(57)【要約】【課題】  ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの幹細胞を培養する際に、週単位で使用可能な、ラット不死化細胞由来のフィーダー細胞を提供すること。【解決手段】  ラット線維芽細胞に、ＣＤＫ４遺伝子とｃｙｃｌｉｎＤ遺伝子とＴＥＲＴ遺伝子を導入することによって不死化させた細胞由来のフィーダー細胞である。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラット線維芽細胞に、ＣＤＫ４遺伝子とｃｙｃｌｉｎＤ遺伝子とＴＥＲＴ遺伝子を導入することによって不死化させた細胞由来のフィーダー細胞。
【請求項２】
請求項１記載のフィーダー細胞を用いることによる幹細胞の培養方法。
【請求項３】
ラット線維芽細胞に、ＣＤＫ４遺伝子とｃｙｃｌｉｎＤ遺伝子とＴＥＲＴ遺伝子を導入することによって不死化させた細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラット不死化細胞由来のフィーダー細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの幹細胞をシャーレ上で培養する際、幹細胞の特徴である多能性（未分化性）を維持するためには、幹細胞を支持するためのフィーダー細胞が必要である。フィーダー細胞は、実験の目的に応じて様々な細胞種が用いられるが、支持細胞として使用可能な期間には限りがあり、培養期間中に継続的に幹細胞を支持することができるフィーダー細胞を用いなければ、幹細胞の多能性を維持することができなくなる。フィーダー細胞を作出するための作業は、とりわけ初代培養細胞由来のフィーダー細胞の場合、対象動物の安楽殺を伴い、技術的に煩雑な工程を必要とする。こうした点に鑑み、不死化細胞由来のフィーダー細胞が開発されている。不死化細胞は無限に増殖するため、不死化細胞を一度作出すれば、不死化細胞からのフィーダー細胞の作出は、マイトマイシンＣ処理や放射線処理などの細胞の有糸分裂の不活化処理（細胞分裂の停止処理）だけで行うことができるので容易である。例えばＳＮＬ細胞は、マウス線維芽細胞由来の不死化細胞であるＳＴＯ細胞に数種類の遺伝子を導入した細胞であり、ＳＮＬ細胞由来のフィーダー細胞は、幹細胞を培養するために世界中で広く用いられている（例えば非特許文献１）。しかしながら、残念なことに、ＳＮＬ細胞由来のフィーダー細胞は、使用可能な期間が数日間と短いため、週単位で使用可能な不死化細胞由来のフィーダー細胞が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ  Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９０）Ｔｈｅ  Ｗｎｔ−１（ｉｎｔ−１）ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ．Ｃｅｌｌ，６２，１０７３−１０８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの幹細胞を培養する際に、週単位で使用可能な、ラット不死化細胞由来のフィーダー細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意検討を行った結果、ラット線維芽細胞に、ＣＤＫ４（Ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ４：サイクリン依存性キナーゼ４）遺伝子とｃｙｃｌｉｎＤ遺伝子とＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：テロメラーゼ逆転写酵素）遺伝子を導入することによって細胞を不死化させた後、その有糸分裂の不活化処理を行った細胞が、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの幹細胞を培養する際にフィーダー細胞として週単位で用いることができることを見出した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明は、請求項１記載の通り、ラット線維芽細胞に、ＣＤＫ４遺伝子とｃｙｃｌｉｎＤ遺伝子とＴＥＲＴ遺伝子を導入することによって不死化させた細胞由来のフィーダー細胞である。
また、本発明は、請求項２記載の通り、請求項１記載のフィーダー細胞を用いることによる幹細胞の培養方法である。
また、本発明は、請求項３記載の通り、ラット線維芽細胞に、ＣＤＫ４遺伝子とｃｙｃｌｉｎＤ遺伝子とＴＥＲＴ遺伝子を導入することによって不死化させた細胞である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの幹細胞を培養する際に、週単位で使用可能な、ラット不死化細胞由来のフィーダー細胞を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ラット線維芽細胞（初代培養細胞）に、ＣＤＫ４遺伝子とｃｙｃｌｉｎＤ遺伝子とＴＥＲＴ遺伝子を導入することで、不死化細胞（Ｋ４ＤＴ細胞）を作出することができることを示すグラフである。
【図２】Ｋ４ＤＴ細胞が、初代培養細胞と比較的近い細胞周期を維持していることを示すチャートである。
【図３】マウス線維芽細胞に、ＣＤＫ４遺伝子とｃｙｃｌｉｎＤ遺伝子とＴＥＲＴ遺伝子を導入しても、不死化細胞を作出することができないことを示すグラフである。
【図４】Ｋ４ＤＴ細胞由来のフィーダー細胞が、マウスＥＳ細胞を培養するための支持細胞として用いることができるものであることを示す写真である（上：明視野下での細胞形態像（バーは５００μｍ）、下：アルカリフォスファターゼ染色下での細胞形態像（バーは１００μｍ））。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の、ラット線維芽細胞に、ＣＤＫ４遺伝子とｃｙｃｌｉｎＤ遺伝子とＴＥＲＴ遺伝子を導入することによって不死化させた細胞由来のフィーダー細胞について詳述する。
【００１０】
まず、本発明において、ラット線維芽細胞に、ＣＤＫ４遺伝子とｃｙｃｌｉｎＤ遺伝子とＴＥＲＴ遺伝子を導入することによって細胞を不死化させる方法は、自体公知の方法であってよく、例えばレンチウイルスベクターを用いた遺伝子導入法を採用することができる（必要であればＭｉｙｏｓｈｉ，Ｈ．（２００４）Ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２４６，４２９−４３８を参照のこと）。この方法によって、標的細胞にＣＤＫ４遺伝子とｃｙｃｌｉｎＤ遺伝子とＴＥＲＴ遺伝子を導入する場合、それぞれの遺伝子を組み込んだ３種類のレンチウイルスプラスミドを必要とするが、それらの具体例としては、ＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ｈｕｍａｎ  ＣＤＫ４Ｒ２４Ｃ（２４位のアルギニンがシステインに置換された変異型ＣＤＫ４）、ＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ｈｕｍａｎ  ＣｙｃｌｉｎＤ１、ＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ｈｕｍａｎ  ＴＥＲＴが知られており（例えばＳｈｉｏｍｉ，Ｋ．，Ｋｉｙｏｎｏ，Ｔ．，Ｏｋａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｕｅｚｕｍｉ，Ｍ．，Ｇｏｔｏ，Ｙ．，Ｙａｓｕｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｓ．ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｎ．（２０１１）ＣＤＫ４  ａｎｄ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１  ａｌｌｏｗ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｒｅｃａｐｔｕｒｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１８，８５７−８６６や、Ｓａｓａｋｉ，Ｒ．，Ｎａｒｉｓａｗａ−Ｓａｉｔｏ，Ｍ．，Ｙｕｇａｗａ，Ｔ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｍ．，Ｔａｓｈｉｒｏ，Ｈ．，Ｋａｔａｂｕｃｈｉ，Ｈ．ａｎｄ  Ｋｉｙｏｎｏ，Ｔ．（２００９）Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，３０，４２３−４３１を参照のこと）、これらは、本発明におけるラット線維芽細胞へのそれぞれの遺伝子の導入のためにも用いることができる。
【００１１】
次に、ラット線維芽細胞に、ＣＤＫ４遺伝子とｃｙｃｌｉｎＤ遺伝子とＴＥＲＴ遺伝子を導入することによって不死化させた細胞（Ｋ４ＤＴ細胞と略称することができる）に対し、その有糸分裂の不活化処理を行う。この処理方法は、フィーダー細胞を作出するための自体公知の方法であってよく、例えばマイトマイシンＣ処理や放射線処理を採用することができる。
【００１２】
こうして作出された本発明のフィーダー細胞は、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの幹細胞を培養する際に、非血清培地条件下において週単位（少なくとも１週間）で用いることができるものであり、また、不死化細胞（Ｋ４ＤＴ細胞）由来であるので、不死化細胞から繰り返し容易に作出することができる。
【実施例】
【００１３】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１４】
（１）細胞の培養
ラット線維芽細胞（初代培養細胞）は、ＤＭＥＭ培地（０８４５９−３５，Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）を基礎培地とし、１０％相当のＦＢＳおよび１％相当のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０２８９２−５４，Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）を加えた培地を用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。細胞の継代は、６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり１×１０４個の細胞を播種し、細胞がコンフルエントになり次第、０．０５％濃度のトリプシンを用いて細胞剥離を行い、実施した。
【００１５】
（２）プラスミドの構築およびラット線維芽細胞への遺伝子導入
上述のＭｉｙｏｓｈｉ，Ｈ．の文献に記載の方法によって、ラット線維芽細胞に、ＣＤＫ４遺伝子とｃｙｃｌｉｎＤ遺伝子とＴＥＲＴ遺伝子を導入した。それぞれの遺伝子を組み込んだ３種類のレンチウイルスプラスミドは、上述のＳｈｉｏｍｉ，Ｋ．らの文献やＳａｓａｋｉ，Ｒ．らの文献に記載の、ＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ｈｕｍａｎ  ＣＤＫ４Ｒ２４Ｃ、ＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ｈｕｍａｎ  ＣｙｃｌｉｎＤ１、ＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ｈｕｍａｎ  ＴＥＲＴを用い、遺伝子導入は、ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  Ｇ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＶＳＶ−Ｇ）をエンベロープに持つ組換えウイルスを、ラット線維芽細胞に感染させることで行った。具体的には、Ｄｏｎａｉ，Ｋ．，Ｋｉｙｏｎｏ，Ｔ．，Ｅｉｔｓｕｋａ，Ｔ．，Ｇｕｏ，Ｙ．，Ｋｕｒｏｄａ，Ｋ．，Ｓｏｎｅ，Ｈ．，Ｉｓｏｇａｉ，Ｅ．ａｎｄ  Ｆｕｋｕｄａ，Ｔ．（２０１４）Ｂｏｖｉｎｅ  ａｎｄ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔａｃｔ  ｋａｒｙｏｔｙｐｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ｃｙｃｌｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ４，ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ，ａｎｄ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ．Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７６，５０−５７に記載の方法に従って、レンチウイルスベクターおよびパッケージングベクターをリポフェクション法によって２９３Ｔ細胞に導入し、培養後（培養方法は上記のラット線維芽細胞の培養方法と同じ）、ウイルス上清を回収し、ウイルスを濃縮した後、ウイルスを含むペレットを培地で懸濁し、ラット線維芽細胞を４８時間曝露することで行った。こうして作出されたラット線維芽細胞由来の不死化細胞（Ｋ４ＤＴ細胞）の継代は、６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり１×１０４個の細胞を播種し、細胞がコンフルエントになり次第、０．０５％濃度のトリプシンを用いて細胞剥離を行い、実施した。Ｋ４ＤＴ細胞は、初代培養細胞と類似した細胞形態を示し、ＰＤＬ（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｌｅｖｅｌ）解析により、細胞分裂が無限に起こり、安定して細胞増殖を続けることがわかった（図１）。加えて、Ｋ４ＤＴ細胞は、培養後期（ＰＤＬ１００の時点）においても細胞老化は検出されなかった（ＳＡ−β−Ｇａｌ染色による）。Ｋ４ＤＴ細胞の細胞周期を、細胞をＭｕｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＭＣＨ１００１０６，Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて染色し、Ｍｕｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（０５００−３１１５，Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって解析した（詳細なプロトコルは製品プロトコルに従った）。その結果、Ｋ４ＤＴ細胞は、初代培養細胞と比較的近い細胞周期を維持していることがわかった（図２）。なお、同様の方法で、マウス線維芽細胞に、ＣＤＫ４遺伝子とｃｙｃｌｉｎＤ遺伝子とＴＥＲＴ遺伝子を導入し、不死化を試みたところ、細胞の分裂回数は増やすことができたが、細胞増殖の途中で分裂停止に至り、不死化することはできなかった（図３）。
【００１６】
（３）Ｋ４ＤＴ細胞の有糸分裂の不活化処理（Ｋ４ＤＴ細胞由来のフィーダー細胞の作出）
Ｋ４ＤＴ細胞を、１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（Ｍ０５０３，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）にて１３５分間培養し、細胞の有糸分裂の不活化処理を行った。処理後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ培地（１０％相当のＦＢＳおよび１％相当のＳＰＡを含む）を用いて培養し、Ｋ４ＤＴ細胞由来のフィーダー細胞（本発明のラット不死化細胞由来のフィーダー細胞）を作出した。翌日、ゼラチンコートした６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり５×１０５個のＫ４ＤＴ細胞由来のフィーダー細胞を再播種した。その後、Ｋ４ＤＴ細胞由来のフィーダー細胞を、ＤＭＥＭ培地（１０％相当のＦＢＳおよび１％相当のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを含む）を用いて培養した。２日後、培地を血清フリー（無血清）の培地（ＤＭＥＭを基礎培地とし、１５％相当のＳｔｅｍ  Ｓｕｒｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（１９７−１６７７５，Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、０．２２ｍＭ相当の２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（２１４３８−８２，Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）、１００×ＭＥＭ  Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１３９−１５６５１，Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、１００×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、さらに１×ＬＩＦ（Ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆａｃｔｏｒ）（１２５−０５６０３，Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）および４．０ｎｇ／ｍＬ相当のＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（ＫＨＦＧＦ００１，ＤＳ  ｐｈａｒｍａ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を加えた培地）に変更して培養した。その結果、Ｋ４ＤＴ細胞由来のフィーダー細胞は、同様の方法で有糸分裂の不活化処理を行うことで作出した初代培養細胞由来のフィーダー細胞と同様に、ゼラチンコートしたプレートへの再播種から１４日経過後であっても、プレートからの細胞の剥離は認められず、安定に維持され、その生細胞数と生細胞率は、初代培養細胞由来のフィーダー細胞の生細胞数と生細胞率と同程度であった。また、その細胞周期は、初代培養細胞の細胞周期と比較的近いものであった。なお、公知の方法（Ｎａｒｉｓａｗａ−Ｓａｉｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２０１２；３３（４）：９１０−７．Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｆｅｂ  １５）に準拠して作出したラット線維芽細胞由来のＥ６Ｅ７細胞（ヒトパピローマウイルス由来のＥ６Ｅ７遺伝子を導入した不死化細胞）に対し、その有糸分裂の不活化処理を同様の方法で行うことで作出したＥ６Ｅ７細胞由来のフィーダー細胞は、ゼラチンコートしたプレートへの再播種から２日経過した時点でプレートからの細胞の剥離が認められ、幹細胞を培養するための支持細胞として実用上用いることができるものではなかった。また、その細胞周期は、初代培養細胞の細胞周期と異なるものであった。Ｋ４ＤＴ細胞の作出方法と同様の方法でＣＤＫ４遺伝子とｃｙｃｌｉｎＤ遺伝子とＴＥＲＴ遺伝子を導入したマウス線維芽細胞に対し、その有糸分裂の不活化処理を同様の方法で行うことで作出したマウス線維芽細胞由来のフィーダー細胞は、ゼラチンコートしたプレートへの再播種から１４日を経過する以前にプレートからの細胞の剥離が認められた。
【００１７】
（４）Ｋ４ＤＴ細胞由来のフィーダー細胞を用いたマウスＥＳ細胞の培養
Ｋ４ＤＴ細胞由来のフィーダー細胞を、ゼラチンコートした６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり５×１０５個播種し、予備培養した２日後、マウスＥＳ細胞を１ｗｅｌｌあたり５×１０４個播種して培養することで、Ｋ４ＤＴ細胞由来のフィーダー細胞が、多能性を維持したマウスＥＳ細胞を培養するための支持細胞として用いることができるものであることを確認した（マウスＥＳ細胞を播種してから４日後の細胞形態像を図４に示す）。なお、培養は、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）で行い、培地は、ＤＥＭＥを基礎培地とし、１５％相当のＳｔｅｍ  Ｓｕｒｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、０．２２ｍＭ相当の２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１００×ＭＥＭ  Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１００×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、さらに１０００×ＬＩＦ、０．７５μＭ相当のＣＨＩＲ９９０２１（１６３−２４００１，Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、０．２５μＭ相当のＰＤ０３２５９０１（１３０３４，Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を加えた培地を用いた。
【００１８】
（５）まとめ
以上の結果から明らかなように、ラット線維芽細胞に、ＣＤＫ４遺伝子とｃｙｃｌｉｎＤ遺伝子とＴＥＲＴ遺伝子を導入することによって、初代培養細胞と性質が比較的近い不死化細胞（Ｋ４ＤＴ細胞）を作出することができたが、同じ齧歯類に属し、生物学的に近縁であるにもかかわらず、マウス線維芽細胞に、ＣＤＫ４遺伝子とｃｙｃｌｉｎＤ遺伝子とＴＥＲＴ遺伝子を導入しても、不死化細胞を作出することはできなかった。また、同じラット線維芽細胞由来の不死化細胞であっても、Ｋ４ＤＴ細胞から作出されたフィーダー細胞は、幹細胞を培養する際に週単位で用いることができるものであったのに対し、Ｅ６Ｅ７細胞から作出されたフィーダー細胞は、実用上用いることができるものではなかった。これらの相違は、本発明者らにとって予想外の結果であり、それぞれの細胞老化機構や細胞修復機構の相違などに起因するものと考えられ、ラット線維芽細胞由来のＫ４ＤＴ細胞から作出されるフィーダー細胞の特徴を際立たせるものである。また、Ｋ４ＤＴ細胞は、特定遺伝子の強制発現といった細胞工学技術の適用が容易な培養しやすい不死化細胞として、病態解明、創薬、再生医療などを目的とする基礎研究にとって有用であるという側面も有する。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明は、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの幹細胞を培養する際に、週単位で使用可能な、ラット不死化細胞由来のフィーダー細胞を提供することができる点において、産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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