(57)【要約】【課題】合成ガスまたは他のガス状炭素源およびメタノールを利用するための方法および生物体の提供。【解決手段】本発明は、アセチルＣｏＡ経路ならびに合成ガスまたは合成ガスおよびメタノールを利用する能力を有する、天然に存在しない微生物の生物体を提供する。一実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物であって、ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２をアセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）、メチルテトラヒドロ葉酸（メチルＴＨＦ）または他の所望の生成物に変換する経路を前記微生物に付与する１つまたは複数の外因性タンパク質を含み、前記１つまたは複数の外因性タンパク質の不在下で、ＣＯまたはＣＯ２およびＨ２をアセチルＣｏＡまたはメチルＴＨＦに変換する能力を欠く微生物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然に存在しない微生物または外因性タンパク質または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年１月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／０２２，８０４号および２００８年６月５日に出願された米国仮特許出願第６１／０５９，２５６号の優先権の利益を主張し、各々のこれらの全内容は、本明細書において参考として援用される。
【０００２】
本発明は、一般に生合成プロセスに、より具体的には合成ガスまたは他のガス状炭素源およびメタノールを用いることができる生物体に関する。
【背景技術】
【０００３】
合成ガス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ  （ｓｙｎｇａｓ））は、石炭、石油、天然ガス、バイオマスまたは廃棄有機物などの任意の有機フィードストックのガス化を通して得ることができる、Ｈ２およびＣＯを主とする混合物である。多数のガス化プロセスが開発されており、ほとんどの設計は、高い温度（５００〜１５００℃）における、酸素の制限が完全燃焼を回避する有機物質の部分酸化に基づいて、０．５：１〜３：１のＨ２／ＣＯの混合物として合成ガスを提供する。水素分を増加させるために蒸気が時々加えられ、典型的には、水性ガス転化反応を通してＣＯ２生成が増加する。
【０００４】
今日、石炭は合成ガスの工業生産に用いられる主な基質であり、それは伝統的に加熱および動力に、またメタノールおよび液体炭化水素のフィッシャー−トロプシュ合成のためのフィードストックとして用いられる。多くの大きな化学会社およびエネルギー会社は、大規模な石炭ガス化プロセスを採用し、この技術を用いる産業において経験がある。
【０００５】
石炭に加えて、多種類のバイオマスが合成ガス生産に用いられている。合成ガスおよびＣＯ２などのガス状基質は、再生可能な化学物質および燃料の生物学的生産で利用可能な、最も安価で最も柔軟性のあるフィードストックを代表する。第二次世界大戦の間、主に欧州で、車、トラック、ボートおよびバスを走らせるために、１，０００，０００以上の小規模バイオマスガス化ユニットが操業されていた。現在では、商業規模（＞２０，０００，０００ポンドのバイオマス／年）で検証されたかまたは検証中の、少なくとも３つの主要なバイオマスガス化技術がある。バイオマスガス化技術は、特に熱およびエネルギー生産のために、商業的に実践されている。燃料または化学物質生産との統合が開発中であり、商業規模ではまだ広く実証されていない。
【０００６】
概して、世界の実質的にいかなる場所においても、石炭、バイオマス、廃棄物、ポリマーなどを含む過剰の材料から、合成ガスを高い費用効果で生産する技術が現在存在する。合成ガスはバイオマスを含むほとんどの有機物質から生産することができるので、合成ガスを用いる利点には柔軟性が含まれる。別の利点は合成ガスが安価であることであり、１００万Ｂｔｕにつき６ドル以下の費用であり、それは、製品１ポンドにつき０．１０ドル以下の原材料費に相当する。さらに、クロストリジウム属の複数の種などの生物体の場合のように、合成ガスを効果的に利用する公知の経路がある。
【０００７】
合成ガスを利用する生物体の利用可能性にもかかわらず、一般に公知の生物体は十分に特徴付けられていなく、商業的開発にあまり適していない。例えば、クロストリジウム属および関連細菌は、高濃度のブタノールなどの特定の生成物に不耐容である偏性嫌気性菌であるので、力価および商品化の可能性が制限される。クロストリジウム属は複数の生成物も生成し、そのことは所望の生成物を得るときに分離の問題を提示する。最後に、クロストリジウム属の遺伝子を操作するための容易な遺伝子ツールの開発は、初期の段階にある。したがって、それらは、所望の生成物の収率または生成特性を改善するための遺伝子工学に直ちに適合させることができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、所望の化学物質および燃料の生成に合成ガスまたは他のガス状炭素源を利用するための微生物およびそれらの使用方法を開発する必要性が存在する。より具体的には、合成ガス利用のための微生物であって、有用な速度および量で価値ある生成物を生成するためのそれらの速やかな設計製作を可能にするための既存の効率的な遺伝子ツールも有する微生物を開発する必要性が存在する。本発明はこの必要性を満たし、関連する利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、アセチルＣｏＡ経路ならびに合成ガスまたは合成ガスおよびメタノールを利用する能力を有する、天然に存在しない微生物の生物体を提供する。一実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物であって、ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２をアセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）、メチルテトラヒドロ葉酸（メチルＴＨＦ）または他の所望の生成物に変換する経路を前記微生物に付与する１つまたは複数の外因性タンパク質を含み、前記１つまたは複数の外因性タンパク質の不在下で、ＣＯまたはＣＯ２およびＨ２をアセチルＣｏＡまたはメチルＴＨＦに変換する能力を欠く微生物を提供する。例えば、微生物の生物体は、アセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性の核酸を含むことができる。微生物の生物体は、ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を単独で、またはメタノールと一緒に含む合成ガスを利用して、アセチルＣｏＡを生成することができる。本発明は、例えば、アセチルＣｏＡ生成の微生物の生物体を培養することによってアセチルＣｏＡを生成する方法であって、前記微生物の生物体が、アセチルＣｏＡを生成する条件下および十分な期間、アセチルＣｏＡを生成するのに十分な量で、アセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性の核酸を発現する方法をさらに提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
天然に存在しない微生物であって、ＣＯおよびＨ２をアセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）に変換する経路を前記微生物に付与する１つまたは複数の外因性タンパク質を含み、前記１つまたは複数の外因性タンパク質の不在下でＣＯおよびＨ２をアセチルＣｏＡに変換する能力を欠く微生物。
（項目２）
前記１つまたは複数の外因性タンパク質が、コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡシンターゼ、アセチルＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼから選択される、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目３）
コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡシンターゼ、アセチルＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼがそれぞれ発現される、項目２に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４）
天然に存在しない微生物であって、ＣＯおよびＨ２を含む合成ガスをアセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）に変換する経路を前記微生物に付与する１つまたは複数の外因性タンパク質を含み、前記１つまたは複数の外因性タンパク質の不在下でＣＯおよびＨ２をアセチルＣｏＡに変換する能力を欠く微生物。
（項目５）
前記合成ガスがＣＯ２をさらに含む、項目４に記載の天然に存在しない微生物。
（項目６）
１つまたは複数の外因性タンパク質が、コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡシンターゼ、アセチルＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼから選択される、項目５に記載の天然に存在しない微生物。
（項目７）
コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡシンターゼ、アセチルＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼがそれぞれ発現される、項目６に記載の天然に存在しない微生物。
（項目８）
天然に存在しない微生物であって、ＣＯ２およびＨ２をアセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）に変換する経路を前記微生物に付与する１つまたは複数の外因性タンパク質を含み、前記１つまたは複数の外因性タンパク質の不在下でＣＯ２およびＨ２をアセチルＣｏＡに変換する能力を欠く微生物。
（項目９）
前記１つまたは複数の外因性タンパク質が、コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡシンターゼ、アセチルＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼから選択される、項目８に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１０）
コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡシンターゼ、アセチルＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼがそれぞれ発現される、項目９に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１１）
天然に存在しない微生物であって、ＣＯおよびＨ２をメチルテトラヒドロ葉酸（メチルＴＨＦ）に変換する経路を前記微生物に付与する１つまたは複数の外因性タンパク質を含み、前記１つまたは複数の外因性タンパク質の不在下でＣＯおよびＨ２をメチルＴＨＦに変換する能力を欠く微生物。
（項目１２）
前記１つまたは複数の外因性タンパク質が、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼから選択される、項目１１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１３）
フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼがそれぞれ発現される、項目１２に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１４）
天然に存在しない微生物であって、ＣＯおよびＨ２を含む合成ガスをメチルテトラヒドロ葉酸（メチルＴＨＦ）に変換する経路を前記微生物に付与する１つまたは複数の外因性タンパク質を含み、前記１つまたは複数の外因性タンパク質の不在下でＣＯおよびＨ２をメチルＴＨＦに変換する能力を欠く微生物。
（項目１５）
前記合成ガスがＣＯ２をさらに含む、項目１４に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１６）
１つまたは複数の外因性タンパク質が、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼから選択される、項目１５に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１７）
フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼがそれぞれ発現される、項目１６に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１８）
天然に存在しない微生物であって、ＣＯ２およびＨ２をメチルテトラヒドロ葉酸（メチルＴＨＦ）に変換する経路を前記微生物に付与する１つまたは複数の外因性タンパク質を含み、前記１つまたは複数の外因性タンパク質の不在下でＣＯ２およびＨ２をメチルＴＨＦに変換する能力を欠く微生物。
（項目１９）
前記１つまたは複数の外因性タンパク質が、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼから選択される、項目１８に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２０）
フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼがそれぞれ発現される、項目１９に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２１）
天然に存在しない微生物であって、ＣＯ２、ＣＯおよびＨ２、またはそれらの組合せからアセチルＣｏＡを生成する遺伝子改変がない前記微生物と比べて、ＣＯ２、ＣＯおよびＨ２、またはそれらの組合せからアセチルＣｏＡを生成する効率の増加を前記微生物に付与する遺伝子改変を含み、ＣＯ２、ＣＯおよびＨ２、またはそれらの組合せをアセチルＣｏＡに変換する経路を含む微生物。
（項目２２）
前記遺伝子改変が１つまたは複数の外因性タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸分子の発現を含み、それによって前記１つまたは複数の外因性タンパク質の発現がＣＯ２、ＣＯおよびＨ２、またはそれらの組合せからアセチルＣｏＡを生成する効率を高める、項目２１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２３）
前記１つまたは複数の外因性タンパク質が、コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡシンターゼ、アセチルＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼから選択される、項目２２に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２４）
コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡシンターゼ、アセチルＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼがそれぞれ発現される、項目２３に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２５）
天然に存在しない微生物の生物体であって、アセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）を生成するのに十分な量で発現されるアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアセチルＣｏＡ経路を有する微生物の生物体を含み、前記アセチルＣｏＡ経路が、メタノール−メチルトランスフェラーゼおよびアセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼを含む微生物の生物体。
（項目２６）
前記アセチルＣｏＡ経路が、ＣＯ２、ＣＯもしくはＨ２、またはそれらの組合せ、およびメタノールをアセチルＣｏＡに変換する能力を付与する、項目２５に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目２７）
前記メタノール−メチルトランスフェラーゼが、メタノールメチルトランスフェラーゼ、コリノイドタンパク質およびメチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼから選択される酵素またはタンパク質を含む、項目２５に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目２８）
前記アセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼが、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質から選択される酵素またはタンパク質を含む、項目２５に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目２９）
前記メタノール−メチルトランスフェラーゼが、メタノールメチルトランスフェラーゼ、コリノイドタンパク質およびメチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼから選択される酵素またはタンパク質を含み、前記アセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼが、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質から選択される酵素またはタンパク質を含む、項目２５に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目３０）
それぞれアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする２つの外因性核酸を含む、項目２５に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目３１）
それぞれアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする３つの外因性核酸を含む、項目２５に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目３２）
それぞれアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする４つの外因性核酸を含む、項目２５に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目３３）
それぞれアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする５つの外因性核酸を含む、項目２５に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目３４）
それぞれアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする６つの外因性核酸を含む、項目２５に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目３５）
それぞれアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする７つの外因性核酸を含む、項目２５に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目３６）
それぞれアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする８つの外因性核酸を含む、項目２５に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目３７）
それぞれアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする９つの外因性核酸を含む、項目２５に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目３８）
それぞれアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする１０個の外因性核酸を含む、項目２５に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目３９）
前記１０個の外因性核酸が、メタノールメチルトランスフェラーゼ、コリノイドタンパク質およびメチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼを含むメタノールメチルトランスフェラーゼをコードし、ならびにメチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質を含むアセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼをコードする、項目３８に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目４０）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目２５に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目４１）
実質的に嫌気性の培地中にある、項目２５に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目４２）
ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをさらに含む、項目２５に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目４３）
ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼが外因性核酸によってコードされる、項目４２に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目４４）
ヒドロゲナーゼをさらに含む、項目２５に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目４５）
前記ヒドロゲナーゼが内因性核酸によってコードされる、項目４４に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目４６）
前記ヒドロゲナーゼが外因性核酸によってコードされる、項目４４に記載の天然に存在しない微生物の生物体。
（項目４７）
アセチルＣｏＡを生成する方法であって、アセチルＣｏＡ経路を有する天然に存在しない微生物の生物体を培養する工程を含み、前記経路が、アセチルＣｏＡを生成する条件下およびアセチルＣｏＡを生成するのに十分な期間、アセチルＣｏＡを生成するのに十分な量で発現されるアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、前記アセチルＣｏＡ経路が、メタノール−メチルトランスフェラーゼおよびアセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼを含む方法。
（項目４８）
前記メタノール−メチルトランスフェラーゼが、メタノールメチルトランスフェラーゼ、コリノイドタンパク質およびメチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼから選択される酵素またはタンパク質を含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記アセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼが、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質から選択される酵素またはタンパク質を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記メタノール−メチルトランスフェラーゼが、メタノールメチルトランスフェラーゼ、コリノイドタンパク質およびメチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼから選択される酵素またはタンパク質を含み、前記アセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼが、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質から選択される酵素またはタンパク質を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５１）
前記天然に存在しない微生物の生物体が実質的に嫌気性の培地中に存在する、項目４７に記載の方法。
（項目５２）
前記天然に存在しない微生物の生物体が、ＣＯ２、ＣＯまたはＨ２、またはそれらの組合せ、およびメタノールの存在下で培養される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記微生物の生物体が、それぞれアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする２つの外因性核酸を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５４）
前記微生物の生物体が、それぞれアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする３つの外因性核酸を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５５）
前記微生物の生物体が、それぞれアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする４つの外因性核酸を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５６）
前記微生物の生物体が、それぞれアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする５つの外因性核酸を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５７）
前記微生物の生物体が、それぞれアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする６つの外因性核酸を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５８）
前記微生物の生物体が、それぞれアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする７つの外因性核酸を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５９）
前記微生物の生物体が、それぞれアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする８つの外因性核酸を含む、項目４７に記載の方法。
（項目６０）
前記微生物の生物体が、それぞれアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする９つの外因性核酸を含む、項目４７に記載の方法。
（項目６１）
前記微生物の生物体が、それぞれアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする１０個の外因性核酸を含む、項目４７に記載の方法。
（項目６２）
前記１０個の外因性核酸が、メタノールメチルトランスフェラーゼ、コリノイドタンパク質およびメチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼを含むメタノールメチルトランスフェラーゼをコードし、ならびにメチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質を含むアセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼをコードする、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記少なくとも１つの外因性核酸が異種の核酸である、項目４７に記載の方法。
（項目６４）
前記天然に存在しない微生物の生物体がピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをさらに含む、項目４７に記載の方法。
（項目６５）
ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼが外因性核酸によってコードされる、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記天然に存在しない微生物の生物体がヒドロゲナーゼをさらに含む、項目４７に記載の方法。
（項目６７）
前記ヒドロゲナーゼが内因性核酸によってコードされる、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記ヒドロゲナーゼが外因性核酸によってコードされる、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
前記天然に存在しない微生物の生物体が、ニトレートの存在下で培養される、項目５１に記載の方法。
（項目７０）
天然に存在しない微生物の生物体であって、４−ヒドロキシブチレート（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｒｙａｔｅ）を生成するのに十分な量で発現される４−ヒドロキシブチレート（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｒｙａｔｅ）経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む４−ヒドロキシブチレート（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｒｙａｔｅ）経路を有する微生物の生物体を含み、前記４−ヒドロキシブチレート（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｒｙａｔｅ）経路の酵素が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニルＣｏＡヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、ホスホトランス−４−ヒドロキシブチリラーゼおよび４−ヒドロキシブチレートキナーゼを含む微生物の生物体。
（項目７１）
前記アセトアセチルＣｏＡチオラーゼが、ａｔｏＢ、ｔｈｌＡ、ｔｈｌＢおよびｅｒｇ１０からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目７０に記載の生物体。
（項目７２）
前記３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼが、ｈｂｄ、ｍｓｅｄ＿１４２３、ｍｓｅｄ＿０３９９、ｍｓｅｄ＿０３８９およびｍｓｅｄ＿１９３３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目７０に記載の生物体。
（項目７３）
前記クロトナーゼが、ｃｒｔ、ｐａａＡ、ｐａａＢ、ｐｈａＡ、ｐｈａＢ、ｍａｏＣ、ｐａａＦおよびｐａａＧからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目７０に記載の生物体。
（項目７４）
前記クロトニルＣｏＡヒドラターゼが、ａｂｆＤ、ｍｓｅｄ＿１３２１およびｍｓｅｄ＿１２２０からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目７０に記載の生物体。
（項目７５）
前記４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼが、ｃａｔ２、ａｂｆＴ−２、ａｂｆＴ−１およびａｂｆＴからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目７０に記載の生物体。
（項目７６）
前記ホスホトランス−４−ヒドロキシブチリラーゼが、ｐｔａおよびｐｔｂからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目７０に記載の生物体。
（項目７７）
前記４−ヒドロキシブチレートキナーゼが、ａｃｋＡ、ｂｕｋ１、ｂｕｋ２およびｐｒｏＢからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目７０に記載の生物体。
（項目７８）
コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素またはポリペプチドをさらに含む、項目７０に記載の生物体。
（項目７９）
前記コリノイドタンパク質が、ｍｔａＣ、ｍｔａＣ１、ｍｔａＣ２およびｍｔａＣ３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目７８に記載の生物体。
（項目８０）
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、ｍｔａＡおよびｍｔａＡ１、ｍｔａＡ２からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目７８に記載の生物体。
（項目８１）
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、遺伝子ａｃｓＥによってコードされる、項目７８に記載の生物体。
（項目８２）
前記コリノイド鉄−硫黄タンパク質が、遺伝子ａｃｓＤによってコードされる、項目７８に記載の生物体。
（項目８３）
前記ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質が、ａｃｓＦおよびｃｏｏＣからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子によってコードされる、項目７８に記載の生物体。
（項目８４）
前記フェレドキシンが、遺伝子ｏｒｆ７によってコードされる、項目７８に記載の生物体。
（項目８５）
前記アセチルＣｏＡシンターゼが、ａｃｓＢおよびａｃｓＣからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子によってコードされる、項目７８に記載の生物体。
（項目８６）
前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼが、遺伝子ａｃｓＡによってコードされる、項目７８に記載の生物体。
（項目８７）
前記ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼが、ｐｏｒおよびｙｄｂＫからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目７８に記載の生物体。
（項目８８）
前記ヒドロゲナーゼが、ｈｙｐＡ、ｈｙｐＢ、ｈｙｐＣ、ｈｙｐＤ、ｈｙｐＥ、ｈｙｐＦ、ｍｏｔｈ＿２１７５、ｍｏｔｈ＿２１７６、ｍｏｔｈ＿２１７７、ｍｏｔｈ＿２１７８、ｍｏｔｈ＿２１７９、ｍｏｔｈ＿２１８０、ｍｏｔｈ＿２１８１、ｈｙｃＡ、ｈｙｃＢ、ｈｙｃＣ、ｈｙｃＤ、ｈｙｃＥ、ｈｙｃＦ、ｈｙｃＧ、ｈｙｃＨ、ｈｙｃＩ、ｈｙｆＡ、ｈｙｆＢ、ｈｙｆＣ、ｈｙｆＤ、ｈｙｆＥ、ｈｙｆＦ、ｈｙｆＧ、ｈｙｆＨ、ｈｙｆＩ、ｈｙｆＪ、ｈｙｆＲ、ｍｏｔｈ＿２１８２、ｍｏｔｈ＿２１８３、ｍｏｔｈ＿２１８４、ｍｏｔｈ＿２１８５、ｍｏｔｈ＿２１８６、ｍｏｔｈ＿２１８７、ｍｏｔｈ＿２１８８、ｍｏｔｈ＿２１８９、ｍｏｔｈ＿２１９０、ｍｏｔｈ＿２１９１、ｍｏｔｈ＿２１９２、ｍｏｔｈ＿０４３９、ｍｏｔｈ＿０４４０、ｍｏｔｈ＿０４４１、ｍｏｔｈ＿０４４２、ｍｏｔｈ＿０８０９、ｍｏｔｈ＿０８１０、ｍｏｔｈ＿０８１１、ｍｏｔｈ＿０８１２、ｍｏｔｈ＿０８１３、ｍｏｔｈ＿０８１４、ｍｏｔｈ＿０８１５、ｍｏｔｈ＿０８１６、ｍｏｔｈ＿１１９３、ｍｏｔｈ＿１１９４、ｍｏｔｈ＿１１９５、ｍｏｔｈ＿１１９６、ｍｏｔｈ＿１７１７、ｍｏｔｈ＿１７１８、ｍｏｔｈ＿１７１９、ｍｏｔｈ＿１８８３、ｍｏｔｈ＿１８８４、ｍｏｔｈ＿１８８５、ｍｏｔｈ＿１８８６、ｍｏｔｈ＿１８８７、ｍｏｔｈ＿１８８８、ｍｏｔｈ＿１４５２、ｍｏｔｈ＿１４５３およびｍｏｔｈ＿１４５４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子によってコードされる、項目７８に記載の生物体。
（項目８９）
遺伝子ａｃｓＥｐｓによってコードされるポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｔｉｄｅ）ＡｃｓＥｐｓをさらに含む、項目７８に記載の生物体。
（項目９０）
ｃｏｄｈ、ｃｏｄｈ−Ｉ、ｃｏｏＦ、ｈｙｐＡ、ｃｏｏＨ、ｃｏｏＵ、ｃｏｏＸ、ｃｏｏＬ、ｃｏｏＫ、ｃｏｏＭ、ｃｏｏＴ、ｃｏｏＪおよびｃｏｄｈ−ＩＩからなる群から選択される遺伝子によってコードされる少なくとも１つの酵素またはポリペプチドをさらに含む、項目７８に記載の生物体。
（項目９１）
メタノールメチルトランスフェラーゼをさらに含む、項目７８に記載の生物体。
（項目９２）
前記メタノールメチルトランスフェラーゼが、ｍｔａＢ、ｍｔａＢ１、ｍｔａＢ２およびｍｔａＢ３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目９１に記載の生物体。
（項目９３）
１）メタノールおよびＣＯ、２）メタノール、ＣＯ２およびＨ２、３）メタノール、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２、４）メタノール、ならびにＣＯおよびＨ２を含む合成ガス、５）メタノール、ならびにＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む合成ガスからなる群から選択されるフィードストックを利用する、項目９１に記載の生物体。
（項目９４）
ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをさらに含む、項目７８に記載の生物体。
（項目９５）
前記ギ酸デヒドロゲナーゼが、ｍｏｔｈ＿２３１２、ｍｏｔｈ＿２３１３、ｍｏｔｈ＿２３１４、ｓｆｕｍ＿２７０３、ｓｆｕｍ＿２７０４、ｓｆｕｍ＿２７０５、ｓｆｕｍ＿２７０６、ｃｈｙ＿０７３１、ｃｈｙ＿０７３２およびｃｈｙ＿０７３３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目９４に記載の生物体。
（項目９６）
前記ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼが、ｍｏｔｈ＿０１０９、ｃｈｙ＿２３８５およびｆｈｓからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目９４に記載の生物体。
（項目９７）
前記メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼが、ｍｏｔｈ＿１５１６、ｆｏｌＤおよびｃｈｙ＿１８７８からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目９４に記載の生物体。
（項目９８）
前記メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼが、ｍｏｔｈ＿１５１６、ｆｏｌＤおよびｃｈｙ＿１８７８からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目９４に記載の生物体。
（項目９９）
前記メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼが、ｍｏｔｈ＿１１９１、ｍｅｔＦおよびｃｈｙ＿１２３３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目９４に記載の生物体。
（項目１００）
１）ＣＯ、２）ＣＯ２およびＨ２、３）ＣＯおよびＣＯ２、４）ＣＯおよびＨ２を含む合成ガス、ならびに５）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む合成ガスからなる群から選択されるフィードストックを利用する、項目９４に記載の生物体。
（項目１０１）
天然に存在しない微生物の生物体であって、１，４−ブタンジオールを生成するのに十分な量で発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む１，４−ブタンジオール経路を有する微生物の生物体を含み、前記１，４−ブタンジオール経路の酵素が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニルＣｏＡヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成性）、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成性）および１，４−ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含み、前記生物体が、アセチルＣｏＡを生成するのに十分な量で発現されるアセチルＣｏＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアセチルＣｏＡ経路をさらに含み、前記アセチルＣｏＡ経路の酵素が、コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼを含む天然に存在しない生物体。
（項目１０２）
前記アセトアセチルＣｏＡチオラーゼが、ａｔｏＢ、ｔｈｌＡ、ｔｈｌＢおよびｅｒｇ１０からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１０１に記載の生物体。
（項目１０３）
前記３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼが、ｈｂｄ、ｍｓｅｄ＿１４２３、ｍｓｅｄ＿０３９９、ｍｓｅｄ＿０３８９およびｍｓｅｄ＿１９３３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１０１に記載の生物体。
（項目１０４）
前記クロトナーゼが、ｃｒｔ、ｐａａＡ、ｐａａＢ、ｐｈａＡ、ｐｈａＢ、ｍａｏＣ、ｐａａＦおよびｐａａＧからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１０１に記載の生物体。
（項目１０５）
前記クロトニルＣｏＡヒドラターゼが、ａｂｆＤ、ｍｓｅｄ＿１３２１およびｍｓｅｄ＿１２２０からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１０１に記載の生物体。
（項目１０６）
前記４−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成性）が、ａｄｈＥ、ａｄｈＥ２、ｍｃｒ、ｒｃａｓ＿２９２９、ｎａｐ１＿０２７２０およびｍｇｐ２０８０＿００５３５からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１０１に記載の生物体。
（項目１０７）
前記４−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成性）が、ａｃｒ１、ｓｕｃＤ、ｂｐｈＧ、ｍｓｅｄ＿０７０９、ｍｃｒ、ａｓｄ−２およびｓａｃｉ＿２３７０からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１０１に記載の生物体。
（項目１０８）
前記１，４−ブタンジオールデヒドロゲナーゼが、ａｌｒＡ、ａｄｈ２、ｙｑｈＤ、ｂｄｈＩ、ｂｄｈＩＩおよび４ｈｂｄからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１０１に記載の生物体。
（項目１０９）
前記コリノイドタンパク質が、ｍｔａＣ、ｍｔａＣ１、ｍｔａＣ２およびｍｔａＣ３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１０１に記載の生物体。
（項目１１０）
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、ｍｔａＡおよびｍｔａＡ１、ｍｔａＡ２からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１０１に記載の生物体。
（項目１１１）
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、遺伝子ａｃｓＥによってコードされる、項目１０１に記載の生物体。
（項目１１２）
前記コリノイド鉄−硫黄タンパク質が、遺伝子ａｃｓＤによってコードされる、項目１０１に記載の生物体。
（項目１１３）
前記ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質が、ａｃｓＦおよびｃｏｏＣからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子によってコードされる、項目１０１に記載の生物体。
（項目１１４）
前記フェレドキシンが、遺伝子ｏｒｆ７によってコードされる、項目１０１に記載の生物体。
（項目１１５）
前記アセチルＣｏＡシンターゼが、ａｃｓＢおよびａｃｓＣからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子によってコードされる、項目１０１に記載の生物体。
（項目１１６）
前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼが、遺伝子ａｃｓＡによってコードされる、項目１０１に記載の生物体。
（項目１１７）
前記ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼが、ｐｏｒおよびｙｄｂＫからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１０１に記載の生物体。
（項目１１８）
前記ヒドロゲナーゼが、ｈｙｐＡ、ｈｙｐＢ、ｈｙｐＣ、ｈｙｐＤ、ｈｙｐＥ、ｈｙｐＦ、ｍｏｔｈ＿２１７５、ｍｏｔｈ＿２１７６、ｍｏｔｈ＿２１７７、ｍｏｔｈ＿２１７８、ｍｏｔｈ＿２１７９、ｍｏｔｈ＿２１８０、ｍｏｔｈ＿２１８１、ｈｙｃＡ、ｈｙｃＢ、ｈｙｃＣ、ｈｙｃＤ、ｈｙｃＥ、ｈｙｃＦ、ｈｙｃＧ、ｈｙｃＨ、ｈｙｃＩ、ｈｙｆＡ、ｈｙｆＢ、ｈｙｆＣ、ｈｙｆＤ、ｈｙｆＥ、ｈｙｆＦ、ｈｙｆＧ、ｈｙｆＨ、ｈｙｆＩ、ｈｙｆＪ、ｈｙｆＲ、ｍｏｔｈ＿２１８２、ｍｏｔｈ＿２１８３、ｍｏｔｈ＿２１８４、ｍｏｔｈ＿２１８５、ｍｏｔｈ＿２１８６、ｍｏｔｈ＿２１８７、ｍｏｔｈ＿２１８８、ｍｏｔｈ＿２１８９、ｍｏｔｈ＿２１９０、ｍｏｔｈ＿２１９１、ｍｏｔｈ＿２１９２、ｍｏｔｈ＿０４３９、ｍｏｔｈ＿０４４０、ｍｏｔｈ＿０４４１、ｍｏｔｈ＿０４４２、ｍｏｔｈ＿０８０９、ｍｏｔｈ＿０８１０、ｍｏｔｈ＿０８１１、ｍｏｔｈ＿０８１２、ｍｏｔｈ＿０８１３、ｍｏｔｈ＿０８１４、ｍｏｔｈ＿０８１５、ｍｏｔｈ＿０８１６、ｍｏｔｈ＿１１９３、ｍｏｔｈ＿１１９４、ｍｏｔｈ＿１１９５、ｍｏｔｈ＿１１９６、ｍｏｔｈ＿１７１７、ｍｏｔｈ＿１７１８、ｍｏｔｈ＿１７１９、ｍｏｔｈ＿１８８３、ｍｏｔｈ＿１８８４、ｍｏｔｈ＿１８８５、ｍｏｔｈ＿１８８６、ｍｏｔｈ＿１８８７、ｍｏｔｈ＿１８８８、ｍｏｔｈ＿１４５２、ｍｏｔｈ＿１４５３およびｍｏｔｈ＿１４５４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子によってコードされる、項目１０１に記載の生物体。
（項目１１９）
遺伝子ａｃｓＥｐｓによってコードされるポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｔｉｄｅ）ＡｃｓＥｐｓをさらに含む、項目１０１に記載の生物体。
（項目１２０）
ｃｏｄｈ、ｃｏｄｈ−Ｉ、ｃｏｏＦ、ｈｙｐＡ、ｃｏｏＨ、ｃｏｏＵ、ｃｏｏＸ、ｃｏｏＬ、ｃｏｏＫ、ｃｏｏＭ、ｃｏｏＴ、ｃｏｏＪおよびｃｏｄｈ−ＩＩからなる群から選択される遺伝子によってコードされる少なくとも１つの酵素またはポリペプチドをさらに含む、項目１０１に記載の生物体。
（項目１２１）
メタノールメチルトランスフェラーゼをさらに含む、項目１０１に記載の生物体。
（項目１２２）
前記メタノールメチルトランスフェラーゼが、ｍｔａＢ、ｍｔａＢ１、ｍｔａＢ２およびｍｔａＢ３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１２１に記載の生物体。
（項目１２３）
１）メタノールおよびＣＯ、２）メタノール、ＣＯ２およびＨ２、３）メタノール、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２、４）メタノール、ならびにＣＯおよびＨ２を含む合成ガス、５）メタノール、ならびにＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む合成ガスからなる群から選択されるフィードストックを利用する、項目１２１に記載の生物体。
（項目１２４）
天然に存在しない微生物の生物体であって、１，４−ブタンジオールを生成するのに十分な量で発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む１，４−ブタンジオール経路を有する微生物の生物体を含み、前記１，４−ブタンジオール経路の酵素が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニルＣｏＡヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成性）、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成性）および１，４−ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含み、前記生物体は、アセチルＣｏＡを生成するのに十分な量で発現されるアセチルＣｏＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアセチルＣｏＡ経路をさらに含み、前記アセチルＣｏＡ経路の酵素が、アセチルＣｏＡシンターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを含む天然に存在しない微生物の生物体。
（項目１２５）
前記ギ酸デヒドロゲナーゼが、ｍｏｔｈ＿２３１２、ｍｏｔｈ＿２３１３、ｍｏｔｈ＿２３１４、ｓｆｕｍ＿２７０３、ｓｆｕｍ＿２７０４、ｓｆｕｍ＿２７０５、ｓｆｕｍ＿２７０６、ｃｈｙ＿０７３１、ｃｈｙ＿０７３２およびｃｈｙ＿０７３３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１２４に記載の生物体。
（項目１２６）
前記ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼが、ｍｏｔｈ＿０１０９、ｃｈｙ＿２３８５およびｆｈｓからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１２４に記載の生物体。
（項目１２７）
前記メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼが、ｍｏｔｈ＿１５１６、ｆｏｌＤおよびｃｈｙ＿１８７８からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１２４に記載の生物体。
（項目１２８）
前記メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼが、ｍｏｔｈ＿１５１６、ｆｏｌＤおよびｃｈｙ＿１８７８からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１２４に記載の生物体。
（項目１２９）
前記メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼが、ｍｏｔｈ＿１１９１、ｍｅｔＦおよびｃｈｙ＿１２３３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１２４に記載の生物体。
（項目１３０）
１）ＣＯ、２）ＣＯ２およびＨ２、３）ＣＯおよびＣＯ２、４）ＣＯおよびＨ２を含む合成ガス、ならびに５）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む合成ガスからなる群から選択されるフィードストックを利用する、項目１２４に記載の生物体。
（項目１３１）
４−ヒドロキシブチレートを生成する方法であって、４−ヒドロキシブチレート経路を有する天然に存在しない微生物の生物体を培養する工程を含み、前記経路が、４−ヒドロキシブチレートを生成する条件下および４−ヒドロキシブチレートを生成するのに十分な期間、４−ヒドロキシブチレートを生成するのに十分な量で発現される４−ヒドロキシブチレート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、前記４−ヒドロキシブチレート経路が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニルＣｏＡヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、ホスホトランス−４−ヒドロキシブチリラーゼおよび４−ヒドロキシブチレートキナーゼを含む方法。
（項目１３２）
前記アセトアセチルＣｏＡチオラーゼが、ａｔｏＢ、ｔｈｌＡ、ｔｈｌＢおよびｅｒｇ１０からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１３１に記載の方法。
（項目１３３）
前記３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼが、ｈｂｄ、ｍｓｅｄ＿１４２３、ｍｓｅｄ＿０３９９、ｍｓｅｄ＿０３８９およびｍｓｅｄ＿１９３３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１３１に記載の方法。
（項目１３４）
前記クロトナーゼが、ｃｒｔ、ｐａａＡ、ｐａａＢ、ｐｈａＡ、ｐｈａＢ、ｍａｏＣ、ｐａａＦおよびｐａａＧからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１３１に記載の方法。
（項目１３５）
前記クロトニルＣｏＡヒドラターゼが、ａｂｆＤ、ｍｓｅｄ＿１３２１およびｍｓｅｄ＿１２２０からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１３１に記載の方法。
（項目１３６）
前記４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼが、ｃａｔ２、ａｂｆＴ−２、ａｂｆＴ−１およびａｂｆＴからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１３１に記載の方法。
（項目１３７）
前記ホスホトランス−４−ヒドロキシブチリラーゼが、ｐｔａおよびｐｔｂからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１３１に記載の方法。
（項目１３８）
前記４−ヒドロキシブチレートキナーゼが、ａｃｋＡ、ｂｕｋ１、ｂｕｋ２およびｐｒｏＢからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１３１に記載の方法。
（項目１３９）
前記生物体が、コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素またはポリペプチドをさらに含む、項目１３１に記載の方法。
（項目１４０）
前記コリノイドタンパク質が、ｍｔａＣ、ｍｔａＣ１、ｍｔａＣ２およびｍｔａＣ３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１３１に記載の方法。
（項目１４１）
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、ｍｔａＡおよびｍｔａＡ１、ｍｔａＡ２からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１３９に記載の方法。
（項目１４２）
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、遺伝子ａｃｓＥによってコードされる、項目１３９に記載の方法。
（項目１４３）
前記コリノイド鉄−硫黄タンパク質が、遺伝子ａｃｓＤによってコードされる、項目１３９に記載の方法。
（項目１４４）
前記ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質が、ａｃｓＦおよびｃｏｏＣからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子によってコードされる、項目１３９に記載の方法。
（項目１４５）
前記フェレドキシンが、遺伝子ｏｒｆ７によってコードされる、項目１３９に記載の方法。
（項目１４６）
前記アセチルＣｏＡシンターゼが、ａｃｓＢおよびａｃｓＣからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子によってコードされる、項目１３９に記載の方法。
（項目１４７）
前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼが、遺伝子ａｃｓＡによってコードされる、項目１３９に記載の方法。
（項目１４８）
前記ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼが、ｐｏｒおよびｙｄｂＫからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１３９に記載の方法。
（項目１４９）
前記ヒドロゲナーゼが、ｈｙｐＡ、ｈｙｐＢ、ｈｙｐＣ、ｈｙｐＤ、ｈｙｐＥ、ｈｙｐＦ、ｍｏｔｈ＿２１７５、ｍｏｔｈ＿２１７６、ｍｏｔｈ＿２１７７、ｍｏｔｈ＿２１７８、ｍｏｔｈ＿２１７９、ｍｏｔｈ＿２１８０、ｍｏｔｈ＿２１８１、ｈｙｃＡ、ｈｙｃＢ、ｈｙｃＣ、ｈｙｃＤ、ｈｙｃＥ、ｈｙｃＦ、ｈｙｃＧ、ｈｙｃＨ、ｈｙｃＩ、ｈｙｆＡ、ｈｙｆＢ、ｈｙｆＣ、ｈｙｆＤ、ｈｙｆＥ、ｈｙｆＦ、ｈｙｆＧ、ｈｙｆＨ、ｈｙｆＩ、ｈｙｆＪ、ｈｙｆＲ、ｍｏｔｈ＿２１８２、ｍｏｔｈ＿２１８３、ｍｏｔｈ＿２１８４、ｍｏｔｈ＿２１８５、ｍｏｔｈ＿２１８６、ｍｏｔｈ＿２１８７、ｍｏｔｈ＿２１８８、ｍｏｔｈ＿２１８９、ｍｏｔｈ＿２１９０、ｍｏｔｈ＿２１９１、ｍｏｔｈ＿２１９２、ｍｏｔｈ＿０４３９、ｍｏｔｈ＿０４４０、ｍｏｔｈ＿０４４１、ｍｏｔｈ＿０４４２、ｍｏｔｈ＿０８０９、ｍｏｔｈ＿０８１０、ｍｏｔｈ＿０８１１、ｍｏｔｈ＿０８１２、ｍｏｔｈ＿０８１３、ｍｏｔｈ＿０８１４、ｍｏｔｈ＿０８１５、ｍｏｔｈ＿０８１６、ｍｏｔｈ＿１１９３、ｍｏｔｈ＿１１９４、ｍｏｔｈ＿１１９５、ｍｏｔｈ＿１１９６、ｍｏｔｈ＿１７１７、ｍｏｔｈ＿１７１８、ｍｏｔｈ＿１７１９、ｍｏｔｈ＿１８８３、ｍｏｔｈ＿１８８４、ｍｏｔｈ＿１８８５、ｍｏｔｈ＿１８８６、ｍｏｔｈ＿１８８７、ｍｏｔｈ＿１８８８、ｍｏｔｈ＿１４５２、ｍｏｔｈ＿１４５３およびｍｏｔｈ＿１４５４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子によってコードされる、項目１３９に記載の方法。
（項目１５０）
遺伝子ａｃｓＥｐｓによってコードされるポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｔｉｄｅ）ＡｃｓＥｐｓをさらに含む、項目１３９に記載の方法。
（項目１５１）
ｃｏｄｈ、ｃｏｄｈ−Ｉ、ｃｏｏＦ、ｈｙｐＡ、ｃｏｏＨ、ｃｏｏＵ、ｃｏｏＸ、ｃｏｏＬ、ｃｏｏＫ、ｃｏｏＭ、ｃｏｏＴ、ｃｏｏＪおよびｃｏｄｈ−ＩＩからなる群から選択される遺伝子によってコードされる少なくとも１つの酵素またはポリペプチドをさらに含む、項目１３９に記載の方法。
（項目１５２）
メタノールメチルトランスフェラーゼをさらに含む、項目１３９に記載の方法。
（項目１５３）
前記メタノールメチルトランスフェラーゼが、ｍｔａＢ、ｍｔａＢ１、ｍｔａＢ２およびｍｔａＢ３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１５２に記載の方法。
（項目１５４）
前記生物体が、１）メタノールおよびＣＯ、２）メタノール、ＣＯ２およびＨ２、３）メタノール、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２、４）メタノール、ならびにＣＯおよびＨ２を含む合成ガス、５）メタノール、ならびにＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む合成ガスからなる群から選択されるフィードストックを利用する、項目１５２に記載の方法。
（項目１５５）
前記生物体が、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをさらに含む、項目１３９に記載の方法。
（項目１５６）
前記ギ酸デヒドロゲナーゼが、ｍｏｔｈ＿２３１２、ｍｏｔｈ＿２３１３、ｍｏｔｈ＿２３１４、ｓｆｕｍ＿２７０３、ｓｆｕｍ＿２７０４、ｓｆｕｍ＿２７０５、ｓｆｕｍ＿２７０６、ｃｈｙ＿０７３１、ｃｈｙ＿０７３２およびｃｈｙ＿０７３３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１５５に記載の方法。
（項目１５７）
前記ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼが、ｍｏｔｈ＿０１０９、ｃｈｙ＿２３８５およびｆｈｓからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１５５に記載の方法。
（項目１５８）
前記メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼが、ｍｏｔｈ＿１５１６、ｆｏｌＤおよびｃｈｙ＿１８７８からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１５５に記載の方法。
（項目１５９）
前記メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼが、ｍｏｔｈ＿１５１６、ｆｏｌＤおよびｃｈｙ＿１８７８からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１５５に記載の方法。
（項目１６０）
前記メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼが、ｍｏｔｈ＿１１９１、ｍｅｔＦおよびｃｈｙ＿１２３３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１５５に記載の方法。
（項目１６１）
前記生物体が、１）ＣＯ、２）ＣＯ２およびＨ２、３）ＣＯおよびＣＯ２、４）ＣＯおよびＨ２を含む合成ガス、ならびに５）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む合成ガスからなる群から選択されるフィードストックを利用する、項目１５５に記載の方法。
（項目１６２）
１，４−ブタンジオールを生成する方法であって、１，４−ブタンジオール経路を有する天然に存在しない微生物の生物体を培養する工程を含み、前記経路が、１，４−ブタンジオールを生成する条件下および１，４−ブタンジオールを生成するのに十分な期間、１，４−ブタンジオールを生成するのに十分な量で発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、前記１，４−ブタンジオール経路が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニルＣｏＡヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成性）、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成性）、１，４−ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含み、前記生物体が、アセチルＣｏＡを生成するのに十分な量で発現されるアセチルＣｏＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアセチルＣｏＡ経路をさらに含み、前記アセチルＣｏＡ経路の酵素が、コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼを含む方法。
（項目１６３）
前記アセトアセチルＣｏＡチオラーゼが、ａｔｏＢ、ｔｈｌＡ、ｔｈｌＢおよびｅｒｇ１０からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１６２に記載の方法。
（項目１６４）
前記３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼが、ｈｂｄ、ｍｓｅｄ＿１４２３、ｍｓｅｄ＿０３９９、ｍｓｅｄ＿０３８９およびｍｓｅｄ＿１９３３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１６２に記載の方法。
（項目１６５）
前記クロトナーゼが、ｃｒｔ、ｐａａＡ、ｐａａＢ、ｐｈａＡ、ｐｈａＢ、ｍａｏＣ、ｐａａＦおよびｐａａＧからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１６２に記載の方法。
（項目１６６）
前記クロトニルＣｏＡヒドラターゼが、ａｂｆＤ、ｍｓｅｄ＿１３２１およびｍｓｅｄ＿１２２０からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１６２に記載の方法。
（項目１６７）
前記４−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成性）が、ａｄｈＥ、ａｄｈＥ２、ｍｃｒ、ｒｃａｓ＿２９２９、ｎａｐ１＿０２７２０およびｍｇｐ２０８０＿００５３５からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１６２に記載の方法。
（項目１６８）
前記４−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成性）が、ａｃｒ１、ｓｕｃＤ、ｂｐｈＧ、ｍｓｅｄ＿０７０９、ｍｃｒ、ａｓｄ−２およびｓａｃｉ＿２３７０からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１６２に記載の方法。
（項目１６９）
前記１，４−ブタンジオールデヒドロゲナーゼが、ａｌｒＡ、ａｄｈ２、ｙｑｈＤ、ｂｄｈＩ、ｂｄｈＩＩおよび４ｈｂｄからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１６２に記載の方法。
（項目１７０）
前記コリノイドタンパク質が、ｍｔａＣ、ｍｔａＣ１、ｍｔａＣ２およびｍｔａＣ３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１６２に記載の方法。
（項目１７１）
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、ｍｔａＡおよびｍｔａＡ１、ｍｔａＡ２からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１６２に記載の方法。
（項目１７２）
前記メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼが、遺伝子ａｃｓＥによってコードされる、項目１６２に記載の方法。
（項目１７３）
前記コリノイド鉄−硫黄タンパク質が、遺伝子ａｃｓＤによってコードされる、項目１６２に記載の方法。
（項目１７４）
前記ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質が、ａｃｓＦおよびｃｏｏＣからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子によってコードされる、項目１６２に記載の方法。
（項目１７５）
前記フェレドキシンが、遺伝子ｏｒｆ７によってコードされる、項目１６２に記載の方法。
（項目１７６）
前記アセチルＣｏＡシンターゼが、ａｃｓＢおよびａｃｓＣからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子によってコードされる、項目１６２に記載の方法。
（項目１７７）
前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼが、遺伝子ａｃｓＡによってコードされる、項目１６２に記載の方法。
（項目１７８）
前記ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼが、ｐｏｒおよびｙｄｂＫからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１６２に記載の方法。
（項目１７９）
前記ヒドロゲナーゼが、ｈｙｐＡ、ｈｙｐＢ、ｈｙｐＣ、ｈｙｐＤ、ｈｙｐＥ、ｈｙｐＦ、ｍｏｔｈ＿２１７５、ｍｏｔｈ＿２１７６、ｍｏｔｈ＿２１７７、ｍｏｔｈ＿２１７８、ｍｏｔｈ＿２１７９、ｍｏｔｈ＿２１８０、ｍｏｔｈ＿２１８１、ｈｙｃＡ、ｈｙｃＢ、ｈｙｃＣ、ｈｙｃＤ、ｈｙｃＥ、ｈｙｃＦ、ｈｙｃＧ、ｈｙｃＨ、ｈｙｃＩ、ｈｙｆＡ、ｈｙｆＢ、ｈｙｆＣ、ｈｙｆＤ、ｈｙｆＥ、ｈｙｆＦ、ｈｙｆＧ、ｈｙｆＨ、ｈｙｆＩ、ｈｙｆＪ、ｈｙｆＲ、ｍｏｔｈ＿２１８２、ｍｏｔｈ＿２１８３、ｍｏｔｈ＿２１８４、ｍｏｔｈ＿２１８５、ｍｏｔｈ＿２１８６、ｍｏｔｈ＿２１８７、ｍｏｔｈ＿２１８８、ｍｏｔｈ＿２１８９、ｍｏｔｈ＿２１９０、ｍｏｔｈ＿２１９１、ｍｏｔｈ＿２１９２、ｍｏｔｈ＿０４３９、ｍｏｔｈ＿０４４０、ｍｏｔｈ＿０４４１、ｍｏｔｈ＿０４４２、ｍｏｔｈ＿０８０９、ｍｏｔｈ＿０８１０、ｍｏｔｈ＿０８１１、ｍｏｔｈ＿０８１２、ｍｏｔｈ＿０８１３、ｍｏｔｈ＿０８１４、ｍｏｔｈ＿０８１５、ｍｏｔｈ＿０８１６、ｍｏｔｈ＿１１９３、ｍｏｔｈ＿１１９４、ｍｏｔｈ＿１１９５、ｍｏｔｈ＿１１９６、ｍｏｔｈ＿１７１７、ｍｏｔｈ＿１７１８、ｍｏｔｈ＿１７１９、ｍｏｔｈ＿１８８３、ｍｏｔｈ＿１８８４、ｍｏｔｈ＿１８８５、ｍｏｔｈ＿１８８６、ｍｏｔｈ＿１８８７、ｍｏｔｈ＿１８８８、ｍｏｔｈ＿１４５２、ｍｏｔｈ＿１４５３およびｍｏｔｈ＿１４５４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子によってコードされる、項目１６２に記載の方法。
（項目１８０）
前記生物体が、遺伝子ａｃｓＥｐｓによってコードされるポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｔｉｄｅ）ＡｃｓＥｐｓをさらに含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１８１）
ｃｏｄｈ、ｃｏｄｈ−Ｉ、ｃｏｏＦ、ｈｙｐＡ、ｃｏｏＨ、ｃｏｏＵ、ｃｏｏＸ、ｃｏｏＬ、ｃｏｏＫ、ｃｏｏＭ、ｃｏｏＴ、ｃｏｏＪおよびｃｏｄｈ−ＩＩからなる群から選択される遺伝子によってコードされる少なくとも１つの酵素またはポリペプチドをさらに含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１８２）
メタノールメチルトランスフェラーゼをさらに含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１８３）
前記メタノールメチルトランスフェラーゼが、ｍｔａＢ、ｍｔａＢ１、ｍｔａＢ２およびｍｔａＢ３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１６２に記載の方法。
（項目１８４）
前記生物体が、１）メタノールおよびＣＯ、２）メタノール、ＣＯ２およびＨ２、３）メタノール、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２、４）メタノール、ならびにＣＯおよびＨ２を含む合成ガス、５）メタノール、ならびにＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む合成ガスからなる群から選択されるフィードストックを利用する、項目１６２に記載の方法。
（項目１８５）
１，４−ブタンジオールを生成する方法であって、１，４−ブタンジオール経路を有する天然に存在しない微生物の生物体を培養する工程を含み、前記経路が、１，４−ブタンジオールを生成する条件下および１，４−ブタンジオールを生成するのに十分な期間、１，４−ブタンジオールを生成するのに十分な量で発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、前記１，４−ブタンジオール経路が、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニルＣｏＡヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成性）、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成性）、１，４−ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含み、前記生物体が、アセチルＣｏＡを生成するのに十分な量で発現されるアセチルＣｏＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアセチルＣｏＡ経路をさらに含み、前記アセチルＣｏＡ経路の酵素が、アセチルＣｏＡシンターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを含む方法。
（項目１８６）
前記ギ酸デヒドロゲナーゼが、ｍｏｔｈ＿２３１２、ｍｏｔｈ＿２３１３、ｍｏｔｈ＿２３１４、ｓｆｕｍ＿２７０３、ｓｆｕｍ＿２７０４、ｓｆｕｍ＿２７０５、ｓｆｕｍ＿２７０６、ｃｈｙ＿０７３１、ｃｈｙ＿０７３２およびｃｈｙ＿０７３３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１８５に記載の方法。
（項目１８７）
前記ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼが、ｍｏｔｈ＿０１０９、ｃｈｙ＿２３８５およびｆｈｓからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１８５に記載の方法。
（項目１８８）
前記メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼが、ｍｏｔｈ＿１５１６、ｆｏｌＤおよびｃｈｙ＿１８７８からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１８５に記載の方法。
（項目１８９）
前記メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼが、ｍｏｔｈ＿１５１６、ｆｏｌＤおよびｃｈｙ＿１８７８からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１８５に記載の方法。
（項目１９０）
前記メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼが、ｍｏｔｈ＿１１９１、ｍｅｔＦおよびｃｈｙ＿１２３３からなる群から選択される遺伝子によってコードされる、項目１８５に記載の方法。
（項目１９１）
前記生物体が、１）ＣＯ、２）ＣＯ２およびＨ２、３）ＣＯおよびＣＯ２、４）ＣＯおよびＨ２を含む合成ガス、ならびに５）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む合成ガスからなる群から選択されるフィードストックを利用する、項目１８５に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、合成ガスを炭素源として用いる例示的なＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を示す図である。メチルテトラヒドロ葉酸（Ｍｅ−ＴＨＦ）を生成するための合成ガスの利用を示すメチル分岐を示す。
【図２】図２は、合成ガスを炭素源として用いる例示的なＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を示す図である。アセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）を生成するための合成ガスの利用を示すカルボニル分岐を示す。ヒドロゲナーゼ（１２）は、合成ガスの水素を、示す多くの反応に必要である還元当量に変換するのに必要である。
【図３】図３は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌおよびブタノール生成経路の統合を示す代謝経路図である。合成ガスで増殖することができる生物体に一般的に特有である変換は、１）ＣＯデヒドロゲナーゼ、２）ヒドロゲナーゼ、３）エネルギー保存ヒドロゲナーゼ（ＥＣＨ）および４）二元機能ＣＯデヒドロゲナーゼ／アセチルＣｏＡシンターゼである。
【図４Ａ】図４は、ブタノールを生成するために合成ガスを利用するプロセスを示す図である。図４Ａは、合成ガスからブタノールへのプロセスのブロック流れ図を示す。図４Ｂは、ガス化装置の詳細を示す図である。ＡＳＵは、空気分離ユニットを表す。
【図４Ｂ】図４は、ブタノールを生成するために合成ガスを利用する方法を示す図である。図４Ａは、合成ガスからブタノールへのプロセスのブロック流れ図を示す。図４Ｂは、ガス化装置の詳細を示す図である。ＡＳＵは、空気分離ユニットを表す。
【図５】図５は、１−ブタノールを生成するＲ．ｒｕｂｒｕｍにおける提案されるポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）経路の改変を示す図である。肉太矢印は、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの１−ブタノール経路を形成する４遺伝子オペロンの異種発現により導入される反応段階を示す。用いる略語は、ＰＨＢ、ポリ−β−ヒドロキシブチレート；ＰｈｂＣ、ＰＨＢシンターゼ；Ｃｒｔ、クロトナーゼ；Ｂｃｄ、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；Ｅｔｆ、電子伝達フラビンタンパク質；ＡｄｈＥ２、アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼである。
【図６】図６は、後に細胞集団およびエタノールまたは酢酸塩などの生成物に変換することができる、アセチルＣｏＡへのＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を含むガスの変換を可能にする完全なＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を示す図である。産生宿主に設計製作することができる例示的な特定の酵素変換に番号を付ける。略語：１０ＦＴＨＦ：１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸、５ＭＴＨＦ：５−メチルテトラヒドロ葉酸、ＡＣＴＰ：リン酸アセチル、ＦＯＲ：ギ酸塩、ＭＥＴＨＦ：メチレンテトラヒドロ葉酸、ＭＬＴＨＦ：メテニルテトラヒドロ葉酸、ＴＨＦ：テトラヒドロ葉酸
【図７】図７は、アセチルＣｏＡへのＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２およびメタノールを含むガスの変換を可能にする合成代謝経路を示す図である。産生宿主に設計製作することができる特定の酵素変換に番号を付ける。さらなる略語：ＭｅＯＨ：メタノール
【図８】図８は、細胞集団および発酵生成物へのメタノール、ＣＯおよびＣＯ２の変換の経路を示す図である。
【図９】図９は、１０マイクログラムのＡＣＳ９０（レーン１）、ＡＣＳ９１（レーン２）、Ｍｔａ９８／９９（レーン３および４）細胞抽出物とサイズ標準（レーン５）およびＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＣＯＤＨ（Ｍｏｔｈ＿１２０２／１２０３）またはＭｔｒ（Ｍｏｔｈ＿１１９７）タンパク質（５０、１５０、２５０、３５０、４５０、５００、７５０、９００および１０００ｎｇ）の対照のウエスタンブロットを示す図である。
【図１０】図１０は、ＣＯ酸化アッセイ結果を示す図である。細胞（ＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロンを有するＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａまたはＥ．ｃｏｌｉ；ＡＣＳ９０またはＡＣＳ９１または空ベクター：ｐＺＡ３３Ｓ）を増殖させ、抽出物を調製した。アッセイは、抽出物を調製した当日に５５℃で種々の時間実施した。メチルビオローゲンの還元を５７８ｎｍで１２０秒間にわたって追跡した。
【図１１】図１１は、アセチル−ＣｏＡへの、さらには４−ヒドロキシ酪酸へのＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２およびメタノールを含むガスの変換の合成代謝経路を示す図である。
【図１２】図１２は、アセチルＣｏＡへの、さらには１，４−ブタンジオールへのＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２およびメタノールを含むガスの変換の合成代謝経路を示す図である。
【図１３】図１３は、アセチルＣｏＡへの、さらには４−ヒドロキシ酪酸へのＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を含むガスの変換の合成代謝経路を示す図である。
【図１４】図１４は、アセチルＣｏＡへの、さらには１，４−ブタンジオールへのＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を含むガスの変換の合成代謝経路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、合成ガスまたは他のガス状炭素源を利用して所望の生成物を生成することができる微生物の開発および使用に関する。さらに本発明は、合成ガスを利用する微生物の製品範囲を広げること、合成ガスを利用して所望の生成物を生成することができる組換え生物体を生成すること、それらの収率、力価および生産性を最適化することに関する。増殖および化学物質生産の基質として合成ガスを効率的に利用することができる、商業的スケールアップに適する組換え生物体、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたは他の生物体の開発は、再生可能な化学物質および燃料の製造にとって費用的に有利なプロセスを提供する。生物体は、速やかに、また相応な費用で最適化および試験することができる。
【００１２】
フィードストックとしての合成ガスの大きな可能性は、対象とする化学物質および燃料に効率的に、またはコスト的に効率よく変換されるその能力に存在する。合成ガス変換のための２つの主な技術は、フィッシャー−トロプシュプロセスおよび発酵プロセスである。フィッシャー−トロプシュ（Ｆ−Ｔ）技術は、第二次世界大戦以来開発され、燃料としてのメタノールまたは混合炭化水素の有効生産を可能にする、無機および金属ベースの触媒を含む。Ｆ−Ｔプロセスの欠点は、以下の通りである：１）所望の生成物の分離の困難をもたらす生成物選択性の欠如；２）中毒への触媒感受性；３）必要とされる高温および高圧のための高いエネルギーコスト；ならびに４）商業的に競争力のある費用で入手可能な生成物の限られた範囲。
【００１３】
発酵プロセスについては、合成ガスは、この材料をエタノール、アセテートおよび水素などの生成物に変換することができる多くの嫌気性微生物のための炭素およびエネルギー源の役目を果たすことが示されている（下記および表１を参照）。合成ガスの発酵的変換の主な利点は、単一の生成物の生成のための生物体の選択性、合成ガス不純物に対するより大きな耐性、より低い作用温度および圧力、ならびに合成ガスからの生成物の大きなポートフォリオの可能性である。発酵プロセスの主要な欠点は、合成ガスを変換することが公知の生物体が、エタノールおよびアセテートなどの限られた範囲の化学物質だけを生成する傾向があり、他の化学物質の効率的な生産体でないこと、生物体が遺伝子操作のための確立されたツールをもたないこと、および生物体が高い濃度の最終生成物に感受性であるということである。
【００１４】
本発明は、合成ガスまたは他のガス状炭素源から化学物質および燃料を含む所望の生成物を生成するのに有効である微生物の生成に関する。本発明の生物体および方法は、従来の石油系生成物、およびグルコース、ショ糖またはリグノセルロース糖から直接に誘導される生成物の両方よりかなり有利な費用で、化学物質および燃料の生成を可能にする。一実施形態では、本発明は、合成ガスまたは他のガス状炭素源を利用して所望の生成物を生成することができる天然に存在しない微生物を提供し、ここで、親微生物は合成ガスを利用する天然の能力を欠く（実施例ＶＩＩＩを参照）。そのような微生物では、１つまたは複数のタンパク質または酵素が微生物で発現され、それによって、合成ガスまたは他のガス状炭素源を利用して所望の生成物を生成する経路を付与する。他の実施形態では、本発明は、例えば、所望の生成物を生成する高い効率を付与する１つまたは複数の外因性タンパク質または酵素を発現させることによって、遺伝子改変された天然に存在しない微生物を提供し、ここで、親微生物は合成ガスまたは他のガス状炭素源を利用して所望の生成物を生成する能力を有する。したがって、本発明は、合成ガスを利用することができる新しい代謝経路を有する微生物を生成すること、ならびに合成ガスまたは他のガス状炭素源を利用して所望の生成物を生成する改善された効率を有する微生物を生成することに関する。
【００１５】
さらに本発明は、ＭｔａＡＢＣ型のメチルトランスフェラーゼ系と一緒にＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のカルボニル分岐を触媒する酵素およびそれに関連するタンパク質をコードする遺伝子を発現する、天然に存在しない微生物を提供する。そのような生物体は、合成ガスから誘導することができる比較的安価な有機フィードストックであるメタノール、ならびにＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を含むガスを、アセチルＣｏＡ、細胞集団および生成物に変換することができる。
【００１６】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉは、他に類を見ない遺伝子ツールを揃えている、産業上の馬車馬（ｗｏｒｋｈｏｒｓｅ）生物体である。合成ガスをアセチルＣｏＡ、すなわち全ての細胞集団の成分および多くの価値ある生成物を誘導することができる中心的な代謝産物に変換する能力をＥ．ｃｏｌｉなどの外来の宿主に導入する（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）ことは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の様々なタンパク質をコードする外因性の遺伝子の発現の後に達成することができる。この経路は、１９４２年のその単離（Ｆｏｎｔａｉｎｅら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ４３巻、７０１〜７１５頁（１９４２年））以来、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を解明するためのモデル生物体であるＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（旧称、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）などの酢酸生成性生物体で非常に活発である。Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、２つの分岐を含む：メチルテトラヒドロ葉酸（Ｍｅ−ＴＨＦ）へのＣＯ２の変換を可能にするイースタンまたはメチル分岐、ならびにアセチルＣｏＡへのメチルＴＨＦ、ＣＯおよび補酵素Ａの変換を可能にするウエスタンまたはカルボニル分岐（図１および２を参照）。本明細書で開示されるように、本発明はＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の両分岐を触媒する遺伝子を発現する天然に存在しない微生物を提供する。そのような生物体は、ＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を含むガスを、アセチルＣｏＡ、細胞集団および生成物に変換することができる。さらに本発明は、ＭｔａＡＢＣ型のメチルトランスフェラーゼ系と一緒にＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のカルボニル分岐を触媒する酵素をコードする遺伝子を発現する、天然に存在しない微生物を提供する。そのような生物体は、合成ガスから誘導することができる比較的安価な有機フィードストックであるメタノール、ならびにＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を含むガスを、アセチルＣｏＡ、細胞集団および生成物に変換することができる。
【００１７】
合成ガス（ｓｙｎｇａｓ）またはプロデューサーガスとしても公知の合成ガス（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ）は、石炭、ならびに炭素質の材（例えば農作物および残渣を含むバイオマス材）のガス化の主要な生成物である。合成ガスはＨ２およびＣＯを主とする混合物であり、それらに限定されないが石炭、石油、天然ガス、バイオマスおよび廃棄有機物を含む任意の有機フィードストックのガス化から得ることができる。ガス化は、高い燃料対酸素比の下で一般に実施される。ほとんどＨ２およびＣＯであるが、合成ガスはより少ない量のＣＯ２および他のガスを含むこともできる。したがって、合成ガスはＣＯ、さらにＣＯ２などのガス状炭素の経済的供給源を提供する。
【００１８】
本明細書で開示されるように、ＣＯおよび／またはＣＯ２を含む合成ガスなどのガス状炭素源は、本発明の天然に存在しない微生物によって利用されて所望の生成物を生成することができる。本明細書で一般に合成ガスとして例示されるが、本発明の天然に存在しない微生物はＣＯおよび／またはＣＯ２を含む任意のガス状炭素源を利用することができるものと理解される。したがって、本発明は、炭素源としてＣＯおよび／またはＣＯ２を利用することができる天然に存在しない微生物に関する。
【００１９】
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、アセチルＣｏＡおよびアセテートなどの他の生成物へのＣＯおよびＨ２の変換を触媒する。一般にＣＯおよび合成ガスを利用することができる生物体は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路に包含されるものと同じ酵素および形質転換の基本セットを通して、ＣＯ２およびＣＯ２／Ｈ２混合物を利用する能力も有する。同じ生物体がＣＯを用いることもでき、同じ経路が含まれることが明らかにされるずっと前に、微生物によるアセテートへのＣＯ２のＨ２依存性変換が認識された。水素が存在して必要な還元当量を供給する限り、多くのアセテート生成菌がＣＯ２の存在下で増殖し、アセテートなどの化合物を生成することが示された（例えば、Ｄｒａｋｅ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ、３〜６０頁、Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９９４年）参照）。これは、以下の式に要約することができる：
２ＣＯ２＋４Ｈ２＋ｎＡＤＰ＋ｎＰｉ→ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２Ｈ２Ｏ＋ｎＡＴＰ
したがって、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を有する天然に存在しない微生物は、アセチルＣｏＡおよび他の所望の生成物の生成のためにＣＯ２およびＨ２混合物も利用することができる。
【００２０】
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は当技術分野で周知であり、１２個の反応からなり、それらは２つの分岐、すなわち（１）メチル分岐および（２）カルボニル分岐に分けることができる。メチル分岐は合成ガスをメチルテトラヒドロ葉酸（メチルＴＨＦ）に変換し、カルボニル分岐はメチルＴＨＦをアセチルＣｏＡに変換する。メチル分岐における反応は、以下の酵素またはタンパク質によって順番に触媒される：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ。カルボニル分岐における反応は、以下の酵素またはタンパク質によって順番に触媒される：メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＡｃｓＥ）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質（例えば、ＡｃｓＦ）、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質（例えば、ＣｏｏＣ）。十分な数のコード核酸を導入してアセチルＣｏＡ経路を生成するための、本明細書で提供される教示および指針に従って、当業者は、宿主生物体に存在しないＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ酵素またはタンパク質をコードする核酸を少なくとも導入することに関して、同じ技術設計を実施することもできることを理解するであろう。したがって、改変された生物体が１つの分岐または完全なＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含むように、本発明の微生物の生物体へ１つまたは複数のコード核酸を導入することは、合成ガス利用能を付与する。
【００２１】
したがって、本発明の天然に存在しない微生物は、ＣＯおよび／またはＣＯ２を提供する合成ガスまたは他のガス状炭素源を用いて、所望の生成物を生成することができる。ＣＯ２の場合、追加の供給源には、それらに限定されないが、メタンがＣＯ２に変換される、アンモニアおよび水素プラントにおける副産物としてのＣＯ２の生成；木および化石燃料の燃焼；ビール、ウィスキーおよび他のアルコール飲料の醸造、または他の発酵プロセスにおける糖発酵の副産物としてのＣＯ２の生成；石灰ＣａＯの製造における石灰岩ＣａＣＯ３の熱分解；リン酸ナトリウム製造の副産物としてのＣＯ２の生成；石灰岩またはドロマイトに対する酸性化された水の作用によって生成される、天然の二酸化炭素源からの直接生成とが含まれる。
【００２２】
本明細書で用いるように、本発明の微生物の生物体または微生物に関して用いられる場合、用語「天然に存在しない」は、その微生物の生物体が、その参照種の野生型株を含むその参照種の天然株で通常見られない、少なくとも１つの遺伝的変化を有することを意味するものとする。遺伝的変化には、例えば、代謝ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を導入する改変、他の核酸の付加、核酸欠失および／または微生物遺伝物質の他の機能的破壊が含まれる。そのような改変には、例えば、参照種の異種の、同種の、または異種および同種のポリペプチドのコード領域およびその機能的断片が含まれる。追加の改変には、例えば、その改変が遺伝子またはオペロンの発現を変化させる非コード調節領域が含まれる。例示的な代謝ポリペプチドには、アセチルＣｏＡ生合成経路内の酵素またはタンパク質が含まれる。
【００２３】
代謝改変は、その天然の状態から変更された生化学反応を指す。したがって、天然に存在しない微生物は、代謝ポリペプチドまたはその機能的断片をコードする核酸に対する遺伝子改変を有することができる。例示的な代謝改変が、本明細書で開示される。
【００２４】
本明細書で用いるように、微生物の生物体または微生物に関して用いられる場合、用語「単離された」は、参照の微生物の生物体が天然で見られるような少なくとも１つの成分を実質的に含まない生物体を意味するものとする。本用語は、その天然環境で見られるような一部または全ての成分が除去されている微生物の生物体を含む。本用語は、その微生物の生物体が天然に存在しない環境で見られるような一部または全ての成分が除去されている微生物の生物体も含む。したがって、単離された微生物の生物体は、それが天然で見られるか、またはそれが天然に存在しない環境で増殖され、保存されるか生存するような他の物質から一部または完全に分離される。単離された微生物の生物体の具体例には、部分的に純粋な微生物、実質的に純粋な微生物、および天然に存在しない培地で培養された微生物が含まれる。
【００２５】
本明細書で用いるように、用語「微生物の」、「微生物の生物体」または「微生物」は、古細菌、細菌または真核生物のドメインに含まれる、微視的細胞として存在する任意の生物体を意味するものとする。したがって、本用語は、顕微鏡的大きさを有する原核生物または真核生物の細胞または生物体を包含するものとし、全ての種類の細菌、古細菌および真正細菌、ならびに酵母および真菌類などの真核生物の微生物を含む。本用語は、生化学物質の生成のために培養することができる、任意の種の細胞培養物も含む。
【００２６】
本明細書で用いるように、用語「ＣｏＡ」または「補酵素Ａ」は、活性酵素系を形成するためにその存在が多くの酵素（アポ酵素）の活性のために必要とされる、有機コファクターまたは補欠分子族（酵素の非タンパク部分）を意味するものとする。補酵素Ａは、特定の縮合酵素で機能し、アセチルまたは他のアシル基転移、ならびに脂肪酸合成および酸化、ピルベート酸化ならびに他のアセチル化で作用する。
【００２７】
本明細書で用いるように、培養または増殖条件に関して用いられる場合、用語「実質的に嫌気性」は、酸素の量が、液体培地中の溶存酸素の飽和量の約１０％未満であることを意味するものとする。本用語は、約１％未満の酸素の雰囲気で維持される、液体または固体培地の密封チャンバー、も含むものとする。
【００２８】
本明細書で用いる「外因性」は、参照分子または参照活性が宿主の微生物の生物体に導入されることを意味するものとする。分子は、例えば、宿主染色体への組込みなどによる宿主遺伝物質へのコード核酸の導入によって、またはプラスミドなどの非染色体遺伝物質として導入することができる。したがって、コード核酸の発現に関して用いられる本用語は、微生物の生物体への発現可能な形でのコード核酸の導入を指す。生合成活性に関して用いられる場合、本用語は、宿主参照生物体に導入される活性を指す。供給源は、例えば、宿主の微生物の生物体への導入の後に参照活性を発現する、同種または異種のコード核酸であってよい。したがって、用語「内因性」は、宿主に存在する参照分子または活性を指す。同様に、コード核酸の発現に関して用いられる場合、本用語は、微生物の生物体に含まれるコード核酸の発現を指す。用語「異種の」は、参照種以外の供給源に由来する分子または活性を指し、「同種の」は、宿主の微生物の生物体に由来する分子または活性を指す。したがって、本発明のコード核酸の外因性の発現は、異種または同種のコード核酸のいずれかまたは両方を利用することができる。
【００２９】
本発明の天然に存在しない微生物の生物体は安定した遺伝的変化を含むことができ、それは変化を失わずに５世代を超えて培養することができる微生物を指す。一般に、安定した遺伝的変化には、１０世代を超えて存続する改変が含まれ、特に安定した改変は約２５世代を超えて存続し、より詳しくは、安定した遺伝子改変は無期限を含めて５０世代を超える。
【００３０】
当業者は、本明細書で例示される代謝改変を含む遺伝的変化が、Ｅ．ｃｏｌｉなどの適切な宿主生物体およびそれらの対応する代謝反応、または所望の遺伝物質、例えば所望の代謝経路の遺伝子に適する供給源生物体に関して記載されることを理解するであろう。しかし、多種多様な生物体の完全なゲノム配列決定およびゲノミクスの領域における高レベルの技術を考慮して、当業者は、本明細書で提供される教示および指針を事実上他の全ての生物体に適用することが容易にできる。例えば、本明細書で例示したＥ．ｃｏｌｉの代謝改変は、参照種以外の種からの同じであるか類似したコード核酸を組み込むことによって、他の種に容易に適用することができる。そのような遺伝的変化には、例えば、一般には種のホモログの遺伝的変化、より詳細には、オルソログ、パラログまたは非オルソロガスな遺伝子置換が含まれる。
【００３１】
オルソログは、垂直伝達（ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｄｅｓｃｅｎｔ）が関係し、異なる生物体での実質的に同じか同一の機能の役割を担う１つまたは複数の遺伝子である。例えば、マウスエポキシドヒドロラーゼおよびヒトエポキシドヒドロラーゼは、エポキシドの加水分解の生物学的機能のためのオルソログと考えることができる。遺伝子は、例えば、それらが同種であるか共通祖先からの進化によって関係していることを示すのに十分な量の配列類似性をそれらが共有する場合、垂直伝達が関係している。それらが、一次配列類似性が識別可能でない程度までそれらが共通祖先から進化したことを示すのに十分な量の三次元構造を共有するが必ずしも配列類似性を共有しない場合にも、遺伝子はオルソログと考えることができる。オルソロガスである遺伝子は、約２５％〜１００％アミノ酸配列同一性の配列類似性を有するタンパク質をコードすることができる。それらの三次元構造も類似性を示す場合、２５％未満のアミノ酸類似性を共有するタンパク質をコードする遺伝子も、垂直伝達によって生じたと考えることができる。組織プラスミノーゲン活性化因子およびエラスターゼを含む、酵素のセリンプロテアーゼファミリーのメンバーは、共通祖先から垂直伝達によって生じたと考えられる。
【００３２】
オルソログには、例えば進化を通して構造または全体的活性が異なった、遺伝子またはそれらのコードされた遺伝子生成物が含まれる。例えば、１つの種が２つの機能を示す遺伝子生成物をコードし、そのような機能が第２の種の異なる遺伝子に分離されている場合、３つの遺伝子およびそれらの対応する生成物はオルソログであるとみなされる。生化学生成物の生成については、当業者は、天然に存在しない微生物の構築のために、導入または破壊される代謝活性を抱えているオルソロガス遺伝子が選択されるべきであることを理解するであろう。分離できる活性を示すオルソログの例は、異なる活性が２つ以上の種の間で、または単一の種の中で異なる遺伝子生成物に分離されている場合である。具体例は、セリンプロテアーゼ活性の２つの型であるエラスターゼタンパク質分解およびプラスミノーゲンタンパク質分解の、プラスミノーゲン活性化因子およびエラスターゼのような異なる分子への分離である。第２の例は、マイコプラズマ５’−３’エキソヌクレアーゼおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性の分離である。第１の種からのＤＮＡポリメラーゼは、第２の種からのエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼの一方または両方にオルソログであると、またはその逆とみなすことができる。
【００３３】
対照的に、パラログは、例えば複製とそれに続く進化的分岐によって関係があるホモログであり、類似または共通しているが、同一でない機能を有する。パラログは、例えば、同じ種または異なる種を起源とするかそれに由来することができる。例えば、ミクロソームのエポキシドヒドロラーゼ（エポキシドヒドロラーゼＩ）および可溶性のエポキシドヒドロラーゼ（エポキシドヒドロラーゼＩＩ）は、同じ種で異なる反応を触媒し、異なる機能を有する、共通祖先から共進化した２つの異なる酵素を表すので、パラログと考えることができる。パラログは、かなりの相互配列類似性を有する同じ種からのタンパク質であり、共通祖先からの共進化を通してそれらが相同であるか関係することを示唆している。パラロガスのタンパク質ファミリー群には、ＨｉｐＡホモログ、ルシフェラーゼ遺伝子、ペプチダーゼなどが含まれる。
【００３４】
非オルソロガス遺伝子置換は、異なる種の参照遺伝子機能の代わりになることができる、１つの種からの非オルソロガス遺伝子である。置換には、例えば、異なる種での参照機能と比較して、起源種で実質的に同じかまたは類似した機能を発揮することができるものが含まれる。一般に、非オルソロガス遺伝子置換は、参照機能をコードする公知の遺伝子に構造的に関係することを確認することが可能であるが、より構造的に関係しないが機能的に類似した遺伝子およびそれらの対応する遺伝子生成物も、本明細書で用いられるような用語の意味の範囲内である。例えば、機能的類似性は、置換しようとする機能をコードする遺伝子と比較して、非オルソロガス遺伝子生成物の活性部位または結合性領域において少なくとも多少の構造類似性を要求する。したがって、非オルソロガス遺伝子には、例えばパラログまたは無関係な遺伝子が含まれる。
【００３５】
したがって、アセチルＣｏＡ生合成能力を有する本発明の天然に存在しない微生物の生物体を特定し、構築することにおいて、特定の種に本明細書で提供される教示および指針を適用することで、当業者は、代謝改変の特定にはオルソログの特定および組入れまたは不活化を含めることができることを理解する。パラログおよび／または非オルソロガスな遺伝子置換が、類似したか実質的に類似した代謝反応を触媒する酵素をコードする参照微生物に存在する範囲内において、当業者はこれらの進化関係の遺伝子を利用することもできる。
【００３６】
オルソログ、パラログおよび非オルソロガスな遺伝子置換は、当業者に周知である方法によって決定することができる。例えば、２つのポリペプチドのための核酸またはアミノ酸配列の検査は、比較される配列間の配列の同一性および類似性を明らかにする。そのような類似性に基づいて、タンパク質が共通祖先からの進化を通して関係していることを示すのにその類似性が十分に高いかどうか、当業者は決定することができる。当業者に周知であるアルゴリズム、例えばＡｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗなどは、生の配列の類似性または同一性を比較、決定し、さらに、重みまたはスコアを割り当てることができる配列中のギャップの存在または重要性を決定する。そのようなアルゴリズムは当技術分野でも公知であり、ヌクレオチド配列の類似性または同一性を決定することに同様に適用できる。関連性を決定するのに十分な類似性のパラメータは、統計的類似性、またはランダムなポリペプチド中で類似したマッチを見出す可能性、および決定されるマッチの有意性を計算するための周知の方法に基づいて計算される。所望により、２つ以上の配列のコンピュータによる比較を、当業者が視覚的に最適化することもできる。関係する遺伝子生成物またはタンパク質は、高い類似性、例えば２５％〜１００％の配列同一性を有すると予想することができる。無関係であるタンパク質は、十分なサイズのデータベースをスキャンする場合に偶然に起こることが予想されるのと事実上同じである同一性を有することができる（約５％）。５％から２４％の間の配列は、比較する配列が関係していると結論するのに十分な相同性を表すことができるか、表すことができない。これらの配列の関連性を決定するために、データセットのサイズを前提とするそのようなマッチの有意性を決定する追加の統計分析を実施することができる。
【００３７】
例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて２つ以上の配列の関連性を決定するための例示的なパラメータは、下に示すようなものでよい。簡単に述べると、アミノ酸配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．８（１９９９年１月５日）および以下のパラメータを用いて実施することができる：マトリックス：０  ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１１；ギャップ伸長：１；ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０；予想：１０．０；ワードサイズ：３；フィルター：オン。核酸配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）および以下のパラメータを用いて実施することができる：マッチ：１；ミスマッチ：−２；ギャップオープン：５；ギャップ伸長：２；ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０；予想：１０．０；ワードサイズ：１１；フィルター：オフ。当業者は、例えば、比較のストリンジェンシーを増加または低減させ、２つ以上の配列の関連性を決定するために、どのような改変を上記のパラメータに加えることができるかを知るであろう。
【００３８】
一実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物であって、ＣＯおよび／またはＣＯ２およびＨ２をアセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）に変換する経路を前記微生物に付与する１つまたは複数の外因性タンパク質を含み、前記１つまたは複数の外因性タンパク質の不在下で、ＣＯおよび／またはＣＯ２およびＨ２をアセチルＣｏＡに変換する能力を欠く微生物を提供する。例えば、前記１つまたは複数の外因性タンパク質または酵素は、コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡシンターゼ、アセチルＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼから選択することができる（図１、実施例ＶＩＩおよびＶＩＩＩを参照）。微生物は、ＣＯおよび／またはＣＯ２およびＨ２をアセチルＣｏＡに変換する経路を付与する、全てまでを含む２つ以上、３つ以上、などのタンパク質および酵素、例えばコバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡシンターゼ、アセチルＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼを発現することもできる。
【００３９】
本明細書で開示されるように、本発明の実施形態は、ＣＯおよび／またはＣＯ２を炭素源として利用して所望の生成物を生成することができる、天然に存在しない微生物を生成することに関する。例えば、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のカルボニルおよび／またはメチル分岐のタンパク質および酵素（図１および２）が、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ酵素を天然に含まない微生物に導入される。Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の遺伝子操作に特に有用な生物体はＥ．ｃｏｌｉであり、それは、利用可能な遺伝子操作ツールだけでなく発酵条件に関してもよく特徴付けられている（実施例ＶＩＩＩを参照）。
【００４０】
別の実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物であって、ＣＯおよびＨ２を含む、合成ガスとしても公知の合成ガスまたは他のガス状炭素源をアセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）に変換する経路を前記微生物に付与する１つまたは複数の外因性タンパク質を含み、前記１つまたは複数の外因性タンパク質の不在下で、ＣＯおよびＨ２をアセチルＣｏＡに変換する能力を欠く微生物を提供する。そのような合成ガスまたは他のガスは、ＣＯ２をさらに含むことができる。したがって、本発明の天然に存在しない微生物は、ＣＯ２、ＣＯおよび／またはＨ２をアセチルＣｏＡに変換する効率を増加させる経路を含むことができる。さらに、本発明は、天然に存在しない微生物であって、ＣＯ２およびＨ２を含むガス状炭素源をアセチルＣｏＡに変換する経路を前記微生物に付与する１つまたは複数の外因性タンパク質を含み、前記１つまたは複数の外因性タンパク質の不在下で、ＣＯ２およびＨ２をアセチルＣｏＡに変換する能力を欠く微生物を提供する。ガスは、ＣＯをさらに含むことができる。本明細書で記載のように、外因性タンパク質は、コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡシンターゼ、アセチルＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼから選択することができる。
【００４１】
さらに別の実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物であって、ＣＯおよび／またはＣＯ２およびＨ２をメチルテトラヒドロ葉酸（メチルＴＨＦ）に変換する経路を前記微生物に付与する１つまたは複数の外因性タンパク質を含み、前記１つまたは複数の外因性タンパク質の不在下で、ＣＯおよび／またはＣＯ２およびＨ２をメチルＴＨＦに変換する能力を欠く微生物を提供する。本明細書で開示されるように、前記１つまたは複数の外因性タンパク質は、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼから選択することができる（図１および実施例ＶＩＩＩを参照）。前記微生物は、ＣＯおよび／またはＣＯ２およびＨ２をメチルＴＨＦに変換する経路を付与する、全てまでを含む２つ以上、３つ以上、などのタンパク質および酵素を発現することもでき、それらには、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼの全てまでが含まれる。
【００４２】
さらに、本発明は、天然に存在しない微生物であって、ＣＯおよびＨ２を含む合成ガスまたは他のガス状炭素源をメチルＴＨＦに変換する経路を前記微生物に付与する１つまたは複数の外因性タンパク質を含み、前記１つまたは複数の外因性タンパク質の不在下で、ＣＯおよびＨ２をメチルＴＨＦに変換する能力を欠く微生物を提供する。合成ガスは、ＣＯ２をさらに含むことができる。さらに、本発明は、天然に存在しない微生物であって、ＣＯ２およびＨ２を含むガス状炭素源をメチルＴＨＦに変換する経路を前記微生物に付与する１つまたは複数の外因性タンパク質を含み、前記１つまたは複数の外因性タンパク質の不在下で、ＣＯ２およびＨ２をメチルＴＨＦに変換する能力を欠く微生物を提供する。ガス状炭素源は、ＣＯをさらに含むことができる。上記のように、外因性タンパク質は、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼから選択することができる。
【００４３】
したがって、本発明は、天然に存在しない微生物、およびそのような微生物を利用して、ＣＯおよび／またはＣＯ２を含む合成ガスまたは他のガスからアセチルＣｏＡまたはメチルＴＨＦなどの所望の生成物を生成する方法、特に、それ以前にはＣＯおよび／またはＣＯ２を含む合成ガスまたは別のガスを炭素源として利用することができなかった、ＣＯおよび／またはＣＯ２を含む合成ガスまたは他のガスを利用することができる微生物を生成することに関する（実施例ＶＩＩＩを参照）。さらに、微生物はＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のメチルおよびカルボニル分岐の両方を含むように設計製作することができる（図１、２および６）。さらに、所望の生成物を生成すること（例えばアセチルＣｏＡまたはメチルＴＨＦを前駆体として有する生成物を生成すること）ができるタンパク質または酵素を発現させることによって所望の生成物を生成するように微生物を設計製作することによって、他の所望の生成物を生成することもできる（図３を参照）。本明細書で開示されるように、そのような微生物は、所望の代謝経路を付与するタンパク質または遺伝子を発現させることによって、または代謝を所望の生成物の方へ誘導することができる欠失を決定することによって生成することができる。
【００４４】
さらに、本発明は、天然に存在しない微生物であって、その遺伝子改変が存在しない前記微生物と比べて高い、ＣＯおよび／またはＣＯ２およびＨ２からアセチルＣｏＡを生成する効率を前記微生物に付与する遺伝子改変を含み、ＣＯおよび／またはＣＯ２およびＨ２をアセチルＣｏＡに変換する経路を含む微生物を提供する。そのような微生物において、遺伝子改変は、１つまたは複数の外因性タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸分子の発現を含むことができ、それによって前記１つまたは複数の外因性タンパク質の発現は、ＣＯおよび／またはＣＯ２およびＨ２からアセチルＣｏＡを生成する効率を高める。本明細書で開示されるように、１つまたは複数の外因性タンパク質は、コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡシンターゼ、アセチルＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼから、そのようなタンパク質の全てまでを含め、選択することができる。そのような天然に存在しない微生物は、１つまたは複数の遺伝子破壊を含む遺伝子改変を代わりに、または追加で有することができ、それによって前記１つまたは複数の遺伝子破壊は、ＣＯおよび／またはＣＯ２およびＨ２からアセチルＣｏＡを生成する効率を高める。さらに、本発明は、天然に存在しない微生物であって、本明細書で開示される方法を用いてメチルＴＨＦまたは他の所望の生成物を生成する高い効率を付与する遺伝子改変を含む微生物を提供する。したがって、本発明は、ＣＯおよび／またはＣＯ２を含む合成ガスまたは他のガスから所望の生成物を生成する能力を既に有する微生物において、所望の生成物の生成効率を向上させることにさらに関する。
【００４５】
本発明は、天然に存在しない微生物であって、ＣＯおよび／またはＣＯ２を炭素源として含む合成ガスまたは他のガスの利用を前記微生物に付与する１つまたは複数のタンパク質を含み、ＣＯおよび／またはＣＯ２の利用を付与する前記１つまたは複数のタンパク質の不在下で炭素源を利用する能力を欠く微生物にも関する。さらに本発明は、天然に存在しない微生物であって、炭素源としての一酸化炭素および／または二酸化炭素の利用を前記微生物に付与する１つまたは複数のタンパク質を含み、前記１つまたは複数のタンパク質の不在下で前記炭素源を利用する能力を欠く微生物を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物であって、Ｈ２と組み合わせた炭素源としてのＣＯおよび／またはＣＯ２の利用を前記微生物に付与する１つまたは複数のタンパク質を含み、前記１つまたは複数のタンパク質の不在下で前記炭素源を利用する能力を欠く微生物を提供する。さらに本発明は、天然に存在しない微生物であって、Ｈ２およびＣＯ２と組み合わせた炭素源としてのＣＯの利用を前記微生物に付与する１つまたは複数のタンパク質を含み、前記１つまたは複数のタンパク質の不在下で前記炭素源を利用する能力を欠く微生物を提供する。そのような微生物は、炭素源から所望の生成物、例えばメチルテトラヒドロ葉酸またはアセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）、またはアセチルＣｏＡもしくはメチルＴＨＦから合成される生成物を含む、本明細書で開示される他の所望の生成物を生成するために用いることができる。そのような天然に存在しない微生物は、本明細書で開示されるような、生成物の生成を増加させる１つまたは複数の外因性タンパク質を発現することができる（図１および２を参照）。
【００４６】
さらに本発明は、天然に存在しない微生物であって、合成ガスまたは他のガス状炭素源の利用を前記微生物に付与する１つまたは複数の外因性タンパク質を含み、前記１つまたは複数の外因性タンパク質の不在下で前記炭素源を利用する能力を有し、それによって前記１つまたは複数の外因性タンパク質の発現が前記炭素源の利用効率を高める微生物を提供する。さらに本発明は、天然に存在しない微生物であって、炭素源としての一酸化炭素の利用を前記微生物に付与する１つまたは複数の外因性タンパク質を含み、前記１つまたは複数の外因性タンパク質の不在下で前記炭素源を利用する能力を有し、それによって前記１つまたは複数の外因性タンパク質の発現が前記炭素源の利用効率を高める微生物を提供する。
【００４７】
さらに別の実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物であって、Ｈ２と組み合わせた炭素源としてのＣＯおよび／またはＣＯ２の利用を前記微生物に付与する１つまたは複数の外因性タンパク質を含み、前記１つまたは複数の外因性タンパク質の不在下で前記炭素源を利用する能力を有し、それによって前記１つまたは複数の外因性タンパク質の発現が前記炭素源の利用効率を高める微生物を提供する。さらに、天然に存在しない微生物であって、Ｈ２およびＣＯ２と組み合わせた炭素源としてのＣＯの利用を前記微生物に付与する１つまたは複数の外因性タンパク質を含み、前記１つまたは複数の外因性タンパク質の不在下で前記炭素源を利用する能力を有し、それによって前記１つまたは複数の外因性タンパク質の発現が前記炭素源の利用効率を高める微生物が提供される。本明細書で開示されるように、そのような微生物は、アセチルＣｏＡ、メチルＴＨＦまたは他の所望の生成物などの所望の生成物を前記炭素源から生成するために用いることができる。
【００４８】
本発明は、メタノールおよび合成ガスを利用してアセチルＣｏＡを生成することができる、天然に存在しない微生物の生物体も提供する。したがって、本微生物の生物体は、メタノールおよびＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２、例えば、ＣＯ２、ＣＯ２およびＨ２、ＣＯ、ＣＯおよびＨ２、ＣＯ２およびＣＯ、またはＣＯ２、ＣＯおよびＨ２を利用して、アセチルＣｏＡを生成することができる。アセチルＣｏＡはほとんどの微生物の生物体で生成されるので、アセチルＣｏＡを生成することができる本発明の天然に存在しない微生物の生物体は、所望の経路を含むように設計製作されたものであると理解される。さらに、微生物の生物体は、メタノールおよび合成ガスを利用してアセチルＣｏＡを生成するように設計製作される（実施例を参照）。一実施形態では、本発明は、天然に存在しない微生物の生物体であって、アセチルＣｏＡを生成するのに十分な量で発現されるアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）経路を有し、前記アセチルＣｏＡ経路は、メタノール−メチルトランスフェラーゼおよびアセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼを含む微生物の生物体を提供する。そのような天然に存在しない微生物の生物体では、アセチルＣｏＡ経路は、ＣＯ２、ＣＯおよび／またはＨ２、すなわちそれらの組合せを、アセチルＣｏＡに変換する能力を付与することができる。そのようなアセチルＣｏＡ経路のメタノール−メチルトランスフェラーゼ活性は、例えば、メタノールメチルトランスフェラーゼ、コリノイドタンパク質（ＭｔａＣなど）およびメチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡなど）から選択される酵素またはタンパク質を含むことができる（実施例ＩＩおよびＩＩＩを参照）。そのようなアセチルＣｏＡ経路のアセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼ活性は、例えば、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥなど）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤなど）、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質（ＡｃｓＦなど）、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質（ＣｏｏＣなど）から選択される酵素またはタンパク質を含むことができる（実施例ＩＩおよびＩＩＩを参照）。本明細書で開示されるように、アセチルＣｏＡ経路をコードする２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上などの核酸を、本発明の天然に存在しない微生物の生物体で発現させることができる。特定の実施形態では、天然に存在しない微生物の生物体は、メタノール−メチルトランスフェラーゼ（メタノールメチルトランスフェラーゼ、コリノイドタンパク質（ＭｔａＣなど）およびメチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡなど）を含む）、ならびにアセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥなど）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤなど）、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質（ＣｏｏＣなど）、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質（ＡｃｓＦなど）を含む）をコードする１０個の外因性核酸を含むことができる。
【００４９】
さらに別の実施形態では、天然に存在しない微生物の生物体は、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをさらに含むことができる。例えば、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼは、外因性核酸によってコードされてもよい。さらに別の実施形態では、本明細書で開示されるように、天然に存在しない微生物の生物体はヒドロゲナーゼをさらに含むことができ、それは内因性または外因性の核酸によってコードすることができる（実施例ＩＩおよびＩＩＩを参照）。
【００５０】
本明細書で開示されるように、天然に存在しない微生物の生物体は、例えば、異種の核酸である少なくとも１つの外因性の核酸を含むことができる。本明細書でさらに開示されるように、天然に存在しない微生物の生物体は、例えば、実質的に嫌気性の培地で増殖させることができる。
【００５１】
本発明は、一般に代謝反応、その反応体もしくは生成物に関して、または、参照代謝反応、反応体もしくは生成物に関連するかそれを触媒する酵素、またはそれに関連するタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸または遺伝子に特に関して本明細書で記載される。本明細書で明示的に特記されていない場合、当業者は、反応への言及が、反応の反応体および生成物への言及も構成することを理解するであろう。同様に、本明細書で明示的に特記されない場合、反応体または生成物への言及は反応へも言及し、これらの代謝構成要素のいずれかへの言及は、参照反応、反応体または生成物を触媒する酵素、またはそれらに関与するタンパク質をコードする遺伝子または複数の遺伝子にも言及する。同様に、代謝生化学、酵素学およびゲノミクスの周知の分野を考慮すると、本明細書での遺伝子またはコード核酸への言及は、対応するコードされた酵素およびそれが触媒する反応、またはその反応に関連するタンパク質、ならびにその反応の反応体および生成物への言及も構成する。
【００５２】
本発明の天然に存在しない微生物の生物体は、１つまたは複数のアセチルＣｏＡ生合成経路に関与する１つまたは複数の酵素またはタンパク質をコードする発現可能な核酸を導入することによって生成することができる。生合成のために選択される宿主の微生物の生物体によって、特定のアセチルＣｏＡ生合成経路の一部または全部のための核酸を発現させることができる。例えば、選択された宿主で所望の生合成経路の１つまたは複数の酵素またはタンパク質が不足する場合、不足する（１つまたは複数の）酵素または（１つまたは複数の）タンパク質のための発現可能な核酸が、その後の外因性発現のために宿主に導入される。あるいは、選択された宿主が経路の一部の遺伝子の内因性発現を示すが、他が不足する場合、アセチルＣｏＡ生合成を達成するために、不足する（１つまたは複数の）酵素または（１つまたは複数の）タンパク質のコード核酸が必要である。したがって、本発明の天然に存在しない微生物の生物体は、所望の生合成経路を得るために外因性の酵素もしくはタンパク質の活性を導入することによって生成することができ、または、所望の生合成経路は、１つまたは複数の内因性の酵素もしくはタンパク質と一緒にアセチルＣｏＡなどの所望の生成物を生成する、１つまたは複数の外因性酵素もしくはタンパク質の活性を導入することによって得ることができる。
【００５３】
選択された宿主の微生物の生物体のアセチルＣｏＡ生合成経路構成要素によって、本発明の天然に存在しない微生物の生物体は、外因的に発現されるアセチルＣｏＡ経路をコードする少なくとも１つの核酸、および１つまたは複数のアセチルＣｏＡ生合成経路のためのコード核酸の全てまでを含む。例えば、アセチルＣｏＡ生合成は、対応するコード核酸の外因性発現を通して、経路の酵素またはタンパク質に欠ける宿主で確立することができる。アセチルＣｏＡ経路の全ての酵素またはタンパク質に欠ける宿主では、その経路の全ての酵素またはタンパク質の外因性発現が含まれてもよいが、経路の全てのタンパク質またはタンパク質は、宿主が経路の酵素またはタンパク質の少なくとも１つを含む場合にも発現させることができるものと理解される。例えば、メタノールメチルトランスフェラーゼ、コリノイドタンパク質（ＭｔａＣなど）およびメチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡなど）を含めることができるメタノール−メチルトランスフェラーゼ、ならびにメチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥなど）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤなど）、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質（ＡｃｓＦなど）、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質（ＣｏｏＣなど）を含めることができるアセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼなど、アセチルＣｏＡの生成のための経路の全ての酵素またはタンパク質の外因性発現が含まれてもよい。
【００５４】
別の実施形態では、合成ガスまたは他のガス状炭素源からアセチルＣｏＡを生成する経路において、その生合成経路の１つまたは複数のタンパク質は、コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡシンターゼ、アセチルＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼから選択することができる（図２、実施例ＶＩＩおよびＶＩＩＩを参照）。メチルＴＨＦを生成する経路において、その生合成経路の１つまたは複数のタンパク質は、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼから選択することができる（図１および実施例ＶＩＩＩを参照）。さらに、アセチルＣｏＡおよびメチルＴＨＦの両方を生成するために必要とされる酵素をコードする遺伝子を、微生物に導入することができる（図３および実施例ＶＩＩＩを参照）。スクシネート、４−ヒドロキシブチレートおよび１，４−ブタンジオールを含む追加の所望の生成物の生成のための代謝経路が、例えば２００７年８月１０日に出願の米国特許出願第１１／８９１，６０２号、およびＷＯ／２００８／１１５８４０に記載される（実施例ＶＩＩＩを参照）。
【００５５】
本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、発現可能な形で導入するためのコード核酸の数が、少なくとも選択される宿主の微生物の生物体のアセチルＣｏＡ経路の不足に対応することを理解するであろう。したがって、本発明の天然に存在しない微生物の生物体は、本明細書で開示されるアセチルＣｏＡ生合成経路を構成する酵素またはタンパク質をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９個、または全てまでの核酸を有することができる。一部の実施形態では、天然に存在しない微生物の生物体は、アセチルＣｏＡ生合成を促進もしくは最適化するか、または宿主の微生物の生物体に他の有用な機能を付与する他の遺伝子改変を含むこともできる。１つのそのような他の機能は、例えば、メタノールなどのアセチルＣｏＡ経路前駆体の１つまたは複数の合成の増強を含むことができる。
【００５６】
一般に宿主の微生物の生物体は、それがアセチルＣｏＡ経路の前駆体を、天然に生成された分子として、または所望の前駆体の新規の生成を提供するか、宿主の微生物の生物体によって天然に生成される前駆体の生成を増加させる設計製作された生成物として生成するように選択される。本明細書で開示されるように、宿主生物体は、前駆体の生成を増加させるように設計製作することができる。さらに、所望の前駆体を生成するように設計製作された微生物の生物体は、宿主生物体として用いることができ、また、アセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質を発現するようにさらに設計製作することができる。
【００５７】
一部の実施形態では、本発明の天然に存在しない微生物の生物体は、アセチルＣｏＡを合成する酵素能力を含む宿主から生成される。この具体的な実施形態では、例えばアセチルＣｏＡ経路反応をアセチルＣｏＡ生成の方へ向けるために、アセチルＣｏＡ経路生成物の合成または蓄積を増加させることが有用なことがある。合成または蓄積の増加は、例えば、上記のアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質の１つまたは複数をコードする核酸の過剰発現によって達成することができる。アセチルＣｏＡ経路の１つまたは複数の酵素および／または１つまたは複数のタンパク質の過剰発現は、例えば内因性の１つまたは複数の遺伝子の外因性発現を通して、または異種の１つまたは複数の遺伝子の外因性発現を通して起こることができる。したがって、天然に存在する生物体は、アセチルＣｏＡ生合成経路の酵素またはタンパク質をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の、すなわち、全てまでの核酸の過剰発現を通して、例えばアセチルＣｏＡを生成する、本発明の天然に存在しない微生物の生物体になるように容易に生成することができる。さらに、天然に存在しない生物体は、アセチルＣｏＡ生合成経路の酵素の活性の増加をもたらす内因性遺伝子の突然変異誘発によって生成することができる。
【００５８】
特に有用な実施形態では、コード核酸の外因性発現が使用される。外因性発現は、発現エレメントおよび／または調節エレメントを宿主および用途に対し特別仕立てにする（ｃｕｓｔｏｍ  ｔａｉｌｏｒ）能力を付与し、使用者によって制御される所望の発現レベルを達成する。しかし、誘導可能なプロモーターまたは他の調節エレメントに連結される場合、例えば負の調節エフェクターの除去または遺伝子のプロモーターの誘導によって、内因性発現を他の実施形態で利用することもできる。したがって、天然に存在する誘導可能なプロモーターを有する内因性遺伝子は、適当な誘導剤を提供することによって上方制御することができるか、または、内因性遺伝子の調節領域を誘導可能な調節エレメントを組み込むように設計製作し、それによって所望の時間における内因性遺伝子の発現の増加の調節を可能にすることができる。同様に、天然に存在しない微生物の生物体に導入される外因性遺伝子のための調節エレメントとして、誘導可能なプロモーターが含まれてもよい。
【００５９】
本発明の方法では、１つまたは複数の外因性核酸のいずれかを微生物の生物体に導入して、本発明の天然に存在しない微生物の生物体を生成することができるものと理解される。核酸は、例えば、微生物の生物体にアセチルＣｏＡ生合成経路を付与するために導入することができる。あるいは、コード核酸を導入して、アセチルＣｏＡ生合成能力を付与するために必要とされる反応のいくつかを触媒する生合成能力を有する、中間の微生物の生物体を生成することができる。例えば、アセチルＣｏＡ生合成経路を有する天然に存在しない微生物の生物体は、所望の酵素またはタンパク質、例えば、メタノールメチルトランスフェラーゼおよびコリノイドタンパク質；メタノールメチルトランスフェラーゼおよびメチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ；コリノイドタンパク質およびコリノイド鉄−硫黄タンパク質；ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質およびフェレドキシンなどの組合せをコードする少なくとも２つの外因性核酸を含むことができる。したがって、生合成経路の２つ以上の酵素またはタンパク質の任意の組合せが、本発明の天然に存在しない微生物の生物体に含まれてもよいと理解される。同様に、所望の生合成経路の酵素および／またはタンパク質の組合せが対応する所望の生成物の生成をもたらす限り、所望により、生合成経路の３つ以上の酵素またはタンパク質の任意の組合せ、例えば、メタノールメチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤなど）およびアセチルＣｏＡシンターゼ；コリノイドタンパク質（ＭｔａＣなど）、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質（例えばＣｏｏＣまたはＡｃｓＦ）；メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥなど）、フェレドキシンおよびアセチルＣｏＡシンターゼなどが、本発明の天然に存在しない微生物の生物体に含まれてもよいと理解される。同様に、所望の生合成経路の酵素および／またはタンパク質の組合せが対応する所望の生成物の生成をもたらす限り、所望により、本明細書で開示される生合成経路の４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたはそれを超える酵素またはタンパク質の任意の組合せが、本発明の天然に存在しない微生物の生物体に含まれてもよい。
【００６０】
本明細書に記載のアセチルＣｏＡの生合成に加えて、他の経路による生成物生合成を達成するために、本発明の天然に存在しない微生物の生物体および方法は、様々な相互組合せならびに当技術分野で周知である他の微生物の生物体および方法との組合せで利用することもできる。例えば、アセチルＣｏＡ生産体の使用以外のアセチルＣｏＡを生成する１つの代替形態は、アセチルＣｏＡ経路の中間体をアセチルＣｏＡに変換することができる別の微生物の生物体を追加することによるものである。そのような方法の１つは、例えば、アセチルＣｏＡ経路の中間体を生成する微生物の生物体の発酵を含む。次に、アセチルＣｏＡ経路の中間体は、アセチルＣｏＡ経路の中間体をアセチルＣｏＡに変換する第２の微生物の生物体のための基質として用いることができる。アセチルＣｏＡ経路の中間体を、第２の生物体の別の培養物に直接加えることができ、または、アセチルＣｏＡ経路中間体の生産体の元の培養物から、例えば細胞分離によってこれらの微生物の生物体を除去することができ、次に、発酵ブロスへの第２の生物体のその後の添加を利用して、中間体の精製工程なしで最終生成物を生成することができる。
【００６１】
他の実施形態では、本発明の天然に存在しない微生物の生物体および方法は、例えばアセチルＣｏＡの生合成を達成するために、多種多様の下位経路で組み立てることができる。これらの実施形態では、本発明の所望の生成物のための生合成経路を異なる微生物の生物体に分離することができ、異なる微生物の生物体を共培養して最終生成物を生成することができる。そのような生合成スキームでは、１つの微生物の生物体の生成物は、最終生成物が合成されるまで第２の微生物の生物体のための基質である。例えば、アセチルＣｏＡの生合成は、別の経路の中間体または生成物への１つの経路の中間体の変換のための生合成経路を含む微生物の生物体を構築することによって達成することができる。あるいは、アセチルＣｏＡは、同じ容器中の２つの生物体を用いる共培養または共発酵を通して微生物の生物体から生合成的に生成することもでき、その場合、第１の微生物の生物体はアセチルＣｏＡ中間体を生成し、第２の微生物の生物体は中間体をアセチルＣｏＡに変換する。
【００６２】
本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、本発明の天然に存在しない微生物の生物体および方法と、他の微生物の生物体との、下位経路を有する他の天然に存在しない微生物の生物体の共培養との、およびアセチルＣｏＡを生成することが当技術分野で周知である他の化学的および／または生化学的方法の組合せとの、多種多様の組合せおよび並べかえが存在することを理解するであろう。さらに、アセチルＣｏＡは他の望ましい生成物の前駆体であるので、本発明の天然に存在しない微生物の生物体は、所望により、アセチルＣｏＡを前駆体または中間体として利用する他の所望の経路を付与できる宿主生物体として用いることができる。
【００６３】
アセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質のためのコード核酸の供給源には、例えば、コードされる遺伝子生成物が参照反応を触媒することができる任意の種を含めることができる。そのような種には、それらに限定されないが、古細菌および真正細菌を含む細菌、ならびに酵母、植物、昆虫、動物およびヒトを含む哺乳動物を含む真核生物を含む、原核生物および真核生物両方の生物体が含まれる。そのような供給源のための例示的な種には、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  Ｐ４、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ  Ｙ１９、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  Ｃ２Ａ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ  ｏｒｉｅｎｔｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｉｂｒａｃｈｉｕｍ  ｐａｃｉｆｉｃｕｓ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｃｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｔｈｅｒｍｉｎｃｏｌａ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｐｈｉｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｎｕｓ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｋｕｚｎｅｔｓｏｖｉｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｎｉｇｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｂｅｎｚｏｉｃｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ  ｆｕｍａｒｏｘｉｄａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｉｄｕｒｉｃｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓなど、ならびに本明細書で開示されるか、対応する遺伝子の供給源生物体として利用可能な他の例示的な種が含まれる。しかし、３９５種の微生物ゲノムおよび様々な酵母、真菌類、植物および哺乳動物のゲノムを含む、今では５５０を超える種（これらの半分以上はＮＣＢＩなどの公開データベースで利用可能）について完全なゲノム配列が利用可能であるので、例えば、公知の遺伝子のホ��ログ、オルソログ、パラログおよび非オルソロガス遺伝子の置換を含む、関係のあるまたは遠戚の種の１つまたは複数の遺伝子のための必要なアセチルＣｏＡ生合成活性をコードする遺伝子の同定、ならびに生物体の間の遺伝子改変の交換は、当技術分野で日常的であり周知である。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉなどの特定の生物体に関して本明細書で記載されるアセチルＣｏＡの生合成を可能にする代謝改変は、原核生物および真核生物の生物体を同様に含む他の微生物に容易に適用することができる。本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、１つの生物体で例示される代謝改変を他の生物体に同等に適用することができることを知るであろう。
【００６４】
代替のアセチルＣｏＡ生合成経路が無関係な種に存在する場合などの一部の例では、例えば、参照反応の代わりに類似するが同一でない代謝反応を触媒する、無関係な種からの１つまたは複数のパラログの外因性発現によってアセチルＣｏＡ生合成を宿主種に付与することができる。異なる生物体の間で代謝ネットワークの間の特定の違いが存在するので、当業者は、異なる生物体の間の実際の遺伝子の使用が異なることがあることを理解するであろう。しかし、本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、アセチルＣｏＡを合成する対象種で微生物の生物体を構築するために、本明細書で例示される微生物の生物体へのコグネイト代謝改変を用いて本発明の教示および方法を全ての微生物の生物体に適用することができることも理解するであろう。
【００６５】
宿主の微生物の生物体を、例えば、細菌、酵母、真菌、または発酵プロセスに適用できる様々な他の微生物のいずれかから選択し、天然に存在しない微生物の生物体をそれらで生成することができる。例示的な細菌には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａから選択される種が含まれる。例示的な酵母または真菌類には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓから選択される種が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉは遺伝子工学に適する特徴のよくわかっている微生物の生物体であるので、特に有用な宿主生物体である。他の特に有用な宿主生物体には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母が含まれる。宿主生物体として適する例示的なアセテート生成菌には、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａおよびＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｆｎｉｅｎｓｅが含まれるが、これらに限定されない（実施例を参照）。
【００６６】
天然に存在しないアセチルＣｏＡ産生宿主を構築してその発現レベルを検査するための方法は、例えば、当技術分野で周知である組換え方法および検出方法によって実施することができる。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１年）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ（１９９９年）に記載されているのを見ることができる。
【００６７】
アセチルＣｏＡの生成のための経路に関与する外因性核酸配列は、それらに限定されないがコンジュゲーション、エレクトロポレーション、化学的形質転換、形質導入、トランスフェクションおよび超音波形質転換を含む当技術分野で周知の技術を用いて、宿主細胞に安定してまたは一時的に導入することができる。Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の原核細胞での外因性発現のために、遺伝子のいくつかの核酸配列または真核生物の核酸のｃＤＮＡは、Ｎ末端ミトコンドリアなどのターゲティングシグナルまたは他のターゲティングシグナルをコードすることができ、それは、所望により、原核生物の宿主細胞への形質転換の前に除去してもよい。例えば、ミトコンドリアのリーダー配列の除去は、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現の増加をもたらした（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０巻、４３２９〜４３３８頁（２００５年））。酵母または他の真核細胞での外因性発現のために、宿主細胞に適するミトコンドリアのターゲティングシグナルまたは分泌シグナルなどの適切なターゲティング配列を加えることによって、遺伝子は、リーダー配列を加えることなしでサイトゾルで発現させることができるか、またはミトコンドリアもしくは他のオルガネラを標的にすることができるか、または分泌を標的にすることができる。したがって、ターゲティング配列を除去するか含むための核酸配列への適当な改変を外因性核酸配列に組み込んで、望ましい特性を付与することができるものと理解される。さらに、当技術分野で周知の技術で遺伝子にコドン最適化を受けさせ、タンパク質の最適化された発現を達成することができる。
【００６８】
宿主生物体で機能的である発現調節配列に作動可能に連結されている、本明細書で例示される核酸をコードする１つまたは複数のアセチルＣｏＡ生合成経路を含むように、１つまたは複数の発現ベクターを構築することができる。本発明の微生物宿主生物体での使用に適用できる発現ベクターには、例えば、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソーム、ならびに宿主染色体への安定した組込みのために操作可能なベクターおよび選択配列もしくはマーカーを含む人工染色体が含まれる。さらに、発現ベクターには、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および適当な発現調節配列を含めることができる。例えば、抗生物質もしくは毒素への耐性を提供するか、栄養要求性の欠乏を補充するか、または培地にない重大な栄養素を供給する、選択可能なマーカー遺伝子が含まれてもよい。発現調節配列には、当技術分野で周知である、構成的プロモーターおよび誘導可能なプロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含めることができる。２つ以上の外因性コード核酸を共発現させる場合、両方の核酸は、例えば、単一の発現ベクターまたは別々の発現ベクターに挿入することができる。単一ベクターの発現のために、コード核酸は、作動的に１つの共通の発現調節配列に連結するか、異なる発現調節配列に、例えば１つの誘導可能なプロモーターおよび１つの構成的プロモーターに連結することができる。代謝経路もしくは合成経路に関与する外因性核酸配列の形質転換は、当技術分野で周知である方法を用いて確認することができる。そのような方法には、例えば、ｍＲＮＡのノーザンブロットもしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などの核酸分析、または遺伝子生成物の発現のためのイムノブロッティング、または導入された核酸配列もしくはその対応する遺伝子生成物の発現を試験する他の適切な分析法が含まれる。外因性核酸は所望の生成物を生成するために十分な量で発現されることは当業者によって理解され、また、当技術分野で周知であって本明細書で開示される方法を用いて十分な発現を得るために、発現レベルを最適化することができることがさらに理解される。
【００６９】
本発明は、アセチルＣｏＡ経路を有する本発明の天然に存在しない微生物の生物体を培養することによってアセチルＣｏＡを生成する方法をさらに提供する。アセチルＣｏＡ経路は、例えば、アセチルＣｏＡを生成する条件下およびそれに十分な期間、アセチルＣｏＡを生成するのに十分な量で発現されるアセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性の核酸を含むことができ、アセチルＣｏＡ経路は、メタノール−メチルトランスフェラーゼおよびアセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼを含む。そのようなアセチルＣｏＡ経路では、メタノール−メチルトランスフェラーゼは、メタノールメチルトランスフェラーゼ、コリノイドタンパク質（ＭｔａＣなど）およびメチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）から選択される酵素またはタンパク質を含むことができる。さらに、そのようなアセチルＣｏＡ経路では、アセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼは、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥなど）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤなど）、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質（ＡｃｓＦなど）、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼおよびニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質（ＣｏｏＣなど）から選択される酵素またはタンパク質を含むことができる。天然に存在しない微生物の生物体は、実質的に嫌気性の培地中に存在することができる。特定の実施形態では、天然に存在しない微生物の生物体は、ＣＯ２、ＣＯおよび／またはＨ２、すなわちそれらの組合せ、およびメタノールの存在下で培養することができる。天然に存在しない微生物の生物体は、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをさらに含むことができ、それは、外因性核酸によって発現させることができる。天然に存在しない微生物の生物体は、例えば、内因性または外因性の核酸によってコードされるヒドロゲナーゼをさらに含むこともできる。
【００７０】
別の実施形態では、天然に存在しない微生物の生物体は、特に実質的に嫌気性の条件下で、電子受容体、例えばニトレートの存在下で培養することができる（実施例ＩＩＩを参照）。バイオマスの所望の増加を達成するために、その加える量がバイオマスの所望の増加のために十分な量の電子受容体を提供する限り、所望により、微生物培養物に適量のニトレート、例えば１ｍＭ〜１００ｍＭ、またはより低いかより高い濃度のニトレートを加えることができるものと理解される。バイオマスの所望の増加を達成するために適当なものとして、そのような量には、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭが含まれるが、これらに限定されない。
【００７１】
アセチルＣｏＡの生成を試験するための適切な精製および／またはアッセイは、周知の方法を用いて実施することができる。試験する各設計製作した株について、３連の培養物などの適切な複製物を増殖させることができる。例えば、設計製作した産生宿主における生成物および副産物の形成を観察することができる。最終生成物および中間体、ならびに他の有機化合物を、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析）およびＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）などの方法、または当技術分野で周知である常用の手順を用いる他の適切な分析法によって分析することができる。発酵ブロス中の生成物の放出を、培養上清で試験することもできる。副産物および残留グルコースは、例えば、グルコースおよびアルコールのための屈折率検出器および有機酸のための紫外線検出器を用いてＨＰＬＣによって（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ９０巻、７７５〜７７９頁（２００５年））、または当技術分野で周知である他の適切なアッセイおよび検出方法によって定量化することができる。外因性ＤＮＡ配列からの個々の酵素またはタンパク質活性を、当技術分野で周知である方法を用いて分析することもできる（実施例ＩＩＩを参照）。
【００７２】
アセチルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡから誘導される生成物は、当技術分野で周知である様々な方法を用いて培養物中の他の成分から分離することができる。アセチルＣｏＡから誘導される生成物には、エタノール、ブタノール、イソブタノール、イソプロパノール、１，４−ブタンジオール、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、４−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、乳酸、メタクリル酸、アジピン酸およびアクリル酸が含まれるが、これらに限定されない。そのような分離法には、例えば抽出法、ならびに連続液液抽出、浸透気化法、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーおよび限外濾過を含む方法が含まれる。上の方法の全ては、当技術分野において周知である。
【００７３】
本明細書で記載される天然に存在しない微生物の生物体のいずれかを培養して、本発明の生合成生成物を生成および／または分泌することができる。例えば、アセチルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡから誘導された生成物の生合成生成のために、アセチルＣｏＡ生産体を培養することができる。
【００７４】
アセチルＣｏＡの生成のために、メタノールおよびＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を含むガスの炭素源およびエネルギー源、ならびに他の必要不可欠な栄養素を含む培地で組換え株が培養される。全プロセスの費用を削減するために、発酵槽の嫌気的条件を維持することが非常に望ましい。そのような条件は、例えば、最初に培地に窒素をスパージし、次にセプタムおよびクリンプキャップでフラスコを密封することによって得ることができる。嫌気条件で増殖が観察されない株のために、限定的通気のための小さな穴をセプタムに開けることによって、微好気的条件を適用することができる。例示的な嫌気的条件は以前に記載されており、当技術分野において周知である。例示的な好気的および嫌気的条件は、例えば、２００７年８月１０日に出願の米国特許出願第１１／８９１，６０２号およびＷＯ／２００８／１１５８４０に記載されている。本明細書で開示されるように、発酵はバッチ、フェドバッチまたは連続的方法で実施することができる。
【００７５】
所望により、培地を望ましいｐＨに維持するために、必要により塩基、例えばＮａＯＨもしくは他の塩基、または酸の添加によって培地のｐＨを所望のｐＨ、特に中性ｐＨ、例えば約７のｐＨに維持してもよい。増殖速度は、分光光度計（６００ｎｍ）を用いて光学濃度を測定することによって決定することができ、グルコース取込み速度は、炭素源減損を経時的に監視することによって決定できる。
【００７６】
増殖培地は、例えば、天然に存在しない微生物に炭素源を供給することができる任意の炭水化物源を含むことができる。そのような供給源には、例えば糖類、例えばグルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、およびデンプンが含まれる。炭水化物の他の供給源には、例えば再生可能なフィードストックおよびバイオマスが含まれる。本発明の方法でフィードストックとして用いることができる例示的なバイオマスの型には、セルロースのバイオマス、ヘミセルロースのバイオマスおよびリグニンフィードストックまたはフィードストックの部分が含まれる。そのようなバイオマスフィードストックは、例えば炭素源として有用な炭水化物基質、例えばグルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトースおよびデンプンを含む。本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、上で例示されるもの以外の再生可能なフィードストックおよびバイオマスを、アセチルＣｏＡの生成のための本発明の微生物の生物体を培養するために用いることもできることを理解する。
【００７７】
したがって、本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、炭水化物、メタノールならびにＣＯ、ＣＯ２および／またはＨ２を含むガスなどの炭素源で増殖させるとき、本発明の生合成された化合物を細胞内発現するか分泌する、天然に存在しない微生物の生物体を生成することができることを理解するであろう。そのような化合物には、例えばアセチルＣｏＡおよび任意のアセチルＣｏＡ経路の中間代謝産物、ならびにアセチルＣｏＡから誘導される生成物（例えばエタノール、ブタノール、イソブタノール、イソプロパノール、１，４−ブタンジオール、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、４−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、乳酸、メタクリル酸、アジピン酸およびアクリル酸）が含まれる。必要なのは、例えば、アセチルＣｏＡ生合成経路の一部もしくは全部の組入れを含む、所望の化合物または中間体の生合成を達成するために必要とされる酵素またはタンパク質活性の１つまたは複数における設計製作することだけである。したがって、本発明は、炭水化物または他の炭素源で増殖させるとアセチルＣｏＡを生成し、炭水化物または他の炭素源で増殖させるとアセチルＣｏＡ経路で示される中間代謝産物のいずれかを生成および／または分泌するか、あるいはアセチルＣｏＡから誘導される生成物を生成および／または分泌する、天然に存在しない微生物の生物体を提供する。本発明のアセチルＣｏＡを生成する微生物の生物体は、中間体、例えば５−メチルテトラヒドロ葉酸（Ｍｅ−ＴＨＦ）から合成を開始することができる。
【００７８】
本発明の天然に存在しない微生物の生物体は、本明細書で例示される当技術分野で周知である方法を用いて、アセチルＣｏＡ経路の酵素またはタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を、アセチルＣｏＡの生成に十分な量で外因的に発現するように構築される。本発明の微生物の生物体は、アセチルＣｏＡの生成に十分な条件下で培養されると理解される。本明細書で提供される教示および指針に従い、本発明の天然に存在しない微生物の生物体は、約０．００１〜２００ｍＭまたはそれを超える細胞内濃度をもたらすアセチルＣｏＡの生合成を達成することができる。一般に、アセチルＣｏＡの細胞内濃度は、約３〜１５０ｍＭ、詳細には約５〜１２５ｍＭ、より詳細には約８〜１００ｍＭ、例えば約１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、８０ｍＭ、またはそれを超える。これらの例示的な範囲のそれぞれの間のおよびそれを超える細胞内濃度も、本発明の天然に存在しない微生物の生物体から達成することができる。
【００７９】
一部の実施形態では、培養条件は、嫌気的または実質的に嫌気的な増殖または維持条件を含む。例示的な嫌気的条件は以前に記載されており、当技術分野において周知である。発酵プロセスの例示的な嫌気的条件が本明細書に記載され、例えば、２００７年８月１０日に出願の米国特許出願第１１／８９１，６０２号およびＷＯ／２００８／１１５８４０に記載されている。これらの条件のいずれかを、当技術分野で周知である他の嫌気的条件と同様に、天然に存在しない微生物の生物体で使用することができる。そのような嫌気的条件の下で、アセチルＣｏＡ生産体は、５〜１０ｍＭまたはそれを超える細胞内濃度、ならびに本明細書で例示される他の全ての濃度で、アセチルＣｏＡを合成することができる。上の記載が細胞内濃度に言及し、アセチルＣｏＡ産生の微生物の生物体はアセチルＣｏＡを細胞内で生成することができるものと理解される。さらに、アセチルＣｏＡから誘導される生成物は、細胞内で生成することおよび／または分泌させることができる。そのような生成物には、エタノール、ブタノール、イソブタノール、イソプロパノール、１，４−ブタンジオール、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、４−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、乳酸、メタクリル酸、アジピン酸およびアクリル酸が含まれるが、これらに限定されない。
【００８０】
培養条件には、例えば、液体培養法だけでなく発酵および他の大規模培養法を含めることができる。本明細書で記載されるように、本発明の生合成生成物の特に有用な収率は、嫌気的または実質的に嫌気的な培養条件の下で得ることができる。
【００８１】
本明細書で記載されるように、アセチルＣｏＡの生合成を達成するための１つの例示的な増殖条件には、嫌気培養または発酵条件が含まれる。特定の実施形態では、本発明の天然に存在しない微生物の生物体は、嫌気的または実質的に嫌気的な条件の下で維持し、培養し、または発酵させることができる。簡単に述べると、嫌気条件とは酸素が欠けている環境を指す。実質的に嫌気的な条件には、例えば、培地中の溶解酸素濃度が飽和の０〜１０％の間にあるような、培養、バッチ発酵または連続発酵が含まれる。実質的に嫌気的な条件には、１％未満の酸素の雰囲気で維持される密封チャンバー内の液体培地または固体寒天で細胞を増殖または休止させることも含まれる。酸素の割合は、例えば、培養物をＮ２／ＣＯ２混合物または他の適切な１つまたは複数の非酸素ガスでスパージすることによって維持することができる。
【００８２】
本明細書で記載される培養条件は、アセチルＣｏＡを製造するために規模を拡大して、連続的に増殖させることができる。例示的な増殖法には、例えば、フェドバッチ発酵およびバッチ分離；フェドバッチ発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離が含まれる。これらのプロセスの全ては、当技術分野においては周知である。発酵法は、特に商業的な量のアセチルＣｏＡの生合成による生産に有用である。一般に、また非連続培養法と同様に、アセチルＣｏＡの連続的および／またはほとんど連続的な生成には、指数増殖期の増殖を持続および／またはほとんど持続させるために十分な栄養素および培地で、本発明の天然に存在しないアセチルＣｏＡ産生生物体を培養することが含まれよう。そのような条件下での連続培養は、例えば、１日、２、３、４、５、６または７日、またはそれを超えて含むことができる。さらに、連続培養は、１週間、２、３、４または５週間、またはそれを超える週および最高数カ月を含むことができる。あるいは、本発明の生物体は、特定の用途に適する場合は数時間培養することができる。連続的および／またはほとんど連続的な培養条件は、これらの例示的な期間の間の全ての期間を含むこともできることを理解すべきである。本発明の微生物の生物体を培養する時間は、所望の目的のために十分な量の生成物を生成するために十分な期間であることがさらに理解される。
【００８３】
発酵法は、当技術分野において周知である。簡単に述べると、アセチルＣｏＡの生合成生成のための発酵は、例えば、フェドバッチ発酵およびバッチ分離；フェドバッチ発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離で利用することができる。バッチ発酵法および連続発酵法の例は、当技術分野で周知である。
【００８４】
かなりの量のアセチルＣｏＡの連続的生成のために本発明のアセチルＣｏＡ生産体を用いる上記の発酵法に加えて、アセチルＣｏＡ生産体は、例えば、生成物を他の化合物に変換するための化学合成法に同時にかけること、または、生成物を発酵培養物から分離し、続いて、所望により、生成物を他の化合物に変換するために、化学変換にかけることができる。
【００８５】
合成ガスをエタノールに変換することができる微生物を含む、少なくとも３０個の異なる野生型生物体が多年かけて単離され、合成ガスまたは合成ガスの成分で増殖することが示された（Ｖｅｇａら、Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０／２１巻、７８１〜７９７頁（１９８９年））（表１を参照）。改善された合成ガス発酵のための候補生物体には、アセテート生成菌（ａｃｅｔｏｇｅｎ）、光栄養生物、硫酸塩還元細菌およびメタン生成菌が含まれ、これらは、唯一の炭素源およびエネルギー源としてＣＯおよび／またはＣＯ２／Ｈ２を利用することができる（Ｓｉｐｍａら、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２６巻、４１〜６５頁、（２００６年））。中温性のアセテート生成菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓは、速い倍加時間を有し、合成ガスでの増殖の間にエタノールおよび少量のブタノールを天然に生成することが示されているので、合成ガス−化学物質のプラットホームのための最も期待される生物体の１つである（Ｈｅｎｓｔｒａら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８巻、２００〜２０６頁（２００７年））。この生物体のために遺伝子ツールを開発することができる。標的遺伝子欠失もしくは挿入のための遺伝子ツールが存在する水素生成（ｈｙｄｒｏｇｅｎｉｃ）紅色非硫黄細菌Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍは、所望の生成物を生成するための合成ガス利用の開発のための別の良好な候補生物体であるが、それは合成ガスから水素を天然に生成するので、必要に応じて代謝改変を設計製作することができる。
【００８６】
一部の合成ガス利用生物体の代謝が知られている。例えば、Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓなどのアセテート生成菌は、水素が存在して必要な還元当量を供給する限り、グルコースの不在下でさえ、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を利用することによってＣＯまたはＣＯ２の存在下で増殖することができる。Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、図３（図１および２も参照）に図示されているが、重要な代謝中間体アセチルＣｏＡの生成を通して唯一の炭素源およびエネルギー源としてＣＯを利用するアセテート生成菌の能力を示す。具体的には、ＣＯを酸化して還元当量およびＣＯ２を生成することができ、またはアセチルＣｏＡに直接に同化することができ、それはバイオマスまたは代謝産物にその後変換される。重要なことに、アセチルＣｏＡは広範囲の代謝産物および他の化学成分（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｙ）の前駆体の役目を果たすことができる、重要な代謝中間体である。したがって、合成ガスまたは他のガス状炭素源からアセチルＣｏＡを生成する微生物の能力は、所望の生成物としての広範囲の化学物質および燃料の生成のために、合成ガス利用生物体、または他のガス状炭素源を利用することができる生物体の設計製作を可能にする。
【００８７】
発酵による化学物質および燃料の商業生産のための存続可能なフィードストックとしての合成ガスまたは他のガス状炭素源の使用を特徴付けるために、現行システムに関連する重要な問題および難題に対処するために実行可能性調査を実施する。予備代謝モデル化研究は、化学物質への合成ガスの変換が熱力学的に非常に好ましいものであること、および特定の化学物質を独占的生成物として作製することができることを示した。このことは、下流での処理の必要性を減少させるだけでなく、生成物の収率を最大にする。さらに、所望により、発酵を連続的に行うことができるように、所望の生成物の生成を増殖と関連させてもよい。連続法は高い細胞濃度に維持され、バッチターンアラウンド時間を回避するので、それらは経済的により好ましい。
【００８８】
本明細書で開示されるように、本発明は合成ガスまたは他のガス状炭素源を利用することができ、高い収率、力価および生産性での化学生成物へのＣＯおよび／またはＣＯ２の効率的な変換を可能にする微生物の開発に関する。１つの例示的な有用な商業的実施形態は、理論最大値の８０％以上の収率、５０ｇ／Ｌ以上の生成物許容度、５０ｇ／Ｌ以上の力価および少なくとも２ｇ／Ｌ／時間の生産性による特定の化学物質の生成を達成することができる生物体の開発に関する。これらの基準は商業上特に有用であるが、これらのいずれかまたは全部の基準未満を達成することができる生物体も、本発明で有用であるものと理解される。例えば、所望の用途のために十分な収率が達成される限り、生物体は、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％などのいずれか以上の収率で特定の化学物質の生成を達成してもよい。同様に、所望の用途のために十分な収率が達成される限り、生物体は、４５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌなどのいずれか以上の生成物許容度を達成することができる。さらに、所望の用途のために十分な収率が達成される限り、生物体は、２００ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌなどのいずれか以上の力価を達成することができる。さらに、所望の用途のために十分な収率が達成される限り、生物体は、１．５ｇ／Ｌ／時間、１ｇ／Ｌ／時間、０．５ｇ／Ｌ／時間などの少なくともいずれかの生産性を達成することができる。
【００８９】
本明細書で開示されるように、合成ガス利用からの生成物としてのブタノールの仮説分析は、フィードストックとして安くて容易に入手できる合成ガスを効率的に利用する能力が、特にフィードストックとしての合成ガスの低い費用からみて、現在の石油化学プロセスよりもおそらく５０％以上費用的に有利であるプロセスをもたらすことができることを示す。低い費用に加えて、合成ガスは、石炭、ならびにスイッチグラスなどのエネルギー作物だけでなく廃棄物、例えば木屑、農業廃棄物、酪農廃棄物および都市ごみを含む多くの型のバイオマスから生成することができる、豊富で柔軟な基質である。したがって、合成ガスまたは他のガス状炭素源を利用して所望の生成物を生成することができる生物体を生成する能力は、ほとんどいかなるバイオマス源からの生成をも可能にする。この特徴は、生物燃料または化学物質の生成のために用いられる各タイプのバイオマスに特異な、異なるプロセスを開発することを不要にする。合成ガスの生成のための廃棄物の使用は、環境汚染物を減少させ、生物廃棄物の深刻な処理問題を軽減するために利用することもできる。さらに、フィードストックとしての合成ガスは、例えば、トウモロコシ由来のエタノール生産に関連するフィード対燃料論争とは無縁である。合成ガス生成で利用可能な広範囲の基質を考慮すると、このフィードストックの供給および経費構造は、経年的に比較的安定なままであることが予想される。最後に、合成ガスは加熱およびエネルギーのために広く用いられ、したがって、生産のための石油系エネルギーの必要性を補うか除去することができる、バイオマス由来のエネルギー源として用いることができ、さらなる費用節約を提供する。
【００９０】
ブタノールを所望の生成物として本明細書の様々な実施形態で例示されているが、所望により、本発明の微生物によって生成することができる任意の生成物を生成することができ、生成物を生成するために利用することができるものと理解される。一般に、所望の生成物には、化学合成で有用な、または燃料として有用な炭化水素が含まれるが、これらに限定されない。例示的な所望の生成物には、それらに限定されないが、メタノール、エタノール、ブタノール、アセテート、ブチレート、ラクテート、スクシネート、４−ヒドロキシブチレート、１，４−ブタンジオールなどが含まれる。
【００９１】
他の態様では、本発明は、４−ヒドロキシブチレートを生成するのに十分な量で発現される４−ヒドロキシブチレート（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｒｙａｔｅ）経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性の核酸を含むことができる４−ヒドロキシブチレート経路を有する天然に存在しない微生物の生物体を提供する。４−ヒドロキシブチレート経路の酵素には、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ホスホトランス−４−ヒドロキシブチリラーゼおよび４−ヒドロキシブチレートキナーゼを含めることができる。
【００９２】
さらに他の態様では、本発明は、１，４−ブタンジオールを生成するのに十分な量で発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むことができる１，４−ブタンジオール経路を有する天然に存在しない微生物の生物体を提供する。１，４−ブタンジオール経路の酵素には、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成性）、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成性）および１，４−ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含めることができる。そのような生物体は、アセチルＣｏＡを生成するのに十分な量で発現されるアセチルＣｏＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性の核酸を有するアセチルＣｏＡ経路を含むこともできる。アセチルＣｏＡ経路の酵素には、コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼを含めることができる。
【００９３】
さらに他の態様では、本発明は、１，４−ブタンジオールを生成するのに十分な量で発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むことができる１，４−ブタンジオール経路を有する天然に存在しない微生物の生物体を提供する。１，４−ブタンジオール経路の酵素には、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成性）、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成性）および１，４−ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含めることができる。そのような生物体は、アセチルＣｏＡを生成するのに十分な量で発現されるアセチルＣｏＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性の核酸を含むアセチルＣｏＡ経路を含むこともできる。アセチルＣｏＡ経路の酵素には、アセチルＣｏＡシンターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを含めることができる。
【００９４】
さらなる態様では、本発明は、４−ヒドロキシブチレート経路を有する天然に存在しない微生物の生物体を培養することを含むことができる、４−ヒドロキシブチレートを生成する方法を提供する。前記経路は、４−ヒドロキシブチレートを生成する条件下およびそれに十分な期間、４−ヒドロキシブチレートを生成するのに十分な量で発現される４−ヒドロキシブチレート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むことができる。４−ヒドロキシブチレート経路は、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ホスホトランス−４−ヒドロキシブチリラーゼおよび４−ヒドロキシブチレートキナーゼを含むことができる。
【００９５】
さらに他の態様では、本発明は、１，４−ブタンジオール経路を有する天然に存在しない微生物の生物体を培養することを含むことができる、１，４−ブタンジオールを生成する方法を提供する。前記経路は、１，４−ブタンジオールを生成する条件下およびそれに十分な期間、１，４−ブタンジオールを生成するのに十分な量で発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むことができる。１，４−ブタンジオール経路は、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成性）、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成性）、１，４−ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含むことができる。そのような生物体は、アセチルＣｏＡを生成するのに十分な量で発現されるアセチルＣｏＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアセチルＣｏＡ経路を含むこともできる。アセチルＣｏＡ経路の酵素には、コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼを含めることができる。
【００９６】
最後に一部の態様では、本発明は、１，４−ブタンジオール経路を有する天然に存在しない微生物の生物体を培養することを含むことができる、１，４−ブタンジオールを生成する方法を提供する。前記経路は、１，４−ブタンジオールを生成する条件下およびそれに十分な期間、１，４−ブタンジオールを生成するのに十分な量で発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むことができる。１，４−ブタンジオール経路は、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成性）、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成性）および１，４−ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含むことができる。そのような生物体は、アセチルＣｏＡを生成するのに十分な量で発現されるアセチルＣｏＡ経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を有するアセチルＣｏＡ経路を含むこともできる。アセチルＣｏＡ経路の酵素には、アセチルＣｏＡシンターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを含めることができる。
【００９７】
他の実施形態では、図１１に表すように、本発明の生物体は、機能的メチルトランスフェラーゼ系、アセチルＣｏＡを合成する能力、およびアセチルＣｏＡから４−ＨＢを合成する能力を有する。本明細書に記載のさらに他の生物体は、図１２に表す、機能的メチルトランスフェラーゼ系、アセチルＣｏＡを合成する能力、およびアセチルＣｏＡからＢＤＯを合成する能力を有する。
【００９８】
本発明は、４−ヒドロキシブチレートを生成するのに十分な量で発現される４−ヒドロキシブチレート経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むことができる４−ヒドロキシブチレート経路を有する天然に存在しない微生物の生物体も提供する。４−ヒドロキシブチレート経路の酵素には、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、ホスホトランス−４−ヒドロキシブチリラーゼおよび４−ヒドロキシブチレートキナーゼを含めることができる。
【００９９】
そのような生物体は、コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼなどの少なくとも１つの酵素またはポリペプチドを含むこともできる。
【０１００】
一部の実施形態では、４−ヒドロキシブチレート経路を有する生物体は、メタノールメチルトランスフェラーゼを含むことができる。そのような生物体は、１）メタノールおよびＣＯ、２）メタノール、ＣＯ２およびＨ２、３）メタノール、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２、４）メタノール、ならびにＣＯおよびＨ２を含む合成ガス、ならびに５）メタノール、ならびにＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む合成ガスなどのフィードストックを利用する。
【０１０１】
４−ヒドロキシブチレート経路を有する他の生物体は、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを有することができる。そのような生物体は、１）ＣＯ、２）ＣＯ２およびＨ２、３）ＣＯおよびＣＯ２、４）ＣＯおよびＨ２を含む合成ガス、５）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む合成ガスなどのフィードストックを利用する。
【０１０２】
本発明は、１，４−ブタンジオールを生成するのに十分な量で発現される１，４−ブタンジオール経路の酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むことができる１，４−ブタンジオール経路を有する天然に存在しない微生物の生物体も提供する。１，４−ブタンジオール経路の酵素には、例えばアセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニル−ＣｏＡヒドラターゼ、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコール形成性）、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド形成性）および１，４−ブタンジオールデヒドロゲナーゼが含まれる。
【０１０３】
そのような生物体は、コリノイドタンパク質、メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ、コリノイド鉄−硫黄タンパク質、ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質、フェレドキシン、アセチルＣｏＡシンターゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼなどの少なくとも１つの酵素またはポリペプチドを含むこともできる。
【０１０４】
一部の実施形態では、１，４−ブタンジオール経路を有する生物体は、メタノールメチルトランスフェラーゼを含むことができる。そのような生物体は、１）メタノールおよびＣＯ、２）メタノール、ＣＯ２およびＨ２、３）メタノール、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２、４）メタノール、ならびにＣＯおよびＨ２を含む合成ガス、５）メタノール、ならびにＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む合成ガスなどのフィードストックを利用する。
【０１０５】
他の実施形態では、１，４−ブタンジオール経路を有する生物体は、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼを含むことができる。そのような生物体は、１）ＣＯ、２）ＣＯ２およびＨ２、３）ＣＯおよびＣＯ２、４）ＣＯおよびＨ２を含む合成ガス、ならびに５）ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２を含む合成ガスからなる群から選択されるフィードストックを利用する。
【０１０６】
本発明の例示的な微生物の生物体は、図１３に表すような経路を含むことができる。そのような生物体は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の機能的メチル分岐、アセチルＣｏＡを合成する能力、およびアセチルＣｏＡから４−ヒドロキシブチレートを合成する能力を含むことができる。本発明の別の例示的な微生物の生物体は、図１４に表すような経路を含むことができる。そのような微生物の生物体は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の機能的メチル分岐、アセチルＣｏＡを合成する能力、およびアセチルＣｏＡから１，４−ブタンジオールを合成する能力を含むことができる。
【０１０７】
より良好な生産体を生成するために、代謝モデル化を利用して増殖条件を最適化することができる。モデル化を用いて、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計することもできる（例えば、米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号を参照）。モデル化分析は、細胞増殖に及ぼす、アセチルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡから誘導される生成物のより効率的な生産への代謝の移行の影響の、信頼できる予測を可能にする。
【０１０８】
所望の生成物の生合成を有利にする代謝改変を特定し、設計するための１つのコンピュータ方法は、ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータフレームワークである（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））。ＯｐｔＫｎｏｃｋは、標的生成物を過剰に生産する遺伝的に安定した微生物をもたらす遺伝子欠失戦略を示唆する、代謝モデル化およびシミュレーションプログラムである。具体的には、フレームワークは、所望の生化学物質を細胞増殖の必須の副産物になるように強制する遺伝子操作を示唆するために、微生物の完全な代謝ネットワークおよび／または生化学ネットワークを調べる。戦略的に置かれた遺伝子欠失または他の機能的遺伝子破壊を通して生化学的生成を細胞増殖と連結することによって、バイオリアクター内での長期間の後に設計製作された株に加えられる増殖淘汰圧は、強制的な増殖連結型の生化学的生成の結果として、性能の改善をもたらす。最後に、遺伝子欠失が構築されると、ＯｐｔＫｎｏｃｋによって選択された遺伝子はゲノムから完全に除去されるので、設計された株がそれらの野生型状態に戻る可能性はごくわずかである。したがって、このコンピュータ方法は、所望の生成物の生合成をもたらす代替経路を特定するために用いること、または所望の生成物の生合成のさらなる最適化のために、天然に存在しない微生物の生物体と共に用いることができる。
【０１０９】
簡単に述べると、ＯｐｔＫｎｏｃｋは細胞代謝のモデル化のためのコンピュータによる方法およびシステムを指すために本明細書で用いられる用語である。ＯｐｔＫｎｏｃｋプログラムは、特定の制約をフラックスバランス分析（ＦＢＡ）モデルに組み込む、モデルおよび方法のフレームワークに関する。これらの制約には、例えば、定性的動態学情報、定性的調節情報および／またはＤＮＡマイクロアレイ実験データが含まれる。ＯｐｔＫｎｏｃｋは、例えばフラックスバランスモデルを通して誘導されるフラックス境界を締め、その後、遺伝子付加または欠失の存在下で代謝ネットワークの性能限界を調査することによって、様々な代謝問題の解法も計算する。ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータフレームワークは、代謝ネットワークの性能限界の効果的なクエリーを可能にするモデル式の構築を可能にし、生じる混合整数線形計画法の問題を解決する方法を提供する。ＯｐｔＫｎｏｃｋとして本明細書で言及される代謝モデル化およびシミュレーション法は、例えば、２００２年１月１０日に出願の米国特許公開第２００２／０１６８６５４号、２００２年１月１０日に出願の国際特許ＰＣＴ／ＵＳ０２／００６６０、および２００７年８月１０日に出願の米国特許出願第１１／８９１，６０２号、およびＷＯ／２００８／１１５８４０に記載されている。
【０１１０】
生成物の生合成生成を有利にする代謝改変を特定および設計するための別のコンピュータ方法は、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）と呼ばれる代謝モデル化およびシミュレーションシステムである。このコンピュータ方法およびシステムは、例えば、２００２年６月１４日に出願の米国特許公開２００３／０２３３２１８および２００３年６月１３日に出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／１８８３８に記載されている。ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）は、コンピュータでネットワークモデルを生成し、生物系の化学反応を通して質量、エネルギーまたは電荷のフラックスをシミュレートして、その系の化学反応の任意のまたは全ての可能な機能を含む解空間を定義し、それによってその生物系に許される様々な活性を決定するために用いることができるコンピュータシステムである。この手法は制約に基づくモデル化と称されるが、その理由は、含まれる反応の公知の化学量などの制約、ならびに反応を通して最大フラックスに関連する熱力学反応および容量制約によって解空間が定義されるからである。これらの制約によって定義される空間を調べて、生物系またはその生化学成分の表現型能力および挙動を決定することができる。
【０１１１】
生物系は柔軟であり、多くの異なる方法で同じ結果に到達することができるので、これらのコンピュータ手法は生物実体と調和している。生物系は、全ての生物系が直面しなければならない基本的な制約によって制限されている進化機構を通して設計される。したがって、制約に基づくモデル化戦略は、これらの一般的な実体を包含する。さらに、制約の締め付けを通してさらなる制限をネットワークモデルに連続的に加える能力は、解空間のサイズの低下をもたらし、それによって、生理的性能または表現型を予測する精度を高める。
【０１１２】
本明細書で提供される教示および指針を考慮すると、当業者は、代謝モデル化およびシミュレーションのための様々なコンピュータフレームワークを適用して、宿主の微生物の生物体における所望の化合物の生合成を設計および実施することができる。そのような代謝モデル化およびシミュレーション方法には、例えば、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）およびＯｐｔＫｎｏｃｋのような上で例示したコンピュータシステムが含まれる。本発明の説明のために、モデル化およびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋ計算フレームワークに関して、いくつかの方法を本明細書に記載する。当業者は、ＯｐｔＫｎｏｃｋを用いる代謝改変の特定、設計および実行を、そのような当技術分野で周知である他の代謝モデル化およびシミュレーションコンピュータフレームワークおよび方法のいずれかに適用する方法を知るであろう。
【０１１３】
上記の方法は、破壊する１セットの代謝反応を提供する。セット内の各反応の除去または代謝改変は、生物体の増殖期の間の必須の生成物として、所望の生成物をもたらすことができる。反応が知られているので、２層の（ｂｉｌｅｖｅｌ）ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の解決は、反応セット内の各反応を触媒する１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の関連遺伝子も提供する。反応セットおよび各反応に関与する酵素をコードするそれらの対応遺伝子の同定は、一般に自動化されたプロセスであり、その反応と、酵素およびコード遺伝子の間の関係を有する反応データベースとの相関関係を通して達成される。
【０１１４】
同定されると、標的細胞または生物体において、所望の生成物の生成を達成するために破壊される反応セットが、セット内の各代謝反応をコードする少なくとも１つの遺伝子の機能的破壊によって実施される。反応セットの機能的破壊を達成する１つの特に有用な手段は、各コード遺伝子の欠失によるものである。しかし、一部の例では、例えば、突然変異、プロモーターもしくは調節因子のためのシス結合部位などの調節領域の欠失を含む他の遺伝子異常、またはいくつかの場所のいずれかにおけるコード配列の切断によって反応を破壊することが有益となることがある。例えば、生成物の連結の速やかな評価が所望され、または遺伝子復帰突然変異が起こる可能性がより低い場合、遺伝子セットの全体未満の欠失をもたらすこれらの後者の異常が有用なことがある。
【０１１５】
所望の生成物の増殖連結型の生合成を含む生合成をもたらすことができる破壊すべきさらなる反応セットまたは代謝改変をもたらす上記の２層のＯｐｔＫｎｏｃｋ問題のさらなる生産的解法を特定するために、整数カットと呼ばれる最適化法を実施することができる。この方法は、各反復での整数カットと呼ばれる追加の制約の組込みで、上に例示されるＯｐｔＫｎｏｃｋ問題を反復して解決することによって進行する。整数カット制約は、解決手法が、生成物生合成を増殖に不可避的に連結する任意の前の反復で特定されるものと正確に同じ反応セットを選択することを、効果的に防止する。例えば、前に特定された増殖連結型の代謝改変が破壊のための反応１、２および３を特定する場合、以下の制約は、その後の解法で同じ反応が同時に考慮されることを防止する。整数カット法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．  １７巻、７９１〜７９７頁（２００１年）に記載されているのを見ることができる。代謝モデル化およびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータフレームワークと組み合わせたそれらの使用に関して本明細書で記載される全ての方法と同様に、反復性コンピュータ分析でのリダンダンシーを減らす整数カット法は、例えばＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）を含む当技術分野で周知である他のコンピュータフレームワークとともに適用することもできる。
【０１１６】
本明細書で例示される方法は、所望の生成物を生合成的に生成する細胞および生物体の構築を可能にし、それには、特定された遺伝子改変を抱えるように設計製作された細胞または生物体の増殖への、標的生化学生成物の生成の必須の連結が含まれる。したがって、本明細書で記載されるコンピュータ方法は、ＯｐｔＫｎｏｃｋまたはＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）から選択されるコンピュータ方法によって特定される代謝改変の同定および実行を可能にする。代謝改変のセットには、例えば、１つまたは複数の生合成経路の酵素の付加および／または、例えば遺伝子欠失による破壊を含む１つまたは複数の代謝反応の機能的破壊を含めることができる。
【０１１７】
上記のように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ方法は、長期の増殖選択に曝した場合、突然変異体微生物ネットワークをコンピュータによって予測されるそれらの最大増殖表現型の方へ進化させることができるという前提で開発された。言い換えると、本手法は、選択圧の下で自己最適化する生物体の能力を導入する。ＯｐｔＫｎｏｃｋフレームワークは、ネットワーク化学量論に基づいて生化学的生成と細胞増殖との間の連結を強制する遺伝子欠失組合せの網羅的な列挙を可能にする。最適遺伝子／反応ノックアウトの同定は、生じたネットワークについての最適増殖の解法が対象とする生化学物質を過剰に生産するように活性反応セットを選択する、２層の最適化問題の解決を必要とする（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））。
【０１１８】
前に例示され、例えば米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号に記載されるように、代謝経路に必要不可欠な遺伝子を同定するために、Ｅ．ｃｏｌｉ代謝のコンピュータ化学量論モデルを使用することができる。本明細書で開示されるように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ数学フレームワークを、所望の生成物の増殖連結型生成をもたらす正確な遺伝子欠失に適用することができる。さらに、２層のＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の解決は、１セットの欠失だけを提供する。全ての意味がある解決、すなわち増殖連結型生成の形成をもたらすノックアウトの全セットを列挙するために、整数カットと呼ばれる最適化技術を実施することができる。これは、上記のように、各反復での整数カットと呼ばれる追加の制約の組込みでＯｐｔＫｎｏｃｋ問題を反復して解決することを必要とする。
【０１１９】
本発明の様々な実施形態の働きに実質的に影響を及ぼさない改変も、本明細書で提供される本発明の定義の範囲内で提供されるものと理解される。したがって、以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、限定するものではない。
【実施例】
【０１２０】
（実施例Ｉ）
合成ガス発酵のための生物体および経路
この実施例では、合成ガスを利用することができる生物体および例示的な経路について記載する。
【０１２１】
少なくとも３０種の異なる生物体が長年にわたり単離され、合成ガスまたはＣＯ、ＣＯ２およびＨ２などの合成ガスの成分で増殖することが示された（Ｈｅｎｓｔｒａら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８巻、２００〜２０６頁（２００７年）；Ｓｉｐｍａら、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２６巻、４１〜６５頁（２００６年））。表１にそのような生物体の例ならびにそれらの増殖至適温度、増殖至適ｐＨ、倍加時間、生成物プロファイルおよび生理学的群などのそれらのいくつかの特性を示す。
【０１２２】
【表１−１】
2019103519.tif 000002
【０１２３】
【表１−２】
2019103519.tif 000003
Ｈｅｎｓｔｒａら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８巻、２００〜２０６頁（２００７年）；Ｓｉｐｍａら、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２６巻、４１〜６５頁（２００６年）から転載
合成ガスの利用の検討に供する生物体の１つの種類は、７２℃と高い温度に耐えることができるという理由から好熱性アセテート生成菌であり、これにより、汚染問題が低減し、蒸留によるブタノールなどの生成物の分離に伴う加熱コストが低くなるであろう。しかし、合成ガスからのアルコール生成は、好熱生物においていまだ実証されておらず、それらの主要な生成物は、水素、アセテートおよび／またはＨ２Ｓである。酢酸生成好熱性細菌の倍加時間も中温性アセテート生成菌より長かった。したがって、初期の試験は、これらの生物体が最も速い倍加時間を有し、合成ガスからアルコールを生成することが示されたので、ブタノールなどの望まれる生成物の生成用の中温性アセテート生成菌に焦点が絞られる。初期の特徴付けは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓにおいて実施されている。全ての合成ガス利用生物体のうち、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉは、その代謝能および至適発酵条件に関する実質的な一連の知識を保有する。Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓは、合成ガスでの増殖中に少量のブタノールを天然で生成することが示された（Ｈｅｎｓｔｒａら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８巻、２００〜２０６頁（２００７年））。
【０１２４】
いくつかの例示的な合成ガス利用生物体の代謝経路が公知である。合成ガスを利用する２つの例示的な経路を図１および２に示す。
【０１２５】
Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよびＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓなどのアセテート生成菌は、ヘキソース糖から一酸化炭素までに及ぶいくつかの炭素源で増殖することができる。グルコースなどのヘキソースは、最初にエムデン・マイヤーホフ・パルナス（ＥＭＰ）解糖によりピルベートに代謝され、これが次にピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼによりアセチルＣｏＡに変換される。アセチルＣｏＡは、バイオマス前駆体を構築するのに用いることができ、あるいは、酢酸キナーゼおよびホスホトランスアセチラーゼによりエネルギーを生ずるアセテートに変換することができる。グルコースのアセテート、エネルギーおよび還元当量への総括的変換は、以下の通りである。
【０１２６】
Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋４ＡＤＰ＋４Ｐｉ→２ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２ＣＯ２＋４ＡＴＰ＋８［Ｈ］
アセテート生成菌は、以下のようにＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路によりＣＯ２をさらにアセテートに変換することによりレドックスバランスも維持しながら、グルコースのアセテートへの変換からより多くのエネルギーを取り出す。
【０１２７】
２ＣＯ２＋８［Ｈ］＋ｎＡＤＰ＋ｎＰｉ→ＣＨ３ＣＯＯＨ＋ｎＡＴＰ
多くのアセテート生成菌は、必要な還元当量を供給するために水素が存在する限り、グルコースの不在下でもＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路によりＣＯ２の存在下で増殖することができるので、上式の係数ｎは、この変換がエネルギー発生活動であることを意味している。
【０１２８】
２ＣＯ２＋４Ｈ２＋ｎＡＤＰ＋ｎＰｉ→ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２Ｈ２Ｏ＋ｎＡＴＰ
図３に示すＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、それぞれＮａ＋またはＨ＋依存性ＡＴＰシンターゼによりＡＴＰを生成し得るＮａ＋またはＨ＋のイオン勾配の形成と連結している（Ｍｕｌｌｅｒ、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６９巻、６３４５〜６３５３頁（２００３年））。これらの公知の形質転換に基づいて、アセテート生成菌は、唯一の炭素およびエネルギーの源としてＣＯを利用する能力も有する。特に、ＣＯは、酸化されて、還元当量およびＣＯ２を生成するか、または後にバイオマスもしくはアセテートに変換されるアセチルＣｏＡへと直接同化され得る。
【０１２９】
４ＣＯ＋２Ｈ２Ｏ→ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２ＣＯ２
しかし、還元当量の要件を満たすのに十分な水素が存在する場合に、より高いアセテートの収率を達成することができる。
【０１３０】
２ＣＯ＋２Ｈ２→ＣＨ３ＣＯＯＨ
図３によれば、アセチルＣｏＡによるアセテートの生成は、１つのＡＴＰ分子を生成させるが、アセチルＣｏＡからのエタノールの生成はそれを生成させず、２つの還元当量を必要とする。したがって、合成ガスからのエタノールの生成は、アセテートの生成が存在しない場合には細胞の増殖に十分なエネルギーを発生すると予想されない。しかし、特定の条件下では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉは合成ガスから主としてエタノールを生成し（Ｋｌａｓｓｏｎら、Ｆｕｅｌ、７２巻、１６７３〜１６７８頁（１９９３年））、以下の経路
２ＣＯ２＋６Ｈ２→ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ＋３Ｈ２Ｏ
６ＣＯ＋３Ｈ２Ｏ→ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ＋４ＣＯ２
２ＣＯ＋４Ｈ２→ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ＋Ｈ２Ｏ
のある組合せは、実際に細胞増殖を支えるのに十分なエネルギーを発生することが示唆される。Ｒ．ｒｕｂｒｕｍなどの水素生成細菌もＣＯおよび水の水素への変換によりエネルギーを発生することもできる（図３を参照）（Ｓｉｐｍａら、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２６巻、４１〜６５頁（２００６年））。重要なメカニズムは、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ（ＥＣＨ）およびＣＯデヒドロゲナーゼの協調作用である。ＣＯデヒドロゲナーゼは、ＣＯからの電子を供給し、これが次に、活性がエネルギー発生プロトントランスロケーションに連結される、ＥＣＨによりプロトンをＨ２に還元するのに用いられる。正味の結果は、水性ガス転化反応によるエネルギーの発生である。
【０１３１】
合成ガス発酵の生成物プロファイルは、生物体および実験条件の選択により決定される。例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉは、エタノールとアセテートの混合物を生成する（Ｋｌａｓｓｏｎら、Ｆｕｅｌ、７２巻、１６７３〜１６７８頁（１９９３年）；ＧａｄｄｙおよびＣｌａｕｓｅｎ、米国特許第５，１７３，４２９号）が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓは、エタノール、アセテート、ブタノールおよびブチレートの混合物を生成する（Ｌｉｏｕら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｅｖｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５５巻（Ｐｔ５）、２０８５〜２０９１頁（２００５年）。それぞれ２６．８ｇ／Ｌおよび１２．４ｇ／Ｌと高いアセテートおよびバイオマスの濃度、ならびに１ｇ／Ｌを下回るエタノール濃度がＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉについて報告された（Ｇａｄｄｙ、米国特許第５，８０７，７２２号、第６，１３６，５７７号、第６，３４０，５８１号）。しかし、この生成物プロファイルは、例えば、栄養制限、培地の変更、より低いｐＨ、還元剤添加などを用いる、クロストリジウム属における酸の生成と比べて溶媒の生成を増加する伝統的な手段により、エタノール生成の増加の方向に移動させることができる。いくつかの条件、例えば、パントテン酸カルシウム制限、コバルト制限、Ｈ２過剰供給、ＣＯ過剰供給、アセテートの条件付けなどに対する生成物プロファイルの感受性が記載された（Ｇａｄｄｙら、米国特許第７，２８５，４０２号）。エタノールの生成について最適化された条件下で細胞リサイクルがない場合にＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ株Ｃ−０１について、それぞれ３３．０ｇ／Ｌ、４．０ｇ／Ｌおよび２．７ｇ／Ｌのエタノール、アセテートおよび細胞の濃度が示された。最大のエタノール生産性は、細胞リサイクルがない場合の２１ｇ／Ｌ／日から細胞リサイクルがある場合の３９ｇ／Ｌ／日までの範囲にあった。
【０１３２】
阻害物質に対する合成ガス発酵の感受性も測定することができる。特定の生成物の生成のためにＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓの発酵条件を最適化する労力がより少ないこと（Ｌｉｏｕら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｅｖｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５５巻（Ｐｔ５）、２０８５〜２０９１頁（２００５））が報告された。しかし、いくつかの最近の試験は、合成ガス阻害物質によるＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓの増殖の抑制を目的とするものであった。具体的には、ＣＯ、ＣＯ２、Ｎ２およびＨ２のみからなる「清浄な」シリンダー入り圧縮ガスを導入したとき増殖は回復したが、バイオマス生成のプロデューサーガスに存在する阻害物質がＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓの増殖およびＨ２の利用を停止させた（Ｄａｔａｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、８６巻、５８７〜５９４頁（２００４年））。ガスを０．０２５μｍフィルターに通すことにより、Ｈ２利用は依然として阻害されていたが、細胞増殖を可能にするのに十分にガスが浄化された（Ａｈｍｅｄら、Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ、３０巻、６６５〜６７２頁（２００６年））。フィルターの走査型電子顕微鏡分析により、灰ではなく、タール粒子が細胞休止をもたらす考え得る原因であったことが示された。可能なタール種は、ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、ｐ−キシレン、ｏ−キシレンおよびナフタレンと同定された。細胞は、０．２μｍフィルターの後に存在するタールに１０〜１５日以内に順応することができた。Ｈ２利用がフィルターサイズに無関係に停止したという事実は、濾過されない成分がヒドロゲナーゼ酵素を阻害していたことを示すものであった。この成分は、後に一酸化窒素と同定された。ＮＯは、≧６０ｐｐｍレベルでヒドロゲナーゼを阻害する（ＡｈｍｅｄおよびＬｅｗｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、９７巻、１０８０〜１０８６頁（２００７年））。所望の生成物を生成する特定の生物体における合成ガスの利用の適切な条件を決定するために同様の試験を行うことができる。
【０１３３】
例示的な実験において、スイッチグラスガス化について以前に記載されたシステム（Ｄａｔａｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、８６巻、５８７〜５９４頁（２００４年）；Ａｈｍｅｄら、Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ、３０巻、６６５〜６７２頁（２００６年））と同様に、ガス化装置を出る合成ガスがサイクロン、凝縮塔、スクラバーおよび０．２μｍフィルターに通されることが想定される。以前に提案された（ＡｈｍｅｄおよびＬｅｗｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、９７巻、１０８０〜１０８６頁（２００７年））ように、４０ｐｐｍ未満のＮＯレベルを達成することができるように空気吹きと対立するものとしての酸素吹きガス化を用いる。さらに、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉを用いた試験で、細胞をあらかじめ順応させない場合でさえ、２．７％未満のＨ２Ｓレベルは阻害的でないことが明らかにされ（Ｋｌａｓｓｏｎら、Ｆｕｅｌ、７２巻、１６７３〜１６７８頁（１９９３年））、レベルは、バイオマスまたは石炭ガス化から得られる合成ガスのレベルより低いと予想される。さらに、進化または順応により、タール微粒子に対する耐性を達成することができる（Ａｈｍｅｄら、Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ、３０巻、６６５〜６７頁（２００６年））。
【０１３４】
（実施例ＩＩ）
合成ガスの利用のための微生物株の設計およびモデリング
この実施例では、合成ガスからの所望の生成物の生成のための例示的な微生物株の設計について記載する。
【０１３５】
初期の試験では、合成ガスを炭素源として用いることができる微生物株の設計のためにＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓおよびＲ．ｒｕｂｒｕｍのゲノムスケールモデルを用いる。代謝モデルおよびシミュレーションアルゴリズムを用いて、合成ガスを利用する株を発生させる。所望の微生物のゲノム配列ならびに密接に関連する種の配列を用いて、標的生物体のゲノムスケール代謝モデルを構築する。この過程を促進するために、Ｇｅｎｏｍａｔｉｃａは、我々の既存の手作業で構築した高品質の代謝モデルとの徹底的な配列比較に基づいて、代謝ネットワークの最初のドラフトを自動的に構築する包括的な方法を開発した。次に、自動的に発生させた遺伝子−タンパク質−反応（ＧＰＲ）割当て（図２参照）を手作業によりチェックし、それらができる限り透明であることを確実にするために、詳細な記録を、Ｇｅｎｏｍａｔｉｃａの自社開発のモデル構築およびシミュレーションプラットホームであるＳｉｍＰｈｅｎｙ（商標）内に目録として収載する。例示的な生成物としてのブタノールの生成のために、ブタノール経路における酵素を、天然ではブタノールを生成しない微生物、例えば、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよびＲ．ｒｕｂｒｕｍにおいて発現させる。
【０１３６】
制約ベースモデリングアプローチ（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ−ｂａｓｅｄ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈ）（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．、１５巻、２８８〜２９５頁（１９９９年）；Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４巻、１３３〜４０頁（２００２年）；ＶａｒｍａおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２巻、９９４〜９９８頁（１９９４年）；Ｐａｔｉｌら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５巻、６４〜６９頁（２００４年）を用いて、代謝モデルを問い合わせる。簡単に述べると、生物体がなすことを計算し、正確に予測することを試みるよりはむしろ、制約ベースアプローチは、支配する物理化学的制約（例えば、化学量論的、熱力学的、容量および調節の制約）が連続的に課せられることに基づいて生物体が示すことができる可能な表現型の範囲を狭くする（Ｐｒｉｃｅら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２１巻、１６２〜１６９頁（２００３年）；Ｐｒｉｃｅら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２巻、８８６〜８９７頁（２００４年））。したがって、生物体が所定の遺伝的および環境条件下でどのように挙動するかについて正確である、正確な表現型の「解」を計算する代わりに、このアプローチは、生物体が起こすことができる表現型の解の可能な組を決定することができる。一般的に、ゲノムスケールの制約ベースモデルは、増殖および副産物分泌パターンなどのいくつかの生理学的特性を予測する（ＥｄｗａｒｄｓおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９７巻、５５２８〜５５３３頁（２０００年）；Ｖａｒｍａら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５９巻、２４６５〜２４７３頁（１９９３年）；ＶａｒｍａおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６０巻、３７２４〜３７３１頁（１９９４年）；Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９巻、１２５〜１３０（２００１年））、基質利用の範囲を決定する（ＥｄｗａｒｄｓおよびＰａｌｓｓｏｎ、前出（２０００年））、増殖のための最少培地を決定する（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８４巻、４５８２〜４５９３頁（２００２年））、適応進化の結果を予測する（Ｉｂａｒｒａら、Ｎａｔｕｒｅ、４２０巻、１８６〜１８９頁（２００２年））、理論的な生成物の収率を計算する（Ｖａｒｍａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．、４２巻、５９〜７３頁（１９９３年））、ノックアウト表現型を予測する（ＥｄｗａｒｄｓおよびＰａｌｓｓｏｎ、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１巻、１頁（２０００年）；Ｓｅｇｒｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９９巻、１５１１２〜１５１１７頁（２００２年）；Ｓｈｌｏｍｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０２巻、７６９５〜７７００頁（２００５年））および異なる生物体の代謝能を比較する（Ｆｏｒｓｔｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１３巻、２４４〜２５３（２００３年））のに有用であることが示された。これらの予測能力に基づいて、モデルを用いて実験室および生産規模の発酵条件下での工業用微生物の代謝挙動を明らかにする。制約ベースアプローチは、株の性能を改善することを目的とした正確に目標を定めた成功を収める遺伝子操作に一般的に適用される程度まで成熟した（Ｂｒｏら、Ｍｅｔａｂ．  Ｅｎｇ．、８巻、１０２〜１１１頁（２００６年）；Ａｌｐｅｒら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３巻、６１２〜６１６頁（２００５年）；Ａｌｐｅｒら、Ｍｅｔａｂ．  Ｅｎｇ．、７巻、１５５〜１６４頁（２００５年）；Ｆｏｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、９１巻、６４３〜６４８頁（２００５年）；Ｐａｒｋら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０４巻、７７９７〜７８０２頁（２００７年））。条件のさらなる最適化を行うために、特性をモニターし続ける。
【０１３７】
生物体のさらなる最適化は、ブタノールなどの所望の生成物の増殖連結型生成を含む、所望の生成物の生成を増大させる遺伝子ノックアウトを決定することによって行うことができる（実施例Ｖ）。Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉは、現在ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の混合物をアセテートおよびエタノールに変換することができるが、Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓは、アセテート、エタノール、ブチレートおよびブタノールの混合物を生成する。Ｒ．ｒｕｂｒｕｍは、アルコールを天然で生成しないが、高レベルのポリ−β−ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を蓄積することが示された。モデリング解析により、生体触媒生物体の代謝をブタノールなどの所望の生成物のより効率のよい生成の方向に移動させる細胞増殖に対する効果の予測が可能である。モデリングはまた、所望の生成経路、例えば、ブタノールの生成により代謝フラックスを推進することを目的とする代謝操作を示す。１つのモデリング方法は、ブタノールなどの所望の生成物の増殖連結型生成を集合的にもたらす遺伝子ノックアウトを選択するために適用される、２層の最適化アプローチであるＯｐｔＫｎｏｃｋ（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．、８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））である。他の全ての増殖選択肢が除去されたため、遺伝子ノックアウト戦略により設計された株は、ネットワーク化学量論により、効率のよい増殖のためにブタノールなどの高レベルの所望の生成物を生成するよう強制される。そのような株は、自己最適化しており、安定である。したがって、それらは、強い増殖選択圧に直面した場合でも生成レベルを典型的には維持または改善し、バッチまたは連続バイオプロセシングに、また進化工学にも適用可能になる。
【０１３８】
いくつかの候補株を設計し、生成条件の最適化を行う。最初のプロセスパラメータを用いる対照発酵と共に、発酵条件を３連で試験する。試験発酵のデータを用いて、プロセスの変更に起因する代謝の変化を評価し、予測と比較するために、シミュレーションを行われ得る。生産性が予想されたものを有意に下回る場合、株を最適化するために、設計過程の第２の反復のためのこの新しい知識を用いてさらなるシミュレーションを行う。
【０１３９】
（実施例ＩＩＩ）
標的生物体の遺伝的ツールの開発
この実施例では、標的生物体の遺伝子操作および設計製作されたツールの開発について記載する。
【０１４０】
合成ガスの利用のための候補株における遺伝系を開発する。特に、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよびＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓの遺伝系を開発する。遺伝的形質転換もＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍにおいて試験する。所望の遺伝エレメントの選択のための可能なマーカーを決定するために、抗生物質耐性を試験する。例えば、多くのクロストリジウム属は、エリスロマイシンおよびクロラムフェニコールに対して感受性である。エレクトロポレーション、コンジュゲーションまたは超音波形質転換を含むが、これらに限定されない、周知の方法を用いてＤＮＡ移入法を開発する。グラム陽性菌のいくつかの発現ベクター、特にＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍに用いるベクターについて追加の試験を行って、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよび／またはＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓにおける所望の遺伝エレメントの発現に対するそれらの有効性を判定する。ベクターのプロモーターを天然Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉまたはＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓのプロモーターで置換することにより、さらなるベクターを開発することができる。さらに、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍおよびＣ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍの自殺プラスミドを含むいくつかの自殺プラスミドを遺伝子操作について試験する。他のクロストリジウム属について開発したアンチセンスＲＮＡ阻害のノックダウン技術も試験する。
【０１４１】
形質転換、発現およびアンチセンスＲＮＡ阻害のツールは、中温性種Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍについて利用可能である。Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍは、セルロース分解のモデル系であり（Ｄｅｓｖａｕｘ、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．、７４１〜７６４頁（２００５年））、一方Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍは、ブタノールなどの溶媒を生成するその能力について広範に特徴付けがなされた（Ｄｕｒｒｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｊ．、２巻、１５２５〜１５３４頁（２００７年））。特に、両種は、エタノールおよび水素を最終生成物として生成することができる。したがって、これらの２つの株から得られる知識は、他のエタノールおよび／または水素生成クロストリジウム属の種について有益なものである。Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍにおける標的突然変異誘発の試験が開始されており、それを他の候補生物体において同様に用いることができる。
【０１４２】
これらの試験の結果は、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよび／またはＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓの遺伝子工学を可能にするだけでなく、発生させた突然変異体の表現型の特徴付けも可能にする。必要に応じてさらなる最適化を行って、方法、プラスミドおよび条件を変化させることにより遺伝系を開発して最適化結果を達成する（Ｌｙｎｄら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．、６６巻、５０６〜５７７頁（２００２年））。
【０１４３】
さらに詳細には、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよびＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓの抗生物質耐性能のプロファイリングを行う。遺伝系の開発における重要な段階は、標的株の天然の抗生物質耐性特性を決定することである。エリスロマイシンおよびクロラムフェニコールは、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍおよびＣ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍにおけるプラスミド上で機能的であることが示された耐性マーカーを有する２つの抗生物質である（ＫａｓｈｋｅｔおよびＣａｏ、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５９巻、４１９８〜４２０２頁（１９９３年）；ＧｒｅｅｎおよびＢｅｎｎｅｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、５８巻、２１５〜２２１頁（１９９８年））。しかし、それらは、その代わりにしばしばアンピシリン、ゲンタマイシン、リファンピシン、カナマイシンおよびテトラサイクリンの抗生物質マーカーを含む一般的な自殺プラスミドでは通常利用可能でない。抗生物質感受性を判定するために、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよびＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓを嫌気性チャンバー内の規定培地中で増殖させる（ＡｈｍｅｄおよびＬｅｗｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、９７巻、１０８０〜１０８６頁（２００７年）；Ｙｏｕｎｅｓｉら、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．、２００７年６月１８日）。上で示したような一般的抗生物質を１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの勾配の濃度で加える。Ｔｙｐｅ  ＦＰ−１１００−Ｃ  Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ  Ｃ装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ；Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）などの機器を用いて増殖温度を３７℃に制御し、種々の間隔で細胞増殖の光学濃度を自動的に測定する。平均値および標準偏差を計算することができるように、生理学的試験の全てを反復して、例えば、３連で行う。この増殖データは、供試抗生物質に対するＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよびＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓの感受性を示す。当該株の増殖を阻害する抗生物質をさらなる試験に用いる。
【０１４４】
さらに詳細には、単純かつ効率のよいＤＮＡ送達方法を遺伝子工学に提供するために、ＤＮＡ移入方法および遺伝子発現システムを開発する。細菌ＤＮＡ移入の方法は、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、化学的形質転換、形質導入および超音波形質転換を含む。それらのうち、エレクトロポレーションおよびコンジュゲーションは、いくつかのクロストリジウム属の種において以前に確立された（Ｊｅｎｎｅｒｔら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１４６巻、３０７１〜３０８０頁（２０００年）；Ｔａｒｄｉｆら、Ｊ．  Ｉｎｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２７巻、２７１〜２７４頁（２００１年）；Ｔｙｕｒｉｎら、Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、８８巻、２２０〜２２７頁（２０００年）；Ｔｙｕｒｉｎら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７０巻、８８３〜８９０頁（２００４年））。超音波形質転換は、グラム陰性菌に対して高い形質転換効率（＞１０６ＣＦＵ／μｇＤＮＡ）を与え（Ｓｏｎｇら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３５巻、ｅ１２９頁（２００７年）、グラム陽性菌において試験することができる使いやすい効率的な方法である。
【０１４５】
エレクトロポレーション、超音波形質転換およびコンジュゲーションをＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよびＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ形質転換効率について試験する。種々のレプリコン、例えば、ｐＩＰ４０４、ｐＡＭβ１およびｐＩＭ１３を有するグラム陽性菌の種々のプラスミドを試験する。必要な場合、サブクローニングを用いて、既存のプラスミドの抗生物質耐性カセットを抗生物質耐性試験に基づく適切なもので置換する。制限酵素消化、Ｔ４リガーゼによる連結反応およびＥ．ｃｏｌｉ形質転換を含む、標準的分子サブクローニング技術をプラスミドの工学的作製に用いる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年））。多くの他のクロストリジウム属の種について必要な場合、宿主細菌による分解から保護するためにＤＮＡ送達の前に、これらのプラスミドをメチル化する。エレクトロポレーションおよびコンジュゲーションについては、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍおよびＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの既存のプロトコールを最初に試験する。エレクトロポレーション設定、回復時間ならびにエレクトロポレーションバッファー中のＣａ２＋およびＭｇ２＋の濃度などのパラメータを変化させて、形質転換効率を最適化する。超音波形質転換については、実験は、以前に記載されたように（Ｓｏｎｇら、前出、２００７年）、低周波数超音波、例えば、４０ｋＨｚおよび延長された回復時間の条件下で行う。
【０１４６】
効率的なＤＮＡ移入プロトコールが特定のプラスミドについて確立されたならば、プラスミドを設計製作して天然Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉまたはＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓプロモーターを組み込み、続いて、複数のクローニング部位を組み込んで、発現ベクターを作製する。ｐＳＯＳ９５およびｐＩＭＰ１などのＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの既存の発現ベクターがプロモーターの変化なしにＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉまたはＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓにおいて機能することができる可能性があると予想され、したがって、これらのプラスミドを最初の試験に用いる。
【０１４７】
遺伝子破壊方法を開発するために、ｐＫＮＯＣＫ、ｐＤＳ３．０、ｐＳＰＵＣおよびｐＢｌｕｃｓｃｒｉｐｔ  ＳＫＩＩなどのいくつかの自殺プラスミドを、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよび／またはＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓの自殺プラスミドとしての適合性についてスクリーニングする。上述のように、結果は、既存の抗生物質耐性カセットが用いられるか、または適切な抗生物質耐性カセットで置換されるかである。選択される標的遺伝子のＤＮＡ断片を適切な自殺プラスミドにサブクローニングする。最初の標的として選択される遺伝子は、エタノール生成に関与するアルコールデヒドロゲナーゼをコードするものである。これらの遺伝子は、副産物の生成をもたらし、ブタノール生成株の破壊の標的として特定される可能性があり、発酵ブロス中のエタノールを分析することによって容易なスクリーニングが可能になるため、選択した。Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓにおけるアルコールデヒドロゲナーゼの欠失が、これらの酵素の広い基質特異性のため、エタノールの生成を低下させることに加えて、ブタノールの生成を低下させるならば、エタノールの生成と比べてブタノールの生成に有利であるＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのａｄｈＥ２のようなアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｔｓｕｉｍｉら、Ｍｅｔａｂ．  Ｅｎｇ．、２００７年９月１４日）は、他のブタノール経路遺伝子と共にクローニングしてブタノール経路を構築することができる。
【０１４８】
設計製作した自殺プラスミドをメチル化し、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよびＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ内に移入させる。適切な抗生物質を含む固形培地上でコロニーを選択する。ＰＣＲ増幅ならびにその後の破壊ゲノム領域の配列決定、サザンブロットおよび生理学的試験を用いて、ゲノムにおける標的遺伝子の正確な破壊を確認する。遺伝子破壊の代替として、発現システムを用いて、その遺伝子発現を抑制するが、完全には根絶しない標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡを発現させることもできる。したがって、アンチセンスＲＮＡシステムは、所望の遺伝子の遺伝子ノックダウンの簡便なアプローチとしての機能を果たす。
【０１４９】
（実施例ＩＶ）
Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍの遺伝的評価
この実施例では、合成ガスの利用のための生物体としてのＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍの遺伝的ツールの開発について記載する。
【０１５０】
Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍは、嫌気的条件下でＣＯを酸化するグラム陰性の紅色非硫黄細菌である（Ｋｅｒｂｙら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７７巻、２２４１〜２２４４頁（１９９５年）；Ｋｅｒｂｙら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７４巻、５２８４〜５２９４頁（１９９２年））。Ｒ．ｒｕｂｒｕｍは、水素の生成と連結する、ＣＯの酸化を触媒するＮｉ−Ｆｅ−Ｓ  ＣＯデヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ）を有する（ＥｎｓｉｇｎおよびＬｕｄｄｅｎ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、１９９１、２６６巻、１８３９５〜１８４０３頁（１９９１年））。そのＣＯ酸化能およびＣＯ２を固定する能力を考慮すると、Ｒ．ｒｕｂｒｕｍは、暗所において合成ガスで効率のよい増殖をすることができる（Ｄｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、９７巻、２７９〜２８６頁（２００７年））。さらに、合成ガスで増殖中に総細胞炭素の最大３４％が、主としてβ−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）からなるポリβ−ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の形で貯蔵されることが示された。細胞炭素が還元４炭素化合物を形成することを効率的に誘導する能力がＲ．ｒｕｂｒｕｍにあるため、それが１−ブタノールなどの所望の生成物の工学的生産のための魅力的なプラットホームになる。さらに、遺伝系がＲ．ｒｕｂｒｕｍについて確立され、広い宿主範囲のＲＫ２誘導体を含む広範囲のクローニングベクターが利用可能である（Ｓａｅｇｅｓｓｅｒら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．、９５巻、７〜１２頁（１９９２年））。Ｒ．ｒｕｂｒｕｍを利用する他の魅力的な態様は、ＰＨＢおよび１−ブタノール合成をもたらす経路におけるかなりの重複が存在することである（図５）。ＰＨＢの合成は生分解性プラスチックとしてのその使用について研究されたので、ＰＨＢ経路の制御および過剰発現に関するかなりの情報が入手可能である（ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＤａｗｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．、５４巻、４５０〜４７２頁（１９９０年））。上述のようにクロストリジウム属の株を操作するために必要な遺伝的ツールを確立することと並行して、１−ブタノール合成経路を形成するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のいくつかの遺伝子からなる合成オペロンも同様に開発する。
【０１５１】
Ｒ．ｒｕｂｒｕｍは、配列が決定され、扱いやすい遺伝系を有する（Ｓａｅｇｅｓｓｅｒら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．、９５巻、７〜１２頁（１９９２年））ので、選択される遺伝子座における標的欠失を作ることができると予想される。マーカーレス欠失を発生させることを可能にする、広い宿主範囲の部位特異的遺伝子切除システムが利用可能である（Ｈｏａｎｇら、Ｇｅｎｅ、２１２巻、７７〜８６頁（１９９８年））。したがって、複数の抗生物質選択に依拠することなく、単一の株における複数のノックアウトを発生させることは可能であろう。この方法は、ＰＨＢ合成における最後の段階である、ＰＨＢシンターゼ遺伝子の欠失を引き起こすことによって試験することができる（Ｈｕｓｔｅｄｅら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．、７２巻、２８５〜２９０頁（１９９２年））。ＰＨＢ合成が４炭素前駆体および還元当量の提案されるブタノール経路と競合する可能性がある（図５）ため、これを選択する。３０重量％以上のＰＨＢを蓄積することも公知であるグラム陰性細菌であるＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓにおける同等の遺伝子の欠失に成功し、増殖に対する有害な影響がないことが報告された（ＫｏｒｏｔｋｏｖａおよびＬｉｄｓｔｒｏｍ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８３巻、１０３８〜１０４６頁（２００１年））。
【０１５２】
（実施例Ｖ）
合成ガスからのブタノールの生成のための微生物の設計製作
この実施例では、合成ガスからのブタノール構成物の生成のための微生物の設計製作について記載する。
【０１５３】
最初の試験において、クロストリジウム属の株、特に、Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓを用いて、ブタノールの生成のためおよびブタノールに対する耐性を得るための合成ガスの利用について設計製作する。Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓは、合成ガスからブタノールを生成することが示された（Ｌｉｏｕら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｅｖｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５５巻（Ｐｔ５）、２０８５〜２０９１頁（２００５年））。Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓを設計製作して、合成ガスの利用効率を増加させ、例示的な所望の生成物としての合成ガスからのブタノールの生成の効率を増加させ、所望の生成物のより高い収率を得ることができるように生成物耐性を増大させる。
【０１５４】
予備的代謝ネットワーク解析により、リグノセルロース由来合成ガスのブタノールへの理論的変換は、糖発酵と比較して有利であることが明らかになった。
【０１５５】
合成ガスからブタノールへ：
１２ＣＯ＋５Ｈ２Ｏ→８ＡＴＰ＋８ＣＯ２＋１Ｃ４Ｈ１０Ｏ
４ＣＯ＋８Ｈ２→４ＡＴＰ＋３Ｈ２Ｏ＋１Ｃ４Ｈ１０Ｏ
４ＣＯ２＋１２Ｈ２→２ＡＴＰ＋７Ｈ２Ｏ＋１Ｃ４Ｈ１０Ｏ
糖からブタノールへ：
１Ｃ６Ｈ１２Ｏ６→２ＡＴＰ＋２ＣＯ２＋１Ｈ２Ｏ＋Ｃ４Ｈ１０Ｏ
１．２Ｃ５Ｈ１０Ｏ５→１．７ＡＴＰ＋２ＣＯ２＋１Ｈ２Ｏ＋Ｃ４Ｈ１０Ｏ
バイオマスのガス化では最適には１：１のＣＯ対Ｈ２の比が得られことを考慮すると、１モルのブタノールの生成には１２モルのＣＯ＋Ｈ２が必要である。重要なことに、合成ガスのブタノールへの発酵による変換は、エネルギー発生活動であり、したがって、生成物の高い収率で細胞増殖を支持する。さらに、最初の計算で、基質の費用は、必要とする等価量の糖より安価であることが明らかになっている。
【０１５６】
上述のように、モデルおよび遺伝的ツールを用いて、細胞増殖の必須の産物としてのブタノールまたは他の所望の生成物の生成を促進する株を設計する。言い換えれば、ブタノールがＣＯでの増殖する間の必要な電子の吸い込み口（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｓｉｎｋ）であるように、細胞を設計製作する。遺伝子ノックアウトと適切な酵素の過剰発現の組合せを有することができ、生成の改善および増殖条件からの耐性のために進化させることができる株を構築する。
【０１５７】
ブタノールを生成するクロストリジウム属の株の構築のために、上述のようなゲノム解析を用いて、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよびＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓにおけるブタノール生成を確立し、かつ／または改善するために必要な生物学的経路を同定する。ブタノール生成のさらなる改善は、合成ガス利用経路および／またはブタノール生成経路タンパク質および酵素の発現を増大させることによって達成することができる。標的生物学的経路における遺伝子を発現させるために、上述のように開発した遺伝子発現ベクターを用いる。複数の遺伝子が存在する場合、遺伝子をＰＣＲ増幅し、合成オペロンとして発現ベクターにクローニングする。得られた発現プラスミドをＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよびＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ内に移入させる。ノーザンブロットおよび／またはリアルタイムＰＣＲ、あるいは他の適切な技術を用いて、転写レベルでの遺伝子発現を試験する。
【０１５８】
ブタノールの生成を改善するために、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよびＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓの内因性遺伝子を不活性化してレドックス電位を別の経路によりブタノール生成の方向に移動させることはあり得ることである。このために、標的遺伝子の内部ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、自殺プラスミド内にクローニングする。次いで、該プラスミドをＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよびＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ内に移入させ、単一交差組換えにより標的遺伝子の破壊をもたらす。正しい破壊は、破壊された遺伝子座から増幅させたＰＣＲ産物の配列決定および／またはサザンブロットにより、あるいは他の適切な分析技術を用いて確認する。複数の標的遺伝子が存在する場合、複数の遺伝子ノックアウトを単一株において発生させることができるように、自殺プラスミドを設計製作して抗生物質マーカーを変化させる。最大３〜６つまでの遺伝子欠失がブタノール生成を最適化するうえで有用であり得ると予想される。
【０１５９】
ブタノール生成のためのＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍの遺伝子工学では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍにおけるブタノール合成経路を形成するいくつかの遺伝子からなる合成オペロンを開発する。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるブタノール生成を可能にする同様なアプローチが最近報告され、グラム陰性生物体における経路の異種発現が可能であることが立証された（Ａｔｓｕｍｉら、Ｍｅｔａｂ．  Ｅｎｇ．、２００７年９月１４日））。Ｒ．ｒｕｂｒｕｍにおけるブタノール生成に必要な遺伝子を広い宿主範囲発現ベクター上で発現させることができる。発現は、ｔａｃプロモーターなどの誘導プロモーターを用いて制御することができる。合成４遺伝子オペロンは、融合ＰＣＲ技術を用いて構築し、クロトナーゼ、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、電子伝達フラビンタンパク質の遺伝子、ならびにアルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ活性を含む。融合／アセンブリーＰＣＲ技術を用いて異種宿主における発現のための合成オペロンが構築された（Ｃｒａｎｅｙら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３５巻、ｅ４６頁（２００７年）；Ｈｉｌｌら、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．、２２６巻、４１〜４８頁（１９９１年））。ブタノールオペロンを野生型およびＰＨＢ合成欠失Ｒ．ｒｕｂｒｕｍ株内に形質転換し、下で述べるように試験する。複数の遺伝子をモデリング試験に基づく除去のために標的にすることが望ましいという可能性もある。これらの欠失は、上述のようにマーカーレス法を用いて実現することができる。
【０１６０】
中間株は構築されているので、それらを生理学的に試験して、ブタノール生成に向けての進行、ならびに確実な増殖および副産物の生成の減少を持続する能力を評価する。増殖およびブタノール生成の初期のスクリーニングは、最初に１ｍＬマイクロリアクター（ＭｉｃｒｏＲｅａｃｔｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ；  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡなど）中で行う。２４ウエルプレートのような構造は、ｐＨ、温度およびガス組成について制御することができる。次の段階として、血清容器を温度およびガス組成制御インキュベーター中で激しく振とうする。これは、ガスヘッドスペースならびに液相のサンプリングと分析を可能にする。ブタノール、エタノールおよび有機酸などの生成物は、常用の手順を用いてガスクロマトグラフィー（ＧＣ／ＭＳ）またはＨＰＬＣにより分析することができる。ヘッドスペース中のＨ２、ＣＯおよびＣＯ２は、以前に記載されたように（ＮａｊａｆｐｏｕｒおよびＹｏｕｎｅｓｉ、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．、３８巻、２２３〜２２８頁（２００６年））、熱伝導度型検出器（ＴＣＤ）検出によるＧＣにより１５％Ａｒを内部標準として用いて分析する。これらの実験において、Ｈ２とＣＯとの１／１の比を有する合成による合成ガスを用いる。ガス組成の影響は、発酵の最適化の間に探究する。
【０１６１】
最初に、１つまたは複数の欠失を有する株を分析し、増殖および発酵プロファイルを野生型細胞に対して比較する。複数の欠失を有する株の増殖は、ブタノール経路の発現の増大がない場合には不十分である可能性がある。１つまたは複数のブタノール経路遺伝子あるいは代謝モデリングにより特定された他の標的を発現する株を野生型宿主において試験して、ブタノール経路を経るフラックスを増大させる能力を評価し、どの段階が障害となっている可能性があるかの予備的評価を行う。合成オペロン構築物を最適化するために、異なる遺伝子順序、ならびに可能な場合、別のプロモーターおよびリボソーム部位を試験する。最も肯定的な結果をもたらす（１つまたは複数の）構築物を所定の遺伝子欠失を含む宿主内に形質転換し、上述のように試験する。結果をモデル予測と比較して、予見できなかった制約および代謝障害が存在する可能性がある箇所を評価する。
【０１６２】
遺伝子工学操作を行った後に、適応進化を用いて、所望の株における生成を最適化する。ブタノールの生成を増殖に連結させる株設計に基づいて、改善された増殖速度および／または収率を有する細胞に有利であり、より高いブタノールの収率をもたらす選択圧をかける。したがって、増殖および生成特性を改善するために適応進化を行わせる（ＦｏｎｇおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．、３６巻、１０５６〜１０５８頁（２００４年）；Ａｌｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１４巻、１５６５〜１５６８頁（２００６年））。結果に基づいて、後のラウンドのモデリングおよび遺伝子工学を用いて生成をさらに最適化することができる。進化工学段階は、定常期が達成される前のバッチ培養物の新鮮培地中への連続継代によって長期の指数増殖に細胞を自動的に維持する装置中で行うことができる。具体的には、特定の細胞密度に達したとき、指数関数的に増殖しつつある細胞を含む培地の一部を１つの領域から、新鮮な培地を希釈のために加えながら隣接する領域に送る。光学濃度測定および液体処理を自動化することにより、連続移動を高速度で行い、それにより、細胞適合性の進化のためのケモスタットの効率に近づけることができる（Ｄｙｋｈｕｉｚｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２２４巻、６１３〜６３１頁（１９９３年））。しかし、単一容器中で細胞を維持するケモスタットと異なり、この方法は、壁増殖（ｗａｌｌ−ｇｒｏｗｔｈ）に順応した細胞の有害な選択の可能性がない（ＣｈａｏおよびＲａｍｓｄｅｌｌ、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３１巻、１２２９〜１２３６頁（１９８５年）；Ｌｙｎｃｈら、Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、４巻、８７〜９３頁（２００７年））。さらに、この方法は、クロストリジウム属の増殖の要件である厳密な嫌気的条件を確実にする閉鎖系で細胞を維持することを可能にする。
【０１６３】
適応進化が果たし得るさらなる役割は、ブタノールならびにＮＯｘおよびタールなどの不純物に対する耐性がより大きい株を開発することである。ブタノール耐性レベルは、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよびＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓについて公表されておらず、これは、耐性レベルを確定するために野生型細胞について測定する。野生型Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍは、約１８０ｍＭ（１．２重量／容積％）の耐性を有すると報告され（Ｔｏｍａｓら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６９巻、４９５１〜４９６５頁（２００３年））、２．１％と高い耐性レベルを達成するように設計製作された（Ｅｚｅｊｉら、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｃ．、４巻、３０５〜３１４頁（２００４年））。クロストリジウム属のブタノール耐性能を改善するための２つのアプローチが現在優勢である。１つは、脂質含量の合理的な遺伝的改変により、あるいは連続富化（Ｓｏｕｃａｉｌｌｅら、Ｃｕｒｒ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１４巻、２９５〜２９９頁（１９８７年））またはランダム突然変異誘発（Ｊａｉｎら、米国特許第５，１９２，６７３号１９９３））などの進化法により、膜の脂質組成および流動性を変化させることを含む。しかし、耐性は、複数の因子の複雑な関数であり、定方向の改変のみによっては達成することは困難である。さらに、細胞は、高濃度のブタノールで溶解すると報告されている（Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｗｅｓｔｈｕｉｚｅｎら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４４巻、１２７７〜１２８１頁（１９８２年））。したがって、株の最適化は、遺伝学、進化および代謝モデリングの組み合わせに基づく。クロストリジウム属におけるブタノール耐性をこの方法により改善することができることを示すために、連続的に増加しつつある濃度のブタノールの存在下で野生型株を適応により進化させることができる。１つの目標は、例えば、２５ｇ／Ｌと高い濃度のブタノールに対する耐性を得るために細胞を進化させることによって細胞を最適化することである。同様な方法を実施することができ、同様な方法を用いて、例えば、ＮＯおよびタールが優勢である芳香族化合物を用いて合成ガス不純物に対する株の耐性を評価することができる。生成および／または不純物耐性の最適化のための適応進化は、連続的または同時に行わせることができる。このアプローチは、商業規模生成に適する耐性レベルを最適化するために、ブタノール耐性および膜流動性に関連する遺伝子の定方向突然変異と統合することもできる。
【０１６４】
例示的な合成ガスからブタノールへの方法を図４に示す。図４にブタノールを生成するための合成ガスを利用する方法のブロック流れ図を示す。
【０１６５】
（実施例ＶＩ）
合成ガス発酵プロセスの開発および最適化
この実施例では、合成ガス発酵プロセスの開発および最適化について記載する。商業規模生成における目標収率を実証し、最適化するために、標準の合成ガスを用いた実験室規模の合成ガス発酵を行う。
【０１６６】
合成ガス発酵で重要なプロセスの考慮事項は、高いバイオマス濃度および良好なガス−液物質移動である（Ｂｒｅｄｗｅｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．、１５巻、８３４〜８４４頁（１９９９年））。水中のＣＯの溶解度は、酸素の溶解度よりいくぶん低い。連続ガススパージ発酵は、制御された発酵槽中で質量分析による常時のオフガス分析ならびに定期的な液体サンプリングとＧＣおよびＨＰＬＣによる分析により行うことができる。液相は、バッチモードで機能し得る。ブタノールおよび副産物の生成を時間の関数として測定する。最終の工業的プロセスは連続的な液体の流れがある可能性があるが、特徴付けおよび最適化の初期の段階における生理学的特性を試験するためにバッチ操作を用いることができる。これらのシステムにおける全ての配管は、嫌気的条件を維持するためにガラスまたは金属である。ガスのスパージは、気泡径を減少させ、物質移動を改善するためにガラスフリットを用いて行う。約０．１〜１ｖｖｍ（１分当たりの蒸気容積）の範囲の種々のスパージ速度を試験する。ガスの取込み速度の正確な測定値を得るために、ガスの流れを一時的に止める定期的なチャレンジを行い、ガス相の組成を時間の関数としてモニターする。
【０１６７】
合成ガス利用に固有の発酵システムも開発する。設計は設計製作した生物体を用いて試験するが、発酵システムの試験は、最初に野生型生物体を用いて株の開発と並行して行うことができる。総括的な目標生産性を達成するために、細胞保持またはリサイクルの方法を用いる。連続して操作されるそのようなシステムに関する通常の問題は、細胞が非生産性表現型に進化する可能性があることである。生物体は所望の生成物の増殖連結型生成のために設計されているので、生物体は遺伝的に安定である。微生物の生物体の濃度を増加させる１つの方法は、タンジェンシャルフロー膜を介して側留から細胞をリサイクルすることである。Ｍｏｏｒｅｌｌａによるアセテートの生成について以前に記載されたように（Ｓａｋａｉ  Ｓ．、Ｙ．  Ｎａｋａｓｈｉｍａｄａ、Ｋ．  Ｉｎｏｋｕｍａ、Ｍ．  Ｋｉｔａ、ＩＩ．  ＯｋａｄａおよびＮ．  Ｎｉｓｈｉｏ、Ａｃｅｔａｔｅ  ａｎｄ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｈ２  ａｎｄ  ＣＯ２  ｂｙ  Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、９９巻、２５２〜２５８頁（２００５年））、反復バッチ式培養も用いることができる。他の種々の方法も用いることができる（Ｂｒｅｄｗｅｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．、１５巻、８３４〜８４４頁（１９９９年）；Ｄａｔａｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、８６巻、５８７〜５９４頁（２００４年））。物質移動を改善するために、１．５気圧の超過圧力などのさらなる最適化も試験することができる（ＮａｊａｆｐｏｕｒおよびＹｏｕｎｅｓｉ、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．、３８巻、２２３〜２２８頁（２００６年））。
【０１６８】
フィードとして純粋なＨ２／ＣＯを用いて満足のいく成績が達成されたならば、商用合成ガス中に存在する可能性が高い阻害物質を含む合成ガス混合物を生成させる。例えば、典型的な不純物プロファイルは、４．５％ＣＨ４、０．１％Ｃ２Ｈ２、０．３５％Ｃ２Ｈ６、１．４％Ｃ２Ｈ４および１５０ｐｐｍの一酸化窒素である（Ｄａｔａｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、８６巻、５８７〜５９４頁（２００４年））。ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、ｐ−キシレン、ｏ−キシレンおよびナフタレンなどの化合物に代表されるタールは、生成に対する影響の有無を試験するためにｐｐｍレベルで加える。例えば、４０ｐｐｍのＮＯはＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓに対して阻害性であることが示されている（ＡｈｍｅｄおよびＬｅｗｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  、９７巻、１０８０〜１０８６頁（２００７年））。培養物は、発酵槽に移す前に振とうフラスコ培養物中で試験する。また、異なるレベルの潜在的阻害性化合物を試験して、それらが細胞増殖に及ぼす影響を定量化する。この知識を用いて、スケールアップ試験および生産のために用いられる合成ガス純度に関する仕様を策定する。特定の成分がスケールアップに用いる合成ガスから減少または除去することが困難であることがわかった場合、１つまたは複数の不純物に耐えるように細胞を適応させるために、上述のような適応進化法を利用することができる。
【０１６９】
（実施例ＶＩＩ）
合成ガス利用微生物を発生させるための最小限の遺伝子セット
この実施例では、特に所望の生成物を生成するために合成ガスを天然では利用しない微生物における、合成ガス利用微生物の発生のための最小限の遺伝子／タンパク質セットの決定について記載する。
【０１７０】
一般的に、微生物はテトラヒドロ葉酸（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｒａｔｅ）を生成する能力を有し、メチルテトラヒドロ葉酸（Ｍｅ−ＴＨＦ）が生合成における、例えば、メチオニン生成における一般的な中間体である。したがって、上で概説し、図１に示すメチル分岐は、合成ガスを利用する生物体の特有な特徴ではない。しかし、Ｍｅ−ＴＨＦを生成するために必要な酵素は、合成ガスを利用しない生物体と比較して合成ガスを利用する生物体においてはるかに活性が高いことが見出された。実際、アセテート生成菌のテトラヒドロ葉酸依存性酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび真核生物などの他の供給源からのものより５０〜１００倍高い比活性を有する（Ｍｏｒｔｏｎら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍ．  Ｓｅｂａｌｄ編、２８章、３８９〜４０６頁、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９３年））。合成ガスを利用することができる生物体を設計するための遺伝子／タンパク質セットを規定するより適当かつ特有な方法は、経路のカルボニル分岐を用いることである（図２を参照）。この分岐は、次の６種のタンパク質の遺伝子を含む：コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ）、アセチルＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）、アセチルＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼおよびＣＯ耐性ヒドロゲナーゼ。したがって、これらの６種の遺伝子／タンパク質は、アセチルＣｏＡを生成することができる合成ガス利用経路を付与するための１つまたは複数のタンパク質セットである。
【０１７１】
（実施例ＶＩＩＩ）
合成ガス利用微生物を発生させるための遺伝子セット
この実施例では、合成ガス利用微生物を発生させるための例示的な遺伝子セットについて記載する。
【０１７２】
ギ酸デヒドロゲナーゼ。ギ酸デヒドロゲナーゼは、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａにおけるホルメートへのＣＯ２の組込みを触媒する２サブユニットのセレノシステイン含有タンパク質である（ＡｎｄｒｅｅｓｅｎおよびＬｊｕｎｇｄａｈｌ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１１６巻、８６７〜８７３頁（１９７３年）；Ｌｉら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、９２巻、４０５〜４１２頁（１９６６年）；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２５８巻、１８２６〜１８３２頁（１９８３年））。遺伝子座、Ｍｏｔｈ＿２３１２およびＭｏｔｈ＿２３１３は、ギ酸デヒドロゲナーゼのαサブユニットをコードすることに関与する実際は１つの遺伝子であるが、βサブユニットは、Ｍｏｔｈ＿２３１４によってコードされる（Ｐｉｅｒｃｅら、Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００８年））。ＣＯ２還元の傾向を有するギ酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする遺伝子の別のセットは、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ  ｆｕｍａｒｏｘｉｄａｎｓにおけるＳｆｕｍ＿２７０３〜Ｓｆｕｍ＿２７０６によってコードされる（ｄｅ  Ｂｏｋら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０巻、２４７６〜２４８５頁（２００３年）；Ｒｅｄａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０５巻、１０６５４〜１０６５８頁（２００８年））。それらのＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａカウンターパートと同様に、Ｓｆｕｍ＿２７０５およびＳｆｕｍ＿２７０６は、実際は１つの遺伝子である。同じ機能を果たすと推測される遺伝子の同様なセットは、Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓにおけるＣＨＹ＿０７３１、ＣＨＹ＿０７３２およびＣＨＹ＿０７３３によってコードされる（Ｗｕら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．、１巻、ｅ６５頁（２００５年））。
【０１７３】
【数１】
2019103519.tif 000004
ホルミルテトラヒドロ葉酸シンターゼ。ホルミルテトラヒドロ葉酸シンターゼは、１つのＡＴＰを消費してホルメートをテトラヒドロ葉酸に連結させる。この反応は、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａにおけるＭｏｔｈ＿０１０９（Ｌｏｖｅｌｌら、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１４９巻、２８０〜２８５頁（１９８８年）；Ｌｏｖｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻、５６８７〜５６９４頁（１９９０年）；Ｏ’ｂｒｉｅｎら、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ．  Ｓｕｐｐｌ．、２６巻、２４９〜２６２頁（１９７６年））、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｉｄｕｒｉｃｉにおけるＦＨＳ（ＷｈｉｔｅｈｅａｄおよびＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６７巻、２０５〜２０９頁（１９８６年）；ＷｈｉｔｅｈｅａｄおよびＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７０巻、３２５５〜３２６１頁（１９８８年））ならびにＣ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓにおけるＣＨＹ＿２３８５（Ｗｕら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．、１巻、ｅ６５頁（２００５年））の遺伝子産物によって触媒される。
【０１７４】
【数２】
2019103519.tif 000005
メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓにおいて、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼがそれぞれＭｏｔｈ＿１５１６、ｆｏｌＤおよびＣＨＹ＿１８７８の二元機能遺伝子産物によって遂行される（Ｄ’ＡｒｉおよびＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６６巻、２３９５３〜２３９５８頁（１９９１年）；Ｐｉｅｒｃｅら、Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００８年）；（Ｗｕら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．、１巻、ｅ６５頁（２００５年））。
【０１７５】
【数３】
2019103519.tif 000006
メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ。Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のメチル分岐の最終段階は、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼによって触媒される。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａにおいて、この酵素は、酸素感受性であり、鉄−硫黄クラスターを含む（ＣｌａｒｋおよびＬｊｕｎｇｄａｈｌ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２５９巻、１０８４５〜１０８４９頁（１９８４年））。この酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｍｅｔＦ（Ｓｈｅｐｐａｒｄら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８１巻、７１８〜７２５頁（１９９９年））およびＣ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓにおけるＣＨＹ＿１２３３によってコードされる（Ｗｕら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．、１巻、ｅ６５頁（２００５年））。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ遺伝子およびそのＣ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓカウンターパートは、推定上のヒドロゲナーゼ遺伝子およびヘテロジスルフィドレダクターゼ遺伝子によって隔てられているＣＯＤＨ／ＡＣＳ遺伝子クラスターの近くに位置する。
【０１７６】
【数４】
2019103519.tif 000007
アセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡＣＳ／ＣＯＤＨ）および関連タンパク質。
【０１７７】
ＡＣＳ／ＣＯＤＨは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のカルボニル分岐の中心酵素である。これは、二酸化炭素の一酸化炭素への可逆的還元を、また一酸化炭素、補酵素Ａ、およびメチル化コリノイド−鉄−硫黄タンパク質のメチル基からのアセチルＣｏＡの合成も触媒する。このコリノイド−鉄−硫黄タンパク質は、メチルトランスフェラーゼを介してメチルテトラヒドロ葉酸によってメチル化される。外来宿主におけるＡＣＳ／ＣＯＤＨの発現は、全てではないとしても、多くの以下のタンパク質およびそれらの対応する活性を導入することを含む。
【０１７８】
メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）
コリノイド−鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）
ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質（ＡｃｓＦ）
フェレドキシン（Ｏｒｆ７）
アセチルＣｏＡシンターゼ（ＡｃｓＢおよびＡｃｓＣ）
一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）
ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質（ＣｏｏＣ）
一酸化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチルＣｏＡシンターゼ活性に必要な遺伝子は、延長オペロンであり得る天然ゲノムの限られた領域に典型的には存在する（Ｍｏｒｔｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６６巻、２３８２４〜２３８２８頁（１９９１年）；Ｒａｇｓｄａｌｅ、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３９巻、１６５〜１９５頁（２００４年）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻、３２〜３６頁（１９８９年））。アセテート生成菌Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのこのオペロンにおける遺伝子はそれぞれ既にクローニングされ、Ｅ．ｃｏｌｉ中で活発に発現した（Ｌｕら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６８巻、５６０５〜５６１４頁（１９９３年）；Ｍｏｒｔｏｎら、前出、１９９１年；Ｒｏｂｅｒｔｓら、前出、１９８９年）。これらの遺伝子のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により特定することができる。
【０１７９】
【数５】
2019103519.tif 000008
水素生成細菌Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓは、アセチルＣｏＡシンターゼによる増殖基質として一酸化炭素を利用することができる（Ｗｕら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．、１巻、ｅ６５頁（２００５年））。株Ｚ−２９０１において、アセチルＣｏＡシンターゼ酵素複合体は、フレームシフト突然変異のため一酸化炭素デヒドロゲナーゼを欠いている（Ｗｕら、前出、２００５年）が、株ＤＳＭ６００８においては、このタンパク質の機能的な非フレームシフト完全長型が精製された（Ｓｖｅｔｌｉｔｃｈｎｙｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０１巻、４４６〜４５１頁（２００４年））。株Ｚ−２９０１のＣ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ遺伝子のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により特定することができる。Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ  ＤＳＭ６００８の配列は、公的に利用可能なデータベースにおいて現在アクセス可能ではないが、配列が利用可能になると容易に決定することができる。
【０１８０】
【数６】
2019103519.tif 000009
メタン生成古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓは、一酸化炭素で増殖することもでき、アセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼ活性を示し、アセテートおよびホルメートの両方を生成する（Ｌｅｓｓｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０３巻、１７９２１〜１７９２６頁（２００６年））。この生物体は、ＡＣＳ／ＣＯＤＨ活性をコードする２セットの遺伝子を含む（ＲｏｔｈｅｒおよびＭｅｔｃａｌｆ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０１巻、１６９２９〜１６９３４頁（２００４年））。Ｍ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ遺伝子の両セットのタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により特定することができる。
【０１８１】
【数７】
2019103519.tif 000010
ＡｃｓＣ、ＡｃｓＤ、ＡｃｓＢ、ＡｃｓＥｐｓおよびＡｃｓＡのタンパク質は、メタン生成ＣＯＤＨ／ＡＣＳのガンマ、デルタ、ベータ、イプシロンおよびアルファサブユニットと一般的に呼ばれている。イプシロンをコードする遺伝子のホモログは、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａなどのアセテート生成菌またはＣ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓなどの水素生成細菌において存在しない。Ｍ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓにおける２つの活性ＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロンの存在に関する仮説は、カルボキシドトロフィック（ｃａｒｂｏｘｉｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）もしくはアセチクラスチック（ａｃｅｔｉｃｌａｓｔｉｃ）増殖に有利な触媒特性（すなわち、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、ｋｃａｔ）、または種々の刺激がＣＯＤＨ／ＡＣＳ発現を誘導することを可能にする差次的遺伝子制御を含む（Ｒｏｔｈｅｒら、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１８８巻、４６３〜４７２頁（２００７年））。
【０１８２】
Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａおよびＣ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓの両方において、ＣＯＤＨをコードするさらなる遺伝子が、ＡＣＳ／ＣＯＤＨオペロンの外側に位置する。これらの酵素は、一酸化炭素の二酸化炭素への変換から電子または還元当量を抽出する能力をもたらす。次いで還元当量は、酸化フェレドキシン、ＮＡＤＰ＋、水または過酸化水素などの受容体に渡されて、それぞれ還元フェレドキシン、ＮＡＤＰＨ、Ｈ２または水を形成する。場合によって、ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ＣＯＤＨに隣接して位置する。Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍにおいて、コードされたＣＯＤＨ／ヒドロゲナーゼタンパク質は、プロトン勾配の形のエネルギーがＣＯのＣＯ２およびＨ２への変換により発生する部位であることが提唱されている、膜結合酵素複合体を形成する（Ｆｏｘら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、６２００〜６２０８頁（１９９６年））。Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓのＣＯＤＨ−Ｉおよびその隣接遺伝子は、Ｒ．ｒｕｂｒｕｍ  ＣＯＤＨ／ヒドロゲナーゼ遺伝子クラスターとそれらが類似性を有することに基づいて、類似の機能的役割を触媒することが提唱された（Ｗｕら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．、１巻、ｅ６５頁（２００５年））。Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓのＣＯＤＨ−Ｉはまた、電極に連結させたとき、強いＣＯ酸化およびＣＯ２還元活性を示すことが示された（Ｐａｒｋｉｎら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１２９巻、１０３２８〜１０３２９頁（２００７年））。Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓのＣＯＤＨ−ＩＩおよび隣接タンパク質ＣｏｏＦをコードする遺伝子がクローニングされ、配列決定された（ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＲｏｂｂ、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．、１９１巻、２４３〜２４７頁（２０００年）。ＣＯＤＨ−ＩＩの細胞質画分はＮＡＤＰＨの生成を触媒することが示され、同化作用の役割が示唆されるが、得られた複合体は膜結合性であった（Ｓｖｅｔｌｉｔｃｈｎｙｉら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８３巻、５１３４〜５１４４頁（２００１年））。ＣＯＤＨ−ＩＩの結晶構造も入手可能である（Ｄｏｂｂｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３巻、１２８１〜１２８５頁（２００１年））。例示的なＣＯＤＨ遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により特定することができる。
【０１８３】
【数８】
2019103519.tif 000011
アセチルＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼ。Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａにおいて、ヘテロジスルフィドレダクターゼをコードする遺伝子のセット（Ｍｏｔｈ＿１１９４〜Ｍｏｔｈ＿１１９６）は、上述のａｃｓ遺伝子クラスターのすぐ下流に位置する。さらに、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａと同様に、Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓは、ａｃｓＥの直後のヘテロジスルフィドレダクターゼをコードする遺伝子のセットを含む。
【０１８４】
【数９】
2019103519.tif 000012
ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）。ＣＯおよびメタノールのアセチルＣｏＡまたはアセテートへのレドックス中性変換と異なり、エタノール、ブタノール、イソブタノール、イソプロパノール、１，４−ブタンジオール、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、４−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、乳酸、メタクリル酸、アジピン酸およびアクリル酸などのより高度に還元された生成物の最高可能収率での生成には、ＣＯおよびＨ２の両者からのさらなる還元当量の抽出が必要である（例えば、図７におけるエタノール生成を参照）。具体的には、還元当量（例えば、図６における２［Ｈ］）は、実施例ＩＩで述べたように一酸化炭素デヒドロゲナーゼによるＣＯおよび水のＣＯ２への変換により、あるいはＨ２からフェレドキシン、フラボドキシン、ＦＡＤ＋、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋などの受容体に電子を移動させる水素利用ヒドロゲナーゼの活性から直接得られる。
【０１８５】
最大４つのヒドロゲナーゼをコードする複数の遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の腸内細菌に固有のものである（Ｓａｗｅｒｓ、Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、６６巻、５７〜８８頁（１９９４年）；Ｓａｗｅｒｓら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６４巻、１３２４〜１３３１頁（１９８５年）；ＳａｗｅｒｓおよびＢｏｘｅｒ、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５６巻、２６５〜２７５頁（１９８６年）；Ｓａｗｅｒｓら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６８巻、３９８〜４０４頁（１９８６年））。酵素活性の多重性を考慮すると、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の宿主生物体は、入って来る分子水素を分裂させ、対応する受容体を還元するのに十分なヒドロゲナーゼ活性をもたらすことができる可能性がある。Ｅ．ｃｏｌｉの内因性水素リアーゼ酵素の中に、フェレドキシンを受容体として用いる膜結合酵素複合体である、ヒドロゲナーゼ３、およびフェレドキシン受容体も用いる、ヒドロゲナーゼ４がある。ヒドロゲナーゼ３および４は、それぞれｈｙｃおよびｈｙｆ遺伝子クラスターによってコードされる。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるヒドロゲナーゼ活性はまた、対応するタンパク質がヒドロゲナーゼ複合体のアセンブリーに関与する、ｈｙｐ遺伝子の発現に依存する（Ｊａｃｏｂｉら、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５８巻、４４４〜４５１頁（１９９２年）；Ｒａｎｇａｒａｊａｎら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９０巻、１４４７〜１４５８頁（２００８年））。産生宿主が十分な内因性ヒドロゲナーゼ活性を欠いている場合、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａヒドロゲナーゼは適切な候補である。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａは、唯一の炭素源としてのＣＯ２により増殖することができ、還元当量がＨ２から抽出され、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路によりアセチルＣｏＡ合成が可能であることが示唆される（Ｄｒａｋｅ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５０巻、７０２〜７０９頁（１９８２年）；ＤｒａｋｅおよびＤａｎｉｅｌ、Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５５巻、８６９〜８８３頁（２００４年）；ＫｅｌｌｕｍおよびＤｒａｋｅ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６０巻、４６６〜４６９頁（１９８４年））（図６参照）。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａは、Ｅ．ｃｏｌｉのいくつかのｈｙｐ、ｈｙｃおよびｈｙｆ遺伝子のホモログを有する。これらの遺伝子によってコードされる、これらのタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により特定することができる。さらに、ヒドロゲナーゼおよび／またはヘテロジスルフィドレダクターゼの機能性をコードするいくつかの遺伝子クラスターがＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ中に存在し、それらの対応するタンパク質配列も以下に示す。
【０１８６】
【数１０】
2019103519.tif 000013
【０１８７】
【数１１】
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【０１８８】
【数１２】
2019103519.tif 000015
補充反応（ａｎａｐｌｅｕｒｏｓｉｓ）の能力も天然に有するこれらの能力を有するように設計製作した宿主生物体（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ニトレートなどの適切な外部電子受容体の存在下で合成ガス発生アセチルＣｏＡで潜在的により効率よく増殖し得る。この電子受容体は、コハク酸デヒドロゲナーゼによって生成する還元キノンから電子を受容することが必要である。外部電子受容体を加えるさらなる利点は、細胞増殖、維持および生成物の生成のためのさらなるエネルギーをアセチルＣｏＡの呼吸から発生させることができることである。代替の戦略は、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）酵素を株に工学的に導入して、外部電子受容体の不在下でバイオマス前駆体の合成を可能にすることを含む。
【０１８９】
ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）。外部電子受容体の不在下での合成ガスおよびメタノールでの嫌気性増殖は、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）によるピルベートの合成を可能にすることによってＡＣＳ／ＣＯＤＨ活性を有する宿主生物体に与えられる。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓのＰＦＯＲがクローニングされ、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現され、酸素の存在下で数日間安定であった活性な組換え酵素が得られた（Ｐｉｅｕｌｌｅら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７９巻、５６８４〜５６９２頁（１９９７年））。酸素安定性は、ＰＦＯＲにおいて比較的まれであり、Ｄ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ酵素のポリペプチド鎖における６０残基の延長により付与されると考えられる。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＰＦＯＲも十分に特徴付けられ（ＭｅｎｏｎおよびＲａｇｓｄａｌｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６巻、８４８４〜８４９４頁（１９９７年））、独立栄養増殖の間にピルベート合成の方向の高い活性を有することが示された（ＦｕｒｄｕｉおよびＲａｇｓｄａｌｅ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７５巻、２８４９４〜２８４９９頁（２０００年））。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＰＦＯＲと５１％同一であるタンパク質をコードする、特徴付けられていないオープンリーディングフレームであるｙｄｂＫを有する。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるピルビン酸オキシドレダクターゼ活性の証拠が記載されている（Ｂｌａｓｃｈｋｏｗｓｋｉら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１２３巻、５６３〜５６９頁（１９８２年）））。これらの例示的なＰＦＯＲ酵素のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により特定することができる。いくつかのさらなるＰＦＯＲ酵素が記載されている（Ｒａｇｓｄａｌｅ、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．、１０３巻、２３３３〜２３４６頁（２００３年））。
【０１９０】
【数１３】
2019103519.tif 000016
この実施例では、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の少なくとも１つを含むガスからアセチルＣｏＡを生成するように生物体を設計製作するための例示的な遺伝子セットについて記載する。
【０１９１】
（実施例ＩＸ）
微生物への合成ガス利用経路の設計製作
この実施例では、合成ガス利用経路を含むように微生物を設計製作することについて記載する。
【０１９２】
ＣＯおよび／またはＣＯ２を炭素源として利用する天然の能力を有するクロストリジウム属の種などの微生物の効率を改善すること（実施例ＩＩ、ＩＩＩおよびＶ）に加えて、ＣＯおよび／またはＣＯ２を利用する天然の能力を有さない微生物を、ＣＯおよび／またはＣＯ２利用経路を付与する１つまたは複数のタンパク質もしくは酵素を発現するように設計製作する。１つの例示的な経路は、ＣＯおよび／またはＣＯ２の炭素源としての利用を可能にし、それにより、微生物が合成ガスまたは他のガス状炭素源を利用することを可能にするＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路である（実施例ＩおよびＶＩＩ）。
【０１９３】
最初の試験において、天然で合成ガスを利用しないＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路などのＣＯおよび／またはＣＯ２利用経路を導入するための標的生物体として用いる。Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、酸素感受性タンパク質および膜結合タンパク質ならびにＥ．ｃｏｌｉ中で天然でない特異的補因子を含む。いくつかのＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路遺伝子がＥ．ｃｏｌｉにクローニングされたが、１つの酵素メチルトランスフェラーゼのみが活性な形で発現することが見出された（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻、３２〜３６頁（１９８９年））。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍからのカルボニル分岐（図２参照）経路遺伝子の精製により、メチルＴＨＦからアセチルＣｏＡへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ変換試験に必要な酵素の最小限のセットが明らかになった（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７４巻、４６６７〜４６７６頁（１９９２年））。
【０１９４】
初期の試験は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路、特にカルボニル分岐（図２）をＥ．ｃｏｌｉに設計製作し、増殖を試験、ならびにメチルＴＨＦおよび合成ガスの両者からのアセテート生成を試験することを対象とする。Ｅ．ｃｏｌｉは、遺伝子操作に適用でき、グルコースから嫌気的条件下でエタノール、アセテートおよびスクシネートのような様々な生成物を効率よく生成することができることが公知であることから、合成ガスまたは他のガス状炭素源を利用することができる天然に存在しない微生物を開発するための良好なモデルである。
【０１９５】
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含むように設計製作されたＥ．ｃｏｌｉ株を発生させるために、該経路のカルボニル分岐に必要なタンパク質および酵素をコードする核酸（図２および実施例ＶＩＩ参照）を、周知の分子生物学技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌ、前出、１９９９年；Ｒｏｂｅｒｔｓら、前出、１９８９年を参照）を用いてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させる。前記のように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍにおけるアセチルＣｏＡ合成における重要なタンパク質をコードする遺伝子クラスターをクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた（Ｒｏｂｅｒｔｓら、前出、１９８９年）。活性タンパク質の生成を確実にするために、培地の金属組成などの条件の特定の変化が必要である。コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ）、アセチルＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）、アセチルＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼおよびＣＯ耐性ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させて、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のカルボニル分岐酵素を導入する（Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の遺伝子については、Ｒａｇｓｄａｌｅ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３９巻、１６５〜１９５頁（２００４年）も参照のこと）。Ｅ．ｃｏｌｉは、コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質活性に必要なコバラミンまたはコバラミン様補因子を通常合成しないので、補因子または必要な補因子の合成のためのタンパク質および酵素をコードする遺伝子も導入することもできる。費用面がおそらくこのアプローチのスケールアップおよび商業的製造の妨げとなると思われるが、コバラミンまたはコバラミン様補因子を培地に加えることができる。より良い代替は、コバラミン要求性タンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ株に必要な遺伝子をクローニングし、発現させることである。これは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍからＥ．ｃｏｌｉへの２０遺伝子を含むコバラミンオペロンの移入および機能発現によって実証された（Ｒａｕｘら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、７５３〜７６７頁（１９９６年））。
【０１９６】
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路遺伝子の発現を、導入された遺伝子の発現を測定するための常用のアッセイ、例えば、ノーザンブロット、ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、イムノブロッティング、または導入された遺伝子の核酸およびタンパク質発現を確認するための他の周知のアッセイを用いて試験する。発現酵素の酵素活性は、個別に、またはアセチルＣｏＡなどの生成物の生成について試験することができる（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、前出、１９８９年を参照）。設計製作されたＥ．Ｃｏｌｉ株がＣＯおよび／またはＣＯ２を炭素源として利用してアセチルＣｏＡを生成する能力は、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣＭＳ）もしくは液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）を用いて直接分析することができるか、あるいは代謝放射性標識または同位元素標識の使用（例えば、放射性ＣＯもしくはＣＯ２の使用）とアセチルＣｏＡ生成物への放射性標識の取込みまたは同位元素標識ＣＯもしくはＣＯ２前駆体の取込みの分析、また質量分析（ＧＣＭＳもしくはＬＣＭＳ）または核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）などの技術による分析を通して、分析することができる。Ｈ２の存在下または不在下で唯一の炭素源としてＣＯおよび／またはＣＯ２のみを使用するＥ．ｃｏｌｉの増殖は、完全に機能的な経路についての他の有用な試験である。
【０１９７】
機能的なＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路がＥ．Ｃｏｌｉ株に設計製作したならば、その経路の効率のよい利用について該株を最適化する。設計製作された株を試験して、導入された遺伝子のいずれが律速レベルで発現するかどうかを決定することができる。必要に応じて、該経路を通してのフラックスを制限する可能性がある１つまたは複数のタンパク質または酵素の発現の増加を用いて、該経路の利用およびアセチルＣｏＡの生成を最適化することができる。
【０１９８】
代謝モデリングを用いて、増殖条件を最適化することができる（実施例ＩＩ参照）。モデリングは、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計するためにも用いることができる（実施例ＩＩ、ＩＶおよびＶならびに例えば、米国特許公開ＵＳ２００２／００１２９３９、ＵＳ２００３／０２２４３６３、ＵＳ２００４／００２９１４９、ＵＳ２００４／００７２７２３、ＵＳ２００３／００５９７９２、ＵＳ２００２／０１６８６５４およびＵＳ２００４／０００９４６６、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号を参照）。モデリング解析は、アセチルＣｏＡまたは他の所望の生成物のより効率の高い生成の方向に代謝を移動させる細胞増殖に対する影響の予測を可能にする。１つのモデリング方法は、下で述べるようなアセチルＣｏＡまたは他の所望の生成物の増殖連結型生成を集合的にもたらす遺伝子ノックアウトを選択するために適用される、２層の最適化アプローチであるＯｐｔＫｎｏｃｋ（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．、８４巻、６４７〜６５７頁（２００３年））である。遺伝子ノックアウト戦略により設計された株は、他の全ての増殖選択肢が除去されたため、ネットワーク化学量論により、効率のよい増殖のための所望の生成物を高レベルで生成することを余儀なくされる。そのような株は、自己最適化しており、安定である。したがって、それらは、強い増殖選択圧に直面した場合でも生成レベルを典型的には維持または改善し、バッチまたは連続式バイオプロセシングに、また進化工学にも適用可能となる。適応進化を用いて、アセチルＣｏＡの生成をさらに最適化することができる（実施例Ｖ）。したがって、適応進化は、増殖および生成特性を改善するために行われる（ＦｏｎｇおよびＰａｌｓｓｏｎ、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．、３６巻、１０５６〜１０５８頁（２００４年）；Ａｌｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１４巻、１５６５〜１５６８頁（２００６年））。結果に基づいて、モデリング、遺伝子工学および適応進化のその後のラウンドを用いて、さらに生成を最適化しかつ合成ガスまたは合成ガス中の不純物に対する酵素の耐性を最適化することができる。
【０１９９】
設計製作した微生物株がＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の利用について最適化されたならば、周知の方法を用いて、また例えば、実施例ＶＩ）で述べたように、発酵プロセスの最適化を行って、収率を増加させることができる。例えば、合成ガスからの０．５ｇ／Ｌ／時間での２０ｇ／Ｌアセテートの生産性レベルは、経路の効率のよい利用のための株のさらなる最適化ならびに発酵条件の最適化を用いて所望の生成レベルを達成することができる所望の生成範囲を表すであろう。
【０２００】
ＣＯおよび／またはＣＯ２を利用する能力を、設計製作された微生物株に付与するためのカルボニル分岐の導入で例示したが、同様なアプローチを適用して、メチルＴＨＦの生成のための酵素をＥ．ｃｏｌｉに導入する。実施例ＶＩＩで上述したように、Ｅ．ｃｏｌｉはメチルＴＨＦを生成する能力を有するが、アセテート生成菌のＴＨＦ依存性酵素はより高い比活性を有する（Ｍｏｒｔｏｎら、前出、１９９３年）。Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のカルボニル分岐を導入するための上述のような方法を用いて、メチル分岐酵素を同様な技術を用いてＥ．ｃｏｌｉに導入する。フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼの酵素の１つまたは複数をコードする遺伝子を導入する（図１参照）。この場合、遺伝子を導入して、内因性酵素活性を増大させ、かつ／またはメチルＴＨＦを生成するためのＣＯおよび／またはＣＯ２の利用の効率を増大させる。経路および発酵条件の最適化を上述のように行う。さらに、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のカルボニル分岐およびメチル分岐の両方を同じ微生物に導入することができる。そのような設計製作された生物体において、ＣＯおよび／またはＣＯ２からのメチルＴＨＦの生成の増加を用いて、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のカルボニル分岐を用いてＣＯおよび／またはＣＯ２を利用するように設計製作された生物体におけるアセチルＣｏＡの生成をさらに増加させることができる（図３および６参照）。
【０２０１】
アセチルＣｏＡは、他の所望の生成物の前駆体として機能し得る。アセチルＣｏＡ生成微生物を発生させたならば、炭素源としてのＣＯおよび／またはＣＯ２から他の所望の生成物を生成するための前駆体としてアセチルＣｏＡを利用するために、さらなる遺伝子を微生物中に導入することができる。例えば、ブタノールの生成のための酵素を導入することができる（図３および実施例Ｖ参照）。アセチルＣｏＡからのブタノール経路の代表的な遺伝子は、ＡｔｏＢ、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ；Ｔｈ１、アセチルＣｏＡチオラーゼ；Ｈｂｄ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ；Ｃｒｔ、クロトナーゼ；Ｂｅｄ、ブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ；Ｅｔｆ、電子伝達フラビンタンパク質；ＡｄｈＥ２、アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼである（Ａｔｓｕｍｉら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００７年９月１４日を参照）。
【０２０２】
スクシネート、４−ヒドロキシブチレートおよび１，４−ブタンジオールなどのさらなる所望の生成物の生成のための代謝経路は、例えば、２００７年８月１０日に出願された米国出願第１１／８９１，６０２号およびＷＯ／２００８／１１５８４０に記載されており、そのような経路の酵素を同様に導入することができ、例えば、スクシニルＣｏＡリガーゼ、スクシニルＣｏＡ：ＣｏＡトランスフェラーゼ、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸：コハク酸セミアルデヒドトランスアミナーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼなどである。アセチルＣｏＡが全ての細胞のＴＣＡサイクルに直接送入され、スクシネートがＴＣＡサイクル中間体である。したがって、ＣＯおよび／またはＣＯ２から生成するアセチルＣｏＡを利用することができる経路を付与するさらなる酵素を、上述のように設計製作し、最適化して、設計製作した微生物から所望の生成物を生成させることができる。
【０２０３】
（実施例Ｘ）
合成ガスおよびメタノールからアセチルＣｏＡを生成するための経路
この実施例では、合成ガス（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ  （ｓｙｎｇａｓ））およびメタノールを利用してアセチルＣｏＡを生成するための例示的な経路について記載する。
【０２０４】
合成ガスおよびメタノールからアセチルＣｏＡを生成することができる生物体は、図７中に示す２つの重要な能力を含有する。１つの能力は、メタノールおよびＴＨＦからの５−メチル−テトラヒドロ葉酸（Ｍｅ−ＴＨＦ）の生成を可能にする機能的メチルトランスフェラーゼ系である。第２の能力は、ＣＯ、補酵素Ａ、およびＭｅ−ＴＨＦのメチル基を組み合わせて、アセチルＣｏＡを形成する能力である。生物体は、外因性のＣＯおよび／またはＣＯ２およびメタノール由来の炭素を「固定」して、アセチルＣｏＡ、細胞集団、および生成物を合成することができる。メタノールおよび合成ガスからアセチルＣｏＡを形成するためのこの経路は、完全なＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の利用と比較してエネルギー学的に有利である。例えば、アセテートへの合成ガスの直接転換は、エネルギー学的には中性のプロセスである（図６参照）。具体的には、１個のＡＴＰ分子がホルミル−ＴＨＦシンターゼによるホルミル−ＴＨＦの形成中に消費され、かつ１個のＡＴＰ分子が、酢酸キナーゼによるアセテートの生成中に生成される。メタノールに関するこの新たな戦略は、メチル分岐生成物、メチル−ＴＨＦ上のメチル基が、ＣＯ２ではなくメタノールから得られることを確実にすることによって、ＡＴＰ消費の必要を回避する。したがってこれは、アセテートの形成が、細胞増殖および維持の支援を助けることができる正のＡＴＰ収率を有することを確実にする。補充反応の能力も天然に有するこれらの能力を有するように設計製作した宿主生物体（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ニトレートなどの適切な外部電子受容体の存在下で、メタノールおよび合成ガスで発生したアセチルＣｏＡで増殖することができる。この電子受容体は、コハク酸デヒドロゲナーゼによって形成された還元キノンから電子を受容することが必要である。外部電子受容体を加えるさらなる利点は、細胞増殖、維持、および生成物の形成のさらなるエネルギーを、アセチルＣｏＡの呼吸から生成することができることである。
【０２０５】
代替の戦略は、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）酵素を株に工学的に導入して、外部電子受容体の不在下でバイオマス前駆体の合成を可能にすることを含む。設計製作した生物体のさらなる特徴は、分子水素から還元当量を抽出する能力である。これは、エタノール、ブタノール、イソブタノール、イソプロパノール、１，４−ブタンジオール、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、４−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、乳酸、メタクリル酸、アジピン酸、およびアクリル酸などの還元生成物の高収率を与える。
【０２０６】
生物体は、以下の供給源：１）メタノールおよびＣＯ、２）メタノール、ＣＯ２、およびＨ２、３）メタノール、ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２、４）メタノールならびにＣＯおよびＨ２を含む合成ガス、および５）メタノールならびにＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２を含む合成ガスから、アセチルＣｏＡ、細胞集団、および標的化学物質を生成することができる。
【０２０７】
生物体へのこの経路の首尾よい工学的導入は、適切な酵素のセットを同定すること、それらの対応する遺伝子を産生宿主にクローニングすること、これらの遺伝子の安定性および発現を最適化すること、発酵条件を最適化すること、および発酵後に生成物形成に関してアッセイすること（実施例ＩＩ〜ＩＶ参照）を含む。以下に記載するのは、アセチルＣｏＡへの合成ガスおよびメタノールの転換に必要とされる経路のそれぞれの段階を触媒するいくつかの酵素である。合成ガスおよびメタノールの利用のために産生宿主を設計製作するために、必須酵素をコードする（１つまたは複数の）外因性ＤＮＡ配列を微生物中で発現させる。
【０２０８】
この実施例では、合成ガスおよびメタノールからのアセチルＣｏＡ生成についての例示的な経路について記載する。
【０２０９】
（実施例ＸＩ）
メタノールおよび合成ガスを利用する微生物を生成するための遺伝子セット
この実施例では、メタノールおよび合成ガスを利用する微生物を生成するための例示的な遺伝子セットについて記載する。
【０２１０】
メタノール−メチルトランスフェラーゼ（ＭＴＲ）。外来宿主中での改変Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の発現（図７参照）は、１セットのメチルトランスフェラーゼを導入して、メタノールによって与えられる炭素と水素ならびにＣＯおよび／またはＣＯ２によって与えられる炭素を利用することを必要とする。ＭｔａＡ、ＭｔａＢ、およびＭｔａＣで示す、３メチルトランスフェラーゼタンパク質の複合体は、望ましいメタノールメチルトランスフェラーゼ活性を実行する（ＮａｉｄｕおよびＲａｇｓｄａｌｅ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８３巻、３２７６〜３２８１頁（２００１年）；Ｒａｇｓｄａｌｅ、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３９巻、１６５〜１９５頁（２００４年）；Ｓａｕｅｒら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４３巻、６７０〜６７７頁（１９９７年）；ＴａｌｌａｎｔおよびＫｒｚｙｃｋｉ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７８巻、１２９５〜１３０１頁（１９９６年）；ＴａｌｌａｎｔおよびＫｒｚｙｃｋｉ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７９巻、６９０２〜６９１１頁（１９９７年）；Ｔａｌｌａｎｔら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６巻、４４８５〜４４９３頁（２００１年））。
【０２１１】
メタノールメチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＢ）およびコリノイドタンパク質（ＭｔａＣ）。ＭｔａＢは、メタノールからＭｔａＣ（コリノイドタンパク質）へのメチル基の移入を触媒する亜鉛タンパク質である。ＭｔａＢおよびＭｔａＣをコードする例示的な遺伝子は、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ（Ｍａｅｄｅｒら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８８巻、７９２２〜７９３１頁（２００６年））およびＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ（Ｇａｌａｇａｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １２巻、５３２〜５４２頁（２００２年））などのメタン生成の古細菌、およびアセテート生成菌のＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（Ｄａｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ６７巻、１６７〜１７６頁（２００７年））において見ることができる。一般に、それらの活性は密接に相互依存しているので、ＭｔａＢ遺伝子とＭｔａＣ遺伝子は染色体上で互いに隣接している。Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、およびＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ中の様々なＭｔａＢおよびＭｔａＣコード遺伝子のタンパク質配列は、それらの以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により特定することができる。
【０２１２】
【数１４】
2019103519.tif 000017
Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ由来のＭｔａＢ１およびＭｔａＣ１遺伝子、ＹＰ＿３０４２９９およびＹＰ＿３０４２９８を、Ｅ．ｃｏｌｉにクローニングし配列決定した（Ｓａｕｅｒら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４３巻、６７０〜６７７頁（１９９７年））。このメタノール−コバラミンメチルトランスフェラーゼ複合体の結晶構造も利用可能である（Ｈａｇｅｍｅｉｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０３巻、１８９１７〜１８９２２頁（２００６年））。Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ中のＭｔａＢ遺伝子、ＹＰ＿３０７０８２およびＹＰ＿３０４６１２は、ＹＰ＿３０４２９９との配列相同性によって同定した。一般に、ＭｔａＢコード遺伝子はトリメチルアミン、ジメチルアミン、モノメチルアミン、またはジメチルスルフィドなどの代替の基質に作用するメチルトランスフェラーゼとの類似性をほとんど、または全く示さないので、相同性検索はメタノールメチルトランスフェラーゼを同定する有効な手段である。ＭｔａＣ遺伝子、ＹＰ＿３０７０８１およびＹＰ＿３０４６１１は、ＭｔａＢ遺伝子とのそれらの近接性、さらにＹＰ＿３０４２９８とのそれらの相同性に基づいて同定した。Ｍ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来の３セットのＭｔａＢおよびＭｔａＣ遺伝子が遺伝的、生理的、および生化学的に特徴付けられている（ＰｒｉｔｃｈｅｔｔおよびＭｅｔｃａｌｆ、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５６巻、１１８３〜１１９４頁（２００５年））。そのセットの２つを欠く突然変異体株はメタノールで増殖することができ、一方３セットのＭｔａＢおよびＭｔａＣ遺伝子の全てを欠く株は、メタノールで増殖することができなかった。これは、遺伝子のそれぞれのセットがメタノール利用において役割を果たすことを示唆する。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＭｔａＢ遺伝子は、メタン生成ＭｔａＢ遺伝子との相同性に基づいて、さらに結晶化しているメタノール誘導コリノイドタンパク質のＭｔａＣとのその隣接染色体の近接性によって同定し（Ｚｈｏｕら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｓｅｃｔ．  Ｆ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｒｙｓｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ６１巻、５３７〜５４０頁（２００５年））、ノーザンハイブリダイゼーションおよびウエスタンブロッティングによってさらに特徴付けした（Ｄａｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ６７巻、１６７〜１７６頁（２００７年））。
【０２１３】
メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＭｔａＡ）。ＭｔａＡは、メタン生成菌中の補酵素Ｍへのまたはアセテート生成菌中のテトラヒドロ葉酸へのいずれかへの、ＭｔａＣからのメチル基の転移を触媒する亜鉛タンパク質である。ＭｔａＡは、メチルドナーとしてメチルコバラミンを利用することもできる。ＭｔａＡをコードする例示的な遺伝子は、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ（Ｍａｅｄｅｒら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８８巻、７９２２〜７９３１頁（２００６年））およびメタン生成の古細菌（Ｇａｌａｇａｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １２巻、５３２〜５４２頁（２００２年））などのｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃ  ａｒｃｈａｅａ、およびアセテート生成菌のＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（Ｄａｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ６７巻、１６７〜１７６頁（２００７年））において見ることができる。一般に、ＣＨ３−ＭｔａＣからのメチル基の転移を触媒するＭｔａＡタンパク質は、他のコリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼと類似性を共有し、染色体上のＭｔａＢおよびＭｔａＣ遺伝子と隣接配向ではないので、バイオインフォマティクスにより同定するのは難しい。それにもかかわらず、いくつかのＭｔａＡコード遺伝子が特徴付けされている。Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉおよびＭ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ中のこれらの遺伝子のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により特定することができる。
【０２１４】
【数１５】
2019103519.tif 000018
Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ由来のＭｔａＡ遺伝子、ＹＰ＿３０４６０２をクローニングし、配列決定し、Ｅ．ｃｏｌｉ中で機能的に過剰発現させた（ＨａｒｍｓおよびＴｈａｕｅｒ、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２３５巻、６５３〜６５９頁（１９９６年））。Ｍ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓでは、ＭｔａＡ１はメタノールでの増殖に必要とされ、一方ＭｔａＡ２は、メタノールからのメタン生成がＭｔａＡ２突然変異体中で低減するが必ずしも必要ではない（Ｂｏｓｅら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９０巻、４０１７〜４０２６頁（２００８年））。Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉおよびＭ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓにおいて、今まで特徴付けられていないが、コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ活性を触媒し得る、多数のさらなるＭｔａＡホモログが存在することに留意することも重要である。
【０２１５】
Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ中の推定ＭｔａＡコード遺伝子を、特徴付けられたメタン生成菌ＭｔａＡ遺伝子とのそれらの配列類似性によって同定した。具体的には、３つのＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの遺伝子が、Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ由来のＹＰ＿３０４６０２と高い相同性（３０％を超える配列同一性）を示す。ＣＨ３−ＭｔａＣからの補酵素Ｍへのメチル基の転移を本来触媒するメタン生成菌のＭｔａＡタンパク質と異なり、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＭｔａＡは、それぞれメタン生成菌およびアセテート生成菌中のテトラヒドロ葉酸および補酵素Ｍの類似した役割を考慮して、テトラヒドロ葉酸にメチル基を転移させる可能性がある。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ由来の推定ＭｔａＡコードの遺伝子のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により特定することができる。
【０２１６】
【数１６】
2019103519.tif 000019
アセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡＣＳ／ＣＯＤＨ）。ＡＣＳ／ＣＯＤＨは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のカルボニル分岐の中心酵素である。これは、二酸化炭素の一酸化炭素への可逆的還元を、また一酸化炭素、補酵素Ａ、およびメチル化コリノイド−鉄−硫黄タンパク質のメチル基からのアセチルＣｏＡの合成も触媒する。このコリノイド−鉄−硫黄タンパク質は、メチルトランスフェラーゼを介してメチルテトラヒドロ葉酸によってメチル化される。外来宿主におけるＡＣＳ／ＣＯＤＨの発現は、全てではないとしても、多くの以下のタンパク質およびそれらの対応する活性を導入することを含む。
【０２１７】
メチルテトラヒドロ葉酸：コリノイドタンパク質メチルトランスフェラーゼ（ＡｃｓＥ）
コリノイド−鉄−硫黄タンパク質（ＡｃｓＤ）
ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質（ＡｃｓＦ）
フェレドキシン（Ｏｒｆ７）
アセチルＣｏＡシンターゼ（ＡｃｓＢおよびＡｃｓＣ）
一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡｃｓＡ）
ニッケル−タンパク質アセンブリータンパク質（ＣｏｏＣ）
一酸化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチルＣｏＡシンターゼ活性に必要な遺伝子は、延長オペロンであり得る天然ゲノムの限られた領域に典型的には存在する（Ｍｏｒｔｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６６巻、２３８２４〜２３８２８頁（１９９１年）；Ｒａｇｓｄａｌｅ、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３９巻、１６５〜１９５頁（２００４年）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻、３２〜３６頁（１９８９年））。アセテート生成菌Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのこのオペロンにおける遺伝子はそれぞれ既にクローニングされ、Ｅ．ｃｏｌｉ中で活発に発現した（Ｌｕら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６８巻、５６０５〜５６１４頁（１９９３年）；Ｍｏｒｔｏｎら、前出、１９９１年；Ｒｏｂｅｒｔｓら、前出、１９８９年）。これらの遺伝子のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により特定することができる。
【０２１８】
【数１７】
2019103519.tif 000020
水素生成細菌Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓは、アセチルＣｏＡシンターゼによる増殖基質として一酸化炭素を利用することができる（Ｗｕら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．、１巻、ｅ６５頁（２００５年））。株Ｚ−２９０１において、アセチルＣｏＡシンターゼ酵素複合体は、フレームシフト突然変異のため一酸化炭素デヒドロゲナーゼを欠いている（Ｗｅら、前出、２００５年）が、株ＤＳＭ６００８においては、このタンパク質の機能的な非フレームシフト完全長型が精製された（Ｓｖｅｒｔｌｉｔｃｈｎｙｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０１巻、４４６〜４５１頁（２００４年））。株Ｚ−２９０１からのＣ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ遺伝子のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により特定することができる。Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ  ＤＳＭ６００８の配列は、公的に利用可能なデータベースにおいて現在アクセス可能ではないが、配列が利用可能になると容易に決定することができる。
【０２１９】
【数１８】
2019103519.tif 000021
メタン生成古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓは、一酸化炭素で増殖することもでき、アセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼ活性を示し、アセテートおよびホルメートの両方を生成する（Ｌｅｓｓｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０３巻、１７９２１〜１７９２６頁（２００６年））。この生物体は、ＡＣＳ／ＣＯＤＨ活性をコードする２セットの遺伝子を含む（ＲｏｔｈｅｒおよびＭｅｔｃａｌｆ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０１巻、１６９２９〜１６９３４頁（２００４年））。Ｍ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ遺伝子の両セットのタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により特定することができる。
【０２２０】
【数１９】
2019103519.tif 000022
ＡｃｓＣ、ＡｃｓＤ、ＡｃｓＢ、ＡｃｓＥｐｓおよびＡｃｓＡタンパク質は、メタン生成ＣＯＤＨ／ＡＣＳのガンマ、デルタ、ベータ、イプシロンおよびアルファサブユニットと一般的に呼ばれている。イプシロンをコードする遺伝子のホモログは、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａなどのアセテート生成菌またはＣ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓなどの水素生成細菌において存在しない。Ｍ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓにおける２つの活性なＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロンの存在に関する仮説は、カルボキシドトロフィックもしくはアセチクラスチック増殖に有利な触媒特性（すなわち、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、ｋｃａｔ）、または種々の刺激がＣＯＤＨ／ＡＣＳ発現を誘導することを可能にする差次的遺伝子制御を含む（Ｒｏｔｈｅｒら、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１８８巻、４６３〜４７２頁（２００７年））。
【０２２１】
Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａおよびＣ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓの両方において、ＣＯＤＨをコードするさらなる遺伝子が、ＡＣＳ／ＣＯＤＨオペロンの外側に位置する。これらの酵素は、一酸化炭素の二酸化炭素への変換から電子または還元当量を抽出する手段をもたらす。次いで還元当量は、酸化フェレドキシン、ＮＡＤＰ＋、水または過酸化水素などの受容体に渡されて、それぞれ還元フェレドキシン、ＮＡＤＰＨ、Ｈ２または水を形成する。場合によって、ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ＣＯＤＨに隣接して位置する。Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍにおいて、コードされたＣＯＤＨ／ヒドロゲナーゼタンパク質は、プロトン勾配の形のエネルギーがＣＯのＣＯ２およびＨ２への変換により発生する部位であることが提唱されている、膜結合酵素複合体を形成する（Ｆｏｘら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７８巻、６２００〜６２０８頁（１９９６年））。Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓのＣＯＤＨ−Ｉおよびその隣接遺伝子は、Ｒ．ｒｕｂｒｕｍ  ＣＯＤＨ／ヒドロゲナーゼ遺伝子クラスターに対するそれらの類似性に基づいて、類似の機能的役割を触媒することが提唱された（Ｗｕら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．、１巻、ｅ６５頁（２００５年））。Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓのＣＯＤＨ−Ｉはまた、電極に連結させたとき、強いＣＯ酸化およびＣＯ２還元活性を示すことが示された（Ｐａｒｋｉｎら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１２９巻、１０３２８〜１０３２９頁（２００７年））。Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓのＣＯＤＨ−ＩＩおよび隣接タンパク質ＣｏｏＦをコードする遺伝子がクローニングされ、配列決定された（ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＲｏｂｂ、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．、１９１巻、２４３〜２４７頁（２０００年）。ＣＯＤＨ−ＩＩの細胞質画分はＮＡＤＰＨの形成を触媒することが示され、同化作用の役割が示唆されるが、得られた複合体は膜結合性であった（Ｓｖｅｔｌｉｔｃｈｎｙｉら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８３巻、５１３４〜５１４４頁（２００１年））。ＣＯＤＨ−ＩＩの結晶構造も入手可能である（Ｄｏｂｂｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３巻、１２８１〜１２８５頁（２００１年））。例示的なＣＯＤＨおよびヒドロゲナーゼ遺伝子のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により特定することができる。
【０２２２】
【数２０】
2019103519.tif 000023
ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）。外部電子受容体の不在下での合成ガスおよびメタノールでの嫌気性増殖は、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）によるピルベートの合成を可能にすることによってＭＴＲおよびＡＣＳ／ＣＯＤＨ活性を有する宿主生物体に与えられる。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓのＰＦＯＲがクローニングされ、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現され、酸素の存在下で数日間安定であった活性な組換え酵素が得られた（Ｐｉｅｕｌｌｅら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７９巻、５６８４〜５６９２頁（１９９７年））。酸素安定性は、ＰＦＯＲにおいて比較的まれであり、Ｄ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ酵素のポリペプチド鎖における６０残基延長により付与されると考えられる。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＰＦＯＲも十分に特徴付けられ（ＭｅｎｏｎおよびＲａｇｓｄａｌｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６巻、８４８４〜８４９４頁（１９９７年））、独立栄養増殖の間にピルベート合成の方向の高い活性を有することが示された（ＦｕｒｄｕｉおよびＲａｇｓｄａｌｅ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７５巻、２８４９４〜２８４９９頁（２０００年））。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＰＦＯＲと５１％同一であるタンパク質をコードする、特徴付けられていないオープンリーディングフレームであるｙｄｂＫを有する。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるピルビン酸オキシドレダクターゼ活性の証拠が記載されている（Ｂｌａｓｃｈｋｏｗｓｋｉら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１２３巻、５６３〜５６９頁（１９８２年））。これらの例示的なＰＦＯＲ酵素のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により特定することができる。いくつかのさらなるＰＦＯＲ酵素が記載されている（Ｒａｇｓｄａｌｅ、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．、１０３巻、２３３３〜２３４６頁（２００３年））。
【０２２３】
【数２１】
2019103519.tif 000024
ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）。ＣＯおよびメタノールのアセチルＣｏＡまたはアセテートへのレドックス中性変換と異なり、エタノール、ブタノール、イソブタノール、イソプロパノール、１，４−ブタンジオール、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、４−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、乳酸、メタクリル酸、アジピン酸およびアクリル酸などのより高度に還元された生成物の最高可能収率での生成には、ＣＯおよびＨ２の両方からのさらなる還元当量の抽出が必要である（例えば、図７におけるエタノール形成を参照）。具体的には、還元当量（例えば、図６における２［Ｈ］）は、実施例ＩＩで述べたように一酸化炭素デヒドロゲナーゼによるＣＯおよび水のＣＯ２への変換により得られるか、あるいはＨ２からフェレドキシン、フラボドキシン、ＦＡＤ＋、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋などの受容体に電子を移動させる水素利用ヒドロゲナーゼの活性から直接得られる。
【０２２４】
最大４つのヒドロゲナーゼをコードする複数の遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の腸内細菌に固有のものである（Ｓａｗｅｒｓ、Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、６６巻、５７〜８８頁（１９９４年）；Ｓａｗｅｒｓら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６４巻、１３２４〜１３３１頁（１９８５年）；ＳａｗｅｒｓおよびＢｏｘｅｒ、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５６巻、２６５〜２７５頁（１９８６年）；Ｓａｗｅｒｓら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６８巻、３９８〜４０４頁（１９８６年））。酵素活性の多重性を考慮すると、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の宿主生物体は、入って来る分子水素を分裂させ、対応する受容体を還元するのに十分なヒドロゲナーゼ活性をもたらすことができる可能性がある。Ｅ．ｃｏｌｉの内因性水素リアーゼ酵素の中に、フェレドキシンを受容体として用いる膜結合酵素複合体である、ヒドロゲナーゼ３、およびフェレドキシン受容体も用いる、ヒドロゲナーゼ４がある。ヒドロゲナーゼ３および４は、それぞれｈｙｃおよびｈｙｆ遺伝子クラスターによってコードされる。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるヒドロゲナーゼ活性はまた、対応するタンパク質がヒドロゲナーゼ複合体のアセンブリーに関与する、ｈｙｐ遺伝子の発現に依存する（Ｊａｃｏｂｉら、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５８巻、４４４〜４５１頁（１９９２年）；Ｒａｎｇａｒａｊａｎら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９０巻、１４４７〜１４５８頁（２００８年））。産生宿主が十分な内因性ヒドロゲナーゼ活性を欠いている場合、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａヒドロゲナーゼは適切な候補である。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａは、唯一の炭素源としてのＣＯ２により増殖することができ、還元当量がＨ２から抽出され、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路によりアセチルＣｏＡ合成が可能であることが示唆される（Ｄｒａｋｅ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５０巻、７０２〜７０９頁（１９８２年）；ＤｒａｋｅおよびＤａｎｉｅｌ、Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５５巻、８６９〜８８３頁（２００４年）；ＫｅｌｌｕｍおよびＤｒａｋｅ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６０巻、４６６〜４６９頁（１９８４年））（図６参照）。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａは、Ｅ．ｃｏｌｉのいくつかのｈｙｐ、ｈｙｃおよびｈｙｆ遺伝子のホモログを有する。これらの遺伝子によってコードされる、これらのタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により特定することができる。さらに、ヒドロゲナーゼおよび／またはヘテロジスルフィドレダクターゼの機能性をコードするいくつかの遺伝子クラスターがＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ中に存在し、それらの対応するタンパク質配列も以下に示す。
【０２２５】
【数２２】
2019103519.tif 000025
【０２２６】
【数２３】
2019103519.tif 000026
【０２２７】
【数２４】
2019103519.tif 000027
この実施例では、生物体を設計製作して合成ガスおよびメタノールからアセチルＣｏＡを生成するための例示的な遺伝子セットについて記載する。
【０２２８】
（実施例ＸＩＩ）
生物体を設計製作して合成ガスおよびメタノールからアセチルＣｏＡを生成するための遺伝子およびコードされる酵素に関するクローニング、発現および活性のアッセイ
この実施例では、合成ガスおよびメタノールを利用する生物体をもたらす酵素をコードする遺伝子のクローニングおよび発現について記載する。
【０２２９】
メタノール−メチルトランスフェラーゼ（ＭＴＲ）。メタノールからＭｅ−ＴＨＦを生成するための、少なくとも最小の遺伝子セット、例えばＭｔａＡ、ＭｔａＢ、およびＭｔａＣをクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させる。これらの遺伝子はプルーフリーディングＰＣＲによってクローニングし、抑制性ＰＡ１−ｌａｃＯ１プロモーターの制御下でのｐＺＥ２２−Ｓなどの高コピー数ベクターにおける発現用に一緒に連結させる（ＬｕｔｚおよびＢｕｊａｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻、１２０３〜１２１０頁（１９９７年））。これらのメチルトランスフェラーゼ活性は補因子としてコバラミンを必要とするので、補酵素Ｂ１２を増殖培地に加える。クローニングした遺伝子は、構築および３遺伝子セットの発現ベクターへの挿入を実証するためのＰＣＲおよび／または制限酵素マッピングによって確認する。推定クローンのＤＮＡ配列決定を実施して、それぞれの遺伝子の予想配列を確認する。確認後、０．０５ｍＭと１ｍＭの間の最終濃度でイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導剤を加えることによって、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２（ＭＧ１６５５）細胞中で最終構築物を発現させる。クローニングした遺伝子の発現は、全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してモニターする。ＭｔａＡＢＣタンパク質の発現がメタノールからテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）にメチル基を転移させる能力をＥ．ｃｏｌｉにもたらすかどうか決定するために、メタノールを様々な濃度で組換え株に供給し、その取込みをメチル−ＴＨＦ合成と共にモニターする。メチルトランスフェラーゼ系の活性は、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ中でのメチル供給源としてのバニレートに関して（ＮａｉｄｕおよびＲａｇｓｄａｌｅ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８３巻、３２７６〜３２８１頁（２００１年））、またはＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉのメタノールメチルトランスフェラーゼ（Ｓａｕｅｒら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４３巻、６７０〜６７７頁（１９９７年）；ＴａｌｌａｎｔおよびＫｒｚｙｃｋｉ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７８巻、１２９５〜１３０１頁（１９９６年）；ＴａｌｌａｎｔおよびＫｒｚｙｃｋｉ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７９巻、６９０２〜６９１１頁（１９９７年）；Ｔａｌｌａｎｔら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６巻、４４８５〜４４９３頁（２００１年））に関して記載されたのと同様に嫌気的にアッセイする。陽性対照用に、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を並行して培養し、内因性メチルトランスフェラーゼ活性をモニターする。活性が外から加えた補酵素Ｂ１２に依存することが実証されると、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのメタノール：コリノイドメチルトランスフェラーゼ活性の発現が確認される。
【０２３０】
アセチルＣｏＡシンターゼ／一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＡＣＳ／ＣＯＤＨ）。標準的なＰＣＲ法を使用して、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ、およびＭ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来のＡＣＳ／ＣＯＤＨ活性に必要不可欠な遺伝子をコードする全オペロンを、ｐＺＡ３３−Ｓ（Ｐ１５Ａベース）またはｐＺＳ１３−Ｓ（ｐＳＣ１０１ベース）などの低または中コピー数ベクターに構築する。メチルトランスフェラーゼ遺伝子に関して記載したように、クローニングした遺伝子の構造および配列を確認する。必須金属（Ｎｉ、Ｚｎ、Ｆｅ）を含み補酵素Ｂ１２を与えた厳密に嫌気的な条件下で増殖させた全細胞の溶解産物のタンパク質ゲル電気泳動によって発現をモニターする。必要に応じて、遺伝子クラスターを、任意の明らかなターミネーターの同定および除去、およびＥ．ｃｏｌｉ中で有効であることが公知である部位から選択したコンセンサスリボソーム結合部位の導入によって、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現用に改変する（Ｂａｒｒｉｃｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２巻、１２８７〜１２９５頁（１９９４年）；Ｒｉｎｇｑｕｉｓｔら、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６巻、１２１９〜１２２９（１９９２年））。しかしながら、それぞれの遺伝子クラスターは、その天然構造および発現と並行した形式でクローニングし発現させる。これは、その大部分が互いに相互作用する様々な遺伝子産物間の、望ましい化学量論を確実にするのを助ける。嫌気的条件下でのＣＯＤＨ／ＡＣＳ遺伝子クラスターの満足のいく発現を得た後、これらの遺伝子を発現してＣＯおよび／またはＣＯ２を細胞の炭素に固定する細胞の能力をアッセイする。初期条件は、炭素源としておよびエネルギー源として外因性グルコースを与え、基質レベルのリン酸化または電子受容体としてのニトレートを用いる嫌気的呼吸を介して厳密に嫌気的に増殖させた細胞を利用する。さらに、外から与えたＣＨ３−ＴＨＦを培地に加える。
【０２３１】
ＭＴＲおよびＡＣＳ／ＣＯＤＨ経路とを組み合せた活性のアッセイ。実施例ＩＩ中に記載したＡＣＳ／ＣＯＤＨ遺伝子をクローニングし、実施例ＩＩ中でも記載したメタノール−メチルトランスフェラーゼ系も発現する細胞中で発現させる。ＭＴＲ発現細胞中へのＡＣＳ／ＣＯＤＨを発現する適合性プラスミドの導入によって、これを実施する。長期安定性を追加するために、ＡＣＳ／ＣＯＤＨおよびＭＴＲ遺伝子を染色体中に組み込むこともできる。メタノールを利用してＭｅ−ＴＨＦを生成することができ、かつ活性なＣＯＤＨ／ＡＣＳ遺伝子を発現することができるＥ．ｃｏｌｉ株を作製した後、メタノールおよび合成ガスの両方を利用して細胞集団およびアセテートに取込む能力に関してそれらをアッセイする。初期条件は、炭素源およびエネルギー源として外因性グルコースを与えて厳密に嫌気的に増殖させた細胞を利用する。あるいは、または、グルコースの添加に加えて、ニトレートを発酵ブロスに加えて、電子受容体および増殖の開始剤として働かせることが可能である。最終的にアセチルＣｏＡに代謝される脂肪酸でのＥ．ｃｏｌｉの嫌気的増殖は、ニトレートの存在下で実証されている（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４７巻、７９３〜８０５頁（２００３年））。ニトレートなどの電子受容体の存在下で微生物の生物体を培養することによる、同様の条件を利用することができる。その細胞内レベルが設計製作した酵素の任意の阻害閾値未満に維持される限り、酸素を提供することもできる。これらの実験に適した組成の「合成による合成ガス」をメタノールと共に利用する。１３Ｃ標識メタノールまたは１３Ｃ標識ＣＯを細胞に提供し、質量分析法を利用して、アセテートおよび細胞集団への標識炭素の取込み、例えばタンパク質性アミノ酸を測定する。
【０２３２】
ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｄ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ、およびＥ．ｃｏｌｉのピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ遺伝子をクローニングし、ＭＴＲおよびＡＣＳ／ＣＯＤＨ活性を示す株中で発現させる。条件、プロモーターなどは前に記載されている。ＰＦＯＲ遺伝子の大きなサイズおよび対応する酵素の酸素感受性を考慮して、低または単コピーのプラスミドベクターの使用または単コピーの染色体への組込みを使用して試験を実施する。（ＦｕｒｄｕｉおよびＲａｇｓｄａｌｅ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５巻、２８４９４〜２８４９９頁（２０００年）中に記載されたのと同様の）活性のアッセイを適用して活性を実証する。さらに、外部電子受容体の不在下でのガス状炭素源およびメタノールでの増殖の実証は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＦＯＲ活性のさらなる証拠をもたらす。
【０２３３】
ヒドロゲナーゼ。宿主生物体の内因性水素を利用するヒドロゲナーゼ活性を、水素の存在および不在下で前に記載したように細胞を増殖させることによって試験する。発酵中により還元された生成物の形成への劇的な変化を観察する場合（例えば、アセテートに対して増加したエタノール）、これは内因性ヒドロゲナーゼ活性が十分活性であることを示す。この場合、異種ヒドロゲナーゼはクローニングおよび発現されない。天然酵素が十分な活性を有していない、または必要とされる受容体を還元しない場合、個々のヒドロゲナーゼ複合体をコードする遺伝子をクローニングし、ＭＴＲ、ＡＣＳ／ＣＯＤＨ、およびＰＦＯＲ活性を示す株中で発現させる。条件、プロモーターなどは前に記載されている。
【０２３４】
この実施例では、合成ガスおよびメタノール利用経路をもたらす遺伝子のクローニングおよび発現、および適切な活性のアッセイについて記載する。
【０２３５】
（実施例ＸＩＩＩ）
合成ガスおよびメタノールを利用するように設計製作した生物体からアセチルＣｏＡを生成するための発酵プロセスの開発および最適化
この実施例では、合成ガスおよびメタノールを利用する生物体の発酵条件の開発および最適化について記載する。
【０２３６】
合成ガス発酵で重要なプロセスの考慮事項は、高いバイオマス濃度および良好なガス−液物質移動である（Ｂｒｅｄｗｅｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．、１５巻、８３４〜８４４頁（１９９９年））。水中のＣＯの溶解度は、酸素の溶解度よりいくぶん低い。連続ガススパージ発酵は、制御された発酵槽中で質量分析による常時のオフガス分析ならびに定期的な液体サンプリングとＧＣおよびＨＰＬＣによる分析により行うことができる。液相は、バッチモードで機能し得る。アルコール、有機酸、および残留グルコース、ならびに残留メタノールなどの発酵産物は、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ＭＤ）によって、例えばＡｍｉｎｅｘ（登録商標）シリーズのＨＰＬＣカラム（例えばＨＰＸ−８７系）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）を使用し、グルコースおよびアルコールに対して屈折率検出器を、そして有機酸に対してＵＶ検出器を使用して定量化する。増殖速度は分光光度計を使用して光学密度（６００ｎｍ）を測定することにより決定する。これらのシステムにおける全ての配管は、嫌気的条件を維持するためにガラスまたは金属である。ガスのスパージは、気泡径を減少させ、物質移動を改善するためにガラスフリットを用いて行う。約０．１〜１ｖｖｍ（１分当たりの蒸気容積）の範囲の種々のスパージ速度を試験する。ガスの取込み速度の正確な測定値を得るために、ガスの流れを一時的に止める定期的なチャレンジを行い、ガス相の組成を時間の関数としてモニターする。
【０２３７】
総括的な目標生産性を達成するために、細胞保持またはリサイクルの方法を用いる。微生物の生物体の濃度を増加させる１つの方法は、タンジェンシャルフロー膜を介して側留から細胞をリサイクルすることである。Ｍｏｏｒｅｌｌａによるアセテートの生成について以前に記載されたように（Ｓａｋａｉら、  Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、９９巻、２５２〜２５８頁（２００５年））、反復バッチ式培養も用いることができる。他の種々の方法も用いることができる（Ｂｒｅｄｗｅｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．、１５巻、８３４〜８４４頁（１９９９年）；Ｄａｔａｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、８６巻、５８７〜５９４頁（２００４年））。物質移動を改善するために、１．５気圧の超過圧力などのさらなる最適化も試験することができる（ＮａｊａｆｐｏｕｒおよびＹｏｕｎｅｓｉ、Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３８巻、２２３〜２２８頁（２００６年））。
【０２３８】
フィードとして純粋なＨ２／ＣＯを用いて満足のいく成績が達成されたならば、商用合成ガス中に存在する可能性が高い阻害物質を含む合成ガス混合物を発生させる。例えば、典型的な不純物プロファイルは、４．５％ＣＨ４、０．１％Ｃ２Ｈ２、０．３５％Ｃ２Ｈ６、１．４％Ｃ２Ｈ４および１５０ｐｐｍの一酸化窒素である（Ｄａｔａｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、８６巻、５８７〜５９４頁（２００４年））。ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、ｐ−キシレン、ｏ−キシレンおよびナフタレンなどの化合物に代表されるタールは、生成に対する影響の有無を試験するためにｐｐｍレベルで加える。例えば、４０ｐｐｍのＮＯはＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓに対して阻害性であることが示されている（ＡｈｍｅｄおよびＬｅｗｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  、９７巻、１０８０〜１０８６頁（２００７年））。培養物は、発酵槽に移す前に振とうフラスコ培養物中で試験する。また、異なるレベルのこれらの潜在的阻害性化合物を試験して、それらが細胞増殖に及ぼす影響を定量化する。この知識を用いて、スケールアップ試験および生産のために用いられる合成ガス純度に関する仕様を策定する。特定の成分がスケールアップに用いる合成ガスから減少させるかまたは除去することが困難であることがわかった場合、１つまたは複数の不純物に耐えるように細胞を適応させるために、適応進化法を利用する。
【０２３９】
この実施例では、合成ガスおよびメタノールを利用する生物体の発酵条件の開発および最適化について記載する。
【０２４０】
（実施例ＸＩＶ）
ＣＯおよび嫌気性培養物を取り扱うための方法
この実施例では、ＣＯおよび嫌気性培養物を取り扱うための方法について記載する。
【０２４１】
アッセイ用の少量のＣＯおよび少量の培養物の取扱い。ＣＯは、毒性である無臭、無色および無味の気体である。したがって、ＣＯを利用する培養物およびアッセイは特別な取扱いを必要とし得る。ＣＯ酸化、アセチルＣｏＡ合成、ミオグロビンを使用するＣＯ濃度、および少量のバッチ培養物中のＣＯ耐性／利用を含めた、いくつかのアッセイは、換気フード内で分注し取り扱うことができる少量のＣＯ気体を必要とする。生化学的アッセイは、非常に少量（＜２ｍｌ）の生化学的アッセイ用培地またはバッファーをＣＯで飽和し、次いでアッセイを実施することを必要とした。ＣＯを取り扱う段階の全てを、適切な高さでサッシセットを有し送風機のスイッチを入れた換気フード内で実施し、ＣＯはシュレンクラインと結合した圧縮気体シリンダーおよびレギュレーターから分注した。後者は、等しい濃度のＣＯがいくつかの考えられるキュベットまたはバイアルのそれぞれに分注されることを確実にする。インプット側に酸素スクラバー、および反対側に油圧放出バブラーおよび通気口を含有する、シュレンクラインを設定した。あるいは、冷却トラップを使用することができる。アッセイ用キュベットは嫌気性とＣＯ含有の両方であった。したがって、アッセイ用キュベットはゴム栓でしっかりと密閉し、気密性ニードルおよびシリンジを使用して試薬を添加または除去した。第２に、少量（約５０ｍｌ）の培養物を、しっかりと密閉した血清容器中において飽和ＣＯで増殖させた。生化学的アッセイと同様に、ＣＯ飽和微生物培養物を、シュレンクラインの設定を使用して換気フード内で平衡状態にした。生化学的アッセイと微生物培養物の両方がポータブルな密閉容器中であり、かつ少量であり、これにより換気フードの外側での安全な取扱いを可能にした。圧縮ＣＯタンクは換気フードと隣接していた。
【０２４２】
典型的には、シュレンクラインを使用してＣＯをキュベットに分注し、それぞれに通気口を設けた。キュベット上のゴム栓は１９または２０ゲージの使い捨て注射針で穴を開け、同様に通気口を設ける。油圧バブラー（ｏｉｌ  ｂｕｂｂｌｅｒ）をＣＯタンクおよび酸素スクラバーと共に使用する。ガラス製または石英製の分光光度計用キュベットは上部に丸穴を有し、その中にＫｏｎｔｅｓストッパースリーブ、Ｓｚ７７７４２５０−０００７を適合させた。ＣＯ検出器ユニットは換気フードの近くに配置した。
【０２４３】
大規模培養物に供給する多量のＣＯの取扱い。発酵培養物にＣＯまたはＣＯとＨ２の混合物のいずれかを供給して、発酵生産中の合成ガスまたはフィードストックとしての合成ガスをシミュレートする。したがって、１リットルから数リットルの範囲の量の細胞が、培地中のＣＯの溶解濃度を増大するためのＣＯ気体の添加を含み得る。これらの状況では、非常に多くの連続投与される量のＣＯ気体を培養物に加える。異なる時点において、培養物を採取し、またはサンプルを除去する。あるいは、発酵槽の一部である組み込んだ連続流遠心分離機を用いて細胞を採取することができる。
【０２４４】
発酵プロセスは嫌気的条件下において一般的に実施する。いくつかの場合、酸素または空気を発酵槽中にポンプで注入して、呼吸環境を与えるのに適した酸素飽和状態を確実にすることは経済的ではない。さらに、嫌気的発酵中に生じる還元力は、呼吸よりも生成物の形成において必要とされる可能性がある。さらに、様々な経路に考えられる酵素の多くは、様々な程度で酸素感受性である。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａなどの古典的なアセテート生成菌は偏性嫌気性菌であり、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路中の酵素は分子状酸素による不可逆的失活に対して非常に感受性がある。酸素耐性アセテート生成菌が存在する一方で、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路中の酵素のレパートリーは、大部分が金属酵素であり、重要な構成要素はフェレドキシンであり、制御は代謝をＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路から逸脱させてエネルギー入手を最大にする可能性があるので、酸素の存在下でいずれも問題を有する可能性がある。同時に、培養中の細胞は酸素スカベンジャーとして働くことができ、これらは大規模な細胞増殖の存在下での非常手段の必要性を抑える。
【０２４５】
嫌気的チャンバーおよび条件。例示的な嫌気的チャンバーは市販されている（例えば、Ｖａｃｕｕｍ  Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ  ＣＡ；ＭＢｒａｕｎ、Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ  ＭＡを参照）。例示的な条件は、１ｐｐｍ以下のＯ２濃度および１ａｔｍの純粋Ｎ２を含む。一例では、３酸素スクラバー／触媒再生器を使用することができ、チャンバーはＯ２電極を含むことができる（Ｔｅｌｅｄｙｎｅなど；Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  ＣＡ）。ほぼ全てのアイテムおよび試薬を、内側チャンバードアを開く前にチャンバーのエアロック中で４回（４Ｘ）循環させる。５ｍｌを超える体積を有する試薬を、チャンバーへの導入前に純粋Ｎ２でスパージする。グローブは１年で約２回とりかえ、チャンバーが酸素レベルの変化に対して次第に緩慢な応答を示すとき、触媒容器は定期的に再生する。チャンバーの圧力はソレノイドにより活性化される一方向バルブによって制御する。それによって周囲より高いレベルにチャンバー圧を設定することができ、パージバルブによる非常に小さなチューブの移動を可能にするので、この特徴は非常に好都合である。
【０２４６】
嫌気的チャンバーは、絶えず非常に低く高度に酸素感受性である嫌気的条件に必要とされる、到達可能なＯ２のレベルを得ることができる。しかしながら、細胞の増殖および取扱いは通常このような予防措置を必要としない。代替の嫌気的チャンバーの構成では、混合中にいくらかの水素ガスを必要とする触媒として、プラチナまたはパラジウムを使用することができる。ソレノイドバルブを使用する代わりに、圧力放出はバブラーによって制御する。機器ベースのＯ２モニタリングを使用する代わりに、試験用ストリップを代わりに使用することができる。嫌気的条件を改善するために、本発明者らのシステム中にいくつかの比較的簡単な変化を施すことができ、いくつかは既に進行中である。
【０２４７】
嫌気性微生物学。ＣＯの取扱いに関して前に記載したように少量の培養物を取り扱う。特に、血清容器または培地容器に厚いゴム栓を取り付け、アルミニウム製クリンプを使用して容器を密閉する。Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈなどの培地を従来の方法で作製し、適切にサイズ分けした血清容器に分注する。容器には適度なバブリングで約３０分間窒素をスパージする。これは培地から大部分の酸素を除去し、この段階の後、それぞれの容器にゴム栓でキャップし（Ｂｅｌｌｃｏの２０ｍｍセプタムストッパーなど；Ｂｅｌｌｃｏ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ）、クリンプで密閉する（Ｂｅｌｌｃｏの２０ｍｍ）。次いで培地容器を、緩慢な（液体）排出サイクルを使用してオートクレーブにかける。少なくとも時折、ストッパーを介して針を突き刺しオートクレーブ中に排出をもたらすことができ、オートクレーブからの除去時に針はすぐに除去する必要がある。滅菌培地は、シリンジおよび針を介して加えた残存培地成分、例えばバッファーまたは抗生物質を有する。還元剤を加える前に、容器は窒素（または用途に応じてＣＯ）を用いて３０〜６０分間平衡状態にする。１００×１５０ｍＭの硫化ナトリウム、２００ｍＭのシステイン−ＨＣｌなどの還元剤を加えることができる。これは、硫化ナトリウムを乾燥ビーカー中に計量し、システインを血清容器中に計量し、両方を嫌気的チャンバーに入れ、硫化ナトリウムを嫌気水に溶かし、次いでこれを血清容器中のシステインに加えることによって行った。硫化ナトリウム溶液はシステインとの接触によって硫化水素ガスを発生するので、容器はすぐに密閉するべきである。培養物に注入するとき、シリンジフィルターを使用して溶液を滅菌する。Ｂ１２（１０μＭのシアノコバラミン）、塩化ニッケル（ＮｉＣｌ２、チャンバー内の嫌気水中で作製した４０ｍＭストックからの２０マイクロモルの最終濃度、かつオートクレーブ処理によって、または培養物への注入時のシリンジフィルターの使用によって滅菌済み）、および硫酸第一鉄アンモニウム（必要とされる最終濃度は１００μＭである−チャンバー内の嫌気水中で１００〜１０００×ストック溶液として作製、かつオートクレーブ処理によって、または培養物への注入時のシリンジフィルターの使用によって滅菌済み）などの、他の成分を注射針を介して加えることができる。嫌気的条件下でのより速い増殖を容易にするために、１リットル容器に嫌気的に増殖した５０ｍｌの前培養物を接種した。ベクターにおけるｐＡ１−ｌａｃＯ１プロモーターの誘導は、０．２ｍＭの最終濃度までイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えることによって実施し、約３時間実施した。
【０２４８】
バブリングしながら連続的な気体の添加を使用して、大容器中で多量の培養物を増殖させることができる。金属製バブラーを備えるゴム栓を培地添加後に容器中に置き、容器の残り部分をセットアップする前に３０分以上窒素をスパージする。滅菌フィルターが容器内で気泡化する気体を滅菌し、容器上のホースが小型Ｃクランプで圧縮可能であるように、それぞれの容器を一緒に置く。培地および細胞は磁気攪拌バーで攪拌する。全ての培地成分および細胞を加えた後、容器を室内空気中においてインキュベーター中でインキュベートすることはできるが、容器中には連続的に窒素をスパージする。
【０２４９】
この実施例では、ＣＯおよび嫌気性培養物の取扱いについて記載する。
【０２５０】
（実施例ＸＶ）
ＣＯ酸化（ＣＯＤＨ）アッセイ
この実施例では、ＣＯ酸化（ＣＯデヒドロゲナーゼ；ＣＯＤＨ）を測定するためのアッセイ法について記載する。
【０２５１】
Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの７遺伝子ＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロンをＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターにクローニングした。完全な約１０ｋｂｐのＤＮＡ断片をクローニングしたが、この領域中の遺伝子のいくつかはそれら独自の内因性プロモーターから発現され、全てが内因性リボソーム結合部位を含有する可能性がある。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａはグラム陽性菌であり、リボソーム結合部位のエレメントはＥ．ｃｏｌｉ中でよく働くと予想される。ＣＯＤＨ活性を定量的に測定するアッセイを使用して、これらのクローンをＣＯ酸化に関してアッセイした。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの遺伝子産物に対する抗血清をウエスタンブロットに使用して、比活性を推定した。以下でより詳細に記載するこの活性は、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの比活性の約５０分の１であると推定した。
【０２５２】
組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞のＣＯＤＨ活性は、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの酵素が５５℃近辺で温度最適性を有するという事実によって制限される可能性があると考えられる。したがって、中温性であり明らかに完全なＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロンおよびＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を有するＭｏｏｒｅｌｌａの近縁、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｆｎｉｅｎｓｅなどの中温性ＣＯＤＨ／ＡＣＳ経路が有利である可能性がある。考えられる宿主生物体としてのアセテート生成菌には、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａおよびＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｆｎｉｅｎｓｅがあるが、これらだけには限られない。
【０２５３】
ＣＯ酸化は、ＣＯＤＨ／ＡＣＳアッセイの最も感度が高くかつ最も確実な酸化である。Ｅ．ｃｏｌｉベースの合成ガスを使用する系は、特に最大活性に関して、クロストリジウム属（すなわち、Ｍｏｏｒｅｌｌａ）系と同程度に嫌気的であることを最終的に必要とする可能性がある。ＣＯＤＨの改善は実行できるはずであるが、最終的には水中でのＣＯガスの溶解性によって制限される。
【０２５４】
最初に、遺伝子のそれぞれを発現ベクターに個別にクローニングした。複数のサブユニット／１複合体の組合せ発現単位を作製した。タンパク質レベルでのＥ．ｃｏｌｉ中での発現を決定した。組合せたＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロンと個別の発現クローンの両方を作製した。
【０２５５】
ＣＯ酸化アッセイ。このアッセイはＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路内の酵素活性のうち、より簡潔で、より信頼できる、より用途が広いアッセイの１つであり、ＣＯＤＨを試験する（Ｓｅｒａｖａｌｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３巻、３９４４〜３９５５頁（２００４年））。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＣＯＤＨの比活性の典型的な活性は、５５℃での５００Ｕまたは２５℃での約６０Ｕである。このアッセイは、ＣＯの存在下でのメチルビオローゲンの還元を利用する。これはストッパー付き、嫌気性の、ガラス製キュベット中において５７８ｎｍで測定する。
【０２５６】
より詳細には、最初に脱イオン水で４回、およびアセトンで１回キュベットを洗浄した後に、ガラス製のゴム栓付きキュベットを調製した。少量の真空グリースをラバーガスケットの上部に塗った。キュベットにＣＯガスを与え、２２Ｇａ．ニードルおよび排気用ニードルで１０分間乾燥させた。０．９８ｍｌ体積の反応バッファー（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．５、２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ））を、排気用ニードルをつけて、２２Ｇａ．ニードルを使用して加え、そして１００％ＣＯを加えた。メチルビオローゲン（ＣＨ３ビオローゲン）ストックは水中に１Ｍであった。それぞれのアッセイは、２０ｍＭの最終濃度で２０マイクロリットルを使用した。メチルビオローゲンを加えたとき、１８Ｇａニードル（一部分）はＣＨ３ビオローゲンを引き出すためのハミルトンシリンジの使用を容易にするためのジャケットとして使用した。４〜５のアリコートを調製し、廃棄して洗浄し、ガスでシリンジを平衡化した。ＣＨ３ビオローゲンストックを作製してＣＨ３ビオローゲンをわずかに還元したとき、少量の亜ジチオン酸ナトリウム（０．１Ｍストック）を加えた。温度は加温したＯｌｉｓ分光光度計（Ｂｏｇａｒｔ  ＧＡ）中で５５℃に平衡化した。ブランク反応（ＣＨ３ビオローゲン＋バッファー）を最初に実施して、ＣＨ３ビオローゲン還元の基本速度を測定した。ＡＣＳ９０およびＡＣＳ９１（それぞれ第１のｃｏｏＣ有りおよび無しのＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＣＯＤＨ−ＡＣＳオペロン）の粗製Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物。１０マイクロリットルの抽出物を一度に加え、混合しアッセイした。還元ＣＨ３ビオローゲンは紫色になる。アッセイの結果は表Ｘ中に示す。
【０２５７】
【表２】
2019103519.tif 000028
Ｍｔａ９８／Ｍｔａ９９は、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉａ由来のメタノールメチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５株であり、したがって、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＣＯＤＨオペロンを含有するＡＣＳ９０  ＡＣＳ９１Ｅ．ｃｏｌｉ株の陰性対照である。
【０２５８】
約１％の細胞タンパク質がＣＯＤＨである場合、これらの数字は、純粋なＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＣＯＤＨの５００Ｕ／ｍｇ活性より約１００倍低いことになる。ウエスタンブロットに基づく実際の推定値は０．５％の細胞タンパク質であり、したがって活性は、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＣＯＤＨの活性より約５０倍低い。それにもかかわらず、この実験は、陰性対照における一層少ない量での組換えＥ．ｃｏｌｉ中でのＣＯの酸化活性を明らかに実証した。陰性対照において見られた少量のＣＯの酸化（ＣＨ３ビオローゲンの還元）は、Ｅ．ｃｏｌｉがＣＨ３ビオローゲンを還元する限られた能力を有し得ることを示す。
【０２５９】
ＣＯＤＨおよびＭｔｒタンパク質の最終濃度を推定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次にウエスタンブロット分析を、ＣＯ酸化、ＡＣＳ、メチルトランスフェラーゼ、およびコリノイドＦｅ−Ｓアッセイにおいて使用した同じ細胞抽出物に実施した。使用した抗血清は精製されたＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＣＯＤＨ−ＡＣＳおよびＭｔｒタンパク質に対するポリクローナル抗血清であり、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体を使用して視覚化した。ウエスタンブロット分析を実施し、結果を図９Ａおよび９Ｂに示す。ＡＣＳ９０およびＡＣＳ９１中のＣＯＤＨの量は、対照レーンとの比較によって５０ｎｇであると推定した。２ＣＯＤＨサブユニットおよびメチルトランスフェラーゼを含むＣＯＤＨ−ＡＣＳオペロン遺伝子の発現は、ウエスタンブロット分析によって確認した。したがって、組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞は７遺伝子オペロンの複数の成分を発現する。さらに、メチルトランスフェラーゼとコリノイド鉄硫黄タンパク質の両方が同じ組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞中で活性があった。これらのタンパク質は、同じ細胞にクローニングした同じオペロンの一部分である。
【０２６０】
ＣＯ酸化アッセイを、陽性対照のＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ細胞の抽出物を使用して繰り返した。Ｅ．ｃｏｌｉＡＣＳ９０およびＡＣＳ９１中のＣＯＤＨ活性は測定可能であったが、それはＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ対照より約１３０〜１５０倍低かった。アッセイの結果は図１０中に示す。簡単に述べると、細胞（ＣＯＤＨ／ＡＣＳオペロンを有するＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａまたはＥ．ｃｏｌｉ、ＡＣＳ９０またはＡＣＳ９１または空ベクター：ｐＺＡ３３Ｓ）を増殖させ、抽出物を前に記載したように調製した。抽出物を調製した日に、様々な時間で５５℃において前に記載したようにアッセイを実施した。メチルビオローゲンの還元は１２０秒間にわたるタイムコースで５７８ｎｍにおいて追跡した。
【０２６１】
これらの結果は、ＣＯ酸化（ＣＯＤＨ）アッセイおよび結果について記載する。メチルビオローゲン還元アッセイにより測定して、組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞はＣＯ酸化活性を発現した。
【０２６２】
（実施例ＸＶＩ）
アセチルＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）の活性アッセイ（ＣＯ交換アッセイ）
この実施例では、ＡＣＳのアッセイ法について記載する。
【０２６３】
このアッセイは、ＣＯとアセチルＣｏＡのカルボニル基のＡＣＳ触媒型交換を測定する（Ｒａｙｂｕｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７巻、７６９８〜７７０２頁（１９８８年））。（精製酵素または細胞抽出物の一部のいずれかとしての）ＡＣＳを、ＣＯ雰囲気下でカルボニル炭素において１４Ｃで標識したアセチルＣｏＡと共にインキュベートする。活性ＡＣＳの存在下において、反応物の液体相中の放射活性は、それが１４Ｃ標識アセチルＣｏＡと１４Ｃ標識ＣＯのレベル間の平衡により定義される最小値に達するまで、指数関数的に低減する。ＡＣＳ９０およびＡＣＳ９１を発現するＥ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５の同じ細胞抽出物は他のアッセイで利用し、かつ対照抽出物はこの方法によってアッセイした。
【０２６４】
簡単に述べると、より詳細には、正常雰囲気下で小さなアッセイ用バイアル中に、０．３ＭのＭＥＳバッファー、ｐＨ６．０中の０．２ｍＭアセチルＣｏＡ、０．１ｍＭメチルビオローゲン、および２ｍＭＴｉ（ＩＩＩ）シトレートの溶液を作製した。全成分を加えたときの合計反応物体積は５００μｌであった。バイアルはゴム栓（Ｂｅｌｌｃｏ）およびクリンプアルミニウムシール（Ｂｅｌｌｃｏ）で密閉して、気密性の反応雰囲気をもたらした。それぞれのバイアルに１００％ＣＯを数分間、バイアルの雰囲気を完全に交換するほど十分長くスパージし、嫌気的チャンバーに移した。アッセイ用バイアルは５５℃の砂浴中に置き、その温度に平衡化した。４０μｌの１ＭのＨＣｌを含む合計１０個のシンチレーションバイアルを、それぞれのアッセイ用バイアルに関して調製した。気密性のハミルトンシリンジを使用してＡＣＳをアッセイ用バイアルに加え、約２〜３分間インキュベートして反応を平衡状態に近づけた。気密性のハミルトンシリンジを使用して１μｌ（０．３６ｎｍｏｌｅ）の１４ＣアセチルＣｏＡを加え、アッセイを開始した（時間＝０分）。開始して直ちに時点（ｔｉｍｅ  ｐｏｉｎｔ）をとった。気密性のハミルトンシリンジを用いて、アッセイ用バイアルからサンプル（４０μｌ）を除去した。調製したシンチレーションバイアル中の４０μｌのＨＣｌにそれぞれのサンプルを加えて、反応をクエンチした。ＡＣＳ酵素はアセチルＣｏＡからＣＯに１４Ｃ標識を移すので、アイソトープの濃度は指数関数的に低下する。したがって、アッセイでは初期の時点で頻繁にサンプル採取した。それぞれのサンプルに関する正確な時間を記録した。反応の正確なペースはＡＣＳ酵素に依存するが、一般に数個のサンプルをすぐに得て、最初の１０〜１５分にわたってサンプル採取する。サンプルは１〜２時間採取し続ける。
【０２６５】
特定の例示的なアッセイでは、４つのアッセイ条件、ブランク（ＡＣＳ含まず）、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのＡＣＳを発現する１２μｌの精製Ｅ．ｃｏｌｉ株、４μｌの精製Ｅ．ｃｏｌｉＡＣＳ、および３．７μｌのＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａＣＯＤＨ／ＡＣＳを使用した。別の例示的なアッセイでは、４つのアッセイ条件、１０８μｇのＣＯＤＨ／ＡＣＳ、１ｍｇのＭｔａ９９細胞抽出物、１ｍｇのＡＣＳ９０細胞抽出物、および１ｍｇのＡＣＳ９１細胞抽出物を使用した。酵素は１００μｌ溶液（５０ｍＭのＫＰｉ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６）として加えた。大部分のＣＯＤＨ−ＡＣＳ活性に使用することができるより高感度なアッセイは、以下に記載する合成アッセイである。
【０２６６】
この実施例では、ＡＣＳ活性を測定するためのアッセイ条件について記載する。
【０２６７】
（実施例ＸＶＩＩ）
アセチルＣｏＡの合成およびメチルトランスフェラーゼアッセイ
この実施例では、アセチルＣｏＡの合成およびメチルトランスフェラーゼアッセイについて記載する。
【０２６８】
合成アッセイ。このアッセイは、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ、メチルトランスフェラーゼ（ＭｅＴｒ）、およびコリノイドＦｅ−Ｓタンパク質（ＣＦｅＳＰ）を使用して、メチルテトラヒドロ葉酸、ＣＯ、およびＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成するｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応である（Ｒａｙｂｕｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７巻、７６９８〜７７０２頁（１９８８年））。関与するそれぞれの酵素を添加または除外することによって、このアッセイは、活性に関する、１つまたは複数の精製酵素または細胞抽出物の試験から、様々な条件下または限られた量の基質または酵素を用いた反応のキネティクスの決定まで、広範囲の実験に使用することができる。様々な時点で得た反応のサンプルを１ＭのＨＣｌでクエンチし、これによってアセテートをアセチルＣｏＡの最終産物から切り離す。Ｄｏｗｅｘカラムでの精製後、クロマトグラフィー、質量分析によって、または放射活性の測定によってアセテートを分析することができる。正確な方法は、反応物中で使用する特異的基質によって決定される。
【０２６９】
１４Ｃ標識メチルＴＨＦを利用して、単離したアセテートサンプルの放射活性を測定した。主な目的はＣＦｅＳＰサブユニットを試験することであった。このアッセイは＋／−精製メチルトランスフェラーゼ酵素も含んでいた。以下の６つの異なる条件、（１）陽性対照として、精製ＣＯＤＨ／ＡＣＳ、ＭｅＴｒ、およびＣＦｅＳＰ、（２）精製ＣＯＤＨ／ＡＣＳおよびＡＣＳ９０細胞抽出物、（３）精製ＣＯＤＨ／ＡＣＳおよびＡＣＳ９１細胞抽出物、（４）精製ＣＯＤＨ／ＡＣＳ、ＭｅＴｒおよびＡＣＳ９０細胞抽出物、（５）精製ＣＯＤＨ／ＡＣＳ、ＭｅＴｒおよびＡＣＳ９１細胞抽出物、（６）精製ＣＯＤＨ／ＡＣＳ、ＭｅＴｒおよび可能な限り多くのＡＣＳ９１細胞抽出物（ＭＥＳバッファー除く）をアッセイした。
【０２７０】
ＣＯを充填したアッセイ用バイアル中嫌気的チャンバー中で反応物を構築する。合計反応物体積はバイアル体積と比較して小さく、したがって、気密性のハミルトンシリンジを使用し試薬を嫌気性に保つ限り、バイアルをＣＯで充填する前後に試薬を加えることができる。反応物（合計約６０ｕｌ）は、細胞抽出物（アッセイ番号１以外）、ＣｏＡ、Ｔｉ（ＩＩＩ）シトレート、ＭＥＳ（アッセイ番号６以外）、精製ＣＯＤＨ／ＡＣＳ、１４Ｃメチルテトラヒドロ葉酸、メチルビオローゲン、およびフェレドキシンからなっていた。さらに、精製ＭｅＴｒをアッセイ番号１および番号４〜６に加え、かつ精製ＣＦｅＳＰをアッセイ番号１に加えた。
【０２７１】
５５℃での砂浴中の嫌気的チャンバーにおいて反応を実施した。加えた最終試薬は１４Ｃメチルテトラヒドロ葉酸であり、これによって反応を開始した（ｔ＝０秒）。初期サンプルをすぐに採取し、次に３０分、１時間、および２時間でサンプルを採取した。６つの条件は同時に実施したので（この実験は主に定性実験であったので）、これらの時点は正確ではない。シンチレーションバイアル中の１５μｌの１Ｍ  ＨＣｌに１５μｌのサンプルを加えた。最終サンプルに関して、１５μｌ未満が反応物中に残った場合、アッセイ用バイアルは１５μｌのＨＣｌですすいで、反応物の残りを得た。１０μｌ体積の細胞抽出物をアッセイ番号２〜５に使用し、かつ２６．４μｌ体積の細胞抽出物をアッセイ番号６に使用した。
【０２７２】
アッセイ中で使用する精製酵素の典型的な量は以下の通りである：ＣＯＤＨ／ＡＣＳ＝約０．２ｎｍｏｌｅ、ＭｅＴｒ＝０．２ｎｍｏｌｅ、ＣＦｅＳＰ＝０．０５ｎｍｏｌｅ。以下のような典型的なアッセイ濃度を使用する：ＣＯＤＨ／ＡＣＳ＝１ｕＭ、Ｍｅ−ＣＦｅＳＰ＝０．４ｕＭ、ＭｅＴｒ＝１ｕＭ、フェレドキシン＝３ｕＭ、ＣｏＡ＝０．２６ｍＭ、１４Ｃメチル−ＴＨＦ＝０．４ｍＭ、メチルビオローゲン＝０．１ｍＭ、およびＴｉ（ＩＩＩ）シトレート＝３ｍＭ。
【０２７３】
反応混合物を計数した後、ＡＣＳ９０抽出物中のコリノイドＦｅ−Ｓタンパク質は活性があり、全体活性は陽性対照の約１／５に近づき、陰性対照（抽出物含まず）を有意に超えたと決定した。
【０２７４】
非放射性合成アッセイを使用することもできる。任意選択の非放射性アッセイ条件は以下の通りである：アッセイ条件番号１：１００ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、１ｍＭのＣｏＡ、１ｍＭのＭｅ−ＴＨＦ、０．３３ｍＭＴｉ（ＩＩＩ）シトレート、９５０ｕｌまでの体積、＋５０ｕｌの抽出物、５５℃でＣＯ雰囲気（対照に関してＡｒ）下でインキュベートした。コリノイドメチル担体は光感受性であるので、これらの反応は暗所で実施するべきである。アッセイ条件番号２：１００ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、１ｍＭのＣｏＡ、１ｍＭのＭｅ−ＴＨＦ、１ｍＭのメチルビオローゲン、９５０ｕｌまでの体積、＋５０ｕｌの抽出物、暗所中５５℃での、ＣＯ雰囲気下でインキュベートした。反応は１０μｌの１０％ギ酸でクエンチし、サンプルは１時間、３時間、および６．５時間で採取し、−２０℃で保存した。アッセイ条件番号３：１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．６、５ｍＭＣｏＡ、７．５ｍＭのＭｅ−ＴＨＦ、１ｍＭのＭｅ−ビオローゲン、９０μｌまでの体積、＋１０μｌの抽出物、１時間暗所中５５℃での、ＣＯまたはＡｒ下でインキュベートし、１０μｌの１０％ギ酸でクエンチし、−２０℃で保存した。
【０２７５】
Ｌｕら（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５巻、３１２４〜３１３３頁（１９９０年））では、合成反応に関するｐＨ最適条件は７．２と７．５の間であることがわかった。Ｌｕらは、１０ｍＭを超えるＣｏＡ濃度は阻害的であったことも発見した。ＬｕらはＭｅ−ＴＨＦの代わりのメチルドナーとしてのヨウ化メチルの使用を記載し、５〜７．５ｍＭの濃度を使用した。ＬｕらはＤＴＴまたは他の還元剤が必要ではなかったことも決定したが、彼らは電子伝達体としてフェレドキシンを使用した。メチルビオローゲンは前に記載した反応中で置換された。さらに、Ｍａｙｎａｒｄら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｉｎｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ９巻、３１６〜３２２頁（２００４年）は、電子伝達体は厳密には必要ではなかったが、それを含まないと合成のタイムラグをもたらしたことを決定した。Ｍａｙｎａｒｄらは、使用のときに電子伝達体として１ｍＭのメチルビオローゲンを使用した。
【０２７６】
メチルトランスフェラーゼアッセイ。ＣＯＤＨ−ＡＣＳオペロン内には、アセチルＣｏＡの合成の一部としてメチルテトラヒドロ葉酸からＡＣＳ複合体へのＣＨ３の移動を触媒する、必須のメチルトランスフェラーゼ活性がコードされている。これはメチル経路とカルボニル経路が合流する段階である。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａのオペロン内では、Ｍｔｒコード遺伝子はＭｏｔｈ＿１１９７であり、主要なＣＯＤＨサブユニットおよびＡＣＳサブユニットの後に来る。したがってＭｔｒ活性は、より近隣の遺伝子が発現され得るという間接的な証拠を構成するであろう。
【０２７７】
Ｍｔｒの活性は分光法によってアッセイした。具体的には、Ｃｏ（ＩＩＩ）を含むメチル化ＣＦｅＳＰは約４５０ｎｍで小さな吸収ピークを有し、一方Ｃｏ（Ｉ）を含む非メチル化ＣＦｅＳＰは約３９０ｎｍで大きなピークを有する。このスペクトルは、コバルトと鉄−硫黄クラスター発色団の両方に起因する。さらに、ＣＦｅＳＰはＣｏ（ＩＩ）に自然に酸化することができ、これは約４７０ｎｍで広範囲の吸収ピークをもたらす（Ｓｅｒａｖａｌｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８巻、５７２８〜５７３５頁（１９９９年））。組換えメチルトランスフェラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａから精製したＣＦｅＳＰおよびメチルテトラヒドロ葉酸を使用して試験する。コリノイドタンパク質のメチル化は、４７０ｎｍでの主要ピークの不在と共に、４５０ｎｍでの吸収の同時増大を伴う３９０ｎｍでの吸収の低下として観察される。
【０２７８】
非放射性アッセイも、１３Ｃ−メタノールを使用して開発されている。これはテトラヒドロ葉酸に移動し、分子質量＋１のＭＴＨＦを生成するはずである。あるいは、メチルトランスフェラーゼは、メタノールのメチル基のホモシステインへの移動によるメチオニンを形成することにも働くと考えられる。メチオニンの＋１の質量はＭＴＨＦ＋１またはいくつか他の可能性のものより容易に検出可能であるので、このアッセイも有用である。１３Ｃの使用に加えて、重水素をトレーサーとして使用することもでき、この両方は質量分析を使用して測定することができる。これらのトレーサーはｉｎ  ｖｉｖｏ標識試験で使用することもできる。例えば電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）、メスバウアー分光法、電子核二重共鳴（ＥＮＤＯＲ）、赤外線、磁気円二色性（ＭＣＤ）、結晶学、Ｘ線吸収、ならびにストップトフローおよびフリーズクエンチＥＰＲを含めた速度論的方法を含めた、他のアッセイ法を使用して、様々な中間体または生成物を決定することができる。
【０２７９】
図８は、メタノールメチルトランスフェラーゼをＣＯＤＨ／ＡＣＳ（「合成ガス」）経路に適合させることが可能である方法を例示する。本質的に、メタノールのメチル基は、コバラミン（ｃｏｂａｂａｌａｍｉｎ）依存性のプロセスによってテトラヒドロ葉酸、次いでＣＯＤＨ／ＡＣＳのコリノイド−ＦｅＳタンパク質（さらにコバラミンタンパク質）に移動し、それは次にメチル基をＡＣＳ反応に与え、アセテートの合成をもたらす。メタノールメチルトランスフェラーゼ複合体は３つの遺伝子産物からなり、これらの２つ、ＭｔａＢとＭｔａＣ、（Ｍｏｔｈ＿１２０９とＭｏｔｈ＿１２０８）は隣接しており、容易にクローニングした。第３のＭｔａＡは３つの異なる遺伝子（Ｍｏｔｈ＿２１００、Ｍｏｔｈ＿２１０２、およびＭｏｔｈ＿２３４６）によってコードされる可能性があり、３つの遺伝子全てが必要とされるかどうか、またはこの３つのサブセットが機能し得るかどうかは不明である。Ｅ．ｃｏｌｉにおける全てのクローニングは、Ｌｕｔｚ−Ｂｕｊａｒｄのベクターを使用して実施した（ＬｕｔｚおよびＢｕｊａｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻、１２０３〜１２１０頁（１９９７年））。
【０２８０】
以下のアッセイを使用して、メタノールメチルトランスフェラーゼの遺伝子産物をコードするＭｔａＢの活性を決定することができる。後者の陽性対照はバニレート（ｖａｎｉｌｌａｔｅ）のｏ−脱メチル化で実施することができる。
【０２８１】
メタノールメチルトランスフェラーゼ反応。例示的なメタノールメチル転移反応は以前に記載されている（ＳａｕｅｒおよびＴｈａｕｅｒ、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４９巻、２８０〜２８５頁（１９９７年）；ＮａｉｄｕおよびＲａｇｓｄａｌｅ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８３巻、３２７６〜３２８１頁（２００１年））。反応条件は以下の通りである：５０ｍＭのＭＯＰＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．０；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；４ｍＭのＴｉ（ＩＩＩ）シトレート、０．２％のドデシルマルトシド（ＳＤＳの代わり、ＳａｕｅｒおよびＴｈａｕｅｒ、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５３巻、６９８〜７０５頁（１９９８年）を参照））、２５μＭのヒドロキシコバラミン、１％のＭｅＯＨまたは１ｍＭのバニレート（メチルトランスフェラーゼの型に応じて）。
【０２８２】
これらの反応は、３７℃または５５℃において暗所でのスペクトログラフの読取りによって測定する。このアッセイは、それぞれメタノールまたはバニレートからコバラミンにメチル基を移動させる、ＭｔａＢまたはＭｔｖＢの能力を試験する。
【０２８３】
（実施例ＸＶＩＩＩ）
Ｅ．ｃｏｌｉのＣＯ耐性実験およびＣＯ濃度アッセイ（ミオグロビンアッセイ）
この実施例では、高濃度のＣＯに対するＥ．ｃｏｌｉの耐性について記載する。
【０２８４】
飽和量のＣＯの存在下でＥ．ｃｏｌｉが嫌気的に増殖することができるかどうか試験するために、小体積の嫌気性微生物学に関して前に記載したように、５０ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地（および還元溶液、ＮｉＣｌ２、Ｆｅ（ＩＩ）ＮＨ４ＳＯ４、シアノコバラミン、ＩＰＴＧ、およびクロラムフェニコール）を含む１２０ｍｌの血清容器中に培養物をセットアップした。これらの容器のうちの半分は窒素ガスで３０分間平衡化し、半分はＣＯガスで３０分間平衡化した。空ベクター（ｐＺＡ３３）は対照として使用し、ｐＺＡ３３空ベクターならびにＡＣＳ９０とＡＣＳ９１の両方を含有する培養物はＮ２とＣＯの両方で試験した。全てを接種し、３７℃で攪拌（２５０ｒｐｍ）しながら３６時間増殖させた。３６時間の間の最後に、フラスコの検査によって全てにおける多量の増殖が示された。観察した増殖の大部分は一晩で長いラグを伴って生じた。
【０２８５】
全ての培養物がＣＯの存在下で十分増殖したように見えたことを考慮して、最終ＣＯ濃度を確認した。これはＣＯに曝したときのミオグロビンのスペクトルシフトのアッセイを使用して実施した。亜ジチオン酸ナトリウムで還元したミオグロビンは４３５ｎｍで吸収ピークを有し、このピークはＣＯを用いると４２３ｎｍにシフトする。低波長および３００ｎｍ以降の全スペクトルを記録することが必要であるため、石英製キュベットを使用しなければならない。ＣＯ濃度は標準曲線に対して測定し、ＣＯの最大水溶性に関するヘンリーの法則の定数＝２０℃および１ａｔｍで９７０マイクロモルに依存する。
【０２８６】
ＣＯ濃度のミオグロビン試験用に、キュベットは水で１０回、アセトンで１回洗浄し、次いでＣＯＤＨアッセイと同様にストッパーで密閉した。Ｎ２をキュベットに約１０分間吹き付けた。１ｍｌ体積の嫌気性バッファー（ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、２ｍＭのＤＴＴ）を、ハミルトンシリンジを用いてブランク（ＣＯで平衡化せず）に加えた。１０マイクロリットル体積のミオグロビン（約１ｍＭ、変動があり得、非常に多くの量がまさに必要となる）および１マイクロリットルの亜ジチオン酸（ｄｉｔｈｉｏｎｉｔｅ）（２０ｍＭストック）を加えた。ＣＯの標準曲線は、１マイクロリットル増分で加えたＣＯ飽和バッファーを使用して作製した。ピーク高およびシフトはそれぞれの増分に関して記録した。試験した培養物はｐＺＡ３３／ＣＯ、ＡＣＳ９０／ＣＯ、およびＡＣＳ９１／ＣＯであり、これらのそれぞれを同じキュベットに１マイクロリットル増分で加えた。実験の途中で、第２のキュベットをセットアップし使用した。その結果は表３中に示す。
【０２８７】
【表３】
2019103519.tif 000029
表３中に示す結果は、ＣＯの存在または不在下で株を培養したかどうかとは無関係に培養物が増殖したことを示す。これらの結果は、Ｅ．ｃｏｌｉが嫌気的条件下でＣＯへの曝露に対して耐性であり得ること、およびＣＯＤＨ−ＡＣＳオペロンを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞がいくらかのＣＯを代謝し得ることを示す。
【０２８８】
これらの結果は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、ＣＯＤＨ／ＡＣＳを発現しようとしまいと、飽和量のＣＯの存在下で増殖することができたことを実証する。さらに、これらはＣＯの代わりに窒素中で、対照と同程度に十分増殖した。この実験は、Ｅ．ｃｏｌｉの研究室株が、正常大気圧で実施した合成ガスプロジェクトにおいて到達可能なレベルで、ＣＯに無反応であることを実証した。さらに、予備実験は、ＣＯＤＨ／ＡＣＳを発現する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞が、おそらく二酸化炭素への酸化によって、いくらかのＣＯを実際に消費したことを示した。
【０２８９】
（実施例ＩＸＸ）
４−ヒドロキシブチレートおよび１，４−ブタンジオールを生成するための例示的な経路
この実施例では、アセチルＣｏＡから４−ヒドロキシブチレートおよび１，４−ブタンジオールを生成するための例示的な経路について記載する。
【０２９０】
本明細書で開示するような、（１）メタノール有りおよび無しでの合成ガスをアセチルＣｏＡに変換するための経路と、（２）アセチルＣｏＡを４−ヒドロキシブチレート、または１，４−ブタンジオールに変換するための経路の組合せ。このように、本発明は、炭水化物フィードストックから４−ヒドロキシブチレート、または１，４−ブタンジオールを生成するように設計製作された生物体に優る固有の収率の利点を有する生産生物体および変換経路を提供する。例えば、グルコースからの４−ヒドロキシブチレート、および１，４−ブタンジオールの最大理論収率は、本明細書に記載するアセチルＣｏＡから進行する代謝経路を使用して１モル当たり１モルである。具体的には、解糖によりグルコース１モル当たり２モルのアセチルＣｏＡが誘導され、かつ２モルのアセチルＣｏＡが、４−ヒドロキシブチレート、または１，４−ブタンジオールの１モル当たりに必要とされる。正味の変換は以下の化学量論式によって記載される：
４−ヒドロキシブチレート：Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋１．５Ｏ２→Ｃ４Ｈ８Ｏ３＋２ＣＯ２＋２Ｈ２Ｏ
１，４−ブタンジオール：Ｃ６Ｈ１２Ｏ６→Ｃ４Ｈ１０Ｏ２＋ＣＨ２Ｏ２＋ＣＯ２
一方、そのより単純な成分、ＣＯおよびＨ２へのグルコースのガス化、次に本明細書に記載する経路を使用する、４−ヒドロキシブチレート、および１，４−ブタンジオールへのそれらの変換は、以下の最大理論収率をもたらす：
４−ヒドロキシブチレート：６ＣＯ＋６Ｈ２→１．３３３Ｃ４Ｈ８Ｏ３＋０．６６７ＣＯ２＋０．６６７Ｈ２Ｏ
１，４−ブタンジオール：６ＣＯ＋６Ｈ２→１．０９１Ｃ４Ｈ１０Ｏ２＋１．６３６ＣＯ２＋０．５４５Ｈ２Ｏ
グルコースのガス化は、６モルのＣＯおよび６モルのＨ２を最大で与えることができることに留意されたい。合成ガスからの４−ヒドロキシブチレート、および１，４−ブタンジオールの最大理論収率は、以下に記載するようなメタノールの添加によってさらに高めることができる：
４−ヒドロキシブチレート：ＣＨ４Ｏ＋６ＣＯ＋６Ｈ２→１．６６７Ｃ４Ｈ８Ｏ３＋０．３３３ＣＯ２＋１．３３３Ｈ２Ｏ
１，４−ブタンジオール：ＣＨ４Ｏ＋６ＣＯ＋６Ｈ２→１．３６４Ｃ４Ｈ１０Ｏ２＋１．５４５ＣＯ２＋１．１８２Ｈ２Ｏ
４−ヒドロキシブチレート：２ＣＨ４Ｏ＋６ＣＯ＋６Ｈ２→２Ｃ４Ｈ８Ｏ３＋２Ｈ２Ｏ
１，４−ブタンジオール：２ＣＨ４Ｏ＋６ＣＯ＋６Ｈ２→１．６３６Ｃ４Ｈ１０Ｏ２＋１．４５５ＣＯ２＋１．８１８Ｈ２Ｏ
したがって、本明細書に記載する生物体および変換経路は、炭水化物を４−ヒドロキシブチレート、または１，４−ブタンジオールに変換する有効な手段をもたらすことは明らかである。
【０２９１】
アセトアセチルＣｏＡチオラーゼは、２分子のアセチルＣｏＡをそれぞれアセトアセチルＣｏＡとＣｏＡの１分子に変換する。例示的なアセトアセチルＣｏＡチオラーゼ酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のａｔｏＢ（Ｍａｒｔｉｎら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１巻、７９６〜８０２頁（２００３年））、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｔｈｌＡおよびｔｈｌＢ（Ｈａｎａｉら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７３巻、７８１４〜７８１８頁（２００７年）；Ｗｉｎｚｅｒら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２巻、５３１〜５４１頁（２０００年）、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＥＲＧ１０  Ｈｉｓｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９巻、３１３８３〜３１３８９頁（１９９４年））の遺伝子産物を含む。
【０２９２】
【数２５】
2019103519.tif 000030
アセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに変換する例示的な３−ヒドロキシアシルデヒドロゲナーゼは、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｈｂｄ（Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７８巻、３０１５〜３０２４頁（１９９６年））、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来のｈｂｄ（ＣｏｌｂｙおよびＣｈｅｎら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５８巻、３２９７〜３３０２頁（１９９２年））、およびＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ由来のいくつかの類似した酵素（Ｂｅｒｇら、２００７  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８巻、１７８２〜１７８６頁（２００７年））を含む。
【０２９３】
【数２６】
2019103519.tif 000031
Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｃｒｔの遺伝子産物は、クロトニルＣｏＡへの３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの脱水を触媒する（Ａｔｓｕｍｉら、Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ（２００７年）；Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７８巻、３０１５〜３０２４頁（１９９６年））。さらに、エノイルＣｏＡヒドラターゼは可逆的酵素であり、したがってクロトニルＣｏＡへの３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの脱水を触媒するのに適した候補である。エノイルＣｏＡヒドラターゼ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａのｐｈａＡおよびｐｈａＢ）は、フェニルアセテートの異化中に二重結合のヒドロキシル化を実施すると考えられる（Ｏｌｉｖｅｒａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９５巻、６４１９〜６４２４頁（１９９８年））。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のｐａａＡおよびｐａａＢは類似した形質転換を触媒する（Ｏｌｉｖｅｒａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９５巻、６４１９〜６４２４頁（１９９８年））。最後に、いくつかのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ遺伝子は、ｍａｏＣ、ｐａａＦ、およびｐａａＧを含めた、エノイルＣｏＡヒドラターゼの機能性を実証することが示されている（Ｉｓｍａｉｌら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７０巻、３０４７〜３０５４頁（２００３年）；ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８５巻、５３９１〜５３９７頁（２００３年）；ＰａｒｋおよびＬｅｅ、Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １１３〜１１６：３３５〜３４６頁（２００４年）；ＰａｒｋおよびＹｕｐ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８６巻、６８１〜６８６頁（２００４年））。
【０２９４】
【数２７】
2019103519.tif 000032
ｉｎ  ｖｉｖｏでの逆反応（すなわち、クロトノイルＣｏＡへの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡの脱水）を天然に触媒するいくつかの酵素が、多数の種において同定されている。この形質転換は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍによる４−アミノブチレートの発酵（ＳｃｈｅｒｆおよびＢｕｃｋｅｌ、Ｅｕｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１５巻、４２１〜４２９頁（１９９３年））およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉによるスクシネート−エタノールの発酵（Ｓｃｈｅｒｆら、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １６１巻、２３９〜２４５頁（１９９４年））に使用される。この形質転換は、３−ヒドロキシプロピオネート／４−ヒドロキシブチレートの独立栄養二酸化炭素同化経路の一部としての、古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）、例えばＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａにおける段階でもある（Ｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８巻、１７８２〜１７８６頁（２００７年））。この経路は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを形成するためにクロトノイルＣｏＡの水和反応を使用する。４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼの可逆性は十分に文書化されており（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ４７巻、３２５４〜３２５７頁（２００８年）；Ｍｕｈら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４８巻、３８０〜３８４頁（１９９７年）；Ｍｕｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５巻、１１７１０〜１１７１８頁（１９９６年））、平衡定数はクロトノイルＣｏＡの側で約４であると報告されている（ＳｃｈｅｒｆおよびＢｕｃｋｅｌ、Ｅｕｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１５巻、４２１〜４２９頁（１９９３年））。これは、下流４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼが、クロトニルＣｏＡにおいて熱力学的障害をもたらさないように４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ濃度を低く保つことを示す。
【０２９５】
【数２８】
2019103519.tif 000033
４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼは、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからアセテートにＣｏＡ部分を移動させ、次いで４−ヒドロキシブチレートおよびアセチルＣｏＡを形成する。１つの例示的な４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉのｃａｔ２遺伝子によってコードされる（Ｓｅｅｄｏｒｆら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ．Ａ．  １０５巻、２１２８〜２１３３頁（２００８年）；ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７８巻、８７１〜８８０頁（１９９６年））。Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のａｂｆＴ−２遺伝子は、４−ヒドロキシブチレートおよび１，４−ブタンジオールを生成するための経路の一部として働くときには、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼ活性を示すことも示された（Ｂｕｒｋら、ＷＯ／２００８／１１５８４０（２００８年））。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のａｂｆＴ−１によってコードされるさらなる候補の酵素は、配列相同性によって推測することができる。別の４−ヒドロキシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ由来のａｂｆＴの遺伝子産物によってコードされる（Ｇｅｒｈａｒｄｔら、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １７４巻、１８９〜１９９頁（２０００年））。
【０２９６】
【数２９】
2019103519.tif 000034
例示的なリン酸転移アシルトランスフェラーゼには、ｐｔａによってコードされるホスホトランスアセチラーゼ、およびｐｔｂによってコードされるホスホトランスブチリラーゼが含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｐｔａ遺伝子は、アセチルＣｏＡをリン酸アセチルに、およびその逆に変換することができる酵素をコードする（Ｓｕｚｕｋｉ、Ｔ．  １９６９  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １９１巻、５５９〜５６９頁（１９６９年））。この酵素はアセチルＣｏＡの代わりにプロピオニルＣｏＡを利用して、プロセス中でプロピオネートを形成することもできる（Ｈｅｓｓｌｉｎｇｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２７巻、４７７〜４９２頁（１９９８年））。同様に、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｐｔｂ遺伝子は、ブチリルＣｏＡをリン酸ブチリルに変換することができる酵素をコードする（Ｈｕａｎｇら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２巻、３３〜３８頁（２０００年）；（Ｗａｌｔｅｒら、Ｇｅｎｅ  １３４巻、１０７〜１１１頁（１９９３年））。この同じ酵素は、１，４−ブタンジオールを生成するための経路の一部として働くときには、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡに対して活性を有することが示された（ＷＯ／２００８／１１５８４０（２００８年））。さらなるｐｔｂ遺伝子は、ブチレート産生細菌Ｌ２−５０（ＬｊｕｎｇｄａｈｌおよびＡｎｄｒｅｅｓｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ５３巻、３６０〜３７２頁（１９７８年）およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（Ｖａｚｑｕｅｚら、Ｃｕｒｒ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４２巻、３４５〜３４９頁（２００１年））において見ることができる。
【０２９７】
【数３０】
2019103519.tif 000035
例示的なキナーゼには、ａｃｋＡによってコードされるＥ．ｃｏｌｉ酢酸キナーゼ（ＳｋａｒｓｔｅｄｔおよびＳｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５１巻、６７７５〜６７８３頁（１９７６年））、ｂｕｋ１およびｂｕｋ２によってコードされるＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの酪酸キナーゼ（Ｈｕａｎｇら、２０００  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２巻、３３〜３８頁（２０００年）；Ｗａｌｔｅｒら、Ｇｅｎｅ  １３４巻、１０７〜１１１頁（１９９３年））、およびｐｒｏＢによってコードされるＥ．ｃｏｌｉγグルタミルキナーゼ（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １５７巻、５４５〜５５１頁（１９８４年））が含まれる。これらの酵素は、それぞれアセテート、ブチレート、およびグルタネートをリン酸化する。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のａｃｋＡ遺伝子産物はプロピオネートもリン酸化する（Ｈｅｓｓｌｉｎｇｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２７巻、４７７〜４９２頁（１９９８年））。Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｂｕｋ１の遺伝子産物は、Ｂｕｒｋら、ＷＯ／２００８／１１５８４０（２００８年）中において、１，４−ブタンジオールを生成するための経路の一部として働くときには、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡに対して活性を有することが示された。
【０２９８】
【数３１】
2019103519.tif 000036
アルコール形成性４−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ酵素は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから１，４−ブタンジオールを形成するのに必要とされる２つの還元段階を触媒する。アセチルＣｏＡをアルコールに変換する例示的な２段階のオキシドレダクターゼには、アセチルＣｏＡなどの基質をエタノールに（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のａｄｈＥ（Ｋｅｓｓｌｅｒら、ＦＥＢＳ．  Ｌｅｔｔ．  ２８１巻、５９〜６３頁（１９９１年））、およびブチリルＣｏＡをブタノールに（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のａｄｈＥ２（Ｆｏｎｔａｉｎｅら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８４巻、８２１〜８３０頁（２００２年））変換するオキシドレダクターゼが含まれる。Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のａｄｈＥ２酵素は、Ｂｕｒｋら、ＷＯ／２００８／１１５８４０（２００８年）の参照文献中で、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＢＤＯを生成することが具体的に示された。アセチルＣｏＡのエタノールへの還元に加えて、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ中でａｄｈＥによってコードされる酵素は、分岐鎖化合物イソブチルアルデヒド（ｉｓｏｂｕｔｙｒａｌｄｅｈｙｄｅ）をイソブチリルＣｏＡに酸化することが示されてきている（Ｋａｚａｈａｙａら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １８巻、４３〜５５頁（１９７２年）；Ｋｏｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２７巻、５０５〜５１０頁（２００５年））。
【０２９９】
【数３２】
2019103519.tif 000037
別の例示的な酵素はマロニルＣｏＡを３−ＨＰに変換することができる。この活性を有するＮＡＤＰＨ依存性酵素がＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓにおいて特徴付けられており、この場合それは３−ヒドロキシプロピオン酸サイクルに関与する（Ｈｕｇｌｅｒら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８４巻、２４０４〜２４１０頁（２０００年）；ＳｔｒａｕｓｓおよびＦｕｃｈｓ、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１５巻、６３３〜６４３頁（１９９３年））。３００ｋＤａの質量を有するこの酵素は非常に基質特異的であり、他の公知のオキシドレダクターゼとはほとんど配列類似性を示さない（Ｈｕｇｌｅｒら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８４巻、２４０４〜２４１０頁（２００２年））。他の生物体において、いずれの酵素もこの特異的反応を触媒することは示されていないが、他の生物体が類似した経路を有する可能性があるバイオインフォマティクスによる証拠が存在する（Ｋｌａｔｔら、Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９巻、２０６７〜２０７８頁（２００７年））。Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ  ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＮＡＰ１および海洋生物ガンマプロテオバクテリアＨＴＣＣ２０８０を含めた他の生物体中の酵素候補は、配列類似性によって推測することができる。
【０３００】
【数３３】
2019103519.tif 000038
４−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＢＤＯへの代替の経路は、最初にこの化合物を４−ヒドロキシブタナールに還元することを含む。いくつかのアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼは、アシルＣｏＡをその対応するアルデヒドに還元することができる。このような酵素をコードする例示的な遺伝子には、脂肪酸アシルＣｏＡレダクターゼをコードするＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのａｃｒ１（ＲｅｉｓｅｒおよびＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７９巻、２９６９〜２９７５頁（１９９７年））、脂肪酸アシルＣｏＡレダクターゼをコードするＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．のＭ−１（Ｉｓｈｉｇｅら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６８巻、１１９２〜１１９５頁（２００２年））、ならびにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ中のｓｕｃＤ遺伝子によってコードされるＣｏＡおよびＮＡＤＰ依存性コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼが含まれる（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７８巻、８７１〜８８０頁（１９９６年））。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＳｕｃＤは別のコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼである（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８２巻、４７０４〜４７１０頁（２０００年））。これらのコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、Ｂｕｒｋら、ＷＯ／２００８／１１５８４０（２００８年）の参照文献中で、１，４−ブタンジオールを生成するための経路の一部として、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを４−ヒドロキシブタナールに変換することが具体的に示された。ｂｐｈＧによってコードされるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐにおいてアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをアシル化する酵素はさらに別の有能な酵素である。それはアセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、およびホルムアルデヒドを酸化およびアシル化することが実証されているからである（Ｐｏｗｌｏｗｓｋｉら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７５巻、３７７〜３８５頁（１９９３年））。
【０３０１】
【数３４】
2019103519.tif 000039
アシルＣｏＡをその対応するアルデヒドに変換するさらなる酵素型は、マロニルＣｏＡをマロン酸セミアルデヒドに変換するマロニルＣｏＡレダクターゼである。マロニルＣｏＡレダクターゼは、好熱好酸性古細菌中の３−ヒドロキシプロピオン酸サイクルによる独立栄養炭素固定における重要な酵素である（Ｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８巻、１７８２〜１７８６頁（２００７年）；Ｔｈａｕｅｒ、Ｒ．  Ｋ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８巻、１７３２〜１７３３頁（２００７年））。この酵素は補因子としてＮＡＤＰＨを利用し、ＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａおよびＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｐｐにおいて特徴付けられている（Ａｌｂｅｒら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８８巻、８５５１〜８５５９頁（２００６年）；Ｈｕｇｌｅｒら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８４巻、２４０４〜２４１０頁（２００２年））。この酵素はＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ中でＭｓｅｄ＿０７０９によってコードされる（Ａｌｂｅｒら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８８巻、８５５１〜８５５９頁（２００６年）；Ｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８巻、１７８２〜１７８６頁（２００７年））。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ由来マロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子をクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ中で異種発現させた（Ａｌｂｅｒら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８８巻、８５５１〜８５５９頁（２００６年））。これらの酵素のアルデヒドデヒドロゲナーゼの機能性は、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来の二元機能デヒドロゲナーゼと類似しているが、配列類似性はほとんどない。両方のマロニルＣｏＡレダクターゼ酵素の候補が、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（アスパラギン酸セミアルデヒドへのアスパルチル−４−リン酸の還元および同時の脱リン酸化を触媒する酵素）と高い配列類似性を有する。さらなる遺伝子候補は、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓを含めた他の生物体中でのタンパク質との配列相同性によって発見することができる。
【０３０２】
【数３５】
2019103519.tif 000040
１，４−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ活性を示す酵素は、４−ヒドロキシブタナールから１，４−ブタンジオールを形成することができる。アルコールへのアルデヒドの変換を触媒する酵素（すなわち、アルコールデヒドロゲナーゼまたは同様にアルデヒドレダクターゼ）をコードする例示的な遺伝子には、Ｃ２〜Ｃ１４の中鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードするａｌｒＡ（Ｔａｎｉら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６６巻、５２３１〜５２３５頁（２０００年））、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＤＨ２（Ａｔｓｕｍｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ４５１巻、８６〜８９頁（２００８年））、Ｃ（３）より長い分子を好むＥ．ｃｏｌｉ由来のｙｑｈＤ（Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３４２巻、４８９〜５０２頁（２００４年））、ならびにブチリルアルデヒドをブタノールに変換するＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｂｄｈＩおよびｂｄｈＩＩ（Ｗａｌｔｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７４巻、７１４９〜７１５８頁（１９９２年））が含まれる。
【０３０３】
【数３６】
2019103519.tif 000041
４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を示す酵素（ＥＣ１．１．１．６１）もこの範疇に入る。このような酵素は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ（Ｂｒａｖｏら、Ｊ．  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ．  ４９巻、３７９〜３８７頁（２００４年））、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ（ＷｏｌｆｆおよびＫｅｎｅａｌｙ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  ６巻、２０６〜２１２頁（１９９５年））およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ｂｒｅｉｔｋｒｅｕｚら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８巻、４１５５２〜４１５５６頁（２００３年））において特徴付けられている。
【０３０４】
【数３７】
2019103519.tif 000042
４−ヒドロキシブチレート合成に必要とされる非天然遺伝子を、前に記載したように発現プラスミドにクローニングする。宿主株は、メタノールメチルトランスフェラーゼ活性、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ活性、およびおそらくＰＦＯＲおよびヒドロゲナーゼ活性も発現する。この時点で、これら（ＣＯＤＨ／ＡＣＳなど）の遺伝子はゲノムに組み込まれ、構成的にまたは誘導剤と共に使用することができるプロモーターから発現される（すなわち、ＰＡ１−ｌａｃＯ１はｌａｃＩを含有する細胞中では誘導性であり、または別の方法で構成的である）。４−ヒドロキシブチレートの発現および収率を最適化した後、中立遺伝子座でのこれらの遺伝子の１コピーの組込みによってベース株をさらに改変する。相対的に限られた数の遺伝子（最小で５、および多くて６）を考慮して、必要とされる遺伝子をコードする人工オペロンを構築することができる。組込み型プラスミドを使用してこのオペロンを導入し、ＢａｃｉｌｌｕｓのｓａｃＢ遺伝子によって可能であったように（Ｌｉｎｋら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７９巻、６２２８〜６２３７頁（１９９７年））対抗選択法（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）と結びつける。このようにして、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体中の任意の位置に、マーカー無しで傷跡を残さない（ｓｃａｒ  ｌｅｓｓ）挿入部を作製することができる。最適化は、遺伝子順序ならびにリボソーム結合部位およびプロモーターの改変を含む。
【０３０５】
１，４−ブタンジオール合成に必要とされる非天然の（ｎｏｎｎａｔｉｖｅ）遺伝子を、前に記載したように発現プラスミドにクローニングする。宿主株は、メタノールメチルトランスフェラーゼ活性、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ活性、およびおそらくＰＦＯＲ活性およびヒドロゲナーゼ活性も発現する。この時点で、これら（ＣＯＤＨ／ＡＣＳなど）の遺伝子はゲノムに組み込まれ、構成的にまたは誘導剤と共に使用することができるプロモーターから発現される（すなわち、ＰＡ１−ｌａｃＯ１はｌａｃＩを含有する細胞中では誘導性であり、または別の方法で構成的である）。１，４−ブタンジオールの発現および収率を最適化した後、中立遺伝子座でのこれらの遺伝子の１コピーの組込みによってベース株をさらに改変する。相対的に限られた数の遺伝子（最小で５、および多くて６）を考慮して、必要とされる遺伝子をコードする人工オペロンを構築することができる。組込み型プラスミドを使用してこのオペロンを導入し、ＢａｃｉｌｌｕｓのｓａｃＢ遺伝子によって可能であったように（Ｌｉｎｋら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７９巻、６２２８〜６２３７頁（１９９７年））対抗選択法と結びつける。このようにして、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体中の任意の位置に、マーカー無しで傷跡を残さない挿入部を作製することができる。最適化は、遺伝子順序ならびにリボソーム結合部位およびプロモーターの改変を含む。
【０３０６】
本出願を通じて、様々な刊行物に言及してきた。これらの刊行物の開示は、本出願において、本発明が属する現況技術をより完全に記載するために、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。前に示した実施例を参照しながら本発明を記載してきたが、本発明の精神から逸脱せずに、様々な改変を加えることができることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【外国語明細書】
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