(57)【要約】【課題】本発明は、植物の交配を制御し、交配植物を作出するための方法に関する。【解決手段】本発明はまた、植物における自家不和合性(SI)タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸及び植物、特にイネ科の植物における種子生産を含むSIの操作のための使用に関する。本発明はまた、そのような核酸を含むキット、組成物、構築物及びベクター、並びに関連するポリペプチド、調節エレメント及び方法に関する。本発明はまた、植物における自己配偶子認識遺伝子の発現に関し、並びに、関連する核酸、構築物、分子マーカー及び方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物における交配を制御する方法であって、前記方法は
第1の植物株を第1のZ座位ハプロタイプ及び第1のS座位ハプロタイプで樹立又は同定する工程;
第2の植物株を、第1のZ座位ハプロタイプとは異なる第2のZ座位ハプロタイプ及び第1のS座位ハプロタイプとは異なる第2のS座位ハプロタイプで樹立又は同定する工程;並びに
前記植物株を交雑して交配植物を作出する工程を含み、
前記ハプロタイプは、第1の植物株がS及びZ座位の両方においてヘテロ接合性であり、前記第2の植物株がS及びZ座位の一方においてホモ接合性であり、S及びZ座位の他方においてヘテロ接合性であるように選択され、
第1及び第2の植物株がライグラス属(Lolium)又はウシノケグサ属(Festuca)由来の植物であり、
前記第1及び第2のZ座位ハプロタイプが26Sプロテアソームサブユニット又は無花粉(NOP)ポリペプチドをコードする遺伝子から独立に選択され、
前記第1及び第2のS座位ハプロタイプがグルタミン酸受容体若しくはその前駆体又はセブン-イン-アブセンシアホモログ(SIAH)をコードする遺伝子から独立に選択される、方法。
【請求項２】
前記植物が、ペレニアルライグラス(Lolium perenne)、イタリアンライグラス(Lolium multiflorum)、ハイブリッドライグラス(Lolium boucheanum)、トールフェスク(Lolium arundinaceum)及びメドウフェスク(Lolium pratense)から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Z座位ハプロタイプが
(a)配列番号58〜59に示される配列;
(b)配列番号128〜129に示されるポリペプチドをコードする核酸配列;
(c) (a)及び(b)に記載の全長配列の相補体;
(d) (a)及び(b)に記載の全長配列にアンチセンスな配列;
(e) (a)、(b)、(c)及び(d)に記載の全長配列と少なくとも98％の同一性を有し、少なくとも100ヌクレオチドのサイズを有する、(a)、(b)、(c)及び(d)に記載の全長配列の機能的に活性な断片；並びに
(f) (a)、(b)、(c)、(d)及び(e)に記載の配列と少なくとも98％の同一性を有する、(a)、(b)、(c)、(d)及び(e)に記載の配列の機能的に活性なバリアント
の一つ以上によってコードされる遺伝子から選択され、
前記S座位ハプロタイプが
(a)配列番号39〜40に示される配列;
(b)配列番号109〜110に示されるポリペプチドをコードする核酸配列;
(c) (a)及び(b)に記載の全長配列の相補体;
(d) (a)及び(b)に記載の全長配列にアンチセンスな配列;
(e) (a)、(b)、(c)及び(d)に記載の配列と少なくとも98％の同一性を有し、少なくとも100ヌクレオチドのサイズを有する、(a)、(b)、(c)及び(d)に記載の全長配列の機能的に活性な断片;並びに
(f) (a)、(b)、(c)、(d)及び(e)に記載の配列と少なくとも98％の同一性を有する、(a)、(b)、(c)、(d)及び(e)に記載の配列の機能的に活性なバリアント
の一つ以上によってコードされる遺伝子から選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物における交配を制御するための方法及び交配植物を作出するための方法に関する。本発明はまた、特にイネ科の植物及び穀物種の植物の自己配偶子認識による、植物における自家不和合性タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸及び核酸断片、並びに植物の種子生産を含む、SIの操作のためのその使用に関する。本発明はまた、そのような核酸と関連ポリペプチド、調節エレメント及び方法を含む、キット、組成物、構築物及びベクターに関する。
【０００２】
本発明はまた、植物の自己配偶子認識遺伝子の発現に関し、関連する核酸、構築物、核酸に由来する分子マーカー及び関連の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
いくつかの顕花植物種が自家受粉によって正常に生殖することができない現象は、「自家不和合性」(SI)と呼ばれている。SIの定義は、Lundqvistによって提案された「繁殖性雌雄同株種子植物の自家受粉後における接合子生産能の不能」が受け入れられていた。この語法は、SIと受精後障壁効果を区別するためのものであった。SIはすべての顕花植物の約30%に記述されており、自家受精の防止のために最も重要なシステムである。このシステムの重要な部分は、雌しべが自己又は非自己花粉を区別し、花粉管の発芽及び/又は伸長を抑制若しくは許可して受精をもたらす自己認識である。
【０００４】
システムを調節し、可能にする複数の遺伝的メカニズムがあり、SIは単一のシステムでは表現されない。植物のSIメカニズムの分子的基盤は、双子葉植物種のいくつかの群でよく研究されている。自家不和合性座位(S座位)遺伝子は、1980年代後半にハナタバコ(Nicotiana alata)及びブラッシカ・ラパL.(syn. campestris)において同定された。
【０００５】
複数のアプローチを使用したその後の生物学的調査により、SI因子が同定され、これらの種のSIメカニズムの分子的基盤を解明するのに役立った。
【０００６】
イネ科(イネ科の植物と穀物)の中の植物種は、2座位(S及びZと呼ぶ)配偶体SIシステムにより制御される偏性の異系交配生殖習性を示すことがあり、花粉の遺伝子型は独自の遺伝的構成により自律的に制御される。このシステムは野生オオムギ(Hordeum bulbosum L.)及び穀物ライ麦(Secale cereale L.)のような他殖性のイネ科の種の間で保存されており、その科の内で広く保存されることが分かったが、よく特徴付けられた双子葉植物の単一座位SIメカニズムから遺伝的、及び機構的に区別されると期待される。
【０００７】
自己生成された配偶子花粉管伸長を柱頭表面において抑止することにより自家受精を防ぐことが、イネ科特有のメカニズムである。双子葉植物特有のSIシステムに関与する重要分子シグナルのいくつかは判明したものの、イネ科システムの分子的基盤は不明のままである。
【０００８】
遊離型カルシウム濃度は多くの種において、花粉管の定方向への細胞成長に不可欠である。カルシウムが果たす役割は、細胞壁の剛性を増加することと浸透性を制御するものとして最初、同定された。しかし、細胞内におけるカルシウムの特定濃度は重要であり、遊離型カルシウムは遊離型リン酸塩に基づく細胞代謝により、通常、c. 100nmに保たれているが、遊離型細胞質カルシウム濃度がこの濃度を超えるように高められた場合は、カルシウム塩を形成するために細胞のエネルギー状態との干渉が発生する。花粉管内でのカルシウム勾配は活動期の生長点において勾配が上昇することが研究により同定されており、その上昇は細胞成長により吸収されると推論されている。
【０００９】
以前に、カルシウムはイネ科のSIシステムの制御において役割を果たすことが同定されている。カルシウムチャネル遮断薬(ランタン(lanthanum)及びベラパミル(verapamil))による処理により、ペレニアルライグラス(perennial ryegrass)のSIメカニズムが阻害されることが実証されている。切断した柱頭を化学遮断剤により処理することにより、自己の花粉が発芽することができた。
【００１０】
ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)のS及びZ座位は、同系交配の穀物種、イネ(Oryza sativa L.)及びコムギ(Triticum aestivum L)のゲノムと既知のマクロシンテニー(macrosynteny)である領域において、それぞれ1及び2の連鎖群(LGs)に割り当てられている。イネ科のSI座位の微細構造マッピングがブルーカナリア草(Phalaris coerulescens L.)及び穀物ライ麦について行われ、候補遺伝子を含む領域がS及びZ座位について、それぞれ0.26cMと1.5cMの区間に区切られた。関連する自家不和合性及び自己和合性のイネ科の種についてのSI座位周辺の遺伝子地図共直線性を決定する比較分析が、これらの研究における遺伝子関連(cDNAベースの)マーカーの存在により可能になった。提案された1.5cMのZ含有領域は、イネ染色体4c.長さ125kbからのBACクローン(OSJNBa0070O1 1:ジェンバンク(GenBank)受託番号AL606445)とマイクロシンテニー(microsynteny)を示し、そこには12の予測遺伝子が割り当てられている。
【００１１】
農作物の異系交配のためには、SIメカニズムの理解と制御が繁殖手順を簡素化し、加速させることができる。例えば、ナス科のS-RNaseに基づいたSIシステムの知識は、前もって特徴付けられた自家和合性(Sc)変異株の使用による、アーモンド栽培品種開発のための方法に情報を提供した。そのプログラムは、有用な油含有量と脂肪酸組成のために強化された遺伝子の固定のためにSc対立遺伝子を既存のアーモンドの品種に導入することを含んでいた。また、同系交配により、農学的エリート系統のより簡便なメンテナンスが可能になる。
【００１２】
牧草農作物種の異系交配のための標準的な半ハイブリッド育種方式においては、2つの栽培品種群が異系交配(intercross)され、雑種強勢によって収率が増加した子孫集団が生成されている。しかし、約半分の子孫は、それぞれの親グループ内における同系交配(intracross)に由来し、雑種強勢の恩恵を受けていない。飼料質量の雑種強勢もまた、標準的な半ハイブリッド育種システムを用いたペレニアルライグラス及び他のイネ科の植物の農作物種において報告されている。
【００１３】
SIジェノタイピング技術による新方式においては、SI-対立遺伝子制限個体群が確立され、制限個体群と栽培品種群の間で異系交配することにより、ハイブリッド子孫の比率が高い子孫個体群を生成する。赤クローバーでの実験により、複数の制限個体群を使用した場合において、子孫のハイブリッド比率が向上することと種子収量が改善されることが証明された。
【００１４】
本明細書における先行技術の引用はいかなるものも、オーストラリアにおける技術常識や任意の他の法的権限の一部を成すとの、或いはこの先行技術は当業者に関連技術として確認され、理解され、みなされると合理的に期待されるであろうとの、承認又はいかなる形態の示唆ではなく、また判断されるべきではない。
【００１５】
先行技術に伴う問題点や欠点の1つ又は複数を克服、又は少なくとも軽減することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
出願人は、単子葉植物におけるSI経路の分子的精査について、ゲノミクス及びトランスジェニック改変の両方を含む、広範かつ包括的なアプローチを使用している。遺伝子発現、比較ゲノム、BACクローンの塩基配列決定及び全エキソーム塩基配列決定の時空間プロファイルは、SI経路(S及びZ遺伝子)の構成成分が以前ライグラスにおいてこれらの機能を有することが特徴付けられていなかったイネ科の中からの遺伝子の集合によってコードされている可能性があることを示唆している。
【００１７】
出願人は、イネ科の異系交配植物のS及びZの座位に位置する遺伝子の修飾又は選択がSIメカニズムの抑制又は活性化により受粉と受精を制御するための魅力的な戦略であることを見出した。出願人はまた、イネ科の植物のS及びZの座位に位置する遺伝子の修飾又は選択が交配を制御するために、又は従来の育種手法よりも高い数の交配植物を作出するために使用され得ることを見出した。遺伝子の核酸配列を同定することにより、下方制御を介する又は誘導性発現を介するトランスジェニック改変がハイブリッド育種方式の実現を可能にする。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALENs)又は亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFNを)を使用しての、核酸における特定標的部位の切断を仲介して、内因性核酸配列内のマイクロ欠失及び挿入に至る、標的遺伝子破壊による核酸修飾もまた、受精の制御を可能にする。核酸配列内から発生する固有の変異に由来する分子マーカーの使用もまた、受精を制御するための予測手段を提供しうる。
【００１８】
50304(131X384ウェルプレート)BACクローン(平均挿入サイズ=113kb)から構成されるペレニアルライグラスのBACベースのゲノムライブラリーが、コンティグアセンブリをサポートするように構築され、c.3.4ゲノム同等物に対応すると推定されている(Spangenbergら2005;Forsterら2008)。微細構造遺伝子連鎖マッピング及び物理的なゲノムの特徴付けの組合せにより、ペレニアルライグラスのSI遺伝子を単離するためのマップベースのクローニングの実施が可能となる。
【００１９】
また、全ゲノム配列決定は、ペレニアルライグラスゲノムから遺伝子コンティグ(genie contigs)を生成するために行われており、それにより遺伝子の同定及び核酸の特徴付けを支援することができる。これらの取り組みは、十分な原試料を提供するためにクローン的に繁殖させた1つの植物遺伝子型で実施されてきた(Coganら  2012a, Forsterら  2012)。全般的遺伝子発現(トランスクリプトーム)プロファイルもまた、ゲノムシークエンスについて使用されたように、同じ植物からのRNA核酸の塩基配列決定によって広く生成され、特徴付けられてきた(Coganら  2012b, Forsterら  2012)。
【００２０】
S及びZ遺伝子の同定と特徴付けにより、ペレニアルライグラスの新規育種手法の確立が可能となることがある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
例えば、イネ科の植物は、配偶体Z遺伝子核酸により形質転換してもよいが、ここで(1)前記Z遺伝子特異的核酸による形質転換は、イネ科の自家不和合性植物を自家和合性植物に形質転換させ、また(2)前記Z遺伝子特異的核酸による形質転換は、イネ科の自家和合性植物を自家不和合性植物に形質転換させる。好ましい実施形態では、配偶体Z遺伝子は26Sプロテアソームサブユニット、亜鉛フィンガープロテアーゼ、無花粉(NOP)ポリペプチド、又は、ユビキチン特異的プロテアーゼ22のようなユビキチン特異的プロテアーゼをコードしてもよい。
【００２２】
例えば、イネ科の植物は、配偶体S遺伝子核酸により形質転換してもよいが、ここで(1)前記S遺伝子特異的核酸による形質転換は、イネ科の自家不和合性植物を自家和合性植物に形質転換させ、また(2)前記S遺伝子特異的核酸による形質転換は、イネ科の自家和合性植物を自家不和合性植物に形質転換させる。好ましい実施形態では、配偶体S遺伝子はカリン(Cullin)、グルタミン酸受容体若しくはその前駆体、又はセブン-イン-アブセンシアホモログ(seven-in-absentia homologue)(SIAH)をコードしていてもよい。
【００２３】
したがって、最初の態様において、本発明は、植物における交配又は自家不和合性(SI)制御のための組成物又はキットであって、
イネ科の植物のZ座位からの遺伝子から単離された、又はそれに相当するものである、SIポリペプチドをコードする第1の核酸又は核酸断片;及び
イネ科の植物のS座位からの遺伝子から単離された、又はそれに相当するものである、SIポリペプチドをコードする第2の核酸又は核酸断片を含む、組成物又はキットを提供する。
【００２４】
好ましくは、前記第1及び第2の核酸は、実質的に精製された、又は単離されたものである。
【００２５】
より好ましい実施形態においては、第1の核酸又は核酸断片は、配偶体Z遺伝子であってもよい。
【００２６】
より好ましい実施形態においては、第2の核酸又は核酸断片は、配偶体S遺伝子であってもよい。
【００２７】
特により好ましい実施形態においては、第1及び第2の核酸又は核酸断片は、以降に記載される核酸及び核酸断片の群から選択されてもよい。
【００２８】
例えば、Z遺伝子は、以降に記載される、26Sプロテアソームサブユニット、亜鉛フィンガープロテアーゼ、無花粉(NOP)ポリペプチド、又は、ユビキチン特異的プロテアーゼ22のような、ユビキチン特異的プロテアーゼをコードしていてもよい。
【００２９】
例えば、S遺伝子は、以降に記載される、カリン、グルタミン酸受容体若しくはその前駆体、又はセブン-イン-アブセンシアホモログ(SIAH)をコードしていてもよい。
【００３０】
さらなる好ましい実施形態においては、第1及び第2の核酸又は核酸断片は、以降に記載される、構築物又はベクターに含まれていてもよい。
【００３１】
本発明のさらなる態様においては、植物における交配を制御するための又は交配植物を作出するための方法であって、前記方法は、
第1の植物株を第1のZ座位ハプロタイプ及び第1のS座位ハプロタイプで樹立又は同定する工程;
第2の植物株を第2のZ座位ハプロタイプ及び第2のS座位ハプロタイプで樹立又は同定する工程;並びに
前記植物株を交雑して交配植物を作出する工程を含み、
前記ハプロタイプは、第1の植物株がS及びZ座位の両方においてヘテロ接合性であり、前記第2の植物株がS及びZ座位の一方においてホモ接合性であり、S及びZ座位の他方においてヘテロ接合性であるように選択される、方法が提供される。
【００３２】
好ましくは、第1及び第2の植物株はイネ科の植物である。より好ましくは、それらはイネ科の植物種であって、具体的には、ライグラス(Lolium)又はフェスク(fescue)(Festuca)のような牧草であって、より具体的にはペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)又はトールフェスク(tall fescue)(Festuca arundinaceum;別名Lolium arundinaceumとして知られる)である。
【００３３】
好ましくは、ハプロタイプは、以降に記載されるような、本発明に記載の遺伝子からのものである。
【００３４】
本発明のさらなる態様においては、植物における自家不和合性を操作する方法であって、前記植物に有効量の、本発明に記載の核酸、構築物及び/又はベクターを導入する工程を含む、方法が提供される。
【００３５】
より好ましい実施形態においては、前記方法は植物のSI状態を変化させる工程を含む。
【００３６】
より好ましい実施形態においては、前記方法は、イネ科の植物のZ座位からの遺伝子から単離された、又はそれに相当するものである、SIポリペプチドをコードする第1の核酸又は核酸断片;及び
イネ科の植物のS座位からの遺伝子から単離された、又はそれに相当するものである、SIポリペプチドをコードする第2の核酸又は核酸断片を前記植物に導入する工程を含んでいてもよい。
【００３７】
例えば、Z遺伝子は、以降に記載される、26Sプロテアソームサブユニット、亜鉛フィンガープロテアーゼ、無花粉(NOP)ポリペプチド、又は、ユビキチン特異的プロテアーゼ22のような、ユビキチン特異的プロテアーゼをコードしてもよい。
【００３８】
例えば、S遺伝子は、以降に記載される、カリン、グルタミン酸受容体若しくはその前駆体、又はセブン-イン-アブセンシアホモログ(SIAH)をコードしていてもよい。
【００３９】
本発明はまた、本発明の核酸をSI活性のメディエーター又はモジュレーターをコードする遺伝子と共に共発現することを考慮している。
【００４０】
SI状態とは、繁殖性雌雄同株種子植物の自家受粉後における接合子生成の能力又は不能を意味する。
【００４１】
「SI活性のメディエーター又はモジュレーター」とは、植物細胞、植物カルス、植物、種子又はその他の植物部分の発現、活性又は機能を向上させるか或いは改変させる分子を意味する。例えば、SI活性のメディエーター又はモジュレーターは、花粉管の成長を改善させることがあり、又はSIメカニズムの活動若しくは活性を向上させることもある。
【００４２】
「有効量」とは、前記植物、又はそれに由来する植物、植物の種子若しくはその他の植物部分における識別可能な表現型形質をもたらすのに十分な量を意味する。そのような量は、植物の種類、投与経路及び他の関連要因を考慮して、適切に熟練した者によって容易に決定できる。そのような者は、適切な投与量と投与方法を容易に決定することができるであろう。例えば、Maniatisらによる、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor)を参照されたい。この開示の全体は引用によって本明細書に取り込まれる。
【００４３】
本発明の方法と材料を使用して、自家不和合性は、例えば、好ましくはポリペプチドを過剰発現させるためか、又はセンス抑制において、本発明のセンス核酸の追加コピーを取り込ませることによって、形質転換された植物において、形質転換されていない対照植物と比較して、誘発、増加、減少、抑圧又は改変させてもよい。これらは、例えば、本発明のアンチセンス核酸を取り込ませることによって、減少又は改変させてもよい。
【００４４】
さらなる態様において、本発明は、植物のSI経路において活性であるポリペプチドをコードする遺伝子を同定する工程、並びに、前記植物におけるSIメカニズムを抑制又は誘導するために前記遺伝子を上方制御又は下方制御する工程を含む、植物のSI状態を改変するための方法を提供する。好ましくは、前記遺伝子は本発明に記載の核酸である。好ましくは、前記植物は、以下に記載のものである。
【００４５】
前記遺伝子の発現を「上方制御する」とは、植物において、対照植物と比較して前記遺伝子の発現と、並びに、その結果として、その遺伝子にコードされたタンパク質の発現を上昇させることを意味する。
【００４６】
前記遺伝子の発現を「下方制御する」とは、植物において、対照植物と比較して前記遺伝子の発現と、並びに、その結果として、その遺伝子にコードされたタンパク質の発現を減少させることを意味する。
【００４７】
上方制御又は下方制御は、当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、遺伝子は、遺伝子のセンスコピーの追加コピーを取り込ませることによって上方制御してもよい。遺伝子は、例えば、アンチセンス核酸、遺伝子のフレームシフト若しくはそうでなければ修飾したセンスコピー、又は干渉RNA(RNAi)をコードする核酸を取り込ませることによって、下方制御することができる。上方制御又は下方制御はまた、核酸中の特定の標的部位の切断を媒介し、内因性の核酸配列内の微小欠失及び挿入をもたらす、転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ又は亜鉛フィンガーヌクレアーゼの使用を介して達成することができる。
【００４８】
植物細胞へ本発明の遺伝子構築物を取り込ませるための技術は当業者に知られている。そのような技術には、細胞、組織、カルス、未成熟及び成熟胚への高速度入射導入が含まれる。本発明の遺伝子構築物を取り込ませた細胞は、上述したように、当該技術分野においてよく知られているテクニックを用いて、選択され、その後、形質転換した植物を再生するために適切な培地で培養してもよい。温度、pHなどのような培養条件は、当業者にとって明白である。得られる植物は、当該技術分野においてよく知られている方法を使用して、有性生殖的に又は無性生殖的に生殖させてよい。
【００４９】
植物の「SIメカニズムを抑制する」とは、花粉管の伸長とその結果として自己花粉の受精をもたらすことを阻害する植物の特質を低減することを意味する。
【００５０】
植物の「SIメカニズムを活性化する」とは、花粉管の伸長とその結果として自己花粉の受精をもたらすことを阻害する植物の特質を導入することを意味する。
【００５１】
さらなる態様において、本発明は、植物の自家不和合性(SI)タンパク質、その相補体、それについてアンチセンスである配列並びにその機能的に活性な断片及びバリアントをコードする実質的に精製又は単離された核酸又は核酸断片を提供する。好ましくは、前記核酸又は核酸断片は、プロテアソームサブユニット、より具体的には26Sプロテアソームサブユニット、カリン(カリンとはユビキチンE3リガーゼ、より具体的にはRINGベースのE3ユビキチンリガーゼの構築に関与する分子スキャフォールドである)、グルタミン酸受容体又はその前駆体、亜鉛フィンガープロテアーゼ、無花粉(NOP)ポリペプチド、セブン-イン-アブセンシアホモログ(SIAH)及び、ユビキチン特異的プロテアーゼ、より具体的にはユビキチン特異的プロテアーゼ22からなる群から選択されるポリペプチドをコードする。
【００５２】
前記核酸又は核酸断片は、イネ科の植物からの遺伝子から単離してもよいし、一致させてもよい。好ましい実施形態において、核酸又は核酸断片は、イネ科の植物種、具体的にはライグラス又はフェスクのような牧草、より具体的にはペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)又はトールフェスク(Festuca arundinaceum、別名Lolium arundinaceumとしても知られている)からの遺伝子から単離してもよいし、一致させてもよい。
【００５３】
「核酸」とは、遺伝情報の能力を有するヌクレオチド鎖を意味する。この語句は一般的に、遺伝子又はその機能的に活性な断片若しくはバリアント、及びその表現形に影響を与える生物体のゲノムの中の他の配列を指す。「核酸」の語句には、単鎖又は二重鎖の(cDNA又はゲノムDNAのような)DNA及び(mRNA又はマイクロRNAのような)RNAが含まれ、任意選択で合成、非野生型又は改変ヌクレオチド塩基、合成核酸及びその組合せが含まれる。
【００５４】
本発明の核酸は、全長遺伝子、又はその部分であってよく、本明細書において「核酸断片」及び「ヌクレオチド配列」とも呼ばれる。便宜のために、これらの全てを網羅するために「核酸又は核酸断片」の表現が使用される。
【００５５】
「実質的に精製された」とは、本発明の核酸が由来する生物体の天然に存在するゲノム内において、その核酸に隣接する遺伝子が無いことを意味する。したがって、この語句は、例えば、ベクター;自律的に複製するプラスミド若しくはウイルス;又は原核生物若しくは真核生物のゲノムDNAに取り込まれる核酸、或いは、他の配列と独立して分離した分子(例えば、cDNA又はPCR若しくはエンドヌクレアーゼ消化によって生成されるゲノム若しくはcDNA断片)として存在する核酸が含まれる。それはまた、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である核酸が含まれる。好ましくは、実質的に精製した核酸は90%、より好ましくは95%、更により好ましくは98%純粋である。
【００５６】
「単離した」の語句は、その材料がその元々の環境(例えば、もしそれが天然に存在するものであれば、天然環境)から除かれていることを意味する。例えば、生きている植物内に存在する天然に存在する核酸は単離されていないが、自然系内に共存している材料のいくつか又は全てから分離されている同じ核酸については、単離されている。そのような核酸はベクターの部分であり得るし、及び/又はそのような核酸は組成物の一部であり得、そのようなベクター又は組成物がその自然環境の一部ではないようになお単離されうる。
【００５７】
そのような核酸又は核酸断片はコンセンサスコンティグ(consensus contig)を形成するように集合しうる。本明細書に使用されるように、「コンセンサスコンティグ」の語句は、配列の相同性の共通又は重なった領域を共有する複数の構成ヌクレオチド配列が集合したヌクレオチド配列を指す。例えば、共通又は重なり合った配列を同定するために複数の核酸又は核酸断片のヌクレオチド配列が比較され、整列させることができる。共通又は重なり合った配列が複数の核酸又は核酸断片の間に存在する場合には、その配列(及び、したがって、それらの対応する核酸又は核酸断片)は単一の近接した(contiguous)ヌクレオチド配列に整列させることができる。
【００５８】
好ましい実施形態において、本発明は、植物自家不和合性(SI)タンパク質をコードするか、又は植物SIタンパク質をコードする配列に相補的若しくはアンチセンスな、実質的に精製又は単離された核酸又は核酸断片を提供するものであって、前記核酸若しくは核酸断片は:
(a)配列番号1から70に示される配列;
(b)配列番号71から140に示されるポリペプチドをコードする核酸配列;
(c) (a)及び(b)において規定される配列の相補体;
(d) (a)及び(b)において規定される配列にアンチセンスな配列;
(e) (a)、(b)、(c)及び(d)において規定される配列の機能的に活性な断片;並びに
(f) (a)、(b)、(c)、(d)及び(e)において規定される配列の機能的に活性なバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００５９】
好ましくは、SIタンパク質は、プロテアソームサブユニット、より好ましくは26Sプロテアソームサブユニット、カリン、グルタミン酸受容体又はその前駆体、亜鉛フィンガープロテアーゼ、C2及びGRAMアミノ酸ドメインを含むタンパク質、より具体的には、シグナル伝達、膜輸送、及び/又は膜共役プロセスに関わるタンパク質、より好ましくは、NOP遺伝子にコードされるタンパク質、SIAH、並びにユビキチン特異的プロテアーゼ、より好ましくは、ユビキチン特異的プロテアーゼ22からなる群から選択される。
【００６０】
より好ましい実施形態としては、本発明は、プロテアソームサブユニット、より具体的には、26Sプロテアソームサブユニットをコードするか、又はプロテアソームサブユニット、より好ましくは、26Sプロテアソームサブユニットをコードする配列に対して相補的若しくはアンチセンスである実質的に精製又は単離された核酸又は核酸断片を提供し、前記核酸又は核酸断片は:
(a)配列番号58及び図3に示される配列;
(b)配列番号128に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(c) (a)及び(b)において規定される配列の相補体;
(d) (a)及び(b)において規定される配列に対してアンチセンスな配列;
(e) (a)、(b)、(c)及び(d)において規定される配列の機能的に活性な断片;並びに
(f) (a)、(b)、(c)、(d)及び(e)において規定される配列の機能的に活性なバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００６１】
より好ましい実施形態としては、本発明は、カリンをコードするか、又はカリンをコードする配列に対して相補的若しくはアンチセンスである実質的に精製又は単離された核酸又は核酸断片を提供し、前記核酸又は核酸断片は:
(a)配列番号20及び図5に示される配列;
(b)配列番号90に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(c) (a)及び(b)において規定される配列の相補体;
(d) (a)及び(b)において規定される配列に対してアンチセンスな配列;
(e) (a)、(b)、(c)及び(d)において規定される配列の機能的に活性な断片;並びに
(f) (a)、(b)、(c)、(d)及び(e)において規定される配列の機能的に活性なバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
より好ましい実施形態としては、本発明は、グルタミン酸受容体又はその前駆体をコードするか、又はグルタミン酸受容体又はその前駆体をコードする配列に対して相補的若しくはアンチセンスである実質的に精製又は単離された核酸又は核酸断片を提供し、前記核酸又は核酸断片は:
(a)配列番号39及び図7に示される配列;
(b)配列番号109に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(c) (a)及び(b)において規定される配列の相補体;
(d) (a)及び(b)において規定される配列に対してアンチセンスな配列;
(e) (a)、(b)、(c)及び(d)において規定される配列の機能的に活性な断片;並びに
(f) (a)、(b)、(c)、(d)及び(e)において規定される配列の機能的に活性なバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００６３】
より好ましい実施形態としては、本発明は、亜鉛フィンガープロテアーゼをコードするか、又は亜鉛フィンガープロテアーゼをコードする配列に対して相補的若しくはアンチセンスである実質的に精製又は単離された核酸又は核酸断片を提供し、前記核酸又は核酸断片は:
(a)配列番号62及び図9に示される配列;
(b)配列番号132に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(c) (a)及び(b)において規定される配列の相補体;
(d) (a)及び(b)において規定される配列に対してアンチセンスな配列;
(e) (a)、(b)、(c)及び(d)において規定される配列の機能的に活性な断片;並びに
(f) (a)、(b)、(c)、(d)及び(e)において規定される配列の機能的に活性なバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００６４】
より好ましい実施形態としては、本発明は、C2及びGRAMドメインを含むポリペプチド、好ましくは無花粉(NOP)ポリペプチドをコードするか、又はC2及びGRAMドメインを含むポリペプチド、好ましくは無花粉(NOP)ポリペプチドをコードする配列に対して相補的若しくはアンチセンスである実質的に精製又は単離された核酸又は核酸断片を提供し、前記核酸又は核酸断片は:
(a)配列番号59及び図11に示される配列;
(b)配列番号129に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(c) (a)及び(b)において規定される配列の相補体;
(d) (a)及び(b)において規定される配列に対してアンチセンスな配列;
(e) (a)、(b)、(c)及び(d)において規定される配列の機能的に活性な断片;並びに
(f) (a)、(b)、(c)、(d)及び(e)において規定される配列の機能的に活性なバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００６５】
より好ましい実施形態としては、本発明は、セブン-イン-アブセンシアホモログをコードするか、又はセブン-イン-アブセンシアホモログをコードする配列に対して相補的若しくはアンチセンスである実質的に精製又は単離された核酸又は核酸断片を提供し、前記核酸又は核酸断片は:
(a)配列番号40及び図13に示される配列;
(b)配列番号110に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(c) (a)及び(b)において規定される配列の相補体;
(d) (a)及び(b)において規定される配列に対してアンチセンスな配列;
(e) (a)、(b)、(c)及び(d)において規定される配列の機能的に活性な断片;並びに
(f) (a)、(b)、(c)、(d)及び(e)において規定される配列の機能的に活性なバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００６６】
より好ましい実施形態としては、本発明は、ユビキチン特異的プロテアーゼ、より好ましくは、ユビキチン特異的プロテアーゼ22をコードするか、又はユビキチン特異的プロテアーゼ、より好ましくは、ユビキチン特異的プロテアーゼ22をコードする配列に対して相補的若しくはアンチセンスである実質的に精製又は単離された核酸又は核酸断片を提供し、前記核酸又は核酸断片は:
(a)配列番号54及び図15に示される配列;
(b)配列番号124に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(c) (a)及び(b)において規定される配列の相補体;
(d) (a)及び(b)において規定される配列に対してアンチセンスな配列;
(e) (a)、(b)、(c)及び(d)において規定される配列の機能的に活性な断片;並びに
(f) (a)、(b)、(c)、(d)及び(e)において規定される配列の機能的に活性なバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００６７】
本発明は、本発明の核酸の機能的に活性な断片及びバリアントを包含する。核酸に関する「機能的に活性な」とは、断片又は(アナログ、誘導体若しくは変異体)バリアントが植物におけるSIを操作する能力があることを意味する。例えば、それは植物におけるプロテアソーム、より具体的には、プロテアソームサブユニット、更により具体的には、26Sプロテアソームサブユニットを操作する能力であってよい。例えば、それは植物におけるE3ユビキチンリガーゼ、より具体的には、カリンを操作する能力であってよい。例えば、それは植物における流入チャネル、より具体的には、グルタミン酸受容体を操作する能力であってよい。例えば、それは植物におけるユビキチン特異的プロテアーゼ活性、より具体的には、亜鉛フィンガープロテアーゼ活性を操作する能力であってよい。例えば、それは植物におけるシグナル伝達、膜輸送、及び/又は膜共役プロセスを操作する能力であってよい。例えば、それは植物におけるSIAHを操作する能力であってよい。例えば、それは植物におけるユビキチン特異的プロテアーゼ、より具体的には、ユビキチン特異的プロテアーゼ22を操作する能力であってよい。
【００６８】
そのようなバリアントには天然に存在する対立遺伝子バリアント及び天然に存在しないバリアントが含まれる。1つ又は複数のヌクレオチドの付加、欠損、置換及び誘導体化は、修飾が断片又はバリアントの機能的活性の喪失をもたらさない限りにおいて考慮される。好ましくは、機能的に活性な断片又はバリアントは、その断片又はバリアントが対応する上述の配列の関連部分と少なくとも約80%の同一性、より好ましくは少なくとも約90%の同一性、更により好ましくは少なくとも約95%の同一性、最も好ましくは少なくとも約98%の同一性を有する。そのような機能的に活性なバリアント及び断片には、例えば、保存的核酸変換を有するものが含まれる。
【００６９】
特に好ましい断片には、センス又はアンチセンスの配向の配偶体遺伝子の高頻度可変領域を含む核酸配列の断片、並びにそれらの断片の機能的に活性なバリアントが含まれる。図17から図37を参照されたい。
【００７０】
好ましくは、前記断片には、少なくとも20ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも50ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも100ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも200ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも500ヌクレオチドのサイズを有する。
【００７１】
特に好ましい実施形態において、前記断片又はバリアントには、本明細書に記載される図17から図37に示される配列が含まれてもよい。
【００７２】
「保存的核酸変換」とは、遺伝コードの縮重による、コードされるタンパク質におけるアミノ酸の保存をもたらす核酸置換を意味する。そのような機能的に活性なバリアント及び断片にはまた、例えば、対応するアミノ酸配列において1つ又は複数の残基の保存的アミノ酸置換をもたらす核酸変換を有するものが含まれる。
【００７３】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸が同じクラスの他の1つのアミノ酸により置換されることを意味し、前記クラスは下記のとおりである。
非極性:Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp
非荷電極性:Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln
酸性:Asp、Glu
塩基性:Lys、Arg、His
【００７４】
他の保存的アミノ酸置換は、下記のようになされてもよい。
芳香族:Phe、Tyr、His
プロトンドナー:Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp
プロトンアクセプター:Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln
【００７５】
本発明のさらなる態様においては、本発明に記載の1つ又は複数の核酸を含む遺伝子構築物が提供される。
【００７６】
好ましい実施形態において、前記遺伝子構築物には、本発明に記載の核酸及びメディエーター又はSI活性のモジュレーターをコードする遺伝子を含むキメラ配列が含まれていてもよい。
【００７７】
他の好ましい実施形態としては、遺伝子構築物には、:
イネ科の植物のZ座位からの遺伝子から単離された、又はそれに相当するものである、SIポリペプチドをコードする第1の核酸又は核酸断片;及び
イネ科の植物のS座位からの遺伝子から単離された、又はそれに相当するものである、SIポリペプチドをコードする第2の核酸又は核酸断片が含まれてもよい。
【００７８】
本明細において使用される「遺伝子構築物」の語句は、人工的に集合されたか単離された目的の遺伝子を含む核酸分子を指す。好ましくは、前記遺伝子構築物は組み換え核酸分子である。一般的には、構築物には、目的の遺伝子又は遺伝子群、いくつかの場合において目的の遺伝子にもなりうるマーカー遺伝子、及び適切な制御配列が含まれる。制御配列を構築物に含めることは任意選択的であることが理解されるべきであり、例えば、そのような配列は、宿主細胞の制御配列が使用される場合において必要でないことがあり得る。構築物の語句はベクターを含むが、それに限定されるものとみなされるべきではない。
【００７９】
「キメラ配列」とは、元々別のタンパク質にコードされた2つ以上連結された核酸、又は機能的に活性なその断片若しくはバリアントを含む融合遺伝子の発現による組換え体手段により生成されるハイブリッドを意味する。
【００８０】
「融合遺伝子」とは、好ましくは翻訳融合として融合タンパク質の発現が可能となるように複数の核酸が連結されていることを意味する。典型的には、これには第1のタンパク質をコードする核酸配列から終止コドンの除去と、その後に第2のタンパク質の核酸配列のインフレームでの付加が含まれる。融合遺伝子は、その後に単一のタンパク質として細胞により発現される。そのタンパク質は、両方のオリジナルタンパク質の全長配列、或いはその一方の又は両方の機能的に活性な断片若しくはバリアントを含むように設計されてもよい。
【００８１】
好ましい実施形態において、本発明に記載の遺伝子構築物はベクターであってよい。
【００８２】
「ベクター」とは、遺伝物質を標的細胞へ転移させるために使用される遺伝子構築物の意味である。ベクターの語句は、クローニング及び発現ベクターの両者を包含する。ベクターは多くの場合、いくつかの供給源からの核酸分子を含む組み換え分子である。
【００８３】
ベクターは任意の適切なタイプであってよく、ウイルス性であっても非ウイルス性であってもよい。ベクターは発現ベクターであってよい。そのようなベクターには、染色体、非染色体及び合成核酸配列、例えば、植物ウイルスの誘導体;バクテリアプラスミド;アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)からのTiプラスミドの誘導体;アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)からのRiプラスミド;ファージDNA;酵母人工染色体;バクテリア人工染色体;バイナリーバクテリア人工染色体;プラスミド及びファージDNAの組合せに由来するベクターが含まれる。しかしながら、標的細胞内において複製可能であるか、組み込み可能であるか、生存可能である限りにおいて、任意の他のベクターも使用してもよい。
【００８４】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、ベクターには、プロモーター、本発明に記載の核酸又は核酸断片及びターミネーターのような調節エレメントが含まれてもよく;ここで前記調節エレメント、核酸又は核酸断片及びターミネーターは作動可能なように連結されている。
【００８５】
「プロモーター」とは、作動可能なように連結された核酸配列の転写を指示するのに十分な核酸配列を意味する。
【００８６】
「作動可能なように連結された」とは、核酸及びプロモーターのような制御配列が適切な条件下、例えば、転写活性化タンパク質のような適切な分子が制御配列に結合する場合などにおいて前記核酸の発現が可能なように連結されていることを意味する。好ましくは、作動可能なように連結されたプロモーターは関連の核酸の上流にある。
【００８７】
「上流」とは、核酸に沿って3'から5'への方向を意味する。
【００８８】
プロモーター及びターミネーターは任意の適切なタイプであってよく、それらが標的細胞内において機能的であるならば、標的細胞に対して内因性であっても、外因性であってもよい。
【００８９】
本発明の構築物及び方法において使用されるプロモーターは、恒常的、組織特異的又は誘導性プロモーターであってよい。例えば、プロモーターは、多くの植物組織における発現についての恒常的なカリフラワーモザイクウイルス(CaMV35S)プロモーター、光条件下において植物の光合成組織における遺伝子の発現を媒介することができる誘導性「光合成プロモーター」(例えば、リブロース1,5-二リン酸)、又は例えば、セイヨウアブラナ(Brassica napus)のnapin遺伝子、トウモロコシ(Zea mays)zein 4遺伝子、イネ(Orysa sativa)PR602遺伝子及びコムギ(Triticum aestivum)グルテリン(glutelin)遺伝子からなる群から選択される遺伝子からの、種子特異的プロモーターのような組織特異的プロモーターであってよい。
【００９０】
本発明の遺伝子構築物に採用してもよい種々のターミネーターもまた、当業者にとってよく知られているものである。ターミネーターはプロモーター配列と同じ遺伝子由来のものであってもよいし、違う遺伝子由来のものでもよい。特に適切なターミネーターは、(CaMV)35S polyAのようなポリアデニル化シグナル並びにノパリン(nopaline)合成酵素(nos)及びオクトピン(octopine)合成酵素(ocs)遺伝子のような他のターミネーターである。
【００９１】
遺伝子構築物には、プロモーター、遺伝子及びターミネーターに加えて、核酸の発現に必要なさらなる因子が異なる組合せで含まれてもよく、例えば、ベクター骨格、複製起点(ori)、多重クローニング部位、スペーサー配列、エンハンサー、(トウモロコシユビキチンUbiイントロンのような)イントロン、抗生物質抵抗性遺伝子並びに(ネオマイシンリン酸基転移酵素[nptll]遺伝子、ハイグロマイシンリン酸基転移酵素[hph]遺伝子、フォスフィノスリシンアセチル基転移酵素[bar又はpat]遺伝子のような)他の選択可能なマーカー遺伝子、及び(ベータ-グルクロニダーゼ[GUS]遺伝子[gusA]のような)受容体遺伝子などが含まれてもよい。また、遺伝子構築物には、翻訳開始のためのリボソーム結合部位が含まれていてもよい。また、遺伝子構築物には、発現増幅のための適切な配列が含まれていてもよい。
【００９２】
当業者は、前記核酸の発現をもたらすために、遺伝子構築物の様々な構成成分が作動可能なように連結されることを理解するであろう。本発明の遺伝子構築物の構成成分を作動可能なように連結する技術は、当業者にとってよく知られているものである。そのような技術には、合成リンカーのような、リンカーの使用が含まれ、例えば、1つ又は複数の制限酵素部位を含ませることが挙げられる。
【００９３】
なお、さらなる態様において、本発明は、植物細胞において外来性遺伝子の発現を引き起こすことができる、実質的に精製又は単離された調節エレメントを提供する。好ましくは、調節エレメントは、植物自家不和合性(SI)タンパク質並びに機能的に活性な断片及びそのバリアントをコードする核酸又は核酸断片から単離される。好ましくは、調節エレメントは、プロテアソームサブユニット、より具体的には、26Sプロテアソームサブユニット、カリン、グルタミン酸受容体若しくはその前駆体、亜鉛フィンガープロテアーゼ、C2及びGRAMアミノ酸ドメインの両者を有するポリペプチド、より好ましくは無花粉(NOP)遺伝子、SIAH、又はユビキチン特異的プロテアーゼ、より好ましくは、ユビキチン特異的プロテアーゼ22をコードする核酸又は核酸断片から単離される。
【００９４】
調節エレメントは、単鎖又は二重鎖である(cDNA又はゲノムDNAのような)DNA及び(mRNAのような)RNAを含む核酸分子であってよく、任意選択で、合成、非天然又は改変ヌクレオチド塩基、及びその組合せを含んでいてもよい。
【００９５】
好ましくは、調節エレメントはプロモーターを含む。好ましい実施形態としては、調節エレメントは、プロテアソームサブユニット遺伝子プロモーター、より好ましくは26Sプロテアソームサブユニット遺伝子プロモーターを含む。他の好ましい実施形態においては、調節エレメントは、カリン遺伝子プロモーターを含む。他の好ましい実施形態においては、調節エレメントはグルタミン酸受容体又はその前駆体の遺伝子プロモーターを含む。他の好ましい実施形態においては、調節エレメントは、亜鉛フィンガープロテアーゼ遺伝子プロモーターを含む。他の好ましい実施形態においては、調節エレメントは、C2及びGRAMアミノ酸ドメインの両者を有するポリペプチドからのプロモーターを含み、より好ましくは無花粉(NOP)遺伝子からのプロモーターを含む。他の好ましい実施形態においては、調節エレメントは、SIAH遺伝子プロモーターを含む。他の好ましい実施形態においては、調節エレメントは、ユビキチン特異的プロテアーゼ遺伝子プロモーター、より好ましくは、ユビキチン特異的プロテアーゼ22遺伝子プロモーターを含む。
【００９６】
好ましくは、調節エレメントは、イネ科の植物からの調節エレメントから単離されるか、又は対応するものであってよい。好ましい実施形態としては、調節エレメントは、イネ科の植物種、具体的には、ライグラス又はフェスクのような牧草、より具体的にはペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)又はトールフェスク(Festuca arundinaceum;別名Lolium arundinaceumとして知られる)からの調節エレメントから単離される、又はそれに相当するものであってよい。
【００９７】
本発明のこの態様の特に好ましい実施形態においては、調節エレメントにはペレニアルライグラスからの26Sプロテアソームサブユニット遺伝子からのプロモーターが含まれる。
【００９８】
好ましくは、調節エレメントには図3に示した配列;又は高頻度可変領域を含む機能的に活性な断片若しくはそのバリアントのプロモーター因子が含まれる。プロモーター因子は図3の2335位置に示すATG開始コドンの上流に位置することを、当業者は理解するであろう。
【００９９】
本発明のこの態様の他の特に好ましい実施形態においては、調節エレメントにはペレニアルライグラスからのカリン遺伝子からのプロモーターが含まれる。
【０１００】
好ましくは、調節エレメントには図5に示した配列;又は高頻度可変領域を含む機能的に活性な断片若しくはそのバリアントのプロモーター因子が含まれる。プロモーター因子は図5の294位置に示すATG開始コドンの上流に位置することを、当業者は理解するであろう。
【０１０１】
本発明のこの態様の他の特に好ましい実施形態においては、調節エレメントにはペレニアルライグラスからのグルタミン酸受容体又は前駆体遺伝子からのプロモーターが含まれる。
【０１０２】
好ましくは、調節エレメントには図7に示した配列;又は高頻度可変領域を含む機能的に活性な断片若しくはそのバリアントのプロモーター因子が含まれる。プロモーター因子は図7の788位置に示すATG開始コドンの上流に位置することを、当業者は理解するであろう。
【０１０３】
本発明のこの態様の他の特に好ましい実施形態においては、調節エレメントにはペレニアルライグラスからの亜鉛フィンガープロテアーゼ遺伝子からのプロモーターが含まれる。
【０１０４】
好ましくは、調節エレメントには図9に示した配列;又は高頻度可変領域を含む機能的に活性な断片若しくはそのバリアントのプロモーター因子が含まれる。プロモーター因子は図9の625位置に示すATG開始コドンの上流に位置することを、当業者は理解するであろう。
【０１０５】
本発明のこの態様の他の特に好ましい実施形態においては、調節エレメントにはペレニアルライグラスからのNOP遺伝子からのプロモーターが含まれる。
【０１０６】
好ましくは、調節エレメントには図11に示した配列;又は高頻度可変領域を含む機能的に活性な断片若しくはそのバリアントのプロモーター因子が含まれる。プロモーター因子は図11の7924位置に示すATG開始コドンの上流に位置することを、当業者は理解するであろう。
【０１０７】
本発明のこの態様の他の特に好ましい実施形態においては、調節エレメントにはペレニアルライグラスからのSIAH遺伝子からのプロモーターが含まれる。
【０１０８】
好ましくは、調節エレメントには図13に示した配列;又は高頻度可変領域を含む機能的に活性な断片若しくはそのバリアントのプロモーター因子が含まれる。プロモーター因子は図13の124位置に示すATG開始コドンの上流に位置することを、当業者は理解するであろう。
【０１０９】
本発明のこの態様の他の特に好ましい実施形態においては、調節エレメントにはペレニアルライグラスからのユビキチン特異的プロテアーゼ遺伝子からのプロモーターが含まれる。
【０１１０】
好ましくは、調節エレメントには図15に示した配列;又は高頻度可変領域を含む機能的に活性な断片若しくはそのバリアントのプロモーター因子が含まれる。プロモーター因子は図15の6784位置に示すATG開始コドンの上流に位置することを、当業者は理解するであろう。
【０１１１】
この文脈における「機能的に活性な」とは、断片又は(アナログ、誘導体又は変異体などの)バリアントが植物細胞、特に生殖組織における導入遺伝子の発現を引き起こすことができることを意味する。そのようなバリアントには、天然に存在する対立遺伝子バリアント及び天然に存在しないバリアントが含まれる。1つ又は複数のヌクレオチドの付加、欠損、置換及び誘導体化は、修飾が調節エレメントの機能的活性の喪失をもたらさない限りにおいて考慮される。好ましくは、機能的に活性な断片又はバリアントは、その断片又はバリアントが対応する上述の配列の関連部分と少なくとも約80%の同一性、より好ましくは少なくとも約90%の同一性、更に好ましくは少なくとも約95%の同一性、最も好ましくは少なくとも約98%の同一性を有する。好ましくは、前記断片には、少なくとも100ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも150ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも200ヌクレオチドのサイズを有する。
【０１１２】
本発明のこの態様の特に好ましい実施形態においては、調節エレメントには:
図3のヌクレオチド0から2334、
図3のヌクレオチド500から2334、及び
図3のヌクレオチド1000から2334;
又は機能的に活性な断片若しくはそのバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列が含まれる。
【０１１３】
本発明のこの態様の特に好ましい実施形態においては、調節エレメントには:
図5のヌクレオチド0から293、並びに機能的に活性な断片及びそのバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列が含まれる。
【０１１４】
本発明のこの態様の特に好ましい実施形態においては、調節エレメントには:図7のヌクレオチド0から787、並びに機能的に活性な断片及びそのバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列が含まれる。
【０１１５】
本発明のこの態様の特に好ましい実施形態においては、調節エレメントには:図9のヌクレオチド0から624、並びに機能的に活性な断片及びそのバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列が含まれる。
【０１１６】
本発明のこの態様の特に好ましい実施形態においては、調節エレメントには、
図11のヌクレオチド0から7923、
図11のヌクレオチド6968から7923、及び
図11のヌクレオチド7468から7923、
又は機能的に活性な断片若しくはそのバリアント
からなる群から選択されるヌクレオチド配列が含まれる。
【０１１７】
本発明のこの態様の特に好ましい実施形態においては、調節エレメントには、
図13のヌクレオチド0から123、並びにその機能的に活性な断片及びバリアント
からなる群から選択されるヌクレオチド配列が含まれる。
【０１１８】
本発明のこの態様の特に好ましい実施形態においては、調節エレメントには、
図15のヌクレオチド0から6783、
図15のヌクレオチド5087から6783、
図15のヌクレオチド5587から6783、及び
図15のヌクレオチド6087から6783;
又はその機能的に活性な断片若しくはバリアント
からなる群から選択されるヌクレオチド配列が含まれる。
【０１１９】
「外来性遺伝子」とは、前記調節エレメントと天然には関連していない遺伝子を意味する。本発明のある実施形態においては、外来性遺伝子は関連の植物又は植物細胞において天然には見出されないものでもある。
【０１２０】
外来性遺伝子は任意の適切なタイプであってよい。外来性遺伝子は、DNA(例えば、cDNA若しくはゲノムDNAなど)又はRNA(例えば、mRNAなど)のような核酸、及びその組合せであってよい。外来性遺伝子は、植物においてSIを操作することができる遺伝子であってよく、或いは、植物においてSIを操作することができるその断片又は(アナログ、誘導体若しくは変異体などの)バリアントであってよい。そのようなバリアントには、前記標的遺伝子にアンチセンスである核酸配列、又はそのアナログ、誘導体、変異体若しくは断片が含まれる。導入遺伝子は、標的条件及び遺伝子発現の下方又は上方制御が必要かに依存してタンパク質又はRNA配列をコードしてよい。
【０１２１】
本発明に記載の調節エレメントは外来性遺伝子を発現するためにトランスジェニック植物の産生において作動可能なようにそれに連結して使用してもよい。好ましくは、調節エレメントは植物の生殖組織における遺伝子発現のために使用される。
【０１２２】
好ましくは、本発明の遺伝子構築物は、本明細書に記載のように実質的に精製又は単離される。この文脈における「実質的に精製される」とは、遺伝子構築物が、本発明の核酸又はプロモーターが由来する生物体の天然に存在するゲノム内において、その核酸又はプロモーターに隣接する遺伝子を有さないことを意味する。したがって、この語句は、例えば、ベクター;自律的に複製するプラスミド若しくはウイルス;又は原核生物若しくは真核生物のゲノムDNAに取り込まれる遺伝子構築物、或いは、他の配列と独立して分離した分子(例えば、cDNA又はPCR若しくは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されるゲノム若しくはcDNA断片)として存在する遺伝子構築物が含まれる。それはまた、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である遺伝子構築物が含まれる。好ましくは、実質的に精製された遺伝子構築物は少なくとも約90%の純度、より好ましくは少なくとも約95%の純度、更により好ましくは少なくとも約98%の純度である。
【０１２３】
形質転換した宿主細胞の選択のための、表現型形質を提供する選択可能なマーカー遺伝子の使用の代替として、形質転換した細胞中の遺伝子構築物の存在は、例えばPCR(polymerase chain reaction;ポリメラーゼ連鎖反応法)、サザンブロットハイブリダイゼーション解析、組織化学分析(例えばGUSアッセーなど)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、ノーザン及びウエスタンブロットハイブリダイゼーション解析など、当該技術分野においてよく知られている他の手法によって決定されてもよい。
【０１２４】
本発明の遺伝子構築物及びベクターは、様々な植物、好ましくは単子葉植物、好ましくはドクムギ(genera Lolium)、ウシノケグサ(Festuca)、スズメノヒエ(Paspalum)、チカラシバ(Pennisetum)、キビ(Panicum)属及び他の飼料のようなイネ科の植物、並びに芝草、コーン、カラスムギ、サトウキビ、コムギ及びオオムギに組み込まれてもよい。
【０１２５】
本発明の遺伝子構築物は、任意の適切な手法により植物に導入してもよい。本発明の遺伝子構築物を植物細胞へ取り込ませる手法(例えば、形質導入、トランスフェクション、形質転換又は遺伝子ターゲッティングなど)は、当業者によく知られている。そのような手法には、アグロバクテリウムによる導入、リゾビウムによる導入、組織、細胞及びプロトプラストへのエレクトロポレーション、原形質融合、生殖器官への注入、未成熟胚への注入並びに細胞、組織、カルス、未成熟及び成熟胚への高速度入射導入、遺伝子銃形質変換、ウィスカーズ形質転換、並びにそれらの組合せが含まれる。手法の選択は形質転換する植物又は菌のタイプに大きく依存するであろうし、適切な当業者により容易に決定されてもよい。プロトプラストの形質転換については、PEGによる形質転換が特に好ましい。
【０１２６】
本発明の遺伝子構築物を取り込んだ細胞は、以降に記載のように選択し、その後、当該技術分野においてよく知られている手法を用いて、適切な培地中に培養し形質転換植物を再生してもよい。温度、pH等の培養条件は当業者にとって明らかであろう。結果としての植物は、形質転換した植物の継続的世代を産生するために、当該技術分野においてよく知られている方法を用いて、有性生殖的又は無性生殖的に生産されてもよい。
【０１２７】
本発明のさらなる態様においては、例えば、ベクター又は構築物、本発明の核酸又は核酸断片で形質転換したものを含む、植物細胞、植物、植物種子又は他の植物部分が提供される。好ましくは、植物細胞は形質転換した植物細胞である。
【０１２８】
「形質転換した植物細胞」とは、形質転換を施した植物細胞を意味する。
【０１２９】
「形質転換」とは、核酸を植物細胞内へ移動することを意味する。
【０１３０】
「導入遺伝子」とは、植物細胞を形質転換することに適した核酸を意味する。
【０１３１】
植物細胞、植物、植物種子又は他の植物部分は任意の適した種からのものでもよい。好ましい実施形態においては、植物細胞、植物、植物種子又は他の植物部分は、単子葉植物、好ましくはドクムギ、ウシノケグサ、スズメノヒエ、チカラシバ、キビ属及び他の飼料のようなイネ科の植物、並びに芝草、コーン、カラスムギ、サトウキビ、コムギ及びオオムギからのものでよい。
【０１３２】
本発明はまた、植物、植物種子若しくは他の植物部分、又は本発明の植物細胞若しくは植物に由来する植物抽出物も提供し、本発明のベクター若しくは構築物、核酸若しくは核酸断片、又は調節エレメントで形質転換したものも含む。
【０１３３】
本発明の核酸又は核酸断片は、核酸ハイブリダイゼーションの方法、並びに(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法、リガーゼ連鎖反応法のような)核酸増幅手法の様々な使用により例証されるようにDNA及びRNA増幅の方法のような配列に依存したプロトコールを使用して、同じ又は他の植物種からの相同SIタンパク質をコードするcDNA及び遺伝子を単離するために使用されてもよい。
【０１３４】
例えば、他の26Sプロテアソームサブユニット遺伝子、カリン遺伝子、グルタミン酸受容体若しくは前駆体遺伝子、亜鉛フィンガープロテアーゼ遺伝子、NOP遺伝子、SIAH遺伝子、又はユビキチン特異的プロテアーゼ遺伝子は、本発明の核酸又は核酸断片の全て又は一部を、所望の植物からのライブラリーを当業者によく知られている方法を用いてスクリーンするためのハイブリダイゼーションプローブとして使用して直接単離してもよい。本発明の核酸配列に基づいた特異的オリゴヌクレオチドプローブは当該技術分野において知られている方法により設計され、合成されてもよい。更に、全体の配列は、ランダムプライマーDNAラベリング、ニックトランスレーション、又はエンドラベリング法のような当業者に知られている方法によってDNAプローブを合成することに直接使用してよいし、或いは利用できるin vitro転写システムを使用したRNAプローブを合成することに直接使用してもよい。更に、本発明の配列の一部又は全てを増幅するために、特異的プライマーを設計し、使用してもよい。得られた増幅産物は増幅反応の間に直接ラベルしてもよいし、増幅反応の後にラベルしてもよく、適切なストリンジェンシーの条件下において全長cDNA又はゲノム断片を単離するためにプローブとして使用してもよい。
【０１３５】
更に、本発明の核酸又は核酸断片の短いセグメントはDNA又はRNAからの相同遺伝子をコードするより長い核酸又は核酸断片を増幅するために、プロトコールにおいて使用されてもよい。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法は、クローン化された核酸断片のライブラリーにおいて実行されてもよい。ここで、1つのプライマーの配列は、本発明の核酸配列に由来するものであり、他のプライマーの配列は、植物遺伝子をコードするmRNA前駆体の3'末端にポリアデニル酸トラクトが存在していることを利用する。或いは、第2のプライマー配列はクローニングベクターに由来する配列に基づいたものでもよい。例えば、当業者は転写物の1点から3'又は5'末端間の領域のコピーを増幅するPCRを用いてcDNAを生成するために、RACEプロトコール(Frohmanら(1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:8998;引用によりその開示全体が本明細書に取り込まれる)に準ずることができる。市販されている3'RACE及び5'RACEシステム(BRL)を用いて、特異的3'又は5'cDNA断片を単離してもよい(Oharaら(1989; Proc. Natl. Acad Sci USA 86:5673; Lohら(1989) Science 243:217;引用によりその開示全体が本明細書に取り込まれる)。3'RACE及び5'RACE手順により生成した産物は全長cDNAを生成するために混合してもよい。
【０１３６】
本発明のさらなる態様において、実質的に精製又は単離されたSIポリペプチドが提供される。好ましくは、SIポリペプチドは、プロテアソームサブユニット、より具体的には26Sプロテアソームサブユニット、カリン、グルタミン酸受容体又はその前駆体、亜鉛フィンガープロテアーゼ、C2及びGRAMアミノ酸ドメインの両者を含むポリペプチド、より好ましくは、無花粉(NOP)遺伝子にコードされるポリペプチド、SIAH、並びにユビキチン特異的プロテアーゼ、より好ましくは、ユビキチン特異的プロテアーゼ22からなる群から選択される。
【０１３７】
SIポリペプチドは、イネ科の植物からのポリペプチドから単離されてもよいか、又はそれに相当するものでもよい。好ましい実施形態においては、SIポリペプチドはイネ科の植物種、具体的にはライグラス又はフェスクのような牧草、より具体的にはペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)又はトールフェスク(Festuca arundinaceum、別名Lolium arundinaceumとしても知られている)からのポリペプチドから単離してもよいし、一致させてもよい。
【０１３８】
好ましい実施形態においては、本発明は、
(a)明細書記載の配列番号71から140に示される配列;
(b)明細書記載の配列番号1から70に示される配列にコードされるポリペプチド;
(c) (a)及び(b)に記載の配列の機能的に活性な断片;並びに
(d) (a)、(b)及び(c)に記載の配列の機能的に活性なバリアント
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実質的に精製又は単離されたSIポリペプチドを提供する。
【０１３９】
好ましい実施形態においては、本発明は実質的に精製又は単離されたプロテアソームサブユニットポリペプチドを提供する。より具体的には、26Sプロテアソームサブユニットポリペプチドであって、前記ポリペプチドは:
(a)明細書記載の配列番号128に示される配列;
(b)明細書記載の配列番号58に及び図3に示される配列にコードされるポリペプチド;
(c) (a)及び(b)に記載の配列の機能的に活性な断片;並びに
(d) (a)、(b)及び(c)に記載の配列の機能的に活性なバリアント
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１４０】
好ましい実施形態においては、本発明は、
(a)明細書記載の配列番号90に示される配列;
(b)明細書記載の配列番号20に及び図5に示される配列にコードされるポリペプチド;
(c) (a)及び(b)に記載の配列の機能的に活性な断片;並びに
(d) (a)、(b)及び(c)に記載の配列の機能的に活性なバリアント
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実質的に精製又は単離されたカリンポリペプチドを提供する。
【０１４１】
好ましい実施形態においては、本発明は:
(a)明細書記載の配列番号109に示される配列;
(b)明細書記載の配列番号39に及び図7に示される配列にコードされるポリペプチド;
(c) (a)及び(b)に記載の配列の機能的に活性な断片;並びに
(d) (a)、(b)及び(c)に記載の配列の機能的に活性なバリアント
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実質的に精製又は単離されたグルタミン酸受容体ポリペプチド又はその前駆体を提供する。
【０１４２】
好ましい実施形態においては、本発明は、
(a)明細書記載の配列番号132に示される配列;
(b)明細書記載の配列番号62に及び図9に示される配列にコードされるポリペプチド;
(c) (a)及び(b)に記載の配列の機能的に活性な断片;並びに
(d) (a)、(b)及び(c)に記載の配列の機能的に活性なバリアント
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実質的に精製又は単離された亜鉛フィンガープロテアーゼポリペプチドを提供する。
【０１４３】
好ましい実施形態においては、本発明は、
(a)明細書記載の配列番号129に示される配列;
(b)明細書記載の配列番号59に及び図11に示される配列にコードされるポリペプチド;
(c) (a)及び(b)に記載の配列の機能的に活性な断片;並びに
(d) (a)、(b)及び(c)に記載の配列の機能的に活性なバリアント
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実質的に精製又は単離されたNOPポリペプチドを提供する。
【０１４４】
好ましい実施形態においては、本発明は、
(a)明細書記載の配列番号110に示される配列;
(b)明細書記載の配列番号40に及び図13に示される配列にコードされるポリペプチド;
(c) (a)及び(b)に記載の配列の機能的に活性な断片;並びに
(d) (a)、(b)及び(c)に記載の配列の機能的に活性なバリアント
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実質的に精製又は単離されたSIAHポリペプチドを提供する。
【０１４５】
好ましい実施形態においては、本発明は、
(a)明細書記載の配列番号124に示される配列;
(b)明細書記載の配列番号54に及び図15に示される配列にコードされるポリペプチド;
(c) (a)及び(b)に記載の配列の機能的に活性な断片;並びに
(d) (a)、(b)及び(c)に記載の配列の機能的に活性なバリアント
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実質的に精製又は単離されたユビキチン特異的プロテアーゼポリペプチドを提供する。
【０１４６】
本発明は、本発明のポリペプチドの機能的に活性な断片及びバリアントを包含する。この文脈における「機能的に活性な」は、断片又はバリアントに由来する対応するタンパク質の1つ又は複数の生物学的特性をその断片又はバリアントが有することを意味する。1つ又は複数のアミノ酸の付加、欠損、置換及び誘導体化は、修飾が断片又はバリアントの機能的活性の喪失をもたらさない限りにおいて考慮される。好ましくは、断片又はバリアントは、その断片又はバリアントが対応する上述の配列の関連部分と少なくとも約80%の同一性、より好ましくは少なくとも約90%の同一性、より好ましくは少なくとも約95%の同一性、最も好ましくは少なくとも約98%の同一性を有する。そのような機能的に活性なバリアント及び断片にはまた、例えば、対応するアミノ酸配列において1つ又は複数の残基の保存的アミノ酸置換を有するものが含まれる。
【０１４７】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸が同じクラスの他の1つのアミノ酸により置換されることを意味し、前記クラスは下記のとおりである:
非極性:Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp
非荷電極性:Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln
酸性:Asp、Glu
塩基性:Lys、Arg、His
【０１４８】
他の保存的アミノ酸置換は、下記のようになされてもよい:
芳香族:Phe、Tyr、His
プロトンドナー:Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp
プロトンアクセプター:Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln
【０１４９】
好ましくは、前記断片は少なくとも10アミノ酸、より好ましくは少なくとも20アミノ酸、より好ましくは少なくとも50アミノ酸、より好ましくは少なくとも100アミノ酸、より好ましくは少なくとも200アミノ酸のサイズを有する。
【０１５０】
特に好ましい実施形態においては、前記断片又はバリアントは、本明細書に記載の図38から図58に示した配列を含むものであってよい。
【０１５１】
発明のこの態様のさらなる実施形態においては、本発明に記載の核酸又は核酸断片から組換えによって生産されるポリペプチドが提供される。ポリペプチドを組み換え的に生産する技術は当業者に知られている。
【０１５２】
本発明の核酸配列及び推定アミノ酸配列が利用できることにより、cDNA発現ライブラリーの免疫学的なスクリーニングが容易となる。推定によるアミノ酸配列の一部を代表する合成ペプチドが合成されてもよい。これらのペプチドは、アミノ酸配列を含むペプチド及び/又はタンパク質に対して特異性を持つポリクローナル又はモノクローナル抗体を生産するために動物を免疫化する目的で使用してもよい。これらの抗体は、その後、目的の全長cDNAクローンを単離するためにcDNA発現ライブラリーをスクリーニングするために使用してもよい。
【０１５３】
本発明のなおさらなる態様において、核酸ライブラリーからの核酸断片を塩基配列決定する工程を含む、本発明の核酸又は核酸断片を単離する方法が提供される。
【０１５４】
核酸ライブラリーは、任意の適切なタイプであってよいが、好ましくはcDNAライブラリーである。
【０１５５】
核酸又は核酸断片は、組み換えプラスミドから単離してもよく、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法を用いて増幅してもよい。
【０１５６】
塩基配列決定は、当業者に知られている技術により、実行されてもよい。
【０１５７】
なおさらなる態様において、本発明は、植物のSI経路において活性であるポリペプチドをコードする遺伝子の配列についての多様性を同定すること及びそのようなバリアントを分子マーカーとして配備することを含む。より具体的には、前記方法は、当業者に知られている方法を用いてS及びZ座位での遺伝子多様性を解析することによって、イネ科の植物内のS及びZ座位における植物の特異的遺伝子構成を決定する工程を含む。この遺伝子多様性はSI遺伝子の周囲の領域内であってよく、代理様式(proxy manner)で使用されてもよい。遺伝子内の配列多様性及びそれらのコードされたポリペプチドの例は、図17から図58に示されている。
【０１５８】
したがって、本発明は、本発明の核酸若しくは核酸断片又は分子遺伝子マーカーとしてのそのSNPの使用を提供する。
【０１５９】
より具体的には、本発明に記載の核酸又は核酸断片及び/又はそのヌクレオチド配列情報は、特にペレニアルライグラス(Lolium perenne)などのようなイネ科の植物において、量的形質遺伝子座(QTL)タギング、QTLマッピング、DNAフィンガープリンティング及びマーカー補助選択における分子遺伝マーカーとして使用してもよい。なおより具体的には、本発明に記載の核酸又は核酸断片は、SI制御又は操作に関連した植物改良における分子遺伝マーカーとして使用してもよい。なおより具体的には、本発明の核酸又は核酸断片の対立遺伝子バリアントにおけるSNPを明らかにする配列情報は、特にペレニアルライグラスのようなイネ科の植物における、QTLタギング及びマッピング並びにマーカー補助選択についての分子遺伝マーカーとして使用してもよい。
【０１６０】
文脈によって他の解釈が必要な場合を除き、本明細書において使用される「含む」並びに「含み」及び「含まれる」のようなその語句のバリエーションは、さらなる付加、構成成分、整数値又は工程を排除することを意図しない。
【０１６１】
文脈によって他の解釈が必要な場合を除き、本明細書において使用される単数形「a」「an」「the」は、その複数形の態様を含む。
【０１６２】
以下、添付の例及び図に言及しながら、本発明をより十分に記載する。しかしながら、以下の記載は一例に過ぎず、いかなる場合にも上述の発明の記載の一般性を制限するように解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】イネ(Oryza sativa)及びヤマカモジグサ(Brachypodium distachion)のモデルゲノムと比較した、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)において区切られたS領域の比較遺伝子イデオグラムを示す図である。イネ(Oryza sativa)とヤマカモジグサ間で共通に同定された遺伝子を連結する線で示した。塩基配列決定したペレニアルライグラスからのBACクローンの集合断片を比較ゲノムマップ及びそれらの遺伝子内容の予想位置に沿って示す。ペレニアルライグラスのヌクレオチド配列の遺伝子内容はイネ属数字番号に基づいてLpの接頭辞と共にオーソロガス遺伝子として記載する。
【図２】イネ(Oryza sativa)及びヤマカモジグサのモデルゲノムと比較した、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)において区切られたZ領域の比較遺伝子イデオグラムを示す図である。イネ(Oryza sativa)とヤマカモジグサ間で共通に同定された遺伝子を連結する線で示す。塩基配列決定したペレニアルライグラスからのBACクローンの集合断片を比較ゲノムマップ及びそれらの遺伝子内容の予想位置に沿って示す。ペレニアルライグラスのヌクレオチド配列の遺伝子内容はイネ属数字番号に基づいてLpの接頭辞と共にオーソロガス遺伝子として記載する。
【図３ａ】ペレニアルライグラス(Lolium perenne)LpOs06g0607800 26Sプロテアソームサブユニット遺伝子を含む遺伝子クローンの核酸配列を示す図である。LpOs06g0607800遺伝子の開始コドン(ATG)を太字イタリック下線で示す。
【図３ｂ】図３ａの続きである。
【図３ｃ】図３ｂの続きである。
【図３ｄ】図３ｃの続きである。
【図３ｅ】図３ｄの続きである。
【図３ｆ】図３ｅの続きである。
【図３ｇ】図３ｆの続きである。
【図３ｈ】図３ｇの続きである。
【図３ｉ】図３ｈの続きである。
【図３ｊ】図３ｉの続きである。
【図３ｋ】図３ｊの続きである。
【図３ｌ】図３ｋの続きである。
【図４】ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)の遺伝子銃による形質転換において使用したペレニアルライグラスZmUbi_LpOs06g0607800_nos発現カセットを含む形質転換ベクターのマップを示す図である。
【図５ａ】ペレニアルライグラス(Lolium perenne)LpOs05g0149600カリン遺伝子を含む遺伝子クローンの核酸配列を示す図である。カリン遺伝子の開始コドン(ATG)を太字イタリック下線で示す。
【図５ｂ】図５ａの続きである。
【図５ｃ】図５ｂの続きである。
【図５ｄ】図５ｃの続きである。
【図５ｅ】図５ｄの続きである。
【図６】ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)の遺伝子銃による形質転換において使用したペレニアルライグラスZmUbi_LpOs05g0149600_nos発現カセットを含む形質転換ベクターのマップを示す図である。
【図７ａ】ペレニアルライグラス(Lolium perenne)LpOs06g0680500グルタミン酸受容体(LpGlul)遺伝子を含む遺伝子クローンの核酸配列を示す図である。グルタミン酸受容体遺伝子の開始コドン(ATG)を太字イタリック下線で示す。
【図７ｂ】図７ａの続きである。
【図７ｃ】図７ｂの続きである。
【図８】ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)の遺伝子銃による形質転換において使用したペレニアルライグラスZmUbi_LpGlu1_nos発現カセットを含む形質転換ベクターのマップを示す図である。
【図９ａ】ペレニアルライグラス(Lolium perenne)LpOs04g0648500亜鉛フィンガープロテアーゼ遺伝子を含む遺伝子クローンの核酸配列を示す図である。亜鉛フィンガープロテアーゼ遺伝子の開始コドン(ATG)を太字イタリック下線で示す。
【図９ｂ】図９ａの続きである。
【図９ｃ】図９ｂの続きである。
【図９ｄ】図９ｃの続きである。
【図１０】ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)の遺伝子銃による形質転換において使用したペレニアルライグラスZmUbi_ LpOs04g0648500_nos発現カセットを含む形質転換ベクターのマップを示す図である。
【図１１ａ】ペレニアルライグラス(Lolium perenne)LpOs06g0607900 No-Pollen (LpNOP)遺伝子を含む遺伝子クローンの核酸配列を示す図である。LpNOP遺伝子の開始コドン(ATG)を太字イタリック下線で示す。
【図１１ｂ】図１１ａの続きである。
【図１１ｃ】図１１ｂの続きである。
【図１１ｄ】図１１ｃの続きである。
【図１１ｅ】図１１ｄの続きである。
【図１１ｆ】図１１ｅの続きである。
【図１１ｇ】図１１ｆの続きである。
【図１１ｈ】図１１ｇの続きである。
【図１１ｉ】図１１ｈの続きである。
【図１１ｊ】図１１ｉの続きである。
【図１２】ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)の遺伝子銃による形質転換において使用したペレニアルライグラスZmUbi_LpNOP_nos発現カセットを含む形質転換ベクターのマップを示す図である。
【図１３】ペレニアルライグラス(Lolium perenne)LpOs05g0152900セブン-イン-アブセンシアホモログ(LpSIAH)遺伝子を含む遺伝子クローンの核酸配列を示す図である。LpSIAH遺伝子の開始コドン(ATG)を太字イタリック下線で示す。
【図１４】ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)の遺伝子銃による形質転換において使用したペレニアルライグラスZmUbi_LpSIAH_nos発現カセットを含む形質転換ベクターのマップを示す図である。
【図１５ａ】ペレニアルライグラス(Lolium perenne)LpTC1 16908遺伝子を含む遺伝子クローンの核酸配列を示す図である。LpTC1 16908遺伝子の開始コドン(ATG)を太字イタリック下線で示す。
【図１５ｂ】図１５ａの続きである。
【図１５ｃ】図１５ｂの続きである。
【図１５ｄ】図１５ｃの続きである。
【図１５ｅ】図１５ｄの続きである。
【図１５ｆ】図１５ｅの続きである。
【図１５ｇ】図１５ｆの続きである。
【図１５ｈ】図１５ｇの続きである。
【図１６】ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)の遺伝子銃による形質転換において使用したペレニアルライグラスZmUbi_LpTC1 16908_nos発現カセットを含む形質転換ベクターのマップを示す図である。
【図１７】S座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図１８】S座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図１９】S座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図２０】S座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図２１】S座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図２２】S座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図２３】S座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図２４】S座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図２５】S座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図２６】S座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図２７】S座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図２８】S座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図２９】Z座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図３０】Z座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図３１】Z座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図３２】Z座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図３３】Z座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図３４】Z座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図３５】Z座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図３６】Z座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図３７】Z座位CDSバリアントを示す図である。検出した配列変異は[ ]の内部に両方の対立形質を記載し、特定する。
【図３８】S座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図３９】S座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図４０】S座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図４１】S座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図４２】S座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図４３】S座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図４４】S座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図４５】S座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図４６】S座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図４７】S座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図４８】S座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図４９】S座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図５０】Z座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図５１】Z座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図５２】Z座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図５３】Z座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図５４】Z座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図５５】Z座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図５６】Z座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図５７】Z座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図５８】Z座位アミノ酸バリアントを示す予想されるアミノ酸翻訳を示す図である。
【図５９ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図５９ｂ】図５９ａの続きである。
【図６０ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図６０ｂ】図６０ａの続きである。
【図６１ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図６１ｂ】図６１ａの続きである。
【図６２ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図６２ｂ】図６２ａの続きである。
【図６３ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図６３ｂ】図６３ａの続きである。
【図６４ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図６４ｂ】図６４ａの続きである。
【図６５ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図６５ｂ】図６５ａの続きである。
【図６６ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図６６ｂ】図６６ａの続きである。
【図６７ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図６７ｂ】図６７ａの続きである。
【図６８ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図６８ｂ】図６８ａの続きである。
【図６９ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図６９ｂ】図６９ａの続きである。
【図７０ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図７０ｂ】図７０ａの続きである。
【図７１ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図７１ｂ】図７１ａの続きである。
【図７２ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図７２ｂ】図７２ａの続きである。
【図７３ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図７３ｂ】図７３ａの続きである。
【図７４ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図７４ｂ】図７４ａの続きである。
【図７５ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図７５ｂ】図７５ａの続きである。
【図７６ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図７６ｂ】図７６ａの続きである。
【図７７ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図７７ｂ】図７７ａの続きである。
【図７８ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図７８ｂ】図７８ａの続きである。
【図７９ａ】ペレニアルライグラスの遺伝子銃による形質転換において使用したZmUbi_SI gene_nos発現カセットの核酸配列を示す図である。レジェンド:ゲートウェイattB1部位(太字下線);トウモロコシUbiプロモーター(イタリック)+イントロン(下線イタリック);アンチセンス及びセンス方向でのペレニアルライグラスコーディング領域(下線);rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字イタリック)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)。
【図７９ｂ】図７９ａの続きである。
【図８０】形質転換パイプラインの図説である;A、ドナーのライグラス材料の調製;B、体細胞胚カルスイニシエーション;C、カルス増殖;D、浸透処理;E、発現カセットを含む導入遺伝子の遺伝子銃送達;F、適切な選択剤を含む組織培養培地におけるカルス成長;G、カルスからの推定トランスジェニック植物の再生;H、推定トランスジェニック植物の樹立。
【図８１】再生したトランスジェニックイベントからの個々の分げつのトランスジェニック状態のPCR評価を示す図である。各々の形質転換イベントは、再生した植物から分割した3つの個々の分げつにより評価した。3つの分げつ全てにおいて導入遺伝子が存在することを確認できたサンプルのみを、さらなる評価の対象イベントとして認めた。図中の番号1及び2で示した角括弧は、1、全ての分げつが導入遺伝子の存在についてネガティブであるため破棄するであろうトランスジェニックイベント、及び2、全ての3つの分げつが導入遺伝子の存在についてポジティブな結果を生じたトランスジェニックイベント、を示す。
【図８２】A及びBは、それぞれS及びZ候補遺伝子の下方制御についてのSiRNA構築物での例示的なトランスジェニック植物についての生存花粉粒のFDA染色を示す図である。生存及び非生存の両方の花粉粒がA及びBの両方において観察できる。
【図８３】ライグラス花の精査のステージを示す図である。A-無処置のライグラス花。生殖性の成熟度に達した際に、葯を花から取り除く。柱頭突起がその後、伸長し、目視できるであろう。B-個々の小穂をさらなる精査のために花穂から切除した。C-雄及び雌生殖性組織を小穂から切除した。D及びE-受粉した柱頭における花粉管成長を検査するために雌組織を更に切除した。
【図８４】花粉管成長の不和合性反応を示す図である。A及びB、柱頭突起上に出芽した単一の花粉粒の例及び接触の際に成長が停止する。接触の際花粉管は、矢印で示すように、細胞質圧力により頻繁に形状が肥大するであろう。C、LpOs05g0149600についてのSiRNA構築物を含むトランスジェニック植物からの自家受粉の不和合反応。
【図８５】非形質転換植物での和合性花粉管成長を示す図である。花粉は無関係のライグラス植物から取られ、非形質転換花の上に置いた。花粉管は柱頭突起と接触させ、その後、子房に向かって定方向に成長し続けた。成長する花粉管は、細胞質圧力を保持するために規則的な間隔(矢印により示す)でカロース栓を沈着させ、精子細胞をうまく子房に向かって移動させるであろう。これらの立ち退いた領域は空胞化するであろう。
【図８６】和合性花粉反応を示す図である。花粉管は柱頭突起と接触させ、その後、子房に向かって定方向に成長し続けた。和合性花粉管は規則的な間隔(矢印により示す)でカロース栓を沈着させるであろう。反応はLpOs06g0680500についてのsiRNA構築物を含むトランスジェニック植物の自家受粉において観察された。
【図８７】LpOs05g0152900遺伝子についてのsiRNA構築物を含む2つの異なる植物の花粉-柱頭相互作用の顕微鏡像である。2つの異なるトランスジェニックイベント(A及びB)は不和合性から部分的な和合性までの表現型の範囲を示す。
【図８８】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図８９】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図９０】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図９１】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図９２】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図９３】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図９４】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図９５】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図９６】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図９７】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図９８】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図９９】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図１００】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図１０１】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図１０２】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図１０３】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図１０４】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図１０５】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図１０６】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図１０７】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図１０８】ペレニアルライグラスSI遺伝子の発現プロファイルを示す図である。発現プロファイルは、オルソロガスなテンプレートとして使用したヤマカモジグサCDS遺伝子配列と比較して、ペレニアルライグラス(Lolium perenne L.)遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列読み取りデータのBLAST解析により決定した。
【図１０９】F1雑種イネ科植物育種の模式図である。最初に、S及びZ座位の上又は周りのマーカーを用いて、植物の遺伝子型を同定する。その後、2つの親のプールを生成及び増加させる。十分な種子が生成されたら、プール間の雑種強勢度の試験と共に行う。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１６４】
(実施例1.SI遺伝子の単離)
比較ゲノミクス及びBACクローン及びゲノムシークエンシングを通して、S及びZ座位の両方の範囲を決定した。シークエンスデータ中の全ての遺伝子を同定した[Table 1(表1)及びTable 2(表2)]。配列は、FGENESH予想ソフトウェアを通して決定された。実施例6に記載のように、発現プロファイルを各遺伝子について決定した。オルソロガスな鋳型として使用したミナトカモジグサCDS遺伝子配列と比較した、ペレニアルライグラス遺伝子型Impact04の複数の組織からの配列の読みのBLAST解析を通して発現プロファイルを決定した(図88〜図108を参照されたい)。
【０１６５】
【表１Ａ】
2019103526.tif 000002
【０１６６】
【表１Ｂ】
2019103526.tif 000003
【０１６７】
【表１Ｃ】
2019103526.tif 000004
【０１６８】
【表１Ｄ】
2019103526.tif 000005
【０１６９】
【表２Ａ】
2019103526.tif 000006
【０１７０】
【表２Ｂ】
2019103526.tif 000007
【０１７１】
【表２Ｃ】
2019103526.tif 000008
【０１７２】
(実施例2.再シークエンシングデータによるDNAヌクレオチドの相違の同定)
S及びZ座位の鍵となる候補として21遺伝子のコホートを選択した。これらの遺伝子は、発現プロファイル及び配列アノテーションに基づいて選択された。
【０１７３】
この21遺伝子のコレクション全てには、これらの遺伝子のコード領域を再シークエンスするように設計されたPCRプライマーがあった。これらの設計されたPCRアンプリコンは、大きなゲノム断片を産生するように最適化された。合計50の植物遺伝子型を、再シークエンシング用の鋳型DNAとして使用した。再シークエンスされている遺伝子座位における対立遺伝子のバリエーションを最大にするための潜在的に広範囲の多様性を有する多様な広がりの植物として50種の植物を選択した。
【０１７４】
これらのアンプリコンを産生させ、次いで、各遺伝子型からプールし、より小さい断片に物理的に切断した。各試料を同定するために、切断した断片上にDNAバーコード及びシークエンシングアダプターを連結し、次いで、全ての試料を合わせて、次世代lllumina MiSeqプラットフォームを使用して300bp×2の読みでシークエンスした。
【０１７５】
結果として得られたシークエンスデータをバーコードを使用して個々の試料に帰し、次いで、質を確認して質の低い読みを除外した。次いで、これらの配列の読みを、増幅された遺伝子に参照アライメントし、バリアント塩基を同定した。次いで、個々の試料を合わせて、潜在的に100種の異なる対立遺伝子を有する、50試料からの全てのバリアント塩基を同定するためのデータセットを得た。
【０１７６】
各遺伝子についてバリアント塩基を記録し、そのバリエーションが自然界において同義であるか同義でないかを同定した。研究下の遺伝子のそれぞれについての最低限の必要条件は、その転写産物中に同定される5個以上のバリアントアミノ酸が存在することであった。5個のバリアントアミノ酸の合計により、完全な無作為交配の最大の組換えを可能にする、データセットからの最大32種の潜在的なハプロタイプが可能になるはずであった。
【０１７７】
100種のハプロタイプを再シークエンスしたので、高レベルの多様性が予想されるが、選択された植物からのハプロタイプ間でのある程度の重なりがありえたので、固有のハプロタイプの総数はシークエンスした数よりも少なくなりえた。
【０１７８】
ペレニアルライグラスは、2〜4種のハプロタイプの再シークエンシングに基づいて、遺伝子内の20〜30塩基毎に1個のSNPからの範囲に及ぶ推定で、そのゲノム内に高度な配列バリエーションを有するとして特徴付けられている。2個の例外付きで、再シークエンスした遺伝子の全ては、その遺伝子のコード領域内に、必要とされる対立遺伝子多様性をもたらしうるポリペプチドの十分な多様性を生じるはずである十分なバリエーションを含んでいた(図17〜図58を参照されたい)。検出された配列バリエーションは、[]内で両方の対立遺伝子型が記載されて同定される。
【０１７９】
遺伝子LpOs05g0151300及びLpOs05g0152400は、それぞれ3個及び2個のバリアントアミノ酸しか有さず、十分な多様性を有していなかった。
【０１８０】
(実施例3-SI遺伝子の単離:ライグラスLpOs06g0607800 26Sプロテアソーム遺伝子のクローニング)
ペレニアルライグラスSI座位の細密な規模の遺伝的及び物理的なマッピング用の新規遺伝子マーカーを開発するために、ライムギ及び/又はブルーカナリーグラスにおけるオルト座位同時分離に基づいて、連鎖した非相同cDNA由来のRFLPマーカーをS座位及びZ用に選択した。分子マーカー開発、遺伝子マッピング及び部分解剖については、Shinozukaら(2010)に記載されている。構築されたデータセットの結果として、モデルイネ科種、特にイネ及びミナトカモジグサとの細密な規模の比較配列シンテニーが、範囲を決定したS及びZ領域について達成された。モデルイネ科種からの定義された遺伝子相補体を使用して、記載の遺伝子に特異的なプライマー対でBACライブラリーをスクリーニングし、39種の特異的なクローンを同定した。選択されたBACクローンの素性を、座位特異的なアンプリコンの直接シークエンシングを通して検証した。これらの特異的なBACクローンを、次いで、Sanger及び/又はGSFLXの技術を使用してシークエンスし、結果として得られたデータを、Newblerソフトウェアパッケージを使用して配列構築した。シークエンシング及び構築後、BLAST及び遺伝子予想ソフトウェアツールを使用して遺伝子様ヌクレオチド配列を同定した。得られた情報に基づき、SI座位領域の物理的なマップを構築するための解像度及びシークエンスデータを更に向上させるためのさらなるクローンを選択するためにこの操作を繰り返した(図1及び図2)。
【０１８１】
BACシークエンシングから同定されてペレニアルライグラスの分離集団において遺伝的にマップされた特異的な遺伝子座位の再シークエンシングから分子マーカーを開発し、生成された配列の位置を確認した。
【０１８２】
単一のペレニアルライグラス遺伝子型(植物-Impact04)のゲノムを、約70×のカバー度でシークエンスして、lllumina GA2X及びHiSeq2000プラットフォーム上で100bp対の末端配列の読みの約20億のシークエンシングの読みが生成されている。SOAPdenovo v.1.05ソフトウェアパッケージを使用して、このシークエンスデータを、構築する前に、質の高い読みのためにフィルターにかけた。配列構築は、構築される塩基の数、並びに構築されるコンティグ及びスキャフォールドの平均長に関して、一範囲の入力のkmerサイズに基づいた反復的な動作の評価を通して経験的に最適化されている。最適な構築は、約1.7Gbをカバーする190万のスキャフォールドを生成しているのに対して、全てのコンティグ及びシングルトンは約3.5Gbをカバーする。
【０１８３】
モデルイネ科植物種ミナトカモジグサのコード配列に対する、コンティグ及びスキャフォールドの比較により、全ての予測される遺伝子の約86%及びモデルイネ科植物種からの代替の転写産物に対する推定上のペレニアルライグラスオルソログの同定が可能になった。個々のブラキポディウム遺伝子配列に関連性のある転写産物及びゲノム配列をグループ化して個々の局所的なCAP3に基づいた構築にするために、並行性の高いBLAST解析法に基づいてパイプラインアプローチを実施した。このアプローチにより、対応するブラキポディウム遺伝子にインデックス付けされた23,285個の遺伝子ファイルが生成された。エクソーム配列ライブラリーの開発により、対応する調節エレメントと共に、遺伝子コンティグの大規模なコレクションの同定が可能になった。このコンティグのコレクションを、次いで、BACスクリーニングプロセスを通して同定されなかったS及びZ座位内の予測される遺伝子の存在についてスクリーニングした。
【０１８４】
イネ遺伝子Os06g0607800との配列類似性を示すBACクローン関連配列から新規ペレニアルライグラス遺伝子が同定され、それ故に、このライグラス遺伝子はLpOs06g0607800(配列番号58及び図3)と呼ばれた。このライグラス遺伝子には、BLASTx解析を通して(イネアミノ酸配列と比較してe値=3e-65で)26Sプロテアソームサブユニット遺伝子として注釈がつけられていた。この遺伝子には、AAA ATPアーゼドメイン(配列番号128)も含まれていた。
【０１８５】
加えて、BACシークエンシングを通してZ座位領域内に同定されたライグラス26Sプロテアソームサブユニット遺伝子は、BLAST解析を通したゲノムのImpact04配列とBLAST解析を通して比較された。BACクローンからの配列並びにゲノムの配列の同定により、該遺伝子のコード領域からのバリアント配列塩基の同定が可能になった(図33及び図54)。
【０１８６】
細胞内タンパク質分解は、ユビキチン-プロテアソーム経路又はオートファジー-リソソーム/液胞経路を通して主に調節及び可能にされる。タンパク分解事象は、自己花粉拒絶を通してSIにおいて重要な役割を果たしている。ユビキチン介在性タンパク質分解は、アブラナ科(Brassicaceae)及びナス科のSI機序に関与している。
【０１８７】
26Sプロテアソームは、20Sコアプロテアソーム(CP)エレメント及び19S調節粒子(RP)からなる。タンパク質分解は20Sの区画で生じるのに対して、19SのエレメントはATP依存性及びCPに対する基質特異性を与える。RPは、標的のアンフォールディング及び輸送における機能が予想される6つのAAA-ATPアーゼサブユニットの環(RPTとして略記されることが多い)と、3つの非ATPアーゼサブユニット(RPNとして略記されることが多い)との2つのエレメントからなる。26Sプロテアソームサブユニット遺伝子LpOs06g0607800は、AAA-ATPアーゼドメインを含むので、クラスRPTに属する。
【０１８８】
26Sプロテアソーム遺伝子のRTP2サブユニットが破壊された、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana L.)変異株により、雄及び雌の配偶子伝達には、配偶子形成における発育停止及び失敗を回避するために、RPT2遺伝子の正常なコピーが必要なことが実証されている。タバコ(Nicotiana tabacum L.)において、NtRpn3遺伝子は、カルシウム依存性プロテインキナーゼと物理的に相互作用してカルシウム依存的な様式でリン酸化されることが見出された。
【０１８９】
理論によって限定されることを出願人らが望むものではないが、LpOs06g0607800 26Sプロテアソーム遺伝子は、それ故に、Z座位の雌決定因子であることが提唱される。
【０１９０】
(実施例4-LpOs06g0607800 26Sプロテアソーム遺伝子の逆位ヘアピン構造を含んでいる形質転換ベクターの作製)
LpOs06g0607800発現カセットは、トウモロコシからのユビキチン(Ubi)遺伝子からのプロモーター、5'非翻訳領域及びイントロン(Tokiら  1992)、並びにその後ろのデュラムコムギ(Triticum turgidum subsp. durum)からのRGA2遺伝子のイントロン2(Douchkovら  2005)によって遮断された逆位リピート内にあるペレニアルライグラスからのLpOs06g0607800遺伝子の500bpのコード配列からなる。このヘアピンカセットは、A.ツメファシエンスpTi15955からのノパリン合成酵素遺伝子(nos)の転写ターミネーター及びポリアデニル化部位(Fraleyら  1983)を含む3'非翻訳領域(UTR)で終結された。
【０１９１】
(シス又はトランスのいずれかで送達される)選択カセットは、イネからのアクチン(Act1)遺伝子からのプロモーター、5'非翻訳領域及びイントロン(McElroyら  1990)、並びにその後ろの合成の、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を与えるタンパク質をコードする、大腸菌(E. coli)からのhph遺伝子(Kasterら  1983)の単子葉植物における発現のためにコドンを最適化したバージョンを含んでいた。このカセットは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35s遺伝子からの転写ターミネーター及びポリアデニル化部位(Chenault及びMelcher 1993)を含む3'UTRで終結された。
【０１９２】
この選択カセットは、商業的な遺伝子合成業者(GeneArt, Life Technologies社)によって合成され、ゲートウェイ可能なベクター中にクローニングされた。LpOs06g0607800発現カセットは、商業的な遺伝子合成業者(GeneArt, Life Technologies社)によって側方のattB部位付きで合成された。シスでの送達のために、LpOs06g0607800発現カセットを、pDONR221 II(Invitrogen, Life Technologies社)中にBP Clonase反応でサブクローニングした。得られた導入クローンを、hph発現カセットをコードしているゲートウェイ可能なベクターとのLR Clonase II(Invitrogen, Life Technologies社)反応に使用した。全ての構築されたプラスミドのコロニーを、最初にミニプレップDNAの制限消化によってスクリーニングした。制限エンドヌクレアーゼは、New England Biolabs社(NEB; Ipswich, MA)及びPromega社(Promega Corporation, Wl)から得られた。QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen社、Hilden)又はPure Yield Plasmid Maxiprep System(Promega Corporation社、Wl)を供給業者の説明書に従って使用して、プラスミド調製を行った。ABI Sanger Sequencing及びBig Dye Terminator v3.1サイクルシークエンシングプロトコール(Applied Biosystems, Life Technologies社)を使用して、選択されたクローンのプラスミドDNAをシークエンスした。SEQUENCHER(商標)ソフトウェア(Gene Codes Corporation社、Ann Arbor、Ml)を使用して、シークエンスデータを構築及び解析した。
【０１９３】
この遺伝子発現カセットのイデオグラムを図4に示している。この発現カセットの全配列を図75に示している。
【０１９４】
(実施例5-SIのRNAi介在性下方制御のためのLpOs06g0607800 26Sプロテアソーム遺伝子のdsRNA産物の発現のためのペレニアルライグラスのバイオリスティック形質転換)
LpOs06g0607800 26Sプロテアソーム遺伝子配列、RNAiカセットの発現を動かすもの及びハイグロマイシン耐性のための大腸菌からのhph遺伝子の合成バージョンを含んでいるベクターを用いたペレニアルライグラスのバイオリスティック共形質転換をペレニアルライグラスの胚形成カルス上で行った。
【０１９５】
形質転換プロトコールに沿って使用したベクターは、以前に植物形質転換実験において成功して使用されている(Bilangら、1991; Spangenbergら、1995a; Spangenbergら、1995b; Yeら、1997; Baiら、2001)。ペレニアルライグラスバイオリスティック形質転換法を図80に概説している。
【０１９６】
結果として得られたトランスジェニック植物の表現型の評価は、植物を栽培して成熟させ、次いで、12時間の照明と共に5℃で10週間の春化期間の後に、植物を24時間の照明と共に22℃にさらすことによって行った。温度及び感知される日長における変化は、植物における開花を開始させたが、これは、それから2〜3週後に生じた。ライグラス花が開花する前に、花穂を、形態学的な変化又は変形について確認し、次いで、紙袋に入れて、花を他の潜在的な花粉ドナーから単離した。開花している花穂は、開花が完了するまでその単離状態で維持されてもよく、その時に種子セットが評価されうる。複数の花穂を植物毎に袋に入れて各小穂及び花を種子産生について視覚的に評価してもよい。
【０１９７】
推定上のトランスジェニック植物が選択培地上で一度再生されたら、その植物を3つの単一の植物若芽に分けた。従来のPCRを通して、各若芽を個別に導入遺伝子の存在についてスクリーニングした。オリゴヌクレオチドプライマーは、標的遺伝子の逆位ライグラスリピートを遮断する、デュラムコムギからのRGA2イントロン配列を標的とした第2のアッセイと同様にトウモロコシからのユビキチン(Ubi)遺伝子に由来したプロモーター領域に設計されていた。これらの領域は、内因性ライグラスゲノムからのクロス増幅を最小にするために選択された。アッセイを展開し、クロス増幅が生じていないことを確認するために、形質転換を行っていないライグラスゲノムDNA上で最初に試験した。トランスジェニック事象は、両方のアッセイでの導入遺伝子の存在について3つの若芽全てが陽性の結果を返したときのみに選択された。不定の結果が認められた場合には、陽性であった単一の若芽を生育培地に戻して、それらを3つの若芽に再び分けて再びスクリーニングできるようになるまで更に栽培した。
【０１９８】
図81は、再生されたトランスジェニック事象からの個々の若芽についてのトランスジェニック状態のPCR評価を示している。各形質転換事象は、再生された植物から分けた3つの個々の若芽を通して評価された。3つの若芽全てが導入遺伝子の存在の陽性の確認を示した例のみ、その事象を更に評価することが受け入れられた。図中の番号1及び2を有する角括弧は、1は、全ての若芽が導入遺伝子の存在について陰性であるので捨てられるはずであるトランスジェニック事象を同定し、且つ2は、3つの若芽全てが導入遺伝子の存在について陽性の結果を生じたトランスジェニック事象を同定する。
【０１９９】
構築物当たり平均12の異なるトランスジェニック事象が生じ、3〜19の範囲であった。これらの植物を土壌に移して適切な封じ込め温室で維持した。
【０２００】
【表３】
2019103526.tif 000009
【０２０１】
生殖の成熟に達している植物において表現型の評価を行った。反応を確実に見られるように、最初に、花粉粒を生存率について評価した。形質転換及び組織培養プロセスを通過している植物細胞における一般的な影響は、結果として生じた全体の植物の受精能の低下である。生存率は、フルオレセイン二酢酸(FDA)での染色を通して確認された。FDAは、親油性化合物であり、且つ膜透過性及び非蛍光性である。生存可能な花粉粒は、細胞内エステラーゼ活性を有することになり、細胞内にFDAが入るとすぐにFDAの酵素的加水分解を行うことができることになる。一度FDAが生存可能な花粉粒内で加水分解されると、それは、細胞質内で強い緑色の蛍光を生じて、細胞の外に拡散することができずに保持されることになる、高度に蛍光性の化合物になる。
【０２０２】
図82は、生存可能な花粉粒、例えば、S及びZ遺伝子のそれぞれの候補の下方制御用のsiRNA構築物でのトランスジェニック植物のFDA染色を示している。生存可能な花粉粒及び生存不能な花粉粒の両方は、A及びBの両方において認められうる。
【０２０３】
花粉生存率を確認し次第、花粉-雌しべの相互作用を評価した。花粉-雌しべ相互作用を顕微鏡的に評価するために、開花しているライグラス植物の花組織の解剖を行った。
【０２０４】
図83は、ライグラス花解剖の段階を示している。A-ライグラスの完全な花。生殖の成熟に達することにより、葯は花から出る。柱頭の乳頭は、次いで、伸長して見えるようになる。B-さらなる解剖のために、個々の小穂を花穂から摘出した。C-雄及び雌の両方の生殖組織を小穂から摘出した。D及びE-受粉した柱頭における花粉管伸長を調査するために雌の組織を更に摘出した。
【０２０５】
各トランスジェニック事象は、PCRスクリーニングプロセスに記載のように3つの植物によって表された。導入遺伝子siRNA構築物の挿入が結果として一範囲の発現レベルをもたらす可能性が高いので、複数のトランスジェニック事象が必要とされる。トランスジェニック事象間での発現におけるこの相違は、反応についての一範囲の表現型をもたらす可能性が高い。花粉-雌しべの和合性/不和合性の反応を、柱頭の組織との接触時の花粉管伸長停止、又は子房に向かって伸長を誘導された花粉管を通して可視化することができる。観察される表現型上の信頼性を評価するために、植物毎に複数の花が必要とされる。一度受粉したら、柱頭の組織を単離して、アニリンブルー染色を行い、この組織を倒立蛍光顕微鏡下で可視化した。一範囲の反応が認められた。多くの植物について自家不和合性の発生が認められたが、部分的和合性の例も認められた。
【０２０６】
図84は、花粉管伸長の不和合性の反応を示している。A及びB、柱頭の乳頭上で発生している及び接触により伸長が停止される単一の花粉粒の例。接触により花粉管は、細胞質圧力を通して形状がふくらむようになることが多く、矢印によって示されている。C、LpOs05g0149600用のsiRNA構築物を含んでいるトランスジェニック植物からの自家受粉の不和合性の反応。
【０２０７】
図85は、形質転換を行っていない植物での和合性の花粉管伸長を示している。無関係なライグラス植物から花粉を採取して、形質転換を行っていない花上に置いた。花粉管は、柱頭の乳頭と接触されており、次いで、子房に向かって定方向の様式で伸長を継続している。細胞質の圧力を保持して、精細胞が子房に向かって移動するのに成功することを可能にするために、伸長により花粉管は、(矢印によって示される)一定の間隔でカロースプラグを沈着することになる。これらの空いた領域は、空胞になることになる。
【０２０８】
図86は、和合性の花粉反応を示している。花粉管は、柱頭の乳頭と接触されており、次いで、子房に向かって定方向の様式で伸長を継続している。和合性の花粉管は、(矢印によって示される)一定の間隔でカロースプラグを沈着することになる。この反応は、LpOs06g0680500用のsiRNA構築物を含んでいるトランスジェニック植物の自家受粉において観察された。
【０２０９】
図87は、LpOs05g0152900遺伝子用のsiRNA構築物を含んでいる2種の異なる植物の花粉-柱頭相互作用の顕微鏡画像を示している。2つの異なるトランスジェニック事象(A及びB)は、不和合性から部分的和合性までの一範囲の表現型を示す。
【０２１０】
(実施例6-LpOs06g0607800 26Sプロテアソーム遺伝子の発現解析)
複数の異なる組織型由来のcDNA試料のディープシークエンシングを通して、単一の遺伝子型のペレニアルライグラスをトランスクリプトーム解析にかけた。合計19種の異なるRNA試料を、遺伝子発現の地上及び地下の両方の面のために葉、偽茎及び根の試料を含む、栄養組織から作製した[Table 4(表4)]。加えて、葯、雌しべ、柱頭及び受粉した雌しべから一まとまりの生殖ライブラリーを作製した。このライブラリーを、RNASeq調製法を使用したllluminaに基づくシークエンシング用に調製した。シークエンシングプロセス後の識別を可能にするために、各ライブラリーを内部的にバーコード化した。
【０２１１】
lllumina HiSeq2000プラットフォームから合計約6億のシークエンシングの読みが生成された。各組織試料から約3千万の配列の読みが生成された。次いで、生成された配列をフィルターにかけ、配列の読み当たり<3塩基を確実にするように整えた質を「N」と呼び、平均的及び局所的なPhred質は全ての例において>30であった。
【０２１２】
質をフィルターにかけた読みを、次いで、ミナトカモジグサゲノムのコード配列に対してBLASTn解析した。遺伝子毎のBLASTnの合致数を、組織型毎に計数して表化した。試料毎に生成された読みの数が異なっていたので、比較解析用に標準化した値を生成するために、BLASTnマップされた読み計数を75パーセンタイルで標準化した。遺伝子欠失又は作製された新規のあらゆる遺伝子カタログの不完全な構築の問題を軽減するために、このミナトカモジグサゲノムを、この解析において全体のゲノム参照として使用した。
【０２１３】
【表４Ａ】
2019103526.tif 000010
【０２１４】
【表４Ｂ】
2019103526.tif 000011
【０２１５】
LpOs06g0607800遺伝子として同定される核酸配列を、ミナトカモジグサゲノム配列のコード部分に対して比較したときに、最も近く合致する遺伝子配列としてBradi1g36400が同定される。この解析から生成された発現プロファイルにより、雌しべ組織において自家受粉に応じて経時的に遺伝子発現における劇的な増加が確認される(図104)。一定レベルの遺伝子発現が植物全体にわたって検出されるが、解析において他の遺伝子ファミリーメンバーからのいくらかの干渉が起こりうる。或いは、遺伝子の一般的な発現が全組織にわたって別の機能を有している場合もあり、又は特定のプロモーターエレメントの結果として非組織特異的な遺伝子発現を示す場合もある。
【０２１６】
(実施例7-SI遺伝子の単離:ライグラスLpOs05g0149600カリン遺伝子のクローニング)
実施例3に概説した方法を使用して、イネ遺伝子Os05g0149600との配列類似性を示すBACクローン関連配列から新規ペレニアルライグラス遺伝子が同定され、それ故に、このライグラス遺伝子はLpOs05g0149600(配列番号20及び図5)と呼ばれた。このライグラス遺伝子には、BLASTx解析を通してカリン遺伝子として注釈がつけられていた(配列番号90)。
【０２１７】
加えて、BACシークエンシングを通してS座位領域内に同定されたライグラスカリン遺伝子は、BLAST解析を通したゲノムのImpact04配列とBLAST解析を通して比較された。BACクローンからの配列並びにゲノムの配列の同定により、該遺伝子のコード領域からのバリアント配列塩基の同定が可能になった(図21)。
【０２１８】
カリンは、RINGに基づくE3ユビキチンリガーゼを集める役割を果たしている分子的足場である。ナス科、バラ科(Rosaceae)及びオオバコ科(Plantaginaceae)ファミリーの範囲内において、SI機序は、動原体タンパク質のサプレッサーと共に、カリン遺伝子、F-box遺伝子からなる複合体の形成を含む。この複合体は、標的タンパク質にポリユビキチン鎖を付加し、それによってユビキチン化されたタンパク質が26Sプロテアソームによって分解されるようになる、ユビキチンE3リガーゼ活性を有する。複合体中のカリン遺伝子は、他のサブユニットを集めるのに役割を果たし、標的タンパク質に付加するためにユビキチンタンパク質を召集するさらなる化合物に結合する。
【０２１９】
(実施例8-LpOs05g0149600遺伝子の逆位ヘアピン構造を含んでいる形質転換ベクターの作製)
LpOs05g0149600発現カセットは、トウモロコシからのユビキチン(Ubi)遺伝子からのプロモーター、5'非翻訳領域及びイントロン(Tokiら  1992)、並びにその後ろのデュラムコムギからのRGA2遺伝子のイントロン2(Douchkovら  2005)によって遮断された逆位リピート内にあるペレニアルライグラスからのLpOs05g0149600遺伝子の500bpのコード配列からなる。このヘアピンカセットは、A.ツメファシエンスpTi15955からのノパリン合成酵素遺伝子(nos)の転写ターミネーター及びポリアデニル化部位(Fraleyら  1983)を含む3'非翻訳領域(UTR)で終結された。
【０２２０】
(シス又はトランスのいずれかで送達される)選択カセットは、イネからのアクチン(Act1)遺伝子からのプロモーター、5'非翻訳領域及びイントロン(McElroyら  1990)、並びにその後ろの合成の、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を与えるタンパク質をコードする、大腸菌からのhph遺伝子(Kasterら  1983)の単子葉植物における発現のためにコドンを最適化したバージョンを含んでいた。このカセットは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35s遺伝子からの転写ターミネーター及びポリアデニル化部位(Chenault及びMelcher 1993)を含む3'UTRで終結された。
【０２２１】
この選択カセットを、実施例4に記載のように合成、送達及びシークエンスした。
【０２２２】
この遺伝子発現カセットのイデオグラムを図6に示している。この発現カセットの全配列を図63に示している。
【０２２３】
(実施例9-SIのRNAi介在性下方制御のためのLpOs05g0149600カリン遺伝子のdsRNA産物の発現のためのペレニアルライグラスのバイオリスティック形質転換)
実施例5に記載のように、LpOs05g0149600遺伝子配列、RNAiカセットの発現を動かすもの及びハイグロマイシン耐性のための大腸菌からのhph遺伝子の合成バージョンを含んでいるベクターを用いたペレニアルライグラスのバイオリスティック共形質転換をペレニアルライグラスの胚形成カルス上で行った。
【０２２４】
(実施例10-LpOs05g0149600カリン遺伝子の発現解析)
実施例6に概説した方法を使用して、LpOs05g0149600遺伝子として同定される核酸配列を、ミナトカモジグサゲノム配列のコード部分に対して比較したときに、最も近く合致する遺伝子配列としてBradi2g35830が同定される。この解析から生成された発現プロファイルにより、全組織において構成的なレベルの遺伝子発現が確認される(図92)。しかし、有意に上昇したレベルの遺伝子発現は、雌しべ及び5分に受粉した雌しべ並びに0分及び5分の全体の花及び柱頭において認められる。認められた発現のパターンは、5分の雌しべにおける対応する増加と共に、柱頭において0から5分まで増加し、その後、1時間の時点で構成的なレベルまで減少すると説明することができる。
【０２２５】
(実施例11-SI遺伝子の単離:ライグラスLpOs06g0680500グルタミン酸受容体遺伝子のクローニング)
実施例3に概説した方法を使用して、イネ遺伝子Os06g0680500との配列類似性を示すBACクローン関連配列から新規ペレニアルライグラス遺伝子が同定され、それ故に、このライグラス遺伝子はLpOs06g0680500(図7及び配列番号39)と呼ばれた。このライグラス遺伝子には、BLASTx解析を通して(イネアミノ酸配列と比較してe値=0)グルタミン酸受容体遺伝子として注釈がつけられており、必須のGABAドメイン(配列番号109)が含まれていると同定された。
【０２２６】
グルタミン酸受容体遺伝子は、シロイヌナズナ及びタバコにおいて、花粉管並びに根毛等の定方向のパターンの伸長を受ける先端の細胞型において流入チャネルを形成するとして同定されている。シロイヌナズナ根細胞における研究により、グルタミン酸塩が膜電位の鋭い脱分極、及び細胞内カルシウムにおける付随した上昇を誘発することが示されている。グルタミン酸受容体アンタゴニストの存在下でタバコ花粉管の伸長が抑制されることが示されており、これは、カルシウムの特異的な定方向の取り込みの場合にも同様である。シロイヌナズナにおけるグルタミン酸受容体遺伝子を発現している花粉の遺伝子ノックアウト実験により、伸長率における低下並びに先端及び管の形態異常が報告されている。
【０２２７】
理論によって限定されることを出願人らが望むものではないが、LpOs06g0680500 LpGlu1グルタミン酸受容体遺伝子は、それ故に、S座位の雄決定因子であることが提唱される。
【０２２８】
(実施例12-LpOs06g0680500 LpGlu1遺伝子の逆位ヘアピン構造を含んでいる形質転換ベクターの作製)
LpOs06g0680500遺伝子として同定された核酸配列は、発現カセットのデザインエレメントとして選択された484bpの断片を有する。発現を動かすために、トウモロコシユビキチン遺伝子プロモーター(Christensenら  1992)を使用し、転写を停止するために、ノパリン合成酵素(nos)遺伝子ターミネーター(Bevan、1984; Rogersら、1985)を選択した。
【０２２９】
LpGlu1発現カセットは、トウモロコシからのユビキチン(Ubi)遺伝子からのプロモーター、5'非翻訳領域及びイントロン(Tokiら  1992)、並びにその後ろのデュラムコムギからのRGA2遺伝子のイントロン2(Douchkovら  2005)によって遮断された逆位リピート内にあるペレニアルライグラスからのLpGlu1遺伝子の484bpのコード配列からなる。このヘアピンカセットは、A.ツメファシエンスpTi15955からのノパリン合成酵素遺伝子(nos)の転写ターミネーター及びポリアデニル化部位(Fraleyら  1983)を含む3'非翻訳領域(UTR)で終結された。
【０２３０】
(シス又はトランスのいずれかで送達される)選択カセットは、イネからのアクチン(Act1)遺伝子からのプロモーター、5'非翻訳領域及びイントロン(McElroyら  1990)、並びにその後ろの合成の、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を与えるタンパク質をコードする、大腸菌からのhph遺伝子(Kasterら  1983)の単子葉植物における発現のためにコドンを最適化したバージョンを含んでいた。このカセットは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35s遺伝子からの転写ターミネーター及びポリアデニル化部位(Chenault及びMelcher 1993)を含む3'UTRで終結された。
【０２３１】
この選択カセットを、実施例4に記載のように合成、送達及びシークエンスした。
【０２３２】
この遺伝子発現カセットのイデオグラムを図8に示している。この発現カセットの全配列を図68に示している。
【０２３３】
(実施例13-SIのRNAi介在性下方制御のためのLpOs06g0680500グルタミン酸受容体遺伝子のdsRNA産物の発現のためのペレニアルライグラスのバイオリスティック形質転換)
実施例5に記載のように、LpOs06g0680500 LpGlu1遺伝子配列、RNAiカセットの発現を動かすもの及びハイグロマイシン耐性のための大腸菌からのhph遺伝子の合成バージョンを含んでいるベクターを用いたペレニアルライグラスのバイオリスティック共形質転換をペレニアルライグラスの胚形成カルス上で行った。
【０２３４】
(実施例14-LpOs06g0680500グルタミン酸受容体遺伝子の発現解析)
実施例6に概説した方法を使用して、LpOs06g0680500遺伝子として同定される核酸配列を、ミナトカモジグサゲノム配列のコード部分に対して比較したときに、最も近く合致する遺伝子配列としてBradi1g32800が同定される。この解析から生成された発現プロファイルにより、栄養組織における高レベルの遺伝子発現及び葯におけるいくらかの遺伝子発現が確認される(図97)。グルタミン酸遺伝子は、異なる植物組織にわたって多くの機能に関与することになる、ミナトカモジグサゲノム内の遺伝子ファミリーを代表するものであり、関連配列の結果的なマッピング又はグルタミン酸遺伝子の別の機能は、構成的な発現を説明する可能性が高く且つ説明しうるものである。それにもかかわらず、発現における有意な増加は、葯において検出されており、雌の雌しべ又は柱頭組織においては検出されていない。
【０２３５】
(実施例15-SI遺伝子の単離:ライグラスLpOs04g0648500遺伝子のクローニング)
実施例3に概説した方法を使用して、イネ遺伝子Os04g0648500との配列類似性を示すBACクローン関連配列から新規ペレニアルライグラス遺伝子が同定され、それ故に、このライグラス遺伝子はLpOs04g0648500(図9及び配列番号62を参照されたい)と呼ばれた。このペレニアルライグラス遺伝子は、TC116908関連遺伝子と物理的に連鎖すると同定された。TC116908由来の遺伝子マーカーは、ライ麦(ライムギ)においてZ座位で共分離された(Hackauf及びWehling 2005)。TC116908オルソログを含んでいるペレニアルライグラスBACクローンにおいて、LpOs04g0648500及び他の2つの遺伝子が同定された(Shinozukaら  2010)。
【０２３６】
LpOs04g0648500遺伝子には、BLASTx解析を通してユビキチン特異的プロテアーゼ22遺伝子として注釈がつけられていた(配列番号132)。この遺伝子は、Znf-UBP及びBRAP2ドメインを含んでいた。Znf-UBPドメインは、ユビキチン特異的プロテアーゼ活性を示し、標的特異的な脱ユビキチニル化(de-ubiquitinylation)を通してタンパク質安定剤として機能する。ヒトBRAP2ドメインは、元来、BRCA1(乳がん1)遺伝子産物と相互作用するとして同定された。配列相同性検索により、このドメインは、シロイヌナズナAt2g26000[亜鉛フィンガー(ユビキチン-ヒドロラーゼ)ドメイン-含有タンパク質]及びAt2g42160[亜鉛フィンガー(C3HC4-型RINGフィンガー)ファミリータンパク質]遺伝子産物においても保存されていることが示されており、この遺伝子がユビキチン-プロテアソーム系に関与することが示唆されている。
【０２３７】
S-RNaseに基づき且つアブラナ科型のSI系において、ユビキチン-プロテアソーム系の関連が示唆されている。26Sプロテアソーム複合体は、UBPで結合され、26Sプロテアソーム複合体の19S調節粒子は、UBPによって活性化される。Z座位に連鎖されたBACクローンにおいて、26Sプロテアソーム関連遺伝子(LpTC116908及びLpOs06g0607800)が同定され、その産物は、LpOs04g0648500遺伝子産物と相互作用しうる。
【０２３８】
理論によって限定されることを出願人らが望むものではないが、LpOs04g0648500ユビキチン特異的プロテアーゼ22遺伝子は、それ故に、Z座位におけるSI決定因子のうちの1つであることが提唱される。
【０２３９】
(実施例16-LpOs04g0648500遺伝子の逆位ヘアピン構造を含んでいる形質転換ベクターの作製)
LpOs04g0648500遺伝子として同定された核酸配列は、発現カセットのデザインエレメントとして選択された578bpの断片を有する。発現を動かすために、トウモロコシユビキチン遺伝子プロモーター(Christensenら  1992)を使用し、転写を停止するために、ノパリン合成酵素(nos)遺伝子ターミネーター(Bevan、1984;Rogersら、1985)を選択した。
【０２４０】
LpOs04g0648500発現カセットは、トウモロコシからのユビキチン(Ubi)遺伝子からのプロモーター、5'非翻訳領域及びイントロン(Tokiら  1992)、並びにその後ろのデュラムコムギからのRGA2遺伝子のイントロン2(Douchkovら  2005)によって遮断された逆位リピート内にあるペレニアルライグラスからのLpOs04g0648500遺伝子の578bpのコード配列からなる。このヘアピンカセットは、A.ツメファシエンスpTi15955からのノパリン合成酵素遺伝子(nos)の転写ターミネーター及びポリアデニル化部位(Fraleyら  1983)を含む3'非翻訳領域(UTR)で終結された。
【０２４１】
(シス又はトランスのいずれかで送達される)選択カセットは、イネからのアクチン(Act1)遺伝子からのプロモーター、5'非翻訳領域及びイントロン(McElroyら  1990)、並びにその後ろの合成の、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を与えるタンパク質をコードする、大腸菌からのhph遺伝子(Kasterら  1983)の単子葉植物における発現のためにコドンを最適化したバージョンを含んでいた。このカセットは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35s遺伝子からの転写ターミネーター及びポリアデニル化部位(Chenault及びMelcher 1993)を含む3'UTRで終結された。
【０２４２】
この選択カセットを、実施例4に記載のように合成、送達及びシークエンスした。
【０２４３】
この遺伝子発現カセットのイデオグラムを図10に示している。この発現カセットの全配列を図77に示している。
【０２４４】
(実施例17-SIのRNAi介在性下方制御のためのLpOs04g0648500遺伝子のdsRNA産物の発現のためのペレニアルライグラスのバイオリスティック形質転換)
実施例5に記載のように、LpOs04g0648500遺伝子配列、RNAiカセットの発現を動かすもの及びハイグロマイシン耐性のための大腸菌からのhph遺伝子の合成バージョンを含んでいるベクターを用いたペレニアルライグラスのバイオリスティック共形質転換をペレニアルライグラスの胚形成カルス上で行った。
【０２４５】
(実施例18-LpOs04g0648500遺伝子の発現解析)
実施例6に概説した方法を使用して、LpOs04g0648500遺伝子として同定される核酸配列を、ミナトカモジグサゲノム配列のコード部分に対して比較したときに、最も近く合致する遺伝子配列としてBradi5g23970が同定される。この解析から生成された発現プロファイルにより、全ての生殖試料における増加と共に、全組織における低レベルの構成的な発現が確認される。最も高いレベルの遺伝子発現は、雌しべ試料において検出された(図106を参照されたい)。
【０２４６】
(実施例19-SI遺伝子の単離:ライグラスLpOs06g0607900遺伝子のクローニング)
実施例3に概説した方法を使用して、イネ遺伝子Os06g0607900との配列類似性を示すBACクローン関連配列から新規ペレニアルライグラス遺伝子が同定され、このライグラス遺伝子はそれ故にLpOs06g0607900(図11及び配列番号59を参照されたい)と呼ばれた。この遺伝子は、C2及びGRAMの両方のアミノ酸ドメイン(配列番号129)を含んでいた。C2ドメインは、塩基性領域によって分離されている2つの高度に保存されたドメインからなる。C2ドメインは、シグナル伝達又は膜輸送に関連するタンパク質中で見出されるカルシウム依存性の膜ターゲティングモジュールである。このドメインは、カルシウム依存性リン脂質結合及び膜ターゲティングプロセスに関与することが多い。GRAMドメインは、グルコシルトランスフェラーゼ、Rab様GTPアーゼ活性化因子及びミオチューブラリンドメインである。このドメインは、膜に連結したプロセス及びシグナル伝達に関連する。GRAMドメインは、最初に、2000年(Doerksら)にコンピュータ的に同定され、それ以降、ドメインの機能解析により標的膜とのタンパク質結合における役割が明らかにされてきた。
【０２４７】
BAC配列特徴付けから同定された新規遺伝子のイネホモログは、その機能が部分的に記載されており、「無花粉」遺伝子(Osnop)と呼ばれている。イネOsnop遺伝子は、Dsトランスポゾン挿入戦略を通して同定及び特徴付けされた。その欠失遺伝子は、葯が異常で花粉を産生しないことが示された。GUSレポーター遺伝子とのプロモーター融合を通して、内因性遺伝子は、花粉形成及び花粉管の発生において後期に遺伝子発現を示しているとして特徴付けされた(Jiangら  2005)。
【０２４８】
理論によって限定されることを出願人らが望むものではないが、LpOs06g0607900無花粉(LpNOP)遺伝子は、それ故に、Z座位の雄決定因子であることが提唱される。
【０２４９】
(実施例20-LpOs06g0607900 LpNOP1遺伝子の逆位ヘアピン構造を含んでいる形質転換ベクターの作製)
LpOs06g0607900発現カセットは、トウモロコシからのユビキチン(Ubi)遺伝子からのプロモーター、5'非翻訳領域及びイントロン(Tokiら  1992)、並びにその後ろのデュラムコムギからのRGA2遺伝子のイントロン2(Douchkovら  2005)によって遮断された逆位リピート内にあるペレニアルライグラスからのLpOs06g0607900遺伝子の400bpのコード配列からなる。このヘアピンカセットは、A.ツメファシエンスpTi15955からのノパリン合成酵素遺伝子(nos)の転写ターミネーター及びポリアデニル化部位(Fraleyら  1983)を含む3'非翻訳領域(UTR)で終結された。
【０２５０】
(シス又はトランスのいずれかで送達される)選択カセットは、イネからのアクチン(Act1)遺伝子からのプロモーター、5'非翻訳領域及びイントロン(McElroyら  1990)、並びにその後ろの合成の、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を与えるタンパク質をコードする、大腸菌からのhph遺伝子(Kasterら  1983)の単子葉植物における発現のためにコドンを最適化したバージョンを含んでいた。このカセットは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35s遺伝子からの転写ターミネーター及びポリアデニル化部位(Chenault及びMelcher 1993)を含む3'UTRで終結された。
【０２５１】
この選択カセットを、実施例4に記載のように合成、送達及びシークエンスした。
【０２５２】
この遺伝子発現カセットのイデオグラムを図12に示している。この発現カセットの全配列を図76に示している。
【０２５３】
(実施例21-SIのRNAi介在性下方制御のためのLpOs06g0607900遺伝子のdsRNA産物の発現のためのペレニアルライグラスのバイオリスティック形質転換)
実施例5に記載のように、LpOs06g0607900遺伝子配列、RNAiカセットの発現を動かすもの及びハイグロマイシン耐性のための大腸菌からのhph遺伝子の合成バージョンを含んでいるベクターを用いたペレニアルライグラスのバイオリスティック共形質転換をペレニアルライグラスの胚形成カルス上で行った。
【０２５４】
(実施例22-LpOs06g0607900遺伝子の発現解析)
実施例6に概説した方法を使用して、LpOs06g0607900遺伝子として同定される核酸配列を、ミナトカモジグサゲノム配列のコード部分に対して比較したときに、最も近く合致する遺伝子配列としてBradi1g36390が同定される。この解析から生成された発現プロファイルにより、ほぼ独占的に葯において高レベルの遺伝子発現が確認される。0分に受粉した花及び柱頭において限られた発現が検出されており、これは、花の中の葯から又は花粉粒の初期発生から結果として生じた可能性がある(図105を参照されたい)。
【０２５５】
(実施例23-SI遺伝子の単離:ライグラスLpOs05g0152900セブン-イン-アブセンシアホモログ遺伝子のクローニング)
実施例3に概説した方法を使用して、遺伝子型Impact04のエクソームシークエンシングから、イネ遺伝子Os05g0152900との配列類似性を示すペレニアルライグラス遺伝子が同定された(図13及び配列番号40)。この同定された遺伝子は、セブンインアブセンシアホモログ(SIAH)遺伝子との配列類似性により、LpSIAH(配列番号110)と呼ばれた。
【０２５６】
SIAHタンパク質は、N末端にRINGフィンガードメイン及びC末端にSinaドメインを含み、ホモダイマーが形成されるとユビキチン-E3リガーゼ活性を有する(Den Herderら  2008)。植物種におけるSIAHタンパク質機能の抑制により、結果として根系の増強、葉の拡大及び若枝数の増加となり、SIAHタンパク質が広範囲にわたる植物発育上のプロセスに関与することが示唆されている。
【０２５７】
SIAHタンパク質の基質は、相互作用後にユビキチン関連経路において分解される。グルタミン酸受容体タンパク質は、SIAHタンパク質の基質である。SIAHタンパク質のRINGフィンガードメイン及びグルタミン酸受容体タンパク質のSiah相互作用ドメインは、相互作用に必須である。SIAH及びグルタミン酸受容体タンパク質の相互作用は、カルシウム電流の変調に効果を発揮する。グルタミン酸受容体様遺伝子LpGlu1は、物理的にLpSIAHの近くに位置しているとして同定された。
【０２５８】
(実施例24-LpOs05g0152900 LpSIAH遺伝子の逆位ヘアピン構造を含んでいる形質転換ベクターの作製)
LpSIAH発現カセットは、トウモロコシからのユビキチン(Ubi)遺伝子からのプロモーター、5'非翻訳領域及びイントロン(Tokiら  1992)、並びにその後ろのデュラムコムギからのRGA2遺伝子のイントロン2(Douchkovら  2005)によって遮断された逆位リピート内にあるペレニアルライグラスからのLpSIAH遺伝子の400bpのコード配列からなる。このヘアピンカセットは、A.ツメファシエンスpTi15955からのノパリン合成酵素遺伝子(nos)の転写ターミネーター及びポリアデニル化部位(Fraleyら  1983)を含む3'非翻訳領域(UTR)で終結された。
【０２５９】
(シス又はトランスのいずれかで送達される)選択カセットは、イネからのアクチン(Act1)遺伝子からのプロモーター、5'非翻訳領域及びイントロン(McElroyら  1990)、並びにその後ろの合成の、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を与えるタンパク質をコードする、大腸菌からのhph遺伝子(Kasterら  1983)の単子葉植物における発現のためにコドンを最適化したバージョンを含んでいた。このカセットは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35s遺伝子からの転写ターミネーター及びポリアデニル化部位(Chenault及びMelcher 1993)を含む3'UTRで終結された。
【０２６０】
この選択カセットを、実施例4に記載のように合成、送達及びシークエンスした。
【０２６１】
この遺伝子発現カセットのイデオグラムを図14に示している。この発現カセットの全配列を図69に示している。
【０２６２】
(実施例25-SIのRNAi介在性下方制御のためのLpOs05g0152900 LpSIAH遺伝子のdsRNA産物の発現のためのペレニアルライグラスのバイオリスティック形質転換)
実施例5に記載のように、LpOs05g0152900 LpSIAH遺伝子配列、RNAiカセットの発現を動かすもの及びハイグロマイシン耐性のための大腸菌からのhph遺伝子の合成バージョンを含んでいるベクターを用いたペレニアルライグラスのバイオリスティック共形質転換をペレニアルライグラスの胚形成カルス上で行った。
【０２６３】
(実施例26-LpOs05g0152900 LpSIAH遺伝子の発現解析)
実施例6に概説した方法を使用して、LpOs05g0152900遺伝子として同定される核酸配列を、ミナトカモジグサゲノム配列のコード部分に対して比較したときに、最も近く合致する遺伝子配列としてBradi2g35550が同定される。この解析から生成された発現プロファイルにより、主に葯及び0分に受粉した柱頭において遺伝子発現が確認される。他の全組織において低い又は無視できる発現が観察された(図98を参照されたい)。
【０２６４】
(実施例27-SI遺伝子の単離:ライグラスLpTC116908遺伝子のクローニング)
実施例3に概説した方法を使用して、イネ遺伝子Os04g0647300及びオオムギ遺伝子TC116908との配列類似性を示すBACクローン関連配列から新規ペレニアルライグラス遺伝子が同定され、それ故に、このライグラス遺伝子はLpTC116908と呼ばれた。ライ麦(ライムギ)において、TC116908由来の遺伝子マーカーは、ライムギのZ座位で共分離された。TC116908由来のマーカーの近くに、4つの遺伝子マーカーが位置していた(Hackauf及びWehling 2005)。これらの対応する遺伝子マーカーは、ペレニアルライグラスのLG2のより下方の部分に割り当てられた(Shinozukaら  2010)。遺伝子マーカー関連配列を含んでいるBACクローンをシークエンスし、Z座位にコードされているペレニアルライグラス遺伝子を同定した(図15及び配列番号54を参照されたい)。
【０２６５】
LpTC116908遺伝子には、BLASTx解析を通してユビキチン特異的プロテアーゼ22遺伝子として注釈がつけられていた(配列番号124)。この遺伝子は、Znf-UBP(亜鉛フィンガーユビキチン特異的プロセッシングプロテアーゼ)及びペプチダーゼC19ドメインを含んでいた。Znf-UBPドメインは、ユビキチン特異的プロテアーゼ活性を示し、標的特異的な脱ユビキチニル化を通してタンパク質安定剤として機能する。ペプチダーゼC19ドメインは、Znf-UBP様ドメインと配列類似性を共有し、且つユビキチン特異的ペプチダーゼ活性を有する。LpTC116908遺伝子は、ペレニアルライグラス生殖器官内で発現されていた(Shinozukaら  2010)。
【０２６６】
S-RNaseに基づき且つアブラナ科型のSI系において、ユビキチン-プロテアソーム系の関連が示唆されている。26Sプロテアソーム複合体は、UBPで結合され、26Sプロテアソーム複合体の19S調節粒子は、UBPによって活性化される。Z座位に連鎖されたBACクローンにおいて、26Sプロテアソーム関連遺伝子(LpOs06g0607800及びLpOs04g0648800)が同定され、その産物は、LpTC116908遺伝子産物と相互作用しうる。
【０２６７】
理論によって限定されることを出願人らが望むものではないが、LpTC116908ユビキチン特異的プロテアーゼ22遺伝子は、それ故に、Z座位のSI決定因子のうちの1つであることが提唱される
【０２６８】
(実施例28-LpTC116908 LpOs04g0647300遺伝子の逆位ヘアピン構造を含んでいる形質転換ベクターの作製)
LpTC116908発現カセットは、トウモロコシからのユビキチン(Ubi)遺伝子からのプロモーター、5'非翻訳領域及びイントロン(Tokiら  1992)、並びにその後ろのデュラムコムギからのRGA2遺伝子のイントロン2(Douchkovら  2005)によって遮断された逆位リピート内にあるペレニアルライグラスからのLpTC116908遺伝子の492bpのコード配列からなる。このヘアピンカセットは、A.ツメファシエンスpTi15955からのノパリン合成酵素遺伝子(nos)の転写ターミネーター及びポリアデニル化部位(Fraleyら  1983)を含む3'非翻訳領域(UTR)で終結された。
【０２６９】
(シス又はトランスのいずれかで送達される)選択カセットは、イネからのアクチン(Act1)遺伝子からのプロモーター、5'非翻訳領域及びイントロン(McElroyら  1990)、並びにその後ろの合成の、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を与えるタンパク質をコードする、大腸菌からのhph遺伝子(Kasterら  1983)の単子葉植物における発現のためにコドンを最適化したバージョンを含んでいた。このカセットは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35s遺伝子からの転写ターミネーター及びポリアデニル化部位(Chenaultら  1993)を含む3'UTRで終結された。
【０２７０】
この選択カセットを、実施例4に記載のように合成、送達及びシークエンスした。
【０２７１】
この遺伝子発現カセットのイデオグラムを図16に示している。この発現カセットの全配列を図73に示している。
【０２７２】
(実施例29-SIのRNAi介在性下方制御のためのLpTC116908遺伝子のdsRNA産物の発現のためのペレニアルライグラスのバイオリスティック形質転換)
実施例5に記載のように、LpTC116908遺伝子配列、RNAiカセットの発現を動かすもの及びハイグロマイシン耐性のための大腸菌からのhph遺伝子の合成バージョンを含んでいるベクターを用いたペレニアルライグラスのバイオリスティック共形質転換をペレニアルライグラスの胚形成カルス上で行った。
【０２７３】
(実施例30-LpTC116908遺伝子の発現解析)
実施例6に概説した方法を使用して、LpTC116908遺伝子として同定される核酸配列を、ミナトカモジグサゲノム配列のコード部分に対して比較したときに、最も近く合致する遺伝子配列としてBradi5g23920が同定される。この解析から生成された発現プロファイルにより、受粉した柱頭試料の両方における有意な増加と共に、全組織における低レベルの構成的な発現が確認される。遺伝子発現における僅かな増加は、雌しべ試料並びに偽茎においても確認される(図102)。
【０２７４】
(実施例31.逆位ヘアピン構造を含んでいる形質転換ベクターの作製)
実施例4に概説した方法を使用して、siRNA構築物を全21候補遺伝子用に調製した。再シークエンシングデータから、最も保存された300〜500bpの遺伝子の領域を設計に選択した。
S座位
LpOs05g0148600
LpOs01g0369700
LpOs05g0149100
LpOs05g0149500
LpOs05g0149600
LpOs05g0150400
LpOs05g0150500
LpOs05g0151300
LpOs05g0152400
LpOs06g0680500
LpOs05g0152900
LpOs05g0153200
Z座位
LpOs04g0645500
LpOs04g0645600
LpOs04g0647300
LpOs03g0193400
LpOs06g0607800
LpOs06g0607900
LpOs04g0648500
LpOs04g0648600
LpOs04g0648900
【０２７５】
図59〜図79は、ペレニアルライグラスのバイオリスティック介在性形質転換において使用した発現カセットの核酸配列を示している。凡例:ゲートウェイattB1部位(太字下線):トウモロコシUbiプロモーター(斜体)+イントロン(斜体下線);アンチセンス及びセンス方向のペレニアルライグラスコード領域(下線):rga2イントロン(太字);ノパリン合成酵素(nos)ターミネーター(太字斜体)、ゲートウェイattB2部位(太字下線)
【０２７６】
(実施例30.F1雑種イネ科植物育種における、S及びZ区間からのゲノムデータの適用)
ヘテローシス又は雑種強勢は、F1雑種の能力が両親のものよりも優れている現象である。現在、ライグラス栽培品種は、一般に、限られた数のエリートの親(4〜12)から繁殖され、互いに多交雑され、それから更に多交雑されて、商業的販売に好適な種子数に増やされている。現在、ライグラス育種においてヘテローシスを取り入れる商業的な活動又は企画はない。
【０２７７】
S及びZ座位との連鎖不平衡にある遺伝子マーカーの同定により、ハプロタイプの予測が可能となる。S及びZハプロタイプについて個体の遺伝子型を同定できることにより、選択的に妨害すること及びハプロタイプを組み合わせることによって効率的なF1雑種ライグラスを生産するための新しい道が開かれる。連鎖される遺伝子マーカーを使用してSI対立遺伝子を選択的に妨害することによるF1雑種ライグラスの生産は、近い将来における商業的なライグラス育種への費用効果的な適用の最大の可能性を示す。SIを妨害するためのSI遺伝子マーカーの適用により、育種家が、事前の必要条件なしで自由に使える任意の生殖質を用いて働くことができるようになる。ハプロタイプを規定しているSIマーカーにより、育種家が、規定されたプール内で(自家受粉させることなく)SIハプロタイプを選択的に妨害できるようになり、プール内での和合性を低下させ、次いで、無作為な交雑のために2種のプールを一緒に持ってくることができるようになる。ここで、SIハプロタイプによってプール間の和合性がプール内よりも確実に高くなる場合には、結果としてF1後代の増産がもたらされる。
【０２７８】
例えば、最初の段階において、表現型的にエリートの植物の育種圃場は、SIに連鎖される分子マーカーで遺伝子型を同定するはずであり、且つハプロタイプの予測が行われるはずである。次いで、個体の対(親プールと呼ばれる)が同定されるはずであり、そこでは、一方の個体は、S及びZの両方においてヘテロ接合性であり、他方の個体は、一方の座位、S又はZのいずれか、においてホモ接合性であり、且つ他方の座位においてヘテロ接合性である(ヘテロ接合性の個体において同一のハプロタイプが存在する)。例えば:
個体x s1s2-z1z2
個体y s1s2-z1z1
【０２７９】
プール間でS及びZハプロタイプが完全に異なる2種の親プールが同定され、次のステップに進められる。2種の選択されたプールは、後に続く段階においてプールA及びプールBと呼ばれる。
【０２８０】
最初の親プール開発の後に、種子を掛け合わせする。この種子を増やす段階の間に、花粉の流動又は外部からの種子を通して外来のSIハプロタイプが導入されることを確実になくすために、プールA及びBを単離の状態に維持する。
【０２８１】
各プール内での1回の無作為交配により、S及びZのハプロタイプの頻度が、平衡にされることになり、このとき、50%の個体はS及びZ座位の両方においてヘテロ接合性であり、25%はS又はZにおいて一方のハプロタイプについてホモ接合性であり、且つ残りの25%の個体は同一の座位でホモ接合性であるが、反対のハプロタイプについてである。例えば:
25%の個体  - s1s1-z1z2
50%の個体  - s1s2-z1z2
25%の個体  - s2s2z1z2
【０２８２】
2種のプール内での非選択の無作為交配を継続することにより、ホモ接合性及びヘテロ接合性の頻度は維持されることになるが、種子数が増加する。毎回の交配において、ヘテロ接合性の座位は、交互に替わることになる。例えば:
25% - s1s1-z1z2    25% - s1s2-z1z1    25% - s1s1-z1z2
50% - s1s2-z1z2 → 50% - s1s2-z1z2 → 50% - s1s2-z1z2
25% - s2s2-z1z2    25% - s1s2-z2z2    25% - s2s2-z1z2
【０２８３】
プール内の花粉は、S及びZ座位の両方においてヘテロ接合性の個体とは決して和合性にならないことになる。結果として、それらの個体(これは、植物の50%を占める)は、花粉ドナーのみになることになり、いかなる種子も生じず、結果としてプール内では50%の種子産生率になる。
【０２８４】
一度プール内で十分な種子が産生されると、等しい数の種子を合わせて、F1種子産生のために外に植え付けられるはずである。プール内からの花粉は、それぞれのS及びZのヘテロ接合性の個体と和合性でなく、2種のプール間からの花粉のみが、それらの個体に受精させることになるので、結果としてそれらの植物から100%のF1雑種種子が得られることになる。残りの個体は、プール内及びプール間の両方からの花粉と和合性であり、F1雑種及びプール内の両方の種子を産生することになる。しかし、プール間からは、プール内からよりも、より多くの和合性ハプロタイプの組合せがあるので、より高い割合の種子がF1雑種になることになる。
【０２８５】
プール間及びプール内の全てのハプロタイプの組合せのシミュレーション、及び和合性の組合せの割合から、記載のスキームに従って産生されたF1雑種種子の理論上の百分率は>83%である。雑種個体は、プール内の種子よりも強健且つ競争的である可能性が高く、農場において競争的な草地の状況下で栽培されるときに、雑種の割合、>83%、はより高くなる可能性が高い。提唱される育種設計において、プールA及びBは、1回の交雑後にハプロタイプの頻度の平衡に達することになり、これは、プールが外来の花粉から単離された状態に維持されている限り、必要と考えられるだけ多くの世代にわたり、育種家がプール内で種子を増やせることを意味している。これにより、育種家が、後代においても依然としてヘテローシスを確実に維持するために、増やしたそれぞれの種子のプール間で小規模の検定交雑を行うことも可能になる。育種設計の間に、受粉の調節が必要とされる時点はない。
【０２８６】
この育種設計は、限定されるものではないが、自家不和合性を調節しているS及びZ座位を有する、イネ科に属しているあらゆる異系交配イネ科植物種に適用されうる。より好ましくは、イネ科植物種は、タケ亜科(Bambusoideae)、エールハルタ亜科(Ehrhartoideae[以前はOryzoideae])又はイチゴツナギ亜科(Pooideae)分岐群のものであるはずである。より好ましくは、イネ科植物種は、ポエアエ連(Poeae)のものであるはずである。より好ましくは、イネ科植物種は、ライグラス属(Lolium)、ウシノケグサ属(Festuca)、イチゴツナギ属(Poa)、カモガヤ属(Dactylis)、スズメノチャヒキ属(Bromus)、ライムギ属(Secale)、チカラシバ属(Pennisetum)及びキビ属(Panicum)のものであるはずである。より好ましくは、イネ科植物種は、ライグラス属及びウシノケグサ属のものであるはずである。より好ましくは、種は、ライグラス属のものであるはずである。より好ましくは、ライグラス属種は、ペレニアルライグラス(Lolium perenne)、イタリアンライグラス(Lolium multiflorum)、ハイブリッドライグラス(Lolium boucheanum)、トールフェスク(Lolium arundinaceum)及びメドウフェスク(Lolium pratense)であるはずである。
【０２８７】
図109は、F1雑種イネ科植物育種の模式図を示している。最初に、S及びZ座位の上又は周辺のマーカーを使用して植物の遺伝子型を同定する。次いで、2種の親プールを作製して掛け合わせを行うと共に、一度十分な種子が産生されたプール間のヘテローシスの程度を試験する。
【０２８８】
(参考文献)
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2019103526.tif 000015
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図３ｇ】
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【図３ｈ】
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【図３ｉ】
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【図３ｊ】
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【図３ｋ】
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【図３ｌ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１１ｆ】
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【図１１ｇ】
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【図１１ｈ】
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【図１１ｉ】
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【図１１ｊ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１５ｅ】
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【図１５ｆ】
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【図１５ｇ】
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【図１５ｈ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９ａ】
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【図５９ｂ】
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【図６０ａ】
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【図６０ｂ】
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【図６１ａ】
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【図６１ｂ】
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【図６２ａ】
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【図６２ｂ】
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【図６３ａ】
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【図６３ｂ】
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【図６４ａ】
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【図６４ｂ】
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【図６５ａ】
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【図６５ｂ】
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【図６６ａ】
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【図６６ｂ】
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【図６７ａ】
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【図６７ｂ】
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【図６８ａ】
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【図６８ｂ】
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【図６９ａ】
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【図６９ｂ】
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【図７０ａ】
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【図７０ｂ】
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【図７１ａ】
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【図７１ｂ】
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【図７２ａ】
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【図７２ｂ】
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【図７３ａ】
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【図７３ｂ】
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【図７４ａ】
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【図７４ｂ】
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【図７５ａ】
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【図７５ｂ】
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【図７６ａ】
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【図７６ｂ】
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【図７７ａ】
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【図７７ｂ】
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【図７８ａ】
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【図７８ｂ】
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【図７９ａ】
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【図７９ｂ】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【配列表】
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