(57)【要約】【課題】新規なチロシナーゼ活性増強剤とその利用方法を提供すること。【解決手段】有効成分として下記一般式（Ｉ）を有する化合物を含有する、チロシナーゼ活性増強剤とする。【化１】2019043877.tif 000016              （Ｉ）  （式中、Ｒ１は、ＯＲ２またはＮＲ３Ｒ４であって、Ｒ２は水素またはＣ１〜３のアルキル基であり、Ｒ３及びＲ４は、水素またはＣ１〜３のアルキル基から独立して選択される基であるか、Ｒ３とＲ４が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする４員環、５員環、または６員環のアザシクロアルキル基を形成する。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として下記一般式（Ｉ）を有する化合物を含有する、チロシナーゼ活性増強剤。
【化１】
2019043877.tif 000010
（Ｉ）
（式中、Ｒ１は、ＯＲ２またはＮＲ３Ｒ４であって、Ｒ２は水素またはＣ１〜３のアルキル基であり、Ｒ３及びＲ４は、水素またはＣ１〜３のアルキル基から独立して選択される基であるか、Ｒ３とＲ４が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする４員環、５員環、または６員環のアザシクロアルキル基を形成する。）
【請求項２】
有効成分として下記一般式（Ｉ）を有する化合物を含有する、メラニン産生促進剤。
【化２】
2019043877.tif 000011
（Ｉ）
（式中、Ｒ１は、ＯＲ２またはＮＲ３Ｒ４であって、Ｒ２は水素またはＣ１〜３のアルキル基であり、Ｒ３及びＲ４は、水素またはＣ１〜３のアルキル基から独立して選択される基であるか、Ｒ３とＲ４が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする４員環、５員環、または６員環のアザシクロアルキル基を形成する。）
【請求項３】
有効成分として下記一般式（Ｉ）を有する化合物を含有する、メラニン産生促進用化粧品組成物。
【化３】
2019043877.tif 000012
（Ｉ）
（式中、Ｒ１は、ＯＲ２またはＮＲ３Ｒ４であって、Ｒ２は水素またはＣ１〜３のアルキル基であり、Ｒ３及びＲ４は、水素またはＣ１〜３のアルキル基から独立して選択される基であるか、Ｒ３とＲ４が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする４員環、５員環、または６員環のアザシクロアルキル基を形成する。）
【請求項４】
請求項３に記載のメラニン産生促進用化粧品組成物を含む、化粧品。
【請求項５】
有効成分として下記一般式（Ｉ）を有する化合物を含有する、医薬組成物。
【化４】
2019043877.tif 000013
（Ｉ）
（式中、Ｒ１は、ＯＲ２またはＮＲ３Ｒ４であって、Ｒ２は水素またはＣ１〜３のアルキル基であり、Ｒ３及びＲ４は、水素またはＣ１〜３のアルキル基から独立して選択される基であるか、Ｒ３とＲ４が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする４員環、５員環、または６員環のアザシクロアルキル基を形成する。）
【請求項６】
尋常性白斑またはパーキンソン病の治療、またはメラノーマの予防のための医薬であって、請求項５に記載の医薬組成物を有効成分として含む、医薬。
【請求項７】
請求項１に記載のチロシナーゼ活性増強剤、請求項２に記載のメラニン産生促進剤、請求項３に記載のメラニン産生促進用化粧品組成物、または請求項５に記載の医薬組成物を含有する外用剤。
【請求項８】
有効成分として下記一般式（Ｉ）を有する化合物を含有する、試薬組成物。
【化５】
2019043877.tif 000014
（Ｉ）
（式中、Ｒ１は、ＯＲ２またはＮＲ３Ｒ４であって、Ｒ２は水素またはＣ１〜３のアルキル基であり、Ｒ３及びＲ４は、水素またはＣ１〜３のアルキル基から独立して選択される基であるか、Ｒ３とＲ４が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする４員環、５員環、または６員環のアザシクロアルキル基を形成する。）
【請求項９】
チロシナーゼによるフェノール系化合物の除去を促進する試薬であって、
請求項８に記載の試薬組成物を含有する、試薬。
【請求項１０】
チロシナーゼによるポリマー形成を促進する試薬であって、
請求項８に記載の試薬組成物を含有する、試薬。
【請求項１１】
下記一般式（ＩＩ）を有する化合物の存在下でチロシナーゼ活性を測定する方法。
【化６】
2019043877.tif 000015
（ＩＩ）
（式中、Ｒ１は、ＯＲ５またはＮＲ６Ｒ７であって、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、水素、炭素原子１〜１２個を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基、炭素原子３〜６個を有するシクロアルキル基、炭素原子２〜６個と二重結合１又は２個を有するアルケニル基、炭素原子２〜６個と三重結合１又は２個を有するアルキニル基、アリール基、ハロ基、Ｃ１〜Ｃ１２ハロアルキル基、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル基、ホルミル基、オキシカルボニル基、カルボキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルカルボキシレート基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルアミド基、アミノカルボニル基、アミノ基、シアノ基、ジアゾ基、ニトロ基、チオ基、スルホキシル基、及びスルホニル基から成る群から独立して選択され、前記アリール基は、炭素環式アリール基又は複素環式アリール基であり、ここで、前記炭素環式アリールは原子６〜２０個を含み、前記複素環式アリールは炭素原子２〜２０個と、窒素、酸素及び硫黄から成る群より選ばれるヘテロ原子１〜５個を含むか、あるいはＲ６及びＲ７は、Ｒ６とＲ７が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする３〜８員環のアザシクロアルキル基を形成する。）
【請求項１２】
チロシナーゼ活性を増強する化合物のスクリーニング方法であって、
請求項１０に記載した測定方法を用いて、複数の前記一般式（ＩＩ）を有する化合物の存在下でチロシナーゼ活性を測定する工程と、
前記複数の一般式（ＩＩ）を有する化合物の中から、チロシナーゼ活性を増強する化合物を特定する工程と、を含むスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシナーゼ活性増強剤とその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チロシナーゼは、皮膚の濃淡を調節するメラニンの生合成のための鍵酵素として知られている。チロシナーゼは、Ｌ‐チロシンを酸化してＬ‐ＤＯＰＡにするモノフェノラーゼ活性と、Ｌ‐ドーパを酸化してドーパキノンにするジフェノラーゼ活性の両方の活性を有する。生成したドーパキノンは複数の酸化・重合反応を経てメラニンとなる。
【０００３】
これまでに、マッシュルーム・チロシナーゼ活性の酵素反応速度を増大させる化合物として、［化１］に示した化合物が報告されている（例えば、非特許文献１〜４参照）が、ヒト・チロシナーゼ活性に対する増強作用を有する化合物は見出されていない。
【０００４】
【化１】
2019043877.tif 000002
これまでにメラニンの生合成や、メラノサイトが関与する疾患がいくつか知られている。
【０００５】
尋常性白斑は、皮膚に不規則な色素欠失症状を呈する疾患である。尋常性白斑に対して、Ｎａｒｒｏｗ‐Ｂａｎｄ  ＵＶＢ（ＮＢＵＶＢ）照射が、毛包のバルジにあるメラノサイトの遊走を促し、これにより表皮におけるメラノサイトの再分布が引き起こされることが示されている（例えば、非特許文献５参照）。この併用薬としてチロシナーゼ活性を増強する化合物が適当であると考えられている（例えば、非特許文献６参照）。
【０００６】
白髪は、頭髪の毛包のメラニン産生力が低下した状態であり、チロシナーゼ活性を増強することで、予防、改善を行うことができると考えられている。
【０００７】
また、パーキンソン病は錐体外路症状を示す進行性の神経変性疾患であり、中脳の黒質にあるドーパミン作動性神経細胞の減少又は消失が発症の一因となるため、病変部は、黒質の脱色を伴う（例えば、非特許文献７参照）。アポモルフィンにより誘発したパーキンソン病モデルマウスの黒質に、自家のメラノサイトを移植することで、黒質局所でのＬ−ＤＯＰＡの産生が促進され、パーキンソン病モデルマウスの代表的な行動である回転行動を抑制されたことが報告されている（例えば、非特許文献８参照）。また、Ｌ−ＤＯＰＡは、神経伝達物質であるドーパミンの前駆体であり、血液脳関門を通過することが可能であるため、パーキンソン病に有用な薬剤として用いられている（例えば、特許文献１〜２参照）。これらの事実から、チロシナーゼを活性化する物質は、パーキンソン病の治療薬として有用であると考えられている。
【０００８】
さらにチロシナーゼは、汚染水の除去（例えば、非特許文献９、１０参照）やフェノール性のバイオポリマーの合成（例えば、非特許文献９、１１参照）にも用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ２０１１０６８１４７
【特許文献２】公開特許公報ＪＰ２００７００８８８８
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】E Sanjust, G Cecchini, F Sollai, N Curreli, A Rescigno. 3-hydroxykynurenine as a substrate/activator for mushroom tyrosinase. Arch. Biochem. Biophys. 2003; 412: 272-278.
【非特許文献２】S Guan, W Su, N Wang, P Li, Y Wang. A potent tyrosinase activator from Radix Polygoni multiflori and its melanogenesis stimulatory effect in B16 melanoma cells. Phytother. Res. 2008; 22: 660-663.
【非特許文献３】MM El Sadek, SY Hassan, HE Abdelwahab, GA Yacout. Synthesis and bioassay of a new class of furanyl-1,3,4-oxadiazole derivatives. Molecules 2013; 18: 8550-8562.
【非特許文献４】L Qin, Y Wu, Y Liu, Y Chen, P Zhang. Dual effects of alpha-arbutin on monophenolase and diphenolase activities of mushroom tyrosinase. PLoS One 2014; 9: e109398.
【非特許文献５】Goldstein NB et al. Narrow Band Ultraviolet B Treatment for Human Vitiligo Is Associated with Proliferation, Migration, and Differentiation of Melanocyte Precursors. J Invest Dermatol. 2015 Aug;135(8):2068-76.
【非特許文献６】MR Namazi, AK Shotorbani. Evaluation of the Efficacy of Topical Ethyl Vanillate in Enhancing the Effect of Narrow Band Ultraviolet B against Vitiligo: A Double Blind Randomized, Placebo-Controlled Clinical Trial. Iran J Med Sci 2015; 40: 478-484.
【非特許文献７】KL Double, W Maruyama, M Naoi, M Gerlach, P Riederer. Biological role of neuromelanin in the human brain and its importance in Parkinson's disease. Melanins and melanosomes: biosynthesis, biogenesis, physiological, and pathological functions 2011; 225-246.
【非特許文献８】Asanuma M et al. Transplantation of melanocytes obtained from the skin ameliorates apomorphine-induced abnormal behavior in rodent hemi-parkinsonian models. PLoS One. 2013 8; e65983.
【非特許文献９】RO de Faria1, VR Moure1, MAL de A Amazonas, N Krieger and DA Mitchell: The Biotechnological Potential of Mushroom Tyrosinases. Food Technol. Biotechnol. 2007 45;287-294.
【非特許文献１０】E Chiacchierini, D Restuccia, G Vinci, Bioremediation offood industry effluents: Recent applications of free and immobilised polyphenoloxidases, Food Sci. Technol. Int. 2004 10;373-382.
【非特許文献１１】T Chen, HD Embree, LQ Wu, GF Payne, In vitro protein-polysaccharide conjugation: Tyrosinase-catalyzed conjugation of gelatin and chitosan, Biopolymers 2002 64;292-302.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、新規なチロシナーゼ活性増強剤とその利用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一実施態様は、有効成分として下記一般式（Ｉ）を有する化合物を含有する、チロシナーゼ活性増強剤、メラニン産生促進剤、メラニン産生促進用化粧品組成物、または医薬組成物である。
【００１３】
【化２】
2019043877.tif 000003
（Ｉ）
（式中、Ｒ１は、ＯＲ２またはＮＲ３Ｒ４であって、Ｒ２は水素またはＣ１〜３のアルキル基であり、Ｒ３及びＲ４は、水素またはＣ１〜３のアルキル基から独立して選択される基であるか、Ｒ３とＲ４が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする４員環、５員環、または６員環のアザシクロアルキル基を形成する。）
本発明の他の実施態様は、上記メラニン産生促進用化粧品組成物を含む化粧品、または上記医薬組成物を含む、尋常性白斑またはパーキンソン病の治療またはメラノーマの予防のための医薬である。
【００１４】
本発明のさらなる実施態様は、上記チロシナーゼ活性増強剤、上記メラニン産生促進剤、上記メラニン産生促進用化粧品組成物、または上記医薬組成物を含有する外用剤である。
【００１５】
本発明のさらなる実施態様は、下記一般式（ＩＩ）を有する化合物の存在下でチロシナーゼ活性を測定する方法である。
【００１６】
【化３】
2019043877.tif 000004
（ＩＩ）
（式中、Ｒ１は、ＯＲ５またはＮＲ６Ｒ７であって、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、水素、炭素原子１〜１２個を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基、炭素原子３〜６個を有するシクロアルキル基、炭素原子２〜６個と二重結合１又は２個を有するアルケニル基、炭素原子２〜６個と三重結合１又は２個を有するアルキニル基、アリール基、ハロ基、Ｃ１〜Ｃ１２ハロアルキル基、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル基、ホルミル基、オキシカルボニル基、カルボキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルカルボキシレート基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルアミド基、アミノカルボニル基、アミノ基、シアノ基、ジアゾ基、ニトロ基、チオ基、スルホキシル基、及びスルホニル基から成る群から独立して選択され、前記アリール基は、炭素環式アリール基又は複素環式アリール基であり、ここで、前記炭素環式アリールは原子６〜２０個を含み、前記複素環式アリールは炭素原子２〜２０個と、窒素、酸素及び硫黄から成る群より選ばれるヘテロ原子１〜５個を含むか、あるいはＲ６及びＲ７は、Ｒ６とＲ７が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする３〜８員環のアザシクロアルキル基を形成する。）
本発明のさらなる実施態様は、チロシナーゼ活性を増強する化合物のスクリーニング方法であって、上記測定方法を用いて、複数の前記化合物（ＩＩ）の存在下でチロシナーゼ活性を測定する工程と、前記複数の前記化合物（ＩＩ）の中から、チロシナーゼ活性を増強する化合物を特定する工程と、を含むスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によって、新規なチロシナーゼ活性増強剤およびその利用方法を提供することが可能になった。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。なお、本発明の目的、特徴、利点、および、そのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をこれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１９】
＝＝チロシナーゼ活性増強剤＝＝
本発明の一実施形態であるチロシナーゼ活性増強剤は、一般式（Ｉ）の化合物（本明細書では、化合物（Ｉ）と称する）を有効成分として含む。
【００２０】
【化４】
2019043877.tif 000005
（Ｉ）
（式中、Ｒ１は、ＯＲ２またはＮＲ３Ｒ４であって、Ｒ２は水素またはＣ１〜３のアルキル基であり、Ｒ３及びＲ４は、水素またはＣ１〜３のアルキル基から独立して選択される基であるか、Ｒ３とＲ４が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする４員環、５員環、または６員環のアザシクロアルキル基を形成する。）
化合物（Ｉ）は、４−フェニルフェノールの類縁体であり、４−フェニルフェノールが原料として、当業者に公知の方法で容易に化学合成できる。
【００２１】
本明細書で用いられるチロシナーゼ（EC1.14.18.1）の由来は特に限定されないが、マッシュルーム（Agaricus bisporus）由来であることが好ましく、哺乳類由来であることがより好ましく、ヒト由来であることがさらに好ましい。
【００２２】
このチロシナーゼ活性増強剤は、チロシナーゼのモノフェノラーゼ活性および／またはジフェノラーゼ活性を増強する効果を有する。従って、チロシナーゼのモノフェノラーゼ活性増強剤および／またはジフェノラーゼ活性増強剤として利用できる。
【００２３】
また、この活性増強効果は、試験管内であっても生体内などの細胞内であっても発揮され、従って、このチロシナーゼ活性増強剤は、メラニン産生促進剤として利用できる。メラニン産生促進剤の具体的な利用方法には、化粧品組成物および医薬組成物としての利用が含まれる。
【００２４】
このチロシナーゼ活性増強剤は、Ｌ-チロシンやＬ-ドーパなどのチロシナーゼの基質を含んでもよい。特に、モノフェノラーゼ活性増強剤はＬ-チロシンを含み、ジフェノラーゼ活性増強剤はＬ-ドーパを含むことが好ましい。
【００２５】
＝＝メラニン産生促進剤＝＝
本発明の一実施形態に係るメラニン産生促進剤は、上述のチロシナーゼ活性増強剤を有効成分として含有する。
【００２６】
メラノサイトなどのチロシナーゼを有する細胞を、化合物（Ｉ）に接触させることにより、細胞が化合物（Ｉ）を取り込み、細胞内のチロシナーゼ活性を増強する。活性化されたチロシナーゼは、Ｌ-チロシンを酸化してＬ-ドーパにする反応と、Ｌ-ドーパを酸化してドーパキノンにする反応の両方の反応を促進し、その結果、メラニンの産生が増強される。細胞は、培養細胞であっても、生体内の細胞であってもよい。細胞への化合物（Ｉ）の投与方法は特に限定されないが、培養細胞の場合は、培地に添加すればよく、生体内の細胞の場合は、経口投与であっても、非経口投与であってもよいが、塗布剤であることが好ましい。塗布を行う方法は特に限定されず、手で塗る、綿や繊維状の布で塗りつける、スプレーで吹きつける、などが例示できる。
【００２７】
＝＝化粧品＝＝
本発明の一実施形態に係るメラニン産生促進用化粧品組成物は、上述のチロシナーゼ活性増強剤を有効成分として含有する、すなわち、化合物（Ｉ）を有効成分として含む。この化粧品組成物を含む化粧品の形状は特に限定されず、例えば、クリーム、オイル、ローション、乳液、化粧水、美容液などが例示できる。
【００２８】
あらゆる人種において、肌の色を濃くすることについては、一定の需要がある。例えば、経済的なステータスであったり、ファッションの一部であったり、その目的は限定されないが、メラニン産生促進効果を有する化粧品を用いることで、肌の色を濃くするのが容易になる。また、紫外線によらずに肌の色を濃くできれば、特に白色人種にとって、メラノーマの発症率を下げることができる。
【００２９】
また、頭髪の毛包のメラノサイトのメラニン産生能力の低下による白髪化はチロシナーゼ活性増強剤を用いることで予防、抑制することができる。
【００３０】
＝＝治療薬＝＝
本発明の一実施形態に係る医薬組成物は、上述のチロシナーゼ活性増強剤を有効成分として含有する、すなわち、化合物（Ｉ）を有効成分として含む。
【００３１】
この医薬組成物を含む医薬の剤形は特に限定されず、経口剤であっても非経口剤であってもよいが、非経口剤の場合、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、スプレー剤、液剤などの外用剤であることが好ましい。
【００３２】
この医薬は、尋常性白斑またはパーキンソン病の治療、またはメラノーマの予防に用いることができる。尋常性白斑の治療では、Ｎａｒｒｏｗ‐Ｂａｎｄ  ＵＶＢ（ＮＢＵＶＢ）照射による治療と併用することが好ましい。
【００３３】
＝＝試薬＝＝
本発明の一実施形態に係る試薬組成物は、上述のチロシナーゼ活性増強剤を有効成分として含有する、すなわち、化合物（Ｉ）を有効成分として含む。
【００３４】
チロシナーゼは、還元剤の存在下でモノフェノールをо−ジフェノールにするо−ヒドロキシル化反応、およびо−ジフェノールをｏ−キノンにする酸化反応を触媒する。従って、この試薬組成物は、チロシナーゼによるフェノール系化合物の除去を促進する試薬として利用できる。フェノール系化合物を除去する対象としての液体は特に限定されないが、飲料用液体または廃水であることが好ましい。
【００３５】
上述の酸化反応でできたキノンは、酵素の非存在下でオリゴマー化し、より安定な高分子量のポリマーが生成する。あるいは、ｏ−キノンは、タンパク質同士をクロスリンクさせ、タンパク質のネットワークを作製することができる。また、チロシナーゼは、ゼラチンのチロシン残基を酸化し、キトサンのアミノ基と反応させることで、ゼラチンとキトサンをクロスリンクさせ、ゲルを生じさせる。従って、この試薬組成物は、チロシナーゼによるポリマー形成を促進する試薬として利用できる。
【００３６】
＝＝チロシナーゼ活性を測定する方法＝＝
本発明の一実施形態に係るチロシナーゼ活性測定方法は、下記一般式（ＩＩ）を有する化合物（本明細書では、化合物（ＩＩ）と称する）の存在下でチロシナーゼ活性を測定する方法である。
【００３７】
【化５】
2019043877.tif 000006
（ＩＩ）
（式中、Ｒ１は、ＯＲ５またはＮＲ６Ｒ７であって、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、水素、炭素原子１〜１２個を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基、炭素原子３〜６個を有するシクロアルキル基、炭素原子２〜６個と二重結合１又は２個を有するアルケニル基、炭素原子２〜６個と三重結合１又は２個を有するアルキニル基、アリール基、ハロ基、Ｃ１〜Ｃ１２ハロアルキル基、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルカルボニル基、ホルミル基、オキシカルボニル基、カルボキシ基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルカルボキシレート基、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルアミド基、アミノカルボニル基、アミノ基、シアノ基、ジアゾ基、ニトロ基、チオ基、スルホキシル基、及びスルホニル基から成る群から独立して選択され、前記アリール基は、炭素環式アリール基又は複素環式アリール基であり、ここで、前記炭素環式アリールは原子６〜２０個を含み、前記複素環式アリールは炭素原子２〜２０個と、窒素、酸素及び硫黄から成る群より選ばれるヘテロ原子１〜５個を含むか、あるいはＲ６及びＲ７は、Ｒ６とＲ７が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする３〜８員環のアザシクロアルキル基を形成する。）
酵素活性を測定する具体的な方法は特に限定されないが、Ｌ‐チロシンまたはＬ‐ドーパの基質をチロシナーゼに作用させて反応させ、経時的に４７５ｎｍの吸光度を測定することによって、反応産物であるドーパキノンを定量し、その増加量の変化、すなわち反応速度（例えば、y軸に蓄積量、x軸に時間をとったグラフにおいて、そのグラフの傾き）を酵素活性の指標とすることができる。
【００３８】
マッシュルーム・チロシナーゼは、細胞質中に遊離している酵素であるので、適当なバッファー中で、Ｌ‐チロシンやＬ−ＤＯＰＡなどの基質を酵素に接触させることで、基質が酵素から触媒作用を受ける。しかし、ヒト・チロシナーゼは膜結合型酵素であるため、細胞から得た酵素を用いたアッセイ系が好ましい。例えば、界面活性剤を含んだバッファーにメラノサイト由来の細胞を懸濁し、ホモジェナイズした後、遠心して上清を回収し、粗酵素液として用いることができる。細胞は、ヒト・メラノサイト由来であれば、生体から単離された細胞であっても、培養細胞であってもよく、正常細胞であっても、メラノーマ細胞であってもよい。必要に応じて、ウルトラフィルトレーションで粗酵素液を濃縮したり、透析でアッセイバッファーに置換したりしてもよい。アッセイバッファーは特に限定されないが、リン酸緩衝液が好ましく、マッキルベイン緩衝液がより好ましい。こうして得られた粗酵素液を基質に接触させることによって、基質が酵素から触媒作用を受ける。そして、触媒反応後の反応産物を吸光度などで検出することにより、酵素活性の指標とすることができる。
【００３９】
ドーパキノンを定量する代わりに、Ｌ‐チロシンをチロシナーゼに作用させて反応させ、反応産物であるＬ‐ドーパと３‐Ｍｅｔｈｙｌ‐２‐ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｏｎｅｈｙｄｒａｚｏｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＭＢＴＨ）の呈色反応により生じる色素の極大吸収波長である５０５ｎｍの吸光度を測定することによって、Ｌ‐ドーパの生成量を酵素活性の指標とすることもできる。あるいは、反応速度ではなく、反応を開始して一定時間後の反応産物（Ｌ‐ドーパやドーパキノン）の生成量を測定することによって、その生成量を酵素活性の指標とすることもできる。
【００４０】
＝＝チロシナーゼ活性を増強する化合物のスクリーニング方法＝＝
本発明の一実施形態に係るスクリーニング方法は、複数の化合物（ＩＩ）の存在下でチロシナーゼ活性を測定する工程と、その化合物の中から、チロシナーゼ活性を増強する化合物を特定する工程と、を含む。この時の測定方法は、上述したチロシナーゼ活性を測定する方法に準じる。そして、化合物を添加していない時の酵素の活性と比較し、化合物を添加した場合に酵素の活性が増大するような化合物を特定することによって、チロシナーゼ活性を増強する化合物を得ることができる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、下記の実施例は本発明の範囲を限定するために記載されるものではない。
【００４２】
［実施例１］
本実施例では、４‐フェニルフェノール類縁体である下記化合物１〜５が、マッシュルーム・チロシナーゼ活性を増強することを示す。
【００４３】
【化６】
2019043877.tif 000007
まず、４‐フェニルフェノール化合物１〜５（Combi-blocks社より購入）をＤＭＳＯに溶解した、５０μＭまたは１５０μＭの４‐フェニルフェノール化合物溶液を調製した。９６穴マイクロタイタープレートを用い、これらの４‐フェニルフェノール化合物溶液２μｌに対し、マッシュルーム・チロシナーゼ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を４００Ｕ／ｍｌに調製したマッシュルーム・チロシナーゼ溶液１０μｌと、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を３８μｌ加えた。その後、基質となる０．２ｍＭのＬ‐チロシン（和光純薬工業株式会社製）を５０μｌ又は１．０ｍＭのＬ‐ＤＯＰＡ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を５０μｌ加えた時点を反応開始時とし、３０℃でインキュベートしながら、Ｌ‐チロシンを加えたウエルは反応開始後６０秒ごとに、Ｌ‐ＤＯＰＡを加えたウエルは反応開始後３０秒ごとに、４７５ｎｍの波長における吸光度を測定した。吸光度測定終了後、x軸に時間を、y軸に吸光度をプロットしたグラフを作成し、比例部分の直線の傾きを求め、酵素活性とした。なお、コントロールとして、４‐フェニルフェノール化合物１〜５の代わりにＤＭＳＯを加えた試料を用い、同様に酵素活性を算出し、コントロールの酵素活性に対する、化合物添加時の酵素活性の割合（比活性）を求めた。表１に算出した結果を示す。
【００４４】
【表１】
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表１に示すように、化合物１〜５のいずれも、マッシュルーム・チロシナーゼの活性を増強する。特に、化合物３〜５は、マッシュルーム・チロシナーゼ活性を顕著に増強する。
【００４５】
［実施例２］
本実施例では、実施例１でマッシュルーム・チロシナーゼ活性を顕著に増強した化合物３〜５が、ヒト・チロシナーゼ活性を増強することを示す。
【００４６】
ヒトメラノーマ由来細胞株Ｇ-３６１細胞をＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地（１０％ＦＢＳ及び規定量のペニシリン／ストレプトマイシン（和光純薬工業株式会社製）を含む）で培養し、８０％コンフルエントの状態で回収した。回収した細胞に０．１％ＮＰ‐４０を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加え、氷上で１０分間静置した後、ポッター型ホモジェナイザーで２０回ストロークした。その後８００×ｇで遠心を行い、上清を１０，０００分子量カットのＡｍｉｃｏｎ（登録商標）  Ｕｌｔｒａ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に移し、さらに１，４００×ｇで遠心を行った。その後溶媒を透析法により、アッセイバッファーである１００ｍＭマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．４）に置換し、粗酵素液を得た。
【００４７】
化学合成した４‐フェニルフェノール化合物３〜５をそれぞれ、ＤＭＳＯに溶解し、５００μＭの化合物溶液を調整した。９６穴マイクロタイタープレートを用い、化合物溶液３〜５をウエルに２μｌずつアプライし、１８μｌのアッセイバッファーを加えた。その後、上述の操作で得た粗酵素液３０μｌを加え、基質溶液を５０μｌ加えた。この基質溶液は、１００ｍＭ  ３‐Ｍｅｔｈｙｌ‐２‐ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｏｎｅｈｙｄｒａｚｏｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＭＢＴＨ）５μｌ、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド４０μｌ、２ｍＭ  Ｌ−チロシン５００μｌ、１ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡ１μｌ、マッキルベイン緩衝液(ｐＨ５．４)４３４μｌより構成される。５０μｌの基質溶液（０．５ｍＭのＬ‐チロシン及び０．５μＭのＬ‐ＤＯＰＡを含有する）を加えた時点を反応開始時とし、３０℃でインキュベートしながら、反応開始時から５分ごとに、５０５ｎｍの波長における吸光度を測定し、上述の式（Ｉ）を用いて比活性を算出した。その結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
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表２に示すように、化合物３〜５は、全てヒト・チロシナーゼのモノフェノラーゼ活性を増強する。