(57)【要約】      （修正有）【課題】抗菌スペクトルが広く、様々な用途、特に眼感染症の治療に好適であり、かつ好ましくは耐性真菌が発生しにくい、抗真菌薬として特に好適な抗菌薬を提供する。【解決手段】抗菌性（抗細菌性、抗真菌性および／または抗原虫性）を有する式［（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫを含む単離ペプチドテトラマーおよびその誘導体を開示する。前記誘導体は、少なくとも１つのペプチドモノマー中に、少なくとも１つのアミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸欠失、ペプチドモノマー内における再配列および／または少なくとも１つの非タンパク質構成アミノ酸による修飾を含んでいてもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドモノマー（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）を出発物質とした、式［（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ（式中ｉ＝０または１である）の単離ペプチドテトラマー誘導体であって、
出発物質である該ペプチドモノマーに含まれる２つ以上のアミノ酸がアラニン残基で置換されている単離ペプチドテトラマー誘導体。
【請求項２】
［（ＲＧＡＡＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＫＶＶＡＡ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＡＫＡＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＫＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＡＡＡＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＡＫＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＡＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＡＡＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉおよび［（ＲＧＲＫＡＡＡＡ）２Ｋ］２ＫＫｉ（式中ｉ＝０または１である）からなる群から選択される、請求項１に記載の単離ペプチドテトラマー誘導体。
【請求項３】
薬剤、医薬組成物および／もしくは抗菌性組成物として使用するための、ならびに／または治療において使用するための、請求項１または２に記載の単離ペプチドテトラマー誘導体。
【請求項４】
少なくとも１種の微生物感染症を予防および／または治療するための薬剤の製造における、請求項１または２に記載の単離ペプチドテトラマー誘導体の使用。
【請求項５】
前記微生物感染症が、細菌感染症、真菌感染症および原虫感染症からなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記微生物感染症が真菌感染症である、請求項４または５に記載の使用。
【請求項７】
請求項１または２に記載の単離ペプチドテトラマー誘導体を含む、コンタクトレンズ用液剤および／もしくは点眼液、医薬組成物および／もしくは抗菌性組成物、器具のコーティングのための組成物ならびに／またはキット。
【請求項８】
請求項１または２に記載の単離ペプチドテトラマー誘導体の製造方法。
【請求項９】
前記ペプチドテトラマーまたはペプチドテトラマー誘導体が４つの同一のペプチドモノマーを含む前記方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に第１の保護されたＫ残基を結合させる工程；
（iii）第１のＫ残基中の１つのアミン基から保護基を除去する工程；
（iv）第１のＫ残基に第２の保護されたＫ残基を連結する工程；
（v）第２のＫ残基中の１つのアミン基から保護基を除去する工程；
（vi）第２のＫ残基に２つの保護されたＫ残基を連結する工程；
（vii）連結させた２つのＫ残基から保護基を除去する工程；
（viiii）各ペプチドモノマーの配列に従って、保護されたアミノ酸残基をＣ末端からＮ末端の方向へ連結し、連結の都度、次の連結のために保護基を除去することによって、さらに鎖を伸長させる工程；
（ix）加える残基の数に応じて、アミノ酸残基の連結を終了する工程；および
（x）任意で、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドテトラマーまたはペプチドテトラマー誘導体が４つの同一のペプチドモノマーを含む前記方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に第１の保護されたＫ残基を結合させる工程；
（iii）第１のＫ残基中の１つのアミン基から保護基を除去する工程；
（iv）第１のＫ残基に第２の保護されたＫ残基を連結する工程；
（v）第２のＫ残基中の１つのアミン基から保護基を除去する工程；
（vi）第２のＫ残基に２つの保護されたＫ残基を連結する工程；
（vii）連結させた２つのＫ残基から保護基を除去する工程；
（viii）２つのＫ残基の各アミン基に、保護された末端アミン基を有するペプチドモノマーを１つずつ連結する工程；および
（iv）任意で、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドテトラマーまたはペプチドテトラマー誘導体が４つの同一のペプチドモノマーを含む前記方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に第１のＫ残基を結合させる工程；
（iii）結合させた第１のＫ残基に２つの保護されたＫ残基を連結する工程；
（iv）連結させたＫ残基から保護基を除去する工程；
（v）各ペプチドモノマーの配列に従って、保護されたアミノ酸残基をＣ末端からＮ末端の方向へ連結し、連結の都度、次の連結のために保護基を除去することによって、さらに鎖を伸長させる工程；
（vi）加える残基の数に応じて、アミノ酸残基の連結を終了する工程；および
（vii）任意で、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドテトラマーまたはペプチドテトラマー誘導体が４つの同一のペプチドモノマーを含む前記方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に第１のＫ残基を結合させる工程；
（iii）結合させた第１のＫ残基に２つの保護されたＫ残基を連結する工程；
（iv）連結させたＫ残基から保護基を除去する工程；
（v）２つのＫ残基の各アミン基に、保護された末端アミン基を有するペプチドモノマーを１つずつ連結する工程；および
（vi）任意で、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌性、特に抗真菌性を有するテトラマー型ペプチドに関する。さらに本発明は、該テトラマーペプチドの製造方法に関する。また本発明は、微生物、特に真菌の増殖を抑制するための、該多量体の使用に関する。本発明はさらに、該テトラマーペプチドを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗真菌薬は、真菌の増殖抑制および／または真菌の殺傷（殺真菌薬）に使用される。例えば、抗真菌薬は、真菌による感染症の治療や、患者（特に免疫が低下した患者）における真菌感染症の発症を予防するために用いられる。病原性真菌感染症は、米国における感染症関連死因の第７位を占める。実際に最近の調査では、真菌性疾患が地球上の生物の脅威となりつつあることが示唆されている。
【０００３】
真菌類における一般的な創薬ターゲットは、ヒトの同種分子種とよく似ており、ヒトにおいても抑制作用を及ぼす恐れがあるため、利用可能な抗真菌薬の種類は抗細菌薬と比べて限られている。抗真菌薬としては、ポリエン類、アゾール類、アリルアミン類、フルシトシンおよびエキノキャンディン類が挙げられる（図９）。さらに最近の報告では、既存の抗真菌薬に対する耐性真菌の発生の増加が指摘されている。
【０００４】
真菌性角膜炎や角膜真菌症などの眼の真菌感染症は、熱帯地域では一般的に見られる。先進国では、コンタクトレンズやコンタクトレンズケア液の使用が真菌性角膜炎の主な危険因子となっている。コンタクトレンズによる真菌性角膜炎が初めて確認されて以来、複数の国で眼の病原性真菌感染症の発生が報告されている（図１０）。しかし、真菌性角膜炎に対して米国ＦＤＡで認可されている眼科用抗真菌薬はナタマイシンのみである。
【０００５】
薬剤耐性真菌の出現は免疫不全患者の増加と相まって、臨床医による治療の選択の幅を狭めており、新しいタイプの抗真菌薬の必要性が強調されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、抗菌スペクトルが広く、様々な用途、特に眼感染症の治療に好適であり、かつ好ましくは耐性真菌が発生しにくい、抗真菌薬として特に好適な抗菌薬の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１態様において本発明は、ペプチドモノマー（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）を出発物質とした、式［（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ（式中ｉ＝０または１である）を含む単離ペプチドテトラマー、または該ペプチドテトラマー［（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉの単離ペプチドテトラマー誘導体であって、出発物質である該ペプチドモノマーと比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸欠失、少なくとも１つのペプチドモノマー内における再配列、および／または少なくとも１つのペプチドモノマーにおける少なくとも１つの非タンパク質構成アミノ酸による修飾を含む、単離ペプチドテトラマーまたは単離ペプチドテトラマー誘導体に関する。
【０００８】
また、本発明は上記の単離ペプチドテトラマー誘導体または単離ペプチドテトラマーの使用に関する。
【０００９】
さらに、本発明は上記の単離ペプチド誘導体または単離ペプチドテトラマーの製造方法を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】モノマー、直鎖状レトロダイマー、ペプチドダイマーＢ２０８８、ペプチドテトラマーＢ４０１０、スクランブルＢ４０１０およびナタマイシンの構造を示す図である。
【図２】Ｂ４０１０によるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの殺菌動態を示したグラフであり、（Ａ）はＡＴＣＣ１０２３１株における結果、（Ｂ）はＤＦ２６７２Ｒ臨床分離株における結果を示す。グラフに記載の濃度のＢ４０１０、アムホテリシンＢおよびナタマイシンとともに２×１０６個の細胞をインキュベートした。グラフに記載の時点において試料の一部をＳＤＡに播種し、細胞生存率を測定した。
【図３】金属イオンおよび複合生体液の存在下におけるＢ４０１０の抗真菌性を示すグラフである。（Ａ）は一価金属イオンまたは二価金属イオンの存在下で測定したＭＩＣ値を示す。バー上の数字はＭＩＣの測定値を示す。（Ｂ）は金属イオン存在下でのＢ４０１０の殺カンジダ性を示す。Ｂ４０１０の濃度は５．５μＭであった。（Ｃ）はトリプシン存在下での抗真菌活性を示す（トリプシン：Ｂ４０１０＝１：１００）。（Ｄ）は５０％ウサギ涙液存在下でのＢ４０１０の殺カンジダ活性を示す。
【図４】Ｂ４０１０の毒性と角膜上皮再生速度を示すグラフである。（Ａ）は、４％ウサギ赤血球に対するＢ４０１０およびポリエン系抗真菌薬（ナタマイシンおよびアムホテリシンＢ）の溶血活性を示す。（Ｂ）は、ヒト角膜上皮（ＨＣＥ）細胞に対するＢ４０１０およびポリエン系抗真菌薬の細胞毒性を示す。（Ｃ）は、フルオレセイン染色により測定した、ニュージーランドホワイトウサギの角膜上皮再生に対するＢ４０１０の影響を示す。ペプチドの濃度は２２μＭであった。
【図５】Ｂ４０１０がＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの細胞膜電位、膜透過性および形態に及ぼす影響を示すグラフである。（Ａ）は、真菌の細胞壁多糖であるβ−キチンに対するＢ４０１０のアフィニティ欠如を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。（Ｂ）は、様々な濃度のＢ４０１０により誘導された、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓによるＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎの取り込みを示す。（Ｃ）は、ｄｉＳＣ３５アッセイによりＢ４０１０媒介性膜脱分極を観察した結果である。（Ｄ）は、Ｂ４０１０により誘導された、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの細胞外へのＡＴＰ放出を示す。挿入図はＡＴＰ放出の動態を示す。Ｂ４０１０の濃度は５．５μＭであった。（Ｅ）は、未処理のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのＳＥＭであり、スケールバーは２μｍ（挿入図のスケールバー＝２００ｎｍ）である。（Ｆ）は、５．５μＭのＢ４０１０で処理したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのＳＥＭ像であり、スケールバーは１μｍ（挿入図のスケールバー＝１００ｎｍ）である。
【図６】種々の添加物がＢ４０１０の殺カンジダ性および膜透過化性に及ぼす影響を示すグラフである。（Ａ）は膜電位に対するＣＣＣＰとＮａＮ３の影響を示す。（Ｂ）は生存率に対する種々の添加物の影響を示し、（Ｃ）はＡＴＰ放出に対する種々の添加物の影響を示す。（Ｄ）は膜電位に対するイオンチャネル阻害剤の影響を示す。矢印は添加物を加えた時点を示す。
【図７】Ｂ４０１０と哺乳類モデル膜または真菌モデル膜との相互作用を示すグラフである。（Ａ）は、Ｂ４０１０またはスクランブルＢ４０１０を添加後の、ＰＣ：ＰＥ：ＰＳ：エルゴステロールＳＵＶからのカルセイン放出の経時変化を示す。（Ｂ）は、ＰＣ：コレステロールＳＵＶからのカルセイン放出の経時変化を示す。ペプチドと脂質の比率はグラフに示す。
【図８】ＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）中のＢ４０１０およびスクランブルＢ４０１０のＣＤスペクトルである。
【図９】現在使用されている抗真菌薬の例を示した図である。
【図１０】２００７年〜２０１２年の眼の病原性真菌類を調査した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
「非タンパク質構成アミノ酸」は、２０種の標準アミノ酸が様々な数および組合せで配列されることによって通常構成される天然のタンパク質には通常見いだされないアミノ酸を指す。
【００１２】
「保護されたアミノ酸」は、カルボキシ基またはアミン基に保護基が付加されていることでこれらのいずれかの基が保護されており、これらのカルボキシ基とアミン基の両方ではなく、いずれか一方のみがペプチド結合を形成できるアミノ酸を意味する。アミン基が保護されている場合、カルボキシ基のみが別のアミン基とペプチド結合を形成できる。また、カルボキシ基が保護されている場合、アミン基のみが別のカルボキシ基とペプチド結合を形成できる。ポリペプチドの末端アミン基または末端カルボキシ基を同様に保護して、カルボキシ末端またはアミン末端のいずれか一方のみがペプチド結合を形成できるようにしてもよい。
【００１３】
本発明は、ペプチドモノマー（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）を出発物質とした、式［（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ（式中ｉ＝０または１である）を含む単離ペプチドテトラマー、または該ペプチドテトラマー［（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉの単離ペプチドテトラマー誘導体であって、出発物質である該ペプチドモノマーと比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸欠失、少なくとも１つのペプチドモノマー内における再配列、および／または少なくとも１つのペプチドモノマーにおける少なくとも１つの非タンパク質構成アミノ酸による修飾を含む、単離ペプチドテトラマーまたは単離ペプチドテトラマー誘導体に関する。さらに、任意の２つのペプチドモノマー、任意の３つのペプチドモノマーまたはすべてのペプチドモノマーが、少なくとも１つのアミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸欠失、ペプチドモノマー内における再配列および／または少なくとも１つの非タンパク質構成アミノ酸による修飾によって改変されていてもよい。出発物質であるペプチドモノマーの配列はＲＧＲＫＶＶＲＲである（配列番号１）。
【００１４】
ｉ＝０の場合、単離ペプチドテトラマーは［（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２Ｋである。
ｉ＝１の場合、単離ペプチドテトラマーは［（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫである。
【００１５】
単離ペプチドテトラマーは［（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２Ｋに由来していてもよく、あるいは、単離ペプチドテトラマーは［（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫである。
【００１６】
単離ペプチドテトラマー誘導体は式［（ペプチド）２Ｋ］２ＫＫを有する。
【００１７】
具体的には、単離ペプチドテトラマー誘導体は以下の分岐構造を有する。
【化１】
2019038807.tif 000002
【００１８】
単離ペプチドテトラマー誘導体も同様に、以下の分岐構造を有する。
【化２】
2019038807.tif 000003
【００１９】
ペプチド１、ペプチド２、ペプチド３およびペプチド４はそれぞれ、出発物質としての上記のペプチドモノマーに由来している。ペプチド１、ペプチド２、ペプチド３およびペプチド４は同じ配列を有していてもよく、異なる配列を有していてもよい。
【００２０】
ペプチド１、ペプチド２、ペプチド３およびペプチド４は、それぞれ独立して、配列番号２〜２６のいずれか１つを含んでいてもよい。
【００２１】
上記のアミノ酸置換は、出発物質であるペプチドモノマーに含まれる１つ以上のアミノ酸残基の任意の適切なアミノ酸による置換であってもよい。また、上記の置換は、出発物質であるペプチドモノマーに含まれる１つのアミノ酸の任意の適切なアミノ酸による置換であってもよい。例えば、上記のアミノ酸置換は少なくとも１つのアラニン置換であってもよい。上記のアミノ酸置換は、出発物質である少なくとも１つのペプチドモノマー（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）に含まれる１つのアミノ酸を任意の適切なアミノ酸で順次置換することを含んでいてもよい。
【００２２】
具体的には、上記のアミノ酸置換は、出発物質である少なくとも１つのペプチドモノマー（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）に含まれる１つのアミノ酸をアラニンで順次置換することを含む。
【００２３】
従って、単離ペプチドテトラマー誘導体は、［（ＡＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＡＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＡＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＡＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＫＡＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＫＶＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＫＶＶＡＲ）２Ｋ］２ＫＫｉおよび［（ＲＧＲＫＶＶＲＡ）２Ｋ］２ＫＫｉ（式中ｉ＝０または１である）からなる群から選択されてもよい。
ＡＧＲＫＶＶＲＲ＝配列番号２
ＲＡＲＫＶＶＲＲ＝配列番号３
ＲＧＡＫＶＶＲＲ＝配列番号４
ＲＧＲＡＶＶＲＲ＝配列番号５
ＲＧＲＫＶＡＲＲ＝配列番号６
ＲＧＲＫＶＡＲＲ＝配列番号７
ＲＧＲＫＶＶＡＲ＝配列番号８
ＲＧＲＫＶＶＲＡ＝配列番号９
【００２４】
ｉ＝０の場合、単離ペプチドテトラマー誘導体は、［（ＡＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２Ｋ、［（ＲＡＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２Ｋ、［（ＲＧＡＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２Ｋ、［（ＲＧＲＡＶＶＲＲ）２Ｋ］２Ｋ、［（ＲＧＲＫＡＶＲＲ）２Ｋ］２Ｋ、［（ＲＧＲＫＶＡＲＲ）２Ｋ］２Ｋ、［（ＲＧＲＫＶＶＡＲ）２Ｋ］２Ｋおよび［（ＲＧＲＫＶＶＲＡ）２Ｋ］２Ｋからなる群から選択される。
【００２５】
ｉ＝１の場合、単離ペプチドテトラマー誘導体は、［（ＡＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２Ｋ、［（ＲＡＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫ、［（ＲＧＡＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫ、［（ＲＧＲＡＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫ、［（ＲＧＲＫＡＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫ、［（ＲＧＲＫＶＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫ、［（ＲＧＲＫＶＶＡＲ）２Ｋ］２ＫＫおよび［（ＲＧＲＫＶＶＲＡ）２Ｋ］２ＫＫからなる群から選択される。
【００２６】
別の実施形態においては、出発物質であるペプチドモノマーに含まれる２つ以上のアミノ酸がアラニン残基で置換されていてもよい。
【００２７】
例えば、単離ペプチドテトラマー誘導体は、［（ＲＧＡＡＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＫＶＶＡＡ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＡＫＡＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＫＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＡＡＡＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＡＫＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＡＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＡＡＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、および［（ＲＧＲＫＡＡＡＡ）２Ｋ］２ＫＫｉ（式中ｉ＝０または１である）からなる群から選択されてもよい。
ＲＧＡＡＶＶＲＲ＝配列番号１０
ＲＧＲＫＶＶＡＡ＝配列番号１１
ＲＧＡＫＡＶＲＲ＝配列番号１２
ＲＧＲＫＡＡＲＲ＝配列番号１３
ＲＧＡＡＡＶＲＲ＝配列番号１４
ＲＧＡＫＡＡＲＲ＝配列番号１５
ＲＧＲＡＡＡＲＲ＝配列番号１６
ＲＧＡＡＡＡＲＲ＝配列番号１７
ＲＧＲＫＡＡＡＡ＝配列番号１８
【００２８】
ｉ＝０の場合、単離ペプチドテトラマー誘導体は、［（ＲＧＡＡＶＶＲＲ）２Ｋ］２Ｋ、［（ＲＧＲＫＶＶＡＡ）２Ｋ］２Ｋ、［（ＲＧＡＫＡＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＫＡＡＲＲ）２Ｋ］２Ｋ、［（ＲＧＡＡＡＶＲＲ）２Ｋ］２Ｋ、［（ＲＧＡＫＡＡＲＲ）２Ｋ］２Ｋｉ、［（ＲＧＲＡＡＡＲＲ）２Ｋ］２Ｋ、［（ＲＧＡＡＡＡＲＲ）２Ｋ］２Ｋ、および［（ＲＧＲＫＡＡＡＡ）２Ｋ］２Ｋからなる群から選択される。
【００２９】
ｉ＝１の場合、単離ペプチドテトラマー誘導体は、［（ＲＧＡＡＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫ、［（ＲＧＲＫＶＶＡＡ）２Ｋ］２ＫＫ、［（ＲＧＡＫＡＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫ、［（ＲＧＲＫＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫ、［（ＲＧＡＡＡＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫ、［（ＲＧＡＫＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫ、［（ＲＧＲＡＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫ、［（ＲＧＡＡＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫ、および［（ＲＧＲＫＡＡＡＡ）２Ｋ］２ＫＫからなる群から選択される。
【００３０】
別の実施形態において、単離ペプチドテトラマー誘導体は［（ＶＲＧＲＶＲＫＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ（式中ｉ＝０または１である）を含んでいてもよい。この実施形態においては、出発物質であるペプチドモノマー（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）内においてアミノ酸が再配列されており、すなわち出発物質であるペプチドモノマーの配列がスクランブルされている。ｉ＝０の場合、単離ペプチドテトラマー誘導体は［（ＶＲＧＲＶＲＫＲ）２Ｋ］２Ｋである。ｉ＝１の場合、単離ペプチドテトラマー誘導体は［（ＶＲＧＲＶＲＫＲ）２Ｋ］２ＫＫである。
ＶＲＧＲＶＲＫＲ＝配列番号１９
【００３１】
別の例では、上記のアミノ酸欠失は、出発物質である少なくとも１つのペプチドモノマーのＮ末端からアミノ酸を順次欠失させることを含んでいてもよい。従って、単離ペプチドテトラマー誘導体は、［（ＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉおよび［（Ｒ）２Ｋ］２ＫＫｉ（式中ｉ＝０または１である）からなる群から選択されてもよい。
ＧＲＫＶＶＲＲ＝配列番号２０
ＲＫＶＶＲＲ＝配列番号２１
ＫＶＶＲＲ＝配列番号２２
ＶＶＲＲ＝配列番号２３
ＶＲＲ＝配列番号２４
ＲＲ＝配列番号２５
Ｒ＝配列番号２６
【００３２】
ｉ＝０の場合、単離ペプチドテトラマー誘導体は、［（ＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２Ｋ、［（ＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２Ｋ、［（ＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２Ｋ、［（ＶＶＲＲ）２Ｋ］２Ｋ、［（ＶＲＲ）２Ｋ］２Ｋ、［（ＲＲ）２Ｋ］２Ｋおよび［（Ｒ）２Ｋ］２Ｋからなる群から選択される。
【００３３】
ｉ＝１の場合、単離ペプチド誘導体は、［（ＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫ、［（ＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫ、［（ＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫ、［（ＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫ、［（ＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫ、［（ＲＲ）２Ｋ］２ＫＫおよび［（Ｒ）２Ｋ］２ＫＫからなる群から選択される。
【００３４】
単離ペプチドテトラマーにおける非タンパク質構成アミノ酸による修飾は、（i）少なくとも１つのペプチドモノマー内の任意の位置に少なくとも１つの非タンパク質構成アミノ酸を付加すること、および／または（ii）少なくとも１つのペプチドモノマーに含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基を非タンパク質構成アミノ酸で置換することを含んでいてもよい。
【００３５】
具体的には、非タンパク質構成アミノ酸は、少なくとも１つのペプチドモノマーのいずれの位置に付加されていてもよい。
【００３６】
本発明の上記いずれかの態様による単離ペプチドテトラマーまたは単離ペプチドテトラマー誘導体は、薬剤、医薬組成物および／もしくは抗菌性組成物として使用するためのものであってもよく、かつ／または治療において使用するためのものであってもよい。抗菌性組成物は、抗細菌性組成物、抗真菌性組成物、抗原虫性組成物のいずれであってもよい。特に、抗菌性組成物は抗真菌性組成物を包含する。
【００３７】
本発明は、少なくとも１種の微生物感染症を予防および／または治療するための薬剤の製造における、本発明の上記いずれかの態様による単離ペプチドテトラマーまたは単離ペプチドテトラマー誘導体の使用を包含する。微生物感染症は、細菌感染症、真菌感染症および原虫感染症からなる群から選択されてもよい。特に、微生物感染症は真菌感染症を包含する。
【００３８】
本発明はまた、少なくとも１種の微生物の増殖を阻害および／または抑制する方法であって、本発明の上記いずれかの態様による少なくとも１つの単離ペプチドテトラマーまたは単離ペプチドテトラマー誘導体を該微生物と接触させることを含む方法を包含する。この方法はインビトロ法であってもよい。該微生物は細菌、真菌および原虫からなる群から選択されてもよい。特に、該微生物は真菌を包含する。
【００３９】
本発明はまた、少なくとも１種の微生物感染症を予防および／または治療する方法であって、本発明の上記いずれかの態様による少なくとも１つの単離ペプチドテトラマーまたは単離ペプチドテトラマー誘導体を投与することを含む方法を包含する。
【００４０】
本発明はさらに、本発明の上記いずれかの態様による単離ペプチドテトラマーまたは単離ペプチドテトラマー誘導体を含む、コンタクトレンズ用液剤および／もしくは点眼液、医薬組成物および／もしくは抗菌性組成物、器具のコーティングのための組成物ならびに／またはキットを包含する。
【００４１】
単離ペプチドテトラマーまたは単離ペプチドテトラマー誘導体の製造方法も本発明の一部として包含される。
【００４２】
一例において、４つの同一のペプチドモノマーを含むペプチドテトラマーまたは４つの同一のペプチドモノマーを含む単離ペプチドテトラマー誘導体を製造するための上記の方法は、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に第１の保護されたＫ残基を結合させる工程；
（iii）第１のＫ残基中の１つのアミン基から保護基を除去する工程；
（iv）第１のＫ残基に第２の保護されたＫ残基を連結する工程；
（v）第２のＫ残基中の１つのアミン基から保護基を除去する工程；
（vi）第２のＫ残基に２つの保護されたＫ残基を連結する工程；
（vii)連結させた２つのＫ残基から保護基を除去する工程;
（viiii）各ペプチドモノマーの配列に従って、保護されたアミノ酸残基をＣ末端からＮ末端の方向へ連結し、連結の都度、次の連結のために保護基を除去することによって、さらに鎖を伸長させる工程；
（ix）加える残基の数に応じて、アミノ酸残基の連結を終了する工程；および
（x）任意で、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む。
【００４３】
別の例において、４つの同一のペプチドモノマーを含むペプチドテトラマーまたは４つの同一のペプチドモノマーを含む単離ペプチドテトラマー誘導体を製造するための上記の方法は、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に第１の保護されたＫ残基を結合させる工程；
（iii）第１のＫ残基中の１つのアミン基から保護基を除去する工程；
（iv）第１のＫ残基に第２の保護されたＫ残基を連結する工程；
（v）第２のＫ残基中の１つのアミン基から保護基を除去する工程；
（vi）第２のＫ残基に２つの保護されたＫ残基を連結する工程；
（vii）連結させた２つのＫ残基から保護基を除去する工程；
（viii）２つのＫ残基の各アミン基に、保護された末端アミン基を有するペプチドモノマーを１つずつ連結する工程；および
（iv）任意で、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む。
【００４４】
別の態様によれば、４つの同一のペプチドモノマーを含むペプチドテトラマーまたは４つの同一のペプチドモノマーを含む単離ペプチドテトラマー誘導体を製造するための上記の方法は、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に第１のＫ残基を結合させる工程；
（iii）結合させた第１のＫ残基に２つの保護されたＫ残基を連結する工程；
（iv）連結させたＫ残基から保護基を除去する工程；
（v）各ペプチドモノマーの配列に従って、保護されたアミノ酸残基をＣ末端からＮ末端の方向へ連結し、連結の都度、次の連結のために保護基を除去することによって、さらに鎖を伸長させる工程；
（vi）加える残基の数に応じて、アミノ酸残基の連結を終了する工程；および
（vii）任意で、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む。
【００４５】
また、４つの同一のペプチドモノマーを含むペプチドテトラマーまたは４つの同一のペプチドモノマーを含む単離ペプチドテトラマー誘導体を製造するための上記の方法は、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に第１のＫ残基を結合させる工程；
（iii）結合させた第１のＫ残基に２つの保護されたＫ残基を連結する工程；
（iv）連結させたＫ残基から保護基を除去する工程；
（v）２つのＫ残基の各アミン基に、保護された末端アミン基を有するペプチドモノマーを１つずつ連結する工程；および
（vi）任意で、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む。
【００４６】
本発明の概略を説明したが、以下の実施例を参照することにより本発明をより容易に理解することができるであろう。ただし、以下の実施例は例示を目的として記載されており、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００４７】
具体的な記載のない、当技術分野において公知の標準的な分子生物学的手法については、概して、Green, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (2012)に記載の手法に従った。
【００４８】
実施例１：Ｂ４０１０テトラマーペプチドおよびスクランブルＢ４０１０
ペプチドモノマーＲＧＲＫＶＶＲＲＫＫ（配列番号２７）、直鎖状レトロダイマーＲＧＲＫＶＶＲＲＫＫＫＲＲＶＶＫＲＧＲ（配列番号２８）、ペプチドダイマーＢ２０８８（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）２ＫＫ、ペプチドテトラマーＢ４０１０［（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫおよびスクランブルＢ４０１０［（ＶＲＧＲＶＲＫＲ）２Ｋ］２ＫＫを図１に示す。ナタマイシンの構造も同時に図１に示す。
【００４９】
修飾ペプチド
この方法においては、Ｂ４０１０の配列（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）中の各アミノ酸をアラニン残基で置換し、抗菌活性と溶血活性とをハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法で評価する。第２の方法では、Ｂ４０１０の配列中の各アミノ酸残基を順次欠失させ、活性−毒性プロファイルを上記と同様に評価する。すべてのペプチドのＭＩＣを少なくとも３種の菌株に対して評価した後、成績の最も良かったペプチドを複数選択し、５０％ウサギ涙液、２５％血清、またはトリプシン（酵素：ペプチド＝約１：１００）中においてこれらのペプチドの活性を評価する。表１に修飾ペプチドとそれらの特性を示す。
【００５０】
【表１】
2019038807.tif 000004
【００５１】
複合生体液中において優れた活性を示すペプチドを確認後、表２に例示した非タンパク質構成アミノ酸残基による以下の修飾を選択する。
【００５２】
【表２】
2019038807.tif 000005
【００５３】
実施例２：試薬およびペプチド
試薬とペプチド：サブローデキストロース寒天はAcumedia社（ミシガン、ミシガン州、米国）から購入した。ペプチドはEZBiolabs社（カーメル、インディアナ州、米国）から購入した。Ｌ−α−ホスファチジルコリン（ＰＣ）、Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、Ｌ−α−ホスファチジルセリン（ＰＳ）、Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）などの脂質は、Avanti Polar Lipids社（アラバマ州、米国）から購入した。エルゴステロール、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）、４−アミノピリジン（４−ＡＰ）、５−ニトロ−２−（３−フェニルプロピルアミノ）安息香酸（ＮＰＰＢ）、ガドリニウム（III）クロリド、塩化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）および３’，３’−ジプロピルチアジカルボシアニン（ｄｉＳ−Ｃ３−５）色素は、Sigma-Aldrich社（ミズーリ州、米国）から購入した。ＡＴＰ生物発光キットはMolecular Probes社（オレゴン州、米国）から購入した。アムホテリシンＢおよびナタマイシンはSigma-Aldrich (S) Pte社（シンガポール）から粉末の形態で入手した。
【００５４】
実施例３：円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル測定
ペプチド（０．６ｍｇ／ｍＬ）の遠紫外ＣＤスペクトルを、光路長０．１ｃｍの石英キュベットを用い、１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．０）中２５℃でＪＡＳＣＯ Ｊ８１０分光偏光計（ＪＡＳＣＯ、東京、日本）により測定した。２６０ｎｍ〜１９０ｎｍのスペクトルを０．１ｎｍ間隔、走査速度５０ｎｍ／分で記録した。最終的なスペクトルは、４回走査の平均である。ＣＤデータは平均残基楕円率（（θ）ｍｒｗ、ｄｅｇｃｍ２ ｄｍｏｌ−１）として表した。
【００５５】
実施例４：多価ペプチドの抗真菌活性
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定
酵母菌株を培養し、平底マイクロタイタープレートにおいて、６倍希釈したサブローデキストロース（ＳＤ）ブロス中に初期ＯＤ６００＝約０．０８で懸濁した。同じブロスで段階希釈したペプチドを上記酵母液と混合し、最終ペプチド濃度を０．４〜２２μＭとした。インフィニットＭ２００マイクロプレートリーダー（Tecan Group社、スイス）を用いて、１００ｒｐｍ、３７℃で２４／４８時間オービタル振とうしながら、３０分間隔でＯＤ６００を測定することにより抗真菌活性を評価した。ペプチドを含まない培養物を陽性対照とし、ブロスのみまたは２２μＭのペプチドを加えたブロスを陰性対照とした。完全な阻害に必要な最小濃度を目視とＯＤ６００測定により求め、ＭＩＣとした。実験は３連で行った。
【００５６】
結果：ペプチドモノマーＲＧＲＫＶＶＲＲＫＫ（配列番号２７）と直鎖状レトロダイマーＲＧＲＫＶＶＲＲＫＫＫＲＲＶＶＫＲＧＲ（配列番号２８）は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ株とフザリウム菌株に弱い抗真菌活性を示した（表３）。しかしながら、分岐リシンを介して上記モノマー配列を２つ連結すると（Ｂ２０８８、図１）、モノマーと比較してＭＩＣ値は大幅に低下した（約１／１４）（表３）。さらに、分岐リシンを介して上記分岐ダイマーを２つ組み合わせて四分岐ペプチド（Ｂ４０１０）を作製した。四分岐ペプチド（Ｂ４０１０）のＭＩＣは、上記共有結合ダイマーと比較してさらに１／４〜１／１０に低下した（表３）。また、２種のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ臨床分離株に対するＢ４０１０（０．３４μＭ）のＭＩＣ値は、アムホテリシンＢ（１．４μＭ）のＭＩＣ値および米国ＦＤＡで認可されている唯一の眼科用抗真菌薬であるナタマイシン（１５μＭ）のＭＩＣ値より低かった。興味深いことに、Ｂ４０１０の配列をスクランブルしたＳｃ＿Ｂ４０１０のＭＩＣ値は２〜４倍上昇したが、十分な効力を有していた。上記２種の四分岐ペプチドのＣＤスペクトルは、２００ｎｍ付近に強い負のピークを示し、これらのペプチドが不規則な立体配座を有していることが示唆された（図８）。
【００５７】
ペプチドＢ４０１０はＡＴＣＣ標準株および臨床分離株に対して広い抗真菌活性スペクトルを示した（表３）。その活性は、米国ＦＤＡで認可されている唯一の眼科用薬物であるナタマイシンより２〜４倍優れていた。表４は、設計した他のペプチドのＭＩＣおよび細胞毒性を示す。
【００５８】
【表３】
2019038807.tif 000006
【００５９】
【表４】
2019038807.tif 000007
【００６０】
実施例５：Ｔｉｍｅ−Ｋｉｌｌ動態分析
Ｔｉｍｅ−Ｋｉｌｌ動態は、２種のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ株（ＡＴＣＣ１０２３１およびＤＦ２６７２Ｒ）において測定した。菌株をＳＤブロス中で一晩培養し、細胞濃度をリン酸緩衝液で１０５〜１０６ＣＦＵ／ｍＬに調節した。それぞれの培養物にペプチドまたは抗真菌薬を加えた。培養物に加えたペプチドまたは抗真菌薬はそれぞれ適切な最終濃度となるように調節した（Ｂ４０１０（ＡＴＣＣ株では１．４〜１１μＭ、ＣＡ２６７２Ｒ株では０．３７〜３．７μＭ）、アムホテリシンＢ（ＣＡ２６７２Ｒ株において０．５５μＭ〜１１μＭ）およびナタマイシン（ＡＴＣＣ株では４．７μＭ〜７５μＭ、ＣＡ２６７２Ｒ株では３０μＭ））。試験溶液を一定振とうしながら３７℃でインキュベートした。真菌懸濁液１００μＬを所定の時点で採取し、段階希釈（１０２倍または１０３倍）してＳＤＡ平板培地に入れた。この平板培地を３７℃で４８時間インキュベートし、コロニー数を計数した。データは、陽性対照に対する細胞生存率（％）として表した。
【００６１】
図２Ａおよび図２Ｂは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓをＢ４０１０またはポリエン系抗真菌薬に接触させて行なった濃度依存的Ｔｉｍｅ−Ｋｉｌｌ実験の結果を示す。ＡＴＣＣ株では、Ｂ４０１０は１×ＭＩＣの濃度において１時間で約９１％の殺菌を誘導し、濃度を２×ＭＩＣに上げると約９７％の殺菌が観察された。Ｂ４０１０の濃度を４×ＭＩＣおよび８×ＭＩＣに上げると、それぞれ２０分および１０分において生存細胞の対数減少値が４Ｌｏｇ（９９．９９％）となった。一方、ナタマイシンは、１６×ＭＩＣの濃度でも同様のエンドポイントに到達するのに２４時間かかった。また、臨床分離株Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓＤＦ２６７２Ｒに対するＢ４０１０、ナタマイシンおよびアムホテリシンＢの殺菌動態も比較した。Ｂ４０１０は２×ＭＩＣの濃度において１時間で完全に殺菌することができたのに対し、アムホテリシンＢは１６×ＭＩＣの濃度において最大の効果を発揮するのに８時間弱を要した。しかしながら、２×ＭＩＣの濃度のナタマイシンでは２４時間接触させた後でも殺真菌作用は観察されなかった。
【００６２】
実施例６：一価カチオンおよび二価カチオンがＢ４０１０の抗真菌活性に及ぼす影響
金属イオンによる影響を検討するため、ＳＤブロスを適切な濃度の塩で調節した。塩の最終濃度は、ＮａＣｌおよびＫＣｌでは１００ｍＭおよび１３５ｍＭとし、ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２では０．５〜２ｍＭとした。上記と同様にＭＩＣの測定を行った。ブロスにＣ．ａｌｂｉｃａｎｓＡＴＣＣ１０２３１細胞と塩とを加えたものを陽性対照とした。ブロスに塩のみ（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、またはＭｇＣｌ２）を加えたもの、またはブロスに塩と２２μＭのペプチドとを加えたものを陰性対照とした。
【００６３】
生存率に対する金属イオンの影響を検討するため、金属イオンの最終濃度が適切な濃度となるように、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを含むブロス溶液（ＯＤ６００＝０．４〜０．６）を調節し、５．５μＭのＢ４０１０とともに６時間インキュベートし、４８時間後に上記と同様にして細胞生存率を測定した。
【００６４】
結果：生理学的濃度の金属イオン（ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２）がＢ４０１０の抗真菌活性に及ぼす影響を検討した。生理学的条件に近い（涙液中の濃度に近い）濃度の一価カチオンまたは二価カチオンの存在下、様々な濃度のペプチドを用いてＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ１０２３１の増殖を観察した（図３Ａ、図３Ｂ）。１００ｍＭまたは１３５ｍＭのＮａＣｌを添加するとＢ４０１０の抗真菌活性は上昇し、３．１２５μｇ／ｍＬにおいて増殖は目視で観察されなかった（図３Ａ）。１３５ｍＭのＮａＣｌを添加することによって抗真菌活性は上昇しＭＩＣは半減したが、生理学的濃度の二価カチオンはＭＩＣ値を２倍に上昇させるに至った（図３Ａ）。高濃度のＣａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンは、ＭＩＣ値を２倍に上昇させた。カリウムはＢ４０１０の抗真菌活性にさらに劇的な影響を与え、２５ｍＭのＫＣｌが存在すると、ＭＩＣ値は８倍上昇することが観察された（図３Ｂ）。１００ｍＭのＫＣｌを添加すると、ＫＣｌを培地に加えなかった場合と比較して、ＭＩＣの上昇は１６倍を超えた。また、Ｂ４０１０の殺カンジダ活性のカチオン感受性も測定した。一価カチオンまたは二価カチオンの存在下でＢ４０１０（５．５μＭ）を添加すると、生存細胞は完全に見られなくなった（図３Ｂ）。しかし、高濃度のＫＣｌの存在下では、殺カンジダ活性がやや低下することが観察された。
【００６５】
実施例７：トリプシン、血清および涙液がＢ４０１０の抗真菌活性に及ぼす影響
トリプシンまたは５０％涙液の存在下におけるＢ４０１０の抗真菌活性
特に明記しない限り、すべての実験においてＡＴＣＣ１０２３１株を使用した。Ｂ４０１０（１ｍｇ／ｍＬ）をトリプシンとともに（酵素：ペプチド＝１：１００）３７℃でインキュベートした。様々な時間間隔（０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間）でこの混合物から２０μＬを採取し、１μＬのトリプシン阻害剤と混合した。この混合物を１８０μＬの酵母液に加え、ＯＤ６００で増殖を２４時間観察することでペプチドの抗真菌活性を測定した。トリプシン／トリプシン阻害剤の存在下（Ｂ４０１０は添加せず）で行った同様の実験を陽性対照とした。涙液（ＴＦ）中での抗真菌活性の評価では、新たに採取したウサギＴＦにペプチドを溶解し、３７℃で６時間インキュベートした。インキュベーション後、涙液中ペプチドを、一晩培養した等量のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ（約１０６ＣＦＵ／ｍＬ）と混合し、３７℃で２４時間インキュベートした。ペプチドの最終濃度は、４．４μＭ、８．８μＭ、および２２μＭとした。インキュベートした混合物を段階希釈（１０２倍または１０３倍）し、そこから１００μＬをＳＤ寒天平板培地に播種後、３７℃で４８時間インキュベートした。培養物のみおよび５０％涙液との培養物を陽性対照とした。データは、涙液を加えなかった培養物に対する殺菌率（％）で表した。５０％涙液の存在下において約６〜１０％の殺菌率が観察された。
【００６６】
５％ヒト血清中におけるＭＩＣの測定
５％ヒト血清が２種のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ臨床分離株に対するＢ４０１０の活性に及ぼす影響を検討した。ヒト男性血清を１３,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して脂質を除去し、上清を回収した。臨床分離株Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ２６７２ＲおよびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ１９７６Ｒに対するＭＩＣ値は、標準培地（ＳＤブロス）中および上記の５％血清上清を含む標準培地中で測定した。
【００６７】
３種の複合的な生物学的環境においてペプチドの抗真菌性を検討した。
【００６８】
トリプシン
ペプチドＢ４０１０をトリプシンとともに（トリプシン：ペプチド＝１：１００）３７℃でインキュベートした。様々な時間間隔でこの混合物から一部を採取し、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ酵母液に加え、増殖を観察した（図３Ｃ）。トリプシンとともにインキュベーションを行っても６時間まで抗真菌活性の低下は観察されず、四分岐ペプチドが改善されたタンパク分解抵抗性を有していることが示唆された。
【００６９】
涙液およびヒト血清
また、涙液やヒト血清などの複合生体液の存在下においてＢ４０１０の抗真菌効果を観察した。
【００７０】
涙液
Ｂ４０１０の抗真菌活性を５０％涙液中で測定した。涙液の非存在下では、ペプチド濃度５．５μＭで生存細胞の約９８±２％の死滅が観察された。しかしながら、５０％涙液の存在下では、低濃度（４．４μＭおよび８．８μＭのＢ４０１０）において殺カンジダ活性が中程度抑制された（図３Ｄ）。しかし、２２μＭでは活性低下は観察されず、涙液の存在下でＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの対数減少値を３Ｌｏｇより大きくするには、高濃度のペプチドが必要であることが示唆された。
【００７１】
血清
Ｂ４０１０の抗真菌効果に対する血清の影響は、５％ヒト血清の存在下で、２種のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ臨床分離株に対するＢ４０１０のＭＩＣの変化を測定することにより検討した。いずれの菌株においても、ＭＩＣ値は血清の非存在下での０．３４μＭから、血清の存在下で５．５μＭに上昇し、５％血清中でＭＩＣは１６倍上昇することが示唆された。
【００７２】
実施例８：溶血、細胞毒性、角膜上皮再生速度およびインビボ毒性に対するＢ４０１０の影響
溶血アッセイ
ペプチドおよび抗真菌薬の溶血活性は、ウサギ赤血球に対して測定した（Ｏｒｅｎら、１９９７）。すなわち、ペプチドまたは抗真菌薬をＰＢＳで段階希釈してｒＲＢＣ（最終濃度４％ｖ／ｖ）と混合し、３７℃で１時間インキュベート後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清に放出されたヘモグロビンを５７６ｎｍの吸光度で測定することにより、ヘモグロビンの放出を観察した。ＰＢＳ（何も添加せず）中の細胞懸濁液の測定値を０％溶血とし、１％トリトン−Ｘ１００中の細胞懸濁液の測定値を１００％溶血とした。
【００７３】
溶血アッセイの結果：Ｂ４０１０が哺乳類細胞の細胞膜の完全性を破壊する能力を、ウサギ赤血球を用いた溶血アッセイにより評価した。ペプチドは４４０μＭの濃度でもウサギ赤血球に対して有意な溶血活性（＜１％溶血）を示さなかった（図４Ａ）。一方、アムホテリシンＢおよびナタマイシンは低濃度で有意な溶血活性を示し、ＨＣ５０値はそれぞれ５９．４±７．８μＭと１３９．６±０．１８μＭであった。
【００７４】
表５に種々のペプチドテトラマーの溶血アッセイの結果をまとめた。
【００７５】
【表５】
2019038807.tif 000008
【００７６】
ヒト結膜上皮細胞に対する細胞毒性
ＩＯＢＡ−ＮＨＣ細胞を標準的な条件（５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気）で、１μｇ／ｍＬウシ膵臓インスリン、２ｎｇ／ｍＬマウス上皮増殖因子、０．１μｇ／ｍＬコレラ毒素、５μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、５０ＵＩ／ｍＬペニシリンおよび５０ＵＩ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。すべての実験において、５０〜８０代継代した細胞を使用した。正常な培養成長を位相差顕微鏡法により毎日観察した。コンフルエントとなった細胞を緩やかな条件でトリプシンとともにインキュベートすることで剥がし、計数した。フローサイトメトリーによる細胞毒性アッセイのマイクロタイター分析を行うため、細胞を９６ウェル培養プレート（コーニング、スキポール−レイク、オランダ）に播種した（約１０,０００個／ウェル）。培養を３７℃で２４時間継続した。その後、サブコンフルエントとなった細胞（培養面が７０％近くを覆う状態）を種々の濃度（０．２２μＭ〜２２５μＭ）のペプチドに接触させた。MultiTox-Fluor Multiplexアッセイキット（プロメガ、ウィスコンシン州、米国）を用いてＡＦＣ蛍光（λｅｘ＝４８５ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）を測定することにより、細胞毒性を一定時間ごとに測定した。８時間インキュベートした後でも検出可能な毒性は認められなかったため、ペプチドとともに細胞を２４時間インキュベートした後に細胞生存率を測定し、ＥＣ５０（生存細胞を５０％減少させるのに有効なペプチド濃度）を求めた。
【００７７】
インビボ細胞毒性
Ｃ５７ＢＬ６野生型マウス（６〜８週齢）を用いてＢ４０１０の急性毒性を評価した。投与経路ごとに健常野生型マウスを２匹ずつ選択した。Ｂ４０１０を腹腔内投与（２００ｍｇ／ｋｇ）または静脈内投与（１００ｍｇ／ｋｇ）した。投与経路ごとに２匹のマウスを使用し、２４／４８時間観察して死亡率または毒性の徴候を測定した。
【００７８】
細胞毒性アッセイの結果：２２０μＭのＢ４０１０を接触させることによって細胞生存率は５０％低下した（図４Ｂ）。Ｂ４０１０のＥＣ５０値はナタマイシン（２１１．７±２０．５μＭ）と同程度であり、アムホテリシンＢ（１３４±１６μＭ）よりも良好であった（図４Ｂ）。
【００７９】
ウサギモデルの角膜創傷治癒
Ｂ４０１０の局所投与がインビボでの角膜創傷治癒に影響を与えるかどうかをさらに検討した。すべての動物実験は、眼科および視覚研究における動物の使用（実験動物のケアおよび使用に関するガイドライン）についてのＡＲＶＯ宣言（the ARVO statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research, the guide for the Care and Use of laboratory animals）（National Research Council）に従い、Singhealth Experimental Medical Centre（SEMC）の監督下で行った。４匹のニュージーランドホワイトウサギを２群に分け、２匹を対照群（生理食塩水）、２匹をＢ４０１０を用いた試験群とした。ウサギに１ｍＬのケタミン（１００ｍｇ／ｍＬ）と０．５ｍＬのキシラジル（２０ｍｇ／ｍＬ）を筋肉内注射して鎮静した。１％キシロカインを局所投与し角膜を麻酔した。既報（Ｃｒｏｓｓｏｎら、１９８６）に従い、５ｍｍトレフィンを用いて創縁の切り込みを入れ、滅菌した小さなメス（BD-Beaver）で上皮細胞を物理的に除去し、基底膜はそのまま残した。２２μＭのＢ４０１０を１日３回局所投与することによってウサギを処置した。角膜創傷を確認するために眼科医院で用いられている無毒色素であるフルオレセインナトリウムで角膜創傷を染色して可視化し、コバルトブルーフィルターを用いた細隙灯生体顕微鏡で観察した。上皮再生される過程の残留創傷範囲をImage-J1.440によって測定した。
【００８０】
結果：１日３回のＢ４０１０（２２μＭ）の局所投与による上皮創傷治癒速度は、対照群と変わらなかった（図４Ｃ）。角膜上皮の創傷が治癒することは眼の自然免疫の回復に必須であることから、この結果は重要である。マウスにおけるインビボ毒性についての予備試験では、ＩＰ投与（２００ｍｇ／ｋｇ）、ＩＶ投与（１００ｍｇ／ｋｇ）のいずれでも、死亡、罹患または毒性の徴候は認められなかった。
【００８１】
実施例９：ｅｒｇΔ株に対するＢ４０１０の抗真菌活性
野生型（ＷＴ）および変異型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株に対するＭＩＣの測定
変化したステロール構造およびステロール組成を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｅｒｇΔ変異株に対してもＢ４０１０の抗真菌活性を試験した。
【００８２】
ＷＴ株または変異株から得た同一形状の数個のコロニーを０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＳＤブロスに直接播種し、３０℃で一晩培養した。遠心分離により細胞を回収し、滅菌水で洗浄後、凍結した。細胞をＳＤ寒天平板培地に再度播種し、３７℃で４８時間インキュベートした。変異株の同一形状のコロニーを２つまたは３つ回収し、ＳＤブロスに播種した。ペプチドを滅菌水に溶解し、ＷＴ株または変異株と混合し、試験管中３７℃で４８時間または７２時間インキュベートした。酵母菌株の増殖を抑制したペプチドの最小濃度を目視により決定した。
【００８３】
結果：耐性病原体の発生は、真菌感染症を管理する上で大きな脅威である。ステロールの変化がＢ４０１０の抗真菌活性に影響を及ぼすかどうかを調べるために、エルゴステロール（ｅｒｇΔ）経路に特定の変異を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を用いて実験を行った。表６に、変化したステロール構造およびステロール組成を有する種々のｅｒｇΔ変異株と野生型とに対するＢ４０１０のＭＩＣ値をまとめた。興味深いことに、ｅｒｇΔ変異株はいずれもＢ４０１０に対して高い感受性を示し、そのＭＩＣ値は野生型と比較して１／２〜１／４に低下した。
【００８４】
ＥｒｇΔ変異株はＢ４０１０に対して高い感受性を示す。変異の結果、これらの変異株は、エルゴステロールのＢ環またはＣ環と側鎖とが変化した構造のステロールを蓄積する。菌株に与えた主なステロールを表５に簡単に示す。全体として、変異株のＭＩＣ値は野生型と比較して１／２〜１／４に低下した。変異株ｅｒｇ２Δ、ｅｒｇ３Δ、ｅｒｇ３Δｅｒｇ６Δおよびｅｒｇ４Δｅｒｇ５Δは、Ｂ４０１０に対して高い感受性を示した（野生型と比較してＭＩＣが１／４に低下した）。変異株ｅｒｇ２Δｅｒｇ６Δおよびｅｒｇ６Δは、Ｂ４０１０に２倍高い感受性を示した。
【００８５】
【表６】
2019038807.tif 000009
【００８６】
実施例１０：細胞壁成分との相互作用
ＳＤＳ−ＰＡＧＥプルダウンアッセイ
作用機序を調べる別の研究において、真菌の細胞壁の主成分であるキチンやβ−Ｄ−グルカンなどの不溶性多糖類に対するＢ４０１０のアフィニティを検討した。Ｂ４０１０（５．５〜２２μＭ）をキチン（エビの殻由来）またはβ−Ｄ−グルカンと３７℃で２時間インキュベートした。この混合物を１０,０００ｇで遠心分離し、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％）で分析した。キチンやβ−Ｄ−グルカンを用いない対照実験も行い、これらの糖質ポリマーに対するペプチドの結合を定量した。
【００８７】
キチン、β−Ｄ−グルカンのいずれにおいても沈降は認められず、ペプチドは細胞壁多糖類に対してアフィニティを示さなかった（図５Ａ）。
【００８８】
実施例１１：Ｂ４０１０の膜破壊活性
２種の相補的な蛍光光度分析を行い、Ｂ４０１０が膜標的化作用を有するかどうかを検討した。
【００８９】
ＳＹＴＯＸＧｒｅｅｎ（ＳＧ）取り込みアッセイ
ペプチドが細胞膜を透過性にするかどうかを調べるために、ＳＧの取り込みを分析した。ＳＧは、無傷の細胞膜を有する細胞とインキュベートしても蛍光を発しない膜非透過性の色素である。ＳＧは、細胞膜に損傷を有する細胞では細胞内の核酸と結合して強い蛍光を発する。
【００９０】
ＳＧ取り込みアッセイを実施するため、一晩培養したカンジダ（ＡＴＣＣ１０２３１）を遠心分離により採取し、ＨＥＰＥＳ緩衝液で３回洗浄後、ＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁した。ペプチドを添加する前に、細胞を１μＭのＳＧとともに暗所でインキュベートした。様々な濃度のペプチドを加え、５２０ｎｍで発光強度の増大を観察した（λｅｘ＝４８５ｎｍ）。実験終了時に１％トリトン−Ｘ１００を加え、取り込み率（％）を求めた。
【００９１】
結果：Ｂ４０１０が細胞膜を透過性にする能力をＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ取り込みアッセイにより検討した。この蛍光色素は、損傷した細胞膜を有する細胞を染色し、細胞内の核酸と結合して強い蛍光を発する。Ｂ４０１０を添加すると、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの蛍光強度が急激に増加することが観察され、細胞膜溶解作用が確認された（図５Ｂ）。
【００９２】
１μＭのＳＧとインキュベートしたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓにＢ４０１０を加えると、色素は急速に取り込まれ、それと同時に蛍光強度が濃度依存的に上昇した（図５Ｂ）。１／２×ＭＩＣ値（１３％）および１×ＭＩＣ値（２４％）では、弱い透過性が観察された。２×ＭＩＣのＢ４０１０を添加すると、１０分で約７０％の細胞に膜損傷が起こった。Ｂ４０１０濃度を４×ＭＩＣに上昇させると、２５分以内により高いレベルの色素取り込み（＞９０％）が観察された。
【００９３】
ｄｉＳ−Ｃ３−５細胞膜脱分極
Ｂ４０１０の添加によるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの膜電位の変化を、膜電位感受性プローブｄｉＳ−Ｃ３−５色素の放出により観察した。すなわち、一晩培養した中間対数増殖期のカンジダ細胞を５ｍ ＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、この懸濁液１ｍＬを１０μＭのｄｉＳ−Ｃ３−５色素と混合し、サーモシェーカーにおいて３７℃で１〜２時間インキュベートした。色素を取り込んだ細胞の懸濁液８００μＬを石英キュベットに移し、懸濁液をキュベット内で攪拌しながら、Quanta Master分光蛍光計（Photon Technology International、ニュージャージー州、米国）を用いて蛍光強度の変化を発光波長（λｅｍ）６７０ｎｍ（励起波長６２２ｎｍ）で観察した。励起バンド幅と発光バンド幅をそれぞれ１ｎｍと２ｎｍに設定した。蛍光レベルが一定となった後、ペプチドの最終濃度が０．２２〜２２μＭになるようにＨＥＰＥＳ緩衝液中濃縮ペプチド溶液１０μＬを加えた。蛍光強度の変化を１時間または２時間連続して測定した。また、エネルギー毒素およびイオンチャネル阻害剤の影響を調べるために、これらの添加物を先に加えてから５．５μＭのＢ４０１０を加えた。蛍光強度の変化を上記と同様に観察した。
【００９４】
酵母は細胞内が負の静止膜電位に維持されていることから、Ｂ４０１０の殺カンジダ作用が膜全体の電気化学勾配の消失によるものかどうかを調べるために電位感受性プローブであるｄｉＳ−Ｃ３−５を用いた。図５Ｃは、電位感受性プローブを取り込んだＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを用いた、Ｂ４０１０の添加による膜電位の濃度依存的消失を示す。脱分極はＢ４０１０の添加により瞬時に起こり、この脱分極の経時変化は細胞からのプローブの放出を示している。しかし、ＭＩＣの２倍を超えるペプチドを添加しても、最終的な膜電位消失に有意な差は見られなかった。
【００９５】
膜電位の消失と殺カンジダ活性との関連性を確認するために、同一条件下で細胞生存率試験を行った。ペプチドの濃度を４×ＭＩＣよりも高くすると、生存能が完全に消失することが観察された。ＳＧ取り込みアッセイを合わせたこれらの結果から、Ｂ４０１０は急速な膜電位の消失を引き起こし、かつ濃度依存的にＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの細胞膜を透過性にすることが確認された。
【００９６】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓをＢ４０１０に暴露させた後の金属イオンとＡＴＰの細胞外放出を分析することによって、膜摂動が膜のバリア機能に影響を及ぼすかどうかを検討した。
【００９７】
細胞外カチオンの測定
一晩培養した後期対数増殖期のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを遠心分離により採取し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）で５回洗浄後、ＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁し、ＯＤ６００＝０．４に調節した。この懸濁液５ｍＬにＢ４０１０（最終濃度５．５μＭ）を加え、３７℃で２時間インキュベートした。この混合物を３,０００ｇで遠心分離し、上清中のＫ＋、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋の存在を、ＣＭＭＡＣ施設（シンガポール国立大学、化学学部）で利用可能なPerkin Elmer Dual-view Optima 5300 DV誘導結合プラズマ発光分光計（ICP-OCS、マサチューセッツ、米国）により推算した。
【００９８】
ＡＴＰ生物発光アッセイ
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓをＢ４０１０に暴露させた後の細胞外ＡＴＰレベルを既報の方法（Ｋｏｓｈｌｕｋｏｖａら、１９９９）で測定した。細胞（ＯＤ６００＝約０．６）を３７℃で１．５時間インキュベートし、種々の添加物の存在下または非存在下においてオービタル振とうしながら３７℃で２時間インキュベートした。Ｂ４０１０（５．５μＭ）を加え、振とうしながら３７℃で１．５時間さらにインキュベートした。各チューブを５０００ｇで５分間遠心分離した。その後、上清２５μＬに２２５μＬの沸騰ＴＥ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）を加え、よく混合した。この混合物を再度さらに２分間沸騰させ、試験を行うまで４℃で保存した。１００μＬのルシフェリン−ルシフェラーゼＡＴＰアッセイ混合物を上清１００μＬに加え、インフィニットＭ２００マイクロプレートリーダー（Tecan Group社、スイス）を用いて発光を観察した。経時変化実験では、様々な時間間隔で細胞（ＯＤ６００＝０．４）を５．５μＭのペプチドで処理した。用量依存試験では、ペプチドの濃度を０．４〜４４μＭの範囲で変動させた。細胞外ＡＴＰ濃度は、メーカーの説明書に従い、ＡＴＰアッセイキット（Molecular Probes、オレゴン州、米国）により得た検量線を用いて決定した。
【００９９】
結果：上清中のＫ＋とＣａ２＋のバックグラウンド濃度はそれぞれ４３．４±２μＭおよび２．５±０．５μＭであった。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓをＢ４０１０（５．５μＭ）とともに２時間インキュベーション後、２倍を超えるカリウム濃度の上昇（１０４±４．２μＭ）およびカルシウム濃度の上昇（５．８±１．３μＭ）が見られたが、Ｎａ＋イオンレベルおよびＭｇ２＋イオンレベルには有意な変化は認められなかった。ＡＴＰ生物発光アッセイでは、Ｂ４０１０添加によるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓからの急速なＡＴＰの放出が示された（図５Ｄ挿入図）。ＡＴＰの放出もペプチド濃度に依存しており、約４×ＭＩＣのＢ４０１０で最大となった（図５Ｄ）。Ｂ４０１０で処理したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形態学的変化を走査型電子顕微鏡法により観察した。未処理の細胞は滑らかな表面を有する丸いドーム型であった（図５Ｅ）。一方、Ｂ４０１０とともに３０分間インキュベートしたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの細胞表面はかなり損傷し、表面に出芽痕を有していた（図５Ｆ）。いくつかの細胞では異常物質の放出も認められ（図５Ｆ挿入図）、Ｂ４０１０の膜溶解作用が示唆された。
【０１００】
エネルギー毒素またはイオンチャネル阻害剤の存在下でのＢ４０１０の殺カンジダ活性
エネルギー毒素およびイオンチャネル阻害剤の影響を見るために、酵母細胞（１０５〜１０６ＣＦＵ／ｍＬ）を添加物の存在下または非存在下において３７℃で２時間インキュベートした。最終濃度５．５μＭのＢ４０１０ペプチドを細胞懸濁液に加え、３７℃で１．５時間さらにインキュベートした。各細胞懸濁液を希釈後、細胞１００μＬを播種し、３７℃でインキュベートした。添加物を含む（ペプチドは含まない）ＳＤＡ平板培地を陽性対照とした。３７℃で４８時間インキュベーション後、各平板培地に形成されたコロニーの数を数えることで細胞生存率を求めた。添加物の最終濃度は、ＣＣＣＰ（５μＭ）、ＮａＮ３（５ｍＭ）、４−ＡＰ（１ｍＭ）、ＮＰＰＢ（０．５ｍＭ）、ガドリニウム（II）クロリド（１ｍＭ）、塩化テトラエチルアンモニウム（１５ｍＭ）であった。独立した２連の実験の平均値を報告した。それぞれの添加物を使用した対照実験も行い、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する添加物の毒性を評価した。
【０１０１】
結果：
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの代謝作用がＢ４０１０に対する感受性に及ぼす影響を検討するため、ｄｉＳ−Ｃ３−５を取り込んだ細胞を５μＭのＣＣＣＰ（プロトン勾配の脱共役剤）または５ｍＭのＮａＮ３（ミトコンドリア阻害の古典経路と代替経路に対する遮断剤）とともにインキュベートし、Ｂ４０１０添加後の蛍光強度の変化を観察した。ＣＣＣＰの添加により蛍光強度は大幅に低下し、膜電位の崩壊が示された。次にＢ４０１０を加えると、膜電位差はわずかに変化した（図６Ａ）。既にＶｅｅｒｍａｎらによって明らかにされているように、色素を取り込んだ細胞にＮａＮ３を添加すると弱い脱分極が起こった。次にＢ４０１０を加えると、蛍光強度は上昇した（図６Ａ）。一方、アジド処理細胞では対照細胞と比較して蛍光強度が約１／２５に低下したが、遠心分離によりＮａＮ３を除くと強度変化は回復し、このエネルギー毒素が殺カンジダ活性を可逆的に阻害することが示された。これらの結果から、プロトン脱共役剤およびエネルギー毒素はいずれも、Ｂ４０１０によって誘導された細胞膜の脱分極を著しく低下させたことが示唆された。ＣＣＣＰとあらかじめインキュベートしたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞はＢ４０１０による殺傷から部分的に保護されるが、ＮａＮ３の存在下では完全に保護されることが観察された（図６Ｂ）。
【０１０２】
ＣＣＣＰおよびＮａＮ３がＢ４０１０によるＡＴＰ放出に及ぼす影響も検討した。細胞生存率アッセイの結果と一致して、ＡＴＰ生物発光アッセイでは、Ｂ４０１０で処理した細胞の細胞外ＡＴＰレベルが有意に増加することが示された（図６Ｃ）。一方、ＣＣＣＰまたはＮａＮ３であらかじめ処理した後、Ｂ４０１０を添加した細胞では、Ｂ４０１０処理細胞と比較してＡＴＰ放出が有意に低下した（図６Ｃ）。
【０１０３】
イオンチャネル阻害剤がＢ４０１０の抗真菌活性に及ぼす影響：
Ｂ４０１０がＫ＋とＡＴＰを急速に放出させること、および外部からのＫ＋の添加により細胞死が減少し、高いイオン濃度ではＭＩＣが１６倍上昇することから、イオンチャネル阻害剤によってＣ．ａｌｂｉｃａｎｓをＢ４０１０から保護できるのではないかという疑問がもたらされた。非特異的有機カチオン性阻害剤（ＴＥＡおよび４−ＡＰ）ならびに酵母伸展活性化イオンチャネル遮断剤であるＧｄ３＋がＢ４０１０の殺カンジダ活性に及ぼす影響を検討した。ペプチドは、ＴＥＡまたは４−ＡＰで前処理した細胞の生存率を有意に低下させた（図６Ｂ）。生存率の低下と一致して、ＴＥＡまたは４−ＡＰで前処理後にＢ４０１０を添加した細胞では、これらの阻害剤を用いなかった細胞と同程度の量のＡＴＰの放出が観察された（図６Ｃ）。一方、Ｇｄ３＋とともにインキュベートした細胞では、Ｂ４０１０の誘導による殺傷から部分的に保護された（５４±６％の生存率低下）。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞をアニオンチャネル阻害剤であるＮＰＰＢで前処理した後にＢ４０１０を添加すると、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓはＢ４０１０から有意に保護された（１２±４％の殺菌率）（図６Ｂ）。さらに、完全または部分的な保護を提供する添加物によって、ＡＴＰの流出が完全に消失または減少することがＡＴＰ放出アッセイから確認された（図６Ｃ）。
【０１０４】
Ｂ４０１０活性の欠失と膜電位変化との関係性を調べるために、ｄｉＳ−Ｃ３−５色素を取り込んだ細胞の強度変化に添加物が及ぼす影響をＢ４０１０の添加前と添加後とで測定した。ＴＥＡおよび４−ＡＰは膜電位を変化させなかったが、Ｂ４０１０を次いで添加すると、膜電位は完全に消失し、強度変化の大きさは、４−ＡＰまたはＴＥＡをあらかじめ添加しなかった細胞で観察されたものと同等であった（図６Ｄ）。色素を取り込んだＣ．ａｌｂｉｃａｎｓにＧｄ３＋を加えると、有意な脱分極が観察された。次いでＢ４０１０を添加すると膜電位の弱い消失が起こり、細胞生存率およびＡＴＰ放出アッセイが増強された。ＮＰＰＢとインキュベートした細胞では、膜電位の崩壊が起こったが細胞生存率には影響を及ぼさなかった。次いでＮＰＰＢ処理細胞にＢ４０１０を加えると、膜電位の消失が妨げられ（図６Ｄ）、Ｂ４０１０の殺カンジダ性が消失した。種々の添加物の存在下での色素放出アッセイから、負の静止膜電位と代謝活動とがＢ４０１０の殺カンジダ活性に極めて重要であることが示唆された。
【０１０５】
１５重量％エルゴステロールを含むＰＣ／ＰＥ／ＰＩもしくはＰＳ脂質（５：２．５：２．５）またはＰＣ／コレステロール（１０：１）を用いて小さな一枚膜リポソーム（Small unilamellar vesicle：ＳＵＶ）を調製した（Ｍａｋｏｖｉｔｚｋｉら、２００６）。ＰＣ／ＰＥ／ＰＩもしくはＰＳ／Ｅｒｇ ＳＵＶは以下のようにして調製した。ガラス管中で脂質をクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）に溶解した。エルゴステロールを同じ溶媒に溶解し、脂質混合物に加えて、エルゴステロールの最終含量を１５重量％とした。脂質−エルゴステロール混合物を窒素ガスで乾燥し、脂質層を形成させた。このフィルムを２０ｍＭのＰＢＳを含む緩衝液（ｐＨ７）中で水和し、ボルテックスし、超音波処理した。超音波処理（５秒間、４０℃）の都度、液体窒素で凍結し、３７℃の水浴で解凍した。この手順を透明な分散物が目視できるまで５〜６回繰り返した。得られたＳＵＶを２つに分けた。一方には５０ｍＭのカルセインを加え、１時間インキュベートした。カルセインを添加したＳＵＶ１００μＬを、２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で平衡化したUltrahydrogel（登録商標）２５０カラム（７．８ｍｍ×３００ｍｍ）に注入し、カラム容量の１．５倍を流速１ｍＬ／分で通液してイソクラティック溶出することによって、過剰なカルセインを除去した。得られたカルセイン添加リポソームと、カルセインを含まないリポソームとを混合し（１：１）、リポソーム最終濃度を調整した。ペプチド濃縮物を加えて、ペプチド：リポソーム比を１：３０または１：１５とした。ペプチドまたはトリトンＸ−１００を添加した後の蛍光シグナルの変化を、ＰＴＩ分光蛍光計を用いて励起波長４８０ｎｍ、発光波長５１２ｎｍで測定した。各時点において放出されたカルセインのパーセンテージを下記の式により算出した。
【数１】
2019038807.tif 000010
式中、Ａ０はペプチド添加後に観察された蛍光強度、Ａｍｉｎはベースラインの平均強度（ペプチド添加前）、Ａｍａｘは１％トリトンＸ−１００添加後の飽和相の平均強度である。
同様の手順によりＰＣ／コレステロールＳＵＶを調製した。
【０１０６】
結果：図７Ａは、ペプチド：脂質比が１：３０および１：１５の場合のＳＵＶからのカルセインの急速な放出を示す。ペプチド濃度を高くするとカルセインの放出量が増加した。Ｂ４０１０によりカルセインの放出は約６８％となったのに対し、スクランブルペプチドでのカルセインの放出は約４１％であったが、これは後者のペプチドのＭＩＣ値が高かったことと一致する。一方、ナタマイシンではカルセインの放出は観察されず、ナタマイシンはエルゴステロールと複合体を形成し、大きな膜貫通孔を形成しなかった（図７Ａ）。哺乳類モデル膜（ＰＣ：コレステロール）では、Ｂ４０１０はわずかな量のカルセインの放出しか誘導せず（図７Ｂ）、真菌モデル膜に高い選択性があることが示唆された。
【０１０７】
考察
熱帯の国々では、真菌症の発症率は高く、健康的にも経済的にも大きな問題となっている。免疫不全患者の増加、食品における抗真菌薬の多用、医療器具やインプラントの使用の増加などによって、真菌感染症の発症はますます増加している。全身性カンジダ症による死亡率は４０％であり、米国における院内血流感染の原因の第４位となっている。現在使用されている抗真菌薬とそれらの特性を表７に例示する。以下のような抗真菌薬が使用されているものの、耐性真菌の増加と抗真菌薬の選択肢が限られているという問題が残されている。
【０１０８】
【表７】
2019038807.tif 000011
【０１０９】
本研究から、弱い抗真菌性を持つペプチドを多量体化することで、抗真菌性や膜透過活性がモノマーと比較して大幅に増強されることが明らかとなった。上記の一連のＢ４０１０ペプチドは以下の特徴を有する。
１．様々なタイプの真菌や酵母を速やかに殺菌する（１時間未満）。
２．膜のステロール組成が変化した変異型酵母を殺菌できる。
３．分解されにくい。
４．生理学的濃度の一価イオンおよび二価イオンに抵抗性がある。
【０１１０】
モノマーを４つ有する最も活性なペプチド（Ｂ４０１０）は、カンジダ株およびフザリウム菌株に対して優れた抗真菌活性を示した。配列のスクランブル化により抗真菌活性が１／２〜１／４に低下したことから、アミノ酸配列の重要性が示された。
【０１１１】
また、Ｂ４０１０の殺カンジダ活性動態をポリエン系抗真菌薬と比較した。ＡＴＣＣ株、臨床分離株のいずれに対しても、Ｂ４０１０は２×ＭＩＣ値または４×ＭＩＣ値の濃度で１時間未満に生存細胞の３Ｌｏｇの減少を認めたが、ポリエン系抗真菌薬では同様のエンドポイントに到達するのに高濃度と長時間とを要した。さらに、Ｂ４０１０の抗真菌性を、一価カチオンまたは二価カチオンの存在下と複合生体液中とで検討した。その結果、Ｂ４０１０の抗真菌活性は、高濃度のＫ＋イオンでは活性の低下が観察されたものの、生理学的なイオン強度では変化は見られなかった。高濃度のＫ＋が酵母細胞に及ぼす強い脱分極作用が、抗真菌活性の低下の原因であると考えられる。
【０１１２】
トリプシンまたは涙液と６時間インキュベートしても、Ｂ４０１０は有意な抗真菌活性を維持した。これらの結果から、複合的な生物環境におけるＢ４０１０の高い安定性が示唆される。ヒト血清の存在下では、２種の臨床分離株に対するペプチドのＭＩＣ値は約１６倍上昇した。Ｂ４０１０とアルブミンまたは他のタンパク質との相互作用がＭＩＣ値の上昇の原因であると考えられる。これらの結果を総合すれば、複合生体液中でのＢ４０１０の抗真菌効果が高いことが注目される。
【０１１３】
アゾール系抗真菌薬およびポリエン系抗真菌薬に対するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの耐性発現についてはいくつかのメカニズムが報告されている。公知のアゾール耐性およびポリエン耐性のうち最も重要視されているメカニズムは、エルゴステロール生合成経路の特定のステップが変化することによってステロール構造やステロール組成が定性的または定量的に変化することである。ＡＩＤＳ患者や白血病患者から単離されたアゾール耐性Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ株中のステロール組成を分析すると、エルゴスタ−７，２２−ジエノールが蓄積していた。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ４、ＥＲＧ６およびＥＲＧ３の変異によりポリエン系抗真菌薬およびアゾール系抗真菌薬に対する耐性が増強することが明らかにされている。しかし、変化したステロール構造やステロール組成を有する酵母変異株はいずれもＢ４０１０に対して高い感受性を示す。アゾール系抗真菌薬およびポリエン系抗真菌薬に対して本質的に耐性を有するｅｒｇ３Δ変異株が、ｅｒｇ２Ｄ変異株やｅｒｇ２Ｄ６Ｄ変異株よりも、Ｂ４０１０に対して高い感受性を示すことは注目に値する。ステロールの変化によって膜流動性が高まり、このことによってＢ４０１０の透過性が増加したことが、変異株で観察された高い感受性の原因かもしれない。
【０１１４】
生体防御ペプチドの治療有効性は、高い細胞毒性や溶血活性によっても制限される。ナタマイシンやアムホテリシンＢと比較して、本発明のペプチドはより高い濃度でもウサギ赤血球に対して溶血を起こさなかった。しかし、本発明のペプチドのＨＣＥ細胞に対する細胞毒性はナタマイシンと同程度であり、アムホテリシンＢよりも高かった。Ｂ４０１０はウサギの角膜上皮再生速度に影響を及ぼさず、マウスに対しても急性毒性を示さなかったことから、本発明のペプチドは外科的用途で安全であることが示された。
【０１１５】
多くの抗真菌性ペプチドは抗真菌作用の発揮に無傷な細胞壁を必要とすることから、Ｂ４０１０の細胞壁多糖類に対するアフィニティを試験した。Ｂ４０１０は、プルダウン実験において共沈が観察されなかったことから、β−Ｄ−グルカンやキチンにアフィニティを示さなかった。膜標的化特性を精査し、急速な殺カンジダ活性と関連づけるために、膜透過性化動態にＢ４０１０の濃度が及ぼす影響をＳＧ取り込みアッセイとｄｉＳ−Ｃ３−５放出アッセイにより検討した。いずれの濃度においても、急速なＳＧの取り込みが観察され、最大の取り込みは４×ＭＩＣの濃度で認められた。この結果は、４×ＭＩＣにおいて３０分間で完全に殺菌されるというＴｉｍｅ−Ｋｉｌｌ動態アッセイの結果を支持するものである。ｄｉＳ−Ｃ３−５色素放出実験からは、低濃度で弱い膜電位の消失が示唆され、最大の消失は２×ＭＩＣを超えて観察された。同じ条件下において４×ＭＩＣのＢ４０１０に接触させた酵母細胞の生存率が低下することから、膜電位の消失が殺カンジダ活性と関連していることが示唆される。膜電位の急速な消失とＳＧ取り込みは、ペプチドと細胞膜の直接的な相互作用を示すものだと考えられる。
【０１１６】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓをＢ４０１０に暴露させるとＫ＋イオンおよびＣａ２＋イオンが２倍増加することから、細胞膜の損傷が示された。Ｂ４０１０で処理した酵母細胞からのＡＴＰの細胞外放出は濃度依存的であり、最大流出は４×ＭＩＣで認められた。ＡＴＰ流出動態は４×ＭＩＣにおいて３０分以内に最大になり、殺カンジダ活性動態と一致していた。ＳＥＭ実験では、Ｂ４０１０で処理したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの形態は損傷して表面が粗くなり、広範囲に出芽痕を有していた。この観察によっても、ペプチドの主要かつ不可欠な標的が恐らく細胞膜であることが示唆される。
【０１１７】
この研究では、細胞膜電位やエネルギー代謝に影響を及ぼす添加物が、Ｂ４０１０による殺菌からＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを実質的に保護することが示された。ＣＣＣＰは５μＭで細胞膜を脱分極させることが示されているが、ミトコンドリアの脱分極には高濃度（＞５０μＭ）が必要である。細胞生存率アッセイでは、５μＭのＣＣＣＰで細胞を前処理すると、Ｂ４０１０から細胞を部分的に保護することができることが確認された（細胞の生存率：４５％）。ｄｉＳ−Ｃ３−５アッセイでは、５μＭのＣＣＣＰ存在下で膜電位が崩壊することが示された。同様の効果がアニオンチャネル阻害剤であるＤＩＤＳの存在下でも観察された。これらの結果は、負の電気化学勾配の変化が、Ｂ４０１０からＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを保護するメカニズムの根幹をなしている可能性を示唆している。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの膜電位は−７６±５ｍＶであり、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの膜電位は−１２０ｍＶであることが明らかにされている（５５，５６）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの膜電位が低いことは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて観察されたＭＩＣ値（５．５μＭ）がＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのＭＩＣ値（０．３７〜１．４μＭ）よりも高いことと関連すると考えられる。
【０１１８】
上記を裏付けるものとして、高濃度の細胞外Ｋ＋は細胞生存率に影響を与えることなく酵母細胞を強く脱分極させ、次いでＢ４０１０を添加すると膜電位はほとんど変化せず、Ｂ４０１０から部分的に保護された（細胞の生存率：４０％）。さらに、膜電位を変化させないイオンチャネル阻害剤は、Ｂ４０１０から酵母細胞を保護することができなかった。しかし、ＮａＮ３の存在下ではＢ４０１０の殺カンジダ活性は完全に消失した。ＮａＮ３は膜電位に影響を与えることなく酵母の形質膜の流動性を変化させることが明らかにされている。このことと一致して、膜流動化剤を添加するとＢ４０１０の抗真菌活性は回復した。従って、上記から、Ｂ４０１０の殺カンジダ作用が形質膜電位および膜流動性に関連があることが示唆される。
【０１１９】
精製脂質とエルゴステロールとを含むカルセイン担持ＳＵＶにＢ４０１０が及ぼす影響から、本発明のペプチドの膜溶解作用が明確に示された。この実験の結果では、Ｂ２０８８ペプチドまたはＳｃ＿Ｂ４０１０ペプチドの存在下でカルセイン放出の低下が観察されたことから、四分岐化とアミノ酸配列とが細胞膜の損傷に重要であることがさらに示された。しかし、コレステロールを含む両性イオン性ＳＵＶでは、Ｂ４０１０によるカルセインの放出は低下し、哺乳類モデル膜との相互作用は弱いことが示唆された。エルゴステロールを含む混合リポソームにおける高いカルセイン放出率（％）および伸長されたペプチド立体配座の維持は、ＭＤシミュレーションにおいて得られた結果を支持するものであった。さらに、酵母に対するＭＩＣが低く、ＨＣＥ細胞に対するＥＣ５０値が高かったことから、Ｂ４０１０が真菌細胞膜を選択的に損傷することが確認された。
【０１２０】
結論として、この研究から、分岐リシンコアを用いて活性の弱い４つのペプチドを１つのペプチドとして構築することによってその特性が増強され、さらに直鎖状抗菌ペプチドが有する制限の一部を克服できることが明らかとなった。さらに、本発明のペプチドは、ステロール構造やステロール組成が変化した複数種の酵母菌株に対して高い効力を示すことから、耐性菌に対する有効性が示唆される。本発明のペプチドはインビトロ試験およびインビボ試験において毒性を示さなかった。Ｂ４０１０は細胞膜を標的とし、膜電位を急速に消失させ細胞内成分を失わせる。膜電位や代謝活動を変化させる添加物は抗真菌性に大きく影響する。ＳＵＶを用いた実験により、本発明のペプチドは哺乳類モデル膜よりも真菌モデル膜により選択的であることが示された。推定配列の１番目のアルギニン残基は、負に帯電した真菌モデル膜との相互作用の媒介に重要な役割を果たした。これを裏付けるものとして、１番目のアルギニンを置換すると抗真菌活性が約１／２〜１／４に低下した。生体内での状態をシミュレートすることは難しいが、本研究では広範囲な実験とコンピュータシミュレーション研究とを組み合わせて、抗真菌ペプチドとモデル脂質との相互作用をさらに解明した。本研究は、治療において重要でありかつ耐性菌に対する有効性が期待される新規抗真菌薬を合理的に設計するための指針となる。
【０１２１】
この出願には以下の発明［１］〜［２７］が含まれる。
［１］ペプチドモノマー（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）を出発物質とした、式［（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ（式中ｉ＝０または１である）を含む単離ペプチドテトラマー、または該ペプチドテトラマー［（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉの単離ペプチドテトラマー誘導体であって、
出発物質である該ペプチドモノマーと比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸欠失、少なくとも１つのペプチドモノマー内における再配列、および／または少なくとも１つのペプチドモノマーにおける少なくとも１つの非タンパク質構成アミノ酸による修飾を含む、単離ペプチドテトラマーまたは単離ペプチドテトラマー誘導体。
［２］前記アミノ酸置換が少なくとも１つのアラニン置換を含む、前記［１］に記載の単離ペプチドテトラマー誘導体。
［３］出発物質である少なくとも１つの前記ペプチドモノマー（ＲＧＲＫＶＶＲＲ）に含まれる１つのアミノ酸がアラニンで順次置換されている、前記［２］に記載の単離ペプチドテトラマー誘導体。
［４］［（ＡＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＡＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＡＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＡＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＫＡＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＫＶＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＫＶＶＡＲ）２Ｋ］２ＫＫｉおよび［（ＲＧＲＫＶＶＲＡ）２Ｋ］２ＫＫｉ（式中ｉ＝０または１である）からなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の単離ペプチドテトラマー誘導体。
［５］出発物質である前記ペプチドモノマーに含まれる２つ以上のアミノ酸がアラニン残基で置換されていてもよい、前記［１］に記載の単離ペプチドテトラマー誘導体。
［６］［（ＲＧＡＡＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＫＶＶＡＡ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＡＫＡＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＫＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＡＡＡＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＡＫＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＡＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＡＡＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉおよび［（ＲＧＲＫＡＡＡＡ）２Ｋ］２ＫＫｉ（式中ｉ＝０または１である）からなる群から選択される、前記［１］または［５］に記載の単離ペプチドテトラマー誘導体。
［７］前記アミノ酸欠失が、出発物質である少なくとも１つの前記ペプチドモノマーのＮ末端からアミノ酸を順次欠失させることを含む、前記［１］に記載の単離ペプチドテトラマー誘導体。
［８］［（ＧＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＫＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＶＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉおよび［（Ｒ）２Ｋ］２ＫＫｉ（式中ｉ＝０または１である）からなる群から選択される、前記［１］または［７］に記載の単離ペプチドテトラマー誘導体。
［９］前記単離ペプチドテトラマーにおける非タンパク質構成アミノ酸による修飾が、（i）少なくとも１つの前記ペプチドモノマー内の任意の位置に非タンパク質構成アミノ酸を付加すること、および／または（ii）少なくとも１つの前記ペプチドモノマーに含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基を非タンパク質構成アミノ酸で置換することを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の単離ペプチドテトラマー誘導体。
［１０］式［（ＶＲＧＲＶＲＫＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ（式中ｉ＝０または１である）を含む、前記［１］に記載の単離ペプチドテトラマー誘導体。
［１１］薬剤、医薬組成物および／もしくは抗菌性組成物として使用するための、ならびに／または治療において使用するための、前記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の単離ペプチドテトラマーまたは単離ペプチドテトラマー誘導体。
［１２］少なくとも１種の微生物感染症を予防および／または治療するための薬剤の製造における、前記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の単離ペプチドテトラマーまたは単離ペプチドテトラマー誘導体の使用。
［１３］前記微生物感染症が、細菌感染症、真菌感染症および原虫感染症からなる群から選択される、前記［１２］に記載の使用。
［１４］前記微生物感染症が真菌感染症である、前記［１２］または［１３］に記載の使用。
［１５］少なくとも１種の微生物の増殖を阻害および／または抑制する方法であって、
前記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の少なくとも１つの単離ペプチドテトラマー誘導体または単離ペプチドテトラマーを該微生物と接触させることを含む方法。
［１６］前記微生物が、細菌、真菌および原虫からなる群から選択される、前記［１５］に記載の方法。
［１７］前記微生物が真菌である、前記［１５］または［１６］に記載の方法。
［１８］インビトロ法である、前記［１５］〜［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］少なくとも１種の微生物感染症を予防および／または治療する方法であって、
前記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の少なくとも１つの単離ペプチドテトラマーまたは単離ペプチドテトラマー誘導体を対象に投与することを含む方法。
［２０］前記微生物感染症が、細菌感染症、真菌感染症および原虫感染症からなる群から選択される、前記［１９］に記載の方法。
［２１］前記微生物感染症が真菌感染症である、前記［１９］または［２０］に記載の方法。
［２２］前記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の単離ペプチドテトラマーまたは単離ペプチドテトラマー誘導体を含む、コンタクトレンズ用液剤および／もしくは点眼液、医薬組成物および／もしくは抗菌性組成物、器具のコーティングのための組成物ならびに／またはキット。
［２３］前記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の単離ペプチドテトラマーまたは単離ペプチドテトラマー誘導体の製造方法。
［２４］前記ペプチドテトラマーまたはペプチドテトラマー誘導体が４つの同一のペプチドモノマーを含む前記方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に第１の保護されたＫ残基を結合させる工程；
（iii）第１のＫ残基中の１つのアミン基から保護基を除去する工程；
（iv）第１のＫ残基に第２の保護されたＫ残基を連結する工程；
（v）第２のＫ残基中の１つのアミン基から保護基を除去する工程；
（vi）第２のＫ残基に２つの保護されたＫ残基を連結する工程；
（vii）連結させた２つのＫ残基から保護基を除去する工程；
（viiii）各ペプチドモノマーの配列に従って、保護されたアミノ酸残基をＣ末端からＮ末端の方向へ連結し、連結の都度、次の連結のために保護基を除去することによって、さらに鎖を伸長させる工程；
（ix）加える残基の数に応じて、アミノ酸残基の連結を終了する工程；および
（x）任意で、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む、前記［２３］に記載の方法。
［２５］前記ペプチドテトラマーまたはペプチドテトラマー誘導体が４つの同一のペプチドモノマーを含む前記方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に第１の保護されたＫ残基を結合させる工程；
（iii）第１のＫ残基中の１つのアミン基から保護基を除去する工程；
（iv）第１のＫ残基に第２の保護されたＫ残基を連結する工程；
（v）第２のＫ残基中の１つのアミン基から保護基を除去する工程；
（vi）第２のＫ残基に２つの保護されたＫ残基を連結する工程；
（vii）連結させた２つのＫ残基から保護基を除去する工程；
（viii）２つのＫ残基の各アミン基に、保護された末端アミン基を有するペプチドモノマーを１つずつ連結する工程；および
（iv）任意で、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む、前記［２３］に記載の方法。
［２６］前記ペプチドテトラマーまたはペプチドテトラマー誘導体が４つの同一のペプチドモノマーを含む前記方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に第１のＫ残基を結合させる工程；
（iii）結合させた第１のＫ残基に２つの保護されたＫ残基を連結する工程；
（iv）連結させたＫ残基から保護基を除去する工程；
（v）各ペプチドモノマーの配列に従って、保護されたアミノ酸残基をＣ末端からＮ末端の方向へ連結し、連結の都度、次の連結のために保護基を除去することによって、さらに鎖を伸長させる工程；
（vi）加える残基の数に応じて、アミノ酸残基の連結を終了する工程；および
（vii）任意で、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む、前記［２３］に記載の方法。
［２７］前記ペプチドテトラマーまたはペプチドテトラマー誘導体が４つの同一のペプチドモノマーを含む前記方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に第１のＫ残基を結合させる工程；
（iii）結合させた第１のＫ残基に２つの保護されたＫ残基を連結する工程；
（iv）連結させたＫ残基から保護基を除去する工程；
（v）２つのＫ残基の各アミン基に、保護された末端アミン基を有するペプチドモノマーを１つずつ連結する工程；および
（vi）任意で、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む、前記［２３］に記載の方法。
【０１２２】
参考文献
Crosson C.E., Klyce S.D. and Beuerman R.W. (1986) Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process. Invest Ophthalmol Vis Sci. 27:464-73.
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【図１】
2019038807.tif 000012
【図２】
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【図３】
2019038807.tif 000014
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019038807.tif 000021
【配列表】
2019038807000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月25日(2018.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
［（ＲＧＲＫＶＶＡＡ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＫＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＡＡＡＶＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＡＫＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＲＡＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉ、［（ＲＧＡＡＡＡＲＲ）２Ｋ］２ＫＫｉおよび［（ＲＧＲＫＡＡＡＡ）２Ｋ］２ＫＫｉ（式中ｉ＝０または１である）からなる群から選択される単離ペプチドテトラマー誘導体。
【請求項２】
薬剤、医薬組成物および／もしくは抗菌性組成物として使用するための、ならびに／または治療において使用するための、請求項１に記載の単離ペプチドテトラマー誘導体。
【請求項３】
少なくとも１種の微生物感染症を予防および／または治療するための薬剤の製造における、請求項１に記載の単離ペプチドテトラマー誘導体の使用。
【請求項４】
前記微生物感染症が、細菌感染症、真菌感染症および原虫感染症からなる群から選択される、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記微生物感染症が真菌感染症である、請求項３または４に記載の使用。
【請求項６】
請求項１に記載の単離ペプチドテトラマー誘導体を含む、コンタクトレンズ用液剤および／もしくは点眼液、医薬組成物および／もしくは抗菌性組成物、器具のコーティングのための組成物ならびに／またはキット。
【請求項７】
請求項１に記載の単離ペプチドテトラマー誘導体の製造方法。
【請求項８】
前記ペプチドテトラマーまたはペプチドテトラマー誘導体が４つの同一のペプチドモノマーを含む前記方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に第１の保護されたＫ残基を結合させる工程；
（iii）第１のＫ残基中の１つのアミン基から保護基を除去する工程；
（iv）第１のＫ残基に第２の保護されたＫ残基を連結する工程；
（v）第２のＫ残基中の１つのアミン基から保護基を除去する工程；
（vi）第２のＫ残基に２つの保護されたＫ残基を連結する工程；
（vii）連結させた２つのＫ残基から保護基を除去する工程；
（viii）各ペプチドモノマーの配列に従って、保護されたアミノ酸残基をＣ末端からＮ末端の方向へ連結し、連結の都度、次の連結のために保護基を除去することによって、さらに鎖を伸長させる工程；
（ix）加える残基の数に応じて、アミノ酸残基の連結を終了する工程；および
（x）任意で、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドテトラマーまたはペプチドテトラマー誘導体が４つの同一のペプチドモノマーを含む前記方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に第１の保護されたＫ残基を結合させる工程；
（iii）第１のＫ残基中の１つのアミン基から保護基を除去する工程；
（iv）第１のＫ残基に第２の保護されたＫ残基を連結する工程；
（v）第２のＫ残基中の１つのアミン基から保護基を除去する工程；
（vi）第２のＫ残基に２つの保護されたＫ残基を連結する工程；
（vii）連結させた２つのＫ残基から保護基を除去する工程；
（viii）２つのＫ残基の各アミン基に、保護された末端アミン基を有するペプチドモノマーを１つずつ連結する工程；および
（ix）任意で、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドテトラマーまたはペプチドテトラマー誘導体が４つの同一のペプチドモノマーを含む前記方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に第１のＫ残基を結合させる工程；
（iii）結合させた第１のＫ残基に２つの保護されたＫ残基を連結する工程；
（iv）連結させたＫ残基から保護基を除去する工程；
（v）各ペプチドモノマーの配列に従って、保護されたアミノ酸残基をＣ末端からＮ末端の方向へ連結し、連結の都度、次の連結のために保護基を除去することによって、さらに鎖を伸長させる工程；
（vi）加える残基の数に応じて、アミノ酸残基の連結を終了する工程；および
（vii）任意で、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドテトラマーまたはペプチドテトラマー誘導体が４つの同一のペプチドモノマーを含む前記方法であって、
（i）少なくとも１つの固相を準備する工程；
（ii）固相に第１のＫ残基を結合させる工程；
（iii）結合させた第１のＫ残基に２つの保護されたＫ残基を連結する工程；
（iv）連結させたＫ残基から保護基を除去する工程；
（v）２つのＫ残基の各アミン基に、保護された末端アミン基を有するペプチドモノマーを１つずつ連結する工程；および
（vi）任意で、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む、請求項７に記載の方法。