４４】
Ｐ．少なくとも９０重量％の正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび好ましくは約５重量％未満の不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質混合物が、
（１）好ましくはプロテインＡクロマトグラフィー精製ステップを含む、１以上の精製ステップであって、該ステップがエタネルセプト系タンパク質を含有する回収細胞培養流体を精製するために用いられ、該精製ステップが、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトから明確に分離しない、１以上の精製ステップ、
（２）実施形態１に記載の混合モードクロマトグラフィーステップ（ａ）および（ｂ）；ならびに
（３）単に分析目的で実施されるＳＥＣ、ＨＩＣまたは他の分析的クロマトグラフィーステップ、
以外の、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離するための如何なるクロマトグラフィー分離または精製ステップも実施せずに、または実施の必要なく得られる、実施形態ＡからＯのいずれかの方法。
【０１４５】
Ｑ．ステップ（ｂ）の溶出液中に存在するタンパク質の量が、Ａ２８０におけるＵＶ吸光度により決定され、ステップＢ溶出液中の正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が疎水性相互作用クロマトグラフィーにより決定され、ならびにステップ（ｂ）の溶出液中に存在する正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの総量が、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定される、実施形態ＡからＰのいずれかの方法。
【０１４６】
Ｒ．タンパク質混合物中に存在する正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離するために、前記混合物を精製するための混合モードクロマトグラフィー方法であり、
（ａ）疎水性部分およびイオン交換部分を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂を、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトが、混合モードクロマトグラフィー樹脂に固定、結合または捕捉されるように、正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質混合物を含有する溶液と接触させるステップ；ならびに
（ｂ）該混合モード樹脂を、エタネルセプトタンパク質を混合モードクロマトグラフィー樹脂から溶出できる溶液と接触させ、溶出液を得、溶出液中の正確に折り畳まれたエタネルセプトの、不正確に折り畳まれたエタネルセプトに対する量の比が、ステップ（ａ）において樹脂に導入されたタンパク質混合物の比より大きいステップ、
を含む方法。
【０１４７】
Ｓ．混合モードクロマトグラフィー樹脂が、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ混合モードクロマトグラフィー樹脂である、実施形態Ｒの方法。
【０１４８】
Ｔ．混合モードクロマトグラフィー樹脂が、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ混合モードクロマトグラフィー樹脂である、実施形態Ｒの方法。
【０１４９】
Ｕ．
（Ａ）不正確に折り畳まれたエタネルセプトが、ステップ（ｂ）において得られた溶出液の約５重量％未満を構成し、正確に折り畳まれたエタネルセプトが、ステップ（ｂ）において得られた溶出液の約９０重量％より多くを構成し、ならびに正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの総量が、ステップ（ｂ）において得られた溶出液の少なくとも約９５重量％を構成する、または
（Ｂ）ステップ（ｂ）において得られた溶出液もしくはこれらの一部が、正確に折り畳まれたエタネルセプトを含み、不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含まない、もしくは基本的に含まない、実施形態ＡからＴの方法。
【０１５０】
Ｖ．混合モード樹脂がＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣであり、本方法のステップ（ａ）および（ｂ）が、約４．５から約７．５の間のｐＨにおいて実施され、溶出ステップ（ｂ）が、混合モード樹脂を塩溶液と接触させることによって実施される、実施形態ＡからＵのいずれかの方法。
【０１５１】
Ｗ．混合モード樹脂がＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅであり、ステップ（ａ）および（ｂ）が、約４．５から約８．５の間のｐＨにおいて実施され、溶出ステップ（ｂ）が混合モード樹脂を塩溶液と接触させることによって実施され、前記溶液が場合によりアルギニンをさらに含む、実施形態ＲからＶのいずれかの方法。
【０１５２】
Ｘ．塩溶液が、ステップ（ｂ）において勾配により適用され、これによって塩濃度が徐々に上昇する、実施形態ＶまたはＷの方法。
【０１５３】
Ｙ．ステップ（ｂ）の塩濃度勾配が、約０から約１Ｍの塩濃度で上昇する、実施形態Ｘの方法。
【０１５４】
Ｚ．塩が、塩化ナトリウムおよび硫酸ナトリウムから選択される、実施形態ＶからＹのいずれかの方法。
【０１５５】
ＡＡ．ステップ（ｂ）の間に、ステップ（ｂ）において樹脂に接触させる溶液のｐＨが徐々に上昇、または徐々に低下する、実施形態ＲからＺのいずれかの方法。
【０１５６】
ＢＢ．ステップ（ｂ）の溶出液中に得られた正確に折り畳まれたタンパク質の量が、ステップ（ａ）において樹脂に導入されたタンパク質混合物中に存在するタンパク質の量の少なくとも約６０重量％、好ましくは少なくとも約７０重量％である、実施形態ＲからＡＡのいずれかの方法。
【０１５７】
ＣＣ．該方法が、
第１の混合モード分離（分離番号１）を、ステップ（ａ）および（ｂ）を実施することによって実行し、次に、
第２の混合モード分離（分離番号２）を、ステップ（ａ）および（ｂ）を再度実施することにより実行し、
分離番号１のステップ（ｂ）において得られた溶出液を、分離番号２のステップ（ａ）において、タンパク質混合物を含む溶液として使用する、
方法を２回以上実行する、実施形態ＡからＢＢのいずれかの方法。
【０１５８】
ＤＤ．分離番号１において使用される混合モード樹脂が、分離番号２において使用される混合モード樹脂と同じである、または異なる、実施形態ＣＣの方法。
【０１５９】
ＥＥ．分離番号１および分離番号２が、下記の組み合わせ：
分離番号１がＣＡＰＴＯ  ＭＭＣを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、
分離番号２がＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する；
分離番号１がＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、
分離番号２がＣＡＰＴＯ  ＭＭＣを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する；
分離番号１がＣＡＰＴＯ  ＭＭＣを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、
分離番号２がＣＡＰＴＯ  ＭＭＣを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する；または
分離番号１がＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、
分離番号２がＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する；
から選択される方法で実施される、実施形態ＤＤの方法。
【０１６０】
ＦＦ．分離番号１および分離番号２が、下記の様式：分離番号１がＣＡＰＴＯ  ＭＭＣを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、分離番号２がＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する、において実施される、実施形態ＥＥの方法。
【０１６１】
ＧＧ．実施形態ＡからＦＦのいずれかの方法により得られる、エタネルセプト含有タンパク質混合物または前記混合物を含む医薬として許容される製剤であり、前記タンパク質混合物が、正確に折り畳まれたエタネルセプトをタンパク質混合物の約９０重量％より多くを構成する量で含み、不正確に折り畳まれたエタネルセプトをタンパク質混合物の約５重量％未満を構成する量で含み、タンパク質混合物が、エタネルセプト含有タンパク質混合物の少なくとも約９５、好ましくは少なくとも約９８重量％を構成する、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの総量を有する、エタネルセプト含有タンパク質混合物または前記混合物を含む医薬として許容される製剤。
【０１６２】
ＨＨ．ＴＮＦアルファ媒介性病態の治療を必要とする対象への投与に適切な、高純度のエタネルセプトを含む医薬として許容される製剤であり、主要量の正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび微量の不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質混合物を含有し、
（ｉ）不正確に折り畳まれたエタネルセプトが、タンパク質混合物の約１０重量％未満、好ましくは約８重量％未満、最も好ましくは約５重量％未満を構成し；
（ｉｉ）正確に折り畳まれたエタネルセプトが、タンパク質混合物の９０重量％より多く、好ましくは約９２重量％より多く、好ましくは約９５重量％より多くを構成し、
（ｉｉｉ）正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの合計量（ただし、これらの凝集体は含まない。）が、タンパク質混合物の少なくとも９５重量％、好ましくは少なくとも９８重量％を構成し、
該製剤が、対象への投与に適切な製剤をもたらす医薬として許容される不活性成分、賦形剤またはキャリアをさらに含む、
医薬として許容される製剤。
【０１６３】
ＩＩ．エタネルセプト調製物が、製剤の約２５から約７５ｍｇ／ｍｌを構成し、該製剤が、スクロース、塩化ナトリウム、塩酸Ｌ−アルギニンおよびリン酸ナトリウムをさらに含む、実施形態ＨＨの製剤。
【０１６４】
ＪＪ．正確に折り畳まれたエタネルセプト対不正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が高純度で存在するエタネルセプト含有タンパク質混合物を生産する方法であって、
（１）エタネルセプトを哺乳動物発現系において発現させ、正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトの両方を含むエタネルセプト含有タンパク質混合物を含有する回収細胞培養流体を得るステップ；
（２）ステップ１において得られた回収細胞培養流体を精製工程に供し、これによってステップ（１）において生産された回収細胞培養流体中に存在する望ましくない不純物の量が減少した、または実質的に不純物を含まないエタネルセプト含有タンパク質混合物を得るステップ；
（３）ステップ（２）において得られたエタネルセプト含有タンパク質混合物を、イオン交換部分および疎水性相互作用部分の両方を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂と、混合物中に含有されるタンパク質を樹脂に固定するために１回以上接触させるステップ；ならびに
（４）ステップ３によりこの上に結合されたタンパク質を有する樹脂と、正確に折り畳まれたエタネルセプトを混合モード樹脂から溶出する溶液とを接触させ、ステップ３において樹脂に導入されたエタネルセプト含有混合物よりも、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトに対して高い割合で有する、エタネルセプト含有タンパク質混合物を含む溶出液を得るステップ；
を含み、ここで；
（ｉ）ステップ２の精製により得られたエタネルセプト含有タンパク質混合物中に存在するタンパク質の量が、ステップ１において得られた回収細胞培養流体中に存在するエタネルセプト系タンパク質混合物の量の少なくとも約８０重量％であり；
（ｉｉ）ステップ４において溶出されたタンパク質混合物中に存在する正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトタンパク質の総量が、ステップ２から得られたタンパク質混合物中に存在するこれらの量の少なくとも約６０重量％であり；
（ｉｉｉ）ステップ４の溶出液中に存在する正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が、ステップ１において得られた回収細胞培養流体中に存在するエタネルセプト含有タンパク質混合物の量の少なくとも約３０重量％、好ましくは少なくとも約３５重量％であり、ならびに
（ｉｖ）前記正確に折り畳まれたエタネルセプトが、ステップ４において得られた溶出液の少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％を構成する、
方法。
【０１６５】
ＫＫ．混合モード樹脂が、ＣＡＰＴＯ  ＭＭＣおよびＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥからなる群から選択される、実施形態ＪＪの方法。
【０１６６】
ＬＬ．下記の追加ステップ：
ステップ（５）：ステップ４の溶出液中に得られたタンパク質混合物を、イオン交換部分および疎水性相互作用部分の両方を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂と接触させ、混合物中に含有されるタンパク質を樹脂に固定するステップ、ならびに次に、
ステップ（６）：前記樹脂を、正確に折り畳まれたエタネルセプトをそれから溶出する溶液と接触させ、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトに対して高い割合で有するタンパク質混合物を含む溶出液を得るステップ、を含み、
前記追加ステップ５および６に使用される混合モード樹脂がステップ３および４に使用される混合モード樹脂と同じである、または異なる、
実施形態ＪＪまたはＫＫの方法。
【０１６７】
ＭＭ．ステップ（３）および（４）において使用される混合モード樹脂が、ＣＡＰＴＯ  ＭＭＣであり、ステップ（５）および（６）において使用される樹脂がＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥである、実施形態ＬＬの方法。
【０１６８】
ＮＮ．ステップ４（および／または実施形態ＬＬの場合、ステップ６）が、正確に折り畳まれたエタネルセプトを混合モード樹脂から溶出するために、混合モード樹脂を塩溶液と接触させるステップにより実施され、場合により、（ｉ）溶液と樹脂との前記接触ステップの間に、ステップ（４）または（６）において、塩溶液の濃度が徐々に上昇し、場合により、（ｉｉ）溶液と樹脂との前記接触ステップの間に、溶出溶液のｐＨがステップ（４）および／または（６）において、徐々に上昇または低下する、実施形態ＪＪからＭＭのいずれかの方法。
【０１６９】
ＯＯ．本方法のステップの１つ以上において得られる産物を、ろ過、例えば、ウイルスろ過および／またはタンジェンシャルフローろ過に供する、実施形態ＪＪからＮＮのいずれかの方法。
【０１７０】
ＰＰ．ステップ２が、プロテインＡクロマトグラフィーカラムを使用して実施される、実施形態ＪＪからＯＯのいずれかの方法。
【０１７１】
ＱＱ．ステップ２が、疎水性部分およびイオン交換部分を有する混合モード樹脂を使用して実施される、実施形態ＪＪからＯＯのいずれかの方法。
【０１７２】
ＲＲ．少なくとも９０重量％の正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび好ましくは約５重量％未満の不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質混合物が、下記の１以上：
（１）場合により、好ましくはプロテインＡクロマトグラフィー精製ステップを含む、１以上の精製ステップであって、該ステップがエタネルセプト系タンパク質を含有する回収細胞培養流体を精製するために用いられ、該精製ステップが、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離しない、１以上の精製ステップ、
（２）実施形態Ａ（または実施形態ＬＬによるステップ３、４、５および６）に列挙した混合モードクロマトグラフィーステップ（３）および（４）の前記１以上の事象；ならびに
（３）場合により、単に分析目的で実施される１以上のＳＥＣ、ＨＩＣまたは他のクロマトグラフィーステップ、
以外の、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離するための如何なるクロマトグラフィー分離または精製ステップも実施せずに得られる、実施形態Ａ−ＰＰのいずれかの方法。
【０１７３】
ＳＳ．単に分析目的で実施する場合を除き、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離する手段として単一モード疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用を排除する、実施形態ＡからＲＲのいずれかの方法。
【０１７４】
ＴＴ．ＴＮＦ媒介性疾患を患う対象を治療する方法であり、対象個体に、正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質混合物を含有する医薬製剤を投与し、前記混合物が実施形態ＡからＳＳのいずれかの方法により得られ、タンパク質混合物中の不正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が、前記混合物の約５重量％未満であるステップを含む、方法。
【０１７５】
ＵＵ．タンパク質混合物中の不正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が前記混合物の約３重量％未満であり、混合物中の正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が前記混合物の約９５重量％より多い、実施形態ＴＴの方法。
【０１７６】
ＶＶ．ＴＮＦ媒介性疾患を患う対象を治療する方法であり、対象個体に、正確に折り畳まれたエタネルセプトおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含むタンパク質混合物を含有する医薬製剤を投与し、タンパク質混合物中の不正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が、前記混合物の約５重量％未満であるステップを含む、方法。
【０１７７】
ＷＷ．タンパク質混合物中の不正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が前記混合物の約３重量％未満であり、混合物中の正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が該混合物の約９５重量％より多い、実施形態ＴＴ−ＶＶの方法。
【０１７８】
ＸＸ．正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプト（これらの凝集体を除く）の総量が、前記混合物の少なくとも約９５重量％である、実施形態ＴＴ−ＶＶのいずれかの方法。
【０１７９】
ＹＹ．正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプト（これらの凝集体を除く）の総量が前記混合物の少なくとも約９８重量％である、実施形態ＸＸの方法。
【０１８０】
ＺＺ．「不正確に折り畳まれたエタネルセプト」という用語が、特に他のことが明記されない限り、正確に折り畳まれたおよび／または不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含む凝集体を含むと理解される、実施形態ＡからＹＹのいずれかの方法または組成物。
【０１８１】
ＡＡＡ．ステップ１の回収細胞培養液中に含有されるエタネルセプト系タンパク質の量が、Ｆｃ  ｅｌｉｓａにより決定される、実施形態ＪＪからＱＱの方法。
【０１８２】
ＢＢＢ．ステップ４（または実施形態ＬＬの場合、ステップ４および６）において混合モード樹脂から得られた溶出液中に存在するエタネルセプト系タンパク質の量が、Ａ２８０においてＵＶ吸光度により決定される、実施形態ＪＪ−ＱＱのいずれかの方法。
【０１８３】
ＣＣＣ．ステップ２の精製工程から得られる産物中に存在するエタネルセプト系タンパク質の量が、Ａ２８０においてＵＶ吸光度により、またはＦｃ  ｅｌｉｓａにより決定される、実施形態ＢＢＢの方法。
【０１８４】
ＤＤＤ．正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離するための方法であり、このような分離を達成するためにクロマトグラフィー手段が使用され、該クロマトグラフィー手段が、混合モードクロマトグラフィー単独からなる、または基本的にこれからなり、該混合モードクロマトグラフィーにおいて、正確に折り畳まれた、および不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含む混合物を、イオン交換部分および疎水性部分を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂と接触させ、そこから溶出し、少なくとも約８５、好ましくは少なくとも約９０、最も好ましくは少なくとも約９５重量％の正確に折り畳まれたエタネルセプトを含む溶出液を得る、方法。
【０１８５】
ＥＥＥ．混合モード樹脂がＣＡＰＴＯ  ＭＭＣおよびＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥから選択され、溶出が塩溶液により実施され、場合により漸増塩濃度勾配が使用され、塩溶液のｐＨが約４から約８．５の範囲であり、場合により、ｐＨが徐々に上昇または低下する勾配で適用され、溶出液が、一定期間かけて樹脂から得られ、前記期間中の早期に収集された溶出液が、不正確に折り畳まれたエタネルセプトを含まない、または基本的に含まない、実施形態ＤＤＤの方法。
【図１】
2019038817.tif 000005
【図２Ａ】
2019038817.tif 000006
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
2019038817.tif 000008
【図３Ｂ】
2019038817.tif 000009
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2019038817.tif 000011
【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2019038817.tif 000013
【図５Ｂ】
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【図６】
2019038817.tif 000015
【図７Ａ】
2019038817.tif 000016
【図７Ｂ】
2019038817.tif 000017
【図８Ａ】
2019038817.tif 000018
【図８Ｂ】
2019038817.tif 000019
【図９】
2019038817.tif 000020
【図１０Ａ】
2019038817.tif 000021
【図１０Ｂ】
2019038817.tif 000022
【図１１Ａ】
2019038817.tif 000023
【図１１Ｂ】
2019038817.tif 000024
【図１２】
2019038817.tif 000025
【図１３】
2019038817.tif 000026
【図１４】
2019038817.tif 000027
【図１５Ａ】
2019038817.tif 000028
【図１５Ｂ】
2019038817.tif 000029
【図１６】
2019038817.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月9日(2018.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正確に折り畳まれたエタネルセプトを、不正確に折り畳まれたエタネルセプトから分離するための混合モードクロマトグラフィー方法であって、
（ａ）エタネルセプトの正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれた両方の立体構造を含む第１のエタネルセプト含有タンパク質混合物を、イオン交換部分および疎水性部分の両方を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂に結合させるステップであって、混合モードクロマトグラフィー樹脂が、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ混合モードクロマトグラフィー樹脂またはＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ混合モードクロマトグラフィー樹脂であるステップ；
（ｂ）正確に折り畳まれたエタネルセプトを、混合モード樹脂を塩溶液と接触させることにより混合モード樹脂から溶出し、第１のエタネルセプト混合物より高い割合の正確に折り畳まれたエタネルセプトを含む第２のエタネルセプト含有タンパク質混合物を得るステップであって、塩溶液が段階的にまたは０から１Ｍの線形濃度勾配にて適用されるステップ
を含む方法であって、
不正確に折り畳まれたエタネルセプトが、ステップ（ｂ）において得られた溶出液の１０重量％未満を構成し、正確に折り畳まれたエタネルセプトが、ステップ（ｂ）において得られた溶出液の９０重量％より多くを構成し、ならびに正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの総量が、ステップ（ｂ）において得られた溶出液の少なくとも９５重量％を構成し；
ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）が４．５から８．５の間のｐＨにおいて実施され、ならびに前記塩溶液が場合によりアルギニンをさらに含み；および
単に分析目的で実施する場合を除き、疎水性相互作用クロマトグラフィーステップの使用を排除する、方法。
【請求項２】
混合モードクロマトグラフィー樹脂が、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ混合モードクロマトグラフィー樹脂である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）の間に、ステップ（ｂ）において樹脂に接触させる塩溶液のｐＨが変化する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
正確に折り畳まれたタンパク質の量が、ステップ（ａ）において樹脂に導入されたタンパク質混合物中に存在するタンパク質の量の少なくとも７０重量％である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
ステップ（ｂ）の溶出液中に存在するタンパク質の量が、Ａ２８０におけるＵＶ吸光度により決定され、ステップ（ｂ）の溶出液中の正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより決定され、ならびにステップ（ｂ）の溶出液中に存在する、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの総量が、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定される、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
第１の混合モード分離（分離番号１）を、ステップ（ａ）および（ｂ）を実施することによって実行し、次に、
第２の混合モード分離（分離番号２）を、ステップ（ａ）および（ｂ）を再度実施することにより実行し、
分離番号１のステップ（ｂ）において得られた溶出液を、分離番号２のステップ（ａ）において、タンパク質混合物を含有する溶液として使用する
方法を２回以上実行する、方法。
【請求項７】
分離番号１において使用される混合モード樹脂が、分離番号２において使用される混合モード樹脂と同じである、または異なる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、
分離番号１および分離番号２が、下記の組み合わせ：
分離番号１がカチオン交換体を含む混合モードクロマトグラフィー樹脂を混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、
分離番号２がアニオン交換体を含む混合モードクロマトグラフィー樹脂を混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する；
分離番号１がアニオン交換樹脂を含む混合モードクロマトグラフィー樹脂を混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、分離番号２がＣＡＰＴＯ  ＭＭＣを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する；
分離番号１がＣＡＰＴＯ  ＭＭＣを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、
分離番号２がＣＡＰＴＯ  ＭＭＣを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する；または
分離番号１がＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、
分離番号２がＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する；
から選択される方法で実施される、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、
分離番号１および分離番号２が、下記：分離番号１がＣＡＰＴＯ  ＭＭＣを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用し、分離番号２がＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥを混合モードクロマトグラフィー樹脂として使用する；方法においてで実施される、方法。
【請求項１０】
正確に折り畳まれたエタネルセプト対不正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が高純度で存在するエタネルセプト含有タンパク質混合物を生産するインビトロの方法であって、
（１）エタネルセプトをインビトロの哺乳動物発現系において発現させ、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトの両方を含むエタネルセプト含有タンパク質混合物を含有する回収細胞培養流体を得るステップ；
（２）ステップ１において得られた回収細胞培養流体を精製工程に供し、これによってステップ（１）において生産された回収細胞培養流体中に存在する望ましくない不純物の量が減少した、または実質的に不純物を含まないエタネルセプト含有タンパク質混合物を得るステップ；
（３）ステップ（２）において得られたエタネルセプト含有タンパク質混合物を、イオン交換部分および疎水性相互作用部分の両方を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂と、混合物中に含有されるタンパク質を樹脂に固定するために１回以上接触させるステップであって、混合モードクロマトグラフィー樹脂が、ＣＡＰＴＯ  ＭＭＣおよびＣＡＰＴＯ  ＡＤＨＥＲＥからなる群から選択されるステップ；ならびに
（４）ステップ３によりこの上に結合されたタンパク質を有する樹脂と、正確に折り畳まれたエタネルセプトを混合モード樹脂から溶出する溶液とを接触させ、ステップ３において樹脂に導入されたエタネルセプト含有混合物よりも、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトに対して高い割合で有する、エタネルセプト含有タンパク質混合物を含む溶出液を得るステップであって、塩溶液が塩化ナトリウム、硫酸ナトリウムまたはアルギニンを含む塩溶液であり、塩溶液が段階的にまたは０から１Ｍの線形濃度勾配にて適用されるステップ；
を含み、
ステップ４が４．５から８．５のｐＨで実施され、
ここで；
（ｉ）ステップ２の精製により得られたエタネルセプト含有タンパク質混合物中に存在するタンパク質の量が、ステップ１において得られた回収細胞培養流体中に存在するエタネルセプト系タンパク質混合物の量の少なくとも８０重量％であり；
（ｉｉ）ステップ４において溶出されたタンパク質混合物中に存在する、正確に折り畳まれたおよび不正確に折り畳まれたエタネルセプトタンパク質の総量が、ステップ２により得られたタンパク質混合物中に存在するこれらの量の少なくとも６０重量％であり；
（ｉｉｉ）ステップ４の溶出液中に存在する正確に折り畳まれたエタネルセプトの量が、ステップ１において得られた回収細胞培養流体中に存在するエタネルセプト含有タンパク質混合物の量の少なくとも３０重量％であり、ならびに
（ｉｖ）前記正確に折り畳まれたエタネルセプトが、ステップ４において得られた溶出液の少なくとも９０重量％を構成する、
方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
下記の追加ステップ：
ステップ（５）：ステップ４の溶出液中に得られたタンパク質混合物を、イオン交換部分および疎水性相互作用部分の両方を有する混合モードクロマトグラフィー樹脂と接触させ、混合物中に含有されるタンパク質を樹脂に固定するステップ、ならびに次に、
ステップ（６）：前記樹脂を、正確に折り畳まれたエタネルセプトをそれから溶出する溶液と接触させ、正確に折り畳まれたエタネルセプトを不正確に折り畳まれたエタネルセプトに対して高い割合で有するタンパク質混合物を含む溶出液を得るステップ、
を含み、
前記追加ステップ５および６に使用される混合モード樹脂が、ステップ３および４に使用される混合モード樹脂と同じである、または異なる、
方法。
【外国語明細書】
2019038817000001.pdf