(57)【要約】【課題】同時培養または血清含有培地に依拠せず、かつ、中間体としての胚葉体凝集物の形成を要請せずに、幹細胞を、二次造血へと分化させる方法および組成物を提供する。【解決手段】本発明は、血清／フィーダーフリー条件下で、ＥＢの形成を必要とすることなく、スケーラブルな単層培養プラットフォームにより、ｈｉＰＳＣを含む多能性幹細胞から導出した、二次造血性内皮（ＨＥ）および二次造血幹細胞（ＨＳＣ）を介して、造血系統細胞を発生させるための方法および組成物を提供する。本発明はまた、単層培養において、造血系の細胞を、多能性幹細胞から分化させ、拡大するための方法および組成物であって、多能性幹細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦと接触させるステップを含む方法および組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０１５年１月２６日に出願された米国仮出願番号第６２／１０７，５１７号および２０１５年１１月４日に出願された米国仮出願番号第６２／２５１，０１６号に基づく優先権を主張しており、これらの開示は、それらの全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は一般に、多能性幹細胞から、全ての造血系の細胞を製造するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、ヒト人工（ｉｎｄｕｃｅｄ）多能性幹細胞を含む多能性幹細胞から、全ての造血系の細胞を製造するための、改善された培養プラットフォームに関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）技術は、がんを含む、多数の血液悪性腫瘍および非血液悪性腫瘍の処置のための治療において実行可能な造血細胞の、高度に有望であり潜在的に無際限の供給源を代表する。造血細胞治療の同種供給源としての、ｈｉＰＳＣおよび遺伝子操作ｈｉＰＳＣ技術の有望性を推し進めるためには、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＣ）のみでなく、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、およびＮＫリンパ系細胞、およびこれらの前駆細胞の多様なサブセットを含む免疫エフェクター集団も、効率的かつ再現可能に発生させることが可能なことが不可欠である。
【０００４】
リンパ球を生成するポテンシャルを伴うＨＳＣの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける導出は、胚発生の間の時間的および空間的に異なる、少なくとも２つの血液形成の波：一次（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ）造血および二次（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ）造血の存在により複雑である。一次造血は、胚体外卵黄嚢内で起始し、一過性で限局的な造血レパートリーであって、始原赤血球系細胞および骨髄性細胞を主に含むが、ＨＳＣを含まない造血レパートリーを発生させる。新生ＨＳＣは、二次造血性内皮（ＨＥ）と称する動脈血管系内の、特化した内皮前駆体からの二次波（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｗａｖｅ）の後期の間にのみ出現する。次いで、二次ＨＥは、内皮から造血への移行を経て、ＨＳＣを発生させ、次いで、これらは、最終的に、骨髄へと移動し、成体寿命を通じて、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、およびＮＫリンパ系細胞を含む多系統造血を存続させる。従って、ＨＳＣおよびリンパ系エフェクター細胞の、多能性幹細胞からの発生は、良好に設計および検証された方法および組成物を介して、早期の胚性造血発生の、二次プログラムへの複雑な段階を、正確に再現する能力に依存する。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ｈｉＰＳＣの、二次ＨＥへの指向性分化について記載している研究の数は、限定されている。治療を目的とするｈｉＰＳＣの活用における主要な障害は、多能性を維持し、そして分化を誘導するために、マウス由来の間質細胞またはヒト由来の間質細胞と共に、組成未知の血清含有培地の存在下で、このような細胞をまず同時培養することの要請であった。加えて、既存のプロトコールはまた、外胚葉細胞、中胚葉細胞、および内胚葉細胞を含む多様な分化細胞を含む、異質性の細胞凝集物である胚葉体（ＥＢ）を形成するように、ｉＰＳＣを培養することからなる戦略も採用している。これらの手順は、例えば、クランプを形成するようにスピンするか、細胞をウェル内で沈殿および凝集させるか、または懸濁培養物中の受動的凝集およびクランプ形成を可能とすることにより、多能性細胞を凝集させることを要請する。形成されたＥＢは、ある特定の持続期間にわたり、分化下に維持し、典型的には、適正な分化を可能とするように、７〜１０日間にわたり、培養系を誘導し、次いで、ＥＢを、さらなる成熟のために、接着培養へと移すか、または後続の分化ステップへと進むために、細胞型の選択のため単一細胞へと解離させる（Kennedyら、Cell  Reports、２０１２年、１７２２〜１７３５頁；Knorrら、Stem  Cells  Translational  Medicine、２０１３年、２巻：２７４〜２８３頁）。例えば、Kennedyらは、ｉＰＳＣの分化のためにＥＢを発生させることについて教示しており、多能性細胞を、コラゲナーゼおよびトリプシンで処理して、小型の凝集物を形成するように、細胞のスクレーピングを可能とし、次いで、これを培養して、ＥＢが形成された。ＥＢの形成は、多能性幹細胞の分化を容易とすることが示されているが、凝集物および後続のＥＢを形成することの要請は労働集約的なものであり、この工程における細胞数の増大は最小限であり、三次元的ＥＢ凝集物中の細胞内容物の、培地因子への曝露は、一貫せず、不均等であり、これにより、分化段階が可変的な、異質性の細胞産物をもたらし、効率的で合理的となるために要請される、製造工程のスケーラビリティーおよび再現性は大きく損なわれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kennedyら、Cell  Reports、２０１２年、１７２２〜１７３５頁
【非特許文献２】Knorrら、Stem  Cells  Translational  Medicine、２０１３年、２巻：２７４〜２８３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、同時培養または血清含有培地に依拠せず、かつ、中間体としての胚葉体凝集物の形成を要請せずに、幹細胞を、二次造血へと分化させる方法および組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は一般に、幹細胞を培養し、造血細胞運命へと分化させるための、細胞培養条件、培地、培養プラットフォーム、および方法に関する。
【０００８】
具体的には、本発明は、血清／フィーダーフリー条件下で、ＥＢの形成を必要とすることなく、スケーラブルな単層培養プラットフォームにより、ｈｉＰＳＣを含む多能性幹細胞から導出した、二次造血性内皮（ＨＥ）および二次造血幹細胞（ＨＳＣ）を介して、造血系統細胞を発生させるための方法および組成物を提供する。本発明の方法に従い分化させうる細胞は、多能性幹細胞から、特定の最終分化細胞および分化転換細胞へとコミットした前駆細胞、多能性中間体を経由せずに、造血運命へと直接移行する、多様な系統の細胞にわたる範囲にある。同様に、幹細胞の分化により作製される細胞は、複能性幹細胞または前駆細胞から、最終分化幹細胞、および全ての介在する造血系統細胞にわたる範囲にある。
【０００９】
本発明は、単層培養において、造血系の細胞を、多能性幹細胞から分化させ、拡大するための方法および組成物であって、多能性幹細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦと接触させるステップを含む方法および組成物を提供する。従って、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞は、胚葉体を形成せずに、多能性幹細胞から得られ、拡大される。次いで、中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＷＮＴ経路活性化因子との接触下に置いて、胚葉体を形成せずに、二次造血性内皮（ＨＥ）のポテンシャルを有する、拡大された中胚葉細胞を、多能性幹細胞から得る。ｂＦＧＦと、任意選択で、ＲＯＣＫ阻害剤と、かつ／またはＷＮＴ経路活性化因子との引き続く接触により、二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞を、二次ＨＥ細胞へと分化させ、これまた、分化の間に拡大される。
【００１０】
造血系の細胞を得るための、本明細書で提示される方法は、ＥＢの形成に至る細胞の拡大は僅少〜最小限であり、集団内の細胞の、均質な拡大および均質な分化を要求する、多くの適用では重要であって、煩瑣かつ低効率である単層培養を可能としないため、ＥＢに介在される多能性幹細胞の分化より優れている。
【００１１】
本明細書では、造血幹細胞、ならびにＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、およびＮＫ細胞など、分化させた後代細胞の導出を結果としてもたらす二次造血性内皮への分化を容易とする単層分化プラットフォームが提供される。証明された単層分化戦略は、分化効率の増強を、大スケールの拡大と組み合わせ、治療的に意味がある数の、多能性幹細胞由来の造血細胞の、多様な治療適用のための送達を可能とする。さらに、本発明により、本明細書で提示される方法を使用する単層培養は、全範囲にわたる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化、ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるモジュレーション、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏにおける、長期にわたる造血系の自己再生、再構成、および生着を可能とする機能的な造血系細胞をもたらすことも開示された。
【００１２】
本発明の一態様は、多能性幹細胞由来の造血系細胞を得るための培養プラットフォームであって、群Ｉ：（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、二次ＨＳＣを、二次造血性内皮から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含み、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；ならびに（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含み、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から分化させ、拡大するのに適する培養培地を含む培養プラットフォームを提供する。
【００１３】
代替的に、多能性幹細胞由来の造血系細胞を得るための培養プラットフォームは、群ＩＩ：（ｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細胞を得るのに適する培養培地；ならびに（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地を含む。一部の実施形態では、上記の培養プラットフォームの多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の培養プラットフォームの群（ＩＩ）は、（ｉｖ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む。
【００１４】
上記の培養プラットフォームについての一部の実施形態では、群（Ｉ）および（ＩＩ）の各々は、さらなる培養培地をさらに含む。
【００１５】
群（Ｉ）は、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子を含み；ＢＭＰ活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化させるのに適する培養培地、または（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と；ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子を含み、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地をさらに含みうる。これらのさらなる培養培地は、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるのに適する。
【００１６】
群（ＩＩ）はさらに、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数を含まず、多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体を、Ｔ細胞前駆体もしくはＴ細胞へと分化させるのに適する培養培地；または（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、プレＴ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地を含むことが可能であり；これらのさらなる培養培地は、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるのに適する。
【００１７】
上記の培養プラットフォームについての一部の実施形態では、群（Ｉ）および（ＩＩ）の各々はなお、さらなる培養培地をさらに含む。
【００１８】
群（Ｉ）は、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＢＭＰ活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分化させるのに適する培養培地；または（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子；ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み；多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地をさらに含むことが可能であり；これらのさらなる培地は、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるのに適する。
【００１９】
群（ＩＩ）について述べると、上述の培地に加えて、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数を含まず、多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞前駆体もしくはＮＫ細胞へと分化させるのに適する培地；または（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、プレＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培地をさらに含むことが可能であり；これらのさらなる培地は、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるのに適する。
【００２０】
さらに別の実施形態では、提供される培養プラットフォームの群（ＩＩ）は、（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来のｐｒｅ−ＨＳＣを、造血複能性前駆体へと分化させるのに適する培養培地；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ｐｒｅ−ＨＳＣへと分化させるのに適する培養培地をさらに含み；これらの培養培地は、多能性幹細胞由来の造血複能性前駆体を発生させるために提供される。
【００２１】
本発明の別の態様は、多能性幹細胞由来の造血細胞を分化させ、拡大するための組成物であって、以下の群（Ｉ）または（ＩＩ）のうちの１または複数を含む組成物を提供する。
【００２２】
群（Ｉ）：（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と；ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと；多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、二次ＨＳＣを、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と；多能性幹細胞由来の中胚葉細胞とを含み、二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；ならびに（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子と；ｉＰＳＣとを含み、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地。
【００２３】
群（ＩＩ）：（ｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと；二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来の、造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含むが、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と；多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を含まず、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細胞を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；ならびに（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦと；ｉＰＳＣとを含み、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地。
【００２４】
多能性幹細胞由来の造血細胞を分化させ、拡大するための組成物についての一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【００２５】
多能性幹細胞由来の造血細胞を分化させ、拡大するための組成物についての一部の実施形態では、群（ＩＩ）は、（ｖｉ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と；多能性幹細胞とを含まず；多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地など、さらなる組成物を含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【００２６】
上記の多能性幹細胞由来の造血細胞を分化させ、拡大するための組成物についての一部の実施形態では、群（Ｉ）は加えて、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子と；多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体とを含み；ＢＭＰ活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化させるのに適する培養培地、または（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子と；多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣとを含み、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地を含み；これらのさらなる培地は、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるのに適する。
【００２７】
上記の多能性幹細胞由来の造血細胞を分化させ、拡大するための組成物の群（ＩＩ）について、一部の実施形態では、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数と；多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体とを含まず、多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体を、Ｔ細胞前駆体もしくはＴ細胞へと分化させるのに適する培養培地；または（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、二次造血性内皮を、プレＴ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地をさらに含む。これらのさらなる培地は、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるのに適する。
【００２８】
上記の多能性幹細胞由来の造血細胞を分化させ、拡大するための組成物についての、さらに他の一部の実施形態では、群（Ｉ）は、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体とを含み、ＢＭＰ活性化因子を含まず、ＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分化させるのに適する培養培地；または（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣとを含み、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地をさらに含む。これらのさらなる培地は、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるのに適する。代替的に、上記の多能性幹細胞由来の造血細胞を分化させ、拡大するための組成物の群（ＩＩ）は、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数と；多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体とを含まず、プレＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞前駆体もしくはＮＫ細胞へと分化させるのに適する培地；または（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、二次造血性内皮を、プレＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培地をさらに含む。これらの培養培地は、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるのに適する。
【００２９】
さらに他の一部の実施形態では、上記の多能性幹細胞由来の造血細胞を分化させ、拡大するための組成物の群（ＩＩ）は、多能性幹細胞由来の造血複能性前駆体を発生させるための、１もしくは複数の培地をさらに含み、この培地は、（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含むが、ＲＯＣＫ阻害剤と、多能性幹細胞由来のｐｒｅ−ＨＳＣとを含まず、ｐｒｅ−ＨＳＣを、造血複能性前駆体へと分化させるのに適する培養培地；ならびに／または（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、二次造血性内皮を、ｐｒｅ−ＨＳＣへと分化させるのに適する培養培地を含む。
【００３０】
本発明の一態様は、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるための培養プラットフォームであって、群Ｉ：（ｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含み、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、二次ＨＳＣを、二次造血性内皮から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；ならびに（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と；ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと；１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含み、Ｔ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから分化させるのに適する培養培地；ならびに、任意選択で、（ｖ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと；１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子を含み；ＢＭＰ活性化因子を含まず、Ｔ細胞を、Ｔ細胞前駆体から分化させるのに適する培養培地を含む培養プラットフォームを提供する。
【００３１】
代替的に、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるための培養プラットフォームは、群ＩＩ：（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞を、中胚葉細胞から得るのに適する培養培地；（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、二次造血性内皮を、プレＴ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地；ならびに（ｖ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数と；多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体とを含まず、プレＴ細胞前駆体を、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞へと分化させるのに適する培養培地を含む。
【００３２】
多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるための、上記の培養プラットフォームについての一部の実施形態では、群ＩＩの培養プラットフォームは、（ｖｉ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【００３３】
本発明の別の態様は、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞を発生させるための培養プラットフォームであって、群Ｉ：（ｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含み、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させるのに適する培養培地；（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含み、中胚葉細胞を、二次造血性内皮へと分化させるのに適する培養培地；（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、二次造血性内皮を、二次ＨＳＣへと分化させるのに適する培養培地；（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；二次ＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地；ならびに、任意選択で、（ｖ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＢＭＰ活性化因子を含まず、ＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分化させるのに適する培養培地を含む培養プラットフォームを提供する。
【００３４】
代替的に、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞を発生させるための培養プラットフォームは、群ＩＩ：（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細胞を、中胚葉細胞から得るのに適する培養培地；（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細胞から分化させるのに適する培養培地；（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮を、プレＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培地；ならびに（ｖ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まず、プレＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞へと分化させるのに適する培養培地を含む。
【００３５】
多能性幹細胞由来のＮＫ細胞を発生させるための、上記の培養プラットフォームについての一部の実施形態では、群ＩＩの培養プラットフォームは、（ｖｉ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【００３６】
本発明のさらに別の態様は、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮（ｉＨＥ）を発生させるための培養プラットフォームであって、（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細胞を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から得るのに適する培養培地；ならびに（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、ＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地を含む培養プラットフォームを提供する。
【００３７】
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮（ｉＨＥ）を発生させるための培養プラットフォームについての一部の実施形態では、培養プラットフォームは、（ｉｖ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む。
【００３８】
本発明のなお別の態様は、多能性幹細胞由来の造血複能性前駆体を発生させるための培養プラットフォームであって、（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細胞を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から得るのに適する培養培地；（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み；二次造血性内皮を、ｐｒｅ−ＨＳＣへと分化させるのに適する培養培地；ならびに（ｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まず、ｐｒｅ−ＨＳＣを、造血複能性前駆体へと分化させるのに適する培養培地を含む培養プラットフォームを提供する。一部の実施形態では、培養プラットフォームは、（ｖｉ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【００３９】
本発明の別の態様は、多能性幹細胞の分化を、二次造血系細胞へと方向付けるための方法であって、群Ｉ：（ｉ）多能性幹細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞の、多能性幹細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉ）多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮細胞の、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉｉ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まない組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣの、造血性内皮細胞からの分化および拡大を誘発するステップとを含む方法を提供する。
【００４０】
代替的に、多能性幹細胞の分化を、二次造血系細胞へと方向付けるための方法は、群ＩＩ：（ｉ）多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む組成物と接触させて、中胚葉細胞の、多能性幹細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉ）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞の、中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉｉ）二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、二次造血性内皮の、二次造血性内皮のポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステップとを含み；任意選択で、多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、造血性内皮を有する中胚葉細胞、および／または二次造血性内皮を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップを含む。
【００４１】
多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化を方向付けるための方法についての一部の実施形態では、群（ＩＩ）の方法は、多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、多能性幹細胞を播種し、拡大するステップをさらに含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【００４２】
多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化を方向付けるための方法についての一部の実施形態では、多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化は、胚葉体の発生を欠き、単層培養形態にある。
【００４３】
上記の方法についての一部の実施形態では、得られた多能性幹細胞由来の二次造血性内皮細胞は、ＣＤ３４＋である。一部の実施形態では、得られた二次造血性内皮細胞は、ＣＤ３４＋  ＣＤ４３−である。一部の実施形態では、二次造血性内皮細胞は、ＣＤ３４＋
ＣＤ４３−  ＣＸＣＲ４−  ＣＤ７３−である。
【００４４】
上記の方法についての他の一部の実施形態では、群Ｉは、（ｉ）多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣの、Ｔ細胞前駆体への分化を誘発するステップと、任意選択で、Ｔ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと；１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、Ｔ細胞前駆体の、Ｔ細胞への分化を誘発するステップとをさらに含む。一部の実施形態では、方法の群ＩＩは、（ｉ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、二次造血性内皮の、プレＴ細胞前駆体への分化を誘発するステップと；任意選択で、（ｉｉ）プレＴ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まない組成物と接触させて、プレＴ細胞前駆体の、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞への分化を誘発するステップとをさらに含む。方法についての一部の実施形態では、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体は、ＣＤ３４＋  ＣＤ７＋である。
【００４５】
上記の多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化を方向付けるための方法についての、さらに他の一部の実施形態では、方法の群Ｉは、（ｉ）多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、二次ＨＳＣの、ＮＫ細胞前駆体への分化を誘発するステップと；任意選択で、（ｉｉ）ＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含むが、ＢＭＰ活性化因子を含まない組成物と接触させて、ＮＫ細胞前駆体の、ＮＫ細胞への分化を誘発するステップとをさらに含むか、または方法の群ＩＩは、（ｉ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、二次造血性内皮の、プレＮＫ細胞前駆体への分化を誘発するステップと；任意選択で、（ｉｉ）多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含む組成物であって、媒体が、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数を含まない組成物と接触させて、プレＮＫ細胞前駆体の、ＮＫ細胞前駆体もしくはＮＫ細胞への分化を誘発するステップとをさらに含む。一部の実施形態では、方法の群ＩＩは、（ｉ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、二次造血性内皮の、ｐｒｅ−ＨＳＣへの分化を誘発するステップと；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含むがＲＯＣＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来のｐｒｅ−ＨＳＣを、造血複能性前駆体へと分化させるのに適する培養培地をさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法を使用して得られた多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣは、ＣＤ３４＋  ＣＤ４５＋であり、長期にわたる生着に適する。
【００４６】
本発明の別の態様は、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるための方法であって、群Ｉ：（ｉ）多能性幹細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含む組成物と接触させて、中胚葉細胞の、多能性幹細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉ）中胚葉細胞を、ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含む組成物と接触させて、二次造血性内皮の、中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉｉ）二次造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まない組成物と接触させて、二次ＨＳＣの、二次造血性内皮からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｖ）二次ＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、二次ＨＳＣの、Ｔ細胞前駆体への分化を誘発するステップと；任意選択で、（ｖ）Ｔ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと；１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含むが；ＢＭＰ活性化因子を含まない組成物と接触させて、Ｔ細胞前駆体の、Ｔ細胞への分化を誘発するステップとを含む方法を提供する。
【００４７】
代替的に、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるための方法は、群ＩＩ：（ｉ）多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む組成物と接触させて、中胚葉細胞の、多能性幹細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉ）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含むが、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞の、中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉｉ）二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、二次造血性内皮の、二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｖ）二次造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、二次造血性内皮の、プレＴ細胞前駆体への分化を誘発するステップと；（ｖ）プレＴ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み；ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まない組成物と接触させて、プレＴ細胞前駆体の、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞への分化を誘発するステップとを含み；任意選択で、播種された多能性幹細胞、中胚葉細胞、二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞、および／または二次造血性内皮を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くことができる。一部の実施形態では、上記の方法の群ＩＩは、ｉＰＳＣを、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含むが、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、多能性幹細胞を播種し、拡大するステップをさらに含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。方法についての一部の実施形態では、多能性幹細胞の、Ｔ系統細胞への分化は、胚葉体の発生を欠き、単層培養フォーマットにある。
【００４８】
本発明のさらに別の態様は、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるための方法であって、群Ｉ：（ｉ）多能性幹細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含む組成物と接触させて、多能性幹細胞の、中胚葉細胞への分化を誘発するステップと；（ｉｉ）中胚葉細胞を、ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含む組成物と接触させて、中胚葉細胞の、二次造血性内皮への分化を誘発するステップと；（ｉｉｉ）二次造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まない組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮の、二次ＨＳＣへの分化を誘発するステップと；（ｉｖ）二次ＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、二次ＨＳＣの、ＮＫ細胞前駆体への分化を誘発するステップと；任意選択で、（ｖ）多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含むが、ＢＭＰ活性化因子を含まない組成物と接触させて、ＮＫ細胞前駆体の、ＮＫ細胞への分化を誘発するステップとを含む方法を提供する。代替的に、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるための方法は、群ＩＩ：（ｉ）多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む組成物と接触させて、中胚葉細胞の、多能性幹細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉ）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞の、中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉｉ）二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞を、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと；ＲＯＣＫ阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮の、二次ＨＥのポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｖ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮の、プレＮＫ細胞前駆体への分化を誘発するステップと；（ｖ）多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイト���インを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まない組成物と接触させて、多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体の、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞への分化を誘発するステップとを含み；任意選択で、播種された多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、および／または二次造血性内皮を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップを含む。一部の実施形態では、群ＩＩの多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるための方法は、ｉＰＳＣを、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含むが、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、ｉＰＳＣを播種し、拡大するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるための方法は、胚葉体の発生を欠き、単層培養フォーマットにある。
【００４９】
本発明の別の態様は、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させるための方法であって、（ｉ）ｉＰＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞の、多能性幹細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉ）多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、二次ＨＥのポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞の、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉｉ）二次ＨＥのポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと；ＲＯＣＫ阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮の、二次ＨＥのポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステップとを含み；任意選択で、播種された多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、および／または二次造血性内皮を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、上記の多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させるための方法は、ｉＰＳＣを、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含むが、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、ｉＰＳＣを播種し、拡大するステップをさらに含み、かつ／またはｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣを、二次造血性内皮の細胞へと分化させる上記の方法は、胚葉体の発生を欠き、単層培養フォーマットにある。
【００５０】
本発明の別の態様は、多能性幹細胞由来の、造血系の複能性前駆体を発生させるための方法であって、（ｉ）ｉＰＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞の、ｉＰＳＣからの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉ）多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含むが、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞の、中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｉｉ）二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、二次造血性内皮の、二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞からの分化および拡大を誘発するステップと；（ｉｖ）二次造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、二次造血性内皮の、ｐｒｅ−ＨＳＣへの分化を誘発するステップと；（ｖ）ｐｒｅ−ＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含むが、ＲＯＣＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、ｐｒｅ−ＨＳＣの、造血複能性前駆体への分化を誘発するステップとを含み；任意選択で、播種された多能性幹細胞、中胚葉細胞、および／または二次造血性内皮を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、上記の多能性幹細胞由来の造血複能性前駆体を発生させるための方法は、多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含むが、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、多能性幹細胞を播種し、拡大するステップをさらに含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、多能性幹細胞の、上記の方法を使用する造血複能性前駆体への分化は、胚葉体の発生を欠き、単層培養フォーマットにある。
【００５１】
本発明のさらなる態様は、本明細書で開示される培養プラットフォームから発生させる、１または複数の細胞集団：多能性幹細胞由来の（ｉ）ＣＤ３４＋二次造血性内皮（ｉＣＤ３４）であって、上記ｉＣＤ３４細胞が、複能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞へと分化する能力を有し、ＣＤ３４＋  ＣＤ４３−である、ＣＤ３４＋二次造血性内皮；（ｉｉ）二次造血性内皮（ｉＨＥ）であって、上記ｉＨＥ細胞がＣＤ３４＋である、二次造血性内皮；（ｉｉｉ）多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣであって、上記ｉＨＳＣがＣＤ３４＋  ＣＤ４５＋である、二次ＨＳＣ；（ｉｖ）造血複能性前駆細胞であって、上記ｉＭＰＰ細胞が、ＣＤ３４＋  ＣＤ４５＋である、造血複能性前駆細胞；（ｖ）ＣＤ３４＋  ＣＤ７＋であるＴ細胞前駆体；（ｖｉ）ＣＤ４＋またはＣＤ８＋であるＴ細胞；（ｖｉｉ）ＣＤ５６＋  ＣＤ７＋  ＣＤ１６１＋であるＮＫ細胞前駆体；ならびに（ｖｉｉｉ）ＣＤ５６＋  ＣＤ５７＋  ＣＤ１６＋  ＣＤ９４−であるＮＫ細胞を含む組成物を提供する。
【００５２】
本発明のなおさらなる態様は、本明細書で開示される方法を使用して発生させる、１または複数の細胞株またはクローン細胞：多能性幹細胞由来の（ｉ）ＣＤ３４＋二次造血性内皮（ｉＣＤ３４）であって、上記ｉＣＤ３４細胞が、複能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞へと分化する能力を有し、ＣＤ３４＋  ＣＤ４３−である、ＣＤ３４＋二次造血性内皮；（ｉｉ）二次造血性内皮（ｉＨＥ）であって、上記ｉＨＥ細胞株またはクローン細胞が、ＣＤ３４＋である、二次造血性内皮；（ｉｉｉ）二次ＨＳＣであって、上記ｉＨＳＣがＣＤ３４＋  ＣＤ４５＋である、二次ＨＳＣ；（ｉｖ）造血複能性前駆細胞（ｉＭＰＰ）であって、上記ｉＭＰＰ細胞が、ＣＤ３４＋  ＣＤ４５＋である、造血複能性前駆細胞；（ｖ）ＣＤ３４＋  ＣＤ７＋であるＴ細胞前駆体；（ｖｉ）ＣＤ４＋またはＣＤ８＋であるＴ細胞；（ｖｉｉ）ＣＤ５６＋  ＣＤ７＋  ＣＤ１６１＋であるＮＫ細胞前駆体；ならびに（ｖｉｉｉ）ＣＤ５６＋  ＣＤ５７＋  ＣＤ１６＋  ＣＤ９４−であるＮＫ細胞を提供する。
【００５３】
本発明の別の態様は、開示される方法を使用して発生させる細胞集団、細胞株、またはクローン細胞：多能性幹細胞由来の（ｉ）ＣＤ３４＋二次造血性内皮（ｉＣＤ３４）であって、上記ｉＣＤ３４細胞が、複能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞へと分化する能力を有し、ＣＤ３４＋  ＣＤ４３−である、ＣＤ３４＋二次造血性内皮；（ｉｉ）二次造血性内皮（ｉＨＥ）であって、上記ｉＨＥ細胞株またはクローン細胞がＣＤ３４＋である、二次造血性内皮；（ｉｉｉ）二次ＨＳＣであって、上記ｉＨＳＣが、ＣＤ３４＋  ＣＤ４５＋である、二次ＨＳＣ；（ｉｖ）造血複能性前駆細胞であって、上記ｉＭＰＰ細胞がＣＤ３４＋  ＣＤ４５＋である、造血複能性前駆細胞；（ｖ）ＣＤ３４＋  ＣＤ７＋であるＴ細胞前駆体；（ｖｉ）ＣＤ４＋またはＣＤ８＋であるＴ細胞；（ｖｉｉ）ＣＤ５６＋  ＣＤ７＋  ＣＤ１６１＋であるＮＫ細胞前駆体；ならびに（ｖｉｉｉ）ＣＤ５６＋  ＣＤ５７＋  ＣＤ１６＋  ＣＤ９４−であるＮＫ細胞のうちの１または複数を使用して、造血系の自己再生、再構成、または生着を促進する方法を提供する。
【００５４】
まとめると、本発明は、胚葉体を多能性幹細胞から発生させずに、単層内の、多能性幹細胞の直接的な分化を可能とし、これにより、他の造血系細胞を、極めて高レベルの効率を伴う、スケーラブルかつ信頼できる形で得ることができる、中胚葉細胞、二次ＨＥ、および二次ＨＳＣの分化および拡大を達成する方法および組成物を達成する。
本発明の特定の態様では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
多能性幹細胞の分化を、造血系細胞へと方向付けるための方法であって、（ｉ）前記多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む組成物と接触させて、中胚葉細胞を得るステップと；（ｉｉ）前記中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＷＮＴ経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、二次造血性内皮（ＨＥ）のポテンシャルを有する中胚葉細胞を得るステップとを含み、二次造血性内皮（ＨＥ）のポテンシャルを有する前記中胚葉細胞が、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＣ）、造血複能性前駆細胞（ＭＰＰ）、プレＴ細胞の前駆細胞、プレＮＫ細胞の前駆細胞、Ｔ細胞の前駆細胞、ＮＫ細胞の前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＢ細胞を含む造血系細胞を提供することが可能であり；中胚葉細胞および二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞が、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）において、胚葉体を形成せずに得られる方法。
（項目２）
二次ＨＥのポテンシャルを有する前記中胚葉細胞を、ｂＦＧＦとＲＯＣＫ阻害剤とを含む組成物と接触させて、二次ＨＥ細胞を得るステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記二次ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、造血複能性前駆細胞（ＭＰＰ）を得るステップをさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記二次ＨＥ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと；任意選択で、ＢＭＰ活性化因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦのうちの１または複数とを含む組成物と接触させて、プレＴ細胞前駆体、Ｔ細胞前駆体、および／またはＴ細胞を得るステップをさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記二次ＨＥ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、任意選択で、ＢＭＰ活性化因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦのうちの１または複数とを含む組成物と接触させて、プレＮＫ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、および／またはＮＫ細胞を得るステップをさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤と、ＧＳＫ３阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む組成物と接触させて、前記細胞を播種し、拡大するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記多能性幹細胞、前記中胚葉細胞、および／または二次造血性内皮のポテンシャルを有する前記中胚葉細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記多能性幹細胞の、造血系細胞への分化が、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記多能性幹細胞の、造血系細胞への分化が、フィーダーフリー条件下である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記多能性幹細胞の、造血系細胞への分化が、間質フリー条件下にある、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＷＮＴ経路活性化因子が、ＧＳＫ３阻害剤である、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記ＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ＢＭＰ経路活性化因子が、ＢＭＰ４である、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、チアゾビビンまたはＹ−２７６３２である、項目２に記載の方法。
（項目１７）
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２である、項目２に記載の方法。
（項目１８）
多能性幹細胞の分化を、造血系の細胞へと方向付けるための方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞を、ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子とを含む組成物と接触させて、中胚葉細胞を得るステップと；
（ｉｉ）前記中胚葉細胞を、ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含む組成物と接触させて、造血性内皮を得るステップと；
（ｉｉｉ）前記造血性内皮を、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと；ＢＭＰ活性化因子とを含む組成物と接触させて、二次ＨＳＣを得るステップであって、前記組成物が、任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まないステップと
を含む方法。
（項目１９）
（ｉｖ）二次ＨＳＣを、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；ＢＭＰ活性化因子と、１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、Ｔ細胞前駆体を得るステップと、任意選択で、
（ｖ）Ｔ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、Ｔ細胞を得るステップと
をさらに含むか、または
（ｖｉ）二次ＨＳＣを、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；ＢＭＰ活性化因子とを含む組成物と接触させて、ＮＫ細胞前駆体を得るステップと；任意選択で、
（ｖｉｉ）ＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含む組成物と接触させて、ＮＫ細胞を得るステップであって、前記組成物が、ＢＭＰ活性化因子を含まないステップと
をさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記二次ＨＳＣが、ＣＤ３４＋  ＣＤ４５＋である、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記二次ＨＳＣが、長期にわたる生着に適する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記Ｔ細胞前駆体が、ＣＤ３４＋  ＣＤ７＋である、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記ＮＫ細胞前駆体が、ＣＤ５６＋  ＣＤ７＋  ＣＤ１６１＋である、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化を方向付けることが、胚葉体の発生を欠く、項目１８に記載の方法。
（項目２５）
多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化を方向付けることが、単層培養下である、項目１８に記載の方法。
（項目２６）
多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化を方向付けることが、フィーダーフリー条件下である、項目１８に記載の方法。
（項目２７）
多能性幹細胞の、造血系の細胞への分化を方向付けることが、間質フリー条件下である、項目１８に記載の方法。
（項目２８）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目１８に記載の方法。
（項目２９）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるための方法であって、前記方法が、
（Ｉ）多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、Ｔ細胞を得るステップであって；前記組成物が、ＢＭＰ活性化因子を含まないステップ
を含み；
前記多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体が、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む組成物と接触させて、分化および拡大を可能とすることにより得られ；
前記多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣが、多能性幹細胞由来の造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と；ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず；
前記多能性幹細胞由来の二次造血性内皮が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含む組成物と接触させて、分化および拡大を可能とすることにより得られ；
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含む組成物と接触させて、分化および拡大を可能とすることにより得られるか；または前記方法が、
（ＩＩ）多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含む組成物
と接触させて、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体もしくはＴ細胞を得るステップであって、前記組成物が、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数を含まないステップ
を含み；
前記多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体が、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ；
前記多能性幹細胞由来の二次造血性内皮が、二次ＨＥのポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ；前記組成物が、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず；
二次ＨＥのポテンシャルを有する、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られる、
方法。
（項目３１）
多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤と、ＧＳＫ３阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む組成物と接触させて、前記多能性幹細胞を播種し、拡大するステップ
をさらに含み、前記組成物が、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させることが、胚葉体の発生を欠く、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させることが、単層培養下である、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させることが、フィーダーフリー条件下である、項目３０に記載の方法。
（項目３５）
多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させることが、間質フリー条件下である、項目３０に記載の方法。
（項目３６）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目３０に記載の方法。
（項目３７）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるための方法であって、前記方法が、
（Ｉ）多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞を得るステップであって、前記組成物が、ＢＭＰ活性化因子を含まないステップ
を含み；
前記多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体が、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ；
前記多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣが、多能性幹細胞由来の造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず；
前記多能性幹細胞由来の造血性内皮が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞の分化を誘発して、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ；
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られるか；
または前記方法が、
（ＩＩ）多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体もしくはＮＫ細胞を得るステップであって、前記組成物が、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数を含まないステップ
を含み；
前記多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体が、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ；
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮が、二次ＨＥのポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず；
二次ＨＥのポテンシャルを有する、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず；
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られる、
方法。
（項目３９）
播種された多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞、および／または二次造血性内皮を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤と、ＧＳＫ３阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む組成物と接触させて、前記細胞を播種し、拡大するステップをさらに含み、前記組成物が、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させることが、胚葉体の発生を欠く、項目３８に記載の方法。
（項目４２）
多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させることが、単層培養下である、項目３８に記載の方法。
（項目４３）
多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させることが、フィーダーフリー条件下である、項目３８に記載の方法。
（項目４４）
多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させることが、間質フリー条件下である、項目３８に記載の方法。
（項目４５）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目３８に記載の方法。
（項目４６）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させるための方法であって、
二次ＨＥのポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を得るステップであって、前記組成物が、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないステップを含み；
二次ＨＥのポテンシャルを有する、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず；
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られる、
方法。
（項目４８）
多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤と、ＧＳＫ３阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む組成物と接触させて、前記多能性幹細胞を播種し、拡大するステップ
をさらに含み、前記組成物が、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
播種された多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細胞、および／または二次造血性内皮を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む、項目４７および４８に記載の方法。
（項目５０）
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させることが、胚葉体の発生を欠く、項目４７に記載の方法。
（項目５１）
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させることが、単層培養下である、項目４７に記載の方法。
（項目５２）
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させることが、フィーダーフリー条件下である、項目４７に記載の方法。
（項目５３）
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させることが、間質フリー条件下である、項目４７に記載の方法。
（項目５４）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目４７に記載の方法。
（項目５５）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
多能性幹細胞由来の造血系の複能性前駆体を発生させるための方法であって、
多能性幹細胞由来のｐｒｅ−ＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞由来の複能性前駆体を得るステップであって、前記組成物が、ＲＯＣＫ阻害剤を含まないステップを含み；
前記多能性幹細胞由来のｐｒｅ−ＨＳＣが、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ；
前記多能性幹細胞由来の二次造血性内皮が、二次ＨＥのポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず；
二次ＨＥのポテンシャルを有する、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず；
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られ、前記組成物が、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず；
前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む組成物と接触させて、細胞の分化および拡大を可能とすることにより得られる、
方法。
（項目５７）
多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤と、ＧＳＫ３阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む組成物と接触させて、前記多能性幹細胞を播種し、拡大するステップ
をさらに含み、前記組成物が、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
播種された多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細胞、および／または二次造血性内皮を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む、項目５６および５７に記載の方法。
（項目５９）
多能性幹細胞由来の造血系の複能性前駆体が、胚葉体の発生を欠く、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
多能性幹細胞由来の造血系の複能性前駆体が、単層培養下にある、項目５８に記載の方法。
（項目６１）
多能性幹細胞由来の造血系の複能性前駆体が、フィーダーフリー条件下にある、項目５８に記載の方法。
（項目６２）
多能性幹細胞由来の造血系の複能性前駆体が、間質フリー条件下にある、項目５８に記載の方法。
（項目６３）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目５８に記載の方法。
（項目６４）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
項目１から６４に記載の方法を使用して発生させる細胞集団、細胞株、またはクローン細胞のうちの１または複数を含む組成物を使用して、造血系の自己再生、再構成、または生着を促進する方法であって、前記細胞集団、細胞株、またはクローン細胞が、
（ｉ）多能性幹細胞由来のＣＤ３４＋二次造血性内皮（ｉＣＤ３４  ＨＥ）であって、前記ｉＣＤ３４細胞が、複能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞へと分化する能力を有し、前記ｉＣＤ３４細胞がＣＤ３４＋  ＣＤ４３−である、ＣＤ３４＋二次造血性内皮；
（ｉｉ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮（ｉＨＥ）であって、前記ｉＨＥ細胞株またはクローン細胞がＣＤ３４＋である、二次造血性内皮；
（ｉｉｉ）多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣであって、前記ｉＨＳＣが、ＣＤ３４＋  ＣＤ４５＋である二次ＨＳＣ；
（ｉｖ）多能性幹細胞由来の複能性前駆細胞であって、前記ｉＭＰＰ細胞が、ＣＤ３４＋  ＣＤ４５＋である、複能性前駆細胞；
（ｖ）多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体であって、ＣＤ３４＋  ＣＤ７＋であるＴ細胞前駆体；
（ｖｉ）多能性幹細胞由来のＴ細胞であって、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋であるＴ細胞；
（ｖｉｉ）多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体であって、ＣＤ５６＋  ＣＤ７＋  ＣＤ１６１＋であるＮＫ細胞前駆体；ならびに
（ｖｉｉｉ）多能性幹細胞由来のＮＫ細胞であって、ＣＤ５６＋  ＣＤ５７＋  ＣＤ１６＋  ＣＤ９４−であるＮＫ細胞
から選択される、
方法。
（項目６６）
多能性幹細胞由来の造血系細胞を得るための培養プラットフォームであって、
Ｉ：
（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；および
（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
またはＩＩ：
（ｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得るのに適する培養培地；ならびに
（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地
を含む培養プラットフォーム。
（項目６７）
群ＩＩが、
（ｉｖ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む、
項目６６に記載の培養プラットフォーム。
（項目６８）
Ｉ：
（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含み；ＢＭＰ活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＴ細胞へと分化させるのに適する培養培地、または
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含み、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるのに適するか、
あるいはＩＩ：
（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数を含まず、多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体もしくはＴ細胞へと分化させるのに適する培養培地；または
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるのに適する、
項目６６に記載の培養プラットフォーム。
（項目６９）
Ｉ：
（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＢＭＰ活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞へと分化させるのに適する培養培地；または
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるのに適するか、
あるいはＩＩ：
（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数を含まず、多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体もしくはＮＫ細胞へと分化させるのに適する培地；または
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、プレＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるのに適する、
項目６６に記載の培養プラットフォーム。
（項目７０）
群（ＩＩ）が、
（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来のｐｒｅ−ＨＳＣを、多能性幹細胞由来の複能性前駆体へと分化させるのに適する培養培地；または
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来のｐｒｅ−ＨＳＣへと分化させるのに適する培養培地
をさらに含み；
前記培養培地が、多能性幹細胞由来の造血複能性前駆体を発生させるのに適する、項目６６に記載の培養プラットフォーム。
（項目７１）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目６６に記載の培養プラットフォーム。
（項目７２）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目７１に記載の培養プラットフォーム。
（項目７３）
多能性幹細胞由来の造血細胞を得、かつ拡大するための組成物であって、
Ｉ：
（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮から得るのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と；多能性幹細胞由来の中胚葉細胞とを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から得るのに適する培養培地；ならびに
（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子と；ｉＰＳＣとを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から得るのに適する培養培地；
またはＩＩ：
（ｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と；二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞とを含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から得るのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と；多能性幹細胞由来の中胚葉細胞とを含まず、二次造血性内皮のポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から得るのに適する培養培地；ならびに
（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦと；多能性幹細胞とを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から得るのに適する培養培地
のうちの１または複数を含む組成物。
（項目７４）
群（ＩＩ）が、
（ｖｉ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と；多能性幹細胞とを含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地
をさらに含む、項目７３に記載の組成物。
（項目７５）
Ｉ：
（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子と；多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体とを含み；ＢＭＰ活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＴ細胞へと分化させるのに適する培養培地、または
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と；ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子と；多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣとを含み、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体へと分化させるのに適し、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるのに適する培養培地
をさらに含み、
あるいはＩＩ：
（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数と；多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体とを含まず、多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体もしくはＴ細胞へと分化させるのに適する培養培地、または
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるのに適する、
項目７３に記載の組成物。
（項目７６）
Ｉ：
（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体とを含み、ＢＭＰ活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞へと分化させるのに適する培養培地；または
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子；ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣとを含み、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるのに適するか、
あるいはＩＩ：
（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数と；多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体とを含まず、多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体もしくはＮＫ細胞へと分化させるのに適する培地；または
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、プレＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培地
をさらに含み、
前記培養培地が、多能性幹細胞由来のＮＫ系統細胞を発生させるのに適する、
項目７３に記載の組成物。
（項目７７）
群（ＩＩ）が、多能性幹細胞由来の造血複能性前駆体を発生させるための、１または複数の培地をさらに含み、前記培地が、
（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、ＲＯＣＫ阻害剤と；多能性幹細胞由来のｐｒｅ−ＨＳＣとを含まず、多能性幹細胞由来のｐｒｅ−ＨＳＣを、多能性幹細胞由来の複能性前駆体へと分化させるのに適する培養培地；ならびに／または
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；多能性幹細胞由来の二次造血性内皮とを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来のｐｒｅ−ＨＳＣへと分化させるのに適する培養培地
を含む、項目７３に記載の組成物。
（項目７８）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目７３に記載の培養プラットフォーム。
（項目７９）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目７８に記載の培養プラットフォーム。
（項目８０）
多能性幹細胞由来のＴ系統細胞を発生させるための培養プラットフォームであって、
Ｉ：
（ｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；ならびに
（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと、１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含み、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣから分化させるのに適する培養培地；ならびに、任意選択で、
（ｉｉｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインと；１もしくは複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含み；ＢＭＰ活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のＴ細胞を、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体から分化させるのに適する培養培地；
またはＩＩ：
（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞内の二次ＨＥのポテンシャルを得るのに適する培養培地；
（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来の造血性内皮のポテンシャルを伴う前記中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地；ならびに
（ｖ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数を含まず、多能性幹細胞由来のプレＴ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体もしくはＴ細胞へと分化させるのに適する培養培地を含むプラットフォーム。
（項目８１）
群（ＩＩ）が、
（ｖｉ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地
をさらに含む、項目８０に記載の培養プラットフォーム。
（項目８２）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目８０に記載の培養プラットフォーム。
（項目８３）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目８２に記載の培養プラットフォーム。
（項目８４）
多能性幹細胞由来のＮＫ細胞を発生させるための培養プラットフォームであって、
Ｉ：
（ｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ活性化因子を含み、多能性幹細胞を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞へと分化させるのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮へと分化させるのに適する培養培地；
（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；任意選択で、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣへと分化させるのに適する培養培地；ならびに
（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣを、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地；ならびに、任意選択で、
（ｉｖ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＢＭＰ活性化因子を含まず、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞へと分化させるのに適する培養培地；
またはＩＩ：
（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得るのに適する培養培地；
（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から分化させるのに適する培養培地；
（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、プレＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培養培地；ならびに
（ｖ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１もしくは複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数を含まず、多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体もしくはＮＫ細胞へと分化させるのに適する培養培地
を含むプラットフォーム。
（項目８５）
群（ＩＩ）が、
（ｖｉ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む、
項目８４に記載の培養プラットフォーム。
（項目８６）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目８４に記載の培養プラットフォーム。
（項目８７）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目８６に記載の培養プラットフォーム。
（項目８８）
多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を発生させるための培養プラットフォームであって、
（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得るのに適する培養培地；ならびに
（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の前記中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地
を含む培養プラットフォーム。
（項目８９）
（ｉｖ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む、
項目８８に記載の培養プラットフォーム。
（項目９０）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目８８に記載の培養プラットフォーム。
（項目９１）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目９０に記載の培養プラットフォーム。
（項目９２）
複能性幹細胞由来の造血複能性前駆体を発生させるための培養プラットフォームであって、
（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、前記多能性幹細胞由来の中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得るのに適する培養培地；
（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地；
（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮を、多能性幹細胞由来のｐｒｅ−ＨＳＣへと分化させるのに適する培養培地；ならびに
（ｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞由来のｐｒｅ−ＨＳＣを、多能性幹細胞由来の複能性前駆体へと分化させるのに適する培養培地
を含む培養プラットフォーム。
（項目９３）
（ｖｉ）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず、多能性幹細胞を播種し、拡大するのに適する培養培地
をさらに含む、項目９２に記載の培養プラットフォーム。
（項目９４）
前記多能性幹細胞が、ｉＰＳＣである、項目９２に記載の培養プラットフォーム。
（項目９５）
前記ｉＰＳＣが、ナイーブｉＰＳＣである、項目９４に記載の培養プラットフォーム。
（項目９６）
（ａ）任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない培養培地；ならびに
（ｂ）項目４から７に記載の培養プラットフォームから発生させる、１または複数の細胞集団：
（ｉ）多能性幹細胞由来のＣＤ３４＋二次造血性内皮（ｉＣＤ３４  ＨＥ）であって、前記ｉＣＤ３４細胞が、複能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞へと分化する能力を有し、ＣＤ３４＋  ＣＤ４３−である、ＣＤ３４＋二次造血性内皮；
（ｉｉ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮（ｉＨＥ）であって、前記ｉＨＥ細胞がＣＤ３４＋である、二次造血性内皮；
（ｉｉｉ）多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣであって、前記ｉＨＳＣが、ＣＤ３４＋  ＣＤ４５＋である、二次ＨＳＣ；
（ｉｖ）多能性幹細胞由来の複能性前駆細胞であって、前記ｉＭＰＰ細胞が、ＣＤ３４＋  ＣＤ４５＋である、複能性前駆細胞；
（ｖ）多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体であって、ＣＤ３４＋  ＣＤ７＋であるＴ細胞前駆体；
（ｖｉ）多能性幹細胞由来のＴ細胞であって、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋であるＴ細胞；
（ｖｉｉ）多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体であって、ＣＤ５６＋  ＣＤ７＋  ＣＤ１６１＋であるＮＫ細胞前駆体；ならびに
（ｖｉｉｉ）多能性幹細胞由来のＮＫ細胞であって、ＣＤ５６＋  ＣＤ５７＋  ＣＤ１６＋  ＣＤ９４−であるＮＫ細胞
を含む組成物。
（項目９７）
（ｉ）ＣＤ３４＋  ＨＥ細胞（ｉＣＤ３４）、ならびにｉＣＤ３４−Ｃ、ｉＭＰＰ−Ａ、ｉＴＣ−Ａ１、ｉＴＣ−Ａ２、ｉＴＣ−Ｂ１、ｉＴＣ−Ｂ２、ｉＮＫ−Ａ１、ｉＮＫ−Ａ２、ｉＮＫ−Ｂ１、およびｉＮＫ−Ｂ２から選択される、１または複数の培養培地；
（ｉｉ）二次造血性内皮（ｉＨＥ）、ならびにｉＣＤ３４−Ｃ、ｉＭＰＰ−Ａ、ｉＴＣ−Ａ１、ｉＴＣ−Ａ２、ｉＴＣ−Ｂ１、ｉＴＣ−Ｂ２、ｉＮＫ−Ａ１、ｉＮＫ−Ａ２、ｉＮＫ−Ｂ１、およびｉＮＫ−Ｂ２から選択される、１または複数の培養培地；
（ｉｉｉ）二次ＨＳＣ、ならびにｉＭＰＰ−Ａ、ｉＴＣ−Ａ１、ｉＴＣ−Ａ２、ｉＴＣ−Ｂ１、ｉＴＣ−Ｂ２、ｉＮＫ−Ａ１、ｉＮＫ−Ａ２、ｉＮＫ−Ｂ１、およびｉＮＫ−Ｂ２から選択される、１または複数の培養培地；
（ｉｖ）複能性前駆細胞（ｉＭＰＰ）およびｉＭＰＰ−Ａ；
（ｖ）Ｔ細胞前駆体（ｉｐｒｏＴ）、ならびにｉＴＣ−Ａ１、ｉＴＣ−Ａ２、ｉＴＣ−Ｂ１、およびｉＴＣ−Ｂ２から選択される、１または複数の培養培地；
（ｖｉ）Ｔ細胞（ｉＴＣ）、およびｉＴＣ−Ｂ１またはｉＴＣ−Ｂ２；
（ｖｉｉ）ＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏＮＫ）、ならびにｉＮＫ−Ａ１、ｉＮＫ−Ａ２、ｉＮＫ−Ｂ１、およびｉＮＫ−Ｂ２から選択される、１または複数の培養培地；ならびに
（ｖｉｉｉ）ＮＫ細胞（ｉＮＫ）と、ｉＮＫ−Ｂ１またはｉＮＫ−Ｂ２
（ｉｘ）ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）、ならびにｉＨＳＣ−Ａ、ｉＨＳＣ−Ｂ、およびｉＨＳＣ−Ｃ
からなる群から選択される、多能性幹細胞由来の造血細胞と、１または複数の培養培地とを含む組成物であって；
ｉＨＳＣ−Ａが、Ｗｎｔ経路活性化因子およびＢＭＰ活性化因子を含み；
ｉＨＳＣ−Ｂが、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含み；
ｉＨＳＣ−Ｃが、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；
ｉＴＣ−Ａ１が、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、およびＤＬＬ−４からなる群から選択される、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含み；
ｉＴＣ−Ｂ１が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、およびＤＬＬ−４からなる群から選択される、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含み；（ｉＨＳＣプラットフォーム）；
ｉＮＫ−Ａ１が、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；
ｉＮＫ−Ｂ１が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み；
ｉＣＤ３４−Ｃが、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；
ｉＭＰＰ−Ａが、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；
ｉＴＣ−Ａ２が、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦと；ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；
ｉＴＣ−Ｂ２が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み；
ｉＮＫ−Ａ２が、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦと、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；
ｉＮＫ−Ｂ２が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む、
組成物。
（項目９８）
ｉＨＳＣ−Ｃが、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず；ｉＴＣ−Ａ１が、ＶＥＧＦおよび／もしくはＩＬ１５を含まず；ｉＣＤ３４−Ｃが、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず；ｉＴＣ−Ｂ１が、ＢＭＰ活性化因子を含まず；かつ／またはｉＴＣ−Ｂ２が、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１もしくは複数を含まない、項目９７に記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の、完全に分化したＴ細胞への造血分化のための多段階工程についての、例示的な概略図を示す図である。
【００５６】
【図２】図２は、ｈｉＰＳＣの、完全に分化させたＮＫ細胞への造血分化のための多段階工程についての、例示的な概略図を示す図である。
【００５７】
【図３ＡＢＣ】図３Ａ〜３Ｅは、９日間の経過にわたる形態の変化であって、ｈｉＰＳＣから造血細胞への移行を裏付ける形態の変化を示す図である。
【図３ＤＥ】図３Ａ〜３Ｅは、９日間の経過にわたる形態の変化であって、ｈｉＰＳＣから造血細胞への移行を裏付ける形態の変化を示す図である。
【００５８】
【図４ＡＢ】図４Ａ〜４Ｄは、それらが、多能性を離れて、造血運命へと完全に移行するときの、幹細胞の発現プロファイルを示す図である。
【図４ＣＤ】図４Ａ〜４Ｄは、それらが、多能性を離れて、造血運命へと完全に移行するときの、幹細胞の発現プロファイルを示す図である。
【００５９】
【図５ＡＢ】図５Ａ〜５Ｃは、多様な方法および出発インプットにより発生させたｈｉＰＳＣから分化させた造血細胞のＣＤ３４／ＣＤ４５発現プロファイルを示す図である。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｃは、多様な方法および出発インプットにより発生させたｈｉＰＳＣから分化させた造血細胞のＣＤ３４／ＣＤ４５発現プロファイルを示す図である。
【００６０】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、記載される分化培養培地中の単層として介在された場合の、ＣＤ３４分化効率の改善を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃは、記載される分化培養培地中の単層として介在された場合の、ＣＤ３４分化効率の改善を示す図である。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、記載される分化培養培地中の単層として介在された場合の、ＣＤ３４分化効率の改善を示す図である。
【００６１】
【図７】図７は、単一細胞解離の後、ＲＯＣＫ阻害下で分化させた造血細胞の生存および増殖を示す図である。
【００６２】
【図８】図８は、２２日培養後にｈｉＰＳＣから分化した造血細胞による、ＣＤ３４発現の維持を示す図である。
【００６３】
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｂは、生着したＣＤ３４陽性細胞の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける再構成であって、ヒトＣＤ４５マーカーをもっぱら発現する細胞の存在と、Ｔ細胞およびＢ細胞の両方の存在を伴う、ＣＤ３４＋細胞の再構成とにより見られる再構成を示す図である。ＣＤ３４陽性細胞は、ＧＳＫ３阻害剤を伴い、単層フォーマットで、ＥＢまたは凝集中間体を伴わずに培養されたナイーブｈｉＰＳＣに由来する。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｂは、生着したＣＤ３４陽性細胞の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける再構成であって、ヒトＣＤ４５マーカーをもっぱら発現する細胞の存在と、Ｔ細胞およびＢ細胞の両方の存在を伴う、ＣＤ３４＋細胞の再構成とにより見られる再構成を示す図である。ＣＤ３４陽性細胞は、ＧＳＫ３阻害剤を伴い、単層フォーマットで、ＥＢまたは凝集中間体を伴わずに培養されたナイーブｈｉＰＳＣに由来する。
【００６４】
【図１０】図１０は、ＣＤ５６−／ＣＤ７＋／ＣＤ３＋／ＴＣＲαβ＋ゲーティング戦略により導出され、ＣＤ５６陽性細胞および単一のＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞が、ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４陽性細胞を、間質細胞の非存在下で、かつ可溶性ＤＬＬ１およびＤＬＬ４組換えペプチド（Ｔ細胞に限る）の存在下で、分化培地中でさらに培養された場合に識別されたことを示す図である。
【００６５】
【図１１】図１１は、ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４陽性細胞が、ＰＤ−Ｌ１表面発現の増強された発現に見られるように、薬理学的モジュレーションに応答しうることを示す図である。
【００６６】
【図１２】図１２は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の、二次造血性内皮（ｉＨＥ）および複能性前駆体（ｉＭＰＰ）への造血分化のための多段階工程についての概略図を示す図である。培養は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎに代える場合、完全に組成既知へと転換されうることに注意されたい。
【００６７】
【図１３】図１３は、人工多能性幹細胞の、Ｔ細胞前駆体（ｉｐｒｏＴ）および完全に分化させたＴ（ｉＴ）細胞への造血分化のための多段階工程についての概略図を示す図である。培養は、ＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉをＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）で置き換えて完全規定に転換されうることに注意されたい。
【００６８】
【図１４】図１４は、人工多能性幹細胞の、ＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏＮＫ）および完全に分化させたＮＫ（ｉＮＫ）細胞への造血分化のための多段階工程についての概略図を示す図である。培養は、ＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉをＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）で置き換えて、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎに代える場合、完全に完全規定組成既知へとに転換されうることに注意されたい。
【００６９】
【図１５Ａ】図１５Ａ〜Ｃは、１０日間の経過にわたるｉＨＥの出現、ならびにｉＰＳＣ分化当たりの、ｉＣＤ３４細胞およびｉＨＥ細胞のアウトプットを示すフローサイトメトリープロファイルを示す図である。計算は、代表的な培養および最適化されていない培養についてのスナップショットに基づく。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜Ｃは、１０日間の経過にわたるｉＨＥの出現、ならびにｉＰＳＣ分化当たりの、ｉＣＤ３４細胞およびｉＨＥ細胞のアウトプットを示すフローサイトメトリープロファイルを示す図である。計算は、代表的な培養および最適化されていない培養についてのスナップショットに基づく。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜Ｃは、１０日間の経過にわたるｉＨＥの出現、ならびにｉＰＳＣ分化当たりの、ｉＣＤ３４細胞およびｉＨＥ細胞のアウトプットを示すフローサイトメトリープロファイルを示す図である。計算は、代表的な培養および最適化されていない培養についてのスナップショットに基づく。
【００７０】
【図１６Ａ】図１６Ａ〜Ｅは、プレーティング密度および増殖因子の滴定を含むプロトコールへの改変であって、１０日目におけるＨＥのアウトプットを改善する改変を示す図である。Ａ）０日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｂ）２日目〜６日目におけるＢＭＰ４の濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｃ）３．７５日目におけるＣＨＩＲの濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｄ）６日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｅ）８日目におけるＩＧＦ１およびＥＰＯの添加が、１０日目におけるＨＥを減少させることを示す図である。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜Ｅは、プレーティング密度および増殖因子の滴定を含むプロトコールへの改変であって、１０日目におけるＨＥのアウトプットを改善する改変を示す図である。Ａ）０日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｂ）２日目〜６日目におけるＢＭＰ４の濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｃ）３．７５日目におけるＣＨＩＲの濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｄ）６日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｅ）８日目におけるＩＧＦ１およびＥＰＯの添加が、１０日目におけるＨＥを減少させることを示す図である。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜Ｅは、プレーティング密度および増殖因子の滴定を含むプロトコールへの改変であって、１０日目におけるＨＥのアウトプットを改善する改変を示す図である。Ａ）０日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｂ）２日目〜６日目におけるＢＭＰ４の濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｃ）３．７５日目におけるＣＨＩＲの濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｄ）６日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｅ）８日目におけるＩＧＦ１およびＥＰＯの添加が、１０日目におけるＨＥを減少させることを示す図である。
【図１６Ｄ】図１６Ａ〜Ｅは、プレーティング密度および増殖因子の滴定を含むプロトコールへの改変であって、１０日目におけるＨＥのアウトプットを改善する改変を示す図である。Ａ）０日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｂ）２日目〜６日目におけるＢＭＰ４の濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｃ）３．７５日目におけるＣＨＩＲの濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｄ）６日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｅ）８日目におけるＩＧＦ１およびＥＰＯの添加が、１０日目におけるＨＥを減少させることを示す図である。
【図１６Ｅ】図１６Ａ〜Ｅは、プレーティング密度および増殖因子の滴定を含むプロトコールへの改変であって、１０日目におけるＨＥのアウトプットを改善する改変を示す図である。Ａ）０日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｂ）２日目〜６日目におけるＢＭＰ４の濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｃ）３．７５日目におけるＣＨＩＲの濃度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｄ）６日目におけるプレーティング密度が、１０日目におけるＨＥ集団に影響を及ぼすことを示す図である。Ｅ）８日目におけるＩＧＦ１およびＥＰＯの添加が、１０日目におけるＨＥを減少させることを示す図である。
【００７１】
【図１７Ａ】図１７Ａ〜Ｂは、１０日目のＨＥが、複能性であり、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路に依存する二次造血を表すことを示す図である。Ａ）７日間のＭＰＰアッセイにわたる形態の変化を、出現しつつあるＣＤ４５造血細胞についてのフローサイトメトリープロファイルと共に示す図である。Ｂ）ｉＰＳＣ由来のＣＤ３４＋細胞が、ｉＭＰＰアッセイにおいて、Ｎｏｔｃｈ依存性二次ＣＤ４５＋細胞を発生させることを示す図である。
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜Ｂは、１０日目のＨＥが、複能性であり、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路に依存する二次造血を表すことを示す図である。Ａ）７日間のＭＰＰアッセイにわたる形態の変化を、出現しつつあるＣＤ４５造血細胞についてのフローサイトメトリープロファイルと共に示す図である。Ｂ）ｉＰＳＣ由来のＣＤ３４＋細胞が、ｉＭＰＰアッセイにおいて、Ｎｏｔｃｈ依存性二次ＣＤ４５＋細胞を発生させることを示す図である。
【００７２】
【図１８Ａ】図１８Ａ〜Ｂは、低酸素条件下の分化の、ｉＨＥおよびｉＭＰＰ造血前駆体の発生に対する効果を示す図である。Ａ）低酸素状態下における単層分化が、１０日目において、ｉＣＤ３４陽性細胞およびｉＨＥ細胞の両方の百分率を増大させることを示す図である。Ｂ）低酸素条件下で発生させた、１０日目のｉＣＤ３４＋  ＨＥ細胞を、ｉＭＰＰアッセイにおいて、さらに分化させうることを示す図である。
【図１８Ｂ】図１８Ａ〜Ｂは、低酸素条件下の分化の、ｉＨＥおよびｉＭＰＰ造血前駆体の発生に対する効果を示す図である。Ａ）低酸素状態下における単層分化が、１０日目において、ｉＣＤ３４陽性細胞およびｉＨＥ細胞の両方の百分率を増大させることを示す図である。Ｂ）低酸素条件下で発生させた、１０日目のｉＣＤ３４＋  ＨＥ細胞を、ｉＭＰＰアッセイにおいて、さらに分化させうることを示す図である。
【００７３】
【図１９Ａ】図１９Ａ〜Ｄは、ソートされていない１０日目の培養またはソートされた１０日目の培養が、低温保存され、造血ポテンシャルを維持する能力を示す図である。Ａ）低温保存された、１０日目の、ソートされていない分化培養が、生存し、ｉＭＰＰアッセイにおいて、ＣＤ４５＋造血細胞を発生させうることを示す図である。Ｂ）、Ｃ）、およびＤ）低温保存された、１０日目の、ｉＣＤ３４＋でソートされた細胞が、生存し、ｉＭＰＰアッセイにおいて、ＣＤ４５＋造血細胞を発生させうることを示す図である。
【図１９Ｂ】図１９Ａ〜Ｄは、ソートされていない１０日目の培養またはソートされた１０日目の培養が、低温保存され、造血ポテンシャルを維持する能力を示す図である。Ａ）低温保存された、１０日目の、ソートされていない分化培養が、生存し、ｉＭＰＰアッセイにおいて、ＣＤ４５＋造血細胞を発生させうることを示す図である。Ｂ）、Ｃ）、およびＤ）低温保存された、１０日目の、ｉＣＤ３４＋でソートされた細胞が、生存し、ｉＭＰＰアッセイにおいて、ＣＤ４５＋造血細胞を発生させうることを示す図である。
【図１９Ｃ】図１９Ａ〜Ｄは、ソートされていない１０日目の培養またはソートされた１０日目の培養が、低温保存され、造血ポテンシャルを維持する能力を示す図である。Ａ）低温保存された、１０日目の、ソートされていない分化培養が、生存し、ｉＭＰＰアッセイにおいて、ＣＤ４５＋造血細胞を発生させうることを示す図である。Ｂ）、Ｃ）、およびＤ）低温保存された、１０日目の、ｉＣＤ３４＋でソートされた細胞が、生存し、ｉＭＰＰアッセイにおいて、ＣＤ４５＋造血細胞を発生させうることを示す図である。
【図１９Ｄ】図１９Ａ〜Ｄは、ソートされていない１０日目の培養またはソートされた１０日目の培養が、低温保存され、造血ポテンシャルを維持する能力を示す図である。Ａ）低温保存された、１０日目の、ソートされていない分化培養が、生存し、ｉＭＰＰアッセイにおいて、ＣＤ４５＋造血細胞を発生させうることを示す図である。Ｂ）、Ｃ）、およびＤ）低温保存された、１０日目の、ｉＣＤ３４＋でソートされた細胞が、生存し、ｉＭＰＰアッセイにおいて、ＣＤ４５＋造血細胞を発生させうることを示す図である。
【００７４】
【図２０Ａ】図２０Ａ〜Ｂは、１０日目の分化培養を、ＨＥポテンシャルを喪失せずに、周囲温度で、一晩にわたり出荷しうることを示す図である。Ａ）７日目における培養を、インキュベーター内で維持する（対照）か、または一晩にわたる出荷のために処理した後、続くさらなる２日間にわたり、インキュベーターへと再導入したことを示す図である。次いで、１０日目における両方の培養を、ｉＣＤ３４細胞およびｉＨＥ細胞の存在について解析した。一晩にわたり出荷された培養中に、Ｔ字型フラスコは、７０％の基礎培地を伴う３０％の培養培地、または１００％の培養培地を含有した。Ｂ）細胞数の計算について示す図である。
【図２０Ｂ】図２０Ａ〜Ｂは、１０日目の分化培養を、ＨＥポテンシャルを喪失せずに、周囲温度で、一晩にわたり出荷しうることを示す図である。Ａ）７日目における培養を、インキュベーター内で維持する（対照）か、または一晩にわたる出荷のために処理した後、続くさらなる２日間にわたり、インキュベーターへと再導入したことを示す図である。次いで、１０日目における両方の培養を、ｉＣＤ３４細胞およびｉＨＥ細胞の存在について解析した。一晩にわたり出荷された培養中に、Ｔ字型フラスコは、７０％の基礎培地を伴う３０％の培養培地、または１００％の培養培地を含有した。Ｂ）細胞数の計算について示す図である。
【００７５】
【図２１ＡＢ】図２１Ａ〜Ｃは、ＣＤ４５＋  ＣＤ５６−ゲーティング戦略を活用して、ｈｉＰＳＣから導出された、早期ＣＤ３４＋  ＣＤ７＋  Ｔ細胞前駆体、および成熟ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットを示す図である。Ａ）早期Ｔ系統細胞マーカーが、ＣＤ３４＋／ＣＤ７＋により規定されるｉｐｒｏＴ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｂ）成熟Ｔ細胞マーカーが、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞により規定される成熟Ｔ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｃ）５日目のＴ細胞の分化について、臍帯血に由来するＣＤ３４陽性細胞、およびｉＣＤ３４陽性細胞の、ｉｐｒｏＴ細胞を発生させるポテンシャルを比較する図である。
【図２１Ｃ】図２１Ａ〜Ｃは、ＣＤ４５＋  ＣＤ５６−ゲーティング戦略を活用して、ｈｉＰＳＣから導出された、早期ＣＤ３４＋  ＣＤ７＋  Ｔ細胞前駆体、および成熟ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットを示す図である。Ａ）早期Ｔ系統細胞マーカーが、ＣＤ３４＋／ＣＤ７＋により規定されるｉｐｒｏＴ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｂ）成熟Ｔ細胞マーカーが、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞により規定される成熟Ｔ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｃ）５日目のＴ細胞の分化について、臍帯血に由来するＣＤ３４陽性細胞、およびｉＣＤ３４陽性細胞の、ｉｐｒｏＴ細胞を発生させるポテンシャルを比較する図である。
【００７６】
【図２２Ａ】図２２Ａ〜Ｃは、ＣＤ４５＋ゲーティング戦略を活用して、ｈｉＰＳＣから導出された、早期ＣＤ５６＋  ＣＤ７＋  ＣＤ１６１＋  ＮＫ細胞前駆体、および成熟ＣＤ５６＋  ＣＤ１６＋  ＣＤ８＋  ＮＫ細胞サブセットを示す図である。Ａ）早期ＮＫ系統細胞マーカーが、ＣＤ７およびＣＤ５６により規定されるｉｐｒｏＮＫ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｂ）成熟ＮＫ系統細胞マーカーが、ＣＤ５７、ＣＤ１６、ＣＤ９４、およびＣＤ５６により規定される成熟ＮＫ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｃ）５日目のＮＫ細胞の分化について、臍帯血に由来するＣＤ３４陽性細胞、およびｉＣＤ３４陽性細胞の、ｉｐｒｏＮＫ細胞を発生させるポテンシャルを比較する図である。
【図２２Ｂ】図２２Ａ〜Ｃは、ＣＤ４５＋ゲーティング戦略を活用して、ｈｉＰＳＣから導出された、早期ＣＤ５６＋  ＣＤ７＋  ＣＤ１６１＋  ＮＫ細胞前駆体、および成熟ＣＤ５６＋  ＣＤ１６＋  ＣＤ８＋  ＮＫ細胞サブセットを示す図である。Ａ）早期ＮＫ系統細胞マーカーが、ＣＤ７およびＣＤ５６により規定されるｉｐｒｏＮＫ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｂ）成熟ＮＫ系統細胞マーカーが、ＣＤ５７、ＣＤ１６、ＣＤ９４、およびＣＤ５６により規定される成熟ＮＫ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｃ）５日目のＮＫ細胞の分化について、臍帯血に由来するＣＤ３４陽性細胞、およびｉＣＤ３４陽性細胞の、ｉｐｒｏＮＫ細胞を発生させるポテンシャルを比較する図である。
【図２２Ｃ】図２２Ａ〜Ｃは、ＣＤ４５＋ゲーティング戦略を活用して、ｈｉＰＳＣから導出された、早期ＣＤ５６＋  ＣＤ７＋  ＣＤ１６１＋  ＮＫ細胞前駆体、および成熟ＣＤ５６＋  ＣＤ１６＋  ＣＤ８＋  ＮＫ細胞サブセットを示す図である。Ａ）早期ＮＫ系統細胞マーカーが、ＣＤ７およびＣＤ５６により規定されるｉｐｒｏＮＫ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｂ）成熟ＮＫ系統細胞マーカーが、ＣＤ５７、ＣＤ１６、ＣＤ９４、およびＣＤ５６により規定される成熟ＮＫ細胞の存在をマークすることを示す図である。Ｃ）５日目のＮＫ細胞の分化について、臍帯血に由来するＣＤ３４陽性細胞、およびｉＣＤ３４陽性細胞の、ｉｐｒｏＮＫ細胞を発生させるポテンシャルを比較する図である。
【００７７】
【図２３Ａ】図２３Ａ〜Ｃは、単層ｈｉＰＳＣ造血分化プラットフォームが、ＥＢの形成の間には見られない、スケーラブルな拡大戦略を可能とすることを示す図である。Ａ．ｈｉＰＳＣを凝集させて、胚様体を形成し、１４日間にわたり分化させてから、ＣＤ３４およびＣＤ４３の発現について解析した。Ｂ．ｈｉＰＳＣを、単層として播種し、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＸＣＲ４およびＣＤ７３について解析する前に、８日間にわたり分化させた。Ｃ．単層に介在される造血分化およびＥＢに介在される造血分化の両方について、経時的にＤ３４陽性細胞をカウントしプロットした。
【図２３Ｂ】図２３Ａ〜Ｃは、単層ｈｉＰＳＣ造血分化プラットフォームが、ＥＢの形成の間には見られない、スケーラブルな拡大戦略を可能とすることを示す図である。Ａ．ｈｉＰＳＣを凝集させて、胚様体を形成し、１４日間にわたり分化させてから、ＣＤ３４およびＣＤ４３の発現について解析した。Ｂ．ｈｉＰＳＣを、単層として播種し、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＸＣＲ４およびＣＤ７３について解析する前に、８日間にわたり分化させた。Ｃ．単層に介在される造血分化およびＥＢに介在される造血分化の両方について、経時的にＤ３４陽性細胞をカウントしプロットした。
【図２３Ｃ】図２３Ａ〜Ｃは、単層ｈｉＰＳＣ造血分化プラットフォームが、ＥＢの形成の間には見られない、スケーラブルな拡大戦略を可能とすることを示す図である。Ａ．ｈｉＰＳＣを凝集させて、胚様体を形成し、１４日間にわたり分化させてから、ＣＤ３４およびＣＤ４３の発現について解析した。Ｂ．ｈｉＰＳＣを、単層として播種し、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＸＣＲ４およびＣＤ７３について解析する前に、８日間にわたり分化させた。Ｃ．単層に介在される造血分化およびＥＢに介在される造血分化の両方について、経時的にＤ３４陽性細胞をカウントしプロットした。
【００７８】
【図２４】図２４は、オフザシェルフ（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）のｉＮＫ細胞およびｉＴ細胞を産生するための、単層ｈｉＰＳＣ造血分化プラットフォームによる、スケーラブルな拡大戦略についての概略図を示す図である。計算は、代表的な培養および最適化されていない培養についてのスナップショットに基づく。
【００７９】
【図２５】図２５は、ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４陽性細胞が、ＣＤ３＋  Ｔ細胞の生存の抑制により、免疫調節特性を有することを示す図である。
【００８０】
【図２６】図２６は、ＣＤ４５＋  ＣＤ５６−ゲーティング戦略を使用して、ｈｉＰＳＣから導出された成熟ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットを示す図である。
【００８１】
【図２７】図２７は、フィーダーベースの懸濁培養が、ｉＣＤ３４由来のＮＫ細胞の成熟を支援することを示す図である。
【００８２】
【図２８】図２８は、ｉＣＤ３４由来のｉＮＫが、末梢血ＮＫ細胞と同様の様式で、サイトカインの刺激に応答して、炎症促進性サイトカインを分泌しうることを示す図である。
【００８３】
【図２９】図２９は、ＣＤ４５＋ゲーティング戦略を使用して、臍帯血ＣＤ３４陽性細胞から導出されたｐｒｏ−ＮＫ細胞の間質フリー分化が、従来の間質ベースの分化プラットフォームより急速であることを示す図である。
【００８４】
【図３０】図３０は、ｉＰＳＣ由来のｉＣＤ３４＋細胞の、ＮＫ細胞への間質フリー分化を示す図である。プレートに結合させたＤＬＬ４は、ＣＤ５６＋  ＣＤ７＋  ＣＤ１６１＋  ＮＫ細胞前駆体の分化は支援するが、ＣＤ１１ｂ＋骨髄性細胞の分化は支援しない。
【００８５】
【図３１】図３１は、ＵＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の、Ｔ細胞への間質フリー分化を示す図である。
【００８６】
【図３２】図３２は、ｉＰＳＣ由来のｉＣＤ３４＋細胞の、Ｔ細胞への間質フリー分化を示す図である。
【００８７】
【図３３】図３３は、ｈｉＰＳＣ由来のｉＣＤ３４＋細胞の生着を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
（発明の詳細な説明）
本発明は一般に、幹細胞を、二次造血細胞運命へと分化させるための方法および組成物に関する。より特定すると、本発明は、発生の種々の段階において、二次造血性内皮から、完全に分化した造血細胞であって、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、およびＮＫ細胞を含む造血細胞にわたる範囲の二次造血表現型を呈するように、ｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ由来の細胞を誘導しうる、多段階分化プラットフォームを提供する。すなわち、本発明は、細胞が、二次造血運命、例えば、ＣＤ３４＋二次造血幹細胞を、より呈しやすくなるようにするための方法および組成物を提供する。代替的に、本発明の方法および組成物は、ＥＢまたは凝集物の形成を回避することにより、二次造血性内皮（ＨＥ）を、ナイーブｉＰＳＣから、スケーラブルな様式で発生させる。
【００８９】
Ａ．定義
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。下記では、本発明の目的で、以下の用語について規定する。本明細書では、「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」という冠詞を、その冠詞の文法的目的語のうちの１つまたは１つを超える（すなわち、少なくとも１つ）を指すのに用いる。例として述べると、「ある要素」とは、１つの要素または１つを超える要素を意味する。
【００９０】
代替辞（例えば、「または」）の使用は、代替物の一方、両方、またはこれらの任意の組合せを意味すると理解されたい。
【００９１】
「および／または」という用語は、代替物の一方または両方を意味すると理解されたい。
【００９２】
本明細書で用いられる「約」または「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して、最大で１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％変化する、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さの、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％となる、ある範囲の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。
【００９３】
本明細書で使用される「実質的に」または「本質的に」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれ超の、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態では、「本質的に同じ」または「実質的に同じ」という用語は、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲であって、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さとほぼ同じ範囲を指す。
【００９４】
本明細書で使用される「〜を実質的に含まない」および「〜を本質的に含まない」という用語は、互換的に使用され、細胞集団または培養培地などの組成物について記載するのに使用される場合、指定された物質もしくはその供給源を、９５％含まない、９６％含まない、９７％含まない、９８％含まない、９９％含まないか、または従来の手段で測定する場合に検出不能である組成物など、指定された物質またはその供給源を含まない組成物を指す。組成物中の、ある特定の成分または物質「を含まない」またはこれ「を本質的に含まない」という用語はまた、このような成分または物質が、（１）組成物中に、いかなる濃度でも含まれないか、または（２）組成物中に、機能的に不活性であるが、低濃度で含まれることも意味する。同様の意味は、「〜が存在しない」という用語にも適用されるが、特定の物質またはその供給源が、組成物において存在しないことを指す。
【００９５】
本明細書で使用される「感知可能な」という用語は、事象の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲であって、１または複数の標準的な方法により、たやすく検出可能な範囲を指す。「感知不可能な」および「感知可能でない」という用語およびこれらの同義語は、事象の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲であって、標準的な方法により、たやすく検出可能でないか、または検出不能である範囲を指す。一実施形態では、事象は、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％未満の回数で生じる場合、感知可能でない。
【００９６】
本明細書を通して、文脈によりそうでないことが要請されない限り、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「〜を含むこと」という語は、言明されるステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含は示唆するが、他の任意のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外は示唆しないことが理解される。特定の実施形態では、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「〜を有する」、「〜を含有する」、および「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語を、同義に使用する。
【００９７】
「〜からなること」とは、「〜からなること」という語句に後続するあらゆる語句を含み、かつ、これに限定されることを意味する。従って、「〜からなること」という語句は、列挙される要素が要請されるかまたは必須であり、他の要素は存在しえないことを指し示す。
【００９８】
「〜から本質的になること」とは、この語句の後に列挙される任意の要素を含み、かつ、列挙される要素について、本開示で指定される活性または作用に干渉または寄与しない、他の要素に限定されることを意味する。従って、「〜から本質的になること」という語句は、列挙される要素が要請されるかまたは必須であるが、他の要素は任意選択であり、それらが列挙される要素の活性または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて、存在してもよく、存在しなくてもよいことを示す。
【００９９】
本明細書を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「さらなる実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはこれらの組合せに対する言及は、この実施形態との関連において記載されている特定の特色、構造、または特徴が、本発明の少なくとも１つの実施形態に組み入れられていることを意味する。従って、本明細書を通した、多様な箇所における、前出の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特色、構造、または特徴を、１または複数の実施形態において、任意の適切な形で組み合わせることもできる。
【０１００】
「ｅｘ  ｖｉｖｏ」という用語は一般に、生体外の人工的な環境、好ましくは、天然条件の変更を最小とする環境における生組織内または生組織上で行われる実験または測定など、生体外でなされる活動を指す。特定の実施形態では、「ｅｘ  ｖｉｖｏ」における手順が、生体から採取され、通常は無菌条件下にある実験装置内で、典型的には、状況に応じて、数時間または最長で約２４時間であるが、最長で４８もしくは７２時間またはそれ超を含む時間にわたり培養された生細胞または生組織を伴う。ある特定の実施形態では、このような組織または細胞を回収し、凍結させ、その後、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける処理のために融解させることができる。数日間より長くかかる組織培養の実験または手順であって、生細胞または生組織を使用する実験または手順は、典型的には、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」であると考えられるが、ある特定の実施形態では、この用語を、ｅｘ  ｖｉｖｏと互換的に用いることができる。
【０１０１】
「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は一般に、生体内でなされる活動を指す。
【０１０２】
本明細書で使用される「中胚葉」という用語は、早期の胚発生の間に現れ、循環系、筋肉、心臓、皮膚、骨格、ならびに他の支持組織および結合組織の血液細胞を含む、多様な特化した細胞型を発生させる、３つの胚芽層のうちの１つを指す。
【０１０３】
本明細書で使用される「二次（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ）造血性内皮」（ＨＥ）または「多能性幹細胞由来の二次造血性内皮」（ｉＨＥ）という用語は、内皮から造血への移行と呼ばれる過程において、造血幹細胞および前駆細胞を発生させる、内皮のサブセットを指す。胚内の造血細胞の発生は、側板中胚葉から、血管芽細胞を経て、二次造血性内皮および造血前駆体へと、逐次的に進む。
【０１０４】
本明細書で使用される「造血幹細胞」または「二次造血幹細胞」という用語は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、およびＢ細胞を含む、成熟骨髄性細胞型およびリンパ系細胞型の両方を発生させることが可能なＣＤ３４＋幹細胞を指す。
【０１０５】
本明細書で使用される「再プログラム化すること」、または「脱分化」、または「細胞能力を増大させること」、または「発生能を増大させること」という用語は、細胞の能力を増大させること、または細胞を低分化状態へと脱分化させる方法を指す。例えば、細胞能力を増大させた細胞は、再プログラム化されていない状態にある同じ細胞と比較して、発生可塑性が大きい（すなわち、より多くの細胞型へと分化しうる）。言い換えれば、再プログラム化された細胞とは、再プログラム化されていない状態にある同じ細胞より低分化状態にある細胞である。
【０１０６】
本明細書で使用される「分化」という用語は、特化していない（「コミットしていない」）細胞または低特化細胞が、例えば、血液細胞または筋肉細胞など、特化した細胞の特色を獲得する工程である。分化細胞または分化誘導細胞とは、細胞の系統内で、より特化した（「コミットした」）位置を占める細胞である。分化過程へと適用される場合の「コミットした」という用語は、分化経路において、正常な状況下では、特異的細胞型または細胞型のサブセットへと引き続き分化し、かつ、正常な状況下では、異なる細胞型へと分化することも、低分化細胞型へと戻ることもありえない点まで進んだ細胞を指す。
【０１０７】
本明細書で使用される「分化マーカー遺伝子」または「分化遺伝子」という用語は、その発現が、多能性細胞など、細胞内で生じる細胞の分化を示す遺伝子を指す。分化マーカー遺伝子は、以下の遺伝子：ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ  ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）、ＺＩＣ１、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ４、ＰＡＸ５、ＲＢＰＪ、ＲＵＮＸ１、ＳＴＡＴ１、およびＳＴＡＴ３を含むがこれらに限定されない。
【０１０８】
本明細書で使用される「分化マーカーの遺伝子プロファイル」、または「分化遺伝子プロファイル」、「分化遺伝子の発現プロファイル」、「分化遺伝子の発現シグネチャー」、「分化遺伝子の発現パネル」、「分化遺伝子パネル」、または「分化遺伝子シグネチャー」という用語は、複数の分化マーカー遺伝子の発現または発現レベルを指す。
【０１０９】
本明細書で使用される「能力」という用語は、細胞にアクセス可能な、全ての発生選択肢の総体（すなわち、発生能）を指す。細胞能力の連続体（ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）は、全能性細胞、多能性細胞、複能性細胞、少能性細胞、単能性細胞、および最終分化細胞を含むがこれらに限定されない。
【０１１０】
本明細書で使用される「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、身体または体細胞（すなわち、胚本体）の全ての系統を形成する細胞の能力を指す。例えば、胚性幹細胞とは、３つの胚芽層である、外胚葉、中胚葉、および内胚葉の各々から、細胞を形成することが可能な、多能性幹細胞の種類である。多能性とは、完全な生体を発生させることが不可能である、不完全または部分的な多能性細胞（例えば、胚盤葉上層幹細胞またはＥｐｉＳＣ）から、完全な生体を発生させることが可能な、より始原性で、より多能性の細胞（例えば、胚性幹細胞）にわたる範囲の、発生能の連続体である。
【０１１１】
本明細書で使用される「人工（ｉｎｄｕｃｅｄ）多能性幹細胞」またはｉＰＳＣという用語は、幹細胞が、分化した成体細胞、新生児細胞、または胎児細胞であって、３つの胚芽層（ｇｅｒｍ  ｌａｙｅｒまたはｄｅｒｍａｌ  ｌａｙｅｒ）：中胚葉、内胚葉、および外胚葉全ての組織へと分化することが可能な細胞へと誘導されるか、または変化した、すなわち、再プログラム化された細胞から作製されることを意味する。作製されたｉＰＳＣとは、天然で見出される細胞を指さない。
【０１１２】
本明細書で使用される「胚性幹細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊による、天然に存在する多能性幹細胞を指す。胚性幹細胞は、多能性であり、発生の間に、３つの主要な胚芽層：外胚葉、内胚葉、および中胚葉の全ての派生物を発生させる。胚性幹細胞は、胚体外膜または胎盤に寄与しない、すなわち、全能性ではない。
【０１１３】
本明細書で使用される「複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、１または複数の胚葉（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）の細胞へと分化する発生ポテンシャルを有するが、３つ全ての細胞へと分化する発生ポテンシャルは有さない細胞を指す。従って、複能性細胞はまた、「部分的に分化した細胞」とも称することができる。複能性細胞は、当技術分野で周知であり、複能性細胞の例は、例えば、造血幹細胞および神経幹細胞など、成体幹細胞を含む。「複能性」とは、細胞が、所与の系統内の、多くの種類の細胞を形成しうるが、他の系統の細胞は形成しえないことを指し示す。例えば、複能性造血細胞は、多くの異なる種類の血液細胞（赤血球、白血球、血小板など）を形成しうるが、ニューロンは形成しえない。従って、「複能性」という用語は、発生ポテンシャルの程度が、全能性および多能性より低度な細胞の状態を指す。
【０１１４】
多能性幹細胞の分化は、培養培地中の刺激剤または細胞の物理的状態の変化など、培養系の変化を要請する。従来の戦略の大半は、胚葉体（ＥＢ）の形成を、系統特異的分化を誘発する、一般的かつ極めて重要な中間体として活用する。ＥＢとは、それらの三次元的領域内で、多数の系統を発生させるので、胚発生を模倣することが示されている三次元クラスターである。典型的には、数時間〜数日間の分化過程を通して、単純ＥＢ（例えば、分化するように誘発された凝集多能性幹細胞）は、成熟し続け、嚢胞性ＥＢへと発生し、この時点で、分化し続けるように、典型的に、数日間〜数週間にわたり、これらをさらに処理する。ＥＢの形成は、多能性幹細胞を、細胞の三次元的多層クラスター内で、互いと近接させることにより誘発するが、これは、液滴内に多能性細胞を沈降させること、細胞を「Ｕ」字型底ウェル−プレートへと沈降させることを含むいくつかの方法のうちの１つ、または機械的撹拌により達成することが典型的である。多能性培養物維持培地中で維持された凝集物は、適正なＥＢを形成しないので、ＥＢの発生を促進するために、多能性幹細胞凝集物は、さらなる分化キューを要請する。従って、多能性幹細胞凝集物は、えり抜きの系統への誘発キューをもたらす、分化培地へと移すことが必要である。多能性幹細胞の、ＥＢベースの培養物は、ＥＢ細胞クラスター内の増殖がわずかである分化細胞集団（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）の発生を結果としてもたらすことが典型的である。細胞の分化を容易とすることは実証されているが、三次元構造にある細胞の、環境からの分化キューに対する曝露が一貫せず、分化状態が可変性であるため、ＥＢは、異質性の細胞を発生させる。加えて、ＥＢは、創出および維持が煩瑣である。さらに、ＥＢを介する細胞の分化に伴う細胞の拡大はわずかであるが、これもまた、低分化効率に寄与する。
【０１１５】
これに対して、「ＥＢの形成」とは顕著に異なる「凝集物の形成」を使用して、多能性幹細胞の分化を誘導し、かつ／または多能性幹細胞由来の細胞の集団を拡大することができる。例えば、凝集物ベースの多能性幹細胞の拡大では、増殖および多能性を維持するように、培養培地を選択する。細胞の増殖は一般に、凝集物のサイズを増大させ、大型の凝集物を形成するが、これらの凝集物は慣用的に、小型の凝集物へと、機械的または酵素的に解離させて、培養物中の細胞増殖を維持し、細胞数を増大させることができる。ＥＢ培養物と顕著に異なり、維持培養物中の凝集物内で培養された細胞は、多能性のマーカーを維持する。
【０１１６】
本明細書で使用される「単層分化」とは、細胞の三次元多層クラスター、すなわち、「ＥＢの形成」を介する分化と顕著に異なる分化法を指す用語である。本明細書で開示される他の利点の中でも、単層分化は、分化を誘発するためのＥＢの形成に対する必要を回避する。単層培養は、ＥＢの形成など、胚発生を模倣しないため、特異的系統への分化は、ＥＢにおける３つの胚葉全てへの分化と比較して、最小限である。
【０１１７】
多能性は部分的に、細胞の多能性特徴について評価することにより決定することができる。多能性特徴は、（ｉ）多能性幹細胞形態；（ｉｉ）無際限の自己再生のポテンシャル；（ｉｉｉ）ＳＳＥＡ１（マウスに限る）、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１−６０／８１、ＴＲＡ１−８５、ＴＲＡ２−５４、ＧＣＴＭ−２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０および／またはＣＤ５０を含むがこれらに限定されない多能性幹細胞マーカーの発現；（ｉｖ）３つの体系統細胞（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）全てへと分化する能力；（ｖ）３つの体系統細胞からなる奇形腫形成；ならびに（ｖｉ）３つの体系統細胞に由来する細胞からなる胚葉体の形成を含むがこれらに限定されない。
【０１１８】
多能性の２つの種類：後期胚盤胞の胚盤葉上層幹細胞（ＥｐｉＳＣ）と類似する、多能性の「プライミング」状態または「準安定」状態、および早期／植込み前胚盤胞の内部細胞塊と類似する、多能性の「ナイーブ」状態または「基底」状態については、既に記載されている。いずれの多能性状態も、上記で記載した特徴を呈示するが、ナイーブ状態または基底状態は、（ｉ）雌性細胞内のＸ染色体の前不活化または再活性化；（ｉｉ）単一細胞の培養の間における、クローン性および生存の改善；（ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化のグローバルな低減；（ｉｖ）発生調節性遺伝子プロモーター上の、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３抑制性クロマチンマークの沈着の低減；ならびに（ｖ）プライミング状態の多能性細胞と比べた、分化マーカーの発現の低減をさらに呈示する。細胞を再プログラム化する標準的な方法であって、外因性の多能性遺伝子を、体細胞へと導入し、発現させ、次いで、結果として得られる多能性細胞からサイレンシングまたは除去する方法は一般に、多能性のプライミング状態の特徴を有することが見られる。標準的な多能性細胞培養条件下では、基底状態の特徴が観察される、外因性トランス遺伝子の発現を維持しない限り、このような細胞は依然として、プライミング状態にある。
【０１１９】
本明細書で使用される「多能性幹細胞形態」という用語は、胚性幹細胞の古典的な形態特色を指す。通常の胚性幹細胞形態は、球状で、かつ、小型であり、核対細胞質比が大きく、核小体の存在が注目すべきであり、典型的な細胞間間隔を伴うことにより特徴付けられる。
【０１２０】
本明細書で使用される「フィーダー細胞」または「フィーダー」とは、フィーダー細胞は、第２の細胞型を支援するための増殖因子および栄養物を供給するので、第２の種類の細胞と同時培養される、１つの種類の細胞であって、第２の種類の細胞が増殖しうる環境を用意する細胞について記載する用語である。フィーダー細胞は、任意選択で、それらが支援する細胞と異なる種に由来する。例えば、幹細胞を含むヒト細胞のある特定の種類は、マウス胚性線維芽細胞、または不死化マウス胚性線維芽細胞の初代培養物により支援することができる。フィーダー細胞は典型的に、他の細胞と共に同時培養する場合、それらが支援している細胞を、それらが凌駕することを防止するように、照射またはマイトマイシンなどの抗有糸分裂剤による処理により不活化することができる。フィーダー細胞は、内皮細胞、間質細胞（例えば、上皮細胞または線維芽細胞）、および白血病性細胞を含みうる。前出を限定せずに述べると、１つの特異的フィーダー細胞型は、ヒト皮膚線維芽細胞などのヒトフィーダーでありうる。別のフィーダー細胞型は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）でありうる。一般に、多様なフィーダー細胞を使用して、多能性を部分的に維持し、ある特定の系統への分化を方向付け、エフェクター細胞など、特化した細胞型への成熟を促進することができる。
【０１２１】
本明細書で使用された、「フィーダーフリー」（ＦＦ）環境は、培養条件、細胞培養物、または培養培地などの環境であって、フィーダー細胞もしくは間質細胞を本質的に含まず、かつ／またはフィーダー細胞の培養によりあらかじめ馴化されていない環境を指す。「あらかじめ馴化された」培地とは、フィーダー細胞を、培地中で、少なくとも１日間など、ある期間にわたり培養した後で収集された培地を指す。あらかじめ馴化された培地は、培地中で培養されるフィーダー細胞により分泌される増殖因子およびサイトカインを含む、多くのメディエーター物質を含有する。
【０１２２】
本明細書で使用される「対象」という用語は、任意の動物、好ましくは、ヒト患者、家畜、または他の飼育動物を指す。
【０１２３】
「多能性因子」または「再プログラム化因子」とは、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、細胞の発生能を増大させることが可能な薬剤を指す。多能性因子は、限定せずに述べると、細胞の発生能を増大させることが可能な、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および低分子を含む。例示的な多能性因子は、例えば、転写因子および低分子の再プログラム化剤を含む。
【０１２４】
「〜に接着する」とは、容器に付着する細胞、例えば、適切な培養培地の存在下で、無菌のプラスチック製（またはコーティングされたプラスチック製）の細胞培養ディッシュまたはフラスコに付着する細胞を指す。ある特定のクラスの細胞は、細胞培養容器に接着しない限り、培養物中で存続または増殖（ｇｒｏｗ）しない。ある特定のクラスの細胞（「非接着性細胞」）は、接着せずに、培養物中で維持され、かつ／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）する。
【０１２５】
「培養」または「細胞培養」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境における、細胞の維持、増殖（ｇｒｏｗｔｈ）、および／または分化を指す。「細胞培養培地」、「培養培地」（各場合において、単一の「培地」）、「サプリメント」、および「培地サプリメント」とは、細胞培養物を培養する栄養組成物を指す。
【０１２６】
「〜を培養する」、または「〜を維持する」とは、組織外または体外、例えば、無菌のプラスチック製（またはコーティングされたプラスチック製）の細胞培養ディッシュ内またはフラスコ内において、細胞を存続、繁殖（増殖）、および／または分化させることを指す。「培養」または「〜を維持すること」は、培養培地を、栄養物、ホルモン、および／または細胞を繁殖および／または存続させるのに一助となる他の因子の供給源として活用しうる。
【０１２７】
本明細書で使用された、「解離」細胞とは、他の細胞または表面（例えば、培養プレート表面）から、実質的に分離または精製された細胞を指す。例えば、細胞は、機械的方法または酵素的方法により、動物または組織から解離させることができる。代替的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて凝集する細胞は、クラスター、単一細胞、または単一細胞とクラスターとの混合物による懸濁液への解離などにより、酵素的または機械的に、互いから解離させることができる。さらに別の代替的な実施形態では、接着性細胞を、培養プレートまたは他の表面から解離させる。従って、解離は、細胞の、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および基質（例えば、培養物表面）との相互作用の破壊、または細胞間のＥＣＭの破壊を伴いうる。
【０１２８】
Ｂ．概観
本発明は一般に、ナイーブ多能性細胞を、中胚葉細胞、二次造血性内皮、二次造血幹もしくは二次造血前駆細胞、ＣＤ３４＋細胞、複能性前駆体（ＭＰＰ）（好中球前駆体を含む骨髄性細胞へと分化することが可能である）、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体を含む、非多能性細胞または部分的に分化した細胞；あるいは、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＮＫ細胞など、完全に分化した最終造血細胞へと分化させる多段階工程に関する。本発明はまた、開示される方法で使用される組成物；および開示される方法を使用して発生させた細胞集団、細胞株、またはクローン細胞にも関する。
【０１２９】
当技術分野で使用される方法とは対照的に、本発明は、ｉＰＳＣの分化におけるＥＢの形成を回避した。提示される通り、ｉＰＳＣから導出される造血系細胞は、クローンｉＰＳＣ細胞を、ＴＧＦβフリーの培養培地に播種して、それらの多能性の基底状態またはナイーブ状態を維持し、クローンｉＰＳＣ細胞を、ＥＢの形成を伴わない単層フォーマットで分化させ、段階的戦略を活用して、低分子の化学物質、増殖因子、およびサイトカインの適正な組合せを、分化の早期段階および中期段階に適用することにより得た。従って、本発明は、ｉＰＳＣからのＥＢの形成を要請しない即時の分化のために、拡大されたクローンｉＰＳＣの、単層の形態にある接着培養物への直接的移行を可能とする。
【０１３０】
従って、本発明は、ＳＢ４３１５３２を含む、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を使用せずに、幹細胞を、二次造血細胞および機能的な造血系細胞へと、高効率で分化させることを可能とする培養プラットフォームを提供する。なおさらに、既往の研究と異なり、本発明はまた、ｉＰＳＣに由来する、ＥＢまたは凝集中間体への必要を伴わずに、単層培養物中の、ｉＰＳＣの直接的分化を支援する、フィーダーフリーの無血清条件を使用する培養プラットフォームも提供する。
【０１３１】
Ｃ．培養プラットフォーム
多能性細胞を培養するための既存の方法は、フィーダー細胞、またはフィーダー細胞であらかじめ馴化され、ウシ胎仔血清を含有する培地に大きく依存するが、このような環境は、臨床使用および治療における使用のための細胞を作製するのに適さない場合がある。例えば、動物成分への曝露は、免疫拒絶の重大な危険性、および識別されていない病原体を、処置される患者へと伝染させる重大な危険性を提示する可能性があり、動物レトロウイルスを潜在的に再活性化させうるため、このような異種夾雑環境で培養された細胞は一般に、ヒトへの細胞移植に適さないと考えられる。本明細書で想定されるフィーダーフリー環境など、動物フリーの培養培地を使用する培養系は、臨床的グレードの細胞株、特に、ｈＥＳＣ、ｈｉＰＳＣ、および多能性幹細胞由来のＨＳＣ、Ｔ細胞株、Ｂ細胞株、ＮＫＴ細胞株、またはＮＫ細胞株の製造を容易とする。
【０１３２】
特定の実施形態では、フィーダーフリー環境は、ヒトフィーダー細胞を本質的に含まず、限定せずに述べると、マウス胚性線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、角化細胞、および胚性幹細胞を含むフィーダー細胞であらかじめ馴化されていない。フィーダーフリーの細胞培養培地は、多能性細胞の培養、細胞の再プログラム化、単一細胞の培養、解離、および多能性細胞の継代培養、多能性細胞の細胞ソート、基底状態の多能性細胞の発生、基底状態の多能性の維持、多能性細胞の分化の誘導における使用に適する。特定の実施形態では、フィーダーフリー環境を使用して、多能性を誘導し、再プログラム化の効率を改善し、細胞の能力を増大させるかもしくは維持し、かつ／または分化を誘導する。ある特定の実施形態では、フィーダーフリー環境は加えて、サイトカインおよびｂＦＧＦを含む増殖因子も実質的に含まない。
【０１３３】
本発明の一部の態様では、上記で記載したｉＰＳＣ分化の段階のうちの１または複数は、フィーダーフリー条件下で実行することができる。このようなフィーダーフリー条件は、単層培養および懸濁培養を含むがこれらに限定されない形態でありうる。本発明の一実施形態では、多能性細胞の、中胚葉細胞への分化は、単層フィーダーフリー条件下で実行する。本発明の別の実施形態では、中胚葉細胞の、二次造血性内皮への分化は、単層フィーダーフリー条件下で実行する。さらに本発明の別の実施形態では、二次造血性内皮の、造血幹細胞への分化は、単層フィーダーフリー条件下で実行する。本発明の一実施形態では、二次造血幹細胞の、複能性前駆体、Ｔ細胞前駆体、またはＮＫ細胞前駆体への分化は、懸濁フィーダーフリー条件下または単層フィーダーフリー条件下に続く、懸濁フィーダーフリー条件下で実行する。本発明の別の実施形態では、Ｔ細胞前駆体の、完全に分化したＴ細胞への分化、またはＮＫ細胞前駆体の、完全に分化したＮＫ細胞への分化は、懸濁フィーダーフリー条件下または単層フィーダーフリー条件下に続く、懸濁フィーダーフリー条件下で実行する。
【０１３４】
任意の適する容器または細胞培養コンテナを、基礎培地中および／または細胞培養サプリメント中の細胞培養物のための支持体として使用することができる。しかし、一部の実施形態では、培養容器の表面を、接着促進性マトリックス／基質（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ＲＧＤ含有ポリペプチド、ゼラチンなど）でコーティングすることにより、細胞の付着を促進し、特定の実施形態では、本明細書で開示される、細胞培養培地およびサプリメントの効果を増強することができる。当技術分野では、細胞を培養および継代培養するのに適する基質が公知であり、限定せずに述べると、ビトロネクチン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、エラスチン、オステオポンチン、トロンボスポンジン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）など、天然に存在する細胞株により産生されるマトリックスと、ポリアミン単層およびカルボキシ末端化単層など、合成または人工の表面との混合物を含む。一部の実施形態では、フィーダーフリー条件の準備は、マトリックスでコーティングした表面上の細胞の培養を含む。一実施形態では、本明細書で想定される培養プラットフォームは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはビトロネクチンを含むマトリックス／基質を含む。培養物についての一部の実施形態では、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を使用し、従って、培養物は、完全に組成既知である。
【０１３５】
本発明の一部の態様では、上記で記載した分化段階のうちの１または複数は、無血清条件下で実行することができる。細胞の付着および／または誘導に適する、市販の無血清培地の例は、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）製のｍＴｅＳＲ（商標）１またはＴｅＳＲ（商標）２、ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）製のＰｒｉｍａｔｅ  ＥＳ／ｉＰＳ細胞培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）製のＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＣ  ＳＦＭ、およびＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製のＸ−ＶＩＶＯ（商標）を含む。
【０１３６】
さらなる実施形態では、培養プラットフォームの培地のうちの１または複数は、フィーダーフリー環境であり、任意選択で、サイトカインおよび／または増殖因子を実質的に含まない。他の実施形態では、細胞培養培地は、血清、抽出物、増殖因子、ホルモン、サイトカインなどのサプリメントを含有する。一般に、培養プラットフォームは、段階特異的な、フィーダーフリーの無血清培地のうちの１または複数を含むが、これらの各々は、以下：栄養物／抽出物、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、および培地添加剤のうちの１または複数をさらに含む。適切な栄養物／抽出物は、例えば、多くの異なる哺乳動物細胞の増殖を支援するために広く使用される基礎培地である、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２）；ＫＯＳＲ（ノックアウト血清置換）；Ｌ−グルタミン；ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）を含みうる。他の培地添加剤は、ＭＴＧ、ＩＴＳ、βＭＥ、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）を含みうるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本発明の培養培地は、以下のサイトカインまたは増殖因子：上皮増殖因子（ＥＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ４）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフェリン、多様なインターロイキン（ＩＬ−１〜ＩＬ−１８など）、多様なコロニー刺激因子（顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）など）、多様なインターフェロン（ＩＦＮ−γなど）、ならびに幹細胞因子（ＳＣＦ）およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）など、幹細胞に対して効果を及ぼす他のサイトカインのうちの１または複数を含む。これらのサイトカインは、例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ）製の市販品を得ることができ、天然の場合もあり、組換えの場合もある。他の一部の実施形態では、本発明の培養培地は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ４）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、造血増殖因子（例えば、ＳＣＦ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＥＰＯ、ＩＬ３、ＴＰＯ、ＥＰＯ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）；および白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１１、ＩＬ１５に由来する、１または複数のサイトカインのうちの１または複数を含む。一部の実施形態では、増殖因子／マイトジェンおよびサイトカインは、経験的に、または確立されたサイトカイン技術分野により誘導される通りに決定される濃度において、段階特異的および／または細胞型特異的である。
【０１３７】
一般に、人工多能性細胞を分化させるための技法は、特異的細胞経路の、直接的または間接的なモジュレーションであって、ポリヌクレオチドベースの手法、ポリペプチドベースの手法、および／または低分子ベースの手法を使用するモジュレーションを伴う。細胞の発生能は、例えば、細胞を、１または複数のモジュレーターと接触させることにより、モジュレートすることができる。本明細書で使用される「〜を接触させること」は、１または複数の因子（例えば、低分子、タンパク質、ペプチドなど）の存在下で細胞を培養することを伴いうる。一部の実施形態では、細胞を、１または複数の薬剤と接触させて、細胞の分化を誘導する。このような接触は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養の間に、１または複数の薬剤を、細胞へと導入することにより行うことができる。従って、接触は、１または複数の薬剤を、栄養細胞培養培地中の細胞へと導入することにより行うことができる。細胞は、１または複数の薬剤を含む培養培地中で、細胞が所望の分化表現型を達成するのに十分な時間にわたり維持することができる。他の一部の実施形態では、「接触」は、ベクターを介して、１または複数の因子を、細胞へと導入する場合に生じる。一部の実施形態では、１または複数のベクターを、レトロウイルス、センダイウイルス、およびアデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを伴うベクター系、またはｍＲＮＡにより導入する。
【０１３８】
他の実施形態では、本明細書で開示される培養プラットフォームの、段階特異的な、フィーダーフリーの無血清培地のうちの１または複数はさらに、１または複数の低分子を含む。一部の実施形態では、培養プラットフォームは、ＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む細胞培養培地を含み、ＴＧＦβ受容体またはＡＬＫ５の阻害剤に限定されないがこれらを含めた、ＴＧＦβ／アクチビンシグナル伝達経路の低分子阻害剤から構成されないか、または含まない。
【０１３９】
本明細書で想定される培養プラットフォームはまた、自発性の分化を低減し、かつ／または基底状態の多能性を達成した、業務グレードまたは臨床グレードの多能性細胞の均質な集団を活用することにより、多数の利点ももたらす。一実施形態では、均質なｉＰＳＣを、ＧＳＫ−３阻害剤と、ＭＥＫ阻害剤と、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤とを含む組成物中に維持するが、組成物は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない。本明細書で使用される「均質な」という用語は、細胞の集団であって、各細胞が、集団内の他の細胞と同じであるか、または実質的に同じである集団を指す。一実施形態では、細胞は、各細胞が、本明細書で想定される、同じ多能性マーカー、例えば、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ１−８１のうちの１または複数を発現する場合に、集団内の他の細胞と同じである。一実施形態では、集団は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ超の細胞が、集団内の他の細胞と同じであるか、または実質的に同じである場合に、均質である。
【０１４０】
様々な実施形態では、本明細書の二次造血性内皮を介して、造血系統細胞を発生させるための、培養プラットフォームの細胞培養培地は、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）阻害剤およびＡＬＫ５阻害剤を含む、ＴＧＦβ／アクチビンシグナル伝達経路の阻害剤を含まないか、またはこれを本質的に含まない。一実施形態では、培養プラットフォームは、ナイーブｈｉＰＳＣを維持するための培地であって、ＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地の播種を含む。いかなる特定の理論に束縛されることも望まないが、本発明者らは、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤が、再プログラム化の効率は増大させるが、多能性細胞集団の長期にわたる維持、品質、および均質性には反することを発見した。すなわち、ＴＧＦβ経路シグナル伝達の阻害は、細胞の再プログラム化の効率を改善したが、この阻害の解除は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養系、特に、フィーダー細胞フリーで、単一細胞の、酵素的継代培養を使用する系であって、自発性の分化を低減し、「基底」多能性状態または「ナイーブ」多能性状態にとどまる、均質な多能性集団が好ましい系内の、多能性細胞集団の、その後の維持に寄与する。本明細書で使用される「長期」という用語であって、継代培養の数に限定されないが、これにより測定される「長期」という用語は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０代、またはそれ超の継代培養を意味することが多い。規定される通り、「継代培養」とは、細胞が、所望の程度まで増殖したら、細胞を、複数の細胞培養表面または細胞培養容器へと分け、播種する行為を指す。加えて、準安定性の多能性細胞を、本明細書で開示される、ＧＳＫ３阻害剤と、ＭＥＫ阻害剤と、任意選択で、ＲＯＣＫ阻害剤とを含むが、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含まない培地中で培養することにより、自発性の分化の低減を達成し、かつ／または基底状態の多能性を達成するように、多能性細胞を移行させる。
【０１４１】
ｉＰＳＣの、基底状態の多能性またはナイーブ型の多能性を達成することはまた、ＥＢ中間体を形成せずに、ｉＰＳＣを分化させることにより、造血系細胞を得るのにも重要である。加えて、ナイーブｉＰＳＣの、二次ＨＥへの分化の効率はまた、ＥＢおよびその凝集物を形成しない単層培養の使用にも、大きく影響される。一部の実施形態では、培養プラットフォームは、ＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培地を含む。他の一部の実施形態では、培養プラットフォームは、ＧＳＫ３阻害剤を含む培地を含むが、ＴＧＦβＲ／ＡＬＫ５阻害剤を含まず、この培地は、本明細書で提示される培養プラットフォームを使用して、二次ＨＥおよび／または二次ＨＳＣ細胞の発生を促進する。
【０１４２】
１．ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤
ＴＧＦβ受容体（例えば、ＡＬＫ５）阻害剤は、ＴＧＦβ受容体（例えば、ＡＬＫ５）に対する抗体、これらのドミナントネガティブの変異体、およびこれらの発現を抑制するアンチセンス核酸を含みうる。例示的なＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２（例えば、Inmanら、Molecular  Pharmacology、６２巻（１号）：６５〜７４頁（２００２年）を参照されたい）；３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミドとしてもまた公知のＡ−８３−０１（例えば、Tojoら、Cancer  Science、９６巻（１１号）：７９１〜８００頁（２００５年）を参照されたい；例えば、Ｔｏｉｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから市販されている）；２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン；Ｗｎｔ３ａ／ＢＩＯ（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Daltonら、ＷＯ２００８／０９４５９７を参照されたい）；ＧＷ７８８３８８（−｛４−［３−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリジン−２−イル｝−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）ベンズアミド）（例えば、Gellibertら、Journal  of  Medicinal  Chemistry、４９巻（７号）：２２１０〜２２２１頁（２００６年）を参照されたい）；ＳＭ１６（例えば、Suzukiら、Cancer  Research、６７巻（５号）：２３５１〜２３５９頁（２００７年）を参照されたい）；ＩＮ−１１３０（３−（（５−（６−メチルピリジン−２−イル）−４−（キノキサリン−６−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）ベンズアミド）（例えば、Kimら、Xenobiotica、３８巻（３号）：３２５〜３３９頁（２００８年）を参照されたい）；ＧＷ６６０４（２−フェニル−４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン）（例えば、de  Gouvilleら、Drug  News  Perspective、１９巻（２号）：８５〜９０頁（２００６年）を参照されたい）；ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩）（例えば、DaCostaら、Molecular  Pharmacology、６５巻（３号）：７４４〜７５２頁（２００４年）を参照されたい）；およびピリミジン誘導体（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Stieflら、ＷＯ２００８／００６５８３において列挙されているピリミジン誘導体を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。さらに、「ＡＬＫ５阻害剤」は、非特異的キナーゼ阻害剤を包摂することを意図しないが、「ＡＬＫ５阻害剤」は、例えば、ＳＢ−４３１５４２（例えば、Inmanら、J.  Mol.  Pharmacol.、６２巻（１号）：６５〜７４頁（２００２年）を参照されたい）など、ＡＬＫ５に加えて、ＡＬＫ４および／またはＡＬＫ７も阻害する阻害剤を包摂することを理解されたい。本発明の範囲を限定することを意図せずに述べると、ＡＬＫ５阻害剤は、間葉から上皮への転換／移行（ＭＥＴ）過程に影響を与えることが考えられる。ＴＧＦβ／アクチビン経路は、上皮から間葉への移行（ＥＭＴ）の駆動因子である。従って、ＴＧＦβ／アクチビン経路を阻害することにより、ＭＥＴ（すなわち、再プログラム化）過程を促進する���とができる。
【０１４３】
ＡＬＫ５の阻害の効果を示すデータを考慮すると、ＴＧＦβ／アクチビン経路の阻害は、同様のＡＬＫ５阻害の効果を及ぼすことが考えられる。従って、ＴＧＦβ／アクチビン経路の任意の阻害剤（例えば、上流または下流の）を、本明細書の各段落で記載される通り、ＡＬＫ５阻害剤と組み合わせて使用することもでき、これらの代わりに使用することもできる。例示的なＴＧＦβ／アクチビン経路阻害剤は、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＳＭＡＤ２／３のリン酸化の阻害剤、ＳＭＡＤ２／３とＳＭＡＤ４との相互作用の阻害剤、ならびにＳＭＡＤ６およびＳＭＡＤ７の活性化因子／アゴニストを含むがこれらに限定されない。なおさらに、下記で記載される類別化は、構成上の目的でなされるものであり、当業者は、化合物が、経路内の１または複数の地点に影響を与える可能性があり、従って、化合物が、規定された類別のうちの１つを超える類別において機能しうることを知るであろう。
【０１４４】
ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）阻害剤は、ＴＧＦβ受容体に対する抗体、そのドミナントネガティブの変異体、およびそれをターゲティングするｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸を含みうる。ＴＧＦβ受容体阻害剤の具体例は、ＳＵ５４１６；２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩（ＳＢ−５０５１２４）；レルデリムマブ（lerdelimumb）（ＣＡＴ−１５２）；メテリムマブ（ＣＡＴ−１９２）；ＧＣ−１００８；ＩＤ１１；ＡＰ−１２００９；ＡＰ−１１０１４；ＬＹ５５０４１０；ＬＹ５８０２７６；ＬＹ３６４９４７；ＬＹ２１０９７６１；ＳＢ−５０５１２４；ＳＢ−４３１５４２；ＳＤ−２０８；ＳＭ１６；ＮＰＣ−３０３４５；Ｋｉ２６８９４；ＳＢ−２０３５８０；ＳＤ−０９３；Ｇｌｅｅｖｅｃ；３，５，７，２’，４’−ペンタヒドロキシフラボン（Ｍｏｒｉｎ）；アクチビン−Ｍ１０８Ａ；Ｐ１４４；可溶性ＴＢＲ２−Ｆｃ；およびＴＧＦβ受容体をターゲティングするアンチセンストランスフェクトされた腫瘍細胞（例えば、Wrzesinskiら、Clinical  Cancer  Research、１３巻（１８号）：５２６２〜５２７０頁（２００７年）；Kaminskaら、Acta  Biochimica  Polonica、５２巻（２号）：３２９〜３３７頁（２００５年）；およびChangら、Frontiers  in  Bioscience、１２巻：４３９３〜４４０１頁（２００７年）を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
【０１４５】
ＳＭＡＤ２／３のリン酸化の阻害剤は、ＳＭＡＤ２またはＳＭＡＤ３に対する抗体、これらのドミナントネガティブの変異体、およびこれらをターゲティングするアンチセンス核酸を含みうる。阻害剤の具体例は、ＰＤ１６９３１６；ＳＢ２０３５８０；ＳＢ−４３１５４２；ＬＹ３６４９４７；Ａ７７−０１；および３，５，７，２’，４’−ペンタヒドロキシフラボン（Ｍｏｒｉｎ）（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Wrzesinski、前出；Kaminska、前出；Shimanukiら、Oncogene、２６巻：３３１１〜３３２０頁（２００７年）；およびKataokaら、ＥＰ１９９２３６０を参照されたい）を含む。
【０１４６】
ＳＭＡＤ２／３とＳＭＡＤ４との相互作用の阻害剤は、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３および／またはｓｍａｄ４に対する抗体、これらのドミナントネガティブの変異体、およびこれらをターゲティングするアンチセンス核酸を含みうる。ＳＭＡＤ２／３とＳＭＡＤ４との相互作用の阻害剤の具体例は、Ｔｒｘ−ＳＡＲＡ、Ｔｒｘ−ｘＦｏｘＨ１ｂ、およびＴｒｘ−Ｌｅｆ１（例えば、Cuiら、Oncogene、２４巻：３８６４〜３８７４頁（２００５年）；およびZhaoら、Molecular  Biology  of  the  Cell、１７巻：３８１９〜３８３１頁（２００６年）を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
【０１４７】
ＳＭＡＤ６およびＳＭＡＤ７の活性化因子／アゴニストは、ＳＭＡＤ６またはＳＭＡＤ７に対する抗体、これらのドミナントネガティブの変異体、およびこれらをターゲティングするアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されない。阻害剤の具体例は、Ｓｍａｄ７（ＰＴＯオリゴヌクレオチドとしての）（例えば、それらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｉｙａｚｏｎｏら、ＵＳ６５３４４７６、およびＳｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒら、ＵＳ２００５１１９２０３を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
【０１４８】
２．Ｗｎｔ経路アゴニスト
本明細書で使用される「Ｗｎｔシグナル促進剤」、「Ｗｎｔ経路活性化因子」、「Ｗｎｔ経路活性化剤」、または「Ｗｎｔ経路アゴニスト」という用語は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ／１３、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ７ｃ、Ｗｎｔ８、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ８ｃ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１５、およびＷｎｔ１６のうちの１または複数のアゴニストを含むがこれらに限定されない、Ｗｎｔシグナル伝達経路のアゴニストを指す。Ｗｎｔ経路アゴニストはさらに、以下のポリペプチドまたはそれらの断片：Ｄｋｋポリペプチド、Ｃｒｅｓｃｅｎｔポリペプチド、Ｃｅｒｂｅｒｕｓポリペプチド、Ａｘｉｎポリペプチド、Ｆｒｚｂポリペプチド、Ｔ細胞因子ポリペプチド、またはドミナントネガティブのＤｉｓｈｅｖｅｌｅｄポリペプチドのうちの１または複数を含むがこれらに限定されない。
【０１４９】
Ｗｎｔ経路アゴニストの非限定的な例はさらに、以下：Ｗｎｔポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｗｎｔポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、活性化Ｗｎｔ受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、活性化Ｗｎｔ受容体のアミノ酸配列を含むポリペプチド、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を促進する有機低分子、Ｗｎｔアンタゴニストの発現または活性を阻害する有機低分子、Ｗｎｔアンタゴニストの発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ｗｎｔアンタゴニストの発現を阻害するリボザイム、Ｗｎｔアンタゴニストの発現を阻害するＲＮＡｉ構築物、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ、Ｗｎｔアンタゴニストに結合し、その活性を阻害する抗体、β−カテニンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、β−カテニンポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、Ｌｅｆ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、およびＬｅｆ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドのうちの１または複数を含む。
【０１５０】
Ｗｎｔ経路アゴニストはさらに、例えば、ドミナントネガティブのＧＳＫ−３ポリペプチド、ＧＳＫ３αポリペプチド、またはＧＳＫ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ドミナントネガティブのＧＳＫ−３ポリペプチド、ＧＳＫ３αポリペプチド、またはＧＳＫ３ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、ＧＳＫ−３、ＧＳＫ３α、またはＧＳＫ３に結合し、その発現または活性を阻害する有機低分子、ＧＳＫ−３、ＧＳＫ３α、またはＧＳＫ３に結合し、その発現および／または活性を阻害するＲＮＡｉ構築物、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ、ＧＳＫ−３、ＧＳＫ３α、またはＧＳＫ３に結合し、その発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＧＳＫ−３、ＧＳＫ３α、またはＧＳＫ３に結合し、その発現および／または活性を阻害する抗体、ＧＳＫ−３、ＧＳＫ３α、またはＧＳＫ３に結合し、その発現を阻害するリボザイム、およびβ−カテニン標的遺伝子を活性化させる任意のＧＳＫ−３非依存性試薬であって、ＧＳＫ−３の阻害への効果において類似する試薬などのＧＳＫ３阻害剤を含む。
【０１５１】
３．ＧＳＫ３阻害剤
ＧＳＫ３阻害剤は、本明細書で想定される組成物における使用に適する、特異的な例示的Ｗｎｔ経路アゴニストであり、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および低分子を含みうるがこれらに限定されない。本明細書で想定されるＧＳＫ３阻害剤は、ＧＳＫ３α／βの発現および／またはＧＳＫ３α／βの活性を減殺しうる。本明細書で想定されるＧＳＫ３阻害剤の例示的な例は、ＧＳＫ３をターゲティングする抗ＧＳＫ３抗体、ドミナントネガティブのＧＳＫ３変異体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されない。
【０１５２】
他の例示的なＧＳＫ３阻害剤は、ケンパウロン、１−アザケンパウロン、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＣＴ  ９９０２１、ＣＴ  ２００２６、ＳＢ２１６７６３、ＡＲ−Ａ０１４４１８、リチウム、ＴＤＺＤ−８、ＢＩＯ、ＢＩＯ−アセトキシム、（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−（２−フェニルキナゾリン−４−イル）アミン、ピリドカルバゾール−シクロペンタジエニル（cyclopenadienyl）ルテニウム錯体、ＴＤＺＤ−８  ４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン、２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（１−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール、ＯＴＤＺＴ、アルファ−４−ジブロモセトフェノン、ＡＲ−ＡＯ１４４−１８、３−（１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオン、ＴＷＳ１  １９ピロロピリミジン化合物、Ｌ８０３Ｈ−ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ２またはそのミリストイル化形態、２−クロロ−１−（４，５−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン、ＧＦ１０９２０３Ｘ、ＲＯ３１８２２０、ＴＤＺＤ−８、ＴＩＢＰＯ、およびＯＴＤＺＴを含むがこれらに限定されない。
【０１５３】
特定の例示的な実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、またはケンパウロンである。
【０１５４】
好ましい実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。
【０１５５】
別の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＢＲＤ０７０５である。
【０１５６】
４．ＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤
本明細書で想定される組成物における使用に適するＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および低分子を含むがこれらに限定されない。本明細書で想定されるＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤は、ＭＥＫもしくはＥＲＫの発現および／またはＭＥＫもしくはＥＲＫの活性を減殺しうる。本明細書で想定されるＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤の例示的な例は、ＭＥＫまたはＥＲＫをターゲティングする抗ＭＥＫ抗体または抗ＥＲＫ抗体、ドミナントネガティブのＭＥＫ変異体またはＥＲＫ変異体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されない。
【０１５７】
他の例示的なＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ９８０５９、ＵＯ１２６、ＳＬ３２７、ＡＲＲＹ−１６２、ＰＤ１８４１６１、ＰＤ１８４３５２、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、ＧＳＫ１  １２０２１２、ＡＲＲＹ−４３８１６２、ＲＯ５１２６７６６、ＸＬ５１８、ＡＺＤ８３３０、ＲＤＥＡ１  １９、ＡＺＤ６２４４、ＦＲ１８０２０４、およびＰＴＫ７８７を含むがこれらに限定されない。
【０１５８】
さらなる例示的なＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤は、国際特許公開第ＷＯ９９／０１４２６号、同第ＷＯ０２／０６２１３号、同第ＷＯ０３／０７７９１４号、同第ＷＯ０５／０５１３０１号、および同第ＷＯ２００７／０４４０８４号において開示されている化合物を含む。
【０１５９】
ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤のさらに例示的な例は、以下の化合物：６−（４−ブロモ−２−クロロ−フェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸（２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ）−アミド、６−（４−ブロモ−２−クロロ−フェニルアミノ）−７−フルオロ−３−（テトラヒドロ−ピラン−２−イルメチル）−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸（２−ヒドロキシ−エトキシ）−アミド、１−［６−（４−ブロモ−２−クロロフェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−イル］−２−ヒドロキシ−エタノン、６−（４−ブロモ−２−クロロ−フェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸（２−ヒドロキシ−１，１−ジメチル−エトキシ）−アミド、６−（４−ブロモ−２−クロロ−フェニルアミノ）−７−フルオロ−３−（テトラヒドロ−フラン−２−イルメチル）−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸（２−ヒドロキシ−エトキシ）−アミド、６−（４−ブロモ−２−フルオロ−フェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸（２−ヒドロキシ−エトキシ）−アミド、６−（２，４−ジクロロ−フェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸（２−ヒドロキシ−エトキシ）−アミド、以下、ＭＥＫ阻害剤１と称する、６−（４−ブロモ−２−クロロ−フェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸（２−ヒドロキシ−エトキシ）−アミド、２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−１，５−ジメチル−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド（以下、ＭＥＫ阻害剤２と称する）、４−（４−ブロモ−２−フルオロフェニルアミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−１，５−ジメチル−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリダジン−３−カルボキサミド、および薬学的に許容されるこれらの塩を含む。
【０１６０】
好ましい実施形態では、ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤は、ＰＤ９８０５９である。
【０１６１】
５．ＲＯＣＫ阻害剤
Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）とは、Ｒｈｏキナーゼ（その３つのアイソフォーム（ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、およびＲｈｏＣ）が存在する）の下流のエフェクターとして働くセリン／トレオニンキナーゼである。本明細書で想定される組成物における使用に適するＲＯＣＫ阻害剤は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および低分子を含むがこれらに限定されない。本明細書で想定されるＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＯＣＫの発現および／またはＲＯＣＫの活性を減殺しうる。本明細書で想定されるＲＯＣＫ阻害剤の例示的な例は、ＲＯＣＫをターゲティングする抗ＲＯＣＫ抗体、ドミナントネガティブのＲＯＣＫ変異体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されない。
【０１６２】
本明細書で想定される、例示的なＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビン、Ｙ２７６３２、ファスジル、ＡＲ１２２−８６、Ｙ２７６３２、Ｈ−１１５２、Ｙ−３０１４１、Ｗｆ−５３６、ＨＡ−１０７７、ヒドロキシル−ＨＡ−１０７７、ＧＳＫ２６９９６２Ａ、ＳＢ−７７２０７７−Ｂ、Ｎ−（４−ピリジル）−Ｎ’−（２，４，６−トリクロロフェニル）尿素、３−（４−ピリジル）−１Ｈ−インドール、および（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−Ｎ−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド、ならびに、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，０４４，２０１号において開示されているＲＯＣＫ阻害剤を含むがこれらに限定されない。
【０１６３】
一実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビン、Ｙ２７６３２、またはピリンテグリンである。
【０１６４】
好ましい実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンである。
【０１６５】
本明細書で想定される組成物中および細胞培養培地中の低分子の量は、変動させることができ、使用される特異的分子および組合せ、培地中で培養される細胞の種類、および特異的適用を含む特異的培養条件に従い最適化することができる。一実施形態では、低分子は、多能性を誘導し、再プログラム化の効率を改善し、細胞の能力を増大させるかもしくは維持するか、または基底状態の多能性を誘導もしくは維持するのに十分な濃度で、組成物中に存在する。
【０１６６】
本発明の別の態様は、本発明による使用のためのＮｏｔｃｈ活性化因子に関する。Ｎｏｔｃｈは、Ｎｏｔｃｈ１を含むがこれらに限定されない、Ｎｏｔｃｈ受容体ファミリーの全てのメンバーを包摂する。Ｎｏｔｃｈ活性化因子は、Ｎｏｔｃｈ受容体のアゴニストを含むがこれらに限定されない。Ｎｏｔｃｈアゴニストは、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合し、例えば、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインを切断させ、核へと移行させるなど、Ｎｏｔｃｈ受容体と関連するシグナル伝達事象も、誘発または介在する。Ｎｏｔｃｈ活性化因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、およびＤＬＬ−４を含むがこれらに限定されない。Ｎｏｔｃｈ活性化因子は、それらの開示が参照により本明細書に組み込まれる、ＥＰ２６０６８８４、ＵＳ６６８９７４４、およびＵＳ５７８０３００において開示されているＮｏｔｃｈ活性化因子を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドのうちの１または複数を、可溶性ペプチドとして導入することもでき、固体材料上に固定化させることもできる。固体材料は、ポリスチレンプレート、またはビーズを含みうるがこれらに限定されない。Ｎｏｔｃｈリガンドの固定化のためのビーズは、アガロースビーズ、磁気ビーズ、およびラテックスビーズでありうる。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドペプチドを、ビーズへとコンジュゲート／固定化させる。別の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドペプチドを、ポリスチレンプレートの表面へとコンジュゲート／固定化させる。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドの固定化は、非共有結合的である。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドペプチドを、細胞により提示する。
【０１６７】
本発明のさらに別の態様は、それらの開示が参照により本明細書に組み込まれる以下の公報：ＷＯ２０１４０１１５４０、ＷＯ２０１４０６２１３８、およびＷＯ２００５１１７９９４において開示されている薬剤を含むＢＭＰ経路活性化因子に関する。本発明による使用のためのＢＭＰ経路活性化因子は、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−２、およびＢＭＰ−４を含むがこれらに限定されない。本発明の非限定的実施形態では、ＢＭＰ経路活性化因子は、ＢＭＰ−４である。ＢＭＰとは、形質転換増殖因子ベータスーパーファミリーのメンバーである、多機能性サイトカインである。骨形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体は、Ｓｍａｄの活性化を介して、ＢＭＰシグナル伝達を介在する。ＢＢＭＰリガンドは、ＢＭＰ受容体である、ＢＭＰＲＩおよびＢＭＰＲＩＩに結合する。ＢＭＰＲＩＩがリン酸化した後、続いて、ＢＭＰＲＩが活性化する。ＢＭＰＲＩがリン酸化すると、その後、ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｍａｄ（Ｒ−Ｓｍａｄ）タンパク質がリン酸化し、これが、ｃｏｍｍｏｎ  ｍｅｄｉａｔｏｒ−Ｓｍａｄ（ｃｏ−Ｓｍａｄ）と会合し、核に入り、そこで、遺伝子の発現を調節する。一実施形態では、ＢＭＰ経路活性化因子は、ＢＭＰ４である。
【０１６８】
本発明は、ｉＰＳＣから分化させた二次ＨＳＣを介して、またはｉＰＳＣから分化させた二次造血性内皮を介して、ｉＰＳＣから造血系細胞を得るための組成物を提供するが、これらの手法の各々は、所望の細胞を分化させるための、ｉＰＳＣからのＥＢの形成を欠く。
【０１６９】
６．ｈｉＰＳＣ分化プラットフォーム
Ｉ．ｉＨＳＣプラットフォーム
本発明の一態様は、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣを含む多能性幹細胞から得るための培養培地を提供する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一実施形態では、培養培地は、Ｗｎｔ経路活性化因子およびＢＭＰ活性化因子を含む。一実施形態では、培養培地は、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含む。一実施形態では、培養培地中のＷｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。一実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、培養培地は、細胞外マトリックスタンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表１に示される濃度範囲で含む。一部の実施形態では、培養培地は、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎではなく、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を使用する場合、完全に組成既知である。
【表１】
2019103521.tif 000002
【０１７０】
本発明の一態様は、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から得るための培養培地を提供する。一実施形態では、培養培地は、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含む。一実施形態では、培養培地は、Ｗｎｔ経路活性化因子、ＢＭＰ活性化因子を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一実施形態では、培養培地は、Ｗｎｔ経路活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含む。一実施形態では、培養培地中のＷｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。一実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一実施形態では、任意選択のＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２である。一部の実施形態では、本明細書の培養培地は、細胞外マトリックスタンパク質を含む。他の実施形態では、培養培地は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表２に示される濃度範囲で含む。一部の実施形態では、培養培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎに代える場合、完全に組成既知である。
【表２】
2019103521.tif 000003
【０１７１】
本発明の一態様は、二次ＨＳＣを、造血性内皮から得るための培養培地を提供する。一実施形態では、培養培地は、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む。一実施形態では、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む培養培地は、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まない。一実施形態では、培養培地は、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含むｉＨＳＣ基礎培地を含む。一実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、培養培地は、細胞外マトリックスタンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表３に示される濃度範囲で含む。一部の実施形態では、培養培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎに代える場合、完全に組成既知である。
【表３】
2019103521.tif 000004
【０１７２】
本発明の一態様は、Ｔ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから得るための培養培地を提供する。一実施形態では、培養培地は、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む。一実施形態では、培養培地は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＢＭＰ活性化因子と、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含むｉＴＣ基礎培地を含む。一実施形態では、ｉＴＣ基礎培地は、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子の組合せを含む。一実施形態では、ｉＴＣ基礎培地は、フィブロネクチンを含まない。一実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、およびＤＬＬ−４を含むがこれらに限定されないＮｏｔｃｈリガンドである。一部の実施形態では、ＤＬＬ−１およびＤＬＬ−４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。一部の実施形態では、培養培地は、細胞外マトリックスタンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表４に示される濃度範囲で含む。一部の実施形態では、培養培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎに代える場合、完全に組成既知である。
【表４】
2019103521.tif 000005
【０１７３】
本発明の一態様は、Ｔ細胞を、Ｔ細胞前駆体から得るための培養培地を提供する。一実施形態では、培養培地は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、およびＩＧＦからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む。一実施形態では、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＩＧＦとを含む培養培地は、ＢＭＰ活性化因子を含まない。一実施形態では、培養培地は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦからなる群から選択される増殖因子およびサイトカイン、ならびにＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含むｉＴＣ基礎培地の組合せを含む。一実施形態では、ｉＴＣ基礎培地は、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子の組合せを含む。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、およびＤＬＬ−４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ−１および／またはＤＬＬ−４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４を含む。一部の実施形態では、培養培地は、細胞外マトリックスタンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表５に示される濃度範囲で含む。一部の実施形態では、培養培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎに代える場合、完全に組成既知である。
【表５】
2019103521.tif 000006
【０１７４】
本発明の一態様は、ＮＫ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから得るための培養培地を提供する。一実施形態では、培養培地は、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＶＥＧＦからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む。一実施形態では、培養培地は、ＳＣＦと、Ｆｌｔ３Ｌと、ＶＥＧＦと、ＢＭＰ活性化因子と、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含むｉＮＫ基礎培地とを含む。一実施形態では、ｉＮＫ基礎培地は、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５の組合せを含む。一実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、培養培地は、細胞外マトリックスタンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表６に示される濃度範囲で含む。一部の実施形態では、培養培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎに代える場合、完全に組成既知である。
【表６】
2019103521.tif 000007
【０１７５】
本発明の一態様は、ＮＫ細胞を、ＮＫ細胞前駆体から得るための培養培地を提供する。一実施形態では、培養培地は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む。一実施形態では、培養培地は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７と、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含むｉＮＫ基礎培地とを含み、ＢＭＰ活性化因子を含まない。一実施形態では、ｉＮＫ基礎培地は、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５の組合せを含む。一部の実施形態では、培養培地は、細胞外マトリックスタンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表７に示される濃度範囲で含む。一部の実施形態では、培養培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎに代える場合、完全に組成既知である。一部の実施形態では、ＮＫの増殖、発生、および成熟を刺激する人工抗原を、ビーズコンジュゲーション、細胞膜粒子、または抗原提示細胞の形態で導入する。
【表７】
2019103521.tif 000008
【０１７６】
本発明の別の態様は、Ｔ細胞を得るための培養プラットフォームであって、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、およびＩＧＦからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカイン、ならびにＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含むｉＴＣ基礎培地を含み、ＢＭＰ活性化因子を含まず、Ｔ細胞を、Ｔ細胞前駆体から発生させるのに適する培養培地；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ｉＴＣ基礎培地とを含み、Ｔ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから発生させるのに適する培養培地；（ｉｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、二次ＨＳＣを、造血性内皮から発生させるのに適する培養培地；（ｉｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適する培養培地；ならびに（ｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適する培養培地のうちの１または複数を含む培養プラットフォームを提供する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【０１７７】
一実施形態では、Ｔ細胞を得るための培養プラットフォームは、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカイン、ならびにＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含むｉＴＣ基礎培地を含み、ＢＭＰ活性化因子を含まず、Ｔ細胞を、Ｔ細胞前駆体から発生させるのに適する培養培地を含む。一実施形態では、培養培地（ｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ｉＴＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉ）は、Ｔ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから発生させるのに適する。一実施形態では、培養培地（ｉ）および（ｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉｉ）は、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、二次ＨＳＣを、造血性内皮から発生させるのに適する。一実施形態では、培養培地（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｖ）は、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適する。別の実施形態では、培養培地（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）を含む培養プラットフォームは、（ｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｖ）は、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【０１７８】
本発明の一態様は、Ｔ細胞前駆体を得るための培養プラットフォームであって、（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ｉＴＣ基礎培地とを含み、Ｔ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから発生させるのに適する培養培地；（ｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、ＨＳＣを、二次造血性内皮から発生させるのに適する培養培地；（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含み、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適する培養培地；ならびに（ｉｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含み、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適する培養培地のうちの１または複数を含む培養プラットフォームを提供する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【０１７９】
一実施形態では、Ｔ細胞前駆体を得るための培養プラットフォームは、（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ｉＴＣ基礎培地とを含む培養培地を含み、培養培地（ｉ）は、Ｔ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから発生させるのに適する。一実施形態では、培養培地（ｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉ）は、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、ＨＳＣを、二次造血性内皮から発生させるのに適する。一実施形態では、培養培地（ｉ）および（ｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉｉ）は、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適する。別の実施形態では、培養培地（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｖ）は、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【０１８０】
本発明の一態様は、二次ＨＳＣを得るための培養プラットフォームであって、（ｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、ＨＳＣを、二次造血性内皮から発生させるのに適する培養培地；（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含み、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適する培養培地；（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含み、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適する培養培地のうちの１または複数を含む培養プラットフォームを提供する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【０１８１】
一実施形態では、二次ＨＳＣを得るための培養プラットフォームは、（ｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地を含み、培養培地（ｉ）は、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、ＨＳＣを、二次造血性内皮から発生させるのに適する。一実施形態では、培養培地（ｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉ）は、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適する。別の実施形態では、培養培地（ｉ）および（ｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉｉ）は、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適する。一部の実施形態では、得られる二次ＨＳＣは、ＣＤ３４＋  ＨＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【０１８２】
本発明のなお別の態様は、造血性内皮を得るための培養プラットフォームであって、（ｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適する培養培地；ならびに（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含み、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適する培養培地のうちの１または複数を含む培養プラットフォームを提供する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【０１８３】
一実施形態では、造血性内皮を得るための培養プラットフォームは、（ｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地を含み、培養培地（ｉ）は、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適する。別の実施形態では、培養培地（ｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉ）は、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【０１８４】
本発明のさらなる態様は、ＮＫ細胞を得るための培養プラットフォームであって、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含むｉＮＫ基礎培地を含み、ＢＭＰ活性化因子を含まず、ＮＫ細胞を、ＮＫ細胞前駆体から発生させるのに適する培養培地；（ｉｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＶＥＧＦからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子と、ｉＮＫ基礎培地とを含み、ＮＫ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから発生させるのに適する培養培地；（ｉｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、ＨＳＣを、二次造血性内皮から発生させるのに適する培養培地；（ｉｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適する培養培地；ならびに（ｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含み、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適する培養培地のうちの１または複数を含む培養プラットフォームを提供する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【０１８５】
ＮＫ細胞を得るための培養プラットフォームについての一実施形態は、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含むｉＮＫ基礎培地とを含む培養培地を含み、培養培地（ｉ）は、ＢＭＰ活性化因子を含まず、ＮＫ細胞を、ＮＫ細胞前駆体から発生させるのに適する。一実施形態では、培養培地（ｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＶＥＧＦからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子と、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含むｉＮＫ基礎培地を含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉ）は、ＮＫ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから発生させるのに適する。一実施形態では、培養培地（ｉ）および（ｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉｉ）は、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、ＨＳＣを、二次造血性内皮から発生させるのに適する。一実施形態では、培養培地（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｖ）は、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適する。別の実施形態では、培養培地（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）を含む培養プラットフォームは、（ｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｖ）は、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【０１８６】
本発明の別の態様は、ＮＫ細胞前駆体を得るための培養プラットフォームであって、（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含むｉＮＫ基礎培地とを含み、ＮＫ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから発生させるのに適する培養培地；（ｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、ＨＳＣを、二次造血性内皮から発生させるのに適する培養培地；（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含み、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適する培養培地；ならびに（ｉｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含み、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適する培養培地のうちの１または複数を含む培養プラットフォームを提供する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【０１８７】
ＮＫ細胞前駆体を得るための培養プラットフォームについての一実施形態は、（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＶＥＧＦからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含むｉＮＫ基礎培地とを含む培養培地を含み、培養培地（ｉ）は、ＮＫ細胞前駆体を、二次ＨＳＣから発生させるのに適する。一実施形態では、培養培地（ｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉ）は、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、ＨＳＣを、二次造血性内皮から発生させるのに適する。一実施形態では、培養培地（ｉ）および（ｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉｉ）は、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適する。別の実施形態では、培養培地（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｖ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｖ）は、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生させるのに適する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【０１８８】
ＮＫ細胞前駆体を得るための培養プラットフォームについての一実施形態は、ビーズコンジュゲーション、細胞膜粒子、および／または抗原提示細胞の形態の人工抗原であって、ＮＫの増殖、発生、および成熟を刺激するための人工抗原のうちの１または複数を含む。
【０１８９】
本発明のなお別の態様は、二次ＣＤ３４＋細胞を発生させるための培養プラットフォームであって、（ｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、ＢＭＰ活性化因子を含むｉＨＳＣ基礎培地とを含み、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず、ＨＳＣを、二次造血性内皮から発生させるのに適する培養培地；（ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含み、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から発生させるのに適する培養培地；ならびに（ｉｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤と、ｉＨＳＣ基礎培地とを含み、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣを含む多能性幹細胞から発生させるのに適する培養培地のうちの１または複数を含む培養プラットフォームを提供する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【０１９０】
ＩＩ．ｉＣＤ３４プラットフォーム
本発明のさらなる態様は、多能性幹細胞を使用して二次造血性内皮を得るための培養プラットフォームを提供する。本明細書で使用される二次造血性内皮とは、二次造血へと方向付けられた造血性細胞集団であって、二次ＨＳＣ、造血複能性前駆体（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、成熟Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含むがこれらに限定されない、全ての造血細胞を発生させる能力を伴う造血細胞集団である。
【０１９１】
一実施形態では、ｉＰＳＣを含む多能性幹細胞を使用して、二次造血性内皮を得るための培養プラットフォームは、ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含む培地の播種を含む。一部の実施形態では、培地の播種は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一実施形態では、本発明の培養培地の播種における低分子の組合せを、表９に、運命維持培地（ＦＭＭ）として示す。培地の成分は、表９に示される濃度範囲内の量で、培地中に存在しうる。一実施形態では、二次造血性内皮を得るために使用されるｉＰＳＣは、運命再プログラム化培地（ＦＲＭ）を使用して発生させ、本明細書で開示される段階特異的分化に適する、ｉＰＳＣ細胞株の基底状態またはナイーブ状態を確立し、持続させるように、ＦＭＭ中でさらに維持された細胞株であった。このようにして得られた基底状態ｉＰＳＣまたはナイーブｉＰＳＣは、低温保存に適する。本発明では、保持されたｉＰＳＣ細胞株またはクローンｉＰＳＣを、二次造血性内皮への後続の分化のために、ＦＭＭに播種することができる。
【表９】
2019103521.tif 000009
【０１９２】
本発明の一態様は、中胚葉の、ｉＰＳＣを含む多能性幹細胞からの分化および拡大のための培養培地を提供する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一実施形態では、培養培地は、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦと、低分子を、表１０に示される組合せで含むＣＤ３４基礎培地とを含む。一部の実施形態では、培養培地は、細胞外マトリックスタンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表１０に示される濃度範囲で含む。一部の実施形態では、培養培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎに代える場合、完全に組成既知である。
【表１０】
2019103521.tif 000010
【０１９３】
一実施形態では、中胚葉の、多能性幹細胞からの分化および拡大のための、上記の培養培地は、０．２〜５０ｎｇの間のｂＦＧＦをさらに含む。
【０１９４】
本発明の一態様は、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、ｉＰＳＣを含む多能性幹細胞から得るための培養培地を提供する。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一実施形態では、培養培地は、ＢＭＰ活性化因子と、ＧＳＫ３阻害剤と、ｂＦＧＦとを含む。一実施形態では、二次ＨＥのポテンシャルを達成するために、ＧＳＫ３阻害剤を含む培養培地を、中胚葉細胞への特化後に限り適用する。一実施形態では、ＢＭＰ活性化因子と、ＧＳＫ３阻害剤と、ｂＦＧＦとを含む培養培地は、低分子を、表１１に示される組合せで含むＣＤ３４基礎培地をさらに含む。一実施形態では、上記の培養培地は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない。一部の実施形態では、培養培地は、細胞外マトリックスタンパク質を含む。他の実施形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表１１に示される濃度範囲で含む。一部の実施形態では、培養培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎに代える場合、完全に組成既知である。
【表１１】
2019103521.tif 000011
【０１９５】
本発明の一態様は、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から得るための培養培地を提供する。一実施形態では、培養培地は、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む。一実施形態では、培養培地は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、ＩＬ１１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、低分子を、表１２に示される組合せで含むＣＤ３４基礎培地とを含む。一実施形態では、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、ＩＬ１１と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培養培地は、ＩＧＦ１および／またはＥＰＯを含まない。他の実施形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表１２に示される濃度範囲で含む。
【表１２】
2019103521.tif 000012
【０１９６】
本発明の一態様は、複能性前駆体（ＭＰＰ）細胞を、二次造血性内皮から得るための培養プラットフォームを提供する。ＭＰＰは、好中球前駆体を含む骨髄性細胞へとさらに分化させることができる。一実施形態では、培養プラットフォームは、（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮を、ｐｒｅ−ＨＳＣへと分化させるのに適する培養培地（表１３）を含む。別の実施形態では、二次造血性内皮を、ｐｒｅ−ＨＳＣへと分化させるための培養培地を含む培養プラットフォームは、（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１とを含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まず、ｐｒｅ−ＨＳＣを、複能性前駆体へと分化させるのに適する培養培地をさらに含む。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。他の実施形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表１３に示される濃度範囲で含む。
【表１３】
2019103521.tif 000013
【０１９７】
本発明の一態様は、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞を、二次造血性内皮から発生させるための培養プラットフォームを提供する。一実施形態では、培養プラットフォームは、（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮を、プレＴ細胞前駆体（ｐｒｅ−ｐｒｏＴ）へと分化させるのに適する培地；ならびに（ｉｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まず、プレＴ細胞前駆体を、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞へと分化させるのに適する培地（表１４）を含む。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。他の実施形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表１４に示される濃度範囲で含む。
【表１４】
2019103521.tif 000014
【０１９８】
本発明の一態様は、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞を、二次造血性内皮から発生させるための培養プラットフォームを提供する。一実施形態では、培養プラットフォームは、（ｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮を、プレＮＫ細胞前駆体（ｐｒｅ−ｐｒｏＮＫ）へと分化させるのに適する培地；ならびに（ｉｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まず、プレＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞へと分化させるのに適する培地を含む。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。他の実施形態では、本明細書の培養培地は、低分子、増殖因子、および／またはサイトカインを、表１５に示される濃度範囲で含む。
【表１５】
2019103521.tif 000015
【０１９９】
本発明の別の態様は、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞を得るための培養プラットフォームであって、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれらを本質的に含まず、プレＴ細胞前駆体を、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞へと分化させるのに適する培地；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮を、プレＴ細胞前駆体へと分化させるのに適する培地；（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮の、中胚葉細胞からの分化および拡大に適する培養培地；（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、中胚葉細胞内の二次造血性内皮のポテンシャルを得るのに適する培養培地；（ｖ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生し、拡大するのに適する培養培地；ならびに（ｖｉ）ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まず、ナイーブｉＰＳＣを播種し、拡大するのに適する培養培地のうちの１または複数を含む培養プラットフォームを提供する。一部の実施形態では、上記の全ての培地は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２またはＢＩＯである。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。
【０２００】
一実施形態では、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞を発生させるための培養プラットフォームは、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７を含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれらを本質的に含まず、プレＴ細胞前駆体を、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞へと分化させるのに適する培地を含む。別の実施形態では、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞を得るための培養プラットフォームであって、培地（ｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮を、プレＴ細胞前駆体へと分化させるのに適する培地をさらに含む。別の実施形態では、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞を得るための培養プラットフォームであって、培地（ｉ）および（ｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮の、中胚葉細胞からの分化および拡大に適する培養培地をさらに含む。さらに別の実施形態では、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞を得るための培養プラットフォームであって、培地（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得るのに適する培養培地をさらに含む。さらに別の実施形態では、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞を得るための培養プラットフォームであって、培地（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）を含む培養プラットフォームは、（ｖ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む。別の実施形態では、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞を得るための培養プラットフォームであって、培地（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）を含む培養プラットフォームは、（ｖｉ）ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まず、ナイーブｉＰＳＣを播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む。一部の実施形態では、上記の全ての培地は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２またはＢＩＯである。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ因子を、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞を発生させるための培養プラットフォームにおいて使用する。一部の実施形態では、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、およびＤＬＬ−４を含むＮｏｔｃｈ因子を、可溶性ペプチド、ビーズへとコ��ジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。
【０２０１】
本発明の別の態様は、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞を得るための培養プラットフォームであって、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれらを本質的に含まず、プレＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞へと分化させるのに適する培地；（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮を、プレＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培地；（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮の、中胚葉細胞からの分化および拡大に適する培養培地；（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、中胚葉細胞内の二次造血性内皮のポテンシャルを得るのに適する培養培地；（ｖ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生し、拡大するのに適する培養培地；（ｖｉ）ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まず、ナイーブｉＰＳＣを播種し、拡大するのに適する培養培地のうちの１または複数を含む培養プラットフォームを提供する。一部の実施形態では、上記の全ての培地は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２またはＢＩＯである。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、ＮＫの成熟は、ＮＫの増殖、発生、および成熟を刺激する人工抗原であって、ビーズコンジュゲーション、細胞膜粒子、および／または抗原提示細胞の形態で導入される人工抗原のうちの１または複数を使用して行う。
【０２０２】
一実施形態では、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞を発生させるための培養プラットフォームは、（ｉ）ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれらを本質的に含まず、プレＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞へと分化させるのに適する培地を含む。一部の実施形態では、ＮＫの成熟は、ＮＫの増殖、発生、および成熟を刺激する人工抗原であって、ビーズコンジュゲーション、細胞膜粒子、および／または抗原提示細胞の形態で導入される人工抗原のうちの１または複数を使用して行う。別の実施形態では、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞を得るための培養プラットフォームであって、培地（ｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み、二次造血性内皮を、プレＮＫ細胞前駆体へと分化させるのに適する培地をさらに含む。別の実施形態では、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞を得るための培養プラットフォームであって、培地（ｉ）および（ｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮の、中胚葉細胞からの分化および拡大に適する培養培地をさらに含む。さらに別の実施形態では、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞を得るための培養プラットフォームであって、培地（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｖ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得るのに適する培養培地をさらに含む。さらに別の実施形態では、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞を得るための培養プラットフォームであって、培地（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）を含む培養プラットフォームは、（ｖ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含み、中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから発生し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む。別の実施形態では、ＮＫ細胞前駆体またはＮＫ細胞を得るための培養プラットフォームであって、培地（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）を含む培養プラットフォームは、（ｖｉ）ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まず、ナイーブｉＰＳＣを播種し、拡大するのに適する培養培地をさらに含む。一部の実施形態では、上記の全ての培地は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２またはＢＩＯである。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部の実施形態で��、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。
【０２０３】
本発明の一態様は、二次造血性内皮を発生させるための培養プラットフォームであって、（ｉ）二次造血性内皮の、中胚葉細胞からの分化および拡大のための培養培地であり、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む培養培地；（ｉｉ）中胚葉細胞内の、二次造血性ポテンシャルを得るための培養培地であり、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む培養培地；（ｉｉｉ）中胚葉細胞を、ナイーブｉＰＳＣから分化させ、拡大するための培養培地であり、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む培養培地；ならびに（ｉｖ）ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含む、ナイーブｉＰＳＣの播種および拡大培養物であり、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない播種培養物のうちの１または複数を含む培養プラットフォームを提供する。一部の実施形態では、二次造血性内皮は、ＣＤ３４＋である。一部の実施形態では、上記の全ての培地は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２またはＢＩＯである。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。
【０２０４】
一実施形態では、二次造血性内皮を得るための培養プラットフォームは、（ｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮を、中胚葉細胞から、分化させ、拡大するのに適する培養培地を含む。一実施形態では、培養培地（ｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉ）は、中胚葉細胞内の、二次造血性ポテンシャルを得るのに適する。別の実施形態では、培養培地（ｉ）および（ｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｉｉｉ）は、中胚葉細胞を、ナイーブｉＰＳＣから、分化させ、拡大するのに適する。さらに別の実施形態では、培養培地（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を含む培養プラットフォームは、（ｉｖ）ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含む培養培地をさらに含み、培養培地（ｖ）はＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まず、培養培地（ｖ）は、ナイーブｉＰＳＣを播種し、拡大するのに適する。一部の実施形態では、上記の全ての培地は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２またはＢＩＯである。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。
【０２０５】
本発明の一態様は、ＣＤ３４＋二次造血性内皮を発生させるための培養プラットフォームであって、（ｉ）二次造血性内皮を、中胚葉細胞から分化させ、拡大するための培養培地であり、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み、二次造血性内皮が、ＣＤ３４＋二次造血性内皮を含む培養培地；（ｉｉ）中胚葉細胞内の、二次造血性ポテンシャルを得るための培養培地であり、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む培養培地；（ｉｉｉ）中胚葉細胞を、ナイーブｉＰＳＣから分化させ、拡大するための培養培地であり、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む培養培地；ならびに（ｉｖ）ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含む、ナイーブｉＰＳＣの播種または拡大培養物であり、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない播種培養物のうちの１または複数を含む培養プラットフォームを提供する。一部の実施形態では、上記の全ての培地は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２またはＢＩＯである。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。
【０２０６】
本発明の一態様は、中胚葉細胞を発生させるための培養プラットフォームであって、（ｉ）中胚葉細胞を、ナイーブｉＰＳＣから分化させ、拡大するための培養培地であり、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む培養培地；ならびに（ｉｉ）ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含む、ナイーブｉＰＳＣの播種または拡大培養物であり、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない播種培養物のうちの１または複数を含む培養プラットフォームを提供する。一部の実施形態では、上記の全ての培地は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２またはＢＩＯである。一部の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０１２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンまたはＹ２７６３２である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２である。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、中胚葉細胞を発生させるための培養プラットフォームは、（ｉｉｉ）ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含み、中胚葉細胞内の、二次造血性ポテンシャルを得るための培養培地をさらに含みうる。一部の実施形態では、ＢＭＰ活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤とを含む培養培地は、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない。
【０２０７】
Ｃ．ＣＤ３４＋細胞、二次造血性内皮、複能性前駆体、Ｔ細胞前駆体またはＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を得る方法
本発明は、１または複数の培養培地を含む多段階培養プラットフォームを使用して、多能性幹細胞由来の二次造血細胞を発生させる方法を提供する。方法は、フィーダーフリー条件に適する。方法はまた、単層培養にも適し、従って、当技術分野で公知の方法と比較して、多能性幹細胞を分化させるために、ＥＢの形成または凝集中間体を要請しない。提供される方法により、複能性前駆細胞（ｉＭＰＰ）、ナチュラルキラー細胞前駆体（ｉｐｒｏ−ＮＫ）、Ｔ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−Ｔ）、成熟ＮＫ細胞（ｉＮＫ）、およびＴ細胞（ｉＴ）へとさらに分化させることが可能な、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮（ｉＨＥ）、二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）、ＣＤ３４＋  ＨＥ（ｉＣＤ３４）を発生し、同時に、これらを拡大する。本発明のさらなる態様はまた、多能性幹細胞由来のＣＤ３４＋細胞、ＨＥ、ＨＳＣ、および／またはＭＰＰから分化させた骨髄性細胞を発生させる方法も提供する。
【０２０８】
一実施形態では、本発明は、単層培養において、造血系の細胞を、多能性細胞から分化させ、拡大するための方法であって、多能性細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦと接触させるステップを含み、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が、胚葉体を形成せずに、多能性幹細胞から得られ、拡大され、次いで、これが、ＢＭＰ経路活性化因子と、ｂＦＧＦと、ＷＮＴ経路活性化因子との接触下に置かれ、胚葉体を形成せずに、多能性幹細胞由来の二次造血性内皮（ＨＥ）のポテンシャルを有する、拡大された中胚葉細胞が、多能性幹細胞から得られる方法を提供する。ｂＦＧＦと、任意選択で、ＲＯＣＫ阻害剤と、かつ／またはＷＮＴ経路活性化因子との後続の接触により、二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞を、二次ＨＥ細胞へと分化させ、これを分化の間にまた、拡大もする。
【０２０９】
造血系の細胞を得るための、提供される方法は、ＥＢの形成が細胞の拡大をもたらさず、単層培養を可能とせず、かつ煩瑣かつ低効率であるため、ＥＢに介在される多能性幹細胞の分化より優れている。加えて、本発明により、本明細書で提示される方法を使用する単層培養は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、長期にわたる造血系の自己再生、再構成、および生着を可能とする、機能的な造血系細胞をもたらすことも開示された。
【０２１０】
下記で詳述される通り、本発明は、二次ＨＳＣまたは二次造血性内皮を得ることを介して、造血系細胞を、多能性細胞から得る方法を提供する。特に、本発明は、分化のためにＥＢを形成せずに、造血系細胞の、多能性細胞からの分化を方向付ける方法を提供する。
【０２１１】
Ｉ．ｉＨＳＣプラットフォーム
１．ｉＨＳＣを、多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の中胚葉、またはＨＥから分化させ、拡大すること（ｉＨＳＣプラットフォーム）
本発明の一態様は、多段階工程を使用して、二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）を発生し、拡大する方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させる第１段階で始まり、次いで、第２段階で、中胚葉細胞を、造血性内皮（ＨＥ）へと分化させ、拡大する。第３段階では、ＨＥ細胞を、二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）へと分化させ、これを同時にまた、拡大もする。本発明はまた、二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＨＥへと分化させ、拡大することと、ＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させることとを含む方法も提供する。代替的に、本発明は、二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）を発生し、拡大する方法であって、多能性幹細胞由来のＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させることを含む方法を提供する。上記の方法についての一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣを含む。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。
【０２１２】
二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）を、ナイーブ多能性幹細胞から作製する方法についての一実施形態では、方法は、（１）多能性細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および細胞外マトリックスタンパク質のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させること、そして分化させた中胚葉細胞を拡大することと；（２）中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む第２の培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、二次造血性内皮へと分化させること、そして二次ＨＥ細胞を拡大することと；（３）二次ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第３の培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、二次ＨＳＣへと分化させること、そして二次ＨＳＣが拡大することを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣを含む。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートすることをさらに含む。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一部の実施形態では、上記の方法は、中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、およびＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、二次造血性内皮へと分化させることを含む。
【０２１３】
二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から発生し、拡大する方法についての一実施形態では、方法は、中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、二次ＨＥ細胞へと分化させることであって、二次ＨＥ細胞を拡大することと；（２）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む第２の培地と接触させることにより、得られたＨＥ細胞を、ｉＨＳＣへと分化させることであって、ｉＨＳＣを拡大することとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートすることをさらに含む。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。
【０２１４】
二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）を、多能性幹細胞由来のＨＥから発生し、拡大する方法についての一実施形態では、方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む培地と接触させることであって、ｉＨＳＣを、多能性幹細胞由来のＨＥから分化させ、拡大することを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートすることをさらに含む。
【０２１５】
２．ＨＥを、多能性幹細胞または多能性幹細胞由来の中胚葉から分化させ、拡大すること（ｉＨＳＣプラットフォーム）
本発明の一態様は、多段階工程を使用して、二次造血性内皮を発生し、拡大する方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させる第１段階で始まり、次いで、第２段階で、中胚葉細胞を、拡大し、造血性内皮へと分化させる。出発多能性細胞は、基底状態の人工多能性幹細胞またはナイーブ人工多能性幹細胞および胚性幹細胞を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、発生させ、拡大される造血性内皮は、二次造血性内皮である。一部の実施形態では、発生させる二次造血性内皮は、ＣＤ３４陽性である。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、二次造血性内皮へと分化させることにより、造血性内皮を発生し、拡大する方法を提供する。
【０２１６】
二次造血性内皮を、多能性幹細胞から分化させ、拡大する方法についての一実施形態では、方法は、（１）細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および細胞外マトリックスタンパク質のうちの少なくとも１つを含む第１の培地と接触させることにより、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させることと；（２）中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む第２の培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、造血性内皮へと分化させることであって、二次ＨＥ細胞を拡大することとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＧＳＫ３阻害剤を、Ｗｎｔ経路活性化因子として含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＨＩＲ９９０２１またはＢＩＯを、ＧＳＫ３阻害剤として含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＨＩＲ９９０２１を、ＧＳＫ３阻害剤として含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＳＢ４３１５４２またはＡ８３−０１を、ＴＧＦβ受容体阻害剤として含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＳＢ４３１５４２を、ＴＧＦβ受容体阻害剤として含む。
【０２１７】
造血性内皮を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から分化させ、拡大する方法についての一実施形態では、方法は、中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、造血性内皮へと分化させることを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られた二次ＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。
【０２１８】
３．中胚葉細胞を、ｉＰＳＣから分化させ、拡大すること（ｉＨＳＣプラットフォーム）
本発明の一態様は、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から発生させる方法を提供する。出発多能性細胞は、基底状態の人工多能性幹細胞またはナイーブ人工多能性幹細胞および胚性幹細胞を含むがこれらに限定されない。
【０２１９】
中胚葉細胞を、多能性幹細胞から発生し、拡大する方法についての一実施形態では、方法は、多能性幹細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および細胞外マトリックスタンパク質のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させることを含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＧＳＫ３阻害剤を、Ｗｎｔ経路活性化因子として含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＨＩＲ９９０２１またはＢＩＯを、ＧＳＫ３阻害剤として含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＨＩＲ９９０２１を、ＧＳＫ３阻害剤として含む。
【０２２０】
４．Ｔ細胞前駆体を、多能性幹細胞から得ること、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、ＨＥ、または二次ＨＳＣから得ること（ｉＨＳＣおよびｉＴＣプラットフォーム）
本発明の一態様は、多段階工程を使用して、Ｔ細胞前駆体を、多能性幹細胞から発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させ、中胚葉細胞を拡大する第１段階で始まり、次いで、第２段階で、造血性内皮を、分化させ、拡大する。第３段階では、ＨＥ細胞を、二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）へと分化させ、ｉＨＳＣを拡大する。第４段階では、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させる。本発明はまた、Ｔ細胞前駆体を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＨＥへと分化させること、次いで、ＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させること、次いで、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させることを含む方法も提供する。本発明は、Ｔ細胞前駆体を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させること、次いで、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させることを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、Ｔ細胞前駆体を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させることを含む方法を提供する。
【０２２１】
Ｔ細胞前駆体を、多能性幹細胞から作製する方法についての一実施形態では、方法は、（１）多能性細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および細胞外マトリックスタンパク質のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させること、そして中胚葉細胞が拡大することと；（２）中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む第２の培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、造血性内皮へと分化させること、そしてＨＥ細胞を拡大することと；（３）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第３の培地と接触させることにより、ＨＥ細胞を、二次ＨＳＣへと分化させること、そしてｉＨＳＣが拡大することと；（４）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む第４の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させることとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートすることをさらに含む。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、およびＤＬＬ−４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ−１およびＤＬＬ−４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。
【０２２２】
Ｔ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、ＨＥ細胞へと分化させると、ＨＥが拡大することと；（２）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第２の培地と接触させることにより、得られたＨＥ細胞を、ｉＨＳＣへと分化させること、そしてｉＨＳＣを拡大することと；（３）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む第３の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させることとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートすることをさらに含む。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、およびＤＬＬ−４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ−１およびＤＬＬ−４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。
【０２２３】
Ｔ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＨＥから発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む培地と接触させることにより、ＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；（２）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路とを含む第２の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。
【０２２４】
Ｔ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のｉＨＳＣから発生させる方法についての一実施形態では、方法は、ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させるステップを含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、多能性幹細胞由来のＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートし、得るステップをさらに含む。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、およびＤＬＬ−４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ−１およびＤＬＬ−４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。
【０２２５】
５．Ｔ細胞を、多能性幹細胞から得ること、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、ＨＥ、ｉＨＳＣ、またはＴ細胞前駆体から得ること（ｉＨＳＣおよびｉＴＣプラットフォーム）
【０２２６】
本発明の一態様は、多段階工程を使用して、Ｔ細胞を、多能性幹細胞から発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させると、中胚葉細胞が分化しながら拡大する第１段階で始まり、次いで、第２段階で、中胚葉細胞を、造血性内皮へと分化させると、ＨＥ細胞が拡大する。第３段階では、ＨＥ細胞を、二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）へと分化させると、ｉＨＳＣが拡大する。第４段階では、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−Ｔ）へと分化させる。第５段階では、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞へと分化させる。本発明はまた、Ｔ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＨＥへと分化させ、ＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させ、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させ、次いで、Ｔ細胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化させるステップを含む方法も提供する。本発明は、Ｔ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させ、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させ、Ｔ細胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化させるステップを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、Ｔ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させ、Ｔ細胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化させるステップを含む方法を提供する。さらに、本発明は、Ｔ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化させるステップを含む方法を提供する。
【０２２７】
Ｔ細胞を、多能性幹細胞から作製する方法についての一実施形態では、方法は、（１）多能性幹細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および細胞外マトリックスタンパク質のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させると、中胚葉細胞が拡大するステップと；（２）中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む第２の培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、造血性内皮へと分化させると、ＨＥ細胞が拡大するステップと；（３）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第３の培地と接触させることにより、ＨＥ細胞を、ｉＨＳＣへと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；（４）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む第４の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させるステップと；（５）Ｔ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む第５の培地と接触させることにより、Ｔ細胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、およびＤＬＬ−４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ−１およびＤＬＬ−４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。
【０２２８】
Ｔ細胞を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、ＨＥ細胞へと分化させると、二次ＨＥ細胞が拡大するステップと；（２）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第２の培地と接触させることにより、得られたＨＥ細胞を、ｉＨＳＣへと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；（３）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む第３の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させるステップと；（４）Ｔ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む第４の培地と接触させることにより、Ｔ細胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、およびＤＬＬ−４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ−１およびＤＬＬ−４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。
【０２２９】
Ｔ細胞を、多能性幹細胞由来のＨＥから発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞由来のＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；（２）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む第２の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させるステップと；（３）Ｔ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む第３の培地と接触させることにより、Ｔ細胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＳＣをソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、およびＤＬＬ−４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ−１およびＤＬＬ−４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。
【０２３０】
Ｔ細胞を、多能性幹細胞由来のｉＨＳＣから発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、Ｔ細胞前駆体へと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；（２）Ｔ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む培地と接触させることにより、Ｔ細胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、多能性幹細胞由来のＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートし、得るステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ経路活性化因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、およびＤＬＬ−４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ−１およびＤＬＬ−４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。
【０２３１】
Ｔ細胞を、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、Ｔ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含む培地と接触させることにより、Ｔ細胞前駆体を、Ｔ細胞へと分化させるステップを含む。
【０２３２】
６．ＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞から得ること、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、ＨＥ、またはｉＨＳＣから得ること（ｉＨＳＣおよびｉＮＫプラットフォーム）
本発明の一態様は、多段階工程を使用して、ＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞から発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させると、中胚葉細胞が拡大する第１段階で始まり、次いで、第２段階で、中胚葉細胞を、造血性内皮へと分化させると、ＨＥ細胞が拡大する。第３段階では、ＨＥ細胞を、二次ＨＳＣへと分化させると、二次ＨＳＣが拡大する。第４段階では、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させる。本発明はまた、ＮＫ細胞前駆体を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＨＥへと分化させ、次いで、ＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させ、次いで、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるステップを含む方法も提供する。本発明は、ＮＫ細胞前駆体を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させ、次いで、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるステップを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、ＮＫ細胞前駆体を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるステップを含む方法を提供する。
【０２３３】
ＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞から作製する方法についての一実施形態では、方法は、（１）多能性幹細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および細胞外マトリックスタンパク質のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させると、中胚葉細胞が拡大するステップと；（２）中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む第２の培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、造血性内皮へと分化させると、ＨＥ細胞が拡大するステップと；（３）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第３の培地と接触させることにより、ＨＥ細胞を、ｉＨＳＣへと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；（４）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第４の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。
【０２３４】
ＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＨＥ細胞へと分化させると、ＨＥ細胞が拡大するステップと；（２）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第２の培地と接触させることにより、得られたＨＥ細胞を、ｉＨＳＣへと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；（３）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第３の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。
【０２３５】
ＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のＨＥから発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞由来のＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；（２）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第２の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。
【０２３６】
ＮＫ細胞前駆体を、多能性幹細胞由来のｉＨＳＣから発生させる方法についての一実施形態では、方法は、ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるステップを含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、多能性幹細胞由来のＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートし、得るステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。
【０２３７】
７．ＮＫ細胞を、多能性幹細胞から得ること、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞、ＨＥ、ｉＨＳＣ、またはＮＫ細胞前駆体から得ること（ｉＨＳＣおよびｉＮＫプラットフォーム）
本発明の一態様は、多段階工程を使用して、ＮＫ細胞を、多能性幹細胞から発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させると、中胚葉細胞が拡大する第１段階で始まり、次いで、第２段階で、中胚葉細胞を、造血性内皮へと分化させると、ＨＥ細胞が拡大する。第３段階では、ＨＥ細胞を、二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）へと分化させると、ＨＳＣが拡大する。第４段階では、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−ＮＫ）へと分化させる。第５段階では、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞へと分化させる。本発明はまた、ＮＫ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＨＥへと分化させ、ＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させ、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させ、次いで、ＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分化させるステップを含む方法も提供する。本発明は、ＮＫ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させ、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させ、ＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分化させるステップを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、ＮＫ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させ、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分化させるステップを含む方法を提供する。さらに、本発明は、ＮＫ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分化させるステップを含む方法を提供する。
【０２３８】
ＮＫ細胞を、多能性幹細胞から作製する方法についての一実施形態では、方法は、（１）多能性幹細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および細胞外マトリックスタンパク質のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させると、中胚葉細胞が拡大するステップと；（２）中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む第２の培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、二次造血性内皮へと分化させると、ＨＥ細胞が拡大するステップと；（３）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第３の培地と接触させることにより、ＨＥ細胞を、ｉＨＳＣへと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；（４）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第４の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるステップと；（５）ＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む第５の培地と接触させることにより、ＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、およびＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、二次造血性内皮へと分化させるステップを含む。一実施形態では、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。
【０２３９】
ＮＫ細胞を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、および、任意選択で、ＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ＨＥ細胞へと分化させると、中胚葉細胞が拡大するステップと；（２）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第２の培地と接触させることにより、得られたＨＥ細胞を、ｉＨＳＣへと分化させると、二次ＨＥ細胞が拡大するステップと；（３）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第３の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるステップと；（４）ＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む第４の培地と接触させることにより、ＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一部の実施形態では、上記の方法は、中胚葉細胞を、ＢＭＰ経路活性化因子、およびＷｎｔ経路活性化因子、およびＴＧＦβ受容体阻害剤のうちの少なくとも１つを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、二次造血性内皮へと分化させるステップを含む。
【０２４０】
ＮＫ細胞を、多能性幹細胞由来のＨＥから発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞由来の二次ＨＥを、ｉＨＳＣへと分化させると、ｉＨＳＣが拡大するステップと；（２）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む第２の培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるステップと；（３）ＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む第３の培地と接触させることにより、ＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。
【０２４１】
ＮＫ細胞を、多能性幹細胞由来のｉＨＳＣから発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）ｉＨＳＣを、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む培地と接触させることにより、ｉＨＳＣを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるステップと；（２）ＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む第２の培地と接触させることにより、ＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、多能性幹細胞由来のＨＳＣ（ｉＨＳＣ）をソートし、得るステップをさらに含む。
【０２４２】
ＮＫ細胞を、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、ＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む第５の培地と接触させることにより、ＮＫ細胞前駆体を、ＮＫ細胞へと分化させるステップを含む。
【０２４３】
ＩＩ．ｉＣＤ３４プラットフォーム
１．二次ｉＨＥを導出し、拡大すること（ｉＣＤ３４プラットフォーム）
本発明の一態様は、最適化された多段階工程を使用して、二次造血性内皮（ｉＨＥ）を発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を播種し、拡大する第１段階で始まる。次いで、この段階で、多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと分化させると、中胚葉細胞が拡大する。次いで、拡大された中胚葉集団を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉集団へと分化させ、次いで、二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞から、分化させ、拡大する。代替的に、本発明は、二次造血性内皮（ｉＨＥ）を発生させる方法であって、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から、分化させ、拡大し；次いで、二次造血性内皮（ｉＨＥ）を、中胚葉細胞から、分化させ、拡大するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。本発明は、二次造血性内皮（ｉＨＥ）を発生し、拡大する方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を分化させ、拡大し、二次ｉＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞を得、次いで、これらを、ｉＨＥへと分化させるステップを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、二次造血性内皮を発生し、拡大する方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ｉＨＥへと分化させるステップを含む方法を提供する。本明細書で開示される方法は、ＥＢの形成を伴わない、最適化された単層ｉＣＤ３４培養プラットフォームであって、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培養プラットフォームを活用する。
【０２４４】
二次造血性内皮（ｉＨＥ）を、多能性幹細胞から作製する方法についての一実施形態では、方法は、（１）細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む培地と接触させることにより、中胚葉集団を、多能性幹細胞から分化させ、拡大するステップと；（２）細胞を、ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎｔ経路活性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させることにより、中胚葉集団を分化させ、拡大して、中胚葉細胞内の、二次ＨＥのポテンシャルを得るステップと；（３）細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させるにより、二次ＨＥのポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、二次ＨＥ細胞へと分化させ、拡大するステップとを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、二次ＨＥのポテンシャルを達成するために、細胞を、ＧＳＫ３阻害剤を含む培養培地と接触させることは、中胚葉細胞への特化後に限る。一部の実施形態では、上記の方法は、播種されたｉＰＳＣおよび／または中胚葉細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、多能性細胞を、ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞を播種すると、多能性幹細胞が拡大するステップをさらに含む。
【０２４５】
二次造血性内皮（ｉＨＥ）を、播種された多能性幹細胞から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から分化させ、拡大するステップと；（２）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎｔ経路活性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させることにより、二次ｉＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞を得るステップと；（３）中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｉＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞から分化させ、拡大するステップとを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４陽性を使用してソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、上記の方法は、播種されたｉＰＳＣおよび／または中胚葉細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。
【０２４６】
二次造血性内皮（ｉＨＥ）を、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎｔ経路活性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞を得るステップと；（２）中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、二次ＨＥのポテンシャルを有する中胚葉細胞から分化させ、拡大するステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、上記の方法は、中胚葉細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。
【０２４７】
多能性幹細胞由来の中胚葉細胞内の、二次造血性内皮（ｉＨＥ）のポテンシャルを得る方法についての一実施形態では、方法は、中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させると、中胚葉細胞が拡大するステップを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、上記の方法は、中胚葉細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。
【０２４８】
２．二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を導出し、拡大すること（ｉＣＤ３４プラットフォーム）
本発明の一態様は、最適化された多段階工程を使用して、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を播種する第１段階で始まる。次いで、播種された多能性幹細胞を、中胚葉へと発生させる。第３段階では、中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと、さらに分化させる。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を発生させる方法であって、播種された多能性幹細胞を、中胚葉へと分化させるステップを含む方法と、中胚葉を、二次造血性ポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させる方法とを提供する。本発明は、二次ＨＥのポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を発生させる方法をさらに提供するが、方法は、多能性幹細胞由来の中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させるステップを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。本明細書で開示される方法は、最適化されたｉＣＤ３４培養プラットフォームであって、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培養プラットフォームを活用する。
【０２４９】
多能性幹細胞から導出された中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得る方法についての一実施形態では、方法は、（１）多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から分化させ、拡大するステップと；（２）細胞を、ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎｔ経路活性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得るステップとを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、上記の方法は、多能性幹細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、細胞を、ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞を播種するステップをさらに含む。
【０２５０】
二次造血性内皮のポテンシャルを有する、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、多能性幹細胞由来の中胚葉から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、細胞を、ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎｔ経路活性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させることにより、中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させるステップを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、上記の方法は、中胚葉細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。
【０２５１】
３．中胚葉を、多能性幹細胞から導出し、拡大すること
本発明の一態様は、最適化された多段階工程を使用して、多能性幹細胞由来の中胚葉を発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を播種する第１段階で始まり、次いで、第２段階で、播種された細胞を、中胚葉へと分化させる。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。本明細書で開示される方法は、最適化されたｉＣＤ３４培養プラットフォームであって、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培養プラットフォームを活用する。
【０２５２】
多能性幹細胞由来の中胚葉を、多能性細胞から作製する方法についての一実施形態では、方法は、細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、播種された多能性幹細胞から分化させ、拡大するステップとを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、上記の方法は、播種されたｉＰＳＣを、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、多能性細胞を、ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫを含む培地と接触させることにより、ｉＰＳＣを播種し、拡大するステップをさらに含む。
【０２５３】
４．造血複能性前駆体（ｉＭＰＰ）を導出すること（ｉＣＤ３４プラットフォームおよびｉＭＰＰプラットフォーム）
本発明の一態様は、最適化された多段階工程を使用して、多能性幹細胞由来の複能性前駆体（ｉＭＰＰ）を発生させる方法を提供する。一般に、方法は、多能性幹細胞を播種する第１段階で始まる。播種された細胞を拡大し、中胚葉細胞へと分化させる。中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと拡大し、分化させ、その後、中胚葉細胞を、二次造血性内皮へと分化させる。ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ＨＳＣへと拡大し、分化させ、次いで、好中球前駆体を含む骨髄性細胞へと分化することが可能な、複能性前駆体へと拡大し、分化させる。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来の複能性前駆体（ｉＭＰＰ）を発生させる方法であって、播種された多能性細胞を、中胚葉へと分化させ、中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させ、次いで、中胚葉細胞を、二次ｉＨＥへと分化させ、次いで、これらを、ｉＭＰＰへと分化させるステップを含む方法を提供する。本発明は、多能性幹細胞由来のｉＭＰＰを発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させ、次いで、中胚葉細胞を、二次ｉＨＥへと分化させ、次いで、これらを、ｉＭＰＰへと分化させるステップを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来のｉＭＰＰを発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、二次ｉＨＥへと分化させ、次いで、これらを、ｉＭＰＰへと分化させるステップを含む方法を提供する。さらに、本発明は、多能性幹細胞由来のｉＭＰＰを発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のｉＨＥを、ｉＭＰＰへと分化させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。本明細書で開示される方法は、ＥＢの形成を伴わない、最適化された単層ｉＣＤ３４培養プラットフォームであって、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培養プラットフォームを活用する。
【０２５４】
造血複能性前駆体（ｉＭＰＰ）を、多能性幹細胞から作製する方法についての一実施形態では、方法は、（１）多能性細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から分化させ、拡大するステップと；（２）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎｔ経路活性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得るステップと；（３）細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細胞から分化させ、拡大するステップと；（４）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、任意選択で、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｉＭＰＰへと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法は、細胞を、ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞を播種し、拡大するステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ＨＳＣへと分化させるステップをさらに含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ＨＳＣへと分化させるステップを含む方法は、ｐｒｅ−ＨＳＣ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まないか、またはこれを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ−ＨＳＣを、ｉＭＰＰへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、上記の方法は、播種された多能性幹細胞、中胚葉、および／または二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３���陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２またはチアゾビビンである。
【０２５５】
多能性幹細胞由来の複能性前駆体（ｉＭＰＰ）を、多能性幹細胞由来の中胚葉から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎｔ経路活性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得るステップと；（２）細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞から分化させ、拡大するステップと；（３）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、任意選択で、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｉＭＰＰへと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ＨＳＣへと分化させるステップをさらに含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ＨＳＣへと分化させるステップを含む方法は、ｐｒｅ−ＨＳＣ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まないか、またはこれを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ−ＨＳＣを、ｉＭＰＰへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、上記の方法は、中胚葉および／または二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。
【０２５６】
多能性幹細胞由来の複能性前駆体（ｉＭＰＰ）を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）細胞を、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から分化させ、拡大するステップと；（２）ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、任意選択で、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｉＭＰＰへと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ＨＳＣへと分化させるステップをさらに含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ＨＳＣへと分化させるステップを含む方法は、ｐｒｅ−ＨＳＣ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まないか、またはこれを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ−ＨＳＣを、ｉＭＰＰへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、上記の方法は、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。
【０２５７】
多能性幹細胞由来の複能性前駆体（ｉＭＰＰ）を、多能性幹細胞由来の二次ＨＥ細胞から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、任意選択で、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｉＭＰＰへと分化させるステップを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ＨＳＣへと分化させるステップをさらに含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ＨＳＣへと分化させるステップを含む方法は、ｐｒｅ−ＨＳＣ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まないか、またはこれを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ−ＨＳＣを、ｉＭＰＰへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。一部の実施形態では、上記の方法は、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。
【０２５８】
５．多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−Ｔ）またはＴ細胞を導出すること（ｉＣＤ３４プラットフォームおよびｉＴプラットフォーム）
本発明の一態様は、最適化された多段階工程を使用して、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−Ｔ）または多能性幹細胞由来のＴ細胞を発生させる方法を提供する。一般に、方法は、中胚葉細胞を、分化させ、拡大する多能性幹細胞で始まる。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。次いで、中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させる。その後、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、二次造血性内皮へと分化させ、同時に、培地中で、これらを拡大する。次いで、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ｐｒｏＴへと分化させ、次いで、Ｔ細胞前駆体（ｐｒｏ−Ｔ）へと分化させ、同じ培地中で、これらを、引き続き、Ｔ細胞へと分化させることができる。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−Ｔ）またはＴ細胞を発生させる方法であって、播種された多能性幹細胞を、中胚葉へと分化させ、中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させ、次いで、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、ｉＨＥへと分化させ、次いで、これらを、Ｔ細胞前駆体またはＴ細胞へと分化させるステップを含む方法を提供する。本発明は、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−Ｔ）またはＴ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させ、次いで、これらを、ｉＨＥへと分化させ、次いで、これらを、ｉｐｒｏ−ＴまたはＴ細胞へと分化させるステップを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体またはＴ細胞を発生させる方法であって、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ｉＨＥへと分化させ、次いで、これらを、ｉｐｒｏ−ＴまたはＴ細胞へと分化させるステップを含む方法を提供する。さらに、本発明は、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−Ｔ）またはＴ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のｉＨＥを、ｉｐｒｏ−ＴまたはＴ細胞へと分化させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。本明細書で開示される方法は、最適化されたｉＣＤ３４培養プラットフォームであって、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培養プラットフォームを活用する。一部の実施形態では、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、およびＤＬＬ−４を含むがこれらに限定されないＮｏｔｃｈ因子を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。
【０２５９】
多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−Ｔ）またはＴ細胞（ｉＴ）を、多能性幹細胞から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む培地と接触させることにより、播種された多能性幹細胞を、中胚葉へと分化させるステップと；（２）細胞を、ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎｔ経路活性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させることにより、中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させるステップと；（３）細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、二次ＨＥ細胞へと分化させるステップと；（４）ＨＥ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、任意選択で、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子からなる群から選択される、１または複数の因子と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｉｐｒｏ−ＴまたはｉＴへと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、上記の方法は、細胞を、ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含む培地と接触させることにより、多能性幹細胞を播種し、拡大するステップをさらに含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦからなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ｐｒｏＴへと分化させるステップをさらに含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ｐｒｏＴへと分化させるステップを含む方法は、ｐｒｅ−ｐｒｏＴ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ−ｐｒｏＴを、ｉｐｒｏ−ＴまたはｉＴへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、多能性幹細胞由来のｐｒｏ−Ｔを、１または複数のＮｏｔｃｈ因子と共にステップを含む。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、またはＤＬＬ−４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ−１およびＤＬＬ−４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。一部の実施形態では、上記の方法は、播種された多能性幹細胞、中胚葉、および／または二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２またはチアゾビビンである。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。
【０２６０】
多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−Ｔ）またはＴ細胞を、多能性幹細胞由来の中胚葉から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）細胞を、ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎｔ経路活性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させることにより、中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させるステップと；（２）細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、二次ＨＥ細胞へと分化させるステップと；（３）ＨＥ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、任意選択で、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子からなる群から選択される、１または複数の因子と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｉｐｒｏ−ＴまたはｉＴへと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦからなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ｐｒｏＴへと分化させるステップをさらに含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ｐｒｏＴへと分化させるステップを含む方法は、ｐｒｅ−ｐｒｏＴ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ−ｐｒｏＴを、ｉｐｒｏ−ＴまたはｉＴへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、多能性幹細胞由来のｐｒｏ−Ｔを、１または複数のＮｏｔｃｈ因子と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、またはＤＬＬ−４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ−１およびＤＬＬ−４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。一部の実施形態では、上記の方法は、中胚葉および／または二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２またはチアゾビビンである。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。
【０２６１】
多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−Ｔ）またはＴ細胞（ｉＴ）を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、二次ＨＥ細胞へと分化させるステップと；（２）ＨＥ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、任意選択で、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子からなる群から選択される、１または複数の因子と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｉｐｒｏ−ＴまたはｉＴへと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦからなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ｐｒｏＴへと分化させるステップをさらに含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ｐｒｏＴへと分化させるステップを含む方法は、ｐｒｅ−ｐｒｏＴ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ−ｉｐｒｏＴを、ｉｐｒｏ−ＴまたはｉＴへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、多能性幹細胞由来のｐｒｏ−Ｔを、１または複数のＮｏｔｃｈ因子と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、またはＤＬＬ−４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ−１およびＤＬＬ−４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。一部の実施形態では、上記の方法は、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２またはチアゾビビンである。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ���容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。
【０２６２】
多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−Ｔ）またはＴ細胞（ｉＴ）を、多能性幹細胞由来のＨＥ細胞から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、二次ＨＥ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、任意選択で、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子からなる群から選択される、１または複数の因子と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｉｐｒｏ−ＴまたはＴへと分化させるステップを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦからなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ｐｒｏＴへと分化させるステップをさらに含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ｐｒｏＴへと分化させるステップを含む方法は、ｐｒｅ−ｐｒｏＴ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ−ｉｐｒｏＴを、ｐｒｏ−ＴまたはｉＴへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、多能性幹細胞由来のｐｒｏ−Ｔを、１または複数のＮｏｔｃｈ因子と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ因子は、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、またはＤＬＬ−４である。一部の実施形態では、ＤＬＬ−１およびＤＬＬ−４を、可溶性ペプチド、ビーズへとコンジュゲートさせたペプチド、表面へとコンジュゲートさせたペプチド、または細胞により提示されたペプチドとして導入することができる。一部の実施形態では、上記の方法は、多能性幹細胞由来のＨＥ細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２またはチアゾビビンである。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。
【０２６３】
６．多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−ＮＫ）またはＮＫ細胞を得ること（ｉＣＤ３４プラットフォームおよびｉＮＫプラットフォーム）
本発明の一態様は、最適化された多段階工程を使用して、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−ＮＫ）またはＮＫ細胞（ｉＮＫ）を発生させる方法を提供する。一般に、方法は、一部の実施形態では、播種される、多能性幹細胞で始まる。多能性幹細胞を、中胚葉細胞へと発生させ、これらを拡大し、その後、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させる。次いで、二次造血性内皮を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞から、分化させ、拡大する。ＨＥ細胞は、ｐｒｅ−ｐｒｏＮＫへと分化させ、次いで、ＮＫ細胞前駆体（ｐｒｏ−ＮＫ）へと分化させることが可能であり、同じ培地中で、これらを、引き続き、ＮＫ細胞へと分化させることができる。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−ＮＫ）またはＮＫ細胞を発生させる方法であって、播種された多能性幹細胞を、中胚葉へと分化させ、中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させ、次いで、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、ｉＨＥへと分化させ、次いで、これらを、ＮＫ細胞前駆体へと分化させるステップを含む方法を提供する。本発明は、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−ＮＫ）またはＮＫ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来の中胚葉を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞へと分化させ、次いで、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、ｉＨＥへと分化させ、次いで、これらを、ｉｐｒｏ−ＮＫまたはｉＮＫへと分化させるステップを含む方法をさらに提供する。代替的に、本発明は、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体またはｉＮＫを発生させる方法であって、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞を、ｉＨＥへと分化させ、次いで、これらを、ｉｐｒｏ−ＮＫまたはｉＮＫへと分化させるステップを含む方法を提供する。さらに、本発明は、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−ＮＫ）またはＮＫ細胞を発生させる方法であって、多能性幹細胞由来のｉＨＥを、ｉｐｒｏ−ＮＫまたはｉＮＫへと分化させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ＮＫ細胞前駆体を得るための培養プラットフォームは、ｐｒｏ−ＮＫ細胞を、ＮＫの増殖、発生、および成熟を刺激する人工抗原であって、ビーズコンジュゲーション、細胞膜粒子、および／または抗原提示細胞の形態で導入される人工抗原のうちの１または複数と接触させることにより、ＮＫ細胞を導出するステップを含む。本明細書で開示される方法は、最適化されたｉＣＤ３４培養プラットフォームであって、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培養プラットフォームを活用する。
【０２６４】
多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−ＮＫ）またはＮＫ細胞（ｉＮＫ）を、播種されたｉＰＳＣから発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ｂＦＧＦとを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞を、多能性幹細胞から分化させ、拡大するステップと；（２）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎｔ経路活性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させることにより、中胚葉細胞内の、二次造血性内皮のポテンシャルを得るステップと；（３）細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞から分化させ、拡大するステップと；（４）ＨＥ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、任意選択で、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子からなる群から選択される、１または複数の因子と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｉｐｒｏ−ＮＫまたはｉＮＫへと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦからなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ｉｐｒｏＮＫへと分化させるステップをさらに含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ｐｒｏＮＫへと分化させるステップを含む方法は、ｐｒｅ−ｐｒｏＮＫ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ−ｐｒｏＮＫを、ｐｒｏ−ｉＮＫまたはｉＮＫへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＮＫ細胞前駆体を得るための培養プラットフォームは、ｐｒｏ−ＮＫ細胞を、ＮＫの増殖、発生、および成熟を刺激する人工抗原であって、ビーズコンジュゲーション、細胞膜粒子、および／または抗原提示細胞の形態で導入される人工抗原のうちの１または複数と接触させることにより、ＮＫ細胞を導出するステップを含む。一実施形態では、上記の方法は、多能性細胞を、ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含む培地と接触させることにより、ナイーブ多能性細胞を播種し、拡大するステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法は、播種されたｉＰＳＣ、中胚葉、および／または二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２またはチアゾビビンである。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。
【０２６５】
多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−ＮＫ）またはＮＫ細胞（ｉＮＫ）を、多能性幹細胞由来の中胚葉から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）中胚葉を、ＢＭＰ活性化因子、Ｗｎｔ経路活性化因子、およびｂＦＧＦを含む培地と接触させることにより中胚葉を分化させ、二次造血性内皮のポテンシャルを有する中胚葉細胞を得るステップと；（２）細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を分化させ、二次ＨＥ細胞を得るステップと；（３）ＨＥ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、任意選択で、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子からなる群から選択される、１または複数の因子と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることにより二次ＨＥ細胞を分化させ、ｉｐｒｏ−ＮＫまたはｉＮＫを得るステップとを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦからなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ｐｒｏＮＫへと分化させるステップをさらに含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ｐｒｏＮＫへと分化させるステップを含む方法は、ｐｒｅ−ｐｒｏＮＫ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ−ｐｒｏＮＫを、ｉｐｒｏ−ＮＫまたはｉＮＫへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＮＫ細胞前駆体を得るための培養プラットフォームは、ｐｒｏ−ＮＫ細胞を、ＮＫの増殖、発生、および成熟を刺激する人工抗原であって、ビーズコンジュゲーション、細胞膜粒子、および／または抗原提示細胞の形態で導入される人工抗原のうちの１または複数と接触させることにより、ＮＫ細胞を導出するステップを含む。一部の実施形態では、上記の方法は、中胚葉および／または二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２またはチアゾビビンである。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。
【０２６６】
多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−ＮＫ）またはＮＫ細胞（ｉＮＫ）を、二次造血性内皮のポテンシャルを伴う、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、（１）二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を分化させ、拡大するステップと；（２）ＨＥ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、任意選択で、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子からなる群から選択される、１または複数の因子と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｉｐｒｏ−ＮＫまたはｉＮＫへと分化させるステップとを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦからなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ｉｐｒｏ−ＮＫへと分化させるステップをさらに含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ｐｒｏ−ＮＫへと分化させるステップを含む方法は、ｐｒｅ−ｐｒｏＮＫ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ−ｐｒｏＮＫを、ｉｐｒｏ−ＮＫまたはｉＮＫへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＮＫ細胞前駆体を得るための培養プラットフォームは、ｐｒｏ−ＮＫ細胞を、ＮＫの増殖、発生、および成熟を刺激する人工抗原であって、ビーズコンジュゲーション、細胞膜粒子、および／または抗原提示細胞の形態で導入される人工抗原のうちの１または複数と接触させることにより、ＮＫ細胞を導出するステップを含む。一部の実施形態では、上記の方法は、播種された多能性幹細胞、中胚葉、および／または二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２またはチアゾビビンである。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。
【０２６７】
多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏ−ＮＫ）またはＮＫ細胞（ｉＮＫ）を、多能性幹細胞由来のＨＥ細胞から発生させる方法についての一実施形態では、方法は、二次ＨＥ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数と、任意選択で、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子からなる群から選択される、１または複数の因子と、ＲＯＣＫ阻害剤とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｉｐｒｏ−ＮＫまたはｉＮＫへと分化させるステップを含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一部の実施形態では、上記の方法は、ＨＥ細胞を、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦからなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数とを含む培地と接触させることにより、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ｉｐｒｏＮＫへと分化させるステップをさらに含む。他の実施形態では、二次ＨＥ細胞を、ｐｒｅ−ｉｐｒｏ−ＮＫへと分化させるステップを含む方法は、ｐｒｅ−ｐｒｏＮＫ細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される増殖因子およびサイトカインのうちの１または複数を含み、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まないか、またはこれらを本質的に含まない培地と接触させることにより、ｐｒｅ−ｐｒｏＮＫを、ｉｐｒｏ−ＮＫまたはｉＮＫへと分化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＮＫ細胞前駆体を得るための培養プラットフォームは、ｉｐｒｏ−ＮＫ細胞を、ＮＫの増殖、発生、および成熟を刺激する人工抗原であって、ビーズコンジュゲーション、細胞膜粒子、および／または抗原提示細胞の形態で導入される人工抗原のうちの１または複数と接触させることにより、ＮＫ細胞を導出するステップを含む。一部の実施形態では、上記の方法は、播種された多能性幹細胞、中胚葉、および／または二次造血性内皮のポテンシャルを伴う中胚葉細胞を、約２％〜約１０％の間の低酸素圧下に置くステップをさらに含む。一部の実施形態では、上記の方法から得られたｉＨＥ細胞は、ＣＤ３４を発現する。一部の実施形態では、上記の方法は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用して、得られたｉＨＥ細胞をソートするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートするステップは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。一部の実施形態では、方法のＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ４である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、ＧＳＫ３阻害剤である。一部の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２またはチアゾビビンである。一部の実施形態では、上記の方法における培地は、ＴＧＦβ受���体阻害剤を含まないか、またはこれらを本質的に含まない。
【０２６８】
上記に照らすと、本明細書で想定される培養プラットフォームにより提示される利点のうちの１つは、多能性幹細胞の分化のためのＥＢの形成を伴わずに、単一多能性細胞を培養し、継代培養し、解離させることによる生存率および生存の増強である。一部の実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣである。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。単一細胞懸濁液への解離など、細胞の、単一細胞への解離は、酵素的手段または機械的手段により達することができる。本発明の方法では、細胞の、単一細胞への解離を可能とすることが当技術分野で公知である、任意の酵素的薬剤を使用することができる。一実施形態では、解離剤を、トリプシン／ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ−Ｓｅｌｅｃｔ、コラゲナーゼＩＶ、およびディスパーゼから選択する。また、ＥＤＴＡ、Ａｃｃｕｔａｓｅ、またはＡｃｃｕＭａｘなどのキレート剤も、本明細書で想定される方法に従う細胞の解離において、単独で、または酵素的薬剤と組み合わせて、使用することができる。解離剤は、単一細胞への解離を容易とするように、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ中に溶解させることができる。一部の実施形態では、解離の間および解離後における細胞の生存を増強するために、生存促進物質、例えば、１または複数の増殖因子、細胞死およびアポトーシスに関与する細胞経路の阻害剤、または馴化培地を添加する。一実施形態では、生存促進物質は、チアゾビビンを含むがこれらに限定されない、ＲＯＣＫ阻害剤である。
【０２６９】
細胞培養および培地回収における技法については、Huら、Curr.  Opin.  Biotechnol.、８巻：１４８頁、１９９７年；K.  Kitano、Biotechnology、１７巻：７３頁、１９９１年；Curr.  Opin.  Biotechnol.、２巻：３７５頁、１９９１年；Birchら、Bioprocess  Technol.、１９巻：２５１頁、１９９０年；「Teratocarcinomas  and  embryonic  stem  cells:  A  practical  approach」（E.  J.  Robertson編、IRL  Press  Ltd.、１９８７年）；「Guide  to  Techniques  in  Mouse  Development」（P.  M.  Wassermanら編、Academic  Press、１９９３年）；「Embryonic  Stem  Cell  Differentiation  in  vitro」（M.  V.  Wiles、Meth.  Enzymol.、２２５巻：９００頁、１９９３年）；「Properties  and  uses  of  Embryonic  Stem  Cells:  Prospects  for  Application  to  Human  Biology  and  Gene  Therapy」（P.  D.  Rathjenら、１９９３年）において概括されている。幹細胞の分化については、Robertson、Meth.  Cell  Biol.、７５巻：１７３頁、１９９７年；およびPedersen、Reprod.  Fertil.  Dev.、１０巻：３１頁、１９９８年において総説されている。
【０２７０】
本発明では、特異的特徴付けにより細胞の集団を濃縮するための戦略が、方法の多様な段階で提供される。一実施形態では、多能性幹細胞を、細胞集団から濃縮する方法は、集団内の細胞を解離させることにより、単一細胞懸濁液を制作するステップと、細胞を再懸濁させるステップとを含む。解離させた細胞は、細胞を維持するか、または細胞ソートを実施するのに適する、任意の溶液中または培地中に再懸濁させることができる。特定の実施形態では、多能性単一細胞懸濁液は、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤を含有し、ＴＦＧβ阻害剤を欠く。ある特定の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１であり、かつ／またはＲｏｃｋ阻害剤は、チアゾビビンである。
【０２７１】
特定の実施形態では、多能性細胞をポジティブに選択するように、細胞の集団をソートし、かつ／または集団から、再プログラム化されていないか、もしくは非多能性細胞を枯渇させ、これにより、多能性細胞について濃縮された細胞の集団を得る。一実施形態では、単一細胞懸濁液を調製し、次いで、例えば、適切な抗体を使用して多能性のマーカーについて染色することなどによりソートするための単一細胞を調製する。細胞は、磁気ビーズソートまたはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）ソートなどにより細胞をソートする、任意の適切な方法によりソートすることができる。
【０２７２】
細胞は、限定せずに述べると、ＳＳＥＡ３／４、ＴＲＡ１−６０／８１、ＴＲＡ１−８５、ＴＲＡ２−５４、ＧＣＴＭ−２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＳＳＥＡ１（マウス）、ＣＤ３０、ＳＳＥＡ５、ＣＤ９０、および／またはＣＤ５０の発現を含む、多能性についての１もしくは複数のマーカー、または細胞の分化を指し示すマーカーに基づきソートすることができる。様々な実施形態では、細胞を、多能性または分化についての、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのマーカーに基づきソートする。ある特定の実施形態では、細胞は、ＳＳＥＡ４の発現に基づきソートし、ある特定の実施形態では、ＴＲＡ１−８１および／またはＴＲＡ１−６０と組み合わせた、ＳＳＥＡ４の発現に基づきソートする。ある特定の実施形態では、細胞を、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−８１、またはＴＲＡ１−６０、および／またはＣＤ３０の発現に基づきソートする。一実施形態では、細胞を、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−８１、およびＣＤ３０に基づきソートする。別の実施形態では、細胞を、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０、およびＣＤ３０に基づきソートする。ある特定の実施形態では、分化についての１または複数の表面マーカーを使用する細胞のソートは、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６およびＣＤ７、ならびにＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−８１、および／またはＣＤ３０などの多能性マーカーを含むがこれらに限定されない。
【０２７３】
一部の実施形態では、再プログラム化を経る細胞の集団、または多能性細胞の集団は、分化した細胞から枯渇される。一実施形態では、多能性細胞の集団、または再プログラム化するように誘導された細胞は、分化した細胞についての、１または複数の細胞表面マーカーを有する細胞から枯渇され得る。分化する細胞についての細胞表面マーカーの例示的な例は、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６、およびＣＤ７を含むがこれらに限定されない。特定の実施形態では、ＣＤ１３を、分化細胞についての表面マーカーとして使用する。
【０２７４】
他の実施形態では、細胞の集団を、所望の系統へと分化するように誘導し、多能性細胞を枯渇させて、濃縮された分化しているか、または分化した細胞の集団を得る。一部の実施形態では、分化した細胞の集団は、特異的系統へと分化するように誘導されたＥＳＣまたはｉＰＳＣなどの細胞の集団を含む。一部の実施形態では、上記で記載したネガティブ細胞ソート法（「パニング」）、など、多能性のマーカーに基づく磁気ビーズまたはＦＡＣＳに従う、集団内の細胞のソートを使用して、細胞の集団から、多能性細胞を枯渇させることができる。一部の実施形態では、分化細胞を含む細胞の集団を、多能性マーカーを使用するＦＡＣＳによりソートし、多能性マーカーを発現する細胞を枯渇させた画分を得る。他の実施形態では、細胞の集団を、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６、およびＣＤ７を含むがこれらに限定されない系統特異的マーカーなど、分化についてのマーカーに基づくＦＡＣＳによりソートして、多能性のマーカーを枯渇させた画分を得る。本発明の一部の特定の実施形態では、ＣＤ１３を、分化細胞についての表面マーカーとして使用する。
【０２７５】
Ｄ．本明細書で提示される方法およびプラットフォームにより発生させた細胞集団および細胞株
一部の実施形態では、再プログラム化の後で培養した細胞を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３５、４０、４２、もしくは４５日間、またはこれらの間の任意の日数にわたり、分化するように誘導する。一部の実施形態では、再プログラム化の後で培養した細胞を、約１〜４２日間、２〜４０日間、２〜３５日間、２〜２０日間、２〜１０日間、４〜３０日間、約４〜２４日間、約６〜２２日間、または約８〜約１２日間にわたり誘導する。一部の実施形態では、細胞は、ｉＰＳＣを含む多能性幹細胞である。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、ナイーブｉＰＳＣである。一実施形態では、濃縮は、クローン多能性幹細胞由来の分化細胞コロニーを、比較的短時間で得、これにより、多様な段階にある、多能性幹細胞由来の分化細胞を発生させる効率を改善するための方法をもたらす。一実施形態では、濃縮は、ＣＤ３４を発現するＨＥ細胞、ＣＤ３４を発現するＨＳＣ細胞、Ｔ細胞前駆体またはＮＫ細胞前駆体、およびＴ細胞またはＮＫ細胞を導出し、これにより、細胞集団の各々を発生させる効率を改善するための方法をもたらす。濃縮は、分化段階／細胞型を示す特異的な特徴的マーカーを発現する細胞を識別し、得るように、細胞の集団をソートすることを含みうる。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７３、および／またはＣＸＣＲ４を使用する。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性を使用する。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性およびＣＤ４３陰性を使用する。一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、およびＣＤ７３陰性を使用する。他の一部の実施形態では、ソートすることは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陰性、ＣＤ７３陰性、およびＣＸＣＲ４陰性を使用する。さらなる濃縮法は、所望されない細胞型を表すマーカーを発現する細胞の枯渇であって、所望される細胞型の、濃縮された集団を得る枯渇を含む。
【０２７６】
従って、本発明の一態様は、（ｉ）多能性幹細胞由来のＣＤ３４＋  ＨＥ細胞（ｉＣＤ３４）であって、上記ｉＣＤ３４細胞が、複能性前駆細胞へと分化する能力を有し、ＣＤ３４＋  ＣＤ４３−である、ＣＤ３４＋  ＨＥ細胞；（ｉｉ）多能性幹細胞由来の二次造血性内皮（ｉＨＥ）であって、上記ｉＨＥ細胞株またはクローン細胞がＣＤ３４＋である、二次造血性内皮；（ｉｉｉ）多能性幹細胞由来の二次ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）であって、ＣＤ３４＋  ＣＤ４５＋であり、長期にわたる生着に適するｉＨＳＣ；（ｉｖ）多能性幹細胞由来の複能性前駆細胞（ｉＭＰＰ）であって、上記ｉＭＰＰ細胞がＣＤ３４＋  ＣＤ４５＋である、複能性前駆細胞；（ｖ）多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆体（ｉｐｒｏＴ）であって、ＣＤ３４＋  ＣＤ７＋であるＴ細胞前駆体；（ｖｉ）多能性幹細胞由来のＴ細胞（ｉＴＣ）であって、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋であるＴ細胞；（ｖｉｉ）多能性幹細胞由来のＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏＮＫ）であって、ＣＤ５６＋  ＣＤ３−であるＮＫ細胞前駆体；ならびに（ｖｉｉｉ）多能性幹細胞由来のＮＫ細胞（ｉＮＫ）であって、ＣＤ５６＋ＣＤ５７＋ＣＤ１６＋であるＮＫ細胞の、１または複数の細胞集団、細胞株、またはクローン細胞を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、上記の組成物、細胞集団、細胞株、またはクローン細胞は、低温保存に適する。一部の実施形態では、組成物、細胞集団、細胞株、またはクローン細胞は、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間を超えるが、３日間、４日間、５日間、６日間、または１週間を超えない期間にわたる周囲保存条件に適する。
【０２７７】
本発明の別の態様は、（ｉ）ＣＤ３４＋  ＨＥ細胞（ｉＣＤ３４）、ならびにｉＭＰＰ−Ａ、ｉＴＣ−Ａ１、ｉＴＣ−Ａ２、ｉＴＣ−Ｂ１、ｉＴＣ−Ｂ２、ｉＮＫ−Ａ１、ｉＮＫ−Ａ２、ｉＮＫ−Ｂ１、およびｉＮＫ−Ｂ２から選択される、１もしくは複数の培養培地；（ｉｉ）二次造血性内皮（ｉＨＥ）、ならびにｉＭＰＰ−Ａ、ｉＴＣ−Ａ１、ｉＴＣ−Ａ２、ｉＴＣ−Ｂ１、ｉＴＣ−Ｂ２、ｉＮＫ−Ａ１、ｉＮＫ−Ａ２、ｉＮＫ−Ｂ１、およびｉＮＫ−Ｂ２から選択される、１もしくは複数の培養培地；（ｉｉｉ）二次ＨＳＣ、ならびにｉＭＰＰ−Ａ、ｉＴＣ−Ａ１、ｉＴＣ−Ａ２、ｉＴＣ−Ｂ１、ｉＴＣ−Ｂ２、ｉＮＫ−Ａ１、ｉＮＫ−Ａ２、ｉＮＫ−Ｂ１、およびｉＮＫ−Ｂ２から選択される、１もしくは複数の培養培地；（ｉｖ）複能性前駆細胞（ｉＭＰＰ）およびｉＭＰＰ−Ａ；（ｖ）Ｔ細胞前駆体（ｉｐｒｏＴ）、ならびにｉＴＣ−Ａ１、ｉＴＣ−Ａ２、ｉＴＣ−Ｂ１、およびｉＴＣ−Ｂ２から選択される、１もしくは複数の培養培地；（ｖｉ）Ｔ細胞（ｉＴＣ）、およびｉＴＣ−Ｂ１もしくはｉＴＣ−Ｂ２；（ｖｉｉ）ＮＫ細胞前駆体（ｉｐｒｏＮＫ）、ならびにｉＮＫ−Ａ１、ｉＮＫ−Ａ２、ｉＮＫ−Ｂ１、およびｉＮＫ−Ｂ２から選択される、１もしくは複数の培養培地；ならびに／または（ｖｉｉｉ）ＮＫ細胞（ｉＮＫ）、およびｉＮＫ−Ｂ１もしくはｉＮＫ−Ｂ２；（ｉｘ）ＨＳＣ（ｉＨＳＣ）、ならびにｉＨＳＣ−Ａ、ｉＨＳＣ−Ｂ、およびｉＨＳＣ−Ｃに由来する多能性幹細胞のうちの１または複数を含む混合物であって、
ａ．ｉＨＳＣ−Ａが、Ｗｎｔ経路活性化因子およびＢＭＰ活性化因子を含み；
ｂ．ｉＨＳＣ−Ｂが、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＢＭＰ活性化因子と、任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含み；
ｃ．ｉＨＳＣ−Ｃが、ＢＭＰ活性化因子と、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＧＦ、およびＴＰＯからなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含む。一部の実施形態では、組成物が、Ｗｎｔ経路活性化因子と、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤とを含まず；
ｄ．ｉＴＣ−Ａ１が、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、およびＤＬＬ−４からなる群から選択される、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含み；一部の実施形態では、組成物が、ＶＥＧＦおよび／またはＩＬ１５を含まず；
ｅ．ｉＴＣ−Ｂ１が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、およびＩＬ６からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインと、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ−１、ＤＬＬ−３、およびＤＬＬ−４からなる群から選択される、１または複数のＮｏｔｃｈ経路活性化因子とを含み（ｉＨＳＣプラットフォーム）；一部の実施形態では、組成物が、ＢＭＰ活性化因子を含まず；
ｆ．ｉＮＫ−Ａ１が、ＢＭＰ活性化因子と、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＶＥＧＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；
ｇ．ｉＮＫ−Ｂ１が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ７、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み；
ｈ．ｉＣＤ３４−Ｃが、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まず；
ｉ．ｉＭＰＰ−Ａが、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；
ｊ．ｉＴＣ−Ａ２が、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦと；ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；
ｋ．ｉＴＣ−Ｂ２が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含み；組成物が、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１または複数を含まず；
ｌ．ｉＮＫ−Ａ２が、ＢＭＰ活性化因子と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦと、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインとを含み；
ｍ．ｉＮＫ−Ｂ２が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される、１または複数の増殖因子およびサイトカインを含む
混合物を提供する。
【実施例】
【０２７８】
以下の実施例は、例示を目的として提示されるものであり、限定を目的として提示されるものではない。
【０２７９】
（実施例１）
ｈｉＰＳＣの発生および維持
ＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＬａｒｇｅＴ、ＯＣＴ４／ＳＯＸ２、またはＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＮＡＮＯＧ／ＬａｒｇｅＴを含む多様な因子の組合せを、ＲＯＣＫ経路阻害剤、ＭＥＫ経路阻害剤、ＧＳＫ３経路阻害剤、およびＴＧＦβ受容体阻害剤を含有する再プログラム化培地（Valamehrら、Sci  Rep.、２０１２年、２巻：２１３頁）の存在下で使用して、線維芽細胞および血液細胞を含む体細胞を、多能性状態へと再プログラム化するように誘導した。誘導の１４日後、再プログラム化集団を、ＲＯＣＫ経路阻害剤、ＧＳＫ３経路阻害剤、およびＭＥＫ経路阻害剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含有する維持培地（Valamehrら、Stem  Cell  Reports、２０１４年、２巻（３号）：３６６〜３８１頁）へと切り換えた。細胞を、無制限に、維持培地中で保った。
【０２８０】
誘導のおよそ３週間後、再プログラム化集団を、９６ウェルプレートの個々のウェルへとソートした。選択されたクローンを特徴付け、完全に再プログラム化されたクローンであって、ナイーブｈｉＰＳＣを表すクローンを、分化研究のために選択した（Valamehrら、Stem  Cell  Reports、２０１４年、２巻（３号）：３６６〜３８１頁）。維持の間および分化後における未分化細胞パーセントを決定するために、フローサイトメトリー解析を、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１８１、およびＣＤ３０の同時表面発現について行った。
【０２８１】
（実施例２）
ｉＨＳＣ培養プラットフォームを使用する造血分化
造血系統細胞への分化を誘発するために、ナイーブｈｉＰＳＣを、維持培地中単層として播種し、およそ２５％のコンフルエンシーに達するまで拡大させた。この時点で、培養培地を、ｉＨＳＣ−Ａへと切り換えることにより、造血分化を誘発した（図１を参照されたい）。図１に例示される通り、その後、分化の誘発の４８時間後に、培養物を、ｉＨＳＣ−Ｂへと切り換えるのに続き、分化の誘発の４〜５日目に、ｉＨＳＣ−Ｃへと切り換えた。付着培養物は、接着させたまま維持し、培地交換の間に撹乱しなかった。
【０２８２】
分化工程中の早期に、指向性分化を、系統マーカーである、ＣＤ５７、ＮＥＳＴＩＮ、ＳＯＸ１７、およびＢＲＡＣＨＹＵＲＹによりモニタリングした。図３は、指向性分化による、外胚葉系統から離れ、中胚葉系統に向かうシフトを示す。後続の分化段階を通して、造血細胞のクラスターと類似する形態である丸い細胞（図４Ａ）、ｈｉＰＳＣ関連表面マーカーの喪失（図４Ｂ）、ならびにＢｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＤ３４、ＣＸＣＲ４、およびＣＤ４５など、表面マーカーの出現（図４Ｃおよび４Ｄ）からなるｈｉＰＳＣ形態が、分化集団へと付与された。９日目（この時点は、最適には１４日目まで延長されうる）に、細胞を、単一細胞へと解離させ、ＣＤ３４およびＣＤ４５の表面発現について解析した（図５Ａ〜５Ｃ）。単一細胞の解離は、最も一般的にはＡｃｃｕｔａｓｅによって支援され、４０μｍのメッシュを通して濾過して単一細胞を回収した。ＦＡＣＳ  ＡｒｉａまたはＭＡＣＳによる濃縮を使用して、ＣＤ３４陽性細胞またはＣＤ３４およびＣＤ４５陽性細胞を、さらなる処理および試験のために回収した。
【０２８３】
（実施例３）
ｉＨＳＣ培養プラットフォームを使用する分化に続く、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける特徴付けおよび試験
分化させた二次造血幹細胞の拡大可能性およびそれが維持されるかを決定するため、ＣＤ３４でソートまたは濃縮された集団を、Ｓｔｅｍｓｐａｎ造血幹細胞培養培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）、１×ＣＣ１１０サプリメント（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、および５μＭのチアゾビビンまたは１０μＭの２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を補充した（最初の数日間、生存を改善するために培養中に）懸濁培養物へと移した。培養に、新鮮培地を、隔日でフィードし、ピペッティングして、ＣＤ３４陽性でソートされた細胞の分裂から生じる凝集物をバラバラにした。数週間培養した後、スケーリングされた懸濁培養を、表面マーカーの発現および生細胞数によって評価および測定した。図８で裏付けられる通り、ＣＤ３４ソート集団は、ＣＤ３４集団の喪失を最小限として、培養で２２日間にわたり維持された。懸濁培養物の生存率を改善するために、ＲＯＣＫ経路の低分子阻害剤を添加した。図７は、ＲＯＣＫ阻害の存在下における、単一細胞解離物の継代培養後の細胞の生存および増殖を示す。図６Ａ〜６Ｃは、図１に記載される分化法の改善であって、単層培養およびＥＢ培養の両方へと適用された改善を示すが、単層フォーマットでは、ＥＢにより介在される分化と比較して、より高パーセントのＣＤ３４細胞が存在することが示された。
【０２８４】
（実施例４）
ｉＨＳＣ培養プラットフォームを使用する分化に続く、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける再構成
導出された二次造血幹細胞の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能性および生着のポテンシャルを示すために、上記で記載したｈｉＰＳＣ分化工程から導出されたＣＤ３４陽性細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａを使用してソートするか、またはＭＡＣＳビーズを使用して濃縮した。回収された細胞を、トリパンブルー染色によりカウントして、生存率を決定した。およそ３０，０００個のＣＤ３４陽性生細胞を、ＨＢＳＳ中に再懸濁させ、眼窩後注射を介して、ＮＳＧマウスへと導入した。ＮＳＧマウスは、生着研究の前に、致死線量未満の３００ｒａｄで、２４時間にわたり照射した。加えて、ソートされていない分化集団（最大で２５０，０００個）のほか、ヒト末梢血もまた、対照として、ＮＳＧマウスへと導入した。２週間ごとに、マウスから採血し、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、およびＣＤ３を含むヒト特異的マーカーを使用して、ヒト血液の寄与について評価した。図９Ａは、ヒトＣＤ４５マーカーをもっぱら発現する細胞の存在と共に見られる通り、生着したＣＤ３４陽性細胞の、１２週間にわたる再構成を裏付ける。データはまた、骨髄系集団およびリンパ系集団の両方を発生させる、生着細胞の多系統能も示す。図９Ｂは、Ｔ細胞およびＢ細胞の両方を伴う、ＣＤ３４＋細胞の、１８週間にわたる再構成を裏付ける。
【０２８５】
（実施例５）
ｉＨＳＣ培養プラットフォームを使用する分化に続く、低分子モジュレーション
薬理学的モジュレーションに応答する、ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４陽性二次造血幹細胞の能力について評価するため、ＣＤ３４でソートまたは濃縮された細胞を、公知のモジュレーターで処理した。３７℃で一晩にわたるインキュベーションの後、ＣＤ３４陽性細胞を、表面ＰＤＬ１発現の上方調節を含む薬理学的応答についてフローサイトメトリーにより評価した。媒体対照と比較して、優により多く処理されたＣＤ３４細胞は、開示される方法を使用して、ナイーブｈｉＰＳＣから導出されたＣＤ３４陽性細胞の、免疫調節潜在力の指標である、集団全般の全発現の増大に加えて、ＰＤＬ１表面タンパク質の上方調節（図１１を参照されたい）を裏付けた。
【０２８６】
（実施例６）
ｉＨＳＣ培養プラットフォームを使用する分化に続く、特異的造血系への分化の継続
ソートまたは濃縮されたＣＤ３４陽性細胞を、造血系へと、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む、多様な特異的細胞型に向かってさらに分化させた。Ｔ細胞に特異的なＣＤ３４陽性細胞を濃縮して、フィーダー細胞を含有しない懸濁培養物またはＯＰ９間質細胞を含有する接着培養物またはマトリゲルコーティングされた表面へと移した。設定に関わりなく、培養物に、可溶性ＤＬＬ１およびＤＬＬ４を含有するｉＴＣ−Ａ１を補充した（図１）。およそ１０日後、培養の設定を、ｉＴＣ−Ｂ１へと切り換えて、Ｔ細胞の成熟を完了させた。およそ３０〜４０日後（当初の分化誘導後）、細胞集団を、ＣＤ３、ＣＤ７、ＴＣＲαβ、ＣＤ４、およびＣＤ８の表面発現を含むＴ細胞の組成について評価した。図１０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、導出されたＣＤ３４陽性細胞の分化能力であって、ＣＤ７集団からの、ＣＤ４およびＣＤ８の発現により規定される、別個のＴ細胞の集団を発生させる分化能力を示す。
【０２８７】
ＮＫ細胞に特異的なＣＤ３４陽性細胞を、ＩＬ１５、ｉＮＫ−Ａ１培地（図２）を含む分化培地で、およそ１０日間にわたり処理し、ｉＮＫ−Ｂ１培地（図２）へと切り換えて、さらに１０〜２０日間にわたり処理した（図１０におけるＣＤ５６陽性集団を参照されたい）。培養は、懸濁フォーマットで実施した。
【０２８８】
本明細書で記載される多段階分化プラットフォームは、逐次的分化法を使用して、二次造血幹細胞を、多能性幹細胞を含む、様々な幹細胞、前駆細胞、または分化転換細胞から導出する工程を示した。導出されたＣＤ３４陽性造血幹細胞は、スケーリングのために、懸濁培養物中で保つことができ、造血幹細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を含む、多系統の造血細胞型を発生させうる。さらに、導出されたＣＤ３４陽性二次造血幹細胞は、免疫調節性表面タンパク質であるＰＤＬ１を上方調節することにより、薬理学的モジュレーションに応答することも示された（図１１）。なおさらに、生着させると、導出されたＣＤ３４陽性細胞は、骨髄系集団およびリンパ系集団の両方の再構成を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける再構成が可能であった（図９）。多能性幹細胞を含む多様な集団から導出された二次造血幹細胞は、患者特異的治療および再生への医学適用に理想的な候補物質である。
【０２８９】
（実施例７）
ｉＣＤ３４培養プラットフォームを使用する造血分化、および生着のポテンシャルを有するＨＥ集団の識別
上記のｉＨＳＣプラットフォームを、造血系細胞の分化のためにさらに最適化した。造血系への分化を誘発するため、ｈｉＰＳＣを、０日目（Ｄ０）に、維持培地中の単層として播種し、約２４時間にわたり、接着および拡大を可能とした。１日目であるこの時点で、維持培地を除去し、維持因子を伴わない基礎培地に置きかえた。培養培地を、ｉＣＤ３４−Ａへと切り換えることにより、約２日目に、造血分化を誘発した（図１２を参照されたい）。図１２に例示される通り、３日目に、培養培地に増殖因子であるｂＦＧＦを補充し、その後、分化のために、ｉＣＤ３４−Ｂ培地へと切り換えた。それらを単一細胞へと解離させる時点である約５日目〜６日目まで、単層を維持し、約１０日目における分化まで、ｉＣＤ３４−Ｃ培地中の、低密度の単層として播種した。約２日目における造血分化の開始から、分化の約１０日目まで、低酸素圧（２〜１０％のＯ２）を維持した。
【０２９０】
培養工程中に、造血系への指向性分化を、単層の、単一細胞への解離と、ＣＤ３４、ならびに、任意選択で、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＸＣＲ４、およびＣＤ７３である表面マーカーの発現についての解析とによりモニタリングした（図１５Ａ）。分化の約８日目に、ＨＥを表す細胞集団の出現を、細胞表面発現シグネチャーであるＣＤ３４＋により観察した。ＣＤ３４＋細胞内ではまた、ＣＤ４３−  ＣＸＣＲ４−  ＣＤ７３−も観察された。ＣＤ３４＋集団は、約１０日目まで維持された（図１５Ａ）。約９日目まで早めることもでき、約１２日目まで延期することもできる、１０日目時点で、細胞を、単一細胞へと解離させ、ＣＤ３４＋  ＨＥ集団を、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａを使用するＦＡＣＳにより、さらなる解析および機能的な評価のためにソートした。造血アウトプット能の例として、単一のｉＰＳＣのインプットに対し、合計４６３個のＣＤ３４＋細胞（図１５Ａ）および４１個のＣＤ３４＋  ＣＤ４３−  ＣＸＣＲ４−  ＣＤ７３−細胞（図１５Ａ）が発生し、二次ＨＥ細胞への転換率は、少なくとも２．５％であった。
【０２９１】
ｈｉＰＳＣ由来のｉＨＥの生着のポテンシャルを裏付けるため、１０日目におけるＣＤ３４＋細胞をソートし、上記で記載したｉＭＰＰアッセイにおいて、７日間にわたり培養した。培養（１０日間にわたるｉＣＤ３４の培養に、７日間にわたるｉＭＰＰの培養を加えた）合計１７日間の後、眼窩後注射を介して、およそ４００，０００個の細胞を、ＮＳＧへと注射した。２００，０００個の臍帯血ＣＤ３４＋細胞を、対照としての別個のマウスへと注射した。図３３は、マウスの末梢血中の、ヒトＣＤ４５マーカーを発現する細胞の存在により見られる通り、生着したＣＤ３４陽性細胞の、５週間にわたる再構成を裏付ける。
【０２９２】
（実施例８）
低分子、サイトカイン、およびプレーティング密度のモジュレーションによる、ＨＥ発生の最適化
約１０日間にわたる分化の後における、ＨＥの、ｈｉＰＳＣからの効率的な発生を最適化するため、いくつかのパラメータについて検討した。分化の０日目における、単層の最適なプレーティング密度を、ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングした６ウェル培養ディッシュ上にｈｉＰＳＣをプレーティングし、ウェル１つ当たり７．５×１０４個からウェル１つ当たり１．５×１０５個へと量を増大させ、次いで、約１０日目に、ＣＤ３４＋  ＨＥ集団の発生を解析することにより評価した。図１６Ａは、細胞のプレーティング密度を増大させると、ＣＤ３４＋細胞の全百分率は増大するが、ＣＸＣＲ４−  ＣＤ７３−  ＨＥ亜集団は減少することを裏付ける。この減少にも拘らず、１０日間にわたる単層分化の後における、ｈｉＰＳＣの、ＨＥへの転換率は、ウェル１つ当たり１．５×１０５個の最高被験プレーティング密度のときに最高であった（図１５Ｃ）。
【０２９３】
造血分化の初期段階における、ＢＭＰ４の濃度のモジュレーションの、ＨＥの発生に対する効果は、分化の約２日目〜約６日目において、０ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌの範囲にわたり濃度を増大させるＢＭＰ４で培養物を処理することにより評価した。１０日目におけるＨＥの発生を、ＣＤ３４＋  ＨＥ集団の検出により評価した。図１６Ｃは、２日目〜６日目においてＢＭＰ４の濃度を増大させると、１０日目において、閾値を下回るＢＭＰ４濃度で、ＨＥ集団が増大することから、約３ｎｇ／ｍＬの最適濃度が指し示されることを裏付ける。
【０２９４】
Ｗｎｔ経路活性化因子であるＣＨＩＲ９９０２１は、ｈｉＰＳＣからの二次造血プログラムの誘導の一因である。造血分化プロトコールの誘導相における、ＣＨＩＲのモジュレーションの効果は、約３．７５日目〜約６日目において、ＣＨＩＲの濃度を増大させて培養を処理することによって評価した。図１６Ｄは、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度を増大させると、ＣＤ３４＋細胞の全百分率は増大するが、ＨＥ亜集団の百分率は減少することから、ＣＨＩＲ９９０２１の最適濃度は、およそ１ｕＭであることを裏付ける。
【０２９５】
指向性分化プロトコールの６日目において、単層培養物を、単一細胞へと解離させ、ＨＥへとさらに分化させるために、単層として再プレーティングした。６日目におけるプレーティング密度は、図１６Ｅで裏付けられる通り、ＨＥの発生に影響を及ぼすことが示された。この図は、細胞の濃度を、１．５×１０５個から、７．４×１０４個へと減少させると、ＨＥ集団の百分率は増大することを示す。
【０２９６】
指向性分化のための先のプロトコールは、ＨＥの発生の間に、ＩＧＦ１サイトカインおよびＥＰＯサイトカインの添加を要求した。図１６Ｆは、ＩＧＦ１およびＥＰＯの添加が、約１０日目において観察される、ＨＥの百分率を減少させ、これらの因子の除去が、分化法の改善を結果としてもたらすことを示す。
【０２９７】
（実施例９）
Ｎｏｔｃｈ依存性の造血およびＭＰＰの分化による、ＨＥの造血ポテンシャルの決定
ｈｉＰＳＣ由来の二次集団の造血ポテンシャルを裏付けるため、ＦＡＣＳを使用して、ＨＥ細胞をソートし、図１２の複能性前駆体アッセイ（ｉＭＰＰ）で記載される通り、ＣＤ４５＋造血前駆体を発生させる、内皮から造血への移行を経るそれらの能力について評価した。およそ３０，０００個のＣＤ３４＋  ＨＥ細胞を、懸濁液中の凝集物として、ｉＭＰＰ−Ａ培地中で、一晩にわたり培養し、次いで、単層としてプレーティングし、６〜８日間にわたり、さらに培養した。図１７Ａは、丸い造血細胞の出現を伴う、単層培養物中の表現型の変化、およびフローサイトメトリー染色により、６〜８日間の培養期間にわたってＣＤ４５＋の存在が識別されることを示す。
【０２９８】
指向性分化プロトコールの１０日目に発生したＨＥ集団が、二次ＨＥを表すのかどうかについて評価するため、ＣＤ３４＋でソートされたＨＥ細胞を、Ｎｏｔｃｈ経路阻害剤であるガンマセクレターゼ阻害剤（γＳＩ）で、ｉＭＰＰアッセイの持続期間である７〜９日間にわたり処理した。新鮮なγＳＩを、２日ごとに、ｉＭＰＰ−Ａ培養培地へと添加した。約８日後、単層培養物を、フローサイトメトリーにより、ＣＤ４５＋造血細胞の出現について評価した。γＳＩで処置された培養中では、媒体対照と比較して、有意により少ないＣＤ４５＋細胞が見られたことから、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路への依存性、および二次ＨＥの存在が裏付けられる（図１７Ｂ）。
【０２９９】
（実施例１０）
酸素条件の操作を介する、ＨＥおよびｉＭＰＰの発生の最適化
酸素環境が、二次ＨＥおよびｉＭＰＰ造血前駆体の発生に影響を与えるのかどうかについて評価するため、ｈｉＰＳＣを、図１２で記載されている通り、正常酸素（２１％のＯ２）条件下または低酸素（５％のＯ２）条件下で分化させた。分化の約１０日目に、単層を、フローサイトメトリーにより、ＣＤ３４＋  ＨＥ集団の存在について、カウントし、評価した。図１８Ａに見られる通り、低酸素条件下の分化は、発生するＣＤ３４＋  ＨＥの量の増大を結果としてもたらした。低酸素条件下で発生させたＨＥが、ＣＤ４５＋造血前駆体を発生させるポテンシャルを保持していたことを確認するために、正常酸素条件および低酸素分化条件によるＣＤ３４＋細胞を、ＦＡＣＳにより単離し、ｉＭＰＰアッセイにより評価した。いずれの条件下で発生させたＨＥも、同等のｉＭＰＰポテンシャルを有することから、低酸素条件下の造血分化は、二次ＨＥのアウトプットを増大させることが指し示される（図１８Ｂ）。
【０３００】
（実施例１１）
８日目の分化培養物およびＨＥの低温保存
直接的分化プロトコールの約１０日目において、全培養物を、解離させて、１０％のＤＭＳＯを補充した８日目の培地中の低温保存後において、造血ポテンシャルを維持するそれらの能力について評価した。融解させた細胞を、再懸濁させ、その後、図１２で記載されている通り、ｉＭＰＰ−Ａ培地中で、７日間にわたり培養してから、フロー解析にかけた。図１９Ａに見られる通り、低温保存された１０日目の細胞は、凍結／融解工程後も生存し、ＣＤ４５＋細胞の存在により見られる通り、非凍結対照と同等の造血ポテンシャルを有していた。
【０３０１】
ソートされたＣＤ３４＋細胞を、低温保存後において、造血ポテンシャルを維持するそれらの能力について評価した。低酸素条件下で発生させた、１０日目のｉＣＤ３４を単離し、図１２で記載されている通り、直接ｉＭＰＰアッセイへとプレーティングするか、またはｉＭＰＰ−Ａ培地中で７日間にわたり低温保存し、次いで、融解させ、ｉＭＰＰアッセイにプレーティングした。図１９Ｂに見られる通り、低温保存されたＨＥは、凍結／融解工程後も生存し、非凍結対照と比較して効率は低下しているが、ＣＤ４５＋細胞の存在により見られる通り、造血ポテンシャルを維持することが可能であった（図１９Ｂ上パネル）。低温保存されたｉＣＤ３４はまた、より高い密度（ウェル１つ当たり細胞２００，０００個）でもプレーティングしたが、これは、ＣＤ４５＋細胞のアウトプットを増大させるように見えた（図１９Ｄ）。
【０３０２】
（実施例１２）
一晩にわたる出荷後における、８日目の分化培養物の回復
６ウェルプレートによる６日目の分化培養物を、フラスコ１つ当たり細胞２００，０００個の播種密度で、Ｔ２５培養フラスコへと継代培養し、次いで、８日目に培地で完全に満たし、発泡スチロール製の箱の中で一晩にわたり保って、新鮮な細胞を、低温保存の必要なしに、直接出荷することの実施可能性について評価した。可能な限りにわたり３７℃の温度を保持するために、当初に３７℃の水浴中で保たれた保冷パックもまた、発泡スチロール製の箱に添付した。２つの培地組成物：８日目のステップで活用される、３０％の濃度のサイトカインおよびモルフォゲンを伴うフラスコ（図１２）と、１００％の濃度のサイトカインおよびモルフォゲンを伴うフラスコとについて、３７℃のインキュベーター内で保たれた対照フラスコと共に調べた。９日目に、これらのフラスコを箱から取り出し、フラスコに新たなキャップを取り付けると共に、培地を、８日目の培地１０ｍＬで置きかえ、回復させてから、ＣＤ３４＋  ＨＥ集団の存在についての、１０日目のフロー解析のために処理した。図２０に見られる通り、ＨＥの全般的なアウトプットは、全ての条件間で同等であったことから、８日目の培養物の新鮮なままでの一晩にわたる出荷の、ＨＥ細胞を送達するための有効な手段としての実施可能性が裏付けられる。
【０３０３】
（実施例１３）
ＤＬＬ４を発現する間質細胞を使用する、ＨＥの、成熟Ｔリンパ系および成熟ＮＫリンパ系への分化の継続
ソートされたＣＤ３４＋  ＨＥ細胞を、Ｔリンパ系およびＮＫリンパ系へとさらに分化させた。Ｔ細胞に特異的なＨＥ細胞をソートして、低付着型組織培養物プレート上で、ＢＭＰ４、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７を含有するｉＴＣ−Ａ無血清分化培地（図１３）中の凝集物として、１６時間にわたり培養した。１６時間後、凝集した細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７を含有するｉＴＣ−Ｂ分化培地に、ＤＬＬ４を発現する間質細胞を含有する接着培養に移した。５日後、ｉＴＣ−Ｂ培地を維持して、Ｔ細胞の分化を完了させた。培養のおよそ１０日後（ＨＥの単離後）、細胞表面マーカーであるＣＤ３４およびＣＤ７の同時発現により、培養物を、Ｔ細胞前駆体の発生について評価した。およそ１５〜２０日間にわたるさらなる分化の後で、これらのＣＤ３４＋  ＣＤ７＋  Ｔ細胞前駆体は、ＣＤ４およびＣＤ８の発現により見られる通り、成熟Ｔ細胞の別個の集団を発生した。図２１は、同時培養物中で発生したＣＤ４５＋  ＣＤ５６−集団についての解析により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、１０日目のＨＥ集団の分化能力であって、早期Ｔ細胞前駆体および成熟Ｔ細胞サブセットを発生させる分化能力について示す。図２６は、培養のおよそ３０日後（ＨＥの単離後）、同時培養物中で発生したＣＤ４５＋  ＣＤ５６−集団についての解析により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、１０日目のＨＥ集団の分化能力であって、成熟Ｔ細胞サブセットを発生させる分化能力について示す。
【０３０４】
ＮＫ細胞に特異的なＨＥ細胞をソートして、低付着型組織培養物プレート上で、ＢＭＰ４、ＳＣＦ、ＩＬ３、ＩＬ１５、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７を含有するｉＮＫ−Ａ無血清分化培地（図１４）中の凝集物として、１６時間にわたり培養した。１６時間後、凝集した細胞を、ＳＣＦ、ＩＬ３、ＩＬ１５、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７を含有するｉＮＫ−Ｂ分化培地中に、ＤＬＬ４を発現する間質細胞を含有する接着培養へと移した。５日後、ｉＮＫ−Ｂ培地を維持して、ＮＫ細胞の分化を完了させた。培養のおよそ１０〜１５日後（ＨＥの単離後）、培養物を、ＮＫ細胞前駆体の発生について評価した後、さらに１０〜１５日間にわたる培養の後において、成熟ＮＫサブセットについても評価した。ＣＤ５６およびＣＤ１６１（ＮＫＲ−Ｐ１Ａ）は、早期ＮＫ細胞の発生の間に発現する第１の細胞表面マーカーであり、これに続いて、後期の成熟ＮＫ細胞サブセット上では、ＣＤ１６、ＫＩＲ、ＣＤ８、およびＮＫＧ２Ｄ（ＣＤ３１４）が発現する。図２２は、同時培養物中で発生したＣＤ４５＋集団についての解析により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、１０日目のＨＥ集団の分化能力であって、早期ＮＫ細胞前駆体および成熟ＮＫ細胞サブセットを発生させる分化能力について示す。ＮＫ細胞前駆体の成熟を増強する代替的な方法は、懸濁培養物中の、フィーダー細胞との同時培養である。２０日目のｉＮＫ細胞を、ＤＬＬ４−間質細胞培養物から、ＳＣＦ、ＩＬ１５、ＦＬＴ３Ｌ、およびＩＬ７を含有するｉＮＫ−Ｂ培地中のフィーダーベースの懸濁培養物へと移し、さらに１２日間にわたる培養下に置いた。図２７は、間質およびフィーダーベースの同時培養物中で発生したＣＤ４５＋集団についての、末梢血由来のＮＫ細胞と比較した解析により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、フィーダー懸濁培養物を使用する、１０日目のＨＥ集団の分化能力であって、成熟ＮＫ細胞サブセットを発生させる分化能力について示す。ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４＋細胞を、ＮＫ系統細胞へと、２０日間にわたり分化させ、次いで、さらに成熟させるために、懸濁培養物に入れた。成熟ＮＫ系統マーカーは、ＣＤ５６、ＣＤ１２２、ＮＫｐ３０、ＣＤ９４、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、およびＫＩＲにより規定される成熟ＮＫ細胞の存在を識別する。
【０３０５】
（実施例１４）
高度にスケーラブルな拡大戦略を可能とする、単層ｈｉＰＳＣ造血分化プラットフォーム
ｈｉＰＳＣを、図１２〜１４で記載される、組成既知、無血清で、フィーダーフリーの培養物中の単層として播種し、造血細胞へと分化させ、凝集下にあるｈｉＰＳＣ状態であって、造血分化の誘発の前に胚葉体を形成するｈｉＰＳＣセットアップ（Kennedyら、Cell  Reports、２０１２年、１７２２〜１７３５頁）と比較した。いずれの培養物セットも、初期出発数として、１００，０００個のｈｉＰＳＣを使用した。造血分化工程において、細胞カウントおよび表現型の評価を慣用的に行って、各系の拡大ポテンシャルを裏付けた。図２３で示される通り、分化の６日目までに、単層培養物では、顕著な数のＣＤ３４陽性細胞（ＣＤ３４陽性細胞が検出されなかったＥＢフォーマットと対比して、２００万個超のＣＤ３４＋細胞）が検出された。分化の８日目に、単層フォーマットは、およそ２４０万個の細胞を発生させたが、ＥＢフォーマットでは、ＣＤ３４陽性細胞の検出は、およそ１００，０００個に過ぎず、出発材料としてのｉＰＳＣがほぼ同数であるにも拘らず、およそ２４倍の差が見られた。加えて、評価時に、単層フォーマットからは、二次造血を示唆するＣＤ３４＋  ＣＤ４３−細胞のみが作製されたのに対し、ＥＢフォーマットからは、一次造血を示唆するＣＤ３４＋  ＣＤ４３＋が大半の細胞が作製された（Kennedyら、２０１２年）。図２４は、オフザシェルフのｉＮＫ細胞およびｉＴ細胞を産生するための、本明細書で開示される、単層ｈｉＰＳＣ造血分化プラットフォームのスケーラブルな拡大をさらに示す。本明細書で提示される多能性細胞クローン拡大プラットフォームは、例えば、１個の多能性細胞クローンから、各々が治療的に機能的な、１０６個を下回らないＮＫ細胞またはＴ細胞を有する、治療用量のバイアル約１００万本への、オフザシェルフ用のスケーラビリティーを確保する。開示されるクローン拡大は、広範な均質性をさらにもたらし、従って、製品の一貫性、品質管理、および品質保証を確保する。一部の実施形態では、１個の多能性細胞クローンは、遺伝子操作される。
【０３０６】
（実施例１５）
ｉＣＤ３４＋細胞の免疫調節特性
ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４陽性細胞（ｉＣＤ３４）の免疫調節能力を決定するため、ＣＤ３４でソートされた細胞を、ｉＭＰＰ−Ａ培地中で、末梢血由来の、ＣＤ３を発現する活性化Ｔ細胞と共に同時培養した。３７℃で５日間にわたるインキュベーションの後、同時培養物を、カウンティングビーズと混合し、フローサイトメトリーを介してアッセイして、各試料中の細胞の絶対数を決定した。図２５は、ＣＤ３＋  Ｔ細胞単独を含有する培養物との比較により見られる、ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４＋細胞の免疫調節ポテンシャルについて示すが、ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４＋細胞と共に同時培養されたＣＤ３＋  Ｔ細胞が、細胞の生存を低減したのに対し、培養物中のＣＤ３４＋細胞の総数は、影響を受けなかった。
【０３０７】
（実施例１６）
サイトカインの放出および脱顆粒により見られる、サイトカイン誘導性活性化による、ｉＮＫ細胞機能の決定
ｈｉＰＳＣ由来の成熟ｉＮＫ細胞の機能性を裏付けるため、２０日目（ＨＥの単離後）に、ｉＮＫ細胞を、ＳＣＦ、ＩＬ１５、ＩＬ７、およびＦｌｔ３Ｌを含有するｉＮＫ−Ｂ培地に、さらに１０日の間、フィーダーベースの懸濁培養物へと移した。１０日間にわたるさらなる培養の後、ｉＮＫ細胞を、ＩＬ１２およびＩＬ１８で刺激して、ｉＮＫ細胞の活性化を誘導した。ｉＣＤ３４由来のｉＮＫは、末梢血ＮＫ細胞と同様の様式で、サイトカインの刺激に応答し、炎症促進性サイトカインを分泌した。図２８は、ＣＤ１０７Ａ（脱顆粒を表す細胞表面マーカー）の発現、およびＣＤ４５＋  ＣＤ５６＋ゲーティング戦略に基づく、インターフェロンガンマについての細胞内染色により見られる、ｉＮＫ細胞の活性化であって、同じ間質およびフィーダー懸濁液による同時培養物と、末梢血由来のＮＫ細胞とを使用して発生させた、臍帯血由来のＮＫ細胞と比較した活性化について示す。
【０３０８】
（実施例１７）
Ｔ細胞およびＮＫ細胞を発生させるための間質フリーの分化培養物の確立
間質フリーの分化プラットフォームを使用して、臍帯血由来のｉＴ前駆体およびｉＮＫ前駆体、ならびにｈｉＰＳＣ由来のｉＴ前駆体およびｉＮＫ前駆体を発生させるためにさらに、上記のＴリンパ系およびＮＫリンパ系の分化プラットフォームを最適化した。
【０３０９】
ＮＫ細胞に特異的な、濃縮された臍帯血ＣＤ３４＋細胞を、ＤＬＬ４タンパク質または対照タンパク質を含有する培養プレート内の、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ１５、およびＩＬ７を含有するｉＮＫ−Ａ無血清分化培地にプレーティングした。５日後、ｉＮＫ−Ｂ培地を維持して、ＮＫ細胞の分化を完了させた。培養のおよそ１０〜１５日後、培養物を、ＮＫ細胞前駆体の発生および骨髄性細胞が存在しないことについて評価した。ＣＤ５６、ＣＤ７、およびＣＤ１６１は、ＮＫ細胞の発生の間に発現する、最初の細胞表面マーカーである。ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１４は、骨髄性細胞サブセット上で発現する細胞表面マーカーである。図２９は、臍帯血ＣＤ３４＋細胞の、ＮＫ細胞への間質フリー分化について示す。ＣＤ４５＋ゲーティング戦略を使用したところ、プレートに結合させたＤＬＬ４は、ＣＤ５６＋  ＣＤ７＋  ＣＤ１６１＋  ＮＫ細胞前駆体の、間質ベースの培養物および間質フリーの対照培養物と比較して、より急速で効率的な分化を支援し、臍帯血ＣＤ３４＋細胞は、ＤＬＬ４を発現する、間質フリーの分化プラットフォームにおいて、従来の間質ベースの分化プラットフォームと同様の様式（表現型に関して）で、早期ＮＫ細胞前駆体（ｐｒｏ−ＮＫ）を発生させる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化能力を有することが示された。早期ＮＫ系統マーカーにより、ＣＤ５６、ＣＤ７、およびＣＤ１６１により規定されるｐｒｏＮＫ細胞が存在することと、骨髄性マーカーである、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１４が存在しないこととが識別される。
【０３１０】
間質フリーの分化プラットフォームにおいて、ｉＮＫ細胞前駆体を発生させるときの、ｈｉＰＳＣ由来のＨＥ細胞の能力を裏付けるため、１０日目のＣＤ３４＋  ｉＨＥソート細胞を、ｉＮＫ−Ａ２培地において、ＤＬＬ４タンパク質または対照タンパク質を含有する培養物中で培養した。次いで、ｈｉＰＳＣ由来のＣＤ３４＋細胞を、ＮＫ系統細胞へと、２０日間にわたり分化させ、次いで、さらに成熟させるために、懸濁培養に置いた。図３０は、ＣＤ４５＋ゲーティング戦略を使用して、ＣＤ５６、ＣＤ１６１、およびＣＤ９４の発現により見られるような、ｉＮＫ細胞前駆体を発生させるｈｉＰＳＣ由来のｉＨＥの能力を示す。プレートに結合したＤＬＬ４は、ＣＤ５６＋  ＣＤ７＋  ＣＤ１６１＋  ＮＫ細胞前駆体の分化は支援するが、ＣＤ１１ｂ＋骨髄性細胞の分化は支援しない。５日後、ｉＮＫ−Ｂ２培地を維持して、ＮＫ細胞の分化を完了させた。フィーダーベースの懸濁培養物中の、ｈｉＰＳＣ由来のｉＮＫ細胞の成熟は、ＣＤ４５＋ゲーティング戦略を使用すると、末梢血ＮＫ細胞に表現型が似ている、成熟ＮＫ細胞を結果としてもたらす。成熟ＮＫ系統マーカーは、ＣＤ５６、ＣＤ１２２、ＮＫｐ３０、ＣＤ９４、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、およびＫＩＲにより規定される成熟ＮＫ細胞の存在を識別する。
【０３１１】
Ｔ細胞に特異的なＣＤ３４＋細胞であって、臍帯血から濃縮されたＣＤ３４＋細胞を、ｉＴ−Ａ２培地において、ＤＬＬ４タンパク質または対照タンパク質を含有する培養物にプレーティングした。５日後、Ｔ細胞前駆体（ｐｒｏＴ）を発生させるために、ｉＴ−Ｂ２培地を維持した。培養のおよそ１０〜１５日後、細胞表面マーカーであるＣＤ３４およびＣＤ７の同時発現により、培養物を、Ｔ細胞前駆体の発生について評価した。図３１は、ＣＤ４５＋ゲーティング戦略を使用して、ＤＬＬ４を発現する、間質フリーの分化プラットフォームにおいて、Ｔ細胞前駆体を発生させるＣＤ３４＋臍帯血細胞の能力について示す。ＣＤ４５＋  ＣＤ５６−ゲーティング戦略を使用したところ、臍帯血ＣＤ３４陽性細胞から導出されたｐｒｏＴ細胞の間質フリー分化プラットフォームは、従来の間質ベースの分化プラットフォームより急速であることが示された。早期Ｔ系統マーカーは、ＣＤ３４、ＣＤ５、およびＣＤ７により規定されるようなｐｒｏＴ細胞の存在を識別する。
【０３１２】
間質フリーのプラットフォームにおいて、ｉＴ細胞を発生させる、ｈｉＰＳＣ由来のＨＥ細胞の能力を裏付けるため、１０日目のＣＤ３４＋  ｉＨＥソート細胞を、ＤＬＬ４タンパク質または対照タンパク質を含有する培養においてｉＴ−Ａ２培地中で培養した。図３２は、ＣＤ４５およびＣＤ７の発現により見られるように、ｉＴ前駆体を発生させる、ｈｉＰＳＣ由来のｉＨＥの能力を例示する。
【０３１３】
当業者は、本明細書で記載される方法、組成物、および産物が、例示的な実施形態を表すものであり、本発明の範囲に対する限定として意図されるものではないことをたやすく察知するであろう。当業者には、本明細書で開示される本開示には、本発明の範囲および精神から逸脱せずに、様々な代替および改変を施しうることがたやすく明らかであろう。
【０３１４】
本明細書で言及される、全ての特許および刊行物は、本開示が関する技術分野の当業者の水準を示す。全ての特許および刊行物は、各個別の刊行物が、参照により組み込まれるものとして、具体的かつ個別に指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３１５】
本明細書で例示的に記載される本開示は、本明細書では具体的に開示されない、任意の１または複数の要素、１または複数の限定の非存在下で、適切に実施することができる。従って、例えば、本明細書の各場合において、「〜を含むこと」、「〜から本質的になること」、および「〜からなること」という用語のうちのいずれかは、他の２つの用語のうちのいずれかで置きかえることができる。採用してきた用語および表現は、限定的な用語ではなく、記載的な用語として使用されており、このような用語および表現の使用において、示され、記載される特色を有する、任意の同等物またはそれらの部分を除外する意図は存在せず、特許請求される本開示の範囲内では、多様な改変が可能であることが認識されている。従って、本開示は、好ましい実施形態および任意選択の特色により、具体的に開示されているが、当業者は、本明細書で開示される概念の改変および変化を利用する場合があり、このような改変および変化も、付属の特許請求の範囲により規定される、本発明の範囲内にあると考えられることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３ＡＢＣ】
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【図３ＤＥ】
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【図４ＡＢ】
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【図４ＣＤ】
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【図５ＡＢ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１ＡＢ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【外国語明細書】
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