(57)【要約】      （修正有）【課題】損傷または罹患した組織を修復および／または再生する組成物又は方法の提供。【解決手段】心筋球（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ）または心筋球由来細胞（ＣＤＣ）から回収された複数のエキソソームを含む、医薬組成物。好ましくは、エキソソームが１以上のマイクロＲＮＡ断片を含む、医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋球（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ）または心筋球由来細胞（ＣＤＣ）から回収された複数のエキソソームを含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記エキソソームが１以上のマイクロＲＮＡ断片を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記１以上のマイクロＲＮＡ断片が、ｍｉＲ２７−ａ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−１９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１０、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−２２、ｌｅｔ−７ｆ、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−２３ａ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記１以上のマイクロＲＮＡ断片が、ｍｉＲ２７−ａ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−１９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１０、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−２２、ｌｅｔ−７ｆ、ｍｉＲ−１４６ａ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記１以上のマイクロＲＮＡ断片がｍｉＲ−１４６ａおよびｍｉＲ−２１０を含む、請求項２から４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記エキソソームが遠心分離により得られる、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記エキソソームが、サイズ排除ろ過により得られる、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記エキソソームが直径約２０ｎｍから約９０ｎｍである、請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
心筋球または心筋球由来細胞（ＣＤＣ）の集団をさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記心筋球または心筋球由来細胞（ＣＤＣ）が、前記個体に対して自己由来である、請求項１から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記心筋球または心筋球由来細胞（ＣＤＣ）が、前記個体に対して同種異系である、請求項１から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
心筋球由来細胞（ＣＤＣ）の集団から単離された複数のエキソソームを含み、
前記エキソソームが１以上のマイクロＲＮＡを含み、
前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−２２、およびｍｉＲ−２４からなる群から選択される、医薬組成物。
【請求項１３】
心筋球由来細胞（ＣＤＣ）の集団から単離された複数のエキソソームを含み、
前記エキソソームがｍｉＲ−１４６ａ及びｍｉＲ−２１０を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１２年８月１３日出願の米国特許仮出願第６１／６８２，６６６号の利益を主張するものであり、この全開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【政府出資の研究に関する表明】
【０００２】
本明細書に開示の発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）による研究プロジェクト助成金（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｇｒａｎｔ）（Ｒ０１  ＨＬ０８３１０９）の下の政府支援で行った。米国政府は本発明の特定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、全体として、損傷または罹患した細胞または組織の修復または再生のための方法および組成物に関する。いくつかの実施形態は、損傷または罹患した組織を修復および／または再生するための、細胞から単離されたエキソソーム（またはエキソソーム由来のタンパク質および／または核酸）または合成代用物の投与に関する。特に、いくつかの実施形態は、特定の細胞型、例えば、心筋幹細胞に由来するエキソソームおよび心筋組織の修復および／または再生における該エキソソームの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
多くの疾患、傷害および病弊は、細胞および組織の喪失または損傷を伴う。例としては、限定するものではないが、神経変性疾患、内分泌性疾患、癌および心血管疾患が挙げられる。これらの限定されない例は、まさに、実質的医療費、生活の質の低下、職場における生産性の喪失、労働者災害補償費および当然のことながら死亡の原因である。例えば、冠状動脈性心疾患は、米国における死亡の主原因の１つであり、年間に６５０，０００人を超える命を奪っている。米国において毎年およそ１３０万人が、心臓発作（または心筋梗塞、ＭＩ）を患っている（大まかに８００，０００人が初回心臓発作および大まかに５００，０００人がその後の心臓発作）。ＭＩから生き残る人々のなかでも、多くの場合心機能の低下、関連する副作用または心疾患の進行のため、数多くの人々が１年以内にさらに死亡すると思われる。心疾患は、男性および女性両方の死亡の主原因であり、心疾患の最も一般的な型である冠状動脈性心疾患は、米国において２００８年におよそ４００，０００人の死亡をもたらした。病因に関わらず、冠状動脈性心疾患または心不全に苦しむ人々の大部分は、恒久的な心臓組織の損傷を患っており、これは多くの場合生活の質の低下につながる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
傷害、疾患またはこれらの組み合わせにより損傷した（または損傷を受け続ける）組織の修復および／または再生のための方法および組成物の必要性が存在する。古典的な療法、例えば、薬理学的介入または装置による介入または外科手術はプラスの効果を提供したが、損傷または罹患した組織の修復または再生において、予想外の有益な効果をもたらす方法および組成物を本明細書において提供する（いくつかの実施形態を通して、これらの方法および組成物は、古典的療法を補完するために使用される）。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本明細書において、損傷組織を有する個体において組織を再生する方法を提供し、該方法は、損傷組織を有する個体を同定するステップ、および複数のエキソソームを個体に投与するステップを含み、エキソソームが再生細胞から分泌され、エキソソームが１以上のマイクロＲＮＡ断片を含み、複数のエキソソームの投与後、１以上のマイクロＲＮＡ断片が損傷組織において遺伝子発現を改変し、損傷組織の生存能力を改善する、および／または個体において新しい組織の形成を容易にする。いくつかの実施形態において、エキソソームの投与は、１以上の上述のプラス効果と組み合わせて、組織における機能改善をもたらす。いくつかの実施形態において、エキソソームは合成起源である。一部のこのような実施形態において、合成エキソソームは、再生細胞から分泌される実質的または厳密に模倣的なエキソソームを複製するために作製される。
【０００７】
いくつかの実施形態において、再生細胞は哺乳動物起源である。いくつかの実施形態において、再生細胞はヒト細胞である。一部の実施形態において、細胞はヒト非胚性再生細胞である。いくつかの実施形態において、再生細胞は個体に対して自己由来であるが、いくつかの他の実施形態において、再生細胞は個体に対して同種異系である。異種細胞または同系細胞が、特定の他の実施形態に使用される。
【０００８】
いくつかの実施形態において、損傷組織を有する個体において組織を再生する方法を提供し、該方法は、損傷組織を有する個体を同定するステップ、および１以上のマイクロＲＮＡ断片またはこれらの誘導体を個体に投与するステップを含み、１以上のマイクロＲＮＡ断片の投与後、１以上のマイクロＲＮＡ断片が、損傷組織における遺伝子発現を改変し、損傷組織の生存能力を改善する、および／または個体において新しい組織の形成を容易にする。したがって、一部の実施形態において、エキソソームを投与する必要はなく、むしろ特定のエキソソーム中に存在すると思われる、または存在することが公知であるｍｉＲＮＡ（および／またはタンパク質）を直接投与して、損傷組織の再生をもたらすことができる。いくつかのこのような実施形態において、マイクロＲＮＡ断片またはこれらの誘導体は合成的に作製できる。一実施形態において、マイクロＲＮＡ断片またはこれらの誘導体は、１以上の内因性マイクロＲＮＡ分子を模倣する配列により合成される。またはいくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、標的細胞中の特定の遺伝子に相補的であり、標的遺伝子の発現を減少させることができる。相補的ｍｉＲＮＡ（例えば、アンタゴｍｉＲとして公知のアンチセンス分子）およびｍｉＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ模倣体）の組み合わせが、いくつかの実施形態において使用される。いくつかの実施形態において、修飾（例えば、化学的修飾）が、マイクロＲＮＡの安定性を強化するために実施され、それによって、マイクロＲＮＡ（またはこれらの断片／誘導体）を投与する能力が改善される。一部の実施形態において、単なるマイクロＲＮＡ断片、これらの模倣体、これらの誘導体もしくはこれらの化学的複製物またはこれらの組み合わせ（例えば、エキソソームは含まれない）が投与される。しかし、いくつかの実施形態において、本明細書において述べたように、投与は、１以上のマイクロＲＮＡ断片またはこれらの誘導体を含む複数の合成リポソームの投与を含む。追加の実施形態において、複数の再生細胞が、エキソソームおよび／またはｍｉＲＮＡと一緒に投与される。
【０００９】
いくつかの実施形態において、損傷組織は心臓組織を含む。いくつかの実施形態において、再生細胞は心筋球を含む。いくつかの実施形態において、再生細胞は心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を含む。いくつかの実施形態において、エキソソーム供給源としての心筋球および／またはＣＤＣの使用は、得られたエキソソームが（他の細胞型由来のエキソソームと比較して）予想外に優れた治療利益を提供するので、特に有利である。一部の実施形態において、このような利益の例としては、限定するものではないが、分解の低減、心臓再生に対する特異性の強化、免疫原性の低下などが挙げられる。さらに、いくつかの実施形態において、心筋球およびまたはＣＤＣをスクリーニングして、それらの細胞に特有のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを同定する。そのプロファイルは、いくつかの実施形態において、合成エキソソームおよび／またはｍｉＲＮＡの作製および投与により、少なくとも一部複製される。したがって、心筋球および／またはＣＤＣの治療有効性は、細胞それ自体を投与しなくても、予想外に反映され得る。いくつかの実施形態において、エキソソームおよび／またはｍｉＲＮＡが標的組織において免疫応答の低下をもたらすので、これは治療有効性の改善をもたらす。
【００１０】
いくつかの実施形態において、損傷組織は、神経系（ｎｅｕｒａｌ）および／または神経（ｎｅｒｖｏｕｓ）の組織、上皮組織、骨格筋組織、内分泌組織、血管組織、平滑筋組織、肝臓組織、膵臓の組織、肺組織、腸組織、骨組織、結合組織またはこれらの組み合わせの１以上を含む。いくつかの実施形態において、損傷組織は、急性事象のため、修復、再生または機能改善が必要である。急性事象としては、限定するものではないが、外傷、例えば裂傷、挫滅もしくは衝突傷害、ショック、血液もしくは酸素流の喪失、感染症、化学薬品もしくは熱への曝露、毒物もしくは毒液曝露、薬物の過剰使用もしくは過剰曝露などが挙げられる。例えば、いくつかの実施形態において、損傷組織は心臓組織であり、急性事象は心筋梗塞を含む。一部の実施形態において、エキソソームの投与は、梗塞を受けたエリアの心臓の壁厚の増加をもたらす。さらなる実施形態において、組織は、慢性疾患または進行中の傷害のため損傷される。例えば、進行性変性疾患は、時間と共に広がる組織損傷につながる可能性がある（時として、療法の試みを考慮しても）。しかし、慢性疾患が組織損傷を起こし続けて変性するとは限らない。いくつかの実施形態において、慢性疾患／傷害としては、限定するものではないが、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、ドーパミン作動系障害（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、痴呆、局所脳虚血を含む虚血、身体外傷（例えば、ＣＮＳにおける挫滅または圧迫傷害）による後続の影響、神経変性、免疫の活動亢進もしくは欠損、骨髄の交換もしくは機能補充、関節炎、自己免疫異常、炎症性腸疾患、癌、糖尿病、筋力低下（例えば、筋ジストロフィー、筋委縮性側索硬化症など）、失明および聴力喪失が挙げられる。心臓組織は、いくつかの実施形態において、慢性疾患、例えば、鬱血性心不全、虚血性心疾患、糖尿病、心臓弁膜症、拡張型心筋症、感染症などによっても損傷を受ける。損傷の他の原因としては、限定するものではないが、傷害、加齢に伴う変性、癌および感染症が挙げられる。いくつかの実施形態において、再生細胞は、修復または再生を必要とする同じ組織型に由来する。いくつかの他の実施形態において、再生細胞は、修復または再生を必要とする組織以外の組織型に由来する。いくつかの実施形態において、再生細胞は体細胞を含むが、一方、さらなる実施形態において、再生細胞は生殖細胞を含む。さらに追加の実施形態において、１以上の細胞型の組み合わせが、エキソソーム（またはエキソソームの内容物）を得るために使用される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、エキソソームは、直径約１５ｎｍから約９５ｎｍであり、約１５ｎｍから約２０ｎｍ、約２０ｎｍから約２５ｎｍ、約２５ｎｍから約３０ｎｍ、約３０ｎｍから約３５ｎｍ、約３５ｎｍから約４０ｎｍ、約４０ｎｍから約５０ｎｍ、約５０ｎｍから約６０ｎｍ、約６０ｎｍから約７０ｎｍ、約７０ｎｍから約８０ｎｍ、約８０ｎｍから約９０ｎｍ、約９０ｎｍから約９５ｎｍおよびそれらの重複範囲を含む。ある実施形態において、より大きなエキソソームが得られ、直径がより大きい（例えば、約１４０から約２１０ｎｍの範囲のエキソソーム）。有利なことに、いくつかの実施形態において、エキソソームは合成の膜結合粒子（例えば、エキソソーム代用物）を含み、これらは、実施形態に依存して、特定範囲の直径に構成される。このような実施形態において、エキソソーム代用物の直径は、特定の用途（例えば、標的部位または送達経路）に応じて適合される。さらに追加の実施形態において、エキソソーム代用物は標識または修飾され、投与後の特定の部位または領域への輸送を強化される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、エキソソームは、再生細胞の遠心分離により得られる。いくつかの実施形態において、超遠心分離が使用される。しかし、いくつかの実施形態において、超遠心分離は使用されない。いくつかの実施形態において、エキソソームは、再生細胞のサイズ排除ろ過により得られる。上記のように、一部の実施形態において、合成エキソソームが作製され、これらは上記と同様の機序により単離することができる。
【００１３】
いくつかの実施形態において、エキソソームは、ｍＲＮＡの翻訳および／または切断を抑制することによって遺伝子発現の改変を誘導する。一部の実施形態において、遺伝子発現の改変は、望ましくないタンパク質または他の分子、例えば、細胞死経路に関連する分子または周囲細胞にさらなる損傷を誘導する分子（例えば、フリーラジカル）の阻害をもたらす。いくつかの実施形態において、遺伝子発現の改変は、直接または間接的に、所望のタンパク質または分子（例えば、有益な効果を有する分子）の創造をもたらす。タンパク質または分子それ自体が、望ましくある必要はない（例えば、タンパク質または分子が、組織に対する損傷に関連して全体で有益な効果を有し得るが、他に関連して有益な効果をもたらさなくてもよい）。一部の実施形態において、遺伝子発現の改変は、望ましくないタンパク質、分子または経路の抑制（例えば、有害な経路の阻害）を引き起こす。いくつかの実施形態において、遺伝子発現の改変は、１以上の炎症性物質および／またはこのような物質に対する感受性の発現を減少させる。有利なことに、エキソソームまたはｍｉＲＮＡの投与は、いくつかの実施形態において、特定の炎症性分子および／または炎症経路に関与する分子の下方制御をもたらす。したがって、いくつかの実施形態において、エキソソームまたはｍｉＲＮＡと接触した細胞は、傷害後の炎症または疾患による炎症の事象においても、生存能力の強化を享受する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、エキソソームは、損傷組織の１以上のレシピエント細胞と融合する。いくつかの実施形態において、エキソソームは、マイクロＲＮＡを損傷組織の１以上のレシピエント細胞内に放出し、それによって、損傷組織の１以上の細胞中の少なくとも１つの経路を改変する。一部の実施形態において、エキソソームは、損傷組織の細胞を取り巻く環境を改変することによって、損傷組織の細胞に対するそれらの影響力を発揮する。一部の実施形態において、エキソソームの内容物または特徴によって、またはそれらの結果として作製されるシグナルは、特定の細胞性経路の増加または減少をもたらす。例えば、エキソソーム（またはそれらの内容物／特徴）は、タンパク質および／または脂質のプロファイルを変化させることによって、細胞環境を改変することができ、これにより、順に、この環境における細胞挙動の改変をもたらすことができる。さらに、いくつかの実施形態において、エキソソームのｍｉＲＮＡは、レシピエント細胞において遺伝子発現を改変することができ、これにより、その遺伝子が関与する経路が改変され、その後、細胞環境がさらに改変され得る。いくつかの実施形態において、エキソソームの影響は、血管新生を直接または間接的に刺激する。いくつかの実施形態において、エキソソームの影響は、細胞複製に直接または間接的に影響を及ぼす。いくつかの実施形態において、エキソソームの影響は、細胞のアポトーシスを直接または間接的に阻害する。
【００１５】
エキソソーム（またはそれらの内容物）の有益な効果は、直接損傷または傷害を受けた細胞に対するものだけとは限らない。一部の実施形態において、例えば、開示された方法により影響を受ける損傷組織の細胞は、健康な細胞である。しかし、いくつかの実施形態において、開示された方法により影響を受ける損傷組織の細胞は、損傷細胞である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、再生は、組織の機能を改善するステップを含む。例えば、心臓組織が損傷されるある実施形態において、機能改善は、心拍出量、収縮性、心室機能の増加および／または不整脈の減少（数ある機能改善の中で）を含み得る。他の組織に関しては、機能改善、例えば、神経損傷の治療に応答した認知の強化、肺損傷の治療に応答した血液−酸素移行の改善、免疫学的関連組織損傷の治療に応答した免疫機能の改善は、同様に実現することができる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ断片は、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ２７−ａ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉｒ−１９ｂ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉｒ−２７ｂ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−１９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉｒ−２１０、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−２２、ｌｅｔ−７ｆ、ｍｉＲ−１４６ａおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、これらのｍｉＲＮＡの１、２、３またはそれ以上が、心臓組織の治療に使用される。一実施形態において、マイクロＲＮＡはｍｉＲ−１４６ａを含む。一実施形態において、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−２１０を含む。さらなる実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ９２ａ、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３４、ｍｉ−Ｒ３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３６３およびｍｉＲ−３０ｂならびにｍｉＲ−４９９の１以上を含む。いくつかの実施形態において、エキソソームは、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ９２ａ、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３４、ｍｉ−Ｒ３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３６３およびｍｉＲ−３０ｂまたはｍｉＲ−４９９のいずれも含有しない。いくつかの実施形態において、エキソソームは、組織機能の再生および／または改善をさらに容易にする少なくとも１つタンパク質をさらに含む。
【００１８】
投与は、実施形態に依存してさまざまな経路によって行うことができる。例えば、一部の実施形態において、送達は組織に局所的である。一部の実施形態において、送達は全身的である。一実施形態において、送達は心筋内経路によるものであり、一方他の実施形態において、送達は冠動脈内経路によるものである。ある実施形態において、プラスの効果が実現されるような速度の改善および／または治療期間の改善のために、送達経路の組み合わせも使用される。例えば、一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは標的組織に直接送達され、エキソソームは全身経路により送達される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本方法は、エキソソームが得られる再生細胞を個体に、エキソソームの投与前、投与と同時または投与後のいずれかで投与するステップをさらに含む。これらの細胞の投与は、同じ経路によっても、または別の経路によってもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態において、損傷または罹患した心臓組織の修復または再生のための組成物を提供し、該組成物は、心臓幹細胞の集団から単離された複数のエキソソームを含み、心臓幹細胞が心筋球由来細胞の集団を含み、エキソソームが少なくとも１つのマイクロＲＮＡを含み、マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２４、およびｍｉＲ−２６ａからなる群から選択され、損傷または罹患した心臓組織を有する対象に対する投与において、エキソソームが心臓細胞の生存能力、心臓細胞の増殖および心臓細胞の機能の１以上を増加させる。一実施形態において、組成物は、複数の心臓幹細胞をさらに含む。一実施形態において、エキソソームのｍｉＲＮＡペイロードは、ｍｉＲ−１４６ａを含む、それからなる、または本質的にそれからなる。一実施形態において、エキソソームのｍｉＲＮＡペイロードは、ｍｉＲ−２１０を含む、それからなる、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態において、損傷または罹患した心臓組織の治療のための、心筋球由来細胞の集団から単離された複数のエキソソームを含む組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態において、損傷または罹患した心臓組織の治療のための、複数のｍｉＲＮＡ、複数のエキソソームおよび／または複数の心筋球由来細胞を含む組成物の使用を提供する。
【００２１】
合成マイクロＲＮＡ−１４６ａおよび薬学的に許容されるキャリアを含む、損傷または罹患した心臓組織の修復または再生のための組成物もまた提供する。一実施形態において、合成ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１４６ａからなる、または本質的にそれからなる。一部の実施形態において、合成ｍｉＲＮＡは、合成ｍｉＲ２１０もまた含む。一実施形態において、合成ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２１０からなる、または本質的にそれからなる。一部の実施形態において、マイクロＲＮＡは直接投与され、一方、一部の実施形態において、マイクロＲＮＡは、（単離または合成的に作製された）エキソソームの送達により投与される。
【００２２】
いくつかの実施形態において、損傷組織の修復を必要とする対象を同定するステップ、および再生細胞に由来するエキソソームを含む組成物の対象への投与を指示して、それによって損傷組織の修復をもたらすステップを含む方法を提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、損傷組織の修復を必要とする対象を同定するステップ、および１以上のｍｉＲＮＡを含む組成物の対象への投与を指示して、それによって損傷組織の修復をもたらすステップを含む方法を提供する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、損傷組織の修復を必要とする対象を同定するステップ、および再生細胞由来のエキソソーム、ｍｉＲＮＡおよび再生細胞の１以上を含む組成物の対象への投与を指示して、それによって損傷組織の修復をもたらすステップを含む方法を提供する。
【００２５】
いくつかのこのような実施形態において、損傷組織の修復は、解剖学上の修復（例えば、組織再生）および機能的修復の両方を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、エキソソームを作製する方法を提供し、該方法は、ヒト非胚性再生細胞の集団を得るステップ、ヒト非胚性再生細胞の集団を培養するステップ、およびヒト非胚性再生細胞の培養集団をヒドロラーゼ酵素に曝露して、細胞のエキソソーム分泌を誘導し、それによってエキソソームを作製するステップを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、分泌されたエキソソームを回収するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、ヒドロラーゼは、酵素のＤＮＡｓｅ  Ｉスーパーファミリーのメンバーを含む。いくつかの実施形態において、ヒドロラーゼは、スフィンゴミエリナーゼ、例えば、リソソーム酸性スフィンゴミエリナーゼ、分泌型亜鉛依存性酸性スフィンゴミエリナーゼ、中性スフィンゴミエリナーゼおよびアルカリ性スフィンゴミエリナーゼからなる群から選択される型のスフィンゴミエリナーゼを含む。いくつかの実施形態において、中性スフィンゴミエリナーゼが使用される。一実施形態において、中性スフィンゴミエリナーゼは、マグネシウム依存性中性スフィンゴミエリナーゼおよびマグネシウム非依存性中性スフィンゴミエリナーゼの１以上を含む。さらなる実施形態において、中性スフィンゴミエリナーゼは、中性スフィンゴミエリナーゼＩ型、中性スフィンゴミエリナーゼ２型および中性スフィンゴミエリナーゼ３型の１以上を含む。上記のように、いくつかの実施形態において、エキソソームは、脂質二重層を作製するための確立された方法により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成的に製造される。このような実施形態において、合成エキソソームは有利にカスタマイズされ、特定の組織型および、場合により損傷の特定起源による損傷を再生することができる。
【００２７】
上で要約され、以下にさらに詳細に説明される方法は、施術者によりなされる特定の行動を記載するが、これらは、別の参加者によるそれらの行動の指示もまた含むことができることを理解すべきである。したがって、「エキソソームを投与するステップ」などの行動は、「エキソソームの投与を指示するステップ」を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、直接および間接的機序を含む、細胞および組織の再生のさまざまな要素の全体の概略図を表す。
【図２Ａ−２Ｄ】図２Ａ−２Ｄは、単離プロトコルの間のエキソソームの単離および細胞の特徴に関する情報を表す。図２Ａは、本明細書に開示のいくつかの実施形態に従った、培養細胞からのエキソソームの単離に関する概略図を表す。図２Ｂは、エキソソーム単離のための調製前の、無血清培養馴化におけるＣＤＣの生存を表す図である。図２Ｃおよび２Ｄは、（それぞれ）０日および１５日における、無血清馴化の下    で培養されたＣＤＣの明視野の顕微鏡画像を示す。
【図３Ａ−３Ｅ】図３Ａ−３Ｅは、エキソソームの特徴付けデータを表す。図３Ａは、細胞の上清およびエキソソーム分画のＲＮＡ含有量に関するデータを表す。図３Ｂは、図２Ａに要約した単離スキームから作製されたエキソソーム数に関するデータを示す。図３Ｃは、ＮＨＤＦおよびＣＤＣについてのさまざまな表面遺伝子の発現の差を示す。図３Ｄは、エキソソーム顕微鏡画像を示す。図３Ｅは、エキソソームの直径と比較した、エキソソームの頻度の分析を表す。
【図４】図４は、細胞増殖および細胞死に対するエキソソーム処理の効果の評価のための概略プロトコルを表す。
【図５Ａ−５Ｄ】図５Ａ−５Ｄは、細胞死および細胞増殖に対するエキソソーム処理の効果に関するデータを表す。図５Ａは、さまざまな供給源由来のエキソソームと一緒にインキュベーション後の、細胞のアポトーシスに関するデータを示す。図５Ｂは、さまざまな供給源由来のエキソソームと一緒にインキュベーション後の、細胞の増殖活性に関するデータを示す。図５Ｃは、さまざまなエキソソーム組成物に曝露後の、細胞のアポトーシスを表す免疫蛍光ＴＵＮＥＬ染色を示す。図５Ｄは、さまざまなエキソソーム組成物に曝露後の、細胞の増殖活性を表す免疫蛍光Ｋｉ−６７染色を示す。
【図６】図６は、血管新生に対するエキソソーム処理の効果を評価するための概略プロトコルを表す。
【図７】図７は、内皮細胞をさまざまな培地およびエキソソーム調製物により処理後の、血管新生に関する要約データを表す。
【図８Ａ−８Ｅ】図８Ａ−８Ｅは、血管形成アッセイによる血管新生の結果の顕微鏡写真を表す。
【図９】図９は、心筋梗塞に供され、さまざまなエキソソーム調製物により処置されたマウスの生存に関するデータを表す。
【図１０】図１０は、心筋梗塞およびエキソソーム調製物により処置された後の心機能データを表す。
【図１１Ａ−１１Ｃ】図１１Ａ−１１Ｃは、心筋梗塞およびエキソソーム調製物による処置後の心エコー図検査（ＥＣＨＯ）データを表す。
【図１２Ａ−１２Ｈ】図１２Ａ−１２Ｈは、エキソソーム投与後の心臓組織における解剖学的改善に関するデータを表す。図１２Ａ−１２Ｄは、心筋梗塞およびさまざまな細胞供給源由来のエキソソーム調製物による処置後の、マッソントリクローム染色データを表す。組織生存能力瘢痕量、生存心筋量および壁厚に関する要約データを、それぞれ図１２Ｅ−１２Ｈに示す。
【図１３】図１３は、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）に由来するエキソソームによる処置後の、炎症マーカーの心筋レベルの減少に関するデータを表す図である。
【図１４Ａ−１４Ｃ】図１４Ａ−１４Ｃは、エキソソーム分泌の機序に関するデータを表す。図１４Ａは、中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤（ＧＷ４８６９）によるＣＤＣ由来エキソソームの分泌の阻害に関する、用量応答データを表す。図１４Ｂは、エキソソーム分泌の阻害に応答した、細胞の生存能力を示す。図１４Ｃは、対照細胞または中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤（ＧＷ４８６９）により処理された細胞に由来するエキソソームの投与後の、心機能のデータを要約したものである。
【図１５Ａ−１５Ｂ】図１５Ａ−１５Ｂは、中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤（ＧＷ４８６９）により処理された細胞または対照細胞（ＣＤＣ）に由来するエキソソームの投与後の、ＥＣＨＯデータを表す。
【図１６Ａ−１６Ｂ】図１６Ａ−１６Ｂは、中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤（ＧＷ４８６９）により処理された細胞または対照細胞（ＣＤＣ）に由来するエキソソームにより処置された心臓組織のマッソントリクローム染色を表す。
【図１７Ａ−１７Ｄ】図１７Ａ−１７Ｄは、動物を、中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤（ＧＷ４８６９）により処理された細胞または対照細胞（ＣＤＣ）に由来するエキソソームにより処置した後の、生存組織の量（リスク領域中、１７Ａ）、瘢痕量（１７Ｂ）、全生存心筋量（１７Ｃ）または梗塞の厚さ（１７Ｄ）に関するデータを表す。
【図１８Ａ−１８Ｂ】図１８Ａ−１８Ｂは、対照細胞（正常なヒト皮膚線維芽細胞：ＮＨＤＦ）と比較した、ＣＤＣから単離されたエキソソーム由来のｍｉＲＮＡ発現のプロファイリングを表す。図１８Ａは、ＮＨＤＦ細胞と比較した、ＣＤＣ由来エキソソーム中の選択されたｍｉＲＮＡの相対的発現を表す。図１８Ｂは、ＮＨＤＦおよびＣＤＣにおいて同等に発現したｍｉＲＮＡ、有意に上方制御されたｍｉＲＮＡ、および有意に下方制御されたｍｉＲＮＡの一覧表を示す。
【図１９】図１９は、ｍｉｌ４６ａの投与の効果を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究の概略を表す。
【図２０Ａ−２０Ｄ】図２０Ａ−２０Ｄは、細胞を、ｍｉｌ４６ａまたは対照ｍｉＲＮＡのいずれかにより処理した後の細胞の生存能力および死に関するデータを表す。図２０Ａは、ＮＲＶＭにｍｉＲ１４６ａをトランスフェクトした６時間後の細胞の生存能力を評価するためのカルセイン染色の結果を表す。図２０Ｂは、ＮＲＶＭにｍｉＲ１４６ａをトランスフェクトした１２時間後の細胞の生存能力を評価するためのＥＴＨＤ−１染色の結果を表す図である。図２０Ｃは、過酸化水素に曝露されたＮＲＶＭに対する、ｍｉＲ１４６ａの保護効果を示すデータを表す。図２０Ｄは、塩化コバルトに曝露されたＮＲＶＭに対する、ｍｉＲ１４６ａの保護効果を示すデータを表す。
【図２１Ａ−２１Ｇ】図２１Ａ−２１Ｇは、ｍｉＲ１４６ａの再生能力を示すｉｎ  ｖｉｖｏデータに関する。図２１Ａは２つの梗塞心臓を示し、一方、２１Ｂは対照の模倣ｍｉＲＮＡにより処理された心臓のマッソントリクロームを示し、２１ＣはｍｉＲ１４６ａにより処理された心臓のマッソントリクロームを示す。図２１Ｄは、ＭＩ後３０日にわたる対照および処置されたマウスの駆出率を示す。図２１Ｅ、２１Ｆ、および２１Ｇは、ｍｉＲ１４６ａまたは対照模倣ｍｉＲにより処置された動物由来の心臓の、（それぞれ）全生存組織量、瘢痕量および壁厚を示す。
【図２２】図２２は、ｍｉＲ１４６ａをトランスフェクトされた培養心筋細胞中の公知の炎症性分子に関する発現データを示す。
【図２３】図２３は、過酸化水素に曝露後、ｍｉＲ２１０をトランスフェクトされた培養心筋細胞の細胞生存能力に関するデータを示す。
【発明の詳細な説明】
【００２９】
本明細書に開示の方法および組成物のいくつかの実施形態は、疾患（複数可）により損傷される、または有害な影響を受ける組織の治療に有用である。疾患の圧倒的多数は、細胞または組織の機能を、（たとえ急性であっても）少なくともいくらか傷つける。本明細書に開示の方法および組成物のいくつかの実施形態は、損傷された、それらの機能を制限された、または疾患の結果としてそれ以外の形で傷つけられた、細胞および／または組織の修復および／または再生を可能にする。いくつかの実施形態において、本明細書に開示の方法および組成物は、補助療法として使用して、細胞または組織に負の影響を与える疾患治療の有害な副作用を改善することもできる。
【００３０】
損傷または罹患した組織のための治療法
概して、１以上の比較的一般的な治療法の使用は、疾患の進行を止めるための試みにおける、損傷または罹患した組織の治療、すでに起きた損傷の逆行、さらなる損傷の予防および患者の健康状態の全体としての改善のために使用される。例えば、多数の病態は、総合的な方法論またはライフスタイルの変更（例えば、心血管疾患、糖尿病などのリスクを減少させるための食事の改善）により容易に治療可能である。多くの場合、より重度の病態は、より進んだ医療的介入を必要とする。薬剤療法または薬学的療法は、特定の疾患を患う患者を治療するために、日常的に施される。例えば、高血圧を患う患者は、血管の圧力および血液量を低下させ、それによって高血圧を治療するために、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤の処方が可能である。さらに、癌患者は、多くの場合、癌性腫瘍の広がりを制限する、および／または癌性腫瘍を根絶するための試みにおいて、さまざまな抗癌化合物のパネルを処方される。外科的方法もまた、特定の疾患または傷害を治療するために用いることができる。場合により、埋め込み装置が、薬学的または外科的療法に加えて、またはそれらの代わりに使用される（例えば、心臓ペースメーカー）。近年では、追加の療法タイプ、例えば、遺伝子療法、タンパク質療法および細胞療法などが、非常に前途有望になってきている。
【００３１】
細胞療法は、一般的に言って、細胞集団の対象への投与を伴い、投与された細胞が、傷害、疾患またはこれらの組み合わせのいずれかにより損傷された細胞に、機能的または物理的に取って代わることが意図される。さまざまな異なる細胞型を、細胞療法において投与することができ、（ある場合において）幹細胞が特に好ましく、それは、複数の細胞型に分化するそれらの能力のため、したがって、それらを使用して治療できる疾患または傷害に対する柔軟性を提供するためである。
【００３２】
タンパク質療法は、外来性タンパク質の投与を伴い、この外来性タンパク質は、疾患または傷害を患う対象において不足したタンパク質に機能的に取って代わる。例えば、合成の酸性アルファ−グルコシダーゼが、ＩＩ型糖原病を患う患者に投与される。
【００３３】
加えて、核酸療法が、特定の疾患または病態の治療候補として調査されている。核酸療法は、外来性核酸またはこれらの短い断片の対象への投与を伴い、これは、遺伝子発現経路をさまざまな機序、例えば、標的遺伝子産物が発現しないような、標的遺伝子の翻訳抑制、標的遺伝子の切断を介して改変するためである。
【００３４】
特定の細胞療法が、意味深い再生効果を提供することは分かっているが、本明細書に開示のいくつかの実施形態は、（ある実施形態において、場合により細胞を投与することもあるが、）細胞を対象に投与する必要なくそれらの再生効果を生み出す方法および組成物を伴う。
【００３５】
エキソソームおよび小胞結合核酸およびタンパク質産物
核酸はヌクレアーゼにより急速に分解されるので、核酸は、一般的に体内では遊離の核酸としては存在しない。ある型の核酸は、膜結合粒子を伴う。このような膜結合粒子は、大部分の細胞型から脱落し、細胞膜の断片から成り、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびタンパク質を含有する。これらの粒子は多くの場合、それらが脱落された細胞の組成を反映する。エキソソームはこのような膜結合粒子の１つのタイプであり、通常、直径約１５ｎｍから約９５ｎｍの直径範囲であり、この直径範囲は、約１５ｎｍから約２０ｎｍ、２０ｎｍから約３０ｎｍ、約３０ｎｍから約４０ｎｍ、約４０ｎｍから約５０ｎｍ、約５０ｎｍから約６０ｎｍ、約６０ｎｍから約７０ｎｍ、約７０ｎｍから約８０ｎｍ、約８０ｎｍから約９０ｎｍ、約９０ｎｍから約９５ｎｍおよびこれらの重複範囲を含む。いくつかの実施形態において、エキソソームはより大きい（例えば、約１４０から約２１０ｎｍの範囲であり、この範囲は、約１４０ｎｍから約１５０ｎｍ、１５０ｎｍから約１６０ｎｍ、１６０ｎｍから約１７０ｎｍ、１７０ｎｍから約１８０ｎｍ、１８０ｎｍから約１９０ｎｍ、１９０ｎｍから約２００ｎｍ、２００ｎｍから約２１０ｎｍおよびこれらの重複範囲を含む）。一部の実施形態において、もともとの細胞体から生み出されるエキソソームは、少なくとも１つの次元（例えば直径）において、元々の細胞体の１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、５０００、１０，０００分の１である。
【００３６】
エキソソームを指す代替の名称もよく使用される。したがって、本明細書において使用する場合、「エキソソーム」という用語は、その普通の意味を示し、微小胞、エピジモソーム（ｅｐｉｄｉｄｉｍｏｓｏｍｅｓ）、アルゴソーム（ａｒｇｏｓｏｍｅｓ）、エキソソーム様小胞、微小粒子、ｐｒｏｍｉｎｉｎｏｓｏｍｅｓ、プロスタソーム（ｐｒｏｓｔａｓｏｍｅｓ）、デキソソーム、テキソソーム、ｄｅｘ、ｔｅｘ、ａｒｃｈｅｏｓｏｍｅｓおよびオンコソーム（ｏｎｃｏｓｏｍｅｓ）等の用語も含み得る。エキソソームは広範囲の哺乳動物細胞により分泌され、正常および病的な状態の両方において分泌される。エキソソームは、一部の実施形態において、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは他の内容物を第１の細胞から別の細胞（または複数の細胞）に運ぶことによって、細胞内メッセンジャーとして機能する。いくつかの実施形態において、エキソソームは、血液凝固、免疫調節、代謝制御、細胞分裂および他の細胞過程に関係する。エキソソームを分泌する多種多様な細胞のため、いくつかの実施形態において、エキソソーム調製物は診断ツールとして使用することができる（例えば、エキソソームは、特定の組織から単離することができ、それらの核酸またはタンパク質内容物を評価することができ、それによりその後、疾患状態または疾患発症のリスクと相関させることができる）。
【００３７】
エキソソームは、いくつかの実施形態において、細胞調製物からろ過、遠心分離、抗原に基づく捕捉などの１以上を含む方法により単離される。例えば、いくつかの実施形態において、培養液中で成長させた細胞の集団が収集されプールされる。いくつかの実施形態において、単分子層の細胞が使用され、この場合、細胞は場合によりプールの前に処理され、細胞の収率が改善される（例えば、皿を掻き取る、および／またはトリプシンなどの酵素により酵素的に処理され、細胞を遊離させる）。いくつかの実施形態において、懸濁液中で成長させた細胞が使用される。その後、エキソソーム分画を残りの細胞内容物および細胞の集団由来の残屑から分離するために、プールされた集団は１回以上の遠心分離（いくつかの実施形態において、超遠心分離および／または密度遠心分離が用いられる）に供される。一部の実施形態において、遠心分離の実施はエキソソームの回収のために必要とは限らない。いくつかの実施形態において、細胞の予備処理が、エキソソーム捕捉の効率を改善するために使用される。例えば、いくつかの実施形態において、細胞からのエキソソーム分泌速度を上昇させる薬剤が、エキソソームの全体収率を改善するために使用される。一部の実施形態において、エキソソーム分泌の増大は実施されない。一部の実施形態において、エキソソームの特定のサイズ（例えば、直径）を収集するために、サイズ排除ろ過が、遠心分離と併せて、またはそのかわりに使用される。いくつかの実施形態において、ろ過は必ずしも使用されない。さらに追加の実施形態において、エキソソーム（またはエキソソームの亜集団は、エキソソーム上またはその中の特有のマーカー（例えば、膜貫通タンパク質）の選択的同定により捕捉される）。このような実施形態において、特有のマーカーは、特定のエキソソーム集団を選択的に濃縮するために使用することができる。一部の実施形態において、エキソソームの特定のマーカーまたは特徴に基づく濃縮、選択またはろ過は、実施されない。
【００３８】
投与（下記でより詳細に述べる）において、エキソソームは、標的組織の細胞と融合することができる。本明細書において使用する場合、「融合」という用語はその普通の意味を示し、エキソソームと標的細胞との完全または部分的な接合、合併、統合または同化を指すものである。いくつかの実施形態において、エキソソームは標的組織の健康な細胞と融合する。一部の実施形態において、健康な細胞との融合は健康な細胞に改変（例えば、損傷または罹患した細胞の周りの細胞または細胞間環境における改変）をもたらし、この改変により損傷または罹患した細胞に対する有利な効果がもたらされる。一部の実施形態において、エキソソームは損傷または罹患した細胞と融合する。一部のこのような実施形態において、損傷または罹患した細胞の活性、代謝、生存能力または機能に対する直接の効果が存在し、組織に対して全体的な有利な効果をもたらす。いくつかの実施形態において、エキソソームと、健康もしくは損傷した細胞との融合は、全体として、組織に対する有益な効果に必ずしも必要ではない（例えば、一部の実施形態において、エキソソームは、標的組織の細胞の周りの細胞間環境に影響を与える。）。したがって、いくつかの実施形態において、エキソソームと別の細胞との融合は起こらない。いくつかの実施形態において、細胞−エキソソームの接触がなくても、なおエキソソームはレシピエント細胞に影響を与える。
【００３９】
投与および療法
本明細書において、細胞または組織が傷害、損傷、疾患あるいは機能および／または生存能力の喪失につながるいくつかの他の事象を受けた後で、細胞または組織の修復または再生に使用するための方法および組成物を提供する。組織の損傷が存在するかどうかに関わらず、損傷の予防および／または細胞間の核酸（またはタンパク質）の往復のための方法および組成物もまた提供する。
【００４０】
加えて、エキソソームの作製を容易にする方法を提供する。いくつかのこのような実施形態において、ヒドロラーゼを使用して、細胞からのエキソソームの遊離（例えば分泌）を容易にする。ある実施形態において、エステル結合、糖（例えば、ＤＮＡ）、エーテル結合、ペプチド結合、炭素−窒素結合、酸無水物（ａｃｉｄ  ａｎｈｙｒｉｄｅｓ）、炭素−炭素結合、ハロゲン化物結合、リン−窒素結合、イオウ（ｓｕｌｐｈｅｒ）−窒素結合、炭素−リン結合、イオウ−イオウ結合および／または炭素−イオウ結合の１つ以上を切断するヒドロラーゼが使用される。一部の実施形態において、ヒドロラーゼはＤＮＡｓｅ（例えば、糖を切断する）である。ある実施形態では、特異的ヒドロラーゼ、例えば、リソソーム酸性スフィンゴミエリナーゼ、分泌型亜鉛依存性酸性スフィンゴミエリナーゼ、中性スフィンゴミエリナーゼおよびアルカリ性スフィンゴミエリナーゼの１つ以上が用いられる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、エキソソームは、細胞または組織の修復または再生を開始するために、対象に投与される。いくつかの実施形態において、エキソソームは幹細胞由来である。いくつかの実施形態において、幹細胞は非胚性幹細胞である。一部の実施形態において、非胚性幹細胞は成人幹細胞である。しかし、ある実施形態において、胚性幹細胞は、場合によりエキソソームの供給源として使用される。一部の実施形態において、体細胞がエキソソームの供給源として使用される。さらに追加の実施形態において、生殖細胞がエキソソームの供給源として使用される。
【００４２】
エキソソーム供給源として幹細胞を用いるいくつかの実施形態において、幹細胞由来エキソソームの核酸および／またはタンパク質内容物は、損傷または罹患した細胞の修復または再生をもたらすために特に適している。いくつかの実施形態において、エキソソームは、治療されるべき組織に由来する幹細胞から単離される。例えば、一部の実施形態において、心臓組織が修復されるべきである場合、エキソソームは心臓幹細胞に由来する。心臓幹細胞は、いくつかの実施形態において、心臓のさまざまな領域から得られ、限定するものではないが該領域は、心房、中隔、心室、心耳およびこれらの組み合わせを含む（例えば、一部の実施形態において心臓の部分または全体が、心臓幹細胞を得るために使用され得る）。いくつかの実施形態において、エキソソームは、心臓幹細胞を含む、または培養操作を行って心臓幹細胞を生じさせることが可能な細胞（または細胞の群）（例えば心筋球および／または心筋球由来細胞（ＣＤＣ））に由来する。心筋球の単離に関するさらなる情報は、米国特許第８，２６８，６１９号、２０１２年９月１８日発行に見出すことができ、当該特許は参照により本明細書にその全体が組み込まれる。いくつかの実施形態において、心臓幹細胞は心筋球由来細胞（ＣＤＣ）である。ＣＤＣ単離の方法に関するさらなる情報は、米国特許出願第１１／６６６，６８５号、２００８年４月２１日出願および米国特許出願第１３／４１２，０５１号、２０１２年３月５日出願に見出すことができ、当該出願は両方とも、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。幹細胞の他の型もまた、実施形態に依存して使用でき、限定するものではないが、これらは、骨髄幹細胞、幹細胞由来脂肪組織、間葉幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞およびニューロン幹細胞を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態において、エキソソームの投与は、レシピエントによる免疫拒絶による合併症が減少するので、特に有利である。特定の型の細胞または遺伝子療法は、療法のレシピエントの免疫応答の可能性により阻止される。臓器移植または組織移植と同様に、特定の型の異質細胞（例えば、レシピエント由来でない）は、レシピエントの免疫機能により攻撃および除去される（または部分的もしくは完全に非機能性にされる）。これを克服するための１つの取り組みは免疫抑制療法の同時投与であるが、これは費用が掛かり、患者が他の感染因子にさらされることにつながり得る。したがって、エキソソーム療法は、免疫応答が限定されるので、特に有益である。いくつかの実施形態において、このことが、（いくつかの実施形態において、自己由来供給源が使用されることもあるが）同種異系細胞供給源に由来するエキソソームの使用を可能にする。さらに、免疫応答の可能性の低下は、エキソソーム療法をより広い患者集団に用いることを可能にし、この患者集団は、免疫無防備状態の患者および活動亢進性の免疫系を有する患者を含む。さらに、いくつかの実施形態において、エキソソームは遺伝物質のすべての補体を運ぶわけではないので、投与後の望まない細胞成長（例えば、奇形種の形成）のリスクが低下する。有利なことには、実施形態に依存して、エキソソームは、エキソソームの最終的なレシピエントに対して同種異系、自己由来、異種または同系である供給源から得られた細胞に由来することができる。さらに、特定のｍｉＲＮＡおよび／またはタンパク質のエキソソームの発現に関して特徴付けられているエキソソームのマスターバンクが作製でき、定義された対象においてオフザシェルフでその後使用するために長期保存可能である。しかし、いくつかの実施形態において、エキソソームは単離され、その後、長期または短期の保存をすることなく使用される（例えば、エキソソームは、それらの作製後、実行可能な限り早く使用される）。
【００４４】
いくつかの実施形態において、エキソソームが投与される必要はなく、むしろ、エキソソームにより運ばれる核酸および／またはタンパク質を、組織の修復を必要とする対象に投与してもよい。このような実施形態において、エキソソームは、本明細書に記載のように回収され、それらのタンパク質および／または核酸内容物の遊離および収集の方法に供される。例えば、いくつかの実施形態において、エキソソーム膜を崩壊し、エキソソームからタンパク質の収集を可能にするために、エキソソームは洗浄剤（または非洗浄剤）系溶液により溶解される。上記のように、特定の方法を、その後場合により用いて、特に所望のタンパク質を同定および選択することができる。いくつかの実施形態において、核酸は、エキソソームのカオトロピック崩壊およびその後の核酸の単離を使用して単離される。核酸単離のための他の確立された方法もまた、カオトロピック崩壊に加えて、またはその代わりに使用することができる。単離される核酸としては、限定するものではないが、ＤＮＡ、ＤＮＡ断片およびＤＮＡプラスミド、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ，制御ＲＮＡ、非コードおよびコードＲＮＡなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡが単離される場合、ＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲに基づく（または他の増幅）方法において鋳型として使用でき、対象のＲＮＡの多数のコピーを（ＤＮＡ形態で）作製できる。このような場合、特定のＲＮＡまたは断片は特定の対象によるものでなければならず、エキソソームの単離およびＲＮＡの調製は、場合により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成およびその所望の配列の同時投与により補完されてよい。
【００４５】
いくつかの実施形態において、細胞由来のエキソソームは、１以上の追加の薬剤と組み合わせて投与される。例えば、いくつかの実施形態において、エキソソームは、（例えば、エキソソーム内容物を補うために）エキソソーム由来の１以上のタンパク質または核酸と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、エキソソームが単離される細胞は、エキソソームと併せて投与される。いくつかの実施形態において、このような取り組みは、緊急およびより長期間のエキソソーム送達を有利に提供する。（例えば、実際のエキソソーム送達に基づき緊急に、および細胞送達に基づき長期間、送達後細胞はエキソソームを分泌し続ける）。
【００４６】
いくつかの実施形態において、エキソソームは、より伝統的な療法、例えば外科的療法または薬学的療法と併せて送達される。いくつかの実施形態において、取り組みのこのような組み合わせは、標的組織の生存能力および／または機能において相乗的改善をもたらす。一部の実施形態において、エキソソームは、遺伝子療法ベクター（複数可）、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡとして使用される核酸またはＲＮＡ干渉を達成する核酸）、および／または他の細胞型に由来するエキソソームの組み合わせと併せて送達することができる。
【００４７】
本明細書に開示の組成物は、実施形態に依存し多くの経路のうちの１つにより投与することができる。例えば、エキソソーム投与は、局所または全身的な投与であってよい。局所投与は、治療されるべき組織に依存して、一部の実施形態において、組織への直接投与（例えば、心筋内注入などの直接注入）により達成され得る。局所投与はまた、例えば特定組織の洗浄（例えば腸内または腹膜洗浄）により達成することができる。いくつかの実施形態において、全身投与が使用され、例えば、静脈内および／または動脈内送達により達成することができる。ある実施形態において、冠動脈内送達が使用される。いくつかの実施形態において、エキソソームは、損傷または罹患した組織を特異的に標的とする。一部のこのような実施形態において、エキソソームは（例えば、遺伝的またはその他で）修飾され、特異的標的部位に指向される。例えば、修飾は、一部の実施形態において、エキソソームに対する特異的細胞表面マーカーの発現の誘導を含むことがあり、これは所望の標的組織の受容体との特異的な相互作用をもたらす。一実施形態において、エキソソームの本来の内容物は除去され、所望の外来性タンパク質または核酸と置き換えられる。一実施形態において、エキソソームの本来の内容物は、所望の外来性タンパク質または核酸により補完される。しかし、一部の実施形態において、エキソソームの標的化は実施されない。いくつかの実施形態において、エキソソームは、特異的な核酸またはタンパク質を発現するように修飾され、これは、とりわけ標的化、精製、追跡などのために使用することができる。しかし、いくつかの実施形態において、エキソソームの修飾は実施されない。一部の実施形態において、エキソソームはキメラ分子を含まない。
【００４８】
一部の実施形態において、皮下または経皮送達方法が使用される。相対的に小さいサイズのため、エキソソームは血管を通過して、微細血管まで下り、それによって組織内への有意な貫通を可能にするので、エキソソームは特定の型の療法にとって特に有利である。一部の実施形態において、これは、損傷または罹患した組織の中心部分（例えば、腫瘍または梗塞した心臓組織エリアの中心部分）へのエキソソームの直接送達を可能にする。加えて、いくつかの実施形態において、エキソソームはそれらのペイロード（例えば、常在核酸および／またはタンパク質）を、血液脳関門を越えて送達でき、血液脳関門は、多くの中枢神経系療法に対する障害を歴史的に提示してきたので、エキソソームの使用は特に有利である。しかし、ある実施形態において、エキソソームは、血管脳関門を通す注入により中枢神経系に送達することができる。いくつかの実施形態において、エキソソームは
投与のためのより低いプロファイルの送達装置（例えば、より小さいサイズのカテーテルおよび／または針）を可能にするので、エキソソームは、投与にとって特に有益である。いくつかの実施形態において、より小さいサイズのエキソソームは、脈管構造のより小さい、および／またはより回旋した部分を通るそれらの移行を可能にし、順にエキソソームは、最も標的とする組織のより大きな部分に送達され得る。
【００４９】
投与されるエキソソームの用量は、実施形態に依存して、約１．０×１０5から約１．０×１０9エキソソームの範囲であり、該範囲は約１．０×１０5から約１．０×１０6、約１．０×１０6から約１．０×１０7、約１．０×１０7から約５．０×１０7、約５．０×１０7から約１．０×１０8、約１．０×１０8から約２．０×１０8、約２．０×１０8から約３．５×１０8、約３．５×１０8から約５．０×１０8、約５．０×１０8から約７．５×１０8、約７．５×１０8から約１．０×１０9、およびこれらの重複範囲を含む。ある実施形態において、エキソソーム用量は、キログラム当たりに基づいて、例えば、約１．０×１０5エキソソーム／ｋｇから約１．０×１０9エキソソーム／ｋｇで投与される。さらなる実施形態において、エキソソームは、標的組織の質量に基づいた量、例えば、約１．０×１０5エキソソーム／グラム標的組織から約１．０×１０9エキソソーム／グラム標的組織で送達される。いくつかの実施形態において、エキソソームは、特定の標的組織中のエキソソーム数細胞数の比に基づいて投与され、例えば、エキソソーム：標的細胞の比は約１０9：１から約１：１の範囲におよび、該範囲は、約１０8：１、約１０7：１、約１０6：１、約１０5：１、約１０4：１、約１０3：１、約１０2：１、約１０：１およびこれらの比の間の比を含む。さらなる実施形態において、エキソソームは、標的組織中の細胞数より約１０倍の量から約１，０００，０００倍多い量で投与され、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１０００倍、約１０，０００倍、約１００，０００倍、約５００，０００倍、約７５０，０００倍およびこれらの量の間の量を含む。エキソソームが同時療法（例えば、エキソソームがさらに脱落可能な細胞、薬学療法、核酸療法など）と併せて投与される場合、投与されるエキソソームの用量は、それに応じて調整されてよい（例えば、必要に応じて増加または減少して、所望の治療効果を達成する）。
【００５０】
いくつかの実施形態において、エキソソームは、単回のボーラス用量で送達される。しかし、一部の実施形態において、複数回用量のエキソソームが送達されてもよい。ある実施形態において、エキソソームは、時間と共に指定された速度で注入（またはそうでなければ送達）可能である。いくつかの実施形態において、エキソソームが、有害事象（例えば、傷害または損傷する事象、あるいはＭＩなどの有害な生理的事象）の後、比較的短い時間枠内で投与される場合、それらの投与は、標的組織の損傷の発生または進行を予防する。例えば、エキソソームが、有害事象後約２０から約３０分以内、約３０から約４０分以内、約４０から約５０分以内、約５０から約６０分以内に投与される場合、組織に対する損傷または有害な影響は、（このような早期の時点で治療されなかった組織と比較して）減少される。一部の実施形態において、投与は、有害事象の後可能な限り早い。一部の実施形態において、投与は、有害事象の後実施可能な（例えば、対象が他の点では一度安定した）限り早い。いくつかの実施形態において、投与は、約１から約２時間以内、約２から約３時間以内、約３から約４時間以内、約４から約５時間以内、約５から約６時間以内、約６から約８時間以内、約８から約１０時間以内、約１０から約１２時間以内、およびこれらの重複範囲以内である。あるさらなる実施形態において、有害事象の長時間後の時点で行われた投与は、組織への損傷の予防に有効である。
【００５１】
上記のように、エキソソームは、少なくともある程度、ある細胞療法の結果として見られる間接的組織再生効果の一部を提供する。したがって、一部の実施形態において、（単独または核酸などの補助物質と組み合わせた）エキソソームの送達は、組織の修復促進、機能改善、生存能力増加またはこれらの組み合わせとして働く、特定の効果（例えば、パラクリン効果）を提供する。一部の実施形態において、送達されるエキソソームのタンパ
ク質内容物は、標的組織の修復または再生の少なくとも一部を担っている。例えば、エキソソームにより送達されるタンパク質は、標的組織中の損傷、切断、突然変異またはそうでなければ不適切に機能性もしくは非機能性のタンパク質に取って代わって機能することができる。一部の実施形態において、エキソソームにより送達されるタンパク質は、組織の修復または再生をもたらすシグナル伝達カスケードを開始する。いくつかの実施形態において、エキソソームによるｍｉＲＮＡの送達は、損傷組織の修復および／または再生の全部または一部を担っている。上記のように、ｍｉＲＮＡの送達は、特定のメッセンジャーＲＮＡ（例えば、プログラムされた細胞死に関与するメッセンジャーＲＮＡ）の翻訳を抑制するように動作することができ、またはメッセンジャーＲＮＡの切断をもたらし得る。いずれの場合も、および一部の実施形態において、組み合わせて、これらの効果は、標的組織において細胞シグナル伝達経路を改変し、本明細書において開示のデータにより実証されるように、細胞の生存能力の改善、細胞複製の増加、有益な解剖学上の効果および／または細胞機能の改善をもたらすことができ、これらはそれぞれ、順に、損傷または罹患した組織の修復、再生および／または機能改善に全体として寄与する。
【００５２】
損傷または疾患の原因
本明細書に開示の方法および組成物は、広範囲のタイプの損傷または疾患により影響を受けた細胞または組織の修復または再生に使用できる。本明細書に開示の組成物および方法は、遺伝による疾患、細胞または身体の機能障害の治療、正常もしくは異常な細胞の老化との戦い、耐性の誘導、免疫機能の調節に使用できる。さらに、細胞または組織は、外傷、例えば、鈍的衝撃、裂傷、血流の喪失などにより損傷され得る。細胞または組織は、副次的効果、例えば傷害後の炎症、感染症、（例えば、傷害または外傷の結果として遊離したプロテアーゼによる）自己消化によりさらに損傷され得る。本明細書に開示の方法および組成物はまた、ある実施形態において、急性事象の治療にも使用でき、該急性事象は、限定するものではないが、心筋梗塞、脊髄傷害、脳卒中および外傷性脳傷害を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示の方法および組成物は、慢性疾患の治療に使用でき、該慢性疾患は、限定するものではないが、神経学的障害または神経変性障害（例えば、多発性硬化症、筋委縮性側索硬化症、熱中症、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、ドーパミン作動系障害（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、ＡＩＤＳなどの他の原因によりもたらされる痴呆、局所脳虚血を含む脳虚血、身体外傷、例えば、脳、脊髄、神経または網膜の挫滅または圧迫傷害を含む、ＣＮＳにおける挫滅または圧迫傷害、ならびに神経変性を生み出す任意の他の急性の傷害または損傷）、免疫不全、（例えば、骨髄の除去または移植の後の）骨髄の再増殖の促進、関節炎、自己免疫障害、炎症性腸疾患、癌、糖尿病、筋力低下（例えば、筋ジストロフィー、筋委縮性側索硬化症など）、進行性失明（例えば、黄斑変性）および進行性聴力喪失を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態において、エキソソームは、さまざまな癌性標的組織を治療するために投与でき、該癌性組織は、限定するものではないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、カポシ肉腫、リンパ腫、胃腸癌、虫垂癌、中枢神経系癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、（限定するものではないが、星状細胞腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽種、髄上皮腫を含む、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、子宮頸癌、結腸癌、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性疾患、腺管癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫有毛細胞白血病、腎細胞癌、白血病、口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、眼癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、下垂体癌、子宮癌および膣癌の１以上により影響を受ける組織を含む。
【００５４】
または、いくつかの実施形態において、エキソソームは、感染した標的組織、例えば、１以上の細菌、ウイルス、真菌および／または寄生生物に感染した標的組織に送達される
一部の実施形態において、エキソソームは、細菌起源の感染症を有する組織を治療するために使用される（例えば、感染性細菌は、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）およびクラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リッケチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）およびエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ならびにこれらの突然変異または組み合わせからなる属の群から選択される）。いくつかの実施形態において、エキソソームは、１以上の細菌機能を阻害または予防し、それによって、感染症の重症度および／または期間を減少させる。いくつかの実施形態において、エキソソームの投与は、細菌（または他の病原体）を補助療法（例えば抗生物質）に感作させる。
【００５５】
一部の実施形態において感染症はウイルス起源であり、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、サイトメガロウイルス、エボラウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器系発疹ウイルス、風疹ウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスからなる群から選択される１以上のウイルスの結果である。エキソソームは、同様に広範囲の細胞型を治療するために使用でき、該細胞型は、限定するものではないが、血管細胞、上皮細胞、間質細胞、筋系（骨格筋、平滑筋および／また心筋）、骨格細胞（例えば、骨、軟骨および結合組織）、神経細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、シュワン細胞）、肝細胞、腎細胞、腸細胞、肺細胞、皮膚細胞または体内の任意の他の細胞を含む。
【００５６】
治療組成物
いくつかの実施形態において、損傷または疾患により有害な影響を受けた組織の修復または再生に使用するための、エキソソームを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、エキソソームを含む、それからなる、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態において、エキソソームは、核酸、タンパク質またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、エキソソーム内の核酸は、（ある実施形態はＤＮＡを含むエキソソームを伴ったが）ＲＮＡの１以上の型を含む。ＲＮＡは、いくつかの実施形態において、メッセンジャーＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびこれらの組み合わせの１以上を含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ２７−ａ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉｒ−１９ｂ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉｒ−２７ｂ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−１９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉｒ−２１０、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−２２、ｌｅｔ−７ｆ、ｍｉＲ−１４６ａおよびこれらの組み合わせの１以上を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、合成マイクロＲＮＡおよび薬学的に許容されるキャリアを含む、それからなる、または本質的にそれからなる。いくつかのこのような実施形態において、合成マイクロＲＮＡはｍｉＲ１４６ａを含む。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（例えば、成熟していない）であるが、一方で、一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは成熟しており、さらに追加の実施形態において、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと成熟ｍｉＲＮＡの組み合わせが使用される。
【００５７】
いくつかの実施形態において、組成物は、細胞の集団に由来するエキソソームならびに集団由来の１以上の細胞（例えば、エキソソームと、それらの「親細胞」との組み合わせ）を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、さまざまな細胞型に由来する複数のエキソソーム（例えば、第１及び第２の型の「親細胞」に由来するエキソソームの集団）を含む。上記のように、いくつかの実施形態において、本明細書に開示の組成物は、単独で、または１以上の補助の治療法（例えば、薬学的、細胞療法、遺伝子療法、タンパク質療法、外科手術など）と併せて使用することができる。
【実施例】
【００５８】
下記に提供する実施例は、本発明の限定されない実施形態であることが意図される。  
【００５９】
実施例１−エキソソームの単離および特徴付け
心臓組織の修復および再生のエリアの先行する研究は、心臓組織の修復および／または再生が直接および間接的因子の結果であることを実証していた。例えば、ＣＤＣが、再生された心臓組織のおよそ１０％を占めていることが示されている。このような研究は、別の機序、例えば、間接的効果が働いていることを示唆している。上記のように、エキソソームおよびそれらの核酸内容物は、間接的機序による細胞または組織の修復および／または再生の提供に、少なくとも一部関与していると思われる。本実施例は、エキソソームおよびそれらの核酸内容物を特徴付けるために設計した。
【００６０】
エキソソームを単離するために、培養された細胞を、無血清培地において１００％集密まで成長させた。この実験に関して、エキソソームの収量およびＲＮＡ内容物を、培養されたＣＤＣと、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の間で比較した。いくつかの実施形態において、エキソソームが他の細胞型から単離することができ、集密が１００％未満の時点でも回収することができることを理解するべきである。培養約１５日後、細胞を培養容器から移し、遠心分離により細胞残屑を除去した。ＥＸＯＱＵＩＣＫエキソソーム沈殿溶液（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）中でインキュベーション後、細胞を遠心分離処理して（１５００×ｇ、３０分；しかし、一部の実施形態においては、他の条件が使用される）エキソソームペレット分画および上清分画を得た。一部の実施形態において、エキソソーム沈殿溶液中のインキュベーションは、エキソソーム（またはこれらの内容物）の単離を、超遠心分離を必要とせずに強化する。しかし、一部の実施形態において、場合により超遠心分離を使用する。一部の実施形態において、エキソソーム単離後、エキソソーム（またはそれらの内容物）の下流での使用に依存して、他の試薬および／またはインキュベーション条件も使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、エキソソームが、電子顕微鏡法またはフローサイトメトリにより研究されるべきである場合、ＰＢＳによるインキュベーションを使用する。機能性研究が実施されるべきある実施形態において、（一部の実施形態において、エキソソームが除去された）細胞成長培地を使用する。タンパク質および／またはＲＮＡをエキソソームから単離すべきある実施形態において、溶解バッファーを使用する。単離工程の概略図を図２Ａに示す。ＲＮＡ濃度は、両方の細胞型および両方の単離分画に関して決定した。図３Ａに示すように、ＣＤＣおよびＮＨＤＦ細胞両方に関するエキソソームペレット分画は、大量のＲＮＡを含有する。ＣＤＣから単離されたタンパク質性物質の量を、ＮＨＤＦ細胞と比較して、エキソソームペレット分画のＣＤ６３（膜貫通タンパク質のマーカー）含有量を評価することによって比較した。データを図３Ｂに示す。図３Ｃは、ＣＤＣとＮＨＤＦとを比較する追加の遺伝子発現データを示す。ＣＤ８１は、膜貫通４スーパーファミリー（テトラスパニンファミリーとしても公知である）のメンバーであるタンパク質をコードする。タンパク質のこのファミリーは、例えば、細胞の発達、活性化、成長および運動性の制御に関与する、さまざまなシグナルトランスダクション事象を媒介する。これらのタンパク質はまた、インテグリンと複合体を形成し、したがって、細胞接着および融合において役割を果たし得る。ＬＡＭＰ１（ＣＤ１０７ａとしても公知である）は、免疫細胞の活性化に関係する膜糖タンパク質であるタンパク質をコードする。エズリン（またはサイトビリン）は、チロシン−キナーゼ基質として機能し、細胞の膜と、アクチン細胞骨格との間の機能性リンカーとして働く表在性膜タンパク質（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする。したがって、このタンパク質は、細��接着の維持、細胞の遊走および細胞の組織化において重要な機能を有する。ＡＬＩＸ（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−Ｌｉｎｋｅｄ  ｇｅｎｅ  ２  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｘ）は、細胞質タンパク質をコードするが、ＡＬＩＸが、エキソソームおよびファゴソームにおいて濃縮されることが既に確立されている。したがって、ＡＬＩＸは、さまざまな細胞由来の調製物を特徴付けるために使用できる、エキソソームの追加のマーカーとして働く。図３Ｄは、さまざまな倍率の走査電子顕微鏡画像を表す。図３Ｅは、エキソソームの直径対頻度のヒストグラムを示す。エキソソームの直径範囲は、約１５ｎｍから約２０５ｎｍの間であり、大部分のエキソソームは、直径約１５ｎｍから約９５ｎｍの範囲である。
【００６１】
これらのデータは、ＣＤＣがｍＲＮＡおよびタンパク質両方の豊富な供給源であり、これらが、ＣＤＣ投与後に実現される間接的再生効果において役割を果たし得ることを示している。
【００６２】
実施例２−エキソソームは、他の細胞の生存および増殖を促進する
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験に着手し、エキソソームの他の細胞型に対する再生促進および抗アポトーシス効果を評価した。エキソソームを、上記のようにＣＤＣまたはＮＨＤＦ細胞から単離した。エキソソームペレット分画の一部を、その後、培養した新生ラットの心室筋細胞（ｎｅｏｎａｔａｌ  ｒａｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ）（ＮＲＶＭ）と一緒に、チャンバースライドにおいておよそ７日間同時インキュベーションした。７日の終わりに、同時培養液を、増殖または細胞死（アポトーシスのマーカーにより測定）の指数変化に関して免疫組織化学により評価した。このプロトコルの概略図を図４に示す。図５Ａは、ＴＵＮＥＬ染色により測定した、ＮＲＶＭ細胞の死に関するデータを示す。ＮＲＶＭ細胞と、ＣＤＣから単離されたエキソソームとのインキュベーションは、対照細胞およびＮＨＤＦ細胞由来のエキソソームと共にインキュベートされた細胞の両方と比較して、有意に低いアポトーシスの程度をもたらした（ＣＤＣ：２５．２±０．０４％；ＮＨＤＦ：４５．１±０．０５％、ｐ＜０．０１）；対照：４１．４±０．０５％、ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。図５Ｂは、ＮＲＶＭ細胞とＣＤＣから単離されたエキソソームとのインキュベーションが、対照細胞およびＮＨＤＦ細胞由来のエキソソームと共にインキュベートされた細胞の両方と比較して、有意により多い細胞増殖活性（Ｋｉ６７により測定して）をもたらしたことを示している（ＣＤＣ：４２．７±０．０４％；ＮＨＤＦ２２．５±０．０４％；対照：９．１％±０．０３％、ｎ＝４、ｐ＜０．００１）。図５Ｃは、エキソソームなし、ＮＨＤＦ細胞由来のエキソソームと一緒、またはＣＤＣ由来のエキソソームと一緒にインキュベートしたＮＲＣＭにおけるＴＵＮＥＬ染色の共焦点蛍光顕微鏡分析を示す。図５Ａのように、ＮＲＣＭとエキソソームとのインキュベーションはアポトーシスを減少させ（ＴＵＮＥＬ陽性染色が少ない）、ＣＤＣ由来エキソソームは、ＮＨＤＦ由来のエキソソームよりもより有意な減少を提供した。図５Ｄは、Ｋｉ６７染色の共焦点蛍光顕微鏡分析を示す。再度、図５Ｂに示すデータを総括すると、ＣＤＣ由来エキソソームは、ＮＲＣＭの増殖活性の増加をもたらす。まとめると、これらのデータは、細胞死を減少させ、増殖活性を増加させるそれらの能力に基づき、他の細胞型と比較して、ＣＤＣが組織の修復および／または再生に関連し特に有益であり得るエキソソームを提供することを示唆している。これらの効果は、いくつかの実施形態において、急性的に損傷された細胞または組織、または、たとえ慢性的に損傷または罹患した細胞または組織において実現された場合でも、損傷した細胞または組織の修復または再生を助ける。
【００６３】
実施例３−エキソソームは、血管新生を促進する
損傷または罹患した領域における細胞または組織の増殖の増加および／または死の減少に加えて、血流の再建または維持は、細胞または組織の修復または再生において中枢的な役割を果たし得る。したがって、血管新生を促進するエキソソームの能力を評価した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、さまざまな同時インキュベーション条件に供した。これらの条件を図６に表す。簡潔に言うと、ＨＵＶＥＣ細胞を培養皿において成長因子低下ＭＡＴＲＩＧＥＬで成長させた。細胞を、新生ラット心筋細胞培地（ＮＲＣＭ）、ＣＤＣ由来エキソソーム添加ＭＲＣＭ、ＮＨＤＦ由来エキソソーム添加ＭＲＣＭ、血管細胞基礎培地（ＶＣＢＭ）または血管細胞成長培地、（ＶＣＧＭ）のいずれかにおいて成長させた。図７に示すように、ＶＣＧＭは、ＶＣＢＭと比較して強固な血管形成を誘導した（ＣＤＣ：９３９３±６８９；ＮＨＤＦ：２８１３±４９４．５、対照、１０９７±１１６．１、ｎ＝３、ｐ＜０．０５）。ＮＲＣＭ由来培地は、ＶＣＢＭと同様の血管形成をもたらした（データ非掲載）。示したように、ＣＤＣに由来するエキソソームを添加した培地もまた、有意な血管形成を誘導したが、一方、ＮＨＤＦに由来するエキソソームを添加した培地は、血管形成が少ないことが示された。さまざまな処理条件からもたらされた血管形成の代表的顕微鏡写真を図８Ａ−８Ｅに示す。これらのデータは、細胞の増殖および細胞死の減少に対するプラスの効果に加えて、特定の細胞型に由来するエキソソームが血管形成を促進する能力を有することを実証し、この能力は、ｉｎ  ｖｉｖｏで新しい血管系を形成する能力の代表である。したがって、いくつかの実施形態において、エキソソーム（またはエキソソームの内容物、例えばｍＲＮＡまたはタンパク質）の、損傷または罹患した組織の領域への投与は、血管新生の増加をもたらす。これが順に、標的領域において細胞および組織の生存能力および／または機能を改善する能力を有する。
【００６４】
実施例４−ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるエキソソームの効果
上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験結果を考慮して、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を実施して、心筋梗塞後の心臓組織再生に対するエキソソーム投与の効果を決定した。急性心筋梗塞（ＭＩ）を、左冠動脈前下行枝中部の結紮によりおよそ３ヶ月齢のＳＣＩＤ／Ｂｅｉｇｅマウスに作り出し、エキソソーム調製物またはビヒクルを、２カ所の梗塞周囲部位に直接可視化の下で注入した。本明細書に開示のように、他の送達経路（例えば、冠動脈内、心筋内、ＩＶなど）が、一部の実施形態において使用される。動物に、対照溶液（イスコフ改変ダルベッコ培地；ＩＭＤＭ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ−ＸＯ）から単離されたエキソソーム、ＮＨＤＦ（ＮＨＤＦ−ＸＯ）から単離されたエキソソームまたはＣＤＣ（ＣＤＣ−ＸＯ）から単離されたエキソソームのいずれかを与えた。注入後、各実験群の生存率を、時間と共に追跡した。加えて、ＭＲＩ画像を、梗塞後１日、梗塞後１４日および梗塞後３０日に収集し、心臓組織の寸法を特徴付けた。図９は、生存実験の結果を要約する。顕著なことには、８匹のＣＤＣエキソソーム注入マウスのうち７匹が３０日間生存したことである。対照的に、１０匹のＮＨＤＦエキソソーム注入マウスはわずか６匹しか３０日間生存しなかった。７匹の対照マウスのうち６匹が３０日間生存した。ＭＳＣ−ＸＯデータは非掲載である。全体の生存の改善に加えて、ＣＤＣから単離されたエキソソームの投与は、機能の改善をもたらした。これらのデータを図１０に表し、これは、ＣＤＣに由来するエキソソームにより処置された群において、心筋梗塞後２週間および４週間の両方において有意に改善された左室駆出率（ＬＶＥＦ）を示す。ＣＤＣに由来するエキソソームによる処置の結果としてのＬＶＥＦの改善は、ＮＨＤＦエキソソーム群（これは、対照またはＭＳＣ−ＸＯにより処置された細胞と差がなかった）に見られる心機能の低下を考慮すると驚くべきである。２週間において、ＣＤＣエキソソーム群のＬＶＥＦは４０．８±２．３３％であった（ＮＨＤＦ群３２．３４±２．０％、ＭＳＣ−ＸＯ群３２．４１±１．９％およ
び対照群３１．３１±３．２％と比較；いずれもｎ＝６、ｐ＜０．０５）。４週間において、ＣＤＣエキソソーム群のＬＶＥＦは４４．０３±１．５％であった（ＮＨＤＦ群３１．８±１．７％、ＭＳＣ−ＸＯ群３１．１７±１．５％および対照群３１．５±２．７％と比較；いずれもｎ＝６、ｐ＜０．０５）。
【００６５】
これらの機能改善に加えて、ＣＤＣに由来するエキソソームの投与は、再生された心臓組織の量の増加をもたらした（例えば、図１１Ｃを図１１Ａ−１１Ｂと比較して参照されたい）。ＭＳＣ−ＸＯに関するエコーデータは非掲載である。解剖学的改善に関する追加のデータ（例えば、心筋の再生）を図１２に示す。図１２Ａ−１２Ｄは、さまざまな処置群それぞれに由来する心臓組織の、代表的なマッソントリクローム染色切片を表す。図１２Ｄと図１２Ａとの比較により、ＣＤＣに由来するエキソソームが壁厚を増加させ、空洞の体積を減少させたことが明示され、このことは心機能の改善と解釈される。ＮＨＤＦに由来するエキソソーム（１２Ｂ）もまた、対照と比較して壁厚を増加させたが、ＣＤＣ由来エキソソームと同程度ではなかった。対照的に、ＭＳＣ由来エキソソームは、ＮＨＤＦまたはＣＤＣのいずれとも同程度に心筋を再生できなかった。
【００６６】
図１２Ｅは、リスク領域（梗塞部位の周辺エリア）における組織の生存能力パーセントに関するデータを表す。ＣＤＣに由来するエキソソームは、対照（ｐ＜０．０１）ならびにＮＨＤＦエキソソーム（ｐ＜０．０１）と比較して、細胞の生存能力を有意に改善した。リスク領域の生存能力は、ＭＳＣ−ＸＯ処置マウスと比較した場合、有意な差はなかった。
【００６７】
解剖学的改善のさらなる徴候を、図１２Ｆ−１２Ｈに示す。図１２Ｆは、誘導された心筋梗塞からもたらされた瘢痕量の絶対量を示す。ＮＨＤＦエキソソームは、対照と比較して瘢痕量を有意に減少しなかったが、ＣＤＣに由来するエキソソームは、対照との比較だけでなく、他のすべての処置群と比較しても瘢痕量を有意に減少させた。（対ＭＳＣ−ＸＯ、ｐ＜０．０５、対対照およびＮＨＤＦ−ＸＯ、ｐ＜０．０１）。瘢痕組織は収縮性の減少を有するので、このことは解剖学的改善を表すだけでなく、瘢痕組織の減少は、多くの場合機能的改善を伴う。図１２Ｇは、ＣＤＣに由来するエキソソームが、対照または他のいずれの処置群と比較しても、心臓組織の全生存心筋量の有意な増加をもたらすことを示している（ｐ＜０．０５）。最終的に、図１２Ｈは、ＣＤＣに由来するエキソソームが、梗塞領域の心臓の壁厚の有意な増加をもたらすことを示している（対照およびＭＳＣエキソソームの両方と比較して、ｐ＜０．０１、ＮＨＤＦエキソソームと比較して、ｐ＜０．０５）。この場合も同様に、この厚みの増加は、いくつかの実施形態において、心臓機能の増加に少なくとも一部寄与している。
【００６８】
これらのデータは、いくつかの実施形態において、機能的改善がエキソソームの投与からもたらされることを示している。いくつかの実施形態において、解剖学的改善が生じる。さらに追加の実施形態において、機能的および解剖学的改善の両方が実現される。さらに、エキソソームの投与は、いくつかの実施形態において、損傷または疾患の領域において細胞または組織の生存能力の増加をもたらす。一部の実施形態において、エキソソームそれ自体が投与される必要はなく、むしろエキソソームの内容物または内容物の一部を投与して（例えば、核酸、タンパク質またはこれらの組み合わせ）、機能的および／または解剖学的改善を得ることができる。
【００６９】
これらの解剖学的および機能態改善に加えて、いくつかの実施形態において、損傷または罹患した組織へのエキソソームの投与は、損傷または疾患の１以上の副次的効果を改善させることができ、このような副次的効果は、多くの場合傷害の増強または損傷組織における機能喪失につながる。いくつかの実施形態において、炎症が１つのこのような副次的効果である。損傷を受けた、または疾患を患う組織への炎症細胞の浸潤は、しばしばさらなる損傷および／または機能喪失を誘導し得る。例えば、炎症細胞は、特定の経路を開始でき、これが細胞のさらなる破壊をもたらし、これは直接傷害または罹患させない破壊を含む。副次的効果に対するエキソソーム送達の効果を評価するために、炎症マーカーのパネルの発現レベルを、心筋梗塞１ヵ月後に評価した。これらのデータを図１３に示す。表したように、ＣＤＣに由来するエキソソーム（各群の左のバー）は、より低レベルの炎症関連マーカーを伴う。マーカーに依存して、ＣＤＣに由来するエキソソームは、炎症マーカー発現の有意な低下を表示する（例えばフラクタルキン、ＧＣＳＦ、ＩＬ１２ｐ４０ｐ７０、ＭＩＰ−ｌｇの発現を参照されたい）。いくつかの実施形態において、本明細書に開示の方法は、ＢＬＣ、ＣＤ３０Ｌ、エオタキシン、エオタキシン２、ＦａｓＬ、フラクタルキン、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンガンマ、ＩＬ−ｌａ、ＩＬ−ｌｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０ｐ７０、ＩＬ−２０ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、Ｉ−ＴＡＣ、ＫＣ、レプチン、ＬＩＸ、リンホタクチン、ＭＣＰ−１、ＭＣＳＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−ｌｇ、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、ＴＣＡ−３、ＴＥＣＫ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、腫瘍壊死因子アルファ、ｓＴＮＦ−Ｒｌ、およびｓＴＮＦ−Ｒ２の１以上の発現（または関連する炎症活性）の低下をもたらす。一部の実施形態において、エキソソームの投与は、３０日より速い時点における炎症マーカーの減少をもたらす。例えば、一部の実施形態において、傷害後の炎症マーカーの即時減少によって、炎症による組織に対するその後の損傷がより少なくなる。したがって、一部の実施形態において、炎症マーカーは、約２から約５時間、約５から約７時間、約７から約１０時間、約１０から約１５時間、約１５から約２０時間、約２０から約２４時間、およびこれらの重複範囲に及ぶ時間枠におけるエキソソームの投与により減少される。さらに追加の実施形態において、エキソソーム投与は、約１日から約３日、約３日から約５日、約５日から約１０日、約１０日から約１５日、約１５日から約２０日、約２０日から約３０日、およびこれらの重複範囲の時間枠における炎症マーカーの減少をもたらす。さらに、いくつかの実施形態において、エキソソームの投与は、長期間にわたり炎症メディエーターの発現および／または浸潤を減少させる。
【００７０】
実施例５−エキソソーム分泌の機序
エキソソームが、罹患または損傷した組織の修復および／または再生を容易にできることを理解することだけが重要ではなく、エキソソームの効率的な収集のための工程を理解することもまた重要である。エキソソーム分泌に関与する機序を理解することおよびいくつかの実施形態が、エキソソーム単離の効率の最適化を可能にする。
【００７１】
一般的に言って、エキソソームは、エンドサイトーシスリサイクル経路に由来する膜結合体である。エンドサイトーシスの間、エンドサイトーシス小胞が細胞膜において形成され、初期エンドソームを形成するために融合する。後期エンドソームに成熟後、多小胞体（ＭＶＢ）として公知の腔内膜小胞は、細胞質内腔に芽を出す。しかし、リソソームと融合する代わりに、ＭＶＢは細胞膜と直接融合して、エキソソームを細胞外空間に放出する。多くの場合、特異的シグナル伝達分子または分子の複合体は、エキソソーム放出を達成するために必要である。スフィンゴミエリナーゼは、特定の脂質を切断する酵素であり、エキソソーム放出において役割を果たし得る。このことを調査するために、中性スフィンゴミエリナーゼの阻害剤（ＧＷ４８６９、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて実験を実施した。ＣＤＣをＤＭＳＯ（対照）またはＧＷ４８６９と一緒にインキュベートし、その後、エキソソームを上記のように収集した。図１４Ａは、培養されたＣＤＣがＧＷ４８６９に曝露されたことによる、ＣＤＣからのエキソソーム分泌の用量依存性減少に関するデータを示す。図１４Ｂは、分泌の減少が、ＣＤＣの生存能力の低下によるものではないことを確認するデータを示す。示したように、ＤＭＳＯ（対照）またはＧＷ４８６９に曝露されたＣＤＣは、生存能力において有意な差を示さなかった（カルセイン染色に基づく）。スフィンゴミエリナーゼ阻害のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を試験するために、マウスを、（上記のように）急性心筋梗塞に供し、ＤＭＳＯ（対照）に曝露されたＣＤＣに由来するエキソソーム、またはＧＷ４８６９に曝露されたＣＤＣに由来するエキソソームのいずれかを用いて処置した。図１４Ｃは、ＧＷ４８６９への曝露の結果として、ＬＶＥＦを改善できなかったが、一方対照的に、ＤＭＳＯ（溶媒対照）に曝露されたＣＤＣに由来するエキソソームはＬＶＥＦの改善をもたらしたことを示す。ＬＶＥＦのこれらの改善は、ＭＩ後３０日であっても統計的に有意であった。図１５Ａ−１５Ｂは、ＤＭＳＯ曝露ＣＤＣ由来のエキソソームの投与による、より大きな解剖学的改善（１５Ｂ）、およびＧＷ４８６９に曝露されたＣＤＣ由来エキソソームの投与後、解剖学的改善が欠落していることを表すＭＲＩデータを示す。
【００７２】
図１６Ａ−１６Ｂは、エキソソームが、ＣＤＣ投与からもたらされる心臓組織の修復および再生において重要な役割を果たすことをさらに実証している。図１６Ａに示すように、エキソソーム分泌の阻害剤であるＧＷ４８６９によるＣＤＣの処理および得られたエキソソームの投与は、急性ＭＩ後の心臓の壁厚の減少をもたらす。対照的に、図１６Ｂに示すように、ＣＤＣとＤＭＳＯとのインキュベーションは、壁厚の増加により実証されるように、エキソソームの有益な効果に有害な影響を与えない。図１７Ａ−１７Ｄに示す追加のデータは、ＣＤＣからのエキソソーム放出の阻害がプラスの利益を減少させることを、さらに実証している（例えば、梗塞領域における細胞の生存能力の低下、瘢痕量の増加、生存組織心筋量の減少および壁厚の減少）。いくつかの実施形態において、エキソソームの供給源として使用される細胞は、エキソソーム放出の阻害を予防する１以上の薬剤および／またはエキソソーム放出を促進する１以上の薬剤により処理されてよい。したがって、いくつかの実施形態において、エキソソームを使用する細胞の修復または再生の最終的有効性は、エキソソームを生じる細胞の特定の処理により改変可能である。一部の実施形態において、エキソソームは単独で投与され、細胞の修復再生をもたらすが、一部の実施形態において、エキソソームは、それらのエキソソームを生じる細胞と組み合わせて投与される（例えば、細胞−エキソソーム併用療法）。後者の取り組みは、一部の実施形態において、投与後、細胞がエキソソームを産生し続け得るので、再生効果を強化する。しかし、ある実施形態において、エキソソームも細胞もどちらの投与も必要が無く、むしろエキソソームまたは細胞から単離された産物（例えば、核酸もしくはタンパク質またはこれらの組み合わせ）を投与して、プラスの再生効果を得ることができる。
【００７３】
実施例６−エキソソームマイクロＲＮＡのプロファイリングおよび再生有効性
上記のように、一部の実施形態において、エキソソーム由来産物（例えば、核酸もしくはタンパク質またはこれらの組み合わせ）は、損傷または罹患した細胞または組織に再生効果を提供するために投与することができる。ある実施形態において、ＤＮＡがエキソソームから単離できるが、一部の実施形態において、ＲＮＡがエキソソームから単離できる（ＤＮＡに加えて、またはその代わりに）。特定の型のＲＮＡ、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）などが、エキソソームにより担持されることが公知である。上記のように、ｍｉＲＮＡは、多くの場合標的メッセンジャーＲＮＡ転写産物（ｍＲＮＡ）に対する相補配列に結合し、それによって、翻訳抑制、標的ｍＲＮＡの変性および／または遺伝子サイレンシングをもたらすことによって、転写後レギュレーターとして機能する。エキソソームに含有されるｍｉＲＮＡについてより理解を深めるために、ｍｉＲＮＡのプロファイリング実験を実施した。エキソソームをＣＤＣおよびＮＨＤＦの両方から上記のように調製し、全ＲＮＡを、確立された方法によってエキソソームから単離した。ｃＤＮＡを全ＲＮＡから作製し、ＲＴ  ＰＣＲ反応において鋳型として使用して、ｍｉＲＮＡのパネルの発現レベルを決定した。図１８Ａは、ＮＨＤＦ細胞と比較した、ＣＤＣ中のさまざまなｍｉＲＮＡの発現レベルを表す（データは、ＮＨＤＦ発現に関する倍数変化として表し、ＮＨＤＦ発現がＸ軸における「０」値である）。図のように、ＣＤＣおよび対照細胞の間で差次的発現を示すさまざまなｍｉＲＮＡが存在する。一部の実施形態において、対照細胞を上回る発現の増加を示すｍｉＲＮＡが、（例えば、このようなｍｉＲＮＡを含有するエキソソームの投与、またはｍｉＲＮＡの直接投与により）その後の組織再生に使用される候補である。特に、ｍｉＲ１４６ａは、ＣＤＣにおいて２５０倍を超える発現増加を示す。図１８Ｂは、ＣＤＣと比較してＮＨＤＦ細胞において同等に発現するｍｉＲＮＡ（この実施形態において、同等は、発現の１０倍未満の変化に設定した）、ＣＤＣにおいて有意に上方制御されるｍｉＲＮＡ（右）およびＣＤＣにおいて有意に下方制御されるｍｉＲＮＡ（左）の一覧表を示す。しかし、一部の実施形態において、被験細胞型に依存して、他のｍｉＲＮＡが発現の改変を示す。例えば、一部の実施形態において、対照細胞と比較して、発現の低下を示すｍｉＲＮＡは、組織再生におけるその後の使用の候補である。ｍｉＲＮＡ発現が上方制御されるか、または下方制御されるかが、ｍｉＲＮＡが、その後翻訳の抑制または翻訳のディスク阻止に関連する経路に関与するかどうかに関係し得る。
【００７４】
ｍｉｌ４６ａの大量の発現を前提として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究を実施して、ｍｉＲＮＡ自体の再生効果を提供する能力を決定した。実験の概略図を図１９に示し、ＮＲＶＭの生存に重要な標的遺伝子のタンパク質コード領域に相補的なｍｉＲ−模倣体（サイズおよび構造はｍｉｌ４６ａと一致するが、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）に由来し、したがってこれはヒトｍＲＮＡに特異的ではない）を作製する。ＮＲＶＭに、４０ｎＭのｍｉ１４６ａまたは対照ｍｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトし、単分子層として成長させた（１０％培地）。細胞の生存能力をカルセイン蛍光６時間およびＥＴＨＤ−１蛍光１２時間で、それぞれ評価した（それぞれ図２０Ａおよび２０Ｂ）。図２０Ａに示すように、６時間において、ｍｉ１４６ａをトランスフェクトされた細胞は、有意により多いカルセイン蛍光を発現し、これは生存細胞の指示である（カルセインＡＭは非蛍光性の、無傷の生細胞に容易に浸透する疎水性化合物であり、細胞内エステラーゼによるカルセインＡＭの加水分解により、細胞の細胞質中に十分保持される、親水性の強力な蛍光性化合物であるカルセインが生じる）。さらに１２時間において、ｍｉ１４６ａをトランスフェクトされた細胞は、有意により少ないＥＴＨＤ−１蛍光を発現し（２０Ｂ）、これもまた細胞の生存能力の強化を示す（ＥＴＨＤ−１は、損傷または死細胞において蛍光を発する）。図２０Ｃは、ｍｉＲ１４６ａが、その後酸化条件に曝露される細胞内にトランスフェクトされた場合、保護効果を誘導することを示す。ｍｉＲ１４６ａまたは対照模倣体のいずれかをトランスフェクトされた培養ＮＲＶＭを、過酸化水素に曝露して、（確立されたプロトコルを使用して）組織の虚血からもたらされる酸化条件を模倣した。カルセイン染色を使用して生存能力を評価し、これらのデータは、ｍｉＲ１４６ａをトランスフェクトされたＮＲＶＭが、対照のＮＲＶＭより有意に大きい生存能力を示すことを示す。同様に、塩化コバルトに曝露した場合（低酸素症を模倣する、図２０Ｄ）、ｍｉＲ１４６ａは保護効果を提供した。したがって、これらのデータは、ｍｉｌ４６ａ単独（例えば、エキソソーム供給源または細胞を含まない）が、対照データにより示されるように、未処理細胞の生存能力を低下させる悪条件にもかかわらず、細胞の生存能力の増加をもたらすことができることを示している。したがって、一部の実施形態において、細胞の再生が、マイクロＲＮＡ単独の投与（例えば、適切な生理学的キャリアを含むが、エキソソームまたは細胞を含まない）により達成される。一部の実施形態において、エキソソームおよび／または細胞の投与は、エキソソームおよび／または細胞の投与の前、同時またはその後のマイクロＲＮＡの投与により強化され得る。
【００７５】
ｍｉＲＮＡそれ自体の再生能力をさらに評価するために、ｍｉＲ１４６ａを、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＩモデルにおいて評価した。上記のＭＩプロトコルに従って、ｍｉＲ１４６ａまたは模倣体対照を与えたマウスに梗塞を生み出した。ｍｉＲＮＡを、５０ｎｍの濃度で梗塞周囲注入により送達した。機能性評価を、ＭＩ後１５および３０日において実施し、組織再生を、ＭＩ後３０日に、上記の方法により査定した。また上記のように、ｍｉＲＮＡ（またはエキソソームおよび／または細胞）の他の濃度または送達経路が、実施形態に依存して使用可能である。
【００７６】
図２１Ａに示すように、対照模倣体ｍｉＲＮＡを与えたマウス由来心臓（左の心臓）は、ｍｉＲ１４６ａを与えたマウス心臓（右の心臓）と比較して、肉眼で見てより大きな梗塞領域を有する。図２１Ｂおよび２１Ｃは、巨視的比較でさらに裏付けられる。図２１Ｂは、対照としてｍｉＲ模倣体を与えたマウス由来の梗塞下心臓のマッソントリクローム染色を示す。壁厚は著しく薄く、ｍｉＲ−１４６ａにより処置されたマウスの梗塞した心臓に由来する、図２１Ｃに示した心臓より筋繊維が少ない。この組織学的分析は、ｍｉＲ−１４６ａによる処置が、梗塞後のコラーゲン（例えば、瘢痕形成）の減少および組織再生をもたらすことを示している。組織の増加があるだけでなく、その増加は心臓機能の増加をさらに伴う。図２１Ｄに示すように、ｍｉＲ１４６ａにより処置したマウスは、ＭＩ後１５日および３０日において有意に多い駆出率を有した。この機能の増加は、壁厚の増加と相まって、いくつかの実施形態において、有意に改善された臨床的結果につながる。図２１Ｅ−２１Ｇは、２１Ｂおよび２１Ｃに示された組織学的データを再確認する。全生存組織量は、ｍｉＲ１４６ａにより処置されたマウスにおいて有意に多かった（ｐ＜０．０５）（図２１Ｅ）。瘢痕量は、ｍｉＲ１４６ａ処置マウス（図２１Ｆ）において有意に少なく（ｐ＜０．０１）および梗塞幅（例えば、壁厚）は、ｍｉＲ１４６ａ処置マウスにおいて有意に大きかった（図２１Ｇ）。まとめると、これらのデータは、ｍｉＲ１４６ａが、たとえ単独（例えば、ＣＤＣなどの幹細胞を伴わず、エキソソームを含まない）で投与されても、損傷された心臓組織の修復において高度に有効であり、瘢痕サイズの減少および生存組織の増加により解剖学的に有効であるだけでなく、機能に関しても有効であることを確認している。心臓組織の再生または瘢痕サイズの減少単独では、心臓療法の開発において重要であるが、ＭＩ後の患者を治療する最終目的に届かないので、この二重の影響は臨床的に意味が深い。したがって、いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ、例えば治療的に有効な細胞、例えばＣＤＣにおいて上方制御されるマイクロＲＮＡの投与は、損傷した心臓組織の機能的および解剖学的修復両方に予想外につながる。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ１４６ａは特に有効である。
【００７７】
ｍｉＲＮＡ単独の有効性は、少なくとも一部は、ｍｉＲＮＡにより誘導されるさまざまな生理学的機序によるものと思われる。例えば、ｍｉＲＮＡの投与は、細胞の代謝活性の増加および／またはタンパク質合成の増加を支援でき、これは、細胞が、心臓の傷害または疾患からもたらされる悪条件をより多く生き残ることを可能にし得る。マイクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ投与からもたらされる炎症の誘導限定により、さらに有効であり得る。図２２は、心筋細胞にｍｉＲ１４６ａまたは模倣体対照がｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトされた後で収集された差次的遺伝子発現データを示す。データを、確立した方法により遺伝子チップ分析により収集した。示すように、ｍｉＲ１４６ａにより処理された心筋細胞は、ＭＲＰＳ１２（ミトコンドリアリボソームタンパク質）、ＣＴＨ（シスタチオナーゼ（ｃｙｓｔｏｔｈｉｏｎａｓｅ））、ＭＴＦＰ１（ミトコンドリア分裂プロセスタンパク質１（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １））およびＳＬＣ５０Ａ１（糖輸送体）の上方制御をもたらし、これは、処理された心筋細胞の代謝活性および／またはタンパク質合成の増加に関係し得る。顕著なことには、ｍｉＲ１４６ａにより処理された心筋細胞は、ＩＲＡＫＩ（インターロイキン−１受容体関連キナーゼ１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  １））およびＴＲＡＦ６（ＴＮＦ受容体関連因子ファミリー（ＴＮＦｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ）のメンバー）のレベルを低下させることを示し、これらは両方とも炎症経路の早期シグナル伝達段階に関与することが確立されている。したがって、（対照模倣体ｍｉＲＮＡにより処理された心筋細胞と比較した）これらの遺伝子の発現の減少は、心筋細胞における免疫活性の量および／また強度を低下させることができる。結果として、処理された心筋細胞は、心臓傷害後にもたらされ得る炎症応答にもかかわらず、生存能力の改善を享受することができる。この改善された生存能力は順に、いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡがプラスの（解剖学的および機能的の両方の）治療利益を提供できる機序であり得る。
【００７８】
上方制御される他のｍｉＲＮＡもまた、いくつかの実施形態において、プラスの治療結果をもたらすために使用できる。例えば、ＣＤＣにおいて（ＮＨＤＦと比較して）およそ３０倍に上方制御されるｍｉＲ２１０は、心筋細胞をＨ2Ｏ2に曝露した場合、用量応答様式で心筋細胞の生存能力を改善した。図２３はこのデータを示す。トランスフェクトされるｍｉＲ２１０の量を４０ｎＭから３２０ｎＭまで増加すると、心筋細胞の生存能力の（カルセイン蛍光に基づき）１０倍を超える増加がもたらされた。したがって、選択されたｍｉＲＮＡとの接触後、悪条件を生き残るための心筋細胞などの細胞の能力の改善は、本明細書に開示のいくつかの実施形態に従って、心臓組織の損傷を治療するためのｍｉＲＮＡ単独の使用を支援する。いくつかの実施形態において、治療に関連するｍｉＲＮＡの投与は、標的細胞（心筋細胞など）へのｍｉＲＮＡの直接送達を含む。いくつかの実施形態において、その送達は、ｍｉＲＮＡを標的細胞に接触および／または進入可能にするビヒクル中のｍｉＲＮＡを投与することによって達成される。これは、実施形態に依存して、脂質ベースのトランスフェクション剤、ウイルス性因子（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスなど）または粒子系因子（例えば、遺伝子銃）を含んでよい。ｍｉＲＮＡは、いくつかの実施形態において、約１０ｎＭから約１０μΜの範囲の濃度で送達することができ、この濃度範囲は、約１０ｎＭから約２０ｎＭ、約２０ｎＭから約３０ｎＭ、約３０ｎＭから約４０ｎＭ、約４０ｎＭから約５０ｎＭ、約５０ｎＭから約６０ｎＭ、約６０ｎＭから約７０ｎＭ、約７０ｎＭから約８０ｎＭ、約８０ｎＭから約９０ｎＭ、約９０ｎＭから約１００ｎＭ、約１００ｎＭから約１５０ｎＭ、約１５０ｎＭから約２００ｎＭ、約２００ｎＭから約４００ｎＭ、約４００ｎＭから約８００ｎＭ、約８００ｎＭから約１μΜ、約１μΜから約２μΜ、約２μΜから約４μΜ、約４μΜから約６μΜ、約６μΜから約８μΜ、約８μΜから約１０μΜおよびこれら範囲の間の任意の濃度を含む。  
【００７９】
上で開示した実施形態の特定の特長および態様のさまざまな組み合わせまたは部分的組み合わせが実施可能であり、さらに本発明の１以上の範囲内であることが企図される。さらに、実施形態に関連する任意の特定の特長、態様、方法、特性、特徴、質、寄与、要素などの本発明における開示は、本明細書に述べた他の実施形態において使用可能である。したがって、開示された発明のさまざまな様式を形成するために、開示された実施形態のさまざまな特長および態様が、相互に組み合わせ、または置き換えることができることは理解すべきである。したがって、本明細書に開示の本発明の範囲が、上記の実施形態の特定の開示により限定されるべきではないことが意図される。さらに、本発明はさまざまな改変および代わりの形態を行いやすく、これらの具体的実施例が図面で示され、本明細書において詳細に記載されている。しかし、本発明が開示された特定の形態または方法に限定されるものではなく、反対に、本発明はさまざまな記載の実施形態および添付の特許請求の範囲の精神および範囲内である全ての改変、等価物および代替物を対象とすることを理解すべきである。本明細書に開示の任意の方法は、列挙された順番に実施する必要はない。本明細書に開示の方法は、施術者によりなされるある行動を含むが、これらは、任意の別の参加者による、明確または含蓄的のいずれかでのそれらの行動の指示もまた含むことができる。例えば、「エキソソームを投与するステップ」などの行動は、「エキソソームの投与を指示するステップ」を含む。本明細書に開示の範囲もまた、ありとあらゆる重複、部分範囲およびこれらの組み合わせを包含する。「まで」、「少なくとも」、「を超える」、「未満」、「間」などの言葉は、列挙された数字を含む。「約」または「およそ」などの用語が先に立つ数字は、列挙された数字を含む。例えば「約３ｍｍ」は「３ｍｍ」を含む。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２１Ｇ】
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【図２２】
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【図２３】
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