(57)【要約】【課題】効率的に病理診断等において有効な情報を取得できる粒子測定方法、検体処理方法、および粒子撮像装置を提供する。【解決手段】粒子測定方法は、粒子内の標的核酸を粒子内で標識および増幅する工程（Ｓ１３）と、粒子の表面の標的ポリペプチドおよび／または標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識する工程（Ｓ１４）と、標識された標的核酸と、標識された標的ポリペプチドおよび／または標識された他の標的核酸と、を測定する工程（Ｓ２）と、を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子内の標的核酸を前記粒子内で標識および増幅する工程と、
前記粒子の標的ポリペプチドおよび／または前記標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識する工程と、
標識された前記標的核酸と、標識された前記標的ポリペプチドおよび／または標識された前記他の標的核酸と、を測定する工程と、を含む、粒子測定方法。
【請求項２】
前記粒子の標的ポリペプチドおよび／または前記標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識する工程において、前記粒子の表面の標的ポリペプチドを標識し、
標識された前記標的核酸と、標識された前記標的ポリペプチドおよび／または前記他の標的核酸と、を測定する工程において、標識された前記標的核酸および標識された前記標的ポリペプチドを測定する、請求項１に記載の粒子測定方法。
【請求項３】
前記粒子内の前記標的核酸を前記粒子内で標識および増幅する工程と、前記粒子の前記標的ポリペプチドおよび／または前記標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識する工程とを行った後に、標識された前記標的核酸と、標識された前記標的ポリペプチドおよび／または前記他の標的核酸と、を測定する工程を行う、請求項１または２に記載の粒子測定方法。
【請求項４】
標識された前記標的核酸と、標識された前記標的ポリペプチドおよび／または前記他の標的核酸と、を測定する工程において、前記粒子の画像を撮像する工程を含む、請求項１ないし３の何れか一項に記載の粒子測定方法。
【請求項５】
標識された前記標的核酸と、標識された前記標的ポリペプチドおよび／または前記他の標的核酸と、を測定する工程において、標識された前記標的核酸と、標識された前記標的ポリペプチドおよび／または前記他の標的核酸と、を含む液体をフローセルに流し、前記フローセル中の前記液体に光を照射することにより得られた光を撮像する、請求項１ないし４の何れか一項に記載の粒子測定方法。
【請求項６】
標識された前記標的核酸と、標識された前記標的ポリペプチドおよび／または前記他の標的核酸と、を測定する工程の後に、撮像した前記画像を分析する工程を行う、請求項１ないし５の何れか一項に記載の粒子測定方法。
【請求項７】
前記標的核酸を第１標識物質で標識し、前記標的ポリペプチドおよび／または前記標的核酸とは異なる他の標的核酸を前記第１標識物質と異なる第２標識物質で標識する、請求項１ないし６の何れか一項に記載の粒子測定方法。
【請求項８】
前記粒子内の前記標的核酸を前記粒子内で標識および増幅する工程において、前記粒子および前記標的核酸を標識する標識物質を含む混合液を調製し、
前記混合液は、プロテアーゼを実質的に含まない、請求項１ないし７の何れか一項に記載の粒子測定方法。
【請求項９】
前記混合液は、ポリメラーゼをさらに含む、請求項８に記載の粒子測定方法。
【請求項１０】
前記混合液は、プライマーをさらに含む、請求項８または９に記載の粒子測定方法。
【請求項１１】
前記粒子を含む液体の温度を２５℃以上９５℃以下とした後に、前記粒子内の前記標的核酸を前記粒子内で標識および増幅する工程を行う、請求項１ないし１０の何れか一項に記載の粒子測定方法。
【請求項１２】
前記粒子を含む液体の温度を２５℃以上７５℃以下とした後に、前記粒子内の前記標的核酸を前記粒子内で標識および増幅する工程を行う、請求項１ないし１１の何れか一項に記載の粒子測定方法。
【請求項１３】
前記標的核酸を標識および増幅する工程の後に、前記標的ポリペプチドおよび／または前記標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識する工程を行う、請求項１ないし１２の何れか一項に記載の粒子測定方法。
【請求項１４】
前記標的ポリペプチドおよび／または前記標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識する工程において、前記標的ポリペプチドと特異的に結合する標識抗体により前記標的ポリペプチドを標識する、請求項１ないし１３の何れか一項に記載の粒子測定方法。
【請求項１５】
前記粒子の標的ポリペプチドおよび／または前記標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識する工程において、前記粒子に含まれる標的ポリペプチドを標識し、
標識された前記標的核酸と、標識された前記標的ポリペプチドおよび／または前記他の標的核酸と、を測定する工程において、標識された前記標的核酸および標識された前記標的ポリペプチドを測定する、請求項１ないし１４何れか一項に記載の粒子測定方法。
【請求項１６】
前記粒子の標的ポリペプチドおよび／または前記標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識する工程において、前記標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識し、
標識された前記標的核酸と、標識された前記標的ポリペプチドおよび／または前記他の標的核酸と、を測定する工程において、標識された前記標的核酸とは異なる他の標的核酸を測定する、請求項１ないし１５何れか一項に記載の粒子測定方法。
【請求項１７】
粒子および前記粒子内の標的核酸と結合する標識プローブを含み、プロテアーゼを実質的に含まない混合液を調製する工程と、
前記粒子内の前記標的核酸を増幅する工程と、
を含む、検体処理方法。
【請求項１８】
前記混合液は、ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１７に記載の検体処理方法。
【請求項１９】
前記混合液は、プライマーをさらに含む、請求項１７または１８に記載の検体処理方法。
【請求項２０】
前記粒子を含む液体の温度を２５℃以上９５℃以下とした後に、前記混合液を調製する工程を行う、請求項１７ないし１９の何れか一項に記載の検体処理方法。
【請求項２１】
前記粒子を含む液体の温度を２５℃以上７５℃以下とした後に、前記混合液を調製する工程を行う、請求項１７ないし１９の何れか一項に記載の検体処理方法。
【請求項２２】
前記標的核酸を標識および増幅する工程の後に、標識された前記標的核酸を測定する工程を行う、請求項１７ないし２１の何れか一項に記載の検体処理方法。
【請求項２３】
標識された前記標的核酸を測定する工程において、前記粒子の画像を撮像する工程を含む、請求項２２に記載の検体処理方法。
【請求項２４】
前記粒子の画像を撮像する工程において、標識された前記標的核酸を含む液体をフローセルに流し、前記フローセル中の前記液体に光を照射することにより得られた光を撮像する、請求項２３に記載の検体処理方法。
【請求項２５】
標識された前記標的核酸を測定する工程の後に、撮像した前記画像を分析する工程を含む、請求項２２ないし２４の何れか一項に記載の検体処理方法。
【請求項２６】
粒子内の標的核酸が前記粒子内で標識および増幅され、前記粒子の標的ポリペプチドおよび／または前記標的核酸とは異なる他の標的核酸が標識された前記粒子を含む液体を流すフローセルと、
前記フローセルに光を照射する光源と、
前記光源から光を照射することにより前記液体中の粒子から得られた光を撮像する撮像部と、を備える、粒子撮像装置。
【請求項２７】
前記フローセルは、粒子内の標的核酸が前記粒子内で標識および増幅され、前記粒子の表面の標的ポリペプチドが標識された前記粒子を含む液体を流す、請求項２６に記載の粒子撮像装置。
【請求項２８】
前記撮像部は、前記標的核酸を標識する第１標識物質から得られる蛍光と、前記標的ポリペプチドおよび／または前記標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識する第２標識物質から得られる蛍光と、を撮像する、請求項２６または２７に記載の粒子撮像装置。
【請求項２９】
前記液体は、プロテアーゼを実質的に含まない、請求項２６ないし２８の何れか一項に記載の粒子撮像装置。
【請求項３０】
前記撮像部は、ＣＣＤカメラである、請求項２６ないし２９の何れか一項に記載の粒子撮像装置。
【請求項３１】
前記撮像部は、ＴＤＩカメラである、請求項２６ないし３０の何れか一項に記載の粒子撮像装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子測定方法、検体処理方法、および粒子撮像装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
異常細胞を検出する方法として、目的の核酸を標的核酸として増幅させるｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ法がある。非特許文献１では、大腸菌内の特定の核酸を検出する実験が開示されている。図１６に示すように、この実験では、オペレータは大腸菌をホルマリンで固定した後、大腸菌をプロテアーゼ処理し、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマー等の試薬を大腸菌内に浸透させて、大腸菌内で標的核酸を増幅させる。オペレータは、蛍光顕微鏡で標的核酸の存在を確認する。このように、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ法は、標的核酸を増幅させることにより、確実に標的核酸を検出することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】黒川顕ほか、「Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ法による腸管出血性大腸菌の検出」、日本細菌学雑誌、５２（２）、５１３−５１８、１９９７年、日本細菌学会
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
細胞や細菌等に異常があり、その原因が核酸である場合、非特許文献１に開示されている手法は有効である。しかし、異常の原因が核酸でなかった場合、他の原因として、タンパク質等のポリペプチドの異常が挙げられる。あるいは、核酸およびポリペプチドの両方に異常が存在する場合もある。
【０００５】
また、たとえば、細胞に含まれている複数の核酸に異常の原因がある場合、それぞれの核酸に対して有効な検出方法を用いて異常を発見することは、適切な病理診断を行ううえで重要である。
【０００６】
本発明は、効率的に病理診断等において有効な情報を取得できる粒子測定方法、検体処理方法、および粒子撮像装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様は、粒子測定方法に関する。本態様の粒子測定方法は、粒子内の標的核酸を粒子内で標識および増幅する工程と（Ｓ１３）と、粒子の標的ポリペプチドおよび／または標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識する工程（Ｓ１４）と、標識された標的核酸と、および標識された標的ポリペプチドおよび／または標識された他の標的核酸と、を測定する工程（Ｓ２）と、を含む。
【０００８】
「粒子」とは、検体に含まれる細胞や細菌等を意味する。また、測定対象となる粒子は、小胞体のエクソソーム等であってもよい。上記した「検体」とは、人から直接採取した血液や皮膚等の組織片等を意味する。「ポリぺプチド」とは、アミノ酸残基がペプチド結合により繋がった分子であり、たとえば、比較的分子量の小さいアミノ酸重合体や、分子量の大きいタンパク質も含む。
【０００９】
また、「標的核酸の標識および増幅」とは、単に、粒子内に存在する核酸すなわちＤＮＡやメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を増幅させるという意味に限られない。たとえば、近年、盛んに研究されている細胞外小胞の一種であるエクソソームの内部にはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等のノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、およびこれらによって制御された核酸もまた対象に含まれる。標的核酸の増幅においては、このｍｉＲＮＡを増幅するのに限られず、ｍｉＲＮＡから転写された核酸が増幅されてもよい。本態様に係る粒子測定方法では、以上のような核酸を含む全ての粒子が測定対象となる。以下、「標的核酸の標識および増幅」とは同様の意味として説明する。
【００１０】
「他の標的核酸」とは、互いに異なる遺伝子情報を有する２つの標的核酸のうち、一方の標的核酸を意味する。また、核酸の塩基配列において、互いに異なる２つの領域のうち、一方の領域を意味する場合も含まれる。上記の標的核酸および他の標的核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。
【００１１】
本態様に係る粒子測定方法によれば、１つの細胞に対し、標的核酸の増幅と標識、および標的ポリペプチドの標識を同時に行うかあるいは、１つの細胞に対し、互いに異なる２つの標的核酸の標識を同時に行うことが可能である。また、上記の構成であれば、１つの細胞について、核酸の異常の有無とポリペプチドの異常の有無、あるいは、互いに異なる２つの核酸の異常の有無について、それぞれの情報を相補的に関連付けることができるため、病理診断等において有効な情報を得ることができる。
【００１２】
また、本態様に係る粒子測定方法において、標的核酸の標識および標的核酸の増幅は、どちらを先に行っても構わない。以下、「標的核酸の標識および増幅」は、同様である。
【００１３】
本態様に係る粒子測定方法において、粒子の標的ポリペプチドおよび／または標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識する工程（Ｓ１４）では、粒子の表面の標的ポリペプチドを標識し、標識された標的核酸と、標識された標的ポリペプチドおよび／または他の標的核酸と、を測定する工程（Ｓ２）において、標識された標的核酸および標識された標的ポリペプチドを測定するよう構成され得る。
【００１４】
本態様に係る粒子測定方法によれば、１つの細胞に対し、標的核酸の増幅と標識、および標的ポリペプチドの標識を同時に行うことができる。また、１つの細胞について、核酸の異常の有無とポリペプチドの異常の有無の両方の情報を取得することができるため、１つの細胞に対する評価の信頼性が向上する。
【００１５】
本態様に係る粒子測定方法において、粒子内の標的核酸を粒子内で標識および増幅する工程（Ｓ１３）と、粒子の標的ポリペプチドおよび／または標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識する工程（Ｓ１４）とを行った後に、標識された標的核酸と、標識された標的ポリペプチドおよび／または他の標的核酸と、を測定する工程（Ｓ２）を行い得る。
【００１６】
標識された標的核酸と、標識された標的ポリペプチドまたは他の標的核酸を測定する方法として、たとえば、光源からの光が照射されたフローセルに測定試料、つまり、標識された標的核酸と、標識された標的ポリペプチドまたは標識された他の標的核酸が含まれる液体を流して液体から生じた光を撮像する方法や、蛍光顕微鏡で撮像する方法等がある。このような測定により、同一の粒子に対して標的核酸の増幅と、標的ポリペプチドの標識または他の標的核酸の増幅が行われていたかを評価できる。
【００１７】
本態様に係る粒子測定方法において、標識された標的核酸と、標識された標的ポリペプチドおよび／または他の標的核酸と、を測定する工程（Ｓ２）は、粒子の画像を撮像する工程を含むよう構成され得る。
【００１８】
これにより、オペレータは、標的核酸の増幅の有無と、標的ポリペプチドまたは他の標的核酸の増幅の有無とを視覚的に確認することができる。
【００１９】
本態様に係る粒子測定方法において、標識された標的核酸と、標識された標的ポリペプチドおよび／または他の標的核酸と、を測定する工程（Ｓ２）は、標識された標的核酸と、標識された標的ポリペプチドおよび／または他の標的核酸と、を含む液体をフローセル（１０）に流し、フローセル（１０）中の液体に光を照射することにより得られた光を撮像するよう構成され得る。
【００２０】
これにより、多量の粒子について、異常の原因が、核酸であるのかポリペプチドであるのか、または、その両方であるのかを測定できる。あるいは、互いに異なる核酸によって異常が生じたのかを測定できる。よって、測定結果の信頼性が向上する。
【００２１】
本態様に係る粒子測定方法において、標識された標的核酸と、標識された標的ポリペプチドおよび／または他の標的核酸と、を測定する工程（Ｓ２）の後に、撮像した画像を分析する工程（Ｓ３）を行い得る。
【００２２】
このように、撮像された画像に基づいて、粒子の異常の原因が、核酸であるのかポリペプチドであるのか、または、その両方であるのかを、精度よく評価できる。あるいは、互いに異なる核酸どうしによって異常が生じたのかを精度よく評価できる。
【００２３】
本態様に係る粒子測定方法において、標的核酸を第１標識物質で標識し（Ｓ１３）、標的ポリペプチドおよび／または標的核酸とは異なる他の標的核酸を第１標識物質と異なる第２標識物質で標識する（Ｓ１４）ように行い得る。
【００２４】
このように、標的核酸と、標的ポリペプチドまたは他の標的核酸のそれぞれを標識すれば、標的核酸が増幅されたか否か、標的ポリペプチドが標識物質で標識されたか否か、また、他の標的核酸が増幅されたか否か、を適切に判定することができる。
【００２５】
本態様に係る粒子測定方法において、粒子内の標的核酸を粒子内で標識および増幅する工程（Ｓ１３）は、粒子および標的核酸を標識する標識物質を含む混合液を調製する。この場合、混合液は、プロテアーゼを実質的に含まないよう調製され得る。
【００２６】
標的核酸の増幅に供するための混合液の調製を、混合液にプロテアーゼが含まれている状態で行った場合、プロテアーゼの作用により、粒子の表面のポリペプチドは分解されてしまう。このような混合液に含まれている粒子に対して、標的ポリペプチドの標識を行うことはできない。これに対して、混合液の調製を、プロテアーゼを実質的に含まない状態で行った場合、粒子の表面のポリペプチドは、完全には分解されない。これにより、本態様に係る粒子測定方法であれば、標的ポリペプチドを標識することができる。これにより、１つの粒子から、標的核酸に基づく情報を得ながら、同時に、標的ポリペプチドに基づく情報を取得できる。よって、粒子の評価をより正確に行い得る。
【００２７】
この場合、混合液は、ポリメラーゼを含むよう調製され、また、プライマーをさらに含むよう調製され得る。これにより、標的核酸の増幅に必要な試薬が混合液に添加され、粒子内の標的核酸の増幅が適切に進行し得る。
【００２８】
本態様に係る粒子測定方法において、粒子を含む液体の温度を２５℃以上９５℃以下とした（Ｓ１２）後に、粒子内の標的核酸を粒子内で標識および増幅する工程（Ｓ１３）を行い得る。
【００２９】
粒子を含む液体をこのような範囲の温度に調整した場合、粒子の表面のポリペプチドの隙間は広がるが、ポリペプチドが完全に分解されることがない。そのため、粒子は、表面のポリペプチドの形状を維持した状態で液体中に残存する。そして、隙間が広がったことにより、粒子の内部に試薬が効率よく浸透する。よって、粒子の内部には標的核酸の増幅に要する試薬が十分に存在するため、標的核酸の増幅がスムーズに進行する。また、上記のとおり、粒子は完全に分解されていないため、同一の粒子に対して、標的ポリペプチドの標識を行い得る。
【００３０】
本態様に係る粒子測定方法において、粒子を含む液体の温度を２５℃以上７５℃以下とした（Ｓ１２）後に、粒子内の標的核酸を粒子内で標識および増幅する工程（Ｓ１３）を行い得る。
【００３１】
粒子を含む液体をこのような範囲の温度に調整した場合、粒子は、表面のポリペプチドの形状を維持した状態で液体中に残存し、粒子の内部に試薬がより一層効率よく浸透する。よって、標的核酸の増幅反応がより一層スムーズに進行する。また、上記のとおり、粒子の表面のポリペプチドは完全に分解されていないため、同一の粒子に対して、標的ポリペプチドの標識を行い得る。
【００３２】
本態様に係る粒子測定方法において、標的核酸を標識および増幅する工程（Ｓ１３）の後に、標的ポリペプチドおよび／または標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識する工程（Ｓ１４）を行い得る。
【００３３】
このように、標的核酸を増幅した後、同一の粒子に対して、標的ポリペプチドを標識する工程または他の標的核酸を標識する工程を行うことにより、標的核酸と、標的ポリペプチドまたは他の標的核酸とに関する情報を一度に取得できる。よって、１つの粒子に対する評価の信頼性が上がる。
【００３４】
本態様に係る粒子測定方法において、標的ポリペプチドおよび／または標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識する工程（Ｓ１４）は、標的ポリペプチドと特異的に結合する標識抗体により標的ポリペプチドを標識するように行い得る。
【００３５】
これにより、目的とする標的ポリペプチドが粒子の表面あるいは内部に含まれているか否かを、適切に判定することができる。
【００３６】
本態様に係る粒子測定方法において、粒子の標的ポリペプチドおよび／または標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識する工程（Ｓ１４）は、粒子に含まれる標的ポリペプチドを標識し、標識された標的核酸と、標識された標的ポリペプチドおよび／または他の標的核酸と、を測定する工程（Ｓ２）において、標識された標的核酸および標識された標的ポリペプチドを測定するよう構成され得る。
【００３７】
「粒子に含まれる標的ポリペプチド」とは、粒子の表面に位置する標的ポリペプチド、および粒子の内部に存在する標的ポリペプチドを意味する。
【００３８】
本態様に係る粒子測定法によれば、１つの細胞に対し、標的核酸の増幅と標識、および標的ポリペプチドの標識を同時に行うことができる。疾患の原因は、複数の遺伝子異常が組み合わさって生じる場合がある。そのため、１つのみの標的核酸に関する情報では、充分な診断を行うことが出来ない。本態様の構成であれば、１つの細胞内に含まれる標的核酸および標的ポリペプチドについて、異常の有無を調べることができる。そして、これらの情報を相補的に関連付けることで、病理診断等において有効な情報を得ることができる。
【００３９】
本態様に係る粒子測定方法において、粒子の標的ポリペプチドおよび／または標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識する工程は（Ｓ１４）、標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識し、標識された標的核酸と、標識された標的ポリペプチドおよび／または他の標的核酸と、を測定する工程（Ｓ２）において、標識された標的核酸とは異なる他の標的核酸を測定するよう構成され得る。
【００４０】
本態様に係る粒子測定法によれば、１つの細胞に対し、異なる２つの標的核酸について、標識および増幅を同時に行うことができる。よって、それぞれの標的核酸の異常の有無を調べることができる。そして、これらの情報を相補的に関連付けることで、病理診断等において有効な情報を得ることができる。
【００４１】
本発明の第２の態様は、検体処理方法に関する。本態様に係る検体処理方法は、粒子および粒子内の標的核酸と結合する標識プローブを含み、プロテアーゼを実質的に含まない混合液を調製する工程と、粒子内の標的核酸を増幅する工程（Ｓ１３）と、を含む。
【００４２】
本態様に係る検体処理方法において、混合液の調製は、プロテアーゼを実質的に含まない状態で行われる。これは、つまり、混合液にプロテアーゼが添加されていないか、あるいは、混合液にプロテアーゼは添加されているものの、プロテアーゼの効果が低い状態であることを意味する。通常、粒子内の標的核酸の増幅は、プロテアーゼ処理を施してから行われるが、本態様であれば、プロテアーゼ処理は不要となる。よって、通常、混合液にプロテアーゼ処理を施した場合、プロテアーゼを失活させる処理も行うが、そのような処理も不要である。よって、標的核酸の増幅に掛かる手間が省かれ、標的核酸の増幅が効率よく進行する。また、プロテアーゼおよびプロテアーゼを失活させる試薬が不要であるため、コスト削減に寄与する。
【００４３】
また、混合液は、プロテアーゼを実質的に含まないため、粒子の表面のポリペプチドは、完全に分解されない。よって、たとえば、粒子に対して標的核酸の増幅を行った後、続けて、粒子の表面のポリペプチドに対して標的ポリペプチドの標識を行い、標的ポリペプチドの異常の有無を調べることができる。このように、同一の粒子に対して行い得る検査が増える。
【００４４】
本態様に係る検体処理方法において、混合液は、ＤＮＡポリメラーゼをさらに含むよう構成され、また、プライマーをさらに含むよう調製され得る。これにより、標的核酸の増幅に必要な試薬が混合液に添加され、粒子内の標的核酸の増幅が適切に進行し得る。
【００４５】
本態様に係る検体処理方法において、粒子を含む液体の温度を２５℃以上９５℃以下とした（Ｓ１２）後に、混合液を調製する工程を行い得る。これにより、第１の態様と同様に、標的核酸の増幅反応がスムーズに進行する。また、標的核酸の増幅反応にプロテアーゼ処理を必要としないため、プロテアーゼおよびプロテアーゼを失活させる試薬が不要となり、コスト削減に寄与する。
【００４６】
本態様に係る検体処理方法において、粒子を含む液体の温度を２５℃以上７５℃以下とした（Ｓ１２）後に、混合液を調製する工程を行い得る。これにより、第１の態様と同様に、標的核酸の増幅反応がより一層スムーズに進行する。
【００４７】
本態様に係る検体処理方法において、標的核酸を標識および増幅する工程（Ｓ１３）の後に、標識された標的核酸を測定する工程（Ｓ２）を行うよう構成され得る。
【００４８】
標的核酸の増幅が適切に行われていたかを測定する方法として、たとえば、光源からの光が照射されたフローセルに測定試料、つまり、標識された標的核酸および標識された標的ポリペプチドが含まれる液体を流して液体から生じた光を撮像する方法や、蛍光顕微鏡で撮像する方法等がある。このような測定により、標的核酸の増幅が行われていたかを評価できる。
【００４９】
本態様に係る検体処理方法において、標識された標的核酸を測定する工程（Ｓ２）は、粒子の画像を撮像する工程を含むよう構成され得る。
【００５０】
これにより、オペレータは、標的核酸の増幅の有無を視覚的に確認することができる。
【００５１】
本態様に係る検体処理方法において、粒子の画像を撮像する工程は、標識された標的核酸を含む液体をフローセル（１０）に流し、フローセル（１０）中の液体に光を照射することにより得られた光を撮像するよう構成され得る。
【００５２】
これにより、多量の粒子について、標的核酸の増幅の有無を確認することができる。よって、測定結果の信頼性が向上する。
【００５３】
本態様に係る検体処理方法において、標識された標的核酸を測定する工程（Ｓ２）の後に、撮像した画像を分析する工程を行い得る。
【００５４】
このように、撮像された画像に基づいて、粒子の異常の原因を精度よく評価できる。
【００５５】
本発明の第３の態様は、粒子撮像装置に関する。本態様に係る粒子撮像装置は、粒子内の標的核酸が粒子内で標識および増幅され、粒子の標的ポリペプチドおよび／または標的核酸とは異なる他の標的核酸が標識された粒子を含む液体を流すフローセル（１０）と、フローセル（１０）に光を照射する光源と、光源から光を照射することにより液体中の粒子から得られた光を撮像する撮像部（１５４）と、を備える。
【００５６】
これにより、第１の態様と同様に、同一の粒子について、標的核酸の増幅と、標的ポリペプチドの標識または他の標的核酸の増幅が行われたか否かを効率よく測定することができる。
【００５７】
本態様に係る粒子撮像装置において、フローセル（１０）は、粒子内の標的核酸が粒子内で標識および増幅され、粒子の表面の標的ポリペプチドが標識された粒子を含む液体を流すよう構成され得る。
【００５８】
これにより、多量の粒子について、異常の原因が、核酸であるのかポリペプチドであるのかを測定できる。よって、測定結果の信頼性が向上する。
【００５９】
本態様に係る粒子撮像装置において、撮像部は、標的核酸を標識する第１標識物質から得られる蛍光と、標的ポリペプチドおよび／または標的核酸とは異なる他の標的核酸を標識する第２標識物質から得られる蛍光と、を撮像するよう構成され得る。
【００６０】
これにより、同一の粒子について、標的核酸の増幅の有無と、標的ポリペプチドの標識の有無または他の標的核酸の増幅の有無とが明確に判別することができる。よって、測定対象の粒子について、異常の原因が、核酸であるのかポリペプチドであるのか、または、その両方であるのかを測定できる。あるいは、互いに異なる２つの核酸の両方であるのか、または、どちらか一方であるのかを測定できる。よって、測定結果の信頼性が向上する。
【００６１】
本態様に係る粒子撮像装置において、液体は、プロテアーゼを実質的に含まないよう構成され得る。
【００６２】
これにより、標的核酸の標識および増幅と、標的ポリペプチドの標識とがされた液体に対して、プロテアーゼを失活させる処理は不要であるため、手間が省かれる。また、プロテアーゼおよびプロテアーゼを失活させる試薬が不要であるため、コスト削減に寄与する。
【００６３】
本態様に係る粒子撮像装置において、撮像部（１５４）は、ＣＣＤカメラであるよう構成され得る。撮像部がＣＣＤ（Charge-Coupled Device）カメラであれば、標識された標的核酸および標識されたポリペプチドの画像を明瞭に撮像することができる。
【００６４】
本態様に係る粒子撮像装置において、撮像部（１５４）は、ＴＤＩカメラであるよう構成され得る。撮像部がＴＤＩ（Time Delay Integration）カメラであれば、撮像部の受光面で受光した蛍光を積算して蛍光画像および明視野画像を生成する。これにより、細胞の蛍光画像および明視野画像の品質を高めることができる。
【発明の効果】
【００６５】
本発明によれば、効率的に病理診断等において有効な情報を得ることができる粒子測定方法、検体処理方法、および粒子撮像装置となる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、実施形態に係る粒子測定方法を説明するフローチャートである。
【図２】図２は、実施形態に係る粒子測定方法が適用されるフローサイトメータに関する概略構成図である。
【図３】図３は、明視野画像と、標的核酸に基づく蛍光画像と、標的ポリペプチドに基づく蛍光画像と、マージ画像とを表示する表示部を示した図である。
【図４】図４は、測定試料の測定結果に基づく分析結果を表示する画面の一例を示した図である。
【図５】図５（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、実施形態の比較例に係る粒子測定方法を説明する図である。図５（ａ）は、標的核酸の増幅を説明する模式図である。図５（ｂ）は、標的核酸の増幅を説明するフローチャートである。図５（ｃ）は、標的ポリペプチドの標識を説明する模式図である。図５（ｄ）は、標的ポリペプチドに対する標識を説明するフローチャートである。
【図６】図６（ａ）は、実施形態に係る粒子測定方法を説明する図である。図６（ｂ）は、実施形態に係る粒子測定方法によって１つの粒子から得られる情報を示した図である。
【図７】図７は、検証１に係る測定１〜５の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、検証１に係る測定１より得られた、明視野画像、標的核酸の画像、標的ポリペプチドの画像、標的核酸と標的ポリペプチドとの混合画像である。
【図９】図９は、検証２に係る測定４、６〜８の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、検証５に係る測定４より得られた、明視野画像、標的核酸の画像、標的ポリペプチドの画像、標的核酸と標的ポリペプチドとの混合画像である。
【図１１】図１１は、検証６に係る測定９より得られた、明視野画像、標的核酸の画像、標的ポリペプチドの画像、標的核酸と標的ポリペプチドとの混合画像である。
【図１２】図１２は、検証７に係る測定１０の標的核酸の画像である。
【図１３】図１３（ａ）は、検証８に係る測定１１の標的核酸の明視野画像および蛍光画像である。図１３（ｂ）は、検証８に係る測定１１のＰＣＲ前後のスキャッタグラムである。
【図１４】図１４は、検証９に係る測定１２より得られた、明視野画像、標的核酸の画像、標的ポリペプチドの画像、標的核酸と標的ポリペプチドとの混合画像である。
【図１５】図１５は、検証１０に係る測定１３より得られた、明視野画像、増幅を行った標的核酸の画像、ＦＩＳＨ法により標識した標的核酸の画像、増幅を行った標的核酸とＦＩＳＨ法を適用した標的核酸との混合画像である。
【図１６】図１６は、関連技術を説明するための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
＜実施形態＞
本発明の実施形態に係る粒子測定方法は、標的核酸を増幅させること、および標的ポリペプチドとそのポリペプチドを標識する抗体との結合を測定対象となる同一の粒子に対して行う。
【００６８】
ここで、「測定対象となる粒子」とは、検体から抽出され、核酸を備えており、表面をポリペプチドで覆われている細胞や細菌等を意味する。また、測定対象となる粒子は、小胞体のエクソソーム等であってもよい。上記した「検体」とは、人から直接採取した血液や皮膚等の組織片等を意味する。「ポリぺプチド」とは、アミノ酸残基がペプチド結合により繋がった分子であり、たとえば、比較的分子量の小さいアミノ酸重合体や、分子量の大きいタンパク質も含む。また、実施形態に係る粒子測定方法は、測定対象の粒子がホルマリン等の薬剤で処理、つまり、粒子が固定されている状態ではなく、測定対象の粒子が液体に分散された状態にて行われる。
【００６９】
以下では、オペレータは、測定に供するための試料の調製を行い、調製した試料から生じた蛍光を撮像する装置を用いて粒子測定方法を実行する場合について説明する。粒子測定方法の全てのステップが、装置により自動で実行されてもよい。
【００７０】
１．粒子測定方法について
はじめに、実施形態に係る粒子測定方法について、図１に基づいて説明する。
【００７１】
［測定試料の調製］
ステップＳ１において、オペレータは、測定に供するための試料すなわち測定試料を調製する。この測定試料の調製には、ステップＳ１１〜Ｓ１４の４つの処理が含まれる。以下、具体的に説明する。
【００７２】
（１）前処理
ステップＳ１１としてオペレータは、被検者から検体すなわち組織片等を採取する。この検体から測定対象の粒子すなわち細胞や細菌等を抽出する。オペレータは、抽出した粒子を液体に分散させる。そして、オペレータは、液体に緩衝液や試薬等を混合し、遠心分離で処理等を行う。
【００７３】
（２）前処理後の液体に対する温度調整
次に、オペレータは、ステップＳ１２として、前処理後の液体の温度を調整する。この処理は、後に行われる標的ポリペプチドと標識抗体との結合において、非常に重要な処理である。前処理後の液体の温度は、２５℃以上９５℃以下の範囲に調整されることが好ましい。より好ましくは、２５℃以上７５℃以下の範囲である。このような範囲に前処理後の液体の温度が調整されると、ポリメラーゼおよびプライマーがこの液体に添加された場合に、測定対象の粒子内に試薬が浸透する効率が上がり、標的核酸の増幅がスムーズに進行する。
【００７４】
（３）標的核酸の増幅
続いて、オペレータは、ステップＳ１３として、標的核酸の増幅を行うために、前処理後の液体にポリメラーゼおよびプライマーを添加して混合液を調製する。この処理では、先に行った温度の調整により、測定対象の粒子内にポリメラーゼおよびプライマーが効率よく浸透する。なお、「ポリメラーゼ」は、たとえば、ＤＮＡポリメラーゼである。
【００７５】
そして、オペレータは、ＰＣＲ装置を用いて標的核酸の標識および増幅を行う。ＰＣＲ装置は、測定試料に対して温度制御を行って、標的核酸の増幅および標識を行う。ここで、標的核酸を標識する第１標識物質を混合液に添加した後、標的核酸の増幅を行ってもよく、あるいは、標的核酸の増幅をした後に第１標識物質を混合液に添加してもよい。なお、「第１標識物質」は、標的核酸の増幅が行われていたか否かを確認するための標識物質であり、たとえば、ＧＡＰＤＨ＿９７＿ＦＡＭのような標識プローブである。また、次に説明する標的ポリペプチドの標識における標識物質と区別するため、説明の便宜上、「第１標識物質」とした。
【００７６】
（４）標的ポリペプチドと標識抗体との結合反応
次に、オペレータは、ステップＳ１４として、標的ポリペプチドと標識抗体との結合反応を行う。上記のように前処理後の液体には温度調整が行われているため、粒子の表面のポリペプチドの形状が維持されつつ、ポリペプチドに形成されている隙間が広がる。このため、粒子の表面のポリペプチドに対して、標的ポリペプチドの標識を行い得る。したがって、実施形態によれば、同一の粒子に対して、標的核酸の標識と、標的ポリペプチドの標識とを両方行うことができる。
【００７７】
標的ポリペプチドと標識抗体との結合反応が行われたか否かは、上記の標的核酸の第１標識物質とは異なる第２標識物質で確認される。第２標識物質は、たとえば、Alexa Fluor 647 anti-human CD45 Antibodyのような標識プローブである。
【００７８】
以上により、測定試料の調製が終了する。次に、測定試料に対して測定を行う。本実施形態では、測定試料から生じた蛍光を撮像する装置を用いて測定を実行する場合について説明する。
【００７９】
［測定試料の測定］
ステップＳ２において、オペレータは、測定試料から生じた蛍光を撮像する装置を用いて、標識された標的核酸の画像、および標識された標的ポリペプチドの画像を取得する。ステップＳ２で用いられる装置は、粒子撮像装置であり、たとえば、フローサイトメータである。
【００８０】
図２は、フローサイトメータの構成を模式的に示す図である。フローサイトメータ１０は、撮像ユニット１００と、処理部１１と、記憶部１２と、表示部１３と、入力部１４と、を備える。撮像ユニット１００は、フローセル１１０と、光源１２１〜１２３と、集光レンズ１３１〜１３３と、ミラー１４１と、ダイクロイックミラー１４２と、集光レンズ１５１と、光学ユニット１５２と、集光レンズ１５３と、撮像部１５４と、を備える。
【００８１】
上述したように、ステップＳ１において、調製された測定試料が、フローサイトメータ１０に設けられたフローセル１１０の流路１１１に流される。測定試料に含まれる粒子は、撮像ユニット１００により撮像される。
【００８２】
光源１２１〜１２３は、フローセル１１０を流れる測定試料に光を照射する。光源１２１〜１２３は、たとえば、半導体レーザやアルゴンレーザーにより構成される。光源１２１〜１２３から出射される光は、それぞれ、互いに異なる波長λ１１〜λ１３のレーザ光である。集光レンズ１３１〜１３３は、それぞれ、光源１２１〜１２３から出射された光を集光する。ミラー１４１は、波長λ１１の光を反射する。ダイクロイックミラー１４２は、波長λ１１の光を透過させ、波長λ１２の光を反射する。こうして、波長λ１１〜λ１３の光が、フローセル１１０の流路１１１を流れる測定試料に照射される。
【００８３】
測定試料に波長λ１１、λ１２の光が照射されると、粒子を染色している蛍光色素から蛍光が生じる。具体的には、標的核酸を標識する蛍光色素すなわち第１標識物質は、波長λ１１の光が照射されると、波長λ２１の蛍光を生じる。標的ポリペプチドを標識する蛍光色素すなわち第２標識物質は、波長λ１２の光が照射されると、波長λ２２の蛍光を生じる。測定試料に波長λ１３の光が照射されると、この光は細胞を透過する。細胞を透過した波長λ１３の光は、明視野画像の生成に用いられる。なお、波長λ２１、λ２２、λ１３は、互いに異なる波長である。
【００８４】
集光レンズ１５１は、フローセル１１０の流路１１１を流れる測定試料から生じた波長λ２１、λ２２の蛍光と、フローセル１１０の流路１１１を流れる測定試料を透過した波長λ１３の光とを集光する。光学ユニット１５２は、３枚のダイクロイックミラーが組み合わせられた構成を有する。光学ユニット１５２の３枚のダイクロイックミラーは、波長λ２１、λ２２の蛍光と波長λ１３の光とを、互いに僅かに異なる角度で反射し、撮像部１５４の受光面上において分離させる。集光レンズ１５３は、波長λ２１、λ２２の蛍光と波長λ１３の光とを集光する。
【００８５】
撮像部１５４は、たとえば、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）カメラやＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）カメラにより構成される。ＣＣＤカメラであれば、標識された標的核酸および標識されたポリペプチドの画像を明瞭に撮像することができる。また、撮像部１５４は、ＴＤＩ（Time Delay Integration）カメラにより構成するのが好ましい。ＴＤＩカメラは、受光面で受光した蛍光を積算して蛍光画像および明視野画像を生成する。これにより、細胞の蛍光画像および明視野画像の品質を高めることができる。撮像部１５４は、波長λ２１、λ２２の蛍光と波長λ１３の光とを撮像して、波長λ２１、λ２２の蛍光にそれぞれ対応した蛍光画像と、波長λ１３の光に対応した明視野画像とを、撮像信号として出力する。
【００８６】
処理部１１は、ＣＰＵにより構成される。処理部１１は、これに限定されず、ＣＰＵとマイクロコンピュータにより構成されてもよい。処理部１１は、記憶部１２に記憶されたプログラムに基づいて各種の処理を行う。処理部１１は、撮像ユニット１００と、記憶部１２と、表示部１３と、入力部１４とに接続されており、各部からの信号を受信し、各部を制御する。記憶部１２は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ハードディスク等により構成される。表示部１３は、液晶ディスプレイ、プラズマディスプレイ、ＣＲＴ（Cathode Ray Tube）ディスプレイ等により構成される。入力部１４は、たとえば、マウス、キーボード等により構成される。
【００８７】
処理部１１は、撮像部１５４により撮像された蛍光画像および明視野画像を記憶部１２に記憶させる。また、オペレータが入力部１４を介して画像の表示指示を入力すると、処理部１１は、蛍光画像および明視野画像を含む測定結果画面２００を表示部１３に表示する。
【００８８】
図３に示すように、測定結果画面２００は、明視野画像と、標的核酸に基づく蛍光画像と、標的ポリペプチドに基づく蛍光画像と、マージ画像（混合画像）とを表示する。マージ画像は、標的核酸に基づく蛍光画像と標的ポリペプチドに基づく蛍光画像とをマージした蛍光画像である。このように、フローサイトメータ１０で測定した測定試料の測定結果が表示される。
【００８９】
なお、測定試料の測定には、フローサイトメータの他に、たとえば、蛍光顕微鏡により画像の取得等もある。
【００９０】
［分析］
ステップＳ３において、処理部１１は、ステップＳ２で取得した標識された標的核酸の画像、および標識された標的ポリペプチドの画像に基づいて、所定の事項について分析する。たとえば、フローサイトメータ１０で測定試料を測定した場合であれば、図３に示す測定結果画面２００に表示される測定結果から、標的核酸や標的ポリペプチドの個数をカウントし、細胞や細菌等が正常であるか異常であるかを評価する。また、画像に明瞭に標的核酸や標的ポリペプチドが現れているか、という点から、粒子すなわち細胞や細菌等の異常の原因が、核酸であるのかポリペプチドであるのか、或いは、その両方であるのかを評価することもできる。
【００９１】
［分析結果の表示］
ステップＳ４において、処理部１１は、ステップＳ３で分析した結果として、図４に示すように、分析結果画面２０１を表示部１３に表示させる。図４では、表示の一例として、測定対象を白血球細胞とし、標的核酸がＧＡＰＤＨ遺伝子、標的ポリペプチドがヒトＣＤα抗原である場合を示す。「分析結果」の欄で、核酸およびポリペプチドの異常の有無を表示させる。図４では、たとえば、核酸に異常があり、ポリペプチドは正常であった場合を示す。分析結果画面２０１には、ステップＳ２で得た測定結果を表示させてもよい。また、スキャッタグラムやヒストグラムを作成してもよい。
【００９２】
このように分析結果を表示すれば、たとえば、医師等は、病気の診断を行うために核酸およびポリペプチドの異常について調べた場合、治療方針の決定に役立てることができる。
【００９３】
２．比較例に係る粒子測定方法と実施形態に係る粒子測定方法との対比
実施形態に係る粒子測定方法では、標的核酸の増幅および標的ポリペプチドの標識は、同一の粒子に対して行われるため、実施形態に係る粒子測定方法は、従来の粒子測定方法とは大きく異なる。以下、従来の粒子測定方法を比較例とし、本発明の実施形態に係る粒子測定方法と対比する。以下では、図５（ａ）〜（ｄ）を参照して、比較例に係る粒子測定方法を適用して、病気の原因を調査するために、核酸の増幅を行う場合を考える。
【００９４】
［比較例に係る粒子測定方法］
図５（ａ）および（ｂ）は、それぞれ、比較例における標的核酸の増幅の手順を示す模式図およびフローチャートである。
【００９５】
比較例では、測定対象の粒子すなわち被検者から採取した細胞や細菌等が、保存の観点からホルマリン等の薬剤で処理されたものである。このような状態は、いわゆる、「細胞が固定」された状態であり、細胞内にＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーを含む試薬を浸透させることができない。したがって、比較例では、図５（ａ）に示すように、標的核酸の増幅を行う場合、ポリペプチドを分解する処理、すなわちプロテアーゼ処理が必要となる。
【００９６】
図５（ｂ）に示すように、ステップＳ１０１において、プロテアーゼ処理が行われる。比較例では、図５（ａ）に示すように、プロテアーゼ処理によってポリペプチドが分解されるため、標的核酸を増幅させるための試薬が、細胞内に浸透することが可能となる。そして、ステップＳ１０２において、標的核酸の増幅が行われる。その後、オペレータは、たとえば、蛍光顕微鏡等を用いて標的核酸の画像を取得する。
【００９７】
取得された標的核酸の画像において、細胞内の標的核酸の増幅が確認されなかった場合、病気の原因は、核酸にはないことが分かる。この場合、考え得る原因として、ポリペプチドに異常が発生していることが挙げられる。
【００９８】
図５（ｃ）および（ｄ）は、それぞれ、比較例におけるポリペプチドの標識の手順を示す模式図およびフローチャートである。
【００９９】
図５（ｄ）に示すように、ステップＳ１０３において、標的ポリペプチドと標識抗体との結合反応が行われることにより、標的ポリペプチドの標識が行われる。ここで、標的核酸の増幅で用いた細胞は、プロテアーゼ処理によってポリペプチドが分解されている。このため、標的核酸の増幅で用いた細胞に対して、標的ポリペプチドと標識抗体との結合反応を行うことができない。そこで、オペレータは、別途、同一の被検者から採取した他の細胞を含む検体を用意した後、標的ポリペプチドと標識抗体との結合反応を行う。この場合も、オペレータは、たとえば、蛍光顕微鏡等を用いて標的ポリペプチドの画像を取得する。
【０１００】
このように、比較例では、オペレータは、標的核酸の増幅、および標的ポリペプチドと標識抗体との結合反応を別々で行う必要があるため、手間が掛かり煩雑である。また、上記の処理は、細胞をスライドガラスに乗せた状態で行われる。そのため、多くの粒子すなわち細胞に対して標的核酸の増幅を行いたい場合、オペレータには作業の負担が掛かる。
【０１０１】
さらに、比較例では、１つの粒子から分かる情報は、異常な核酸の有無または標的ポリペプチドの有無のどちらかの情報である。つまり、１つの粒子からは、１つの情報しか得られない。このため、１つの粒子に対して、核酸およびポリペプチドの情報を相補的に評価することができない。
【０１０２】
［比較例に係る粒子測定方法と実施形態に係る粒子測定方法との相違点］
次に、本発明の実施形態に係る粒子測定方法が比較例に係る粒子測定方法と相違する点について説明する。
【０１０３】
実施形態では、標的核酸の増幅、および標的ポリペプチドの標識が同一の粒子に対して行われる。実施形態における標的ポリペプチドと標識抗体との結合反応は、粒子の表面のポリペプチドが完全に分解されていないために行うことができる。
【０１０４】
上記のことを可能にする要因として、実施形態では、測定対象である粒子すなわち細胞が液体に分散された状態であることが挙げられる。すなわち、実施形態では、比較例と異なり、粒子は固定された状態ではない。このため、粒子内にポリメラーゼおよびプライマーを含む試薬を浸透させる場合、粒子の表面のポリペプチドにある程度の衝撃を与える必要はあるが、比較例のような強い衝撃までは必要ない。
【０１０５】
そこで、実施形態に係る粒子測定方法では、試薬を粒子内に十分浸透させるべく、図６（ａ）に示すように、前処理後の液体の温度を調整する。図６（ａ）に示す温度調整は、図１のステップＳ１における前処理後の液体に対する温度調整（Ｓ１２）の処理に対応する。これにより、粒子の表面のポリペプチドは、完全には分解されず、その形状が維持されつつ、隙間が広がる。この広がった隙間を通じて、ポリメラーゼおよびプライマーを含む試薬が粒子の内部に浸透する。これにより、プロテアーゼを実質的に含まない状態であっても、粒子内で標的核酸の増幅が行われる。図６（ａ）に示す標的核酸の増幅は、図１のステップＳ１における標的核酸の標識および増幅（Ｓ１３）の処理に対応する。
【０１０６】
なお、図６（ａ）では、標的核酸の増幅を行う前に、標的核酸を標識する標識プローブを添加する様子が図示されているが、これは、標的核酸の増幅の後に行っても構わない。
【０１０７】
ここで「プロテアーゼを実質的に含まない状態」とは、混合液にプロテアーゼを一切添加しない場合だけを意味するのではなく、混合液にプロテアーゼを添加したものの、その量が極微量であり、プロテアーゼの効果が奏さないような場合をも意味する。
【０１０８】
このため、図１のステップＳ１において、同一の粒子に対して、標的核酸の増幅を行った後、分解されていない粒子の表面のポリペプチドに対して、標的ポリペプチドと標識抗体との結合反応を行うことができる。
【０１０９】
このように、実施形態に係る粒子測定方法では、１つの粒子、すなわち、１つの細胞や細菌等に対して標的核酸の増幅、および標的ポリペプチドの標識を行うことができる。このため、標的核酸の増幅、および標的ポリペプチドの標識を効率よく行うことができる。
【０１１０】
［実施形態に係る粒子測定方法による効果］
実施形態の粒子すなわち細胞や細菌等は、液体に分散された状態である。このため、たとえば、比較例のように、粒子がホルマリン等の薬剤で固定されているような場合、
オペレータが粒子をスライドガラスに乗せる等の処理を行う必要はない。よって、実施形態に係る粒子測定方法であれば、オペレータは、フローサイトメータを用いて、多量の細胞に対して標的核酸の測定を一度に行い得る。
【０１１１】
また、標的核酸の増幅、および標的ポリペプチドの標識ごとに細胞を用意する必要がない。これは、たとえば、病気の患者から何度も検体すなわち組織片を採取する必要がなく、患者のストレス軽減に繋がる。
【０１１２】
また、実施形態においては、ポリメラーゼおよびプライマーを、プロテアーゼの影響を実質的に含まない状態で、粒子内に浸透させる。このため、プロテアーゼを失活させる処理を行う必要がない。よって、試薬を節約できる。
【０１１３】
上記したとおり、比較例では、１つの粒子から得られる情報は、核酸の異常の有無またはポリペプチドの異常の有無である。つまり、１つの粒子から１つの情報しか得られない。これに対し、実施形態に係る粒子測定方法では、図６（ｂ）に示すように、核酸の異常の有無とポリペプチドの異常の有無との組み合わせにより、１つの粒子から、４種類の組み合わせの何れかに合致した情報が得られる。そして、核酸とポリペプチドとの両方の情報が１度に、しかも、多量に得ることができるため、より信頼性の高い情報が得られる。これらの情報を相補的に関連付けることにより、粒子の評価を精度よく行い得る。その結果、患者に対して適切な投薬や治療方針を提案することが可能となる。
【０１１４】
また、１つの粒子から標的核酸の情報および粒子の表面のポリペプチドの情報が得られることにより、新たなバイオマーカーとして病理診断に活かすことが期待できる。これは、たとえば、核酸に変異が生じており癌化していることを核酸の情報から取得した場合に、その癌化した細胞の表面にＰＤ-Ｌ１（programmed cell death-1 ligand-1）が発現している情報を得ることができれば、癌の治療薬として抗ＰＤ-１抗体医薬品であるニボルマルを治療薬として選択することが可能となる。
【０１１５】
また、血中の細胞やエクソソーム中の核酸に変異が生じており癌化していることを核酸の情報から取得した場合に、その細胞またはエクソソームの表面抗原の情報を得ることにより、その細胞またはエクソソームがどの臓器に由来するものなのか特定することができる。これにより、どの臓器に腫瘍が生じているのか判断の助けとなる。
【０１１６】
３．実施形態に係る粒子測定方法の検証 
次に、本発明の実施形態に係る粒子測定方法により、同一の粒子すなわち細胞や細菌等に対して、標的核酸の増幅および標的ポリペプチドの標識を最適に行うための条件について検証するため、発明者らは、検証１〜８を行った。はじめに、検証１〜８に供する測定試料の調製の手順について説明する。
【０１１７】
［測定試料の調製］
（Ａ）前処理
測定対象の粒子に白血球細胞を用いた。標的核酸はＧＡＰＤＨ遺伝子、標的ポリペプチドはヒトＣＤ４５抗原とした。
（Ａ−１）被検者から適量採取した白血球を液体に分散させ、全量を２００μＬとした。これを所定のチューブに収容した。
（Ａ−２）溶血剤１ｍＬをチューブに加えた。
（Ａ−３）１５分間氷冷させた。
（Ａ−４）４℃の環境下でチューブを４００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
（Ａ−５）上清を除去した。
（Ａ−６）チューブに溶血剤４００μＬを加えて、チューブ内の内容物を洗浄した。
（Ａ−７）４℃の環境下でチューブを４００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
（Ａ−８）上清を除去した。
（Ａ−９）チューブにＰＢＳを１８０μＬ入れて、内容物を懸濁させた。
（Ａ−１０）内容物を所定の温度に調整し、所定時間保持した。
（Ａ−１１）４℃の環境下でチューブを４００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
（Ａ−１２）上清を除去した。
【０１１８】
（Ｂ）標的核酸の増幅
（Ｂ−１）標的核酸の増幅を行うため、試薬をチューブに添加した。試薬の組成は、以下のとおりであった。
・３´末端側プライマー：GAPDH_97_F
・５´末端側のプライマー：GAPDH_97_R
・ＤＮＡポリメラーゼ：Taqman（登録商標）Gene Expression Master Mix
・標的核酸の標識プローブ：GAPDH_97_FAM
・蒸留水
（Ｂ−２）試薬に含まれる各組成物の濃度および量は、以下のとおりであった。なお、以下で、「使用開始前」とあるのは、製品状態または保存状態にあるときを意味する。「最終濃度」とは、試薬として調製されたときの濃度である。
・３´末端側プライマー：チューブに０．５μＬ添加した。使用開始前の濃度は、１０．０μＭであり、最終濃度は、０．２μＭであった。
・５´末端側プライマー：チューブに０．５μＬ添加した。使用開始前の濃度は、１０．０μＭであり、最終濃度は、０．２μＭであった。
・Taqman（登録商標） Gene Expression Master Mix：製品としては２倍濃縮であるが、使用するに当たり、１倍に希釈した。チューブに、１倍に希釈したTaqman（登録商標） Gene Expression Master Mixを１２．５μＬ添加した。
・GAPDH_97_FAM：チューブに０．５μＬ添加した。使用開始前の濃度は、１０．０μＭであり、最終濃度は、０．２μＭであった。
・蒸留水：チューブに１１μＬ添加した。
上記のように試薬を調製した。全量は、２５.０μＬであった。
（Ｂ−３）上記で試薬を添加した後、チューブをＰＣＲ装置にセットして、標的核酸の増幅反応を行った。標的核酸の増幅反応は、５０℃で２分間の後、９５℃で１０分間の反応を行った後、第１段階として９５℃で１５秒、第２段階として６０℃で６０秒の２段階を４０サイクル行った。
【０１１９】
（Ｃ）標的ポリペプチドの標識
標的核酸の増幅の後、引き続いて、標的ポリペプチドと標識抗体との結合反応を行った。以下に手順を示す。
（Ｃ−１）チューブにＰＢＳを７５μＬ入れて、測定試料を懸濁させた。
（Ｃ−２）チューブに抗CD45抗体を５μＬ添加した。また、標的ポリペプチドと標識抗体との結合反応を標識する標識プローブとして、Alexa Fluor 647 anti-human CD45 Antibody（BioLegend）を用いた。
（Ｃ−３）４℃の環境下で、６０分間、標的ポリペプチドと標識抗体との結合反応を行った。
以上の手順で調製した測定試料を用いて以下の検証を行った。
【０１２０】
［検証１：標的核酸の増幅の効率と前処理後の液体の温度調整との関係］
検証１では、標的核酸の増幅の効率を測定し、上記の手順にて調製した測定試料で標的核酸の増幅が行われていたかを検証した。また、内容物すなわち前処理後の液体の温度調整との関係についても併せて検証した。具体的には、測定試料の調製の手順（Ａ−１０）で、温度を異ならせた場合、標的核酸の増幅の効率に変化があるのか否かについて検証した。
【０１２１】
手順（Ａ−１０）において、内容物の温度を、測定１：２５℃、測定２：５０℃、測定３：７５℃、測定４：９５℃、測定５：１００℃とし、保持時間は全ての温度で２分とした。なお、温度の条件以外は全て同じとした。
【０１２２】
検証結果を図７のグラフに示す。図７に示すＣｔ値は、標的核酸の増幅の効率を示す指標であり、Ｃｔ値が低いほど、標的核酸の増幅効率がよいことを示す。図７のグラフに示されるように、各温度によってＣｔ値は異なっていた。よって、標的核酸の増幅の効率に前処理後の液体の温度調整が影響することが分かった。このうち、測定４（９５℃）の場合が最もＣｔ値が低いことから、手順（Ａ−１０）において、前処理後の液体を９５℃に調整した場合、標的核酸の増幅の効率が最もよいことが分かった。
【０１２３】
［検証１の結論］
・測定試料に対し、標的核酸の増幅の後に、標的ポリペプチドの標識を行った場合でも、標的核酸の増幅に影響を及ぼさない。
・前処理後の液体の温度調整時の温度は、標的核酸の増幅の効率に影響を及ぼす。
・前処理後の液体の温度を９５℃に調整し、保持時間を２分とした場合、標的核酸の増幅の効率は良好である。
【０１２４】
[検証２：標的核酸の増幅および標的ポリペプチドの標識]
検証１では、手順（Ａ−１０）において、前処理後の液体の温度を９５℃に調整し、保持時間を２分とした場合（測定４）、標的核酸の増幅の効率が向上することが分かった。しかし、検証１は、標的ポリペプチドの標識が適切に行われていたかについて検証されていない。そこで、検証１の測定１〜５の各条件について、標的核酸の増幅および標的ポリペプチドの標識がどちらも適切に行われていたか検証した。
【０１２５】
検証２では、標的核酸の増幅が行われた細胞数、および標的ポリペプチドの標識が行われた細胞数の合計数を、全細胞で除算した割合を算出した。つまり、この割合は、標的核酸の増幅と、標的ポリペプチドの標識との両方が行われた割合であるため、値が高ければ高いほど、効率よく両者の反応が行われたと判断できる。結果を表１に示す。
【０１２６】
【表１】
2019103489.tif 000003
【０１２７】
なお、表１中の（ｂ）全細胞数および（ｃ）白血球数は、汎用フローサイトメータにより計測した。（ｄ）標的核酸の増幅、および標的ポリペプチドが標識された細胞数は、フローサイトメータによって撮像された画像から算出した。また、表１中の（ｄ）の算出では、標的核酸に基づく蛍光画像において蛍光強度が所定の閾値以上であり、かつ、標的ポリペプチドに基づく蛍光画像において蛍光強度が所定の閾値以上である場合に、標的核酸の増幅、および標的ポリペプチドが標識されたと判定した。そして、標的核酸の増幅、および標的ポリペプチドが標識されたと判定された細胞数を、表１中の（ｄ）の値とした。
【０１２８】
検証１では、図７のグラフに示したとおり、標的核酸の増幅の効率は、測定４の場合が最も良かった。しかし、表１の結果によれば、測定４の場合、標的核酸の増幅、および標的ポリペプチドの標識が行われた細胞の割合（ｅ）は、１６.７％と低かった。これに対し、測定１の割合（ｅ）は、最も高い４３．６％であり、測定２および測定３の割合（ｅ）は、それぞれ、２８．２％および２２．５％であった。この結果から、手順（Ａ−１０）では、前処理後の液体の温度を高温に調整するにつれて、割合（ｅ）が減少することが分かった。とくに、検証５の１００℃における割合（ｅ）は、１４．８％と低かった。
【０１２９】
検証２の結果から、実施形態に係る粒子測定方法は、手順（Ａ−１０）で前処理後の液体の温度が２５℃以上９５℃以下の範囲において行った場合、同一の細胞に対して、標的核酸の増幅および標的ポリペプチドの標識の両方を効率的に行い得ることが分かった。
【０１３０】
ここで、測定４の場合、割合（ｅ）は、１６.７％と低いが、検証１の結果である図７のグラフに示されているとおり、少なくとも標的核酸の増幅は良好に行われていた。このため、測定４の場合も同一の細胞に対して、標的核酸の増幅および標的ポリペプチドの標識の両方が行われていたと判定できる。
【０１３１】
なお、測定５の場合、割合（ｅ）が低かった原因として、前処理後の液体の温度を高温に調整すると、細胞自体に影響を及ぼし、標的核酸の増幅を行う前に、検体に含まれていた細胞が減少し、測定する細胞数自体が少なくなってしまったことが考えられる。よって、手順（Ａ−１０）で温度を高温にする場合、標的核酸の増幅の効率がよい状態と、標的核酸の増幅、および標的ポリペプチドの標識が行われた細胞の割合とを良好な結果にするためには、多量の細胞が必要であると考えられる。
【０１３２】
また、上記のとおり、表１の（ｄ）標的核酸の増幅、および標的ポリペプチドが標識された細胞数は、フローサイトメータによって撮像された画像から算出した。そのような画像は、具体的には、図８に示されているような画像である。図８の各画像は、測定１の粒子を撮像した画像であり、左側から順に、明視野画像、標的核酸の画像、標的ポリペプチドの画像であり、一番右側の画像は、標的核酸の増幅の画像と標的ポリペプチドの画像とをマージした画像である。このように、実施形態に係る測定試料の手順の処理を行えば、フローサイトメータによって撮像された標的核酸の画像および標的ポリペプチドの画像を適切に取得することができる。
【０１３３】
［検証２の結論］
・同一の細胞に対する標的核酸の増幅および標的ポリペプチドの標識は、前処理後の液体の温度調整時において温度の保持時間を２分とし、温度を２５℃以上９５℃以下の範囲にした場合、良好に行われる。
・とくに、２５℃以上７５℃以下の範囲にした場合、より良好である。
【０１３４】
［検証３：標的核酸の増幅の効率と、前処理後の液体の温度調整を行う時間］
検証１において、前処理後の液体の温度調整を９５℃で行った場合、標的核酸の増幅の効率が最もよいことがわかった。ここで、検証３では、前処理後の液体の温度調整を行う時間と標的核酸の増幅の効率との関係について検証した。
【０１３５】
手順（Ａ−１０）において、前処理後の液体の温度９５℃とし、保持する時間を、測定６：１分、測定７：１０分とした。また、手順（Ａ−１０）の温度調整において、前処理後の液体の温度を２５℃に調整した測定１は、検証２においては、標的核酸の増幅、および標的ポリペプチドの標識が行われた細胞の割合が良好であった。そこで、前処理後の液体の温度を２５℃に調整し、保持時間を０分とした場合を測定８として、この測定８についても前処理後の液体の温度調整を行う時間と標的核酸の増幅の効率との関係について検証した。測定６〜８のＣｔ値を図９に示す。
【０１３６】
その結果、図９に示すように、測定６のＣｔ値は、測定４のＣｔ値よりも低かった。よって、手順（Ａ−１０）において、前処理後の液体の温度を９５℃に調整する場合、保持時間を１分間とすれば、標的核酸の増幅は効率よく行われることが分かった。
【０１３７】
また、測定８は、Ｃｔ値が最も高かかったため、標的核酸の増幅の効率は、測定６および７より不良であるが、検証１の図７のグラフに示したとおり、測定１とほぼ同等のＣｔ値であった。そのため、測定８の条件では、測定１と同様に、標的核酸の増幅、および標的ポリペプチドの標識が行われた細胞の割合が高いことが予想された。
【０１３８】
［検証３の結論］
・前処理後の液体の温度を９５℃に調整した場合、保持時間を１分とすれば、標的核酸の増幅の効率は良好である。
【０１３９】
［検証４：標的核酸の増幅と標的ポリペプチドの標識］
次に、検証２と同様に、測定６〜８の条件について、標的核酸の増幅および標的ポリペプチドの標識が実行されたか否かについて検証した。標的核酸の増幅が行われた細胞数、および標的ポリペプチドの標識が行われた細胞数の合計数を、全細胞で除算した割合を算出した。結果を表２に示す。
【０１４０】
【表２】
2019103489.tif 000004
【０１４１】
表２の結果より、標的核酸の増幅、および標的ポリペプチドの標識が行われた細胞の割合（ｅ）においては、測定８の４５．５％が最も高かった。これは、検証３の結果から予想した結果と合致する。これに対し、測定６および測定７の割合（ｅ）は、１４．５％および１６．１％であった。検証４も、検証２と同様に、前処理後の液体の温度を高温に調整するにつれて、割合が減少していた。この原因は、検証２と同様であると考えられる。
【０１４２】
［検証４の結論］
・前処理後の液体の温度を９５℃に調整し、保持時間を１分および１０分とした場合、それぞれ、同一の細胞に対して、標的核酸の増幅および標的ポリペプチドの標識は行われる。
・前処理後の液体の温度を２５℃に調整した場合も、同一の細胞に対して、標的核酸の増幅および標的ポリペプチドの標識は行われる。
【０１４３】
［検証１〜４のまとめ］
検証１〜４の測定１〜８の結果から、実施形態に係る粒子測定方法において、手順（Ａ−１０）すなわち、前処理後の液体の温度調整は、２５℃以上９５℃以下の範囲に調整した場合、標的核酸の増幅数、および標的ポリペプチドの標識が効率よく行われることが分かった。また、２５℃以上７５℃以下の範囲である場合は、より効率よく行われることが分かった。
【０１４４】
［検証５：標的ポリペプチドの標識および温度の調整の関係］
検証１〜４では、標的核酸の増幅の効率は、測定試料の手順（Ａ−１０）での温度に影響されることが分かった。次に、検証５では、手順（Ａ−１０）にて、温度を調整した前処理後の液体に対し、標的核酸の増幅ではなく、標的ポリペプチドの標識を行い、温度の調整が標的ポリペプチドの標識に影響を及ぼすのか否かを検証した。
【０１４５】
測定４（温度の調整を９５℃、２分間行った場合）において、手順（Ａ−１０）にて、温度を調整した後、標的ポリペプチドの標識を行い、フローサイトメータにより標的ポリペプチドの画像を取得した。その画像を図１０に示す。
【０１４６】
図１０の各画像は、図８で示した画像と同様に、左側から順に、明視野画像、標的核酸の画像、標的ポリペプチドの画像であり、一番右側の画像は、標的核酸の増幅の画像と標的ポリペプチドの画像とをマージした画像である。図１０に示すように、測定４では、標的ポリペプチドが標識抗体に適正に標識されていることが示されている。よって、温度の調整が標的ポリペプチドの標識に影響を及ぼさないことが判明した。
【０１４７】
［検証５の結論］
・前処理後の液体の温度の調整は、標的ポリペプチドの標識に影響を及ぼさない。
【０１４８】
［検証６：標的核酸の増幅と標的ポリペプチドの標識との順番］
検証１〜４では、標的核酸の増幅を行った後、標的ポリペプチドの標識を行った。検証６では、その逆、つまり、標的ポリペプチドの標識を行った後に、標的核酸の増幅を行った場合、標的核酸の増幅および、標的ポリペプチドの標識の精度に関して検証した。
【０１４９】
測定４において、測定試料の調製の手順（Ａ−１２）の後、手順（Ｃ）すなわち標的ポリペプチドの標識を行い、続いて、手順（Ｂ）すなわち標的核酸の増幅を行った。この測定条件を測定９とした。そして、フローサイトメータにより標的核酸、および標的ポリペプチドの画像を取得した。その画像を図１１に示す。図１１の各画像は、図８および図１０で示した画像と同様に、左側から順に、明視野画像、標的核酸の画像、標的ポリペプチドの画像であり、一番右側の画像は、標的核酸の増幅の画像と標的ポリペプチドの画像とをマージした画像である。
【０１５０】
図１０の明視野画像以外の画像は、発色のむらが見られ、輪郭がぼやけた状態の画像となっていた。また、図１０の明視野画像以外の画像は、輪郭も含め、全体的にぼやけており、不明瞭な画像であった。よって、標的ポリペプチドを標識抗体による標識を行った後に、標的核酸の増幅を行った場合、標的核酸の増幅、および標的ポリペプチドの標識の両者とも困難になることが示された。したがって、実施形態のように、標的核酸の増幅を行った後に、標的ポリペプチドの標識を行えば、標的核酸の増幅、および標的ポリペプチドを精度よく標識できることが示された。
【０１５１】
［検証６の結論］
・標的核酸の増幅を行った後に標的ポリペプチドを標識抗体によって標識すれば、標的核酸の増幅および標的ポリペプチドの標識を精度よく行い得る。
【０１５２】
［検証７：測定対象がエクソソームの場合］
上記の検証１〜６は、測定対象を白血球細胞として検証した。次に、白血球細胞以外、たとえば、細菌等でも実施形態に係る粒子測定方法で標的核酸の増幅を行うことができるか否かについて検証した。
【０１５３】
測定対象に小胞体であるエクソソームを用いて、測定試料の調製を行った。ただし、標的ポリペプチドの標識は行わないため、手順（Ａ）および（Ｂ）のみの処理を行った。手順（Ａ−１０）の温度を調整する段階では、チューブの内容物を２５℃に調整し、２分間保持した。これを測定１０とする。
【０１５４】
測定１０に対して標的核酸の増幅を行った後、標的核酸の増幅が行われた否かを確認するため、超解像顕微鏡でエクソソームの超解像画像を撮像した。撮像されたエクソソームの超解像画像を図１２に示す。なお、超解像顕微鏡による撮像においては、蛍光色素が、蛍光を生じる状態と蛍光を生じない状態とに切り替えられ、複数の蛍光画像が取得される。そして、取得された複数の蛍光画像に基づいて、高解像の画像すなわち超解像画像が取得される。
【０１５５】
図１２に示すように、円状の輪郭が明瞭に撮像され、標的核酸の撮像が確認された。よって、測定対象をエクソソームとした場合でも、標的核酸の増幅が行われることが分かった。
【０１５６】
［検証７の結論］
・実施形態に係る粒子測定方法は、エクソソームを測定対象としても適用できる。
【０１５７】
［検証８：測定対象が大腸菌の場合］
次に、測定対象に大腸菌を用いて、測定試料の調製を行った。ただし、標的ポリペプチドの標識は行わないため、手順（Ａ）および（Ｂ）のみの処理を行った。手順（Ａ−１０）の温度を調整する段階では、チューブの内容物を２５℃に調整し、２分間保持した。これを測定１１とする。
【０１５８】
測定１１に対して標的核酸の増幅を行った後、標的核酸の増幅が行われた否かを確認するため、蛍光顕微鏡で大腸菌の画像を撮像した。撮像された大腸菌の画像を図１３（ａ）に示した。
【０１５９】
また、調製された測定試料を、フローサイトメータを用いて測定した。これにより、測定試料に含まれる大腸菌ごとに、前方散乱光の波形信号の面積および側方散乱光の波形信号の面積が取得され、取得された各パラメータに基づいて図１３（ｂ）の上段に示すスキャッタグラムが作成された。図１３（ｂ）に示すスキャッタグラムにおいて、破線で囲んだ領域は、大腸菌の分布に対応する領域である。この領域に含まれる大腸菌に基づいて、図１３（ｂ）の下段に示すように、横軸を蛍光の波形信号の面積とし、縦軸を頻度とするヒストグラムが作成された。図１３（ａ）の左側は、標的核酸の増増幅の処理が行われる直前すなわち手順（Ｂ−２）と（Ｂ−３）との間における測定試料に基づいて作成されたスキャッタグラムおよびヒストグラムであり、図１３（ｂ）の右側は、標的核酸の増幅すなわち手順（Ｂ−３）が行われた後の測定試料に基づいて作成されたものである。
【０１６０】
図１３（ａ）、（ｂ）の結果から、大腸菌を測定対象としても、実施形態に係る粒子測定方法で標的核酸の増幅を行えることが示された。
【０１６１】
［検証８の結論］
・実施形態に係る粒子測定方法は、大腸菌を測定対象としても適用できる。
【０１６２】
なお、検証７で用いたエクソソームは、近年、非常に注目されており、エクソソームの解明が発癌機構の解明に繋がるとして、研究が進められている。実施形態に係る粒子測定方法をエクソソームに適用し、癌のバイオマーカーとして役立てられることが期待される。
【０１６３】
［検証９：粒子内の標的ポリぺプチドの標識］
上記検証１〜６では、標的ポリペプチドは、図６（ｃ）に示すように、測定対象の粒子の表面つまり外表面に存在していた。検証９では、標的ポリペプチドが粒子の内部に含まれている場合であっても、実施形態に係る粒子測定方法を適用することができるか、検証した。
【０１６４】
検証９では、測定対象の粒子として、ｉＰＳ細胞を用いた。標的核酸は、ＧＡＰＤＨ遺伝子とし、標的ポリペプチドは、Oct４タンパク質とした。標的核酸の標識および増幅は、検証１の手順（Ａ）、（Ｂ）と同様に行った。標的ポリペプチドの標識の手順を以下に示す。検証９では、検証１の手順（Ｃ）と区別するため、手順（Ｄ）とする。また、手順（Ａ−１０）の温度を調整する段階では、チューブの内容物を２５℃に調整し、２分間保持した。
【０１６５】
（Ｄ）標的ポリペプチドの標識
標的核酸の増幅の後、引き続いて、測定対象の粒子の内部に含まれている標的ポリペプチドと標識抗体との結合反応を行った。
（Ｄ−１）チューブにＰＢＳを７５μＬ入れて、測定試料を懸濁させた。
（Ｄ−２）チューブに抗Oct4抗体を５μＬ添加した。
（Ｄ−３）２５℃の室温で１５分間、標的ポリペプチドと標識抗体との結合反応を行った。
以上の手順で測定試料を調製した。検証９における上記の測定条件を測定１２とする。
【０１６６】
測定１２の測定試料をフローサイトメータに流し入れ、標的核酸および標的ポリぺプチドの画像を撮像した。図１４の各画像は、測定１２を撮像した画像であり、左側から順に、明視野画像、標的核酸の画像、標的ポリペプチドの画像であり、一番右側の画像は、標的核酸の増幅の画像と標的ポリペプチドの画像とをマージした画像である。このように、実施形態に係る測定試料の手順の処理を行えば、フローサイトメータによって撮像された標的核酸の画像および標的ポリペプチドの画像を適切に取得することができる。
【０１６７】
［検証９の結論］
・実施形態に係る粒子測定方法は、細胞の内部に含まれている標的ポリペプチドの標識にも適用できる。
【０１６８】
［検証１０：ＦＩＳＨ法による標的核酸の標識］
上記の検証１〜９では、測定対象の粒子の標的核酸の標識を、粒子内において標的核酸の増幅により行った。検証１０では、実施形態に係る粒子測定方法において、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ法）を適用できるか検証した。
【０１６９】
検証１０では、ＧＡＰＤＨ遺伝子に対する標的核酸の増幅および標識の後、ＧＡＰＤＨ遺伝子とは異なるＰＭＬ遺伝子を標的核酸として、ＰＭＬ遺伝子の標識をＦＩＳＨ法により行った。つまり、図１のフローチャートにおけるステップＳ１４の標的ポリペプチドの標識が、ＦＩＳＨ法による標的核酸の標識で置き替わったことを意味する。ＧＡＰＤＨ遺伝子に対する標的核酸の増幅および標識は、検証１の手順（Ａ）および（Ｂ）と同様に行った。検証１０では、標的ポリペプチドの標識は行わず、手順（Ｂ）の後、手順（Ｅ）を行った。以下に手順（Ｅ）を示す。なお、手順（Ａ−１０）の温度を調整する段階では、チューブの内容物を２５℃に調整し、２分間保持した。
【０１７０】
（Ｅ）ＦＩＳＨ法
手順（Ｂ）にて、ＧＡＰＤＨ遺伝子に対する増幅の後、引き続いて、ＰＭＬ遺伝子に対して標識を行った。
（Ｅ−１）チューブにHybridization Solution A(Cytocell、HA1000L)を７５μＬ添加した。
（Ｅ−２）チューブに標識プローブとして、PML Probe in Texas Red(Cytocell、MPH6480)を５μＬ添加した。
（Ｅ−３）上記で試薬を添加した後、チューブを９５℃で５分間加熱した後、４５度で１時間、静置させた。
（Ｅ−４）チューブを６００ｇで３分間遠心分離した後、上清を除去した。
（Ｅ−５）チューブに１００μＬのＰＢＳを入れて、測定試料を懸濁させた。
【０１７１】
以上の手順で測定試料を調製した。検証１０における上記の測定条件を測定１３とする。測定１３の測定試料をフローサイトメータに流し入れ、増幅を行った標的核酸およびＦＩＳＨ法を適用した標的核酸の画像を撮像した。図１５の各画像は、測定１３を撮像した画像であり、左側から順に、明視野画像、増幅を行った標的核酸の画像、ＦＩＳＨ法により標識した標的核酸の画像であり、一番右側の画像は、標的核酸の増幅の画像とＦＩＳＨ法により標識した標的核酸の画像とをマージした画像である。このように、実施形態に係る測定試料の手順の処理を行えば、フローサイトメータによって撮像された標的核酸の画像および他の標識標的核酸の画像を適切に取得することができる。
【０１７２】
［検証１０の結論］
・実施形態に係る粒子測定方法は、標的核酸の標識にＦＩＳＨ法を適用できる。
【０１７３】
検証１０の検証結果より、実施形態に係る粒子測定方法は、１つの粒子すなわち細胞に含まれる複数の核酸に対して、核酸の増幅およびＦＩＳＨ法によって異常を検出できることが分かった。
【０１７４】
上記のとおり、ＦＩＳＨ法は、遺伝子のコピー数異常を検出する場合に非常に有効な方法である。一方、核酸の増幅は、遺伝子の異常を検出することはできるものの、遺伝子のコピー数異常の検出には不向きである。つまり、核酸の増幅では検出することが困難だった遺伝子の変異をＦＩＳＨ法により検出することができ、また、ＦＩＳＨ法では検出が困難であった遺伝子の異常を核酸の増幅により検出できる。このように、１つの細胞について核酸の増幅およびＦＩＳＨ法を同時に用いた場合、それぞれの検出方法は、それぞれが得意とする異常の検出を行い、その結果、互いの弱点を補完するように、遺伝子の異常を検出することができる。これらのことから、１つの細胞について核酸の増幅およびＦＩＳＨ法を同時に行う検出方法は、遺伝子の異常の検出をより正確に行うことができ、より信頼性の高い情報が得られる検出臨床価値の高い検出方法として期待されている。
【０１７５】
また、ＨＥＲ２遺伝子が増幅している乳がん患者に対しては、抗ＨＥＲ２療法が行われる。しかしながら、ＨＥＲ２遺伝子が増幅している患者のうち約２０％の患者は、ＰＩＫ３Ｃａ遺伝子変異が生じているとされている。このように、ＨＥＲ２遺伝子が増幅し、さらに、ＰＩＫ３Ｃａ遺伝子変異が生じている患者は、完全寛解率が半分に低下するという報告がある。そこで、ＨＥＲ２遺伝子に対してはＦＩＳＨ法により、また、ＰＩＫ３Ｃａ遺伝子に対してはｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲにより測定することにより、乳がん患者に対して抗ＨＥＲ２療法が適切に効果を奏するか判断することができ、治療方針の決定の一助とすることができる。
【０１７６】
このように、１つの粒子すなわち細胞に含まれる複数の核酸に対して、核酸の増幅およびＦＩＳＨ法によって異常を検出することは、臨床診断において非常に有用な方法である。
【０１７７】
なお、検証１０において、ＧＡＰＤＨ遺伝子は、特許請求の範囲に記載の「標的核酸」に相当し、ＰＭＬ遺伝子は、特許請求の範囲に記載の「他の標的核酸」に相当する。
【０１７８】
検証１０では、標的ポリペプチドの標識は行われなかったが、標的核酸の増幅および他の標的核酸のＦＩＳＨ法による標識の後、検証１と同様に、手順（Ｃ）の処理により測定試料を調製してもよい。他の標的核酸をＦＩＳＨ法によって標識した場合でも、図６を参照して説明したように、粒子の表面のポリペプチドは、完全には分解されず、その形状が維持されつつ、隙間が広がる。したがって、標的ポリペプチドの標識を行うことができる。また、標的核酸、他の標的核酸、および標的ポリぺプチドのそれぞれを標識する標識物質は、それぞれ、特許請求の範囲に記載の「第１標識物質」、「第２標識物質」、および「第３標識物質」に相当する。また、標的ポリぺプチドは、検証９の検証結果より、粒子の内部に含まれていてもよい。
【０１７９】
なお、検証１０では、標的核酸の増幅を行った後に、他の標的核酸に対してＦＩＳＨ法による標識を行った。この順番を逆にした場合でも、それぞれの標的核酸が標識される可能性がある。
【０１８０】
このように、実施形態に係る粒子測定方法であれば、測定対象の粒子ごとに、標的核酸の増幅、他の標的核酸の標識、および標的ポリペプチドの標識を適宜組み合わせて、粒子の異常を検出することができる。
さらに、上記の検証では、測定対象の粒子について、標的核酸の標識および増幅と、標的ポリペプチドの標識との組み合わせ、あるいは、標的核酸の標識および増幅と、他の標的核酸の標識との組み合わせについての検証を行ったが、実施形態に係る粒子測定方法であれば、標的核酸の標識および増幅、標的ポリペプチドの標識、および他の標的核酸の標識を同時に行い、測定を行うことが可能である。
【０１８１】
そのような例として、乳がんの診断が挙げられる。乳がんの診断では、細胞内タンパク質であるＫｉ６７と、上述したＨＥＲ２遺伝子およびＰＩＫ３Ｃａ遺伝子の異常について調べる。従来は、Ｋｉ６７は免疫染色、ＨＥＲ２遺伝子はＦＩＳＨ法、ＰＩＫ３Ｃａ遺伝子はｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲにより、それぞれ別個に検出されていた。しかし、実施形態に係る粒子測定方法であれば、これらのタンパク質および遺伝子を同時に測定することが可能となる。これらを同時に測定することにより、測定の作業効率を向上させることができる。よって、乳がん患者に早期に診断結果を提示することが可能となる。また、本願発明の方法によれば、一つの細胞に対してＫｉ６７、ＨＥＲ２遺伝子、ＰＩＫ３Ｃａ遺伝子の状態を把握することができるため、これらの関連性から新たな臨床価値を生み出す可能性があると考えられる。
【符号の説明】
【０１８２】
１０  フローサイトメータ
１１０  フローセル
１２１〜１２３  光源
１５４  撮像部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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