(57)【要約】      （修正有）【課題】膵臓癌を処置するための方法及び医薬組成物の提供。【解決手段】ＯＸ１Ｒ（オレキシンの７回膜貫通レセプター）アゴニストを投与することを含む、膵臓癌の処置のための方法。大半の膵臓腺癌においてＯＸ１Ｒの発現が示され、このことは膵臓腺癌におけるＯＸ１Ｒの異所性発現を示唆する。ＡｓＰＣ−１細胞を異種移植したヌードマウスへのオレキシン−Ａ注射は、腫瘍の進行を減少させた。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
該被験体に、治療有効量のＯＸ１Ｒアゴニストを投与することを含む、それを必要とする被験体における膵臓癌の処置のための方法。
【請求項２】
前記ＯＸ１Ｒアゴニストが、小有機分子である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＯＸ１Ｒアゴニストが、抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ＯＸ１Ｒアゴニストが、キメラ抗体、ヒト化抗体又は全ヒトモノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ＯＸ１Ｒアゴニストが、ポリペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記ＯＸ１Ｒアゴニストが、オレキシン−Ａ又はオレキシン−Ｂの機能的等価物である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記ＯＸ１Ｒアゴニストが、配列番号２又は３と８０％以上の同一性を有するポリペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記ＯＸ１Ｒアゴニストが、イムノアドヘシンである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記ＯＸ１Ｒアゴニストが、アプタマーである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記膵臓癌が、膵管癌等の膵臓腺癌、漿液性嚢胞腺腫、腺房細胞癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）等の、膵外分泌の他の腫瘍、及びインスリノーマ等の膵臓神経内分泌腫瘍からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記被験体が、化学療法剤も投与される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
膵臓癌の処置を、それを必要とする被験体において行う方法であって、ｉ）該被験体から得られた腫瘍組織試料におけるＯＸ１Ｒの発現レベルを測定する工程；ｉｉ）工程ｉ）で測定された該発現レベルを、基準値と比較する工程；及びｉｉｉ）工程ｉ）で測定された該レベルが該基準値より高い場合、該被験体に、治療有効量のＯＸ１Ｒアゴニストを投与する工程を含む方法。
【請求項１３】
膵臓癌を処置するための薬物をスクリーニングする方法であって、ｉ）複数の試験物質を提供する工程；ｉｉ）該試験物質がＯＸ１Ｒアゴニストであるかを決定する工程；及びｉｉｉ）ＯＸ１Ｒアゴニストである該試験物質をポジティブに選択する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓癌を処置するための方法及び医薬組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
膵臓癌は、極めて予後不良の侵攻性疾患である。これは最も悪性である癌の１つであって、潜行性の発症を特徴とし、通常、診断が遅れ、診断後の生存率が低い。例えば、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、米国における癌による死因の第４位である。近年の治療の進歩にもかかわらず、ＰＤＡＣにおける長期の生存は、疾患の初期段階で手術を受けた患者に限られる場合が多い。ＰＤＡＣの生物学的侵攻性は、部分的には、この腫瘍の化学療法に対する抵抗性によるものである。現在、処置の基準は、ゲムシタビンによる全身的化学療法にとどまっており、これは緩和を目的とするもので、不本意な最低限の延命効果しかない。ごく最近、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン及びオキサリプラチン（フォルフィリノックス）投与計画による、単剤ゲムシタビンに対しての、臨床的にも統計的にも意味のある延命効果の実証（Conroy et al., N. Engl. J. Med., 364: 1817- 1825 (2011)）、及び膵管腺癌（ＰＤＡＣ）に特徴的な繊維形成性間質（desmoplastic stroma）を標的とするとみられる、アルブミン結合パクリタキセルのナノ粒子（ｎａｄ−パクリタキセル）の導入（Garber, K., J. Natl. Cancer Inst., 102: 448-450 (2010)）が、古典的な細胞毒の革新的な組み合わせ及び改善された送達が、実際、進行したＰＤＡＣにおける化学療法の有効性に、実質的な影響を及ぼしうるという期待を高めた。従って、膵臓癌処置におけるわずかな進歩はあるものの、膵臓癌の有効な治療を開発・提供する、改善された治療及びより創造的なアプローチが依然として必要とされている。
【０００３】
オレキシン（ヒポクレチン）には、視床下部で産生される２種の神経ペプチド、オレキシンＡ（ＯＸ−Ａ）（３３アミノ酸のペプチド）及びオレキシンＢ（ＯＸ−Ｂ）（２８アミノ酸のペプチド）（Sakurai T. et al., Cell, 1998, 92, 573-585）が含まれる。オレキシンは、マウスにおける食餌消費を促進することが見出されており、このことは、食餌行動を制御する中枢フィードバック機構におけるメディエーターとしての、これらのペプチドの生理的な役割を示唆している。オレキシンは、睡眠及び覚醒の状態を制御しており、このことは、ナルコレプシー又は不眠症患者にとって、治療上の風穴を開ける（opening potentially novel therapeutic approaches）ものである。オレキシンはまた、覚醒、報酬、学習及び記憶において役割を果たしていることが示されている。２種のオレキシンレセプターが、哺乳類においてクローニング及び特徴付けされている。それらはＧタンパク質共役レセプター（７回膜貫通レセプター）のスーパーファミリーに属し（Sakurai T. et al., Cell, 1998, 92, 573-585）：オレキシン−１レセプター（ＯＸ１Ｒ又はＨＣＴＲ１）はＯＸ−Ａに選択的であり、オレキシン−２レセプター（ＯＸ２Ｒ又はＨＣＴＲ２）は、ＯＸ−ＡともＯＸ−Ｂとも結合しうる。近年の研究により、オレキシンによるＯＸ１Ｒの活性化が、結腸癌細胞において、それらが結腸癌化学療法において最も一般的に用いられる薬物に対し抵抗性であっても、活発な（robust）インビトロ及びインビボのアポトーシスを促進しうることが示された（Voisin T, El Firar A, Fasseu M, Rouyer-Fessard C, Descatoire V, Walker F, Paradis V, Bedossa P, Henin D, Lehy T, Laburthe M. Aberrant expression of OX1 receptors for orexins in colon cancers and liver metastases: an openable gate to apoptosis. Cancer Res. 2011 May 1;71(9):3341-51）。注目すべきことに、全ての原発性結腸直腸腫瘍は、その部位やデュークステージに関わりなくＯＸ１Ｒを発現していたが、隣接する正常結腸細胞や、対照の正常組織は陰性であった。よって、この研究は、ＯＸ１Ｒが結腸癌（化学療法耐性のものであっても）の急所（Achilles's heel）であることを支持し、かつＯＸ１Ｒアゴニストが結腸癌治療についての新規な候補となりうることを示唆するものである。
【０００４】
発明の概要
本発明は、膵臓癌を処置するための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は、それを必要とする被験体における膵臓癌の処置に用いるためのＯＸ１Ｒアゴニストに関する。
【０００５】
発明の詳細な説明
本発明は、それを必要とする被験体における膵臓癌の処置に用いるためのＯＸ１Ｒアゴニストに関する。
【０００６】
本明細書で使用する用語（tem）「ＯＸ１Ｒ」は、当技術分野における一般的な意味を有し、オレキシンの７回膜貫通レセプターＯＸ１Ｒを指す。本発明によれば、ＯＸ１Ｒは、Ｇｑ介在型ホスホリパーゼＣ活性化や細胞カルシウム一過性変化（transients）とは関連していない機構を通じて、ヒト膵臓癌細胞株におけるアポトーシスを促進する。オレキシンは実際、ＯＸ１Ｒ、ＩＴＩＭ及びＩＴＳＭにおける、チロシンを基盤とする（tyrosine-based）モチーフ２つのチロシンリン酸化を誘発し、これはホスホチロシンホスファターゼＳＨＰ−２の動員（recruitment）をもたらすが、このものの活性化は、ミトコンドリア性アポトーシスに関与している（Voisin T, El Firar A, Rouyer-Fessard C, Gratio V, Laburthe M. A hallmark of immunoreceptor, the tyrosine-based inhibitory motif ITIM, is present in the G protein-coupled receptor OX1R for orexins and drives apoptosis: a novel mechanism. FASEB J. 2008 Jun;22(6):1993-2002.; El Firar A, Voisin T, Rouyer-Fessard C, Ostuni MA, Couvineau A, Laburthe M. Discovery of a functional immunoreceptor tyrosine-based switch motif in a 7-transmembrane-spanning receptor: role in the orexin receptor OX1R-driven apoptosis. FASEB J. 2009 Dec;23(12):4069-80. doi: 10.1096/fj.09-131367. Epub 2009 Aug 6.）。ＯＸ１Ｒの例示的なアミノ酸配列を配列番号１として示す。
【０００７】
オレキシンレセプター−１  ＯＸ１Ｒ（配列番号１）
1 mepsatpgaq mgvppgsrep spvppdyede flrylwrdyl ypkqyewvli aayvavfvva
61 lvgntlvcla vwrnhhmrtv tnyfivnlsl advlvtaicl pasllvdite swlfghalck
121 vipylqavsv svavltlsfi aldrwyaich pllfkstarr argsilgiwa vslaimvpqa
181 avmecssvlp elanrtrlfs vcderwaddl ypkiyhscff ivtylaplgl mamayfqifr
241 klwgrqipgt tsalvrnwkr psdqlgdleq glsgepqprg raflaevkqm rarrktakml
301 mvvllvfalc ylpisvlnvl krvfgmfrqa sdreavyacf tfshwlvyan saanpiiynf
361 lsgkfreqfk aafscclpgl gpcgslkaps prssashksl slqsrcsisk isehvvltsv
421 ttvlp
【０００８】
従って、本明細書で使用する用語「ＯＸ１Ｒアゴニスト」は、天然のものであれ、そうでないものであれ、ＯＸ１Ｒと結合することができ、一過性のカルシウム放出とは独立したシグナル伝達経路の活性化（ＳＨＰ−２の動員及び細胞のアポトーシスの誘発に関与）からなるＯＸ１Ｒ活性を促進するあらゆる化合物を指す。
【０００９】
いくつかの実施態様においては、ＯＸ１Ｒアゴニストは小有機分子である。用語「小有機分子」は、医薬品において一般的に用いられる有機分子に匹敵するサイズの分子を指す。この用語は、生体高分子（例えば、タンパク質、核酸等）を排除している。好ましい小有機分子は、サイズにおいて、約５０００Daまで、より具体的には２０００Daまで、最も具体的には約１０００Daまでの範囲である。
【００１０】
ある実施態様においては、ＯＸ１Ｒアゴニストは抗体又はその一部である。
【００１１】
本明細書で使用する「抗体」には、天然及び非天然の両抗体が含まれる。具体的には、「抗体」には、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、並びにその一価及び二価フラグメントが含まれる。更に、「抗体」には、キメラ抗体、全合成抗体、一本鎖抗体及びそのフラグメントが含まれる。抗体は、ヒト抗体又は非ヒト抗体でありうる。非ヒト抗体は、人における免疫原性低下のために、組換え法によりヒト化されていてもよい。
【００１２】
本明細書に記載の抗体又はその一部の一つの実施態様において、抗体はモノクローナル抗体である。本明細書に記載の抗体又はその一部の一つの実施態様において、抗体はポリクローナル抗体である。本明細書に記載の抗体又はその一部の一つの実施態様において、抗体はヒト化抗体である。本明細書に記載の抗体又はその一部の一つの実施態様において、抗体はキメラ抗体である。本明細書に記載の抗体又はその一部の一つの実施態様において、抗体の一部は、抗体の軽鎖を含む。本明細書に記載の抗体又はその一部の一つの実施態様において、抗体の一部は、抗体の重鎖を含む。本明細書に記載の抗体又はその一部の一つの実施態様において、抗体の一部は、抗体のＦａｂ部を含む。本明細書に記載の抗体又はその一部の一つの実施態様において、抗体の一部は、抗体のＦ（ａｂ’）２部を含む。本明細書に記載の抗体又はその一部の一つの実施態様において、抗体の一部は、抗体のＦｃ部を含む。本明細書に記載の抗体又はその一部の一つの実施態様において、抗体の一部は、抗体のＦｖ部を含む。本明細書に記載の抗体又はその一部の一つの実施態様において、抗体の一部は、抗体の可変ドメインを含む。本明細書に記載の抗体又はその一部の一つの実施態様において、抗体の一部は、抗体のＣＤＲドメインを含む。
【００１３】
抗体は、従来の方法論に従って調製される。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Nature, 256:495, 1975）を用いて作成しうる。本発明において有用なモノクローナル抗体を調製するためには、マウスその他の適切な宿主動物を、抗原の形態のＯＸ１Ｒにより、適切な間隔（例えば、２週間ごと、１週間ごと、２か月ごと又は１か月ごと）で免疫する。サクリファイス（sacrifice）から１週間以内に、動物に最終の抗原の「ブースト」を投与してもよい。免疫する間に、免疫学的アジュバントを用いることが好ましい場合が多い。適切な免疫学的アジュバントには、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ｒｉｂｉアジュバント、ハンターのタイターマックス、ＱＳ２１又はＱｕｉｌＡといったサポニンアジュバント又はＣｐＧ含有免疫賦活オリゴヌクレオチドが含まれる。他の適切なアジュバントは、当該分野において周知である。動物の免疫は、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、鼻腔内その他の経路で行ってよい。所与の動物を、複数の形態の抗原により、複数の経路で免疫してよい。簡潔に言えば、組換えＯＸ１Ｒを、組換え細胞株を用いて提供してもよい。具体的には、ＯＸ１Ｒを、表面にＯＸ１Ｒが発現しているヒト細胞の形態で提供してもよい。免疫の投与計画に続いて、動物の脾臓、リンパ節その他の組織からリンパ球を分離し、ポリエチレングリコール等の試薬を用いて適切な骨髄腫細胞株と融合させて、ハイブリドーマを形成する。融合に続いて、文献記載の通りに（Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3rd edition, Academic Press, New York, 1996）、標準的方法を用いて、細胞を、ハイブリドーマについては増殖を許容するが、融合のパートナーについてはそうでない培地に入れる。ハイブリドーマの培養に続いて、所望の特異性を有する、即ち抗体に選択的に結合する抗体の存在について、細胞上清を分析する。適切な分析技術には、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降法及びウェスタンブロッティングが含まれる。他のスクリーニング技術は、当該分野において周知である。好ましい技術は、非変性ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー及び免疫沈降法といった、コンホメーションが正常で、本来の形に折りたたまれた抗原に対しての、抗体の結合を確認するものである。
【００１４】
当技術分野において周知のことであるが、意義深いことに、抗体分子の小さな一部であるパラトープのみが、その抗体のエピトープへの結合に関与している（一般に、Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照）。例えば、Ｆｃ’及びＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合には関与していない。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと呼ばれる、ｐＦｃ’領域が酵素的に開裂した抗体、又はｐＦｃ’領域なしで産生された抗体は、正常な抗体の両方の抗体結合部位を保持している。同様に、Ｆａｂフラグメントと呼ばれる、Ｆｃ領域が酵素的に開裂した抗体、又はＦｃ領域なしで産生された抗体は、正常な抗体分子の一方の抗体結合部位を保持している。更に進めると、Ｆａｂフラグメントは、抗体軽鎖と、抗体重鎖の一部（Ｆｄと示される）が、共有結合したものからなる。Ｆｄフラグメントは、抗体の特異性の主要な決定因子であり（抗体の特異性は変わっていないのに、単一のＦｄフラグメントが、１０種類までの異なる軽鎖を伴っている場合がある）、またＦｄフラグメントは、単離されてもエピトープ結合能を保持している。
【００１５】
当技術分野において周知のことであるが、抗体の抗体結合部には、抗原のエピトープと直接に相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、パラトープの第三級構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）が存在する（一般に、Clark, 1986; Roitt, 1991を参照）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄフラグメント及び軽鎖の両者には、それぞれが３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲＳ）で分離されている、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、具体的にはＣＤＲＳ領域、より具体的には重鎖のＣＤＲＳが、抗体の特異性に大きく関与している。
【００１６】
哺乳類抗体の非ＣＤＲ領域を、元の抗体のエピトープ特異性を維持したままで、同種又は異種の抗体における同様の領域で置き換えうることが、現在、当技術分野において十分に確立されている。このことは、非ヒトＣＤＲを、ヒトＦＲ及び／又はＦｃ／ｐＦｃ’領域と共有結合で接続して機能的抗体を製造する「ヒト化」抗体の開発及び使用において最も明確に示される。
【００１７】
特定の実施態様において、本発明は、ヒト化された形態の抗体を含む組成物及び方法を提供する。本明細書で使用する「ヒト化」は、ＣＤＲ領域外のいくらか、大半又は全てのアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン分子由来の対応するアミノ酸で置換されている抗体を記載するものである。ヒト化の方法には、米国特許第４８１６５６７号、米国特許第５２２５５３９号、米国特許第５５８５０８９号、米国特許第５６９３７６１号、米国特許第５６９３７６２号及び米国特許第５８５９２０５号（これらは参照により本明細書に組み入れられる）に記載のものが含まれるが、これらに限定されない。前記米国特許第５５８５０８９号及び米国特許第５６９３７６１号、並びに国際公開公報第９０／０７８６１号はまた、ヒト化抗体の設計に使用し得る、考えられる４つの基準を提案している。初めの提案は、アクセプターには、ヒト化されるべきドナーの免疫グロブリンと著しく相同的な、特定のヒト免疫グロブリンからのフレームワークを用いる、又は、多数のヒト抗体からのコンセンサスフレームワークを用いる、というものであった。第２の提案は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク内のあるアミノ酸が異常であり、その位置のドナーのアミノ酸が、ヒトの配列において典型的なものであるならば、アクセプターよりもドナーのアミノ酸を選択しうるというものであった。第３の提案は、ヒト化免疫グロブリン鎖中の３つのＣＤＲにすぐ隣接する位置では、アクセプターのアミノ酸よりもドナーのアミノ酸を選択しうるというものであった。第４の提案は、抗体の３次元モデルにおいて、アミノ酸が、ＣＤＲから３Å以内に側鎖の原子を有すると予測され、かつそのＣＤＲと相互作用しうると予測されるフレームワークの位置にあるドナーのアミノ酸を用いるというものであった。前記の方法は、当業者がヒト化抗体を作成するために採用しうるいくつかの方法の単なる例示である。当業者は、抗体をヒト化するための他の方法を熟知しているであろう。
【００１８】
ヒト化された形態の抗体の一つの実施態様では、ＣＤＲ領域外のいくらか、大半又は全てのアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン分子由来の対応するアミノ酸で置換されているが、１つ以上のＣＤＲ領域内のいくらか、大半又は全てのアミノ酸は不変である。抗体が所与の抗体と結合する能力を阻害しない限り、アミノ酸のわずかな付加、削除、挿入又は修飾は許容される。適切なヒト免疫グロブリン分子には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＭ分子が含まれるであろう。「ヒト化」抗体は、元の抗体と類似の抗原特異性を保持している。しかし、あるヒト化の方法を用い、Wu et al.（Mol. Biol. 294:151, 1999（その内容は、参照により本明細書に組み入れられる））により記載された「指向進化」の方法を用いて、抗体結合の親和性及び／又は特異性を増加しうる。
【００１９】
全長（Fully）ヒトモノクローナル抗体もまた、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックなマウスを免疫することによって、調製することができる。米国特許第５５９１６６９号、米国特許第５５９８３６９号、米国特許第５５４５８０６号、米国特許第５５４５８０７号および米国特許第６１５０５８４号、並びにそれらにおける引用文献（これらの内容は、参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。これらの動物は、内因性（例えばマウスの）抗体の産生において機能的な欠損が存在するように、遺伝的な修飾を受けている。これらの動物は更に修飾されて、これらの動物を免疫することにより、関心ある抗原に対する全長ヒト抗体の産生がもたらされるように、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子座の全体または一部を含む。これらのマウス（例えば、XenoMouse(Abgenix)、HuMAb mice(Medarex/GenPharm)）の免疫に続き、標準的なハイブリドーマ技術に従って、モノクローナル抗体を調製することができる。これらのモノクローナル抗体はヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、従って、ヒトに投与した時、ヒト抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）応答を惹起しないであろう。
【００２０】
ヒト抗体製造のためのインビトロ方法も存在する。これらには、ファージ提示技術（米国特許第５５６５３３２号及び米国特許第５５７３９０５号）及びヒトＢ細胞のインビトロ刺激（米国特許第５２２９２７５号及び米国特許第５５６７６１０号）が含まれる。これらの特許の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００２１】
よって、当業者にとっては明らかであろうが、本発明はまた、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ及びＦｄフラグメント；Ｆｃ及び／又はＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト又は非ヒト配列で置き換えられているキメラ抗体；ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト又は非ヒト配列で置き換えられているキメラＦ（ａｂ’）２フラグメント抗体；ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト又は非ヒト配列で置き換えられているキメラＦａｂフラグメント抗体；及びＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２領域が、相同的なヒト又は非ヒト配列で置き換えられているキメラＦｄフラグメント抗体を提供する。本発明はまた、いわゆる一本鎖抗体をも包含する。
【００２２】
種々の抗体分子及びフラグメントは、一般に知られている免疫グロブリンクラス（ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが含まれるが、これらに限定されない）のいずれに由来するものであってもよい。ＩｇＧサブクラスは当業者にとって周知であり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
他の一つの実施態様において、本発明による抗体は、シングルドメイン抗体である。用語「シングルドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「ＶＨＨ」は、ラクダ科哺乳動物に見出されうるタイプの、元々軽鎖を欠いている、抗体の単一の重鎖可変ドメインを指す。そのようなＶＨＨは、「nanobody（登録商標）」とも呼ばれている。本発明によれば、ｓｄＡｂは特に、ラマのｓｄＡｂでありうる。
【００２４】
本明細書に記載の試薬の一つの実施態様では、試薬はポリペプチドである。特定の実施態様において、前記ポリペプチドは、オレキシン−Ａ又はオレキシン−Ｂの機能的等価物である。
【００２５】
本明細書で使用する用語「オレキシン−Ａ」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、配列番号２で示されるアミノ酸配列を指す。
【００２６】
オレキシン−Ａ（配列番号２）： peplpdccrqk tcscrlyell hgagnhaagi ltlx
【００２７】
本明細書で使用する用語「オレキシン−Ｂ」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、配列番号３で示されるアミノ酸配列を指す。
【００２８】
オレキシン−Ｂ（配列番号３）： 1 fsgppglqgr lqrllqasgn haagiltm
【００２９】
本明細書で使用する「オレキシンの機能的等価物」は、ＯＸ１Ｒと結合することができ、そのことにより、本発明によるＯＸ１Ｒ活性を促進するポリペプチドである。用語「機能的等価物」には、オレキシン−Ａ及びオレキシン−Ｂのフラグメント、変異体及び突然変異タンパク質が含まれる。よって、用語「機能的等価物」には、ＯＸ１Ｒと結合し、本発明によるＯＸ１Ｒ活性（例えば、癌細胞のアポトーシス（aoptosis））を促進する能力を、タンパク質類似体が保持するように、アミノ酸配列を変えること、例えば、１個以上のアミノ酸の削除、置換又は付加によって得られる、オレキシン（即ち、オレキシン−Ａ又はオレキシン−Ｂ）のあらゆる等価物が含まれる。アミノ酸置換は、例えば、アミノ酸配列をコードするＤＮＡの点突然変異によって行ってもよい。
【００３０】
いくつかの実施態様において、前記機能的等価物は、対応するタンパク質と８０％以上相同である。好ましい実施態様では、前記機能的等価物は、例えば、Pileup配列分析ソフトウェア（Program Manual for the Wisconsin Package, 1996）といった、何らかの従来の分析アルゴリズムにより評価するとき、９０％以上相同である。本明細書で使用する用語「機能的等価フラグメント」はまた、ＯＸ１Ｒと結合し、本発明によるＯＸ１Ｒ活性を促進する、オレキシンの何らかのフラグメント又はフラグメントの集合物を意味する場合がある。従って、本発明は、オレキシン−Ａ又はオレキシン−Ｂの、ＯＸ１Ｒと結合し、本発明によるＯＸ１Ｒ活性を促進する少なくとも一部の配列に対応する配列を有する、連続するアミノ酸を含むポリペプチドを提供する。
【００３１】
機能的等価フラグメントは、本明細書において同定されているヒトオレキシンと同一のタンパク質ファミリーに属しうる。「タンパク質ファミリー」とは、共通の機能を共有し、共通の配列相同率を示す一群のタンパク質を意味する。相同タンパク質は、ヒト以外の種に由来するものであってよい。具体的には、完全タンパク質の全アミノ酸配列にわたる、機能的に等価なタンパク質配列間の相同率は、２５％以上である。より具体的には、タンパク質又はタンパク質フラグメントの全アミノ酸配列にわたる相同率は５０％以上であり、更に具体的には、相同率は７５％以上である。より具体的には、全配列にわたる相同率は８０％超である。より具体的には、全配列にわたる相同率は９０％超である。より具体的には、全配列にわたる相同率は９５％超である。
【００３２】
当業者にとっては明らかなことであろうが、本発明のポリペプチドは、あらゆる適切な手段により製造しうる。本発明に従って使用するのに十分な量のポリペプチド又はその機能的等価物を製造するためには、簡便には、本発明のポリペプチドを含む組換え宿主細胞を、適切な条件下で培養することにより、発現を達成しうる。具体的には、ポリペプチドは、組換え手段により、コードしている核酸分子からの発現により製造する。種々異なる宿主細胞における、ポリペプチドのクローニング及び発現のための系は周知である。組換え型で発現させる場合、ポリペプチドは、具体的には、宿主細胞における、コードしている核酸からの発現により生成する。具体的な系における個々の要件に応じて、あらゆる宿主細胞を使用しうる。適切な宿主細胞には、細菌、哺乳類細胞、植物細胞、酵母及びバキュロウィルス系が含まれる。異種ポリペプチドの発現のための、当技術分野において入手可能な哺乳類細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、Ｈｅｌａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞その他多くのものが含まれる。細菌もまた、どの細菌を操作し、増殖させうるかについての容易さ故に、組換えタンパク質製造のための好ましい宿主である。一般には、好ましい細菌宿主は大腸菌である。
【００３３】
いくつかの実施態様においては、本発明のポリペプチドはイムノアドヘシンである。
【００３４】
本明細書で使用する用語「イムノアドヘシン」は、異種タンパク質の結合特異性（ＯＸ１Ｒと結合することができる「アドヘシン」）と、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能が組み合わされた抗体様分子をいう。構造的には、イムノアドヘシンは、ＯＸ１Ｒへの所望の結合特異性を有する（即ち「異種」である）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部は、典型的には、ＯＸ１Ｒについての結合部位を少なくとも含む、連続するアミノ酸配列である。一つの実施態様では、アドヘシンは、配列番号２又は配列番号３により特徴付けられるポリペプチドを含む。イムノアドヘシン中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭといった、あらゆる免疫グロブリンから得られるものであってよい。
【００３５】
免疫グロブリン配列は、典型的には（ただし必然的ではない）、免疫グロブリン定常ドメイン（Ｆｃ領域）である。イムノアドヘシンは、ヒト抗体の価値ある化学的及び生物学的特性のうちの多くを有しうる。イムノアドヘシンは、適切なヒト免疫グロブリンヒンジ及び定常ドメイン（Ｆｃ）配列と連結した、所望の特異性を有するヒトタンパク質の配列から構成しうるので、関心ある結合特異性を、ヒト成分全てを用いて達成することができる。そのようなイムノアドヘシンは、患者にとっての免疫原性が最低限のものであり、慢性的又は反復使用においても安全である。
【００３６】
一つの実施態様において、Ｆｃ領域は、本来の配列のＦｃ領域である。一つの実施態様において、Ｆｃ領域は、変異型のＦｃ領域である。更に他の一つの実施態様において、Ｆｃ領域は、機能的Ｆｃ領域である。本明細書で使用する用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに用いられ、本来の配列のＦｃ領域及び変異型のＦｃ領域を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端までにわたる、と定義される。イムノアドヘシンの付着部（adhesion portion）と免疫グロブリン配列部は、最小限のリンカーにより連結されていてよい。免疫グロブリン配列は、典型的には（ただし必然的ではない）、免疫グロブリン定常ドメインである。本発明のキメラにおける免疫グロブリン部は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得られるものであってよいが、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３である。
【００３７】
本発明のポリペプチド、本発明によるそのフラグメントおよび融合タンパク質（例えばイムノアドヘシン）は、グリコシル化（例えば、Ｎ結合又はＯ結合グリコシル化）、ミリスチル化、パルミチル化、アセチル化及びリン酸化（例えば、セリン／スレオニン又はチロシン）をはじめとする（ただしそれらに限定されない）翻訳語修飾を示すものでありうる。
【００３８】
特定の実施態様においては、本発明の治療方法において用いられるポリペプチドは、その治療有効性を改善するために修飾されていてもよいことが意図されている。治療化合物のそのような修飾は、毒性を低減し、循環時間を増し、又は生体内分布を変えるために用いてよい。例えば、生体内分布を変える種々の薬物担体媒体（drug carrier vehicles）と組み合わせることにより、潜在的な重要治療化合物の毒性を有意に低減することができる。例えば（In example）、ジペプチドを付加することは、内因性トランスポーターを用いる、循環する薬物の血液−網膜関門を通じての目への浸透を改善することができる。
【００３９】
薬物生存率を向上するための戦略は、水溶性ポリマーの利用である。種々の水溶性ポリマーが、生体内分布を変え、細胞取り込みの様式を向上し、生理的関門を通じての浸透性を変え、生体からのクリアランス速度を変えることが示されている。ターゲッティング及び徐放効果を達成するために、薬物部分を、ポリマー鎖上の末端基として、主鎖の一部として、又はペンダント基として含有する水溶性ポリマーが合成されてきた。
【００４０】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、その高度の生体適合性と修飾の容易さから、薬物担体として広く用いられてきた。種々の薬物、タンパク質及びリポソームへの取り付けが、滞留時間を向上し、毒性を低減することが示されている。ＰＥＧは、その鎖末端のヒドロキシル基を介して、またその他の化学的方法を通じて、活性剤と結合しうるが、ＰＥＧ自体は、１分子あたり、最大で２個の活性剤に限られている。別のアプローチでは、ＰＥＧとアミノ酸の共重合体が、ＰＥＧの生体適合特性を保持しているが、１分子あたりの多数の結合点（より大きな薬物負荷をもたらす）という付加された利点を有し、また合成上の設計で種々の用途に適合させうる、新規な生体適合材料として検討された。
【００４１】
当業者は、薬物の有効な修飾のためのＰＥＧ化技術を承知している。例えば、ＰＥＧと、リジンのような三官能性モノマーの交互重合体からなる薬物送達ポリマーが、VectraMed (Plainsboro, N.J.)により用いられている。ＰＥＧ鎖（典型的には２０００ダルトン以下）が、安定なウレタン結合を介してリジンのα−及びε−アミノ基（a- and e-amino groups）に結合している。そのような共重合体は、ポリマー鎖に沿った、厳密に制御された所定の間隔で、反応性ペンダント基（リジンのカルボン酸基）を提供しつつ、ＰＥＧの望ましい特性を保持している。反応性ペンダント基は、誘導体化、架橋又は他分子との結合に用いることができる。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量及び薬物とポリマーの間の開裂可能な結合を変えることにより、安定で、長時間循環するプロドラッグの製造において有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／結合基複合体の間隔と、結合物の分子量あたりの薬物の量（より小さいＰＥＧセグメントは、より大きな薬物負荷をもたらす）に影響する。一般に、ブロック共重合体結合物の分子量を増加させることは、結合物の循環半減期を増加させるであろう。それでも、結合物は、容易に分解されうるか、又は、限界糸球体濾過（threshold-limiting glomular filtration）を下回る分子量（例えば６０kDa未満）を有していなければならない。
【００４２】
加えて、循環半減期の維持及び生体内分布に重要なポリマー主鎖に対し、標的組織において特定のトリガー（典型的には酵素活性）によりポリマー主鎖から放出されるまで、治療剤をプロドラッグの形態に維持するためのリンカーを用いてもよい。例えば、この様式の組織活性化薬物送達は、生体内分布における特定の部位への送達が必要である場合に特に有用であり、治療剤は病変の部位又はその近傍で放出される。活性化薬物送達に用いる結合基のライブラリーは当業者に公知であり、酵素の速度論、活性酵素の存在量（prevalence）及び選択された疾患に特異的な酵素の開裂特異性に基づくものでありうる。そのようなリンカーを、治療送達のための、本明細書に記載のタンパク質又はタンパク質のフラグメントの修飾に用いてもよい。
【００４３】
一つの実施態様において、ＯＸ１Ｒアゴニストはアプタマーである。アプタマーは、分子認識の観点からは、抗体の代替物に相当する（represents）分子のクラスである。アプタマーは、高度の親和性及び特異性をもって、実質的にあらゆるクラスの標的分子を認識する能力を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。そのようなリガンドは、ランダム配列ライブラリーのSystematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX)を通じて単離しうる。このランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成により得ることができる。このライブラリーにおいて、各メンバーは、固有の配列を有する直鎖状オリゴマー（最終的には化学修飾される）である。ペプチドアプタマーは、プラットフォームタンパク質（大腸菌チオレドキシンＡのような）により提示される、コンホメーションが拘束された抗体可変領域からなり、２ハイブリッド法によるコンビナトリアルライブラリーより選択される。
【００４４】
本明細書で使用する用語「膵臓癌」又は「膵癌」は、膵臓細胞由来の癌に関する。具体的には、膵臓癌は、膵臓腺癌（例えば膵管腺癌）に加え、膵外分泌部の他の癌（例えば漿液性嚢胞腺腫）、腺房細胞癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）及び膵臓神経内分泌腫瘍（例えばインスリノーマ）を含んだ。
【００４５】
いくつかの実施態様においては、治療有効量の本発明のＯＸ１Ｒアゴニストを、被験体に投与する。
【００４６】
「治療有効量」は、何らかの医療処置に適用しうる合理的なリスク対効果比において、膵臓癌を処置するのに十分な量のＯＸ１Ｒを意味する。本発明の化合物及び組成物の一日あたりの総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で、担当医により決定されるであろうことが理解されよう。いずれかの具体的な被験体についての特定の治療有効投与量レベルは、処置される障害およびその障害の重症度；使用する特定の化合物の活性；使用する特定の組成物、被験体の年齢、体重、一般的健康状態、性別及び食餌；使用する特定の化合物の投与時間、投与系路及び排泄速度；処置の期間；使用する特定のポリペプチドと組み合わせて、又は同時に用いる薬物；及び医療分野において周知の類似の因子をはじめとする、種々の因子に応じて変動するであろう。例えば、化合物の投与量を、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは、十分に当該分野の技術の範囲内である。しかし、製品の一日あたりの投与量は、０．０１〜１，０００mg（成人１人に対して一日あたり）に及ぶ広い範囲で変動しうる。具体的には、処置すべき被験体に対する投与量の、症状に対する調節のため、組成物は、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgの有効成分を含有する。薬剤は、典型的には約０．０１mg〜約５００mg、具体的には１mg〜約１００mgの有効成分を含有する。有効量の薬物を、通常は、一日あたり０．０００２mg/体重kg〜約２０mg/体重kg、特に、一日あたり約０．００１mg/体重kg〜７mg/体重kgの投与量レベルで供給する。
【００４７】
本発明のＯＸ１Ｒアゴニストは、その薬学的に許容され得る賦形剤、及び場合により、生分解性ポリマーのような徐放マトリックスと組み合わせて、治療組成物を形成してもよい。
【００４８】
「薬学的に」又は「薬学的に許容され得る」とは、必要に応じて哺乳類、特にヒトに投与するとき、副作用、アレルギー反応その他の有害な反応を生じない、分子の実体及び組成物を指す。薬学的に許容され得る担体又は賦形剤とは、無毒な固体、半固体又は液体である、あらゆる様式の充填剤、希釈剤、カプセル化材料又は製剤助剤を指す。
【００４９】
本発明の、経口、舌下、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与用の医薬組成物においては、活性成分を単独で、又は他の活性成分と組み合わせて、単位剤形で、従来の医薬用担体（pharmaceutical supports）との混合物として、動物及び人間に投与することができる。適切な単位剤形には、錠剤、ゲルカプセル、散剤、顆粒剤及び経口用懸濁液又は溶液といった経口経路の剤形、舌下及びバッカル投与剤形、エアゾール、埋め込み、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、くも膜下及び経鼻投与剤形並びに直腸投与剤形が含まれる。
【００５０】
具体的には、医薬組成物は、注射しうる製剤のための、薬学的に許容され得る媒体を含有する。これらは具体的には、等張滅菌塩溶液（リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム又はマグネシウム等、又はそのような塩の混合物）、又は、場合により滅菌水又は生理食塩水を添加すると、注射用液剤の構成が可能になる乾燥（特に凍結乾燥）組成物であってよい。
【００５１】
注射用の使用に適した剤形には、滅菌水溶液又は水性分散液；ゴマ油、ラッカセイ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。いずれの場合も、この剤形は滅菌されていなければならず、また容易に注射できる（easy syringability exists）程度に流動性があらねばならない。製造及び保管の条件下において安定であらねばならず、また細菌、真菌といった微生物の汚染作用に対して保存されていなければならない。
【００５２】
本発明の化合物を遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩として含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水の中に調製することができる。分散液は、グリセリン、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物、並びに油中でも調製することができる。通常の保管及び使用の条件下において、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含有する。
【００５３】
本発明のＯＸ１Ｒアゴニストは、中性又は塩の形態で組成物に処方することができる。薬学的に許容し得る塩には、例えば塩酸又はリン酸といった無機酸、又は、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等といった有機酸と形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）が含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩もまた、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化鉄（ＩＩＩ）といった無機塩基、及び、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等といった有機塩基から導出しうる。
【００５４】
担体はまた、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物及び植物油を含有する溶媒又は分散媒でありうる。例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、必要な粒子径の維持（分散液の場合）により、また界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の種々の抗菌及び抗真菌剤（antibacterial and antifuCASK agents）により、微生物の作用の防止をもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば糖類又は塩化ナトリウムを含有することが好ましいであろう。注射用組成物における吸収の延長は、同組成物における吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によりもたらすことができる。
【００５５】
滅菌注射液は、必要量の活性ポリペプチドを、必要に応じて、先に列挙した種々の他の成分と共に、適切な溶媒に加え、次いで濾過滅菌（filtered sterilization）することにより調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌した有効成分を、基本の分散媒及び先に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌した媒体に加えることにより調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、減圧乾燥及び凍結乾燥技術であり、これは、有効成分の粉末と、追加の所望の成分（あれば）を合わせたものを、予め滅菌濾過したそれらの溶液から生成する。
【００５６】
溶液は、製剤されると、投与製剤と適合する様式で、また治療に有効であるような量で投与されるであろう。製剤は、前記注射用溶液の様式のような、種々の投与形態で容易に投与することができるが、薬物放出カプセルなどもまた使用することができる。
【００５７】
水溶液で非経口投与するためには、例えば、必要であれば溶液を緩衝化すべきであり、また液体希釈剤をまず十分な食塩又はグルコースで等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適している。このことに関連して、使用しうる滅菌水性媒体は、本開示に照らして、当業者には公知であろう。例えば、１回分の投与量を、等張ＮａＣｌ溶液１mLに溶解することもでき、皮下注入流体１０００mLに添加することもでき、また提案された注入部位に注射することもできるであろう。処置される被験体の様態に応じて、いくらかの投与量の変動が必然的に生じるであろう。いずれにしても、投与についての責任者が、個々の被験体についての適切な投与量を決定するであろう。
【００５８】
本発明のＯＸ１Ｒアゴニストは、投与１回分に、約０．０００１〜１．０ミリグラム、又は約０．００１〜０．１ミリグラム、又は約０．１〜１．０ミリグラム（約１０ミリグラムさえも）を含むように、治療混合物に処方しうる。投与複数回分の投与も可能である。
【００５９】
静脈内又は筋肉内注射のような、非経口投与用に処方された本発明の化合物に加えての、他の薬学的に許容され得る形態には、例えば、錠剤その他の経口投与用固体；リポソーム製剤；徐放性カプセル；及びその他の現在用いられている形態が含まれる。
【００６０】
いくつかの実施態様において、本発明のＯＸ１Ｒアゴニストは、化学療法剤と組み合わせて用いられる。化学療法剤には、チオテパ及びシクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなアルキルスルホナート類；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）及びウレドーパ（uredopa）のようなアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスホルアミド（triethiylenethiophosphoramide）及びトリメチロロメラミン（trimethylolomelamine）をはじめとするエチレンイミン類及びメチラメラミン類（methylamelamines）；アセトゲニン類（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン(合成類似体のトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン類（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体のＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エスタムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードのような窒素マスタード類；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムスチンのようなニトロソウレア類；エンジイン抗生物質のような抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンガンマＩＩ及びカリケアミシンオメガＩＩ；ダイネミシンＡをはじめとするダイネミシン；クロドロナートのようなビスホスホナート；エスペラミシン；また、ネオカルジノスタチンクロモフォア及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア）、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、アントラマイシン（authrarnycin）、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カラビシン（carabicin）、カミノマイシン（caminomycin）、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、ケラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートのような葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジンのようなピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎薬；フロリン酸（frolinic acid）のような葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（aldophosphamide glycoside）；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルシン；ジアジコン；エフロルニチン（elformithine）；酢酸エリプチニウム；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；エポチロン；エトグルシド；レンチナン；ロニダミン（lonidainine）；メイタンシン及びアンサミトシンのようなメイタンシノイド類；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（mopidanmol）；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（特にＴ−２トキシン、ベラクリンＡ（verracurin A）、ロリジンＡ及びアングイジン)；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えばパクリタキセル及びドキセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンのような白金配位錯体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロナート；イリノテカン（例えばＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（difluoromethylomithine）（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸のようなレチノイド類；カペシタビン；および前記のあらゆるものの薬学的に許容し得る塩、酸又は誘導体が含まれるが、それらに限定されない。
【００６１】
本発明の更なる目的は、膵臓癌の処置を、それを必要とする（in thereof）被験体において行う方法であって、ｉ）前記被験体から得られた腫瘍組織試料におけるＯＸ１Ｒの発現レベルを測定する工程；ｉｉ）工程ｉ）で測定された前記発現レベルを、基準値と比較する工程；及びｉｉｉ）工程ｉ）で測定された前記レベルが前記基準値より高い場合、前記被験体に、治療有効量のＯＸ１Ｒアゴニストを投与する工程を含む方法に関する。
【００６２】
ＯＸ１Ｒの発現レベルは、当技術分野において周知のいかなる方法で測定してもよい。例えば、ｍＲＮＡの量を測定する方法は、当技術分野において周知である。典型的には、まず試料（例えば、患者から調製した細胞又は組織）に含まれる核酸を、標準的方法に従って、例えば、溶解酵素又は化学物質溶液を用いて抽出するか、又は、製造元の説明書に従い、核酸結合樹脂を用いて抽出する。次に、抽出したｍＲＮＡをハイブリダイゼーション（例えばノーザンブロット分析）及び／又は増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲ）により検出する。好ましくは、定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。リアルタイムの定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲが特に有利である。或いは、免疫組織化学（ＩＨＣ）法を用いてもよい。ＩＨＣは、試料又は組織標本中のターゲットをインサイチューで検出する方法を特異的に提供する。ＩＨＣでは、試料の全体的な細胞の完全性が維持され、よって、関心あるターゲット（即ちＯＸ１Ｒ）の存在及び位置の両方の検出が可能になる。典型的には、試料をホルマリンで固定し、パラフィンに埋め込み、染色及びそれに次ぐ光学顕微鏡での観察のため、切って切片とする。現行のＩＨＣ法は、直接ラベリング、或いは二次抗体に基づく、又はハプテンに基づくラベリングのいずれかを用いる。公知のＩＨＣシステムの例には、例えば、EnVision（商標）（DakoCytomation）、Powervision（登録商標）（Immunovision, Springdale, AZ）、NBA（商標）キット（Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA）、HistoFine（登録商標）（Nichirei Corp, Tokyo, Japan）が含まれる。特定の実施態様においては、腫瘍組織切片を、ＯＸ１Ｒに対する抗体と共にインキュベーションした後、スライドその他の支持体に据え付けてもよい。次いで、適切な固体支持体に据え付けた試料において、顕微鏡観察を行ってよい。顕微鏡写真作成のため、試料を含む切片を、スライドグラスその他平面状の支持体に据え付け、選択的染色により関心あるタンパク質の存在を強調してもよい。
【００６３】
「基準値」は、「閾値」又は「カットオフ値」でありうる。典型的には、「閾値」又は「カットオフ値」は、実験的に、経験的に又は理論的に決定することができる。当業者には認識されていることであろうが、閾値はまた、実験上及び／又は臨床上の現状に基づき、恣意的に選択することもできる。閾値は、試験の機能と、リスク対効果のバランス（偽陽性及び偽陰性の臨床上の重要性）に照らして、最適化された感度及び特異性が得られるように決定されなければならない。典型的には、最適化された感度及び特異性（閾値もそうであるが）は、実験データに基づく受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて決定することができる。典型的には、閾値は、ＯＸ１Ｒアゴニストによる処置を受けるのに十分な量のＯＸ１Ｒレベルを有する、１以上の被験体に由来する腫瘍組織試料において測定されたＯＸ１Ｒ発現レベル（又は比、又はスコア）から導出される。更に、これらの閾値の確立には、適切に保存された過去の（historical）被験体試料における、ＯＸ１Ｒ発現レベル（又は比、又はスコア）の遡及的な測定を用いてもよい。
【００６４】
本発明の更なる目的は、膵臓癌を処置するための薬物をスクリーニングする方法であって、ｉ）複数の試験物質を提供する工程；ｉｉ）前記試験物質がＯＸ１Ｒアゴニストであるかを決定する工程；及びｉｉｉ）ＯＸ１Ｒアゴニストである前記試験物質を肯定的に選択する工程を含む方法に関する。
【００６５】
典型的には、本発明のスクリーニング方法は、表面にオレキシン−１レセプターが発現している適切な細胞を提供する工程を含む。そのような細胞には、哺乳類、酵母、ショウジョウバエ又は大腸菌からの細胞が含まれる。具体的には、オレキシン−１レセプターをコードするポリヌクレオチドを用いて細胞をトランスフェクションし、レセプターを発現させる。次いで、発現させたレセプターを、試験物質及び必要に応じてオレキシン−１レセプターのリガンド（例えばオレキシン類）と接触させて、ＳＨＰ−２の動員及び細胞の細胞アポトーシスの誘発といった、機能的反応の活性化を観測する。機能的アッセイは、El Firar A, Voisin T, Rouyer-Fessard C, Ostuni MA, Couvineau A, Laburthe M. Discovery of a functional immunoreceptor tyrosine-based switch motif in a 7-transmembrane-spanning receptor: role in the orexin receptor OX1R-driven apoptosis. FASEB J. 2009 Dec;23(12):4069-80. doi: 10.1096/fj.09-131367. Epub 2009 Aug 6に記載されているように行いうる。具体的には、比較工程は、試験物質により誘発された活性と、オレキシンのような周知のＯＸ１Ｒアゴニストにより誘発された活性を比較することを含みうる。具体的には、周知のＯＸ１Ｒアゴニストと類似の、又はそれよりもよりよい活性を有しうる物質を、ポジティブに選択する。
【００６６】
典型的には、本発明のスクリーニング方法はまた、細胞表面に存在するオレキシン−１レセプターに結合しうる試験物質のスクリーニングをも含みうる。典型的には、試験物質を標識（例えば放射性標識で）し、結合をオレキシンのような周知のＯＸ１Ｒアゴニストと比較する。調製物を標識ＯＸ１Ｒと共にインキュベーションし、ＮＧＡＬと結合した試験物質の複合体を単離して、当技術分野において公知の日常的な方法に従い特徴付けを行う。或いは、ＯＸ１Ｒを固相支持体に結合させて、細胞から可溶化させた結合性分子がカラムに結合し、次いで溶出して日常的な方法に従い特徴付けされるようにしてもよい。もう一つの実施態様では、ＮＧＡＬにより調節されるシグナル伝達又は制御経路の分子のような、ＮＧＡＬと結合する分子を発現する細胞から、細胞内コンパートメントを調製してもよい。調製物を、候補化合物の存在下又は不在下に標識ＮＧＡＬと共にインキュベーションする。候補化合物の結合性分子と結合する能力は、標識リガンドとの結合の減少に反映される。
【００６７】
典型的には、候補化合物は、小有機分子、ペプチド、ポリペプチド又はオリゴヌクレオチドからなる群より選択される。
【００６８】
肯定的に選択された試験物質を、膵臓癌の処置のためのその特性を更にアッセイするという観点から、更なる選択工程に付してもよい。例えば、肯定的に選択された候補化合物を、膵臓癌の動物モデルにおけるその特性を更にアッセイするという観点から、更なる選択工程に付してもよい。
【００６９】
膵臓癌の処置に有用でありうる薬物を開発するために、前記アッセイは、試験物質を同定するための高スループットのスクリーニング技術を用いて行ってよい。高スループットのスクリーニング技術は、自動化されたロボットシステムを用いて複数のアッセイを行うため、多穴プレート（例えば、９６、３８９又は１５３６穴プレート）を用いて行ってよい。よって、試験物質の大きなライブラリーを、高効率な様式でアッセイしうる。より具体的には、マイクロタイタープレート（９６穴又は３８４穴）のウェルで増殖する、安定的にトランスフェクションした細胞を、化合物のライブラリーの高スループットのスクリーニングに適合させることができる。ライブラリー中の化合物は、前記のトランスジェニック細胞を含有するマイクロタイター皿のウェルに、自動化された様式で１種ずつ適用されよう。アポトーシス性シグナルを活性化する試験物質が同定されたら、更なる特徴付けのためにそれらを肯定的に選択する（slected fro）ことができる。これらのアッセイは、いくつかの利点を提供する。試験物質を丸ごとの細胞に曝露することは、その活性を、その試験物質が作用しうる自然な状況において評価することを可能にする。このアッセイは、マイクロタイタープレートのフォーマットにおいて容易に行えるので、記載されたアッセイを自動化されたロボットシステムによって行うことができ、このことが、多数の試料を、合理的に短い期間内に試験することを可能にする。本発明のアッセイは、これまで試験されていない化合物又は抽出物の活性を評価するためのスクリーンに用いることができ、この場合には、単一の濃度を試験して対照と比較する。本発明のアッセイはまた、ある範囲、例えば１００μM〜１μMの範囲を試験し、アポトーシスが最大になる濃度を計算することにより、化合物の相対的効力を評価するのにも用いることができる。
【００７０】
以下の図面及び実施例により、本発明を更に説明する。ただし、これらの実施例及び図面は、いかなる様式であれ本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、ＡｓＰＣ−１細胞を異種移植したヌードマウスへのオレキシン−Ａ注射により誘発された、腫瘍の縮小を示す。
【００７２】
実施例
オレキシンは、睡眠／覚醒の制御に関与する視床下部ペプチドである。本発明者らは、オレキシンが、結腸直腸癌細胞における活発なアポトーシスを促進することを示した。細胞死は、ＯＸ１Ｒ配列中の２個のＩＴＩＭ（免疫受容体チロシン抑制性モチーフ）の存在並びにチロシンホスファターゼＳＨＰ−２の動員及び活性化が関与するオリジナルの機構を通じて、オレキシン１レセプター（ＯＸ１Ｒ）により媒介される。クラスＩＧＰＣＲであるＯＸ１Ｒは、原発結腸直腸腫瘍及び肝転移において異常に発現する。膵管腺癌（ＰＡＣ）は、予後不良の極めて悪性の腫瘍である。化学療法処置は、不十分な奏効率を示す。本発明者らは、免疫組織化学により、大半の膵臓腺癌におけるＯＸ１Ｒの発現を示したが、このことは、試験したＰＡＣの９８％におけるＯＸ１Ｒの異所性発現を示唆するものである。
【００７３】
この研究の目的は、１／ヒトＰＡＣ細胞株におけるＯＸ１Ｒの存在を調査し、アポトーシスに関連するオレキシン−Ａの効果を解析すること；２／オレキシン−Ａに応答した腫瘍増殖の検討のため、ＯＸ１Ｒを発現する細胞株から、インビボ異所性異種移植モデルを開発することであった。３つのＰＡＣ細胞株（ＡｓＰＣ−１、ＨＰＡＦ−ＩＩ及びＳＷ１９９０）において、ｍＲＮＡ（ＲＴ−ＰＣＲ）、タンパク質（免疫細胞化学）及び機能のレベルで、ＯＸ１Ｒの発現を検討した。ＯＸ１Ｒを発現する細胞株からの動物モデル（異所性異種移植）の開発は、腫瘍増殖におけるオレキシン−Ａの効果を検討することを可能にした。切除した腫瘍を、免疫組織化学により解析した。ＡｓＰＣ−１細胞のみが、ＯＸ１Ｒを発現する。
【００７４】
オレキシン−Ａによる処置は、ミトコンドリア性アポトーシスを促進することにより、細胞増殖阻害を３２％促進した。本発明者らは、ＳＨＰ阻害剤ＮＳＣ−８７８７７を用いて、同阻害剤の、ＡｓＰＣ−１細胞におけるオレキシン誘発アポトーシスを逆転する能力を示した。ＡｓＰＣ−１細胞を異種移植したヌードマウスへのオレキシン−Ａ注射は、処置した場合において、腫瘍の進行を４９％減少させた。全ての腫瘍は、サイトケラチン７、ＣＡ９（低酸素症のマーカー）及びＯＸ１Ｒを発現する低分化腺癌に相当するものであった。オレキシン−Ａで処置した（カスパーゼ−３が活性化された）腫瘍では、アポトーシスの誘発が観測された。
【００７５】
結論として、この研究は、ＰＡＣにおけるオレキシンの抗腫瘍及びアポトーシス促進効果を示した。このことに関連して、オレキシンレセプターは、膵臓の抗腫瘍治療及び／又は前臨床診断における新しい有望な標的に相当する。
【００７６】
参考文献
本願全体にわたり、本発明が関連する分野の状態を、種々の参考文献が記載している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【図１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年12月7日(2018.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載される発明。
【外国語明細書】
2019038842000001.pdf