(57)【要約】【課題】  慢性腎不全（以下、ＣＫＤという）患者における高リン血症の発症のしやすさを試験する方法を提供する。【解決手段】  ＣＫＤ患者より採取された検体中の線維芽細胞増殖因子−２３（以下、ＦＧＦ−２３という）を測定し、当該検体中のＦＧＦ−２３濃度が基準値以上の場合には当該患者が高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には当該患者が高リン血症を発症しにくい、という基準と比較することにより、当該ＣＫＤ患者に対する高リン血症の発症のしやすさを試験する方法。本発明のＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさを試験する方法は、臨床診断において有用である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性腎臓病（以下、ＣＫＤという）患者より採取された検体中の線維芽細胞増殖因子−２３（以下、ＦＧＦ−２３という）を測定し、当該検体中のＦＧＦ−２３濃度が基準値以上の場合には当該患者が高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には当該患者が高リン血症を発症しにくい、という基準と比較することにより、当該ＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさを試験する方法。
【請求項２】
以下の工程を含有する、請求項１記載の方法。
（１）ＣＫＤ患者より検体を採取する工程；
（２）工程（１）で採取された検体中のＦＧＦ−２３を測定し、測定値を得る工程；
（３）既知濃度のＦＧＦ−２３を検体として用いて、工程（２）と同様の方法により、ＦＧＦ−２３濃度と測定値との間の関係を示す検量線を作成する工程；
（４）工程（２）で得られた測定値と、工程（３）で作成したＦＧＦ−２３濃度と測定値との間の関係を示す検量線とから、当該検体中のＦＧＦ−２３濃度を決定する工程；
（５）工程（４）で決定された当該検体中のＦＧＦ−２３濃度を、当該検体中のＦＧＦ−２３の濃度が基準値以上の場合には当該患者は高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には当該患者は高リン血症を発症しにくい、という基準と比較する工程；
（６）工程（５）での比較の結果、工程（４）で決定された当該検体中のＦＧＦ−２３濃度が基準値以上の場合には、当該患者は高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には、当該患者は高リン血症を発症しにくいと判定する工程。
【請求項３】
基準値が、推算糸球体濾過量(eGFR)が60 mL/分/1.73 m2以上である被検者におけるＦＧＦ−２３濃度の95%信頼区間の上限値である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
推算糸球体濾過量(eGFR)が60 mL/分/1.73 m2以上である被検者におけるＦＧＦ−２３濃度の95%信頼区間の上限値が、50〜150 pg/mLである請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＣＫＤ患者が、ステージ３〜５のＣＫＤ患者である、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
線維芽細胞増殖因子−２３（以下、ＦＧＦ−２３という）測定試薬、及び、慢性腎臓病（以下、ＣＫＤという）患者より採取された検体中のＦＧＦ−２３濃度が基準値以上の場合には当該患者が高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には当該患者が高リン血症を発症しにくい、という基準が記載された基準表を含む、ＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさを試験するための試薬。
【請求項７】
ＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさが、以下の工程を含有する方法により試験される、請求項６記載の試薬。
（１）ＣＫＤ患者より検体を採取する工程；
（２）工程（１）で採取された検体中のＦＧＦ−２３を、ＦＧＦ−２３測定試薬を用いて測定し、測定値を得る工程；
（３）既知濃度のＦＧＦ−２３を検体として用いて、工程（２）と同様の方法により、ＦＧＦ−２３濃度と測定値との間の関係を示す検量線を作成する工程；
（４）工程（２）で得られた測定値と、工程（３）で作成したＦＧＦ−２３濃度と測定値との間の関係を示す検量線とから、当該検体中のＦＧＦ−２３濃度を決定する工程；
（５）工程（４）で決定された当該検体中のＦＧＦ−２３濃度を、当該検体中のＦＧＦ−２３の濃度が基準値以上の場合には当該患者は高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には当該患者は高リン血症を発症しにくい、という基準表に記載された基準と比較する工程；
（６）工程（５）での比較の結果、工程（４）で決定された当該検体中のＦＧＦ−２３濃度が基準値以上の場合には、当該患者は高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には、当該患者は高リン血症を発症しにくいと判定する工程。
【請求項８】
基準値が、推算糸球体濾過量(eGFR)が60 mL/分/1.73 m2以上である被検者におけるＦＧＦ−２３濃度の95%信頼区間の上限値である、請求項６又は７記載の試薬。
【請求項９】
推算糸球体濾過量(eGFR)が60 mL/分/1.73 m2以上である被検者におけるＦＧＦ−２３濃度の95%信頼区間の上限値が、50〜150 pg/mLである請求項８記載の試薬。
【請求項１０】
ＣＫＤ患者が、ステージ３〜５のＣＫＤ患者である、請求項６〜９の何れかに記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性腎臓病（以下、ＣＫＤという）患者における高リン血症の発症のしやすさを試験する方法、及び、ＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさを試験するための試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
繊維芽細胞増殖因子−２３（以下、ＦＧＦ−２３という）は、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーの一員であり、主として骨組織で産生され、腎臓に作用し、腎尿細管でのリンの再吸収を阻害する。
【０００３】
ＦＧＦ−２３は、251個のアミノ酸からなる蛋白であり、このうちＮ端24個のアミノ酸はシグナルペプチドであり、分泌されるＦＧＦ−２３は227個のアミノ酸からなるものと考えられている。一部のＦＧＦ−２３は、プロテアーゼの１種であるfurin等により179番目のアミノ酸Argと180番目のアミノ酸Serとの間でプロセッシングを受ける（非特許文献１、２参照）。プロセッシングを受けない、227個のアミノ酸からなる全長ＦＧＦ−２３は、血中リン濃度の低下等の生物活性を有するのに対して、このプロセッシングを受けた後のＮ端、及び、Ｃ端フラグメントは不活性であることが報告されている（非特許文献１、２参照）。
【０００４】
ＣＫＤは、以下の(1)、(2)のいずれか又は両方が３ヶ月以上続いている状態をいう。
(1)蛋白尿（微量アルブミン尿）等の尿異常、画像診断や血液検査、病理所見で腎障害が明らかである状態；
(2)血清クレアチニン値を基に推算した糸球体濾過量(eGRF：estimated glomerular filtration rate)が60 mL/分/1.73 m2未満の状態。
【０００５】
腎臓の機能を表す指標としてeGFRが用いられる。GFRは、糸球体が1分間に血液をろ過して作れる尿の量を示しており、健常人におけるeGFRは、約100 mL/分/1.73 m2である。ＣＫＤはステージ１〜５に病期が分類されており、ステージが上がるにつれて症状も重篤になる。特に、ステージ３〜５のＣＫＤ患者においては、eGFRは60 mL/分/1.73 m2未満であり、専門医との連携による診療が必要となる。ＣＫＤが悪化すると、末期腎不全に移行すると共に、腎機能の低下によりリンが体外へ排泄されずに体内に蓄積する病態である高リン血症が現れる。
【０００６】
血中リン濃度は、腸管からのリン吸収、腎尿細管でのリン再吸収、及び、骨や細胞内のリンとの動的平衡により調節されており、このうち、腎尿細管でのリン再吸収が、慢性的なリン濃度の調節に最も重要と考えられている。ＦＧＦ−２３は、腎尿細管でのリン再吸収の抑制と、血中１，２５水酸化ビタミンＤ濃度の低下を介した腸管でのリン吸収の抑制により、血中リン濃度を低下させる。ＣＫＤの早期ステージでＦＧＦ−２３濃度が上昇し、次いで、ＣＫＤの後期ステージで、リン濃度が上昇することが報告されている（非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Endocrinology, vol.143, p.3179-3182 (2002).
【非特許文献２】Lab. Clin. Pract., vol.26, No.2 p.111-116 (2008).
【非特許文献３】Clin. J. Am. Soc. Nephrol., vol.7, No.5, p.810-819 (2012).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の通り、ＣＫＤのステージ分類によるＦＧＦ−２３濃度とリン濃度の変動については報告がなされているが、一方で、特定のＣＫＤ患者において、当該ＣＫＤ患者由来の検体中のＦＧＦ−２３濃度から、当該ＣＫＤ患者が将来、高リン血症を発症しやすいか否かを試験することについては知られていない。本発明の目的は、ＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさを試験する方法、及び、ＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさを試験するための試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
今般、発明者らは、ＣＫＤ患者より採取された検体中のＦＧＦ−２３濃度から、当該患者が将来、高リン血症を発症しやすいか否かを試験することができることを見出して本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１０］に関する。
［１］ＣＫＤ患者より採取された検体中のＦＧＦ−２３を測定し、当該検体中のＦＧＦ−２３濃度が基準値以上の場合には当該患者が高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には当該患者が高リン血症を発症しにくい、という基準と比較することにより、当該ＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさを試験する方法。
［２］以下の工程を含有する、［１］記載の方法。
（１）ＣＫＤ患者より検体を採取する工程；
（２）工程（１）で採取された検体中のＦＧＦ−２３を測定し、測定値を得る工程；
（３）既知濃度のＦＧＦ−２３を検体として用いて、工程（２）と同様の方法により、ＦＧＦ−２３濃度と測定値との間の関係を示す検量線を作成する工程；
（４）工程（２）で得られた測定値と、工程（３）で作成したＦＧＦ−２３濃度と測定値との間の関係を示す検量線とから、当該検体中のＦＧＦ−２３濃度を決定する工程；
（５）工程（４）で決定された当該検体中のＦＧＦ−２３濃度を、当該検体中のＦＧＦ−２３の濃度が基準値以上の場合には当該患者は高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には当該患者は高リン血症を発症しにくい、という基準と比較する工程；
（６）工程（５）での比較の結果、工程（４）で決定された当該検体中のＦＧＦ−２３濃度が基準値以上の場合には、当該患者は高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には、当該患者は高リン血症を発症しにくいと判定する工程。
［３］基準値が、推算糸球体濾過量(eGFR)が60 mL/分/1.73 m2以上である被検者におけるＦＧＦ−２３濃度の95%信頼区間の上限値である、［１］又は［２］記載の方法。
［４］推算糸球体濾過量(eGFR)が60 mL/分/1.73 m2以上である被検者におけるＦＧＦ−２３濃度の95%信頼区間の上限値が、50〜150 pg/mLである［３］記載の方法。
［５］ＣＫＤ患者が、ステージ３〜５のＣＫＤ患者である、［１］〜［４］の何れかに記載の方法。
【００１０】
［６］ＦＧＦ−２３測定試薬、及び、ＣＫＤ患者より採取された検体中のＦＧＦ−２３濃度が基準値以上の場合には当該患者が高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には当該患者が高リン血症を発症しにくい、という基準が記載された基準表を含む、ＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさを試験するための試薬。
［７］ＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさが、以下の工程を含有する方法により試験される、［６］記載の試薬。
（１）ＣＫＤ患者より検体を採取する工程；
（２）工程（１）で採取された検体中のＦＧＦ−２３を、ＦＧＦ−２３測定試薬を用いて測定し、測定値を得る工程；
（３）既知濃度のＦＧＦ−２３を検体として用いて、工程（２）と同様の方法により、ＦＧＦ−２３濃度と測定値との間の関係を示す検量線を作成する工程；
（４）工程（２）で得られた測定値と、工程（３）で作成したＦＧＦ−２３濃度と測定値との間の関係を示す検量線とから、当該検体中のＦＧＦ−２３濃度を決定する工程；
（５）工程（４）で決定された当該検体中のＦＧＦ−２３濃度を、当該検体中のＦＧＦ−２３の濃度が基準値以上の場合には当該患者は高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には当該患者は高リン血症を発症しにくい、という基準表に記載された基準と比較する工程；
（６）工程（５）での比較の結果、工程（４）で決定された当該検体中のＦＧＦ−２３濃度が基準値以上の場合には、当該患者は高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には、当該患者は高リン血症を発症しにくいと判定する工程。
［８］基準値が、推算糸球体濾過量(eGFR)が60 mL/分/1.73 m2以上である被検者におけるＦＧＦ−２３濃度の95%信頼区間の上限値である、［６］又は［７］記載の試薬。
［９］推算糸球体濾過量(eGFR)が60 mL/分/1.73 m2以上である被検者におけるＦＧＦ−２３濃度の95%信頼区間の上限値が、50〜150 pg/mLである［８］記載の試薬。
［１０］ＣＫＤ患者が、ステージ３〜５のＣＫＤ患者である、［６］〜［９］の何れかに記載の試薬。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、ＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさを試験する方法、及び、ＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさを試験するための試薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＣＫＤ患者より採取された血清中のＦＧＦ−２３濃度が60 pg/mL未満の群と、60 pg/mL以上の群に対して、カプラン・マイヤー法を用いて作成した高リン血症非発症率曲線を表す。横軸は、ＦＧＦ−２３濃度を決定した日（基準日）からの日数（経過時間）を表し、縦軸は、高リン血症非発症率を表す。実線はＦＧＦ−２３濃度が60 pg/mL未満のＣＫＤ患者群を、点線はＦＧＦ−２３濃度が60 pg/mL以上のＣＫＤ患者群を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．ＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさを試験する方法
本発明の高リン血症の発症のしやすさを試験する方法は、ＣＫＤ患者より採取された検体中のＦＧＦ−２３を測定し、当該検体中のＦＧＦ−２３濃度が基準値以上の場合には当該患者が高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合は当該患者が高リン血症を発症しにくい、という基準と比較することにより、当該ＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさを試験することを特徴とする方法である。
【００１４】
本発明において、ＣＫＤ患者とは、前述の通り、以下の(1)、(2)のいずれか又は両方が３ヶ月以上続いている状態の患者をいう。
(1)蛋白尿（微量アルブミン尿）等の尿異常、画像診断や血液検査、病理所見で腎障害が明らかである状態；
(2)eGRFが60 mL/分/1.73 m2未満の状態。
【００１５】
本発明において、ＣＫＤ患者としては、ステージ１〜５のＣＫＤ患者が挙げられ、ステージ３〜５のＣＫＤ患者が好ましい。
【００１６】
本発明において、ステージ１のＣＫＤ患者とは、eGRFが90 mL/分/1.73 m2以上のＣＫＤ患者を意味し、ステージ２のＣＫＤ患者とは、eGRFが60 mL/分/1.73 m2以上、89 mL/分/1.73 m2以下のＣＫＤ患者を意味し、ステージ３のＣＫＤ患者とは、eGRFが30 mL/分/1.73 m2以上、59 mL/分/1.73 m2以下のＣＫＤ患者を意味し、ステージ４のＣＫＤ患者とは、eGRFが15 mL/分/1.73 m2以上、29 mL/分/1.73 m2以下のＣＫＤ患者を意味し、ステージ５のＣＫＤ患者とは、eGRFが15 mL/分/1.73 m2未満のＣＫＤ患者を意味する。
【００１７】
本発明において、ＣＫＤ患者より採取された検体としては、当該患者から採取された検体であって、ＦＧＦ−２３が測定され得る検体であれば特に制限はなく、例えば全血、血清、血漿、尿等が挙げられる。
【００１８】
本発明において、ＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさを試験する方法は、例えば以下の工程を含有する方法により行うことができる。
（１）ＣＫＤ患者より検体を採取する工程；
（２）工程（１）で採取された検体中のＦＧＦ−２３を測定し、測定値を得る工程；
（３）既知濃度のＦＧＦ−２３を検体として用いて、工程（２）と同様の方法により、ＦＧＦ−２３濃度と測定値との間の関係を示す検量線を作成する工程；
（４）工程（２）で得られた測定値と、工程（３）で作成したＦＧＦ−２３濃度と測定値との間の関係を示す検量線とから、当該検体中のＦＧＦ−２３濃度を決定する工程；
（５）工程（４）で決定された当該検体中のＦＧＦ−２３濃度を、当該検体中のＦＧＦ−２３の濃度が基準値以上の場合には、当該患者は高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には、当該患者は高リン血症を発症しにくい、という基準と比較する工程；
（６）工程（５）での比較の結果、工程（４）で決定された当該検体中のＦＧＦ−２３濃度が基準値以上の場合には、当該患者は高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には、当該患者は高リン血症を発症しにくいと判定する工程。
【００１９】
＜工程（１）＞
工程（１）において、ＣＫＤ患者より採取された検体としては、前述の検体等が挙げられる。
【００２０】
＜工程（２）＞
工程（２）において、工程（１）で採取された検体中のＦＧＦ−２３の測定は、工程（１）で採取された検体中のＦＧＦ−２３を測定し得る方法であれば、如何なる方法を用いて行うことができ、例えば免疫学的測定法等の方法を用いて行うことができる。免疫学的測定法としては、任意の公知の免疫学的測定方法が挙げられ、例えば放射免疫測定法(RIA)、酵素免疫測定法(ELISA)、蛍光免疫測定法(FIA)、間接蛍光抗体法(Indirect Fluorescence assay)、発光免疫測定法(Luminescent immunoassay)、物理化学的測定法［比濁免疫測定法(TIA)、ラテックス凝集法(LAPIA)、微粒子計数免疫凝集測定法(PCIA)］、ウェスタンブロッティング法等が挙げられ、ELISA法が好ましい。免疫学的測定法においては、サンドイッチ法、競合法等を用いることができ、また、ホモジアニス法、ヘテロジニアス法等も用いることができる。また、市販の、免疫学的測定法に基づくＦＧＦ−２３測定試薬を用いて、工程（１）で採取された検体中のＦＧＦ−２３を測定することもできる。市販の、免疫学的測定法に基づくＦＧＦ−２３測定試薬としては、例えばHuman Intact FGF-23 ELISA Kit(Immutopics社製)、Human FGF-23 ELISA Kit(Merck Millipore社製)、FGF-23測定試薬（カイノス社製）等が挙げられる。
【００２１】
免疫学的測定法を用いた、工程（１）で採取された検体中のＦＧＦ−２３の測定方法の具体的態様を以下に示す。
・測定方法１
以下の工程を含有する、工程（１）で採取された検体中のＦＧＦ−２３の測定方法。
(I)工程（１）で採取された検体と、ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体とを反応させて、第１抗体とＦＧＦ−２３の免疫複合体を生成させる工程；
(II)工程(I)で生成した免疫複合体と、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体とを反応させて、第１抗体、ＦＧＦ−２３及び標識化第２抗体の免疫複合体を生成させる工程；
(III)工程(II)で生成した免疫複合体中の標識量を測定する工程。
【００２２】
抗体（第１抗体、第２抗体）としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できるが、モノクローナル抗体が好ましい。また、抗体（第１抗体、第２抗体）としては、抗体をパパイン処理により得られるFab、ペプシン処理により得られるF(ab’)2、ペプシン処理−還元処理により得られるFab’等のFc部分を除去した抗体フラグメントも使用できる。
【００２３】
第１抗体が認識するＦＧＦ−２３中の部位（エピトープ）と、第２抗体が認識するＦＧＦ−２３中の部位（エピトープ）とは同じであっても異なっていてもよいが、異なっていることが好ましい。ＦＧＦ−２３の測定において使用される抗体（第１抗体、第２抗体）は、ＦＧＦ−２３そのもの、又は、抗体（第１抗体、第２抗体）が認識するＦＧＦ−２３中の部位（エピトープ）に相当するペプチドを抗原として用いて通常の抗体の作製方法により取得することができ、また、市販品としても入手可能である。ＦＧＦ−２３に結合する抗体としては、例えばFERM BP-7838、FERM BP-7839、FERM BP-7840、FERM BP-8268としてそれぞれ寄託されたハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体等が挙げられる。
【００２４】
工程(I)及び工程(II)における反応温度としては、ＦＧＦ−２３の測定を可能とする反応温度であれば特に制限はなく、例えば0〜50℃が挙げられ、4℃〜40℃が好ましい。工程(I)及び工程(II)における反応時間としては、ＦＧＦ−２３の測定を可能とする反応時間であれば特に制限はなく、例えば1分間〜72時間であり、5分間〜20時間が好ましい。
【００２５】
工程(I)〜(III)は、水性媒体中で行うこともできる。水性媒体としては、ＦＧＦ−２３の測定を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定されないが、ｐＨ１〜１１の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、トリス緩衝剤、グッド緩衝剤等が挙げられる。
【００２６】
グッド緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝剤、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝剤、２−［Ｎ−（２−アセトアミド）アミノ］エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）緩衝剤、２−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝剤、２−｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−スルホエチル）ピペラジン（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）緩衝剤、２−ヒドロキシ−３−｛［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ピペラジン（ＨＥＰＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（３−スルホプロピル）ピペラジン（ＥＰＰＳ）緩衝剤、トリシン［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］緩衝剤、ビシン［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］緩衝剤、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝剤、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝剤等が挙げられる。
【００２７】
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、0.001〜2.0 mol/Lが好ましく、0.005〜1.0 mol/Lがより好ましく、0.01〜0.1 mol/Lが特に好ましい。
【００２８】
工程(I)と工程(II)とは同時に行うこともできる。工程(I)と工程(II)との間には、洗浄工程を設けても、設けなくてもよいが、洗浄工程を設けることが好ましい。また、工程(II)と工程(III)との間には、洗浄工程を設けても、設けなくてもよいが、洗浄工程を設けることが好ましい。第１抗体は不溶性担体に固定化されていなくても、固定化されていてもよいが、固定化されていることが好ましい。第１抗体が不溶性担体に固定化されている場合、工程(I)後の不溶性担体を洗浄することにより、工程(I)で生成した第１抗体と測定対象成分の免疫複合体を、未反応成分（検体由来の成分、過剰の第１抗体等）から分離することができる。同様に、工程(II)後の不溶性担体を洗浄することにより、工程(II)で生成した第１抗体、ＦＧＦ−２３及び標識化第２抗体の免疫複合体を、未反応成分（過剰の標識化第２抗体等）から分離することができる。洗浄液としては、リン酸緩衝化生理食塩水［0.15 mol/L塩化ナトリウムを含有する10 mmol/L リン酸緩衝液、pH7.2（以下、ＰＢＳと記す）］、界面活性剤を含有するＰＢＳ、後述の水性媒体等をあげることができる。当該界面活性剤としては、例えばツイーン(Tween)２０等の非イオン性界面活性剤等が挙げられる。
【００２９】
不溶性担体としては、ＦＧＦ−２３の測定を可能とする不溶性担体であれば特に制限はない。不溶性担体の好ましい素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属等が挙げられる。不溶性担体の好ましい形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックス等の微粒子、スティック等が挙げられ、９６ウェル／枚のポリスチレン製マイクロタイタープレート等が好ましい。
【００３０】
第１抗体の不溶性担体への固定化方法としては、物理学的結合を利用した方法、化学的結合を利用した方法、及び、これらの併用等、公知の方法が用いられる。物理学的結合としては、例えば静電的結合、水素結合、疎水結合等が挙げられる。化学的結合としては、例えば共有結合、配位結合等が挙げられる。
【００３１】
第１抗体は、直接、不溶性担体に固定化してもよいし、間接的に不溶性担体に固定化してもよい。間接的な固定化方法としては、例えばアビジンを固定化した不溶性担体に、ビオチン化した第１抗体の溶液を添加し、ビオチンとアビジンとの特異的結合を介して、第１抗体を不溶性担体に固定化する方法、Fcを固定化した不溶性担体に、第１抗体の溶液を添加し、Fcと第１抗体との相互作用により、第１抗体を不溶性担体に固定化する方法が挙げられる。さらに、第１抗体は、リンカーを介した共有結合により不溶性担体に固定化してもよい。リンカーとしては、例えば、第１抗体の官能基と不溶性担体がその表面に保持している官能基の両者と共有結合できる分子等が挙げられ、第１抗体の官能基と反応することができる第１の反応活性基と、不溶性担体がその表面に保持している官能基と反応することができる第２の反応活性基とを同一分子内に持つ分子が好ましく、その中でも、第１の反応活性基と第２の反応活性基が異なる基である分子が特に好ましい。第１抗体の官能基および不溶性担体がその表面に保持している官能基としては、カルボキシル基やアミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、Ｎ−ヒドロキシサクシニル基、マレイミド基等が挙げられる。リンカーにおける活性な反応性基としては、アリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、アルデヒド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン等の基が挙げられる。
【００３２】
・測定方法２
以下の工程を含有する、工程（１）で採取された検体中のＦＧＦ−２３の測定方法。
(I)工程（１）で採取された検体を、競合物質に標識が結合した標識化競合物質、及び、ＦＧＦ−２３と標識化競合物質の両者に結合する抗体と反応させて、該標識化競合物質と該抗体の免疫複合体を生成させる工程；
(II)工程(I)で生成した免疫複合体中の標識量を測定する工程。
【００３３】
工程(I)と工程(II)との間には、洗浄工程を設けても、設けなくてもよいが、洗浄工程を設けることが好ましい。洗浄工程で用いる洗浄液としては、例えば前述の洗浄液等が挙げられる。ＦＧＦ−２３と標識化競合物質の両者に結合する抗体は、不溶性担体に固定化されていても、固定化されていなくてもよいが、固定化されていることが好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。該抗体を不溶性担体に固定化する方法としては、例えば前述の第１抗体を不溶性担体に固定化する方法等が挙げられる。工程(I)における反応温度としては、ＦＧＦ−２３の測定を可能とする反応温度であれば特に制限はなく、例えば0〜50℃が挙げられ、4℃〜40℃が好ましい。工程(I)における反応時間としては、ＦＧＦ−２３の測定を可能とする反応時間であれば特に制限はなく、例えば1分間〜72時間であり、5分間〜20時間が好ましい。
【００３４】
工程(I)及び(II)は、水性媒体中で行うこともできる。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。ここで、競合物質とは、「ＦＧＦ−２３に結合する抗体」に結合できる物質であって、かつ、その結合が、ＦＧＦ−２３と競合的であるような物質を意味し、ＦＧＦ−２３そのものも含まれる。標識化競合物質は、競合物質と前述の標識物質とを用いて、前述の標識化第２抗体の調製方法と同様の方法により調製することができる。
【００３５】
・測定方法３
以下の工程を含有する、工程（１）で採取された検体中のＦＧＦ−２３の測定方法。
(I)工程（１）で採取された検体を、競合物質、及び、ＦＧＦ−２３と該競合物質の両者に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体と反応させて、該競合物質と該標識化抗体の免疫複合体を生成させる工程；
(II)工程(I)で生成した免疫複合体中の標識量を測定する工程。
【００３６】
工程(I)と工程(II)との間には、洗浄工程を設けても、設けなくてもよいが、洗浄工程を設けることが好ましい。洗浄工程で用いる洗浄液としては、例えば前述の洗浄液等が挙げられる。競合物質は、不溶性担体に固定化されていなくても、固定化されていてもよいが、固定化されていることが好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。競合物質を不溶性担体に固定化する方法としては、例えば前述の第１抗体を不溶性担体に固定化する方法と同様の方法等が挙げられる。工程(I)における反応温度としては、ＦＧＦ−２３の測定を可能とする反応温度であれば特に制限はなく、例えば0〜50℃が挙げられ、4℃〜40℃が好ましい。工程(I)における反応時間としては、ＦＧＦ−２３の測定を可能とする反応時間であれば特に制限はなく、例えば1分間〜72時間であり、5分間〜20時間が好ましい。
【００３７】
工程(I)及び(II)は、水性媒体中で行うこともできる。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。標識化抗体は、該抗体と前述の標識物質とを用いて、前述の標識化第２抗体の調製方法と同様の方法により調製することができる。
【００３８】
測定方法１及び測定方法３における（第２）抗体を標識する標識物質、測定方法２における競合物質を標識する標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、タグ配列を含むポリペプチド、金属コロイド粒子、着色ラテックス粒子等が挙げられる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば、FITC（フルオレッセイン  イソチオシアナート）、RITC（ローダミンＢ−イソチオシアナート）等が挙げられる。その他の蛍光物質として、例えばquantumdot（Science, 281, 2016-2018, 1998）、フィコエリスリン等のフィコビリ蛋白質、GFP（Green fluorescent Protein）、RFP（Red fluorescent Protein）、YFP（Yellow fluorescent Protein）、BFP（Blue fluorescent Protein）等の蛍光を発する蛋白質が挙げられる。発光物質としては、例えば、アクリジニウムおよびその誘導体、ルテニウム錯体化合物、ロフィン等が挙げられる。またルテニウム錯体化合物としては、電子供与体と共に電気化学的に発光する、Clin. Chem. 37, 9, 1534-1539, 1991に示されたものが好ましい。放射性同位元素としては、例えば、3H、14C、35S、32P、125I、131I等が挙げられる。タグ配列を含むポリペプチドとしては、FLAGペプチド（FLAGタグ、Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys）、ポリヒスチジン（Hisタグ、His His His His His His）、mycエピトープペプチド（mycタグ、Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu）、ヘマグルチニンエピトープペプチド（HAタグ、Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala）等が挙げられる。
【００３９】
（第２）抗体の標識化は、（第２）抗体の官能基と標識物質の官能基との間で、リンカーを介してまたは介さず共有結合を生じる反応によって行うことができる。官能基としては、カルボキシル基、アミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、ヒドロキシサクシニルエステル基、マレイミド基、イソチオシアナート基等が挙げられる。この官能基同士の間で縮合反応を行わせることが可能である。
【００４０】
リンカーを介さない結合方法としては例えば、EDC等のカルボジイミド化合物を用いる方法等が挙げられる。この場合、NHSまたはその誘導体等の活性エステルを使用することも可能である。また、イソチオシアナート基とアミノ基の間の縮合反応は、他の試薬を必要とせず、中性〜弱アルカリ性の条件で混合するだけで進行するため、好ましい。
【００４１】
リンカーとしては、例えば、（第２）抗体の官能基に反応する官能基と、標識物質の官能基に反応する官能基の両方の官能基を分子内に有するものが挙げられ、（第２）抗体のアミノ酸残基と反応することができる第１の官能基と、標識物質の官能基と反応することができる第２の官能基とを同一分子内に有する分子が好ましく、その中でも、第１の官能基と第２の官能基とが異なる基である分子が特に好ましい。リンカーの官能基としては、例えば前述の官能基が挙げられる。
【００４２】
放射性同位元素を（第２）抗体に化学的に結合させる方法としては、例えば文献（Antibody Immunoconj. Radiopharm., 3, 60, 1990）記載の方法が挙げられる。
【００４３】
標識物質が酵素、アビジン、蛍光を発する蛋白質、フィコビリ蛋白質、タグ配列を含むポリペプチド等のポリペプチドである場合には、公知の遺伝子組換え技術（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）に従って、標識物質と抗体の融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを作製し、発現ベクターを適当な宿主に導入して、宿主を培養することにより製造することができる。融合蛋白質をコードするDNAは、抗体および標識物質をそれぞれコードするDNAをPCR等でクローニングし、それぞれのDNAをリガーゼ反応で連結することにより得ることができる。
【００４４】
標識量の測定は、標識物質に応じて適切な方法を選択することができる。標識物質が発色物質、すなわち、ある波長の光を吸収する物質の場合には、分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が蛍光物質の場合には、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が発光物質の場合には、発光光度計や発光マルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が放射性同位元素である場合、放射性同位元素の量は、放射活性をシンチレーションカウンター、γ−ウェルカウンター等により測定することができる。
【００４５】
標識が酵素である場合、標識量の測定とは、酵素活性を測定することを意味する。酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、標識量を測定することができる。酵素がペルオキシダーゼである場合には、例えば吸光度法、蛍光法、発光法等によりペルオキシダーゼ活性を測定することができる。吸光度法によりペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および酸化発色型色原体の組み合わせとを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。
【００４６】
ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、テトラメチルベンジジン、ｏ−フェニレンジアミン、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
【００４７】
酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類（トリンダー試薬）との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）等が挙げられる。フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。
【００４８】
蛍光法によりペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および蛍光物質の組み合わせとを反応させ、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で生成した蛍光の強度を測定する方法等が挙げられる。当該蛍光物質としては、例えば４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。
【００４９】
発光法によるペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および発光物質の組み合わせとを反応させ、発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で生成した発光の強度を測定する方法等が挙げられる。当該発光物質としては、例えばルミノール化合物、ルシゲニン化合物等が挙げられる。
【００５０】
酵素がアルカリホスファターゼである場合には、例えば発光法等によりアルカリホスファターゼ活性を測定することができる。発光法によりアルカリホスファターゼ活性を測定する方法としては、例えばアルカリホスファターゼとその基質とを反応させ、生成した発光の発光強度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。アルカリホスファターゼの基質としては、例えば３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）、２−クロロ−５−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ）、３−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＳＰＤＴＭ）、［１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニルイデン］フェノキシメチルリン酸・二ナトリウム塩（ＬｕｍｉｇｅｎＴＭ  ＡＰＳ−５）等が挙げられる。
【００５１】
酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである場合には、例えば吸光度法（比色法）、発光法または蛍光法等によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定することができる。吸光度法（比色法）によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等が挙げられる。発光法によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えばガラクトン−プラス［Galacton-Plus、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社製］またはその類似化合物等が挙げられる。蛍光法によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の蛍光度を蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えば４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等が挙げられる。
【００５２】
酵素がルシフェラーゼである場合には、例えば発光法等によりルシフェラーゼ活性を測定することができる。発光法によりルシフェラーゼ活性を測定する方法としては、例えばルシフェラーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。ルシフェラーゼの基質としては、例えばルシフェリン、セレンテラジン等が挙げられる。
【００５３】
ＦＧＦ−２３の測定方法において、抗原抗体反応、すなわち、測定方法１における工程(I)及び工程(II)、測定方法２及び測定方法３の工程(I)を、金属イオン、塩類、糖類、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等の共存下で行うことができる。金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等が挙げられる。塩類としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙げられる。糖類としては、例えばマンニトール、ソルビトール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、バイオエース、プロクリン３００、プロキセル（Proxel）ＧＸＬ等が挙げられる。蛋白質としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、カゼイン、ブロックエース（大日本製薬社製）等が挙げられる。蛋白質安定化剤としては、例えばペルオキシダーゼ安定化緩衝液［Peroxidase Stabilizing Buffer、ダコサイトメーション（DakoCytomation）社製］等が挙げられる。
【００５４】
＜工程（３）＞
工程（３）において、ＦＧＦ−２３濃度と測定値との間の関係を示す検量線は、既知濃度のＦＧＦ−２３濃度を有する標準品を検体として用いて、前述のＦＧＦ−２３の測定方法により測定を行い、得られた測定値とＦＧＦ−２３濃度とから検量線を作成することができる。
【００５５】
＜工程（４）＞
工程（４）において、工程（１）で採取された検体中のＦＧＦ−２３濃度は、当該検体を用いて、前述のＦＧＦ−２３の測定方法により測定を行い、得られた測定値と上述の検量線とから決定することができる。
【００５６】
＜工程（５）＞
工程（５）において、上記によって得られた、工程（１）で採取された検体中のＦＧＦ−２３濃度を、当該検体中のＦＧＦ−２３の濃度が基準値以上の場合には、当該患者は高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には、当該患者は高リン血症を発症しにくい、という基準と比較する。
【００５７】
本発明における基準値としては、ＣＫＤ患者が高リン血症を発症しやすいか否かを判定し得る基準値であれば特に制限はなく、例えばeGFRが60 mL/分/1.73 m2以上である被検者におけるＦＧＦ−２３濃度の95%信頼区間の上限値等が挙げられる。eGFRが60 mL/分/1.73 m2以上である被検者としては、例えば健常人、ステージ１〜２のＣＫＤ患者等が挙げられる。eGFRが60 mL/分/1.73 m2以上である被検者におけるＦＧＦ−２３濃度の95%信頼区間の上限値は、通常、50〜150 pg/mLであり、55〜100 pg/mLが好ましく、60〜75 pg/mLが特に好ましい。
【００５８】
＜工程（６）＞
工程（６）において、工程（５）での比較の結果、工程（４）で決定された当該検体中のＦＧＦ−２３濃度を上記基準と比較した結果、当該検体中のＦＧＦ−２３濃度が基準値以上の場合には、当該患者は高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には、当該患者は高リン血症を発症しにくいと判定する。
【００５９】
本発明において、高リン血症とは、ＣＫＤ患者が発症する高リン血症、すなわち、腎機能の低下によりリンが体外へ排泄されずに体内に蓄積する病態を表す。本発明において、ＣＫＤ患者が高リン血症を発症しているか否かの判定は、高リン血症発症の判定を可能とする方法であれば如何なる方法であってもよく、例えばＣＫＤ患者より採取した血清中のリン濃度が健常人の血清中のリン濃度の上限値以下である場合は、当該患者は高リン血症を発症していないと判定し、ＣＫＤ患者より採取した血清中のリン濃度が健常人の血清中のリン濃度の上限値を超えた場合は、当該患者は高リン血症を発症していると判定することができる。当該健常人の血清中のリン濃度の上限値としては、例えば4.1〜4.6 mg/dL等が挙げられる。
【００６０】
本発明において、ＣＫＤ患者のステージは如何なるステージであってもよく、例えば、ステージ１〜２であっても、ステージ３〜５であってもよい。ステージ１〜２のＣＫＤ患者であっても、当該ＣＫＤ患者より採取した検体中のＦＧＦ−２３濃度が基準値以上であれば、当該ＣＫＤ患者は高リン血症を発症しやすいと判定することができる。また、ステージ３〜５のＣＫＤ患者であっても、当該ＣＫＤ患者より採取した検体中のＦＧＦ−２３濃度が基準値未満であれば、当該ＣＫＤ患者は高リン血症を発症しにくいと判定することができる。
【００６１】
２．ＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさを試験するための試薬
本発明は、また、ＦＧＦ−２３測定試薬、及び、ＣＫＤ患者より採取された検体中のＦＧＦ−２３濃度が基準値以上の場合には当該患者が高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には当該患者が高リン血症を発症しにくい、という基準が記載された基準表を含む、ＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさを試験するための試薬に関する。本発明の試薬は、本発明の方法に用いることができる。
【００６２】
本発明の試薬におけるＦＧＦ−２３測定試薬は、前述のＦＧＦ−２３の測定方法に使用される試薬である。ＦＧＦ−２３測定試薬としては、検体中のＦＧＦ−２３を測定し得る試薬であれば特に制限はなく、例えば免疫学的測定法に基づいた試薬等が挙げられる。免疫学的測定試薬としては、例えば前述の免疫学的測定方法に基づく試薬等が挙げられる。また、ＦＧＦ−２３測定試薬として、市販の、免疫学的測定法に基づくＦＧＦ−２３測定試薬を用いることもできる。市販の、免疫学的測定法に基づくＦＧＦ−２３測定試薬としては、例えばHuman Intact FGF-23 ELISA Kit(Immutopics社製)、Human FGF-23 ELISA Kit(Merck Millipore社製)、FGF-23測定試薬（カイノス社製）等が挙げられる。
【００６３】
免疫学的測定法に基づいた、ＦＧＦ−２３測定試薬の具体的態様を以下に示す。
・測定試薬１
ＦＧＦ−２３に結合する第１抗体、及び、ＦＧＦ−２３に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体を含むＦＧＦ−２３測定試薬。
・測定試薬２
競合物質に標識が結合した標識化競合物質、及び、ＦＧＦ−２３と標識化競合物質の両者に結合する抗体を含むＦＧＦ−２３測定試薬。
・測定試薬３
競合物質、及び、ＦＧＦ−２３と競合物質の両者に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体を含むＦＧＦ−２３測定試薬。
【００６４】
第１抗体、第２抗体、標識化第２抗体、競合物質、標識化競合物質、ＦＧＦ−２３と標識化競合物質の両者に結合する抗体、ＦＧＦ−２３と競合物質の両者に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体としては、例えば前述の第１抗体、第２抗体、標識化第２抗体、競合物質、標識化競合物質、ＦＧＦ−２３と標識化競合物質の両者に結合する抗体、ＦＧＦ−２３と競合物質の両者に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体等がそれぞれ挙げられる。
【００６５】
測定試薬１において、第１抗体は不溶性担体に固定化されていても、固定化されていなくてもよいが、固定化されていることが好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。測定試薬２において、ＦＧＦ−２３と標識化競合物質の両者に結合する抗体は不溶性担体に固定化されていても、固定化されていなくてもよいが、固定化されていることが好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。測定試薬３において、競合物質は不溶性担体に固定化されていても、固定化されていなくてもよいが、固定化されていることが好ましい。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
【００６６】
ＦＧＦ−２３測定試薬には、前述の金属イオン、塩類、糖類、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等が含まれていてもよい。
【００６７】
本発明の試薬における基準表は、ＣＫＤ患者より採取された検体中のＦＧＦ−２３濃度が基準値以上の場合には当該患者が高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には当該患者が高リン血症を発症しにくい、という基準が記載された基準表である。
【００６８】
本発明において、ＦＧＦ−２３測定試薬を用いて、ＣＫＤ患者における高リン血症の発症しやすさを試験する方法としては、例えば以下の工程を含有する方法等が挙げられる。
（１）ＣＫＤ患者より検体を採取する工程；
（２）工程（１）で採取された検体中のＦＧＦ−２３を、ＦＧＦ−２３測定試薬を用いて測定し、測定値を得る工程；
（３）既知濃度のＦＧＦ−２３を検体として用いて、工程（２）と同様の方法により、ＦＧＦ−２３濃度と測定値との間の関係を示す検量線を作成する工程；
（４）工程（２）で得られた測定値と、工程（３）で作成したＦＧＦ−２３濃度と測定値との間の関係を示す検量線とから、当該検体中のＦＧＦ−２３濃度を決定する工程；
（５）工程（４）で決定された当該検体中のＦＧＦ−２３濃度を、当該検体中のＦＧＦ−２３の濃度が基準値以上の場合には当該患者は高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には当該患者は高リン血症を発症しにくい、という基準表に記載された基準と比較する工程；
（６）工程（５）での比較の結果、工程（４）で決定された当該検体中のＦＧＦ−２３濃度が基準値以上の場合には、当該患者は高リン血症を発症しやすく、基準値未満の場合には、当該患者は高リン血症を発症しにくいと判定する工程。
【００６９】
ＣＫＤ患者としては、例えば前述のＣＫＤ患者等が挙げられる。検体としては、例えば前述の検体等が挙げられる。工程（１）で採取された検体中のＦＧＦ−２３の測定は、ＦＧＦ−２３測定試薬を用いて行われる。ＦＧＦ−２３測定試薬としては、例えば前述のＦＧＦ−２３測定試薬等が挙げられる。ＦＧＦ−２３濃度と測定値との間の関係を示す検量線は、前述の方法等により作成することができる。工程（１）で採取された検体中のＦＧＦ−２３濃度は、前述の方法等により決定することができる。決定されたＦＧＦ−２３濃度と比較される基準としては、前述の基準等が挙げられる。決定されたＦＧＦ−２３濃度と基準との比較により、ＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさを判定するための基準値としては、前述の基準値等が挙げられる。
【００７０】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７１】
ＣＫＤ患者より採取された血清検体中のＦＧＦ２３濃度の決定
（１）ＦＧＦ−２３測定用キット
以下の磁性粒子懸濁液、ビオチン結合抗ＦＧＦ−２３抗体溶液、及び、アルカリホスファターゼ標識抗ＦＧＦ−２３抗体フラグメント溶液を含有するＦＧＦ−２３測定キットを調製した。
【００７２】
＜磁性粒子懸濁液＞
磁性粒子として、ストレプトアビジンが結合した市販の磁性粒子（Dynabeads MyOne Streptavidin T1；ダイナル社製）を用いて、以下の組成からなる磁性粒子懸濁液を調製した。
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ストレプトアビジン結合磁性粒子          ０．７５ｍｇ／ｍＬ
ＢＳＡ                                  ０．１％
塩化ナトリウム                          ０．１ｍｏｌ／Ｌ
【００７３】
＜ビオチン結合抗ＦＧＦ−２３抗体とビオチン結合抗ＦＧＦ−２３抗体溶液＞
第１抗体として、FERM BP-7838として寄託されたハイブリドーマが生産する抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体２Ｃ３Ｂを用いて、当該抗体とNHS−ビオチンとを混合し、３７℃で１時間反応させ、反応後の混合物をセファデックスG-25カラム（ＧＥヘルスサイエンス・ジャパン社製）に供して未反応のNHS−ビオチンを除去し、ビオチン結合抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体を調製した。得られたビオチン結合抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体を用いて、以下の組成からなるビオチン結合抗ＦＧＦ−２３抗体溶液を調製した。
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                        ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体２Ｃ３Ｂ    ５μｇ／ｍＬ
ＢＳＡ                                      ０．１％
塩化ナトリウム                              ０．１ｍｏｌ／Ｌ
【００７４】
＜アルカリホスファターゼ標識抗ＦＧＦ−２３抗体フラグメントとアルカリホスファターゼ標識抗ＦＧＦ−２３抗体フラグメント溶液＞
第２抗体フラグメントとして、FERM BP-7839として寄託されたハイブリドーマが生産する抗ＦＧＦ−２３モノクローナル抗体３Ｃ１Ｅをペプシンで消化した後、G3000SWカラム（東ソー社製；口径：21.5 mm；長さ：60 cm）を用いたHPLCシステム（日立製作所社製）でF(ab’)2を分離した。得られたF(ab’)2を２−メルカプトエチルアミン塩酸塩（ナカライテスク社製）で還元した後、G3000SWカラム（東ソー社製；口径：21.5 mm；長さ：60 cm）を用いたHPLCシステム（日立製作所社製）でFab’を分離した。得られたFab’とアルカリホスファターゼとを以下の手順により、マレイミド法によって結合させた。
【００７５】
マレイミド化試薬Sulfo-HMCS（同仁化学研究所社製）を用いて、アルカリホスファターゼをマレイミド化し、反応混合物をセファデックスG-25ゲル濾過カラム（ＧＥヘルスサイエンス・ジャパン社製）に供して未反応のSulfo-HMCSを除去し、マレイミド化アルカリホスファターゼを得た。
【００７６】
調製したマレイミド化アルカリホスファターゼと、上記で得られたFab’とを混合し、アルカリホスファターゼ標識Fab’抗体を作製した。得られたアルカリホスファターゼ標識Fab’抗体を用いて、以下の組成からなるアルカリホスファターゼ標識抗ＦＧＦ−２３抗体フラグメント溶液を調製した。
ＭＥＳ（ｐＨ６．５）                        ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
アルカリホスファターゼ標識抗ＦＧＦ−２３抗体フラグメント
５μｇ／ｍＬ
ＢＳＡ                                      ０．１％
塩化ナトリウム                              ０．１ｍｏｌ／Ｌ
【００７７】
（２）検量線の作成
ＷＯ２００３／５７７３３号パンフレットに記載された方法によって製造したＦＧＦ−２３を、0.2%BSAを含むリン酸緩衝化生理食塩水（0.15 mol/L 塩化ナトリウムを含有する10 mmol/L リン酸緩衝液、pH7.2）にてＦＧＦ−２３濃度が10,000 pg/mL、3,000 pg/mL、1,000 pg/mL、300 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL、5 pg/mL、0 pg/mLになるように希釈したものを標準溶液として用いた。
【００７８】
上記各標準溶液10μLに、（１）で調製した磁性粒子懸濁液、ビオチン結合抗ＦＧＦ−２３抗体溶液、及び、アルカリホスファターゼ標識抗ＦＧＦ−２３抗体フラグメント溶液を各30 μL加えて攪拌し、37℃で20分間反応させた。磁性粒子を磁力で集めて、磁性粒子以外の反応溶液を除去すると共に、洗浄液［0.1%ツイーン２０を含有する50 mmol/L  ＭＯＰＳ緩衝液(pH7.35)］で磁性粒子を5回洗浄した。その後、９−（４−クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン・二ナトリウム塩を主成分とする発光基質液を100 μL加えて攪拌し、生じた発光量(RLU)を測定し、ＦＧＦ−２３濃度と発光量(RLU)との間の関係を示す検量線を作成した。
【００７９】
（３）ＣＫＤ患者より採取された血清検体中のＦＧＦ−２３濃度の決定
検体として、特定非営利活動法人つくば臨床検査教育・研究センターが保有する、ステージ３〜５のＣＫＤ患者２９名より採取した血清２９検体の各血清検体を用いる以外は、上記（２）と同様の方法により測定を行い、各血清検体に対する発光量を得た後、得られた発光量と上記（２）で作成した検量線とから、各血清検体中のＦＧＦ−２３濃度を決定した。
【００８０】
（４）ＣＫＤ患者の経過観察による高リン血症発症有無の確認
上記（３）において、当該ＣＫＤ患者２９名それぞれに対して、それぞれの患者より採取した血清中のＦＧＦ−２３濃度を決定した日から12〜826日間、経過を観察した。経過を観察期間中に、随時、それぞれの患者より血清を採取し、採取した血清中のリン濃度を決定し、決定されたリン濃度が4.5 mg/dL未満であれば当該ＣＫＤ患者は高リン血症を発症していないと判定し、決定されたリン濃度が4.5 mg/dL以上であれば当該ＣＫＤ患者は高リン血症を発症していると判定した。その結果を第１表及び第２表に示す。
【００８１】
【表１】
2019082329.tif 000003
【００８２】
【表２】
2019082329.tif 000004
【００８３】
第１表及び第２表から明らかなとおり、ＦＧＦ−２３濃度が60 pg/mL未満であったＣＫＤ患者においては、全５名中、すべての患者において、高リン血症の発症が観察されなかったのに対して、ＦＧＦ−２３濃度が60 pg/mL以上であったＣＫＤ患者においては、全２４名中、２０名において、高リン血症の発症が観察された。この様に、ＣＫＤ患者より採取された血清中のＦＧＦ−２３濃度を60 pg/mLという基準値と比較することにより、ＦＧＦ−２３濃度が当該基準値未満の場合には、当該患者は高リン血症を発症しにくく、ＦＧＦ−２３濃度が当該基準値以上の場合には、当該患者は高リン血症を発症しやすいと判定できることが判明した。
【実施例２】
【００８４】
実施例１における、ＦＧＦ−２３濃度が60 pg/mL未満である５名のＣＫＤ患者からなる群と、ＦＧＦ−２３濃度が60 pg/mL以上である２４名のＣＫＤ患者からなる群の両群とについて、ＦＧＦ−２３濃度を決定した日（基準日）から高リン血症の発症が確認された日までの日数を調べた。その結果を図１に示す。図１は、カプラン・マイヤー法による高リン血症非発症率曲線である。ログランク検定において、Ｐ値が0.05未満であったことから、ＦＧＦ−２３濃度が60 pg/mL以上のＣＫＤ患者群の方が、ＦＧＦ−２３濃度が60 pg/mL未満のＣＫＤ患者群に比較して、統計的に有意に高リン血症を発症し易いことが示された。
【００８５】
この様に、ＣＫＤ患者より採取された検体中のＦＧＦ−２３濃度を決定し、その濃度が基準値未満であれば当該患者は高リン血症を発症しにくく、その濃度が基準値以上であれば当該患者は高リン血症を発症しやすいとする基準と比較することにより、ＣＫＤ患者の高リン血症の発症のしやすさを試験できることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明のＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさを試験する方法、及び、ＣＫＤ患者における高リン血症の発症のしやすさを試験するための試薬は、臨床診断において有用であり、ＣＫＤ患者の生活の質の向上に寄与するものである。
【図１】
2019082329.tif 000005