(57)【要約】【課題】遺伝子欠損や薬剤を用いることなく、ＮＡＳＨの病態により近い病態を示すＮＡＳＨ誘発実験動物を作出するための飼料であって、且つ実験動物の生育に影響を与えない、ＮＡＳＨ誘発実験動物用飼料およびその製造方法、並びにＮＡＳＨモデル動物の作出方法を提供する。【解決手段】炭水化物源３５〜６０質量％、アミノ酸源１０〜２５質量％、油脂類１５〜３５質量％、並びにミネラル類および／または金属塩類３〜８質量％を含有する非アルコール性脂肪肝炎誘発実験動物用飼料において、（ｉ）前記アミノ酸源として、メチオニン０．０５〜０．４質量％を含有し、（ｉｉ）コリン類の含有量が０．０１質量％以下であり、（ｉｉｉ）前記ミネラル類および／または金属塩類として、鉄化合物０．０５〜０．５質量％を含有する実験動物用飼料およびその製造方法、並びに非アルコール性脂肪肝炎モデル動物の作出方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭水化物源３５〜６０質量％、アミノ酸源１０〜２５質量％、油脂類１５〜３５質量％、並びにミネラル類および／または金属塩類３〜８質量％を含有する非アルコール性脂肪肝炎誘発実験動物用飼料において、
（ｉ）前記アミノ酸源として、メチオニン０．０５〜０．４質量％を含有し、
（ｉｉ）コリン類の含有量が０．０１質量％以下であり、
（ｉｉｉ）前記ミネラル類および／または金属塩類として、鉄化合物０．０５〜０．５質量％を含有することを特徴とする実験動物用飼料。
【請求項２】
前記炭水化物源として、α化澱粉１５質量％以上を含有する請求項１に記載の実験動物用飼料。
【請求項３】
前記実験動物がげっ歯類である請求項１または２に記載の実験動物用飼料。
【請求項４】
前記油脂類として、コーン油、パーム油、大豆油、ラード、牛脂、菜種油およびサフラワー油から選択される少なくとも１種の食用油脂を主として含有する請求項１〜３のいずれかに記載の実験動物用飼料。
【請求項５】
前記アミノ酸源がカゼインベースである請求項１〜４のいずれかに記載の実験動物用飼料。
【請求項６】
炭水化物源３５〜６０質量％、アミノ酸源１０〜２５質量％、油脂類１５〜３５質量％、並びにミネラル類および／または金属塩類３〜８質量％を含有する非アルコール性脂肪肝炎誘発実験動物用飼料の製造方法において、
（ｉ）前記アミノ酸源として、メチオニン０．０５〜０．４質量％を配合し、
（ｉｉ）コリン類の含有量を０．０１質量％以下に調節し、
（ｉｉｉ）前記ミネラル類および／または金属塩類として、鉄化合物０．０５〜０．５質量％を配合する工程を含むことを特徴とする実験動物用飼料の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の実験動物用飼料を実験動物に摂取させる工程を含むことを特徴とする非アルコール性脂肪肝炎モデル動物の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪肝炎誘発実験動物用飼料およびその製造方法、並びに非アルコール性脂肪肝炎モデル動物の作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、アルコールの摂取量が基準値以下であっても発症する肝臓病である、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の患者数が急増しており注目されている。ＮＡＦＬＤには、予後が比較的良好である非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、および進行性疾患である非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）が含まれる。
ＮＡＳＨを発症すると、肝細胞が破壊され、線維化を起こし、その後肝硬変に進行し、その一部において、肝がんが発生する。ＮＡＳＨの発症には、肥満、糖尿病、脂質異常症、高血圧症などが関連すると考えられているが、発症および進行のメカニズムは解明されておらず、そのメカニズム解明のためにはＮＡＳＨを誘発する実験動物が必要である。
【０００３】
ＮＡＳＨ誘発実験動物としては、遺伝子欠損動物や薬剤誘導性の実験動物が開発されているが（例えば、特許文献１および非特許文献１参照）、これらはＮＡＳＨの病態を必ずしも反映したものではないという問題がある。
【０００４】
したがって、遺伝子欠損や薬剤を用いることなく、ＮＡＳＨの病態により近い病態を示すＮＡＳＨ誘発実験動物を作出するための飼料であって、且つ実験動物の使用目的やその生育に悪影響を与えない、ＮＡＳＨ誘発実験動物用飼料およびその製造方法、並びにＮＡＳＨ誘発実験動物の製造方法の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１７−００６０２２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３  ４９９：９７−１０１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、このような要望に応え、現状を打破し、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、遺伝子欠損や薬剤を用いることなく、非アルコール性脂肪肝炎（以下、単に「ＮＡＳＨ」と称することがある）の病態により近い病態を示すＮＡＳＨ誘発実験動物を作出するための飼料であって、且つ実験動物の使用目的やその生育に悪影響を与えない、ＮＡＳＨ誘発実験動物用飼料およびその製造方法、並びにＮＡＳＨモデル動物の作出方法を提供することを目的とする。なお、本明細書において、「実験動物の使用目的やその生育に悪影響を与えない」および「実験動物に悪影響を与えない」とは、ＮＡＳＨおよびこれに関連する病態を発症する以外には、飼料として嗜好性に問題がなく実験動物が摂食し、体重が落ち込むことがなく生育し、ＮＡＳＨおよびこれに関連する病態の動物モデルとして適合することを意味する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意努力した結果、実験動物用飼料において、栄養成分やその配合を調整することにより、遺伝子欠損や薬剤を用いることなく、ＮＡＳＨの病態により近い病態を示すＮＡＳＨ誘発実験動物を作出するための飼料であって、且つ実験動物に悪影響を与えない、ＮＡＳＨ誘発実験動物用飼料となることを知見した。
【０００９】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  炭水化物源３５〜６０質量％、アミノ酸源１０〜２５質量％、油脂類１５〜３５質量％、並びにミネラル類および／または金属塩類３〜８質量％を含有する非アルコール性脂肪肝炎誘発実験動物用飼料において、（ｉ）前記アミノ酸源として、メチオニン０．０５〜０．４質量％を含有し、（ｉｉ）コリン類の含有量が０．０１質量％以下であり、（ｉｉｉ）前記ミネラル類および／または金属塩類として、鉄化合物０．０５〜０．５質量％を含有することを特徴とする実験動物用飼料である。
＜２＞  前記炭水化物源として、α化澱粉１５質量％以上を含有する前記＜１＞に記載の実験動物用飼料である。
＜３＞  前記実験動物がげっ歯類である前記＜１＞または＜２＞に記載の実験動物用飼料である。
＜４＞  前記油脂類として、コーン油、パーム油、大豆油、ラード、牛脂、菜種油およびサフラワー油から選択される少なくとも１種の食用油脂を主として含有する前記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の実験動物用飼料である。
＜５＞  前記アミノ酸源がカゼインベースである前記＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の実験動物用飼料である。
＜６＞  炭水化物源３５〜６０質量％、アミノ酸源１０〜２５質量％、油脂類１５〜３５質量％、並びにミネラル類および／または金属塩類３〜８質量％を含有する非アルコール性脂肪肝炎誘発実験動物用飼料の製造方法において、（ｉ）前記アミノ酸源として、メチオニン０．０５〜０．４質量％を配合し、（ｉｉ）コリン類の含有量を０．０１質量％以下に調節し、（ｉｉｉ）前記ミネラル類および／または金属塩類として、鉄化合物０．０５〜０．５質量％を配合する工程を含むことを特徴とする実験動物用飼料の製造方法である。
＜７＞  前記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の実験動物用飼料を実験動物に摂取させる工程を含むことを特徴とする非アルコール性脂肪肝炎モデル動物の作出方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決することができ、遺伝子欠損や薬剤を用いることなく、ＮＡＳＨの病態により近い病態を示すＮＡＳＨ誘発実験動物を作出するための飼料であって、且つ実験動物の使用目的やその生育に悪影響を与えない、ＮＡＳＨ誘発実験動物用飼料およびその製造方法、並びにＮＡＳＨ誘発実験動物の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、試験例１において、飼料２を摂取させたマウスについて、１２週間後、３０週間後、４０週間後、および５４週間後の肝臓をデジタルカメラで撮影した画像を示す図である。
【図２】図２は、試験例１において、飼料３を摂取させたマウスについて、１２週間後、２０週間後、３０週間後、および４０週間後の肝臓をデジタルカメラで撮影した画像を示す図である。
【図３】図３は、試験例１において、飼料１または２を摂取させたマウスについての肝臓薄層切片のヘマトキシリンエオシン染色後の光学顕微鏡写真を示す図である。
【図４】図４は、試験例１において、飼料１または２を摂取させたマウスについての脂肪沈着の評価結果を示す図である。
【図５】図５は、試験例１において、飼料１または２を摂取させたマウスについての炎症細胞浸潤の評価結果を示す図である。
【図６】図６は、試験例１において、飼料１または２を摂取させたマウスについてのＮＡＳの評価結果を示す図である。
【図７】図７は、試験例１において、飼料１または２を摂取させたマウスについて、３週間後、および１２週間後の肝臓の薄層切片のマッソントリクローム染色後の光学顕微鏡写真を示す図である。
【図８】図８は、試験例１において、飼料１または２を摂取させたマウスについての線維化の評価結果を示す図である。
【図９】図９は、試験例１において、飼料１、２または３を摂取させたマウスについての、飼育開始から１週間ごとの体重測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（実験動物用飼料）
本発明の実験動物用飼料（以下、「飼料」と称することがある）は、炭水化物源と、アミノ酸源と、油脂類と、ミネラル類および／または金属塩類とを少なくとも含み、必要に応じてさらにその他の成分を含む。
【００１３】
＜炭水化物源＞
前記炭水化物源としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、糖類、澱粉類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００１４】
前記炭水化物源の前記飼料における含有量としては、３５〜６０質量％であれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、ＮＡＳＨ誘発性、栄養のバランス等の点で、４０〜６０質量％が好ましい。
【００１５】
−糖類−
前記糖類としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、スクロース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、ラクトースなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記糖類は、公知の方法により調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
【００１６】
前記糖類の前記飼料における含有量としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、嗜好性、栄養のバランス等の点で、３〜２５質量％が好ましく、５〜２０質量％がより好ましい。
【００１７】
−澱粉類−
前記澱粉類としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、コーンスターチ、ワキシーコーンスターチ、小麦澱粉、馬鈴薯澱粉、タピオカ澱粉、米澱粉、サゴ澱粉などが挙げられる。前記澱粉類は、α化澱粉であってもよいし、未α化澱粉であってもよい。また、酸処理澱粉、架橋澱粉、エーテル化澱粉、エステル化澱粉などの加工がされた加工澱粉であってもよい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００１８】
前記澱粉類の前記飼料における含有量としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、嗜好性、栄養のバランス等の点で、２０〜５５質量％が好ましく、２５〜５０質量％がより好ましい。
【００１９】
前記α化澱粉の前記飼料における含有量としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、前記飼料の成型性・保型性に優れる点で、１５質量％以上が好ましく、２５質量％以上がより好ましく、３０質量％以上がさらに好ましい。
【００２０】
＜アミノ酸源＞
前記アミノ酸源としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、カゼインベースのアミノ酸源、卵白ベースのアミノ酸源、大豆蛋白ベースのアミノ酸源などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、ＮＡＳＨ誘発性、栄養のバランス等の点で、カゼインベースのアミノ酸源が好ましい。
本発明において、カゼインベースのアミノ酸源とは、カゼインのアミノ酸成分と同様の組成となるように配合したアミノ酸源である。
前記アミノ酸源は、公知の方法により調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
【００２１】
前記アミノ酸源の前記飼料における含有量としては、１０〜２５質量％であれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、ＮＡＳＨ誘発性、栄養のバランス等の点で、１５〜２０質量％が好ましい。
【００２２】
メチオニンの前記飼料における含有量としては、０．０５〜０．４質量％であれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、ＮＡＳＨ誘発性および実験動物に悪影響を与えない点で、０．０７〜０．３質量％が好ましい。
【００２３】
＜油脂類＞
前記油脂類としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、大豆油、コーン油、菜種油、米油、綿実油、ゴマ油、ヒマワリ油、パーム油、ヤシ油、落花生油、サフラワー油、ココナッツ油、カカオバター等の植物性油脂、ラード、牛脂等の動物性油脂などが挙げられるが、嗜好性、栄養のバランス等の点で、コーン油、パーム油、大豆油、菜種油、サフラワー油、ラードおよび牛脂から選択される少なくとも１種の食用油脂を主として含有することが好ましい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記油脂は、公知の方法により調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
【００２４】
本発明において、コーン油、パーム油、大豆油、菜種油、サフラワー油、ラードおよび牛脂から選択される少なくとも１種の食用油脂を主として含有するとは、前記飼料において、コーン油、パーム油、大豆油、菜種油、サフラワー油、ラードおよび牛脂から選択される少なくとも１種が最も配合量の多い油脂類であることを意味する。
【００２５】
前記油脂の前記飼料における含有量としては、１５〜３５質量％であれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、嗜好性や栄養のバランスだけでなく、ＮＡＳＨ誘発性および実験動物に悪影響を与えない点で、２０〜３０質量％が好ましい。
【００２６】
さらに、前記油脂類としてコレステロールを含有してもよい。
前記コレステロールの前記飼料における含有量としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、配合する場合は通常は０．１〜５質量％の範囲である。
【００２７】
＜ミネラル類および／または金属塩類＞
前記ミネラル類および／または金属塩類としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、鉄、銅、亜鉛、マンガン、モリブデン、セレン、シリコン、クロム、ニッケル、リチウム、バナジウム、ヨウ素、フッ素、ホウ素、塩素、硫酸根（ＳＯ４）、硫黄（無機）、食塩等のミネラル類、鉄化合物、銅化合物、亜鉛化合物、マンガン化合物、コバルト化合物、クロム化合物、カルシウム化合物、マグネシウム化合物等の金属塩類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記鉄化合物としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、クエン酸鉄、クエン酸鉄アンモニウム、塩化鉄、塩化第二鉄、炭酸鉄、酸化鉄、硫酸鉄などが挙げられるが、ＮＡＳＨ誘発性および実験動物に悪影響を与えない点で、酸化鉄、硫酸鉄、およびクエン酸鉄から選択される少なくとも一種が好ましい。
【００２８】
前記ミネラル類および／または金属塩類は、公知の方法により調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
前記ミネラル類および／または金属塩類の前記飼料における含有量としては、３〜８質量％であれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、栄養のバランスや実験動物に悪影響を与えない等の点で、４〜７質量％が好ましい。
【００２９】
前記ミネラル類の具体例としては、例えば、米国国立栄養研究所（ＡＩＮ）が発表したマウス・ラットを用いた栄養研究のための標準精製飼料におけるミネラル混合であるＡＩＮ−７６ミネラル混合（１９７７年発表）、ＡＩＮ−９３Ｇミネラル混合（１９９３年発表）などが挙げられる。
【００３０】
前記ミネラル混合の代表例として、ＡＩＮ−９３Ｇミネラル混合を添加した飼料１００ｇ中の前記ミネラル混合由来のミネラルの組成を以下に示す。
・  カルシウム    ・・・  ５００（ｍｇ）
・  リン          ・・・  １５０（ｍｇ）
・  マグネシウム  ・・・  ５０（ｍｇ）
・  ナトリウム    ・・・  １００（ｍｇ）
・  カリウム      ・・・  ３６０（ｍｇ）
・  鉄            ・・・  ３．５（ｍｇ）
・  銅            ・・・  ０．６（ｍｇ）
・  亜鉛          ・・・  ３．０（ｍｇ）
・  マンガン      ・・・  １．０（ｍｇ）
・  モリブデン    ・・・  ０．０１５（ｍｇ）
・  セレン        ・・・  ０．０１５（ｍｇ）
・  シリコン      ・・・  ０．５（ｍｇ）
・  クロム        ・・・  ０．１（ｍｇ）
・  ニッケル      ・・・  ０．０５（ｍｇ）
・  リチウム      ・・・  ０．０１（ｍｇ）
・  バナジウム    ・・・  ０．０１（ｍｇ）
・  ヨウ素        ・・・  ０．０２（ｍｇ）
・  フッ素        ・・・  ０．１（ｍｇ）
・  ホウ素        ・・・  ０．０５（ｍｇ）
・  塩素          ・・・  １６０（ｍｇ）
・  硫黄（無機）  ・・・  ３０（ｍｇ）
【００３１】
前記鉄化合物の前記飼料における含有量としては、０．０５〜０．５質量％であれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、栄養のバランスや実験動物に悪影響を与えない等の点で、０．０７〜０．４質量％が好ましい。
【００３２】
＜コリン類＞
前記コリン類としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、塩化コリン、重酒石酸コリン、クエン酸水素コリン、クエン酸二水素コリン、アセチルコリン、塩化アセチルコリン、ホスファチジルコリン、コリン酒石酸水素塩などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３３】
前記コリン類の前記飼料における含有量としては、０．０１質量％以下であれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、ＮＡＳＨ誘発性の点で、０．００１質量％以下が好ましく、０％がより好ましい。
【００３４】
＜その他の成分＞
前記飼料におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、ビタミン類、セルロース、第三ブチルヒドロキノン等の精製飼料用原料、汎用されている一般的飼料原料などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記その他の成分は、公知の方法により調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
前記その他の成分の前記飼料における含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、適宜選択することができる。
【００３５】
−ビタミン類−
前記ビタミン類としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ１、ビタミンＫ３、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビオチン、葉酸、パントテン酸カルシウム、パラアミノ安息香酸、ニコチン酸、イノシトール、重酒石酸コリン、塩化コリンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記ビタミン類は、公知の方法により調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
前記ビタミン類の前記飼料における含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、適宜選択することができる。
【００３６】
前記ビタミン類の具体例としては、例えば、米国国立栄養研究所（ＡＩＮ）が発表したマウス・ラットを用いた栄養研究のための標準精製飼料におけるビタミン混合であるＡＩＮ−７６ビタミン混合（１９７７年発表）、ＡＩＮ−９３ビタミン混合（１９９３年発表）などが挙げられる。
【００３７】
前記ビタミン混合の代表例として、ＡＩＮ−９３ビタミン混合のビタミンの組成を以下に示す。
・  ニコチン酸                                ・・・  ０．３０％
・  パントテン酸Ｃａ                          ・・・  ０．１６％
・  ビタミンＢ６                              ・・・  ０．０７％
・  ビタミンＢ１                              ・・・  ０．０６％
・  ビタミンＢ２                              ・・・  ０．０６％
・  葉酸                                      ・・・  ０．０２％
・  Ｄ−ビオチン（２％）                      ・・・  ０．１０％
・  ビタミンＢ１２（０．１％）                  ・・・  ０．２５％
・  ビタミンＥ（５０％）                      ・・・  １．５０％
・  ビタミンＡ（１００万ＩＵ／ｇ）            ・・・  ０．０４％
・  ビタミンＤ３（５０万ＩＵ／ｇ）            ・・・  ０．０２％
・  ビタミンＫ１（ｐｈｙｌｌｏｑｕｉｎｏｎｅ）・・・  ０．０１％
・  グラニュー糖                              ・・・  ９７．４１％
【００３８】
−セルロース−
前記セルロースは、公知の方法により調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
前記セルロースの前記飼料における含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、適宜選択することができるが、１０質量％以下が好ましく、５質量％以下がより好ましい。
【００３９】
−汎用されている一般的飼料原料−
前記汎用されている一般的飼料原料としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、コーンフラワー、小麦粉、大豆粕、米ぬか、ふすま、大麦粉、魚粉、肉粉、脱脂粉乳などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記汎用されている一般的飼料原料は、公知の方法により調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
前記汎用されている一般的飼料原料の前記飼料における含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、適宜選択することができる。
【００４０】
前記飼料の形状、構造、大きさ、硬さとしては、特に制限はなく、実験動物に応じて適宜選択することができる。
【００４１】
前記飼料は、必要に応じて滅菌処理を行ってもよい。
前記滅菌処理としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、γ線照射による滅菌処理、オートクレーブによる滅菌処理などが挙げられる。
【００４２】
＜対象＞
前記飼料の対象となる実験動物としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ等のげっ歯類の他にミニブタ、ビーグル犬、サルなどが挙げられるが、げっ歯類が好ましい。
【００４３】
前記飼料の製造方法としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、後述する本発明の実験動物用飼料の製造方法により、好適に製造することができる。
【００４４】
（実験動物用飼料の製造方法）
本発明の実験動物用飼料の製造方法は、上記した前記飼料を製造する方法である（以下、「飼料の製造方法」と称することがある）。
【００４５】
前記飼料の製造方法は、炭水化物源３５〜６０質量％、アミノ酸源１０〜２５質量％、油脂類１５〜３５質量％、並びにミネラル類および／または金属塩類３〜８質量％を含有する実験動物用飼料の製造方法であって、（ｉ）前記アミノ酸源として、メチオニン０．０５〜０．４質量％を配合し、（ｉｉ）コリン類の含有量を０．０１質量％以下に調節し、且つ（ｉｉｉ）前記ミネラル類および／または金属塩類として、鉄化合物０．０５〜０．５質量％を配合する工程を含む限り、特に制限はなく、一般的な方法を適宜選択することができる。
【００４６】
例えば、ペレット状固型飼料とする場合には、上記原料を混合後、アジテーターまたはコンディショナーにて、水および蒸気を用いて原料水分が１０〜２５質量％程度となるように調製する。次いで、ペレットミル、エクストルーダー等の押出造粒機に投入してダイの孔より押し出し、所望の長さとしたペレットを固定刃または回転刃で切断し、その後乾燥する方法などが挙げられる。
ペレットの径および長さとしては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、径３〜１５ｍｍ程度、長さは前記径の１〜１．５倍以上とするなどが挙げられる。
前記乾燥の方法としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、通常の通風乾燥などを用い、８０〜１４０℃程度の加熱により乾燥する方法などが挙げられる。
【００４７】
（非アルコール性脂肪肝炎モデル動物の作出方法）
本発明の非アルコール性脂肪肝炎モデル動物の作出方法は、上記した前記飼料を用いた、非アルコール性脂肪肝炎モデル動物を作出する方法である（以下、「モデル動物の作出方法」と称することがある）。
【００４８】
前記モデル動物の作出方法は、上記した前記飼料を実験動物に摂取させる工程を含む限り、特に制限はなく、一般的な方法を適宜選択することができる。
例えば、前記飼料を実験動物に摂取させ、飼育する方法などが挙げられる。
【００４９】
前記実験動物としては、前記飼料の対象となる実験動物と同様である。
【００５０】
前記摂取としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、自由摂取、強制経口投与などが挙げられるが、簡便性の点から、自由摂取が好ましい。
前記摂取期間としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、ＮＡＳＨ誘発性の点から、３週間以上が好ましく、９週間以上がより好ましく、１２週間以上がさらに好ましく、２０週間以上が特に好ましい。
【００５１】
前記飼育としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、２０〜２６℃の温度条件下、１２時間点灯および１２時間消灯の照明条件下での飼育が挙げられる。
【実施例】
【００５２】
以下、試験例を示して本発明を説明するが、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではない。
【００５３】
（比較例１）
一般的な実験用の基礎飼料として、ＡＩＮ−９３Ｇ飼料を比較例１の飼料（以下、「飼料１」と称することがある）とした。
飼料１の配合組成は、以下のとおりである。
カゼイン（２０．０％）、シスチン（０．３％）、βコーンスターチ（３９．７％）、αコーンスターチ（１３．２％）、スクロース（１０．０％）、大豆油（７．０％）、セルロースパウダー（５．０％）、ＡＩＮ−９３Ｇミネラル混合（３．５％）、ＡＩＮ−９３ビタミン混合（１．０％）、重酒石酸コリン（０．２５％）、第三ブチルヒドロキノン（０．００１４％）。「ＡＩＮ−９３Ｇミネラル混合」および「ＡＩＮ−９３ビタミン混合」は、米国国立栄養研究所（ＡＩＮ）が１９９３年（ＡＩＮ−９３）に発表したマウス・ラットを用いた栄養研究のための標準精製飼料（ＡＩＮ−９３精製飼料）におけるビタミン混合およびミネラル混合を表す。
【００５４】
（実施例１〜２）
下記表１に記載の原料を混合した後、水を外割４０％に加水して一軸押出し成型機にて、孔径１２ｍｍのダイの孔より押し出して固型飼料を得た。次に、バンド乾燥機で乾燥した後冷却する通常の条件下で、実施例１〜２のペレット状固型飼料を得た（実施例１の飼料を「飼料２」、実施例２の飼料を「飼料３」と称することがある）。
下記表２に、カゼインのアミノ酸組成を示した。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
【表２】
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【００５７】
（試験例１）
＜非アルコール性脂肪肝炎誘発実験動物の作製＞
４週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスを市販ケージにて、飼料１、２または３と、水とを自由摂取させ、飼育した（２３±２℃、点灯１２時間、消灯１２時間）。
【００５８】
＜病態観察＞
飼料２を摂取させたマウスについて、１２週間後（ｎ＝５）、３０週間後（ｎ＝５）、および４０週間後（ｎ＝５）、５４週齢後（ｎ＝５）に安楽死させ、肝臓を摘出し、病態の進行を観察した。摘出した肝臓をデジタルカメラで撮影し、画像を図１に示した。
【００５９】
１２週間後には、１００％のマウスにおいて、脂肪肝、炎症、および線維化が観察された。
３０週間後には、８０％のマウスにおいて、直径２ｍｍ未満の結節が観察され（黒三角）、４０％のマウスにおいて、直径２ｍｍ以上の大型結節が観察された（白三角）。
４０週間後には、６０％のマウスにおいて、直径２ｍｍ以上の大型結節が観察された（白三角）。５４週間後には、１００％のマウスにおいて、肝臓の腫瘍化が観察された。
【００６０】
飼料３を摂取させたマウスについて、１２週間後（ｎ＝５）、２０週間後（ｎ＝５）、および３０週間後（ｎ＝５）、４０週齢後（ｎ＝５）に安楽死させ、肝臓を摘出し、病態進行を観察した。摘出した肝臓をデジタルカメラで撮影し、画像を図２に示した。
【００６１】
１２週間後には、１００％のマウスにおいて、脂肪肝、炎症、および線維化が観察された。
２０週間後には、６０％のマウスにおいて、直径２ｍｍ未満の結節が観察され（黒三角）、４０％のマウスにおいて、直径２ｍｍ以上の大型結節が観察された（白三角）。
３０週間後には、８０％のマウスにおいて、直径２ｍｍ以上の大型結節が観察され（白三角）、肝硬変の疑いが見受けられた。４０週齢後（ｎ＝５）でも、３０週齢と同程度の結果が観察され、４０週間後には、５０％のマウスにおいて、肝臓の腫瘍化が観察された。
【００６２】
図１および２の結果から、正常マウスに飼料２または３を摂取させることにより、短期間でヒトの非アルコール性脂肪肝炎の病態に類似する病態を示す実験動物が作製できることが分かった。
【００６３】
＜病理評価＞
飼料１を摂取させたマウスについて、３週間後（ｎ＝３）、２０週間後（ｎ＝３）および３０週間後（ｎ＝３）に安楽死させ、肝臓を摘出した。
飼料２を摂取させたマウスについて、３週間後（ｎ＝４）、６週間後（ｎ＝４）、９週間後（ｎ＝５）、１２週間後（ｎ＝５）、２０週間後（ｎ＝５）、および３０週間後（ｎ＝５）に安楽死させ、肝臓を摘出した。摘出した肝臓から常法に従って薄層切片標本を作製した。
【００６４】
−ヘマトキシリンエオシン染色−
前記薄層切片標本をマイヤーのヘマトキシリン液に８分間浸漬させ、水洗後、エオシン液に３分間浸漬させることにより染色し、前記薄層切片を光学顕微鏡で観察した。
飼料１を摂取させたマウスの２０週間後、並びに飼料２を摂取させたマウスの、９週間後および３０週間後の薄層切片の光学顕微鏡写真を図３に示した。
対物レンズ２０倍の視野にて、ＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｓｃｏｒｅ）による評価を行なった。ＮＡＳによる評価は、表３の基準に従った。
脂肪沈着の評価結果を図４に示した。
炎症細胞浸潤の評価結果を図５に示した。
ＮＡＳの評価結果を図６に示した。
【００６５】
−−マイヤーのヘマトキシリン液−−
１０００ｍＬの蒸留水に、５０ｇの硫酸カリウムアルミニウムを添加したＡ液と、２０ｍＬのアルコールに、１ｇのヘマトキシリン、０．２ｇのヨウ化ナトリウム、５０ｇの抱水クロラール、３ｍＬの酢酸を添加したＢ液とを混合した。
【００６６】
−−エオシン液−−
１００ｍＬの蒸留水に、１ｇのエオシンＹおよび０．１ｍＬの酢酸を添加して混合した。
【００６７】
【表３】
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【００６８】
−マッソントリクローム染色−
前記薄層切片を媒染剤で１０〜１５分間浸漬させ、水洗後、ワイゲルドの鉄ヘマトキシリン液に５分間浸漬させ、軽く水洗後、１％塩酸７０％アルコールで分別し、１液に２〜５分間浸漬させ、軽く水洗後、２液に３０分間以上浸漬させ、軽く水洗後、３液に５分間浸漬させ、軽く水洗後、１％酢酸水に浸漬させることにより染色し、前記薄層切片を光学顕微鏡で観察した。
飼料１を摂取させたマウスの３週間後、並びに飼料２を摂取させたマウスの、３週間後および１２週間後の薄層切片の光学顕微鏡写真を図７に示した。
１２週間後には、１００％のマウスで線維化が観察された。
【００６９】
対物レンズ２０倍の視野にて、表４の基準に従い、線維化を評価した。評価結果を図８に示した。
【００７０】
−−媒染剤−−
１０％トリクロル酢酸水溶液と、１０％重クロム酸カリウム水溶液とを当量混合した。
【００７１】
−−１液−−
９０ｍＬの１％ビーブリッヒスカーレット、１０ｍＬの１％酸性フクシンおよび１ｍＬの酢酸を混合した。
【００７２】
−−２液−−
２００ｍＬの蒸留水に、５ｇのリンモリブデン酸および５ｇのリンタングステン酸を添加して混合した。
【００７３】
−−３液−−
１００ｍＬの蒸留水に、２．５ｇのアニリン青および２ｍＬの酢酸を添加して混合した。
【００７４】
【表４】
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【００７５】
図１から図８の結果より、正常マウスに飼料２または３を摂取させることにより、短期間でヒトの非アルコール性脂肪肝炎の病態に類似する病態を示す実験動物が作製できることが分かった。具体的には、３週間で１００％の個体で脂肪沈着、炎症細胞浸潤および線維化が認められ、３０〜４０週間で６０〜８０％の個体で大型結節認められ、飼料３では４０週間で５０％の個体で、および飼料２では５４週間で１００％の個体で腫瘍化が認められた。
【００７６】
＜体重＞
飼料１、２または３を給餌してマウスを飼育し、経時でのマウスの体重変化を試験した。体重の測定は、飼育開始から１週間ごとに行った（ｎ＝３−５）。測定結果を図９に示した。
図９の結果より、飼料２または３を給餌して飼育したマウスにおいて、飼料１を給餌して飼育したマウスと同様に、経時的に体重が増加して成長が阻害されないことが分かった。したがって、実験動物の生育に必要な栄養組成を維持していることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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