(57)【要約】【課題】αｖβ３インテグリンに対して高親和性を示し各種腫瘍の癌原発巣の診療に汎用性があり、臓器よりも腫瘍への高い集積性を示し、簡素かつ迅速に製造でき、安全で、放射線診断や放射性核種内用療法に用いることができるもので医薬として利用できる、放射標識されたアルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列を含むオリゴペプチド誘導体及びそれを用いた医薬を提供する。【解決手段】オリゴペプチド誘導体は、環状オリゴペプチド配列からなりアルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列を有しつつ、放射性同位体で標識されている。医薬は、前記オリゴペプチド誘導体を含有するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状オリゴペプチド配列からなりアルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列を有しつつ、放射性同位体で標識されていることを特徴とするオリゴペプチド誘導体。
【請求項２】
インテグリンに、結合し、配位し、及び／又は親和することを特徴とする請求項１に記載のオリゴペプチド誘導体。
【請求項３】
前記放射性同位体が、放射性ヨウ素、放射性アスタチン、放射性ストロンチウム、放射性イットリウム、放射性ラジウム、放射性ビスマス、放射性アクチニウム、放射性ルテチウム、放射性レニウム、及び放射性銅から選ばれる何れかの放射性核種を含んでいることを特徴とする請求項１〜２の何れかに記載のオリゴペプチド誘導体。
【請求項４】
前記放射性同位体がα線を放出することを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のオリゴペプチド誘導体。
【請求項５】
前記放射性同位体が、211Ａｔを含んでいることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載のオリゴペプチド誘導体。
【請求項６】
前記環状オリゴペプチド配列のアミノ酸残基の芳香環基に直接、若しくは前記環状オリゴペプチド配列へスペーサー基を介して又は介さずに結合した芳香環基に、前記放射性同位体が結合していることを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載のオリゴペプチド誘導体。
【請求項７】
前記環状オリゴペプチド配列が、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄ−アミノ酸配列を有していることを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載のオリゴペプチド誘導体。
【請求項８】
前記環状オリゴペプチド配列中の前記Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−フェニルアラニン、又はＤ−チロシンであることを特徴とする請求項７に記載のオリゴペプチド誘導体。
【請求項９】
環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−フェニルアラニン−リジン）オリゴペプチド誘導体、環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−チロシン−リジン）オリゴペプチド誘導体、環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−フェニルアラニン−バリン）オリゴペプチド誘導体、又は環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−チロシン−バリン）オリゴペプチド誘導体であることを特徴とする請求項１〜８の何れかに記載のオリゴペプチド誘導体。
【請求項１０】
環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄ−フェニルアラニン−リジン）オリゴペプチド誘導体、環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄ−チロシン−リジン）オリゴペプチド誘導体、環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄ−フェニルアラニン−バリン）オリゴペプチド誘導体、又は環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄ−チロシン−バリン）オリゴペプチド誘導体であることを特徴とする請求項１〜９に記載のオリゴペプチド誘導体。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れかに記載のオリゴペプチド誘導体を含有することを特徴とする医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞やそれにより亢進された組織のリガンドに結合し放射線診療に用いるオリゴペプチド誘導体、及びそれを用いた医薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
放射性同位元素である放射性核種（ＲＩ）を有する放射性医薬品は、治療や診断のような診療に用いられている。このような放射性核種として例えば、治療用に89Ｓｒ、90Ｙ、135Ｉ、131Ｉ、125Ｉ、153Ｓｍ、186/188Ｒｅ、211Ａｔ、223Ｒａなどが知られ、体内診断用に18Ｆ、67/68Ｇａ、99ｍＴｃ、111Ｉｎ、123Ｉ、133Ｘｅなどが知られ、体外診断用に3Ｈ、125Ｉなどが知られている。
【０００３】
放射性核種内用療法（Radionuclide Therapy）は、放射性核種内用療法用薬剤を静注や経口で投与し、癌原発巣や転移巣のような病巣部位にこの放射性薬剤を集積させ、放射性薬剤から放出されるα線又はβ線のような放射線により、病巣部位の癌細胞を破壊するというものである。
【０００４】
日本で保険適応となっている放射性核種内用療法用薬剤として、β線を放出するヨウ化ナトリウム(核種：131Ｉ)、塩化ストロンチウム(同89Ｓｒ)及び放射標識抗CD20抗体(同90Ｙ)や、α線を放出する塩化ラジウム(同223Ｒａ)などがある。
【０００５】
これらの薬剤を用いた放射性核種内用療法は、例えば甲状腺機能亢進症や甲状腺癌において甲状腺がヨウ素を取り込む性質を利用したり、骨転移などの骨代謝の亢進した病態の領域にラジウムが集積する性質を利用したりして、放射性核種のヨウ化ナトリウムや塩化ラジウムの薬剤を投与し、甲状腺癌等の病巣部位や骨転移領域で、α線やβ線を放出させて、癌細胞を破壊して死滅させ、抗腫瘍効果を発揮するというものである。
【０００６】
β線を放出する放射性核種内用療法用薬剤は病巣部位の癌細胞に集積したとしても、β線は飛程が０．５ｍｍ程度と比較的長いため癌細胞や近隣の正常細胞まで到達し、癌細胞の破壊のみならず正常細胞までも損傷してしまう。一方、α線を放出する放射性核種内用療法用薬剤は病巣部位の癌細胞に集積すると、α線は、β線に比べ約４００倍もの高い線エネルギー付与(LET)（α線:80keV/μm、β線:0.2 keV/μm）を有し、強い細胞傷害性を持ち飛程が極めて短い。そのため、α線はその癌細胞の標的部位にしか到達せず癌細胞を破壊するが、近隣の正常細胞を損傷しない。
【０００７】
このようなα線を放出する放射性核種として211Ａｔも知られている。211Ａｔは安定同位体が存在しないため、詳しい物理的性質が未だに不明なハロゲン元素である。Ａｔは、ＩやＢｒなど他のハロゲンと類似した化学的性質・化学反応性を持つ。そのため、既知のハロゲン誘導体での合成法を応用してＡｔ標識して、治療用に放射性核種として211Ａｔを導入し得る。211Ａｔは半減期が７．２時間で短く安全性が高い。このような211Ａｔを各種病巣部位などの標的部位に効率良く集積できれば、放射性核種内用療法において高い治療効果が期待できる。
【０００８】
ところで、細胞質膜を貫通する受容体であって細胞接着に関与する接着因子であるインテグリンは、１８種類のαサブユニット、８種類のβサブユニットが確認されている（非特許文献１）。そのうち、αｖβ３インテグリンは、血管新生のマーカーであり、また様々な癌細胞に過剰発現している（非特許文献２）。腫瘍による血管新生の亢進の際の血管の内皮細胞にαｖβ３インテグリンが発現したり、腫瘍の癌原発巣の癌細胞にαｖβ３インテグリンが発現したりしている。アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)配列を含むペプチドはαｖβ３インテグリンに対して高親和性を示す（非特許文献３）
【０００９】
特許文献１に、環状ＲＧＤモチーフおよびスペーサー配列により共有結合で連結された２つのエキスタチンＣ末端部分を含有する、αｖβ３インテグリンに対する選択的アフィニティーを示す、αｖβ３インテグリンのアンタゴニスト化合物が記載されており、放射性同位元素を錯化することができるキレート化剤が例示されている。
【００１０】
特許文献２に、α３β１−インテグリン、α５β１−インテグリン、αｖβ３−インテグリンおよびαｖβ５−インテグリン、および他のインテグリンのうちの少なくとも一つを阻害すること、およびヒトまたは動物の対象者におけるｂＦＧＦ産生を阻害すること、のうちの少なくとも一方を行うためのものであって、対象者に有効量のＲＧシステイン酸ペプチドまたはその誘導体を投与する工程を含む方法が記載されている。特許文献２には、ＲＧシステイン酸ペプチドまたはその誘導体は放射性標識されており、かつ腫瘍を検出するために用いられる方法が例示されている。
【００１１】
αｖβ３インテグリンに対して高親和性を示し、各種腫瘍の癌原発巣の放射線診断や放射性核種内用療法に用いることができるアルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列を含むペプチドが求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Margret Schotteliusら, “Ligands for Mapping αvβ3-Integrin Expression in Vivo”, Account of Chemical Research., 2009年，第42巻，p.969-980
【非特許文献２】Roland Haubnerら， “Radiolabeled αvβ3 Integrin Antagonists: A New Class of Tracers for Tumor Targeting”, Journal of Nuclear Medicine，1999年，第40巻，p.1061-1071
【非特許文献３】Ulrich Herselら， “RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond”, Biomaterials，2003年，第24巻，p.4385-4415
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特表２００９−５１２６４３号公報
【特許文献２】特開２０１７−１０５８３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、αｖβ３インテグリンに対して高親和性を示し各種腫瘍の癌原発巣の診療に汎用性があり、臓器よりも腫瘍への高い集積性を示し、簡素かつ迅速に製造でき、安全で、放射線診断や放射性核種内用療法に用いることができるもので医薬として利用できる、放射標識されたアルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列を含むオリゴペプチド誘導体、及びそれを用いた医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記の目的を達成するためになされた本発明のオリゴペプチド誘導体は、環状オリゴペプチド配列からなりアルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列を有しつつ、放射性同位体で標識されているというものである。
【００１６】
このオリゴペプチド誘導体は、インテグリンに、結合し、配位し、及び／又は親和することができるものである。
【００１７】
このオリゴペプチド誘導体は、前記放射性同位体が、放射性ヨウ素、放射性アスタチン、放射性ストロンチウム、放射性イットリウム、放射性ラジウム、放射性ビスマス、放射性アクチニウム、放射性ルテチウム、放射性レニウム、及び放射性銅から選ばれる何れかの放射性核種を含んでいることが好ましい。
【００１８】
このオリゴペプチド誘導体は、記放射性同位体がα線を放出するものである。
【００１９】
このオリゴペプチド誘導体は、前記放射性同位体が、例えば211Ａｔを含んでいるというものである。
【００２０】
このオリゴペプチド誘導体は、前記環状オリゴペプチド配列のアミノ酸残基の芳香環基に直接、若しくは前記環状オリゴペプチド配列へスペーサー基を介して又は介さずに結合した芳香環基に、前記放射性同位体が結合していることが好ましい。
【００２１】
このオリゴペプチド誘導体は、前記環状オリゴペプチド配列が、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄ−アミノ酸配列を有していると一層好ましい。
【００２２】
このオリゴペプチド誘導体は、前記環状オリゴペプチド配列中の前記Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−フェニルアラニン、又はＤ−チロシンであると、なお一層好ましい。
【００２３】
このオリゴペプチド誘導体は、例えば環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−フェニルアラニン−リジン）オリゴペプチド誘導体、環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−チロシン−リジン）オリゴペプチド誘導体、環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−フェニルアラニン−バリン）オリゴペプチド誘導体、又は環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−チロシン−バリン）オリゴペプチド誘導体である。
【００２４】
このオリゴペプチド誘導体は、環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄ−フェニルアラニン−リジン）オリゴペプチド誘導体、環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄ−チロシン−リジン）オリゴペプチド誘導体、環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄ−フェニルアラニン−バリン）オリゴペプチド誘導体、又は環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄ−チロシン−バリン）オリゴペプチド誘導体であると、一層好ましい。
【００２５】
前記の目的を達成するためになされた本発明の医薬は、前記のオリゴペプチド誘導体を含有するというものである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のオリゴペプチド誘導体は、簡素な構造で、選択的にインテグリンとりわけαｖβ３インテグリンに対して高親和性を示して結合、配位し及び／又は親和でき、従来のオリゴペプチド誘導体やその放射性同位体標識化合物に比べ、臓器よりも腫瘍への高い集積性を示す腫瘍特異性に優れるものである。
【００２７】
このオリゴペプチド誘導体は、簡易且つ迅速に簡便に高純度で製造できるため、半減期が比較的長い放射性同位体でも数日程度と比較的短い放射性同位体でも含有させることができ、安全性が高く、品質に優れている。さらにこのオリゴペプチド誘導体は、医薬として用いることができる。とりわけ半減期が７．２時間と短い211Ａｔを放射性同位体として用いる場合であっても、簡便な合成法で投与の少し前に調製できるので、放射能を十分に活用して放射線治療効果を発揮できる。
【００２８】
このオリゴペプチド誘導体は、腫瘍組織、例えば腫瘍の癌原発巣の癌細胞、転移しつつある微小癌転移組織又は転移してしまった転移組織、腫瘍による新生血管への高い集積性に起因して、放射性同位体による高い腫瘍組織選択的撮像能や癌細胞やそれに起因する殺傷能を有する。
【００２９】
特に放射性同位体が、α線を放出する211Ａｔであると癌細胞のみを破壊し正常細胞を損傷しない。
【００３０】
このオリゴペプチド誘導体を含有する医薬は、経口投与や静注投与又は腫瘍組織への直接投与により、癌細胞やそれによる新生血管の内皮細胞のインテグリンとりわけαｖβ３インテグリンにオリゴペプチド誘導体を集積させて、腫瘍組織の選択的な放射線診断に利用して正確で確実な画像診断や、腫瘍組織へ有効成分を集積させる放射性核種内用療法に利用して確実で安全な癌細胞の破壊やアポトーシスを誘導することができる。
【００３１】
また、このオリゴペプチド誘導体を含有する医薬は、腫瘍組織への集積性が高いので、放射線診断にも用いることができ、安全で確実に腫瘍組織部位、腫瘍組織によって亢進した血管部位、微小癌転移乃至癌転移した部位、郭清すべき腋窩リンパ節部位などを、特定したり、腫瘍の進行状況を診断したりするのに、用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明を適用するオリゴペプチド誘導体について担癌モデルマウスにおける体内放射能分布の結果を示すグラフである。
【図２】本発明を適用する別なオリゴペプチド誘導体について担癌モデルマウスにおける体内放射能分布の結果を示すグラフである。
【図３】本発明を適用するさらに別なオリゴペプチド誘導体について担癌モデルマウスにおける体内放射能分布の結果を示すグラフである。
【図４】本発明を適用するさらに別なオリゴペプチド誘導体について担癌モデルマウスにおける体内放射能分布の結果を示すグラフである。
【図５】本発明を適用するオリゴペプチド誘導体について非放射性リガンドによる阻害試験の結果を示すグラフである
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの形態に限定されるものではない。
【００３４】
本発明のオリゴペプチド誘導体は、アミノ酸配列が環状オリゴペプチド配列のみからなりアルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列を有しつつ、放射性同位体で標識されているものである。
【００３５】
オリゴペプチド誘導体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列を有していると、インテグリン、そのファミリーの中でも特にαｖβ３インテグリンを認識してそこへ結合し、配位し、及び／又は親和することができるものである。
【００３６】
この放射性同位体が、放射性ヨウ素（135Ｉ、131Ｉ、125Ｉ）、放射性アスタチン（211Ａｔ）、放射性ストロンチウム（89Ｓｒ）、放射性イットリウム（90Ｙ）、放射性ラジウム（223Ｒａ）、放射性ビスマス（212/213Ｂｉ）、放射性アクチニウム（225Ａｃ）、放射性ルテチウム（177Ｌｕ）、放射性レニウム（186/188Ｒｅ）、及び放射性銅（64/67Ｃｕ）から選ばれる何れかの放射性核種及びそれらが崩壊した放射性核種又はそれの安定同位体核種を含んでいてもよい。
【００３７】
中でも、Ｘ線を放射する125Ｉ、α線を放射する211Ａｔが好ましい。とりわけ、この放射性同位体が211Ａｔであると、放射性核種内用療法用薬剤として用いられるオリゴペプチド誘導体が病巣部位の癌細胞やそれにより亢進した血管内皮細胞のαｖβ３インテグリンに結合等をして短時間で集積し、α線が、死滅させるべき癌細胞等の組織のみに到達して損傷を惹き起こして破壊及びアポトーシスを誘導するが近隣の正常細胞を損傷しない。
【００３８】
オリゴペプチド誘導体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列を含む環状オリゴペプチド配列に直接、若しくはスペーサー基を介して又は介さずに結合した芳香環基に、前記放射性同位体が結合していてもよい。その芳香環基はフェニル基のような炭化水素芳香環であっても複素芳香環であってもよい。オリゴペプチド誘導体は、環状オリゴペプチド配列中にフェニルアラニン残基やチロシン残基がある場合にその芳香環に前記放射性同位体が直接結合していてもよい。スペーサー基を介して結合した芳香環基は、例えば前記環状オリゴペプチド配列中にリジン残基がある場合にその末端の遊離ε−アミノ基に結合するもので前記放射性同位体が結合しているベンゾイル基、ベンジルオキシカルボニル基が挙げられる。
【００３９】
オリゴペプチド誘導体は、例えば環状ペンタオリゴペプチド配列からなるもので、官能基が非アミノ酸で保護されているものであってもよいが、環状のオリゴペプチド配列に別なアミノ酸が結合していないものである。この環状のペンタオリゴペプチド配列は、天然型Ｌアミノ酸から構成されていてもよく、一つ又は複数が非天然型Ｄアミノ酸で置換されて構成されていてもよい。
【００４０】
オリゴペプチド誘導体中、環状オリゴペプチド配列は、例えばアルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄ−アミノ酸配列を有している。中でも、オリゴペプチド誘導体中、環状オリゴペプチド配列は、環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−任意のアミノ酸−リジン）又は環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−任意のアミノ酸−バリン）が好ましく、環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄ−アミノ酸−リジン）又は環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄ−アミノ酸−バリン）であると一層好ましい。環状ペンタペプチド配列中の任意のアミノ酸はチロシン又はフェニルアラニンであることが好ましく、中でもＤ−チロシン又はＤ−フェニルアラニンであると一層好ましい。
【００４１】
オリゴペプチド誘導体は、放射性同位体で標識された環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄ−アミノ酸−リジン）オリゴペプチド誘導体、又は放射性同位体で標識された環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄ−アミノ酸−バリン）であると、αＶβ３インテグリンへの親和性が高くなる。
【００４２】
オリゴペプチド誘導体は、より具体的には、下記化学式(Ｉ)
【化１】
2019043892.tif 000002
（式(Ｉ)中、Ｘ１は前記の放射性同位体を示す）で表わされるもので、フェニルアラニン残基のベンゼン環に直接放射性同位体125Ｉである放射性ヨウ素又は211Ａｔである放射性アスタチンで直接標識した環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−フェニルアラニン−リジン）オリゴペプチド誘導体であることが好ましい。中でもＸ１が125Ｉ又は211Ａｔである化合物は、生体内放射能分布試験を行ったところ、腫瘍組織への高い集積を示した。
【００４３】
化学式(Ｉ)で表わされるオリゴペプチド誘導体の合成法は、例えば非放射性ヨウ素で置換したフェニルアラニン残基を有する環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−ヨウ素置換フェニルアラニン−リジン）オリゴペプチドをペプチド固相合成で作製し、次いで非放射性ヨウ素−放射性ヨウ素置換反応、例えばヨウ素基を有機スズで置換しクロラミンＴやＮＣＳのような酸化剤の存在下で放射性ヨウ素イオン(125Ｉ−)又は放射性アスタチンイオン(211Ａｔ−)で置換するというものである。
【００４４】
また、別なオリゴペプチド誘導体は、具体的には、環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−チロシン−リジン）オリゴペプチド誘導体、とりわけ下記化学式(II)
【化２】
2019043892.tif 000003
で表わされるもので、チロシン残基のベンゼン環に放射性同位体125Ｉである放射性ヨウ素で直接標識した環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄ−チロシン−リジン）オリゴペプチド誘導体（式(II)中、Ｘ２は前記の放射性同位体を示す）であってもよい。中でもＸ２が125Ｉである化合物は、生体内放射能分布試験を行ったところ、腫瘍組織への高い集積を示した。
【００４５】
化学式(II)で表わされるオリゴペプチド誘導体の合成法は、環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−Ｄ−チロシン−リジン）オリゴペプチドをペプチド固相合成で作製し、次いでクロラミンＴ存在下で放射性ヨウ素イオン(125Ｉ−)をチロシン残基の水酸基の隣に導入するというものである。
【００４６】
さらに、別なオリゴペプチド誘導体は、具体的には、下記化学式(III)
【化３】
2019043892.tif 000004
（式(III)中、Ｘ３は前記の放射性同位体を示す）で表わされるもので、放射性同位体125Ｉである放射性ヨウ素又は211Ａｔである放射性アスタチンで標識されたベンゾアミドでリジン残基が保護されている環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−フェニルアラニン−リジン）オリゴペプチド誘導体であってもよい。中でも、Ｘ3が125Ｉである化合物は、生体内放射能分布試験を行ったところ、腫瘍組織へ幾分低い集積性を示したが、腸への高い集積性も示した。
【００４７】
化学式(III)で表わされるオリゴペプチド誘導体の合成法は、例えば、Ｎ-スクシンイミジル ３-(トリ-n-ブチルスズ)ベンゾエート(N-Succinimidyl 3-(tri-n-butylstannyl)benzoate：ATE)にt-ブチルハイドロパーオキサイド(tert-Butyl hydroperoxide)存在下で放射性ヨウ素イオン(125Ｉ−)を反応させてＮ-スクシンイミジル ３-125ヨードベンゾエート(N-Succinimidyl 3-125iodobenzoate)とし、未置換の環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−フェニルアラニン−リジン）オリゴペプチドに反応させて、トリエチルアミン存在下で、放射性ヨウ素標識ベンンゾアミドとして保護されている環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−フェニルアラニン−リジン）オリゴペプチド化合物を得るというものである。なお、環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−チロシン−リジン）からも同様にして放射性ヨウ素(125Ｉ)置換体を得ることができる。
【００４８】
本発明の医薬は、前記オリゴペプチド誘導体を有効成分として含有するというものである。
【００４９】
この医薬を用いて、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）イメージング試験を行うことができる。
【００５０】
この医薬は、前記オリゴペプチド誘導体をαｖβ３インテグリンに結合し、配位し、及び／又は親和する有効成分として含有し、必要に応じ、非毒性で不活性の薬学的に許容しうる賦形剤、例えば固体状、半固体状もしくは液状の希釈剤、分散剤、充填剤及び担体と混合することにより、製剤化されている。さらに安定剤、保存剤、ｐＨ調整剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料防腐剤、媒質、生理食塩水、別な薬効を有する薬剤が添加剤として含まれていてもよい。
【００５１】
この医薬の剤形は、例えばエリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、軟膏、懸濁剤、液剤、腸溶剤、乳剤、硬膏剤、坐剤、散剤、錠剤、シロップ剤、注射剤、トローチ剤、軟膏剤、ハップ剤、リニメント剤、リモナーデ剤、ローション剤が挙げられる。液状媒体に溶解させてもよく懸濁させてもよく、固体状媒体に分散させたものであってもよい。
【００５２】
この医薬は、経口で投与してもよいが、吸収・分布・代謝の観点から静脈注射・点滴で投与することが好ましく、腫瘍組織近傍に直接注入してもよい。
【００５３】
この医薬中、前記オリゴペプチド誘導体は、トレーサ量という薬理作用を示さないごく微量の化学量で標識し、精製後、投与するというものである。
【００５４】
この医薬の投与量、用量は、前記オリゴペプチド誘導体である有効成分の有効性、投与の形態・経路、癌の進行ステージ、患者の体型・体重・年齢、併用する他の疾患の治療薬の種類や量に応じ、適宜選択される。その投与は、１〜３０日間隔又は１〜６月間隔で間欠的に投与される。
【００５５】
この医薬は、以下のように使用されて、効能を発揮する。例えば211Ａｔを有するオリゴペプチド誘導体を含有した医薬を、腫瘍を治療すべき患者に投与する。医薬に含有されているオリゴペプチド誘導体が、経口投与又は血中投与により血液等を介して流動し又は腫瘍部位近傍に投与されて、腫瘍部位に到達する。オリゴペプチド誘導体は、環状オリゴペプチド配列の存在によって、腫瘍の癌原発巣の癌細胞に発現し又は腫瘍による血管新生の亢進の際の血管の内皮細胞に発現しているαｖβ３インテグリンにおけるアルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列に対する受容体部位に結合し、配位し、及び／又は親和する。その結果、このオリゴペプチド誘導体が、癌細胞や、腫瘍による血管新生の亢進の際の血管内皮細胞に専ら集積して留まる。その際、オリゴペプチド誘導体の放射性同位体211Ａｔがα線を放出する。α線は飛程距離が短く、結合等をした腫瘍組織の癌細胞等を選択的に放射能で破壊してアポトーシスを誘導し死滅させる。しかしα線はその近傍の正常細胞にまで到達できないので正常組織を損傷しない。
【００５６】
この医薬を放射線治療に用いる場合を例に説明したが、放射線診断に用いる場合でも、同様に集積するので、放射線診断の際にも癌細胞や、腫瘍による血管新生の亢進の際の血管内皮細胞を検知することができるが、その近傍の正常組織を損傷しない。
【実施例】
【００５７】
以下に、本発明のオリゴペプチド誘導体を合成し、医薬としての有用性について、実証した例を示す。
【００５８】
用いた試薬、及び機器は以下の通りである。
（試薬・機器）
ペプチド固相合成に必要な試薬である2-クロロトリチル クロライド レジン(2-chlorotrityl chloride resin)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-D-Phe-OHは渡辺化学工業株式会社(東京, 日本)、Fmoc-Lys(Boc)-OH、ヒト精製αvβ3インテグリン、薄層クロマトグラフィー (TLC Silica gel 60F254)はMerck (Darmstadt, ドイツ)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールハイドレート)1-hydroxybenzotriazolehydrate (HOBt)、1,3-diisopropylcarbodiimide (DIPCDI)は国産化学株式会社(東京, 日本)、N,N-ジメチルホルムアミド(N,N-dimethylformamide)(DMF)は和光純薬工業株式会社(大阪, 日本)、[125I]NaIは、Perkin Elmer (Waltham, MA, 米国)より購入し、その他試薬はナカライテスク(京都, 日本)より購入し、試薬はすべて特級試薬を用いた。211At-は国立大学法人大阪大学より供給を受けた。U87MG (ヒトグリオーマ細胞株)はDSファーマバイオメディカル株式会社(大阪, 日本)より購入した。逆相HPLCについて、Comosil 5C18-AR-II (4.6 × 150 mm)、Comosil 5C18-AR-II (10 × 150 mm)カラムはナカライテスク株式会社(京都, 日本)、送液ユニットLC-20AD及びLC-20AR、カラムオーブンCTO-10A及びCTO-20A、吸光度検出器のSPD-10A及びSPD-20Aは株式会社島津製作所(京都, 日本) の製品を用い、エレクトロンスプレーイオン化質量測定装置(ESI-MS)のJMS-T100TDは日本電子株式会社(JEOL) (東京, 日本)、放射線測定装置オートウェルガンマシステムのAccuFLEX gamma ARC-7010は株式会社日立ヘルスケア・マニュファクチャリング(柏, 日本)、及びWallac Wizard 1470 Gamma Counter はPerkin Elmer (Waltham, MA, 米国)を用いた。
【００５９】
（実施例１：化学式(Ｉ)タイプのオリゴペプチド誘導体）
前記化学式(Ｉ)で表わされるオリゴペプチド誘導体は、下記化学反応式[１]〜[４]に示す方法で合成した。また得られたオリゴペプチド誘導体は、有効性試験に用いた。その合成の詳細は以下の通りである。
【００６０】
【化４】
2019043892.tif 000005
【００６１】
【化５】
2019043892.tif 000006
【００６２】
【化６】
2019043892.tif 000007
【００６３】
【化７】
2019043892.tif 000008
【００６４】
Fmoc-4-ヨード-D-フェニルアラニン（Fmoc-4-iodo-D-phenylalanine）(1)の合成
既存の方法に従い、化学反応式[１]に示すように、Ｄ−フェニルアラニンにI2及びNaIO3を反応させヨード-D-フェニルアラニン(D-Phe(4-I)-OH)とした後、Fmoc-OSuをK2CO3存在下で反応させることにより、Fmoc-4-ヨード-D-フェニルアラニン(1)(Fmoc-D-Phe(4-I)-OH)を得た。その理化学分析結果は、DART-MS (m/z calcd for ([M+H]+): 514.04 found: 514.04)であり、化合物(1)の構造を支持する。
【００６５】
c[Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-4-iodo-D-Phe-Lys(Boc)] (2)の合成
化合物１を用いて、化学反応式[２]に示すように、通常のFmoc固相合成法に従いレジン結合ペプチドとFmocアミノ酸とをN,N-ジイソプロピルカルボジイミドとHOBt存在下、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)中で攪拌することにより結合させ、ピペリジンによりFmoc基を脱保護する操作を繰り返すことによりペプチド鎖を伸長させて、同式に示す固相支持体樹脂（黒丸）に結合した鎖状のオリゴペプチドとし、次いで30%ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)で固相支持体樹脂から切り出してH2N-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-OHとし、ジフェニルリン酸アジド(DPPA)及びNaHCO3存在下、c[Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-4-iodo-D-Phe-Lys(Boc)] (2)を合成した。逆相HPLCによる精製を行い、白色粉末の化合物(2)(63.8 mg, 37.4 %)を得た。逆相HPLCにはCosmosil 5C18-AR-II (10 × 150 mm)カラムを使用し、移動相は0.1 %テトラフルオロ酢酸(TFA)を含有する水:メタノール(20:80)から、10分間で(10:90)に変換するグラジエント法にてUV = 220 nm、流速4.0 mL/minの条件で行った。その理化学分析結果は、ESI-MS (m/z calcd for ([M+H]+): 1138.41 found: 1138.66)であり、化合物(2)の構造を支持する。
【００６６】
I-c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (3)の合成
化学反応式[４]に示すように、化合物(2)(10mg: 8.79μmol)をTFA:水:トリイソプロピルシラン((i-Pr)3SiH)(38:1:1, 500 μL)の混合溶液に溶解し、室温にて2時間撹拌を行った。溶媒を窒素ガスにより留去し、残留物を逆相HPLCにて精製し、白色粉末の化合物I-c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (3) (6.1 mg, 95.2%)を得た。逆相HPLCにはCosmosil 5C18-AR-II (10 × 150 mm)カラムを使用し、移動相は0.1%のTFAを含有する水:メタノール(70:30)から、10分間で(50:50)に変換するグラジエント法にてUV = 220 nm、流速4.0 mL/minの条件で行った。その理化学分析結果は、ESI-MS (m/z calcd for ([M+H]+): 730.21 found: 730.18)であり、化合物(3)の構造を支持する。
【００６７】
Sn(nBu)3-c[Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys(Boc)] (4)の合成
化学反応式[３]に示すように、化合物(2) (5.6mg 4.9μmol)を、無水1,4-ジオキサン (400μL)に溶解し、ビス(トリブチルスズ([(nBu)3Sn]2) (5.96μL: 2.4当量)、及びビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II) ジクロリド(PdCl2[P(C6H5)3]2)(517.26μL: 0.15当量)を加え、窒素雰囲気下、60℃に加熱しながら2時間撹拌後、逆相HPLCによる精製を行い、白色粉末のSn(nBu)3-c[Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys(Boc)] (4) (512μg, 8.00%)を得た。逆相HPLCにはCosmosil 5C18-AR-II (10 × 150 mm)カラムを使用し、移動相は0.1%のTFAを含有する水:メタノール(5:95)から、10分間で(2.5:97.5)に変換するグラジエント法にてUV = 220 nm、流速4.0 mL/minの条件で行った。その理化学分析結果は、ESI-MS (m/z calcd for ([M+H]+): 1302.62 found: 1302.62)であり、化合物(4)の構造を支持する。
【００６８】
Sn(nBu)3-c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (5)の合成
化学反応式[４]に示すように、化合物(3)(2.0 mg 2.74 μmol)を、無水メタノール(300 μL)に溶解し、N,N-ジイソプロピルメチルアミン(DIEA, 2.5当量)、及びビス(トリブチルスズ) ([(nBu)3Sn]2)(5.82 μL, 4.0当量)を加え、窒素ガスを吹きかけた。その後、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)(Pd2(dba)3)(384.6 μg, 0.15 当量)を加え、窒素雰囲気下、70℃に加熱しながら12時間撹拌後、逆相HPLCによる精製を行い、白色粉末のSn(nBu)3-c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (5) (839.7μg, 34.3%)を得た。逆相HPLCにはCosmosil 5C18-AR-II (10 × 150 mm)カラムを使用し、移動相は0.1%のTFAを含有する水:メタノール(30:70)から、10分間で(25:75)に変換するグラジエント法にてUV = 220 nm、流速4.0 mL/minの条件で行った。その理化学分析結果は、ESI-MS (m/z calcd for ([M+H]+): 894.42 found: 894.44)であり、化合物(5)の構造を支持する。
【００６９】
125I-c[Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys(Boc)] (6)の作製
化学反応式[３]に示すように、化合物(4) (30μg, 23.0nmol)をエタノール(79 μL)に溶解し、クロラミンT/エタノール溶液(1 mg/mL, 15 μL)、1%酢酸/エタノール溶液(21 μL)、及び[125I]NaI (3.7 MBq, 3 μL)を加えて室温にて10分間放置し、逆相HPLCにて精製することで125I-c[Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys(Boc)] (6) (放射化学的収率: 82.9%、放射化学的純度: 96.6%)を得た。逆相HPLCにはCosmosil 5C18-AR-II (4.6 × 150 mm)カラムを使用し、移動相は0.1%のTFAを含有する水:メタノール(20:80)から20分間で(0:100)に変換するグラジエント法にて、流速1.0 mL/minの条件で行った。
【００７０】
125I-c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (7)の作製（化合物(6)使用）
化学反応式[３]に示すように、化合物(6)をTFA:水:トリイソプロピルシラン(38:1:1, 80 μL)の混合溶液に溶解し、室温にて90分間撹拌を行った。溶媒を窒素ガスにより留去し、残留物を逆相HPLCにて精製し、125I-c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (7) (放射化学的収率: 75.1%、放射化学的純度: 97.0%。以下、125I-c(RGDfK)と略記することがある)を得た。逆相HPLCにはCosmosil 5C18-AR-II (4.6 × 150 mm)カラムを使用し、移動相は0.1%のTFAを含有する水:メタノール(70:30)から20分間で(30:70)に変換するグラジエント法にて、流速1.0 mL/minの条件で行った。この化合物(7)と、放射性同位体非標識でヨウ素置換体である化合物(3)であるI-c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (3)との逆相HPLCによる分析と比較したところ、同じリテンションタイムに夫々単一の溶出ピークが検出され、化合物(7)であることが確認された。
【００７１】
125I-c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (7)の作製 (化合物(5)使用)
化学反応式[４]に示すように、化合物(5) (30μg, 33.6 nmol)をアセトニトリル(5 μL)に溶解し、1%酢酸/アセトニトリル溶液(10 μL)、[125I]NaI (3.7 MBq, 3 μL)、及びN-クロロスクシンイミド(NCS)/アセトニトリル溶液(1 mg/mL, 15 μL)を加えて80℃に加熱しながら15分間反応させたのち、亜硫酸水素ナトリウム(NaHSO3)水溶液(1 mg/mL, 15 μL)で反応を停止し、逆相HPLCにて精製することで化合物(7) (放射化学的収率: 83.1%、放射化学的純度: 96.1%)を得た。逆相HPLCにはCosmosil 5C18-AR-II (4.6 × 150 mm)カラムを使用し、移動相は0.1%のTFAを含有する水:メタノール(70:30)から20分間で(30:70)に変換するグラジエント法にて、流速1.0 mL/minの条件で行った。前記と同様に、この化合物(7)と、化合物(3)であるI-c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)との逆相HPLCによる分析と比較したところ、同じリテンションタイムに夫々単一の溶出ピークが検出され、化合物(7)であることが確認された。
【００７２】
211At-c[Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys(Boc)] (8)及び211At-c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (9)の作製
化学反応式[３]に示すように、化合物(4) (30μg, 23.0 nmol)をアセトニトリル(5 μL)に溶解し、1%酢酸/アセトニトリル溶液(10 μL)、[211At]At-/H2O (3.7 MBq, 3 μL)、及びN-クロロスクシンイミド (NCS)/アセトニトリル溶液(1 mg/mL, 15 μL)を加えて80℃に加熱しながら15分間反応させたのち、亜硫酸水素ナトリウム(NaHSO3)水溶液(1 mg/mL, 15 μL)で反応を停止することで211At-c[Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys(Boc)] (8) (放射化学的収率: 91.2%)を得た。その後、溶媒を窒素ガスにより留去し、残留物をTFA:水:トリイソプロピルシラン(38:1:1, 80 μL)の混合溶液に溶解し、室温にて10分間振とうした。溶媒を窒素ガスにより留去後、残留物を逆相HPLCにて精製し、211At-c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (9) (放射化学的収率: 33.3%、放射化学的純度: 97.7%。以下、211At-c(RGDfK)と略記することがある)を得た。逆相HPLCにはCosmosil 5C18-AR-II (4.6 × 150 mm)カラムを使用し、移動相は0.1%のTFAを含有する水:メタノール(70:30)にて、流速1.0 mL/minの条件で行った。この化合物(9)と、放射性同位体非標識でヨウ素置換体である化合物(3)であるI-c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)との逆相HPLCによる分析と比較したところ、リテンションタイムが近いところに、夫々単一の溶出ピークが検出され、化合物(9)であることが確認された。
【００７３】
211At-c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (9)の作製 (化合物5使用)
化学反応式[４]に示すように、化合物(5) (30μg, 33.6 nmol)をアセトニトリル(5 μL)に溶解し、1%酢酸/アセトニトリル溶液(10 μL)、[211I]At-/H2O (7.4 MBq, 100 μL)、及びN-chlorosuccinimide (NCS)/アセトニトリル溶液(1 mg/mL, 15 μL)を加えて80℃に加熱しながら15分間反応させたのち、亜硫酸水素ナトリウム(NaHSO3)水溶液(1 mg/mL, 15 μL)で反応を停止し、逆相HPLCにて精製することで211At-c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (9) (放射化学的収率: 50.1%、放射化学的純度: 96.9%)を得た。逆相HPLCにはCosmosil 5C18-AR-II (4.6 × 150 mm)カラムを使用し、移動相は0.1%のTFAを含有する水:メタノール(70:30)にて、流速1.0 mL/minの条件で行った。前記と同様に、この化合物(9)と、前記の化合物(3)であるI-c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (3)との逆相HPLCによる分析と比較したところ、リテンションタイムが近いところに、夫々単一の溶出ピークが検出され、化合物(9)であることが確認された。
【００７４】
（比較例１-1：化学式(Ｉ)タイプの放射性同位体非標識のオリゴペプチド誘導体）
化学式(Ｉ)タイプに対する放射性同位体非標識のオリゴペプチド誘導体である下記化学式
【化８】
2019043892.tif 000009
で示すI-c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (3)（以下、I-c(RGDfK)と略記することがある）は、実施例１の途中で合成したものである。その理化学分析結果は、ESI-MS (m/z calcd for ([M+H]+): 730.21 found: 730.18)であり、化合物(3)の構造を支持する。
なお、実施例１で合成した211Ａｔで標識した誘導体（化合物(9)）と比較例１-1における非標識のＩで置換した誘導体（化合物(3)）との逆相HPLCによる分析にはCosmosil 5C18-AR-II (4.6 × 150 mm)カラムを使用し、標識した誘導体に対し放射性強度と非標識の誘導体に対し220nm紫外線とで検出し、移動相は0.1%のTFAを含有する水:メタノール(70:30)、流速1.0 mL/minの条件で行ったところ、211Ａｔで標識した誘導体の方がやや遅いリテンションタイムに、夫々単一の溶出ピークが現れ、高い純度であることが示された。
【００７５】
（比較例１-2：化学式(Ｉ)タイプのハロゲン非置換のオリゴペプチド誘導体）
化学式(Ｉ)タイプに対するハロゲン非置換のオリゴペプチド誘導体であるc(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (10) (以下、c(RGDfK)と略記することがある)は、実施例１での原料としてヨウ素非置換のＤ−フェニルアラニンを用いたこと以外は、実施例１の方法に準じ、以下のようにして合成した。
【化９】
2019043892.tif 000010
その理化学分析結果は、ESI-MS (m/z calcd for ([M+H]+): 604.31 found: 604.41) であり、化合物(10)の構造を支持する。
【００７６】
（実施例２：化学式(II)タイプのオリゴペプチド誘導体）
前記化学式(II)で表わされるオリゴペプチド誘導体は、実施例１での原料としてヨウ素置換のＤ−フェニルアラニンに代えてＤ−チロシンを用いたいこと以外は、実施例１の方法に準じて後述の化合物(13)を合成し、下記化学式
【化１０】
2019043892.tif 000011
で示す125I-c(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys) (11) (以下、125I-c(RGDyK)と略記することがある)は、下記の方法で合成した。c(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys) (13) (100 μg, 0.16 μmol)を0.1Mリン酸緩衝液(PH:7.4)(100 μL)に溶解し、[125I]NaI (3.7 MBq, 1 μL)、クロラミンT/水溶液(1 mg/mL, 10 μL)加えて室温にて10分間放置したのち、亜硫酸水素ナトリウム(NaHSO3)水溶液(1 mg/mL, 10 μL)で反応を停止し、逆相HPLCにて精製することで125I-c(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys) (11) (放射化学的収率: 84.7%、放射化学的純度: 98.2%)を得た。逆相HPLCにはCosmosil 5C18-AR-II (4.6 × 150 mm)カラムを使用し、移動相は0.1%のTFAを含有する水:メタノール(80:20)から20分間で(50:50)に変換するグラジエント法にて、流速1.0 mL/minの条件で行った。この化合物(11)と、後述する放射性同位体非標識でヨウ素置換体である化合物(12)であるI-c(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys)との逆相HPLCによる分析と比較したところ、同じリテンションタイムに、夫々単一の溶出ピークが検出され、化合物(11)であることが確認された。
【００７７】
（比較例２-1：化学式(II)タイプの非放射性のハロゲン置換のオリゴペプチド誘導体）
化学式(II)タイプに対する非放射性のハロゲン置換のオリゴペプチド誘導体である下記化学式
【化１１】
2019043892.tif 000012
で示すI-c(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys) (12) (以下、I-c(RGDyK)と略記することがある)は、下記の方法で合成した。ヨウ素(I2) (254mg 1mmol)、亜硝酸ナトリウム(NaNO2) (69mg 1mmol)を水:メタノール(1:1)溶液10mLに室温で30分以上撹拌した。この溶液68.3μLにc(RGDyK) (3.25mg 5.25μmol)を加えて室温で3時間撹拌後、逆相HPLCによる精製を行い、白色粉末のI-c(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys) (12) (1.28mg, 32.71%)を得た。逆相HPLCにはCosmosil 5C18-AR-II (10 × 150 mm)カラムを使用し、移動相は0.1%のTFAを含有する水:メタノール(80:20)から、10分間で(65:35)に変換するグラジエント法にてUV = 220 nm、流速4.0 mL/minの条件で行った。その理化学分析結果は、ESI-MS (m/z calcd for ([M+H]+): 746.20 found: 746.25)であり、化合物(12)の構造を支持する。
【００７８】
（比較例２-2：化学式(II)タイプのハロゲン非置換のオリゴペプチド誘導体）
化学式(II)タイプに対するハロゲン非置換のオリゴペプチド誘導体である下記化学式
【化１２】
2019043892.tif 000013
で示すc(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys) (13) (以下、c(RGDyK)と略記することがある)は、実施例１での原料としてＤ−チロシンを用いたいこと以外は、実施例２の方法に準じて合成した。その理化学分析結果は、ESI-MS (m/z calcd for ([M+H]+): 620.31 found: 620.27)であり、化合物(13)の構造を支持する。
【００７９】
（実施例３：化学式(III)タイプのオリゴペプチド誘導体）
前記化学式(III)で表わされるオリゴペプチド誘導体は、比較例１-2で得た化合物(10)(c(RGDfK))を用い、下記化学反応式[５]
【化１３】
2019043892.tif 000014
に示す方法で、リジン残基が放射性同位体125Ｉである放射性ヨウ素で標識されたベンゾアミドとして保護されている環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−フェニルアラニン−リジン）オリゴペプチド化合物(14)（以下、125IB-c(RGDfK)と略記することがある）として、以下のようにして合成した。
ATE (0.5 mg, 0.98 μmol)をエタノール(55 μL)に溶解し、クロラミンT/エタノール溶液(4 mg/mL, 15 μL)、1%酢酸/エタノール溶液(21 μL)、及び[125I]NaI (3.7 MBq, 24 μL)を加えて室温にて10分間放置し、溶媒を、窒素ガスにより約50 μL程度に濃縮後、水(50 μL)を加え、逆相HPLCを用いて精製し、[125I]SIBを得た。逆相HPLCにはCosmosil 5C18-AR-II (4.6 × 150 mm)カラムを使用し、移動相は0.1%のTFAを含有する水:メタノール(50:50)から20分間で(30:70)に変換するグラジエント法にて、流速1.0 mL/minの条件で行った。[125I]SIBを含む溶液を、50℃に加熱しながら、窒素ガスにて溶媒を完全に留去し、DMF (50 μL)に溶解後、c(RGDfK) (50 μg, 68 nmol) に加え、TEA (0.5 μL)を加えて室温にて40分インキュベートを行った後に逆相HPLCにより精製を行い、化合物(14) (放射化学的収率: 30%、放射化学的純度: 99%)を得た。逆相HPLCにはCosmosil 5C18-AR-II (4.6 × 150 mm)カラムを使用し、移動相は0.1%のTFAを含有する水:メタノール(60:40)から20分間で(10:90)に変換するグラジエント法にて、流速1.0 mL/minの条件で行った。
なお、実施例３で合成した標識した誘導体(化合物(14))と後述する比較例３で合成した非標識の誘導体(化合物(15))との逆相HPLCによる分析にはCosmosil 5C18-AR-II (4.6 × 150 mm)カラムを使用し、標識した誘導体に対し放射性強度と非標識の誘導体に対し220nm紫外線とで検出し、移動相は0.1%のTFAを含有する水と0.1%のTFAを含有するメタノールとの60:40〜10:90での0〜20minのグラジエントにて、流速1.0 mL/minの条件で行ったところ、同じリテンションタイムに夫々単一の溶出ピークが現れ、標識／非標識以外は同一であることが示された。
【００８０】
（比較例３：化学式(III)タイプの放射性同位体非標識のオリゴペプチド誘導体）
化学式(III)タイプに対する放射性同位体非標識のオリゴペプチド誘導体である下記化学式
【化１４】
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で示す非放射性同位体のヨウ素で置換ベンゾアミドとして保護されている環状（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−フェニルアラニン−リジン）オリゴペプチド化合物(15)（以下、IB-c(RGDfK)と略記することがある）は、実施例３での原料中間体としてＮ-スクシンイミジル ３-(125ヨード)ベンゾエートに代えて、Ｎ-スクシンイミジル ３-ヨードベンゾエートを用いたこと以外は実施例３の方法に準じて合成した。その理化学分析結果は、
ESI-MS (m/z calcd for ([M+H]+): 834 found: 834)であり、化合物(15)の構造を支持する。
【００８１】
以下に、本発明を適用するオリゴペプチド誘導体及び本発明を適用外のオリゴペプチド誘導体を評価した方法と、その結果を示す。
【００８２】
（評価試験１：αvβ3 インテグリンに対するin vitroでの結合アッセイ(Binding Assay)）
αvβ3インテグリンとの親和性の評価は過去に報告された方法（Dijkgraaf Iら，“Improved targeting of the αvβ3 integrin by multimerisation of RGD peptides.” EJNMMI.， 2007年, 第34巻第2号，p.267-273）をわずかに変更し、以下のように行った。ヒト精製αvβ3インテグリン(200 μg/mL)を600 ng/mLとなるようにcoating buffer (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2 0.5 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, pH 7.4)に溶解し、96穴イムノロックウェルモジュールプレート (Thermo, Waltham, MA, 米国)に100 μLずつ加え、4℃で一晩放置させた。その後、ウェルをbinding buffer [0.1% 牛血清アルブミン(BSA) / coating buffer, 200 μL]で2度洗浄した後blocking buffer (1% BSA / coating buffer, 200 μL)を加え、2時間室温にて放置後、binding buffer (200 μL)で2度洗浄した。次に放射性リガンドとして125I-c(RGDyK)、非放射性リガンドとしてI-c(RGDfK)、c(RGDfK)を用い、また、放射性リガンドとして125I-c(RGDfK)、211At-c(RGDfK)、非放射性リガンドとしてc(RGDfK)を用い、ウェルに放射性リガンド(37 kBq, 95 μL)、及び非放射性リガンド(2 nM - 2 mM, 5 μL)を加え、37℃にて1時間振とうを行った後、ウェルをbinding buffer (200 μL, 300 μL, 350 μL、合計3度)を用いて洗浄し、ウェルの放射能を測定した。
【００８３】
なお、この評価試験１中、アスタチンに安定同位体が存在しないため、非放射性リガンドを固定して、放射性リガンドを変化させて評価したものである。その結果を、下記表１に示す。
【表１】
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【００８４】
表１から明らかな通り、125I-c(RGDyK)、125I-c(RGDfK)、211At-c(RGDfK)のαｖβ３インテグリンへの親和性を調べたところ、高い親和性を有するという結果が得られた。
【００８５】
また、この評価試験１と同様にして、安定同位体が存在している核種の場合、放射性リガンドを固定して、コールド体を比較して評価した。その結果を、下記表２に示す。
【表２】
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【００８６】
（評価試験２：担癌モデルマウスにおける体内放射能分布）
U87MGヒトグリオーマ細胞をEMEMメディウムで5% CO2、37℃条件下において培養し、細胞数5×106をヌードマウス[4 weeks, BALB/c Slc-nu/nu, female (15-19 g; Japan SLC)]の背面皮下へ移植した。28日後、125I-c(RGDfK)、及び211At-c(RGDfK)の混合液(37 kBq, 74 kBq/100 μL)を担癌モデルマウスに尾静脈投与した。投与1、4時間後にマウスを屠殺し、各臓器を摘出、臓器の重量と放射能を測定した。211Atの放射能は70-120 keVのエネルギーレンジにて測定を行い、125Iは211Atが減衰した後に1-80 keVのエネルギーレンジで測定した。
【００８７】
その結果を図１に示す。図１から明らかな通り、125I-c(RGDfK)、及び211At-c(RGDfK)の両化合物は腫瘍組織に高く集積していた。また、125I-c(RGDfK)、及び211At-c(RGDfK)の両化合物が類似の体内分布を示すこと、ヨウ素アニオン、アスタチンアニオンの集積臓器として知られている胃への放射能集積が低いことから、生体内で顕著な脱ヨウ素化、脱アスタチン化は起こっていないことが分かった。
【００８８】
また、125I-c(RGDyK)と125I-c(RGDfK)、125I-c(RGDyK)、及び125IB-c(RGDfK)については、単独液としたこと以外は同様にして体内放射能分布を測定した。その結果を、夫々図２〜図４に示す。図２から明らかな通り、125I-c(RGDyK)、125I-c(RGDfK)及び125I-c(RGDyK)の三化合物は腫瘍組織に高く集積していた。また、125I-c(RGDyK)、125I-c(RGDfK)及び125I-c(RGDyK)の三化合物が類似の体内分布を示すこと、ヨウ素アニオンの集積臓器として知られている胃への放射能集積が低いことから、生体内で顕著な脱ヨウ素化は起こっていないことが分かった。また、図４から明らかな通り、125IB-c(RGDfK)は腫瘍組織にも腫瘍組織へ幾分低い集積性を示したが、腸への高い集積性(小腸；投与後1時間に54.9%ID/g)を示した。
【００８９】
（評価試験３：非放射性リガンドによる阻害試験）
上記と同様に担癌モデルマウスを作製し、c(RGDfK) (0.2 mg/mouse)を125I-c(RGDfK)、及び211At-c(RGDfK)の混合液(37 kBq, 74 kBq/100 μL)と同時に尾静脈投与した。投与1時間後にマウスを屠殺し、各臓器を摘出、臓器の重量と放射能を測定した。211Atの放射能は70-120 keVのエネルギーレンジにて測定を行い、125Iは211Atが減衰した後に1-80 keVのエネルギーレンジで測定した。
【００９０】
その結果を、図５に示す。図５から明らかな通り、c(RGDfK)同時投与によるブロッキング実験により腫瘍への集積が著しく低下したことより、125I-c(RGDfK)、及び211At-c(RGDfK)の腫瘍への集積は、αｖβ３インテグリンを介していることが分かった。
【００９１】
これらの結果から、I-c(RGDfK)はαVβ3インテグリンに対し、c(RGDfK)と同程度の高い結合親和性を示すことが分かった。また、125I-c(RGDfK)の体内放射能分布実験では125I-c(RGDyK)と類似した分布傾向が観察された。さらに211At-c(RGDfK)は125I-c(RGDfK)と類似した体内動態を示した。125I-c(RGDfK)では、投与早期に腎臓への放射能集積(投与後1時間に6.7%ID/g)が観察されたが、滞留せずにクリアランスされ、腫瘍への放射能集積(投与後1時間に4.1%ID/g)は125IB-c(RGDfK)に比べ高く、125I-c(RGDyK)と類似した体内分布傾向が観察された。
【００９２】
なお、本発明のオリゴペプチド誘導体自身が医薬を兼ねる例として記載したが、患者に投与する際には、錠剤や注射剤の医薬製剤である医薬として調製して用いることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明のオリゴペプチド誘導体は、癌原発巣や転移組織の癌細胞を特異的に攻撃して破壊する医薬品として有用であり、産業上の利用可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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