(57)【要約】【課題】長期保存安定性に優れる化学発光試薬組成物及び化学発光試薬キットを提供する。【解決手段】化学発光試薬組成物は、１，２−ジオキセタン誘導体と、金属塩と、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシル−３−アミノプロパンスルホン酸及び２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１,３−プロパンジオール、並びに、非イオン性界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種と、を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，２−ジオキセタン誘導体と、
金属塩と、
Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシル−３−アミノプロパンスルホン酸及び２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１,３−プロパンジオール、並びに、非イオン性界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種と、
を含む、化学発光試薬組成物。
【請求項２】
更に、化学発光増強剤を含む、請求項１に記載の化学発光試薬組成物。
【請求項３】
前記非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアリールエーテル及びポリオキシエチレンアルキルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は請求項２に記載の化学発光試薬組成物。
【請求項４】
前記１，２−ジオキセタン誘導体は、下記一般式（１）で表される化合物である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の化学発光試薬組成物。
【化１】
2019082428.tif 000008
[一般式（１）中、Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子若しくはハロゲン原子を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ４はＯＰＯ３２−・２Ｍ＋で表わされる基を表す。前記Ｍは、ナトリウム原子、カリウム原子又はＮＨ４を表す。]
【請求項５】
前記金属塩は、マグネシウム塩である、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の化学発光試薬組成物。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の化学発光試薬組成物と、
酵素と、
を含む化学発光試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学発光試薬組成物及び化学発光試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＥＩＡ）は、標識物である酵素と基質との反応によって起こる発色量、蛍光量又は発光量を測定して、測定対象物を定量する測定法である。
ＥＩＡの中でも、酵素と化学発光基質との反応による発光量を測定する化学発光酵素免疫測定法（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＣＬＥＩＡという）は、測定時間が短く、かつ、高感度であることから、ＨＩＶ、ＨＣＶ等のウイルス、その他生体内微量成分等を測定するために広く用いられている。
【０００３】
化学発光基質である１，２−ジオキセタン誘導体は、発光時間が長く、高感度な測定が可能であるため、近年注目されており、更なる感度の向上、測定操作の改善等が行われている（例えば、特許文献１参照）。
また、１，２−ジオキセタン誘導体を安定化させてＣＬＥＩＡの測定感度を維持するために、１，２−ジオキセタン誘導体に糖を添加することにより安定化する技術が開示されている（例えば、特許文献２参照）。
熱安定性に優れた化学発光用材料として、１，２−ジオキセタン誘導体の溶液、並びに、カチオン性界面活性剤および蛍光性物質を含有する溶液、を有することを特徴とする、化学発光用材料が開示されている（例えば、特許文献３参照）。
抗原等の検体中の測定対象成分を測定するに際して、反応温度等の影響を受けずに正確な測定を可能とする、検体中の測定対象成分の測定方法として、検体中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第１抗体とを、脂肪酸アルカノールアミド存在下に反応させる測定方法が開示されている（例えば、特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平３−７２４８９号公報
【特許文献２】特開平５−１４０１４６号公報
【特許文献３】特開２０１４−１４１６４２号公報
【特許文献４】特開２０１５−７６５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１には、１，２−ジオキセタン誘導体の安定性についての評価はなされていない。また、特許文献４にはアルカリフォスファターゼの基質と、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝剤が記載されているが、保存安定性について何ら示唆されていない。
【０００６】
特許文献２〜特許文献４において、ジエタノールアミン緩衝剤で希釈調製した１，２−ジオキセタン誘導体の溶液では、最大１４日間までの安定性が得られているものの、更に長期間保管した場合の安定性の評価はなされていない。
この点について発明者らが検討したところ、１，２−ジオキセタン誘導体をジエタノールアミン緩衝剤で希釈調製すると、１，２−ジオキセタン誘導体の分解が進むため、酵素と反応による発光量が保存日数に依存して急激に減少し、ＣＬＥＩＡの感度が低下する傾向がある。
そのため、１，２−ジオキセタン誘導体を含む溶液の長期保存した場合の更なる安定性の向上が求められている。
【０００７】
本発明は、上記のような事情に鑑みてなされたものであり、長期保存安定性に優れる化学発光試薬組成物及び化学発光試薬キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らが鋭意検討した結果、金属塩と、特定の化合物及び非イオン性界面活性剤の少なくとも１種と、を含有することで、１，２−ジオキセタン誘導体中のジオキセタン構造部分の分解が抑制され、長期間保存安定性に優れることを見出した。
【０００９】
すなわち、上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の態様が含まれる。
＜１＞  １，２−ジオキセタン誘導体と、
金属塩と、
Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）及び２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１,３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）、並びに、非イオン性界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種と、
を含む、化学発光試薬組成物。
＜２＞  更に、化学発光増強剤を含む、＜１＞に記載の化学発光試薬組成物。
＜３＞  前記非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアリールエーテル及びポリオキシエチレンアルキルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種である、＜１＞又は＜２＞に記載の化学発光試薬組成物。
＜４＞  前記１，２−ジオキセタン誘導体は、下記一般式（１）で表される化合物である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の化学発光試薬組成物。
【００１０】
【化１】
2019082428.tif 000002
【００１１】
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子若しくはハロゲン原子を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ４はＯＰＯ３２−・２Ｍ＋で表わされる基を表す。前記Ｍは、ナトリウム原子、カリウム原子又はＮＨ４を表す。
【００１２】
＜５＞  前記金属塩は、マグネシウム塩である、＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の化学発光試薬組成物
＜６＞  ＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の化学発光試薬組成物と、
酵素と、
を含む化学発光試薬キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の一実施形態によれば、長期保存安定性に優れる化学発光試薬組成物及び化学発光試薬キットを提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の一実施形態の化学発光試薬組成物及び化学発光試薬キットについて説明する。
なお、本明細書において、数値範囲における「〜」は、「〜」の前後の数値を含むことを意味する。本明細書に段階的に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本明細書に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本明細書において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合は、特に断らない限り、組成物中に存在する該複数の物質の合計量を意味する。
【００１５】
《化学発光試薬組成物》
本発明の化学発光試薬組成物（以下、単に「試薬組成物」ともいう。）は、１，２−ジオキセタン誘導体と、金属塩と、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）及び２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１,３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）（以下、「特定化合物」ともいう。）、並びに、非イオン性界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種と、を少なくとも含む。
本発明の化学発光試薬組成物は、上記構成を有することで１，２−ジオキセタン誘導体の分解を抑制するので、長期保存安定性に優れる。そのため、長期保存後の本発明の試薬組成物を用いて化学発光酵素免疫測定法を行った場合であっても、測定対象成分を高感度に検出可能な程度の発光量が得られる。
以下、本発明の試薬組成物が含有する各成分の詳細について説明する。
【００１６】
＜１，２−ジオキセタン誘導体＞
本発明の試薬組成物は、１，２−ジオキセタン誘導体を含む。
１，２−ジオキセタン誘導体は化学発光基質であるので、酵素と反応（すなわち、酵素反応）して発光する。例えば、酵素標識物質等と結合した検出対象成分と、試薬組成物中の１，２−ジオキセタン誘導体と、を反応させて、１，２−ジオキセタン誘導体の分解により得られる発光量を測定することで、検出対象成分を定量又は検出することができる。
【００１７】
１，２−ジオキセタン誘導体としては、下記一般式（１）で表される化合物が挙げられる。
【００１８】
【化２】
2019082428.tif 000003
【００１９】
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子若しくはハロゲン原子を表し、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ４はＯＰＯ３２−・２Ｍ＋で表わされる基を表す。前記Ｍは、ナトリウム原子、カリウム原子又はＮＨ４を表す。
【００２０】
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ３におけるハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子が挙げられる。
これらの中でも、反応性の観点から、ハロゲン原子としては、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子であることが好ましく、塩素原子又は臭素原子であることがより好ましく、塩素原子であることが更に好ましい。
【００２１】
反応性の観点から、Ｒ１及びＲ３としては、それぞれ独立に、水素原子、塩素原子、臭素原子若しくはヨウ素原子であることが好ましく、水素原子、塩素原子若しくは臭素原子であることがより好ましく、水素原子若しくは塩素原子であることが更に好ましい。
【００２２】
一般式（１）中、Ｒ２で表される炭素数１〜４のアルキル基は、直鎖又は分岐鎖であってもよい。
炭素数１〜４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基又はイソプロピル基が挙げられる。
標識酵素との反応性の観点から、Ｒ２としては、直鎖の炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましく、直鎖の炭素数１又は２のアルキル基であることがより好ましく、メチル基であることが更に好ましい。
【００２３】
Ｒ４としては、ＯＰＯ３２−・２Ｎａ＋又はＯＰＯ３２−・２Ｋ＋で表される基であることが好ましく、ＯＰＯ３２−・２Ｎａ＋で表される基であることがより好ましい。
【００２４】
一般式（１）において、Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、塩素原子、臭素原子若しくはヨウ素原子であり（より好ましくは水素原子、塩素原子若しくは臭素原子であり、更に好ましくは水素原子若しくは塩素原子である。）、Ｒ２は炭素数１〜３の直鎖のアルキル基であり（より好ましくは炭素数１又は２の直鎖のアルキル基であり、更に好ましくはメチル基である。）、Ｒ３は水素原子又は塩素原子、臭素原子若しくはヨウ素原子であり（より好ましくは水素原子又は塩素原子若しくは臭素原子であり、更に好ましくは水素原子又は塩素原子である。）、Ｒ４は、ＯＰＯ３２−・２Ｎａ＋又はＯＰＯ３２−・２Ｋ＋で表される基であることが好ましい（より好ましくはＯＰＯ３２−・２Ｎａ＋で表される基である。）。
【００２５】
以下、一般式（１）で表される１，２−ジオキセタン誘導体の具体例を示す。但し、１，２−ジオキセタン誘導体は以下の具体例によって限定されることはない。下記具体例において、一般式（１）中のＭは、ナトリウム原子又はカリウム原子を表す。
【００２６】
【化３】
2019082428.tif 000004
【００２７】
一般式（１）で表される１，２−ジオキセタン誘導体は、合成して得てもよく、市販品を用いてもよい。製造コスト及び入手のしやすさから、１，２−ジオキセタン誘導体としては、市販品を用いることが好ましい。
【００２８】
１，２−ジオキセタン誘導体の具体例としては、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ（登録商標）、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社製）、２−クロロ−５−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）、ロシュ・ライフサイエンス社製）、３−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＳＰＤ（登録商標）、ロシュ・ライフサイエンス社製）、［１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニルイデン］フェノキシメチルリン酸・二ナトリウム塩（Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＡＰＳ−５、ルミガン社製）及び９−（４−クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン・二ナトリウム塩等が挙げられる。
【００２９】
これらの中でも、標識酵素との反応性の観点から、１，２−ジオキセタン誘導体は、ＡＭＰＰＤ（登録商標）、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）及びＣＳＰＤ（登録商標）からなる群より選択される少なくとも１種を用いることが好ましく、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）及びＣＳＰＤ（登録商標）の少なくとも一方を用いることがより好ましく、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）であることが更に好ましい。
【００３０】
１，２−ジオキセタン誘導体の含有量は、目的に応じて適宜選択することができる。１，２−ジオキセタン誘導体の含有量としては、０．０１ｍＭ〜０．５ｍＭであることが好ましく、より好ましくは０．０３ｍＭ〜０．３ｍＭである。
【００３１】
＜金属塩＞
本発明の試薬組成物は、金属塩を含む。酵素活性は、金属塩の存在下で高まるため、１，２−ジオキセタン誘導体と酵素との反応効率も高めることができる。
【００３２】
酵素活性の観点から、金属塩としては、２価の金属塩であることが好ましい。
２価の金属元素としては、マグネシウム、亜鉛、カルシウム、銅、鉄、バリウム等が挙げられる。
２価の金属塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化鉄等が挙げられる。
これらの中でも、測定感度の観点から、金属塩としては、マグネシウム塩であることが好ましく、塩化亜鉛及び塩化マグネシウムの少なくとも一方であることがより好ましく、塩化マグネシウムであることが更に好ましい。
金属塩は１種を単独で用いてもよく、又は２種以上を併用してもよい。
【００３３】
金属塩の含有量としては、通常用いる範囲であれば特に制限はない。酵素反応速度の観点から、０．５ｍＭ〜２ｍＭであることが好ましく、０．５ｍＭ〜１ｍＭであることがより好ましい。
【００３４】
＜特定化合物＞
本発明の試薬組成物は、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）及び２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１,３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）（特定化合物）、並びに、非イオン性界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種と、を含む。
特定化合物は、１，２−ジオキセタン誘導体のジオキセタン構造部分に作用し、ジオキセタン構造の分解（ジオキセタン環の開環）の抑制に寄与すると推察される。
本発明の試薬組成物は、１，２−ジオキセタン誘導体と特定化合物とを含むことで、長期保存安定性に優れる。
【００３５】
長期保存安定性の観点から、特定化合物としては、ＣＨＥＳ及びＣＡＰＳＯの少なくとも一方であることが好ましく、ＣＨＥＳであることがより好ましい。
特定化合物が、例えば、環構造などの疎水性を示す構造を有する場合、１，２−ジオキセタン誘導体のジオキセタン環の開環を更に抑制することが可能となる。
【００３６】
特定化合物のｐＨは、特に制限されず、目的により適宜調整することができる。
特定化合物のｐＨとしては、例えば、７〜１２の範囲であることが好ましく、８〜１１の範囲であることがより好ましい。
【００３７】
長期保存安定性の観点から、特定化合物の含有量としては、０.０５Ｍ〜３Ｍであることが好ましく、０．１Ｍ〜２Ｍであることがより好ましい。
【００３８】
＜非イオン性界面活性剤＞
本発明の試薬組成物は、特定化合物及び非イオン性界面活性剤の少なくとも一方を含む。非イオン性界面活性剤は、構造中に疎水性領域と親水性領域とを有するので、１，２−ジオキセタン誘導体に作用し、１，２−ジオキセタン誘導体のジオキセタン構造部分の分解を抑制すると推察される。
本発明の試薬組成物は、１，２−ジオキセタン誘導体と非イオン性界面活性剤とを含むことで、長期保存安定性に優れる。
【００３９】
非イオン性界面活性剤としては、１，２−ジオキセタン誘導体の分解を抑制できるものであれば特に制限されない。
非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアリールエーテル、ポリオキシアルキレン誘導体、アルキルアルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アルキルイミダゾリン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、脂肪族アルコールエトキシレート、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール等が挙げられる。
【００４０】
ポリオキシエチレンアリールエーテルとしては、例えば、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリスチリル化エーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン−プロピレンポリスチリル化エーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンパラクミルフェニルエーテルが挙げられる。
これらの中でも、長期保存安定性の観点から、ポリオキシエチレンアリールエーテルとしては、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル及びポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルの少なくとも一方であることが好ましい。
【００４１】
ポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルドデシルエーテル、ポリオキシエチレンコレステリルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンペンタエリスリトールエーテルが挙げられる。
これらの中でも、長期保存安定性の観点から、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、アルキル基の炭素数が１２〜１４であるポリオキシエチレンアルキルエーテルであることが好ましい。
【００４２】
これらの中でも、長期保存安定性の観点から、非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアリールエーテル及びポリオキシエチレンアルキルエーテルの少なくとも一方であることが好ましく、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル及びポリオキシエチレンアルキルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましい。
【００４３】
非イオン性界面活性剤としては、市販されているものを用いてもよく、例えば、商品名「Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００」、「Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−４０５」（以上、ダウ・ケミカル社製）、「ニューコール７０３」、「ニューコール７０４」、「ニューコール７０６」、「ニューコール７０７」、「ニューコール７０８」、「ニューコール７０９」、「ニューコール７１０」、「ニューコール７１１」、「ニューコール７１２」（以上、日本乳化剤株式会社製）、「ノイゲンＥＡ−８７」、「ノイゲンＥＡ−１３７」、「ノイゲンＥＡ−１５７」、「ノイゲンＥＡ−１６７」、「ノイゲンＥＡ−１７７」、「ノイゲンＥＡ−１９７Ｄ」、「ノイゲンＥＡ−２０７Ｄ」（以上、第一工業製薬株式会社製）、「エマルゲン７０５」、「エマルゲン７０７」、「エマルゲン７０９」（以上、花王株式会社製）が挙げられる。
【００４４】
非イオン性界面活性剤の分子量は特に制限されない。非イオン性界面活性剤の分子量は、例えば、数平均分子量で４０〜１００００であることが好ましく、５０〜１０００であることがより好ましい。
【００４５】
長期保存安定性の観点から、非イオン性界面活性剤の含有量としては、組成物の全質量に対して、０.０５Ｍ〜３Ｍであることが好ましく、０．１Ｍ〜２Ｍであることがより好ましい。
【００４６】
＜化学発光増強剤＞
本発明の試薬組成物は、更に化学発光増強剤（以下、「エンハンサー」と称する場合がある。）を含むことが好ましい。
本明細書において化学発光増強剤とは、１，２−ジオキセタン誘導体の化学発光を増強する作用をもつ化合物を示す。
１，２−ジオキセタン誘導体の化学発光の増強作用の有無は、例えば、化学発光増強剤を用いずに化学発光させた場合の発光強度と、化学発光増強剤を用いて化学発光させた場合の発光強度とを、それぞれ検出装置（発光光度計）で測定し、それぞれの発光強度の値を比較して確認することができる。
【００４７】
化学発光増強剤としては、例えば、ポリ（ビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロライド）（ＴＢＱ）、ポリ［ビニル（ベンジルジメチルアンモニウムクロライド）］（ＢＤＭＱ）、ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド）（ＴＭＱ）、ポリ（ビニルベンジルトリエチルアンモニウムクロライド）（ＴＥＱ）、ポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロリド等の４級アンモニウム塩ポリマー、フルオレセイン等が挙げられる。
これらの中でも、化学発光増強剤としては、発光強度の観点から、４級アンモニウム塩ポリマーであることがより好ましく、検出感度の点から、ポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロリドを含む市販品である、Ｅｍｅｒａｌｄ−ＩＩＴＭ（ＴＲＯＰＩＸ社製）であることが好ましい。
【００４８】
化学発光増強剤の含有量としては、通常用いる範囲であれば特に制限はなく、所望する発光強度に応じて適宜調整することが可能である。
【００４９】
＜その他の添加剤＞
本発明の試薬組成物は、必要に応じて、前記化合物以外のｐＨ調整剤、保存安定性を確保するためにアジ化ナトリウム等の保存剤などの添加剤を適宜含有していてもよい。
【００５０】
ｐＨ調整剤としては、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、塩酸、水酸化ナトリウム等が挙げられる。
【００５１】
本発明の試薬組成物は、ＡＭＰＰＤ（登録商標）、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）及びＣＳＰＤ（登録商標）からなる群より選択される少なくとも１種の１，２−ジオキセタン誘導体と（より好ましくはＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）及びＣＳＰＤ（登録商標）の少なくとも一方であり、更に好ましくはＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）である。）、２価の金属塩と（より好ましくは塩化亜鉛及び塩化マグネシウムの少なくとも一方であり、更に好ましくは塩化マグネシウムである。）、ＣＨＥＳ及びＣＡＰＳＯ、並びに、ポリオキシエチレンアリールエーテル及びポリオキシエチレンアルキルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種と（より好ましくはＣＨＥＳ及びオクチルフェノールエトキシレートの少なくとも一方である。）、を含有することが好ましい。
【００５２】
本発明の試薬組成物は、検体又は試料中に含まれる検出対象成分の検出及び定量を目的とする測定法に適用することができる。中でも、本発明の試薬組成物は、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）に好適に用いることができる。
【００５３】
化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）における検出対象成分としては、特に制限されず、例えば、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺ホルモン（ＴＳＨ）等のホルモン、ＡＦＰ、ＣＥＡ等の癌関連物質、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）等のウイルス抗原並びにその抗体及び核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）等を挙げられる。
【００５４】
本発明の試薬組成物を用いて化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）により、検出対象成分を検出又は測定する方法としては、例えば以下の工程を含む方法が挙げられる。但し、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００５５】
上記検出対象成分を検出する方法としては、例えば、検出対象成分が抗原である場合、抗原に対して特異的に結合する抗体を予め固相化（固相化抗体）させておき、この固相化抗体と、検出対象成分である抗原を含む試料と、抗原に対して特異的に結合する抗体を酵素標識した抗体（酵素標識抗体）と、を混合する工程と、未反応の酵素標識抗体を洗浄分離した後に、本発明の試薬組成物を加える工程と、１，２−ジオキセタン誘導体の分解による発光量を測定する工程と、を経ることで検出対象成分を検出することができる。
１，２−ジオキセタン誘導体の分解による発光量は、酵素量、すなわち、検出対象成分と結合した酵素標識抗体の量に比例して増加するため、発光量を測定することにより、検出対象成分を定量することができる。
【００５６】
化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）における検体又は試料として、特に制限はなく、例えば、ヒト及び動物の血液、尿、唾液、血清、血漿、糞便等が挙げられる。
【００５７】
抗原と固相化抗体との反応時間は、抗原と固相化抗体とが反応できれば特に制限はなく、例えば、１分間〜３０分間であってもよい。
このときの反応温度としては、抗原と固相化抗体とが反応可能であれば特に制限はなく、例えば４℃〜４０℃であり、反応効率の観点から、好ましくは２５℃〜３８℃である。
【００５８】
固相化抗体及び酵素標識酵素に用いる抗体は、例えば、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれを用いてもよい。
抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、ヒト等の動物種由来のものでもよく、特に制限されない。また、抗体としては、例えば、動物種由来の血清から、従来公知の方法により作製してもよく、あるいは市販の各種抗体を利用してもよく、特に制限されない
【００５９】
固相化抗体は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
固相としては、例えば、磁性粒子、ビーズ、プレート等が挙げられる。後述のＢ／Ｆ分離を行いやすい観点から、固相化抗体としては、磁性粒子に固相化された抗体であることが好ましい。
固相化抗体は、従来公知の方法により固相化した固相化抗体を用いてもよく、又は、市販の固相化抗体を利用してもよい。
【００６０】
酵素標識抗体における酵素としては、特に制限されず、例えば、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）が挙げられる。
取り扱い易さ、入手し易さ等の観点から、酵素としては、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）であることが好ましい。
酵素標識する方法は、特に制限されず、例えば、従来公知の方法を用いて酵素標識してもよい。
【００６１】
未反応の酵素標識抗体を洗浄する方法としては、抗体と結合している抗原（Ｂｏｎｄ）と、抗体と結合していない抗原（Ｆｒｅｅ）とが分離（Ｂ／Ｆ分離）できれば特に制限されず、従来公知の方法を用いることができる。
Ｂ／Ｆ分離の方法としては、比重差を利用した遠心分離、溶解度差を利用して沈降法、磁気を利用した分離法等が挙げられる。
【００６２】
Ｂ／Ｆ分離の回数としては、特に制限はなく、例えば、１回〜５回、より好ましくは３回〜４回程度である。
【００６３】
固相化抗体と抗原と酵素標識抗体とを混合する時間としては、固相化抗体と抗原と酵素標識抗体とを含む複合体が形成可能であれば特に制限はなく、例えば１分〜３０分間程度であり、好ましくは１分〜５分間程度である。
【００６４】
固相化抗体と抗原と酵素標識抗体とを混合する温度としては、固相化抗体と抗原と酵素標識抗体とを含む複合体が形成可能であれば特に制限はなく、例えば４℃〜４０℃であり、好ましくは２５℃〜３８℃である。
【００６５】
１，２−ジオキセタン誘導体の分解による発光量の測定は、検出装置（発光光度計）を用いて測定することができる。
その際に、発光量の測定の開始点及び積算時間は任意であるが、発光量が安定し且つ発光量の濃度依存性の高い時間を選択することが好ましい。
例えば、測定開始点は、上記複合体と試薬組成物又は特定試薬とを混合した後、０〜１時間、好ましくは０〜３０分、特に好ましくは０〜１５分であり、測定の積算時間は１秒〜１分、好ましくは１秒〜３０秒、特に好ましくは１秒〜１０秒である。
【００６６】
《化学発光試薬キット》
本発明の化学発光試薬キットは、本発明の試薬組成物と、酵素と、を含む。
化学発光試薬キットは、本発明の試薬組成物を含むので、１，２−ジオキセタン誘導体の分解が抑制される。そのため、化学発光試薬キットは長期保存安定性に優れ、化学発光試薬キットを用いて化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）を行った場合、検出対象成分を高感度に検出することができる。
【００６７】
なお、本発明の化学発光試薬キットに含まれる試薬組成物は、既述の試薬組成物の各成分と同様であり、好ましい例、好ましい量、及び、好ましい組合せも同様である。
【００６８】
本発明の化学発光試薬キットに含まれる酵素としては、１，２−ジオキセタン誘導体と反応して、化学発光に寄与する酵素であれば特に制限されない。このような酵素としては、例えば、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）が挙げられる。
【００６９】
本発明の試薬組成物又は化学発光試薬キットは、１，２−ジオキセタン誘導体が分解されにくいので、長期保存安定性に優れる。そのため、測定対象成分を高感度に検出することが可能であり、臨床検査分野等に好適に適用することが可能である。
【実施例】
【００７０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７１】
（実施例１）
＜化学発光試薬溶液の調製＞
最終濃度が１０質量％となるように、化学発光基質溶液（商品名；CDP-StarＴＭ  Substrate(0.4mM Ready-To-Use) with Emerald-IIＴＭ Enhancer、 Size A、Ｔｒｏｐｉｘ社製、製品番号:Ｔ２２１６）２ｍＬを、０．１ＭのＣＨＥＳ緩衝剤（Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸ナトリウム、ｐＨ９．５）及び１ｍＭの塩化マグネシウムを含む緩衝剤（ｐＨ９．５）１８ｍＬに混合し、化学発光試薬溶液を調製した。
【００７２】
上記で調製した化学発光試薬溶液を２５℃に設定した恒温槽で２８日間保存した。
保存開始を０日目とし、０日目並びに保存開始後１４日目及び２８日目の化学発光試薬溶液をそれぞれ評価用試験液とした。この評価用試験液を化学発光基質として用いて、下記測定方法により甲状腺ホルモン（ＴＳＨ）を測定し、長期保存安定性の評価を行った。
【００７３】
[評価]
＜ＣＬＥＩＡによる甲状腺ホルモン（ＴＳＨ）の測定＞
反応容器にＴＳＨ抗体を感作させた磁性微粒子を含む溶液（固相化抗体）５０ｕＬを移し、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）で標識したＴＳＨ抗体（標識酵素抗体）を含む溶液を５０μＬ添加した。
次いで、３０μＩＵ/ｍＬのＴＳＨ抗原を含む標準液を５０μＬ添加し、３７℃で５分間反応させて、酵素標識抗体とＴＳＨ抗原と固相化抗体とを含む複合体を形成させた。
反応後、反応容器にＴＢＳＴ（Tris Buffered Saline with Tween 20；50mM Tris-HCl、150mM NaCl pH7.4、0.05% Tween20）を加えて洗浄した。洗浄を３回繰り返して、未反応の酵素標識抗体をＢ/Ｆ分離したのち、反応容器に化学発光基質として評価用試験液を１５５μＬ添加して、上記複合体と化学発光反応させた。
化学発光反応より得られる発光量を、プレートリーダー（製品名；マルチモードプレートリーダＤＴＸシリーズ  ＤＴＸ  ８００、日本モレキュラーデバイス株式会社製）を用いて測定した。その結果を表１に示す。
なお、保存開始０日目の化学発光試薬溶液を用いてＴＳＨを測定したときの発光量を１００％とした。
【００７４】
（実施例２又は実施例３並びに比較例１〜比較例４）
実施例１において、ＣＨＥＳ緩衝剤を、表１に示す希釈液に変更した以外は実施例１と同様にして化学発光試薬溶液を調製し、同様の条件で２８日間保存した。所定期間保存した化学発光試薬溶液を評価用試験液とし、この評価用試験液を化学発光基質として用いて、実施例１と同様の測定方法でＴＳＨを測定し、長期保存安定性の評価を行った。結果を表１又は表２に示す。
【００７５】
【表１】
2019082428.tif 000005
【００７６】
表１における略号は以下の通りである。
・ＣＨＥＳ緩衝剤（０．１Ｍ  Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸ナトリウム、ｐＨ９．５）
・ＡＭＰＤ緩衝剤（０．１Ｍ  ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１,３−プロパンジオールｐＨ９．５）
・ＣＡＰＳＯ緩衝剤（０．１Ｍ  Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシル−３−アミノプロパンスルホン酸ナトリウム、ｐＨ９．５）
【００７７】
【表２】
2019082428.tif 000006
【００７８】
表２における略号は以下の通りである。なお、表２中の「−」は、測定結果がないことを意味する。
・ＤＥＡ緩衝剤（ジエタノールアミン、ｐＨ９．５）
・Ｂｉｃｉｎｅ緩衝剤（０．１Ｍ  Ｎ，Ｎ−ジ(２−ヒドロキシエチル)グリシンナトリウム、ｐＨ９．５）
・Ｔｒｉｓ緩衝剤（０．１Ｍ  トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸、ｐＨ９．５）
・ＡＭＰＳＯ緩衝剤（０．１Ｍ  ３−[(１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル)アミノ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、ｐＨ９．５）
【００７９】
（実施例４）
＜化学発光試薬溶液の調製＞
化学発光基質溶液（商品名；CDP-StarＴＭ Substrate (0.4 mM Ready-To-Use) with Emerald-IIＴＭ Enhancer  Size A、Ｔｒｏｐｉｘ社製、製品番号:Ｔ２２１６）２ｍＬを０．２５ｍＭのＴｒｉｔｏｎ−Ｘ４０５（非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレン（４０）オクチルフェニルエーテル）及び１ｍＭの塩化マグネシウムを含む０．１Ｍ  ジエタノールアミン緩衝剤（ｐＨ９．５）１８ｍＬを混合した溶液に溶解し、化学発光試薬溶液を調製した。
【００８０】
上記で調製した化学発光試薬溶液を２５℃条件下で２８日間保存した。保存開始を０日目とし、０日目並びに保存開始後７日目、１４日目及び２８日目の化学発光試薬溶液をそれぞれ評価用試験液とした。この評価用試験液を化学発光基質として用いて、実施例１と同様の測定方法で、ＴＳＨを測定し、長期保存安定性の評価を行った。結果を表３に示す。
【００８１】
（実施例５〜実施例８並びに比較例５及び比較例６）
実施例４において、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ４０５を、表２に示す希釈液に変更した以外は実施例４と同様にして化学発光試薬溶液を調製し、この評価用試験液を化学発光基質として用いて、実施例４と同様の測定方法でＴＳＨを測定し、長期保存安定性の評価を行った。
なお、比較例５では、希釈液を添加せずに、１ｍＭの塩化マグネシウムを含む０．１Ｍ  ジエタノールアミン緩衝剤（ｐＨ９．５）に化学発光基質溶液を溶解させて、化学発光試薬溶液を調製した。結果を表３に示す。
【００８２】
【表３】
2019082428.tif 000007
【００８３】
表３における略号は以下の通りである。なお、表３中の「−」は、測定結果がないことを意味する。
・Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ４０５（ポリオキシエチレン（４０）オクチルフェニルエーテル（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）、０．２５ｍＭ）
・Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ポリオキシエチレン(１０)オクチルフェニルエーテル（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）、０．２５ｍＭ）
・ニューコール７１０（ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル（ポリオキシエチレンアリールエーテル）、０．２５ｍＭ、日本乳化剤株式会社製）
・エマルゲン７０５（ポリオキシエチレンアルキルエーテル、０．２５ｍＭ、花王株式会社製）
・ＰＥＧ２０００（ポリエチレングリコール、０．０５質量％、平均重量分子量２０００、商品名；ポリエチレングリコール＃２０，０００、ナカライテスク株式会社製）
【００８４】
表１〜表３に示されるように、１，２−ジオキセタン誘導体と、金属塩と、特定化合物及び非イオン性界面活性剤の少なくとも一方と、を含む実施例１〜実施例７の試薬組成物は、長期保存した場合であっても、特定化合物又は非イオン性界面活性剤を含有しない比較例１〜比較例６の試薬組成物と比べて、発光量が維持されていることが分かる。
従って、本発明の試薬組成物は、長期保存安定性に優れることがわかる。