(57)【要約】【課題】広範なタンパク質について、濃縮可能でありかつ安定性が高いタンパク質複合体を含有する水性懸濁剤を提供する。【解決手段】緩衝液中で表面電荷を有するタンパク質とポリアミノ酸とが複合体を形成して懸濁する水性懸濁液で、前記複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより前記タンパク質の濃縮が可能であり、前記複合体中で、前記タンパク質が振とうストレス耐性、流動性向上、耐酸化性、熱安定性、および凝集抑制性の少なくとも１つを有する水性懸濁剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
緩衝液中で表面電荷を有するタンパク質とポリアミノ酸とが複合体を形成して懸濁する水性懸濁液で、前記複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより前記タンパク質の濃縮が可能であり、前記複合体中で、前記タンパク質が振とうストレス耐性を有するタンパク質水性懸濁剤。
【請求項２】
前記複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質を添加して前記タンパク質が溶解可能である請求項１に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項３】
前記ポリアミノ酸がカチオン性ポリアミノ酸、またはアニオン性ポリアミノ酸である請求項１または２に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項４】
前記カチオン性ポリアミノ酸が、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジンおよびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つであり、前記アニオン性ポリアミノ酸が、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸およびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つである請求項３に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項５】
前記カチオン性または前記アニオン性ポリアミノ酸の分子量が、０．５ｋＤａ〜１０００ｋＤａの範囲である請求項３または４に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項６】
前記タンパク質の分子量が、３ｋＤａ〜６７０ｋＤａの範囲である請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項７】
前記複合体が、前記緩衝液のｐＨと前記タンパク質の等電点（ｐＩ）の差の絶対値が０．５〜４．０の範囲に、前記タンパク質の最大濃縮率が存在するように濃縮可能である請求項１ないし６のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項８】
前記振とうストレス耐性を有する水性懸濁剤は、前記複合体が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の水溶液と比較して振とうストレス耐性が高い請求項１ないし７のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項９】
前記タンパク質が生物活性を有するタンパク質である請求項１ないし８のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項１０】
前記タンパク質が酵素、サイトカイン、ホルモン、抗体、抗体フラグメントおよび融合タンパク質の少なくとも１つである請求項１ないし９のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項１１】
前記タンパク質が糖鎖を有する請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項１２】
前記ポリアミノ酸が分岐鎖を有しないポリアミノ酸である請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項１３】
前記水性懸濁剤が、緩衝液、タンパク質、ポリアミノ酸およびｐＨ調整剤以外の添加剤を含有しない請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項１４】
前記複合体を形成しその後可溶化する工程で前記タンパク質の二次構造が保持される請求項１ないし１３のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項１５】
請求項１ないし１４のいずれかに1項に記載の前記複合体を含む水性懸濁液に低濃度の電解質が添加され前記タンパク質が溶解されてなるタンパク質含有水性液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質とポリアミノ酸との複合体で、前記タンパク質が複合体中で濃縮時に活性が劣化しない、振とうストレス耐性、流動性向上、耐酸化性、熱安定性、および凝集抑制性の少なくとも１つを有する水性懸濁剤に関する。また、前記複合体を緩衝液中で再溶解して得られる水性液に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術の進歩により、種々のタンパク質が医薬品として提供される機会が増している。特に抗体についての技術進歩は目覚しく、キメラ抗体やヒト化抗体、さらには糖鎖改変技術を応用した抗体も実用化され、数々の抗体医薬品が大きな治療効果を上げている。タンパク質医薬品は、従来用時溶解して用いる凍結乾燥製剤として提供されることが多かったが、近年では、より簡便に使用できる水性剤として提供されるようになってきている。また、投与についても、従来静脈注射による投与が一般的であったが、患者の利便性まで考慮し、皮下注射により投与されるタンパク質医薬品が増している。皮下注射では、静脈注射に比べ投与容量を少なくする必要があるため、タンパク質を高濃度化することが必須となる。また、特に抗体医薬品は、高用量で用いられるため、抗体医薬品を皮下注射する場合には、より高濃度化することが要求される。さらに最近は、投与回数を減らす目的で高濃度化する試みもなされており、提供される市販製剤にはタンパク質濃度が１００ｍｇ／ｍＬ以上のものも存在する。
しかしながら、元来生体高分子であるタンパク質は、振とう等の物理的ストレスや酸化等の化学的ストレスに弱く、特に凍結乾燥製剤に比べ水に溶解して水性剤とした場合には変性しやすい。変性したタンパク質は、本来の活性を失い凝集体や会合体を形成することが多く、また、この反応は不可逆な場合が多い。このような凝集体の形成は、一般にタンパク質が高濃度である程起きやすく、振とう等による気液界面への暴露およびタンパク質分子どうしの相互作用の機会が増えることにより、特に長期保存時や輸送時に凝集体が形成される可能性が高まる。凝集体の形成は、タンパク質医薬品の有効性を低下させ、さらに安全性をも脅かす。すなわち、投与後に抗薬物抗体の産生がおこる等の望まれない免疫反応を惹起する可能性を有する（非特許文献１）。このため、米国ＦＤＡおよび欧州ＥＭＥＡでは、免疫原性の評価に対するガイドラインを設定し、対策を喚起している。また、酵素やサイトカイン等の低濃度のタンパク質製剤においても、種類や製剤によって凝集体を形成しやすいものが存在し、溶解時や投与時に激しく振とうしない、フィルターを通す等、用時の取扱に注意を要するものも少なくない。
このような背景から、タンパク質の各種ストレスに対する安定性を向上させることは極めて重要な課題であり、特にタンパク質が高濃度な状態や凝集体を形成しやすいタンパク質においても適用できる汎用性が高い安定化技術の構築が望まれている。
【０００３】
これに対し、タンパク質の安定性を向上させるための取組みとして、主に各種添加剤による安定化が数多く検討されている。特許文献１では、アミノ酸エステル、ポリアミンの添加によるタンパク質の安定化方法が、また、特許文献２では、ポリエチレングリコール、および特定のアミノ酸としてアラニン、アルギニン、グルタミン酸、またはこれらの誘導体を共存させることによる熱ストレスに対するタンパク質の安定化方法が開示されている。
一方、タンパク質とポリアミノ酸による複合体に関して、ドラッグデリバリーシステムとしての検討もなされている。特許文献３では、生体内での安定性と機能性の付与を目的とし、疎水化ポリアミノ酸と抗原タンパク質あるいは抗原ペプチドとの複合体が、免疫原性を高める免疫アジュバントとして利用できることを開示している。また、特許文献４では、カチオン性ポリマーの一つとしてポリアミノ酸を用いた複合体が、内包させるタンパク質とデリバリーシステムを構成するポリマーマトリックスとの相互作用を低減させ、優れた持続放出性を示すシステムに組み込まれる技術として開示されている。しかし、これら複合体を含む水性懸濁剤の輸送時や保存時の安定性については検討されていない。
【０００４】
特許文献５には、請求項１に、「抗体製剤を作製する方法であって、抗体をポリカチオンと組み合わせる工程を含む方法。」が、記載されている。請求項４には、「ポリカチオンが、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリヒスチジン、およびカチオン性多糖類、またはその混合物からなる群より選択される。」、請求項２４には、「製剤が、前記ポリカチオン組成物と組み合わせたときに、ポリカチオンの非存在下での前記抗体製剤の溶解性と比較して、より大きい溶解性を有する」、請求項２５には、「製剤が、ポリカチオン組成物と組み合わせていない抗体製剤と比較して、増大した貯蔵寿命を有する」ことが記載されている。しかし、抗体とポリアミノ酸との複合体である固体粒子の形成、抗体とポリアニオンとの組合せについての記載はない。特許文献５には「１つの実施形態において、抗体は、ポリカチオンの非存在下の抗体またはＦｃ融合分子を含む組成物よりも大きい水への溶解性を有する（［００２１］参照）と記載される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３９７６２５７号公報
【特許文献２】特許第５１１９５４５号公報
【特許文献３】国際公開第２０１０／１１０４５５号
【特許文献４】特表平７−５０３７００号公報
【特許文献５】特表２０１０−５３６７８６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ，  Ｈ．  Ｃｌｉｎ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ２４（１１）：１７２０−１７４０．  ２００２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、上述の状況に鑑みてなされたもので、タンパク質を含み輸送時や保存時の安定性に優れ、用時の取り扱い性に優れる水性懸濁剤を提供することにある。本発明者らは、上記目的で種々のタンパク質について鋭意研究を重ねた結果、タンパク質とポリアミノ酸とが緩衝液中で懸濁する複合体を形成し、この複合体中でタンパク質が振とうストレス耐性、流動性向上、耐酸化性、熱安定性、および凝集抑制性の少なくとも１つを有し安定性が向上することを見出し、本発明をなすに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、タンパク質とポリアミノ酸とを組み合わせる工程を含む方法で、タンパク質が振とうストレス耐性を有し安定性が向上することを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、以下を提供する。
（１）緩衝液中で表面電荷を有するタンパク質とポリアミノ酸とが複合体を形成して懸濁する水性懸濁液で、前記複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより前記タンパク質の濃縮が可能であり、前記複合体中で、前記タンパク質が振とうストレス耐性、流動性、耐酸化性、耐熱性、および凝集抑制性からなる群から選択される少なくとも1つを有するタンパク質水性懸濁剤。
（２）前記複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質を添加して前記タンパク質が溶解可能である（１）に記載のタンパク質水性懸濁剤。
（３）前記ポリアミノ酸がカチオン性ポリアミノ酸、またはアニオン性ポリアミノ酸である（１）または（２）に記載のタンパク質水性懸濁剤。
（４）前記カチオン性ポリアミノ酸が、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジンおよびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つであり、前記アニオン性ポリアミノ酸が、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸およびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つである（３）に記載のタンパク質水性懸濁剤。
（５）前記カチオン性または前記アニオン性ポリアミノ酸の分子量が、０．５ｋＤａ〜１０００ｋＤａの範囲である（３）または（４）に記載のタンパク質水性懸濁剤。
（６）前記タンパク質の分子量が、３ｋＤａ〜６７０ｋＤａの範囲である（１）ないし（５）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（７）前記複合体が、前記緩衝液のｐＨと前記タンパク質の等電点（ｐＩ）の差の絶対値が０．５〜４．０の範囲に、前記タンパク質の最大濃縮率が存在するように濃縮可能である（１）ないし（６）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（８）前記振とうストレス耐性を有する水性懸濁剤は、前記複合体が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の水溶液と比較して振とうストレス耐性が高い（１）ないし（７）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（９）前記流動性を有する水性懸濁剤は、前記複合体が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質水溶液と比較して粘度が低い（１）ないし（７）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１０）前記耐酸化性を有する水性懸濁剤は、前記複合体が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質水溶液と比較して耐酸化性が高い（１）ないし（７）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１１）前記耐熱性を有する水性懸濁剤は、前記複合体が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の水溶液と比較して耐熱性が高い（１）ないし（７）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１２）前記凝集抑制性を有する水性懸濁剤は、前記複合体が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の水溶液と比較して凝集抑制性が高い（１）ないし（７）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１３）前記タンパク質が生物活性を有するタンパク質である（１）ないし（１２）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１４）前記タンパク質が酵素、サイトカイン、ホルモン、抗体、抗体フラグメントおよび融合タンパク質の少なくとも１つである（１）ないし（１３）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１５）前記タンパク質が糖鎖を有する（１）ないし（１４）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１６）前記ポリアミノ酸が分岐鎖を有しないポリアミノ酸である（１）ないし（１５）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１７）前記水性懸濁剤が、緩衝液、タンパク質、ポリアミノ酸およびｐＨ調整剤以外の添加剤を含有しない（１）ないし（１６）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１８）前記複合体を形成しその後可溶化する工程で前記タンパク質の二次構造が保持される（１）ないし（１７）のいずれか１に記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１９）上記（１）ないし（１８）のいずれか１つに記載の前記複合体を含む水性懸濁液に低濃度の電解質が添加され前記タンパク質が溶解されてなるタンパク質含有水性液。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の水性懸濁剤は、緩衝液中で表面電荷を有するタンパク質とポリアミノ酸とが複合体を形成して懸濁し、前記タンパク質が複合体中で濃縮時に活性が劣化しない、振とうストレス耐性、流動性向上、耐酸化性、耐熱性、および凝集抑制性の少なくとも１つの効果を有する。具体的にはタンパク質とポリアミノ酸が複合体を形成し安定化され、水性懸濁液から水分を除去することにより濃縮可能である。輸送時や保存時の安定性に優れ、用時の取り扱い性に優れる。一般にタンパク質医薬品の安定化には、賦形剤、界面活性剤、安定化剤等の添加剤が用いられるが、これらを用いる際には、タンパク質医薬品毎にその種類や組合せ、添加量を最適化するための複雑かつ膨大な検討が必要となる。本発明の水性懸濁剤は、ポリアミノ酸との複合体を形成することで簡便に安定化させることができ、従来必要であった添加剤を加える必要がない。また、凍結乾燥製剤で必要となる煩雑な溶解操作を必要とせず、そのまま投与する、あるいは用時に塩化ナトリウムに代表される無機塩を加えて溶解させて水性液として投与することができる。さらに、タンパク質が高濃度であっても粘度が低いという特徴を有するため、使用時に容器中に残存し無駄となる量を減らすことができ、また、シリンジを用いて投与する際には、同濃度のタンパク質水溶液に比べ弱い力で投与することができる。
本発明の水性懸濁剤は、上記のいずれか１つの特徴を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、Ｌ-アスパラギナーゼに対して、ポリリジン（Ｐｏｌｙ‐Ｋ、分子量４ｋＤａ−１５ｋＤａ)添加の状態を示す図である。図１の１）、２）図においてそれぞれ右側の試料はＭＯＰＳ緩衝液中のＬ-アスパラギナーゼ、左側の試料はＭＯＰＳ緩衝液中のＬ-アスパラギナーゼに対して、ポリリジンが添加されている。図１の１)は添加直後で、左試料で複合体が形成された水性懸濁液を示す。２）は一定時間経過後、左試料は形成された複合体が自然沈降する状態を示す。一方ポリリジンを添加しない右試料は１）および２）で複合体ができていないことを示す。
【図２】図２は、図１と同じ試料の遠心分離後の状態を示す図である。図２の３）の左試料は、図１の２）の左試料を遠心分離して複合体がペレット状になった状態を示す。図２の４）の左試料は、遠心分離後の上清の緩衝液が除去され複合体中のタンパク質がポリリジン添加前と比べ１０倍濃縮された状態を示す。図２の３）、４）の右試料は、遠心分離後も変化がないことを示す。
【図３】図３は、図３の５）左試料で、図２の４）の左試料の全体を振って、ペレット状であった複合体を再懸濁させた状態を示す図である。図３の５）の右試料は図２の４）の右試料の全体を振っても複合体ができていない状態が変わらないことを示す。  図３の６−１）は図３の５）にＮａＣｌを添加した状態を示す図である。図３の６−１）左試料は、図３の５）の左試料にＮａＣlを添加して複合体を再溶解させた状態を示す。図３の６−１）の右試料は、図３の５）の右試料にＮａＣｌを添加しても複合体ができていない状態が変わらないことを示す。図３の６−１）の左試料はポリリジン添加前と比べ１０倍程度に濃縮された再可溶化状態であるのに対し、図３の６−１）の右試料は図３の５）の右試料と同程度あるいはＮａＣｌを添加した分希釈された状態を示す。  また図３の６−２）の左試料は、図３の６−１）の左試料に緩衝液、水等を加えることで量を調整しても再溶解させた状態が変わらないことを示す。図３の６−２）の左試料は、図３の６−１）の左試料に緩衝液を加えることで、ポリリジン添加前と同等のタンパク質濃度となっている状態を示す。  図３の６−３）の右試料は図３の５）の右試料から上清の緩衝液を除去しさらに両試料にＮａＣｌを添加した状態を示す図である。図３の６−３）の左試料は図３の６−１）の左試料と同様にポリリジン添加前と比べ１０倍程度に濃縮された再可溶化状態であるのに対し、図３の６−３）の右試料はポリリジン添加前と比べＮａＣlを添加した分希釈され、さらにタンパク質量として９割が失われている状態を表わす。
【図４】図４は、ＭＯＰＳ緩衝液中に添加したＬ-アスパラギナーゼとポリリジンとの混合質量部の比に対する、Ｌ-アスパラギナーゼの濃縮倍率を示すグラフである。実線はタンパク質濃度（濃縮倍率）、破線はタンパク質の活性倍率を示す。両グラフは一致しており、複合体を形成し、その後可溶化した後にタンパク質の活性が保持されていることが示される。
【図５】図５は、タンパク質とポリアミノ酸との複合体の最大濃縮倍率が、緩衝液のｐＨとタンパク質の等電点ｐＩの差の絶対値が０．５〜４．０の範囲に存在することを示すグラフである。
【図６】図６は、後に説明する試験例１３において得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体（ＭＯＰＳ緩衝液中）を形成して濃縮後再溶解した実施例８４（破線）とポリアミノ酸を含有せず濃縮されていない比較例８４（実線）を対照液として、ＣＤスペクトルを測定したグラフである。両者のＣＤスペクトルは一致し、複合体を形成し、その後可溶化した後に、タンパク質の二次構造は変化せず保持されていることが示される。
【図７】図７は、後に説明する試験例１４において得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体（ＭＯＰＳ緩衝液中）を形成して濃縮後再溶解した実施例８７（破線）とポリアミノ酸を含有せず濃縮されていない比較例８７（実線）を対照液として、ＣＤスペクトルを測定したグラフである。両者のＣＤスペクトルは一致し、複合体を形成し、その後可溶化した後に、タンパク質の二次構造は変化せず保持されていることが示される。
【図８】図８は、後に説明する試験例１５において得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体（クエン酸緩衝液中）を形成して濃縮後再溶解した実施例８８（破線）とポリアミノ酸を含有せず濃縮されていない比較例８８（実線）を対照液として、ＣＤスペクトルを測定したグラフである。両者のＣＤスペクトルは一致し、複合体を形成し、その後可溶化した際に、濃縮されたタンパク質の二次構造は変化せず保持されていることが示される。
【図９】図９は、後に説明する試験例１５−２において得られたヒトＩｇＧ・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体（クエン酸緩衝液中）を形成して濃縮後再溶解した実施例８８−２（破線）とポリアミノ酸を含有せず濃縮されていない比較例８８−２（実線）を対照液として、ＣＤスペクトルを測定したグラフである。両者のＣＤスペクトルは一致し、複合体を形成し、その後可溶化した際に、濃縮されたタンパク質の二次構造は変化せず保持されていることが示される。
【図１０】図１０は、後に説明する試験例２６において抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液（実施例９２）の振とう後（破線）について、およびポリアミノ酸を含有しない対照液（比較例９２）の振とう前（実線）について、測定されたＣＤスペクトルを示すグラフである。抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に振とうストレスを加えた場合と、加えていない場合とでＣＤスペクトルが一致し、複合体中のタンパク質に振とうストレスを加えてもタンパク質の二次構造が保持されていることが示される。
【図１１】図１１は、後に説明する試験例２７において抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液（実施例９６）の振とう後（破線）について、およびポリアミノ酸を含有しない対照液（比較例９６）の振とう前（実線）および振とう後（破線）について、測定されたＣＤスペクトルを示すグラフである。対照液に振とうストレスを加えた場合と、加えていない場合とでＣＤスペクトルが一致せず二次構造変化が生じているのに対し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に振とうストレスを加えた場合と、加えていない場合とでＣＤスペクトルが一致し、複合体中でタンパク質が振とうストレスを加えてもタンパク質の二次構造が保持されていることが示される。
【図１２】図１２は、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリアリルアミン複合体（ＰＡＡ−ＡＳＮａｓｅ）含有水性懸濁液からのＬ-アスパラギナーゼの回収率（対照実施例１１１）、およびＬ−アスパラギナーゼ・ポリエチレンイミン複合体（ＰＥＩ−ＡＳＮａｓｅ）含有水性懸濁液からのＬ−アスパラギナーゼの回収率（対照実施例１１２）を示すグラフである。  Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリリジン複合体含有水性懸濁液（実施例1〜１１参照）およびＬ−アスパラギナーゼ・ポリエチレンイミン複合体含有水性懸濁液からのＬ−アスパラギナーゼの回収率が１００％近いのに対し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリアリルアミン複合体含有水性懸濁液からのＬ−アスパラギナーゼの回収率は有意に低かった。このことからポリエチレンイミンにより、ポリリジンと同様にＬ−アスパラギナーゼと複合体を形成し、濃縮および回収が可能であることが示された。
【図１３】図１３は、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリリジン複合体含有水性懸濁液（実施例１１４）、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリエチレンイミン複合体含有水性懸濁液（対照実施例１１４）およびＬ-アスパラギナーゼＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）溶液（比較例１１４，buffer）をそれぞれ振とうした後に、Ｌ−アスパラギナーゼの残存活性を測定した結果を示すグラフである。Ｌ-アスパラギナーゼ・ポリリジン複合体含有水性懸濁液（実施例１１４）における残存活性と比べ、Ｌ-アスパラギナーゼ・ポリエチレンイミン複合体含有水性懸濁液（対照実施例１１４）における残存活性は有意に低く比較例１１４における残存活性と同等であった。即ちＬ-アスパラギナーゼ・ポリエチレンイミン複合体含有水性懸濁液は振とうストレスに対する安定化効果を有しないことが示された。
【図１４】２気室プレフィルドシリンジの保存時と溶解時との操作を説明する模式図である。
【図１５】図１５（Ａ）は、ラットＩｇＧクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）溶液（白丸）とラットＩｇＧ・ポリグルタミン酸複合体含有水性懸濁液（黒丸）とをラットに皮下注射したラットの体重変化を示すグラフである。縦軸：ラット体重（ｇ）、横軸：注射後の日数である。ラットＩｇＧクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）溶液投与群（白丸）とラットＩｇＧ・ポリグルタミン酸複合体含有水性懸濁液投与群（黒丸）とで、ラット体重に有意な差は認められなかった。図１５（Ｂ）は、ラットＩｇＧクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）溶液とラットＩｇＧ・ポリグルタミン酸複合体含有水性懸濁液をラットに皮下注射した後、１週間および２週間後の臓器の重さを測定したグラフである。縦軸：臓器重量（ｇ）、横軸：各臓器の１および２週後を示す。ラットＩｇＧクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）溶液投与群（白棒）とラットＩｇＧ・ポリグルタミン酸複合体含有水性懸濁液投与群（黒棒）とでいずれのラット臓器重量においても有意な差は認められなかった。
【図１６】図１６は抗ＩｇＥモノクローナル抗体溶液（白丸）と、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリグルタミン酸複合体含有水性懸濁液（黒丸）をラットに皮下注射した後の、血漿中抗ＩｇＥモノクローナル抗体濃度の推移を示したグラフである。縦軸：ラット血漿中の抗ＩｇＥモノクローナル抗体濃度、横軸：注射後の日数である。抗ＩｇＥモノクローナル抗体溶液投与群（白丸）と、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリグルタミン酸複合体含有水性懸濁液投与群（黒丸）とで、血漿中抗ＩｇＥモノクローナル抗体濃度−時間曲線は同等であった。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明のタンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁剤の一例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔タンパク質〕
本発明に使用されるタンパク質は、高純度であり、緩衝液中で表面電荷を有するタンパク質であれば特に限定されない。好ましくは生物活性を有するタンパク質であり、より具体的には、植物、動物、微生物等の生物由来のタンパク質、あるいは遺伝子組換え技術を用いて製造されたタンパク質などが挙げられる。本発明において、より好ましい形態のタンパク質は、酵素、サイトカイン、ホルモン、抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質等の医療用タンパク質である。
タンパク質が抗体または抗体フラグメントであると、これらのタンパク質を製剤または診断剤としてヒトに適用する際に、本発明の水性懸濁剤を用いればより安定に運搬、保存が可能であり、しかも用時にヒトに投与することが容易であり有用性が高い。タンパク質は糖鎖を有していてもよく、糖鎖は親水性であり、本発明の複合体含有水性懸濁液中で何らかの相互作用を有すると考えられる。
高純度であるとは医療用タンパク質であれば、医薬品レベル、ヒトの医薬品として使用可能なレベル、であり、その他のタンパク質では試薬級の高純度、例えば不純物の総量で０．１質量％以下という閾値が挙げられる。
〔ポリアミノ酸〕
本発明に使用されるポリアミノ酸またはその水溶性塩は、緩衝液中で表面電荷を有するポリアミノ酸またはその水溶性塩であれば特に限定されない。後に説明する本発明の複合体またはタンパク質水性懸濁剤に使用するポリアミノ酸は、試薬級の高純度、例えば不純物量の総量で０．１５質量％以下という閾値があげられる。
具体的にはカチオン性あるいはアニオン性ポリアミノ酸またはその塩である。カチオン性ポリアミノ酸として、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸のナトリウム塩等、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリシトルリン等の塩酸塩等が挙げられる。本発明において、より好ましい形態のポリアミノ酸の形態は、カチオン性ポリアミノ酸として、ポリ−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム塩、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム塩、アニオン性ポリアミノ酸として、ポリ−Ｌ−アルギニン塩酸塩、ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩、ポリ−Ｌ−アルギニン臭化水素酸塩、ポリ−Ｌ−リジン臭化水素酸塩が例示できる。ポリアミノ酸はホモ重合体もしくは共重合体、またはその混合物である。好ましくはホモ重合体である。ポリアミノ酸は主鎖と側鎖のカルボキシル基またはアミノ基との間にＣＨ２基が存在するのが好ましい。ポリアミノ酸の５０％細胞増殖抑制濃度は好ましくは０．２％以上であり、より好ましくは１．０％以上である。
【００１２】
〔緩衝液〕
本発明に使用する緩衝液は、水素イオン濃度に対する緩衝作用のある溶液を指し、緩衝液は少量の酸や塩基を加えたり、多少濃度が変化したりしてもｐＨが大きく変化しないように調整された水溶液である。緩衝液は通常化学的に用いられるものであれば特に限定されないが、生物学的に用いられる緩衝液が好ましい。より好ましい形態の緩衝液は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））緩衝液、ＴｒｉｓＨＣl緩衝液、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ, ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−pｉｐｅｒａｚｉｎｅ  ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、グリシンＮａＯＨ緩衝液等の生体試料に適したもので、生体への投与が可能な緩衝液を用いることができる。
【００１３】
〔タンパク質・ポリアミノ酸複合体〕
１．タンパク質・ポリアミノ酸複合体
本発明の複合体は、以下の（１）〜（４）の特性を有する。
（１）本発明のタンパク質とポリアミノ酸との複合体は、タンパク質とポリアミノ酸とが緩衝液中で複合体を形成して懸濁する複合体含有水性懸濁液中に得られる。
（２）タンパク質は前記緩衝液中で複合体を形成し、得られる複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより濃縮可能である。
（３）複合体は、複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質を添加して溶解可能である。
（４）前記タンパク質は前記複合体中で安定であり、濃縮時に活性が劣化しない。
【００１４】
以下にタンパク質が、Ｌ-アスパラギナーゼ、ポリアミノ酸がポリリジンである場合を例として上記（１）〜（３）の特性を説明する。
（１）本発明のタンパク質とポリアミノ酸との複合体は、タンパク質とポリアミノ酸とが緩衝液中で複合体を形成して懸濁する複合体含有水性懸濁液中に得られる。
図１は、Ｌ-アスパラギナーゼに対して、ポリリジン（Ｐｏｌｙ−Ｋ、分子量４ｋＤａ−１５ｋＤａ)添加の状態を示す図である。右側の試料はＭＯＰＳ緩衝液中のＬ-アスパラギナーゼ、左側の試料はＭＯＰＳ緩衝液中のＬ-アスパラギナーゼ１質量部に対して、ポリリジンが０．０５質量部添加されている。１)の左試料は、添加直後で、白い固体粒子状の複合体が形成された水性懸濁液を示す写真である。２）の左試料は、形成された複合体が、一定時間経過後自然沈降する状態を示す写真である。一方ポリリジンを添加しない右試料は１）および２）で複合体ができていないことがわかる。
図２は、図１と同じ試料で、３）の左試料は、図１の２）の左試料を遠心分離して複合体がペレット状になった状態を示す写真である。４）の左試料は、上清の緩衝液を除いて複合体が１０倍濃縮された状態を示す写真である。
複合体の形成時に条件によっては一部のタンパク質が上清中に残存することもあると考えられる。
【００１５】
（２）タンパク質は前記緩衝液中で複合体を形成し、得られる複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより濃縮可能である。
図２の４）左試料中に示すように、得られたタンパク質・ポリアミノ酸複合体は、上清の緩衝液を除去して濃縮されたタンパク質を保持する複合体を得ることができる。図２の３）の左試料に示すように遠心分離して複合体を得てもよい。複合体含有水性懸濁液は緩衝液、水等を添加して任意の濃度に薄めることもできる。
（３）複合体は、前記複合体含有水性懸濁液に無機塩である低濃度の電解質を添加して溶解可能である。電解質としてはＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２等が例示できるが、好ましくは生体適合性が最も高いＮａＣｌが選択される。電解質濃度は限定されないが５質量％以下で、複合体が溶解する十分量を用いることができる。
【００１６】
図３は、図２と同じ試料で、図３の５）の左試料は、図２の４）の左試料の全体を振ってペレット状であった複合体を再懸濁させた状態を示す写真である。図３の５）の右試料は複合体が形成されていない図２の３）、４）の右試料と同様に全体を振っても複合体が形成されないことに変わりがないことを示す。
図３の６−１）左試料は、図３の５）の左試料にＮａＣlを添加して複合体を再溶解させた状態を示す。図３の６−１）の右試料は、図３の５）の右試料にＮａＣlを添加しても複合体ができていない状態が変わらないことを示す。図３の６−１）の左試料はポリリジン添加前と比べ１０倍程度に濃縮された再可溶化状態であるのに対し、図３の６−１）の右試料は図３の５）の右試料と同程度あるいはＮａＣlを添加した分希釈された状態を示す。
また図３の６−２）の左試料は、図３の６−１）の左試料に緩衝液、水等を加えることで量を調整しても再溶解させた状態が変わらないことを示す。図３の６−２）の左試料は、図３の６−１）の左試料に緩衝液、水等を加えることで、ポリリジン添加前と同等のタンパク質濃度となっている状態を示す。
図３の６−３）の左試料は図３の５）の左試料にＮａＣｌを添加した状態を示す図である。図３の６−３）の右試料は図３の５）の左試料と量が同等となるよう図３の５）の右試料の一部を除去しさらにＮａＣｌを添加した状態を示す図である。図３の６−３）の左試料は図３の６−１）の左試料と同様にポリリジン添加前と比べ１０倍程度に濃縮された再可溶化状態であるのに対し、図３の６−３）の右試料はポリリジン添加前と比べＮａＣlを添加した分希釈され、さらにタンパク質量として９割が失われている状態を表わす。
図４は、ＭＯＰＳ緩衝液中に添加したＬ-アスパラギナーゼと、Ｌ-アスパラギナーゼ1質量部に対するポリリジン混合比に対する、Ｌ-アスパラギナーゼの非濃縮に対する濃縮倍率を示すグラフである。Ｌ-アスパラギナーゼの濃縮倍率は、複合体を含む水性懸濁液を遠心分離して得られた複合体にＮａＣlを添加して再溶解し、得られた水性液中で、Ｌ-アスパラギナーゼ濃度を吸光度から算出する。
【００１７】
本発明の複合体は、緩衝液中に表面電荷を有するタンパク質とポリアミノ酸とを含み、前記タンパク質と前記ポリアミノ酸とが好ましくは静電的相互作用によって形成される複合体で、前記緩衝液のｐＨと前記タンパク質の等電点ｐＩの差の絶対値が、好ましくは０．５〜４．０で、１超の濃縮倍率が得られる。図５に示すように濃縮倍率はタンパク質の種類が変わっても｜ｐＨ-ｐＩ｜が０．５から２付近の範囲では濃縮率が上がり、約１０倍の濃縮倍率が得られ、その後は｜ｐＨ-ｐＩ｜の値にかかわらずほぼ横ばい状態の濃縮率を示す。つまり、｜ｐＨ-ｐＩ｜が、好ましくは０．５〜４．０、より好ましくは１．０〜４．０、より好ましくは１．０〜３．５、より好ましくは１．８〜３．５、より好ましくは１．８〜３．０、さらに好ましくは１．８〜２．５の範囲で適切に濃縮できることがわかる。
【００１８】
タンパク質とポリアミノ酸との複合体中のタンパク質の最大濃縮率が、緩衝液のｐＨと前記タンパク質の等電点ｐＩの差の絶対値が好ましくは０．５〜４．０の範囲に存在する理由は不明である。本発明者らは、複合体中のタンパク質の最大濃縮率が、緩衝液のｐＨと前記タンパク質の等電点ｐＩの差の絶対値がより好ましくは１．５〜４．０、さらに好ましくは１．０〜４．０、より好ましくは１．０〜３．５、より好ましくは１．５〜３．５、より好ましくは１．８〜３．５、より好ましくは１．８〜３．０、さらに好ましくは１．８〜２．５の範囲に存在することは、タンパク質とポリアミノ酸とが複合体を形成する静電的相互作用の状態を表す１つの特徴であると考えているが、本発明はこれらの機序に限定されるものではない。
【００１９】
（４）前記タンパク質は前記複合体中で安定であり、濃縮時に活性が劣化しない。
ここで、活性が劣化しないとは、複合体が濃縮操作によっても同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液に対してその生物活性が好ましくは８０％以上保持されることをいう。さらに好ましくは８５％以上、９０％以上保持されることをいう。場合によっては１００％超の測定値を示す場合もあるがその原因は測定誤差によるものか何かの機序によるものか不明である。
【００２０】
また、前記タンパク質は前記複合体中で安定であり、複合体を形成しその後可溶化した後にタンパク質の二次構造が保持され、濃縮されてもタンパク質の二次構造は保持される。タンパク質が本発明の複合体を形成し濃縮された後、再溶解されても、タンパク質の二次構造の変化はほとんどないことが分かっている。後に説明する実施例８４、８７、８８，８８−２の結果を示す、図６、７、８、９でそれぞれ複合体形成前と、複合体形成および再溶解後とのそれぞれのＣＤスペクトルを測定して確認されている。本発明に用いる高純度タンパク質の濃縮時の濃度は限定されないが、好ましくは、０．１ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬで用いても二次構造が変化しないことが上記実験から推定できる。
【００２１】
本発明のタンパク質・ポリアミノ酸複合体はその特性により異なる用途を持つ以下の５つの特性で特徴付けられる複合体［１］〜複合体［５］として説明できる。
〔１．振とうストレス耐性を有するタンパク質・ポリアミノ酸複合体（以下、複合体［１］という）〕
本発明の複合体［１］は、以下の（１）〜（５）の特性を有する。
（１）本発明のタンパク質とポリアミノ酸との複合体［１］は、タンパク質とポリアミノ酸とが緩衝液中で複合体を形成して懸濁する複合体含有水性懸濁液中に得られる。
（２）タンパク質は前記緩衝液中で複合体［１］を形成し、得られる複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより濃縮可能である。
（３）複合体［１］は、複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質を添加して溶解可能である。
（４）タンパク質は本発明の複合体を用いる濃縮で、その活性が損なわれない。またタンパク質は、複合体を形成しその後可溶化した後にタンパク質の二次構造が保持され、濃縮されてもタンパク質の二次構造は保持される。
（５）タンパク質は複合体［１］中で振とうストレス耐性を有する。
（１）〜（４）の特性については上記１．タンパク質・ポリアミノ酸複合体で説明したのと同様でありここでは記載を省略する。以下に特性（５）を説明する。
【００２２】
（５）前記タンパク質は前記複合体中で振とうストレス耐性を有する。
ここで、振とうストレス耐性を有するとは、複合体［１］が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液に対して振とうストレス耐性がより高いことを言い、具体的には振とう後の活性残存率がより高いこと、またはタンパク質の構造がより保持されること、またはタンパク質の残存率がより高いことをいう。
振とうストレスとは、例えば後に実施例の試験例で示すような１００〜５００ｒｐｍ×１０〜１００時間の振とうを緩衝液中のタンパク質または複合体に与えることを言う。振とうストレス耐性とはタンパク質の種類によって異なるので限定できないが、振とうストレス前と比較して振とうストレス後のタンパク質の残存活性率が、複合体を形成しない場合の残存活性率と比較して１０％〜９９％高いことをいう。好ましくは１０％〜５０％、さらには１５％〜５０％であってもよい。
また、上記の振とうストレスの前後において、タンパク質の濃度を吸光度で測定すると、複合体を形成しない場合は多量の不溶性の沈殿物ができて振とう後、遠心分離して凝集体を除くと緩衝液中のタンパク質の濃度が低くなりタンパク質含量の残存率が小さくなり、７％未満となる場合もある。一方複合体を形成する場合は振とうストレスの前後において複合体中のタンパク質が安定でありタンパク質含量の残存率が測定によっては１００％以上の値となる。複合体中のタンパク質含量の残存率の値は、複合体を形成しない場合の対照液のタンパク質含量の残存率の値より、好ましくは１５％〜９９％高く、より好ましくは１８％〜９５％高く、さらには２５％〜９０％高い。
【００２３】
〔２．流動性を有するタンパク質・ポリアミノ酸複合体（以下、複合体［２］という）〕
本発明の複合体［２］は、以下の（１）〜（５）の特性を有する。
（１）本発明のタンパク質とポリアミノ酸との複合体［２］は、タンパク質とポリアミノ酸とが緩衝液中で複合体を形成して懸濁する複合体含有水性懸濁液中に得られる。
（２）タンパク質は前記緩衝液中で複合体［２］を形成し、得られる複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより濃縮可能である。
（３）複合体［２］は、複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質を添加して溶解可能である。
（４）タンパク質は本発明の複合体［２］を用いる濃縮で、その活性が損なわれない。またタンパク質は、複合体を形成しその後可溶化した後にタンパク質の二次構造が保持され、濃縮されてもタンパク質の二次構造は保持される。
（５）タンパク質は複合体［２]中で流動性に優れる。
（１）〜（４）の特性については上記１．タンパク質・ポリアミノ酸複合体で説明したのと同様でありここでは記載を省略する。以下に特性（５）を説明する。
【００２４】
（５）タンパク質は前記複合体［２］中で流動性に優れる。
ここで、流動性を有する、流動性に優れる、または流動性の向上とは、複合体［２］が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液に対してより流動性を有することを言い、具体的には同一緩衝液同一濃度で、複合体［２］中に含まれるタンパク質の粘度がより低いことをいう。
複合体［２］中のタンパク質の粘度はタンパク質の種類、濃度によって異なり限定されない。対照液の粘度の６０％以下であり、好ましくは５５％以下、さらには５０％以下であってもよい。
【００２５】
〔３．耐酸化性を有するタンパク質・ポリアミノ酸複合体（以下、複合体［３］という）〕
本発明の複合体［３］は、以下の（１）〜（５）の特性を有する。
（１）本発明のタンパク質とポリアミノ酸との複合体［３］は、タンパク質とポリアミノ酸とが緩衝液中で複合体を形成して懸濁する複合体含有水性懸濁液中に得られる。
（２）タンパク質は前記緩衝液中で複合体［３］を形成し、得られる複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより濃縮可能である。
（３）複合体［３］は、複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質を添加して溶解可能である。
（４）タンパク質は本発明の複合体［３］を用いる濃縮で、その活性が損なわれない。またタンパク質は、複合体を形成しその後可溶化した後にタンパク質の二次構造が保持され、濃縮されてもタンパク質の二次構造は保持される。
（５）タンパク質は複合体［３］中で耐酸化性を有する。
（１）〜（４）の特性については上記１．タンパク質・ポリアミノ酸複合体で説明したのと同様でありここでは記載を省略する。以下に特性（５）を説明する。
（５）タンパク質は複合体［３］中で耐酸化性を有する。
ここで、酸化ストレスとは、添加された酸化性化合物中の活性酸素種等がタンパク質中の酸化を受けやすいアミノ酸側鎖に切断、会合、修飾などを引き起こし、タンパク質の一次構造に生じさせる変化を言い、耐酸化性を有するとは、複合体［３］が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液に対して耐酸化性がより高いことを言い、具体的には同一緩衝液同一濃度で、酸化性化合物の添加に対して複合体［３］中のタンパク質の活性残存率が同一化合物添加の対照液より高いこと、またはタンパク質の構造がより保持されることをいう。
用いる酸化性化合物としては、０．０１〜３．００質量％の過酸化水素水と緩衝液との混合物、１〜１０ｍＭ銅イオン存在下の１〜１０ｍＭアスコルビン酸等が例示でき、所定時間、所定温度後のタンパク質の活性変化または一次構造の変化を測定する。所定時間、所定温度は例えば、１〜１０時間、２０℃〜４０℃であってもよい。
複合体［３］中のタンパク質の耐酸化性はタンパク質の種類、濃度によって異なり限定されない。同一酸化ストレス下の対照液の残存活性との差が５％〜３０％高く、好ましくは５％〜２５％高く、さらには１０％〜２０％高くてもよい。
また、タンパク質の構造保持は、複合体を形成しない対照液（比較例）における酸化ストレス下の一次構造変化率を１００％とした場合、複合体中のタンパク質における同様の酸化ストレス下の一次構造変化率は好ましくは９５％以下、より好ましくは９１％以下、さらには８７％以下に抑制される。
【００２６】
〔４．耐熱性を有するタンパク質・ポリアミノ酸複合体（以下、複合体［４］という）〕
本発明の複合体［４］は、以下の（１）〜（５）の特性を有する。
（１）本発明のタンパク質とポリアミノ酸との複合体［４］は、タンパク質とポリアミノ酸とが緩衝液中で複合体を形成して懸濁する複合体含有水性懸濁液中に得られる。
（２）タンパク質は前記緩衝液中で複合体［４］を形成し、得られる複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより濃縮可能である。
（３）複合体［４］は、複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質を添加して溶解可能である。
（４）タンパク質は本発明の複合体［４］を用いる濃縮で、その活性が損なわれない。またタンパク質は、複合体を形成しその後可溶化した後にタンパク質の二次構造が保持され、濃縮されてもタンパク質の二次構造は保持される。
【００２７】
（５）タンパク質は複合体［４］中で耐熱性を有する。
（１）〜（４）の特性については上記１．タンパク質・ポリアミノ酸複合体で説明したのと同様でありここでは記載を省略する。以下に特性（５）を説明する。
ここで、耐熱性を有するとは、複合体［４］が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液に対して耐熱性がより高いことを言い、具体的には同一緩衝液、同一濃度で、熱負荷後の複合体［４］中のタンパク質の活性が複合体を形成しない対照液と比較してより高いこと，またはタンパク質の変性温度がより高温であることをいう。
熱負荷とは例えば後に実施例の試験例で示すような、所定温度、所定時間、例えば、室温〜６０℃×５分〜２０時間で複合体[４]または同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液に熱を加えることを言う。耐熱性は、複合体[４]または同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液を冷所保存した場合の活性を１００％として上記熱負荷を与えた複合体[４]または同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液における活性保持率を測定することで評価できる。または、複合体[４]と同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液とを示差走査熱量測定し各変性温度を測定することで評価できる。
複合体［４］中のタンパク質の耐熱性はタンパク質の種類、濃度によって異なり限定されない。同一熱ストレス下の対照液の活性残存率との差が５％〜９５％、好ましくは１０％〜９５％以下、さらには２０％〜８５％であってもよい。
複合体［４］中のタンパク質の熱変性温度は対照液と比較して好ましくは、１℃〜２０℃高い。
【００２８】
〔５．凝集抑制性を有するタンパク質・ポリアミノ酸複合体（以下、複合体［５］という）〕
本発明の複合体［５］は、以下の（１）〜（５）の特性を有する。
（１）本発明のタンパク質とポリアミノ酸との複合体［５］は、タンパク質とポリアミノ酸とが緩衝液中で複合体を形成して懸濁する複合体含有水性懸濁液中に得られる。
（２）タンパク質は前記緩衝液中で複合体［５］を形成し、得られる複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水分を除去することにより濃縮可能である。
（３）複合体は、複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質を添加して溶解可能である。
（４）タンパク質は本発明の複合体［５］を用いる濃縮で、その活性が損なわれない。またタンパク質は、複合体を形成しその後可溶化した後にタンパク質の二次構造が保持され、濃縮されてもタンパク質の二次構造は保持される。
（５）タンパク質は複合体［５］中で凝集抑制性を有する。
（１）〜（４）の特性については上記１．タンパク質・ポリアミノ酸複合体で説明したのと同様でありここでは記載を省略する。以下に特性（５）を説明する。
ここで、凝集抑制性を有するとは、複合体［５］が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液に対して凝集抑制により優れていることを言い、具体的には複合体の形成により凝集体の形成が抑制されることを言う。凝集体の形成は、複合体［５］および同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液中のタンパク質の振とうストレス前後の凝集量を総タンパク質量から上清のタンパク質量を差し引くことで算出する、あるいはサイズ排除クロマトグラフ法による可溶性凝集体ピーク面積を測定することで評価できる。あるいは複合体［５］および同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の対照液中のタンパク質の加熱ストレス前後の凝集体数増加率、あるいは濁度増加率を算出することで評価できる。これらの測定により複合体[５]中のタンパク質が種々の条件下で凝集体の形成が抑制されていることを評価できる。
複合体［５］中のタンパク質の凝集抑制性はタンパク質の種類、濃度によって異なり限定されない。同一振とうストレス下の対照液との不溶性凝集体化率の差が５％〜２０％、好ましくは振とうストレス後に凝集物を実質的に有しない特性であってもよい。同一振とうストレス下で可溶性凝集体増加率は対照液との比率で３０％以下、好ましくは１０％以下、さらには５％以下であってもよい。同一振とうストレス下で凝集体数増加率は対照液との比率で１．０％以下、好ましくは０．５％以下、さらには０．２％以下であってもよい。同一加熱ストレス下で濁度増加率は対照液との比率で１０％以下、好ましくは６％以下、さらには４％以下であってもよい。
【００２９】
〔タンパク質・ポリアミノ酸複合体を含む水性懸濁剤の特性〕
タンパク質が正又は負の表面電荷を有する。ポリアミノ酸がカチオン性またはアニオン性である。
カチオン性、中性またはアニオン性ポリアミノ酸の分子量が、０．５ｋＤａ〜１０００ｋＤａの範囲であるのが好ましい。より好ましくは５ｋＤａ〜８００ｋＤａ、さらには１０ｋＤａ〜５００ｋＤａが好ましい。タンパク質の分子量が、３ｋＤａ〜６７０ｋＤａの範囲であるのが好ましい。ポリアミノ酸の５０％細胞増殖抑制濃度は好ましくは０．２％以上であり、より好ましくは１．０％以上である。
タンパク質が正の表面電荷を有する場合はアニオン性ポリアミノ酸と組合せ、タンパク質が負の表面電荷を有する場合はカチオン性ポリアミノ酸と組合せるのが好ましい。
タンパク質は、水性懸濁液中で０．０１ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で含まれる。
水性懸濁液に用いる緩衝液のｐＨは、ｐＨ３〜ｐＨ１０．５の範囲が好ましい。
本発明の水性懸濁剤は、緩衝液中に表面電荷を有するタンパク質とポリアミノ酸を含み、これらの配合比が好ましくは前記タンパク質１質量部に対し前記ポリアミノ酸が０．００５質量部〜６質量部の範囲であり、前記緩衝液のｐＨが含まれる前記タンパク質の等電点ｐＩより０．５以上塩基性又は酸性側に調整されていて、前記タンパク質と前記ポリアミノ酸が静電的相互作用による複合体を形成している、安定なタンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁剤である。
本発明の水性懸濁剤は、タンパク質の等電点に応じて緩衝液のｐＨとポリアミノ酸を選択するのみで簡便に濃縮、安定化させることができ、従来必要であった添加剤を加える必要がない。水性懸濁剤は、緩衝液、タンパク質、ポリアミノ酸、ｐＨ調整剤以外の添加剤を加えることもできるが加える必要はない。また、凍結乾燥製剤で必要となる煩雑な溶解操作を必要とせず、そのまま製剤として投与できる。あるいは用時に塩化ナトリウムに代表される無機塩を加えて溶解して製剤として投与することができる。
【００３０】
〔タンパク質・ポリアミノ酸複合体を形成するタンパク質とポリアミノ酸との組み合わせ〕
本発明の複合体は、タンパク質とイオン性ポリアミノ酸とを含んでなる。
１．（１）酸性領域（ｐＨ３.０以上〜６．０未満）に等電点をもつタンパク質（酵素、サイトカイン、抗体フラグメント等）の場合、等電点より酸性側に緩衝能のある緩衝液を用いる場合は、ポリグルタミン酸（ＭＷ：７５０〜５０００、ｐＩ：２．８１〜３．４６）、ポリグルタミン酸（ＭＷ：３０００〜１５０００、ｐＩ：２．３６〜３．００）、ポリグルタミン酸（ＭＷ：１５０００〜５００００、ｐＩ：１．８５〜２．３６）、ポリグルタミン酸（ＭＷ：５００００〜１０００００、ｐＩ：１．５６〜１．８５）、ポリアスパラギン酸（ＭＷ：２０００〜１１０００、ｐＩ：２．０６〜２．７５）、ポリアスパラギン酸（ＭＷ：５０００〜１５０００、ｐＩ：１．９３〜２．３９）およびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つのアニオン性ポリアミノ酸を加えて、複合体を形成する。また、等電点よりアルカリ性側に緩衝能のある緩衝液を用いる場合は、ポリリジン（ＭＷ：１０００〜５０００、ｐＩ：１０．８５〜１１．５８）、ポリリジン（ＭＷ：４０００〜１５０００、ｐＩ：１１．４９〜１２．０６）、ポリリジン（ＭＷ：１５０００〜３００００、ｐＩ：１２．０６〜１２．３７）、ポリリジン（ＭＷ：３００００〜、ｐＩ：１２．３７〜）、ポリアルギニン（ＭＷ：５０００〜１５０００、ｐＩ：１３．４９〜１３．９７）、ポリアルギニン（ＭＷ：１５０００〜７００００、ｐＩ：１３．９８〜１４．００）、ポリアルギニン（ＭＷ：７００００〜、ｐＩ：１４．００）、ポリヒスチジン（ＭＷ：５０００〜２５０００、ｐＩ：７．７４〜８．３０）およびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つのカチオン性ポリアミノ酸を加えて、複合体を形成する。
【００３１】
（２）なお、酸性領域に等電点をもつタンパク質の緩衝液としては公知の緩衝液が適宜使用でき、特に限定されるものではない。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ緩衝液（トリス塩酸緩衝液）、ＭＥＳ緩衝液（２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液）、ＴＥＳ緩衝液（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液）、酢酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液（３−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液）、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液）、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液（ピペラジン−１、４−ビス（２−エタンスルホン酸）緩衝液）などのＧＯＯＤ緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、グリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝液などのアミノ酸系緩衝液、トリス−ホウ酸緩衝液、ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液、ホウ酸緩衝液などのホウ酸系緩衝液、またはイミダゾール緩衝液などが用いられる。
【００３２】
２．（１）中性領域（ｐＨ６．０以上〜８．０以下）に等電点をもつタンパク質（抗体、抗体フラグメント、融合タンパク等）の場合、等電点より酸性側に緩衝能のある緩衝液を用いる場合は、ポリグルタミン酸（ＭＷ：７５０〜５０００、ｐＩ：２．８１〜３．４６）、ポリグルタミン酸（ＭＷ：３０００〜１５０００、ｐＩ：２．３６〜３．００）、ポリグルタミン酸（ＭＷ：１５０００〜５００００、ｐＩ：１．８５〜２．３６）、ポリグルタミン酸（ＭＷ：５００００〜１０００００、ｐＩ：１．５６〜１．８５）、ポリアスパラギン酸（ＭＷ：２０００〜１１０００、ｐＩ：２．０６〜２．７５）、ポリアスパラギン酸（ＭＷ：５０００〜１５０００、ｐＩ：１．９３〜２．３９）およびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つのアニオン性ポリアミノ酸を加えて、複合体を形成する。また、等電点よりアルカリ性側に緩衝能のある緩衝液を用いる場合は、ポリリジン（ＭＷ：１０００〜５０００、ｐＩ：１０．８５〜１１．５８）、ポリリジン（ＭＷ：４０００〜１５０００、ｐＩ：１１．４９〜１２．０６）、ポリリジン（ＭＷ：１５０００〜３００００、ｐＩ：１２．０６〜１２．３７）、ポリリジン（ＭＷ：３００００〜、ｐＩ：１２．３７〜）、ポリアルギニン（ＭＷ：５０００〜１５０００、ｐＩ：１３．４９〜１３．９７）、ポリアルギニン（ＭＷ：１５０００〜７００００、ｐＩ：１３．９８〜１４．００）、ポリアルギニン（ＭＷ：７００００〜、ｐＩ：１４．００）、ポリヒスチジン（ＭＷ：５０００〜２５０００、ｐＩ：７．７４〜８．３０）およびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つのカチオン性ポリアミノ酸を加えて、複合体を形成する。
【００３３】
（２）なお、中性領域に等電点をもつタンパク質の緩衝液としては公知の緩衝液が適宜使用でき、特に限定されるものではない。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ緩衝液（トリス塩酸緩衝液）、ＭＥＳ緩衝液（２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液）、ＴＥＳ緩衝液（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液）、酢酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液（３−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液）、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液）、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液（ピペラジン−１、４−ビス（２−エタンスルホン酸）緩衝液）などのＧＯＯＤ緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、グリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝液などのアミノ酸系緩衝液、トリス−ホウ酸緩衝液、ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液、ホウ酸緩衝液などのホウ酸系緩衝液、またはイミダゾール緩衝液などが用いられる。
【００３４】
３．（１）アルカリ性領域（ｐＨ８．０超過〜１１．０以下）に等電点をもつタンパク質（サイトカイン、ホルモン、抗体、抗体フラグメント等）の場合、等電点より酸性側に緩衝能のある緩衝液を用いる場合は、ポリグルタミン酸（ＭＷ：７５０〜５０００、ｐＩ：２．８１〜３．４６）、ポリグルタミン酸（ＭＷ：３０００〜１５０００、ｐＩ：２．３６〜３．００）、ポリグルタミン酸（ＭＷ：１５０００〜５００００、ｐＩ：１．８５〜２．３６）、ポリグルタミン酸（ＭＷ：５００００〜１０００００、ｐＩ：１．５６〜１．８５）、ポリアスパラギン酸（ＭＷ：２０００〜１１０００、ｐＩ：２．０６〜２．７５）、ポリアスパラギン酸（ＭＷ：５０００〜１５０００、ｐＩ：１．９３〜２．３９）およびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つのアニオン性ポリアミノ酸を加えて、複合体を形成する。また、等電点よりアルカリ性側に緩衝能のある緩衝液を用いる場合は、ポリリジン（ＭＷ：１０００〜５０００、ｐＩ：１０．８５〜１１．５８）、ポリリジン（ＭＷ：４０００〜１５０００、ｐＩ：１１．４９〜１２．０６）、ポリリジン（ＭＷ：１５０００〜３００００、ｐＩ：１２．０６〜１２．３７）、ポリリジン（ＭＷ：３００００〜、ｐＩ：１２．３７〜）、ポリアルギニン（ＭＷ：５０００〜１５０００、ｐＩ：１３．４９〜１３．９７）、ポリアルギニン（ＭＷ：１５０００〜７００００、ｐＩ：１３．９８〜１４．００）、ポリアルギニン（ＭＷ：７００００〜、ｐＩ：１４．００）、ポリヒスチジン（ＭＷ：５０００〜２５０００、ｐＩ：７．７４〜８．３０）およびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つのカチオン性ポリアミノ酸を加えて、複合体を形成する。
【００３５】
（２）なお、アルカリ性領域に等電点をもつタンパク質の緩衝液としては公知の緩衝液が適宜使用でき、特に限定されるものではない。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ緩衝液（トリス塩酸緩衝液）、ＭＥＳ緩衝液（２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液）、ＴＥＳ緩衝液（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液）、酢酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液（３−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液）、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液）、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液（ピペラジン−１、４−ビス（２−エタンスルホン酸）緩衝液）などのＧＯＯＤ緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、グリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝液などのアミノ酸系緩衝液、トリス−ホウ酸緩衝液、ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液、ホウ酸緩衝液などのホウ酸系緩衝液、またはイミダゾール緩衝液などが用いられる。
【００３６】
〔タンパク質・ポリアミノ酸複合体を含む水性懸濁剤の製造方法〕
（工程１）：緩衝液のｐＨを、含まれる前記タンパク質の等電点ｐＩより絶対値で０．５以上４．０以下塩基性側および・または酸性側に調整する。
（工程２）：前記緩衝液に、表面電荷を有する前記タンパク質を０．０１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲、前記ポリアミノ酸を０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲となるように加えて前記タンパク質・ポリアミノ酸複合体を含む水性懸濁液を形成させる。
（工程３）：このタンパク質・ポリアミノ酸複合体を含む水性懸濁液から少なくとも一部の水分、または緩衝液を遠心分離、限外濾過、上清除去等より選ばれる方法で除去し、前記タンパク質が０．１ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で含まれるよう調整する。
（工程４）：工程３で調製した水性懸濁液に、工程３で除去した水分または緩衝液の量よりも少ない量の緩衝液、水等を添加することにより濃縮されたタンパク質濃度を有するタンパク質・ポリアミノ酸複合体を含む水性懸濁液を得る。あるいは、工程３で除去した水分または緩衝液の量と等しい量の緩衝液、水等を添加することにより同等のタンパク質濃度を有するタンパク質・ポリアミノ酸複合体を含む水性懸濁液を得る。あるいは、工程３で除去した水分または緩衝液の量よりも多い量の緩衝液、水等を添加することにより希釈されたタンパク質濃度を有するタンパク質・ポリアミノ酸複合体を含む水性懸濁液を得る。
（工程５）：上記の工程１および工程２の後に得られた複合体を含む水性懸濁液から水分を除去せずに、緩衝液、水等を添加することにより希釈されたタンパク質濃度を有するタンパク質・ポリアミノ酸複合体を含む水性懸濁を得る。
【００３７】
上記タンパク質が、医療用タンパク質である場合は、上記の工程１、工程２、工程３および工程４あるいは上記の工程１、工程２および工程５により水性懸濁剤が製造される。
本発明の製剤は、緩衝液中で表面電荷を有するタンパク質製剤とポリアミノ酸とが複合体を形成して懸濁する水性懸濁剤で、前記複合体含有水性懸濁剤から少なくとも一部の水分を除去することにより前記タンパク質製剤の濃縮が可能であり、前記複合体中で、前記タンパク質製剤が安定化された水性懸濁タンパク質製剤である。また、本発明は、緩衝液中で表面電荷を有するタンパク質製剤とポリアミノ酸とで複合体を形成して水性懸濁剤として医療用タンパク質を安定化する方法である。水性懸濁剤中の複合体濃度を高めてもよいし複合体が集まって少量または極少量の水層と層分離した二層の状態にしてもよい。また複合体を湿った状態で分離してもよい。さらに、水性懸濁剤中の複合体に無機塩である低濃度の電解質を添加して溶解して水性剤として医療用に用いてもよい。水性懸濁剤を塩で解離させた際のｐＨが、ヒトに投与するのに不適切な強アルカリ性、例えばｐＨ８以上、もしくは強酸性、例えばｐＨ４以下などであった場合、酸性の緩衝液、あるいはアルカリ性の緩衝液などを加えることで、ｐＨを投与に適切な中性付近に調整することができる。
医療用タンパク質製剤は限定されないが、医療用に用いられる酵素、サイトカイン、ホルモン、抗体、抗体フラグメントおよび融合タンパク質の少なくとも１つである。
【００３８】
医療用タンパク質製剤は具体的には以下が例示できるが、本発明が適用できるタンパク質製剤はこれらに限定されない。
（酵素）
アルテプラーゼ、モンテプラーゼ、イミグルセラーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、アガルシダーゼアルファ、アガルシダーゼベータ、ラロニダーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、イデュルスルファーゼ、ガルスルファーゼ、ラスブリカーゼ、ドルナーゼ  アルファ
アスパラギナーゼ、ペグアスパラギナーゼ、コンドリアーゼ
（血液凝固線溶系因子）
バトロキソビン、オクトコグアルファ、ルリオクトコグアルファ、エプタコグアルファ、エルラロクトコグアルファ、ツロクトコグアルファ、エフトレノナコグアルファ、血液凝固因子、
トロンボモジュリンアルファ
（血清タンパク質）
血清アルブミン
（ホルモン）
ヒトインスリン、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリングルリジン、インスリンデグルデク、リラグリチド、ソマトロピン、ペグビソマント、メカセルミン、カルペリチド、グルカゴン、ホリトロピンアルファ、ホリトロピンベータ、テリパラチド、メトレレプチン
（ワクチン）
組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチン、乾燥細胞培養不活化Ａ型肝炎ワクチン、組換え沈降２価ヒトパピローマウイルス様粒子ワクチン、組換え沈降４価ヒトパピローマウイルス様粒子ワクチン
（インターフェロン類）
インターフェロンアルファ、アルブミン修飾インターフェロンアルファ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファコン、インターフェロンベータ、インターフェロンベータ−１ａ、インターフェロンベータ−２ｂ、インターフェロンガンマ−１ａ、ペグインターフェロンアルファ−２ａ、ペグインターフェロンアルファ−２ｂ、
（エリスロポエチン類）
エポエチンアルファ、エポエチンベータ、ダルベポエチンアルファ、エポエチンベータペゴル、エポエチンカッパ、
（サイトカイン類）
フィルグラスチム、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモロイキン、テセロイキン、トラフェルミン、
（抗体）
ムロモナブ−ＣＤ３、トラスツズマブ、リツキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、トシリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ベバシズマブ、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、セツキシマブ、ラニビズマブ、オマリズマブ、エクリズマブ、パニツムマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、モガムリズマブ、セルトリズマブペゴル、オファツムマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、ブレンツキシマブベドチン、ナタリズマブ、ニボルマブ、アレムツズマブ、ヨウ素１３１修飾トシツモマブ、カツマキソマブ、アデカツムマブ、エドレコロマブ、アブシキシマブ、シルツキシマブ、ダクリズマブ、エファリズマブ、オビヌツズマブ、ベドリズマブ、ペムブロリズマブ、イクセキズマブ、ジリダブマブ、イピリムマブ、ベリムマブ、ラキシバクマブ、ラムシルマブ
（融合タンパク質）
エタネルセプト、アバタセプト、ロミプロスチム、アフリベルセプト
【００３９】
本発明の水性懸濁剤または水性剤は、後に示すように一般毒性がない。非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内を含む、任意の投与の経路用に、ならびに必要であれば、局部治療、病変内投与用に製剤化される。非経口注入としては、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、または皮下の投与が挙げられる。好ましくは、注射によって、最も好ましくは、静脈内または皮下の注射によって投与される。局所、特に、経皮、経粘膜、直腸、経口の投与、または例えば、所望の部位の近くに置かれたカテーテルを通じた局部投与を含む。投与の経路に応じて、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤を含んでもよい。そのような賦形剤の例としては、水、薬学的に許容される有機溶媒等が例示できる。
【００４０】
本発明の水性懸濁剤または水性剤は、プレフィルドシリンジまたは２気室プレフィルドシリンジ等の投与装置が例示できる。従来医療用タンパク質を投与する場合、点滴静注、皮下注射などが行われ、医療施設において医療従事者により投与、あるいは患者自宅における自己投与などが行われている。医療用タンパク質の熱安定性が十分でない場合は冷蔵保存が必要な場合がある。自己注射等のプレフィルドシリンジを冷蔵庫で保存することは患者にとって大きな負担となる。例えば２気室を備えるシリンジを用い、後に述べる実施例１０２〜１０６で示されるように熱安定性を有する本発明の複合体を含む水性懸濁剤を１室に保持し、他の１室に低濃度の電解質を保持して、保存安定性を高めれば冷蔵ではなく室温で保存できる可能性が考えられ、実現できればそのメリットは大きい。用時には２気室の間を流体連通させて水性剤として投与することができる。
図１４には、２気室プレフィルドシリンジの一例を示す。プレフィルドシリンジ１は、外筒２と、外筒２内で摺動し得るガスケット３および４と、ガスケット３および４を移動操作するプランジャ５（基端側）を備えている。外筒２とガスケット３とで囲まれる空間である先端側の1室内には、予め本発明のタンパク質・ポリアミノ酸複合体６が液密に収納され、ガスケット３を隔てている基端側の２室には溶解液７である電解質水溶液が収納されプランジャ５とガスケット３および４で封止されている。１室の外筒２には拡径部８を備えている。この状態が保存時である。保存時には本発明の医療用タンパク質は、本発明のポリアミノ酸複合体中で保存され安定性が高い。
溶解時にはプランジャ５が押されガスケット４が溶解液７を押すので溶解液７に押されたガスケット３が拡径部８のある先端側に移動し、溶解液７が拡径部８を経由して先端側の１室に流れ、本発明のタンパク質・ポリアミノ酸複合体６と混合され、複合体中のタンパク質を再溶解してタンパク質溶液とする。
【００４１】
〔タンパク質の濃縮方法、濃縮された、あるいは同等の、あるいは希釈されたタンパク質濃度を有する水性剤の製造方法〕
（工程１）：緩衝液のｐＨを、含まれる前記タンパク質の等電点ｐＩより絶対値で例えば０．５以上４．０以下塩基性側および・または酸性側に調整する。
（工程２）：前記緩衝液に、表面電荷を有する前記タンパク質を０．０１ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲、前記ポリアミノ酸を０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲となるように加えて前記タンパク質・ポリアミノ酸複合体を含む水性懸濁液を形成させる。
（工程３）：上記の工程１および工程２の後に得られた複合体を含む水性懸濁液から少なくとも一部の水分、または緩衝液を遠心分離、限外濾過、上清除去等より選ばれる方法で除去し、前記タンパク質が０．１ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で含まれるように水性懸濁液を調整する。
（工程４）：工程３で調製した水性懸濁液に、工程３で除去した水分または緩衝液の量よりも少ない量の低濃度の電解質を添加して複合体中のタンパク質を緩衝液中に再溶解することにより濃縮されたタンパク質濃度を有する水性液を得る。あるいは、工程３で除去した水分または緩衝液の量と等しい量の低濃度の電解質を添加して複合体中のタンパク質を緩衝液中に再溶解することにより同等のタンパク質濃度を有する水性液を得る。あるいは、工程３で除去した水分または緩衝液の量よりも多い量の低濃度の電解質を添加して複合体中のタンパク質を緩衝液中に再溶解することにより希釈されたタンパク質濃度を有する水性液を得る。
（工程５）：上記の工程１および工程２の後に得られた複合体を含む水性懸濁液から水分を除去せずに、低濃度の電解質を添加して複合体中のタンパク質を緩衝液中に再溶解することにより希釈されたタンパク質濃度を有する水性液を得る。
【００４２】
上記タンパク質が、医療用タンパク質である場合は、上記の工程１、工程２、工程３および工程４あるいは上記の工程１、工程２および工程５により水性剤が製造される。
工程１では、前記緩衝液のｐＨを、含まれるタンパク質の等電点をｐＩとして、｜ｐＩ−ｐＨ｜を０．５〜４．０の範囲に調整して、複合体を得るのが好ましい。
【００４３】
（１）タンパク質の濃縮方法
以下の工程１）〜３）は任意の順序で行うことができ、同時に行っても逐次に行ってもよい。
１）タンパク質を緩衝液に加える。
２）ポリアミノ酸を緩衝液に加える。
３）緩衝液のｐＨを、含まれるタンパク質の等電点をｐＩとして、｜ｐＩ−ｐＨ｜を例えば０．５以上に調整する。
４）緩衝液中でタンパク質とポリアミノ酸とが複合体を形成し水性懸濁液が得られる。
５）少なくとも一部の水分または緩衝液を除去する。得られる複合体中のタンパク質濃度は工程１）の緩衝液中のタンパク質濃度より濃縮したタンパク質が得られる。
６）必要な場合は、得られた水性懸濁液を遠心分離して複合体を得る。
【００４４】
（２）複合体の溶解方法
得られた複合体は、水性懸濁液中に、低濃度の電解質を添加して再溶解することができる。電解質としてはＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2等が例示できるが、好ましくは生体適合性が最も高いＮａＣｌが選択され、濃度は５質量％以下である。再溶解に使用するＮａＣｌ濃度は好ましくは８ｍＭ（０．０４８質量％）以上であり、より好ましくは４０ｍＭ（０．２４質量％）以上である。
得られた複合体を再溶解して緩衝液中に溶解したタンパク質を可逆的量で得るためには、｜ｐＩ−ｐＨ｜を０．５〜４．０の範囲とするのが好ましい。
【００４５】
（３）タンパク質濃度測定方法
緩衝液中のタンパク質濃度は、例えば波長２８０ｎｍの吸光度を測定して標準曲線から濃度を算出する。複合体中のタンパク質濃度は遠心分離して得られる複合体を上記（２）の方法で溶解して、例えば波長２８０ｎｍの吸光度を測定して標準曲線から濃度を算出する。例えばタンパク質濃縮時の濃度変化を非濃縮に対する濃縮倍率で算出し、また複合体に振とう、酸化、熱等のストレス負荷を行い負荷後の濃度変化を負荷前に対する残存率で算出する。
（４）タンパク質の二次構造の変化の測定方法
複合体中のタンパク質のＣＤスペクトルを当該タンパク質を上記（２）の方法で溶解した水溶液として測定する。複合体に振とう、酸化、熱等のストレス負荷を行い負荷前後でのＣＤスペクトルを測定し、タンパク質の二次構造変化を検出する。同様にタンパク質の対照液を同一緩衝液中で同濃度でＣＤスペクトルを測定し、複合体の負荷後のＣＤスペクトルと比較して変化が見られない場合は上記負荷によっても複合体中のタンパク質の二次構造は変化しなかったことが示される。
【００４６】
（５）タンパク質活性測定方法
１）Ｌ-アスパラギナーゼ活性：水溶液中で測定する。複合体は上記（２）の方法で溶解して測定する。Ｌ-アスパラギナーゼが触媒する、アスパラギンをアスパラギン酸とアンモニアに分解する反応で、反応液中のアンモニア濃度を定量し、Ｌ-アスパラギナーゼ活性を求める。例えばタンパク質濃縮時の活性変化を非濃縮時に対する活性倍率で算出し、また複合体に振とう、酸化、熱等のストレス負荷を行い負荷後の活性変化を負荷前に対する残存率で算出する。
２）抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性（ＩｇＥ結合能またはＩｇＥ受容体阻害能）
水溶液中で測定する。複合体は上記（２）の方法で溶解して測定する。ＥＬＩＳＡ法により抗ＩｇＥモノクローナル抗体による、ＩｇＥとの結合活性またはＩｇＥ受容体に対するＩｇＥ結合の阻害活性を測定する。両者とも、ＩｇＥ−抗ＩｇＥ抗体の結合を見るアッセイであり、ＩｇＥ結合試験はＩｇＥと結合した抗ＩｇＥモノクローナル抗体濃度が測定され、ＩｇＥ受容体阻害試験はＩｇＥ受容体と結合したＩｇＥ濃度が測定される。例えばタンパク質濃縮時の活性変化を非濃縮時に対する活性倍率で算出し、また複合体に振とう、酸化、熱等のストレス負荷を行い負荷後の活性変化を負荷前に対する残存率で算出する。具体的には実施例７４の試験例４がＩｇＥ結合試験で、その他の抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性は受容体阻害試験で測定される。
３）抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性：（ＴＮＦα結合能）
水溶液中で測定する。複合体は上記（２）の方法で溶解して測定する。ＥＬＩＳＡ法により抗ＴＮＦαモノクローナル抗体による，ＴＮＦαとの結合活性を測定する。例えばタンパク質濃縮時の活性変化を非濃縮時に対する活性倍率で算出し、また複合体に振とう、酸化、熱等のストレス負荷を行い負荷後の活性変化を負荷前に対する残存率で算出する。
４）抗ＴＮＦαモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメント活性：（ＴＮＦα結合阻害能）
水溶液中で測定する。複合体は上記（２）の方法で溶解して測定する。ＥＬＩＳＡ法により、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントによる、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体とＴＮＦαとの結合阻害活性を測定する。例えばタンパク質濃縮時の活性変化を非濃縮時に対する活性倍率で算出する。
【００４７】
（６）振とうストレスに対する安定性の測定方法
１）振とうストレスに対する抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体の安定性
振とうストレス前後におけるタンパク質含量の変化をタンパク質含量残存率として測定する。振とうストレス前に吸光度を測定して抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体濃度を測定する。振とうストレスを与え、それにより不溶性の凝集体ができた場合の不溶性の沈殿物を遠心分離して除いた後の吸光度を測定して抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体濃度を測定しタンパク率含量残存率を求める。
２）振とうストレスに対する抗ＴＮＦαモノクローナル抗体の安定性
振とうストレス前後におけるタンパク質含量の変化をタンパク質含量残存率として測定する。振とうストレス前に吸光度を測定して抗ＴＮＦαモノクローナル抗体濃度を測定する。振とうストレスを与え、それにより不溶性の凝集体ができた場合の不溶性の沈殿物を遠心分離して除いた後の吸光度を測定して抗ＴＮＦαモノクローナル抗体濃度を測定しタンパク質含量残存率を求める。
３）振とうストレスに対する抗ＩｇＥモノクローナル抗体の安定性
振とうストレス前後におけるタンパク質含量の変化をタンパク質含量残存率として測定する。振とうストレス前に吸光度を測定して抗ＩｇＥモノクローナル抗体濃度を測定する。振とうストレスを与え、それにより不溶性の凝集体ができた場合の不溶性の沈殿物を遠心分離して除いた後の吸光度を測定して抗ＩｇＥモノクローナル抗体濃度を測定しタンパク質含量残存率を求める。
【００４８】
（７）タンパク質の一次構造の変化率の測定方法
１）ペプチドマッピング法：タンパク質を化学的もしくは酵素的に消化して、生じたペプチド断片を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）などで分離検出、そのクロマトパターンを比較することで、構成しているアミノ酸の変化を確認する試験法。タンパク質の一次構造の変化の状態を一次構造の変化率で算出できる。
【００４９】
（８）熱ストレスに対する安定性の測定方法
１）示差走査熱量測定法：一定の熱を与えながら基準物質と試料の温度を測定し、試料の状態変化による吸熱反応や発熱反応を測定する試験法。タンパク質の構造転移に伴う熱の出入りを直接測定でき、タンパク質の熱変性温度が測定できる。
【００５０】
（９）凝集抑制性の測定方法
１）抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体の複合体および複合体を形成しない対照液に振とうストレスを加えた前後のサンプルについて、後に実施例で具体的に記載する条件で遠心分離して沈降した不溶性凝集量を、振とう後に上清中に残存する抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体量を振とう前における総抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体量から差し引いた量として求める。
２）Ｌ-アスパラギナーゼのポリアミノ酸との複合体および対照液を加熱した前後のサンプルについて、各凝集体数を、マイクロフローイメージング法を用いて求める。
３）上記２）と同じサンプルについて吸光度を測定し濁度を求める。
４）抗ＴＮＦαモノクローナル抗体のポリグルタミン酸との複合体および複合体を形成しない対照液に振とうストレスを加えた前後のサンプルについて、各凝集体数を、マイクロフローイメージング法を用いて求める。
５）サイズ排除クロマトグラフ：サイズ排除クロマトグラフィー、分子篩（ふるい）クロマトグラフィー、ＳＥＣ（Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）とも呼ばれる。試料の分子サイズに基づく篩い分けを原理とするクロマトグラフィーである。タンパク質分子は担体内部にまで拡散できるが、凝集体は担体内部に到達できず担体の外部を流れ去るので凝集体の量が測定できる。後に記載する実施例９８の測定では可溶性凝集体量がピーク面積として測定される。
【実施例】
【００５１】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔１．ポリアミノ酸による濃縮可能性を示す実施例１〜７２および比較例１〜７２、ポリアミノ酸ではないアミノ酸単体では濃縮が出来ないことを示す陰性対照比較例７−２、２７−２〕
＜Ｌ−アスパラギナーゼ＞
（実施例１）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼ（ｐＩ：４．７、ＭＷ：１４１ｋＤａ）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００５２】
（実施例２）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．４）を用いた以外は実施例１と同じ操作を行い、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例３）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）を用いた以外は実施例１と同じ操作を行い、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）を用いた以外は実施例１と同じ操作を行い、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例５）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．１〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００５３】
（実施例６）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ２．９）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．３〜２質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例７）
ポリ−Ｌ−アルギニン（ＭＷ：５ｋＤａ−１５ｋＤａ）を用いた以外は実施例１と同じ操作を行い、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−アルギニン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００５４】
（実施例８）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１４．７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０２５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例９）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．５〜７質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：１ｋＤａ−５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００５５】
（実施例１０）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．００５〜０．３質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：１５ｋＤａ−３０ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例１１）
ポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：３０ｋＤａ以上）を用いた以外は実施例１０と同じ操作を行い、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例１２）
１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例１３）
１０ｍＭ  ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ, ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた以外は実施例１２と同じ操作を行い、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００５６】
＜ヒト血清アルブミン＞
（実施例１４）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、ヒト血清アルブミン（ｐＩ：５．０、ＭＷ：６９ｋＤａ）を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ヒト血清アルブミン１質量部に対し０．０５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ヒト血清アルブミン・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例１５）
ポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：１５ｋＤａ−３０ｋＤａ）を用いた以外は実施例１４と同じ操作を行い、ヒト血清アルブミン・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例１６）
ポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：３０ｋＤａ以上）を用いた以外は実施例１４と同じ操作を行い、ヒト血清アルブミン・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００５７】
＜ウシ血清アルブミン＞
（実施例１７）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、ウシ血清アルブミン（ｐＩ：５．０、ＭＷ：６９ｋＤａ）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ウシ血清アルブミン１質量部に対し０．０５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ウシ血清アルブミン・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例１８）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．４）を用いた以外は実施例１７と同じ操作を行い、ウシ血清アルブミン・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例１９）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、ウシ血清アルブミンを４９．７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ウシ血清アルブミン１質量部に対し０．０３〜０．１５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ウシ血清アルブミン・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００５８】
＜ＩＮＦ−α−２ｂ＞
（実施例２０）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中において、インターフェロン（ＩＮＦ）−α−２ｂ（ｐＩ：５．７、ＭＷ：１８ｋＤａ）を０．０４ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ＩＮＦ−α−２ｂ、１質量部に対し０．０５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ＩＮＦ−α−２ｂ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例２１）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、ＩＮＦ−α−２ｂを０．１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ＩＮＦ−α−２ｂ、１質量部に対し０．０５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ＩＮＦ−α−２ｂ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００５９】
＜ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド＞
（実施例２２）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）中において、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ｐＩ：１０．５、ＭＷ：３ｋＤａ）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド、１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：０．７５ｋＤａ−５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例２３）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた以外は実施例２２と同じ操作を行い、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００６０】
＜ウシサイログロブリン＞
（実施例２４）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、ウシサイログロブリン（ｐＩ：５．５、ＭＷ：６７０ｋＤａ）を０．１２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ウシサイログロブリン、１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ウシサイログロブリン・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例２５）
ポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：３０ｋＤａ以上）を用いた以外は実施例２４と同じ操作を行い、ウシサイログロブリン・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００６１】
＜抗ＴＮＦαモノクローナル抗体＞
（実施例２６）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αモノクローナル抗体（ｐＩ：８．７、ＭＷ：１５０ｋＤａ）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜２質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例２７）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−ＤＬ−アスパラギン酸（ＭＷ：２ｋＤａ−１１ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−ＤＬ−アスパラギン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例２８）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．５〜７質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：０．７５ｋＤａ−５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例２９）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例３０）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．７）を用いた以外は実施例２９と同じ操作を行い、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例３１）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた以外は実施例２９と同じ操作を行い、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００６２】
（実施例３２）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．１〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例３３）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０１〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：１５ｋＤａ−５０ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例３４）
ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：５０ｋＤａ−１００ｋＤａ）を用いた以外は実施例３３と同じ操作を行い、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例３５）
１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例３６）
１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた以外は実施例３５と同じ操作を行い、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例３７）
１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた以外は実施例３５と同じ操作を行い、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例３８）
１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた以外は実施例３５と同じ操作を行い、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００６３】
＜抗ＩｇＥモノクローナル抗体＞
（実施例３９）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）モノクローナル抗体（ｐＩ：７．６、ＭＷ：１５０ｋＤａ）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０２５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４０）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた以外は実施例３９と同じ操作を行い、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４１）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０３〜１質量部のポリ−ＤＬ−アスパラギン酸（ＭＷ：２ｋＤａ−１１ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−ＤＬ−アスパラギン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４２）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を１５．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜０．３質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４３）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００６４】
（実施例４４）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．１）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．１〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４５）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）を用いた以外は実施例４４と同じ操作を行い、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４６）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０２５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４７）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０３〜０．１５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４８）
ポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：１５ｋＤａ−３０ｋＤａ）を用いた以外は実施例４７と同じ操作を行い、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例４９）
ポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：３０ｋＤａ以上）を用いた以外は実施例４７と同じ操作を行い、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例５０）
ポリ−Ｌ−アルギニン（ＭＷ：５ｋＤａ−１５ｋＤａ）を用いた以外は実施例４７と同じ操作を行い、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−アルギニン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００６５】
＜抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体＞
（実施例５１）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中において、抗上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）モノクローナル抗体（ｐＩ：６．９、ＭＷ：１５０ｋＤａ）を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体１質量部に対し０．０１〜０．５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例５２）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）を用いた以外は実施例５１と同じ操作を行い、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例５３）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）中において、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００６６】
（実施例５４）
１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）を用いた以外は実施例５３と同じ操作を行い、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例５５）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）中において、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体１質量部に対し０．３〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例５６）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ２．９）中において、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体１質量部に対し０．５〜１．５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例５７）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中において、ＥＧＦＲモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例５８）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）を用いた以外は実施例５７と同じ操作を行い、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例５９）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）を用いた以外は実施例５７と同じ操作を行い、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００６７】
＜抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体＞
（実施例６０）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において、抗ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）２モノクローナル抗体（ｐＩ：８．７、ＭＷ：１５０ｋＤａ）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例６１）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．７）を用いた以外は実施例６０と同じ操作を行い、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例６２）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）を用いた以外は実施例６０と同じ操作を行い、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例６３）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）中において、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体１質量部に対し０．１〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００６８】
＜抗ＣＤ２０モノクローナル抗体＞
（実施例６４）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｐＩ：８．７、ＭＷ：１５０ｋＤａ）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体１質量部に対し０．０５〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例６５）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）を用いた以外は実施例６４と同じ操作を行い、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例６６）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．７）を用いた以外は実施例６４と同じ操作を行い、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例６７）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）中において、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体１質量部に対し０．１〜１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００６９】
＜ヒト型可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質＞
（実施例６８）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）中において、ヒト型可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質（ｐＩ：８．０、ＭＷ：１５０ｋＤａ）を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ヒト型可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質１質量部に対し０．０２５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ヒト型可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例６９）
ポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：１５ｋＤａ−３０ｋＤａ）を用いた以外は実施例６８と同じ操作を行い、ヒト型可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例７０）
ポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：３０ｋＤａ以上）を用いた以外は実施例６８と同じ操作を行い、ヒト型可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００７０】
＜ヒト免疫グロブリンＧ＞
（実施例７１）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、ヒト免疫グロブリンＧ（ｈＩｇＧ）（ｐＩ：６．９、ＭＷ：１５０ｋＤａ）を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ｈＩｇＧ１質量部に対し０．０１〜０．５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ｈＩｇＧ・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（実施例７２）
ポリ−ＤＬ−アスパラギン酸（ＭＷ：２ｋＤａ−１１ｋＤａ）を用いた以外は実施例７１と同じ操作を行い、ｈＩｇＧ・ポリ−ＤＬ−アスパラギン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００７１】
（比較例１〜７２）
上記実施例１〜７２においてポリアミノ酸を加えなかった以外は実施例１〜７２と同じ操作を行った。
［試験例１］
上記実施例１〜７２について、得られた各タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、波長２８０ｎｍの吸光度を測定することによりタンパク質濃度を測定した。また、上記比較例１〜７２について、波長２８０ｎｍの吸光度を測定することによりタンパク質濃度を測定した。これらの結果より、各比較例におけるタンパク質濃度に対する各実施例のタンパク質濃度比を求めたところ、実施例１〜７２の全てで、タンパク質濃度が上昇しており、濃縮できることが示された。結果の詳細を表１〜７に示した。
【００７２】
【表１】
2019043955.tif 000002
【００７３】
【表２】
2019043955.tif 000003
【００７４】
【表３】
2019043955.tif 000004
【００７５】
【表４】
2019043955.tif 000005
【００７６】
【表５】
2019043955.tif 000006
【００７７】
【表６】
2019043955.tif 000007
【００７８】
【表７】
2019043955.tif 000008
【００７９】
（比較例７−２、比較例２７−２）
上記実施例７において、ポリ−Ｌ−アルギニン（ＭＷ：５ｋＤａ−１５ｋＤａ）を用いるかわりにＬ-アルギニンを用い、それ以外は実施例７と同じ操作を行って、陰性対照とした（比較例７−２）。また、上記実施例２７において、ポリ−ＤＬ−アスパラギン酸（ＭＷ：２ｋＤａ−１１ｋＤａ）を用いるかわりにアスパラギン酸を用い、それ以外は実施例２７と同じ操作を行って陰性対照とした（比較例２７−２）。
（比較例７および２７）
上記陰性対照の比較例としてアミノ酸もポリアミノ酸も加えなかった上記比較例７、比較例２７と同じ試料を作成した。
［試験例２］
上記比較例７−２および２７−２について、得られた各タンパク質・アミノ酸含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、波長２８０ｎｍの吸光度を測定することによりタンパク質濃度を測定した。また、上記比較例７および２７について、波長２８０ｎｍの吸光度を測定することによりタンパク質濃度を測定した。これらの結果より、各比較例におけるタンパク質濃度に対する各実施例のタンパク質濃度比を求めたところ、陰性対照比較例７−２および２７−２においてはタンパク質濃度の上昇が認められず、ポリアミノ酸ではないアミノ酸単独では、濃縮できないことが示された。結果の詳細を表８に、ポリアミノ酸により濃縮が可能だった実施例７および２７の結果と併記して示した。
【００８０】
【表８】
2019043955.tif 000009
【００８１】
〔２．ポリアミノ酸による濃縮可能性を示す実施例７３〜７６（その他のタンパク質）〕
＜ダルベポエチンα＞
（実施例７３）
１０ｍＭ  グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．５）中において、ダルベポエチンα（ｐＩ：８．８、ＭＷ：３６ｋＤａ）を０．１２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ダルベポエチンα１質量部に対し０．１〜２質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：３０ｋＤａ以上）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ダルベポエチンα・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
【００８２】
＜高濃度抗ＴＮＦαモノクローナル抗体＞
（実施例７４）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を１５．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０２〜０．５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００８３】
＜高濃度抗ＩｇＥモノクローナル抗体＞
（実施例７５）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を１５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０２〜０．５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００８４】
＜抗ＴＮＦαモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメント＞
（実施例７６）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において、抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメント（ｐＩ：８．８、ＭＷ：１１０ｋＤａ）を１．１６ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメント１質量部に対し０．０２５〜０．５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメント・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００８５】
【表９】
2019043955.tif 000010
【００８６】
〔３．タンパク質の濃縮は最大濃縮率を有する。〕
本発明の複合体を形成するタンパク質の濃縮方法は、用いた緩衝液のｐＩ、ｐＨ，に対して濃縮率を表にすると最大濃縮率を示すことがわかる。
下記表１０は、表１〜７の濃縮中のタンパク質の等電点ｐIに対して緩衝液のｐＨを変化させて、ｐＩ‐ｐＨの絶対値（｜ｐＩ‐ｐＨ｜）が表１０に示す値となっている状態で、タンパク質とポリアミノ酸とを緩衝液中に添加してタンパク質とポリアミノ酸との複合体を形成した。得られた複合体中のタンパク質濃度を測定し、濃縮率の最大値が得られる｜ｐＩ‐ｐＨ｜の値を示した。
濃縮率を｜ｐＩ‐ｐＨ｜に対してプロットすると図５に示すグラフが得られる。複合体中のタンパク質の最大濃縮率が、｜ｐＩ−ｐＨ｜、１．５〜４．０の範囲に存在することが図５に示されている。
濃縮率の最大値が得られる｜ｐＩ−ｐＨ｜の値は以下である。
抗ＴＮＦαモノクローナル抗体−ポリ-Ｌ-グルタミン酸:２．２
抗ＩｇＥモノクローナル抗体−ポリ-Ｌ-グルタミン酸:２．２
抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体−ポリ-Ｌ-グルタミン酸:２．２
Ｌ-アスパラギナーゼ−ポリ-Ｌ-リジン：２．３
【００８７】
【表１０】
2019043955.tif 000011
【００８８】
〔４．タンパク質の濃縮で活性が損なわれないことを示す実施例７７〜８６〕
＜抗ＩｇＥモノクローナル抗体＞
（実施例７７）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．２５、０．０５、０．１、０．１５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（比較例７７）
ポリ−Ｌ−グルタミン酸を加えなかった以外は実施例７７と同じ操作を行った。
［試験例３］
上記実施例７７について、得られた抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに、抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。また、比較例７７について、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。これら結果より、比較例７７におけるタンパク質濃度に対する実施例７７のタンパク質濃度比、および比較例７７における抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性に対する実施例７７の抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性の比を求めたところ、タンパク質濃度比、活性比ともに約１０倍に上昇しており、抗ＩｇＥモノクローナル抗体の活性を損なうことなく濃縮できることが示された。結果を表１１に示した。
【００８９】
【表１１】
2019043955.tif 000012
【００９０】
（実施例７８）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を１５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５、０．１０、０．１５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（比較例７８）
ポリ−Ｌ−グルタミン酸を加えなかった以外は実施例７８と同じ操作を行った。
［試験例４］
上記実施例７８について、得られた抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに、抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。また、比較例７８について、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。これらの結果より、比較例７８におけるタンパク質濃度に対する実施例７８のタンパク質濃度比、および比較例７８における抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性に対する実施例７８の抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性の比を求めたところ、タンパク質濃度比、活性比ともに約１０倍に上昇しており、抗ＩｇＥモノクローナル抗体の活性を損なうことなく濃縮できることが示された。結果を表１２に示した。
【００９１】
【表１２】
2019043955.tif 000013
【００９２】
（実施例７９）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を１５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（比較例７９）
ポリ−Ｌ−グルタミン酸を加えなかった以外は実施例７９と同じ操作を行った。
［試験例５］
上記実施例７９について、得られた抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに、抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。また、比較例７９について、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。これらの結果より、比較例７９におけるタンパク質濃度に対する実施例７９のタンパク質濃度比、および比較例７９における抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性に対する実施例７９の抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性の比を求めたところ、タンパク質濃度比、活性比ともに約１０倍に上昇しており、抗ＩｇＥモノクローナル抗体の活性を損なうことなく濃縮できることが示された。結果を表１３に示した。
【表１３】
2019043955.tif 000014
【００９３】
（実施例８０）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．６質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、各抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（比較例８０）
ポリ−Ｌ−グルタミン酸を加えなかった以外は実施例８０と同じ操作を行った。
［試験例６］
上記実施例８０について、得られた各抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに、抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。また、比較例８０について、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。これら結果より、比較例８０におけるタンパク質濃度に対する実施例８０のタンパク質濃度比、および比較例８０における抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性に対する実施例８０の抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性の比を求めたところ、タンパク質濃度比、活性比ともに約１０倍に上昇しており、抗ＩｇＥモノクローナル抗体の活性を損なうことなく濃縮できることが示された。結果を表１４に示した。
【００９４】
【表１４】
2019043955.tif 000015
【００９５】
＜Ｌ−アスパラギナーゼ＞
（実施例８１）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０２５、０．０５、０．１０、０．１５、０．３、０．５、０．７および１質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（比較例８１）
ポリ−Ｌ−リジンを加えなかった以外は実施例８１と同じ操作を行った。
［試験例７］
上記実施例８１について、得られたＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。また、比較例８１について、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらにＬ−アスパラギナーゼ活性を測定した。これらの結果より、比較例８１におけるタンパク質濃度に対する実施例８１のタンパク質濃度比、および比較例８１におけるＬ−アスパラギナーゼ活性に対する実施例８１のＬ−アスパラギナーゼ活性の比を求めたところ、タンパク質濃度比、活性比ともに約１０倍に上昇しており、Ｌ−アスパラギナーゼの活性を損なうことなく濃縮できることが示された。結果を表１５に示した。
【００９６】
【表１５】
2019043955.tif 000016
【００９７】
（実施例８２）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０２５、０．０５、０．１、０．１５および０．３質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
（比較例８２）
ポリ−Ｌ−リジンを加えなかった以外は実施例８２と同じ操作を行った。
［試験例８］
上記実施例８２について、得た各Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。また、比較例８２について、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらにＬ−アスパラギナーゼ活性を測定した。これら結果より、比較例８２におけるタンパク質濃度に対する実施例８２のタンパク質濃度比、および比較例８２におけるＬ−アスパラギナーゼ活性に対する実施例８２のＬ−アスパラギナーゼ活性の比を求めたところ、タンパク質濃度比、活性比ともに約１０倍に上昇しており、Ｌ−アスパラギナーゼの活性を損なうことなく濃縮できることが示された。結果を表１６に示した。
【００９８】
【表１６】
2019043955.tif 000017
【００９９】
＜抗ＴＮＦαモノクローナル抗体＞
（実施例８３）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５、０．１、０．１５、０．３、０．５および１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（比較例８３）
ポリ−Ｌ−グルタミン酸を加えなかった以外は実施例８３と同じ操作を行った。
［試験例９］
上記実施例８３について、得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性を測定した。また、比較例８３について、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性を測定した。これらの結果より、比較例８３におけるタンパク質濃度に対する実施例８３のタンパク質濃度比、および比較例８３における抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性に対する実施例８３の抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性の比を求めたところ、タンパク質濃度比、活性比ともに約１０倍に上昇しており、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体の活性を損なうことなく濃縮できることが示された。結果を表１７に示した。
【０１００】
【表１７】
2019043955.tif 000018
【０１０１】
（実施例８４）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を１５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（比較例８４）
ポリ−Ｌ−グルタミン酸を加えなかった以外は実施例８４と同じ操作を行った。
［試験例１０］
上記実施例８４について、得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性を測定した。また、比較例８４について、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性を測定した。これらの結果より、比較例８４におけるタンパク質濃度に対する実施例８４のタンパク質濃度比、および比較例８４における抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性に対する実施例８４の抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性の比を求めたところ、タンパク質濃度比、活性比ともに約１０倍に上昇しており、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体の活性を損なうことなく濃縮できることが示された。結果を表１８に示した。
【表１８】
2019043955.tif 000019
【０１０２】
（実施例８５）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．４質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、各抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
（比較例８５）
ポリ−Ｌ−グルタミン酸を加えなかった以外は実施例８５と同じ操作を行った。
［試験例１１］
上記実施例８５について、得られた各抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性を測定した。また、比較例８５について、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性を測定した。これら結果より、比較例８５におけるタンパク質濃度に対する実施例８５のタンパク質濃度比、および比較例８５における抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性に対する実施例８５の抗ＴＮＦαモノクローナル抗体の比を求めたところ、タンパク質濃度比、活性比ともに約１０倍に上昇しており、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体の活性を損なうことなく濃縮できることが示された。結果を表１９に示した。
【０１０３】
【表１９】
2019043955.tif 000020
【０１０４】
＜抗ＴＮＦαモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメント＞
（実施例８６）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において、抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメント（ｐＩ：８．８、ＭＷ：１１０ｋＤａ）を１．１６ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５、０．１および０．３質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメント・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例１２］
上記実施例８６について、得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメント・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメント活性を測定した。また、比較例８６について、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに抗ＴＮＦαモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメント活性を測定した。これらの結果より、比較例８６におけるタンパク質濃度に対する実施例８６のタンパク質濃度比、および比較例８６における抗ＴＮＦαモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメント活性に対する実施例８６の抗ＴＮＦαモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメント活性の比を求めたところ、タンパク質濃度比、活性比ともに約１０倍に上昇しており、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメント活性を損なうことなく濃縮できることが示された。結果を表２０に示した。
【０１０５】
【表２０】
2019043955.tif 000021
【０１０６】
〔５．タンパク質の濃縮で二次構造が保たれる実施例８４、８７、８８、８８−２〕
＜抗ＴＮＦαモノクローナル抗体＞
（実施例８４のＣＤスペクトルの測定）
［試験例１３］
上記実施例８４について、得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、ＣＤスペクトルを測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を１５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例８４）として、ＣＤスペクトルを測定した。その結果、両者のＣＤスペクトルは一致しており、タンパク質の濃縮により二次構造が変化せず、保たれていることが明らかとなった。結果を図６に示した。
（実施例８７）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０４質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例１４］
上記実施例８７について、得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５．０ｍｇ／ｍＬであった。さらに、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、ＣＤスペクトルを測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例８７）として、ＣＤスペクトルを測定した。その結果、両者のＣＤスペクトルは一致しており、タンパク質の濃縮により二次構造が変化せず、保たれていることが明らかとなった。結果を図７に示した。
【０１０７】
（実施例８８）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例１５］
上記実施例８８について、得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５．０ｍｇ／ｍＬであった。さらに、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、ＣＤスペクトルを測定した。また、１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）中において抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例８８）として、ＣＤスペクトルを測定した。その結果、両者のＣＤスペクトルは一致しており、タンパク質の濃縮により二次構造が変化せず、保たれていることが明らかとなった。結果を図８に示した。
【０１０８】
＜ヒトＩｇＧ＞
（実施例８８−２）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中において、ヒトＩｇＧを３０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ヒトＩｇＧ１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ヒトＩｇＧ・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例１５−２］
上記実施例８８−２について、得られたヒトＩｇＧ・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、６００ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、さらに、ＣＤスペクトルを測定した。また、１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中においてヒトＩｇＧを０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例８７）として、ＣＤスペクトルを測定した。その結果、両者のＣＤスペクトルは一致しており、タンパク質の濃縮により二次構造が変化せず、保たれていることが明らかとなった。結果を図９に示した。
【０１０９】
〔６．振とうストレスに対する安定化効果を示す実施例８９〜９６〕
＜Ｌ−アスパラギナーゼ＞
（実施例８９）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例１６］
上記実施例８９について、得られたＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５．０ｍｇ／ｍＬであった。残りのＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液をポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。振とう前および振とう後のＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＬ−アスパラギナーゼを５．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例８９）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液のＬ−アスパラギナーゼ活性を測定した。これらの結果より、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液（実施例８９）および対照液（比較例８９）について、振とう前に対する振とう後のＬ−アスパラギナーゼ活性残存率を求めたところ、対照液では活性の低下がみられたが、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液では活性の低下は認められず、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の振とうストレスに対する安定化効果が示された。結果を表２１に示した。
【０１１０】
【表２１】
2019043955.tif 000022
【０１１１】
（実施例９０）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した以外は実施例８１と同じ操作を行った。
［試験例１７］
上記実施例９０について、得られたＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、１０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りのＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液をポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。振とう前および振とう後のＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＬ−アスパラギナーゼを１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例９０）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液のＬ−アスパラギナーゼ活性を測定した。これらの結果より、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液および対照液について、振とう前に対する振とう後のＬ−アスパラギナーゼ活性残存率を求めたところ、対照液では活性の低下がみられたが、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液では活性の低下は認められず、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の振とうストレスに対する安定化効果が示された。結果を表２２に示した。
【０１１２】
【表２２】
2019043955.tif 000023
【０１１３】
＜抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体＞
（実施例９１）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中において、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を１３．３ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体１質量部に対し０．０７質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例１８］
上記実施例９１について、得た抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、７８．５ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液をポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で９０時間振とうした。振とう前および振とう後の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中において抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を７８．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例９１）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液（比較例９１）に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果より、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、振とう前に対する振とう後のタンパク質含量残存率を求めたところ、対照液では残存率の低下がみられたが、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液では残存率の低下はみられず、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の振とうストレスに対する安定化効果が示された。結果を表２３に示した。
【０１１４】
【表２３】
2019043955.tif 000024
【０１１５】
＜抗ＴＮＦαモノクローナル抗体＞
（実施例９２）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０４質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例１９］
上記実施例９２について、得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に９倍量の１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、０．５ｍｇ／ｍＬとして、ポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。振とう前および振とう後の抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。
また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例９２）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果より、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、振とう前に対する振とう後のタンパク質含量残存率を求めたところ、対照液では残存率の顕著な低下がみられたが、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液では残存率の低下が有意に抑制され、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の振とうストレスに対する安定化効果が示された。結果を表２４に示した。
【０１１６】
【表２４】
2019043955.tif 000025
【０１１７】
（実施例９３）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例２０］
上記実施例９３について、得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に９倍量の１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を加え、０．５ｍｇ／ｍＬとして、ポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。振とう前および振とう後の抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。
また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例９３）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果より、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、振とう前に対する振とう後のタンパク質含量残存率を求めたところ、対照液では残存率の顕著な低下がみられたが、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液では残存率の低下が有意に抑制され、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の振とうストレスに対する安定化効果が示された。結果を表２５に示した。
【０１１８】
【表２５】
2019043955.tif 000026
【０１１９】
［試験例２１］
上記実施例９３について、得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性を測定した。また、比較例９３について抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性を測定した。これらの結果より、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、振とう前に対する振とう後の活性残存率を求めたところ、対照液では活性残存率の顕著な低下がみられたが、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液では活性残存率の低下が有意に抑制され、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の振とうストレスに対する安定化効果が示された。結果を表２６に示した。
【０１２０】
【表２６】
2019043955.tif 000027
【０１２１】
（実施例９４）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例２２］
上記実施例９４について、得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に９倍量の１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を加え、５．０ｍｇ／ｍＬとして、ポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。振とう前および振とう後の抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。
また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を５．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例９４）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果より、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、振とう前に対する振とう後のタンパク質含量残存率を求めたところ、対照液では残存率の低下がみられたが、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液では残存率の低下が認められず、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の振とうストレスに対する安定化効果が示された。結果を表２７に示した。
【０１２２】
【表２７】
2019043955.tif 000028
【０１２３】
（実施例９５）
溶液の調製量を増やした、具体的には実施例９４では遠心分離し全容の９割を上清部として除去し０．０６ｍＬの抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得たのに対し、遠心分離前の調製量を６分の８倍量として遠心分離後に０．０８ｍＬの水性懸濁液を得た以外は実施例９４と同じ操作を行った。
［試験例２３］
上記実施例９５について、得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に９倍量の１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を加え、５．０ｍｇ／ｍＬとして、ポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。振とう前および振とう後の抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。
また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を５．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例９５）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果より、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、振とう前に対する振とう後のタンパク質含量残存率を求めたところ、対照液では残存率の低下がみられたが、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液では残存率の低下が認められず、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の振とうストレスに対する安定化効果が示された。結果を表２８に示した。
【０１２４】
【表２８】
2019043955.tif 000029
【０１２５】
［試験例２４］
上記試験例２３において上清部のタンパク質濃度測定を実施した試料と同じ試料について、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体活性を測定した。これらの結果より、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、振とう前に対する振とう後の活性残存率を求めたところ、対照液では活性残存率の顕著な低下がみられたが、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液では活性残存率の低下が有意に抑制され、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の振とうストレスに対する安定化効果が示された。結果を表２９に示した。
【０１２６】
【表２９】
2019043955.tif 000030
【０１２７】
＜抗ＩｇＥモノクローナル抗体＞
（実施例９６）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例２５］
上記実施例９６について、得られた抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に９倍量の１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）を加え、０．５ｍｇ／ｍＬとして、ポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。振とう前および振とう後の抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。
また、１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中において抗ＩｇＥモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例９６）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果より、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、振とう前に対する振とう後のタンパク質含量残存率を求めたところ、対照液では残存率の顕著な低下がみられたが、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液では残存率の低下は認められず、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の振とうストレスに対する安定化効果が示された。結果を表３０に示した。
【０１２８】
【表３０】
2019043955.tif 000031
【０１２９】
〔７．振とうストレスに対して二次構造が保たれる実施例９７、９８〕
＜抗ＴＮＦαモノクローナル抗体＞
［試験例２６］
上記試験例１９において得た抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液（実施例９２）の振とう後について、ＣＤスペクトルを測定した。一方上記試験例１９において得た対照液（比較例９２）の振とう前について、ＣＤスペクトルを測定した。その結果、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に振とうストレスを加えた場合と、加えていない場合とでＣＤスペクトルが一致しており、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液において振とうストレスを加えても二次構造が保たれていることが明らかとなった。結果を図１０に示した。
【０１３０】
＜抗ＩｇＥモノクローナル抗体＞
［試験例２７］
上記試験例２５において得た抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液（実施例９６）の振とう後について、ＣＤスペクトルを測定した。一方上記試験例２５において得た対照液（比較例９６）の振とう前後について、ＣＤスペクトルを測定した。その結果、対照液に振とうストレスを加えた場合と、加えていない場合とでＣＤスペクトルが一致せず二次構造変化が生じているのに対し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に振とうストレスを加えた場合と、加えていない場合とでＣＤスペクトルが一致しており、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液において振とうストレスを加えても二次構造が保たれていることが明らかとなった。結果を図１１に示した。
【０１３１】
〔８．流動性向上を示す実施例９９〕
＜抗ＩｇＥモノクローナル抗体＞
（実施例９９）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を６．０ｍｇ／ｍＬ、８．０ｍｇ／ｍＬおよび１０．０ｍｇ／ｍＬの各濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０８質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）をそれぞれ加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、各抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例２８］
上記実施例９９について、得られた抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、それぞれ６０．０ｍｇ／ｍＬ、８０．０ｍｇ／ｍＬおよび１００．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液について、差圧式粘度計で粘度を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において抗ＩｇＥモノクローナル抗体を６０．０ｍｇ／ｍＬ、８０．０ｍｇ／ｍＬおよび１００．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例９９）とし、差圧式粘度計で粘度を測定した。これらの結果より、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液は対照液と比べて粘度が低く、流動性に優れることが示された。結果を表３１に示した。
【０１３２】
【表３１】
2019043955.tif 000032
【０１３３】
〔９．酸化ストレスに対する安定化効果を示す実施例１００、１０１〕
＜Ｌ−アスパラギナーゼ  タンパク質濃度４０．０ｍｇ／ｍＬ＞
（実施例１００）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１８ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例２９］
上記実施例１００について、得たＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、９０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りのＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液に０．１８％過酸化水素／１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を１．２５倍量加えることで、４０．０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液／０．１％過酸化水素とした。この液を２時間、４時間および６時間の間それぞれ３７℃に保った。また、０．１８質量％過酸化水素／１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）の代わりに１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を１．２５倍量加えることで、４０．０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液とした。これらの液を２、４および６時間、３７℃に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＬ−アスパラギナーゼを９０．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液とし、０．１８質量％過酸化水素／１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を１．２５倍量加えることで４０．０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギナーゼ／０．１％過酸化水素とし、さらに０．１８質量％過酸化水素／１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）の代わりに１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を１．２５倍量加えることで、４０．０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギナーゼとした。これらの対照液を、同時に３７℃に保った。２、４および６時間、３７℃に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。これらの結果より、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液および対照液について、過酸化水素非存在下に対する、過酸化水素存在下のＬ−アスパラギナーゼ活性残存率を求めたところ、対照液では活性の顕著な低下がみられたが、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液における活性の低下はより軽微であり、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の酸化ストレスに対する安定化効果が示された。結果を表３２に示した。
【０１３４】
＜Ｌ−アスパラギナーゼ  タンパク質濃度８０．０ｍｇ／ｍＬ＞
［試験例３０］
上記実施例１００について、得たＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、９０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りのＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液に０．９質量％過酸化水素／１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を０．１２５倍量加えることで、８０．０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液／０．１％過酸化水素とした。この液を２、４及び６時間３７℃に保った。また、０．９質量％過酸化水素／１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）の代わりに１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を０．１２５倍量加えることで、８０．０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液とした。これらの液を２、４および６時間、３７℃に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＬ−アスパラギナーゼを９０．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液とし、０．９質量％過酸化水素／１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を０．１２５倍量加えることで８０．０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギナーゼ／０．１％過酸化水素とし、さらに０．９質量％過酸化水素／１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）の代わりに１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を０．１２５倍量加えることで、８０．０ｍｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギナーゼとした。これらの対照液を、同時に３７℃に保った。２、４および６時間、３７℃に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。これらの結果より、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液および対照液について、過酸化水素非存在下に対する、過酸化水素存在下のＬ−アスパラギナーゼ活性残存率を求めたところ、対照液では活性の顕著な低下がみられたが、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液における活性の低下はより軽微であり、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の酸化ストレスに対する安定化効果が示された。結果を表３２に示した。
【０１３５】
【表３２】
2019043955.tif 000033
【０１３６】
＜抗ＩｇＥモノクローナル抗体＞
（実施例１０１）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を６．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例３１］
上記実施例１０１について、得た抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、６０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に０．６質量％過酸化水素を０．１倍量加えることで、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液／０．１％過酸化水素とした。この液を２時間３７℃に保った。また、０．６質量％過酸化水素の代わりに水を０．１倍量加えることで、５０．０ｍｇ／ｍＬ  抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液とした。これらの液を２時間３７℃に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加えた。さらにトリプシンによる断片化を行ったものについて、ペプチドマッピング法による一次構造分析を行った。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）中において抗ＩｇＥモノクローナル抗体を６０．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例１０１）とし、０．６質量％過酸化水素を０．１倍量加えることで５０．０ｍｇ／ｍＬ  抗ＩｇＥモノクローナル抗体／０．１％過酸化水素とし、さらに０．６質量％過酸化水素の代わりに水を０．１倍量加えることで、５０．０ｍｇ／ｍＬ  抗ＩｇＥモノクローナル抗体とした。これらの対照液を、２時間３７℃に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加えた。さらにトリプシンによる断片化を行ったものについて、ペプチドマッピング法による一次構造分析を行った。これらの結果より、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、過酸化水素非存在下に対する、過酸化水素存在下の一次構造変化率を、ピーク面積の減少率により算出した。抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液（実施例１０１）における一次構造の変化率は、対照液（比較例１０１）における一次構造の変化率と比べ有意に抑制されており、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の酸化ストレスに対する安定化効果が示された。対照液における一次構造の変化率を１とした際の結果を表３３に示した。
【０１３７】
【表３３】
2019043955.tif 000034
【０１３８】
〔１０．熱ストレスに対する安定化効果を示す実施例１０２〜１０６〕
＜Ｌ−アスパラギナーゼ＞
（実施例１０２）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例３２］
上記実施例１０２について、得られたＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、１０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りのＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を５分間、１５分間および３０分間、６０℃あるいは冷温に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＬ−アスパラギナーゼを１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例１０２）とし、５分間、１５分間および３０分間、６０℃あるいは冷温に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を測定した。これらの結果より、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液および対照液について、加熱時の非加熱時に対するＬ−アスパラギナーゼ活性残存率を求めたところ、対照液では活性が顕著に低下したが、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液では活性の低下が有意に抑制され、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の熱ストレスに対する安定化効果が示された。結果を表３４に示した。
【０１３９】
【表３４】
2019043955.tif 000035
【０１４０】
（実施例１０３）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを４．３ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）、または０．０５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：１５ｋＤａ−３０ｋＤａ）、または０．０３質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：３０ｋＤａ以上）、または０．０５質量部のポリ−Ｌ−アルギニン（ＭＷ：５ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液、またはＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−アルギニン複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例３３］
上記実施例１０３について、得られたＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液、またはＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−アルギニン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、４３．０ｍｇ／ｍＬであった。残りのＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液、またはＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−アルギニン複合体含有水性懸濁液（実施例１０３）について、示差走査熱量測定を行った。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＬ−アスパラギナーゼを４３．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例１０３）とし、示差走査熱量測定を行った。各水性懸濁液または対照液の変性温度を求めたところ、対照液と比べ、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液、またはＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−アルギニン複合体含有水性懸濁液ではより高温でタンパク質の変性が生じることが明らかとなり、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の熱ストレスに対する安定化効果が示された。結果を表３５に示した。
【０１４１】
【表３５】
2019043955.tif 000036
【０１４２】
＜抗ＩｇＥモノクローナル抗体＞
（実施例１０４）
１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を１．２５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．１質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例３４］
上記実施例１０４について、得られた抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、１０．６ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を１５時間、６０℃あるいは冷温に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において抗ＩｇＥモノクローナル抗体を１０．６ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液とし、１５時間、６０℃あるいは冷温に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。これらの結果より、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液および対照液について、加熱時の非加熱時に対する抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性残存率を求めたところ、対照液では活性が低下したが、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液では活性の低下が抑制され、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の熱ストレスに対する安定化効果が示された。結果を表３６に示した。
【０１４３】
【表３６】
2019043955.tif 000037
【０１４４】
（実施例１０５）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例３５］
上記実施例１０５について、得られた抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に９倍量の１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を加え、５ｍｇ／ｍＬとして、１５時間、６０℃あるいは冷温に保った後、または６０時間、５０℃あるいは冷温に保った後１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。また、１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中において抗ＩｇＥモノクローナル抗体を５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液とし、１５時間、６０℃あるいは冷温、または６０時間、５０℃あるいは冷温に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性を測定した。これらの結果より、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、加熱時の非加熱時に対する抗ＩｇＥモノクローナル抗体活性残存率を求めたところ、対照液では活性が低下したが、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液では活性の低下が抑制され、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の熱ストレスに対する安定化効果が示された。結果を表３７に示した。
【０１４５】
【表３７】
2019043955.tif 000038
【０１４６】
（実施例１０６）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を５．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０７５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例３６］
上記実施例１０６について、得た抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液について、示差走査熱量測定を行った。また、１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）中において抗ＩｇＥモノクローナル抗体を５０．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液とし、示差走査熱量測定を行った。各水性懸濁液または対照液の変性温度を求めたところ、対照液と比べ、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液ではより高温でタンパク質の変性が生じることが明らかとなり、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の熱ストレスに対する安定化効果が示された。結果を表３８に示した。
【０１４７】
【表３８】
2019043955.tif 000039
【０１４８】
〔１１．凝集抑制効果を示す実施例１０７〜１１０〕
＜抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体＞
（実施例１０７）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中において、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を５．３ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９．４割を上清部として除去し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例３７］
上記実施例１０７について、得られた抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、８９．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液をポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で９０時間振とうした。振とう前および振とう後の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した（実施例１０７）。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中において抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を８９．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例１０７）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果より、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、総タンパク質量から上清部のタンパク質量を差し引くことでタンパク質の不溶性凝集体量を算出し、振とう前に対する振とう後のタンパク質の不溶性凝集体化率を求めたところ、対照液と比べて抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液ではタンパク質の不溶性凝集体化率が抑制されており、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の凝集抑制効果が示された。結果を表３９に示した。
【０１４９】
【表３９】
2019043955.tif 000040
【０１５０】
（実施例１０８）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中において、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を５．３ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９.５割を上清部として除去し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例３８］
上記実施例１０８について、得られた抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、１１４．９ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液をポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で９０時間振とうした。振とう前および振とう後の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した（実施例１０８）。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中において抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を１１４．９ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例１０８）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果より、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、総タンパク質量から上清部のタンパク質量を差し引くことでタンパク質の不溶性凝集体量を算出し、振とう前に対する振とう後のタンパク質の不溶性凝集体化率を求めたところ、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液ではタンパク質凝集を認めず、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の凝集抑制効果が示された。結果を表４０に示した。
【０１５１】
【表４０】
2019043955.tif 000041
【０１５２】
＜Ｌ−アスパラギナーゼ＞
（実施例１０９）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例３９］
上記実施例１０９について、得られたＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、１０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りのＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液（実施例１０９）を５分間６０℃あるいは室温に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、マイクロフローイメージング（ＭＦＩ）法により凝集体数を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＬ−アスパラギナーゼを１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例１０９）とし、５分間６０℃あるいは室温に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、マイクロフローイメージング法により凝集体数を測定した。これらの結果より、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液および対照液について、加熱時の凝集体数を非加熱時の凝集体数で除することにより、凝集体数の増加率を求めたところ、対照液における凝集体増加率と比べて、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液における凝集体増加率は有意に低く、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の凝集抑制効果が示された。結果を表４１に示した。
［試験例４０］
上記実施例１０９について、得られたＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、１０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りのＬ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を５分間６０℃あるいは室温に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、濁度測定として波長６００ｎｍの吸光度を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＬ−アスパラギナーゼを１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液とし、５分間６０℃あるいは室温に保った後、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、濁度測定として波長６００ｎｍの吸光度を測定した。これらの結果より、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液および対照液について、加熱時の濁度を非加熱時の濁度で除することにより、濁度の増加率を求めたところ、対照液における濁度増加率と比べて、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液における濁度増加率は有意に低く、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の凝集抑制効果が示された。結果を表４１に示した。
【０１５３】
【表４１】
2019043955.tif 000042
【０１５４】
＜抗ＴＮＦαモノクローナル抗体＞
［試験例４１］
上記実施例９５について、得られた抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に９倍量の１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を加え、５．０ｍｇ／ｍＬとして、ポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。振とう前および振とう後の抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、マイクロフローイメージング（ＭＦＩ）法により凝集体数を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を５．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例９５）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、マイクロフローイメージング法により凝集体数を測定した。これらの結果より、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、振とう時の凝集体数を非振とう時の凝集体数で除することにより、凝集体数の増加率を求めたところ、対照液における凝集体増加率と比べて、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液における凝集体増加率は有意に低く、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の凝集抑制効果が示された。結果を表４２に示した。
【０１５５】
【表４２】
2019043955.tif 000043
【０１５６】
＜抗ＩｇＥモノクローナル抗体＞
（実施例１１０）
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を５．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．１質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例４２］
上記実施例１１０について、得られた抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５０．０ｍｇ／ｍＬであった。残りの抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に９倍量の１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）を加え、５．０ｍｇ／ｍＬとして、ポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。振とう前および振とう後の抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、サイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ）法による分析を行った（実施例１１０）。また、１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．４）中において抗ＩｇＥモノクローナル抗体を５．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例１１０）とし、シリンジに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、サイズ排除クロマトグラフ法による分析を行った。これらの結果より、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液および対照液について、求めたところ、対照液では可溶性凝集体ピーク面積が顕著に増大したのに対し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液では可溶性凝集体ピーク面積の増大が有意に抑制され、タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液の凝集抑制効果が示された。結果を表４３に示した。
【０１５７】
【表４３】
2019043955.tif 000044
【０１５８】
〔１２．合成ポリマーを用いた比較実験〕
【０１５９】
（対照実施例１１１，１１２）
（１）Ｌ−アスパラギナーゼをポリエチレンイミンで濃縮し、１００％近い回収が可能
であることの確認
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０５質量部のポリアリルアミン（ＭＷ：５ｋＤａ）またはポリエチレンイミン（ＭＷ：１．８ｋＤａ）を加えた．これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・各ポリマー複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例４３］
上記対照実施例１１１および１１２について、得られたＬ−アスパラギナーゼ・ポリアリルアミン複合体含有水性懸濁液（対照実施例１１１）およびＬ−アスパラギナーゼ・ポリエチレンイミン複合体含有水性懸濁液（対照実施例１１２）の一部を採り、１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、タンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリエチレンイミン複合体含有水性懸濁液からのＬ−アスパラギナーゼの回収率が１００％近いのに対し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリアリルアミン複合体含有水性懸濁液からのＬ−アスパラギナーゼの回収率は有意に低かった。このことからポリエチレンイミンにより、ポリリジン（実施例１〜１１参照）と同様にＬ−アスパラギナーゼと複合体を形成し、濃縮および回収が可能であることが示された。結果を図１２に示した。
【０１６０】
（対照実施例１１３）
（２）抗ＴＮＦαモノクローナル抗体をポリアクリル酸で濃縮できる事の確認
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し（比較例１１３）、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０４質量部のポリアクリル酸（ＭＷ：５ｋＤａ）を加えた（対照実施例１１３）。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリアクリル酸複合体含有水性懸濁液を得た。また、比較例１１３はポリアクリル酸を加えなかった以外は同じ操作を行った。
［試験例４４］
この液に１５０ｍＭとなるよう塩化ナトリウムを加え遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。結果を表４４に示す。比較例１１３におけるタンパク質濃度に対する対照実施例１１３のタンパク質濃度比を求めたところ、約９．９倍に上昇しており、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体をポリアクリル酸で濃縮できることが示された。結果を表４４に示す。
【０１６１】
【表４４】
2019043955.tif 000045
【０１６２】
（対照実施例１１４）
（３）ポリリジンまたはポリエチレンイミンとＬ−アスパラギナーゼとの複合体を形成することによる、振とうストレスに対する安定化効果の比較
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）（実施例１１４）またはポリエチレンイミン（ＭＷ：１．８ｋＤａ）（対照実施例１１４）を加えた．これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・各ポリマー複合体含有水性懸濁液を得た。
［試験例４５］
実施例１１４および対照実施例１１４で調製した各液に９倍量の１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、１０．０ｍｇ／ｍＬとして、ポリプロピレン製チューブに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。振とう前および振とう後のＬ−アスパラギナーゼ・各ポリマー複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＬ−アスパラギナーゼを１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液（比較例１１４）とし、ポリプロピレン製チューブに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。Ｌ−アスパラギナーゼ・各ポリマー複合体含有水性懸濁液および対照液について、振とう前に対する振とう後のタンパク質含量残存率を求めた。結果を図１３に示す。Ｌ-アスパラギナーゼ・ポリリジン複合体含有水性懸濁液（実施例１１４）における残存活性と比べ、Ｌ-アスパラギナーゼ・ポリエチレンイミン複合体含有水性懸濁液（対照実施例１１４）における残存活性は有意に低く比較例１１４における残存活性と同等であった。即ちＬ-アスパラギナーゼ・ポリエチレンイミン複合体含有水性懸濁液は振とうストレス耐性を有しないことが示された。
【０１６３】
（４）ポリグルタミン酸とポリアクリル酸における細胞障害性の確認
培地にポリグルタミン酸（ＭＷ：３−１５ｋＤａ）、ポリアクリル酸（ＭＷ：５ｋＤａ）およびポリアクリル酸（ＭＷ：２５ｋＤａ）をそれぞれ溶解し、各ポリマーについて０〜１％となるよう種々のポリマー溶液を調製した。各ポリマーにおける０〜１％の各溶液を９６ウェルプレートに播種したＣＨＯ細胞上に加え、ＣＯ２インキュベーター中で１８時間培養した。１８時間後にポリマーを含まない培地（０％ポリマー溶液）で培養した際の細胞増殖率と、各ポリマー溶液下で培養した際の細胞増殖率を比較したところ、ポリアクリル酸溶液（ＭＷ：５ｋＤａ、２５ｋＤａともに）においては０．０５〜０．１％程度の濃度からＣＨＯ細胞増殖を抑制しはじめ、細胞増殖を５０％抑制する濃度は０．１７％付近であることが示された。一方ポリグルタミン酸溶液においては１％溶液でもほとんどＣＨＯ細胞増殖を抑制することはなかった。結果を表４５に示す。
【０１６４】
【表４５】
2019043955.tif 000046
【０１６５】
〔１３．複合体の再溶解に要する塩濃度の確認〕
＜抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリグルタミン酸複合体の解離に要する塩濃度の確認＞
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、抗ＴＮＦα抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＴＮＦα抗体、１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：３ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。調製した水性懸濁液に、ＮａＣｌ濃度が０〜１００ｍＭ（０〜０．６質量％）となるように調製した各ＮａＣｌ含有１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を９倍量加えて遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。開始時のタンパク濃度に対するＮａＣｌ添加、遠心分離後の上清のタンパク質濃度比を求めたところ、ＮａＣｌ濃度が１０ｍＭ（０．０６質量％）以上でタンパク質濃度の上昇を確認した。この結果より、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液の再溶解、即ち複合体からの抗ＴＮＦαモノクローナル抗体の遊離には１０ｍＭ（０．０６質量％）以上のＮａＣｌ濃度が必要であることが示された。結果を表４６に示す。
【０１６６】
【表４６】
2019043955.tif 000047
【０１６７】
＜Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリリジン複合体の解離に要する塩濃度の確認＞
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ、１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ：４ｋＤａ−１５ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液を得た。調製した水性懸濁液に、ＮａＣｌ濃度が０〜１００ｍＭ（０〜０．６質量％）となるように調製した各ＮａＣｌ含有１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を９倍量加えて遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。開始時のタンパク濃度に対するＮａＣｌ添加、遠心分離後の上清のタンパク質濃度比を求めたところ、ＮａＣｌ濃度が８ｍＭ（０．０４８質量％）以上でタンパク質濃度の上昇を確認した。この結果より、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリ−Ｌ−リジン複合体含有水性懸濁液の再溶解、即ち複合体からのＬ−アスパラギナーゼの遊離には８ｍＭ（０．０４８質量％）以上のＮａＣｌ濃度が必要であることが示された。結果を表４７に示す。
【０１６８】
【表４７】
2019043955.tif 000048
【０１６９】
〔１４．  複合体含有水性懸濁剤の毒性試験〕
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中において、ラットＩｇＧを１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、ラットＩｇＧ  １質量部に対し０．１２質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：５０ｋＤａ−１００ｋＤａ）を加えた。この調製した液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、ラットＩｇＧ・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。また対照液として１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中において、ラットＩｇＧを１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した。水性懸濁液および対照液をラットの背中に５０ｍｇ/ｋｇで皮下注射した。その後ラット体重および心臓、肺、肝、脾、腎といった臓器の重さを測定した。結果を図１５（Ａ）、（Ｂ）に示す。対照液投与群（白丸および白棒）と複合体含有水性懸濁液投与群（黒丸および黒棒）とで体重、臓器重量に有意な差は無かった（図１５（Ａ）、（Ｂ））。さらに上記の臓器と投与部位について病理評価および血液検査を行ったところ、上記の全臓器及び投与部位に病理的変化は無く、さらに対照液投与群と複合体含有水性懸濁液投与群とで全血液検査項目に有意な差は無かった。以上の結果より本発明のタンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁液には毒性がないことが確認された。
【０１７０】
〔１５．  タンパク質・ポリアミノ酸複合体含有水性懸濁剤皮下投与時のタンパク質血漿中濃度推移の確認〕
１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体を１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０５質量部のポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＭＷ：５０ｋＤａ−１００ｋＤａ）を加えた。これら調製した各液を遠心分離し全容の９割を上清部として除去し、抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリ−Ｌ−グルタミン酸複合体含有水性懸濁液を得た。また対照液として抗ＩｇＥモノクローナル抗体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した。水性懸濁液および対照液をラットの背中に１０ｍｇ/ｋｇで皮下注射した。その後ラット血漿中の抗ＩｇＥモノクローナル抗体濃度をＥＬＩＳＡ法により定量した。結果を図１６に示す。対照液投与群（白丸）と複合体含有水性懸濁液投与群（黒丸）とで血漿中抗ＩｇＥモノクローナル抗体濃度−時間曲線が一致しており、対照液と水性懸濁液が皮下投与後に同様の挙動を示すことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１７１】
本発明は以下のいずれかの特性を有するので有用性が高い。
広範なタンパク質について、輸送時の振動や保存時の熱ストレス、酸化ストレスに対して安定である水性懸濁剤である。本発明は複合体を形成し安定化され、輸送時や保存時の安定性に優れる。本発明の複合体は限外ろ過等の特別な設備を必要とせずにタンパク質濃度を簡便に高濃度に濃縮できる。濃縮による活性の低下が少ない。本発明の水性懸濁剤は、タンパク質の等電点に応じて緩衝液のｐＨとポリアミノ酸を選択するのみで簡便にタンパク質を安定化させることができ、従来必要であった添加剤を加える必要がない。また、凍結乾燥製剤で必要となる煩雑な溶解操作を必要とせず、複合体含有水性懸濁液をそのまま製剤として投与でき、あるいは用時に塩化ナトリウムに代表される無機塩を加えて再溶解して水性液として投与することができる。本発明の水性懸濁剤は、タンパク質が高濃度であっても粘度が低いという特徴を有するため、使用時に容器中に残存し無駄となる量を減らすことができ、また、シリンジを用いて投与する際には、同濃度のタンパク質水溶液に比べ弱い力で投与することができる。
【符号の説明】
【０１７２】
１      プレフィルドシリンジ
２      外筒
３，４  ガスケット
５      プランジャ
６      タンパク質・ポリアミノ酸複合体
７      溶解液（ＮａＣｌ溶液）
８      拡径部
【図１】
2019043955.tif 000049
【図２】
2019043955.tif 000050
【図３】
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【図４】
2019043955.tif 000052
【図５】
2019043955.tif 000053
【図６】
2019043955.tif 000054
【図７】
2019043955.tif 000055
【図８】
2019043955.tif 000056
【図９】
2019043955.tif 000057
【図１０】
2019043955.tif 000058
【図１１】
2019043955.tif 000059
【図１２】
2019043955.tif 000060
【図１３】
2019043955.tif 000061
【図１４】
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【図１５】
2019043955.tif 000063
【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年12月3日(2018.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質とポリアミノ酸との複合体および緩衝液を含む、タンパク質水性懸濁剤であって、
前記ポリアミノ酸が、カチオン性ポリアミノ酸またはアニオン性ポリアミノ酸であり、
前記タンパク質が、ダルベポエチンアルファ、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド、ウシサイログロブリン、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体、抗ＩｇＥモノクローナル抗体、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、ヒトＩｇＧ、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメント、およびヒト型可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である、タンパク質水性懸濁剤。
【請求項２】
前記ポリアミノ酸がポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジンおよびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項３】
前記ポリアミノ酸がポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸およびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項４】
前記ポリアミノ酸の分子量が０．５ｋＤａ〜１０００ｋＤａである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項５】
前記緩衝液のｐＨと前記タンパク質の等電点（ｐＩ）の差の絶対値が０．５〜４．０である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項６】
前記緩衝液が、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液、およびグリシン−ＮａＯＨ緩衝液からなる群から選択されるいずれか１種である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項７】
前記緩衝液、前記タンパク質、前記ポリアミノ酸およびｐＨ調製剤以外の添加剤を含有しない、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項８】
緩衝液中でタンパク質とポリアミノ酸との複合体を形成して水性懸濁液とし、前記複合体中で前記タンパク質が振とうストレス耐性を有する、タンパク質の安定化方法であって、
前記タンパク質が、酵素、インターフェロン、ダルベポエチンアルファ、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド、ウシサイログロブリン、抗体、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメント、およびヒト型可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種であり、
前記ポリアミノ酸がカチオン性ポリアミノ酸である、
タンパク質の安定化方法。
【請求項９】
前記ポリアミノ酸がポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジンおよびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項８に記載のタンパク質の安定化方法。
【請求項１０】
前記ポリアミノ酸の分子量が０．５ｋＤａ〜１０００ｋＤａである、請求項８または９に記載のタンパク質の安定化方法。
【請求項１１】
前記緩衝液のｐＨと前記タンパク質の等電点（ｐＩ）の差の絶対値が０．５〜４．０である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質の安定化方法。
【請求項１２】
前記タンパク質の分子量が３ｋＤａ〜６７０ｋＤａである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のタンパク質の安定化方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が糖鎖を有する、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質の安定化方法。
【請求項１４】
前記酵素がＬ−アスパラギナーゼである、請求項８〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質の安定化方法。
【請求項１５】
前記インターフェロンがインターフェロンベータ−２ｂである、請求項８〜１４のいずれか１項に記載のタンパク質の安定化方法。
【請求項１６】
前記抗体が、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体、抗ＩｇＥモノクローナル抗体、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、およびヒト免疫グロブリンＧからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項８〜１５のいずれか１項に記載のタンパク質の安定化方法。
【請求項１７】
前記緩衝液が、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液、およびグリシン−ＮａＯＨ緩衝液からなる群から選択されるいずれか１種である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のタンパク質の安定化方法。
【請求項１８】
前記振とうストレスが、前記複合体に、１００〜５００ｒｐｍ×１０〜１００時間の振とうを与えることである、請求項８〜１７のいずれか１項に記載のタンパク質の安定化方法。