(57)【要約】【課題】  ＲＮＡ検出方法を提供する。【解決手段】  検出対象のＲＮＡの３’末端配列の少なくとも一部と相補的な第一の相補鎖領域、ＲＮＡプロモーター配列、蛍光配列、及び第二の相補鎖領域を有し、３’末端が化学修飾された、ＲＮＡ検出用ＤＮＡプローブにより解決する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕出対象のRNAの3’末端配列の少なくとも一部と相補的な第一の相補鎖領域、RNAプロモーター配列、
蛍光配列、及び
第二の相補鎖領域
を有し、
３’末端が化学修飾された、ＲＮＡ検出用ＤＮＡプローブ。
【請求項２】
ＲＮＡ検出方法において、請求項１に記載のＤＮＡプローブ、蛍光剤及び消光剤を有する蛍光プローブ、並びにＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ活性を有する酵素、ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ活性を有する酵素を用いて、
（ｉ）検出対象のＲＮＡとプローブとの間でＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖を形成させ、
（ｉｉ）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ活性を有する酵素によりＲＮＡの３’末端から核酸伸長反応を行い、
（ｉｉｉ）伸長反応によってＲＮＡプロモーター二重鎖が形成され、
（ｉｖ）ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ活性を有する酵素によりプロモーター下流のＤＮＡ配列（蛍光配列、第二の相補鎖領域）を鋳型にＲＮＡを繰り返し合成し、
（ｖ）合成されたＲＮＡ鎖が第一の相補鎖領域と二重鎖形成し、（ｉ）〜（ｉｖ）を繰り返す工程と、
（ｖｉ）合成されたＲＮＡ鎖を蛍光プローブで検出する工程を含む
ことを特徴とするＲＮＡ検出方法。
【請求項３】
ＲＮＡプロモーターが、Ｔ７ＲＮＡプロモーターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
蛍光プローブの蛍光剤がＦＡＭ、消光剤がＢＨＱ１である、請求項２または３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡの検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ増幅反応としてＴＲＣ反応（非特許文献１）が用いられる。ＴＲＣ反応では、標的ＲＮＡの増幅のため、アンチセンスプライマー、プロモータープライマーなど、複数のプライマーを必要とする。これらのプライマーは３’末端からの核酸伸長を行う目的で作製されているため、３’末端に特別な化学修飾はされておらず、フリーの状態で存在する。核酸増幅反応において３’末端がフリーのプライマー種が多い場合、プライマーダイマーの形成等により、目的核酸が増幅されないことがあり、プライマー設計が煩雑になることが考えられた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３１４：：７７−８６，  ２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、検出対象ＲＮＡ増幅の際に、３’末端がフリーな核酸を用いないＲＮＡ増幅方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する。
［１］
検出対象のＲＮＡの３’末端配列の少なくとも一部と相補的な第一の相補鎖領域、ＲＮＡプロモーター配列、
蛍光配列、及び
第二の相補鎖領域
を有し、
３’末端が化学修飾された、ＲＮＡ検出用ＤＮＡプローブ。
［２］
ＲＮＡ検出方法において、［１］に記載のＤＮＡプローブ、蛍光剤及び消光剤を有する蛍光プローブ、並びにＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ活性を有する酵素、ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ活性を有する酵素を用いて、
（ｉ）検出対象のＲＮＡとプローブとの間でＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖を形成させ、
（ｉｉ）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ活性を有する酵素によりＲＮＡの３’末端から核酸伸長反応を行い、
（ｉｉｉ）伸長反応によってＲＮＡプロモーター二重鎖が形成され、
（ｉｖ）ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ活性を有する酵素によりプロモーター下流のＤＮＡ配列（蛍光配列、第二の相補鎖領域）を鋳型にＲＮＡを繰り返し合成し、
（ｖ）合成されたＲＮＡ鎖が第一の相補鎖領域と二重鎖形成し、（ｉ）〜（ｉｖ）を繰り返す工程と、
（ｖｉ）合成されたＲＮＡ鎖を蛍光プローブで検出する工程を含む
ことを特徴とするＲＮＡ検出方法。
［３］
ＲＮＡプロモーターが、Ｔ７ＲＮＡプロモーターである、［２］に記載の方法。
［４］
蛍光プローブの蛍光剤がＦＡＭ、消光剤がＢＨＱ１である、［２］または［３］に記載の方法。
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）検出原理
本発明の検出原理の概略を図１に示す。図１は本発明の代表的な検出原理を示す図であり、本発明はこれに限定されない。
（１−１）検出対象のＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的配列を有するＤＮＡプローブ（プローブＡ）の第一の相補鎖領域と検出対象のＲＮＡとの間でＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖が形成される
（１−２）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の働きにより、ＲＮＡの３’末端よりＤＮＡ伸長反応が行われる。
（１−３）その結果、プローブＡ中のＲＮＡプロモーター配列（プロモーター領域）のＤＮＡ二重鎖が形成され、ＲＮＡポリメラーゼの働きにより、転写反応によりＲＮＡ鎖が繰り返し合成される。
（１−４）合成されたＲＮＡ鎖の一部（第二の相補鎖領域の相補鎖）と、プローブＡの第一の相補鎖領域との間でＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖が形成され、（１−２）〜（１−４）が繰り返し行われる。
（１−５）合成されたＲＮＡと蛍光プローブとの反応によりＲＮＡを検出する。
（２）プローブＡ
本発明に用いられるプローブＡは、検出対象のＲＮＡ配列の少なくとも一部と相補的な配列（第一の相補鎖領域）を有し、その結果、検出対象のＲＮＡと二重鎖を形成可能な一本鎖のＤＮＡプローブである。またプローブＡのＤＮＡ配列中には、プロモーター領域、蛍光配列、第二の相補鎖領域を含む。また、プローブＡの３’末端からの望まない核酸合成を防ぐために３’末端側は伸長反応が行われないよう化学修飾を行う。３’末端側の化学修飾は特に限定されず、リン酸化、ビオチン化、アミノ化等を例示可能である。特に本発明ではリン酸化しておくことが好ましい。
（３）第一の相補鎖領域
本発明において第一の相補鎖領域は、プローブＡ中のＤＮＡ配列であり、検出対象のＲＮＡの３’末端の一部に対して相補的な配列であればよい。第一の相補鎖領域の鎖長は１５〜２５塩基が好ましい。
（４）プロモーター領域
本発明においてプロモーター領域は、ＤＮＡ二重鎖形成時にＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡへの転写を行うことが可能なプロモーター配列である。具体的なプロモーター配列は、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターなどがあげられる。特に、本発明ではＴ７プロモーターを用いることが好ましい。
（５）蛍光配列
本発明において蛍光配列は、検出に用いる蛍光プローブの一部と相同的な配列である。蛍光プローブとしては、モレキュラービーコン等が好ましい。
（６）第二の相補鎖領域
本発明において第二の相補鎖領域は、第一の相補鎖領域の一部と相同的な配列を有し、また第一の相補鎖領域と比べ検出対象のＲＮＡに対して相補的配列が短いことが好ましい。ここで「相同的な配列」とは第一の相補鎖領域の一部と完全同一であってもよく、また、検出対象のＲＮＡの３’末端の一部に対してハイブリダイズできる限り、第一の相補鎖領域の一部と、例えば７５％以上の相同性、８０％以上の相同性、８５％以上の相同性、９０％以上の相同性、９５％以上の相同性であってもよい。第二の相補鎖領域の鎖長は１２〜２２塩基が好ましい。
（７）検出装置
検出装置を必要とする場合は、リアルタイムＰＣＲ装置を用いればよい。また本実施例で用いた、ＴＲＣＲリアルタイムモニター（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０  東ソー製）を用いてもよい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法によれば、３’末端がフリーな核酸（プライマーなど）を用いずに、ＲＮＡ鎖を繰り返し増幅することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の検出系の概要を示す図である。
【図２】各濃度のＲＮＡを検出した際の蛍光強度変化を示す図である。
【実施例】
【０００９】
以下、本発明を実施例によって具体的に示すが、本発明はこれに限定されない。
実施例１  プローブＡの作製
３’末端をリン酸化修飾したプローブＡ（配列番号１）はグライナー社による受託合成により作製した。プローブＡにおけるＤＮＡ配列は第二の相補鎖領域（配列番号１の１〜１７位）、蛍光配列（配列番号１の１８〜３７位）、プロモーター領域（配列番号１の３８〜６５位）、第一の相補鎖領域（配列番号１の６６〜８５）を含むよう設計した。
実施例２  検出対象ＲＮＡの作製
検出対象のＲＮＡ（配列番号２）はグライナー社による受託合成により作製した。
実施例３  蛍光プローブの作製
５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ１で修飾した蛍光プローブ（配列番号３）はグライナー社による受託合成により作製した。
実施例４  ＲＮＡの検出
実施例２で作製したＲＮＡを実施例１で作製したプローブＡ及び、実施例３で作製した蛍光プローブを用いて検出した。溶液中の酵素濃度などの詳細を以下に示す。プローブＡ  ５０ｎＭ、蛍光プローブ  ３００ｎＭ、９６−７ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ニッポンジーン）  ８Ｕ／３０μＬ、Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）、Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）、ＤＴＴ  ５ｍＭ、ＮＴＰ  ３ｍＭ、ｄＮＴＰ  ０．２５ｍＭ、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ０．２Ｕ／μＬ、ＢＳＡ  １２０μｇ／ｍＬ、反応温度４２℃。
【００１０】
上記溶液中に各濃度の実施例２で作製したＲＮＡを図２に示す各濃度で共存させ、プローブ由来の蛍光強度の変化を時間経過ごとにＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー製）を用いて確認した。結果を図２に示す。ＲＮＡ濃度に応じた時間あたりの蛍光強度増幅が起こることが確認された。
【００１１】
以上の結果から、本発明の方法により、ＲＮＡを検出できることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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