(57)【要約】【課題】  成熟期以降の被験動物を用いる指標アミノ酸酸化法を提供すること。【解決手段】    被験動物群にタンパク質含有試料を給餌すると共に指標アミノ酸を投与する指標アミノ酸酸化法によりタンパク質代謝要求量を測定する方法であり、  前記被験動物群の被験動物が、成熟期以降の被験動物であり、  前記指標アミノ酸は、１３Ｃ標識の指標アミノ酸を含むものであり、  前記投与する指標アミノ酸の１回当たりの投与量は、被験動物に対して、０．０１〜０．２ミリモル／ｋｇ体重量であることを特徴とする、  タンパク質代謝要求量の測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験動物群にタンパク質含有試料を給餌すると共に指標アミノ酸を投与する指標アミノ酸酸化法によりタンパク質代謝要求量を測定する方法であり、
前記被験動物群の被験動物が、成熟期以降の被験動物であり、
前記指標アミノ酸は、１３Ｃ標識の指標アミノ酸を含むものであり、
前記投与する指標アミノ酸の１回当たりの投与量は、被験動物に対して、０．０１〜０．２ミリモル／ｋｇ体重量であることを特徴とする、
タンパク質代謝要求量の測定方法。
【請求項２】
前記タンパク質含有試料の１回当たりの給餌量が、１日摂取量の１／２４〜１／８量である、及び／又は、前記タンパク質含有試料の給餌間隔が、１〜３時間間隔である、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記指標アミノ酸の投与間隔が、０．５〜１．５時間間隔である、請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記１３Ｃ標識の指標アミノ酸は、前記投与する指標アミノ酸中に４０質量％以上含まれるものであり、及び／又は、被験動物に対して、１３Ｃ標識の指標アミノ酸０．００４〜０．１ミリモル／ｋｇ体重量にて投与させるものである、請求項１〜３の何れか１項に記載の測定方法。
【請求項５】
前記指標アミノ酸の投与は、前記タンパク質含有試料の給餌とは別に行われるものであり、かつ、前記タンパク質含有試料の給餌後に前記指標アミノ酸の投与を開始する、請求項１〜４の何れか１項に記載の測定方法。
【請求項６】
前記タンパク質含有試料に含有させるタンパク質が、食用タンパク質群、並びに当該食用タンパク質由来の分解物及びペプチドから選択される１種又は２種以上のものである、請求項１〜５の何れか１項に記載の測定方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、成人用タンパク質含有組成物に配合するタンパク質の決定方法。
（１）複数種類の食用タンパク質からなる食用タンパク質群から１種類又は複数種類の食用タンパク質を選択する工程、
（２）請求項１〜６の何れか１項に記載の測定方法において、選択された前記食用タンパク質を前記タンパク質含有試料のタンパク質として用い、当該タンパク質含有試料を被験動物に給餌して、タンパク質代謝要求量を測定する工程、
（３）前記食用タンパク質の代謝要求量を指標として、前記組成物における前記食用タンパク質を決定する工程。
【請求項８】
前記成人用タンパク質含有組成物が、高齢者向け飲食品組成物、疾患向け飲食品組成物及びスポーツ向け飲食品組成物からなる群から選択されるいずれかの組成物である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質代謝要求量の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、骨格筋の維持や細胞内シグナル伝達等に利用されているので、体外に失われる窒素量を補いつつ体タンパク質を維持するようにタンパク質を摂取することが重要である。しかし、タンパク質の摂取量を摂取エネルギーで判断すると摂取エネルギー量が十分であっても、身体の構造と機能とを正常にするために必要なタンパク質の摂取量（代謝要求量）が不足する場合がある。そこで、この必要な摂取量をタンパク質必要量として、このタンパク質必要量は窒素出納法によって決定されていた。この窒素出納法にはその方法上の様々な問題点があることから、食事タンパク質必要量の評価方法が種々検討され、そのなかに指標アミノ酸酸化法（非特許文献１及び２）がある。
指標アミノ酸酸化法（ＩＡＡＯ法）は、窒素出納法とは原理が大きく異なり、窒素出納法の代替法として動物とヒトにおいて開発されたものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】栄養学雑誌Vol.69, No.6, 285-293（2011）
【非特許文献２】J. Nutr. Sci. Vitaminol., No.57, 418-425（2011）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
非特許文献１には、この＜指標アミノ酸酸化法の原理＞として、「リシンが第一制限アミノ酸と仮定すると、合成するタンパク質よりも用意したアミノ酸の方が少ない状態（低タンパク質）では、合成すべきタンパク質に必要なリシン量が供給されないので、タンパク質合成量は低下し、他の余った指標アミノ酸は分解され、その炭素骨格は呼気ＣＯ２として排出される。しかし、合成すべきタンパク質に必要な量以上にリシンが供給される（高タンパク質）と、タンパク質はそれ以上合成する必要がないので、指標アミノ酸由来の呼気ＣＯ２の排出量は一定となる。」ことが記載され、この指標アミノ酸酸化法の利点として、指標アミノ酸をかなりの量与えても栄養学的に問題がないこと；測定の精度や正確さについて高いレベルが要求されないこと；また体調や生活スタイルが変化すればその都度適切なタンパク質代謝要求量を算出できること等が挙げられている。
【０００５】
そして、非特許文献１及び２の指標アミノ酸酸化法において若齢期（５〜６週齢）の被験動物のみを使用しているので、本発明者らは、この若齢期以外の年齢層、特に成熟期以降に関するタンパク質代謝要求量を得ようと試みた。このような試みを行う発端として、本発明者らは以下の（１）及び（２）を考えた。
【０００６】
（１）例えば、若齢期は、成長途中であり、筋肉の質・量・形は変化及び増大傾向にある一方で、成熟期以降は、成長が止まり、筋肉の質・量・形は安定傾向又は減少傾向になる。このため、若齢期で求められたタンパク質代謝要求量を、成熟期以降向けのタンパク質含有組成物の設計に利用するには十分に注意が必要である。より具体的には、例えば、ヒトの腎臓病患者は中高年以降で多く発症しているために、指標アミノ酸酸化法を用いて検討する場合、若齢期よりも成熟期以降の被験動物を用いて行う方が適している。
【０００７】
（２）また、例えばマウスやラット等小型動物が多く使用されているが、このような小型被験動物は成長速度も早く若齢期間も短いので、長期的な観点からタンパク質代謝要求量を求めることは難しい。
【０００８】
このようなことから、本発明者らは、後記実施例に示すように、非特許文献２の指標アミノ酸酸化法に従って、若齢期の被験動物ではなく成熟期以降の被験動物を用い、低タンパク食群と高タンパク食群に分けて試験を行った。しかしながら、その結果、低タンパク食群及び高タンパク食群との間で有意差が得られず、タンパク質代謝要求量が測定できなかった。
【０００９】
そこで、本技術は、成熟期以降の被験動物を用いる指標アミノ酸酸化法を確立し提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
非特許文献１の図５の説明に「指標アミノ酸酸化法の原理」として「他の余った指標アミノ酸は分解され、その炭素骨格は呼気ＣＯ２として排出される」とされていること、また、非特許文献１の図５に示す「用意したアミノ酸」のうち指標アミノ酸の量が「合成するタンパク質」に比べ常に高く設定されていることから、指標アミノ酸の投与量は不足しないように高めに設定されていると通常であれば理解する。
【００１１】
しかしながら、本発明者らは、あえて成熟期以降の被験動物に対する指標アミノ酸の経口投与量を、若齢期の被験動物に対する指標アミノ酸の経口投与量よりも大幅に低減させ、半分以下にした。このように指標アミノ酸の経口投与量を減らすことで、被験動物が成熟期以降であっても、低タンパク食群と高タンパク食群との間で有意差が得られた。このようにすればタンパク質代謝要求量が測定できることを本発明者らは全く意外にも見出し、そして本発明を完成させた。
【００１２】
さらに、本発明者らは、１日の給餌間隔を若齢期よりも短くすること、及び／又は、この間隔で給餌する際の１回当たりの給餌量を若齢期よりも減らすことで、低タンパク食群と高タンパク食群との間の有意差がより大きくなることも見出した。
【００１３】
本技術は、以下のとおりである。
〔１〕
被験動物群にタンパク質含有試料を給餌すると共に指標アミノ酸を投与する指標アミノ酸酸化法によりタンパク質代謝要求量を測定する方法であり、
前記被験動物群の被験動物が、成熟期以降の被験動物であり、
前記指標アミノ酸は、１３Ｃ標識の指標アミノ酸を含むものであり、
前記投与する指標アミノ酸の１回当たりの投与量は、被験動物に対して、０．０１〜０．２ミリモル／ｋｇ体重量であることを特徴とする、
タンパク質代謝要求量の測定方法。
〔２〕
前記タンパク質含有試料の１回当たりの給餌量が、１日摂取量の１／２４〜１／８量である、及び／又は、前記タンパク質含有試料の給餌間隔が、１〜３時間間隔である、前記〔１〕に記載の測定方法。
〔３〕
前記指標アミノ酸の投与間隔が、０．５〜１．５時間間隔である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の測定方法。
〔４〕
前記１３Ｃ標識の指標アミノ酸は、前記投与する指標アミノ酸中に４０質量％以上含まれるものであり、及び／又は、被験動物に対して、１３Ｃ標識の指標アミノ酸０．００４〜０．１ミリモル／ｋｇ体重量にて投与させるものである、前記〔１〕〜〔３〕の何れか１つに記載の測定方法。
〔５〕
前記指標アミノ酸の投与は、前記タンパク質含有試料の給餌とは別に行われるものであり、かつ、前記タンパク質含有試料の給餌後に前記指標アミノ酸の投与を開始する、前記〔１〕〜〔４〕の何れか１つに記載の測定方法。
〔６〕
前記タンパク質含有試料に含有させるタンパク質が、食用タンパク質群、並びに当該食用タンパク質由来の分解物及びペプチドから選択される１種又は２種以上のものである、前記〔１〕〜〔５〕の何れか１つに記載の測定方法。
〔７〕
以下の工程を含む、成人用タンパク質含有組成物に配合するタンパク質の決定方法。
（１）複数種類の食用タンパク質からなる食用タンパク質群から１種類又は複数種類の食用タンパク質を選択する工程、
（２）前記〔１〕〜〔６〕の何れか１つに記載の測定方法において、選択された前記食用タンパク質を前記タンパク質含有試料のタンパク質として用い、当該タンパク質含有試料を被験動物に給餌して、タンパク質代謝要求量を測定する工程、
（３）前記食用タンパク質の代謝要求量を指標として、前記組成物における前記食用タンパク質を決定する工程。
〔８〕
前記成人用タンパク質含有組成物が、高齢者向け飲食品組成物、疾患向け飲食品組成物及びスポーツ向け飲食品組成物からなる群から選択されるいずれかの組成物である、前記〔７〕に記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本技術によれば、成熟期以降の被験動物を用いる指標アミノ酸酸化法を確立し提供することができる。なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】従来のＩＡＡＯ法で「成熟期」の被験動物を用いた場合、２２％カゼイン食及び６％カゼイン食における、Δ１３ＣＯ２（‰）／１００ｇ  ＢＷ（縦軸）及び測定時間（横軸）に示す。
【図２】本技術のＩＡＡＯ法で「成熟期」の被験動物を用いた場合、１５％カゼイン食及び１％カゼイン食における、Δ１３ＣＯ２（‰）／１００ｇ  ＢＷ（縦軸）及び測定時間（横軸）に示す。なお＊は有意差があることを示す。
【図３】本技術のＩＡＡＯ法におけるタンパク質代謝要求量の算出を示す。Δ１３ＣＯ２（‰）／１００ｇ  ＢＷ（縦軸）及びタンパク質摂取量（横軸）に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００１７】
本技術は、被験動物群にタンパク質含有試料及び指標アミノ酸を投与する指標アミノ酸酸化法により、タンパク質代謝要求量を測定する方法であり、以下の（ａ）〜（ｃ）を特徴とする方法である。
（ａ）前記被験動物群の被験動物が、成熟期以降の被験動物である。
（ｂ）前記指標アミノ酸は、１３Ｃ標識の指標アミノ酸を含むものである。
（ｃ）前記投与する指標アミノ酸の１回当たりの投与量は、被験動物に対して、０．０１〜０．２ミリモル／ｋｇ体重量（以下、「体重量」を「ＢＷ」ともいう）である。
なお、若齢期における指標アミノ酸の経口投与量は、非特許文献１のＩＡＡＯ法において、一般的に指標アミノ酸のフェニルアラニン約３０〜６０ｍｇ／ｋｇ体重量である。これに対し、本技術における経口投与させる指標アミノ酸の量は、特に、若齢期における指標アミノ酸の経口投与量の半分以下にすることを特徴とする。
【００１８】
なお、本技術の特徴とする部分以外は、非特許文献１記載の指標アミノ酸酸化法に準じて行うことができる。
本技術では、非特許文献１の指標アミノ酸酸化法に準じて、絶食後に試験を開始することが望ましい。また、当該指標アミノ酸酸化法に準じて、絶食前の通常食、その給餌及びその期間、また絶食及びその期間を適宜設定してもよい。
【００１９】
本技術に使用されるタンパク質含有試料の調製は、非特許文献２の指標アミノ酸酸化法に準じて行えばよい。
タンパク質含有試料として、タンパク質代謝要求量を求めるための屈曲点を得るために、少なくとも高タンパク食群及び低タンパク食群になるように、タンパク質含有量が異なる試料を複数用いる。異なる試料数は、少なくとも３種以上が望ましく、５〜１０種類がより望ましい。
また、試料中のタンパク質含有量が異なる場合でも、試料中の指標アミノ酸含有量を一定に保つように同じに調整することが、好ましい。このため、最もタンパク質含有量が高い試料中の指標アミノ酸含有量に合わせて、他の試料中の指標アミノ酸の含有量を添加等で調整することが、好ましい。さらに、指標アミノ酸の代謝物であるアミノ酸の含有量も各試料共に同じに調整することがより望ましい。本技術において、例えば、指標アミノ酸がフェニルアラニンの場合、フェニルアラニンの代謝物であるチロシンを同じに調整することが望ましい。
【００２０】
本技術における被験動物群の外的環境（温度等）及び試験日以外の管理は、非特許文献２の指標アミノ酸酸化法に準じて行えばよい。
例えば、試験日以外は、個別生活とし、食事は自由摂取とすることが挙げられる。
【００２１】
また、本技術における呼気測定器及びこの使用は、非特許文献１の指標アミノ酸酸化法に準じて行えばよい。例えば、各被験動物の呼気測定は、呼気測定器（呼気中の１３ＣＯ２量測定装置）にて「１３ＣＯ２／１２ＣＯ２」の比を測定する。測定開始時の呼気測定データをプレ値（Ｐｒｅ値）とし、「（呼気１３ＣＯ２値（‰）−呼気１３ＣＯ２値Ｐｒｅ値（‰））÷体重（ｇ）×（１００ｇ）」で、「Ｏｖｅｒ  ｂａｓｅｌｉｎｅ  Δ１３ＣＯ２（‰）／１００ｇＢＷ（体重量）値」を求める。
【００２２】
＜被験動物＞
本技術は、使用する被験動物に特徴があるので、以下に詳細を説明する。
本技術に用いられる被験動物の種類は特に限定されず、例えば、ほ乳類等が挙げられる。当該ほ乳類として、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等のネズミ等）、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒト等が挙げられる。このうち、げっ歯類が、コストの観点及び実験モデル構築の容易さの観点から、好適である。
本技術に用いられる被験動物群の個体数は、特に限定されず、４〜８匹程度であればよい。
【００２３】
本技術に用いられる被験動物は、成熟期以降のものである。本技術において「成熟期以降」とは、著しい成長が終了し、体重、体組成、代謝等が安定し始める時期以降をいう。成熟期以降には、「更年期」、「高齢期」も含まれる。「更年期」とは、成熟期で安定していたホルモンバランスが崩れる時期をいい、「高齢期」は、成熟期よりも、肉体的（例えば、筋力、骨、臓器器官）に大幅に低下が見られる時期をいう。
例えば、ラットの場合、「若齢期」は４〜１０週齢、「成熟期以降」は、１２週齢以降とされている。このラットの成熟期以降を、ヒトの成人期、更年期、高齢期に当てはめることが可能である。
【００２４】
本技術では成熟期以降を評価できるため、各ライフステージ別の代謝変化を評価できる。この結果より、各ライフステージ向けの製品（例えば、高齢者向け製品、ロコモ対策用製品、更年期向け製品等）を検討することができる。また、本技術では加齢によるタンパク質の代謝変化を評価することができる。この結果より、加齢対策の製品を検討することができる。
本技術では被験動物の各種モデルを適宜使用することもできるので、各種モデル（運動モデル（例えば、廃用性筋萎縮モデル、強制運動モデル等）、疾患モデル（例えば、精神的ストレスモデル、遺伝子欠損動物によるモデル等））を使用してタンパク質代謝の変化を評価することができる。これにより、各種製品（スポーツ向け、疾患向け等）のタンパク質含有量の裏付けデータにすることも可能である。
本技術では、成熟期以降で評価できるため、好適なタンパク質含有組成物として、成熟期以降、いわゆる成人病又はその予備軍の疾患向け組成物；スポーツ向けの組成物（プロテイン）；高齢者向け組成物等が挙げられ、これら各組成物は製品とすることができる。
【００２５】
＜経口投与工程＞
本技術の経口投与工程は、被験動物群に指標アミノ酸を投与することを特徴とする。当該指標アミノ酸の経口投与は、後述するタンパク質含有試料の給餌と同時期に又は別々に行われてよく、本技術は被験動物群にタンパク質含有試料を給餌すると共に指標アミノ酸を投与する。これらを別々に投与する場合、タンパク質含有試料を給餌する前又は給餌した後に、指標アミノ酸を投与してもよい。
好適には、被験動物群にタンパク質含有試料を給餌するとともにこの給餌とは別に指標アミノ酸を経口投与することである。これにより、より精度良くタンパク質代謝要求量を測定することができる。
より好適には、前記指標アミノ酸の投与は前記タンパク質含有試料の給餌とは別に行われるものであり、かつ前記タンパク質含有試料の給餌後に前記指標アミノ酸の投与を開始することである。これにより、より精度良くタンパク質代謝要求量を求めることができる。
【００２６】
＜給餌＞
本技術において、被験動物群にタンパク質含有試料を給餌することを特徴とするので、以下に詳細を説明する。
〔タンパク質含有試料〕
本技術において、タンパク質含有量が異なる試料を複数用いることが望ましい。指標アミノ酸酸化法においてタンパク質代謝要求量を求めるために、タンパク質含有量が異なる試料を複数調製する。当該タンパク質含有量の差は、通常、最高と最低の差が１０〜３０質量％になることが望ましい。なお、複数調製されたタンパク質含有試料は、それぞれタンパク質含有量が異なるため、当該タンパク質に由来する指標アミノ酸の含有量も異なる。本技術において、タンパク質含有試料中の指標アミノ酸の含有量を揃える必要があるため、任意の指標アミノ酸量に合わせてタンパク質含有試料に指標アミノ酸を添加して含有量を調整することが望ましく、 タンパク質含有量が最も高いタンパク質含有試料中の指標アミノ酸量に合わせることがより望ましい。
【００２７】
タンパク質含有試料中の指標アミノ酸含量は、当該試料１００ｇ当たり、好ましくは０．１〜１０ミリモルであり、より好ましくは１〜９ミリモルであり、さらに好ましくは２〜８ミリモルであり、よりさらに好ましくは４〜７ミリモルである。または、タンパク質含有試料中の指標アミノ酸含量は、当該試料１００ｇ当たり、好ましくは１７〜１６５０ｍｇであり、より好ましくは１６５〜１４８７ｍｇであり、さらに好ましくは３３０〜１３２２ｍｇであり、よりさらに好ましくは６７０〜１２００ｍｇである。
【００２８】
タンパク質含有試料の給餌開始時〜給餌終了時（試料回収時）までの間は、当該試料を被験動物が自由に摂取できることが望ましい。
【００２９】
前記タンパク質含有試料に含有させるタンパク質は、特に限定されず、任意のタンパク質を選択することができる。より好適には、前記タンパク質が、食用タンパク質群、並びに当該食用タンパク質由来の分解物及び当該食用タンパク質由来のペプチドから選択される１種又は２種以上のものである。
【００３０】
前記食用タンパク質は、飲食品として使用可能なタンパク質であれば特に限定されず、例えば、天然物、抽出物、加工物又はこれらのうち２種類以上の混合物が挙げられる。当該食用タンパク質として、例えば、脱脂粉乳、乳タンパク質（ホエイタンパク質、カゼインタンパク質、ラクトフェリン等）、大豆粉末、分離大豆タンパク質、卵、卵白、アルブミン等が挙げられる。また、アミノ酸スコアの高いものを選択してもよい。
【００３１】
また、前記食用タンパク質由来の分解物は、前記食用タンパク質の加水分解物であることが好適であり、さらに、酸加水分解、アルカリ加水分解又は酵素加水分解から選択される手段で行うことが好適であり、このうち酵素加水分解がより好ましい。当該酵素としては、例えば、ペプチダーゼが挙げられ、当該ペプチダーゼとしてエンド型ペプチダーゼ及ヘキソ型ペプチダーゼが挙げられるが、エンド型ペプチダーゼがさらに好ましい。酵素処理条件は、処理温度、処理ｐＨ、処理時間等を適宜調整してもよい。また、酵素分解物をさらに分離精製した分離精製物を使用してもよい。
また、前記食用タンパク質由来のペプチドは、アミノ酸残基数が特に限定されず、高分子ペプチドであってもよく低分子ペプチドであってもよく、例えば、アミノ酸残基数が２〜３０のものが好適である。
【００３２】
前記「アミノ酸スコア」は、アミノ酸組成に基づくタンパク質の栄養評価法に用いられるスコアであり、食品に含まれるタンパク質の各必須アミノ酸含量を一定の基準値（アミノ酸評点パタン）と比較した際の比較割合（百分率）の最小値のことをいう。当該最小値が１００を上回る場合、タンパク質のアミノ酸スコアは１００とみなすのが通例であるが、しかし本技術において、当該最小値が１００を上回る場合であっても、当該最小値をそのままアミノ酸スコアと定義してもよい。前記基準値としては、例えば、ＦＡＯ（国連食糧農業機関）によって推奨されたアミノ酸評点パタン（amino acid scoring patterns、〔Report of an FAO Expert Consultation. Dietary protein quality evaluation in human nutrition 2011  「Dietary protein quality evaluation in human nutrition」:Table.5 Recommended amino acid scoring patterns for infants, children and older children, adolescents and adults, :No.92:29-43（2013）〕のＴａｂｌｅ．５参照）を使用することができる。なお、本技術では、当該評点パタンが将来的に更新される場合があっても、その使用を妨げるものではない。
具体的には、タンパク質１ｇ当たりのアミノ酸含量（ｍｇ）の各アミノ酸の評点パタンに対する割合（％）を計算し、最も小さい数値を示すアミノ酸の評点パタンに対する割合（％）を「アミノ酸スコア」と定義することが可能である。
【００３３】
〔給餌量〕
本技術における試験開始後の「１回当たりのタンパク質含有試料の給餌量」及び／又は試験開始後の「タンパク質含有試料の給餌間隔」は、特に限定されない。なお、本技術における「給餌間隔」とは、試料給餌と試料給餌との間の期間である。
【００３４】
本技術における試験開始後の「１回当たりのタンパク質含有試料の給餌量」（以下、「１回当たりの給餌量」ともいう。）は、下限値として「１日摂取量」の１／４８量以上であることが好ましく、また、上限値として、「１日摂取量」の１／３量以下であることが好ましい。当該範囲として、より好ましくは、「１日摂取量」の１／２４〜１／８量であり、さらに好ましくは１／２４〜１／１２である。給餌する１回当たりのタンパク質含有試料を被験動物が全摂取することが好適である。これにより、日常の食事の摂取によるタンパク質代謝により近い条件で成熟期以降のタンパク質代謝要求量を測定することができる。
【００３５】
また、後述する経口投与される指標アミノ酸とは別に、１回当たりのタンパク質含有試料の給餌において前記タンパク質含有試料から摂取される指標アミノ酸の量は、０．００１〜０．５ミリモルであることが好ましく、０．００５〜０．３ミリモルであることがより好ましく、０．０１０〜０．１５ミリモルであることがさらに好ましく、よりさらに好ましくは０．０３〜０．１５ミリモルである。
また、前記タンパク質含有試料から摂取される指標アミノ酸の量は、１回当たりのタンパク質含有試料の給餌において、０．００２〜１．１ミリモル／ｋｇ体重であることが好ましく、０．０１〜０．６５ミリモル／ｋｇ体重であることがより好ましく、０．０２〜０．５５ミリモル／ｋｇ体重であることがさらに好ましく、０．０５〜０．４５ミリモル／ｋｇ体重であることがさらに好ましい。
【００３６】
なお、本技術における「１日摂取量」（以下、「通常食時の１日当たりの平均摂取量」ともいう。）は、被験動物の各個体の１日当たりの平均的な食事（飼料）の摂取量であり、これが適性に求められる手法であれば、決定手段は特に制限されない。例えば、所定期間における被験動物の１日の摂取量平均値を決定する方法；被験動物において一般的な食事量が定まっている場合にはこれを指標として決定する方法；及び被験動物の基礎代謝量を測定して必要カロリーを算出し、当該必要カロリーを指標として飼料の摂取量を決定する方法等を例示することができる。このうち、本技術においては、試験開始前１〜５日間における被験動物用飼料の各日の摂取量を測定し、当該測定値から各被験動物の１日当たりの平均摂取量を算出する方法が好ましく、試験開始前の３日間における被験動物用飼料の各日の摂取量を測定し、当該測定値から各被験動物の１日当たりの平均摂取量として算出した値であることがより好ましい。このとき、被験動物用飼料は通常食でよく、当該通常食は被験動物に自由摂取させてよい。
【００３７】
また、本技術における、試験開始後の「１回当たりの給餌量」は、「通常食時の１日平均給餌量」を「所定値」で割ったものである。当該「所定値」は任意に設定することができる。このため、「１回当たりの給餌量」に「１日当たりの給餌回数」を乗じても「通常食時の１日平均給餌量」とは一致しない場合がある。
本技術における試験開始後の「タンパク質含有試料の給餌間隔」は、下限値が０．５時間以上であることが好ましく、上限値は４時間以下であることが好ましい。当該範囲として、より好ましくは１〜３時間間隔であり、さらに好ましくは１．５〜２．５時間の間隔である。これにより、体内のアミノ酸濃度が安定した状態で正確に呼気中１３ＣＯ２量を測定することができる。
【００３８】
〔給餌期間〕
本技術における試験開始後の給餌期間は、特に限定されず、適宜設定することができる。当該給餌期間とは、試験開始時〜終了後の期間である。
被験動物がげっ歯類の場合、好ましくは６〜１０時間であり、より好ましくは７〜９時間である。この期間であれば同一の生活リズムで短期間に複数の試験群を行うことができるので、当該給餌期間にすることが作業効率の観点から望ましい。
また、本技術におけるタンパク質の総給餌量は特に限定されず、適宜設定することができる。
【００３９】
＜指標アミノ酸経口投与＞
本技術において、指標アミノ酸の投与は特に限定されないが、指標アミノ酸は、前記タンパク質含有試料の給餌とは別に経口投与することが好ましい。
〔経口投与用指標アミノ酸〕
本技術における経口投与に使用される指標アミノ酸（以下、「経口投与用指標アミノ酸」ともいう）は、必須アミノ酸であることが好ましく、少なくともバリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン又はリシンを含むことがより好ましく、このうちフェニルアラニンであることがさらに好ましい。
経口投与用指標アミノ酸は、１３Ｃ標識の指標アミノ酸を含むものである。この１３Ｃを含ませることによって、呼気測定工程において、呼気中の１３Ｃを含む二酸化炭素量を測定することができる。
なお、非特許文献１では炭酸水素塩（及び１３Ｃ標識の炭酸水素塩を含む）を経口投与している。本技術において、非特許文献１と同様に炭酸水素塩（及び１３Ｃ標識の炭酸水素塩）を経口投与してもよい。
【００４０】
本技術における指標アミノ酸の経口投与の投与間隔は、特に限定されず、下限値として好ましくは０．１時間以上、より好ましくは０．５時間以上であり、さらに好ましくは１時間以上であり、また、上限値として好ましくは５時間以下、より好ましくは４時間以下である。当該範囲として、より好ましくは０．５〜４時間、さらに好ましくは０．５〜３時間であり、さらに好ましくは０．５〜１．５時間であり、より好ましくは０．５〜１時間である。これにより、呼気中の１３ＣＯ２量をより正確に測定することができる。
【００４１】
本技術における経口投与の回数は、特に限定されず、下限値として好ましくは２回以上、より好ましくは３回以上であり、また、上限値として好ましくは１０回以下、より好ましくは８回以下である。当該範囲として、より好ましくは３〜８回、さらに好ましくは４〜６回である。また、投与形態としては、強制経口投与が好ましい。
【００４２】
本技術における経口投与用の指標アミノ酸の1回当たりの経口投与量は、被験動物に対して、下限値として好ましくは０．０１ミリモル／ｋｇ体重量以上であり、上限値として好ましくは０．２ミリモル／ｋｇ体重量以下である。当該範囲として、より好ましくは、０．０１〜０．１２ミリモル／ｋｇ体重量、さらに好ましくは０．０２〜０．１ミリモル／ｋｇ体重量であり、よりさらに好ましくは０．０３〜０．０６ミリモル／ｋｇ体重量であり、よりさらに好ましくは０．０３６〜０．０５５ミリモル／ｋｇ体重量である。これにより、成熟期以降のタンパク質代謝要求量をより正確に得ることができる。
【００４３】
本技術において、経口投与用の指標アミノ酸中における経口投与用の１３Ｃ標識アミノ酸を高濃度で含むものを、及び／又は、特定量の１３Ｃ標識アミノ酸を、被験動物に対して経口投与することが好適である。
【００４４】
本技術における１３Ｃ標識の指標アミノ酸は、経口投与用の指標アミノ酸中に２０質量％以上含まれることが好ましく、より好ましくは４０質量％以上であり、さらに好ましくは６０質量％以上であり、さらに好ましくは８０質量％以上であり、さらに好ましくは９９質量％以上であり、よりさらに好ましくは１３Ｃ標識の指標アミノ酸のみ（１００質量％）を経口投与に使用することである。なお、１３Ｃ標識の指標アミノ酸は、公知の製法にて合成したものを使用してもよく、市販品を使用してもよい。
【００４５】
本技術における経口投与用の１３Ｃ標識の指標アミノ酸の1回あたりの経口投与量は、被験動物に対して、下限値として好ましくは０．００４ミリモル／ｋｇ体重量以上、より好ましくは０．０１ミリモル／ｋｇ体重量以上であり、より好ましくは０．０３５ミリモル／ｋｇ体重量以上であり、より好ましくは０．０４ミリモル／ｋｇ体重量以上であり、よりさらに好ましくは０．０５ミリモル／ｋｇ体重量以上である。
また、当該経口投与用の１３Ｃ標識の指標アミノ酸の1回あたりの経口投与量は、被験動物に対して、上限値として好ましくは０．１ミリモル／ｋｇ体重量以下、さらに好ましくは０．０８ミリモル／ｋｇ体重量以下、よりさらに好ましくは０．０６ミリモル／ｋｇ体重量以下である。
また、当該経口投与用の１３Ｃ標識の指標アミノ酸の1回あたりの経口投与量の範囲として、被験動物に対して、好ましくは０．００４〜０．１ミリモル／ｋｇ体重量、より好ましくは０．０３〜０．０８ミリモル／ｋｇ体重量、さらに好ましくは０．０３６〜０．０５４ミリモル／ｋｇ体重量である。これにより、成熟期以降のタンパク質代謝要求量をより正確に得ることができる。
【００４６】
また、本技術において、被験動物に対して５〜１５ｍｇ／ｋｇ体重量の１３Ｃ標識アミノ酸を経口投与した後に、１〜３時間間隔で、２〜１２ｍｇ／ｋｇ体重量の１３Ｃ標識アミノ酸を少なくとも３回経口投与量させることが、好ましい。
【００４７】
本技術における指標アミノ酸の経口投与の開始（第１回目）は、前記タンパク質含有試料の第１回目の給餌後に行うことが好ましい。また、第２回目以降の経口投与と給餌の時期とが重なる場合には、経口投与に次いで給餌の順で行うことが好ましい。
また本技術における指標アミノ酸の経口投与量は、第１回目と第２回目以降とで、変更することが好ましい。
【００４８】
本技術における第１回目の指標アミノ酸の経口投与量は、非特許文献１に記載の指標アミノ酸酸化法における第１回目の指標アミノ酸の経口投与量と比較して、１/２〜１/３倍に低く設定することが望ましい。これにより成熟期以降のタンパク質代謝要求量をより正確に得ることができる。
なお、被験動物がげっ歯類の場合、非特許文献１に記載の指標アミノ酸酸化法における第１回目のフェニルアラニンの経口投与の総量（１２Ｃ及び１３Ｃ）は、３３ｍｇ／ｋｇ体重量であり、第２回目以降の量は目安として６０ｍｇ／ｋｇ体重量ｋｇである。
【００４９】
また、本技術における第２回目以降の指標アミノ酸の経口投与量を、第１回目の経口投与量と比較し、少なくすることが、より好ましい。
【００５０】
本技術における経口投与の間隔は、特に限定されず、下限値として好ましくは０．５時間以上、より好ましくは１時間以上であり、また、上限値として好ましくは５時間以下、より好ましくは４時間以下である。当該範囲として、より好ましくは１〜４時間、さらに好ましくは１．５〜３時間である。これにより成熟期以降のタンパク質代謝要求量をより正確に得ることができる。
【００５１】
＜呼気測定工程及びタンパク質代謝要求量決定工程＞
各被験動物群に対し、各試料を給餌するとともに指標アミノ酸を経口投与する＜経口投与工程＞を上述したように行い、各被験動物群の呼気測定を行う。
斯様にして、異なるタンパク質含有量の試料ごとに被験動物群を用いて試験を実施する。このように異なる試料を用いて実施することで、タンパク質摂取量と呼気中の１３Ｃを含む二酸化炭素量とに相関関係が得られる。
得られたこのタンパク質摂取量と呼気中の１３Ｃ量の相関関係に基づいて、屈曲点を求め、この屈曲点を被験動物のタンパク質代謝要求量として決定することができる。この屈曲点は、biphase linear regression crossover modelやmixed-effect change-point regression models等により算出することができる。参考文献１（K. Hayamizu et al., J. Clin. Biochem. Nutr., 2011, Vol. 49, No.2, pp.115-120）では、mixed-effect change-point regression modelsがより好ましいことが示されている。統計解析には、統計ソフト「Ｒ」や「ＳＡＳ」等を使用することができる。また、本技術の呼気測定方法及びタンパク質代謝要求量の計算方法は、非特許文献２に記載の指標アミノ酸酸化法に準じて行うことができる。
【００５２】
＜本技術における別の態様＞
本技術では、同一の被験動物群に対して異なる時期に、又は被験動物群を複数使用して同時期に、試験を行うことが可能である。
指標アミノ酸酸化法においてタンパク質代謝要求量を求めるために、同一の被験動物群に対して、異なる時期に（例えば、一定の間隔日数をおきながら）、異なるタンパク質含有量の試料を摂取させて試験を行ってもよい。
【００５３】
本技術は成熟期を用いるため若齢期と異なり生体状態が安定であるので、同一個体の被験動物群を、試験時期をずらして使用することが可能である。このように、同一個体の被験動物群を使用できることは、コストの観点から有利である。また、同一個体の被験動物群を使用するため、個体差が生じにくく、代謝機能（特に呼吸量）がほぼ同じであるので、タンパク質代謝要求量を精度良く測定することも可能である。
同一個体を連続的に使用するとき、試料中のタンパク質含有量が高い設定から低い設定の順に繰り返す個体と、低い設定から高い設定の順に繰り返す個体に分けることが望ましい。いずれの順序で投与するかはランダムに決定することも可能であるが、被験動物の全群を半数に分け、一方を順次試料中のタンパク質含有量を低から高にし、他方をその逆に順次試料中のタンパク質含有量を高から低にすることが好ましい。そして、このパターンを試験ごとに交互に入れ替えることで、被験動物群の体重量の均一化を行うことが好ましい。
【００５４】
また、複数の被験動物群に対して、同時期に、異なるタンパク質含有量の試料を摂取させて試験を行ってもよく、この場合には歳（年齢又は週齢）を合わせて同時期に行うことができるので、歳に関連するタンパク質代謝要求量が精度良く測定することが可能である。
【００５５】
＜本技術の用途＞
上述したように、本技術によれば、成熟期以降の被験動物を用いる指標アミノ酸酸化法を提供することができる。これにより、成熟期以降の被験動物を用いて、タンパク質代謝要求量を測定することができる。
さらに、本技術によれば、長期での試験が可能となり、また成人向けや高齢者向け、高齢ペット向け等といった成熟期以降用の製品又は成熟期以降の疾患別製品の設計への応用も期待できる。
【００５６】
＜本技術を用いる目的対応のタンパク質含有組成物の設計方法＞
また、本技術は、以下の工程を含む目的対応のタンパク質含有組成物を提供することも可能である。また、本技術は、成人用タンパク質含有組成物に配合するタンパク質の決定方法を提供することも可能である。このように、本技術を用いれば、目的に適したタンパク質の質評価を行うこともできる。なお、上述した内容と共通する構成についてはその説明を省略する。
（１）複数種類の食用タンパク質からなる食用タンパク質群から１種類又は複数種類の食用タンパク質を選択する工程、
（２）本技術の測定方法において、選択された前記食用タンパク質の代謝要求量を測定する工程、
（３）前記食用タンパク質の代謝要求量を指標として、前記組成物における前記食用タンパク質を決定する工程。
前記（２）において、より好適には、選択された前記食用タンパク質をタンパク質含有試料のタンパク質として用いる；当該選択された食用タンパク質を含有する試料を被験動物に給餌する；そして、タンパク質代謝要求量を測定する工程である。
【００５７】
また、本技術は、以下の工程を含む目的対応の食用素材を提供することも可能である。また、本技術は、成人用タンパク質含有組成物に配合する食用素材の決定方法を提供することも可能である。なお、上述した内容と共通する構成についてはその説明を省略する。
なお、当該食用素材は、食用可能な素材であれば特に限定されず、既知又は新規な素材でもよく、当該食用素材として、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、炭水化物（例えば、単糖、オリゴ糖、多糖等）、有機化合物（炭化水素、複素環系、例えば、ハロゲン、酸素、硫黄、窒素等を含む特性基を有する化合物）、油脂（動植物性油脂、微生物性油脂等）等が挙げられる。当該食用素材の被験動物への投与時期は、特に限定されず上述の本技術の測定方法の試験開始前から投与してもよい。
【００５８】
本技術の目的対応の食用素材を決定するための態様として、以下の工程が挙げられる。
（１）複数種類の食用素材からなる食用素材群から１種類又は複数種類の食用素材を選択する工程、
（２）本技術の測定方法において、選択された前記食用素材を前記タンパク質含有試料と同時期に又は別々に被験動物に投与する；そしてタンパク質代謝要求量を測定する工程、
（３）前記タンパク質の代謝要求量を指標として、前記組成物における前記食用素材を決定する工程。
【００５９】
このように本技術の食用素材の決定方法を用いれば、タンパク質代謝を調節可能な食用素材を見出すと共に、タンパク質及び食用素材の適した組み合わせを見出すこともできる。
タンパク質の代謝要求量を指標とする場合、当該要求量が低くなる食用素材はタンパク質代謝を改善させるものと云え、当該要求量が高くなる食用素材はタンパク質代謝を低下させるものと云える。これにより、用途に応じて又は食用タンパク質に応じて食用素材を選択又は回避することができる。
【００６０】
また、本技術の測定方法を用いて食品素材を決定してタンパク質代謝改善用組成物を設計する方法、すなわち、本技術は、以下の工程を含む、タンパク質代謝改善用組成物の設計方法を提供することも可能である。
（１）複数種類の食用素材からなる食用素材群から１種類又は複数種類の食用素材を選択する工程、
（２）本技術の測定方法により、選択された前記食用素材の投与に伴う食用タンパク質代謝要求量の変化を測定する工程、
（３）前記食用タンパク質の代謝要求量の変化を指標として、前記組成物における食用素材を決定する工程。
【００６１】
具体的には、任意の食用素材を選択し、当該食用素材をタンパク質代謝異常の被験動物に投与する群と投与しない群とを設定し、各群の被験動物について本技術の測定方法によりタンパク質代謝要求量を測定する。
次いで、各群のタンパク質代謝要求量に差が生じた場合であって、前記食用素材の投与によりタンパク質代謝要求量が低くなった場合、当該食品素材はタンパク質代謝改善効果を有すると判断する。したがって、当該食品素材を含有するタンパク質代謝改善用組成物とすることができる。
このようにして複数の食品素材のタンパク質代謝改善効果を評価し、改善効果の高い食用素材を使用して、タンパク質代謝改善用組成物を調製することができる。  
【００６２】
前記目的対応のタンパク質含有組成物のうち成人用タンパク質含有組成物が好ましく、当該成人用タンパク質含有組成物として、例えば、高齢者向け飲食品組成物、疾患別飲食品組成物、スポーツ向け飲食品組成物等が挙げられ、当該組成物を製品にしてもよい。
本技術では目的に対応するため、これに適した被験動物を選択することができる。従来のアミノ酸酸化法では若齢期を用いていたが、しかし本技術では若齢期に制限されることなく成熟期以降を用いることを可能とした。
すなわち、本技術では目的に適した被験動物を選択することが可能となったので、目的に合致した食用タンパク質の質をより正確に評価することができる。
【００６３】
本技術は、健常であり且つ成熟期以降の被験動物を用いることができる。高齢者を想定する場合老齢マウス等を用いることがあるが、本技術であれば健常状態で更年期や高齢期にさせた被験動物を使用することができる。これにより更年期や高齢期のタンパク質代謝要求量をより正確に得ることができるので、選択された食用タンパク質の質をより正確に評価することができる。
【００６４】
本技術は、若齢期以外でも使用することができるので、成熟期以降の疾患別のモデル被験動物を用いることができる。疾患別モデルとして、例えば、腎臓病モデル、糖尿病モデル、高血圧モデル、脳卒中モデル、及び脂質代謝異常モデル等が挙げられる。これにより成熟期以降で発症する疾患（いわゆる成人病）又はその発症前の境界領域に対するタンパク質代謝要求量をより正確に得ることができる。これにより、疾患別に選択された食用タンパク質の質をより正確に評価することができる。
【００６５】
本技術によれば、タンパク質の質を評価しつつ、より良質なタンパク質の原料選定のため又は良質なタンパク質に変化させる食用素材の原料選定のための裏付けのデータを幅広く得ることができる。
本技術によれば、加齢によるタンパク質代謝変化の評価ができ、これによりライフステージ別の代謝変化を評価することができる。高齢者向け製品におけるタンパク質含有量の裏付けデータが得られる。
本技術によれば、各種モデルを用いた評価ができ、これにより各種モデル（運動、疾患、遺伝子欠損等）における代謝量の変化を評価し、各種製品（スポーツ製品、疾患別製品など）のタンパク質含有量の裏付けデータが得られる。
本技術によれば、任意の食用素材投与によるタンパク質代謝変化を評価することも可能であり、製品組成の参考データにすることができる。
【００６６】
本技術によれば、いずれも成熟期のラットを用いることで、「ヒトでは困難なモデルを用いた評価（疾患など）」や、「若齢期では難しい長期の試験（運動モデル、複数のタンパク質の比較など）」が可能になる。
【００６７】
また、本技術のタンパク質代謝要求量は、前記のとおり、タンパク質の摂取量と呼気中の１３ＣＯ２量との関係のプロットから算出することができる。しかし、本技術のタンパク質代謝要求量の測定方法は、タンパク質代謝要求量の算出方法に単に限定されるものではない。
本技術のタンパク質代謝要求量の測定方法は、タンパク質代謝要求量を算出する前のデータから、タンパク質の質の傾向を予測できる場合がある。このため、本技術のタンパク質代謝要求量の測定方法は、タンパク質の質の良し悪しを判定することも含まれる。例えば、ある特定の時点における１３ＣＯ２量から推定することも可能な場合がある。また、例えば、２種類のタンパク質の質を対比する場合、これらの間で有意差が生じる場合がある。
より具体的には、本技術の方法により、種々のタンパク質について成熟期のアミノ酸代謝要求量を算出し、ある特定の時点における呼気中の１３ＣＯ２量との相関関係が成立する場合がある。この場合、さらに、当該相関関係が一次関数である場合には、ある特定の時点における呼気中の１３ＣＯ２量を本技術のアミノ酸代謝要求量とみなして成人用タンパク質の質を評価することが可能である。
【００６８】
なお、本技術の方法を、装置のＣＰＵ等を含む制御部、及び記憶媒体（ＵＳＢメモリ、ＨＤＤ、ＣＤ、ネットワークサーバ等）等を備えるハードウエア資源にプログラムとして格納し、制御部によって実現させることも可能である。また、本技術は、本技術の方法として、コンピュータを機能させるためのプログラムとすることも可能である。
【実施例】
【００６９】
以下、試験例及び実施例等に基づいて本技術を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する試験例及び実施例等は、本技術の代表的な実施例等の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
【００７０】
本試験例で行う指標アミノ酸酸化法によるタンパク質代謝要求量確認試験について、以下の＜被験動物＞、＜ベース飼料＞及び＜飼育条件及び測定条件＞の記載内容に従って行った。
＜被験動物＞
Ｗｉｓｔａｒ／ＳＴ  ラット（オス）
日本ＳＬＣから購入。
１週間の馴化の後に試験を開始。
＜ベース飼料＞
実験動物用飼料ＡＩＮ−９３Ｍから、タンパク質（カゼイン）、コーンスターチ、及びシスチンを除去した「ＡＩＮ−９３Ｍ特注飼料（ＡＩＮ−９３Ｍ＊）」を、作製又は購入し、この特注飼料をベースにして、各試験食を調製する。
なお、実験動物用飼料ＡＩＮ−９３Ｍは、米国国立栄養研究所（American Institute of Nutrition)から1993年に発表されたマウス・ラット等の実験動物用の栄養研究のための標準精製飼料である。
【００７１】
＜飼育条件及び測定条件＞
・試験日以外は、ケージで個飼し、食事は自由摂取とする（ＡＩＮ−９３Ｍ食：オリエンタル酵母工業株式会社製）。
・試験開始前の３日間における実験動物用飼料の各日の摂取量を測定し、当該測定値から１日当たりの平均摂取量として算出した値を各ラット群の「１日当たりの摂取量」とする。
・試験開始前１２時間以上は絶食とする。同一個体に対して、異なる実験食ごとに順次試験を行う場合、試験日の間隔は最低１日空ける。
・試験日の給餌条件、試験食の具体的内容は、下記の各試験例に示す。
・呼気測定は、測定開始時の呼気測定データをプレ値（Ｐｒｅ値）とする。呼気測定器（呼気中の１３ＣＯ２量測定装置）は、「１３ＣＯ２／１２ＣＯ２」の比が測定できる赤外分光分析装置ＰＯＣｏｎｅ（大塚電子株式会社）を用いる。
・呼気測定、給餌、及び指標アミノ酸（１３Ｃ指標アミノ酸含む）投与が被る場合は、呼気測定→指標アミノ酸（１３Ｃ指標アミノ酸含む）投与→給餌の順で行う。
・指標アミノ酸（１３Ｃ指標アミノ酸含む）投与の際は、チャンバーからラットを出し、ゾンデによる強制経口投与を行う。
「Ｏｖｅｒ  ｂａｓｅｌｉｎｅ  Δ１３ＣＯ２（‰）／１００ｇ  ＢＷ  値」の求め方は、（呼気１３ＣＯ２値（‰）−呼気１３ＣＯ２値Ｐｒｅ値（‰））÷体重（ｇ）×（１００ｇ）である。
【００７２】
なお、スケジュールの一例として、後述する試験例３のスケジュールを下記表１に示す。
【００７３】
【表１】
2019174379.tif 000002
【００７４】
［試験例１］
（１−１）実験食の調製
タンパク質含有試料として、以下の手順にて、本試験に使用する実験食を調製した。
ベース飼料（実験動物用飼料ＡＩＮ−９３Ｍの特注飼料、オリエンタル酵母工業株式会社製）に、コーンスターチ（オリエンタル酵母工業株式会社製）及びカゼイン（オリエンタル酵母工業株式会社製「ミルクカゼイン」）を表２記載の配合割合で混合して、タンパク質含有量の異なる高タンパク食及び低たんぱく食の２種類の実験食１−１（２２％カゼイン食）及び実験食１−２（６％カゼイン食）を調製した。なお、前記カゼイン１００ｇ当たりのフェニルアラニン含量は４５００ｍｇ（２７．２４ミリモル）、チロシン含量は５０００ｍｇ（２７．６ミリモル）であった。
【００７５】
【表２】
2019174379.tif 000003
【００７６】
各実験食は、ベース飼料、カゼイン及びコーンスターチの総量に対してカゼインの含有量がそれぞれ２２及び６質量％となるように各カゼインの配合量を調整した。また、ベース飼料の配合量は固定とし、カゼイン配合量の差分はコーンスターチの配合量で調整することで、ベース飼料、カゼイン及びコーンスターチの総量のエネルギー量が各実験食で同一になるように設計した。
【００７７】
さらに、各実験食において、タンパク質配合量の違い（カゼイン配合量の違い）によって生じるフェニルアラニン及びチロシン含量の差分を補うために、実験食１−１には、ベース飼料、カゼイン及びコーンスターチの合計量１００ｇ当たり、Ｌ−フェニルアラニン（Ｐｈｅ、和光純薬社製）０．３６ｇ、及びＬ−チロシン（Ｔｙｒ、和光純薬社製）０．４ｇを添加し、実験食１−２には、Ｌ−フェニルアラニン（Ｐｈｅ、和光純薬社製）１．０８ｇ、及びＬ−チロシン（Ｔｙｒ、和光純薬社製）１．２ｇを添加した。すなわち、実験食１−１及び１−２は、いずれもカゼイン含量３０％に相当するアミノ酸を有し、実験食１００ｇ当たりのフェニルアラニン含量が１３５０ｍｇ、チロシン含量が１５００ｍｇであった。
【００７８】
（１−２）呼気中１３ＣＯ２量の測定
（１−２−１：低タンパク食群）
１６〜１７週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒラットを成熟期の被験動物とし、１群８匹として用意した。当該１ラット群（ｎ＝８）を、試験日前日の２０時から試験当日の９時まで１３時間絶食させた。
実験日当日は、９時から１８時まで３時間毎に前記（１−１）にて調製した実験食のうちの低タンパク食である「６％カゼイン食」を、「１回当たりの給餌量（１／８）」にて、当該１ラット群に給餌し、当該１ラット群に全て摂取させた。
当該実験食の「１回当たりの給餌量（１／８）」は、「１日当たりの摂取量」の「８分の１量」とした。また、１回当たりの給餌によって摂取された実験食中の指標アミノ酸の量は、０．２２９〜０．２６５ミリモルであった。なお、体重換算の摂取量としては、０．４７０」〜０．５７５ミリモル／体重量（平均摂取量０．５１９ミリモル／ｋｇ体重）であった。
【００７９】
１５時より１回目の「指標アミノ酸（１３Ｃ標識アミノ酸含む）」の強制経口投与を開始した。１５時では１３Ｃ標識アミノ酸であるL-[1-13C]-phenylalanine (１３Ｃ−Ｐｈｅ) (99 atom percent excess; Cambridge Isotope Laboratories)及び市販品のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、並びにＮａＨ１３ＣＯ３及びＮａＨＣＯ３を精製水に溶解して「１３Ｃ−Ｐｈｅ：３．３ｍｇ／ｋｇＢＷ（０．０２ミリモル／ｋｇＢＷ）及びＰｈｅ：２９．７ｍｇ／ｋｇＢＷ（０．１８ミリモル／ｋｇＢＷ）並びにＮａＨ１３ＣＯ３：０．８８ｍｇ／ｋｇＢＷ及びＮａＨＣＯ３：７．９２ｍｇ／ｋｇＢＷ」で経口投与した。２回目以降は、実験食の摂取終了時まで１時間間隔で１６時、１７時及び１８時に「１３Ｃ−Ｐｈｅ：６ｍｇ／ｋｇＢＷ（０．０３６ミリモル／ｋｇＢＷ）及びＰｈｅ：５４ｍｇ／ｋｇＢＷ（０．３３ミリモル／ｋｇＢＷ）」で経口投与した。合計４回経口投与した。
【００８０】
１３Ｃ標識物質を経口投与した後、速やかにラットをチャンバーに入れた。１５時から１９時まで３０分ごとに、チャンバー内の気体を呼気サンプルとして呼気採取バッグに回収した。回収した呼気サンプルは赤外分光分析装置ＰＯＣｏｎｅ（大塚電子株式会社）を用いて、呼気中１３ＣＯ２量を測定した。呼気分析の結果は１５時の１３ＣＯ２量をプレ値（Ｐｒｅ値）とし、各時間の測定値からＰｒｅ値を引いた値をΔ１３ＣＯ２（‰／１００ｇＢＷ）として算出した。
【００８１】
（１−２−２：高タンパク食群）
前記（１−１）で調製した実験食の「低タンパク食」を「高タンパク食」に代えた以外は、前記（１−２−１：低タンパク食群）の試験と同様にして行った。すなわち、実験食毎に、日を変えて同一個体に対して次の高タンパク食試験を実施した。なお、前記（１−２−１）の試験を先行して実施する被験動物と、本試験を先行して実施する被験動物とを均等（ｎ＝４ずつ）に分けて実施した。
【００８２】
（１−３）結果
その結果、各実験食群のΔ１３ＣＯ２（‰／１００ｇＢＷ）の経時変化は、図１のとおりになった。低タンパク食群と高タンパク食群との間で、Δ１３ＣＯ２に有意差は認められなかった。従来のＩＡＡＯ法（非特許文献１参照）では、成熟期におけるカゼインタンパク質の代謝要求量を適切に求めることができないと判断した。
【００８３】
［試験例２］
（２−１）実験食の調製
本発明のタンパク質含有試料として、以下の手順にて、本試験に使用する実験食を調製した。
ベース飼料（実験動物用飼料ＡＩＮ−９３Ｍの特注飼料、オリエンタル酵母工業株式会社製）に、コーンスターチ（オリエンタル酵母工業株式会社製）及びカゼイン（オリエンタル酵母工業株式会社製「ミルクカゼイン」）を表３記載の配合割合で混合して、タンパク質含有量の異なる高タンパク食及び低タンパク食の２種類の実験食２−１（１５％カゼイン食）及び実験食２−２（１％カゼイン食）を調製した。
【００８４】
【表３】
2019174379.tif 000004
【００８５】
各実験食は、ベース飼料、カゼイン及びコーンスターチの総量に対してカゼインの含有量がそれぞれ１５及び１質量％となるように各カゼインの配合量を調整した。また、ベース飼料の配合量は固定とし、カゼイン配合量の差分はコーンスターチの配合量で調整することで、ベース飼料、カゼイン及びコーンスターチの総量のエネルギー量が各実験食で同一になるように設計した。
【００８６】
さらに、各実験食において、タンパク質配合量の違い（カゼイン配合量の違い）によって生じるフェニルアラニン及びチロシン含量の差分を補うために、実験食２−１を基準（カゼイン含量で）として、実験食２−１と同じになるように、実験食２−２には、ベース飼料、カゼイン及びコーンスターチの合計量１００ｇ当たり、Ｌ−フェニルアラニン（Ｐｈｅ、和光純薬社製）０．６３ｇ、及びＬ−チロシン（Ｔｙｒ、和光純薬社製）０．７０ｇを添加した。すなわち、実験食２−１及び２−２は、いずれも実験食１００ｇ当たり、フェニルアラニンを６７５ｍｇ（４．０９ミリモル）、チロシン７５０ｍｇ（４．１４ミリモル）を含むものである。
【００８７】
（２−２）呼気中１３ＣＯ２量の測定
（２−２−１：低タンパク食群）
１３週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒラットを、成熟期の被験動物とし、１群８匹として用意した。当該１ラット群（ｎ＝８）を、試験日前日の１８時から試験当日の１１時まで１７時間絶食させた。
実験日当日は、１１時から１７時まで１時間毎に前記（２−１）にて調製した実験食のうちの低タンパク食である「１％カゼイン食」を、「１回当たりの給餌量（１／２４）」にて、当該１ラット群に給餌し、当該１ラット群に全て摂取させた。
当該実験食の「１回当たりの給餌量（１／２４）」は、「１日当たりの摂取量」の「２４分の１量」とした。また、１回当たりの給餌によって摂取された実験食中の指標アミノ酸の量は、０．０３７〜０．０４１ミリモルであった。なお、体重換算の摂取量としては、０．０９４〜０．１０８ミリモル／体重量（平均摂取量０．１００ミリモル／ｋｇ体重）であった。
【００８８】
１４時より１回目の「指標アミノ酸（１３Ｃ標識アミノ酸含む）」の強制経口投与を開始した。１４時では１３Ｃ標識アミノ酸であるL-[1-13C]-phenylalanine (１３Ｃ−Ｐｈｅ) (99 atom percent excess; Cambridge Isotope Laboratories)を精製水に溶解して「１３Ｃ−Ｐｈｅ：９ｍｇ／ｋｇＢＷ」で経口投与した。この１回目に経口投与させたときの１３Ｃ−Ｐｈｅの指標アミノ酸投与量は、０．０５４ミリモル／ｋｇ体重量であった。２回目以降は、実験食の摂取終了時まで１時間間隔で１５時、１６時及び１７時に「１３Ｃ−Ｐｈｅ：６ｍｇ／ｋｇＢＷ」で経口投与した。この２回目以降に経口投与させたときの１３Ｃ−Ｐｈｅの指標アミノ酸投与量は、０．０３６ミリモル／ｋｇ体重量であった。合計４回経口投与した。なお、この経口投与に使用した指標アミノ酸（１３Ｃ標識アミノ酸含む）」は、１３Ｃ標識アミノ酸９９質量％である。
【００８９】
１３Ｃ標識物質を経口投与した後、速やかにラットをチャンバーに入れた。１４時から１８時まで３０分ごとに、チャンバー内の気体を呼気サンプルとして呼気採取バッグに回収した。回収した呼気サンプルは赤外分光分析装置ＰＯＣｏｎｅ（大塚電子株式会社）を用いて、呼気中１３ＣＯ２量を測定した。呼気分析の結果は１４時の１３ＣＯ２量をプレ値（Ｐｒｅ値）とし、各時間の測定値からＰｒｅ値を引いた値をΔ１３ＣＯ２（‰／１００ｇＢＷ）として算出した。
【００９０】
（２−２−２：高タンパク食群）
前記（２−１）で調製した実験食の「低タンパク食」を「高タンパク食」に代えた以外は、前記（２−２−１：低タンパク食群）の試験と同様にして行った。すなわち、実験食毎に、日を変えて同一個体に対して次の高タンパク食の試験を実施した。なお、前記（２−２−１）の試験を先行して実施する被験動物と、本試験を先行して実施する被験動物とを均等（ｎ＝４ずつ）に分けて実施した。
【００９１】
（２−３）結果
その結果、各実験食群のΔ１３ＣＯ２（‰／１００ｇＢＷ）の経時変化は、図２のとおりになった。低たんぱく食群と高タンパク食群との間で、１５時以降のほぼ全ての測定時点におけるΔ１３ＣＯ２には、ｔ検定における有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。本技術のＩＡＡＯ法では、従来のＩＡＡＯ法における強制経口投与の指標アミノ酸量を、約半分以下にすることによって、成熟期におけるカゼインタンパク質の代謝要求量を求めることができると判断した。さらに、本技術のＩＡＡＯ法では、従来のＩＡＡＯ法における１回当たりの給餌量を少なくし、給餌間隔を短くすることで、成熟期におけるカゼインタンパク質の代謝要求量をより好適に求めることができると判断した。
【００９２】
［試験例３］
（３−１）実験食の調製
本発明のタンパク質含有試料として、以下の手順にて、本試験に使用する実験食を調製した。
ベース飼料（実験動物用飼料ＡＩＮ−９３Ｍの特注飼料、オリエンタル酵母工業株式会社製）に、コーンスターチ（オリエンタル酵母工業株式会社製）及びカゼイン（オリエンタル酵母工業株式会社製「ミルクカゼイン」）を表４に記載の配合割合で混合して、タンパク質含有量の異なる７種類の実験食３−１〜３−７を調製した。
【００９３】
各実験食は、ベース飼料、カゼイン及びコーンスターチの総量に対してカゼインの含有量が５、７、９、１３、１７、２１、及び２５質量％となるようにカゼインの配合量を調整した。また、ベース飼料の配合量は固定とし、カゼイン配合量の差分はコーンスターチの配合量で調整することで、ベース飼料、カゼイン及びコーンスターチの総量のエネルギー量が各実験食で同一になるように設計した。
【００９４】
【表４】
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【００９５】
さらに、各実験食において、タンパク質配合量の違い（カゼイン配合量の違い）によって生じるフェニルアラニン及びチロシン含量の差分を補うために、実験食３−１を基準として、実験食３−２〜３−７には、Ｌ−フェニルアラニン（Ｐｈｅ、和光純薬社製）、及びＬ−チロシン（Ｔｙｒ、和光純薬社製）を添加した。フェニルアラニン及びチロシンは、各実験食のベース飼料、カゼイン及びコーンスターチの合計量１００ｇに対して、表５に記載の量を添加した。すなわち、実験食３−１〜３−７は、いずれも実験食１００ｇ当たり、フェニルアラニンを１１２５ｍｇ（６．８１ミリモル）、チロシン１２５０ｍｇ（６．９ミリモル）を含むものである。
【００９６】
【表５】
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【００９７】
（３−２）指標アミノ酸酸化法によるタンパク質代謝要求量確認試験
１５〜１８週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒラット（ｎ＝８）を用意し、試験日前日の１８時から試験当日の１１時まで１７時間絶食させた。実験日当日は１１時から１７時まで２時間毎に前記（１）にて調製した実験食のうちの１種類を摂取させた。当該実験食の１回当たりの給餌量は、１日当たりの摂取量の１２分の１量とした（１．９〜２．１ｇ）。また、１回当たりの給餌によって摂取された実験食中の指標アミノ酸の量は、０．１２８〜０．１４３ミリモルであり、体重換算の摂取量としては、０．２５６〜０．３４９ミリモル／体重量（平均摂取量０．２９８ミリモル／ｋｇ体重）であった。
なお、各ラットについて試験開始前の３日間における実験動物用飼料の各日の摂取量を測定し、当該測定値から１日当たりの平均摂取量として算出した値を各ラットの「１日当たりの摂取量」とした。
【００９８】
１４時より１３Ｃ標識アミノ酸の経口投与を開始し、１４時では１３Ｃ標識アミノ酸であるL-[1-１３Ｃ]-phenylalanine (１３Ｃ−Ｐｈｅ) (99 atom percent excess; Cambridge Isotope Laboratories)を精製水に溶解して９ｍｇ／ｋｇＢＷ経口投与した。この経口投与させたときの１３Ｃ−Ｐｈｅの指標アミノ酸投与量は、０．０５４ミリモル／ｋｇ体重量であった。以降は、実験食の摂取終了時まで１時間間隔で１５時、１６時及び１７時に１３Ｃ−Ｐｈｅを６ｍｇ／ｋｇＢＷずつ経口投与した。合計４回経口投与した。この経口投与させたときの１３Ｃ−Ｐｈｅの指標アミノ酸投与量は、０．０３６ミリモル／ｋｇ体重量であった。なお、この経口投与に使用する、指標アミノ酸（１３Ｃ標識アミノ酸含む）」は、１３Ｃ標識アミノ酸９９質量％である。
【００９９】
１３Ｃ標識物質を経口投与した後、速やかにラットをチャンバーに入れた。１４時から１８時まで３０分ごとに、チャンバー内の気体を呼気サンプルとして呼気採取バッグに回収した。回収した呼気サンプルは赤外分光分析装置ＰＯＣｏｎｅ（大塚電子株式会社）を用いて、呼気中１３ＣＯ２を測定した。呼気分析の結果は１４時の１３ＣＯ２量をＰｒｅ値とし、各時間の測定値からＰｒｅ値を引いた値をΔ１３ＣＯ２（‰／１００ｇＢＷ）として算出した。
【０１００】
（３−３）結果
前記（３−２）の試験を、同一の個体（前記Ｗｉｓｔａｒラット）に対して、前記（３−１）で調製した実験食毎に行った。すなわち、実験食毎に、日を変えて同一個体に対して合計７回の試験を実施した。その結果、実験食毎のΔ１３ＣＯ２（‰／１００ｇＢＷ）の経時変化を求め、Δ１３ＣＯ２量が安定した１７時、１７時３０分及び１８時の平均Δ１３ＣＯ２量とタンパク質摂取量との相関を示すプロットから屈曲点を算出し、当該屈曲点をタンパク質代謝要求量として求めた（図３）。屈曲点は、前記平均Δ１３ＣＯ２量及びタンパク質摂取量のデータから、参考文献１（K. Hayamizu et al., J. Clin. Biochem. Nutr., 2011, vol. 49, No.2, pp.115-120）に記載の手法（mixed-effect change-point regression models）に基づいて、統計ソフト「Ｒ」により統計解析を行って算出し、前記屈曲点におけるタンパク質摂取量をタンパク質代謝要求量として求めた。
その結果、１５〜１８週齢の成熟期のＷｉｓｔａｒラットにおけるカゼインタンパク質の代謝要求量は５．２２ｇ／ｋｇＢＷ／ｄａｙとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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