(57)【要約】【課題】蛍光性ＡＧＥｓおよびカルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）の生成を効率的に抑制する蛋白質糖化反応阻害剤を提供すること。【解決手段】ホモイソフラボノイドおよびトリヒドロキシフラバノンからなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物を有効成分として含有することを特徴とする、蛋白質糖化反応阻害剤である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホモイソフラボノイドおよびトリヒドロキシフラバノンからなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物を有効成分として含有することを特徴とする、蛋白質糖化反応阻害剤。
【請求項２】
ホモイソフラボノイドが、サッパニン型およびブラジリン型のホモイソフラボノイドであって、３個以上のフェノール性水酸基を有することを特徴とする請求項１に記載の蛋白質糖化反応阻害剤。
【請求項３】
ホモイソフラボノイドが、ブラジラン、ブラジリン、7,3',4'-トリヒドロキシ-3-ベンジル-2H-クロメン、3-デオキシサッパノンＢおよびサッパノンＡからなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項１または２に記載の蛋白質糖化反応阻害剤。
【請求項４】
ホモイソフラボノイドが、7,3',4'-トリヒドロキシ-3-ベンジル-2H-クロメンであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛋白質糖化反応阻害剤。
【請求項５】
トリヒドロキシフラバノンが、ブチンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質糖化反応阻害剤。
【請求項６】
飲食品に、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛋白質糖化反応阻害剤を添加することを特徴とする、蛍光性ＡＧＥｓまたはカルボキシメチルリジン生成を抑制する方法。
【請求項７】
化粧料に、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛋白質糖化反応阻害剤を添加することを特徴とする、蛍光性ＡＧＥｓまたはカルボキシメチルリジン生成を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質糖化反応による最終生成物（Advanced Glycation End Products：「ＡＧＥｓ」と略称され、「終末糖化産物」とも呼ばれる）の生成を阻害する、蛋白質糖化反応阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化反応（Glycation）とは、グルコース等の還元糖とアミノ酸や蛋白質とのアミノ・カルボニル反応のことを指し、１９１２年にL.C.Maillardが発見したことから、メイラード反応とも呼ばれる。
この糖化反応は、かつては生体外、すなわち食品での研究が主に進められてきたが、１９６０年代頃からヒトを始めとする動物の生体内でも同様の反応が起こることが明らかとなった。
さらに、生体内で糖化反応によって生成される糖化蛋白は、老化現象や糖尿病合併症、アルツハイマーなどに関係することが近年明らかとなっていることから、この糖化反応を阻害する研究が盛んに行われている。
ヒトの体内に蓄積されるＡＧＥｓは、飲食品の摂取や化粧料の適用により、それらに含まれるＡＧＥｓが体内に入る場合と、体内で糖化反応が生じて蓄積される場合とがある。
従って、老化現象や種々の疾患を有効に予防するためには、これら二つのルートによるＡＧＥｓの蓄積を防止することが重要である。
【０００３】
糖化反応には大別すると、前期糖化反応と後期糖化反応がある。
前期糖化反応では、還元糖とアミノ酸や蛋白質のアミノ基との反応からシッフ塩基が生成後、エナミノールを経て、アマドリ転位によって安定なアマドリ化合物が生成する。
後期糖化反応においては、前期糖化反応により生成したアマドリ化合物が脱水、酸化、縮合、環状化などを経て、糖化反応最終生成物であるＡＧＥｓに変化する。ＡＧＥｓとは、あくまでも糖化反応最終生成物の総称であり、一定の構造を示すものではない。これまでにＡＧＥｓとして、ペントシジン、ピロピリジン、クロスリン、カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）などが同定されている。
【０００４】
ＣＭＬは生体中で形成される主要な抗原性のＡＧＥｓであり、糖化修飾された蛋白質のリジン残基の酸化により生成する。また、グルコースの酸化分解より生成するグリオキサールを介してＣＭＬが生成する経路も知られている。
ＣＭＬは、皮膚老化、骨粗鬆症、糖尿病合併症（腎症、網膜症、神経障害、アテローム性動脈硬化）、アルツハイマー等との関連性が指摘されており、ＣＭＬの生成を抑制することはこれらの疾病を予防する点において有効であると考えられる。
【０００５】
ＡＧＥｓには物理化学的な特徴として蛍光性を示すものが複数あり、例えばピロピリジン（Pyrropyridine）、クロスリン（Crossline）などが挙げられる。
そのうち、ピロピリジンとクロスリンは、励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍの蛍光を示すことが知られている（以下この波長の蛍光を持つＡＧＥｓを「蛍光性ＡＧＥｓ」と記載することとする）。
従来のＡＧＥｓ産生阻害剤の評価方法はこの蛍光性ＡＧＥｓの蛍光強度を測定したものが一般的であった。
ただし、この手法は励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍに蛍光を持つ複数のＡＧＥの総蛍光量を検出しており、特定の化合物の生成を測定したものではない。
また、蛍光強度による測定では、ＣＭＬのような非蛍光性のＡＧＥｓを測定できないという欠点があった。
【０００６】
ＡＧＥｓ産生阻害剤としてアミノグアニジン（Aminoguanidine）が知られている。この化合物は、もともと糖尿病合併症の治療薬として開発が進められ、糖尿病合併症である網膜症、腎障害、神経障害に有効であることがモデル動物で確認されている。しかし、アミノグアニジンの服用により種々の副作用が報告されている。
従って、重篤な副作用をもたらさない安全で効果の高いＡＧＥｓの産生を抑制する物質の研究が重要となっている。より高い安全性を図るためには、化学合成物よりも天然物、特に植物由来の成分である方が有利である。
【０００７】
そこで、植物に由来するＡＧＥｓ産生阻害剤の検討が従来からなされている。
例えば、特許文献１において、ボタン属植物抽出物、タツナミソウ属植物抽出物、セイヨウヤマハッカ属植物抽出物、ヒマワリ属植物抽出物、アロエ属植物抽出物、アマドコロ属植物抽出物、アマ属植物抽出物、バラ属植物抽出物、シナノキ属植物抽出物、カンアオイ属植物抽出物、ドクダミ属植物抽出物、カントウ属植物抽出物、ワレモコウ属植物抽出物、ハッカ属植物抽出物、ニワトコ属植物抽出物から選ばれるＡＧＥｓ生成抑制剤が提案されている。
【０００８】
また、特許文献２において、西洋バラ、ハイブリッドローズ、エイジツ、ブドウ葉、カキ葉、リンゴ葉、マリーゴールド花、モクレン葉の抽出物の抽出物を有効成分とするメイラード反応阻害剤が提案されている。
【０００９】
また、特許文献３において、アグリモニー、アシュワガンダ、アニス、アマチャヅル、甘葉懸鈎子、銀杏、ウイキョウ、ウイッチヘーゼル、ウコン、エキナセア、エゾウコギ、エルダー、エルバ・マテ、オリーブ、オレガノ、オレンジ、柿、カキドオシ、カミツレ、ガラナ、含羞草、菊、ギムネマ、キャッツクロー、キャットニップ、キラウェイ、キンギンカ、グァバ、クコヨウ、くまざさ、クミクスチン、黒大豆、くわ、シナモン、ケツメイシ、ゴーヤ、コーラナッツ、ゴカヒ、ゴツコラ、コリアンダー、コンフリー、サキシマスオウ、サフラワー、サラシア・オブロンガ、サンザシ、サンシチニンジン、しそ、ジュウヤク、ジュニパーベリー、ジンジャー、杉、スギナ、ステビア、スペアミント、
【００１０】
セイジ、セイボリー、セイヨウサンザシ、仙査、タイム、タヒボ、ダンデライオン、チャービル、チャノキ、チャボトケイソウ、チョウジ、デイジー、ディル、トチュウ、ニクズク、南姜、ネトル、白猪母邱、白花蛇舌草、ハゴロモソウ、バジル、ハス、半枝連、ヒース、ピーチ、ヒソップ、びわ、フィーバーフュー、フクギ、藤、プランタゴ・サイリュウム、ブルーベリー、ブルーマロウ、ペニーロイヤル、ベニバナ、ペパーミント、ホップ、ポリジ、ポンドアップル、マシュマロー、マジョラム、マリーゴールド、マレイン、マロウスモール、
【００１１】
マロウブルー、ミフクラギ、ミルクシスル、メデゥスイート、モッカ、ヤエヤマ  アオキ、ヤクルマギク、ヤローフラワー、ユーカリ、ヨクイニン、ヨモギ、ラズベリー、ラベンダー、リンデン、ルイボス、レモングラス、レモンタイム、レモンバーベナ、レモンバーム、ローズヒップ、ローズピンクバッツ、ローズマリー、ローズレッド、ローレル、羅布麻、ワイルドストロベリーより選ばれる植物抽出物を含有するグリケーション阻害剤が提案されている。
しかし、上記の抑制剤や阻害剤はいずれも、効果が十分ではないという課題を残していた。
【００１２】
特許文献４において、植物のソボク（蘇木）抽出物から得られるホモイソフラボノイドである、sappanchalcone、3'-deoxy-4-O-methylsappanol、brazilein、brazilin、sappanol、4-O-methylsappanolを含有するメラニン生成抑制剤が提案されているが、メラニンの
形成はメイラード反応によるものではない。また、得られたホモイソフラボノイドが蛋白質糖化反応を阻害する効果については何ら示唆されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００３−２１２７４９号公報
【特許文献２】特開２００６−２７３８１１号公報
【特許文献３】特開２０１０−２４８２１２号公報
【特許文献４】特開２０１２−３６１０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ＡＧＥｓ、特に、前駆体が異なり生成経路や構造の異なる蛍光性ＡＧＥｓおよびＣＭＬの生成を同時に効果的に抑制しうる有効成分を含む蛋白質糖化反応阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するために、本発明者らは、種々の天然由来成分について、蛋白質糖化反応阻害作用の有無、またその程度について鋭意検討した。
その結果、ホモイソフラボノイドおよびトリヒドロキシフラバノンが蛋白質糖化反応に対する優れた阻害作用を示すことを見出した。
【００１６】
さらに、ホモイソフラボノイドの中でも、３個のフェノール性水酸基を有する、ブラジリン型およびサッパノン型のホモイソフラボノイド、そして、トリヒドロキシフラバノンの中でもブチンに優れた蛍光性ＡＧＥｓおよびＣＭＬ抑制作用があることを見出した。
【００１７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕ホモイソフラボノイドおよびトリヒドロキシフラバノンからなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物を有効成分として含有することを特徴とする、蛋白質糖化反応阻害剤。
〔２〕ホモイソフラボノイドが、サッパニン型またはブラジリン型のホモイソフラボノイドであって、３個以上のフェノール性水酸基を有することを特徴とする上記の蛋白質糖化反応阻害剤。
〔３〕ホモイソフラボノイドが、ブラジラン、ブラジリン、7,3',4'-トリヒドロキシ-3-ベンジル-2H-クロメン、3-デオキシサッパノンＢおよびサッパノンＡからなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする上記の蛋白質糖化反応阻害剤。
〔４〕ホモイソフラボノイドが、7,3',4'-トリヒドロキシ-3-ベンジル-2H-クロメンであることを特徴とする上記の蛋白質糖化反応阻害剤。
【００１８】
〔５〕トリヒドロキシフラバノンが、ブチンであることを特徴とする上記の蛋白質糖化反応阻害剤。
〔６〕飲食品に、上記の蛋白質糖化反応阻害剤を添加することを特徴とする、蛍光性ＡＧＥｓまたはカルボキシメチルリジン生成を抑制する方法。
〔７〕化粧料に、上記の蛋白質糖化反応阻害剤を添加することを特徴とする、蛍光性ＡＧＥｓまたはカルボキシメチルリジン生成を抑制する方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、生体内で生成する糖化反応最終生成物である蛍光性ＡＧＥｓおよびＣＭＬの生成を効果的に抑制する蛋白質糖化反応阻害剤を提供することが可能となる。
さらに本発明の蛋白質糖化反応阻害剤は、製剤化が容易で種々の形態の製剤に適用でき
、主に老化現象に対する医薬品、医薬部外品、食品や化粧品などに幅広く応用することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１におけるソボクのメタノール抽出物をクロマトグラフィーによって分離する工程を示すフローチャートである。
【図２】実施例１におけるソボクのメタノール抽出物をクロマトグラフィーによって分離する工程（図１の続き）を示すフローチャートである。この段階で化合物３が得られる。
【図３】実施例１におけるソボクのメタノール抽出物をクロマトグラフィーによって分離する工程（図１の続き）を示すフローチャートである。この段階で化合物１、４、５、６が得られる。
【図４】実施例１におけるソボクのメタノール抽出物をクロマトグラフィーによって分離する工程（図１の続き）を示すフローチャートである。この段階で化合物２が得られる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
〔１〕ホモイソフラボノイド
ホモイソフラボノイドは、通常のイソフラボノイド（炭素数１５）より炭素原子が一つ多い１６個の炭素骨格を有するフラボノイドのサブクラスである。
ホモイソフラボノイドは、炭素骨格の特長からさらに、サッパニン型（sappanin-type）、シラシリン型（scillascillin-type）、ブラジリン型（brazilin-type）、セサルピン型（caesalpin-type）、プロトサッパニン型（protosappanin-type）の５つのタイプに分類されている。
【化１】
2019038753.tif 000002
【００２２】
これまでに約２４０の天然ホモイソフラボノイドが発見され、植物の様々な部位に分布することが報告されている。
本発明で用いるホモイソフラボノイドは、５つのタイプのいずれでも構わないが、サッパニン型またはブラジリン型ホモイソフラボノイドが好ましい。フェノール性水酸基は３個以上が好ましく、３個がさらに好ましい。
【００２３】
さらに、ホモイソフラボノイドの中でも、
化合物１：ブラジラン〔brazilaneまたはrel-(6aR,11bR)-6,6a,7,11b-tetrahydroindeno[2,1-c]chromene-3,9,10-triol〕、
化合物２：ブラジリン〔Brazilinまたはrel-(6aS,11bR)-7,11b-dihydro-6H-indeno[2,1-c][1]benzopyran-3,6a,9,10-tetrol〕、
【００２４】
化合物３：7,3',4'-トリヒドロキシ-3-ベンジル-2H-クロメン、
化合物４：３−デオキシサッパノンＢ〔3-Deoxysappanone Bまたは3-(3,4-Dihydroxybenzyl)-7-hydroxy-2,3-dihydro-4H-chromen-4-one〕、
化合物５：サッパノンＡ〔Sappanone A又は3-[(3,4-Dihydroxyphenyl)methylene]-2,3-dihydro-7-hydroxy-4H-1-benzopyran-4-one〕、
が特に好ましい。なお、下記の化学式中、飛楔型表示は相対立体配置を表す。
【化２】
2019038753.tif 000003
【００２５】
上記の化合物において、殊更好ましい化合物は、化合物３の7,3',4'-トリヒドロキシ-3-ベンジル-2H-クロメンであり、ＣＭＬ生成を最も効果的に抑制することができる。
【００２６】
〔２〕トリヒドロキシフラバノン
フラバノンは下記の構造を有し、フラボンの還元生成物である。
【化３】
2019038753.tif 000004
【００２７】
トリヒドロキシフラバノンは、フラバノンの３個の水素をヒドロキシ基に置換したフラバノンの誘導体である。
トリヒドロキシフラバノンのうち、化合物６：ブチン〔butinまたは2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-hydroxy-2,3-dihydrochromen-4-one〕が好ましい。
【化４】
2019038753.tif 000005
【００２８】
ホモイソフラボノイドおよびトリヒドロキシフラバノンは、市販品を適宜購入して本発明の蛋白質糖化反応阻害剤の有効成分として使用することができる。
あるいはホモイソフラボノイドやトリヒドロキシフラバノンを含有する植物から抽出・精製して有効成分として使用することもできる。
以下、ホモイソフラボノイドおよびトリヒドロキシフラバノンを植物から抽出し分離し、精製する場合について説明する。
【００２９】
〔３〕植物からホモイソフラボノイドおよびトリヒドロキシフラバノンを抽出する方法
（１）抽出する原材料
本発明で使用するホモイソフラボノイドおよび／またはトリヒドロキシフラバノンは、これらを含むことが知られている植物を適宜選び、抽出、分離することにより調製することができる。
使用する植物は、ホモイソフラボノイドおよび／またはトリヒドロキシフラバノンを含み、入手しやすく、有害物質や夾雑物が少ないといった理由で、抽出し易い植物であれば特に限定されない。
抽出効率等を考慮すると、目的とするホモイソフラボノイドおよびトリヒドロキシフラバノンの双方を含有する、マメ科ジャケツイバラ属の植物が好ましく、特にスオウ（Caesalpinia sappan）、オウコチョウ（C. pulcherrima）、ブラジルボク（C. echinata）、ジャケツイバラ（C. decapetala）などが好ましい。
部位は、葉、茎、根、花、種子あるいは全草を抽出対象として使用することができる。
【００３０】
特に好ましいものはソボクである。ソボクは、インド・マレー半島原産の常緑小高木のマメ科植物スオウ（蘇芳；「スホウ」とも称される）の乾燥した茎（心材）であり、赤色染料の他、解熱・消炎・鎮痛を目的した生薬（生薬名「ソボク（蘇木）」）として利用されている。
古来より生薬としてヒトに供されてきた安全面での実績、入手のし易さや経済性、特に前述した好適な有効成分が全て含有されている点を総合的に考慮すると、ソボクを抽出処理の対象とすることが最も好ましい。
【００３１】
（２）抽出溶媒
ホモイソフラボノイド、および／またはトリヒドロキシフラバノンを含む植物の抽出処理に使用する抽出溶媒は、水、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールなどの炭素数１〜３の低級アルコール、あるいは１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、１，２−ペンタンジオール、１，３−プロパンジオールなどの多価アルコール）などを、単独あるいは２種類以上の任意の混液として使用することができる。
【００３２】
抽出溶媒の中でも、本発明では水またはエタノール水溶液を用いることが、安全面から見て好ましく、効果の点からはエタノール水溶液を用いることが好ましく、通常は１０〜９５質量％エタノール水溶液、より好ましくは３０〜９５質量％エタノール水溶液、さらに好ましくは３０〜７０質量％エタノール水溶液が用いられる。
【００３３】
抽出溶媒としては、当該植物の乾燥体を基準として、通常は１〜５００倍量、好ましくは２〜２００倍量、より好ましくは４〜１００倍量、最も好ましくは５〜５０倍量用いられる。
用いる溶媒量が１倍量未満の場合は、抽出後の固液分離が困難になる場合があり、溶媒量が５００倍量を超えた場合は、使用目的に応じては濃縮する必要が出てくることがある。
【００３４】
抽出温度は、通常は０〜２００℃、好ましくは３０〜１５０℃、より好ましくは４０〜１００℃、さらに好ましくは５０〜９０℃で行われる。抽出溶媒が水またはエタノール水溶液の場合は、その沸騰温度で抽出することが好適である。
【００３５】
抽出時間は、抽出する温度にも依存するが、通常は０．１〜８時間、好ましくは０．２〜４時間、より好ましくは０．５〜２時間で行われる。抽出時間が０．１時間未満の場合は抽出が十分行われていない可能性があり、抽出時間が８時間を超える場合は、経済的でない場合がある。
好適には０．５〜２時間程度かけて５０〜９０℃で加熱還流抽出した後、濾紙などを用いて固液分離して、ホモイソフラボノイド、および／またはトリヒドロキシフラバンを含む抽出液を得る。
【００３６】
（３）単離・精製
前記ホモイソフラボノイドおよび／またはトリヒドロキシフラバノンを含む抽出液は、そのままでも蛋白質糖化反応阻害剤として使用できるが、純度が低いため力価が低い。そこで、吸着剤等を使用して、精製・単離して使用することが好ましい。
吸着剤としては、ホモイソフラボノイドおよび／またはトリヒドロキシフラバノンを吸着することが出来る吸着剤であれば特に限定されないが、合成吸着剤、アルミナ、シリカゲル、アルミニウムオキシド、アルキルシリル化シリカゲル、アリルシリル化シリカゲル、ゼオライトなどが例示される。
アルコール水溶液、またはアルコール類で抽出した抽出液を吸着剤に吸着させる場合は、アルコールを除去した後、吸着剤に接触させることが好ましい。
【００３７】
本発明で使用する合成吸着剤としては、疎水性を示す多孔質の芳香族系合成樹脂吸着剤であって実質的にイオン交換能を有しないものあれば、特に限定されることはないが、好ましくは、その母体がスチレン系、具体的にはスチレン・ジビニルベンゼン共重合体、例えば「アンバーライト（登録商標）XAD-4」（オルガノ株式会社製）、「ダイヤイオン（登録商標）HP-20」（三菱ケミカル株式会社製）、「セパビーズ（登録商標）SP-700」（三菱ケミカル株式会社製）、メタクリル系、例えば「ダイヤイオン（登録商標）HP-2MG」（三菱ケミカル株式会社製）、デキストラン系、例えば「セファデックス（登録商標）G-25」（ＧＥ ヘルスケア・ジャパン株式会社製）などを使用することができる。
【００３８】
抽出液を吸着剤に吸着させる方法としては、抽出液に合成吸着剤を添加、撹拌し吸着後、濾過操作により合成吸着剤を回収するバッチ法、あるいは合成吸着剤を充填したカラムを用いて連続処理により吸着処理を行うカラム方式が採用されるが、生産性の点からカラムによる連続処理方法が好ましい。
【００３９】
合成吸着剤の使用量は、抽出液中に含まれる蛋白質糖化反応阻害成分の濃度にもよるが
、抽出液に対して、０．１〜５０体積％であることが好ましい。
抽出液を、合成吸着剤を充填したカラムに通液する条件としては、ＳＶ（空間速度）＝０．５〜５［ｈ-1］、好ましくは１〜３［ｈ-1］の通液速度で、合成吸着剤に対する通液倍数（ＢＶ）＝１〜１０［ｖ／ｖ］で通液するのが、効率的に蛋白質糖化反応阻害成分を吸着できるので好ましい。
【００４０】
（４）水洗浄処理
抽出液中に含まれる蛋白質糖化反応阻害成分を吸着処理した後、そのまま溶出液を用いて、蛋白質糖化反応阻害成分を回収しても良いが、合成吸着樹脂に吸着されない成分は、蛋白質糖化反応阻害活性が弱いため、水洗浄処理により除去することが好ましい。
抽出液中の蛋白質糖化反応阻害成分は、合成吸着剤と良好な吸着性を呈する。したがって、水を通液しても蛋白質糖化反応阻害成分は溶出されないため、水洗浄工程の条件は特に制限されないが、ＳＶ（空間速度）＝０．５〜５［ｈ-1］、好ましくは１〜３［ｈ-1］の通液速度で、合成吸着剤に対する通液倍数（ＢＶ）＝１〜１０［ｖ／ｖ］で通液するのが、効率的に水洗浄処理できるので好ましい。
【００４１】
（５）溶出処理
上記のようにして抽出液を合成吸着剤の吸着、水洗浄処理したのち、アルコール水溶液を通液させ、抽出物中の蛋白質糖化反応阻害成分を選択的に合成吸着剤から溶出させる。
アルコール水溶液は、水とアルコール類（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールなどの炭素数１〜３の低級アルコール、あるいは１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、１，２−ペンタンジオール、１，３−プロパンジオールなどの多価アルコール）などを、単独あるいは２種類以上の任意の混液として使用することができる。
アルコール水溶液としては、水とエタノールの混合物が好ましく、１０〜９９質量％エタノール水溶液が好ましく、２０〜７０質量％エタノールがさらに好ましい。
【００４２】
溶出工程の条件は特に制限されないが、ＳＶ（空間速度）＝０．５〜５［ｈ-1］、好ましくは１〜３［ｈ-1］の通液速度で、合成吸着剤に対する通液倍数（ＢＶ）＝１〜１０［ｖ／ｖ］で通液するのが、効率的に蛋白質糖化反応阻害成分を溶出できるので好ましい。
【００４３】
（６）製剤化
ホモイソフラボノイドおよびトリヒドロキシフラバノンは、そのままでも蛋白質糖化反応阻害剤として十分に使用できるが、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、付加的成分を添加する、あるいは他の有効成分と組み合わせて合剤にする等、種々変形して実施可能である。
例えば、ホモイソフラボノイドおよび／またはトリヒドロキシフラバノンを公知の各種天然香料や合成香料と組み合わせて香料組成物にすることが例示される。
【００４４】
また、化粧品類などで通常使用される基剤、添加剤等を併用して、化粧品、医薬部外品用の製剤として使用できるほか、酸化防止剤（ビタミンＣ、ビタミンＥなど）や、糖類、甘味料、増粘安定剤、ｐＨ調整剤などと組み合わせて飲食品、健康食品、食品添加物、医薬品用の組成物としても使用できる。
さらに、本蛋白質糖化反応阻害剤は、液剤以外の形状、例えば乳液状、ベースト状、ゲル状、パウダー状（粉末状）、顆粒状、ペレット状、スティック状、固形状等の何れの形態として提供されてもよい。
【００４５】
〔４〕蛋白質糖化反応阻害剤の適用
背景技術の項で述べた通り、糖化反応は、食品等の生体外のみならずヒトを始めとする動物の生体内でも起こる。
本発明の蛋白質糖化反応阻害剤は、飲食品や化粧料などにおける蛋白質糖化反応を阻害するだけでなく、当該阻害剤をヒトが摂取することにより体内の蛋白質糖化反応を阻害することができ、医薬品や栄養補助食品、健康食品として幅広く適用することができる。
【００４６】
本発明の蛋白質糖化反応阻害剤を飲食品または化粧料に添加することによって、飲食品や化粧料の中で生成されるＡＧＥｓ、特に蛍光性ＡＧＥｓまたはカルボキシメチルリジンの生成を抑制することができる。
飲食品の例としては、例えば、コーヒー、紅茶、清涼飲料、乳酸菌飲料、無果汁飲料、果汁入り飲料、栄養ドリンクなどの飲料類、リキュール、果実酒などの酒類、アイスクリーム、シャーベットなどの冷菓類、スナック類、栄養食品、ゼリー、プリン、羊かんなどのデザート類、クッキー、ケーキ、チョコレート、チューイングガム、饅頭などの菓子類、菓子パン、食パンなどのパン類、ラムネ菓子、タブレットなどの錠菓類、ハム、ソーセージ等の畜肉食品、ちくわ、かまぼこ等の魚肉食品、魚介類食品、ドレッシング、醤油、ジャム、ふりかけ等の調味料等を挙げることができる。
これら飲食品への本発明の蛋白質糖化反応阻害剤の添加量は、０．１ｐｐｍ〜１％、好ましくは１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍである。
【００４７】
また、化粧料の例としては、化粧水（ローション）、乳液、クリーム、オイル、軟膏、パック、リップ、口紅、ファンデーション、アイライナー、頬紅、マスカラ、アイシャドウー、マニキュア・ペディキュア、爪被覆剤、爪被覆除去剤、ひげ剃り用剤、シャンプー、リンス、ヘアトリートメント、ヘアトニック、ヘアスプレー、ヘアクリーム、ヘアローション、整髪料、育毛料、パーマネント液、染毛料、ハンドソープ、ボディーソープ、歯磨き剤、洗口料、洗顔料・石鹸類、香水、防臭制汗剤を挙げることができる。
これら化粧料への本発明の蛋白質糖化反応阻害剤の添加量は、０．１ｐｐｍ〜１％、好ましくは１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍである。
【実施例】
【００４８】
次に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
〔実施例１〕（ホモイソフラボノイドおよびトリヒドロキシフラバノンの調製）
市販のタイ産ソボク粉末５００ｇにメタノールを５Ｌ加え、２４時間室温で浸漬抽出した。濾過後、残渣に対して前記と同じ条件でメタノールによる浸漬抽出を２回行った。
得られた抽出液を合わせて減圧濃縮した後、凍結乾燥し、ソボク抽出物５６．３ｇを得た。
【００４９】
得られたソボク抽出物を図１〜４に示す各種クロマトグラフィーにより分離し、ブラジラン（「化合物１」、収量７．１ｍｇ、赤褐色固体）、ブラジリン（「化合物２」、収量４．１ｍｇ、赤色固体）、7,3',4'-トリヒドロキシ-3-ベンジル-2H-クロメン（「化合物３」、収量６．６ｍｇ、赤色固体）、3-デオキシサッパノンＢ（「化合物４」、収量  ７１．７ｍｇ、赤褐色固体）、サッパノンＡ（「化合物５」、収量３．５ｍｇ、褐色固体）、およびブチン（「化合物６」、収量３．１ｍｇ、黄色固体）を得た。
【００５０】
得られた各化合物１〜６は、ＮＭＲを用いて同定を行った。以下に同定資料を示す。
ブラジラン（化合物１）
収量７．１ｍｇ、赤褐色固体、ＥＳＩ−ＭＳ（positive）：ｍ／ｚ＝２９３［Ｍ＋Ｎａ］+、比旋光度 [α]D＝−２．０°（ｃ＝０．１，ＭｅＯＨ）（文献値＋１０３°，ｃ＝１．０，ＭｅＯＨ）。1Ｈおよび13Ｃ−ＮＭＲデータ（５００，１２５ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）ならびに文献値を表１に示す。参照文献：伊藤友紀 慶應義塾大学2013年度卒業論文。
【００５１】
【表１】
2019038753.tif 000006
【００５２】
ブラジリン（化合物２）
収量４．１ｍｇ、赤色固体、ＥＳＩ−ＭＳ（positive）：ｍ／ｚ＝３０９［Ｍ＋Ｎａ］+、比旋光度 [α]D＝＋７０．６°（ｃ＝０．１，ＭｅＯＨ）（文献値＋１１８．８°，ｃ＝１．９，ＭｅＯＨ）。1Ｈおよび13Ｃ−ＮＭＲデータ（５００，１２５ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ, ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ6）ならびに文献値を表２に示す。参照文献：伊藤友紀 慶應義塾大学2013年度卒業論文。
【００５３】
【表２】
2019038753.tif 000007
【００５４】
7,3',4'-トリヒドロキシ-3-ベンジル-2H-クロマン（化合物３）
収量６．６ｍｇ、赤色固体、ＥＳＩ−ＭＳ（positive）：ｍ／ｚ＝２９３［Ｍ＋Ｎａ］+。1Ｈおよび13Ｃ−ＮＭＲデータ（５００，１２５ＭＨｚ，ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ6）ならびに文献値を表３に示す。参照文献：Zhao H., Bai H., Wang Y., Li W., Koike K., Journal of natural medicines 62, 325-327 (2008).
【００５５】
【表３】
2019038753.tif 000008
【００５６】
３−デオキシサッパノンＢ（化合物４）
収量７１．７ｍｇ、赤褐色固体、ＥＳＩ−ＭＳ（positive）：ｍ／ｚ＝３０９［Ｍ＋Ｎａ］+、比旋光度 [α]D＝−１３．２°（ｃ＝０．１，ＭｅＯＨ）（文献値−１０．０°，ｃ＝０．８１，ＭｅＯＨ）。1Ｈおよび13Ｃ−ＮＭＲデータ（５００，１２５ＭＨｚ，ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ6）ならびに文献値を表４に示す。参照文献：Fu L.C., Huang X.A., Lia Z.Y., Hu Y.J., Liu H.J., Cai X.L., Molecules, 13, 1923-1930 (2008).
【００５７】
【表４】
2019038753.tif 000009
【００５８】
サッパノンＡ（化合物５）
収量３．５ｍｇ、褐色固体、ＥＳＩ−ＭＳ（positive）：ｍ／ｚ＝３０７［Ｍ＋Ｎａ］+。1Ｈおよび13Ｃ−ＮＭＲデータ（４００，１２５ＭＨｚ，ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ6，ＣＤ3ＯＤ）ならびに文献値を表５に示す。参照文献： Chang T.S., Chao S.Y., Ding H.Y., International journal of molecular sciences 13, 10359-10367 (2012)
【００５９】
【表５】
2019038753.tif 000010
【００６０】
ブチン（化合物６）
収量３．１ｍｇ、黄色固体、ＥＳＩ−ＭＳ（positive）：ｍ／ｚ＝２７３［Ｍ＋Ｎａ］+、比旋光度 [α]D＝＋２°（ｃ＝０．１，ＭｅＯＨ）（文献値−３６．１°，ｃ＝１．０，ＭｅＯＨ）。1Ｈおよび13Ｃ−ＮＭＲデータ（４００，１２５ＭＨｚ，ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ6，ＣＤ3ＯＤ）ならびに文献値を表６に示す。
参照文献：Guilian T., Ubin Z., Tianyou Z., Fuquan Y., Ito Y., Journal of Chromatography A 1049, 219-222 (2004).
【００６１】
【表６】
2019038753.tif 000011
【００６２】
〔試験例１〕（蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制作用の測定）
実施例１で得られた化合物１〜６について、以下の通り、蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制作用の測定を行った。
【００６３】
〔検体の調製〕
実施例１で得られた化合物１〜６をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）（以下「ＰＢＳ」と省略する。）に溶解して１ｍＭ、５００μＭ、２５０μＭ溶液（最終濃度１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ）を作製した。（なお、ＰＢＳは、リン酸二水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム・１２水和物、塩化ナトリウムおよび精製水から調製した。）
既知のＡＧＥｓ産生阻害剤であるアミノグアニジンは９ｍＭ溶液（最終濃度  ９００μ
Ｍ）を作製した。（なお、アミノグアニジンは、和光純薬社製の試薬、塩酸アミノグアニジンを使用した。）
【００６４】
〔試験の手順〕
ヒト血清アルブミン (ＨＳＡ)（SIGMA社製「A1653」）をＰＢＳで溶解して５ｍｇ／ｍＬに調製し、次にメチルグリオキサール（ＭＧＯ）（MP Biomedicals,LLC 155558）をＨＳＡ水溶液に加えて5 ｍＭに調製した (ＨＳＡ−ＭＧＯ水溶液) 。ＰＢＳ６００μＬ、ＨＳＡ−ＭＧＯ水溶液３００μＬ、検体１００μＬを混合し、６０℃のインキュベータ中にて２４時間反応させた。
【００６５】
反応後、蛍光マイクロプレートリーダー（励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍ）にて蛍光強度を測定した（以下、ＭＧＯ（＋）・サンプルという）。
対照として、ＨＳＡ−ＭＧＯ水溶液を添加せず、代わりにＨＳＡ水溶液を添加したものを測定した（以下、ＭＧＯ（−）・サンプルという）。
コントロールとして、検体を含有しないもの（以下、ＭＧＯ（＋）・コントロールという）、検体およびＭＧＯを含有しないもの（以下、ＭＧＯ（−）・コントロールという）を測定した。
蛍光性ＡＧＥｓ生成率は、以下の式により算出した。
【００６６】
【数１】
2019038753.tif 000012
【００６７】
〔結果および実施例の効果〕
得られた結果を表７に示す。表の結果から、実施例１の化合物は濃度依存的に蛍光性ＡＧＥｓの生成を抑制し、既知の蛋白質糖化阻害剤であるアミノグアニジンよりも強い活性を示すことが明らかとなった。
また、実施例１の化合物のうち、化合物１および２は特に強い蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制作用を有することが確認された。
【００６８】
【表７】
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【００６９】
〔試験例２〕（カルボキシメチルリジン生成抑制作用の測定）
実施例１で得られた化合物１〜６について、ＡＧＥｓの１種であるカルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）の生成抑制作用の測定を行った。
ＣＭＬ生成抑制作用の測定は、コスモ・バイオ株式会社製 「コラーゲンＡＧＥｓ抗糖化アッセイキット，ＣＭＬ特異的, グリオキサール」（AAS-AGE-K02）を用いて行った。
コラーゲンが固相化されたプレート上にグリオキサールとサンプルを添加し、３７℃、２４時間インキュベートした。インキュベート後、抗ＣＭＬ抗体を用いて、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりＣＭＬ量を測定した。ＣＭＬ生成率は、蛍光性ＡＧＥｓ生成率と同様にして算出した。
【００７０】
得られた結果を表８に示す。表８の結果から、実施例１の化合物は濃度依存的にＣＭＬの生成を抑制し、既知の蛋白質糖化阻害剤であるアミノグアニジンよりも強い活性を示すことが明らかとなった。
また、実施例１の化合物１〜６のうち、化合物３の7,3',4'-トリヒドロキシ-3-ベンジル-2H-クロメンは特に強いＣＭＬ生成抑制作用を有することが確認された。
【００７１】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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